株式会社クロマニックテクノロジーズ

逆相カラム Biphenyl, PFP および PFP&C18 の分離特性
長 江

1

徳 和， 塚 本

友 康， 小 山隆 次

は じ め に

逆相クロマトグラフィーでは，C18（ODS）カラムは保持時間が長く，耐久性が高く，さらに多くの応用例が発表されていることなどから，多くのクロマトグラ
ファーが使用しており，汎用性の高いカラムである。しかし試料によっては， C18 カラムでは分離が難しく，他の固定相のカラムを用いると簡単に分離できる場合もある。 C18 固定相と分離選択性が異なる固定相して，C30 固 定 相 ， Phenyl 固 定 相 ， Biphenyl 固 定 相 ， Pentafluorophenyl（ PFP ）固定相， Cyano 固定相などが知られている。 C30 固定相は 100 ％ 水系移動相条件でも保持時間の再現性が高い，ビタミン E の異性体の分離が可能，脂溶性の高いカロテンやトリグリセリドの異性体の分離が良いなどの特徴がある。 Phenyl 固定相やBiphenyl 固定相はアルキル基型固定相にはない p 電子を有してる事が特徴で， p p 相互作用や CH / p 相互作用1)が働く。PFP 固定相はフェニル基に五つのフッ素原子が結合しており， p p 相互作用のみならず，水素結合性，双極子相互作用，静電的相互作用が働くと言われている。 Cyano 固定相は疎水性が低く，三重結合を有しているので，逆相固定相としては特異的な存在である 。 本 稿 で は Biphenyl 固 定 相 と PFP 固 定 相 お よ び
PFP と C18 を併せ持つ PFP&C18 固定相について C18固定相とは異なる分離特性を解説する。

2

標準試料による逆相固定相の比較

図 1 に逆相固定相の模式図を示す。フェニル基系固定相はケイ素原子とフェニル基の間にスペーサーとしてアルキル基を入れる事が多いが， Biphenyl 固定相はケイ素原子に直にビフェニル基が結合している。図 2 に同一の比表面積 340 m2 g－1 の全多孔性シリカに三官能

図1逆相固定相の模式図性シリル化試薬を結合後，エンドキャッピング処理を行った C30 固定相， C18 固定相， C8 固定相， Phenyl
固 定 相 ， Biphenyl 固 定 相 ， PFP 固 定 相 お よ び

ンの分離係数としての疎水性およびトリフェニレンと o 

PFP&C18 固定相による標準試料の分離と，それぞれのターフェニルの分離係数としての立体選択性を示す。ウ充剤の炭素含有量，カフェインとフェノールの分離係ラシルの溶出時間をホールドアップタイムとして計算し数としての水素結合性，アミルベンゼンとブチルベンゼた。 C30， C18 および C8 のアルキル基固定相は炭素含676

ぶんせき  

な保持の変化がない特性を利用したものである。 PFP固 定 相 ， PFP&C18 固 定 相 ， Phenyl 固 定 相 お よ び
Biphenyl 固定相は，アルキル基固定相よりも水素結合性が高い値となった2) 。特に Biphenyl 固定相は C18 固定相と同じエンドキャッピングを施しており，残存シラノール基の影響は少ないはずであるが，エンドキャッピングを施していない C18 固定相と同等か，それ以上の高い水素結合性を示した。フェノール基やビフェニル基の特性として，ベンゼン環に由来する p 電子の存在により環の中心部が最もマイナスに偏っていると考えられ，この電子の偏りが水素結合性（CH/p 相互作用）を大きくしており，カフェインのような極性化合物をより強く保持するようになると推察される。 Biphenyl 固定相はベンゼン環が二つ結合しており，固定相としては結晶状態になっておらず，液体に近い状態であると考えられ，二つのベンゼン環は約 45 度傾いて結合している。
この隣接した二つのベンゼン環の相乗効果により水素結合性がより強くなっていると思われる。立体選択性の評価に用いられたトリフェニレンと o ターフェニルは三つのベンゼン環が結合しており，トリフェニレンは三つの ベンゼ ン環が平 面的に配 置してい るのに 対し， o 
ターフェニルはそれぞれのベンゼン環はねじれた状態になっている。この立体的な差の認識（分離）度合いを立体選択性としている。アルキル基固定相ではアルキル鎖長の長い固定相程，立体選択性は高くなり，メチル基の位置異性体である b トコフェロールと g トコフェ
ロールは立体選択性の高い C30 固定相の方が C18 固定
相 よ り 良 い 分 離 を 示 す3) 。 Biphenyl 固 定 相 お よ び
図2

