厚生省新薬開発研究事業
微生物の二次代謝産物に由来する

難病治療薬（E−64）の開発研究

昭和58年度研究報告書
班 長 今堀和友

昭和59年3月

ま

え

が

き

難病治療薬四一餌）の開発研究も，開始以来5年を経過し，後一年を残すのみとなった。それだけに，この一年間においては，総仕上げのための追込みが急ピッチに進んだ印象がある。
基礎的な面でいうならば，筋ジストロフィーの発症に関与すると思われる，カルシウム
依存性中性プロテアーゼ（CANP）の遺伝子のタロ−ニソグ，それによる一次構造の決定が一挙に完了したことである。これによって，E一朗の作用模作の研究が一段と飛躍することが期待される。
モデル疾患動物に対するE−64−d（EST）の効果に関しては，前年からのハムスターに関してさらに詳細な検討がなされた他，ジストロフィーマウスに関しても投与により，自発運動の改善，平均寿命の延長がみられたのである。
臨床研究に関しても長足の進歩がなされた。昨年度に開始された第一相臨床試験は本年度において，1日3回，7日間の連投をも含む試験を終え，第二相臨床試験の前半をも終えるまでに至った。
組織の発足以来，本研究は充分な基礎固めの上に立った上で開発応用研究へと向ってきた。一年後に控えた，臨床応用の可能性の判定がどうでるにせよ，我々のとった道筋は誤っていなかったと思うし，研究によって得た所は少なくなかったと信じている○
最後に本研究に多大の援助を賜った厚生省薬務局の方々，研究に努力を傾注された班員の諸兄，さらに本年度よりの第二相臨床試験に献身的に協力賜った，国立療養所東埼玉病院，同新潟病院の方々に心からなる感謝を捧げるものである0

班長

今

掘

和

友

目

次

まえがき

Ⅰ E‑64類縁体の開発

1. EST製造法の検討

沢田 二郎

9

2. EST原体の規格および試験方法の設定

沢田

二郎

13

3. ESTの慢性毒性に関する研究

大関

正弘

19

4. ESTの生殖に及ぼす影響

大関

正弘

41

5. ESTのマウス骨髄細胞染色体異常試験

大関

正弘

59

6. ESTの局所刺激に関する研究

大関

正弘

63

7. ESTの一般薬理作用

福原

武彦

65

大関

正弘

75

今堀

和友

87

10．カルシウムプロテアーゼの機能発現機構

鈴木

紘一

91

11．カルシウムプロテアーゼと細胞情報の受容伝達

西塚

泰美

95

12．高分子量不活性型多重機能プロテアーゼ

市原

明

101

8. エポキシコハク酸1,4‑14C標織体を用いたESTのラットにおける生体内動態
Ⅱ 酵素レベルでの効果
9．カルシウム高感受性および低感受性カルシウム依存性
中性プロテアーゼⅢ 細胞・組織レベルでの効果
13．ニューロフィラメント変性とプロテアーゼ─続報─

杉田 秀夫 115

14. ハムスター培養筋のZ帯変性に対するE‑64‑c の作用

小沢鍈二郎

121

15. 実験的急性筋崩壊に対するESTの効果

石浦

127

16. 高感度免疫転写法を用いた血清中のα‑アクチニンの検出

野々村 禎昭 131

章一

Ⅳ 個休レベルでの効果
17. ジストロフィーハムスターのカテプシンB&Lに対する勝沼 信彦 139

ESTの効果18. 筋ジスハムスター (UM‑X7.1)の骨格筋に対する

ESTでの治療効果─1H‑NMRによる観察

宮武

正 145

19．筋ジストロフィーハムスターの移植筋の再生および
寺尾 寿夫 149

アミノ酸代謝に及ぼすESTの効果
20．ハムスター心筋症発生機序の解明および柴田 宣彦 155

その抑制に関する研究
21. ESTの肝薬物代謝酵素ならびにグルタチオン関連酵素

北川 晴雄 165に対する影響22. 筋ジストロフィーハムスターにおけるESTの薬効大関 正弘 171に関する研究23. 筋ジストロフィーマウスにおけるESTの効果

大関 正弘 183

に関する研究Ⅴ臨

24. ESTの第1相臨床試験─続報─

試

験

宮原

正 193

杉田 秀夫

宮
武正

25. ESTの早期第2相臨床試験

床217

I E−64類縁体の開発

1．EST製造法の検討

沢田 二郎

2．EST原体の規格および試験方法の設定

沢田 二郎

3．ESTの慢性毒性に関する研究………………………大関正弘

4．ESTの生殖に及ぼす影響‥……・

大関 正弘

5．ESTのマウス骨髄細胞染色体異常試験

大関 正弘

6．ESTの局所刺激に関する研究………………………大関

7．ESTの一般薬理作用

正弘

福原 武彦

8．エポキシコハク酸1，4−14C標識体を用いたESTのラットにおける生体内動態…・…・……‥…

大関 正弘

1．EST製造法の検討

沢 田 二 郎＊研究協力者 曽 田

馨＊ 渡 辺 慶 昭＊ 横 尾 千 尋＊

小 熊 清 司＊ 村 田 充 男＊

定供給する事が可能な，実用的製造法の確立を有無，収率等を比較検討した。また，最も好結果を与えた方法については，さらに当量関係の検討も行った。
3．EST製造の最終工程の改良検討目的に，従来よりの製造法を基本とし，さらにLTt−ESモノエチルエステルとp一ニトロフェ

以下に述べる項目につき，改良検討を実施した。
1．レアルギニソを用いた光学分割法1）により単離精製後，レロイシルイソアミルアミドと反日的

本年度我々は，高品質のESTを，大量に安ノールを縮合して活性エステル体とし，これを得られる中間体：L一トラソスーエポキシコノ、ク酸（L−t−ES）ジェチルエステルの光学純度応させることによりESTを製造する方法を検の改善。

純度を，従来法による場合と比較した。

2．中間体：Boc−L−ロイシルイソアミルアミ
ドの簡便な製造法の検討。
3．EST製造の最終工程において，副生成物が少なく，精製が容易な製法の検討。
方

法討した。また，得られたESTについて，収率，結果および考察
1．Lt−ESジエチルエステルの光学純度の改善
光学純度は，得られたL−t−ESジェチルエス
テルの比旋光度と，文献上の最高値である＋114．703）から求めた光学収率を用いて表わし

G．B．Payneらの方法2）に準じてフマル酸よた。
図1に示すように，DL，t−ESからL−t−ESとり得たDレt−ESを用い，既報の方法1）に従っ

L−アルギニソのジアステレオマ一塩を形成し，て，L−t−ESとL一アルギニソのジアステレオマ

未精製のままエステル化した場合，L−t−ESジ

1．Lt−ESジエチルエステルの光学純度の改善

一塩を形成した後，直接エステル化を行った。

ェチルエステルの比旋光度は＋98．80で，光学

この際，ジアステレオマ一塩を再結晶するこ収率は86．1％であった。ところが，このジアとにより，L−t−ESジェチルエステルの光学純

ステレオマ一塩を，水−メタノール（2：1）より度を向上させることを検討した。

再結晶することにより，しトESジエチルエス

2．Boc−レロイシルイソ7ミル7ミドの製造法の検テルの比旋光度は＋109．30となり，光学収率

討を95．3％に向上させることができた。

Boc−L−ロイシソ1水和物とイソアミルアミ

通算収率は若干低下したが，L−tTESジェチン（IAA）を，種々の方法で縮合し，副生成物のルエステルの光学純度は，ESTの純度および最終工程の収率に大きく影響するため，この時＊大正製薬株式会社総合研究所

点で光学純度を向上させることができたこと
9t E一朗類縁体の開発

。。2。寸
（DL）

CO2HL・Arginine

CO2H・LArg

J

MeOH：H20HO2C．0
（4：1）

J

Salt

CO2Et

EtO2C O（L）（L）

〔α〕芳＝51．60（C＝1．02，H20）〔α〕欝＝98．80（C＝1．12，EtOH）

0Veral Yield73．2％
Optical Yield86．1％

Recrystallization

MeOH：H20（2：1）

CO2H・L・Arg

EtO2C雇CO2Et

H。2。バブ（L）（L）

〔α〕芳＝54．70（C＝1．00，H20）〔α〕紆＝109．30（C＝1．09，EtOH）

Overall Yield64．9％
Optical Yield95．3％
図1いt−ESジエチルエステルの光学純度の改善

表I Boc−トロイシルイソアミルアミドの製造法の検討（1）Boc−L−Leu・OH・H20＋IAA（1eq）

DCC（1．1eq）／ROH（1．1e

（1eq）

RO H
1
2
3

AcOEt

Boc−L・Leu−IAA

Y ield （％）
15．
6

H ON p￣H O S u73 ．
8

H O B t

96 ．
3

4

79 ．
3

DCC：㊥N＝C＝N㊥HOSu：HO・N3
HOBt：HO−N

10

竃 HONp：HO晶NO2

1．EST製造法の検討
表2 Boc−いロイシルイソアミルアミドの製造法の検討（2）Boc−L−Leu・OH・H20＋IAA（1eq）

DCC／HOBt
Boc−L・Leu・IAA
AcOEt

（1eq）

D C C （eq）

H O B t（e q ） Y ie ld （
％）

1

1．
1

1．
1

96．
3

2

1．
0

1．
0

95．
3

A

Et。2。dC

O2H H・L−Leu・IAA

H。ぬ訂

DCC／HOSu

EtO2C

40％

CO−L−Leu−IAA

0＞′U／嘉慧155％）

76％EtO2C雇CO◎NO2
図2

EST製造の最終工程の改良は，極めて有利であると考えられる。

イシルイソアミルアミドを図2−Aに示すよう2．Boe−L一ロイシルイソ7ミル7ミドの製造法の検討
Boc−L−ロイシソ1水和物とイソアミルアミに直接縮合していたが，副生成物が多く，得らンを表1に示すような4種煩の方法によって縮必要があった。また，このため収率もかなり低合してみた。その結果，DCC／HOBt法が極め下していた。

て収率が良く，副生成物も無いことから，得られたBoc−L−ロイシルイソアミルアミドは未精製合方法を検討した結果，図2−Bに示すようなでも十分に使用できることが明らかとなった。

活性エステル体を経由する方法が，極めて優れれたESTの純度が低いため，精製を繰り返す

そこで，副生成物が少なく，精製が容易な縮そこで，次にDCC，HOBtの使用量を，1．1当ていることを見出すことができた。すなわち，量から1当量に減らしてみたが，表2に示す通L−t−ESモノエチルエステルを，一旦，活性エ

り，同等の収率で良好な結果が得られた。以上

ステル体であるp−ニトロフユニルエステルにの結果から，大量製造においては，DCC／HOBt

導き精製した後，L−ロイシルイソアミルアミド法を用いることにした。

と反応させることにより，従来よりも高品質の3．EST製造の最終工程の改良検討

ESTを，安定して得ることに成功した。また，

従来は，L−t−ESモノエチルエステルとL−ロ

収率も従来法より向上した。
11

I E−64額縁体の開発
表3

ESTの純度HPLC（％）

M e th o d

E ST

ト1

ト2

ト4

A

96 ．
8

0．
5

0．
8

1．
9

B

99 ．
3

0．
5

0．
2

0

I−l r．∩ハdCO●L￣Leu．NHCH2甲CH2CH3

IL4①NHgNH①′￣1T T

EtO2C′

0

CO・L−Leu−IAA
Ⅰ二

ll

・日・

CO−LLeu−IAA

得られたESTの純度は，高速液体クロマト
グラフィー法によって測定したが，その結果を表3に示す。
従来法をA法，改良法をB法としたが，不純物Ⅰ−1は，使用するイソアミルアミンの純度

は，DCC／HOBt法で製造することにより，末精製でも使用可能なものが得られるようになった。
（3）ESTの純度に大きく影響を与える最終工程を，p−ニトロフェノールを用いる活性エスに由来するため変化は認められなかった。しかテル法に改良した結果，従来よりも高純度のし，不純物卜2，ト4に関しては大幅な減少がESTを安定して得ることに成功した。
EST製造法に関して，上記のような改良を認められ，その結果EST本体の純度は99．3％に向上した。

行った結果，現在，kgスケールでのパイロッ

このように，ESTの製造において，最も大きな問題点があると考えられた最終工程を改良

ト製造が可能となったので，本格的な大量製造の目処がついたものと考えている。

できたことにより，従来よりも大幅なスケール
アップが可能となった。
結論

本年度我々は，EST製造法に関して改良検討を行い，次のような成果を得ることができた。
（1）中間体L−tTESジェチルエステルは77ル
酸を原料とする光学分割法を用い，L−t−ESとレアルギニソのジアステレオマ一塩を再結晶することにより，従来よりも光学純度が高く，高品質のものが得られるようになった。
（2）中間体Boc−L−ロイシルイソアミルアミド
12

参考文献
1）沢田二郎：E−64−d製造法の検討，厚生省新薬開発研究事業「微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和57年度研究報
告書，9−26，1983．
2）Payne，G．B．and Williams，P．H．：Reaction
Of Hydrogen PeroxideIV．Sodium tangstate
Catalyzedepoxidatioムofα，β−unSaturatedacid，
J．Org．Cbem．，24，54，1959．
3）Seebach，D．and Wasmuth，D．：Herstellung
VOnerythr0−2−HydroxybernSteins良ure−Deriva−
ten aus Apfels畠ureester，Helv．Chim．Acta，
63，197，1980．

2．EST原体の規格および試験方法の設定

研究協力者

岬
半

日

田

沢

田

二

郎＊

哲

夫＊

青

田

継

親＊

丸

田

忠

雄＊

光

一＊

田

中

唯

夫＊

築

山

文

枝＊

的

EST原体1）の品質確保のための暫定規格および試験方法を設定する。
方

法

1．試料
本実験に用いた試料は大正製薬蹄で合成されたものである。表1にESTの構造式，化学名，分子式および分子量を示す。
2．測定機器EST原体の規格および試験方法の設定には以下の装置を用いた。
赤外吸収スペクトル：日本分光工業製DS−
701G型回折格子赤外分光光度計。
旋光度：日本分光工業製DIP−4型ディジタ
ル旋光計。
融点：ヤマト科学製MP−21型融点測定器。
高速液体クロマトグラフ：日立製作所製655
型液体クロマトグラフ。
自動積分計：SICシステムインスツルメンツ
製SIC7000A型データ処理装置。
3．測定項目および方法第十改正日本薬局方（以後日局と略す。）通則および一般試験法に準拠した。
結果および考察
1．性状
原体5ロットについて観察した結果，全Pッ＊大正製薬株式会社総合研究所

ト結晶性の粉末であった。また，色，においお
よび味については，全ロット白色でにおいはな
く，味は初めないが後にわずかに苦かった。初
め味がない理由としては，本品の溶解速度が遅いことによるものと考えられた。
溶解性については「局方記載の手引について」に記載の溶媒および本試験に用いる溶媒す
べてについて測定した。結果は表2に示すとおりである。
2．確認試験
確認試験（1）は，本品のエステル部分にヒドロ
キシルアミンを作用させ，生成するヒドロキヰ
ム酸に塩化第二鉄を加え，錯塩を形成させる皇色反応である。確認試験（2）は，本品を塩酸で加水分解後，生成するアミノ酸をニソヒドリンで発色させる呈色反応である。両法ともに操作が簡単で呈色も明瞭であり，確認試験法として利用可能であった。確認試験（3）は赤外吸収スペク
トルを利用し，本品の特性波数を用いて確認する方法である（図1）。原体5ロットについて
上記確認試験（1）（2）（3）を適用した結果，すべて陽性であった（表3）。
3．旋光度
本品は3個の不斉炭素を有し，光学活性を示す。鈴木2）の報告より，光学純度は薬理活性と相関があると考えられるので，旋光度を規定す
ることは重要である。旋光度測定には濃度および温度が影響するので，これらについて検討した。結果は表4に示すとおりで，濃度0．5〜2．0％，温度15〜250の範囲では，ほぼ一定の比旋13I E−64類縁体の閑発
表1ESTの化学名，構造式，分子式および分子量Chemical Name：Ethyl（2S，3S）−3〔（S）−3−methy1−1−（3−methylbutylcarbamoyl）butylcarbamoyl〕

StructuralFormula：HSC2。；〉∠竺ゝ〈NN 器；CH2C （CH3 z
I

Moleclllar Formula：ClTH30N205
Molecular Weight：342．43

表2 各種溶媒に対する溶解性
Solubility at200C I）escription Term
SoIvent（ml）／Solute（1g）inJ．P．X

Solvents

MetbanoI

Freely soluble

Dehydrated EthanoI
EtbanoI

Freely soluble

AcetoneSolubleEtber

Very slightly soluble

Water

PracticallyinS01uble

SolubleむUu再qJOSqく

4000

3200

24001900

1700150013001100
Wavenumber（cm．りWavenumber（cm．1）

900

700

Assignment

3292

リ

2961

y C−H

1755

リ

1642

y C＝0（CONH）

1555

∂

899

y as Cこ示C

N−H

C＝0（COOC2H5）

N−H

図1確認試験（3）赤外吸収スべクレレ
表3 性状および確認試験（1）（2）（3）の測定結果
A

Description
Identi丘cation（1）＋：Positive
14

500

B

C

＋

＋

＋

＋

十

十

（2）

＋

＋

＋

（3）

＋

＋

＋

300

2．EST原体の規格および試験方法の設定
表4 旋光度測定条件の検討
EST濃度の影響

温度の影響

嘉一＼聖三二 0・5％ 1・0％ 2・0％

150

200

250

＋51．70＋52．40＋51．50＋51．60＋51．80＋52．201
2＋52．70＋52．50＋51．90＋50．90＋51．40＋50．80＋51．70＋52．10＋51．90Av．

＋52．60＋51．40＋51．10

表5 旋光度の測定結果
OpticalRotation
〔α〕芸

Av．

CV．

Specification＋51．70 ＋52．10 ＋52．10 ＋52．70 ＋52．40 ＋52．20

0．7％＋49−＋540

A

B

C

D

E

（0．1g，Dehydrated Ethanol，10ml，100mm）
表6 融点，純度試験（1）（2）（3），乾燥減量および強熱残分の測定結果
Items

Speci負cations

Melting Point（OC）

123−127O

A

B

C

D

E

125．9

125．8

125．9

125．9

125．5

Purity：（1）Cbloride （％）（2）HeavyMetalS（ppm）（3）Arsenic（ppm）

Not more tban2
Not more tban O．5＜2

Loss onDrying（％） ＜0．30
Residue onIgnition （％） ＜0．10

光度が得られたので，測定条件としてはEST
濃度1％，測定温度200とした。
原体5ロットをこの条件で測定した結果，各ロットとも＋520前後の旋光度を示した（蓑
5）。この結果より規格範囲は平均値およびロット間のバラツキを考慮し，＋49〜＋540 と定めた。
4．融点
日局一般試験法により測定した結果，本品5
ロットの実測値は125．5〜125．90の範囲内であった。この結果より，規格範囲としては実測値
および日局を参考にして123〜1270と定めた（表6）。
5．純度試験
合成過程で塩酸を使用していることから塩化物の定性反応ならびに常法に従い重金属およびヒ素の試験法を設定し，それぞれ純度試験（1）（2）（3）とした。

Not more tban O．0095＜0．012
＜10
0．95
0．04

0
0．04

0
0

0．05
0．04

0．07
0．02

純度試験（1）〜（3）の原体5ロットの試験結果は
蓑6に示すとおりで，いずれもほとんど検出されなかった。それぞれの規格は実測値，検出限界および日局各条の規格を考慮して設定した。
なお，副生成物を規制することを目的として，類縁物質の検出法を検討中である。額縁物
質としては，合成時の副生成物，合成原料等，
表7に示す5物質が考えられ 現在高速液体ク
ロマトグラフ法（HPLC法）を用いて試験中である。
6．乾燥減量
本品は熱に安定であることから乾燥温度は1050とし，0．5〜3時間の範囲内で乾燥減量を測定したところ，どの時間においてもほとんど減量は認められず，本品はほとんど吸湿性がな
いものと考えられた。測定条件としては1050，
2時間とし，限度値は日局各条の規格を参考として0．30％以下と定めた（表6）。
15I E−64類縁体の開発
表7 類縁物質の構造
H＼／0＼／CONHCHCO−R′
l

No

EST

Structures

R；−OC2H5

Rl：−NHCH2CH2CH（CH3）2

ト1

R：−OCtH5

ト2

R：−NHCHCONHCH2CH2CH（CH，）2

R′：−NHCH2CH（CHJ）CH2CH．

R′：−NHCHICH2CH（CH3），

CH2CH（CHJ）2
Ⅰ一3

R：−OH

R′：−NHCH2CH2CH（CH，）2：二〇還誓
表8 定量値に及ぼすアルカリ反応温度及び時間の影響

Temp・（OC）

RoomTemp・Time（min）

10

Found（％）

100．1

RefhⅩ（80−85OC）

60

10

20

30

100．6

100．1

99．3

99．1

表9 定量法の精度および再現性
1

Found（％）

2

99．8

3

4

5

6

7

Av．

CV．

99．4 100．1 99．9 100．1 99．7

99．5

99．8

0．3

表10 原体5ロットの定量結果（％）
Lot

A

B

C

100．7

CV．

0．8

0．3

0．1

1

100．4

0

100．4

7

100．6

Av．

9
9

100．1

6

99．8

9
9

100．8

3

7

100．8

100．4

9
9

100．6

101．3

8

100．1

2

D
9
9

1

TotalAv・嘉，＝100．2％SD＝0．5

7．強勲残分
日局一般試験法に従って測定した結果，強熱
残分はほとんど認められなかった。
限度値としては，日局各条の規格を参考として0．10％以下と定めた（表6）。
8．定量法
定量法としては，絶対量を測定する目的で滴定法を検討した。本法はESTのエステル部分にアルカリを反応させた後，過剰のアルカリを16

塩酸で逆滴定する方法である。初めにアルカリとの反応温度および時間について検討した。結果は表8に示すとおりで，室温10分および60分
ならびに800で10〜30分のいずれの条件でも100％近い定量値が得られた。従って，反応条
件としては最も操作が簡単で緩和な条件である
室温10分間と定めた。
本法での繰り返し定量を行った結果は表9に示すとおりで，平均値妄7＝99．8％，変動係数

2．EST原体の規格および試験方法の設定（CV）0．3％ と良好な値が得られた。
以上の結果から，本法は簡単で実用性のある方法と判断し，定量法として採用した。次に本法を用いて原体5ロットを定量した結果，総平均値云5＝100．2％，標準偏差（SD）0．5であったので含量規格としては斎15土3SD（100．2土
1．5）を考慮し，98．0〜102．0％に暫定的に設定した（表10）。
9．暫定規格および試験方法
1〜8の検討結果より，原体の暫定規格および試験方法を以下のように設定した。
本品を乾燥したものは定量するとき，EST（ClTH30N205）98．0〜102．0％を含む。
性状 本品は白色の結晶性粉末で，においはな
く，味は初めないが，後にわずかに苦い。
本品はメタノールまたは無水エタノールに溶けやすく，エタノールまたはアセトンにやや溶けやすく，エーテルに極めて溶けにく
く，水に鱒とんど溶けない。
確認試験（1）本品0．1gに水酸化カリウム・エ
タノール試液5mlおよび塩酸ヒドロキシル
アミンの飽和エタノール溶液5mlを加え，10分間加熱する。冷後，希塩酸3mlおよび
塩化第二鉄試液5滴を加えるとき，液は赤褐
色〜暗紫色を呈する。
（2）本品0．02gをとり，5N塩酸試液5mlを加え，還流冷却器を付け1時間加熱する。
冷後，5N水酸化ナトリウム水溶液約5mlを加えてpHを6〜9に調整後，ニソヒドリ
ン試液5mlを加え，水浴中で時々振り混ぜながら10分間加熱するとき，液は青紫色を望する。
（3）本品を乾燥後，1〜2mgをとり，赤外吸収スペクトル測定法の臭化カリウム錠剤法によって測定するとき，3，292cm￣1，2，961cm￣1，
1，755cm￣1，1，642cm−1，1，555cm￣1および899cm￣1付近に吸収を認める。
旋光度〔α〕冨：＋49〜＋540（乾燥後，0・1g，
無水エタノール，10m1，100mm）。
融点123〜1270。
純度試験（1）塩化物 本品0．3gにアセトン
30mlを加えて溶かし，希硝酸6mlおよび水を加えて50mlとする。これを検液とし試験を行う。比較液は0．01N塩酸0・10mlにアセトン30ml，希硝酸6mlおよび水を加えて50mlとする（0．012％以下）。
（2）重金属 本品1．0gをとり，第2法により操作し，試験を行う。比較液には鉛標準液
1．Omlを加える（10ppm以下）。
（3）ヒ素 本品1．0gをとり，第3法により検液を調製し，装置Bを用いる方法により試験を行う（2ppm以下）。
（4）類縁物質 本項目については現在検討中である。
乾燥減量 0．30％以下（1g，1050，2時間）。
強熱残分 0．10％以下（1g）。
定量法 本品を乾燥し，その約0・8gを精密に量り，正確に0．1N水酸化カリウム・エタノ
ール液50mlを加えて溶かし，約10分間放置後，0．1N塩酸で滴定する。（指示薬フェノールフクレイソ試液3滴）。同様の方法で空試験を行う。
0．1N水酸化カリウム・エタノール液lml＝34．243mg（ClTH30N205）

貯法 しゃ光した気密容器。
結論

EST原体の品質を保証するために，規格および試験方法の検討を行った。
その結果は次のように要約される。
1．本品の確認試験法としては，2種頬の呈色反応と特性波数を用いる赤外吸収スペクトル法を設定した。
2．本晶は結晶性の粉末で，光学活性体である
ことから，示性値として融点および旋光度の規格を設定した。
3．本品の純度試験項目としては塩化物，重金属およびヒ素の限度値を設定し，この他に不純物含量を規制する目的で，HPLC法による限度値の設定を検討している。
4．本晶の定量法としては，操作が簡便で絶対量を測定する滴定法を設定した。
5．本品5ロットについて，今回設定した暫定規格および試験方法を適用した結果，全ロッ
17I E−64塀縁体の開発

ト規格内であったが，今後さらに詳細な検討を進める予定である。

代謝物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」
昭和57年度研究報告書，9−23，1982．
2）Suzuki，E．：Reaction of calcium・aCtivated

参考文献

neutralprotease（CANP）with an epoxysuc−
Cinyl derivative（E−64−C）andiodoaceticacid，

1）沢田二郎：E−64−dの物理化学的性質および製剤化の検討，厚生省新薬開発研究事業「微生物の二次18J．Biocbem．，93，1305−1312，1983．

3．ESTの慢性毒性に関する研究

＊

隆文裕

＊
＊

良千

島井戸

大筒長

＊大正製薬株式会社総合研究所＊

物を含む）あて群分けして実験に使用した。動
物は，空調を施したバリヤーシステムの動物宝
で個別に飼育し，飼料（MF：オリェソタル酵母社製）と水は自由に摂取させた。
2．投与量および投与方法
ESTは水に難溶であるため5％アラビアゴ
ム水溶液で懸濁した。投与量は，2，10および50mg／kg とし，投与方法は経口投与として，投与開始後5週日までは毎日，6週以降は，1
週6回投与を行った。対照には，5％アラビアゴム水溶液を同様に投与した。
3．検査項目（1）一般状態および死亡状況
投与期間中は投与時，休薬期間中は1週1回，＊1．動物
6週令のWistar系雌雄ラット（静動協：体重堆191〜220g，雌123〜136g）を約1週間予
備飼育後，1群15〜22匹（回復性を検討する動

＊

法

男司彦

方

保隆正

ESTの安全性研究の一環として，ラットに6ヶ月間ESTを経口授与し，その毒性ならびに回復性を検討する。

＊

的

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弘

＊

目

本川西

櫓阪川

＊

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雄明隆
＊

大

貞正

板村辺

中木渡

研究協力者

ト

死亡の有無および一般状態を観察した。

（2）体重投与期間中は投与5週日までは1遇2回，それ以降および休薬期間中は1遇1回座重を測定した。
（3）摂食量および摂水量′投与期間中は投与13遇までは，1週1回，それ以降および休薬期間中は2遇に1回摂食量および摂水量を測定した。
匝）血液学的検査
投与および休薬期間終了後，エーテル軽麻酔
下に大腿静脈より採取したEDTA・2K加血液について，赤血球数，ヘモグロビン量，ヘマト
クリット値，血小板数，白血球数，MCV，MCH
およびMCHC（Coulter counter model S
plus，CoulterelectronicsINC・），白血球百分率および網赤血球数（Hematrak480，Ge0−
metricdatacorporation），赤血球膜抵抗（C．
P．C．system，三鬼エンジニアリング株式会社）を，またクエン酸ナトリウム処理により得た血菜について，プロトロソピソ時間（Clotek
system，Hyland division travenollabora−
toriesINC．）を検査した。
（5）血液生化学的検査
血液学的検査用試料の採取後，大腿動脈および静脈切断により採血し，遠心分離（3，000rpm，
15分間）した血清について，血糖（酵素法），
19

I E−64類縁体の開発

総蛋白質（ビウレット法），アルブミン（BCG法），尿素窒素（酵素法），クレアチニソ（Ja鮎法），総ビリルビン（Jendrassik−Cleghorn法），総コレステロール（酵素法），トリグリセ
ライド（GPO−MEHA法），GOT（UV法），
GPT（UV法），ALP（Kind−King変法），LDH（Wr6blewskトLaDue法），無機リン（モリブデンブルー直接法），リン脂質（酵素法），尿酸（酵素法），カルシウム（OCPC法），CPK（GSCC準拠法）を自動生化学分析装置（CL−12，島津製作所）により，またナトリウムおよびカリウムイオンをイオンメーター（CLM−101

CL，島津製作所）にて各々測定した。また
A／G比を総蛋白質およびアルブミン量より算出した。
（6）尿検査投与開始の前日，投与100日日および182日
日また休薬35日日の24時間蓄尿について，糖，蛋白，pH，ケトン体，潜血（ラブスティックス
Ⅲ，マイルス三共株式会社）の半定量的検査を行った。
（7）尿分析
投与開始の前日，投与100日日および182日
日また休薬35日目の24時間蓄尿について，尿量を測定し，またクレアチニン（Ja脱法）を自動生化学分析装置（CL−12，島津製作所）により，ナトリウムおよびカリウムイオンをイオンメー

ター（CLM−101CL，島津製作所）にて各々測定した。
（8）病理解剖学的検査
投与および休薬期間終了後，エーテル軽麻酔下で，放血致死させ，開胸腹して，内部諸臓器を観察し摘出した。脳，心臓，肺，肝臓，腎臓，脾臓，腸間膜リンパ節，胸腺，下垂体，甲状腺，副腎，精巣，精巣上体，卵巣および子宮については重量を測定した。
これら詣臓器ならびに大腿骨，大腿骨骨髄，
骨格筋，脊髄，膵臓，冒，十二指腸，回腸，結腸，皮膚，眼球，膀胱，前立腺，精のうおよび乳腺については10％中性緩衝ホルマリン液で固定後，常法に従い，パラフィン切片からH．E．
染色標本を作成した。さらに肝臓と腎臓につい20ては，各群の約半数例にPAS染色およびOil
redO染色を加え，また腎臓には全例Weigertのfibrinoid染色を施し，病理組織学的検査を実施した。
（9）推計学的処理
各測定値は，対照群と投与群間で分散分析（F−検定）を行い，等分散の場合は，t一検定，不等分散の場合はAspin−Welch法によりそれぞれ有意性を検定した。
結

果

1．一般状態および死亡状況観察
試験期間中，EST投与による死亡例は認められず，中毒症状も観察されなかったが，投与過誤により雄の対照群で2例，50mg／kg群で1例が死亡した。
2．体重，摂食宣および摂水量
体重変動を図1に示した。体重は，雄の50mg／kg群に投与19週以降，増加抑制が認められた。休薬期間中は，対照群と同様の推移を示した。
摂食量および摂水量は，投与および休薬期間
中ともEST投与による変化は認められなかった。
3．血液学的検査
血液学的検査結果を表1，2に示した。
投与期間終了時，雄において10mg／kg以上の群にMCVの減少，50mg／kg群に網状赤
血球数の増加が認められたが，いずれも生理的範囲内の変動であった。
4．血液生化学的検査
血液生化学的検査結果を表3，4に示した。
投与期間終了時，雄の2mg／kg以上の群にGOT，GPT，LDHの増加，10mg／kg以上の群にトリグリセライドの減少が認められた。雌では，10mg／kg以上の群にGOT，GPTの増加が認められた。
その他の測定項目において種々の変化が認められたが，いずれも生理的範囲内にあり，意義ある変化とは思われなかった。休薬期間終了後
上記変化のうち，雄でGOT，GPT，LDHの増加，雌でGPTの増加が継続して認められた。

3．ESTの慢性毒性に関する研究

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図1ラット慢性毒性試験における体重変動

5．尿検査および尿分析
尿検査および尿分析においてESTによる変化は認められなかった。
6．病理学的検査（1）剖検所見
いずれの投与群においても著変は認められなかった。
（2）臓器重量
絶対重量を表5，6に，相対重量を表7，8に示した。
投与期間終了時，絶対および相対重量において，雄の10mg／kg以上の群，雌の50mg／kg
群に腎臓重量の増加が認められた。その他，腸間膜リンパ節および精巣重量に変化が認められたが，いずれも一定の傾向が認められず，投薬による影響ではないと思われた。
休薬期間終了後，雌の50mg／kg群において，腎臓重量の増加が継続して認められた。
（3）病理組織学的検査

EST投与により，肝臓および腎臓に組織変化が観察された。
肝臓：投与期間終了時，3核以上の多核肝細胞が，2mg／kg以上の群で多数出現し，用量反応性に増加して認められた。また肝細胞の小城の増殖巣（健常細胞よりも小型で，胞体は塩基好性を示す）が，雄の10mg／kg以上の群に見られた（写真1）。その他，肝細胞の単細胞性あるいは，小巣状性壊死が，雄の2mg／kg以上の群および雌の50mg／kg群に散見された。
休薬期間終了後，肝細胞の多核化と肝細胞の増殖巣が，上記投与期間終了時とほぼ同等に観察されたが，肝細胞の小巣状性壊死は，ほとん
ど認められなかった。
腎臓：投与期間終了時，雌雄とも10mg／kg以上の群に，尿細管上皮細胞に，硝子滴沈着が用
量反応性に増強して認められた（写真2）。
休薬例においても，上記変化が認められたが，投与期間終了時と比較して，軽減して観察され21

I E−64煩縁体の開発

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3．ESTの慢性毒性に関する研究

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た。その他の諸臓器については，EST投与による明らかな変化は認められなかった。
考察EST2，10，50mg／kgをラットに6ヶ月間経口投与した結果，亜急性毒性試験と同様に肝臓，腎臓への影響を示唆する種々の変化が観察された。すなわち血液生化学的検査において，雄の2mg／kg，雌の10mg／kg以上の群にGOT，GPTの増加が認められ，病理組織学的検査では，2mg／kg以上の群に単細胞ないし小巣状性壊死の増強および多核肝細胞の出現，
30s Fibrinoid Stain．

また10mg／kg以上の群に肝細胞の増殖巣などが観察され，これらの変化は休薬後も継続して認められた。
GOT，GPTの増加は，既に行ったラット単離肝細胞を用いた試験1）においても，低濃度（1×10￣7M）から認められており，ESTの肝細胞に対する直接的な何らかの作用が示唆される。

また肝細胞の壊死および多核化現象は，臨床において薬剤過敏性肝障害時に多く出現する2）と言われ，またその肝障害の程度は投与量に比例せず，実験動物での再現はできないとも言わ3．ESTの慢性毒性に関する研究

れている3）。EST投与によるこれらの変化は，用量反応性に増加し，またはは全例に認められに障害を受けた糸球体から尿細管内に排泄されることから，過敏症あるいはアレルギー性の秩た蛋白が再吸収されたものと言われているのが，6ヶ月の長期投与により該変性性変化以外の形序による発現機構とは異なるものと考えられ態的変化は認められず，しかも休薬により軽減る。

した状態で認められた。

さらに，肝細胞の増殖巣については，前癌病
変の前段階として見られる場合があるとする報告がある4）。このような肝臓に対する諸変化は，

これらESTの腎臓に対する変化はイヌおよびハムスターなどでも認められており5），種差が比較的ない変化と考えられるが，硝子滴沈着

イヌ5）およびサル6）の亜急性毒性試験では認め以外の変化がほとんど認められない事から，そられず，ラットに特異的であることから，ESTれほど重篤な毒性的意義を有するものではないの生体内動態には種差があるものと考えられと思われる。

る。
なお，血液生化学的検査におけるLDH，トリグリセライド等の変化もESTの肝臓への影
響を示唆する変化と思われるが，その校序については現在のところ明らかではない。
腎臓では，重量増加および尿細管上皮細月包への硝子滴沈着の増加が認められた。しかし，尿検査および血液生化学的検査において機能的障害と思われる変化は認められなかった。
また，尿細管上皮細胞の硝子滴沈着は一般的
Ⅰ．イ

日

的

ESTの安全性研究の一環としてピーグル犬に6ヶ月間ESTを経口授与し，その毒性ならびに回復性を検討する。
方

法

1．動物
ホワイトイーグル社（米国）から5ヶ月令で購入した雌雄ピーグル犬を約3ヶ月間予備飼育したのち使用した。なお，投与開始時の体重は7．1〜12．7kgであった。

結ラットにESTの論
2，10，50mg／kgを6ヶ月間経口投与し，慢性毒性を検討した結果，亜急性毒性試験と同様，GOT，GPTの上昇のはか，腎臓重量の増加，肝細胞の多核化，増殖
巣，壊死，腎変性など，主として肝臓，腎臓の障害を示唆する変化が認められたが，休薬によりこれらの変化は軽減化し回復傾向がうかがわれた。
ヌ

ESTの粉末結晶をゼラチンカプセルに充填し，
1日1回6ヶ月間にわたり経口投与した。対照
群には空のゼラチンカプセルを投与した。
3．戟察および検査方法
一般症状については毎日観察を行い，体重，
摂餌量および摂水量を投与開始後3ヶ月間は週1回，その後は4週に1回測定した。さらに投与開始前，投与1ヶ月，3ヶ月，6ヶ月および休薬後には以下の諸検査を実施した。
（1）血液学的検査
前腕静脈より採血したEDTA・2K加血液を用い，赤血球数，白血球数，血小板数，へそグPビン量，ヘマトクリット値，MCV，MCH

動物は空調を施した動物舎でアルミ製ケージに個別飼育し固型飼料（DS，オリェソタル酵および母社製）および，水は自由に摂取させた。

Plus，CoulterelectronicsINC．）網赤血球数

2．投与方法MCHC（Coulter counter model S

および白血球百分率（Hematrak480，Geome−

動物を1群4〜6匹として，ESTの5，50，

tric data corporation），赤血球膜抵抗性（C．

500mg／kg群および対照群の4群に分けた。

P．C．system，三鬼エンジニアリング株式会
31I E−64類縁体の開発

雄

雌

0

4

8

12

投

与

16

期

20

24

0

間

4
（weeks）

一休薬期間十図2 イヌ慢性毒性試験における体重変動社），プ。トロンビン時間（Clotek system，Hyland division travenol laboratories

INC．）を検査した。
（2）血液生化学的検査
前腕静脈より採取した血液を遠心分離し，その血清について自動生化学分析装置（CL−12，
島津製作所）を用い，血糖（酵素法），総蛋白質（ビウレット法），アルブミン（BCG法），尿素窒素（酵素法），クレアチニソ（Ja仔伝法），
総ビリルビン（Jendrassik−Cleghorn法），総コレステロール（酵素法），トリグリセライド（GPO−MEHA法），GOT・GPT（UV法），
ALP（Kind−Eing変法），LDH（Wr6blewski−
LaDue法），無機リン（モリブデンブルー直接法），カルシウム（OCPC法），尿酸（酵素法），
CPK（GSCC準拠法），リン脂質（酵素法）を測定し，またナトリウム・カリウムをイオンメーター（CLM−101CL，島津製作所）により測定した。またA／G比を総蛋白質およびアルブ
ミン量より算出した。

（3）尿検査32

代謝ケージにより採集した尿について試験紙を用い，糖，蛋白，pH，ケトン体，潜血反応，ビリルビン，ウロビリノーゲソ（以上マルティ
スティクス，マイルス三共株式会社）を検査す
るとともに，24時間蓄尿について尿量，比重（尿比重計）の測定，沈法の鏡検を行い，さらにナトリウム，カリウム，クレアチニソ量を血清測定方法に準じて定量した。
（4）肝臓および腎臓校能検査
肝枚能検査はBSP法（30分値），腎較能検
査はPSP法（15分，25分，35分値）により，血中停滞率および血中半減期の測定を行った。
（5）限科学的検査
肉眼的な外部観察をするとともに，眼底カメラ（コーワ，RC−2）を用い，網膜の観察を行った。
以上の諸検査終了後，ベントパルビタール麻
酔下に頸動脈より放血死させ開胸腹して，諸臓器の肉眼的観察を行い，また，大脳，小脳，心臓，肺，肝臓，腎臓，脾臓，腸間膜リン㌧ペ節，胸腺，膵臓，精巣，精巣上体，前立腺，卵巣，

3．ESTの慢性毒性に関する研究雄：

表9 イヌ慢性毒性試験における血液学的検査所見

Time examined（Month）

740±66744土55711士70749土66765土46
828土49670土48＊734土36

16．3士1．817．0±1．4
17．3士1．6
17．6±1．5

16．5土0．8
16．7士1．0
16．3土0．4
17．0土0．9

16．6土1．5
16．6土1．2
16．3土1．5
17．2土1．7

16．9土0．8
17．9土1．1
14．5士1．3＊
15．3土1．0＊
48．8土3．8
49．0士3．4
47．6土4．3
50．4±4．649．8±2．5
53．3士3．6
42．7土3．7＊
46．0±3．1＊
256土54278±54
243士46
221士22311±86
331土105421士106＊
424土109＊
154士36
134士19131土15129土12124±26124土41
128士34126土202

2

Hematocrit（％）

1

7
4

2

2

1

176

1

2

3

0 1 2 0 17 2 8
7 7 6 4 6 3 8 2
9 2 2 2 2 1 1 1 14土土土土 土士士士 土土土士
94

8 1 3 38
4

5
7 12 989 18

土±土士 士土士土Leucocytes（102／mm3）

3312
5土
4士
5土
4
士

136

3 0 5 7 9 50 7
9 6 2 4 5 3 3 2
1 1 1 1

Platelets（103／mm3）

485
00
55
12 2 2 20

Dose（mg／kg）

Contro1

5

50

500

No．of animals

4

4

6

6

＊

2 9 7 37 6 5 51 1 1 1

2

3

4

3

9 43 52 1 7 14 3 2 5

6
3

8 5 0
2 2 2

＊
＊
9 1 3 2 ＊＊6494 8125 3
2 5 0 87 2 5 94 3 2
5 7 6 5 0 1 1 12333 5676 ±±士土
土土土± 土土±土 士
土
士
土
士
土
±
土
5 5 5 1
8 5 2 8 26 2 9 3 2 3
2 3 3 215
1 1 1
50 5 064
崩

8 3 2 87 8 2 07777

l 13 30 4 5 06 6 761 1 1 1

8
5

9
0 9
1 3

1

1

1

1 5

5 4 4

8
1

8 0 0
1 2 2

土士土± 士土土土 土±士士

8 6 80 1 4 86
5
0 0 11 2 2 5 2 2

0 6 2
6 4 5

±士士土
土土±士 ±士土土 土士士土 ±土士士
4 17 5 2 1 7 8 6 7 7 9 3 2 9 5 5 3 3 2
6 6 5 1 2 1 3 3
6 6 2 32 2 2 3 1 1 1 1
7 7 7 77 7 6 6 00 8 8

0
5

1

1

1

1 5

5

5

4

8 7 7 910 5 1
499 7
0 00 0 2 2 1 3 3 5 4 3±土士士

7 8 5 02 2 2 3

1
1

1
1

1
1

1
1

1
5

土士土士 ±±士士 士±±土
2 70 4 6 8 6 ︵∂ 8 1 7 5

3 1 1
5 5 5

3 8 5 80136

7 7 7 71 1 1 13 3 7 41 3 2 20 4 3 39 0 2 1 6 5 7 4 6 7 6 3
9 7 493 1 5 487 76
2 20 72 2 2 2 1 1 1 1

土士土土 士土±土
3 3 8 10 8 5 18 7 7 70136

Time examined（Month）

2 00 4 8

741土36743土43709土30738±495 6 4 66 4 9 2745±44773±37766士54782土42

No．of animals

0 4 1 33 3 3 2

60136

Leucocytes（102／mm3）6136Platelets（103／mm3）

40

Hematocrit（％）

4

0136

Hemoglobin（g／dl）

500

Erythrocytes（101／mm3）

774±47808士53764土36
770士55
Erythrocytes（10．／mm3）50

Hemoglobin（g／dl）

5
Contro1
Dose（mg／kg）＊：p＜0．05，＊＊：p＜0．01

雌：＊p＜0．05，＊＊：p＜0・01

33

I E→64類縁体の開発
委10 イヌ慢性毒性試験における血液生化学的検査所見（堆）No・Ofanimals

3．2±0．2
3．2土0．2
3．2土0．2
3．3土0．3

17．3土2．6
21．2土4．8
21．9土2．0
20．2士2．0＊

18．1土5．1
18．7土4．519．1±5．2
18．7士2．9

17．2士4．8
19．2士3．4
21．9±4．4
17．4士4．2

1．00土0．05
0．72±0．10
0．75士0．05
0．87土0．10

0．98土0．09
0．72土0．13
0．77士0．16
0．90土0．07

0．95士0．15
0．71±0．09
0．77土0．14
0．87土0．14

110土7
113土7
115土2
115士6

116土16108土11118土7
115土5

121±28115土25116土20115土25

122士21
111士27117±17
107士21

43土11
47土5
37士13
42±20
27±5
31士5
25土5
23土6

41士11
54±24
55士18
42土5
24土3
25士2
16土5＊
27土2

35土12
44土9
35土22
40土19
26士2
30土6
26土3
27±7

43士14

36土6
34土8
38士3
35土5

38士10
37土11
35土9
37土8

36土12
31土11
32±10
31士7

38土9
23土4＊
22士6＊＊
25土4＊＊

7．5士0．9
6．1土0．9
5．4土0．9
5．2土1．4
139土26102士18132土31139±65

7．7土0．4
5．8土0．6
6．3±1．9
6．3士1．3
220士13290土21
176土60165土25

6．5土1．0
4．0土1．0＊
4．5土0．8
4．3土0．7
156士3981士9＊129±36121±668．5土1．3

144士1
133土15141±1
148土0
5．2土0．2
4．3土0．4
4．6土0．3
4．8士0．2

144土1
129±1
142土1
149士1
4．9土0．1
4．6土0．1
4．7土0．1
4．8土0．2

145土1
129士1
141士1
146土1
4．8土0．3
4．5士0．2
4．5土0．3
4．7土0．2

144士1
126±4
141土0
146土1＊

l

0

l

0

l

0

1

0

2

0

2

0

2

0

2

3

7

4

4

4

0

1

7

0

3
1

0

2
1

0

7
0

0

0
1

0

2 4
8 8

0

0

0
7

0

5 9 7 78
7 7 6
1 1 1 0土土士土 土土土土 土土土土 土土土土

8
1

2 7

34

3．3土0．2
3．3土0．1
3．2土0．1
3．3土0．1

3＊：p＜0．05，＊＊：p＜0．01

5．6士0．3
4．8±0．6＊
5．4土0．4＊

2

Ⅹ（mEq／1）

5．7土0．3
5．7土0．4
5．7士0．2
6．0土0．3

3

Na（mEq／1）

5．7士0．2
5．6土0．1
5．9士0．2
6．2±0．1

2

LDH（IU／1）

6

3

ALP（K−AU）

6

3

GPT（IU／1）

4

3

GOT（IU／1）

4

3
6

Triglyceride（mg／dl）

500

9
5

Cholesterol（mg／dl）

50

7
5

Creatinine（mg／dl）

5

7
5

BUN（mg／dl）

eAlbumin（g／dl）

Contro1dTTotalprotein（g／dl）

響
1
3
6
︒
1
3
6
︒
1
3
6
︒
1
3
6
︒
1
3
6
︒
1
3
6
︒
1
3
6
︒
1
3
6
︒
1
3
6
︒
1
3
6
︒
1
3
6
︒
1
3
6

