学位論文内容の要旨

博士の専攻分野の名称

博士（医 学）

氏 名

鹿内 浩樹

学 位 論 文 題 名
GABA 合成酵素含有 5-HT 作動性神経の生理学的特性に関する研究【目的と背景】 化学シナプスでは、神経細胞はシナプス前ニューロンから後ニューロンに神経伝達物質を放出し、情報を伝達する。これを担う神経伝達物質は、グルタミン酸やγ-アミノ酪酸 (GABA) などのアミノ酸、アセチルコリンやドーパミンなどのモノアミンが典型的である。これらの神経伝達物質がニューロペプチドや成長因子などの神経調節因子と共放出される可能性が報告されているが、アミノ酸やモノアミン同士の classical な神経伝達物質の共放出も少なからず報告されている。これはシナプス前ニューロンが複数の神経伝達物質によって後ニューロンの活動を制御すると考えられる興味深い現象である。セロトニン (5-hydroxytriptamine: 5-HT) は、臨床的所見および動物実験の結果から、精神機能の調節に深く関わっていると考えられる神経伝達物質である。中枢神経系における 5-HT 作動性神経は、脳幹の正中部に位置する縫線核群を起始核として存在する。中でも背側縫線核(dorsal raphe nucleus: DRN) および正中縫線核の 5-HT 作動性神経は、扁桃体や側坐核、大脳皮質や海馬にそれぞれ投射し、情動調節機能に関与している。DRN には 5-HT を単独発現する 5-HT ニューロンと GABA の合成酵素である glutamic acid decarboxylase (GAD) を共発現する 5-HT/GAD ニューロンが存在していることが報告されている。これは 5-HT/GAD ニ
ューロンが GABA と 5-HT を共放出する可能性を示唆するものであるが、詳細は全く不明である。また 5-HT と同様に、GABA も情動調節機能を担う神経伝達物質であることから、5-HT/GAD ニューロンは情動に特化した生理学的機能を有することが想定される。そこで本研究では、この 5-HT/GAD ニューロンの機能的役割の追究を目的として、電気生理学的検討、形態学的検討および情動ストレス応答に関わる行動薬理学的検討を行った。本研究は第 1 章「GABA 合成酵素含有 5-HT 作動性神経の電気生理学的および形態学的特徴の検討」
および第 2 章「GABA 合成酵素含有 5-HT 作動性神経のストレス応答性に焦点を当てた行動薬理学的および組織化学的検討」で構成される。
【材料と方法】① 電気生理学的解析：生後 3-4 週齢の雄性 Wistar/ST rat の脳から縫線核を含む厚さ 300 m の冠状断急性スライスを作製し、背側縫線核神経細胞から whole-cell patchclamp 記録を行った。電気記録後、ガラス管電極より回収した total RNA を用いて単一細胞RT-PCR 法を行い、5-HT 合成酵素である tryptophan hydroxylase 2 (TPH2) mRNA および67kbp-GAD (GAD67) mRNA の発現パターンから記録ニューロンを分類した。② 形態学的解
析：多色蛍光 in situ hybridization 法または免疫蛍光法により、TPH2、GAD67、小胞体 GABAトランスポーター (VIAAT)、5-HT トランスポーター(HTT) の mRNA およびタンパク質の局在解析を行った。③行動薬理学的解析：open field (OF) ストレスまたは contextual fearconditioning (CFC) ストレスを負荷した後、ラットを 4% paraformaldehyde で灌流固定し、厚さ 30 m の凍結切片を作製した。神経細胞活性時の最初期遺伝子 c-fos のタンパク質 (c-Fos)
を ABC 酵素抗体法により検出し、DRN を背側部 (DRD)、腹側部 (DRD)、lateral wing 部(DRL) に細分化した各領域における c-Fos 発現数を計測した。この c-Fos 発現の情動特異性を検証するため、ストレス負荷前に benzodiazepine 系抗不安薬である diazepam を全身投与し、各領域の c-Fos 発現数の変動を計測した。次に情動ストレス特異的 c-Fos 発現のニューロン選択性を解析するために、c-Fos 抗体、TPH2 抗体および GABA ニューロンのマーカーである parvalbumin (PV) 抗体を用いた 3 重免疫蛍光染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡による免疫蛍光顕微鏡解析を行った。
【結果と考察】第 1 章：単一細胞 RT-PCR 法により、whole-cell patch clamp 記録ニューロン(n= 82)は、TPH2 mRNA 陽性である 5-HT ニューロン (52.4%, n= 43)、TPH2/GAD67 mRNA両陽性である 5-HT/GAD67 ニューロン (12.2%, n= 10)、GAD67 mRNA 陽性である GAD67
ニューロン (4.9%, n = 4) およびいずれも陰性であるその他のニューロン (30.5%, n = 25 )に分類された。5-HT/GAD67 ニューロンは、5-HT ニューロンおよび GAD67 ニューロンと比較して、低い発火頻度および低い膜抵抗値という電気生理学的特徴を示した。発火頻度は Aタイプ K+電流(IA)によって調節される。この IA は電位依存性 K+チャネルのサブタイプである Kv4 ファミリーの関与が知られることから、5-HT/GAD67 ニューロンにおける Kv4 発現様式の違いが示唆される。さらに、入力抵抗値は膜受容体密度や膜表面積に依存することから、他のニューロンと比較して 5-HT/GAD67 ニューロンのサイズが大きい可能性が示唆される。形態学的特性解析では、特に DRL に 5-HT/GAD67 ニューロンの局在が検出された。この 5-HT/GAD67 ニューロンには VIAAT の mRNA およびタンパク質が検出されず、DRN の 5-HT 作動性神経投射先の神経終末においても HTT と VIAAT の共発現は検出されなかった。これは、5-HT/GAD67 ニューロンからの GABA の遊離の可能性を否定するものであり、5-HT と GABA の 2 つの神経伝達物質が co-release される可能性は低いということを示した。過去の報告から、5-HT/GAD67 ニューロン内の GABA は神経伝達物質として存在するのではなく、神経保護作用や神経栄養因子としての機能を持つことが考えられた。第 2章：OF ストレス負荷により、DRL、DRD、DRV のいずれの領域においても c-Fos の発現が増大し、特に DRL では DRD および DRV と比較して有意な発現数増大が見られた。CFC ス
トレス負荷では、DRD, DRV, DRL すべての領域において c-Fos 発現数が増大したものの、領域間での有意差は無かった。これらのストレス負荷による DRL における c-Fos 発現増大は、抗不安薬 diazepam の投与により有意に抑制されたことから、この c-Fos 発現は不安情動特異的であることが示された。また、OF ストレス負荷により誘発された c-Fos は、5-HT ニューロンよりも 5-HT/PV ニューロンに選択的に発現しており、CFC ストレスにより誘発された c-Fos はその逆であった。これは 5-HT ニューロンよりも 5-HT/GAD67 ニューロンは OFストレスのような軽度なストレスに対して選択的に反応することを示すものであり、ストレスの強度や種類に応じて DRL 内の存在する神経細胞は異なった反応を示すことが考えられた。
【結論】GABA 合成酵素 GAD67 含有 5-HT 作動性神経は、ラット DRL 領域に局所的に存在していることが明らかとなった。この神経細胞は共存する GABA を遊離せず、5-HT 作動性神経や GABA 作動性神経とも異なった電気生理学的特徴を持つ。また mild なストレスに対して反応し、生体のストレス応答反応に寄与することが示唆された。一部のストレスに対して特異的に反応性を示すこの神経の生理学的機能や形態学的特徴を追求していくことは、情動関連精神疾患の病態解明の糸口となることが期待される。