グルカゴン認識ペプチド
並びにグルカゴン検出法
産業技術総合研究所 生命工学領域
健康医工学研究部門 バイオセンシング研究グループ
研究員 重藤 元

2021年9月9日
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本発表で紹介する技術
・グルカゴン受容体から抽出したグルカゴン結合ペプチド・グルカゴン結合ペプチドを用いた簡便かつ特異的なグルカゴン検出方法2

背景・グルカゴンは膵臓のα細胞から分泌されるペプチドホルモンであり血糖値を上昇させる作用を持つ
・血糖値のコントロールにはインスリンよりもグルカゴンが重要な役割を担っているとされる「グルカゴン中心説」が提唱される等、その重要性は増している
膵島組織の分泌する血糖値制御因子
膵島組織
膵β細胞
膵α細胞

インスリン
グルカゴン

血糖値下降作用
血糖値上昇作用3

従来技術とその問題点
グルカゴンには類似のアミノ酸配列を有するペプチドホルモンが多数存在しており、抗体を用いたELISAでは正確な測定は困難であった
グルカゴン（血糖値の上昇）・・・・・・・・・・・・・・・ ・ HSQGTFTSDYSKYLDSRR AQDFVQWLMNTミニグルカゴン（不明）・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ・・・・・ AQDFVQWLMNT
オキシントモジュリン（食欲の抑制）・・・・・・・・・・・・・ HSQGTFTSDYSKYLDSRR AQDFVQWLMNT KRNRNNIA
グリセンチン （インスリン分泌促進）RSLQDTEEKSRSFSASQADPLSDPDQMNEDKR HSQGTFTSDYSKYLDSRR AQDFVQWLMNT KRNRNNIA

配列の類似性からELISAなどの抗体検出が困難
正確なグルカゴン測定には、特異性が高い検出システムが必要
4従来技術とその問題点

保険適応済みグルカゴンELISAキット

体外診断用医薬品
承認番号22800EZX00083000
http://www.cosmic-jpn.co.jp/data/up_img/1485318365-156776.pdf

体外診断用医薬品
承認番号22400AMX01505000
https://www.info.pmda.go.jp/downfiles/ivd/PDF/
670977_22400AMX01505000_A_01_04.pdf

ELISAによる測定では類似体への交差性が10-20%程度見られる

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グルカゴン結合ペプチドの設計
グルカゴン結合ペプチドの探索とグルカゴン検出プローブの設計

目標：抗体を超える特異性、かつ同等の検出感度・類似誘導体との交差性がない
・抗体と同程度のアフィニティ・細胞・生体内での安定性

グルカゴン受容体
・生体内において各類似体を特異的に検出
・生体内（in situ ）イメージングに対応可能

1．受容体配列を利用したプローブ設計
グルカゴン

配列3配列2配列1配列5配列4配列6

グルカゴンーグルカゴン受容体結合様式
Nature, 553, 106–110 (2018)6本研究で用いたグルカゴン結合ペプチド候補
ペプチド配列

配列1配列2配列3配列4配列5配列6
グルカゴン

AEVAAMYSSFQVMYTVGYVLVIDGLLRTRYSQAIGDDLSVSTWKCLFENVQCWTSNDNMGFWWILR

HEVVFAFVTDEHAQGTLRSAALFFDLF
YTVGYIDGLLRTRYSQAIGDDLSVSTWKCLFENVQCWTSNDNMGFWIDGLLRTRY

HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT

AA数18252327272829

・既知のアミノ酸配列からのスクリーニング
・幾つかの異なる配列の組合せ（3次元的な結合を考慮）
・グルカゴンのみを検出するための特異性が期待できる・血中の測定のための細胞・生体内における安定性が期待できる・イメージングで十分に解析可能な高いS/N比が期待できる
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グルカゴン結合ペプチドに修飾した、結合環境により波長の変化する蛍光色素
２．結合環境に応答する蛍光色素の検討
N

緑色蛍光O

S

O

グルカゴン

青色蛍光

N

OSNH

NH
Peptide (配列1-6)O結合Peptide(配列1-6)ペプチドーグルカゴン結合による疎水性環境への変化

受容体ペプチドと環境応答性蛍光色素の融合による特異性の高い、高感度なプローブの開発
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新規グルカゴン検出プローブのグルカゴン結合時の蛍光スペクトル