Dose（mg／kg）

5．7±0．7
3．2士0．3
2．5土0．6＊
2．6±0．5＊

2．7土0．6

81土16＊＊
74士27＊
57土6
29土4
32士4
31土5
29土5

4．5土0．8＊
5．2土1．0
5．3土0．9
196土11692土10165±57
175土85

4．8土0．2＊

4．6土0．3
5．0土0．2＊

5．1±0．2

3．ESTの慢性毒性に関する研究
表11イヌ慢性毒性試験における血液生化学的検査所見（雌）No．of animals

5．6土0．3
5．2土0．4
5．6士0．3
5．7土0．3

3．4±0．3
3．4士0．2
3．3土0．2
3．5±0．2

3．4±0．1
3．5土0．2
3．2土0．1
3．5士0．1

3．4土0．2
3．1土0．3
3．2士0．3
3．1土0．2＊

19．4士6．7
17．5土3．9
25．2士3．4＊
19．9土4．0

18．3土4．3
20．3±4．8
19．7土5．7
19．1土4．5

16．0士3．8
21．2土2．6
18．4士3．2
18．6土5．6

0．68土0．12

0．81士0．10

0．77土0．06

0．75土0．07＊

0．70±0．11＊＊

0．70土0．12■

0．78土0．07
0．77土0．12

0．84士0．12
0．74土0．14

0．78土0．11
0．73土0．09

104士28102土31
127士51
149土13
37士13
34土11
57土22
38土12

107土13117±16123土22
140土34
37士17
55士31
49±23
63土27

116土28102土21
128土45135±46
33土15
53土14
52土10
63土25

36土9
36士9
26士3
25士5

31土7
31士7
25士4
25土8

32土9
32土9
24土5
28土9

34士5
33土7
32土5
28土7
9．0士0．9
6．9土0．8
7．6士1．0
6．7土1．2

58土55
32土7
29土3
30土2＊

37土6＊
25土5
27土4
26土6

8．8土2．1
6．6土1．4
5．9土0．7
6．3土1．0

8．1土1．7
6．1土1．5
6．1土1．8
6．7土2．1

197±68109±32
153士30149士69154士25
109士18144土13
116士18143土4485土20
156士56108土23

143土3290土20
174士74124土38

140±1
147土6
147±1
148土0

146士9
145土1
146士1
149土2

139土2
144士1
146土2
148土1

140土3
146土1
147土1
147土1

4．6士0．2
4．7士0．2
4．6士0．2
4．9土0．4

4．7土0．2
4．8土0．2
4．5士0．2
4．7土0．2

4．4土0．3
4．7土0．2
4．6土0．4
4．8±0．2

4．3土0．2＊
4．8土0．3
4．5土0．6
4．7土0．4

0

1

0

1

4

9

5

5

3

3

3 0

6
6
0

0

5
0

0

5 7
0 0

0

0

1

0

2

0

0

0

1 7 5
9 7 7

0

2
8
8
1 0

4

2

9
1

0

0

0
2

7

2

3

0

5
1

1

3

5

l

3

3

0

3

4

1
2

8
1
1

8 8 9 02 2 3 10 2 9 92 3 3 3
1 1 1

8
2 8
2 1 2

7 2 2 94 5 5 2

8
5
9

2 2 8
3 2 2

3

0
3

5
3
1
3

2 5 3
3 3 3

5

4

5

8

4

0

7

5

3

1 8
1

6

4

3
5

0
1

士士士土 士土土士 士土±士 土±土± 士土士士 士士士土 土±土土 ±士士士 士土士士3

K（mEq／l）

5．4土0．2
5．7土0．3
5．6土0．2
6．2±0．3

3

Na（mEq／1）

5．6土0．3
5．5土0．3
5．8±0．3
6．2±0．2

6

LDH（IU／1）

6

1

ALP（K−AU）

6

5

GPT（IU／1）

4

6

GOT（IU／1）

4

5

Triglyceride（mg／dl）

500

6Cholesterol（mg／dl）

50

4Creatinie（mg／dl）

5

5

BUN（mg／dl）

eAlbumin（g／dl）

Contro1dTiTotalprotein（g／dl）

讐
1
3
6
︒
1
3
6
︒
1
3
6
︒
1
3
6
︒
1
3
6
︒
1
3
6
︒
1
3
6
︒
1
︒
6
︒
1
3
6
︒
1
3
6
︒
1
3
6
︒
1
3
6

Dose（mg／kg）＊：p＜0．05，＊＊：p＜0・0135

l E−64類縁体の開発
表12 イヌ慢性毒性試験におけるBSP，PSP試験所見

堆：
Dose（mg／kg）

Contro1

No・Of animals

BSP test

30min．value（％）
PSP test
Tl／2（min．）

5

50

500

6

6

4

4

Time examined（Month）
0
1．8土1．1
1
1．6土0．93
2．8士2．5
6
2．1士1．8
0
16．4士2．8
1
15．3士2．13
18．3±2．6
6
16．0士2．5

1．7士0．3
1．8土0．3
1．5土0．4
1．8土0．718．4±3．5
18．8士2．1
16．7士2．1
17．6±2．0

1．6土0．3
1．2土0．2
1．6土0．3
1．8土0．3
18．1土2．7
16．6土1．4
16．6土1．8
16．2±1．5

1．5土0．4
1．7土1．0
1．7±0．9
1．8士1．3
16．2±1．8
19．7土7．4
16．9士3．2
16．9土2．5＊：p＜0．05，＊＊：p＜0．01

雌：Dose（mg／kg）

Contro1

5

50

500

No・Of animals

4

4

6

6

1．5土0．5
1．7土0．8
2．3±1．4
2．6±0．916．5±1．1
16．9土1．6
15．8土2．6
16．3土1．4

1．7土0．5
2．1土0．8
1．9士0．4
2．0土0．7
16．2士2．1
16．2土1．6
15．9±1．9
14．3土1．5

1．7士0．7
1．7士0．4
1．6土0．3＊
1．6±0．4＊

BSP test

30min．value（％）
PSP test
Tl／2（min．）

Time examined（Montb）0
1．7士0．3
1
1．5土0．23
2．2土0．56
2．5±0．8016．9±0．8
1
16．2士2．0
3
17．4士0．9
6
16．0土1．0

15．5士0．9＊
17．8＝ヒ1．9

17．1士1．8
15．6±2．1＊：p＜0．05，＊＊：p＜0．01

表13 イヌ慢性毒性試験における臓器重量（堆）I）ose（mg／kg）

Contro1

No・Of animals
Liver（g）
Kidney（g）
Rigbt
Left

Mesentericlymph nodes（g）
Thymus（g）
Thyroid gland（mg）
Rigbt

5

50

3

4

4

265±10220士44249土24210土39316土49253±39436土40＊＊405±48＊＊

A．W． 25．6土2．3
R．W． 21．0±1．7
A．W． 25．5±2．6
R．W． 20．9土2．1
A．W．
8．9土2．2
R．W．
7．2土1．4
A．W．
6．3±1．2
R．W．
5．1土0．9

24．5土4．7
20．2土1．O
25．5士5．4
21．0土0．5
8．8土2．2
7．2±0．5
8．3土2．7
6．7±1．0

28．1±3．4
22．5土2．633．8±2．6＊＊
31．6±4．4＊

28．6士4．2
23．0土3．434．7±2．8＊＊32．4±4．2＊＊

9．1士1．1
7．3土1．3
6．8土1．7
5．6土2．1

11．2±2．7
10．4±3．1
5．6±1．3
5．2土1．3474±138443士150
523土144487士150

A．W．
R．W．

A．W．
R．W．
A．W．
R．W．

485土154394土110515±129418土85502±152410±72423土127351±83413士100
326士49

Rigbt

A．W．
R．W．

628土40516土60613±80524土132

Left

A．W．
R．W．

589土118479土73667土65567±122627土71
501±24591土78480土114Left

500

475士178379土135

4

Adrenal gland（mg）

A・W・：absolute organ weight，R．W．：relative organ weight＊：p＜0・05，＊＊：p＜0．0136760±151
706土139769土65＊714±69＊＊

3．ESTの慢性毒性に関する研究
表14 イヌ慢性毒性試験における臓器重量（雌）Dose（mg／kg）

Contro1

5

50

500

No．of animals

3

4

4

4

A．W．
R．W．

Liver（g）

254士57
241士17249土62242土30281±28294士21＊

352士48410土36＊＊22．5±4．5
21．6士3．9
21．7土3．8
20．9土2．8
9．5土1．8
9．6士4．3
4．8土0．9
4．6士0．9

20．6土3．4
20．2土1．3
20．7土2．9
20．3土1．4
7．1土2．2
6．8土1，3
5．8土2．4
5．7土2．1

23．6士2．5
24．8士3．3
23．0土1．0
24．3土3．0
7．3土2．7
7．8土3．5
8．5士2．6
8．9土2．8

27．6土4．5
32．5士6．5
27．9士3．6
32．9土6．1＊
9．5土5．1
10．6土3．8
3．1士1．3
3．5土0．9

A．W．
R．W．
A．W．
R．W．

527土178
501士119470土106462士156437±88427土27402：土68
395土38415土111428±77384±86402土84511土134616±238
542土138651±233

A．W．
R．W．
A．W．
R．W．

731士179721士268
692土98669士106704±179710±254554土265583士237

618士45736±164627土102630土162573±81600土72

616士36730土127

Kidney（g）

A．W．
R．W．
Left
A．W．
R．W．
Mesentericlymph nodes（g） A．W．
R．W．
A．W．
TllymuS（g）
R．W．
Rigbt

Thyroid gland（mg）
Right
Left
Adrenal gland（mg）
Right
Left

A．W．：absolute organweight，R．W．：relative organ weight＊：p＜0．05，＊＊：p＜0・01

子宮，顎下腺，下垂体，甲状腺，副腎を摘出秤量した。これらの諸臓器，ならびに眼球，気管，喉頭，気管支，食道，胃，十二指腸，空腸，回腸，結腸，直腸，胆のう，上皮小体，耳下腺，舌下腺，脊髄，坐骨神経，大腿骨，大腿骨骨髄，骨格筋，贋胱，皮膚，乳腺について，10％中性緩衝ホルマリソ液にて固定し，常法に従ってパラフィソ切片を作成し，H・E・染色を行った後，病理組織学的検査を行った。
また，肝臓，腎臓についてはOilred O染
色Weigertのfibrinoid染色による鏡枚も行った。
6ヶ月間の投与終了後，対照群の1匹，EST
50および500mg／kg群の各2匹，計5匹について，1ヶ月間の休薬期間を設けて，慢性毒性試験と同様な実験条件，実験方法により回復性を検討した。
結果

体重変動を図2に，諸検査の所見を表9〜14に示す。

1．一般症状死亡例はいずれの投与群においても観察されなかった。
主な症状の変化としては，50および500mg／
kg群に軟便が共通して見られた。500mg／kg
群では投与開始まもなく軟便が見られ，4ヶ月
目位まで継続して見られた。50mg／kg群では500mg／kg群に比べると軽度であり，発症の時期も投与1ヶ月日頃より，3ヶ月日頃に多く見られた。
また，全群に共通して，未吸収検体が糞中に混じって排泄されるのが見られた。排泄量は高投与群ほど多く見られた。
その他，500mg／kg群の数例に軽度削疫ならびに元気消失が見られた。摂餌量は500mg／kg
群の雄で減少が認められ，摂水量はいずれの投与群においても著変は認められなかった。
2．体重500mg／kg群において雄で軽度減少ないし増加抑制が，雌で増加抑制傾向が認められた。
3．血液学的検査
37

¶J．．．．∴﹂⁚什い︸・

一
ぎ
ー

■

■−

肝臓（EST500mg／kg雄ピーグル犬）
肝実質細胞内への硝子滴沈着
×400Weigert

写真4

一■一

●・

写真3

感誉・

ト∴至鯉ら

東町

ヾ・ト1
Tl ●●h

⁝や宣ト﹂

●

・も
■t

止せ1土iト、￣ごs Fibrinoid Stain．

腎臓（EST500mg／kg雌ピーグル犬）皮質尿細管上皮への硝子滴沈着×200Weigert

500mg／kg群の雌雄に投与3および6ヶ月目の検査で，ヘモグロビン量およびヘマトクリ
ット値の減少が認められた。また雄で3ヶ月目に赤血球数の減少および3，6ヶ月目に血小板数の増加が認められた。
4．血液生化学的検査
500mg／kg群の雄に総蛋白・アルブミンの減少，トリグリセライドの増加およびGPTの減少が見られた0その他，雌雄で散発的に有意な変化が認められたが，いずれも意義ある変化とは思われなかった。
38∴雪ぎ︷1．詩．

●

h′

j●

−

ヽ．

ウ

ギ
予
．
．
．
お

一点﹁ ：．㌧

●・、！

け野鶴

hJ﹂

隼 恥弓漸絞I E−64類縁体の開発

S

Fibrinoid Stain．

5・尿検査，機能検査および脹科学的検査
いずれの検査においても著変は認められなかった。
6．臓器重量500mg／kg群の雄において，肝臓，腎臓および副腎の重量増加，雌において肝臓および腎臓の重量増加が見られた。
7．病理組織学的検査
ESTによると思われる主要な変化として，
肝実質細胞内への硝子滴沈着（写真3）が雌雄の50mg／kg群より軽度から中等度に用量反応

3．ESTの慢性毒性に関する研究

性に認められた。硝子滴の性状はEosin（＋），
PAS（土）およびWeigertのfibrinoid（＋）の反応を示した。
また，腎臓の皮質尿細管上皮の硝子滴沈着（写真4）が，雄では50mg／kg群より，雌では5mg／kg群より用量反応性に認められた。
1ヶ月間の休薬により投与期間内に見られた変化はいずれも消失あるいは軽減化して観察さ
れた。
考

察

EST5，50および500mg／kgをど−グル
犬に6ヶ月間経口投与し，また投与終了後1ヶ月間の休薬期間を設け回復性を検討した結果，500mg／kg群で下痢，体重増加抑手札 軽度貧血，血中蛋白質，脂質の変化，肝臓重量の増加，腎臓重量の増加，肝実質細胞内への硝子滴沈着，腎臓の皮質尿細管上皮の硝子滴沈着等の全身症状ならびに肝臓および腎臓への影響を示
唆する変化が観察された。また50mg／kg群では下痢，肝臓重量の増加および500mg／kg群と同様な肝臓，腎臓の器質的変化が認められた。5mg／kg群では雌において同様な腎臓の器質的変化が認められた。
以上のように6ヶ月間の投与におけるESTによる種々の変化は1ヶ月間投与の亜急性毒性
試験5）時に見られたと同様な肝臓，腎臓への影
響を主体とするものであり，肝実質細胞内への硝子滴沈着のみが慢性毒性において新たに出現した変化であった。しかしこの変化は他の器質的な変化を伴わず，また機能的な変化もうかがわれない事から，肝臓に及ぼす影響としてそれほど重篤な変化とは考え難い。前述のラットの亜急性毒性，慢性毒性で見られた肝臓の変化とは本質的に異なるものと考えられる。
腎臓については，亜急性毒性およびラットの場合と同様な器質的変化が認められ，亜急性毒性よりも低用量から発現が見られるものの，変化の増強あるいは新たな質的変化の発現は認められないことから腎肢の機能，器質に及ぼす影響は比較的弱いものと考えられる。一方，ESTによる影響として肝臓に比較すると動物種差のない変化であると推察される。
結論

ピーグル犬にESTの5，50，500mg／kgを6ヶ月間経口投与した結果，50および知Omg／
kgで肝臓5mg／kg以上で腎臓にそれぞれ影響を示唆する変化が観察された。
文

献1）大正製薬未発表．
2）大部 誠：急性薬剤過敏性肝障害生検肝の病理
組織学的ならびに組織計測的検討，肝臓25，501，
1984．

3）級田敏次：薬物と肝臓，中外医学杜．
4）Squire，R．A．and Levitt，M・H・：Reportof
a workshop on Classi丘cation of Speci丘c
Hepatocellular LesionsinRats，35，3214，1975・
5）大関正弘：E−64−dの亜急性毒性に関する研究，
厚生省新薬開発研究事業「微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和57
年度研究報告書，27−63，1983．
6）大正製薬社内報未発表．
7）宮地 徹：臨床組織病理学，杏林書院．

39

4．ESTの生殖に及ぼす影響（胚・器官形成期投与試験）

大 関 正 弘＊
研究協力者

山
大

日

田
場

由

隆＊

井

上

孝

志＊

香＊

中

根

貞

雄＊

的

ESTを妊娠ラットの胚・器官形成期に経口授与し，胎仔ならびに出産仔に及ぼす影響を検
討する。
方

法

1．使用動物および飼育条件
動物は，Wistar系ラット雌14遇令，雄15週
令（静動協）を用いた。飼育は，木屑敷プラスチ
ックケージに動物を入れ，バリヤーシステムの空調動物室で固型飼料（オリェソタル酵母社：
MF）および水（殺菌水）を自由に摂取させる
方法で行った。
予備飼育により順調な体重増加を示した雌雄を2：1の割合で一夜同居させ，翌朝，屋内に精子の認められた雌を選び，その日を妊娠0日と定めた。妊娠動物は，1群31〜34匹（予試験
7〜10匹）に分け試験に供した。
2．投与量および投与方法
予試験の結果，ESTl，000mg／kg投与量で流産の多発，500mg／kg投与量で高頻度の胎
仔致死，250mg／kg投与量で胎仔体重の抑制が認められた（表1，2）。これより，本試験の投与量を最大250mg／kg／day とし，以下70および20mg／kg／dayに設定した。
ESTは，5％アラビアゴム水溶液に懸濁し，体重100g当りlmlの割合で1回／日，胃ゾ＊大正製薬株式会社総合研究所

内

田

英

男＊

ソデを用い強制経口投与を行った。対照には，
ESTと同様な方法で5％アラビアゴム水溶液を授与した群を設けた。
3．投与期間
妊娠7日から17日目までの11日間，連日授与した。
4．検査項目および検査方法（1）母獣（Fo）．
母獣は，ノ毎日症状を観察し，体重を投与期間
中は毎日，その他は遇1〜2回，摂餌量は遇1〜2回測定した。
妊娠20日日に，約2／3例を頸椎脱臼により屠
殺し，臓器および子宮内の肉限的観察を行った0
残り約1／3例については自然分娩させ，妊娠日数，分娩状態，生死，体重，哺育能力を調べた。
哺青は，出産仔を生後4日令時に1母獣当り8匹になるよう淘汰し，離乳時まで観察した。分
娩後21日日には全例屠殺し，臓器の肉眼的観察
および着床痕数の測定を行った。
（2）次世代胎仔（Fl）
妊娠20日日に母獣を開腹し，子宮内状態，着床数，生存仔数および死亡仔数を調べた。死亡
仔は，その形状により吸収，初期，中期および後期死亡に分類し1），生存胎仔は，性別判定，体重測定および外表・内臓・骨格の観察を行った。
内臓観察については，1母獣当り雌雄各1〜2匹ずつの胎仔をプアソ固定した後，Wilson2），
Barrow3）および西村4）らの方法に従い行った。
骨格観察については，内臓観察に供した残りの胎仔すべてを70％アルコールに固定した後，41

I E−64莱頁縁体の開発
表1母獣（Fl）の体重変動〈予試験〉
Groups（mg／kg）

Contro1

250

500

1，000

Days of gestation
O

178．9土8．42（10）178．7土6．98（9）182．9土5．59（7）3

182．3土6．97（10）183．2土8．70（9）187．0土5．85（7）78188．9土7．86（10）190．4土7．35（10）189．7土7．94（9）188．4土8．70（9）192．9士8．56（7）192．7土8．30（7）9191．3土7．94（10）189．9土9．40（9）191．0士8．04（7）188．6士8．65（8）187．3土8．03（8）10194．1士7．13（10）192．3土10．04（9）193．5土8．25（7）188．1土8．02（8）11194．8土10．74（9）191．6土8．76（7）185．3土11．50≠（8）

12198．1土7．56（10）200．4土7．40（10）190．1土8．65＊（7）184．1土11．621＊（8）13203．2±7．50（10）197．1土10．60（9）199．3土12．91（9）191．7土9．78＊（7）181．1土10．84＊＊（8）14204．9土9．41（10）202．2土12．38（9）193．6土9．42＊（7）176．4土13．09＊＊（8）15203．5士13．19（9）194．3土10．82＊（7）177．6土14．44＊＊（8）16207．9土8．91（10）213．4±10．39（10）174．2土13．82＊＊（8）219．8土11．09（10）206．2±13．63（9）209．3土15．83（9）195．2土11．44＊＊（7）17194．9士14．66＊＊（7）175．5土14．04＊＊（8）18227．4土13．06（10）240．9土16．39（10）214．8±16．71（9）226．1土21．20（9）197．5±16．59＊＊（7）176．3土13．96＊＊（8）205．8土16．03輌（7）189．2土14．26＊＊（8）20

178．9土7．79（8）183．0土8．08（8）190．2±8．11（8）Mean土S．D．（No．ofanimals），＊：P＜0．05，＊＊：p＜0．01，Unit：Gram

表2 胎仔（Fl）所見〈予試験〉
Groups（mg／kg）
No．of dams

Contro1

250

500

1，000

10

9

7

8

Abortion rate［％］

0．0
0／10

11．1
1／9

14．3
1／7

50．0

No・Ofimplants

84

49

41

42

Implants perlitter

4／8

8．4±3．3（10）6．1±3．3（8）6．8土4．2（6）10．5土2．4（4）

Total

4く3〉

2く2〉

37＊＊〈6＊〉

42＊＊く4〉

Resorption

3く3〉

2〈2〉

36＊＊く6り36＊＊〈4〉

Early death
Middle death

1く1〉

0〈0〉

0

〈0〉

0〈0〉

0く0〉

0

〈0〉

0〈0〉

0く0〉

1〈1〉

No．of resorbed anddead fetuses

Late deathNo．oflive fetuses
Live fetuses perlitter80

8．0±3．4（10）Sex ratio
Male／Female

47

5．9j＝3．2（8）4

0．7土1．0＊＊（6）

1．22

1．61

1．00

44／36

29／18

2／2

Body weight［g］

Male

3．16±0．21（44）2．50土0．22＊＊（29）1．37土0．08＊＊（2）Female2．94土0．37（36）2．30土0．23＊＊（18）1．36土0．07＊＊（2）Male＋Female

3．06±0．31（80）2．42土0．24＊＊（47）1．36土0．06＊＊（4）No．of fetuses withexternal anomalies

0く0〉

0く0〉

Mean士S・D．，＊：p＜0．05，＊＊：p＜0．01，a）：Edema（）：No．of animals observed〈〉：No．of dams conceived with case42

1＊〈1〉a）

6＊＊〈1〉
0

〈0〉

0

く0〉
0

0．0土0．0＊＊（4）4．ESTの生殖に及ぼす影響
表3 母獣（Fo）の体重変動
Groups（mg／kg）

Contro1

Days of gestationO
169．0土6．72（33）378174．2士6．26（33）181．2士6．77（33）182．4士6．41（33）9185．1土7．39（33）1011188．4土8．09（33）191．5土7．97（33）12

193．4士8．20（33）

13

20

70

169．4±9．17（31）174．2土8．49（31）181．3土9．15（31）182．0土9．36（31）184．2±9．71（31）187．8土10．43（31）191．3土10．03（31）170．3土8．44（34）176．0土9．21（34）170．2土8．50（31）182．5士9．87（34）183．5士9．34（34）182．4土8．81（31）181．8士8．71（31）185．6土9．94（34）183．3土8．61（31）186．6土9．12（31）188．9土10．14（34）192．7±10．13（34）194．7土10．35（34）196．8±8．81（33）194．1±10．09（31）197．2土10．43（31）14

199．8±9．11（33）200．3土10．70（31）15203．3土10．65（31）208．3土11．11（31）200．6土10．79（34）203．9土10．47（34）16203．5土9．60（33）208．4土10．36（33）17215．5土11．71（33）215．4土12．11（31）18223．0土12．95（33）237．4土15．49（33）

20

250

197．4土10．53（34）208．7土11．36（34）174．9士7．69（31）189．4±9．43（31）190．1土9．35（31）193．2士10．12（31）197．2±10．22（31）199．9士10．57（31）204．4土10．98（31）211．4土11．79（31）222．8土13．95（31）215．7土11．78（34）223．2±12．65（34）237．0土16．41（31）237．9土15．85（34）235．0土14．12（31）191．5土4．82＊＊（11）191．8士13．85（11）204．9士7．91（11）194．6土11．32＊＊（11）202．1士9．00（11）218．0士11．33（11）212．4土10．21（11）211．8士14．00（11）215．7土9．93（11）215．1土9．04（11）212．0土12．90（11）219．6土12．39（31）Days after delivery
0
7
14
21

182．4±8．40（11）201．8土6．00（11）212．6土9．11（11）213．8±8．35（11）199．1士12．04（11）Mean土S．D．（No．of anirnals），＊＊：p＜0．01，Unit：Gram

Dawson5）の方法に準じ，アリザリンレッドS
骨格標本を作製し行った。
（3）次世代出産仔（Fl）
出産仔は，数，生死，性別，外表を調べた後，毎日一般状態および外表分化状態を観察し，1
週毎に体重を測定した。生後21日目には，1母獣当り雌雄各1〜2匹ずつを剖検し，軟Ⅹ線撮
影検査（ソフテックス社：CMB−2型）を行った。
生後21日日以後，生存させた出産仔は，1母獣当り雌雄各1匹ずつを行動・感覚機能検査，
学習・情動性検査および生殖能検査に供した。
行動・感覚機能は，3週令時にFox6），Irwin7）
およびAltman8）の方法に準じ，正向反射，耳介反射，音反射，角膜反射，光反射，痛覚反射，
平衡感覚を調べ，5遇令時には傾斜板（シナノ製作所：SN−463型）で筋力を，さらに，7運
命時にはSchapiro9）の方法により，遊泳による運動協調性を調べた。学習能は，7週令時にWaterfilled multiple T−maZe（室町揆枕：NM−01塑）で10），また，8遇令時にPassive
avoidance response（PAR）装置（自社製）
により，学習能・情動性の検索を行った11）。生
殖能は，10週令時に1母獣当り雌雄各1匹を用いて，兄妹を避け3週間の交配を行い，その間交尾数を調べ，さらに，交尾成立した雌については妊娠の成否を観察した。交尾後20日目に約2／3例の雌を開腹し，着床数，黄体数を調べ，残りの雄は自然分娩させ哺育能力を観察し，哺育終了後は臓器の肉眼的観察ならびに着床痕数の測定を行った。
（4）次々世代胎仔（F2）
次世代胎仔（Fl）と同様に，生存仔数，死亡
仔数とその時期，外表観察，性別判定および体重測定を行った後，生存胎仔全例について軟Ⅹ
線投影により骨格を検査した。
（5）次々世代出産仔（F2）
次世代出産仔と同様に，数，生死，性別，外表および体重を調べ，生後21日目まで毎日一般状態を観察した。
43

I E−64類縁体の閲発
表4 母獣（F。）の摂餌量
Groups（mg／kg）

Contro1

20

70

250

Days of gestation

10．2±1．23（31）10．6土1．01（34）9．6土0．95＊＊（34）8．5±1．62＊＊（31）12．6土1．25（33）10．1土1．14（31）12．8±1．09（31）11．7土1．19＊＊（34）

10．9土1．90＊＊（31）14．1土1．38（33）13．4±1．94（33）13．9±1．54（34）
14・2士2・19（34）13．5±1．35（31）13．4士2．32（31）11．6土3．43（11）25．3土4．92（11）11．1±3．25＊（11）3810．2±1．56（33）
10．5土1．00（33）

13
17
20

14．2士1．56（31）10．5±1．11（31）15．3土2．48＊＊（31）Days after delivery
2

14．0土2．77（11）11．7土4．13（11）71428．1土4．16（11）35．9±4．89（11）25．1±3．81（11）2147．0±6．26（11）36．0土6．28（11）45．5土8．39（11）32．3±6．50（11）24．2±4．80（11）32．3±8．18（11）44．4±9．48（11）39．8±10．04（11）Mean土S・D・（No．ofanimalS），＊：p＜0．05，＊＊p＜0．01，Unit：Gram

表5 分娩母獣（F。）および出産仔（Fl）所見
Groups（mg／kg）

Contro1No．of dams

11

Rate of dams withlive
newt：OrnS［％］
Duration ofgestation
［day］

100
11／11

Newbornsperlitter100

9．1土2．4（11）No．of stillborn

11

11

100
11／11

100
11／11

22．3土0．5（11）22．3土0．5（11）8．9土2．9（11）87

7．9土2．9（11）

85

81

0

1
1．2
1／81

Birth rate［％］93．5

100／100

0n day2l

100
81／81

Sex ratio
Male／Female
No．of newborns withexternal anomalies
Mean土S・Dり

1．22
55／45
0
0／100

92

8．4土2．4（11）
2
2．2
2／92

94．1

81．8＊

90／11080／85

座﹁ ▲〃5〃081
00 01 99／
08 07 ︐3
0
1
1
0

100

10．0土2．0（11）7．4土3．0（11）

0．0
0／100
100／107110

7．7士3．3（11）Stillborn rate［％］Survivalrate［％］On day4

250

11

98

9．7土2．4（11）No．of newborns

70

100
11／11

22．1±0．3（11） 22．2土0．4（11）No・Ofimplantationtraces lO7
Implantation traces per
litter20

86．7＊＊
78／90
98．6
68／69
1．20
49／41
0
0／92

＊：p＜0．05，＊＊：p＜0．01（）：No．of animals observed

5．統計処理結

平均値の差は，t−検定，率の差はが一検定を用い，いずれも危険率1％および5％で統計学 1．母獣（F。）に及はす影響

的有意性を検討した。

44

果

母獣の体重変動を表3に示した。妊娠中は，いずれの投与群も対照群と変わらぬ推移を示

4．ESTの生殖に及ぼす影響
表6 胎仔（Fl）所見
Groups（mg／kg）

20
0．0

2

0
く

＊

﹀

0

﹀

2
く
﹀
﹀
﹀

0
く

0

1．17
105／90

2

1．19
93／78

＊

1．37
107／781
く

8．5士2．7（23）

1

﹀
0
く
0

8．6土2．7（20）

2
く

﹀
0
く
0

8．4士2．8（22）

3

2

﹀
1
く
1

﹀ ﹀ ﹀ ﹀
5 1 0 0くくくく
00 1 0 0

﹀
2
く
3

﹀

0

195

171

185

﹀
5
く
9

﹀
2
く
4

﹀

Sex ratio
Male／Female

0

Live fetuses perlitter﹀

Late deathNo．oflive fetuses

1

Early death
Middle death﹀

8

Resorption

8．8士2．8（20）

﹀

9

Total

175

8．8±2．7（22）畑∴Ⅶハu川W細

1mplants Ferlitter
No．of resorbed anddead fetuses

3No．ofimplants l94︶0︵
6200．04士
022
0
1

22
0．O

70

︶

Abortion rate［％］20︵
523．004土
029
8

No．of dams

Contro1

201

10．1士2．6（20）0．83＊

91／110l30dy weight［g］

Male

3．14士0．27（107）
2．93士0．26（78）3．17土0．19（93）3．11±0．28（105）

2．44士0．36＊＊（91）Female2．91土0．24（78）2．91士0．26（90）

2．34士0．29＊＊（110）Male＋Female

3．05土0．28（185）3．05±0．25（171）

3．02士0．29（195）2．39土0．33＊＊（201）No．of fetuses withexternal anomalies

0〈0〉

0〈0〉

0〈0〉

0〈0〉

Mean土S．D．，＊：p＜0．05，＊＊：p＜0．01（）：No．of animals observed〈〉：No．of dams conceivedwith case
L，分娩後においても，分娩直後に20および250mg／kg群に有意な増加が示されたのみであった。また，いずれの投与群にも死亡例は認められず，症状にも異常は観察されなかった。
摂餌量では表4に示したように，70mg／kg群の妊娠8，13日目，250mg／kg群の妊娠8，13日日および分娩後2日目に有意な減少がみら
れ，250mg／kg群の妊娠20日日に有意な増加が認められた。妊娠20日目に屠殺した母獣の臓
器および子官内に，異常は認められなかった。
分娩母獣および出産仔の所見を，表5に示した。分娩した母獣のすべてに分娩異常は認められなかったが，出産仔については，250mg／kg
群に出生仔率（出生仔数／着床痕数×100）および4日日の生存仔率（生後4日目の生存仔数／
出生仔数×100）に低下が認められた。分娩後21日目に哺育終了母獣を屠殺し，臓器の肉眼的な観察を行ったが，異常は認められなかった。
2．次世代脂仔（Fl）に及はす影響

胎仔所見を表6に示した。20および70mg／
kg群では，対照群との間に有意な変化は認められなかったが，250mg／kg群では吸収胚数が対照群に比べ減少し，性比（雄／雌）もアンノミ
ランスで雄性が減少しており，生存胎仔体重も低値であった。外表異常仔は，1例も認められなかった。
ブアン固定胎仔の内臓検査所見を，表7に示した。250mg／kg群に母獣16例から無限仔31
例と中限仔3例が観察され（写真1），対照群との間に有意な差が認められた。さらに，250mg／kg群で精巣および卵巣に転移が6例認められたが，有意なものではなかった。胎仔の骨格異常および変異の検査所見を表8−1に，化骨状態の検査所見を表8−2に示した。異常骨としては，250mg／kg群に椎体不整，椎弓
癒合，肋骨欠損および頸椎弓欠損が有意な出現
頻度で観察され，変異骨としては250mg／kg
群に椎体分離，頸椎弓分離，過剰腰椎，頸肋骨，
45

I E−64類縁体の閑発
表7 胎仔（Fl）内臓検査所見Groups（mg／kg）

contro1No．of examined fetuses
Head

0く0〉
0く0〉
0〈0〉
0く0〉

O

﹀
0
く

O

﹀
0
︿

34＊＊く16＊＊〉a）
34＊＊〈16＊＊〉

0

﹀
﹀

0

﹀

0

﹀

0

0〈0〉
0〈0〉
0〈0〉
0く0〉

﹀

0

0〈0〉

﹀

0

側∴W川∵Ⅶ州W m

0く0〉
0

﹀
﹀

0

﹀

0

﹀

0

﹀

0

﹀

6

﹀

0

﹀

6

1

朝〟W㈹ W川∵鴨川W烙

0

46

O

1

写真1胎仔（Fl）の頭部粗大切片
左：双無限 中央：片無限 右：正常

0〈0〉

﹀
0
く

0

＊＊：p＜0．01，〈〉：No．of dams conceivedwith casea）：Anophthalmia（31），Microphthalmia（3）O

0No．of abnormal fetuses

﹀
0
く

0

Ectopia testis or ovary
OtberS

0

Ectopia renis

0Diaphragmatic hernia

0

Fused kidney0

Hypoplasia of kidney0

Hydronepbrosis

0

Abdominal viscera

0No．of abnormal fetuses

0

Rigbt aortic arch
Otbers川 川 0 0 い り ・ ＝ 宣 川川≠ト0．1

Ventricular septaldefectO⁝細片OU⁝腑⁝㌍腑畔廿伸1ト

Maerocardius﹀

0

Eetocardia

﹀
0
く

﹀

0

﹀

0

Tboracic ViSCera

O

﹀

0

No．of abnormal fetuSeS

﹀
0
く

﹀

0

Otbersハ U

0Atretorrbinia﹀

Enlargement of third ventricle

19
64
﹀
0
く

0

Enlargement oflateralventricle﹀

Atrophy of cerebellum

畑∴W〟W㈹二Ⅶ血W川Atrophy of cerebrum

1854畑∴Ⅶ〟W州 Ⅶ〟Wm
0000000

No．of dams

20

4．ESTの生殖に及ぼす影響
表8−1胎仔（Fl）骨格検査所見一異常および変異−Groups（mg／kg）
No．of dams
No．of examined fetuses

Contro1

20

70

250

22

20

23

20

125

117

131

137

Abnormalities
Fusion of vertebralcenters

0〈0〉

0〈0〉

Deformity of vertebralcenters

0〈0〉

0〈0〉

0〈0〉

9＊＊く7＊＊〉

1〈1〉

10＊＊〈7＊＊〉

0く0〉

0〈0〉

0〈0〉

0〈0〉

0〈0〉

0〈0〉

Fusion of sternebrae

0〈0〉

0〈0〉

0〈0〉

Fusion of ribs

0〈0〉

0〈0〉

0く0〉

Waved ribs

0く0〉

0〈0〉

0く0〉

Absence of ribs

0〈0〉

0〈0〉

0く0〉

Knob of ribs

0く0〉

Others0く0〉﹀ ﹀ ﹀ ﹀
4 1 0 0．′＼ く く く
5 1 0 0

0

0

1〈1〉
0

〈0〉
1〈1〉

0

〈0〉

11＊＊〈8＊り

0

く0〉

10

〈8〉

16＊＊〈10＊＊〉0〈0〉25＊＊〈10＊＊〉

0
︿
0

﹀

﹀
0
く
0

﹀

﹀
﹀
0
く
0

0
く
0

﹀

﹀
0
く
0
﹀
0
く
0
﹀
0
く
0
﹀
0
く
0
﹀
1
く
1
﹀
1
く
1
﹀
0
く
0
﹀
0
く
0

﹀ ﹀ ﹀ ﹀ ﹀ ﹀ ﹀ ﹀0 0 0 0 0 0 0 0
く く く く く く く く
0 0 0 0 0 0 0 0﹀ ﹀ ﹀ ﹀ ﹀ ﹀ ﹀ ﹀ ﹀0 0 0 0 0 0 1 4 0 0
く く く ／＼ く く く く く く
0 0 0 0 0 0 1 5 0 0

0
く
0

﹀
1
く
1

﹀

﹀
0
／＼
0

﹀
0
く
0

0
く
0

Otbers′＼Shortening of ribs

＼ ／Lumbar ribs﹀

Cervical ribs

0

Dislocated sternebrae

0Accessory sternebrae／＼

Asymmetryof sternebrae﹀

Split of sternebrae／＼

Rudimentarylumbar vertebrae

2

Splitoflumbarvertebralarches
Extralumbar vertebrae

2

Bifurcation of cervical vertebral
arcbes＼ ノ

Split of cervicalvertebralarches／＼

Bif11rCation of vertebral centers

6

Split of vertebralcenters

7

Bilobed vertebral centers〈0〉35＊＊〈12＊＊〉a）

＼ ／
﹀
﹀
﹀ ﹀
0
2
5
0
1
く
／＼ く く く03501

Variations

﹀ ﹀
0 0
く く
0 0

Fusion of vertebral arches
Deformity of vertebralarches

0

0

〈0〉

0

く0〉

34＊＊〈14＊り
0

〈0〉

0

〈0〉

0

〈0〉

0

〈0〉

0

〈0〉

12榊く6＊〉
41＊＊〈17＊り
7＊〈7＊り0

く0〉＊：p＜0．05，＊＊：p＜0．01，〈〉：No・Ofdamsconceivedwithcasea）：Absenceofvertebralarches（31）・Extravertebralarches（1），Bifurcationofribs（3）

腰肋骨および13肋骨短小の有意な出現が認められた（写真2）。化骨状態では，70mg／kg群に
第5胸骨核，250mg／kg群に第6・7頸粒体，
第1〜6胸骨核，前肢左右の第5中手・基節骨および尾椎骨に有意な化骨遅延が認められた。
3．次世代出産仔（Fl）に及ほす影響
出産仔の体重変動を表9に示した。20および70mg／kg群では雌の出生直後に有意な増加がみられ，250mg／kg群の雌雄に強い増加抑制が認められた。軟Ⅹ線投影による骨格検査では，2501mg／kg群で胎仔の骨格標本観察時にみちれたものと同様の異常骨が認められた。外表分化状態を表10に示した。250mg／kg群で歯芽萌出，限瞼開裂および精巣下降に遅延が認められた。250mg／kg群で生後18日目まで限瞼開裂しなかったもののうち，39例が無限仔，2例が中限仔であった（写真3）。
行動・感覚機能検査所見を表11に示した。
250mg／kg群の眼球正常仔および片無限仔において光反射に異常が認められた。水迷路学習
検査の成績を表12に，PAR学習・情動性検査の成績を表13に示した。水迷路検査では，20お47

I E−64類縁体の開発
表8−2 胎仔（F．）骨格検査所見一化骨状態−
Groups（mg／kg）

Contro1

125

250

116〈20〉131〈23〉731

22No．of examined fetuses

70

0
2

No．of dams

20

Skull
125〈22〉

＼／
0
2
′＼
＊
＊

4
1
1

Supraoccipitalbone

﹀
﹀

0

﹀

0

﹀
＊

0

﹀

＊
＊

9

＊
＊

3
1

︿くくく

﹀

0

＊

9く7〉

0

0く0〉

0

﹀
3

0

0く0〉

﹀

﹀
0

0

0く0〉

94〈22〉

1
1

0

0く

0

8く

0
2

＼／ ＼′
7
0

﹀
0

97〈21〉﹀
0

7th cervicalcenter

﹀﹀
70
2
ノ＼

6く6〉

7

6th cervicalcenter

97

2く2〉

﹀
4

﹀
0

5th cervicalcenter

くく
く
くくく
7 0 0 0 3﹀
0′＼

4th cervical center﹀0

3rd cervical center﹀
9

ノ＼ ／＼ ′＼
5 0 0 01

lst cervical center2nd cervical center

くくく

Cervicothoracic vertebrae

Sternebrae

76＊＊〈19〉

＊

2
く く

2 7
1
1

く

6

﹀
0

︾︾のめ

114＊＊〈20〉117〈23〉
2︿

129〈23〉
6
2
1

′＼ ′＼
0 0

3

′ ＼ ′＼ ′ ＼

8く4〉

﹀ ﹀
﹀
0
2 113

6th sternebra

﹀ ﹀
0 0
2 2

18く11〉﹀
02

5th sternebra

3 4
0 1
1

117〈22〉ノ＼

4th sternebra′＼

124く22〉

9 5
0 1
1 1

3rd sternebra′＼

125く22〉

2nd sternebra l18く22〉

611

lst sternebra

78＊＊〈18〉
46＊＊〈14＊〉
1＊＊〈1＊＊〉
0＊＊〈0〉

Forelimb

131〈23〉

125〈22〉

117〈20〉131〈23〉

125〈22〉

117〈22〉

131〈23〉Left

125く22〉

117〈20〉131〈23〉

125く22〉

117〈20〉131〈23〉

137〈20〉

125く22〉

117〈20〉131〈23〉136〈20〉

117〈22〉

115く23〉

124く23〉65＊＊〈14＊〉

117〈22〉

115〈20〉

125〈23〉63＊＊く14り4th metacarpus Right
Left

5th metacarpus Right
Left

No・Of proximalphalanges
Rigbt o．4土0．6（125）
Left o．3士0．5（125）

7
3
1

Left

3rd metacarpus Right

6
3
1

7 6
3 3
1 1

117く20〉0

0く0〉

125〈22〉﹀ ﹀ ﹀ ﹀ ﹀ ﹀0 0 0 0 0 0
2 2 2 20〈0〉くく く く く く0

2nd metacarpus Right

＼ノ
0

′＼ ′＼
0 0

Left

﹀﹀
0 0

1st metacarpus Right

0．5士0．6（117）

0．5土0．7（131）0．0士0．0＊＊（137）

0．3土0．5（117）

0．4土0．6（131）0．0土0，0＊＊（137）

0く0〉

0く0〉

0く0〉

0〈0〉

0く0〉

Hindlimb
﹀
O
﹀
l

′＼ ′＼
O l

lst metatarsus Right
Left

2nd metatarsus Right

125〈22〉

117〈20〉131く23〉

137く20〉Left

125〈22〉

117〈20〉131〈23〉

137〈20〉

3rd metatarsus Right

125く22〉

117〈20〉131〈23〉

137〈20〉Left

125〈22〉

117〈20〉131〈23〉

137〈20〉

125〈22〉

117〈20〉131〈23〉

137〈20〉125く22〉

117〈20〉131〈23〉

137〈20〉

124〈22〉

117〈20〉131〈23〉

135〈20〉

125〈22〉

117く20〉131く23〉

135く20〉

4th metatarsus Right
Left

5th metatarsus Right
Left

No．of proximalpbalanges
Rigbt o．0士0．0（125）
Left o．0土0．0（125）
No・Of caudalvertebrae 4．4土0．6（125）
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4．4土0．6（117）

4．4土0．6（131）3．4±0．8＊＊（137）4．ESTの生殖に及ぼす影響

写真2 胎仔（Fl）の骨格標本
胸椎体不整および分離，右第12胸椎弓欠損，腰肋骨の出現
表9 出産仔（Fl）の体重変動
Groups（mg／kg）

Contro1

20

70

250

Male
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14
21
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49
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10．1士 1．14＊＊（31）19．1± 2．02＊＊（31）30．0 土 2．96＊＊（30）52．8 ± 4．69＊＊（27）80．9 士 6．42＊＊（27）102．7 土 8．40＊＊（27）11．3士0．77（36）21．1士1．56（36）33．4±2．28（36）59．2土5．41（26）89．5土4．75（26）113．9士5．90（26）132．9±6．12（26）148．0±6．96（26）120．6土10．05＊＊（27）134，1土10．49＊＊（27）Mean土S．D．（No．of animals），＊：p＜0．05，＊＊‥p＜0．01，Unit：Gram49

I E−64類縁体の開発
表10 出産仔（Fl）の外表分化状態
Groups（mg／kg）

Contro1

20

70

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No．of dams

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11

11

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100．0

Descent of testis［％］
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27／27

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26／27

81／81

＊：p＜0．05，＊＊：p＜0．01a）：Anophthalmia（39），Microphthalmia（2）

写真3 片無限出産仔（Fl）

よび70mg／kg群は対照群と変わらなかったが，250mg／kg群において眼球奇形仔を含んだ雌雄に所要時間およびェラー数の有意な増加が認められた。しかし，眼球正常仔の成績では，
異常はみられなかった。PAR検査においては，
学習前では250mg／kg群の眼球奇形仔を含む
雌雄に潜時の有意な増加が，また，雄に排尿回数の有意な増加が認められた。学習後では，250mg／kg群の雌双無限仔に，身づくろい回数の低下が認められた。しかし，水迷路検査と同様に250mg／kg群の眼球正常仔には，異常は示されなかった。
50

生殖能検査の成績を蓑14に示した。250mg／
kg群で交尾率（交尾成立数／交配数×100）の低下および交配日数（交尾成立までの日数）の遅延が認められた。しかし，眼球正常仔の成績
では，異常はみられなかった。受胎率（妊娠成立数／交尾成立数×100）はいずれの投与群も対照群と変わらなかった。妊娠20日日ならびに分娩後21日日の剖検において臓器の肉眼的な異常は1例も観察されなかった。自然分娩させた次世代仔は，いずれの投与群にも分娩異常はみられず，次々世代出産仔を順調に哺育した。

4．ESTの生殖に及ぼす影響

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4．ESTの生殖に及ぼす影響

4．次々世代胎仔（F2）に及はす影響
いずれの投与群においても，子宮内状態，生存仔数，死亡仔数，性比，体重は，対照群と変わらず，外表異常仔も全く認められなかった。
軟Ⅹ繰撮影検査からは，いずれの投与群においても，異常骨あるいは変異骨を有する胎仔は認められなかった。
5．次々世代出産仔（F2）に及はす影響
いずれの投与群においても，出産仔の発育および一般状態に異常は観察されなかった。
考察

ESTは，母獣（Fo）に対し500mg／kg以上の鱒与量で流産を誘発し，70および250mg／kgの投与量で投与期間中の摂餌量を減少させた。
次世代胎仔（Fl）に対しては，500mg／kg以上の投与量で死亡仔の増加（1，000mg／kg：
100％，500mg／kg：90．2％），250mg／kg投与
量で体重を低下させ，さらに，250mg／kg投与量で眼球異常仔（53．1％），骨異常仔，骨変異仔ならびに化骨遅延仔を有意に増加させた。
しかし，70mg／kg投与量では一部の陶骨核だ
けに化骨遅延を示す胎仔を若干増加させたが，他に対照群と異なる変化はみられなかった。
250mg／kg投与量において，生存仔性比に雄性数の減少に基づく値（0．83）が示されたが，死胚胎仔数および対照群の性比の／ミランスからみて，偶発的なものと考えられた。次世代出産
仔（Fl）に対しては，250mg／kg投与量で出生率・生存率の減少，発育・外表分化日の遅延，外表異常（無限仔）および骨格異常が示され，胎仔にみられた発育抑制，外表異常（無限仔）
および骨格異常が生後にも継続して認められた。行動・感覚機能検査では，250mg／kg投与
量で光反射に高頻度の異常（雌雄各々57．9％）がみられ，外観上眼球形成異常を示さない動物にも異常が認められた。250mg／kg投与量で胎仔・出産仔にみられた限異常は，EST投与による特徴的なものであり，玉置が報告した12）
Vincristine誘発奇形と類似（退行変性性限奇形）の形態を示すものと思われた。水迷路学習
検査，PAR学習・情動性検査および生殖能検査においても，250mg／kg投与量で眼球奇形による影響が認められた。20および70mg／kg投与量では，対照と同様な成績であった。次々世
代胎仔・出産仔（F2）に対しては，いずれの投与量においても外表異常仔は1例も観察されず，骨格，発育，一般状態にも影響は認められなかった。
以上の結果より，ESTはラットに対し500mg／kg以上の投与量で流産を含む強い胎
仔毒性を示し，250mg／kg投与量で眼球・骨格に奇形を誘発する薬剤であると考えられた。
しかし，ESTは次世代仔（Fl）に限り影響を与えるもので，次々世代仔（F2）以後の子孫に影響しないものと推察された。
結論

