関東森林研究 73 (2022)

南根腐病菌をモデルとする樹病罹病木を想定した病原菌特異的定量方法の確立
山口宗義 1・秋庭満輝 1・佐橋憲生 1・矢崎健一 1
１ 森林総合研究所
要旨：定量 PCR 法(以下 qPCR 法)を用いて，南根腐病菌である Phellinus noxius をモデルとし宿主樹木数種の木粉を用いて、材内に存在する菌の特異的かつ定量的解析方法を定量 PCR 法（以下 qPCR 法）により確立した。P. noxius 株 15菌株に対し，近縁種４株および植物種由来 DNA を対照に特異的に検出されうる定量 PCR プログラムを最適化した。
次に，定量性を確認するため，既知量の P. noxius 菌体を含む希釈系列を用いた定量解析を行った。また，樹木内部の菌の定量性を確認するために，イヌマキ，フクギ，ホルトノキ，モクマオウの４樹種を対象に各樹木存在下の定量解析を行った。その結果，P. noxius のみが検出されうる定量 PCR 条件の最適化に成功した。また，回帰分析の結果，各種樹木存在下における定量性も示された。
キーワード：南根腐病，定量 PCR 法，樹病，菌糸体定量

Establishment of a pathogen-specific quantification method assuming diseased trees
using Phellinus noxius as a model
Muneyoshi Yamaguchi1, Mitsuteru Akiba1, Norio Sahashi1, Kenichi Yazaki1
1 Forestry and Forest Products Research Institute
Abstract: Using the quantitative PCR method (qPCR method), we established a specific and quantitative analysis method of thisfungi in several kinds of wood modeled on Phellinus noxius, which is a pathogen of brown root rot. Using 15 strains of P. noxius
strain, we optimized a qPCR program that can specifically separate and quantify P. noxius DNA from control DNA, which is derived
from 4 related species and plant species. In order to confirm the quantitativeness, a quantitative analysis was performed using adilution series containing a known amount of P. noxius mycelium. In addition, in order to confirm the quantitativeness of fungal
mycelium in tree, quantitative analysis was performed using a mixture of mycelium and each wood, which was used four tree species,
Podocarpus macrophyllus, Garcinia subelliptica, Elaeocarpus zollingeri , and Casuarina equisetifolia. As a result of optimizing theqPCR conditions, only the P. noxius strain were successfully detected. In addition, regression analysis suggests that the qPCR method
is also available in the mixture condition of the P. noxius and another tree.
Key-word: Phellinus noxius, qPCR method, forest pathology, quantification of myceliumる(２，３)。また，樹種を選ばず感染することから被害Ⅰ はじめに菌類やバクテリアを病原とする樹病による樹木の衰退が拡大しやすい(１)ため，将来，地球温暖化に伴い本州により短期間で森林の健全性が損なわれる。病原の感染でも蔓延する恐れがある。そのため、本病の早期発見技拡大防止のためには樹病の早期発見が重要であるが，現術の開発が急務である。

在,その診断は外部からの観察可能な病徴によるところが大きい。しかし，根や幹から感染する樹病は，病徴が顕在化するはるか以前に潜在的に病気が進行している(４)。特に土壌中の根から感染する土壌病害は早期発見及び防除が困難である。
近年，熱帯・亜熱帯地域において「南根腐病」(図-１)による被害が深刻である。本病は担子菌 Phellinus noxius(和名:シマサルノコシカケ)が樹木根系へ感染した後，羅
病木は根・葉が枯損・脱落し，枯死に至る。日本では南西諸島と小笠原諸島において多数の被害が確認されてい－129－（受理日 2022 年 1 月 28 日）

Ⅲ 結果と考察

土壌中に存在する環境 DNA を分析し，分子生物学的な手法を用いた微生物叢の把握や特定微生物の存在量を１． 特異性試験１把握する技術が開発され，自然環境中の微生物動態が把Wang らが，既報(６)で南根腐病菌 P. noxius を土壌中握されつつある。本報では，その技術を応用し，南根腐の DNA から抽出したサンプルを用いて検出および定量病菌である Phellinus noxius をモデルとした数種の木材PCR 法で定量した条件があるため，その方法で供試南根内における本菌の特異的かつ定量的解析方法を定量腐病菌株，近縁種，樹木根分離菌株の DNA を用いて定PCR 法によって確立したので報告する。

