厚生労働省精神・神経疾患研究委託費
13公一1

遺伝性筋疾患に対する分子治療の基盤研究

総括研究報告書（平成13年度〜平成15年度）

平成16年3月

主任研究者

武田伸一

目

次

＊総括研究報告

主任研究者

武

田

伸

一

Ⅰ．遺伝性筋疾患に対する遺伝子治療
1）AAVベクターを用いた骨格筋への遺伝子導入法並びにAAVベクター作製法
に関する検討自治医科大学医学部 分子病態治療研究センター 遺伝子治療研究部

小

11

澤

敬

也

2）アデノ随伴ウイルスベクターを用いたDuchenne型筋ジストロフィーに対する遺伝子治療の開発に関する基盤的研究

14

国立精神・神経センター神経研究所 遺伝子疾患治療研究部

武

田

伸

一

3）代謝性筋疾患に対する分子治療の基盤研究

21

国立精神・神経センター 神経研究所 疾病研究第五部

辻

野

精

一

4）非ウイルスベクターを用いた骨格筋への遺伝子導入及び発現法の開発に関する研究
大阪大学大学院 医学系研究科 遺伝子治療学

金

田

安

史

5）筋ジストロフィー治療を目指した遺伝子デリバリー用DDSの開発
京都大学大学院 薬学研究科

25

28

西

川

元

也

6）RNAiを用いた疾患モデル動物の作出に向けた基礎的研究

32−C2C12細胞を用いたRNAi誘導とその効果−
国立精神・神経センター 神経研究所 疾病研究第三部

北

條

浩

彦

Ⅱ．幹細胞を用いた移植治療法の開発
7）骨格筋組織幹細胞移植治療に関する基礎的研究
三菱化学生命科学研究所 幹細胞研究ユニット

39

橋

本

有

弘

8）筋ジストロフィーの骨髄移植による治療法の開発的基礎研究
大阪大学大学院 薬学研究科 細胞生理学分野

42

山

元

弘

9）造血組織に由来する筋幹細胞の同定と生着に関する研究
京都大学大学院 医学研究科 発達小児科

46

平

家

俊

男

10）成体幹細胞を用いた心筋再生による心不全治療法の確立
慶應義塾大学 医学部 心臓病先進治療学

49

福

田

恵

一

11）ES細胞を用いた筋ジストロフィーの治療法の確立及び血管におけるジストロフィンの機能解析
熊本大学 医学部 附属病院 発達小児科

1

53

木

村

重

美

Ⅲ．分子病態に基づく治療法の開発
12）ミトコンドリアの病態制御と家族性筋萎縮性側索硬化症の分子治療法開発
大阪市立大学大学院 医学研究科 分子病態学

井

上

63

正

康

13）ミトコンドリア脳筋症の分子治療に関する基盤研究

66

国立精神・神経センター 神経研究所 疾病研究第二部

後

藤

雄

一
70

14）ミトコンドリアを標的するリポソームベクターの基礎的研究
自治医科大学 医学部 生化学

遠

藤

仁

司

15）ジストロフィン欠損筋細胞で発現変動する分泌性タンパク質群の機能解析
財団法人 東京都医学研究機構 東京都臨床医学総合研究所 腫瘍生化学研究部門

原

76

孝

16）ヒト筋マイクロアレイの開発とそれを用いた筋疾患の分子病態の解明
塚 原
北陸先端科学技術大学院大学 ナノマテリアルテクノロジーセンター

彦
81

俊

文

Ⅳ．筋ジス犬を中心とした新たなモデル動物の開発
8917）核移植技術を用いたマウスES細胞由来個体の作出
近畿大学 農学部

角

田

幸

雄
92

18）新しいモデル動物作成法の開発による遺伝性ヒト疾患の病態解析
京都大学大学院 医学研究科 病理系腫瘍生物学講座

鍋

島

陽

一
98

19）筋ジストロフィー関連モデル動物の生産・供給システムの検討
財団法人 実験動物中央研究所

日

置

恭

司
102

20）遺伝子改変マウスを用いた神経・筋疾患モデルの作出
岡崎国立共同研究機構 基礎生物学研究所 形質転換生物研究施設

笹

岡

俊

邦

21）遺伝性筋・神経疾患モデルマウスにおける高次脳機能障害についての研究

104−Dystrophinの中枢における役割の検討−
国立精神・神経センター 神経研究所 疾病研究第四部

関

口

正

幸
108

22）実験動物としての筋ジストロフィー犬の研究−生殖工学技術を用いた繁殖及びコロニーの維持について−
財団法人 実験動物中央研究所

谷

岡

功

邦

23）筋ジストロフィーモデル犬における健康管理と病態解析
国立精神・神経センター 神経研究所 実験動物管理室

2

111

高

橋

明

男

Ⅴ．遺伝子医療に関する社会医学的研究
24）筋ジストロフィー患者の遺伝子医療に対する知識と態度の検討

121−2070名へのアンケート調査及び31名への聞き取り調査の結果−
社団法人 日本筋ジストロフィー協会

貝

谷

久

宣

Summary129

研究者一覧表

133

3

総

括

研

究

報

告

主任研究者
【研究目的】

武田伸

一谷岡 功邦 ㈲実験動物中央研究所

当研究班は「遺伝子性筋疾患の根本治療への基盤研

塚原 俊文 北陸先端科学技術大学院大学

究（10公一1）」の成果を受けて，原因遺伝子の追求と病

辻野 精一 国立精神・神経センター

態解明が進んでいる遺伝子性筋疾患に対して，根治的角田 幸雄 近畿大学農学部

な治療法を確立するために，設立された．当研究班の鍋島 陽一 京都大学大学院医学系研究科

研究目標を以下に示す．

西川 元也 京都大学大学院薬学研究科（15年度）

1．遺伝性筋疾患に対する遺伝子治療を確立する

橋本 有弘 三菱化学生命科学研究所

2．骨髄および骨格筋そのものから骨格筋細胞系語の幹原細胞を得て，効率の高い移植法を確立する

孝彦 東京都臨床医学総合研究所

日置 恭司 ㈲実験動物中央研究所

3．分子病態の解明を前提とした新たな発想に基づく治

福田 恵一 慶応義塾大学農学部

療のための方法論を開発する

平家 俊男 京都大学大学院医学系研究科（14年度〜）
北棟 浩彦 国立精神・神経センター（15年度）

4．治療法を臨床に応用するために，筋ジストロフィー
犬を中心としたモデル動物を開発する

三好 浩之 理化学研究所筑波研究所（14年度）

5．遺伝子医療に関する社会医学的研究

山元

弘 大阪大学大学院薬学研究科

以上の目標を達成するために，（10公一1）の構成班員を中心として，全国から優れた研究戦略を持つ研究者【研究成果】

を選抜し，総員24名の班員構成とした．3年間の特筆

1．遺伝性筋疾患に対する遺伝子治療法の確立

すべき研究成果として，マウスモデルに対して遺伝子ジストロフィン欠損による筋ジストロフィー及びacid

治療の方法が確立したことと，筋ジストロフィーの新maltase欠損症などの代謝性筋疾患を主たる対象として，

たなモデル動物として筋ジストロフィー犬のコロニー

アデノウイルスベクター，アデノ随伴ウイルス（AAV）

を確立し，同大の飼育・実験施設を立ち上げたことがベクター等を用いた研究及びウイルスベクターを用い特記される．

ないplas血dあるいはRNAiによる研究が行われた．（武田，小澤，金田，鈴木，辻野，西川，北修）【研究組織】a）AAVベクターを用いた筋ジストロフィーの遺伝子治

主任研究者

療法の開発

武田 伸一 国立精神・神経センター

AAVベクターは抗原性が低く，骨格筋における長期分担研究者

間安定した発現が期待されている．しかし，導入遺伝
mouseの手法を用いて，小型でしかも充分な機能を持つ

自治医科大学医学部

micro−dystrophin遺伝子の開発研究が行われた．第二年

他日本筋ジストロフィー協会

度には，AAVベクターによる遺伝子導入に伴う免疫応

大阪大学大学院医学系研究科

答がubiquitousなCMVプロモーターではなく，骨格筋

国立精神・神経センター（13年度）

特異的なMCKプロモーターを利用することによって軽熊本大学大学院医学薬学研究部

減することを明らかにした．第三年度には，筋ジスト

菊池木村也 宣 史 桟 美
敬 久 安 建 重子の長さ制限があるため，第一年度の研究でtransgenic

遠藤 仁司 自治医科大学医学部
澤 谷 田
小 月 金

井上 正康 大阪市立大学大学院

後藤 雄一 国立精神・神経センター

ロフィーの表現型を改善する能力を持つCSlmicro−

斎藤（小原）探美子 東京医科歯科大学（13年度）

dystrophinを組み換えたAA隼MCK−ACSlを作製し，mdr

笹岡 俊邦 岡崎国立共同研究機構基碇生物学研究所

マウス骨格筋に導入したところ，24週に及ぶmicro−鈴木

dystrophinの発現が確認された．しかも，筋ジストロフ

聡 日本医科大学医学部ト14年度）

関口 正幸 国立精神・神経センター

ィーの症状が既に発症している5過齢のマウス骨格筋

高橋 明男 国立精神・神経センターに導入した場合でも，ジストロフィンの陽性線経では
ー5一

中心核線経の比率が低下し，単位面積当たりの張力もa）骨髄SP細胞の筋細胞への分化

増加していた．さらに，興味深いことには，筋ジスト

幹細胞移植を用いた遺伝性筋疾患に対する治療法のロフィーの症状が発症する以前の10日齢マウス骨格筋限界の一つは，その効率が低いことにある．そこで，に導入した場合には，micro−dystrophinの陽性線経の比率は20％以下であるにもかかわらず，筋張力の正常化

幹細胞を濃縮する方法として骨髄細胞からHoechst dyeとセルソーターを用いてSP分画を得た．sp細胞は放射が観察され，その背景として，micro−dystrophin陽性線

線を照射したm血マウスに移植すると，骨格筋に分化経の選択的肥大が検出された．さらに，Beagle種の筋すると共に，造血系を再構築することが判明している．

ジストロフィー犬のコロニーを確立した国立精神・神SP細胞を単独でh vitroで培養しても，筋細胞に分化さ

経センターの中型実験動物研究施設において，筋ジス

せることができなかった．ところが，SP細胞を単一筋

トロフィー犬骨格筋に対してAAVベクター遺伝子導入

線維培養法を用いて筋衛星細胞と共に共培養すると筋を行ったが，筋ジス犬あるいはその正常対照犬骨格筋細胞に分化させることができた．注目されることとして，に導入した場合でも，過剰な免疫応答が誘導され，導造血能力のある骨髄や胎児肝のSP細胞は，共培養系で入遺伝子産物の発現が短期間に留まることが判明した．

筋細胞に分化することができたが，骨髄の非SP細胞分

イヌ骨格筋から準備した初代骨格筋培養細胞に対しては，画や，造血能力のない新生児肝細胞は，筋細胞への分AAVベクターの感染性はむしろ高い結果を得た．イヌ

化能力を持たなかった．一方で，骨髄SP細胞であれば，骨格筋への導入でも免疫抑制剤の使用により，不完全

血球系であっても，非血球系であっても，筋細胞に分ながら，免疫応答が抑制され，導入遺伝子産物の長期化することが観察された．筋細胞に分化しうる細胞は間発現が観察された．しかし，AAVベクターを用いた

共通した細胞表面の性質を有すると考えられるが，さ方法論をヒトに対して応用するためには，免疫応答現らに分子機構の研究を進めることで幹細胞が筋細胞に

象の背景の解明とその抑制法の確立が求められている．

分化する効率を高める方策を見出すことが期待される．

b）AAVベクターの新たな血清型の開発

b）骨格筋衛星細胞

AAVベクターについては，血清型により組織におけ筋衛星細胞と筋再生の関連はよく知られているが，る遺伝子導入発現効率が異なることが知られていた．

これまで筋衛星細胞にはよい分子マーカーがなかった．

そこで，5種の血清型AAVl−，AAV2−，AAV3−，AjN−4，

そこで山元班員は，静止期筋衛星細胞のみを認識する

AAV5−を用いてLacZ遺伝子をサル骨格筋へ導入した結モノクロナール抗体のを得るべく，研究を開始した．

果，AAV1−LacZ及びAAV5−LacZの発現効率が高いこと

その結果得られた抗体の一つ2C／6は，ほぼ静止期の筋が明瞭になった．一方，平成15年度の班会議に特別講

衛星細胞のみを認識していた．そこで次に同抗体とセ演して頂いた米国ワシントン大学のチェンバーライン

ルソータを用いて筋衛星細胞のみを集め，DNAchipを教授は，AAV6ベクターを用いるとマウスの尾静脈経由用いたexpressionpro丘kの検討を行っている．

で全身の骨格筋と心筋に対する遺伝子導入が可能との3．分子病態に基づく治療法の開発

驚くべき結果を発表された．今後dystrophin，Acid

分子遺伝子の発展は，多くの疾患の遺伝学的な背景

maltase等疾患モデルに対する治療用遺伝子に応用されを明らかにしたが，これらの原因遺伝子産物の機能をることが期待される．

前提とした分子病態研究は従来とは異なる発想の治療

2．幹紐胞を用いた移植治療法の開発

研究を可能にしている．（後藤，関口，井上，遠藤，原，

骨格筋は強い再生能力を持つ器官である．再生能力

塚原）の源泉は，これまで基底膜と筋形質膜にはさまれて存

a）筋ジストロフィー細胞株における遺伝子発現

在する筋衛星細胞のみに求められていた．ところが，遺伝性筋疾患の病態を解明するために，ジストロフ

筋衛星細胞を培養して筋ジストロフィー（DMD）患児

ィンを欠損する筋細胞株（肌血−Sm）と正常（BlO−Sm）に移植を行っても，その効果は明瞭でなかった．そこに加えて，Duchenne型あるいはBecker型と診断されたで骨髄等に存在する筋細胞系譜の幹細胞が注目される患者は検筋からも細胞株を樹立した．両者を詳細に比ようになった．筋ジストロフィー等の遺伝性筋疾患に較検討したところ，mdk筋及びDMD／BMD筋で共通し対して幹細胞移植を用いる最大の利点は，経静脈的投て発現低下している未知の遺伝子（分泌性セリンプロ

与により，全身の骨格筋に効果が期待できることにある．

テアーゼ様分子）と肌血筋でのみ発現増加している9（木村，橋本，福田，山元，武田，平家，三好）

種類の遺伝子（Thymosinβ4，Osteopontin，PC3など）が見出された．
ー6−b）ヒト筋cDNAマイクロアレイの開発吸不全死が減少し，心不全死が増加していることから，

筋ジストロフィーに関しては，細胞膜，基底膜関連

筋ジス犬の心筋障害の分子病態を解明し，新たな治療のタンパク質の他，核膜関連タンパク質，細胞質に存法を開発することが期待される．そこで，筋ジストロ

在する酵素群，糖鎖修飾タンパク質など多岐にわたる

フィー犬の心臓について継続的な病理学的検討を行った．

分子が関与している．そこで筋ジストロフィーに共通

その結果，心電図変化に見合う左室の線維化は観察さする病態像及び個々の病型を特徴付ける病態像を明られず，4ケ月齢から刺激伝導系であるPurkinje線経の選かにするために，ヒト筋cDNAマイクロアレイの開発

択的空胞変性が検出された．電子顕微鏡を用いた超薄を行った．これまでにヒト骨格筋に発現する3，500種類

切片の検討では，空胞に一致した膜構造は観察されず，の遺伝子発現を解析することが可能になった．6例の断裂したmyofibrilと変性したmitochondriaが検出されDMD生検筋を分析した結果では，壊死変化の増加あるたことから，空胞はmyo丘ilの崩壊を反映していると考いは重症例ないし，軽症例であるのかによって，遺伝えた．さらに筋ジス犬のmrki可e線経には全長型のジス子発現のプロファイリングが異なることが判明した．

トロフィンの発現は欠くが，C型の分子種が検出された．

すなわち，患者生検筋を用いた分子病理的研究が可能になったといえる．

そこで，microdissection法を用いて，息犬のPurkinje線
維のみを集積し，Ⅵ屯stemblot法を用いて検討したところ，C）ジストロフィン欠損による中枢神経障害

同Purkinje線維のみにDp71が検出された．同Purkinje

ジストロフィン欠損によるDuchenne型筋ジストロフ

線椎の膜でLl−Calpainの発現増加を認めたことと考え併

ィーでは，約50％の例で知能低下を認めることはよくせると，Dp71の発現が膜でのCa−Channelの活性化を引知られているが，基質的な病変は認められず，その分き起こし，それがp−Calpainの膜へのtranSlacationを引き

子病態は明らかでない．関口班員は，J血マウスをモデ起こしている可能性がある．今後，ジストロフイ￣ンのルとして研究を行い，同マウスをモデルとして研究を欠損がなぜ叫e線経の選択的障害を引き起こすのか，行い，同マウスは学習・記憶機構に障害はなく，運動

また，Purkinje線経の障害により，どのような電気的異性も保たれていたが，情動行動に異常があることを初常を生ずるのか，検討することが重要である．

めて明らかにした．

b）核移植技術の応用

マウスES細胞から安定してマウス個体を作出するた
4．筋ジス犬を中心とした新たなモデル動物の開発

め核移植技術の確立を試みた．ES細胞由来の核移植を筋ジストロフィーを中心とする遺伝性筋疾患では，行った場合，桑実胚，胚盤胞への発生率，着床率は比

分子遺伝学の進歩により明らかにされた原因遺伝子に較的高いが，産子数は少なく，しかも出生後すぐに死

ついてはノックアウトマウスの作製もほぼ出そろって亡する傾向にあった．

いる．しかし，それらはembryoniclethalであったり，軽症であるために必ずしも病態・治療モデルとして適5．遺伝子医療に関する社会医学的研究（月谷）切ではない．そこで，核移植技術，RNAiなど新たな方

日本筋ジストロフィー協会を中心として，筋ジスト

法論の下にモデル動物を開発する必要がある．特に，ジストロフィン欠損のm血マウスに対して重症で進行

ロフィー患者，家族に対する広範なアンケート調査が行われた．今年度はその結果を詳細に解析したが，筋性の経過を辿る筋ジストロフィー犬を中心とした開発

ジス患者家族の79％は，自分たちの病気が遺伝子の変研究を行った．（笹岡，高橋，谷岡，角田，鍋島，日置）異によるものであり，71．2％は遺伝子診断ができること

a）筋ジストロフィー犬を知っていた．しかし，実験段階でも遺伝子治療を受

平成13年11月から，国立精神・神経センター内に設けたいと思う人は21．0％に留まっており，受けたくな立された中型実験動物研究施設において，筋ジス犬のいと回答した23．7％を下回っていた．

飼育が開始され，同14年6月からは，同施設内での繁殖も開始された．特に同15年6月から，人工授精による繁殖が可能になったことから，Beagle犬をbaseにした筋ジストロフィー犬のcolonyは確立したと考えている．
筋ジス犬は骨格筋障害を呈することはもちろんであるが，早期から心電図上Ⅱ，Ⅲ，aVf誘導の深いq波を呈し，
しかも8−10ケ月齢を中心に突然死が観察された．
DDMDの療育においても，人工呼吸器の発達により呼−7−Ⅰ．遺伝性筋疾患に対する遺伝子治療

AAVベクターを用いた骨格筋への遺伝子導入法
並びにAAVベクター作製法に関する検討
小 澤 敬 也■
研究協力者 水上 浩好，卜部 匡訂，岡田 尚ピ，松下 耳，久米 晃軒【緒 言】

ノムコピー相当のベクターを注入し，長期にわたる発

アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターは非病原性ウイ

現と骨格筋に与える影響につき評価した．なお，動物ルスに由来することから安全性が高く，しかも骨格筋・実験計画は自治医大動物実験指針規定などに沿って動心筋への遺伝子導入効率に優れているなど，現時点で物倫理面を含めて審議され，承認を受けている．

の遺伝子導入法としてははは理想的な性質を備えている．

AAVの血清型一覧

本研究ではAAVベクターを用いる方法の実用化を念頭発見に置き，筋細胞への遺伝子導入法において利用するベ

ベ ク ター

2 型 との

開発

相同性
中等度

クターキャブシドの血清型・プロモーター・エンハン

1 型

1 965

19 99

サーなどにつき好適な条件を探索すると共に，動物個

2 型

1 966

19 82

体レベルにおける導入遺伝子の長期的な発現及び宿主

3 型

1 966

19 96

側の反応に関して検討を加えた．一方，ベクター産生

4 型

糸に関する進歩としては，従来行ってきたパッケージ

5 型

ング細胞株に関して引き続き検討を行うと共に，全く6 型

新しい方法としてバキュロウイルスを用いる作製法を7 型開発し，需要が増大している各血清型ベクターの効率

8 型

1 966
1 984
1 998
20 02
20 02

19 97

高い
低い

由来

レセ プ ター

主 な標 的 組 織

サル不明

骨格筋 、その他

ヒト†￣、
へ J 7 ノ硫 酸

神経

ヒ ト

不明

神経

サル

Sialic aCid
d2 ・
3 （
0）

脳室上 衣
気 道上 皮 、 神 経

19 99

低い

ヒト

P DG F
receptor

19 99

中等度

A AV−
1
十
A AV −
2

不明

A AV −1 と酷 似

2 0 02

中等度

サル

不明

骨格 筋

2 0 02

中等度

サル

不明

肝層

表1
これまでに報告されたAAVの各血清型につき主な知見を抜粋した．各々の血清型のレセプター及び組織特異性に関して情報が集積しつつある．

よい産生に向けて原型である2型のシステムを改変した．
【方 法】
1）血清型に関する検討

2）ベクター作製システムに関する改良

AAVの1型から5型までのベクター作製システムに関しては，供与を受ける，もしくは2型ベクターの作

パッケージング細胞株の樹立では，従来用いてきた製システムを本研究室において改変するなどによって

Cre−loxPシステムを更に改良し，それぞれ独立して発現準備した（表1）1■）．各血清型のキャブシドによる効果制御が可能である野生型及び変異型のloxPシステムをを比較する目的で，CMVプロモーターを用いてβ−ガラ

用いて，AAVのcap遺伝子及びrep遺伝子の発現誘導可

クトシダーゼ（β一Gal），マウスエリスロポエチン（Epo）
及びヒト型凝固第Ⅸ因子を発現するAAVベクターを各々

能なプラスミドを構築した5）．これら2種類のプラスミ

構築・作製した．AAV−LacZ及びAAV−Epo筋注群では選択した．これらのクローンは増幅した後，10cmディ

ドを293細胞にトランスフェクションし，クローンを4週齢のC5乃U6Jマウスを用い，前脛骨筋にlX1011ゲ

ッシュを用いてパッケージング能力を検討した．検討

ノムコピー相当のベクターを注入した．AAV−LacZ筋注に際しては，LacZ発現プラスミドをトランスフェクシ

群については，注入2週間後に当該筋組織を摘出し，ヨンした上でCre発現アデノウイルスベクターを感染さ

組織標本におけるⅩ−Gal染色及び筋組織におけるβ一Galせることで，LacZ遺伝子を搭載した活性の測定を行った．また，AAV−Epo筋注群では2週産生させ，ベクター産生量についてはDNAドットプロ

間毎に採血し，血中Epo濃度及び血液学的指標を追跡した．

ット法を用いて定量した．

AAVベクターをまた，バキュロウイルスを用いるAAVベクター作製

ヒト型凝固第Ⅸ因子を搭載したベクター（AAV一m）法としては，2型のベクターを作製するシステムを土は4週齢のSCIDマウスを用いて前脛骨筋にl xlOllゲ

台とし6），特に需要の多い1型及び5型のベクター作製＊自治医科大学医学部分子病態治療研究センター遺伝子治療研究部−11−システムに関する基礎検討を行った．即ち，既に作製は従来の2型における結果とほぼ同等の発現を示した（図済みのAAV2のRep，VPをそれぞれ発現する組換えバ1）．β−Gd活性の測定結果も同様の成績を示した（図2）．

キュロウイルスbacRep2，bacVP2，2型ITRの間にいずれの筋標本においても明らかな組織障害像や細胞

GFP遺伝子を組み込んだbacGFP2以外に，AAVlのVP

浸潤などは認められなかった．

を発現するbacVPl，また，AAV5のRep，VPをそれぞ

Epo発現とAAVの血清型との比較検討では，血中のれ発現するbacRep5，bacVP5，ならびに5型ITRの間に

Epo濃度は1型が最も高く，5型がこれに次ぎ，残りはGFP遺伝子を挿入したbacGFP5を作製した．AAVlを

いずれも2型と同程度であった（図3）．血液学的指標作製するにはbacGFP2，bacRep2，bacVPlを，AAV5をについてはいずれの群においても著明な赤血球増加が作製するにはbacGFP5，bacRep5，bacVP5を組み合わせ，それらを浮遊培養系の昆虫細胞に感染させた．回収し引き起こされ，群間の統計学的有意差は認められなか

たAAVベクターはセシウム密度勾配超遠心法により精のベクターを用いた場合にも血清Epo濃度及び血液学的指標は高値を持続した．

った．また4ケ月までの観察期間中，いずれの血清型

製濃縮した．また，293細胞を用いた従来法で作製した
AAVベクターと，遺伝子導入効率の比較検討を行った．

︵一己＼nHE︶JuOUOdH【結 果】
LacZ遺伝子発現効率とAAVの血清型との関係を比較検討したところ，筋標本のⅩ−Gal染色では，1型及び5型において最大の発現が認められ，2・3・4型でAAV−l AAV−2

AAV−3
Pre

2

4

6

8

10

12

14

16

WeeksafterinJeCtion

図3 各血清型由来AAVベクターを用いた筋肉へのEpo遺伝
子導入
4週齢のC57BL／6Jマウスの左右前脛骨筋に対して脚当たり3
xlOlOゲノムコピー相当のベクターを注入し，Epo血中濃度を長期にわたり観察した．
SCIDマウスにおける各血清型の比較においても1型を用いた場合が最良であり，第Ⅸ因子では200mg／mlに達する血中濃度が得られ，5型ではおよそ10ng／mlレ

図l各血清型AAVベクターを用いた筋肉へのLacZ遺伝子導入：X−Gal染色4週齢のC57BL／6Jマウス前脛骨筋に脚当たり3Ⅹ1010ゲノムコピー相当のベクターを注入し，2週間後に当該筋組織を摘出，組織標本でⅩ−Gal染色を行った．

ベルでこれに次ぎ，その他の血清型の場合には更に低かった．また，いずれの場合にも投与後10週間の観察
期間にわたってほぼ一定の血中濃度を保っていた．1型を用いた場合につき1年間追跡したが，第Ⅸ因子の54の骨格筋を解析したが，組織障害などは認められず，

3

免疫染色においても導入遺伝子の発現が確認された．
パッケージング細胞株の樹立に向けた検討では，選フ ﹂︵月旦邑叫6︑月卓もt且
合名j讃豆

血中濃度はほぼ同じレベルで推移した．また，1年後別したクローンの中からAAVベクターの産生効率が良好なものが見出された．最高のものでは10cmディッシ
ュあたり2．0Ⅹ1010のベクター産生が観察された（図4）．
4週間後の検討によってもこの産生量はそれほど低下せ
1

2

3

4

5

ず，このクローンは比較的安定した産生株になっていSerotypes

るものと考えられた．また，バキュロウイルスを用いた検討では，AAVl及びAAV5由来のベクター産生

図2

各血清型AAVベクターを用いた筋肉へのLacZ遺伝子導入：β−GaI活性
図1で用いた筋組織と同様の標本におけるβ−Gal活性の測定結果．
ベクターと同時に注入した色素の分布から注入の中心部付近を選定し，脚当たり3箇所の標本を用いて比較を行った．X−Gal染色で得られた視覚的印象と良く相関する結果が得られた．

効率は，AAV2ベクターの場合とほぼ同様に100mlの培養で1013ゲノムコピーに相当するベクターが産生可能であった．293細胞，Cos細胞，骨格筋などへの遺伝子−12−導入効率については，昆虫細胞で作製したAAVベクタ

はバキュロウイルスを用いる方が造かに容易であり，ーと従来法で作製したものの間で特に違いは認められなかった．

今後ヒトへの応用などで更に大量のベクターが必要にわれる．

PSNSRep r惑→藍S

PSNSRep
Cre

−
一

＋

＋

一

＋

【結 論】

Rep78
Rep6S

＋Cre盲し＿→AAVベクターを用いた骨格筋に対する遺伝子治療法

Rep52
Rep10

につき，様々な血清型由来のベクターを比較検討し，

cpBPCap 己卜‰

導入遺伝子にかかわらず1型由来のベクターが有用で
CPBI℃ap − ＋ ＋
Cre

一

一

あることを確認した．その効果は少なくとも1年にわ＋＋Cre→：「患▼Capなることを考えると，後者の方法は極めて魅力的と思たって持続し，遺伝子導入を行った骨格筋に対する悪こ

影響は観察されなかった．以上の結果を通して，AAV

pA

ベクターを用いた方法の有効性と安全性を証明するこMaximumvectorproductionrate＝2．OxlOlOvg／10cmdishとが出来た．また，野生型及び変異型のloxP配列を利図4

AAVベクターパッケージング細胞株の樹立に向けた戦略Cap発現プラスミド（CPBPCap）においては，そのままでは
CAGプロモーターによりブラストサイジン耐性遺伝子が発現する．そこにCreリコンビナーゼを作用させると，2カ所のloxP間の配列が失われ，CAGプロモーターがcap遺伝子を発現させるようになる．一方，Rep発現プラスミド（PSNSRep）
においては，未処置時にはp5プロモーターによりneo耐性遺伝子が発現するが，Creリコンビナーゼの作用によりloxS（変異loxP）間の配列が外れ，Repが発現するに至る．両者のプラスミドを安定して保持する細胞株を選択することで，効率の良いAAVベクターパッケージング細胞株が樹立された．

用することで新規のAAVのパッケージング細胞株を樹立した．さらに，バキュロウイルスを用いる方法の開発を進め，今後はその実用化に向けた研究を一層推進していく計画である．

【参考文献】
1）ChioriniJA，Kim F，Yang L，et al：Cloning andCharacterizationofadeno−aSSOCiatedviruStyPe5・JⅥ1V1
73：1309−19，1999．

【考 察】2）chioriniJA，YangL，LiuY，etal：CIoningofadeno−

骨格筋を標的としてLacZ，エリスロポエチン及び凝

associated viruStype4（AAV4）and generation of

固第Ⅸ因子遺伝子を導入し，血清型の比較を行った．

recombinantAAV4particles．JⅥTD171：6823−33，1997．

その結果，いずれの遺伝子を用いた場合にも1型に由3）MuramatSuS，MizukamiH，YoungNS，etal：Nucleotide

来するキャブシドを用いることで他を大きく凌駕する

SequenClng and generation ofaninfectious clone of

効果が得られた．LacZ遺伝子を用いた場合には5型を

adeno−aSSOCiatedviruS3．ⅥTDlogy221：208−17，1996．

用いても高い効果が得られたが，β−Galは筋組織内に蓄積すること，1型と5型のいずれの場合にも組織が強4）xiaoW，ChimuleN，BertaSC，etal：Genetherapy
VeCtOrSbased onadeno−aSSOCiatedviruStypel．JⅥtV1

度に青染していることから酵素活性が飽和しているた

73：3994−4003，1999．

めに違いが出にくかったものと考えられる．一方，エ5）MizukamiH，OkadaT，OgasawarY，etal：Separate

リスロポエチン及び凝固第Ⅸ因子を用いた場合にはほCOntrOlofRepandCapexpressionutilizingmutantand

ぼ同様の傾向が認められ，血中への分泌などに関して

Wild−tyPeloxP sequences andimproved packaging

は問題がなかったものと考えられた．1年間の観察に

SyStemforadeno−aSSOCiatedviruSVeCtOrPrOduction・Mol

よっても組織に対する影響がなく，高い発現が持続しβわfgcJZWJ（hpress）ていることから，安全性に関しても問題がないものと

6）UrabeM，DingC，KotinRM：Insectcellsasafactoryto

思われ，様々な応用が期待できる．

PrOduceadeno−aSSOCiatedviruStyPe2vectors．肋mGene

AAVの作製系としてはこれまで様々なパッケージン

乃er13：1935−43，2002．

グ細胞株が報告されてきているが，実用レベルとして

7）ogasawaraY，MizukamiH，UrabeM，etal：Highly

広く使われるに至ったものはない．今回我々の樹立しregulatedexpressionofadeno−aSSOCiatedviruSlargeRep

た細胞株は以前野生型のloxPシステムを利用して樹立

PrOteinsin stable293celllines using the CrenoxP

した細胞株に比べて30倍程度高い産生効率を有しておSWitchingsystem．JGenⅥTV180：2477−80，1999．

り5）7），トランスフェクション法を用いた場合に迫る倍を得ることができた．しかしながら，実際の作業効率
ー13−アデノ随伴ウイルスベクターを用いたDuchenne型筋ジストロフィーに対する遺伝子治療法の開発に関する基盤的研究
武

田

伸

一＊

研究協力者 坂本美喜書，吉村 まどか書，湯浅勝敏書，鈴木友子事，
横田俊文攣，池本 打，望月靖史書
タ一による遺伝子導入では，マイクロ・ジストロフィ【緒 言】

ンの発現は短期に留まり，機能を充分に評価するには

Duchenne型筋ジストロフィー（DMD）は，ジストロ

至らなかった．

フィン遺伝子の異常により引き起されるⅩ連鎖性劣性の遺伝性筋疾患である1）．DMDは，発生率が高く（男そこで，AAVベクターを用いたDMDに対する遺伝

児3，500人に1人），進行性の重篤な骨格筋障害を生じ，子治療法を開発するために，先ずTg〝血マウスを作製

呼吸障害や心障害による早期死亡として特徴づけられる．

し，マイクロ・ジストロフィンの機能を評価した7）．次

現在，筋ジストロフィーに対する効果的な治療法がなに，肌血骨格筋へのAAVベクターによる効果的な遺伝いことから，根治的な治療法の開発が期待されている．

子導入について検討を行った8）後，実際にAAVベクタ

ウイルスベクターを用いたDMDに対する遺伝子治療

ーを用いて治療用マイクロ・ジストロフィン遺伝子をとして，全アデノウイルス（Ad）ゲノムを欠失させ，〝血骨格筋へ導入し，筋ジストロフィーの表現型の改善

全長型ジストロフィンcDNA

について検討した．

を挿入可能にしたgutted

Adベクターが開発されたが，ベクターの生産性が低い【方 法】

ことやhelperAdの混入などの問題から，臨床応用へは問題が残されているか．一方，アデノ随伴ウイルス（血1．トランスジェニック〝1血マウスの作製と解析

associatedviruS，AAV）ベクターは，成熟骨格筋への導

骨格筋で導入遺伝子の高発現を得るために，CAGプ

入効率が高く，導入遺伝子の安定した長期発現を与える．

ロモーター9）の下流にマイクロ・ジストロフィンcDNA

しかしながら，組み込み可能なサイズに4．9 kb以下とを挿入した発現カセットを作製した．これをC57BL／6

制限があることから，AAVベクターを用いたDMDにマウスの胚に注入し，F。マウスを作出した．導入遺伝

対する遺伝子治療法を開発するためには，機能的な小子陽性のF。雄マウスをジストロフィンが欠損した雌の型のジストロフィン遺伝子が必要となる．

仇血マウスと交配し，全長型ジストロフィンを欠きマイジストロフィンの4つの機能ドメインのうち，ロッド・

クロ・ジストロフィンのみを発現するTg〝1血Flマウス

ドメインは，N末端のアクチン結合ドメインとシステを得た．5週および10週齢のTg〝血マウスから前脛骨

イン・リッチ及びC末端ドメイン間のスペーサーとし筋（m）と横隔膜を単離し，凍結標本を作製した．また，ての機能を持つと考えられる3）．ごく軽症のBecker型

血清クレアチンキナーゼ（CK）値を測定すると共に，

筋ジストロフィーの患者からクローニングされた6．4kb

横隔膜を用いて張力測定を行った．対照群としては，のミニ・ジストロフィン

正常C57BL／10（BlO）マウスおよび同腹の導入遺伝子

cDNAは，ロッド・ドメイン

陰性の∽血Flマウスを用いた．

が大きく欠損していたが，ミニ・ジストロフィンを発現するトランスジェニック（Tg）∽血マウスにおいて，2．AAVベクターの作製

表現型を著しく改善させた4）5）．
このミニ・ジストロフィンを基に，我々は，更にロUbiquitousな発現が可能なCMVプロモーターまたはッド・ドメインを短縮したマイクロ・ジストロフィン

筋特異的な短縮型のmusclecreatinekinase（MCK）プロ

遺伝子を構築し，第一世代Adベクターを用いて椚血骨モーターの下流でβ一galactosidase（β一gal）またはマイク格筋に導入した6）．その結果，ロッド・リピートを1個

ロ・ジストロフィンを発現する2型AAVベクター，

以上持つマイクロ・ジストロフィンは効果的に発現し，

AAV−CMVLacZ，AAV−MCKLacZ，AAV−MCKACSlを作筋形質膜に局在することが示された．しかし，Adベク

製した．短縮型MCKプロモーターは，マウスMCK遺＊国立精神・神経センター 神経研究所 遺伝子疾患治療研究部−14−

伝子の発現調節領域から筋特異的な活性を与えるエン

いて検出した．ジストロフィン染色は，抗ジストロフ

ハンサー領域（200bp）とコア・プロモーター領域（約ィン抗体NCL−DYSB（Novocastra）とM．0，M．kit（Vector

360bp）を取り出し，構築した10）．AAVベクターの組

Laboratory）を用いて検出後，DABで発色させた．或は，

み換えにあたっては，Pittsburgh大学Xiao博士との共同

Alexa488−1abeledanti−mOuSeIgG（H＋L）（MolecularPrObes）

研究により，adenoviruS−freeのplasmidco−tranSftction法

を用いて一次抗体を検出した．同時に，ヘマトキシリを用いて作製した11）．csclによる密度勾配超遠心法により濃縮・精製した後，ドットプロット法によりウインまたはTOT0−3（MolercularPrObe）を用いて核を共染した．（4）画像解析：CCDカメラを用いて顕微鏡画像

ルスカ価（vectorgenome，Vg）を測定した．

を取り込んだ後，仝横断面における中心核および辺緑核線維数と，ジストロフィン陽性および陰性線維数を3．骨格筋へのAAVベクターの導入測定した．問質面積および筋線維横断面積（Cross

10日齢または5週齢のBlOまたは椚血マウスのTA

SeCtionarea）の計測は，画像解析ソフトImageproplus
TM（MediaCybemetics）を用いた．

筋に，それぞれ15Pl（7．5×1010vg）または5伸1（2．5−5．0×1011vg）のAAVベクターを直接注射した．AAV−
CMVLacZとAAV−MCKLacZの導入では，1，2，4，8過後【結 果】に解析を行った．一方，AAV−MCKACSlの導入では，

1．トランスジェニックm血マウスを用いたマイクロ・

導入8，24週後にTA筋を採取し，張力測定後，凍結標

ジストロフィンの機能解析本を作製した．対照群として，同週齢のBlOTA筋およ

小型で機能的なマイクロ・ジストロフィン遺伝子をび非導入例の肋血TA筋を用いた．

同定するために，ヒトミニ・ジストロフィンcDNA（6．4kb）を基に，ロッド・リピートをそれぞれ4，3，1個持

4．骨格筋の解析

つ3種類のロッド短縮型micro−dystrophinCSl（4．9kb），（1）張力測定：埼玉医科大学池本隆昭博士との共同

AX11（4．4kb），M3（3．7kb）cDNAを作製した（図1）．

研究により確立した方法を用いて，強縮時の最大張力

これらのロッド・ドメインはトリプル・ヘリックス構を測定し，単位面積あたりの筋張力を算出した7）．（2）造を維持するように再構築した12）．

組織化学染色：凍結標本から横断切片（10岬−）を作製

マイクロ・ジストロフィンの筋変性に対する保護効

し，H＆E染色，またはX−Gal染色，Masson−Trichrome

果を検討するために，マイクロ・ジストロフィンを発染色を行った．（3）免疫組織化学染色：6いmの凍結切現するTg〝血マウスを作製した．免疫組織化学的染色片を作製し，アセトン固定後，免疫染色を行った．内では，3種ともマイクロ・ジストロフィンは形質膜に因性のマウスIgGはFITC−COrtiugatedF（ab，）2fragmentof

局在し，さらにジストロフィン結合蛋白質の形質膜でgoatanti−mOuSeIgG（H＋L）（LeincoTeclm010gies）を用の発現を回復させた（datanotshown）．次に，マイクロ・furHengthdystrophin

roddomainmini−dystrophin

EZZaactin・bindingdomain

micro・dystrophin
4．9 kb

4．4 kb団 hinge
O rodrepeat

E】cysteine−richdomain
C−terminaIdomain

図1

マイクロ・ジストロフィンcDNAの構築

全長型ジストロフィン（cDNA14kb）は，N末端よりアクチン結合ドメイン，ロッド・ドメイン，システイン・T）ッチ・ドメイン，
C末端ドメインの4つの機能ドメインから構成される．ロッド・ドメインは，24個のロットリピートと4個のヒンジから成る．ご
く軽症のベッカー型筋ジストロフィー患者からクローニングされたミニ・ジストロフィン（cDNA6．4kb）のロッド・ドメインを更に短縮し，ロッド・リピートを4，3，1個持つマイクロ・ジストロフィンCSl（4．9kb），AXll（4．4kb），M3（3．7kb）cDNAを構築した．

