関東森林研究 67-1(2016)

論 文

アカマツ針葉および形成層から得られた endophytic bacteria の特徴
Characteristics of endophytic bacteria isolated from Japanese red pine needle leaves and cambium
田中恵＊1・奈良一秀＊2
Megumi TANAKA＊1 and Kazuhide NARA＊2＊１ 東京農業大学地域環境科学部
Tokyo University of Agriculture, 1-1-1 Sakuragaoka, Setagaya, Tokyo 156-8502＊２ 東京大学大学院新領域創成科学研究科
The University of Tokyo, 5-1-5 Kashiwanoha, Kashiwa, Chiba 277-8563
要旨：Endophytic bacteria とは，健全な植物組織に存在し宿主に明らかな病徴や症状を引き起こさないバクテリアである。樹木
根圏には多数のバクテリアが見られ，一部は endophytic bacteria として組織内に存在する可能性が示唆されている。しかしながら，地上部に存在するものについては殆どわかっていない。ヨーロッパアカマツ成木の針葉や枝の endophytic bacteria は地下部のものとは群集が異なるとされているが，このような違いは実生の時点においても見られるのか，また，群集組成に部位や年齢による違いが見られるか調べるために，苗畑で育苗された当年生及び３年生アカマツ実生の針葉及び茎・形成層から希釈平板法を用いてバクテリアを分離し種を推定した。その結果多くは Bacillus 属や Burkholderia 属あるいは放線菌などで，特に形成層には Burkholderia 属が多く見られた。一方，針葉は Bacillus 属が多く，比較的単純なバクテリア相であることが明らかになった。
キーワード：アカマツ実生，内生バクテリア，地上部，Bacillus 属，Burkholderia 属
Abstract: Endophytic bacteria are defined as bacteria that colonize healthy plant tissue without causing obvious disease or producing obvious
injury to the host. Numerous bacterial species have been described in plant rhizosphere, and many of them colonize plant roots as endophytic
bacteria. However, little is known about what bacteria exist in aboveground tissues of plants. A few studies have shown that endophytic
bacteria in needle leaves and branches were different from those of roots in mature Scots pine trees. To investigate whether these differences
are also observed in young seedlings, we studied endophytic bacteria in needle leaves and stem/cambium of 1st-year and 3rd-year Japanese
red pine seedlings using dilution plate methods and compared them with rhizosphere bacteria in previous studies. As a result, many
endophytic bacteria in above-ground tissues included Bacillus, Burkholderia, and actinobacteria species. Specifically Burkholderia or
Methylobacterium were dominant in the cambium of 3rd-year seedlings, while Bacillus was dominant in needle leaves. These endophytic
bacterial communities were relatively simple than that of rhizosphere bacteria.
Keyword：Pinus densiflora seedling, endophytic bacteria, aboveground tissue, Genus Bacillus, Genus Burkholderia
Ⅰ はじめにても同様の群集組成を持っているのだろうか。また，地上“endophytic bacteria” は内生バクテリアとも呼ばれ，健全な植物組織に存在し宿主に明らかな病徴や症状を引き起こ部の中でも針葉，あるいは茎や形成層といった部位によりバクテリア群集は異なるのだろうか。

さないバクテリアである（１）。樹木根圏には多数のバクテ

さらに，endophytic bacteria が植物体内にいつ，どうやっリアが見られることが知られている（３，９）が，その一て侵入するのかについてもあまりわかっていない。ヨーロ部は根圏や根面といった根の表面ではなく根内，すなわちッパブドウの根面に蛍光標識した Burkholderia phytofirmans

組織内に endophytic bacteria として存在する可能性が示唆さを直接接種した実験例では時間を追うごとに接種バクテリれている（７）。しかしながら，特に木本植物の地上部に存アが根内から花軸，さらに実の中に移動していく様子が観在するendophytic bacteria については殆どわかっていないの察されている（２）ことから，endophytic bacteria は植物体が現状である。地下部である外生菌根圏では樹種に関わら内を移動しコロニーを形成する可能性が考えられている。

ず，主にプロテオバクテリアに属する培養可能なバクテリ

本研究はアカマツ（Pinus densiflora）実生を材料とし，苗アが優占することがわかっている（10）が，地上部におい畑に播種された当年生及び 3 年生実生の針葉及び茎・形成－ 121 －(2016 年 3 月 17 日受理)

