厚生

省

神経疾患研究委託費

筋ジストロフィー症モデル動物の開発に関する研究

野村班

昭和60年度研究報告書

昭 和 61年 3 月

研究報告書作成にあたり
厚生省神経疾患研究委託費による「筋ジストロフィー症動物の開発・供給に関する研究」玉は昨
昭和59年度をもって3年間の研究期間を終了し、一応の成果をあげることができました。しかし、ヒト疾患のモデルとなる動物の開発は一朝一夕にできるものではなく、また、モデル動物の開発は研究がおこなわれている限り続けねばなりません。そこで今年度より「筋ジストロフィー症モデル
動物の開発J班が発足することになりました。
モデル動物の開発には異常形質の発見、特性の分析、遺伝的背景の均一化など、極めて長い年月を要するものであります。また、飼育・維持方法によっては疾病感染により実験に供することができなくなるなどの問題点もあり、モデル動物の飼育・管理の方法も併せて開発する必要があります。
従って、この斑の目的は、前の班での目的、1）筋ジストロフィー症モデル動物の生産・供給、
2）新しい筋ジストロフィー症モデル動物の開発・改良、および

3）筋ジストロフィー症動物の飼育管理方法の検討、をそのまゝ引きつぐことになりましたが、本研究班では新しい技術、例えば発生工学の手法をもちいてモデル動物の開発・改良に一層の重点をおくために、一部班員の交代が行なわれました。
本研究班では、筋ジストロフィー症研究の進展のため、より良いモデル動物の開発・改良を月指すとともに、大量の実験動物を供給できるよう努力を致す所存であります。
今後も、諸法の先生方のご協力をお騎い申しあげる次第であります。
おわりに、ご協力下さった班員各位、ならびに本研究委託費の取扱いに種々お世話いただいた厚生省当局、国立神経センター、日本筋ジストロフィー協会の方々に心から感謝いたします。

昭和61年3月

野

村

達

次

目

次

筋ジストロフィー症に関する文献調査（1984）

1

野

村

達

次

筋ジストロフィー筋の発育分化と壊死発現に関する組織学的、組織化学的研究
埜

研究協力者

中

征

11

哉

禹

満

横

山

峯

介

江

崎

孝三郎

33

キメラマウスによる筋ジストロフィー症の解析

研究協力者

勝

木

元

也

横

山

峯

介

高 橋 利 一
日下部

守

昭

37

膜結合蛋白質の単離と構造解析
研究協力者

高

松

研

藤

城

正

敏

高

坂

新

一

塚

田

裕

三

45

新たに発見された後肢麻痺ラット
江 崎 孝三郎

研究協力者

埜

中

征

哉

津

金

隆

夫

63

後肢麻痺マウスhlpの病態と遺伝について
富

研究協力者

田

武

菊 池 建 機
埜

中

若

杉

山

崎

征

哉
昇

一

斗

矮性鶏における筋ジストロフィー遺伝子発現

69

研究協力者

菊

池

建

機

武

田

伸

一

糖原病Ⅱ型ウズラの改良

77

研究協力者

水

谷

誠

新

海

久

夫

小

池

雅

春

中

山

一

彦

筋ジストロフィーハムスターの繁殖ならびに系統育成について

研究協力者

89

斉

藤

田

中

松

崎

宗

雄
亨

哲

也

昭和60年度厚生省研究報告書，1−9，1986

筋ジストロフィー症に関する文献調査（1985）
野 村 達 次＊筋ジストロフィー症モデル動物の開発研究の関する動物実験」についての文献調査をおこな一環として「疾患モデル動物」、「哺乳類、トった。それらの中から∴海外における筋ジスト

リ類における筋ジストロフィーとその近縁疾患】

ロフィーに関する文献（1叩5年分）を以下にならびに「筋ジストロフィーとその近縁疾患に紹介する。1￣6）

H

工

C E

Dick，D．J．，Boakes，R．J．，Harris，J．B．：A cerebellar
abnormalitYin the mouse with motor end−Plate disease．
Neuropath01．Appl．Neurobi01．．11（2），141−7，1985．
Peterson，A．C．：Peripheral nervesin shiverer −−−
Dystrophic mouse chimeras：eVidence that a non−SChwann
Ceii coponentis required for axon ensheathmentin viv0．
J．Neurosc土．，5（7）′1740−54′1985．

Srivastava，U．，Sebag，M．，Thakur，Il．：Biochemical

Changesin progressive muscular dystrophY．
Nucleic

acids′

PrOteins′

and

total

thYmuS and spieen of dYStrOPhic mice．
Cell Bi01．．63（5）．325−32，1985．
Znfante′J・P・：Defective

synthesis

XHZ．

nucleotidesin

theCan．J．Biochem．

ofglYCerOPhosphorYIch01ine

in murine muscular dystrophY；The primary m01ecularlesion？
Febs．Lett．，186（2），205−10，1985．
Hohr

J・F・′

FitzsimonsI

R・B・：HYOSinisoformsin

and dYStrOPhic human and murine muscles・

normalAdv・Exp．

Hed．Bi01．，182．43−62′1985．

Pette．D．，Klug，G．，Reichmann．H．：Parvalbumin reductioninrelateiontopossiblein muscular dYStrOPhY・
7，1985．

perturbationsofCA2＋一homeostasis

Adv・Exp・Med・Bi01．r182／265−●（財）実験動物中央研究所−1−

tIatson，A．Y．，Leonard．J．L．，Radie，K．A．，；4ellen，S．A．，
MurphY，R．A．：Alterationsin the pituitarY−thyroid axis
and5−deiodinase

dystrcphy．
Beuche′activityin

mice

with

muscular

Endocrin0logy，116（6），2201−8，1985．

W．，Friede′

R．L．：A

quantitative

assessment

Of myelin sheathsin the peripheral nerves of dYStrOPhic，
quaking，and trembler mutants． Acta neuropath01．（Berl．），
66（1）′

29−36′1985．

Noireaud，J．，LeotY，C．：Potassium and caffeine
COntraCtureSinlimb muscles of normal and dYStrOPhic（C57BL／6J dY2J／dY2J）mice． Exp．Neur01．，87（3），495−
502′1985．

Beuche′W．，Friede′

R．L．：Maked

axon

bundles

enclosedby single segments of myelin sheaths in the nerves ofnon−dystrophic C57BL−Ob／十mice．

Neuropath01．

Appl．

Neurob⊥01．′10（5），369−77，1984．

Parry，D．J．，Desypris′

G．：FatiguabiiitY

andoxidative

CaPaCity of forelimb and hindlimb muscles of dYStrOPhic
mice． Exp．Neur01．，87（2），358−68，1985．
MObleY，B．A．：・CA2＋
fibersofmYOdYStrOPhic

CaPaCitY
muscie．

anduptakerateinskinedExp．Neur01．，87（1）′137−46，1985．
Younger，L・E・．Silverman，H．：Breeding and offspring
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Sc土．，34（5），471−4，1984．
Cohen，A・＝・：Some contributions to the cell bi010gY
Of photoreceptors．
proctorlecture．
＝nvest．Ophthalm01．
Ⅴ土S．Sc土．，25日2）′1354−65′1984．
Whalen，R．G．，Johnstone′

D．，Bryers，P．S．，Butler−

Browne，G・S・，Ecob，H．S．，Jaros，E．：A developmentallY
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Febs．Lett．，177（1）′51−6，1984．

Marcucci，F．，C01omb0．L．，De Ponte．G．，Hussini，E．：
Decreasein N−aCety1−L−aSPartic acidin brain of
myodYStrOPhic

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1984．
Peterson，A．C．．BraY，G．H．：Normal basal laminas are−2−realized on dystrophic schwann cellsin dYStrOPhicin
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Semple′J．W．，Wade，A．W．，Szewczuk，M．R．：Natural

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rZ．
Age−related tissue distribution and enhanced NK activitYin the thYmuS Of dystrophic mice．
Clin．Zmmun01．
工mmunopath01．′

Cossu，G．′

33（2），144−53′1984．

Eusebi，F．，Senni，M．＝．，H01inaro′

H．；

Zncreased endocytosis of acetylch01ine receptors bydYStrOPhic mouse mYOtubesin vitr0． Dev．Bi0l．，110（2），362−8′1985．

Gordon，T．′

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Noireaud，J・T Leoty・C・・Schmidt，H・：AcetYIch01ine−
SenSitivityin fast and slow twitch muscle of normal
and dystrophic（C57BL／6J dy2J／dY2J）mice． Pflugers
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KirkebY，S．．Moe′

D．：Biochemical

andhistochemicai

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muscle．Exp．iath01．，27（3），131−6，1985．
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to the study of the nervous system． Dev．Neurosci．，
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ParrY，D．J．，DesYPris，G．：Succinic dehydrogenase
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HA朗STERS

Walkiewicz．M．J．，Nich01ls，D．H．：Phosphorylation of
the sarc01ernma of dYStrOPhic and normal hamster muscle
f01lowing denervation．J．Neur01．Sci．，69（1−2），93−
102′1985．

Karpati，G．，、Jacob，P．，Carpenter S．，Prescott，S．：
HYPOPhYSeCtOmY mitigates skeletal muscle fiber damage

ー3−

in

hamsterdYStrOPhY．

Ann．Neur01・，17（1）′60−4，1985・

Hofker，山．H．．Wapenaar，H．C．，G00r，N．，Bakker，E・．
Van Ommen，G．J．，Pearson，P．L‥
detectingrestriction＝S01ation of probes

fragmentlength

p01ymorphisms■

from X chromosome−SPeCificlibrapieS：Potential use
for diagnosis of Duchenne muscular dystrophy． Hun・
Genet．，70（2），148N56，1985．
Zngie′

C．，Wiliiamson，R．De

R．R．，Haapala，K．，Bates′

La

Chapelle′

A・，Herva，G．，Willard，H・F・，Pearson，

P．，Davies．K．E．：Happing DNA sequencesin a human X−
Chromosome deletion which extends across the region
Of the Duchenne muscular dYStrOPhY mutation．
Am．J．
Hum．Genet．，37（3），451−62，1985．

Roncuzzi，L・′Faddal

S∵Nochi，Ⅰ4・・Prosperi，L・，SangiOrgi，S．．Santamaria，R．．Sbarra，D・，Besana，D・，
王40randi，L．，Rocchi，工・1．，etal．：二MappingOf

X−iinked

Becker muscular dystrophY through crossoversidentifiedbY DNA p0iYmOrPhisms and bY haplotype characterization

in somatic cell hybrids．

Am．J．Hum．Genet．，37（2），407−17′1985．

Francke，U．，Ochs′

H．D．．De

martinville，B．，etal．：

Hinor XP21chromosome deletion in male associated withexpression of Duchenne muscular dYStrOPhY，Chronic
granuiomatous disease，retinitis pigmentOSa，and McLeod
Syndrome．

De

Am．J．Hum．Genet．′

か1artinville′37（2）．250−67，1985．

B．，Kunkel，L．三・1．，Bruns′

G．，et

al．：

Localization of DNA sequencesin region XP210f thehuman X chromosome：Search for m01ecular markers ciose
to the Duchenne muscular dystrophylocus．
Am．J．Human
Genet．，37（2），235−49，1985．

CH＝CKENS

Sohar，＝．，Fekete，E．．Yorke，G．，Cosentino，B．，Roisen，
F．J．′

Bird，J．W．：Proteinase

activities

dYStrOPhic chicken mYOblastsin culture．
B土01．Res．．180′

innormalandProg．Clin．

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Dietert，R．R．．Sanders，B．G．：Leukocyte celi populations
inhereditarY

muSCulardYStrOPhic

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ー4−chickens．J．Hered．′

Feit，H・，Domke′

R・：Changesin

turbidity

duringmicrotubule assemblYin brain extracts from normal
Chickens and chickens with muscular dYStrOPhy．J・
Neur0genet．′1（2）′141−52′1984．

Huszar，G・′Vigue，L・r

HainesrJ・：MYOSin

heavy

chain

in avian muscular dYStrOPhY COrreSPOnds to the neonatal
isozYme・J・Bi01．Chem．，260（18），9957−60，1985．
Demichele，S・J・，Brown，R・G・／Krasinr B・W・／SweenYr
P・R・：Connective tissue metab01ismin muscular dystrophY．
Amino

acid

compositionofnative

types

＝l

HZr

ZV′

and

V c011agenis01ated from the gastrocnemius muscle ofembryonic chickens with genetic muscular dYStrOPhy．
Comp・Biochem・Physi01．（B），81（1），149−57，1985．
Sok01ove′

P．H．：Alteredmembrane

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Bennett，Ⅴ・D・．Ha11，N．，Deiuca，M．，Suelter，C．H．；
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S・R・r

Kundu／S．K．／Harati，Y．′

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Thacore，H・R・，Kibier，P二K．，Gregorio，C．C．′
C・H・，Hudecki，I4・S・‥

Characterization

P011ina，

oflymphocyte

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Vigue′L・（Delucia▲′J・r

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Lebherz′

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WrightlandsYnthesis

denervated′

and

of

giYC01Ytic

dystrophic

skeletal＝nt．J．Biochem．，16（12），1201→5，1984．

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ー6−

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Kester，・工4．．Privitera，C．A．：Phosph01ipid

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献

1）野村達次：筋ジストロフィー症に関する文

4）野村達次：筋ジストロフィー症に関する文

献調査（1978），厚生省神経疾患研究委

献調査（1982），厚生省神経疾患研究委

託費「肪ジス・トロフィー症動物の生産・開託費「筋ジストロフィー症動物の開発・供発に関する研究」乱 昭和54年度研究報

給に関する研究」乱 昭和57年度研究報

告書，1−7，1980．

告書，1−5，1983．

2）野村達次：筋ジストロフィー症に関する文

5）野村達次：筋ジストロフィー症に関する文

献調査（1979），厚生省神経疾患研究委

献調査（1983），厚生省神経疾患研究委

託費「筋ジストロフィー症動物の生産・開託費「筋ジストロフィー症動物の開発・供発に関する研究」班，昭和55年度研究報

給に関する研究」乱 昭和58年度研究報

告書，1−15，1981．

告書，1−9，1984．

3）野村達次：筋ジストロ7−イー症に関する文

6）野村達次：筋ジストロフィー症に関する文一

献調査（1980，1981），厚生省神経疾

献調査（1984），厚生省神経疾患研究委

患研究委託費「筋ジストロフィー症動物の託費「筋ジストロフー症動物の開発・供給

生産・開発に関する研究班，昭和56年度

に関する研究」乱 昭和59年度研究報告

研究報告喜，1−12，1982．

書，5−12，1985．

−9−昭和60年度厚生省研究報告書，11−31，1986

筋ジストロフィー筋の発育分化と壊死発現に関する組織学的、組織化学的研究
埜 中 征 哉■
研究協力老 廃満：横山峯が■江崎孝三即や
進行性筋ジストロフィーは、筋の変性・壊死る。これらの2種類の筋ジストロフィーマウス

がその主病変である。筋の壊死発現のメカニズの臨床症状の違いが、一体どのようなところか

ムを明らかにすることは、進行性筋ジストロフ

ら起因するのか、又、両者では組織病理上の違ィーの病態を解き明かす鍵である。近年動物モいがあるが、特にその壊死・再生の過程の違い

デルの研究により、病態解明のための知見が多がどこから起因するのかを明確にする必要があく得られるようになった。筋ジストロフィーのる。今回我々は、筋の発育分化という観点から動物モデルは、現在までに様々なものが見出さ