標準試料の分離と水素結合性・疎水性・立体選択性
カラム，Sunrise C30, Sunniest C18, Sunniest C8, Sunni-est Phenyl, Sunniest Biphenyl, Sunniest PFP, Sunniest

Phenyl 固定相については立体的な差の認識よりも， p p 相互作用が強く発揮されてトリフェニレンと o ターPFP&C18, Sunniest PFP, Sunniest PFP&C18, 150 mm
×4.6 mm i.d., 5 nm；移動相；メタノール/水＝75/25；フェニルが保持されていると考えられる。アルキル基固流速， 1.0 mL / min；カラム温度， 40 °C ；検出， UV250

溶出するが，フェニル基固定相では p p 相互作用によ

nm ；ピーク； 1 ＝ウラシル， 2 ＝カフェイン， 3 ＝フェノール 4＝ブチルベンゼン，5＝o ターフェニル，6＝アり o ターフェニルの保持が大きくなり，アミルベンゼミルベンゼン，7＝トリフェニレン。

ンとの溶出順序が逆転した。トリフェニレンの保持につ定相では o ターフェニルの溶出後にアミルベンゼンがいて，Phenyl 固定相では o ターフェニルとトリフェニレンは同じ時間に溶出したが， Biphenyl 固定相はアル有量の多い順番で保持が大きく，フェニル基，ペンタフキル基固定相と同様にトリフェニレンの保持が大きくルオロフェニル基固定相では炭素含有量の保持への効果なった。Phenyl 固定相と Biphenyl 固定相は，共にフェがアルキル基固定相より低い。C8 固定相と Biphenyl 固ニル基型の固定相として分類されるが，水素結合性と立定相との比較では， C8 固定相の方が，炭素含有量は低体選択性の値が大きく異なった。 PFP 固定相はフェニいがアミルベンゼンの保持は大きい。水素結合性はフェル基に五つのフッ素原子が結合し，疎水性相互作用，水ノールを基準としたカフェインの保持割合であり，水素素結合性，双極子相互作用， p p 相互作用および静電結合性が大きいと極性の高い（水素結合性が強い）化合的相互作用が働くとされており，他の固定相と大きく異物の保持が大きくなる。これは，エンドキャッピングをなる。 PFP 固定相と PFP&C18 固定相については，こ

施していない C18 充剤では残存シラノール基とカこで用いた立体選択性の値は 2 以上になった。これはフェインの水素結合性による二次的相互作用が強く働く他の固定相に比べ非常に大きな値であり， o ターフェ為，カフェインの保持は大きくなるが，フェノールは残ニルとトリフェニレンの保持についてはフェニル基型固存シラノール基による二次的相互作用を受け難く，大き定相と同様にアルキル基固定相とは異なる相互作用が働

ぶんせき  677

い て い る と 推 察 さ れ る 。 ま た ， PFP&C18 固 定 相 は有機溶媒と緩衝液の混合溶媒の移動相より疎水性が高PFP 固定相に C18 固定相を加えたもので，疎水性の値

く，さらに，塩基性化合物の保持は疎水性の高いもの

は C18 固定相が加わったことで増加し，保持は大きく程，保持時間が長くなっており，逆相の分離挙動を示しなったが，水素結合性や立体選択性の値は PFP 固定相ている（図 3 ）。移動相中の有機溶媒濃度の増加と共にとほぼ同じであり， PFP&C18 固定相も PFP 固定相とカチオンの保持が大きくなるのは，静電的相互作用が移同様な分離特性を有していた。PFP 固定相は PFP 独自の分離挙動を示し，特にフッ素原子の電子吸引性により，構造中の電子の偏りが生じるため，カチオンの保持が大きくなる。図 3 にコアシェルシリカに表面処理を施した C18 固定相と PFP 固定相の塩基性化合物の分離を示す。移動相 pH は 7 であり，これらの塩基性化合物はプロトン化したカチオンとして存在する。移動相中のアセトニトリル濃度は 80 ％ であり，C18 固定相では塩基性化合物をほとんど保持していないのに対し， PFP固定 相は 5 分か ら 8 分 に溶 出し ，大 きな 保持 を示 した。これは静電的相互作用による保持の増大であると考えられる。このカチオンの保持を大きくしている相互作用を陽イオン交換相互作用であるとする報告4)もあるが，PFP 固定相のフッ素原子はイオン化しておらず，イオン交換は起こり得ない。また，この静電的相互作用は移動相中有機溶媒濃度が高くなる程，大きく作用し，塩基性 化 合 物の 保 持 時 間 が 長 く な る。 こ の 現 象 を HILIC
モードの分離挙動であると説明されること5) もある。
HILIC モードは順相モードの一部であり，移動相に有機溶媒と水溶液の混合溶媒を用いた場合を特に HILIC

