DNA 精製方法

唾液サンプル(500µL)からの精製方法

以下は精製溶液(PT-L2P-5)を用いた DNA 精製用のマニュアルです。
Oragene・DISCOVER から DNA を精製する場合は P.3～5 を参照下さい。簡易マニュアルは P.6を参照下さい。
【必要な機器/試薬】
・唾液検体を採取した Oragene・DISCOVER(型番 OGR-500、OGR-575 等)
・prepIT・L2P(型番 PT-L2P-5)
・遠心分離器(15,000xg で運転可能なもの)
・ウォーター/エアーインキュベーター(50℃で運転可能なもの)
・1.5mL マイクロチューブ
・95～100%エタノール（室温）・70%エタノール（室温）・DNA 保存用 TE buffer(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH8.0)または類似 Buffer唾液サンプル(唾液と保存溶液の混合溶液)500µL からの精製方法

精製手順

備考

1. Oragene を数秒間静かに転倒撹拌させ、チューブ ・粘性の高い唾液と保存溶液を十分に混合す内のサンプルを混合します。

るためです。
・この加熱処理は、DNA を十分に抽出するために行われ、2. サンプルを 50℃でウォーターバスでは最低 1 時間、 ヌクレアーゼを完全に不活性化させるために必ず行ってく
エアーインキュベーターでは最低 2 時間インキュベートします。
注意：ウォーターバスの場合、サンプルの入ったチューブが浮いてしまうのため、エアーインキュベーションを推奨します。ウォーターバスを使用する場合は、チューブが常に水に浸かっていることを確認して下さい。

ださい。
・この加熱処理は、どの段階(唾液採取後、精製直前)でも行うことが可能です。
・サンプルの均一性を保つため、チューブから唾液を分注する前に Oragene のチューブのまま加熱処理を行ってください。
・この加熱処理は、オーバーナイトで実施することも可能です。
・エアーインキュベーターでは、ウォーターバスよりも熱伝導性が低いため、より⾧めの加熱処理が必要です。

3. Oragene のチューブから 500µL のサンプルを ・残ったサンプルは、室温または凍結（-15℃
1.5mL のマイクロチューブへ移します。

～-20℃）で保存することができます。

4. マイクロチューブに PT-L2P-5 を 20µL（サンプル ・不純物や阻害物質が沈殿し、サンプルが混容量の 1/25）添加し、数秒よく攪拌させます。
5. 氷上で 10 分間冷却させます。

濁することもあります。
・室温で処理することも可能ですが、氷上よりも不純物を取り除く効果が多少劣ります。
・より⾧い時間(最⾧ 15 分間まで)遠心させる

6. 室温で 5 分間、遠心分離( 15,000 x g)させます。

ことで、最終的な DNA 溶液の濁度(A320)を下げる可能性があります。

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神奈川県川崎市宮前区宮崎 2-10-9 TEL:044-853-2958

FAX:044-854-2958

URL:http://www.kyodo-inc.co.jp E-mail:kikaku@kyodo-inc.co.jp Ver:PD-PR-006 Issue 12/2018-10p. 3

7. 上澄みを新しいマイクロチューブに移します。不純物を含んだペレットは廃棄します。

・ペレットは不純物を含んでいます。誤って沈殿をかき乱してしまった場合は、もう一度遠心することを推奨します。
・エタノールを加えることで DNA が沈殿しま

8. 室温 95-100%エタノール 600µL を上澄み 500µL に添加します。静かに 10 回、転倒撹拌します。

す。サンプル中の DNA 量によっては DNA が沈殿物として確認できます。
・沈殿物が見えない場合も、以降の手順に従い DNA を回収してください。

9. サンプルを室温で 10 分間静置し、DNA を沈殿させ ・不純物と DNA が共に沈殿するため、-20℃ます。

で冷却しないで下さい。
・チューブのキャップのヒンジ部がローター

10. 室温で 2 分間、遠心分離(15,000 x g)させます。の中心に対して逆方向となるよう配置します。遠心分離させた際に DNA 沈殿物がヒンジ部の下に沈殿し、簡単に見つけられます。
・沈殿したペレットには DNA を含んでいます。ペレットを失うことで、最終的な DNA 収量も減る可能性があります。

