厚生省新薬開発研究事業

微生物の二次代謝産物に由来する

難病治療薬（E−64）の開発研究

昭和56年度研究報告書
班 長 今堀和友

昭和57年3月

ま

え

が

き

難病治療薬E−64の開発研究を開始して3年を経過した。この間われわれは，あくまで患者に投与できる医薬品の開発を念頭におきつつも，基礎的研究を幅広く畏関することを重要視し，研究を進めてきた。
この地道な基礎的研究の集積により，第3年次に当る本年度においては，E−64およ添その類縁体が治療薬として有用であることを示す結果が数多く得られた。それらは本報告書中に精しく述べられているが，その中よりいくつかの例を挙げれば次のようになる。
まず筋ジストロフィーの成因に関与すると思われる，カテプシソB，Lおよびカルシウム依存性
中性プロテアーゼを本薬剤は不可逆的に失括させるし，invivoの投与でも阻害がみられる。反面
毒性はきわめて低く，種々の医薬品中でも最も低い部類に属することが明らかになった。
一万，本薬剤の臨床の応用を目ざし，次のような新しい研究を展開した。すなわち経口投与の場
合を考え，腸間での吸収効率をあげるため，E−64のエステル体を合成し，期待通りの結果を得た
ことと，また，よりヒトの疾患に近いと思われる筋ジストロフィーハムスターをモデル動物とし，これへの投与の研究を開始したことである。
なお前にも述べた様に，本組織では着実に基礎的研究を進めてきているので，本報告書の内容の一部は単に新薬開発の一例としてだけではなく，細胞内プロテアーゼの動態や，細胞内蛋白代謝の研究者にも資する所があろうと思われる。その方面でも本報告書が活用されれば幸いである。
おわりに・本研究のために絶大な援助を賜った厚生省薬務局の方々，これに応えて研究推進に努力を憤倒された班員の皆様，さらに班の運営のためあらゆる援助を頂いた大正製薬の開発部の方々に深謝するものである。
班を代表して
今

掘

和

友

目

次

まえがき

Ⅰ E‑64 類緑体の開発
1. E‑64 類縁体の製造

沢田

二郎

9

2. E‑64 類縁体のin vivoにおけるプロチアーゼ阻害

沢田

二郎

13

3. E‑64‑c エステル誘導体の生物薬剤学的研究

沢田

二郎

29

4. E‑64 類縁体の安全性に関する研究

大関

正弘

35

大関

正弘

39

大関

正弘

47

西塚

泰美

57

今堀

和友

63

江橋

節郎

69

5. E‑64 およびその類縁体の筋ジストロフィーハムスターにおける生体内動態
6. E‑64‑c の生体内動態に関する研究(その2)
Ⅱ 酵素レベルでの効果
7．カルシウムプロテアーゼとイノシトール燐脂質の代謝回転

8. カルシウムプロテアーゼ類の性質とこれに対するE‑64および類縁体の阻害効果
9. E‑64‑c の心筋蛋白質分解に及ぼす影響
10．筋ジストロフィーハムスターにおけるチオール性カテプシンの活性に対するE‑64投与の効果

勝沼 信彦 73

11．筋ジストロフィーチキンにおける筋ガングリオシドの代謝に関する研究宮武正79

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果
12. 初代培養肝細胞の蛋白代謝に及ぼすロイペプチンとE‑64の影響

市原

13. 培養筋細胞の変性に及ぼすE‑64‑c の作用
14. 培養筋細胞の蛋白代謝に及ぼすE‑64‑c の影響

15. ニューロフィラメント変性に対するE‑64‑c の効果(続報)

明

83

小沢鍈二郎

87

石浦

章一

91

杉田

秀夫

97

宮武

正 103

16. 脳ミエリン蛋白のin vitroにおける分解に対するE‑64の効果について17. 移植筋の再生に及ぼすE‑64の効果

寺尾 寿夫 107

Ⅳ 個体レベルでの効果
18. ラット組織に存在するチオールプロテアーゼインヒビター
について

19. E‑64‑c の一般薬理作用

勝沼 信彦 115
福原 武彦 121

〜諸種摘出臓器標本に及ぼす影響〜

20. E‑64‑c のグルタチオン関連酵素系への影響

北川 晴雄 131

21. E‑64およびその類縁体の筋ジストロフィーハムスターに対する薬効に関する研究

大関 正弘 135

I E−64類縁体の開発

1．E−64類縁体の製造

沢田 二郎

2．E−64類縁体のinvivoにおけるプロテアーゼ阻害

沢田 二郎

3．E−64−Cエステル誘導体の生物薬剤学的研究

沢田 二郎

4．E−64類縁体の安全性に関する研究

大関 正弘

5．E−64およびその類縁体の筋ジストロフィーハムスターにおける生体内動態・・・大関 正弘

6．E−64−Cの生体内動態に関する研究（その2）大関 正弘

1．E−64類縁体の製造

＊
けnH
自只

＊

孝子

＊

＊

直

達西

安小

＊

晴子

正敏

＊

井木

玉柏

二

田

紀司文
＊

沢
＊

和清貞

田熊村

花中大

研究協力者

aの中間産物である。この合成はすでに報告1）日

的E−64類縁体，中でもE−64−Cがinvitroでしたのでここではその概要を図2に示す。

protease（CANP）

Ep−487はE−64−a製造法に準じ図3の方法によった。次にこの方法を具体的に説明する。

およびCathepsinB，Lなどのチオールプロテ
アーゼを最も強く阻害し，その製造面の検討か

1．L−トランスエポキシコハク酸モノエチルエス
テル

Ca2＋−aCtivatedneutralらも有用性が高いことが報告されてきた。
しかしながら，これを本研究の最終日標である筋ジストロフィーの治療薬として開発しようとする時，さらに高い生体内利用性を目指した

D−酒石酸より既報2）の方法に従い立体選択的に合成した。
2．N−（t−Butoxycarbonyl−LIetleyl）−1，4−diami・
notmtame

改良が望まれる。すなわち，人患者への投与を

N−（tTButoxycarbonyl−L−leucyl）−Nl−ben−

想定し，その標的器官である骨格筋，あるいはZyloxycarbony1−1，4−diaminobutanelOgを

心臓への薬物の移行性に留意しなければならな

メタノール100mlに溶解し，5％Pd−CO．5g

い0およびPd−blackO．3gを加え弱い水素気流下

この目的にそって，ラット，モルモット．犬等

室温にて5br激しく挽拝した。触媒を炉別後，の哺乳動物に投与した時の，上記酵素の変動を減圧下メタノールを十分留去し，得られた油状一つの指標としてより優れたbioavailabilityを有する薬物の製造を志向して，E−64−Cのの目的物6．23gをそのまま次の反応に用いた

prodrug化を主題とし，併せて既報のE−64−a等についても比較検討した。
本研究の目的は，これらの薬物の製造法を確立し，有用な化合物を供給することにある。
方法

E−64−Cのエチルエステル体であるEp−453（収率90％）。
3．Ⅳ一（t−IhtoェyearbonyトL−leucyl）−N′−aCetyト1，4−diamimobutane

N−（t−Butoxycarbonyl−L−leucyl）−1，4−dia−minobutane7．6gおよびtriethylamine2．81g
をジクロロメタン50mlに溶解し，aCetyl
Chloride2．0gのジクPPメタン溶液を氷冷掟
拝下滴下し，水冷下2時間，ついで室温で1時はE−64−C合成の中間体でありその合成経路は間按拝した。反応液をlNHCl溶液，飽和重図1に示した通りである。この詳細はすでに報曹水および飽和食塩水で順次洗浄し，乾燥後濃告した1）。Ep−460，Ep−461はいずれもE−64−

縮乾固した。得られた残法を酢酸エチルーエチル
エーテルより結晶化して目的物7gを得た（収＊大正製薬株式会社総合研究所

率81％）。
9

I E−64類縁体の開発
し−Leu Isoamylamine Yield（％）

95
95
65

H

CO−NH−CH−CO−NH−CH2＼／
C−C

0verall：59

？H2

／＼／＼
EtOOC

O

H

CH

／＼
CH3

7H2
CH

／＼

CH3

CH3

CH3

図1Ep−453の製造

ES L−Leu l，4−Diaminobutane Yield（％）
BoC

Z・1／2H2CO3

60

Z

85

Z

95

EtO

Z

60

HO

Z

95

HO

H

80

OH

H

Boc
EtO

0

H

H

H

CO−NH−CHLCO−NH−（CH2）4−NH2
＼
／
C−C

J

／＼／＼

HOOC

O

0vera11：22

CH2
1

H

CH

／＼

CH3

CH3

図2

E−64−aの製造

L−Leu l，4−Diaminobutane
Z・1／2H2CO3

60

Z

85

NH2

90

Ac

81

Ac

90

Ac

48

H COLNH−CH−CO−NH−（CH2）4−NH−C−CH3
＼
／
l l】
C−C
CH2
／＼／＼
CH
EtOOC O Hl／＼

CH3CH3

図3 Ep−487の製造
10

YieId（％）

0verall：16

1．E−64類縁体の製造
表1 E−64類縁体の昭和56年度製造量

H＼／CONH7HCO￣R2
CH2Rl。。／C▽C＼H。。
・■

／＼

CH3

CH3

Compounds RI R2

Totalamount（g）

E−64−a H

NH（CH2）4NH2

Ep−460H

NH（CH2）4NHCOOCH2◎ 15．0

Ep−461

Et

Ep−487Et

NH（CH2）4NHCOCH3

Ep−453Et

NH（CH2）2CHく認

154．8

〝

4．N−LLeueyトⅣ′−aCety1−1，4−diamimoblltame

N−（t−Butoxycarbonyl−L−leucyl）−N，−aCe−ty1−1．4−diaminobutane5．95g を99％蟻酸
180mlに溶解し室温で4時間農拝した。蟻酸
を減圧下留去した後，水に溶解し，水冷下10％28．5

C，56．09；H，8．11；N，10．90．Found：C，56．17；H，7．94；N，7．94．
結果および考察E−64−C，E−64−aなどE−64類縁体の生体内

苛性ソーダ溶液でアルカリ性とした後，酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄，乾燥，濃縮し得られた油状の目的物3．8g
をそのまま次の反応に使用した（収率90％）。

利用率を向上させる具体的な手段としてこれら

5．N−〔N−（L−3−frα昭一Etl10ⅩyCarbonyloxirame−

いて検討した。この結果は別項で報告する（製2−Carbonyl）−L−leucyl〕−Ⅳ′−aCetyト1，4−diamimobu−

剤学的検討の項参照）。E−64−aの誘導体Ep−
461も，この目的に別して得られた化合物であtalle（Ep−487）のprOdrug化を試みた。この可能性を検討する目的で表1に示す誘導体を得た。まずE−64−Cのエチルエステル体を得，その有用性につ

N−L−Leucyl−N，−aCetyト1，4−diaminobuta−

る。この化合物の場合，そのCANP或いは

ne3．8g，L−tranS，ePOXySuCCinicacidmon0−Cathepsinの阻害作用の面からみると十分目

ethylester2・5g，N−methylmorphorine

的に適う化合物であったが，ベンジルオキシカ

l．9gおよび1−hydroxybenztriazo12・53gをルポニル基（Z基）に起因すると思われるラッ

テトラヒドPフラン50mlに溶解し，氷冷農

トでの体重増加抑制作用が認められたのでZ基

押下，1−ethy1−3−（3−dimethylaminopropyl）−

をアセチル基（Ac基）に交換したEp−487を待，基礎的な検討材料に供した。

carbodiimide hydrochloride

3．58g

を徐々

に加えた。氷冷下2時間，室温で2時間置拝後
濃縮し，残達を酢酸エチルに溶解した。酢酸エチ
ル溶液をlNHCl，飽和重曹水および飽和食
塩水で順次洗浄し乾燥後濃縮乾固した。得られEp−453，Ep−487はいずれも腹腔内投与で筋ジストロフィーハムスターBIO14．6の骨格筋および心臓のCANPおよびCathepsinB，Lの活性を強く抑制しており（別項参照），実用性

た白色粉末を酢酸エチルーエチルエーテルより結晶化し目的物2．8gを得た（収率48％）oの面からこのようなprodrug化が有意義であ

m．p．173〜1740C，〔α〕謬＝＋44・40（C＝1，

により経口剤としても十分可能性が出てきたこ

MeOH），元素分析：Calcd．forC18H31N306：とは特筆に値する。なお，本研究により得られることを示唆している。また，このような修飾

11I E−64類縁体の開発た化合物の一覧を表1に一括して示す。これらの化合物は主として，生物薬剤学的研究および薬効評価試験に供された。
結論

E−64−CのprOdrug化により実用に即した改善を主目的に製造面から本研究を進め，そのエチルエステル体であるEp−453が，腹睦内投
与での生体内利用率の向上のみならず，経口剤としても十分利用しうる可能性があるという結12果を得，さらに本化合物の製造法を確立した。
併せて，E−64−aに関する同様な知見から，
E−64の煩縁体のPrOdrugに関する基礎を確
立した。
参照文献
1）沢田二郎：E−64及びその類縁体の製・造に関する研究，昭和54年度研究報告書，9，1980．
2）沢田二郎：L−トランスエポキシコハク酸製造法
に関する研究，昭和54年度研究報告書，15，1980．

2．E−64類縁体のinvivoにおけるプロテア，ゼ阻害

郡紆（CANP）およびカテプシソB，L，H等のチオールプロテアーゼを強く阻害することはすでに清忠＊精製されたCa2＋−aCtivatedneutralprotease

熊崎＊

材料および方法

的

E−64およびその類縁体は種々の動物由来の

中岡

＊

井木村

＊

晴子文

二

玉柏大

＊

直

肘 正敬貞

田

紀孝子

＊

沢

和

田達西

目

花安中

研究協力者

1）E−64およびその類縁体本研究に使用したE−64およびその類縁体の構造を図1に示した。Ep−454のみエポキシコ
ハク酸部分がDL体であるが，他の類縁体はす詳しく報告されている。一方，in vivoの作用

べてL体である。なお，構成アミノ酸はすべてについてもラット肝，あるいは筋ジストロフィL体である。

ーチキン骨格筋等において確認されているl・2）。

2）使用動物

本年度，本研究班では新たに実験モデル動物

ラットは静岡県実験動物農業協同組合より入として筋ジストロフィーハムスター（BIO14．6

手した7〜8週令のウィスク一系，雄性を使用系）を用い薬効評価実験が拡大されることになした。筋ジストロフィーハムスター（BIO14．6）

ったが，筋ジストロフィー治療薬を志向する場

および同系列の無発症ハムスター（BIO FIB）

合，その際的臓器として重要な骨格筋，あるいは心筋でのCANP，あるいはカテプシソ群のは，BIO−RESEARCHCONSULTANTS，Inc．

挙動を明確に把握することは極めて重要であろ

ルデンハムスターは金丸動物店より入手し使用う。本研究は該モデル動物であるジストロフィーハムスターにE−64およびその類縁体を授与した。いずれも雄性で，購入後，当社研究所で1週間予備飼育したのち，7〜12遇令で実験にした時の上記プロテアーゼの変動を追跡し，本供した。

薬物による治療法を確立する目的で行われた。

3）某物投与法

なお，本研究を実施するに際し，CANPおよ（ケンブリッジ，米国）より，正常対照のゴーi）腹腔内投与びカテプシソ群の数量標本を用いた分別定量法

特記しない限り 0．1％Tween−80 を含むを確立し，本法を用いジストロフィーハムスタ

0．5％CMC溶液に薬物を50mg／mlの割合で懸濁または溶解し使用した。

ーの臓器，特に心筋，骨格筋におけるこれらのプロテアーゼの薬物投与による影響を正常動物と対比させながら詳しく調べた。この結果について報告する。

ii）ミニポンプ法

E−64−aは水溶液として，E−64−Cは重曹で中和後水溶液として用いた。なお，オスモティ
ックミニポンプはAIzet魯（東海医理科）を使用した。

＊大正製薬株式会社総合研究所
13

I E−64類縁体の開発
CONHCHCO−R2

H

＼

／

C−C

／＼／＼
RlOOC

O

CH2

l

H

CH

／＼

CH3

E−64

CH3

NH（CH2）4NHC−NH2
11H

E−64−aH

Ep−460NH
NH（CH2）4NH2

NH（CH2）4NHCOOCH2◎

E

Ep−461H

E−64−CH

Ep−479E

Ep−487

NH（CH2）4NHCOCH3
NH（CH2）7NH2E

NH（CH2）2CHく詑

Ep−453E

Ep−454

NH（CH2ゆ図1E−64およびその類縁体の構造
Tisst】eReaction mixturel．Oml
Homogenize with

2mM CysteinelmM EDTA
O．lM Acetate buffer，pH5・0
10％ DMSO
O．3％ Triton X−100
Enzyme solution

Centrifuge at30，000×gmax
for

Sup．
Preincubate

forlO

min

4−9volumesof Buffer A containing O．25M

at

20min

ppL

37●c

I

Add O．025mlof80mM Suc−L−Tyr−L−Met−NA

Apply O．7mlto a DEAE−Cellulose column（lVhatman DE52，Bed volume O．5m】）

I

Incubate for30−60min at370c
I

Determination of released2−maphthylamineby the method of AJ．Barrett

図2 カテプシソB＆L活性測定法

Ehtionl．Washing
2．Elution1

Buffer A（2．O ml）

3．Elution2

BufEer A十0．3M NaCl（1．5ml）

BuEfer A十0．15M NaCl（2．O ml）（Inもibitorlraclion）（m−CANP fraclion）

Buffer A：4）放器ホモジネート調製法
E−64およびその類縁体を腹腔内投与した場

20mM Tris−HCl，pH7．5．
containingl mM EGTA
and5mM2−merCaptOethanol

合は3時間後，オスモティックミニポンプを用いて投与した場合はミニポンプを除去した直後

図3にいずれも放血致死させ，直ちに下大静脈より

Ⅹ−100を含むPBS（pH7．4）を加え，ウルト

50〜100U／mlヘパリンを含む生食水を通し，ラタラックスホモジナイザー（Janke＆Kun−

可能な限り臓器中の血液を除去した後，取り出

kel社製）を用いて，骨格筋（大腿四頭筋）の場

した臓器を−800Cに凍結保有した。

合は20％，心臓および肝臓では各10％ホモジネ
ートを調製し，トレックスガーゼで炉過し，そ

臓器は紳断した後，00Cで0．1％Triton
14

DEAEセルP−スを応用したCANP分画法

2．E−64類縁体のinvivoにおけるプロテアーゼ阻害
表t 新規基質の種々のカテプシソによる加水分解性（勝沼らのデータより）
Cathepsin（U／mg protein）
Substrate
B

L

H

C

BANA

0．559

0．183

0．822

0．123

Suc−L−Tyr−L−Met−NA

2．246

1．565

0

0．050

の炉液を酵素液とした。
5）酵素活性測定法

性測定用基質の開発を目指し，勝沼らとの協同研究でメチオニンをベースとして約30位のペプ

i）カテプシソ■B＆LはSuccinyl−L−Tyr−チドを新たに合成して検討した結果，表1に示

L−Met−2−naphthylamideを基質として，図2

すように Succinyl−L−Tyr−L−Met−2−naph−のごとく反応させ，遊離する2−naPhthylamine
をA．J．Barrettの方法3）で測定した。

thylamideが従来カテプシソBあるいはH用ii）カテプシソD；0・lM酢酸buffer（pHL−Arg−2−naphthylamide（BANA）よりカテ3・8），0・3％Triton X−100，0．84mg〔HC〕一プシソBおよびLに対して，特異性，感受性共に，はるかに高いことがわかった。

methylhemoglobin（0．2FECi／mg）および酵素液を含む全量0．2mlの反応液を300C，30分間

基質として良く用いられて来たN−α−Benzyl−

この基質の特異性をさらに検討するため，ラット肝ホモジネートを用い本基質を分解する酵

incubate した後，TCA上活の放射能を測定
し，酵素活性とした。

素活性のE−64に対する感受性を検討した。図iii）Acid phosphatase；6．0mM Sodium

4に示すようにその活性は非常に低濃度のE−

P−nitrophenylphosphate，33mM acetate

64でほぼ完全に阻害されることから，このbuffer（pH5．0），0．3％Triton X−100およSuccinyl−L−TyrTL−Met−2−naphthylamide

び酵素液を含む反応液3mlを370C，10分間
incubateした後，1N NaOHlmlを加えての分解は大部分カテプシソBおよびL様酵素に反応を停止し，遊離した9−nitrophenolを405nmの吸光度で測定した。

naphthylamideはE−64に比較的感受性の低よるものと考えられる。一方 L−Tyr−LTMet−いカテプシソCによってよく分解される基質でiv）CANP活性測定法

あるが，事実本基質の分解活性のE−64に対す

上述の様にして採取した臓器を用い図3に示る感受性は，図4に示したように，前者と比べすように処理して K．Suzuki ら4）により新てはるかに低い。CANPはこれらの基質に作たに定義されたm−CANP fractionを得た。

用しない。したがってSuccinyl−L−Tyr−L−
Met−naPhthylamideを分解する動物臓器ホモ

このmTCANPfractionの活性を〔HC〕me−thylcaseinを基質として既報の方法5）で測定した。

ジネート中の活性のほとんどはカテプシソBお等電点沈殿法による測定は既報の方法6）に準じて行った。

対する感受性に大差がないことからその全活性は両酵素の和であると考えられる（カテプシソ

なお，ここで必要に応じて測定した蛋白量は
いずれもLowry法7）によった。
結果

1．SuccinyトL−Tyr−L−Meト2−naphthylamide を用いるカテプシンB＆L活性測定法
特異性が高く，かつ，高感度のカテプシソ活

よびLと考えられ，さらに両酵素のこの基質にB＆Lと表示する）。
この基質を用いると50〜100mgの湿重量に相当する臓器ホモジネートでもカテプシソB＆L活性が測定でき，表2に示したように，その活性の強さほ肝臓＞心臓＞筋肉の順であった。
2．E−64およびその類縁体のin Yitroにおけるカ
テプシンB＆L阻害活性15

I E−64塀縁体の開発

0︵訳︶LgA叫一U可l望p叫S遥10−910−8

10−7

10−6

10−5

10−4

10−3

E−64（M）
図4 E−64のSuccinyl−L−Tyr−L−Met−NAの加水分解阻害活性
表2 SuccinylTL−Tyr−L−Met−NAのラット臓器ホモジネートによる加水分解性
TissuesRelease of2−naphthylamine（nM／min／g・tissue）
pH5・O

ラット心臓ホモジネートを用い，invitroで

pH6・0

ベてin vitroでは比較的弱い阻害活性しか示のE−64およびその炉縁体のカテプシソB＆L

さなかった。

阻害活性を測定した結果を図5に示した。すべての化合物が10−7〜10￣9M という非常に低い

3．E−64およびその類縁体のラットにおけるカテプ
シンB＆L阻書活性

濃度で阻害を示しており，その強さの傾向は，
Hashida ら1）およびA．J．Barrettら8）によvivoでのカテプシソB＆L阻害活性は，図E−64およびその類縁体の単回投与によるinる肝臓由来の精製カテプシソでの結果とよく符6に示すようにinvitroでの結果と多少違い，合する。

E−64−aが最も強く，また，invitroでは比較

中でも，Ep−460は特に強い阻害活性を示し的弱かったエステル体のEp−453および487

たが，エポキシコハク酸のフリーカルポキシルにもかなり強い阻害活性が見られた。このこと

基をェスチル化した高脂溶性誘導体であるEp−

は，これらの薬物の組織への移行性が極めて重453，454および461は対応するフリー体に比要な要因であることを意味しており，エステル

16

2．E−64類縁体のinvivoにおけるプロテアーゼ阻害≡

e：E−64C〇：E−64−aA

ム：E−64−Cヽ＼

D一一一口：Ep−454
ヽ

＼＼

0

台三一Uく訳

ト−X：Ep−453＼＼●一一一一●：Ep−460

0−−−−く〉：Ep−461
＼

ヽヽ

＼

、軋、

l

△・一一「△：Ep−479

1、、−、二ト一一一一一一一一一一一一一ー＿＿＿

10￣9

10￣8

Inhibitor conc．（M）

図5InvitroにおけるE−64およびその類縁体によるラット心臓ホモジネート中
カテプシソB＆L阻害活性体は対応するフリー体のprOdrug となりうる
ことを示唆している。
次に5日間連投した時の結果を図7に示し
た0単回投与と比べて残存酵素活性にあまり大きな差はなく，E−64類縁体には組織内への顕著な蓄積効果はないと思われた。
なお，本実験で，Ep−461では体重減少が認められ，保護基による毒性が示唆されたので，以後はそのベンジルオキシカルポニル基をアセチル基に変えたEp−487に切り替えた。
次に，最も強い活性を示したE−64−aを用
い，100mg／kgをラットに腹腔内授与した後の酵素活性の変動を経時的に調べたところ，カ
テプシソB＆L活性は筋肉，心臓共に，ほぼ3時間後から回復しはじめ，24時間後にほぼ元のレベルに戻った（図8）。
一方，E−64−aは同じライソゾーム酵素であるカテプシソDおよびAcidphosphatase のレベルにはあまり大きな影響を与えないという
事実，本物質が試験管内でライソゾーム膜に何ら影響を与えない事実を考え合わせると，その作用はクPPキンのようなライソゾームに対する直接作用ではないといえる。
E−64−aによるinvivoでのカテプシソB＆
L阻害活性は，図9に示すように肝臓＞筋肉＞心臓の順に強く，この差は阻害剤の臓器細胞内への移行性の差を反映していると思われる。カ
テプシソDはE−64類縁体では直接阻害されないにもかかわらず，肝臓で若干低下していた。
この理由については今のところ十分説明できない。
4．筋ジストロフィーハムスター（BIO14．6）諸臓
器の酵素活性およびE−64−8投与による影響
まず，無発症FIBおよび正常ゴールデンハム
17I E−64類縁体の開発

H eartM usclel

E−64
E−64−aE−64−Cll

Ep−453lEp−454
Ep−460Ep−479ll

Ep−487
Control

t

l

l

．

l
50

100

50

％Activity

1
100％ActiYity

図6InvivoにおけるE−64およびその類縁体によるラット筋肉および心臓カテプシソB＆L
阻害活性
ウィスク一系ラット（7遇令）に100mg／kg腹腔内投与した。（n＝4）

l

E−64

Heart

E−64−Cl

Ep−461

1

Ep−453Controll

E−64
E−64−ClMus。
leEp−461
Ep−453lControll50

100

ResidualActivity（％）
図7 E−64およびその類縁体の5日間連続投与によるラット筋肉および心臓カテプシソ∵B＆L
阻害活性
ウィスク一系ラット（7遇令）に100mg／kg／day腹艦内投与した○（n＝4）
182．E−64類縁休のinvivoにおけるプロテアーゼ阻害

Acid Phosphatase
C

コ

Heart

＝

＝

MuscIe

言Aでく訳

Cathepsin D∠ゝ＿＿1△

Heart

▲一一1▲

MuscleCathepsins B＆L〇・・・一一の Heart

三

3

6

三

MuscIe12Time after admistration（hr）

図8 E−64−a投与後のラットライソゾーム酵素活性の経時変化
ウィスク一系ラット（6遇令）に100mg／kg腹腔内授与した。（n＝4）

音＞竜く訳
25

50

100

25

50

100

25

50

100

Dose of E−64−a（mg／kg）
図9

E−64−aによるラット臓器カテプシソB＆L阻害活性の用量依存性
ウィスク一系ラット（8遇令）に腹腔内投与した。（n＝4）
19I E−64類縁体の開発［コ‥MaleNormalSyrian，llweeksold

田：MaleNormalBIOFIB・llweeksold
田：MaleDystrophicBIO14・6，11weeksold
図10 筋ジストロフィーハムスターと無発症ハムスターの筋肉中酵素活性の比較□：MaleNormalSyrian，11weeksold
ロ‥MaleNormalBIOFIB，llweeksold

田：MaleDystrophicBIO14・6，11weeksold
図11筋ジストロフィーハムスターと無発症ハムスターの心臓中酵素活性の比較
20

2．E−64類縁体のinvivoにおけるプロテアーゼ阻害

3

6

12

18

24

3

6

12

18

24

3

6

12

18

24

Time after administration（hr）
図12 E−64−a投与後の正常ハムスター臓器中ライソゾーム酵素活性の経時変化
ゴールデソハムスター（8退令） に100mg／kg腹腔内投与した。（n＝4）

スターとの骨格筋および心臓の酵素活性を比較した（図10，11）。BIO14．6は，無発症動物に比べ骨格筋でカテプシソB＆Lが約6〜10倍，カ

5．E−64類縁体のオスモティ・yクミニポンプ投与による臓器酵素活性への影響

テプシソDが約3倍高く，Acid phospllataSe以上の実験ではすべてE−64類縁体を腹腔内へ投与したが，動物体内に埋め込み，薬物を持も若干上昇していた。しかし心臓ではいずれの続的に一定量ずつ徐々に放出させることのでき酵素も上昇しているが，その程度は軽微であるオスモティックミニポンプを用い，BIO14．6にE−64−Cを50mg／kg／dayになるように調る。
BIO14．6にE−64−aを100mg／kg腹腔内

整し，2週間投与した。骨格筋のカテプシソ

投与した場合，正常ゴールデンハムスター（図B＆Lは強く抑制され，ほぼ正常動物のレベル

12）およびラット（図6）の場合と比べて，カまで低下しており，カテプシソDおよびAcid

テプシソB＆L活性の回復が遅く，36時間後

Phosphatase共にわずかに抑制傾向がみられでも，いずれの臓器においても元のレベルまでた（図16）。心臓ではカテプシソB＆Lのみがには戻らなかった（図13〜15）。

正常レベルまで抑制され，他の酵素活性には影

このようにBIO14．6におけるE−64−aのカテプシソB＆L阻害作用は，正常ラットあるいはハムスターよりも，より顕著であった。
一方，CANP活性は既報の等電点沈殿法5）で測定するとBIO14．6は骨格筋，心臓共に，響がなかった（図17）。一方，肝臓ではカテプシ
ソB＆Lは，ほは正常レベルまで抑制されていたが，カテプシソD，Acidphosphatase共に，約20％程度上昇していた（図18）。これら酵素の上昇は，すでに報告したように大量投与

FIBおよび正常ハムスターに比べてはるかに低により発現する肝および腎での弱い副作用9）をい値を示した（図10，11）。この点について後でさらに詳しくふれる。

反映しているとも考えられるが，現在のところ，この原因は明らかではない。
21

I E−64類縁体の開発

3

図ほ

12
24
36
Time after admirlistration（hr）

E−64−a投与後の筋ジストロフィーハムスター
臓器中カテプシソB＆L活性の経時変化
BIO14．6ハムスター（9適合）に100mg／kg
腹腔内投与した。（n＝4）

12

24

36

Time after administratioIl（hr）

図15 E−64−a投与後の筋ジストロフィーハムスター
臓器中Acid phosphatase活性の経時変化
BIO14．6ハムスター（9週令）に100mg／kg
腹腔内授与した。（n＝4）
上述のように，従来採用してきた等電点沈殿法を用いると筋ジストロフィーハムスターの骨格筋および心臓中CANP活性はゴールデンハ
ムスターのそれの約20％しか認められなかった（図16，17）。両者のCANPの等電点が違う
可能性もあるので，精査した結果，図22〜24に示した様に，肝では両者に差がなかったが，骨格筋および心臓では，至適pHに違いがあり，その活性の最大値は筋ジストロフィーの方がか

12

24

36

Time after administration（hr）

なり低かった。
等電点沈殿法は比較的簡便なCANP測定法

図日 E−64−a投与後の筋ジストロフィーハムスター
臓器中カテプシソD活性の経時変化
BIO14．6ハムスター（9遇令）に100mg／kg
腹腔内投与した。（n＝4）

ではあるが，この方法がすべての臓器標本に適用しうるか否かは明らかではない。そこで上記の結果を確認するため，内在性インヒビターを次にラットでの比較において，最も強い作用完全に除去することの出来るI）EAE−Cellulose
カラムクP・マト法との比較を試みた。図25に示を示したE−64−aと上述のE−64−Cをオスモテすようにカラム法での測定値は等電点沈殿法のィックミニポンプを用いて正常ハムスターに投それと違い，骨格筋ではBIO14．6の方がわず

与し，比較した結果，E−64−aの方がカテプシかではあるが高く，心臓でもほぼ同程度であっ

ソB＆Lをより強く阻害し，加えて肝におけた。また正常ハムスターでも等電点沈殿法でのるカテプシソDおよびAcid phosphatase等測定値より高く，活性回収率がカラム法の方がの上昇が認められず，カテプシソB＆L阻害

高いことがわかった。この事は等電点沈殿法で活性に関する限り，E−64−aの方がE−64−Cより優れていることがわかった（図19〜21）。

はCANPの失活度が高いか，あるいは内在性イ
ンヒビターの混在がさけちれないことを意味し

6．筋ジストロフィーハムスター腋器中CANP活性ており，ハムスターの臓器を材料とする限りカ22

2．E−64類縁体のinvivoにおけるプロテアーゼ阻害

N

14．6

［コ：Control

N

14．6

［N

：Male Normal Syrian，8weeks old

悶：E−64−C

N

14．6

N

14．6

14．6：Male Dystrophic BIO14．6，10weeks old

図16 E−64−Cを2週間継続投与した筋ジストロフィーハムスターの筋肉中酵素活性50mg／kg／dayになるようオスモティックミニポソプを用いて投与した。

N

14．6

N

⊂］‥Control［N［ 田：E−64−C

14．6

N

14．6

N

14．6

：Male NormalSyrian，8weeks old

14．6：Ma］e Dystrophic BIO14．6，10weeks old

図17 E−64−Cを2週間継続授与した筋ジストロフィーハムスターの心臓中酵素活性50mg／kg／dayになるようオスモティヅクミニポンプを用いて投与した。
23

I E−64類縁体の開発

N

14．6

N

⊂］：ControI［N

E∃：E−64−C

14．6

N

14．6

N

14．6

：Male Normal Syrian，8weeks old

14．6：Male Dystrophic BIO14．6，10weeks old

図18 E−64−Cを2週間継続投与した筋ジストロフィーハムスターの肝臓中酵素活性50mg／kg／dayになるようオスモティックミニポンプを用いて投与した。

□：ControI E巨E−64−a
図19

E−64−aおよびE−64−Cの1週間継続投与による筋肉中酵素阻害活性の比較
ゴールデンハムスター（8週令）に50mg／kg／dayになるようオスモティ
ックミニポソプを用いて投与した。（n＝4）

242．E−64類縁体のinvivoにおけるプロテアーゼ阻害

0

音＞コUく訳

□：Contro1

日：E−64−a

図20 E−64−aおよびE−64−Cの1週間継続投与による心臓中酵素阻害活性の比較
ゴールデンハムスター（8遇令）に50mg／kg／dayになるようオスモティックミニポ
ンプを用いて投与した。（n＝4）□：Control

団：E−64−a

図21E−64−aおよびE−64−Cの1週間継続投与による肝威中酵素阻害活性の比較
ゴールデンハムスター（8遇令）に50mg／kg／dayになるようオスモティックミニポ
ンプを用いて投与した。（n＝4）
25I E−64頬縁体の開発︵701×茎Sのコで⊃︶さニ＞コUく︵TOtX写SS叫lぞn︶言去りく
4．6

