研究論文

天然高分子マイクロカプセルを用いた多孔質集合体の開発
加藤一徳 *2

吉村裕 *1

藤田浩文 *1

Preparation of Porous Matrices of Natural Polymer Using Microcapsules
Kazunori KATOH, Hiroshi YOSHIMURA and Hirofumi FUJITA
Owari Textile Research Center,AITEC *1 Research and Development Division,AITEC *2
複数のキトサン-アルギン酸カプセルを鋳型に充填し、羊毛由来のケラチンとトリポリリン酸を作用させた。カプセルは接着し、カプセル集合体となった。カプセル間の接着は、カプセル表面のキトサン（カチオン）とケラチン（アニオン）の間のイオンコンプレックス形成能に加え、トリポリリン酸によるキトサン架橋によると考えられた。このカプセル集合体にヘモグロビンを担持し、その放出特性を調べた。集合体からヘモグロビンは徐放され、蒸留水と比較して電解質水溶液中でその放出は促進された。

1. はじめにカプセルを作製した。

ケラチンは髪、羊毛、爪などを構成する繊維状タンパ

本稿では、カプセルを多孔質物に成形するために、複ク質である。タンパク質のアミノ酸配列から、ケラチン数のカプセルを密に充填した後、カプセル間を接着させの分子骨格には比較的たくさんのシステイン残基（5〜ることで、図１に示すマイクロカプセル多孔質集合体の10 mol%）が存在し、それらが分子間ジスルフィド架橋作製を試みた。また、カプセル集合体の薬物徐放のモデ結合で結ばれている１）。羊毛繊維のしなやかさや強さはこの架橋結合が起因しているものと考えられる。しかしルとして、ヘモグロビンを集合体に担持して、その放出特性も併せて調べた。

ながら、ケラチンをタンパク質として利用する場合、強固な分子間ジスルフィド架橋結合は、羊毛からケラチンを抽出する際の障害となる。羊毛由来のケラチンタンパ
ク質は、そのアミノ酸配列に細胞接着に関与する配列（RGD、LDV）を含んでいるため ２）-４） 、コラーゲンなどの様な医用材料としての利用が期待される。山内ら ５) は還元剤と界面活性剤を併用して羊毛からケラチンを高収率で抽出する方法を開発した。筆者ら ６） は、羊毛から抽出したケラチン水溶液をスプレードライ乾燥して、粉末とし、その粉末を圧縮成型して緻密なフィルムを作製した。このフィルム上で動物細胞を培養したところ、細胞はフィルム表面に接着し、活発に増殖した。
コラーゲン、キトサン、アルギン酸やポリ乳酸など医用高分子を損傷被覆材、Scaffold（細胞足場材料）やDDS（ドラッグデリバリーシステム）材料などに使用するためには、スポンジやマイクロカプセルなどに成形されな123ければならない ７)、８） 。そこで、筆者らは、ケラチンとキトサンを複合化することにより、マイクロスケールのカプセルを試みている。等電点（ｐI：4.8〜6.0） １） かカプセル多孔質集合体
カプセル
接着部分

ら判断して中性〜弱アルカリ性付近でアニオン性のケラ
図１チンと、カチオン性天然多糖高分子であるキトサンの間で複合体を形成する。このことより、直径 250μm程度の*1 尾張繊維技術センター加工技術室*2 基盤技術部

2.1 試料

カプセル集合体の概念図

2. 実験方法

2. 実験方法
2.1.1 ケラチンから 3.7％CaCl 2 水溶液に滴下、直径約 5mmまたは 1mm以下のアルギン酸カルシウムカプセルを一旦作った。その二亜硫酸ナトリウム 150g、尿素 720g、ドデシル硫酸

カプセルを 0.75%キトサン水溶液に移して、キトサンでナトリウム 75g の混合水溶液 1.5L に、羊毛 150g を加え被覆した。カプセルはキトサン溶液に分散させたままて 100℃、30 分間還元処理することにより、羊毛からケ5℃で保存した。

ラチンを抽出した。そして、得られたケラチン水溶液を2.3 カプセル間接着方法とカプセル集合体の作製

透 析 用 セ ル ロ ー ス チ ュ ー ブ （ 分 画 分 子 量 ： 12,000 〜

2.3.1 カプセル間接着方法

14,000）に充填し 3 日間透析した後、ロータリーエバポ
レーター（N-11、東京理科器械㈱製）で濃縮した。そし(a)て、精製ケラチン水溶液を 50℃でスプレードライ乾燥

