厚生

省

新薬開発研究費

微生物の二次代謝産物に由来する
難病治療薬（ロイぺプチン）の開発研究
梅沢班

昭和58年度研究報告書

昭和59年3月

研究報告書の作成にあたって「微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプチソ）の開発研究」
が，昭和54年度に厚生省薬務局より新薬開発研究としてとりあげられ，私が班長として本研究班が発足し，第5年度を迎えた．
第5年度は，前年度までの研究に引き続き，ロイペプチソ，べスタチソ，ホルフェニシノールに加え，新たにホルフェニシンおよびアルファメニソなどにつき活発な基礎研究を行うとともに，ロイペプチソおよびベスタチソの臨床研究を行い，さらにホルフェニシノールについても臨床研究を開始した．また，本年度は本研究班の基礎ならびに臨床研究のよりいっそうの充実を図るため，
新たに丸山班員，青柳班員，福山班月，および松本班員を加えた．
かくして，上述の低分子酵素阻害物質の生化学的，薬理学的，生理学的，病理学的研究，ならびにモデル動物に対する効果の研究などの広範囲の基礎領域
で大きな進展が得られたわけである．さらに，臨床研究において，生後速やかに阻害物質を投与することにより，治療効果を期待しうる可能性が示唆された．この事実は割目すべき成果ということができる．筋ジストロフィー症の治療薬開発という困難な研究領域に，ようやく解決の兆しがみえたといえよう．
本研究班の5年間にわたる成果に基づいて，さらに研究を続けることは，筋ジストロフィー症を含む難病の治療に大きな光を与えるものと信ずる．しかし，臨床効果の検討には，さらに5年以上にわたる長期の研究が必要である．
本研究を重要課題としてとりあげられた厚生省薬務局に感謝する次第である．

昭和59年3月

班

長

梅

沢

浜

天

目

次

梅

沢

浜

夫

ⅰ

研究報告書の作成にあたって

総括研究報告微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプチン）
の開発研究

3

梅

沢

浜

夫

分担研究報告ロイペプチンのプロテアーゼ阻害作用に関する研究

17

村

地

孝

螢光・HPLCによる血清ホルフェニシノールの定量法とP‑ヒドロキシペスタチンのプレカラム螢光誘導体化

25

大

倉

洋

甫

筋ジストロフィーマウスの筋肉代謝網に対する低分子酵素阻害物質の影響

35

青

柳

高

明

43

EAEモルモットに対するロイペプチンの効果
岩

崎

祐

三

ロイペプチンの薬理学的研究

49

大
ⅰ

塚

正

徳

筋ジストロフィーハムスターに対するベスタチン投与の効果

61

高

木

昭

夫

塩酸ブピバカイン（マーカイン）処理による筋崩壊と筋再生に対するベスタチンの影響

67

埜

中

征

哉

鶏ジストロフィー筋における新生児型構造蛋白質の出現

─べスタチンの投与と除神経の影響

73

丸

山

工

作

筋ジストロフィー症マウスに対するアルファメニン投与の影響

83

松

下

宏

2，3の筋萎縮症患者に対するベスタチンの効果

89

村

上

慶

郎

べスタチン服用時のDMD患者の血中濃度および臨床効果の検討93

三吉野 産 治
進行性筋ジストロフィー症に対するベスタチンの使用経験

101

福

山

幸

夫

筋疾患に対するベスタチンの効果に関する臨床的研究
─Ⅰ．神経筋疾患におけるベスタチン投与後の尿中アミノ酸の変動

115

木

下

真

男

筋疾患に対するベスタチンの効果に関する臨床的研究
─Ⅱ．筋疾患に対するベスタチンの効果判定に関する

臨床的まとめ

119

木

ⅱ

下

真

男

筋ジストロフィーに対するベスタチンの影響

─血清CKとmuscle‑specific enolaseを指標として

123

祖父江 逸 郎筋ジストロフィーを中心とする各種筋疾患に対するベスタチン投与後の経過報告

131

里 吉 栄二郎
ホルフェニシノールの体内動態に関する研究

143

松

本

郁

男

ロイペプチンおよびペスタチンの難病治療薬としての

開発研究

149

田中 亘・石井靖男
微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプチン）開発研究班分担研究者一覧

191

ⅲ

総

括

研

究

報

告

微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプチン）の開発研究

羊任研究者 梅本研究班は，微生物の二次代謝産物に由来する

択

浜

HPLC

夫

による血清ホル7ェニシノールの定量法

筋ジストロフィー治療薬を開発することを目的ととクーヒドロキシベスタチソのプレカラム質光誘して，昭和54年度に厚生省薬務局より新薬開発

導体化

研究として発足し，現在に至っている．

3）青柳高明（微生物化学研究所）：一筋ジス

微生物の二次代謝産物として発見した多くの低トロフィーマウスの筋肉代謝網に対する低分子酵

分子酵素阻害物質は，広範囲の生理活性を有する

素阻害物質の影響

ことで世界の注目を集めている．このうち，セリ

4）岩崎祐三（東北大学医学部）：−EAEモル

ソ・チオールプロティナーゼ阻害物質として見出

モットに対するロイペプチソの効果

5）大塚正徳（東京医科歯科大学医学部）：−されたロイペプチソならびに細胞膜酵素阻害物質，
すなわち細胞膜結合物質として発見されたべスタ

ロイべプチソの薬理学的研究

チソおよびホルフェニシノールが，筋ジストロフ6）高木昭夫（国立武蔵療養所神経センター）：ィーマウスの発症ならびに症状の進行を阻止する

一筋ジストロフィーハムスターに対するべスタチ

効果のあることが明らかにされた．このことは，

ソ投与の効果筋ジストロフィー症の治療にきわめて重要なこと

7）埜中征哉（国立武蔵療養所神経センター）：

である・さらに，臨床研究において，すでに症状−塩酸ブビバカイン（マーカイン）処理による筋の進行した症例には治療効果を望むことは難しい

崩壊と筋再生に対するベスタチソの影響が，Duchenne型のような遺伝的疾患には，生後

8）丸山工作（千葉大学理学部）：一鶏ジスト

速やかに細胞膜結合物質を授与することにより，ロフィー筋における新生児型構造蛋白質の出現−

治療効果を期待できる可能性が示唆された．なお，

べスクチソ投与と除神経の影響

ホルフェニシノールは，病因に関与する遺伝子に9）松下宏（和歌山県立医科大学）：一筋ジ

対する作用がモデル動物の試験で認められている．

ストロフィーマウスに対するアルファメニソ投与

上述した成果は筋ジストロフィー症の治療に大きの影響な光を与えたものといえよう．

10）野村達次（実験動物中央研究所）：一筋ジストロフィー動物の生産・供給各分担研究者により施行された研究は次の通り
である．
1）村地

11）村上慶郎（国立療養所箱根病院）：−2，3の筋萎縮症患者に対するべスタチソの効果

孝（京都大学医学部）：−ロイべプ

12）三吉野産治（国立療養所西別府病院）：−

チソのプロテアーゼ阻害作用に関する研究

べスタケン服用時か DMD患者の血中濃度およ2）大倉洋甫（九州大学薬学部）：一蛍光・ー

3−I・Ⅱ両カルパインとも，80kDaおよび25kDa

び臨床効果の検討
13）福山幸夫（東京女子医科大学）：一進行性の2つのサブユニットから成るヘテロ二量体であ筋ジストロフィー症に対するベスタチソの使用経ることが明らかとなった．両酵素のアミノ酸組成

験

はかなり類似しているが，決して同一ではない・

14）木下英男（東邦大学医学部）：一筋疾患にⅠ型は2．0／nICa2十で50％活性化を受けるのに対して，Ⅱ型は200／爪ICa2十で50％活性を発現

対するべスタチソの効果に関する臨床的研究
15）祖父江逸郎（名古屋大学医学部）：一筋ジする．Ⅰ型はSr2十のほかBa2十およびMn2十にストロフィーに対するべスタチソの影響一血清

よってもかなり活性化されるが，Ⅱ型では Sr鈷

CKとmuscle−SpeCific enolase を指標として以外のイオンはほとんど無効であった・

16）里書栄二郎（国立武蔵療養所神経セソク

筋肉以外の組織からカルパインⅠとカルパイン

ー：一筋ジストロフィーを中心とする各種筋疾患

Ⅱを同時に並行精製することは，いままで成功しに対するベスタチソ投与後の経過報告ていなかった．今回の研究により，同一臓器の両酵素の直接比較が可能となったわけで，両酵素の17）松本郁男（万有製薬株式会社）：−ホルフ歎似点と相違点がかなり明瞭に示された・今後，ェニシノールの体内動態に関する研究
18）田中 亘（日本化薬株式会社）：−ロイペ

両者のサブユニット同士の比較実験や，免疫学的

プチソおよびべスタチソの難病治療薬としての開連関性などの研究により，これら諸酵素の作用お発研究

よび阻害概括が分子構造の水準で明らかにされる

次に，上記各班員の研究報告について要約する・

ものと期待される．

1．ロイぺプチンのプロテアーゼ阻害作用に関

2．螢光・HPLCによる血清ホル7ェ二シノールの定量法とp一ヒドロキシベスタチンする研究のプレカラム蛍光誘導体化

村地班員は，Ca鈷 依存性チオールプロティナ

大倉班員は，ホルフェニシノールの筋ジストローゼに対するロイペプチソの阻害作用を検討する

フィー症に対する薬効を判定する目的で，高感度目的で，腎臓からカルパインの精製を行った・

定量法の開発研究を行った．

動物組織細胞に広く分布しているCa2＋依存性
システイソプロティナーゼ（カルパイソと総称す

ホルフェニシノールがアルカリ性で酸化され，る）は，そのCa2十要求性に閑し2種類あること盛い螢光を発することを見出した・この蛍光反応が知られてきたが，そのいずれもがロイペプチソ

条件を検討し，血清ホルフェニシノールの蛍光・の強い阻害作用を受ける．

HPLCによる定量法を開発した．また，57年度に提出したべスタチソの螢光・HPLC

彼らは，ラット腎臓からⅠ型，Ⅱ型の2種類のカルパイソを，ほとんど同様の方法により並行しでは血清中微量に存在するその代謝物クーヒドロキシベスて精製した．3．64gの租蛋白質分画から出発して，

タチソ〔1nmol（400ng）／ml以下〕を有意に定量

カルパイソⅠを0．53mg（6，170倍精製），カルパ

できなかったので，新たにクーヒドロキシべスタ

インⅡを0．33mg（4，160倍精製）収得した・精チソのHPLC

製控品はいずれもゲル電気泳動的に均質性を示し究を行った．

た．Ⅰ型の等電点は5．3，Ⅱ型のそれは4．6であにおける蛍光誘導体化法の基礎研

1）蛍光・HPLCった．

による血清ホル7ェニシノ

ールの定量

SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果，−血清100〆を過塩素酸で除蛋白し，その4−

微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイべプチソ）の開発研究

上活100〆に25mMフェリシアソ化カリウ

した．最終投与時の3時間後に屠殺したのち，前ム50〆および3・5MKOH200〆を加え・肢筋，後肢筋，心，脾，肝，腎を摘出し・ホモジ

500Cで15分間加温する．反応液に，1・5ht

ェネートの遠心上清について，7種類のアミノペ

Na2SO350〆および1・0人Ⅰアンモニア緩衝

プチダーゼ，5種類のエソドペプチダーゼ，3種液（pH8．5）とC．HClの等容温液100βを類のグリコシダーゼ，クレアチソキナーゼ・ホス

加える．この反応液100βをHPLCに付す・

ファクーゼ，およびェステラーゼなどの酵素活性

HPLCは，カラムにLiChrosorb RP−18を，の変動について検討した．上述の阻害物質を投与

溶離液に4mMテトラー乃−プチルアソモニウ

することにより，誘起された各臓器内の酵素活性ムヒドロキッドを含む0．1人tの変動は，これらの阻害物質のfHpわか におけるアソモニア緩衝液（pH8．5）を用いて行う・蛍光検出は・阻害活性とは無関係に，さまざまの酵素活性に影

励起385nmおよび発光485nmで行う・こ響を与えていることを明らかにした・の方法により，血清中1nmol（200ng）／mJ以

4種の阻害物質投与により誘起された酵素変化

上の濃度で存在するホルフェニシノールを6のパターンには，何らかの類似性があることが推分以内に分離し，精度よく定量できた・

察された．それゆえ，順位相関係数を求めて検討した結果，前肢筋および後肢筋の酵素網に，上述

2）HPLCにおける9−ヒドpキシべスタチソの質光誘導体化の阻害物質がきわめて高い類似性をもった変動を

クーヒドロキシベスダチソのフェノールのオ与えることを明らかにした・ホルフェニシンはロ

ルト位にアルデヒド基を導入し，アルデヒド

イペプチソ，べスタチソ，およびホルフェニシノ

試薬の4，5−ジメトキシー1，2−ジアミノペソゼールと同様に，筋ジストロフィーマウスの治療に

ソモノ塩酸塩によって蛍光ラベル化する・こ有効であることを示唆した・のラベル化反応は，チロシソ含有ペプチドに一方，脾の酵素網に対してはホルフェニシノー

対しても螢光体を与える．これらのラベル化

ルのみが，他の阻害物質の作用と異なることを認

体は，逆相分配HPLCにより分離され，高めた．ホルフェニシノールは免疫応答細胞に対し，感度に検出された（4〜10pmol／HPLC注入

他の阻害物質と異なる影響を与えるものと考える・

量）．検量線は，少なくとも5nmol（HPLC

4．EAEモルモットに対するロイぺプチンの注入量）まで，それぞれ原点を通る直線性を

効果

示した．

岩崎班員は，炎症性脱髄疾患に関するロイべプ

3．筋ジストロフィーマウスの筋肉代謝網に対チソの研究を行った．

する低分子酵素阻害物質の影響

EAE（experimental allergic encephalomyelit−

青柳班員は，筋ジストロフィーマウスに対するis）は，ヒトの脱髄性神経疾患の動物モデルとし

低分子酵素阻害物質の治療効果を調べる目的で・て研究されている．この髄鞘脱落のメカニズムと阻害物質投与により誘起される筋肉を含む諸臓器

して，免疫反応の中で活性化されたmacrophage内における酵素網の動態に関する研究を行った・の分泌するneutralproteinaseが髄鞘の崩壊をき

ロイペプチソ（500J唱／日），ベスタチソ（200たすという考え方がある．この酵素の主なものが

揮／日），・かレフェニシノール（500〝g／日）・およ

plasminであるということから，その括抗剤であびホルフェニシン（500／唱／日）は筋ジストロフ

るロイべプチソが脱硫現象を防ぎうるのではないィーマウスに，毎日1回腹腔内に8日間連続投与かと考えられる．このような考えから，以下の実

−

5

−

験を試みた．

ロイベプチソによりウサギの血圧が一過性〔方 法〕220〜420g の成熟モルモットをに下降することを昨年度報告し，神経節遮断

4群に分けた．第1群（15匹），感作の前日作用によるものと推測した．この点を検討しよりロイペプチソ25mg／kg，2回／日腹腔内たところ，フェントラミン処置下においてもに投与したもの；第2群（15匹），感作後1週

ロイペプチソにより血圧下降がみられた．

目より同様にロイペプチンを投与したもの；

2）副交感神経節に対する作用

第3群（15匹），発症した日からロイべプチ

摘出したラット顎下神経節をTyrode液でンを授与したもの；第4群（7匹），ロイペプ

潅流し，神経節細胞より細胞内記録を行った．

チンを授与しなかったもの．毎日の観察と体ロイべプテンは，節前神経刺激で発生するコ

重測定を続けたのち，21日目にすべて潅流

リン作動性fastEPSPを抑制した．アセチル固定を行い，大脳と脊髄とを採取して組織観

コリンを節後神経細胞に適用すると，時間経察に供した・効果判定に用いた項目は，臨床

過の速い脱分極と，それに続く遅い経過の脱的および組織的発症率，発症日，臨床症状を分極とが記録された．ロイペプチンは前者を5段階に分けて得られた臨床的重症度，一定抑制し，後者を増強した．

の部位の観察から得られた組織的重症度，お3）脊髄運動ニューロンおよびⅠ乱シナプス伝

よび体重の推移などである．

達に対する作用〔結 果〕1）臨床的発症率では第1・2群でラットを人工呼吸器で維持し，脊髄運動ニやや低率であったが，組織的発症率では差がューロンの細胞内記録により，活動電位，静なかった．2）第3・4群の発症日は同じであ

止電位，後退分極を測定した．ロイペプチン

ったが，第1・2群ではそれより1日，2日を静脈内投与したのち最高4時間にわたって遅かった．3）臨床的重症度では，軽度なが記録を行ったが，上記電気的性質の変化はみら差がみられ，第1・2群で軽かった．しかられなかった．また，Ⅰ乱感覚神経刺激によし，組織的重症度には差はなかった．4）体り発生するEPSPにも変化はみられなかっ

重増加の割合は，第1・2群に比較して第3・た．

4群で高かった．体重増加の頂点に至る時期

4）摘出脳幹一脊髄標本に対する作用は第2・3・4群で一致していたが，第1群で本標本は最近開発され，呼吸様活動をJ〝

はそれより3日遅れた．5）発症後同時期にびわroで記録，観察しうる特性をもつ．ロイ

得られた脳，脊髄の標本で，第1・2・3群のべプチソを濯流液中に適用したところ，9例

ものに好中球，microgliaの浸潤が目立った．

中2例において呼吸様活動の頻度の増加が観以上の結果から，EAEモルモットに対するロ

察され，この効果はアトロピソにより抑制さイペプチソ効果は，有効とはいいがたいものの，れた．

その過程の中で何らかの影響があるものと考えられた．

5）摘出脊髄一尾標本に対する作用
本標本で尾に圧侵害刺激を加えると，痛み反応と考えられる電位を前蝦から記録できる．

5・ロイぺプテンの薬理学的研究

圧侵害刺激により発生する時間経過の遅い電

大塚班員は，ロイペプチソの薬理学的研究を行

位はェソケファリンにより抑制された．ロイった．

べプチソは，単独ではこの電位に影響を与え

1） ロイべプチソの血圧下降作用の検討なかったが，エンケファリンの作用を増強し−

6

一

微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプチソ）の開発研究

7．埴校了ビバカイン（マーカイン）処理によた．

る筋崩壊と筋再生に対するぺスタチンの影
響

6．筋ジストロフィーハムスターに対するベス
タチン投与の効果

埜中班員は，塩酸プビバカイン処理による筋崩
壊と筋再生に対するべスタチソの影響について研高木班員は，筋ジストロフィーハムスターにべ究を行った．

スタチソを皮下注射により長期投与し，筋ジスト
ロフィーの自然経過に対する影響を研究した・

局所麻酔剤である塩酸ブビバカイソ（マーカイ〔方 法〕筋ジスハムスター（BIO14・6）19ン）は，筋細胞膜のみを破壊し，他の支持組織は匹および対照（BIO FIB）8匹に，べスタチ

損傷しないので，筋線経の強い壊死のあとでも再ソ2mg／動物／日を6〜8週間にわたって背部生は早い．また，再生線経は均一で，その発育と皮下に連日投与した．筋ジストロフィー病変

分化過程に再現性があり，統計的処理が可能であの指標として，血清CK値と筋組織中の壊死る．この実験系にべスタチソを投与し，その影響

線維および再生線維数を採用した・をみた．

〔結 果〕1）筋ジスハムスターは，実験中

約250gのWistarラット84匹を次の4群に分に約半数が死亡した．しかし，これは薬剤のけた．①無処置，無治療群，㊤べスタチソ10mg／

影響でないことは明瞭であった．一般に，筋kg／日投与群，④マーカイン（0・25％液）0・5mg

ジスハムスターの成長は対照に比して遅滞し

筋注群，④マーカイソ，べスタチソ治療群・マーていた．2）筋ジスの血清CK値に関して，

カインは，ヒラメ筋内に直接筋注した．①〜④群

べスタチソ投与群と非投与群の間に差を認めとも，マーカイン注後2，7，14 日目に相当するなかった．しかし，両群において，CK値の日に各群7匹ずつ計28匹よりヒラメ筋を採取し，ばらつきは著明であった．3）筋ジスEDL筋

生化学的，組織化学的検索を行った．

における壊死線経の比率は薬剤群0〜1．5％，

べスタチソ単独投与では酸ホスファクーゼ，カ

生食群0〜0．4％，また再生線経については，

テプシソD活性が多少上昇する傾向にあったが，薬剤群2．8〜26．4％，生食群4・6〜17・7％でそれ以外のあった．いずれについても，薬剤の影響は認ーゼ値には変動はなく，また筋線維径にも影響をめなかった．筋ジスSOLについても，同様与えなかった．マーカイン注により上記ライソゾな結果であった．

ーム酵素活性は上昇し，ベスタチソは酸ホスファ〔考案とまとめ〕今回の実験の問題点の第1

クーゼの活性をやや抑制する傾向にあったが，壊は，筋ジス群の死亡数が多く少数例の観察と死の過程には大きな影響を与えなかった．再生線なった点である．第2は，指標とした血清経はべタスチソ投与によっても影響を受けず，そCK値あるいは壊死・再生繰維数は，筋ジスの筋線維径，分化の状態は無治療群のそれと差はでは明らかに異常であった．しかし，筋ジス

みられなかった．

α一グルコシダーゼ，α−ガラクトシダ

個体間でのばらつきが著明なため，微妙な薬

マーカインによる筋の壊死はあまりに強烈であ剤の効果を検出することは不可能と思われた・

るので，援徐に壊死，再生と繰り返す筋ジストロ

このような条件下の実験であったが，べスタ

フィーと病変過程を等しくは評価できない．ロイ

チソは筋ジスハムスターの自然経過に著明なペプチソは筋の再生を著明に遅延させたが，べス

影響を与えることはないと結論された・

タチソは再生の抑制はなかった．

ー

7

−

8．鶏ジストロフィー筋における新生児型構造

9．筋ジストロフィーマウスに対する7ル77

蛋白質の出現−ベスタチン投与と除神経のメ二ン投与の影響

影響

松下班員は，アルファメニソを発症直後の筋ジ

丸山班員は，べスタチソ投与における鶏ジスト

ストロフィーマウスに投与し，その症状回復効果について研究を行った．

ロフィー症の発症に及ぼす効果について研究を行った．

べスタチソおよびホルフェニシノールを発症直鶏胸筋では，醇化後の成長期に筋構造蛋白質の後の筋ジストロフィーマウスに連続投与することタイプが著しく変化する．たとえば，醇化直後のにより症状進行が完全に抑制されることが見出さ

ヒヨコの幼君筋には遅筋型C蛋白質が存在するが，れたので，引き続き他のimmunomodifierについ醇化後2週間で消失し，速筋型に変る．他方，遺て，同様な方法によって症状進行に対する抑制効

伝性の筋ジストロフィー鶏（NH413系）では，果の検定を行っている．本年度は，べスタチソに筋ジストロフィー症の発症に伴い，消失した遅筋

類似した阻害活性を示すアルファメニソAおよび型C蛋白質が再出現し，醇化直後のヒヨコの筋にBを用いて実験を行った．

類似したものになる．したがって，C蛋白質のタイ

実験は，約1カ月齢で軽度な症状を示す筋ジス

プの変化は筋ジストロフィー症の指標になりうる．

トロフィーマウスを用いて行い，これらにアルフ

本研究では，べスタチン投与が鶏における筋ジァメニソAおよびBを1日2回ずつ2，4，6，おストロフィー症の発症に及ぼす効果について，主よび12週間連続投与したのち，血清中ならびにとして遅筋型C蛋白質の消長を指標として検討し骨格筋中のマーカー酵素の活性にいかなる影響をた．

与えるかについて検討した．その結果，血清中の醇化後1適齢から，体重1kg当り5mgずつ

PK活性はAあるいはBの投与によって著明に低べスタチソを連日皮下注射により投与した．1カ

下していることが認められ，またCPK活性も同

月後，鶏筋胸をとり出し凍結切片を作製して抗道様に低下の傾向を示していた．骨格筋中での酵素

筋C蛋白質抗体で処理し，蛍光抗体法により検出活性の変化は，まずアルカリおよび中性プロテアを試みたところ，大胸筋表層部細胞のうち遅筋型

ーゼが全投与群で，著しい活性低下を示している

C蛋白質を含むものの割合は，べスタチソ授与しことが注目された．また，PK，CPK，LDHなど

たもので0．6％，非投与のもので3％であった．

の酵素活性は逆に，いずれの投与群でも増加の傾

このことは，べスタチソ投与により，筋ジストロ

向を示していた．とくに，A投与群ではこの傾向

フィー症の進行がやや遅れることを示唆している．

が顕著であった．これらの結果は，アルファメニ

しかし，3カ月齢に達したものでは，今回の投与

ソの投与によって，筋線経の膜機能に関してやや量ではべスタチソの効果はあまり認められなかっ

改善の散侯がみられることを示唆しているものとた．

考えられる．しかし一方，尿中のクレアチンおよ

次に，筋ジストロフィー症の実験モデル系の1

びクレアチニソの含量は，アルファメニソ投与につとして，鶏除神経胸筋を作成して調べたところ，

よっても大きな変化を示さず，むしろ重篤なクレ

除神経後1〜2週間で遅筋型C蛋白質やβ型トロアチン尿症の状態を続けていた．また，6週間投ポミオシンの出現が認められ，筋ジストロフィー

与実験の場合の体重変化を調べてみると，Aまた筋とよく似た状態となることが明らかとなった．

はB投与群でともに食塩水投与疾病マウスに比較してやや増加の傾向を示してはいたが，正常並みには戻らず，12週間投与によっても症状の進行−

8−

微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイべプチソ）の開発研究はまったく抑制されなかった．

改善し，歩行も転倒回数の減少，階段の昇降が可

以上の結果から，アルファメニソAまたはBは，能となったが，現在，経過観察中である．検査成すでに発症している筋ジストロフィーマウスの症績を含めて，特別の副作用はみられなかった．

状進行に対して，これを顕著に改善させる効果があるとは断定できなかった．しかしながら，投与

12．ベスタチン服用時の DMD 患者の血中濃時期をさらに早めることによって効果が得られる

度および臨床効果の検討

可能性はまだ残っているものと考えられる．

三吉野班員は，べスタチソの臨床効果を評価する目的でDuchennemusculardystrophy（DMD）

10．筋ジストロフィー動物の生産・供給症患者にべスタチソを投与し，臨床効果および副

野村班員は，筋ジストロフィー症治療薬開発研作用の検討を行った．

究班の班員に筋ジストロフィー鶏の卵を供給する

これまで，ベスタチソを朝食前1回服用させ血目的で，種卵の生産ならびに飼育の改良を行った．

中濃度について検討してきたが，安定した血中濃さらに，筋ジストロフィーマウスの供給を行うと度を得ることができなかった．

ともに，米国産筋ジストロフィーハムスターの供

今回，DMD患者20名にべスタチソ成人量60給を行い，また，遺伝的背景の均一な筋ジストロ

mg／日を毎食後3回1週間服用させ，そのうちのフィーハムスターの育成を検討している．

5名は1週間ごとに倍量して成人量480mg／日まで漸増し，血中濃度と臨床効果について新たに検討した．

11．2，3 の筋萎縮症患者に対するベスタチンの効果

その結果，1）分割投与により安定した血中濃村上班員は，前年度に引き続きべスタチソを筋度を得ることができた．2）漸増法では，投与量増疾患患者に投与して，その効果について検討した．

加とともに血中濃度が上昇した．3）20例中19

対象は19例で，一部に前回から使用している

例が30分後に最高血中濃度0．72±0．22／唱／mJ

症例が含まれている．使用期間は6カ月から30を示し，1時間より半減期130±68分の短い安定カ月．投与方法は，1日量60，270mgの固定法

した分布を示したことより，べスタチソは半減期と，1日量30mgより毎週，一部隔週に30，100の短い比較的吸収の速い薬物であることが推測さ

mgずつ増量し，600mgから1，5COmgに及んだ

れた．4）1日1回隔日投与より，1日3回連日投ものもある．

与のほうが安定した血中濃度が得られた．5）漸成績は，自覚症状が初期に軽度の改善を認めた増法においては，GOT，GPT，LDHの漸増法実

多発性筋炎の1例および1歳8カ月のDuchenne

施前後の値に有意な差をみなかったが，CPKの型筋ジストロフィー症で症状の改善と血清CPK

低下してくる例がみられた．6）服用期間が長くの低下の傾向を認めたのみで，他はいずれも効果

なると，CPK の低下する例がみられ，また血中はみられなかった．

濃度と CPKがともに上昇している例数が減少す

検査成績では，白血球数を含む一般血液検査，る傾向がみられた．7）ADLでは，1週間服用者

尿検査，血圧，心電図，振力，血液生化学検査に

5名中軽快1名，不変1名，低下3名であり，4著変はみられなかった．

週間服用者5名中軽快1名，低下4名であった．

1歳8カ月の

8）副作用として発疹1名，悪心・嘔吐1名をみDuchenne型筋ジストロフィー

たが，後者の因果関係は不明であった．

症では，べスタチソの増量とともに血清CPK値

これらのことより，今後の方針として，1）副作は低下の傾向を示し，症状でも，登はん性起立が−9−

用に注意しながら，投与量を成人量480mg／日 よ

通してみると悪化し，機能レベルとしては使用前

り増量しつつ血中濃度の飽和点を見出すこと，2）のそれより低下していた．

その量の3ないし4分割投与による長期投与を行

Becker型，LG型では一過性にやや改善を示

いながら臨床効果を判定したい，と考えている・

した1例を除き，運動機能レベル，走行時間，起立時間に変化がなかった．
Duchenne型の検査所見では，血清CPKは1

13．進行性筋ジストロフィー症に対するベスタ

例を除いて全例投与開始後1，2，3週日の値は低チンの使用経験
福山班員は，進行性筋ジストロフィー症に対す下傾向を示したが，その後は一定の憤向がなかっるベスタチソの治療効果を評価する目的で，東京

た．45mg／kg／日服用した例では，服用後のCPK

女子医大小児科外来に通院中のDuchenne型10値が服用前値の1／5の値まで低下していた．尿中名（preclinicalcasel例を含む），Becker型3の名，肢帯型2名，先天型5名（福山型4名，良性後で有意差なく，投与量（mg／体重／日）とも特別塑1名）にべスタテンを投与し，臨床効果およびな関係はなかった．明確な副作用は消化器症状の副作用の検討を行った．

みであり，服用中止，減量，消化剤投与などで改原則として，最初の4週間は成人相当量60→
120→240→480mg

を1日分として，1週間ごとに漸増投与し，分3で服用させた．480mg相当

3一メチルヒスチジン／クレアチニソ比は開始前

善した．服用中に全身倦怠を示し，中止後改善した例があったが，同時期に感冒症状もあり，ベス
タチソの副作用か否かは不明である．

量に達したのちは最終量で維持した．その後，副14．筋疾患に対するベスタテンの効果に関する作用を認めない場合，30mg／kg／日 まで増量した・

臨床的研究

この際，Duchenne型の1例で，最高45mg／kg／
日 を5週間服用した例があった．服用前と投与

木下班員は，ベスタチソの筋疾患患者に対する開始後最初の4週間は1週間ごとに採血および1影響および6施設での評価について集計を行った．

日採尿を行い，血清CPKなどの酵素，ベスタチ

1）当施設での検討（尿中アミノ酸の検討）

ソの血中濃度，カルニチソ，血中，尿中のクレア

10例の神経筋疾患患者に連続4週から3年

チン，クレアチニソ，尿中3−メチルヒスチジソのにわたりべスタテンを投与し，1例に有効性測定を行い，その後は約1カ月間隔で同血清酵素を認めた．また，同時に行った尿中アミノ酸を検討した．同時に運動機能も評価した．1例をの変動に関する検討では，とくに 3→メチル

除いて全例最初の1週間のみ入院で評価し，そのヒスチジンの排泄量を測定したが，有意な変後は外来で評価した．

化は得られなかった．

全経過を通じ運動戟能の猛得，改善を示したの

2） 6施設での成績のまとめ

は，Duchenne型のpreclinicalcaseの1例と，東邦大学，国立神経センター，国立箱根病

先天型の3例（全例運動機能上昇期にある）のみ

院，国立西別府病院，名古屋大学，東京女子であった．これらの症例の投与後の運動横能狂得

医大の6施設での74例の集計では，とくに経過は，Duchenne型，先天型の平均的自然経過

Duchenne型ジストロフィー症で投与開始後に比して差がなかった．このほかに，Duchenne

比較的早期に血清LDH，CPKの一時的な改型2例では全経過で軽度運動槙能レベルの改善が善があり，投与方法の改良によってはさらにみられた．他の症例では，一時的に起立時間，走有効な成績が得られる可能性が示映された．

行時間の改善をみた例もあったが，6カ月全体をまた，多発筋炎の症例の一部では，ステロイ

ー10→

微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプチン）の開発研究

ドとの併用で臨床所見の改善がみられ，このチニソ，クレアチン値とも明らかな変化を示

ような使用法の有用性も確かめられた．

さなかった．6）自他覚的に特記すべき副作
用は認められなかった．

13．筋ジストロフィーに対するベスタテンの影
響一血清CKとmuscle−SpeCiGc enolase

16．筋ジストロフィーを中心とする各種筋疾患に対するベスタチン投与後の経過報告を指標として里書班員は，べスタチソ（NK421）を各種筋疾

祖父江班員は，各種神経筋患者血清中のβ型
enolaseを測定し，べスタチソの効果を検討した．
〔目

患に長期投与を行い，その臨床経過を検討した．

的〕筋障害の指標として血清CKが〔対象と方法〕長期観察例の対象は，LG

広く利用されてきた．一方，解糖系酵素であPMDるβ型enolase（muscle−SPeCific enolase，

dystrophyMSE）は，骨格筋，心筋に存在し，CK同様，

polymyositis 2例，dermatomyositisl例の筋障害の指標となることが期待される．そこ

計17例で，最大投与量は500mg／日 5例，で，さまざまな神経筋疾患患者で両者の関係

450mg／日 4例，300mg／日 2例，240mg／日

を調べ，べスタチソ投与によってこれらがど

1例，200mg／日2例，60mg／日2例，30mg／のような影響を受けるか検討した．

日1例である．投与期間は8〜33カ月（平〔対象と方法〕1）血清MSE

2例，Duchenne PMD

5例，

CK：各種

均19．2 カ月）である．以上の症例に対して

神経筋疾患患者162例と対照53例の血清10m歩行，階段昇降時間，筋力テスト，血MSEをenzymeimmunoassay法で測定し，清CPK値を測定し，評価を行った．また，

血清CK値，ミオグロピソ債との相関をみた．

経過中3回にわたって低頻度反復電気刺激をPMD患者におけるMSEとCK値の異常値

行い，母指内転筋張力を測定した．NK421

出現率を比較した．2）当班のプロトコール

血中濃度測定の対象は，1W用量固定法ではに従ってべスタチソの投与（漸増法）と採血

LG PMD5例，FSH PMDl例，myOtOnicを行い，CK値とMSE値を中心に諸検査結dystrophy

果の推移を調べた．対象患者は5例（肢帯型

人型Pompel例の計13例，4W用量漸増

2例，Duchenne型2例，筋緊張性ジストロ法ではLGPMDl例，myOtOnic dystrophy

フィー1例）で年齢19〜36歳．4週間の漸2例の計3例である．

増投与後，さらに4週間90mg／日 固定投与

〔結果および考察〕筋ジストロフィーの長期を行い，同様の方法で検査した．

投与例で臨床的改善を示した例はなかった．

〔結と6例，FSH PMDl例，myOtOnic果〕1）対照群の血清MSE値は3例，Duchenne PMD

3例，成

7．5

誘発筋電図では，2例に筋張力低下がみられ±3．8ng／mJであり，PMD群では有意に高たが，1例では2年半の経過中，筋張力低下

い値を示した．2）血清MSEとCK値の相は生じなかった．myositis例では，SterOid，関係数は0．831（P＜0．001），ミオグロピソ

免疫抑制剤に∴NK421を併用することによりとは0．595（P＜0．001）であった．3）神経筋

臨床的改善を示す幌向があった．血清CPK値疾患におけるCK と MSE の異常値出現率

は，筋ジストロフィーの多数例で低下を示し，には有意な差がなかった．4）べスタチソ投

この傾向はCPK高値のDuchennePMD例

与によって血清CK値，MSE値とも有意なで強くみられた．血中濃度測定では，20mg

変動を示さなかった．5）血中，尿中のクレア

月艮用後1〜2hrで500〜1，000ng／mlのpeak

ー11−値が得られ，480mg／日に漸増後（160mg服のためそのままでは測定できなかったので，

用後）には7，000〜8，000ng／mlまでpeak

メトキシイミノ体に誘導したのちHPLC

で値が上昇した．この観察期間中，多くの例で一斉分析する方法を，現在確立しつつある．

血清CPKの低下がみられ，長期観察例でみ3）［3H］一ホルフェニシノールを経口および静られたと同様，高CPK値を示すLGPMD，

脈内投与し，血中濃度，総排泄，bioavai・

Duchenne PMD例で強くみられた．なお，

labilityの検討を行った．1mg／kgの経口投

血中NK421濃度と血清CPK値の改善度の与では，投与後21分で最高濃度1．703／唱／mJ間に相関はなかった．NK421投与中，4例に達し，ピーク以後は速やかに減少し，投与に消化器症状がみられたが，NK421の増量

後8時間で最高濃度の1／30 以下までに減少により出現する傾向があった．しかし，これした．また，静脈注射した場合の AUC とらの例でも一時中止，減量により症状が消失比較することにより，経口投与におけるし，その後投与を続行することができた．血bioavai1abilityの高いことが示された．

液，尿所見に異常はなかった．

また，投与後48時間までに投与量の90〜95％が尿中に排泄され，蓄積性があまりないことが示された．

17．ホルフェ二シノールの体内動態に関する研究18．ロイぺプチンおよびぺスタテンの難病治療

松本班員は，ホルフェニシノールの難病治療薬

薬としての開発研究としての開発研究に対する基礎研究を行った．

田中・石井両班員は，ロイペプチソおよびべス

1） ホルフェニシノールの製造
各班員にホルフェニシノールを供給するた

タチソの難病治療薬としての開発研究に対する基めに製造法の改良を行い，ホルフェニシノー

礎研究を行うとともに，各班員にロイペプチソ，

ルの製造を行った．

べスタチソを提供した．

2）体内動態研究

1）治験薬の試製と製剤研究

2−1）ホルフェニシノールの末変化体血渠中濃治験用べスタチソ10％ドライシ′ロップ剤度の測定法として，簡便で高感度のRIA法

8kgおよびベスタチソ100mgの検討を行った．代謝物M−2〜M−6の中で5万カプセルを試製した．また，それらおよM−3のみが14％の交叉反応性を示したが，

びロイぺプチソの原末と治験用製剤（散剤，

血菜中ではほとんど末変化体としてのみ存在

カプセル剤）の安定性を，前年度に引き続きしているので，とくに前処理を行うことなく

追跡した．

カプセル剤

定量できることを明らかにした．測定限界は

2）Bioavailability

10ngであった．

2−1）べスタチソをマウスに経口授与したとき j2−2）代謝物M−1〜M−6の定量法について検の血中・筋肉中濃度の推移と代謝物を，3H−討を行った．尿中代謝物として現在までに知べスタチソを用い，単回または1日1回7日られているM−1〜M−6までの代謝物のうち間の連与について検討した．血中，筋肉中のアミノ基を有するM−1，M−3は，強酸性イ

放射活性は投与量に比例する．連与すると後オン交換樹脂に吸着させ，分別溶出したのち期（投与後4，8−時間）の値が上がり，24時

RIA法で定量する方法を確立した．また，未間の血中濃度曲線下面積は単回の1．6倍に吸着のM−2，4，5，6は，M−2の不安定性のはった．尿中回収率は単回で83〜91％，連−12−微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプチソ）の開発研究

与で97％に達し，投与量に依存しないが，経皮投与を親水軟膏でラットについて試み

低投与量（1．32mg／kg）では代謝物である

た結果は，30mg／kgで2，4，8時間後に恒AHPAが尿中放射活性の47％を占め，高投

常的に約100ng／gの筋肉内濃度を示した．

与量（12．47mg／kg）では22％と投与量に依

血中濃度も同水準であり，、これを先に記した存した．筋肉中でも同傾向であり，低投与量

経口投与時のそれと比べると，血中濃度曲線

では69％，高投与量では26％のAHPAが下面積で2．5倍であった．また，3）に記す

検出された．血中AHPAは少ない．血液・

ウサギの経皮毒性試験に際して，血祭，投与

筋肉・尿中に他の代謝物は検出されなかった．

部位筋肉，非投与部位筋肉の標本を採取してなお，AHPAの存在比は連与によって増加分析したとき，最高血中濃度は初日に150〜しなかった．筋肉中濃度は初期（投与後1時

280ng／mJに達した．しかし，連与による上間）では血中の約半分であるが，後期では同昇は認められなかった．筋肉中濃度は，連与等となり，連与（12．6mg／kg）の1，4，8時による上昇傾向と用量依存傾向を示した．

間値は放射活性でそれぞれ750，450，220ng／2−3）べスタチソの簡易定量法を開発した．

gであり，放射活性中の末変化べスタチソの1つは螢光HPLC法であり，溶出ベスタチ

存在比は1時間値で78％であった．したがソと 0−phthalaldehydeの反応成績体の螢光って，筋肉にべスタテンを到達させて濃度を検出により，血奨0．2mJ標本で200mg／mJ

維持することは，ロイペプチソに比べて容易まで測れる．これにより，臨床研究班員のプである．

ロトコールスタディーの血奨標本を測定した．

2−2） ロイべプチソをラットに経口，十二指腸他法はべスタチソの抗血清によるRIAであ（30mg／kg），門脈（10mg／kg）投与したとり，1．25ng／mJまで削ることができ，べスタ

きの6時間の血中濃度曲線下面債はそれぞれチソの生体内代謝物との交叉反応はない．

0．36，8．31，20．47ng・hr／mJであった．しかし，腸溶錠としたロイペプチソをイヌに経3）毒性試験
ロイペプチソの経皮毒性試験として，日本口投与したときの血中濃度は，裸錠のそれよ

白色種雄ウサギの刈毛した背部皮膚（5×5りも低かった．また，フラジオマイシン前投

cmつ に0，10，20，および30％硫酸ロイペ

与でラットの腸内細菌叢を減弱させておいて

プチソ軟膏を0．5g，35日間連続塗布した結も血中濃度は向上しなかった．人工胃液，人果，4群とも死亡例なく，一般状態の変化も

工腸液中37〇Cでの残存はそれぞれ94％（4各検査所見のロイべプチソによると考えられ時間），80％（6時間）であった．ロイペプ

る変化も認められず，この条件では何ら毒性

テンのジェチルアセタールの経口血中濃度もを示さないと結論される．

ロイペプチソのそれと異ならなかった．

−13−

分

担

研

究

報

告

ロイペブテンのプロテアーゼ阻害作用に関する研究

村

研

究

目

地

孝＊

研

的

究

方

法

ニワトリ骨格筋のCa2＋依存性中性プロテアー

ウィスク一系ラット（200〜300g）を用い，断ゼ（CANP）がロイべプチソによって強く阻害さ

頭後可及的速やかに血液を除いた腎臓を4倍量のれることはよく知られている．われわれは，ラッ

20mMトリスーHCl緩衝液（1mM EDTA，1mM

ト肝臓，脳，腎臓，膵臓，赤血球，胸腺などに広EGTA，0．25M庶糖，5mM2−メルカプトエタ

く分布する同種のプロテアーゼが，そのCa汁要

ノール含有，pH7．5）でホモゲナイズし，求性およびSH還元剤要求性においてCANPと105，000g，90分問題遠心して，その上活をカル

著しく類似していることを知り，これらに対するパインⅠ（低Ca2十要求性）およびカルパインⅡ

放線菌由来の一群のプロテアーゼ阻害剤の効果を（高Ca2＋要求性）の精製のための出発材料とした．

検討したところ，とくにロイべプチソによって強プロテアーゼ活性は，50mMトリスーHCl緩衝

い阻害を受けることを見出した．

液を用いたカゼイソ加水分解により定量した．通そこで，骨格筋のCANPに関する進んだ知見

常，pH7．5，30℃で30分間温置によるトリクロと並行して，上記の全身組織細胞に広く分布してル酢酸可溶性ペプチドなどの増量をFolin−Low・いるCa2十依存性システイソプロティナーゼ（以ry法により，750nmの吸光度増加として計測し下カルパインCalpain と総称する）について，そた．カルパインⅠの定量には0．1mM CaC12を，の精製と性質の研究を系統的に展開することにしカルパインⅡの定量には5mM CaCl2を活性化た．とくに，カルパインを特異的に阻害する細胞剤として加えた．いずれの場合も5mht L−システ

内インヒビター蛋白質の存在を発見したので，こ

イソを共存させた．プロテアーゼの1単位は750

れをカルパスタチソ（calpastatin）と名づけ，そmmの吸光度1．0の増加を30分間で与えるべきの精製と性質についても研究を行うことにした・

酵素量と定義した．

これらの研究を通じて，ロイペプチソのプロテ

カルパインに対するカルパスタチソの作用をみアーゼ阻害作用の一般的分子機構を解明するととるためには，カルパスタチソ標品をあらかじめカ

もに，その生理的病態的意義を明らかにすること

ルパインとpH7．5，300Cで10分間接触させたが本研究の目的である．

のち，反応混液のカゼイソ加水分解活性を測定し，活性の低下度を計測する方法を用いた．1単位の＊京都大学医学部附属病院検査部

カルパインを失活させるインヒビター活性を1単−17−位とした．

質蛋白質標品として収得し，その諸性質を比較し
た．
研

究

結

果
1．カルパインⅠおよびⅠⅠの並行精製

ラット腎臓よりカルパインIおよびⅡを，ほぼ

出発材料360mlをI）EAE−セルロースカラム

同様の方法により並行して精製し，それぞれを均

クロマトグラフに供した結果を図1に示す．

6
4
2

40

60

80

100

︵盲＼の盲⊃︶言＞葛＜︵ − ︶∈UO記ld UO息LOSq＜︵⁝⁝︶20

120

・Fraction number（14mL／tube）

図1DE52chromatography of rat kidney crude extract．
A column of DE52（3．2×17cm）wasloaded withrat kidney crude extract containing
proteinin

360mZ and eluted with

3，640mg of

2l of buffer A

having alinear gradient of50to400mM NaCland
at a rate of50ml／hr．Fractions of14ml each wereCOllected．

−．absorbance at280nm；−●−，Calpain

I activity；−0−，CaIpainII activity．

表l PuriGcation of calpainIand calpainII from rat kidney

Step＊ Tot詫詣Vity 等￡n Sp言霊蒜訪ity Pで濫読On て妥㌢
︶
1
︵
170寧＊

3，640

1

0．0465

︶
2
︵

856
︶
3
︵
︶
4
︵

＊

︶
︶
︶
︶
︶
︶
5
1
2
3
4
5
︵
︵
︵
︵
︵
︵

CaIpainII

380

2．25

59．1

203

4，470

27．6

287

6，170

17．8

16．1

31．4

236

1．13
0．53

562＊＊

1，810

3，640

1

0．154

134

100＊＊＊

675

506

152

48

13．5

87

100＊＊＊

619

3．43

180

1，170

34．2

344

0．86

401

2，600

19．0

215

0．33

642

4，160

11．9

stepsare：（1）Crude extract．（2）DE52chromatography，（3）（NH4）2SO4fractionation and fo1−

lowed by TSK−Gel G3000SWG chromatography，（4）blue Sepharose CL−6B chromatography，
and（5）DEAE−Bio−GelAchroTnatOgraphy・＊＊

Calpain activitiesin crude extract were only apparent values，Since both enzymes were not

Separated andinhibitor（S）co−eXisted．We assumed that the proteolytic activity measured as O．1
mMCa2＋represented

only

calpainI

activity

andtheactivity

measured

at5mMCa2＋represented

CalpainIplus calpainIIactivity．
＊＊＊

Activitiesafter DE52chromatPgraphy weretaken aslOO％for therespective enzymes・−18−

ロイべプチソのプロテアーゼ阻害作用に関する研究︵︑∈＼のlモ⊃0＞焉一巴∵言＞葛く︵ − ︶︵当一望凸長至阜EU O記一q UO亘LOSq＜︵＝⁚＝︶
0

1

2

30

1

2

3

EffIuent voIume（relative vaIue）

図2

Comparison of chromatographic patterns of calpainI andcalpainII

from

rat

kidney．一日，absorbanceat

280nm；−＋−，CalpainI activity；一〇−，CalpainII activity・Abscissae

and ordinates are gratedin relative values．To obtain true
values the relative valuesaretobemultiplied by the following
factois．Forabsorbance：A，0．6；B，0．3；C，0．15；D，0．085；
E，0．04；F，0．025．For enzyme actlVlty：A，30；B，48・5；C，
10；D，26；E，5；F，10．For emuent volume：in A and B，
1representslO8ml，2，144ml，and3，180ml；in C and D afactor of40is to be used；in E and F a factor of30is to be
used．A，C，and E are for calpainI and B，D，and F are forcalpainII．The elution profiles are：A andB，from TSK−Gel
G3000SWG（2．5×60cm）；C and D，fromblueSepharose CL−
6B（1．5×7．5cm）；E and F，from DEAE−Bio−Gel A（1・3×6．0cm）．Theflow rates（per hr）were：180mlin A and B；
40mlin C and D；15mlin E and F．

NaCl濃度勾配によって，先に溶出されるⅠ型酵

2．精製カル／りンⅠおよびⅠⅠの諸性質

素と，あとで溶出されるⅡ型酵素をそれぞれ集め，

1）サブユニット構造

別々に次の各段階のクロマトグラフに供した（図精製標品のポリアクリルアミドゲル電気泳動結2）．両酵素は，はば同様の操作により，それぞれ果を図3に掲げる．図3Aに示すように，両者と電気泳動的均質標品にまで精製された．表1に示もにSDS非存在下に単一バンドを与えるが，Ⅱ

す通り，3．64gの租蛋白質分画から出発して，カ型のほうが陽極への移動度が大きく，より酸性蛋

ルパインⅠを0．53mg（6，170倍精製），カルパイ

白質であることが知られた．この事実は，図1のンⅡを0．33mg（4，160倍精製）収得した．

陰イオン交換クロマトグラフにおける溶出位置の差をもよく説明している．一方，図3Bに示すよ
−19−

A

1

11
−

−

Origin ＼Origln・−・

67K・一一−−−・−

43K■■

M l；Ⅰ十ⅠⅠ呈II M

94K

−

一一80K

−

■
㌢

30K

−

一・・・25K

20．1K■−■Front．−

Front一−−図3

Gel electrophoresis of puri丘ed calpainI and calpainII from rat kidney．A，nOn−
denaturing polyacrylamidegelelectrophoresis；thecathode on top・EachlOfLg Of
puri丘edcalpainI（left）and calpainII（right）was applied to a7．5％polyacrylamide
gelandelectrophoresed・B，SDS−pOlyacrylamide gel electrophoresis．Polyacrylamidegel（12％）withO．1％SDS．was used．Marker proteins used were：phosphorylase b（94，000（94K）），bovine serum albumin（67，000（67K）），OValbumin（43，000（43K）），Carbonic anhydrase（30，000（30K）），SOybean trypsininhibitor（20，100（20．1K））andα」actalbumin（14，400（14．4K））．Lane M，marker proteins

with

α一

1actalbumin on thegelfront；laneI，5FLg Of puri丘edcalpainI；1aneI＋ⅠⅠ，4fLg
of calpainI and4FLg Of calpainII；laneII，5fLg Of purified calpainII．

10￣7

10二6

10￣5

10￣4

Free oakiumion（M）

図4

Calcium requirement of calpainI and calpainII fromrat kidney．●，CalpainI；O，CalpainIl．PurifiedenヱymeS Were dialyzed against

20mMimidazolerHClbuffer，pH7．5，COntaining2mM EGTA and5mM2−
mercaptoethanol．The en2：ymatic reaction was carriedout at pH7・3in Ca2十一EGTA bu仔ers．

うに，SDS存在下ではⅠ型，II型ともに80kDa2）等零点と最適pHと25kDaのサブユニットより成ることが明らか

等電点電気泳動の結果によれは，Ⅰ型の〆はにされた．別に行ったゲル濾過実験の結果から，

5．3，Ⅱ型のpJ■は4．6であった．Ca2十非存在下両酵素の分子量は約110，000であるので，両者とに加温した場合の酵素蛋白質の熱安定性を比較す

もに大小それぞれ1個ずつのサブユニットから成ると，Ⅰ型はⅡ型に比して明らかに高い安定性をるヘテロ二量体構造であると結論された．

示した．カゼインを基質としたときの両型酵素の最適pHはいずれも 7．5付近でほとんど差異を−20−

ロイペプチソのプロテアーゼ阻害作用に関する研究
表2 Effects of various divalent cations on the activity of
calpainI and calpainII

Concentration（mM）
Protease Cation
3

5
4

0

0

0

0

0 0
0
1

0
0
0 0
1 1

0
0
1

0
6

0
6

0

0

0

0
0
1

1
8

0

7
8

8
4

0

1
6

4
4

0

9

8

4

0

0

0

0

0

0

0

CalpainII

1

0

5

6
0

1

0

0
0

0

0
0

相即脚脚Ⅳ哩W脚㍍

CalpainI

0．1

1

Figuresin the table are expressedin percent，taking aslOO％
theactivity

5mM

Ca2＋

measured

for

atlmM

Ca2＋

calpainII．All

for

the

calpainI

cations

were

and

that

used

as

at

the

respective chlorides．

認めなかった．
3）Ca2十要求性

は，そのCa2＋要求性に現れた．図4に示すように，カゼイン基質に対し，Ⅰ型は2匹M Ca2十で50％活性化を示したが，Ⅱ型ではこの値は200〆Mであった．しかし，活性のCa2十依存曲線は0︵訳︶ぎモ葡EOL倉＞ちくカルパイソⅠとカルパインⅡの最も顕著な相違

まったく同様のパターンを示した．Ca2十以外の
1

2価金属イオンの効果を表2に示す．Ⅰ型はSr2十2Calpastatin（units）のほか，Ba2＋およびMn2十によってもかなり活

図5

Effect of calpastatin on calpainI and性化されるが，Ⅱ型ではSr2十 以外のイオソはほ

calpainII．●，CalpainI；O，CalpainII・
Each tube contained o．4 unit of the

とんど無効であった．

puri丘ed enZyme．After preincubation
with various amounts of calpastatin at4） カルパスタチンの阻害効果

30℃for5min，the remaining activity

ラット腎臓から部分的に精製したイソヒビター

was assayed．

であるカルパスタチソの効果を示したのが図5である．同じ見かけの活性に対する阻害度でみる

5） アミノ酸組成と，カルパインⅡのほうがカルパインⅠよりも強

図6に，カルパイソⅠおよびⅡのアミノ酸組成

く阻害される結果が得られる．しかし，表1に示を示す．一見してわかるように，両型酵素のアミしたように，Ⅰ型のほうがその比活性においてⅡノ酸組成はかなり類似しており，それに比して，型より2倍ほど強いことを考慮に入れると，カルカルパスタチソやカルモデュリソのアミノ酸組成