Wistar系妊娠ラットの胚・器官形成期にESTを経口投与した。その結果，500mg／kg以上の投与量で強い胎仔毒性がみられ，250rng／kg投与量で次世代仔（Fl）に眼球・骨格異常の多発および生殖能への影響が示された。しかし，70mg／kg投与量ではこれらの変化はみら
れず，250mg／kg以下の投与量では次々世代仔（F2）に対して影響は認められなかった。
文献1）山田 隆，西山 軌 笹島道忠，中根貞雄：
0ⅩaprOZinの生殖試験−ラットにおける妊娠前及び妊娠初期投与試験−，医薬品研究，15，207−224，
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2）Wilson，J．G．：Methods for administering
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3）Barrow，・M．V．and Taylor，W．J．：A rapid
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4）西村耕一：マウスおよびラット胎仔の胸部内臓奇形観察のための頗徴解剖法，Cong．Anomり14，
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5）Dawson，A．B．：A note on the staining of
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red S，Stain Technology，1，123−124，1926．
57

I E−64類縁体の開発
6）Fox，W．M．：Re且ex−OntOgenyandbehaviouralabilityin the rat：Assessment of central

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nervous system development，Science，168，234−241，1965．

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58

56，439−453，1940．

11）山田 隆，内田英男，市川明美：生殖試験における次世代動物の学習障害検索について，Exp．
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12）玉置勝：Vincristineによるラット胎仔の限奇形とその成立枚序について，Cong．Anom・，9，157−
170，1969．

5．ESTのマウス骨髄細胞染色体異常試験

大 関 正 弘＊
研究協力者 安 井
鈴

日

木

的

ESTをマウスに授与して骨髄細胞における染色体異常誘発の有無を検討する。
方法

生後7週令のddY系雄マウスを静動協より購入し，およそ1週間予備飼育した後，実験に供した。
ESTの投与量は急性毒性試験の結果を参考にddY系雄マウスの腹腔内投与によるLDlO値に相当する2，400mg／kgを最大耐量とし，以下1，200mg／kgおよび10mg／kg（1群5匹）を設け，いずれも5％アラビアゴムによる懸濁液とした。
一方，陽性対照としてマイトマシンC3mg／kgを生理食塩水に溶解して用いた。
投与容量は10〜20ml／kgとし，いずれも単回腹腔内に投与した。
薬物投与の6，24および48時間後に動物を頸樵脱臼により屠殺した。屠殺2時間前にコルセ
ミド4mg／kgを腹腔内授与した。
大腿骨から骨髄細胞を生理食塩水で洗い出し，これを1，000rpmで10分間遠沈した後，0．075M塩化カリウム水溶液を加えて370Cで
15分間低張処理した。次いでacetic−alcobol（酢酸1容にメタノール3容）を用いて懸濁ならびに遠沈の操作を3回反復して細胞を国定＊大正製薬株式会社総合研究所

一＊

酒

井

洋＊

中

根

茂＊
貞

雄＊

し，最終的に一様な細胞浮遊液を得た。その2，3滴をスライドグラス上に落として一夜自然風乾した後，3％ギムザ液（原液をゼーレン
ゼソ緩衝液で希釈）で染色して顕微鏡標本を得た。
観察は染色体がよく拡がり，その各々が明瞭に区別できる分裂中期像を選んで，動物1匹当り50個の細胞について染色体数を数え，また染色体異常の有無を調べた。
・染色体異常の指標はギャップ，切断，交換および断片とし，個々の分裂中期像で染色体異常が1つでも認められた細胞は異常細胞数1個として数えた。
観察した細胞数はESTの各投与群ならびに各処理時間につき250個とした。一方，陰性対
照群は各処理時間とも150個とした。両者の問でX2法により統計学的有意性を検定した。
結果および考察
表1，2に試験結果を示す。両表に見るようにESTの10，1，200および2，400mg／kg投与
群すべての染色体像は陰性対照のそれと同等である。すなわち，数的異常としては異数性細胞（2I卜1，あるいは2州＋1）が250細胞中7〜10例見られ，その出現率は2．8〜4．0％の範囲であった。また，構造的異常としては染色分体型のギャップ，切断の他に染色同位体型のギャップも見られたが，異常を有する細胞は0〜2．0％の範囲であった。X2検定の結果は数的異常，構造的異常ともにEST各投与群，各処理時間に59

I E−64類縁体の開発
表1Numericalanalysis of the bone−marrOW Cellchromosome of mice
injectedintraperitoneally with EST and Mitomycin C
Time
Dose after No．of No．of（mg／kg）treatment animals cells（br）Compound

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1

表2

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8

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5％gum arabic

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11（4．4）13（5．2）12（4．8）StruCturalanalysis of the bone一marrOW Cellchromosome of mice
injectedintraperitoneally with EST and Mitomycin C
Time

Compo。nd

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（hr）

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Aberrant

Isochro一，空禁＿、▲＿空竺＿▲Pel且聖1．9f matid matidEx−

5．ESTのマウス骨髄細胞染色体異常試験

ついて，それぞれ陰性対照との間に有意な差異は認められなかった。また用量依存的な異常増加も認められなかった。
一方，陽性対照として用いたマイトマイシン
C投与群では数的異常として，6，24および48
時間処理でそれぞれ11例（4．4％），13例（5．2％）および12例（4．8％）の異数性細胞が見られたが，これらはいずれも陰性対照と比較して有意な差異ではなかった。これに対し，構造的異常では6，24および48時間処理でそれぞれ
7．2％，31．2％および9．2％の異常細胞が出現
し，いずれの処理時間とも陰性対照に対して有意な上昇であった（表2）。その主な異常としては染色分体型のギャップおよび切断，ならびに交換であり，交換の内容は対称型がほとんど
であった。

結

語

ddY系雄マウスを用い，ESTの10，1，200
および2，400mg／kgの各投与群ならびに陰性
対照（5％アラビアゴム）および陽性対照（マイトマイシンC，3mg／kg）の計5群を設け，腹腔内1回投与後6，24および48時間に大腿骨髄細胞の染色体標本を作製し，鏡放した。
その結果，ESTの各投与群による染色体の異数性および構造的異常はそれぞれ2．8〜4．0％，0〜2．0％の範囲であり，いずれも陰性対照との問に有意な差異は認められず，また用量依存的な異常増加も認められなかった。
以上より，ESTはマウス骨髄細胞に対し染色体の異常を誘発しないものと判定された。

61

6．ESTの局所刺激に関する研究

大 関 正 弘＊
研究協力者 中 根 貞 雄＊ 阿 部 訓 志＊
岩

城

理

進＊

須

江

美佐子＊

表1ESTの皮膚一次刺激性
目

的

ESTの安全性試験の一環として，皮膚一次刺激性ならびに限粘膜刺激性をウサギにおいて
検討する。
方

法

体重2．9〜3．8kgの日本白色種雄性ウサギ（新日本動物）を使用した。
1．皮膚一次刺激性
ESTはアセトンにて2，10および50mg／ml
溶液とし，各液0．1mlを刈毛したウサギ背部
皮膚6ヶ所に24時間閉塞塗布した。
塗布24，48および72時間後に，塗布部位皮膚を観察し，Draizeら1）の皮膚刺激性判定基準に従って評価した。
2）限粘膜刺激性
ESTは比較的刺激性の少ないエチルアルコールにて，0．5および11mg／ml溶液とし，各液0．1mlを6例のウサギの左限結膜のうに滴下した。なお，右眼には対照としそれぞれの溶媒を同様に処置した。
点眼1，4，6，24，48，72時間および7日後に角膜，虹彩および結膜を観察し，Draizeら2）の限粘膜刺激性判定基準に従って評価した。

＊大正製薬株式会社総合研究所a）Draizeらの判定基準に従って評価し，平均値を示した。最高評点＝8b）被験物質塗布後の時間

結果

1．皮膚一次刺激性
塗布24，48および72時間後のDraize法による評点を表1に示した。
いずれの濃度のEST溶液においても72時間後まで紅斑，浮腫および痴皮形成は認められなかった。
2．眼粘膜刺激性
点眼1，4，6，24，48，72時間および7日後のDraize法による評点を表2に示した。
ESTO．5mg／ml点眼群では6例中1例に軽度な角膜の混濁が認められた以外，刺激反応は認められなかった。また，溶媒である25％ェ
チルアルコール点眼でも同様の反応が認められた。
11mg／ml点眼群では24時間後をピークとして角膜の混濁，結膜の充血および腫脹，および分泌物の増加が認められたが，7日後ではそれ
63

l E−64額縁体の開発
表2

ESTの限粘膜刺激性a）Draizeらの判定基準に従い，平均値を示した。最高評点＝110b）被験物質点眼後の時間
C）（）内は刺激性の認められた例数

ら変化は認められなかった。また，溶媒である

コール溶液点眼による刺激反応は溶媒として用50％ェチルアルコール点眼群でも同様な反応が認められた。

いた50％ェチルアルコール溶液に起因するも

考察

EST50mg／miアセトン溶液をウサギ皮膚のと考えられた。このことより，ESTに限粘膜刺敵性はほとんどないものと判断された。
結語に24時間閉塞塗布した場合，いずれの時点でもESTの局所刺激性をウサギで検討した結果

皮膚刺激反応は認められなかった。このことよより，ESTに皮膚一次刺激性および限粘膜刺激性はないものと判断された。

り，ESTに皮膚一次刺激性はないものと判断された。
限粘膜刺激性に関しては，ESTllmg／mi
溶液0・lmlの点眼により軽度の刺激反応が認

参考文献

ル溶液でも同様でほぼ同程度の刺激反応が認め

1）Draize，J・H・：Appraisal of the Safty ofChemiCalsin Foods．Drugs and Cosmetics，
FDん46，1959．

られたことより，ESTllmg／mlェチルアル

2）Draize，J．H．：ibid，49．

められたが，一 溶媒である50％ェチルアルコー

64

7．ESTの一般薬理作用
一中枢神経系ならびに諸種摘出臓器標本に及ぼす影響一

福

原

武

彦＊

研究協力者 高 野 一 夫＊ 木 村 直 史＊
蜂

谷

芳

弘＊

北

川

晴

美＊

を，横隔神経一横隔膜標本は95％酸素ガス，
日的E−64およびその類縁体の進行性筋ジストロ

5％炭酸ガスの混合ガスで飽和した370CのKrebs−Ringerbicarbonate液を，そして気管フィー症に対する治療薬としての有効性評価にならびに大動脈標本は95％酸素ガス，5％炭関する開発研究の一環として，57年度までにE−64（DL体，L体），E−64−CおよびEST

酸ガスの混合ガスで飽和した37ccのTyrode（E−64−d）の呼吸，循環機能および中枢神経系の活動に及ぼす影響ならびにE−64−CおよびESTの諸種摘出臓器標本に及ぼす影響について薬理学的研究を行ってきたト7）。本年度は，さらにESTの諸種摘出臓器標本に及ぼす影響
ならびに脳波を指標として中枢神経系に及ぼす影響を検討した。

液を満したマグヌス装置（マグヌス管内容積57ml）に懸垂した。張力トランスデューサー（Forcetransducer，tyPe45196A，日本電気三栄）を用いて各標本の自発収縮あるいは電気刺激により誘発される収縮に対するESTの影響を検討した。
3．被験薫物の適用液量ならびに最終濃度
EST3mgを無水エタノール1mlに溶解
し，濃度3×10￣3g／mlの薬液を調製した。まⅠ．ESTの諸種摘出臓器標本に及はす影響
方法

1．実験動物および摘出旗器標本た，これをさらに蒸留水で10倍に希釈し，濃度
3×10一一g／mlの液を得た。両溶液の適用液量を0．57mlとして実験を行った。したがってマグ
ヌス管（内容積57ml）内最終濃度はそれぞれ

実験にはラット（Wistar系，雄性，体重210

3×10−5g／mlまたは3×10￣6g／mlであったo〜255g）ならびにハムスク，（Golden系，雄ESTは水に不溶であるため，今回の実験条件

性，体重120〜135g）を用い，断頭，放血後に下に適用しうる最高濃度はマグヌス管内最終濃各種臓器標本を摘出した。ラットの心房，横隔度で3×10￣5g／mlであった。なお，対照とし神経一横隔膜および気管標本ならびにハムスタ
ーの大動脈標本の四種の摘出臓器標本についててEST溶液を調製するに用いたと同量のエタ検討した。
2．実験条件び1％）を適用し，その影響を検討した。また各臓器標本のうち，心房標本は摘出後，100％
酸素ガスで飽和した250CのRinger−Locke液

ノール溶液（マグヌス管内最終濃度0．1％およ
比較のため用いたAChおよびnoradrenalineの最終濃度はそれぞれ10￣6g／mlおよび10￣5g／mlであった。

＊東京慈恵会医科大学第2薬理学教室
65

I E−64類縁体の開発
表1諸種摘出臓器榎本に及ぼすESTの影響

Phrenic
nerVe−

110±3247士48

108土6

36士42＊

diapbragm111±1186土14

107土5＊

67土41

Tracbea1

5

Aorta l5

A＝EST3×10−

relax．

relax．

relax．

relax．

100％2】

61土10＊

72土20＊

relax．

cont．

relax，

COnt．

100％封

101±17

134士31g／mi・B：EST3×10−5g／mi，C：0・1％ェタ

ノール，D：1％ェクノール，H．R．：収縮回数，Amp・：収縮振幅，indirect：間接刺軌direct：直接刺激・relax・：弛緩，COnt・‥収縮，N：例数，1）：N＝4・2）：AChl0−6g／mlによる収縮・3）：nOradrenalinel0−5g／mlによる収縮，貢±SD：平均値±
標準偏差，＊：p＜0．05

図1ラット摘出心房標本の自発収縮に及ぼすESTならびに溶媒の影響
A：EST3×10−6g／mi・B：EST3×10−5g′ml，C：0・1％ェクノール，D：1％ェ
クノールの適用による影響○図の右下部の横線は時標10SeCを，縦線は校正50mgを示すo「●」はESTあるいはェクノールの適用時点を示す。

結果

1．摘出心房標本に及ほす影響（1）ESTの影響
EST3×10￣6g／miの適用により心房標本の用により，適用後5分で収縮の振幅は対照時に比べ有意の減少を示し，その程度はEST
3×10￣5g／ml適用時と同方向，同程度であった（図トD，表1）。

タノール適用により心房標本の自発収縮には2・摘出槙照神経一横隔膜標本に及はす影響
横隔膜筋の直接電気刺激（矩形波，刺激電圧
7・5〜19・5V，刺激持続0．5msec，刺激頻度0・2Hz）あるいは横隔神経電気刺激による間接刺激（矩形波，刺激電圧8〜10V，刺激持続0・5msec，刺激頻度0．2Hz）により誘発される筋収縮に及ぼすESTの影響を検討した。
（1）ESTの影響影響が認められなかった（図1−C，表1）が，3×10￣5g／mlの溶媒である1％ェクノール適直接および間接刺激により誘発された横隔膜の収縮に対してEST3×10￣6g／mlは著明な自発収縮には影響が認められなかった（図1−
A，表1）。3×10￣5g／mlの適用により適用5分後に収縮振幅は対照時に比べ有意に減少した（図1−B，表1）。
（2）溶媒の影響
EST3×10￣6g／mlの溶媒である0．1％のエ

66

7．ESTの一般薬理作用

図2

ラット横隔神経一横隔膜標本の直接ならびに間接刺激による収縮に及ぼすESTならびに溶媒の影響
A：EST3×10−6g／ml，B：EST3×10￣5g／ml，C：0．1％ェクノール，D：1％ェクノ

ール適用による影響。A〜Dにおける高振幅の収縮：直接刺激による収縮。A〜Dの振幅の小さな収縮‥間接刺激による収縮。両刺激とも刺激電圧8V，刺激持続0・5msec，
刺激頻度0．2Hz。図の右下部の横線は時標1minを，縦線は校正1gを示す0「●」はESTあるいはエタノールの適用時点を示す。

r r

二√二一．

図3 ラット気管標本の自発収縮ならびにAChによる収縮に及ぼす影響
A：EST3×10−6g／ml，B：EST3×10￣5g／ml，C：0．1％ェクノール，D：1％エタノ
ール，E：AChlOL6g／ml，F：EST3×10r5g／ml前処置後のAChlO￣6g／ml，G：
1％エタノール前処置後のACblO￣6g／ml適用による収縮。図の右下部の横線は時標
1minを，右端の縦線は校正500mgを示す。A〜Dの「●」はESTあるいはエタノールの適用時点を，E〜Gの「●」はAChの適用時点を示す。

影響を与えなかった（図2−A，表1）。EST
3×10￣5g／mlの適用直後，直接ならびに間接
両刺激に対する両応答に，共に一過性の収縮高の増大とそれに続く収縮高の減少が認められた（図2−B，表1）。この収縮高の減少の程度は直接刺激の場合に比べて間接刺激による収縮において，より大きい傾向が認められたが，有意ではなかった（N＝5）。図2に間接刺激時において，より減少の程度が大であった1例を示す。

（2）溶媒の影響
EST3×10J6g／mlの溶媒である0．1％ェク
ノールの適用により，両刺激による横隔膜筋の収縮には著明な影響が認められなかった（図2−
C，表1）が，3×10￣5g／mlの溶媒である1％ェタノール適用により両刺激による筋収縮において，EST3×10．5g／ml適用時と同程度，同方向の変化が認められた（図2−D，表1）。

67I E−64炉縁体の開発

図4

ハムスター大動脈標本の自発収縮ならびにnoradrenalineによる収縮に及ぼす影響
A：EST3×10￣6g／mi（左）．3×10￣Sg／ml（右），B：0．1％エタノール（左），1％ェ
クノール（右），C：nOradrenalinelO￣5g／ml，D：EST3×10，5g／ml前処置後のnoradrenaline10−5g／mi，E：1％エタノール前処置後のnoradrenalinelO￣Sg／ml

適用による収縮。回の右下部の横線は時標lminを，右端の縦線は校正500mgを示す。Aの「●」はESTの，Bの「●」はエタノールの．C〜Eの「●」はnor−

adrenalineの適用時点を示す。

3．摘出気管標本に及ほす影響（1）ESTの影響
EST3×10−6g／mlならびに3×10￣5g／mlの適用により，用量依存的に軽度の気管標本の弛緩が認められた（図3−A，B，表1）。
（2）溶媒の影響
EST3×10．6g／mlならびに3×10￣5g／mlの溶媒である0．1％および1％ェクノールの適用により，EST適用と同程度，同方向の用量依存的な気管標本の弛緩が認められた（図3−
C，D，表1）。
（3）AChによる収縮に及ぼすESTの影響
AChlO￣6g／mlの適用による気管標本の収縮（図3−E）は，EST3×10−5g／mlの前処
置により，有意に抑制された（図3−F，表1）。
また，EST3×10−5g／mlの溶媒である1％ェ
クノール前処置によっても同程度に抑制された（図3−G，表1）。
4．摘出大動脈標本に及はす影響（1）ESTの影響
大動脈標本はEST3×10￣6g／mlの適用により軽度に弛緩し（図4−A，表1），3×10￣5g／mlの適用により収縮が認められた（図4−A，
表1）。
（2）溶媒の影響
EST3×10．6g／mlの溶媒である0．1％ェク
ノールの適用により，大動脈標本は軽度に弛緩
68

し（図4−B！表1），EST3×10￣5g／mlの溶媒である1％ェクノールの適用により収縮が認められ，その程度はEST3×10￣6g／mlな
らびに3×10￣5g／mlの適用時と同程度であった（図4−B，表1）。
（3）Noradrenalineによる収縮に及ぼす
ESTの影響
NoradrenalinelO．5g／mlの適用による大動脈標本の収縮（図4−C）は，EST3×10−5g／ml
ならびにその溶媒である1％ェクノールの前処置により著明な影響を受けなかった（図4−
D，E，表1）。
Ⅰ．光ならびに昔刺激による脳波誘発反応に及
はす影響
方

法

1．実験動物
体重2．5〜2．7kgの成熟，雌性のウサギを用いた。
2．実験条件エーテル麻酔下に gallamine triethiodide（5mg／kg，i．Ⅴ．）により非動化した後，大動脈血圧，心電図，横隔神経遠心性発射活動，呼気
ガス酸素ならびに炭酸ガス濃度の連続監視下に
人工呼吸により換気レベルを適正に維持した。
頸部で両側の迷走，交感，減圧神経を切断し7．ESTの一般薬理作用
表2

ウサギ自発脳波に及ぼすESTlg／kg経口適用の影響
AfterEST（1g／kg p．0．）
30min

60min

90min

120minmean±SD mean±SD mean土SD mean±SD mean士SD（N＝6）

EEG T．P．
EEG M．F．（Hz）

（N＝6）

（N＝6）

（N＝3）

（N＝5）

100

102土20107土31

101土98114土61

3．8±1．5

3．5±1．5

3．4±0．9

3．0土1．5

3．3土0．3

EEG：前頭一後頭頭皮上脳波，T．P．：総パワー値，M・F・：平均周波数，N：例数，SD：標準偏差

図5 光刺激（1Hz）によるウサギ脳波誘発反応に及ぼすESTlg／kgの経口適用の影響
A，B：EST適用前，C，D：EST適用後30分，A，C：前頭一後頭頭皮上，B，D：後頭一後頭頭皮上の各脳波。BおよびD直下の横線は光刺激（1Hz，30sec）時点を示す。図の右下部の境線は時標10SeCを，図の右端部の縦線は校正50′ Ⅴを示す。

た。また温熱マットを用いて保温し，直腸温を37〜37．20Cに維持した。
3．被験薬物の適用法および適用量
ESTを5％アラビアゴム溶液に懸濁し，カテーテルを介して胃内に適用した。ESTの適用量は1g／kg，適用液量は5ml／kgとした。
4．脳波（EEG）
中枢神経系の活動の指標として前頭一後頭ならびに後頭一後頭頭皮上脳波を同時に導出し，データレコーダー（TEAC，R−81）を用い磁気て光ならびに音刺激による脳波誘発反応に及ぼすESTの影響を検討した。光刺激は1Hz，刺激持続60秒間および30Hz，15秒間とし，また
音刺激は1，000Hz，15秒間および2，000Hz，15秒間とした。実験終了後，磁気テープに収録
した記録データを再生し，医用電算校（シグナ
ルプロセッサー，7TO8，日本電気三栄）を用いて，自発脳波ならびに脳波誘発反応のパワー
スペクトル分析および誘発反応の加算平均法により計量的解析を行った。

テープに記録した。薬物適用後120分にわたっ69

I E一朗類縁体の開発

186

160

0

13．0

Hz

図6 光刺激（1Hz）によるウサギ前頭一後頭脳波誘発反応のパワースペクトルに及ぼす．EST
lg／kgの経口適用の影響
A：EST適用前未刺激時の脳波，B：EST適用前光刺激1Hzによる脳波誘発反応，
C：EST適用後60分における脳波誘発反応，D：EST適用後120分における脳波誘発反応の各ノミワースペクレレ。各グラフの縦軸はパワー値，横軸は周波数（0〜13．0Hz）を示す。各グラフの右端の縦線は校正値を示す。また各グラフ右上の数値は，薬物適用前，未刺激時の総パワー値を100とした各時点における総パワー値の相対値を示す。

結

果

1．自然脳波に及ほす影響
前頭一後頭頭皮上自発脳波の総パワー値は5
例においてESTlg／kgの経口適用後30，60，90および120分間において変化が認められなかった（表2）。また脳波の平均周波数も5例において適用後30，60，90および120分において有意の変化が認められなかった（表2）。
2．光刺激1Hzによる脳波誘発反応に及ほす影響
光刺激1Hzにより前頭一後頭，後頭一後頭の頭皮上脳波に著明な脳波誘発電位が認められ（図5−A，B），ESTlg／kg適用後120分まで誘発電位発現に変化が認められなかった。適用後30分での誘発電位発現の様子を図5−C，Dに示した。加算平均法による誘発電位の波形にも適用後30，60および120分において変化が認やられなかった。また，光刺激1Hzによる誘発反応のパワースペクトルには1，2，3および4Hzの帯域にピークが認められた（図6−
B）が，EST適用後30，60および120分にお70

いてノミワースベクトルならびに総パワー値には有意な変化は認められなかった（図年，表3）。
3．光刺激30Hzによる脳波誘発反応に及ほす影響
光刺敢30Hzにより前頭一後頭ならびに後頭
一後頭頭皮上脳波に著明な誘発反応が認められた（図7−A，C），光刺敦30Hzによる誘発
反応にはESTlg／kg適用後も著明な変化が認められなかった。適用後60分の例を図7−
B，Dに示す。パワースペクトル解析により得られた脳波誘発反応の総／くワー値には薬物適用
後30，60および120分において有意な変化が認められなかった（表3）。また誘発反応の周
波数帯域別の総パワー値は，薬物適用前0．5〜
3．5Hzの帯域で総パワー値の減少傾向，3．5〜
30Hzの帯域で増大傾向が認められたが，この傾向はESTlg／kg適用後60分においても認められた（表4）。
4．1，000Hzおよび2，000Hzの音刺激による脳波誘発反応に及はす影響
1，000Hzならびに2，000Hzの音利敵により脳波誘発反応が認められた。図7−E，Gに

7．ESTの一般薬理作用
表3

ウサギ脳波誘発反応の総パワー値に及ぼすESTlg／kg経口適用の影響
BeforeN

30min

After EST（1g／kg p．0，）
60min
120minmean土SD mean土SD mean土SD

F−0

3

0−0

87土33

145土85130土35100

78土30

121士65134土103

100

136土67

134土58115土16

3

一

2

O

0

0

F
一

O

0
一

2，000Hz

118士33155土973︐

auditory

93土5

100

0−0
F

l，000Hz

100％

F−0
0

auditory

3

100

65±12

92土36

67士35

100

86土32

82土29

64土15

100

75±21

98±48

84土47

100

76土24

78±3

87土4

photic：光刺激，auditory：音刺激，F−0：前頭一後頭頭皮上脳波，0−9：後頭一後頭頭皮上脳波，N：例数，
SD：標準偏差

図7 光刺激（30Hz）ならびに音刺激（1，000Hz）によるウサギ脳波誘発反応に及ぼすEST
lg／kg経口適用の影響
A，C，E，G：薬物適用前，B，D，F，H：EST適用後60分．A，B，E，F：前頭一後頭，C，I），
G，H：後頭一後頭の頭皮上脳波。C，D直下の横線は光刺激（30Hz）時点を示し，G，H
直下の横線は音刺激（1，000Hz）時点を示す。国の右下部の横線は時標10secを，図の右端の縦線は較正50J Ⅴを示す。

1，000Hzの音刺激による誘発反応の1例を示した。ESTlg／kg適用後もこの誘発反応に著明な変化は認められなかった（1，000Hz刺激
による誘発反応の1例を図7−F，Hに示す）。
パワースペクトル解析により得られた両刺激による誘発反応の総パワー値には，薬物適用後30，60および120分において有意の変化が認められなかった（表3）。また両刺激による誘発
反応の周波数帯域別の総パワー値は，薬物適用
前0．5〜3．5Hzの帯域で減少，3．5〜30Hzの帯域で増大の傾向が認められたが，この傾向は
ESTlg／kg適用後60分においても認められた（表4）。

71

I E−64類縁体の開発
表4 ウサギ脳波誘発反応の周波数帯域別総ノミワー値に及ぼすESTlg／kg経口適用の影響
0．5−3．5Hz

3．5−7．5Hz

7．5−30Hz

mean土SD mean土SD mean土SD

Photic：光刺敦・auditory：音刺激，F−0：前頭一後頸頭皮上脳波，0−0：後頭一後頭頭皮上脳波，N：例数，
SD：標準偏差。各値は薬物適用前後における未刺激時の各周波数帯域の総ノミワ一倍を100とした時の刺激時の総パワー値を示す。

考用9）によるものと考えられる。またそれに続く収縮高の減少はェクノールによる骨格筋細胞の察

Ⅰ．ESTの諸種摘出臓器標本に及はす影響

脱分枝（Knutsson，E．（1961）10））によるもの

EST3×10，5g／mlの適用により，摘出心房と考えられる。気管標本はESTならびにその標本の収縮振幅は有意に減少を示した。この収縮抑制作用はESTの溶媒として用いたェクノ

溶媒として用いたェクノールにより同程度の用ールの抑制作用と考えられ，3×10￣5g／ml以下

収縮に対する抑制作用もEST3×10−5g／mlと量依存的な弛緩を示し，また，気管標本のAChの濃度のESTは摘出心房標本に影響を与えな

1％ェクノールの適用により同程度に認められいものと考えられる。Gimenoら（1962）は摘出ラットむ房標本に対して，エタノールが速効た0このことからESTの気管標料こ対する作用は溶媒として用いたェタノールによる作用と性かつ可逆的な負の変力作用を有することを報考えられる。大動脈標本はEST3×10−6g／ml

告し，その原因が活動電位の減少と収縮機構にの適用により軽度の弛緩を，3×10−5g／mlの対する直接作用にあることを示唆している8）。
横隔神経一横隔膜標本の直接ならびに間接刺激適用により軽度の収縮を示したが，この作用は溶媒として用いたエタノールと同程度であり，により誘発される収縮に対して

EST3×3×10￣5g／ml以下の濃度では大動脈平滑筋に

10−5g／ml とその溶媒として用いた1％ェクノ

対してEST自体は影響をもたないものと考えられる。

ールの影響との間に差異は認められなかった。
このことはEST自体が3×10￣5g／mlの濃度
以下では横隔神経一横隔膜標本に影響を与えな

Ⅰ・光ならびに音刺激による脳波誘発反応に及ほす
影響いものと考えられる。EST（3×10−5g／ml）の今回検討したウサギ自発脳波の総パワー値な

1％ェクノール溶液ならびに1％ェクノール適

らびに平均周波数はESTlg／kg経口適用後

用直後，両種刺数による収縮の一過性増大は，120分まで有意の変化が認められなかった。こGage（1965）が報告した脂肪族アルコールの神経インパルスによる神経終末からのACh放出のことはESTが1g／kgの用量以下では脳波の発現に関与する中枢神経系の諸機構に対して増加作用とシナプス後段のACh感受性増大作

ほとんど影響を与えないものと考えられる。し72

7．ESTの一般薬理作用

かし昨年度報告したウサギの1実験例において
給ノミワ一倍の増大と平均周波数の低下が認められた事実7）は，ESTが大量に経口適用された
場合，軽度の中枢神経系の抑制状態が発現する可能性も示唆する。また1Hzならびに30Hzの光刺激により脳波誘発反応が認められ，30Hzの光刺激では0．5〜3．5Hzまでの徐波の減少ならびに3．5〜30Hzまでの速波の増加という覚醒反応（arousalresponse）が認められた。また音刺激1，000ならびに2，000Hzに
おいても光刺激30Hzの場合と同周波数帯域で同方向の反応が認められた。これら誘発反応
はESTlg／kg経口適用により有意の変化が認められなかったことから，ESTは1g／kg以下の用量の経口適用において，光ならびに音刺激による誘発反応発現に関与する中枢神経機構
および神経系路にはほとんど影響を与えないものと考えられる。
要

約

本研究において，ラット摘出心房，横隔神経一横隔膜標本，気管標本ならびにハムスター大動
脈標本を用い，これらの自発収縮ならびに薬物
および電気刺激により誘発される収縮に及ぼす
ESTの影響を検討した。さらにウサギを用い，非動化の急性実験条件下にESTの自発脳波および光ならびに音刺激による脳波誘発反応に及ぼす影響を検討した。
（1）EST3×10．6g／mlならびに3×10￣5g／mlの溶媒である0．1％ならびに1％ェクノールの適用により，以下の諸種摘出臓器標本におけるEST3×10￣6g／mlならびに3×10．5g／mlの適用時と同方向，同程度の変化が認められた。
したがって，EST3×10￣6g／mlおよび3×10，5g／mlの適用による各摘出臓器標本の変化はESTそのものによる影響とは考え難い。
（2）心房の自発収縮の振幅はEST3×10￣5g／mlの適用により有意に減少した。
（3）直接ならびに間接刺激により誘発された
横隔神経一横隔膜標本の収縮はEST3×10￣5g／mlの適用により一過性の振幅増大とそれに続く振幅の減少を示した。

（4）気管標本はEST3×10−6g／mlならびに3×10￣5g／ml適用により，軽度の用量依存的な弛緩を示した。
（5）大動脈標本はEST3×10−6g／mlの適用により軽度の弛緩を，3×10￣5g／mlの適用
により軽度の収縮を示した。
（6）ESTlg／ml（0．5％アラビアゴム溶液に懸濁）の経口適用後，自発脳波の総パワー値な
らびに平均値周波数には適用前と比べて有意な変化が認められなかった。
（7）光（1Hzならびに30Hz）および音（1，000Hzならびに2，000Hz）刺激による脳波誘発反応の総パワー値および周波数帯域別の総パワー値は ESTlg／kg適用前後において有意の変化を示さなかった。
参考文献
1）福原武彦：E−64の一般薬理作用一特に呼吸・循
環校能及び中枢神経系に及ぼす影響一，厚生省新薬開発研究事業「微生物の二次代謝産物に由来する斑病治療薬（E−64）の開発研究」昭和54年度研究報告書．63−79，1980．
2）福原武彦‥E−64−Cの一般薬理作用一特に呼吸・循環機能及び中枢神経系に及ぼす影響一，厚生省新薬開発研究事業「微生物の二次代謝産物に由来す
る難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和55年度研究報告容，14ト158，1981こ
3）木口百合子，後藤和利，高野一夫，西川嘉伸，
八反丸善文，宮川政昭，亀井淳三，福原武彦：徽
生物二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の呼吸，循環機能および脳波に及ぼす影響，慈恵医大誌，96，701イ11，1981．
4）木口百合子，高野一夫，西川嘉胤 八反丸善文，
宮川政昭，木村直史，福原武彦：E−64額縁体（E−64−C）の循環機能に及ぼす影響，慈恵医大誌，97，
ト9，1982．
5）木口百合子，福原武彦：ウサギ，ネコの横隔神経発射活動に及ぼすE−64の影響，東京慈恵会医科大学昭和55年度学内共同研究報告書，74−77，1981．
6）福原武彦：E−64−Cの一般薬理作用一諸種摘出臓
器標本に及ぼす影響−，厚生省新薬開発研究事業「徴生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和56年度研究報告書，121−130，1982．

7）福原武彦：E−64−dの一般薬理作用一呼吸・循環
校能および中枢神経系に及ぼす影響ならびに諸種73

I E一朗類縁体の開発

摘出臓器標本に及ぼす影響−，厚生省新薬開発研究
事業「傲生物の二次代謝産物に由来する毘病治療薬（E−64）の開発研究」昭和57年度研究報告書，
79−91，1983．

9）Gage，P．W．：Theeffectofmethyl，ethyland
n−prOpyl alcohol on neuromuscular transmis・
Sionin therat，J．Pharmacol．exp．Ther．，150，
236−243，1965．

8）Gimeno，A．L．，Gimeno，M．F．and Webb，J．
L：Effects of ethanol on cellular membrane10）Knutsson，E．：Effect of ethanol ozl thepotentials and contractility ofisolated rat
atrium，Amer，J．Physio1．，203，194−196，1962．

Of frog muscle負bres，Acta Physiol．Scand．，

74

membranepotentialandmembraneresistance

52，242−253，1961．

8．エポキシコハク酸1，4−14C標識体を用いた
ESTのラットにおける生体内動態

大

関

正

弘＊

研究協力者 福 島 清 実＊ 河 野 喜 郎＊ 吉 田 英 生＊
長

都

亘＊

篠

研究日的
昨年度著者1）はロイシンを標識したESTの生体内動態について検討した結果，組織への放射能の残留性を認め，その傾向は特に肝，腎に顕著であることを報告した。この結果は，安全性試験で認められた肝毒性および腎毒性2）と関連するものと思われる。その残留性は，エポキ
サイド誘導体であるESTが，その親電子的性
質により組織蛋白に共有結合した結果によるものか，あるいはESTの持づ2個の酸アミド結合の酵素的加水分解により遊離するHC−ロイシンの蛋白への取り込みによるものか明らかではない。
今回，著者はこれらの点について明らかにするため，ESTの活性基と思われ声エポキシコハ
ク酸部分を標識した〔epoxysuccinyll，4−日C〕
ESTを用いて，ラットにおける体内動態についてロイシン標識体の場合と比較検討した。
実験材料および方法
1．標識化合物〔Epoxysuccinyll，4−14C〕EST（以下11C−
EST（E）と略す）は，〔1，4−1．C〕fumaricacidを原料として

崎

文

子＊

京

極

和

旭＊

100％であった。
2．実験動物および投与法
動物は，Wistar系雄ラット（体重170〜200g）および同系雌ラット（体重130〜150g）を静岡実験動物農業協同組合より購入し，1週間以上予備飼育したのち，一夜絶食後実験に供した。いずれの動物も薬物投与後2時間から給餌した。
標識化合物は5％アラビアゴムに懸濁し，特記する場合を除いて5mg／kgで経口授与した03．血中濃度の測定
HC−EST（E）をラットに経口投与したのち，尾静脈より経時的に20JJlずつ採血し，放射能を測定した。
4．尿糞および呼気申排泄率の測定
ラットに11C−EST（E）を経口投与したのち代謝ケージに収め，所定時間ごとに自然排泄尿および糞を分別採取した。採取した尿は水で希
釈後，糞は均質化したのち，その一部を取り放射能を測定した。
HC−EST（E）を経口投与後，ラットを呼気
描集用代謝ケージ（メタポリカC0−2型，杉山
元医理器）に収め，呼気中炭酸ガスをモノユタ
HO＊co−NHCHCO−NHCH2New England Nuclear（NEN）に委託して合成した（図1）。比放射能は11．46／上G／mg，放射化学的純度は薄層クロマトグラフィー（以下TLC）の結果，ほぼ＊大正製薬株式会社総合研究所

C2HS。。6）C乙さくH。産も。A3
図1〔Epoxysuccinyll，4J−C〕ESTの化学構造＊標識位置 放射化学的純度：98．7％以上
比放射能：4mCi／mmole
75

1

2

3

4

5

6

7

8

24（hr）

図2 ラットに14C−EST5m盲／kg経口投与後の血中放射能濃度
各点はN＝5の平均値を示す。
ノールアミン：メタノール（3：2）500ml中にい，クロロホルム：メタノール：酢酸（9：1：

捕集し，所定時間ごとにその一部を採取して放射能を測定した。
5．胆汁中排泄率の測定

2）で展開した。TLC上の放射能は，TLCリ

ラットを軽くェーテル麻酔したのち，総胆管にポリェチレンカニューレを挿入した。麻酔覚醒後，14C−EST（E）を経口投与したのち，ボールマンケージに収め，所定時間ごとに胆汁を採取し，尿の場合と同様に放射能を測定した。
6．組織内濃度の測定をかき取り放射能を測定することにより定量した。

ラットに14C−EST（E）を経口投与後，所定時間に放血致死させ，各種組織を摘出した。
各組織は，一部あるいは全部をSoluene350・（Packard，3255型）で放射能を測定した。
TLCプレート上の放射能は，かき取ったシリ（Packard）で可溶化後，放射能を測定した。
7．代謝物の分析

および希釈LIQUIFLUOR（NEN）10mlを加えて測定した。

採取した24時間尿および胆汁は，0．1N塩酸によりpH2．0に調整したのちアンパーライト
ⅩAD−4カラムに放射能を吸着させ，水洗後メタノールで溶出した。
消化管内容物は，4倍量のメタノールを加えてホモジナイズし，遠心分離後上清をメタノー
ル抽出画分とした。

9．全身オートラジオグラフィー

各抽出物は減圧下濃縮乾固し，少量のメタノールに溶解後TLCにより代謝物を分析した。
プレートはシリカゲル60F251（Merck）を用
76

ニアアナライザー（Bertold）で測定，または
オートラジオグラムにより検出し，放射能領域

8．放射能の測定
各試料は，必要に応じて30％過酸化水素水で脱色したのち，AQUASOL−2（NEN）10miを加えて液体シンチレーションカウンター

カゲルにゲル化剤，Cab−0−Sil（Packard），

雌雄ラットに1．C−EST（E）50mg／kg経口
投与後，所定時間に動物をェーテル麻酔死させ，直ちにドライアイスーn−ヘキサン中で凍結したのちPMVクライオミクロトーム（LKB，2250型）で40／J厚の全身切片を作成した。切
片は凍結乾燥後，工業用Ⅹ線フイルム（フジ，No．150）で1ヶ月間密着露出して全身オート
ラジオグラムを得た。

8．ェポキシコハク酸1，4−1−C標識体を用いたESTのラットにおける生体内動態

00︵qSOP︼︒㌔︶

Urine
図3

CO2

雄ラットに1．C−EST5mg／kgを経口投与後5日間の尿，糞および呼気中排泄率
尿糞中排泄率は1−C−EST（L）N＝4，1．C−EST（E）N＝5の平均値土S・E・を，呼気中排泄率は1−C−EST（L）N＝1，1−C−EST（E）N＝3の平均値を示す。

00︵む叫︒P葛∴宗︶

Urine
図4

Feces

Feces

CO2

雌ラットに11C−EST5mg／kgを経口投与後5日間の尿，糞および呼気中排泄率
尿糞中排泄率はN＝5の平均値士S．E．を，呼気中排泄率はN＝3の平均値を示す。

10．ロイシン標識体の体内動態
ロイシン部分をHC標識したEST（以下結果HC−EST（L）と略す）のラットにおける体内1．血中濃度推移

動態については，尿糞および呼気中排泄率の測

雌雄ラットにHC−EST5mg／kgを経口投与したのちの血中放射能濃度推移を図2に示す。

定を除いて昨年度報告した結果をそのまま使用した。

HC−EST（E）を投与した場合，雌雄ラット
77

I E−64類縁体の開発︵むSOP︼︒㌔︶
1

2

3

4

5

6

24（hr）

図5 堆ラットに1−C−EST5mg／kg経口投与後の胆汁中排泄率
各点は∴N＝5の平均値を示す。

いずれも速やかに吸収され，投与後30分で最高値に達したのち，以後速やかに低下した。HC−
EST（L）投与時と比較して血中濃度は低く，持続性も認められなかった。
2．尿糞および呼気中への排泄
1−C−ESTを経口投与したのち5日間の尿，糞および呼気中への放射能の排泄率を図3，図4に示す。
1−C−EST（E）の尿，糞中への排泄は，雄ラ
ットではそれぞれ15．1％，77．4％，雌ラットでは20．3％，65．2％であり，HC−EST（L）の場
合と大きな差異は認められなかった。また，呼気中への排泄は，雄，雌それぞれ，6．5％，7．5％認められ，HC−EST（L）の場合とほぼ同様であった。
3．胆汁中への排泄
胆汁中への放射能の排泄は，図5に示すように，1−C−EST（E）では24時間後までに53．9％とHC−EST（L）の場合に比べてやや高い値を示した。
4．全身オートラジオグラフィ一
雄ラットにllC−EST（E）50mg／kgを経口授与した場合の放射能の分布を図6に示す。投与後30分では，消化管内容物に最も高く，次いで肝，腎に高濃度認められ，他の臓器への分布は極めて少なく血液レベルかそれ以下の濃度を示した。以後6時間までその分布パターンに変
78

化は認められなかった。24時間後では，腸内容物および肝，腎に放射活性が認められ，他の組織ではほぼ消失していた。120時間後においても腎，肝に微弱ながら放射能の残留が認められた。特に腎では，皮質にのみ放射能の残留が観察された。このような分布パターンは，HC−
EST（L）投与時に見られた膵臓，唾液腺，消化管壁，骨髄等への分布，あるいは腎皮質内帯への高濃度の残留等の分布パターンl）とは明らかに異なっていた。
雌ラットにおける分布像の推移は，堆ラットの場合と同様であり，性差は認められなかった（図7）。
5．組織内濃度14C−EST（E）5mg／kgを雌雄ラットに経口投与後，30分，2，6，24，および120時間の組
織内放射能濃度を表1，蓑2に示す。
雌雄ラットいずれも投与後30分で最高値に達し，以後速やかに低下した。
雄ラットでは，30分で胃，小腸，次いで肝，腎に高濃度分布し，血中濃度の10倍以上の濃度を示した。他の組織は血液とほぼ同等かそれ以下の低濃度を示した。以後経時的に低下し，24
時間後では腎に最も高く，次いで肝，消化管に比較的高い活性が認められた。120時間後では，腎，肝にのみ低濃度残留した。
雌ラットでは，雄ラットと比較して投与初期8．ェポキシコハク酸1，4−日C標識体を用いたESTのラッ日における生体内動態

Stomach Kjdney

Ljver

Stomach Kidney

Liver Intestinal contents
Stomach Kjdney

Liver Intestinal contents

KjdneyLiver Intestinal contents

Kjdney

120

hr

図6

雄性ラットに14C−EST（E）（50mg／kg）を経口投与後の全身オートラジオグラム
79I E−64類縁体の開発

30mjn

Liver Intestinal contents
Kjdney

120

hr

図7
80

雌性ラットに14C−EST（E）（50mg／kg）を経口投与後の全身オートラジオグラム

8．ェポキシコハク酸1，4−1．C標識体を用いたESTのラットにおける生体内動態
表1堆ラットに1−C−EST（E）5mg／kgを経口投与後の放射能の組織内分布
Radioactive concentration（FLg EST eq／mlor g）

Blood

0．5br

2hr

0．34土0．03

0．12士0．01

6hr

24br

120br

0．05土0．01

0．03土0．01

0．05土0．01
0．01士0．00

Liver

0．67土0．05
16．70土1．35

0．18±0．01
5．77士0．44

0．06土0．00
2．56土0．21

0．01士0．00
0．84士0．04

0．23土0．01

Xidney8．37土0．51

4．77土0．37

2．39士0．12

Heart

0．13土0．02

0．05士0．01

0．12士0．06

1．25±0．04
0．01土0．00

0．46士0．04
0．02士0．00

Lung

0．24土0．03

0．08±0．01

0．04土0．00

0．03士0．00

0．03土0．01

Brain

0．01土0．00
0．05士0．00

0．02土0．00
0．05士0．01

0．01士0．00

0．02土0．00

Spleen0．02土0．00
0．10土0．01

Pancreas0．22士0．05

0．08土0．01

0．07±0．01

0．03土0．00
0．03土0．00

0．04士0．00
0．04土0．00

Muscle0．08土0．02

0．04士0．02

0．02土0．01

0．02土0．01

0．01士0．00

Skin

0．20±0．02

0．08土0．01

0．04±0．01

0．02士0．01

0．03土0．00

Fat

0．06土0．01
0．23土0．05

0．06士0．05
0．19士0．03

0．01土0．00
0．11土0．05

0．01土0．00

0．01士0．00

Adrenal0．04土0．00

0．05±0．00

Hypophysis

0．32土0．07

0．13±0．03

0．14士0．08

Thyroid

0．60土0．15

0．14士0．02

0．06土0．03

0．07土0．041
0．04士0．02

0．19±0．01
0．10土0．01

Salivary gland

0．23土0．06
0．18土0．06

0．05土0．01
0．07土0．01

0．04土0．00
0．05土0．01

0．01士0．00

0．02±0．00

Eye ball

0．10土0．01

0．04士0．00

0．03土0．00

0．05土0．02
0．01士0．00

0．23土0．04
0．01士0．00

Thymus0．14士0．04

0．04土0．00

0．04±0．00

0．02土0．00

0．02土0．00

0．02±0．00

0．03士0．02

0．01土0．00

0．03土0．00
2．02土0．44

0．01土0．00

0．01士0．00

0．33土0．09
0．16土0．03

0．03土0．00
0．08士0．01

PlasmaBone一marrOW

Testis
Prostate

0．08±0．01

0．03土0．00

Stomach0．10土0．02
26．88土6．19

0．04±0．01
10．47士1．56

Smallintestine

25．82士12．01 16．34士2．36

1．31±0．18

数値はN＝5の平均値士S．E．を示す。
に腎ではより高濃度に，肝ではより低濃度分布する傾向を示したほかは同様な分布パターンを示した。
11C−EST（L）投与時の場合1）と比較すると，腎，肝への高濃度の残留は認められず，速やかな消失を示した。
6．代謝物の分布（1）尿および胆汁中代謝物
雌雄ラットに1．C−EST（E）5mg／kg経口投与後24時間の尿および胆汁中代謝物のラジオ
蒋層クロマトグラムを図8，図9に示す。
尿および胆汁中主代謝物は，HCTEST（L）
投与と同様にE−64−Cであり一部ジオール体も認められたが，いずれもHC−EST（L）投与時に認められなかった代謝物ピークが少量ながら検出された。
（2）消化管内容物中代謝物