層から希釈平板法を用いてバクテリアを分離し種を推定

滅菌水１ml を入れたマイクロチューブに入れたものを１することで，endophytic bacteria が実生のどの段階から存在次希釈とした。２次希釈まで作成し，実生と同様に YG 培するのか，年齢や部位による群集構造の違いについて調べ地にシャーレ１枚あたり 100μL ずつ塗布し暗黒下 25℃でた。また，10 年生稚樹及び成木から導管流を採取し，同様培養した。作業途中でのコンタミネーションの有無を確認の 手 法を 用い てバ クテ リアの 分 離を 試み るこ とでするため上記の作業を滅菌水のみでも行った。

endophytic bacteria が樹木体内を移動する可能性についても検討した。

Ⅲ 結果と考察Ⅱ 材料と方法の分離及び推定 ２次希釈液の培養によって得られたバク１．アカマツ当年生・３年生実生の endophytic bacteria
１．アカマツ当年生・３年生実生の endophytic bacteria

テリアの平均コロニー数を図－１に示す。針葉と茎・形成の分離及び推定 アカマツ実生は，東京都西東京市の東京層ではコロニー数に大きな違いがみられた。針葉は年齢に大学大学院農学生命科学研究科附属演習林田無演習林の関わらずコロニー数が少ない傾向がみられ，当年生実生で第一苗畑で育苗されているものを使用した。供試体として

平均 1.8 個，３年生実生でも平均 4.3 個ときわめて少ないこ

当年生実生５個体，３年生実生５個体をそれぞれ選び，培とがわかった。一方，茎・形成層ではそれぞれ平均 31.5 個，養当日に当年生実生から針葉と茎，３年生実生から針葉と12.2 個と針葉よりもバクテリアコロニーは多く出現する傾形成層を採取した。針葉は１個体から１cm に切ったもの向がみられた。

を５本，茎は１個体につき１cm ずつ採取した。形成層は当年生針葉から出現した全てのコロニー（18 個），３年１個体につき幹に１ヶ所メスで５mm 角の切れ目を入れ，生針葉から 48 コロニーをピックアップしたシークエンス表皮ごと剥ぎ取った。

した結果を図－２に示す。針葉ではシークエンスに成功し供試体の内，形成層は表皮をむき，それ以外の部位は中た 55 コロニー中，Bacillus 属が最も多くなり，全体の 71％

性洗剤で軽く洗浄した後，クリーンベンチ内で３%過酸化を占めた。次いで Methylobacterium 属が 13%，属レベルで水素水を用いて 15 秒表面殺菌し，滅菌水で３回洗浄した。の推定ができなかったものの，Rhizobiales 目バクテリアがその後，滅菌水 100μL を入れたマイクロチューブ内で7%となった。次に当年生茎・３年生形成層から各 50 コロ

3,000rpm，30 秒で破砕し滅菌水 900μL を加えたけん濁液をニーをピックアップしたシークエンスした結果を図－３に１次希釈とし，10%ずつ希釈し得られるけん濁液を３次希示す。シークエンスに成功した 96 コロニーの内では針葉と釈まで作成した。けん濁液は YG 培地（Yeast extract 1g,同様に Bacillus 属が最も多く，全体の 35％を占めた。次い

Glucose 1g, K2HPO 4 0.3g, KH2PO4 0.2g, MgSO4·7H2O 0.2g,

で Burkholderia 属が 18%，いずれも放線菌門に属する

Agar 15g, DW 1L, pH7.0）にシャーレ１枚あたり 100μL ずつ

Curtobacterium属，Frondihabitans属がそれぞれ14%と８%，塗布し暗黒下 25℃で培養した。

Methylobacterium 属が８%，属レベルでの推定ができなかっ出現したバクテリアはサンプルごとにランダムに 10 コたものの，Rhizobiales 目バクテリアが 5%となった。これら