一15−

ジストロフィンの機能を評価するために，骨格筋病理像，の賦活化を軽減するために，筋特異的なMCKプロモー

中心核線維数，血清CK値，電気生理学的な筋張力発生

ターを用いた遺伝子導入の効果を検討した．AAV−を指標として，各Tg〝通マウスの解析を行った（図2）．

MCKLacZをmdx骨格筋へ導入したところ，CMVプロ

その結果，5週齢と10週齢に共通して，マイクロ・ジ

モーターに比べβ−galの長期発現が認められ，導入4週

ストロフィンCSlは椚drマウスで認められる筋ジスト

後の椚血骨格筋では細胞浸潤も軽減し，免疫応答の航

ロフィーの表現型を著しく改善させた．csl−Tg〝7血マ活化も抑制されていた（図3下段）．

ウスでは，組織学的にも筋変性はほとんど認められず，
中心核線維数や血清CKも正常BlOマウスと有意差はな

3．AAVベクターを用いたマイクロ・ジストロフィン

かった．また，機能的にも筋張力産生は正常レベルま遺伝子の導入による治療効果の検討で回復していた．一方，AXll，M3はロッド・リピート

AAVベクターへの挿入可能サイズは4．9kb以下であ数に比例して表現型が改善していたが，正常レベルにることから，CSIcDNA（4．9kb）の5，，3，非翻訳領域とは及ばなかった．

altemative splicingを受けるexon71−79を欠失させた3．8kbのACSl遺伝子を作製した（図4A）．これを，短縮型

2．AAVベクターを用いた椚血骨格筋への遺伝子導入

MCKプロモーターの下流に連結し，治療用ベクター

AAVベクターによる骨格筋での導入発現効率を検討

AAV−MCKACSlを作製した．AAVベクターによる治療するために，AAV−CMVLacZをBlOおよびmdx骨格筋効果を検討するために，筋変性開始前の10日齢，あるへ導入した．その結果，BlO骨格筋では，β−galの発現は8週後まで維持されたのに対し，椚血骨格筋では，4いは変性・再生の過程である5週齢の∽血骨格筋へ導入を行った．

週後，β−gal発現は急速に低下した．導入4週後の椚血

5週齢へ導入した場合，8，24週の長期に渡って，40骨格筋では，β一gal陽性線経の周辺にCD4，CD8陽性細〜50％の筋線椎で△CSlの発現が認められた（図4B，C）．

胞を含む強い細胞浸潤が認められ，IgGの沈着が多量に検出された（図3上段）．m血骨格筋における免疫応答

形態学的に解析したところ，AAV導入肋血骨格筋では
中心核線椎の割合が減少し，とりわけ△CSl陽性線経でmdk CSl−Tgmdk AXll−TgJm加

4

4

5

6

transgenic

4

4

4

10

mdk BlO CSIAXll M3

mdk

transgenic

∩

0
0

5

0
0
2

0

3

BlO CSIAXll M3

D ︵篭＼ZさのULOI U扁l￠10琶乳S

C ︵﹂∋000L⁝害■岩∈⊃LUS

0

式辞︶ 4

B SLむq荘Pq扇面一〇⊃u・OLluUU

80

7

5

4

3

mdk BlO CSIAXll M3

mdk

transgenic

14

n

mdk

mdk

図2 マイクロ・ジストロフィンを発現するトランスジェニック（T9）m血マウスの解析
5週齢のBlOマウス，mdxマウス，CSl一，AXl1−，M3−Tgmdxマウスの解析結果を示す．（A）前脛骨筋の組織像（H＆E染色，Bar＝50
匹1）．（B）前脛骨筋における中心核線経の割合．（C）血清クレアチン・キナーゼ（CK）値．（D）横隔膜における単位面積あたりの筋
張力産生能．

−16−

NUd﹂＞≡U・＞くく NU巾﹂ゞU≡−＞くく

X−Gal

lgG

図3 筋特異的プロモーターを用いたm血骨格筋への遺伝子導入
5週齢mdxマウスの前脛骨筋にAAV−CMVLacZまたはA，W−MCKLacZを導入し，4週後に解析を行った．（左列）H＆E
染色・（中列）x−Gal染色・（右列）MouseIgGの免疫組織染色（Inset：対側の非導入筋，Bar＝100um）．上段のAjW−
CMVLacZ導入筋では，β−gal陽性線経の周辺に細胞浸潤の集族が認められ，問質および筋線維内にIgGの沈着が検出された・一方，下段のAAV−MCKLacZ導入筋では，細胞浸潤は乏しく，IgGの沈着も検出されなかった．

A E71−78

muscle−SPeCifictruncatedMCKpromoter

Enhancer Corepromoter

AAV−MCKACSl

CSI cDNA
5㌧UTR

4．9 kbACSI cDNA
3．8 kbMCKpromoter

C

TIUl

自UOnH二日0 0

0 △ U

T−OT⊥

0 8 0

∞ 80 60 40 20 0

W
4
2

W
8

︵芭sLむq荘警芝のOd・S＞凸

＋

★

E
80
60
40
20

︵邑sLむqこ聖一扇Od・S＞凸

00

8W

24W

図4 治療用AAVベクターのm血骨格筋への遺伝子導入（A）治療用AAVベクターの作製：CSIcDNA（4．9kb）の5，，3，非翻訳領域（URT）とexon71−78を削除し，3．8kbの△CSIcDNAを構築した・これを，MCKプロモーターの下流に連結し，AAV−MCK△CSlを作製した．（B−E）5週齢または10
日齢のmdxマウスの前脛骨筋へAAV−MCK△CSlを導入し，8週，24週後の△CSlの発現と組織像を調べた．（B，D）導入24
週後のジストロフィンの免疫組織染色像とH＆E染色像（Bar＝50pm）．（C，E）△CSl陽性線経の割合．（B，C）5週齢への導入：ACSl陽性線経は広範囲に存在し，平均で8週後39．2％，24週後51．5％であった．また，△CSl陽性線経には中心核（＋）と辺縁核（＊）が混在していた．（D，E）10日齢への導入：△CSl陽性線経は5週齢に比べ少なく，8週後22．8，24週後
16・5％であった．しかし，ほとんどの△CSl陽性線経が辺縁核（＊）を呈した．
−17−

低かった（図5A）．さらに，筋病変を表す筋重量や筋AAVベクター導入後の∽血骨格筋を解析したところ，

張力産生は正常BlOマウスのレベルまで改善していた（図筋重量と筋張力の間に正の相関が認められ，筋重量増5B）．一方，10日齢への導入では，△CSl陽性線椎の比加に伴い張力産生能が改善していた（図6A）．さらに，率は5週齢での導入に比べ低く，約20％であった個4D，筋肥大には結合織（問質面積）の増加が関与していな

E）．治療効果を解析したところ，△CSl陽性線経におかったことから，筋線経の肥大（真性肥大）が示唆さ

ける中心核数は著しく減少していた（図5C）．興味深れた（図6B）．そこで，個々の筋線経について横断面

いことに，△CSl陽性線椎は少なかったにも拘わらず，積を計測したところ，AAV導入m血骨格筋の△CSl陽

筋張力は正常レベルまで回復していた（図5D）．しかし，性線経では，平均筋線維横断面積がBlOおよびm血，△筋重量においては，有意な改善は認められなかった（dabCSl陰性線椎に比べ著しく肥大していた（図6C）．ヒnotshown）．

ストグラム解析を行ったところ，∽血や△CSl陰性のマイクロ・ジストロフィンの発現量が機能回復にど仙血線経は小径への偏倍が確認されたが，△CSl陽性ののように貢献するかを検討するために，△CSl陽性線経

仙血線経では小径線椎が減少し，むしろ正常Bl0線維は少ないが筋張力の改善が認められた10日齢への導入

以上に大径線経の割合が増加していた（datanotshown）．

について解析を行った（図6）．筋張力回復の視点から

B

A

★★
1

★

★★
11

★★
日

「＃1「★l■0

BL0−0モ空20篭邑S

0︵N∈∈︑Z∈︶

000 80 60 40 20 0

︵邑sLOqG Pのl詔一〇コu・21UUO★★

11

BlO ACSI ACSl mdx

114

BlO AAV−
injected（＋）（−）nmdx

m血AAV−injected mdk

D

C

★★

l

H

★★
￣

★

★★
ll

l

l

＃rr一一五「

0

80

0

60
40

︵N∈∈＼Z∈︶

0

0

4
0
1
B

BlO ACSI ACSl mcb（（＋）（−）

AAV−injected m血

7番

20

0

の0﹂0−0で虚空0≡0乳S∞︵邑sLむqG P叫扇面一〇⊃u・OL≡OU

★★

7

n

m血

図5 治療用AAVベクター導入後のm血骨格筋における治療効果
5週齢または10日齢のmdrマウスの前脛骨筋へAAV−MCK△CSlを導入し，24週後に中心核線経の割合（A，C）と筋張力（B，D）を測定した．（A，B）5過齢への導入（C，D）10日齢への導入（＊：P＜0．05，＊＊‥P＜0．01，＃‥N・S・）

ー18−

の

0
0

0

0

0

50

60

70

Muscleweight（mg）

55

65

75

（
±SEM）

0

0
5

0

0

U

★★

0
0

0

q）

★★
一

0
5

0

♂

00b＞0・05）

0
0︵芭聖旧断臣0（Pく0．05）

C ︵N∈ま︶謡LqUO苛むSSSOJO

0

A ︵N∈∈＼Z∈︶00﹂0−0≡0乳S

r＝−0．596
r＝0．779

★★
∫

0

qL
γ

Muscleweight（mg）

」
5877

1525

6347

9674

n

BlO ACSI ACSl mcb（（＋）（−）

AAV−injected mdx

図610日齢で導入したm血骨格筋の形態学的解析
10日齢でAAV−MCK△CSlを導入した24週後のmdxマウスの前脛骨筋における治療効果と筋線維肥大の関係について解析した・（A）筋張力と筋重量の相関．（B）問質面積と筋重量の相関．（C）筋線経の横断面積（＊＊：p＜0．01，＃‥N．S．）．

【考 察】

gal発現は維持されていた．

1．マイクロ・ジストロフィンの機能

3．治療用AAVベクターを用いた肌血骨格筋における

マイクロ・ジストロフィンを発現するTg′乃血マウス

治療効果を作製し，形態学的および機能的に評価したところ，
ロッド・リピート数に依存して表現型（変性・再生像，

AAV−MCK△CSlを変性発症前および変性過程のmdi

中心核線経の割合，CK値，筋収縮力）の改善が認めら骨格筋に導入したところ，いずれの時期においても治れた．これは，ロッド構造，特にロッド・リピート数

療効果が認められた．また，CSlを更に短縮した△CSlは，がマイクロ・ジストロフィンの機能にとって重要であ筋変性に対する防御効果および生理学的機能を充分にることを示唆した．特に，CSlは正常レベルと同等の維持していることが示唆された．5週齢での導入では，改善効果を示した．これは，少なくともロッド・リピ

約50％の筋線経に△CSlの発現が得られ，発症後の治ート4個とヒンジ3個は，筋収縮による機械的ストレ療によって機能および病態が回復することを示した．

スに対してマイクロ・ジストロフィン分子にflexibility

また，発症前の10日齢の導入では，約20％の筋線経へを与え，形質膜の安定性を向上させると考えられる．

の発現でも機能的な改善が認められ，△CSl陽性線経の代償的な肥大により筋張力が改善することが示唆された．

2．AAVベクターを用いた骨格筋への効果的な遺伝子

これは，DMD筋では膜機能が残存する筋線経の肥大が里を機能低下に対応していることからも支持される14）．

AAVベクターを用いたm血骨格筋への遺伝子導入にジストロフィンの発現と機能回復についての示唆が，おいて，ubiquitousなCMVプロモーターは導入遺伝子
産物に対する強い免疫応答を誘導し，導入4週後に遺これまでDMDキャリアやTg〝血マウスの研究から得られている．これらの結果では，ジストロフィン蛋白

伝子発現を急速に低下させた．これは，AAVベクター

量は表現型にはあまり影響を及ぼさず，むしろジストが感染した抗原提示細胞内で導入遺伝子産物の産生がロフィン陽性線維数が表現型の改善にとって重要な因起こり，細胞障害性T細胞が活性化されるためと考え子であると考えられてきた．例えば，機能回復が認められる14）．その背景に，dystrophicなmdx骨格筋ではられたminiTdystrophinTgmdxマウスでは，蛋白量は20−

Dendritic cellやMacrophageなどの抗原提示細胞が多数30％であったが，発現線維数は半数程度であった4）5）．

存在し，AAVベクター導入後の免疫応答を増強するこ

本研究は，更に少ない20％以下の陽性線雅致で機能がとが挙げられる8）．これに対しては，筋特異的なMCK回復することを示した．これは，今後の治療研究におプロモーターを使用することで導入効果の改善が認めいて，治療効果を得るための重要な指標を与えるもの

られた．結果は示さなかったが，BlOマウスを用いて同と考えられる．

様に検討したところ，AAV−CMVLacZの導入では12週

4．今後の検討課題

以降にβ一gal発現が減少する傾向にあったが，MCKプ
ロモーターを用いた場合では導入1年7ケ月後でもβ−DMDに対する治療研究では，これまで小型の仇血マー19−

ウスが用いられてきたが，軽症で進行性は目立たない．

cDNAs．FEβ∫エgrf425，329−36，1998．

そこで，ヒトへ応用するためには，重症で進行性の経

7）Sakamoto M，Yuasa K，Yoshimura M，et al：Micro−

過を辿る大型の筋ジストロフィー犬15）を用いた臨床前dystrophin cDNA ameliorates dystrophic phenotypes試験が必要となる．AAVベクターを用いたイヌ骨格筋

whenintroducedintomdxmiceasatransgene．Biochem

への遺伝子導入について検討を行ったところ，マウス

βf呼んγ∫Re∫COmmI仇293：1265−72，2002・とは大きく異なり，高い導入発現効果が得られていない．

8）YuasaK，SakamotoM，Miyagoe−SuzukiY，etal：Adeno−

AAVベクターを導入したイヌ骨格筋では，導入初期か

associated viruS VeCtOr−mediated gene transferinto

ら免疫応答を伴った強い細胞浸潤が観察されたことから，

dystrophin−deficient skeletalmuscles evokes enhanced

今後は免疫応答の機序を詳細に解明することがヒトへ

immune response agalnSt the transgene product・Geneの応用を考えるうえで重要と考えられる．更に，導入

乃er9：1576−88，2002．

発現効率を改善するために，免疫抑制剤の併用や異な

9）NiwaH，Yamamura

K，MiyazakiJ，et

al＝EfficientるserotypeのAAVベクターによる導入についても検討

selection forhigh−eXPreSSion transfectantS Witha novel

していく必要がある．

eukaryoticvector．Gene108：193−199，1991・
10）ShieldMA，HaugenHS，CleggCH，etal：E−boxsitesand【結 論】

aproximalregulatoryreglOnOfthemusclecreatinekinase

我々は，AAVベクターを用いたDMDに対する遺伝

genedifferentiallyregulateexpressionindiverseskeletal

子治療法の確立を試みた．

musclesandcardiacmuscleoftransgenicmice．MoICell（1）マイクロ・ジストロフィンの機能をTg〝血マウス

βわJl ：5058−68，1996．

11）Xiao X，LiJ，SamulskiRJ：Production ofhigh−titer

を用いて検証したところ，ロッド・リピート4個

recombinantadeno−aSSOCiatedviruSVeCtOrSintheabsenceを持つCSlが最も効果的であった．
（2）AAVベクターを用いた仙血骨格筋への遺伝子導入

Ofhelperadenoviru．JⅥ1V172：2224−2232，1998・

では，筋特異的な短縮型MCKプロモーターの利用

12）KoenigM，KunkelLM：Detai1edanalysisoftherepeatが有効であった．

domain of dystrophin reveals four potential hinge（3）AAVベクターを用いてマイクロ・ジストロフィン

SegmentSthatmay conferflexibility・JBioIChem265：△CSlを∽血骨格筋へ導入したところ，筋変性に4560−66，1998．

対する保護効果と筋張力産生の改善効果が認めら

13）Zhang Y Chirmule N，Gao GP，et al：CD401igand−れた．

dependent activation of cytotoxic Tlymphocytes byadenoTaSSOCiated viruS VeCtOrSin vivo：rOle ofimmature【参考文献】

dendriticcells．JlalVl74：8003−10，2000．

14）ZamitPS，PartridgeTA：Sizingupmusculardystrophy・

1）EmeryAEH：Duchenne musculardystrophy，2nd edn・〃dJ〟edS：1355−6，2002．

OxfordUniversityPress，Oxford，1993・
2）TbkedaS，Miyagoe−SuzukiY：Genetherapyfbrmuscular15）ShimatsuY，KatagiriK，FurutaT，etal：CanineX−1inked

dystrophies：CurrentStatuSandfutureprospects・BioDrugs

musculardystrophyinJapan（CXMDJ）．ExpAnim52：93−

15：635−644，2001．

97，2003．

3）BrownSC，LucyJA：Dystrophin．Gene，PrOteinandcell
biology，CambridgeUniversityPress，Oxford，1997・
4）Wells DJ，Wells KE，Asante EA，et al：Expression ofhumanfu11−1engthandminidystrophinintransgenicmdx
mice：implicationsforgenetherapyofDuchennemuscular
dystrophy．肋mMoIGenet4：1245−1250，1995・
5）PhelpsSF，HauserMA，ColeNM，etal：Expressionoffu1l−
lengthandtrunCateddystrophinmln1−geneSintranSgenic
mdxI血ce．〃〟∽〟oJGe〃gr4：1251−8，1995．
6）1血asa K，Miyagoe Y，1bmamoto K，et al：Effective
restorationofdystrophin−aSSOCiated proteinsin vivo byadenovirus一mediatedtransferoftruncateddystrophin

ー20−代謝性筋疾患に対する分子治療の基盤研究
辻

野

精

一＊

研究協力者 水上浩明榊，小澤敬也＊＊，NinaRaben榊【緒 論】

組織の遺伝子導入効率が異なることが知られるように

Acidmaltase（AM）はライソゾーム酵素でグリコーなってきたため，今回，異なる血清型のAAVベクター

ゲンを加水分解しグルコースを生成する．遺伝性代謝によるAMTKOマウスへのAM遺伝子導入効率を比較検性筋疾患の一つであるacidmaltase欠損症（AMD）は討し，その結果に基づき，5型AAVベクターを用いた

分解されないグリコーゲンがライソゾームに蓄積し組長期的AM遺伝子発現を観察した．

織を障害する．臨床的に発症時期により乳児型，若年型，成人型の3型に分類され，若年型と成人型は症状がほ【対象と方法】

ぼ骨格筋に限局するが，乳児型は呼吸筋，心筋が強く

1）AM−KOマウス及び線維芽細胞

侵され早期に死に至る重篤な病態である1）．しかしなが使用したAM−KOマウスはそのAM遺伝子のエクソン

ら現在有効な治療法はない．欧米では酵素補充療法の6をネオマイシン耐性遺伝子で置換することにより作

臨床治験が行われており一定の効果が報告されている

製された3）4）．このマウスにおいてグリコーゲンの蓄積が1回投与の効果は持続せず投与を繰り返し継続するは生下時より認められるが，臨床的にはヒトの乳児型必要があり，将来的に遺伝子治療も期待される．我々は，のような表現型をとらず，成獣になっても動作の緩慢

筋への高効率な遺伝子導入を可能とするアデノウイル

はあるものの明かな心肥大や肝肥大を認めず生殖も正スベクター及びアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター

常と同様である．しかしながら7−8月齢で著明なミオパを用いた遺伝子治療の効果を動物モデルにおいて検討

チ一，すなわち後脚が開き走行ができなくなり，傍脊してきた．自然発生AMDウズラを動物モデルとして用柱筋の異常によると考えられる脊柱の後考などを生じる．

い，ヒトAMを発現する組換えアデノウイルスの筋局

線維芽細胞はその皮膚より培養した．

所的効果を報告した2）のに引き続き，AMノックアウト（KO）マウス3）4）を用いて検討を行ってきた．アデノウ

2）AAVベクター

イルスベクターでは心艦内投与で肝にAMを大量に発ヒトAM cDNA挿入ベクタープラスミド，AAV遺伝

現させることが可能で，肝で発現したAMは主に前駆子発現プラスミド，アデノウイルス遺伝子発現プラス蛋白として分泌され血液を介し全身に及び，筋細胞なミドをリン酸カルシウム法を用いて293細胞に同時にどで取り込まれライソゾーム中で活性型AMにプロセ

トランスフェクションし作製した（AAV−AM）．cMVスされるといった過程を経て全身に効果を及ぼした．

プロモーターによりMが発現される構築となっている．

しかしベクター自体の問題点である免疫原性のため長塩化セシウム溶液による濃度勾配法を用い2回精製し，期の効果は望めず，臨床症状の改善には至らなかった．

定量的ドットプロットを用いてウイルス量を決定した．

アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターは非分裂細胞

2型（AAV2−AM），3型（AAV3−AM），5型（AAV5−AM）の3種の血清型のAAVベクターを作成した．

への遺伝子導入効率に優れ，かつ免疫原性が低く野生型ウイルスでさえ病原性がないという点から遺伝子治3）AAVベクターのわvfvo投与療に用いるベクターとして期待されている．当初，広6週齢のAM−KOマウスの前脛骨筋内に各血清型

く研究に用いられていた血清型2型のAAVベクターでは，少なくとも我々の用いているAM−KOマウスのストレイ

AAV−LacZまたはAAV5−AMを2．3Ⅹ10日particles注射した．

ンでは心腔内投与による肝での発現も筋肉内投与によ注射位置マーカーとしての墨を混注した．AAV5−AMにる筋局所的発現も非常に弱く，効果を示すことができ関しては，前，2週後，5週後，9週後，6ケ月後に各3なかった．最近，AAVベクターの血清型により生物種，匹ずつ解剖し注射側，村側の前脛骨筋，肝，心筋を採＊国立精神・神経センター神経研究所疾病研究第五部＊＊自治医科大学分子病態治療研究センター遺伝子治療研究部＊＊＊米国NIH

−21−

取した．

2）LacZをマーカーとした各血清型AAVベクターのAM−KOマウス前脛骨筋への遺伝子導入効率の比較．

4）AM活性とグリコーゲン含量の測定

AAV5＿LacZとAAV3−LacZはAAV2−LacZに比べ明らかに遺伝子の導入発現効率が良かった（図2）．

培養細胞または凍結組織標本をホモジナイズし4−
MUGを基質とLAM活性を測定した．またグリコーゲンは完全に加水分解した後，グルコース量として定量

3）血清型5型AAVベクター（AAV5−AM）によるした．

AMKOマウスinvivo遺伝子導入．

AAV5−AMを注射したAM−KOマウスの前脛骨筋では2週後にはAM活性は正常値以上に上昇しグリコーゲン

5）組織染色量は低下した．5および9週後には正常値程度のAM活

組織をクライオスタットを用い10匹1切片とし，PAS性を維持しグリコーゲン量の軽減も続いていた6ケ月後，染色またはβ−galactosidase染色を行った．

M活性は再び上昇する傾向を認め，1個体では著増した．
それに伴いグリコーゲン量も再び低下する傾向を認め

6）Westemblot解析
凍結組織標本のホモジネートをSDS−7．5％ポリアクリ

た（図3，図4）．pAS染色（図5）とWestemblot（図ルアミドゲルに電気泳動しニトロセルロース膜にプロ6）でも生化学的解析結果と一致する結果を得たが，ット後抗ヒトAM抗体と反応させた．

PAS染色では5週以降，筋線経によってグリコーゲン
が再び蓄積する線経と，持続して蓄積が改善している【結 果】

線経があることが示された．注射していない側の前脛1）各血清型AAVベクターによるAM−KOマウス線維

骨筋，及び心筋，肝には明らかな効果は認められなかった．

芽細胞への遺伝子導入．

AM−KOマウスの線椎芽細胞に対するAM遺伝子の導入発現効率はAAV5TAMとAAV3−AM

がAAV2−AMに【考 察】

比べ明らかに効率が良かった．さらにAAV5−AMは以前，我々は従来広く用いられてきたAAV2ベクタ

AAV3−AMよりもやや効率が良い傾向が見られた（図1）．

ーでは，少なくともこのAM−KOマウスのストレイン（C57BL／6x129／Sv）では線維芽細胞及び筋組織で遺伝
子導入発現効率が非常に低いことを報告した．しかし︿D∈＼﹂至OEu︶ゝlち竜田翳空再∈P．でく∩

AAVベクターはその血清型によって動物種や標的臓器での効率が異なることが知られるところとなり，今回，他の血清型AAV5およびAAV3ベクターをAAV2ベク
ターと比較した．AM−KOマウスの培養皮膚線維芽細胞∩

及びin vivo筋組織では，AAV2ベクターに比べAAV5
およびAAV3の遺伝子導入発現効率が高く，これらの使用は遺伝子治療研究に有用と思われた．

AAV2

AAV3

次にAAV5−AMをAM−KOマウスの前脛骨筋に注射しAAV5たところ少なくとも6ケ月に渡り，酵素活性の上昇の

AAVserotypes−AM区＝AAV2−AM，AAV3−AM，AAV5−AMを感染した1週間後のAM−KOマウス由来培養皮膚線維芽細胞のAM活性．

AAV2−LacZ

AAV3−LacZ

AAV5−LacZ

図2 AAV2−LacZ，AAV3−LacZ，AAV5−LacZをAM−KOマウスの前脛骨軌こ注射し1週間後のβ−galactosidase染色・
−22−

図3

図4

AAV5−AMを注射したAM−KOマウス前脛骨筋のAM活性．
丸は個々の値で平均を棒グラフで示した．

図5

−23−

AAV5−AMを注射したAM−KOマウス前脛骨筋のグリコーゲン含量．丸は個々の値で平均を棒グラフで示した．

AAV5−AMを注射したAM−KOマウス前脛骨筋のPAS染色．
黒い粒子はマーカーとして混注した墨が残留している．
NT：処置なし．

Non−treated

2W

5W

9W

−119kDa

図6

■

95kDa

−

760r70kDa

AAV5−AMを注射したAM−KOマウス前脛骨筋の抗ヒトAM抗体を用いたWestern bl0t解析．AMは119kDaの前駆蛋白から
75，76，70kDaの活性型にプロセスされることが知られている．

持続，及び蓄積するグリコーゲンの軽減を認め，長期

少なくともこのAM−KOマウスのストレインでは線的効果を示すことができたと考えられた．5週後，9週後と酵素活性は正常程度であったのが6ケ月後再び維芽細胞及び筋組織でAAV5およびAAV3の遺伝

2週後と同程度に上昇したのは，AAVベクターがある

有用と思われた．

子導入発現効率が遥かに高く，遺伝子治療研究に

程度染色体に組み込まれ安定して遺伝子を発現できるようになったことが理由である可能性も考えられた．

2）AAV5−AMのAM−KOマウス個体筋肉内投与は6ケしかし注射していない側の前脛骨筋や心筋，肝では月までの長期に渡り効果を及ぼし続けることを示

酵素活性は上昇せず，全身的効果を及ぼすことはできしたが，全身的効果を及ぼすには至らなかった．

なかった．アデノウイルスの場合，心腔内注射すると肝でAMが強く発現し主に前駆蛋白として分泌され血【文 献】

液を介し全身に及び，筋細胞などで取り込まれリソソ

1）DiMauro S，Servidei S，Tsltiino S：Disorders ofーム中で活性型AMにプロセスされるといった過程を

Carbohydratemetabolism：Glycogenstoragediseases．In

経て全身に効果を及ぼしたが，CMVプロモーターAAV

ThemolecularandgeneticbasisofneurologlCaldisease

ベクターの場合は心腔内投与しても肝でAMが大量発（editedbyRosenbergRN，PruSinerSB，DiMauroS，et

現することはなかった．

al），2nded，ButterworthqHeinemann，Boston，1067−97，

同じライソゾーム病であるFabry病の遺伝子治療研究

1997．

では筋にAAVベクターで遺伝子導入すると，そこから

2）TsltiinoS，KinoshitaS，TashiroT，etal：AdenoviruS−酵素（α−galactosidase）が分泌され全身的効果を示した

mediatedtransferofhumanacidmaltase genereducesという報告がある．この差異の理由としては酵素蛋白

glycogen accumulationinskeletalmuscleofJapaneseにより筋細胞からの分泌が異なる可能性があると考えられた．

quailwithacidmaltasedeficiency．Hum Gene Ther9：1609−16，1998．

しかし本疾患では正常の20％程度の酵素活性があれ

3）RabenN，NagarajuK，LeeE，etal‥TargeteddisruPtion

ば発症しないことが知られており，その程度の酵素を

Oftheacida−glucosidasegeneinmicecausesanillness

全身の筋に供給することによってすでに出現しているWith criticalfeatures ofbothinfantile and adulthuman

症状も回復する可能性がある．このような意味では本glycogen storage disease typeII・JBioIChem273：

疾患のような代謝性疾患は遺伝子治療の実用の可能性

19086−92，1998．

が比較的高いと考えられ今後とも研究を続けることの

4）Raben

意義は大きいと思われる．

N，Nagaraju

K，Lee

E，et

al＝Modulationof

diseaseseventylnmicewithtargeteddisruPtlOnOfthe
acid〔1−glucosidasegene．NeuYVmuSCulDisofdlO：283−【結 論】

91，2000．

1）従来広く用いられてきたAAV2ベクターに比べ，→24−非ウイルスベクターを用いた骨格筋への遺伝子導入
及び発現法の開発に関する研究
金 田 安 史＊【緒 言】

した．遺伝子としてはCMVpromoterをもつluciferaseを最初の遺伝子治療臨床研究が，1990年に始められて用いた．

以来，現在，全世界で900以上の遺伝子治療プロトコ

次にNakedplasmidDNAにオプチゾン等の造影剤を混ールが提出され，試験的治療が行われている．期待は合し超音波を用いて遺伝子を導入する方法をマウスのされているが，現在行われている遺伝子治療はまだ医

胎仔期，成育期に応用し，できるかぎり広範囲の筋肉療の段階にあるものではなく，遺伝子医薬品を開発す

内へ遺伝子導入できる条件を検討した．

るための試験的な医療であり，安全性と一部有効性を

2．遺伝子発現の増強，維持に関する研究

評価することから始められている．いくつかの有効例
が最近報告されているが，全般的にはまだ目立った成遺伝子発現の増強法としてRNA増幅可能なSFV

果は上がっていない．特に全身性の筋疾患はもっとも

replicasevectorによる骨格筋での遺伝子発現増強研究をむずかしいターゲットの一つであろう．解決すべき課行った．

題はいかに広範囲の筋組織に遺伝子導入ができ，治療

遺伝子の長期発現のためにEpstein−BarrviruS（EBV）に十分な程度の発現レベルを保持できるかという点でのレプリコン装置を用いたレプリコンプラスミドを作あろう．

成した．これはEBVの0riP，EBNA−1の配列を挿入した

言うまでもなく遺伝子導入ベクターの開発は遺伝子

プラスミドで，CMVpromoterをもつluciferase遺伝子を治療の成功の鍵として注目されてきた．方法にはウイ含んでいる．これらをHVJ−liposomeでマウス前頚骨筋

ルスベクターと非ウイルスベクターがありそれぞれ開に導入し，1uciferase発現とサザンプロットを施行した．

発が進んでいるが，理想とする高効率・低侵襲ベクタ

EBのレプリコンベクターではEBNA−1は元来作成されー開発は実現されていない．

ていたプラスミド由来のプロモーター（Amp resistant

本研究においては遺伝性筋疾患の有効な分子治療法

gene中に含まれるプロモーター配列）によって制御さの確立をめざして骨格筋への有効な遺伝子導入法と効れているが，これをさらに強力なCMVpromoterに置き

果的な発現法の開発を行うことを目的とする．現状で換えたプラスミドを作成した．

は骨格筋は遺伝子導入が行いやすい組織ではあるにも関わらず，筋疾患の治療には十分な成果はあがってい以上，動物実験については大阪大学医学系研究科で定ない．そこで非ウイルスベクターの筋肉への導入効率

める動物実験のガイドラインを遵守した．

を増強できる方法を開発し∴できる限り広範囲の骨格筋に遺伝子発現を検討した．また導入遺伝子の発現に【結 果】も注目する必要があり，転写活性を増強Lかつ碓持するために必要なコンポーネントを取り入れた新たな発

1．Electroporation法
1uciferase遺伝子を前脛骨筋に導入して導入効率を検現系を開発を試みた．これらの方法を，マウスの胎仔期，討したところ，24時間後のLuciferaseタンパク産生量は成育期の筋肉内へ遺伝子導入と発現増強及び維持を評

マウスでそれぞれ170倍（plate電極，6pulses，50V，

価した．

100msec），またラットで800倍（100V，50msec）であった．また，LacZ遺伝子をマウス前脛骨筋に導入して【方 法】

導入範囲を検討したところ，3日日のⅩ−gal染色において

1．非ウイルスベクターによる骨格筋への遺伝子導入

全体の約半分にβ一galactosidase陽性細胞を認めた（図1）．

法の開発

2．骨格筋遺伝子導入への超音波造影法の応用

まず骨格筋にNakedDNAを注入し，電気パルスをか

1）NakedluciferaseplasmidDNAを8週令のマウスの骨けるエレクトロポレーション法の最適化の条件を検討

格筋に注入すると，20帽以上のDNAの注入によ＊大阪大学大学院医学系研究科

ー25−

NakedDNA法

Electroporation法
図1 ラット骨格筋でのLacZ遺伝子発現って約2週間にわたってルシフェラーゼの発現が束型超音波発生装置を開発し，その効果を調べた．

得られた．Naked DNAの遺伝子導入効率を増強す

現在のところ，lmlの遺伝子溶液（50％オプチゾるため超音波を併用したが，これだけでは安定しン200匹g DNA）を尾静脈から注入し，直後に骨格た発現増強がえられなかった．そこで造影剤のオ

筋に超音波を当てると骨格筋に遺伝子発現がおこることがわかった．

プチゾンをNaked DNA溶液と1：1で混合して骨格筋に注入後超音波をかけると約10倍以上の遺伝子

3．遺伝子発現増強法の開発

発現の増強が得られた．オプチゾン50−75％が最も導入には適していた1）．用いた超音波の条件は1

RMを増幅する方法による遺伝子発現の増強系として，

MHz，2．5W／cm2でlLlO分間照射すればほぼ同等導SFV replicase vectorを用いて，LacZ遺伝子発現を培養入効率が得られたので，最もダメージの少ない1細胞，骨格筋で検討した．BHK−21細胞ではSFV分間の照射を行うことにした．しかし遺伝子を導replicase vectorによるLacZ遺伝子発現はreplicaseを用

入5秒後に超音波処理を行うとこのような効率のいない場合の約10倍増強された．またマウス骨格筋でよい遺伝子発現が得られたが，超音波処理5秒後の発現はSFVreplicaseによってやはり約10倍増強された．

に遺伝子を注入すると発現は10％以下に低下した．
2）この超音波・造影剤法をマウス胎仔への遺伝子導入に用いた．妊娠13週のICRマウスの子宮内の胎4．遺伝子発現の維持法の開発

仔の羊水内にガラス微小管を用いて10匹1のNaked

1）EBVレプリコンプラスミド導入による筋肉内でのDNA／オプチゾン溶液を注入し，子宮外から超音波

ルシフェラーゼ遺伝子の発現レベルの推移を経時（4．OW／cm2の強度で2Hzの超音波を10秒間が最適

的にフォローした結果，EBレプリコンがあること条件であった）をかけて遺伝子発現をみた．ルシによって遺伝子発現が導入7日においても導入1

フェラーゼ遺伝子発現は主として胎仔の全身皮膚

日後の発現レベルよりも高く維持された．レプリに認められ，発現レベルはNaked DNAのみ，或い

コンがないと3日日をピークに低下した．サザン

はNakedDNA／超音波の約1000倍であった2）．GFP

プロットを行なって1uciferase遺伝子のコピー数の遺伝子発現も導入され，胎仔皮膚に点状に発現が比を比較したところ，導入3日，7日後でともに通見られた．蛍光オリゴの取り込みも同様であった．

常のプラスミドのコピー数が約3倍多かった．

羊水中ではなく，胸腔内に導入すると肺と横隔膜に，

2）培養細胞に導入した場合CMVpromoterでドライブ

腹腔内では腸，脳室内導入では脳室周囲に遺伝子されるEBNA−1は元来の弱いプロモーターでコン発現が認められた．発現は導入後から漸次低下しトロールされるEBNA−1と比較して約10倍のたが，生後1週間まで認められた．この手技によEBNA−1の発現増強を可能にした．これらのプラス

る胎仔生存率は50−70％であった．

ミドをマウス前頚骨筋に導入して1uciferase遺伝子3）血液中に遺伝子と造影剤を入れ，目的の組織に体発現を比較した．cMV−EBNA−1のものが，弱いプ

外から超音波を当てることにより物理的な標的遺ロモーターでドライブされるEBNA−1をもつ伝子導入を試みた．そのために東芝との共同で集

luciferase発現EBレプリコンベクターと比較して3−−26−

5倍であった．そこでluciferase遺伝子のコピー数

えば臨床応用も近いのではないかと考えられる．

をサザンプロットで解析したところ，両プラスミド間で有意な差を認めなかった．

【参考文献】
1）Taniyama Y，Tachibana K，Hiraoka K，et al：【考 察】Developmentofsafeandemcientnovelnonviralgene

1）エレクトロポーレーション法は骨格筋での遺伝子

tranSftruslng ultrasound；enl1anCement Oftransfection

発現の増強に適し，安全性の面からも他の内蔵よ

efnciency ofnaked plasmid DNAinskeletalmuscle．

りは骨格筋や皮膚等の直接外部からアプローチでGg乃e乃er！）：372−380，2002．

きる対象が臨床応用にも近いであろう．しかしヒ2）EndohM，Morishita，R，KanZakT，etal‥Fetalgene

トの場合に最適な条件をとることから始めなけれ

transftr byintra−uterine Shotgun Method（SGM）

ばならないと考えられる．大型動物での実験が必

uslng microbubble−enhanCedultrasound．Molnel・5：

要である．

501−505，2002．

超音波造影法による骨格筋での遺伝子発現増強

3）otomo T，Yamamoto S，Morishita R，et al：EBVは可能であるが，メカニズムとしてはmicrobubble

repliconvectorsystemenhanCeStranSgeneeXPreSSioninの破裂によるエネルギーによって細胞膜に微少なVivo：aPplicationstogenetherapyforcanCer．JGene

孔があいて遺伝子が注入されるようである．した〟gd3：345−352，2001．

がって細胞毒性があること，組織の表層のみの遺伝子導入にとどまることなどまだ改良されるべき技術である．胎仔への遺伝子導入は倫理的な問題がクリアーされねばならず，また現技術では生存率をほぼ100％にまで改善しないと実用的な技術ではない．しかし胎仔横隔膜への遺伝子導入が可能である点は有用性を認めてもよい．
2）sFVreplicasevectorは骨格筋における遺伝子発現増強には応用可能であるが，rePlicaseと下流の遺伝子の距離がかなり重要なポイントではないかと考えられるデータを得ている．今後の検討課題である．
3）EBVレプリコンの長期遺伝子発現は従来はoriPが核マトリックスに結合し，安定化されるためであろうと考えられてきた．しかし今回の実験ではEB
レプリコンを含まないプラスミドでも安定に（むしろコピー数が多く）核内に存在することがわかった．したがってEBレプリコンの遺伝子発現増強
作用は転写活性を高く維持できるようにクロマチン構造を変化させているのではないかということが示唆される．EBレプリコンをもたないと遺伝子が残っていても転写が不活性化されうると考えられる3）．この転写活性化はEBNA−1の発現量と相関しているようであり，EBNA−1がor汐に結合することによって転写が活性化できるような構造を維持されるのではないかと推測される．
【結 論】
まだ実用性には乏しいが，非ウイルスベクターによる筋肉組織への遺伝子導入・発現技術は着実に改良が重ねられており，今後大型動物での検討を克明に行な−27−

筋ジストロフィー治療を目指した
遺伝子デリバリー用DDSの開発
西 川 元 也＊
研究協力者 小林直樹＊，岡部貴幸＊，牧田一宏＊，橋田 充＊，高倉書信＊【緒 言】