雌雄ラットにHC−EST（E）5mg／kg経口投与後の消化管内容物中代謝物の量的割合を蓑
3，表4に示す。
雌雄ラットの胃内放射能は，いずれも6時間
後までに大部分消失した。胃内放射能の大部分は未変化体であったが，一部E−64−Cおよびその他の未知代謝物が存在した。一方，腸内放射能は投与後6時間までは，胆汁排泄の寄与によ
り投与量の30〜50％と変化はなかったが，未変化体の割合は30分後ですでに雌雄ラットとも4％以下にすぎず，E−64−Cが比較的多かった。
以後6時間まではM−aが増加したが，逆にE−64−Cは低下し2％以下であった。
考察〔Epoxysucciny11，4−日C〕EST（HC EST（E））をラットに経口投与した際の血中放射能81

I E−64類縁体の閑発表2 雌ラットにHC−EST（E）5mg／kgを経口投与後の放射能の組織内分布
Radioactive concentration（FLg EST eq／mlor g）
0．5br

2br

6br

24br

120IlrBlood

0．43土0．05

0．13土0．01

0．09土0．03

0．08土0．02

0．06土0．00

Plasma0．73土0．05

0．18±0．02

Liver

10．28土1．00

4．65土0．24

0．03土0．00
1．81士0．10

0．02土0．00
1．06土0．13

0．01＞
0．24土0．02

Kidney11．46土0．74

7．84土0．71

2．28士0．12

1．07土0．18

0．31土0．01

Heart

0．15土0．02

0．04土0．00

0．02土0．00

0．03士0．00

0．04土0．01

Lung

0．05土0．02
0．02士0．00

0．07士0．03

0．18土0．14

0．03士0．00

Brain

0．26土0．01
0．03土0．01

Spleen0．10土0．01

0．06士0．00

0．01土0．00
0．07士0．02

0．01土0．00
0．06土0．02

0．01土0．00
0．04土0．00

Pancreas0．27土0．04

0．08土0．00

0．10土0．03

0．07士0．02

0．06土0．00

Muscle0．06±0．00

0．08土0．04

0．02土0．00

0．01土0．00

0．02土0．00

Skin

0．10土0．02
0．02土0．00

0．03士0．00

0．03土0．01

0．04土0．00

Fat

0．26土0．02
0．06±0．01

Adrenal0．27土0．03

0．28土0．04

0．02土0．01
0．21土0．08

0．01土0．00
0．07土0．02

0．02土0．00
0．06土0．01

Hypopもysis

0．19土0．02
0．24土0．04

0．13±0．03
0．12土0．03

0．04土0．01

0．10土0．02

0．14土0．04

Tbyroid
Salivary gland

0．16±0．03

0．05士0．01

0．07土0．02
0．05±0．01

0．11土0．03
0．03土0．01

0．23土0．02
0．03土0．00

Bone一marrOW

0．14士0．02

0．08土0．02

0．05土0．01

0．16土0．05

0．17土0．03

0．04土0．00
0．07土0．01

0．03±0．00

0．09土0．02

0．02土0．00

Thymus0．07士0．00
0．13土0．01

Ovarium

0．19士0．01

0．12±0．02

0．04土0．01
0．04土0．01

0．10土0．05
0．04土0．01

0．03士0．01
0．05土0．01

Uterus
Stomacb

0．29土0．03
36．96士7．83

0．12士0．02
5．60土1．64

Smallintestine

28．91士10．00

4．14土1．15

Eye ball

0．04土0．01

0．03土0．01

0．02土0．00

0．36土0．08
0．61土0．16

0．14土0．03
0．15土0．02

0．04土0．01
0．07土0．01

数値はN＝5の平均値士S．E．を示す。
は速やかに上昇し，投与後30分で最高値に達し，以後速やかに低下した。また全身オートラ
ジオグラムおよび組織内濃度の測定結果からも，血中濃度推移と同様に放射能の消失は速やかであった。これらの結果は，11C−EST（L）えられる。
尿糞および胆汁中への放射能の排泄率は，14C−EST（L）の場合に比べて大きな差異は認められなかった。また，呼気中への排泄もほぼ同等であり，ESTの一部はC02にまで代謝さ解され，遊離した11C−ロイシンの組織蛋白へれるものと思われる。しかし，尿および胆汁中
代謝物においては，HC−EST（L）投与時には認められなかった代謝物が検出された。これら
は，エポキシサクシニルロイシン部分の酸アミド結合が，アミダーゼ等の加水分解酵素により水解されて遊離するェポキシコハク酸そのものに由来する代謝物と推定され，前述したESTからのロイシンの遊離を示唆するものである。
一方，消化管内容物中代謝を分析した結果，胃内ではESTは安定であると思われるが，腸内では投与初期（30分後）に未変化ESTはの取り込みにより残留性が認められたものと考数％以下しか存在せず，速やかにエステルの水投与時に認められた腎，肝での顕著な放射能の
残留1）はESTそのものによるものではなく，
多くはロイシンあるいはロイシンイソアミルア
ミドに由来することを示唆している。
一般に，標識アミノ酸を投与した場合，膵臓，
消化管壁，唾液腺等によく分布し，その消失は緩慢であるといわれている3）。11C−EST（L）の場合も煩似した分布傾向を示しており1），また今回の結果はこのような分布を示さなかったことから，ESTの一部は酸アミド結合が加水分

828．ェポキシコハク酸1，4J−C標識体を用いたESTのラットにおける生体内動態
4

3

0

0

1

4

3

21

00

0

0

00

2

14C・EST（L）

14C・EST（E）

十十0．O Rf value l．0l

十0．O Rf vaIue l．0

SoIvent system：CHC13・MeOH・AcOH（9：1：2）
1：EST 2：M・a 3：E−64・C 4：di・OH
図8

ラットに1−C−EST5mg／kgを経口投与後の尿中代謝物のラジオタロ1∵トグラム

14C．EST（L）

14C−EST（E）

4

3

21

4

3

21

0

0

00

0

0

00

八」」
十

十

0．O Rf value l．0

八」」
十

十

0．O Rf value l．0

SoIvent system：CHC）3−MeOH・AcOH（9：l：2）
1：EST 2：M・a 3：E−64−C 4：di−OH
図9

堆ラットに）一C−EST5mg／kgを経口投与後の胆汁中代謝物のラジオクロマトグラム83I E−64類縁体の閑発
表3 ラットに1−C−EST（E）5mg／kgを経口投与後の胃内放射能の残存率および代謝物の量的割合
Time（br）

Metabolite％

StomachCOntentS（％of dose）

EST

5

0
2

18．79

72．16

11．87

85．03

E−64−C

Others

1．38

26．46

0．39

14．58

6

0．22
5

0

e
a

m
e
f

2

18．59

71．97

5．59

22．44

3．69

64．14

3．26

32，60

6

0．06

数値はN＝2の平均値を示す。
表4 ラットに1．C−EST（E）5mg／kgを経口投与後の腸内放射能の残存率および代謝物の量的割合

Time（hr）慧慧1％。f。。S。）

Metabolite％
EST

E−64−C

50

M−aOthers
74．65

2
6
4

20．43

0．96

42．95

14．90

1．86

54．75

1．72

39．73

1．31

0．04
5

0

a

22

e

f

38．20

2

m

27．03
23．85

4．16

21．27

1．18

53．69

＊

6

e

40．32
38．29

4

0．82

数値はN＝2の平均値を示す（＊：N＝1）。
解等の代謝を受けるものと考えられる。しか2．尿糞，呼気および胆汁中排泄率にはロイシし，投与後30分に胃，腸内合わせて約60％のン標識体と大きな差はなかったが，尿，胆汁

放射能が回収されたにすぎず，少なくとも40％は速やかに吸収されたものと考えられる。
今回，活性基をldC標識したESTを用いてラットにおける生体内動態について検討したが，肝，腎になおわずかながら残留することが認められており，ESTそのものが組織蛋白と共有結合することは完全に否定はできない。今後，さらに詳細な体内動態について検討することにより，薬効および毒性発現機序について明らかにする予定である。
結論〔Epoxysuccinyll，4−11C〕ESTを用いてラットにおける体内動態を検討し次の結果を得た。
1．経口投与後の血中放射能の消失は，ロイシン標識体に比べて速やかであった。
84

中代謝物に新たな代謝物を検出した。
3．組織分布において，ロイシソ標識体と異なる分布パターンを示し，肝，腎への残留性も少なかった。
4．胃内では比較的安定であるが，腸内で速やかに代謝される。
文献1）大関正弘：E−64−dの生体内動態に関する研究，
厚生省新薬開発研究事業「微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和57
年度研究報告書，127−146，1983．
2）大関正弘：E−64−dの亜急性毒性に関する研究，
厚生省新薬開発研究事業「傲生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和57
年度研究報告書，27−54，1983．
3）河村成男：ラットにおける静脈内投与時のグル
タチオソの生体内動態について，基礎と臨床⑥，15（3），1253，1981．

Ⅰ 酵素レベルでの効果

9．カルシウム高感受性および低感受性カルシウム依存性中性プロテアーゼ………今掘和友

10．カルシウムプロテアーゼの機能発現撥構鈴木 紘一

11．カルシウムプロテアーゼと細胞情報の受容伝達

西塚 春美

12．高分子量不活性型多重撥能プロテアーゼ

市原明9．カルシウム高感受性および低感受性
カルシウム依存性中性プロテアーゼ

今

掘

和

友＊

研究協力者 川 島 誠 一＊ 猪 股 光 司＊
林

昌

はじめに

美＊

中

村

愛＊

明確にするため，両CANPの酵素学的性質とタソバク化学的性質を詳細に検討した。

カルシウム依存性中性プロテアーゼ（CANP）

方は広く動物界に分布している細胞内プロテアー
ゼであり，細胞にとって重要な制御田子である
カルシウムイオンによりその活性が調節されている。CANPの生体内役割は種々仮想されて法用いたFL−CANPとm−CANPはウサギ骨格筋よりほぼ同じ精製過程を経て均一にまで精製した3）。CANP中のSH基はClassI（初めかいるが，筋肉組織では構造タンパク質の代謝にら表面に露出しているもの），ClassⅡ（Ca2十関与していると考えられ，その乱れが筋ジストの添加により露出するもの），ClassⅢ（尿素にロフィーや心筋梗塞の原因とみなされている。

より変性させると露出するもの）とに分類し，

CANPには〝M程度の生理的カルシウム濃度で活性化される高感受性（rCANP）とmM程DTNBで滴定した4）。アミノ酸分析およびペプチドマップはSDS−PAGEにより80Kサブ度の非生理的カルシウム濃度を必要とする低感ユニットと30Kサブユニットに分離した後，各受性（m−CANP）の2種炉が存在するが，その必然性やそれぞれの役割は不明である。一つの々について行った。
結果

仮説としてm−CANPはFL−CANPの前駆体で，自己消化により〃−CANPに変換するという考えがあった。実際，m−CANPの自己消化によ1．FL−CANPとm−CANPの＃素学的性質の比較

りそのカルシウム感受性は高まりrCANP的FL−CANPはm−CANPより低濃度のCa2 により活性化される（gαはrCANPで50／′M，になる1）。そこで，昨年度は天然に存在する〝−

m−CANPで700FLM）が，他の金属イオンに対CANP（天然型fL−CANP）がm−CANPの自しても高い感受性を有する。Jj−CANPはSr2十己消化により得られる〝−CANP（誘導型〝−
CANP）と同一であるか否かを明らかにするた（gα＝450′

めに，ウサギ骨格筋より天然型〝−CANPを精万，m−CANPはSr2＋（Ka＝5・1mM）でCa2＋

製Lm−CANPと比較した。その結果，天然型の約50〜60％の活性化を受けるのみで，Ba2十には全く活性化効果はない。
m−CANP活性はpH7．6に，FL−CANP活性FL−CANPの分子量はm−CANPのものより大きく，m−CANPの自己消化により生じる可能性は否定的となった2）。本年度はこれをさらに＊東京都老人総合研究所

り

Ca2十

M）やBa2十（gα＝1・5mM）によと同じレベルまで活性化される。一はpH7．3に至適pHを有するが，FL−CANPの方が広いpH範囲で活性である。また活性の熱安定性にも大きな差があり，600C，10分間87Ⅰ 酵素レベルでの効果

0

10

20

30

Reaction Time（min）
図1TitrationofSHGroupsofFL−CANPandm−CANPwithDTNBの処理でm−CANPは完全に失活するのに対ソ，E−64−Cなどのペプチド性チオールプロテ

し，rCANPは85％の活性を保持している。

アーゼ阻害剤やモノヨード酢酸，N−エチルマ

この〝−CANPの高安定性は，自己消化によりレイミドなどのアルキル化試薬によって強い阻害を受けることから，チオールプロテアーゼに生じる誘導型rCANPが非常に不安定である
ことと対照的である。カゼイン，血清アルブミ

属すると考えられる。そこで，両CANPに存ン，インシュリンB鎖，プロタミンなどの基質に対し両CANPとも同じKmを有するが，そ在するSH基の存在状態をDTNBによる滴定法で調べた（図1）。表面に露出しているClassの最大切断速度は〝−CANPの方が数倍高い値を示す。

Iとしては，m−CANPで7残基，iL−CANP
では4残基が滴定された。Ca2十の添加により以上のように，FLTCANPとm−CANPの酵

露出するClassIは，m−CANPでは2〜3残素学的性質には顕著な差が認められた。しか基存在するのに対し，rCANPにはなかった。
したがって，m−CANPでは活性中心のSH基

し，これらは同一の一次構造を有する酵素の活性中心周辺が異なる立体構造をとることによっても説明可能である。そこで，両CANPのタ
ンパク化学的煩似性を検討した。

はClassIに属するのに対し，FL−CANPでは表面に露出していると考えられる。
両CANPから80Kサブユニットと30Kサ

2・FL−CANPとm−CANPのタンバク化学的性質の比較

ブユニットを単離し，それぞれのアミノ酸組成を分析してみると，30Ⅹサブユニットのアミノ

両CANPとも，ロイべプチン，アンチパイ

酸組成は両CANPで一致していたが，80Kサ

88

9．カルシウム高感受性および低感受性カルシウム依存性中性プロテアーゼ
図2Amino Acid Compositions of CANP Subunits

図2

AminoAcidCompositions of CANPSubunits

ブユニットでは若干の差が認められ，m−CAN
Pではアスパラギン酸，ダルクミソ酸，イソロ
イシンの含量が高く，〃−CANPではバリンとセリンの含量が高かった（図2）。また，30K
サブユニットの特徴として，その著しく高いグ
リシン含量（約20％）がある。
両CANPの一次構造上の差異を明確にする
ために，単離したサブユニットをぶ．α〟rg〟5
V8プロテアーゼで消化し，そのペプチドマッ
プを比較した。30Kサブユニットはともに切断
されず，この点でも共通性があった。一方，80
Kサブユニットのペプチドマップ図は異なって
いて，同一ポリペプチドから成るとは考えられ

躯体ならばmTCANPとFL−CANPの細胞内存在部位は同一となり，その撥能は〝−CANPの機能として発現されることになる。しかし，上述の結果からFL−CANPとm−CANPは本質的に異なる別個の酵素と考えられる。すなわち，
FL−CANPとm−CANPは細胞内で別々の存在部位を有し，それぞれに固有の機能を果たしている可能性が強い。両CANPの存在比が組織により異なっていることもこの可能性を支持している5）。したがって，今後は〃−CANPおよびm−CANPそれぞれの細胞内局在部位を同定し，そこにおいて果たしているそれぞれの機能を追及することが必要となる。

生理的Ca2＋濃度では不活性なm−CANPが天然型FL−CANPはm−CANPとは異なるタンパク質であり，したがってm−CANPの自己消化により生じる誘導型rCANPとは異なる。しかし，天然型FL−CANPと誘導型FL−CA
NPは共にClassIのSH基を欠き，活性中心SH基が表面に露出しているという点では一致している。そこで，誘導型〃−CANPについて提出されているモデル6）が定性的には適用で活性なFL−CANPの前駆体か否かでCANPの役割は大きく違ってくる。もしm−CANPが前き，FL−CANPとmTCANPの活性中心の構造は似ていると考えられる。実際，阻害剤に対すない（図3）。
以上のように，FL−CANPとm−CANPはその立体構造はもちろん，一次構造においても異なっており，両者は相互変換し得るような関係にはないことが明らかになった。
考

察

89

Ⅰ 酵素レベルでの効果

Peptide Mapof80KCANP Subunit（S．aureuSV8proteaSe）

粁鱒鱒

研一CANP

04K一

一‥一

｝■

『■

淋

1

87K一・嗜尋警
二＝ここ

48K■一

−■

−

童や廃し

●

さO K−

媚

態

準

漱

鼻姦ゞ

軌も

4

8

■■■

20．1K−

隼：娩

14．4K・−

V、噛ノ

0
図3

4

8

16

32

0

PeptideMapof80ECANPSubunit（S．aureusV8protease）

る感受性や基質に対する親和性にはほとんど差はなかった。
また，CANPの触媒サブユニットである80
Ⅹサブユニットは両CANPで異なっているが，30Ⅹサブユニットには差はなく，両CANPに共通と考えられる。これが，80Kサブユニット

Imabori，E．and Kawashima，S．：Puri丘cationand characterization of a calcium−aCtivatedneutral protease from rabbit skeletal

muscleWhich requires calciumions of FLM order
COnCentration，J．Biochem．，93，291，1983．

3）Eawashima，S．，Nomoto，M．，Hayasbi，M．，
Inomata，M．，Nakamura，M．andImahori，K．：と30Kサブユニットは独立に生合成されたのちComparison of calcium−aCtivated neutral

後生的に結合してCANPを生じるものなのか，

proteases from skeletal muscle of rabbit andあるいはCANP遺伝子群にFL−CANPの80K部分とm−CANPの80K部分および共通の30Ⅹ部分とが存在し，転写あるいはその後のプロ
セシングの段階で2種類のCANPに分岐する
ことによるのかは興味深いことである。
文

献1）Suzuki，Ⅹ・，Tsuji，S．，Kubota，S．，Kimura，Y．
andlmahori，Ⅹ・：Limited autolysis of Ca2＋

Chicken．，J．Biocbem．，95，95，1984．
4）Suzuki，K．：Reaction of calci11m−aCtivatedneutralprotease（CANP）with an epoxysucc・
inylderivative（E−64−C）andiodoacetic acid，
J．Biocbem．，93，1305，1983．
5）Kawashima，S．，Obsumi，Mリ

Hayasbi，M．，

Inomata，M．，Nakamura，M．andImahori∴K．：
Lackof tissue−SpeCificity of calcium−aCtivatedneutral proteases from skeletal muscle andlung of rabbit，J．Biochem．，95，1231，1984．

−aCtivated neutralprotease（CANP）change＄6）Suzuki，K．andIshiura，S．：Effect of metal

its＄en＄itivity to Ca2＋ions，J．Biochem．，90，

ions on the struCtureandactivityofcalcium−

275，1981．

activated neutral protease（CANP），J．Bio−

2）Inomata，MりHayashi，M．，Nakamura，Mリ

90

Chem．，93，1463，1983．

10．カルシウムプロテアーゼの機能発現機構

鈴
研究協力者

木

紘

一＊

今 城
忍＊ 如 月榎 森 康 文＊ 川 崎

正
博

継＊
史＊

大

野

茂

男＊

すべく分析を行っている。

はじめに

2．CANPの種々の生物における分布カルシウム依存性中性プロテアーゼ（CAN

今まで主として哺乳塀や鳥煩のCANPが研P）の活性の異常が筋ジストロフィー症と関係究されているが，CANPの機能を明らかにすすると考えられているが1・2），これを確認するたるには，より広い範囲でCANPを比較生化学

めにはタンバク質レベルの研究と共に核酸レベ的に研究するべきである。そこで魚群（イナルでの研究が必須である。本年度はCANPのダ），軟体動物（アサリ，ミル貝），頼皮動物（ナ遺伝子に関する研究の第一歩としてニワトリ
m−CANPのクローニングを行った。また，こマコ），真性粘菌，酵母を材料にしてCANP

れと並行してCANPの構造と生体内横能，活ビターは魚類にしか見出されなかった。イナダ性制御機構などを解明するために，ニワトリ
m−CANPのアミ／酸配列，CANPのインヒのCANPは分子量，Ca2十一感受性，インヒビターの効果，カラムクロマトグラフィーの溶出

ビター，CANPの分布等に関する研究を行っ位置などから哺乳類のCANPとほぼ同じ性質た。

を持っていた。したがって，典型的なCANP
は脊椎動物にしか存在しないと解釈した。

結果と考察

3．CANPインヒビターの精製

1．m−CANPのアミノ酸配列の解析

既にCANPイソヒビターは2，3の生物か

ニワトリ m−CANPをヨード酢酸で修飾後，トリプシン消化を行い，Sephadexの精製を行ったが，CANPおよびそのインヒとHPLCら精製されているが，分子量や性質等の点で種々の矛盾がみられ，この原田は不明であった。

でペプチドを精製した。精製したペプチドを気

ここでは，フェニルセファロースを使った新し相のアミノ酸配列分析装置で分析した。今まい迅速な調製法でインヒビターを精製した。ウ

で，活性中心を含むペプチド，60Kの活性断

シ，ヒト肝臓のインヒビターは分子量10．9万

片のN末端領域，および種々のペプチドを解析

で，今まで報告されたインヒビターのうちではした。活性中心を含むペプチドは29残基で，このアミノ酸配列より CANPはカテプシソB，

最も大きい部類であった。このイソヒビター1

Lやパパインなどのチオールプロテアーゼと極CANPに特異的ではあったが，種々の生物のめて近い関係にあることが確認された3）。引続m一，rCANPは全く同様に阻害された（図1）。また，このインヒビターとCANPの相きタンパク質レベルでCANPの全構造を決定＊東京都臨床医学総合研究所

分子は5分子のCANPを阻害し，この阻害は互作用が可逆的か否かを検討し，図2，3に示す結果を得た。この結果から，CANPとイン
91

Ⅰ 酵素レベルでの効果

05︵S︸明uコ︶意A叫JUqdNqU皆川u叫dEU銘

0

2．5

5．0

HumanCANPInhibitor／CANP
図1種々のCANPに対するヒト

CANPインヒピタPの効果

CANP
O ca2＋＋＝■EDTAO把三tment
＝

さ

［コ

Inhibitor

口語蒜宝hibit。rRemainingInhibitoryActivity（％）
CANP＋Inhibitor

92
Withoutheattreatment O

Inhibitor

Without CANP lO4
Withoutheat treatment lOO

図2

92

CANP・インヒビター複合体から解離させたインヒビターの活性10．カルシウムプロテアーゼの横能発現機構

P
Ca2＋

○

E
D
m
一

□

︵
＝
日

ANO＋

C

ExcessCm・CANP●＼ニ［コ

色￡sa，。fCANPActivity

Inhibitor
3
2︵S一芸n︶主人叫︸UくdN亘U

1

2

3

InhibitorAdded（units）
図3

CANP・イソヒビター複合体から解離させたCANPの活性

ヒビターの相互作用は完全に可逆的で，CANP
・インヒビターの複合体を解離させると，CA
NPとインヒビターはそれぞれ元の活性を持つ
ことが証明された4）。

が検出されたが，これらとm−CANPとの関係については現在検討を加えている。
5．ニワトリm−CANPのCDNAのクローニング
ニワトリ m−CANPのアミノ酸配列をもと

インヒビターはタンパク質分解酵素の作用をに3種類の14マーのオリゴヌクレオチドのミッ非常に受けやすく，その分解産物の中に従来報

クスドプローブ（各16，24，32種類の混合物）

告されていた分子量6〜8万に相当する断片もを合成した。mRNAとしては，上記の筋肉由見られた。インヒビターの阻害活性は分子量が3万程度になってもそれほど低下しなかった0来のものを用い，これをもとにCDNAを合成した。ホモポリマーティリング法によりpBR

これらの結果から，従来インヒビターで見られ322のPstI部位にCDNAを挿入しクローニていた矛盾はインヒビターの分解産物をとらえていたと考えるとよく説明できることがわかっソクを行った。
テトラサイクリン耐性で選択した約9，000個た。

のコロニーを3種のプローブでスクリーニング

4．CANPの生合成

し，これらとハイブリダイズするクローン

ニワトリ肝臓，心臓，筋肉，肺などの種々の組織から，グアニジンチオシアネートでmRNAを抽出し，塩化セシウムと庶糖密度勾配遠心等で精製した。ウサギ赤血球ライ七一ト系でこの

pCP521を得た。このクローンは2・3kbのcI）NA部分を含み，CANPの活性中心システ
イソ残基の近傍のアミノ酸配列に相当する塩基mRNAを翻訳させ，翻訳産物を抗体で沈澱さ配列を含んでいたので，m−CANPのCDNAのクローンであると結論した。このpCP521

せSDS電気泳動により分析した。翻訳産物にをプローブにして，さらにもう1つのプラスミは分子量8万および10万のタソバク質のノミソド

ッドpCP2を単離した。このプラスミッドは93

Ⅰ 酵素レベルでの効果
表1精製CANPイソヒビターの性質
Chicken5）

Rabbit6）

Human7，8）

Bovine9）

Humanmuscle muscle erythrocyte heart livcr

68K

Molecular weigbt

68K

60−70K

145K lO9Ⅹ

250−280Ⅹ

aggregate
Subunit200−300Ⅰ（

Stoichiometry（inhibitor／CANP）

l2

Heatstability＋＋

Contentofaromaticaminoacid（％）

0．24

4．2

＋

＋

2．2

Isoelectric pH

4．55

1．9kbのインサートを含み，両者のCDNAの塩基配列から全長3．4kbのm−CANPcDNA

0
2・＋2・045・

34K2）Imahori，E．，Suzuki，K．andXawashima，S．：
Calcium activated neutral protease andits
exogenous and endogenous inhibitorS，N．

の塩基配列を決定した。
塩基配列から予想されるCANPのアミノ酸配列は，タンバク質側で分析した結果とよく一

Xatsunuma et al．eds．，Japan Sci．Soc．PresS，
173−179，1983．

3）Suzuki，E．，HayaSbi，H．，HayasIli，T．and

致していた。現在，タンパク質を使ってアミノ

Iwai，l（．：Amino acid sequence around the

酸配列を決定しながらCANPのアミノ酸配列

active site cysteine residue of calcium・aCtiと他のタンパク質の構造を比較検討している。

Vatedzleutralprotease（CANP），FEBSLetterS，

予備的な知見によれば，CANPはチオールプ
ロテアーゼと，カルシウム結合タンパク質の少なくとも2つの遺伝子が進化の過程で融合してできたものと考えられる。
また得られたニワトリ

m−CANPのCDNA

をプローブにして，ニワトリ，ウサギ，ヒトにおいてm−CANP，FL−CANP，30Kサブユニ
ットのクローニングを行い，これと並行して
CANP遺伝子の解析も進めている。
文献1）今堀和友，鈴木紘一：細胞内プロテアーゼの生
理作用と病理作用，プロテアーゼ，一島英治霜，
学会出版センター，153−172，1983．

94

152，67，1983．

4）今坂忍，如月正継，大野茂男，鈴木紘一：生化
学，55，978，1983．
5）ⅠSbiura，S．，Tsuji，S．，MurofuShi，H．and

Su2；uki，l（．：Biochim．Biophys．Acta，701，216，
1982．

6）Takahashi・Nakamura，M．，Tsuji，S．，Suzuki，E．andImabori，K．：J．Biocbem．，90，1583，1981．
7）Takano，E．and Muracbi，T．：J．Biocbem．，
92，2021，1982．

8）Melloni，B．，Sparatorc，B．，Salamino，F．，
Michetti，M．and・Pontremoli，S．：Biochim．
Biopbys．Res．Commun．，107，779，1983．

9）Mellgren，R．L．and Carr，T．C．：Arch．
Biochem．Biophys．，225，779，1983．

11．カルシウムプロテアーゼと細胞情報の受容伝達

西 塚 春 美＊
研究協力者

岸

本

明＊

竹

はじめに

山

宜

典＊

中

西

宏

之＊

テル（TPA，図2）が受容体を経由することな
く直接Cキナーゼを活性化させ，情報の増幅伝

生体の多彩な機能の発揮や適応の現象にはホ達を導くことを見出し，Cキナーゼ系の生理的

ルモソや神経伝達物質のほか，細胞増殖因子や重要性を確立することが可能となった4〜わ。こ

白血球遊走因子，血管収縮，弛緩因子等の生理活性物質が関与しており，その化学的基盤の解の観点からの解析によって，Cキナーゼと細胞

明は種々の疾患の病態解明に直結している。こ内に動員されたCa2＋の両者が共に細胞反応に不可欠であり，両者が相剰的に作用して初めてれら多岐にわたる生理活性物質の受容伝達携帯

細胞の諸機能が発揮されることが明らかとなっとして，私共は蛋白質燐酸化酵素（Cキナー

た。このことは生理活性物質の受容伝達機構にゼ）を介する横序を提唱しているが，Cキナー

おいて，Ca2＋の動員という問題と蛋白質燐酸

ゼは従来のサイクリックAMPを介するもの

化反応を初めて直接結びつけるものであり，細とは異なった極めて重要な情報伝達系であることが確立されてきた。この携帯では形質膜に与胞内Ca2＋プロテアーゼ反応を含めたCキナー
ゼ系の情報伝達枚構の解明に有力な緒を開くもえられたシグナルによりイノシトール燐脂質のである。以下にその概略を報告する。

（PI）が選択的に加水分解され，ここに生成する微量のジグリセリド（DG）がCキナーゼを材料および方法

活性化し，その活動の引き金となっている（図CキナーゼおよびCa2＋プロテアーゼはすで

1）1・2）。Cキナーゼの活性化にはCa2＋ プロテに記載した方法8）に従いラット大脳の可溶性画

アーゼによる限定分解の方式もあり，Cキナー分より調整した。血小板の調整，血小板蛋白質

ゼ系の情報伝達機構の一環となっていることをの燐酸化反応の測定，血小板からのセロトニン

前年度報告した3）。このようにCキナーゼ系の放出反応の測定はすでに記載した方法9）に従い情報伝達摸構の化学的基盤をほぼ明確なものに行った。OAG，TPAその他試薬は市販品を用なし得たことから，今後の解析の焦点の一つとしてこの機構の制御・増幅剤の吟味とその応用いた。E−64−Cは大正製薬より寄贈をうけた。
ホスホリパーゼCは〔3H〕イノシトール燐脂を開始した。その結果，合成ジグリセリドであるトオレオイルー2−アセチルーグリセリド（OA

質からの〔3H〕イノシトール燐酸の遊離をもって測定した。Ca2＋プロテアーゼの活性は125ⅠG）や発癌プロモーターであるホルポールエス

で標識したカゼインを基質として5％トリクロ
ル酢酸に可溶性の放射能を測定して行った。

＊神戸大学医学部第二生化学教室
95

1

酵素レベルでの効果

Extrace11ular signals
Receptor

Synergistic Rolesin Cellular Responses
図1

Cキナーゼ系の情報伝達機構とCat＋プロテアーゼ

00−C−（CH2）12CH3の生成が引き金となってCキナーゼ系が作動することははば確実なものである。今回，種々の合成ジグリセリドや天然脂質のうち，OAGや
TPAが九日正即日において受容機構を介さずに直接にCキナーゼの活性化と細胞機能の発現を導くことを見出した。その一例としてTPAによる血小板の活性化を図3に示している。トロンビンやコラーゲンで血小板を刺激するとCキナーゼが活性化され分子量約4万の蛋白質（40K蛋白質）を燐酸化することを明らかにしているが，30ng／ml程度の微量のTPAで血小板を刺激しても40K蛋白質の著明な燐酸化が

CH20H
図2

TPA（12−0−Tetradecanoylphorbo1−
13−aCetate）の構造見られる。しかし，この際PIの代謝回転は作動しておらず，TPAが直接Cキナーゼを活性化し，40K蛋白質を燐酸化している可能性が極めて強い。

結果と考察
1．Cキナーゼと情報伝達機構
従来私共が明らかにしているように，外界刺激の受容に対応したPIの代謝回転によるDG
96

一方，セロトニンの放出に関してはTPAは
ほとんど無効であり，TPA単独ではCキナー
ゼを活性化しても血小板椀能を発現できないことを示している。ここで，0．4〝MのCa2＋イ
オノフォア（A23187）をTPAに共存させると

11．カルシウムプロテアーゼと細胞情報の受容伝達

句

■

．

1 芦−
「

SerotoninreleaseT P A plus
A 23187
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0

10

20

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t

l

10

20

l r −
L
′
30100

TPAAdded（ng／ml）
図3

血小板の活性化に及ぼすTPAとCが＋イオノフォアA23187の効果

セロトニンの放出が著明に保進される。A23187

がCa2＋プロテアーゼで活性化されることが示

単独では40K蛋白質の燐酸化やセロトニンの唆された。PIリパーゼCは種々の組織に広く放出を導かないことから，TPAによるCキナーゼの活性化とA23187によるCa2十の動員の分布し，PIの代謝回転の引き金となる反応を両者が血小板機能の発現に必須であると結論されている。しかし，その活性に101M程度のれる。また，白血球や肥満細胞等の実験系でCa2＋を必要とすることから，活性化機序の解も，Ca2十の動員とCキナーゼを介した蛋白質

明が問題となっていた。私共は今回，ラット大燐酸化反応の両者が細胞揆能発現に相剰的に作脳の粗抽出液をCa2十とCa2＋プロテアーゼの用することが明らかとなっている。

存在下にインキュべ−トした後，PIリパーゼ
Cの活性を対照と比較した。図4にその結果を

2．Cat＋プロテアーゼとの関連

触媒することから，受容枚樺との関連が注目さ

前年度までの解析で明らかにしたように，示しているように，Ca2＋プロテアーゼ処理をしCa2＋プロテアーゼ，特に10￣6M程度のCa2十たPIリパーゼCは10−7M程度の微量のCa2十で活性化される酵素が受容伝達機構に密接に関で活性を現わす。この詳細な機構については不連してCキナーゼを限定分解し，活性化する可明であり，現在解析を進めているが，Ca2＋プ

能性が極めて高い。さらに，今回PIに特異的

ロテアーゼがCキナーゼだけでなく PIリパーに作用するホスホリパーゼC（PIリパーゼC）

ゼCを介しても情報伝達機構にさらに広く関与
97

Ⅱ 酵素レベルでの効果

l

l

l

︵701×邑︒︶意＞⁝︸︒くじ翳邑二︒竜S︒云

●
●

1

1

●

●

●

q 伽 7−d 如 J JわJJ

古び フ
柁 d なぞJ Jわ 〃

○
0

l

10￣8

10￣7

l

10−6

10￣5

l

10−4

I

10−3

Ca2十（M）

図4

ホスホリパーゼCの活性化

している可能性が考えられる。これらの知見はめるとともに，E−64−Cの有効性の検討への応

E−64−Cの有効性の解明にあたっても新たな観点を与えるものである。

用を進めている。
昭和58年度の報告を終えるに当たり，本研究

今回の解析によってもCa2＋プロテアーゼのに多大の御支援と御助言を賜った今掘和友博

生理意義とE−64−Cの有効性との関連について

士，ならびに大正製薬株式会社の各位，厚生省

その核心に迫ることに成功したとはいいがた

新薬開発研究助成に対して深い感謝の意を捧げい。しかし，細胞内Ca2＋プロテアーゼの持つます。

意義と問題の一つが明らかになったように思われる。特に，上述したようにCキナーゼ系の情報伝達機構は従来具体的意義が明確でなかっ文

献た細胞内Ca2＋動員と密接に関連して細胞機能

1）Nishizuka，Y．：TrendsinBiochem．Sciences，8，13．1983．

を発揮させていることから，TPAやOAGを

2）Nisbizuka，Y．：Nature，308，693，1984．

さらに種々の実験系に応用することによってC

3）西塚春美：厚生省新薬開発研究事業「微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和57年度研究報告雷．159．1983．
4）Eaibuchi，E．，Takai，Y．，Sawamura，M．，
Hoshijima，M．，Fujikura，T．and Nishizuka，

キナーゼの意義とともCa2＋プロテアーゼによる限定分解反応の生理的解釈の一端をときはく・す可能性が強い。現在，さらに詳細な解析を進98

11．カルシウムプロテアーゼと細胞情報の受容伝達
Y．：J．Biol．Cbem．，258，6701，1983．
5）Kikkawa，U．，Takai，Y・，Tanaka，Y・，Miyake，
R．and Nisbiguka，Y．：J．Biol．CbeIm，258，
11445，1983．
6）Yamanishi，J・，Takai，Y・，Ⅹaibuchi，Ⅹ・，Sano，E．，Castagna，M．andNishizuka，Y．：Biochem．
Biopbys．Res．Commu丑．，112，778，1983・

Ⅹikkawa，U．，Takai，Y．，Nishizuka，Y．，Itob，
E．and Tomioka，C．：Biocbem．Biopby乱Res．
Commun．，116，743，1983．
8）Kisbimoto，A．，Eajikawa，N・，Sbiota，M・and
Nisbizuka，Yi：J．Biol．Cbem．，258，1156．1983．
9）Sano，E．，Takai，Y．，Yamanisbi，J・and
Nisbizuka，Y．：J．Biol．Cbem．，258，2010，1983．

7）Kajikawa，N．．Eaibuchi．1（・，Matsubara，T・，

99

12．高分子量不活性型多重機能プロテアーゼ

市 原
研究協力者

はじめに
最近，細胞内蛋白質の分解経路としてライソ
ゾーム系以外に非ライソゾーム系が注目されており，特に蛋白合成の誤翻訳や突然変異および合成後の化学修飾によって生じた異常蛋白質の急速な分解排除は主として後者の経路で行わ
れ，かつこの過程はェネルギー依存性であることが知られている1）。従来，動物細胞の上活画分にはCa2十依存性SH一プロテアーゼを除いてエンド塑プロテアーゼの存在についてはほとん
ど知られていないが，最近ネズミ肝臓上清画分に高分子量プロテアーゼの存在が報告2・3）された。我々はこの酵素を，ヒト，ウサギ赤血球，
ネズミ肝臓および筋肉から分離・精製しその性質を検討した結果，本酵素が従来記載されているプロテアーゼの概念には類をみない種々の特散を持っていることがわかった4）。そこで本酵
素活性の変動を正常および筋ジスロフィーハム
スターの肝臓，筋肉で測定すると共に合わせてEST投与の影響についても検討した。
方

明＊
田

中

啓

二＊

測定する場合にはあらかじめ反応液中にポリー
L−リジン（Mr＝30，000，1mg／ml終濃度）を添加する。反応終了後，1・Omlの5mg／ml血
清アルブミンを含む10％TCAを加えて反応を停止し，さらに40C2時間放置した後低速遠心（3，000rpm，10分）しその上活中に遊離してきた放射活性を液体シンチレーションカウ
ンターで測定する。酵素を含まない値を対照とし1時間当りに分解されたカゼイソ1〃g量を1単位とする。なお，3H−Caseinは還元的メチル化によって作製した。
2．合成基質分解活性の測定
ヵゼイン分解法と同様な反応液中にlmM
CBZ−Ala・（Arg）2−MNAあるいは0・1mM
Glutaryl−（Ala）2・Phe−MNAを添加して370C
測分間保温した後0．3mlの1％SDSを加えて反応を停止する。生成したMNA量は2・5m1
0．1M Tris−HCl pH8．5を加えた後，励起335nm発光410nmで1nmoleMNAを標準試料として螢光光度計で測定する。酵素を含まない値を対照とし1時間当りに生成した
MNAlnmole量を1単位とする。

法

結果と考察
1．カゼイン分解活性の測定
50mM Tris−HCl pH8．0，1mM DTT，
20FLg3H−Casein（105dpm）および2FLg精製
酵素あるいは100′唱粗抽出液を含む200JJlの反応液を370C1時間保温する。活性型酵素を

1．不活性型酵素の発見
一般に哺乳動物組織の上清分画における蛋白質の分解活性は低く，特異的なプロテアーゼの存在は疑問視されていた。しかしながら，上溝画分をDEAE−セルロース・クロマトグラフィ＊徳島大学医学部酵素研究施設

ーで分別し，カゼイソ分解活性を測定すると
101

Ⅰ酵素レベルでの効果︵lu＼モu⁝票雲晋︶S官lOLP葺u叫麗dU・MHU・HM II・・ムー

50

100

150

200

FractionNumber
図1ウサギ赤血球細胞質分画におけるカゼイソ分解活性のDEAE一セルロ＿ス．
クロマトグラフィー

A：ウサギの赤血球（500ml）を2倍量のlmMDTTを含む10mMTriS−
HClpH7・0緩衝液で溶血後，遠心し上清画分を得る。あらかじめ平衡化
したDEAE一セルロース（WhatmanDE52，150g）を加え4OCで1時間
援絆した後，カラムにつめ0−0・4MNaCl（全量21）の直結勾配で溶出し，各分画（12ml）の一部（50〝1）の酵素活性を測定した。
B：Aと全く同じ操作を20％グリセリン存在下で行った。Control（0）の活性は得た画分をそのまま測定し，Heat（●）の場合は各分画1mlをダリ
セリソを含まない平衡化緩衝液で透析後，500C3分間の熱処理をしてから活性を測定した。
全く同様な結果はヒトの赤血球，ネズミの肝臓および筋肉を酵素源とした
場合でも観察された。

102

12．高分子量不活性型多重琉能プロテアーゼ

0．2M塩濃度近辺に強い活性が溶出された（図トA）。なおCa2＋依存性プロテアーゼは0・lM
塩濃度の位置に溶出するが，ここではその蛋自性特異阻害剤が同時に溶出されることならびにCa2十が存在しないことのために，その活性は観察されない。他方，同じ操作をグリセリン存在下で行うと，図1−Bに示すように，どの分画にもカゼイン分解活性は見出されないが，各分画を透析によってグリセリンを除いた後，500C3分間熱処理してから酵素活性を測定す
ると図1−Aに見られたと同じ溶出位置に強い精製手法で単一にできるが，重要な点はグリセリンおよびSH一基保護剤を添加して酵素を不堵性が認められた。以上の結果は上清画分には不活性型プロテアーゼが存在し，この酵素は
DEAE−セルロースとの相互作用によって活性を用いたpharmaciaFPLCによって精製し化されるが，グリセリン存在下では不活性型に保持され熱処理によって活性型に転換されることが示唆された。さらに上清画分を数週間凍結保存すると自動的に活性化され同様にグリセリンを添加しておくと不活性型酵素として数ヶ月間維持される。また，凍結，熱処理，DEAE一できる。

セルロース・クロマトグラフィーによって一度

MNAに代表されるようなトリブシソ様酵素の活性型に転換された後にグリセリンを添加して基質の他Glutaryl−（Ala）2・Phe−MNAのよう活性状態に保持することであり一度活性化されると精製は困難である。
ウサギおよびヒト赤血球からはDEAE−セル
ロース，PEG6，000処理，BiogelA−1・5m，
Heparin−Sepharose CL−6B，Hydroxyl−
apatiteによって完全精製できる。500mlの赤血球から約30mgの精製酵素が分離できる。
一方，ネズミ肝臓および筋肉からは上記の方法に加えて，SephacrylS−400およびMono Q
た。図2にネズミ肝臓からの最終標品を示す。
50匹のネズミから約30mgの精製酵素が調整
3．複合酵素活性部位の同定
精製酵素はカゼインの他グロピソ，変性アルブミン，変性IgGなど種々の蛋白質を基質として分解し1atencyを示す。他方種々の合成基質の分解活性を調べると CBZ−Ala・（Arg）2−も不活性型には移行しないので，これらの変化な典型的なキモトリプシン様酵素の基質にも作は不可逆的である。他方，ポリーL−リジソやポリーL−オルニチソのような塩基性ポリペプチド用する（表1）。しかしその特異性はトリブシ
ソおよびキモトリプシンより厳密でN末端を修の添加やトリプシンによる限定分解によって本飾したトリペプチド誘導体をよく分解する。ま

酵素は活性化される。そして興味深いことは本た蛋白質を基質とした場合と異なり合成基質の酵素の不活性型への保持にはダリセリソの他ジ
チオスレイトールやメルカプトエタノールのよ

分解にはlatencyは観察されない。
これらの基質を分解する活性部位を同定する

うなSH−保護剤の共存が必須であるが，逆にため種々のプロテア「ゼ阻害剤，各種修飾剤のN−エチルマレイミドやDTNBのようなSH一

影響を調べると表2に示してあるように蛋白基修飾剤によって活性化される。しかし塩基性
ポリペプチドで活性型に転換された酵素はこれ

質，トリプシン用合成基質，キモトリプシン用
合成基質を加水分解する活性は全く異なった挙らSH一基修飾試薬によって強く阻害される。
以上のことから不活性型と活性型の相互転換には種々のSH一基が重要な役割を演じているらしいことが示唆された。なお，塩基性ポリペプ

動を示す。各種試薬の濃度依存性，時間変化な

チドは人工的な不可逆的活性化因子であるが再現性がよく，また，操作が簡単なので通常の測定に有効である。
2．酵素の精製
本酵素は比較的多量含まれているため通常の蛋白質である可能性が示唆された。

どの解析からこれらの基質を分解する活性部位
は互いに独立していると結論され，本酵素が複合酵素活性部位を同一分子内に有する多重機能
これら合成基質を分解する活性は精製過程の各種クロ・マトグラフイ一においてカゼイン分解
活性と全く同一な挙動を示し，また以下に示す
蛋白化学的性質，免疫学的性質から判断してこ
103

Ⅰ酵素レベルでの効果︵HE＼モ篭︶Sモー︒LP占︒雇dU・Hml▼？

500

FractionNumber（lml／tube）

盲．∽−○︶EuO∞N︼dごu空Pqむ＞叫Jdlむ出
0

5

10

15

20

Retention Time（min）
鼠2 ネズミ肝臓酵素のMonoQを用いたFPLC
ネズミ肝臓250gを材料とし・①DEAE−セルロース，②PEG6，000分画，③Biogel
A−1・5m・④Heparin−SepharoseCL−6B・⑤Hydroxylopatite，⑥SephacrylS−400の各クロマトグラフィーで得た試料（15mg）を10mM2−メルカプトェクノールおよび20％グリセリンを含む50mMTris−HClpH7・5で平衡化したFharmaciaFPLCのMonoQカラムにかけ0−0二川KClで溶出した0活性はポリーいリジンの有無で測定した。