パインとカルパスタチソの相互作用における分子との間には大差がある．カルパインⅠおよびⅡは，間の比率はⅠ・Ⅱ両型の間で大差がないものと考それぞれはば同量の塩基性および芳香族アミノ酸

えてよい．

を含有しているが，両者の間に明確な差異を示す−21−

Rat kidneyca匝JnI

Rat kidney calDainIl

A

Human erythrocyte calpastatin Bovine brain calmodulin

図6 Comparison of amino acid compositionsofrat kidney calpainI（A），CalpainII（B），
human erythrocytecalpastatin（C），andbovine brain calmodulin（D）．The calculated
mol％of amino acids are plotted on the spokes which have percent graduations（2％each）So that the distribution patterns can be directly compared among four
PrOteins・Values of half−CyStine and tryptophan were omitted from the plottings．
Ⅰn the case of calmodulin，One trimethyllysine residue wasincludedintolysine
residues．

アミノ酸成分もある．たとえば，カルパインⅠはより多くのプロリンおよびバリンを含み，一方，

考察

カルパインⅡはより多くのグルタミン酸とイソロ
イシンを含有している．

カルパイン（Ca2十 依存性システイソプロティ
ナーゼ）には，その活性化に〃nI濃度のCa2十を必要とするⅠ型酵素と，mM濃度のCa2十を必要とするⅡ型酵素とのあることは1980年以来知ら−22−

ロイペプチソのプロテアーゼ阻害作用に関する研究
表3

Comparison of some properties of ca］painIand calpainIIfrom rat kidney
Properties

CalpainI

CaIpainII

Molecular weight
Sephadex G−150
SDSrpolyacrylamide gel electrophoresis
Isoelectric polnt

110，000

115，000

80K＊＋25K

80K＋25K

5．3

4．6

2／JM

200〃M

Free Ca2＋concentration which gave：
Half一maXimal

activityMore than30％left

Temperature stability（afterlOmin at58℃）

7．0〜7．5

OptimalpH
＊

l mM

lO〟M

Full activity

No activityleft
7．5〜8．080K，25K，gfc．，80，000，25，000，gfc．

れていた．しかしながら，同一臓器に含まれる

い研究課題が将来に残されている．

Ⅰ・Ⅱ両型酵素を同時に（並行して），しかもほぼ

なお，精製カルパインⅠおよびⅡともにロイペ

同様の方法で高度精製し，その諸性質を直接比較

プチソの阻害作用を強く受け，その見かけの阻害することには成功していなかった．われわれは，率の間には差異を認めなかったので，ロイべプチ

ラット腎臓がⅠ・Ⅱ両型酵素をほぼ同量に含有し，ソの結合部位や阻害機構のうえで両酵素問に差がしかも内在性インヒビターであるカルパスタチソ

ないものと推定された．

の含量が少ないためⅠ型の精製に対する障害が少また，生体内でⅠ・Ⅱ両酵素のいずれがより生ないことに注目し，この臓器を出発材料として理的に有意義であるのかもまったく不明であり，

Ⅰ・Ⅱ両型の平行精製を完成することができた・

両酵素の細胞内分布とともに，緊急に解明される

ブタ骨格筋については，カルパイソⅠとⅡの比較べき研究課題である．

研究があるが，それぞれ異なった方法によって精

カルパイン，カルパスタチソに関して，われわ

製されており，今回のわれわれの研究のような直れは，ラット腎臓カルパインの精製研究1・14）のは接比較は達成されていない・

か，広く動物組織に分布しているこの系につき酵今回得られた諸性質の一部をまとめたものが蓑

素化学的ならびに免疫化学的研究を展開し，それ3である．また，アミノ酸組成の比較は図6に掲

ぞれの成果をあげつつある2￣4・11￣13・15￣17）．また，

げた通りである．これらの結果から，カルパイソ

カルパイソ，カルパスタチソに関する数篇の解説

ⅠとⅡとは，その蛋白質分子としての全体像にお論文を発表した5￣lO）

いてきわめて類似していること，しかも，その文

Ca2十要求性という一点においてはきわめて異な献1）Yoshimura，N．，Kikuchi，T．，Sasaki，T．，Kitaha−ra，A．，Hatanaka，M．，and Murachi，T．Twoっていることがわかる．
このような特異な類似性と相違性が，両酵素蛋

distinct Ca2＋−prOteaSeS（caIpainIandcalpainII）purifiedconcurrentlyby thesamemethod

白質の化学構造とどのように関連しているのか，

from rat kidney．J．Biol．Chem．，258，8883−

また両酵素は遺伝子支配を異にした分子であるのか，とくに80kDaサブユニットも30kDaサブ8889（1983）．

2）Hatanaka，M．，Kikuchi，T．，and Murachi，T．
CalpainI，alow

ユニットもそれぞれに互いに異なっているのか，
それともたとえば30kDaサブユニットのみはⅠ・Ⅱ型に共通であるのかなど，きわめて興味深−23−

Ca2十一requiring

protease，

from human erythrocytes：Purification andsubunit structure．Biomed．Re5．，4，381−388（1983）．

3）Yamato，S．，Tanaka，K．，and Murachi，T．The

appearance of a

34，000−daltoninhibitor of

Calpain（Ca2十一dependent

cysteineing（December，1983），London，England，Pp．
46−47．

proteinase）

9）村他 者．カルパイン．金属タン㌧ペク質の化学，

in ratliver after the administration of phe−nylhydrazine．Biochem．Biophys．Res．Com−
ほれ，115，75ト721（1983）．
4）Sasaki，T．，Yoshimura，N．，Kikuchi，T．，Hata−naka，M．，Kitahara，A．，Sakihama，T．，and Mu・rachi，T．Similarity and dissimilarityin sub−大塚秀之助，山中陸生編，pp．76−78，講談社，東京（1983）．
10）村地 孝．カルパインとカルパスタチソ．代乱
20，429−438（1983）．

11）小倉享一，前田 満，田中隆治，野本享資，田中一仁，村地 孝．新規チオールプロテアーゼイン
ヒビター．生化学，55，825（1983）．
12）高野恵美子，北原愛子，畑中道代，川口直美，神奈木玲児，村地 孝．カルパイン及びカルパスタ
チンの酵素免疫測定法（EIA）．生化学，55，828

unit structures ofcalpainsIandIIfrom var−ious sources asdemonstratedbyimmunologi−
Cal cross，reaCtivity．J．Biochem．，94，2055−
2061（1983）．

5）Murachi，T．Calpain and ca】pastatin．Trends
870C九g′机（1983）．

∫rf．，8，167−169（1983）．

6）Murachi，T．Intracellular

Ca2＋

protease

anditsinhibitorprotein：Calpainandcalpastatin．
ZTZ Calcium and Cell Function，ed．by W．
Y．Cheung，Vol．4，Pp．377−410，Academic
Press，New York（1983）．
7）Murachi，T．，Takano，E．，and Tanaka，K．Cal−
PaStatin，anendogenousinhibitorproteinact−
ing speciGcally on calpain．Zn ProteinaseIn−hibitors：MedicalandBiologicalAspects，ed．
by N．Katunuma，H．Umezawa，and H．Hol・
Zer，Pp・165−172，Japan Scienti丘c Societies

Press，Tokyo and Springer−Verlag，Berlin（1983），

8）Murachi，T．Calcium−dependent proteinases
and speciGcinhibitors：Calpain andcalpasta・
tin．Abstr．，607th BiochemicalSociety Meet−−

13）中山 昇，稲本 俊，田中一仁，日笠頼則，村地孝．マウス及びヒト脾細胞幼君化におけるカルパ
イン・カルパスタチソの動態．生化学，55，828（1983）．

14）吉村長久，畑中道代，菊池孝信，佐々木隆志，村地

孝．カルパインⅠとカルパインⅡの同時精製．生化学，55，978（1983）．
15）菊池孝信，湯元 昇，畑中道代，村地 孝．カル
パインのサブユニットに関するタンパク化学的研究．生化学，55，979（1983）．
16）佐々木隆志，吉村長久，北原愛子，先浜俊子，村地 孝．カルパインⅠとカルパインⅡの免疫学的相違について．生化学，55，979（1983）．
17）吉田晴子，村他 者，塚原 勇．ウシ限水晶体のカルパイン，カルパスタチソおよび，内部基質について．生化学，55，979（1983）．

24−螢光・HPLCによる血清ホルフェ二シノールの定量法とクーヒドロキシべスタチンのプレカラム螢光誘導体化

大 倉 洋 甫＊
研究協力者

田村和彦＊・石田淳一＊・甲斐雅亮＊

螢光体に導き，逆相分配HPLC で分離，検出すはじめるものである．

にわれわれは，筋ジストロフィー症の治療薬とし

実

験

方

法

て検討されているロイペプチソ1），べスタチソ2・3）1）試薬溶液の調製

および関連代謝物を彗光検出による高速液体クロa）0．5人Ⅰアソモニア緩衝液（pH8．5）一塩酸

マトグラフィー（HPLC）によって定量する方法（6．2人Ⅰ）混液
1．0人Ⅰアンモニア緩衝液（pH8．5）は，1・0hf

を開発してきた．今回，ホルフェニシノールがアルカリ性で酸化され，強い蛍光を発することを見塩化アンモニウムと1．0ht

水酸化アソモ三ウム

出し，血清中のホルフェニシノールを螢光・（25％アンモニア水を水で6．5倍に希釈して調HPLC により簡便に定量する分析法を開発した・製）でpH8．5に調整してつくる・この7ソモニ

また，57年度において開発したベスタチソのア緩衝液と市販の濃塩酸を等容量ずつ混合する．

螢光・HPLC法を用い，引き続き，三吉野班員ら

b）HPLCの溶離液により筋ジストロフィー症患者に投与されたべス

市販の0．5人Ⅰテトラ一花−プチルアンモニウムヒ

タチソの血清濃度を測定した．しかし，その活性ドロキシド4mgと0．1人Ⅰアンモニア緩衝液（pH

代謝物であるクーヒドロキシべスタチソ〔1nmol8．5）496mgを混合する．使用前に，減圧下（約15（400mg）／mJ以下〕については，血清に内在するmmHg）で5分間脱気する．

妨害因子のために鋭敏に測定することができなか

2）基準操作ったので，今回新たに♪−ヒドロキシべスタチソa）除蛋白法

のHPLC

血清100／JJに水（検量線作成時にはホルフェにおける螢光誘導体化法の基礎研究を

ニシノールの標準液）50〆および0．75入Ⅰ過塩素

行った．

酸100〆を加え，800gで5分間遠心する・このⅠ．血清ホルフェ二シノールの定量

上清100〆を蛍光反応に用いる．
b）賛光反応

開発した血清ホルフェニシノールの定量法は，

上記試料100βに25mMフェリシアソ化カリ

除蛋白した血清中のホんフェニシノールをフェリ

ウム（ホルフェニシノール標準液のみを試料としシアソ化カリウム存在下水酸化カリウム溶液中でた場合は1．OmM）50／′Jおよび3．5M水酸化カ＊九州大学薬学部

リウム溶液200βを加え，50℃で15分間加温−25−

する．反応液に，1．5hI亜硫酸ナトリウム 50〆と各試薬容量を用いて得た最終反応液の蛍光を蛍およびアンモニア緩衝液と塩酸混液100〆を加光分光光度計（日立MPF−4，1×1cm石英セル

える．最終反応液100〆をHPLCに付す．

使用）で測定した．
図1に，ホルフェニシノール標準液を基準操作

C）HPLC
高速液体クロマトグラフには日立655型を使に従って螢光反応させたときに得られる蛍光スペ

用し，LiChrosorb RP−18（粒径5FLm，メルク

クトルを示す．385および500mmにそれぞれ励社）を充填したカラム（150×4mm，i．d．）に溶離起および発光極大波長が認められる．このスペク液を1．Oml／min（約100kg／cm2圧力）で送液し，トルは，最終反応液のpH，反応に用いるフェリ

ホルフェニシノールの賛光体を分離する．蛍光検

シアン化カリウムおよび水酸化カリウムの濃度を出は，18／jJのフローセルを装備した日立650−10

変化させても，その形において著しい変化を示さ

LC蛍光分光光度計を用い，励起波長385nmおない．
この蛍光反応における反応時間とその温度につよび発光波長500mm で行う．

いて検討した結果を図2に示す．反応温度が高いほど，得られる蛍光強度は速く最大値に達する．

結果および考察1）螢光反応条件

しかし，70および1000Cにおいて生じる蛍光は，HPLC

による血清中のホルフェニシノールをそれぞれ最適加熱時間を過ぎると急激に減少する．

定量する方法を確立するために，まず10nmol／ml

基準操作には，再現性のよい蛍光強度を得るためのホルフェニシノールの標準液を用いて，アルカに，500Cで15分間加温する条件を選んだ．

リ性酸化によるその発蛍光条件について検討した．

図3に示すように，ホルフェニシノールの発蛍

なお，以下各条件を求めた実験操作では実験の部

光は，フェリシアン化カリウムの濃度と試料溶液の基準操作b）に準拠し，かつその10倍の試料に共存する除蛋白血清量に著しく影響される．螢

︵S雲コと巴一挙品︶

をsuOlU一85OS巴0⊃一山

300

500

・400

600

Wavelength（nm）
図l Excitation and emission spectra of the 丘nal reaction
mixture of forphenicinol．a，eXCitation spectra；b，emiS・Sion spectra．aland bl，a POrtion（1．Oml）oflOnmol／ml
forphenicinoIsolution was treated by the standard proce−
dure；a2and b2，reagent blank corresponding toalandb1．
−26−

螢光・HPLCによる血清ホルフェニシノールの定量法と♪−ヒドロキシべスタチソのプレカラム螢光誘導体化
a

】00

b

0

︵の一モコを芸事曳
きS忘lUW0200S20⊃一山

30

20

10

Reaction time（min）

図2

EHects of reaction temperature and time on the血orescencedevelopment from forphenicinol．Portions（1・Oml）oflOnmol／ml
forphenicinoIsolution were treated by the standard procedure but
for various reaction times at difrerent reaction temperatures．a，100；b，70；C，50；d，37；e，23；f，2℃．

0︵の言⊃ゝ﹂空l至d︶倉suO︸uTの0UOOSOJOコに

0

10

20

30

40

K3Fe（CN）6（mM）

図3

Effects of the potassium ferricyanide concentration and the
deproteinizedserumvolumeOnthe負uorescencedevelopmentfrom
forphenicinol．Portions（1．Oml）of（a）10nmol／mlforphenicinoI
solution or the solutionsin the presence of（b）30，（C）60，and（d）90％，V／v of the deproteinized serum were treated by thestandard procedure．

光反応に用いる試料がホルフェニシノール標準液存させると，より高濃度のフェリシアン化カリウの場合は，1．OmlIのフェリシアン化カリウムでムを必要とする・基準操作には，ホルフェニシノ

最大の螢光強度が得られるが，その試料に除蛋白した血活（基準操作2）のa）で得た上清）を共−ル標準液を試料とする場合は1・OmMのフェリシアソ化カリウムを，血清試料を扱う場合は−27−

ウムは，逆に蛍光反応を阻害するか，生じた質光
物質の分解を促すものと思われる．なお，他の酸mhI），過酸化水素（0．1〜10mhI）について検討したが，いずれもフェリシアソ化カリウムによっ0︵のl一5ゝ﹂巴芸Ld︶
倉suOlU忘28の巴○⊃一山

化剤として，過マンガソ酸カリウム（0．01〜10て得られる最大蛍光強度の1／4以下であった．
図4は，ホルフェニシノールの先賢光に及ぼす
水酸化カリウム濃度の影響について調べたものである．ホルフェニシノールの標準液および除蛋白
血清を含むその試料を，それぞれ同様に処理した
0

1

2

3

4

5

6

とき，両者とも基準操作に用いた3．5hI の水酸

KOH（M）
図4化カリウム濃度で最大の蛍光強度が得られる．なE汀ect of the potassium hydroxide concen−
tration on theお，水酸化カリウムのかわりに水酸化ナトリウム

fluorescence developmentfrom forphenicinol．Portions（1．Oml）ofを用いても，同様な結果を示した．

（a）10nmol／ml forphenicinoI solution or（b）the solutionin the presence of90％，

図5に示すように，最終反応液のpHが8．8〜

V／v of the deproteinized serum were treat−

9．5において最大の蛍光強度が得られるが，反応

ed by the standard procedure．

後の強アルカリ溶液中でも，その蛍光強度は比較
25mhIのそれを，それぞれ使用することにした．

的強い．基準操作では，HPLCの溶離液が弱アル

酸化剤の最適浪度が血清量に依存する原因は，血カリ性であるので，アソモニア緩衝液と塩酸の温清に存在する多数の還元性物質（糖，カテコール

液で最終反応液のpHを9．0〜10．0に調整した．

アミンなど）によってその酸化力が失われるもの

また，反応後に加えた亜硫酸ナトリウムは，反と考えられる．また，過剰のフェリシアン化カリ

応を停lLするとともに，生じた質光を安定化する．

0︵のlモ⊃ご空一幸且をsuむlUⅧ028SOJO⊃一﹂

7

ll

9

I3

PH

図5

Effect of pH of the丘nal reaction

miXture On the

fluorescence from forphenicinol．Portions（1．Oml）oflOnmol／ml forphenicinoIsolution were treated by thestandard procedurebutthefinalreaction mixtures were
adjusted to various pHs with hydrochloric acid（6．2M）
and ammonium buffers（0．5M，Various pHs）．
−28−

螢光・HPLCによる血清かレフェニシノールの定量法とクーヒドロキシベスタチソのプレカラム螢光誘導体化

はホルフェニシノールに対してかなり高い選択性

表1Fluorescences from other substances
under the same reaction condition asを有していることがわかる・

that for forphenicinol2）血清ホルフェ二シノールのHPLC
Compounds＊

Relative8uorescenceintensity

ForphenicinoI100＊＊

ホルフェニシノールの標準液（20nmol／mJ）を

Dopa

0．8

用い，基準操作2）のb）およびC）に準じて処Dopamine

1．5

理したときに得られるクロマトグラムを図6に示

Adrenaline

3．2

Noradrenaline

0．4

Tyrosine

0．9

分に溶出され，試薬ブランクに基づく質光体（2〜Tyramine

1．2

4分に溶出，図6のB）と完全に分離されている・

Serotonine

6．3

Phenylalanine

0．0

Alanine0．0

様に処理してHPLCに付したところ，それらか

Glucose0．0

ら認められた蛍光体はいずれも試薬プラソクの貸Galactose

0．0

hIannose

0．0

Ribose0．0＊

す．ホルフェニシノールの麓光体は保持時間4・9

また，表1に示した物質（各200nmol／mJ）を同光ピークと同じ保持時間に溶出し，ホルフェニシ
ノールの測定を妨害しない．
HPLCによるこの分離は，逆相分配型のPortions（1．Oml）OflOOnmol／ml solutions

Liof thecompoundsweretreatedby thestand−

Chrosorb RP−18を充填したカラムを用い，溶離

ard procedure・＊＊ The且uorescenceintensityfromforphenicinoI

液にカウンターイオソ（四級アソモニウムカチオン）を含むpH8．5のアンモニア緩衝液を使用しwas taken aslOO．

て行われている．ホルフェニシノールの蛍光体が反応に，1．OmlIのフェリシアン化カリウムを用

pH8．8〜9．5で強く発賛光することから，移動相いた場合は80mhI以上，25mMのフェリシアン

のpHは弱アルカリ性が望ましい・また，カウソ

化カリウムを用いた場合は少なくとも0・8ht以

クーイオンとして溶離液に加えたテトラー乃−プチ

上の濃度の亜硫酸ナトリウムを必要とした・基準

ルアンモニウムヒドロキシドは，ホルフェニシノ

操作には，飽和濃度に近い1．5人Iのそれを使用

ールの蛍光体と試薬ブランクのそれとの分離をよしている．これにより，最終反応液あるいは中和くするために加えたものである．このイオンが移前の強アルカリ性溶液における質光は，それらの動相にない場合は，ホルフェニシノールの賛光ピ反応液を室温で少なくとも1時間放置しても安定

ークは早く溶出し，試薬ブランクのそれと重なる・である．

このことは，ホルフェニシノールのカルポキシル

生体内に存在しかつ螢光性を示す物質（カテコ基がその蛍光体にも残存していることを示唆する・ールアミソ頬，チロシソ，およびセロトニン）を

図7は，60mgのホルフェニシノールを健常人

本蛍光反応で処理したときに得られる相対蛍光強に経口投与し，投与前と投与後（2時間および8度を表1に示した．等濃度のホルフェニシノール

時間後）における血清中のホルフェニシノールをから得た蛍光強度と比較すると，それらの物質か

このHPLC

らの蛍光強度はきわめて小さい・同様に，フェニある．投与前の血清で得られたクロマトグラム

ルアラニソ，アラニソ，グルコース，ガラクトー（図7のA）には，ホルフェニシノールの質光体

ス，マンノース，およびリポース（各100nmcl／が溶出する保持時間にはピークは検出されないが，mJの溶液）を用いて検討したが，いずれも蛍光投与後の血清では（図7のBとC），明らかにホは認められなかった．この結果より，本鐙光反応

ルフェニシノールの蛍光ピークが検出されている・−29−で処理したときのクロマトグラムで（B）をのUヱ∪膿む2むOS23一山

0

4

8

12

16

0

Time（min）

図6

4

8

12

16

Time（mln）

Chromatograms obtained with（A）the reaction mixture
Of forphenicinol and（B）the reagent blank．Portion（1．Oml）of20nmol／ml forphenicinol or water for the blank
WaS treated by the standard procedure．HPLC conditions：
COlumn，LiChrosorb RP−18；mObile phase，0．1M am−
monium buffer（pH8・5）containing4mM tetra−n−butylam−monium hydroxide；80W rate，1．Oml／min；fluorescence
detection・E文385nmand

Em500nm・Peaks：1，forphe−nicinol；2，reagent blank．
（C）

倉のUU三の20OS巴○⊃一﹂

0

4

g

12

7lme（m了ni

図7

0

4

8

12

Time（min）

0

4

8

12

Time（min）

Chromatograms obtainedwith（A）drugrfree serum and sera at（B）2and（C）8hrafter oraladministration of forphenicinolto a
healthy

man・Dose：60mg・Peaks＝1，reagent

blankcontaining

SOme Substances from serum；2，forphenicinol．Serum concentra−tion of forphenicinol（nmol／ml）：A，0．0；B，7．5；C，1．9．
−30−

螢光・HPLCによる血清ホルフェニシノールの定量法と♪一ヒドロキシべスタチソのプレカラム螢光誘導体化

このとき，れレフェニシノールのピークが溶出しとき，図1のスペクトルと完全に一致した・

たのちには，血清由来の蛍光ピークは認められな基準操作に従い，ヒト血清に添加したホルフェ

い．したがって，HPLCの試料は約8分間隔で順ニシノールの検量線を作成した・添加したホルフ

次クロマトグラフに注入でき，分析できる・なお，ェニシノールのピークの高さは，少なくとも250

図7のBにおけるホルフェニシノールのピークのnmol／mJ血清中まで原点を通る直線を示した・こ

溶出液を分取し，その蛍光スペクトルを測定したのときの回帰直線式の相関係数（わは0・9998で︵盲︑一〇Eu︶
一〇u巧で〇五﹂0 O UO葛圭の28∈20S
0

0．51

4

2

6

8

Time after administration（hr）

図8

Serumconcentrationsofforphenicinolafteroraladministrationof forphenicinolto three healthy men・Dose：60mg・a・ad−
ministration at5hr after feeding；b and c，administration at
30min after feeding．
CH（CH3）2
1

R◎

CHz

NH2
L

CH2−CH−CH−CONH−CHrCOOH（bestatin．R＝H；P−hydroxybestatin7R＝OH）

（8）

（A）
Na104

R◎cHzCHO

CHC13

OH￣

R◎cH2−く二〕◎二：：：；xぷHx遜寧：：二；H：；：：◎：：；・HC・

NH2
L，−hydroxybestatin・X＝−CH2−CH−CH−CO−Leu
1

0H（●DDB），ePtides，X＝−CHZrCHこ図9Schemeofthefluorescencederivatizationofbestatinandp−hydroxybestatinwithDDB・
−

31−

ある．

あった．また，この検量線から求めた血清中のホルフェニシノールの検出限界は，ぶ／Ⅳ＝2 において1．Onmol（197ng）／mJであった．これは，

実

験

方

法

HPLCの注入量で表すと，8pmol（1．6ng）のホ

1）螢光誘導体化反応

ルフェニシノール量に相当する．除蛋白時におけ試料溶液200βに3．0hI水酸化カリウム溶液

るホルフェニシノールの添加回収率は，血清10050〆とクロロホルム100〆を加え，600Cで10〆に1．0および0．25nmolのホルフェこシノー

分間振坦する．13．0hl酢酸50／JJを加えてホルルを添加した場合，それぞれ98±4．2および95

ミル化反応を停止するとともに，蛍光反応の至適±4．8％（平均値±標準偏差，乃＝10）であった．

pH3・8に導き，1．3mM DDB溶液300FLlを加本法による血清ホルフェニシノールのモニター

えて60℃で18分間蛍光反応する．

例として，60mgのホルフェニシノールを健常人

2）HPLC条件（3名）に経口投与したときの血清濃度変化を測定

高速液体クロマトグラフには東洋曹達

803Dした．結果を図8に示す．上述したように，蛍光を使用し，流速0．8m〃minに設定した．カラム

反応に必要なフェリシアン化カリウムの濃度は各（150×4mm，i．d．）はLiChrosorbRP−18（粒径

検体の血清によって多少変化する可能性があるの

5／Jm，メルク社）を充填したもので，溶離液には，で，図8における定量値は各血清に標準ホルフェ

アセトニトリル，9．2M塩化カリウムー塩酸緩衝

ニシノールを別に添加した標準添加検量線から求液（pH2．2）および0．05Mヘキサンスルホン酸

めている．検討した血清3検体に関しては，添加ナトリウムの混液（図10参照）を使用する．螢光

したホルフェニシノールのピークは同一添加量に検出は，12／∠Jのフローセルを装備した島津RF−おいてほぼ同じ高さに示し，ホル7ェニシノール

530肇光モニターを用い，励起波長348nmおよの発蛍光性は検体間で差がなかった．

び発光波長420nmで行う．

本法における繰返し精度を，図8で求めたb検
体の2時間および8時間後の各血清中のホルフェ結果および考察

ニシノール濃度をそれぞれ10回繰返し測定して上記の鐙光ラベル化反応は，チPシソ残基を有求めた．その変動係数（平均定量値）は，それぞするペプチドに対してもDDBの螢光ラベル化体

れ5・3％（7・5nmol／mOおよび6．8％（1．9nmol／を与えた．クーヒドロキシべスタチソおよびチロシ

mJ）であった．

ソ含有ペプチドを用いて，HPLC−UV検出（吸収波長：260nm）によってホルミル化条件を，

ⅠⅠ・p−ヒドロキシベスタテンの蛍光誘導体化

HPLC蛍光検出によってDDBによる螢光誘導体化条件をそれぞれ検討し，実験方法に述べた基
クーヒドロキシべスタチソの新たな螢光ラベル化

準振作を得た．

法の原理を図9Bに示す．この螢光ラベル化法は，

図10に，この提作によって得たクーヒドロキシ

クーヒドロキシべスタチソをクロロホルム存在下ア

べスタチソおよびチロシソ含有ペプチドの蛍光ラルカリ性でホルミル化し（Reimer−Tiemann反ベル化体を逆相分配HPLCで分離し，蛍光検出応4）），当班員らによって開発した芳香族アルデヒ

したときのクロマトグラムを示す．各ラベル化体

ド類の蛍光ラベル化剤〔4，5−ジメトキシー1，2−ジは良好に分離されている．このとき，クーヒドロキ

アミノベンゼンモノ塩酸塩（DDB）〕と弱酸性

シべスタチソを除いて他のペプチドからは，少量（pH3．8）で反応させ，蛍光誘導体に導くものでであるが，ペプチド結合が開裂して生じた副反応−32−螢光・HPLCによる血清ホルフェニシノールの定員法と♪一ヒドロキシべスタチソのプレカラム螢光誘導体化
（8−り

0

4

8

12

（A−2）

reagent blank

16

24

20

28

32

亡三人二二
36

¶me（min）

図10

0

4

8

12

16

20

¶me（min）

Chromatograms of DDB derivatives offormylatedp−hydroxybestatin，tyrosine，and peptides containing tyrosyl residue．HPLC conditions：
COlumn，LiChrosorb RP−18；mobile phase，CH3CN−0．2M KCl・HCl（pH2．2）−0．05M sodium hexanesulfonate（A−1，2；26：64：10，V／V），（B−1，2；18：62：20，V／V）；dow rate，0．8ml／min．Concentrations of
COmpOunds used for derivatization：A−1，20nmol／ml each；B−1，10nmoI／ml each．Abbreviations：EK，enkephalin；Ang，angiotensin；
Y，tyrOSine；YG，Tyr−Gly；YGG，Tyr−Gly−Gly；GY，Gly−Tyr．

tyrosineYGかhydroxybestatin

YGG
GY
Leu−EK
Met−EK

nmoりinjectionvolume（柑OJJJ）

図11Relationship between the peak heights and the amounts ofP−hydroxybestatin．tyrosine，and related peptides．Thelimits
Ofdetection（pmolof the compoundsin aninjection volume，
100FLl）：♪−hydroxybestatin，4．0；tyrosine，3．4；YG，3．7；
YGG，5．2；GY，6．4；MeトEK，10．5；Leu−EK，8．7．
−

33−

物がおのおのデッ■ドボリューム付近に観察された．

いは動物に投与したホルフェニシノールの血中モ

なお，クロマトグラムA−1のHPLC条件下では，ニターが螢光HPLCにより可能となった．しかクロマトグラム A−2 におけるジおよびトリペプ

し，ホルフェニシノールの代謝物が尿中においてチド類はすべてデッドボリューム付近に溶出され認められているので，HPLCによるそれらの分離

る．

と検出条件も調べる必要がある．
また，これらの化合物は，設定した操作によっ

また，設定したクーヒドロキシべスタチンの蛍て再現性よくホルミル化され，かつDDBによっ

光ラベル化法は，血中に微量存在するそのHPLCて蛍光体に導かれた．それらの検量線を図11に定量に適用可能と思われるが，このためには血清示す．いずれも原点を通る直線を示す．検出限界に存在する多数のフェノール性水酸基を有する化

は，刃Ⅳ＝2 において，クーヒドロキシべスタチソ

合物からの妨害を除去することが肝要であり，血では4．Opmol（1．3ng）／HPLC注入量であり，他清の前処理およびHPLCのペプチド類は4〜10pmol／HPLC注入量であっ分検討する必要がある．

の分離条件について充た．本法によるクーヒドロキシべスタチソ標品の検出感度は，先に提出した過ヨウ素酸酸化による
DDBの螢光誘導体化法のそれよりも1／10ほど劣る．この主な原因は，クーヒドロキシべスタチソのホルミル化生成が完全でないことによる（収率：約10％）．今後，さらにこのホルミル化条件を検討し，その収率を高める予定である．

文献1）大倉洋南，甲斐雅亮，三浦哲朗．微生物の二次代謝物に由来する難病治療薬の開発研究．昭和55
年度報告書，p．25（1980）．
2）大倉洋甫，石田淳一，山口改段，弓場郁代．微生
物の二次代謝物に由来する難病治療薬の開発研究．昭和57年度報告書，p．21（1983），
3）Ishida，J．，Yamaguchi，M．，Kai，M．，and Ohku−
ra，Y．J．Cんromαfogr．，305，381−389（1984）．
4）Wynberg，H．C九g桝．凡作．，60，169−184（1960）．

お

あ

り

に

本研究において，筋ジストロフィー症患者ある−34−

筋ジストロフィーマウスの筋肉代謝網に対する低分子酵素阻害物質の影響

青 柳 高 明＊
研究協力者

和田孝雄＊・小島蕗子＊・永井真知子＊・原田滋子＊

再度比較検討したので，その結果について述べる．
は

じ

め

に

実

験

方

法

筋ジストロフィー症の発症および進展のメカニズムとして，蛋白分解酵素の異常による筋蛋白崩筋ジストロフィーマウス

壊が重要な役割を演じているという考え方がかな

3適齢（堆）の筋ジストロフィーマウス（C57

り一般的になっている．筆者らは，正常および筋

BL／6J，dy／dy）は実験動物中央研究所より購入

ジストロフィー症のニワトリ，マウス，およびハした・動物は酵素阻害物質の最終投与時の3時間

ムスターなどの筋肉を含む各種臓器内の酵素活性後に屠殺し，直ちに前肢筋，後肢筋，心，脾，肝，の変動を経時的に調べた結果，従来注目されていおよび腎を摘出し，一70℃で保存した．臓器は，たエソドべプチダーゼの異常のみでなく，アミノ10倍量のphosphatebufferedsaline（PBS，pH

ペプチダーゼ，グリコシダーゼ，ホスファクーゼ，7．2）の中で，組織ホモジェナイザー（ultra−tur−ェステラーゼなどの広範囲な酵素活性の異常が関rax）を用いて1分間ホモジェナイズした．酵素活

与していることを明らかにした＝）．この知見を性の測定には，組織ホモジェネートの3，000×タ，基にして，各種の低分子酵素阻害物質を筋ジスト

20分間の遠心上清を用いた．

ロフィーマウスの治療に導入する試みがなされ，ベスタチソ，ホルフェニシノールなどにおいて，酵素阻害物質

その有効性が示唆されている一・5）．正常および病態

ホルフェニシン8）（500〝g／日），ロイべプチソ9）

モデル動物における酵素網の変動を経時的に調べ，（500／唱／日），べスタチソ10）（200〝g／日），およびまた酵素阻害物質の投与により誘起される代謝網

ホルフェニシノール7）（500／堵／日）は生理食塩水の変動を追究することは，ホメオスタシス機構を（0・2mg）に溶かし，毎日1回，腹腔内に8日間連明らかにするとともに，各種疾病の治療への応用日投与した．対照群には，生理食塩水（0．2mg）をを可能にするものと考える○）．

同様に投与した．阻害物質の構造は図1に示す．

本報告では，すでに報告したロイペプチソ，べスタチソ，ホルフェニシノールを筋ジストロフィ

基ーマウスに投与したとき誘起される酵素網の変動

酵素活性測定用の基質は下記のものを用いた．

を7），さらにホルフェニシソを加えることにより

L−glutamic acidβ−naphthylamide hydrochlo・＊微生物化学研究所

質ride（Glu・NA），L−arginineβ−naPhthylamide
−

35−

NH2
CH3

CH3

C＝NH

CH−CH3

CH−CH3

CH2

CH2

NH

。H。も

（CH2）3CH3嶋CO−NH−CH−CO−NH−CH−CO−NH−CH．CHO

Leupeptln

NHZ
CH−COOH

Forphenicine

申 軍。H3
CH20H
1

cH2

1

1

H2N−CH−CH−CO．NH−CH−COOH

HOH2C

Bestatin

ミニ

CH−COOH

Forphenicinol

図l Structure oflow−mOlecular weight enzymeinhibitors．
hydrochloride（Arg・NA），L−prOlineβ−naph−

れの基質溶液および．PBSを含む反応試験管（1・5thylamide（Pro・NA），L−leucineβ一naPhthyl−

×10cm）に分注し，37℃で1時間の反応を行った．

amide（Leu・NA），L−formylmethionineβ−na−

カテプシソDとクレアチンキナーゼは前述の緩衝

Phthylamide（fMet・NA），L−Phenylalanineβ一液を用い，pH3．2 と pH9．0 の条件下で反応を

naphthylamide（Phe・NA），glycyl−L−PrOlyl−L−

行った．すべての酵素活性の測定には3本ずつのleucineβ−naPhthylamide hydrobromide，Naq

反応試験管を用い，その平均値を記載した．各酵

benzoyl−L−arginine ethylester hydrochloride

素活性の基質および測定方法は表1に記載する．

（BAEE），Na−aCetyl−L−tyrOSine ethyl ester

すなわち，7種類のアミノべプチダーゼ活性の測（ATEE），aCetyトL−alanyl−LTalanyl−L−alanine

定は，2mMβ−naphthylamide誘導体（0．25ml），

methyl ester（Ac（Ala）3・ME），hemoglobin，PBS（0．65ml），および上活分画（0．1ml，適宜希P−nitrophenyl−α−D−glucopyranoside（NP−GIc），

釈）を用いて反応を行い，すでに報告した方P−nitrophenyl−α−D−mannOPyranOSide（NP−

法川・12）で反応を止め，525nmの吸光度を測定しMan），P−nitrophenyl−N−aCetyl−β−D−glucosa・

た．セリソプロティナーゼ活性の測定は，75mll

minide（NP−GIcNAc），1−14C−Creatine，2−ni−ペプチドェステルあるいはALア七チルアミノ酸

trophenylphosphate（NPP），P−nitrophenylを基質として用い，すでに報告した方法1・11）で反acetate（NPA）．

応を止め，525nmの吸光圧を測定した．カテプ

シソD活性の測定は，0．5％ ヘモグロビン（1．0穣衝液mg，pH3．2）を基質として用い，既報の方法日1）

酵素活性測定用の緩衝液は0．02人IPBSを用いで反応を止め，280nmの吸光度を測定した．グリ

た・ただし

カテプシソDの測定には0．2人l

コシダーゼ活性の測定は，2．5m叩・Tnitrophenyl

SOdium acetate buffer（pH3．2），クレアチンキ

誘導体（0．1mg）を基質として用い，既報の方

ナーゼの測定には

法l・11・川で反応を止め，400nmの吸光度を測定しsodium glycine buffer（pH9．0）を用いた．

た．クレアチンキナーゼ活性の測定は，1mhIク
レアチン（1714C−クレアチン，50，000dpm）を基酵素活性の測定

質として用い，反応終了後Dowex50（H十）カラ組織ホモジェネートの遠心上清分画は，それぞムの通過液の放射活性を測定した7・l封．ホスファ−36−

筋ジストロフィーマウスの筋肉代謝網に対する低分子酵素阻害物質の影響
表l List of the enzymes measured and their substrates
EnzymeAbbreviation

Substrate

α−D−Mannosidase（EC3．2．1．24）

Mannosidase

NP−Manβ−N−aCetyl−D，glucosaminidase（EC3・2・1・30）

GIcNAc−aSe

NP−GIcNAc

Creatine kinase（EC2．7．3．2）

CK

1−14CLCreatine

Alkaline phosphatase（EC3．1．3．1）

Phosphatase
Esterase

NPP

Phe・NA

4
1
4
1

1

1
1

7

5
1

1

1
1

4
1

1

1
1

4
1

NPA

l

Arylesterase（EC3．1．1．2）

1
1
1
1

Hemoglobin
NP−GIcl

Glucosidase31α−I）−Glucosidase（EC3．2．1．20）

lCathepsin D

1
1

Ac（Ala）3・ME

Carboxyl proteinase（EC3．4．23．5）

l

ATEE

Elastase−Jike1
1

Chy−try−likeSerine Proteinase（EC3．4．21）

lSerine proteinase（EC3．4．21）

1
1

GIy・Pro・Leu・NA
BAEElTrypsin−like11Serine proteinase（EC3．4．21）lGly−Pro−Leu−AP11Tripeptide aminopeptidase（EC3．4．11．4）

lPhe−AP

2
1

fMet・NA

Phenylalanine aminopeptidasel

Leu・NA

fMeトAP

1
1

Leu−AP

Formylmethionine aminopeptidasel

Leucine aminopeptidase（EC3．4．11．1）

1
1

Arg・NA
Pro・NAlPro−AP

1
1

Proline aminopeptidasel

Glu・NA

AP−B

1
1

AP−A

Arginine aminopeptidase（EC3．4．11．6）

lAspartate aminopeptidase（EC3．4．11．7）

Reference forassay method

クーゼならびにエステラーゼ活性の測定は，15し，表1に記載した17種類の酵素活性について，

mlIP−nitrophenyl誘導体を基質として用い，既その変動を検討した．

報の方法Itll・14）で反応を止め，400nmの吸光度を測定した．

表2は，前肢筋における酵素網の動態を示す．
Pイペプチソ投与群ではfMet−AP，Chy−try−like，Cathepsin Dなどの活性が有意に増加する傾向を蛋白の測定示したが，AP−A，Leu−AP，phosphatase，eSter・

標準蛋白として，ウシ血清アルブミンを用い，ase などの活性は，有意に低下する傾向にあるこ

LolVry法相で測定した．

とが認められた．べスタチソ投与群ではfMet−
AP活性のみ増加したが，AP−A，Leu−AP，

統 計17）

Phe−AP，tryPSin−1ike，glucosidase，Creatine

各酵素活性の変化を，対照を基準としてStu・kinase，phosphatase，eSteraSeなどの活性が有意

dentのt値で表し，そのプラス値の大きいものに低下する傾向にあることが認められた．また，からマイナス値の大きいものへと順位づけし，そホルフェニシノール投与群では，fMet−AP 活性の順位についての相関をSpearman

のみ増加したのに対し，AP−A，Leu−AP，tryp−の順位相関係数（rs）として表した．

sin−like，Chy−try−like，glucosidase，GIcNAc−
ase，phosphatase，eSteraSeなどの多くの酵素活結果および考察

性が有意に低下する傾向にあることが認められた．
さらに，ホルフェニシン投与群では，AP−A，筋ジストロフィーマウスに前述の4種類の阻害

Leu−AP，Phe−AP，trypSin−like，ChyLtry−1ike，物質を連日（1日1回）投与し，8日後に屠殺しCathepsin D，glucosidase，GIcNAc−aSe，phos・

たのち，前肢筋，後肢筋，心，脾，肝，腎を摘出phatase，eSteraSeなどの多くの酵素活性が有意−37−

表2 Changesin enzymaticactivity offorelimb muscle of dystrophic miceinduced bylow−mOlecular−Weightinhibitors
Specific activity±S．D．（N＝5）

EnzymeNone（N＝10）

Leupeptln

AP−A

1．63± 0．22

0．60＊＊

AP−B

10．45±1．53

Pro−AP
Leu−AP

0．95±

Bestatin

1．26±

ForphenicinoI

0．22＊＊

1．28±

0．06＊＊

8．39：± 2．29（＊）

9．22±1．14

9．08＝±1．42

2．65±1．25

2．42±

1．45± 0．43（＊）

2．54±

8．96± 0．93

5．68± 3．45＊

7．67± 0．74＊

7．58± 0．12＊

0．49

3．67±1．18

0．85

4．03± 0．36

6．34±1．41＊＊＊5．17± 0．67＊＊＊4．60± 0．07＊＊

Phe−AP

14．23±1．31

10．87± 5．32（＊）

10．93± 2．31＊＊

13．59± 0．58

0．94±

0．97± 0．18（＊）

1．03± 0．15

1．16二と

0．18

0．48

1．24± 0．31＊
10．04±1．36

fMet−AP

Gly−Pro−LeuLAP

Forphenicine

6．65±1．49＊＊

4．42± 0．80
10．54±

2．25＊＊

1．19± 0．26

Trypsin−like

72．79± 8．72

102．07±47．93（＊）

54．42±21．40＊

55．11±13．43＊＊

43．09±16．95＊＊＊

Chy−try−like
Elastase−like

74．98±14．62

134．26±25．32＊＊＊

63．53±23．28

90．06± 5．96＊

48．01±19．05＊事

49．00± 7．51

48．74±18．50

45．76±18．82

54．11±

7．22

Cathepsin D
Glucosidase

0．0069±0．0007

0．0085±0．0009＊＊

0．0071±0．0009

0．0066±0．00100．71± 0．24

0．74± 0．16

0．40二と

0．04＊

0．43± 0．0＊

0．34±

Mannosidase

0．17± 0．15

0．31± 0．28

0．14±

0．03

0．19± 0．05

0．14± 0．01

GIcNAc−aSe
Creatine kinase

1．75± 0．55

2．22：±1．07

22．51± 4．76

19．75±10．43

4．34± 0．92

Phosphatase

131，56±45．58

Esterase1．22± 0．25（＊）
16．05±

0．14＊

19．27± 3．48

2．74＊

1．46± 0．20＊＊＊1．67±1．23＊＊＊67．62±16．80＊

1．13±

45．36±15．29

62．57± 2．85＊＊

0．0048±0．0017＊＊

0．61±

0．07＊＊

0．27＊＊＊

18．01± 2．85（＊）

1．42±

0．19＊＊＊

57．31±

4．81＊＊

2．40二と0．29＊＊＊

43．77±12．97＊＊（＊），♪＜0・1；＊，♪＜0・05；榊，♪＜0．01；＊＊＊，♪＜0．001．

表3

Changesin Enzymaticactivity of hindlimb muscle oE dystrophicmiceinducedbylow−mOlecular−Weightinhibitors
Speci丘c activity±S．D．（N＝5）

EnzymeNone（N＝10）

Leupeptln

Bestatin

ForphenicinoI

Forphenicine

AP−A

1．60± 0．23

1．44± 0．22

1．54：± 0．09

1．28± 0．38（＊）

1．36± 0．48

AP−B

10．07±1．35

9．60±1．55

10．78± 0．56

9．76± 0．66

8．35±1．06＊

Pro−AP

3．63± 0．78

3．14± 0．84

3．48± 0．22

4．22± 0．56

3．99± 0．44

Leu−AP

4．56± 0．37

6．46± 0．20＊＊＊7．12±

0．37＊＊＊

6．15±1．49＊＊

5．93土1．44＊

fMeトAP

3．60± 0．31

4．87± 0．88＊＊

4．70：±

0．27＊＊＊

5．24±1．40＊＊■3．82± 0．83

Phe−AP

13．41± 2．12

11．36± 0．78（＊）

12．11± 0．70

11．86±1．24

Gly−Pro−Leu−AP

1．28± 0．17

1．38±

0．11

1．32± 0．09

1．15± 0．15

1．08± 0．25け）

Trypsin−like

36．40±10．94

52．35± 8．58＊

38．05± 5．01

33．81±12．51

22．51±

4．33＊

Chyrtryrlike

40．17± 8．53

50．92±14．82（■）

40．90± 6．09

51．95：±12．75（＊）

25．21±

4．03＊＊

Elastase−1ike

29．68± 4．94

36．06±14．86

34．20± 3．64（＊）

31．55＝±26．00± 6．00

Cathepsin D O・0042±0・0005

0・0056±0・0005＊＊＊0．0047±0．0006

5．29

0．0043±0．0009

9．38± 2．69＊＊

0．0034±0．0011（＊）

Glucosidase

0．49：± 0．08

0．52士 0．09

0．52± 0，03

0．45士 0．09

0．37± 0．15（＊）

Mannosidase

0．21＝ヒ 0．05

0．21± 0．02

0．23± 0．02

0．18± 0．03

0．19± 0．04

GIcNAc−aSe

0．86± 0．15

1．20±

0．98± 0．19

0．96± 0．09

Creatine kinase

35．68± 4．56

32．88± 4．69

34．83±1．7835．33±10．41

Phosphatase1．90± 0．79

1．43± 0．50

1．71± 0．26

1．44± 0．63

Esterase

46．42± 7．50

49．95± 5．95

49．11± 6．36

50．71± 9．04

0．19＊＊（＊），♪＜0．1；＊，♪＜0．05；＊＊，♪＜0．01；＊＊＊，♪＜0．001．

−38−

0．71± 0．26
25．71±

2．43＊＊＊

2．71± 0．51（＊）
34．65±

9．29＊

筋ジストロフィーマウスの筋肉代謝網に対する低分子酵素阻害物質の影響に低下する傾向にあるのヰこ対−LU酵素活性が増加

ペプチソー投与群では，ProTAP，▲Phe−AP，Gly−する酵素は認められなかった．上記の阻害物質のPro−Leu−AP，Cathepsin D，phosphatase

うち，ホルフェニシン投与群が最も強く酵素網にの活性が増加したが，trypSin−like 活性のみ有意変動を与えることが認められた．

に低下する傾向にあることが認められた．べスタなど

表3は，後肢筋における酵素網の動態を示す．

チソ投与群では，AP−B，Pro−AP，Leu−AP，

ロイペプチソ投与群では Leu−AP，fMeトAP，

Phe−AP，Gly−Pro−Leu−APなどの活性が増加すtrypsin−like，Cathepsin D，GIcNAc−aSeなどのることが認められたが，trypSin−likeおよびchy−

活性が有意に増加する傾向にあることが認められ

try−likeの活性は有意に低下した．また，ホルフ

たが，活性低下を示す酵素は認められなかった．

ェニシノール投与群では，Pro−AP，Leu−AP，また，べスタチソおよびホルフェこシノール投与

PheTAP，

群ではLeu−APおよびfMetTAP活性が有意に

esteraseなどの活性が増加することが認められた増加したが，その他の酵素活性については有意なのに対し，trypSin−1ike，Chy−try−like，glucosi−

変動が認められなかった．一方，ホルフェニシン

dase，mannOSidaseなどの活性が有意に低下した．

投与群では，AP−B，Phe−AP，trypSin」ike，Chy−

さらに，ホルフェニシン投与群では，Phe−AP，try−like，Creatinekinase，eSteraSeなどの活性がGly−Pro−LeuTAP，phosphatase，eSteraSeなどの低下するのに対し，Leu−AP 活性のみ有意に増活性が増加するのに対し，AP−B，glucosidase，

加することが認められた．後肢筋においてもホル

mannosidaseなどの活性が有意に低下する傾向

フェニシソ投与群が酵素網に強い変動を与えるこを示した．

とが認められた．

Gly−Pro−LeuTAP，

phosphatase，

表2〜表4で明らかなことは，これらの阻害物

表4は，脾における酵素網の動態を示す．ロイ質を投与することにより誘起された各臓器内の酵

表4 Changesin enzymatic activity of spleen of dystrophicmiceinduced bylow−mOlecular−Weightinhibitors
Speci丘c activity±S．D．（N＝5）

EnzymeNone（N＝10）

Leupeptln

AP−A

0．52± 0．18

0．43± 0．05

AP−B

16．74± 1．15

15．78±

Pro−AP

1．47± 0．04

1．60± 0．15＊

2．60

Bestatin

ForphenicinoI

0．35± 0．03（＊）

0．50± 0．09

18．40±1．35＊

15．69± 2．07

1．65±

0．17＊＊

5．94±

0．63＊＊

10．85±

0．75

Forphenicine

1．79±

0．27＊＊

7．13±

1．03＊＊＊

Leu−AP

4．38± 0．98

5．11± 1．48

fMeトAP

11．94± 2．13

12．96±

Plle−AP

4．29：± 0．12

5．73±

1．10＊＊＊

4．70± 0．46＊

5．77±

0．12＊＊＊

Gly−Pro−Leu−AP

0．55士 0．01

1．03＝ヒ0．35＊＊＊

0．68± 0．05＊＊＊

0．87±

0．09＊＊＊

Trypsin−1ike

231．33± 52．17

160．73±Chy−try−like351．13土113．35

Elastase−1ike
Cathepsin D
Glucosidase

0．0303土0．0129

2．970．64± 0．16
12．53：±

3．58＊＊

1．48± 0．40
5．02± 0．82
11．51± 0．92

10．86± 1．29

5．47±1．00＊＊
0．94±

0．41＊＊

170．03±30．56＊

175．03±10．93＊

299．83土119．69

198．37土27．66＊

209．97土120．64＊ 248．64土68．27（＊）

147．43土 97．42 126．57土 55．77

103．60土31．54

134．92土13．84

195．18土64．61

0．0476土0．0174

0．0366土0．0129

0．0293土0．0202

73．59＊

0．0384土0．0134＊

1．05土

0．32

0．76土

0．34

0．85土

Mannosidase

0．74土

0．30

0．49土

0．34

0．48± 0．12（＊）

GIcNAc−aSe

9．11±

9．81

3．43±

1．16

3．92±

0．96

2．27±

Phosphatase
Esterase

1．94± 0．32

2．02±

0．33

2．54±

2．43± 0．48＊

15．27± 1．10 16．52± 1．27（＊）

0．19

16．50±1．02（＊）（＊），♪＜0．1；書，♪＜0．05；＊＊，♪＜0・01；＊＊事，♪＜0・001・

−39−

0．15土

0．16＊＊＊

0．0 ± 0．0＊＊＊

34．66±

179．99土39．37（＊）

0．69土

0．05＊

0．10± 0．14＊＊＊

0．13

2．04±

0．22

0．95＊

2．67±

0．45＊＊

2．05＊＊＊

24．33±

3．77＊＊＊

表5

Correlations among enzymatic changesinduced bylow一mOlecular−Weightinhibitors
X

Forphenicine

Leupeptln

Bestatin

Organsy Leupeptln Bestatin For−nOI Bestatin ForrnoI For−nOl
Forelimb O．69＊

0．94＊＊

0．92＊＊

0．86＊＊

0．88＊＊

Hindlimb O．75＊＊

0．84＊＊

0．86＊＊

0．96＊＊

0．94＊＊

Spleen O．92＊＊

0．89＊＊

0．08

0．95＊＊

0．97＊＊
0．98＊＊

−0．13

−0．15

＊，♪＜0．05；＊事，♪＜0．01．

For−nOl：forphenicinol．

素活性の変動が，これらの阻害物質のi乃 びわro一方，脾臓における相関性は，ホルフェニシン，における阻害活性とは無関係に，さまざまの酵素

ロイペプチソ，べスタチソの間に高い類似性が認活性に影響を与えていることである．これらの結められるのに対し，ホルフェニシノールのみが他果から，少なくとも上記4種の阻害物質による酵の阻害物質の作用とまったく異なっていることが素活性の変動には何らかの類似性があることが推認められた．脾臓の酵素網にホルフェニシノール

察される．それゆえ，阻害物質の投与により誘起のみ異なった作用を与えたことは，きわめて興味された各臓器内の酵素活性の変化を対照群と比較あることと考えられる．

し，Studentのt値を算出した．t値は対照群からの変化の程度を表すものであるから，その変化

ま

と

め

の程度に順位をつけることにより，酵素変化のパターンを表すことが可能である．このようにして筋ジストロフィーマウスに対する低分子酵素阻得た順位表を各阻害物質間で比較し，相互の相関

害物質の治療効果を調べる目的で，阻害物質投与の程度を順位相関係数（r8）を求めることによりにより誘起される筋肉を含む臓器内の酵素網の動検討した．

態を検討した．ロイペプチソ，べスタチソ，ホル

表5は，阻害物質投与により誘起された各臓器

フェニシノール，およびホルフェニシソは筋ジス

内の酵素網変化の相関性を示す．前肢筋におけるトロフィーマウスの筋肉内の酵素網に有意な変動

各阻害物質の相関性は，全般的にかなり類似してを与えることを明らかにした．7乃わけ0で異なる

いる．ホルフェニシンはベスタチソおよびホルフ阻害活性を示す阻害物質の投与により起る酵素網ェニシノールと，またロイペプチソはべスタチソの変動は，前肢筋および後肢筋において高い類似およびホルフェニシノールと，さらにベスタチソ性を示した．ホルフェニシンはロイペプチソ，ベはホルフェニシノールとの間に，高い類似性が認

