日大生活科研報（Rep. Res. Inst. Sci for Liv., Nihon Univ.）45；61～66, 2023

論業績第867号

文

魚類をモデルとした高用量アスコルビン酸投与による酸化ストレス軽減評価
難波※１

※２

亜紀・岩崎

※３

大・上田龍太郎・間野※４

伸宏

Evaluation of high-dose ascorbic acid administration for oxidative stress reduction in fish model
※１※２

※３

※４

Aki NAMBA, Dai IWAZAKI, Ryutaro UEDA and Nobuhiro MANOABSTRACT

High-dose administration of ascorbic acid is expected to be beneficial for various diseases, but the mechanism is still unclear. In the present study, we investigated the effects of ascorbic acid administration on oxidative
stress in a fish model. As a result, there were no differences between administration and control groups, except
for a significant decrease in the CAT activity in hepatopancreas. On the other hand, lipid peroxide levels in all
tissues were lower compared with control group, suggesting that this experimental system can be used as amodel for high-dose ascorbic acid administration. In the future, it will be necessary to optimize the concentration, frequency, and duration of administration, and analyze the effects of the administration on the antioxidant
defense capacity of each tissue throughout experimental period to conclude the usefulness of this administration
model.
キーワード：アスコルビン酸

高用量評価等の活性酸素種（ROS）を除去し、酸化ストレス

１．はじめに高用量でのアスコルビン酸投与は、貪食細胞やを防ぐ性質を有することが明らかとなっている２）。

Tリンパ球の活性を亢進することが報告されてお一方で、アスコルビン酸濃度を高めると酸化促進

り 、敗血症患者に対する対処法として期待され作用を示す報告もある３）。癌は酸化ストレスと深ている。また、アスコルビン酸は補酵素としてのい関係があることが指摘されており、高用量での機能のほか、抗酸化物質の一つとして知られておアスコルビン酸投与は癌治療法の一つとして注目

り、スーパーオキシドラジカル（O2 ）、ヒドロキ

されている４）５）が、機序については不明な点も多シラジカル（・OH）、および過酸化水素（H2O2）

く、処方の実施には賛否両論があるのが現状であ※１

Assistant Professor, Department of Food and Nutrition,１）－

日本大学短期大学部（三島校舎）食物栄養学科

助教

Junior College (Mishima Campus), Nihon University※２

日本大学生物資源科学研究科博士前期課程

学生

Graduate School of Bioresources Sciences, College of Biore-sources Sciences, Nihon University※３

日本大学短期大学部（三島校舎）食物栄養学科

教授 Professor, Department of Food and Nutrition, Junior College(Mishima Campus), Nihon University※４

日本大学生物資源科学部海洋生物学科准教授

Associate Professor, Department of Marine Science, College ofBioresources Sciences, Nihon University― 61 ―る。医療等において本投与をより適正利用していメを用いた。民間養殖種苗会社から購入後、水温くためには、生体レベルでの詳細な実験検証が必を20±１℃に調整した上面濾過式500 L水槽内に要であるが、哺乳動物を用いた実験検証は多くの設置した生簀内の１区分（W35×D50×H40 cm）制約があり、多様な解析手段が求められている。

当り15尾移し（図１）、ヒラメ EP F-3（日清丸紅餌

そこで本研究では、魚類をモデルとした高用量料, Table 1）を１日１回、総魚体重当り１-３％給のアスコルビン酸投与の実験系の有用性検証を最餌することにより10日間馴致飼育を行った。

終目標として、同投与が魚体に及ぼす影響について解析を行った。実験魚には、飼育が容易で様々２．２

工繁殖が可能なヒラメ Paralichthys olivaceusを選択

アスコルビン酸

アスコルビン酸には、L(+)-アスコルビン酸（特な多様なストレス実験ができ 、年間を通して人６）級, Wako）を使用した。

した。そして、同投与が抗酸化酵素であるスーパーオキシドジムスターゼ（SOD）、カタラーゼ（CAT）、２．３

グルタチオンペルオキシダーゼ（GP-x）の活性、調整

高用量アスコルビン酸投与およびサンプルおよび酸化ストレスにより生成される過酸化脂質

アスコルビン酸投与は、先行研究６）により経口量（脂質過酸化度）に及ぼす影響について、腸管、投与でも肝膵臓に有意な組織蓄積が生じることが胃、肝膵臓および腎臓組織を解析した。

確認されていたことから、経口投与法により実施した。すなわち、飼料１㎏当りL-アスコルビン酸２．材料および方法2,000 mgを展着させ、毎日魚体重当り３％給餌し２．
１た（アスコルビン酸展着区）。また同期間、非展着供試魚供試魚には個体差が少なく、本研究の各測定項の飼料を与えた魚体を対照とした（対照区）。