104

12．高分子量不活性型多重践能プロテアーゼ
表1精製酵素の基質特異性のトリプシンおよびキモトリブシソとの比較

substrate

誌 慧 Trypsln α−Chym0−trypSin

0

l

0

l

0

l

0

l

0

l
1

0

5

0

5

0

1

0

1

0

0

0
1
2

5

7

0

Arg−NAl0

Gly・Arg−NAl0

Arg・Arg−MNAl0

Bz−Tyr−Ethyl−Ester
Substrate for Aminopeptidase㈲100 692712060

5

Glutaryl−Ala・Ala・Ala−MNA

︒︒
31
7
31
24
8635
81
71
︒3
︒1
︒︒︒︒

0

Glutaryl−Gly・Gly・PheTMNA

5Bz−Arg・Gly・Pbe・Pbe・Leu−MNA

0

Me−Succinyl−Phe・Leu・Phe−MNA

5

Glutaryl−Phe・Leu・Phe−MNA0

Me−Glutaryl−Ala・Ala・Phe−MNA

5

Succinyl−Ala・Ala・Phe−MNA0GlutaryトAla・Ala・Phe−MNA

5Tosyl−Arg−Methyl−Ester
Substrate forChymotrypsin−like Enzyme0

BZ−Arg−Ethyl−Ester

5

BZ−Arg・NA

0

CBZ−Arg・Arg−MNA

5

CBZ−Gly・Gly・Arg−MNA

0

CBZ−Ala・Ala・Lys−MNA

5

CBZ−Arg・Arg・Arg−MNA

0

CBZ−Ala・Arg・Arg−MNA㈲10 0 8 10
61
34
00
4
81

㈲1
︒︒
︒1
1
︒2
1
3︒︒︒︒㈲1

Substrate for Trypsin−like Emzyme

Ala●Ala●Phe−MNA

Leu−NA

表2 種々基質分解活性に対する酵素阻害物質の異なった影響
CBZ−Ala・
COmpOund丘nalconc．

0
9
5
8
0
1
6
5
4
5
0
8
7

0

0

0

0

0

0

0

（lmM）

0

（50／唱／ml）

O−pbenantbroline

1（50J唱／ml）

Pepstatin

8E−64−C

4（50J唱／ml）（50J唱／ml）

1

ChymostatinGlt−（Ala））・（Arg）「MNA Pbe−MNA

一（50JIM）

Leupeptin

7

（lmM）

Hemin

2

（lmM）

CBZ−Gly・Leu・Phe−CH2CI

5

Ala・Ly＄・Arg−CH2CI

4

（lmM）

3

（10mM）

NEM

5

DFP

3H−CHJCasein＊＊Protease was activated by poly−L−lysine105

Ⅰ酵素レベルでの効果
表3 高分子量不活性型多重機能プロテアーゼの性質

1・分子量（Mr＝400−550Ⅹ）・ゲルろ過法（BiogelA−1・5m）， 沈降平衡法（Rayleigb干渉光学系）
2・等電点（pI＝4t9）密度勾配等電点分酎こて等電点沈澱
3．E主題19．7
4・S20，W18・2（シュリーレソ光学系）
5・球状蛋白質（ネガティブ染色後の電子頗徴鏡観察）6・サブユニット構造（約20ケの異質蛋白質の複合体）二次元（pI∴Mr）電気泳動分析
7・複合活性部位（多重校能）a・高分子変性蛋白質
b・トリプシン様酵素の基質ペプチド
C・キモトリプシン様酵素の基質ペプチド8・不活性型 高分子蛋白質を分解する活性部位
9・セリンプロテアーゼ（DFP，PMSF）
10・エンドペプチダーゼ活性（全ての活性部位）
11・至適pH 8−9（全ての活性部位）
12．局在性 細胞質画分

13・分布 動物組織（細菌，酵母不含）

図3 ネズミ肝蹟酵素の電子頭数鏡写真
精製酵素をuranylacetateで染色した後HitachiHU−2型電子原敬鏡で観察した。倍率×180，000

れらが異なった蛋白質の混合体でないことも明瞭である。したがって本酵素が基質特異性を異にしたプロテアーゼ複合体であると言うこと

合活性機能を持つ多重機能プロテアーゼである

は，蛋白質の速やかな分解機構を考える上でそれらの複合活性部位の連動した作用を想定すると特に合理的な生物学的意義を有するシステムと思われる。
4．酵素学的性質

万前後でこの高分子の例は他のプロテアーゼ群と比較しても例外的であり，その意味はおそら
く上記の多彩な機能を反映しているものと考えられる○等電点は4．9である。赤血球，肝臓，筋肉から精製した酵素のアミノ酸組成を比較す
ると全く同一であり，異種臓器間においても同本酵素が通常は不活性型で存在することと復106ことはすでに述べたが，それ以外の生化学的性
質について蓑3に列記した。まず分子量は約50

12．高分子量不活性型多重磯能プロテアーゼ

酵素のサブユニット構造と推定しているが，もしこれが事実であればプロテアーゼ以外でもこのような酵素の例はほとんどないと思われる。
現在，無細胞蛋白合成系を利用してこの酵素のm−RNAの分離を行っており，将来遺伝子側からのこの酵素の構造を決定したいと考えている。と同時に蛋白質研究の立場から解離・会合の検討も行っているので，できる限り早い時期にこの多重機能プロテアーゼのサブユニッ‖降造を解明し，本酵素の活性型一不活性型分子の相互転換の枚棒を明らかにしたいと考えている。

さて，本酵素の複合活性部位に対する阻害の様式は大きく異なるもののいずれの部位もDFPあるいはPMSFにSenSitiveなセリソ
プロテアーゼである。と同時に本酵素の二つのペプチダーゼ活性がいずれもNEMやDTNBのようなSH一基修飾試薬によって阻害されることと，前に述べたように蛋白質分解活性部位
図4 ネズミ肝臓酵素の沈降速度法による解析
シュリーレソ光学系によって分析した精製酵
素の沈降図形沈降係数（S20W）は18．2と計質された。約1％の試料を使用。同様な結果は
ヒト赤血球酵素についても得られた。
じ酵素が存在することを示唆している。本酵素をネガティブ染色した後電子顕微鏡で観察するの活性発現にもSH一基が重要であるらしいことを考え合わせると，本酵素のサブユニット間の相互作用にSH一基が関与していると推定される。
事実，本酵素のSH一基をDTNBで滴定す
ると1分子当り約50個のSH一基がありその約15％が酵素分子の表面に露出している結果が得と図3に示したように球状構造をしており，まられた。しかしながら本酵素のいずれの活性もたこの事実からこの蛋白質がかなり固い構造を

E−64−Cには全く影響されないのでSH−プロテ

していることが示唆された。図4に超遠心法でのシュリーレン光学像を示したが，対称形の単アーゼの範疇には属さず，SH一基は活性部位の近傍で活性発現に関与しているものがあると推一成分であることがわかった。また沈降係数を計質すると18．2とかなり大きい値であった。さ定された。今後，酵素分子内のSH一基の役割について詳細に検討したいと考えている。

らに交差免疫電気泳動でも単一蛋白質であることを同定した（図5）。

さて，本酵素の至適pHは各々の活性部位で多少異なるもののいずれも弱アルカリ性領域

このようにこのプロテアーゼが単一の巨大分にあり，中性pHでも十分な活性を示している子であることは疑いのない事実であるが，これことは，その細胞質画分の局在性において生理をSDSや尿素で変性解離させた後電気泳動や的に十分意義があると思われる。図7−Aには等電点分画を行うと十教本の異なった成分に分精製酵素におけるカゼイン分解活性のpH一依離される。図6にMrとpI変化の二次元電気存性を示してあるが，この曲線は図7−Bに示泳動の分析図を示したが，このように約20種類

すように，上清画分におけるパターンと極めてのスポットが検出される。現在，種々の理由によりこれらが自己消化の人工産物ではなくこの類似しており，本酵素が細胞質における主要な
プロテアーゼであることを示唆している。
107

Ⅱ 酵素レベルでの効果

図5 ウサギ赤血球酵素の交差免疫電気泳動精製酵素をモルモットに免疫して得られた抗血清を利用した。

●↑￣・●

・

r一一●

／「惣

図6 ネズミ肝臓酵素の二次元電気泳動
9・5M尿素存在下で等電点分画した精製酵素を15％ポリアクリルアミド
ゲルのSDS⊥電気泳動を行った後銀染色した。

108L

12．高分子量不活性型多重揆能プロテアーゼ

0︵∈コ∈明誓言叫︒婆S官−○烏合u叫翳dU・Hc

100

5

6

7

8

9

10

pH
図7 精製酵素および細胞質画分におけるカゼイソ分解活性のpH一依存性
A：肝臓精製酵素
0：対照（1atent活性）●：ポリーレリジン添加による活性型酵素
B：ネズミ肝臓上清画分
肝臓の25％ホモジネート（10mM Tris−HClpII7・5，10mM2−
MSH，0．25Mショ糖，0．1mM EDTA）を105，000×g，1時間遠心し，得た上清分画をショ糖を含まない緩衝液で透析したものを酵素源とした0 ㌢ヨ糖は活性化を阻害するのでこの除去操作は必要。

109

Ⅰ 酵素レベルでの効果
表4 正常および筋ジストロフィーハムスターの肝臓，筋肉細胞画分におけるカゼイン分解活性とESTの影響
JH−CaseinI）egrading Activity

Protein Contents（ng／g wet wt）（FLg／h／mgprotein）
None（FLg／h／g wet wt）＋PLL None＋PLL−Liver−Normal

23．7

293

1，801

Dystropbic

25．3

316

1，874

Dystrophic＋EST

27．2

483

2，344

Normal

11．7

167

644

Dystropbic

7．6

76

236

I）ystrophic＋EST

6．2

68

162

−Skeletal Muscle−

PLL：Poly−L−lysine
表5正常および肪ジストロフィーハムスターの肝臓，筋肉細胞質画分における二種のべプチダーゼ活性とESTの影響
CBZ−Ala・（Arg）2−MNA Glutaryl−（Ala）2・Phe−MNA（nmoles／h（nmoles／h（nmoles／h（nmoIs／h／／mg protein）／g wet wt）／mg protein）

g wet wt）

Normal

24．0

1，824

Dystropbic

19．2

1，421

Dyetrophic＋EST

28．5

2，451

−Liver−−Skeletal Muscle−
Normal

17．0

935

6．1

336

Dystrophic

5．2

161

2．8

87

I）ystrophic＋EST

4．9

127

2．8

73

また上画分におけるプロテアーゼ活性の潜在性は特に興味深くその調節横序の解明が待たれ在性やその分布に関しては，ポリーL−リジンにる。さらにCBZ−Ala・（Arg）2−MNA や Gl・

よる活性化で追跡しており，この現象が極めて特異的であるとは言え，確実な結論を得ること

utaryl−（Ala）2・phe−MNA分解の至適pHもは困難であるので現在本酵素の特異抗体を利用

精製酵素と上清画分で極めて煩似しており，細した免疫学的な方法で解析しつつある。

胞質でのこれらの基質の分解もおおむね本酵素

5．筋ジストロフィーにおける活性変動によるものと推定された。
なお，塩基性ポリペプチドによるカゼイン分
解活性の促進は上清分画においてのみ観察さ以上，述べてきたように，本酵素はいくつかの新しい性質を有しているが，その生物学的意義は不明である。そこで，筋蛋白質分解の冗進

れ，他の分画に認められないことから本酵素は細胞質に存在すると結論した。また本酵素は酵状態にある筋ジストロフィーにおける活性変動

母や細菌には存在しないがネズミの各臓器や種イン分解活性と二種の合成基質分解活性を対照々の樹立細胞株を含め広く動物細胞内に分布していると思われる。しかしながら細胞内での局と筋ジストロフィー・ハムスターで比較すると110を検討した。表4および表5に示すようにカゼ

両者ではいずれの活性とも肝臓では有意に変化

12．高分子量不活性型多重摸能プロテアーゼしなかったにもかかわらず，筋肉では筋ジスト

LGoldberg教授の研究室でLloydWaxman

ロフィー動物で著しく低下していることがわか博士の協力を得て行ったものであることを付記った。現在，筋ジストロフィーの筋細胞におけする。

る本酵素活性の低下の理由と生理的意義については不明であるが，その原因が酵素活性の減少
か酵素量の変動によるものかについての免疫学的な検討を行っている。なお，ESTの投与はこれらの変化に何ら影響しなかった。

文

献1）Goldberg，A．L．and St．John，A．C．：Ann．
Rev．Biocbemり45，747−803，1976．

2）DeMartino，G．N．and Goldberg，A．L．：J．
Biol．Cbemり254．3712−3715，1979．

付記3）Rose，Ⅰ．A．，Warms，J．U．B．and Hershko，
A．：J．Biol．Cbemり254，8135−8138，1979．

ここで解説した項の中でウサギ赤血球における本酵素の発見，精製等に関する成績は著者の

4）Tanaka∴K．，Waxman，L．and Goldberg，A．
L．：Submitted for Publication．

一人（田中）がハー／：−ド大学生理学 Alfred

111

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果

13．ニューロフィラメソト変性とプロテアーゼー続報−

杉田 秀夫

14．ハムスター培養筋のZ帯変性に対するE−64−Cの作用小沢撰二郎

15．実験的急性筋崩壊に対するESTの効果

石浦 章一

16．高感度免疫転写法を用いた血清中のα−アクチエソの検出………………………野々村被昭

13．ニューロフィラメント変性とプロテアーゼ

ー続

杉
研究協力者

鎌
藤

田

報−

秀

夫＊

倉

恵

子＊

石

浦

章

一＊

田

武

久＊

埜

中

征

哉＊＊

我々はこれまでに末梢神経，脊髄よりneuro一を含むbufferに溶解し，SDSpolyacrylamide

点lament（Nf）を抽出し，この上清を可溶性分

gel electrophoresis（PAGE）にかけ観察し画とし，これにCa2＋−aCtivatedneutralpro−

た。前回までの方法で抽出したNfも同様に

tease（CANP）が存在すること1−2），およびNf

incubate

してSDS PAGEで観察した。

にm−CANP，FL−CANP，CathepsinBなどを

次にこのTKMNfを低張液（10mMTriS−

作用させ，Nf triplet（200K，160K，68K）のHCl，pH6．8，0．1mM EGTA，5mM mer・

うち160Kが最も速く変性することを発表してきた3）。今回は，Nf結合性のCANPの有無

CaptOethanol）に対し透析後，5mM Ca2＋存について調べ，また一方で，末梢神経にCANPにSDS PAGEで観察した。

が存在することの形体的裏付けに関する実験を行った。

2．TKM NfのimmⅦnOrepliea

方法

1．Nf抽出とinctlbation
Nfをこれまでの低張液を用いるSchlaepfer在下にincubateした。この結果も前述と同様

二方法で抽出したNf，ニワトリ骨格筋より抽出した粗CANP，末梢神経の全homogenate
をSDSPAGEにかけ，これをCellurose
nitrate膜に電気泳動的に転写し，この膜に抗らの方法4）とは異なる等張液（50mM Tris−

CANP血清，FITCラベル抗ウサギ血清を370Cで反応させた。

HCl，pH7．5，25mM KCl，10mM MgC12，

3．末檎神経におけるCANPの形体学的徴察

5mM EGTA，2mM mercaptoethanol）と1％Triton X−100を用いるCzosnekらの方

末栴神経凍結切片（5／ ）を，−200Cアセト
ンで15分固定後，20％ヤギ血清，抗CANP血清法5）で抽出した。これをTKMNfとする（表（×50），FITCラベル抗ウサギ血清を順次370C1）。このTKMNfを等張液（10mMTris−
HCl，pH6．8，0．1MNaCl，5mMmercapto−

で反応させた後，螢光顕微鏡で観察した。対照としてはウサギ血清を抗CANP血清のかわりに

ethanol，0．1mM EGTA）に対し透析後，用いた。

0．1mM，lmMのCa2＋ 存在下，Ca2＋−free，lmM Ca2＋＋0．1mg／ml E−64，C存在下の各

結果

条件下に370Cでincubateした。15分ごと

1．TKM Nfを0．1mM，1mM Ca2＋存在に90分間，50／ 1ずつ試料をとり，同量のSDS

下にincubateすると，0．1mMの場合は60分
から，lmMの場合は15分より変性した。Nf＊ 国立武蔵療養所神経セソクー疾病研究第一部＊＊国立武蔵療養所神経センター微細構造部

tripletの中では，160Kの変性がやや速く生じた。この変性は，Ca2＋−freeの状態では生じ
115

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果

Extraction of neurofilament（rat peripheralnerve orspinalcord）

Homogenizein tlVO Or three volumes of buffer（10mM PB or Tris・HCl，5mM EDTA，pH7．2）

Stand for one hour at4℃

﹁㌣蜘澤咽

l

SupernatantlVaS adjusted to O．lM NaCI
concentration
I

Centrifuge at20，000×g for30min
．†L

n
a
t
a

igh・Speed centrifugation atlOO，000×g for120min

SuCrOSe）＼
Supernatant

Extraction of Neurofilament
R − ▲ I H

at spinal cord

omogenizein3volumes of TKM Buffer（50mM Tris・HCl，pH7．5
25mM KCl，10mM MgC125mM EGTA
2mM mercaptoethanol）

・汀de
l︼晶
S−1−HlIIPI▲▼D

Add1％Triton X・100
at40c forlhh speed centrifugation

38，000rpm（Hitachi RP65），2hte

Dialyze to buffer（20mM Tris・HCl，pH6．8，
0．1M NaC15mM mercaptoethanol
O．1mM EGTA）
表1A：Schlaepferらの方法によるneuro丘lament精製法。低張液を用いる。
B：Czosnekらの方法によるneuro丘lament精製法。

なかった。またE−64−C存在下では変性は抑制された（図1）。これに対し，これまでの低張液を用いる方法で抽出したNfは6時間のin−
Cubationでも，0．1mM，1mM Ca2＋存在下で変性を生じなかった（図2）。このTKMNf
を低張液Iこ対し透析後，5mM Ca2＋存在下にincubateすると，Nfの変性は非常にゆるやかなものとなる（図3）。
2．Immunoreplica法ではCANPのband
l16が出るのみで，TKM Nfにbandは出なかった（図4）。
3．末梢神経の軸索が螢光で染まりmyelinは染まらなかった。対照の生食では全く染まらなかった。他にperineurium．シュワン細胞，
シュワン鞘の周囲が染まっていると思われる（図5，6）。

む

表意量l雷

十

⁚⁚塵一・

おき

十

ぺ函滅

3

4

5

6

7

8

9

10

1112

1314

嵐

∵一一⁚一・・一月．﹂H一﹂↓↓

持出Er卜∴ニー⊥ふトbr↑．7十十ヒヒiLト∵LTl︻lf．．t粗壁1

＋↓

畠﹁﹂

13．ニューロフィラメント変性とプロテアーゼー続報−

ン

151617

図1Nf（TKM）incubationの結果08％SDS gel，CBB染色1，2はCa2＋−free，3〜7は0・1mMCa2＋存在下，8〜12は1mMCa2＋存在下，
13〜17はlmM Ca2＋と共に0．1mg／mlE−64−C存在下にNfをそれ自体incubateした結果である。1，2は0，60分，他の各条件下の5本は左から右へ0，15，30，45，60分の
incubation timeを示す。矢印は上から下へ，200E，160K，68K の各tripletを示す。
TKMNfは，Ca2＋依存性に変性していくことがわかる。
0．1mM Ca2＋

200K−■

1mM Ca2＋−■−−

160K−■

■■■■

・．・．＿

■・−■

−

−

■■−

■■■

■■■■

■ト一

一、●

一・■ト

一●

68K一一

■−

■
■

−■・！夢 惣 儀鬱 帆・・

！！！−
0
図2

2

4

6

h O

2

4

6h

Nf（Schlaepferらの方法でとったもの）のincubationの結果。8％SDSgel，CBB染色
左の4本は0．1mM Ca2＋存在下，右の4本は1mM Ca2＋存在下にincubateした結果で，各々，左から右へ0，2，4，6時間のincubation時間を示す。矢印は上から下へ200K，160K，68KのNf tripletを示す。この方法で抽出したNfは4時間近いincuba−tionでも変化はみられない。

117

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果
5mMCa2＋
A

■■→

→J
一■■｛

▼■■曽

桝r●

一一一●・

I−●

■■

→￡

■−

一一

一▼

一寸■−■

■−

−▲−

●−

一■

−

￣

t−

さ

￣■F

忽逼逼 攣
彰

威

Jここー

■

0

15

30

45

0

lsotonic
図3

15

30

45min

Hypotonic

TKMNfを等張液透析後（A）・低張液透析後（B），5mMCa2十存在下にincubateした結果。8％SDSgel．CBB染色
矢印は上から下へ200K・160K・68KのNftripletを示すo A，Bともに左から右へ
0・15，30，45分のincubation時間を示すo Aでは図1と同じく15分より160Kから変性する。Bでもやはり変性しているが，Aに比べずっとゆるやかなものとなっている。
B

SDS gel（8％）

Immunoreplica◆、→■・

書誌聖二望こ一一さ・

80K￣二二二二
一■■

→■lJ瑚

68K→・●一一一fl▲▲
Nf Nf（TKM）cANP N。rVe Nf（T‰）CANPNerve
図4

118

A：左よりSchlaepferらの方法で抽出したNf，TKMNf，ニワトリ骨格筋よりとった粗CANP，ラットの末栴神経homogenateをSI〕Sgel（8％）にかけたもの。CBB染色
Nf，Nf（TXM），Nerveの三本の矢印は上から下へ200K，160K，68KのNftripletを示すo CANPの80Kの矢印がCANPのbandを示す。
B：Aのimmunoreplicaであるo CANPのbandのみ見られTXMNfにbandは見られなかった。

13．ニューロフィラメント変性とプロテアーゼー続報−

図5 末梢神経横断面。×160
A，B：抗CANP血清をかけたものでAは
pllaSeである。軸索とperineurium
が染まっている。
C，D：対照としてウサギ血清をかけたもの
で，Cはpbaseである。
考案

1の実験より，Ca2＋依存性にNfを変性させ，E−64−Cで抑制される酵素が，等張液，

図6

A，B：宋棉神経横断面。×1000
AがpbaseでBが螢光をみたものである。軸索とシュワソ鞘の周囲が染まっている。

C，D：末梢神経縦断面。×400
CがpbaseでDが螢光をみたものである。軸索が染まっている。他に点状に染まっているのほ，シュワン細胞と思われる。

Trion X−100を用いて抽出したTKM Nfに結合していると推測される。この酵素はCANP

石崎ら6）は，Nf結合性のCa2十依存性pro−である可能性が強く，また，0．1mM Ca2＋存

teaseについて発表しており，これが高濃度の在下でもKCl（0．6M）で遊離するとしている。今回のNfは1mM

の場合よりゆるやかだが変性するため，〃−typeのものも存在してい我々の実験は，これを裏付けるものであるが，ると思われる。低張液に対しNfを透析後，immunoreplica法でband検出はできなかっCa2＋存在下にincubateすると，変性はゆるた。このことは必ずしもNfに結合しているやかになるため，低張液で結合していたCANPCANPの存在を否定するものではないと思わが遊離した可能性がある。このため，これまでれる。ごく微量の結合の可能性もあり，また，の低張液を用いたNf抽出法ではNfにCANP
は結合していなかったと推測される。しかし，今回行ったimmunoreplica法の感度の問題もあると思われる。

TKM NfにCANPが本当に結合しているか

免疫組織化学的方法では，軸索にCANPが存在することがわかったが，光顧レベルである

どうかについてはなお不明である。可溶性分画中のものが単に付着しているのみである可能性もある。

ため，Nfその他に結合するものであるかどうかは不明であった。他にシュワン細胞，Peri−
119

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果

neuriumなどにも存在していると思われる。
文

献1）Kamakura，K．，Ishiura，Sり

業「飲生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和57年度研究報告書，207−
215，1983．

Sugita，H．and

Toyokura，Y．：Identi負CationofCa2＋−aCtivatedneutralprotease（CANP）intheratperipheral
nerve，Biomed．Res．，3，91−94，1982．
2）Eamakura，K．，Isbiura，S．，Sugita，H．and

4）Schlaepfer，W．W．：Studies on theisolation
and

sub＄truCtureOf

mammalianneuro＿

丘laments，J．UltrastruCt．Res．，61，149−157，1977．

5）Czosnek，H．，Soifer，D．，Mack，E．and
Wisniewski，H．M．：Similarityofneurofilament

Toyokura，Y．：Identi丘Cation of Ca7＋−aCtivated

PrOteins from different parts of the rabbit

neutralproteasein the the peripheralnerve

nervous system，TrainRes．，216．387−398，1981．

andits effects onneurofilamentdegeneration，
J．Neurocbem．，40，908−913，1983．

6）Ishizaki，Y．，Tashiro，T．andKurokawa，M．：

3）杉田秀夫，鎌倉恵子，石浦章一；ニューロフィ

the160kDa component of the neuro丘lament

ラメソト変性と〝−CANP，厚生省新薬開発研究事120

A calcium・aCtivated protease which degradeS
triplet，Eur．J．Biochem．，131，41−45，1983．

14．ハムスター培養筋のZ帯変性に対する
E−64−Cの作用

小

沢

瑛二郎＊

研究協力者 熟 海 佐保子＊＊ 萩 原 康 子＊

1982年本班会議においてカナダのJasmin教
授は次のような研究を発表した1）。筋ジストロ
フィーハムスターの筋芽細胞を3週間培養すると，筋管細胞の形成は行われるが，そこに含まれるmyo負brilのZ帯が消失する。このこと
は，Z帯がCaactivatedneutralproteinase（CANP）によってよく分解されることを考え合わせると重要である。すなわちCANPのin vitroでのinhibitorである E−64−Cがこの変化を阻害するか否かが問題となるからである。
我々はJasmin教授の結果を追試しさらにその変化に対するE−64−Cの効果について検討しょうとした。ところがここに問題がある。すな
わちJasminらほ，ハムスター新生児よりの筋芽細胞を用いることができるのに反し，我々は成熟ハムスターの骨格筋中に存在する衛星細胞を用いる以外に方法がなかった。哺乳煩の衛星細胞の培養は必ずしも増殖がよくなく，したがって培養が容易ではない。我々は昨年の班会議において衛星細胞の培養条件について検討した
結果について報告した2）。それによればラットと′、ムスターという比較的近縁の動物においても培養条件が違う。今年はこれに従って培養した筋管細胞に対してE−64−Cを投与し，その形
態学的変化を光顕および電顕で検討した。その結果は以前ニワトリの培養筋を用いて行った実＊ 国立武蔵療養所神経センター機能研究部＊＊山梨医科大学解剖学教室

験と同様に，低濃度のE−64−Cには筋の成長をやや促進する作用があるが，高濃度のE−64−Cには退行性変化を与え，遂に消滅させる作用がある。またZ帯の変化はJasminらの報告とは異なって，Z帯が流れた様相を呈するが，E−64−Cにはこの変化を抑える作用はなかった○
方法

ハムスターは実中研より提供されたBIO
14．6を用いた。ハムスターを放血死させた後，消毒し，背筋，腰筋を取り，細切後0・1％
Difcotrypsinの0．9％NaCl溶液中でスターラーをまわして処理した。室温で30分処理後3倍量の培養液A（EagleMEM85％，ウマ
血清15％）で反応を停止させ，細胞を集めた
後，再び同様にtrypSin処理し，単細胞として脱落したものを集めて，35mmFalconplastic
培養皿に106個ずつ描いてCO2インキュベータ
ーにて培養した。培養液は培養液B（HamF12
40％，DulbeccomodifiedMEM40％，ウマ
血清10％，仔ウシ血清10％）を用いたが，細胞が培養皿一杯になった場合にはそれ以後培養
液Aに切りかえた。実際には播いた後1週間で一杯に広がった。培養液は通常3日で交換した。なおE−64−Cは，0・9％NaCl液に溶かし，細胞が一杯になってから加え，最後まで同じ濃度を保つようにした0光顕写真は，細胞を固定せずに撮影した0電顕写真は培養液を除いた後，0・9％NaC1
5mM燐酸バッファーpH7・4の液で洗った′121

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果

匪‖筋ジストロフィーハムスター培養筋細胞（1，320×）

図2 筋ジストロフィーハムスター培養筋細胞に・E−64−C3〝g／mlを加えたもの。
0揮／mlに比して特に著しい差はない。（1，360×）

図3 筋ジストロフィーハムスター培養筋細胞に，E−64−C30〝g／mlを加えたもの。
線維芽細胞の増殖強く，筋管細胞は変性に陥いっている。（1，320×）122

14．ハムスター培養筋のZ帯変性に対するE−64−Cの作用

図4

筋ジストロフィーハムスターの培養筋細胞

Z帯が部分的に融け出したような像を呈し（矢印），太いフィラメソトと細いフィラメントの配列が乱れている。（29，000×）

図5 正常ハムスターの培養筋細胞
Z帯（矢印）は同一の太さで，A帯（A），Ⅰ帯（Ⅰ）が明瞭にみられる。（32，000×）

後，2．5％グルタールアルデヒド，2％ノミラフ

結果ォルムアルデヒド固定後，0．1％オスミウム酸
固定，洗った後酢酸ウラン染色後，アルコール

培養に移された衛星細胞は，増殖し融合し筋にて段階的に脱水，エボン包哩を行った。その管細胞を作る。この際一緒に取れて来た線推算

後超薄切片を作り電顕にて観察した。

細胞の増殖は非常に強く，培養1週間も経つと培養皿のかなりの部分は線維芽細胞で覆われ，筋管細胞は数視野に1ケ位にみえることが多123

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果

図6筋ジストロフィーハムスター衛星細胞を1週間培養し，これにE−64−C3邦／ml加えてさらに17日間培養したもの0筋原線経はよく形成されているが，あちこちにZ帯の融け出したような像（矢印）がみられる。（28，000×）

図7 図6と同一条件で培養した筋管細胞だが，発生のより若い時期のもの。
この筋管細胞では・Z帯がそれぞれのSarCOmereに見られず，まばらに出現しているにすぎない（矢印）。（17，000〉く）

い0もちろん筋管細胞の発達がもっとよいこと

筋では，筋原線経はよく形成されているが，そもある。時間が経つにつれて筋管細胞の成長ものZ帯が部分的に融け出したような像がみらみられるが，線維芽細胞の増殖に圧迫されて部
分的にやせ細り，長い短冊型の筋管細胞がかな

れそのためA帯，Ⅰ帯が不明瞭になっている

り不整形をとることも少なくない（図1）。
電顕的にはジストロフィーハムスターの培養124（図4）。空腹もかなりみられる。また核は著し
く不整化している。これに対して正常ハムスタ
ーの培養筋では・空腹化は多少みられるが，Ⅰ

14．ハムスター培養筋のZ帯変性に対するE−64−Cの作用

図8 図6と同一条件の培養筋管細胞。Z帯の流れ出したような部分の高倍像。
Z帯の，節線経の長軸に直角方向の成分が不明瞭である。（83，000×）

図9 筋ジストロフィーハムスター衛星細胞を1週間培養し，これにE−64−C30／唱／ml加えてさらに17日間培養したもの。筋線経の変性がひどく，細胞内にAutophagicvacuole（Au），空胞（Ⅴ）などが多数見られる。筋原線経は細胞辺縁部に配列が乱れてわずかに存在する（矢印）。（23，000×）

帯の中央にZ帯が同一の太さでみられる（図5）。

がみられる。筋管細胞は，3J瑠／mlでは光顕上
0〝g／mlと同じである（図1，2）。しかし濃度し高濃度（30／Jg′／ml）の存在下では抑えられ，を増すにつれて，変性の程度を増し，30上嶋／ml
では，培養3週間ではわずかに筋管細胞がみられただけであった（図3）。この変化は以前報告したニワトリ培養骨格筋に対するL−E−64（天然物）の作用とほぼ一致するものである3）。

かつ細胞内に微細顆粒状のものがみられ変性像

電顕的観察は，E−64−C3／瑠／ml加えたもの

E−64−Cの効果
光頗的には，線維芽細胞の増殖は低濃度（3／瑠／ml）の存在下ではE−64−Cが存在しない場合（0〃g／ml）とほとんど同じである。しか125

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果

では，E−64−CはZ帯の融け出した像ができるのを改善しなかった（図6）。しかし筋原緑綬の病変の筋管細胞が得られるとは限らない点にある。

の成長は，0／堰／mlに比して幾分よいという印

Z帯がこのように融け出すのは，Nemalin

象が得られた。また，比較的発生の早い段階の筋管細胞では，TautuandJasmin（1982）がmyopathyや実験的には納らの培養筋細胞に対する抗コリンエステラーゼ剤の作用による指摘したように，Z帯がほとんど消失している
筋管細胞がみられるが，E−64−Cを投与したもNemalin−likeの形態の変化が知られている4）。
しかし形態的にも細い点迄この場合と同じといのにも同様の筋管細胞がみられ（図7），この点

うわけではなく，ここに報告した現象がいかなに関してもE−64−Cに改善作用があるようにはる機構によるかは不明である。

みえない。Z帯が融け出したような像を高倍率

E−64−Cには一般的に，細胞毒性があるが，下で観察すると，筋細胞の長軸方向に沿った成分は明瞭にみられるが，これに直角方向の成分

単核細胞よりも多核の筋管細胞の方に特に毒性が強い。しかも筋管細胞に起こったZ帯の変化がはっきりしないという特徴がある（図8）。

に対する阻止あるいは改善作用は認められなか

E−64−C30J唱／ml投与したものでは，筋管った。このことは，初めのもくろみのように細胞の変性像が強く，細胞内にはAutophago−Jasmin らの成績の正確な追試ができなかった

SOmeライソゾームなどが異常に増加し，空胞

ためか′もしれない。この点からもジストロフィも多数みられる。筋原線経は多くの筋管細胞では配列が乱れたものが断片的にみられるのみである。

ーハムスターの新生児の使用が可能になることが望まれる。

討論

ハ4スターの衛星細胞の培養は，単一細胞にしてモノレーヤー培養で行うことはかなり困難
であり，特に3週間を保つことは困難である。
1983年来日したProscheckは，このような条

E−64−C3FLg／mlの存在でmyofibrilの発達がややよかったことは，以前我々が報告した亭
うに，ニワトリの培養筋のクレアチンキナーゼ
活性の蓄積が低濃度3〜10／Jg／mlのL−E−64
によって促進されるということと併せて考えると，やはりE−64−Cは培養細胞でも幾分蛋白分解を阻害しているのかもしれない。

件下で衛星細胞を3週間保つことは不可能であると述べている。我々は，このことに数回成功することができ，それを電顕用サンプルとした。
E−64−C3／瑠／ml投与筋管細胞において，Z帯が紡錘状に流れている像を高倍で観察すると，筋線経の長軸方向に直角の成分がほとんどみられないという所見が得られたが，これが薬を入れてない場合のジストロフィー筋でも同様
なのか，あるいは薬が関係しているか否か，さらに検討を要する。解析に困難な点は，1つのdish内で培養したすべての筋管細胞が同一所見を皇するとは限らないこと，また毎回同程度

126

文

献

1）Tautu，C．andJasmin，G．：J．Neuropathol．
Exptl．Nearolり41，87−103，1982．

2）小沢鋲二郎：厚生省新薬開発研究事業「徴生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和57年度研究報告書，189−191，1983．
3）小沢瑛二郎，木村一郎，萩原康子，三浦 力：
厚生省新薬開発研究事業「徴生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和54年
度研究報告書，9ト94，1980．
4）Osame，M．，Kawabuchi，M．，Igata，A．and
Sugita，H．：Proc．Japan Acad．，51，598−603，
1975．

15．実験的急性筋崩壊に対するESTの効果

研究協力者

石

浦

章

佐

野

元

規＊

藤

田

武

久＊

安

楽

治

美＊

杉

田

秀

夫＊

はじめに

一＊

注2日前より投与し，以後実験終了時まで水と共に自由に摂取させた。断頭，脱血後，ヒラメかにした1）。（1）局所麻酔剤である塩酸プビバカ

筋を10倍量の生食−0．1％トライトンⅩ−100液でホモジナイズし，8，000rpm，10分の遠心上

イソをラットヒラメ筋に直接筋注する方法にて清を用いて諸酵素活性を測定した。沈澱はアル

昨年の班会議において我々は以下の点を明ら

急性の筋崩壊を起こすことが可能である2）。（2）

カリで可溶化後，筋構造タンパク質の定量に用筋崩壊はマクロファージの浸潤を伴い，筋内マ
クロファージ量と筋タンパク量が一見反比例しいた。カテプシソ∵B＆L，HおよびDは，
Suc−Tyr−Met−naPhtylamide，Arg一methyl−ている。（3）浸潤マクロファージ量と，筋ホモジ

coumarylamideおよびへモ〆。ピソを基質とネート中のカテプシソB＆L活性は良い相関を持っている。（4）カテプシソBはマクロファー

して測定した。

ジに局在している3）。（5）シクロへキシイミド投（FD）を用いたOhkumaらの方法5・6）によった。EST長期投与ラットの腹腔にFDを投与

与によってマクロファージの増生ならびに筋構
造タンパク質の減少が抑制される4）。
以上の結果は，この実験的筋崩壊過程において，マクロファージ由来のプロテアーゼ，特にカテプシソ塀が筋構造タンパク質の消化に関与していることを示唆している。この系を用いてESTの大量経口投与の効果を検討した。また
今回は，大量投与による副作用を検討するため
肝ライソゾームの性状についても若干研究を加ライソゾ，ム内pHの測定はFITC−dextran

し，12時間後に肝臓を取り出し，従来の方法のごとくライソゾーム画分を調製した。以後，FDの螢光強度がpHに依存することを利用してライソゾーム内のpHを測定した。
結

果

1．EST投与の効果（筋注2および7日目）
図1にEST大量投与の効果（2および7日目）を示す。本図は筋崩壊の指標である筋構造

えた。
方

法

タンパク質量の変化を百分比で示したもので，参考として埜中らのべスタチソ投与結果（40

プビバカインによる筋崩壊の作製は昨年度のmg／kg／day，腹腔内投与）を併せのせる7）。昨

報告，ならびに既報に準じた。
ESTは飼料に混入したもの（300mg／kg／day，

年度，ESTの経口投与にて筋構造タンパク質

大正製薬から提供された）を，ブビバカイン筋

度は図1に示すごとく有意差は出なかった。同＊国立武蔵療養所神経セソクーの低下が有意に抑制された結果を待たが，本年様に，ベスタチソ投与においても急性筋崩壊を防ぐことはできなかった。
127

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果

2．EST投与に対する酵素活性の変動

100

次にESTが細胞内チオールプロテアーゼ活
性をどの程度抑制するかを判定するため，筋ホられるライソゾーム内チオールプロテアーゼ煩の測定を行った。表1，2にその結果を示す。
筋注2日日では，既報のごとくマクロファージ
由来と考えられるカテプシソB＆Lの他，カテ0筋構造タンパク量

モジネートを調製し，筋崩壊に関与すると考え

プシソH，カテプシソDなどすべてのライソゾーム酵素活性が上昇するが，EST投与によっ︵％︶て，チオールプロテアーゼであるカテプシソ
B＆LおよびカテプシソHのみが有意に活性低下を示す（前者が31％に，後者が71％に低下）ことが判明した。チオールプロテーゼ以外の酵素活性には全く影響が見られないことから，ラ0

イソゾームの増生をESTが抑えたのではなく，
2日‖

7日‖

7日‖

7ビバカインのみ

7ビバカイン＋ベスタナン

7ビバカインのみ

7ビバカイン＋ベスタナン

7ビバカイン＋EST

n い

7ビバカインのみ

LrJHn⁚

7日HRU

7ビバカイン＋EST

l

7日目口‖

プビバカインのみ

2日H

2日‖⁚

・J・Hn⁚．．1 日い2日日日H

E−64−Cがライソゾーム内に蓄積し標的酵素でした可能性が高いと考えられる。全く同様にブ

図1 プビバカイン投与による筋構造タンパクの減少
EST，ベスタチソ共に有意に筋構造タソバクの減少を抑制しなかった。
表1あるカテプシソB＆LとカテプシソHを阻害
ビバカイン筋注7日目においても標的酵素活性の低下（カテプシソB＆Lは62％に，カテプ
シソHは72％に低下）が見られた。
3．肝ライソゾームに対するEST投与の効果以上の実験により，EST大量投与による試薬のライソゾームへの蓄積が考えられたのでライソゾームの形状ならびにそのタンパク分解能
力を推測する最も良い方法であるライソゾーム
内pHの測定を肝臓を用いて行った。表3にそプビバカイソ筋注2日後の筋ホモジネート中ライソゾーム酵素活性の比較
EST非投与ラット（n＝5）

プビバカイン筋注

対照EST投与ラット（n＝5）

プピ／ミカイン筋注

対照

カテプシソ■ B＆L（nmol／mg／h）

36．9±8．5

4．9土1．9

11．4土4．0＊

2．4土1．1

カテプシソH（nmol／mg／h）

21．0土3．0

4．4土0．5

15．0土4．74＊

4．4土1．4

カテプシソD（U／mg）

0．441±0．060

0．042土0．019

0．457：土0．043

0．129土0．059

酸性ホスファクーゼ
（U／mg）

0．160土0．021

0．111土0．020

0．168土0．029

0．122土0．021

α−ガラクトシダーゼ（U／mg）

0．85土0．13

0．21土0．02

0．82土0．07

0．22土0．03

α−グルコシダーゼ（U／mg）

0．44土0．12

0．37土0．03

0．53土0．09

0．37土0．04＊p＜0．001，＊＊p＜0．05

12815．実験的急性筋崩壊に対するESTの効果
表2 プビバカイソ筋注7日後の筋ホモジネート中ライソゾーム酵素活性の比較
EST非投与ラット（n＝5）

プビバカイソ筋注62．9土15．1

対照EST投与ラット（n＝5）

プビノミカイソ筋注

対

照39．1土8．1＊＊
30．3士4．3＊

6．2土1．7
9．7±0．7

カテプシソH

41．8＝ヒ4．6

8．1士1．7
9．4土0．6

カテプシソD

0．868土0．058

0．306士0．040

0．766土0．105

0．318土0．015

酸性ホスファクーゼ

0．233士0．014

0．155±0．002

0．223±0．016

0．160土0．011

α−カ ラクトシダーゼ

0．76土0．13

0．53土0．08＊＊

0．17士0．01

α−ブルコシダーゼ

0．48士0．08

0．15士0．01
0．34±0．03

0．48土0．07

0．36士0．04

カテプシソB＆L＊p＜0．01，＊＊p＜0．02

注．表1とは全く別個の実験のため，値の比較はできない。
表3

EST投与による肝ライソゾーム内pHの
変化

正常ラット

溜謂 （n＝4）

EST投与ラット
4日日

5．15，5．10（n＝2）≡：gg，5・60（n＝3）

を消化してしまう可能性である。第3は，今回の実験での筋崩壊の割合が2日で70％への減少と少なめだったため（昨年度，有意差が出た実験では2日で40％へと低下した），ESTの効果があらわれなかった可能性が考えられる。ベス
タチソ投与でカテプシソH活性のみを特異的に抑制しても全く変化が見られないことより，カ

EST投与ラット
30日日の結果を示す。投与4日目にて正常範囲より高くなっており，1ケ月の長期投与後ではクロ∵P
キソなどの弱アミン投与よりも高くなっている
ことがわかる。ライソゾーム内タンパク分解がEST投与によりどの程度抑制されるかは今後の問題である。

テプシソHの寄与は少ないと考えられ，やはりカテプシソB＆L活性と筋タンパク分解の関係を明らかにしない限りこの種の実験とその効果の判定はむずかしいという印象を受けた。特にカテプシソBは浸潤マクロファージに局在しているため，細胞内でのタンパク分解活性と，筋ホモジネートでの活性との間に相関がある
か，EST投与により前者が後者と同様な阻害

考察

今回の結果により，ESTを大量経口投与す
ることにより細胞内チオールカテプシソの活性をある程度抑制することに成功した。しかしながら筋崩壊の1つの目安である構造タンパク質の急激な減少を抑制することはできなかった。
この説明としてはいくつかの可能性が考えられる。第1は，筋崩壊にはカテプシソB，H，Lなどのチオールプロテアーゼが関与していない可能性であるが，f乃如froでの筋タンパク分解能
力の強さ3）や現在までの多くの知見9〜11）を考えあわせると，この可能性はないと思われる。第2は，EST投与による標的酵素の阻害が100％ではないため，少々でも筋細胞内にあるカテプ
シソ（特にB＆L）が大量の筋構造タンパク質を受けるかどうかなどは今後に残された問題である。
ESTの大量投与によりライソゾーム内pHの大幅な上昇を見たが，この二次的なタンパク分
解作用の低下は予期せぬものであり，ESTの効果が倍加することが期待される。反面，ライ
ソゾーム機能の変化が予測され，長期投与についてはその投与量，投与間隔など供重な対応が
望まれる。
文

献

1）石浦章一，埜中征歳，宮沢寛，中瀬浩史，高木昭夫，杉田秀夫：急性筋崩壊における E−64−Cの効果，厚生省新薬開発研究事業「微生物の二次代謝産物に由来する雉病治療薬（E−64）の開発研究」
昭和57年度研究報告書，193−199，1983．
129

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果
2）Nonaka，Ⅰ．，Takagi，A．，Ishiura，S．，Nakase，

H・andSugita，H．：Pathophysiologyofmuscle
負bernecrosisinducedby bupivacaine hydro・
Chloride，ActaNeuropathol，60，167−174，1983．
3）Isbiura，S・，Nonaka，Ⅰ．，Nakase，H．，Tsucbiya，

K・，Okada，S．and Sugita，H．：Immunocyto−
Chemicallocalization of cathepsin Bin de・
generatingrat skeletal muscleizlduced by alocalanesthetic，bupivacaine，J．Biochem．，94，
311−314，1983．

に対するべスタチソ投与の効果，厚生省新薬開発研究事業「徽生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプチソ）の開発研究」昭和58年度
報告．
8）勝沼信象 野田隆，磯貝和秀：カテプシソBによる筋蛋白分解の蛋白化学的ならびに形態学的研究，厚生省筋ジストロフィー江橋班，昭和55年度報告書，153−158．
9）Kominami，E．，Hashida，S．，Ⅹbairallab，E．

5）Ohkuma，S．，Moriyama，Y．andTakano，T．：

A．and Katunuma，N．：Sequestration of cyto・Plasmic enzymesin an autophagic vacuole−lysosomal systeminduced byinjection ofleupeptin，J．Biol．Chem．，258，6093−6100，1983．
10）Miyazawa，H．，Isbiura，S．，Yonemoto，K．，
Takagi，A．and Sugita．H．：Effectofhindlimb

Identi丘Cationandcharacterizationofaproton

immobilization on thelysosomal enzyme

pumponIysosomes by fhorescein−isothiocya−

activityin the rat skeletalmuscle．Biomed．

4）Ishiura，S・，Nonaka，Ⅰ．，Fujita，T．andSugita，

H．：Effect of cycloheximideadminiStrationon
bupivacaine−inducedacutemuscledegradation，
J・Biocbem．，94，1631−1636，1983．

nate−dextran幻uorescence，Proc．Natl．Acad．
Sci．，79，2758−2762，1982．

Res．，4，597−602，1983．
11）Ishiura，S．，Nonaka，Ⅰ．，NakaSe，H．，Tada，A．

6）佐野元乳萩原弘一，石浦章一，杉田秀夫：実and Sugita，H．：Two step mechanism of

験的クPPキンミオノミチ一。Rimmedvacuoleを伴うdisblmyopatbyとの閑適，厚生省筋ジスト
Pフィー三好班班会議（昭和58年度）．
7）埜中征歳，石浦章一：マーカインの筋崩壊過程

myo負brillar protein dcgradationin acute130

plasmocid−induced muscle necrosis，Biochim．
Biophys．Acta，798，332−342，1984．

16．高感度免疫転写法を用いた
血清中のα−アクチニンの検出

江

＊

子

即事

禎井

々

村松

野即

橋 節 郎＊＊

研究協力者 丸 山

はじめに
筋ジストロフィー患者に例えばESTを治療薬として用いた場合，その効果判定が問題になる。ジストロフィー症では細胞膜の透過性上
昇一破壊が進行し，外液Ca2＋が進入し，細胞内Ca2＋濃度がmMのオーダーになると細胞中m−CANPが活性化し筋原線経の破壊が起こると考えられる。この中でもZ帯は特に感受性強く，CANPの攻撃を受け，α−アクチニソが遊離してくる。α−アクチニソ自体はCANPに抵抗性があるので血清中に出たα一アクチニ
ソを測定出来れば，ジストロフィー症の進行状況について目安となる。しかし血清中のα−アクチニソ濃度は極度に低いのでその測定は困難であろう。まずα−アクチニソを高濃度に含むような分画を行い，さらに高感度法でα−アクチニソを捕えるようにしなければならない。
ESTの研究・応用がPhase2に入った段階

は結果に述べる。一部砂襲平滑筋からも抽出精製した。
硫安分画前に血清−α一アクチニソ混液を安定化するために50mMトリス塩酸緩衝液（pH7．4）になるように調製，DFP，PMSF，E−64−
CおよびEST，トラジP−ル，AF−2，アザイ
ドNa，DTTを適当量加えた。
SDSゲル電気泳動はLaemmlil）に従いミ
ニスラブを用いた。転写はミニスラブ用装置を用い0．45Jmニトロセルロース膜にTowbinの方法2）を一部変更して行った。
抗体はニワトリ胸筋より精製したα一アクチ
ニソを兎に注射してポリクローナル抗体として採取した血清を用いた。高感度免疫転写反応は片山らの方法に従って行った。一部市販のモノ
クローナル抗砂嚢α−アクチニソを用いた。これらの詳細は結果の部で述べる。
結果で班長より緊急要請があったので，当初計画を変更して上記の問題解決のため，以下の基礎実験を行った。濃縮分画として硫安分画を，高感

1．試料の作製
α−アクチニソはひき肉を高イオン強度でミ度法として免疫転写法を利用した。

で数時間抽出した。遠心上清を12〜18g／dl硫

実験方法
血清として新鮮ニワトリのものと，陳旧複数
患者血清を用いた。
α一アクチニソは鶏胸筋より精製した。詳細＊ 東京大学医学部第一薬理＊＊岡崎国立共同研究携帯生理学研究所