スタチソ，ホルフェニシノールと同様に，筋ジスめられた．しかし，ホルフェニシンとロイペプチ

トロフィーマウスの治療に有効であることを示唆

ソの作用は，前肢筋において多少異なった傾向にした．

あることが示唆された．

一方，脾の酵素網に対しては，ホル7ェニシノ

後肢筋における相関性はロイべプチソ，ベスタ

ールのみが他の阻害物質の作用と異なることを認

チソ，ホルフェニシノールの間に高い類似性が認めた．ホルフェニシノールは，免疫応答細胞に対められたが，ホルフェニシンの作用は少し異なる

し，他の阻害物質とは異なる影響を与えるものとように思われる．しかし，前肢見方および後肢筋を考えられる．

総合的に観察するとき，上記4種の阻害物質の作用はきわめて類似性が高いといえる．
ー40−

筋ジストロフィーマウスの筋肉代謝網に対する低分子酵素阻害物質の影響
文9）Aoyagi，T．，Miyata，S．，Nambo，M・，Kojima，F．，Matsuzaki．M．，Ishizuka，M・，Takeuchi・T・，
and Umezawa，H．J．A771ibi0．，22，558r568

献1）Aoyagi，T．，Wada，T．，Kojima，F・，Nagai，Mand Umezawa，H．J．Clin．777VeSt．，67，517（1969）．

10）Umezawa，H．，Aoyagi，T．，Suda，H・，Hamada，M．，and Takeuchi，T．J．Aniibiot・，29，97−

59（1981）・
2）Wada，T．，Kojima，F．，Nagai，M・，Aoyagi，Tand Umezawa，H．J．Pharm．Lわn．，4，184−
190（1981）・

99（1976）・
11）Aoyagi，TF

βoc最花．βJoクんプ∫．

Nagai，M．，andUmezawa，H・J・Pharm・

βッ机，7，312−321（1984）・
4）Matsushita，H．InStudyontheClinicalAp−
plicationsofSecondaryMetabolitesfrom Mi−
crobes（Annual Report of Muscular Dystro−
phy Committee，SuppOrtedby Ministry of
Health and Welfare），pp．45−50（1980）（in

Suda，H．，Nagai，MOgawa，K・，

Suzuki，J．，Takeuchi，T．，and Umezawa，H・3）Aoyagi，T．，Wada，T．，Yamamoto，K・，Kojima・

Acfd，452，131−143（1976）．
12）Suda，H．，Yamarnoto，KAoyagi，T・，andUme−zawa，H．βわr最仇．βわ♪んッ∫．Acfd，616，60−
67（1980）．

13）Aoyagi，T．，Kunimoto，S．，Morishima，H・，Ta−keuchi，T

and

Umezawa，H．J．AntibIot・，

24，687−694（1971）．

Japanese）．

5）Matsushita，H．InStudyontheClinicalAp・
plicationsofSecondaryMetabolitesfromMi−
crobes（Annual Report of MllSCular Dystro−
phy Committee，SuppOrted by Ministry of
Health and Welfare），pp．51−57（1982）（inJapanese）．

6）青柳高明．自然，10月号，39−47（1983）・
7）Aoyagi，T．，Wada，T・，Iwabuchi，M・，Kojima・F．，Nagai，M．．and Umezawa，H・Biochem・J〃f．，5，97−103（1982）・

8）Aoyagi，T．，Yamamoto，T・，Kojiri，K・，Kojima，F．，Hamada，M．，Takeuchi．T．，and Umezawa，
H．J．A〃f路oJ．，31，244−246（1978）．

ー14）Aoyagi，T．，Nagai，M．，Iwabuchi，M・，Liaw，W・S．，Andoh，T．．and Umezawa，H・Cancer
Rg∫リ38，3505−3508（1978）・

15）Aoyagi，T．，Wada，T．，Kojima，F・，Nagai，M・，
Miyoshino．S・，andUmezawa，H・Cli77・Chim・
Acfd，129，165−173（1983）・
16）Lowry，0．H．，Rosebrough，N・J・，Farr，A・L，
andRandall．R．J．J．Biol．Cheln

193，265−275（1951）．

17）Steel，R．G．D．and Torrie，J・IJ・Principles
and Procedures of Statistics，McGraw−Hill
Book Co．，Inc．，New York（1960）・

41−

EAEモルモットに対するロイペプチンの効果

岩 崎 祐 三＊研究協力者

山本悌司＊・今野秀彦＊

実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）は，中枢イペプチソ25mg／kgを腹腔内に投与したもの，

神経の白票あるいは髄鞘塩基性蛋白（MBP）で感第2群（15匹）は感作後1週間目より同様にロイ作された動物に生じる中枢神経系の疾患で，ヒトペプチソを投与したもの，第3群（15匹）は発症の多発性硬化症の一疾患モデルとして研究されてした日からロイべプチソを投与したもの，第4群いる．このEAEにみられる脱髄現像のメカニズ（7匹）はロイペプチソの投与を行わなかったもムについては種々論議されているが，Cammer2）のとし，いずれも体重の測定と臨床的な観察を続は，免疫反応によって活性化されたmacrophage

け，生存したものすべて21日目に4％パラフォ

がplasminogenactivatorを含むneutralprotein・

ルム＋0．5％グルタール液にて港流固定を行った・

asesを分泌し，これが髄鞘の崩壊を起すと述べ

臨床症状の判定は，0，まったく異常のみられなている．もしこのneutralproteinase，とくにい状態；1，体重減少とともに自発運動が少なく

macrophageが分泌するplasminogen activatorなった状態；2，後肢の運動麻痺と排便障害のみ

によってplasminogenから合成されるplasmin

られた状態；3，著しい後肢麻痺のためほとんどが脱髄疾患の臨床徴侯や病理像をひき起すのに重動けなくなった状態；4，死亡；と5段階に分け

要な役割を済ずるとするならば，この酵素の抵抗て行った．連日記録されたこれらのSCOreの中で剤であるロイべプチソの投与によってEAEの発最も高い値を，その例の臨床的重症度とした・な

病を防ぐことができるのではないかと考えられる

お，病気の進行のため，途中で濯流固定を行ったのである．

ものも死亡として扱った．

このような考えに基づいて，EAEモルモット

各モルモットより採取した脳，脊髄から下垂体に対するロイペプチソの効果をみる目的から，以茎を通る部分，延髄上端，頸膨大部，胸髄のほぼ下の実験を行った．

中央部および腰膨大部の5個所を切り出し，H・E
染色標本を作製した（図3）．それぞれの組織学
方的な変化の強さを次のように6段階に分けて識別法した（図4）．0，まったく異常のみられないも
220〜420gの成熟したモルモットに，FCAをの；1，クモ膜下脛へのわずかな細胞浸潤がみら加えた脊髄ホモジェネート0・1mgを背部の皮内れたもの；2，1と3の中間のもの；3，クモ膜下に接種して感作した．このモルモットを4群に分腔の細胞浸潤に加え実質内の血管周囲への細胞浸け，第1群（15匹）は感作前日より1日2回，ロ潤がみられたもの；4，3と5の中間のもの；5，
これらの所見が広汎にしかも高圧にみられ，実質＊東北大学医学部脳疾患研究施設
ー43−

の崩壊が著しいもの．これらのgradingをscore

把捉できなかった症例でも，その組織像をみるととし，5枚の標本の結果を加算し各モルモットの組織的重症度とした．夜間死亡により試料の採取

明らかに細胞浸潤が認められた例もあり，組織像に基づいた発症率のほうが高率であった．しかし，ができなかったのは，第1群の1例のみである．

いずれの発症率においても各群の間に有意差は確効果判定に用いた項目は，臨床像からみた発病認されなかった．

率，組織像からみた発病率，発症日，臨床的重症度，組織的重症度，組織所見および体重の推移な

発

どである．

症状の発現がみられた日を示す．発症前にロイ症

日

べプチソの投与を受けなかった第3・4群では

結果（表1，図1，図2）

15．4±3．4 日，これに対して第2群では約1日，第1群では約2日遅れて発症する結果となり，統発症

計的に有意差は認められないが，ロイペプチソ投率

臨床的には，第3・4群に比して第1・2群の与群では発症の遅れる傾向が示された．

ものでやや低値の傾向がみられたが，症状発現が表l The effect ofleupeptin on the EAE guinea pig
Incidence Clinical onset

Clinical HistoIQgicalGroupl ll／15

14／14

73．3％
Group2

Group3
Group4

10／15

Clinicalscore Pathologicalscore（day）

17．4±3．6

1．5±1．3

13．4±4．8

16．9±4．1

1．5±1．4

11．8±6．0

15．0±3．3

2．0±1．2

12．6±4．8

16．1±3．5

2．1±1．3

13．6±4．7

100％
14／15

66．7％

93．3％

13／15

14／15

86．7％

93．3％

6／7

7／7

85．7％

100％

l毒茎一ゝ占−0訳
5

10

15

20

Experimentalday

図1The mean weight for each groupis expressed as percentof the mean weight of the respective group at Day1．
−

44−

EAEモルモットに対するロイペプチンの効果

日

15

20

Experimentalday

図2 Percentileloss of BW relative tothe maximum BW gain（100％）in
each experimental group・

図3

The丘ve transverse sectionsofthe brain
and spinalcord from which the path0−

臨床的重症度

10gical gradings were made・The sec−
tions are through theopticchiasma，the

有意差検定では明らかな違いはないものの，平upper medulla and the spinal cord（thecervical andlumbarintumescence，the

均値だけについてみるならば，発症以前からロイ

mid−thoraciclevel）．

ベプチンの投与を受けた第1・2群ではいずれも1．5であるのに対し，第3群では2・0，第4群でのものは細胞浸潤がクモ膜下脛や血管周囲にほぼは2．1と重症度を増していた．また，罷病期間を限局し，その細胞の種類もほとんどがmononu−

考慮した臨床的重症度の適当な判定方法は見あた

clear cell であるのに対し，その他の群ではこのらないが，全体的には第3・4群に対し第1・2

血管周囲の病変からさらにこれを中心に実質内へ

群で羅病期間がやや良い印象を受けた・浸潤する細胞がみられ，この中には分葉核をもつ
顆粒球が目立った（図5）．また，クモ膜下腹の中

組織的重症度にもこのような細胞が認められ細胞浸潤の程度あるいはその広がりなどについ群に明瞭であった．

とくに第1・2ての検討であるが，第2・3群でやや低値がみられたものの，有意の差は得られなかった・一方

体重の推移

各群で，発症日および臨床的重症度のほぼ同様の

感作当日の体重を100とし，その後の変化を割例で病変の性格について比較を行った・その結果，合で示したものが図1である．第3群と第4群と発症して3〜4日日に得られた標本では各群ともはほぼ同様の経過がみられた．それぞれ11日目，

目立った違いは認められないものの，SaCri丘ceま

12日目まで急激な体重増加を示すが，その後，約でに9〜11日間の経過を示したものでは，第4群5日の間に著しい減少patternがみられ，緩やか

−

45

−

・上組．

古グ町⁚⁝

〆．．㌻宰

図4
Example of thepathologies ofvarry−ing severity，With
which the grading

wasdetermined．A：
Gradel，in which
only slight cellular

in別trationsinto the
leptomeninges wereobserved，Whilc noparenchymatousle−
sions wereidenti丘ed．
B：Grade3，the ce1−
1ularin負ltrationsin−
cluded parenchyma−
tousperivascularreg−ions．C：Grade5，inwhich the parenchy−
mal tissues were ex−tensiveLy invoIved
withcellularinfiltra−tion as well as tissue
C destruction．

EAEモルモットに対するロイベプチソの効果

as the parenchymatous tissue remotefrom the blood vessels・The
inLiltratingcellsidenti丘edincludeneutrophile，rOundcells，andmi一

croglia．This case was given

leupeptin prlOr tO administration of

from Group4 casesin which thepathologicalprocesses appeared toinvoIve only perivascular areas at
this stage．

antigen（Groupl）and differs

な増加傾向へと移行していた．第2群の体重推移効果という面からこれらの結果をみると，発症率

は，感作後1週日まで第3・4群とほぼ同様に増については，臨床的にはロイペプチソの投与を行加しているが，次の2日間に軽度ながら減少の時わなかった群でやや高いように思われた．組織像期があり，再び増加へと向かうものの，12日目をからみると，いずれも高率に病変がみられ，ロイ

境に緩やかな減少傾向がみられた．これらに対しペプチソ投与群と非投与群との間に差は認められて，第1群では，体重増加の割合は少ないものの，なかった．また，臨床的重症度や組織的重症度に

このピークに達する時期が11日［‖：やや遅くなおいても明瞭な違いはみられなかった・しかし，っており，その後の体重減少は軽度で緩やかなも今回試みたいくつかの検討項目の中で，結果に差のであった．

がみられたものがある．その1つに発症日の違い

次に．体重減少の割合を明らかにする目的から，があげられる．つまり，あらかじめロイペプチン

ピーク時期の体重を100とし，その後の減少を表の投与を受けていた第1・2群では，非投与群よしたものが図2である．第4群は急激に著い、体り発症が遅れたことである．このことは，ある程重減少をきたすのに対して，第2群は徐々に，し度客観的に動物の状態を示す体重の変動によってかも減少の割合は軽いものであった・第1群は急裏づけられているように思われる・必ずしも症状激な減少を示すものの，減少の割合は少なかった・出現の時期と体重減少の時期とは一致していない

第3群では，第4群とほほ同様の傾向がみられた・が，緩やかな体重減少を示した第2群を除けば，臨床的な発症時期の違いがそのまま体重減少の始考まる時期の違いに移行しているように思えるので

案ある．このようなことから，ロイペプチソにEAEの発症時期を遅らせる効果があるとは断定できな

ロイペプチソのEAEに対する予防および治療
−

47

−

いにしても，何らかの影響を与えることが推測さ

まだその病変の中に存在することを意味するもの

れる．

であり，ロイペプチソを投与しなかった群と比較

次に，ピーク後に続く体重減少の経過についてすると病変の吸収が遅延していることを示すもの

みると，第3・4群に比較して，第1・2群つまと思われる．この原因については，たとえば組織り症状出現より以前からロイペプチソを投与した崩壊が政しかったために吸収作業が遅れているの群では，体重減少の割合が小さく，しかもそれがか，あるいは清掃機能の低下によるものなのかな

遷延する憤向にあるということである．ピークにど，種々のことが考えられるし，また，そこにロ達した体重を100 とし，その後の減少を割合でイペプチソがどのように関与しているのかなどに示すこの方法は，1980年にBrosnanl）が種々のついても，興味のもたれる点であろう．

proteinaseinhibitorのEAE

ラットに対する効

ロイペプチソのEAE動物に対する治療効果に果を判定するのに用いたものと同じ方法である．

ついては，1980年にBrosnanらl）が実験を行っこれによると，第1・2群の経過はロイペプチソており，効果はなかったとしている．今回の実験の有効性を示すものと判断されることになる．しでは，投与方法あるいは判定方法などさらに工夫

かし，感作当初からの体重増加の推移をみると，されなければならない点がいくつかあるが，これ第1・2群と第3・4群との間に明らかな差がみらの結果について全体的にみると，EAEの発症

られ，ロイペプチソの投与が体重の増加に何らのおよび経過に対し何らかの影響は示唆されるもの影響も与えないとする田中ら4）の報告と異なるもの，治療効果の点からするならば有効性は認めがのであることから，この体重の変動についてはロ

たいように思われる．

イペプチソ以外の要田の影響，たとえは1日に2回の注射の動物に与えるストレスなどについても文考慮されなければならず，一概に有効と判断する

献1）Brosnan，C．F．，Cammer，W

Norton，W．T．，and

Bloom，B・R・，Proteinaseinhibitors suppress
the development of experimental allergic

ことはできないように思われる．
次に，病変の組織所見から，ロイペプチソを投

encephalomyelitis．Nature，285，

与した第1・2・3群では実質内への細胞浸潤が2）Cammer，W．，Bloom，B．R．，Norton，W．T．，andGordon，S・Degradation of basic proteinin
myelinbyneutralproteasessecretedbystimu−

血管周囲からさらに広い領域にまで及んでおり，この細胞の中にはmicrogliaや分乗核をもつ好中

lated macrophage：A p〇SSible mechanism

球が目立つことである．これらの細胞はEAE病

Ofin8ammatory demyelination．Proc．Natl．
A 止 5cf・U．5．A．，75，1554−1558（1978）．
3）Waksman，B．H．and Adams，R．AD．，A his−

変においてしばしばみられるものであるが，とくに好中球は急激型の病変や組織崩壊の激しい部位

tologic study of the earlylesionin experi−mental allergic encephalomyelitisin theguinea pig and rabbit．A71t．J．Pathol．，41，に出現し，崩壊産物や血管より浸出した血策成分によって招来される，EAEにとっては二次的に135−162（1962）．

4）田中寿子，溝辺満利．NK−381のマウスおよびラットにおける急性毒性とラットにおける5週間の経口亜急性毒性．実中研・前臨床，3，9−22（1977）．

出現する細胞とされている3）．この場合，横能的にはいわゆる清掃細胞と考えられるのであるが，この細胞が出現しているということは崩壊産物が−235−237（1980）．

48−

ロイペブテンの薬理学的研究

大 塚 正 徳＊研究協力者

宮田雄平＊・小西史朗＊・柳澤光彦＊・村越隆之＊

岡本

司＊・玉井

これまでの研究に引き続き，ロイべプチソおよびベスタチソの薬理作用を研究したが，今年度は

直＊・松戸隆之＊・宋時栄＊

24〜33日齢ラットを脊髄動物とし，ロイペプチ
ソの静注による効果を研究した・
4）新生ラットの摘出延髄一脊髄標本

とくに，次の5種の標本について実験を行った・

ロイペプチソは中小動物の呼吸活動に対しては

1） ウサギの血圧
昭和57年度の研究において，ロイべプチソの影響を与えないと報告されているが，運動ニュー静注により，ウサギの血圧が一過性に下降するこ

ロンに対する作用の検討のためラットにロイべプとを認め，昭和54年度の研究におけるラット血チソを静注した際，しばしば呼吸が不整になっ圧に対する効果と一致する結果を得た・この降圧た．そこで，呼吸に対する作用をより直接的に調作用の機序としては，神麓節遮断作用（昭和54，

べるため，最近当教室において鈴江により開発さ55年度報告）が考えられた．もしこの推定が正しれた新生ラットの脳幹一脊髄標本1・2）を用いて，そいとすれば，α型遮断薬の前処置により交感神経の呼吸様活動に対する影響を検討した・性の血圧上昇脚構を除いておけばロイペプチソの5）新生ラットの摘出脊髄一尾標本

降圧作用は消失するのではないかと予想され，以昨年度は，摘出脊髄に坐骨神経と腰部および下下この点について検討を行った．

肢がつながった標本を用い，皮膚侵害刺激により

2）副交感神経節に対する作用誘発される脊髄反射電位に対するェソケファリン

昭和54年度および55年度の研究において，の効果，およびロイべプチソ，べスタチソによるロイペプチソがモルモット交感神経節における伝ェソケファリソ効果の促進について報告した・そ達を遮断することを報告した・これらに引き続き，の後の研究により，下肢よりも尾をつけた標本の今年度は，副交感神経節である顎下神経節（sub−ほうが侵害反射の研究には適していることがわか

mandibular ganglion）における，コリン作動性ったので，これを用いて研究を行った．

伝達と節後神経細胞のアセチルコリン感受性に対するロイべプチソの効果を検討した．

実

験

方

法

3） ラット脊髄に対する作用
脊髄反射および脊髄運動ニューロンに対するロ

1） ウサギの血圧

イペプチソの効果は，これまで幼君ラットの摘出

体重3．0〜3．3kgの雄ウサギを用いた・ウレタ

脊髄を用いて検討を行ってきた．今年度は，J乃

ン1g／kgを耳静脈から投与して麻酔し，大腿動∫加の脊髄に対する薬理作用を検討するために，

脈および大腿静脈にポリエチレン製カテーテルを挿入した．動脈カテーテルは正トランスデューサ＊東京医科歯科大学医学部薬理学教室−

49−

一に接続して血圧の連続的モニターに用い，静脈

渉厩徴鏡で観察しながら，微小電極を刺入し，細カテーテルからは薬物を投与した．

胞内電位を記録した．舌神経を吸引電極を介して刺激して，コリン作動性fast EPSP（興奮性シナ2）ラット副交感神経節

プス後電位excitatorypostsynapticpotential）をエーテル麻酔下に，ラット（2カ月齢）から顎誘発させた．ロイペプチソはTyrode液に溶かし

下神経節を舌神経および顎下腹とともに摘出した．

て，潅流によって適用した．アセチルコリン

記録槽に神経節標本を固定し，Tyrode液（33〜（acetylcholine chloride）は30FLg／mlの濃度で緻

350C）で連続的に潅流した．神経節細胞を微分干

小ピペット（先端の直径10／jm）に充填し，神経

図1尾に圧侵害刺激（tail pinch）を与えることにより誘発される脊髄反射電位測定の実験装置．1〜3日齢ラットよりとり出した脊髄一尾標本を人工
脳背髄液港流下の液相中に固定した．右上の記鍬は尾に加える圧刺激の期
間を延ばすことにより tail pinch potentialが増大することを示している．記録下の数字は刺激期間を示す．1kg／cm之は注射器のピストンに加えた圧．記録およびtail pinchの方法は本文参照．
−50−

ロイべプチソの薬理学的研究

LGSの運動ニューロソに，2M酢酸カリウム

節細胞の近辺に圧力パルスによって適用した・を填めた抵抗15〜30Mnのガラス徴′J、電極を刺

3）ラット脊髄入し，逆行性活動電位，後退分極，静止電位，

24〜33 日齢のWistar系ラットを，ベント／；ル

LGSおよびMG

ビタール（50mg／kg，i．p．）麻酔下に，Th8〜9の神経刺激により発生する

EPSPにつき測定を行った．

の高さで脊髄を切断し，脊髄動物とした・椎骨を除去して腰部脊髄を露出し，脊髄固定装置に固定

4）摘出延髄一脊髄標本した．また，左後肢において，外側俳腹筋ヒラメ

0〜3日齢Wistar系ラットから，エーテル麻酔筋（以下LGSと略す）および内側俳腹筋（以下下に脳脊髄を摘出して四丘体レベルで除脳し，小MGと略す）の支配神経を霞出し，末梢側で切断脳も除去した．標本を人工脳脊髄液で涯流中の槽して，末端をそれぞれの白金刺激電極上に固定し内に固定し，第4ないし第5頸髄前根から吸引電た．脊髄および神経は，流動パラフィンで覆って極で細胞外記録を行った．実験によっては胸郭を乾燥を防ぎ，脊髄の呼吸性動揺を抑えるために気接続したまま摘出し，肋間筋の一部に糸をかけ，

胸し，人工呼吸を行った．ロイペプチソは経静脈

トラソスデューサーを介して運動を記録した（図的に10mg／kgを投与した・

7参照）．薬物は港流により適用した・

mmHg

Leu

Leu

Phe

W芦へr
l

l

E

図2

F

G

ウサギ血圧に対するロイペプチソの降圧作用と7ェソトラミソの影響・AおよびD：T7イペプチソ（Leu）10mg／kg静江によって起った降圧反応・BおよびF：ノルアドレナリン（Nor）4Jg／kg静注による昇圧反応・C：フェこ／トラミソ（Phe）2．5mg／kg静江の1分20秒後にロイべプチソ10mg／kg静江
したときの血圧の変化．フェソトラミソによる降圧作用がプラトーに達したの
ちにも，ロイべプチソ10mg／kgによる降圧作用は単独投与の場合と同程度に認められた．フェソトラミソ投与の11分30秒後のノルドアレナリン4〟g／kg静注による昇圧反応は対照の約1／3に抑えられていた・E：フェソト
ラミン2．5mg／kg静江によって起った降圧反応．G：フェソトラミソ2・5
mg／kg静江の4分後にロイペプチソ10mg／kg静江したときの血圧の変化・
フェソトラミソ投与の2分20秒後にノルアドレナリン4／上g／kg静江したが，明らかな昇圧反応は認められなかった．ロイべプチソ投与により，回復しかけた血圧が再び下降している．フェソトラミソ投与の13分40秒後ノルアドレナ
リン4／Jg／kg静江したが，昇圧反応は対照の約40％に抑えられていた・A〜CおよびD〜Gは，それぞれ同じ動物で得られた記録を示す・−

51−

5）摘出脊髄一尾標本

は十数秒で10〜15mmHg下降し，以後ゆっくり

1〜3 日齢ラットより脊髄と尾を連続した状態

回復して約5分でほぼもとのレベルに復帰した

でとり出し，液槽中に固定し，95％02，5％C02（図2AおよびD）．

を通気して充分飽和した人工脳脊髄液を1分間にb）ノルアドレナリン単独の作用

7mgの速度で涯流した．尾の先端から3〜4mm

ノルアドレナリン4／唱／kgの静注により収縮のところにビン㌧セットを固定し，4〜5分間隔で期圧は数秒で約30mmHg上昇し，速やかに下降

尾に約0．6〜1kg／cm2，0．08〜0．15秒の圧刺激をして1分前後でほぼ元のレベルに復した（図2B

ピンセットを介して加え，機械的侵害刺激としおよびF）．

た．tailpinchにより誘発される脊髄反射電位は，

C）7ェントラミン単独の作用

L3〜L5の前根から細胞外記録によって記録した

フェソトラミソ 2．5mg／kg の静注により収縮（図1）．メチオニン・エンケファリン，ロイペプ

期圧は1〜2分で30〜60mmHg下降し，ゆっく

チソ，およびべスタチソは人工脳脊髄液に溶解し，り回復して10分前後で元のレベルに複帰した潅流適用した．

（図2E）．ノルアドレナリンの昇圧反応は，フェソトラミソ 0．8mg／kg 投与後少なくとも4分間
実

験

結

果

はまったく消失していることを確かめた（図2G
参照）．

1） ウサギ血圧に対するロイぺプチンの効果とd）7ェントラミン前処置下でのロイぺブテン

α型遮断藁の影響の作用

定常状態の血圧を記録し，血圧に動揺のないこ

ノルアドレナリン坤g／kg静注により昇圧反とを確認したのち，以下に記すように薬物の血圧応の認められることを確認したのち（図2B，F），

に対する影響を調べた．安定状態での血圧は収縮

フェソトラミソ2．5mg／kg

期120〜140mmHg，拡張期110〜115mmHgでないし4分後にロイペプチソ10mg／kgを静注しあった．

た・ロイペプチソはフェントラミン投与により血を静注した．その1a） ロイぺプチン単独の作用圧が最小値に達し，一定あるいは回復傾向を示す

ロイペプチソ10mg／kgの静注により収縮期圧時期に投与されたが，いずれにせよ，この時期は

A

B

Control

Leupeptln
10msec100〟g／mJ

図3 顎下脱神経節のコリン作動性伝達に対するロイペプチンの効果．神経節細胞から細胞内電位記録を行った・神経を0・5H之で吸引電極を介して刺激して，コリン作動性fast EPSPを誘発した・A：正常溶液中のfast EPSPを5回重ねて記録したもの．B：ロイペプチソ10．4g／mlを含む溶液で瀧流して2〜3分後．C‥ロイぺプチンを洗い去って6〜7分後の反応．
−

52−

ロイべプチソの薬理学的研究

2）ラット副交感神経節に対するロイぺプテン

ノルアドレナリンによる昇圧反応が認められないの作用時期に相当していた．この条件下で血圧は平常血
圧より20〜40mmHg下降したレベルにあったが，ロイべプチソ（10￣lg／mJ）は，節前神経刺激でロイペプチソ10mg／kgを投与すると，血圧はさ誘発されるコリン作動性fast EPSPを抑制した・

らに8〜20mmHgの下降を示した（図2Cおよ抑制率は約50％であった（図3）．このとき，節びG）．

後ニューロンの活動電位，入力抵抗は変化しなかA

ControlR−C

図4 顎下腺神経節の節後神経細胞のアセチルコリン感受性に対するロイぺプチソの効果．記録は図3と同じように行った．アセチルコリン（30／g／mJ）を微小ピペット（先端10pm）に填め，圧力パルス（0．5kかcm2，500msec）
をピペットに加えることによって，節後ニューロソ近傍にアセチルコリソを局所適用した．A：正常液中でアセ
チルコリンにより誘発された脱分極反応．速い経過の反応に続いて，遅い脱分極性反応がわずかにみられる．
B：ロイべプチソ（101g／mJ）を泥流適用し始めて2〜
3分後．速い脱分極反応は抑制され，遅い脱分極反応は増大した．C：ロイぺプチソを洗い去って2分後．D：
ロイペプチソを洗い去って26分後．速い反応の抑制は完全に回復したが，遅い脱分極反応の増強はわずかに残
っている．
−

53−

った．

3）ラット脊髄運動ニューロンおよび脊髄反射

節後神経細胞にアセチルコリンを圧力パルスでに対するロイぺプチンの効果

適用すると，時間経過の速い脱分極と，それに続

図5は，MGの神経刺激によりLGS運動ニュ

く遅い経過の脱分極が記録された（図4A）．ロイ

ーロンに発生したEPSPの大きさをヒストグラ

ペプチソ（10￣4g／m〜）は，アセチルコリンの速い

ムにしたものである．Aがコントロール，Bがロ

脱分極を約50％程度抑制した．これに対して，

イべプチソ10mg／kg投与群を示している．それ遅い脱分梅成分はロイペプチンで著しく増強されぞれの平均値は，コントロール1．41±0．11（S．

た（図4B）．ロイペプチソを洗い去って2分後にE．M．）mV，ロイペプチソ投与後1．28±0．09mV

速い脱分極に対する抑制効果がほとんど消失したであり，有意な差を認めなかった（表1）．

時期に，増強作用は依然として認められた（図4

図6は，LGSの神経刺激によってLGS運動ニC）．6分後には増強作用もほとんど消失した（図ューロンに発生したEPSPのヒストグラムを示

4D）．

している．Aはコントロール，Bはロイペプチソ

SU〇二石＞LOSq0−O L石qE⊃Z
0

1

2

0

3

2

3

Amplitude（mV）

Ampl】tUde（mV）

図5

1

MG神経刺激によってLGS運動ニューロンに起る EPSPの大きさの分布を示すヒストグラムとロイべプチソの効果∴細胞内電極による記録，A：COntrOl．
B：ロイペプチン投与後．P＝0．05でAB両群間に有意差は認められない．

表1ロイべプチンのLGS運動ニューロ∵／の電気的特性およびEPSPに対する作用
ActionContro1potential＊l72．27±1．51（乃＝26）

Leupeptln

75・27±2・18（乃＝20）AHP＊2

EPSP＊3（MG）

2．92±0．28

1．41±0．11（れ＝4）（循＝21）

2・44±0．25

1．28±0．09（循＝7）（れ＝20）EPSP＊▲（LGS）

2．36±0．17（れ＝16）

2．44±0．22（乃＝17）

各値は平均値±S・E・M・（mV）・LGS運動ニューロンからの細胞内記録．上段の値は対照，下段の値はロイペプ
チソ10mg／kg静江後・1−teSt（P＝0・05）でいずれの値についてもロイペプチン投与群とコントロール群で有意差はみられなかった．
＊l 逆行性活動電位の振幅．
＊2 逆行性活動電位に続く後過分垣の振幅．
＊3 MG神経刺激によるEPSPの大きさ．
＊4 LGS神経刺激による EPSPの大きさ．
−

54

−

ロイべプチソの薬理学的研究
投与群を示す．平均値は，コントロール2．36±
0．17mV，ロイペプチソ投与後

そのほか，表1にみるように逆行性活動電位，2．44±0．22mV

後過分垣も含めて，ロイべプチソ投与群とコソト

で有意差を認めなかった（表1）．

ロール群を比較したが，すべてのパラメーターにのU0−1空LOSq0−O JOq∈⊃Z
0

1

2

3

4

0

5

2

3

4

5

Amp机ude（mV）

Amplitude（mV）

図6

1

LGS神経刺激によってLGS運動ニューロンに起るEPSPの大きさの分布を示すヒストグラムとロイべプチソの効果．細胞内記録．A：COntrOl・
B：ロイべプチソ投与後．ク＝0．05でAB両群問に有意差は認められな
い．

lseo

DU

100mSeC

Transducer

図7 摘出脳幹一脊髄一胸郭標本における活動．A‥上のトレースは横隔神経からの細胞外記録，下のトレースは胸郭の上向きの動きを示す．B：脊髄神経前祝（C5，上のトレース）と，反対側横隔神経（下のトレース）からの同時記録．ともに細胞外記録・C：標本および実験装
置．Phrは横隔神経．
−

55−

つき両群間に有意の差を認めなか・つた．

が毎分5．〜15回の頻度で自発的かつ規則的に観察された（図7）．この脱分極は対側の杭隔神経

4）新生ラットの摘出延髄一脊髄標本におけるから記録されるインパルス発射と同期し（図7B），

呼吸様活動に対するロイベプチンの作用

また脳幹一脊髄および胸郭の一都から成る標本で

図7Cに示すように，第4または第5頸髄前板

は胸郭の上下運動とも同期していた（図7A）．以から細胞外記録を行うと，0．2mV 程度の脱分極

下，この自発的な頸髄前板脱分極の頻度を呼吸様

Leupeptin rOO FLg／m／

Leupeptin 川OJJg／mJ

LeupeptinJOO FLg／ml＋atropinel0JLM」0・ZmV

図8 呼吸様リズムに対するロイべプチンの影響．1日齢ラットより脳幹一脊髄を連続したまま摘出し，第5頸髄前板より自発性脱分極をAC記録した（上向きが脱分極）．薬物を横線に示す期間，淀流により投与した．A：ロ
イペプチソ100／Jg／mJが呼吸頻度に影響しなかった例．B：ロイべプチ
ソ100JJg／mJが呼吸頻度を増加した例．C：B例と同一標本で約100分・後にロイべプチソ100／g／mJとアトロピソ10〟Mを同時投与した例．
記録中，基線の振幅の一時的な増大は，遅い時間経過の不規則な電位変化が起った際のもの．
−

56−

ロイペプチソの薬理学的研究

は，標本の状態が全体的に悪化し，Bに比べて薬リズムの頻度の指標とした．
脳幹側涯流液の温度，pH，イオン濃度の変化

物適用前の頻度が落ちているので，頻度に促進的に応じて呼吸様リズムの頻度も変化した1・2）．また，に働く薬物の作用は出やすくなっている．頻度は伝達物質およびそれに開通する薬物によっても頻適用直前をコントロールとして薬物投与により有度の変化が観察された3）．

意に増加しているが，ロイペプチソ単独の効果に

ロイべプチソ100／堰／mJの適用により9例中7比べ明らかに作用が弱まっていることがわかる．

例では頻度の著明な変化はなかったが（図8A），

図8B，Cの例での呼吸周期の分布を図9に示す．

2例において港流中に頻度が増加した（図8B）．

呼吸頻度の増加に応じて周期の分布の中心が短い

この標本の呼吸数を著明に増加させるものとしてほうへずれていることがわかる．

は，脳幹の伝達物質またはその候補物質の中で，substance P，TRHなどのペプチドのほか，アセ5）新生ラット摘出脊髄一足標本における侵害

チルコリン（ムスカリソ作用）が報告されてい反射電位に対するエンケファリンとロイぺ

る8）．本報告中の副交感神経節での研究により，プチンの作用

ロイペプチソはアセチルコリンのニコチン作用を

図1に示す標本で尾に圧侵害刺激（tailpinch）

抑えムスカリソ作用を増強させるという興味深いを加えると，前限（L3〜L5）から約15〜40秒続

結果が得られているが，呼吸様リズムの頻度増加

く脱分極性の反射電位（tailpinch potential）が作用がこのメカニズムによるか否かを検討するた記録された．この反射電位は，メチオニソ・エソめ，アトロピソ10／nIを同時適用した．図8C

ケファリン（1匹M）やモルヒネ（2匹M）により著
C

A

10

】4

0

10

20

30

10

14

0

10

20

30

R︼

SuO焉＞LOSq0−0しぶ∈コZ

6

2

6

lnteⅣat（seo）

図9

呼吸周期に対するロイペプチソの影響．図8BとCに示した記録より，薬物投与前と投与中の連続する60〜70
回の呼吸周期を測り，分布をヒストグラムに示した．
A：図8Bのロイべプチソ適用前．平均値，S．E．M．，および例数（以下数値は同様）：8．85±0．43sec（25）．B：
同じく適用中．6．53±0．21sec（35）．C：図8Cのロイ
ペプチソとアトロピソ適用前．15．0±0．75sec（39）．
D：同じく適用中．12．8±0．57sec（33）．
−57−−

Leupeptin
200JIM

Bestatin
200JJM

ナ＼LJ−

」」㌧
30sec

図10

Tailpinchlpotentialに対するロイペプチソ（A）とべスタチン（B）の作用．2日齢ラットの摘出脊髄一尾標本を用いた．尾に5分間隔で圧刺激（0．6kg八m2，80msec）を加えた際に記録される電位変化．aは薬物投与前，bは潅流中，Cは除去後．

しく抑制された・ロイペプチソ200／瓜 を適用す
ると前板にわずかな一過性の脱分極を生じたが，考察

tailpinchpotentialはまったく影響を受けなかった（図10）．しかし，ロイペプチソはメチオニ

今回のウサギ血圧に対する実験結果は，最初にン・エンケファリンの作用を明らかに増強した．

述べた推定とは反するものとなった．すなわち，

すなわち，図11Aでは，メチオニン・エンケフ

α型遮断薬の前処置によってもロイべプチソの降ァリン0．1FLMはtailpinchpotentialにまった圧作用は消失せず，ロイペプチソ単独投与の場合

く影響を与えなかったが，ロイペプチソ200匹Mとほぼ同程度の降圧作用が観察された．今回用い存在下では同じ濃度のメチオニン・エンケファリ

たフェソトラミソの量は，30mmHg

ンはtailpinch potentialを著しく抑制した（図を惹起するノルアドレナリンのα作用を遮断する

11B）．一方，べスタチソはそれ自身，前択電位にのに充分な量であった．また，ロイべプチソの投対して抑制効果を示し，自発発火を抑制し，tail与は，このα遮断効果がまだ充分有効なときに行

pinch potentialに対しても軽度の抑制作用を示

われた．したがって，今回認められたロイペプチ

した．この抑制は，べスタチソを洗い去ると消失

ソの降圧作用をα遮断効果の不足のためとは考えした（図10）．また，べスタチソはメチオニン・にくい．また，今回は充分な数の実験を繰り返す

エンケファリンの作用を著しく増隠し，べスタチ

ことができなかったため，結果に記載しなかった

ソ200〆M存在下にメチオニン・エンケファリン

が，ヘキサメソニウム8mg／kg投与後（ノルアド0．1FLMはtailpinch potentialをほは完全に消失

レナリンの昇圧反応は7mmHg程度に抑えられさせた（図11）．

ていた）にロイペプチソ10mg／kgを静江してもの昇圧反応

降圧反応が認められた例がある．したがって，今回の結果は，ロイペプチソの降圧作用機序として−58−

ロイペプチソの薬理学的研究
be

coニol人＿忙虹

」」L
k L k
30sec

図11Tail pinch potentialに対するメチオニン ・エソケファリ
ンの抑制作用とこれに対する増強効果．A は正常人工脳脊
髄液中．Bはロイべプチソ，Cはべスタチ ソをそれぞれ200〟Mの濃度で濯流中．bでメチオニン・ エンケファリン
0．1pMの効果はほとんど認められないが， B，Cではロイ
ペプチソおよびベスタチンがェソケファリ ンの作用を増強

し，tailpinchpotentialを著しく抑制した．尾に5分間隔で一定の圧刺激0．6kかm2，0．1secを加えた．

神経節遮断効果の関与を全面的に否定するものでの差を考えるうえで興味深い・
今回ラット脊髄で観察した結果からは，脊髄運はないが，むしろこれ以外の可能性を示唆するも動ニューロンの電気的諸特性は，ロイべプチソののとなった．
ロイペプチソは，すでに昨年度までの研究で示静脈内投与によって投与後最高4時間にわたり影したように，神経筋接合部や交感神経節における響を受けないと考えられる．これは，昭和55年

コリソ作動性伝達を遮断するが，これと同様に副度に，われわれが幼若ラット摘出脊髄の運動ニュ

交感神経節のコリン作動性伝達も抑制した・このーロンについて報告した結果とよく符合する．し

抑制効果は，節後神経細胞上のニコチン性アセチ

かし，経静脈的に投与されたロイペプチソが作用

ルコリン受容体の遮断作用によるものと結論できを示さなかったのは，血液脳関門を通過しなかっる．アセチルコリンでひき起される時間経過の遅たためかもしれず，この点は今後に残された問題

い脱分極反応（おそらくムスカリソ性アセチルコである．

リン受容器を介する反応）がロイペプチソで著明

ロイペプチソによる呼吸様活動の頻度増加作用に増強された事実は，ニコチン性およびムスカリ，は主としてムスカリソ性作用またはその増強によ

ソ性受容体の脚構上の差，あるいは電位発生機構

ると考えられるが，9例中7例でこの作用がみら−59−

れなかったのは，摘出標本において，呼吸リズム

れに続く遅い経過の脱分極とが記録された．ロイの形成にムスカリン性受容体を介するア七テルコ

ペプチソは前者を抑制し，後者を増強した．

リソの関与の程度が標本ごとに異なるためではな

3）脊髄運動ニューロソおよびIaシナプス伝

いかと推定される．

達に対する作用本研究で新たに開発した摘出脊髄一尾標本を用

ラットを人工呼吸器で維持し，脊髄運動ニュー

い，尾に圧侵害刺激を与えたときに誘発される

ロソの細胞内記録により，活動電位，静止電位，

tailpinchpotentialについてロイペプチソおよび後退分極を測定した．ロイペプチソを静脈内投与

べスタテンの作用を検討した．ロイペプチソはしたのち最高4時間にわたって記録を行ったが，tailpinchpotentialに対し，ほとんど影響を与え

上記電気的性質の変化はみられなかった・また，なかったが，少数例（5例中2例）で軽度の増大

Ia感覚神経刺激により発生するEPSPにも変化傾向を示した．この成績は，ロイべプチソが脊髄はみられなかった．

ニューロン周囲のプロテアーゼを抑制した結果，

4）摘出脳幹一脊髄標本に対する作用

侵害刺激によって遊離される興奮性のペプチド性

本標本は最近開発され，呼吸様活動をi′ わro

伝達物質の作用が増強された可能性が考えられる．

で記録，観察しうる特性をもつ．ロイべプテンを一方，べスタチソは，tailpinchpotentialを軽度抵抗液中に適用したところ，9例中2例においてに抑制し，またメチオニン・エンケファリンの作

呼吸様活動の頻度の増加が説察され，この効果は用を著しく増強した．これらの結果は，べスタチ

アトロピソにより抑制された．

ソのエソケファリナーゼ抑制作用によって説明が

5）摘出脊髄一尾標本に対する作用可能であり，さらにtailpinch potentialに内因

本標本で尾に圧侵害刺激を加えると，痛み反応性のエンケファリン作動性ニューロンが関与してと考えられる電位を前根から記録できる．圧侵害いる可能性を示唆するものである．

刺激により発生する時間経過の遅い電位はエソケ
ファリンにより抑制された．ロイペプテンは，単総独ではこの電位に影響を与えなかったが，エソケ

括

ファリンの作用を増強した．
1） ロイべプチソの血圧下降作用の検討
文

ロイペプチソによりウサギの血圧が一過性に下降することを昨年度報告し，神経節遮断作用によるものと推測した．この点を検討したところ，フェソトラミソ処置下においてもロイペプチソにより血圧下降がみ．られた．

献1）Suzue，T．Eleetricalactivitiesofin viLrobrainstem−Spinal cord preparation of the new−born rat：Rencxes and respiratory rhythm
generation．Proceedings of theInternational
Union of Physiological Sciences，29th Con−
gress，Sydney，Vol．15，p．40（1983）．

2）副交感神経節に対する作用

2）Suzue，TMurakoshi，T．，and

Tamai，S．Elec−trophysiology of reaexesinanisolated brain−

抽出したラット顎下神経節をTyrode液で潅流し，神経節細胞より細胞内記録を行った．ロイべ
プテンは，節前神経刺激で発生するコリン作動性
fast EPSPを抑制した．アセチルコリンを節後神経細胞に適用すると，時間経過の速い脱分極とそー60−

Stem−Spinal cord preparation of the newborn
rat．月わ桝gd．Rg∫．，4，611−614（1983）．

3）村越隆之，∃；井 直，鈴江俊彦，大塚正徳．摘出
脳幹一脊髄標本の呼吸様リズムに対する薬物の影
響．第57回日本薬理学会総会プログラム・要旨
集，p．221，0−179（1983）．

筋ジストロフィーハムスターに対する

ベスクテン投与の効果

高 木 昭 夫＊
研究協力者

藤田武久＊・猪飼哲夫＊・杉田秀夫＊・埜中征哉＊

近年，筋ジストロフィーに対する実験的治療とを作製し，通常の組織化学染色を行った・タイプ

して，蛋白分解酵素の阻害剤が応用されるように

2C筋線維数はおのおのPHにおけるATPaseなった．対象を筋ジストロフィーのモデル動物に染色標本から算定した．壊死線維数は横断標本に限った場合，その効用に関して必ずしもコソセン

おいて壊死線維により占められる面債を測定し，サスに達していないと思われる＝）・著者らは，それより逆算した．強縮張力はKrebs−Ringer液

前回筋ジストロフィー鶏にロイペプチソを投与し中で白金坂電極で刺激して記録した・刺激条件はた効果を報告した4）．今回は，筋ジストロフィー

10V，15msec，50Hzの矩形波である．

ハムスターに対してべスタチソを投与したので，
結

その効果を報告する．効果判定に際して，いかな

果る指標に基づくかは重要な問題である・ジストロ

1．筋ジストロフィーハムスター（表1）

フィー筋の特徴を分析してこの点も若干考察した・

生後約4カ月齢の筋ジスと正常対照のハムスタ
方ー問で比較を行った．最も顕著な差は血清CK

法

生後4〜6週齢の筋ジス′、ムスター（BIO

値であった．筋ジスでは，対照の49倍に増加していた．EDL筋についての比較では，筋湿重量14．6）とその対照（BIOFIB）は，実験動物中央が筋ジスで有意に増加していた・可溶性蛋白量，研究所より供給を受けた・ベスタチソを生理食塩

筋CK活性値や強縮張力に関しては，両者間に差

水に溶解し，2mg働物（15〜30mg／kg／日に相を認めなかった．後述のように，形態指標では両当）を6〜8週間にわたって連日（日曜日を除者間に著明な差異を認めている・筋ジスでは，壊く）背部皮下に注射した・対照群には，同量の生

死筋線経の存在やタイプ2C筋線維数の増加が

理食塩水を注射した．薬剤投与中は体重の消長を目立っている．

記録した．屠殺時に採取した骨格筋（長址伸筋，
EDL；ヒラメ筋，SOL）と血清について各種の分

2．芸剤投与中の成長（図1）析を行った．creatine kinase（CK）活性はNA・

べスタチソ投与は生後4〜6週目より開始した・

DPH法（CPKモノテスト，べ−リンガ−，マン筋ジスでは9／19，対照では2／8が実験中に死亡

ハイム）により測定した．蛋白量はBiuret法にした．ベスタチソ群と生食群の間で，死亡率にはょり測定した．形態学的検索には，凍結切片標本

差はないようであった・この期間におけるハムス
ターの体重増加は正常対照のほうが顕著であった・＊国立神経センター疾病研究一部−

61−

表1筋ジスハムスター（BIO14．6）と対照（BIO FIB）の特散
Dys（乃＝8）

Con（乃＝6）

15，227±5，501ヰ

Serum CK（U／］）

EDL，Wet Weight（mg）

36±6
61±4

Soluble protein（mg／g）

308±150♪＜0．00126±3♪＝0．0264±17

CKin EDL muscle（U／g）＊＊

1，815±545

2，166±303

Tetanus tension（g／muscle）

2．2±0．4

2．3±0．1＊

Mean±S．D．

＊＊

CK，Creatine kinase；EDL，eXtenSOr digitorumlongus muscle．

0︵ごl竜竃き古○皿

2

4

6

2

8

4

6

8

llme（weeks）

図1ベスタチン投与中における筋ジス（Dys）および対照（Con）ハムスターの体重の増加．実験1のみを図示した．●，べスタチソ；O，生理食塩
水；†．死亡．

4．骨格筋の壊死，再生（表4，表5）筋ジスと対照の両者において，べスタチソは体重に影響を与えることはなかった．

筋ジスEDL筋中の壊死線維数は0〜21に分布していた．べスタチソの影響は，とくに認められ3．血清CK値（表2，表3）なかった．タイプ2C（再生）線経の全筋線維数

筋ジスハムスターの血清CK値は，2，680からに占める比率は2．8〜26．4％であった．この指標

45，810U／Jの広範囲に分布していた．しかし，正に対する影響もみられなかった．筋ジスSOLに常対照とオーバーラップすることはない．ベスタ

おいて，非投与群の壊死線維はやや少ない傾向をチソ投与群と非投与群の間にCK値の差はない示した（♪＝0．05）．しかし，タイプ2C線経の比ものと判定した．正常ハムスターの血清CK値

率には差は認められなかった．正常対照のEDLは128と454U／Jの問に分布した．非投与群がでは，壊死筋線経は存在しない．タイプ2C線経

少数のため，べスタチソの影響は不明であった．

は，存在したとしても0．3％以下であった．正常のSOLではやはり壊死線経はなく，タイプ2C
は1．6〜4．1％存在した．
−62−

筋ジストロフィーハムスターに対するべスタチソ投与の効果

表2筋ジスハムスターの血清CKに対するべス
タチソの影響Bestatin Serum CK（U／L）

対照ハムスターの血清CK値に対するべス
タチソの影響Ⅰ．D．No．

Bestatin Serum CK（U／E）＋＋

1439172
74些
02
67

Ⅰ．D．No．

表3

912

6，190

913

45，810914＋＋

35，905

＋

＋

911
＋

＋

2，680

＋
＋
＋

9，492

Mean

4，870

S．E．

10，565916

16，501

917

6，459
一

14，032

一

7，264

一

6，768

一

10，978

発現が何であるかはまだ知られていない・しかし，
節線維壊死と再生は，筋ジスの本態に密接に関連した現象と推定される．他方，筋の諸酵素活性の変動，構成要素の変動などは，壊死，再生に伴う二次的現象と考えられる．今回は血清CK値・筋組織の壊死線経やタイプ2C（再生）線経の数を考指標に採用した．血清CK値は筋ジスにおいて

案対照の平均50倍に増加しており，その差は歴然
筋ジス動物モデルを対象とした実験的治療の報としている．正常対照の骨格筋には，壊死線経は

告は数多くはない卜l・…）．これらでは，効果判定

まったく観察されない．また，タイプ2C線椎の指標として，血清CK値，筋病理組織，筋内のは，正常EDLには存在せず，正常SOLには諸酵素活性や運動能力が使用されてきた・いうま

1〜4％存在するのみであった・ちなみに，ハム

でもなく，筋ジスの本態，すなわち異常遺伝子のスターを使用して筋再生実験を行うと，再生筋は

表4Type2C nbers（％）

No・Of totalfibers
l
﹁
▲
l

＋

l

＋

7
3
8
7
墾
0
7
︒
3
3
7
7
4
5
3

＋

l

＋

02
8
・7
04
・︒・書芸1

＋

1
1
2
4
2
2
2

＋

一
l

8
︒
2
6︒
0
2
︒

1
︐
1
︐
1
︐
7

︒4
1
・・6器崇5・00
1
・ 0 ・8 0
2・001・
5 后 07・0 0 ・
︒0
2・
0

＋

0
2
8
7
3
5
5

Bestatin Necrotic nbers（％）

霊1

I．D．N。．

筋ジスハムスター EDLの壊死およびタイプ2C線維数に対するべスクチンの影響︒

表5筋ジスハムスター SOLの壊死およびタイプ2C綻維数に対するベスタチンの影響

Bestatin Necrotienbers（％）

Type2Cfibers（％）

No．oftotalfibers

2
5

0．0．

5霊
1
54
・・ 837417
・4崇・19・228
2崇・25・︒茄9・640
1・8・36・3︒・2︒・01・︒云1・51・︒000

9︒1︒
94
︒9
3︒
98922笠Meam906927笠豊

Ⅰ・D・No・

701
756
1，097
998
933
1，049
985
931
148
654
1，128
1，051
1，090
980
220

再生後4〜5週にわたってタイプ2Cの反応を皮下注射により投与して，その影響を観察した．

呈し，その後成熟筋になる．したがって，タイプ

主として，血清CK債，筋組織における壊死およ

2C線経の存在は，1カ月以内に筋壊死が存在しび再生線維数を指標とした．少数例での実験であたことを意味すると解釈される．

ったが，べスタチソ投与は筋ジストロフィーの自生後4〜6週の早期よりべスタチソ投与を開始
した・筋ジスハムスターは，原因は不明であるが，然経過に著明な影響を及ぼすことはないようであった．

実験期間中に約半数が死亡した．したがって，少俳腹筋のべスタチソ濃度測定は，日本化薬（株）

数例における検討ということになった．別の問題

総合研究所中山道則博士に依顔した．その結果は，点は，上記のパラメーターたとえば血清CK値や筋ジスハムスター132±56ng／gram（6），対照

壊死線維数で，筋ジスハムスターの個体問におけハムスター135±124（4）であった．

るばらつきが大きいことであった．したがって，
薬剤の影響が著明なときにのみ検出可能な性質の文ものと考えられた．

献1）松下 宏，辻 繁勝．ハムスター筋ジストロフィー症に対するロイべプチソおよびべスタチソ投与の影響．厚生省新薬開発研究（梅沢班）．昭和56
年度研究報告書，pp．5ト56（1982）．
2）Enomoto，A．and Bradley，W．B．Therapeutic
trialsin muscular dystrophy．Arch．NeuYOl．，

このような条件下の実験であったが，べスタチ
ソは筋ジスハムスターの自然経過に著明な影響を与えることはないと結論された．筋ジストロフィーの薬物治療に関しては，さらに多種の薬剤のス

34，771−773（1977）．
3）Sher，J．H．，Strachcr，A．，Shaaq，S，A．，and Har−

クリ一二ソグを行う必要があろう．現在，スクリdy−Stashin，J．Suceessful treatment ofmurineーニングの方法についての予備実験を行っている．

muscular dystrophy with the proteinasein−hibitorleupeptin．Proc．NatL．Acad．Sci．
打．5．Aり78，7742−7744（1981）．

ま

と

め

4）Nonaka，Ⅰ．，Ishiura，S．，Takagi，A．，and Sugita，

H．Therapeutic trial with proteaseinhibitor（leupeptin）in chicken muscular dystrophy．
AcねⅣg鋸γ噌gJ加J．（βgrJ．），58，279−285（1982）．

筋ジストロフィー・ハムスターにべスタチソを−64−

筋ジストロフィーハムスターに対するベスタチン投与の効果

5）高木昭夫，埜中征我，石綿章一ほか．ロイペプチ
ソによる実験的治療．厚生省新薬開発研究（梅沢班）．昭和57年度痍究報告盈pp．59−62（1983）．
6）Chelmieka−Schorr，E．E．，Arnason，B．G．W．，
Astram，K．E．，and Darzynkiewicz，Z．Trea・