4．8

5．0

5．2

5．6

5．6

4．6

4．8

pH
三

図22

一

二：Normal

5．0

5．2

5．4

5．6

pH

●一一一一一●：Dystrophic

正常および筋ジストロフィーハムスター筋肉
ホモジネートの種々のpHにおけるCANP活△一一一一△：Normal

ムー−−−TA：Dystrophic

図24．正常および筋ジストロフィーハムスター肝臓
ホモジネートの種々のpHにおけるCANP活性性︵701×賀SSコ址＼⊃︶書芸Uく考察

骨格筋では他の臓器と比べてカテプシソBお
よびLが少なく，その測定には多量の検体が必要であったが，新たに開発したSuccinyl−L−
Tyr−L−Met−2−naphthylamideを基質として用いることにより，ハムスターのような小動物
でも十分測定できるようになった。
オスモティックミニポンプを用いて投与する
方法は，50mg／kg／day程度の投与量では，徐々に放出するため血中に確認できる程の薬物の
4．6

4．8

5．0

5．2

5．4

pH
O一一・・・・・の：Normal o−

図23

一・C：Dystrophic

正常および筋ジストロフィーハムスター心臓
ホモジネートの種々のpHにおけるCANP活性存在は認められなかったが，臓器のカテプシソ
B＆L活性は十分抑制していた。この方法では投与期間中切れ目なく薬物が放出され恒常的に抑制がかかるので，腹腔内単回投与よりも優れた投与方法と思われる。
CANPについてみると，DEAE−Cellulose
カラムによる部分精製法では低濃度のCa2十でラム法の方が優れていると思われるo

活性化される〝−CANPはインヒビターと同じ

E−64−Cをオスキティックミニポンプを用い画分に溶出されるので，本法ではm−CANPのて授与した時のCANP活性は，正常ハムスタ

活性のみを測定していることになる。ヒト筋ジーでは変らないが，BIO14．6では有意ではな

ストロフィー症では，m−CANPがその症状のいが，低下傾向がみられた。

進展に重要な役割をしていると考えられている

26

2．E−64類縁体のinvivoにおけるプロテアーゼ阻害

E−64−C

−

＋

一

十

一

Normal BIO14．6
図25

十

一

＋

Normal BIO14．6

E−64−Cを2週間継続授与した筋ジスト1］フィーハムスター筋肉および心臓中CANP活性への影響
50mg／kg／dayになるようオスモティックミニポンプを用いて投与した。（n＝3）
点線は等電点沈殿法による測定値を示す。

が，〃−CANPおよびインヒビターの挙動が明確になれば本症での筋肉蛋白代謝におけるCANP

E−64−a，E−64−Cを腹腔内投与およびオスモティックミニポンプ投与法により投与した時のの役割がさらに明らかにされると思われる。

CANP，カテプシソB＆L等の変動を精査し64−C投与により抑制傾向がみられた。今回の実た。
カテプシソB＆Lは心，骨格筋共に顕著な

験では例数が少ないため，さらに確認する必要低下がみられほぼ正常動物レベルにまで抑えらがあるが，本報大関の報告によれば，BIO14．6

れた。CANP（m，CANP）にも明らかな低下に腹腔内75mg／kg，7週間連続投与により有傾向が認められた。

上述のように少なくともm−CANPは，E−

意にm−CANPが抑制されており，E−64類縁3．本結果は実験動物，特に筋ジストロフィー

体は十分量のCa2十が存在しうる条件下では，生体内で，CANPを阻害することができることを意味しているように思われる。

ハムスターにおける治療実験に際して薬物の投結論

1．E−64類縁体投与による標的臓器，すなわ
ち，骨格筋，心臓のCANP，カテプシソB＆L等の変動を明確に把握するため，その微量定量法を確立した。
2．筋ジストロフィーハムスターBIO14．6に与量を設定する上で重要な知見となりうる。
参照文献
1）S．Hashida，T．Towatari，E．Kominami＆

N．Katunuma：Inhibition by E−64derivatives
Of ratliver cathepsin B and cathepsin Lin
vitro andin vivo，J．Biochem．88，1805−1811，
1980．

2）T．Noda，K．Isogai，N．Xatunuma，Y・Taru−
moto＆M．Ohzeki：Effects on cathepsin B，
27

I E−64類縁体の開発
H and Din pectoral muscle of dystrophic
Chickens（Line413）ofinvivoadministration
Of E−64−C，J．Biochem．，90，893−896，1981・
3）A．J．Barrett：A new assay forcathepsin
Bandotherthiolproteinases，Anal．Biochem・，の問題点，昭和54年度研究報告書，p・139，1980・
7）0．H．Lowry，N．J．Rosenbrough，A．J．Farr＆R．J．Romdall：Protein measurement withthe folin phenolreagent，J．Biol．Chem．，193，
265，1951．

4）K．Suzuki，S．Tsuji，S．Xubota，Y・Kimura

8）A．J．Barrett，A．A．Kembhavi，M．A・Brown，
H．Kirschke．C．G．Knight，M．Tamai ＆ K．

＆E．Imahori：Limited autolysis of Ca2＋−

Hanada：L−iYanS−Epoxysucciny1−1eucylamide

activated neutral protease（CANP）changes（4−guanidino）butane（E−64）anditsanalogues

its sensitivity to Ca2＋ions，J．Biochem・，90，

asinhibitors of cysteine proteinasesincluding

275−278，1981．

Cathepsins B．H and L，Biochem・J．．201，189−

47，280−293，1972．

5）大関正弘：E−64−Cの薬効に関する研究（1），昭和55年度研究報告書，p・123，1981・
6）杉田秀夫：Ca依存性プロテアーゼの活性測定法

28

198，1982．

9）大関正弘：E−64−Cの急性及び亜急性毒性に関する研究，昭和55年度研究報告書，p．99−109，1981．

3．E−64−Cエステル誘導体の生物薬剤学的研究

沢 田 二 郎＊研究協力者 小団扇 省 三＊ 小 沢 康 雄＊
小

目

山

郁

的

夫＊

中

池

郁

子＊

（4）水溶液中での安定性
10％ア七トニトリル含有 Carmody 広域緩前報1）においてE−64−Cの製剤化にあたって

衝液2）（pH5−8）10mlにEp−453500fLgをその基礎的諸性質について検討した結果，その強酸性という性質（pKa2．38）から判断して溶解し，50′唱／mlの溶液を調製した。この液を370Cに保存し，残存率の経時的変化を高速液体

も本薬剤は吸収性の面から必ずしも優れた薬剤

クロマトグラフィー（HPLC）により測定した。

ではないことを報告した。そこで本年度はE−（5）血渋中での加水分解

64−Cが優れたプロテアーゼ阻害作用を有する

血祭はラット，ハムスター，犬のヘパリン加という特性を生かしながら，なおかつ高い吸収血祭を用いた。Ep−453250〝gを10％アセトニ性を付与すべく生物薬剤学的見地からの改良をトリル含有1／15Mリン酸塩緩衝液（pH7．4）

試みた。一つの試みとしてE−64−CのPrOdrug化が期待できる。本報の目的はE−64−Cのエチ5mlに溶解し，基質溶液を調製した。この溶

ルエステル体（Ep−453）を用いてその可能性を検討することにある。

後，血菜2．5mlを加え，直ちに振り混ぜ反応を方法

液を37．0土0．50C の水浴中に5分間保持した開始した。以後，経時的に反応液をlmlずつ
サンプリングし残存する基質について HPLCを用いて定量した。

（1）試料（6）桔熟小腸法による吸収実験

E−64−CおよびEp−453は，著者らが合成し絶食させたラットをウレタン麻酔後開腹し，たものを用いた。その構造式，分子式，分子量を表1に示す。

十二指腸の両端および胆管を結集して膠管ループを作った。このループ内に5％アラビアゴム（2）使用動物

水溶液lml当り薬物10mgの濃度の試料溶

犬はピーグル犬雌性体重約10kg，ラットは液0．1mlを注入し，一定時間後，採血と結染
小腸の摘出を行った。血菜中薬物と摘出結果小ウィスク一系雄性体重約150gおよびハムスタ
ーはゴールデン系雄性体重約70gをそれぞれ用いた。
（3）各種溶媒に対する溶解性
各種溶媒に対する溶解性を日本薬局方通則に従って試験した。
＊ 大正製薬珠式会社総合研究所

腸内の未吸収残存薬物の定量はHPLCを用いて実施した。吸収率は投与量と残存量の差から算出した。
の 経口投与による吸収実験
5％アラビアゴム水溶液10mlにE−64−C，
Ep−453をそれぞれ100mg懸濁し，投与検液を調製した。これを体重1kg当り50mg投与
29

I E−64類縁体の開発
表1E−64−CおよびEp−453の構造
E p−
453

E−
64−
C
H 0 ：〉△

く： N H …
1：芸

ご

H抑

。； 〉△
H i）
2 。2H 与C 15H 26N ま05

C 17H M N 20 j

M ．
W ．314M．
W ．342

表2 各種溶媒に対する溶解性
Solvents

Solubility SoIvent（ml）／
Solute（1g）Ep−453

MethanoI
AcetoneDioxaneEthyl acetate
Water
Etber
n−Hexane

した。投与15分，30分，60分後に採血屠殺し，血菜を得た。血染中薬物の定量はHPLCを用いて行った。
（8）腹腔内投与実験
投与検液の調製は次の様に行った。E−64−Cを飽和重曹水を用いて中和後，0．5％CMCおよび0．1％Tween80を含む水溶液を用いて500
mg／10mlの検液を調製した。また，Ep−453
は500mgを10mlの0．5％CMCおよび0．1％
Tween80を含む水溶液に懸濁して検液を調製した。これらを体重1kg当り75mg投与した。投与5分，10分，15分，30分，60分後に採血屠殺し，血菜を得た。血祭中薬物の定量はHPLCを用いて行った。
（9）定員法
1）10％アセトニトリル含有緩衝液中の薬物の定量
反応液lmlをとり，図1の溶離液で10倍希釈してHPLCの試料とした。
2）結染小腸内の薬物の定量摘出した結数小腸に5％リン酸水溶液5mlを加えた後，分光分析用酢酸エチル30mlを
30〈： N 慧l器

C H 2C（C）
z

加える。次にホモジナイザーで30秒間磨砕し，3分間遠心分離（3000r．p．m．）する。この酢
酸エチル層10mlを分取し，減圧下に濃縮する。残留物を図1に示す溶離液6mlに溶かし，この液をHPLCの試料とした。本操作での添加回収率はE−64−C，Ep−453 それぞれ，95．7％，96．7％であった。
3）血未申薬物の定量
血祭中薬物の定量は沢田ら3）の方法で実施した。供試動物の血祭0．5mlに5％リン酸水溶液0．5mlを加えた後，分光分析用酢酸エチル
7mlを加えてよく振り混ぜ，3分間遠心分離（3000r．p．m．）する。この酢酸エチル層5mlを分取し，減圧下に濃縮する。残留物を図1に示す溶離液lmlに溶かし，この液をHPLCの試料とした。
HPLCはいずれの定量操作においても図1に示す条件で実施した。
結果（1）物理化学的性質
各種溶媒に対する溶解性の検討結果を表2に示す。Ep−453はE−64−C と比較して水に対して極めて溶けにくく，ジオキサンや酢酸エチル
に対しわずかながら溶けやすい物性を持つことがわかった。
また，逆相カラム（Nucleosil C−18）を用いたHPLCによる保持時間を比較するとE−
64−C，Ep−453それぞれ5．0分，8．2分でありEp−453の方がより脂溶性の高い物性を持つことが明らかとなった（図1）。
一般にエステル化合物は水素イオンや水酸基イオンにより分解しやすいことが知られてい3．E−64−Cエステル誘導体の生物薬剤学的研究
E−64−C HPLC Conditions
Ep−453column；Nucleosil C−18（5JJm）
150mm X

4mmID

Mobile Phase
MeOH：H20：H3PO4＝54．5：45．0：0．5

Flow Rate；1．O ml／min

Column Temperature；400C

0

4 812
Time（min）

Deteetor；210nm

図1逆相カラムによるE−64−CとEp−453の脂溶性の比較

0M等−d国hO訳一三P登還＼〇一一一O pH5
■一一一一●

pH6△一・一・△

pH7▲一一一「▲pH81

2

3

Time（hr）
図2 水溶液中でのEp−453の安定性（370C）
る。そこで Ep−453の水溶液中での安定性に及ぼすpHの影響について検討した。その結果，pH5においては安定であり，pHが高くなるに従って分解が促進された。残存率の経時的変化（図2）からEp−453の分解は一次反応式に従うことがわかった。なお，Ep−453の分解に対応して等モルのE−64−Cの生成が認められたことから，この分解は単純な加水分解反応と考えられる。
（2）ラット結熱小腸法による吸収実験
ラット結染小腸法により吸収性を検討した結果を図3に示す。E−64−Cでは60分で6．7％しか吸収されなかったのに対し，Ep−453の消化管での吸収性は良く，投与60分後において39．3％が吸収され，さらに吸収が増加する傾向を示した。なお，Ep−453投与60分後において結染
小腸内に残存する薬物の約20％は加水分解を受けたE−64−Cとして検出された。したがって，吸収率の算出はE−64−CをEp−453に換算して求めた。
結染小腸を経時的に摘出した時，同時に血菜中の薬物濃度を測定した。その結果，図4に示す様にE−64−C投与の場合，血菜中からE−64−Cを検出することはできなかった。それに対し，
Ep−453を授与したグループでは血菜中に30分
後をピークとして約2／唱／mlの脱エステル体
であるE−64−Cを認めた。しかし，いずれの時間においても未変化体のEp−453は検出感度（0．1〃g／ml）以下であった0（3）経口投与
次に両薫物をラットに経口投与した場合の吸収性を血中移行量から比較検討した（図5）。
Ep−453投与の場合，代謝物のE−64−Cのみが血菜中に認められた。投与15分後に最高血中濃度約3／噌／mlを示し，以後緩やかに消失する傾向を示した。一方，E−64−Cの場合血菜中に薬物は検出されず，本試験においても Ep−453の方が消化管での吸収性が優れていることが明らかとなった。
細 腹腔内投与
旗隆内投与後の血中への両薬物の移行性についてラットおよびハムスターを用いて比較検討した。その結果ラットの場合，両薬物の血中移行
バターンに差は認められず，投与10分後にピー
クがあり，60分後においてほぼ大部分が消失し31

I E−64類縁体の開発

30

Time（min）

図3 結染小腸法による吸収実験（投与量：1mg／ラット，平均土S・D・3例平均）︵昌運三∈＼買︶㌣上道−凹︵冨S巾一d HE＼誉J U−諾丁由30

Time（min）

図4 結魚小腸法による吸収実験時の血中濃度（投与量：1mg／ラット，2，3例平均）3060Time（mh）

図5 経口投与後の血中濃度（投与量：50mg／kgラット，2，3例平均）た。血中濃度時間曲線下面積〔AUC（FLg・ml￣1・br）〕はE−64−C投与およびEp−453投与でそれぞれ，42．3，38．5の値が得られた（図6）。一方ハムスターにE−64−Cを投与した場合，最高血中濃度は63．8J堰／ml（投与10分後）であり，30分後においては2．5〝g／mlと急数な消失パターンを示した。これに対してEp−453投与の場
合，最高血中濃度は30．2J唱／ml（投与15分後）
32

で以後緩やかな消失パターンとなった。E−64−C
およびEp−453投与時のAUC（FLg・ml￣l・hr）
はそれぞれ19．6，18．5で有意な差を認めなかった（図7）。なおEp−453を投与した場合，両動物共に血祭中にはE−64−Cのみが検出され，速やかに加水分解されることがわかった。
（5）血中エステラーゼによる加水分解の種差

3．E−64−Cエステル誘導体の生物薬剤学的研究

000MS寸−du−○訳−望p叫Su出0
0︵言S再td tE＼誉エリー諾Td

0−−O Dog●・一一一●

Hamster△一・一△Rat

30

Time（min）

図6 腹腔内投与後の血中濃度（投与量：75mg／kgラット，2，3例平均）30Time（min）

図8 血渠中でのEp−453の加水分解（370C）00
0︵雲hSjd tE＼誉J U−寸や−凹スチル体であり，水に対する溶解性や逆相カラムを用いたHPLCの保持時間の測定により，より脂溶性が高いことが明らかとなった。

030

Time（min）

図7 腹腔内投与後の血中濃度（投与量：75mg／kgハムスター，2，3例平均）
Ep−453の血菜中での加水分解をin vitro
で検討したところ，図8に示す様に著しい種差が認められた。半減期はラット，ハムスター，
イヌそれぞれ27秒，66．1分，191．8分であった。各供試動物においてEp−453の減少に対応
して等モルのE−64−Cが生成した。熱処理した
ラット血菜中ではEp−453は安定であることから，この分解は酵素によるものと考えられる。
考察

薬物の消化管粘膜などの生体膜透過性は，薬物の脂溶性が支配的因子であることが一般に認められている。Ep−453はE−64−Cのエチルエ

In situ桔染小腸法で両薬物の吸収性について比較した。その結果，Ep−453はE−64−Cよりも高い吸収率を示し，脂溶性の高いものはど
吸収性が良いという一般的な傾向を認めた。投与60分後においてEp−453の腸内残存量のうち約20％はE−64−Cとして検出され，Ep−453は消化管内で一部加水分解されることがわかった。E−64−C投与の場合，吸収率が低いことから，Ep−453は未変化体として膜透過していると考えられる。この場合，血中からはE−64−Cのみが検出され，体内での加水分解が速やかであることが明らかになった。
In situ結致小腸法は吸収に影響を及はす田子を単純化できるが，実際に薬物が経口授与された場合には吸収の前段階としての溶解などの物理化学的性質，胃内容物排泄，消化管の固有運動性，胆汁の影響などの生理的因子等が関係してくる。このため，経口投与後経時的に血中濃度を測定した。その結果，in situ法で得られた結果と同様な傾向が認められ，E−64−Cのエチルエステル化は消化管粘膜の透過性を向上させることが明らかとなった。
次に注射剤の形で旗睦内投与したところ，ラ33

I E−64類縁体の開発

ットの場合，血中濃度パターンは E−64−Cと用部位での薬物濃度に影響を与えると考えられ

Ep−453の間に差は認められなかった〇一万ハムスターの場合，Ep−453はE−64−Cと比較しる。今回はE−64−Cのエチルエステル誘導体についてのみ検討したが他のエステル体についてて血中への移行が遅延する傾向が認められた。
腹腔内投与では，ラット，ハムスター共にE−も実用化の面から今後十分検討する価値があると考えられる。

64−Cを投与した場合でも高い血中濃度が得ら

参考文献

れ，経口投与と比べて血中への移行が優れる投与ルートであることがわかる。これは腹隆内投与の場合には，膜透過性よりも溶解速度が律速となっているためと考えられる。
先に，著者らはェステラーゼ活性には種差があること，またェスチルの種掛こよって加水分解速度が異なることを明らかにした4）。Ep−453の血菜での加水分解速度も動物種により著しい差が認められ，ラットは2．5分で大部分が加水分解されるのに対し，ハムスターの場合60分においても半分以上残存していた。この相違は作

34

1）沢田二郎：E−64−Cの物酬ヒ学的性質及び製剤化の検討，微生物の二次代謝物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究，昭和55年度研究報告書，
p．21−33，1981．

2）W．R．Carmody：J．Chem・Ed・，38，559，1961・
3）沢田二郎：E−64及びその類縁体の生物薬剤学的研究，微生物の二次代謝物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究，昭和54年度研究報告書，
p．159〜166，1980・

4）岬哲夫，山田稔，平井良助，小森真樹子，和志
武三徳，小沢康雄，小山郁夫．書沢弘：薬剤学，
42（2），92−98，1982．

4．E−64類縁体の安全性に関する研究

大 関 正 弘＊
研究協力者

笹

木

目

島
村

道
正

忠＊
明＊

的

E−64類縁体の筋ジストロフィーハムスター
における薬効試験に先立ち，これらを正常ハム
スターに2週間皮下連続授与し，その亜急性毒性を予備的に検討する。
方
1．動

法

物

樽
河

本

保

男＊

西

章＊

赤

大
間

島
文

隆＊
子＊

水溶液の二種煩を用い，各々投与群と同様に処置した。
3．検査項目（1）一般症状
毎日一般症状の観察および体重測定を行った。
（2）血液学的検査
投与終了後ベントパルビタールによる軽麻生後6週令の雄性ゴールデンハムスター（金酔下に外腸骨動脈および静脈より採取した新鮮血を用いてコールターカウンターModel丸動物）を2週間予備飼育した後，1群6匹あSP（株式会社日科機）により赤血球数，白血て群別し実験に使用した。動物は温度23土20C，球数，ヘモグロビン量，ヘマトクリット値，湿度55土5％のオープンシステムの動物室で，血小板数の測定を行った。

プラスチックケージに3匹ずつ収容して飼育（3）血液生化学的検査

し，固型飼料（オリェンタル酵母社製MF）と水を自由に摂取させた。

投与終了後ベントパルビタールによる軽麻酔下に外陽骨動脈および静脈より採取した新2．投与量および投与方法

鮮血を遠心分離して得た血清についてオート

検液はE−64−aを生食水溶液とし，Ep−453

アナライザー（日立712型自動分析装置）を用

は0．1％Tween80を含む0．5％CMC溶液

い，グルコース量（グルコース酸化酵素法），
総蛋白量（Biuret法），アルブミン量（BCGに懸濁，E−64−Cは重曹水にて中和後生食水溶液とし，Ep−453は3．25％（W／v），その他は12．5％液に調製した。

法），A／G比〔アルブミン／（総蛋白一アルブ

投与量はE−64−aおよびE，64−Cともに，500ミン）〕，尿素窒素量（Urease−Indophenol法），クレアチニン量（Jaだe法），総コレスmg／kg，Ep−453については250mg／kgとし，テロール量（酵素法），GOT，GPT活性（UV

投与容量はEp−453の場合体重100gあたり
0．4ml，その他は0．2mlとして1日1回14日法），ALP活性（Kind−King変法），LDH活間，毎日定時にハムスターの背部に皮下授与した。対照群には生食液，0．5％CMC−Tween80性（ピルビン酸ヒドラジン．発色法），無枚燐
量（Fiske−Subbarow法），CPK活性（ヤトロンCPK−Sキット法）の計13項目について測定を行った。

＊大正製薬株式会社総合研究所
35

I E−64類縁体の開発

0

2

4

6

8

10

12

14（days）

図1E−64類縁体のハムスターへの2週間連続皮下投与における体重変動（4）尿検査

うちの肝および腎については10％ホルマリ

与4日日から投与部位の脱毛および切傷が認められ，瘡蓋を形成し，投与終了時まで回復が認められなかった。その他の投与群では顕著な変化は見られなかったが，対照群を含む各群で途中死亡例が1〜2匹散発的に認められた。
体重変動を図1に示す。
E−64−C群では対照群と同様な体重増加推移が観察されたが，E−64−aおよびEp−453群では対照群に比べ体重増加の抑制あるいは減少傾向がみられた。
2．血液検査血液学的検査所見を表1に示す。

ン液で固定後，常法のごとく切片を作製し，H．E．およびPAS染色を施し病理組織学的Ep−453群で血小板数の増加が，E−64−C群
で赤血球数，血色素量およびヘマトクリット値

検索を行った。

の減少幌向が認められた。
血液生化学的検査所見を表2に示す。
いずれの測定値にも統計的に有意な変化はみられなかった。
3．病理学的検査
途中死亡例では下痢および肛門部に出血塊の投与終了時の強制排泄尿について蛋白，
糖，pH，ケトン体，潜血（ラブスティック
スー日本エームス社）の半定量的検査を行った。
（5）病理解剖学的検査
投与終了後ベントパルビタールの軽麻酔下に放血致死させ，開胸腹して内部諸臓器を観察し，心，肺，肝，腎，脾，腸間膜リンパ節，胸腺，下垂体，副腎，精巣，精巣上体を摘出し，各々重量を測定した。これらの諸臓器の結果

1．−般症状および体重変動
E−64−C投与群において投与直後，投与部位の疫病を示すような行動がみられ，2例では投36

4．E−64類縁体の安全性に関する研究
表1E−64類縁体のハムスターへの2週間連続皮下投与における血液学的検査所見
Group Contro1−1

No・OfaniInals

6

Hematocrit
MCV
MCH
MCHC
Platelets
Leucocytes

4

Ep−4535860±56

839士40796土57（g／dl）

16．7土0．9

16．5土0．6

15．7土1．1（％）

Erythrocytes（×101／mm3）
Hemoglobin

E−64−a EL64−c controト2

5

4827土3915．2士1．5

16．3±1．3

822土8753．4土3．452．9±2．1

49．7士3．7

51．4：土1．7

51．7±3．0（〆） 62．0±0．7（γr） 19．4土0．4

63．1土2．1
19．7士0．262．5±0．3

62．2士1．5
18．5土2．3

63．0士2．919．9±1．2（％）

31．2土0．7

19．7±0．1
31．5土0．4

31．2士0．7（×103／mm3）（×102／mm3）

639土65225土80766±242
144土46

Mean土S・D・（No．of animals）

29．7土3．2
764土 4131．5±1．2

767士193148±44254土233

137士501055士43＊＊＊＊p＜0．01

表2 E−64類縁体のハムスターへの2週間連続皮下投与における血液生化学的検査所見
Group Contro1−1

No・Ofanimals

E−64−a EL64−c contro1−2

6

4

5

Ep−453

5

4

Blood sugar（mg／dl）

143土28150±17158±36

180土31132±76

Total protein（g／dl）

5．1土0．8

4．9土0．9（g／dl）

1．8土0．4

5．7土0．3
2．1士0．2

5．4土0．4

Albumin5．0士1．3
1．8±0．6

2．0土0．3

1．7士0．3

0．5土0．1

0．6土0．0

0．6士0．1
22．6±2．2
0．3土0．0

0．6±0．1
24．3±3．2

0．5±0．0
21．6±4．8

A／G ratio
BUN（mg／dl）

25．7±3．6

Creatinine（mg／dl）

0．3土0．028．2±7．6
0．4士0．0

0．3土0．1

0．3土0．1

CholesteroI（mg／dl）

136土43

111士35

135士51

130土14160士84

GOT

（K−U）

60±27

143±158

54±21

GPT

（K−U）

24士13

33土33

21土6

61±36
22土10

64土43
15±9

Al−P

（KA−U）

24．4土10．2
311土17716．2±3．7
243土81

26．4士11．0（LU）

27．1土14．3
468±36418．4±4．0

LDH

280土105357土152IP（mg／dl）

6．3土1．3

6．5土1．4

6．8±0．8

6．6土0．8

6．8土1．3

CPK（トU）

2387土1418

3201士2401

2365±9022552±1039

2930±1936

Mean土S．D．（No．of animals）

附着が認められ，剖検所見では結腸の充血，回病理組織学的検索は生存例についてのみ行っ

腸および盲腸粘膜の出血，ビラン等の変化とともに腸管内容物中に寄生虫卵が検出された。これらの所見は各薬剤群の生存例にも共通して観察された。

た。肝ではいずれの投与群においてもグリソソ各摘出臓器の絶対重量および相対重量を表3，4に示す。
絶対重量，相対重量の両者が対照群に比べ有意な差を示す臓器は認められなかったが，絶対重量においてE−64−C群の心臓および腎臓に増加が認められ，相対重量においてほ，Ep−453
群で腎臓の増加および精巣の減少がそれぞれ認められた。

鞘周囲の好酸球を主体とする細胞浸潤がほとん
どの例に観察され，また肉芽腫あるいは壊死が各群の一部の例に散見された。しかし，腎では各群とも著変は認められなかった。
考察

E−64額縁体をハムスターに14日間連続投与した今回の実験は，薬効試験の投与量の目安をつけるべく行った試験であることから，いわゆるハムスターにおける毒性試験としては不充分なものであり，また寄生虫の寄生などもあって37

I E−64煩縁体の開発
表3 E−64類縁体のハムスターへの2週間連続皮下投与における臓器重量（絶対重量）
Group Contro1−1

E−64−a E−64−c control−2

No．of animals

Ep−453

6

4

5

5

4

Heart

（mg）

265±48300土62339土51＊

332土29285士77Lung（mg）

434土52433土110457±58481土15Liver（g）

3．10±1．27

3．81士1．26

4．38土1．09

4．12土0．64

456土833．87±1．11

Xidney（g）

0．74土0．14

0．86土0．14

0．90土0．07＊ 0．77土0．09

0．94±0．19

Spleen

（mg）

93±35

87土48

118土5593±15

112±68

87士23

96土40

105土47

96土34

68±24

Mesentericlymph nodes（mg）

Thymus

（mg）

44土12

38土25

47土11

53土12

34土16

Hypophysis（mg）

2．8土0．8

3．5土0．6

2．6土0．5

2．0士0．7

3．0土1．4

Adrenalgland（mg）

15．7±3．92．52±1．04

19．3土4．1
2．87±0．71

20．8土4．2
2．98±0．49

20．8土3．6
3．21±0．54

19．8土4．4（g）

Epididymis（mg）

581：±258

590土274613±216696土154499＝ヒ265

Finalbody weight（g）

81．8±19．8

84．4±24．6

92．5±12．2

94．9土14．2

84．7土19．9

TestisMean±S．D．（No．of animals）

2．45±0．74＊p＜0．05

表4 E−64類縁体のハムスターへの2週間連続皮下投与における臓器重量（相対重量）Group Contro1−1

No．of animals

ET64−a E−64−c contro1−2

Ep−453

6

4

5

5

4

335土21

Heart

（mg％）

331±39363土43366土23355±52

Lung

（mg％）

556土134

517土31

495土34514土64547土73Liver
KidneySpleenMesentericlymph nodes
ThymusHypopbysis
Adrenalgland
TestisEpididymiS

（g％）
（g％）
（mg％）

3．85士1．22

4．48±0．49

4．71土0．85

4．36±0．47

4．52士0．58

0．98土0．43 1．05土0．15

0．98土0．09

0．82土0．06 1．11±0．05＊＊

（mg％）
（mg％）
（mg％）
（mg％）
（g％）
（mg％）

Mean土S．D．（No．of animals）

111土27

98±36

125士4999土19124土45

110土32130土75112土43102土3583±31

55：土1242土20

3．6±1．1

4．4土1．451±8
2．9±0．755土9
2．2±1．039±13
3．7±2．1

19．8土5．0

23．3土3．3

22．4士2．4

21．9士2．1

24．2土8．0

2．91±0．96672±248

3．43土0．25
674土158

3．22土0．28

3．38土0．25

2．86±0．25＊

649士166727±63564土173＊p＜0．05＊＊p＜0．01

必ずしも充分な毒性評価を行える内容のものでkgをハムスターに14日間連続皮下投与して，はないが，あえて今回の結果とラットの成績1）とを比較すると，E−64莱頁縁体による毒性はハ

その亜急性毒性を検討した結果，ムスターにおいてより弱く，種差があるように思われた。また三薬物中ではEp−453にやや毒性の強い幌向がうかがわれた。今後さらにハムスターにおけるより詳細な毒性評価を行う予定
である。

1．各被験薬剤とも顕著な毒性的変化は認められなかった。
2．三薬剤間の亜急性毒性を比較すると，Ep−453がいくぶん強く，E−64−a とE−64−Cとはほは同等と考えられた。
文

結語

E−64煩縁体250mg／kgあるいは500mg／
38

献1）大関正弘：昭和56年度研究報告書，1980．

5．E−64およびその類縁体の筋ジストロフィー
ハムスターにおける生体内動態

大 関 正 弘＊
研究協力者 福 島 清 美＊ 河 野 喜 郎＊ 青 田 英 生＊
長

都

亘＊

船

渾

洋

子＊

野

津

隆

司＊

物として自然発症筋ジストロフィーチキンNo・た。3H−E−64および3H−E−64−aは生理食塩
水に，HC−E−64−CはNaHCO3−生理食塩水に溶解後，それぞれ5mg／kgの割合で皮下授与した。

413を用いE−64−Cの薬効評価を行ったが，期待薬物投与後の血中濃度，尿糞中排泄，組織内した程の効果を認めることができなかった1）。

濃度，全身マクロオートラジオグラフィーおよ

一方，もう一つの疾患モデルとして筋ジストロ
フィーハムスターが注目されてきた。ヒトとハび尿中代謝物の分析は前報4，5）と同様に実施した。また肝および腎における共有結合量の測定

ムスターの筋ジストロフィーの異同についてはに関しては，ラットの場合6）と同様に行った。

研究日的昨年度，ヒト筋ジストロフィー症のモデル動

今後さらに詳細な比較検討を得たねばならない結果が本疾患モデルを用いた薬効評価は十分検討に値するものであろう。
L．Proschek2）らの報告によれはCardiomyo−

1．血中濃度ハムスターに3H−E−64，3H−E，64−aおよびを伴う筋ジストロフィーハムスター

11C−E−64−C5mg／kgを皮下投与したときの血UMXィ．1の心筋壊死ならびにCa2＋の沈着を

中放射能濃度推移を図1に示す。3検体とも投E−64−a，E−64−Cが有意に抑制するという。我与後20minに最高血中濃度に達し，その時の々も筋ジストロフィーハムスターモデルにおけ

値はE−64が他の2検体に優っていた。その後るE−64誘導体の薬効評価を試みつつある0本

いずれも2hr後まで速やかに減衰し，半減期はE−64が24．1minで最も短く，ついでE−64−C

Pathy

研究の目的はこの様な背景のもとにE−64，E−
64−a，E−64−C のハムスターにおける生体内動態を明確にし，評価の一助とすることにある0
実験材料および方法
標識化合物はWilzbach法3）で3Hガスを用が26．7min，E−64−aが34．6minの順であった。2hr以降はほぼ一定の低濃度が維持される傾向にあった。E−64およびE−64−aについては24hr値が9br値より高かった。
2．尿糞中への排泄

いて標識した3H−E−64および3H−E−64−a，なハムスターに3H−E−64，3H−E−64−aおよびらびにし〔U」．C〕leucine（RCC）から当社でHC−E−64−C5mg／kgを皮下投与したときの尿合成したHC−E−64−Cを用いた。動物は体重72

糞中への放射能の排泄を図2に示す。3着とも〜82gのGolden系雄性ハムスターを使用し主に尿中へ排泄され，一部糞中へ排泄された。
いずれも24br以内に大部分が排泄され，以後＊大正製薬株式会社総合研究所

5日後まで少量の排泄が継続していた。5日後39

I E−64類縁体の開発︵ぎ＼b叫等︶uO 巴一uBu︒U蓬一UjP遥

図1ハムスターに3H−E−64，JH−E−64−号および14C−E−64−Cを皮下投与後の血中放射能濃度
各点は4匹の平均値を示す。

1

2

3

4

5

Time after administration（day）
図240

ハムスク，に3H−E−64，3H−E−64−aおよびHC−E−64−C5mg／kgを皮下投与後の尿糞中への放射能累積排泄量
各点は4匹の平均値を示す。

5・E−64およびその類縁体の筋ジストロフィーハムスターにおける生体内動態

20mjn

図3

ハムスターに3H−E−6425mg／kgを皮下投与後の全身オートラジオグラム

41

I E−64類縁体の開発

20mjn

深 窓

ヴ惑
い
甥∵
モ
ミ
象′
漉

ま．
空
∴

、∴、
接

し
′
完 露一羨∴
じ
・
等

⊥・
莞

り

十
‡
∵

薫
請 謁 撃

や
′
、
ン
′
ノ蔑
誉
燕

図4

42

ハムスターに14C−E−64−C25mg／kgを皮下投与後の全身オートラジオグラム

5．E−64およびその類縁体の筋ジストロフィーハムスターにおける生体内動態表1

ハムスターに】H−E−645mg／kgを皮下投与後の主要組織への放射能分布
Radioactive concentration（FLgEq／gor ml）

Tissue

20min

24hr

168llrBlood

3．825±0．283

0．398土0．054

0．169土0．010

Plasma6．623土0．253

0．092土0．010

0．126土0．003

Muscle1．059土0．120

Heart

0．093士0．023
0．153士0．015

Lung1．450土0．032
2．839土0．074

0．127土0．064
0．238土0．067
0．295±0．052

0．132土0．013

Liver

3．448±0．333

0．770土0．103

0．219土0．017

Kidney18．354土2．132

1．405士0．103

0．355士0．024

The data represent the mean士S．E．of four animals．
表2

ハムスターに3H−E−64−aを皮下投与後の主要組織への放射能分布

The data represent the mean土S．E．of four animals．
表3

ハムスターに14C−E−64−Cを皮下投与後の主要組織への放射能分布

The data represent the mean土S．E．of four animals・までの尿糞中への排泄率は，E−64，E−64−aおよびE−64−Cそれぞれ85．4％，80．4％，93．2％
であり，回収率が低かった。
3．全身オートラジオグラフィー
3H−E−64および14C−E−64−C25mg／kgをハムスターに皮下投与後，20min，3Ilr，24hrの全身オートラジオグラムを図3，図4に示す。
3H−E，64投与後20min