オシンを除いた後，低イオン強度，弱アルカリ
安分画を行い，沈連をlmM重曹に透析後，30，000廻転1時間遠心し上清をDEAE52カラ
ムにかけ30mM KCl，10mMトリス塩酸（pH7．4），100mM KClトリス，300mMKClト

リスでステップで流出させた。100mM XCl
で90〜92K，300mM KClで95Kの蛋白質が得られた。必要に応じてウルトロゲル34ゲル
131

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果
lday

PS

3d

lw

−

■

2W

−■

94K−
雪踏軒

Ph

魔

ヽ鯵

血

0α

血

Ph pb

鵬

IS

だ
ヽ

■

図1α−アクチエソの精製後SDS−PAGE上での変化
上段：α−アクチ三ソ（αA）とPhosphoryla＄e−b分画（ph）のSDS−PAGE，0αは粗標本，
下段：上段に相当する分画の免疫転写の免疫染色
IS・￣￣

S1

2

3

4

5

SO

αA

730mg（73mg／ml）＋αA50Qug

Am・S・ppt

く10g／d1

Ⅳ 2

S
S

〃 3

S

〃 4
〃 5

5
0
2

〉 30

5
4
2

25−30

9
4

20−25

56
6
4
1

15−20

5mg

S

10−15

〃 l

S

TotalProteins

Add・50mM Tris・HCl（pH7．4）
DFP，PMSF・E−64・C，EST Trasylol，Azide，AF・2＆DTT

S Chicken Serum＋N・aActinin
SI Human Serum＋N・aActinin
S

HumanSerum＋M−aActinin

図2 血清へのα−アクチニソ添加の説明図
上段：S標本の免疫転写，免疫染色 他は本文参照のこと
132

16．高感度免疫転写法を用いた血清中のα−アクチエソの検出

藤ECONDARY

Nitrocellulose

PRIMARYANTIBODY

Anti・aActinin（chicken skeletal→Rabbit）
M。n。Cl。nalAnti・αActinin（chicken gizzard→Mouse）

BIOTINYL・2ND
ANTIBODYORBIOTINYL・PROTEIN

Anti・RabbitIgG
Anti・mOuSeIgG

Horseradish謡霊a芸持
SOLID PHASE ANTIGEN

Blotted・SDS・PAGE

図3 高感度免疫転写法を説明する模式図
説明は本文参照のこと

炉過を500mMXClトリスで行った。図1に

1下段に免疫染色で示してあるが，α−アクチニ

みるように100mMKC1分画，300mMKC1

ソ分画はバンド数が増えていくが，Pbospho・

分画は単一ノミソドとして得られた（ldayPhrylase−b分画は全く染まっていない○このα一アクチニソをN−α−アクチニソと呼ぶ（野々村およびαA），3〜4日過ぎると300mM KC1
分画は高い易動度を示す／（ソドがSDS−PAGE
上で現われた（3dαA）。1週間以上たつとさによって調製されたもの）。

らに高い易動度の所に3つノミソドが現われた実験を行った。このために3種の実験を行っ（lw，2WαA）。別の実験により100mMKC1た。図2下段にあるようにニワトリ血清にN−
α−アクチニソを加えたもの（Sで標示する），人

分画はPhosphorylase−bを含んでおり，300
mMKCl分国が其のα−アクチニソであること

次に血清中にα一アクチニソを混ぜ濃縮する

間血清に∴N一α−アクチニソを加えたもの（S′），

がわかっているので何らかの原因でα−アクチ

別のα−アクチニソ（M−α−7クチニソと呼ぶ，

ニソはSDS，β一メルカプトエタノールでもほど丸山によって調製された）を人間血清に加えたもの（S′′）を用い，方法で書いたように処理しけない重合体が時間と共に出来たことになる。
例えば強いS−S結合体が出来たかとも考えられるのでSDS−PAGEに際してDTTを高濃度加えてみたが変化しなかった。このような変化が純化したα−アクチニソに生じたことは後述
する免疫転写法でも確かめられた。すなわち図た後，10g／dl，10−15g／dl，15−20g／dl，20−25
g／dl，25−30g／dlで硫安分画しそれぞれの沈法を50mMトリス（pH7．4）に溶解し，それぞれの蛋白濃度を測定した。図2にはS の例が示してある。すなわち73mg／ml濃度の血133

∵﹂■︸■

u叫u叫︺U可も滅S士uく

IS

Ph

Na

Ma

・︐⁚■tIⅢ 細胞・組織レベルでの効果

S′5

S′4S13■■一八S′2S′lWLWGWSK

PS−

u溝も＜寧苫＜︻空0−UOuO言Sl

図4 S′標本の免疫転写
上段：免疫転写，免疫染色中段：ニトロセルロース膜へ転写後蛋白染色
下段：市販モノクローナルα−アクチニソ抗体を用いた免疫転写，免疫染色

清10mlに50叫gのM−α−アクチニンを加用いて100mA1時間20分で，少なくとも95K

え硫安分画したものである0それぞれの分画を附近のバンドをすべて転写された。一部は通過

Sl′′，S2〝，…と呼んだ。

したかもしれないが，不明である。一応以下の実験はすべてこの方法に従った。

2．免疫転写法
図2上段にはSを用いた実験の免疫転写，免高感度法はすべて片山らの方法3）に従った。

疫染色の結果が示してある0明らかにS2分画

以下模式図で簡単に原理を説明する（図3）。

にのみα一アクチニンの存在が示されている。
この実験はNⅧ一アクチニン調製後直ぐ行ったのでバンドは一本である。

3〜5％アルブミンで転写ニトロセルロース膜（solidphaseantigenがバンドに分かれ吸着している）をブロックして，アルブミン下で抗次にニトロセルロースへの転写効率の実験を行った0結果は省略するが転写時の溶液中のメ

α￣アクチこソ血清でインキュベイトする。ノタノール濃度を5％に下げた条件で11％ゲルをロテインAで反応させる。洗条後ワサビベルオ

134

ニデットおよび緩衝液で洗条後，ビオチン化プ

16．高感度免疫転写法を用いた血清中のα−アクチニソの検出

biotinylated
Pro・A
●￣．一

■▲

曹嶋賢

鬱幣

一

ノ

WLWGWSK S；Sユ

S；S芸

Sも

Ga Ma Na Ph M

図5 S′′標本を用いた免疫転写，免疫染色
図4下段以外の免疫転写，免疫染色はすべてポリクローナルα−ア
クチニソ坑血清を用い，高感度片山法㌣を用いたキシダーゼ結合アピジンDで反応させ，洗粂後
チクロルー1−ナフトールと過酸化水素で発色

チニソ特異バンドの他に上に一つ，WGでは特異バンドをα−アクチニソの正しい位置に得でに図1，2で示した。

たが，WLでは異なった上の位置にバンドが現われていた。Pbosphorylase−b（Ph）は全く

3．血清「α−7クチニン混液のSDS−PAGI∃免疫転写

反応しなかった。中の蛋白染色でみてわかるよ

図4にS′を用いた実験結果を示す。この時

うに蛋白としてはわずかなα−アクチニソが良は全く同様に行った3つのSDS−PAGEを3つのニトロセロース膜に転写した後，上段は上く反応していることがわかる。下の市販モノク
ローナルα−アクチニソ抗体の結果は驚いたこ

述した方法で免疫反応させ免疫染色し，中段はとにWGとN−αの一部にわずか反応がα−ア

免疫反応せず，アミドブラックで蛋白染色し，クチニン位置に出ているに過ぎずPhで強く反下段は市販のモノクローナル抗体を用いて免疫応していた。この結果は重大であるが今回はこ反応・染色した。下の実験はこれ迄の方法と異なるので図3を用いて説明する。我々が作ったれだけにとどめておく。

ポリクロール抗体の代りに市販のモノクローナ

この場合，硫安分画前の混合原液SoHにも反ルα一アクチニソ抗体でインキュベイトし（IgM

応はなく，S2日ぉよびわずかにS3′′で反応がをもっている），ビオチソ化プロテインAの代出ていた。WL，WG，WSKは前と同様結果でりにビオチソ化抗マウスIgGで反応させ（こあるが，一部分解が始まっているように思われの抗マウスIgGはIgMと反応することがわる。濃度を薄くしたのでM−αでは単一バンド

かっている），以下前述した方法と同様に染色にみえ，新たに加えた砂嚢α−アクチニソ（Gα）

迄行った。

も良く反応しているが，分解が始まっているかさせる。このようにして行った実験の一部はすS′′を使って同様な実験を行った（図5）。

上の例ではS′系列はS2′のみが反応し，1にみえる。Pbや分子量マーカー（M，94K，

週間以上過ぎているので4本のバソドが出てい64K，42K，30K，20K，14K）は全く反応しる。別にN−αは上に，M−αは下にいくつかのていない。

バンドが出ている。M−αの下のバソドは古い

考

察

標本なので分解が始まっているのであろう。別に全骨格筋ホモジェネイト（WSK），全砂嚢ホα−アクチニソは低イオソ強度抽出，硫安分

モジェネイト（WG），全肝臓ホモジェネイト

画，超遠心，ステップのDE−52カルムクロマ（WL）についても行って，WSKではα−アクトグラフィーおよびゲル炉過を組み合わせて容135

Ⅲ 細胞・組織レベルでの効果

易に精製出来る。DE−52カルムでグラジィェ

Blue−Bで試みた。50mMトリス（pH7．4）

ソト法で溶出させるとPhosphorylose−bとα−アクチニソの分離が悪くなってしまうので気をで平衡化し，同上液に溶解した10−15g／dl硫
安分画を与え，同上液で洗粂する。次いで500つける必要がある。原因は不明であるが，α−ア

mMNaClトリスを与え，次いで1M NaSCN

クチニソは重合体が出来る可能性があり注意がで溶出させる。α一アクチニンは最初の50mM必要である。

トリスでほとんど完全に溶出した。アルブミン

Towbinの方法が導入されて以来免疫転写は500mMNaClでわずか，lM NaSCNで法は有用なことがわかっているが，螢光ラベル
は解像が悪いし，ヨードラベルーオートラジオ

ほとんど完全に溶出される。50mMトリス液を集め再度硫安分画かまたはPEG20，000など

グラフィーは手間がかかる。片山らによって導入された方法はプロテインAがIgGと良く反で濃縮すれば，多少手間を要するが効果的な標本を得られる。しかし実際に患者から得られる

応し，ビオチソーアピジンDという強い結合を血清はわずかなので硫安分画1回が出来れば可用いるので高感度に検出出来，感度ではヨードとしなければならないかもしれない。この免疫ラベルに勝るとも劣らない良い方法である。こ転写法は定量的とはいかないので存在が確認出の方法を用いて血清中に混じたα一アクチニソ

来たらサンドイッチ法などの定量法へもっていを硫安分画で分けたところS，S′，S′′共2分画くべきであろう。しかし本実験でみられたよう

すなわち10−15g／dlのところに集まった。わずに市販抗体を使う危険を考えると，解像力の良

かに15−20g／dlにも反応した。図2で10g／dl

いSDS−PAGEで分解能をあげα一アクチニソ

ではほとんど蛋白が沈澱しないので実際上はの存在をバンドで確認してから次のステップへ

18g／dl位で沈澱する分画を集めれば充分であ移るべきと考える。

ろう。血清中には膨大なアルブミンを含み，これは図4中をみてわかるようにほとんどの分画にきてしまう。今SDS−PAGEで沢山の試料を与えればα−アクチニソの検出は容易になる
筈であるが，アルブミンの混在がSDS−PAGEを妨害してしまう。
そこでアルブミンを除く方法を考えた。色素
リガソドクロマトグラフィ

136

ーをア

ミ

コソの

文

献

1）Laemmii，U∴K．：Nature，227，680−685．1970．
2）Towbin，lL，Staehelin，T．and Gordon，J．：
Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．76．4350−4354，1979．
3）Katayama，E．，Wakabayashi，T．，Reinach，F．，Masaki，T．and Fishman，D．A．：J．Bio・Cbem．，95，721−727，1984．

Ⅳ

個体レベルでの効果

17．ジストロフィーハムスターのカテプシソB＆Lに対するESTの効果………勝沼信彦

18．筋ジスハムスター（UM−Ⅹ7．1）の骨格筋に対するESTでの治療効果

・官武正………………・寺尾芳夫

20．ハムスター心筋症発生機序の解明およびその抑制に関する研究…………………柴田宜彦

21．ESTの肝薬物代謝酵素ならびにダルクチオソ関連酵素に対する影響…………北川晴雄

22．筋ジストロフィーハムスターにおけるESTの薬効に関する研究………………大関正弘

23．筋ジストロフィーマウスにおけるESTの効果に関する研究……………………大関正弘−lH−MRによる観察
19．筋ジストロフィーハムスターの移植筋の再生およびアミノ酸代謝に及ぼすESTの効果

17．ジストロフィーハムスターのカテブシンB＆L

に対するESTの効果

勝

沼

信

彦＊

研究協力者 木 南 英 紀＊ 板 東 祥 晃＊

はじめに筋ジスロフィーハムスターに対するESTの薬効の総合試験の中で，ESTの効果をみる一つの指標である骨格筋のカテプシソB＆Lの結果

1．ジストロフィーハムスター骨格筋におけるカテ
プシンB＆L活性のばらつき
筋ジストロフィー症では，羅患部は一様でな活性測定を分担した。同時にチオール性カテプ

く，不均一であることはよく知られているが，シソに対する内在性インヒビターを測定し，でカテプシソ活性もばらつきが大きい。その1例

きるだけ細胞内に近い状態で，ESTの効果をを図1に示す。正常およびジストロフィーハム

みる試みをした。

スターより大腿四頭筋，長指伸筋，ひらめ筋を
左右の脚より取り出し，筋ホモジネート中のカ

材料と方法

テプシソB＆L活性を測定した結果である。

本試験は，大関等との共同研究によるものである。使用した動物およびEST投与量等実験

正常ハムスターでは3つの筋におけるカテプシ
ソ活性に大きな差はなく，左右差もない。ジス

条件の詳細は後述される通り1）であり，EST投トロフィーハムスターでは，カテプシソ活性の与終了後採取した標本を用いて行った。大腿四上昇は認められるが，その値は大きく異なり，頭筋を4倍量のEDTAO．lmM，塩化カリウム

第1例の長指伸筋では左右で5倍以上の活性の20mM，トリス塩酸バッファーpH7・5，10mM開きがある。ESTの投与効果の判定の指標のを含む0．25M庶糖液でホモゲナイズし，10，000
×g，20分遠心後，その上清はチオールプロテ

1つとしてカテプシソの活性を測定する場合の大きな問題点である。できるだけこのばらつき

アーゼインヒビター（以下TPIと省略する）のを少なくするため，以下のESTの投与実験で測定に，沈澱分画は0．05M酢酸バッファーpH

は工夫がなされている。

5．0に懸濁し，元の量に合わせ，一度軽くホモ

2．筋ジストロフィーハムスターにおけるカテプシ
ンB＆L活性および内在性チオールプロテアー
ゼの活性上昇ゲナイズした後，カテプシソB＆L活性の測定に供した。カテプシソB＆L活性はZ−Phe−Arg−MCAを用いたKirschke＆Barrettの正常および筋ジストロフィーハムスターの大方法2）で，TPIは遠心上清をpH2．5で8001

腿四頭筋におけるカテプシソB＆L活性およ

分間熱処理後，中和し，その遠心上清を用いて木南らの方法3）で測定した。

びその内在性インヒビターわ活性の関連を図2に示す。正常動物の筋中のイソヒビターに比べ，ジストロフィー筋ではその活性が数倍上昇＊徳島大学医学部酵素研究施設酵素化学部門

しているが，ばらつきの幅は広くはない。一139

Ⅳ 個体レベルでの効果

D y s tro p h y
1

N o rm a l

2

3

■
O
▲

Q u a d ric ep s

︵茎SS叫小切＼nE︶J．臼u芯dj︶dU□ E D L△ S ole u s

O p en le ft
C lo s ed righ t

ロ

▲

■
0

［
］

0

■
△ ▲

●
O

A
●

□

△

●
O ● □ ■△▲

国1Cathepsin B，L Activitiesin Various Muscles ofDystropbic HamSterS方，ジストロフィー筋のカテプシソB＆L活

3．カテプシンB＆Lに対するESTの投与効果

性は正常筋の3倍から100倍く・らいまでの活性UM一Ⅹ7．1系ジストロフィーハムスター生後の上昇がみられ，インヒビターを上まわる活性

4週目より，ESTを4週間混餌投与された動の上昇と活性のばらつきの大きさが着日され物の大腿四頭筋のカテプシソB＆L活性を図3る。最近，我々はカテプシソBと内在性インヒに示す。雄と掛こ分けて，その活性を示した。

ビターに対する抗体を用いて，免疫組織を化学的にプロテアーゼとインヒビターの局在をジス

正常動物群に比べ，ジストロフィー対照群ではトロフィー筋について調べており，カテプシソ

らかである。10mg／kg／日および30mg／kg／

B，インヒビター共に筋細胞に浸潤してきた細日のEST投与では，雄，雌共，カテプシソ活胞，特に大型のマクロファージに局在すること

性を抑制する効果はなかった。300mg／kg／日

を証明している。とすれば，インヒビターを上のESTの投与で，カテプシソ活性の抑制の傾まわるカテプシソ活性の上昇は単に浸潤細胞の向が認められるが，ジストロフィー症における数だけでは説明できず，図2はそれに対する答

カテプシソ活性のばらつきが大きいため，統計

強いカテプシソ活性の上昇がみられることは明えを示唆している。 すなわち筋内へ浸潤してき的な検定を行うことができなかった。図4は内たマクロファージではインヒビターを上まわる在性チオールプロテアーゼインヒビターに対す

カテプシソ活性を有する可能性がある。その実

るESTの投与効果を示している。正常動物群

証は今後の課題である。

に比べ，ジストロフィー群では約3倍の活性上

140

17．ジストロフィーハムスターのカテプシソB＆Lに対するESTの効果

500

1000

＞TPIactivity（mU／gtissue）
図21nterrelationofCathepsins andTPIContentsinNormal
and Dystropbic Muscles141

Ⅳ 個体レベルでの効果

3 00m g／k g／d ay

N o rm al

30m g ／kg／day

10m g／kg ／da y

8

○

O

C o ntro l

● EST
〇

O

〇
●

（
X）

○

○

○

〇

●

●

●
●

0

●

0

0

●
●

♂

′

≡

；

○

●

○

●

。

‡

蒜

ヽ

○

●

豊i §… 邑i 登を

管

・

ぁ

●

′

（10）（9 ）
重 曹

●

（
12）
（
11） （5）（5） （6）
（8） （
11）
（9） （
10）
（
11） （
12）
（
11）
よ
♀
よ
千
よ
♀
○

EZ）3

●

EffectofESTonCathepsin B．LActivitiesinDystrophic

Muscle（UM−Ⅹ7．1Hamsters）

昇が認められるが，ESTの投与はインヒビタ（図2）の模作の一端を調べる目的で，ラット

ーのレベルには全く影響を与えていない。

の腹腔内マクロファージをカゼイネイト投与動考察

骨格筋はリソゾームのカテプシソ■B＆L活

物と無処理動物から調製し，その中のカテプシ
ソBおよびHと内在性インヒビター量を測定した。炎症性マクロファージ（カゼイネイト処性は肝臓の1／70〜1／80で非常に弱い。骨格筋の内在性チオールプロテアーゼインヒビターのレ理）は対照マクロファージに比べ，インヒビタ

ベルはカテプシソBあるいはHに相当する量が存在することを酵素免疫測定法で確認してい増えているという結果が得られた。このことがジストロフィー筋に浸潤してきたマクロファー

る。骨格筋におけるカテプシソ活性上昇の枚作

ジでも起こっている可能性が高いと考えていには2種，すなわち骨格筋中のカテプシソ活性る。

ー量には変化がないが，カテプシソ量は著しくが上昇する場合と非筋細胞の浸潤によってみかカテプシソ■B＆Lに対するESTの投与効

け上骨格筋のプロテアーゼの活性が上昇する場

果をみるにあたり，できるだけ値のばらつきを合があり，ジストロフィー症は後者であること減らすため，例数を増やすことおよび同胞の動を我々は明らかにしている。

物を用い個体差を減らすという工夫が今回なさ

ジストロフィー症ハムスターにおける内在性れた。しかし，結果はそれでもなお，ジストロ

インヒビターを上まわるカテプシソ活性の上昇

フィー筋におけるカテプシソB＆L活性にばら142

17．ジストロフィーハムスターのカテプシソB＆Lに対するESTの効果

N o rm al

3 00m g／kg／day
（○
3 ）（2
●）

（6 ）（8 ）（11）（9 ）（10 ）（1 1）（12）（11）

i
0
0
4
0
0
3
0
0
2

︵宣SS叫︺u＼⊃∈︶J〇一讃JulUS雲芯l︒Jd l︒コ↑（12）（11 ）10m g／kg ／da y

3 0m g／kg／d ay（
10）（9 ）
王

OC
o
n
t
r
o
l
●
EST

王

0
0
1

占
図4

守

A

ム

宇

♀

Effect of EST on ThioIProteinaseInhibitorin Dystrophic
Muscle（UM−Ⅹ7．1HaⅡlSterS）

つきが大きく，EST300mg／kg／日の投与で効果がある印象を得ただけであり，昨年度も 300
mg／kg／日でのみ有効という結果と一致してい文

献1）大関正弘：筋ジストロフィーハムスターにおける。薬物の効果が十分でない1つの大きな原因

るESTの薬効に関する研究，厚生省新薬開発研究は薫物の筋肉内濃度が低い可能性が考えられる。

事業「徽生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬

ジストロフィー症では骨格筋細胞にマクロファ（E−64）の開発研究」，昭和58年度研究報告書，1984．

ージなどの浸潤細胞がくい込んでいるような像

2）Barrett，A．J．and Kirschke，H・：Cathepsin
B，Cathepsin H，and Cathcpsin L，Methodsが観察されるが，E−64−CがカテプシソB＆Lを抑制するためには投与されたESTが，筋細胞中のマクロファージのリソゾームへ効率よくEnzymo1．，80，535，1981．
3）Kominami，E．，Wakamatsu，N・andKatunu・
ma，N．：Puri丘cation and Characterizaion of

入る必要がある。300mg／kg／日のESTの投与

ThioI ProteinaseInhibitorfrom Rat Liver，J．

では正常運動筋レベルまでカテプシソ活性を完

Biol．Cbem．，257，14648，1982．

全に抑制する効果はなく，やはり，マクロファージのリソゾームへは十分な濃度に達してないと想像される。
薬物の筋内の濃度に内在性インヒビターが影響する可能性はプロテアーゼとインヒビターの細胞性局在性が異なること，ジストロフィー症
ではインヒビターを上まわるカテプシソが存在することなどから少ないと思われる。
143

18．筋ジスハムスター（UM−Ⅹ7．1）の骨格筋に対する
ESTでの治療効果−1H−NMRによる観察

官

武

正＊

研究協力者 桑 原 武 夫＊ 湯 浅 龍 彦＊＊

はじめに週の時点，およびその5週間後の2つの時点で行った。

崩壊あるいは変性過程にある骨格筋に対する

NMRspectrometerはJNMGX270を使ESTの効果を確認する方法として生化学的，病理学的，あるいは生理学的各方面からのアプ

用し，サーフェイスコイル（平均直径8mm）をハムスターの下腿屈側に接触させ，これをローチがなされているが，lH−NMRを利用し，6．4Tesla

飯が血0にて生化学的情報を得る方法もその一ての研究としてはCIlangら2）の筋ジスチキン

中心に静置した（図1）。
共鳴周波数は269．70MHzで，Saturation
recoveryInethod4）を用い，10個のFreein−
ductiondecay（FID）を得（図2），各々のFIDのpeakintensityの減衰曲線より非線形最小二乗法にて計算を行いTl時間を求めでの例，さらに，著者ら3）の筋ジスハムスター

た5）。

（BIO）での例がある。

測定時温度は室温で行い，麻酔はベントパル
ビタール35mg／kgの腹腔内投与によった。

つである。
今日までにIH−NMRを筋ジストロフィー症に応用した例としては，ヒトではNewmanら1）の例があり，また，prOtOnTl時間を指標とし本報告書ではprotonTl時間を指標として
ESTが筋ジストロフィー症骨格筋に及ぼす影響について観察を行った途中経過について報告のSuperCOnducting magnet

結

の

果

EST投与経過のprOtOn Tl時間の推移を

する。
材料と方法
材料は筋ジスハムスター（UM−Ⅹ7．1）17匹
ならびに正常コントロール5匹である。
筋ジスハムスター（UM−Ⅹ7・1）は生後4遇
よりEST O．0375％を基本飼料に混入し授与したもの（N＝8）と同時に生まれた非投与群（N＝9）とに分けた。
NMRでの測定はEST投与後4遇ないし5＊ 新潟大学脳研究所神経内科＊＊国立小千谷療養所神経内科

図3に示す。
EST投与後4ないし5週の筋ジスハムスターのprOtOnTl時間は1．72土0．13（mean土SD）秒であるのに対し，同一遇令の非投与群
では1．64土0．06秒，さらに，同一週令の正常コ
ントロールでは1．67土0．06秒であり，これら3群間に統計的に有意の差は認められなかった。
EST投与後9ないし10遇では投与群では1．81土0．12秒，非投与群では1．80土0．11秒であった。両者に有意の差は認められなかった○
測定2点間，すなわち5週間におけるproton
Tl時間の変化率を投与群と非投与群で比較し145

Ⅳ 個体レベルでの効果

Superconductingmagnet

図1Diagram of experimentalsystcm

図2

Samplesofproton signals，Showingthe methodofaquiringprotonTltime
by saturation recovery method．

146

18．筋ジスハムスター（UM−Ⅹ7・1）の骨格筋に対するESTでの治療効果−lH−NMRによる観察
NO

TREATMENTEST

TREATED（0．0375％p．0．）

N＝9

N＝8

7・8

12・13

7・8

12・13
weeks afterbirtll（4・5）（9−10）（4・5）（9−10）（weeksoftreatment）

図3

Changesofproton Tltimefromhind・legmuscleofEST−
administrated（right）and non・administrated（left）dys・．trophichamster・Thosefrom7weeks−01d−nOrmalcontrol
are shownin between．

たものを図4に示す。
EST投与群では0．019土0．037秒／遇であるのに対し，非投与群では0．035土0．027秒／遇と投与群でprotOn Tl時間の延長がやや鈍化する傾向が見られた。しかしながら，これら2群間に統計的に有意の差は認められなかった。
考案

IH−NMRは周知の如く水素原子核（lH＝proton）の生体内での存在状態を反映するものであり，著者らが今回検討の指標としたpro−
tonTl時間は組粒中の自由水（非結合水）の多寡により影響を受ける。すなわち，蛋白質の如き細胞構成高分子化合物の状態の変化を反映するものとされている6）。
このprOtOnTl時間は著者ら7）が報告した如く，骨格筋の成熟に伴って指数閑数的に短縮してくることが知られている0147

Ⅳ 個体レベルでの効果

NON・TREATED ESTTREATED

今回の観察期間中にはESTの効果を統計学的に有意の差として確認することはできなかった。しかしながら，今回の実験では例数も限られ，観察期間も短く，結論づけることはできな
いと思われる。
本報告で示した方法は，従来の生検筋を使った報告と異なり，玩血加での報告であり他に煩を見ないものである。
本方法では，動物を殺すことなく，同一個体で薬物の効果を追跡できるという点で極めて有意義な方法と考えられ，今後，さらに多くの症
例で長期の観察を行う予定である。
文

献1）Newman，R．J・，Bore，P．J．，Chan，L，Gadiazl，
D．G．，Styles，P．，Taylor，D．and Radda，G．X．：
NuclearmagneticresonancestudiesofforearmmuscleinDuchenne dystrophy，Brit．Med．J．，
284（6322），1072−1074，1982．

2）Chang，I）・C・，Misra，L．X．．Beall，P．T．，
Fanguy，R．C．and Hazlewood，C．F．：Nuclear
magnetic resonance studies of muscle water
protonsin dystrophy of chickens，J．Cell．
Pbysio1．，107，139−145，1981．

図4

Changes of proton TL time during5
Weeks． Those of EST・treated cases

3）桑原武夫，湯浅龍彦，官武正：核磁気共鳴法に

are shown on theright and those ofー症の発症撥序に関する臨床的研究」三好班，昭non−treated cases are shown on the

和57年度研究報告書，214−217，1983．
4）Jeffrey，L．E．and Ackerman，J．JH．：NMR

left．

よる筋ジストロフィー症の研究，「筋ジストロフィ

Tl meaSurementin homogenous Blwith

現在までのところ，著者らが知り得た限りでは，筋ジストロフィー症の骨格筋においてpro・Surface coils，J．Magn．Reson．，53，52−64，1983．
5）Boden，N．：Detection of organic structures

tonTl時間の推移を経時的に観察した報告はby physical methods，Chapter2，Pulsed NMR

認められない。

methods，4，51，1971，Academic Press New
York and London．

Changら2）の生後1年の筋ジスチキン大胸6）Hazlewood，C．F．，Chang，D．C．，NichoIs，B．

筋での報告，さらに著者ら3）の生後100日の筋

L and Woessner，D．E．：Nuclear magnetic

ジスハムスター餅腹筋での報告より，筋ジスト

resonance transverse relaxation times of

ロフィー症骨格筋は健常骨格筋に比べるとpro−
ton Tl時間が延長していることが知られていWater PrOtOnSin skeletal muscle，Biophys．J．，

る。
ESTでの治療効果はこの延長するproton
T1時間が正常の骨格筋の成熟のパターンに，より近づくことで判定できると推察される。

148

14，583−606，1974．

7）湯浅龍彦，桑原武夫，官武正：核磁気共鳴法による骨格筋の発達に関する研究．NMR医学2（1）．
49−54，1982．

19．筋ジストロフィーハムスターの移植筋の再生
およびアミノ酸代謝に及ぼすESTの効果

寺 尾 寿 夫＊
研究協力者 増 野 和 子＊ 高 津 成 美＊て集め，スルホサリチル酸で除蛋白後アミノ酸

研究目的

自動分析機で測定した。また尿中へのクレアチ

1．骨格筋を生体に移植した場合，移植された筋は変性崩壊し除去されるが，それと共にSatellite cellの活性化が起こりニソはCreatinineset（マトロソ）を用いて測定した。

myotubeの結果と考察形成を経て新たな筋線経が完成される。この筋の再生過程に及ぼすESTの効果を検討した。

1．移植筋の再生に対するESでの効果

2．ハムスターの尿中に排泄される遊離アミ移植後2ヶ月目にとり出した移植筋では，図ノ酸，特に筋蛋白質の崩壊の目安となる3−メ1に示す様に中心核を持つ再生筋線経が全体にチルヒスチジソについてESTの効果を検討し分布していた。
BIO14．6ハムスターのEDLをBIO14．6ハ

た。
材料と方法
1．移植手術および再生筋の測定
生後約2ヶ月の筋ジストロフィーハムスター（BIO14．6）およびコントロールハムスターを用い，長指伸筋（EDL）の移植手術を行った。
移植後2ヶ月目に移植した筋肉をとり出し再生
筋線経の数，直径および移植筋の湿重量を測定
し，移植筋の再生の良否を比較するパラメーターとした。なお移植の方法，再生筋線経の数，
直径の測定方法については57年度報告書に記載した方法を用いた1）。
ESTは移植後2ヶ月間混餌（0．125％含有）で飼育することにより投与した。対照群はESTを含まない同一飼料で飼育した。
2．尿中の遊離アミノ酸の測定
ハムスターの24時間尿を採尿ケージを使用しムスターに移植した場合（dys．→dys．），EST
を混和こより投与した群は対照群に比べ再生筋の数（図2a）），平均直径（図2b））および移植筋の湿重量（図2C））が低い傾向がみられたがいずれも統計学上有意な差はなかったoBIOFIBハムスターのEDLをBIOFIBハムスタ，に移植した場合（cont．→COnt・）も図2に示した通りdys．→dys．の場合と同様の傾向を得たが，いずれも有意な差ではなかった。
ハムスターのEDLを移植した場合，移植前
は2〜4日目で外側から内側に向い，Originalの筋線経の変性，崩壊が始まり除去された後，活発な筋線経の再生が起こり，10〜14日目には移植筋全体が新しい再生筋線経におき変わる。
originalの筋線経の変性，崩壊，除去がその後の筋再生に極めて重要と思われる。ESTは筋線経の変性，崩壊，除去の過程を遅延させて＊帝京大医学部第1内科いる可能性が当然考えられる。その結果として
149

Ⅳ 個体レベルでの効果

図1移植後2ヶ月目の再生筋b）Diameter

C）Wet weightdys．→dys．cont．一→cont．

dys．一→dys．cont．→cont．

dys．→dys．cont．→cont．
●

T
⊥
T
T
l

口 八 丁 A Y T A

I・丁！十1ユ・

40⁚︵些E︶一忘だ妄＼芯≧

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J

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L
U

a）Number

0

0

0．125

0

EST（％）

図2

150

0．125

0

0．125

0

EST（％）

0．125

00．12500．125

EST（％）

TheeffectofESTonregeneratedmuSClefiber2monthsaftertransplantation．

19．筋ジストロフィーハムスターの移植筋の再生およびアミノ酸代謝に及ぼすESTの効果＊＊＊p＜0．05

図3

・：・p＜0．01

Urinaryfreeaminoacidlevelsofdystrophichamster・

EST投与群ではそれに続く再生過程も遅れ，再生筋の数，平均直径，湿重量に対しても抑制的な効果が表われたとも考えられる。再生筋のた。
BIO14．6ハムスターにESTを生後2ヶ月

数と平均直径は移植後4ヶ月後までは徐々に増加する事から，初期段階での遅れがその後の再100mg／kg／dayに相当）により投与すると，生を遅らせていると想像されこの点も含めてさらに長期の投与期間につき観察を続ける予定である。
2．尿中の遊離7ミノ酸

オニソ，セリン，アスパラギソ，グリシン・テ

生後約2ヶ月日のBIO14・6およびBIOFIB
ハムスターの尿中へ排泄される遊離アミノ酸を比較した結果，BIO14．6ハムスターには部分

より強く軽減された。

的アミノ酸尿がみられることを昨年に引続き症
例数を増し確認した（図3）。有意に排泄増加のみられたアミノ酸は3−メチルヒスチジン，
β一アラニソ，ロイシン，リジンでありその他タ
ウリン，グルタミソ，グリシンなども排泄増加傾向を示した。
昨年はBIO14．6ハムスターにESTを2週間経口投与（100mg／kg／day）すると尿中排泄量が減少するアミノ酸が目立ち，部分的アミノ酸尿は軽減される傾向をみいだしたので，ESTをさらに長期間授与した場合の影響を検討し日から2ヶ月に∴bたり泥餌（0．125％含有，2週間投与の場合と比べて図4に示す如くスレ
ロシソ，β−アラニソ，トおよび3−メチルヒス
チジン，アルギニソなどさらに多くのアミノ酸の排泄量が有意に減少し，部分的アミノ酸尿は
図5ではBIOFIBハムスターにESTを同様に2ヶ月間投与した結果を示した。BIOFIB
ハムスターでもやはりESTにより尿中排泄が低下するアミノ酸が多かったが，有意に減少したアミノ酸はBIO14．6ハムスターでは12種であったのに対し，BIOFIBハムスターでは6種と少なく，ESTの効果はBIO14・6ハムス
ターにより強く現われたと言える0
生後約4ヶ月のUM−Ⅹ7・1ハムスターとGoldenハムスターの尿中に排泄されるアミノ酸を図6に示した。UM−Ⅹ7・1ハムスターでは多くのアミノ酸の排泄量がGoldenハムスク￣
より低い値を示したが，体重あたりの排泄量を151

Ⅳ 個体レベルでの効果

●

■

●

●

＝＊p＜0．05

図4

●●●

●●●

‥p＜0．01

●

●

●

●

●●

●

・p＜0．001

TheefEectofESTon freeaminoacidsinurineofdystrophichamster．

日暮p＜0．05

・：＊p＜0．01

図5 The effect of EST on free amino acidsin urine of control hamster．

152

19．筋ジストロフィーハムスターの移植筋の再生およびアミノ酸代謝に及ぼすESTの効果

ヰ＊＊

＊

＊

＊

＊

＊＊＊

＊＊＊p＜0．05

図6＊筆書日p＜0．01

■

＝

■＊

■

＊p＜0．001

Urinaryfreeaminoacidlevelsofdystrophichamster（UM−Ⅹ7・1）

表1TheeHectofESTonurinaryexcretionof3−Methylhistidine・

BIO

FIB

BIO14．6
Golden
UM一Ⅹ7．1

EST

3−Mebis（％）（〃mOle／24br）

3−Mebig（〟mOle／24br）

O l．4土0．5
0．125
0．9士0．40
2．0土0．5
0．125
1．0土0．2
O l．1土0．2
0

0．7士0．2

creatinine（mg／24br）
0．5土0．2
0．3土0．1
1．1士0．5
0．4土0．1
0．3土0．1
0．3土0．1

考えれば両者の問には大きな差はないと考えら

蓑1に示した通りBIO14．6′、ムスターは他れる。またGoldenハムスターとBIOFIBハの3種のハムスターに比べ，クレアチニソ1mg
あたりの3−メチルヒスチジンの排泄が著しくムスターの間にも差はなかった。
EST投与によりみられたアミノ酸排泄の変高い値を示した。またこれはESTの2ヶ月間

化は筋肉や肝でのアミノ酸代謝に及ぼすESTの影響を示すと考えられる。

投与により有意に減少した。この結果はBIO
14．6ハムスターでは他の3種のハムスターに

3．3一メチルヒスチジンの尿中排泄量の変化
3−メチルヒスチジンはミオシン，アクチンに比べ筋蛋白質の崩壊が冗進しているが，ESTを2ヶ月間投与する事により筋蛋白質の崩壊が抑えられたためと考えられる0
またUM−Ⅹ7．1ハムスターでは筋蛋白質の崩
壊はそれほど冗進していないことを示していると思われる。

含まれ，これらの蛋白質の分解後再利用されることがないアミノ酸であるため筋蛋白質の崩壊量を表わす良い指標であると考えられている2・3）。

153

Ⅳ 個体レベルでの効果

結

語

参考文献

1．移植筋の再生筋線経の数，平均直径，湿1）寺尾寿夫，増野和子，大沢仲昭：移植筋の再生

重量はEST2ヶ月間経口投与によりいずれもならびにアミノ酸代謝に対するE−64の効見厚生省新薬開発研究事業「微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和57年
度研究報告書，201，1983．
2）Ballard，F・J・，Tomas，F．M．and Stern，L．
M．：Increased turnover of muscle contractile

減少する傾向がみられたが有意ではなかった。
2．BIO14・6ハムスターの部分的アミノ酸
尿はEST投与により顕著に減少した。特に3−メチルヒスチジン排泄はEST投与により有意に減少した。これはBIO14．6ハムスターで克進している筋蛋白質の崩壊が，ESTにより抑制されたことを示唆している。
3．UM−Ⅹ7．1ではコン1トロールに比し，尿中アミノ酸の排泄増加は明らかでなかった。

154

PrOteinin Duchenne muscular dystrophy asassessed by3−Methylhistidine and creatinine
excretion，Clin．Sci．，56，347，1979．
3）Mckeran，R．0．，Halliday，D．，Purkiss，P．and
Royston，P．：3−Methylhistidine excretion as
anindexofmyofibrillarproteincatabolismin
neuromuscular diSeaSe，J．Neurol．Neuro−
Surgery Psychiat．，42，536，1979．

20．ハムスター心筋症発生機序の解明およびその抑制に関する研究

柴

田

宜

彦＊

研究協力者 和 田日

的昨年，私共はヒトの特発性心筋症に類似した心病変や，筋ジストロフィー症に似た骨格筋病
変を示すシリヤ系ゴールドハムスターにCa2＋
依存性プロテアーゼ阻害剤であるESTを授与
した成績の一部を報告した。すなわち，ミニポ
ソプ皮下埋没法（75mg／kg／日，4週間）では心組織内のCa含量は，対照群に比し明らかに低値を示したが，経口的に自由に摂取される混餌法（4遇投与および8週投与）では上記の方法ほど明らかに対照群との間に差がある傾向はつかみえず，わずかに4週間投与実験でややEST投与群が低値を示すのみであった。特に8週間投与群では，対照との間に全く差がみられなかった。今年度は混餌法で8週間投与実験を繰り返し，その成績を確かめることを一つの目的とした。次いでEST連続投与が寿命に与える影響を観察すると共に，数世代にわたる連続投与も行って，EST投与が与える心筋の変化について観察した。心筋変化の指標としては
前回同様，心組織内Ca含量と組織学的な石灰沈着巣の程度をとりあげた。
一方，私共は，遺伝的に心筋病変をもつハム
スターBIOの心筋構造蛋白ではSDS・尿素処
理後のポリアクリルアミドゲル電気泳動図（PAGE）で，部分的ではあるがミオシン重鎮＊ 大阪府立成人病セソター第一内科＊＊大阪府立成人病セソクー病理

昭＊＊（My−H）に崩壊像を見た。そして，その像は健常ハムスター心筋の筋原線経に，心筋から抽出されたCa2＋依存性中性プロテアーゼ（CANP）
を5mMCaC12存在下で反応させた時の構造蛋白変化に酷似している事を報告した。また，心病変を有するハムスター心筋ではCa2十含量の多いことも明らかにされた。これらはハムス
ター心筋症の成因の一つに心筋CANPの活性化の関与を推測させる。しかし，心筋には当然ながらCANP阻害因子が内在するので，心筋症心筋における本田子の動態が問題となる。そこで今回は，心筋症ハムスターと健常ハムスターの心筋につき，心筋ホモジネートの上清分画に含有されるCANP阻害田子活性につき比較検討した。
実験材料と方法
1．EST投与実験
UM−Ⅹ7．1′、ムスターを用い，同腹仔を二群に等分し，一群にはEST混入固形飼料の経口投与を行い，他方は非投与群として普通固形飼料を投与した。実験方法は次の通りである。
（1）8週間投与実験
生後16日目のハムスターに投与を開始し，8週間連続投与を行った。実験は繰り返し7回行った。EST投与量は100mg／kg体重／日で対照群を含めて用いた動物数は48匹であった。
（2）一代長期投与東験
生後20日目より投与を開始し，動物が死ぬまで連続投与して，投与群と非投与群の生存日数155Ⅳ 個体レベルでの効果
heart muscles＋10vol．of5mM THB（pH7．4）
50mM NaC13mMβ・ME
4mM EDTA⊥ ▼ 叩 ⊥ J は l 岨ctt．27×1。3×g，。。min．

P・（pHadjustto7・4）
llysis against

D

5mM THB（pH7．4）
10mM NaC13mMβ・ME
O．1mM EDTA

AE52Sephacel column chromatography（よ。。i。nt， 0．1・0．6M NaCl）
A）

CANP fraction］

Linhibitor fraction］
dialysis against

J

50mM THB（pH7．4）
10mM NaC13mMβ−ME
O．1mM EDTA44）2

SO4 fract．（25・60％）

diA1ysIS

DEAE52Cellulofine
COlumn chromatography

gr†川

︵

adient，0．1−0．6M NaCl）

sとha≡ryl

5mM THB（pH7．4）
50mM NaC13mMβ・ME
O．1mM EDTA
S・200gel filtration︵

H4）2SO4 fract．（25・60％）dた云l；

5mM THB（pH7．4）
50mM NaC13mMβ・ME
O．1mM EDTA

phacryl S・200gel filtration
図1ハムスター心筋からのCANP阻害田子およびCANPの粗分画の調整を比較した。投与量は，100mg／kg体重／日 であり，実験に用いた動物数は28匹であった。
（3）数世代連続投与実験群
兄妹交配による妊娠ハムスターを二分し，妊娠10日日頃より，一群にはEST混餌食を他方には普通食を与え，世代を重ねても投与群の子
孫にはESTを，非投与群の子孫には普通食を連続投与し，それぞれの世代ごとの心変化を観156

察し比較検討した。投与量は100mg／kg体重／日 と30mg／kg体重／日 であった。
各実験群共，屠殺したハムスターの心臓の半分は，組織内Caの定量に，他の半分は組織学的な検索に供した。組織学的には，石灰沈着の程度を0，1，2，3度とし，それぞれに0から3までのスコアを与え，動物数で割った平均値をもって，それぞれの群の石灰沈着度（grade）

20．ハムスター心筋症発生按序の解明およびその抑制に関する研究とした。また，妊娠歴のある雌ハムスターはす

ベて検索対象から除外した。
2．心筋CANP阻害因子の検討（1）ハムスター心筋からのCANP阻害因子（Inbib．）粗分国の調整（図1）
健常および心筋症ハムスター，それぞれの心臓を約80個ほど集め，心室筋のみを材料とし，

り

′

＼

＜〝g／g tissue＞□ESTト）
匡ヨEST（＋）
ト一一一S．E．

湿重量15gから図1に従い調整した。すなわ
ち心筋ホモジネートの遠心上清をまずDEAE
52Sephacelカラムクロマトにかけ，0・1〜

0．6M NaClでelute，0．30〜0．40M分画に
CANP阻害因子成分を，0．45〜0．5M分画にCANP活性成分を得た。CANP阻害因子成分
は，再度DEAECellulofineでカラムクロ■マトを行い，0．3〜0．4MNaC1分画に本成分を回収後，硫安処理し，25〜60％分画を得，SephacrylS−200カラムでゲル炉過を行い部分精製されたCANP阻害因子を得た。
（2）CANP活性とCANP阻害活性測定法
CANP活性は変性カゼインを基質にCANP
含有原品を加え，5mMCaC12添加で反応開始，一定時間後TCAで反応を止め，遠心し，上清のOD280nmでの吸光度で測定した。心筋CANPの調整は図1の如く心筋を処理，最後にSephacrylS−200によりゲル炉過を行い，部分精製標品として得た（図3分画50〜60）。
CANP阻害活性は，上述の如く得た一定のtriallst

図2

2nd

3rd

4th

5th

6th

7th

Calcium contentin the heart−Cl10W，100mg／kg／day，8wks−

grade
3．0

⊂コEST（−）
国EST（＋）
ト一一S．E．

CANP標品にCANP阻害田子成分を加え，変性カゼイン存在下に5mMCaC12添加で反応を始め，反応系のCANP活性を測定，CANP
阻害成分無添加の値を100％として表示した。
成績

1．EST投与実験（1）8週間投与実験
この実験は，7回繰り返し行った。心組織内
Ca量は，投与群と非投与群の間には一定の傾向を示す成績が認められなかった。組織学的な
石灰沈着巣はすべてEST投与群の方にかえって病変が強い傾向が認められた（図2，3）。
（2）一代長期投与実験
生存日数は，EST投与群においてわずかに

］

］

］

］

］

］

］

tria11st

2nd

3rd

4th

5th

6th

7th

図3

Grade ofcalci丘cationin the heart
一七bow，100mg／kg／day，8wks一

長期間生存する傾向がうかがわれたが，統計学的に有意差はなかった（図4）。
（3）数世代連続投与実験
世代を通じて長期間観察する実験は現在第3代目（F3）まで観察中である。心筋内Ca量は，
157

Ⅳ 個体レベルでの効果

0130

150
図4

230daysSurvivalof experimentaland controlanimals

100mg／kg体重／日投与群ではFl，F2，F3とも投与群においてわずかに高かったが，30mg／
kg体重／日投与群では，はっきりした煩向がみられなかった。しかし，両投与群とも差はF3においてFl，F2 より軽度である傾向がうかがわれた。組織学的な石灰沈着巣の程度は100mg／kg体重／日，30mg／kg体重／日投与群共，Fl，F2は投与群に高度であったが，F3では投与群の方が軽度であった（図5，6．7，8）。
2．心筋CANP阻害田子の検討（1）心筋CANP活性
前述の方法により健常および心筋症ハムスタ，の心筋のCANPを抽出し，SephacrylS−
200によりゲル炉過されたCANP標品の活性パターンは図9，10に示す如くである。すなわ
ち，両群とも活性分画はFr．50〜60前後に得られた。病的心，健常心それぞれのCANP精製過程におけるピーク活性を示す分画の0．1％
SDS−10％PAGEは図11（左）の如くである。
かなり不純であるが，病的心の場合，Sephacryl
S−200ゲル炉過後のものではかなり精製され，分子量約13万のべブタイドバンドが，略単一的にみられた（回申5）。正常心でも，病的心と同様の処理で得られた最終標晶で，病的心のもの
158

