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四国医誌 ６１巻３，４号 ９１〜９４ AUGUST２５，２００５（平１７）

原著（第１４回徳島医学会賞受賞論文）

ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）における Lysophosphatidylcholine（LPC）
刺激による VEGF レセプターのトランスアクチベーション
藤玉田置佳俊子１），吉晃１）栖正典２），井澤有紀１），兼松康久１），１）

徳島大学大学院ヘルスバイオサイエンス研究部病態情報医学講座情報伝達薬理学分野

２）

奈良県立医科大学医学部薬理学講座（平成１７年５月２日受付）（平成１７年５月１３日受理）

Lysophosphatidylcholine（LPC）は，動脈硬化発症にFlk-１／KDR 活性化阻害剤として SU１４９８，VTKi，ERK１／２

関わる酸化 LDL の主要構成成分であり，接着分子，ケの上流にある MEK１／２の阻害剤として PD９８０５９，U０１２６，

モカインや活性酸素種産生などさまざまな血管内皮の反Src の活性化阻害剤として Herbimysin A（HA），PP２を応を引き起こすことが知られており１，２），血管の炎症部使用した。

位や動脈硬化病巣部位に集まっていることが報告されている３）。近年，LPC の受容体として，細胞増殖や免疫反応に応答する G２A，GPR４などの G タンパク共役型４，５）受容体（GPCR）が報告されている

結果HUVEC において，LPC の刺激に応答して Flk-１／KDR。また，LPC によっが活性化された。LPC は Flk-１／KDR を１０分をピークとて mitogen-activated protein（MAP）kinase が活性化さして活性化し，それは LPC１µM から２０µM まで濃度依存れることも報告されている６）。しかしながら，内皮細胞的であった。LPC による Flk-１／KDR の活性化は，Flk-１／における LPC による細胞内情報伝達機構の詳細は未だKDR 活性化阻害剤 SU１４９８，VTKi の前処置によって抑明らかにはなっていない。今回われわれは，LPC による制された。また，不活性 Src を transfect した HUVEC

血管内皮細胞の増殖について，vascular endothelial growthにおいて，LPC による Flk-１／KDR の活性化が抑制され，factor（VEGF）受容体の一つ fetal liver kinase-１／kinase-

Src 阻害剤でも同様の結果が得られた。さらに，Flk-１／insert domain-containing receptor（Flk-１／KDR）の関与

KDR の下流に存在する，ERK１／２，Akt も LPC によっ（transactivation）とその細胞内分子機構について検討をて活性化された。LPC によって活性化された ERK１／２，行った。

Akt は，Flk-１／KDR 活 性 化 阻 害 剤 SU１４９８，VTKi，不実験方法
培養ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を用い，LPCによって刺激した。Flk-１／KDR 活性の測定は Flk-１／KDR

活性 Src の transfect また Src 阻害剤 HA，PP２によって抑制された。これらのことより，HUVEC での LPC 刺激による Flk-１／KDR の transactivation への c-Src, ERK
１／２，Akt の関与が示唆された。の抗体を用いて免疫沈降し，リン酸化したチロシン残基最後に，LPC による Flk-１／KDR の transactivation を特異的抗体４G１０を用いた Immune blot にて行った。ERK介した HUVEC の増殖を確認した。LPC による HUVEC

１／２，Akt の活性化，活性化 Src の測定は phospho-specificの増殖は，Flk-１／KDR 活性化阻害剤 SU１
４９８，VTKi，抗体を用いた Western blot 法にて行った。細胞の増殖性

MEK１／２阻害剤 PD９８０５９と U０１２６，Src 阻害剤 HA，PPは，LPC 刺激後２４時間培養し MTT assay にて評価した。

２の前処置，不活性 Src の transfect によって抑制され

HUVEC へ の 不 活 性 Src プ ラ ス ミ ド の transfection はた。以上のことより，c-Src を介した LPC による HUVEC

CytoPure-huv Transfection Reagent を用い，transfectionの増殖には Flk-１／KDR の活性化（transactivation）が関

２４時間後にアッセイを行った。実験に用いた阻害剤は，与している可能性が示唆された。

９２

考藤 田 佳 子 他

原因の一つとして考えられている。LPC による Src を察介した Flk-１／KDR 活性化（transactivation）は，HUVECアンジオテンシン II，エンドセリンなどによる GPCRの増殖に関与している可能性があり，内皮細胞活性化に

刺 激 か ら，epidermal growth factor 受 容 体，VEGF 受基づく動脈硬化形成初期相に関わっていることが示唆さ

容体等のチロシンリン酸化型受容体が活性化されるれた。

transactivation はいくつか報告されている７，８）。Trans-activation が心肥大やがん，また血管病変に影響を与えていることも報告されている９，１０）。しかし，酸化 LDL

文

献の主要構成成分である LPC についての transactivation

１）Kume, N., Cybulsky, M.I., and Gimbrone, M.A., Jr :は未だ報告されていない。われわれの今回の検討で，血Lysophosphatidylcholine, a component of atherogenic

管内皮細胞において，LPC 刺激によって VEGF 受容体

lipoproteins, induces mononuclear leukocyte adhesionの一つである Flk-１／KDR が c-Src を介して transactiva-molecules in cultured human and rabbit arterialtion を起こすことが明らかとなった。Flk-１／KDR の活

endothelial cells. J. Clin. Invest.,９０：１
１３８‐１１４４，１９９２性化は下流に存在する Akt，ERK１／２の活性化を引き起２）Kugiyama, K., Sugiyama, S., Ogata, N., Oka, H., et al. :こし，細胞の遊走，増殖，内皮細胞の活性化を引き起こ