では皮下投与部位のほか，腎と膀胱内尿に最大の放射活性を認め，ついで血液，肺，肝に比較的高い放射能を認めた。心筋，皮膚にも分布が観察され，骨格筋にもわずかに移行がみられたが，消化管内容への移行は認められなかった。3br後に至ると，腸内容物に高い放射活性が認められ，ついで腎，肝，ハーダー腺，骨髄に分布を認めたが，他の部位ではほとんど消失した。24hr後43

I E−64類縁体の開発
表4 ハムスターに3H−E−64，3H−E−64−aおよび1−C−E−64−C5mg／kgを皮下投与後の肝および腎の組織蛋白への共有結合
Covalent bound radioactivity（nmole Eq／g tissue）

Time after administration

E−64−aLiver Xidney

Liver Kidney
0．61

土0．06
1．70

土0．20

Liver Kidney

1．17
±0．10

9．28
土0．60

2．82
±0．40

0．29

1．91

±0．04

土0．30

3．11
±0．50

1．13

4．52

1．44

5．98

士0．23

±0．39

土0．21

土1．14

0．53

0．78

0．38

1．08

0．69

1．90

土0．03

±0．01

土0．01

土0．03

±0．08

±0．10

The data represent the mean±S．E．of four animals・

3H−E−64n−BuOH，AcOH，H20（3：1：1）

図5

14C−E−64−C

3H−E−64−an−BuOH，AcOH，H20

CHC13，MeOH，AcOH（4：1：2）（9：l：1）

ハムスターに3H−E−64，3H−E−64−aおよび1−C−E−64−C5mg／kgを皮下投与後
24hrの尿のメタノール溶出画分のラジオ薄層クロマトグラム

では肝の放射活性はほとんど消失したが，腸内容，腎，ついで骨髄に微弱ながら残存が認められた。

骨髄になお活性を認めた。

HC−E−64−Cでは，皮下投与後20minで膀胱内尿，腸内容物および腎に極めて高い放射活性が認められ，ついで肝，血液，肺に分布する
ほか，唾液腺，ハーダー腺，膵，皮膚等に，骨格筋，心筋に優る分布が観察された。3br後
では腸内容物の放射活性が最大であり，腸管下部まで移行していた。また腎の皮質内帯にも強ハムスターに5mg／kgの用量で皮下投与後，最い放射活性が見られたが，肝および血液では低下した。そのほか唾液腺，ハーダー腺等の分泌腺および骨髄，消化管壁に放射活性が保持されていた。24hr後に至ると，腸内容物の放射活性は減弱したが，腎の皮質内帯，分泌腺およびれる心筋および骨格筋への特異的な移行性は認

44

4．主要組織への分布
3H−E−64，3H−E−64−aおよび14C−E−64−Cを高血中濃度到達時間（20min）および24hr後の主要組織内濃度を調べた。その結果を表1，
表2および表3に示す。
20min後では，3検体とも腎に高濃度に分布したが，他の臓器はいずれも血液中濃度と同レベルかそれ以下であった。標的臓器と考えらめられなかったが，3検体を比較すると，心ではE−64−C＞E−64＞E−64−a，骨格筋ではE−64＞E−64−a＞E−64−Cの順であり，いずれも骨格筋より心に若干高い分布を示した。またこの時

5．E−64およびその炉縁体の筋ジストロフィーハムスターにおける生体内動態の血柴中濃度は血中濃度の2倍弱であった。

からの吸収が遅いことが示唆された。しかし，

24hr後では，3検体ともいずれの組織にお以後の血中濃度推移および半減期はほぼ同じレ

いても消失が著しかったが，腎にはなお1〜3〃g Eq／gの残存活性がみられた。また血集中ベルであり，両種間に著しい差はみられなかった。

濃度に比べて血液中濃度が高いことから，血球への移行性が推定された。

され，5日間で75％前後であった。E−64，E−

尿糞中への排泄は，3者とも主に尿中へ排泄

168hr後では，3検体ともいずれの組織にお

64−aおよびE−64−Cの5日間の総排泄率はそいても低レベル放射活性の残留が認められ，特れぞれ85．4，80．4，93．2％であり，回収率がに腎に比較的高い濃度を示した。

やや低く，一部体内に残留することが示唆され

5．肝および腎蛋白との共有結合た。ラットの場合と比較すると，E−64およびハムスターに3H−E−64，3H−E−64−a および
HC−E−64−Cを5mg／kgの用量で皮下投与後，肝および腎の組織蛋白への共有結合について検討した結果を表4に示す。E−64−Cの腎を除いて，いずれの場合も20minに比べて24hr後の値が上まわっていた。また，7日後もなおかなり残存しており，総分布放射能の80％以上が蛋白との共有結合体として存在していた。
6．尿中代謝物

20minで腎および膀胱内尿に極めて高い放射ハムスターに3H−E−64，3H−E−64−aおよび活性が認められ，腎排泄が速やかなものと推察

E−64−aでははば同様であるのに対し，E−64−Cではラットの尿中排泄が約50％とかなり低いので，E−64−Cについてのみ種差が認められた。
これはE−64−Cがラットでは胆汁中に多く排泄されており4，5），胆汁中排泄率の差によるものと考えられる。
組織への分布をオートラジオグラフ ィ ーにより調べると，E−64，E−64−C とも，投与後

HC−E−64−Cを皮下投与後24hrの尿中代謝物される。またE−64−Cでは，同時点においてすのラジオ薄層クロマトグラムを図5に示す。尿でに消化管内容に放射活性が認められることかをアン㌧べ−ライトⅩAD−2カラムにかけ，メタら，E−64に比べて胆汁中への排泄が速やかでノールで溶出した時の溶出率はいずれも92％以あると考えられる。E−64，E−64−C ともに投与上であり，ほとんどの放射能が回収された。こ後短時間では腎に高濃度分布するが，他の組織のメタノール溶出国分について，ラジオ薄層ク

では血液レベルと同等かそれ以下であった。

ロマトグラフィーにより分析した結果，いずれ

24hr後では腎，骨髄，分泌腺になお残存しての場合も未変化体のピークが最大であった。その量的割合は，E−64，E−64−aおよびE−64−C

いた。主要組織中濃度を測定した場合，3者とそれぞれ76．4，55．9，76．7％であり，E−64−aてもなお24hr値の1／4以上の濃度で分布しての代謝が最も著しかった。

おり，残留性が認められた。なお標的組織と考考察もほぼ類似した分布傾向を示し，7日後においえられる骨格筋，心筋への移行は少なかった。
ラットの場合4・5）と比較すると，E−64−Cの肝での分布がラットではハムスターよりも著しく高

ハムスターに3H−E−64，3H−E−64−aおよびHC−E−64−Cを皮下投与したときの血中濃度推かったことを除いて，大体同等のレベルにあ移は，いずれも20min後に最高値に達し，以り，両種間に分布に関する著しい差はないもの

後速やかに減衰するが，2br以降ほぼ一定の低濃度が維持される類似した経時変化を示し，と考えられる。

3着間に大きな差異は認められなかった。先に行ったラットの場合4）は，E−64およびE−64−a有結合についても検討した。先に行ったラット

ハムスターにおける肝と腎の組織蛋白への共におけるE−64−Cの組織蛋白への共有結合の実の10min後の血中濃度がハムスターよりも高験6）では，E−64−Cの残留性5）および腎，肝にく，ラットに比べてハムスターの皮下投与部位

対する毒性7）は組織蛋白への共有結合によるも45

I E−64類縁体の開発のと推察した。ハムスターにおいても同様に共有結合が認められたが，肝，腎への共有結合性はラットと比較すると約1／4と低く，ラットより低毒性であるとも考えられる0
ハムスターにおける尿中代謝物は，3検体とも未変化体が主であったが，E−64−aは，E−64，
E−64−Cに比べて未変化体の割合が少なかった。ラットの場合4・5）もE−64，E−64−Cの尿中代謝物は未変化体が多かったが，E−64−Cの割
合は約50％で，ハムスターの場合より低かった。この原因として腸肝循環の有無あるいは代謝活性上の種差による可能性が考えられる0結論

布が最も高く，心筋，骨格筋への移行は低濃度であった。
以上により，ハムスターにおける3検体の生体内動態には，特記するような差異はなく，ほぼ煩似した体内挙動を示すものと推察される0またラットとの間にも，E−64−Cの排泄経路を除いて著しい種差はないものと考えられる○文献1）大関正弘：E−64−Cの薬効に関する研究（1）一筋ジストロフィーチキンに対する薬効試験，昭和55年
度研究報告書，p．123，1981・
2）L．Proschek：私信
3）Wilzbach，K・E・‥Tritium−labelling

by

ex−

posure of organic compounds to tritium gas，

E−64およびその煩縁体E−64−a，E−64−Cの3検体につき，3HまたはHC標識体を用いてハムスターにおける生体内動態を比較検討した。
皮下投与時の血中放射能濃度は，・いずれも20min後に最高値に達し，以後速やかに減衰するが，2hr以降低濃度が保持された。また
3検体とも主に尿中へ速やかに排泄され，一部糞中へも排泄された。尿中代謝物は未変化体が最も多かった。体内分布は3検体とも腎への分

46

J．Am．Chem．Soc．，79，1013，1957・
4）大関正弘：E−64及びその類縁体の生体内動態に関する研究，昭和54年度研究報告書，p・149，1980・
5）大関正弘：E−64−Cの生体内動態に関する研究，
昭和55年度研究報告書，p・163，1981・
6）大関正弘：E−64−Cの生体内動態に関する研究（2），本誌，1982・
7）大関正弘：E−64−Cの急性及び亜急性毒性に関する研究，昭和55年度研究報告書，p・99．1981・

6．E−64−Cの生体内動態に関する研究（その2）大 関 正 弘＊
研究協力者 福 島 清 実＊ 吉 田 英 生＊
長

都

亘＊

研究目的

野

津

隆

司＊

3．代謝物の分離，定量
経口投与後の糞および消化管内容物は水でホ

先に著者1）は，14C−E−64−Cのラットにおけモジナイズし，遠沈後その上清をAmberlite

る生体内動態について検討し，投与経路による代謝パターンの相違ならびに連続投与による組織への蓄積，残留傾向を認めた。そこで今回，
E−64−Cのラットにおける代謝への腸内細菌の関与および代謝物の化学構造を明らかにするとともに，組織蛋白への共有結合の可能性についても追加検討した。

XAD−2カラムにかけ，MeOH溶出西分につ実験材料および方法
1．標識化合物，実験動物および投与法
標識化合物，ラットおよび投与液調製は前報1）に準じた。標識検体は，特記する場合を除いて5mg／kgの用量で，経口または皮下投与した。
2．ラ・yト盲腸内容物によるim Yitro代謝実験
Schelineの方法2）に準じた。すなわち，ラット盲腸内容物を10倍容の1．C−E−64−C（1mg／ml）を含む培養液で十分混合後，チーズクロスで炉過し，N2ガスまたは02−CO2混合ガス（95：5）をバブルしたのち各気流下で密栓し，370Cでインキュべ−トした。培養掛ま，0．1M
リン酸塩緩衝液（pH7．4）に酵母エキスおよびペプトンを，それぞれ0．5％に溶かしたものを使用した。なお，以上の操作は可及的無菌的に実施した。

いて蒋層クロマトグラフィー（TLC）により分離した。In vitro反応液はそのまま前記カラムにかけ，同様に代謝物を分離した。経口投
与後の尿は硫酸酸性下（pH2．0）酢酸エチルにより代謝物を分離し，脱水，濃縮乾固後少量の
MeOHに溶解したのち，CH2N2によりメチルエステル化後ガスクロ質量分析（GC−MS）の試料とした。TLC上の放射能はオートラジオ
グラムにより検出し，各代謝物の放射能領域をかき取り放射能を測定することによ り定量した。
4．代謝物の同定
In vitro反応液より各代謝物をメチルエス
テル体として分取TLCにより単離，精製し，
GC−MS，MS，NMRによりスペクトル解析を行い，合成琴品と比較して同定した0経口投与後の尿中代謝物も，GC−MSにより合成標品と比較して同定した。
5．共有結合の測定
In vivo実験の場合，ラットにHC−E−64−Cを皮下投与後所定時間に断頭潟血し，肝および腎を取り出したのち水にて10％ホモジネートを作成した。In vitro実験では，未処理ラットの肝および腎を0．1Mリン酸塩緩衝液にて10％＊大正製薬株式会社総合研究所

ホモジネートにし，HC−E−64−Cを50／唱／mlの濃度で添加したのち370Cでインキュべ−トし47

I E−64類縁体の開発
表1ラットにHC−E−64−C5mg／kgを経口投与後の糞および腸内容物中代謝物の組成
Metabolites（％）
Unchanged Mainmetabolite Others
24brfeces

18．52

53．58

28．13

結

果

1．糞および消化管内容物中の代謝物
ラットに14C−E−64−C（5mg／kg）を経口投
与後の，糞および消化管内容物中代謝物の量的割合を表1に示す。24brの糞では，未変化体

Intestinal

は20％弱であるのに対し，主代謝物である低極
lbr
12br

88：10
8．03

4・65
65．72

7・25
26．25

性の未知代謝物は53．6％と多かった。一方，消化管内容物は，投与初期ではほとんどが未変化体であったが，12br後では未変化体は10％以︵9．0⁚t⁚eH00UざUゴ○岩U．MtU U

下となり，低極性未知代謝物の割合が増加した。
2．腸内細菌による代謝
ラットの盲腸内容物を含む培養液に14C−E−
64−C（1mg／ml）を添加し，嫌気的および好気的
条件下に370Cで以brインキュべ−トしたの
ち代謝物を検索した。代謝物の薄層クロマトグ
ラムのオートラジオグラムを図1に示す。好気的条件下では，嫌気的条件下よりもHC−E一朗−C
はよく代謝されており，ほとんどが低極性未知
代謝物となっていた。また低極性未知代謝物はanaerobi（：

図1aerobic2成分存在しており，Rf値の高い順にM−a，を添加し，24hrインキュべ−ト後の代謝物のM−b とした。これを経時的に調べると図2に示すように，嫌気的条件下ではM−aは，8，ラジオ薄層クロマトグラム

以hr後それぞれ添加総放射能の1．5，12．4％

ラットの盲腸内容物にHC−E−64−Clmg／mlと経時的に増加したのに対し，M−bは8brでた。Invivoホモジネートおよび所定時間後のinvitro反応液に，10倍量の10％トリクPP
酢酸（10％TCA）を加えて蛋白を沈殿させ，さらに数回10％TCAにて洗浄した。TCA洗浄蛋自画分は，80％MeOH，100％EtOHにて各々数回ずつ，放射能が検出されなくなるまで洗浄し，乾燥後0．1NNaOHにて溶解した
のち，一部は蛋白定量に用い，残部は放射能を測定して共有結合量を算出した。
6．放射能の測定
試料の一定量，あるいは蒋層坂上の放射能はシリカゲルをかき取りCab−0−Silを加え，In−
sta−GellOmlに溶解あるいは懸濁させて，液体は4．6％，以hrでは3．4％であった。好気的条件下ではM−aの生成が著しく，別hrで87．8％に達した。一方，M−bは7hrまでは増加し，13．6％とM−aよりも多く存在したが，以後別brまで6％前後と一定値を示していた。
3．代謝物の化学抜道
E−64−C をラット盲腸内容物とインキュベー
ト後，代謝物をメチルエステル体として単離，精製し，GC−MSで分析した結果を図3に，NMRスペクトルの主なシグナルについての結果を表2に示す。
M−aメチルエステルのMSでは分子イオン

シンチレーションカウンター．（Packard，3255

ピーク（M＋）がm／e314に認められ，未変化型）で測定した。

体メチルエステルのM十に対して質量数が14少ない。また，フラグメソトイオンピークのうち，m／e86，115，200からロイシルイソアミ

486．E−64−Cの生体内動態に関する研究（その2）anaerobic

aerobic

％

4

24

8

3

hcubation time（hr）

7

12

16

24

Incubation time（hr）

図2 ラット盲腸内容物による嫌気的および好気的条件下でのHC−E−64−Cの代謝
M−a methylester

M−b methylester

訳音suヱu⁝ぎ dt遥

10訳書u芸叩芸ヱ遥

MeO2C−CH2TCH2−CO−R

100

200

300

m／e

R：−NH−CH−CO−NH−CH2−CH2−

CHく認

CH2
F

CH

／＼
CH3
図3

CH3

代謝物M−aおよびM−bメチルエステルの質量スペクトル

ルアミド基には変化がなく，エポキシ環の脱酸

それぞれ2Hに相当するシグナルはサクシニ

素および2H付加したサクシニルロイシンイ

ル基のメチレン基に帰属でき，MSにより推定

ソアミルアミドと推定した。NMRスペクトル

した化学構造を支持している。

でもロイシンイソアミルアミド基のプロトソシ

M−bメチルエステルはUV吸収を持ち，MSはM＋がm／e312に認められ，M−aメチル

グナルは未変化体とほとんど差はなく保持されており，∂2．45〜2．61および∂2．62〜2．78のエステルより質量数が2少ない。またフラグメ
49

I E−64額縁体の開発
表2

代謝物M−aおよびM−bメチルエステルの核磁気共鳴スペクトル

CompoundSignaland number of protonppm（∂）

M−a methylester

2．45−2．61（2II，m）−OC−CH2−CH2−CO一

2．62−2．78（2H，m）
4．40−4．57（lH，m）
3．70

M−b methylester（3Ⅰも S）

一CH〈賢一CO2CH3

3．12−3．40（2H，m）−CHく

1．32−1．80（6H，m）−CH2−

6．86（lH，d，J＝16Hz）−OC−CH＝CH−C0−

7．13（lH．d，J＝16Hz）

4．54−4．71（lH，m）
3．80（3H，S）−CHく㌘−CO2CHユ

3．12−3．44（2H，m）

ーCHく

1．32−1．80（6H，m）−CH2−

Chemicalshiftin∂from tetramethylsilane，SOIvent CDCl，．
＄：Singlet，d：doublet，m：multiplet
J：COupling constant

ソトイオンピークのうち，m／e86，113，198から，フマリルロイシンイソアミルアミドと推定した。NMRスペクトルでも，∂6．86および∂7．13の2Hに相当する2つの2垂線（J＝16Hz）は，フマリル基の2つのプロトンに帰属できることから，上記の化学構造を支持している。
なお，M−aメチルエステルおよびM−bメ
チルエステルの推定化学構造を持つ合成標品の621

各スペクトルは，M−aメチルエステルおよび

851M−bメチルエステルと完全に一致した。
4．尿中代謝物

0
0
2
6
2
2

E−64−Cをラットに大量に経口投与（500mg

382／kg）し，24Ilr尿について代謝物を抽出，メチル化後GC−MSにより代謝物を分析した。
この時のマスクロマトグラムを図4に示す0大

Scan number

量投与のためM−aの生成は少ないが，明らかにM−aと保持時間およびMSが完全に一致す
るピークを認め，経口投与時の尿中低極性未知
代謝物はM−aであることが明らかとなった0

50

100

50

図4

ラットにE−64−C500mg／kg経口投与後の尿中代謝物のマスクロマトグラム

6．E−64−Cの生体内動態に関する研究（その2）5．肝および腎蛋白との共有結合
ラット肝および腎の10％ホモジネートに11C−
E−64−Cを50／瑠／ml（0．16InM）の濃度で添加して370Cでインキュベート後，経時的に蛋白との共有結合画分の放射能を測定した。その結果，図5に示すように肝，腎とも経時的に共有結合体が増加し，腎が肝に優る傾向．がみられた。
一方，HC−E−64−C5〜500mg／kgをラットに皮下投与後，lhrの肝および腎組織蛋白への共有結合を検討した結果を表3に示す。肝での図5

ラットの肝および腎ホモジネートに
HC−E−64−C を添加してイソキュべ−
ト後の蛋白への共有結合

表3ラットにHC−E−64−Cを皮下投与後lhrの肝および腎の組織蛋白への共有結合
Covalentbound radioactivity

Tissue（nmoleEq／gtissue）

5

LiYer

6．4

±0．3

25

20．4

500

20．5

49．6

36．9

±1．7

士1．0

±1．6

Kidney41．1119．0

157．7

220．1

216．8

士2．1士4．1

土13．6

土2．2

士20．3

The datarepresent the mean土S．E．of
three animalS．

表4

ラットにHC−E−64−C25mg／kgを皮下投与後の肝および腎の組織蛋白への共有結合
Covalent bound radioactivity

Timeafter（nmoleEq／gtissue）
administration Liver Kidney

20min
24br
120Ilr

13．92士0．12
13．18土0．12
2．80＊

70．11±0．78
86．77土0．12
35．32＊The data represent the mean士S．E．of
tllree animals．
＊；One animalに調べた結果を表4に示す。24hr後の共有結合量は，肝では20min後と同じレベルにあったが，腎では上昇していた。120hr 後では，
24hr値の1／4以上が残存しており，腎では約35nmolが共有結合体として存在した。なお，こDose（mg／kg）
125
250

士2．1

共有結合量は用量の増加とともに増大し，500
mg／kgではg組織当たり約50nmolの共有結合を認めたが，腎では肝の4倍以上の高い値を示し，250mg／kg でほぼプラトーに達し，約200mmolの共有結合が認められた。また，
HC−E，64−C25mg／kg を皮下投与して経時的の時点では総分布放射能の80％以上が共有結合体であった。
考察

著者1）は先に14C−E−64−Cのラットにおける代謝を調べ，皮下投与時の尿中代謝物は未変化
体が主であったが，経口投与時の尿中主代謝物
は低極性未知代謝物であり，投与経路により代謝パターン1こ差があることを認めた。今回，経口投与時の糞中代謝物を調べたところ，主代謝物は尿中と同じく低極性未知代謝物であり，消化管内容物中代謝物も初期は未変化体が多い
が，その後任極性未知代謝物の割合は増加した。さらに，胆汁中にはこの未知代謝物はほとん
ど認められなかった1）ことから，低極性未知代
謝物の生成に関して腸内細菌の関与が考えられた。そこで，ラット盲腸内容物と11C−E−64−Cを嫌気的および好気的条件下でインキュベートしたところ，低極性未知代謝物が生成し，それには2成分が含まれており，M−a，M−b が認め51I E−64類縁体の開発

ほ，Ⅰvie5）がテルペソエポキサイドあるいはディルドリンのエポキシ環の還元反応を報告して

H
CO−R
＼
／
c
c

／ ＼ ／＼HOOC

O

H（E−64−C）

H、。±。／CO−R
HOOC／

＼H

（M−b）

HIH
l

l

HOOC−c c−CO−R

⊥

ム

（M−a）

R：−NH−CH−CO−NH−CH2−CH2−CH
＿；

CH2
l

CH

／＼

CH3

CH3

図6 E−64−Cの推定代謝経路（ラット盲腸内容）られた。経時的にみると，M−b の生成は初期いるに過ぎず，興味深い反応である。
一方，HC−E−64−Cをラットに連続皮下投与
した場合，多くの組織で単回投与に比較して蓄積傾向を示し，腎＞肝に最も高濃度に分布し，投与中止後の消失も極めて遅かった1）。また，ラットの亜急性毒性試験において，腎および肝の変性，細胞核の変化，壊死の組織像が報告されている6）。一般に蛋白，核酸のような生体高分子に共有結合する薬物は組織障害を惹起することが多いといわれており7），共有結合による毒性発現の可能性が考えられた。そこで今回，invitroおよびinvivoでの肝および腎の組織蛋
白との結合を調べたところ，いずれの場合も蛋
自画分に強固に結合した放射能を認め，共有結合しているものと考えられた。invivoにおける共有結合量は，投与量の増加とともに増大
し，消失は極めて遅かった。また，肝に比べ腎の共有結合体濃度は数倍高かった。E−64−Cは投与後大部分が速やかに排泄されるが1），一部は腎等の生体組織蛋白と共有結合することにより，長時間生体に留まり，蓄積傾向を示すとともに毒性発現に関与するものと考えられる0にはM−aよりも多いが，その後M−aの生成が増加し，M−b は一定の低レベルを維持したままであったことから，M−bはM−aの中間代謝物と考えられた。また，嫌気的条件下よりも好気的条件下の方がM−aへの代謝は速やかであったことから，E−64−CからM−aへの代謝において，通性嫌気性菌の関与が考えられた。
M−aおよびM−bを単離し，GC−MS，NMR
等により化学構造を解析したところ，M−aはすクシニルロイシンイソアミルア

ミド，M−bはフマリルロイシンイソアミルアミドと同定できた。E−64−Cの腸内細菌による代謝経路は図6

結論E−64−CのHC標識体を用いて，ラットにおける生体内動態について追加検討した。
E−64−Cを経口授与した後の糞および消化管
内容物中に，主代謝物としてM−aを認めた0
ラット盲腸内容物とのインキュベーショソにより，代謝物M−a，M−bの生成が認められ，E−
64−Cは経口投与後腸内細菌により M−bを経てM−aに代謝されるものと推定した。またこれらの代謝物の化学構造を同定した。
ラット肝および腎の組織蛋白との共有結合を

ポキシ環が還元されM−bとなり，さらに2重結認め，E−64−Cは生体組織蛋白と共有結合する
ことにより，残留，蓄積憤向を示すものと考え合が還元されM−aに至る経路である。腸内細られる。

のように考えられる。すなわち，E−64−Cのエ菌による2重結合の還元反応は，Grimthsら3），
Scheline4）により報告されており一般的な反応であると考えられるが，エポキシ環の還元反応
52

文

献

1）大関正弘：E−64−Cの生体内動態に関する研究，

6．E−64−Cの生体内動態に関する研究（その2）
昭和55年度研究報告書，p163，1981．
2）Scheline，R．R．：Decarboxylation and de−methylation of some phenolic benzoic acidderivatives by rat caecal contents，J．Pharm．
Pharmaco1．，18，664，1966．
3）Griffiths．L．A．andSmith，G．E．：Metabolism

Of apigenin and related compoundsintherat．
Metabolite formationinuivoandbyintestinal
microflorain vLLro，Biochem．J．，128，901，
1972．

4）Scheline．R．R．：Metabolism offoreigncom・
pounds by gastrointestinal microorganisms，
Pbarmaco1．Revり25，451，1973．

5）Ivie，G．W．：Epoxide to olefine：A novel
biotransformationin the rumen，Science，191．
959，1976．

6）大関正弘：E−64−Cの急性及び亜急性毒性に関する研究，昭和55年度研究報告書，p99，1981．
7）佐藤哲男：ラジオアイソトープ薬物代謝実験法，
日本アイソトープ協会編，p529，1981．

53

Ⅰ 酵素レベルでの効果

7．カルシウムプロテアーゼとイノシトール燐脂質の代謝回転………………………西塚春美

8．カルシウムプロテアーゼ頬の性質とこれに対するE−64および類縁体の阻害効果

9．E−64−Cの心筋蛋白質分解に及ぼす影響

今堀 和友
江橋 節郎

10．筋ジストロフィーハムスターにおけるチオール性カテプシソの活性に対するE−64投与の効果

勝沼 信彦

11．筋ジストロフィーチキンにおける筋ガングリオシドの代謝に関する研究………官武正

7．カルシウムプロテアーゼとイノシトール燐脂質

の代謝回転

酉
研究協力者 岸 本
西

山

塚

春

美＊

明＊ 梶 川 憲 雄＊ 塩 田
馨＊

高

はじめに
ホルモンや神経伝達物質など，種々の刺激が細胞に加わった際の生体膜受容および細胞内情報伝達機構の解明は最近の最も重要な課題のひ

橋

十

郎＊

高

井

誠＊
義

美＊

る。なお，Ca2十に親和性の高いプロテアーゼと親和性の低いプロテアーゼをそれぞれCa2十プロテアーゼⅠおよびⅠと呼ぶ。
材料および方法とつとなってきた。私共は生体膜イノシトール

Cキナーゼはラット大脳の可溶性画分よりす燐脂質の代謝回転に共役して活性化される蛋白でに記載した方法2）で部分精製したのち，5〜

質燐酸化酵素（以下Cキナーゼと略す）の解析

20％のショ糖密度勾配遠心法を用いて調製しを行っているが，この酵素は従来よりよく知られているCyClic AMPを介する情報伝達系とた。各種の燐脂質は赤血球膜より抽出分画した5）。ジオレイソ，その他のジグリセリドは市は異なったきわめて重要な情報伝達系を構成し販品を蒋層クロマトで精製して用いた。E−64ていると考えられる1）。ところでCキナーゼのは大正製薬より寄贈をうけた。その他の試薬はいまひとつの活性化様式としてCa2＋プロテア

市販品を用いた。

ーゼによる限定分解がある（図1）。この種のプロテアーゼとしてはCa2十に対する親和性のCキナーゼ活性は前報5）に従い〔「32P〕ATPから仔牛胸腺のHlヒストンへの32Pの取り込

異なった二種の酵素が知られているが，両プロみをもって測定した。Ca2＋プロテアーゼの活

テアーゼはともに分子量77，000の単一蛋白質性は125Ⅰで標識したカゼインを基質として，5であるCキナーゼを分子量51，000の活性フラ％トリクロル酢酸に可溶性の放射能を測定する

グメソトに限定分解する2・3）。この二種のプロ

か，あるいはCキナーゼを基質として限定分解

テアーゼのうちCa2十に対する親和性の高いプの結果生成する活性フラグメソトのキナーゼ活

ロテアーゼが形質膜に結合したCキナーゼに作性をHlヒストンを基質として測定した3）。

用することは前年度報告したが4），今回，このプロテアーゼを高純度に精製してさらに詳細な解析を行った。その結果，このプロテアーゼは結果および考察1）Cat＋プロテア一ゼⅠの精製と性質

イノシトール燐脂質の代謝回転に共役して活性ラット大脳を0．25Mのショ糖を含む緩衝液化された形質膜結合型のCキナーゼに選択的に作用して不可逆的に活性型の酵素に変換するこで破砕したのち，100，000×g上清を調製した。

とを明らかにした。以下はその概略を報告す

せ，0〜0．4M NaClの直線濃度勾配で溶出しこれをDEAEセルロース（DE−52）に吸着さた。Ca2＋プロテアーゼⅠは約0．1M NaClで＊神戸大学医学部第二生化学教室

溶出されたが，Ca2＋プロテアーゼⅠの溶出に
57

Ⅰ 酵素レベルでの効果
表1

ラット脳のCが十プロテアーゼの精製
Specific activity

Fraction

Casein hydrolysis＊

C−Ⅹinase activation書＊

（a）

（b）

（units／mg of protein）

Extract

0．044I）EAE−Cellulose

0．43

Sephadex G−150

1．3

Sucrose density
gradient centrifugation

17

DEAE−Sepharose

41

Phenyl−Sepharose

191

＊
＊＊

One unit：One FLgCaSein digested permin
One unit：One unit of active fragment produced per min

表2

低濃度Cat十で活性化されるCa打プロテアーゼ

Brain

Heart

muscle＊（rat）

Molecular weight

88K

Isoelectric point

5．5

王（a for Ca2＋

Skeletal（Canine）

muscle＊＊（porcine）

135K

80K＋30K

20J▲M

40JjM

45J

Optimum pH

7．5−8．5

7．0

7．5−8．0

M

Inhibitor

Leupeptin

Leupeptin Leupeptin

muscle＊＊＊（Chicken）

79K（60Ⅹ）30′

M

7．5−7．8
Leupeptin
E−64

E−64
Substrate

Skeletal

C−Kinase

Casein Myo丘bril

Phosphorylase
Xinase

BSA

CaseinCaseinCasein＊＊＊＊＊＊Mellgren（1980）FEBS Lett．，109，129
Daytonct aL．（1981）Biochim．BiophyS・Acta，659，48
Suzukict aL．（1981）J．Biochem．，90，1787

ゼⅠ画分を濃縮後，・セファデックスG−150のpH7．5〜8．5を示した。活性の発現にはCa2＋が必須であり，そのEa値は20′JMであった。

ゲル炉過，ひきつづいて5〜20％のショ糖密度

他の二価金属イオンとしてはSr2十とMn2十が勾配遠心法を行った。さらに活性画分をI）EAE

わずかに有効であるが，Mg2＋，Zn2＋，Ba2＋，
Cu2＋はまったく無効であった。また，ロイべは約0．3M NaClを要した。Ca2＋プロテアー

セファロースに吸着させたのち，0．05〜0．25M
NaClの直線濃度勾配で溶出した。最後にフェプチソ，キモスクチソ，アンチパイン，E−64

ニルセファロースに吸着後，20％ェチレングリ
コール含有の緩衝液で溶出した。エチレングリなどのチオールプロテアーゼのインヒビターはすべて阻害作用を示したが，TLCK，PMSF．

コールは七ファデックスG−50の小カラムにて大豆トリプシンインヒビターは無効であった。

除去し，最終標品を得た。以上の精製過程によ

今回高度に精製したCat十プロテアーゼⅠの性

りCa2＋プロテアーゼⅠは約4，000倍に精製することができた（表1）。

質とMellgren6），Daytonら7），Suzukiら8）精製したCa2＋プロテアーゼⅠの分子量は格筋より調製したCat十プロテアーゼの性質と88，000と推定され 等電点は5．5，至適pHはを比較した（表2）。分子量にいくぶん相違が58

がそれぞれイヌ心筋，ブタ骨格筋，ニワトリ骨

7．カルシウムプロテアーゼとイノシトール燐脂質の代謝回転

Ca2十一Protease

Active Fragment
M．W．77，000

M．W．51，000

Ca2十

Ca2＋

Phospholipid

Diglyceride ］

Phospholipid

dependent

independent

Diglyceride

図1Ca打プロテアーゼによるCキナーゼの活性化l︵M■01×邑U︶亡0叫一夕三UくむS空七城−U

0

l

l

C a 2＋（0 ．
1m M ）
十P ho s ph o lip id （12 ／一g ／m り＋D ioIein （0・
6 ／一g ／m l）

C a 2＋ （0．
1m M ）＋
P h o sp h o Iip id （1 2 〝g ／m l）

5

C a 2 ＋a lo n e
EGT A
0

l
10

l
20

30

Time（min）
図2 Cat十によるCキナーゼ活性化に及ぼす燐脂質およびジオレイソの効果認められるが，Ca2十に対するKa値が数十〃Mであり，中性付近に至適pHをもち，チオール

0．1

0．2

ChIorpromazine（mM）

図3 タロルプロマジソによるCキナーゼ
活性化の抑制に保温するとCa2十への親和性が高まることを

プロテアーゼのインヒビターで阻害されるこ認めた。この成績はSuzukiらの報告を支持す
るものと思われる。

と，さらにカゼインがきわめてよい基質になる

2）Cキナーゼ系とCa汗プロテ7−ゼの関連

ことなどその性質はよく一致している。したがCa2＋プロテアーゼⅠによるCキナーゼの限って，これらのCa2＋プロテアーゼはすべて同定分解反応にはCa2＋以外に燐脂質が必須であじ種類の酵素であると考えられる。