相対蛍光強度グルカゴンとプローブ反応後の蛍光スペクトル解析結果 (327nm励起)
配列1配列2配列3グルカゴンありグルカゴンなし
蛍光波長 (nm)蛍光波長 (nm)配列5配列6蛍光波長 (nm)蛍光波長 (nm)

相対蛍光強度

配列4蛍光波長 (nm)蛍光波長 (nm)

グルカゴンに対する結合能を有する6種類のペプチド配列による新規プローブを開発

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新規グルカゴン検出プローブのグルカゴン検出
感度測定
グルカゴンとプローブ反応後の蛍光強度測定結果 (327nm励起)
配列5使用

1.543120.50

グルカゴン検出下限；50 nM
配列5使用

5(453nm蛍光強度) /(505nm蛍光強度)

相対蛍光強度213504505506500110100100010000

グルカゴン濃度 (nM)
グルカゴン(nM)・グルカゴン濃度依存的なシグナルが観察された・検出感度は現状ELISAに及ばない
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新規グルカゴン検出プローブのグルカゴン類似体検出(特異性検討)
グルカゴン（血糖値の上昇）
HSQGTFTSDYSKYLDSRR AQDFVQWLMNTミニグルカゴン（不明）AQDFVQWLMNT
オキシントモジュリン （食欲の抑制)
HSQGTFTSDYSKYLDSRR AQDFVQWLMNT KRNRNNIA
グリセンチン RSLQDTEEKSRSFSASQADPLSDPDQMNEDKR HSQGTFTSDYSKYLDSRR AQDFVQWLMNT KRNRNNIA
相対蛍光強度（標的が存在しない際(0)の蛍光を1とした）(インスリン分泌促進)4

各標的100 nMを測定

標的なし

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10配列1配列2配列3配列4配列5配列6本プローブの交差性
ELISAキットの交差性
グルカゴン: 100%
グルカゴン: 100%
ミニグルカゴン: 5.4%
ミニグルカゴン: 18%オキシントモジュリン：18.6% オキシントモジュリン：24%
グリセンチン：0.1%
グリセンチン：14%

既存法(ELISA)と比較して特異性の高いグルカゴン検出が可能

11新技術の特徴・従来技術との比較• グルカゴンとの結合能を有するペプチドの開発• 従来法では1日～の測定時間が必要であったが、サンプルとプローブを混合するだけで迅速かつ特異的にグルカゴンを測定が可能
グルカゴン検出方法の比較

LC-MS/MS

ELISA

プローブによる
イメージング

感度

◎

〇

△

特異性

◎

△

◎

解析速度×△

◎

簡便性×△

◎

コスト×△

◎
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想定される用途• 簡便なグルカゴン検査• 健康診断などにおける血液検査の検査項目にグルカゴンを追加• 研究ツールとして血中グルカゴンのリアルタムモニタリング
13実用化に向けた課題• 現状検出感度がELISAに及ばないため、より強力にグルカゴンに結合するペプチド配列を検討中• 血液サンプルなどでも安定的に測定可能な測定条件の最適化• 蛍光以外の手法(発色など)でも検出可能となるようシグナル産生部位の改良
14企業への期待• 現在医療機関とも共同研究を開始しているが、企業との連携は実現していない。そのためホルモン検査技術に関する製品化の経験(薬事承認など)や、技術を持つ企業との共同研究を希望。
• 研究ツールとしての応用も期待できるため、糖尿病やホルモンの機構解明に興味を持つ企業との共同研究を希望。
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本技術に関する知的財産権• 発明の名称：グルカゴン認識ペプチド並びにグルカゴン検出法• 出願番号 ：特願2019-189244• 出願人：国立研究開発法人産業技術総合研究所• 発明者：重藤 元、鈴木 祥夫、山村 昌平

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お問い合わせ先
産業技術総合研究所
知的財産部 技術移転室
ＴＥＬ 029－862－6158
ＦＡＸ 029－862－6159
e-mail aist-tlo-ml@aist.go.jp
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