頓死発現との関連について検討を加えたので報れているが、マウスでは今日主に2種類が知ら告する。

れている。1つは、Michelsonらが最初に報
告し1）、後に遺伝子名dyを与えられた常染色体

く対象・方法＞

牲劣性遺伝を示す129／ReJ−d〆句である。こ

対象は．C57BL／10ScSn−7n血（mdxマウス）の遺伝子はC57BL／6J系に導入され、C57BLとC57BL／6J如／如くdyマウス）及び対照と／6Jd〆旬として一般化している。もう1つは、してC57BL／10ScSn（対照マウス）を用いた。

最近Bulfieldら2）が最初に報告したⅩ染色

dyマウスは、体外受精によって得たホモを使

体牲劣性退転の形式をとるC57BL／10SeSn

用した。mdxマウスと対照マウスは、生直後、のmutantマウスで、退転子名Tn血が与えら

5日、10日、15日、20日、30日、60

れている。

日、90日、180日目を、dyマウスは、5日、これらのマウスの間には、臨床的に明らかな

10日、15日、￣20日、30日、60日目の差がみられる。mdxマウスでは、進行性の筋力

各時点を経時的にみた。mdxマウスと対照マウ低下はなく、見かけ上は正常と変わらない8）4）。

スは各5匹、dyマウスは各3匹から、各時点

これに対して、dyマウスでは、生後約2週目

で、下肢の筋を採取し、電顕用と光顕用に固定に後肢のひきずりや痙攣（tWitchindが出現した。15日目までは下腿全体を、20日目以し、これらの症状は成長に従って強くなり、3後は右長持伸筋、右前脛骨筋（自筋）、右ヒラ

ケ月頃より後肢は常に伸展したままとなり、前メ筋（赤筋）をとり出し、トラガカントゴムを肢だけで移動するようになる。m血マウスは2用いてコルク片の上に筋の線維方向が垂直にな

年以上生存するのに対して、dyマウスでは飼るように立てて、液体窒素で冷却したイソペン

育条件にもよるが生後5、6ケ月以内に死亡す

タン中で凍結固定した。クリオスタットで横断・国立武蔵療養所神経センタ一・・（財）実験動物中央研究所−11−

面での連続凍結切片を作製し、haematoxy−

した後に電頗観察（日立H−600型）を行ない、lin and eosin（HE），Gomori trich−

弱拡大で写真撮影したものから、線筋維数・節rome変法、NADH−TR，aCid phospha−

線経の核数・筋衛星細胞の数及び筋衛星細胞のtase，ATPase（routine，PH4．5，4．3）

核の数をそれぞれ算定し、筋衛星細胞の出現頻の各染色を施した三）HE染色のヒラメ筋を写真

度を検討した。

撮影し、結線維数及び筋線維中の中心核線経のく結比率（緊）を算定し、定量的検討を行なった。
光頴用固定と同時に、左ヒラメ絢を採取しカ

果＞（1）組織学的所見

コジル酸ナトリウム緩衝グルタールアルデヒト（a）mdxマウス‥昨年の報告6）のように、生固定を行なった。OsQl後国定（lanthanum

後15日日頃より壊死線経が大きな集塊を成し法），ア′しコール脱水ののちにエホキシ樹脂にてみられるのが、その特徴の1つであった（図包埋し、電顕用標本とした。横断面の1J 厚切1）。壌死線維群は貪食反応を伴ない、また片を作製し、トルイジンブルー染色を施こし、HE染色で胞体がbasophilicに染まり中

最終倍率1000倍に写真撮影し、image

心核を持った再生線経を含んでいた。この時期

anaiyzer（Kontron）を用いて、平均筋線の電頭では（図2）、empty sarc01emmal

維径を測定した。酢酸ウランと鉛の二重染色をtubeやOpaque線経などの変性線経がみら

図2．

玖drマウス

30日日

過収縮を呈するOpaque線経とempty sarcolemmal tubeなど、壊死の早期を示す。
−12−

の存在

れた。これら壊死線経は、続いて中心核をもつなると中心核線経は増加し、壊死線経に貪食細再生線維となり、次第にその直径を増し、60

胞が多く見られ、また比較的大型の筋衛星細胞

日目以後は中心核線経は大きな集塊を形成してを伴なった未熟な筋線経などもみられるように存在した（図3）。壊死線経の出現頻度は次第なった（図6，7）。20日目には、さらに壊に減少したが180日目にも散在性に存在した。

死再生の過程が活発になっていた（図8）。筋

最も壊死線経が多くみられたのは、生後30−

線経は大小不同が目立ち、壊死線経とそれを取60日目であった。180日目においても、脂肪り囲む貪食細胞もさらにその数を増していた。

の増加やfibrosisは、ほとんどみられなか

しかしながら、この壊死線経はmdxマウスの時った。

のように大きな集塊を形成することはなかった。

（b）dyマウス；5日日には壊死性の変化は未熟で大型の核で明瞭な核小体のみられる線経

みられず、巌線経は細胞境界が明瞭でやや大型も増加している。さらにfibros土Sや脂肪組の核を持っていた。しかし、10日目には壊死織の増加がみられた。

線経が散見するようになった（図4）。これら

mdxマウスとdyマウスの筋組織像の変化をの壊死線維はまだ数が少なく、非壊死部の筋線まとめたのが図9である。

経は核が胞体の辺縁部に存在し、筋線維内構造（2）平均線維径、経線維数、中心核線維も良く保たれていた（図5）。15日目に

前述の方法でヒラメ筋の平均線維径、総線維

図5・dyマウス

10日日、ヒラメ筋

核は細胞の辺縁に存在しており、筋線稚内構造も良好である。

−13−

喝

薫ゝ

′
曇

10lJm

祝す
登

図7．dyマウス

15日目、ヒラメ筋

未熟で明瞭な核小体をもつ中心核線経とそれを取り囲む多くの貪食細胞、活動化している筋衛星細胞もみられる。
−14−

照．mdx，dyマウスともに次第に増加してい0

く傾向がみられた（図10）。dyマウスでは、51020306090120da叩

15日目より線維径のバラつきが大きいが、こNECROTtC F旧ERS−−

れは筋線経の大小不同が目立つ時期と一致して−

ノー

Variat10n hn‖ber siZe■

いた。ただし平均直径でみると、他の二者と大＿きな差は認めなかった。

OpaquOれber／

Hypertrophは川erS

対照及びmdxマウスヒラメ筋の総線維数は、

一■■1−1

生後20日日まで両者に大きな差はなく、成長／

REGENERAT川旧FIBERS
−

−

−

−

−

−

−

と共にその数を増していた。しかし、dyマウ−

スでは、生後15日か

lnternal nucle事−r

Rber splitt】ngていく傾向がみられた

︑ b I ノ ︵／筋線経の総数が減少し図11）。これは、壊死再生の過程が活発になってくることと逆相関

Fib†OSis

しており、後述する中心核線維出現の時期にも一致していた。20日目には筋線維総数はさらAdipo＄e tissueに減少し、mdx、対照マウスに比して有意に低
ノ

−：mdx

い値となっていた。

．▲−：dy図9．mdxマウスとdyマウスの組織病理学的変化

冨800
．」⊃

∈
コ

Z

数、中心核線経の出現比率を、生後5日日より 400
検索した。
平均線維径は、5日目から30日目まで、対
0

5

10

15

20day＄

図11．対照、mdx，dyマウス の
総線維数の経時的変化

次に中心核線経の出現頻度についてみると

20（図12）、mdxマウスでは、20日目から中心核線経が増加しはじめ、30日目にはほぼ半

100：亡。ntr01数、60日日以後は大部分が中心核線経で占め＝●■二●1二●1二●tl●＝■
0：
●：mdx

られていた。これに対して、dyマウスでは、

■：dy

5

・10

15

20

図10．対照、mdx，dyマウスの筋線経の直径の推移

30day3

中心核線経の占める比率の値がmdxよりも低いのではあるが、15日目よりその出現頻度が増加しており、これは壊死再生の過程が活発化−15−は同様であった（図13）。ATPase染色でも、してくる時期に一致していた。

20日目まではtypel，type2の分別は良好であった（図14）。しかし、30日目には、ほとんどタイプ分別が不良となり、inter−myofibrillar networkの乱れがみられるようになった（図15）。
dyマウスでは、生後10日目では、NADH−TR
染色で、対照と差は認めなかった（図16）。壊
死再生の活発な20日目には、筋線維タイプの分別は悪くなり、ATPase染色で未熟な線経が目立つようになった（図17）。

（4）筋衛星細胞（sate11ite cell）
筋衛星細胞は、1anthanum染色をすると、母細胞である筋線維細胞と明瞭に境界されてお（3）組織化学染色
染色で、15日り、また母細胞と基底険を共有していた（図18）。

目まで筋線経のタイプ分別は良好で、その染色700倍の低倍率で写真撮影した電顕写真より、性では対照と差は認めなかった。壊死再生が活

筋線維（MF）、紡線維核（MN）、筋衛星細胞発になってくる20日目でも、非壊死部の線維（SC）、筋衛星細胞核（SN）の各々の総数をmdxマウスfま、NADH＿TR

ぢ

夢一一■1■二■■￣■√￣￣．二「。慧〉＼観図18．対照マウスや鷲

5日目、ヒラメ筋

筋衛星細胞が、ianthanumで母細胞と明瞭に境界されている。
MN：筋線維核

SN：筋衛星細胞核−16−

各検体ごとに算定した。今回、筋衛星細胞の出後から生後2−3週頃までの問の検索が困難で現頻度をみる指標として、総核数に対する筋衛

あった1り15）聖実中研の横山らは、体外受精に星細胞の核数の比を百分率で表わしたもの（SNよってホモとホモとをかけ合わせて100野に発／MN＋SNxlOO（ヲり）を用いた。

症マウスを得ることに成功したご）これによって壊死再生が活発になってくる前の15日目まdyマウスでも生直後からの検索が可能になっでの筋衛星細胞の出現を重点的にみた（図19）。

たばかりでなく、さらには胎生期の検索をも可能となったということは、特筆すべき事柄であSN／MN＋SN（％）
Sll：tat●mt●C●ItlluCl●lる。

HH；myOnUCI●1dyマウスは、筋ジストロフィー鶏と同様に7）筋線経の発育分化に遅れがあるのではないかと考えられていた。今回我々は、この体外受精に冊中よって得たdyマウスを用いて、筋線経の発育分化について検索を行った。それと同時にmdx○：COntrd
●：mdx
｝；dy

5

10

15

マウスに関しても同様に筋の発育分化について検討した。
dyマウスもmdxマウスも、出生直後より発血ys

育に従って肪線経の直径は徐々に増大しており、

図19．対照、mdx，dyマウスの筋衛星

組織化学分析でも筋線維タイプの分化がすすみ、細胞の出現頻度。

筋は成熟している。また、筋衛星細胞の出現で対照、mdx，dy

マウスともに5日目には25

みると、生後5日目に高かった値が、対照と差界前後であるが、10日目には209ら前後となはなく、下がってきている。この筋衛星細胞は、り15日目にはそれよりわずかに減少していく

胎生期に多く出現しており、筋が発育分化する傾向がみられた。すなわち、生直後は筋衛星細に従って、その出現頻度が減少してくる。よっ胞は多く出現するが、その発育に従って、出現て、もし筋の発育分化に遅れがある場合には、頻度が三者ともに減少していくことがわかった。

筋衛星細胞の出現頻度が高い値をとりつづけることになる。dyマウス及びmdxマウスでは、く考察＞

壊死発現までの問筋衛星細胞の出現は対照と差筋ジストロフィーハムスターでは生下時にホはなかった。このことは筋ジストロフィーマウ

モが識別できるため10ミ また筋ジストロフィー

スでも筋の発育分化には、特に遅れがみられな

鶏やmdxマウスでは確実に発症動物が得られる

いことを示していると思われる。すなわち、、両

ので2）や7ミこれらのモデル動物では出生直後か者ともに筋の発育分化の途上に異常なく、筋線らの研究が可能となった。これに対して、dy経が一度成熟した時点で壊死がおこってくるとマウスは、従来よりヘテロとヘテロをかけ合わいうことが推定される。
壊死発現の次には、再生という過程がおこる

せてホモを得るため、ホモであるか否かは臨床症状が出現してからでなければわからず、生直

が、dy，mdx−17−

マウスでは、再生線経は中心核

線経で特徴づけられると考えられている。すな

いないことがうかがわれる。mdxマウスとdy

わち、dy，mdxマウス両者において、中心核

マウス■の臨床上の差は、この再生の相違を反映

線経の周辺にしばしば貪食細胞を多く認めるしていると考えられる（図20）。

（図7）。貪食細胞の存在は、その場所に壊死の過程が以前存在したことを物語っており、この中心核線経はその前に壊死という過程を経たと考えられ得る。言い換えれば．この中心核線
経は再生線経であることを裏づける所見といえる。塩酸ブビバカインによって人為的に筋の壊

CLIMCAL FIIIDINGS

死をおこさせる実験では、経時的にみると填死

P▼○■mU●thV●■■〔●■■

線経が中心核線経に置き換わることが確認され

hG▼●■■●d■●r′llCX■ndRくG・仙細山…l＋＋uUSCLE▲HERVEP▲THOLOGY
H●trO■■■ndl●9…l■ll…

を用いて、中心核線経は稜々の段階

十C01叩t●l●l●COV●ry▲lt●lnyOn●￠lO●h＋の再生線維であると報告されている曽従って、

D●l●y●dれJ●￠l●仙〟typ●dlH●l●ntl■tloれht■

yt01日■●mkY●仙01●■

hYOIY●dl的●rlyp●

が即ち再生線経であることは、これらのことか＋ 一 J ●

rlblO●l●

壊死の発現したあとに出現してくる中心核線経

十

十十一日◎

graphy■檜∈）㍉◎−㊥−り■ている㌔また、dyマウスでは、autOradio一■什＋Dyll叩●lh山bll

らも疑いのないところである。
PHO；DllCh●hl●M別l●rl−y暮tlOPhy

dyマウスとmdxマウスではナ壊死再生を中●：Ot▲●bm■〜■●●nhl■川●OqOuP●○：dlt加t仙D】D

心とした筋組織病理学上での相違点がいくつか
図20．

あげられる。

ヒトDuchenne型筋ジストロ
フィーと筋ジストロフィーマウ

まず壊死・再生の発現の時期である。dyマスの比較

ウスの方がmdxに比して壊死線経の発現の時期がやや早く、また、これに伴なう再生を反映す

同じ壊死線経であっても、その再生の仕方がる中心核線経の出現時期も、dyマウスの方が異なるのは何故であろうか。両者の筋緑綬以外やや早い。壊死の発現は、mdxマウスが大きなでの組織学上の差は、結合織増生の有無である。