り，なかでもセリン燐脂質が最も有効である。

ところで，Suzukiら9）はニワトリ骨格筋にまた，燐脂質にジグリセリドが微量共存すると，

おいてlmM程度のCa2十で活性化される従

この限定分解反応は著明に促進される（図2）。

来のプロテアーゼ（m−CANP）が自己消化をう

この種のジグリセリドとしては不飽和脂肪酸をけると，Ca2＋に親和性の高い酵素（FL−CANP）に変換することを報告している。私共もラット

少なくとも1分子含有する必要があり，飽和脂大脳のCa2＋プロテアーゼⅡをCa2＋の存在下た。一方カゼインを基質とした際には，燐脂質

肪酸のみからなるジグリセリドでは無効であっ59

Ⅱ

酵素レベルでの効果

Signall

Ca2＋（10￣5M）…・…・‥

Ca2＋−Protease

ActiveFragment∴

H

Pん0gpんoryhffo几

図4 Cキナーゼの活性化機構

やジグリセリドの効果は認められず，これらの因子はCa2十プロテアーゼⅠに作用して活性化しているのではなく，基質であるCキナーゼに作用していると推定される。Ca2十 とともに燐
脂質とジグリセリドが共存するとCキナーゼは可逆的に活性化されるので3），活性型のCキナーゼがCa2十 プロテアーゼⅠによって選択的に限定分解されることを示している。事実，燐脂質に作用してCキナーゼ活性を抑制する作用のあるクロルプロマジン10）を反応系に加えた場合，Cキナーゼ活性が抑制されるのと平行して
限定分解反応も抑制される（図3）。
一方本稿ではその詳細については省略する
が，in vivoにおけるCキナーーtf系の意義については主に血小板を用いて検討した11・12）。その結果，イノシトール燐脂質の代謝回転によるジ
図5 Cキナーゼ活性化に及ぼすE−64の効果
60

グリ・セリドの生成が引き金となってCキナーゼ

7．カルシウムプロテアーゼとイノシトール燐脂質の代謝回転系が作動することがほは確実となった。

検討にあたってほCキナーゼの限定分解反応が以上のCキナーゼの活性化枚構に関する解析

形質膜あるいは燐脂質，ジグリセリドを含む複結果をまとめると，図4に示すようにCa2＋ プ

雑な反応の場で進行していることを考慮する必ロテアーゼⅠがこの種の情報伝達系に関与して要があると思われる。

いる可能性がある。すなわち，生理活性物質の刺激によってホスホリパーゼCが作用してジグ

文

リセリドが生成するが，ジグリセリドによって、Cキナーゼが形質膜に結合し，まず可逆的に活性化される。一方この種の生理活性物質の作用に際しては細胞内のCa2＋濃度が上昇する

献1）Takai．Y．，Kaibuchi，K．，Matsubara，T．，Sano，K．，Yu，B．＆Nishizuka．Y．：Recent advances
in calcium and cell function，Plenum Press，
1981．

が13・14），Ca2＋濃度上昇に伴ってCa2＋プロテア

2）Inoue，M．，Kishimoto，A．，Takai，Y．＆Nishi・Zuka，Y．：J．Biol．Chem．，252．7610，1977．

ーゼⅠが活性を発揮する。その結果，活性型C3）Kishimoto．A．，Kajikawa，N．，Tabuchi，H．，

キナーゼが限定分解をうけ，キナーゼ活性を保Shiota，M．＆ Nisbizuka，Y．：J．Biocbem．，90，

持した活性フラグメソトが形質膜から遊離して種々の生物学的機能を果す可能性である。この活性フラグノントがどのような基質の燐酸化を触媒するか，あるいはCキナーゼとの間の基質や触媒按能の相違については興味深い問題であり，現在解析を進めている。
3）E−64による阻害作用
今回高度に精製したCa2＋プロテアーゼⅠがE−64によって阻害されることはすでに表2に889，1981．

4）西塚春美：微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究，昭和55年度研究報
告書，p．49，1981．
5）Kishimoto，A．，Takai，Y．，Mori，T．，Kikkawa，
U．＆Nishizuka，Y．：J．Biol．Chem．，255，2273，
1980．

6）Mellgren，R．L．：FEBS Lett．，109，129，1980．
7）Dayton，W．R．，Shollmeyer，J．V．，Lepley，R．
A．＆Cortes，L．R．C．：Biochim．Biophys．Acta，
659，48，1981．．

示したが，その阻害効果を図5に示した。通常

8）SuzukiK．，Tsuji，S．，Ishiura，S．，Kimura，Y．，のCキナーゼを基質に用いた場合にはE−64はKubota，S．＆Imahori，K．：J．Biochem．90，

強力な抑制効果を示し，そのKi値はほぼ
1／喀／mlとこれまでの報告とよく一致している。しかし，リン脂質に結合した活性型Cキナーゼの限定分解反応もE−64によって阻害されるが，その効果は弱まりKi値が10／Jg／mlとなる。さらに，実際の形質膜に結合したCキナーゼの限定分解反応に対するE−64の効果が著

1787，1981．

9）Suzuki．K．，Tsuji，S．，Kubota，S．，Kimura，Y．
＆Imabori，K．：J．Biocllem．，90，275，1981．
10）Mori．T．，Takai，Y．，Minakucbi．R．，Yu，B．
＆ Nishizuka，Y．：J．Biol．Chem．．255，8378．
1980．
11）Kawahara，Y．，Takai．Y．，Minakuchi，RりSano，K．＆ Nishizuka，Y．：J．Biochem．，88，
913，1980．

しく低下することは前回報告したとおりであ12）Kawabara，Y．，Takai，Y．，Minakucbi，R．．

る。一方，Ca2＋プロテアーゼⅠの粗抽出液

Sano，K．＆Nisbizuka，Y∴Bi∝hem．Biopbys．

（100，000×g上清画分）を用いた際にはCキナーゼの限定分解反応はE−64によって阻害され13）Berrige，M．J．：Adv．Cyclic Nucleotide Re5．，ない。これらの結果がどのような理由に基づく
かは現時点ではあきらかではないが，今後Ca2十Res．Communリ97，309，1980．

6．1，1975．

14）Rasmmussen，H．＆Goodman，D．B．P．：Phy・Siol．Rev．，57，421，1977．

プロテアーゼの意義の解明とE−64の有効性の61

8．カルシウムプロテアーゼ類の性質とこれに対するE−64および類縁体の阻害効果

今

掘

和

友＊

研究協力者 鈴 木 紘 一＊＊ 辻
木

村

吉

雄＊＊

中

崇 −＊＊ 久保田 俊一郎＊＊村愛＊

その様な見地から，本年度においてはまずm

は じ め にジストロフィーにおける筋タンパク質の崩壊から〃への変換をさらに精しく研究した。この研究の過程において，m−CANPのままでも因の原因の1つとして，われわれはカルシウムで子の添加によってCa2＋感受性が著しく増大す

活性化される中性プロテアーゼ（以下CANPることが明らかになった。併せて従来明確にでと略す）を考え，これに対する阻害剤としてきなかったE−64およびその額縁体のCANP

E−64およびその類縁体の研究を行ってきた。

に対する作用模作についての研究結果についてものべる。

本研究出発当時においてはCANP

としては

mM程度のCa2＋で活性化されるいわゆる
m−CANPのみに注目していた。このmM

方

と

法

いう濃度は生理学的濃度に比して著しく高く，今回使用したCANPはトリの胸筋より石滴したがってCANPは細胞が病的状態になりそらの方法3）で精製したものを用いた。すでにわの中のCa2＋濃度が異常に上昇したときにのみ作用すると考えられた。しかしCANPが殆どれわれはヒト，ウサギなどの骨格筋からCANP

あらゆる組織に存在することは，CANPが何てトリのものと同一であることが分っているか

等かの生理的役割をも果すことを示唆していらである。なお以下にのべる研究の大半はウサた。折しもMellgrenl）が50FLMという生理学的に近い濃度のCa2＋で活性化されるCANP

が同様な結果を得ている。E−64ならびにE−（rCANP）の存在を発表し，さらに昨年度の64−Cは大正製薬より供与されたものを用いた。

を精製しているが，これらは種々の性質においギのCANPについても行い，予備的ではある

本報告書において，われわれは，FL−CANPはm−CANPの自己消化により生成することを示し結た2）。その結果，生理学的条件下で作用するの（1）m−CANP自己消化の時間経過4）

はFL，CANPであるが，mrCANPからFL−CA
NPへの変換は制御されていると考えられる。
これに対し，この制御が効かなくなり，〝−CA
NPが必要以上に生成することが病的状態といえるのかもしれない。
＊ 東京都老人総合研究所＊＊東京大学医学部第二生化学教室

果

m−CANPの自己消化は，20mM Tris−HCl
pH7．5，5mM

2−メルカプトェクノール，

0．5mM CaC12を含む緩衝液中で00Cで行った。一定時間毎に試料の一部をとり出し，活性を測定するとともに，SDS電気泳動で分子の大きさを測定した。活性は100／JMのCa2十存在下で〃−CANPの総活性を，6mM Ca2＋存在下で，m−CANPとFL−CANPの活性の和を63

Ⅱ 酸素レベルでの効果︵訳︶トトHA−トUく HA−トくJ日出

Kへの変換とがバランスしているためと考えればよい。したがって〝1＋〃2の総量は減少するのである。すなわち自己消化はm→〝l→〃2→
30Kの順序で進行することになる。
このことは次の事実によっても証明される。
例えば自己消化開始後2分で反応をE−64で止めると76Kの〝1の／くソドのみがみられるが，10分で止めると〃1と仲のバソドが主としてみ
0

0
0
1

験的事実から明らかである。（1）自己消化反応︵
訳︶ ↑N⊃〇三く 凹Al↑くJHだ

られることからも分る。またmから〃への変換がm−CANPの自己消化によることも次の実のCa2＋依存性は，カゼインを基質としたときのものと一致し，（2）自己消化の反応はEDT
A，ヨード酢酸，ロイペプチソ，E−64の添加で停止する。（3）自己消化反応のpH依存性はカゼインを基質として用いた際のm−CANP活
性のpH依存性と一致する。（4）m−CANPに
トリプシン，キモトリプシン，パパイン，ズプ
30

60

90

REACTION TIME（min）

図1 自己消化に伴う〟−CANPの生成を活性（A）およびSDSゲル（B）で追跡した
A：6mM（●），100J M（○）Ca2＋存在下での活性B：m−CANP（●），FLl−CANP（■），FL2−CANP（▲）の消長

チリシン等を作用させた際，CANPの失活は起るが，〃−CANP活性は現れない0
なお，抗m−CANP抗体はfLl，FLZと交叉反応を示し，オクタロニーテストにおいてスパーを生じない。すなわち〃1，仲はm−CANPのフラグメソトではあるが，抗原決定群はm−CA
NP と共通している。

求めた。

CANPの生理的機能はまだ明らかにされて結果を図1に示してある。rCANP活性ははいないが，プロテインキナーゼの活性化やス反応開始後2分でピークに達し，その後次第にテロイドホルモンのレセプターのプロセッシン

減少してゆく。一方SDSゲル電気泳動では，

グなどが示唆されているし，また細胞内タンパ

2分では80Kのm−CANPはすでに殆ど消失

ク質の代謝回転にも関与しているとも想像されしており，その代わりに76Kのバンドが主成る。この様な枚能の発現は生理的条件下で行わ分として現れる。これを〃1−CANPとよぶ。

れるから，この役割を担うのは〃−CANPであ〝rCANPは急激に消失し，代わって60Kのると思われる。したがって細胞の必要性に応じバンドが現れてくる。これを〃rCANPとよぶ。上の活性の時間経過と対比させてみると明てのみ，mから〃への変換が行われるよう制御されていることが要求される。この種の制御

らかなように，FLl−CANPもFL2−CANPも共に

較構については後で論ずることとする。

〃−CANP活性をもっている必要がある。

なお，〃lと仲とは分離精製を行っていない
ため，それぞれのCa2＋感受性の差や基質特異

なお図には示してないが，時間と共に，四の他に30Kのノミソドが現れる。これは活性はな性の差などが分らない。したがって〝1，〃2のい。図1において〃2の量はほぼ一定であるの

生理的役割のちがいも今後に残された問題であに，時間と共に〃−CANP活性が少しずつ減少る。

するのは，〝1から〃2への変換と，〝2から30
64

8．カルシウムプロテアーゼ炉の性質とこれに対するE−64および類縁体の阻害効果（2）エフェクターによるm−CANPの活性化5）つあり，その間に強い協同性が存在することを示している。これをもう少し具体的に説明すると次のようになる。Ca2＋非存在下ではm−CA
NPの活性部位は閉じた形になっており，したがって不活性である。また活性部位の中には第二のCa2＋結合部位があると考えられる。第一の部位にCa2＋が結合するとm−CANPのコソ
ホーメーショソ変化が起り6），活性部位は開くと考える。すると第二の結合部位にCa2十が結

●
／
／

．
・
・■
了
0
5

になり，明らかにS字型である。このことは
m−CANPにはCa2＋結合部位が少なくとも2001

性を精しくしらべてみると図2の曲線Aのよう︵訳︶トヒA−↑UくHAl↑くJ凹出

m−CANPの活性化にはmM程度のCa2＋を必要とするが，m−CANP活性のCa2＋依存

／
∫

■
■
1巨エゴ■
・
−」ト
一
・
〇

／
／

J一
／′
J
′
′
′′
＿
＿」
ゝ＿
＿
＿
Jr 一
0

0．
1 0．
2 0．
3 0．
4 0．
5 0．
6

．
ト・
−⊥一
・
・
・
1
2

6

CONCENTRATION OF Ca2＋（mM）

図2

種々の条件下でのCANP活性のCa打依存性A（…○…）m−CANPのみ
B（…●…）〝−CANPのみ
C（一〇一）m−CANP＋2mM Mn打D（−●−）〝−CANP＋lmM Mnt＋

合することにより，活性が発現されるのであろう。しかも第一，第二の結合部位におけるCa2十の解離定数KlとK2 との間に，Kl≫K2の現在までにしらべた限りでは，Mn2十 と同じくェフェクターとして作用するものにBa2十が関係が成立しているとしよう。そうなると第一あるが，いずれもmMという非生理学的高濃の結合部位に結合するためには高濃度のCa2十度を必要とする。しかしながら今後の研究によが必要であるが，一端結合したとなると活性部って，生理学的濃度で作用するェフェククーが発見される可能性はある。

位が開き，直ちに第二の部位にCa2十が結合する。これが協同性である。
一方，〃−CANPにおいては，活性部位を被なお，図2の曲線Dは，〝−CANPにlmMのMn2＋を加えた場合である。わずかではあっていたふたが加水分解で取り除かれている。

るがやはりMn2＋により，Ca2◆感受性が高ま

そのため第二の結合部位は初めから露出している。曲線BがややS字性をもつことも考えるることになるから，低濃度のCa2十で活性化さと，〝−CANPにおいてもCa2＋結合部位間の協同性は少し残っていると考えられる。

れるのであろう。
もしもこのモデルが正しければ，第一の結合

もう1つ重要なことは，m−CANPを2mM部位に働く Ca2＋は一種のアロステリックエフ

Mn2＋存在下，50／jMのCa2十とインキュべ−ェクターと見なせる。そこで，もしCa2＋以外

トすると，rCANPに変換することである。

のエフェクターがこの役割を果たすことができ

一方Mn2＋なしで，例えば100JJMの Ca2十存在下，FL−CANPをm−CANPに作用させてれば，そのエフェクター存在下ではm−CANP
もCa2＋に高感受性となるはずである。
図2の曲線Cは2mM Mn2＋存在下でのも，前者は後者を〝に変換することはできない。このことはm−CANPの活性部位が開い

m−CANP活性のCa2＋依存性である。明らかて，いわゆる活性型にならない限り，自己消化に〃−CANP（曲線B）に勝るとも劣らない高用の基質になり得ないことを示している。他

感受性である。一方Mn2十それ自体ではCAN

方，Mn2＋のようなェフェククーが存在しさえPを活性化する作用は全くない。すなわち，

すれば，生理的条件下でもmから〝への変換は起りうるのである。すなわち一時的なCat十

Mnt十は第一の結合部位に対するCa2◆の代役は果たせるが，第二の結合部位に対するCa2十の細胞内流入がなくてもrCANPの生成は可の作用は代行できないのである。

能である。細胞内の〃−CANPがいずれの道筋65

1

酸素レベルでの効果を経て生成されるのかは今後の問題である。

ーポー止一十一軒−一握次に，エフェクターで活性化されたm−CA
NPのCa2＋感受性は，〃−CANPと同じ程度であるのであるから，生理学的条件下で作用す
るのがいずれであるのかも不明である。串だ，ェフェクタ一による活性化は可逆的であるのに対し，〃一CANPへの変換は不可逆的であることを考えれば，細胞は時と場合に応じ2つを使い分けていることは予想できることである。
またエフェクターによる活性化やrCANPの生成はいずれも細胞の必要に応じて行われる
様制御されているはずである。しかしこの制御が乱れて，いずれの機構にせよ無差別な活性化が起れば，当然筋ジストロフィーの様な症状を来すと考えられる。
（3）E−64およびその類縁体のCANP活性阻書機構7）
ロイべプチソ，アンチパインおよびE−64な

0

10

20

30

40

50

INHIBITOR／CANP（mole／mole）

図3 種々の外来性インヒビターの阻害様式
E−64−C（O，●），ロイペプチソ（ロ，■），
アンチパイン（△，▲）（●，｝，▲）：＋lmMCa打（0，口，△）：−Ca2十らびにその煩縁体はCANP以外にも多くのチではカルシウムの存在如何にかかわらず失活は

オールプロテアーゼを阻害することが知られて認められなかった。なお図には示してないが，
E−64についてもE−64−Cと同様の結果が得らいる。これらの多くの場合において，前2着は末端のアルデヒド基が，後者ではェポキシ基が酵素の活性部位のSH基と反応することによりこれを不可逆的に失活させるのである。tでたがって，阻害様式は非競合的であり，阻害剤添加量に比例して活性が減少する。

れた。すなわちE−64やE−64−CがCANPを
不可逆的に阻害するのに対し，ロイべプチソ，
アンチパインは可逆的に阻害することになる0
これらの事実にもとづき，E−64やその頼縁体の阻害機構につき，次のように考えることが

一方CANPに対しては，これら阻害剤はすできる。まず，不可逆的阻害にCa2十を必要とべて非競合的に阻害するが，阻害剤添加量と活することは，これら薬剤がCANPの活性部位，性減少度とは比例やず，他のチオールプロテアーゼとは阻害機構を異にするのではないかと考恐らくはチオール基と反応することを示唆してえられていた。

にのべた従来の結果とくいちがう様にも見える

この点を明らかにすべく，本年度は図3に示すような実験を行った。すなわちロイペプチソ，
アンチパイン，E−64−Cのいずれかとm−CANPいる。他方，ここに得られた不可逆的失活は前が，これは次の様に説明できる。E−64およびその類縁体は酵素に結合した後，チオール基ととを図の横軸に示したモル比で混合し，1mM反応する速度がきわめて低いのであろう0そのため，酵素反応測定用の混合液に加えると，可Ca2十の存在下または非存在下で300C，60分

逆的な阻害剤として作用するが，図3のように反応させる。未反応の阻害剤を透析で除いた

予め阻害剤と酵素とを長時間反応させておけば不可逆的阻害がみられるのである。

後，m−CANPの残存活性を測定した。
図から明らかなように，過剰のE−64−Cを考

察

Ca2＋存在下で酵素とインキューべ−トし声ときのみに不可逆的失活が起るが，E−64−CでCa2＋

E−64およびその額縁体は筋ジストロフィー

非存在の場合や，ロイペプチソ，アンチパイン症の進行を停止する目的で開発されてきた○そ66

8・カルシウムプロテアーゼ煩の性質とこれに対するE−64および類縁体の阻害効果の際仮定されたことは，筋ジストロフィー症がらないのである。したがってこれら阻害剤の代

細胞内プロテアーゼの無差別な作用に由来するということであり，したがってE−64およびそ謝速度が速く，細胞内の滞留時間が短かければ，細胞内CANPに対する阻害効果は上らなの類縁体の効果判定の基準の1つは，これら薬剤がどれ程強く，またどの様な機構でプロテアいという結果になってしまう。すなわち投与法などとの関連で，細胞内滞留時間をどの様にしーゼを阻害するのかということになる。

て延ばすかが今後の大きな問題である。

プロテアーゼの侯補としてわれわれは従来よ

もう1つの問題は，筋ジストロフィーを引きりCANi）を想定し，これについての研究を行起すのがCANPであると考えた場合，その無ってきた。しかしながら，従来研究の対象とし制御な活性化が上記3つの可能性のうちのどれてきたm−CANP以外にFL−CANPが存在すであるかである。E−64やE−64−Cの阻害作用は従来mMのCa2＋存在下におけるm−CANP

ることがMellgrenによって明らかにされ，さらにわれわれは昨年度の本報告書で，rCANP
はm−CANPの自己消化により形成される可能性を指摘した。

のみについて研究されてきた。しかしながら，
rCANPやェフェクダーで活性化されたm−

本年度はさらにこれにつき詳細に研究した結らに対する阻害剤の効果も詳細に研究する必要があるであろう。

R，FL−CANPには少なくとも，FLl，fL2の2種

CANPも候補の1つと考えられる以上，これ類が存在し，自己消化によりm→〝1→〃2の順序
文で形成されることを明らかにした。一万m−CA
NPは自己消化によらなくても，Mn2十のよう献なェフェククーの添加により，〃M程度のCa2十1）Mellgren，R・L・：Cainecardiaccalciumdepen−
dentproteases，FEBS Lett．，109，129，1980．

で活性化されるようになることを発見した。

2）今掘和友これらの事実は，たとえ筋ジストロフィー症の原因をCANPに求めるとしても，次の3通

他：微生物の二次代謝産物に由来す

る難病治療薬（E−64）の開発研究，昭和55年度研究報告書，p．43，1981．
3）Ⅰ血iura，S．，Murofushi，H．，Suzuki，K．andりの説明が可能となる。（1）細胞内のCa2＋のImahori，K．：Studies of a calcium−aCtivated

流入が無制御となり，細胞内がmM程度の

neutral protease from chicken skeletal mus−Ca2＋濃度となる結果，m−CANPが活性化さ

CleI，J．Biocbem．，84，225，1978．

れる。（2）ェフェククーによるm−CANPの4）Suzuki，K．．Tsuji，S．．Ishiura，S．，Kimura，活性化が無制御に行われる。（3）m−CANPかY・，Kubota，S．andImahori，Ⅹ．：Autolysis ofら〝−CANPへの変換が無制御に起る。これらのうち，どれが妥当なのかは今後の研究により明らかにしてゆく必要があろう。
一方E−64およびE−64−CはCa2＋存在下
でm−CANPを不可逆的に失活させることを，
本年度の研究で初めて明らかにすることができた0 このことはこれら阻害剤が過剰に活性化さCalcium・aCtivated neutralproteaseofchicken
Skeletalmuscle，J∴Biochem．，90，1787，1981．
5）Suzuki，KリandTsuji，S．：Synergistic

acti・

Vation of caIcium・aCtivated neutral proteaseby

Mn2＋and

CaZ＋，FEBS

Lett．，140，16．1982．

6）Tsu5i，S・，Ishiura，SりTakahashi−Nakamura，

M・，Katamoto，T．，Suzuki，K．andImahori，
K．：Studies on a calcium・aCtivated neutral
protease of rabbit skeletal muscleII．Chara・

れたCANPのみを失活させるであろうという

Cterization of sulfhydryl groups and a role

点では医薬として有望なものといえるであろ

OfCa2＋ionsin

う0 しかしながら，酵素活性測定用の反応液に阻害剤を加えたのでは不可逆的失活がみられないという点に問題がある。すなわちE−64やE−64−CのCANPに対する反応速度が低いため，活性測定中には不可逆的失活はほとんど起

thisenzyme，J．Biochemり90，

1405，1981．

7）Suzuki．X．，Tsuji，S．andIshiura，S．：Effect
OfCa2＋on

theinhibitionofcalcium・aCtivatedneutralprotease byleupeptin，antipain andexpoxysuccinate derivatives．FEBS Lett．，136，
119，1981．

679．E−64−Cの心筋蛋白質分解に及ぼす影響

研究協力者

友
小

は

じ

め

江

橋

節

松

健

一＊

浜

一

に

郎＊
石

浦

弘＊

表1チロシソ遊掛こ及ぼすE−64−Cの効果
Exp・No・Tyrosine release（nmoles／mg）

C

4
6

1 2 3．4 1 2︑3 4

▲・L

O
r

筋蛋白質の分解に及ぼす影響を推定した。tyrO・Sineは心筋では合成も分解もされず，細胞内のtyrOSine poolはmediumと速やかに平衡する。したがって，CyCloheximideを用いて
tyrosineの再利用を阻止した場合，遊離するE

正常なWistar系雄性成熟ラットの摘出心
耳を対象として，Fulksらの方法2）に従って，遊離するtyrosine量を測定してE−64−Cの心nO方法および結果

C

昨年度我々はE−64−Cが骨格筋蛋白質の分解を抑制することを発表した1）。E−64−Cがin
Vitroで阻害するthiolproteaseは心筋にも存在することが証明されているため，今回我々はE−64−Cの心筋蛋白質の分解に及ぼす影響を
検討した。

章

lIlr

2hr

0．319

0．272

0．284

0．239

0．266

0．222

0．334

0．295

0．230

0．258

0．305

0．233

0．135

0．159

0．217

0．238

Control O．300土0．027

0．257±0．028

E−64−C O．221±0，063

0．222士0．031

m±S．D．
Xrebs−Ringer液と平衡させたのち，毎時遊離
するtyrosine量をUdenfriendらの方法3）に従って測定した。その結果，心耳湿重量当り毎時遊離するtyrosine量（nmoles／mg／hr）はtyrosine量は心筋蛋白質の分解量を反映する2）。
E−64−Cの濃度は骨格筋その他の実験で至適とされた範囲内の20′唱／mlとした。
1）まず，心耳蛋白質全体の分解量を推定す

E−64−C群で一見少ない印象を受けた。しかし，
統計学的処理の結果，有意差は認められなかった（表1）。

る実験を行った。心耳を0．5mM cyclohexi−
mideを含むKrebs−Ringer液中で，95％02−5％CO2混合ガスを通気しながら380Cに保合成の速い蛋白質の分解を推定する実験を行っ

温，振過した。1時間のpre−incubationを行って血液を洗浄し，細胞内のtyrOSinepoolを＊東京大学医学部第一薬理学教室＊＊国立武蔵療養所神経センター疾病研究第一部

2）ついで，0′Haraらの方法4）に従って，た。心耳を，1FLCi／mlの1．C−tyrOSineを含
み．Cycloheximideは含まないKrebs−Ringer

液中で4時間振塗し，11C−tyrOSineを取り込ませた。次に，0．5mMcycloheximideを含んだErebs・Ringer液中に移し，1時間のpre−incubationを行って細胞外の過剰なHC−tyrO−
Sineを洗浄した。その後毎時遊離する11C−ty−69

Ⅰ 酵素レベルでの効果
表2 日C一チロシソ遊離に及ぼすE−64−C（20／唱／ml）の効果
Exp．No．

1−C−tyrOSine release（Cpm／mg）
lbr

表4 日C−チロシソ遊離に及ぼすE−64−C（20J唱／ml）の効果
Exp．No．

1．C−tyrOSine release（Cpm／mg）

2br

4
7
3

3

0
0
3

4

4
7
2

389

2br

377

144

427

200

531

241

533

266

一

1
5
3

2

282

3

2
6
3

1

2

2
4
5

4

1

7
4
5

3

O
r
t
n
O

1
5
5

2

C

1

O
r

・●L

n
O
C

317

lbr

4

151

2

150

1

C

4
6

E

C

E

4
6

188

3

61

225

580

366

555

261

505

259

．

386

4

60

Contro1

520±115312土109

Contro1

467土67212土46E−64−C394土68222土38E−64−C506土75278土53m±S．D．

m土S．D．
表3 日C−テロシソ遊離に及ぼすE−64−C（20JJg／ml）の効果
Exp．No．

HC−tyrOSine release（Cpm／mg）
lhr

表51−C−チPシソ遊離に及ぼすE−64−C（20／唱／ml）の効果

Exp．No．

HC−tyrOSine release（％）
1br

2hr

3

3
3
6

4

．

1
5

4

1

一

9
2

2

2

4

C

4
6

0
4

L

4

1

3
4

3

3

3

4

5

0
6

4
4

O
C

一

E

4
6

r

〇

t
n

C

443±76

一351土122

Contro1

250土43E−64−C

5．09土0．88

0 2 0 1 43
50
27
0
64
5
52
432322222

7

3

2 1 36106
70 5 841お265354344

1

r

0

t
n

6
7

C︒

4

2

6 7− 9 2 6 2 2 1
7− 3 7 1 4 8 9 8
2 5 3 2 2 1 2 2

■

4
8

1

O
r
t
n
O
C

586土1292hr

3．17土0．56

4．12土0．21 2．40土0．19

m土S．D．

m土S．D．

rosineのisotope量を測定した。その結果，
心耳湿重量当り遊離するisotope量（CPm／mg／hr）は，第1回実験ではE−64−C群で有意な低値を示した（表2）。しかし，第2回およびの方法4）に従い，その後心耳を10％TCA中で
homogenateとし，遠心分離後得られるTCA
insolubleな蛋白質中のHC−tyrOSineのisotope
量を測定した。その結果，前者の後者に対する第3回実験では明らかな差は認められなかった（表3および4）。
3）さらに，14C−tyrOSineの取り込み効率

割合（％）はE−64−C群で一見小さい印象を受けた。しかし，統計学的処理の結果，有意差は見出せなかった（表5）。

が個体により異なる可能性を考慮して，取り込
まれた量に対する遊離する量の割合を検討する実験を行った。心耳を2分割し，一方はさきの0′Haraらの方法4）に従って，毎時遊離する
14C−tyrOSineのisotope量を測定した。他方はpre−incubation終了までさきの0′Haraら
70

考

察

今回我々の行った実験は正常ラットを対象として，E−64−Cの濃度を20FLg／mlに限定したものである。この条件下ではE−64−C群と対照群との間には有意差を見出せなかった。あるシ

9．E−64−Cの心筋蛋白質分解に及ぼす影響

リーズの実験で有意の結果だ得られたが，その後実験条件をより厳密にして再検討したところ，有意性を確認することはできなかった。最初の実験の有意性は全く偶然の統計的産物とも考えられなくはないが，他方，我々が研究方法を吟味してゆく過程で，重要な条件を無意識に落してしまっている可能性もある。今回のような例は，病的状態の動物を扱う場合にしばしば経験されることであり，そのまま見過してしまってよい事かどうか根本的な反省を要する問題である。このような観点をも含めて研究計画の再検討を行いたい。今後は，さらに条件を吟味しながら，例数を重ねて検討する必要がある。

文献1）江橋節郎，小浜一弘，自尾智明，三谷昌平：N−〔N−（LtranS−3ヾarboxirane−2−てarbonyl）−L−Leu−Cyl〕73−methyl−butylamine（E−64−C）の筋蛋白質
代謝に及ぼす影響，E−64班会議昭和55年度報告書，
89−92，1981．

2）FulkS，R．M．，Li，J．B．and Goldberg，A．L．：
Effect ofinsulin．glucose and amino acids onprotein turnoverin rat diaphragm，J．Biol．
Cbem．，250，290−298，1975．
3）Udenfriend，S．andCooper，J．R．：Thechemi−
Calestimation of tyrosine and tyramine，J．
Biol．Chem．，196，227−233，1952．
4）0′Hara．D．S．，Curfman，G．D．，Trumbull，C．

G．andSmith，T．W．：Aprocedure for measur−ing the contributions ofintracellular andextracellular tyrosine pooIs to the rate ofmyocardial protein synthesis，J．Mol．CelL
Cardio1，13，925−940，1981．

71

10．筋ジストロフィーハムスターにおけるチオール性

カテプシンの活性に対するE−64投与の効果

勝 沼 信 彦＊研究協力者 木 南 英 紀＊ 磯 見 和 秀＊

はじめに
昨年E−64の生体内動態を3H−E−64を用いて追跡した結果，肝，腎においては，E−64は血中から速やかに細胞質を遊離の形で通過して，リソゾームの中へ主としてpermeationで運ばれることを明らかにした1）。しかし，E−64の週目に動物を殺した。対照動物としては同週令のFIBを用いた。動物はいずれも大正製薬より供して頂いた。大腿筋，心筋，肝を分離し，4倍量の0．25M庶糖でホモゲナイズした後，10，000×g，20分間遠心し，その上清を用いてチオールプロテアーゼインヒビター，アルドラーゼ，乳酸脱水素酵素を測定した。沈澱画分

骨格筋への移行率は肝，腎に比べ低かった。一は，0．2％トリトンⅩ−100を含む0．05Mリン

方，筋ジストロフィーチキンでは，チオール性酸バッファーpH6に懸濁し，もう一度軽くホ

カテプシソであるカテプシソBおよびHの活性

モゲナイズした後，10，000×g，10分間遠心し，が筋で上昇していること，E−64の長期投与にその上清を用い，各種カテプシソ活性，酸フォ

より筋のカテプシソ活性を正常動物レベルまで

スファクーゼ，β−ガラクトシダーゼ活性を測定は抑制できるが，身体機能の回復はみられないした。各種のアミノ酸ナフチルアミド基質はことを報告してきた2）。

Barrettの方法3）で，酸フォスファターゼは

本年は筋ジストロフィーハムスターの大腿Igarasbiらの方法4）で，β−ガラクトシダーゼは筋，心筋と肝臓におけるチオール性カテプシソ
活性およびその内在性インヒビターの活性レベ

Ⅹ01dovskyらの方法5），チオールプロテアーゼ
インヒビターは木南らの方法で6），乳酸脱水素

ルの変動とそれらに対するE−64の投与効果に酵素およびアルドラーゼはNADHの減少速度ついて検討した。

から測定した。

実験材料および方法

結果および考察筋ジストロフィーハムスター（BIO14．6）はジストロフィーハムスター大腿筋におけるリソソ
ームチオールプロテアーゼとそのインヒビター活性6遇令および8週令を用いた。動物は2群に分け，一方には6週令ではE−64−aを40mg／
kg，1週間腹腔内授与し，8遇令では，7週間
各種E−64類縁体を70mg／kg連日投与し，それぞれ7週目および15週日に動物を殺した。他の群はE−64無投与で，同じく7週目および15＊徳島大学医学部酵素研究施設酵素化学部門

15遇令ジストロフィーハムスター（BIO14．6）と対照動物（FIB）の大腿筋の各種酵素活性が

図1に示されている。リソゾームのチオールカ
テプシソ（カテプシソB，H，L）を特異的に測定できる基質はないので，各種のアミノ酸−2−
ナフチルアミド（−NA）を用いた測定結果が示されている。Z−アルギニルーアルギニソー2−NA73