目の解析が可能な臓器量が得られる約10 gのヒラ10日間給餌後、各区から無作為にヒラメを５尾ずつ取り上げ、0.2 g/L 3-aminobenzoic acid ethyl ester（MS-222, Sigma）を用いて麻酔した。次に開腹しろ過槽て腸管、胃、肝膵臓および腎臓組織を採取し、肝(A)膵臓の一部は－80℃で保存した。残りの組織は全て４倍量（ w/v ）の冷却10 mM リン酸塩緩衝液（ PBS, pH 7.2）を加えてホモジナイズして遠心（20,000 ×g、20分、４℃）を行い、得られた上清を組織抽出液として使用時まで－80℃で保存した。
２．４(B)
35cm

アスコルビン酸組織含有量の測定

経口投与に伴うヒラメ体内におけるアスコルビ

50cm

ン酸の蓄積状況を確認するため、ヒドラジン法により肝膵臓からアスコルビン酸を抽出後、シリカ

対照区
アスコルビン酸ゲルカラム（Silica-215-N, 株式会社センシュウ科

展着区学）を用いた高速液体クロマトグラフィー（HPLC）

40cm法により、組織100 g当りのアスコルビン酸含有量

図１ 本研究で用いた上面濾過式500L水槽（A）．同水槽内に４区分した生簀（B）を設置し、そのうち２区分にヒラメを15尾/区分となるように移してアスコ
ルビン酸展着区または対照区（15尾/区分）とした。また、給餌した飼料や溶出成分が他の区分に流入しないよう、注水・排水位置を調整した．

を算出した。
２．５

SOD活性の測定

SOD活性の測定は、SOD Assay Kit- WST（Dojin）を用いて実施した。すなわち、事前の予備試験結― 62 ―

果に基づき、PBSを用いて、胃抽出物は500倍（w/11000
Unit/mg protein = ( A － A0 ) × ―――― × ―――
100.00622
1× ――――――
protein (mg)v）、腸管抽出物は100倍、肝膵臓抽出物は1,000倍、腎臓抽出物は50倍に希釈した。次に、吸光度450nm で求めた SOD 阻害活性を Superoxide dismutase
from bovine erythrocytes（Sigma）を用いて作成した

A：340 nmにおける１分間の吸光度の減少値、検量線からunit数に変換し、Bio-Rad Protein Assay

A0：ブランクの吸光度（Bio-Rad）を用いて測定した各試料のタンパク質濃度 1 mg当りに換算したものをSOD活性とした。

２．８

脂質過酸化度の測定

脂質過酸化度の測定はKosugi et al.（1993）９）を一２．
６

部改変して実施した。すなわち、組織抽出液50 µl

CAT活性の測定

カタラーゼ活性の測定は、Aebi et al.（1984） のに8.1％ドデシル流酸ナトリウム（SDS, Wako）溶方法を一部改変して実施した。すなわち、PBSを液100 µl、20％ 酢酸緩衝液（pH 3.5）750 µl、0.8％用いて腸管抽出物は10倍、胃抽出物は50倍、肝膵

Butylhydroxytoluene（BHT; 2,6-ジ -T-ブチル -4-メチ

臓および腎臓抽出物は100倍に希釈し、基質としルフェノール , Wako）25 µl、0.8％ 2-Thiobarbituricて10 mM 過酸化水素980 µlと希釈した試料20µlをAcid（TBA; 4,6-ジヒドロキシ -2-メルカプトピリミ

石英セル中で混合させた。１分間室温で反応させ、

ジン , Wako）750 µl、および超純水 350 µlの順で加その前後に吸光度（240nm）を測定することで１え、良く混合した。５℃で60分静置後、沸騰水中分当りの減少値（ΔOD）を求めた。さらにΔODに移して60分反応させた。氷上で反応を停止させを１分間の吸光度の減少値、Vc/Vxを抽出物の希た後、超純水500 µl、n-ブタノール（Wako）：ピ釈率、Bio-Rad Protein Assayを用いて測定した各試リジン（Wako）＝15：5 混液2.5 mlを加えて激し料のタンパク質濃度をproteinとして、下記の式にく混合させた。遠心（1710×g、10分）後、上清基づきCAT活性を求めた。

を 1 ml採取して吸光度（532 nm）を測定し（吸光７）値A）、抽出液の代わりにPBS 50 µlを加えたもの

Catalase unit ＝ (ΔOD/0.071/2)×(Vc/Vx)

をブランク（A0）として、下記の式に従い生成さ×(希釈倍率/protein)れた赤色色素量を求め、最後に組織重量 1 g当りの赤色色素量（TBARS量, µmol/g of tissue）を脂質