図3

C18 と PFP 固定相による塩基性化合物の分離
カラム，SunShell C18, PFP, 150 mm×4.6 mm i.d., 2.6nm；移動相，アセトニトリル/10 mmol/L リン酸緩衝液モードと表現している。順相モードでは移動相よりも固（pH 7.0)＝80/20；流速，1.8 mL/min；カラム温度，25定相の方の極性が高く，極性の高い溶質程，保持が大き°C ；ピーク， 1＝ウラシル， 2＝プロプラノロール， 3 ＝ノルトチプチリン，4＝アミトリプチリン。

くなり，逆相とは反対になる。しかし， PFP 固定相は

図4

メチル馬尿酸異性体の分離
カラム，SunShell C18, SunShell C30, SunShell Phenyl, SunShell Biphenyl, 150 mm×4.6 mm i.d., 2.6 nm；移動相，有機溶媒/25 mmol/L リン酸緩衝液（pH 3.0）有機溶媒は図中に記載，流速，1.0 mL/min；カラム温度，40 °C；検出，UV230 nm；ピーク，o , m , p メチル馬尿酸。

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ぶんせき  動相中の有機溶媒濃度が高い程，相対的に強くなる事が理由である推察され，逆相分配相互作用に二次的に静電的相互作用が加味されているものと考えられる。

3Biphenyl カラムの分離例

図 4 に種々の固定相と移動相を用いて得られたメチル馬尿酸異性体の分離を示す。固定相として C18, C30,Phenyl および Biphenyl を用い，移動相中の有機溶媒としてメタノールおよびアセトニトリルを用いて，それぞれの固定相の分離を比較した。メチル馬尿酸はメタ体とパラ体の異性体の分離が難しく，近接して溶出される。
それぞれのクロマトグラム上にメタ体とパラ体の異性体の分離係数 a を示した。移動相中の有機溶媒が 25 ％ メタノールと 13.5 ％ アセトニトリルを比較すると，25 ％メタノールは固定相により保持時間が大きく異なり，Phenyl 固定相は C18 固定相より保持時間は長くなり，Biphenyl 固定相はさらに保持時間が長く， C18 固定相と比較し約 2 倍の保持時間となった。しかし， 13.5 ％アセトニトリルではすべての固定相でほぼ同じ保持時間となった。さらに，Biphenyl 固定相におけるパラメチル馬尿酸とメタメチル馬尿酸の溶出順序に関しては，25 ％ メタノールでは他の固定相とは溶出順序が逆転したが， 13.5 ％ アセトニトリルでは他の固定相と同じ溶出順序であった。 25 ％ メタノールで Phenyl 固定相やBiphenyl 固定相においてメチル馬尿酸の保持が大きくなったのは， p p 相互作用によるものであると考えられる。アセトニトリルの CN の三重結合が固定相と溶質の間の p p 相互作用を弱めるため，13.5 ％ アセトニト
リルではフェニル基の特徴が発揮されず，保持時間はそ

図5

核酸塩基の分離カラム，SunShell C18 (pore size, 9 nm), SunShell RP AQUA (C30, pore size, 16 nm), SunShell Biphenyl (poresize, 9 nm), 150 mm×4.6 mm i.d., 2.6 nm；移動相，A）
メタノール/ 10 mmol / L 酢酸アンモニウム（ pH 6.8 )＝20/80，B）10 mmol/L 酢酸アンモニウム（pH 6.8)；流速， 1.0 mL / min ；カラム温度， 40 °C ；検出， UV250nm；ピーク，1＝亜硝酸ナトリウム，2＝シトシン，3＝ウラシル，4＝グアニン，5＝チミン，6＝アデニン。