Ⅰ 酵素レベルでの効果

Valuesareexpressedasmeans±standarddeviationoflOhamsters⊂＝コN。rmaI臣≡ヨDystrophic

図1正常およびジストロフィーハムスター大腿筋における諸酵素の活性は主としてカテプシソBを，Bz一アルギニソー2−
NAはカテプシソBおよびH両者を，Suc−チロ

時間目に動物を殺し，大腿筋中の各種プロテア

シルーメチオニンー2−NAはカテプシソLおよびした値が図2に示されている。E−64に感受性ーゼ活性を測定した。E−64無投与群との比較

カテプシソBを測定している。グリシルーアルの高いカテプシソBの有意の活性阻害が認めら

ギニソー2−NAはカテプシソCに特異的な基質

れるが，Ep−453を除き，対照動物のレベルまである。15週令では，対照動物に比し，リソゾでは阻害されてなかった。ここには示されていームのチオールプロテアーゼ活性は著明に上昇

ないが，チオール非依存性のその他の酵素活性している。それほどの基質を用いても観察されには全く影響がなかった。Ep−453は長期投与る。しかし，他のリソゾーム酵素，酸フォスフ

により，弱い毒性効果がみられるが，カテプシ

ァクーゼの活性上昇がみられない。もう一つ，

ソに対する阻害効果が大きく，有効な薬剤とし着目すべきことはチオールプロテアーゼインヒて期待できる。

ビターの活性上昇であり，ジストロフィー動物
で約2倍の上昇が認められる。細胞質の他の酵

7遇令の筋ジストロフィーハムスターの鼠 心筋，
肝におけるプロテアーゼ活性とE−64の投与効果

素，アルドラーゼやLDHの活性はむしろジス

15週令のジストロフィーハムスターでは，カトロフィー症で減少傾向がみられ，細胞質のタ

テプシソB，H，Lの4〜5倍の上昇がみられる

ンパク量も減少していないことから，このインが，もっと若い時期ではどうか，また骨格筋以

ヒビターレベルの上昇はかなり特異的であるこ外の臓器，心筋や肝でも同じようにプロテアーとを示唆する。

ゼ活性に変動があるかどうかを調べた。表1に示すように，骨格筋および心筋ではカテプシソ

チオールプロテ7−ゼの活性上昇に対するE−64の投与効果

活性の上昇が認められるが，15遇令に比べ上昇

生後8週目から7週間連日E−64類縁体を70mg／kg，1日1回腹腔内投与し，最終投与後24率は低い。リソゾームの他のマーカー酵素酸フ74ォスファクーゼ，β−ガラクトシダーゼの活性は

10．見方ジストロフィーハムスターにおけるチオール性カテプシソの活性に対するE−64投与の効果

Z−Arg−Arg−2NA（mt〟gmuscle）
0

10

20

30

40

50

NormalDystrophy
Dys＋E−64＋E−64−a
十E−64−e＋Ep453＋Ep487

Z−Arg−2NA（mU夜muscle）
0

10

20

30

40

50

NormalDystrophy
Dys＋E−64
十E−64−a＋E−64−e＋Ep453
十Ep487

図2

ジストロフィーハムスター大腿筋のリソゾームプロテアーゼ活性に対するE−64およびその類縁体の投与効果75

Ⅰ 酵素レベルでの効果
表17遇令ジストロフィーハムスター諸臓器のリソゾームプロテアーゼ活性に対する
E−64−aの投与効果
FIB Dystrophic I）ystrophic＋E−64−amU／g tissue
MllSCleCatbepsin H（B）

14．7士2．6

30．6土6．6

17．9士1．6

Cathepsin：B

26．6土6．1

64．8土7．4

39．2土4．8

Cathepsin L（B）

45．1±17．4

94．6土13．5

74．4土11．5

Cathepsin C
Acid−P−aSe

989土153909土125943±121174土13183土15

187士20TPI

190土5

379±67359土28

Catbepsin H（B）

77．1土1．7

164土36136土14Cathepsin B

150土6

231士26

205土11Cathepsin L（B）

254土16436士82

260土34Cathepsin C

976土912320土580

1950土150

Acid−P−aSe

396土36415土42398土17TPI

209±17216土20198土33

Heart

Liver
Catbepsin H（B）

283土27525士38298土35Cathepsin B

550土501070±100517士63Cathepsin L（B）

856土521660±150

646土156

14200土1700

13700土900

11100土2400

1180土70

1430土180

1330土190

369土39493土36429±31CathepSin C
Acid−P−aSe
TPI

TPI：ThioI proteinaseinhibitor

15週令同様，活性増加はみられない。チオール性

る。以前の報告2・7）通り，肝臓ではジストロフ

めジアミノべプチダーゼ活性を示すカテプシソ

ィー症におけるプロテアーゼの活性増加は正常

Cは骨格筋では活性の増加は認められないが，レベルまで抑制されているのに対し，骨格筋，心筋では抑制は認められるが，部分的である。

心筋では約2倍活性が上昇している。チオール
プロテアーゼインヒビターは，骨格筋は15遇令
同様2倍活性が上昇しているが，心筋では有意

ストロフィーハムスターでは，ジストロフィーの増加はない。ジストロフィーハムスターにおチキンのフリップテストのような身体機能を簡けるこの内因性インヒビターレベルの増加がカ

単に測定できる方法はない。動物を傾斜板にのテプシソ活性の上昇に対する負の調節因子としせ，何度までもちこたえられるかを指標にしとくに心筋ではE−64の阻害効果は弱い。筋ジて働いているのか，今のところ全く証拠はなて，身体扱能を知ろうとする試みを大正製薬のい。ジストロフィー症の標的臓器ではない肝臓

花田らは行っており，前記の7週間E−64を投でもプロテアーゼ活性が上昇していることは注与した動物と無投与動物について，この方法で目に値する。15遇令でも同様の活性増加が認め比較したところ全く差はみられなかったといられるが，骨格筋のような著明な増加はない。

う。この結果は，昨年のジストロフィーチキン

6週令のジストロフィーハムスターにE−64−にも長期に渡りE−64を投与した結果とよく一aを1週間連続投与し，最終投与後24時間目に動物を殺し，各種臓器のプロテアーゼ活性を測定した結果が表1の一番右の閥に示されてい致しており，骨格筋のプロテアーゼ活性の抑制

76は認められるが，身体枚能の改善はみられないと結論づけちれる。しかし，E−64の投与を開10．筋ジストロフィーハムスターにおけるチオール性カテプシソの活性に対するE−64投与の効果

始した時点ではジストロフィー症は発症しており，リソゾームプロテアーゼの活性もすでに上昇しているので，もっと初期よりE−64を投与
し，効果判定をする必要があると考えられる。
文献3）Barrett，A．J．：Anal．Biochem．，47，280−293，
1972．

4）Igarashi．M．＆ Hallander，V．P．：J．Biol．
Chem．，243，6084−6089，1968．
5）Koldovsky，0．＆Palmieri，M：J．Biochem．
125，697−701，1971．
6）Kominam王，E．，Wakamatsu，N．＆Ⅹatsunuma，

1）Hashida，S．，Ⅹominami，E．，＆Katsunuma，
N．：J．BiocIlem．，91，1373−1380，1982．
2）Noda，T．，Isogai，K．，Katsunuma，N．，Taru・
moto，Y．＆Ohzeki，M．：J．Biochem．，90，893−
896，1981．

N．：Biochem．Biophys．Res．Commun．，99，568−

575，1981．
7）Hashida，S．，Towatari，T．，Kominami，E．＆Katsunuma，N．：J．Biocllem．，88，1805−1811，
1981．

77

11．筋ジストロフィーチキンにおける筋ガングリオシドの代謝に関する研究
官 武正＊

研究協力者 挺 美 智 至＊ 官 谷 信 行＊
山 田 剛 道＊＊有 賀 敏 夫＊＊

はじめに

6時間incubateする。これに5FLg CDHを含むChloroform−methanol（2：1，V／V）500

チキン筋のガングリオシドは構造の特異なものが多く含まれていたが，その大部分のものは〃1を加え，FoIchの分画を行う。さらに下層を全て薄層クロマトプレートにつけ，CDHに構造が明らかとなってきた1・2）。著者らは，こ相当するシリカゲルをかき取り，〔3H〕GM3

れまで筋ジストロフィーチキンを用いて，筋ガ
ングリオシドを正常と比較検討し，ジストロフ

gangliosideが分解して生じた〔3H〕CDHをシ
ンチレーションカウンターで測定する。

ィー筋では GM3 ganglioside を始め，大多結

数のガングリオシドの増量が認められた2）。今
回は，このガングリオシド増加の撥序を明らかにする目的でGM3

gaglioside

果（1）筋のGM3ganglioside sialida5eの分解酵素で筋GM3ganglioside sialidaseの至適pHある GM3 ganglioside sialidase の測定法

は4．8，酵素反応は6時間まで直線的に進行し，を確立し，筋ジスチキンを正常と比較検討する

また酵素量を変えて測定すると，蛋白400〝g／

と共に，E−64投与の効果についても検討した。

100Jllまで反応は直線的に進んだ。ディターゼ
ソトの効果を調べた結果，taurOCbolateが最材料および方法
鶏前胸筋をホモジネートし，酵素液として用も有効で，またその至適濃度は120／Jg／1∝）〝1であった。以上より，方法に記載したごとく，いた。GM3gangliosideはウシ副腎10kgよ筋におけるGM3ganglioside sialidase活性

りI．edeenら3）の方法で分離精製して得た。こ測定法を確立した。

れをSchwarzmannらの方法でSphingosine但）正常およびジストロフィーチキンにおける GM】
g8mglioside8ialidaSeおよびglycosidase活性：部分をトリチウムラベルして基質として用いた。

表1のごとくGM3gangliosidesialidaseの活GM3 ganglioside sialidase 活性測定法は

性は，ジストロフィーチキン筋で約2倍の増加

以下のごとく行った。すなわち，〔3H〕GM3gan−を認めた。Glycosidaseのうち，a−glucosidase

glioside，8FLg；SOdiumtaurocholate，120FLg；

のみ正常値を示したが，他は全て3−10倍の増

enzyme，10−100FLgprOtein／50FLl，0．1Ncit−

加を認めた。

rate phosphate buffer（50FLl）を加え370C，（3）筋glyeosidase活性に対するE−64の効果
E−64投与によるglycosidase活性に対する＊新潟大学脳研究所神経内科

効果を調べた結果，表1のごとく，測定した全綿東京都臨床医学総合研究所てゐglycosidaseで変化を認めなかった。
79

Ⅰ 酵素レベルでの効果
表1チキン筋におけるglycosidase活性α−Man．

α−Fue．

16．6

4．90

4．60

103．8

Control（n＝11）＊＊＊

Dystrophy

5．68

3．97

（n＝22）（1．39）（1．45）（2．46）（2．02）（1．41）（27．3）

4．70

2．90

13．6

5．28

4．00

73．5

（1．27）（0．58）（1．34）（0．59）（1．15）（18．8）

7．22

5こ30

16．7

5．17

5．00

122．9

（2．35）（1．94）（3．28）（1．53）（2．18）（32．8）

8．06

5．13

17．7

6．03

5．71

111．4

（1．74）（1．37）（3．81）（1．29）（1．43）（26．7）

Treated dystrohy
P．0．E−64−C（n＝4）

Treated dystrophy
E−64−C150mg／kg（n＝20）

Treated dystrophy
E−64−C300mg／kg（n＝21）＊

activity：nmOles／mg protein／hr＊＊（）：Standard deviation＊＊＊（n＝）：number of samples

考察

我々は，筋ガングリオシドをジストロフィー筋と正常筋で比較検討した結果，ほとんど全てのガングリオシドがジストロフィー筋で増加していた。この増加の按序として，これらのガン
グリオシドを含む膜系の増加，これらのガング
リオシドの合成の克進または分解の低下が想定された。そこで今回我々は，チキン筋で最も含の増加の枚序としては，前述のごとく合成克進
またはガングリオシドの含量の大きい膜成分の増加が考えられるが，これは今後に残された問
題である。
文

献

1）Chien，J．L．＆Hogan，E．L．：Characteriza・tion of two ganglioides of the paraglobosideseries from chicken skeletalmuscle，Biochim．
Biophys．Acta，620，454−461，1980．

量の多いGM3gangliosideの分解酵素である
GM3 ganglioside sialidase について検討し

2）Miyatake，T．，Atsumi，T・，Ariga．T・＆
Nakamura，K．：Gangliosidesin dystrophic

た。この酵素活性は，ジストロフィー筋ではむ

chicken muscle，inIntemational Symposium

しろ増加が認められた。
したがって，ジストロフィー筋におけるガン3）Ledeen，R．W．，Yu，R・K・＆Eng，L・F・；グリオシド増加の機序として，分解の低下は否

On Muscular Dystroptly．inpress．
Gangliosidesofhumanmyelin：Sialosylgalacto−
sylceramide（G7）as a major component，J・

定された。
またE−64−C投与により，GM3 gangliosi−

4）Schwarzmann，G・：A simple and novel

desialidaseおよび他のglycosidaseの活性に

method for tritiumlabeling of gangliosides

は変化がなかった。

and other sphingolipids，Biochim．Biophys．

筋ジストロフィーにおける筋ガングリオシド

80

Neurocbemり21，829−839，1973．

Acta，529，106−114，1978．

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果
12．初代培養肝細胞の蛋白代謝に及ぼすロイべプチソとE−64の影響………………市原

13．培養筋細胞の変性に及ぼすE−64−Cの作用

明

小沢鋲二郎

14．培養筋細胞の蛋白代謝に及ぼすE−64−Cの影響…………………‥・………………石浦章一

15・ニューロフィラメント変性に対するE−64−Cの効果（続報）……………………杉田秀夫

16．脳ミエリソ蛋白のinvitroにおける分解に対するE−64の効果について……宮武

17．移植筋の再生に及ぼすE−64の効果

正

寺尾 寿夫

12．初代培養肝細胞の蛋白代謝に及ぼす
ロイぺプチンとE−64の影響

市

研

究

目

原

的

明＊

表1 ラットの肝臓，腎臓にロイペプチンで誘導されるHb水解活性

我々が用いているネズミ肝実質細胞の初代培

酵素活性
誘導前
誘導後

養系は肝臓の多様な機能をよく再現し，また種々のホルモンにも応答する1）。この系を用いて〃gチロシソ／min／mg蛋白

肝細胞の蛋白ターンオーバーを検討し，培地ア

肝

臓

0．6

8．5

ミノ酸の豊富な時には細胞は蛋白合成が促進し

腎

臓

3．1

11．2

脾

臓

0．2

0．9

肺，筋，心，脳

＜0．1

＜0．4

て種々の血清蛋白を合成分泌するが，アミノ酸が欠乏すると分解に憤き，多くのアミノ酸が培地に放出されることを見出した2）。その種類と結果および考察量は肝蛋白の平均含量とよく煩似しているので肝蛋白の分解を直接反映している。この様な系に対する蛋白分解酵素の阻害剤であるE−64や

1）ロイぺプチンで誘導されるHb水解活性の同定
培養細胞での誘導では量が少ないのでラット

ロイペプチソの影響を検討し，ロイべプチソはにロイペプテンを5mg／100g体重で4日間投与すると肝臓と腎臓の活性が著明に増加した（表1）。腎臓には誘導前にも相当の活性が認められるが，これが誘導される酵素と同じか否かは今後の検討によらねばならない。

肝蛋白分解を60％程度阻止することを示したが，同時にこの細胞にヘモグロビン（Hb）水解活性を誘導することを見出した3）。E−64にはこの作用は無い。今回はこの誘導された酵素の性質を明らかにすると共に，他の肝機能に対するE−64の影響を報告する。
方

肝臓の酵素をpH3・5処理，lMNaCl処理，硫安分画，クロマトフォカシソグ，セファデッ

法

クスG−75，ホスホセルロースカラムクロマト

グラフィーを用いて単一蛋白に迄精製した。分

肝細胞培養法はすでに報告した方法によった2）。酵素活性はべブスタチソ存在下のHb水解活性をAnson法で測定した3）。血清蛋白合
成は抗体を用い1），HC−ロイシンのとりこみで測定した。細胞の蛋白合成もHC一ロイシンのとりこみで測定した3）。グルカゴソの脱感作はサイクリックAMP形成で測定した1）。
＊徳島大学医学部酵素研究施設酵素病理部門

子量は20，000のモノマーである。ホスホセル
ロースカラムのクロマトグラフィーからの0．8

MNaClによる溶出では0．3Mにわずかと0．
55Mに大部分の活性が認められた。この溶出パターンは培養細胞の誘導酵素の場合とよく一致している4）。
この方法でカテプシソH，Bとは明らかに異なることが示されたが，後者の画分はカテプシ
83

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果
表2

ロイベプチソで誘導されたHb水解酵素の
性質

添加物

濃度

酵素活性（％）
0
0
1

1mM
5
5

べブスタチソ

0．1／唱／ml

pイペプチソ0．1

キモスクチソ

0．1

E−64

0．1

0 4 6 90 5 6 6
1

O．2

7

I

8
9

PCMB

5
9

2一メルカプト
ェクノール
DFP

9 7
0 1
1 1

MnC12
EDTA

表3 プロテアーゼイソヒビターの血清蛋白合成に及ぼす影響（6時間）

蒜芯整諾繁盛無添加
ロイべプチソ

260
239

185
152

12・4
11．5

鍔琵言＿

211

172

11・8

ペブスタチソ

203

151

12．3

E−64

207

161

12．3

一つであるリボ蛋白についても検討したが，この量にもプロテアーゼ阻害剤の影響は見られなかった。また細胞内蛋白の合成に対しても大きソLに一致した。しかしMn2十による阻害がな影響はなかった。

なく，EDTAやSH還元剤による活性化がな
いこと，また種々の酵素を分解しないこと等明が，現在の実験条件では分泌された蛋白が肝臓

らかにL一タイプとは異なる（表2）。べブスタにとりこまれていない可能性が強い。

用いた阻害剤の濃度の検討も必要ではある

チソで阻害されないことはD一タイプでないこ

この事はこれら血清蛋白が肝臓にとりこまれとも示している。しかしPCMBやロイべプチ

るには血中や他臓器で何らかの修飾を受ける必ソ，E−64で阻害されることはこの酵素がチオ要があることを示唆している。

ール性であることを示している。この酵素はリソゾームに局在しているが，誘導されるとミク次に肝細胞とグルカゴソを長く接触させるとロソーム以外の種々の画分に広く分布する様に

グルカゴソ作用の脱感作がおこる1）。これはレセプターやアデニレートサイクラーゼ系のイン

なった4）。このことはリソゾームの膨大化とそ

ターナリゼーショソとリソゾームによる分解にの膜の弱くなったことによると思われる0以上の結果からこの誘導酵素は従来知られてょると考えられている。そこで，E−64でこの脱感作が阻害されるか否かをCAMP形成を指いるリソゾーム系の酸性チオールプロテアーゼ

標に検討したが（表4），脱感作を抑制する作とは性質の異った酵素であることが明らかとなったが，この酵素の誘導機構については蛋白合用は見られなかった。以上の結果はロイべプチ成を伴った枚構を考えねはならず，性質が頬似していることからカテプシソLの前駆体の可能は影響を与えるが，血清蛋白のターンオー／て−性も考えられるが，その詳細は不明である。ま

認められないことを示している。これが用いた

たその生理的意味もよくわからない0指標が適当でないのかターンオーバーがおそく

2）肝機能に対するE−64の影響て実験時間では検出できなかったのかは今後のソやE−64は細胞内蛋白質のターンオーバーにやアデニレートサイクラーゼ活性等には影響が初代培養肝細胞は種々の血清蛋白を合成分泌するが1），一部は再度肝臓にとりこまれリソゾ

表4 グルカゴン脱感作に及ぼすE−64の影響
CAMP形成（Pモル／5分）
E−64無添加 E−64添加ームで分解されると考えられている。
そこで種々のプロテアーゼ阻害剤をこの系に細加えれば分泌蛋白の蓄積がおこる可能性が考えられる。しかしこの系にロイべプチンやE−64

未処理
グルカゴソ処理を添加してもその分泌量にはあまり影響を与え細胞はグルカゴソ（10￣TM）で12時間処理した。
E−64は50／Jg／ml添加。

なかった（表3）。血清蛋白の代表的なものの
84

胞

395
75

348
45

12．初代培養肝細胞の蛋白代謝に及ぼすロイべプチソとE−64の影響
Cell．Biochem．，43，145−160，1982．

問題である。

2）Tanaka，K．，Kishi，K．，Ichihara．A．：Bioche・

結
1．

語

ロイべプチソでネズミ肝臓，腎臓にヘモグ

ロビン水解酵素が誘導されるが，その性質は従来知られるカテプシソ群とは異っていた。

mical studies onliver functionsin prlmary
Cultured hepatocytes of adult ratsII．Regula・tion of proteinand amino acid metabolism，J．
BiocIlemり86，863，1979．

3）Tanaka，K．，Ikegaki，N．，Ichihara，A．：Effe・

E−64にはこの酵素の誘導能はなかった。

CtS Ofleupeptinandpepstatinon proteinturn−

2．培養肝細胞の血清蛋白分泌，膜のアデニレ
ートサイクラーゼの脱感作にE−64は影響をOVerin adult rat hepatocytesin primaryculture，Arch，Biochem．BiopllyS．．208，296，
1981．

与えなかった。
文

献1）Ichihara，A．，Nakamura，T．，Tanaka，K．：
Use of hepatocytesin primary culture forbiochemicalstudies onliver functions，Molec．

4）市原明，田中啓二，生垣尚彦：プロテアーゼ阻
害物質によるべブスタチソ非感受性ヘモグロビン
水解酵素の誘導，微生物の二次代謝産物に由来す
る難病治療薬（E−64）の開発研究，昭和55年度研究報告書，55−59，1981．

85

13．培養筋細胞の変性に及ぼすE−64−Cの作用

小

沢

瑛二郎＊

研究協力者 萩 原 康 子＊

E−64を筋ジストロフィー症の治療に用いよコンプラスチック35mm培養皿当り2〜3×105

うとする試みは，次の発想によっている。すな
わち，筋ジストロフィー症は筋細胞の破壊によ

個播いてCO2インキュベーター中で培養した。培養液として85％EaglesMEM，15％ウって発症するが，この破壊は筋細胞中に含まれマ血清に，ニワトリトランスフェリン（Tf）10

る蛋白分解酵素によるものであり，したがって〃g／mlを加えたものを用いた。この報告では蛋白分解酵素阻害剤を細胞に与えることによっ

TfとはニワトリTfを指す1）。培養4日後にて細胞の破壊を阻止できるであろう。われわれ各種の処理を開始した。この系ではCK活性ははこの3年間in vitroでの神経支配のない筋

殆んど筋管細胞に由来する。したがって筋管細細胞を用いて蛋白分解あるいは細胞の崩壊に対するE−64の作用について報告した。

胞の「量」を推定するのにCK活性を用いた。

第1年目には筋の成長と共に筋細胞に蓄積されるクレアチンキナーゼ（CK）活性の増加に及

吸光度の増加で行った。
細胞の増殖のマーカーとしてDNA量を用い

ぼすE−64の影響について報告した。すなわちた。DNAは，Hinegardner法で測定した2）。

D−L型E−64ではCK活性の増加がわずかに多いこと，しかしL−塾はCK活性の蓄積に無効であることを報告した。

CXの測定はNADPHの増加に伴う

結

340mm

果

1）細胞の増殖成長に及はすE−64の効果

第2年からは標準漂晶としてE−64−Cを用い初めに生体から分離された筋芽細胞の増殖とることになったのでこれを用いた。培養細胞中
で合成された蛋白の分解の速度に及ぼすE−64

成長に及ぼすE−64−Cの効果をみた。細胞を培の影響を調べたが，結果に影響はなかった。
本年は主として人工的に培養筋細胞が変性破64−Cを10〝g／ml添加した。その後時間を追って1枚の培養皿の上に生えている細胞に含ま壊される条件を作りそれに及ぼすE−64の効果れるDNAの量を測定した。Control，E−64−Cを検討し，またE−64の細胞増殖に及ぼす影響をみた。

添加群共に殆んど同じ程度の増加がみられた。

方法

貯卵11日のニワトリ胚胸筋よりとった細胞をレンズベーパーを通して単一細胞とし，7ブル

養皿に播いてから7時間後培養液を交換しE−同様の実験で筋管細胞中に蓄積されるCK活性は初めのうち全く差がなかったが，5日後には
E−64−C添加群の方がやや高かった（図1）。
2）トランスフェリン（Tf）欠乏による筋の変性
ニワトリ筋細胞の成長のためにはTfが必要である。Tf存在下で筋芽細胞は分裂して数を＊国立武蔵療養所神経センター機能研究部

増し，融合し，ついに大きな筋管細胞を形成す
87

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果

2︵葛篭︑u盲︑一〇∈チ二号主立二六

0

1

2

3

4

5

6

lncubation Time（day）

匿＝ 培養筋細胞の成長に及ぼすE−64−Cの効果
3×105cells／dishを措き，細胞がdisbに付着した後（7時間後）に培養液を交換して培養を続けた。新しい培養液に●−●E−64−ClO〃g／mlを添加した。○……OE−64−Cを添加しなかった。

42︵工の至u盲︑一〇∈l︶喜＞；0再ゞU

5

6

7

8

9

10

11

lncubation Time（day）

図2 トラソスフェリン（Tf）欠乏による培養筋細胞変性へのE−64−Cの効果
2×105cells／dishをニワトリTflOFLg／miを含む培養液で4日間培養した後，培養液を交換して培養を続けた。新しい培養液に ●−●ニワトリTflOJ唱／ml，E−64−C
lOJ唱／mlを添加，○−○ニワトリTflO〝g／mlのみ添加，●・…‥●E−64−ClO／唱／
mlのみ添加．0……○いずれも添加しなかった。ⅠncubationTimeの上段は培養液交換時を0とした。下段は細胞を播いてからの通算期間である。
88

13．培養筋細胞の変性に及ぼすE−64−Cの作用︵エS葛︑U盲︑一〇∈l︶喜＞票岩︶岩
0

0

3

6

9

1ncubation Time（hr）

図3 EGTAによる培養筋細胞破壊へのE−64−Cの効果
3×10Scells／dishを4日間培養後，●ET64−ClOFLg／mi添加，OE−64−C無添加の培養液に交換した。18時間後に再び以下に記す薬物等を加えた新しい培養液に交換してその時点をincubationTimeの0とした。●・・・…●E−647ClOFLg／ml，EGTA3mM．
〇・・・・・・〇EGTA3mMのみ，●−●E−64−ClOFLg／mlのみ，○−○無添加︵エS扇くu盲︑−0∈l︶主＞膏吋ゞ0
060［ncubation

120

180

Time（min）

図4 Dibucaineによる培養筋細胞破壊へのE−64−Cの効果
3×1ぴcells／disbを4日間培養後，●E−64−ClO〝g／ml添加，OE−64−C無添加の培養液に交換した。2時間後に再び以下に記す薬物を加えた新しい培養液に交換してその時点をincubationTimeの0とした。●・・・・・・●E−64−ClOFLg／ml，dibucaineO．5mM，○……OdibucaineO．5mMのみ．●−●E−64−ClOpg／miのみ，○−○無添加89

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果る。しかし培養液からTfを除くと大きな筋管細胞は数日で変性し始め，やがて死滅する3）。
この際に起る筋の崩壊過程に対するE−64−Cの作用をみた。培養4日目にTfを含まない培養液に交換し同時にE−64−Cを10FLg／ml加えた。Tfをぬいてもこの実験ではしばらくCK
活性の蓄積があったが培養7日目よ り減少した。形態学的にも脂肪滴変性などがみられた。
この過程においてE−64−Cを加えたものも，加えないものも全く同じ変化がみられた（図2）。
3）EGTA添加による筋の破壊
培養液からCaイオンを除くと一たん形成された筋管細胞も空胞変性を起し約一昼夜で破壊される4）。この作用は培養液にEGTAを加えても全く同様に起る。ここでは培養液にEGTA
3mMを加えた。培養液にはCaイオンは2mM以下しか含まれないし，pHも弱アルカリ性に保たれるから，遊離しているCaイオンの濃度はかなり低いものと思われる。破壊されないで残っている筋管細胞の量をCK活性で推定することによってEGTAの作用をみることができる。
EGTAの筋破壊作用に対するE−64−Cの効果をみるために，EGTAの作用開始18時間前にE−64−ClO′唱／mlを培養液に添加した。
EGTAを加える時にも培養液を交換してE−64−Cを10／Jg／ml加えた。この際もE−64−Cを加えても加えなくても破壊の程度は全く同じであった（図3）。
4）局所麻酔薬dibucaineによる筋の破壊
局所麻酔薬bupivacaineが筋管細胞を破壊することはすでに報告されている。局所麻酔薬
dibucaineはbupivacaipeよりも低濃度で破壊作用があった。この作用はPH dependent
であってアルカリ性ではより強く破壊が起る。
今回は徐々に破壊を起すために弱アルカリで実験を行った。
E−64−ClOFLg／mlを，dibucaine添加2時間前に培養液に添加した。dibucaine添加直前に培養液を交換し，E−64−Cも新たに添加した。dibucaine添加後細胞の破壊は徐々に進90

んだがE−64−Cはこの過程に全く影響を及ぼさなかった（図4）。
考察筋ジストロフィー症の治療薬の実験にいわゆる筋ジストロフィー症のモデル動物が用いられる。これらの動物では，骨格筋の変性破壊が起るので， 筋ジストロフィー症 の名を冠して呼ばれている。しかしこれらが本当に筋ジスト
ロフィー症のモデルになっているか否かはまた別の問題である。いいかえれば筋ジストロフィー症モデル動物へE−64−Cを投与することは，本態は不明であるが筋の変性破壊が起る病気を持つ動物へE−64−Cを投与することを意味する。ここにのべたのは変性破壊を起す培養筋紅胞へE−64−Cを与える実験である。モデル動物
ではおそらく成熟した細胞の病的状態であり，神経支配も存在するであろう。それに反し培養
筋細胞は，成熟度としては筋管細胞以上には進
まないし，今回の実験の場合には神経支配もない。しかも今回の変性は薬物を用いた人為的なものもある。しかしながら，E−64−Cがこれらの何れかに効けば，その薬物としての研究の一
つの足がかりとなると考えて実験を行った。しかし結果は残念ながらすべてnegativeに終った。
文献1）Ozawa．E．＆Hagiwara，Y．：Avian andma・
mmalian transferrins are required for chickand rat myogenic cell growthin vitro，re−
SPeCtively．Proc．Japan Acad．B．，57，406，1981．
2）Hinegardner，R．T．：Animproved餌ometricassay for DNA，Anal．Biochem．，39，197−201．
1971．

3）Ozawa，E．＆Hagiwara，Y．：I）egenerationof
large myotubes following removal of trans−
ferrinfromculturemedium，Biomed．Research，
3，16−23，1982．
4）Ozawa，E．：Differencesin sensitivity to Ca
ionlackbetweenmyoblastsandlargemyotubes
fromchickenbreastmuscle，Develop．，GrowthandDifferリ20，179−189，1978．

14．培養筋細胞の蛋白代謝に及ぼすE−64−Cの影響

石
研究協力者

山

下

杉

田

浦

秀

研究目的
E−64−CのinvivoにおけるプT］チアーゼ抑制効果を調べるため，培養骨格筋細胞を材料として蛋白質の代謝速度を測定した。また，外液に投与したE−64−Cの筋細胞へのとりこみと，蛋白の分解速度との関係を検討した。
．材料ならびに方法（1）培養系ならびに培養条件
ニワトリ12日胚の胸筋より江橋の方法1）で細胞を得た。筋芽細胞はゼラチン処理を施した直径10cmのFalcon dishにまき（3×106

Cells），EagleのMinimumEssentialMedium（MEM）80％，馬血清10％，ニワトリ胚抽出物（CEE）10％の混合液10mlと共に37OcのCO2インキュベーター（5％CO2−95％Air）
内で培養した。24時間後，MEM80％，馬血清

15％，CEE5％のmediumに交換し，以後6日目，太い筋管細胞で皿がおおわれる時点まで培養を続けた。
（2）E−64−Cのとりこみ（1）の条件で培養した細胞に，〔3H〕E−64−C（365／▲Ci／mg，大正製薬より）を外液より添加し，一定時間培養を続けた後，細胞内にとりこまれたカウントを測定した。

＊ 国立武蔵療養所神経センター疾病研究第一部＊＊ 東京大学医学部薬理学教室

章

一＊

茂＊＊

小

浜

一

弘＊＊

夫＊

江

橋

節

郎＊＊

（3）蛋白代謝の測定
培養7日日にlpCi／mlの3H−Leuを加え，24時間培養を続け蛋白質をラベルした。ついで培養液を除き，10mlのMEMで3回洗濯して過剰の 3H−Leuを除いた。この時点で培養液にE−64−Cを添加し，さらに24時間の培養中に，標識された蛋白質の分解がどの程度抑制されるかを定量した。全蛋白質への3H−Leuのとりこみは，細胞を生理食塩水で洗った後，10％
過塩素酸（PCA）を加えて蛋白質を沈殿させ（最終濃度PCA5％），アルカリで融解後，カウントを測定した。蛋白量は牛血清アルブミンを標準としてLowry法で測定した。筋構造
蛋白質，特にミオシンH鎖とアクチンへの3H−
LeuのとりこみはSDS電気泳動法を用いて定量した（昨年の江橋の報告参照1））。誤差を最小限にする目的で，同一サンプルの量を変化させて泳動し，少なくとも5回の平均をとって1点の値とした。個々のバソドの蛋白量は，同一ゲル内の標準蛋白質の量から逆算した。
一方，蛋白分解はもう1つの別の方法でも測定可能である。細胞内で蛋白分解が行われると，培養外液にアミノ酸が遊離する。前述した
ように，3H−Leuで標識された蛋白質の放射能
比活性の減少を測定するよりも，分解されたア
ミノ酸中に存在する放射能を測定する方が鋭敏に蛋白分解量を検出することが可能である。外液に添加した3H−Leuを除いた後，一定時間培養し，培養液0．8mlに25％PCAO．2mlを加え40cl時間放置した後，3000rpm5分間
91

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果

表1 実験手順2−6

Set up myogenic cellculture
Refeedall cells

7

Pulse withlFLCi／mlJH−Leu

8A）Sacrifice plates

1B）Rinseout・H，Start

ChaseC）Add E−64−C tO plates
Sacrifice all remalnlng plates︵一∈＼琶︶pヱ巴已L︒U∈叫．0−寸や−凹

Day ofExperiment Manipulations

0

10

20

30

︵ヱdtd＼ぎ︶ 0−寸やIH

E−64−C（FLg／ml）in meditJm
図2 E−64−Cの細胞内へのとりこみことがわかる。
次に24時間後の時点での細胞内へのとりこみ
量と添加E−64−C濃度の関係を図2に示す。この実験では〔3H〕E，64−Cならびに〔14C〕Inulin
を同時に添加し，Inulinによって細胞外容積（extracellularspace）を計算した後E，64−Cのとりこみ量を求めた。細胞は比重1として計算した。図2の破線は外液と細胞内が平衡に達したと仮定した場合の理論曲線である。実験データ（実線）は，24時間後では細胞内濃度が外の遠心で沈童査を除き上活を中性にした後，カウントを測定した。分解量は，実験終了後PCA
で蛋白を沈殿させ残存放射活性を測定した後，次式で計算し％表示をした。
分解量（％）
外液のカウソト×100
残存カウント＋外液に流出した
カウント総量結果

実験手順を表1に示した。
まず最初に，E−64−Cの筋管細胞へのとりこ
みの経過を測定した（図1）。この図は，外液にE−64−Cを1〃g／mlの割合で添加し，直後および2，4，24時間後のとりこみ量を示したものである。細胞へのとりこみは短時間で飽和するのではなく，24時間後までゆっくりと上昇する
92