DNA（pEGFP−F；4．8kbp）のCMVプロモータの開始点

筋肉は外来性遺伝子の発現が比較的容易であり，プからSV40pA末尾までをPCRにより増幅し，1．7kbpのラスミドDNAをはじめとする各種ベクターの注射によ

EGFP−F発現ユニット（EGFPFmini）を作成した（図1）．

り簡便に遺伝子発現を得ることができる．また，筋肉
EGFP−FcDNA

細胞は寿命が長いためアデノウイルスベクターなど特CMVに免疫原性の高いベクターを使わない限り遺伝子発現

SV40pA

PrOmOter

Reverseは長期間持続する傾向にある．このような特徴を有す

PrlmerForwardる筋肉細胞での遺伝子発現が対象となることから，筋Primerジストロフィーに対する遺伝子治療の可能性は高いと

PEGFP−F（4806bp）

考えられる．しかしながら，ベクターの筋肉注射による投与では遺伝子発現が投与部位近傍に限局されるため，細胞単位での機能回復が必要と考えられる筋ジストロ
フィーに対する治療効果はあまり期待できない．筋ジストロフィーに対する遺伝子治療を実現するためには，多数の筋肉細胞に対して効率的に治療用遺伝子をデリバリーする技術の開発が不可欠である．我々はこれまでに，血管内への大容量プラスミド水溶液の急速投与
により血管内圧を一時的に上昇させることで，広範囲

EGFPFminiの筋肉細胞への遺伝子導入が可能であることを明らか（1707bp）にしてきた1・2）．そこで本研究では，血管内へのプラス

図1EGEP−FをコードするプラスミドDNA（pEGEP−F）の構
造とPCRによるEGEPTF発現ユニット（EGEPFmini）の作成

ミドDNA水溶液投与による遺伝子導入において，プラ
スミドDNAのサイズが及ぼす影響について検討した．
また，遺伝子導入の結果産生されるタンパク質に対して動態制御機能を付加し，遺伝子非導入細胞へのタン

2．プラスミドDNAの放射標識：プラスミドDNAの構

パク質デリバリーによるタンパク質陽性細胞数の増大

造変化を最小限にし，また細胞内で代謝分解された放を試みた．

射活性を有するDNA分解物の細胞外排出低減を目的に，
新規放射標識法を開発した3）．即ち，第一級アミノ基を【方 法】

もつ4−lp−aZidosalicylamido】butylamine（ASBA）と二官能

1．プラスミドDNA：CMVプロモータ下にホタルルシ

性キレート試薬diethylenetriaminepentaaceticacid（DTPA）

フェラーゼまたは，farnesyl化シグナルを有する緑色蛍無水物を予め結合させ，紫外線照射によりプラスミド

光タンパク質（EGFP−F），β一ガラクトシダーゼをコード

DNAに共有結合した．未反応物を除去後，【lllIn］InC13とするプラスミドDNAを用いた．細胞浸透ペプチド（ce11−

混和することにより1111m標識プラスミドDNAを得た．

penetratingpeptide，CPP）としてHIVTatペプチドとHSV

3．マウス下肢筋肉へのプラスミドDNAデリバリー

VP22タンパク質を選択し，各配列をベクターに挿入すマウスを麻酔下開腹し，大動脈および大静脈を一時的ることによりCPP融合β−ガラクトシダーゼ発現ベクタにクランメで遮断することにより血流を一時的に停止ーを構築した．また，EGFP−Fをコードするプラスミド

させた状態下で尾動脈内に2mlのプラスミドDNA水溶＊京都大学大学院薬学研究科

ー28一

液を急速（5秒）に投与した．投与15秒後にクランメを得られた．図3に，111In標識プラスミドDNAを投与し外し，腹部を縫合した．一定時間の後に筋肉を回収し，放射活性またはルシフェラーゼ活性を測定した．

たときの筋肉組織での放射活性の分布を示す．200ド1のプラスミドDNA水溶液投与では下肢筋肉への放射活性4．ハイドロダイナミクス法による肝臓への遺伝子導入：の有意な集積は認められず，上肢筋肉とほほ同程度のLiuらの方法4）に準じ，1．6mlの生理食塩水に潜解した低い分布であった．これに対し，2mlの溶液量で動脈内pEGFP−FまたはEGFPFminiをマウス尾静脈内に急速投投与した場合には，下肢筋肉全体へのほぼ均一かつ高与した（ハイドロダイナミクス法による遺伝子導入）．

い分布が得られた．一方，筋肉への遺伝子投与法とし一定時間後に肝臓を摘出，凍結組織切片を作成し，共て汎用されるプラスミドDNAの筋肉注射後の動態につ焦点レーザー顕微鏡による観察により遺伝子発現を評いても併せて検討した．プラスミドDNA水溶液（20ド1）

価した．また，各種β−ガラクトシダーゼ発現ベクター

を右俳腹筋に注射したところ，投与筋肉への高濃度なも同様に投与し，肝臓を摘出後Ⅹ−galによる組織染色を行った．

蓄積が認められ，それ以外の筋肉への移行は乏しいことが明らかとなった．
2．PCR断片化による遺伝子発現細胞数の増大：図4に，【結 果】

pEGFP−FまたはEGFPFminiを同じ投与量（8．83pmol）
でマウスに投与したときの肝臓凍結切片の共焦点レー

1．下肢筋肉へのプラスミドDNAデリバリーの定量的壁昼：静脈内に20叫1のプラスミドDNA水溶液を投与した場合には，下肢筋肉での遺伝子発現（ルシフェラ

発するEGFP陽性細胞が検出されたが，EGFPFminiを投ーゼ活性）は殆ど認められなかった（図2）．これに対し，与した場合（図4B）に，より多くの肝細胞での遺伝子2mlの洛液量で同量のプラスミドDNAを投与した場合発現が得られる傾向が認められた．

ザー顕微鏡像を示す．いずれの場合にも，緑色蛍光をには高い遺伝子発現が認められた．特に動脈内投与に3．CPP融合による遺伝子発現後のβ−ガラクトシダーゼより静脈への投与と比較して約25倍高い遺伝子発現がの細胞間分布：ハイドロダイナミクス法により通常の︵U苫OaDE︑∃∝︶鯉娯甲−mHnふミβ−ガラクトシダーゼを発現するpLacZを投与した場合に1．5×108

は，これまでの報告4）にあるように肝静脈近傍の肝細胞での遺伝子発現が認められた（Eg5A）．Tatペプチド融
合β−ガラクトシダーゼ発現ベクター（pTat−LacZ）の投

1．0×108

与により，phcZの場合とほぼ同様の染色像が得られた（図5B）．これに対し，VP22融合β−ガラクトシダーゼ発現5．0×107ベクター（pLacZ−VP22）では肝臓がより広範囲に染色され（図5C），VP22を融合することで遺伝子発現により得られたβ−ガラクトシダーゼが，遺伝子非発現細胞に移行することが示唆された．

静脈内投与 静脈内投与 動脈内投与（0．2ml）

（2ml）

（2ml）

図2 プラスミドDNA水溶液血管内投与後の下肢筋肉での遺
伝子発現
（A）

（C）

（B）

上l

5
1
0

10

1

5

︵￠コの空音SOP−○邑岩場蒜鰯

20

T G Q Q G T 上肢
右下肢 左下肢柑
T G Q Q G T 上肢
右下肢 左下肢15

10

T G Q Q G T 上肢
右下肢 左下肢

図3 プラスミドDNAの筋肉組続での分布（A）尾静脈内注射（200匹1），（B）筋肉注射（右排腹筋，20両），（C）大容量動脈内注射法（2ml）．T，脛骨筋；G，排腹筋；Q，大腿筋−29−

ックマウスにおける検討の結果，筋肉組織の機能回復には，発現の均一性，即ちジストロフィン発現細胞数が重要であること，また発現量は正常値の20％程度で十分であることを報告している．従って，筋ジストロ
フィーに対する遺伝子治療の試みにおいては，できるだけ多数の筋肉細胞への遺伝子導入を実現する方法，
即ち遺伝子デリバリーシステムの開発が重要であると考えられる．
我々はこれまでに，プラスミドDNAを血管内に投与することで，マウス骨格筋あるいは横隔膜細胞に対して効率良く遺伝子導入が可能であることを報告してきたl・2）．しかしながら，筋肉組織の血管は連続内皮で構成されることから，巨大分子であるプラスミドDNAは生理的条件下では殆ど透過できない．しかしながら，今回の検討から，一時的に血管内圧を上昇させることでプラスミド恥を筋肉組織にデリバリー可能であり（図3），さらには遺伝子発現が得られることが明らかとな
図4 ハイドロダイナミクス法による（A）pEGFP−Fまたは（B）EGFPFmini投与後の肝臓切片の共焦点レーザー
顕微鏡像った（図2）．血管壁や細胞膜を介する物質の透過現象【考 察】とした遺伝子導入法であるハイドロダイナミクス法を筋肉への遺伝子導入は，プラスミドDNA，アデノウ

用い，DNAサイズを小さくすることによる遺伝子導入

イルスベクター，AAVベクターなどを組織間隙に注入

細胞数増大について検討した．4．8kbpのプラスミド

することで容易に達成可能である．1990年のWolffらによる報告5）以来，プラスミドDNAの筋肉注射は筋肉へ

DNAに対し，1．7kbpのDNA断片とすることで遺伝子発現細胞数が増大する傾向が認められ，遺伝子発現に至の最も簡便かつ安全な遺伝子導入法として注目されてる過程においてDNAサイズを小さくすることの有用性きた．このときの遺伝子発現効率はウイルスベクターが示唆された．ジストロフィンは現在知られるタンパと比較すると低いものの，これを改善する方法として，

ク質の中で最も長い遺伝子にコードされたタンパク質投与する溶液組成の選択や投与容積の増加，高分子のであり，そのcDNAだけでも14kbpと非常に長い．従っ

添加，エレクトロポレーション・超音波の利用などがて，全長ジストロフィンcDNAを含有するプラスミド検討され，その有用性が報告されている．こうした検DNAは通常17kbp程度になる．一方，ベクターサイズ

討では，遺伝子発現が改善されることに加えて，遺伝の限界から，AAVベクターなどへのジストロフィン

子導入細胞数の増大が得られる場合もある．しかしな

cDNAの組み込みにおいては，ロッドドメインを短縮しがら，依然として遺伝子発現細胞はプラスミドDNA投

たマイクロ，ミニジストロフィンが開発されている7）．

与部位近傍に限局される．一方，Phelpsら6）は，肌血マウ

プラスミドDNAをはじめとする非ウイルスベクターにスにジストロフィン遺伝子を導入したトランスジェニ

よる遺伝子導入法は，用いる遺伝子サイズに制限がな

は通常分子サイズに依存し，小さいものほど透過に適していることが考えられる．本研究では，肝臓を標的

図5 ハイドロダイナミクス法による（A）pLacZ．
（B）pTat−LacZ．（C）pLacZ−VP22投与後の肝臓×−gal染色像

一30−

いことが利点の一つとされるが，本研究の結果から，【参考文献】

デリバリー効率を考慮した場合には非ウイルスベクタ

1）LiuF，NishikawaM，ClemensPR，etal：TranSfbroffu11−

ーによる遺伝子導入においても短縮化ジストロフィン

1engthDmdtothediaphragmmuscleofDmdTndxhldxmiceの利用についての検討が必要であると考える．

through systemic administration ofplasmid DNA・Mol

非常に効率的な遺伝子発現が得られるハイドロダイ

乃gr4：45−51，2001．

ナミクス法による肝臓への遺伝子導入においても，遺2）Liang KW，Nishikawa M，Liu F，et al：Restoration of

伝子導入可能な細胞は約40％であるとされるl）．下肢筋

dystrophin expressionin mdx mice byintravascular

肉への遺伝子導入においては2mlと非常に多い溶液量lIt）eCtionofnakedDNAcontainingfu11，1engthdystrophinを用いているにも関わらず，遺伝子発現細胞数は肝臓

CDNA・GereT71er（inpress）．

と比較すると少ない．本研究では，DNAサイズを小さ

3）NishikawaM，NakanOT，OkabeT，etal：Residualizing

くすることによる遺伝子デリバリーの改善に加え，発indium−111−radiolabel for plasmid DNA andits

現により得られるタンパク質を遺伝子非発現細胞にデapplicationtotissue distribution study．Biocotdugαem

リバリーすることで，ジストロフィン陽性細胞数を増

14：955−61，2003．

大することを試みた．これまでにCPPと総称される多4）LiuF，SongY，LiuD：Hydrodynamics−basedtranSftction

数のペプチドが報告され，invitroならびにinvivo実験か

inanimalsbysystemicadmimistrationofplasmidDNA・らこれらが高い細胞膜透過能を有することが証明されGe〃g乃er6：1258−66，1999．

ている名）．また，タンパク質あるいはプラスミドDNA5）WolffJA，MaloneRW，WilliamSP，etal：Directgene

複合体にCPPを結合することで，これら高分子の細胞

tranSferintomousemuscleinvivo．Science247：1465−8，

内デリバリーが達成できることも示されている．しか1990．

しながら，invivoにおいて，遺伝子発現の結果得られた

6）PhelpsSF，HauserMA，ColeNM，etal：Expressionoffu11−

CPP融合タンパク質が，細胞外，さらには別の細胞内

1engthandtrunCateddystrophinmln1−geneSintranSgenicへ移行するかについては明らかではない．我々は，β−ガラクトシダーゼをモデル細胞質局在タンパク質として

mdxmice．肋mMoIGenet4：1251−8，1995．
7）Sakamoto M，Yuasa K，Yoshimura M，et al．Micro−用いた検討から，HSVVP22をβ−ガラクトシダーゼに敵合することで，ハイドロダイナミクス投与後の肝臓にdystrophin cDNA ameliorates dystrophic phenotypes

おいてより多くの乳頭陽性細胞を得ることに成功した（国βf叩カツ∫Re∫Comm肌293：1265−72，2002．

Whenintroducedintomdxmiceasatransgene・Biochem5）．一方，HIVTatペプチドを用いた場合には同様の効

8）Langel U：CeJJ一掬乃g加血g P中上fde∫ごPmcg∫∫e∫伽d

果は得られなかった．TatのCPP配列中には核移行シグ

AwLications，nOrida：CRCPressLLC，2002．

ナルも含まれることから，細胞内に存在するTat融合β−
ガラクトシダーゼの細胞外移行は生じにくいものと推9）ElliottG，OIHareP＝Intercellulartraffickingandprotein

deliverybyaherpesviruSStruCturalprotein・Cel188：223−

察される．vp22には核移行特性はか−ことから9），細胞33，1997．

外への移行が促進されたものと考える．今後は，ジス
トロフィンにこのアプローチを応用し，細胞膜への移行なども含めた解析を検討する予定である．
【結 論】
ジストロフィン陽性筋肉細胞数を増大するためには，血管内にプラスミドDNA水溶液を投与することが有効であり，投与するDNAサイズを縮小することでさらなる改善が可能であることを示した．また，HSVVP22の利用により，遺伝子非発現細胞へのタンパク質デリバリーが可能であることを明らかにした．本研究で用いたアプローチは，筋ジストロフィーに対する遺伝子治療においてジストロフィン陽性細胞数を増大するための有効なテクノロジーになるものと考える．

ー31−

RNAiを用いた疾患モデル動物の作出に向けた基礎的研究−C2C12細胞を用いたRNAi誘導とその効果−
北 健 浩 彦＊研究協力者 左合典子＊＊【緒 言】

DNA，合成siRNAを用いたトランスフェクションは，
単離後2〜3時間以内に行った．

遺伝性筋疾患をはじめ様々な遺伝性疾患の病態解明
そして治療法の確立のために，それらの疾患に対する

2．C2C12細胞の培養と分化誘導

モデル動物やモデル細胞の利用は不可欠であり，そしてそのはたす役割は非常に大きい．しかしながら，有筋管細胞への分化能をもつマウス筋芽細胞由来株

用な疾患モデル動物・細胞を作出するためには非常に

C2C12細胞は，grOWthmedium（GM）［15％ウシ胎児血清，

多くの時間と労力を費やさなければならないのが現状

100U血1ペニシリン，100匹かnlストレプトマイシンをである．また，多くの疾患がそうであるように複数の含むDMEM】を用いて未分化状態で増殖培養し，筋管細遺伝因子が疾患と関連していた場合，それらを従来の胞へ分化誘導する場合は，Differentialmedium（DM）［5％

方法を使ってモデル動物・モデル細胞を作出すれば，ウマ血清を含むDMEM】を用いて培養を行い，筋管細胞

さらに膨大な時間と労力を要するのは必至である．よに分化させた．

って，従来のモデル動物・モデル細胞作出技術に代わる簡便な手法の確立は，より複雑な疾患に対する有用

3．レポーター遺伝子と合成smallinterfering RNA

なモデル動物・細胞作出に大きく貢献すると考えられる．

（SiRNA）を用いたRNAi誘導

近年，最も注目されている生体内現象の中にRNA

ホタル・ルシフェラーゼレポーター遺伝子に対するinterference（RNAi；RNA干渉）が挙げられる．これは，21塩基のRNAオリゴヌクレオチド（SiRNA）を合成し，二本鎖RNAによって引き起こされる配列特異的な遺伝

熟変成−アニーリングによって二本鎖のオリゴヌクレ

子発現の転写後抑制現象であり，晴乳動物細胞をはじ

オチド二量体（siRNA二量体）を形成させた．そのめ様々な生物種で観察されている．この不思議な現象

siRNA二量体とホタル・ルシフェラーゼ遺伝子をコーが報告されたのは，わずか5年前（1998年）のことでドするプラスミドDNA，PGL3（プロメガ社），そしてあり1），その分子メカニズムについてはまだ十分理解さコントロール遺伝子としてウミシイタケ・ルシフェラ

れてはいない．しかしながら，今日，すでに様々な分ーゼ遺伝子をコードするプラスミドDNA，PhRL−TK（プ野で簡便な遺伝子ノックダウン方法として利用されてロメガ社）をリボフェクタミン2000試薬（インビトロ

いる．

ジェン社）によって細胞内に共トランスフェクション

今回我々は，このRNAiに着目し，そのRNAi誘導技

した．その後，それぞれの実験で示す時間や時期に，術を用いた遺伝子ノックダウン方法によって遺伝性筋

細胞抽出液を調整し，デュアル・ルシフェラーゼアツ

疾患に対する疾患モデル動物・モデル細胞を作出する

セイ法を用いてルシフェラーゼの活性を測定し，RNAi

ための基礎的研究を行った．

によるホタル・ルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制効果
を調べた．

【方 法】
4．RNA抽出とRT−PCR

1．マウス長指伸筋からの筋線維単離

すでに報告されている手法に従って2），ICRマウス下

TRIZOL試薬（インビトロジェン社）を用いて，マウ肢から長指伸筋を摘出し，コラゲナーゼ処理によってス各組織そしてC2C12細胞から仝RNAを抽出した．そ

筋線経を解し，筋線経を単離した．単離した筋線経は，して，得られたRNAを鋳型にオリゴdTと逆転写酵素

10％ウマ血清を含むDulbeccos modified Eagle medium

を用いてcDNAを合成し，PCR法によって遺伝子発現（DMEM）内で37℃，5％CO王で培養した．プラスミドを調べた（RT−PCR）．正確な発現量を調べるために，＊国立精神・神経センター神経研究所＊＊東京大学大学院医学系研究科−32−

PCRにはABIPRISM7000によるリアルタイムPCR法

我々は，まず始めに，マウス各組織間におけるDicerを用いて解析を行った．

遺伝子の発現量の違いについて検討を行った．マウス
各組織より仝RNAを抽出し，RT−リアルタイムPCR法【結果・考察】によってDicerそしてコントロール遺伝子として二本鎖RNAによるRNAiの誘導過程において，Dicer

G3PDHの発現量を調べた．その結果，骨格筋と心筋組と呼ばれるRNaseIII様のリボヌクレアーゼが重要な働織においてDicerの発現量が他の組織に比べてはるかにきをすることがすでに知られている．Dicerは長い二本低いことが示された（図1）．この結果は従来の結果と鎖RNAを切断し21〜25bpのsiRNA二量体を生じさ，一致し，筋肉系の細胞・組織においてDicer遺伝子の発そして，その切断されたsiRNA二量体がRNA−induced

現が低下していることを示唆している．さらに我々は，Silencing complex（RISC）に取り込まれて配列特異的なRISC複合体に関わる遺伝子，eIF2Cl〜4遺伝子5），にRNAiメデイエーターとして機能する．興味あることに，ついても各組織間での発現量の違いを調べた．その結果，骨格筋組織においては，このDicer遺伝子の発現量が特驚くべきことに，eIF2Cl〜4遺伝子もDicer遺伝子と同に少ないことがノーザンプロットやRT−PCR法を用い様に，骨格筋，心筋組織においてそれらの発現量が他た解析で知られている3リ）．

の組織と比べて明らかに低いことが示された（図2）．
これらの結果から，次のような疑問が挙げられる：2

竜舟望§責・∈hOZ

RNAiに関わる遺伝子の発現量が少ない筋肉細胞・組織

0において，実際にRNAiが誘導されるのであろうか？こ

8の疑問に答えるために，我々は，マウス下肢より長指6伸筋を摘出し，そこから筋線経を単離した．そして，

4

その筋線経に合成siRNAを用いてRNAiを誘導し，RNAi活性が見られるか否かについて検討を行った．

2

︑ヾJ一ざ

㌔甘

︒
⁚
ざ

gぜ烏仁㌔㌔

単離した筋線経に，レポーター遺伝子であるホタル・
ルシフェラーゼ（Photinusluciferase）遺伝子に対する19
塩基対の合成siRNA二量体6）とホタル・ルシフェラー
ゼ遺伝子をコードするプラスミドDNA（pGL3）そしてコントロール遺伝子としてウミシイタケ・ルシフェ

図1 各組続におけるDicerの発現量

eIF 2C l（lC R m ousetissues）
30
「
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一
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ICRm ousetissues）
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至 言 至 芸 旦
∽ J宮 蔓 蔓∈ト ト巨 日日 日日E

5

eIF2C3（ICRmousetissues）

eIF2C4（
ICRm ousetissues）

0
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弓dMU＼mUN已0・EhON

．
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図2 遺伝子発現プロファイル
ー33−

言

J 「 ‥｛ ．「「 ．▲ ．
眉

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‥

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∽

J言

■
蓋

召
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1

8

0

9

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8

0

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′ 0

0

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2

3

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0

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0

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0

0

．UnTd∃uむ牢．UmTS∃u⁝lOjh．∈LOZ

1

l

0

2

0

1

．Unt・q︑︑叫篭も︼雪．UmT的ミミ︑Qqも．≡JOZ■contro1

7

11

14

17

21

0

controI
図3

siRNA

DaysafterRNAiinduction
図4

筋線経におけるRNAi誘導

C2C12細胞分化誘導に伴うRNAj活性の変化

ラーゼ（Renillaluciferase）遺伝子をコードするプラス

機構の喪失によるものなのか否かを確認するために，

ミドDNA（phRL−TK）を共トランスフェクションし，

筋管細胞分化後にRNAiを誘導し，その活性の有無を調

24時間後，ルシフェラーゼの活性を測定してRNAiにべた．その結果，図5に示すように，筋管細胞分化後

よるホタル・ルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制を解析にも強いRNAi活性が観察された．これらの結果から，した．その結果，図3に示すように，強いホタル・ル

上記のRNAi活性の低下について一つの可能性が考えら

シフェラーゼ遺伝子の発現抑制が観察され，筋肉細胞・れる．すなわち，細胞内に成立した活性型のRISCの安組織におけるRNAiの誘導・活性機構の存在が確認され定性が時間の経過と共に徐々に失われていったと考えた．

られる．分化したC2C12筋管細胞と同様に細胞分裂を次に，筋管細胞への分化過程におけるRNAiの特徴・

停止した神経細胞内にRNAiを誘導した場合，その活性性質を調べるために，マウス筋芽細胞由来株C2C12細は少なくとも3週間にわたって持続する7）．これら二つ胞を用いたRNAi誘導実験を行った．まず，分化過程にの細胞種でのRNAi活性の違いは，活性型RISCの安定

おけるDicer，eIF2Cl〜4遺伝子の発現プロファイルを性が細胞種・組織ごとに異なる可能性を示唆している．

上記と同じ方法によって解析した．その結果，未分化

最後に，内在性遺伝子をターゲットとしたRNAiによ細胞から筋管細胞に分化するに伴って，Dicer，eIF2Cl

る遺伝子ノックダウンを試みた．ターゲットとして選〜3遺伝子の発現が減少することが観察され，そして，

んだ内在性遺伝子はDystrobrevin−alpha（DtnA）と−beta

骨格筋組織に近い発現プロファイルが示された．

（DtnB）遺伝子で，それぞれの遺伝子に対して合成

eIF2C4遺伝子発現については，未分化，分化細胞でほsiRNA二量体を設計しRNAiによるノックダウン実験の

とんど差がなく，発現量は骨格筋組織と同じであった．

メデイエークーとして用いた．合成siRNA二量体を未このC2C12細胞にRNAiを誘導し，同時に筋管細胞へ

分化C2C12細胞に導入し，48時間後に仝mAを抽出し，の分化誘導を行うと，強いRNAi活性が誘導後一週間ほRT＿リアルタイムPCR法によってターゲット遺伝子のど観察され，その後，徐々にその活性が失われていっ

発現量を解析した．その結果，約50％の遺伝子ノックた（図4）．この活性の低下が，上記で示したDicer，

ダウン効果が見かけ上観察された（図6）．しかしながら，

eIF2Cl〜4遺伝子発現の減少に伴うRNAi誘導・活性

この結果には，SiRNAの細胞内への導入効率に疑問が

0．8

0．7

0．7

0．7

Oj

●j

0

r 『 画室痕
●J

Oj

l．3

●．ユ

●J

0．1

l．1

8

0

controI siRNA controI siRNA

図5

0

0．1

Oj

0ノl

2

●J

0．

0．5

4

0．4

0．6

′ 0

0．

8

0．さ

0▼I

ュ

1
0．，

2

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1
0．9

月勺号じ＼ひ已払︶品玉．EhOZ

C2C12myoblast
1
0．，

毒

毒

毒

等

図6 RNAjによる内在性DtnA，DtnB遺伝子ノックダウン

C2C12細胞分化後におけるRNAj誘導−34−

あり，効率の良いsiRNA導入法が今後の重要な課題になると考える．

【結 論】
本研究によって，mAi誘導・活性に関わる重要な遺伝子（DicerやeIF2Cl〜4遺伝子）の発現が少ない筋肉細胞においても，RNAiが正確に誘導され，強い活性を示すことが実証された．この成果は，RNAiを応用した
様々な遺伝性筋疾患モデル動物・モデル細胞の作出の可能性をさらに高め，それらのモデルを用いた新規治療法・治療薬の開発の実現化を期待させると考える．
【参考文献】
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7）omiK，TokunagaKandHohjohH：Long−1astingRNAi
activityinmammalianneurOnS．FEBSletE（inpress）．

−35−

Ⅰ．幹細胞を用いた移植治療法の開発

骨格筋組織幹細胞移植治療に関する基礎的研究

橋 本 有 弘＊
研究協力者 稲川匡代＊，梅田理恵子＊
【方 法】

【緒 言】
筋疾患の治療法として筋芽細胞移植の有効性が検討（ヨヒト筋衛星細胞由来筋細胞の分離・培養され，臨床応用も試みられてきたが，その有効性は未女性患者（44歳）乳ガン切除後の形成手術の際に生だ確認されていない個1）．筋細胞移植治療の有効性を，じた余剰筋組織（背部骨格筋）は，神奈川がんセンタ

移植細胞の「質」という面から再度検討する必要性がーにおいて，患者の承諾（インフォームド・コンセント）ある．また，実験動物に由来する筋細胞に比べ，ヒトを確認後，実験に供した．筋組織を押切後，細胞分散

筋細胞の性質については不明の点が多い．筋疾患に対液（0．025％Ⅴ型コラゲナーゼV，0．125％トリプシン）する細胞移植治療法を確立するためには，ヒト筋衛星処理し，得られた単離細胞を，初代培養筋細胞用増殖細胞およびそれに由来する筋細胞の性質を解明する必要がある．

培地（pmGM，20％FCS，2％UltraserGinhDMEM）に懸
濁後，タイプⅠコラーゲンでコートした100−mm培養皿

本研究は，マウス筋衛星細胞の初代培養法を基盤とに播き，10％炭酸ガス存在下，37℃で培養した．

して，ヒト筋衛星細胞の初代培養法を確立し，「筋疾患（ヨヒト筋衛星細胞由来筋細胞クローンHu5の培養に対する幹細胞移植治療法」開発のための基盤となる

ヒト初代培養筋細胞より単一細胞由来のクローン

ヒト筋衛星細胞の性質解明をめざす．

Hu5を分離し，解析に用いた．Hu5は2xlO5細胞をタイ

A．自己筋幹細胞移植治療（自己移植）

B．非自己筋幹細胞移植治療け口移植）

骨格筋組織の再生

図1 筋細胞移植治療のアウトライン
筋細胞移植治療としては，患者筋組織より分離・培養し，遺伝子導入によって機能を正常化したのち（exovivo遺伝子治療），
患者筋組織へ移植する「自己細胞治療」と，正常筋組織から得られた筋細胞を患者組銭へ移植する「アロ移植治療」が考えられる．自己細胞移植の場合ですら，筋組織に移植された筋細胞のほとんどは，移植後24時間以内に死滅すると報告されており，その克服が必須の課題となっている．さらに，アロ移植においては移植免疫反応の抑制が必要になる．
＊三菱化学生命科学研究所幹細胞研究ユニットー39−

プⅠコラーゲンでコートした100−mm培養皿に播き，③Hu5における骨分化マーカーの発現

pmGM中で10％炭酸ガス存在下，37℃で培養した．

Hu5は骨分化決定因子Runx2を発現していることが，③Hu5の培養下における分化誘導

蛍光抗体法およびRT−PCR法によって示された．さらに，

Hu5に筋分化を誘導する場合は，培養開始24時間後

Hu5は未分化増殖状態にあるにもかかわらず，骨芽細に培地を「初代培養筋細胞用分化培地（pmDM；2％胞の初期マーカーである骨型アルカリ性フオスフアタ

FCS，5トtg／ml holo−tranSferri，10トLg／mlinsulin，10nMーゼ（ALP）を発現していることが，特異抗体による

seleniteinhDMEM）」に交換し，培養した．骨分化を誘染色によって明らかになった（図3）．

導する場合は，培養開始掴8時間後に培地を「10％FCS，10mMβGPinDMEM」に交換し，培養した．
④ヒト・デイシェンヌ型筋ジストロフィー筋組織の解析
デイシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）と診断された生後4カ月および5カ月の男児の上腕二頭筋より摘出された筋組織の凍結切片を作製し，抗体染色および組織化学的検索に供した．インフォームド・コンセ
ントは国立精神・神経センターにおいて確認された．
【結 果】（∋Hu5の増殖・分化能

Hu5は約20時間の倍加時間を示したが，継代数が10図3で培養すると，PmGM中でも筋管細胞を形成した．また，

ヒト初代培養筋筋細胞クローンHu−5における骨型アル
カリ性フオスファターゼの発現
未分化なHu−5は，BMP2非存在化で，既に骨芽細胞のマーカーである骨型アルカリ性フオスフアターゼを発現している．

セミコンフルエントになった時点で，培地をpmDMに交換すると速やかに筋管細胞を形成した．これらの筋④骨分化能の検討

代を越えると急激な増殖低下を示した．Hu5は高密度

管細胞はMHCを発現していることがと特異抗体法を用

Hu5をβグルセロリン酸（βGP）存在下で培養すると，いて確かめられた（図2）．

細胞周囲にカルシウム（リン酸カルシウムと推測される）を蓄積し，骨最終分化が誘導された．カルシウム沈着
はBMP2刺激がなくとも，βGP単独で誘導された．
（9Hu5の不死化

Hu5を不死化するために，ヒト・テロメラーゼ遺伝
子およびヒト・パピローマ初期遺伝子E7を導入した．
両遺伝子を導入されたHu5細胞は，継代数80以上，集団倍加数200以上に渡って培養・維持することができた．
また，これらの細胞は筋分化能を保持していることが確認された．
⑥DMD筋組織における骨芽細胞マーカーの発現
DMD筋組織において再生筋繊維がALP活性を示すことが知られている（図4）．骨型ALP特異的抗体を用い

図2 ヒト初代培養筋筋細胞ク⊂トーンHい5の筋分化
Hu−5はコンプルエントな状態で放置すると，増殖培地中でも互いに細胞融合し，発達した筋管細胞に分化する．分化した細胞は，ミオシン重鎮を発現している．

た免疫染色によって，このALP活性は骨型ALPの発現によるものであることが明らかになった（図5）．また，
DMD筋組織において，骨型ALPを発現するPax7陽性②Hu5における筋細胞系譜マーカーの発現の筋前駆細胞が同定された．

蛍光抗体法を用いて検討した結果，未分化Hu5はMyoD，
PAX7，neStin，desminという筋細胞系譜のマーカータ
ンパク質を発現していることが明らかになった．また，
筋分化マーカーであるサルコメリック・ミオシン重鎖（MHC）の発現は見られなかった．
−40−

ヒトDMD筋組織において，再生筋繊維が骨型ALPを発現していること，骨型ALP陽性の筋前駆細胞が存在することが判明した．以上の結果は，in vitroのみならずinvivoにおいても，ヒト筋サテライト細胞系譜では，
骨芽細胞マーカーの発現が誘導されることを示している．
これはマウス，ラットでは見られない現象であり，ヒト筋細胞がヒト固有の性質を有していることを示唆している．本研究において確立された不死化ヒト筋細胞は，
ヒト筋細胞の性質解明のためにきわめて有効な実験系を提供するものと期待される．
【結 論】
私達はヒト骨格筋より筋細胞クローンを分離・増殖させる条件を確立した．解析の結果，ヒト初代培養筋
図4

ヒト再生筋繊雑におけるアルカリ性フオスファターゼ
活性ヒト・デイシェンヌ型筋ジストロフィー患者の筋組織中に見られる再生筋繊維は，アルカリ性フオスフアターゼ活性を示す．
Fast Blue RRを用いた組織化学法によってアルカリ性フオス7
7ターゼ活性を検出した．

細胞は，マウス筋細胞には見られない特有の性質を有するものと考えられた．さらに，分化能を保持したまま，
ヒト筋細胞を不死化することに成功し，ヒト筋細胞の性質解明に資する，新たな実験系を樹立した．
【謝 辞】
ヒト筋細胞の分離に関しては，神奈川癌センター 安
本茂 先生，清水調 先生，ヒト筋細胞の不死化に関しては国立癌センター 清野透 先生，ヒト・デイシ
ェンヌ型筋ジストロフィー筋組織の解析に関しては，
国立精神・神経センター 埜中征哉 先生，後藤雄一
先生との共同研究の成果である．共同研究者の皆様に深く感謝申し上げます．
【参考文献】
1．Wada M R，Inagawa−Ogashiwa M，Shimizu S，et al：
Generationofdifferentfatesfrommultipotentmusclestem
Cells．βeveJ叩me〝7129：2987−2995，2002．
2．HashimotoN，OgashiwaM：Isolationofadifferentiation−
defective myoblastic cellline，INC2，eXPreSSlng muSCle

図5

ヒト再生筋繊維における骨型アルカリ性フオスファターゼ発現
ヒト・デイシェンヌ型筋ジストロフィー患者の筋組織中に見られる再生筋繊維は，骨型アルカリ性フオス77ターゼを発現している．モノクロナール抗体による蛍光染色像を示す．

LIMproteinunderdifferentiation−inducingconditions．Dev
GnフWfあか解7r39：363−372，1997．

【考 察】
私達は先に確立したマウス筋衛星細胞の初代培養系における成果を基盤として，ヒト骨格筋細胞の初代クローン培養に成功した．得られたヒト筋細胞クローン
Hu5はマウス筋細胞と同様に，筋分化能のみならず骨分化能をも保持していた．さらに，Hu5はBMP2非依存的に骨型Mを発現することが明らかになった．また，−41一

筋ジストロフィーの骨髄移植による治療法の開発的基礎研究
山 元

弘●

研究協力者 深田 宗一朗＊ ＊＊，樋口 才飛＊，瀬川 将訂，幸田 健一書，山本 有希宇辻川

和丈＊，湯浅勝敏綿，上住聡芳＊＊，鈴木 友子＊事，武田 伸一輌【緒 言】

期間後，宿主マウスにカルジオトキシン（CTX）を投ほ乳動物の骨髄中には，様々な血液細胞に分化し得

与した後骨格筋を採取し，GFP蛍光を共焦点レーザー

るいわゆる造血系幹細胞が存在する．しかし近年，造顕微鏡下で観察した．宿主マウスをm血とした時は，骨細胞，軟骨細胞，脂肪細胞，血管細胞，肝臓細胞はCTX無処理で観察した．

じめ，心筋細胞や骨格筋細胞に分化できる細胞も骨髄

2．筋衛星細胞特異的モノクロナル抗体の作成中に存在することが明らかにされ，骨髄移植法により様々な疾患を治療できる可能性が示唆されるようになった．

筋前駆細胞を選択的に濃縮する手法を確立するため，

Fe汀加らは，免疫能を欠損したマウスに筋再生を誘導し，マウス筋芽細胞株C2C12細胞をラットに免疫し，モノ同時に骨髄細胞を移植すると骨髄由来細胞が再生筋中

クロナル抗体を得た．抗体は，C2C12細胞に対する反に見つかること1），またGusso山らは，放射線照射した応性を基礎に選択し，その後組織化学的検索により選〝血マウスに骨髄移植することで，ジストロフィン陽性

別した．その結果，マウス筋衛星細胞を認識するモノの筋が再生することを報告しわ，骨髄移植による筋ジス

クロナル抗体SM／C2．6を得た．sM／C2．6反応性細胞をトロフィーの治療法が一躍注目を集めるようになった．

セルソータ一にて分別採取し，培養や移植による筋分

われわれは，標識マーカーとしてGFP遺伝子を導入し化能の検討，さらに細胞表面マーカー抗原を解析した．

たマウスを用いて，骨髄細胞移植による筋再生のため

3．筋再生過程における炎症性細胞の解析の新しい再構築実験系の確立を試み，これまでの報告を検証するとともに，より効率のよい移植法を目指し

正常C57BL／6マウス前脛骨筋にCTXを授与し，経時て筋ジストロフィー治療のための基礎的研究を進めた封．

的に筋を組織化学的に解析した．筋再生時のマクロフ

また筋衛星細胞を認識するモノクロナル抗体を作成し，ァージの機能を調べるために，叩（osteopetrosis）マウ

筋衛星細胞の性格付けを行った4）．さらに，筋再生過程

スを肌血マウスと交配し，（函）m血およびそのパート

での炎症性細胞の役割についても検討し，いくつかのナー遺伝子型マウスを得た．これらにエバンスブルー

興味深い知見を得た．

（EBD）を投与し，筋組織からEBDを回収してその濃度を定量した．

【方 法】
1．骨格筋の再生に関する検討【結 果】

岡部ら封により開発されたGFP遺伝子導入マウスを，

1．骨髄細胞移植，胎児肝臓細胞移植による筋再生効率の比較

正常C57BU6マウスと交配し，GFP陽性マウスを選び，ドナー細胞を調製した．ドナー細胞には，成骨髄細胞，

放射線キメラマウス，新生児キメラマウスいずれのあるいは胎齢14−15日の胎児肝臓細胞を用いた．実験動場合も，頻度は低いがドナー細胞由来のGFP陽性筋が物中央研究所から恵与されたm血マウスは，自家繁殖見つかった．また新生児キメラマウスの場合，ドナー

して用いた．

細胞が筋衛星細胞として骨格筋内に存在した3）．

キメラマウスは，2種類の方法で作成した．一つは前脛骨筋の仝筋繊維のうち，GFP陽性繊維がどれほ

10Gyのガンマ線照射したマウスにドナー細胞を移植すど認められるかを算出したが，ドナー細胞が再生に参る放射線キメラ法と，もう一つは妊娠マウスにブスル

加する割合は，多くてもたった3％弱にしか過ぎず，

フアンを腹腔内投与し，出生後に骨髄細胞もしくは胎

単純な細胞移植法では機能的な筋を再生することは非児肝臓細胞を投与する新生児キメラ法を用いた3）．一定

常に難しいことがわかった3）．しかし，骨髄細胞と胎児＊大阪大学大学院薬学研究科細胞生理学分野＊＊国立精神・神経センター神経研究所遺伝子疾患治療研究部

ー42−

2．SM／C2．6抗体を用いた筋衛星細胞の単離濃縮

肝臓細胞の再生筋への寄与率を移入した細胞数で比較

モノクロナル抗体のうち，SM／C2．6抗体が筋衛星細胞すると，胎児肝臓細胞をドナーとしたときの方がはるを認識していることが示唆された（図2A−C）．筋線

かに優れていることがわかった（図1）．
もー×︵︼ぷ∈∃SttむUp舅且屠二票差≡虐葛邑↑汽︶

維培養法（Singlefiberculture）で調べると，線経に付着した単細胞が染色できた（図2D）．さらに骨格筋から
50
0 ．0 0 2

単細胞分画を採取し，SM／C2．6抗体を用いて精製した細0 ．0 0 0 6胞を培養すると，desmin陽性の筋管を形成し（図2E），

0

T

5
0

なおかつ筋管にはMyoD陽性の核が認められた（図2F）．
SM／C2．6抗体を用いてGFPマウス骨格筋から精製した細胞を∽血マウス前脛骨筋内に移植し，精製細胞の筋