量 PCR を行った。PCR 条件は①PN-1F/2R primer 使用時

Ⅱ 材料と方法

で 95℃45 秒, 60℃45 秒, 72℃60 秒を 50 サイクル，②G1-１． 材料

F /R primer 使用時で 94℃45 秒, 56℃45 秒, 72℃45 秒を 50

供試南根腐病菌株：Phellinus noxius KPN57, 84,130, 212,サイクルとした。定量 PCR 法で増幅した産物をアガロー

260, 117, 141, 163, 186, 267, 304, 323, 327, 334, 363 (計 1５スゲル電気泳動に供した(図-２)。

株 森林総合研究所保存株)
近 縁 種 ： Phellinus lamaensis FSM141, Pyrrhoderma
sendaiense

WD1765,Phellinus

lamaensis

WD1849,Pyrrhoderma adamantinum WD2074 (森林総合研究所保存株)
沖縄の樹木の腐朽根から分離した Polyporales 目またはHymenochaetales 目の菌株： KF86, KF87, KF88, KF89,
KF92, KF94 (森林総合研究所保存株)
菌による希釈を行う対照菌体として食用キノコ菌ウス
ヒラタケ Pleurotus pulmonarius，樹木内部の菌を定量する

既報の条件を再現して定量 PCR を行った結果，P.

条件下での想定対象樹木といてイヌマキ Podocarpus

noxius 以外の樹木分離菌でも PCR で増幅されうる PCR

macrophyllus，フクギ Garcinia subelliptica，ホルトノキ条件であることが確認された。また，既報で特異性を考Elaeocarpus zollingeri，モクマオウ Casuarina equisetifolia

慮した定量 PCR として P. noxius を定量する方法としてを用いた。

報告されている②の G1 プライマー使用の方法でも，近２． DNA の抽出と特異性試験縁種が増幅しており，本条件での定量 PCR を用いた方法

PD(ポテトデキストロース)寒天平板培地で増殖させたには，特異性が求められる条件下の非特異性断片の生成，南根腐病菌，近縁種，樹木分離菌の各菌糸体を常法の目的 DNA サイズより長いサイズの DNA 断片の増幅生DNA 抽出方法で抽出し，定量 PCR による特異性試験に成において問題があり，本条件での定量 PCR は不適切で供した。使用したプライマーは Wang らが ITS 領域からあることが確認された。

設 計 さ れ た プ ラ イ マ ー (PN-1F:agtttgcgctcatccatctc, PN2R:agccgacttacgccagcag,

G1-F:gccctttcctccgcttattg,

これらのプライマーを再利用し，PCR 条件の検討，最G1-適化を行うことでこの問題を解決し，定量 PCR が可能な

R:cttgatgctggtgggtctct) (６) を候補に用いた。定量 PCR 機

条件を検討した。

は Roche 社製の Light Cycler 480 Ⅱ（ヒートブロック方式

２． 特異性試験２温度制御），使用酵素は TOYOBO 社製の THUNDERBIRD

供試南根腐病菌株，近縁種，樹木根から分離した真菌

SYBR qPCR mix を用いた。

類菌株の DNA を用いて，定量 PCR の反応条件最適化を

３． 定量性試験
定量性を確認するため，P. noxius 培養菌体を調整し，凍結乾燥後の粉体を他の粉体菌体（ウスヒラタケ）で希行った。条件検討した中での最適化された結果，使用プライマーは上述①の PN-1F，PN-2R プライマーセットを用い，PCR 条件は 95℃ 10 秒, 69℃ 20 秒,72℃ ８秒を 50

釈系列を作成し標準試料とした。イヌマキ，フクギ，ホサイクルとする条件で最適化された。本条件での増幅結

ルトノキ，モクマオウの各樹木粉体より既知量の P.

果を示す(図-３)。

noxius が混和している標準試料を作製した。これら標準

P. noxius のみが増幅し，近縁種や他の菌，微生物，樹試料から既報(５)に基づき DNA を抽出し定量 PCR 法に木由来 DNA では増幅しない PCR 条件の最適化に成功して P. noxius 菌を検出および定量に供した。

た。改良点は，アニーリング温度条件を比較的厳しい温－130－

関東森林研究 73 (2022)度である 69℃に設定したこと，伸長温度条件を比較的短木材中の定量性も確認するために，
イヌマキ，フクギ，

い８秒に設定したこと，PCR 反応時の温度による酵素劣ホルトノキ，モクマオウの４樹種を用い，各樹木粉体を化を防ぐため，乖離温度 95℃での時間を短くしたこと，樹木に対して既知の P. noxius が混和している標準試料である。

を作製した。

また，他の真菌類や森林で生育する樹木で本 PCR 条件

この標準試料から既報(５)に基づき DNA を抽出し最が反応しないことを確かめるため，食用きのこ類や代表適化された PCR 条件での定量 PCR 法にて P. noxius 菌を的な樹種（クロマツ，アカマツ，ヤマザクラ，ツツジ，検出および定量に供した。なお，各樹木由来 DNA は本サカキ，シラベ，ネジキ，ホオノキ，ソヨゴ，リョウブ

PCR 条件で増幅しないことは確認済みである。各 P.