液の約40％になっていることを示している。これより計算すると1／Jg／mlのE−64−Cを外液に添加した場合，24時間後には細胞内で1．2〃Mとなり標的酵素の1つであるCaプロテアーゼ（CANP）のKi＝2FLM2）に比べてもまだかな
り低いことがわかる。この事実は，材料が培養細胞という比較的条件の良いものに対してもE−64−C が細胞内にとりこまれにくいことを示しており，生体内での蛋白分解作用を抑えるた
めにはなお十分な投与方法の検討が必要である
ことを示唆している。
一方，通常の細胞の蛋白代謝には，CANP
のみではなくカテプシソなどのライソゾーム酵素が関与していることが知られている3）。特にカテプシソBやLなどのチオールプロテアー
ゼの作用は広く認められているところであり，
E−64−Cに対しても高い感受性を持つ（Ki＜0．2

14．培養筋細胞の蛋白代謝に及ぼすE−64−Cの影響
表2

E−64−CのミオシンH鎖（MHC）な
らびにアクチン（A）分解に及ぼす影響……C王王B法

Specific Radioactivity（Cpm／〝g）No．of Exp．

No addition E−64−C（lFLg／ml）
4
5
2

1
8
2

6
4
2

2
7
2

3
8
1

5
9
1

1
9
4

4
8
4

C
H
M

1
0
7

5
6
7

1
7
4

1
3
4
4
2
1

4
6
1

A

7
7
3
0
8
2
8
5
6
6
0
0
1

1 0 7 28 4 2 5
2 2 6 01〃M）ことからE−64−Cが何らかの蛋白質の代謝を抑制することは十分考えられる。そこで我33々は，昨年度の江橋らの実験の延長線上として，ミオシンH鎖とアクチンの代謝について
E−64−Cの効果を調べた。表2は外液にE−64−C
IJ噌／ml添加し24時間後に残存する〔3H〕Leu
含有蛋白質の量を無添加のものと比較したもの

E−64−C（〝g／ml）

図3 E−64−Cの蛋白分解に対する影響縦軸のC／H，は｝Hの量が蛋白量に比例する
のでHCの比放射活性（Cpm／mg）を表すと考えられる。

である。5〜6回の独立した実験なので個々の値の差は培養条件の相違によるものである。比放射活性が高いものほど蛋白質が分解されないで残っていることを示す。表で明らかなように質の代謝はE−64−Cの添加（3〜33fLg／ml）によって影響を受けなかった。もちろんミオシン
H鎖，アクチンも同様である。これらの事実は

1′唱／mlのE−64−Cの添加では有意差は出ない
ことがわかる。

一見E−64−Cが何らの生理活性を持たないように見える。さもなければ，パルスラベルされた以上の実験より，E−64−Cの効果が現れない

蛋白量が少なすぎて比放射活性で見る限り非標のは，添加量が少ないことがまず考えられる。

識蛋白質（2重標識の場合は3H）の寄与が大き

そこでE−64−Cを33／唱／mlまで上げ，蛋白分解に及ぼす効果を調べた。なお，E−64−Cは可能性がある。

くなり，その結果差違が見出せなくなっている

100J唱／mlまで蛋白合成に関しては何らの影響

そこで次に，ノミルスラベルされた蛋白質の分を与えないことは確認した。図3は筋全抽出物

解だけを測定する目的で，培養外液に遊出する
PCA可溶性の放射活性の大小を測定すること（WH）ならびに可溶性分画（Supernatant）蛋
白質代謝に及ぼすE−64−Cの効果を調べたものである。まず培養初日より培養液中に0．2′疋i／mlの〔3H〕Leuを添加し続けておき，7日日にした。すなわち，24時間の問にHCで標識された蛋白質（PCA不溶性のもの）に対する分解量（その後，一定時間中に遊出したカウソりに〔HC〕Leu（lJ疋i／ml）で蛋白質を2重標識した。図中のC／Hは比放射活性を示すと考えのパーセンテージを計算し，それを分解量と考られる。図3で明らかなように，すべての蛋白

PCA可溶性分画に来ており，TLC上では80％えた。外液に遊出する放射活性はその大部分が93

E−64−CE−64−C
添加 無添加亡○叫−噌PEu名訳

王

図4 E−64−C の Short−lived Protein分解に
対する影響

Oh

24h

4811

ト・・・・．・・→llc
図6 細胞内蛋白質の分解（まとめ）最後に図6に実験結果をまとめたスキームを
uO二名巴ぎp訳示す。図3ならびに表2においてE−64−Cの効果が見られなかった理由の1つは，比放射活性を測定する方法自体の不確実さと共に，全蛋白質の53％がパルスラベルされたのが次の日には41％に減少している（図6参照）ような系で，E−64−C添加による53→43％の変化を測定できなかったことによるのではないかと考えられる。一方，図6の斜線部のみを測定する方法（図4，5）では㍊−41＝12％
0

3

10

と53−43＝1030

E−64−C（〃g／ml）
図5 E−64−Cのlong−lived Protein分解に対する影響
以上がLeu のままであることが確認された。

％の差が」雪㌢×100＝17％と計算できるため，有意差が出たものと思われる。
考察

我々の目的は，E一朗−Cによって基質である

よって，膜を通しての蛋白質の運搬や，Leuの代謝は無視出来ると考えた。図4は，E−64−C

細胞内蛋白質の分解がどの程度抑えられるかをの外液添加に対する細胞蛋白質の分解抑制効果

定量することにある。しかしながら，最適条件をプロットしたもので，特に短期間の分解（1（E一朗−C，紬〃g／ml）においても20％以上の阻〜2h）を見たものである。3′唱／mlのE−64−Cでも有意に（P＜0．05）分解が抑制されている害は見られなかった。この理由はいくつか考えることができる。第1は，骨格筋細胞が薬剤ののが明らかである。長期間追うと（0〜24b）

浸透に対して抵抗性があるため，肝細胞のよう

30J唱／mlのみ有意差（P＜0．05）が検出された（図5）。これらの事実により，半減期の短に多量のE−64−Cが濃縮されるようなことはな
く，細胞内濃度が上がらず，したがってプロテい蛋白質の分解に効果があることは明らかであアーゼを阻害しないことがあげられる。第2のる。

問題は，筋蛋白質の大部分が代謝の遅い構造蛋

94

14．培養筋細胞の蛋白代謝に及ぼすE−64−Cの影響

自質で占められているため，蛋白全体の代謝に
E−64−Cの効果が反映されないことが考えられるO図5に示すようにlong−1ivedproteinの分解に対してほ効果が薄いことからもこの仮説は十分考えられる。第3は，骨格筋の蛋白質分解にチオールプロテアーゼが関与していない可能性であるが，これは否定的であろう。今後，
細胞内プロテアーゼの役割を明確にすることが必要であると思われる。

文

献1）江橋節郎，小浜一弘，自尾智明，三谷昌平：昭
和55年度 本報告書，pp．89−92，1981．
2）石浦章一，埜中征歳，杉田秀夫：同上，pp．75〜83，1981．

3）勝沼信彦，野田隆，磯貝和秀：同上，pp．37〜
41，1981．

95

15．ニューロフィラメント変性に対する

E−64−Cの効果（続報）杉 田 秀 夫＊・＊＊
協力研究者

鎌

倉

恵

子＊

石

浦

章

一＊＊

近年，Waller変性（末梢神経切断により断清に0・1M濃度になるようNaClを加え，Nf端より末梢で認められる変化）では，主としてneurofilament（Nf）に変性が生じ1），この変を安定化させ再び上記条件で遠心した。この上清を1Msucroseへ重層し，SW−50．1Beck−

性にCa2＋依存性proteaseが関与していると

man rotorで47，000r．p．m．，90分超遠心しの推測2・3）がなされている。我々は，前回，inVitroにおけるラット末梢神経切片incubation

た。このpelletをNfとし，その上清を粗CAMP抽出に用いた。

の実験より，NfがCa2十イオン依存性に変性し，その変性がE−64−Cにより阻害されること

度0〜30％，30〜40％，40〜50％，50〜60％，を見出し発表した4）。さらに∴Nfが骨格筋より60〜80％になるよう加えた各沈澱，および硫安抽出した Ca2＋−aCtivated neutral protease（CANP）により変性することを確かめた。こ80％では沈澱しない分画について，各沈澱を20mM Tris−HCl（pH7．5），0．1M KClおれらの結果より，我々は，末梢神経内にCANP

よび1mM GEDTA（glycoletherdiamine−と類似の生物学的性質を有する酵素の存在を推測した。

tetraacetic acid）を含む溶液0．2mlに溶解

今回は，上記推測をさらに確かめるために，別に，CANP活性が硫安0〜50％分画に全活

末梢神経より粗CANPの抽出を試み，その生性が回収されることがわかったので（表la参

物学的性質を調べた。また，免疫学的方法を用いて，末梢神経内CANPの存在を確かめた。

照），末梢神経，脊髄上活の0〜50％硫安沈澱

材料および方法
1．粗CANPの抽出法
Schlaepfer5），Moriら6）の方法に従ってNf

この上清に硫酸アンモニウム（硫安）を飽和し，CANP活性を測定した。また，これとはにおけるCANP活性も測定し，この分画を粗CANPとした。
2．CANP活性測定法7）
Alkali−denatured succinyl casein を基質8）として用いた。0．24％ alkali−denaturedを精製した際の上清を用いた。ラット坐骨神経

SuCCinylcasein，25mM27merCaptOethanol，を，5mM EDTA（disodium ethylenedi−

0・lMグリセロリソ酸ナトリウムHCl（pHaminetetraacetate，dihydrate）を含む107・5）溶液450／ 1に検体50JJlを加え，5mM
CaC12存在下，および非存在下で300C，30分

mMリン酸緩衝液（pH7．2）中で，pOlytron
でhomogenizeL，20．000g，30分遠心後，上＊東京大学医学部脳研神経内科＊＊国立武蔵療養所神経七∴／クー疾病研尭第一部

incubateした。各検体に0．5mlの10％トリ
クロール酢酸を加え，40C1時間静置後，：000
g，5分遠心した。上清の280nmにおける吸光度を測定し，Ca2＋有無での差をとった。197

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果

時間，280nmでのODl・0の増加を1単位（U）とした。

表1a）各濃度の飽和硫安沈澱におけるCANP活性
ammonium sulfate CANP activity

3．粗CANPのNfに対する効果

saturation（％）

末梢神経上清の0〜50％硫安沈澱分画を，20mMTris−HCl（pH7．5），0．1MNaCl，lmM

30to40GEDTA，5mM2−merCaptOethan01を含む

40to50溶液に対し透析しこれを粗CANPとした。Nf

50to60も上記溶液に対し透析し，Nf75J増に対し粗60to80CANPO．4〜0．6Uを加え，全量を500Jした。これを①Ca2＋−free，②6mMCa2＋存在下，③6mMCa2＋と共にE−64−Cまたは
1eupeptinを0．5mg／ml含むもの，④6mM

0．066（36．9％）
0．064（35．7％）
0．049（27．4％）
0
（0 ％）
0
（0 ％）
0
（0 ％）

O to30

80

1と

（U／g）

b）ラット末棉神経および脊髄でのCANP活性CANP activity of CANP activity of
peripheralnerve（U／g） spinalcord（U／g）

Mg2＋存在下，⑤6mMCa2＋存在下でPHを4または10にしたもの，以上の条件下に320C

1．

0．118

2．

0．136

2． 0．60

で，2〜3時間incubateした。また，対照と

3．

0．134

3．

してNf75〃gを粗CANPを加えず，400′′1の1． 0．510．129土0．008（mean士S．D．）

0．40

0．503±0．082（mean土S・D・）

上記溶液中で6mM Ca2＋存在下にincubate
した。経時的に各検体50／jlをとり出し，同量が免疫学的に交叉することは石浦により確かめの2％SDS（SOdiumdodecylsulfate），0・08

られた。

MTris−HCl（pH6．8），10％vol／volglyce−
rol，5mM2−merCaPtOethanolを含む溶液で結

果

溶解後，この10FLlを7．5％SDSPAGE（p0−1．CANP活性の測定

1yacrylamide gel electrophoresis）にかけた。染色はCBBR−250を用いた。一方，①②

ラット末梢神経よりNfを精製した際の上清に各飽和度の硫安を加えて生じた沈澱のCANPの条件下でincubateしたものを12．5％SDS

活性は表1aに示すごとくである。これからPAGEにかけCellulose nitrate膜（Schlei−
cher＆Schtill製0．45FLMpore）に電気泳動

CANP活性は0〜50％の硫安沈澱中に全活性が回収されることがわかる。また，硫安0〜50

的に20mM Tris，120mM glycine，20％％沈澱中で測定した末栴神経，脊髄のCANP

ethanol（pH8．5）溶液中でTowbinら9）の方活性は表1bに示すように，それぞれ0・129土
0．008U／g，0．503土0．082U／gであった。

法により転写した。これにウサギ抗ラット200
各々370C，60分作用させた。

2．粗CANP（末梢神経）のNfに対する効果
6mMのCa2十存在下に∴Nfは15分で消失

4．Immunoreplica法9）による末梢神経内CANPのした。Gel泳動上，200Kに相当する蛋白が，同定

160K，68Kの蛋白よりやや速く消失した。こ先述したごとくラット末梢神経より抽出したの変化はE−64−Cやleupeptinで阻害された。

粗CANP，ラット骨格筋より抽出したCANP，

Ca2＋のかわりにMg2＋が存在した場合，Ca2＋

ラット坐骨神経より抽出したNfを7．5％SDS
PAGEにかけた。これを前述したごとく，Ce−が存在してもpHが4や10の場合，Nfの消失

KNf抗体，ヤギFITC標識抗ウサギIgGを

11ulosenitrate膜に転写し，ウサギ抗ニワトはみられなかった（図1）。また，対照として粗CANPを加えずNfのみをCa2＋存在下にpH

リ骨格筋CANP抗体，ヤギFITC標識抗ウ

4，7．5，10の各条件下にincubateしたが，2

サギIgGを各々訂OC，60分作用させた0なお

時間の範囲ではNfに変化はみられなかった。

ニワトリ骨格筋CANPとラット骨格筋CANP

Nfの粗CANPによる変化は抗200K Nf抗98

15．ニューロフィラメント変性に対するE−64−Cの効果（続報）

2

3

ーー

5

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El沖−C血脚inM√ト飴＋＋ca十十帥4 げ110
図1Nfに粗CANPを各条件下で1時間作用させた結果
1：GEDTAを含むCa2＋−free溶液。3：6mMCa2＋存在下，PH7．5。4：6mMCa2＋＋0・5mg／mlのE−64−C，pH7・5。5‥6mMCa2＋＋0・5mg／mlのleupeptin，pH7．5。
6：6mMMg2＋，pH7・5。7：6mMCa2＋，pH4。8：6mMCa2＋，pHlO。2は対照としてのNfであるO矢印はNftripletを示し上から下へ200K，160K，68Kの蛋白を示す。
7．5％SDSgel，CBB R−250染色。

12
−

4

−

−

−

＝＝＝＝

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5

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7

8

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203060彗三二】■三・
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■■■一

．軍一義謬

200000320

20の000−

NF

EGl■A

Ca＋＋

NF

図2 Nfに粗CANPを作用させた結果のimmunOrePlica
2〜5：Nfに粗CANPをCa2＋−freeの条件で作用させた結果。6〜9：6mMCa2・存在下に∴Nfと粗CANPをincubateした結果。各々，左から右へ0，20，30，60分の
incubation時間を示す。1，10は対照としてのNfで矢印は200Kの蛋白を示す。上段は12・5％SDSgel，CBBR−250染色。下段は上段の抗ラットNf（200K）抗体による
immunoreplicaである。黒い矢印はdegenerativeな蛋白を示す。
99

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果

図3

ラット坐骨神経より抽出したNf，粗CANP，ラット骨格筋より精製したCANPの抗ニヮトリ骨格筋CANP抗体によるimmunoreplica。Aは7．5％SDSgel，CBB R−250
染色。BはAのimmunOreplicaである。各々，左から右へNf，骨格筋CANP・粗CANP（ラット坐骨神経より）となっている。 矢印は73Kの蛋白を示す。
体を用いたimmunoreplica法でも確かめられた（図2）。しかし，SDS gel上Ca2十存在下に∴Nfのみならず，他のband，例えばNfに近接したbandやactin，tubulinに相当すると思われるbandにも変化が生じた。
3．1mmⅦnOreplie8法によるラット末梢神経内CA NPの同定
ラット末梢神経より抽出した粗CANP内に，ラット骨格筋より抽出したCANPと同じ73Kのbandが一本同定された。Nf内にはこのbandは同定できなかった（図3）。
考察

末梢神経より粗CANPを抽出して，その活性測定および，Nfを基質としてその生物学的性質を調べた。末栴神経homogenateの可溶性分画にCANP活性は存在した。飽和硫安0〜50％の沈澱中に全活性が回収されたが0．129
土0．008U／g とかなり低く，脊髄の約1／4，ニ
ワトリ骨格筋3〜5U／glO）の約1／30であった。
末梢神経をbomogenize

した条件下では可溶

性分画に存在し，このことは骨格筋の場合と同様であるが，CytOSkeletonと結合しての存在
100を否定するものではなく，その局在に関して
は，免疫学的方法による電鍵での検索が必要であろう。
Nfを基質として粗CANPの性質を調べると，Ca2＋存在下に中性の条件でNfを変性させるが，Mg2十存在下，Ca2十存在下でもpH4や10の条件ではNfを変性させなかった0 ま
た，Nf変性は1eupeptinやE，64−Cで阻害された。これらの性質は骨格筋等でいわれている
CANPll）ときわめて類似した性質である。一方，Nfのみを，粗CANPを作用させずに，
Ca2十 存在下に pH4，7．5，10 の各条件下にincubateした場合はNfに変性は生じなかった。このことよりNf変性はCa2十の直接作用ではないと思われる。また，前回坐骨神経切片をinvitroでincubateした実験4）ではCa2＋
依存性の変性はNfのみに選択的に生じたが，
粗CANPを作用させた場合は他の蛋白にも変性が生じた。この事は粗CANPがNfに対し量的に多い可能性，Nf，粗CANP精製時に混入した他の軸索蛋白，例えばtubulin，aCtin
が構造的に変化して粗CANPの作用を受け易くなった可能性，電気泳動上tubulin，aCtin

15．ニューロフィラメント変性に対するE−64−Cの効果（続報）と同じ易動度となる他の変性蛋白を観察している可能性などが考えられる。
以上より末梢神経内に骨格筋等でいわれているCANPと類似の性質を持つ酵素が存在していると推測されるが，この事を免疫学的方法によりさらに確かめた。その結果，末梢神経内には，骨格筋CANPと同じ抗原性をもつ73Kのbandが存在することが確かめられた。我々の方法で精製したNfには，このbandを見出せなかったが，この事は必ずしもNfとCANPが結合して存在する可能性を否定するものではない。
CANPは最近，骨格筋以外の種々の臓器での存在が確認され，ubiquitousな存在と思われる12）。この役割についてはまだ不明な点が多い。病的状態では，Duchennemusculardys−
trophyにおける細胞膜異常により細胞内への4）Ⅹamakura，K．，Ihara，Y．，Sugita．H．，et al．：
InhibitionbyE−64−C Of neurofilament degen−erationinducedbycalciumions，Biomed．Res．，
2，327，1981．

5）Schlaepfer，W．W．：Studies on theisolation
andsubstructureofmammalianneurofila＿

ments，J．Ultrastruct．Res．，61，149，1977．
6）Mori，H．＆

Kurokawa，M．：Morpbologicaland biochemical characterizationof neuro負la．
mentsisolated from the ratperipheralnerve，Biomed．Res．，1，24，1980．
7）Sugita．H．＆Ishiura，S．：Calcium activatedneutralproteasein Duchenne musculardyst−
rophy．Preliminarystudy，InCurrentresearchin muscular dystrophy，Japan，1978−1979，p．
108．

8）Sugiura，M．，Ishikawa，M．，Sasaki，M．，etal．：A new・method forprotease activitymea・
Surement，Anal．Biochem．，97，11，1979．

CANPが活性化され9）Towbin，H・，Traehelin，T．＆Gordon，J．：
Electrophoretic transfer of proteins from

Z−bandを変性させるという仮説13）のように，

polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets．

末梢神経でもWaller変性では同様な秩序によ

Procedure and some applications，Proc．Natl．

Ca2十の流入が高まり

りNfを変性させるといった推測がなりたつ。

Acad．Sci．U．S．A．，76，4350，1979．

しかし，生理的役割については，今までCANP

10）杉田秀夫，石浦章一：筋ジストロフィー症とプ
ロテアーゼ，神経進歩，24，821，1980．

活性にはmMorderのCa2＋が必要とされて11）Ishiura，S．，Murofushi，H．，Suzuki，K．，et

いたため議論の多いところであったが，最近，al．：Studies of a calcium−aCtivated neutral

FLMorderで活性化するCANPの存在が確認され1ト16），何らかの生理的役割をはたしていprotease from chicken skeletal

ると思われる。末梢神経でもNfなどCytOSk−
eletonのturnoverに，とくに神経terminal

muscle．1．

Puri丘cationandcharacterization，J．Biochem．，
84，225，1978．

12）Murachi，T．，Tanaka，K．，Hatanaka，M．，etal．：IntracellularCa2＋−dependentprotease（Ca・で何らかの役割をはたしているのではないかと推測される。
文

献1）Schlaepfer，W．W．＆Micko，S．：Chemical

1pain）andits high−mOlecular−Weight endogen−
OuSinhibitor（Calpastatin），Advancesin Enz−
ymeRegulation，editedbyWeber，G．，Pergamon
Press，New York・0Xford，p．407，1981．
13）Ebashi，S．＆Sugita．H．：The role of calci−and structuralchanges of neuroBlamentsin

uminphysiologicalandpathologicalprocesses

transected rat sciatic nerve，J．CellBio1．，78，

Of skeletalmuscle，Current Topicsin Nerve

369，1978．

and MuscleResearch，editedbyAguayo，A．J．
＆Karpati，G．，Excerpta Medica，Amsterdam・2）Schlaepfer，W．W．＆Hasler，M．B．：Chara−
Cterization of the calciuminduced disruption
Of neuro別amentsin ratperipheralnerve，Br−
ain Res．，168，299，1979．
3）Schlaepfer，W．W．＆Freeman，L．A．：Calci−um−dependent degradationofmammalianneu−
ro61amentsbysolubletissue factor（S）from
rat spinalcord，Neuroscience，5，2305，1980．

0Ⅹford，p．73，1978．

14）Mellgren，R．L．：Canine cardiac calcium−
dependentproteases：Resolutionoftwoforms
with different requirements for calcium，
FEBS Lett．，109，129．1980．
15）Murachi，T．，Hatanaka，M．．Yasumoto，Y．，
et al．：A quantitative distribution study onlOl

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果
calpain and calpastatinin rat tissues andCells，Biochem．Int1．，2，651，1981．
16）Suzuki，l（．，Tsuji，S・，Kubota，S・．et al・：
LimitedautolysisofCa＋−aCtivatedneutralprotease（CANP）changesits sensitivity to
Ca2＋ions，J．Biochem．，90，275，1981・

102

17）鎌倉恵子，杉田秀夫：フィラメント変性とプロテアーゼ，神経進歩，26，278，1982．
18）Kamakura，K．，Ishiura，S・．Sugita，H・，etal・：
Identi丘cation of CaZ＋−aCtivated neutral prote−ase（CANP）inthe rat peripheralnerve，Bio−Cbem．Res．，3，91，1982．

16．脳ミエリン蛋白のhvitroにおける分解に対するE−64の効果について

宮

武

正＊

研究協力者 佐 藤 修 三＊ 田 中 正 美＊

はじめにるインヒビターがMS患者に使用できるなら
ば，ミニリンの崩壊を抑制することができ，多発性硬化症（MS）をはじめとした脱髄性疾MSの治療に応用できる可能性がある。ここで患の多くは，その原因が不明であり，したがっはin vitroにおけるE−64のミニリン蛋白分て根本的治療法がない現状である。MSの病因

解の抑制作用について検討した。

についてはミエリソ塩基性蛋白（BP）による自己免疫的秩序が予想されているが不明な点が多方法

い。ミエリンの中性プロテアーゼについてはこ

人の凍結脳（−800C）のスライスを使用直前

れまでも報告がある1）が，それらの多くは変性に融解し，灰自質を離断し自質のみを使用しヘモグロビンなどの外因性基質を使った研究た。ミニリンはNorton

ら4）の方法にて精製で，ミエリンを純化していくとほとんどその活し，約10mg／mlの蛋白濃度にし蒸留水に浮性が失われることから，それらはミニリン外か遊させた。これを10mMTris−HCl（pH7．5），

らのCOntaminantであろうとされている。我々は純化したミニリンを中性のバッファー中で0．5％Triton X−100に浮遊させ，各種濃度のCaC12およびE−64−aを混ぜて，250Cにてイ

インキュベーションすると，BPと ミ ニリ ン

ソキュべ−ショソした。インキュベーション終糖蛋白（Myelin Associated Glycoprotein：

了後，ドライアイスーメタノール液中で凍結しMAG）は分解されるが，他のミエリソ蛋白はほて反応を止め，直ちに凍結乾燥した。凍結乾晩

とんど変化しないことをすでに報告しており，後，エーテル：エタノール（3：2）液にて脱脂

おそらくミニリン内因性もしくは，それに深くし，Laemmliら5）の方法に従って12．5％SDS−

関連した中性プロテアーゼによるものであろう

polyacrylamide slab gelと予想している2）。さらにMS患者の脳自質かった。泳動後0．25％クマシーブルー，25％イ

ら純化したミニリンを同様にインキュベーショ

ソプロ′リール，10％酢酸中で染色し，7．5％

にて電気泳動を行

ンして，対照と比較するとBP，MAGともにそ

メタノール，7．5％酢酸中で脱色した。その後の分解速度がMSミユリンで速いことを報告しスペクトロデソシトメーターにて各蛋白の色素た3）。すなわち，MS患者脳にて，このミエリ結合能を測定し定量した。

ン内因性もしくは，それに関連した中性プロテ
アーゼ活性が高まっている可能性があると考えている。もしこのプロテアーゼ活性を抑制でき結果

インキュベーション前の各ミエリソ蛋白の色
素結合能による定量では，BPは316土9mg／g＊新潟大学脳研究所神経内科

Whole myelinprotein，プロテオリビッド蛋103

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果
表1

ミエリソ蛋白の分解に及ぼすCa2十とプロテアーゼインヒビターの影響

Wolfgram Protein Proteolipid Protein Basic Protein
Pre−incubation
Incubation Control（withlmM CaCl2）

1mM CaC12＋100fLM E−64−a1mM EDTA

316± 9C

199±11l17±6

194±21177±19b73±571±9

199士10136±108

209士16162±17a80±4
67土2

210土 6174土4e194土 4302± 7C

Without CaC12lmM CaC12＋lJJM E−64−a
1mM CaCl2十10pM E−64−a192±15

図1をデソシトメーターでそれぞれの蛋白を定量したもの。3回の異なった実験の平均±S．D．（mgprotein／g
総ミェリン蛋白）。

a：p＜0．05（対Incubation Control）
b：p＜0．01（〝）

C：p＜0．001（〝）

自（PLP）は192土15mg／g protein，ウォル
フグラム蛋白（W蛋白）は72±2mg／gproteinであった。250C，18時間のインキュベーション
にて，BPは1mMCaC12の存在下では117土
W三三ヨヨ■＝三重苦璽∃■‡土王宣＝＝三日≡＝ご＝＝三6mg／g proteinと低値を示したが，カルシウ

ムの非存在下（1mM EDTA

もしくは1mM

EGTA）ではほとんどインキュベーション前とPLP……●−●l

BP胃▼一一●雷管●一曽
l・I

ト▼

■■

4

5

6

変りなく，BPの分解がカルシウム依存性であることが確かめられた。カルシウムの存在下でもPLPおよびW蛋白は有意な減少は示さなかった。1mMCaCl2および1fLMのE−64−aの存在下で，250C，18時間のインキュベーショ
ンを行ったところ，BPは136±10mg／g proT

12

3

7

8

910

tein，10pMのEp64−aの存在下では162mg／g
PrOtein，100fLMの

図1

インキュベーション前後の ミェリン蛋白のSDSゲル電気泳動図

Er64−aの存在下では174mg／g proteinとE−64raにてBP分解に対する抑制効果が認められた（表1，図1）。

精製されたミェリンを 0．5％Triton
Ⅹ−100を含んだ10mM Tris−HClpH
7．5中でインキュベーショ ンしたもの。

察

ここに示した条件，つまり10mMTris−HCl，

No・1−7；総菜白星30〝g， No．8−10：他の実験シリーズ，総蛋白量20J堰，No．

pH7．5，250CのインキュベーションでBPは

1，No．8：インキュベーション前，No．

分解されるが，PLPやW蛋白がほとんど変化

2：CaC12，EDTA，EGTAなど無添加

しないという理由については，おそらくそれぞにて，250C，18時間インキュベーショ

れの蛋白のミエリソ内での局在に関連している

ンしたもの，No．3，No．9：lmMCaC12
添加，No．4：E−64−al〝M，No．5：E−
64−alOJ104

考M，No・6：E−64−alOOJ

可能性がある。BPはそのほとんどがmajor
denseline つまり 01igodendroglia の延長

M，

No．7：lmM EDTA，No．10：1mMとして考えるならば，その細胞内に存在するとEGTA考えられている。一方，PLPなどはミエリソ

16．脳ミエリソ蛋白のin vitroにおける分解に対するE−64の効果についての脂質二重膜に埋り込んでいるとされている。
したがって，もしここに示した中性プロテアー

後充分に検討される価値があるものと思われる。

ゼが，細胞内に局在しているとすれば，膜に埋り文込んでいるPLPなどへは作用し難く，同じ部
位つまりmaiordenseline．にあるBPが分解され易いと想像される。BPがMSの自己免疫的病因に関して，その抗原として重要視され

献1）Riekkien，P．J．and Clausen，J．：Proteaseactivity of myelin，Brain Res．，15，413−430，
1969．

2）Sato，S．，Quarles，R．H．and Brady，R．0．：ている現在，ここに示したようなミエリソ内因

Susceptibility of the myelin associated glyco−性もしくはその関連プロテアーゼによるBPのPrOteinandbasicproteintoaneutralprotease

選択的な分解は重要な現象と考えられる。

inhighlypuri丘ed myelin fromhumanandrat

E−64によるBPの分解の抑制はその濃度をかなり高くしても部分的抑制にすぎないことから，BPの分解は単一のプロテアーゼによるものではない可能性も強い。しかし，かなり低濃度（1／ Mや10′ M）のE−64−aにてもBPの分解抑制効果がみられたことは注目すべきこと
で，臨床的応用の可能性を示唆する結果であった。今後多くの検討の余地はあるが，MSの難治例も多い現状では，ここに示したE−64を含brain，J．Neurochem．，39，97−105，1982．
3）Sato，S．，Quarles，R．H．and Brady，R．0．：

Susceptibility of endogenous proteins to aproteaseinpuri負edmyelin，Trans．Amer．Soc．
Neurocbem．，12，80，1981．
4）Norton，W．T．and PodusIo，S．E．：Myelina−
tionin rat brain；Methodofmyelinisolation，
J．Neurocbem．，21，749−758，1973．
5）Laemmli，V．K．and Favre∴M．：Maturation
Of the head of bacteriophage T4．Ⅰ．DNA

PaCking events，J．Mol．Bio1．，80，575−600，1973．

めて，prOteaSeinhibitorsの臨床的応用は今

105

17．移植筋の再生に及ぼすE−64の効果

寺

尾

寿

夫＊

研究協力者 大 沢 仲 昭＊＊ 増 野 和 子＊

目homogenize L，nOn−COllagenous protein

的（NCP）を定量したl）。

筋ジストロフィーなどの筋肉を動物に移植しなお，対照群では同様に筋移植を行った動物

た場合に起る再生現象は，まずsatellite cellに生理食塩水を腹腔内に毎日注射し，これをEが活性化され，次いで新たなmyotubeが形成−64注射群と比較した。

され，次第に成熟した筋線経に発達して行くこ

結果および考察とはよく知られている。この様な移植後の筋の再生現象に，E−64がいかなる影響を与えるかを知る目的で，以下の実験を行った。
方

肉眼的には，E−64−CまたはE−64−aを注射した動物（マウス，ラット）でのEDL移植後の再法

今回の実験で使用した動物は

1）肉眼的戟察

ddy系マウス生筋は，コソトロールに比して明確な差はみられなかった。第1図はE−64−Cを注射したddy

およびWistar系ラットである。
筋の移植にはExtensor digitorumlongus

系マウスでのEDL移植後の2週目の再生筋を（EDL）を用い，再生の条件のもっとも良いである。

Orthotopical autotransplantation
た。

2）組織学的歓察を行っ

生理食塩水注射のコソトロールと比較したもの

移植後の再生の過程をラットのEDL移植に

E−64−CまたはE−64−aはマウスの場合はついて時間的に追求してみると，移植後2〜3100mg／kg，ラットの場合は33mg／kgの割合
で，移植直後より毎日腹腔内に注射した。

phageなどの細胞に富むintermediate zone

筋移植後は，種々の時間後に再生筋を取り出

日で最外層にmyOblast，fibroblast，maCrO・が形成され日と共に中心に向って求心性に移動

し，次のごとく処理した。

する2）。この層は，へマトキシリソのみで淡く染

1）再生筋を凍結後，クリオスタットで薄切し，色すると，核に富むintermediate2；Oneが最へマトキシリン・エオジン，トリクロームなど

外部に出現しているのがよくわかる3）。この層の通常の染色と，ATPase（pH9．4）．DPNHなどの組織化学的染色を行った。
2）また，再生筋全体を取り出し，重量測定後は求心性に内側に進み，その後に再生筋から成る層が形成されてくる。しかし，移植後1週から10日日頃までは，中心部にはdonor側の変性に落ち入った筋が，Centralzoneとして残＊帝京大学第1内科■＊東京大学第3内科っており，これをATPase染色でみると，最内層には移植したOriginalの筋によるChecker−107

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果

匪‖

EDLの移植後2週目の再生筋を示す
E−64：E−64−ClOOmg／kg毎日腹匝内注射
CONT：生理食塩水注射

boardpatternが残っている3）。またラットの例でも移植筋中心部まで新しい筋線経で満たさ場合には移植筋の一番外層に1〜2層のdonor

れており，また再生筋線維そのものの組織学的の節線経が生き残ることがある。
EDL移植後2週を経過すると，最内層まで

特徴は両者間に差を認めなかった。
例数は多くないが，E−64−aの注射では，体再生筋で埋まる様になる。そして再生節線維の重kg当り100mgを腹鮭内に注射し，2週間みから成る新しい筋線経の束が出来上る。これを経た移植筋では，中心部にdonorの筋が残らの過程は本質的にはマウスでも同様であった。

り，いわゆるCentral zoneの消失が著しく遅マウスでEI）Lの自家移植を行い，E−64−Cを体重kg当り100mg毎日腹腔内延しているのが認められた（図3）。コントロールでは，2週間を経過した場合には，これはE−64注射の再生過程への影響
a） マウスに注射し，時間を追って再生筋の形成を生理食塩水注射のすでに消失し，再生筋線経は置き変っていた。
この現象はE−64−aによる移植筋の分解の抑制によると考えられる。
b）

ラット

コントロールと組織学的に比較してみると，移ラットのEDLを自家移植後，E−64−Cを毎植後1週間目では両者に著明な差はみられなか

日33mg／kg腹腔内注射し，種々の時間後移った。図2はEDL移植後毎日E−64−C注射を植筋を取り出し，生理食塩水注射のコン′ロール行ったマウスの1週間後のものである。中央にと比較してみたが，両者に差が認められなかっ残っているdonorの筋肉がやや多い様にみえることを除けば，生理食塩水を注射したコント