」「

）
0

虎 」

0

BM

分可能を調べたところ，投与局所に中心核を持った
GFP陽性の再生筋線経が認められた（図2G，H）．

FL

C57もL／6（CTX・treated）

IiM

以上の事実を総合すると，SM／C2．6 抗体は筋衛星細FL
mdx

胞を認識し，かつ筋衛星細胞を単離精製することを可（untreated）

図1 細胞移植による筋再生の効率比較投与した細胞（骨髄細胞，胎児肝臓細胞）当たりのGFP陽性
繊維数を算出した．正常C57BL／6マウスを宿主としてCTX処
理により筋再生を誘導した場合（左），m血マウスを宿主として，CTX処理無しで自然な筋再生を観察した場合（右）を示した．
ドナー細胞としての成マウス骨髄細胞（BM）と胎児肝臓細胞（FL）を比較すると，明らかに胎児肝臓細胞が優れていることがわかる．

能にする新規モノクロナル抗体であることがわかった．
そこで次に，筋衛星細胞が持つ細胞表面抗原マーカーの検索を試みた．まずSM／C2．6抗体が，筋衛星細胞が持つ既知の細胞表面分子を認識しているかどうかを確認する目的でtwo−COlorflowcytometry法で調べ，M−
cadherinやC−met（HGF一受容体）ではないことを明らかにした（データ省略）．さらに，筋衛星細胞はC−kit￣，

図2 新規モノクロナル抗体SM／C2．6の反応性と筋衛星細胞の性格付け
A：SM／C2．6抗体で成マウス骨格筋を染色した．
B：Aと同一切片のラミニンとDAPIの二重染色．
C：新生時期マウス骨格筋のSM／C2．6抗体染色（ラミニン，DAPIとの三重染色）．
D：成マウス骨格筋繊維培養時のSM／C2．6抗体染色．矢頭の位置に陽性細胞が見つかる．
E：SM／C2，6抗体を用いてセルソーターで分離精製した筋単核細胞を，いったん増殖させた後分化培養系に移した．desmin染色．
F：Eと同一集団のMyoD染色．
G：SM／C2．6抗体で精製したGFPマウス由来筋単核細胞をmdxマウスに移植し，筋組織を調べた．H，E染色．
H：再生筋繊維が発現するGFP蛍光（Gと同一切片）．

一43一Sca−1￣，CD45．，CD34・であることがわかった（図3）．

わるようにマクロファージの浸潤が認められた（デーHoechst33342dye−Stainingtestによる解析で，筋衛星細タ省略）．マクロファージが筋再生のきっかけに関与し胞はmainpopulation（MP）に含まれ，Sidepopulation（SP）ていることが示唆されたため，叩／＋マウスと肋血マウにはほとんど見つからなかった （図4）．

スを交配し，マクロファージ系細胞が減少するqpんpm血マウスを得て，組織化学的に検討した．その結果，両肌血マウスは叩ル川血マウスに比べて筋再生が遅ち▼ 笈一七や．N一U︑言S

延することがわかった（データ省略）．こうした表現型を定量的に比較する目的で，マウスにEBDを腹腔内投与した後還流により血液を洗浄除去し，採取した骨格筋中に含まれるEBDを抽出して分光光学的に定量した．
図5に示すように，励〝血マウス筋は叩ル〝1血マウスに比べて多量のEBDを含有していることがわかり，

ShⅣC・2．6
9．
貼㌔I N一−一！
壕．？U︑−■dS

や．N∴︶︑■・dS

等 山海 ︻空0 ユ4dマクロファージの欠如は筋再生の効率を著明に低下させていることが明らかになった．

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E B D 定 量㌔■92

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図3 筋衛星細胞の細胞表面マーカー抗原
SM／C2．6抗体反応性筋衛星細胞をtwo−COlorflowcytometry法で解析した．筋衛星細胞はC−kit−，Sca−1一，CD457，CD34＋の表
現型を示す．

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〆m 朝川＝5J

図5 叩ゐpm血マウス骨格筋へのEBDの取り込み量＋ル〝血，叩ル用血マウス（左）に比べ，励〝血マウスではEBDの取り込み量が増加しており，マクロファージが減少したマウスでは筋再生不良がうかがえる．

2〔め 都8 も08 8図10番0▼≡ ㌔l ㌔■ l空

や．N．Ui・dS【考察と今後の課題】
通常の放射線照射骨髄キメラマウスに比べて，骨髄細胞移植した新生児キメラマウスにGFP陽性筋の出現
頻度が高い傾向が認められ，また骨髄細胞に比べて，胎児肝臓細胞の方が高い頻度で筋前駆細胞を含んでい

図4 筋衛星細胞はmainpopulation分画の細胞
左上：筋単核細胞をHoechst33342で染色し，MP分画（Rl）とSP分画（R2）にgateした．
右上：Verapamil存在下ではSP分画（R2）が消失している．
それぞれの分画のSM／C2．6抗体反応性．筋衛星細胞はMP分画（Rl）に含まれ（左下），SP分画（R2）（右下）にはごくわ
ずかしか見当たらない．

ることがわかった．ドナー細胞は租分画であるため，
厳密な意味での前駆細胞の貢献度の違いについては結論を下せないが，胎児肝臓にも筋前駆細胞が含まれる
ことは興味深い．この事実を根拠にマウス臍帯血移植を試みたところ，頻度は低いが臍帯血中にも前駆細胞があること，また臍帯血細胞を培養することで筋繊維生成をも認めた（データは示していない）．今後，臍帯

3．筋再生過程におけるマクロファージの役割

正常C57BL／6マウスにCTXによる筋再生を誘発し，血移植の効率についてさらに検討を加え，臍帯血バンクへの期待につなげたい．

経時的に筋組織を観察したところ，障害初期（12−24時間目）には多数の顆粒球の浸潤が認められ，筋再生がしかし，ドナー細胞が筋再生に参加することが明ら始まる頃（48−72時間日）には，顆粒球の消失と入れ替かにできても，残念ながらその再生への貢献度はきわ−44−

めて低く，現時点では，骨髄移植や臍帯血移植が筋ジ

害筋に取り込まれる色素を定量した．その結果叩んp

ストロフィー治療にすぐに結びつくとは考えられない．

m血では，叩八m血に比べ色素の取り込み量が高く，筋こうした問題点を克服する手段の一つとして，本研究

再生が有意に遅れていることがわかった．さらに抗M−

では筋前駆細胞を選択的に濃縮できるかどうか，そのCSF受容体抗体を投与した実験でもマクロファージのためにはどのような手法が可能であるかを検討し，ま役割が再現され（データは示していない），筋再生にはず筋衛星細胞を特異的に単離精製するために，モノク

マクロファージが重要な機能を果たしていることが明

ロナル抗体の作成を進めた．その結果，SM／C2．6と名づらかになった．今後，初期に浸潤する顆粒球，遅れてけたモノクロナル抗体が，効率よく筋衛星細胞を濃縮浸潤するマクロファージを局所に誘導する因子の検索，できることがわかった．sM／C2．6が認識する分子は現在

マクロファージが産生する因子の検索などを進める予解析中であるが，M−CadherinやC−metではないことを明定であり，筋再生の効率を上昇させる手法の開発に役らかにした．sM／C2．6が筋衛星細胞に反応することから，立つものと考えている．

筋衛星細胞の細胞表面抗原分子を調べた．そして，C−kit．，Sca−1−，CD45−，CD34＋であることを明確にした．

【結 論】

さらにIloechst33342dye−Stainingtestによる解析から，
筋衛星細胞はMP分画に含まれることを明らかにした．

1．骨髄移植や胎児肝臓細胞移植は，筋再生の治療手段となり得る可能性が示唆されたが，臨床応用に

これまで筋衛星細胞の存在を示唆してきたSP分画にははまだ程遠い手法であると考えられる．

ほとんど見つからないことから，筋衛星細胞の新しい2．筋再生の効率を上昇させる目的で，筋前駆細胞をフェノタイプが同定できたものと考える．現在このモ特異的に認識する抗体の作成を進め，筋衛星細胞

ノクロナル抗体を用いた骨髄細胞からの前駆細胞濃縮を選択的に単離・濃縮できるモノクロナル抗体をは成功していない．他の抗体との組み合わせが必要と得た．この抗体を用いて筋衛星細胞を単離し，そ思われ，更なるモノクロナル抗体作成を進めている．
筋再生時には，多数の炎症性細胞の浸潤が認められる．

の性格付け，細胞表面抗原マーカーを同定することに成功した．

本研究では，炎症性細胞のうち特にマクロファージに

3．筋再生過程におけるマクロファージの役割を調べ，着目し，その役割を調べた．マクロファージは炎症後再生にはマクロファージが必須の役割を果たすこ

期に浸潤が盛んになり，特にマクロファージ浸潤時期とを明らかにした．

に一致して筋再生が始まる．このことは，マクロファージが崩壊した筋を会食処理し，その結果空間的・細【参考文献】

胞接触的な刺激が筋衛星細胞に伝わり筋再生のきっか

1）FerrariG，Cusella−De−AngelisG，ColettaM，etal：Muscle

けになると考えることが可能である．しかし一方，マregeneration by bone marrow−derived myogenic

クロファージが産生する何らかの生理活性分子が筋衛

PrOgenitors．Science279：1528730，1998．

星細胞の増殖・分化に働いていると考えることもできる．

2）GussoniE，SoneokaY，StricklandCD，etal：Dystrophin

もし生理活性分子が同定できれば，細胞移植による筋

expressioninthe mdx mouse restored by stem cell

再生手法に新しい考え方を導入することもできる．こtransplantation．Nature401：390−4，1999．

うした観点から，まず画フェノタイプとm血フェノ3）FukadaS，Miyagoe−SuzukiY，TsukiharaH，etal：Muscle

タイプを持つ（砂如∽血マウスを作出し，その筋組織を

regenerationbyreconstitutionwithbonemarroworfetal

調べた．叩ルクマウスはマクロファージ分化に重要な

livercellsfromgreenfluorescentprotein−genetranSgenic

M−CSF遺伝子に変異があるマウスで，OSteOPetrOSisマウ

mice．JCgJJ∫cfll5：1285−93，2002．

スと呼ばれる．このマウスではマクロファージ系細胞

4）FukadaS，HiguchiS，SegawaM，etal：Pmincationandの分化が低下し，その結果osteoclastが減少するため，Cell surface marker characterization of mouse skeletal

骨代謝が正常に起こらない．したがって大理石（骨）musclestemcells，Satellitecells，byanovelmonoclonal病（osteopetrosis）モデルとされる．

antibody．ExpCellRes（inpress），2004．

〝血マウスは自然な筋崩壊・再生が繰り返されるため，

5）okabeM，IkawaM，KominamiK，etal：lGreenmiceTasa

マクロファージ数の減少を伴った叩々p椚血での筋再生

SOurCeOfubiquitousgreencells．FEBSLett407：313−19，を調べたところ，筋再生の遅延が組織化学的に見出さ1997．

れた（データは示していない）．再生遅延は筋組織の部
位によるバラツキが大きいため，EBDを投与して，障−45−

造血組織に由来する筋幹細胞の同定と生者に関する研究
平 家 俊 男＊研究協力者 吉本 桃子＊，塩田光隆＊，春山 宗忠＊＊，中畑 龍俊＊【緒 言】

GFP（CloneTeq社），ラミニン（DAKO社）．次にアル

近年，造血幹細胞移植を受けた個体において，骨格

カリホスプアターゼ（ALP）或いはCy3の二次抗体で筋を含む様々な組織に，ドナー由来の細胞が分化する染色（共にJacksonImmunOResearch（JIR）社）．ヘキス

ことが示された．この現象は，骨髄組織において，1）

ト33324染色にて核染色．染色後00n旭顕微鏡（0bmp心

造血組織の枠を超えて様々な組織に分化し得る幹細胞社）にて観察．

が存在する，2）造血幹細胞が造血組織の枠を超えてSinglecellculture（単繊維培養）：排腹筋をコラゲナー

分化し得る可塑性を有する，という2つの可能性を示

ゼで37℃90分処理し，単一筋繊維を採取しマトリゲル

唆する．一方，組織の枠を超えた分化は，レシピェン

でコートした24ウェルプレートにのせ10％ウマ血清／

トの組織細胞とドナーの造血細胞との融合により生じ0．5％血ckenibryoextract（CEE，Giko社）／DMEM（Sigma

るとの報告もある．骨格筋再生の機構において，上記社）にて培養．4日日に20％FCS／10％ウマ血清／1％の3種類の機構のうち，どの機構が主となる再生機構

CEE／DMEMに変更．8日目に2％FCS／10％ウマ血を担うのか明らかではない．今回我々は，GFPトラン

清／0．5％CEE／DMEMに変更し培養を続けた．

スジェニックマウスに由来する造血幹細胞分画を用いて，

PCR：KSL細胞移植後6ケ月後の俳腹筋から行った単繊

放射線照射マウスや，C−kit遺伝子の変異を有し幹細胞

維培養のウェルよりDneasy Tissue Kit（QUIAGEN社）

が減少するW／Wマウスに移植し，骨格筋再生過程におにてDNA採取．GFPプライマーは（5，−3，）；CTG GTC

ける役割について検討した．さらに，骨髄に存在する

GAGCTGGACGGCGACG及びCACGAACTCCAG

非血球細胞より，骨格筋細胞に分化する細胞の同定を

CAG GAC CATG，neStedGFPプライマーは（5，−3，）；

試みた．

ACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA及びCTT CTC
GTTGGGGTCTITGCTC．

1．骨髄造血幹細胞から筋肉分化に関する検討
【方 法】

【結 果】

細胞：GFPトランスジェニック（Tg）マウス（C57BIJ6）の骨髄細胞を脛骨，俳骨から採取．ビオテン化一次抗WT：GFPTgマウス由来KSL細胞（CD45陽性を確認）
を致死量照射したWTマウスに移植し，蛍光顕微鏡及体（CD3，CD45RIB220，Mac−1，Gr−1，Ter119，全て

び免疫染色にてGFP陽性細胞を観察した．移植後3日

PharMingen（PM）社）を反応させ，autOMACS（Militenyi

目にはGFP陽性筋線経は検出されなかった．移植後10

Biotec社）にて1ineage陰性（Lin−）細胞を採取．次にLin一細胞をScal−PE抗体とC−kit−APC抗体（共にPM社）

筋等の全身筋組織にてGFP陽性筋線経が観察された（図日目と20日目では肋間筋，大腿四頭筋，腹壁筋，外眼に反応させ，FACSVantage（BectonDickinson（BD）社）
にてC−kit陽性Scal陽性Lin陰性（KSL）細胞を採取．

1−A）．横断面では様々な大きさの筋線経が存在し，そ移植：GFP Tgマウス由来の1−5xlO3KSL細胞をWTーを形成する傾向にあった．筋組織内の総核数に対す（C57BL／6）由来の2x105骨髄細胞と共に，9．OGy全身照るGFP陽性細胞の比率はこれまでの報告より多く，5−射したWT或いはmdx（C57BL／10）成人マウスの尾静20％であった．移植後30日以降はGFP陽性筋線経は観脈より静脈注射．日齢0−3のW／Wvマウス（C57BL／6）

察されなかったが，いくつかのGFP陽性単核球がラミの場合は非照射で前顔面静脈より注射．

ニン直下に検出された．wvマウスへの移植群ではど

免疫染色：筋組織を4％paraformaldehydeで固定LOCTの時期においてもGFP陽性筋線経は全く検出されなか

コンパウンド包埋後に−30℃凍結保存．クライオスタッ

ったが，移植後30日目にいくつかのGFP陽性単核球がトで厚さ7匹mの凍結切片を作成し，一次抗体反応；

ラミニン直下に存在していた．wT及びWvマウスとの中心に核が局在していた．それら筋線椎はクラスタ＊京都大学医学部小児科，助教授＊＊京都大学大学院医学研究科医学研究科発達小児科学ー46−

も移植後6ケ月の単線維培養では筋線経の増殖を認め，遊培養群に分けた．直接分化群はconfluentになった時

ALPで染色されるGFP陽性筋線経が存在した．更にnested PCRによりGFP DNAを検出した．移植後30日

点で5−aZaCytidine（5−aZa，Sigma社）5匹M／2％FCS／
IMDMに変更．24時間後に2％FCS／IMDMに変更し2以内の早期では単線維培養からの筋線経の増殖は認め

週間培養した．浮遊細胞群は低接着性条件にて浮遊培

なかった．

養させsphereを形成（図2−B）した後再び平面培養に戻

mdx：GFP Tgマウス由来KSL細胞を致死量照射した

し，COnfluentになった時点で5−aZaで同様に筋肉分化を

mdxマウスに移植し蛍光顕微鏡及び免疫染色にてGFP誘導した・その後ミオシン（zymed社），デスミン（sigma

陽性細胞を観察した．移植後3ケ月と6ケ月の両方にお社），ミオジェニン（DAKO社）を一次抗体とし免疫染

いて，GFP陽性筋線経が全身の筋組織において観察された．これらはALP染色によりGFP陽性である事を確

色（Cy3，JIR社）を行った．又，Sphere形成後の細胞の表面抗原をFACSCaliber（BD社）で解析した．

認した（図1−B）．ラミニン陽性の筋線椎も一部に検出
された．

【結 果】
直接分化群では一度も筋管細胞を得る事はなかった．

Ⅰ．骨髄問質細胞からの筋肉分化に関する検討

浮遊細胞群では筋管細胞様に変化する細胞を得た（図【方 法】

2−B）．これらはミオシン，デスミン，ミオジェニンが4週齢のC3上昨Ie雌マウスの骨髄細胞から血eage（皿，陽性であった．sphereを形成した細胞はCD45，CD34

CD8a，Macl，B220，Gr−1，Terl19，全てPM社）陰性

陰性で，Scal，CD105，β1インテグリン，CD44，VE

細胞を採取し，20％FCS／IMDM（Sigma社）にて培養

カドヘリン（全てPM社）が陽性であった．

し，Sub−COnfluentになった時点で継代．これを繰り返し
ある程度均一な細胞が得られた時点で直接分化群と浮A 移植後20日（WT群）

B．移植後6ケ月（mdx群）
星印；GFP陽性筋線維

図1骨髄造血幹細胞移植後GFP−ALP染色

A・浮遊培養7日目のsphere（x200）

B．5−aZaCytidine添加14日目の筋管細胞（x40）

図2 骨髄問質細胞からの筋肉分化−47−

いて，検討を進めていく必要がある．

【考 察】
骨髄組織は，造血細胞の基となる造血幹細胞と，造【結 論】

血幹細胞の生存，増幅，分化を支持する微少環境を形成するストローマ細胞から成る．さらに，ストローマ

lin−の造血幹細胞分画に，骨格筋再生に寄与する細胞

細胞には，脂肪細胞，軟骨細胞，筋肉細胞などの分化群が存在することを明らかにした．この細胞群は，移し得る間菓系幹細胞が含まれることが近年の研究で明植後早期の骨格筋再生に寄与するとともに，移植後後らかとなった．この分類に従うと，骨格筋は閉業系幹期には，骨格筋幹細胞として存在することが判明した．

細胞より増殖分化する．しかし，閉業系幹細胞よりの一方，非血球細胞郡にも，骨格筋へと分化する細胞群

骨格筋への分化効率は低く，造血細胞移植による骨格が存在することも明らかとなった．

筋再生への寄与度については検討の余地を残している．
今回我々は，まず従来造血幹細胞と分類されているIin一【参考文献】

細胞分画を移植することにより，筋肉再生機構につい1）HeikeT，NakahataT：ExvivoexpanSionofhematopoieticて解析した．レシピェントマウスとして放射線照射を

stem cells by cytokines・BiochimBiqphysActa1592：

行った正常マウス，C−kit遺伝子に変異を有し造血幹細313−312，2002．

胞の数的減少をきたすW／Wマウスを用いて検討したと

2）Ito M，KobayashiK，Suzue K，Kawahata M，et al：

ころ，移植後早期において，GFP陽性の骨格筋が多数

NOD／SCIDgcnullmouse：Anexcellentrecipientmouse

観察され，移植造血幹細胞の骨格筋への分化が示唆さmodelforengraftmentofhumanCells・BloodlOO：3175−

れた．GFP陽性筋肉は長期の観察では認められなくな

3182，2002．

るが，SinglefibercultureにおいてGFP陽性の筋芽細胞

3）HiramatSuH，NishikomoriR，HeikeT，etal：Completeが同定され，骨格筋幹細胞に分化し得ることも観察さ

reconstitution ofhumanlymphocytes drom cord bloodれた．この結果は，従来造血幹細胞として捉えられて

CD34＋Cells using theNOD／SCID／γcnuu mice model・

いたlin一細胞分画には，造血幹細胞活性とともに，骨格

βわodlO2：873−880，2003．

筋へと分化し得る細胞分画を含むことを意味する．今後，

4）Yoshimoto M，Shinohara T，Heike T，et al：Direct

この分画が，造血細胞，骨格筋細胞に分化し得るより

visualization of transplanted hematopoletic cell

未熟な幹細胞に相当するのか，造血幹細胞としての可reconstitutioninintact mouse organsindicated the塑性あるいはtransdifferentiationとして捕らえるのか，

presenceofaniche・ExpHemato131：733−740，2003・

さらなる検討が必要である．さらに，mdxマウスにお5）MitsuiT，WatanabeS，TaniguchimY，etal：lmpaired

いて同様の移植を行ったところ，移植後早期，後期にneutrophil maturationin trunCated G−CSF receptor−

わたってGFP陽性骨格筋が多数観察された．生体におtranSgenicmice・BloodlOl：2990−2995，2003

いて組織への幹細胞生着には，標的とする組織の障害の存在が必要とされている．mdxマウスにおいて観察された現象は，障害，再生を繰り返しているmdxマウスの骨格筋においては，移植造血幹細胞の生着，骨格筋への分化を促進する分子学的機構が存在することが考えられ，この観点よりの検索も必要と考えられる．
一方，近年，骨髄より血球系マーカーを有しない多分化幹細胞（MAPC）の同定が報告された．我々も同様の多能を有する細胞の同定を試み，様々な体性幹細胞の作成に用いられているsphere法を応用することにより，骨格筋への分化能を有する細胞の同定を行った．現在，この細胞の生体内における幹細胞活性を検討中である．
我々の結果は，造血組織の中のどの細胞群が主として
骨格筋再生に主として寄与するかという問題に，結論をもたらしていない．今後，mdxマウス等を用いて，筋ジストロフィー症の治療には有効な細胞群の同定，および生着部位である障害骨格筋の分子学的機構につー48−

成体幹細胞を用いた心筋再生による心不全治療法の確立

福

田

恵

一＊

研究協力者 藤田 淳＊，板橋祐史＊＊，真鍋知宏＊＊，川口治子＊，八木 崇＊＊【日 的】③GFPトランスジェニックマウスの骨髄細胞を採取し，本研究では骨髄間葉型幹細胞を分化誘導することに致死量放射線照射後の同系マウス（C57BL／6）に骨髄移

より心筋細胞を作製し，心不全治療に応用しうるレベ

植した．2月後マウスの末梢血を採取し，血球系細胞をルに至るまでの基礎研究を目指している．これまでのmcs解析した．また，骨髄血のサイトスピン標本を作研究で骨髄由来の再生心筋がカテコラミンのql受容体，成した．血球系細胞のキメラ率が90％を超えるマウス

β1，β2受容体を発現し，心肥大や心収縮力の増加などに関して，麻酔開胸し左冠動脈結贅により心筋梗塞をの機能を有することを明らかにしてきた．本研究では作成した．梗塞作成の翌日より10日間GCSF，GM−CSF

再生心筋細胞をイオンチャネルの移植する技術の開発を投与した．生存率を観察するとともに，2ケ月後心エを試みることを第一の目的とした．次に，骨髄移植モ

コーにて心機能を評価後に心臓を摘出した．レーザー

デルを用い，生体内の骨髄開業系幹細胞を心筋梗塞巣

顕微鏡により抗心筋アクチニン抗体，抗α−平滑筋アクに移動させ，心筋細胞に分化し得るかいないかを解析

チン（a−SMA）抗体，抗von willebrand Factor（vwF）

した．幹細胞が骨髄から心筋梗塞巣に速やかに移動さ抗体とDAPI（核染色）の共染色により心筋組織再生について解析した．

せるため，各種サイトカインを使用し，その影響も観察することを第2の目的とした．

【結 果】
【方 法】

①cMG細胞では5−アザシチジンによる最終分化誘導①再生心筋細胞におけるイオンチャネルの発現：をかける前よりIRKlとMERGの発現が観察された．

CMG細胞に最終分化誘導を行う前後で恥を採取した．

これは最終分化誘導をかける以前に静止膜電位を呈す

心筋細胞に発現することが知られているイオンチャネることが示唆された．洞結節型の活動電位を呈する分

ルIca，L，If，IKl，IK，Ach，IK，ATP，Ⅰ【。，IKs，Ⅰむを形成する

化誘導後2週頃よりHCN4，Caαlc，KV1．4の発現が観サブユニットの発現をRTPCR法を用いて観察した．具察された．これはこの時期にペースメーカー電位を生体的にはkl（ⅡⅨ1，Ⅱはコ），Im（MERG），IKs（KvLqTl，

じるげ電流とIc止電流が記録されることを示唆していた．

minK），Ito（KVl．2，KVl．4，KV2．1，KV4．2，KV4．3），

心室筋細胞型を呈する4週以後にはHCNl，KV2．1，m．2，

kガP（Km6．1，KR6．2，SUR2A，SUR2B），kACh（GⅡⅨ1，

IRK2，KIR6．1，KIR6．2，SUR2Aの発現が観察された．

GRK4），If（HCNl，HCN2，HCN3，HCN4）の発現を解析

これはCMG細胞がIK，Å汀，Ito電流を発現することを示し，した．同時にCMG細胞にパッチクランプ法と活動電

この時期に心室筋細胞型活動電位を呈することを説明

位を記録することにより遺伝子発現と機能の相関を検討した．

し得る現象と考えられた．分化誘導後6週までの時点
ではKVl．2，KV4．3，KvLQTl，minK，GIRKl，GIRK4②再生心筋細胞の移植：の発現は認められなかった．これはCMG細胞がIKs，

ミオシン軽鎖−2VのプロモーターにGFPを組み換えた

ⅠX，Achを発現しないことを示し，CMG細胞が心房筋の表遺伝子を発現させたCMG細胞に分化誘導を行い，心筋現型を取らないことと一致する所見と考えられた（図1，細胞のみをmcsにて単離した．単離した細胞をマウス

2）．

心臓に移植し，移植心を解析した．移植細胞のマーカ②cMG細胞をマウス心臓に移植すると，移植された

ーにはGFPだけでなく，アデノウイルスにlacZを組み細胞はレシピェントの心筋細胞と平行した走向を示した．

込んだ遺伝子改変ウイルスを感染させ，lacZを発現させた．

移植細胞は3カ月以上はレシピェントに生着することが観察された（図3，4）．

＊慶應義塾大学医学部心臓病先進治療学＊＊慶應義塾大学医学部呼吸循環器内科
ー49−

CMG（叫」裏ET）
M O

24

CMG如）」：L即

6・＋

M O

24

6・十

■600bp G旧Kl
288bp

GlRK4

CMGtWk）
M O

24

6

−

H（RTI
＋

CMG神明」出p4245bp

KIR6．2

M O

24

6

−

＋

350bp

557bp MERG

4600bp SUR2A
452bp KvLQT1

l396bp550bp 節晒1
4414bp→■286bp

晶山（HE染色およびLacZ染色）
図3 再生心筋細胞移植後4週間目の組織像（HE染色およびLacZ染色）
図4 再生心筋細胞移植後4週日の組織像③梗塞後2ケ月の時点での生存率は生食投与群では約

掛召凶於60％，G−CSF投与群で約90％であり，著明な生存率の改善を認められた（図5）．一方，GM−CSF投与群では生食投与群に比し急性期の死亡率の増加が観察された．

些誓慧冨蒜迅GM−CSFを投与した群では急性期において梗塞巣に多数のCD45陽性，MACl陽性のマクロファージの浸潤を認めたが，G−CSF投与群ではCD45陽性細胞は認めるもののMACl陽性の細胞は有為に低かった．梗塞後2か

lo

10

20

30

40

月の段階の心エコーによる解析ではG−CSF投与群では梗塞作製（−1日）

生食投与群に比べて左室駆出率（EF）の上昇，左室拡
図5

張末期径（LVEDD）の短縮が観察され，心機能の改善を認められた．一方，GM−CSF投与群ではEFの低下，
Ⅰ〃EDDの拡大を認め，心機能の増悪が観察された．梗
塞後2ケ月の時点での組織では梗塞部位に一致してGFP
陽性細胞が多数観察され，その一部は心筋，血管内皮，
平滑筋細胞の抗体と共染色され，骨髄幹細胞により組織再生がなされていること，G−CSF投与によりこの50−

図6骨髄由来のGEP陽性再生心筋細胞

GR｝陽性細胞が著しく増強することが観察された（図6）．

frOm mesenchymalstem cells for cardiovascular tissue

GFP陽性細胞中の心筋細胞の占める割合は10％程度でengineering．Artdicial0TganS25：183−193，2001．

あり，残りの細胞の多くは抗アクチこン抗体，抗SNA2）TbharaS，FukudaK，KodamaH，etal：PotassiumChannel

抗体，抗vwF抗体の染色が陰性であり，線維芽細胞樵

BlockerActivatesExtracellularSignalRegulatedKinasesの細胞であると推測された．

ViaPyk2andEGFReceptorinRatCardiomyocytesK＋
ChannelBlocker−Evoked Signalsin Cardiomyocyte．J【考 察】A〟C（フJJCの豆わ738：1554−1563，2001．

本研究により骨髄細胞由来の心筋細胞はin vivoの心

3）sanoM，FukudaK，KatoT，etal＝ERKandp38MAPK，筋細胞と同様にイオンチャネルを発現し，かつ経時的

butnotNFLl（B，areCriticallylnVOIvedinreactiveoxygenに発現が変化することが明らかとなった．このイオン

SPeCiesTmediatedinductionofILL6by anglOtenSinIIin

チャネルの変化が活動電位の変化をもたらすものと考

Cardiacfibroblasts．CiTtlRes89：661−669，2001．

えられた．再生心筋細胞は移植された後，レシピェン

4）HakunoD，FukudaK，Makino S，etal：Bonemarrow−

トの心筋細胞と連結し，長期間生体心に生着すること

derived cardiomyocytes（CMG cell）expressedが明らかとなった．

functionallyactive adrenerglC andmuscarinicreceptors・

骨髄多能性幹細胞は心筋梗塞時に梗塞巣に移動し，

Crc〟αわ〝105：380−386，2002．

血管内皮・平滑筋・心筋等の組織再生に寄与した．適5）KodamaH，FukudaK，ThkahashiT，etal：RoleofEGF

切なサイトカインの投与は骨髄多能性幹細胞による組

receptor and Pyk2in endothelin−1−induced ERK

織再生能力を向上させ，心機能を改善した．生体内でactivationinratcardiomyocytes．JMoICellCaJdiol34：

成体幹細胞を流血中に誘導し，組織分化することがで

139−50，2002．

きれば，患者本人の幹細胞で組織再生し得る方法を開6）Fukuda K：Molecular characterization ofregenerated

発することができることになり，心筋症その他の心筋

Cardiomyocytes derivedfrom adult mesenchymal stem

全体が障害される疾患の治療にも結びつくものと考えられる．

Cells．C（7円geJ痛αJd乃OmdJJg∫42：1−9，2002．

7）Fukuda K：Use ofadultmesenchymalstem cells forregenerationofcardiomyocyteanditsapplicationtocell【文 献】

transplantation therapy．Bone Marrow7ねn岬Iant32：
S25−S27，2003．

1）FukudaK：Developmentofregenerativecardiomyocytes

一51一8）Fukuda K：Stem cell transplantation as a mode ofregenerative medicine．々nMedAssocationJ46：333−
338，2003．

9）FukudaK：Reprogramingofbonem∬rOWmeSenChymal
stemcensintocardiomy∝yteS．Cb〝peteSRenLhLSBio毎ies
325：1−12，200210）Kodama

H，FukudaK，mkahashiE，etal：Selective

invoIvementofp130Cas／Crknyk2／C−Srcinendothelin−1−

inducedJNK activation．伽ertention41：1372−1379，
2003．

11）AriizumiT，KinoshitaM，YokotaC，etal：Amphibianin
Vitroheartinduction：aSimpleandreliablemodelforthe
studyofvertebratecardiacdevelopment・h7tJDevBio1
47：405−410，2003．
12）FukudaK：Regenerationofcardiomyocytesfrombone
marrow：Useofmesenchymalstemcellforcardiovascular
dssueenglneenng．qわrec加0わ訂41：165−175，2003・
13）YuasaS，FukudaK，TbmitaT，etal：Cardiomyocytes
undergocellsdivisionfbllowlngmyOCardialinfarctionis
a spatiallyand temporallyrestrictedeventinrats・MoI
CellBiochem（inpress）2004．
14）Hisaka Y，IedaM，NakamuraT，et al：Powerfuland
COntrOllable anglOgeneSis by uslnggene−mOdified cells
expresslng human hepatocyte growth factor andthymidinekinase．JAmCoILCaTdiol（inpress）2004・
15）Ieda M，Fukuda K，Kimura K，et al：Endothelin−1
regulates cardiac sympathetic nerveinnervationintherodent heart by controlling nerve grOWth factor
expression・JClinb2VeSt（inpress）2004・
16）Tbkal1aShiT，FukudaK，MiyoshiS，etal：LIFactivatescardiac

L−tyPeCa2＋Channels

viaphosphorylationofserine18290frabbitCavl．2CiTrRes（inpress）2004．
17）FukudaK：Regenerattivemedicineforcardiomyocyte・J甲〟gdA∫∫J（inpress）2004・
18）FukudaK：Applicationofmesenchymalstemcellsfor
theregeneration ofcardiomyocyte andits use forcell
transplantationtherapy・HumanCel113：83−94，2003・

ー52−

ES細胞を用いた筋ジストロフィーの治療法の確立，及び血管におけるジストロフィンの機能解析
木 村 重 美＊
研究協力者Ⅰ．小篠史郎＊，伊藤 薫＊，池澤 誠＊，平沼多加志＊，松倉 誠＊，
三池輝久＊，荒木喜美1，山村研一1，阿部訓也2，丹羽仁史3
Ⅱ．伊藤 薫＊，小篠史郎＊，池澤 誠＊，平沼多加志＊，松倉 誠＊，
吉岡 毅＊，三池輝久＊，荒木喜美1，山村研一1，鈴木 操4，
三輪岳志5，GailD．Thomas6
Ⅰ．ES細胞を用いた筋ジストロフィーの治療法の確立

ミドと応答プラスミドの2つのプラスミドが必要である．

【緒 言】の発現が抑えられ，除去することにより発現が誘導さDuchenne型筋ジストロフィー（DMD）は筋力低下がれるES細胞をクローニングする．つまり，tetraCyCline

進行し，20歳代で亡くなる病である．現在のところ，を除去することにより，ES細胞は筋細胞に誘導される根治治療法はない．近年，ウイルスベクター，細胞移訳である．丹羽ら5）は既にTet−Offシステムに従うES

植などの根治治療に向けて基礎研究がなされている．

細胞を得ている．その細胞（ZHTc6）においてTet−Off

しかし，最もよく研究が行われているウイルスベクタシステムで制御されているcDNAをMyoD遺伝子に入ーは全身投与が出来ないなどの問題がある．

れ替えることにより，MyoD遺伝子がTet−Offシステム

このシステムを利用して，tetraCyCline存在下ではMyoD

しかし，骨髄や骨格筋より分離した筋細胞になる幹に従うES細胞を得る．

細胞（SP cell，MDSCs）を経静脈的にマウスに投与したところ1）2）3）全身の骨格筋へ移行し筋線経になること

1．ES細胞（Zmc6）の培養が解明された．この方法により筋ジストロフィーの治ZHTc6の維持にはGMEM，15％KnockoutSR（Gibco），

療が可能であることが示唆された．しかし，この骨髄

LIFlOOOUhnl，SOdiumpymVate，nOn−eSSentialaminoacids，由来の細胞は骨髄細胞の1％以下であり，また未分化

2−merCaPtethanol，doxycyclinelOO ng／ml，ZeocinlOの状態で長期培養できないなどの欠点がある．

ドg／mlの培養液を使用した．ゼラチンコートデツシュを一方，ES細胞（embryomiCstemcell）は多分化能を保使用し，維持には3日毎に細胞をトリプシン処理し，ったまま長期培養が可能であるが，以下の問題点がある，播種した．相同組替えの起きたクローンを椎持するた

1つは筋細胞のみに分化するように制御することが困めの培養液は，前述の維持培養液にG418150 匹g／ml，難ということ，2つ日はこの細胞を個体に導入した場合，

Hygromycin80Llg／mlを加えたものを使用した．分化を腫瘍形成が認められること，3つ目は免疫反応を回避誘導するための培養液は，GMEM，4％FBS，SOdium

できないと言うことである．その1，2の解決のために，

pyruVate，nOn−eSSential amino acids，2−merCaPtethanol，

Tet−Offのシステムを利用して筋細胞への分化を誘導すG418150pghnl，Hygromycin80pghnlを使用した．

る転写因子であるMyoD遺伝子4）を人工的に制御し，

2．Supertargeting法（図1）

ES細胞を筋細胞に分化させ，その細胞を用いて治療に応用する．

モーター領域とエdCZ遺伝子とでMyoD遺伝子をはさん応答ベクターと相同性があるtetracycline反応性プロ
だSupertargeting Vectorを作製した（図1）．100LLgの【方 法】

Supertargeting Vectorを3xlO7個のZHTc6細胞にTet−Offシステムとはtetracycline存在下では日的遺伝

electroporation法で導入した．その後，doxycycline存在子の発現が抑えられ，除去することにより発現が開始下でG418の濃度を200または300匹g／mlとしてスクリされるシステムである．このシステムには調節プラス

ーニングし，10〜14日後にコロニーを20個ピックア＊熊本大学医学部附属病院発達小児科
1．熊本大学医学部附属病院臓器形成
2．理化学研究所筑波研究所バイオリソースセンター
3．理化学研究所発生・再生科学総合研究センター

4．熊本大学動物資源開発センター
5．大阪大学遺伝情報実験施設
6．Dept．ofIntemalMedicine，HypertensionDivision
UTSouthwesternMedicalCenter，USA
ー53−

ZHTc6細胞

した．

【結 果】
1．Supertargetlng

SupertargetingVectorをZHTc6細胞に導入後Southem

Superはrgetlng
VeCtOr

MCl tk里相同組替えが起こる

blotting法にて3．2kbのバンドを確認し，相同組替えによりOct3遺伝子がMyoD遺伝子に置き変わったクロー

ヱi誓空MCl止弧．bZ．慧甘卜

ンを3個得た（図2）．これらのクローンはいずれもdoxycycline存在下でLLZCZ染色が陽性であった．

図1Supertargeting法
ZHTc6細胞は調節プラスミドと応答プラスミドを持っており，Supertargeting Vectorは応答プラスミドとDNA配列が相同性がある部分があるためにこれを導入すると一定の確率で相同組替えを起こす．tTA：tetraCyCline−COntrOlledtransactivator，TRE：
tetl・aCyCline，reSpOnSeelement，IRES：enCephalomyocarditisintemalribosomeentrysite，MCltk：herpessimplexviruSthymidinekinase（HSVtk）genewithOutpAunderthecontrolofMClexpressionunit

SacISupert嘲ing表芸
Vector

（PyFlOlmousepolyomaviruSmutantenhancer＋HSVtkminimal

SacI＿旺二つ腰m×My。。×i

promoter）

ZHTc6−MyoDップした．その後一カ月間で十分な増加が得られた細胞について，Southemblotting法およびLacZ染色でOct3遺伝子がMyoD遺伝子に相同組替えがおこっているク

1（B）

ローンを確認した．southem blotting法の際にはその細

2

3

4

5

6

C

4．8kb一−胞よりDNAを抽出してSacIで切断し，プローブには

3．2kb→

pcHllO（LacZ遺伝子を含むプラスミド）をSacIとEcoRVで切断して得られた800bpの切断断片を

図2 相同組み換え体の解析（A）相同組み換え体の解析方法（B）southemblotting法によるSupertargetingVectorをZHTc6細胞に導入後ピックアップしたクローン（1〜6）の解析．相同組替えの起きたクローン（3，5，6）ではMCl tkプロモーター内のSacIサイトの存在のため3．2kbのバンドが生じた．C：

GeneCleanIIを用いて精製してこれをプローブとした．

3．分化誘導維持のための培養液よりdoxycyclineを除去し，分化誘導培地に変更した．まず，MyoD遺伝子が発現するか

Control（ZHTc6）

Westem blotting法で確認した．その後，連日細胞の形

2．hvitroでの分化誘導

態を経時的に観察した．その細胞よりタンパクを分離し，筋分化マーカーの発現をWestemblotting法で解析した．

MyoD遺伝子に入れ替わったクローン（以下，4．Westemblotin

ZHTc6−MyoDと呼ぶ）をdoxycyclineを除去した分化培

12．5％のポリアクリルアミドゲルで24mAで2時間か養液中で培養するとWestern blotting法でMyoDタンパ

けて電気泳動し，80Vで2時間かけてメンプレンにクが発現していることを確認した（後述）．その後，経blo血gした．一次抗体については，抗血加n抗体（SKiMA
D1033）は1：100，抗myogenin抗体（SIGMA M5815）