集塊を形成して壊死に陥いるのに対して、dy

ほぼ完全に再生のおこるmdxマウスでは

マウスではそのように大きな集塊を成すことがfibrosisや脂肪織の増加がほとんどみられない。しかしながら、次の再生の過程をみると、ないが、完全に再生で代償されないdyマウス

mdxマウスではほとんど全てが中心核線経としではribrosisや脂肪織増加が早期よりみらて置換されるため、総線維数は対照と変わるこれる。この結合織の増生が再生の過程においてとなく増加しており、いったん広範に壊死に陥何らかの抑制田子となっている可能性は否定でったものがほぼ完全に再生されているのがわかきない。他の動物モデル、例えば筋ジストロフ

る。しかし、dyマウスでは、壊死再生の活発ィーハムスターでも10！mdxマウスと同様に、になってくる15日目より路線維数が減少して群を成して壊死再生がおこり、末期まで結合織

おり、壊死が再生によって完全には代供されて増生をみることなく、再生はよく壊死を代償し−18−ている。dyマウスにおける結合織増生が、原＜結

因なのか結果なのか、つまりfibrosisにより筋全体の伸展性が悪くなり同時に脂肪織によdy，mdxマウスのヒラメ筋では
1）生後15−20日目までの筋の発育と分化って再生すべきSpaCeを占拠されるために再生が悪くなるのか、あるいは、何らかの原因にに異常はなかった。
2）生後15日目まで筋衛星細胞の形態、頻度

より再生過程がスムースにいかないために非特異的な反応の結果としてribrosisや脂肪織語＞は対照と差はなかった。
3）dyマウスでは生後10日目、mdxマウスへの置換がおこるかは、明らかではない。前者

では15日日頃より壊死・再生が開始した。

では、結合織そのものにdyマウスとmdxマウ4）発育・分化途上筋は壊死に陥りにくいと思スに差があることになる。dyマウスはin vi−
troでfibroblastと筋原線経の関連性がわれた。
5）再生過程には、結合織増生などの2次的因研究されているが、Summersら11）は、dyマ子も関与すると考えられた。

ウス筋の培養で筋新生の減少がみられ、それはfibroblastの出現によって相対的に筋原線

く文経が減少するからとしている。だがfibro−

1）Michelson，A．M．，Russeli，E．S．

blastそのものには差がないと述べている。

献＞

and Harman，P．J．（1955）：

後者では、再生がおこってくる前の段階での両Dystrophia muscularis：A

者の差である。

hereditary primary myopathy

dyマウスとmdxマウスが次に異なる点が、

in the house mouse．Proc．

神経病理学的所見にある。dyマウスでは、神経系の異常所見が存在する。dyマウスでは脊Natl．Acad．Sci．USA，41，

髄の限神経に髄鞘形成不全（amyelination，

2）Bulfield，G．，Siller，W．G．，

dysmシelination）が認められている12とWight，P．A．L．and Moore，K．J．

しかしながら、組織病理学的にみると、筋には（1984）：X chromosome−1inked

神経原性の変化はほとんどみられない。壊死にmuscular dystrophy（mdx）in

陥った線経が再生してくるreinnervation

the mouse．Proc．Natl．Acad．

の段階で、この脱髄した神経の影響が出てくる
Sci．USA，81，1189−1192．

可能性もある。mdxマウスでは神経終末は正常であり急と 坐骨神経ではdyマウスの如く著しい

3）Dangain，J．and Vrbova，G．

脱随はみられないが、7週目のmdxマウスで無（1984）：Muscle development

髄神経野がわずかにみられたと報告されてい死）

in mdx mutant mice．Muscle

神経性因子の関与については、今後さらに検討

Nerve，7，700−704．

が必要と思われる。

一19−

regenerationin dystrophic

4）Tanabe，Y．，Esaki，K．and

mice．Am．J．Patho1．，41，41−53．

Nomura，T．（1986）：Skeletal

10）Homburger，F．（1979）：

Muscle pathologyin X
chromosome−linked muscular

Myopathy of hamster dystrophy

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317，2−17．

5）Dubowitz，V．and Brooke，M・H・

11）Summers，P．J．and Parsons，R・（1973）：Muscle biopsy．
A modern approach．Saunders，（1981）J A quantitative

London．

assessment of dystrophic mouse（129ReJ dy／dy）myogenesis6）杉田秀夫（1985）：筋ジストロフィー症モ
デル動物の開発，mdxマウス骨格筋の病理

in vitro．Neuropathol．Appl・学的研究，厚生省神経疾患委託費「筋ジスNeurobiol．7，269−277．

トロフィー症動物の開発・供給に関する研究」野村班

12）Bradley，W．G．andJenkinson，

昭和59年度研究報告乱M．（1973）：Abnormalities of

13−31．

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7）Nonaka，I．and Nakamura，H．

and dystrophic mouse muscle・（1982）：Muscle differenti−

J．Neurol．Sci．，18，227−247．
ation and regenerationin13）中村晴臣（1985）：mdxマウスの坐骨神経

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A quantitative study．Anat，法による筋ジストロフィーマウス（C57BL

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／6−dy／土γ）の作出，厚生省神経疾患研16）Summers，P．J．and Parsons，R．

究委託費「筋ジストロフィー症動物の開発・供給に関する研究」野村班 昭和59年度（1981）：An electron

研究報告書，119−122．

−21−

図1．

mdxマウス

30日目

生後30日目のmdxマウスにみられる壊死巣。多数の貪食細胸がみられる部位は、酸フォス77クーゼで悟性が高い。

図3．mdxマウス

90日目、長指伸筋

中心核線経が群を成して存在する。中心核線経の直径は、正常と同じ位になっているものも多数みられる。結合織の増生はほとんどみられない。 H＆E

図4．dyマウス

10日目、長指伸筋

壊死線経が散見される。

図8．dyマウス

H＆E

20日目、ヒラメ筋

壊死線経、貪食細胞、中心核線経が多くみられ、壊死再生が活発である。 H＆E

図13．対照−7ウス（cont）もmdxマウスの非壊死部（mdx）も、生後20日目
までは、筋線維経と筋線維タイプの分化には変わりない。NADH−TR．

図14．対照（cont）もmdxマウス（mdx）も、20日目までは筋線維タイプ
はよく分化していて未分化な線経はみられない。ATPase（pH4．3）。

図15・左対照マウス（cont）、右mdxマウス（mdx）
mdxマウスで筋線維タイプの分別が不良で、intermyofibri11ar
networkの乱れがある。 NADH＿TR．

図16・dyマウスも10日日までは筋線経の直径および節線維タイプの分布に異常はない。NADH−TR，

図17．

dyマウス

20日目

酸化酵素染色で筋線経のタイプの分別が悪く、ATP染色で中間色に染まる
タイプ2C線経が増加している。左NADH−TR，右ATPase（pH4．3）．

昭和60年度厚生省研究報告書，33−36，1986

キメラマウスによる筋ジストロフィー症の解析
勝 木 元 也1，8）
研究協力者 横山峯介ワ高橋利一1）
日下部守畔）
2種以上の遺伝的にことなる細胞からなる個

2）筋の耐久力試験

体をキメラという。キメラマウスは、ことなる筋ジストロフィー症の筋力測定法として一般

2種の系統の胚を集合し、1個の胚に発生した的に用いられている金網登り試験（55℃のホ後、偽妊娠レシピェントメスマウスの子宮内にットプレート上に金網で作った円筒を置きマウ移植することによって得られる。キメラマウス

スを入れる。マウスは即座に金網に登りホット

は1個体中に、退転的性質を異にする細胞が接プレートから逃避するJを実施した。7分間のして存在するため、自然には決して生ずること

テスト期間中における金網からの落下回教と落のない動物実験系となり得ると考えられる。

下した後、ホットプレート上にとどまった時間

筋ジストロフィー症のモデルの可能性があるを調べた。人道上の立場から、連続1分間ホッマウスのうちmdx変異の性質について解析をトプレートから逃避できなかったマウスは、テ

キメラマウスを用いて行なった。正常と筋ジス

ストを中止した。このテスト後、マウスは通常

トロフィー症マウスとの間にキメラを作出し、通りの活動を示し、後遺症はみられなかった。

筋の耐久力を調べた。また一部の個体の骨格筋

3）筋の免疫組織化学的観察については免疫組織化学的な方法により、筋肉マウスを959らェクノール・19ら酢酸固定液
で、濯流固定し、エタノール脱水、ポリエステの性質を観察した。

ルワックス包埋後、4／（方法）

m切片を作成し、脱ワックス後、特異抗体を用いて間接螢光抗体法により観察した。

1）キメラマウスの作出
810−mdJおよびBALB／Cのメスマウスを
ホルモン処理し、排卵を誘発し、それぞれのオ（結果）スマウスと交配後、8細胞期胚を採取した。プ

1）キメラマウスの作出

ロナーゼ処理で透明帯を除去したそれぞれの系接着させた胚は培養により97界（33／34）

統の胚を1個づつとり出し、レクチンを含む培が単一集合胚へと発生した。これらの集合胚を養液中で接着し、一夜培養した。単一の集合胚

レシピェントメスマウスの子宮内へ移植したとに発生した胚を、偽妊娠3日目のレシピェント

ころ14匹（42界）の産仔が得られた。離乳

メスマウスの子宮内に移植し、産仔へと発生さした13匹の個体は、その被毛色からキメラ型せた。

5匹、Bl0−m山型6匹、BALB／C型2匹に分類された。

1）（財）実験動物中央研究所
2）名古屋大学医学部
3）東海大学総医研−33−

筋の耐久力試験の結果、810−m血では落下係なのかが解かるはずである。すなわち、キ・メ

回数が多く、落下している時間も長かったが、ラマウスは動物実験系としては、遺伝的疾患の正常なBlOやBALB／Cでは回数は少く、時原因の診断に用いることができるものと考えら間も短かった。キメラでは個体差がみられたが、れる。
キメラマウス作出の方法は、すでに20通り

Bl0−mdJ に近い傾向がみられたもキメラ個体の骨格筋の組織化学的観察の結果、以上の系統の組み合わせで成功しており、系統Bl0−mdxとBALB＾の両方の細胞が筋セン

によってはキメラになる率が少ないものも存在

イ中でモザイク状に混り合っていることが確認するが、今回行なったBl0−7記JとBALB／t

された。

との組み合わせは、C57BL／6とBALB／eな
ど正常近交系同志の組み合わせに比しても、高（討論）

い作出効率を示した。作出されたキメラマウス

筋ジストロフィー症マウスmdxと正常とのの被毛の割合（表3）には偏よりがみられ、問のキメラの性質を調べることにより、mdx

Bl0−mdJの割合が多いもののみが得られたが、の機能欠損が正常細胞によって正常化されるか、個体数が少ないため、このような偏よりに意味

あるいは同一個体中の正常細胞をmdx化するか、があるかどうかについては討論できない。このあるいは混在の割合によって機能欠損が表われ点に関しては、現在キメラ個体数を増やす努力

るかを知ることができる。また、神経一筋接合をしている。

部におけるmdx塾と正常型との相互関係が観察

筋ジストロフィー症の症状を解析する方法のできれば、mdxの性質が筋肉に由来するのか、一つとして、一般的に用いられている筋の耐久神経に由来するのか、あるいはどちらとも無関

力試験を行なった。表1，2に示される通り、

表1．

筋の耐久力試験（1）筋ジストロフィー症

7W llW▲・01

Bl0−mdJ9（23）218（111）＊

15W

19W

23W

4（99）＊

2（4）

17（62）

14（39）

1（2）

3（66）＊

27（90）

38（107）3
4
5

7（80）＊

3（63）＊

11（31）

49（160）7（97）＊

9（97）＊

4（97）束30（85）

9（27）

1（5）

2（10）

0

1（

8（92）＊

06（83）＊

1（5）

0

1

9T

16（144）＊

6）

0

2

2（13）
1（10）

3（32）

2（9）

1（

0

1（15）

3（18）

0

3

5（35）
2（26）

1（

5）

3（21）

2（

8）

0

0

0

4

1（5）
0

5

7）

落下回数（落下していた時間：秒）＊途中で実鼓を中止（1分間以上落下したまゝのとき）−34−

表2． 筋の耐久力試験 〈2）正 常
7W llW
0
6（15）

0

0

0

0

0

0

0

3

0

23W

0

2

12（61）

19W
0

▲0

1

0
1

8

2（3）

15W

0

0

5

︵
3

0

4

9（55）

0

1（5）

1（2）

6（23）

0

︶
8

3（5）

0
0

0

0

0

0

0

0

︶
6

1

0

0

3

0

0

2

〇十

1

1（21）
4（24）
0
0

0

︶
1
3
︵
6

5

0

4

落下回数（落下していた時間：秒）

表3．

筋の耐久力試験（3）キメラおよび筋ジストロフィー症

枝毛の割合（界）（黒：茶：自）
︶
0
4

︶
8
1
1
︵
5

0
1

︶
0
1

︶
7
3
1
︵
6

0
1

︶
5

︵
3

︶
0
6

5 0
9 0
︵
l

5

︶
0
︶
0

︵
︵
3 4

︶
0
4

0

2
︵

3

︶
1
2
1
︵
7

1

0†

Bl0−mdJ

︶
0
6

0
4

5
8
︵

1

9

0
8
︵

2

0
2
︵

1

︷0

810−mdJ◆一一→BALB／1

29W

︶
3
6
︶
︶
7 8
8 9

4

︵
︵
5 4

3

︵
4

2

落下回数（落下していた時間：秒）

遇齢およびメス・オスによって多少の相異がみられた

照との差は顕著であった。そこで810−mdJのが、19遇齢以降では、810−mdJとその対照

メスを対照とし、29遇齢のキメラマウスを用いとなる810では筋の耐久力に差がみられ、mdxて筋の耐久力試験を行なった（表3）。

と正常とを機能的に識別する方法として適当で被毛の割合から、正常BALB／もの被毛でああると考えられた。とくにmdxのオスはメスに比べ、る白の占める割合は少く、mdx由来のものが多落下回数においても落下した時間においても対い個体が得られた。被毛のキメラ性と筋肉の免−35−

疫組織化学的観察との結果は必ずしも対応する

今後、キメラマウスを用いた動物実験系の開ものではなかった。すなわちキメラの筋肉に占発課題として、系統別の細胞標識となり得る抗

める正常の割合は、少なくとも509ら以上のよ体を作り、較能とは別に細胞の構造がキメラ個うであったが、さらに確認の必要がある。

体で変化するかどうかを、それぞれの細胞系統

筋の耐久力試験の結果、キメラマウスはいずに沿って研究する必要があると思われる。また、れもBlO一m血筋ジストロフィー症型であり、発生の進み方にともなう筋ジストロフィー症のキメラ個体に存在する正常細胞によってはその進行性について、キメラ個体でも調べる必要が捺能を正常化できないことを示している。

あると思われる。

−36−

昭和60年度厚生省研究報告書，37−43，1986

膜結合蛋白質の単離と構造解析
高
研究協力者

松

研

藤城正敏，高坂新一
塚田裕三

膜結合型の難溶性蛋白質には、形態形成、維rose，CM sepharose等で精製を繰り返持に係わる興味ある多くの蛋白質が存在していし、比活性で約200倍の部分精製を行ない分子るが、可溶化が難しくまた量的にも微量である