200

と同様，分子量約13万のペブタイドバンドが主成分である事を示したが，少量のより高分子のペブタイドバンドもみられた（国中8）。イヌ
健常心筋を同様に処理して得たm−CANP（回申1）およびハムスター心筋から得たCANP
活性標品はPAGE上，略同様の像を示したので，ハムスターのCANP標品はm−CANPと思われ，種差に無関係に略同等の分子量を示す
ものと思われる。ともあれ，この程度の純度をもつCANP標品が，心筋15g当り健常心で約6mg，病的心で約7．5mg得られ，心筋15g当りの総活性では両群間に有意の差を認め得なかった。
（2）心筋CANP阻害因子活性
健常および心筋症ハムスターの心筋ホモジネ
ートからのCANP阻害因子の精製各過程におけるピーク括性分画の0．1％SDS−10％PAGE
は図11（右）の如くである。純化最終過程のSephacrylS−200 のゲル炉過で得られた
CNPA阻害田子の遠出パターンは，図12（健常心），図13（病的心）の如くで，阻害活性を示
す分画は健常心ではFr．40〜70，病的心でFr．40〜60であった。各分画の阻害活性は健常
心の方が病的心に比し大であり，各分画の比活20．ハムスター心筋症発生機序の解明およびその抑制に関する研究
Ca＜〝g／g tissue＞

Ca＜〃g／g tissue＞

一十

︶

E
S

T＝個憎週内T掴一h

毒 舌 菩 匹 ⁚ーーー帽一h図6︶

E

S

Calcium contentin theheart

ST ST且

コ団Ⅰ

E

H⁝

E

ST ST且口団lI闘憎順通す凋順憎過図5

Calciumcontentintheheart−Cbow，30mg／kg／day，Fl→F3−

一一Cbow，100mg／kg／day，Fl→F3−

grade

匠≡ヨEST（＋）
l−→S．Eこ

一Fl

︑0

■

ー
項
⁚
・
⁚
小
過
．
一
︒
−
−

T国N⁝帽ⅧⅧⅧ通す−凋憎Ⅷ相川週Fl［：コEST（一）

l

F3

図7

Grade of calcificationin the heartlCbow，100mg／kg／day，Fl→Fl−

性も健常心のものが大であった。ともあれ，図11（右）にみるように，精製過程の進行につれ純化が進み，健常心では，Sephacryl S−200
ゲル炉過後のもので分子量約30万のべブタイド
バンドが主成分となり，これに少量の分子量約13万のベブタイドの混在する標晶が得られた。

図8

Gradeofcalci丘cationinthe heart
一TCbow，30mg／kg／day，Fl一→Fl−

病的心では，健常心と同一処理によっても本田子の純化は健常心のもの程進まず，健常心の標品でみられたバソド以外に数ノミソドの混在が認められた。この精製化の程度，つまり難易が両群間における本田子の活性の差を生じているのかも知れないが，図13のSephacrylカラムク
159

Ⅳ 個体レベルでの効果︵⁝・⊥己bu．−・−＋NdU︶︵uuOのN白○︶ゎニ＞叫lU再dNくU

1
0

50

80

Fraction No．（3．Oml／tube）

図9

SephacrylS−200columnchromatography forisolation of m−CANP
from myocardium of healthy hamster．

T⁝・く↑Uu﹁・−＋N再U︶︵EuOのN凸○︶ゎニ＞ Ud dZくU

1
0

50

Fraction No．（3．Oml／tube）

図10

SephacrylS−200columnchromatography forisolation of m−CANF
from myocardium of diseased hamster．

160

20．ハムスター心筋症発生轢序の解明およびその抑制に関する研究

：一rI
t

1

2

3

4

5

6

7

8

1．イヌ心筋（健常）m−CANP
2．イヌ心筋（健常）／卜CANp
3．ハムスター病的心遠心上清分画
4．ハムスター病的心DEAE−Sephacelカラム分画
5．ハムスター病的心SephacrylS−200カラム分画
6．ハムスター健常心遠心上清分画
7．ハムスター健常心DEAE−Sephacelカラム分画
8．ハムスター健常心SepもacrylS−200カラム分画
CANPのPAGE

ハムスター

病的心
1．DEAE−Sephacelカラム分画2．I）EAE−Cellul0丘ne カラム分画
3．SephacrylS−200カラム分画
健常心
4．DEAETSephacelカラム分画
5．DEAE，Cellulofineカラム分画
6．SepbacrylS−200カラム分画
CANP阻害田子のPAGE

図11PAGEは 3％〜10％のLaemuli法により作成。標品の処理はWeber−0Sbom法による。各漂品は40J唱〜30′唱を用いた。

ロマトでの本田子の活性分画における遊出蛋白
量は健常心で明らかに高い。すなわち，阻害活性をもつ分国の総蛋白量は，健常心15gから
10．3mg（病的心の3．5倍）であり，明らかに病的心で阻害因子の総量の減少が示された。
以上の成績はCANPおよびCANP阻害因子の比較である。純度が未だ不十分な標晶のため問題は残るが，心筋症ハムスター心筋では
CANPの総量では健常心と差はないが，阻害因子の総量は有意に小さいことを示唆するもの
といえる。
考

察

今回は，すべてEST混餌食の経口投与法を行ったが，これらの成続は概して失望的なものであった。すなわち，投与群と非投与群の間に明確な差が証明されなかったのである。
結果のばらつきの原因として一つには経口的摂取であるための摂取量の不均一性を挙げなければならない。次に胃におけるESTの分解や，消化管による吸収力の個体差も考えなければならないと思われる。もし，ESTをコンスタントに作用させるのが良いのであれば，泥解法では夜間に主として餌取されるため血中濃度の時差目差がかなりあるであろうとも考えられる。前年報告したミニポンプ皮下埋没法や胃チューブによる強制経口投与法の成績では，かな
り有効であることが認められたのであるから，
ESTが心病変改善に全く役立たないと考えるよりは投与法の問題と考えた方が理解し易い。
ミニポンプ法，強制経口法は長期間の観察が技術的困難であるためESTの腹腔内あるいは筋肉内投与による効果を試みる必要もあるのではないかと考えられる。
生存日数の差は，EST投与群においてより長く生きる慣向がみられたが，有意差はなかっ161

Ⅳ 個体レベルでの効果

き⁝＞七U？dNくU︵ − u芯一〇Jd︶∈uO宍凸○

︵
−
・
−
︶

一Uむー︼むご〇一逼Ju−

50Fraction No．（3．Oml／tube）

図12

SephacrylS−200columnchromatography forisolation of m−CANP−inhibitor
from myocardium of healthy hamster．

た。しかし，これは14匹ずつ計28匹のみの検討であるため，もう少し多数例による検討が望ましい。

累代世帯による成熟も 現在のところF3までしか検討が進んでいないが，F3の心組織内
Ca量および組織学的な変化の程度は，Fl，F2に比べてわずかに軽度の傾向が認められた。こ
の成績は今後，代を重ねて検討しなければ結論的なことはいえないが興味のある成績である。
問題は妊娠中も経口投与を続けているわけであるが，もしかなりの濃度のESTが胎盤を通過しているのであれば，好結果が期待できるので162はなかろうか。胎盤通過の有無と程度の検討が望まれる。
生化学的には，今回，CANPの阻害田子について検討した。緒言でも一部述べたが，心筋症
心筋では心筋構造蛋白，就中Myの崩壊，変性のみられる事が和田らにより My染色法による光学顕微鏡的所見，柴田らによるSDS処
理後の電気泳動所見（PAGE）により明らかにされた。
この事は，心筋症の心筋では何らかの蛋白分
解酵素の活性化が起こって，それによりMyを代表とする構造蛋白の融解が起こるものと考え

20．ハムスター心筋症発生機序の解明およびその抑制に関する研究

きち叫も？dN＜U

％

0
0
1

5

︵ − ・ 1 ︺︼Uむ己むご○︺道上ul︵1u蔓OLd︶∈uOのN qO

50

Fraction No．（3．Oml／tube）

図13

SephacrylS−200columnchromatographyforisolationofm−CAMP−intlibitor
from myocardium of diseased hamster．

られる。一方，心筋症心筋では，梗塞部心筋の如く酸性化はみられず，組織pHは健常部と同じく中性である。
そしてCa沈着が目立つと共に，心筋のCa2＋量の大きいことも明らかにされた。他方，和田，乾らは心筋症ハムスターの赤血球院の構成蛋白は，SDS処理PAGEの上で健常動物のものと差異のある事を示し，柴田らは心筋症の心筋小
泊体のATP依存性Ca2＋取込み能は健常心筋のものに比Ll／2程度に減弱していることを報告した。これらの知見を基に心筋症心筋の構造蛋白の崩壊に関与する蛋白分解酵素の性質を考えてみると，中性付近でCa2十の増大と関連すて活性化されるものとしてCa2十依存性・中性
蛋白分解酵素（CANP）が想起される。
しかしながら，各臓器細胞には，幾種類もの蛋白分解酵素の阻害因子が存在し，活性化が起こるためには，一時的あるいは可逆的に活性阻
害因子の非活性化，あるいは減弱化が必須条件であろうと考えられる。
心筋症ハムスターの心筋では小泊体のCa2＋取込み能が低く，細胞膜を介するCa2＋透過性が大きくなり細胞内Ca2十濃度の増大を生じ，
CANPの活性化が起こると考えられるが，阻害因子が十分であればCa2＋濃度は高くても活性化はみられない筈である。よって今回CANPの阻害因子につき検討した。
この結果，心筋のCANP総活性は健常群と心筋症群との間で差異はみられず，その基本的性状も同じであった。ところがCANP阻害因
子は，その得られた標品の純度がCANP以上に不純であり，したがって阻害田子の真の定量的検討は未だ出来得ないかもしれないが，現時点での粗活性標品で比較すると，その総活性は心筋症心筋で明らかに低ぐ（得られた標晶の比活性も心筋症で低いが，標品の収量が有意に低い），Ca2＋濃度の上昇など活性化条件が整えば健常心筋に比し容易にCANPが作動し得るも163

Ⅳ 個体レベルでの効果のと考えられる。
心筋症心筋の病変は多くの場合一様に全体に生ずるものでなく，島状に生じているので，たとえ上述の様にCANPが活性化されるにしてもなぜ島状に局所的に病変を生じてくるのか，
その理由は未だ不明である。
ともあれ，今回の成績はあくまでPrelimi・
naryなもので鱒あるが，心筋症における心筋構造蛋白の崩壊の一因にCANPにが関与している可能性を強く示唆するものといえよう。
SHprotease阻害物質である ESTの心筋症ハムスターへの投与実験で，少なくともミニ
ポンプによる常時投与方式を採った場合，心筋症の進展阻止効果のみられたことは，昨年度報
告において述べた。これは，CANPが典型的なSHプロテアーゼの一種である事から，心筋症の進展の一因にCANPが関与しているとす
ると当然な成績と考えられる。
今後，より精製されたCANP阻害因子を得て，できれば免疫組織学的にも検討し明確な結論を得たい。

164

結語

EST混餌食の経口的投与は，ミニポンプ皮下移植による投与や，胃チューブによる強制的
経口投与法に比べて効果が乏しく，また繰り返し行った実験成績の再現性も乏しかった，これは摂取量のバラツキと胃での薬剤の分解や腸管よりの吸収量に問題があるのではないかと考えられ，さらに飼料保存中のEST効果滅弱も考慮に入れる必要があると思われる。
今回の実験成績から，EST混餌食経口投与が無効であるとの決論は速断であり，少なくとも延命効果についての検討と，多数世代を累ねた子孫における成績を検討する必要がある。
そして，心筋症心筋では，CANP活性は健常心筋に比し大差なく，CANP阻害因子の減少がみられた。
これらの生化学的検討とCANP阻害物質・EST投与による心筋症進展抑制効果（ミニポンプによる）から，心筋症の進展にCANPの活性化の関与が示唆された。

21．ESTの肝薬物代謝酵素ならびにグルタチオン関連酵素に対する影響

北 川 晴 雄＊研究協力者 佐 藤 哲 男＊ 五十嵐

研究目的

隆＊

0．5％CMC液に用時懸濁し経口授与した。な
お対照群には0．5％CMC液を5ml／kgの割

生体に取り込まれた異物は，主に肝ミクロゾームのCyt．P−450系により代謝的活性化を受け毒性を発現する例が多く報告されている。さらにこれら活性代謝物の一部はグルタチオン抱合を受け速やかに解毒・排泄されることも多くの例について知られている。この様に毒性発現撥樺において，肝ミクロゾームの薬物代謝酵素
系およびグルタチオン抱合系は極めて重要な役割を担っていると考えられる。したがって，生体にとっては異物として認識される医薬品が，肝臓の薬物代謝酵素あるいはグルタチオン抱合系に影響を与えるか否かは，それ自身あるいは薬物併用時の毒性発現に関して重大な意義を有する。以上の観点から，本分担研究課題として
本年度はE−64−Cのエステル誘導体であるESTのラット肝薬物代謝酵素系およびグルタチオン

合で経口投与した。

代謝酵素系に及ぼす影響を1h t法相で検討した。

て酵素材料とした。総グルタチオン量および実験材料および方法

動物は断頭潟血後，肝臓を取り出しその湿重量を測定後1．15％KClにて濯流し，肝重量の4倍容の1．15％KClを加えてホモジナイズした。このようにして得られた20％ホモジネー
トの0．5mlと2M HClOr4mM EDTA液
0．5mlをよく混和し，10，000rpm5分間00Cにて遠心分離を行い，その上活を用いて総グル
タチオン量および酸化型（GSSG）グルタチオ
ン量を測定した。
また，20％ホモジネートの一部はガーゼを通して肝血管等の線維質を除いた後，γ−GTP活性の測定に用いた。さらに残りのホモジネート
は常法に従い超遠心分離により ミクロゾーム（Ms）画分と細胞質（cytosol）画分とに分離した。Ms画分は一定量の1．15％KClに懸濁しGSSG量はTietzeの方法1）およびGrifnthの方法2）により測定し，還元型グルタチオン（GSH）量は総グルタチオン量からGSSG量を

体重130〜140gのSD系雄性ラットを使用
し，飼育期間中は恒温，恒湿の条件下で飼育し差し引いて求めた。ホモジネートのγ−GTP活

た。動物は日本クレアK．K．のラット・マウス

た，Msのアミノピリン脱メチル化活性はNasb

用飼料（CE−2）を与え，飲料水は自由に摂取させた。動物を3群に分け，50mg／kg群，

法4）により，アニリン水酸化活性の測定はImai

200mg／kg群および対照群とした。ESTはムP−450量およびbS量はOmura and Sato

＊千葉大学薬学部薬効・安全性学講座薬物学研究室

元酵素（Fpl）活性はMihara and Satoの方性はIgarasbiらの方法3）により測定した。まand Satoの方法5）に準じて行った。チトクロの方法6）により求め，NADH−Ferricyanide還165

Ⅳ 個体レベルでの効果
表1EffectoftreatmentwithESTonbodyweight，1iverweight and the recovery
Of the proteinin rats
Protein recovery

Treatment

ControI

Body weight Liver weight（mg／gliver）

（g）

（g）

175．0土5．1

7．3±0．3

19．3土1．2

Microsomes Cytosol

75．5±2．9

EST
50mg／kg

166．0土0．3

7．7土0．3

17．2土1．2

68．7土1．9200mg／kg

169．7±3．8

7．2土0．3

19．6土0．6

75．1土2．1

Each value represents mean±S．E．obtained from5−6animals．
Rats were treated with EST，Orally for5days．

表2

EffectoftreatmentwithESTontheactivitiesofaminopyrineN−demethylation
and aniline hydroxylationin ratliver microsomes

Treatment

Aminopyrine N−demethylation

Aniline hydroxylation（nmole／min／mgprot）（nmole／min／gliver）（nmole／min／mgprot）（nmole／min／gliver）
Contro1
EST

3．65土0．27

69．84土4．81

0．64±0．01

12．36土0．73

50mg／kg

3．21土0．45

56．88土9．99

0．72土0．04

13．03土0．83

200mg／kg

3．25土0．13

65．03±2．44

0．59土0．04

11．84土0．81

Each value represents mean土S．E．obtained fron5−6aninals．
Ratsweretreatedwith EST，Orally for5days．

法に7）より，NADPHTチトクロムP−450還元との間で有意な変動はみられなかった（表1）。

酵素（Fp2）活性はPhillipsandLangdonのまた，MsおよびCytosolのg肝あたりの蛋

方法8）により，それぞれ測定した。また，
CytOSOl中のグルタチオンベルオキシダーゼ

白量においても対照群との間に有意差は認められなかった。

（GSH−Px）活性は過酸化水素（H202）を基質としてLawrence andBurkの方法9）に準じ

2．EST投与による肝Ms薬物代謝酵素活性に対する影響て測定した。グルタチオン還元酵素活性は

肝Msにおけるアミノピリンの脱メチル化活

MasseyandWilliamsの方法10）により求め性およびアニリンの水酸化活性に及ぼすESTた。さらに，グルタチオンS−トランスフェラ

投与の影響を表2に示した。EST50mg／kg

ーゼ活性は，基質として1−クロロー2，4−ジニト

あるいは200mg／kgいずれの投与群においてロベンゼン（CDNB）と，1，2−ジクロロー4−ニも対照群と比較して，両代謝活性に有意な変動はみられなかった。また，肝MsのCyt．P−450

トロベンゼン（DCNB）の両者を用いHabigらの方法11）に従い測定した。なお，蛋白定量はLowryらの方法12）により行った。
実験結果

量およびb5量に関しては表3に示すように，
いずれもEST投与による変動は認められなかった。さらに，表4から明らかなように，Fpl活性およびFp2活性においてもEST連続投与

1．EST投与による体重，肝重量および蛋白回収率
に対する影響による著明な影響はみられなからた。

EST50mg／kgおよび200mg／kgを5日

影響に関しては，表5に示すように肝臓内総グ間連続投与した時の体重および肝重量は対照群

ルタチオン量は50mg／kg，200mg／kgいずれ

166

次に，ESTのグルタチオン代謝系に対する

21．ESTの肝薬物代謝酵素ならびにグルタチオン関連酵素に対する影響
表3

EffcctoftreatmentwithESTonthecontentofcytochromeP−450andcytochromeb5
in ratliver microsomes

Cytocbrome P−450

Cytocbrome b5（nm6le／mgprot）（nmole／gliver）（nmole／mgprot）（nmole／gliver）

Treatment

ControI

0．77土0．03

14．87±0．91

0．49±0．01

9．45土0．53

0．73±0．10
0．72土0．01

12．89士2．21
14．64土0．23

0．50土0．01
0．46土0．01

9．08土0．41
9．46土0．36

EST
50mg／kg
200mg／kg

Eachvaluerepresentsmean土S・E・Obtainedfrom5−6animals・
Rats were treated with EST，Orally for5days．

表4

EffectoftreatmentwithESTontheactivitiesofNADPH−CytOChromeP−450reductase
and NADH−ferricyanide reductasein ratlivermicrosomes

Treatment

ControI

NADH−ferricyanide reductase

NADPH−CytOChrome P−450reductase（U／mg prot）（U／gliver）（U／mgprot）（U／gliver）

0．19土0．02

2．82土0．07

2．24土0．08

43．30土3．49

0．23土0．01

2．49土0．25

2．14±0．19

37．06土4．49

2．97土0．13

2．11土0．11

43．04土2．29

EST50mg／kg
200mg／kg

0．23土0．01

Each value represents mean±S．E．obtained from 5−6animals．
Rats were treated with EST，Orally for5days・の用量でもほとんど有意な変動はみられなかった。しかし，この時のGSSG量はEST投与
群において対照群に比較して約10〜15％程度の減少傾向を示した。それに対してGSH量はほとんど変動しなかった。したがって，GSH量とGSSG量の比は対照群で約200なのに対しEST両投与群では235〜250に増加した。そこ
で，グルタチオンの酸化還元に関与するグルタ
チオン還元酵素活性およびグルタチオンベルオ
キシダーゼ活性に対するESTの影響を検討した（表6）。グルタチオン還元酵素活性はEST
50mg／kgまたは200mg／kg投与により用量依存的に活性は上昇し，200mg／kg投与群では対照群の約20％の有意な増加であった。一方，グルタチオンベルオキシダーゼ活性は，グルタチオン還元酵素活性の場合とは逆に用量依存的に活性は低下し，200mg／kg投与群では対照群に比較して約40％の減少を示した。表7に示すように，グルタチオンS−トランスフェ

ラーゼ活性に対する影響ではCDNB，DCNB

いずれの基質に対してもEST投与による有意な変動はみられなかった。さらに，肝γ−GTP
活性に対するESTの影響を表8に示した○肝
ホモジネートにおけるγ−GTP活性は，EST
50mg／kg投与により対照群の約1・7倍に，200mg／kg投与により約2．0倍と用量依存的に増加した。
考察および結論
今回，f乃めβにおけるESTによる薬物代
謝酵素およびグルタチオン代謝系に与える影響を検討するにあたり，投与したESTの用量設
定は，これまでE−64およびその誘導体の一つであるE−64−Cの連続投与実験で用いた
50mg／kgと，最近，高用量の連続投与により血中トランスアミナーゼが増加することが報告されていることから，今回200mg／kgとの2用量について検討を加えた。ESTは50mg／kg，200mg／kgいずれの用量においても肝Ms薬
物代謝活性およびCyt．P−450量，Cyt・b5量167

Ⅳ 個体レベルでの効果
表5

Effectof treatment with ESTon hepaticglutathione concentrationSand the redox ratioin rats

Treatment l簑豊等e蒜

で蒜 （。S競gs。）

7．43土0．17

7．28土0．17

35．39土1．57

206．46土5．74

50mg／kg

7．48土0．42

7．45土0．42200mg／kg

7．31土0．45

7．27土0．45

29．95士1．72
31．76±2．96251．33土17．67
235．71土19．25

Control

EST

Each value represents mean土S．E．obtained from5−6animalS，Rats were treatedwithEST，Orally for5days．
表6

Effectoftreatmentwith ESTon the activitiesof glutathione reductase
andglutathioneperoxidasein ratliver cytosol

Glutathionereductase Glutathioneperoxidase

Treatment（mU／mgprot）（U／gliver）（U／mgprot）（U／gliver）

50．65土1．55

3．82土0．13

0．17±0．01

12．62土1．37

50mg／kg

55．25土4．22

4．08土0．08

0．14土0．01

9．66土0．35

200mg／kg

59．80土1．67＊＊

4．49土0．18＊

0．12±0．01書き

9．12土0．70＊

ControI
EST

Each value represents mean土S．E．obtained from5−6animals．
RatS Were treatedwith EST，Orally for5dayS．
＊p＜0・05，綿p＜0・01vscontrol；Jp＜0・05vs50mg／kg−treatedgroup．

表7

EffectoftreatmentWithESTon theactivitiesofglutathione
S−tranSferase＄in ratlivercytosol

CDNB

Treatment

DCNB（mU／mgprot）（U／gliver）（mU／mgprot）

754．40土7．78

56．95±2．1632．52土1．47

2．47土0．20

50mg／kg

727．40土50．74

50．05土3．89

31．30±2．88

2．17土0．26

200mg／kg

722．33土33．38

54．10土2．34

28．45±1．51

2．14土0．13

ControI（U／gliver）

EST

Each value represents mean土S．E．obtained from5−6animals．
Rat＄Were treated with EST，Orally for5days．

表8

Effectof treatment with ESTontheactivityofγ−glutamyltranspeptidase
in ratliver homogenates

Treatment

γ一glutamyltranspeptidase activity（mU／mg prot）（mU／gliver）

0．725土0．014

134．24土5．494

50mg／kg

1．240土0．112＊

224．67士20．788＊＊

200mg／kg

1．458土0．242＊

229．08土24．643＊

ControI
EST

Each value represents mean土S．E．obtained from5−6animals．
RatsweretreatedwithEST，Orallyfor5days．
＊p＜0．05，＊＊p＜0．0l vs control．

168

21．ESTの肝薬物代謝酵素ならびにグルタチオン関連酵素に対する影響にはほとんど影響を与えなかった。さらに，薬時にラットの血清GOT，GPT値が有意に上昇

物代謝における電子伝達系の重要な構成成分でするという報告と考え合わせると，今回みられあるFpl活性，Fp2活性に対しても全く影響はみられなかった。これらの事実から，ESTはた肝γ−GTP活性の上昇は肝障害の危険性を疑わせるものである。したがって，本被験化合物

ラット肝において少なくとも薬物の酸化反応，ESTの連続投与は薬物の第1段階反応にはほいわゆるphasel reaction（第1段階反応）

とんど影響を与えないのに対し，第2段階反応にはほとんど影響がないものと考えられる。

に対しては，少なからず影響を及ぼすものと思一方，薬物の抱合反応である phase 2 re−

われる。さらに，ESTの連続投与に際し，肝action（第2段階反応）の一つであるグルタチ

障害の可能性もあり，使用にあたっては留意す

オン抱合には，抱合の律速酵素であるグルタチ

べき点であると思われる。

オンS−トランスフェラーゼの他に，生体内基文質であるGSH量の変動も大きく関与している。また，生体内GSHレベルは種々の関連酵
素により巧妙に調節されていることから，今回
EST投与によりグルタチオン還元酵素活性が増加し，グルタチオンベルオキシダーゼ活性は逆に減少したことは興味深い結果である。EST
200mg／kg投与によりグルタチオンベルオキ
シダーゼ活性は約砲に低下したにもかかわら

献1）Tietze，F．：Anal．Biochem．，27，502，1969・
2）Grifnth，0．W．：Anal．Biochem・，106，207，
1980．

3）Igarashi，T．，Satoh，T．，Ueno，K・and
Xitagawa，H．：J．Biocbem．，93，33，1983．
4）Nash，T．：Biochem．J．，55，416，1953・
5）Imai，Y．，Ito，A．and Sato，R．：J・Biochem・，
60，417，1966．

ず，生体内総グルタチオン量およびGSH量に

6）Omura，T．and Sato，R．：J．Biol．Chem・，239，

は，大きな変化がみられなかったが，もしグルタチオソベルオキシダーゼの生体内基質である

7）Mihara，K．and Sato，R．：J・Biochem・．71，

過酸化水素あるいは過酸化物が生成しているよ
うな条件下では，このダルクチオソベルオキシ
ダーゼ活性の低下を反映して生体内グルタチオ
ンレベルに著明な変動がみられることが予想される。また，EST投与により最も顕著にみられた酵素活性の変動は，肝γ−GTP活性であり，その活性は50mg／kg，200mg／kgと用量依存的に上昇した。γ−GTP活性は肝胆道系疾
患時においても著明に活性が上昇することか
ら，血清トランスアミナーゼ活性と共に肝障害

2370，1964．

725，1972．

8）Phillips，A．Ⅴ．and Langdon，R・G・：J・Biol・
Cbem．，237，2652，1962．
9）Lawrence，R．A．and Burk，R・F・：Biochem・
Biophys．Res．Commun．，71，952，1976・
10）Massey，V．and Williams．C・H・：J・BioL
Cbem．，240，4470，1965．

11）Habig，W．H．，Pabst，M．J・andJakoby，W・B．：J．Biol．Chem．，249，7130，1974．

12）Lowry，0．H．，Rosebrough，N・J・，Farr，A・L・
and Randall，R．L．：J．Biol．Chem．，193，265，
1951．

のマーカーとしても知られている。EST投与

169

22．筋ジストロフィーハムスターにおけるESTの薬効に関する研究
＊
＊
＊
＊
＊

＊

■秀文男勇

和貞保

＊

見村本田

＊

磯大橋潮

＊

子紀子雄旭

＊

＊

和和聡貞和

＊

用い，ESTの薬効に関する共同研究を実施した。その結果，EST投与により，CPK等の血菜マーカー酵素活性の低下と，心筋の壊死性変化の抑制傾向が認められた1）。
今年度は，UM−Ⅹ7．1系筋ジストロフィー
ハムスターを自家繁殖し，昨年の結果を追試，確認することを主目的に統計的に評価しうる実験例を重ね，ESTの薬効評価を行った。
また，BIO14．6系筋ジストロフィーハムス
ターについても，国内で繁殖が可能となり，幼令の動物が，若干手に入ったので，UM−Ⅹ7．1
糸筋ジストロフィーハムスターと同様な評価を
行った。

弘

＊

昨年度，当研究班では，UM−Ⅹ7．1系およびBIO14．6系筋ジストロフィーハムスターを

本田上板極

松花山中京

＊

的

正

関

子晴明明巳

＊

大

敬正正俊克

苅

日

木井村家田

相玉木野野

研究協力者

3．投与法
ESTを固型飼料（オリエンタル酵母社，
CMF）に混合し，自由に摂取させた。また，対照群には，飼料のみを与えた。
4．投与量および動物数
表1に示す。
5．投与期間3〜4週令で投与を開始し，8週令まで，約1ヶ月間継続した。なお，BIO14．6ハムスタ
ーの100mg／kg／day投与実験の一つは，10遇
令まで，約1．5ヶ月間継続した。
6．検査項目（1）体重
投与期間中3〜4日ごとに測定した。
（2）臓器重量屠殺後，心臓，肝臓，および腎臓重量を測定した。

で繁殖し，BIO14．6系ハムスターは実験動物（3）血液生化学分析
血液は外腸動脈および静脈より採取し，ヘパリンを加えて遠心し，血祭とし，日立712型自動分析装置を用い，血染中のCPK（01iver変法）GOT，GPT，LI）H（UV法）活性を測定

中央研究所より購入し，実験に供した。

した。

2．群分け

（4）骨格筋分析
前脛骨筋に20mMTris−HClpH7・5−1mM
EDTA5mM2−merCaptOethanolを加えてホモジナイズし，10，000×g15分間遠心後の上清について，日立712型自動分析装置を用い，CPK活性を測定した。

材料と方法
1．動物
UM−Ⅹ7．1系および正常ハムスターは当社

可能な限り同腹の仔を均等に2群に分け，片方を対照群とし，もう一方をEST投与群とした。
＊大正製薬株式会社総合研究所

171

Ⅳ 個体レベルでの効果
表1投与量および動物数
ハムスター

投 与 量
（約mg／kg／day）

飼料中EST濃度
（％）

投与期間
（月）

動 物 数＊（匹）
対照群
EST投与群雄

Norma1300

0．375

610（10）

3

6

9（9）

2
1

2
2

︶
2
2
︵

1
1

1
1

2
2

︶
2
2
︵

6

1
1

7
1

︶
1
4
︵

8

9

7
1

0
1

2
1

2
2

︶
2
2
︵

1
1

7
1

︶
8
2
︵

1 8
1

2 9
1

3
2

6

︶
︶
︶
6 3 8
4 2 2
︵
︵
︵

5

6

l
1

︶
l
1
︵

6

5

l
1

︶
l
1
︵

6

5

︶
︶
1 8
1
︵
︵

6

1
1

4

1 8
1

5

4

5

4

9

︶
︶
1 9
1
︵
︵

7
1

0
1

1

0

0

5
7
3

1

0

5
2
1

0
0
3

5
2
1

0
0
1

0

0
0
1

0

0
0
3

0．375

計

1

0
0
1

0．125

雌

0

0．0375

雄00
3

BIO14．6

0．0125

4

計

1

0
1

UM一Ⅹ7．1・1．0

雌＊：動物数については，今年度行った実験の匹数の示す。
（）内は昨年度と今年度の実験のトータルの数を示す。

（5）心筋分析
心臓は縦に2分割後，片方を用いてLillieの10％緩衝ホルマリンに固定後，約4βのパラ
フィン切片から，H．E．染色標本を作製し，病理組織学的検査を行った。もう一方は既報の方
法1）で灰化してカルシウム含量を測定した。
（6）肉眼的観察
心臓，舌および横隔膜については，昨年度報告l）した方法に従って壊死性病巣の肉眼的観察を行った。
（7）統計学的処理
昨年度実施した同様の試験の結果を併せて，平均値および標準偏差を求め，t−検定により，対照群とEST投与群の平均値の差の有意性を検討した。なお，雌雄の測定値に差が認められないので両者併せて統計処理した。
結

果

1．体重に及はす影響
正常，UM−Ⅹ7．1およびBIO14．6ハムス
ターともいずれの投与量においても体重増加に
対しEST投与による影響は認められなかった。
2．血揖酵素活性（CPR，GOT，GPT，LDH）に及はす影響
表2，3，4に示すようにUM−Ⅹ7．1およびBIO14．6 ハムスターでは，正常ハムスタ
ーに比べ，CPK，GOT，GPT，LDHなどの血祭酵素活性は著しく高い値を示す。
172

正常ハムスターにおいては，EST300mg／
kg／day投与により，LDHが低下したものの．
他の酵素活性は変化がなかった（表2）。
UM−Ⅹ7．1ハムスターにおいては，10mg／

kg／day投与では，CPK活性が低下したものの，30mg／kg／day投与においては，昨年度は実験例によっては血菜酵素活性の低下が認められたが，これまで実施したすべての実験を集計し，統計処理したところ，投与による有意な改善はないと判断すべき結果を得た。
さらに，今年度は，ESTlOOmg／kg／day投与の実験も行ったが，この用量でも血柴酵素活性の低下は認められなかった。
一方，EST300mg／kg／day投与によって，血祭中のCPK，GOT，GPT活性が有意に低下し，投与による病変の改善傾向がうかがわれた（蓑3）。
BIO14．6

ハムスターにおいては，EST

lOOmg／kg／day，1ヶ月投与天険では，対照群の血祭酵素活性が他の実験例に比べ高い値を示
し，EST投与によってCPK，GOT，LDH活
性が有意に低下したが，1．5ヶ月投与および，300mg／k色／day，1ヶ月投与によっては，これ
ら酵素活性の抑制は認められなかった（表4）。
3．骨格筋に及はす影響（1）前脛骨筋中CPK活性
前脛骨筋中のCPK活性は，UM−Ⅹ7．1ハ
ムスターの100mg／kg／day投与実験を除い

22．筋ジストロフィーハムスターにおけるESTの薬効に関する研究
表2
ハムスター・

正常ハムスターにおける血祭酵素活性

酵素活性（mean士S．E．）

投 与 量（mg／kg／day）

300

Normal

対 照 群

EST投与群GOT

1．19土0．249
4．89土8．38

0．688土0．181
34．3士3．53

GPT

32．8土4．27

35．0土7．40

LDH

215土17．9

169土8．971

CPK

CPK：IU／ml．GOT，GPT：Karmen−Unit，LDH：IU／1，1：p＜0・05
表3

UM−Ⅹ7．1ハムスターにおける血祭酵素活性

酵素活性（mean土S・E・）

ハムスター（監′孟′。霊）酵素

UM一Ⅹ7．1

対 照 群

EST投与群39．0土3．55

29．5±2．581

388士29．2

335土24．3

116士4．18
726土57．1

107土5．10
633土46．543．3±2．77

39．8土2．96

443土39．0

384土27．7

116土6，13115±5．13

927土84．1

872土67．5

33．7土2．80

34．3土3．25

382土27．2

372土26．6

113土4．90
729士53．5

106土5．27
750土70．0

GOT

36．4土3．76
298土25．5

24．8士2．231
224士15．31

GPT

91．5土3．40

72．4±3．1511

LI）H730±67．1

582士37．9

CPK

CPK：IU／ml，GOT，GPT：Karmen−Unit，LDH：IU／1

1：p＜0．05，1いp＜0．01て，全般的には，筋ジストロフィーハムスター

る。UM−Ⅹ7．1ハムスターの横隔膜と心臓のは，正常ハムスターに比べ，わずかではある

病巣はBIO14．6ハムスターよりも全般的に広が有意に低い。しかし，EST投与により，このCPK活性にはほとんど影響はなかった（図汎である。
UM−Ⅹ7．1ハムスターにおいては，EST

1）。

lOmg／kg／day群の舌，30mg／kg／day群の横（2）舌，横隔膜および心臓の壊死性病巣の肉眼的観察
UM−Ⅹ7．1およびBIO14．6ハムスターの

舌，横隔膜，心臓の壊死性病巣は，肉眼的にみると巣状またはすじ状に自色調を皇して観察されるが，この病巣の拡がりは個体によって様々
で，個体問の発症度に大きな′ミラツキがみられ隔膜，300mg／kg／day群の舌と心臓，またBIO14．6ハムスターにおいてはEST300mg／
kg／day群の心臓等に病巣の軽減傾向が認められたが，いずれも有意ではなかった（図2，3）。
4．心筋に及ほす効果（1）カルシウム含量
心筋中のカルシウム含量値をそのまま統計処
173

Ⅳ 個体レベルでの効果
表4

BIO14．6ハムスターにおける血菜酵素活性

酵素活性（mean土S．E．）

ハムスター （監′孟′あ 投讃問 酵素
BIO14．6

100

1．0

対 照 群

EST投与群54．3土5．44
722土90．2
241土34．7

36．4土6．151
436±55．81
181：土25．3

1568士174

973土123129．7±3．38
422土36．730．4±3．72
432土42．9154±10．1

155土8．98

656士57．1

708土54．3

7
4

6
2

●

●

9
．

3

7

4

2

1

G

134土14．9

0

5

8

6

L

2 1 1 3
土 土 士 土
8 4 0 4G

PKOTPTDH

C

29．3±4．26
400±50．5

30826土84．9†

CPK：IU／ml，GOT，GPT：Karmen−Unit，LDH：IU／1，1，†：p＜0．05

N o rm al

甲−︵．甲S羽u冨u︶ 01×茎SS叩︺でnl

300（m g／kg／
day）

U M ・
Ⅹ7 ．
1
10

30

100

B I O 1 4 ．6300

1 0 0 （1 m ）1 0 0 （1 ．5 m ）300＊［コ：Control

国：EST−treated＊：p＜0．05

図1前脛骨筋中CPK活性理した結果を図4に示す。

UM−Ⅹ7．1ハムスターを用いた実験では，

dayl．5ヶ月投与実験では投与終了時10遇令で各実験によって，対照群の心筋中カルシウムレ
ベルがかなり異なっていた。EST300mg／kg／

あるが他はすべて8週令のハムスターである。

day投与によってカルシウム含量の低下傾向

これらの筋ジストロフィーハムスター′においては，加令とともに，心筋中にカルシウムが沈（p＜0．1）がみられたものの，他の投与量では変化が認められなかった。ちなみに，EST

着してくるが，掛こUM−Ⅹ7．1ハムスターに300mg／kg／day投与実験の個々のデータを対おいては，このカルシウム沈着が著しい2）。

数目盛で示したのが図5である。今年度の実験

BIO14．6

174

ハムスターのESTlOOmg／kg／

22．筋ジストロフィーハムスターにおけるESTの薬効に関する研究︵M−○︶一u叫Od

CI EI C2

E2

C3

E3

C4

E4
mean±S．E．

C：Dystrophic controIs（Cl．n：22，C2．n：17，C3．n：22．C4．n：17）
El：EST（10mg／kg／day，n：22）
E2：EST（30mg／kg／day，n：17）
E3：EST（100mg／kg／day，n：23）
E4：EST（300mg／kg／day．n：16）

図2

UM−Ⅹ7．1ハムスターにおける壊死性病巣
175

／

／

︵M・−凸︶一u叩Od

CI EI C2

E2

C3

E3
mean ± S．E．

C：Dystrophic controIs（Cl．C2．n：11．C3．n：8）
El：EST（100mg／kg／day，n：11），Duration：1month
E2：EST（100mg／kg／day，．n：11），Duration：1．5month
E3：EST（300mg／kg／day，n：9），Duration：lmonth

図3
176

BIO14．6ハムスターにおける壊死性病巣

22．筋ジストロフィーハムスターにおけるESTの薬効に関する研究

B IO 14．
6

UM・
Ⅹ7．
1
10

30

100

300

100（
1m） 100（
1．
5m）

300

0
0
0
4

0
0
0
3
0
0
0
2
0
0
0
1

︵．凹．S羽u中書︶舅SSコでuq Eコ叫U一再U

N o血al
300
（
m〟kg／
day）

干
戸臨

「
・
ヨ
芸
．
Ja芸
・
■

ロ：Control

国：EST−treated

図4 心筋カルシウム含量を白丸で，昨年度の実験を黒丸で示したが，良い再現性が得られており．EST300mg／kg／day
投与によってUM−Ⅹ7．1ハムスターでも正常
ハムスターの値に近づく個体が増加している。
さらに，対数目盛で示したカルシウム含量の分布が，かなり正規分布性を持っているように思われたので，現在までに測定した8遇令の無投与のUM−Ⅹ7．1ハムスターの心筋中カルシ
ウム含量値をすべて用いて，正規分布性の検定

高い値を示し，BIO14・6ハムスターではこの時期，心筋へのカルシウムの流入が，著しいことを示唆している。ESTlOOmg／kg／day投与
では1ヶ月および1．5ヶ月投与，共に差は認められなかったが，300mg／kg／day投与では，心筋中カルシウム含量の若干の低下傾向を示し
た（p＜0．1，図4）。
（2）心臓の病理組織学的所見
UM−Ⅹ7．1ならびにBIO14．6ハムスターを行ったところ，そのままの値では正規分布にの心臓における組織変化を大別すると，Calci丘−

従わず，対数に変換すると正規分布性を持つことがわかった。また，対数に変換すると肉限的

edfoci（石灰化巣）とその他のmyOlyticchanges（心筋の壊死，変性，線維化等）の2観察による病変の重篤度とも良い相関性を示し

種掛こ分析され，CalcifiedfociはUM−Ⅹ7・1

た（図6）。
UM−Ⅹ7．1ハムスターの心筋カルシウム含′、ムスターにおいてより顕著である。この2種

量値を対数に変換して統計処理した結果を図7を検討した結果，両者の変化はいずれもUM−に示した。EST300mg／kg／day投与によってⅩ7．1およびBIO14．6ハムスターの300mg／

有意にカルシウム含量が低下したが，10，30おkg／day投与において，障害度の改善傾向が認よび100mg／kg／day投与では，効果が認めらめられた（図8，9，10，11）。

れなかった。
BIO14．6ハムスターにおいては，1ヶ月投与と1．5ヶ月投与で投与終了時，わずか2週間

額の変化を指標にしてESTの投与による影響

考察UM−Ⅹ7．1ハムスターにおいてほ，血菜中

しか週令に差がないのにもかかわらず，心筋中のCPK，GOT，GPT活性はESTを300mg／のカルシウムレベルは，10週令になるとかなりkg／day混餌投与したところ，有意に低下した0177

Ⅳ 個体レベルでの効果

○
○

；●

営。 ト

っ ﹃

80

●
●●

○
●
︒ ﹃

︵ぎl︶賀SS u＼叫も⊥En⁝U︼dU

00
080

0
8 呂§

図5

N orm al
E ST

●

●●
営。 ・
○
O
。

●
：

○
○

●

○

●

8

●

○

○
。8 8

○

00

N orm alC ontrol○○D y strop hic
C o ntrol●●D y stro phic
E ST

UM−Ⅹ7・1ハムスターにおけるEST300mg／kg／day投与試験の心筋カルシウム含量分布︵皆一︶盲qluOU∈n⁝Ul再U
6．0

Severity（grade）
図6
178

心筋カルシウム含量と肉眼的観察による病変重篤度との相関性

22．肪ジストロフィーハムスターにおけるESTの薬効に関する研究

U M −Ⅹ 7 ．
1

H am ster
300

10 0

30

10（
m g／kg／day）﹇︵賀SSコu＼琶︶En⁝U︻d﹈＊＊⊂コ：Control 団：EST・treated ＊＊：p＜0・01
回T UM−Ⅹ7・1ハムスターの心筋カルシウム含量に及ぼすESTの効果

Calcified foci琶Pu∵早耳；諾

CI EI C2

E2

C3

E3

C4

E4
mean ± S．E．

C：Dyst，。phiccontroIs（Cl．n：22．C2．n：17，C3・n：22，C4・n：17）
El：EST（10mg／kg／day，n：22）
E2：EST（30mg／kg／day，n：17）
E3：EST（100mg／kg／day，n：23）
E4‥EST（300mg／kg／day，n：16）

図8 心族組織内の石灰化巣（UM−Ⅹ7・1）
179

諾Pu二言誌己S

CI

EI

C：Dystrophic

C2

E2

C3

E3

C4

E4
mean ± S．E．

controIs（Cl．n：22，C2．n＝17，C3．n：22，C4．n：17）

El：EST（10mg／kg／day．n：22）
E2；EST（30mg／kg／day，n：17）
E3：EST（100mg／kg／day，n：23）
E4：EST（300mg／kg／day．n：16）

図9 心臓組織内のmyolytic changes（UM−Ⅹ7．1）
Calcified foci

XqPuT三冠己SCI EI C2

E2

C3

E3
mean ± S．E．

C：Dystrophic controIs（Cl．C2．n：11．C3．n：8）
El：EST（100mg／kg／day，n：11），Duration：lmonth
E2：EST（100mg／kg／day，n：11），Duration：1．5month
E3：EST（300mg／kg／day，n：9）．Duration：lmonth

図10 心臓組織内の石灰化巣（BIO14．6）

このことは，これらの酵素の筋肉組織からの漏出が，EST投与によってある程度抑制されることを示唆しているものと考えられる。しかし，10mg／kg／day投与でCPK活性が，低下したものの30，100mg／kg／day投与では差がないという，一見矛盾する結果が得られた。血180

菜中のCPK活性は，UM−Ⅹ7．1ハムスター
では，生後，約100日までは上昇し，その後下降すると報告されているものが），病変との相関に関しては不明な点が多く，今後ESTの血菜酵素に対する影響を明らかにするためには，
病気の進行に伴って経時的に血中酵素活性の変22．筋ジストロフィーハムスターにおけるESTの薬効に関する研究

記Pu∵言55SCI EI C2

E2

C3

E3
mean ± S．E．

C：Dystrophic controIs（Cl．C2．n：11，C3．n：8）
El：EST（100mg／kg／day，n：11）．Duration：1month
E2：EST（100mg／kg／day．n：11），Duration：1．5month
E3：EST（300mg／kg／day．n：9），Duration：1month

図11心臓組織内のmyOlyticchanges（BIO14・6）

化を調べ，さまざまなステージでのESTの効果を調べる必要があると思われる。
BIO14．6ハムスターの血莱酵素活性に関しることを示唆していると思われる。UM−Ⅹ7・1
およびBIO14．6ハムスターともこのCPK活性にEST投与による大きな変化は認められなては，ESTlOOmg／kg／day，1ヶ月投与実験

かったが，昨年度，BIO14・6ハムスターで，においてのみ，CPK，GOT，LDH活性の低下

9週令から約9週間30，300mg／kg／day混餌が認められた。この実験では対照群は非常に高投与により，上昇したことを報告した。長期間

い酵素活性を示しており，この鞘乱血祭酵素

投与すれば骨格筋に効果があらわれてくる可能

活性が大きく変動することや，また，個体差も性も否定できない。

大きいことなどから親による酵素活性レベルの一方，心筋中のカルシウム含量は，UM一Ⅹ7・1
ハムスターにおいては，EST300mg／kg／day

違いも反映しているものと思われる。
今後，明確な結論を得るためには，さらに例投与によって有意に低下し，改善傾向が認めら数を増すと共に，UM一Ⅹ7・1ハムスターと同れた。このUM−Ⅹ7．1ハムスターでは心筋カ
ルシウム含量は対数変換すると正規分布性を持様，病気の進行に伴って経時的に評価を行う必要があるだろう。
骨格筋については，昨年既に報告したように，

つことから心筋にカルシウムが沈著しはじめると指数関数的にカルシウム含量が増加してくる

これらの筋ジストロフィーハムスターにおいてと考えられる。また，ほぼ同週令にもかかわらは成令でも，その再生が非常に強く，その結果として，発症程度も個体や筋肉の違いでばらつきが大きいため，薬物の評価は極めて難しい。
したがって今年度は，病変の肉眼的な観察と，
前脛骨筋中のCPK活性を測定するにとどめた。
前脛骨筋中のCPK活性は，筋ジストロフィーハムスターにおいては正常ハムスターより全ず，実験によって対照群の心筋中のカルシウム

般的に低値を示し，この酵素が筋肉から漏出す含量がかなり異なることから，親によるカルシ
ウムレベルの違いや沈着しはじめるタイミングの違いが示唆される。
100mg／kg／day投与実験の対照群が高値を示し，かつ投与による効果が認められないことから，ESTはUM−Ⅹ7．1ハムスターの心筋にカルシウムが沈着する時期を遅らせる効果を
181

Ⅳ 個体レベルでの効果持つものの，心筋へのカルシウム沈着を完全にれらの事実を臨床的に意義づけるためにも，延抑制することはできないものと考えられる。

命効果等の0Verallの作用を種々の用量で検討

BIO14．6 ハムスターは，今年度はじめて幼する必要があると思われる。

令の動物が手に入った。UM−Ⅹ7．1ハムスタ

結ーに比べると，心筋中のカルシウムレベルは低語

いものの8週令と10遇令では3〜5倍も異なっ

UM−Ⅹ7．1糸筋ジストロフィーハムスターており，この時期の病気の進行が著しいことをにESTを10，30，100および300mg／kg／day

示唆している。また，UM−Ⅹ7．1ハムスター

混餌投与し，病変の進行阻止効果について研究と同様，親によるカルシウム沈着のレベルおよびタイミングの相違もうかがわれる。

を行った。その結果，EST300mg／kg／day投BIO14．6 ハムスターは実験例数が少なく，心筋中のカルシウム沈着および心筋の変性が抑与により，CPK等の血菜酵素活性が低下し，正規分布性の検定はできなかったが，EST制され，薬効が明らかとなった。