れ ぞ れ の 固 定 相 で 大 差 な く ， Biphenyl 固 定 相 で の パラ・メタ メチル馬尿酸の溶出順序は逆転しなかったと推察される。
図 5 に C18 ， C30 および Biphenyl 固定相による核酸小さく，ウラシルと近い保持時間となった。これらの現塩基類の分離を示す。核酸塩基は極性が高い為，メタ象は 20 ％ のメタノールを移動相に加えた時も，100 ％ノールを 20 ％ 程度含む移動相では保持係数が 1 以下に水系移動相と同様であった。図 2 で示されている水素なる。有機溶媒を含まない緩衝液の移動相では，例えば結合性が最も高い Biphenyl 固定相は，核酸塩基の保持チミンの保持係数は 3～5 程度に増大する。逆相カラムや，溶出順序に水素結合性が大きく寄与していると考えは有機溶媒濃度が 5 ％ を下回るような移動相では保持られる。Biphenyl 固定相は p p 相互作用や CH/p 相互時間の再現性が低くなることが知られており，これは毛作用1)が働くと言われているが，これらの相互作用も加管作用による充剤細孔内からの移動相の抜け出だしに味され，カフェインの保持を大きくする水素結合性が増より起こるものと報告されている6)。図 5 の C18 カラム大したと考えられる。 100 ％ 水系移動相を用いた場合の有機溶媒を含まない 10 mmol L－1 の酢酸アンモニウの ポ ン プ 停 止 前 後 の 保 持 時 間 の 安 定 性 は ， C30 とム水溶液を移動相とした分離は，カラム出口以降に 5Biphenyl 両固定相とも高く，ポンプ停止後再度通液しMPa の背圧を掛け，充剤細孔内からの移動相が抜けて得られた保持時間はポンプ停止前の 96 ％ 以上であっ出ない様にしている。3 種類の固定相を比較すると，最た。しかし，C18 固定相ではポンプ停止後は 15 ％ まで後に溶出する成分は Biphenyl 固定相が最も大きな保持保持間は減少した。

を示した。また，チミン（ピーク 5）とアデニン（ピー

図 6 には酒石酸，グリコール酸，ギ酸及び乳酸の分ク 6 ）は Biphenyl 固定相のみ溶出順序が逆転した。さ離を示す。 RP AQUA （ C30 ）固定相と Biphenyl 固定

らにグアニンの相対的な保持は Biphenyl 固定相が特に相の比較を行った。アルキル鎖系（ C18 AQ 等）のカぶんせき  679

図6グリコール酸の分離
カラム，SunShell RP AQUA, SunShell Biphenyl, 150mm×4.6 mm i.d., 2.6 nm；移動相，0.1 ％ リン酸；流速，1.0 mL / min ；カラム温度， 40 °C ；検出， UV210 nm ；ピーク，1＝酒石酸，2＝グリコール酸，3＝ギ酸，4＝乳酸。
図7

フルオロベンゼン類の分離
カラム，SunShell PFP, SunShell PFP&C18, SunShell
C18, 150 mm×4.6 mm i.d., 2.6 nm；移動相，メタノー

ラムでは酒石酸とギ酸のピークが接近しており，グリル/水＝60/40；流速，1.0 mL/min；カラム温度，40 °C；
検出，UV250 nm；ピーク，1＝ベンゼン，2＝フルオロコ ー ル 酸 は ほ と ん ど の 場 合 酒 石 酸 と 重 な る 。 RP AQUA（C30）カラムも同様に酒石酸とグリコール酸はベンゼン，3＝トルエン，4＝a,a,a トリフルオロトルエ

重なり， 1 本のピークとなった。しかし Biphenyl カラン。

ムは図 6 及び図 9 に示されている様に，酒石酸ピークとギ酸ピークは離れており，この間にグリコール酸は溶出した。 Biphenyl カラムは酒石酸，グリコール酸及びギ酸の 3 成分の分離が可能であった。

4PFP および PFP&C18 カラムの分離例

図 7 に は PFPF 固 定 相 ， PFP&C18 固 定 相 お よ び
C18 固 定 相 を 用 い た フ ル オ ロ ベ ン ゼ ン 類 の 分 離 を 示す。フルオロベンゼンとベンゼンは C18 固定相では分離不可能であるが， PFP 固定相および PFP&C18 固定相では保持時間は異なるものの十分な分離が達成された。
PFP はハロゲンを含む化合物の選択性が向上した。図8 にはカテコールアミン類の分離を示す。エピネフリンとレボドーパの溶出順序は PFP&C18 固定相と PFP 固定相では逆になった。 PFP&C18 固定相は C18 固定相で分離を行った場合の溶出順序と同じであり，疎水性相互作用が保持に大きく寄与していると推察されるのに対し， PFP 固定相は水素結合性，双極子相互作用が保持に大きく寄与し，極性のより高いエピネフリンの保持が増大したと考えられる。図 9 には 9 種の有機酸の分離を示す。RP AQUA（C30）固定相，Biphenyl 固定相，PFP 固 定 相 お よ び PFP&C18 固 定 相 を 比 較 し て い る