時的にその細胞の形態を観察した．doxycycline除去後3
日目から4日日にかけて約80％の細胞が死滅し，生存はl：10，抗myoD抗体（DAKO M3512）は1：10，抗fast

した細胞の中で5日目で丸いES細胞が突起をだし，7MyosinHeavyChain（fMHC）抗体（SIGMAM4276）は

日日には癒合を認めた．その後10日日で自発的に収縮

1：100，抗actin抗体は1：200で使用した．二次抗体はビを始め収縮の強いところではディッシュから剥離する

オチン化抗マウスIgG抗体を使用し，ABC法により発色反応を行った．

細胞が観察された．（図3）5．nude−mdxマウスへの投与

ZHTc6−MyoDを分化誘導してLACZ染色を施行したが，マイオチューブとなった細胞はエdCZ陽性線経は認めな

3．分化誘導後の上dCZ染色

in vitroで筋細胞へ分化誘導が確認されたZHTc6を
doxycycline除去して2日後に，3xlO6個をnudeTmdxマウ

かった．

スの俳腹筋へ筋注した．その後，14，49日後，投与部

4．筋分化マーカーによる検討

位より骨格筋を分離し，投与した細胞が筋線経に分化

ZHTc6−MyoDを分化誘導かけると，l日日からMyoDの発現が認められた．3日目以降にはdesminが発現し，したかどうかをdystrophin染色，LacZ染色により検討
ー54−

【考 察】

3〜5日目までmyogenin，そして10日目以降にMHCの発現が確認された（図4）．

Supertargeting法により，MyoD遺伝子がTet−0ffシス

5．nude−mdxマウスへの投与

テムに従うクローンを得ることができ，in vitroでは高投与後，14日目ではdystrophin陽性の筋線経は認めな率に筋細胞へ分化誘導が可能であった．ES細胞よりかったが49日目でdystrophin陽性の筋線経を認めた（図MyoDを発現させて分化させた細胞は形態的にも筋管細5）．しかし，投与した細胞がすべて筋細胞に分化した胞様の形態をとり，最終的には自発的な収縮を観察でわけでなくES細胞由来と思われる顆粒様の細胞が多くきるまでなった．また，筋分化関連タンパクの発現を認め，腫瘍化していた．エdCZ染色では陽性線経を認めなかった．

経時的にWestem blotting法で解析したところ，desminが分化誘導3日目に確認でき，次いで3日日にmyogenれ
10日目にfMHCの発現が確認でき間違いなく筋細胞へ分化していることが証明された．McBurneyらはEC細胞をDMSO存在下でembryoidbodyを作製後，デッシュに接着させると全細胞の5−15％が筋細胞へ分化することを報告している6）．我々の方法で筋分化誘導をかけると一部は死滅するが，生存した細胞の90％以上が分化することがわかった．
しかし，その細胞をnude−mdxマウスへ筋注すると腫瘍を形成し，一部の細胞しか筋細胞へ分化しなかった．

図3 ES細胞より筋管細胞へ分化誘導（A）zHTc6−MyoDの維持培養液中の形態．（B）zHTc6−MyoD
を分イヒ誘導培養液中で培養して10日目．細長い細胞同士が癒合しており，自発的に収縮する細胞も認められる．

Day1
Desmlrl

2

3

4

5

7

10

13

このようなことはマイオブラストや骨髄由来のSP cellでは認めていない．In vitroでは高率に分化誘導がかかるが，in vivoでは高率に誘導がかからない原因は以下のことが考えられる．1．何らかの原因でMyoD遺伝

17子の発現が消失しているかもしれないこと，2．

添〃ゆ薮やね＊やや登Hygromycin，G418を投与しないことにより未分化の維MYL−n持が出来なくなり，筋細胞以外の分化にスイッチが入Myogenln
醗禦攣架空・がW刑った可能性があることなどが考えられる．
また，本来gαCZ遺伝とネオマイシン耐性遺伝子は％T芯甑騨域㍊義盛野遜感感鍼

MClプロモーターで制御しているため，筋細胞へ分化

図4 ウエスタンプロット法による筋分化への解析
ZHTc6−MyoDを分化誘導後，筋分化マーカーの発現の継時的変化をWestem blotting法で解析した．

誘導がかかってもgdCZ遺伝子とネオマイシン耐性遺伝
子は発現しているはずである．この細胞はG418存在下で培養しているためネオマイシン耐性遺伝子は発現している．しかし，bcZ遺伝子の発現は認められなかった．
この矛盾はネオマイシン耐性遺伝子と上αCZ染色の感度の差によるものかもしれない．また，これらの遺伝子の上流のMyoD遺伝子が発現することにより，何らかの影響を及ぼしている可能性も考えられる．
これらの結果より，in vitroにおいてMyoD遺伝子はES細胞を高率に筋細胞に分化させることが証明された．
まだまだ，ハードルが高いものの，ES細胞を用いて筋ジストロフィーに対する細胞治療が可能であることを示唆している．

図5 nude−mdxマウスへのZHTc6−MyoDの導入
腫瘍組織の一部のdystrophln染色（A）とH．E．染色（H．E．）．（B）
nude−mdxマウスの俳腹筋のdystrophin染色（ネガティブコント
ロール）．（C）BlOマウスの俳腹筋のdystrophin染色（ポジティブコントロール）【結 論】
Doxycycline存在下では未分化のまま維持することが可能で，Doxycyclineを除去するとinvitroでは高率に筋細胞に分化可能なES細胞株ZHTc6−MyoDを樹立した．
−55−

Ⅰ．血管におけるジストロフィンの機能解析

この細胞をmdx−nudeマウスに筋注すると一部はdystrophin
陽性線経に分化することを確認した．

【緒 言】【参考文献】

Duchenne型筋ジストロフィー（DMD）では筋膜でジ1）GussoniE，SoneokaY，StricklandCD，etal：Dystrophin

ストロフィン（dy）が欠損しているが，筋壊死のメカ

expressionin the mdx mouse restored by stem cell

ニズム及びdyの生理作用は不明である．現在，筋線経

transplantation．NatuTe401：390−4，1999．
2）Ferrari G，Angelis GC，Coletta M，et al：Muscleの膜に存在すdyが欠損することによりその細胞の安定性がなくなり筋崩壊が始まると言われている（膜説）．

regeneration by bone marrow−derived myogenic

しかし，その膜説では筋の再生壊死がグループをなしてDMD患者の骨格筋では存在することが説明がつか

PrOgenitors．Science279：1528−15301998・

3）caoB，ZhengB，JankowskiRJ，etal：Musclestemcells

ない．そこで，我々は筋線経のdyが欠損することにより，differentiateinto haematopoleticlineages but retain

もともと筋線経が脆弱化しているところに血管の異常

myogenicpotential．肋tCelLBio15：640−646，2003．

が加わり血流の異常が筋崩壊が起こるという仮説を考4）DavisRL，WeintraubH，LassarAB：Expressionofa

えている．DMDの血流異常の検討については1980年

Single transfected cDNA converts fibroblasts to

代後半から90年代前半にかけて骨格筋由来のnNOSがmyoblasts．CeJJ51：987−1000，1987．

産生するNOが筋収縮時の血管拡張に大きく関わってい5）NiwaH，MiyazakiJ，SmithA：Quantitativeexpression

ることが報告されるようになってきた．C加mgl）や¶皿3）

Of Oct3／4defines defferentiation，dedifferentiation orのグループが90年代後半に筋ジストロフィーにおける

self−reneWalofEScells．NatGenet24：372−6，2000．

血管機能の異常を報告している．すなわち，正常では6）McBumeyMW，Jones−VilleneuveEM，EdwardsMK，et

骨格筋由来のnNOSがα−adrenergiCな血管収縮を減じる

al：Controlofmuscleand neuronaldifferentiationina

が，dyを欠くDMDやそのモデル動物のmdxマウスでCultured embryonalcarcinoma cellline．NatuTt，299：

はdy欠損によりnNOSも減少するため，運動時に虚血165−7，1982．

状態となり，それがDMDの病態の進行に大きく関わっているというものである．それは以前考えられてきたような構造的な虚血ではなく，微小で局所的・機能的な虚血状態である．
我々はDMDで筋壊死が起こるメカニズムにはnNOSの関与などによる血管平滑筋の機能障害に伴う異常と血液凝固系の克進が大きく関与していると考えている4）．
そこで，mdxマウスの血管平滑筋のみにdyを発現させるトランスジェニックマウス作製し，血管病変に由来する筋壊死の有無を検討すればdyの生理機能についての大きな情報が得られるのではないかと考えた．
【方 法】
1．トランスジェニックマウス作製用のコンストラクト

トランスジェニック作製用のコンストラクトに必要な制限酵素，ApaI，SpeI，HindIII，Nod，SalI，hRI，PstI，のサイトを持つオリゴDNAをまず作製する．このオリゴDNAをBluescriptIIKS−のApaIとPstIで切断したベクターにライゲーションする．その後，そのサイトを利用してSV40のPolyA signal，心臓と平滑筋特異的に発現させる（骨格筋には発現させない）ヒトsmoothmuscleα−aCtin promoter（SMAp）1），ジストロフィン

cDNAをライゲーションする．

ー56一

志した．次に刺激により筋を収縮させ，筋張力がピー

2．ジストロフィン発現の確認

作製したコンストラクトがdyを発現するかC2C12細ク時の50％まで低下した時にNEを安静時と同量投与し，胞にトランスフェクションして導入しdyの発現を確認

血流を測定した．また，別に頚動脈にカテーテルを挿する．

入し，経時的に血圧を測定した．

3．トランスジェニックマウス作製
走法に従いマウスの受精卵に作製したコンストラク【結 果】
1．トランスジェニックマウス作製

トをマイクロインジェクションし仮親マウスに戻しト
ランスジェニックマウスを作製する．

トランスジェニックマウス作製用コンストラクト

4．トランスジェニックマウスの確認（SMAp−dy−An）を図6に示す．

マウスのしっほよりDNA抽出し，プライマー5−−
TGCTCACGAGAACACATGATA−3．とSV4（）
i11「．1日

5．−
SmOOth muscl
α−aCtin

AGTGTATATCAAGGCAGCGAT−3一を使用しPCR法とH l】
m an fuH Iengtb dystrophin

promoter

P（
）
ly A
Si
g na】

プロモーター部位をプローブとしてPstIにてDNAを消図6 トランスジェニックマウス作製用コンストラクト
ヒトsmoothmuscle（1−aCtinpromoterの下流にヒトの14kbのfu11
1ength dystrophinをつなぎ，さらにその下流にSV40のpolyA
signalをつないだ（SMAp−dy−An）．

化しサザンプロット法を用いてコンストラクトが導入されているか確認する．
5．Tg／mdxマウスの作製

トランスジェニックマウスをmdxマウスと交配させ，

SMAp−dy−AnをC2C12細胞に導入した後，ジストロmdxマウスの血管に於いてdyが発現しているトランス

フィン染色をして，dyの発現を調べた結果，約20％のジェニックmdxマウス（Tg／mdx）を作製する．ジスト

細胞がdy陽性であった．
SMApTdy−AnをC57BL／6のマウスの受精卵約800個にロフィン抗体dy60（ホフマン博士より供与）を用いて血管平滑筋におけるdyの発現を確認する．

マイクロインジェクションし，仮親マウスの子宮にそ6．Tg／mdxマウスにおけるdyの組織分布の卵を戻した結果，41匹のマウスが生まれた．生まれ

定量PCRを用いてdyの各臓器における定量を行った．

たマウスのしっばよりDNAを抽出後，プロモーターのTg／mdxマウスの大動脈，骨格筋，心筋，肺，脳，小腸，一部をプローブに用いてサザングプロテイング（図7）

肝臓，精巣，腎臓からTRIzol（Invitrogen）を用いてを施行し，SMAp−dy−Anがに導入されているかを確認し

totalRNAを抽出し，reVerSetranSCriptaseを用いてcDNA

た．また，同時にプロモーター領域とdy領域にプライを作成した（SuperScriptFirstTStrandSynthesisSystemfor

マーを設定しPCR法でも確認をした．その結果，7匹

RT−PCR：Invitrogen）．ヒトdyに特異的にプローブとプのトランスジェニックマウスを得ることができた．こ

ライマーを設定し（プライマー；5一一AGACCTTGGGCAGCTTのうち1匹が原因不明で死亡した．結局得られたトラGAAAAT3

ンスジェニックマウスは6匹である．その内3ラインと5一一GGAGATAACCACAGCAGCAGATG−3一，

プローブ；5がmdxマウスと交配し継代することが可能であった．

−TTGAAGACCTTGAAGAGC−3I），PRISM

7700（AppliedBiosystems）を用い以下の条件でrealtime
RT−PCRを行なった：50℃2分，95℃10分，95℃15秒のアニーリングの後60℃1分の伸長反応を40サイクル．
結果は18S rRNAの発現量を内部標準とし，その相対値を求める検量線法により表した．
7．Tg／mdxマウスにおける血管の機能

momasの方法を用いて血管機能の解析を行った3）．

lkmlan（lystropll如cDXA

マウスを麻酔した後，左下腿三頭筋を膝蓋腱を介してⅠ一㌔11−Psll

トランスデューサーに接続し，左座骨神経を露出して，PrOb。

運動開催の2−3倍の電圧で100Hz，0．2msの電気的刺激

図7

サザンブロッテイング法によるトランスジェニックマウ
スのスクリーニング
プロモーター内部にプローブを設定した．41匹中2匹は解析前に死亡したため，合計39匹についてサザンブロッテイングを行ない，7匹のDNAにおいてトランスジーンの導入を確認した．

を1分間に30回の頻度で10−20分間行なった．右大腿動脈にカテーテルを挿入し，まず安静時にnorepinephrin（NE）を投与し（6．3−12．5ng），左大腿動脈周辺にドップ
ラープローブを設置してVF−lpulsedDopplerflowsystem（CrystalBiotech，Holliston，MA）を用いて血流速度を測−57−

2・トランスジェニックマウスのdyの発現

筋収縮時−15．1kHz／S，ク＝0．004）．血管のコングクタンス

まず，Tg／mdxの肺の血管の平滑筋特異的にdyが発現の変化も同様の結果で，C57Bl／10では安静時にNEを投していることを確認した（図8）．ついで，マウスのラ

与するとコングクタンスの低下は大きいのに対し，筋インにおけるdyの各臓器における発現を定量PCRで検収縮時の投与ではコンダクタンスの低下は有意に減少討した結果を示す（図9）．その結果，骨格筋にはdyが発現せず，平滑筋特異的にdyが発現していることが確認できた．

していた（コンダクタンスの変化：安静時−0．301kHz／
mmHg／S，筋収縮時−0．072kHz／mmHg／S，P＝0．000026）．
mdxマウスではNEを投与した場合コングクタンスの低下に安静時と筋収縮時の間には有意差はなかった（安静時−0・558kHzhnmHg／S，筋収縮時70．649kHzhnmHg／S，
p＝0．112）．これに対し，Tg／mdxにNEを投与した場合，筋収縮時のコングクタンスの低下は安静時に比べ有意に鈍化した（安静時−0．528kHz／mHg／S，筋収縮時−0．36
kHz／mmHg／S，P＝0．020）（図10）．以上より，筋収縮時にmdxでみられたα−adrenergicな血管の収縮による血流の低下は血管平滑筋にdyが存在することにより代償さ

図8 dystrophinの発現
dystrophin抗体（dy60Kd）を用いて肺の血管の免疫染色を行なった・TghndxではC57マウスに比べやや弱いもののdystrophinの発現が確認できた．他のラインのTg／mdxマウスも同様の結果であった．

れ野生型のパターンに近づくことが証明された．

図10 NE投与による血管コングクタンスの変化
C57，mdx，Tg／mdxのマウスに安静時及び筋収縮時にNEを
経動脈的に投与した．Mdxでは筋収縮時も血管は全く拡張しないのに対し，Tg／mdxではC57マウスのように筋収縮時には血管の収縮が減弱していることが分かる．

図9 RT−PCRによるdy発現の定量
脳，肺，心臓，大動脈，腎臓，肝臓，小腸，精巣，骨格筋から
totalRNAを抽出し，realtimeRT−PCRによって各組織での発現量の相対値を比較した．心臓及び平滑筋組織に高い発現を認める一方，骨格筋には極わずかの発現しか認めない．

【考 察】
SMAp−dy−Anの作製は全長で19kbである．ベクターの長さを含めると22kbあり，プラスミドの増殖できる

3．Tg／mdxにおける血管での機能限界の長さである．このコンストラクトは通常の方法

コントロールのC57Bl／10マウスにおいては安静時のでは作製できなかった．よって，必要な制限酵素のサ

血流はNEの投与によってベースラインの値から大きく

イトを人工的に作製し，そのサイトを利用して容易に低下する一方，筋収縮時には低下は小さく，両者の低

このコンストラクトを作製することが出来た．

下の程度には有意な差があった（血流速度の変化：安筋分化の過程でdyの発現はマイオチューブより確認

静時−18・8kHz／S，筋収縮時−3．6kHz／S，ク＝0．000077）．こできるようになる．C2C12細胞はマイオブラストであれに対し，mdxマウスではNEを安静時に投与した場合るため，dyの発現を認めない．ヒトsmoothmuscle（ユーの血流の低下の程度と筋収縮時の血流の低下の程度はactin promoterでは，マイオブラストで遺伝子の発現は有意差はなかった（安静時−31．9虻もめ，筋収縮時−29．9姓Ⅰ水，可能である・よって，C2C12細胞にSMAp−dy−Anを導

ク＝0．粛∫）．これはnomasらの報告と同様の結果である2）．

入後，dy陽性細胞を認めれば，このコンストラクトがこれに対し，Tg／mdxでは安静時の血流の低下はmdxとdyを発現することが可能と考えてよい．

同程度であったが，筋収縮時には安静時に比べ血流低三輪らはヒトsmoothmuscle（ユーaCtinpromoterにレポー

下の程度は小さく，鈍化していた（安静時−25．9kHz／S，ター遺伝子であるCATをつなぎトランスジェニックマ

−58一

ウスを作製し，そのプロモーターの特徴を調べた結果

捌，5：15090−5，1998．

心月蔵と平滑筋に特異的にCATが発現していた．我々も

4）Miike T，Sugino S，Ohtani Y，et al：Vascular

このプロモーターを使用してdy遺伝子が平滑筋特異的

endothelial cellinjury and platelet embolisminに発現していることを定量RT−PCRで確認した．よって，

Duchennemusculardystrophyatthepreclinicalstage．

Tghndxはdyが骨格筋で発現せずに血管平滑筋に特異的

J〃g〟rJ∫cf82：67−80，1987．

に発現しているマウスである．このマウスを使用して

5）MikaelS，BalmanC，ShannonA．H，etal：Functional

血管の機能及び骨格筋での筋崩壊を解析すれば血管平muscleischemiain neuronal nitric oxide synthase−

滑筋におけるdyの機能が明確になる．

deficient skeletal muscle of children with Duchenne

nomasらは1998年に，mdxマウスを用いて血管の運musculardystrophy．PIVC肋tlAcadSciUSA97：13818−

動時の血管に於いてアドレナリン投与後，その血管が拡張せず，収縮した状態が続き一過性に虚血になることを報告している3）．その原因はdyに結合している骨格筋由来のnNOSの欠如であるとしている．ついで，2000年Duchenne型筋ジストロフィーの血流を調べ，DMDの患者においても運動時の反射性の交感神経活動
状態では血管収縮が減弱されず，血流調節が障害されていると報告し，骨格筋のnNOSの欠如が原因であることを示唆している5）．しかし，我々の研究では血管平滑筋のdyが回復することにより血流調節能が改善していることから，血管平滑筋においてdyと結合している
nNOS関与もあることが示唆された．但しTg／mdxでは組織像などの表現型が改善していない．免疫染色の結果から血管におけるdyの発現が野生型のC57Bl／10マウ
スに比べ弱い可能性があり，これが血流の改善が完全ではないことの一因になっていると考えられる．血管の機能がさらに回復すれば表現型も回復することが考えられ，これらの検討は今後の課題である．
【結 論】
我々は平滑筋のみにdyを発現するTg／mdxマウスを3ライン作出し，血管におけるdyの機能解析を行なった．
その結果，血管平滑筋にdyが存在することにより筋収縮時のa−adrenergiCな血管の収縮による血流の低下が改善することが分かった．
【参考文献】
1）changWJ，IannaCCOneST，KimSL，etal：Neuronal
nitricoxidesynthaseanddystrophin−deficientmuscular
dystrophy．PrvcNatlAcadScitLSA93：9142−7，1996．
2）NakanOY，NishiharaT，SasayamaS，etal：TranSCriptional
regulatoryelementsinthe5

upstreamand丘rstintron

reg10nS OfthehumanSmOOth muscleαaCtinencoding

gene．Ge〃e99：285−9，1991．
3）GailDT，MikaelS，KimSL，etal：Impairedmetabolic
modulation of alpha−adrenerglC VaSOCOnStrictionin
dystrophin−dencientskeletalmuscle．PIVCNatlAcadSci

ー59−

23，2000．

Ⅱ．分子病態に基づく治療法の開発

ミトコンドリアの病態制御と家族性筋萎縮性側索硬化症の分子治療法開発
井

上

正

康＊

研究協力者 吉良 幸美＊＊
同様に，5種類のFALS変異SODの膜結合能につい【緒 言】
筋萎縮性側索硬化症（ALS）は中年期以降に発症すても検討した．

る進行性神経変性疾患である．ALSの約5〜10％は常4・G93A−SODIFALSトランスジェニックマウス（Tg）

染色体優性遺伝形質をとる家族性（FALS）であり，その病態発症および進行におけるミトコンドリア障害の発症にCu／Zn−SOD（SODl）の点突然変異が関与するの関与を検討するため，ミトコンドリアの遺伝子変異，ことが判明したが，その分子機構は尚不明である．こ

活性酸素産生および酸化障害の程度を解析した．

れまで，SODlの変異が分子構造維持に関与する部位に5．PC−12細胞を用い，カルニテンがミトコンドリア依

集中していることから，その細胞内局在性変化を検討し，正常SODlがミトコンドリアやベルオキシゾームなど

6・カルニテン（400mgn（gkhy）を含む飲水をTgに与え，に濃縮局在していること，および変異SODlでは両膜運動能力，発症時期，進行速度，及び寿命に対するへの結合性が低下していることを明らかにした．また，

カルニテンの作用を検討した．

存性の障害を抑制しうるか否かを検証した．

他臓器に比較してミトコンドリア依存性の高い運動神

7．筋ジストロフィーの発症と病態進行における酸化障経が特異的ターゲットとなることから，本疾患ではミ害の関与を検討するため，筋ジストロフィーマウス

トコンドリア局所での活性酸素病態が増強し，運動神の骨格筋を脂質過酸化やDNA酸化の指標である4−経に選択的なアポトーシスが誘起される可能性が示唆

HNEと8LOHdG抗体でそれぞれ免疫染色し，酸化障された．さらに，ミトコンドリア依存性アポトーシス

害の程度を解析した．

では長銀脂肪酸の膜毒性が重要であることを明らかにし，
FALSの神経細胞死でも本毒性が関与している可能性が【結 果】示唆された．本研究では，FALSにおけるミトコンドリ

1．SODlの細胞内超微局在性の解析

ア障害の関与，及びβ酸化を介して長鎖脂肪酸をエネ

細胞分画法及び免疫学的検討の結果，細胞質局在とルギーに変換するカルニテンの予防治療効果を検討した．

考えられていたSODlが，細胞内ではミトコンドリア
やベルオキシソームに可逆的に結合、局在しているこ【方 法】とが判明した．さらに，ミトコンドリアへの結合は，膜電位依存性であることが判明した．

1．抗ヒト型SODl，SOD2及びベルオキシソーム膜タ
ンパク質PMP−70の特異的抗体を調整した．本SODl

A

抗体はヒトとラットやマウスのSODlを分別検出可能

1

2

3

4

である．wistar ラットの肝と脳より顆粒画分と細胞質画分を調整し，SODlの細胞内局在をWestern
blotting法により解析した．
2．インタクトな細胞内でのSODlの局在性を検討する

2．変異SODlの細胞内局在性変化ため，ヒト繊維芽細胞の免疫形態学的検討，及びSODlと各オルガネラ膜との結合について生化学的検

FALS患者変異型SODlのミトコンドリアへの結合性討を行った．

を検討した結果，解析した変異SODlは何れもミトコ

3．正常および本研究室で発見したAsn86Ser（N86S）

ンドリア膜への結合力が低下していた

変異SODlを酵母で発現調整し，ラット肝ミトコンド
リアとベルオキシソーム膜との相互作用を検討した．
＊大阪市立大学大学院医学研究科分子病態学教室＊＊同大学共同研究室−63−

3．FALSTgマウスの酸化障害
Tgマウスの脊椎と排腹筋の脂質過酸化を検討した結果，病態の進行に伴い過酸化産物が増加し，8−OHdGのレベルも上昇した．
4．PC12細胞のミトコンドリア膜脱分極におけるカルニテンの影響PC12細胞のミトコンドリアは血清除去により脱分極し，ミトコンドリア依存性アポトーシスを誘起する．カル
こチン添加により本脱分極とアポトーシスが抑制された．

図1SODlの細胞内局在A）ラット肝・脳よりミトコンドリア画分および細胞質画分を調整し，抗SODl抗体を用いたwesternblottingを行った．
1：肝ミトコンドリア画分，2：肝細胞質画分，3：脳ミトコンドリ
ア画分，4：脳細胞質画分．
B）皮膚繊維芽細胞を用いた免疫染色像

5．カルニテンの生体内作用

Tgマウスにカルニテン含有水（400mg珠g／day）を摂取させ，その運動能（ロタロッドにより評価），病態発症時期と進行速度，および寿命に対する影響を検討した．

A

1

2

3

4

コントロールに比較し，カルニテン投与群では運動能h−SOD1−

力の低下時期が約1ケ月半も遅延し，寿命も約1ケ月延RaトSODl−

長した．
6．筋ジストロフィーマウスにおける酸化障害

B
1

2

3

4

脂質過酸化とDNA酸化障害の指標である4−HNEおよ

5び8−OHdGに対する抗体を用いた免疫染色の結果，mdx
h−SODl一厳登搬γ

端機

マウスの骨格筋細胞障害は筋束単位で起こること，再Rat−SODl−

生間もない筋においても脂質過酸化反応が克進してい0

酸化反応が顕著に見られ，筋ジストロフィーにおける筋細胞死に酸化障害の関与が示唆された．
MdxnU︵辞︶uO葛でOSSくー霊LP三宅〇一−∑ることが判明した．また，8−OHdG陽性細胞では脂質過

H皐かR

Gも︻S

GいJR

N∞かS

Wt

図2 FALS変異SODlのミトコンドリア結合能
ラット肝より分離調整したミトコンドリアとFALS患者に見られる変異SODlのinvitrobindingassay．
A）1：ヒトSODlのみ，2：ラットミトコンドリア画分（mt）バ
ンドはラットSOD1，3：mt＋wt−SODl，4：mt＋N86S−SODl，B）1：mt＋wt−SOD1，2：mt＋G37R−SODl，3：mt＋G41S−
SODl，4：mt＋H46R−SODl，5：mt＋I113T−SODl．

図4 mdxマウス筋の酸化障害
10ケ月齢のmdxマウスおよびコントロール筋のHE染色および同領域の4LHNE，8−OHdG免疫染色像．

C）ヒト型SODlのバンドを定量グラフ化︵辞︶古土lUく已〇号∈OUOJ【考察及び結論】
これまでに，FALS患者で見られた変異部位の多くはSODl分子の立体構造に影響する部位に多く，変異SODlの多くは分子構造特性が変化していることが示唆されている．SOD

による02￣の細胞内消去反応は拡散

律速的（部位特異的）に起こらなければならない．し
4

6

7

8

Age（moIlth）

たがって，本研究で兄いだしたごとく，SODlが活性酸

9Age（moIlth）

素産生の主産であるミトコンドリアやベルオキシゾー

図3 G93AFALSTgにおけるカル二チンの治療効果
A）運動機能テスト：ロタロッドを用いて3rpm／minの条件
下で病態の進行に対するカルニチンの作用を検討．
B）寿命に対するカルニチンの作用

ム膜表面に結合局在化していることは極めて重要である．
これにより，両オルガネラから細胞質側にリークして一64−

くる02￣をその膜表面で効率良く消去しうると考えられる．FALS患者で見られる変異SODlではオルガネラへの結合能が低下していることより，変異SODlの局在性変化がミトコンドリア膜局所での02￣の消去不全を誘起し，ミトコンドリアの活性酸素傷害が蓄積し，その結果ミトコンドリア依存性の細胞死を誘導する可能性が示唆された．実際，FALSの症状はミトコンドリア依存性の高い運動神経や骨格筋に特異的に発現する．Tg
マウスでの検討でも，病態の進行に伴い酸化障害が増加しており，本仮説は臨床病態の特性とも良く一致する．
本研究では，ミトコンドリア依存性の神経細胞死がカルニチンにより著明に抑制されること，およびFALS
Tgマウスの病態が著明に軽減することも判明した．この所見は，FALS患者でもカルニチンの保護作用を検討してみる意義があることを示唆する．今後，この点に注目し，病態動物モデルおよびFALS患者における病態軽減法を開発したい．
また，筋ジストロフィーモデルマウス（mdxマウス）を用いた検討の結果，FALS同様に，mdxマウスの骨格筋においても筋束単位での酸化障害が起こっていること，
筋ジスに特徴的な中心核を持つ再生筋においても酸化障害が見られることが判明した．以上のことより，筋ジストロフィーの病態発症・進行においてもミトコン
ドリア障害の関与を検討し，FALS同様に筋肉のミトコ
ンドリアを保護するカルニチンの治療効果を検討してみる価値があると思われる．今後，この点に関してさらに検討していく予定である．
【参考文献】
1）KiraY，SatoE，InoueM：AssociationofCu，Zn−Type
Superoxide Dismutase With Mitochondria andPeroxisomes・A℃力βわC鮎mβ甲砂∫399：96−102，2002．
2）ChangBJ，NishikawaM，SatoE，etal：L−CamitineInhibits
Cisplatin−InducedIrtjury of the Kidney and Small
Intestine．AlrhBiochemBiqphys405：55−64，2002．
3）Nishikawa M，NshiguchiS，ShiomiS，et al：Somatic
mutation of mitochondrial DNAin cancerous andnoncancerous liver tissue in individuals with
hepatocellular carcinoma．Cancer ReseaTTh61：1843−
1845，2001．

4）FurunOT，KannOT，AntaK，etal：RolesofLongChain
FattyAcidsand CamitineinMitochondrialMembrane
Pemeability Transition．Biochem Pharmaco162：1037−
1046，2001．

5）新ミトコンドリア学 内海耕怯 井上正康監修．共立出版．2001
ー65一ミトコンドリア脳筋症の分子治療に関する基盤研究後 藤 雄 一＊
研究協力者 小牧宏文書，綿，三牧正好，和泉美奈綿，西野一三＊，埜中征哉綿を新しいシャーレに蒔き直した．

Ⅰ．自然軽快した3243変異を有する患者由来培養細胞

3243変異率の測定は，野生型／変異型に特異性のあの変異率変動に関する研究

るTaq−Manプローブを用いてそれぞれの分子数を測定し，比率を算出した．また，ミトコンドリアDNA仝周のシ【緒 言】
ミトコンドリア脳筋症の原因として，ミトコンドリ

ークエンスは既報の通りに行い，同定されたG185A多型，

アDNA異常が明らかにされた．患者細胞では変異型とT5775C多型，T7080C多型についても，それぞれ特異正常型が混在しており（ヘテロプラスミーという），変的なTaq−Manプローブを作成し，多型の有無と比率を

異型の比率が細胞機能障害と相関することが判明した．

検出する系を作った．これら多型の正常人での頻度は，将来的には，変異型の比率を人為的に変動させることで，200人のデータ（未発表）を用いた．

異常の発現を抑制し，細胞機能を正常に保つ新しい治療法の開発をめざす．そのために，まず変異ミトコン【結 果】

ドリアDNAの細胞内での挙動を決定している因子の同3243変異の比率が時間の経過とともに増加するA系定を行う．ミトコンドリアDNAのヘテロプラスミ一に列と低下するB系列が得られた（図1）．丙系列において，関係する因子として，細胞の種類，分裂能，エネルギ

変異率が増加（もしくは低下）する前後におけるミト

ー依存度，微小環境（血流，糖の濃度）などが挙げら

コンドリアDNAの仝塩基配列を調べたところ，3243変

れる．我々は，DNAの複製・維持に係わる遺伝的素因

異を含む4個の変異が存在した（表1，図2）．そのうち，がもっとも重要な因子と考え，自然経過で骨格筋のヘ5775変異はホモプラスミーで存在していたが，3243変

テロプラスミーの程度が低下し臨床症状も改善した症

異と同様にヘテロプラスミーとして存在していたのは2例から得た線維芽細胞を用い，ヘテロプラスミーの挙個であった．一つは185変異で，3243変異率の上昇と動を検討した．

ともに変異型のAの比率が低下し野生型のGをもつゲ【対象と方法】

ノムの比率が増加していた．もう一つは7080変異であり，

3243変異を有し，骨格筋でのヘテロプラスミーが自185に比較すると3243変異の挙動に一致はしないが，然に低下した女性1）から，インフォームド・コンセン

野生型のTの比率が低下し変異型のCの比率が増加しトの元に線推芽細胞を樹立した．D−MEM／F12十10％FBSていた．さらに詳細に3243変異率の変動との関係を調の培養液で培養し，週に2回の培養液交換，80％コン

べたところ，図3のような挙動を示した．

フルエンシーで1／2をDNA分離，1／4を凍結保存，1／4
3 24 318 5

57 7 5

7080

A

G

T

T
T
（
H o m o）
T ／C（
H etero ）T（
H om o）
T（
H om o）％Ml】址止

W T

100

●A系列
⑳B系列

80

A l

60

A 2

40

B l

20

B2
0

0

0

0

30

40

50

60

70

80

G
10 ％
G
78 弓
も

A
（
H om o）
A ／G（
H etero ）

G
10 冤
G
1 項〉

A
（
H om o）

C（
H om 0）C（
H om o）
C（
H om o）

A（
H om o）

C（
H om o）

Al．A2＝変異率が上昇した細胞系列の培養初期と後期
Bl．B2：変異率が上昇した細胞系列の培養初期と後期

90100110120
Daysa托ercu1tiv鉱ion

表1両細胞系列の培養初期と後期のミトコンドリアDNA
全塩基配列

図13243変異率が時間とともに変動する2つの細胞系列＊国立精神・神経センター神経研究所疾病研究第二部＊＊国立精神・神経センター武蔵病院

ー66一

％Ml止ant

10

20

30

40

50

60

70

Daァsa丘ercultiv釦ion

図3

図23243VS185VS7080

3243変異率の低下したB系列においては，上記のよMitochondrialmyopathy withprogressive decreasein

うな3243変異率の変動に連動して変化する多型の出現

mitochondrialtRNA−Leu（UUR）mutantgenomes．Annalsは認めなかった（表1，図2）．

げ〃g〟mbgy35：370−373，1994．

【考 察】
時間の経過とともに3243変異率が上昇する系列では，185変異型の減少（野生型の増加）と7080変異型の上昇がパラレルに動いていた．185変異は，正常対照者
200人のうち1人に存在し，7080変異は正常対照者200人には存在しなかった．したがって，これらはきわめて希な多型であり，3243変異率の変動への関与の可能性がある．
185変異の存在する部位はD−loopの中のH鎖複製開始点の近傍である．DNAポリメラーゼ†やTfamなどの複製に係わる諸因子と185部位の塩基との相互作用が存在し，それに変化が起きている可能性がある．今後の検討課題である．
また，7080変異はCOIサブユニットのなかの386
番目のアミノ酸であるフェニルアラニンがリジンに変化する変異であるが，3243変異率の変動との直接的な関係は不明である．

【結 論】
骨格筋で自然に3243変異が低下した患者から得られた線推芽細胞において，時間とともに3243変異率が上昇する細胞系列と低下する細胞系列が得られた．その際，上昇する細胞系列のみに185と7080の部位に3243変異率と比率が連動する多型を兄いだした．今後は，185部
位に相互作用する核性因子の同定と185変異の有無による効果の確認を行うとともに，7080変異の効果についても検討が必要である．
【文 献】
1）Kawakami Y，Sakuta R，Hashimoto K，et al：ー67−

Ⅰ．乳児良性型チトクロームC酸化酵素欠損症の分子病態解析

9例のうち，6例は3歳までに正常対象者と変わらぬ運動能力を回復した完全回復群，3例は人工呼吸や人工栄養などの医学的処理を必要とした不完全回復群であ【緒 言】
乳児良性型チトクロームC酸化酵素欠損症は，乳児期早期に晴乳力低下，筋力低下，呼吸障害などで発症するものの，1歳前くらいから自然に軽快する臨床経過った．
仝例の生検筋からDNAを抽出し，Akanumaらの方法
でミトコンドリアDNA仝周の塩基配列を決定した．
兄いだされた14674変異を検出するために，変異がをたどる希な疾患である．症状のある時期に採取した生検筋では，多数のraggedTredfiber（RRF）とチトクロームC酸化酵素活性の欠損を認めるが，回復期の生検あると制限酵素で切断されるミスマッチプライマーを用いたPCR−RFLP法を行った．

筋では，RRFの減少とチトクローム活性の回復を認める．

【結 果】

この病気は，病初期においては，同様な症状で発症し，9例の仝周シークエンスにより，標準配列とは異なる

急速に多臓器（腎，心など）の障害を併発し死に至る
乳児致死型チトクロームC酸化酵素欠損症との鑑別が困難であり，両疾患の確定診断と予後予測には病因を84個の塩基置換を兄いだした．そのうち多型として報告があるものが69個，報告のないものが15個であり，9例の内の6例に同一塩基の置換（2種類）を兄いだし確定することが重要であるが，未だ明らかになっていた．それは，グルタミン酸転移RNAの3ない．今研究では，われわれが経験した乳児良性型チ末端のアデニンがグアニンに変わる変異（4例），もしくはシトシン

トクロームC酸化酵素欠損症9例の病因の解明のため，に変わる変異（2例）であった（図5）．これらは，正ミトコンドリアDNA仝周の塩基配列の決定を行い，病常日本人200例には存在しない塩基置換であった．

因と考えられる点変異を兄いだした．

また，PCR−RmP法でも点変異の確認ができた（図6）．

【対象と方法】

これらの変異はすべてホモプラスミーで存在すること

乳児期に発症し，病理学的または生化学的またはそが判明した．

の両方で生検筋におけるチトクロームC酸化酵素欠損
AUAAGが確認され，臨床的に症状が改善した9例（男2例，ように，特徴的なRRFとチトクロームC酸化酵素欠損

2

3

4

5

6

7

8

9

筋 生検 時 年 齢

8m

5m

5叩

3m

4m

9m

8m

3m

12m

F

F

F

F

M

M

F

F

F

性

別

G U

12．
5

24．
0

25 ．2

1 4 9．3

23．
5

1 8 ．7

41．
8

5．
5

W NL

髄液乳酸偲

8．
3

ND

21．
3

5 0 ．0

11．
1

ND

48．
2

11．
3

ND

＋

＋＋

＋

RRF
COX欠損
生化学的
COX欠損

−

GG

A・U U G
U−A
G−C

UU・AU
血液乳酸億

l

G

1

l

CGU
U
G

U

例

AAGUUGA
Allll
UACAACG

U．A
G・C GUG CC

AA像を示した．
症

14674Tto C mutatjon

ヾ2E； 14674Tto Gmutation

女7例）を対象とした（表2）．骨格筋所見は，図4のmitochondrjaJtRNA−Glutamate

■」⊥⊥＼

十

十

十

＋

＋

＋

＋

＋

十

＋

ND

＋

＋

N D

N D

ND

ND

ND

図5 T14674C（4例），T14674G（2例）が完全回復例6例全例に存在した

表2 症例の臨床所見←187bp筋病理所見

症例6

襟 髪 喜一、莞登 謂霊 ㌍綽攣

腎 0禦 羨
頴

′
設7

＿ 塁

訝

登

照

蛮 施 瀞
紆
￣

小
指

弘 1．
㍍
・
二・
譜 ㌫法 論忍
岸 貰 ギ
Gr二
〇
≡岩
完喜
つ0m

Gomoritrichrome変法

薫
き
ミ￣
′戯
＿
読
肇読

薫慈￣

短
・∫

←167bp

F11ケ月
薫獣
。
i惑

壁書
′

←408bp三＝
薫欝戦野㌍準泳 ￣ 架 空 竿 ㌦＿
麦←242bp←166bp以←133bp

言…
．
G〇
輩録 染 豪 ㌻ 宣←PatientNo．

チトクロームC酸化酵素
活性染色

図4

図614674変異のPCR−RFLPによる確認−68−

【考 察】
乳児良性型チトクロームC酸化酵素欠損症の9例のうち，完全回復型6例にミトコンドリアDNAの同一部
位にホモプラスミーの点変異を兄いだした．この変異は，
日本人200人には存在せず，また乳児致死型の5例の検討でも存在しなかった（未報告）．したがって，この部
位の点変異は，乳児良性型特異的な病因的変異と考えられる．
この部位は，グルタミン酸転移脱の3 末端に位置し，一次転写産物からのプロセシング，CCA塩基の付加，
U34のアンチコドン修飾，アミノアシル化という一連の転移RNAの成熟のどの部分に影響を与えるかは，今のところ不明である．プレリミナリーな実験結果ではあるが，Northemプロットでは明らかな異常は検出できていない．
このホモプラスミックな点変異の効果が明らかでな
い以上，なぜこの疾患が良性の経過をたどるのかについての知見は得られていないが，上記の転移RNAの成熟化プロセスに関係するある核性因子にアイソフォー
ムが存在し，その発現の変化が関わっている可能性を最も有力と考えて，今後の研究を進めてゆく予定である．
【結 論】
乳児良性型チトクロームC酸化酵素欠損症の特異的なミトコンドリアDNA上の点変異を兄いだした．この
点変異と良性な経過との関係が明らかになれば，他の病気の新しい予防や治療について大きなヒントが得られるものと考えられる．