２．
７

過酸化度とした。

GP-x活性の測定

GP-xの活性はPaglia et al.（1967） の方法を一部
８）

1 mg湿重量の試料が生成したTBARS量(µmol)

改変して実施した。すなわち、5 mM EDTAを含む(A－A0)
100
5.8= ―――――× ――― × ―― × (1.00×106)
1000
11.56×105

1M Tris-HCl緩衝液（pH 8.0：TE）100 µl、100 mM
TE で 溶 解 し た 100 mM Glutathione Reductase frombaker’s yeast（Sigma）10 µl、100 mM TEで溶解しなお標準過酸化脂質として1,1,3,3-tetramethoxy-た2 mM β-NADPH（Sigma）10 µl、各組織の抽出液

propane（TMP; malondiaidehyde-bis, Sigma）を用い30 µl、超純水 660 µlを石英セル中で混合し、37℃た標準線を作成し、本手法による過酸化脂質の測で １ 分 間 反 応 さ せ た 。 次 に 、 7 mM Tert-Butyl

定の正確性を事前に検証した。

hydroperoxide solution（Sigma）10 µlを加え、１分間当りの吸光度（340 nm）の減少値を求めた。な２．９

有意差検定

お ブ ラ ン ク に は 、 7 mM Tert-Butyl hydroperoxide

有意差検定は、アスコルビン酸の定着の確認でsolutionの代わりに超純水を添加したものを使用し、はstudentのt検定、酸化ストレスの評価では、Statcel

以下の式によりGP-x活性を求めた。

add-in software package（OMS）を用いたTukey-kramer検定により多重比較を行った。

― 63 ―

３．３

３．結果
３．
１

CAT活性

肝膵臓中のアスコルビン酸含有量

CAT活性は、肝膵臓において最も高い活性が認

ヒラメ肝膵臓中のアスコルビン酸含有量を測定められた。高用量アスコルビン酸投与に伴う影響した結果、アスコルビン酸展着区では201.8±22.7は組織間で異なり、肝膵臓ではアスコルビン酸展mg/100g組織重量であったのに対し、対照区では着区において有意な減少が認められた（図４）。

129.6±33.6 mg/100g組織重量となり、アスコルビン酸展着区において有意（p < 0.05）な増加が認め*
カタラーゼ活性 (unit/mg of protein)られた（図２）。

*4035302520151050腸管

胃肝膵臓

腎臓

図４ 高容量アスコルビン酸投与を行ったヒラメの腸管、胃、肝膵臓、腎臓組織におけるCAT活性．
■：対照区、□：アスコルビン酸展着区．
*；p < 0.05, studentのt検定．

３．４

GP-x活性GP-x活性は、腎臓において最も高い活性が認め
図２ アスコルビン酸展着飼料（2,000 mg/kg）を10日間与えたヒラメ肝膵臓中のアスコルビン酸含有量．
*；p < 0.05, studentのt検定．

３．
２

られ、高用量アスコルビン酸投与による影響は認められなかった（図５）。

SOD活性

0.35
GP-x (unit/mg of protein)

SOD活性は肝膵臓において最も高い活性が認められたが、高用量アスコルビン酸投与による影響は認められなかった（図３）。

SOD活性 (unit/mg of protein)

60

0.30
0.25
0.20
0.15
0.100.050.0050

腸管

胃肝膵臓

腎臓

図５ 高容量アスコルビン酸投与を行ったヒラメの腸管、胃、肝膵臓および腎臓組織におけるGP-x活性．
■：対照区、□：アスコルビン酸展着区．

403020３．５100腸管

胃肝膵臓

過酸化脂質度

過酸化脂質度は腎臓において最も高い値が認め腎臓

図３ 高容量アスコルビン酸投与を行ったヒラメの腸管、胃、肝膵臓および腎臓組織におけるSOD活性．
■：対照区、□：アスコルビン酸展着区．

られ、いずれの組織でも対照区と比較してアスコルビン酸展着区の方が低い値を示したが、有意な差は認められなかった（図６）。

― 64 ―

過酸化脂質 (nmol/mg of tissue)

して1.7～２倍近い有意な増加が認められたことか
0.30

ら、適切に高用量アスコルビン酸を投与できたも0.25のと判断した。

0.20

しかし、本試験では肝膵臓におけるCATの活性0.15において有意な減少が認められたのを除き、アス0.10

コルビン酸投与に伴う明瞭な変化は確認できなかっ

0.050.00た。一方で、有意差は認められなかったものの、
腸管

胃

肝膵臓

過酸化脂質度の値は調べたいずれの組織において腎臓

図６ 高容量アスコルビン酸投与を行ったヒラメの腸管、胃、肝膵臓および腎臓組織における過酸化脂質．
■：対照区、□：アスコルビン酸展着区．

も低い値を示したことから、高用量アスコルビン酸投与のモデルとして、本試験系は利用可能であると推察された。今後、投与濃度や投与回数・期間について最適化した上で、同投与が各組織の抗酸化防御能に及ぼす影響について経時的に解析を４．考察
本研究では、高用量アスコルビン酸投与の有用性を検証するため、魚類をモデルとした実験を行っ行うことで、本投与モデルの有用性について結論を下す必要がある。