Burst production of superoxide anion in human

すことが知られている。われわれの結果でも，Flk-１／KDR

endothelial cells by lysophosphatidylcholine. Athe-の活性化に引き続き，ERK１／２，Akt の活性化，HUVECの 増 殖 が 確 認 さ れ た。Flk-１／KDR の リ ガ ン ド で あ る
VEGF による反応とすべて同じ反応を確認することはできなかったが，Flk-１／KDR の活性化，内皮細胞の活性化が LPC によって引き起こされた（図）。
LPC は酸化 LDL の主要構成成分として，動脈硬化のrosclerosis,１４３：２０１‐２０４，１９９９３）Ross, R. : Atherosclerosisan inflammatory disease.
N. Engl. J. Med.,３４０：１１５‐
１２６，１９９９４）Zhu, K., Baudhuin, L.M., Hong, G., Williams, F.S., et al. :Sphingosylphosphorylcholine and lysophosphatidylcholine
are ligands for the G protein-coupled receptor GPR４.

図 HUVEC の増殖を引き起こす c-Src を介した LPC による VEGF レセプターのトランスア
クチベーションのシグナル伝達経路

９３

LPC による Flk‐
１／KDR のトランスアクチベーション

J. Biol. Chem.,２７６：４
１３２５‐
４１３３５，
２００１

Convergence of angiotensin II and platelet-derived

５）Kabarowski, J.H., Xu, Y., and Witte, O.N. : Lysophos-growth factor receptor signaling cascades in vascularphatidylcholine as a ligand for immunoregulation.

smooth muscle cells. J. Biol. Chem., ２７０：１２５６３‐Biochem. Pharmacol.,６４：１
６１‐１６７，２００２１２５６８，１９９５６）Wu, L.W., Mayo, L.D., Dunbar, J.D., Kessler, K.M., et９）Asakura, M., Kitakaze, M., Takashima, S., Liao, Y., et al. :al . : Utilization of distinct signaling pathways byCardiac hypertrophy is inhibited by antagonism ofreceptors for vascular endothelial cell growth factor

ADAM１２processing of HB-EGF : metalloproteinaseand other mitogens in the induction of endothelial

inhibitors as a new therapy. Nat. Med., ８：３５‐４０，cell proliferation. J. Biol. Chem., ２７５：５０９６‐
５１０３，

２００２２０００１０）Gschwind, A., Prenzel, N., and Ullrich, A. : Lysophos-７）Prenzel, N., Zwick, E., Daub, H., Leserer, M., et al . :phatidic acid-induced squamous cell carcinoma cell

EGF receptor transactivation by G-protein-coupledproliferation and motility involves epidermal growth

receptors requires metalloproteinase cleavage offactor receptor signal transactivation. Cancer Res.,

proHB-EGF. Nature,４０２：８８４‐
８８８，
１９９９６２：６３２９‐
６３３６，２００２８）Linseman, D.A., Benjamin, C.W., and Jones, D.A. :９４藤 田 佳 子 他

Lysophosphatidylcholine (LPC) transactivates vascular endothelial growth factor (VEGF)
receptor via c-Src in HUVEC
Yoshiko Fujita １）, Masanori Yoshizumi ２）, Yuki Izawa １）, Yasuhisa Kanematsu １）, and Toshiaki Tamaki １）
１）

Department of Pharmacology, Institute of Health Biosciences, The University of Tokushima Graduate School,Tokushima, Japan ;and ２）Department of Pharmacology, Nara Medical University School of Medicine, Nara, JapanSUMMARY
One of the major lipid components of oxidized low density lipoprotein, lysophosphatidylcholine（LPC）is involved in numerous biological processes as a bioactive lipid molecule and has beenshown to be involved in the progression of atherosclerosis. As counter-ligands, G２A and GPR４wereidentified with high binding affinity for LPC that are belonging to orphan G-protein-coupledreceptors（GPCRs）at plasma membranes. Although several GPCR ligands transactivate receptor
tyrosine kinases （RTKs）, such as epidermal growth factor receptor, transactivation of RTK by
LPC has not yet been reported. Here we observed for the first time that LPC treatment induces
tyrosyl phosphorylation of vascular endothelial growth factor （VEGF）receptor２（fetal liverkinase-１／kinase-insert domain-containing receptor, Flk-１／KDR）in human umbilical vein endothelialcells（HUVEC）. VEGF receptor tyrosine kinase inhibitors, SU１
４９８and VTKi inhibited Flk-１／KDR
transactivation by LPC. Furthermore, we examined the effect of the Src family kinases inhibitors,
Herbimycin A and PP２ on LPC-induced Flk-１／KDR transactivation. Herbimycin A and PP２
inhibited Flk-１／KDR transactivation in HUVEC, suggesting that c-Src is involved in LPC-induced
Flk-１／KDR transactivation. Kinase-inactive（KI）Src transfection also inhibited LPC-induced Flk-１／KDR transactivation. In addition, LPC activated extracellular signal-regulated kinase１／２and Akt,
which are downstream effectors of Flk-１／KDR, and these were inhibited by SU１
４９８，VTKi,Herbimycin A, PP２ and KI Src transfection in HUVEC. LPC-mediated HUVEC proliferation wasshown to be secondary to transactivation because it was suppressed by SU１
４９８，VTKi, HerbimycinA, PP２and KI Src transfection. It is concluded that c-Src-mediated Flk-１／KDR transactivation by
LPC may have important implications for the progression of atherosclerosis.

Key words : LPC, endothelial cells, Flk-１／KDR, c-Src, atherosclerosis