量約50，000の蛋白質がCNPaseであることをことや一般に分子量が大きいため構造解析に関示した。酵素活性を保持した状態でのこれ以上しては充分な検討がなされていない。最近、気の精製ま困難であった。Kohsakaら3）は、こ相プロテインシークエソサーの利用が可能となの部分精製標晶でウサギを免疫し、CNPase

り微量サンプルにて蛋白質のアミノ末端アミノを免疫沈降させるが、活性には影響を及ぼさな

酸配列の決定が可能となり、また遺伝子工学的いポリクローン抗体を作製した。ミエリン分画

手法により部分アミノ酸配列からeDNAをクロのタン′くクをこの抗体を用いたイムノプロット

ーニングしその構造解析から蛋白質の構造を解法で検索し、分子量47K、45Kに相当する

析する手法が行われるようになっている。そこ

2種の蛋白質が抗体に反応することを兄い出しで我々は中枢神経系の髄鞘険に存在し、その内た。この二種の蛋白質は、従来叫01rgram

側の裏打ち構造の一つと考えられているWolf−

proteinIa，Ib（WPIa，WPIb：ミェ

gram proteinIa，Ibの単離と構造解析を

リン蛋白質をLaemmli系のSDS−ポリ7クリ

試みているので、この結果について報告する。

ルアミドゲル電気泳動にて分離した際47K、45Kdalton付近に泳動される比較的多量

現在までの研究状況に存在する蛋白質）と呼ばれているものに相当

Kuriharaら1）が髄鞘組戚（ミリェン）にしていた。しかし、抗原が部分精製標品である

2；3′−CyClic nucieotideを3Jの位置で点やポリクローナル抗体であることなどから、水解するphosphodiesterase（CNPase）

WPIa，WPIbとの免疫学的塀似性やCNPase

活性が高度に存在することを兄い出して以来、の抗原本体がいずれであるのかといった点に関本酵素の生理的役割については多くの議論がなしては何ら知見が得られていない状況である。

されているが、いまだ明らかとなっていない。

そこで今回は、1）CNPaseに対するモノク

一方、いくつかの精製法が試みられているが、ローナル抗体を作製し、イムノプロット法にて活性を保持した完全な形での精製は行われていWPIa，WPIb

ない。当研究室のSndaら2）はウシ脳ミエリン

Ia，WPIb

分画よりAmmonium Acetate，Triton

そのパターンから相同性について検討した。

でCNPase活性を可溶化後Phenyil s画ト

慶応義塾大学医学部生理学教室−37−

いずれに反応するか、2）WPを分離精製し、限定分解を行ない

方4）免疫組織染色

法

1）CNPase

ウシ小脳、坐骨神経、マウス脳切片（ホルマの部分精製

リン国定、パラフィン包埋）をHRP conju−

Sudaらの方法に準じて行った。ウシ脳白質を20倍量0．5M Ammonium Acetate，

gated anti Rat工gGを用いた間接法に10mM Tris HCl（pH6．9）でホモゲナイて免疫組織染色を行った。

ズ後1000g20min5）ミエリン分画の調整

遠心し沈査をさらに20

ウシ脳自質あるいはマウス（BA工B／cAn

倍量10m丸【Tris・HCl（pH6．9）、0・59もでホモゲナイズし1000gcrj）全脳よりWhittakerら5）の方法に従20min遠心し沈宜に酵素活性を回収した。沈いSucrose density gradientにより査の1MAmmonium Acetate，1％Tri−調整した。

ton x＿100抽出液をPhenyl−Sephaiose

6）SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動

Triton x−100（SDS−PAGE）

CL−4Bカラムにかけ1MArnmonium Ace−tateと10％Triton x−100のdouble

Laemmliq）の方法に準じた10−20％

linear gradientで溶出し括性分画を得

linear gradientを用いた0サンプルはた。これを50珍ダリセロールで濃縮後、Tris−

6％SDS，2降6−merCaptOethan01に

HEPES（pH6．5）、19ダリ七ロール、0・1％

溶解後、100℃で10分間処理した。

Tritonに対して透析し、部分精製標品とし

7）イムノブロッテイング
Towbinらりの方法に準じ、ニトロセルロー

た。

スフィルターに転写後、ニトロセルロースフィ

2）モノクローナル抗体の作製
LewIs

ラットに部分精製標品（タンパク量

ルタpを59もBSA・PBSでblokingL、培で100JLg）をComplete Freund−s adju−

養上宿と反応させた。HRP conjugatedVantとともに腹腔内投与した。Spleen cellanti−rat（1×108）をmouse myelomのceil（SP染色されたバンドの位置は、ニトロセルロース

2／0一兎／4，2×107）と混合しポリェチレン

フィルターをアミドブラックで染色し確認した。

グリコール、DMSO存在下で融合させた。

8）SDS−PAGEゲルよりの蛋白質の回収＝gGを用いた間接法で染色した。

SDS−PAGE後、ゲルをクマジーブリリアン

HAT培地で融合細胞を選択しCNPaseに対するIgGモノクローン産生細胞をELISA，

トブルー（CBB）にて染色し目的の蛋白質バン

CNPaseに対するbinding assay、免疫ドを切り出した。

組織染色でスクリ⊥ニングした。

①寧Iectro elution3）binding assay

切り出したゲルを0．1NIもOHで1時間処理

抗rat工gGを48穴プレートに吸着後、後、Max Yield（ATTO社製）にて抽出し培養上宿を反応させた。さらに部分精製CNPase

た。抽出′てッ77−には、25mMTris・Hciを反応させ洗浄後プレート上で酵素反応を行わ

pH9．5，19らSDS、泳動槽ノミッフ7−にはせ吸着された酵素活性をTsukadaら4）の方法

250rnMTris・HcI pH9．5，1％SDSをに従がい測定した。

用いた。

−38−

（多 蟻酸抽出

10−20％1inerar gradient SDS

ゲルをホモゲナイズ後20倍量の70笹蟻酸

PAGEで分離し、そのパターンを比較した。

で24時間抽出した。抽出液を濃縮後BioGel
P−10（0．7mX30cm、溶出バップ7−70珍

結果及び考案蟻酸）にてC叩および遊離のSDSを除去し単得られたハイブリドーマ約2000クローンを離原品とした。

スクリーニングし、CNPase9）酸加水分解ーン（TFK−1）を得た。作製されたモノクロー

6N NCl（定沸点塩酸）中で20時間酸加水と反応するクロン抗体は、FiglAに示した如くBinding

分解を行ない、アミノ酸分析を行った。

assayによりCNPase10）限定分解が示された。しかし、この抗体を酵素反応液にプロムシアン分解後、生成するペブタイドを分子と結合すること

添加しても活性の抑制は認められなかった﹁uTそ・ぢ汰申∈＼∽書0邑︶ きて＞Tも4崇ddB

6
0

5

0

4

0

3

0

2

0

⊥

﹁月烏＼TTぎ＼S30一致︶ h■TATも4崇再会U

lgG m仙IgG mAb
X8cont．mAb

x4

回la．モノクローナル抗体（TFK−1）

図lb．モノクロ一一ナル抗体（TFK−1）のCNPaseに対するbinding
aSSay
モノクローナル抗体であらかじめ処理したプレートにはCNPase
活性が回収されるが正常ラット
血清で処理したプレートには回収されない。

のCNPase活性に対する影響
酵素活性測定の反応液中にモノ
クローナル抗体を添加しても活性に．は全く影響を及ぼさない。

ー39−

（FiglB）。このことから、この抗体はCNPase−ナル抗CNPase抗体を用いて得られた結果3）分子は識別し得るが、酵素活性部位とは結合しと全く同様であった。また、Balb／cAnCrj

ないものと思われる。この点に関してはマウスを用い実験においても、上記と全く同様

Kohsakaらが得たウサギP01ycloual抗体の結果を得た。そこで、この2つの蛋白質Wlaの性質と同様であった。この抗体のサブクラスとWlbの構造解析を行ないCNPase活性と構は、doubleimmunodiffusion test

造との関係、WlaとWlbの免疫学的類似性をからIgG2Cであった。本抗体を用いて、HRP

明らかにするとともに、これら蛋白質の遺伝子

COnjugated抗ラットIgGによる間接法にをクローニングし発現メカニズムを索ぐるとこてウシ小脳及び坐骨神経の免疫組織染色を行っとを目的として、まず、マウス脳ミエリン分画たところ、自質部分が強く染色され（Fig2a）．

よりWlaおよびWlbの単離を試みた。マウス

自質部分の拡大像にて軸索と並走するあるいは脳ミエリン分画を2次元電気泳動にて分離した軸素周謁にリング状に染色される像が得られ結果から、WlaとWlbは分子量的に近い（47（Fig2b）、ミエリンの膜構造と強く反応する

Kと45K）ばかりでなく、等電点もいずれも約ことが示された。一方、末梢神経組織（坐骨神9と塩基性で近似していることから、両者を分経）に同様の染色を行ったが、末梢ミエリン膜

離精製することは困難と思われた。そこで両者は全く反応しなかった（Fig2C）。末梢ミエリをSDS PAGEで分離後、CBB染色を行ない

ン膜にもCNPase

Wla，Wlbの位置を確認し各々のバンドを切りは酵素活性として5分の1−10分の1量存在するにも拘らずこのモノク

出し・ゲルからの抽出精製を行ったoEle9tro

ローナル抗体が反応しなかったことから、中枢

elutlonでは、抽出液イオン強度を変化させ神経系と末梢神経系のCNPaseの分子構造がる、抽出液SDS濃度を変化させる、ゲルをア異なる可能性が考えられる。そこで、中枢ミニ

ルカリ処理後抽出する、抽出時間を72時間まリン組織および末梢ミエリン組織の蛋白質をで行う等試みたが抽出効率が59ら以下であったっ

SDS−PAGEにて分離し、CNPaseモノクロ

一万、709も蟻酸抽出では、抽出効率509も以ーナル抗体を用いてイムノプロットを行った結上、抽出過程で多少分解するもののCBB染色果、やはり中枢ミエリンには反応する2本のバ率で90界以上が元の分子量を保つ型で回収さンド（濃染される47Kdaltonと比較的薄くれた。抽出標品からのCBBおよび遊離のSDS

染る45Kdaltonの／：ンド）が得られるにも除去に逆相系高速液体クロマトグラフィーの利拘らず（Fig3）、末梢ミエリンには全く反応が用を検討した。モデル系として使用したBSA

認められなかったことから、中枢型CNPaseは免疫学的に異なるもので蛋白質の場合にはカラムにTSK Phemy1−
5PWRPを使用し、溶出バッフ7−に0．19もトあることが示された。またこのモノクローナル

リフルオロ酢酸、アセトントリル（20−80界抗体と反応する2撞中枢ミエリン蛋白質のうち

grodient）を用い良効な分離ノミターンを得

強く反応する47KはWolfもramIa（Wla）

たが、WlaおよびWlbの場合には溶出ノミッ7

で、比較的反応の弱い45KはWolfgramIb

7−を変化させても樹脂に吸着し溶出条件を得（Wlb）であった。この結果はウサギポリクPることができなかった。そこで蟻酸抽出液を浪と末梢型CNPase−40−

図2．モノクローン抗体による免疫組織化学染色
a．ウシ小脳、自質部分が強く染め出されている。
b．aの拡大像、軸索にそったdouble track staining patternや軸索周囲のring−iike staining patternが見られる。
C．坐骨神経、軸索周囲に全く染色像が認められない。
一41−

肌l敗K

a

b

ないが、以下の実験には支障はなかった。Wlac

及びWlbをアミノ酸組成の分析から得られたメ
チオニン残基数の約500倍のモル数のプロムシ

340ト

アン存在下、709ら蟻酸中でプロムシアン分解

1†0■を行った。分解されたペプチドの分子量ノミタ∴−
ンをSDS−PAGEで検討したところ、35K、

97．4■

30K、25Kdaitonの共通する／；ンドとWlaからは12K、Wlbからは8Kdaltonの異な55．4■

るバンドが得られた。したがってWlaとWlbとは大部分共通する構造を持っており、おそら

一三引き

くWlaのC末端あるいはN末端の数十個のアミ36、5・ノ酸が欠損しているものがWlbであるものと推定された。等電点の類似性や免疫学的類似性もこれで充分説明し得るものと思われる。
今後は、WlaおよびWlbのN端末アミノ酸
配列の決定、これらを限定分解して得られたペプチドフラグメソトの分離精製を行ないWla
20・1←ヽ−およびWlbのアミノ酸配列の部分構造を明らかとし、それをもとにCDNAのクロー一二ングを行う予定である。
図3．モノクローナル抗体（TFK−1）によるミエリン蛋白質のimmunOblot
analysisウシ脳自質ミエリン分画
をSDS−PAGEにて分離後ニトロセル

文

ロース険に転写した。
a．アミドブラック染色

b．対照培養上宿を用いた間接法で染色した。
亡．モノクローナル抗体（TFK−1）を用いた間接法で染色した。
左端の数字は分子量マーカーの位置を示した。モノクロー抗体はWlaと強く反応し、Wlbと比較的弱く反応した。

献1）Kurihara T．and Tsukada Y．
（1967）The regional andSubcellula distribution of
2一，37−CyClic

nucleotide

3㌧phosphohydrolasein theCentral nervous system．J．

縮後Biogel P−10にて溶出バッファーを70

Neurochem．14，1167−1174．

界蟻酸を用いて分離を試みたところ、CBBおよび遊離のSDSが分離され、WlaおよびWlb2）Suda H．and Tsukada Y．

の単離標品が得られた。蛋白質と結合したCBB（1980）Zmproved me七hod forおよびSDSは完全に除去されているとは思えpurification

ー42−of2．，3●−CyClec

31−phosphodiesterase from

5）Whittaker V．P．and Barker

bovine white matter．J．

L・A・，Zn R・Fried（Ed．），

Neurochem．34，941−949．

Methods of NeurochemistryI3）Kohsaka S・，Nishimura Y・，

VOl・2，Marcel Dekker，New

Takamatsu Kり

Shimai K．

York，1972，pp．1−52．

and Tsukada Y．（1983）

6）Laemmli U．K．（1970）Cleavage

Zmmunohistochemical

Of structural proteins duringlocalizationof2一，3，−CyCiic

the assembly of the head of

nucleotide

3㌧Phosphodiesterase

bacteriophage T4．Natureand myelin basic proteinin

227，680−685．

the chick retina・J・Neurochem・7）Towbin H．，Staehelin T．and

41，434−439．

GordonJ．（1979）Electro−

4）Tsukada Y．，Nagai K．and Suda

Phoretic transfer of proteins

H．（1980）A rapid mibro methos

from acrylamide gels tofornitrocellulose sheets：

2■，3．−CyCli．c

nucleotide

3l−phosphohydr01ase assay

procedure and some applications．

using micro high performance

Proc．Natl．Acad．Sci．USA

iiquid chromatography．

76，4350−4354．

J．Neurichem．34，1019−1022．

ー43−

昭和60年度厚生省研究報告書，45−61，1986

新たに発見された後肢麻樺ラット江 崎 孝三郎1）
研究協力者 埜中征戎津金隆夫1）筋ジストロフィー症のモデル動物としては、る異常仔発現の様子を表1に示した。6組の交

dyマウス、mdxマウス、myハムスター、am配から16回の出産によって122匹の仔が得らチキンなどが知られ、研究に使用されている。

れた。このうち、異常発現の時期まで生存したいずれのモデル動物もヒトの筋ジストロフィー

仔108匹の内75匹（メス39匹，オス36匹）と部分的類似点をもち、研究への利用価値の高が正常で、33匹（メス16匹、オス17匹）

いものであるが、一方では相違点も次第に明らであった。異常の発現率は、この異常が常染色かにされている。ヒトの筋ジストロフィー症の体上の1つの劣性遺伝子によって支配され、両原因の解明のためには、さらに多くの筋異常動