一69−

ミトコンドリアを標的するリポソームベクターの基礎的研究

遠 藤 仁 司＊研究協力者 佐藤正章＊，佐藤史＊，坂下英司＊，浜本敏郎＊する薬剤なども考えられる．

【緒 言】
ミトコンドリアは細胞内小器官であり，その構造はプロテオリポソーム

外股とクリステ構造を持つ内膜から構成され，細胞質全体に管状の網様な構造をとって分布する．また核遺ミトコンドリア

ヒトFzo

伝子以外の独自の遺伝子（ミトコンドリアDNA）を有G声する．ミトコンドリアの機能は，細胞の活動に必要なエネルギー産生し，また重要な生体物質の生合成や分ヒトミトコンドリア取合国子

・ミトコンドリアを合国子を有効構成成分とする
プロテオリポソームベクター

解などを触媒する．また活性酸素の産生やアポトーシ

暮ミトコンドリアを特異的に毘諾・措着する
1ミトコンドリア腹と窪包含を生じる

スの誘導シグナルの産生などの生物活性も有する．ミ
トコンドリア遺伝子の異常に基づくミトコンドリア病

・ミトコンドリア鏑に任意のD帖や某剤の導入が可能
0●はミトコンドリア脳筋症の病因であり，さらに拡張型
図1心筋症，ⅠⅠ型糖尿病，アルツハイマー病やパーキンソン

ミトコンドリアを標的するリポソームベクターの概念図

病などの病因にもなる．変異ミトコンドリアDNAは正常ミトコンドリアDNAと共存するヘテロプラスミーとこのミトコンドリアDNAに対する遺伝子治療法の類

して細胞内に存在し，変異DNAの存在比が一定の開催

縁のものとして，マイクロインジェクション法やサイを越えると細胞機能が低下し症状が出現する．ミトコ

ブリッド法による外来ミトコンドリアの移入が報告さンドリアDNAは核と異なりミトコンドリアに存在するれているが，ミトコンドリア以外の多量の細胞質成分

ので，これらの疾患に対する遺伝子治療法は現在確立を移入するという欠点や，また任意の遺伝子や物質をされていない．

ミトコンドリア内に移入できないという欠点がある．

ミトコンドリア遺伝子異常症に対する遺伝子治療には，

本研究では，（1）ヒトミトコンドリア融合因子を単粧

従来型の核遺伝子を標的としたベクターではなく，ミし機能ドメインの検討を行い，ミトコンドリア凝集・

トコンドリア遺伝子をミトコンドリア内に導入する新融合に必須なドメインを明らかにする，（2）このドメイ規な方法が必要とされている．本研究ではミトコンド

ンの組換え蛋白を作製し，ミトコンドリアを標的する

リアを特異的に標的するリポソームベクターを新規にプロテオリポソームを作成し，試験管内での膜融合活開発し研究することを目的とする．我々はミトコンド性を検定する，（3）ミトコンドリア融合装置の補助因子

リア同士の認識と融合を司るヒトミトコンドリア膜貫を解析する．以上の研究を通じて，ミトコンドリアを通タンパクを同定した．本研究ではこのタンパクを膜特異的に標的するリポソームベクター開発の基礎的研の有効構成成分とするプロテオリポソームを開発する（図究を施行する．

1）．この非ウイルス性のリポソームベクターに正常なミトコンドリアDNAを包埋し，これを細胞内に移入す【方 法】

ることにより，正常な遺伝子をミトコンドリア内に導1．ミトコンドリア融合因子ヒトホモログの単離と変入する事が最終的に可能と考えられる．また，このリ異解析

ポソームベクターは，任意の物質（外来遺伝子や薬剤等）

ヒトミトコンドリア融合因子（J的0日）のcDNAを，をミトコンドリア内に導入することが可能である．導ショウジョウバエか（ 的0）遺伝子のホモロジーから入する任意の物質として，変異ミトコンドリアDNAを単離した．これらのcDNAを晴乳細胞発現ベクターに認識するリボザイムや，ミトコンドリアの代謝を改善

組み込み，HeLa細胞に一過性に発現させた．遺伝子導＊自治医科大学医学部生化学講座

ー70−

人後ロダミン123でミトコンドリアを染色し，ミトコ

757のアミノ酸長を有する大きなGTP結合タンパク質で，ンドリアの凝集を共焦点レーザー顕微鏡にて観察した．

C末端に二つの膜貫通ドメインと二つのコイルドコイル

またこれらのカルポキシル末端（C末端）にGFPを付ドメインを有する．J的oJと／舵02は一つの遺伝子から加した遺伝子を作成し，本タンパク質の細胞内局在を選択的スプライシングにて産生される（特許出願：特検討した．また，アミノ末端（N末端）やC末端の欠願200ト254525号，PTC／JPOl／09783）．また々如2と失変異や，GTP結合ドメインへの点変異体を作製し機J的ojにコードさせるタンパク質はN末端にミトコンド能ドメインを検定した．また遺伝子導入した細胞のミリア標的シグナルと予測される構造を有する（図2）．

トコンドリア内膜をチトクロームC酸化酵素染色を行

これらの遺伝子を晴乳類発現ベクターに組み替えHeLa

った後，電子顕微鏡を用いてミトコンドリア膜の融合

細胞に一過性発現させたところ，いずれの遺伝子もミを検定した．さらに本タンパクに対するポリクローナ

トコンドリアの凝集活性が認められた．また，これら

ル抗体を作製した．HeLa細胞からミトコンドリアを分のタンパクのC末端にGFPを融合した遺伝子を発現さ画し，抗体を用いてミトコンドリア上の局在を生化学

せると，いずれの遺伝子産物もミトコンドリアに局在的に検定した．また，ゲルろ過法にて本タンパク質をした．これらの遺伝子のミトコンドリア凝集活性は，含む複合体形成を検定した．

hfzo2＞hfzol＞hfz03の順に高かった（図3）．
次に，これらのタンパク質の機能ドメインを同定す

2．ミトコンドリア融合因子の機能ドメインの作成るためにGTPaseドメインに不活型の点変異を導入した

ヒトミトコンドリア融合因子（hFzo1−3）の機能ドメイ

ところ，hFzol（K88T）とhFzo2（Kl16T）では凝集活ンを解析したところC末端領域が融合活性を持つ領域

性が著明に抑制されたが，hFzo3（KlO9T）では活性にであった．本領域をコードするcDNAを，原核生物発変化は認められなかった．欠失変異解析では，まずC

現用ベクター（pqE80L）に組み込み，大腸菌を用いてHisタグ融合タンパク質の大量産生およびアフイニティ

末端欠失変異を作製したところ，hFz02とhFz03のN末

ー精製を施行した．

ンドリアへの標的活性を有することが共焦点レーザー

端に存在するミトコンドリア標的シグナルは，ミトコ
顕微鏡で確認された．しかしN末端にはミトコンドリ

3．プロテオリポソームの作成と膜融合活性の測定

ア凝集活性は存在しなかった．次にN末端の欠失変異

精製した本蛋白を大豆リン脂質に組み込んだプロテ

解析では，C末端のコイルドコイルドメインと膜貫通ド

オリポソームを作製した．本プロテオリポソーム同士メインで凝集活性が認められた．特にhFzo1，2のC末が膜融合して，リポソーム内容物が混和するか否かを，端領域のみで，GTPase不活化点変異体における活性よテルビウム（Tb）とジピコリン酸（DPA）を用いた蛍りも高いミトコンドリア凝集活性を示したことから，C

光強度の測定により，試験管内で検証した．

末端領域がミトコンドリア凝集活性の活性ドメインであり，N末端のGTPaseドメインは活性調節ドメインで4．免疫沈降法による複合体タンパク質の同定あることが明らかになった（図3）．

Fzoとは別のミトコンドリア融合国子である酵母

ヒトFzoタンパク質はミトコンドリアの凝集活性をMgmlのヒトホモログであるOPAlの遺伝子を単離した．

持つことが示されたが，ミトコンドリアの膜の融合活

このN末端部分に相当するタンパク質を大腸菌にて大性があるか否かを検討するために，電子顕微鏡を用い量産生し，これに対するポリクローナル抗体を作成した．

てミトコンドリア膜の状態を観察した．hfz02を遺伝子

この抗体を用いてHeLa細胞のミトコンドリアを試料と導入したHeLa細胞をチトクロームC染色後，電子顕微して免疫沈降法を行った．これらの免疫沈降物にヒト

鏡にてミトコンドリア像を観察すると，ミトコンドリ

Fzoが存在するか，抗ヒトFzo抗体によるウェスタンプ

ア内膜の融合を示唆する像が示された．次にHeLa細胞ロット法にて検討した．また，OPAlタンパク質のミトからミトコンドリアを精製し，抗hFzo抗体を用いたウコンドリア膜形態形成に関する機能を解析した．

エスタンプロット法にて細胞内局在を検討したところ，
これらのタンパク質はミトコンドリアに局在し，特に【結 果】

亜ミトコンドリア粒子のショ糖密度勾配遠心法の結果

1．ミトコンドリアの凝集および融合を促進する蛋白からミトコンドリア外膜画分および中間比重画分の両の同定と機能解析

方に存在することが示された．またプロテアーゼ保護

ミトコンドリアの凝集および融合に関わるヒトミト

実験からこれらタンパク質のトポロジーを検討したとコンドリア融合因子（hFzoト3）は各々741，769および

ころ，N末端が細胞質側に，C末端がマトリックス側に
−71−

わた07

GTPase

CC

TM

CC

741AA
769AA
＼presequence

3

4

5

6

7

8

91011

121314151617

18

10kbp

GTPase

TM

CC

hFzo3

757AA
＼presequence

Presequence＝mitochondrialtargets．gnal

CC：COiled cojldomain
TM：tranSmembrane domain

図2

ミトコンドリア融合因子・ヒトfzo遺伝子とタンパク質の構造

COiledcoil

GTPasehfzo1−gfp
hfzo2−gfp
htzo3−gIphfzol（k88t）−gfp
hfzo2（k116t）−gfp⊂園

hfzo3（k109t）一gfp

hfzol−head−gfp

旺＝匝
E：＝陸

hfzo2−head−gfp

l 闘 Il闘 帽診
l 闘 Il悶 愕診

hfzo3−head一gfp

hfzo2−CTC・gfp
hfzo3−CTC・gfp
FIY−gfp
0％

圃■■■匝

20％

40％

60％

80％

100％

■

臼elongated

国Perinuclear□largemass

図3 ミトコンドリア凝集活性の要約
HeLa細胞に各変異遺伝子を導入し，ミトコンドリアの凝集パターンをelongated，Perinuclear，largemassの三種類に分類して，それぞれのミトコンドリア凝集活性を検討した．
−72−

存在することが示された．図4にそのモデルを示した．

三三

GTPformlH

CytOPlasm

ニ
CONTACT

LowFIuorescence
kX：276r】m．・㍑日日甘い¶
Fluorescencelncleases

MixingofaqueOuSCon馳n瞳

図5
図4 ヒトミトコンドリア融合因子hFzoのモデルの提唱
GDP formではGTP結合ドメインは膜融合の活性部位であるコ
イルドコイルドメインを抑制するが，GTP fomではコイルド
コイルドメインの抑制は解除され，隣接したミトコンドリア
膜上のコイルドコイルドメイン同士が膜融合を引き起こすと考えられる．IM：innermembrane，OM：Outermembrane．

ヒトFzoタンパク質を有するプロテオリポソームの膜
融合アッセイ法を経時的に測定し検討した．その結果，hFzoを含むプ
ロテオリポソームでは，コントロールである大豆リン脂質のみのリポソームに比較してm／DPAの蛍光強度増加の初速度が有意に高値を示した．すなわちリポソー

2．ミトコンドリア融合因子を用いたプロテオリボソ

ム同士が融合Lかつそれらの内容物が混和することがームの作成と機能解析示された．以上から，hFzoタンパク質はそれ自身が膜融合活性を有する分子であることが示された．

ヒトミトコンドリア融合因子（hFzo2，3）のカルポキ
シル末端領域はミトコンドリア融合活性を示す活性領域である．本領城は各々394および389のアミノ酸長を3．ミトコンドリア融合装置の複合体タンパク質の検討有し，N末端側からコイルドコイルドメイン，二つのミトコンドリア膜を可溶化してゲルろ過を行ったと

膜貫通ドメイン，コイルドコイルドメインの各ドメイ

ころ，いずれのタンパク質も約440kDaの大きさの複合

ン構造を有する．この領域をコードするcDNAを大腸体を形成しており，単量体の大きさでは存在しなかった．

菌発現ベクターであるp（2E80Lにサブクローニングし，

このことから，hFzoタンパク質はミトコンドリア膜融

大腸菌BL21Codon plus株に形質転換した．次にIPTG合装置としてタンパク質複合体を形成していることがで誘導させHis−hFzo融合タンパク質を大量発現させた．

明らかとなった．

2種類の融合タンパク質はいずれも封入体として不溶性

Fzoとは別のミトコンドリア融合因子である酵母

画分に存在していたため8M尿素存在下で可溶化させた

MgmlのヒトホモログであるOPAlの遺伝子を単離し，後，ニッケルNTAカラムを用いて精製した．その後，

このN末端部分に相当するタンパク質を大腸菌にて大透析にて変性剤を除き精製タンパク質をまき戻しさせた．

量産生し，これに対するポリクローナル抗体を作成した．

次に，巻き戻した精製タンパク質に大豆リン脂質を混

この抗体を用いてHeLa細胞のミトコンドリアを可溶化和させプロテオリポソームを作成した．超遠心分離法

し，免疫沈降法を行った．沈降物を抗ヒトFzo抗体ににてリポソームを分離すると，組み換えタンパク質がてウェスタンプロット法を行った結果，OPAlタンパク

検出された．その結果これらのタンパク質はリポソー質とヒトFzoタンパク質は共沈することが明らかにな

ムに組み込まれた膜タンパク質であることが試験管内った（図6）．即ち，OPAlタンパク質はミトコンドリ

で示された．

ア融合装置の複合体の構成因子と考えられた．

次に，このリポソームの膜融合活性をTb／DPA法を用次にOPAlタンパク質のミトコンドリア膜形態形成にいて測定した．Tb／DPA法はTbとDPAを内包するそれ関する機能解析を試みた．抗OPAl抗体を用いてHeLa

ぞれのリポソームを作成したのち，それらを試験管内細胞のウエスタンプロットを施行したところ，分子量で反応させる方法である．膜そのものを蛍光でラベルの異なる二種類のOPAlアイソフォームが存在し，いずした場合とは異なり，リポソームの内腔がミキシング

れもミトコンドリア膜間腔に局在することを明らかにしなければTb／DPAの蛍光が発しないため，Tb／DPA法

した．また，亜ミトコンドリア粒子のショ糖密度遠心はより厳しい条件下での膜融合活性の測定が可能であ法の結果から分子量の小さなタンパク質（short form）

る（図5）．それらの膜融合活性をTb／DPAの蛍光強度は外膜に，また分子量の大きなタンパク質（long bm）−73−

lPwはh
R・OPAlkDa Mt
150

−

106

−

・

＋SDS

的開発を目的としている（図1）．このようなベクターを開発することによって，正常なミトコンドリアDNA

WB

だけでなく，リボザイムなどの任意の外来性遺伝子やミトコンドリアの機能を調節する薬剤などをミトコン
ドリア内に導入することが可能となり，将来的にはミトコンドリアの機能が関わる多くの疾患を対象とした−hFZ0175

新たなドラッグテリノバリーシステムとして利用が可能−になると考えられる．
本研究では，ミトコンドリア同士の凝集と融合を司る因子としてヒトか遺伝子を単離した．本遺伝子は分

50

一・・

子量約80kDaの大きな膜結合型GTPaseをコードする．
本タンパク質はHeLa細胞内でミトコンドリアの凝集活性を有し，電顕上ミトコンドリア内膜の融合を促進する．

罰㌧−

また，ミトコンドリア外膜と内膜を貫通する特徴を有し，
GTPaseドメインによって活性が調節される．ミトコン
ドリア凝集活性はC末端の領域が必要十分であった．
以上から，このC末端領域のタンパク質を，ミトコン
2着■−

ドリアを標的するプロテオリポソームベクターの有効構成成分として使用することが可能と考えられた
前述の仮説を確かめるために，我々はミトコンドリ
ア融合因子のC末端領域の組換え蛋白を作成し，これ100−を脂質に組み込んだプロテオリポソームを作製した．
＿hFZ03円

本タンパク質は膜蛋白であることがinvitroで示された．

−

さらに，Tb／DPA蛍光測定法によりミトコンドリア融合

図6 抗OPAl抗体によるFzoタンパク質との免疫沈降
抗OPAl抗体を用いて，SDS存在下・非存在下で可溶化した
ミトコンドリア試料を免疫沈降した．その沈降物とミトコン
ドリア試料を用いて，抗1げzol抗体および抗肝zo3抗体にてウエスタンプロット法を行なった．その結果，OPAlとhFzo1−3タンパク質は共沈することが示された．なお，＊で示すバンドは抗体の重鎖と軽鎖である．

因子を持つプロテオリポソームに特異的にリポソーム同士が融合し内容物が混和することが試験管内で証明された．これまでの研究から，ミトコンドリア融合因子は巨大な複合体を形成していることが示されたが，今回の実験から本タンパク質が単独で膜融合活性を持は主に内膜に結合して存在することが明らかになった．

つことが示された．本タンパク質は大きな複合体を形

次に可溶化したミトコンドリアをゲルろ過法にて分析成するミトコンドリア融合装置のコア因子と考えられる．

すると，longformは約440kDaの大きさで，Shortform

ヒトFzoタンパク質のC末端領域は，コイルドコイ

は約150kDaの大きさの分子量の分画に存在した．即ち，

ルドメインおよび膜貫通ドメインを持つことから，小それぞれの異なるタンパク質複合体を形成し，特に胞の融合に関する装置（SNARE，SyntaXinなど）の一次

long bmがhFzoタンパク質と複合体を形成することが構造に類似性が認められる．一組のコイルドコイルド

明らかになった．この内膜と外膜への局在の相違は，

メインと膜貫通ドメインを有するSNAREタンパク質もそれぞれの膜の形態が異なっていることを考えると，単独でリポソームの融合活性を持つことから，ヒトFzo

OPAlの分子機構を考える上で重要な問題である．

タンパク質のC末端領域もSNAREタンパク質と同様のメカニズムで膜融合を行うと考えられる．

【考 察】

一方，我々はミトコンドリア融合タンパク質のひとミトコンドリアDNA異常に基づくミトコンドリア病つであるOPAlがhFzoタンパク質と結合することを明の根本的治療には，従来の核遺伝子への遺伝子治療法

らかにした．これまで我々はOPAlが晴乳細胞でアイソとは異なる，ミトコンドリアを標的とした新たな遺伝フォームを形成し，ミトコンドリア内膜と外膜におの子導入法の開発が必要である．本研究では，ミトコン

おの異なる局在を示すことを明らかにした．特に内膜ドリア融合因子を有効構成成分とするミトコンドリアのクリステ構造の形成に関与すると考えられる．特にを特異的に標的する新規なリポソームベクターの基礎

分子量の大きなOPAlアイソフォームは，hFzoタンパ−74−

ク質と同じ約中和kDaの複合体を形成する．このように，

mediatorofE2F−1−induced apoptosis．JBioIChem277：

ミトコンドリア融合装置の全容を明らかにすることは39760−8，2002．

ミトコンドリアを標的するリポソームベクターのミト

8）Satoh M，Hamamoto T，Endo H，et al：Differential

コンドリア融合効率を高める上で重要である．

Sublocalization of Dynamin−related protein OfAl
isoformSinmitochondria．BiochemBiqphysResCommun【結 論】

300：482−93，2003．

本研究ではミトコンドリア融合因子の組換えタンパ

9）JinYiSuzukiH，EndoH，etal：AvertebrateRNA−binding

ク質を脂質に組み込んだプロテオリポソームを作製し，PrOtein Fox−1regulates tissue−SpeCinc splicing via the

ミトコンドリアを特異的に標的するリポソームベクタ

PentanuCleotideGCAUG．EルナβOJ22：905−12，2003．

ーの開発を目指した．我々はミトコンドリア融合因子

10）Yokouchi K，Ito M，Endo H，et al：Stage−SPeCificであるヒトFzoタンパク質を単離し，膜融合活性の必

regulatoryelementofmouseSrygene．MoIRq）TVdDev

須ドメインを同定した．またこのドメインの組換えタ

64：389−96，2003．

ンパク質を作製し，試験管内で作成したプロテオリポ

11）InokiT，YamagamiS，Endo H，et al：Human DDB2

ソームを用いて膜融合活性を証明した．さらにミトコ

SPlicingvariantsaredominantnegativeinhibitorsofUV

ンドリア融合装置のひとつであるOPAlタンパク質を検

damaged DNArepair．Biochem Biqphys Res G）mmun

討し，ヒト細胞にアイソフォームが存在しミトコンド

314：1036−1043，2004．

リア内の局在が異なることを明らかにした．本因子は12）SakashitaE，rmtSumiS，EndoH，etal：HumanRNPSl

ミトコンドリア融合装置の補助因子のひとつである．

andIts associated factors：a VerSatile alternative pre−今後はミトコンドリアDNAを抱埋した本プロテオリポ

mRNAsplicingregulatorinvivo．MoICellBio124：1174−

ソームを細胞にマイクロインジェクションすることに1187，2004．

より，実際に細胞内でミトコンドリアを標的するかを

13）Sato A，Endo H，Kagawa Y，et al：Polymorphism，検討することが重要である．本研究はミトコンドリア

heteroplasmy，mitochondrial病の遺伝子治療の基礎的技術を確立する第一歩である．

βわ∫Cfg〃CeR甲（inpress）【参考文献】
1）Inoki Y，Hakamata Y，Endo H，et al：Proteoliposomes
COlocalized with endogenous mitochondriain mouse

ftrtilizedegg．BiochemBi叩hysRes Commun278：183−
91，2000．

2）InokiYIMiuraT，EndoH，etal：GangliosideGD3andits
mimeticsinducecytochromecreleasefrommitochondria．
βわcJ王gmβf（pカツ∫Re∫C（）椚m〟乃276：1210−6，2000．

3）Kagawa YlInoki Y，and Endo H：Gene therapy bymitochondrial transftr．Adv Drug Deliv Rev49：107−19，2001．

4）遠藤仁司．ミトコンドリアの相互作用と融合．新ミトコンドリア学，共立出版，pp170−8，2001．
5）HayakawaM，SakashitaE，EndoH，etal：Muscle−SPeCificexonicsplicingsilencerforexonexclusioninhumanArPSynthase gamma−Subunitpre−mRNA．J BioIChem277：
6974−84，2002．

6）nmadaH，SakashitaE，EndoH，etal：CDNAcloningand
Characterization ofDrbl，a neW memberofRRM−tyPeneural RNA−binding protein．BiocheTn Biqphys Res
Cbmm〟乃297：96−104，2002．

7）FurukawaY，NishimuraN，EndoH，etal：Apaf−lisa
ー75−fusion and diabetes．

ジストロフィン欠損筋細胞で発現変動する
分泌性タンパク質群の機能解析
原孝 彦＊

研究協力者 中山由紀書，奈良典子＊，戸倉由香1，荒川正行2，松田良一2，河北有規子，
斎藤加代手，竹島泰弘4，松尾 雅文4，加藤真樹5，関 直彦5，北村俊雄6【緒 言】

次に，筋ジストロフィー患者の筋生検より筋細胞株を筋ジストロフィーに代表される筋萎縮症は低年齢で新たに樹立LMdxマウス筋細胞株との遺伝子発現を比のいたましい発病経緯を辿ることから，発症の原因究較することによって，筋再生促進と筋変性に関連する

明と治療方法の開発を目指して世界各国で活発な研究

遺伝子産物の絞り込みをおこなった．最終的にはMdxが進行している．ヒト筋ジストロフィー患者では骨格筋・マウス筋細胞株や筋ジストロフィー患者生検筋細胞株

心筋の変性がおこり，そこが線維化して筋肉組織が加で発現変動する遺伝子群の中から，分泌性タンパク質

齢とともに退縮していく．興味深いことに，筋ジストをコードする5種類の分子に標的をしぼり，詳細な発ロフィーの実験動物モデルであるジストロフィン欠損

現動態と機能探索をおこなった．これら一連の試みを

マウスMdxでは，横隔膜を除いて成獣の骨格筋線経は通じて，骨格筋の再生と筋ジストロフィー発症・病態

機能的に正常に近い．これはMdxマウス筋の再生能力

悪化の新たな分子背景を明らかとすることを目指した．

が高いことに起因すると推察されている．近年，Mdx
マウス横隔膜の変性もIGF−1の強制発現やMyostatinの【方 法】

中和阻害によって克服されることが示された．このよ

Mdxマウス骨格筋およびBlO正常マウス骨格筋初代

うに，筋再生力を高めることも筋ジストロフィーの治培養系に，SV40温度感受性丁抗原をコードするレトロ療戟略として期待されている．一方，Mdxマウスの筋ウイルスを感染させることでそれぞれの筋細胞を株化

再生部位には骨髄の造血幹細胞も動員され，低頻度なした．次に両細胞株の仝cDNAを蛍光標識したプロー

がら筋細胞へと分化転換する．我々は近年の研究によブを用いて，マウスcDNAランダムマイクロアレイやって，再生組織の血管や問質層に造血幹細胞に由来す

サイトカインマクロアレイをハイブリダイズし，発現る骨髄球系血液細胞が多く動員されることを見出して量に差のある遺伝子群を同定した．その後発現レベルいる1）．したがって筋変性部位の迅速な修復時には，筋の差をノーザンプロッテイングやRT−PCRにより確認

細胞自身の再分化と組織再構築のための血管内皮細胞した．一方，ベッカー型あるいはデュシャンヌ型筋ジや問質系細胞の動員が同時に起こっていて，マクロフ

ストロフィーと診断された患者筋生検細胞数例を患者

ァージをはじめとする骨髄球系血液細胞がそれを助け家族の同意のもとで，SV40温度感受性丁抗原を利用していると推察される．我々は，ジストロフィン欠損にてそれぞれ株化した．それらの患者生検筋細胞株を用よる若齢Mdxマウスでの筋変性が，二次的に骨格筋再いて，Mdx筋細胞株で発現変動していた遺伝子群の発生を促進する遺伝子プログラムを発動させているので

現動態を解析した．さらにMdx筋細胞株で発現変動しはないかと仮定した．

ていた分泌性タンパク質をコードする遺伝子については，
筋損傷モデル実験系を用いて筋再生時における発現誘本研究ではまずMdx筋細胞株を樹立してジストロフ

導と生物活性について検討した．

ィン欠損に伴って生ずる遺伝子発現の変化を網羅的に解析することで，筋変性につながる細胞内シグナル分子群および筋再生誘導サイトカインの同定を試みた．

＊財団法人東京都医学研究機構・東京都臨床医学総合研究所 腫瘍生化学研究部門
1，東京大学大学院理学系生物科学
2，同総合文化研究科
3，東京女子医大小児科
4，神戸大学大学院医学系成育医学
5，千葉大学大学院医学研究院機能ゲノム
6，東京大学医科学研究所先端医療研究センター細胞療法−76−

【結 果】ABlO＿Smmdx−Sm

1．ジストロフィン欠損マウス骨格筋細胞株の樹立

Mdxマウスや筋ジストロフィー患者の筋肉中の遺伝
子発現動態を解析するには，直接筋生検よりmRNAを調製するという方法が考えられる．しかし，筋変性部位には多くの炎症性細胞が存在し，また組織像も病気の進行状態に依存して均一ではない．筋ジストロフィ
ぶ，汐
がJゞ・

ーの病変と直接的に関連する骨格筋で発現する遺伝子を単離する目的で，本研究ではまずジストロフィンを
SCHlf・＿1

GARG16

欠損する筋芽細胞株（mdx−Sm）および正常マウス由来
筋芽細胞株（BlO−Sm）を樹立した（図1A）2）3）．これSelenoproteinP

らの細胞株は培養系の中でデスミン陽性の筋管を自発的に分化させる能力を有するが，筋分化の頻度はmdx−
Thymosinβ4smの方がより昂進していた（図1A）．

Arg／Glyamldino−transfelaSe

2．遺伝子発現解析
次にmdx−Sm細胞株と正常BlO−Sm細胞株の遺伝子発β−tublllh

図1mdxマウス骨格筋由来細胞株の樹立と発現変動遺伝子の単離（A）sv40温度感受性T抗原の導入により，mdxマウス筋芽細胞株（mdx−Sm）および正常マウスコントロール筋芽細胞株（BlO−Sm）をそれぞれ樹立した，写真は抗デスミン抗体を用いた免疫染色像を示す．mdx−Sm細胞株の方が筋管形成頻度が高かった．
（B）cDNAマイクロアレイを用いてmdx−Sm細胞株とBlO−Sm細胞株との間の遺伝子発現を比較した結果，図に示すいくつかの遺伝子mRNAの発現が両者間で変動していた．RAMPは本研究によりクローニングした機能未知プロテアーゼ遺伝子．

現の違いをマイクロアレイを用いて比較した．マウス
脳や胎仔に由来する約4000種類のcDNAをのせたマイクロアレイのハイブリダイゼーション解析の結果，mdx
筋細胞株では15種類の遺伝子（新規3を含む）のmRNAが正常筋芽細胞より高いレベルで発現しており，逆に12種類の遺伝子（新規2を含む）は，発現が抑制されていた．前者には，クレアチン合成の律速酵素であるArgK31yamidinob7nSftrase，筋分化促進転写因子ME陀，って調べたところ，ジストロフィン再発現によるレス

アクチン重合を阻害するThymosinβ4（Tβ4）などが含

キューは観察されなかった（データ省略）4）．この結果は，まれ，一方，酸化ストレスから細胞を防御する

Mdx−Sm細胞株で起こっている遺伝子発現変動は，ジス

selenoprotein Pや機能未知プロテアーゼRegenerationT

トロフィン欠損によるのではなく変性と再生を繰り返

associatedmuscleprotease（RAMP）などが発現低下してす筋組織での二次的な細胞内遺伝子プログラムを反映

いた4）（図1B）．また，既製のサイトカインアレイを用しているものと推察される．

いた解析では，IGF−2，BMP−4，OSteOPOntin，frizzledrelated
protein−2（FRPq2），BRAKなどの分泌性タンパク質が4．筋ジストロフィー患者筋生検細胞株の樹立と病態関mdxTSm細胞株で発現昂進し，MCP−1，Thrombospondin−2連遺伝子の発現解析（TSP−2）は逆に発現低下していた（データ省略）．

神戸大・東京女子医大グループとの共同研究として，
筋ジストロフィー患者筋生検細胞の株化を試み，デュ3．Mdx−Sm筋細胞株での遺伝子発現変動とジストロフ

シャンヌ型6例，ベッカー型2例，そして健常人1例にインとの関連ついて，in vitroで筋管形成する温度感受性筋細胞株のジストロフィンタンパク質は筋芽細胞では発現せず，樹立に成功した4）（図2A）．次に，mdx−Sm細胞株で発筋管形成とともに発現誘導され筋繊維の強度保持や筋現変動していた遺伝子群すべてについて，ヒトmRNA

内シグナル伝達を制御すると考えられている．Mdx−Smを検出するプライマーを準備してRT−PCR解析を行っ筋細胞株で観察された遺伝子発現変動が，ジストロフ

た結果，Mdx−Sm細胞株でのみ発現上昇している遺伝子

ィン自体とは独立におこっていることを確かめるために，を9種類（Tβ4，FRP−2，BRAK，OSteOPOntin，など）同マイクロジストロフィン遺伝子をドキシサイクリン誘

定した（データ省略）．一方，新規プロテアーゼRAMP

導性プロモーター下に配置してMdx−Sm細胞株に遺伝子

mRNAの発現は，mdx−SmおよびDMD／BMD患者筋細胞導入した．Mdx−Sm細胞をドキシサイクリン処理後，発株とで共通して発現低下していることを兄い出した4）（図現変動していた遺伝子群をノザンブロッテイングによ

2B）．
ー77−

A

39．50C

32．50C

Trypsln−likeserlneprOteaSe
Slgnalseql】enCe

H．∴∴、∴∴∴

B♂BMD DMD
1

2

3

4

5

6

7

8

9

図3 RAMPプロテアーゼの推定構造と発現（A）コーディング領域の塩基配列から予想されたRAMPプロ
テアーゼの構造上の特徴を示す．cUBドメインはBMPlなど
発生関連タンパク質で，一方CCP（sushi）ドメインは補体や細胞接着タンパク質にそれぞれ観られるモチーフ．RAMPはC
端にトリプシン様セリンプロテアーゼ配列を持つ分泌性タンパク質であった．
（B） 正常成獣マウス臓器におけるRAMPmRNAの発現．
RAMPは骨格筋と脳に特異的に発現していた．

RAMP

β−tubulin

図2 筋ジストロフィー患者筋生検に由来する細胞株の樹立とRAMPmRNAの発現（A）sv40温度感受性丁抗原をコードするレトロウイルスを用いて，DMD患者，BMD患者，および健常人の骨格筋生検初代培養系より筋芽細胞株（DMD，Sml，2，etC）をそれぞれ樹立した．写真は代表的な患者筋生検由来細胞株BMD−Smlを非許容温度（39，5℃）あるいは許容温度（32．5℃）で培養したときの位相差顕微鏡像を示す．
（B）健常人1例（1），BMD患者2例（2，3），およびDMD患者6例（4￣9），の骨格筋生検由来細胞株をそれぞれ用いて
RAMPmRNAの発現をRT−PCRにて解析した．健常コントロールに比べRAMPはDMD，BMD患者筋芽細胞株で発現低下していた．

ATimeartercrashlnJury mRNA】evel
5hld

2d

3d

4d

6dl（氾14d mdx−Sm′■DMD−Sm／

BlO−Sm nomlaトsm

＼

＼

／

−ナ

5．筋損傷モデル実験系を用いた筋再生関連遺伝子の発ノ 、＼硯と機能解析

ヽゝ

一十一

三二

；ニ

上述の遺伝子発現解析結果に基き，以下の5種類の分泌性タンパク質に重点を置いて研究を進めた．筋再生時の発現動態や筋芽細胞に対する生物活性を含めて，これまでに得られた実験結果を以下に列挙する．

annsense

型墾竺：我々がcDNAクローニングした機能不明の新規
プロテアーゼ4）．Mdx筋細胞株，DMD／BMD患者筋細胞株の両方で発現低下していた．そのアミノ酸配列から，
RAMPは分泌性タンパク質で細胞間相互作用にも関与する可能性が推察された（図3A）．mRNAは定常状態

図4

mdx筋細胞株で発現変動する分泌性タンパク質mRNAの筋再生時における発現誘導（A）刺針によりマウス後肢骨格筋に損傷を与えたあと，継時的に筋組織RNAを回収した．それぞれの時点で，mdx−Sm細胞で発現変動していた4種類の分泌性タンパク質のmRNA発現をRT−PCRにて解析した．いずれも筋損傷4日目をピークに発現上昇した．
（B）刺針6日後のTA筋切片を用いてRAMP mRNAの発現を
in situhybridizationにて解析した．antisenseプローブで検出されるRAMP mRNAシグナルは中心核を持つ再生筋（矢印）にのみ存在し，成熟した筋管（失頭）にはなかった．

では脳と骨格筋に主に発現している（図3B）が，針による筋損傷実験では筋再生に伴って発現レベルがさらに上昇した（図4A）．その発現は中心核を持つ再生筋に限局し（図4B矢印），成熟筋では発現していなかった（図4B矢頭）．これらの結果は，RAMPの発現低下が筋ジストロフィーの病態に関与している可能性を示唆している．
！堕：Gアクチン結合性の43アミノ酸から成るペプチ
ドで好中球の動員活性を持つ．Mdx筋細胞株のみなら一78−

ずMdxマウス骨格筋自体でも発現昂進していた．

旦型些：単球とB細胞に作用するケモカインで統一名称

mRNA発現はどの臓器でも観られたが，筋損傷モデル

はCXCL14．Mdx筋細胞株では発現上昇していたが，ではさらに発現が強化された（図4A）．骨格筋の損傷

DMD／BMD患者筋細胞株では逆に発現低下していた．

治癒過程において，Tβ4は再生筋と炎症性細胞の両者でmRNAは脳，卵巣，肺，骨格筋で主に発現．筋損傷時産生されていた（データ省略）．Tβ4および酸化型タンに発現誘導はおこらず，C2C12細胞の遊走刺激活性はパク質を合成し，C2C12細胞株を用いて骨格筋細胞に検出されなかった．

対する生物活性を解析したところ，Tβ4は濃度依存的に細胞間隙への移動を促進し（図5A），筋芽細胞の走化

撃墜旦：血管や結合組織の形成に関与．Mdx筋細胞株で的遊走を刺激する活性を有していた（図5B）．したが発現低下していたが，骨格筋の損傷治癒過程においてって，Tβ4は損傷部位に筋芽細胞を動員する役割を担っは強く発現誘導された（図4A）．

ている可能性が示唆された．

6．遺伝子改変動物の作出

A

本研究で着目した5種類の分泌性タンパク質のin

C2C12scratchassay

vivoでの役割を知るために，muSCle creatine kinaseプロ
25

モーターを使った筋特異的トランスジェニックマウス

20および遺伝子破壊（KO）マウス（BRAK，RAMP）の作

舅15製を開始した．現在までに，Tβ4，TSP−2，RAMPトラ

名10ンスジェニックマウスの第一世代が誕生した．また【乃モ芦BRAK KOマウスはgerm1ine transmissionL，ヘテロ個5体が成育している．

0

0

0．1

1

10（ng／mU【考 察】
mdx−Sm筋細胞株と正常BlO−Sm筋細胞株の遺伝子発C2C12chemotaxisassay

現比較により，mdx筋細胞では筋再生に関与する代謝
酵素，転写因子，そしてサイトカイン遺伝子群が転写00の発現がmRNAレベルで弱まっている可能性が示唆された．特に，最近Selenoprotein Nの遺伝的欠損をもつ

50︵辞︶焉U已

誘導され，逆に筋膜の維持や炎症阻止に関与する分子

筋ジストロフィーが同定されたこと，またセレニウム
欠乏症は筋萎縮症状を示すということからも，mdx筋
0

10100

10100

Tβ4

10三和（ng／mL）

Tβ4so bpGF

細胞におけるSelenoproteinPの発現低下が酸化ストレス
応答の弱体化を介して筋細胞のアポトーシスをもたらしているかもしれない．また，OSteOPOntin上昇とMCP−

図5 Thymosinb4による筋芽細胞の遊走促進（A）満杯になったC2C12筋芽細胞株の中央部を計を用いて溝状に細胞層を剥離し，異なる濃度のThymosinβ4（Tβ4）を添加し8時間培養した後の溝の長さを測定した（scratchassay，n＝9）．
TP4およびその酸化型（Tβ4so）はいずれもC2C12細胞の遁走・移動を促進した．
（B）C2C12筋芽細胞株をケモクキセルの上層に培養し，下層に異なる濃度のTβ4，Tβ4soを加えて6時間培養後，フィルタ
ー裏面に移動してきた細胞数を測定した（chemotaxisassay，n＝6）．
陽性コントロールとして持いたbFGFと同様に，C2C12細胞はTβ4，Tβ4soに対して走化性を示した．

1低下はml優勢の免疫系誘導に作用するため，これが筋変性部位の炎症反応の異常に寄与している可能性がある．
培養筋細胞の大半はジストロフィン陰性であるにも関わらず，多くのmRNA発現がジストロフィン欠損筋細胞株で昂進あるいは低下していた．その中でもDMD／BMD患者筋細胞株よりMdxマウス筋細胞株でよ型：Wntアンタゴニストのひとつで細胞死を抑制す
る活性も知られている．Mdx筋細胞株では発現上昇し筋分化に関しては調べられていないTβ4，TSP−2，FRP−2，ていたが，DMD／BMD患者筋細胞株では逆に発現低下