On chickenswith hereditary muscular dys−
trophy．J．Clin．Inves1．，67，969−974（1981）．
8）Stracher，A．，McGowan，E．B．，and Shafiq，S．
Muscular dystrophy：Inhibition of degenera−tioninvivowithproteaseinhibitors．Science，
200，50−51（1978）．
9）Sugita，H．，Kimura，M．，and Tarumoto，Y．eE
al．Zn vivo administration ofathiol proteaseinhibitor，E，64−C，tO hereditary dystrophic

tment of mouse muscular dystrophywith theproteaseinhibitor pepstatin．J．Neurqpathol．
且坤．Ak〃rO7．，37，263−268（1978）・
7）Iludecki，M．S．，Pollina，C．M．，and Heffner，
R．R．ln vivo efrects of proteaseinhibitors−

chicken．Muscle Nervc，5，738−744（1982）．

65−

塩酸ブビバカイン（マーカイン）処理による筋崩壊と筋再生に対するべスタチンの影響
埜 中 征 哉＊
研究協力者

石浦章一＊・加茂功＊

寺澤健二郎＊・岡田理美＊

進行性筋ジストロフィーの骨格筋をみると，壊死線経が多くあり，進行するにつれて筋線経の数ーカインを前回のロイペプチソの実験のときと同じように使用した2）．

は減少する．壊死と同時に再生も活発にみられる対象 と 方法

が，この再生過程は壊死を代償しえないので病気は進行すると考えられている．もし再生が壊死を対象としたのは，約250gのWistar系ラット

代償するならば，節線経の数の減少や筋力低下はみられないはずだからである．

である．

筋線経がなぜ壊死するかは不明であるが，且英のラットは4群に分け，第1群は無処置，第2群

何らかの異常によるのではないかという膜説が有ではべスタチソのみ10mg／kg／日を腹腔内授与し，力視されている．膜に何らかの異常があり，細胞第3群はマーカインのみ筋注，第4群はベスタチ

外から高濃度のCa2十が細胞内に流入し，そのたソを2日間投与し，3日目のベスタチソ注射後3めにカルシウム依存性中性プロテアーゼ（CANP）〜4時間目にマーカインを注射した．マーカインのようなthiolprotease が活性化されて自己消は生理食塩水で0．25％液とし，両後肢に切開を化を起すと考えられている．ロイペプチソはこの加え，ヒラメ筋内に約0．5mgを直接注射しだ）．

CANPの活性を抑制することは九日め0では確

第1〜4群それぞれ21匹，計84匹を実験に使かめられているが，わ仁め0での効果はまだ確定

用した．ラットはマーカイン注射後48時間，7的でない．

日，14日目に相当する日に，各群より7匹ずつ対

べスタチソは，膜の表面に結合して膜内に局在するエソドペプチダーゼ活性を抑え，免疫増強作象とした．右足のヒラメ筋は生化学用に，左足のヒラメ筋は組織学用に採取した・用があるとされている．ベスタチソ投与により節線維膜が補強されるならば，筋崩壊そのものの予

1）組織学的検索防となり，理論的にはロイペプチソよりも理想的採取したヒラメ筋は，前脛骨筋とともにトラガ

な薬剤といえる．べスタチソは筋ジストロフィー

カントゴムを使用してコルク栓上に立て，液体窒

マウスに有効であったとの報告もある1）．

素で冷却したイソペソタン内で急速凍結した・凍べスタチソの有効性を確認するため，実験的に結連続切片にへマトキシリソ・エオジン（HE），

筋の壊死，再生を起させ，べスタチソを投与した．

Gomoriトリクローム変法，NADH−TR，酸ホス

筋線経を壊死させるために，局所麻酔剤であるマ＊国立武蔵境養所神経セソクー

ファクーゼ染色を行った．また，一部の筋には筋線維タイプの分化をみるためATPase染色（pH−67−

9・4．4．5，4．3）をも行った．今回実験を行った

2）生化学的分析

84匹すべての（マーカイン注後2日目を除く）筋

ヒラメ筋を10倍量のPBS−0．1％

Triton X→

標本でHE染色のものから最終倍率250倍の写100液でホモジェナイズし，遠心後上清を採取し真を作成し，各標本より200本の筋線維直径（マて粗抽出液とした．Triton XLlOO の添加によりーカイン注群では再生線維径）を計測してヒスト筋全体の95％以上のライソゾーム酵素が上清にグラムを作成した．

回収され 本法が適当であることが確認された．
沈殿はアルカリで可溶化し，構造蛋白質の測定に使用した．ライソゾーム酵素として，カテプシソ

tyd●！サ− ′菖サキ、′−＿′占、■．アナヽ
●、や ●・亡

ー

三好

ヽ

■

．・′1、ご●t

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㌔転

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か照秘録

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雷．

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・′︑．・㌧．∴プ二磨

ゞ豆三千 ミ言責

マーカイン注後48時間目のヒラメ筋・無治療対照（A）とべスタチン治療筋（B）の間に形態学的な差はみられない．HE染色，×180．
−68−

ヾ小ね・㌧鴫．．

■Y

■ ︼ ．

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⁚
−
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ト
㌧
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1．攣二・■・、

・言∴ 了∴五・，r二・・∴・J・上．√、・さ￣−

【′ヽ ●

．J ●

澄芦舜∴

ヽ■f一一

即義多√僧

・ ▲七
ヽ−●

ン㌧い∵．

′▲

離慄審

図1ラットヒラメ筋にマーカインを投与したときの筋の壊死（B）．壊死線経には多数の貪食細胞を認める・壊死後48時間目．対照筋（A）．HE染色，×350．

塩酸ブビバカイン（マーカイン）処理による筋崩壊と筋再生に対するベスタテンの影響
D，酸ホスファターゼ，α−グルコシダーゼ，α−ガ

的に検索しても再現性のあることが確認された．

ラグトシダーゼを測定したパ則定法はすでに報告

マーカインを注射した筋では，注射後48時間日した方法に従った3J．

には壊死線維内に強い貪食細胞の侵入をみた（図1，図2A）．この貪食細胞は，酸ホスファターゼ

結果

染色で強い陽性反応を示した．ベスタテンをあらかじめ投与したラットでもマーカインによって強1）組織学的および組織化学的所見

い筋線経の壊死，貪食反応を認め，ベスタチソが0・25％ マーカインを注射した筋では，例外な筋の壊死を抑えている像は得られなかった（図

くその筋線経の90％以上は壊死に陥り，生化学′■⊥、．．一一、；●

2B）．

く．＿t■＿．＿▲

■

一

屯iJ
㌔ここうィ．

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「．■

￣￣

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モ

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′ヽl●、ニ＼・−．了＿、IJ〆慮．こす『▲一寸
t

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■■＼H ri守一

予♪㌧．、†；．こせ一・二丁、七−二・￣ヽ−▲

1．

一∴

一■L t▼一．・・−■●

巨二十一雷←一二号云タ∵−㍉∴ ￣：㍉
．、￣、岳

図3

こ￣−．・≡・一幸，・一一察至

マーカイン注後7日目の再生筋．無治療対照 （A）とベスタチソ治療筋（B）．再生綾経の形態に差は認められない．HE染色，×180．
Flberdiameterhistogramin regenerating紬ers（7days after necrosis）

0

SLむq一−−Q
L0﹄∈⊃Z

0

8

24

40

56

0

8

24

40

56

Fiberdiameter（JJm）
図4

BPVC（マーカイン）のみ投与の群と BPVC とベスタチソ
授与群の間には再生線維径ヒストグラムに差はない．
−

69−

マーカインを投与して4日目ころより，再生線

マーカイン注後14日目には38′∠m前後となった・

経としての形態をみることができた・7日目にはこの時期でも再生線経には中心核があり，塩基好再生線経は28／∠m径前後となり，中心核，塩基好性の胞体をもっていたので，その同定に困難はな性の胞体で特徴づけられ，容易に同定できた（図かった．ベスタチソ無治療の再生筋の平均線維径3A）．べスタチソをあらかじめ授与し，マーカイと筋線経の大小不同のばらつきは 38・2±6・9′Jm

ンを注射し，さらにベスダチソを連続投与したラ（S．D．）で，治療群の平均37．1±7．3〃mと比較

ットでも再生は速やかで，その形態にはベスタチ

して両者間に差は認めなかった（図5）．
ベスタチソのみ14 日間投与したラットのヒラ

ソ無治療のものと比べて大差なかった（図3B）・
ベスタチソ無治療のものの平均再生線維径と筋線

メ筋直径は50〃m弱であり，これは無処置，無治経の大小不同の幅は28．1±6・1〃m（S・D・）で，療の対照と比較して何ら差は認めなかった・また，

治療群の29．5±7．6／丑nとの間に有意の差はみら

組織化学的にみてもべスタチソ投与による筋の変れなかった（図4）．

化は認められなかった．以上をまとめると，ベス
タチソはブビバカイン投与における筋の壊死，再再生線経は7日目以降も急速にその直径を増し，㌧■t∴ ． 1 ⁚
㌦J．一・∴

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ヽI■ 一一i．ご こl・ぺ．一5．、一十．一∴′8・、、Jl、

マーカイソ江後14日目の再生筋．無治療対照（A）とべスタチ
ソ治療筋（B）の間に形態学的な差はみられない・HE染色，×120．

Meanfiberdiameter±variationinfibersize（S・D・）

Nonnecrotic flbers

5040●untreated■bestatin treatedo untreated30□bestatin treated
20﹂の︸のE虐P U宏≦Reg nerating的ers

9く7）16（川）days（）：daysafterBPVCinleotion

図6
−

70−

塩酸ブピノミカイン（マーカイン）処理による筋崩壊と筋再生に対するベスタチソの影響

生の過程に何ら影響を与えないことがわかったソ）は，筋細胞膜を選択的に破壊するり）．実験動（図6）．

物の骨格筋内にマーカイソを直接注射すると，注
射部位は広汎に壊死に陥り，24時間日頃より強2）生化学的所見

い貪食細胞の細胞内への侵入をみる・貪食細胞で構造蛋白の量は正常対照では11．2±1．0mg／mJ

清掃された壊死線経は再生を開始し，注射後4日であったが，マーカイン注後2日目には6．5±

目には再生線経として形態的にとらえられる・マ

1．1mg／mJと減少していた．べスタチソをあらかーカイソは支持組織である血管や末梢神経は破壊

じめ投与した筋でも5．8±1．4であり，構造蛋白しないので再生は速く，1カ月以内でほぼ完全に量からみても，べスタチソは筋の破壊を阻止しえ再生を完了する．この実験系でみる再生緑経は大なかった．

小不同が少なく均一で，経時的な観察で再生の状

ライソゾーム酵素の活性はカテプシソD，酸ホ
スファクーゼ，α一グルコシダーゼがマーカイン江

態に再現性があるため，直径計測など統計的処理に信頼がおける利点がある5）．

により上昇した．注射後2日日と7日目の酸ホス

進行性筋ジストロフィーの主な病理学的特徴は，

ファターゼ値はべスタチソ投与により抑制される

筋線経の壊死と再生である6・7）．薬物などによる治傾向にあった（♪＜0．01）．その他の酵素では，有療効果をみるには筋ジストロフィーのモデル動物

意の差はみられなかった．

があるが，ヒト筋ジストロフィーと異なる点も多く，その評価に多くの問題を残している細・薬物

考

察が筋の壊死，再生にどのような影響を与えるかを形態的に追求するには，マーカイソによる筋壊死

局所麻酔剤である塩酸プビバカイン（マーカイはよい実験モデルといえる・しかし，マーカイソのような薬物による筋の壊死はあまりに激烈であり，緩徐にくる筋ジストロフィーの壊死と必ずしLysosornalenzyme aCtivities

も等値に評価はできない・
C a t h e p s in D

A c id p h o s p h a ta s e
U ／m g

0 ・3

ロ・・
・．．

昨年，われわれはこのマーカインによる実験系∪ノm gにロイべプチソを投与して，その壊死，再生におl ．0

ける態度をみた．ロイペプチソ投与では壊死は抑0 ．5

制されず，再生線経が小径である事実を得た・そ

．
D ．I

．
・・・・・・・・・・
0 ‥・
・・・

れは，ロイペプチソが筋細胞内に入り，筋の壊死と再生に何らかの作用をしている証明となった2）・

α−G 山c o s id a s e

a −G a ，
a c to s id a s e

しかし，再生の遅延がどのような意味をもつのか，■‥‥・0
U ／m g

∪／m g
5

10

解決すべき大きな問題であった・

JJユ

ベスタチソは，細胞膜に結合して膜内に局在するエンドペプチダーゼ活性を抑制し，さらに免疫

．
ロ・・
一■■■
5

・◆
●

2 ．5

増強作用があることで知られている．この薬物を

Ⅰ
コ●
．e ‥・

2

7

14

2

7

一日‥・
凸

あらかじめ動物に投与し，膜増強後にマーカイン

14（days after BPVCinjection）
0：COntrOl●：bestatin onEy

ロ：BPVC q：BPVC−bestatin

図7を注射した際，壊死に何らかの影響を与えるかどうか試みることが今回の実験の目的であった．べ
スタチソ投与後2日目にマーカインを注射したが，−71−

ブビバカイン（マーカイン）処理による筋崩壊と筋再生に対するロイペプチソの影響．厚生省新薬開発研究（梅沢班）．昭和57年度研究報告書，

形態的にも生化学的にも，筋の壊死には何らの影響もみられなかった．これは，マーカインという薬物による筋毒性があまりに強く，ベスタチソのpp．63−69（1983）．
3）Nonaka，Ⅰ．，Takagi，A．，Ishiura，S．，Nakase，H．，

効果をみることができなかったことが原因かもしand Sugita，H．Pathophysiology of muscle

れない．壊死後の再生線経はベスタチソ投与によ丘ber necrosisinduced by bupivacaine hydro−

Chloride（Marcaine）． Acla NeuropatJ10l．
（βgrJ・），60，167−174（1983）．
4）Benoit，P．W．andBelt，W．D．Destruction andり影響を受けなかった．これは再生を遅らせるロ
イべプチソとは対照的であった．

regenerationofskeletalmuscleafter

treat一ment with alocal anesthetic，bupivacaine

結語（Marcaine）．J．Amが．，107，547−556（1970）．

5）小林繁一，鴨下垂彦，埜中征故．Bupivacaine筋
注による実験的筋再生現象の組織化学的研究．臨床神経，22，1191（1982）．

ベスタチソ10mg／kg をあらかじめ（2日間）

6）Nonaka，I．，Takagi，A．，and Sugita，H．The
SigniGcance of type2c musclefibersin Du−

投与し，次に筋線経を壊死させるマーカインを筋注した．さらに，壊死後の再生に対する影響をみ

Chennemusculardystrophy．′MILSCle

Nerve，

4，326−333（1981）．

るためべスタチソを連日投与した．べスタテンが7）埜中征哉，杉田秀夫．進行性筋ジストロフィー症の筋病理−OPaque 線経を中心として−．神経進
歩，24，718−728（1980）．

筋の壊死の過程を抑制する事実は得られなかった．
再生線経を経時的にみたが，再生に対しても何ら

8）Nonaka，Ⅰ・and Sugita，H．Intracytoplasmic

かの影響を与えている事実は得られなかった．

VaCuOlesin aW丘bers of dystrophic chicken
muscle；probable early pathologic eventin−
itiates massive

文献丘ber necrosis．Acta NeuT−0一♪α沌0・（βgrり，55，173−181（1981）．
9）Nonaka，Ⅰ．，Ishiura，S．，Takagi，A．，andSugita，

1）松下 宏，辻 繁勝．筋ジストロフィーマウスに見られる種々な酵素の活性変動に対するロイべプ
チンおよびべスタチン投与の影響．厚生省新薬開発研究（梅沢班）．昭和55年度研究報告書，pp．

H・Therapeutictrialwithproteaseinhibitor（leupeptin）in chicken muscular dystrophy．
A histologic and histochemicalstudy．Acta
Ⅳg〟rO♪d沌0・（βgrJ．），58，279−285（1982）．

55−61（1981）．

2）埜中征鼓，石浦章一，藤田武久，高木昭夫，塩酸−72−

鶏ジストロフィー筋における新生児塑構造蛋白質の出現−ベスタチソの投与と除神経の影響−

丸 山 工 作＊
研究協力者

大日方

昂＊・新保和彦＊

体がすでに作成されているので，これらを用いて研

究目

免疫組織化学的な解析を行うことにより，■個々の的細胞単位で筋ジストロフィー症に伴う変化をとら

醇化直後の新生期のヒヨコと成鶏の胸筋とでは，えることが可能となっている5）．鶏筋ジストロフ

収縮構造を形成する構造蛋白質のタイプに大きな

ィー筋では発症に伴って蛋白質が新生児型へ逆行違いがみられる．成鶏胸筋は速筋としての特徴をするという事実を考えると，正常鶏に人為的に新備え，したがって蛋白質の面からみると，速筋型

生児型蛋白質の出現をひき起させる条件をつくり

C蛋白質，速筋型ミオシソ，α型トロポミオシソ，

出せれば，筋ジストロフィー症研究のうえで有効

胸型トロポニソTなどが存在している・ところが，な実験モデル系となると思われる・

新生期のヒヨコでは，これらに加えて，遅筋型C筋ジストロフィー症マウスの場合，べスタチソ

蛋白質，β型トロポミオシン，足型トロポニソTが症状の軽減にかなり有効であるという報告が，なども存在する．鶏胸筋に関しては，これらを新松下らによりすでになされている8）・この研究で

生児型構造蛋白質とみなすことができるl）・これは，ベスタチソの効果は血流中への酵素の放出とらの蛋白質の存在の有無は，電気泳動と免疫学的運動機能を指標として検討された・したがって，、

手法で容易にとらえることができる．これらの蛋

べスタチソがジストロフィー筋の収縮運動系にど白質のタイプの解析により，筋の成熟度を知るこのような効果をもたらすかということも，また興とができる．新生児型蛋白質から親型蛋白質組成

味のもたれるところである・への移行は，鰐化後約1週間の筋の成長期に急速本研究では，以上の背景に立って，まず筋ジスに進み，2週間でほぼ終了する・

トロフィー鶏をモデル動物として，ベスタチソ投

遺伝性の筋ジストロフィー鶏（NH413系）で与が収縮構造蛋白質系にどのような影響を与える

は，筋ジストロフィー症の発症に伴い，β型トロか，とくに筋ジストロフィー症発症に特徴的にみポミオシン2）や足型トロポニソT3）のような新生られる新生児型蛋白質の再出現がべスタチソによ児型構造蛋白質の出現が起ることがすでに明らかり抑制されるかどうかに着目して研究した・次に，にされた．さらに最近，われわれは，筋ジストロ

筋ジストロフィー鶏にみられる筋蛋白質の変異をフィー筋の細胞に遅筋型C蛋白質が原著に出現す

正常鶏にも人為的にもひき起す条件を探る目的で，ることを報告した▲）．C蛋白質に関しては，速筋

除神経節を作成し，その際の蛋白質の変動を筋ジ型と遅筋型アイソフォームを特異的に認識する抗ストロフィー症の場合と比較検討した．その結果，＊千葉大学理学部

鶏除神経筋では筋ジストPフィー症によく似た状−73−

況がっくり出されることを見出した．

された抗マウスまたは抗ラビットIgG 抗体を反応させ，間接蛍光抗体法により筋線維中に存在す

実験材料と方法

るC蛋白質のタイプを調べた．トロポミオシンのタイプは，0 Farrellの二次元電気泳動法により，

1）ベスタチンの投与

α型およびβ型トロポミオシンの存在の有無に着ベスタチソほ，教化研の青柳博士から御供与い目して分析した．鶏胸筋では部域により多少蛋白

ただいた・筋ジストロフィー鶏（NH413系）お質組成が異なることが知られているので，大部分よびそれに対する対照鶏（NH412系）に，醇化

の実験は，胸筋の表層部かつ中央部付近の筋を採1週齢から，ベスタチン（0．9％食塩水溶液）を取して行った．

5mg／kg／日となるように連日皮下注射により投与結した・当初，醇化直後から10mg′′kg／日を授与す

果ることを計画したが，注射したヒヨコが1〜2週以内にすべて死亡し，結果を得るに至らなかった．

1）ベスタチン投与による影響

対照としてほ，生理食塩水の丸を注射したものを正常鶏（NH412系），筋ジストロフィー鶏用いた．

（NH413系）のいずれにおいても，階化直後の胸筋の筋線経は速筋型C蛋白質と遅筋型C蛋白質を2）神経支配の除去

共有している（図1）．いずれの系統の鶏でも，遅酵化直後，または2〜4カ月齢の鶏胸筋を支配

筋型C蛋白質をもつ細胞は醇化後2週までにほぼする神経（14，15，16頚椎神経）を，脊髄に近い消失する・正常鶏では以後遅筋型C蛋白質の出現部位でまとめて切断し，神経の再生を妨げるためをみることはできないが，筋ジストロフィー鶏でに，神経末端部を背部の皮膚に縫いつけて固定しは，1カ月齢になると遅筋型C蛋白質をもつ細胞

た・手術は胸筋の片側のみについて行い，他方はが再び胸筋内に検出されるようになる（図2上対照として用いた．除神経の側の翼の運動はほぼ段，−Bestatin参照）．このことは，筋ジストロフ

完全に妨げられ，また筋の重量の低下がひき起された．

ィー鶏では筋細胞の幼君化が起ることを意味すると同時に，筋ジストロフィー症の発症の初期の徴

3）蛋白質の解析
筋ジストロフィー症および除神経に伴う変化の指標として，筋構造蛋白質であるC蛋白質とトロ
ポミオシンのアイソフ寸−ムを用いた，C蛋白質のタイプの解析は，すでに作成されている抗速筋型C蛋白質抗体（ポリクローナル抗体）と抗遅筋型C蛋白質抗体（モノクローナル抗体，ALD66）5）を用い，免疫組織化学的に行った．具体的には，液休窒素で冷却したイソベンタン中で急速凍図1幼若なヒヨコ陶筋に存在するC蛋白質のタイ
プ．醇化後2日目のヒヨコ胸筋の連続切片を
抗速筋C蛋白質（左）または抗遅筋C蛋白質（右）抗体で処理し，間接螢光抗体法により調べた．

結固定した筋の連続切片を作成し，これを3％ホルマリンで固定したのち，一次抗体として前述の抗C蛋白質抗体，二次抗体としてFITCで慄識
−

74

−

鶏ジストロフィー筋における新生児塑構造蛋白質の出現

候とみることができる．筋ジストロフィー症の発の横断切片の蛍光顕微鏡像を示す．この時期，ベ症が明瞭になる3〜4カ月齢では，遅筋型C蛋白

スタチソ非投与の筋ジストロフィー鶏では遅筋型質の存在も非常に明瞭となる（図3）．べスタチ

C蛋白質をもつ細胞がある程度の頻度でみられる

ソ投与が筋ジストロフィー症に伴う遅筋型C蛋白のに対して，べスタチソ投与された場合，遅筋型質の出現にどのような効果をもつかを検討した．

C蛋白質をもつ細胞の数はかなり少なかった・胸

図2に，形化後1週齢から1カ月齢までベスタチ筋の領域によっては遅筒型C蛋白質をほとんど検

ソを投与された筋ジストロフィー鶏胸筋の筋線維出できない部分もみられた．本研究ではべスタチ

O lのdL

0享OIS＋Bestatin

0 ＞昌一S

図2筋ジストロフィー難（NH413系）へのべスタチソの効果−1カ月齢でみられるC
蛋白質の変化．下段は醇化後1遇から1カ月齢までベスタチン（5mg／kg／目）を授与されたもの．上段はベスタチン非投与の筋．胸筋の切片に抗速筋C蛋白質抗体（fastC）または抗遅筋C蛋白質抗体（slow C）を作用させ，間接螢光抗体法で観察した．
すべての細胞が速筋C蛋白質を含むのに対し，遅筋C蛋白質を含む細胞は少数である．上段はベスタチンを投与されない1カ月齢の筋ジストロフィー崇胸筋の場合，遅筋型C蛋白質をもつ細胞がかなりみられる．
−

75

−

ソ非投与2例，ベスタチソ投与3例について比較

課題である．本年度の研究ではまだ予備的な観察

したが，べスタチソ投与の有無でみられる違いのにとどまっているが，今回行ったべスタチソ投与

基本的な傾向はいずれの場合でもみられた．観察量では，2〜4カ月齢まで成長するにつれて，筋に用いた大胸筋の表層かつ中央部の細胞の中で遅ジストロフィー鶏では遅筋型C蛋白質の出現は次筋C蛋白質を含む細胞の割合は，べスタチン非投

第に麒著となってきた．図3に，ベスタチソ投与

与では3〜5％，ベスタチン投与では0．一ト0・6

された3カ月齢の筋ジストロフィー鶏胸筋の例を％（表1参照）で，ベスタテン投与が遅筒型C蛋

示す．細胞の形はかなり不揃いとなり，遅筋型C白質の出現（いいかえれば細胞の幼若化）をある程

蛋白質をもつ細胞数が多くみられる．したがって，度抑制していると偲われる．筋ジストロフィー症

筋ジストロフィー症の発症は進行しているものとの発症がより飯箸となる2、3カ月齢の時期にベみなされる．しかし，この例ではフリップテスト

スダチソの効果がどの程度認められるかが重要なでみる限りかなり軽症と思われた．この実験例で

O lのmL守．†しこ

Dystrophy（−Bestatin）

Control（光盈）

1幣

図3 べスタテンの投与，非投与の親（3カ月齢）の筋ジストロフィー鶉と，対照実射こみられる遅筋型
C蛋白質の出現．筋の凍結切片に対して上段は抗速筋C蛋白質抗体，下段は抗遅筋C蛋白質抗体を作用させたもの．
表1筋ジストロフィー鷲胸筋中への抗遅筋C蛋白質抗体に陽性な細胞の出現頻度に対するべスタチソ投与の効果
Positively stained with antトslow Crprotein

No．of cells counted＋

Without Baestatin No．1
No．2

25，524（100％）

With Bestatin No．l
No．2

624

249

378

（0．98）（3．42）（3．08）

17，400（10D％）

Total（2．45）
15487（100％）

十十11

26（2．25）（5．34）

66

874（0．38）（0．05）（0．43）

34，032

130

82

212

（100％）（0．38）（0．24）（0．63）

ベスタチソ投与は1適齢から1カ月齢まで行い，1カ月齢に採取した筋の凍結切片を間接螢光抗体法で調べた．
＋，Weakly stained；＋＋，StrOngly stained・
−

76

−

鶏ジストロフィー筋における新生児型構造蛋白質の出現

みる限り，この時期まで成長したとき，べスタチ

た．すなわち，いずれの場合にも，2週齢以降でン投与の有無による差はあまりないように思われは速筋塑C蛋白質のみがすべての細胞に検出される．詳細は，今後さらに検討されねばならない・

た（図4）．また，細胞の形態の面からみても，

ジストロフィー筋に出現するC蛋白質のタイプを

両者で差はみられなかった．筋ジストロフィー鶏

電気泳動におけるペプチドバンドと関連させて解胸筋でみられるβ型トロポミオシンの出現がべス

析するために，ベスタチソ投与および非投与の筋

タテンの投与により影響されるかどうかを2カ月から抽出された蛋白質をSDS−ポリアクリルアミ

齢まで調べたが，ベスタチン投与，非投与いずれ

ドゲル電気泳動にかけ，分離されたペプチドをニの場合にもごく少量のβ型トロポミオシンの出現

トロセルロース膜に転写し，これに抗体を反応さを認めたのみで，べスタチソ投与の効果があるかせて調べる，いわゆるイムノブロット法を適用しどうかについて結論を得るに至っていない．筋ジた．この手法によっても，免疫組織化学による解

ストロフィーに伴って起るC蛋白質の変異に比べ析とほぼ同様に，ジストロフィー筋に遅筋型C蛋て，トロポミオシンの変異はやや遅れて起るよう白質が検出された．この場合，べスタチソ投与さに思われる2）ので，トロポミオシンに関しては筋れた筋では，非投与の場合に比べて遅筋型C蛋白

ジストロフィーの発症がさらに進む時期まで追質がやや量的に少ない傾向にあった・跡，検討していく必要がある・

正常鶏（NH412系）にベスタチンを投与した
場合，C蛋白質の面からみて，ベスタチン非投与

2）除神経筋にみられる筋蛋白質の変化の鶏との違いを見出すことはまったくできなかっ拒化直後（2日齢）に除神経した鶏胸筋と対照＋Bestatin

0 ︼SdL0＞昌一S

図4

正常鶏（NH412系）に対するベスタチソ投与の影響・1カ月齢について示す・
1週から1カ月齢までべスタチンを授与された．ベスタチン投与の有無によらず，航速筋C蛋白質（上箸）のみが放出され，遅筋C蛋白質（下段）は検出さ
れない．
−

77

−

筋の成長過程で，筋線維中に存在するC蛋白質がんど消失することなく，多くの細胞に存在し続けどのように変化するかを経時的に調べたところ，ることが認められた（図5下段，Denervation参すでに述べたように，対照筋では1週目までに遅照）．本研究では最長2．5カ月齢まで観察を行っ

筋型C蛋白質をもつ細胞はごく少数となり，2週たが，この場合でも，遅筋型C蛋白質の存在が多齢では完全に遅筋型C蛋白質は消失し，親型蛋白

くの細胞に認められた．また，途中で局部的に神質へ移行がほぼ完了する（図5上段，Control参経の再支配が起っているような場合には，遅筋型照）．これに反して除神経された側の胸筋では，C蛋白質の減少がみられた．これらのことから，鶏の成長にもかかわらず，遅筋型C蛋白質ほほと神経を介した情報が新生児型から親型への蛋白質

Anti−S10W C

Denervat10∩

Anl卜Slow C

図5 新生児聖から親型へのC蛋白質の変化に及ぼす除神経の効果．解化2日目に除神経された筋（下段）と対照筋（上段）の成長過程でみられるC蛋白質の変化を示す．
手術後1遇（lw），2遇（2W），3遇（3W），1カ月齢（1m）に採取された筋の横断連続切片に抗速筋C蛋白質（anti−Slow）抗体を作用させたのち，間接蛍光抗体法により観察した．除神経筋では遅筋型C蛋白質が存在し続ける．
−

78−

鶏ジストロフィー筋における新生児型構造蛋白質の出現
Slow C

図6 成鶏胸筋の除神経によってひき起されるC蛋白質アイソフォ
ームの変化．2カ月齢の鶏胸筋を除神経し，1週間後に凍結切片を作成して間接費光抗体法で調べた．抗速筋C蛋白質抗体（A，B）または抗遅筋C蛋白質抗体（C，D）との反応を示す．上段（A，C）は無処理の筋，下段（B，D）は除神経筋を示す．
の変化に深く闘わっていることは疑いない・除神に認められた（図7）．3カ月齢の鶏胸筋では，は経により新生児型から親型への蛋白質のタイプのば100％変化が妨げられる現象は，トロポミオシソ，トロ

ポミオシンは検出されない．3カ月齢の胸筋が険

ポニンT，ミオシンのアイソフォームの場合につ神経されたとき，約2週間後に微量のβ塑トロポ

いても同様に認められた．

ミオシンが出現し（図7f），1カ月後にはさらに

α型トロポミオシンのみで，β型トロ

一方，すでに成熟し，親型蛋白質組成となって明瞭に検出されるようになった（図7g）．このといる2〜4カ月齢の鶏の胸筋を支配する神経を切き，α型トロポミオシンとβ塑トロポミオシンの断した場合には，時間の経過とともに筋細胞の中量比をみると，ちょうど醇化直後のヒヨコの場合に遅筋型C蛋白質の出現が起ることが認められた・（図7a）と類似していた．このことは，除神経さ

たとえば，2カ月齢の鶏胸筋を除神経した場合，れることにより，はば完全に新生児型に逆行した

術後1週間ですでに多くの細胞内に遅筋型C蛋白

ことを示唆している．除神経を受けていない例の質の存在が認められた（図6）・3週間後には，ほ対照筋では，トロポミオシンのタイプの変化はほとんどすべての細胞が遅筋型および速筋型C蛋白

とんど認められない（図7b〜d）．除神経筋では，質を共有しているのが確認され，C蛋白質の面か

新生児塑蛋白質のもう1つの特徴である足型トロ

らみると，ほぼ完全に新生児型に戻っているもの

ポニソTの出現も，トロポミオシン，C蛋白質のと判断された．除神経筋に遅筋型C蛋l′1質が再出変化に並行して起ることが認められた．このよう現する場合，既存か大型の筋線経にその出現が認にC蛋白質，トロポミオシン，トロポニソTが新められ，再生細胞のような小型細胞に特異的に出生児型へ移行するという点では，除神経筋での変現するのではない．すなわち，除神経により，既化と鶏筋ジストロフィー症での変化とはきわめて存細胞の幼若化が起るものとみなされる．除神経

よく似ている．両者に共通するもう1つの点としの効果は，トロポミオシンの場合についても同様て，ミオシン軽鎖の変化をあげることができる．

−79

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図7

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●LL2
c

g

正常崩と除神経筋のトロホミオシ
ンの二次元電気泳二′1ターン．3
カ月齢の鶏胸筋を除神路し，手術後1週間後（a，e），2週間後（C，f），または3週間後（d，g）に調べた．図の左半分は対照筋を，右Jl1分は除神経を示す．aは昭化後2日目の胸筋におけるトFポミオシ
ンのパターン．

Lさ

離しざ2
d

Lr3

図8 除神経された鶏胸筋におけるミオシン軽鎖の変化．酵化2日目（上段，2d−1m）および3カ月齢（下段，3m−1m）の剰匂筋を除神経し，1カ月後にミオシン軽鎖のパターンを
0 Farrell二次元電気泳動法により調べた．
a，Cは対照筋，b，dほ除神経筋．Lrl，Lf2，
Lr。は速筋ミオシン軽鎖を示す．

筋ジストロフィーの発症に伴い，速筋型軽鎖の1

ィ一筋の1つの実験モデルとみなしうる可能性をつLr。の原著な減少が起る．除神経筋の場合に秘めている．

も，まったく同様に，速筋型軽鎖Lr3の減少が認められた（図8）．Lrさが量的に少ない点は，新生まとめと考察児筋に共通する現象である．また，胚子期の胸筋には遅筋型軽鎖の存在が知られているが，ジスト

鶏筋ジストロフィー症に対するベスタチンの効

ロフィー筋，除神経筋，新生児筋のいずれでも遅果に関して，新生児型蛋白質の有無を指懐として筋型軽鎖は検出されない7）検討した・現時点では実験例が多くないので明確以上述べてきたように，蛋白質の特性からみるな結論は差し控えたいが，本実験でみる限り，ジ限り，鶏の場合，ジストロフィー筋と除神経筋とストロフィー症の初期段階での変化，すなわち新はかなり叛似点がみられ，除神経筋をジストロフ

生児型C蛋白質の出現に対してほ，ある程度抑制−80−

鶏ジストロフィー筋における新生児型構造蛋白質の出現的効果を示したといえる・しかし，ジストロフィの投与によりどう影響されるか，筋ジストロフィー症の発症の進行に対して充分な抑制的効果を発ー症に対する効果と合せて検討することは意味が揮したとはみなしがたい．今後の実験においては，あるように思われる．

鶏の飼育条件に慎重な配慮を払いつつ，醇化直後
文

からべスタチソ投与を開始すること，成長に沿って投与量を増加させることを検討する必要がある・
ここでまず問題となるのは，べスタチソの投与開始時期と投与量である．本実験では，蛋白質の1）大日方昂．筋肉の分化一筋タンパク質の多塑性と可変性一一一、科学，53（11），689−696（1983）・
2）Takeda，S．andNonomura，Y・Presenceofthe
tropomyosinβ−Chainin dystrophic chicken
breast面からみて，新生児型から親型への移行がある程献muscle．Biomed．

Res

1，176−179（1980）．

度進行した時点（醇化1週間後）で投与を開始し

3）Obinata，T．，Takan0−Ohmuro，H・，and Matsu−
da，R．Changesin troponin T and myosin

た．また，投与量は従来の報告より少ない量を用

isozymesduring development of normaland

いた．これは，べスタチソ投与が幼若ヒヨコに厳しい影響を及ぼしたからである．本実験では主として筋ジストロフィー症の初期段階についてC蛋
白質に焦点を合せてみたが，筋ジストロフィー症の影響が顕著に現れるトロポミオシンとトロポニ
ソTについても比較検討を加えることにより，新たな知見が得られるものと思われる・
鶏胸筋については，除神経により，蛋白質のタ
イプの面からみて筋ジストロフィー症とよく似た状態がつくられることが明らかにされた・しかし，
除神経筋の筋細胞は，形態的にみると，筋ジスト
ロフィーのように細胞の肥大化や大きな不均一化が顕著に起るわけではない・細胞が丸くなった

dystrophicchickenmuscles・FEBSLeit・・120・
195−198（1980）．

4）大日方昂．鶏ジストロフィー筋におけるC蛋白質
分子種の変化．厚生省筋の発生と分化に関する基礎的研究（江橋班）．昭和57年度研究報告書，
pp．102−108（1983）・

5）Reinach，F．C．，Masaki，T．，Shafiq，S・A・，Obina−ta，T．．and Fischman，D．A．Isoforms of C−
proteinin adult chicken skeletal muscle：
Detection with monoclonal antibodies．J．
CeJJβfoJ．，95，78−84（1982）．
6）松下 宏，辻 繁勝．筋ジストロフィーマウスにみられる種々な酵素の活性変動に対するロイペプ
チンおよびべスタチソ投与の影響．厚生省新薬開発研究（梅沢班）．昭和55年度研究租告苔，pp・55−61（1981）．

7）Obinata，T．，Takan0−Ohmuro，H・，and Matsu−
da，R．Types of troponin T and myosiniso−
zymesin the breast muscle of dystrophic

り，細胞間隙の増大などほ認められる・除神経筋

chicken．Zn Muscular Dystrophy，ed．by S・
Ebashi，pp・105−115，Univ・TokyoPress，Tokyo

にみられる新生児型蛋白質の出現が，べスタチソ（1982）．

−81−

筋ジストロフィー症マウスに対するアルファメニン投与の影響

松
研究協力者

辻

下

宏＊

繁勝＊・楠本茂夫＊・土井芳夫＊

薬剤投与実験には，約1カ月齢の疾病マウス80
研

究

目

頭を2群に分け，一方をアルファメニソA投与，

的

他方をB投与に使用した．各群はさらに各10頭

微生物由来の低分子immunomodi丘erの1つずつ4実験区に分け，それぞれ2週間投与，4週であるべスタチソ，あるいはホルフェニシノール間投与，6週間投与，および12週間投与の実験を筋ジストロフィー症マウスに対して連続投与すに用いた．各実験区はさらに5頭ずつ2ケージにる実験を行い，発症直後の3適齢頃までに投与を分け，一方は薬剤投与マウス，他方は生理食塩水開始したマウスの中で，いったん発現した症状が投与対照マウスとした．

消失し，外見的にまったく正常な成長を遂げる個

アルファメニソ粉末は使用当日に生理食塩水に体が得られることを見出している1・2）．また，初期

1mg／ml濃度に溶解し，1回0．2mlずつ，1日投与による症状の消失に失敗した個体も，長期間2回，連日背部皮下に注射した．対照群には，生投与を続けることによって有意な寿命の延長が得

理食塩水を0．2mJずつ同様に注射した．

られることが認められた．

それぞれの期間連日投与を行ったのち，マウス

そこで，引き続き，これら有効物質に構造の類は屠殺し，血清および骨格筋中のマーカー酵素群似している他の低分子immunomodi丘erを使用の活性を測定した．また，同時に尿中のクレアチ

して，筋ジストロフィー症マウスに同じような連

ソ，クレアチニソ含量の測定も行った．

続投与を行う実験を計画し，症状進行に対する抑酵素活性測定には採血後分離した新鮮血清をそ

制効果の有無の検定を行っている．本年度は，べのまま，また屠後肢筋は屠殺後直ちに採取し，10スタテンに構造の類似しているアルファメニソA

倍容の0．32人Ⅰ庶糖液に入れ，テフロンホモジェ

およびBに関する実験結果を報告する．

ナイザーでホモジェナイズし，通常のSchneider法に従って可溶性分画とミトコンドリア分画に分

材料 と 方法

離し，前者はそのまま，後者はさらに低張液処理によって膜の破砕を行ったのち，それぞれを酵素実験には，C57BL／6J−dy系マウスの疾病個体標品として使用した．

（dy／dy）および，同齢の正常個体（＋／−）を自家酵素活性の測定法は，アルカリプロテアーゼ活繁殖または実験動物中央研究所から購入して使用性はEdmund and Pennington の方法3），Ca2十した．

依存性中性蛋白分解酵素（CANP）はDaytonら＊和歌山県立医科大学第二生理学教室の方法4）．クレアチンキナーゼ（CPK）はHess−83−

表l Alkaline protease activitiesin several tissues of micewith muscular dystrophy

Normal21．4±9．5（7）Dystrophic

58．4±13．6（7）

D／N

Pr．

2．73

上，＜0．001

5．0±3．6（4）6，7±4．6（4）

1．34

N．S．

3・6±1．6（4）4．9±3．7（4）

1．36

N．S．

Unit：AE／mg protein．
Parenthesis show numbers of mice used．

らのUV法5），乳酸脱水素酵素（LDH）はWro−

表2 Histamine concentrationsin several
tissues of mice with muscular

blewskiらの方法6），ピルビン酸キナーゼ（PK）

dystrophy

はTanaka らの方法7）に，それぞれ準じて行った．

Normal Dystrophic D／N

酵素標品中の蛋白含量はLowry法によって測定

Muscle

した．
骨格筋中のヒスタミン含量は，Shore らの 0−
7タールアルデヒド法を基にしたAnton

らの変

3．52

12．35

3．51

Heart l．52

2．00

1．32

Liver O．42

0．35

0．83

Unit：FLg／g wet tissue weight・Each data show average values of three trials．

法8）に従って測定した．

cellの数が筋ジストロフィー症マウスで増加しているという古い報告13）もあることから，この酵素

結果の活性変動を疾病進行のマーカーとして利用する
1）疾病による酵素活性の変動と同時に，萎縮筋中のmast cellの量的変化を示

疾病進行の生化学的マーカーとしてほ，すでにすものとして，maSt Cell のもう1つの特異的ないくつかの酵素が血清中，骨格筋中で特異的な活産物であるヒスタミンの量的変化と比較検討し性変動を示すことが知られている．これらのうち，た．使用されたマウスの月齢は2〜3カ月であ

今回はPK，CPK，およびLDHについて測定をる．
結果は，表1のように，無処置の疾病マウスで行った．また，プロテアーゼ活性としては，CA・NPのほかに，アルカリ側に至適pHのあるは骨格筋中のアルカリプロテアーゼ活性が正常対（pH9．1）アルカリプロテアーゼ活性も疾病進行照に比較して3倍近く活性上昇しており，統計的のマーカーとして測定した．無処置疾病マウスなにも有意な差異を示していることがわかった・さらびに正常対照マウスにおけるこれらマーカー酵らに，組織中のヒスタミン含量についても，表2素の活性変動については，アルカリプロテアーゼのように骨格筋中で大幅に増加していることが認を除いてすでに度々報告してきたので9・10），今回

められ，アルカリプロテアーゼ活性とほぼ並行しは実験を省略した．アルカリプロテアーゼ活性のた変化を示しており，筋ジストロフィー症マウス

変動については，この酵素がmyo丘brillarpro−

では症状進行に伴ってmast cellの量的増加が存

teaseとも呼ばれ，筋線稚内に存在することがわ

在することが確かめられた．

かっていると同時に，maStCell中にも同一酵素が多量に存在すること11），ならびに筋ジストロフ

2）アルファメ二ン短期投与による体重変化

ィー症マウスで著しく活性が増加していること12）

1カ月齢の疾病マウスにアルファメニソAある
いはBをそれぞれ単独で6週間連続授与した場合などが知られている．さらに，骨格筋中のmast−

84−

筋ジストロフィー症マウスに対するアルファメニソ投与の影響△一△一・・・△△／△／△／△／ムー△／Nor血＋saline△／

ムー1／△／︵u︶王君主音○皿

Dystrophic＋aTPhamenine A

△一止／
△／△一′

王三三三三三Dystrophic＋arphamenine B

Dystrophic＋arphameni

Dystrophic＋saline

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Administrationperiod（day）

図1
表3に，臨床症状および体重の変化に対してどのよう

Effects of arphamenineA administration
on serum enzymeactivitiesindystrophic

な影響を及ぼすかについて観察を行った・症状進mlCe

行に関しては，食塩水投与対照あるいは同齢無処置疾病マウスと比較してほとんど変化が認められ

Administration period
Enzymes

2weeks

4weeks

6weeks

PK

70．9

84．2

69．2

84．5

CPK

52．0

63．6

85．9

122．5

なかった．体重変化に関しては，図1のように，わずかに投与群で増加の傾向が認められた・アルファメニソAとBの間にはそれほど差異は認めらLDHれなかったが，対照群に比較して体重増加の最もUnit：arphamenine A／saline xlOO・著しいのは投与開始後2週間くらいまでで，その表4

後は対照群とほとんど並行的な経過を示していた・
3）アルファメ二ン連続投与のマーカー酵素活

12weeks

92．6

146．0

Eだects of arphamenine B administration
on serum enzymeactivitiesindystrophic
mice

Administration period
Enzymes

2weeks

4weeks

6weeks12weeks

性に対する影響PK l28．1

発症後やや時間が経過し症状進行がみられる1

CPK

67．6
72．1

94．6

45．0
100．8

カ月齢の疾病マウスを用いて，アルファメニソを

LDH l47．5

種々の期間に分けて短期連続投与を行い，血清中

Unit：arphamenine B／saline xlOO・

125．7

140．4

64．4
110．6
115．2

に遠出しているマーカー酵素の活性変動に与える影響を調べた．表3および蓑4は，それぞれアルCPK活性がわずかに上昇している以外は，このファメニソAおよびBについての結果を示したも傾向は他の投与期間でも同様に認められた・
また，アルファメニソB投与の場合は，PK活のである．
まず，アルファメニソAであるが，2週間の投性は投与期間が長いほど低下の傾向が強く現れて与によってすでにPKおよびCPK活性が大幅にいるが，CPK の場合はあまり大きな変化はみら低下していることが認められる．12週間投与でれなかった．

−85−

表5Effectsofarphamenine A administrationon muscle enzyme
activitiesin dystrophic mice

Administration period
Enzymes
2weeks

4weeks

6weeks12weeks

159．0

151．4

155．9

106．7

87．6

198．1

124．2

134．1

133．3

Alk．protease

63．5

48．8

69．4

79．7

Neut．protease

72．2

86．3

158．2

89．3

Unit：arphamenine A／saline xlOO．
表6

Effects ofarphamenine B administration on muscle enzyme
activitiesin dystrophic mice

Administration period
Enzymes

2weeks

4weeks

6weeks12weeks

142．9

78．2

114．3

165．6

70．9

100．2

143．3

145．8

133．7

Alk．protease

60．7

80．3

61，5

45．4

Neut．protease

72．8

87．6

83．9

60．9

Unit：arphamenine B／saline xlOO．
表7

Effects of arphamenine administration on urinary creatine concentrationin dystrophic mice

Treatment

Creatine
Creatinine

1

6
5

1

6
0

1

0
6

1

2
7

0

2
8

6

1

一 寸

8
7

0

3

8

0
2

1

3

9
1

9
2

9

1

1

2
1

1

1
4

6

1

6

0 ． 4

7

8

12weeks

6

weeks

2

weeks

6

6

2weeks
4

0

weeks

6

weeks

12

0

weeks

6

Creatinine
4

2weeks4Arphamenine B

Creatine

1 1
1 1

Arphamenine A

Period6

93

Dystrophic

1

6

0

Normal1

Unit：mg／dl．

さらに，LDH酵素の活性に関しては，両薬剤

CPK，およびLDHの活性がいずれも上昇し，ことも，その投与によって血清中の活性上昇をもたの傾向は12週間投与でさらに強くなり，とくにらすことが認められた．

CPK 活性は対照マウスの2倍に活性が上昇し，ほぼ正常マウスの値になっていることが認められ一方，骨格筋中におけるマーカー酵素群の活性変化は，表5および表6のごとくであった．

た・また，プロテアーゼ活性も2週間投与で大幅アルファメニソA投与では，2週間でPK，な活性低下を示し，12週間でも同様な傾向が認
−

86

−

筋ジストロフィー症マウスに対するアルファメニソ投与の影響

細胞数がアルカリプロテアーゼ活性の上昇と並行められた．
アルファメニソB投与の場合はプロテアーゼ活して増加していることが推定された・さらに，心性に対する影響がさらに顕著で，12週間投与で臓，肝臓などではこれら一連の変化があまり顕著

は，中性，アルカリ性ともに対照マウスの約1／2に認められないことから，これらの変化が骨格筋に低下していた．ところが，PK，CPK，LDHなの萎縮症状の進行に強く関連したものであること

どの活性については，いずれの期間でもあまり著が推測される．
1カ月齢の症状がやや進行した筋ジストロフィ

しい変化はみられなかった．

ー症マウスに，アルファメニソAあるいはBを64）アルファメ二ン投与による尿中クレアチン

週間連続授与した場合の体重増加に与える影響をみる実験では，食塩水投与筋ジストロフィー症マ含量の変化
表7は，無処置の正常および疾病マウス尿中のウスに比較していずれもやや好転の傾向を示す結クレアチン排泄量とクレアチン対クレアチニソ比，果が得られたが，実験個体数が少ないこと，投与ならびに疾病マウスに種々の期間アルファメニソ

期間が短いことなどから，確然たる変化とは認め

AおよびBを投与したときの変化を示したものでがたかった．また，増加の傾向も，投与開始後2ある．疾病マウスでは，正常に比較して尿中のク週間くらいまでが最も著しく，その後は対照マウ

レアチン排泄量が大幅に増加しており，クレアチスの変化とほぼ並行した変化を示していることか

ン対クレアチニソ比が1より高い，いわゆるクレ

ら，このまま長期間投与を続けたとしても症状のアチン尿症を望しているのがわかるが，アルファ

消失に結びつくものとは考えられなかった・

メニソAあるいはBの投与によってもこの傾向は薬剤投与による血清中マーカー酵素の活性変化

ほとんど変らず，したがってクレアチン対クレア

はアルファメニソAのほうがBよりもやや良好なチニソ比もすべて1を超えていた．

結果を示しており，とくにPK活性に関しては，
A，Bともに投与を続けることによって活性が明考らかに低下する傾向を示していた．これは，骨格察

筋中の活性増加の憤向と相まって，筋細胞での膜機能の改善を示唆する結果と考えられる・

今回，疾病のマーカー酵素として用いたPK，
CPK，LDHならびにCANPは，いずれも筋ジ

また，骨格筋中のマーカー酵素の活性変化も総ストロフィー症マウスにおいて，疾病の進行に密体的に改善の傾向を示しているが，アルファメニ

接した活性変動を示すことがすでに知られている

ソAのほうがやや良好な結果を示していた．とく

酵素群である．今回新たにマーカー酵素として活に，12週間投与で，PK，CPK酵素が対照の2倍性測定されたアルカリプロテアーゼは，生後2〜に近い活性増加を示していることが注目される・

3カ月齢の筋ジストロフィー症マウス骨格筋中でさらに，プロテアーゼ活性は，中性，アルカリ性

正常対照の3倍近い活性上昇を示していることがともにアルファメニソAあるいはBの投与によっわかり，疾病進行のマーカー酵素として充分利用て活性低下を示しており，萎縮筋線維中の蛋白分できるものと判断された．また同時に，この酵素

解増加に対して改善の傾向があることを示唆するを多量に含有するmast cellについても，その特ものと考えられる．しかし，アルファメニソがこ異的産物であるヒスタミソの含量が同齢の筋ジス

れらプロテアーゼに対して直接活性阻害作用をもトロフィー症マウスの骨格筋で約3．5倍に増加

つものか，あるいは間接的に影響するものかにつしていることから，間接的ながら，maSt Cell の

いては，今回の結果のみでは判断できない．

−87−

次に，尿中に排泄されるクレアチソ量ならびにStoromer，M．H．A

Ca＋＋一aCtivatedproteasepossiblyinvoIvedinmyo丘brillarprotein turn−

クレアチン対クレアチニソ比に関しては，今回のover：Partial characterizationofthepuri丘ed

実験区すづてについてほとんど改善が認められな

enzyme．BiocheTTlistry，15，2159−2167（1976）．

かった．とくに，アルファメニソAの長期間投与

5）Hess，J．W．，Murdock，K．JリandNatho，G．J．W．

Creatinephosphokinase：Aspectrophotometricmethod withimproved sensitivity．Am・J・CJ仇 Pd沌0．．50，89（1968）．
6）Wroblewski，F．and La Due，J．S．Lactic de−hydrogenase activityin blood．Proc．Soc．
Eェ♪．βJoJ．〟で〟．，90，210−213（1955）．

によって，むしろクレアチン排泄量の増加傾向があることが示された．この結果は骨格筋および血清中のマーカー酵素活性の示す変化傾向とは一致
しないが，その原因は不明である．

7）Tanaka，T．，Harano，Y．，Sue，F．，andMorimlユra，

今回の実験結果全体を通して，アルファメニソ

H．

AとBの効果に関してあまり大きな差異は認められなかった．いずれにしても，アルファメニソA

C九g〃王り62，71−91（1967）．

duorometric procedure for tissue histamine
andits distributionin various animals．J．

ストロフィー症マウスに対して単独に連続投与すを示す結果が得られたことから，さらに発症直後
あるいは末発症の時期からこの薬剤の投与を開始することによって，よりはっきりした疾病抑制効
果が得られる可能性が示されたものと考えられる．
文献1）Tsuji，S．and Matsushita，H．Effect of pro−teaseinhibitors on the activity changes ofseveral enzymesin murine muscular dystro−
phy．J．ダムッ∫わ7．50C．J♪仇，43，374（1981）．
2）松下 宏，辻 繁勝．筋ジストロフィー症マウス
に対するホル7ェニシノール投与の影響．厚生省
新薬開発研究費．微生物の二次代謝産物に由来す
る難病治療薬（ロイペプチン）の開発研究．昭和57年度研究報告書，pp．51−57（1982）．
3）Edmund，T．and Pennington，R．J．T．Mast

グムαr〃ldCOJ．E∬♪．Tんgr．，166，285−292（1969）．

9）辻 繁勝，松下 宏．筋ジストロフィー症マウスに見られる種々の酵素活性変動に対するロイペプ
チン投与の影響．第15回日本実験動物学会講演
要旨集，p．75（1980）．
10）松下 宏，辻 繁勝．筋ジス卜占フィーマウスに見られる種々な酵素の活性変動に対するロイベプ
チンおよびべスタチソ投与の影響．厚生省新薬開発研究室守．微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイべプチソ）の開発研究．昭和55年
度研究報告書，pp．55−61（1980）．
11）Woodbury，R．G．，Everitt，M．，Sanada，Y．，Ka−
tunuma，N．，Lagunoff，DりandNeurath，H．A

major serine proteasein ratskeletalmuscle：

Evidenceforitsmastcellorigin．Proc．Natl．
A ば．grf．U．ぶ．A．，75，5311−5313（1978）．
12）Sanada，Y．．Yasogawa，N．，and Katunuma，N．
Serineproteaseinmice with hereditarymus−
Cular dystrophy．J．Biochem．（Tokyo），83，
27−33（1978）．