親がヘテロであったと仮定したときの分離比3物を発見し、モデルとしての評価を行う必要が：1（259も）に近い値であった。

ある。
我々は最近Wistar

表1． 後肢麻痺ラットの発現状況

ラットコロニーの中に後肢の麻痺を起こし、歩行不能となる異常を発母親 数 総 産仔 数 観 察 数 正 常見し、その臨床症状の観察、遺伝様式の調査、

6

12 2

108

75

異常
3 3 （3 0 9♭）

組織学的検索を行ったので報告する。

組織学的検索：ヒラメ筋および前脛骨筋の異常動物発見の経過：1980年以来無菌環境

H．E．染色陵を図1，2に示した。異常動物で下で維持されていた、Wistarラットコロニ

は筋緑経が一様に細くなっている。しかし、筋ーの中に、1985年1月に離乳前の仔が後肢のジストロフィーの時のような壊死、再生所見は

麻痔を起こし、歩行不能となるのを発見した。

みられない。また、神経原性疾患の時のよまた、異常仔を出産した交配の組と同じ家系のうな、grOup atrOphyもみられない。上他の交配の組からも同様の異常仔が出現し、こ腕二頭筋の組織像を図3に示した。後肢ほど顕の異常が遺伝的であることが推測された。

著ではないが、筋線経の細化が認められる。

後肢の麻痔は生後2遇頃から発現し、日の経

長指伸筋のNADH−TR染色像を図4に示した。

過とともに重篤となり歩行も不可能になる。発正常筋では、酸化酵素活性の高い緑経、低い線

育は正常のものより著しく遅れ、生後3−4週経の分別が明確であるのに対し、異常動物の筋・で死に至る。

ではその分別が悪く、筋の発育、分化の遅れが退転様式の検討：異常動物の発見の経過から、この異常は遺伝性であることが推測された。そ見られる。同様な所見はヒラメ筋においても観察された。

こで、異常仔を出直した交配の組、6組におけ

1）（財）実験動物中央研究所
2）国立武蔵療養所神経センター
ー45−

前脛骨筋のCytOChrome c oxidase染色像を図5に示した。図4のNADH−TR染色の以上の検索から今回発見された異常動物は、場合と同様の所見がみられる。 ヒラメ筋の筋ジストロフィーとは異なるものと判断される。

ATPase染色像を図6に示した。この染色で筋の未熟性を主病変とする疾患に先天性ミオパ

みるかぎり、異常動物の筋のタイプ1線経、タチーが考えられるが、これは進行性ではない点

イプ2線経の分布には異常はみられず、個々ので異常ラットの所見と異なる。

筋線経は神経支配を受けていると考えられる。

また、図1，2，3および7において、異常動

長指伸筋のmOdified Gomorli tri−

物の筋において末梢神経の分布密度が高いよう

chrome

染色像を図7に示した。末梢の有髄に感じられるが、これが異常所見であるか否か

神経に著明な異常はみられない。前脛骨筋のについては、今回の検索のみでは判断できない。

acetylcholinesterase染色像を図8に今後、電顕的検索、脊髄前取の検索、神経、筋示した。異常動物の筋においても神経・筋接合の電気生理的検索を行う必要がある。

部の酵素活性に異常は認められない。

−46−

図1．ヒラメ的のH．E．染色像、×80．上：正常、下：異常

・●

図2，前脛骨筋のH．E．染色像、×80．上：正常、下：異常図3・上腕二頭筋のH．E．染色像、×80．上＝正常、下＝異常図4・長指伸筋のNADH−TR染色像、×80．上：正常、下‥異常図5・前脛骨筋のCytochrome c oxidase染色像、×80．上：正常、下：異常図6・ヒラメ筋のATPase染色像、×80．上：lE常、下：異常図7・長指伸筋のmodified Gomor・i trichrome染色像、X80．上：正常、下：異常

︑﹁一

−

■

チず

−ヽ

．
ヽ．

■t

鳥

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図8・前脛骨筋のaCetylcholinesterase染色像、×40．ヒ：正常、下：異常●昭和60年度厚生省研究報告書，63−67，1986

後肢麻樺マウスんJpの病態と遺伝について
富田

武

研究協力者 菊池建邸〜埜中征哉り
若杉 昇り山崎一斗1）
はじめに神経・筋の疾患モデル動物の開発を目指し、病

ヒトの筋ジストロフィー症のモデルマウスと態解析と遺伝解析を同時に進めるために最も適しては、すでにC57BL／6J一句1）ぉよぴC57BL

当と考えられるマウスを対象動物として、検索／6J一m血2）が開発されて、わが国でも病態解析と開発を進めた。その結果、RFM／NgaとCBAや治療法開発のため用いられている。しかし筋／Wgaの交配よりのR世代に後肢麻痺を生後80ジストロフィー症およびこれと密接に関連する

日前後に発症し、約200日で死亡する雌雄合計

脳・神経の異常による筋症恩はヒトにおいて数4個体を発見し、それらの後代よりこの症状を多く知られており、病態や遺伝に関する解析を多発する系統を確立しつつある。今回はその病必要としている。したがって、実験動物におい態と遺伝について報告する。

てさらに多くのモデル動物が開発されると同時に、既知の疾患遺伝子との複合症例の病態につ後肢麻痺マウス、最クの発見と命名

いての解析も必要である。

CBA／1屯aの1匹の雌とRFM／Nga

・われわれはこのような認識のもとに新しい脳・の雄との交配により得られたFl世代はすべて正叫p 8他1人エア？他1

CBA／N伊？

H：1；

RFM／り屯a8」

LF18

叫p

？他2

別わ 8
g毎〉 8
gZp

8

gヱ｝

？

の1匹

RM屯a？

図1・後肢麻痔症（最p）マウスを生んだ交配形式（gJpは正常個体）

1）名古昆大学農学部
2）国立武蔵療養所神経センター
一63−

常であった。Flの雌雄1対の交配により得られ個体を得た。これらの交配結果を図1に示した。

たF2世代の雌4匹、雄3匹、合計7匹のうち、正常同士の雌雄の交配より後肢麻痺を示す子

雌2匹および雄1匹の合計3匹が、生後80日が少数出現することより、この症状を発現する

前後より後肢を伸長したまま引きずる症状を示

遺伝的要因は常染色体上の劣性遺伝子によるとしたのが発見の端緒である。

仮定し、後肢麻痔を示すことから仮にんエア

これら3匹のうち雌雄各1匹は発症後に殺処（hindlimb paralysis）と命名した。

分して剖検に付したが、1匹の雌は同腹の正常雄と交配したところ幸にも初産で3匹を得て、んエpマウスの病態

そのうち生存したただ1匹の正常雄をRFM／最初に発見された雌2匹と雄1匹のんエアマウ

Nga雌にBackcrossして初産9匹、第2産

スの体重の推移、発症時期、死亡または殺処分

6匹で雌8匹、雄7匹の合計15匹の子を得た

時期および出産状況を表1にまとめた。これらが何れも正常であった。これらの雌雄を同腹間の3匹は生後81日目は発症を認めたが撤2ので兄妹交配したところ、後肢麻痔を示す個体が雌は初産をして3匹の子を残した。前述のごと

次代に政見されるようになった。また、ただ1

くこの中よりただ1匹の雄が生存し、離乳し、匹生存したF2雄をBackcross世代の正常雌

そしてんエアマウス確立のもととなったのである。

に交配したところ、1腹3匹の中に1匹の発症

肱1の雌雄は101日齢で殺処分したが、体重は表1．後肢麻痺症マウス（んムp）と正常同腹マウス（gエア）の体重と症状または経過

月日

生 後 日齢んエア 8 払 1 の
体 重 と症状

舛 p ？払 1 の
体 重 と症 状

最 p ？他 2 の体 重 と症 状g

ク 8 の

体 重 と経 過

風 疹 ♀の体 重 の経 過

0

出

産

出

産

出

産

出

産

出

産

19

18

離

乳

離

乳

離

乳

離

乳

離

乳

26

25

1 7 ．310 ． 1

（
g ）

15 ．3

〈g ）

1 4 ．5

（g ）

17 ．5

（g ）

15 ．2

1 1． 232

2 3 ．01 9 ．1

1 9 ．08 1．0

2 0 ．0939

2 5 ．5：辺 ．1

2 1 ．82 6 ．22 2 ．616

46

2 7 ．8三方．6

2 3 ．82 7 ．82 4 ．030

6 0

2 8 ．72 i．1

2 7 ．03 1 ．84 5 ．012 ． 767

2 9 ．42 5 ．5

3 0 ．5

3 2 ．83 4 ．71474

2 9 ．1

2 5 ．5

4 0 ．5a l．6

3 6 ．6

3 2 ．13 2 ．738 ．0

3 4 ．83 9 ．6

3 3 ．93 9 ．83 6 ．4妊娠

3 1 ・8 （宝 霊3 匹

2 6 ．1

2 匹

21

8 1

2 8 ．6

発症

2 4 ．4

発 症

1 ．1 11 01

2 6 ．9殺 処分

2 2 ．8

殺 処 分

18

108

2 9 ．32．1

122

2 5 ．78129

2 5 ．815136

正常 8 交 配

4 ．2 6

19 8

衰 弱 死

一64−

食殺

子 1 匹離 乳

（
g ）

妊 娠

発症後増加せず、やがて減少して末期に至った。

正常個体雌雄の交配の子に最pが出現すること

そして他2の雌は生後200日前後で衰弱死した。

と、雌雄で最pの出現に差がないことより、常同腹の正常雌1匹および正常雄1匹の体重と繁染色体性劣性遺伝子による支配が推定された。

殖記録を次欄に示す。正常な個体は順調に発育

このことを証明するためにAgpを産した交配結をつづけ、雌では出産前に体重の急増が認めら果をまとめて表2に示した。4組のCarrier

れ、出産後はもとの体重に近い所まで復するが、同士と思われる交配よりの子の分離比は合計し雄では生後100日前後まで体重が増加し続けた。

て正常51個体に対して最p20個体であり、発症個体では図2に示すように後肢をひきづ

明らかに3：1の分離比に合致することより、り、またミオクロヌス様のふるえを示しており、最戸は常染色体性単純劣性遺伝子により支配さ外的刺激により全身性強直を起すのを特徴としれていると結論することができる。対照としてていた。

おこなった交配5（正常×Carrier）よりの子は、正常16個体、ん桓0個体の結果が得ら

ふよp疾患の遺伝的支配

れ、上の結論と矛盾しない。

図1に示される最pの発症個体の出現状況は、

表2・後肢麻痔症（最戸）の遺伝解析
交配番号考推 定維 伝子 型

× 推 定 遺 伝子 型

正 常 な 子 の数

兄上p の 子 の 数

合

計

1

且匝／ 最 pg p ／最 p

6

3

9

2

g J P ／ ん桓gP ／んエア

1 7

7

2 4

3

g ヱp ／ んJ p

別 p ／最 戸

9

3

1 2

4

g 桓 ／ んヱp

別 p／混 p

1 9

7

2 6

5

g J p ／甘 Jp

g ヱク／んエア

1 6

0

1 6

案

正常雄との交配より得た正常雄を、父系である

脳・神経・筋の疾患モデル動物の検索と開発

RFM／Nga雌に交配して最戸遺伝子を継代した。

を目指し、病態解析と遺伝解析を同時に進める

このような経緯より考えるに、近交系問の交配ため最も適当であると考えられたマウスを対象は対立遺伝子問のわずかな構造的差異により、とした研究により、後肢麻痺を示す最戸マウス

新しい突然変異を引き起す可能性を示している。

を発見し、発症より死に至る病態の推移を明ら

実際に近交系交配群の後代より突然変異体が発かにすると同時に、その遺臣的支配が常染色体見された例をまとめた記録はなく、また意図的上の単純劣性遺伝子によることを確定することに近交系間交配をおこなっても容易に突然変異ができた。

体を分離することもなく、極めて経験的、結果

混pマウスは、高度に近交されたCBん／l屯a論的議論であったが、最近の組換えDNA技術を系（F80）とRFM／N四系（F32）のF2世代よ駆使した研究により、次第に遺伝子の微細構造り発見されたものであり、さらにBの発症雌とが明らかにされてきたので、今や、この間現のー65−

解明への足がかりが得られつつあるもの考えらば、増殖効率の向上と実験条件の精密化にも役れる。

立つものと期待される。

ともあれ、期待した後肢麻痺を発症する脳・神経・筋疾患のモデル動物が得られ、その遺伝子支配も解明されたので、今後このんエアマウス

1）辻

繁勝，松下

宏

‥

筋ジストロフィーを増殖して、広く病態解析と治療開発のた韓日こ症の実験モデルー筋萎縮症マウスについて活用が望まれる。したがって、次には疾患モデ

一日本臨床，35（11）：54−60，1977．

ル動物としての有用性の評価に努力が向けられ

2）Bulfield，G・，Siller，W・G・，るべきであり、すでに筋病理像および中枢神経

Wight，P．A．and M00re，K・J・

病理像の研究が協力班員により開始されている。

X chromosome−linked muscular

また、最戸遺伝子がどの染色体のいかなる位置

dystrophy（mdx）in the mouse・にあるかを明らかにするため、リンケージ・テ

Proc．Natl．Acad．Sci．USA，ストが開始されている。これらの情報をもとに、
81（4），1189−1192，1984・

さらに既知のジストロフィー遺伝子との複合の実験に進みたいと考えている。

3）横山蜂介，江崎孝三郎：私信んエアマウスの増殖と供給に関しては、この疾

4）Wakasugi，N・Studies on

患の遺伝が解明されて常染色体牲単純劣性退転

fertility of DDK mice：reCi−

子によることが明らかにされたので、遺伝的固定は容易である。この疾患の発現時期が生後鮒日前後であり、ふけ雌が順調に発育すれば初産の子を得ることが可能である。その点では他の劣弱な疾患モデル動物よりは供給にも問題が少ない。また、最近開発された体外受精法8）や、

procal crosses between DDK
and C57BL／6J strains andexperimental transplantationofovary・J●Reprod・Fert・

33，283−291．1973・

すでに確立されている卵巣移植法句を併用すれー66−

図2・ 後肢麻痺症マウス（生後101日）

昭和60年度厚生省研究報告書，69−75，1986

燻性鶏における筋ジストロフィー遺伝子発現
菊 池 建 機l）
研究協力者

武

田

伸

一2）

はじめに

本報告は、ヘテロ鶏（am／斗）にdw遺伝子を常染色体不完全優性の遺伝様式に従う1）鶏の導入し、この退転子が筋の組織および蛋白に対筋ジストロフィー（以下筋ジスと略）遺伝子