SHSHSH

SHS-S
酸化剤（Pulvis Mini-Spray GA32、ヤマト科学㈱製）して、粉末状ケラチンを作製した。
2.1.2 キトサンおよびアルギン酸
分子量 750,000、脱アセチル化度 85%の粉末状キトサン（共和テクノス㈱製、フローナックＮ）、粉末状のアルS-S

ケラチン-キトサンカプセル(b)
ケラチン水溶液ギン酸ナトリウム（関東化学㈱製）を使用した。
2.2 カプセルの作製
2.2.1 ケラチン-キトサン複合カプセル

キトサン-アルギン酸カプセル

まず、0.1N 酢酸水溶液にキトサン粉末を溶解し、1.0%キトサン溶液を作製した。一方、蒸留水にケラチン粉末

図３

カプセル間接着の方法を溶解後、1N 水酸化ナトリウム水溶液で溶液の pH を 8.5

ケラチン-キトサンカプセルには、カプセル表面にケ〜9.0 に調節して 1.0%ケラチン水溶液を作製した。キトラチンが豊富に存在するため、メルカプト基（SH）などサ ン 溶 液 を 、 注 射 器 ま た は ス プ レ ー ノ ズ ル （ Pulvis

反応可能な官能基が存在すると考えられる。ケラチン特Mini-Spray GA32、ヤマト科学㈱製）からケラチン水溶有の官能基を利用するため、酸化剤（過酸化水素）でジ液中に滴下し、直径約 5mm または約 1mm 以下のケラチンスルフィド結合に架橋させることで、カプセル間接着す-キトサン複合カプセルを作製した（図２）。30 分後、カる方法を検討した（図３a）。

プセルをろ取し、1%ケラチン水溶液に分散させ、使用するまで 5℃で保存した。

代表的なカプセル材料としてキトサン-アルギン酸カプセル ９）-１３）を用いた集合体も検討した。このカプセルの表面を被覆しているキトサンはカチオン性であるので、アニオン性のケラチンを被覆することが可能と考えられる。そこで、複数のキトサン-アルギン酸カプセルをケキトサン溶液

カプセルラチンで被覆することで、カプセルの充填状態を保持する方法を検討した（図３b）。
2.3.2 カプセル間の接着
カプセル分散液をガラスフィルター付ロートに移し、吸引ろ過して、過剰の溶液を除去した。ロート上に充填

ケラチン水溶液（表面）
ケラチン-キトサン複合膜（内部）
キトサン溶液された複数のカプセルを接着させるために、ケラチンキトサン複合カプセルに対して、10%過酸化水素水をロートに流し込み、吸引ろ過した。また、キトサン-アルギン酸複合カプセルに対し、2.0%ケラチン水溶液を流し

図２

ケラチン-キトサンカプセルの作製込んだ。30 分間放置した後、カプセルをロートから取り出し、カプセル間接着の有無を調べた。

2.2.2 キトサン-アルギン酸複合カプセル ９）-１３）

2.4 カプセル集合物へヘモグロビンの導入とその放出

アルギン酸ナトリウムを蒸留水に溶解した 1.5%アルギ

カプセル集合物を 0.4％ヘモグロビン水溶液に 4 日間ン酸ナトリウム水溶液を注射器または、スプレーノズル浸漬した。そして、蒸留水または生理的リン酸緩衝液

（PBS）40mL にカプセル集合物を移し、カプセル集合物

ィルム材料と比べて多数の細胞を接着および増殖可能とから放出されるヘモグロビンを可視紫外分光分析により推測された。集合体が含水率の高い構造物であることか検出した。

ら、凍結乾燥など乾燥方法を検討することにより多孔質状に乾燥されると推測される。

3. 結果および考察
3.1 カプセル間の接着

キトサン-アルギン酸
カプセル分散液

ケラチン+トリポリリン酸水溶液

図３の２つの方法共に、カプセル間の強固な接着は認められなかった。しかしながら、図３a の方法を修正し、充填した複数のカプセルに 2.0%ケラチンと 0.1%トリポリリン酸の水溶液を作用させることにより、カプセル間の強固な接着が見られた。トリポリリン酸はキトサ
キトサンとケラチン間のイオンコンプレックス形成にろ紙加え、トリポリリン酸によるキトサンの架橋が、カプセ