ロニーを選び，ダイレクト PCR を行った。出現コロニーがのことから，アカマツ実生地上部の培養可能な endophytic

10 個に満たない場合は全てのコロニーを PCR した。そのbacteria は Bacillus 属が中心であることが明らかになった。

後 16S rRNA 領域（約 800bp）をシークエンスし，NCBI のBLAST 検索を用いて属レベルの推定を行った。

表－１に部位・年齢ごとの推定バクテリア属とコロニー数を示す。全ての部位・年齢において Bacillus 属がみられ２．アカマツ 10 年生稚樹・成木の導管流からのたが，シークエンスしたコロニーに占める Bacillus 属の割

endophytic bacteria 分離 10 年生稚樹及び成木サンプルを合は当年生の針葉で 26%，茎で 22.4%だったのに対し，３田無演習林内のアカマツ林で採取した。各５個体を選び，年生の針葉では 87.5%，形成層では 48.9%と当年生よりも培養当日に当年生枝を採取した。導管流の採取はプレッシ

３年生の方が高い割合を示した。しかしながら，推定されャーチャンバーを用いて行った。枝は針葉と樹皮をすべてた属の数は当年生針葉が４属，３年生針葉が７属，当年生取り去りチャンバーにセットした。クリーンベンチ外での茎が６属，3 年生形成層が 10 属となり，年数が上がるにつ作業のため，70%エタノールで表面殺菌をした３L ビーカ

れていずれの部位でも推定属数が大きくなる傾向が見られーをチャンバー全体を覆うようにかぶせ，空気からのコンた。針葉はバクテリア数が比較的少なく，出現バクテリアタミネーションを防いだ。枝は導管流の採取直前に 70%エ

も Bacillus 属中心であるのに対し，茎・形成層は針葉よりタノールで拭いた剪定ばさみで切り戻し，切り口から出てもバクテリア密度が高く，複雑なバクテリア群集を持つこくる導管流を滅菌ろ紙２枚（直径５mm）に十分吸わせ，とが推察された。

－ 122 －

関東森林研究 67-1(2016)

アカマツ実生の菌根圏バクテリアは菌根菌種に関わらずBurkholderia 属が優占することがわかっている
（６）
。
また，

引用文献

ヨーロッパアカマツ成木の地上部（針葉・枝）と地下部（根（１）BACON, C.W. and HINTON, D.M. (2007) Bacterial

圏）の endophytic bacteria を調べた例では，地上部と地下部

endophytes: the endophytic niche, its occupants, and its utility.の群集は異なるとされている（４）。このことから，当年生

Plant-Associated Bacteria (GNANAMANICKAM, S.S., ed.)

実生の地上部，特に Bacillus 属中心の針葉と Burkholderia

pp. 155–194. Springer, Dordrecht, the Netherlands

属中心の地下部では endophytic bacteria の群集組成が大きく異なっていることが考えられる。

（ ２ ） COMPANT, S., KAPLAN, H., SESSITSCH, A.,NOWAK, J., BARKA, E.A. and CLÉMENT, C. (2008)

本研究で Bacillus 属に次いで多く分離された Burkholderia

Endophytic colonization of Vitis vinifera L. by Burkholderia

属バクテリアは，マツだけでなく，様々な植物の組織からphytofirmans strain PsJN: from the rhizosphere to inflorescense

検出されることから植物と何らかの関連があるとされていtissues. FEMS Microbiol. Ecol. 63: 84-93

る（５）。これらのことから Burkholderia 属バクテリアは選（３）FREY-KLETT, P., GARBAYE, J. and TARKKA, M.

択的にアカマツ実生の組織内に存在することが示唆された。

(2007) The mycorrhiza helper bacteria revisited. New Phytol.

２．アカマツ 10 年生稚樹・成木の導管流からの176: 22-36

endophytic bacteria 分離 実験に用いた全ての導管流サン（４）IZUMI, H., ANDERSON, I.C., KILLHAM, K. andプルについて，最長で３ヶ月間培養し観察を続けたが，いMOORE, E.R.B. (2008) Diversity of predominant endophytic

ずれもバクテリアコロニーは得られなかった。一方，作業bacteria in European deciduous and coniferous tree. Can. J.

途中のコンタミネーションを確認するために同条件下で滅Microbiol. 54: 173-179

菌水を塗布したシャーレにもバクテリアが出現しなかった（ ５ ） NGUYEN, N.H. and BRUNS, T.D. (2015) The

ことから，導管流の採取作業は無菌的に行われたと考えら

microbiome of Pinus muricata ectomycorrhizae: community

れる。これらのことからアカマツの導管流には少なくともassemblages, fungal species effects, and Burkholderia as

培養可能なバクテリアは流れていない可能性が示唆された。

important bacteria in multipartnered symbioses. Microb. Ecol.