13）Bois，P．Mast cells and histamine concentra−

Cell origin of myo丘brillar protease of rat
skeletal

and

heart

muscle．Biochem．Bi0＿〆ッ∫．Acfd，661，28−31（1981）．
4）Dayton，W．R．，Reville，W．J

Characterization and8）Anton，A．H．and Sayre，D．F．A modiaed

あるいはBをすでにある程度症状の進行した筋ジることにより，わずかではあるが病状改善の憤向Crystallization，

metabolicregulationof two typesofpyruvatekinasesisolated from rat tissues．J．Bio−

Go11，D．E．，and−88−

tionin muscle andliver of dystrophicmice．

山肌J∴銅が最．，206，338−340（1964）．

2，3の筋萎縮症患者に対するべスタテンの効果

村 上 慶 郎＊
研究協力者

岡崎

隆＊・林

英人＊・石川和彦＊

100mgずつ増量し，600mgから1，500mgに及はじ

め

んだものもある．

に使用期間は6カ月から30 カ月に及んでいる．

前年度までにロイペプチソ，べスタチソの筋ジストロフィー症および筋萎縮性疾患に対する効果

成績

をみるために検討を加えてきたが，今回はべスタ
チソを筋疾患を主に投与して，その結果を検討し，19例の成績は表1に示すごとくで，初期に自覚

さらに松下班員のベスタチソが動物実験で投与開症状の軽度の改善がみられた多発性筋炎と1歳8始時期が早いほど有効であるとの成績から，1例

カ月の Duchenne 型筋ジストロフィー症のおのの1歳8カ月の型筋ジスト。フィーおの1例以外，明瞭に効果を認めたものはなかっ症の患者に使用を試み，興味ある成績を得たのでた．また，1例の30歳のDuchenne型筋ジスト

報告する．

ロフィー症は肺炎を併発し，呼吸不全で死亡した・

Duchenne

検査成績では，一般尿検査（蛋白，糖，ウロビ

対象および方法

リノーゲソ，沈法）には異常は認めなかった．赤沈，一般血液検査（赤血球数，血色素，ヘマトク

対象は19例で，いずれも国立療養所箱根病院

リット，血小板数，白血球数）でも異常を認めなに入院または外来通院中の患者で，1例の神経原

かった．血液生イ鹿検査では，総コレステロール，性の筋萎縮症を除いてすべてミオパチーである．

総蛋白，電解質（Na，K，Cl），尿素窒素，クレア

内訳は，筋張直性ジストロフィー症3例，Duchen・

チニソに異常を認めなかった．

ne型筋ジストロフィー症3例，顔面肩甲上腕型

血清GOT，GPT，LDH，CPKも，1歳8カ月

筋ジストロフィー症2例，肢帯型筋ジストロフィの Duchenne 型筋ジストロフィー症を除いてはー症2例，および多発性筋炎，Duchenne型筋ジ有意の変動を示さなかった．

ストロフィー症の保因者，背髄性進行性筋萎縮症が各1例ずつであった．年齢は1歳8カ月から66

副作用については，とくに認むべきものはなかった．

歳に及び，男性13例，女性5例であった．
べスタチソの使用量は，1日量60，270mgの固定法と，1日量30mgより毎週，一部隔週に30，

1歳8カ月のDuchenne型筋ジストロフィー症のベス夕子ン投与例
症例は男子で，1歳6カ月で一人立ちの遅れを＊国立療養所箱根病院
−89−

表1

Name Age Sex Diagnosis besE諾t怨霊hs）（競y）（。崇等t）EHect温47

M Myotonic dystrophy

0．M．

42

M Myotonic dystrophy

K．Ⅰ．

58

M

Y．S．

35

F

H．M．

30

M

O．N．

40

N．M．
T．S．

31
66

M Myotonic dystrophy
F FSH dystrophy
M FSH dystrophy
LG dystrophy

K．0．

60

M

Myotonic dystrophy

N．Ⅰ．

37

M

Myotonic dystrophy

S．K．
N．U．

60
52

H．Ⅰ．

50

T．M．

10

Y．H．

55

9

LG dystrophy0000
3 3 3 3

F
F

8
2

54
52

0
3

Myotonic dystrophy
Duchenne PMD

T．W．

2
1
2
1

M Myotonicdystrophy
M SpinalmuscuIar atrophy？

2

Polymyositis

9
0
3
6

M

1

M Duchenne PMD
F Duchenne carrier
2

270

20〜85

270

31〜199270

44〜541

270

99〜584

270

30〜80

270

33、90

270

42〜142

270

37〜92

270

37〜97

60

160〜33460

109〜2796046′）110

60

8

M

6

K．Ⅰ．

0
3

Myotonic dystrophy

A．0．

55〜140179へ′392

0
3

S・N・

270
270
0
3

M Myotonic dystrophy

0
3

48

0
3

S・F・

Duchenne PMD

Died

56〜101

480〜600

126〜356

270〜600

1，800〜800

300〜900

180〜460±

60〜1，50010，830〜4，510±

主訴として保健所に相談に行き，筋ジストロフィであった．血清CPKは10，830単位，LDH2，450ー症を疑われ本院に紹介された．

単位，GOT195単位，GPT168単位であった．

家族歴では，母親の2人の弟が Duchenne 型

昭和58年7月からべスタチソ60mg／dayより筋ジストロフィー症で死亡している．そのうち1

開始し，ほぼ60mgずつ，隔週に増量していった．

人は，本院で18歳で死亡している．患児の祖母

この間，最初はべスタチソの服用が困難でミルクが四肢近位筋の筋力低下を訴え，本院に通院中でに混じたりしていたが，そのうち患者が気づいてある．息児には4歳の姉がいるが，症状は現れていない．

服用しなくなり，次いで患者がヨーグルトが好物

臨床経過は，正常満期産で生下時体重は3，000
g，頸定は3カ月，1歳6カ月で一人立ちができなかった．

であることから，これに混ぜることにより，服用がスムーズにゆくようになった．
服用開始後4過日の8月下旬には，歩行がかな

来院時の現症は，下肢の近位筋の筋力低下が著り可能となった・しかし，歩行に際してよく転んだ．

明で，両俳腹筋部に仮性肥大を認める．一人立ち

2カ月後の9月下旬にはべスタチソを300mg／

は可能であったが，歩行は数歩のみ可能であっdayに増量したが，この頃から登はん性起立がみた．また，登はん性起立を示していた．

られなくなった・しかし，歩行に際してはよく転

体重は12kgで，検査成績は，尿検査で蛋白んでいた．血清CPKは6，670

単位，GOT168（−），糖（−），ウロビリノーゲソ（＋），沈漆は単位，GPTlO3単位，LDHは2，782単位であっ異常なし一般血液検査では，赤血球数477×104，

た．

34．9，血色素

10月下旬には，歩行能力は，前月に比して転ぶ

11．2g／dl，BUN15mg／dl，クレアチニソ0．4mg／dlのがやや少なくなったと母親は述べている．CPK

白血球数7200，ヘマトクリット−▼90−

2，3の見方萎縮症患者に対するべスタチソの効果

0
0
0

6

0
0
0

4
2

0
0
0

︵ぎ︶人心へ巧て・︵言⊃︶エロ﹂■叉dO

1

2

3

4

5

6

時 間（月）
図1CPK，LDHの推移．−，CPK；一一一一，LDH；一・一・一，べスタチソ．

は7，720単位，LDH

は2，112単位，GOT

表2 べスタチソ大量投与後の検査成績（6カ月後）はBefore121単位，GPTは111単位であった．
Gait

11月には，べスタチソ800mg／dayに増量した．

Unable

Alter

Able

Gower slgn Positive Negative

下旬には，手すりを使用して階段の昇降が可能とBody weight

なってきた．

12kg

CPK lO，830units／1

15kg
7，570units／L

LDH

2，450

2，530

GOT

198

180

GPT

168

158

GPT134単位となったが，臨床的には前月と著

WBC

6，700

6，000

変はなかった．

RBC

477×101

12月には，ベスタチソ1，000mg／dayに増量，
CPKは5，300単位，LDH2，366，GOT135単位，

Hb ll．2g／d1

昭和59年1月には体重14．5kgとなり，べス
タチソも1，200mg／dayと増量した．血清CPK475×104
11．5g／dl

Ht

34．9

34

TP

6．6

6．8

は7，570単位，LDH2，520単位，GOT180単位，
GPT180単位であった．臨床的には，手すりにつ単位であった（表2）．

かまらずに，ゆっくりと階段を昇降できるようになった．

べスタチソの投与量と血清CPK，LDHの変動との関係は図1のごとくである．血清CPKは変

2月には体重は15kgに増加したので，ベスタ動の幅が非常に大きいが，べスタチソの増量ととチソを1，500mg／dayに増量した．これは，体重もに減少の傾向にあるようである．LDH，GOT，1kg当り100mg

GPT はべスタチソの増量と関係がみられる．

のベスタチソを投与したことになる．臨床的には，患児は，転ぶ回数が著しく本症例でも，尿検査で蛋白，糖，沈軽などに異減少し，駅の階段を手すりを使用せずに昇降でき常は認められなかった．白血球数，赤血球数などるようになった．血清CPKは5，230単位，GOTの一般血液検査では異常が認められなかった．そは111単位，GPTは112単位，LDHは2，174の他の血液生化学的検査においても，とくに異常−91−

まり変動をみなかった．この症例も，最初にCPKは認められなかった．
また，現在のところ自覚的な副作用は認められが減少したが，再び増加し，その後変動を繰返しながら下降している．

ていない．

ベスタチソの量と筋ジストロフィーマウスの症
考状の回復については，松下らは至適投与量の使用

案が最も効果があると述べているが，ヒトにおいて筋疾患19例（1例の神経原性筋萎縮症を含はこの量が明らかではない．そこでわれわれは，む）にベスタチソの長期間（最大30カ月）の連続もし至適投与量があるならばそれを見出す目的で，投与を行い，自他覚的症状とCPK活性値などのべスタチソの量を体重1kg当り100mgまで増

生化学的な面からの効果について検討を加えたが，加してみたが，本症例では，CPK

60，270mg／day の固定法では，臨床的にも生化

スタチソの量の増加に伴って減少を示すようにみ学的にも効果は認められなかった．しかし，今回えた．しかし，LDH，GOT，GPTはべスタチソの患者の大多数は成人の患者であり，Duchenneの量には関係がみられなかった．

に関してはべ型筋ジストロフィー症を含めて，発病後相当期間

臨床症状については，Gowerの徴侯の消失，歩経過しており，かつ種々の型を含んでいるため同行時の転倒回数の減少，階段の昇降が可能になる様には論じられない．

などの改善が6カ月間のベスタチソの使用でみら

松下らは，筋ジストロフィーマウスの発症直後れたが，これは患児の自然の発育過程によるもの

からベスタチソを連続投与することによって，いかもしれず，直ちにべスタチソの効果とは断定でったん発現した症状が完全に回復したり，長期投きない．今後さらに，長期間の経過観察が必要で与により著しい延命効果があると述べている．こある．

の考えに従えば，発病初期の患者に投与するほど効果がみられるわけであるが，大多数の成人の筋

お

あ

り

に

ジストロフィー症の患者は正確に発病初期に発見することは困難な場合が多い．これに反して，19例の筋疾患患者にべスタチソを60mg／day

Duchenne型筋ジストロフィー症は，比較的発病から1，500mg／day，6カ月から30カ月にわたっ

初期に発見されやすい．われわれの最後の症例はて使用したが，1例の1．8歳であり，かなり早期からべスタチソが使用フィー症を除いて効果はみられなかった．また，され始めたといえる．また，べスタチソを次第に認むべき副作用もなかった．

型筋ジストロ

1例の1．8歳のDuchenne型筋ジストロフィー

増量するにつれて，血清CPK値は下降の傾向にあった．

Duchenne症に60mg／dayから1，500mg／dayまでのベスタ

従来のわれわれの成人の症例の場合，べスタチ
ソの使用開始後一時的にCPK値が減少するもの

チソの漸増大量投与を6カ月間行って，血清CPKの減少傾向と症状の改善傾向を認めた．

がみられたが，これはその後増加し，その後はあ−92−

ベスタチン服用時のDMD患者の血中濃度
および臨床効果の検討
三吉野産治＊
研究協力者

樋口重典＊・金子

薫＊・羽田

明＊・蒙

徳

也＊

谷山晶彦＊・原口洋吾＊・折口美弘＊

目

方

的

法

これまで，われわれはDuchenne型筋ジスト

対象はDMD患者20名，年齢は7歳から21

ロフィー症（以下DMDと略す）入院患者10例

歳，Stage（上田の分類）は2から7である・表1にベスタチソを隔月投与法（1日1回早朝空腹時に投与量，投与法，検査日を示した・投与量は成服用）を試み，約7カ月間にわたり血中濃度を検人量で書いているが，アウグスバーガー式より小討してきた．その結果，安定した血中濃度の維持

児薬用量に換算して服用させた・DMD20例には得られなかった・

成人量として60mg／日相当を毎食後30分に服用させ，7日間投与したものを用量固定法とした・

今回入院DMD20例に投与法，投与期間を変5例と昨年実施した入院

さらに，そのうちの5例については7日間ごとにDMD 5例のデータも参考として，血中濃度と臨倍量投与し，成人量480mg／日まで漸増した・検床効果について新たに検討したので報告する・

査日は，内服開始第1日日および倍量された葵用

更し，別に外来DMD

量の最終服薬日にあたる第7，14，21，28日目と
表1
A）用量固定法
60mg／日 60mg／日 60mg／日60mg／日 60mg／日60mg／日 60mg佃

⊂亘亘）2日呂3日日

4日目

B）漸 増 法＊国立療養所西別府病院
−93−

5日E

6日日（頭重）表2

成人量20mg／個

A）Laboratory data〃＝20l）Serum COnCentration of bestatin︵盲︑琶︶∪膏︼SOq−O UO焉し︶uBU00∈2品

O．5（hr）
1．0
2．0
4．0
2）Blood
GOT
GPT
LDH
CPK
Creatlne
Creatlnlne

3）

Urine

㍉∵

urine volume
Creatlne
Creatinine

0．51

2

4

B）ADL
Time（hr）

した・血中濃度および臨床効果を検討するために，

図1朝食後投与での血中濃度推移．

以下の項目をその指標とした（表2）．1）血中濃度測定は，検査日の朝食後投与から30分後，1り半減期Jl／2＝130±68分の短い安定した分布を示した．

時間後・2時間後，4時間後に採血した血清を用

図2は，28日間に及ぶ漸増法5例について朝

いて，大倉班員に測定していただいたものをデー

食後授与した場合の血中濃度（1時間後と4時間タとした・2）血液生化学検査として，GOT，GPT，後）の推移をみたもので，投与量増量につれて血LDH・CPK・クレアチン，クレアチニソを測定し中濃度は上昇を示した・とくに，成人量480mg／

た・3）尿検査は，検査日前日より24時間蓄尿し，日投与7日後には，1時間後の血中濃度が5．64

尿量および尿中クレアチン，クレアチニソを測定±1・96／唱／mJとかなりの上昇を示した．しかし，

した・4）運動扱能評価として日常生活動作（ADL：整形外科的筋ジスト。フィー症ADLテ

4時間後は1・44±0．25〝g／mJで，1時間後に比較してあまり上昇を示さなかった．

スト・厚生省基準）を測定し，べスタチソ服用前

次に，図2の成人量60mg／日投与した7日間後で比較した・5）副作用の検討には，皮膚症状，

での各人の血中濃度の変動と，別に実施した成人

消化器症状，その他の一般状掛こ注意した．

量600mg／日毎食後投与7日間の朝食1時間後の各人の血中濃度の変動をみた．図3に示すように，

結果

成人量60mg／日投与では，1日目に比べ7日目に血中濃度上昇を示した症例は19例（1名測定

図1は，成人量60mg／日を用量固定法にて投不能）中12例で，とくに1日日の血中濃度が0．5与した場合の血中濃度である．朝食後30分に服〝g／mJ以下と低値を示した5例については，7日用させ（成人量20mgの1回投与に相当する），時

日には前測定値以上の上昇を示した．成人量600

間ごとに血中濃度を測定した服用1日目の値であmg／日投与では，血中濃度の目差変動が2倍以上る・20例中19例が30分後に最高血中濃度を示す場合もあった．成人量60mg／日 および

cm．x＝0・72±0・22閥／mJを示し，服用1時間よ600mg／日投与とも，7日間の短期投与ではかな−94−

べスタチソ服用時のDMD患者の血中濃度および臨床効果の検討

成人量480mg／day

成人量240mg．■■day

二王等︶∪葛lSOq IO UO焉LlUBu8∈⊃﹂品
7

川

21

28

Time（days）

図2 漸増法での血中濃度変化．漸増法5例についての，1時間後の血中濃度（●）▼と4時間後の血中濃度（○）を示す・

琵頒ay
M
；支■品吉

訟悪どOmg／day

川

Jl＝19

︵盲＼等︶∪焉︼SOq IO UO焉きBU00∈コLOS
0

7

1

2

3

4

5

6

7

Time（days）

図3 7日間投与での各人の血中濃度の変動・縦軸の値は朝食後1時間の血中濃度を示す．
りのばらつきを示していた・

終量すなわち成人量480mg／日投与での7日目

表3は，漸増法5例において，投与開始量すなのcm8Ⅹを現す時間をみたもので・成人量60

ゎち成人量60mg／日投与での第1日目と投与最mg′日投与では5例すべてが30分後にcmは

−

95

−

表3

漸増法でのCmaⅩ時間の変動

Serumconcentrationofbestatin（FLg／mL）
e
S
a

C

成人量60mg／日

▲

2

9

﹁

3

7

2

3

3

6

1

5

1

8
l

2
l

5
l
l

5

3

3

7

9

6

7

4

1

7

5
3 4・4

l l．5

0

5

5

4

0・5

2
3

7

3

5
1

6

0

0

0

7

5
1

6

0

0

0

2

6

0

0

0

0

3

0

9

5
1

0

0

0

7

0

3

0

5
6

5
3 3・4

0

0

4

3

4

1

2

0

1 2 3・4 54（hr）i o．5
902

成人量480mg／日

0

1

l

2．0

体重当りの投与量（mg／kg）
図4 体重当りの投与量とJl′2の関係．

を示したが，成人量480mg／日投与では5例中3が短くなると推定された．

例が1時間目にcm．xを示した．

図5は，以前実施したDMDでの1日1回早朝

図4は，半減期（fl／2）と体重当りの投与量

空腹時投与の隔月投与法による，1時間後の血中（mg／kg）との相関をみたものである．対象は，い濃度をみたもので，表4で示す成人量150〜200

ままで当院にて授与した症例の中から，少なくとmg／日が成人量480mg／日1日3回のおよそ1も4週間の服用中止によりべスタチソがWash−

回分に相当する．隔月投与では，成人量120〜150

Out されていると思われた症例も含めた．fl／2

mg／日に増量した頃より，投与期間とともに低下

ほ，投与1時間後から4時間後までの血中濃度よ傾向を示す症例がみられ，さらに成人量150〜り算出した・図で示すように，体重当りの投与量200mg／日では低下症例が多くなった．

が0・3−0・5と0・5以上ではfl′2に差が現れ，

図6は・成人量20mg／日1回投与時の血中濃度について，年齢別に7〜12歳（8例）と13〜21

体重当りの投与量が0．5以上となるに従いJl′2−96−

べスタチソ服用時のDMD患者の血中濃度および臨床効果の検討︵盲︑uエリ膏一の3−O UO焉﹂≡8日8∈2品
0

4

8

12

16

20

24

28

¶me（weeks）

図5

表4

1日1回隔月投与での血中濃度変化．年齢5〜9歳の10例にべスタ
チソを早朝空腹時服用させた．投与法は1カ月間投薬し，その後1カ
月休薬を繰返した．投与後1時間の血中濃度を示す（ただし，血中濃度測定不能者が数名ある）．

隔月投与における血中濃度とCPKの変動
成人量28mg／個

Serum conc．† Serum eOnC．
CPK
†
CPK
乃

6
1 ニ

州
外

0

4

2

1

3

2

0

べスタチソを1日1回早朝空腹時に服用させた．
対象は4歳から9歳の10例である．投与量および投与期間は図5に示している．Ⅰは1カ月間投薬した場合，Ⅱはその後1カ月休養し，さらに次の1カ月間服薬した場合である．Ⅲ，Ⅳも同様の投与法を繰返している．

︵盲＼琶︶ U毒の丘−0UO竜こlU8U00∈⊃しお

刀

0
9
1
9
Ⅱ ニ Ⅲ ニ Ⅳ ニ

5

t．0

0．5

三〕トl三

歳（12例）の2群に分けて比較検討したものである．13−21歳の年齢の群のほうが，各時間における平均血中濃度は前者よりやや高値を示した．
図7は，同じく肥痩度との相関をみたものである．今回肥満傾向の症例が少なかったので，はっ0

きりとはいえないが，肥満傾向に伴って血中濃度

1

2

3

4

¶me（hr）が低下することも考えられる．

図6

図8は，成人量60mg／日 投与時における 才．／2
−97−

年齢別による血中濃度の比較．0，13〜21歳（12例）；●，7〜12歳（8例）・

成人量20mg／一回〃＝20︵︑∈＼苫︶∪焉︼SOq︼O UO焉LIUむ28∈⊃L品

●
●

●●
●

●

●

●
●

●

●

●

l．O

0．40．5
Rohrer●●l．5

sindex（g！［3）

図7 把疫度と血中濃度の相関．構軸の値は体重（g）を身長（cm）の3乗で割って100倍したものを示す．
縦軸の値は投与後1時間の血中濃度を示す．
成人量60mg／日︵∪篭︶でこ19．5−6970−日60Cx（mJ／mi叫．48m2）

2

4

0

2

4

Time（Weeks）

図8 CJ とJl′2の相関．

図9

漸増法でのGOTとGPTの変動．

とクレアチニソ，クレアランス（Cr）との相関を

19．5〜69ではfl／2が150±78分と長く，ばらみたものである．Cr値を19．5〜69（13例）とつきが大きかった．

70〜116（7例）の2群に分けて比較すると，Cr次に，べスタチソの臨床効果について検討を加値が70〜116ではfl／2が93±12分と短く，しえた．べスタチソを漸増授与した5例につき，服かもばらつきも小さかった．一方，Cr値が薬前および最終服薬日（28−98−日日）のGOT，GPT

ベスタチソ服用時のDMD患者の血中濃度および臨床効果の検討
3

享，000

2
−

己

、三

2．000

0

＝
⊂】
」
一
一

2

一

3

0
0

2

4

Time（Weeks）

図10

−

1．000

図13 ADLに及ぼすべスタチソの効果．縦軸は服用後のADL値より服用前のADL
値を差し引いた値である．60mg／日を1週間投与した5例をAに，漸増法を4週間行った5例をBに示す．

漸増法でのLDHの変動．

毎食後投与してCPKを測定すると，2ないし3カ月頃よりCPKが低下してくる例がみられた．
すでに図5に示したように，べスタチソを1日1回早朝空服時に隔月投与し，7カ月まで服用させ
0

1

2

3

た患者について，血中濃度とCPKの動きに関し

4

Time（weeks）

検討を加えたものが表4である．血中濃度が上昇

図11漸増法でのCPKの変動．

しCPKも上昇している例数は，投与期間が長く（図9），LDH（図10）を測定した・GOTは前後なるにつれて少なくなる傾向がみられた．一方，の値に大きな変化はみられず，GPT において上血中濃度が上昇しているがCPKは低下してきた

昇傾向が見受けられた．LDH は上昇した者が2

例数は，5カ月頃までほ増加しつつあった・

例，ほとんど変化しなかった者が3例であった．

図13は，用量固定法および漸増法のそれぞれの変動をみたものであ

5例につき，服薬前後のADLの値の変動をみた

る．CPK の値には一定した傾向はみられず，各ものである．1週間投与した場合（A），軽快1名，個人においてもいくぶん変動はあるものの，低下不変1名，低下3名であり，4週間の漸増法（B）

する傾向は示さなかった．図12は，べスタチソ

では軽快1名，低下4名であった．

図11は，同様にCPKを長期間投与した場合のCPKの動きをみたもの

副作用に関しては，服用者20名中，発疹1名，である．外来患者4名に，ベスタチソを60mg／日

悪心，嘔吐1名であった．発疹は，服薬4週目頃
より体幹部にみられ，服薬終了後に消失した．その性状は米粒大ないし大豆大の膨疹であったが，掻序感はなかった．悪心，嘔吐は服薬ごとにみられたわけでなく，その因果関係は不明であった．

考
O I

2

3

llrne（rnonths）

図12

案

長期服用におけるCPKの変数．ベス
タチソ60mg／日を毎食後投与した4例のCPKを測定した．

これまで，われわれはべスタチソの投与量，投与法を吟味しながらその血中濃度を測定してきたが，安定した血中濃度を得ることが困難であっ−99−

た．今回，毎食後3回の分割投与を行うことによが必要と思われる．

り，ベスタチソの増量に伴いその血中濃度も上昇

一方，臨床効果を検討してみると，今回の投与し，また安定した血中濃度を得ることができた

法において，GOT，GPT，LDHの漸増法前後の（図1）．これにより半減期を測定することが可能

値に有意な差はみられなかったが（図9，図10），となり，べスタチソは半減期の短い比較的吸収のCPKの低下してくる症例がみられたことがわれ

速い薬物であることが推測された．また，その投われの興味をひく点である（図11）．また，60

与量により cm．x を示す時間にずれがみられた

mg／日毎食後投与においても，期間が2ないし3（表3）．その原因として，一般的には，肝内薬物カ月になると CPKの低下する例がみられている代謝に伴う血液中での薬物ターンオーバーの速度（図12）．さらに，50〜65mg／日1回投与においの変化が考えられる．しかし，漸増法5例の各投ても，CPK が低下してきている症例が長期間服与量ごとでの検査日の血中濃度を検討した結果，用により増加傾向を示している（表4）．このこ

CmhⅩがすべて服用後30分ないし1時間にあり，とは，臨床効果には，投与量や方法よりむしろ，

正確にはべスタチン代謝物の増減をみないとわか期間を延ばすことがより重要であることを示唆しらないが，30分前後のずれからは薬物代謝の変ているとも考えられる．ADL の結果をみると，化によるものとは考えにくい．また，半減期と体1週間から4週間という短期間では増悪する例の重当りの投与量の関係で，0．5mg／kg以上になるほうが多いが（図13），長期間投与すれば改善すと半減期が短くなることが推定された（図4）．

る例あるいは進行が遅れる例がみられるかもしれ

このことは，体重当りの投与量が増加するに伴いない．ただし，投与期間が長期になると，病状のcm．xの値が上昇するのに比べて，投与後4時間進行に伴うCPKの低下例がみられることより，

での血中濃度の上昇はあまり高くなかったためと可能な限り年齢や進行度を合せた対照群が必要で考えられる．これらの血中濃度の検討結果から，あろう．

投与法，投与量，投与期間について以下のことが今後の課題として，ADLの検討も含め，血中考えられた．毎食後投与では夕食後投与から翌日

濃度と年齢，肥痩度，Cr との相関をより詳しくの朝食後投与までに12時間以上のブランクがあ

検討することが残されている・

り，べスタチソの半減期が短いことも考え合せる

したがって，今後の方針として，副作用に注意と，1日4回の分割投与がより有効と考えられる．

しながらベスタチソの投与量を480mg／日 より

また，毎食後3回投与では480mg／日まで増量す

さらに増量しつつ血中濃度の飽和点を見出し，そるにつれて血中濃度が上昇しており（図2），その量の3ないし4分割投与による長期投与を行いの上昇が飽和点に達するべスタチンの量を求める

ながら臨床効果を判定したいと考えている．

ことも今後に残された課題の1つである．さらに，600mg／日 7日間の短期間では各人の血中濃度にばらつきが大きいこと，また1日1回隔月投与法
よりも1日3回連日投与のほうが安定した血中濃度が得られたことより，べスタチソの長期間服用−100−

本研究を行うにあたり，血中濃度を測定していただ
きました大倉洋甫教授に深謝致します．また，他の面で協力いただきました西別府病院吉田祐三，植田博子，矢野恵子，守田和正，小国美昭の各氏に深謝致します．

進行性筋ジストロフィー症に対する
べスタチンの使用経験
福 山 幸 夫＊
研究協力者 大澤真木子＊・宍倉啓子＊・鈴木場子＊
陶山亜理子＊・森本武彦＊の式に従った．また，さらにその後副作用を認め
目ない場合，家族と合意のうえで30mg／kg／日まで的増量した．この際，Duchenne型の症例10は
ァミノべプチダーゼBおよびロイシンアミノペ

15mg／kg／日で授与したつもりであったが，家族

プチダーゼの活性を括抗阻害する作用をもつベスの誤解で45mg／kg／日で服用してしまい，すぐにタチソの，進行性筋ジストロフィー症に対する治は減量したくないとの家族の希望もあり5週間同療効果につき臨床的に検討する・

量で継続した．また，Duchenne型の症例8，9・
ぉよびLG型の2例はプロトコールの手違いが対あり，投与法が少々異なっている・

象

検 査 方 法東京女子医科大学小児科筋肉外来に通院中のDuchenne型10名，Becker型3名，肢帯型2名，先天型5名（福山型4，良性型1）1）の計20

図1に示すごとく，最初の4週間は1日目（服名である（表1参照）．Duchenne型の症例1と用前），7日目，14日日・21日目，28日日に採先天型を除き，全例階段昇降可能である・

血および一日採尿を行い，血清中のLDH・GOT，
GPT，CPK，アルドラーゼ，クレアチニソ，クレ

投

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方

ァチソ，カルニチソ，べスタチソの血中濃度，尿法

中のクレアチソ，クレアチニソ，3−メチルヒスチ原則として，最初の4週間は図1に示すごとく漸増量に従い，1週間ごとに成人量の60→120→

ジンの測定を行った．その後は，約1カ月間隔で同血清酵素を検討した・

240→480mg相当量を1日分として漸増投与し，運動機能評価

毎食後30分に分3で服用させた・480mg相当量に達したのちは最終量で維持した・この場合・小投与開始前，7日目，14日目，21日目，28日

児量の換算は
小児薬用量＝（小児の体重）×1．5＋10100×成人薬用量＊東京女子医科大学小児科

日および，その後は約1カ月ごとに評価した・運動機能評価としては，自覚症状（転びやすさ，活発さなど），運動機能レベル，20m走行時問，20m歩行時間，階段を昇る時間（9段），片足立ち−101−︵サー・肖Imt・目︶．AOLdE二UU芯u巴ト︵讐−肖−
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進行性筋ジストロフィー症に対するべスタチソの使用経験
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図1投薬法および検査スケジュール．

保持時間，上肢挙上保持（1800）時間，下肢挙上保らかな運動機能の獲得，改善を示したのは Du・持（900）時間，寝返り，臥位→座位時間，臥位からchenne型の症例1（preclinicalcase）と先天型の立ち上がり時間，ジャソプカ，肺機能，ピソチの症例1，2，5のみであった．

メーターによるピンチカ測定，脛反射の有無，なDuchenne型では，症例4，8が全経過を通じどである．歩行不能な先天型あるいはpreclinicalて軽度運動機能レベルの改善がみられた，他の症

Duchenne型（症例1）では，いざり這いのスピ

例では，一時的に次に述べる起立時間や，走行時

ード，つかまり立ち保持時間など，適宜項目を変間の改善をみたものもあったが，機能レベルとし更して評価した．

ては使用前の機能レベルより低下していた．
Becker型，LG型では，一過性にやや機能レベ副作用の評価ルの上昇した1例を除き運動機能レベルの変化はなく，また走行時間や起立時間などについてもほ皮膚症状，消化器症状，精神症状，体温などのとんど変化がみられなかった．

一般状態，血液一般，血液生化学所見につきチェックした．

先天型では，前述の運動機能上昇期1）にある症
例1，2，5では多少の機能毎改善があったが，運動機能下降期1）にある症例3，4では明らかな

評

価

法

運動機能の改善は認められなかっ丈．しかし，症例4では過去1年間体重が減少傾向にあったもの

Duchenne型の症例3は最初の4週間は入院でが増加し，活気が出てきたという．

評価したが，他の症例は全例最初の1週間のみ入院で評価し，その後は外来で評価した．

2．Duchenne型筋ジストロフィー症の投与前後の変化について

結1）運動機能果

1．全症例の運動機能レベルの変化

種々の項目につき検討したが，起立時間，20m

表1右端の欄に示すごとく，全経過を通して明走行時間（走行といっても Duchenne 型では速−105−

長し，最終観察時には46秒もかかるようになり，
なおかつ何かものにつかまらなければ立てなくなっている．同様に，症例7でも開始前27秒9であったのが，4．8mg／kg／日（成人換算量120mg）に15秒と短縮した．しかし，これも一過性である．
症例5はやや特異である．開始前の起立時間が19秒であったものが，第2，第3週には軽度短縮（13〜15秒）した．しかし，その後増量とともに再び延長し，24mg／kg／日投与後には28秒に至った．その後1カ月に，食欲不振，感染に伴う全身倦怠感のため家族が勝手に服薬を中止し，中止
後1カ月半で測定したタイムは22秒と再び短縮
していた．
10秒以内に起立可能であった症例4，6では，投与前に比し，最終観察時には平均2秒6短縮している．

b）20m走行時間（図3）SeO

図2 床からの立ち上がり時間のべスタチン投与前後の変化．太い実線は左方の測定点より右方の測定点へ移る間に薬の量がふえていることを示し，細い実線は薬が同量で維持されたことを示す．点線は薬が減らされたことを意味する．図3についても同様の表現法を用いた．
歩のような状態となる）が最もばらつきが少なく信頼性があると思われるので，この2項目につき述べる．
a）床からの起立時間（図2）
べスタチソ開始前には，仰臥位から10秒以内に起立可能な例（症例2，3，4，6，8；2歳10カ月〜6歳7カ月）と10秒以上要する例（症例5，7，9，10；症例5を除き全例7歳以上）とあった．図2をみても明らかなように，症例3，8を除き初期に一過性ながら起立時間の短縮が認められた．とくに，症例10では投与開始前33秒であったのが，5mg／kg／日（成人換算量120mg）を服用後18秒5に短縮していた．しかし，その後2．5mg／kg／日に減量したのちは徐々に延−106−

進行性筋ジストロフィー症に対するベスタチソの使用経験

症例5，6，8を除き初期に一過性の改善が認乗といわれ，筋肉崩壊の目安となるといわれていめられる傾向にあり，症例3，4では最終観察時

る．筋ジストロフィー症では全身の筋量が減少しに，開始前より平均2秒早くなっている．

ていると考えられるので，3−メチルヒスチジソ／

2）検査所見クレアチニソ比を出して全身の筋量に対する筋崩a）血清クレアチンホスフォキナーゼ（CPK）

壊の指標とした．
今回の研究では，とくに投与開始4週間までの値

問，1週間ごとに蓄尿を行い分析を試みた．しか

図4に示すごとく，症例3を除く全例で，投与開始1，2，3遇は低下傾向を示した．その後は，しながら，蓄尿が失敗に終る例もあり，開始前値

開始前値より高い値を示すものも低い値を示すもから値を得られたものは5例のみであった．

のもあった・症例10は開始前5，220mU／mJでこのうち3例（症例2，4，8）では，前値よあったものが，45mg／kg／日服用しているときにり4週間目の値のほうが低かったが，2例（症例はその1／5の値の1，016mU／mJまで低下してい5，7）ではむしろ増加していた．開始前倍とた．

1，2，3，4週目の値を比較したが，有意な差はなかった（図5）．

b）尿中3−メチルヒスチジン／クレアチニソ比

べスタチンの投与量（／体重／日）と3一メチルヒ

尿中の3−メチルヒスチジンは主として筋肉由CPK（mU／mり
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図53−メチルヒスチジン／クレアチニン比のべスタチソ投与後の変化，
−107−

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中のGOT，GPTが測定され，その高値のために0．09

乳児肝炎として他院で経過観察中であった症例である．たまたま血清CPK値高値が発見され，当0．08

院に転科してきた．定頸3カ月，座位保持8カ月
0．07で，投与開始直前1歳2カ月の状態で移動はいざ
0．06

り這いにより，つかまり立ちが10秒可能であっ0．05

たが，四つ這いやstand up withsupport

0．04

能であった．投与開始1カ月後（1歳3カ月）に0．03

はつかまり立ちが20分くらい可能となり，2．5

0．02

カ月後（1歳4カ月）にはったい歩きが可能とな

は不り，5カ月半後（1歳7．5カ月）にはstand up

0．Ol

with supportが，また1歳8カ月現在10秒く

0 12 3 4 5 6 7 8 910日1213川15．

らい一人立ちが可能である．

Dose ofbestatin（mg／kg／day）

血液検査所見では，CPK，GOT，アルドラーゼ

図6 3一メチルヒスチジン／クレアチニソ比の体重当りべスタチソ投与量（mg／kg／日）との関係．

ともに2週目に一過性に減少傾向を示したが，その後は元の値に戻っている・

スチジソ／クレアチニソ比を比べてみても，特別べスタチソの量を21．5mg／kg／日に増加したとな関係は得られなかった（図6）．

ころで発熱，発疹が出現し，咽頭発赤その他の感3）Duchenne型筋ジストロフィー症2，3の染散候がなかったため薬疹を疑い，投薬を中止し例についてた．その後2，3日で発疹は消失したが，この投a）運動機能獲得を示したpreclinicalDuchen・

薬を中止してから非常に元気がなくなり，梯妹がne（症例1）について（図7）

悪く食欲も悪かったという．1週間の休薬ののち本症例は，新生児期に黄症が菰かったので血清

S．S．（ly2m）（1982．6．27）Prectinicalcase of Duchenne type PMD

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図7 べスタチンの投与中に運動機能拉得を示した preclinical Duchenneの1例（症例1）．
−108−進行性筋ジストロフィー症に対するべスタチソの使用経験
S．S．（5y5mStageI1−14）DuchennetypePMD
1983AugSept0 0ct．Nov．
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図8 一過性に運動機能レベルの改善のみられた症例・

再び少量ずつ投与したが，著変なく，また食欲もしていた．しかしながら，食欲不振があり，体重出て元気もよくなったという・

も減少していたので，増量前の量に戻した・その後再び手すりを必要とするようになったが，機能b）一過性に運動機能レベルの改善のみられレベルとしてはⅡ−13にとどまっている．また，た症例（症例4）（図8）
母親の兄弟に筋ジストロフィー症の患者がおり，母の姉妹の遺伝相談からこの患児を発見し，2歳％肺活量も，投与開始前80％であったのが95％に増加している・

10カ月より経過をみている症例である．べスタ

血清CPK，GOT，アルドラーゼの動きをみる

チソ開始前は，階段を昇るのに片手は手すりにつと，投与開始後初期に一過性に減少し再び増加し

かまり，片手は膝に手を置く状態（Ⅱ−14）であているが，11〜14．6mg／kg／日投与中にはやや低った．投与開始後1カ月の状態で階段を昇るのを下している．また，14．6mg／kg／日から11．6mg／

観察したところ，手すりも使わず，片手の膝おさ

kg／日に減量投与したのち1カ月の時点では，逆えのみ（Ⅰ−2）でさっさと昇っていった．この時に増加している．

期には，走行時間も起立時間も軽度短縮していた・

尿中3−メチルヒスチジソ／クレアチニソ比につ

その後同量（9．8mg／kg／日）で薬を続けていたが，いては，14．6mg／kg／日投与後1カ月の時点でや寒くなると同時に，階段上昇に片手手すりと片手や低下したが，他はほとんど変化がない・

膝おさえを必要（Ⅱ−14）とするようになった．薬C）一過性に改善傾向を示したが，中止後3日を14．6mg／kg／日まで増量して授与し，1カ月経目に最悪の状態を示し，中止後1カ月半には無投

過したときには，再び手すりなしで階段を昇るこ

薬のまま改善を示した症例（症例2）（図9）とができる（Ⅰ一2）ようになり，起立時間も短縮−109−

症例4の弟である．座位保持8カ月，歩行開始

S・S・（2yJOm）Duchennetype PMD
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ll．●rUnnlng〇・一Sbnd岬●￣●％VC〇図9 一過性に改善傾向を示したが中止後3日目に最悪の状態を示し，中止後1カ月半には無投薬のまま軽度改善を示した例（症例2）．

1歳6カ月である・2歳10カ月現在走れず，階ついては変化がなかった．

段は四つ這いで昇る・投与開始後走行時間，立ち血清CPK，GOT，アルドラーゼについては軽上がり時間ともに短縮し，1カ月半後には階段を度低下している．ことにCPK

昇るのに片手手すり，片手膝おさえ（Ⅱ−14）で昇開始前11，000mU／mJあったものが，開始後からについてみると，

るようになり，改善をみた．15．6mg／kg／日で投4カ月までの間は6，000〜7，000mU／mJ程度に落与したあとが最もよい状態にあったが，食欲不振

ち着いており，また15mg／kg／日投与していたあがあったため10mg／kg／日に減量した．3週間くとは5，770mU／mJとやや低下している．その後，らいで葦麻疹が出現したため，親が勝手に薬を中

服薬中止後3日日の採血では，11，716mU／mJと止して，3日目に来院した．この時点で階段昇降上昇している・この患児においては，尿中の3−は四つ這いで可能，走行時間も起立時間も延長しメチルヒスチジン／クレアチニン比は血清CPKていた・この状態が自然の経過なのか，薬を急激と並行して動いている傾向にあったが，開始前のに中止したことの影響なのか，寒さの影響か，多値より低下していたのは1週間のみであった．

量投与が悪影響を与えたのか不明であったので，そのまま無投薬で経過をみることにした．投薬中

3・先天型筋ジストロフィー症で運動機能獲得

止後2週間および1カ月半に観察したところでは，のみられた症例について

走行時問も起立時間も中止後3日日の状態に比べ

a）福山型の1例（症例2）（図10）

ると短縮し改善を示していた．運動放能レベルに福山型先天性筋ジストロフィー症2歳10カ月

ー110−進行性筋ジストロフィー症に対するべスタチンの使用経験

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図10 運動枚能の獲得を示した福山型先天性筋ジストロフィー症の1例・

運動機能レベル ︵上田︶
5歳6カ月

5歳

4歳6カ月

4歳

3歳6カ月

3歳

2歳6カ月

2歳

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図11先天型筋ジストロフィー症における運動後能獲得歴とベスタチソ使用例の運動枚能狂得歴との比較・●はベスタ
チソ使用開始前にそのレベルに到達したことを示し，㊨はベスタチソ使用開始後に到達したことを示す・回申
HKは症例5の良性先天型，RTは症例2，MKは症
例1で，ともに福山型である．

b）他の先天型筋ジストロフィー症の運動発の症例で，いざり這い移動は可能であったが四つ
這い不能，つかまり立ち不能であった・べスタチ

達歴と比較して（図11）

ソ投与開始後1カ月頃より，浮力の助けを借りれ

図12に示したのは，東京女子医大小児科筋肉

ば湯舟の中でつかまり立ち可能となった・いざり

外来において経験した先天型筋ジストロフィー症

這いのスピードはあまり変化がなかった・血清の運動機能獲得歴の平均±S・D・である・症例1

CPKは入院1週間目に軽度低下したが，GOT，（M．K．）は，2歳になっても匪位保持可能とならアルドラーゼはほとんど変化がない．

ず，生涯定頸のみに終る可能性もあると危惧して
ー111−

いた症例であるが，べスタチン服用を開始した翌

由で無投薬のまま経過を観察中である．

日より数秒ずつ座位保持可能となり，現在は30〜

2例日はDuchenne型の症例5で，新生児〜40分可能である．

乳児期に先天性筋炎の診断名で他院においてステ

症例2（R・T・）は，1歳5カ月でいざり這い可

ロイド剤を投与されていた例で，年齢（5歳9カ能となっており，福山型の女児例としてもともと月）のわりに運動機能レベルが落ちている症例で運動機能獲得の早い症例であった．「四つ這い可

ある・24mg／kg／日で投与して2週間目頃より食能もしくはつかまり立ち可能」が次の目標とする

欲不振があり，ごろごろと横になってばかりいた獲得機能である・ベスタチソ投与開始後，湯舟のという・たまたま母親のお産で祖母がみていた中ではつかまり立ち可能となったが，四つ這いはが，感染羅息も重なり，感冒薬をのませるために不能であり，レベル4と5の間と考えるべきであろう．

べスタチソを中止したところ，翌日から元気に動き回るようになったという．以後，この例には投薬を行っていない．

症例5（H・K．）は，べスタチン開始前より2，3歩独歩可能であり，良性先天性筋ジストロフィ

3例日は，先天型の症例3である．べスタチンー症と考えられる症例である・ベスタチン開始後

投与中に上気道感染があり，高熱が出たために，歩行の安定化，スピード化をみた．2歳8カ月よ

解熱剤（潰瘍の合併がしばしば報告されているもり両手で手すりにつかまり，すべり台の階段を昇の）を併用投与した・3日日より食欲不振，嘔吐

るようになった・著者らの経験では，良性先天型があり，少量の吐血を伴ったため，直ちにすべてで階段昇降可となったのは，これまで1例のみの薬剤の経b投与を中止した．翌日からは嘔吐も（4歳10カ月で獲得）である．

消化管出血もみられないが，この症例にはべスタ
チソを再投与していない．

4．副

作

用

べスタチソ服用中に麻疹に罷息した症例が2例

表1のClinicalepisodeの欄に，べスタチソ月艮
用中に起った，息児にとって不利なepisodeをあったが，その症状，経過とも平均的なものであった．

記してある・この際，体重当りのべスタチソ量の欄（b）にそのepisodeが生じた時期を＊印で記考案した・これらのepisodeの中で，発熱はほとんどの場合上気道感染の徴候を伴っており，べスタチ

べスタチソほ，アミノべプチダーゼBおよびロソとは因果関係がないと思われる．べスタチソのイシンアミノペプチダーゼの活性を括抗阻害するために生じたと思われるのは消化器症状で，Du・作用をもつと同時に，細胞表面に結合する．このChenneの症例2，4，5，LG型の2例でみられた．

結果に基づいて免疫増菰剤として開発されている．

このときの投与量は10〜24mg／kg／日である．こ筋ジストロフィーマウスおよびニワトリの筋肉内

れら消化器症状は軽いもので，減量または消化剤のアミ／べプチダーゼ活性が正常群に比して異常投与で消失している・べスタチンを中止した症例に上昇していることが明らかになったことから，は3例いた・1例は前述のDuchenneの症例2

本剤が筋ジストロフィー症の治療薬として使用さで，孝麻疹が出たために両親が服薬を中止してきれるようになった3）．また，ジストロフィーマウた症例である・中止したのちも等麻疹が出没してスの実験では，血清酵素の減少，体重増加，およおり，ベスタチソ以外の原因が考えられる．両親

び金網よじ登り実験による筋力回復が報告されてはベスタチソ再投与を希望しているが，前述の理いる・この場合，発症初期に投与開始することが−112−−

進行性筋ジストロフィー症に対するべスタチソの使用経験

にべスタチソ20mg／kg／日の治療開始後1〜2週重要であるという4）．
今回のわれわれの使用経験では，明らかな運動

で筋力の回復がみられたが，3週目からは再び元機能の改善がみられたのは，preClinicalDuchen−の状態に戻ったと報告している6）・著者らの経験

neの1例（症例1）と運動機能上昇期にある症では，使用開始後3週目頃までの改善煩向が目立

例1，2，5の4例のみであった・PreClinicalっているので，投与量をふやしすぎないほうがよDuchenneの症例1では，つかまり立ち保持時間

いのかもしれないが，中には減量により悪化し始の延長，つたい歩きの獲得，Standupwithsup−

め，増量により再び改善したものもあり（症例

portが可能となって，明らかに運動発達がみられ

9），現在のところ理由は判明しない・今後，た．しかし，1歳8カ月現在まだ独歩不能であり・

1）長期投与した場合，生体側に慣れの現象がDuchenne塑一般の運動発達歴で独歩開始の年齢生じて効果が出なくなるのか．これは量に関係すが1歳5．82カ月±5．78カ月である5）から，それるか否か．
2）至適投与量は体重1kg当りどれくらいなに比し早いとはいえず，べスタチソの効果によるのか自然の発達なのか判断できない・むしろ，後のか．また，その量を超えて投与した場合，むしろ悪化する可能性があるのか・者の可能性のほうが強いであろう・

3）減量または中止したのちに反動現象がみら

先天型の3例についても，やはり自然の運動発れる可能性があるのか．また，その理由は何か・達である可能性が強い・
軽度運動機能の改善のみられた症例4は，最もなど，解明してゆくべき問題がある・
検査所見では，血清CPK，GOT，アルドラー

べスタチソの効果を感じさせる症例である・しかし，その弟（症例2）は，ベスタチソ14mg／kg／

ゼなどが一時的に減少を示した症例が多かった・

日で投与しているときが最良の状態であったが・最初の1週目は入院中に測定したので，より安静

10mg／kg／日に減量し，しかも葦麻疹のために中が保たれ，低値を示したともいえるが，2週目以止して3日経過したときには運動機能も悪く，そ

後の値については入院，外来は無関係である・まの後休養1カ月で評価したところ，無投薬の状態

た，45mg／kg／日で投与した例では明らかな低下でありながら走行時問も起立時間も改善している・がみられ，膜の安定性に本剤が関係していること

ほかにも減量直後に悪い状態を示した症例（9，がうかがわれる．

10）があることから，減量による一過性の反動現結象のようなものがあるのかもしれない・しかし・語

その後無投薬のまま状態がよくなっているということは，他の例の運動機能改善の判断にも慎重を

1）進行性筋ジストロフィー症20名に対して要するということになる・本症例ではもうしばら

べスタチソを経口投与し，その効果につき検討をく無投薬で運動機能を評価し，悪化傾向がみられ加えた．

るようならば再投与して評価するつもりである・

2）Duchenne塑筋ジストロフィー症のpre・全経過を通しての運動横能は悪化傾向にあって

clinicalcaseおよび運動機能上昇期にある先天型

も，投与開始後間もない時期に，一過性に起立時の3例ではべスタチソ投与中に運動機能獲得をみ間，走行時間の改善をみた症例が多かった・症例

たが，Duchenne型，先天型の平均的経過に比べ2のように無投薬でも改善憤向を示す例もあるのて明らかによいとはいえなかった・

で，一概にはいえないが，べスタチソによる一時

3）一過性に運動機能の改善や血清酵素の低下

的改善と考えたい．松下らも，筋ジスハムスターがみられる例が多かったが，6カ月全体を通して−113−

みると，運動機能が低下する傾向にあった．
4）運動機能評価は，走行時間，起立時間，階段昇降時間が最も適切な方法と思われた．
文

開発研究班．微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイベプチン）の開発研究（梅沢班）．
昭和55年度研究報告書，昭和56年3月，pp．
3−14．

献

1）大澤真木子，鈴木陽子，福山幸夫．先天型進行性筋ジストロフィー症（福山型）の遺伝・臨床・病理・神経進歩，鮎，702−717（1980）．
2）福山幸夫，高柳哲也，松家 豊，佐藤 元，野島元雄，上田 敏，伊藤文雄，和田正士，三吉野産
治，探津 要，大澤真木子．プロジェクト Ⅱ
機能障害の進展過程と臨床評価の基準化（班長：祖父江逸郎）・厚生省神経疾患研究委託軋 筋ジストロフィー症の疫学，臨床および治療に関する研究・昭和57年度報告書，昭和58年3月，pp．
25−38．

3）梅沢浜夫・傲生物の二次代謝産物に由来する悪病治療薬（ロイべプチソ）の開発研究．厚生省新薬−114−4）松下 宏，辻 繁勝．筋ジストロフィーマウスにみられる種々な酵素活性変動に対するロイべプチ
ンおよびべスタチン投与の影響．同上，pp．55−61．
5）福山幸夫，高柳哲也，松家 豊，佐藤 元，野島元雄，上田 敏，伊藤文払和田正士，三吉野産
治，探津 要，大洋真木子．機能障害の進展過程の基準化．厚生省神経疾患研究委託費．筋ジスト
ロフィー症の疫学および治療に関する研究（班長：祖父江逸郎）．総合班会議，昭和58年12月，
東京．
6）松下 宏，辻 繁勝．ハムスター筋ジストロフィー症に対するロイべプチソおよびべスタチン投与の影響・厚生省新薬開発研究費．微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプチン）の開発研究（梅沢姓）．昭和56年度研究報告書，
pp．51−56．

筋疾患に対するべスタテンの効果に関する臨床的研究
Ⅰ．神経筋疾患におけるべスタチン投与後の尿中アミノ酸の変動
木 下 英 男＊1
研究協力者

山田信興＊1，岩崎春雄＊1，馬場繁二＊1，仁科牧子＊1

表1

今回，われわれは，べスタチソの神経筋疾患に与える影響について，客観的かつ定量的に薬効判

T．K．
J．H．

投与による影響についても検討を行った．

S．K．
T．U，
A．S．

対象および投与方法

K．N．
T．0．

べスタチソ投与を行った患者は，男性7例，女l l N I N N N N I N

中3−メチルヒスチジンを測定して，べスタチソ

十 一 ＋ 一 一

U．M．

＋

行った．さらに，筋線維蛋白代謝の指標となる尿PMPMPM諾F S︒LSMSPM崇T．Y．

FMMFMMMMMF

T．T．

をはじめとする種々の血清酵素を測定して検討を

33
22
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44
43
34
63
人3
U3
75
1
5

定を行う目的で，血中べスタチソ濃度と血清CPK

Sex Diagnosis PSL

尿中3−メチルヒスチジンは投与前の値を示す．

性3例の10名で，平均年齢は38．6歳であった．
その内訳は，多発性筋炎3例，皮膚筋炎1例，肢結

果

帯型ジストロフィー症1例，顔面肩甲上腕型ジストロフィー症1例，脂肪蓄積性ミオパチー1例，

1）尿中3−メチルヒスチジンの変化

scapulo−perOnealミオパチー1例，筋萎縮性側索

尿中3−メチルヒスチジン（正常値：180〜390硬化症2例で，全例が筋力低下および筋萎縮を示〝mOl／day）がべスタチソ投与前に正常より低値をしていた．

示したのは3例で，筋疾患では多発筋炎172．2

投与方法は，ベスタチソ 60mg より漸増法に

FLmOl／dayと皮膚筋炎146・6jLmOl／dayであり，神て1週ごとに倍量とし分3投与，480mgを維持

経疾患では筋萎縮性側索硬化症74．1jLmOl／dayで量とした．投与期間は4週から5週であった．

あった・逆に，投与前に高値を示したのは，多発これらの患者のうちでステロイドを併用したの筋炎419．4／JmOl／dayであった．その他か6例には，多発筋炎2例，皮膚筋炎1例，SCapule−per−

おいては，べスタチソ投与前の尿中3−メチルヒoneal ミオパテー1例の4例であったが，各症例

スチジンは正常であった（表1）．

においてべスタチソ投与期間中は一定量とした（表1）．

筋疾患患者5例における尿中3−メチルヒスチ
ジンの変動では，ベスタチソ投与により，多発筋炎と scapulo−PerOneal ミオパチー患者で2，3＊l東邦大学医学部第四内科

週に一時高値を示したが，4遇に投与前と同程度−115−

投与前より正常値下限の半分以下の74．1〃mOl／
dayと低値を示し，投与によっても変動を認めなかった（図2）．
2）血清酵素の変化
10例のう・ち，明らかにGOT，CPKが低下したのは多発筋炎1例であったが，この症例についてはのちに提示する．
その他の9例中，GOTのみが低下したのが皮膚筋炎患者で，45Ⅰ．U．から22Ⅰ．U．と低下した．
CPKのみが低下憤向にあったのは多発筋炎と脂O IW Zw