300mg／kg／day投与でカルシウム沈着の抑制
傾向が表われており，UM−Ⅹ7．1ハムスター

また，BIO14．6系筋ジストロフィーハムス
ターにおいてもEST300mg／kg／day投与にと同様の反応を示したものと思われる。
またUM−Ⅹ7．1およびBIO14．6の両者のよって，心筋変性の抑制傾向が認められた。
今後は，延命効果等の0Verallの効果を明ら

ハムスターにおいて心臓の組織所見でもEST

かにしたい。

300mg／kg／day投与によって，石灰化巣軽減

参考文献

傾向が認められた。今回はカルシウム含量の測定と組織学的な石灰化巣などの検索を行う必要
上，心臓を二分しなければならなかったが，両者の測定結果の総和がその個体の心臓病変の程度を示していると考えることができる。したがってカルシウム含量および組織所見の二つの評
価法から判断して，ESTを投与することによ1）共同研究：筋ジストロフィーハムスターに対するE−64−dの効果，厚生省新薬開発研究事業「徽生物の二次代謝物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」．昭和57年度研究報告書，235−お5，1983．
2）Proschek，L andJasmin，G．：Hereditary
Polymyopathy and cardiomyopothyin．theSyrian hamster．ⅠⅠ．Development of heartって心筋にカルシウムが沈着する時期を遅らせ

necrotic changesin relation to deffective

る効果があると考えられる。

mitochondrial

以上のようにUM一Ⅹ7．1ハムスターにおいて血菜酵素および心筋に及ぼすEST300mg／
kg／day投与の効果が明らかとなった。
本報の評価法でみるかぎりESTは高投与量しか効果が明らかにされなかったが，今後はこ182

function．，Muscle＆Nerve，5，26−32，1982．

3）Jasmin，G．and Proschek．L・：Hereditarypolymyopathy and cardiomyopathyin the
Syrian hamster．Ⅰ．Progression of heart andSkeletalmusclelesionsin the UM−Ⅹ7．11ine．，
Muscle＆Nerve，5，20−25，1982．

23．筋ジストロフィーマウスにおけるESTの効果に関する研究＊＊

また，12遇令以前に死亡した個体は実験から除子文

東北大学薬学部において維持繁殖している
C−57BL／6J−dy系の雄性マウスを使用した。

敬貞（1）使用動物

木村1．実験−1

相大

法

＊
＊

方

＊

る。

＊

考えられる生存期間に対する効果を中心に調べ子紀知

肢摸能および全身的な症状の進行速度を示すと

和和敬

要田であると考えられる。すなわち，チオール
プロテアーゼの強力な阻害剤であるEST投与
により，筋萎縮を抑制し，後肢の機能低下を阻止しうる可能性が考えられる。
今年は，ESTの作用をより多角的に検討することを目的に筋ジストロフィー症マウスの後

＊

＊

＊

昨年度，筋ジスハムスターに対するESTの効果について研究班班員の共同研究を行い，心筋の壊死性変化および血中酵素活性の上昇を抑制しうることを明らかにしたl）。
一方，筋ジスマウスは筋ジスハムスターと異なり，ヒト患者と同様に強い後肢の萎縮が認められ，歩行困難な状態に陥る。筋肉中プロテアーゼによる筋肉蛋白分解克進が筋萎縮の一つの

本田松

＊

研究目的

弘

＊

晴秀進

閲松花小

大

正和

井見藤

玉磯佐

研究協力者

（2）投与方法
ESTを0．0375％になるように固型飼料中（オリェソタル酵母社製CMF）に混入し，3週令より自由摂取させた。薬物投与量は摂餌量から算出し，約35mg／kg／dayに相当する。
（3）自発運動量測定
6週令時より5日ごとに回転力ゴを用いて自発的に運動を行わせ，15分間の回転数を測定した。初回測定値を100として比回転数で示した。
2．実験一2（1）使用動物
実験動物中央研究所より入手したC−57BL／
6J−dy系の雌雄マウスを使用した。
（2）投与方法
4週令より，ESTO．03％（約30mg／kg／day相当）および0．01％（約10mg／kg／day相当）
含む飼料を自由摂取させた以外は実験−1と同様に投与した。
（3）自発運動量測定
5遇令より，1週間ごとに30分間の回転数を測定した以外は実験−1と同様に測定した。

結

果

1．実験−1筋ジスマウスの場合，幼令時は正常な歩行を＊ 大正製薬株式会社総合研究所

示すが，徐々に歩行困難に陥る。その外観的変化は，6〜7遇令時よりぎこちない歩行をするようになり，7〜9遇令時ではけいれんの発生＊＊東北大学薬学部薬理学教室

頻度が増して後肢を引きずって歩くことが多く

外した。

183

Ⅳ 個体レベルでの効果なった。10週令以後は後肢が伸び切ったまま歩行するようになり，12遇令になると関節が曲がらない状態のものが多くなった。
図1に示すControl群の回転数の変化は，症状観察における重篤度の変化にほぼ相関しており，後肢の機能を反映していると思われた。
ESTO・0375％含有飼料投与群の比回転数はControl群のそれと同様に7遇令以後減少はす
るが，9〜12週令の問，Control群より有意に

表1EST混餌投与した筋ジスマウスの平均生存期間（実験−1）
群

n

適

合

Control

14

14．3土0．5

ESTO・0375％含有飼料

917．7土0．7＊＊：p＜0．01，mean土S．E．

2．実験−2
実験−1の結果を確認するため，実験動物中央研究所より入手した雌雄マウスを用いてほぼ多かった。すなわち，ESTは自発運動能の低下を遅らせたと考えられる（図1）。
一方，自発運動量測定終了後も死亡するまで同様の実験条件でESTの効果を検討した。無投与群の自発運動量の経時変化は実験−1とは投薬を続け，その平均寿命を測定した。表1に示したように，EST投与群の平均生存期間は有意に延長された。ESTが症状の進展を抑制することにより隼存期間が延長されたものと思われた（表1）。

雄では，ESTO・03％および0．01％含有飼料投与群ともに比回転数にControl群との間に差はなかった（図3，4）。しかし，雌のEST

184

は同様であり，また，雌雄間には差が認められなかった（図2）。

O・03％含有飼料投与群では9および10週令時，
0・01％含有飼料投与群では9および12週令時に

23．筋ジストロフィーマウスにおけるESTの効果に関する研究︵．凹．S封u票∈︶U︒コ空︒出講
5

6

7

8

9

10

●：Male（n＝13）

1112

1314

151Veeks○：Female（n＝11）

図2 筋ジスマウス自発運動量の加令に伴う変化︵．凹．S¶u申聖E︶u︒⁝葛︸︒出㌔
5

6

7

8

9

●：Control（n＝13）

10

1112

13

1415weeks○：0．03％EST（n＝5）

図3 雄肪ジスマウスの自発運動量におけるEST混訴投与（0．03％）の効果
185

Ⅳ 個体レベルでの効果︵．凹．S引u宕∈︶uO叫玉○出講
5

6

7

8

9

●：Control（n＝13）

101112131415weeks○：0．01％EST（n＝7）

図4 堆筋ジスマウスの自発運動量におけるEST混餌投与（0．01％）の効果︵．凹．S羽u中書︶uO⁝︸再pO出講
5

6

7

8

9

10111213

1415weeks＊：p＜0．05●：Control（n＝11）
図5
186○：0．03％EST（n＝8）

雌筋ジスマウスの自発運動量におけるEST混餌投与（0．03％）の効果

23．筋ジストロフィーマウスにおけるESTの効果に関する研究︵．凹．S羽u宕∈︶u︒こ高盲出講
5

6

7

8

9

101112131415weeks＊＊：p＜0．01●：C。ntr。1（n＝11）
図6○：0．01％EST（n＝5）

雌筋ジスマウスの自発運動量におけるEST混餌投与（0．01％）の効果

4
1
2
1
0
1

StdE⁝uくhO JjEEnN：C。ntr。1−・−：0．03％EST・・・・ ・・−・：0．01％EST
図7 EST混餌授与した筋ジスマウスの生存期間（雌）187

Ⅳ 個体レベルでの効果

2
0
8
6
4
2

SldE明仁＜JO JU一EEnN

0

5

10

15

20

25

Weeks after Birth：Control

一・一：0．03％EST…・・・・・・：0．01％EST

図8 EST温田投与した筋ジスマウスの生存期間（堆）表2

EST混餌投与した肪ジスマウスの平均生存期間（実験−2）
雄

群

n

雌
遇

令

n

過

令

Control

14

22．5土5．73

16

23．1土11．6

EST O．03％含有飼料
EST O．01％含有飼料

5919．7土2．84
20．8土7．46

85

22．2土4．77
26．5土6．50

mean土S．D．

おいてControl群の回転数より有意に多く，
実験−1の結果ほど明らかではないが自発運動量の減少を遅らせる傾向がみられた（図5，6）。

雌雄の死亡経過を図7および8に示した。
雌の死亡時期は雄のそれと比べると広い範囲にまたがっており，バラツキが大きかった。表2にまとめて示すように各群とも平均生存期間に差はなく，実験−1において認められた延命効果の確認はできなかった。
考察

筋ジスマウスは明らかな後肢の機能低下が認められる。この低下を調べるため，回転力ゴを188用いて自発運動量を測定した。
実験−1では自発運動量の減少を遅らせており，実験−2においても雌ではその傾向が認められた。しかしながら，個々の動物について見てみると，傾向は明らかに一定のパターンを示
すが，測定ごとにかなりの変動がみられること，個体差が大きいなどの問題があり，今後さらに統計処理にたえうる実験例を重ねた上で判断する必要があろう。
今回，同じC−57BL／6J−dy系ではあるが，東北大と実験動物中央研究所の二つのコロニーの動物を使用した。東北大のマウスの平均寿命の14．3週（表1）に比べ，後者は約23週（表2）であった。この差の原因として，両者は元来一

23．筋ジストロフィーマウスにおけるESTの効果に関する研究

つのコロニーから出たものではあるが，10年以結上も別々に継代を重ねる間に性質が少しずつ変わって来た可能性が考えられる。また，実験−
1と2は同時期に同施設で実施されたものではないため，飼育環境の差も考慮する必要がある。
実験−2においては5回に分けて入手した動物を使用したが，1回に入手出来る匹数が少な
いため統計学的には有意ではないが入手ごとの平均寿命に多少差がみられた。また，早期死亡例が多く，入手ごとに各群へ均等に配分することができなかった。このことが実験−1と異なりESTの効果が認められなかった原因の一つとも考えられる。各群とも全く同一条件になる
ようにじゅうぶん配慮し，さらに一群の動物数を増した上で検討を重ねる必要があると思われる。

語

1．ESTの混餌投与により，筋ジストロフィーマウスの自発運動量の減少を遅らせる傾向が認められた。しかし，個体差が大きく，より明瞭にするには一群の例数を増して検討する必要があると思われた。
2．延命効果に関しては，実験−1ではESTの効果は有意であったが，さらに用量依存性など詳細な検討が必要である。
参考文献
1）大関正弘：筋ジストロフィーハムスターに対するE−64−dの効果（共同研究），厚生省新薬開発研究事業「微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和57年度報告書，235−284，1983．

189

Ⅴ

臨

床

試

験

24．ESTの第1相臨床試験一続報−

宮原

25．ESTの早期第2相臨床試験

杉田 秀夫
官武
正

正

24．ESTの第1相臨床試験一続報−

＊
＊
＊

的

昨年度，健常成人男子にESTを空腹時1回100mg経口投与し，その際の安全性および生体内動態を検討した1）。
今年度は，本剤を実際の治療の場で用いる際に必要な基礎的知見を得るため，さらに用法・用量を変えてその際の安全性および生体内動態の検討を行った。
試験方法
1．被験者
被験者は，ESTについて安全性，薬理学的諸性質および本試験の主旨，方法，スケジュー
ルについて十分な説明を受け，本試験についてよく理解したうえで参加を志顕した健常成人男子の中から選抜した。
被験者の選抜は健康診断により行い，医師にょる診察および各種臨床検査の結果，本試験に影響を与える可能性のある病歴を持たず，本試験に参加することに問題ないと判断されたものを各段階6名ずつ選んだ。
なお，各段階の被験者の背景として，年令，
身長，体重を示した。
2．枚験薬
被験薬はEST50mgを含有するゼラチン硬カプセル剤（Lot．R13201，Lot．R13526）を

豊本﹂

原

＊

友之弘

貞真正

傑島閑

日

下官大

研究協力者

宮

正＊
原

敬

三＊

今

井

健

郎＊

田

英比古＊

亀

谷

雅

洋＊

勝

順＊＊

使用した。
3．用法・用量
各段階の用法・用量を表1に示した。
第2段階では100mgを，第3段階では200mgを食後30分に適量の水にて服用させた。
第4段階では1回投与量を100mgとし，食後1日3回服用させた。
第5段階では食後1日3回の服用を7日間反復させた。1回投与量は第4段階同様100mgとし，7日目は1回の服用のみとした。
4．主な検査項目
安全性については，臨床検査として血液検
査，尿検査を検討し，その他の検査項目として
血圧，心拍数，体温，拉九 心電図，自覚症状を検討した。
薬物の生体内動態として血清中薬物濃度，尿中排泄を検討した。
なお，表2に主な検査項目を示した。
5．試験スケジュール
各段階の試験スケジュールを図1〜4に示した。投薬，食事，臨床検査，諸検査，採血，採尿は，図1〜4に示したスケジュールに従って実施した。問診および被験者の観察は随時行い
被験者の健康状態の把握に努めた。
6．被験者の管理
被験者は各段階とも試験前日より同一環境，
同一条件下とし，食事は統一食，飲料もできる
だけ質・量ともに統一のものとした。

＊ 東京慈恵会医科大学第二内科＊＊大正製薬株式会社総合研究所

7．定量法
血清中および尿中の薬物の定量は島津LKB−
193

Ⅴ

臨

床

試

験

表1EST第1相臨床試験
用

法・用

被

量

験

者

年 令＊ l 身長＊（cm）l 体重＊（kg）

1llOOmgx1回

空腹時

36．5±5．21173．0土4．9159．3土9．9

2

llOOmgx1回

食後35．2±6．31173．0土3．7158．8土5．7

3

l

食後l

27．3土4．81168．3土4．1159．0土4．0

4

llOOmgx3回／日

5【100mgx3回／日×7日

200mgx1回

食後125．3土1．5l170．7士1．8164．0士5．6
食後l

25．5士2．1l170．8土4．2l

61．0±5．3＊Meanj＝S．D．，n＝6

表2

主な検査項

目

薬物生体内動態：血清中濃度，尿中排泄量
血液一般検査：白血球数，赤血球数，ヘモグロビン，ヘマトクリット，血小板数，
網赤血球，血液像
血液生化学検査：GOT，GPT，LDH，AトP，LAP，γ−GTP，CPK，BUN，クレアチエソ，
尿酸，総コレステロール，中性脂肪，血清総タンパク．タソバク分乱
Cl，Na，K，Ca，P
尿検
査：タソバク，糖，潜血，ウPビリノーゲソ，pH，沈波その他：血圧（臥位），心拍数，体温，捉九心電図，自覚症状

9，600ガスクロマトグラフー質量分析計を用い，大正製薬（株）総合研究所において行った。
試験成績
1．安全性
（1）臨床症状
臨床症状として血圧（臥位），心拍数，体温撞力の経時的変化を図5〜8に示した。いずれの項目においても，各段階を通じて薬剤によると考えられる変化は認められなかった。
心電図についても投与前，後を比較して変化は認められなかった。
また，各段階とも試験期間を通じて自覚症状を訴える例はなかった。
（2）臨床検査成続
各段階の臨床検査成績を表3〜6に示した。
血液一般検査においては，各段階とも検査値の変動は正常範囲内であった。
血液生化学検査においては，BUNが第2段階でわずかに正常域を超える例が認められ，第5段階では増加の傾向が認められた。しかし，
194

いずれの例においてもクレアチニソに変化はな
く，腎への影響を示すものではないと判断された。その他の項目については，各段階とも薬剤による検査値への影響は認められなかった。
血清電解質においては，第4段階投与中（3回日投与後3時間経過時）検査のKが，血液保有中の溶血のため，6例全例で異常値が認められたが，これ以外は各段階とも正常域内の変動であった。Cl，Na，Ca，Pについては各段階とも正常域内の変動であった。
尿検査では，各段階ともほぼ正常値を示し薬剤によると考えられる影響は認められなかった。
2．生体内動態
第1段階については，昨年度報告したが，比較して論ずるため同時に示した。
図9に第1〜第3段階におけるEST投与後の血清中E−64−C濃度推移を，図10に累積尿中排泄量を示した。食後投与では，空腹時投与に比較して最高血清中濃度到達時間（以下Tm．x）
は遅れ，最高血清中濃度（以下cm．x）は高値

24．ESTの第1相臨床試験一続報−
1
試験 開始後時
間

日−1 0 1 2 3 4l Hll l t l

6
l

2

日
8
l

12
l

／
′′

日 日
24
t

◎

投

薬

食

事

●

臨床検査

△

△

諸 検 査

★○

（l O

●

●

●
△＿

（
〉・

○

採

血

日 日 H

l

†

†

t

採

尿

1−

●

■

■

・

■

〜←・
．
・
．
・
．
・
．
」

血圧，心拍数，体温，握力
血圧，心拍数，体温，握力，心電図＊（3

図1第2段階試験スケジュールく100mgxl回
1日

試験開始後 −1 0 1 2 3 4時
間
l lll l l l
投

薬

食

事

●

臨床検査

△

諸 検 査

†

6
l

8
l

食後〉

目 ￣

2

12
l

／′
／

日 目
24
l

◎

★

●

●・

●

△

△

○

○

（
｝

○

（
｝

日

†

†

†

・

・

・

採

血

† †日

採

尿

い

・

1

†
〜
ト．
−
．」

：血圧，心拍数，体温，握力＊（3 ：血圧，心拍数，体温，握力，心電図
図2

第3段階試験スケジュール〈200mgx1回を示した。また，尿中排泄についても，回収率は食後投与において高かった。
食後1∝）mg投与と200mg投与の間には，血清中濃度，尿中排泄量ともに用量相関性が認められ，投与後12時間では血清中に薬物は検出されなかった。
第4，第5段階の血清中濃度推移および累積
尿中排泄量を図11〜14に示した。第4，第5段
階ともTmばは1回目投与後約2時間，2回目食後〉

投与後約3時間，3回目投与後約6時間と徐々に遅れる傾向が認められた。また，7日間反復投与を行った第5段階において，試験期間を通じて前日投与された薬物が翌朝血清中に検出されることはなかった。さらに，7日目の血清中濃度推移は単回投与の場合と同様で，反復投与を行っても吸収，排漸こ影響はないことが確認された。
表7に各段階のAUC，cm＆X，TmLⅩ，Tl色およ
195

Ⅴ

1

11

臨

床

試

験

日

2

11

ll ll l ll l ll l
l
試験開始後
ー
10 2 3 6 89 12 1115 18
21
時
間
（
0）
（
2）
（
3）（
6）
（
12） （
18）
（
0）
（
2）
（
3）（
6） （
12）
投

薬

◎

◎

食

ホ ●

●

臨床 検 査

日

3 日日

l
30
（
24）
（
18）

l
36
（
30）
（
21）

●

●

′−

−

48 50
（
42）
（
44）
（
36）
（
38）

◎
●

●

△

●

△

△

諸 検 査 ★○

0

採

血

† 日

日 † H

採

尿

l・

・

l

†

・

（
｝

○
†

†

†

†

l

l

l

／リ

l

血圧，心拍数，体混，握力＊（芸… 血圧，心拍数，体温，握力，心電図
図3 第4段階試験スケジュール〈100mgx3回／日 食後〉
1

日

‖

2

日

目

3 − 6 日日

7

日

日

8 日日

′
l l l ll l lll

試験開始後 l l ll l l l l l lH−
1 0 23 6 910 12 15
時
間
（
0）（
3）
（
4）
（
0）（
3） 18
（
6）

l ll lH l ． ｛
24
（
0）
（
2×3）（
6） （
12） （
0）
（
2X3）（
6）

（
12） （
0）
（
2X3×4X6）
（
8）（
12）

投

薬

◎

食

事 ●

◎

◎
●

◎
●

●

◎
●

◎
●

◎

◎

◎

●

●

●

臨床検 査 △
諸 検 査書○
採

血 I

採

尿

（
｝
H

† H

い

＊（3

図4

I

H 日

日 †

！

−

H

I

（
24）

◎
●

●

●

●

△

△

○

○

† 川

日

桝 ′
．」一 一 一 旬 刃

†
・

†
．

l

血圧，心拍数，体温，握力
血圧，心拍数，体温，握力，心電図
第5段階試験スケジュール〈100mgx3回／日×7日

び尿中排泄率をまとめた。この解析結果からも空腹時投与に比べ，食後投与の場合吸収速度は遅れ，吸収は良好となることが示唆された。
なお，第4段階のAUC，Cmax，Tm＆Ⅹ，T鳩は採血ポイントの関係上算出不可能であった。

考

食後〉

察

1．安全性
臨床症状については，各段階とも自覚症状を訴える例はなく，血圧（臥位），心拍数，体温，捉力についても本剤による影響は何ら認められなかった。
血液生化学検査の各項目のうち，BUNが2

196

24（hr）；■

・JN什

拡張期庄mHm0000

心拍数︵回／分︶0−−−−一一一ONo．1
…

；No．2

ト…tNo．4△一一一七No．5

D・…・屯No．3▲一一一▲No．6

図5 第2段階 臨床症状
197

g
HH
m
m

心拍数︵回／分︶

‡

2さ呵

70
0
6
− ・・・・・・・・・・ロ

0
5

体温の変化
投与前1

3

6

0−−−一・一・・・一No．1■一一…t No．4

こ

こNo．2

ムー一・d No．5

D…・・□No．3

一一一▲No．6

図6 第3段階 臨床症状
198

24．ESTの第1相臨床試験一続報一

収T叫・・柚■如■

拡張期庄
g

H
m
m

心拍数︵回／分︶
0

No．1

■＝‥−t

0

●・．・．・．・．・．●

No．2

d一一一A

0

D…H1ロ

No．3

456

NNN

〇一一一一

▲一一一1

図7 第4段階 臨床症状
199

Ⅴ

臨

床

試

験

血圧の変化

∴川畑帖■

拡張期庄mmHg

心拍数の変化0000

心拍数︵回／分︶

体温の変化
78（day）＿一一一一一一凸一一一一一4￣−■−■一一，●，−■■

握力の変化
7

8（day）「＋≡∃三三二三二「〇・・・一一一No．1△一一一dNo．5

D…・・qNo．3

一一一No．6

図8 第5段階 臨床症状
200

ト…一No．4●一一一一●No．2

24．ESTの第1相臨床試験一続報−

琵琶湖慮塞題 藍肇N轄

1−の彬

竪冨忠貰由

寧軍芸器由 ︵N 糧ヰ弱 ︵t201

むdOp10日 ︵寸忘昼鞘堂壁遮 整褒N誌 NIの瞞臣皆芯麗坤弱 ︵M霊堂N悪心由 ︵N 彊ヰ弱 ︵t

202

験
試
床
臨
Ⅴ

24．ESTの第1相臨床試験一続報−

電撃鞘堂壁題 整褒N誌 のーの僻琵皆寸N剋坤弱冨普N寒ヰ弱 ︵N彊小輩 ︵t203

琵琶瑠麗産蜃蓋葛の忘T寸鵬

臣望寸N悪ヰ琶臣雷の弱ヰ弱 ︵N荘小母 ︵l

204

験
試
床
臨
Ⅴ

24．ESTの第1相臨床試験一続報−

竃軍制堂璧題 整褒S琵 NI寸僻軍盲裏芸由

臣皆の憩や弱 ︵N程ヰ弱 ︵t205

電撃糊堂壁題 整肇C忘 の1寸瞞

臣皆寸N麗ヰ弱 ︵の臣皆の感心由 ︵N彊小史 ︵t

206

験
試
床
臨
Ⅴ

24．ESTの第1相臨床試験一統報−

肇軍曹警慧訟

出鼓療琵皆罵潜堂監叫弱 ︵のlIの僻匡皆ST弱望琶ヰ弱 ︵N

橿小出 ︵t207

翠冨恵慧蒜講義

環軍国畢讐越 中慧讐芸棺 N−の掘

臣皆St寓意監小型 ︵N 彊ヰ婁 ︵t

208

験
試
床
臨
Ⅴ

24．ESTの第1相臨床試験一続報−

軽出 ︵寸革質恵慧蒜昆虫

電撃榊巡壁題 整褒寸淀 のIの僻︵M

写冨ヨ澄蒜器由 ︵N荘ヰ弱 ︵T209

琴慧憲貰虚

血慧警姦

11竺堆

讐崇義元

︵の

皿皿卜鰯鑑 ︵N 彊ヰ弱 ︵l

210

験
試
床
臨
Ⅴ

24．ESTの第1相臨床試験一続報一

電撃榊塞壁題 整褒S漂 N−￠僻

Ⅱ正平蕗枯 ︵の皿ロト虜拡 ︵N拓坤弱 ︵t211

電撃糊悠壁題 整肇S珠 のーり掘

皿Ⅱや蕊露 ︵のⅡロト鰯結 ︵N 緯ヰ弱 ︵t

212

験
試
床
臨
Ⅴ

24．ESTの第1相臨床試験一統報一

7
0
6
0
5
0
4
0
3
0

︵tu＼苫二慧翌蒜竃

2
0
1
0

0
0
0

︵uE︶嘲磐蓋甘慮憲媒

0

図10 尿中E−64−C累積排泄量

段階，5段階で投与後わずかに正常域を超える例が認められるが，クレアチニソには変化は認
められず，試験期間中の水分摂取状況や食事の影響によるものと考えられた。また，尿検査においても腎への影響を示すような結果は認められなかった。しかしながら，今後さらに臨床試験を進める際は，検査を実施し確認しておいた方がよいものと考えられる0
213

Ⅴ

臨

床

試

験

図11第4段階 血清中E−64−C濃度推移く100mgx3回／日 食後〉

0
7
0
6
0
5
0
4
0
3
0
2

︵uE︶瑞宴蓋を慮環礁

0
1
0

6

12

24

時 問（hr）
図12 第4段階 尿中E−64−C累積排泄量

一方，数種の動物を用いて実施された亜急性毒性試験のうち，ラットにおいて特異的に認められたGOT，GPT活性の上昇は2），各段階を通じ全く認められず，今回の用法・用量の範囲
では肝に対する影響はないものと判断された。
214

以上の通り，本試験の結果からは安全性に関して何ら本質的問題は認められなかった。しかし，本剤は実際に治療の場で用いる場合，進行性筋ジストロフィー症がDuchenne型など小児期に発症する場合が多く，この治療には長期

24．ESTの第1相臨床試験一統報一

（投与）l

十
1

Hl

十
日

2

日

日日

什十
3

叫l

日日4日日5

什十
日日6

Hl
日日

7

日

図13 第5段階 血清中E−64−C濃度推移〈100mgx3回／日×7日・食後〉（投与）十十十

十十十

十十十

十十十

十十十

十十十

十

試験 日（日）図14 第5段階 尿中E−64−e累積排泄量215

Ⅴ 臨 床 試 験
表T Pharmacokineticparameters（Mean土S・D．，n＝6）

f￣lElTg盃丁盃㌃l￣転Tj「l￣宗ノ￣
l

i

こ

：

！

1．35±0．2510．44土0．04

1．2土0．711．3土0．2125．2土3．7

1．81土0．4510．53±0．12

3．2土0．811．4土1．0132．8士3．5

3．30土0．6610．85土0，23

3．3土0．512．0土1．4128．0士5．0

28．4士4．5
1．48土0．1610．54土0．08

2．2土0．411．0土0．2131．6±1．6

AUC：Area under concentration curve
CnaI：Maximum concentration
Tmは：Time to maximum concentration
T城：Serum half−life投与が必要となる。この場合，いきなり長期治療試験に入るのではなく，小児患者における安
全性を確認しておくことが望ましいと考えられる。
2．生体内動態

たがって，治療試験における用量の決定に際しては，患者においても本剤が十分に吸収されることを確認する必要があるものと考えられる。

ESTは経口投与により良好な吸収を示し，吸収後生体内では，酵素阻害活性においてより

1．安全性

活性型のE−64−Cとして検出されることは昨年度報告したl）。今年度さらに用法・用量を変え検討した結果，空腹時投与と食後投与との比較において，食後投与ではTm．又は遅れb＜0．05），
cm＆王は同等あるいは高値を示した。AUCおよび尿中排泄率については有意（いずれもp＜0．05）に食後投与で増加を示したことから，ESTは食後投与の方が望ましいと考えられた。
食後100mg投与と200mg投与の問には，cmは，AUC ともに用量相関性が認められた。
反復投与した第4段階，第5段階の結果からも，本剤は血清中からの消失は比較的速やかで，蓄積性もないことが確認された。
これまで我々は健常人について本剤の生体内動態を検討してきたわけであるが，筋ジストロ
フィー症患者では便秘症状を呈するものが多い
ことが知られており，健常人に比較して消化管の運動性が低下していることも考えられる。し

216

ま

と

め

血液検査，尿検査，一般症状，心電図など各
種検査の結果，本剤によると考えられる影響は認められなかった。
2．生体内動態
ESTは経口投与により良好な吸収を示し，
生体内ではE−64−Cとして検出された。
空腹時投与に比べ，食後投与で生体内利用性は向上した。また，反復投与を行っても，吸収・排泄パターンは単回投与の場合と同様であり，体内への蓄積性も認められなかった。
文献1）宮原正：E−64の第1相臨床試験一第1段階−，
厚生省新薬開発研究事業「傲生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和57
年度研究報告書，147−155，1983．
2）大関正弘：E−64−dの亜急性毒性に関する研究，
厚生省新薬開発研究事業「微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和57
年度研究報告書，27−54，1983．

25．ESTの早期第2相臨床試験

杉

田

秀

夫＊

官

武

正＊＊

研究協力者 石 原 停 幸＊＊＊ 富 谷 信 行＊＊＊＊ 桑 原 武 夫＊＊＊＊日

的先に第1相臨床試験において，健常成人男子にESTを単回投与から反復投与（1日3回7日間）まで行った。その結果，安全性については何ら問題はなく，生体内動態についても確認された1・2）。
今回，本格的な治療試験への移行に先立ち，筋疾患患者に対する本剤の安全性および健常成人と比較した生体内動態についての検討を行った。

試験方法
試験内容を表1に示した。
あらかじめ班内にPIlaSeII小委員会（今堀，江橋，福原，杉田，官武，石原，大関）を設け，試験計画について十分な検討を行った。
1．実施施設
本試験は国立療養所新潟病院および国立療養所東埼玉病院で実施した。
2．対象患者
A段階はDuchenne型筋ジストロフィー症（以下DMDと略す）を含む成人筋疾患患者を対象とした。B段階およびC段階は，独立歩行可能なDMD患者を対象とした。
＊

国立武蔵療養所神経セソクー

なお，各段階とも本試験について説明を受け．
本人または保護者が自主的に本試験への参加に同意し，医師が投与前に臨床検査を実施し，本試験に参加することに問題がないと判断された患者を対象患者として採用した（表2，3）。
3．試験スケジュールおよび検査項目
A，B段階は単回投与とし，朝食後30分に100mg／40kg体重（平均2．1および2．3mg／kg
体重）を投与した。安全性の検討を目的とし，投与前および投与後1週間以内に臨床検査（血液，尿検査）ならびに血圧，心拍数，体温および心電図を実施した。また，生体内動態の検討のために投与前，投与後2，4，6（A段階のみ），8，24時間に採血し，24時間蓄尿を行った（図1）。
C段階は，1日1回朝食後30分，7日間反復授与した。用量については，B段階の血清中濃度の結果を参考にし，筋肉の崩壊に関与していると考えられる骨格筋CANPを理論上十分に阻害しうる量として4．0mg／kg体重（平均3．6mg／kg体重）とした（図2）。臨床検査は，投与開始時および最終投与後24時間に実施した。生体内動態の検討のために投与開始時，最終投与後2，3，6，24時間または3，4，8，24
時間に採血し，最終投与後24時間蓄尿を行った（図3）。
主な検査項目を表4に示した。

＊＊＊ 国立療養所東埼玉病院

4．試験薬剤
EST25mgおよび50mg含有カプセル＊＊＊＊国立療養所新潟病院（Lot．R13819，R13818）を使用した。

＊＊ 新潟大学医学部脳研究所

217

Ⅴ

臨

床

試

験

表1早期第2相臨床試験内容
段

階

t

対

象

l

用

法・用

量

筋疾患患者（含むDucllenne塾）
成人

2・1mg／kg体重×1回（単回投与試験）

Ducbenne型患者
小児（歩行可能）2．3mg／kg体重×1回（単回投与試験）

Ducbenne型患者
小児（歩行可能）3・6mg／kg体重×1回／日×7日（反復投与試験）

表2 A段階 患者の背景
疾患

投体 重（kg）

名与量

A I Ducbenne型

22

1

44．6

B l

〟

24

1

47．0

100

1

2．1

C l

〝

20

1

51．2

100

1

2．0

D l

〟

23

1

31．0

75

1

2．4

E l

〝

20

1

21．3

50

1

2．3

（9l X−W

52

1

46．0

100

1

2．2

G

X−W

27

I

34．2

75

1

2．2

H l

筋緊張型

51

1

49．0

100

1

2．0

I l

〟

51

1

63．0

100

1

1．6

24

1

47．0

100

l

l

⑦l Becker型

mg′bodylm…‡；glOO l

A〜E（Ducbenne型）l21．8土1．8139．0土12．5

85l2・1
2．2土0．16

A〜J（筋疾患患者）

l31．4±13．9l43．4土11．7

90

12．1士0．22

健常人（100mg食後）l｝

35．2土6．3 158．8土5．7

100

11．7土0．16

健常人（200mg食後）l）

27．3±4．8 159．0土4．0

200

1

○歩行可能
1）第1相臨床試験

3．4土0．24

平均±S．D．

表3 BおよびC段階 患者の背景
年

体

令

重

（kg）

投

与

mg／bodyl

量

ふg／kg

16

1

9．6土1．7

1

24．2土7．155

l

2．3土0．31

12】

9．7土2．0】

24．4土3．6

87．5

1

3．6土0．43

平均±S．D．
218

25．ESTの早期2相臨床試験
表4 主な検査項目
薬物生体内動態；血清中濃度，尿中排泄量．
血液一般検査＊；赤血球数，白血球数，ヘマトクリット・ヘモグロビン・血小板数
血液生化学検査：GOT，GPT，ALP，I・DH，γ−GTP，CK，BUN
尿 検 査：pH，タンパク，糖，ウロビリノーゲソ，沈温潜血そ の 他；血圧，心拍数，体温，心電図＊＊：A段階のみ実施
1

試
験
前
服

薬

食

事

0
l

日
2
l

4
l

目
6
t

2

日 日
24hr
l

8
l

試
験
後

廿
●

●

●

●

○

○

諸 検 査書 ◎◎臨 床検 査

l

採

血

採
（蓄

尿
尿）

l

l

l （げ ■l

＼
l

卜−

…

l

場：血圧、心拍数、体温、心電図
場☆：A段階のみ実施
図1単回投与試験（A，B段階）スケジュール

血清中濃度 （早期第2棚小児患者）

EST約2mg／kg p．0．，＞最高血清中濃度（E−64・C）
骨格筋中薬物移行の割合 （筋ジスハムスター）＊

十E−64・C河芸霊芝冨芸芸霊，9監禁tiss。。ト［李］推定小児患者骨格筋中E−64−C濃度
0．16nmol

1，2より0・30〝g′mlX意＝0・05〃g／gtissue

MW314（E・64・C）

くE64−C〉

骨格筋中CANP最 （筋ジスチキン）＊＊
0．125nmol

約10／ g／g tissue

hnV80，000（チキンCANP）

くCANP〉＊ 大関正弘：昭和57年度研究報吾＝乱127−146，1983・＊＊ 給木紘一：昭和57年度研究報：−i書，173−178．1983．
図2

投与量設定の根拠
219

Ⅴ

臨

床

試

験

表5 臨床検査成績（C段階）
GOT（Karmenu）JGPT（Karmen。）L

前l
11

後l

前l

後

ALP（K−A．u）

CK（mu／ml）

前

l

前l

後

γ−GTP（mu／ml）

後

前l

後

9311491191146

2，64213，354

8．9110．31

51

6

2

1

8311471061135

1，4911

2，340

12．4114．61111

9311121157

1131135

3，4061

3，795

13．3114．61

91541144921

98

1，62111，528

811

941

97

5

1

91

6

11311

7

11741142811101105】10110．8111．4111113
99．9110．31

61

61541132

3，06912，830lll．6l12．6l

6l

71211128

3，11812，502I

9．9lll．01

71

8

93

1251127

2，332l8．719．0】71

96811157711101，27111，277113．3112．81

265

981

2261

333

15．8116．81

2，●175

3，6071

3，808

2，063l

7

ll l

1301

2191

2951

276

3，09113，747110．8lll．41

121

791

731

701

71

2，296l

11日
1
崖
0

服薬

0

7 日日
0 23 6
0 34

0

0

分 0

0

71

8

8日
日
24hr

8

24hr

0

検査
■○

○

叩
群l

＝ l

乙l
群

H

採 妹

8112

2，043lll．6l12．Ol ll l ll

21
拍311日
4日
日
5日
臼
6日
日

乙
0
群■

採血

1

1

1，9221

9

7

l

l
l

l

l

＊：血液検査、尿検査、その他
図3 反復投与試験（C段階）スケジュール

試験成績
1．臨床症状A，B段階において血圧，心拍数，体温および心電図について検討した結果，本剤による影響は認められなかった。
また，全段階を通して自覚症状に何ら異常は220認められなかった。
2．臨床検査成捷（1）単回投与試験
A段階においては，血液，尿検査に本剤によると考えられる変動は全く認められなかった。
B段階においては，試験終了後一部の症例で筋由来と考えられるCK，GOT，GPTの上昇

25．ESTの早期2相臨床試験
65（2．1mg／kg）
4〇・・．・．・・一：Duchenne型患者（N＝5）（2．2mg／kg）

沖・…メ：経常成人男子（N＝6）

3100mg／body（1．7mg／kg）

2︵lE＼uヱ 璽誓U・芯・凹与雲一号●一一一●：筋疾患患者（N＝10）

平均±S．D．

4

6

8

12

時 間（hr）
図4 EST経口投与後の血清中E−64−C濃度（A段階）

4（2．3mg／kg）

0−−0：成人Duchenne型患者（N＝5）（2．2mg／kg）

3△一一一べ：健常成人男子（N＝6）
100mg／body（1．7mg／kg）
2︵tE＼uヱ 堅誓U・寸？凹÷誓一号

・一一●：小児Duchenne型患者（N＝16）

平均±S．D．

T￣￣￣−一山

2

4

6

8

12

24

時 間（hr）
図5 EST経口投与後の血清中E−64−C濃度（B段階）が認められたが，本剤との因果関係は不明である。
（2）反復投与試験
血液検査（末梢血，血清電解質）および尿検査については試験前後で変動は認められなかった。血清生化学検査において一部にB段階と同様CK，GOT，GPTの上昇が認められた（表5）。
3．生体内動態（1）血清中濃度
221

Ⅴ

臨

床

試

験

表6 薬物速度論的解析＊：早期第2相試験におけるAUCは，投与後12時間の血中濃度を0として算出。

平均土S．D．

AUC：Area under the serum concentration curve
Cznaェ：Maximum

concentration

T．Z，aI：Time to maximum concentration
T姥：Serum half−life432ニ∈＼ぎご撃鸞・琴Ha紐二号

図6 EST経口投与後の血清中E−64−C濃度（C段階）

EST経口投与後は健常成人男子の場合と同様，血清中にE−64−C として検出されるため
E−64−Cの濃度推移を追った。
成人筋疾患患者（A段階）では，最高血清中濃度（CmaⅩ）は0・47／唱／ml，血清中濃度曲線
222

下面積（AUC）は1．79FLg・hr／ml，最高血清中濃度到達時間（Tm．x）は3．8hr であり，健常成人男子（100mg／body，食後）とほは同様であった。
また，成人DMD患者においてほcm＆X，AUC

25．ESTの早期2相臨床試験

0

0

0

悪や璧↑dU＼巳U000

悪や璧↑OU＼出U

10

20

30

10

40

CKとGOTの関係（C段階）が健常成人男子と比べて低い傾向があったが，血清中移行に本質的な違いはないことが確認された（図4）。
小児患者単回投与（B段階）の検討結果を図5に示した。小児DMD患者においては成人
DMD患者とほぼ同様の血清中濃度推移を示した。
ESTl週間反復投与後の血清中濃度推移（C段階）は，単回投与と比較して同様のパターンを示し，反復投与による蓄積性は認められなかった。また，B段階における2．3mg／kg
体重投与と比較してcm＆Ⅹ，AUCに用量相関性が認められた（図6）。
（2）尿中排泄率
尿中にはE−64−Cとして排泄され，健常成人男子の場合と同様に各段階とも投与後24時間以内に投与量の約30％（EST換算）が尿中へ排泄された。
なお，薬物速度論的解析結果を表6に示した0
考

察

1．安全性
血圧，心拍数，体温，心電図，自覚症状などの臨床症状には，本剤の投与によると考えられる影響は全く認められなかった。
臨床検査成続については，血液検査（末梢血，
血清電解質），尿検査に本剤によると考えられ

30

40

CK／GPT投与荊CK／GOT投与前

図7

20

図8

CKとGPTの関係（C段階）

る変動は認められなかった。血清生化学検査についてもほとんどの症例で本剤によると考えられる変動はなかったが，一部の症例でCK，GOT，GPTの上昇が認められた。
C段階において認められた変動について，解析を行った結果を図7，8に示した。CKとGOT，GPTの変動には高い相関性が認められ
GOT，GPTの上昇は筋由来の可能性が高いと考えられた。
ラット，マウスの亜急性毒性試験3）およびラットの慢性毒性試験4）においてGOT，GPTの上昇が認められているが，これらの変動はCKとの問に相関を認めていないことからゲッ歯頬での変動と，今回の一部の症例で認められた変動とは原因が異なると考えられた。
また，筋ジストロフィー症患者におけるCX，
GOT，GPT値は掛こ初期では非常に高値を示し，かつ変動が大きい。C段階の患者について
過去1年間のこれら検査値の変動を調査した結果，今回の値はこの変動範囲内であり，B段階の一部にみられた変動も，ほぼ1年間の変動内にあった。
以上より，ここで認められたGOT，GPTの上昇は本剤に起因するとは考えにくいが，GOT，GPTが骨格筋および肝の両方に由来することから，今後の治療試験においては肝に特異的なマーカーを設け，安全性をさらに確かめること
223

Ⅴ

臨

にした。
2．生体内動態床試験（成人，小児）における安全性および生体内動態の検討を行うために，成人筋疾患患者に筋ジストロフィー症は，骨格筋の崩壊を生ぜ2・1mg／kg体重を1回，また小児DMD患者

しめる疾患であるが，症状が進行し，起立，歩行不能になると腸の煽動運動も不良となり，薬物の吸収が健常人と異なり，それにより生体内に2・3mg／kg体重を1回および3．6mg／kg体重を1日1回7日間反復投与した。

動態に影響を与える可能性が考えられる。今回，本格的な治療試験に移行する前段階として，成人患者における生体内動態を検討した。
また，動物試験の結果より，本剤は発症初期から投与することが効果的であるとの示唆が得られていることから，今後の臨床試験では，小児患者が対象となる可能性が考えられる。一方，小児における本剤の生体内動態は全く未知であり，成人と異なる挙動を示す可能性もある
ため，B，C段階として小児患者における生体内動態の検索を行った。
成人および小児患者にESTを経口投与した場合，第1相臨床試験の結果と同様に，ESTは体内で加水分解を受け，活性体E−64−Cとして血清中および尿中に検出された。また，血清中濃度推移には，いずれの場合も本質的な相違はなく，用量依存性も認められ，さらに1週間
反復投与後の血清中濃度推移は単回投与の場合と同様で，反復投与を行っても本剤の吸収，排泄に影響はないことが確認された。一方，投与後24時間までの尿中回収率についても，健常成人男子の場合と同様約30％であった。
DMD患者においては，CmLⅩ，AUCが低い
傾向を認めたが，尿中への排泄率は健常成子男子と同じであった。動物試験において，筋ジス
ハムスターでは正常ハムスターに比し骨格筋，心筋への組織移行が良好である5）ことから，ヒ対して，本剤によると考えられる影響は認められなかった。

トの場合でもDMD患者の方がE−64−Cの組織移行が良い可能性が考えられる。
まとめ

EST単回および反復投与時の筋疾患患者

224

安全性に関して，臨床症状および臨床検査に

生体内動態に関しては，経口投与により生体内ではE−64−Cとして検出され，健常人と比べ吸収・排泄に本質的な相違は認められなかった。また，反復投与後も吸収排泄パターンは単回投与の場合と同様であり，体内への蓄積性も認められなかった。
以上より，筋疾患患者における生体内動態が確かめられ，安全性についても問題なかった。
文献1）宮原 正：E−64の第1相臨床試験一第一段階−，厚生省新薬開発研究事業「微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和57年度
研究報告喜，147−155，1983．
2）宮原 正：EST第1相臨床試験一続報−，厚生省
新薬開発研究事業「傲生物の二次代謝産物に由来す
る難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和58年度研究報告書．
3）大関正弘：E−64−dの亜急性毒性に関する研究，
厚生省新薬開発研究事業「傲生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和57年
度研究報告書，27−54，1983．
4）大関 正弘：ESTの侵性毒性に関する研免厚
生省新薬開発研究事業「傲生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和58年度
研究報告書．
5）大関正弘：E−64−dの生体内動態（′こ関する研免厚生省新薬開発研究事業「微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究」昭和57年
度研究報告書，127−146，1983．

微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究班
班 員 および関係者名簿
氏

名

l

施

設

名

l

所

在

地

主任研究者

東京都老人総合研究所〒173板橋区栄町35−2〒444岡崎市明大寺町字西郷中38

勝沼 信彦

岡崎国立共同研究機構生理学研究所
分子生理研究系神経化学研究部門
国立武蔵療養所
神経センター 疾病研究第一部
徳島大学医学部附属
酵素研究施設 酵素化学部門

西塚 春美

神戸大学医学部第二生化学〒650神戸市中央区楠町7−5−1

今相 和友（班長）
分担研究者

江橋 節郎
杉田 秀夫

福原 武彦（幹事） 東京慈恵会医科大学第二薬理学〒187小平市小川東町2620〒770徳島市蔵本町3−18−15〒105港区西新橋3−25−8

小沢瑛二郎

国立武蔵療養所
神経セソタ一 機能研究部〒187小平市小川東町2620

野村 達次

実験動物中央研究所〒213川崎市宮前区野川1430

北川 晴雄（監事） 千葉大学薬学部
薬効・安全性学講座薬物学〒280千葉市弥生町1−33

寺尾 寿夫

帝京大学医学部第一内科〒173板橋区加賀2−11−1市原明

徳島大学医学部附属
酵素研究施設 酵素病理部門〒770徳島市蔵本町3−18−15

宮武正

新潟大学脳研究所 神経内科

〒951新潟市旭町通一番町757

石浦 章一

国立武蔵療養所
神経センター 疾病研究第一部〒187小平市小川東町2620

柴田 宜彦

大阪府立成人病センター 第一内科

〒537大阪市東成区中道1−3−3鈴木 紘一

東京都臨床医学総合研究所
遺伝情報部門〒113文京区本駒込3−18−22

野々村禎昭

東京大学医学部第一薬理学〒113文京区本郷7−3−1

大関 正弘（幹事） 大正製薬㈱ 総合研究所〒330大官市吉野町1−403

沢田 二郎

大正製薬囲 総合研究所〒330大官市吉野町1−403

会沢 孝雄

大正製薬囲 開発部

〒171豊島区高田3−24−1

里書栄二郎

国立武蔵療養所 神経センター〒187小平市小川東町2620

青柳 高明

微生物化学研究所〒141品川区上大崎3−14−23

埜中 征我

国立武蔵療養所
神経セソクー 微細構造研究部〒187小平市小川東町2620

石原 博幸

国立療養所東埼玉病院〒349−01蓮田市大字黒浜4147

班友