ガラスフィルタ

吸引ろ過ンに対する架橋剤として知られている。カプセル表面のル間を接着したと考えられる。直径約 5mm のキトサンアルギン酸カプセルを接着させたカプセル集合物を図４に示す。

図５

図４

マイクロカプセル集合体の作製

接着後のカプセル

3.2 マイクロカプセル集合体の作製
図５にマイクロカプセル集合体の作製方法を示す。
マイクロスケールのキトサン-アルギン酸カプセルは、1.5%アルギン酸ナトリウム水溶液をスプレーノズルから噴霧することで容易に作製できた。カプセル分散液をフィルター付ロートに注いだ後、過剰のキトサン溶液を除去するために下から吸引した。しかし、カプセルの大5 mm
図６マイクロカプセル集合体

きさが小さいと目詰まりを起こす結果、過剰なキトサン溶液を除去できなかった。ろ過可能な大きさとして、直径 500〜800μm のカプセルを使用してロートへのカプセ3.3 マイクロカプセル集合体へのヘモグロビンの担持と放出挙動ル充填を行った。ケラチン（2.0%）とトリポリリン酸ナ

薬物徐放性を調べるためのモデルとして、カプセル集トリウム（0.1%）を含む水溶液を注ぎ、１５分後ロート合体にヘモグロビンを担持し、その放出特性を調べた。

から、取り出した。カプセル集合体表面の写真を図６に0.4%ヘモグロビン水溶液にカプセル集合体を浸漬した示す。カプセル間がケラチンで埋められたため、多孔質

ところ、浸漬 1 日後にはカプセル部分が赤く染まったの状とはならず、シート状であった。しかし、表面形態がで、カプセルがヘモグロビンを担持していることが確認

凹凸で表面積が大きいため、細胞培養基材としては、フされた。浸漬開始から 1 週間後に浸液に移し、ヘモグロビンの放出を開始した。

図８に浸液を蒸留水または種々の濃度のリン酸緩衝

図７にカプセル集合体とアルギン酸カプセル単体と生理食塩水液（PBS）とした場合の放出挙動を示す。

比較した結果を示す。ここで、浸液はリン酸緩衝生理食蒸留水への放出はほとんど認められなかった。一方、塩水液（PBS）とした。アルギン酸カプセルからヘモグPBS に対してヘモグロビンが放出された。PBS の濃度をロビンは短時間で放出された。24 時間後には、ほとんど変化させたところ、高濃度になるとヘモグロビンの放出のヘモグロビンが放出された。一方、集合体からの放出が促進される傾向が認められた。浸液の pH は PBS の濃は非常に遅く、ヘモグロビンが徐放されていることがわ度変化に依らず、7.4 で一定なため、pH の影響とは考えかった。集合体の場合、カプセル表面にキトサンやケラられず、イオン濃度が高い電解質水溶液に対してヘモグチンが被覆されており、このことが放出速度を適度に低ロビンの放出が促進されていると推測された。

下させ、長時間にわたるヘモグロビンの放出を可能にし４．結びていると思われる。

キトサン-アルギン酸カプセルを、ケラチンを用いて1接着させ、カプセル集合体を作製した。カプセル間に空吸光度(Abs)0.9

隙は認められず、多孔質状には成形されなかった。

0.8

カプセル集合体からのヘモグロビンの放出速度は、カ0.7

プセル単体と比較して遅く、長時間の放出が認められた。

0.6

また、イオンの溶解した電解質水溶液においてその放出

0.5は促進された。こうした放出挙動は、医用を指向した用0.4

途の場合都合が良い傾向と考えられた。

0.3

文献

アルギン酸Ca集合体0.21)

0.1

Science and Engineering ,8,566 (1985)

0020406080時間(hr)

図７ カプセル集合物からヘモグロビンの放出
12)

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3)

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00

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集合体（蒸留水)
0.5×PBS
1.0×PBS
1.5×PBS
2.0×PBS

80時間(hr)

図８ カプセル集合物から種々の浸液への放出

12) LimF.:Appl.

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13) Kierstan M. et al.: Biotechnol. Bioeng. ,19,387(1977)