3W

4W

肪蓄積性ミオパチーの2例で，それぞれ

図1筋疾患患者における尿中3−メチルヒスチジ
ンの変動．

826

I．U．が 615Ⅰ．U．，3，750Ⅰ．U．が2，950I．U．

であった・また，逆にCPKが上昇傾向にあったの値となった．

のは肢帯型ジストロフィー症患者で，629Ⅰ．U．が別の1例の多発筋炎患者においては，ベスタチ

1，000Ⅰ．U．となった．

ソ投与前に正常値よりやや低い値を示していたが，血清酵素に変化をみた患者のうちステロイドを投与により低下傾向を示した．この症例について併用したのは，多発筋炎と皮膚筋炎の2症例であは後述する．

った．

その他の2例においては，べスタチンの投与によって有意な変化は認めなかった（図1）．

その他の患者においては，有意な変化を認めなかった（表2）．

神経疾患患者における尿中3−メチルヒスチジ
ンの変動は，1例の筋萎縮性側索硬化症患者では

3）血中ぺスタチン濃度の変化

1，3過に低下を認めたが，4週にはベスタチソ

ベスタチソ投与により血中濃度の上昇を示した

投与前と同程度となり，他の1例ではべスタチソのは8例で，残りの2例については，一部で測定

O Iw

2W

3W

4W

図2 神経疾患患者における尿中3−メチルヒスチジンの変臥−116−

筋疾患に対するべスタチソの効果に関する臨床的研究
表2 べスタチソ投与による酵素および血中べスタチソ濃度の変化
GOT LDH CPK Urinary3−MH Serumbestatinlevel（〃mOl／day）（ng／mり
1
〜
1
〜

〜

−

〜

〜

〜

1

〜

〜

〜

〜

〜

〜

〜

〜

〜

T．0．（ALS）〜

K∴N．（ALS）〜

A．S．（SPM）

1〜

T．U．（LSM）

1

1

J．H．（LG）
S．K．（FSH）〜〜

U．M．（PM）
T．K．（DM）〜〜

T．Y．（PM）〜

1

T．T．（PM）

嘔気を認めたが，一過性であり，ベスタチソ投与を中止するに至らなかった．
5）症例について症例は，53歳の多発筋炎患者で，昭和56年8月に筋力低下を自覚し，同年8月24日に当科に入院した．入院時，全身の筋萎縮および筋力低下を認め，寝たきりの状態であった・
その後，プレドニソおよびロイペプチソ，べス
タチソ投与を行い，現在は介助歩行可能である・
今回，べスタチソを一時中止し，WaSh out後
べスタチソ60mg
0．5

I

2

より投与を始めた．プレドニ

4hr

ソは30mg／dayを維持量として併用した．

図3 血中べスタチソ濃度の経時的変化・

尿中3−メチルヒスチジンは，べスタチソ投与を行っていなかった時期があったため ？ とし前は172．2／上mOl／day と正常下限よりやや低値をた（表2）．

示したが，5週日にはさらに低下し73．0／JmOl／

ベスタチソ投与後の血中濃度の変化については，

dayとなった・

投与開始時，1，2，3，4週いずれも投与後

血中べスタチソ濃度は，べスタチソ投与後ピー30分より上昇し，2時間後にピークとなり，4時クと考えられる2時間目のものであるが，3週ま間後には低下傾向を示した・

では上昇し，それに伴って血清酵素も低下した・

投与量との関係については，投与量を60mgか

しかし，4週，5週では，血中べスタチソ濃度は

ら460mgまで漸増するにつれ血中濃度も上昇す

低下傾向にあった・それに反して，CPKはベス

るが，480mgを維持量とした4週の時点で低下

タチソ投与前の518Ⅰ．U．から162Ⅰ．U．まで低傾向にあった（図3）・下を認めた．
なお，第2週の血中べスタチソ濃度もベスタチ

4）副 作 用ソ投与後2時間目のものであるが，この週に限り，副作用については，多発筋炎患者1例において血中濃度のピークが投与後4時間を示している

−117−

O Iw

2W

3W

4W

5W

図4 症例：T．T．（PM），53Y，F．

（約3，000ng／ml）．単純なtechnicalerrorと思われ訂正する．

逆に尿中 3−メチルヒスチジン排泄は減少すると臨床症状としては，自覚的に筋力改善（肢が軽いう報告もある・要するに，神経筋疾患において，くなった）を認めたが，他覚的に変化は認めなか

筋代謝の異常によっても尿中 3−メチルヒスチジった（図4）．

して異常高値を示し，また高度な筋萎縮があれば，ンは高値を示したり，低値を示したり，一定して
いない．
結

語

今回の結果でも，尿中3−メチルヒスチジソの値は症例により高値を示す場合と低値を示す場合

尿中 3−メチルヒスチジンは，アミノ酸中でそがあって一定しておらず，このことからも，尿中の存在がアクチンおよびミオシンに限定されてお3一メチルヒスチジンはベスタテン投与による効果

り，また筋肉以外にはごく少量しか存在しておら判定のパラメーターにはなりえなかった．

ず，その終末代謝物として尿中に排泄される物質である．

血中ベスタチソ濃度は，べスタチソ投与後2時間でピークを示した．また，投与量の増加ととも

このため，従来，尿中3−メチルヒスチジンはに血中濃度も上昇を示した．しかし，480mgを筋肉の代謝回転を知るうえで注目され，筋疾患の維持量とした4週以降においては，血中濃度は低治療効果判定に有用であるといわれてきた．

下傾向を示した．このことは，enZymeinduction

しかし，ジストロフィーマウスにおいて，筋の変性により尿中 3−メチルヒスチジン排泄が増加の関与も考えられ，今後投与方法についての検討の必要があるように思われる．

−118−

筋疾患に対するべスタテンの効果に関する臨床的研究
Ⅱ・筋疾患に対するベスタチンの効果判定に関する
臨床的まとめ木 下 英 男＊1
研究協力者 里舌栄二郎＊2，祖父江逸郎＊3，三青野産治＊4
村上慶郎＊5，福山幸夫＊6
筋疾患に対するべスタチソの効果判定に関して，

1〜10歳23例，11〜20歳20例，21〜30歳4

従来から臨床部会の各班員が種々の検索を行って例，31〜40歳12例，41歳以後15例であった．

きた．しかし，いずれも比較的少数に対する経験であり，また各自の投与方法が不定であったため，

2）方法

統計学的結論を出すに至っていない．そのため，投与方法は，固定方法（33例），漸増方法（41

昨年度より投与法を比較的しぼって，多数の症例例）の2つの方法で行った．投与期間は4〜5週の検討ができるように検討してきた．本年度は，間とした．

さらに投与方法を画一的にし，この検討を進める

固定方法は，1日投与量を 60mg で固定してとともに，連続投与によって本剤の血中濃度がど行った・漸増方法は，初回投与量を60mg／dayのように上昇を示すかを明らかにし，今後の臨床としてその後徐々に漸増し，1週後に120mg／

部会の進むべき道を決定するための資料とする目

day，2週後に240mg／day，3週後480mg／day

的でまとめを行った．

にし，この投与量を維持とした．今回は，漸増方法を中心に結果を述べる．
行った検査項目は，血清GOT，GPT，LDH，

対象および方法

CPK，クレアチン，クレアチニソ，尿中クレアチ
1） 対ン，クレアチニソ，血中べスタチソ濃度である．

象

対象は，Duchenne型ジストロフィー症35例，

検査は，投与開始日，7，14，21，28日目の早朝

肢帯型ジストロフィー症11例，顔面肩甲上腕型

空腹時に行った．ただし，血中べスタチソ濃度は，ジストロフィー症1例，先天型筋ジストロフィー

施行日に，投与後30，60，120，240分の計4回

症5例，その他の筋ジストロフィー症3例，筋強行った．

直性ジストロフィー症8例，多発性筋炎6例，神結経筋萎縮4例，その他1例の計74例であった．

果

そのうち，男は63例，女は11例，年齢別には，

1）血中ぺスタチン濃度（図1）＊1東邦大学医学部第四内科＊2国立武蔵療養所神経センター＊＄名古屋大学医学部第一内科＊l国立療養所西別府病院＊5国立療養所箱根病院＊8東京女子医科大学小児科

血中べスタチソ濃度は，図1に示すように，投与後1時間をピークとし，その後低下傾向を示した．投与量の増加とともに，血中濃度は上昇傾向を示した．年齢別にみた場合も，疾患別にみた場
−119−

全

1−10歳

体

〃g／mJ

〟g／mJ

6．0

6．0

5．0

5．0

4．0

3．0

2．0

l．0

0

卜
0．5l．02．0

Duchenne型

4．0

3．0

2．0

4．0

0．5l．02．0

4．0

0．5l．02．0

4．0

図1ベスタチソ血中濃度の投与後の変化．−●一，開始；…●…，lw；×，2W；△，3W；0，4W．

全

体

し200

12．00

800

Duchenne型

二：：ニ

二、＼十十

ー∴二

I．208

一三二二
一Ⅳ：ll−16〃：14−19
800

800

ト」

0

開始Iw
図2

2W

3W

4W O

開始IW

2W

3W

4w o

開始Iw

2W

3W

4W

べスカチン投与後の血清LDHの変化．●，固定法；O，漸増法．

血清LDHは，投与開始1週後に若干減少を示合も，同様の曲線を措いた．

したが，その後2，3週目に増加し，4週目に再2）血清諸酵素の変化

び減少した．年齢別にみた場合，1〜10歳の年a）血清GOT

齢層で同様の変化を示し，投与前1，600Ⅰ．U．／J

血清GOTは，投与開始日より4週目まで，有前後を示していたが，1週後に1，200Ⅰ．U．／J前

意な変化は認められなかった．これは，年齢別に後まで減少した．また，疾患別にみた場合，Du・みた場合も，疾患別にみた場合も同様であった．

Chenne型ジストロフィー症で同様の変化を示し，b）血清GPT投与前1，700Ⅰ．U．／J前後であったのが，1週後血清GOTと同様で，年齢別にみた場合も，疾に1，400Ⅰ．U．／J前後まで減少し，その後再び増患別にみた場合も，有意な変化は認められなかっ

加した．

た．

d）血清CPK（図3）C）血清LDH（図2）

血清LDHと同様に，投与開始後1週日に一時−120−

筋疾患に対するべスタチソの効果に関する臨床的研究
全

上〜川歳

体

5．000

5′000

4，000

4，008

3′000

3′080

二＼十二＼二2′000

八r：15−19

Duchenne型〃：15−19

3，000

2．003

2．000

l．009

l．000

ト」

0

二二一∴二

l′008

〃■：3ト32

開始Iw

2W

3W

4W O

開始IW

2W

3W

4w O

開始Iw

2W

3W

4W

図3 ベスタチン投与後の血清CPKの変化．●，固定法；○，漸増法．
全

体

ト一拍歳

Duchenne型．Ⅳ■：32

0．6

0．6

㌫木

0．4

0．4

0．4

ト十十h

〃：23−26
0．2

0，2

二＼十二
〃：10−16〃：12−18

開始Iw 2W 3W 4W
図4

開始Iw 2W 3W 4W

開始Iw 2W 3W 4W

べスタチン投与後の尿中クレアチンの変化．●，回定法；O，漸増法．

全

体

卜柑歳

g／day Duchenne型。Ⅳ ：3t−320．4h〃：14−は

0．4

rY／トロ
Ⅳ：28−37

0．2

0

開始Iw

2W

3W

4w O

H十」0・2開始Iw Zw

3W

4W O

Ⅳ：ll−16

ト牛壬寸1

開始Iw

2W

3W

図5 べスクチソ投与後の尿中クレアチニソの変化．●，固定法；O，漸増法．
−121一

4W

的な減少を示し，その後2，3週目で増加を示しられなかった．疾患別にみた場合，Duchenne塑

た．年齢別にみた場合，1〜10歳の年齢層で同ジストロフィー症でのみ同様の傾向を示し，一時様の変化を示し，投与後1，2週目で減少し，そ的に減少したものの，その後再び増加傾向を示しの後増加を示した．疾患別にみた場合，Duchen・た．

ne型ジストロフィー症でのみ同様の変化を示し，考案および結語

投与開始時4，200Ⅰ．U．／J前後であったのがベス
タチソ増量とともに減少し，2週日で

3，000

Ⅰ．U．／J前後まで減少を示したが，その後べスタチ
ソ増量にもかかわらず増加し，4週目で4，000

血中ベスタチソ濃度について，よく投与量を反映し，投与量の増量とともに増加憤向を示した．

Ⅰ．U．／J前後となった．

血清酵素の変動では，血清CPKおよびLDHe） 血清クレアチン・クレアチ二ン

において，投与前に比べて，投与後1週目ないし血清クレアチンは，投与前と投与後において，2週目まで一時的に減少を示し，べスタチソ投与

有意な変化は認められなかった．年齢別にみた場に効果があった可能性がある．このことは，尿中合も，疾患別にみた場合も，同様に有意な変化をクレアチン・クレアチニソについても同様であっ

認めなかった．

た．これを疾患別にみた場合，Duchenne型ジス

血清クレアチニソも血清クレアチンと同様，投トロフィー症でのみ同様な変化を認めたことから，与後有意な変化を認めなかった．また，年齢別に全体としての変化は，Duchenne型ジストロフィ

みた場合も，疾患別にみた場合も同様であった．

ー症に対しての変化を反映しているように思われf）尿中クレアチン・クレ7チ二ン（図4，図る．また，年齢別にみた場合，1〜10歳の層で同様の変化を認めたのは，おそらくこの年齢層の5）

尿中クレアチンは，投与後1，2週目に低下傾向を示したが，3週目に再び増加し，4週目にま大多数が Duchenne 型ジストロフィー症で占められているためと思われる．

た減少した．年齢別にみた場合，1〜10歳の層以上より，今回の漸増方法では，Duchenne型

で，投与後徐々に減少憤向を示した．疾患別にみジストロフィー症で若干の効果を示したように思た場合，Duchenne 型ジストロフィー症でのみ，われ，特に10才以下でその傾向が著しかったよ投与後1過日に減少，2週日で再び増加し，そのうに見られるが，決して満足すべきほどの改善で後徐々に減少憤向を示した．

はなかった．今後，さらに大量の投与，一時的な尿中クレアチニソは，投与後1週目で一時的に減少したが，その後増加傾向を示した．年齢別に大量投与，ないし間歓的な投与方法に進む必要があるように思われる．

みた場合，各年齢層において，同様な傾向は認め

t汚，

‡
−122−

筋ジストロフィーに対するベスタチンの影響−血清CKとmuscle−SpeCific enolaseを指標として−

祖父江 逸 郎＊研究協力着

陸重雄＊・杢野謙次＊

印東利勝＊・松岡幸彦＊・加藤兼房＊＊

る．
は

じ

め

に

対象 と 方法
進行性筋ジストロフィー（以下PMDと略記）の治療の試みとして蛋白分解酵素阻害剤が導Ⅰ．各種神経筋疾患と血清MSE値

入され，種々の検討がなされてきたが，その評価対象は種々の神経筋疾患患者162例で，年齢はまだ一定していない．ことに実際の臨床上の有4〜72歳，男144例，女18例であった．疾患

効性に関しては，判定基準の設定の困難性もあの内訳は，PMD131例（Duchenne型99例，り，多くの問題を残している・

LG型15例，FSH型9例，先天型8例），筋緊

これまで，筋障害の指標として，血清CKをは

張性ジストロフィー（MyD）9例，筋萎縮性側索じめとする種々の酵素，ミオグロピソなどが広く硬化症（ALS）8例，脊髄性進行性筋萎縮症（SP使われてきた．最近，解糖系の酵素であるeno・

MA）3例，重症筋無力症（MG）2例，その他9laseのうちβ型が骨格筋，心筋などに特異的に存例．対照群は年齢，性を一致させた53例で，年在することが明らかにされl・2），血清CK同様PMD

齢5〜62歳，男47例，女6例であった．これらにおける動態が注目される．われわれの施設でについて，enZymeimmunoassay法でMSEを測は，杢野ら3）が各種神経筋疾患で血清β型enolase

定した．

（以下，これをrnuscle−SpeCific enolase，MSE，また，対象患者のうちPMD131例を含む140と呼ぶ）を測定し，血清CKはじめ従来使用され例について血清CKを，さらにそのうち126例てきた種々の筋障害の指標と比較検討してきた・についてミオグロピソを合せて測定し，MSE とその結果，血清MSEはCKに匹敵する筋障害の相関を調べた．

のよいマーカーとなりうると考えられた．
ⅠⅠ．ベスタチンの血清CK値，nISE値に及

ここでは，血清MSEの臨床的意義を簡単に述

ぼす影響

べ，さらに，少数の患者であるが，べスタチソを授与することによって血清CKおよびMSE値

PMD4例と筋緊張性ジストロフィー1例の計がどのような影響を受けるか検討したので報告す5例を対象とし，ベスタチソの影響を調べた．全例男で，年齢は19〜36歳．患者の内訳と概略は＊名古屋大学医学部第一内科＊＊愛知県心身障害者コロニー発達障害研究所生化学部門

以下の通りである．Duchenne 塑2例（ただし，典型例に比べ経過が長く Becker型に近い．しか−123−

し，心筋障害が強く，同胞や血縁で発症している．Methods

者の生命余後が必ずしも■良好ではないので，ここ．蔵査スケジュール

経過時間 −24hr

ではDuchenne型として扱った）：M．K．，19歳，
身長161cm，体重46kg，4歳頃発症，独歩可能．
K・U・，21歳，身長157cm，体重43kg，発症は

食

事

投

薬

採

血

採

尿

−rhr

O

lhr 2hr 3hr 4hr 5hr

（
朝食）

（
姦）

（
a）

0

（
b）

l

7歳頃，独歩可能．LG型2例：S．0．，23歳，身長151cm，体重36kg，3歳頃歩行障害で発症したと推定，独歩可能．T．H．，33歳，身長173cm，
体重56kg，13歳頃発症，独歩不能で車椅子生活であるが，上肢機能は良好．筋緊張性ジストロフ
ィーの1例（K．M．）は36歳，身長170cm，体⊂⊃印‥蒜査日

重65kg，14歳頃発症，介助してかろうじて歩行図1べスタチソの投与方法と検査スケジュール．

可能であるが，大部分車椅子生活．

の各時点で採血を行い，CK値，MSE値のほか

べスタチソの投与方法は，当研究班のプロトコ

べスタチソの血中濃度を測定した．また，各検査ールに従った（図1）．60mg／日で開始，1週ごと日に血中と尿中のクレアチニソ，クレアチン，に倍増し，4週間で480mg／日まで増量した．そGOT，GPT，LDHなどを合せて測った．

の後90mg／日に減量し，用量を固定して，さらに4週間投与した．服薬は3分月艮とし，薬剤は30

結果mgまたは10mgのカプセルを使用した．検査実
施日は，第1日日，7日（1週間）日，28（4週Ⅰ・神経筋疾患患者の血清 MSE 値とその特間）日，および8週間目とし，それぞれの日に，

微

服薬前，服薬後30分，1時間，2時間，4時間

対照群53例の血清MSE値は7．5±3．8（平40O

J7．500
1

2

・
⊥

・

・
■

・

・

・

・
・

！ ⊥ − ・

一
⁚

一

1

−

T十l

1086

．．iiI一1︺⁝．

20︵盲＼ぎ︶山S三2⊃L拐・・・十・・⁝・・●

OnU O 0
O86
4

i亨Ⅰ⁝・

●ヽヽ■一●●

3

0 nU
︵U O
2

ControIDuchenne LG FSH CongenitalMyD ALS SPMA MG Others99）（ ＝ほ）い〜＝9日 ≒8）（Ii去9）（〃＝8）（〃＝3）い声2日乃＝9）（〟＝53）（〃

PMD

図2 対照群および各種神経筋疾患患者の血清MSE値．＊♪＜0．01，＊＊P＜0．005．

−124−

図3

血清MSE値とCK値との相関・
表l PMD患者における血清MSEとCK値の異常値出現率

No．（％）with elevatedSerumlevels ofType No．

MSE

ズ2−teSt

CK

Duchenne99

91（92）

96（97）N，S．

LG

15

9（60）

12（80）N．5．

FSH

9

2（22）

2（22）

−

Congenita1

88（100）

8（100）−

N．S．＝nOt Significant．

とMSE値の上昇例の頻度を調べた．その際，CK値は125Ⅰ．U．／l，MSE値は15．2ng／mlを超図4えたものを上昇例とした．Duchenne型，LG型

血清MSE値とミオグロビン値との相関・とも，MSE よりCKの上昇率が高い煩向にあっ
均±S．D．，以下同様）ng／mlであった．PMD群

たが，有意な差ではなかった．FSH 型，先天型

では，Duchenne型75．7±70．7ng／ml，LG

では，両酵素の上昇率は等しかった（表1）．

型

26．2±26．3ng／mJ，FSH 塑17．0±22．1ng／mJ，
先天型47．3±27．5ng／mJといずれも高値を示し，ⅠⅠ．ベスタチン投与による諸検査結果の変化

それ以外の疾患では，筋緊張性ジストロフィーが今回対象とした5例は同一疾患（病型）ではな

12．8±6．1ng／mJと有意に高い値をとったほかはいので，症例別に結果を検討した（図5a〜e）．

さまざまであった（図2）．

全体としてみると，血清CK値とMSE値の時間の相関係数は0．831（P＜

的変動はかなり並行していた．ただし，筋緊張性0．001）と高い相関を示したが，ミオグロピソとジストロフィーの患者は，CK値がほぼ正常域にの相関係数は0．595（P＜0．001）であり，CKよ

あるにもかかわらず，MSE値はかなり高値を示

り低かった（図3，図4）．

した．これらの酵素の投与による影響をみると，次に，PMD患者131例について，血清CK値

いずれの例も8週間の投薬では明らかな改善は得血清MSEと

CK

−125−

ta）

a・M・K・，19歳，男，Duchenne型．

012

4

012

4

012

4

b・K．U．，21歳，男，Duchenne型．
図5
−126−

012

4（hr）

筋ジストロフィーに対するべスタチソの影響

C．S．0り23歳，男，LG型．

d．T．H．，33歳，男，LG型．
図5
−127−

（e）

CK MSE（LU〃）（ngノmり 川

012

図5

4W

4

012

4

012

4

8W

012

4（hr）

e・K・M・，36歳，男，MyI）．
症例別にみた血清CK値（●），MSE値（○），およびべスタチン（×）の血中濃度の推移．

0
0
4
0
0
2
0
0
0

＼二三

800

し500

600

l，000
400

500

≦≧海空≦ぎ

0

ノ

ld lw

1

4W

′′′

∈フ

200
0

「

8W

ノ

ld

lW

l

／／

】

4W

8W

図6 5症例の尿中クレアチニン値 （左）とクレアチン値（右）の投薬に伴う推移．
られなかった．

服薬後2時間で最高濃度となったが，ときには4ベスタチンの血中濃度は，60mg／日では初日と時間の濃度が高いこともあった．このべスタチソ

7日目ではほとんど変化なく，大体200〜1，000の血中濃度と血清CK値，MSE値を比較すると，

ng／mlの濃度を保った．480mg／日投与した第28薬剤の増量に従ってベスタチソの血中濃度は着実

日日ではいずれも高値を示し，4，000〜13，000に上昇したが，両酵素ともそれに対応して変化すng／m仁程度の値であった．90mg／日投与した8週る傾向はなかった．一般に，PMDでは尿中クレ目の終りでは，60mg／日投与と類似した値を示し

アチニソの排泄量低下，尿中クレアチンの排泄増た・服薬時間との関係をみると，ほとんどの場合加があるが，これらの値もベスタテン投与によっー128−

筋ジストロフィーに対するべスタチソの影響て改善を示さなかった（図6）．そのほか，血中ク①安静時のCK値が下降すること，④運動による

レアチニソ，クレアチン，GOT，GPT，LDHな

CK値の上昇が抑制されること，の2点が重要であるとの見解を示してきたが，今回の結果ではども特記すべき変化を示さなかった．
自覚的にも他覚的にも，副作用の発現はなかっ

CK値，MSE値ともそのような傾向を示さなかった．ベスタチソの血中濃度と比較してみても，た．

投与量の増加に伴って血中濃度は確実に上昇して考おり，ことに480mg／日授与した28日目には著察

しく高濃度を示したにもかかわらず，これら酵素
ここに述べた解糖系の酵素enolaseは，α，β，の選出が阻止されたとはいいがたい・そこで，当γの3種のSubunitをもち，これらの二量体とし班で行った投与計画を見直してみると，次のようて全身組織に広く分布する．αα−enOlaseはすべな問題点があげられる．べスタチソの血中濃度は，ての組織に，αγ，TT−enOlaseは主に神経系組織に多くの場合服薬後2時間でピークに達し，4時間存在するのに対して，αβ，ββ−enOlase は横紋筋

ではかなり下降するのが普通であった．患者は1組織に特異的に局在することが知られている1・2）．

日3回毎食後薬剤を服用しているため，深夜からこのβ型enolase（MSE）は，細胞内ではCK同早朝にかけて期待すべき血中濃度を確保できない様大部分が可溶成分として細胞質に存在し，分子可能性がある．さらに大きな問題は，どの程度の量88，000〜89，000でCK（MM

血中濃度がPMD患者の筋肉崩壊の阻止のため型）の分子量に必要とされるかという点である・いまのところ

82，000に近いという特徴をもっている．
今回の結果からわかるように，各種神経疾患にまったく不明の状態であるが，今回の使用量よりに類似した態度を示もさらに大量投与をしたほうがよいようであるとした．血清CK値との相関係数は0．831と高く，の印象がもたれており，慎重に患者を観察しながまたPMD患者の異常値検出率においても血清ら大量投与を行っていくことが大切な試みの1つ

CKとの間には有意な差がなく，MSEと思われる．幸いにして，べスタチソによる重篤

はCKに匹敵する筋障害の指標になりうると結な副作用の発現はPMD患者にみられていない・

論された．次に，早朝から昼にかけて一定の時間

その他の問題として，対象患者の選択，投与期間に検査した月内変動パターン（これはもっぱら運の問題があげられる．われわれが今回対象とした動による変動を示していると思われる）を比較し患者はいずれも成人で，長期の碍病期間を有しててみると，CK と MSEの変動様式は，一部を除おり，これまでの経験からしても変化が得られにいてよく類似していた．ミオグロビンでみられた

くいようである．投与期間に関しては，われわれような大きな変動は認められず，この点でも，の施設では，すでに少量1年半投与で明らかな改MSEはCKとともに薬剤投与などの効果判定に善が得られなかったという成績がある・以上の点最も適した指標の1つとしてよいと思われる．

を総合して今後の方針を考えると，若年患者を対おいて，血清MSEはCKとMSE次に，PMD患者に対するベスタチソの影響に象とし，長期間大量投与を行い，臨床症状と検査

ついて考えたい．結論的にいえは，血清CK値，所見の両面から評価していくことが望ましいと考MSE値あるいは血中，尿中のクレアチニソ，ク

えられる．

レアチソ値など，筋障害の指標となる検査成績で評価する限り，明らかな改善は得られなかった・
とくにCK 値については，これまで著者らは，
−129−

ま

と

本研究のベスタチソ血中濃度の測定は，日本化薬（株）医薬事業本部臨床開発部でなされた．ここに深く感謝致します．

め1）各種神経筋疾患患者の血清MSEを測定し，血清CK値などと比較した．その結果，血清MSE
はCKと類似した動態を示し，筋障害のよい指標となることが示された．
2）

文

献

1）Rider，C．C．and Taylor，C．B．Enolaseiso−
enzymesinrattissues：Electrophoretic，Chr0−
matographicandkineticproperties．Biochim．

β嗜め∫．Acね，365，285（1974）．

5例のPMD患者（1例は筋緊張性ジストロフィー）にべスタチソを投与し，薬剤の血中濃度と血清CK値，MSE値その他の検査所見とを比較した．ベスタチソの血中濃度の上昇は良好であったが，8週間の投与期間では血清CK値，
MSE値などで評佑する限り，明らかな有効性は認められなかった．
3）特記すべき副作用はみられなかった．

−130−2）Kato．K・andOkagawa，Y．，etaL．Immunoassay
Of human muscle enolase subunitin serum：
A novel markerantlgen for muscle diseases，C〃飢 Cゐi桝．Acね，131，75（1983）．

3）杢野謙次，陸 重雄ら．神経筋疾患における血清
muscle−SpeCi丘c enolase値の分析一新しい筋障害の指標としての可能性について−．臨床神経，23，852（1983）．

筋ジストロフィーを中心とする各種筋疾患に対するベスタチン投与後の経過報告

里 舌 栄二郎＊
研究協力者

春原経彦＊・富英明＊

昭和56年より，筋ジストロフィーを中心とする筋疾患に対してべスタチソ（NK421）を経口

対象

投与し，その後の臨床経過を観察した・また今回，一部の症例に対してNK421の用量固定法・漸1．NK421長期投与経過観察の対象は，肢帯増法を施行し，血中濃度測定を行ったもので，そ型筋ジストロフィー（LGPMD）6例，顔面肩甲の結果をあわせて報告する．

上腕型筋ジストロフィー（FSH PMD）1例，筋強直性ジストロフィー（myotonic dystrophy）2

表1

1）NK421長期投与経過観察〈59年2月現在〉
対

象

M／F

年 齢 碍病期間（年）最大投与量（mg／日）

1．肢帯型筋ジストロフィー

3／3

36〜53

10〜30

2．顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー

1／0

49

32

3．筋強直性ジストロフィー

1／1

39，43

13，21

450，500

4．Duchenne型ジストロフィー

5／O
StageⅡ 3
Ⅵ1

4〜18

1．5〜1130〜200Ⅶ15．多発性筋炎
6．皮 膚 筋 炎

12，24
13

2）NK421血中濃度測定対象
対

象

3 8
4 1
〜
〜
1 9
3

916
〜32〜〜6
643
1

49
42

＊国立武蔵療養所神経センター

3
︻8
〜
6
3

1．腋帯型筋ジストロフィー
2．筋強直性ジストロフィー

0
／
． ／
3
1

5．成人型Pompe病b）4W用量漸増法

03．筋強直性ジストロフィー
4．DuchennC型筋ジストロフィー

1／
2

2．顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー

0／
1

1．腋帯型筋ジストロフィー

3／2a）11V用量固定法

碍病期間（年）

M／F

200〜500300

例，Duchenne型筋ジストロフィー（DuchennePMD）5例（うちStageⅡ3例，Ⅵ1例，lIl

方法例），多発性筋炎（polymyositis）2例，皮膚筋炎（dermatomyositis）1例の計17例．

1・NK421長期投与例では，30mg／日より経

2・NK421血中濃度測定の対象は，a）1週間

口投与を開始して適時に漸増し，最高投与量は，用量固定法では，LG PMD5例，FSHPMDl

表2のように500mg／日が5例，450mg／日が4

例，myOtOnic dystrophy3例，Duchenne PMD

例，300mg／日が2例，240mg／日が1例，200mg／

3例，成人型Pompe病1例の計13例．b）4週日が2例，60mg／日が2例，30mg／日が1例であ間用量漸増法では，LG PMDl例，myOtOnic

る・ただし，pOlymyositisの2例，dermatomy−

dystrophy 2例の計3例である（表1）．

OSitisの1例ではsteroid，Imuranが併用された．
表3 測定項目

表2 最大投与量
投与量（mg／日）

期間（日）

500

33

1・10m歩行時間
2・階段11段昇降時間
3・筋力検査（5段階方式従手筋カテスト）僧帽筋，三角筋，大胸筋，凍上筋，叔下筋，前銘筋，広背筋，上腕二頭，三頭筋，腕樟骨筋，手関節屈筋，
伸筋，捏力，腸脛筋，大腿内転筋，外転筋，大腿四頭筋，大腿屈筋，前脛骨筋，下腿三頚筋
4．体重5．自覚症状6．副作用
7．血液RBC，WBC，Hb，血小板，CPK，aldolase，ESR，
血清蛋白，T・bil・，GOT，GPT，LDH，AlqP，BUN，

30
24
15
32
22
8
4
1
1
0
3
4
7

creatinine
2

8．尿蛋白

Electrical stimulation
2Hz

l

30

JL

O．lmse（】図1−132−

筋ジストロフィーを中心とする各種筋疾患に対するべスタチソ投与後の経過報告① 投 与 法
用量固定法（60mg／日，毎食後分3）と漸増法（60mg／日，
毎食後分3からスタートし4遇後480mg相，毎食後分3に漸増する）の2法とする．
イ）用量固定法＼
60mg／日 60mg／日 60mg／日 60mg／日 60mg／8 60mg／日 60mg／日（垂）2日目 38日 4日日 5日日6銅（垂）ロ）漸 増 法480mg／日240mg．／日⊂⊃印：検査日
注1）現在べスダチソを投与中の症例を改めて使用する場合は2週間のwash outを要す．
江2）小児薬用量は以下の式により換算する．
小児薬用量＝（小児の体重）×1．5＋60
100

×成人薬用量（む 検査スケジュール
経過時間
食

事

投

薬

採

血

採

尿

−2 4 h r− lh r

o

lh r

2hr

3hr

●
博 食）

（
a）

4 hr

5 hr

（
昼食）
0
（
b）

G）臨床検査項目
血清：LDH，GOT，GPT，CPK，クレアチニソ，クレアチン

尿中：クレアチニソ，クレアチン
江1）血清は検査スケジュール中（a）で示す早朝空腹時に採血する・
江2）尿は24時間苗床し，尿量を測定後サソプリソグする・（彰 べスタチソ血中濃度
江1）検査スケジュール中（b）で示される，投与後0．5，1・0，2・0，
4．01lrの点で採血する．
注2）測定は日本化薬（株）にて実施する．
図2 実 施 要 領．

これら17例の経過観察期間は，8〜33カ月平均したことになる．さらに，LG PMDの症例No．

19．2カ月）である．臨床効果判定には，1カ月間

3，4，5の3例に対し，57年9月，58年3月，

隔で10m歩行時間，階段11段昇降時間，全身59年2月と3回にわたり，尺骨神経に肘部にて18筋の5段階方式による筋力評価を施行し，こ

電気的に低頻度反復刺激（0．1msec矩形波，れらによる総合評価を行った．また，午前中一定

2Hz，1′30′′）を与え，母指内転筋より筋張力，

時刻での血清CPK値，aldolase値を測定し，NKstaircaseの程度，収縮時間，1／2弛緩時間を測定

421投与開始時点での連続3カ月の平均値と最近し，NK421投与中の推移を観察した（図1）．

の連続3カ月の平均値との比をとった（表3）・

NK421投与中の副作用監視のため，血液より赤

このため，この比が1より小さくなれは改善を示

血球数，ヘモグロビン，白血球数，血小板数，血−133−

沈，CPK，aldolase，総蛋白，総ビリルビン，

480mg／日と漸増し，4週間にわたり投与を続け
GOT，GPT，LDH，Al−P，BUN，CRNを， 尿 た．採血，採尿は用量固定法と同様に，1，7，より尿蛋白を測定した．
14，21，28日目に行い，同様の検査項目を測定し2．NK421の血中濃度測定方法について：た（図2）．

a）用量固定法では，NK421を60mg／日，分3で経口投与した．小児の場合は，（体重）×1．5＋60

結

果

×60

100

1・長期観察中の各症例につき，総合的な臨床を目安として投与した．検査項目，スケジュー評価を行い，CPK値の変化とあわせ表4に示しルに関しては，プロトコールに従い，NK421

た・臨床症状の改善を示した例はNo．15，16 の60mg／日投与開始日と7日目の早朝（月良薬前），

POlymyositisの2例のみで，そのほかはすべて投LDH，GOT，GPT，CPK，Creatinine，Crea−

間始時に比較して症状が進行していた．筋ジスト

tineを，前日よりの24時間蓄尿分から尿中cre−

ロフィー例で改善を示した例はなかった．一方，

atine，Creatinineを測定

さらに朝，NK421服

血清CPK値は，筋ジストロフィーの14例中

用後（20mg）30分，1時間，2時間，4時間後12例で投与開始時に比較し軽〜中等虻の低下を示に採血し，NK421の血中濃度を測定した．b）

した・この憤向はとくに，元来CPK債が高かっ

漸増法は，60mg／日より1週間ごとに120，240，

たDuchenne PMDの例（No．10，12，14）で

表4
名

年齢

投与量

期間

376

0
3

1，253→1，028
5
1

2，035→1，268

4
8

0

9
6

16ト→

136

8

7

1，440→1，760

1．22

進行

3

7

7，480→5，050

0．68

進行

2

383→

（StageⅡ）

11．T．A．Duchenne PMD12M（StageⅥ）
12．N．A． Duchenne PMD 9M（StageⅡ）

13．T．S．I）uchenne PMD

4M l．530（StageⅡ）618︶

4，636→3，208︶

11（450mg）

欲12 心持

0

55

131

悪心

既
0
m
g

4
7

103→

177→

副作用

食︵悪

0

466

行行行行行変行
進進進進進不進

3
5

2

0

209

6
9

923

218→

0

1，054一→

4

8
8

33

0・84 進行
0・82 進行
0・62 進行
0

668−→

臨床症状

0
7

33

比

0

7・T・0．Myotonic dys．39F 21
8・K・N．Myotonic dys．43M 13
9．M．Y． FSH PMD
49M 32
10．R．K． Duchenne PMD 9M
500000050000040
5
5
3
4
5
3
2

26
20
28

450−→

0
0
0 ︵U
5
5

0
1

1
5

37M
47M
44F

期間

（年）（mg／日）（日） 開始時 現 在
0
3

6
3

4．K．0． LG PMD
5．Y．K． LG PMD
6．F．K． LG PMD

愕桓 垣＿大 野与 CPK平均値（3カ月）
5
1

3
5

LG PMDLG PMDLG PMD

M F F

1．S．A．
2．M．Y．
3．Y．T．

病

0
3

例

0
0
2

症

NK421長期投与患者経過一覧表

1．61進行

14・E・Ⅰ・D諜…芸：昔D18Ml1 200 4 1，540→567 0・37進行
15・M・S・Polymyositis

48F

12

450

32

95→

200

16・A・S・Polymyositis

34M

24

450

32

440→

478

2．11改善悪心（450mg）

17・K・0・D芯㌫ 68M13 450 32
−134−

1．09

やや改善

94→172 1・83不変

筋ジストロフィーを中心とする各種筋疾患に対するべスタチソ投与後の経過報告
No，lO R・K・9y・0・M，Duchenne PMD

4

6

8

10

12

2
59

図3
No．15M・S・48y・0・F，Pofymyositis

みられた．図3は，No．10，DuchennePMD，9

行していた・一方，図4および図5は，No・15・歳の経過表である．NK421投与開始時に比較し．16のpolymyositisの症例である・それぞれ筋力て臨床的には進行していたものの，血清CPK値 改善が臨床的に認められたにもかかわらず，血清は投与前に比較し低下傾向がみられている・また，CPK値では増加傾向が認められている・
このCPKの動きは，NK421投与量と比較的並−135−

LGPMDの3例について，経過中に3回誘発

O竺

OS一
ON一

＝

〇の

￠区

O u

O M
O N

S 一 望

山

一

OS
Ou
Oト
冨
︵0誤∈︶

∝Nこト

≡二

S壱○ぎ号d■三．〇台M・S・く写OZ136

bMJ NエN

＝

／〟

票
3

． O Z ． ∈ 一 H S＝∴

2〇三d O﹂．﹂．O．ゝ一S．ト．＞C．OZ

∈

3
5呂

OD
の
l■・、
lr〉
Uつ
の
∽

筋ジストロフィーを中心とする各種筋疾患に対するべスタチソ投与後の経過報告

○竺
ON一

竹園

O M
O N

S 一 〇 一

l
／▼

O u
S

一

／
一
月

bCJ N N

t
l
l l
l
l l
1−

〇の

i
−

．OZ．∈一lS

OS一．OZ．∈コS
O竺

OZ一

〇の

ト区

○￠

OM

・ O N

﹁﹂Ⅰ

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S ↓

≡

S

一

137

O竺

∞ S ・ − 1 − 1 ■ i 一 ● ■ t ■ ． 一 ︐ ■ ．

トの・111・l∫′′・−・−・If．∫

ト S ・ ． ∫ 一 ∫

二
■
■
ニ
⁝
−−
■
−
三

・
︒
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倉d21S百〇盲lOきざ・〇・言寸≠叉苫Z〇三d O﹂．三．〇吾の．く・S言Z

表5NK421血中濃度測定期間中のCPK値の変動

CPK値
症

例

病

名

1週後
2週後
3週後
4週後
投与前（600mg／日（120mg／日（240mg／日（480mg／日
服用中）
服用中）
月艮用中）
月艮用中）

年齢

1，S．A．
2．M．Y．
3．Y．T．

LG PMDLG PMDLG PMD

53M

15

464

434

36F

30

753

681

lO

1，280

651

6．F．K．
18．M．S．

LG PMDLG PMD

44F

28

218

99

51M

6

313

312

39M

21

34

39

43F

13

119

95

31M

15

314

357

49M

32

95

80

12M

8

1，760

770

9M

3

7，640

5，050

18M

11

990

704

42M

6

228

83

7．T．0．Myotonic dys．
8．K．N．Myotonic dys．
19．H．N．Myotonic dys．
9．M．Y． FSH PMD
ll．T．A． Duchenne PMD
12．N．A． Duchenne PMD
14．E．Ⅰ．

Duchenne PMD

20．E．K．Adult Pompe

51F

377

438

190

44

38

46

102

89

82

NK421投与開始後の血清CPK値の変動
480

Before

1

2

図13
−140−

3

4weeks筋ジストロフィーを中心とする各種筋疾患に対するべスタチソ投与後の経過報告

表6 副作用筋電図を施行し，筋張力の変化を観察した・図6
は，N0．3の結果である．この症例は，NK421投
与後，CPK値の低下はみられたが，進行性に筋力低下が認められた例である・57年，58年・59
年と年を追うに従って筋張力低下がみられ，同時にCT，T．／2Rの延長がみられており，疾患の進

症例

病

名

農温

症状

3．Y．T．LG PMD
450
10．R．K．Duchenne PMD 120
11．T．A．Duchenne PMD
15．M．S．Polymyositis

悪心
食欲低下，
悪心，下痢
30
悪心
450
悪心

行が示唆されている・
図7は同様にCPK値の低下がみられたにもか（蓑6）．これらの症状は，NK421投与量が増加

かわらず，筋力低下が進行しているNo・5のLG

するにつれて出現する憤向があり，成人2例では

pMDの症例である．N0．3の結果とほぼ同様に，450mg／日，小児2例では30，120mg／日で出現し筋張力の低下が認められ・疾患の進行が示唆されている．なお，これらの症状は，服用を中止してた．図8は，No・4のLG PMDの症例である・

消失した例（No．10，11）のほか，服用継続中自この例は，進行性に筋力低下がみられているにも然消失した例（No．3，15）もあった・そのほか，かかわらず，筋張力，CT，Tl／2Rは経過中ほとん

血液，尿検査上 異常を示した例はなかった・

ど変化がみられなかった・
ま2．NK421血中濃度測定結果：とめ

図9は，NK42160mg／日投与開始日，朝20mg服用後のNK421血中濃度の推移である・

筋ジストロフィーを中心とする筋疾患に対して服用後1〜2時間の間に500〜1・500ng／mJでNK421の長期投与を行ってきたが，筋ジストロ

peakを示し，4時間後に500ng／mlへ低下する

フィー群で臨床的改善をみたものはなかった・し

例が多かった・図10は・NK42160mg／日服用

かし，多くの例で血清CPK値の改善がみられ，1週間目，朝20mg服用後の血中NK421濃度

とくにDuchennePMDなどきわめてCPK値がである．血中濃度のPeakは，やはり同様に1〜高値を示していた症例で，この改善傾向が強かっ

2時間の間でみられ，500〜1，500ng／mgであった・

た．このことより，NK421が，臨床的改善を示

図11および図12は・4週間にわたり漸増法を施行した症例No・1，8の結果である・それぞれ週をさないまでも疾患の進行を抑制している可能性が残された．

追うごとに血中濃度が増加し，4週間目のpeakPolymyOSitis，dermatomyositisの症例では・

値は7，000ng／mg前後であった・なお，このときsteroid，免疫抑制剤にNK421を併用することのpeakも1〜2時間後であった・表5および図13により，臨床的改善を示す傾向が認められた・

は，NK421血中濃度測定期間中の血清CPK値

NK421服用後の血中濃度は，大多数の例で，の変化を示したものである・1週間法を施行した

服用後1〜2時間で500〜1，000ng／mlのPeak
値をとり，480mg／日に漸増後の4週間目では多くの例で，血清CPK値の低下が観察された・
とくにCPK値が1，000U／J以上の症例No・3・

7，000〜8，000ng／mlまでPeak値が増加した・
NK421の血中濃度と血清CPK値の改善度◆と11，14では，中〜高度のCPK値の低下がみられた．この3例のうち，2例はDuchennePMD・
残り1例はLGPMDであった・
NK421投与中，4症例（No・3，10，11，15）に消化器症状（悪心，食欲低下・下痢）がみられたの問には，相関は認められなかった・なお，NK421血中濃度測定のための短期間の観察期間中でも，多くの例で，NK421投与前に比較してCPK値の改善を示した．この傾向は，血清CPK−141−

値の高い例・とくにDuchennePMDで強くみらり消失し，再び投与開始，増量することができれた・
た・そのほか，血液，尿所見での異常はみられな
NK421投与中，消化器症状が4例に認められ かった．
たが，その後休薬あるいは一時減量することによ−142−ホルフェ二シノールの体内動態に関する研究

松 本 郁 男＊

ホルフェニシノールは，細胞表面に存在する種
種の酵素の阻害物質の1つとして微生物化学研究ェニシノールを経口投与および静脈投与した場合の血中濃度，稔排泄についても検討を行った・

所で発見されたアルカリホスファクーゼ阻害剤ホⅠ．ホルフェ二シノールの原未調製

ルフェニシソの誘導体である．ホルフェニシソは，腹腔内投与で免疫賦活作用を有するl）・ホルフェ
ニシノールは酵素阻害活性は示さないが，経口投製造法を図1に示した．∽−ヒドロキシペソズ

与で遅延型過敏症を増強し，感染症に対する防御

アルデヒドを原料として，常法に従って ∽−ヒド

効果，マウス移植性腫瘍に対する抗踵瘍効果を示

ロキシフェニルグリシンとしたのち，アミノ基をすことが知られている2・3）．急性毒性はマウス＞

アセチル化する．次いで，ホルマリンを用いてヒ8，000mg／kg，ラット＞8，000mg／kg，ウサギ＞

ドロキシメチル化したのち，糸状菌由来のアシラ

5，000mg／kg，イヌ＞1，000mg／kgの経口投与でーゼを用いて不斉加水分解し，L−ホルフェニシノ

認められず，またラットに490mg／kg207

日間ールを通計収率29％で得ることができる・回収

経口投与しても毒性が認められない，きわめて低された D−N−Ac−ホルフェニシノールは，ラセミ

毒性な分子量197の低分子化合物であるl）・

化させて再度アシラーゼ処理を行うことにより，同様な膜に存在する酵素の阻害剤でやはり免疫さらに収率を上昇させることができる・増強作用を示すべスタチソが筋ジストロフィー症
ⅠⅠ．ホルフェ二シノールの体内動態

マウスに有効であることから，ホルフェニシノー
ルについても当研究班の松下らにより検討が加えられ，筋ジストロフィー症マウスに発症初期から1．未変化体の測定法

連続投与することにより，症状回復，体重増加，

われわれは，未変化体の測定法として，簡便で筋の耐久力増強などの効果のあることが明らかに大量のサソプルを処理できるRIA法について検された6）．

討を行った・a）標識抗原の調製

われわれは昨年7月より本研究班に参加し，ホルフェニシノールの製造および体内動態研究を担

放線菌の培養で得られ卑し一ホルフェニシンを当することになったが，今年度は主としてホルフ水溶液中でNaB3H▲を用いて還元し，容易にェニシノールおよびその代謝物の簡便で精度の高［3H］−L−ホルフェニシノールを得ることができた

い定量法の開発を検討した．また，［3H］−ホルフ（図2）．

＊萬有製薬（株）目黒研究部
−143−

NaCN

Ht

￣三一 CH −CO2H（y：83％）（y：87％）

H鞄COzHNH2（y：90％）

CHCO2H

OH￣

I

NH
A（）

（y：64％）（y：70％）（D・L）−NLAc−Forphenicinol

†胸0％）
HOH2

＋ HOH2芸かOH−002H

ご払呂：2（L）−Forphenicinol

CH−CO2HlNH
Ac（D）−N−Ac−Forphenicinol
図l Production of（L）−forphenicinol．

NaB3HJoH勒烹：2CH−002H

CH−COZH

H20

】

NH2

［3H】−（L）−ForphenicinoL

Spec摘GaCtiv吋

0．780iJmmol

白ad盲ochendcatyield 45％

図2 Synthesis of SH−labeled−（L）−forphenicinol．

b）感作抗原の調製

プロソ酸を介して結合したMト03により，ウサ8種類の感作抗原を調製して，ウサギに感作しギに感作して得た抗血清を測定に使用した．

た（表1）．

C）基本操作ML06，Mト07は非常に高い抗体産生能を示し

図3に示したように，検体に標識抗原と抗血清

たが，れレフェニシノール自体とは結合せず，サを加えて平衡化させたのちポリェチレングリコー

クシニル化したホルフェニシノールとのみ交叉結ルを用いて沈殿させ，沈殿をアルカリで溶解した

合した．したがって，血中のホルフェニシノール

のち放射能を測定する方法である．この方法で得を測定する場合，サクシニル化をまず行わなけれられた検量線を図4に示したが，測定限界は10mgである．

ばならないが，血清を同条件下サクシニル化を行うと標識抗原と抗体の結合を防害する物質が多量d）代謝物の交叉反応性に生成し，この抗血清は使用できないことが明ら

ホルフェこシノールの代謝物としてはM−1

かとなった・最終的には，抗体価は低いながら（未変化体）からM−5まで知られていたが，後述

も，ホルフェニシノールとBSAを∈−アミノーカするラットの吸排実験により，新たにラットの主−144−

ホルフェニシノールの体内動態に関する研究
表1

Immunogen

H。H2花封H−CONH−BSA・

訂霊慧￡n Immunogen

禁霊霊n

0／10 HOH2裕？H−COOH

7／7

NHCOCH2CH2CONH−BSA（M卜06）

HOH2裕でH−CONHCH2CH2CONH−BSA O／3
NH2

HOH2あ？H−COOH

6／6

NHCOCH2CH2CONH−BTGH（M卜07）

HOH2db？H−CONH（CH2）5CONH−BSAl／3
NH2

0／3

÷三一二
㌻9日￣COOH

HOH20

N NH2

（M卜03）髄11

HOH2払？H−COOH

N＝N−BSA

（M卜0り

0／10

NHCO◎N＝N−BSA

HOH2：払？H−COOHIPVP・・・。′占NHZ＊

Bovine serum albumin．

＊＊Bovine thyroglobulin．
＊＊＊Polyvinylpyrrolidone．

100／jJ

Sample

50mM phosphate buf．pH7，4，0．5％BSA 320pL

3

3H−forphenieinol（0．78Ci／mmol，1．OpCi／ml）40iLl
2

40／JJ

1←Antiserum
Incubate，4OC，OVernight←1％rabbitγ，globulin←22％polyethyleneglycol

1100JJJ
2mJ

Centrifuge，3，0009，15min

〔q
q

O

bO
」

l
Aspirate and discard the supernatant

−l

−2

l
DissoIve the precipitateirLlm10．1N NaOHl←Toluene−Triton−SCintillator
Countin Paekard Tri−Carb．
図3

−3

10mg

10

100
Forphenicinol（ng）

Radioimmunoassay procedure・

図4 Standard curve．

代謝物としてM−6が見出された．蓑2に示したM−3は存在しないことがすでに知られているのように，これらの代謝物の中でM−3のみが14％で，血中の未変化体濃度は前処理をすることなくの交叉反応性を示したが，GC−MS法，RIを用い

このRIA法で測定可能であることが明らかとなた実験などでラット，ウサギ，ヒトでは血中には

った．

−145−

表2 Metabolites of forphenicinol
RIA

Metabolite

CrOSS reaCtivity（％）

M−1

100

（unchanged）

M−2

M−3

CH2−NH2

14

M−4

M−5

日。2勒co2H

M−6日。。芸あ？H−COOH
N−COCH3
H

前処理法の概略を図5に示した．CG−120にか2．血揆中，尿中，糞中代謝物の定量法
代謝物の定量法としてはすでにTLC法，GC−

ける前のサンプルの処理としては，尿はそのまま

MS法が確立されているが，TLC 法は精度に，使用したが，糞はホモジェナイズしたその上清を，GC−MS法では簡便性と代謝物M−2の誘導化に

また血菜は蛋白をェタノール沈殿させ遠心分誰し際しての分解に問題があったので，今回さらに検た上清を乾固したのち，水で再溶解し，CG−120

討を重ねた．

のショートカラムを通過させた．吸着成分は，まホルフェニシノールの代謝物はM−1〜M−6まず2hIピリジンでM−1を溶出したのち，4Nアで知られているが，アミノ基を有するM−1，M−

ンモニア水でM−33，酸性物質であるM−2，M−4，M−5，M−6に大法で定量を行った．未吸着部分の M−2，M−4，

別できる．代謝物定量の前処理に関するわれわれ

M−5，M−6のHPLCによる一斉分析はM−2のの基本的な考えとして，この性質を利用し，強酸

不安定性のために雉行したが，M−2のメトキシイ性カチオン交換樹脂（CG−120）にMTl，M−3をミノ体への誘導化を行い，ClinElut（Analytichem

吸着させ，未吸着のM−2，M−4，M−5，M−6はInternational，U．S．A．）を用いたカラム抽出法

HPLCで定量する．吸着したM−1，M−3は分別でclean−upする方法により，現在定量法を確立

溶出したのち，M−3 の交叉反応性を利用して，しつつある．

M−1，M−3とも前述のRIA法で定量を行うこと
とした．
−146−

を溶出させ，それぞれRIA

ホルフェニシノールの体内動態に関する研究
Feces

Urine（0．5ml）

Plasma…圭∴：二

Homogenize

ccntrifuge，2，000rpm，15minlSup．

Dry upResidue

H20

0．5mJ

CG−120（H form）4・8×15mrn

H20

4mJ

2M aq．pyridine
4mJ

14NNH40H
Eluate4mJ

Non−adsorbed（M−2，4，5，6）
HPLC

Eluate】Dryup

IDryupResidue︻■

KPB−BSA O．5mg

1

m

O

lKPB−BSA O・5m∫
0．1mg

−

A

］
M

RIA
（M−3）

（M−1）
図5

CleanTup prOCedure・

3．ホルフェ二シノールの体内動態

注射とも尿中への排泄がほとんどであり，投与後RIA 法の標識抗原として調製した［3H］一ホル

8時間で投与量の約70％，48 時間までに 90〜

フェニシノールをラットに1mg／kg経口投与，95％排泄され，糞中には投与後48時間で1〜2

あるいは1mg／kg 静脈注射し，ホルフェニシノ％ときわめてわずかで，腸肝循環はあまりないとールの血中濃度，稔排泄，バイオアベイラビリテ

考えられる．
以上の結果から，ホルフェニシノールは投与後ィーについて検討を行った．
図6に，絶食下経口投与および静脈注射したと
きの，ホルフェニシノールの血中濃度の経時変化速やかに吸収され，蓄積することなく速やかに尿中に排泄される薬剤であることが示された．