た。

ロールと変化はなかった。2週を経たもので外層に1層〜2層のdonorの筋がそのまま生は，生理食塩水注射群と同様に，E−64−C注射

き残ることが多い。これがE−64−C注射で影響

108

前述のごとく，ラットではEDL移植後，最17．移植筋の再生に及ぼすE−64−Cの効果

′

．▲

図3

EDL移植後2週日の再生筋（E−64−a注射マウス）
Centralzoneが著明に残存している。

を受けるかどうか注目したが，コントロールと1週では重量はわずかに減少するのみであるの間にとくに差はみられなかった（図4）。
3）再生筋重量が，その後は急速に減少し，移植後2週目では移植前の約1／2になる。

a）ラット
再生筋全体の重量を測定してみると，移植後これらの再生筋の重量を，対側の未処置のEDLの重量で除した値で比較してみた。この109

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果

図4 ラット EDL移植後の再生筋最外層にみられる残存筋層

0
0
∞
0
08000

0

2

0

1

0

3

∞0

2

0

0

珊瑚踵排出＼咄刷韓酬肛

1

3

移植後（注射後）の時間（週）図5 再生筋重量の経時的変化（ラットEDL）
E−64−C＊E−64Ta＊control

重量比をE−64−Cを上記の量注射したラットと，生理食塩水を注射したコントロールと比較してみると，図5に示す様に，移植後1遇，2（＊100m9／k9体重／日）
図6 マウス再生筋（移植後2週）の重量

遇，3週で，両者に有意の差は認められなかっ較したのが図6である。

た。

マウスでは，移植後のEDLの重量はコントロールでは2週日に約1／2に減少するが，E−64−C，b）マウス
マウスで同様に，E−64−CおよびE−64−aを移植後毎日，体重kg当り100mgを腹腔内注射し，2週目の再生筋重量をコソ1トロールと比
110

E−64−a を注射した群ではこの減少がみられなかった。

17．移植筋の再生に及ぼすE−64−Cの効果︵．き．主ござ︶dUN

図8

図7 ラット再生筋のNCPの経時的変化

マウス再生筋（EDL）のNCP（移植後2還）4）Non−COllagenous protein（NCP）の変化
再生筋のNCPを筋の再生の定量的な指標のでは100mgを移植後連日腹腔内に注射し，生理一つとして測定してみた。
ラットのEDLのNCPは移植前では150mg

1）組織学的にはラットでもマウスでも，E−64−Cの影響はみられなかった。

／g wet weightであるが，移植後の再生筋で

2）E−64−aを注射したマウスでは，移植後2は85mg／g w．W．前後で，これは移植後1i乳週間経っても，コソトロールでは消失するCe−

2週，3遇と時間が経っても大きな変化はなかった。

ntralzoneが残存していた。

食塩水を注射したコントロール群と比較した。

3）再生筋の重量を測定すると，33mg／kg注射

またE−64−Cを毎日33mg／kg頗脛内に注射のラット群ではE−64−Cの影響はなかったが，した場合，再生筋の単位湿重量あたりのNCP

100mg／kgのE−64−C，E−64−a を注射したマは7図に示すごとく，経時的に有意の変化はみられなかった。ただし移植後2i臥 3週では筋

ウス群では2週目の再生筋の重量がコントロー
ル群より重かった。

全体の重量は約1／2になるので，再生筋全体の4）再生筋の単位湿重量当りのNCPはE−64

NCPは約半分に減少しているわけである。

注射群とコントロール群との間に有意の差はな
かった。

マウスについても同様に，EDL移植後，毎日100mg／kgのE−64−CまたはE，64−aを2週間腹腔内注射した場合の再生筋の単位重量あたりのNCPの変化を8回に示した。これにみる様にE−64−C群でやや低い傾向があったが，これらの変化はいずれも推計学的に有意ではな
かった。
結

語

ラットおよびマウスを用いてEDLのautO−
transplantation後の筋再生に及ぼすE−64−C，
E−64−a の影響を観察した。E−64−C，E−64−aは体重1kg当り，ラットでは33mg，マウス

文献1）Lilienthal，J．L．J．，Zierler，K．L．，Folk，B．
P．，Buka，R．and Riley，M．J．：Areferencebase
and system for analysis of muECle constitue・
nts．，J．B．Cり182，501−508，1950．

2）Carlson，B．M．，Hansen・Smith．F．M．and
Magin，D．K．：The history of a free muscle
graft，In

MuscleRegeneration，ed．byMauro，A．et a1．，Raven Press．NewYork，pp．493−507，
1979．

3）寺尾寿夫ほか：筋再生に及ぼす神経支配の影響，筋の発生と分化に関する基礎的研究，昭和56年度
研究報告書，pp．31−謂・
111

Ⅳ

個体レベルでの効果

18．ラット組織に存在するチオールプロテアーゼインヒビターについて……………勝沼

19．E−64−Cの一般薬理作用

信彦

福原 武彦

〜諸種摘出臓器標本に及ぼす影響〜
20．E−64−Cのグルタチオン関連酵素系への影響

北川 晴雄

21．E−64およびその類縁体の筋ジストロフィーハムスターに対する薬効に関する大関 正弘

18．ラット組織に存在するチオールプロ
テアーゼインヒビターについて

勝

沼

信

彦＊

研究協力者 木 南 英 紀＊ 若 松 延 昭＊

はじめに頂いた。パパイン，ファイシソはSigmaより筋ジストロフィー症は，筋蛋白の崩壊を伴う購入した。カテプシソ（B，H）パパイン，ファイシソはBZ−アルギニンー2−ナフチルアミド疾患である。生体内での筋蛋白の分解にはリソを基質として，カテプシソLはZ−チロシルー

ゾーム中の特にチオール性プロテアーゼ（カテプシソB，H，L）の重要性が指摘されているト

メチオニンー2−ナフチルアミドを基質として，Barrettの方法9）で測定した。Ca依存性プロ3）。我々は前回ジストロフィーチキンでは，カ

テアーゼの測定はカゼインを基質とする石浦ら

テプシソBおよびHが顕著に上昇していることの方法10）によった。インヒビターの測定は，プおよびE−64の投与で上昇したカテプシソ活性

ロテアーゼを測定する条件下でバッファーをイを抑制しうることを報告した。一方，筋組織にンヒビターに置換して測定した。インヒビター

はチオール性プロテアーゼの阻害物質が存在すの1単位はプロテアーゼ活性1単位を減少する

ることが示唆されており，組織のチオール性プ量として表現されている。

ロテアーゼの測定を困難にする他，in vivoで結果および考察もプロテアーゼの活性の調節を通して，筋蛋白の分解に影響を与えることも考えられる。

チオールプロテ7−ゼインヒビターの組織分布
ラットの各組織を4倍量の0．25M庶糖でホ

今回は組織中のチオールプロテアーゼの精製

モジナイズし，その105，000×g，60分の遠心と諸性質について報告する。
実験材料および方法

上清を用いて，精製カテプシソHに対する阻害活性として表現したものが，表1に示されている。インヒビターは，すべての臓器に活性が認

ラット肝よりのチオールプロテアーゼインヒ

められ，リソゾームのチオール性カテプシソ

ビターの精製は原則としては木南らの方法4）に従った。ただし，熱処理は行わず，その代り，（B，H，L）と同様，すべての細胞に分布していセファデックスG−50カラムクロマトグラフィ

組織はないが，肝，腎では，インヒビター活性ると考えられる。特にインヒビター含量の多いーを行った。カテプシソB，Lは唐渡らの方よりも，BANA水解活性（カテプシソB＋H

法5・6），カテプシソHはKirschke らの方法7）

活性）の方が上まわり，カテプシソ含量よりイ

カテプシソCはHuangとTappelの方法8）にンヒビター含量の方が少ない。一方，骨格筋ではインヒビター活性の方がBANA水解活性よ

従って精製した。カルシウム依存性プロテアー
ゼは石浦博士（国立神経センター）より供してり強く，インヒビターが過剰に存在すると想像される。肝より精製されたインヒビターに対す＊徳島大学医学部酵素研究施設酵素化学部門

る抗体を作成して，各種臓器のインヒビターの115

Ⅳ 個体レベルでの効果
表1チオールプロテアーゼインヒビターの組織分布

organ

黒夢y

㌫諾

units／g tissue

Liver

O．41

Xidney0．52

Pancreas

0．53

Spleen0．60

Stomach0．60

Duodenum

0．36

Smallintestine

0．32

Colon

0．35

Brain

0．43

Heart

0．41

Lung

0．43

Testis0．30

Skeletal muscle

0．11

Serum

0．037

a）Assayed asinhibition ofcathepsin H

免疫学的差異を調べたところ，それらは免疫学

ベると，tight−bindingな阻害を示した。次に，的には同一と考えられた。

カテプシソH，パパイン，ファイシソの阻害をチオールプロテアーゼインヒビターの話性質

定量的にみたのが，図1に示されている04，ラット肝の細胞質分画から，木南らの方法4）

4・8膵のイソヒビターで8・5／唱・9・OJJgのバに従って精製した。ただし，粗抽出液を熱処理すると，インヒビターが蛋白分解的修飾を受けることがわかったので，熱処理のステップは省ノ酸組成の特徴は，トリプトファン残基を含まないことで，50．5％の極性アミノ酸と9．3％の芳香煩アミノ酸残基を含み，107残基からなチソが認められないので，インヒビターは2個のS−S結合をもっていると考えられる。
阻害様式
精製したインヒビターとパパインとをインキ
ュべ−トし，阻害の発現時間を00と370で追05る。1分子に4個の1／2システンと遊離のシス00ーは分子量12，500のモノメリックな蛋白で，等電点は5．1である。糖成分は含まない。アミ︵訳︶ト↑−Al↑UくuSくNl凹ト○∝d U≡≡く∑凹∝き，その代り七ファデックスG−50カラムクロ
マトグラフィーを行っている。精製インヒビタ

図1チオールプロテアーゼイソヒビターによるカ
テプシソH，パパイソ，フアイシンの定量的阻害ってみると，すでに15秒で温度に関係なく最大阻害が認められ，瞬時な阻害であることがわかる。パパインに対する阻害様式は非競合的阻害
で，酵素濃度を横軸にとり，阻害の可逆性を詞
116

2

4

INHIBITOR（〝g）6

18．ラット組織に存在するチオールプロテアーゼインヒビターについて

パインおよびカテプシソHを完全に阻害する。
パパインとカテプシソHの分子量をそれぞれ

このことは，カテプシソHとインヒビターが複合体をつくることで確められる。図2はそれを

23，400，28，000とすると，1モルのパパイン，
カテプシソHを完全に阻害するのに，1モルのSDSを含まないアクリルアミドゲル電気泳動

インヒビターが必要と計算される。ファイシソ

シソH，図2−3は，精製インヒビターである。両者を混合したのが図2−2でカテプシソについても1分子：1分子の阻害様式を示す。
図2

カテプシソH−チオールプロテアーゼイン

ヒビター複合体の形成とE−64による複合体形成の阻止で調べたものである。図2−1は，精製カテプ

Hと，精製インヒビターの間に，蛋白のバンドが得られる。ゲルを切り出し，カテプシソおよびインヒビター活性を測定すると，この部分には両活性ともなく，カテプシソHとインヒビタ

1
∴‥、

2

＿3

4

ーは不活性な複合体を形成することがわかる。
カテプシソHとE−64（C）を反応させたものが

5

一￣ノ・・−‥一：￣L

図2−4で，その後に，インヒビターを加えた

疇■

−

｝■

鴇

−

−

ものが図2−5である。カテプシソHにE−64が結合しておれば，インヒビター，カテプシソ
H複合体形成が著しく妨げられることがわかる。逆に，プロテアーゼ，インヒビター複合体を作っておき，E−64が結合しうるかを3H−E−
64を用いて調べたところ，全く結合しないことがわかった。インヒビターのプロテアーゼとの反応部位については今後検討していく予定である。
インヒビターの阻書スペクトラム

・言

∵

♭

●

・−∵

● −

表2に示すごとく，インヒビターは各種セリ
ンプロテアーゼおよびカテプシソDに対しては，パパインの阻害の10〜20倍量の添加でも全

表2

チオールプロテアーゼインヒビターの阻害スペクトラム

Proteinase

substrate

ID5㌔）
βg

RatlivercathepsinB（1．8pg）

Bz−Arg−βNA

RatlivercathepsinH（0．6pg）

Bz−Arg−βNA o．14

Ratlivercathepsin L（0，6jLg）

Suc・Tyr−Met−βNA o．15

RatlivercathepsinC（1unit）

Gly−Arg−βNA o．045

Ratmusclecalciumactivatedneutralprotease（0．3unit）
Papain（0．6J堰）

CaSeinFicin（1．8〝g）

Bz−Arg−βNA o．46

4．2

＞20

Bz−Arg−βNA o．16

Bovine chymotrypsin（8fLg）

Ac−Tyr−OEt＞50

Bovine trypsin（25J唱）

Bz−Arg−NA＞50

RatmastcellproteaseIⅠ（1．3pg）

Ac−Tyr−OEt＞50

RatlivercathepsinA（0．07unit）

Z−Glu−Pbe＞50

RatlivercathepsinD（0．06unit）

Hemoglobin＞50a）Amount（micrograms）necessaryfor50％inhibitionofactivity
117

Ⅳ 個体レベルでの効果
表3
Fraction

チオールプロテアーゼイソヒビターのラット肝における細胞内分布
Percentagein fraction

Specific
activity

NuclearLarge Microsomal Finalfraction

granules fraction super−

Recovery％natant
2

5

4

2 6 7
1 1 5

7

3

1

3

7
1

7

1

1

1

7

8

3

9

7

9
4
2

97．2

0．9

89．1

0

96．1

4．7
9

′

2

8

1

00

2

8
1

0．27

34．2

1

7

1

2

InbibitorbI

3
1

Glucose−6−phosphatase l．97

9

239

7

0．011

Catalase

2
1Cathepsin D

0
2

2208）

Cytochrome oxidase O．156

6
1

Protein

94．7

2．0

101

94．0

108

a）mg／gliverb）Inhibitorin each subcellular fraction was measured after heat treatment at80OC forlO
min at pH3．0as described by Lenney et al．〔8〕

く阻害しない。カルシウム依存性中性プロテア

アーゼが細胞質に遊出してくれは，これを阻害ーゼはチオールプロテアーゼであるが阻害しなして，望まない蛋白分解を，阻止することは考えい。カテプシソL C，B，H，ファイシソ，バられる。別報で述べるように，ジストロフィー

パインなどのチオール性プロテアーゼは強く阻

動物では筋肉中でカテプシソB，Lの活性上昇害される。一方，血中にもチオールプロテアー

と共に，この内在性インヒビター活性も上昇しゼインヒビター3種が存在するが，これらは組ており，細胞内蛋白分解系の一つの要因とし織のインヒビターのものより分子量は大きく，て，またとくに病的状態では，積極的な役割を

免疫学的にも全く相互に反応しない。血中のイ演じている可能性もあり，今後それらのことをンヒビターは，チオールプロテアーゼに特異的明らかにしていきたい。

であり，カテプシソL，B，ファイシソ，パパインそしてカルシウム依存性中性プロテアーゼ

文献を阻害する。しかし，カテプシソH，Cなどェ
クソペプチダーゼ作用をもつものは阻害しない。E−64の阻害スペクトラムは血中のインヒ
ビターの方に近い。
チオール性プロテアーゼインヒビターの細胞内分画

ラット肝のインヒビターの細胞内局在性を基本的にはDeDuneらの方法11）に従い細胞分画を行い，各種マーカー酵素とインヒビター活性を測定した。表3に示すように，インヒビタ
ーの大部分は細胞質分画に存在することが明らかである。チオール性プロテアーゼの大部分はリソゾームに存在するので，リソゾーム膜を壊すような条件下で組織ホモジネートをつくり，
チオール性カテプシソを測定すると，みかけ上，活性が低く出る可能性がある。生体内でもリソゾーム膜が脆弱化して，リソゾームプロテ
1181）Libby，P．＆Goldberg，A．L．：Sciencel99，534−536，1978．

2）Libby，P．，Ingwall，J．S．＆Goldberg，A．L．：
Am．J．Phys．233，E35−E39，1979．
3）Ward，W．F．＆Mortimore，G・E・；Biochem．
BiopllyS．Res．Commun・87，92−98，1979．
4）Kominami，E．，Wakamatsu，N・＆Katunuma，
N．：Biochem．Biophys．Res．Commun．99，568−575，1981．

5）Towatari，T．，Tanaka，K・，Yoshikawa，D・＆
Katunuma，N．：J．Biochem．84，659−671，1979．
6）Towatari，T．，Kawabata，Y．＆Katunuma，N．：
Eur．J．Biochem．102，279−289，1979．
7）Kirschke，H．，Langner，J．，Wiederanders，B・，
Ansorge，S．，Bohley，P．＆Hanson，H・；ActaBioL
Med．Germ．36，185−199，1977．
8）Huang，F．L．＆Tappel．A．L．：Biochim．

Biophys．Acta，268，527−538，1972．
9）Barrett，A．J．：Anal．Biochem．47，280−293，

18．ラット組織に存在するチオールプロテアーゼインヒビターについて
1972．
10）Ishiura，SリMurofushi，H．，Suzuki，K．＆Ima・
hori，K．：J．Biocbem．84，225−230，1978．

11）De Dune，C．，Pressman，B．C．，Gianetto，R．，
Wattiaux，R．＆Appelmans，F．：Biochem．J．，
60，604−617，1955．

119

19．E−64−Cの一般薬理作用〜諸種摘出臓器標本に及ぼす影響〜

研究協力者

日

高

福

原

武

野

一

夫＊

的

これまでにE−64−Cならびにその類縁体の進

彦＊
木

村

直

史＊

Carbonate液中に，心房標本は100％酸素ガスで飽和した25OCのRinger−Locke液中に懸垂行性筋ジストロフィー症に対する治療薬としてし，トランスデューサー（NihonkohdenForce−
displacement Transducer Model SD−lの臨床における有用性ならびに安全性評価のたT）を用いて自発収縮ならびに電気刺激によりめの基礎研究の一環としてE−64−Cの一般薬理誘発される収縮を記録し，E−64−Cの影響を検作用の検討を行ってきた。昨年度は循環，呼吸討した。

機能および中枢神経系の活動に及ぼすE−64−C

3．被験薬物の適用液量ならびに最終濃度の影響，さらにE−64（DL体，L体）および

E−64−Cは100mgを飽和炭酸水素ナトリウ

E−64−Cの血圧作用の横転について薬理学的検討を行った1へ5）。これに続いて本年度は諸種摘

ム溶液lmlに溶解し，濃度10￣lg／mlの薬液を調製し，必要に応じて，これを蒸留水で希釈

出臓器標本に及ぼすE−64−Cの影響について検した。薬液の適用液量は0．訪mlとし，マグ討した。

ヌス管内最終濃度を10−3g／ml，10．1g／ml，
10￣5g／ml とした。比較，対照のために用い

方

法

た

ACh

およびhistamineのマグヌス管内実験にはモルモット（Hartley系，雄性，200

最終濃度は10．8g／ml，nOradrenalineのそれは10￣5g／mlであり，また，前処置薬として用〜400g）ならびにラット（Wistar−Imamichi

いたdiphenhydramineのそれは10￣7g／ml

1．実験動物および摘出臓器標本系，雄性，250〜400g）を用い，断頭，放血後に各種臓器標本を摘出した。今回，検討した諸種臓器標本は，モルモットの回腸，輸精管ならびに心房標本とラットの横隔神経一横隔膜標本の四種である。
2．実験条件および記録
各臓器標本のうち，回腸，輸精管ならびに横隔神経一横隔膜標本は摘出後マグヌス管（内容積35ml）内に満した95％酸素，5％炭酸ガス混合ガスで飽和した370CのKrebs−Ringer bi−とした。さらに溶媒自体の影響の対照として飽
和炭酸水素ナトリウム溶液（栄養液中でのpH
7．69），トリスー塩酸緩衝液（同pH7．61）および10％塩化ナトリウム溶液をそれぞれ0．おml
適用した。
4．pⅡの測定
各種薬液（0．35ml）適用後，マグヌス管内の栄養液のpHを血液ガス分析装置（ラジオメーター社，BMS−MK2）あるいはpHメーター（掘場，F−7ss）を用いて測定した。

＊東京慈恵会医科大学第2薬理学教室
121

Ⅳ 個体レベルでの効果

図1 モルモット摘出回腸の自発収縮に及ぼすE−64−Cの影響
A：10￣5g／mi適用，B：10￣一g／ml適用，C：10●3g／ml適用各例。図右下の横線は時綬
30secを示し，縦線は校正0．25gを示す。 ●印の時点はE−64−Cの適用時点を示す。

図2

モルモット摘出回腸標本におけるAChならびにhistamineによる収縮に対するE−64−Cの影響
A：AChlO￣一g／ml適用による収縮，B：E−64−ClO−】g／mi前処置後のACh10−8g／ml
適用による収縮，C：histaminelO−●g／ml適用による収縮，D：E−64−ClO一事g／ml前処置
後のhistaminelO．8g／mi適用による収縮。図右下の横線は時標30secを示し，縦線は校
正0・5gを示す。●印の時点は各薬物の適用時点を示す。

122

19．E−64−Cの一般薬理作用

図3 モルモット摘出回腸漂本の自発収縮に対するdipbenIlydramineの影響
AおよびC：E−64−Cl0−3g／ml適用による収縮∴BおよびD：diphenhydraminelO￣7g／ml
前処置後のE−64−Cl0−，g／ml適用による収縮。図右下の横線は時標30secを示し，縦線は校正0．5gを示す。●印の時点は，E−64−ClO￣，g／mlの適用時点を示す。

結

果

1．モルモ・yト摘出回腸標本に及はす影響
1） 自発収縮に及ぼすE−64−Cの影響
E−64−ClO●Sml適用により変化は認められなかった（図1，A）が，10−1g／ml適用により7
例中3例に，わずかな持続性収縮の増大と相動性収縮回数の増加が認められた。収縮の増大と収縮回数の増加が認められた1例を図1のBに示した。また10￣3g／ml適用時には明瞭な持続性収縮の増大と相動性収縮回数の増加が認められた（図1，C）。E−64−Cl0−3g／mlによる収縮パターンには種々の型のものが認められた（図1，C；図3，A．C；図4，A）。
2）ACh，histamine収縮に及ぼすE−64−Cの影響
AChl0−8g／ml ならびにhistaminelO￣8g／mlの適用による収縮（図2，A．C）はE−
64−Cl0−3g／mlの前処置によってほとんど影響を受けなかった（図2，B．D）。
123

Ⅳ 個体レベルでの効果

図4 モルモット摘出回腸標本の自発収縮に及ぼす諸種溶液の影響
A：E−64−Cl0−3g／mlによる収縮，B：飽和炭酸水素ナトリウム溶液（0・35ml）
適用による収縮，C：10％塩化ナトリウム溶液（0．35ml）適用による収縮，D：ト
リスー塩酸緩衝液（0．35ml，栄養液中でのpH7．61）適用による収縮。右下の横線は，時標10secを示し，縦線は校正を0．5g示す。●印の時点はE−64−Cならびに諸種溶液のそれぞれの適用時点を示す。

3）抗histamine薬前処置によるE−64−Cの影響

4）溶媒の影響E，64−ClO￣3g／ml（栄養液中のpH7．56）に6例中4例においてdiphenhydraminelO￣7g／ml前処置後，E−64−ClO￣3g／ml適用により収縮高の減少が認められた（図3，A．B）
が，他の2例では収締高に影響が認められなかった（図3，C．D）。

よる収縮に溶媒として用いた飽和炭酸水素ナト

124

リウム溶液が関与している可能性について検討した。
i）飽和炭酸水素ナトリウム溶液の影響
飽和炭酸水素ナトリウム溶液の0．35mlを

19．E−64−Cの一般薬理作用表1 諸種摘出臓器標本に対するE−64−Cの影響
S p on ta n eou s

E −64−C

Ileu mde慧ns

In d u ced
P h ren ic n erv e− d ia p hra gm

A triu mIleu m
n

N

N

N

†

0

0

1

10￣5g ／m ト→

7

6

6

1

0

0

0

10●1

10−3

†

3

0

0

一
→

3

6

7

1

1

0

0

†

21

0

0

−
→

1

6

3

1

0

0

15

l

6

0

0

N a H C O 】一
→

0

6

0

1

0

0

5

支（
％）

Ⅹ （％）

N

1

3

101 土 60103 土 5豆 （％ ）

11

189 土62＊

1

0

13

6

（1）

0

0

−

0

3

100

（1 ）
100 土2

99士2

8
2

（5 ）

0

8
0

5

7

80 土3 ＊

N
0

100 士2（2 ）3
0

94 ±3 ＊

10
2

0
100

豆（
％）
l

0
101 土2Nm（2 ）88 士8＊

3

89土7 ＊6（1 ）80 土190

7 1土 172†：収縮高増大，→：変化なし，1：収縮高減少，N：例数，Ⅹ：対照値に対する値（％），
n：間接刺軌m：直接刺激，＊：P＜0．01。（）内の数値はE−64−ClO￣一g／ml，10￣3g／mlの反復適用により収縮増大が認められた例数を示す。

適用すると持続性収縮の増大および相動性収縮回数の増加が認められた（図4，B）。飽和炭酸
水素ナトリウム溶液0．35mlのマグヌス管内での最終水素イオン濃度（pH）は7．69であり，またこれを溶媒とするE−64−Cの10￣3g／mlの濃度におけるてグヌス管内pHは7．56であった。
ii）トリスー塩酸緩衝液の影響
回腸標本の収縮高増大の要田にはこの水素イオン濃度の影響の可能性も考えられるので，栄を加えて，収縮を誘発し，これに対するE−64−
Cの影響を検討した。
i）E−64−Cの影響
E−64−ClO￣5g／ml，10−1g／ml の両濃度では，フィールド刺激により惹起された収縮に影響を及ぼさなかった（図5，A．B；表1）が，E−64−ClO￣3g／mlの適用では収縮曲線の基線が上昇し，収縮高の増大（対照値の189土62％，
P＜0．01，N＝7）が認められた（図5，C；表1）。

養液中でのpH7．61に調整したトリスー塩酸ii）飽和炭酸水素ナトリウム溶液の影響

緩衝液0．35mlを適用したが，回腸標本の自飽和炭酸水素ナトリウム溶液（0．35ml）を適用することにより，同様に収縮曲線の基線が上

発収縮にはその影響が認められなかった（図4，
D）。
iii）10％塩化ナトリウム溶液の影響
さらに10％塩化ナトリウム溶液0．35mlの適用によっても収縮の増大が認められた（図4，C）。
5）フィールド刺激による収縮に及ぼす影響
刺激電圧5V，刺激持続10msec，刺激頻度

昇することを認めた（図5，D）。
2．モルモット摘出輸精管標本に及ほす影響
1）E−64−Cの影響
10￣5g／ml，10￣一g／mlおよび10￣3g／mlのいずれの濃度のE−64−C適用によっても輸精管
標本に収縮は認められなかった（N＝6）（図6，
A．B．C）。

0．2Hzの矩形波で回腸標本にフィールド刺激125

Ⅳ 個体レベルでの効果
C

曲蜘曲誹
●●●●

図5 モルモッ、ト摘出回腸標本のフィールド刺激により誘発された収縮に対するE−64−Cならびに飽和炭酸水素ナトリウム溶液の影響
A：E−64−Cl0−5g／ml，B：E−64−Cl0−1g／mi，C：E−64−ClO．3g／mi適用ならびにD：飽
和炭酸水素ナトリウム溶液（0．35ml）適用による影響。フィールド刺激電圧5V，刺激持続10msec，刺激頻度0．2Hz。図右下の横線は，時標lminを示し，縦線は校正0・5gを示す0●印の時点は各濃度のE−64−Cならびに飽和炭酸水素ナトリウム溶液の適用時点を示す。

●

図6

●

モルモット摘出輸精管標本の自発収縮ならびにnOradrenaline による収縮に及ぼすE−64−Cの影響
A：E−64−ClO−Sg／ml，B：E−64−ClO￣一g／mi，C：E−64−ClO￣3g／ml適用による影響
ならびにD：nOradrenalinelO￣Sg／mi適用による収縮，E：E−64−ClO￣Jg／ml前処置
後のnOradrenalinel0−5g／mlによる影響。図右下の横線は時漂30secを示し，縦線は
較正0．5gを示す。●印の時点は，E−64−Cならびにnoradrenalineの適用時点を示す。

126

19．E−64−Cの一般薬理作用

図7 モルモット摘出心房標本の自発収縮に対するE−64−Cならびに諸種溶液の影響
A：E−64−ClO￣5g／ml，B：ET64−Cl0−．g／ml，C：E−64−ClO￣3g／ml適用による影響ならびにD：飽和炭酸水素ナトリウム溶液（0．35ml），E：10％塩化ナトリウム溶液（0．35ml）適用による収縮。図右下の横線は時標30secを示し仁縦線は較正0．5gを示す。●印の時点はE−64−Cならびに諸種溶液の適用時点を示す。
2）Noradrenalineによる収縮に及ぼすE−
64−Cの影響
NoradrenalinelO．Sg／mlの標本にE−64TClO￣3g／mlを前処置してnor・adrenalinel0−5g／mlを再度適用してもそのの適用により輸

精管標本は図6のDの様な収縮を示したが，こ収縮型および収縮高には変化が認められなかった（図6，E）。
127

Ⅳ 個体レベルでの効果︒小鴨舟肇皆匿伺Q嶺馳せ粍りーbdβ∵Y芯・珂小童︑皆Q丘●︒小鴨対叫N出滋パー璧克■↓肢剋d至だこ竪琴等琴等Qト碩区︒NHN．〇竪質感云■UUSgN．〇尾豊麗貢ぎ9．0出田東京♂刃養蚕檻︒養蚕肇閲⁚﹄．Hd■養蚕肇臣⁚H．H■じ■0．円▲司︒瓢蟄将司りー匿用︵一己Sの．〇︶翠琴コ三二も空軍雲ラこ■軌途将司リー匿愕︵t吟．hHdQp甘斑将我．一己Sの．〇︶幾綴肇謎瑚ユニ∵⁚H感染時司り童伺︵lE謁．〇︶革鱒プご＝工藤嘉麗撃墜敬二．取込将ぺりー匿愕tE＼u72﹇？ヰ？由⁚﹄．U．tE＼u7019苫・甲ニH這．tE＼出てSU・芯・出⁚白．q
翠攣患還送盛りーbdだU・芯−日時ケ誇りー濃さQ瑠総意罵蛍臣りふb心題滋程Q椅婁彗堕撃−麗定墜軍人かl
卜の区

工

128

19．E−64−Cの一般薬理作用

3．モルモット摘出心房標本に及はす影響
1） E−64−Cの影響
E−64−ClO￣5g／ml，10一一g／mlならびに10−3g／mlのいずれの濃度の適用によっても，心房標本の自発性収縮回数には影響が認められなかった（図7，A．B．C）。またE−64−ClO，5g／ml
ならびに10￣一g／mlの両濃度においては，心房の自発性収縮高には著明な影響が認められなかったが（図7，A．B；表1），E−64−Cl0−3g／mlの濃度では収縮高の減少（対照値の94土3％，
P＜0・01，N＝18）が認められた（図7，C；表1）。

収縮（間接刺激）について調べてみると，適用後収締高の減少（対照値の80土19％，N＝3）が認められた（図8，G；表1）。
3）トリスー塩酸緩衝液による影響
トリスー塩酸緩衝液（0．35ml，栄養液中でのpH7・61）により変化は認められなかった（図8，H）。
4）10％塩化ナトリウム溶液による影響
10％塩化ナトリウム溶液（0．35ml）の適用により収縮高の減少が認められた（図8，Ⅰ）。以上の諸結果は直接刺激の場合でも同じであった。なお10￣3g／ml，10−4g／mlの濃度のE−642）飽和炭酸水素ナトリウム溶液の影響−Cを反復適用すると適用直後一過性の収縮増

飽和炭酸水素ナトリウム溶液（0．35ml）の大が認められる例があった（蓑1の（）内）。

適用によって収締高の減少が認められた（対照またこのことは飽和炭酸水素ナトリウム溶液

値の80土3％，P＜0．01，N＝5；図7，D；
表1）。

（0・35ml）においても認められた（表1の（）内）。

3）10％塩化ナトリウム溶液の影響
10％塩化ナトリウム溶液（0．35ml）の適用によって収縮高の減少が認められた（図7，E）。
4・ラット摘出槙隔神経一枝隔膜標本に及ほす影響
梼隔神経一横隔膜標本の横隔膜筋を電気刺激する直接刺激と横隔神経を電気刺激する間接刺激により筋収縮を惹起させ，E−64−Cの影響を検討した。刺激強度は両刺激とも刺激電圧が考察

E−64−Cは10．5g／ml，10−4g／mlの両濃度
では摘出回腸標本の自発収縮ならびに電気刺激により誘発された収縮に対してほとんど影響を及ぼさないと考えられる。また E−64−ClO−‡
g／ml適用により自発性ならびに電気刺激による収縮が増大したが，この収縮増大にはE−64−

0・4〜1・8V，刺激持続が0・2msec，刺激頻度が0・2Hzであった0図8のA，B，C，G，H，Ⅰは間接刺激による，また図8のD，E，Fは直接刺激による筋収縮とそれに対するE−
64−Cの各濃度の影響を示している。
1）E−64−Cの影響

Cを溶解している飽和炭酸水素ナトリウム溶

E−64−ClO￣5g／ml適用により両刺激による筋収縮ともその収縮高に変化は認められなかった（図8，A．D；表1）。また10−4g／ml適用
により収縮高がやや減少し（図8，B．E；表1），10￣3g／mlでは両刺激による収縮高の減少（直接刺激89土7％，P＜0．01，N＝9；間接刺激88土8％，P＜0．01，N＝9）が認められた（図8，C．F；表1）。
2）飽和炭酸水素ナトリウム溶液の影響
E−64−Cの溶媒である飽和炭酸水素ナトリウ
ム溶液の作用を横隔神経刺激により惹起させたえられる。またE一朗−ClO￣3g／mlの収縮増大液が関与している可能性が考えられ，10％塩化ナトリウム溶液で収縮が増大し，トリス一塩酸緩衝液で影響が認められなかったことから，この収縮増大の要因の1つには栄養液中でのナト
リウム・イオン濃度が関与している可能性が考は抗histamine薬であるdiphenhydramineの適用により収縮高が減少したという結果から，その一部には，histamine遊離作用が関与している可能性も考えられる。またE−64−C
は10−3g／mlの濃度でACh，histamineによる回腸標本収縮には影響を与えないものと考えられる。
モルモット摘出輸精管標本に E−64−Cl0−5
g／ml，10￣一g／mlならびに10−3g／mlの濃度のものを適用しても影響が認められなかった。ま129

Ⅳ 個体レベルでの効果

たE−64−ClOT3g／mlの前処置によりnorad−
renalineによる収縮にも影響を及ぼさなかったが，このことはE−64−Cが10￣3g／ml以下の濃度において摘出輸精管標本には影響を及ぼさないものと考えられる。
E−64−Cは10￣3g／ml以下の濃度ではモルモ
ット摘出心房標本の自動性収縮回数に影響を及

標本では収縮高の増大を認め，心房ならびに横隔神経一横隔膜標本では収縮高の減少を認めた。
3．回腸標本のAChおよびhistamine収縮に対して，また輸精管標本のnOradren−aline 収縮に対してE−64−C は10￣3g／mlの濃度以下では影響を及ぼさなかった。