11. ピペットにより上澄みのみを取り除きます。沈殿したペレット状の DNA に触れないよう注意してください。

・ペレットをチューブ壁に残すように、ピペットで上澄みを取り除いてください。
・上澄みには不純物が含まれている可能性があり、できる限り全て取り除いてください。
・ペレットの過度な乾燥は、以降の手順において DNA の溶解を困難にさせます。
・残留したエタノールが、アプリケーションに影響を及ぼす可能性があります。
・ペレットを乱さないように気をつけてください。

12. ペレットに 70%エタノール 250µl を静かに添加し、 ・DNA 量によりペレットは小さいかもしれません。
室温で 1 分間静置します。ペレットを乱さないよう・ペレットをかき乱してしまったら 13,000rpm（15,000 x g）に、エタノールを完全に除去します。

で 5 分間遠心分離させてください。
・サンプルから 70%エタノールを除去後、チューブをスピンダウンさせることで残留エタノールを除去することができます。
・より高濃度の DNA を必要とする場合は、TE Buffer を 50µL

13. TE buffer100µL(または類似の低塩 Buffer)を添加添加するように調整して下さい。
・DNA が多い場合、完全に水和(溶解)させるには時間を要し、ペレットを溶解させます。最低 5 秒間撹拌させすることがあります。

ます。

・DNA が完全に水和されなかった場合、DNA 濃度の測定が不正確になる原因となり、PCR などのアプリケーションのエラーに繋がる恐れがあります。

14. DNA を完全に再び水和させるために、室温でオー ・DNA の不完全な再水和は DNA 濃度の測定バーナイトした後によく攪拌してください。また が不正確になる原因となり、PCR などのアプは、時々チューブを撹拌させながら、50℃で 1 時 リケーションのエラーに繋がる恐れがありま間インキュベートしてください。

す。

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・⾧期的な保存は-20℃での凍結をお勧めしま
15. 完全に再水和した DNA の保存方法a)TE Buffer に溶解した状態で-20℃で一定期間保存b)TE Buffer に溶解した状態で 4℃で 2 ヶ月間保存す。
・TE Buffer に溶解した DNA を凍結するとDNA は沈殿します。解凍する際は、ステップ
14 以降からプロトコルに従って処理してください。

DNA の定量化
唾液中 DNA サンプルの DNA 定量は、260nm での吸光度測定よりも蛍光色素を使用した測定の方が正確です。
RNA のコンタミが少ない為、PicoGreen や SYBRgreen などの蛍光色素を使用し、DNA 定 量 す る こ と を 推 奨 し ま す 。 SYBRgreen を 使 用 し た 場 合 の プ ロ ト コ ル は 下 記 のDNAgenotek 社ウェブサイトより入手可能です。
http://www.dnagenotek.com/US/pdf/PD-PR-075.pdf

吸光度測定におけるアドバイス
DNA を吸光度で定量する場合は、まずは精製された DNA を RNase で処理し、RNA を分解させてからエタノール沈殿により RNA 断片を除去することを推奨いたします。詳細プロトコルは下記 DNAgenotek 社のウェブサイトをご参照下さい。
http://www.dnagenotek.com/US/pdf/PD-PR-040.pdf
唾液由来の DNA サンプルは、一般的に血液サンプルと比較して RNA が多く含まれている点にご注意下さい。

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簡易マニュアル

下記はサンプル溶液 0.5mL を精製する場合
検体が採取された Oragene のキットを数秒間静かに攪拌させ、容器内のサンプルを混合する。

50℃でインキュベートします。
ウォーターバスでは最低 1 時間、エアーインキュベーターでは最低 2 時間加熱する。
500µL をマイクロチューブへ移す。
20µL の PT-L2P-5 を添加して、数秒間攪拌する。
氷上で 10 分間冷却させる。
室温で 5 分間遠心(15,000xg)する。
上澄みを新しいチューブに移し、沈殿分は廃棄する。上澄みに 600µL の 95～100%エタノールを添加する。
10 回転倒撹拌する。
室温で 10 分間静置する。
室温で 2 分間遠心(15,000xg)する。
上澄みを除去し廃棄する。
ペレットに 250 µL の 70%エタノールを添加し、1 分間静置する。
100 µL の TE Buffer を添加し、溶解する。
最低 5 秒間撹拌する。
精製された DNA は 4℃または、-20℃で保存㈱協同インターナショナル〒216-0033

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