しどのように作用するかを解析した。dw遺伝（am）は、伴性劣性退転に従う壊性遺伝子（dw）

子は筋ジス鶏において強い変更退転子として作が導入されると、浅胸筋筋線経の急激な萎縮と用すると同時に、ヘテロ鶏浅胸筋においても同消失、それに付随する著しい脂肪組織の増生を様に働き、筋の組俄病変を悪化し、かつ本来へ起こし、症状を著しく悪化する2と 鶏体を小型

テロ鶏筋では合成されないトロポミオシンβ鎖化するdw遺伝子はam遺伝子に対して強い変更を出現させた。

遺伝子として作用する8〜5まam遺伝子をヘテロ接合体として持つヘテロ鶏は、筋組織の病変や材料及び方法

血中酵素活性の上昇において、ホモ接合体の筋

実験矧ま白色レクホン種（WL）と度性鶏WL−

ジス鶏と正常鶏のほぼ中間値を示す1ま しかし、dw）のそれぞれに筋ジスam遺伝子を導入した

筋線経を構成するトロポミオシン、トロポニン

白レク筋ジス鶏（WL−am）と筋ジス賃性鶏（WL−

T、デスミソおよびビメソチンという4つの蛋

am，dw）を用いた。種々の遺伝子型を有する実

白には異常が認められない6と 筋ジス鶏浅胸筋

験鶏はこれらの鶏の交配によって得られた（表の筋線経はトロポミオシンα鎖に加えて、成熟−2）。

した正常筋では見られないβ鎖を含んでいるが、

1）組織学的所見

ヘテロ鶏ではこのβ鎖の合成が抑制される。こ10，16遇、1年齢の鶏浅胸筋の中央部かの意味で、am遺伝子の筋組織レベルでの発現はら組織を採取し、109ら中性ホルマリン溶液に優性、蛋白レベルでは劣性遺伝の様式をとる聖て固定した。固定終了後、組織は四酸化オスミ

表一1．14遇齢の白色レクホン、賃性、および筋ジストロフィー賃性鶏における生体重および血中T4，で3濃度
Body velght（g）
Sex WL

Plasma T4concentratlon（pg／1）
WL

Ⅵ■一dv wL−dv，a爪

pla8ma T3concentration（pg／1）

吼−dv vレdYlam

Ⅵ・

VL−dv Vレdv●a一尺Meles

15鳳7土瓜4隠7士81．58阻7士軋6

14・3士3・4

17・2土21m士1月

1月士0・1

朗±0・8

18・7土3・0

用土0・1

0・9土0ユ

18士02

0・7士0・lFemale1ユ733土光2郎3士3こ；6（応．7士乳6

17月土251月士02

注：値は平均値±標準偏差で示す（個体数は各々6羽）
白色レクホン種と他品種を比較した（t一検定：＊ pく0価，・・pく0．001）

1）東北大学農学部、国立武蔵療養所神経センター
2）信州大学医学部第三内科
一69−

真一2．筋ジストロフィーおよび壊性退転子型と浅胸筋トロポミオシンβ鎖合成との関係じ位置から数本の筋束をガラス棒に結索したまま切出し、−20℃の509もグリセリン中に保存した。筋線経の蛋白はIEF−SDS．PAGE

Male

による2次元電気泳動により分析した。アクリ

dw
Z
dw

＋＋

＋

十／
与

ルアミドの濃度は159あに調整した。ゲルは最終的に0．059もCBBで染色した。

＋
Z

＋
Z

am ／午

dw
Z

Z

am ／
もm

結

＋＋
＋

Z

果

14遇齢において各品種の生体重と血中甲状＋＋睨ホルモンの濃度を測定した。麓性鶏（WL−dw）
le
a rIレ
克m

a m ／十

一
レ午

＋＋

＋

−

は雄雌とも大型の自レグ鶏（WL）に比べて約亜
界体重を減ずる。笈性鶏にさらにam遺伝子が

dw
Z

W

導入された筋ジス笈性鶏（WL−am，dw）では雄＋ZW

で約44界、雌で約48界体重を減ずる。血中十十Thyroxlne（T4）濃度は雄雌、品種間で有
注：この結果は醇化後10および16週齢で得られた。
十、−は2次元電気泳動法で得られたスポットの強度を印象的に示した。

意差は認められない。しかし、血中Tri−
iodothyonine（T3）濃度は、dw遺伝子が導入されると正常値のほぼ半分に低下する。
T3値は楚性鶏と、am遺伝子が導入された筋ジゥムーパラフィン包理法2）で処理され、脂質をス瑳性鶏との問で有意差は見られないが、後者

染め出す組織病理標本を作或した。ニューハンでやや低い傾向を示す。
筋ジスam退転子がニューハンプシャー種筋

プシャー種筋ジス鶏（NH1413）は日生研の水谷誠班員から供与された。

ジス鶏（NH−413）から白レグ筋ジス鷲（WL−2）Thyroxine（T4）とTri−iodothyro−am）、さらに筋ジス渡性鶏（WL−am．dw）へとnine（T3）の血中濃度移行するに従い、浅胸筋の筋線経の萎縮、消失

14週齢の自レグ種（WL）、笈性鶏（WL−

は一層顕著になり、次第に周辺での脂肪組織のdw）、筋ジス笈性鶏（WL−am，dw）雄雌、各6急激な増生を誘発する（図一1）。一方、白レ羽ずつを供試した。巽下静脈より採血し、血環ク種へテロ鶏（am／／与）の浅胸筋は、筋線経の大を分離後、RIA法により測定するまでプールし、

小不同、線維核の増殖を示すが、顕著な脂肪組−20℃に凍結保存した。甲状腺ホルモンの血織の増生は見られない。しかし、ヘテロ鶏にdw

中濃度はトラベノール社のキットを用い、T4遺伝子が導入されると、浅胸筋線経の大小不同

はGamma Coat T4Kit、T3はGammaは一層顕著になり、萎縮した小径線経の割合がCoat T3Kitで測定した。

大となる。筋ジス須佐鶏筋と同様に大量の脂肪

3）筋線経の収縮蛋白の分析が浸潤する（図−2）。

組織学的検索のため採取された部位とほぼ同ー70−

10適齢箪性鶏においてam遺伝子をホモ（am図1・筋ジストロフィー症のニューハンプシャー種（NH−413）、白色レグホン種（WL−am）、

および笈性鶏（Wレ8m，dw）浅胸筋における組織学的変化
a：NH−413，b：WL−am，C：WL−am，dw

図2・16適齢におけるへテロ鶉（am斗）浅胸筋のdv遺伝子へテロ凄合個体（Z血Z＋）（a）とホモ凄合個体（Zd鷲血）（b）間の組織学的比較−71−

neieI一口ここ、持0ミミ1

norma！

dystrく）Phy

拍m／a汀り

（十ハ汀再

（十／＋）

lTM一●

弱敵
●

図3．10週齢矯性鶏（＋／1）、筋ジス簿性鶏（aIlレ七m）、およびへテロ瑳性鶉（am／十）浅胸筋の全筋線維抽出蛋白の比較
dTM：トロポミオシンα鎖1，βTM：トロポミオシンβ鎖、，デスミンが筋ジス筋にみられる。

㌔彗Z十

10wk＄

16wks

aTM・・●

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；‡ご二・

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■−■■

巧や
aTM′

図4．10，16遇、および1年齢におけるへテロ鶏（am／午）浅胸筋トロポミオシンのdw
遺伝子へテロ接合個体（Zdwz＋）とホモ接合個体（Z加Zか）間の比較
dTM：トロポミオシンα鎖も，βでM：トロポミオシンβ鎖っ−72−／am）、またはへテロ（am／Hに導入して浅胸える遺伝子である。この遺伝子は他の遺伝子の筋の収縮蛋白、特にトロポミオシンの質的変化

形質発現を強調したり、その突然変異性を増加に焦点をあてて解析したのが図−3である。正させたりする強調遺伝子と、他の遺伝子の働き

常楚性鶏の筋蛋白はニューハンプシャー踵正常を弱めたり、その働きを完全に抑えてしまった鶏（NH−412）での結果とよく一致する。ミオ

りする抑制遺伝子や抑圧遺伝子とに分けられる。

シン軽鎖は速筋タイプのfLC−1，fLC−2，

筋ジス楚性鶏は、2種の遺伝子、すなわち筋ジ

fLC−3の3種より成り、トロポニンーCも速ス遺伝子（am）と楚性遺伝子（dw）を有する。

筋タイプである。トロポミオシンは殆どα鎖かZ染色体上にあるdw遺伝子がホモまたはへミら成る。一方、筋ジス漆性鶏筋のトロポミオシ

接合体の場合は、常染色体上にあるam遺伝子

ンはd鎖に加えてβ鎖のスポットが認められ、に対して強調遺伝子として作用L am遺伝子のデスミソのスポットも出現する。am遺伝子を発現を増大する。従って、dw遺伝子を有する

ヘテロに持ち．かつdw遺伝子がホモ化した壊筋ジス賃性鶏浅胸筋の筋線経は萎縮、消失し、性鶏では、トロポミオシンα鎖に加えて、僅か

さらに、それらと平行して脂肪組織の浸潤が薗ではあるがA鎖が出現する。このヘテロ鶏での著となる。′同様の結果はヘテロ鶏（am／与）にトロポミオシンβ鎖の合成の状態を、dw遺伝

dw遺伝子が導入された場合にも見られる。

子をホモにもつ小型な雄個体（am／与，Zdw

正常鶏浅胸筋のトロポミオシンはα鎖から成Zdw）と、dw遺伝子をヘテロにもつ大型の雄個るが、筋ジス筋のそれはd鎖に加えてβ鎖が長体（am／㌔Zdwz＋）の間で比較した（図−4）。

期にわたって残存する7之へテロ鶏（打〟午）浅dw遺伝子をヘテロにもつ大型個体の浅胸筋筋

胸筋は正常筋と同様にトロポミオシンβ鎖は出線経にはトロポミオシンβ鎖は出現しない。した現しないOとがって、dw遺伝子の変更遺伝子としての作用

ヘテロ矧ま、体形が小型化するに伴い、野生型

はヘテロ接合体の場合は十分に発揮されない。

対立遺伝子によって制限されていたam遺伝子

一方、dw遺伝子をホモにもつ小型個体は、強の発現が解除され、筋線経の収縮蛋白レベルでい変更遺伝子として作用し、野生型対立遺伝子の異常が現れる。dw遺伝子をヘテロ接合体とによって抑制されていたam遺伝子の作用を強して持つ大型のヘテロ鶏の浅胸筋筋線経はトロ

調し、僅かではあるがトロポミオシンβ鎖を合

ポミオシンβ鎖を合成せず、正常筋と同じ反応成する。このβ鎖のスポットは10，16週給を示す。これらの事実は、導入されたdw遺伝

しかし、dw遺伝子をホモに持つで観察されるが、充分に成熟した1年齢では消子がヘテロ鶏浅胸筋筋線経において、本来am失する。以上に述べた筋ジストロフィーおよび遺伝子の発現が抑制されることによって合成さ賃性遺伝子型と、浅胸筋トロポミオシンβ鎖のれることのない収縮蛋白、特にトロポミオシン

出現との関係を表−2にまとめた。

β鎖を僅かではあるが合成する方向へ修飾したことを示唆する。

考察

伴性劣性遺臣に従う賃性鶏の血中甲状腺ホル変更遺伝子は遺伝子の相互作用によって、他

モン、Tri−iodothyronine（T3）濃度はの遺伝子座にある遺伝子の形質発現に影響を与辟化後早期にすでに著しく低下していることがー73−

報告されている8と14遇齢で行った我々の測Of chickens．TohokuJ．Agr．

定結果もこのことを裏付けている。鶏体を小型

Res．，32：14．1981．

化するdw遺伝子の一義的形質発現の場は甲状

2）Kikuchi，t．et al：Gene

腺ホルモンの低下であり、筋レベルでの筋ジス

expression of muscularの発現は、am遺伝子とホルモンとの相互作用

dystrophyin dwarf chicken・の結果として把握される。甲状腺ホルモンは筋TohokuJ．Agr．Res．，36：17

線経の収縮蛋白や、酵素反応に作用し、過量の1985．

ホルモンは筋線経を速筋へ分化させ、ホルモン濃度の低下は逆に筋線経を遅筋へと変換させる

3）菊池建段等：筋ジストロフィー鶏の発症過ことが知られているOと 今回へテロ鶏浅胸筋で程の品種間差一特に疑小鶏をめぐって￣・みられたトロポミオシンβ鎖の出現は、血中甲昭和58年度厚生省研究報告書（野村斑）・状腺ホルモン濃度の低下による筋線経の遅筋化と関連があるように思われる。このような甲状

4）菊池建機：筋ジストロフィー鶏骨格筋の脂腺ホルモンの筋への作用は神経を介するとも報質と血管系の構築．昭和59年度厚生省研告されているが10ミ詳細なメカニズムは尚明ら究報告書（野村遮），93，1985．
5）菊池建税：筋ジストロフィー鶏−その多面的生物反応−．日本疾患モデル動物研究会

かとなっていない。

要（講演要旨），1984．

約1）楚性dw遺伝子はZ染色体上にあり、血中

6）野々村禎昭等：肪ジストロフィー症窺浅胸

甲状腺ホルモン濃度を低下させることによっ筋の筋線維構成蛋白一筋ジス遺伝子の白レて鶏体を小型化する。

グ鶏への導入−．昭和57年度厚生省研究

2）筋ジスam遺伝子はこのdw遺伝子が導入

報告書（江橋班）．114，1983．

され、ホモ化した場合、強い修飾を受ける。

7）Takeda，S．and Y・Nonomura：

この意味で、dw遺伝子はam遺伝子の変更

Presence Of the tropomyosin

遺伝子として作用する。

L3−Chainin dystrophic chicken

3）dw遺伝子の発現は、am遺伝子をヘテロ

breast muscle．Biomed．Res・，接合体として持つヘテロ鶏浅胸筋にも強い影

1：176，1980

響を示し、本来この筋線経にないトロポミオ
8）Scanes，C．G．et al・：

シンβ鎖の合成を誘発する。

Abnomalitiesin the plasma
引

用文

concentrations of thyroxine，

献

tri−iodothyronine and growth1）Kikuchi，T．et al．：Genetic

hormonein sex−linked dwarf

heterozygous carriersin
hereditary muscular dystrophy

ー74−

and autosomai dwarf WhiteLeghorn domestic fowI Berlin，N．Y．，p593，1980（Ga11s domesticus）．J．Endocr．，10）Johnson，M．A．et al．：A
97：127，1983

neura11y mediated effect of
thyroid hormone deficiency

9）Ianuzzo，C．D．et al．：Aon slow−tWitch skeletal muscle？

possible thyroidal trophic
influence on fast

Zn：Pette，I）．ed．，Plasticity ofand slow

Skeletal muscle myosin．

Muscle．Walter de Gruyter，

In：Pette，D．ed．，Plasticity of

Berlin，N．Y．，p607，1980・

Muscie．Walter de Gruyter，ー75−昭和60年度厚生省研究報告書，77−87，1986

糖原病Ⅱ型ウズラの改良
水谷誠

研究協力者 新海久夫，小池雅春
中山一彦
梼原病Ⅱ型を発症するRW系は野生型羽装でベての雌が自卵を産卵する（自卵形質に固定）

有色卵殻卵と白色卵殻卵を産卵するウズラが混とともにpanda，yellow，Wildぉよぴ

在する閉鎖集団である。有色卵殻卵は検卵が困dilutionの各羽装の混在する系統を作出す難であるため胚を実験に使用する際1つの障害るため以下の交配を行った。

となる。また、野生型羽装は胚に黒色の色素がpandaでdilution羽装を呈するMWE沈着するため、これも胚を実験に使用する際の系の雄とRW系の自卵を産卵する雌の交配およ障害になると思われる。そこで、これらの欠点