を示した．経口投与では，投与後平均21分で最なお，代謝物の定量，doseresponse，連続投与

高濃度1．703／g／mJ（ホルフェニシノール換算量）

による体内動態研究など，さらに検討中である．

に達し，ピーク以後は速やかに減少し，投与後8時間で最高濃度の1／30以下までに減少する．

文

台形方式で求めた経口投与におけるAUCは平均3．677／唱・hr／mJであり，静脈注射におけるAUC3．52FLg・hr／ml と比較してほぼ同じ値を示
し，経口投与における吸収性のよいことが明らか
となった．

献

1）Umezawa，H．Small molecular weightim−
munomodiners produced bymicroorganisms：
Their screening and discoveries，and thegenetics of microbial secondary metabolites．
Zn Small Molecular Immunomodifiers ofMicrobialOrigin．ed．by H．Umezawa，pp．
1−16，Japan Scientinc Societies Press，Tokyo

図7に，尿および糞中への捻排泄についての結果を示した．図に示した通り，経口投与，静脈−147−（1981）．

2）Ishizuka，M．，Ishizeki，S．，Masuda，T．，Momose，
AりAoyagi，T．，Takeuchi，T．，and

Umezawa，H．

0

0

5

2

5

2

0

−

5

︵一〇∪連日のもし0−Ol・＞言ご卓等︶uO葛LlUU282Sd一d

−−

1

2

3

4

5

6

7

8

Time afteradmTnislration（hr）

図6

Plasmalevels of radioactivity after administration of
lmg／kg of［3H］−forphenicinolin rats（mean±S．D．）．

0︵箪言一巴UO葛LOXの聖焉一つ∈⊃0

4

8

48

24

4

8

Time after administration（hr）

図7 Cumulative excretion of radioactivityin urine and feces afteradministrationoflmg／kgof［aH］−forphenicinolin rat（mean±S．D．）．
●，urine；▲，feces；×，tOtal．

Studies on effectsofforphenicinolonimmune
responses．J．A乃J沌oJ．，35，1042−1048（1982）．

3）Ishizuka，M．，Masuda，T．，Kanbayashi，N．，
Watanabe，Y．，Matsuzaki，M．，Sawazaki，Y．，
Ohkura，A．，Takeuchi，TりandUmezawa，H．

Antitumor effect of forphenicinol，alowmolecular weightimmunomodifier，Onmurine−148−transplantable tumors and microbialinfec−
tions．′．A乃JfあわJ．，35，1049−1054（1982）．

4）微生物化学研究所，苗有製薬抹式会社．For−
phenicinolの概要，pp．35−47（1981）．
5）松下 宏，辻 繁勝．傲生物の二次代謝産物に由来する・難病治療薬の開発研究．57年度研究報告書，pp．5ト57（1983）．

ロイペプチンおよびべスタテンの難病治療薬としての開発研究

田中

亘＊2・石井晴男＊2

Ⅰ．Bioavailability
l．ロイべプチソのbioavailability
研究協力者 山下幸和＊1，渡辺恵子＊1，水口 茂＊1，高山秀即1，石橋正冗＊1・宮崎 浩＊2・円堂 隆＊1・新井貞男＊1，竹井征夫＊1，島津忠寿＊12．マウスにおけるべスタチソのbioavailability
研究協力者 諏訪正人＊1，亀谷俊一＊1，渡辺紀子＊1，中山道則＊1，石橋正冗＊1，宮崎 浩＊2
3．RIAによるべスタチソの微量定量法
研究協力者 諏訪正人＊1，渡辺紀子＊1，浅川紀子＊1，入江朱美＊1，中山道則＊1，石橋正光＊1，宮崎 浩＊2
4．高速液体クロマトグラフィーによる血中べスタチソの簡易微量定量法
研究協力者 矢沢勇一＊1，松田隆歳＊1，中川淑子キ1，東海林栄敏＊1，島津忠寿＊lI．製剤研究1．硫酸ロイべプチソおよびその製剤の安定性
研究協力者 石間戸秀之＊1，青木 稔＊1，寺田 隆＊1，二宮 宏＊1
2．硫酸ロイぺプチソ新製剤の研究
研究協力者 石間戸秀之＊1，青木 稔＊1，寺田 隆＊1，二宮 宏＊1
3．べスクチソのドライシロップ剤（細粒状）の調製とその安定性
研究協力者 石問戸秀之＊1，青木 稔＊1，寺田 隆＊1，二宮 宏＊1

Ⅲ．毒性試験
−ロイべプチソ軟膏のウサギにおける35日閉経皮毒性試験
試験責任者 井坂英彦＊3
実験計画指導者 大滝恒夫＊3
試験実施担当者 山口一書＊3，松井英一＊8，今井 清＊！

＊1日本化薬（株）総合研究所＊2 日本化薬（株）医薬事業部＊3食品薬品安全センター秦野研究所−149−

一ロイベプチソおよびベスタチソの難病治療薬としての開発研究

ロイペプチンおよびべスタテンの難病治療薬としての開発研究

1−1．ラ・yトの門脈内，十二指腸内，およびⅠ．Bioavailability

経口投与時の血中濃度
1．ロイベプチンのbioaYailability
1）

実験方法

a） 動 物pィペプチソ（Leup）のbioavailabilityを高めるために，これまでマウスl），ラット2），イヌ1），

雄性CRJ−SD

ラット，7週齢（220〜240g）

およびニワトリ1）を用いて，種々の投与経路におb） 投与量けるロイべプチソの血華中濃度の差異につき検討

ロイペプチソ（Lot．32）60mg／mJ生食溶液を，してきた．しかしながら，動物種差は認められる

ロイペプチソとして門脈内投与時10mg／kg，十ものの，いずれの動物種においても，；経口投与で二指腸内および経口投与時30mg／kgとして投与

はbioavailabilityは低いと判断せざるを得なかした．

った．経口投与において，この低い血安中濃度をC）採血方法示す原田として，①肝臓における初回通過効果，

下記の投与時間後に尾静脈採血し，常法により血梁を得た（乃＝5）．

㊤腸内細菌叢による分解，④経口吸収性の悪さ，門脈内投与：5，15，30分，1，2，4，6時④胃，腸内での分解などが考えられる・そこで，
初回通過効果の有無を明らかにするため，門脈内

間

十二指腸内投与：15，30分，1，2，4，6，

注入，十二指腸内投与した際の血渠中濃度を測定
し，経口投与時のそれと比較した・一方，ラットの8時間

硫酸フラジオマイシソ投与群と非投与群に対して経口投与：30分，1，2，4，6，8時間

十二指腸内投与した際の血中濃度測定によって腸d） ロイベプチンの測定

内細菌叢による分解の可能性を，また日本薬局方

昭和56年度研究報告書に記載したRIA法3）にに記載された人工胃液，人工腸液での安定性など

従って，ロイペプチソの測定を行った．

を明らかにしつつロイペプチソのbioavailabilityを高めるに足る新しい投与方法を検索するため，

2）結果および考察
ロイべプチソ投与後の血中濃度の経時変化を図改めて基礎的な検討を行った．

1に示した．今回の検出限界は0．3ng／〆血菜であった．［AUC］。−6加は門脈投与で20．47±7．62−151−

1−2．腸内細菌がロイベプチンのbioavaiト

叫

1） 実

一

斗土

TI▲

︵盲︑買︶∪豆乳つむ二〇UO焉JlUBU002Sd一d

丁 ■ h l ＼abilityに及ぼす影響

験

腸内細菌の処理には硫酸フラジオマイシン（経口投与）を用いた．実験条件は下記の通りである．

I

a）動

物

→

b）投与方法

︑

︑

J

＼︑

CRJ−SD雄性ラット，8週齢（270〜300g）＼
T ■ ■ ■ ヽ

＼

﹂
卜
ヽ
︑

＼
＼

＼．

TL

T−＼

＼＼

−−り■

﹈

i）腸内細菌処理群（乃＝5）、、・一・1

硫酸フラジオマイシン（100mg／rat／回）を1日
2回，1週間にわたり経口投与したのち，30mg／ml生食溶液を，ロイべプチソ30mg／kgb．W．と丁・−−−−0なるように十二指腸内投与した．投与にあたっては，胃幽門部を結繋後，テルモシリンジを用いて十二指腸内に薬液を注入した．
ii）対照群（乃＝4）

0

1

2

4

6

硫酸フラジオマイシンの前投与を行わずに，ロ8Time after administration（hr）

イペプチソを投与した．

図l Plasma concentrationofleupeptininrats

C）採血時間afterintravenous（10mg／kg；pOrtalvein）

ロイペプチソ投与後，15，30分，1，2，4，6，（』），intraduodenal（30mg／kg）（●），
and oral（30mg／kg）（○）administration

および8時間に尾静脈より採血した．血液は採取

Ofleupeptin．

後10，000rpmx5時間遠心し，血梁を得たのち測FLg・hr／ml（10mg／kg），十二指腸内投与8．31±

定時まで−200Cで凍結保存した．

4・94jLg・hr／ml（30mg／kg），経口投与0．36±0．31d）血中ロイベプチン測定〃g・hr／mJ（30mg／kg）であった．

昭和56年度研究報告書に記載したRIA法に［AUC］。TSh，を比較すると，経口投与時のAUCより行った3）．

を100としたとき，十二指腸内投与時で231，門脈内投与時569であった．門脈内投与後の血中濃2）結果および考察

度は予想したより高い値を示したことから，経口

フラジオマイシン処理群および非処理群両者の投与時の血中濃度が門脈内投与よりも低い理由と血中濃度曲線を図2に示す．［AUC］。＿。はフラジ

して，肝臓における初回通過効果の関与は大きく

オマイシン処理群で 5．23±3．77，非処理群でないことが示唆された．一方，十二指腸内投与に6・19±3・74（〃g・hr／mJ）であり，両者間に有意差

比べ経口投与による血中濃度は非常に低かったこは認められなかった．また，いずれの測定時点にとから，腸管からの吸収率の悪さが経口投与時のおいても血中濃度に有意差は認められなかった．

血中濃度低下の原因ではないことが示唆された．

前節に述べた門脈内注入と十二指腸内投与時のbioavailabilityの差が，腸内細菌によるロイペプ−152−ロイべプチソおよびべスタチソの難病治療薬としての開発研究︵盲忘ミ︶u豆乳コのこO U〇一lgUの282のd一d
0

1

2

4

6

8

Time after administration（hr）

図2

Plasmaconcentrationofleupeptininratsafter
intraduodenal administration ofleupeptin（30mg／kg）．0，COntrOl●，fradiomycintreatment（100mgx2／head／day for．7days）．

チソの分解に起因する可能性は小さいと判断されない．そこで，実際の胃液あるいは腸液中でのロた．

イペプチソは，水溶液中とは異なった挙動を示すとの想定に基づき，消化酵素を含む人工胃液および人工腸液中での安定性を測定した・

1−3．ロイぺプチンの人工胃液および人工腸液中での安定性1）

実験方法a）試料および試液

前節の報告にみられたように，ラットにロイペプチソを授与したとき，投与法の違いによりそのi）0．1％ ロイべプチソ人工胃液溶液

血中濃度に大きな差が認められた・たとえば，投ロイペプチン500mgに，第7改正日本薬局方

与後30分後の血中濃度は，経口投与の場合を1の崩壊試験法に記載されているペプシンを含む人としたとき，十二指腸投与ではその約30倍，門工胃液（pHl．2）を加えて500mgとする・ii）0．05％および0．1％ロイペプチン人工腸

脈内投与では約200倍である．十二指腸投与で高液溶液

い血中濃度が測定されたことは，剤型を改良することによる効果の改善の可能性を示しており，非ロイべプチソ250mgおよび500mgに上記薬

常に興味のあることである．この原因の1つとし局法に記載されているパンクレアチソを含む人工て，投与部位におけるロイべプチソの安定性の差

腸液（pH6．8）を加えておのおの500mgとする・を考えることができるが，本研究班の56年度報iii） ペプシン

告書に記載されている水溶液中の安定性4）によっ

和光純薬工業（株）Pepsin，1：100ては，上記の血中濃度の差を説明することはでき

iv）

−153−

パソクレアチン日本薬局方パンクレアチン（ミクニ化学産業（株））

カラム温度：30℃
溶Ⅴ）水素化ホウ素ナトリウム溶液

媒：0．05Mリン酸一アンモニウム：メ

タノール：アセトニトリル＝80：12：8

溶媒流量：毎分1．4mg

水素化ホウ素ナトリウム320mgに0．1％水酸
化ナトリウム溶液を加えて100mgとする．

測定波長：b）安定性試験の方法

200nm

注入量：0・1％溶液，80〆；0．05％溶液，

実際に投与した場合を考慮し，試験温度は

160〆

37℃とし，保持時間は人工胃液では0．5，1，2，

内部標準溶液：♪一ヒドロキシソ安息香酸エチ

および4時間，人工腸液では0．5，1，2，4，おル75mgを50％ェタノールに溶かし100mgとする．

よび6時間とする．a）のi）およびii）で調製したおのおのの溶液約20mgを各保持時間ごとに準

2） 結

備し，370Cの水浴中，水平振近機を用いて振近し，

人工胃液および人工腸液中のロイベプチソの安決められた時点でとり出し，その10mgを用いて定性を残存率として表1に示し，標準溶液およびロイペプチンの残存量を測定する．
C）定

量

果

各試料の最終時点でのHPLCクロマトグラムを法

図3A〜Dに示す．

安定性試料溶液10mJをとり，これに1％の水

ロイペプチソの残存率は人工胃液（pHl．2）中酸化ナトリウム溶液を加えてpHを12に調整す

では4時間後94．0％，人工腸液（pH6．8）では6

る・次に，水素化ホウ素ナトリウム溶液2mgを時間後 82．4％（0．05％ 溶液）および 79．9％

加えて30分間室温に放置し，1％リン酸水溶液（0．1％）であった．いずれの場合にも生成物はラ2mgおよび内部標準溶液5mgを加え，さらに水セミ化によるD−ロイペプチソであり，分解物はを加えて全量を50mgとし，試料溶液とする．

認められなかった．また，反応液において経時的一方，ロイペプチン5mgおよび10mgを約

なpHの変化も認められず，これらの結果から，10mgの水に溶かし，上と同様に処理して内部標

ロイべプチソは人工胃液および人工腸液中で比較

準溶液5mgを加え，さらに水を加えて全量を50的安定であるといえる．

mgとし，それぞれを0．05％および0．1％標準溶液とする．

3）考察

投与法と血中濃度の関連を究明するため，人工試料溶液および標準溶液について，次の操作条件でHPLC によりロイべプチソの定量を行う．

胃液および人工腸液中での安定性を測定したが，機 器： 日立655型高速液体クロマトグラフ

いずれの場合もロイべプチソは比較的安定であっ

カラム：Nucleosi15C18（H）4．6mmi．d．×

た・経口投与の場合の血中濃度は十二指腸投与の160mm

場合の約1／30であったことから，人工胃液中で
表1人工胃液および人工腸液中でのロイべプテンの安定性
残

料
0・5

人 工 胃 液（0．1％）
人 工腸 液（0．05％）
人 工腸 液（0．1％）

92．9
94．3
96．1

1

存

率
2

（％）
4

6（hr）

95．5

94．3

94．0

94・3

93．1

87．1

82．4

93・4

90．6

84．9

79．9

−154−

ロイべプチソおよびべスクチソの難病治療薬としての開発研究．苦．聖二毒かJ蒜 卜虻仁り析

．ふロ．母心．①母．心中 ト∝屯卜眉

DC．ふロ．℡ふ．百中．心ロ ト正江ト⁝＝

図3 標準溶液および反応溶液のHPLCクロマトグラム・A，標準溶液（0・1％）；B，人工胃液（0．1％，4時間）；C，人工腸液（0・05％，6時間）；D，人工腸液（0・1％，6時間）．peakl，7セチルロイシルロイシン；peak2，L−ロイペプチノール；peak3，D−
ロイべプチノール；peak4，内部標準物質．
のかなりの不安定性を予想したが，人工腸液中に書に記載されている酸性水溶液および各種pHの比べむしろ人工胃液中でのほうが安定性が大きか

リソ酸緩衝液中でのロイペプチソの安定性の結果った．

と同等であり，人工胃液および人工腸液中に添加

また，これらの結果は，56年度本研究班の報告されているペプシソおよびパンクレアチソによる￣二二155−二影響はほとんど認められなかった．

前24時間は絶食した．

したがって，得た結果からは，投与法の違いにC）採血

よる血中濃度の差を説明することができない．そ投与後0・5，1，2，4，6，8，および24時間

れらの差は，何らかの他の原因によるものと考えに前肢静脈より採血した．血液は，常法により血られる．

菓とし，測定時まで−200Cで凍結保存した．
d）血中濃度の測定

1−4．イヌにおける腸溶銀の経口投与

血菓100／∠Jを用いて，昭和56年度研究報告書に記載したRIA法により測定した3）．

1）

実験方法

a）製剤および投与方法

2）結果および考察

ロイペプチソ50mg を含有する裸錠を製し，裸錠および腸溶錠をイヌに経口投与したときのこれに腸溶皮膜を施して，裸錠および腸溶錠とし血中濃度を図4に示した．裸錠投与時の吸収は速た（本研究報告書Ⅱ節）．これらの2錠を水 50

やかであり，投与後30分ですでにピークに逢しmg とともにイヌに経口投与した．なお，同一個た．一方，腸溶錠は投与後4時間で最高血中濃体に対して，腸溶錠投与後1週間に裸錠投与を行った．

度を示し，腸溶錠としての特徴を有していた．

b）動物［AUC］。−24hr は腸溶錠で0．27±0．11，裸錠で0・84±0．17／唱・hr／mJ であり，腸溶錠は裸錠のピーグル犬（雄性，体重約10kg，乃＝3）．投与［AUC］。＿2山 に比し1／3にすぎなかった．

︵盲＼餌ヱ∪温むdつむこO UO焉LIUBU82Sβd

0．0

Timeafteradministration（hr）

図4

Plasma concentration ofleupeptinin male beagledogs
after oraladministration ofleupeptin，tablets（50mgx2）（○）andleupeptin−enteric coatedtablets（50mgx2）
（●）．
−156−

ロイペプチソおよびベスタチソの難病治療薬としての開発研究

前節で述べたように，ラットにおいては経口投
与時よりも十二指腸内投与時のイヌが高い血中濃度を示したが，イヌでの結果はこれと相反する傾向を示し，bioavailability向上のための腸溶錠の可能性は小さいことが示唆された・
1−5．ロイベプチンジエチル7セタール投与
時のロイぺプチンならびにロイぺプチ
ンジエチル7セタールのラットにおけ
る血中濃度

1）実

験

a）動

物

2

5

10

20

50

ng

CRJ−SD系雄性ラット

Cross reacth／ity（％）b）投 与 量

図5

Cross reactivity of Leup（OEt）2（○）toleupeptin（●）by the use of［3H］−leu−

ロイペプチソジエチルアセタールを30mg／kg

peptln andantiserum A−2・で経口投与した．
血投与後0．5，1，2，4，6，および8時間に前肢腋窟動脈より採血した・
d）ロイぺプチンおよびロイベプチンジエチル

タールの測定は，交叉反応性を利用したRIA法3）により実施した・

0
2

ロイペプチソおよびロイペプチソジェチル7セ0
3

7セタールの血中濃度測定

0
5

︵盲＼ぎ︶
∪豆乳コのこO UO焉﹂︸∪8∪8d∈S巾一d

C）採

0

1

2

4

6

8

¶me after administration（hr）

2）結果および考察

図6

Plasma concentration ofleupeptinin
rats after oral administration of Leupa）ロイぺプチンおよびロイぺプチンジエチル（OEt）2（30mg／kg）・

7セタールの測定法
3H一ロイべプチソをトレーサーとし，ロイペプb）ラットにおけるbioavailability

チソカルポキシメトキシムをハブテソとして得ら

本法により，ロイペプチソジェチルアセタール

れた抗血清を用いたときのロイペプチソおよびロをラットに30mg／kgで経口投与したときのロイ

イべプチソジエチルアセタールの特異性を図5にペプチソおよびロイべプチソジュチルアセタール

示す．

の総量の血華中濃度を図6に示す．このときの検図から明らかなように，両者の検量線は完全に

出限界は30ng／mJ（ロイペプチソ換算）であった・

一致し，この方法によりロイペプチソおよびロイ

この図から明らかなように，ロイペプチソを経口

ペプチソジェチルアセタールの識別はできないも投与したときの血中濃度とほとんど変らず，ロイのの，両者の総量の測定が可能となった・

ペプチソジエチルアセタールのプロドラッグとし−157−

ての可能性はほとんどないことが示唆された．

2）結果および考察
血中および筋肉内濃度曲線を図7に示す．

1−6．ラットにおける親水軟膏投与

血中濃度は投与後1〜8時間ではば一定の値を維持した・筋肉内濃度は投与後2時間以降8時間

1）

実験方法

まで，血中濃度と同レベルで推移し，大きな変動

下記の計画に従って投与を行い，各時点で全血は認められなかった．

採取後，軟膏塗布部直下の筋肉を採取した．

［AUC］0−。ほ血中で0．98，筋肉内で0．77a）製剤ならびに投与量（pg・hr／mlorg）である・これまでに行った20％

20％ロイペプチソー親水軟膏．投与直前に調製

ロイペプチソーワセリン軟膏（投与量は今回同様

し・30mg／kg の割合で，脱毛した背部に塗布した．

30mg／kg）投与実験（ラット）3）では，［AUC］。＿8b）動が血中で1・29，筋肉内で1．50（FLg・hr／mlorg）

物だったので，今回の親水軟膏ではワセリン軌膏投

CRJ−SD雄性ラット・8週齢（260〜290g），各与時のAUCと比べて血中で約3／4，筋肉内で約群乃＝3・投与前日にエバクリーム⑧を用いて背部1／2の値が得られたことになる．

（塗布面）を除毛する．自由摂餌．

しかしながら，ワセリン軟膏についてはこれまC）血液ならびに筋肉の採取でに行われた3回の実験問でのAUCに数倍の差

投与後1，2，4，および8時間．採取した血が認められている3・○）・したがって，今回までの結液は血祭とし，また筋肉は採取したままの状態で，果から・親水軟膏，ワセリン軟膏のbioavailability

測定時まで−20℃で凍結保存．

の優劣を論ずるのは困難であった．

d）血中濃度測定は，血奨100〆を用いて，常一方，前節で述べた経口投与時の血中［AUC］。＿。

法に従いRIA法3）で行う．筋肉内濃度測定においは0・43／唱・hr／mJであったのに対して，親水軟膏ては，組織に結合した状態で存在するロイペプテ［AUC］0−8＝0・98，ワセリン軟膏1．29／g・hr／ml

ンをn−nOnanOyl−L−Leu−L−Arg・CHOを用いて遊であった・経口投与よりも軟膏剤のほうが高い離型としたのち，全ロイペプチソ量を測定した3）．

AUCを示し，軟膏剤の有用性が示唆された．

︵U LO盲＼uヱ∪豆乳つむ二〇UO壱lUBUB〇一〇のコ∈PUd2SdE

J一転一定ここここ』

0．Ol
0■

1

2

4

Time aIter administration（hr）

図7

Plasma and muscle concentration ofleupeptinin
rats after percutaneous administration ofleupeptin（30mg／kg；20％hydrophylicointment）．
−158−

ロイべプチソおよびべスタチソの難病治療薬としての開発研究

間の連続投与終了後，剖検時に塗布部直下および今後，bioavailability の高い軟膏剤の設計を含大腿部より約10gを採取した・

めて，残された問題の解決にあたりたい・

b）投

与

量

Vehicle controlと10％，20％，および30％

1−7．ウサギにおけるワセリン軟膏塗布後のロイペプチソーワセリン軟膏を，脱毛した背部皮血柴および筋肉内濃度

膚25cm2に0．5g投与した（ロイべプチソ投与量1）実として0，19，38，および57mg／kgb・W・に相当

験

する）．

（財）食品薬品安全センターにて，ウサギにおける35日閉経皮毒性試験を実施した際に試料をC）濃度測定提供していただいた・

採取された血菓および筋肉内ロイべプチソ濃度

a）試
i）血

測定を，昭和56年度研究報告書に記載した料

RIA法3）に準じて行った．

液

毒性試験と並行して，血中濃度測定のため1群3匹で連続投与し，初回，14日日および35日目2）結果および考察に経時的に血液を採取した・一

測定結果は表2〜表7に示す通りであった・図ii）筋 肉8に示すように，血中ロイペプチソ濃度は，単回1群5匹で実施した毒性試験において，35日

塗布において投与量に依存して上昇したが，連続

表2 Plasma concentration ofleupeptin（vehiclecontrol）
Period（week）

Time（hr）

Plasma concentration（leupeptin ng／mlplasma）

No．6

No．7

No．8

Mean±S．D．

0

N．D．

13．8

N．D．

7．9± 4．1

1

N．D．

20．6

N．D．

10．2± 7．4

2

33．4

31．6

18．8

27．9± 6．5

4

12．6

15．6

19．6

15．9± 2．9

6

25．O

11．2

23．4

19．9± 6．2

24

N．D．

27．6

N．D．

12．5±10．7

AUC（ng・hr／mり

377・8

466．5

353．9

386．1±57．3

0

N．D．

11．4

N．D．

7．1± 3．0

1

N．D．

N．D．

N．D．

5．0± 0．0

2

N．D．

17．8

N．D．

9．3± 6．0

4

N．D．

N．D．

N．D．

5．0± 0．0

6

N．D．

N．D．

11．O

7．0± 2．8

24

N．D．

N．D．

N．D．

5．0± 0．0

180．0

147．5±24．8

120・0

142．4

0

24．O

28．0

72．4

41．5±21．9

1

N．D．

67．8

N．D．

25．9±29．6

2

14．8

10．4

13．2

12．8±1．8

4

N．D．

18．2

N．D．

9．4± 6．2

6

N．D．

10．4

14．8

10．1± 4．0

N．D．

N．D．

N．D．

5．0± 0．0

144・2

282．8

264．0

230．3±61．4

AUC（ng・hr／ml）

24

AUC（ng・hr／ml）

N．D．＜10．0ngleupeptin／mlplasma・−159−

表3 P】asmaconcentrat；onofleupeptin（10％leupeptin）
Period（week）

Plasmaconcentration（leupeptin ng／mlplasma）

Time
（hr）

No・14

No・15

No．16

Mean±S．D．

12．2

13．4

17．8

14．5± 2．4

792．4

20．0

24．4

278．8±362．9
22．5± 5．5

0
1
2

30．0

20．2

17．2

4

15．O

6

N．D．

N．D．
N．D．
N．D．

32．5± 32．0
11．3± 8．9

24

N．D．

77．4
23．8
N．D．

AUC（ng・hr／ml）

968．5

494．8

164．1

542．5±330．1

0

N．D．

20．0

18．O

1

15．8

N．D．

24．4

14．3± 6．6
15．1± 7．9

2

33．4

41．8

45．2

4

20．0

112．4

N．D．

6

10．0

17．4

60．0

24

53．6

24．6

33．8

29．1± 22．0
37．3±12．1

AUC（ng・hr／ml）

5．0± 0．0

40．1± 5．045，8± 47．5

690．8

697．9

1，015．4

801．4±151．4

0

15．2

121．0

113．2

1

N．D．
N．D．
N．D，
N．D．
N．D．
125．1

56．8

10．0

83．1± 48．2
23．9± 23．3

38．2
N．D．
14．6

N．D．
N．D．
N．D．

16．1±15．7

26．6

117．2

570．0

1，728．969．6± 76．6
808．0±676．0

2
4
6
24

AUC（ng・hr／ml）

5．0± 0．0
8．2± 4．5

N．D．＜10．0ngleupeptin／mlplasma．

表4 Plasmaconcentrationofleupeptin（20％leupeptin）
Period（week）

Time
（hr）

No・22

No．23

0

N．D．

N．D．

1

194．2

235．8

Mean±S．D．

N．D．
107．2

5．0±
179．1±

2

113．8

273．8

56．8

967．4

115．2
73．4

167．6±
365．9±

6

120．0
104，2

1，368．0
840．0

166．4
29．0

551．5±
324．4±24

AUC（ng・hr／ml）

2，618．8

12．8±
37．7±

479．4

562．9

521．2±

0

12．4

1

N．D．
N．D．

N．D．
N．D．

8．7±
5．0±

2

7．7±
17．3±

6

16．6

16．6

16．6±

24

46．8

10．4
313．1

28．6±
478．9±

AUC（ng・hr／ml）

644．7

2

10．4
15．2

0

19．4

1

4

7

12．0
42．2

0

33．2

7

10．1±
14．8±

8

15．2
16．4

3 0 2 2 0 8 5
116

8．2±
5．0±

5

13．6

N．D．
N．D．

8

6
24

66・6±37．6］

6

13．2

365・9［9，599・0±10，059・1［2，486．6±132．3］

1

4

8

／：notmeasuredbecauseofdeath・［］：withoutNo・23・N・D・＜10・Ongleupeptin／mlplasma．
−160−

0．0］

425・4［ 65・1± 8．3］
577・7［143・2±23．2］

0

2

N．D．
N．D．

2，354・3

5・0±

2

11．4

1

23，823．80・0［53・5［150・7±43．5］
75・1［114・5± 0．7］

3 0 5 1 0 4 4 1

0

AUC（ng・hr／ml）

5

No．24

4

0

2

Plasmaconcentration（leupeptin ng／mlplasma）

ロイべプチソおよびべスタチソの難病治療薬としての開発研究
表5 Plasma concentration ofleupeptin（30％leupeptin）
Plasma concentration（leupeptin ng／mlplasma）

Time

Period（week）

No．31

（llr）

0．0

0

124．9± 117．2

8

278．4：± 288．8

0268．1± 106．92183．0：±

0

一2

201．8± 224．7

7

2

73．5

4，727．4±2，479．3

3

．

75．7±

2

42．1

40．5：± 13．1

5
5

70．5±

15．8

3

50．6±

2．6

8

51．2：± 12．7

18 2 8 8 8 6 8

2

4
1 2

5
． 4 8 6 8．4 0 0

3275．2± 124．8
3，274．1±1，156．1
232．5±

94．1

85．4±

52．0

2

EJ

5

7

表6

7

N．D．＜10．0ngleupeptin／mlplasma・6

AUC（ng・hr／ml）

0

6
24

8

4

8

2

0
9
8
5
3
6
6
6
4
7
3
3
2
9
8

1

1

0

2

AUC（ng・hr／ml）

7
6
0
7
4
6
9
8
1 6

24

1
6

6

8
5

4

2
3
l

2

︐
8

1

3
2

0

1
5

24

AUC（ng・hr／ml）

67．2
7
2

6

17．8
4
3

4

5．0±

．

2

Mean±S．D．

4
0
8
4
6
D 9・6・7．6・8．．9 6．6 2 0 2 0 2m66811979 18．7．4．5．4．6．1．8．0．
1．2．8．7．
7 ．4 2 1 2 3

1

N．D．

9

一02▲4829 ．22600614002201
D8・L8・6・0・
8．
凡2883317194633490
25
52518965593043392817
48311
2

0

No．32

43．2±

25．5

30．1±

13．6

31．9＝±

6．9

30．9：±

5．2

923．8±

148．0

Plasma and muscle concentration ofieupeptin at24hr after percutaneousadministration ofleupeptin（10，20，and30％）ointment
Plasma and muscle concentration（ng／mJor g）
No．33
P N．D．＊

No．34
N．D．＊

Vehicle controI A N．D．
B N．D．

Mean±S．D．
5．0±

P

0．0

N．D．12・5±0・O
N．D．12．5±

0．0

DO90
鼠73514±±±±nO▲45
ea2・86
M142

6035
m1984︒4

5＊．
3DDD
m軋NN

PAB

10％leupeptin

Group Plasmaanfn器iIB，C器Centration
No．37
13．0

No．38 Mean±S．D．
18．8 15．9± 2．9

20％leupeptin A N．D・ N・D・12・5±0・OB
25．1
41．1 33．1± 8．O

P30％leupeptin A

No．39

No．40

Mean±S．D．

15．6

38．8

27．2±11．6

44．8 202・7123・8±79・O
B N．D． 21．9 17．2± 4．7

N．D．＊＜10．0ngleupeptin／ml plasma・

N．D．＜25．0ngleupeptin／g tissue・P，plasma；A，VaStuS

mりlateral；B，latissimusdorsim・投与による著しい濃度上昇は認められなかった・

連続投与によりAUCの減少することが漠察され

vehicl。C。ntrOl群においてほ再測定によっても占 た・単回投与時の筋肉内ロイペプチソ濃度は，個イペプチソが検出されたが，この原因は不明であ 体問の変動が大きく，投与量と筋肉内濃度値の関る．図8に示した通り，同一投与量で比較すると， 係を論ずることができなかった・連続投与終了時−161−

表7 Muscleconcentration ofleupeptin at24hr after repeatedpercutaneousadministration ofleupeptin（10，20，and30％）ointment for5weeks
Group Muscle concentration（leupeptin ng／g tissue）

Vehicle control

57．1

B N．D．
No．9
A N．D．
B
201．1

10％leupeptin

No．17
A N．D．

20％leupeptin

Mm39
7m・mmMmmM44・

MmmMmmMmmM62・

No．l
A

B N．D．

30％leupeptin

B3，928．0

3835・

︒627・

No．25
A N．D．

No．4

No．5

N．D．

N．D．

21．4±

17．8

32．5

N．D．

21．6±

11．3

No．12

No．13

Mean±S．D．

61．9
70．4

42．7
27．7

Mean±S．D．

28．4±

20．4

69．8±

68．3

Nb．20

No．21

N．D．

N．D．

12．5＝ヒ

530．1

N．D．

133．8± 201．l

恥．28

No．29

Mean±S．D．

N．D．

123．2

51．0±

50．7

188．3

863．9±1，532．8

Mean±S．D．
0．0

40．9

N．D．＜25．0ngleupeptin／g tissue．
A，VaStuS m．，lateral；B，latissimus dorsi m．

である．皮膚は，発毛期になると肥厚するとされ，軟膏塗布という局所刺激により hair cycle が変︵盲＼LfMミ︶○⊃く化するために起った現象であろうと考察されている．連続投与によりAUCが小さくなった原田の1つとして，この皮膚厚化による吸収低下の可能性が示唆された．一方，連続投与によりAUCが小さくなるという現象は，これまでに行われた筋ジストロフィー発症マウスに対するワセリン軟膏
連続投与実験5）およびヒトに対する経口による連
10％

図8

20％

続投与3）においても認められているので，ロイペ

30％

LeupeptLn COnCentrationin ointment

プチソが連続投与により代謝酵素誘導を起す可能

AUCin rabbits after single andrepeated administration ofleu−
peptin ointment．⊂コ，0；l≡三㌧

性も考えられよう．
2．マウスにおけるベスタテンの

2；区翌，5 weeks．

bioavailability

における筋肉内ロイべプチソ濃度は，塗布部直下
において大腿部よりも高濃度を示し，その濃度はベスタチソを筋ジストロフィー症の治療薬とし投与量に依存して上昇した．これに反し，大腿部て開発するにあたって，投与量と血中動態との関におけるその上昇はわずかであった（図9）．血係を明らかにし，血中濃度値から標的組織である中濃度と筋肉内濃度は対応した変化を示さなかっ

筋肉への移行量を推定可能とすることは適切な投た．

与計画を立案するうえで重要である．ここでは，（財）食品薬品安全センターの所見として，軟筋ジストロフィー発症マウスにべスタチソを投与

膏を連続投与すると，皮膚が肥厚したということ

するに先立ち，C57BL／6 マウスにおける単回おー162−

ロイペプチソおよびべスタチソの難病治療薬としての開発研究

Leupeptln COnCentrationin olntment

呈25 2．−50（〟g／g）

図9 Muscleconcentrationofleupeptininrabbits after percutaneous・
ESSg，VatuS m．1ateral；⊂コ，muSCle（administration site）・A，
24hr after administration； B，24hr after repeatedadministration
for5weeks．

よび連続投与時のべスタテン血中動態および筋肉b）実験動物および投与方法

内におけるべスタチソとその代謝物の動態を明ら

単回投与群については，日本チャールスリバー

かにし，血中動態との比較を行うこととした・さより購入した雄性マウスC57IL／6（体重20・5らに，べスタチソ投与時の尿中代謝物の検討をも±0．1g，8適齢）を1群3匹として使用した・同時に実施した．

［3H］−ベスタチソを1．32mg・1．26mCi／kg，5・04
mg・1．26mCi／kg，および12・47mg・1・26m Ci／

1）実験方法kgの割合でおのおのの群に経口用ゾソデを用いa） 試て投与した．連続投与群については，雄性マウ薬

ベスタチソは日本化薬（株）にて製造した医薬

スC57BL／6（体重21．9±0．3g，8週齢）を1群

品純度のものを使用した．放射性同位元素標識

3匹として，［3H］−べスタチソを12．60mg・1・33

化合物である［3H］−ベスタチソ（Ⅳ−［（2ぶ，3月）一mci／kgの割合で1日1回，7日間連続経口投与

3−amin0−2−hydroxy−4−（2′，［3H］）−phenylbutano・した．

yl］−L−1eucine）は N−［（2S，3R）−3−benzyloxy−C）筋肉および血液中濃度の測定

carbonyl，amin0−2−hydroxy−4−（2l−bromo）−phen・i）単回投与群

ylbutanoyl］−L−leucine benzyl esterを原料とし血液中濃度測定群はベスタチソ投与後0・5，1，てNew EnglandNuclear社（Boston，Mass・）に

2，4，8，24時間に尾静脈よりheparinizedcapi1−て3H−ガスによる接触還元を行ったのち，得られ1ary tube（国産遠心器（株），東京）で経時的にた還元生成物をさらに当研究所にて精製した・得採血し，COMBUSTCONEおよびPAD（Pack−

られた［3H］一ベスタチソは放射能検出器（Berth−ard社，Illinois，U．S．A．）にとり乾燥後サソプ

01d HPLC RadioactivityMonitorLB−503型，西ルオキシダイザー（Packard社，B−306型）でドイツ）付HPLC（Shimadzu，LC−4A，島津製作

燃焼し，生じたトリチウム水を冷却して捕集し，所，京都）を用いて放射化学的純度を測定した結Mono PHASET40（Packard社）をシソチt／−ク

果，99％以上であった．また，このものの比放射ーとして用いて液体シソチレーショソカウソダー

能は15mCi／mgであった．

（LSC−753型，アロカ社，東京）で放射能を測定
−163−

した．
また，筋肉中濃度測定群はべスタチソ投与後，1，4，8時間にエーテル麻酔下，上腕動脈より放血死させ，血液および筋肉（後肢大腿部）を採取した．筋肉は一定量を試料とし，燃焼法により放射能を測定した．
ii）連続投与群
最終投与後，血液中濃度，筋肉中濃度測定群はi）と同様に行った．
d）尿糞中排泄率の測定i）単回投与群［3H］−ベスタチソを経口投与したマウスをメタ
ポリックケージ（杉山元医理器（株），東京）中で飼育し，24時間までに自然排泄された尿を採

⊂⊃

0

くつ

0

くつ

l．n

⊂⊃

l．r〉

取した．尿は，その一定量に液体シソチレークー

Retention time（min）

図19

Atomlight（New England Nuclear社）を加えRadiochromatogram
Of［3H］bestatin by
HPLC−RDI．

たのち，直接液体シンチレーションカウンターで放射能を測定した．
ii）連続投与群

クスGS（日本ミリポア，リミテッド，東京）で濾i）の方法と同様に，尿は24時間ごとに採取過して得た濾液をHPLC用試料とした．

し，その放射能を測定した．糞は24時間ごとにii）血採取し，水を加えてホモジェネートし，その一定

べスタチソ投与後1時間のものを用いた．すな

量を試料として燃焼法により放射能を測定した．
e）高速液体クロマトグラフィー（HPLC）による尿中，血紫中，筋肉中代謝物の同定および定量e−1）HPLC条件
装置は，Shimadzu LC−4A

菜

わち，血奨150βにエタノールを40mg加え，室温で10分間放置した．その後3，000rpm

で10分間遠心して得た上清を分取し，溶媒を減圧下で留去したのち，残法を0．5mgの純水に溶解

に

UV

検出器

SPD−1（島津製作所）と放射能検出装置LB−503

した・次いで，マイレクスGS で濾過したのち，濾液をHPLC用試料とした．

を装着したものを用いた．カラムは，Nucleosi1iii）筋 肉7C18H（セソシュー科学，東京）4．6mmi．d．×

べスタチソ投与1，4，8時間後に採取したも20cmを用いた・試料注入後A液（20mゝⅠリン酸のを用いた・すなわち，筋肉1g に生理食塩水

アンモニウム溶液，pH6．0）のみを10分間流し，30mgを加えてホモジェネートし，3，000rpm で

その後B液（メタノール）を毎分2％の割合で20分間遠心して得た上清を，ⅩAD−W（オルガ

50％ まで増加させるグラジェソト溶出法によりノ工業（株），東京）カラム（15mmi．d．×50

分析した．流速は1．5m〃min とした．

mm）に移し純水100mg

で洗浄後，メタノールe−2）HPLC分析のための試料調製

100mgで溶出した．溶出液を減圧下で留去し，残i）尿法を0．5mgの純水に溶解した．次1．、で，マイレ

24時間までに排泄されたものを用い，マイレ

クスGSで濾過したのち，滝液をHPLC用試料ー164−ロイペプチソおよびベスタチソの難病治療薬としての開発研究mg）／30．4mg proteinの割合で加え，370Cで24とした．
f）マウス後肢大隈筋ホモジェネートによるベ

時間イソキュべ−ショソした・インキュベーショ
ン後，反応液をマイレクスGSにて濾過し，得ら

スタチンの代謝（わI pffro）
C57BL／6 マウスをェーテル麻酔下で上腕動脈れた濾液をHPLC用試料とした．

より放血死させ，後肢大腿部より筋肉を得た・その約1gに0．1Mリン酸緩衝液（pH7・3）5mg

2）結果および考察を加えてホモジェネートしたのち，10，000rpm

雄性マウス C57BL／6 に［3H］−べスタチソをにて20分間遠心して上活を得た・この上活に1．32，5．04，および12．47mg／kgの割合で単回経［3H］−べスタチソを1×107dpm（sp・aC・15mCi／

口投与したときの3匹の平均血液中濃度（放射活︵盲＼ぎ︶uO焉LlUO200
12

4

8Time after administration（hr）

図12

図1l Bloodconcentrationsoftheradioactivity

Comparison of blood concentrations ofafter a single oral administration to

the radioactivity after a single（12・47

three malemieeinadoseofl．32mg／kg

mg／kg）（●）and a repeated（12・60mg／（○），5．04mg／kg，and12．47mg／kg（●）

kgx7days）（○）oral administration ofof［3H］bestatin．The radioactivity wascalculatedin the amount of bestatin．

［3H］bestatin．The radioactivity wascalculatedin the amount of bestatin．

表8

Pharmacokinetic parameters of mean blood concentration after a single
anda r6i）eated oraladministration of［3H］bestatin on severaldoses（品）［AUC］0−24

5，241

3
4

12，793．75

012．60＊

4，699

0
6

8，277．50

0

12．47

1，485

3
5

3，003．75

0

5．04

429

6
5

1，172．75

fl伽
0

1．32

cmax Tm8Ⅹ
0．5
0．5
0．5
0．5

fl／2β

geα

12．49

1．243

0．055

13．00

1．315

0．053

19．24

1．156

0．036

14．64

1．621

0．047

＊：repeatedin daily dose of12・60mg／kg for7days・［AUC］。＿2．：areaunderbloodconcentrationtLS・timecurve（ng・hr／ml）・
CmaⅩ：maximum blood concentration（ng／ml）・
Tm＆Ⅹ：time to maximum blood eoncentration（hr）・Ke。Or K。β：elimination rateconstant（hr￣1）・
tl／2。Or tl′2β：blood halfrlife（hr）・

−165−

だ。β

性値のべスタチソ換算値）の推移を図11に示す．

どまった．各測定点における平均血液中濃度は，また，雄性マウスC57BL／6に［3H］一ベスタチソ

単回経口投与群に比べ高くなる傾向がみられたを12．60mg／kgの割合で1日1回，7日間速読が，有意差が認められたのは投与後24時間（K経口投与したときの最終回投与後の，3匹の平均

O．01）のみであった．連続投与群におけるα相

血液中濃度の推移を図12に示す．これら血液中の半減期およびβ相の半減期は単回投与群のそ濃度値より算出したpharmacokinetic parame・
tersを表8に示した．

れと比較してわずかに減少したものの，両者の間に有意差は認められなかった．連続投与群の単回経口投与群の平均血液中濃度における［AUC］。＿24は，単回投与群のそれに比較して1．55

TmaⅩはいずれも0．5時間を示し，Cmaxは用量倍有意（KO・01）に増加した．この［AUC］。−24

依存的に増加した．α相の半減期はいずれの投与の増加は，最終回投与直前（前回投与後24時間量においてもほぼ一定の値（fl／ね0．5〜0．6時間，値）の値が145ng／mJを示していることに起因す

投与後0．5〜2時間値で算出）を示した．一方，るものと推察される．

β相の半減期（fl／2β12−9時間，投与後8〜24

雄性マウス C57BL／6 に［3H］−べスタチソを時間値で算出）は投与量の増加に伴ってわずかに

1・32，5・04，および12．47mg／kgの割合で単回経延長する傾向を示した．［AUC］。＿24は用量依存口投与したときの，平均筋肉中濃度および平均血的に増加することが認められた．また，投与量と液中濃度の推移を図13に示す．各投与量におけ［AUC］。−2．との間にはよい相関（r＝0．997）がる筋肉中濃度の推移は，血液中濃度の場合と同様みられた．連続経口投与群の平均血液中濃度におに，用量依存的に増加することが認められた．ベ

いて，Tmはは単回経口投与時と同様に0．5時間

スタチソを単回経口投与したときの筋肉中濃度をであった．また，cm8Xは単回経口投与時のそれ

血液中濃度と比較した場合，投与後1時間では筋と比較すると約1．1倍となり，わずかな増加にと肉中濃度は血液濃度の1／2以下のレベルであっ■∵︵〇一OS⊃∈竃∪︶uO琶lUBU00

0 0 0
0 0

︵pO〇一q盲＼ぎ︶uO葛﹂言28

1

4

8

1

4

8

Time after administration（hr）

図13

Blood（left）and muscle（right）concentrations of theradioactivity after a single oral administration to threemale micein the doses ofl・32mg／kg（○），5．04mg／kg（●），and12・47mg／kg（ロ）of［3H］bestatin．The radioac→
tivity was calculatedin the amount of bestatin．
−166−

ロイぺプチソおよびべスタチソの難病治療薬としての開発研究
表9

ConcentrationandrelativepercentageofLbestatin、and（2S，3R）AHPA
in pIasma and muscle atlhr after a single oraladministration to
three male mice

Concentration（ng／rnlplasma or g muscle）

Bestatin
Plasma＊51

Muscle19±3

Relative（％）（2S，3R）AHPA

Bestatin115±31

53．7

Plasma619

Muscle156±116

Plasma

2，727

128

95．5

605±263205±41

73．6

Muscle（2S，3R）AHPA

The radioactivity was calculatedin the amount of bestatin．
＊Plasma（乃＝1）．

たが，投与後4，8時間では両者のレベルはほは同程度となった．
さらに，得られた血梁および筋肉からの抽出物をHPLCTRIDにより分析したとき，血奨中および筋肉中に見出された2本のピークは，それらの保持時間から（25，3月），AHPAおよび未変化体であるベスタチソと同定した．他の代謝物は，
このクロマトグラムから見出すことはできなかった．単回経口投与群の各投与量における投与後1時間の筋肉中および血菜中べスタチソと，その代謝物である（2ぶ，3月）AHPAの濃度と，それらの存在比を表9に示す．単回投与後1時間におけ
図14

る血菜中べスタチソの割合と，投与量との間にはRadiochromatogram obtained fromtheincubation

相関関係（r＝0．937）が認められ，投与量の増加

miXture Of［3H］

bestatin and mouse homogenate．

に伴ってベスタチソの割合が増加した・筋肉中におけるべスタチソおよび（2g，3R）AHPAの絶の割合が血奨中のそれと異なった原因として，筋対量はともに投与量の増加に伴って増加し，筋肉中におけるべスタチソの代謝が推察された・そ肉中ベスタチソ濃度と投与量との問に相関関係

こで，マウス筋肉ホモジェネートと［3H］−ベスタ（r＝0．994）が認められた．すなわち，1・32mg／

チソを24時間イソキュべ−ショソした結果，図kgにおけるべスタチソの存在率は（2g，3■R）

14に示すように，（2g，3月）AHPAの生成が観

AHPAのそれに比して約1／2を示し，筋肉中に察された．このことから，［3H］一べスタチソは筋は主に（2g，3月）AHPAが存在していた．しか肉中のprotease

しながら，この傾向は投与量の増加に伴って逆転認され，筋肉内のべスタチソの割合が血菜中のそし，12．47mg／kgの場合，べスタテンは（25，れと異なる要因の1つと推察される・

により加水分解されることが確

3月）AHPAの約2．8倍を示した・標的組織であ雄性マウスに［3H］−べスタチソを12・60mg／kg

る筋肉においてべスタチソと（2ぶ，3月）AHPAの割合で1日1回，7日間連続経口投与したとき−167−

投与群ともほぼ同等の値を示したが，投与後4，8
時間では連続投与群のほうが高くなる傾向がみられた．
雄性マウスに［3H］−ベスタチソを12．60mg／kgの割合で1日1回，7日間連続経口授与したときの，最終投与後1時間における筋肉および血集中に存在するベスタチソと（25■，3月）AHPAの濃度と，それらの存在比を表10に示す．血莱中に存在するべスタチソの割合は単回投与群とほとん
ど変化がなく，97．2％であった．投与後1時間に014おける血液中べスタチソ濃度は，連続投与によりTime after administration（hr）

図15 Blood（○）and muscle（□）con−

上昇する憤向がみられた．筋肉中に存在するべス

Centrations of the radioactivity

タチソの割合は単回投与群とほぼ同じ値を示し，afterarepeatedoraladministra−tiontothrecmalemicein daily

78・3％であった・投与後1時間における筋肉中

dose of12．60mg／kg of［aH］

ベスタチソ濃度は，連続投与にもかかわらず，そbestatin．The radioactivity wascalculatedin the amount ofの上昇は観察されずほぼ同じ値を示した．

bestatin．

雄性マウスに［8H］−ベスタテンを12．60mg／kgの最終投与前および最終投与後1，4，8時間におの割合で1日1回，7日間連続経口投与し0〜ける平均筋肉中濃度を，平均血液中濃度の推移と1日と5〜6日に排泄された尿を実験の部e）のともに図15に示す．最終投与前と最終投与後1方法に従って分析したradiochromatogramSを時間において，平均血液中濃度は平均筋肉中濃度

図16に示す．18．3分に溶出するピークは（25■，よりも高い値を示すものの，投与後4，8時間で3月）AHPAであり，36．0分に溶出するピークははそれらのレベルはほぼ同じ値を示した．この結

べスタチソであった．それ以外のピークは，この果は，単回投与群でみられた結果とよく一致した．

クロマトプラムからは見出すことができなかった．

単回投与群と連続投与群との間で平均血液中濃度

すなわち，単回投与時にみられたのと同様に，連および平均筋肉中濃度について比較したとき，い続投与した場合においても，尿中にはべスタチソ

ずれの時点においても平均血液中濃度は連続投与

および（2S，3R）AHPAが認められたのみであ群のほうが高く，投与後4，8時間値に有意差（そり，連続投与による代謝経路への影響は認められれぞれP＜0．05，P＜0．001）がみられた．また，なかった．

筋肉中濃度は，投与後1時間で単回投与群，連続
表10

雄性マウスに［3H］一べスタチソを1．32，5．04，

Concentrationandrelativepercentage of bestatinand（2S，3R）AHPA
in plasma and muscleatlhr after a repeated oral administration for
7daystomalemouseindailydoseof12．60mg／kgof［3H］bestatin

ng／mlplasma or g muscle

Dose（mg／kg／day）

Bestatin
Plasma4，858

MuscIe537（2S，3R）AHPA

The radioactivity was calculatedin the amount of bestatin．
−168−

Relative ％Bestatin（2S，3R）AHPA

ロイペプチンおよびベスタチソの難病治療薬としての開発研究③クーOH−bestatin（彰Bestatin

、l
￣

−

、

−」1−＿

−＿＿lL＿J．一∪

UV254nm0．0寸

三十」・モ▲・轟・・ミニJ㌻一二y
M

Retention time（mh）

図16

十皿≡︒

①（2R，3R）AHPA②（2S．3R）AHPA

亭二 日

l」D
N

RetentioTltime（min）

Radiochromatograms of the24hr mouse urineafter
a single（A）and a丘nalofrepeated（B）administrationof［3H］bestatin．

表ll Excretion rates（％of dose）of bestatinand（2S，3R）AHPA as metabolitein
24hr urine after a single oral adminis−
tration of［3H］bestatin to male mouse（乃＝1）％of dose

Dose（mg／kg）（2S．3R）AHPA Bestatin Total
1．32

39．4

44．2

5．04

25．4

65．8

83．6
91．2

12．47

18．1

64．7

82．8

図17 Cumulative excretion rates（％ofdose）

および12．47mg／kgの割合で単回経口投与した

of the radioactivityinmouse urine and

ときの，投与後24時間までに排泄された尿を

feces after a repeated oraladministra−

HPLCで分析した結果を表11に示す．投与されtion for7days to malemice（n＝5）

in：daily dose of12・60mg／kg of［3H］

bestatin．⊂コ，urine；囲，feces．

た［3H］−べスタチソは投与量に依存せず，その放射活性でみた場合，0〜24時間に 82・8〜91・2％が尿中に排泄されており，きわめて吸収のよい薬

雄性マウスに．［3H十べスタチソを12．60mg／kg

物であると推察された．べスタチソと（2ぶ，3月）の割合で1日1回，7日間連続経口投与したとき

AHPAの存在割合は投与量に大きく依存しておの尿および糞中排泄率を図17に示す．0〜1日

り，低投与量の割合には（25，3月）AHPAの割

では尿に98．7±1．9％，糞に10．6±2．9％，合計

合が投与量の約40％を占めたのに反し 投与量で109．3±3．4％排泄された．、また，0〜6日間が増加するに従って（2g，3月）AHPAの割合がの累積排泄率は尿に 96．5±3． 5％，糞に13．4±

減少し，未変化体が増加する傾向が認められた・

1．7％，合計で109．9±2．1％排泄された．期間を−169−

通じて尿および糞中排泄率がほとんど変化しない

依存的な傾向は観察されなかった．尿中には，未ことから，連続投与による吸収率の変化はほとん

変化体であるベスタチソが主に排泄され，次いでどないものと推察された．

（25 ，3月）AHPAが確認された．他の代謝物は観察されなかった．

3） ま と め

6・7日間連続投与におけるベスタチンの尿，1・［3H］一べスタチソを1．32，5．04，および糞中排泄率はきわめて高値を示し，高投与量にお12・47mg／kgの割合でマウスに経口投与するとき，いてもべスタチンの吸収はきわめてよいものと推