図8

カテコールアミン類の分離
カラム，Sunniest PFP&C18, Sunniest PFP, 150 mm×4.6 mm i.d., 5 nm；移動相，12.5 mmol/L ギ酸アンモニウム（pH 3)；流速，1.0 mL/min；カラム温度，25 °C；
検出，UV260 nm；ピーク，1＝エピネフリン，2＝レボドーパ。

が，それぞれの固定相で溶出順序は異なり，それぞれの固定相が有する特異な相互作用が発揮されていると推察く疎水性相互作用が他の相互作用よりも保持に大きく寄される。 PFP 固定相と PFP&C18 固定相の比較におい与したためであると考えられる。図 8 と 9 での両分離て ， 保 持 時 間 は PFP&C18 固 定 相 の 方 が 大 き く な っは 100 ％ 水系移動相であり，極性の高い化合物の分離た。これは pH3 の条件での有機酸と固定相との間で働であるが，固定相との相互作用のかかわり方は化合物の680

ぶんせき  

素結合性，双極子相互作用および静電的相互作用により，C18 とは大きく異なる分離が可能である。これらのカラムは， C18 カラムを補完するカラムとして，注目されており，今後の応用例が期待される。
文献

1) A. Fujii, H. Hayashi, J. W. Park, T. Kazama, N. Mikami, S.
Tsuzuki : Phys. Chem. Chem. Phys., 13, 14131 (2011).
2) H. Cramer, D. S. Bell, D. Shollenberger : LCGC Europe, 30,6, 314 (2017).
3) 長江徳和，LC と LC/MS の知恵，1, 8 27 (2020).
4) J. Nichthauser, P. Stepnowski : J. Chromatogr. Sci., 47, 247(2009).
)
5 D. S. Bell, A. D. Jones : J. Chromatogr. A, 1073, 99 (2005).

6 ) 榎並敏行，長江徳和：分析化学（ Bunseki Kagaku ）， 53,1309 (2004).

長江徳和（Norikazu NAGAE)
株式会社クロマニックテクノロジーズ（〒552 0001 大 阪 府 大 阪 市 港 区 波 除 6 3 1 ）。名古屋大学工学部応用化学卒。博士（工学）。≪主な著書≫“LC/MS, LC/MS/MS のメンテナンスとトラブル解決”（分担執筆）（オーム社）。

図9

有機酸の分離E mail : nagae＠chromanik.co.jp

4 カラム，SunShell RP AQUA, SunShell Biphenyl,SunShell PFP, SunShell PFP&C18, 150 mm×4.6 mm
i.d., 2.6 nm ；移動相， 0.1 ％ リン酸；流速， 1.0 mL /min；カラム温度， 40 °C ；検出，UV210 nm；ピーク，
1＝酒石酸，2＝ギ酸，3＝リンゴ酸，4＝乳酸，5＝酢酸，6＝マレイン酸，7＝クエン酸，8＝琥珀酸，9＝フマル酸。

塚本友康（Tomoyasu TSUKAMOTO)
株式会社クロマニックテクノロジーズ（〒552 0001 大 阪 府 大 阪 市 港 区 波 除 6 3 1 ）。中部大学応用生物学研究科応用生物学専攻博士課程修了。博士（応用生物学）。
≪現在の研究テーマ≫液体クロマトグラ
フィー用充剤の開発。
E mail : tsukamoto＠chromanik.co.jp

性質により異なることが示された。
小山隆次（Ryuji KOYAMA)

5

まと め

株式会社クロマニックテクノロジーズ（〒552 0001 大 阪 府 大 阪 市 港 区 波 除 6 3 

本 稿 で 紹 介 し た Biphenyl カ ラ ム ， PFP カ ラ ム とPFP&C18 カラムはそれぞれ C18 カラムにはない特徴1 ）。立命館大学理工学部生物工学科卒。

≪趣味≫クロマトグラフィーE mail : koyama＠chromanik.co.jp

を有しており，Biphenyl は p p 相互作用や大きな水素結合性により，PFP や PFP&C18 は p p 相互作用，水+//////////////////////////////////////////////,
2
1 会社のホームページURL：
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1 http://chromanik.co.jp/
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1 関連製品ページURL：
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1 http://chromanik.co.jp/pdf/biphenyl_catalog_40.pdf
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2
1 http://chromanik.co.jp/pdf/Sunniest_catalog.pdf
2
1 http://chromanik.co.jp/product/SunShell.html
21-0000000000000000000000000000000000000000000000 .

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