等）由来 DNA を用いた PCR を行ったが DNA の増幅がnoxius 菌含有濃度と Ct 値に対し線形単回帰分析を行っ確認されなかった。以上により，P. noxius の DNA のみがた(図-５)。
P. noxius 菌糸量と Ct 値に相関があり，イヌマキ，フク増幅する特異的条件が明らかとなった。
３． 定量性試験１

ギ，ホルトノキ，モクマオウの各樹種環境下で，P. noxius

定量性を確認するため，P. noxius 培養菌体を調整し，菌が定量可能であることが示された。また，おのおのの凍結乾燥後の粉体を他の粉体菌体（ウスヒラタケ）で希樹種環境下では正の相関が得られているが，樹種間では釈系列を作成し標準試料とした。

標準曲線の傾きや切片が異なることも明らかとなった。

この標準試料から既報 (５) に基づき DNA を抽出しこれは，測定対象となる P. noxius 菌の存在する環境場か最適化された PCR 条件での定量 PCR 法にて P. noxius 菌

ら DNA を抽出する際の抽出効率の違いや PCR 反応におを検出および定量に供した。なお，ウスヒラタケ DNA はける反応効率の違い等が複雑に影響しているものと推察

本 PCR 条件で増幅しないことは確認済みである。各 P.

される。

noxius 菌含有濃度と Ct 値に対し線形単回帰分析を行った (図-４) 。なお，Ct 値は PCR 増幅 DNA 産物が検出さⅣ まとめれうる量にまで到達するまでの PCR 反応サイクル数，P.

本研究において，樹木木粉内で存在する南根腐菌の特noxius 菌含有濃度 (P.nox.conc) は P. noxius 粉体菌体量の異的定量方法の確立に成功した。これにより，対象樹木ウスヒラタケ粉体菌体量に対する存在濃度（g/g）である。の幹や根を部分的に採取し，その器官内の樹病菌の検出

その結果,P. noxius 菌糸量と Ct 値に相関があり， 菌糸に加え，樹病菌を定量できる。特異性および検出感度が高いことから病徴が現れる以前の軽微な感染であっても把握可能である。
一方，菌の生育反応場である各樹木の違いにより，標準曲線の傾き及び切片が異なることから，測定する反応場を基準に標準曲線を作成しそれを基に定量することの重要性が明らかとなった。測定対象物のみや抽出されたDNA のみから希釈系列を作成し，それから得られる標準曲線から定量 PCR により定量する方法が散見するが，目的によっては誤測定を生む可能性があるため注意が必要である。

のみが存在する条件下での定量性が示された。

本報では，樹種として４種類を試みたが，他の樹種や樹木が生育している土壌環境下でも定量可能な技術にす

４． 定量性試験２－131－

るためにも，他の樹種や土壌も含めた定量技術の開発がF, Kabeya D, Tobita H, Kitao M, Ishida A (2018) Pine wilt

次への課題となる。

disease causes cavitation around the resin canals andirrecoverable

xylem

conduitdysfunction.

Journalof

Experimental Botany 69: 589–602.

謝辞：本研究は JSPS 科研費 21H02241 の支援を受けて実施した。また，本研究は国立研究開発法人森林総合研( ５ ) Yamaguchi M, Narimatsu M, Fujita T, Kawai M,

究所エンカレッジモデルによる研究支援を受けた。
また，

Kobayashi H, Ohta A, Yamada A, Matushita N, Neda H,

試験体樹木の収集において協力を受けた沖縄県森林資源

Shimokawa T, Murata H (2016) A qPCR assay that specifically研究センターの酒井康子氏に感謝いたします。

quantifies Tricholoma matsutake biomass in natural soil.
Mycorrhiza 26: 847-861

引用文献(６) Wang Y-F, Meng H, Gu VW, Gu J-D (2016) Molecular(１) Sahashi N, Akiba M, Takemoto S, Yokoi T, Ota Y, Kanzaki

diagnosis of the brown root rot disease agent Phellinus noxius

N (2014) Phellinus noxius causes brown root rot on fouron trees and in soil by rDNA ITS analysis. Applied

important conifer species in Japan. European Journal of Plant

Environmental Biotechnology 1: 81-91

Pathology 140: 869–873.
(２) Sahashi N, Akiba M, Ota Y, Masuya H, Hattori T, Mukai
A, Shimada R, Ono T, Sato T (2015) Brown root rot caused byPhellinus noxius in the Ogasawara (Bonin) islands, southern
Japan – current status of the disease and its host plants.
Australasian Plant Disease Notes 10: 33.
(３) Sahashi N, Akiba M, Ishihara M, Ota Y, Kanzaki N (2012)
Brown root rot of trees caused by Phellinus noxius in theRyukyu Islands, subtropical areas in Japan. Forest Pathology
42: 353-361.
(４) Yazaki K, Takanashi T, Kanzaki N, Komatsu M, Levia D－132－