BRAKという分泌性タンパク質4種類が含まれていた．

していた．mRNAは膵臓，心臓，骨格筋，脳で主に発筋再生促進に作用するIGF−1やBMP−4がMdxマウスの現し胎児期で高い．骨格筋の損傷治癒過程において顕場合で発現昂進しているのと同様に，それらもMdxマ

著に発現誘導された（図4A）．

ウスの高い筋再生能と直接関連している可能性がある．

り高く発現していた遺伝子9個には，これまで筋再生・ー79−事実，Tβ4，TSP−2，FRP−2は筋再生時に発現誘導され，高い再生力に寄与していると推察される．今後，これTβ4には筋芽細胞を遊走させる活性が検出された・
BRAKは筋細胞には直接作用しないが，単球を集める

らの分子群の筋再生や筋変性における機能を実験動物
個体レベルで詳細に解析していくことで，筋ジストロ

活性を持つことは注目に値する．筋変性部位には多く

フィーの進行を阻止する新たな治療法の開発に挑みたい．

のマクロファージが集積している上に，最近単球から血管内皮細胞への分化転換も報告された．また我々は【参考文献】

マクロファージ分化誘導サイトカインであるM−CSFに，

1）Tamura H，Okamoto S，Iwatsuki K，et al：In vivo

血管内皮前駆細胞の増殖促進活性があることを兄い出

differentiation of stem cellsin the aorta−gOnad−

している5）．筋組織全体の修復には血管も必須である．

mesonephros reglOn Ofmouse embryo and adult bone

一方，mdx−Smおよび8例のDMD／BMD患者筋細胞抹

ma汀OW．且甲肋mdfOJ30：957−66，2002・とで共通して発現低下していた新規分子RAMPは，分

2）ArakawaM，NakayamaY，HaraT，etal：NegamyCincan

泌性セリンプロテアーゼ様分子で骨格筋と脳に特異的

restore dystrophinin mdx skeletal muscle・Actaに発現していた．RAMPの基質や生理的役割はまだ不坤0わgk。20：154−58，2001．

明であるが，RAMPが再生筋で発現誘導されることか

3）ArakawaM，ShiozukaM，NakayamaY，etal：NeganyCin

らこの分子も筋再生のメデイエーターである可能性がrestores dystrophin expressionin skeletaland cardiac

ある．これらの分泌性タンパク質が協調的に働くことで，

musclesofmdxmice．JBiochem134：751−58，2003．

Mdxマウス筋変性部位の修復が効率的に行われている

4）NakayamaY，NaraN，KawakitaY，etal：Cloningof

ものと推察される．我々は最近，生理的リモデリング

CDNA encoding a regeneration−aSSOCiated mllSCleがおこる妊娠時の子宮筋層で特異的に発現するStathmin

PrOteaSe Whose expressionis attenuatedin celllines

がやはり骨格筋再生時に誘導されることを発見した6）（未derivedfromDuchennemusculardystrophypatients．Am

発表データ）．これらの多くの筋再生関連遺伝子の発現

J助JあoJ．（hpress）

をトリガーする転写制御機構にも興味が持たれる．

5）Minehata K，Mukouyama Y，Sekiguchi T，et al：

それぞれの分子の筋再生における役割を結論付ける

Macrophage−COlony stimulating factor modulates theには個体での解析が必須である．現在作出中の遺伝子

development of hematopoleSis by stimulating

改変マウスを，筋損傷実験やMdxマウスとの交配実験

differentiation ofendothelialcellsinthe AGM reglOn．

に供することで，上述の仮説を検証できるものと期待

βbOd99：2360−68，2002，

theしている．その上で，筋再生に最も効果のある分泌性6）TamuraK，HaraT，YoshieM，etal：EnhanCedexpression

タンパク質あるいはagonistを，筋ジストロフィー患者

ofuterinestathminduringtheprocessofimplantationandの骨格筋や心筋に補充する方法の開発へと進めていき

decidualizationinrats．肋docrinol144：1464−73，2003．

たいと考えている．
【結 論】
Mdxマウス筋細胞株およびDMD／BMD患者由来筋細胞株を新規に樹立し，そこで特異的にmRNA発現変動する代謝系・骨格系・サイトカイン遺伝子群を同定した．
それらの発現変動はジストロフィンとは直接関連しない筋芽細胞内での遺伝子プログラム変化であった．
Mdxマウス筋細胞株で発現変動する遺伝子の中から，
DMD／BMD患者筋細胞株でも共通して発現低下する新規分泌性プロテアーゼMをクローニングした．一方，
DMD／BMD患者筋細胞株と比較してMdxマウス筋細胞株で発現量の多い分泌性タンパク質としてTβ4，FRP−2，
BRAKを同定した．RAMP，Tβ4，FRP−2，それからMdxマウス筋細胞株で発現低下していたTSP−2はいずれも筋再生過程で発現誘導された．これらの分泌性タ
ンパク質の発現レベルの差異が，Mdxマウス骨格筋の−80−

ヒト筋マイクロアレイの開発とそれを用いた筋疾患の分子病態の解明
塚 原 俊 文＊研究協力者 野口 悟＊＊，西野一三＊＊，辻本敦美＊＊＊，長澤 浩＊＊＊＊【緒 言】

我々の開発したこれらマイクロアレイは筋疾患の分子筋ジストロフィーにはジストロフィン，サルコグリ

病態解明に有用な新しいツールを提供すると期待される．

カン，ラミニンα2等の細胞膜・基底膜関連のタンパク質の他に，エメリン，ラミンA／Cの様な核膜関連タン【方 法】

パク質，ミオトこンキナーゼ，カルパイン3といったヒト筋cDNAマイクロアレイの開発

細胞質に存在する酵素群，さらにはフクチンの様な糖

独自の筋cDNAマイクロアレイを作製するために，

鎖修飾関連タンパク質，と極めて多岐にわたる分子がNCBI等の公開されたデータベースよりヒト骨格筋・心関与していることが明らかになっている．一方でこの筋に発現する既知のcDNA情報を収集し，insilicoでク様な多種・多様な遺伝子の異常がなぜ筋ジストロフィ

ロスハイプリグイズを出来るだけ排除したターゲットーという共通の病態像を示すのかについては解明され遺伝子配列候補を集めた筋発現遺伝子のデータベースていない点が多い．

を構築した．相同配列を極力排除し，また増幅長も450

疾患の病理像を分子レベルで理解するためには，正〜550bpに均一化した独自のデータベースに基づいて

常および疾患筋組織でどのような遺伝子（群）が優位

それぞれのcDNAに特異的なPCRプライマーをデザイに発現し，あるいは抑制されているかについての情報

ンし，ヒト骨格筋・心筋のcDNAをテンプレートにしを知ることが必要である．我々は分子病理像を明らかてそれぞれの増幅断片を得た．さらにこれら増幅断片にするためのデバイスとして，ヒト筋cDNAマイクロをクローン化してシークエンスで検証を行った．収集

アレイの開発を行い，これまでに少量の生検筋を用いされたcDNAクローンを用いて，最終的に4，281遺伝子，てヒト骨格筋に発現する4，000種類の遺伝子発現を解析

5，309プローブの大規模ヒト筋cDNAマイクロアレイを可能なマイクロアレイを作成した．我々のマイクロア作成した．ターゲットの作成および検出にはパーキン・レイは症例一例ごとの遺伝子発現解析を可能にし，まエルマー社のテラミドシグナル増幅（TSA）システム

たその解析結果が筋の壊死・再生の度合を反映していを採用した．1pgのRNAを用いてcDNAプローブを合る事を明らかにした．

成し，CDNAマイクロアレイとハイブリダイズした．

一方，同一家系内で症状の異なる例やデイスフェル
リン異常症における三好型と肢帯型筋ジストロフィー等，

DMDの分子病理学的解析

遺伝型が同じであるにもかかわらず表現型が異なる場

6例のデュシャンヌ型筋ジストロフィー（DMD）点合が知られている．この様な現象はSNPsの違いよると者由来の凍結生検筋および正常筋10〜30mgよりそれ考えられることから，筋ジストロフィーにおいてもぞれの細胞質RNAを精製し，TSA法に基づきcDNAを

SNPs解析の必要性が指摘されている．我々は，安価で調製した．対照にヒト正常骨格筋全RNAを用いた競争

安定的なオリゴ型DNAチップの供給を可能にするため，的ハイプリグイズによって遺伝子発現解析を行った．

一体化したオリゴヌクレオチド担体プローブである「プ遺伝子発現プロファイルの解析には Gene Spring ソ

ローブオンキャリア」を開発し，このプローブオンキ

フトウエアを用いた．病理像は連続切片をヘマトキシ

ャリアごとスライドグラス等に固着させることによっ

リンーエオジン染色およびジストロフィン染色する事にてSNPsを含む遺伝子の点変異検索が可能なオリゴ型

よって確認した．

DNAアレイを安価に作製する方法についても考案した．

＊北陸先端科学技術大学院大学ナノマテリアルテクノロジーセンター＊＊国立精神・神経センター神経研究所疾病研究第一部＊＊＊DNAチップ研究所＊＊＊＊（株）荏原製作所精密・電子事業本部−81−

る遺伝子においては，各々のターゲットスポットで同プローブオンキャリアの開発

様の強度が得られた．

高度に細孔径の均一化を計った微小多孔質ガラスをグリシドキシプロピルトリメトキシシランで処理後，筋ジストロフィーに伴う骨格筋での遺伝子発現変化

ヘキサエチレングリコールリンカーを付加した．ガラを解析するため，より単純化された培養骨格筋細胞のス表面における官能基密度は1匹mOle／m之であった．こ系を試みた．ヒト骨格筋初代培養細胞を用いて，筋管れを基材として通常の固相DNA合成法と同様にオリゴ細胞への分化に伴う遺伝子発現の変化を調べた．そのヌクレオチド合成を行いプローブオンキャリアとした．

結果，次の6種類に分類された．Ⅰ）分化とともに漸対象としては点突然変異細胞株が存在するヒトガン抑進的に発現が上昇する遺伝子（1，314クローン），Ⅱ）

制遺伝子，〆Jの947−966ntの配列を用いた．（野生型‥

より急速に発現が上昇する遺伝子（410クローン），Ⅲ）

GGCATGAACCGGAGGCCCAT，HSC−4変異：

分化の初期に発現の極大値をもつ遺伝子（48クローン），GGCATGAACCAGAGGCCCAT，Ca9−22変異：

Ⅳ）変化しない遺伝子（1，821クローン），Ⅴ）増殖期

GGCATGAACTGGAGGCCCAT）判定は三種類のプローに発現があり分化すると減少する遺伝子（478クローン），

ブオンキャリアをFITC標識したそれぞれのアンチセン

ⅤⅠ）増殖停止期に発現の極大値をもつ遺伝子（392クロ

スオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせ，0．1Ⅹーン）であった．この情報はターゲット遺伝子の分類

SSCで洗浄後に残存する蛍光を検出して行った．簡易の指標として使用しうる．次に5人のDMD患者筋から型DNAチップの作成は，スピンコートしたポリブタジの初代培養細胞から増殖筋芽細胞，分化筋管細胞でのエン接着剤上に願濁したプローブオンキャリアをスポ

遺伝子発現のプロファイリングをおこなった．特に分ットし，熱固定後に超音波洗浄して作成した．チップ化後において各患者細胞で遺伝子発現変化に共通性が型のプローブオンキャリアも同様に蛍光標識アンチセ強かった．また，筋細胞内のシグナル活性化経路をモ

ンスオリゴヌクレオチドの残存蛍光を観察して判定した．

ニタリングした結果，IGF−1刺激に伴うAkt系とMAPKで特徴的な遺伝子の発現変化が観察された．

【結 果】

DMD筋における遺伝子発現の変化

開発したヒト筋cDNAマイクロアレイの検証

我々の開発したヒト筋cDNAマイクロアレイは，同6例のDMD筋から得られたマイクロアレイデータを

量のプローブを用いた実験で相対蛍光強度100〜

平均すると，3，500遺伝子の内77遺伝子の発現が正常筋

100，000のレンジで再現性（R＝0．94〜0．98）のある結果と比較して2倍以上に上昇していた．一方，同様に327が得られた．また，CDNAプローブ量が仝RNAl〜4遺伝子では1／2以下に減少していた．それぞれの遺伝子

Pgのレンジにおいて，ターゲッートスポットの蛍光強度を分類すると，免疫応答，サルコメア，細胞外マトリに直線性が得られた．さらに，ヒト骨格筋全RNAからックスおよびシグナル伝達・細胞増殖に関連した遺伝のcDNAプローブで検出された各遺伝子ターゲットス

子群で顕著な発現上昇が観られた．免疫応答関連で最ポットの相対強度及び遺伝子発現順位は，Bortoluzziらも発現が上昇したのは抗原提示細胞に発現するMHCIが示したESTデータベースからの転写プロフィールおCategory Increasedgene Decreasedgene

よび大久保らのBodyMapの骨格筋発現での結果とよく一致していた．また，複数のターゲットスポットがあ

図1 我々が開発したヒト筋cDNAマイクロアレイ
約500bp長の冗長性の無いヒト筋cDNA断片を用いて作成したヒト筋cDNAマイクロアレイ．5，309プローブで4，281遺伝子をカバーしている．二検体からのRNAからそれぞれCy3あ
るいはCy5で標識したcDNAを合成し，ハイプリグイズ後にスキャナーで観察した．各スポットはそれぞれ別のプローブに由来しており，蛍光強度で発現量の増減が判定できる．

energymetabolism

053transcription／tranSlation

1

45

Signal／cellgrowth

539

SarCOmere

8

24

enZyme724

CytOSkeleton

615

receptor／Channel

2

14

immuneresponse

112

proteaSOme

1

10

ECM

9

1

Chaperone

08

unknown

27

92

Tbta1

77

327

表1DMDで2倍（1／2倍）以上変化した遺伝子
ヒト筋cDNAマイクロアレイを用いて6例のDMD患者生検筋における発現遺伝子変化を解析した結果．

−82−

およびIIのHLA−DR遺伝子であった．サルコメア関連てHLA関連遺伝子の発現が上昇していることが明らか

ではα一心筋型アクチンとミオシン軽鎖4および1などとなった．また同様に，分化によって発現する分子種

筋発達に応じて発現する遺伝子群であった．これら遺が切り替わるミオシン軽鎖とトロポこンT遺伝子群に伝子の発現上昇は細胞浸潤や筋線経の壊死・再生を反着目した遺伝子発現プロファイルでは，重症例では全映していると考えられた．一方，発現が低下したのはての分子種が強く発現しているのに対して，軽症例でエネルギー産生，転写・翻訳，シグナル伝達とプロテはミオシン軽鎖2とトロポこンT2遺伝子の発現が低い

アソーム経路に関連した遺伝子であった．これらにはままであった．上記の結果は，これら遺伝子の発現が解糖系酵素や電子伝達系，転写因子，タンパク質合成疾患の重症度と密接に関連していることを示唆した．

の開始因子・伸長因子等が含まれていた．従って，筋組織の機能やホメオスタシスの慢性的な低下の反映でプローブオンキャリアの開発あると考えられた．

スライドグラス等の基盤上に高密度にオリゴヌクレ
オチドを結合させた，いわゆるDNAチップには短いオ

各症例による分子病理学的検討

リゴヌクレオチドを用いるオリゴ型DNAチップと，比6例のDMD患者の筋病理を比較すると，筋線椎の壊

較的長鎖のcDNAを用いるcDNA型マイクロアレイが死・再生像が顕著で，大小不同や線維化を伴う症例と，あるが，このうちオリゴ型は少量のサンプルで一度にこれら変化がよりマイルドな症例が存在していた．各

多くの一塩基多塑（SNPs）を含む多型や変異を検出す

症例の遺伝子発現プロファイルは全体的には良く似てることを可能にするデバイスである．しかしこの場合，いたが，より詳細にそれぞれの症例を比較すると，重DNA鎖が短いため基盤と共有結合させて固定する必要症例と軽症例の二つのグループに別ける事ができた．

があり，その製造には特別な技術が必要である．我々

この結果は，疾患の重症度を反映して幾つかの遺伝子

は合成オリゴヌクレオチドを，合成時の担体である多発現が変化したことを示唆する．そこで，筋壊死のマ

孔質ガラスに固定化されたまま，基盤スライドグラス

ーカーとしてHLA関連遺伝子に着目して遺伝子発現プに固着することで安価で簡便なオリゴ型DNAチップがロファイルを作成したところ，壊死変化の増加に従っ実現できないかと考え，そのための担体となるブロー

莞義認頚報鞘儲霊穿
u・即座研〟円〃u・C肘野の敗A−p斤76紺〟u・仇羽打
〃1八・p斤Ⅳ紹

迂豊 艶艶臨
m抜召差

江北挽薮

脱力・Å蘭
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敗4−ロ斤脚5野※※控糾酢㍑
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m肘n
m野アブ

P雨ien11匹触t4p劇l融5p虞ie爪6

図2

DMD筋の分子病理学的解析

DMD患者6例の生検筋のH＆E染色像（左図）．同一疾患でも細胞浸潤や大小不同の度合は様々である．
6症例におけるHLA関連遺伝子（A），ミオシン軽鎖遺伝子（B），トロポ二ンT遺伝子（C）の発現解析結果（右図）．免疫応答遺伝子であるHLA関連遺伝子や分化度合を反映するミオシン軽鎖とトロポニンT遺伝子の発現は細胞浸潤や壊死・再生の良いマーカーと
なりうる．

−83−

担体一体型
プローブ

スポックーによる
チップ作成

完成した

（蛍光標識DNA）

DNA ChipNative Ca9−22

HSC−4

＼レ
／【＼
＼レ
／重＼

＼レ

茎蓋；：頚

／」＼

図3 新しいオリゴ型DNAチップ作製法の概念図
高度に細孔径の均一化と大孔径化をはかった多孔質ガラスを固相として化学合成したオリゴDNAを切り出す事なく，そのままスライドグラス基盤に配置することで，安価で簡便なオリゴ型DNAチップが作成できる．

ブオンキャリアの開発を行った．
我々は遺伝子の変異が多発ガンを誘発するp53腫瘍
抑制遺伝子を標的として「プローブオンキャリア」の試作研究を行った．ca9−22変異とHSC−4変異は腫瘍細胞株で確認された同遺伝子の一塩基変異である．まず，宙撃葵妻′、′＿＿ラ＿＿＿ミ牽（オリゴ担体一体型プローブ）

図4 担体一体型プローブによる単塩基変異の積出
正常と二種の点突然変異したp53遺伝子の配列を持つ担体一体型プローブを作成し，蛍光標識したそれぞれのDNAとハイブ
リダイズした．プローブに残存する蛍光を観察して，一塩基置換のDNA配列を認識可能か否かを調べた．
お互いに僅か一塩基の置換にもかかわらず，正常プローブには正常の，Ca9−22変異プローブにはCa9−22変異の，HSC変異プ
ローブにはHSC変異の蛍光標識DNAが最も良く結合し，残存蛍光で明るい．

細孔径200nmの多孔質ガラスをオリゴヌクレオチド合
成用担体とするため，多孔質ガラスを3−glycidoxypropy【考 察】

ltrimethoxysilane処理し，Hexaethylen−glycolをリンカー

ヒト筋cDNAマイクロアレイに関する研究として導入した．これに通常のオリゴヌクレオチド合

我々のヒト筋cDNAマイクロアレイによる解析結果は，

成と同様の手順で野生型および二種類の変異型Senseオ

Bortoluzziらや大久保らの示した骨格筋発現での結果とリゴヌクレオチドを合成した．これらの試作プローブ

よく一致しており，また複数のターゲットスポットの各々

オンキャリアを蛍光標識した三種類のAnti−SenSeオリゴ

で同様の強度が得られた．この結果は我々の開発したヌクレオチドとハイプリグイズさせ，洗浄後残存した

マイクロアレイの信頼性の高さを実証している．

蛍光を調べた．三種類のプローブオンキャリアは，そ実際にDMD患者6例の生検筋を我々が開発したヒト

れぞれの蛍光Anti−SenSeオリゴヌクレオチドと最も良く筋cDNAマイクロアレイによる遺伝子発現プロファイ

結合し，他のオリゴヌクレオチドにはほとんど結合しルは疾患筋の病理変化を反映しており，まさに「分子なかった．さらに，これらを珊粉化し，スライドグラ

病理像」であると考えられる．また，上記の解析結果

スに固着したチップを用いて行ったハイブリダイズ実は我々のマイクロアレイの信頼性の高さを実証している．

験でも全体にS／N比が低いものの，僅か一塩基の変異

このマイクロアレイによって症例ごとの遺伝子発現解が認識可能であった．これらの結果は，プローブオン

析が可能となった事から，マイクロアレイを用いた患キャリアを固定化してオリゴ型DNAアレイを作成する

者生検筋の分子病理的研究という新しい可能性が妬けた．

事が可能である事を示唆している．しかし，これまでの成果では全体にS／N比が低いため実用化のためには安価なオリゴ型DNAチップ開発に関する研究

さらなる努力が必要である．S／N比の低下は，細孔径がオリゴヌクレオチド担体一体型プローブの作成と，小さいため，あるいはハイプリグイズ条件が最適化さその細粉化および固定化に関する研究を行い，DNA

れていないため，と考えられる．実際，より細孔径のChipの試作に成功した．それぞれの担体一体型プロー

大きい微小多孔質ガラス担体を用いてプローブオンキ

ブはその相補的DNAとのみ結合し，一塩基置換によるャリアを試作したところ，これまでよりS／N比が改善

変異を認識可能であった．従って，我々の開発した担

した．

体一体型プローブはDNAChipの作製に有効であることが確かめられた．しかしS／N比が低いため，実用化のためにはさらなる努力が必要であると考え，引き続き研究を行う必要がある．

ー84−

【文 献】
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−85−

Ⅳ．筋ジス犬を中心とした新たなモデル動物の開発

核移植技術を用いたマウスES細胞由来個体の作出
角 田 幸 雄＊【緒 言】

によって核移植卵を活性化させ，発生能を比較した．

これまで，マウス体細胞の核移植によって産子は得られているが，家畜の場合と異なって，継代培養した2．個体への発生能が低い原因の解明

体細胞から産子を得ることは困難である1）．ES細胞の

1）ICMとTEの置換場合は，長期間継代培養した細胞の核移植によって産個体を形成する能力に原因があるのか，胎盤を形成子が得られているが，産子生産率は低く，得られた産する能力に原因があるのかを明らかにするための検討

子の多くが分娩直後に死亡している2）3）4）．そこで本研を行った．ES細胞由来胚盤胞から単離した内細胞塊

究は，マウスES細胞から個体を安定して作出する核移（ICM，将来胎子を形成する）を，4倍体胚盤胞へ注入植技術を確立することを目的に実施した．

した（B区）．また，正常な受精卵由来胚盤胞のICMを，
核移植卵由来4倍体胚盤胞へ注入した（C区）．対照と【方 法】

して，正常な胚盤胞のICMを，受精卵由来4倍体胚盤

1．個体への発生能の向上

胞へ注入したものを用いた（A区）．いずれの区の胚盤

1）核移植卵の集合が発生能に及ぼす影響

胞も，偽妊娠雌へ移植し，妊娠満期で胎子への発生状

核移植卵2個を8細胞期で集合して細胞数を増加させ況を検査した．

ることによって，産子への発生能が向上するか否かを

2）初期化因子調べた．

これまでの実験から，第2減数分裂中期（M期）卵2）ドナー細胞の遺伝的背景，細胞周期ならびに核移

細胞質には体細胞核を初期化する因子が存在し，活性植方法の影響化刺激を与えた未受精卵細胞質には存在しないことがドナー細胞は，遺伝的背景が近交系であるNR2，交

しられている5）．M期卵と活性化刺激卵細胞質問で異な雑系であるTT2，TMA−39，41ならびに45の計5株をる代表的な蛋白質は，MPF（maturationpromotingfactor）

用いた．M期への同調は，3Pg血1のNocodazole添加培とMAPK（mitogen−aCtivatedproteinkinase）であること

地で3時間培養後，形態的に丸くなって細胞塊から浮から，この両者が初期化に関与するか否かを検討した．

き上がってくる細胞を用いた．また，Gl期の細胞はES

すなわち，ウシM期末受精卵に種々の活性化刺激を与細胞コロニーをトリプシンで単離後，ゼラチンでコー

えた後，0〜6時間目の卵細胞質にGO／Gl期またはM

トしたディッシュに播種後短時間培養して上清を回収し，期の培養卵丘細胞を核移植して発生能を調べた．ついで，

形態的に小さい細胞を選別して用いた．核移植の方法は，活性化刺激後0〜6時間日の卵細胞質におけるMPF活

従来から用いている不活化センダイウイルス（HVJ）を性をcdc2kinase活性を指標にして，またMAPK活性を用いた細胞融合法と，除核未受精卵への直j妾注入法を用いた．

Westem Blot法で測定し，核移植卵の発生能との関係を検討した．

3）核移植卵の発生速度の影響【結 果】

ES細胞を核移植後，12時間日から22時間日まで1時
間ごとに2細胞期への卵割時期を調べるとともに胚盤1．個体への発生能の向上

胞への発生率を検討した．ついで，卵割時期によって3

1）核移植卵の集合が発生能に及ぼす影響

区に分けて受胚雌へ移植し，個体への発生能を調べた．

集合区における核移植卵の胚盤胞への発生率は60％4）融合方法の影響であり，1回核移植区（59％）および再置換区（63％）

ES細胞をセンダイウイルスならびに電気刺激によっの発生率と比べて大差はみられなかった．

て除核未受精卵に融合させ，発生能を比較した．

集合区における受胚雌へ移植後の着床率は53％であり，5）活性化刺激方法の影響

1回核移植区（29％）および再核置換区（37％）と比べ強度の異なる電気刺激ならびにストロンチウム処置て有意に高かった．しかしながら，胎子が得られた割＊近畿大学農学部ー89−

合は集合区で17％であり，他区（7および11％）と比MPF活性は，活性化刺激後1時間で最低値まで低下す

べて有意差はみられなかった．

ることから，MPFはドナー核の核膜の崩壊に必要であ

2）ドナー細胞の遭伝的背景，細胞周期ならびに核移るが，核の初期化因子とは考えられなかった．また，植方法の影響MAPKカスケードであるp90RSKl，MEKl／2，ERKl／2

細胞融合法を用いた核移植卵の胚盤胞への発生率は2の活性と核移植卵の発生能とは相関しなかったことから，〜67％であり，M期の細胞を用いた方がGl期の細胞をMAPKも体細胞核の初期化に直接は関与していないと用いた場合よりも高かった．しかしながら，受胚雌へ考えられた．

移植後の産子への発生率には大差がなかった．注入法【考 察】の場合も，M期の細胞を用いた方がGl期の細胞を用いた場合よりも胚盤胞への発生率は高かったが，融合法

平成13年度から3年間実施した研究の結果，マウスと比較すると低い傾向がみられた．しかしながら，細ES細胞の核移植によって確実にクローンマウスを得る

胞の遺伝的背景，細胞周期や核移植方法の違いによっことができるようになった．現在の技術では，未受精て核移植卵の産子への発生率は大差がみられなかった．

卵の染色体除去率は100％，ES細胞と除核未受精卵の3）核移植卵の発生速度の影響

融合率は80〜90％，活性化刺激後の核形成率は95〜

核移植卵では，体外受精卵に比べて卵割時期にばら100％，胚盤胞への発生率は60〜80％と高いが，受胚つきが大きく，中間区の卵子の胚盤胞への発生率は，雌へ移植後の産子発生率は1〜5％ときわめて低い．し

早く卵割した卵子や遅く卵割した卵子に比べて高かった．

かも，得られたマウスの多くは，条件によっては分娩

受胚雌へ移植後の胎子への発生率も，中間区で高い傾直後に死亡している．核移植卵における遺伝子発現は，向がみられたが，顕著な差ではなかった．

受精卵とは相同ではないことが明らかにされており，

4）融合方法の影響これが低い産子への発生率や異常産子の出現につながセンダイウイルスを用いた場合のES細胞と除核卵細ると考えられている．その原因として，核移植前のES

胞質の融合率は，電気刺激を用いた場合に比べて高か細胞ですでに非可逆的な変異が生じていること，未受った．しかしながら，融合卵の胚盤胞への発生率は相精卵細胞質における核の初期化が不適切であることの2

異せず，また受胚雌へ移植後の産子への発生率にも大点が考えられている．本研究期間中に，核の初期化の差はみられなかった．

引き金となるのはMPFとMAPKではないことが明らか

5）活性化刺激方法の影響になった6）が，初期化因子の実体は不明である．

電気刺激あるいはストロンチウム処置によって活性化刺激を与えた核移植卵の胚盤胞への発生率には，大【結 論】

差はみられなかった．また，受胚雌へ移植後の産子へ

マウスES細胞の核移植によって，確実に産子を作出の発生率にも，有意な差はみられなかった．

できるようになったが，成功率はなお低い．今後，核の初期化機構を明らかにするとともに，正常な個体へ

2．個体への発生能が低い原因の解明

発生する能力の高いドナー細胞を選別する技術，正常

1）ICMとTEの置換な個体へ発生する能力を持つ核移植卵を作出し，選別

ES細胞由来胚盤胞ICMを4倍体胚盤胞へ注入したBする技術を確立することが必要と考えられる．

区における着床率（76％）は，対照区（71％）と大差なく高かった．しかしながら，産子への発生率（5％）は，【文 献】

これまでの結果（1〜3％）と比べて向上したが，対照

1）TsunodaY，KatoY：NucleartranSfbrtechnology．In

区（45％）に比べて有意に低かった．

TranSgenicAnimalTechnology；A LLZbonztory Hand−

また，正常受精卵由来胚盤胞ICMを核移植卵由来胚

book，2nd edition（C．A．Pinkert ed．），Academic Press

盤胞へ注入したC区では，着床率（24％）も低く，産195−231，2002．

子は全く得られなかった．

2）AmanOT，Kato Y，TsunodaY：Comparisonofheat−2）初期化因子treatedandtetraploidblastocystsfortheproductionof

核移植卵の発生率は，ドナー細胞が核膜をもつか否

COmPletelyES−Cell，derivedmice．勿gote9：153−7，2001・

かによって異なっていた．GO／Gl期の核の場合は，活3）AmanOT，KatoY，TsunodaY：Fulltermdevelopmentof

性化刺激後1〜2時間日で発生率が低下したが，M期

enucleated mouse oocytesfused withembryonic stemの核を用いた場合は5時間目まで低下しなかった．

Cells fromdifferentcelllines．Rq，TDduction121：729−

ー90一

33，2001．

4）AmanOT，TaniT，KatoY，etal：Mouseclonedfrom
embryonic stem（ES）cells synchronizedinmetaphase
Withnocodazole．JExp2bo1289：139−45，2001．
5）Tani T，Kato Y，Tsunoda Y：Direct exposure of
ChromosomestononactivatedovumCytOPlasmisefEbctive
for bovine somatic cellnucleus reprogrammlng．Biol
R甲md

4：324−30，2001．

6）TaniT，KatoY，TsunOdaY：Reprogrammingofbovine
SOmatic cell nucleiis not directly regulated bymaturation promotlng factor or

mitogen−aCtivated

PrOteinkinaseactivity．BioIRqpTDd69：189074，2003．

−91−新しいモデル動物作成法の開発による遺伝性ヒト疾患の病態解析

鍋

島

陽

【緒 言】

一＊
電解質代謝，とりわけカルシウムホメオスタシスの制神経・筋疾患の多くは遺伝子の変異が原因であり，御に関与していることから，脳脊髄液の電解質濃度のその発症，病態の解析，治療法の開発のためには，原測定，脈絡膜におけるカルシウム輸送制御分子の解析，因遺伝子の様々な配列に起こっている変異が原因とな

klotho結合蛋白を免疫沈降と質量分析により解析した．

っている．また，疾患の発症には主要な原因遺伝子のまた，uOtho変位マウスについては，学習機能の解析に変異のみならず，複数の修飾遺伝子の関与が推定されより学習機能の低下が観察されたことからMnSODの活ており，それが発症，病態の個体差を生んでいる．さ性について検討し，海馬における細胞死について検討

らに，ヒトゲノムには数百万に及ぶ遺伝子多型が存在し，した．

各種の疾患と連鎖していると推定されている．よって，（3）新たな個体レベルの遺伝子機能解析システムの開ヒト疾患の理解と治療法の開発のためには，原因遺伝

発に関する研究

子の変異が病態を引き起こすメカニズム，複雑な遺伝

複雑な統合的現象を解析するためには，培養細胞や子間の相互作用，遺伝子多型と疾患の関連など詳細な試験管内実験と共に個体レベルの遺伝子機能の解析が解析が必要であるが，現在の実験システムでは極めて必須である．また，解析対象となる遺伝子は多岐に及び，不十分であると言わざるをえない．また，神経・筋疾

しかも，それぞれの分子の詳細な解析が不可欠である．

患の発症，病態の解析，治療法の開発のためには解析

ところが，これまでの個体レベルの実験システムでは，に活用するモデル動物が必須である．

ターゲット遺伝子の詳細な解析や多数の遺伝子を解析

そこで，本研究では神経筋疾患をはじめとする（1）対象とするのは困杜であることから，新たな方法の開ヒト遺伝性疾患の分子機構の解析と臨床応用の道を切

発なしには，ポストシークエンス時代のゲノム研究にり開くためのモデル動物の開発，（2）モデル動物の変対応できない．そこで研究では「二本鎖RNAの発現を異表現型の解析と分子機構の解明，及び，（3）新たな利用した遺伝子機能欠損誘導系の開発（マウスにおけ

モデル動物作成法の開発，（4）疾患の発症，症状の個るRNAiの利用）」，「任意の組織や任意のタイミングで体差に関与する遺伝子素因の研究（5）遺伝子多型と遺伝子変異を導入する方法の開発」を行い，個体レベ

ヒト関連疾患との連鎖に関する研究を取り上げた．

ルの遺伝子機能解析能力の飛躍的発展を図ることを計画した．また，多数の遺伝子の機能を動物個体，ある【方 法】

いは細胞を用いて解析する新たな方法として電気穿孔（1）疾患モデル動物の開発に関する研究の一環として法による子宮内遺伝子導入法を確立した．本方法では新しい遺伝子改変動物の作成を試みた．又，既に作成

子宮内の胎仔の脳室に発現プラスミド溶液を入れ，電した遺伝子改変マウスについては，その変異表現型の気穿孔によりventricularzoneの細胞に遺伝子を導入し，解析とその分子機構を検討した．具体的には，神経細処理しないものと同様に発育を継続させ，解析に供す胞の発生，移動，ネットワークの形成に関与する遺伝子，

ることができる．

並びにプレセレニン結合蛋白遺伝子，筋衛星用胞で発（4）疾患の発症，症状の個体差に関与する遺伝子素因

現する転写因子（遺伝子ノックアウトマウスの作成との研究

筋衛星細胞のマーキングを目的として，翻訳開始コド

ヒト遺伝病においても主要な疾患遺伝子に加えて多ン下流にEGFPを挿入するタイプの相同組み替えベクタ数の修飾遺伝子が関与しており，病態のより深い理解ーを構築した），また，骨格筋，心筋でのみ発現するにとって，主要疾患遺伝子や修飾遺伝子間の相互作用

TBP結合蛋白についても相同組み替えにより遺伝子ノの解明が不可欠であることを示している．同様に，マックアウトマウスを作成した．

ウス突然変異の表現型は，その変異がどのような系統（2）uothoは腎臓，脈絡膜，副甲状腺で発現しており，の遺伝的背景にあるかによって大きく変化する．この＊京都大学大学院医学研究科腫瘍生物学講座

ー92−

現象は，変異表現型が修飾遺伝子と呼ばれる複数の遺成し，その変異表現型を解析したが，現時点では明瞭

伝子によって影響を受けること，また，それらの修飾な変異表現型が観察されていない．

遺伝子がマウス系統間で多型的であることを示している．

筋衛星細胞で発現する転写因子は発生過程の筋芽細胞，

そこで，多彩な変異表現型をもつKlotho変異マウスをあるいは筋衛生細胞で発現しており，培養筋細胞を用

遺伝的背景の異なるMSMマウス（日本産のマウス）といた実験ではMyoDの機能を阻害する活性を示すこと

掛け合わせ，遺伝的背景の影響を解析した．この結果，から，未分化な筋芽細胞や筋衛生細胞の維持にとってKlotho変異を修飾する遺伝子の存在が推定され，その重要と考え，ノックアウトマウスを作成したが，ホモ遺伝子座の特定を進めている．

変異マウスも生まれ，外見上，野生型と変わらない．

（5）遺伝子多型とヒト関連疾患との連鎖に関する研究

筋衛星細胞で発現する遺伝子であることから，筋再生を誘導し，再生能，再生の時間経過，再生に伴う遺伝多数のヒトKlotho遺伝子座のシークエンスを行い，子発現等を解析している．

遺伝子多型を示す配列を同定したところ，9カ所の配列において，SNP■Sを同定した．ついで2000例を越え

TBP結合蛋白は普遍的に発現するA型と骨格筋，心るヒト遺伝子において，これらの多型の解析を行い，筋でのみ発現するB型が知られており，B型は骨格筋，

臨床検査データとの相関を解析した．今回の対象では心筋において特殊な役割を担っていると推定される．

骨密度，肺機能，肥満，血糖などの生活習慣，年齢がB型は筋発生過程より成熟した筋細胞における特異な影響する事象との相関を解析したことから，喫煙，食転写制御に関与していると推定されており，Notファミ

習慣，妊娠歴，閉経などの違いも考慮した解析を行った．

リーのNot3と強く結合している．ノックアウトマウス
は外見上，野生型と区別ができない．
（2）多彩な老化症状を呈するuo血0変異マウスを樹立し，【結 果】

ヒトの老化疾患解析の重要なモデルマウスであると提（1）新たな遺伝子改変動物の作成
プレセレニン結合蛋白遺伝子については，ショウジ

唱した．次いで，生命維持機構におけるklothoファミ

ョウバエのホモログのRNAiによる機能欠失株の解析にリーの役割の解明，ヒト加齢関連疾患との連鎖解析をより，結合蛋白が神経細胞の発生に重要な役割を担っ

中心に研究を行い，以下の結果をえた．

ている可能性が示唆され，ノックアウトマウスの作成（∋Ⅲotho発現細胞の同定とその解析を決断し，相同組み替え細胞を分離し，マウスを作成

uotho遺伝子はカルシウムホメオスタシスの中枢であした．しかし，マウスの本遺伝子は複雑な構造をとっる腎遠位尿細管，脳の脈絡膜，副甲状腺で強く発現しており，遺伝子欠失部位を越えて遺伝子が転写され，ている．腎遠位尿細管ではカルシウム輸送を担うカル

一部を欠いた蛋白が合成され，明瞭な変位表現型が観シウムチャンネル（EcaC），カルシウムの細胞内輸送を察されなかった．

担うカルビンデインD28K，カルシウム・ナトリウム交第2の分子であるβ一軌）血）遺伝子を同定した．脂肪細換因子，Klotho蛋白が共発現しており，また，胞，肝臓などで発現しており，ノックアウトマウスを

Na＋／K＋ATPaseが強く発現していた．この結果から作成した．β一肋Jbノックアウトマウスはやや体重が軽Klotho発現細胞はカルシウム輸送において特殊な機能

い以外は特に外観的には異常がない．発現部位から脂肪，を担う細胞であることが強く示唆された．

コレステロール代謝との関連を注目し，コレステロール，（参Klotho結合分子の同定と機能解析

胆汁酸代謝を制御する機構を検討した結果，コレステ

抗Klotho蛋白抗体を用いた免疫沈降により野生型マ

ロールを胆汁酸へと変換するCyp7Al遺伝子の発現が克

ウスサンプルでは共沈するが，Klotho変異マウスサン

進しており，コレステロールの腸肝循環の新たな制御

プルでは共沈しない蛋白を分離し，質量分析により因子として機能していることを示唆する結果を得た．

Klotho蛋白結合分子を同定した．Kloth0蛋白はGRP78，

また，高コレステロール餌を与えると，野生型では胆カルネキシン，Na十侃＋ATPaseと結合していた．GRP78，

嚢にコレステロール結石が観察されるが，ノックアウ

カルネキシンはシャペロンとしてKlotho蛋白の成熟，トマウスでは，コレステロール結石が観察されなかった．

細胞内輸送の制御に関わっている．Klotho蛋白はグリア細胞の発生，運動神経の発生に重要な役割を

Na＋／K＋ArPaseと複合体を形成し，この複合体の機能制担う01ig2遺伝子のノックアウトマウスの解析により運動神経の発生異常が兄いだされた．神経細胞の移動，御を介して遠位尿細管，脈絡膜細胞におけるカルシウ

神経突起の伸展とネットワークの形成に機能するGDP−は，尿へのカルシウムの漏出（再吸収障害），脳脊髄液

GTP exchangerであるSTEF遺伝子のノックアウトを作のカルシウム濃度の低下（脈絡膜の輸送能低下）がおム輸送能を制御しており，実際に，uOtho欠損マウスでー93−