血液中の放射活性値から計算した［AUC］。＿24は察された．

用量依存的に増加した．また，12．60mg／kgの割合で7日間連続経口投与時の［AUC］。＿24は単回

3・RIAによるぺスタチンの微量定量法

投与時のそれに比較して約1．55倍に増加した．
血菓中放射活性の内訳は，未変化体であるべスタ

べスタチソ（（2S，3R）一3−amin0−2−hydroxy−4−

チソと，その代謝物である（2ぶ，3月）AHPAのphenylbutanoyl−L−leucine；（2S，3R）−AHPA−L−

みであった．

leu）は，gJ′瑠わ∽ツCe∫OJgp0佃rc〟Jiの培養濾液

2・［3H］−べスタチソを1．と同様に投与した中から見出されたジペプチドである．この薬物のとき，筋肉内放射活性値は用量依存的に増加した．

生体内動態（pharmacokinetics）を知るために

また，筋肉内には，未変化体であるべスタチソとは，高感度で特異的な定量法の確立が必須であ（25，3月）AHPA以外に代謝物は見出されなか

る・先にわれわれは，ガスクロマトグラフィーマ

った・これら化合物は，いずれも投与量に比例しススペクトロメトリーを用いたセレクテッドイオて筋肉内濃度も増加するものの，両者の存在比はンモニタリング（GC−MS−SIM）法による微量定

血菜中のそれと異なるものであった．すなわち，量法について報告した7）．この方法はきわめて高1・32mg／kg投与量の場合，べスタチンの（2ぶ，感度であり，しかも特異性に優れた方法であっ3月）AHPAに対する割合は1／2以下であったの

た・また，生体内において活性代謝物として見出に対し，12・47mg／kg投与量の場合のそれは約されたクーOH一ベスタチソをも同時に定量するこ

2・8倍となった．このことより，標的組織におけとが可能であった．

るべスタチソ濃度を高めるためには投与量を上昇

今回われわれは，GC−MS−SIM法にかわる，よさせる必要のあることを認めた．

り簡便な数量定量法を開発すべく，ラジオイムノ

3・筋肉内に移行した末変化体であるべスタチ

アッセイ法を検討した．そして，従来困難とされ

ソは筋肉内proteaseにより加水分解を受け，たジペプチドの抗血清の調製に成功した，本報告（2ぶ，3ji）AHPAが生成することが確認された．

では，べスタチソを直接BSAに結合させること

この事実は，2・における低投与量での筋肉内べによって得た抗原を用いて製した抗血清の評価をスタチソ濃度の低下を裏づける要因の1つと推察行うとともに，確立したRIA法をGC−MS−SIM

された．

法と比較検討した結果について述べる．

4・7日間連続投与におけるべスタチンの筋中濃度は単回投与時のそれとほぼ同等の値を示し，

1） 実験方法

遵筋投与による上昇は観察されなかった．

a）試5・ベスタテン経口投与時の24時間マウス尿中には，投与量の約83〜91％が排泄され用量薬

ベスタチソは日本化薬（株）にて製造した医薬品純度のものを使用した．各種のベスタチソ同族ー170一

ロイべプチソおよびベスタチソの難病治療薬としての開発研究

体は日本化薬（株）にて製造した標準品を使用しに滴下，撹伴する．滴下終了の10分後にさらにた．ウシ血清アルブミ

ン（BSA）はシグマ社

10mgのethyl−CDIを加え，膳所で18時間撹

（RIA grade，St．Louis，U．S．A・）より購入した

拝した．反応終了後72時間透析し，凍結乾燥にものを使用した．1−ethy1−3⊥（3．dimethyl−amino−

ょり，白色粉末45．5mgを得た．ここで得られpropyl）carbodiimide（ethyl−CDI）は東京化成工

たべスタチソーBSA結合体は，BSAlmolに対し業（株）（東京）より購入したものを使用した・てベスタチソ約9molが結合していることを確認

3H標識ベスタチソ，入L［（2S，3R）−3−amino−

した．

hydroxy−4−（2′−3H）phenylbutanoyl］−L−leucineは，

C）読血清の調製

日本化薬にて合成したⅣ−［（2．9，3月）−3−benzy1−

上記方法により合成したベスタチソーBSA結合

0ⅩyCarbonyl−amin0−2−hydroxy−4r（2／−bromo）−ph−体をComplete Freund s adjuvantでエマルジョ

enylbutanoyl］−L，leucinebenzylesterを原料としン化したものを在来種白色家兎（雌体重2・5〜て，New England Nuclear社（Mass．，Boston）

3．0kg）の背部皮下に繰返し授与して，抗血清をにて3Hガスによる接触還元を行ったのち，当社得た．

にひ精製した．得られた［3H］−べスタチソは，放d） 7ッセイ法

射能検出器（Berthold HPLCRadioactivity Mon−

標準品，［3H］−べスタチソ，および抗血清はすitor LB−503型）付HPLC（島津LC−4A型）をべてリン酸緩衝液（0．051Ⅰリソ酸緩衝液，pH

用いて放射化学的純度を測定した結果，99％以上

7．3；0．1％NaN。，0．1％ゼラチソ，および0・9であった．また，このものの比放射能は15mCi／％NaCl含有）で希釈した・
べスタチソ（250pg〜20mg）の緩衝液（0・1mgであった．
b）ベスタチンtBSA結合体の調製mg）に［3H十べスタチソ0・1mg，希釈抗血清

ベスタチソーBSA結合体は，図18に示すよう（0．1mg），リン酸緩衝液0・2mgを加えてよく撹に，Gharib らの方法8）により ethyl−CDIを用い拝したのち，4℃で18時間インキュべ−トした・て調製した．すなわち，BSA50mgを25mlの結合型および遊離型べスタチソの分離は・デキ

蒸留水に溶解したのち，この溶液中にethyl−CDI

ストラソー炭末混合溶液0．5mgを反応溶液中に加30mgを加えた．次に，あらかじめ5mgのえてよく撹拝し40Cで15分間放置したのち，上dimethylsulfoxide に溶解した［3H］−べスタチ

清をアトムライト⑧液体シソチレ一夕ー4mgに

ソ5mCiを含む50mgのべスタチソを0・1N

加え，液体シンチレーションカウソター（Aloka

NaOHまたはHClでpH5．5に保ちながら徐々社製ModelLSC−753型，東京）にて測定した・e）投与および試料調製法
健康成人男子6名にべスタチソ30mgカプセ

÷÷二二二CH2−CH−CH・CONl＋CH−COOH

ルを経口投与後，0．25，0・5，1，2，3，4，6，
8時間目にそれぞれ血液を採取し，次いで4℃で遠心分離（×2，000g）して血清を得た・得られた

1憲ごD● HC（CH3）2
1

血清は必要に応じて上記緩衝液にて希釈し，アッセイに供した．

f）GC−MS−SIM法◎H2−g二義：馴芸ニoNHl．㊥図18 SynthesisofbestatinrBSA conjugate・e）で得られた血清について，すでに報告した
方法7）によりGC−MS，SIMで測定した・−171−

2）実験結果および考察
a）交叉反応性

daseによる加水分解物として見出された（2S，べスタチソtBSAをハブテン抗原として得られソと同様にわずか0．4％であった．また，他のベ

た抗血清について，［3H］−べスタチソをトレーサ

スタチソ同族体に対する交叉反応性はきわめて弱ーとして，べスタテンおよびその同族体8種の交く，いずれも 0．014％以下であった．

叉反応性について検討した．最終希釈率200倍

Scatchard plot法によりこの抗体のベスタチソ

における，この抗血清の各化合物に対する交叉反への結合定数（ga）を求めたところ，6．757×

応性を図19および蓑12に示す．表12からも108hI−1の値を示した．このことより，得られた明らかなように，ベスタチソをヒトに投与したと抗血清はべスタチソに対してきわめて高い親和性

き，血中に見出された活性代謝物であるクーOH一を有し，その光学異性体をも識別しうる，特異性

べスタチソに対する交叉反応性はわずか0．4％に優れた抗体であることが明らかになった．

3月）AHPAへの交叉反応性は，クーOH−ベスタチであった．さらに，人尿中にべスタチソのpepti・

アッセイ法に準じて，最終希釈率200倍の抗表12 Cross−reaCtivity of structurally related

血清を用いて作成した検量線を図20に示す．検

substances with antirbestatin serum

量線は250pg〜20ng／tube の範囲で良好な直線

Cross−

reactivity（％）（2ぶ，3月，L）Bs l．4ng lOO（25，3凡L）♪−OH−Bs（25，3月）AHPAb）検量綾および検出感度性を示し，血清中べスタチソの微量定量が可能となった・また，RIA法におけるべスタチソの検出

350．Ong O．4

限界は125pg／tubeであった．

350．Ong O．4（2g，35，L）Bs＞10〃g＜0・014（2月，3月，L）Bs＞10〃g＜0・014（2凡35）AHPA（2凡35）AHPA＞10上場＜0・014＞10′招

く0・014

それぞれ0．5，1．0，2．5，10．Ong添加し，本法に（25，3g）AHPA＞10〝g＜0・014より分析したときの回収率を表13に示す．本回（2月，3R）AHPA＞10′嗜＜0・014C）精度および正確度
2〜10倍希釈したヒト血清中にべスタチソを収実験の結果から，本法の実用血中濃度測定範囲●．㍉㌦一二＿

●＼し．
川￣1

1

川

10三

川3

IO・l

StructuralryreIatedsubstances（ng／tube）

図19

Standard curve for bestatin（●）and cross−reactivity of（2S，3R，L）2−OH−bestatin（○）
and（2S，3R）AHPA（△）with anti−bestatin
Serum．
一丁一172−．

ロイべプチンおよびべスタチソの難病治療薬としての開発研究

0．1

10

1

100

log
Concentration of bestatin（ng）

図20 Calibration curveforbestatin・
表13

RecoveryCoe伍cientof variation

0．99±0．05

4．5

2．58±0．19

103．4± 7．752．45±0，15

98．0± 6．052．42±0．14

96．8± 5．8

510．73±1．34

107．3±13．4

10．34±0．92

103．6±10．1

9．28±1．03

92．8±10．3

4
5
5

0
1
×

6．1

99．4±4．555×1．08±0．07

5

2
×

13．2

108．2±6．6

5

0
1
×

103．2±13．6

45×1．03±0．1442×0．51±0．07

14．5

16．6

4

0
1
×

17．9

101．5±14．765×0．47±0．08

94．0±16．802
×0．46±0．03

6

0
1
×

（％）
92．5±15．4

1

5
×（ng／tube）

5

2
×

10．0

Estimated

7

DilutedSerum

Therecoveryof bestatin from normalhumanserum

において精度，正確度とともに充分溝足しうるも法ともに同一のパターンを示した・また，血清中のであった．

濃度測定点において平均値の差の検定を行った結d）血清中濃度の測定

果，いずれの測定点においても有意差は認められ6名の健常人にべスタチソ30mgを経口投与

ず，RIA法，GC−MS−SIM法により得られた血したときの血清中濃度をRIA法およびGC−MS−

清中濃度値はよい一致を示すことを確認した・e）RIAとGC−MS−SIMによる測定値の相関SIM法により測定した結果を図21に示す・両方
法から得られた値はきわめて類似しており，6人

性の平均血清中濃度曲線はRIA法，GC−MS，SIM

図21に示したヒト血清中濃度の測定において−173−

︵盲忘ミ︶く正︵盲＼琶︶∪葛lのOq−O UO召し≡8UOO
0

1

2

3

4

6

8

Time after administration（hr）

GC−MS（〃g／mり

図21Mean serum concentration。fbestatin after oral administra−

図22

Correlation curve of bestatin c。nCentrati。nObtained by use of RIA and GC−MS−SIM．
y＝0・01473＋0・97148ズ（r＝0．989）．

tion of30mg bestatin to male
6volunteers measured by use
Of RIA（●）and GC−MS−SIM（○）．

得られた結果をRIA法およびGC−MS−SIM法

的有意差は認められず，よく一致した値を示すこの両方法について比較したところ，両者の測定値とが実証された．

はきわめてよく一致しており，図22に示す相関図から得られた直線式はy＝0．01473＋0．97148g

4・高速液体クロマトグラフィーによる血葉となり，その相関係数はr＝0．989であった．

3）結中ベスタテンの簡易定量法

論

近年，薬効の評価，薬物治療の適正化など臨床

従来から抗体の作成が困難とされているジペプ上において，血中薬物濃度を測定する意義は大きチドに類別されるべスタチソの抗血清の調製に成く，その際の測定法としては，特異性に優れ，高功した・本坑血清はベスタチソ生体内代謝物同族体および類縁化合物のいずれにも交叉反応性を示

感度で良好な再現性を有し，簡易迅速性のある方法が望まれている．

さず，きわめて化合物特異性の高いものであった．

血中べスタチソの測定法としては，ガスクロマ

本坑血清を用いて確立した血清中べスタチソ測定

トグラフィーーマススべクト

法は，実用血清中濃度測定範囲で充分な検出感度MS）法9），プレカラム反応を用いた高速液体クロを有していた・また，健常人6名にベスタチソをマトグラフ（HPLC）法10㌧RIA法11）などが報告

経口投与して得た血テ嗣こつき，本法と GC−MS−

されているが，今回われわれは，ポストカラム法

SIM法にて同時に測定した結果，両者には統計を用いたHPLCによる血集中べスタチソの簡易ー174−

ロメトリー（GC−ロイべプチソおよびベスタチソの難病治療薬としての開発研究
R2

Rl◎cH2−g：19H−CONH・e〔：：：

CH2−CH−COOHOH

rSCH2CH20H
t

HSCH2CH20H

⊥
m
Y
R
．

H−CH−CONH−CH−COOH：こし三 H2 0H
I

RI

RZ

べスタチソ

H CH（CH3）2クーヒドロキシべスタチソ

0H CH（CH3）2（25，3月）−3−アミノー2−ヒドロキシー4−7ェ
ニルブタノイルーL一フェニルアラニソ

H

図23

C6H5

ベスタチソおよびべスタチソ額縁物質の螢光ラベル化反応

まで撹拝したのち，0．4Mホウ酸緩衝液17と混定量法を設定した．
すなわち，べスタチソは，その構造中に第一ア合する．

ミソを有するので，第一アミソの発螢光試薬としvi）定量用べスタチソ標準品て広く利用されている0−7タルアルデヒドとの純度99．5％以上のものを用いる・

螢光ラベル化反応（図23）により，べスタチソのvii）内部標準溶液

微量蛍光定量法を確立した・

当研究所において西沢ら12）の合成した（25，3月）−3−アミノー2−ヒドロキシー4−7ェニルブタノ

1）実験方法イルーL−7ェニルアラニソ約11mgを精密に秤り，a）試某および試液

水を加えて溶かし，正確に200mgとする．このi）2−メルカプトエタノール（東京化成工業

液2mgを正確にとり，水を加えて正確に200mgとする．

（株），試薬特級）ii）0−7タルアルデヒド（和光純薬（株），試b）試料溶液の調製
ヒト血祭0．2m仁を70mg容遠心分離管にとり，

薬特級）iii）アンバーライトⅩAD−Ⅳ（オルガノ社

内部標準溶液2m仁を加えて軽く混合し，さらにェクノール40mgを加え，超音波装置を用いて15製）
iv）0．4hIホウ酸緩衝液（pHlO・4）

分間撹拝する．15分間静置したのち，3，000rpm

ホウ酸24．7gを秤り，水900mgを加えて溶で10分間遠心分離する．上清を100mg容ナス

かし，8N水酸化ナトリウム溶液を加えてpHを型フラスコにとり，40℃で減圧乾固する・残留物

10．4に調整したのち，全量をlJとする・に0．1N塩酸5mgを加えて溶かし，10mg容遠Ⅴ）螢光ラベル化反応液

心分離管に移したのち，クロロホルム4mgで洗0−7タルアルデヒド30mgを1〜2mgのメタ

い流す．これを超音波装置を用いて30分間撹拝

ノールに溶かし，2−メルカプトエタノール0・3

したのち，3，000rpmで10分間遠心分離する・

mgを加え，液の淡黄色が消えて無色透明になる

上清を，あらかじめ調製したアソパーライトカラー175−

ム（直径6mm，長さ100mm）にかけ，水20ml

き，次に示す操作条件の液体クロマトグラフィー

で2回洗浄後，メタノール20mgで溶出させる．

により得られる溶出液に，送液ポンプから送られ溶出液を減圧乾固し，残留物を液体クロマトグラてきた蛍光ラベル化反応液を混合する．テフロン

フィー移動相200〆にて溶かし，試料溶液とすチューブ（内径0・5mm）中で50℃，1分間反応

る．

させたのち，さらに200Cで2分間反応を行い，C）標準溶液の調製

生成した螢光反応物の箆光強度を測定する．測定

定量用べスタチン標準品約26．4mgを精密に法の概略を図24に示す．

秤り，水を加えて溶かし，正確に300mgとする．

〔操作条件〕

この液5m仁を正確にとり，水を加えて正確に装100mgとし・標準原液とする．さらに，原液を公

置：日立高速液体クロマトグラフ635A

型

比2で3段階希釈する．原液および希釈液0．1

検出器：日立分光蛍光光度計650−10S型

mJずつをそれぞれ70mg容遠心分離管にとり，検出波長：励起波長340nm，螢光波長415nm

それぞれに血菓0．2mgおよびェクノール40mg

カラム：Nucleosi15C18（直径6mm，高さを加え，以下試料溶液の調製と同様に操作し，標準溶液とする．

250mm）

カラム温度：25℃付近の一定温度d）ポストカラム法による液体クロマトグラフ

移動相：0・1％リン酸−アセトニトリル混液

試料溶液および標準溶液のそれぞれ90〆につ（82：18）を5NNaOH溶液を用いてpH6．8に
調整する．

廃液
オート
サンプラー

恥虻

水槽 恒温槽テフロンチューブ 20m 10m
国別

ポストカラム法による液体クロマトグラフィー

対照（血祭のみ）

10

20

保持時間（別30

0Bs275ng／m／

Bs2′200ng／mJ

l：ベスタテン（Bs）
2：内部標準物質（ls）

柑

20

保持時間（別

30

0

川

20

30

保持時間（分）図25血掛こ添加したべスタチンおよび内部際準物質の液体クロマトグラム−176−

ロイべプチソおよびべスタチンの難病治療薬としての開発研究

流速：毎分1．2mg

表14 ベスクチンを血矧こ添加した際の回収率

反応液送液ポンプ：オリエソタルモータ一社

添 加 量（ng／mJ）

反応液流速：毎分■0．7mg

実 測 値（ng／mJ）

回 収 率（％）

276．25

294．8

106．7

552．50

545．9

98．8

1，105・00

1，018・8

2，210．00

2，378・0

92・2
107・6

2）実験結果および考察
a）液体クロマトグラム

とり，それぞれの標準溶液の測定値をプロットす

本定量法による液体クロマトグラムを図25に示す．血渠中べスタチソの抽出精製法は，Selected
Ion Monitoring法によるべスタチソのGC−MS
微量定量法のために開発された方法をそのまま適用したとき，保持時間15分までに血渠中生体成るとき，べスタチソ濃度0〜2，200ng／mJの範囲
で原点を通る良好な直線性を示すことが確認された．また，この際のべスタチソ検出限界は，血奨
0．2mgを用いたとき，約200ng／mJ（刃Ⅳ＝約2）であった．

分に由来すると思われる大きなピークが出現した・C）回

べスタチソおよび内部標準物質は，それぞれ約19分および約26分に良好な単一ピークとして分離溶出された．内部標準物質としては，べスタチ
ソ同族体のうちで（25，3R）−3−アミノー2−ヒド
ロキシー4−7ェニルブタノイルーL−フェニルアラニ

ソが保持時間で最良であった・
べスダチソの生体内代謝物であるクーヒドロキった．

110．5，221．0，442．Ongとなるように添加した試料を調製し，本法に従って測定したときの回収率
を表14に示す．
いずれの濃度においても良好な回収率が得られ，本法は充分使用可能な方法であると判断した・
d）ヒト血祭中ベスタテン濃度の測定
筋ジストロフィー患者からべスタチソ経口投与
前後の血液を採取し，本法により血奨中べスタチ
ソ濃度を測定した．血中濃度推移の1例（52歳，b）検量綾の作成
血菜中べスタチソの検量線を図26に示す・血渠にべスタチソと内部標準物質を添加し，検量線

男性，体重46kg，20mg経口投与）を図27に示す．

作成用標準溶液とした．べスタチソ濃度を横軸に，

3） 結

クロマトグラムより得られた内部標準物質のピー
ク高さに対するべスタチソピーク高さ比を縦軸にを用いて，べスタチソを蛍光を有する誘導体に変

0
0
0
0

︵呈ぎ︶世襲八小へKで真弓︵呈S巴当地帽へ1︺

0．5

l．川0

論

第一アミソの発蛍光試薬0−7タルアルデヒド

l．0275550

2−200

0．51

2

時 間（hr）

ベスタテン（ng／mり

図26

率

血奨0．2mg中にべスタチソをそれぞれ55・25，

シべスタチソの保持時間は約12分であり，生体爽雑物のピークと重なるため，測定は不可能であ収

図27

べスタチソ測定における検量線−177−

べスタチソの血中濃度推移4

換することにより，血集中べスタチソを高感度に

カラム温度：

定量する液体クロマトグラフ法を確立した．

移動相：0・05人Ⅰリン酸−アンモニウム溶液

本法によれは，べスタチソおよび内部標準物質のいずれも生体爽雑物から完全に分離された．ま300C

80mJにメタノール12mJおよびアセトニトリル

8mJを加える．

た，いずれも良好なピーク形状を示した．

流 速：1．4m〃min

本法を用いることにより，約20mgのべスタチ

内部標準溶液：♪一ヒドロキシ安息香酸エチル

ソを定量することが可能であり，血祭0．2mgを7．5mgを50％ェクノール水に溶かし100mgと使用した場合，定量限界濃度は200ng／mJであっする．

た・本法は，べスタチソの薬効評価，治療の適正化など臨床研究において，べスタチソの血中濃度

2）結果および考察を測定する際には有用な簡易定量法であると考えa）硫酸ロイベプチン原未の安定性

る．

表15に示すように，室温30カ月保存後において試料中のロイペプチソのし体の残存率はⅠ．製 剤 研 究

94．8〜97．0％であり，また外観も白色粉末の状態を保持して変化せず，安定であった．

1・硫酸ロイぺプチンの安定性に関する研究b）硫酸ロイぺプチン製剤の安定性
表16に示すように，室温30カ月保存後にお前報に引き続き，硫酸ロイべプチソの原末およ

ける試料中のロイペプチソのし体の残存率は，散び治験用経口製剤（散剤とカプセル剤）の安定性を検討した．

表15 The stability ofleupeptin bulk storedat
the room temperature

Residualamount（％）
ofleupeptin

1）実験方法a）試Storage time（months）
24
30

料

原末，散剤（D−マンニトール10倍数），および

レform

96．6

97．0

カプセル剤（ロイペプチソ50mg含有）を室温下

D−form4．8

1．5に密栓状態で24カ月および30カ月間保存した

L−form94．7

94．8

D−form4．9

1．1

L−form95．3

32

のちに・ロイペプチソ含量および外観変化の観察
を行った．
b）測

定

95．5

D−form l．2

1．0法

各試料の定量は，昭和56年度の本報告書に記

表16 The stability of the oralpreparationfor

載された方法により，ロイべプチソをNaBH4で

the clinical trial ofleupeptin stored at
the room temperature

還元してロイペプチノールとなし，下記の条件にてHPLCにより分析した．

Residualamouヮt（％）
ofleupeptln

Preparations

機 器： 日立655型高速液体クロマトグラフ

5

6

6
9

3

7

1

1

7

4

6
9

3

−178−

9
9

Capsule L，form（Leup50mg） D−f。rm5霊霊盟）in。ィ。rm3

i．d．×160mm

LTf。rm3

カラム：Nucleosi15C18（H）4．6mm

Powder89

検出器：日立638−4型紫外吸光光度計（測定
波長200mm）

Storage time（months）
24
30

ロイべプチソおよびべスタチソの難病治療薬としての開発研究

表17

剤で96．7％，カプセル剤で96・2％であり，またTest resultsofleupePtintablet
Testitems

外観も白色粉末の状態を保持して変化せず，安定

Appearance

であった．

Results

Whitetablet

Leupcontent

44・5mg／tab・Disintegration time（min）

2．硫酸ロイぺプチン製剤の研究

8〜9Weightvariationtest（deviation）Within7・5％
Hardness6kg

2−1．腸溶錠の製剤研究用しうるものと判断した・

先に，ラットおよびイヌにロイべプチソを種々の投与ルートおよび投与方法を用いて投与したとき，その血中濃度に大きな差が認められた・これに引き続いてさらに検討したところ，ロイペプテ
ンは投与後30分の血中濃度が，経口投与に比べて十二指腸投与ではその約30倍，門脈内投与では約200倍であることが見出された・このことは，
ロイべプチソを腸溶性製剤として投与することにょり，bioavailabilityの向上の可能性を示してい

2）膿溶銀の試製実験
1）で得たロイべプチソ裸錠に腸溶性コーティ
ングを施す実験を行った．皮膜物質として通常使用されている化合物につき，ロイペプチソに対する配合安定性を検討した結果，HP−55（ヒドロキ
シプロビルメチルセルロースフタレート），およびHPMC−AS（ヒドロキシプロピルメチルセル
ロ＿スアセテートサクシネート）の2種が有用でる．そこで今回は，ロイべプチソ腸溶錠の製造方あることを確認した・両者とロイペプチソの配合法として，まず裸錠の調製方法を，次いで腸溶性変化を経時的に追跡した結果，HP−55にわずか

コーティングを施す方法を検討した・

な着色を認めたのに反し，HPMC−ASは何ら変化を認めなかったことから，HPMC−ASを最終的に選んだ・

1）裸銀の試製実験

次に，HPMC−AS

錠剤の処方は種々検討した結果，崩壊性がよいものとして，ロイペプチソ25部，D−マソニトー
ル53．8部，アビセル⑧（結晶セルロース）10部，をイソプロピルアルコ￣ルぉよび塩化メチレンに溶解し，本液を用いて上記
裸錠をスプレーコーティソグした・〔結果および考察〕

プリモジェル⑧（カルポキシメチル澱粉誘導体）得られた腸溶コーチィソグ錠の試験結果を表7部とした．これらを混合し，常法により造粒，乾燥後，ステアリン酸マグネシウム1・2部を加えて1錠当りの全量が200mg，ロイべプチソ含量18に示す．この結果から，ロイペプチソ腸溶錠は
日局10，一般試験法記載の崩壊試験条件に適合
し，腸溶性製剤の特質を充分保持しうるものであ50mgの錠剤を得た．
〔結果および考察〕

表18 Testresultsofleupeptin enteric−COated

得られた錠剤の試験結果を表17に示す・調製した錠剤中のロイペプチソ含量は44・5mg／錠で，表示含量の89．0％であった．日局10，製剤総則・錠剤に記載される試験方法および一般試験
法・崩壊試験法に基づいての試験結果から明らかなように，本錠剤は日本薬局方に適合するものであり，腸溶錠とするためのコーティソグ操作に使−179−

tabletTestitems
Appearance
Leup content

Disintegration time（min）
Thelst nuid
The2nd nuid
Thickness of enteric coat

Results
Pale yellow tablet
44．5mg／tab．

Not disintegrated
20〜25
80〜90Jjm

る．本腸溶錠のロイべプチソ含量は，イニシャル

現在検討中である．

値の99．9％であり，ここで検討したコーチィソ
グ方法により含量低下のないことを確認した．さ3．ぺスタチンのドライシロップ剤（細粒状）

らに本腸溶錠は，1）で調製した裸錠をコントロの調製とその安定性ールとしたbioavailabilityの確認実験に供することができるものである．

べスタチソの治験用サンプルとしては，カプセル剤が用いられている，今回の筋ジストロフィー

2−2．軟膏剤の製剤研究に対する治験用サンプルとしては，投与量の増減が簡便なこと，小児への投与が容易なこと，およ

昭和56年度の本報告書に示したロイペプチソ

び他剤との配合投与が可能なことなどを考慮して，と各種軟膏基剤との安定性試験の結果において，細粒状のドライシロップ剤（10倍散）が適当と考

ロイべプチソほ日局親水軟膏中で経時的に含量のえた・そこで，この剤型の製造方法について検討低下することを認めた．この原田の1つとして，を行った．

水分および界面活性剤の影響によるロイべプチソのラセミ化が示掟された．そこで，先報ではロイ

1）ドライシロップ剤の調製法の検討

べプチソの安定性に優れたワセリンを基剤とした

種々検討した結果，成分，組成がベスタチソ

軟膏を用い，ラット13）ぉよびウサギ14）での経皮

10部，D一マンこトール86部，HPC−L3部，お吸収実験を行った結果，ロイペプチソが経皮によよび庶糖脂肪酸エステル1部から成るドライシロって吸収されることが確認された．

ップ剤を常法により造粒して調製した．得られた

今回は，吸収の促進を目的として日局親水軟膏

ドライシ′ロップ剤の外観は白色の細粒，粒度は細を用いた経皮吸収の実験を行うことにし，ロイべ

粒剤粒度規格（日局）に適合した．また，べスタ

プチソ親水軟膏調製に際しての諸条件につき検討

チソ含量は100・0％であり，結果として，本品はした．

治験用サンプルとしての品質を満足していると判断される．

用時調製ロイベプチン親水軟膏の試製
ロイペプチソと通常市販されている日局親水軟2）ドライシロ・yプ剤の安定性

膏を種々の比率で練合した結果，辣合操作の容易

1）で得られたドライシロップ剤について，室性，性状（調度，外観など）および塗布時の展延

温保存，および苛酷条件下保存における安定性を性などを考慮するとき，さらに，可能な限り高含検討した．

有率のロイべプチソ軟膏の調製を意図したとき，

a）実験方法ロイべプチソの含有量の上限は約25部であり，

i）試

20部含有製剤は使用上何ら支障のないことが判

室温下に密栓状態で14カ月間保存，40℃，75

明した・そこで，両者の比率を20部：80部とし，％R・H・，50℃，74％R・H．下に密栓および開放ロイペプチソ親水軟膏を用時調製して，bioavai・状態で2カ月間保存，自然直射光下に密栓状態でlabilityの確認実験に供することにした．

料

2カ月保存したのちに，べスタチソの含量，外観

なお，調製したロイべプチソ親水軟膏は，たと

変化 および薄層クロマトグラフ法による観察なえは室温24時間放置で，外観的な変化はまったどの測定を行った．

く観察されなかった．本製剤の安定性についてはii）測 定 法−180−ロイべプチンおよびべスタチソの難病治療薬としての開発研究

結果を表19外観変化は肉眼鋭察とした．べスタチソの含量に示す．室温下に密栓状態で14は，以下に示す条件の高速液体クロマトグラフ法

カ月間，および苛酷条件下2カ月間のいずれの保で測定した．

存においても，べスタチソの含量は低下せず安定機 器： 日立655型高速液体クロマトグラフ

であった．また，外観は，500C，74％R・H・開放

検出器：日立638−4型紫外吸光光度計（測定

2カ月間の苛酷条件下でわずかに黄色に着色したが，室温下密栓14カ月間，その他の条件下では波長200nm）

白色であった．また，薄層クロマトグラフで，いカラム：Nucleosi15C18（4．6mmi．d．×

ずれの保存条件下でもスポットは単一であり，分160mm）

解物の生成は認められなかった・

カラム温度：300C

以上の結果から，べスタチソドライシロップ剤

移動相：1％リン酸水溶液83mgにアセトニ
トリル17mgを加える．

は室温14カ月保存で何ら含量の低下は認められ

流ず，治験用サンプルとして供給しうることを確認

量：1．4mg／min

内部標準溶液：安息香酸エチルエステル150

した．

／唱／mJ（50％ェタノール水）
試

Ⅲ．毒性試験−ロイべプチソ軟膏の料：ベスタチソとして150／唱／mJ（30％

ウサギにおける35 日間桂皮毒性

アセトニトリル水）

試験

注入量：20〆薄層クロマトグラフは，以下に示す条件で行った．

今回われわれは，ロイペプチソ（軟膏）の安全試

性試験の一環として，ウサギを用い，経皮毒性を料：べスタチソとして2mg／mJ（メタノ

検討したので，その結果を報告する・

ール溶液）
プレート：

シリカゲル60F−254（Merck）

展開溶媒：乃一ブクノール

試験材料および条件

40mJ，氷酢酸10mg，水10mgから成る混液
スポット量：50JJJ

1）使用動物と飼育条件

展開時間：約4時間

生後8週齢で購入した日本白色種雄ウサギ

確 認： ニソヒドリン試液吹付け発色（JW−NIBS，日生研（株）産）を室温23±2℃，b）実験結果湿度45〜60％に調節した飼育室で5週間予備飼

表19 Thestabilityofbestatin dry syrup（6negranules）on thelong−termand accelerated storage conditions

Long−term
Storage eonditions：

InitialStorage time（months）：

Residual amount（％）
of bestatine
Appearance
TLC

100

Room temp．

Accelerated

40℃，R．H．75％

Clf言e＊

Op㌻＊＊

100．9

99．8

Clヂ
100．7

50℃，R・H・74％

DayLlight

Op㌻＊＊

Clヂ

Cl筈e＊

99．8

99．9

99．4

White White White White Pale yellow White WhiteOne spot One spot One spot One spot One spot One spot One spot

＊Sealedin glass bottle．
＊＊Open glassbottle・ー181−

育し，この期詞に一般状態に異常の認やられなか

4）・・∵検査項 召った￣20￣匹を実験に供した．

a） 一般状態の観察

実験開始時の体重は2．3〜2．7kgであった．動

塗布部の観察を毎日塗布前に行い，さらに塗布物をケージ（日本ケージ製）に1匹ずつ収容し，後の動物の一般状態についても全期間にわたって飼料として固型飼料NRT−1（日生研（株）産），飲観察した．

料水として水道水を全実験期調を通じ自由に摂取b）体重測定させた．

塗布開始前，および塗布開始後1週ごとに各動物の体重を測定した．

2）検体調製および塗布方法

C）摂餌量測定a）試験検体

1週ごとに，各動物の1日量の摂餌量を測定し日本化薬（株）総合研究所製剤研究室で調製さた．
d）尿れた以下の4種芳壬の軟膏を用いた．
対査

5週間の塗布終了後の剖検時に，全動物につい

照： 軟膏基剤

10％軟膏：

検

ロイペプチソ10％

含有（Lotて，膀胱より注射筒を用いて採尿した．
色調，混濁を調べたあと，尿試験紙へマコンビ

No．LOl0−001）
20％軟膏： ロイべプチソ 20％ 含有（Lotティックス（マイルス三共）を用いてpH，潜血，
総蛋白，糖を，ウロビリスティックス（マイルスNo．LO20−001）
30％軟膏： ロイペプチソ 30％ 含有（LotNo．LO30−001）

三共）でウpビリノーゲソを，イクトスティックス（マイルス三共）でビリルビンを，ケトスティb）塗布方法ックス（マイルス三共）によりケトン体を，それ塗布開始の前日にあらかじめウサギの頸背部被ぞれ半定量的に測定した．

毛を電気バリカンで刈毛し，脊椎を中心とした面e）血液学的検査

坑5×5cmの皮膚に検体0．5mg（重量約0．5g

5週間の塗布期間終了時（屠殺の前々日）に右相当）を均一になるように塗布したのち，その上耳動脈より採血し，コールターカウンターモデル

を5×5cm

S型（コールターエレクトロニクス社）にて赤血の油紙で被い，さらに厚さ1mm，6×30cmの防湿ゴムで固定した．塗布部の固定

球数，ヘマトクリット値，ヘモグロビン濃度，平をほぼ24時間継続後，塗布部の被いを除去して均赤血球容積（以下，MCVと略す），平均赤血球

動物の塗布面の観察を行い，塗布部を清拭したの

血色素濃度（以下，MCHCと略す），および白血

ち，同部に新たに同様の塗布を行った．塗布は，球数を測定し，コールターカウンターZBI（コー

週6回（日曜日休薬），5週間行った．

ルクーエレクトロニクス祉）にて血小板数を測定したほか，Brecher法により塗抹標本を作製して

5

匹

5

匹

30％ ロイべプチソ群：

520％ ロイペプチソ群：匹

10％ ロイペプチソ群：

5

対照基材軟菊群：匹3）実 験 群

網状赤血球比率を，またライト・ギムザ染色塗抹
標本により白血球型別百分率を算定した．さらに，
屠殺前日に右耳動脈より 3．8％クエン酸ソーダ（10％容量）加注射筒を用いて採血し，クロティック（日本トラべノール）を用いてプロトロンビ
ン時間を測定した．

−182−

ロイべプチyおよびべスタチンの難病治療薬としての開発研究f）血液生化学的検査て重量を測定した．さらに，体重に対する相対重血清蛋自分画は，屠殺前々日の血液学的検査用量も算定した．

血液採血時に，乾燥注射筒を用いて採血した血液ii）組織学的観察

を遠心分離したのち得られた血清について，ヘレ

脳，心，大動脈，肺，気管，肝，腎，脾，胃，ナ電気泳動装置を用いて実施し，各血清蛋自分画

小腸，大腸，膵，下垂体，甲状腺，副腎，精巣，の比率を算定した．また，屠殺解剖時に，放血に

前立腺，膀胱，胸腺，顎下腺，脊髄，大腿骨骨髄，

先立って，ベントパルビタールソーダ麻酔下でヘリンパ節，乳腺，座骨神経，皮膚（塗布局所）をパリン処理注射を用いて下大静脈より採血し，以10％中性ホルマリソ液で固定したのちパラフィ

下の項目について血液生化学検査を実施した・

ソに包理し，へマトキシリソ・エオジン染色標本を作製して病理組織学的検査を実施した・

総蛋白濃度，アルブミン濃度，総コレステロー
ル濃度，ブドウ糖濃度，尿素窒素濃度，尿酸濃度，h） 統計処理法

クレアチニソ濃度，アルカリホスファターゼ活性，本試験における諸測定値は，各群間の平均値のGOT活性，GPT活性，LDH活性，カルシウム差で表示した．各群間の平均値の差の検定はStu−濃度（以上，テクニコンオートアナライザー

dentのt一検定法，また不等分散の場合はAspin−

SMA12／60型使用），総ビリルビソ濃度，無機リ

Welch法に従って有意差検定を行った・

ン濃度（以上，テクニコンオートアナライザーⅡ
試型使用），ナトリウム濃度，カリウム濃度（以下，

験

結

果

炎光比色法・日立205D型使用），塩素濃度（電量滴定法・平沼クロライドカウンターCL−3型使

1）死亡率および一般状態用），さらにA／G比を計算により求めた．

全実験期間を通じて，各群とも死亡例はみられg）臓器重量測定および病理学的検査なかった．対照基剤塗布群，各検体塗布群ともにi）臓器重量

塗布部皮膚の軽度の発赤が散発的にみられたが・

血液生化学検査用の上記採血を行ったのち，各いずれも用量に依存した変化ではなく，さらに発動物を腋窟動脈の切断により放血致死させて剖検

赤の程度が進む憤向もみられなかった・30％塗した．摘出した臓器のうち，脳，胸腺，心，肺，布群の1例では，実験開始後21日目に塗布部皮腎，脾，肝，精巣，副腎，顎下腺，甲状腺につい膚に軽度の痴皮形成が認められたが，その後増強

表29

Body weight and foodconsumption of rabbits during administration
withleupeptin for5weeks

Bodyweight
Dose （kg）orfood（％） consumption

Dosage period（weeks）
＿1

0

1

2

3

4

5

（g）
Contro1

10

20

30

B．W．

2．46±0．0782．55±0．112．56±9．13

2．61±0．15

2．65±0．16
143±402．67±0・12
153±4

2・68±0・11135±8

2．63±0．18

2．64±0．19

2．64±0．21160±18139±212．63±0．132．72±0，142．73±0．122．75±0．12166±23

166±32

156±31133±252．44±0．19

2．56±0．10

2．60±0．09

2．66±0，102．71±0．10143±28147±19152±18149±15150±16F．C．

179±36158±30152±13146±20B．W．

2．46±0．13

2．49＝ヒ0．12

2．52±0．13

2．61±0．20

F．C．

175±29167±17157±16150±22B．W．

2．51±0．12

2．53＝ヒ0．12

2．61±0．11

F．C．

159±29144±19162±25

B．W．

2．48±0．07

2．48±0．06

F．C．

153±18153±16a Mean±S．D．
−183−

133：±18

表2l Urinalysis of rabbits administeredwithleupeptin for5weeks
Dose Animal

8

Y‡？uJI0＋y1

Protein±

Glucose＋蒜ニTalcolorTurbidity pH Glucose Protein 慧霊 Ketones U霊禁こ
KetonesUIUU▲11￣

Bilirubin

±

5

y

3

7

±一±

0

y

4

8
7

±

5

y

5

± ≠ ≠ ±

一

±≠＋

7

5

＋

y

2

±
±
±
＋

6

5

7

5

6

5

6

5

7

0

7

0

h

1
2

一

一一＋

y

5
2

h

6
2

± ≠ 一 一 士 一 ＋ 一 ± 一 ±

5

一 ＋

7

y

＋一十

y

0
2

±一土一一一≠＋

0

＋

8

≠＋

0

±

8

±

0

l

9
1

8

±

y

8
1

5

y

7
1

7

3
1

0

2
1

7

1
1

±

0
1

＋ ＋ ＋ 十一y y yb y yb

9

0

8

0

≠ ±

7

y

9
2

≠

5

8
2

±

7

＋

y

＋

一

7
2

y

一，negative；＋〜≠，pOSitive・

y，yellow；yb，yellowish brown；1y，light yellow．
表22
Daily
dose

（％）

Hematological丘ndings of rabbitsadministered withleupeptin for5weeks
Red blood cells

No．ofanimals

薫ニ3， 語n e蕩rit TSY TS 顎C Re憲yte

5

（5）
706．4
：±20．7

（5）
15．74
±0．40

（5）
45．36

10

5

（5）
689．4
±28．7

（5）
15．34
二と0．68

20

5

（5）
700．2
±44．9

30

5

（5）
695．0

Contro1

±0．8

（5）
22．28
±0．40

（5）
34．72
±0．65

（5）
（5）
43．86
63．6
±1．82
±1．5

（5）
22．26
±0．41

（5）
（5）
35．00
1．00
±0．43
±1．73

（5）
15．40
±0．56

（5）
（5）
44．18
63．2
±1．36
±2．3

（5）
22．04
±0．71

（5）
（5）
34．86
0．60
±0．57
±0．89

（5）
15．54

（5）
（5）
44．62
64．2
±1．07
±1．1

（5）
22．36

（5）
34．82

：±19．3

±0，32

（5）
64．2

±1，17

±0．54

±0．47

（5）
1．60
±3．05

（5）
0．40

±0．55

Hematologicaldata，mean±S．D．；（），N．
Signi丘cantly different from control

することもなかった．そのほか，実験開始前およ2）体重および摂餌量

び実験期間中を通じて，一般状態の変化は認めら

全実験期間の体重，摂餌量を表20に示したが，れなかった・

検体投与群いずれにおいても，対照群と比較して体重，摂餌量に差は認められなかった．

−184−

ロイベプチンおよびべスタチソの難病治療薬としての開発研究
表23

Hematological五mdingsof rabbits administeredwithleupeptin for5weeks
White blood celIs

Daily No．

Sex dose of c。unt Differentiation（％）（％）

animals（×102／mm8）

Band・

Segs・

Eos・

Baso・

Mono・

Lymph．

Control

5 。8崇12．5。．占豊吉．。28．5皇主5．11．≦豊i．81．占皇2．52．≦豊2．667．占宣長．8

l0

5 1。5fa8．2。菜．。28．≦圭）8．61．≦豊吉．。2．≦豊2．31．誌．165．三豊）8．7

20

5 117f島。．9。．占豊吉．。2。．≦皇i。．62．盟53．三豊去．。2．≦豊吉．867．雲量）9．。

30

5 1。。思15．7。．占皇3．。弧箆）7．。2．謹．。。．占圭主．。1．盟161．去圭）7．。

Male

Hematologicaldata，mean±S．D．；（），N．
Signi丘cantly diuerent from control

表24Prothrombin timeofrabbits administeredwithleupeptin for5weeks

Dose
（％）

No．of
animals

Prothrombin time

基剤塗布群と各検体塗布群との問で，プロトロン
ビン時間に差は認められなかった．

（sec）5）血液生化学的検査成溝
Control6．2±0．18l0

6．5±0．220

6．2±0．430

6．2±0．2

血液生化学測定成績を表25および表26に示した．
10％検体塗布群ではグルコース濃度，20％検体塗布群では尿素窒素，尿酸，クレアチニソ，無a Mean±S．D．

機リン，カリウム濃度に軽度の減少が認められ，

3）尿検査成績30％塗布群のA／G比は増加を示したが，いずれ屠殺剖検時に採取した贋胱尿の検査成績を表の値も生理的変動範囲内にあり，用量依存性がな

21に示した．各群ともに，尿の色調，混濁度，いことから，本検体塗布に起因する変化ではない

pH，糖，ケトソ体，ウロビリノーゲソ，およびと判断された．

ビリルビンに著変は認められなかった．対照基剤

血清蛋自分画にも，対照基剤塗布群と各検体塗布群との間に差は認められなかった．

塗布群を含む各群に散発的に蛋白および潜血反応
陽性例が認められたが，用量依存性がなかったこ

6）臓器重量成績とから，本検体塗布に起因する変化ではないと判断された．

臓器重量成績および体重に対する相対重量成績
を表27，表28に示した．
30％検体塗布群の胸腺重量および相対重量が

4）血液学的検査成績
血液学的検査成績を表22および表23に示した．
各群とも，赤血球数，ヘマトクリット値，ヘモ

対照基剤塗布群に比べて軽度に増加していたが，その他の臓器重量には，各群間で差は認められなかった．

グロビン濃度，MCV，MCH，MCHC，網状赤血球比率，白血球数と白血球型別分類，および血小7）病理組織学的所見

板数いずれにも異常は認められなかった．プロト

各動物の病理所見を表29に示した．対照基剤

ロンビン時間の測定成績を表24・に示した．対照

塗布群を含む一部の例で，肺に点状出血，肝に肝

−185−

︵∽︶
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巴芯P芦のLOh Uてdaコヱjpj P巴UlS竃川∈Pq Sl這q巴でuOで巴l u川と○占着Nlの．〇引寸唱の．N︵S︶

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U州u品hOuiSnhO乞sO忘雲dP t3⁝EUJUO⁝ロ

S増むきS hOh Uでdaコヱ 一j P巴とS−U⁝EPd S︺3qE uO SぎーPuu︻薫EUJUO這⁚ヤ量刑瞞

186

ロイべプチソおよびべスタチンの難病治療薬としての開発研究

60．0¶Nの．〇︵め︶

寸0．0刊のN．〇︵崎︶

寸の．〇¶lS．〇︵S︶の寸．〇¶等．S︵S︶の9．0¶のめ．S

寸1．0引のり．S︵∽︶

NN．〇¶l寸．∽

︵∽︶

︵∽︶

の0．0¶Nの．〇
︵S︶

︵如芝地︶
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表28−2

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Organ weight

Dose No．of

Sex

（％）

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10

5

（5）
2．08±0．37

（5）
85±36

（5）
116±34（5）
0．44二と0．03

20

5

（5）
2．08±0．22

（5）
66±41

（5）
119±30（5）0．45±0．01

30

5

（4）
1．96＝ヒ0．19

（5）
60± 8

（5）
120±46（5）0．44±0．03

Male

（5）
68±44

（5）
101±24（5）0．49±0．04

Relativeorganweight（mg／bodyweight（g）），mean±S．D．；（），NSigni丘cantly di仔erent from control＊P＜0．05，＊＊P＜0．01．

表29

ロイぺプチンを35日間連続塗布したウサギ
の病理所見

顎戸霊等

病

理

所

のへそジデリン沈着，腎の尿細管内の致小結石，
大動脈中膜の限局性の石灰化のみられる例もあっ見た・しかし，これらの変化の発生率，変化の程度に明らかな用量依存性はなく，またいずれもウサ

対照群

2 質娼盟胞の巣状壊死・副腎：皮質のギに自然発生的にみられる病変であることから，

3 肝：肝細胞の巣状壊死
4 肝：小薬辺縁帯肝細胞の空胞変性
5 著変なし検体投与に起因する変化ではないと判断された．
なお，検体30％塗布群の1例の塗布部の皮膚に直径約3mm大の潰瘍，痴皮の形成が認められ

9 肝：小葉辺緑帯肝細胞の空胞変性た・しかし，その他の例には皮膚の発赤などの異1011冤逓琵讐昌義状壊死・肺‥肺胞内に常が認められなかったことから，本検体塗布に起12 肝：肝細胞の巣状壊死

因した変化でないと判断された．

13 監…烹責詑帯肝細胞の空胞変性・
結

肺：点状出血． 膵：問質のへそジデリ
17 ソ沈着． 副腎：皮質の点状出血．
腎：尿細管内の微小結石
2018 肺：点状出血・副腎：皮質の点状出血
19 著変なし
20 肺：点状出血
21 肺：点状出血
25

30

26
27
28
29

肺：点状出血 副腎：皮質の点状出血．
大動脈：限局性の中段の石灰化，投与局
所の皮膚に徴小な潰瘍，痴皮形成著変なし
肺：点状出血肺：点状出血． 肝：肝細胞の巣状壊死
肺：点状出血 肺胞の骨化生． 肝：肝細胞の巣状壊死． 副腎：皮質の点状出
血論

ロイペプチソの経皮毒性試験として，日本白色
種雄ウサギの背部皮膚に10，20，30％ ロイペプ
チソ軟膏を35日間にわたり連続（遇6回）塗布した．
その結果，塗布局所には，ロイべプチソあるいは基剤による局所刺激性はほとんど認められなかった・したがって，ロイペプチソ30％を含有す
る軟膏をウサギの皮膚に35日間連続塗布しても，何ら毒性はないと結論される．

細胞の巣状壊死と小葉辺縁肝細胞に限局した空胞変性，副腎皮質に点状出血が散発的にみられたほか，まれに肺胞内への泡沫細胞の浸潤，膵の問質
−188−

文

献

1）田中 亘．微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプチソ）の開発研究．昭和55年
度研究報告書，p．101（1981）．

ロイべプチソおよびべスタチソの難病治療薬としての開発研究
ぶタgCfrom．，7，372（1980）・

2）田中 亘．同上．昭和54年度研究報告書，p・65（1980）．

3）田中 亘．同上．昭和56年度研究報告書，p・103（1982）．

4）田中 亘．同上．昭和56年度研究報告書，p・98（1982）．

5）田中 亘．同上．昭和57年度研究報告替，p・113

10）大倉洋甫，三吉野産治，石田淳一，山口改段，弓場郁代．微生物の二次代謝産物に由来する難病治
療薬（ロイべプチソ）の開発研究・昭和58年度
研究報告書，p．21（1983）・
11）中山道則，渡辺紀子，石橋正冗，宮崎 浩・日本薬学会第104年会（仙台）講演要旨集，p・598（1984）．

（1983）．

6）田中 亘．未発表．
・7）Koyama，M．，Hashimoto，M・，Asakawa，N・，
Ishibashi，M．，and Miyazaki，H．Biomed・肋∫∫5♪gCfrom．，7，372（1980）・
・8）Gharib，H．，Ryan，R・J．，Mayberry，W・E・，andHockert，T．J．C〃れ㌧

E〝docr〃0．，33，509（1971）・

12）Nishizawa，R．．Saino．T．，Takita，T・，Suda・H・，
Aoyagi．T．，andUmezawa・H・J・Med・Chem・・
20，510（1977）．

13）田中 亘．微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイべプチソ）の開発研究・昭和56年
度研究報告書，p・113（1982）・
14）田中 亘．同上．昭和57年度研究報告書，p・118

・9）Koyama．M．，Hashimoto，M・，Asakawa，N・，
Ishibashi，M．，andMiyazaki，H，Biomed．Mass−189−（1983）．

微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプチン）開発研究班分担研究者一覧
氏

名

所

属

班長梅沢浜夫微生物化学研究所

住所

141東京都品川区上大崎3諾温。173

遡貞 岩崎 祐三 東北大学医学部脳疾患研究施設脳徴 980 仙台市星陵町2−1
′ヽ

紐構造部門

ヽ√ヽ∩

′▼■

1・t111′1−h rヽ一つ1■つヽ▼￣【6222−74−1111（内2313）′′ 大塚 正徳 東京医科歯科大学医学部薬理学教室

113 東京都文京区湯島ト5−45
03−813−6111（内3145）〝

213

川崎市宮前区野川1430
044−755−5441（内20）

国立武蔵療養所神経センター疾病研
究第一部

187

小平市小川東町2620
0423−4ト2711（内5115）′′ 埜中 征哉 国立武蔵療養所神経センター微細構
造研究部

187

小平市小川東町2620
0423−4ト2711（内5211）〝

640

和歌山市9番丁90734−31−2151（内319）〝

野村 達次 実験動物中央研究所
高木

′′

昭夫

松下

宏

村地

和歌山県立医科大学第二生理学教室

孝

京都大学医学部附属病院検査部

606 京都市左京区聖護院川原町
075−75ト3502（直）′′ 大倉 洋甫 九州大学薬学部薬品分析化学教室

812 福岡市東区馬出3−ト1
092−64ト1151（内6151〜4）〝874

三吉野産治 国立療養所西別府病院

別府市大字鶴見4548
0977−24−1221ノ｝3〝
春事

250 小田原市風祭412

村上 慶郎 国立療養所箱根病院
木下真男

0465−22−3196

東邦大学医学部附属大橋病院第四内

153 東京都目黒区大橋2−17−6
03−468−1251

科

班員 祖父江逸郎 名古屋大学医学部第一内科教室

466 名古屋市昭和区鶴舞町65．監事 里舌栄二郎 国立武蔵療養所神経センター

187 小平市小川東町2620
0423−41−2711（内400）
0423−44−3781（直）遡員 福山 幸夫 東京女子医科大学小児科教室

162 東京都新宿区市谷河田町1003−353−8111（内3508）′／ 丸山 工作 千葉大学理学部生物学教室
瀞事
〝

青柳
田中

高明

微生物化学研究所酵素研究部

052−741−2111

260 千葉市弥生町1−33
0472−51−1111

141東京都品川区上大崎3−14−23
03−441−4173

115 東京都北区志茂3−3ト12

亘 日本化薬株式会社

03−901−2878

遡員 松本 郁男 万有製薬株式会社研究本部

153 東京都目黒区下目黒2−9−3
03−492−4106

102 東京都千代田区富士見1−11−2東京
富士見ビル
03−237−5131444
岡崎市明大寺町字西郷中38
岡崎国立共同研究機構生理学研究所
0564−54−1111（内821）′′ 石井 靖男 日本化薬株式会社医薬研究開発部
遡友 江橋 節郎

〝 勝沼 信彦 徳島大学医学部酵素化学研究施設−191−

770 徳島市蔵本町3−18−15

0886−31−3111