びyellowの羽装を呈するMWE系の雄とを改良するため、常染色体性の劣性遺伝子によRW系の白卵を産卵する雌の2交配を行い、そり支配されている白色卵殻卵を産卵する形質おれぞれの交配から得られたdilutionおよびよび白色羽装を含む3種の羽装形質を糖原病Ⅱ

yellow型系へ導入することを試みた結果、その系統化を産卵する雌をもどし交配した。これらのもどに成功した。本報告はこの新しく確立された梼し交配から得られたwiid，dilutionおよ原病Ⅱ型発症系（RWE系）の特徴、繁殖成績

yellow

および今後、標識遺伝子として使用可能な血液る個体をRWE系の基礎集団とした。なお、型の検索結果である。

panda羽装で糖原病Ⅱ型を発症する個体はこの各羽装を皇する雄にRW系の自卵の各羽装を塁し梼原病Ⅱ型を発症す

れら基礎集団から得られた後代において出現し

Ⅰ．RWE系の確立とその特徴た。今後、Panda，dilutionおよび

1．RWE系の確立過程

yellowの各羽装を塁する個体を選抜し、最RW系l）は有色卵殻卵および白色卵殻卵（以終的にpanda羽装に関しては固定化する予定

下自卵と略、図1）を産卵する個体が存在するである。

閉鎖集団である。一方、MWE系2）はすでに報2．RWE系の特致

告したごとく、糖原病Ⅱ塾形質に関しては非発RWE系の特徴は、前述のごとく、すべての症系であるが、自卵に固定しているとともに常個体が梼原病Ⅱ型を発症するとともにすべての染色体性の優性遺伝子に支配されているdilu一雌は自卵を産卵する。一方、羽装に関しては

七ion（ホモ半致死）、yellow（ホモ致死）

WildI panda｝

および常染色体性の劣性遺伝子に支配されていtionの各羽裳が混在する（図2）。

yellow・およびdilu−

るpanda8）の各羽裳を示す個体の混在する閉RWE系の梼原病Ⅱ型の加齢に伴う発症率を鎖集団である。そこで、この2系統を用い、す

巽の挙上により判定し、RW系のそれと比較し（財）日本生物科学研究所

−77−

％

た。結果は図3に示すごとく、両系とも2遇齢

成長に関しては、RWE系、RW系およびより発症しはじめ7週齢で約909もの個体が発WE系（コントロール系、自卵、野生型羽装）

症し、両系間で発症率に差はみられなかった。

の0−7週齢までの体重を測定した。結果は表1および図4に示すごとく、RW系およびRWE

100

系は類似の成長を示したが、WE系のそれより

／：

90

二／￣

劣り、7遇齢において体重差は15−20gであった。

80

Ⅱ．RW系の繁殖成績

70

RWE系およびRW系の受精率およびふ化率60

はWE系のそれらより低い。このため、RWE
系およびRW系の維持には両系の性成熟以後の50

受精率およびふ化率の推移を知る必要がある。
40

そこで、槙原病発症系としてはRW系を、正常系としてはWE系を用い、両系の8−29過齢30までの受精率およびふ化率の推移を調査した。
20●−●RW系．結果は図5および図6に示すごとく、両系の受0一一一つRWE系・精率は8−14週給で高く、以後減少する傾向10がみられた。なお、RW系の受精率はWE系の
0

○

￣○

0

1

それより常に10−15界低値を示した。特に
2

週

3

4

5

6

7

齢

25週給において329らまで低下した。この受図3．梼原病町型の発症率＼

20遇齢以後のRW系の受精率の低下は著しく、

表1．

発育の比較

週齢
0

1

2

3

4

5

6

7

R W E

6．
6 ±0 ．
6

14 ，0± 2 ．
3

28．
9 士5．
0

47 ．
2 ±6．
4

63 ．
9 ±7 2

81 ．
0±9 ．
0

幻．
2 ±12 51 05．
3士 15．
8R W

6．
8 ±0 5

13 ．
9士2 ．
1

盟．
6 土4 ．
2

47．
3± 6 ．
2 65．
5±6 ．
7

81 ．
3±8 ．
4

9 5．
5 士12 ．
710 ．
5 ± 16 ．
3

W E

7．
1± 0．
7 16 ．
7±2．
1

3 5．
5±3 ．
8

三
強．
7 ±5．
7 79．
2 ±7 ．
5 96．
6 ±8 ．
6 113 ．
1± 13 ．
1

1 19．
8 士14 ．
3

系統名 ＼※雌雄を含む

単位：gー78−

精率の低下の1原因として巽の挙上不能が考えられる。一方、ふ化率の加齢に伴う推移に関し
二二ノ￣てはRW系とWE系において明らかな差異は観／／察されなかった。しかし、RW系のふ化率はWE系のそれより低い傾向がみられた。このことは、梼原病Ⅱ型形質が胚の生存に不利に働く面もあることを示唆しているかもしれない。
RWE系、RW系およびWE系の2−7カ月
齢の間の受精率およびふ化率の平均値を算出した。結果は表2に示すごとく、糖原病発症系の受精率はRW系で60．7珍、RWE系で47．09♭
一表2．受精率およびふ化率の比較

一一TVE系▲＿．＿＿＿＿＿＿＿▼＿＿＿＿．．．．．＿RW系

系 統 名

受 精 率

ふ 化 率

R W E

4 7 ．05 6 ．3R W

6 0 ．7

6 0 ．9W E

7 7 ．37 9 ．3＝■−■￣RWE系

3

2

1

0

4

遇

5

6

7

齢

図4． 成 長 曲 線％l畑i書≡8︒7︒（2−7カ月齢）

即
似

30

財媒

40

浄

か
0
1

15

遇

齢

図5．RW系とWE系のウズラの加齢に伴う受精率の変化
−79−

25

lF這
図6．

齢

竿至

RW系とWE系ウズラの加齢に伴うふ化率の変化

0
8
0
7

⁚帥4 0・30

線と鴫

加

5
1

−．．．⁚

0
1

201

遇

齢

−

‡：25

i＿∴

t l

図7．加齢に伴う入卵数に対するふ化率の変化（RW系）

ー80−

と正常系の77．39もよりかなり低値となった。

抗血清あるいは異種免疫抗血清ではなく、ウズ

特にRWE系において低く、今後改良すべき点

ラの赤血球あるいは白血球をウズラ（雌）とニワと考えられる。ふ化率に関しては、RWE系にトリ（雄）の交配から得たハイブリッドに免疫しおいて56．39も、RW系では60．99あとWE系て作成した抗血清である。ウズラよりハイブリの79．3界より低値であったが、受精率においッドが約3倍大きいため同種免疫による方法よて観察されたほどの差はみられなかった。

り多量の抗血清を得られる利点がある。免疫の入卵数に対するふ化羽数の率はヒナを実験に組合せを表3に示す。免疫方法は20界の赤血使用する際および次代のヒナを得る際、入卵す

球浮遊液あるいは2mgの血液よりる種卵の個数をきめるめやすとなる。そこで、

Paque液を用いて得た白血球浮遊液各lmeをFicoll−RW系の8−29週齢までのこのふ化率を算出

表3．抗血清の作出法した。結果を図7に示す。図からも明らかなようにRW系の入卵数に対するふ化率は20遇齢

ウズラ（系翫）慧酢用いた′イプリッド

以後30ヲら以下となり回復はみられない。

2554（SBPN）

これらの結果から、RW系を継代する際、種親が20遇齢になる以前に次代のヒナを得るのが適当と考えられる。すなわち、少くとも5カ
月に1回は種親の更新を行うのがよい。この更新期間はWE系の約％である。

赤血球2991（m）〝

4482（m）〝

5638（B）

白血球

5168（PNN）〝

粥10（CWE）〝

Et．RWE系およびRW系の血液型標識遺伝

表4．白血球を免疫して作成した3種の抗血清の凝集力価子
梼原病Ⅱ型発症形質を支配する遺伝子の存在する染色体および連関関係にある遺伝子を解明

品聖清 4692 5047 5579
6
1

0

6
1

8
2
1

0

0

6
1

0

5638

8

5168

行うためRW系およびRWE系の血液型の標識

0

5610

る。そこで、第1段階として連関関係の検索を

0

5024

クローニングなどの研究に必要になると思われ

0

することは今後の糖原病Ⅱ型に関する遺伝子の遺伝子に関して調査した。
ウズラの血液型は免疫抗血清、自然凝集素お

毎週1回ハイブリッドの翼下静脈に免疫した。

よび植物性凝集素（植物レクチン）により識別

白血球を5遇連続免疫して得た3種の抗血清のされるものとに大別される4≧異なるウズラ個体に対する凝集力価を表4に示

1．免疫抗血清により識別される血液型

す。表からも明らかなようにこれらの抗血清はこれまで同種免疫抗血清および異種免疫抗血

抗原特異性が高く、ニワトリの同種免疫抗血清

清により識別される血液型が報告されている5と8）のように吸収操作を必要としない。この点に関しかし、今回筆者らが用いた抗血清は同種免疫

しては同種免疫抗血清と同様である。なお、今ー81一

回用いた抗血清と反応する抗原のシステムと同陰性形質に固定する予定である。一方、RW系

種免疫抗血清により識別されるシステムとの異は4692，5047，7984および9035の各抗血

同は末検索である。また、今回用いた6種の抗清に関しては陰性形質に、5579および2018

血清により識別される抗原問の同座性も未検索

両抗血清に関しては陽性形質に固定する予定でである。

ある。4692，5047および5579の各抗血清

RWE系およびRW系の6種の抗血清に対すに対する凝集性を固定することは、これらの抗る赤血球凝集性を検索した結果を表5に示す。

血清と反応する抗原がニワトリのBシステムと4692，5579および2018の各抗血清に対する同様に組織適合性遺伝子座である可能性が考え両系の陽性・陰性各個体の出現頻度は煩似し、られるため今後これらの系統を用い筋肉の移植陽性個体が陰性個体より多い傾向がみられた。

実験などを行う際に有利になると思われる。

9035に対する陽性・陰性各個体の出現頻度は

2．植物レクチンにより識別される血液型

両系で類似し、陰性個体が陽性個体より多く存

植物レクチンの血液型特異性は高く、ヒトの在した。また、5047および7984両抗血清に

A，B，0およびNなどの血液型を判定する際対する陽性・陰性各個体の出現頻度は両系間で使用されている。また、カツオ7ト、ト8）ぉよぴ

異なり、5047抗血清に関してはRWE系はほ

ニワトリ9）など種々の動物の血液型を識別する

とんどの個体が陰性であったが、RW系では陽レクチンも報告されている。

性・陰性各個体は同程度であった。一万、7984

ウズラの血液型を識別することが知られてい抗血清に関しては両系とも陰性個体が陽性個体

るレクチンにはダイズ望クリタケ11）ぉよぴキ

より多く存在した。今後、RW系は4692，

クイモ（水谷ら未発表）の各レクチンがある。

5047，5579，7984および2018の各抗血清

これら3鐘のレクチンに対する陽性・陰性各個に関しては陽性形質に9035抗血清に関しては体の出現頻度をRWE系およびRW系において

表5．6塩の抗血清に対するRWE系およびRW系の陽性・陰性各個体数

忘で讐守9！守04二守7日98㌧㌍
RWE

●26

RW

24

14・1

16

39■38

17

2

13−30

■

3

37

10．14

26

4

36123

17

6

34．30

10

表6．3踵の植物レクチンに対するRWE系およびRW系の陽性・陰性各個体数
ケ

ク

リ

ク

ズ

イ

ダ

ソ

チ

レ

ク

クイ モ

▲0

＋

十

十

＋

統
系

5

1
1

4
1

0

6
1

0
1

7
1

7
1

6

7
1

0

9
1

3

3
2

4
1

6
2

0

0

0

0

0

0

7
1

R

W

4
1

E

W

R

82

についての退伝子分析．実験動物．23．

検索した。結果を表6に示す。
ダイズレクチンと反応する凝集原ttSb はす

59−61．1974．

べてのウズラに存在する凝集原である。しかし、

4）水谷誠：ニホンウズラの赤血球凝集原（抗産卵雌ではこの凝集原の消失（Sb消失形質）す原）探索の現状，退伝．32．34−39．

る個体と存続（Sb存続形質）する個体が存在す

1978．

る。Sb消失形質が常染色体性の単一優性遺伝

5）Hideki Katoh and Noboru

子により支配されている。RWEおよびRW両

Wakasugi．：Studies on the

系はともにSb消失形質に固定していた亡blood groupsin theJapanese

クリタケレクチンと反応するNs凝集原は一

quail：detection of three

部わ雌においてのみ産卵に伴い出現する凝集原
antigens and theirinheritance・で、常染色体性の単一優性遺伝子により支配さ

Dev．Comp．工mmunol．4．99−110・れている。RW系は産卵時Ns凝集原陽性の個1980．

体が多く、RWE系は産卵時陰性個体の多い傾

6）Hideki Katoh and Noboru

向がみられた。
キクイモレクチンと反応するHt凝集原は前Wakasugi：Studies on blood

述の2種の凝集原と性質が異なり、産卵状態のgroupsin theJapanese quail：

変化により凝集原の存否が影響をうけない凝集

The common antigen possesed by原である。現在、遺伝様式は不明である。両系

red blood cells andieukocytes

とも陽性個体の多い傾向がみられた。

and their inheritance．

今後、寧W系はNsおよびHt両凝集原とも陽＝mmunogenetics13．109−114・1981・

性形質に、RWE系はNs凝集原に関しては陰性形質に、Ht凝集原に関しては陽性形質にそ

7）．Sprague，L．M．，Erythrocyte
antigens of the oceanic skipjack

れぞれ固定する予定である。

（Katsuwonus pelamis）recognized文

献by phytohemagglutimins．Genetics

1）水谷誠：糖原病Ⅱ型ウズラの育成．筋ジス
トロフィー症動物の生産・開発に関する研46．901．1961．
8）水谷誠，梅田茂和，倉益茂実：エンドウ植究．昭和56年度研究報告書．35−52．