実験環境下で発芽前のマツ種子表面に付着するバクテリ

69: 914-921

ア群集を調べた例では，林床に播かれて１週間たった時点（６）田中恵, 奈良一秀 (2007) 土壌と菌根菌の違いが根圏で種子には分離可能なレベルの量のバクテリアが付着するバクテリア群集に及ぼす影響. 第118回日本森林学会大ことがわかっている（８）。このことから，本研究で分離されたバクテリアの多くは種子の発根，発芽過程で空気や土壌を通じて侵入した可能性が考えられる。

会学術講演集 C29（７）TANAKA, M. and NARA, K. (2009) Phylogenetic
diversity of non-nodulating Rhizobium associated with pine
ectomycorrhizae. FEMS Microbiol. Ecol. 69: 329-343

Ⅳ まとめ（８）田中恵, 濵口顕寛, 上原巌, 菅原泉, 佐藤明 (2013)

アカマツ実生の地上部に存在するendophytic bacteria について，培養法を用いて分離した結果，当年生実生の段階で富士青木ヶ原樹海の林床に存在する微生物密度の季節変化. 関東森林研究 64(1) : 45-48

もバクテリアは既に組織内部に存在していることが明らか（９）田中恵, 奈良一秀 (2014) 野外菌根から得られた菌根になった。分離されたバクテリアの多くは Bacillus 属や圏バクテリアが培養菌糸成長に及ぼす影響. 関東森林研

Burkholderia 属あるいは放線菌などで，特に形成層には

究 65(1) : 123-126

Burkholderia 属が多く見られた。一方，針葉は Bacillus 属が（ 10 ） TANAKA, M. and NARA, K. (2015) Bacterial

多く，比較的単純なバクテリア相であることが明らかにな

communities associated with ectomycorrhizal root of pioneer

った。年齢による違いでは当年生よりも３年生の方がバク

dwarf willow in a primary successional volcanic desert. 8th

テリアの群集組成は複雑になる傾向がみられた。侵入経路

International Conference on Mycorrhiza. PS1-61

については本研究では明らかにならなかったが，導管流に培養可能なバクテリアがほぼ見られないことから，アカマ
ツの endophytic bacteria は播種された時点で空気や土壌を通じて種子表面に付着し，その後の発芽過程で侵入する可能性が考えられた。

－ 123 －

図－１. 培養によって得られたバクテリアの平均コロニー数（２次希釈）左：当年生実生 右：3 年生実生 n=3-5
図－２. 針葉由来バクテリアの出現頻度（属レベル）

Fig. 1 Number of bacterial colonies from seedlings (2nd dilution)

灰：Firmicutes 門 斜線：Methylobacterium 白：放線菌門 ドッ
ト：Rhizobiales 目 網かけ：その他

Fig. 2 Bacterial frequency isolated from needle leaves (Genus
表－１. 部位・年齢別の推定バクテリア属及びコロニー数level)

Table 1 Bacterial genus and number of occurrence

grey : Phylum Firmicutes stripe : Methylobacterium white : Phylum

Genus name
Actinobispora
Anoxybacillus
Bacillus
Burkholderia
Chryseobacterium
Cohnella
Curtobacterium
Frondihabitans
Halospirulina
Methylobacterium
Paenibacillus
Propionibacterium
Rhizobiales (Order)
Roseococcus
Sphingomonas
Streptococcus

needle leaves
1st-year

3rd-year

4

1
135

stem

cambium

1st-year

3rd-year

1116

23
1

1
1
13
8
7
128
3

14

5
1
3
1

Actinobacteria dot : Order Rhizobials check : others

total
1
173
17
11138215
4
19
1
3
1

total

1540

49

47151

number of Genera

4761016

図－３. 茎・形成層由来バクテリアの出現頻度（属レベル）
灰：Firmicutes 門 黒：Burkholderia 白：放線菌門 斜線：
Methylobacterium ドット：Rhizobiales 目 網かけ：その他

Fig. 3 Bacterial frequency isolated from stem/cambium (Genuslevel)
grey : Phylum Firmicutes black : Burkholderia white : Phylum
Actinobacteria stripe : Methylobacterium dot : Order Rhizobials
check : others－ 124 －