た。本試験に使用したヒラメは、人為的に飼育管理された種苗がどの地域・季節でも入手でき、体文献側面も大きいことから、特に粘膜組織のモデル研

１）Maggini S., Beveridge S., Sorbata P. J. P. and

究に適した魚種である。著者らも、高用量アスコ

Senatore G. (2008): Feeding the immune system:

ルビン酸投与が粘膜組織に及ぼす影響についてヒthe role of micronutrients in restoring resistance to

ラメをモデルに解析を行っており、抗菌ペプチド

infections. CAB Rev., 3, 1-21.の発現が誘導されることを確認している６）10）。ヒ２）Ahmad I.M., Aykin –Bums N., Sim J.E., Walsh

ラメは典型的な魚食魚であるが、数g以上の魚体

S.A., Higashikubo R., Buettner G.R., Venkataraman

サイズになれば配合飼料のみで飼育可能であり、

S., Mackey M.A., Flanagan S.W., Ober-ley L.W.

動きも少なく、海水魚の中では最も飼育が容易なand Spitz D/R. (2005): Mitochondrial O2- and H2O2

魚種の一つである。また成長も早く、特別な飼育

mediate glucose deprivation-induced stress in human

施設や飼育技術がなくても 5～100 gサイズまで用cancer cells. J. Biol. Chem., 280, 4254－4263.

意することができ、多様な生体実験が可能である

３）Chen Q., Espey M.G., Sun A.Y., Lee J.H., Krishnaという点も魅力的な魚種である。

M.C., Shacter E., Choyke P.L., Pooput C., Kirk

なお、高用量のアスコルビン酸投与研究においK.L., Buettner G.R. and Levine M. (2007): Ascorbateて魚類を利用する場合、投与法の選択が課題であっin pharmacologic concentrations selectively generates

た。魚類でも注射器を用いた接種投与も可能であascorbate radical and hydrogen peroxide in extracel-

るが、強いストレス反応を引き起こすリスクが考

lular fluid in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 104,

えられたことから、経口投与法を選択した。投与8749－8754.

濃度については、1,000～5,000 mg/kg飼料の割合

４）Takemura Y., Satoh M., Satoh K., Hamada H.,

で１週間以上アスコルビン酸を展着した飼料を与Sekido Y. and Kubota S. (2010): High dose of

えると抗病性が向上することを確認していたこと

ascorbic acid induces cell death in mesotheliomaから６）10）、本研究では2,000 mg/kg飼料に濃度を固cells. Biochem. Biophys. Res. Commun., 394(2),定して10日間投与する実験系として設定した。結249-253.

果として、実験に供したヒラメの肝膵臓中のアス

５）Ohno S., Ohno Y., Suzuki N., Soma G. and Inoue

コルビン酸含量をみると、予備試験を含め、全てM. (2009): High-dose vitamin c (ascorbic acid)の試験系でアスコルビン酸展着区は対照区と比較

therapy in the treatment of patients with advanced― 65 ―

Med., 70, 158-169.

cancer. Anticancer Res., 29, 809－915.
６）Mori M., Shibasaki Y., Namba A., Yabu T., Wada

９）Kosugi H., Kojima T. and Kikugawa K. (1993):

N., Shiba H., Anzai H. and Mano N. (2022): Al-Characteristics of the thiobarbituric acid reactivity

teration of hemoglobin ß gene expression in mucosalof human urine as a possible consequence of lipid

tissues of Japanese flounder, Paralichthys olivaceus,

peroxidation. Lipids, 28, 337-343.

in response to heat stress, Edwardsiella piscicida10）Mori M., Ito T., Washio R., Shibasaki Y., Namba

infection, and immunostimulants administration.

A., Yabu T., Iwazaki D., Wada N., Anzai H., Shiba

Fish Shell. Immunol. Report, 100049.

H., Nakanishi T. and Mano N. (2021): Enhancement

７）Aebi H. (1984) : Catalase in vitro. Methods inEnzymology, 105, 21~126.

of immune proteins expression in skin mucus ofJapanese flounder Paralicthys olivaceus upon feeding８）Paglia D.E. and Valentine W.N. (1967): Studies ona diet supplemented with high concentration of

the quantitative and qualitative characterization of

ascorbic acid. Fish Shell. Immunol., 114, 20-27.

erythrocyte glutathione peroxidase. J. Lab. Clin.

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