物性血球凝集素（PHA）により見出された

1982．

ハト赤血球凝集原に関する研究．日畜会乳

2）水谷誠：糖原病Ⅱ型ウズラの遺伝子分析．

52．82−87．1981．

筋ジストロフィー症動物の生産・開発に関9）水谷誠，梅沢英彦，倉益茂実：アメリカヤする研究．昭和58年度研究報告書．47

マゴボウレクチン（PWA）と反応するニワ−56．1984．

トリ赤血球凝集原 pWl3）水谷誠，茅野和夫，梅沢英彦，倉益茂突：
ニホンウズラの新しい羽装ノミンダ（panda）

ー83−ぉよび PⅥなに関する研究．ABRI．12．16−19．
1984．

10）水谷誠，梅沢英彦，倉益茂実：ダイズPHA ll）水谷誠，斉藤司，梅沢英彦，倉益茂実：ク
により見出されたニホンウズラ赤血球凝集

リグケPHAにより新たに見出されたニホ原に関する研究．日畜会報．48．227−

ンウズラ赤血球凝集原．ABRI．9．43

234．1977．

−45．1981．

ー84−図1．有色卵殻卵および白色卵殻卵

︵喜コ裟時．pT蔓は⁚奄﹂．uOココTTP岬．召Sd咄⁚葛↓︶蛾等ゆす球ヨり雇珂≧鍼・N短昭和60年度厚生省研究報告書，89−93，1986

筋ジストロフィーハムスターの繁殖ならびに系統育成について斉 藤 宗 雄l）研究協力者 田中 亨：）松崎哲也l）
筋ジストロフィーの研究には、筋ジストロフ

1匹を1週間同居交配し、その後オスを分離し、ィーマウスを始め、各種の疾患モデル動物が使

メスは個別に飼育し妊娠・出産・哺育させた。

われている。我々は、1982年より81014．6

哺育仔の離乳は生後3遇齢以上で行った。

ならびにUM−Ⅹ7．1糸筋ジストロフィーハムス

2）繁殖成揖ターを導入し、これらの供給体制確立のための（1）81014．6系

生産ならびに筋ジストロフィーハムスターに対1985年1月から12月までの1ヶ年の繁殖応したコントロール系統の育成を行なっている。

状況は、延交配メス数408匹で、出産メス数

以下にこれらの経過を報告する。

170匹（出産率429ら）、総産仔数1，059匹（平均産仔数6．2匹）、総離乳仔数656匹

1．筋ジストロフィーハムスターの繁殖成績（離乳率61界）であった。この成績を生産指数（1匹のメス親から1回の交配で得られる仔

1）筋ジストロフィーハムスター寧らびに飼育・数）として求めると1．6であった。
（2）UM−Ⅹ7．1系

繁殖方法

BIO14．6系と同様に、1985年1月から12動物は、1981年B工Oi−Reseach consul−
tants．工ncより導入した81014．6系、な月の繁殖状況をみると、延交配メス数は392

らびに、1982年DrJasmin，Canada

匹で、出産メス数148匹（出産率38浄）、より導入したUM−Ⅹ7．1系である。

総産仔数950匹（平均産仔数6．4匹）、総離

飼育は、飼育室の温度23士2℃、湿度55±

乳数697匹（離乳率739も）であった。生産

59も、照明は8時−20時の12時間明12時

指数でみると1．7であった。

間暗、換気回数は10回／時 に統御した。ケージはラット用プラスチックケージ（日本クレア

以上、2系統の成績は、昨年・一昨年の生産

製クリンケージ）を用い、床敦にはカンナクズ

指数が約2．0であったことと比べやゝ低い。特を用いた。飼料はr線3I・had照射滅菌済同型に出産率の低下が著しいことから、これは、コ飼料（日本クレア製CA−1）る給与し、飲水はロニーの拡大後に生ずる、親動物の更新の遅れ

水道水をフラジオマイシン（694J タ／1叩力価）

によるものと予想される。今後、留意したい問

500倍の溶液にして与えた。

題である。

なお、飼育器具

器材はすべて高圧蒸気滅菌して用いた。
繁殖は、生後2．5ケ月齢以上のメス1匹オス

1）（財■）実験動物中央研究所

ー89−

2．筋ジストロフィーハムスターのコントロー

用い、1ケージに5−10匹を収容した。飼育管劉ま前述の繁殖に順じて行なった。観察は白ル系の育成斑の有無ならびに形状を1遇に1度20遇齢迄
肉眼的に行なった。

1）BIO14．6系舌白斑の観察（2）成績筋ジストロフィーハムスターの舌に白斑が生ずることが知られている。しかしながら、その20遇齢迄の観察において、舌白斑の認めら

発生率、出現部位ならびに時期についての報告れたのは、メスで73匹中72匹（発生率98．6は少ない。我々は、コントロール系育成の一環

浄）オスで60匹中48匹（発生率80．0界）でとして、これらの観察を行なった。

あった。
白斑の形状は直径1−5mmの円型で、発現部（1）方法
動物は、当研究所で得られたBIO14．6系ハ位は、舌先端に1−2個のもの、中央部に1個

ムスター6遇齢メス73匹、オス60匹を用いのもの、舌根部に1−2個のもの、ならびにこた。飼育ケージは日本クレア製クリンケージをれらが混在するものなどであった。これら部位

匹

6

匹

7

8

9

10

11

12

13

14

2）適齢

2）CPKの測定

毎の発現状況は、オスで舌先端部31匹、中央部9匹、舌根部2匹．その他2匹であった。メ

BIO14．6系の舌日放の観察において、発現

スでは、舌先端50匹、中央部10匹、舌根部

状況にパラツキがみられ、コントロール系育成

1匹、その他11匹であった。このように、舌に当って、舌白斑のみを指標としては∴充分で先端部に発現するものが6−7割を占めていた。

ないと予想された。

発現時期についてみると、オス・メスともにそこで、筋ジストロフィーハムスターのもう

7適齢より認められ、発現する個体は12週齢ひとつの特徴である、血清中のCPK値を測定までに発現する。平均発現時期はメスで8．6±し、これに基づいた、コントロール系の育成を

1．2遇齢、オスで9．0士1．3適齢であった。な試みた。

お、部位による発現時期の差はみられなかった。

（1）方法

（図1）

動物は、81014．6系、N：Syrian（1983
年NIH，USAから導入）、ならびに、BIOFIB．以上、BIO14．6系の舌白斑ま生後12遇齢

系にBIO14．6系を4回戻し交配したものを基

迄にオス・メスほとんどの個体で発現する。しに育成したコントロール系である。CPKならかしながら、少数ではあるが舌白斑の発現しなびに血液測定は、当研究所附属前臨床研究所血い個体も認められた。このことは、コントロー

液化学部谷本義文先生に依頼して行った。動物ル系育成を進めるうえで、極めて重要な知見ではすべて6適齢以上のものを用いた。

ある。

表1・B工014．6，N：SyrianならびにControiハムスターの血液性状系

G P T（I U ）G O T（I U ）

L DH
（IU ）

C P K
（I U ）

Aldorase

無機 リン

（IU ）

呵／加

（
8）

7 10
57 4
46 9

12 70
1 151
104 6

13 67 18 12 769 4 1

54 0
289

8 77
448

58 74
20 83

70 56
52 08
32 55
53 9 7

8．
7
6．
7
5．
8

（
9）

20 52 24
1197 48
67 116
9 69 00
3 26 40

2 11 8統

B 工0 1 4 ．6

N ：SyrianControl

6．
9
6．
3

（
8 ）
（？）

74

33

1 32

2 26

26

5．
9

96
65

30
25

141
15 1

359
3 28

33
29

5．
7
− 5．
2

（8 ）

22 7

58 8

27 7 26 46 68

16 56

5．
0

11 1
97

54
44
51
36

9 75
5 48
3 81

46

10 0
90

265
18 0
1 82

44
48

4．
9
4．
6
6．
1

130

3 04

46

6．
9

（育 成 中 ）※（？）※

BIO FIBへ、81014．6を4回戻し交配後繁殖−91−

（2）成績
（∋847すべてのCPK値を測定した。その結果、BIO14．6，N：Strianならびにコン

トロール系の主な血液性状低値（1000単位以下）を示す個体はメス59
匹オス40匹であったが、高値（1000単位以928上）を示す個体がメス4匹．オス7匹にみられ

1ならびにコントロール系9283の主な血液た。このように、このコントロール系には、舌性状を表1に示す。筋ジストロフィーのBIO

白斑は認められないが、CPK値の高い肪ジス

14．6系と、正常のN：Syrian

を比較するとトロフィー個体が混在することが確認された。

GPT，GOT，LDH．CPKならびにAldorase（参 後代検定による正常ホモ（＋／与）の選抜

値は、BIO14．6系はN：Syrian系に比べ高㊥の成績から、このコロニーを確実なコント

く、とくにCPK値の差は著明であった。コン

ロール系とするため、CPK低値を示すコント

トロール系についてみると、81014．6系と同ロール系（十／／1又は＋／hy）メス・オスにBIO等または、N：Syrian系と同等な値を示すも14．6系（TW／血y）オス・メスを交配し、得られのが混在していた。

る仔全数のCPKを測定し、同腹仔全てが低値

BIO14．69283匹、N：Syrian㊥

コントロール系コロニーのCPK全数検を示す親ペアの、コントロール系を正常ホモ

査（＋／与）とした。確実なコントロール系は、正常ホモ（＋／与）メス・オス問の交配により育成

コントロール系として維持している963、

表2．コントロール系コロニー、CPK全数検査成績
検査数匹

C PK 低値

CPK 高 値

4 0 匹（2 4 6 − 8 7 0 I U ）7匹 （1 1 2 8 − 4 9 5 6 0 1 日 ）

8

47

9

63

59

（ 7 2 − 8 7 6 IU ）．

4（1 4 2 2 − 3 6 9 0 0 I U ）

計

110

99

（ 7 2 − 8 7 6 IU ）11

（1 12 8 − 4 9 5 6 0 IU ）表3．後代検定：コントロール系へのBIO14．6系交配実験
後 代 検 定 ？ ・8

E x p lB I O 14 ．
6 9
×
コ ン ト ロー ル 系 8＋／ 十 8C P K 検 査仔 数

匹IU
2 3 （2 4 6 − 8 7 0 ）

匹
13 5

IU
（ 78 − 10 019 2 ）5（2 4 6 − 6 3 0 ）

33

8

17

（2 6 4 − 8 7 0 ）102（1 8 0 − 1 0 0 1 9 2 ）

8 10 14．
6 8
×
コ ン トロール系 921（ 72 ．
−87 6 ）

142

（1 6 2 − 1 6 3 9 2 3 ）

＋／与 9

6

（ 7 2 − 7 56 ）55

（1 6 2 − 9 9 0 ）15（1 5 6 − 8 7 6 ）87（1 6 8 − 1 6 3 9 2 3 ）8（ 78 − 9 48 ）

推定
＋パ 1−
y

E x p 2
9

＋A Iy

9

−92−

される。

そこで、CPK値を指標としてBIO14．6とのオスわ後代検定：コントロール系オス23匹

後代検定により正常ホモ（十／＋）メス・オスをにBIO14．6系メス23匹を交配し計135匹選び、このメス3オス3を基にコントロール系の仔を得、これらの仔が6週齢に達した時点でコロニーの再育成を図っている。

CPKを測定した。その結果、同腹全庁のCPK

さて、筋ジスBIO14．6系から

my〝

遺伝

が低値を示したのは、5腹であった。高値が混子を省く戻し交配は、継代に当って、筋ジスの在していたのは17腹であった。

舌白斑やCPK値の特徴を指標（発現しない個

メスの検定：コントロール系メス21匹に体を選ぶ）として用いるため、特徴の柏かなバ

81014．6系オス21匹を交配し、合計142

ラツキによっても、選抜ミスの可能性がある。

匹の仔を得た。これらが6適齢に達した時点で幸いにも今回のコロニーは、＋／＋因子が継代

CPKの測定を行った。その結果、同腹仔全数されていた。しかし、今後継代した場合、どののCPKが低値を示したのは、6腹であった。

ような経過となるか不明である。

高値が混在したのは15腹であった。

一方、系統育成としては、既存のハムスターにmy退伝子を導入する方法もある。この場合

以上、舌白斑を指標として育成したコントロ

舌の白斑陽性を指標（発現する個体を選ぶ）とール系の中から、CPKを指標とした後代検定するので、継代は確実に行なうことができる。

により、正常ホモ（一十／＋）メス6、オス5匹を我々は、この方式による新しい筋ジストロフィ

選んだ。そして、この中から動物の状態のよいーハムスターの育成も試みる予定である。

メス3オス3匹選び、確実なコントロール系コ

参考文献

ロニーの育成に着手した。

1）HOMBURGER．F，：Myopathy of

ま と め

hamster dystorophy：History

今年度、筋ジストロフィーハムスターの維持

and morphologic aspects N．Y・は810−14．6系、UM−Ⅹ7．1系ともdl原調に行Acad Sci，2−17（1979）

なわれた。繁殖成績は昨年度と比べるとやゝ低かった。タネ動物の繁殖使用期間を検討する必

2）斉藤宗男：筋ジストロフィーハムスターの繁殖ならびに改良について、．昭和57年度

要がある。
筋ジストロフィーハムスターの舌白斑の観察

厚生省神経疾患委託研究「筋ジストロフィを行なったところBIO14．6系において、ほとー症動物の開発・供給に関する研究」報告

んどの個体で出現するものの、出現しない個体もみられた。このことから、従来行なわれた舌白斑の有無を指標としたコントロール系の育成
方法は不充分であることが予測され、このコロニーの動物の血清中CPX値を測定したところ、
CPK高値を示す個体が混在することが判った。

一93−

書．

昭和60年度第5班（野村班）名簿

区

分

氏

班

長 ■野

村

所
所

一
名

達

次

財 団法 人〒 2 13

運営幹事

江

崎

孝 三郎

事

財団法人

員

関

名
地

実験 動物 中央 研 究所

電 話番 号

0 4 4 −7 5 5 −5 4 4 1

実験 動 物 中央 研 究所

0 4 4 −7 5 5 −5 4 4 1

川 崎市 宮 前区 野 川 1 4 3 0

野 々村

禎

昭

東京 大 学 医学 部 薬 理学 教 室〒 1 1 3 東京 都 文京 区 本 郷 7 − 3 − 1

0 3 −8 1 2 −2 1 1 1

埜

征

哉

国 立武 蔵療 養 所 神経 セ ンター

0 4 2 3 −4 1−2 7 1 1

中〒 18 7班機在

川 崎 市宮 前区野 川 1 4 3 0〒 2 13

幹

属

膠

木

元

也

東 京 都小 平 市小 川 東 町 4− 1− 1

東 海大学 医 学 部細 胞 生 物学 教室〒 2 13高松研

慶 応 義塾 大 学医 学 部生 理 学教 室
〒 1 60

富

田

武

池

建

機

名古 屋 大学 農 学 部家 畜 育種 学 教 室

水

谷

誠

0 5 2 −7 8 1 −5 1 1 1

名古 屋 市 千種 区 不老 町 1

国立 武蔵 療 養所 神 経 セ ンタ．
−〒 18 70 3 −3 5 3 −1 2 1 1

東 京都 新 宿区 信 濃町 3 5〒 46 4菊

0 4 6 3 −9 3 −1 2 1 1

伊 勢原 市 望 星 大

0 4 2 3−4 1 −2 7 1 1

東 京 都小 平 市小 川 東 町 4 − 1− 1

財団法人

日本 生 物 科学 研 究所

0 5 5 1 3 6 −2 3 3 3〒 4 0㌢ 16 山梨 県北巨摩 君机 、
渕 沢町上笹 尾

斉 藤

宗

雄

財 団 法人実 験動 物 中 央 研究 所

〒 2 13川崎 市宮 前 区野 川 1 4 3 0

0 4 4 −7 5 5 −5 4 4 1