ぼさなかった。またE−64−Cl0−3g／ml適用に4．Diphenhydramine 前処置により，6
例中4例においてE−64−C10−3g／ml適用によより自動性収縮の収縮高減少が認められたが，る回腸標本の収縮の減弱を認めた。

この要因の1つには，E−64−Cの溶媒である飽

5．飽和炭酸水素ナトリウム溶液（0．三5ml）

和炭酸水素ナトリウム溶液の栄養液中でのナト
リウム・イオン濃度の影響が考えられる。

および10％塩化ナトリウム溶液（0．25ml）適直接刺激ならびに間接刺激により誘発された用により回腸標本では収縮高の増大，心房ならびに横隔神経一横隔膜標本では収縮高の減少がして，E−64−C各濃度での影響に差異は認められ認められた。
6．栄養液のPHがE−64−ClO￣3g／ml適用なかった。このことからE−64−Cが10￣5〜10￣3

時とほぼ等しいトリスー塩酸緩衝液（0．35ml）

g／mlの用量範囲内で神経・筋接合部の興奮伝適用により，回腸，心房ならびに横隔神経一横達に影響を与えるものではないと考えられる。
またE−64−Cl0−4g／ml，10￣3g／mlで両刺激

隔膜標本の収締高には変化が認められなかった。

ラット摘出横隔神経一横隔膜標本の筋収縮に対による収縮高が減少することが認められたが，この要田の1つには溶媒として用いた飽和炭酸
水素ナトリウム溶液の栄養液中でのナトリ ウ
ム・イオン濃度が関与している可能性が示唆される。またE−64−Cl0−1g／ml，10．3g／mlの反復適用後，E−64−C と飽和炭酸水素ナトリウ
ム溶液（0．35ml）により基線が上昇し収縮高の増大が認められたが，この変化は他の回腸標
本，輸精管標本ならびに心房標本については認
められないものであった。この原因には横隔神経一横隔膜標本の薬物に対する感受性の変化も考えられ今後の検討を必要とする。
要約

モルモット摘出回腸，輸精管，心房ならびにラット横隔神経一横隔膜標本を用い，それらの自発収縮ならびに電気刺激により誘発される収縮に及ぼすE一朗−Cの影響を検討した。
1．E−64−Cは10￣5g／ml，101g／mlの濃度において，いずれの標本においても著明な影響を及ぼさなかった。
2．E−64−Cは10￣3g／mlの濃度において，輸精管標本では影響を及ぼさなかったが，回腸
130

文

献

1）福原武彦：E−64の一般薬理作用一特に呼吸・循環捺能及び中枢神経系に及ぼす影響−，昭和54年
度本研究報告書，p・63−79，1979・
2）福原武彦：E−64−Cの一般薬理作用一柳こ呼吸・循環揆能及び中枢神経系に及ぼす影響−，昭和55年度本研究報告書，p・141〜158，1980・
3）木口百合子，後藤和利，高野一夫，西川嘉凧
八反丸善文，宮川政昭，亀井淳三，福原武彦：後生物二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の呼吸，循環枚能および脳波に及ぼす影響．慈恵医大誌，96，p．701〜711，1981．
4）木口百合子，高野一夫，西川嘉仲，八反丸善丸
宮川政昭，木村直史，福原武彦：E−64額縁体（E−64−C）の循環餃能に及ぼす影響，慈恵医大誌，97，
p．1〜9，1982．

5）木口百合子，福原武彦：ウサギ，ネコの横隔神経発射活動に及ぼすE−64の影響，東京慈恵会医科大学昭和55年度学内共同研究報告乱p，74〜77，
1981．

20．E−64−Cのグルタチオン関連酵素系への影響

北 川 晴 雄＊研究協力者 佐 藤 哲 男＊ 五十嵐

研究目的

隆＊

ml／100g体重の割合で同様に投与した。
動物は断頭潟血後，肝をとり出し，その湿重昨年度までは，E−64およびその誘導体の一量を測定後1．15％KClにて濯流し，肝重量のつであるE−64−Cの薬物代謝酵素活性に対する影響を検索した。本年度はE−64−Cのラット肝4倍容の1．15％KClを加えてホモジナイズした。この様にして得られた20％ホモジネートをグルタチオンレベルおよびその関連酵素である

さらにガーゼを通して肝血管等の線維質を除い

γ−グルタミルトランスべプチダーゼ（r−GTP），

た後使用した。その4mlとノタリン酸を含む

グルタチオンS−トランスフェラーゼ（GST）およびグルタチオンベルオキシダーゼ（GSH−

リン酸緩衝液〔25％HPO3：0．1Mリン酸−
5mMEDTA緩衝液（pH8．0）＝1：3．75〕4ml

Px）活性とγ一ダルクミルシステイン合成酵素（γ−Glu−Cys−Synthetase）活性をinvivoでをよく混和し，105，000×g30分間，00Cにて測定した。グルタチオンは生体常成分として酸化還元系を維持する上で重要な役割をもってい超遠心分離を行い，その上活を還元型（GSH）
および酸化型（GSSG）グルタチオン量の測定に用いた。さらに残りのホモジネートは常法にると同時に，近年では薬物の活性代謝物の処理機構に深く関与していることが明らかにされて分と細胞質（Cytosol）画分とに分離した。Ms

いる0そこでE−64−Cが医薬品として臨床の場において広く用いられる場合のグルタチオンの材料とした。GSHおよびGSSG量は，Hissin

動向を知ることは，極めて意義あることと考える。
実験材料および方法

従い超遠心分離により ミクロゾーム（Ms）画
画分は，一定量の1．15％KClに懸濁して酵素
andHilfの方法1）により螢光光度計（日立MPF−4形）を用い助起波長350nm，螢光波
長420nmで測定した。またホモジネート，Ms

体重200〜248gのSD系雄性ラットを使用

およびCytosolのγ−GTP活性は，Orlowski
and Meisterの方法2）を一部改良したSatoh

し，飼育期間中は恒温，恒湿の条件下で飼育しらの方法3）で測定した。さらにCytosolのグた○動物は日本クレアKKのラット・マウス用

ルタチオン ベルオキシダーゼ活性は，Paglia

飼料（CE−2）を与え，飲料水は自由に摂取させたo E−64−Cは，7〜8％NaHCO，を含む生理食塩水に用時溶解し50mg／kgの割合で皮下授与した。なお対照群には生理食塩水を0．5

andValentineの方法4）の改良法5）を用いた。

−ジニトロベンゼン（CDNB）を用い，Habig＊千葉大学薬学部薬効・安全性学講座薬物学研究室−Synthetase活性は，Sekura and Meister

CytosolおよびMsのグルタチオンS一トラン
スフェラーゼ活性は，基質として1−ク。ロー2，4
らの方法6）に準じて行った。さらにγ−Glu−Cys

131

Ⅳ 個体レベルでの効果
表1E−64−C投与によるラット体重および肝重量への影響
ControI

Body weight（g）Liver weight（g）Treated三58．5土7．08

263．2土4．28

11．47土0．44

11．70土0．24

Rats were treated with E−64−C at a dose of50mg／kg，S．C．for5days．（n＝10）

表2 E−64−C投与によるラット肝蛋白質回収率への影響
Contorl

Treated

Homogenates（mg／gliver）
Microsomes（mg／gliver）

164．04土3．36

156．52±1．31

14．11土1．34

12．13土0．29

Cytosol（mg／gliver）

88．24土2．10

86．73土1．31

Rats were treatedwith E−64−C at a dose of50mg／kg，S．C．for5dayS・（n＝10）

表3 E−64−C投与時のラット肝グルタチオン量の変動
ControI

TreatedP

GSH
1651土0・05

1602土0．05（mg／mg prot）
GSSG

10．Ⅳ土0・24

10．24土0．29（mg／gliver）

219，6土5・9（mg／mg prot）

1・別土0・03

176．9土5．7
1．13土0．04（mg／gliver）

Rats were treatedwith E−64−C at a dose of50mg／kg，S．C．for5days．（n＝10）

表4E−64−C投与によるラット肝γ−タルクミルトランスベプチダーゼ活性の変動
ControI

Treated

Homogenate（mU／mg prot）

0．73土0．06

0．78土0．08（mU／gliver）
Microsomes

120．2土10．2

122．5土12．1（mU／mg prot）

3．53土0．23

4．25土0．38（mU／gliver）

45．37土2．9

47．30土1．2

0．26土0．01
22．60土1．2

0．27±0．01
23．00土0．8

Cytosol（mU／mg prot）（mU／gliver）

Rats were treated with E−64−C at a dose of50mg／kg，S．C．for5days．（n＝10）132

20．E−64−Cのグルタチオン閑適酵素系への影響
表5

E−64−C投与によるラット肝グルタチオソS一トランスフェラーゼ活性の変動
ControI

TreatedCytosol（nmole／min／mg prot）

829．01士18．06（〃mOle／min／gliver）
Microsomes

73．16土2．24

810．31±24．62
70．34土2．55（nmole／min／mg prot）

91．57土2．77

90．45土7．59（FLmOle／min／gliver）

1．29土0．13

1．10土0．09

RatsweretreatedwithE−64−Catadoseof50mg／kg．S．C．for5days．（n＝10）

表6 E−64−C投与によるラット肝グルタチオンベルオキシダーゼ活性の変動
ControI

TreatedHydrogen peroxide（nmole／min／mg prot）

217．50土6．80（〃mOle／min／gliver）

19．16±0．66

207．50土10．35
18．05土1．08（nmole／min／mg prot）

431．84±18．29

431．37±14．69（〃mOle／min／gliver）

38．05士1．59

37．54土1．80

Cumene hydroperoxide

RatsweretreatedwithE−64−Catadoseof50mg／kg，S．C．for5days．（n＝10）

表7 E−64−C投与によるラット肝γ−ダルクミルシステイソ合成酵素活性の変動
Plformed

controI

Treated（〝mOle／min／gliver）

1．132土0．390

1．252土0．075（nmole／min／mgprot）

12．86士0．43

14．40土0．85

RatsweretreatedwithE−64−Catadoseof50mg／kg，S．C．for5days．（n＝10）の方法7）に準じ，生成した無機リンを Fiske

られなかった（表2）。

andSubbaRowの方法8）により定量し，その2）E−64−C投与による肝グルタチオン王に対する影響値から算出した。なお，ホモジネートの蛋白量はLowryらの方法9）により，MsとCytosol

還元型グルタチオン（GSH）量は，E−64−Cの蛋白量は，Gornallらの方法10）により定量した。

投与により，対照群と比較して有意な変動は認結果められなかった（表3）。しかしながら，GSSG
量はE−64−C投与により対照群と比較して有意な減少を示した。

1）E−64−e投与による体重，肝重量および蛋白回収率に対する影響

3）E−64−C投与によるグルタチオン関連酵素系に対する影響

E−64−C50mg／kgの5日間，連続投与によグルタチオンの唯一の分解酵素であるγ−

り体重および肝重量は対照群と比較して有意な変動は認められなかった（表1）。また，ホモ

GTPは，生体内ではその大部分が膜結合性であり一部は可溶性でも存在する。そこでホモジ

ジネート，MsおよびCytosolのg肝あたり

ネートのみならず，MsとCytosolに分離し，の蛋白量においても対照群との間に有意差はみそれぞれのγ−GTP活性を測定した（表4）。
133

Ⅳ 個体レベルでの効果

その結果，ホモジネートおよびCytosol両者

かし，この点に関しては肝の細胞膜分画を行において，いずれも対照群と比較して有意な活い，さらに詳細な検討を待たなければならな性の変動は認められなかった。ここで，Msのい。GSSG

γ−GTP活性はE−64，C投与群において対照群

能性としてはグルタチオンレダクターゼ活性がと比較して若干の活性増加が認められたが，有E−64−C投与により阻害されることが考えられ

意な変動ではなかった。

るが，GSHまた，グルタチオンS一トランスフェラーゼ

レベル減少の原因として，他の可の可能性は少ないように思われる。

活性はCytosolおよびMsいずれにおいても対照群と比較して有意差はみられなかった（表5）。

レベルが変動しないことから，こ

文

献

ベルオキシ

1）Hissin，P．J．and Hilf．R・：AnaL Biochem・，
74，214−226，1976．

ダーゼ活性は，基質としてH202，クメソヒド

2）Orlowski，M．and Meister，A・：Biochim・

さらにCytosolのグルタチオン

ロパーオキシドいずれを用いた場合も対照群と比較して有意な変動は認められなかった（表6）。

Biophys．Acta，73，679−681，1963・
3）Satoh，T．，Takenaga，M・，Kitagawa，H・and
Itoh，S．：Res．Comm．Chem．Path．Pharmacol・，
30．151−161，1980．

また，グルタチオン合成系における待速酵素であるγ−Glu，Cys−Synthetase活性は，E−
64−C投与により有意な変動を示さなかった（表7）。
考察および結論

4）Paglia，D．E．and Valentine．W・N・：J・Lab・
Clin．Med．，70，158−169，1967．
5）Reddy，C．CりTu．Chen−PeiD・，Burgess，J・R・，Ho，Chih−Ying，SchoIz．R．W．and Massaro，E・J．：Biochem．Biophys，Res．Commun・，101，970−978，1981．

6）Habig，W．H・，Pabst，M・J・andJakoby．W・

本研究においてはE−64−C（50mg／kg）5日間連続投与により，肝GSSG レベルのみが顕著に減少した。グルタチオン合成にあずかる
γ−Glu−Cys−Synthetase活性は，有意な変動は認められず，生体内グルタチオンの調節に関与する酵素として γ−GTP，GSH−Px および
GSTなどが知られているが，そのうちGSH−
PxとGST活性は，ほとんど有意差を示さなかった。γ−GTP活性は肝において細胞膜に局在Lll），Ms画分中にも膜結合性として存在す
る12）ことから，E−64−C投与によるGSSGの著明な減少は，GSSGがT−GTPの基質として分解されたことに起因する可能性がある0 し

134

B．：J．Biol．Chem．，249，7130−7139，1974・
7）Sekura，R．andMeister，A・：J・BioL Chem・，
252，2599−2605，1977．

8）Fiske，C．H．and SubbaRow．Y・：J・Biol・Chem．，66，375−400，1925・
9）Lowry，0．HリRosebrough，N・J・，Farr，A・L

and Rhndall，R．L．：J．Biol．Chem．，193，265−
275，1951．

10）Gornall，A．G．，Badawi11，C・S・and David．
M．M．：J．Biol．Chem．，177，751−759，1949・
11）Smith，G．D．and Peters，T・J・：Eur・J・
Biochem．，104，305−311，1980．
12）Ratanasavanh．D・，Tazi，A・，Galteau，M・M・
and Siest，G．：Biochem．Pharmac．，28，1363−
1365，1979．

21．E−64およびその類縁体の筋ジストロフィーハムスターに対する薬効に関する研究＊

隆勇旭司文和

辺

＊
＊
＊
＊
＊

和清貞弘

田極熊村原

＊大正製薬株式会社総合研究所

渡潮京中大相BIO−Research ConsultantsInc．，（ボストン，米国）から入手した7週令のBIO14．6系雄性ハムスター（発症系）およびBIOFIBbybrid
雄性ハムスター（無発症系）を1群10匹あて群
別し，1週間の予備飼育後実験に用いた。
2．投与量および投与方法
供試した薬物の化学構造を表1に示す。E−64−aおよびCは0．1％Tween80を含む0．5％CMC溶液に溶解し，E−64，Ep−453およびEp−487は同液に懸濁して用いた。投与量はいずれも75mg／kgとし，体量100g当たり0．2

＊

1．動物

＊

法

＊

方

＊

験を行い，以下の結果を得たので報告する。

＊

E−64およびその類縁体の予備的な薬効評価試＊トロフィーハムスターBIO14．6系を用い，美ような観点から，今回入手が可能となったジス

明忠代子紀雄＊価することも重要であろうと考えられる。この

正道寿敏和道＊が，今後種々のモデル動物に対して多面的に評＊＊物としてジストロフィー鶏が重用されてきた

弘＊

これまでE−64の薬効評価のためのモデル動村島野木田地木笹網柏花倉＊的正

関男子夫晴靖陽＊大保礼健正恵博

本沢竹井崎木目

樽篠大玉岡荒研究協力者

mlの液量で1日1回49日間にわたり腹腔内に連続投与した。また，対照群（発症群および無発症群）には同量の溶媒のみを与えた。
3．検査項目およびその方法（1）運動揆能測定：別途報告1）した慣斜板法および強制水泳法により，後肢筋力を1週間間隔で測定した。
（2）血液生化学的分析：薬物の最終投与から24
時間後，ベントパルビタールナトリウム麻酔下に外腸骨動脈より採取した新鮮血を遠心分離し，得られた血祭（ヘパリン処置）についてオートアナライザー（日立分析装置712型）により，GOT，GPT活性（UV法），LDH活性（UV法），CPX活性（01iver変法），PK活性（Beisenherg変法）を測定した。
（3）筋酵素活性の測定：外腸骨動脈切断により放血致死せしめた各動物の大腿四頭筋，心臓および肝臓を別出し，−800Cに凍結保存した後，沢田らの方法2）に従って大腿四頭筋，心臓，肝臓のCathepsinB＆L，DおよびAcidpt10S・
phatase活性，大腿四頭筋のCa2◆activatedneutralprotease（CANP）活性を測定した。
（4）組織学的検査：心臓，前脛骨筋，長祉伸筋およびヒラメ筋を別出した後，液体窒素で冷却したイソベンタンで凍結し，約10〝の横断切片を作り，H．E．染色標本を作製して，各群に135

Ⅳ 個体レベルでの効果

Rl。ご〉C▽CくN冨CO￣R2
1

F

CH

／＼
CH，CHユCompounds

1．E−64

RI

H

Rl
NH（CH2）一NHC−NH2
11NH
2．E−64−aH

NH（CH2）。NH2

3．E−64−C

H

NH（CH2）2CHく諾

4．Ep−453

Et

5．Ep−487

Et

表2

NH（CH才）一NHCOCH】

正常ハムスターおよび筋ジストロフィーハムスターの血策中酵素活性
Normal Dystrophy
BIO FIB BIO14．6

CPX

IU／ml

1．1土0．9

14．9土11．5＊＊

PK

IU／ml

0．6土0．2

22．7±14．4＊＊

LDH mIU／ml
GOT K−U

201±76441土127＊＊

31±9

222士65＊＊

GPT

21士11

93±29＊＊

K−U

n＝10

Mean土S．D．
Significant difference from normalhamsters＊＊P＜0．01

おける病変を光顕下で観察した。また，必要に応じて，Masson S trichrome，酸化酵素反応（NADH−TR）およびカルシウム同定のための
GBHA染色を行い観察した。
結果および考察
1．運動機能（1）傾斜板法：薬物投与前の8週令時の測定において，すでに群間に落下角度の有意な差が認められたことから，各群の8週令での落下角度を基準とし，下記の式により落下角度係数を求め，その結果を図1に示した。
落下角度係数＝

T．Ⅴ．−Ⅰ．Ⅴ．
Ⅰ．Ⅴ．

×100

Ⅰ．Ⅴ．：8週令での落下角度
T．Ⅴ．：測定時の落下角度
136

無発症群の落下角度係数はその後の加令によってもほとんど変化しなかった。他方，発症対照群の係数は11遇令までほ減少し，12週令以降は回復が観察された。
薬物投与群ではE−64−C投与群を除いていずれも発症対照群との問に有意な低下が認められた。すなわち，E−64，Ep−487，Ep−453，E−64−a
投与群の順に落下角度係数の減少が大きくなった。この結果は，体重の自然増加抑制作用の結果と相関することから，薬物の全身的な副作用の影響を反映した可能性も考えられる。
（2）強制水泳法：250Cの水を入れたプラスチ
ック製シリンダー内で，ハムスターを強制的に5分間泳がせた時の左後肢の水かき回数を1分かこ測定した。測定は薬物投与前の8週令時と9，11，12，14過令時に行った。発症対照群の21．E−64およびその類縁体の筋ジストロフィーハムスターに対する薬効に関する研究

（％）

C

〇

BIO FIB♯p＜0．05・・p＜0．01●・一一一一一一一一一一一●Control

00t X

mMW田町い．
A．
−．A．Ⅰ−．A．↑〇− −＋〇 E−64
×−一一−×E−64−ar￣￣→コ．一二

E−64−C

震二二二＝轟〆一▲一一一一一一一一一▲Ep−453
D−一一・・・・・・・□Ep−487

8

9

10

11

H（W。eks）

12

図1 E−64およびその類縁体を投与した筋ジストロフィーハムスターの運動機能への影響（傾斜板法）

＼ノブへ竃

2 0
1 0
0 0

hl叫＞コUくqEコーP亡≡

9 0
8〇一一・OBIO FIB＝

9l＝Control∇」−」▽E−64，C T TEp−453
図2

古

lb

＝l■4（耶eks）△T−「△E−64
ロー一・□Ep−487

上．

A E−64−aHp＜0．01

E−64およびその類縁体を投与した筋ジストロフィーハムスターの運動椴能への影響（強制水泳テスト法）
137

Ⅳ 個体レベルでの効果

GPT

GOT

12

3

4

5

6

12

3

4

5

6

12

3

巨ヨ：NormalControl（BIOFIB）［コ：1．Dystrophic Control（BIO14．6）2・E−64
4．E−64−C 5．EpT453 6．Ep−487
IP75mg／kg，7weeks

・p＜0．05

3・E−64−a■・p＜0・01

図3 E−64およびその類縁体を授与した筋ジストロフィーハムスターの血焚中
GOT，GPTおよびLDH活性

1

2

3

4

5

6

Eヨ：NormalControl（BIOFIB）［コ：1．DystrophicControl（BIO14．6）2．E−64 3．E−64−a
4．E−64−C

5．Ep−453

6．Ep−487

IP75mg／kg，7weeks
図4138

E−64およびその常緑体を投与した筋ジストロフィーハムスターの血策中
CPI（およびPK活性

4

5

6

11．E−64およびその類縁体の筋ジストロフィーハムスターに対する薬効に関する研究

田：BIO FIB
口：BIO14．6
1：ControI
2：E−64
3：E−64−a
4：E−64−C
5：Ep−453
6：Ep−487

図5 E−64およびその類縁体を授与した筋ジストロフィーハムスターの臓器中Cathepsin B＆L活性

田：BIO FIB［］：BIO14．6
1：Contro1
2：E−64
3：E−64−a
4：E−64−C
5：Ep−453
6：Ep−487

図6 E−64およびその類縁体を授与した筋ジストロフィーハムスターの筋肉中CANP活性

5分間の回数を無発症群と比較したところ，8
週令時にすでに有意に（P＜0．01）低下していた。しかし，以後加令に伴う水かき回数の減少はみられず，（1）と同様に機能低下の進行状態は観察できなかった。各薬物の投与前の回数を基準にして薬物投与の影響を経時的にみてみると，無発症群では土10％程度の変動範囲であったのに対し，E−64投与群では30日後に有意（P＜0．01）な増加が認められた。しかし，その他の薬物では発症対照群と同じ様な変動範囲内にあった（図2）。
本実験に供したジストロフィーハムスター
は，すでに充分症状の進行した成令動物であり，
この時点で運動按能にかなりの個体差がみられた。しかし，実験期間内では後肢機能の顕著な低下は観察されなかった。このような現象は動物の訓練効果も否定できないが，骨格筋における症状の進展が緩徐であることを示唆している
ものと考えられる。また，このことは筋緑経の壊死と同時に旺盛な再生線経が組織学的に観察
139

Ⅳ 個体レベルでの効果

田：BIO FIB□：BIO14．6
1：Contro1
2：E−64
3：E−64−a
4：E−64−C
5：Ep−453
6：Ep−487

図7 E−64およびその類縁体を投与した筋ジストロフィーハムスターの臓器中Cathepsin D活性田：BIO FIB
［コ：BIO14．6
1：Contro1
2：E−64
3：E−64−−a4：E−64−C
5：Ep−453
6：Ep−487

図8 E−64およびその類縁体を投与した筋ジストロフィーハムスターの臓器中Acid phosphatase活性される事実と符合し，この種の機能検査から薬効を判断する場合，発症の初期からの変化を追跡する必要のあることが示唆される。本実験の結果を踏まえ，今後はより信板性の高い評価法の確立を急く・必要があろう。
2．血液生化学分析
140

発症対照群において血菓中のGOT，GPT，
LDH，CPKおよびPKの活性はすべて無発症群より高く，特にCPX，PKの上昇はそれぞ
れ約4倍，38倍と顕著であった（表2）。
E−64投与群のGPT活性およびEp−453投
与群のGOTおよびGPT活性に有意な低下が21．E−64およびその類縁体の筋ジストロフィーハムスターに対する薬効に関する研究
表3筋ジストロフィーハムスター（BIO14．6）の骨格筋壊死に対するE−64
およびその類縁体の抑制効果
Necrotic

No．
Treatment ofchanges（Severity．Grade0−4）￠

animal Tibialisanteriorm．
01

ControI

0
1

E−64

0
1

E−64−a01

E−64−C
80

Ep−4531

Ep−487

Extensordigitorum soleusm．
longus m．

1．9±0．5

0．4土0．2

1．0土0．4

1．5土0．4

0．0土0．0

1．2土0．5

1．8土0．4

1．5土0．6

2．2土0．6

2．0土0．5

0．6土0．2

0．7±0．3

0．3土0．2

1．5土0．5
2．0土0．7

2．4土0．5

0．2土0．1

1．9土0．5

d Means±S．E．
表4筋ジストロフィーハムスター（BIO14．6）の心筋壊死および石灰沈着に対するE−64
およびその類縁体の抑制効果

No．
Treatment of

Body Wt．（g）A Necrotic changes Calcium deposition

animal Initial Final Incidence Severity4（％） （Grade OL4）

77．2土1．1 99．4土2．3

Ep−4538

76．9士1．3

87．0土1．3

Ep−4871077．2土1．5

97．4士2．2

Normal（F．B bybrid）

10

91．8土0．7 116．3土1．5

0
0
1

10

0
0
1

E−64−C00
1E−64−a77．2±1．4 100．3土1．9
77．0土1．6
97．7土1．700177．2±1．1 106．2土2．0

10
10

0
0
1

10

E−64

0
0
1

ControI

2．2土0．4
2．1±0．2
2．3土0．3

Severitya（Grade0−4）
2．2土0．4
2．2土0．3
2．3土0．3

2．5±0．2

3．2士0．4

1．0土0．2＊
1．7土0．3

1．4土0．3
2．8土0．4￠Means土S．E．
＊P＜0．05453投与群において顕著であった（図5）。こ

みられ，CPK，PX，LDHの活性にもそれぞれ低下傾向がみられた（図3，4）。
ジストロフィーハムスターの血祭酵素活性の上昇に関しては，Liuら3）の報告とよく慣向を一にするが，個体間のばらつきは大きい。この
一つの原因として採血法の問題があり，Bulein
ら4）やLiuらは心臓より直接採血している。
我々は組織標本等採取の都合上，便宜的に外腸骨動脈からの採血法を選んだ。この点に関して
はさらに改良する必要があろう。

一方，筋中CANP活性についてみると，薬物投与により低下傾向がみられ，特にEp−487とE−64−C投与群では有意であった（図6）。

3．組織中の酵素活性の変動
発症対照群の筋（大腿四頭筋）中Cathepsin
B＆L 活性は無発症群に比べて約6倍に上昇

E−64−CのCANP とCathepsinに対する阻害挙動の違いは，両酵素のturnOVer速度に起因するものと考えられる。今回心臓のCANP

し，心臓，肝臓でも上昇傾向がみられた。薬物投与によりこの活性は強く抑制され特にEp一

活性は標本量の関係で測定できなかったが，骨格筋と併行して今後詳細に検討していきたい。

の結果は後述する心筋壊死の抑制作用とよく相関し，プロテアーゼの阻害による症状改善が示唆された。E−64−C投与群では強い阻害作用は認められなかったが，この薬物の場合，臓器細胞中からの消失が早く，最終投与24時間後では酵素活性の回復のあったことが考えられる。

141

Ⅳ 個体レベルでの効果

−→・

■

十

∴｛■

圭二圭∴
■

l

写真1前脛骨筋×200

写真4 心筋（発症対照群）×100 HtE・障害領域。間葉系細胞の増穂を伴う心筋線
経の壊死および石灰沈着。

NADH−TR

▼料、一

＿＿＿：

写真2

長址伸筋

×200

盛を

一

事

写真5 心筋（発症対照群）×100 H・E・心筋線経の壊死。間葉系細胞の著しい増殖ウ

NADH−TR

毒素写習＿二一三一●∵言．㌔−−

，

←

㌧

■■鮫

▼

＿＿

■■

．
▲ま

？て丁二二二‥l

一・舜1如くー

一■−

一

た．￣▲
ヽ丁一、㌢ノぐし

穀倉▲−常還璧牽攣 竺補選＿ゴー
写真3

ヒラメ筋

Cathepsin D

×200

と

につ

いては，筋中CathepsinDを除いて発症対照群と無発症群の間に有意な差はなかった（図7，8）。薬物投与により筋中 Cathepsin D は低下傾向が認められたが，この理由については現
142

一句ら

・ こ．・1
・←▲■

●

′r・

今、・一二・二．蓑

写真6 心筋（発症対照群）×100 H・E・
石灰沈着。

NADH−TR

Acidphosphatase●一

段階では充分に説明できない。
4．組織学的検査
本報で供試した骨格筋は前脛骨筋，長址伸筋
およびヒラメ筋で，前二者は自筋，後者は赤筋に属し，NADH−TR染色で自筋は陽性と陰性

21．E−64およびその類縁体の肪ジストロフィーハムスターに対する薬効に関する研究の混在，赤筋は陽性の線経からなり，両者の区別は容易である（写真1〜3）。発症対照群における骨格筋病変の特徴は，個体差が大きいものの，概して中心核を有する再生線経が数多く，
壊死線経が比較的少ない点である。最も幼君な再生線経は多核で胞体の好塩基性小型化を呈し，いずれも集団をなして散在し，壊死部は増殖した間葉系細胞で占められ三種の骨格筋のうち，壊死線経は長址伸筋において極めて少ない。
各群の1stdckにおける壊死部領域の大きさ，あるいはその散在数からみたSeVerity（その程度によりgradeO〜4の5段階に分けて各々0−4のSCOreを与える）を表3に示す。薬物の作用は自筋においてのみ認められ，Ep−453投与群の前脛骨筋，E−64投与群の長址伸筋において改善憤向がうかがえたが，いずれも
統計的に有意といえる程の変化ではなかった。
発症対照群における心筋の変化は，閉業系細胞の増殖を主徴とした壊死と石灰沈着としてみられた0両者は必ずしも同一部位に共存せず，広汎な壊死巣においても石灰の沈着が少なく，また石灰沈着のかなり多い部位においても壊死性変化に乏しい場合がある。心筋における該所
見はlS柑Ck中に障害域の大きいものから極めて小さいものまで種々の大きさの病変巣を形成して散見される（写真4，5，6）。
各群における心筋l stdckの壊死のSeVeri・tyあるいは石灰沈着の分布状態からみた
SeVerity（上記骨格筋と同様にSCOring）を表4に示す。心筋壊死についてはEp−453投与群において抑制率55％という有意（P＜0．05）な作用がみられたが，他の薬物投群では対照群との間に大きな差は認められなかった。また石灰沈着のSeVerityにおいてもEp−453投与群にのみ抑制傾向が観察された。この結果は血中酵
素活性，組織中のCathepsin等のプt］チアー
ゼ活性の変動とよく符号し，Ep−453の病変進展に対する抑制効果を反映しているものと考えられる。
Ep−453はE−64−Cのエステル体であり，沢田ら2）も報告している様に，ハムスターにおいてE−64−CのprOdrugとしての利用が可能であり，E−64−Cよりも生物学的利用率が高いことから，今後実用化の面で有用であろう。
結論

E−64類縁体をジストロフィーハムスターに49日間腹腔内投与し，運動横能，血中および組
織中酵素，組織学的検査等の評価法をもとに病変の進行阻止効果についてパイロット試験を行った。この結果，E−64−Cのエステル体である
Ep−453に心筋病変を阻止する憤向がみられた。Ep−453は，沢田らの報告2）によればE−
64−CのprOdrug となりうる生体利用性の高い化合物であり，組織学的所見からうかがえた
心筋線経の壊死抑制効果は，同時に測定した血中酵素，組織内プロテアーゼ活性の抑制効果ともよく符合し，少なくとも病気の進行を遅延せしめうる薬物であると考えられる。但し，本薬物は極めて水に難溶であり，そのため投与部位に貯留し，動物に好ましからざる影響を与える
ことも明らかになった。今後製剤学的立場か
ら，剤型の改良，投与方法の改善等が必要であろう。これらを含めて，今回の実験条件は必ずしも充分とは云い難く，今後次の諸点に充分留意しさらに詳細な追加実験が考えられる。
1）ヒトジストロフィーとの異同を明確にする。
2）ハムスターにおける発症および病変の進行と，CANP，Cathepsin等プロテアーゼ活性との因果関係を明らかにする。
3）BIO14．6の骨格筋では壊死線経の再生が旺盛であり，症状の進展は極めて援徐である。したがって，成令の既発症動物を用いて短期間内に薬効を評価することは極めて困難である。今後は，幼令のしかも発症初期の動物を用いるべきであろう。
4）心筋では病変の連続的な進行がみられ，その組織学的評価は有効な手段となりうるだろう。
5）ジストロフィー鶏，マウス等においては
すでに運動機能の評価法が確立しており，ハム
スターにおいても信頼しうる測定法の確立が必143

Ⅳ 個体レベルでの効果

要である。
文

1）大関正弘：本誌
2）沢田二郎：本誌

1443）P．K．S．Liu，E．A．Barnard and P・J・Bar・
nard：Exp．Neuro1．，67，581，1980．
4）I）itta Bulein and Beaumont Hughes：Bio−cbem．Pbarmaco1．，25，981，1976．

微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究班
班 員 および関係者名簿
氏

名・l

施

設

名

l

所

在

地

主任研究者
今相 和友（班長）

東京都老人総合研究所〒173板橋区栄町35−2

江橋一節郎

東京大学医学部第一薬理学〒113文京区本郷7−3−1

杉田 秀夫

東京大学医学部附属脳研究施設 神経内科
徳島大学医学部附属
酵素研究施設 酵素化学部門

分担研究者

勝沼 信彦
西塚 春美

神戸大学医学部第二生化学

福原 武彦（幹事） 東京慈恵医科大学第二薬理学〒113文京区本郷7−3−1〒770徳島市蔵本町3−18−15〒650神戸市中央区楠町7−5−1〒105港区西新橋3−25−8

小沢瑛二郎

国立武蔵療養所
神経セソタ一 概能研究部〒187小平市小川東町2620

野村 達次

実験動物中央研究所〒213川崎市宮前区野川1−33

北川 晴雄（監事） 千葉大学薬学部〒280千葉市弥生町1−33

寺尾 寿夫

帝京大学医学部第一内科〒173板橋区加賀2−11−1市原明

徳島大学医学部附属
酵素研究施設 酵素病理部門〒770徳島市蔵本町3−18−15−

官武正

新潟大学脳研究所 神経内科

〒951新潟市旭町一番町757

石浦章一

国立武蔵療養所
神経センター 疾病研究第一部〒187小平市小川東町2620

大関 正弘（幹事）

大正製薬㈱ 総合研究所〒330埼玉県大官市吉野町ト403

沢田 二郎

大正製薬囲 総合研究所〒330埼玉県大官市吉野町1−403

里書栄二郎

国立武蔵療養所 神経センター〒187小平市小川東町2620

青柳 高明

微生物化学研究所〒141品川区上大崎3−14−23

柴田 宜彦

大阪府立成人病センター 第一内科

〒537大阪市東成区中通1−3−3

薬効・安全性学講座薬物学

班友145