こる．Na＋／K十ATPaseは細胞内外のK，Naのバランス

Estradio13−β−glucronide，β一Estradiol17−β−glucronide，制御，浸透圧を制御する極めて重要な分子であるが，Androsteroneglucronide，Eticholan−3（X−01−17−0neglucronide，

遠位尿細管，脈絡膜細胞では特別に高発現しており，

Tbststeroneβ−Dglucronide，Estrone3−β一glucronide，5β−Klothoと複合体を形成してカルシウムホメオスタシス

Pregnane−3α，20（1−diolglucronide，Dehydroisoandrosteroneを調節することに機能していることが明らかとなった．

3−glucronide，5（1−Androstane−3（1，17β−dio117β−D−glucronide，（参Klotho蛋白によるカルシウムホメオスタシスとピタ

Estri0117β一β−D−glucronide，Estri0116（1−β−D−glucronideandミンD合成の制御

Estrio13β−D−glucronide），PrOteOglycan−disaccarides，intact

活性型ビタミンD合成の新たな調節回路が兄いだされ，PrOteOglycans（chondroitin，Chondroitinsulfate，Chondrosine，

Klotho蛋白がその回路の鍵を走る因子として機能してKeratansulfateandheperansulfate）を入手し，競合阻害活いることが明らかとなった．Klotho変異マウスでは活性により候補分子を絞り，基質候補分子を解析したと性型ビタミンD合成の律速酵素であるloトhydroxylaseのころ，β一Estradio13−β一D一glucronide，Estrone発現が顕著に克進している．しかし，その制御因子とglucronide，Estri013β一D−glucronideなどのステロイドホル

して知られているPTH，CT，活性型ビタミンDのシグ

モンにグルクロン酸が結合した分子のみが基質としてナルはKlotho変異マウスにおいても作動しており，新作用を受けることが明らかとなった．Klotho蛋白はス

たな制御システムを想定することとなった．解析の結果，テロイドーグルクロニドからグルクロン酸を切り取るβ−

Klotho蛋白の欠矢がその発現上昇の要因であること，

グルクロニダーゼ活性を有している．生理活性ステロ

Klotho蛋白が1α−hydoroxylase（活性型ビタミンD合成

イドの活性化の制御がKlotho蛋白の作用機構の本質での律速酵素）の発現を負に制御するネットワークを構あると推定され，新たな生理活性ステロイドの探索へ

成する分子であることが明らかとなった．活性型ビタと研究を展開している．

ミンDはカルシウムチャンネル，カルビンデインD28K，⑤Ⅲotho蛋白のプロセッシングと分泌型Ⅲ0血0蛋白

3−β−D−

たわ才力∂遺伝子の発現上昇を介してカルシウム輸送の克進

ヒトklotho遺伝子の解析からN端側のドメインよりをもたらし，ついで，発現上昇したKlotho蛋白が1α−なる70kdの分泌型Klotho蛋白の存在が推定された．そhydroxylaseの発現を負に制御することによって活性型

こで，70kd分泌型Klothoを高発現するマウスを作成しビタミンD濃度を下方修正する仕組みとなっている．

たが，全く機能を兄いだせなかった．また，マウス，

ビタミンD欠乏餌により血清ビタミンD，カルシウ

ヒト血清中より分泌型Klotho蛋白の同定を試みたが，ム濃度を正常化すると多くの変異症状が消失すること

兄いだせなかった．そこで，新たな抗体を作成し，検から，血清ビタミンD濃度の克進が多彩な変異症状の討したところ，130kDの分泌型蛋白を兄いだした．こ

重要な要因となっていることが明らかとなった．また，の分泌型mo血0は全長型よりプロセスされたものである．

血清ビタミンD，カルシウム濃度の克進がドカルパイン（3）新たな個体レベルの遺伝子機能解析システムの開の過剰な活性化を誘導し，細胞死，組織の分解を引き発に関する研究起こすことを証明した．これによりビタミンDがカル

点突然変異をターゲット遺伝子にコンデイショナル

シウム制御のみならず，多彩な老化症状の発症につなに導入するシステムを開発し，呂的通りにアミノ酸のがる多面的な生体制御機構に関与していることが明ら

変異を導入できることを確認し，変異表現型の解析から，かとなった．また，uOtho変異マウスでは明らかに学習変異を導入したアミノ酸が担う機能を解析することに機能が障害されており，その要因として活性酸素を除成功した．2個の異なるloxP配列をターゲット遺伝子

去に働くSOD活性の海馬における低下と海馬の神経細に組み込んだ相同組換えマウスを作成した．一方，こ胞死の克進が観察された．

のマウスの作成に利用した相同組み替えES細胞を用い④Klotho蛋白の酵素活性て2個の異なるloxP配列に囲まれた遺伝子を交換できることを確認した．更に同様の実験を受精卵を用いてKloth0蛋白はTypelglycosilaseの一月であることから，行っている．

Klotbo・Fcキメラ蛋白を培養細胞で高発現させ，酵素活性を解析したところ，β一Glucoronidase活性を示した．

子宮内電気穿孔法により，Stef，RacI，JNKなどの発現

基質特異性が極めて高く，β−Glucoronidase阻害剤で阻

ベクター，あるいはそのドミナントネガティブベクタ

害される．グルクロン酸をもつ分子が基質の候補と推ーを導入し，神経細胞の挙動を観察した．stefシグナル

定され，生体内分子としてはでプロテオグリカン，アはRacIを活性化し，神経細胞の先導突起の形成，伸展

ルカロイド，ステロイドホルモン，糖脂質，フラボノの制御と，JNKの活性化を介した細胞内骨格のダイナ

イドなどが解析対象となり，SterOidglucronides（β一

ミクスの制御に関与することによって神経細胞の移動ー94−を制御していることが明らかとなった

ベてより高い相関を示すことが確認された．これらは（4）疾患の発症，症状の個体差に関与する遺伝子素因

特定の疾患との連鎖解析ではないことから，詳細な解の研究（∋Klotho表現型のMSM系統による遺伝的修飾につい析により日本人閉経後女性においても，PrOmOter領域およびexon4の多型が骨密度の低下と有意な相関を示した三．

ことから，たわfゐβ遺伝子産物が，老化に伴う骨租老化に関与している可能性が示された．

MSM．motbo系統の表現型を病理学的に解析した結果，血清中のカルシウム及びリン濃度が克進していた．したがって，標準的実験用マウス系統の遺伝的背景にお【考 察】

けるオリジナルKlothoマウスの中心的な病態と考えら（1）新たに作成したノックアウトマウスはいづれも外れるカルシウムホメオスタシスの異常はMSM．Klotho系

見上は野生型と同様に成長しており，今後は筋細胞の統でも同様に認められた．しかし，興味深いことに，

特性，収縮蛋白遺伝子発現，再生能力などの検討を進

他の表現型については，オリジナルklothoマウスと大めることが重要である．また，STEF遺伝子については

きく異なっていた．それは，特定の表現型の緩和と悪機能重複遺伝子が推定されることから，二重ノックア化の二つに大別される．

ウトが必要と思われる．

（∋表現型の緩和

β一肋才力0ノックアウトマウスはコレステロール代謝にMSM．Klotho系統は，性成熟期まで正常個体と同様に関与しており，成人病の発症機構の解析，予防法の開成長し，平均寿命も標準的な実験用マウス系統の遺伝

発に結びつくと期待している．

的背景上のKlothoマウスに比較して約30日延長する．

（2）Klothoについては予想を超えたことが次々に明らまた雌雄生殖器内には正常な形態の精子や二次卵胞がかになり，全く新しい領域の発展に結びつくと考えて認められ，生殖器系の異常が緩和されていた．これらいる．これまで，1α−hydroxylaseの発現上昇により血清の特徴はオリジナルklothoマウスの病態を改善する特中のビタミンD濃度が上昇し，上昇したビタミンDは徴と考えられる．

lα−hydroxylaseの発現を抑制することにより，local（∋腎機能表現型の悪化

negative circuitが成り立っていると考えられてきたが，MSM．Klotho系統は，多飲多尿で，全身の組織への異この制御回路に新たな役者，Ⅲ0血0が必要であるらしい．

所性石灰沈着がklothoマウスよりも重度であった．特このサーキットにおけるKlotho蛋白の占める位置，そに腎臓は細動脈の石灰化と共に尿細管萎縮，糸球体硬の占め方はどのようなものであるかは次の課題である．

化など組織形態の異常が顕著であった．この組織所見

試験管内の打力ルパインの活性化には10匹mOlを越えを裏付けるように血中のBUNは異常に高値で，尿中のるカルシウムが必要とされるが，細胞内のカルシウム

糖の排泄量も増加していた．これらの病態はオリジナ

濃度は1ドmOl以下で，簡単には増加しないと考えられ，

ルuo血0マウスの病態よりも重篤であった．

確かにklotho変異マウスでは血清中のカルシウム濃度①遺伝的修飾に関する考察が克進しているが，この結果から細胞内のカルシウム以上の特徴から，MSM．kloth系統は，オリジナル

濃度が上昇すると考えるのは早計である．けカルパイン

uothoマウスよりも病態が緩やかに進行するため，老化の動物個体における活性化機構は不明であるが，おその過程をより忠実に再現しているモデルマウスである

らく，uOtho変異マウスでは細胞内へのシグナルが誤っと考えられる．またKlotho遺伝子の変異による詳しいて伝えられ，細胞内の匹カルパインのカルシウムに対病態の進行や死因を検討する為にも，より有力なツー

する感受性が完進し，活性化が引き起こされたと推定ルとなる．特に腎臓の表現型はklotho遺伝子の変異にしている．

より受ける障害の感受性がMSMで高い事を示している．

カルシウムの制御は生命維持にとって必須の機構でこのことは，人の腎疾患において腎不全や透析導入にあることから膨大な研究が積み重ねられてきたが，今至るまでの病態の進行スピードが人種により差がある

回の研究により，Kloth0蛋白とNaRATPaseの複合体にことと対応している．

よるカルシウム制御機構の発見やビタミンD合成の新（5）遺伝子多型とヒト関連疾患との連鎖に関する研究

たな制御回路の発見，Klotho蛋白のステロイドβ−グル

ヒトklotho遺伝子座の解析により9カ所の遺伝子多クロニダーゼ活性の解析など，これまでの予想を超え型（SNP−S）を兄いだしており，少なくとも，7カ所はた全く新しい事実が次々と明らかとなり，新たな展開

老化関連疾患や代謝関連指標との連鎖が推定されている．

が推定される．

まお，ホモに変異配列をもつ集団はヘテロの集団に比一95−

（3）cre−loxPシステムの利用により新たな遺伝子操作

expressionofKlothogeneinhumanChronicrenalfailure

技術が可能となった．これらの技術の発展により遺伝

bdney．βわC力emβ甲桓∫Re∫Comm280：1015−1020，

子機能の詳細な解析と構造と機能の連関を個体レベル

2001．

で解析することが可能である．また，症候学的にヒト

2）％mashita T，SekiyaI，Kawaguchi N，et al：klotho−

疾患に近いモデルマウスの作成や疾病の成り立ちを理

deficient mice are resistant to bonelossinduced by

解するためのマウスの開発がすすむものと推定される．

unloading due to sciatic neurectomy・J助dcrinology

点突然変異の導入に成功したが，今後はこの方法を一

168：347−351，2001．

般化できるかどうかである．

3）UchidaA，KomiyaY，1bshiroT，etal：NeurofilamentSOf

子宮内遺伝子導入法は，量，スピードにとどまらず，Klotho，the mutant mouse prematurely displaylng

解析の質的な進歩をもたらすと推定される．RNAiのメ

SymptOmeSreSemblimghumanaglng・JNeulVSCiRes64：

カニズムについて知見，活用法に関する工夫が多数，

364−370，2001．

報告されており，RNAiと子宮内遺伝子導入法を組み合

4）ManabeN，KawaguchiH，ChikudaH，etal：Connection

わされることによって，更に詳細な解析が可能となる

between B−lymphocyte and osteoclast differentiationと推定される．

pa也ways．∫山肌〟〃07167：2625−2631，2001・（4）標準的な実験用マウスの遺伝的背景にあるオリジ

5）Mizuguchi R，Sugimori M，Takebayashi H，et al：

ナルKlothoマウスとMSM此lo仙0系統を用いることによCombinationalroles of Olig2and Neurogenin2in theり，腎障害の進行に関連する修飾遺伝子を遺伝学的にCOOrdinatedinductionofpan−neuralandsubtype−SPeCific

解析する事が可能である．その遺伝子を特定できれば，PrOPertiesofmotoneurons・NeulVn31：757−771，2001・

人の腎障害進行の個人差を生むメカニズムの解明にも

6）YoshidaS，OhboK，TbkakuraA，etal：Sgnl，abasichelix−

繋がると思われる．また，腎臓の表現型に限らず，同loop−helix transcrlPtlOn factor delineatesthe salivary

じ手法を用いれば寿命の延長や生殖器系の改善に関連

glandductcelllineageinmice．DevBio1240：517−530，

する修飾遺伝子の特定もできる．我々のグループは，

2001．

MSM系統の全染色体を一つずつ標準的な実験系統であ7）MorishitaK，ShiraiA，KubotaM，etal：Theprogressionof

るC57BL／6J系統の遺伝的背景に導入したコンソミック

aglnginklothomutantmicecanbemodifiedbydietary

系統を樹立した．通常のqTL解析で可能性のある染色

PhosphoruSandzinc．JNutrition131‥3182−3188，2001・

体領域を同定した段階で，速やかにコンソミック系統

8）1bmagishiT，SaitoY，NakagawaT；et al：Troglitazoneを利用することで，修飾遺伝子同定の効率を大幅に上

improvesendotherialfunctionandaugmentsrenalklotho

げることが可能である．現在，qTL解析の準備を進めている．

mRNA expressionin Otsuka Long−Evans Tbkushima（5）本研究からは，klotho以外にも遺伝子多型解析の〃甲erJe〝∫Rg∫24：705−709，2001．

Fatty（OLETF）ratswithmultipleatherogenicriskfactors・対象となる遺伝子が浮かび上がる可能性があり，それ9）Matsuo N，Hoshino M，Yoshizawa M，et al：らを含めて遺伝子多型と疾患の相関を解析する．このCharacterizationofSTEF，aguaninenucleotideexchange

研究の進展は各個人の「雁患率の将来予測」や「遺伝factorforRacl，requiredfbrneuritegrowth・JBioIChem

子素因にあわせたライフスタイルの検討」につながる

272：2860−2868，2002．

と推定され，倫理問題を考慮しつつ，QOLの改善に役

10）YoshidaT，FujimoriT，NabeshimaY：Mediation of

立てる方向を模索したい．

unusuallyhighconcentrations ofl，25−dihydroxyvltamin
D3in homozygous klotho mutant mice byincreased【結 論】

expression of renal lalpha−hydroxylase gene・

得られていた遺伝子改変マウスの解析，新たな遺伝

助わocrr〃Obgy143：683−689，2002・

子ノックアウトマウスの開発，遺伝子改変マウスの新11）ItoS，FttjimoriT，HayashizakiYetal：Identincationofa

たな作成法の開発を試み，重要な成果が得られ，神経・novelmousemembrane−boundfami1ylglycosidase−like

筋肉系の形成，崩壊の分子機構解明の手がかりが得られ，PrOtein，Which carriesanatyPicalactive site struCture・

病態モデルの開発が前進した．

βわCゐem創り，カブ∫AcJd1576：341−345，2002・

12）TbkebayashiH，NabeshimaY，YoshidaS，etal：nebasic【参考文献】

helix−loop−helixfactorOlig2isessentialfordevelopment

1）KohN，FujimoriT，TamoriA，etal：Severelyreduced

Ofmotoneuronandoligodendrocytelineages・Currenl−96−

βわbgy12：1157−1163，2002．

23：55−61，2003．

13）KashimadaK，YamashitaT，TkujiK，et al：Defectsin25）YoshizawaM，SoneM，MatsioN，et al：Dynamicand

growthandbonemetabolisminklothomutantmiceare

COOrdinated expression prifile of dbl−family guanine

resistant to growth hormone treatment・J Endcrinology

nucleotide exchange factorsin the developlng mOuSe

174：403−410，2002．

brain．Gg乃eE甲rねfrgm∫3：375−381，2003．

14）Thkebayashi H，Ohtsuki T，Uchida T，et al：NonT
OVerlapplng eXpreSSion of Olig3

and Olig2in theembryonic neuraltube・MechanDevelqpl13：169−174，2002．

26）KawauchiT，ChihamaK，NabeshimaYI，etal：nein
Vivo roles of STEFrriaml，RaclandJNKin corticalneuronalmlgration．E〟βOJ22：4190−4201，2003．
27）WakimotoK，FlわimuraH，IwamotoT，etal：Na＋／Ca2＋

15）ManyaH，FujimoriT，NabeshimaY，etal：Klothoprotein

exchanger−deficientmicehave disorganizedmyofibrils

deficiencyleadstooveractivationof（Mu）−Calpain．JBioIand swollen mitochondriain cardiomyocytes・Co〝甲C九gm277：35503−35508，2002．

βわC力emPカブ∫わJββわcJZem〟oJβわ7135：9−15，2003．

16）NakagoshiH，NabeshimaY，MatsuzakiF：Rennementof28）1hhataK，MoriK，MukoyamaM，etal：Regulationof

WinglessexpressionbyaWingless−andNotch−reSPOnSive

Stanniocalcinland2expressioninthekidneybyklotho

homeodomainprotein．DevBioL249：44−56，2002．

gene・βわCんemβf（やあγ∫Rg∫Comm〟乃310：128−34，2003．

17）Kawano K，OgataN，ChianoM，etal：Klotho gene29）SekiK，FujimoriTSavagnerIletal：MouseSnailfamily

POlymorphisms associated with bone density ofaged

transcriptionrepressorsregulatechondrocyteextracellular

postmenopausalwomen．JBoneMineltZIRes17：1744−

matrix，typeIIcollagenandaggrecan．JBioIC7zem278：

1751，2002．

41862−41870，2003．

18）Yamashita T，Okada S，Higashio K，et al：Double30）F可imoriTIKurotakiYMiyazakiJ，etal：Analysisofcell

mutationsinklothoandosteoprotegeringenelocirescued

lineagein the

OSteOPetrOtic phenotype．Endocrinology143：4711−7，

pgveJ（pme〝7130：5113−5122，2003．

2002．

2−Cell and4−Cell mouse embryo・31）Tb可ikawH，KurotakiYFltjimoriT：etal：Klotho，agene19）Tbkeshita K，Yamamoto K，Ito M，etal．Increased

relatedtoasyndromeresemblinghumanPrematureaglng，

expressionofplasminogenactivatorinhibitor−1withnbrinfunctionsin anegative regulatorycircuitofvitaminD

depositioninamurinemodelofaging，Klothomouse・

endocrine system・Molecular Endcrinology17：2393−∫gmわ乃mmあ助椚0∫f28：545−553，2002．

2403，2003．

20）YoshizawaM，HoshinoM，SoneM，etal：Expressionof
Stef，anaCtivatorofRacl，COrrelateswiththestages of32）TbhyamaO，ImuraA，IwanoA，etal：Klothoisanovelβ−
glucuronidase capable of hydrolyzing steroid

neuronalmorphologicaldevelopmentinthemousebrain．

β−glucuronides．JBioIChem（inpress）〟dfc力α乃i∫m∫げ伽vgJ甲meが113：65−68，2002．

33）Tbkeshita K，FujimoriT，KurotakiY，et al：Sinoatrial21）MomoseS，KobayashiTIMitaniH，etal：Identificationof

NodeDysfunctionandEarlyUnexpectedDeathofMicethecodingsequencesresponsibleforTbc2−mediatedtumor

WithaDeftctofKlothoGeneExpression．Cirrulation（inSuPPreSSionuslngatranSgenicratsystem・HumanMolec

press）

Gg乃efk∫11：2997−3006，2002．

22）Nagai T，Yamada K，Kim H−C，et al：Cognition
impalmentinthegenetic modelofaging，klothogene
mutantmice：Aroleofoxidativestress．FbsebJ17：50−52，2003．

23）ⅥmgJ，MatssukawaN，RakugiH，etal：Upregulationof
CAMPisanewfunctionalsignalpathwayofKlothoin
endotherialcells・BiochemBiqphysResComm301：424−
429，2003．
24）KurisakiTIMasudaA，SudoK，etal：Phenotypicanalysis
Ofmeltrina（ADAM12）−denceintmice；InvoIvelmentof
meltrinainadipogenesisandmyogenesis・MoICellBioL−97−

筋ジストロフィー関連モデル動物の生産・供給システムの検討

日 置 恭 司＊研究協力者 筒本まりこ＊，外丸祐介＊，小倉智幸＊，伊藤 守＊【諸 言】

mdr（195匹），C57BL／10ScN（36匹），C57BL／6J−4y（28筋ジストロフィー症の要因解明や治療研究のため，匹），3年間の合計で延べ49機関，97回，1，038匹を供給した．

筋ジストロフィー（筋ジス）モデルマウス・ハムスタ
ーならびに，そのコントロール系を微生物的，遺伝的

2．筋ジスハムスター胚の凍結保存

統御のもとで維持し，研究班を初めとする研究グルー
プに供給した．また，筋ジス研究に適したモデル動物【目 的】の育成を目的に育種繁殖技術，生殖工学技術およびク筋ジストロフィー症シシリアンハムスターは，1962

ローン動物作製技術の開発に努め，これら技術を応用

年Dr．Humburgerらによって育成された．当研究班では，した実験動物学的改良を行った．

筋ジスハムスターBIO14．6系，ならびにコントロールと動物の維持と供給では，1．として筋ジス動物を3年間してBIOFIB系を米国のBIOResearchConsultantsInc．かに渡り研究者に繁殖用タネ動物として供給した．2．とら輸入し，1982年から研究班に配布した．その後，育して個体で維持していた筋ジスハムスターから受精卵（胚）種的改良を行い，現在の筋ジスハムスター（NSJXNSH）一採取と凍結保存を行った．実験動物学的改良では，3．

肌γとコントロール（NSJXNSH）を育成し維持を行っとしてヒトを初めとする異種細胞を生着させたマウスてきた．しかし，近年は研究者からの要望がなくなっの作製は，種々の病態発生機序の解析やその治療，予てきたことから個体での維持を中止して，凍結保存胚防のために重要な役割を果たすと考え，異種細胞の生での維持に置き換える試みを行った．

着と増殖を支持するマウスの開発を試みた．4．として遺伝子操作ES細胞から作出されたクローンマウスの次【方 法】

世代以降への操作遺伝子の伝達を確認した．5．として筋ジスハムスター（NSJXNSH）−〝ヴ／〝Wとコントロール（NSJXNSH）＋／＋を用いた．

ES細胞での相同組換えを利用した遺伝子改変マウスの作製は，重要且つ効果的な手法となり得ることから受精卵の採取：12週齢以上に達した雌ハムスターを

C57BL／6J−みマウスからのES細胞の樹立を試みた・以
上1〜5について報告する．

無作為に選抜して，同じく12週齢以上の同系の雄と1：1で同居させ，自然交配を設定した．すなわち，同居開始の翌日から9こ00−10：00に雌の脛スメアを観察し，精子の有無により交尾を確認した．交尾が確認された雌

1．筋ジスモデル動物の維持とタネ動物の供給
筋ジスモデル動物【マウスC57BL／6J−dy，C57BL／10−

は翌日の14：00−15：00に頚椎脱臼により安楽死させて卵m血，ハムスター（NSJXNSH）−my］およびコントロー

管部を採材し，これをPBI液にて濯流することで2細ル動物【マウスC57BIJlOScN，C57BU6J，ハムスター（NSJ

胞期胚の採取を実施した．

XNSH）】をビニールアイソレーター装置ならびに胚の受精卵の保存：得られた2細胞期胚は，PBI液にて凍結保存によって維持繁殖し，班員の要望に応じて供37℃（培養器中）で10−30分間培養した後，ガラス化法

給した．供給は原則として繁殖用タネマウスとした．
平成13年度は16機関に延べ34回，C57BL／10ィ批正（332を導入した．すなわち，胚を5匹1のlMDMSO添加PBI
液とともに凍結チューブに移して氷上に3分間静置した．

匹），C57BL／10ScN（41匹），C57BL／6J−4y（18匹），平

次いで95tllのDAP213液（2MDMSO，lMアセトアミ

成14年度は18機関に延べ32回，C57BUlO−〝血（303匹），

ド，3Mプロピレングリコール）を添加し，氷上でさら

C57BL／10ScN（74匹），C57BL／6J−4y（12匹），平成15に3分間静置した後，液体窒素中に投入することで凍

年度（4月〜12月）は15機関に延べ31回，C57BL／10−

結保存を実施した．融解操作は，凍結チューブを室温＊（財）実験動物中央研究所−98−

に30−60秒間静置した後，900け1の0．25MSucrose添加

末梢血リンパ球の再構築：NOD−∫C玖 IL−2RYKO，

PBI液で希釈することで実施し，胚は回収後にPBI液に

NODっcfd抗NK抗体投与およびNOD−∫Cfdに正常ヒト末移して顕微鏡下で形態を観察した．

梢血より分離した単核球1×107を腹腔内に移入し，2週後の各マウス腹腔細胞中のヒトCD4＋，CD8＋細胞を【結果・考察】Rowcytome町で産出した．

受精卵の採取と保存：〝ワ／〝伊と＋／＋ハムスターの雌雄

ヒト臍帯血幹細胞の分化と増殖：前者同様のマウスをそれぞれ同居させることで，供試した雌の83％（24／29にヒト臍帯血より分離したCD34＋細胞1×105を尾静脈

匹）および84％（16／19匹）について交尾の確認ができ

より移入し，4週後の各マウス末梢血におけるヒト

た．交尾確認された〝ヴ／〝坪の24匹および＋／＋の16匹のCD45＋およびCD41＋細胞を産出した．

雌から2細胞期胚を採取した結果，合計127個および101個が採取でき，それぞれの受精卵採取効率は6．3個【結果・考察】および5．3個／匹であった．

NOD−SCidへの戻し交配を8回行ったNOD−SCid，IL−

受精卵の保存：得られた2細胞期胚は，雌の個体ご

2RYKOを育成した．その繁殖成績は，出産率68．5％，とに個別の凍結チューブにてガラス化保存を実施し，平均産仔数6．8匹，離乳率96．9％および生産指数4．5と〝ヴ／叩の127個を14チューブに，一方の＋／十の101個を高い繁殖値であった．

11チューブに保存することができた．また，保存した

ヒト末梢血リンパ球およびヒト臍帯血幹細胞の移入＋／十の胚のうち3本の凍結チューブについて融解試験を実験では，NOD−∫C紘IL−2RYKOが，双方ともに生着，実施した結果，100．0％（13個）が回収され，53．8％（7増殖また分化においてNK抗体処理したNOD−∫Cfdより個）が形態的に正常であり，高い生存率が得られた．

も優れていることが明らかとなった．このことは，

さらにこの内の7個について偽妊娠雌への移植試験を実施した結果，全て胚の着床が確認された．

NOD−∫Cfd，IL−2RYKOの高生着にNK活性以外の活性の消失が関連していることを示唆するものと思われる．

以上より，最終的にJ町／myハムスターについては127
個（14チューブ），＋／十については88個（8チューブ）

4．核移植により遺伝子操作ES細胞から作出されたクの2細胞期胚を凍結保存することができ，個体での維ローンマウスの子孫への操作遺伝子の伝達持を中止した．

【目 的】
遺伝子操作ES細胞から作出されたクローンマウスの3．NOD／Shi−∫Cj玖IL−2R KOマウス

次世代以降への操作遺伝子の伝達様式は詳細に示されが示す移入ヒト細胞に対する高生着性についてていない．そこで，クローン技術の実験動物における【目 的】有用性を評価するために，遺伝子組み換えES細胞由来
クローンマウスの操作遺伝子の仔への伝達を調べた．

我々が開発したNOD／Shi−SCidマウス（以下NOD−SCid）
がNK活性，補体活性およびマクロファージ機能を著し
く減退していること，異種細胞の生着性が極めて高い【方 法】

こと，さらにNOD一∫Cfdへの抗NK抗体投与が，その生変異型卵管特異的糖タンパク（oviduct−SPeCific

着をさらに向上させることを明らかにした．このことから，NOD−∫Cfdの生着性をより向上させる目的でNK

glycoprotein：OGP）遺伝子を有する（OGP−／＋）ES細胞から核移植により直接作出したOGP，／＋クローンマウス（♂

細胞を消失させたIL−2R†変異体を導入したNOD／Shi−

7：♀1）を用いて次のような交配を行った．①♂oGP−／十∫Cfd，m−2RYKOマウス（以下NODっcfd，m−2RYKO）を育

クローンマウスと♀C57BL／6Jの交配，②は①由来OGP−

成し，繁殖性および異種細胞の生着性を検討した．

／＋マウスの♂と♀の交配，③oGP−／＋クローンマウスの♂と♀の交配の組み合せを行った．なお，♂クローンマ
ウスはY染色体を欠いたⅩ0型である．

【方 法】
NOD−SCid，IL−2R†KOの育成：NOD−SCidとC57BL／6J−
IL−2RYKOを交配させ，その産仔の中からm−2RY変異体【結果・考察】遺伝子を持つマウスをPCR法にて選別した．そのマウ①で得られた産仔89匹中50匹（56．2％）がOGP−／＋スをさらにNOD−∫Cfdと交配して変異体遺伝子を持ってマウスであった．②では37匹中，OGP−トが9匹（か．8％），

いるマウスの選別を繰り返すことで育成した．さらに，

OGP−／＋が18匹（48．6％）およびOGP十／十が10匹（27．0％）

育成されたNOD−SCid，IL−2RYKOの繁殖性を調査した．

であった．操作遺伝子の伝達は，ほぼメンデルの法則−99−

に従っていた③のクローン♂♀間で26匹の仔が得られ，解離，継代によって増殖した結果，ES細胞株のコンパ

OGP−／−が10匹，OGP−／＋が12匹およびOGP−／−が4匹でクトなコロニーを形成しながら増殖している細胞株を7あった．また，③の交配でⅩ0マウスの伝達も確認されつ得ることができた．この7細胞株の性状は，全てにた．キメラマウスを介した遺伝子組み換えマウス作出

おいて高い正常核型の保有（＞80％）と未分化率（96±法に比べ，クローン技術を用いることで少なくとも一2％）であった．

世代早く遺伝子組み換えマウスを得ることが可能であ

胚盤胞へのES細胞移入によるキメラマウス作出では，った．また，今回のようにⅩ0マウスを使うことによっ各細胞株で60個前後の移入胚移植したところ6つの細て，より早くホモ欠損マウスを得ることも可能であった．

胞株でキメラを含む産仔が生まれ（平均キメラ率38％）
そのうち，4つの細胞株で，キメラ個体へのdyES細胞の寄与率が80％を超えるキメラマウスが得られた．し5．C57BL／6J−みマウスのES細胞樹立の検討【日 的】かし，これら寄与率の高いキメラマウスでも，移入ES

ES細胞での相同組換えを利用した実験動物の遺伝子細胞に由来する筋ジストロフィー症状，即ち，2週齢以降下肢を引きずるような症例は観察されなかった．

改変は，極めて重要かつ効果的な生物学的手法となっている．そこで，疾患モデル動物の直接的な遺伝子改

今回樹立されたC57BL／6J−4yマウスのES細胞株の性変に向けC57IL／6J−みマウスの胚盤胞からES細胞の樹立を試みた．

状検定の結果から明らかに高い未分化率，正常核型率は，
日的遺伝子の組換え体作製時の長期培養でも安定な性
状維持が期待できるものと考えられる．また，ES細胞【方 法】

を遺伝子改変動物作製に用いるためには，キメラ個体

C57BL／6J−4yマウスの凍結受精卵を急速融解し，M2の生殖細胞系列に導入ES細胞が分化し，次世代に伝わ培地で3．5日間培養し，胚盤胞まで発生させた．ES細ることが最も重要である．今回のキメラマウス作出率

胞の樹立または培養にはフィーダー細胞を播種したと寄与率は，生殖細胞系列への寄与が認められている

plateまたはdishを使用した．フィーダー細胞は，使用する前にマウス14．5日齢由来の胎児繊維芽細胞を既知のES細胞の寄与率などと比べても遜色なく，キメ

10けg／mlマイトマイシンCで3時間処理した後，0．1％

される．現在，得られたキメラマウスを交配し，そのgelatinコートしておいた4wellPlateなどに播種した．
ES細胞性状検定：作製されたES細胞はアルカリフ

産仔での生殖細胞系列への寄与の有無を解析している．

オスフアダーゼ染色キットによる未分化細胞コロニー【結 論】の検出を行った．また，ES細胞の核型検査は骨法に従筋ジスモデル動物（マウスC57BL／6J−4y，C57BL／10−

い染色体標本を作製し，観察されるES細胞の染色分体

m血，ハムスターNSJXNSH一mγ）およびコントロール

をランダムに50核選び，カウントした．

動物（マウスC57BL／10ScN，C57BL／6J，ハムスターNSJ

ラ寄与率の高い4株には生殖細胞系列への寄与が期待

キメラマウスの作出：凍結ES細胞を37℃温湯で融解

XNSH）をビニールアイソレーター装置ならびに胚のし，浮遊液をESMに懸濁して，1，200Ipm5分間遠心後，凍結保存によって維持繁殖し，班員の要望に応じて平ESMで細胞数を5×105／dishに調整し3．5cmdishに播種

成13〜15年度の3年間に延べ49機関，合計97回，した．培養2〜3日後に対数増殖期のES細胞を0．25％

1，038匹を供給した．

EDTA−Trypsinで解離し，パスツールピペットで良く撹筋ジスハムスターは1982年から研究班に配布を開始

拝し，6．Ocmdishに浮遊液を入れ，20〜30分間培養すした．その後，育種的改良を行い，現在の筋ジスハム

ることによってフィーダー細胞を除去した．回収したスター（N釘×NSH）ィ町とコントロール（N訂×NSH）を

ES細胞をICRマウスの胚盤胞にマニュピュレークーで育成し維持を行ってきた．しかし，近年は研究者から常法に従いインジェクションし，8時間ほど培養後，卵の要望がなくなってきたことから個体での維持を中止

膜が修復されたら偽妊娠ICRの子宮に移植した．

して，凍結保存胚での維持に置き換えた．

【結果・考察】NOD−∫Cid，Ⅰし2RYKOマウスは従来の免疫不全マウスの中でも異種細胞の生着性に最も優れており，免疫学

胚盤胞まで進んでいる17個の受精卵を培養し，12個的な基礎研究だけでなく，異種細胞を用いた種々の病のICMをピックアップし4wellplateに播種した．培養5日後に2wellに形状の良いES様コロニーが9個確認さ

態機序の解析に有用である．また，幹細胞移入などにれた．その後，これらのコロニーをそれぞれ2〜3回の秘めているマウスを作出した．

よる再生治療のためのレシピェントとしての可能性を−100一

遺伝子操作ES細胞から作出されたクローンマウス技
術の実験動物における有用性を評価するために，遺伝子組み換えES細胞由来クローンマウスの操作遺伝子の仔への伝達を調べた．その結果，キメラマウスを介した遺伝子組み換えマウス作出法に比べ，クローン技術を用いることで少なくとも一世代早く遺伝子組み換え
マウスを得ることが可能であった．
疾患モデル動物の直接的な遺伝子改変に向け，
C57BU6J一身マウスの胚盤胞からES細胞の樹立を試みた．
その結果，7つのES細胞株が得られ，全ての細胞株において正常核型，未分化状態の維持が示された．マウスの胚盤胞に移入しキメラマウスを作出したところ，高いキメラ率と寄与率を示した．このことは，生殖細胞系列への寄与が認められるES細胞が得られることによって，疾患モデル動物での直接的な遺伝子改変研究が可能になることを示唆している．
【参考文献】
1）HiokiK，KuramochiT，EndohS，etal：LackofBcell
Leakinessin BALB／cA−nu，SCid Double Mutant Mice．
且甲A血涙50：67−72，2001．
2）onoY，ShimozawaN，MugurumaK，etal：Productionof
Cloned mice from embryonic stem cells arrested at
metaphase．Rq，TVduction122：731，2001．
3）ItoM，HiramatsuH，KobayashiK，etal：NOD／SCID／rnull
mouse：an eXCellent recIPlent mOuSe mOdel forengraftmentofhumencells．BLOODlOO：93175−3182，
2002．

4）Shimozawa N，Ono Y，Muguruma K，et al：Direct
Production ofGene−targeted Micefrom ES Ce11s by
NuclearTransferandGeneTranSmissiontotheirProgeny．
且甲AJlim51：375−381，2002．

ー101−

遺伝子改変マウスを用いた神経・筋疾患モデルの作出

笹 岡 俊 邦＊
研究協力者 今村道博榊，新石健三奪，野口 悟綿，水野裕訂＊，濱 裕＊＊，
高越奈緒美＊＊，高井恵理手書，松田由喜子綿，金子活俊＊＊，吉田幹好事，
小沢鋲二郎＊＊，武田伸一綿， 埜中征哉…，石田靖雅榊＊【緒 言】

ES細胞プールの中で，ESG遺伝子がノックアウトされ肢帯型筋ジストロフィーであるサルコグリカノバチ

たES細胞が同定された．このES細胞を用いて，ESG
ノックアウトマウスの作成を行った．

ー（SGP）は，サルコグリカン（SG）が責任分子であり，SGはデュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）原因分【結 果】

子ジストロフィン（DYS）と複合体を形成する．これ（A）GSG−／−マウスの筋肥大の解析：まで我々は，β−SGノックアウト（BSG−／−）マウス，及びY−SGノックアウト（GSG−／一）マウスを作成し，筋線

GSG−／−マウスは22週令以降，約半数が筋力低下を示

維膜上のDYS複合体の解析，筋病変の解析を行ったl）2）．

し，筋肥大が顕著になり，全身の骨格筋・骨の湿重量は，また，本マウスを用いてE．P．Ho汗mm教授と共同し，遺対照より20−25％増加し，肥大筋の一つである前脛骨筋

伝子治療実験も進めてきた3）．E−SG（ESG）は，α−SGの湿重量は約1．5倍に，前脛骨筋横断面の筋線椎数は，のホモログとして兄いだされ，骨格筋に加えて臓器に約2倍に増加していた．しかし肥大筋の線維化・脂肪広く分布し，SG複合体を形成する．Myoclonus−dystonia

組織への置換は104週令にいたるまでわずかであり，

syndromeにESGの変異がみられ，ESGが形成するSG

GSG−／−マウスの筋肥大は，筋壊死・再生過程を経た後複合体の神経系における機能も注目されている．本研の筋重量・筋線維数の増加によるものであった．

究では，（A）GSGイーマウスにみられる筋肥大の成因の（B）二重欠損マウスの作成と所見：

解析，（B）DYSとSGの二重欠損マウスの作成によるBSG一例血マウス，GSG一m血マウスとも姿勢異常，脊DYS複合体の役割の解析，（C）mdxマウス，BSG−／−マ

柱琴曲，筋萎縮を示し，病理組織像は，同週令のBSG一

ウス及びGSGイーマウスのコンジェニック系統の作成に／−マウス，GSG−／−マウスの組織所見より進行した所見

よる遺伝背景の均一化，（D）ESGのノックアウトマウ

であった．生存期間はBSG−／−マウス，GSG−／−マウスよス作成を行った．

り短縮していた．
（C）コンジェニック系統の作成：【方 法】

m血マウス，BSG−／−マウスおよびGSG−／一マウスをBSGイーマウス及びGSG−／−マウスは，遺伝子ターゲテ

C57Ⅰ主L／6J系統へ10世代戻し交配を行ない，コンジェニ

イング法により我々が作成した1）2）．〝血マウスは，（財）

ック系統を作成した．これらの系統を用いて二重欠損

実験動物中央研究所から供与された．m血マウスとマウスを作成した．

BSG−／−マウスとの二重欠損マウス（BSG−mdxマウス），（D）ESGノックアウトマウスの作成：

ならびに仙血マウスとGSGイーマウスとの二重欠損マウ

ESGノックアウトES細胞を用いて，マイクロインジェス（GSG一m血マウス）を交配により作成した．また，クション法によりキメラマウスを作成し，ES細胞由来

BSG−／−マウス，GSG−／−マウス及びmdxマウスのそれぞのESGノックアウトマウスを作成した．当該ESクロー

れをC57BL／6Jマウス系統に10世代戻し交配を行い，ンは，ESG遺伝子の最終ユキソンを欠失しており，

コンジェニック系統を作成した．また，奈良先端科学

ESGノックアウトマウスは当該ユキソンにコードされ技術大学院大学の石田助教授らが進めている，独自のる細胞質内C末端領域の機能解析に有用であり，また，

ベクターを用いたジーントラッププロジェクトによるマーカー遺伝子の発現によるESG発現細胞の同定も可＊岡崎国立共同研究機構基礎生物学研究所＊＊国立精神・神経センター神経研究所＊＊＊国立精神・神経センター武蔵病院＊＊＊＊奈良先端科学技術大学院大学−102−

能である．

alpha−and beta−SarCOglycanby adeno−aSSOCiated viruS：
emcientrescueofmuscle，butdifferentialtoxicity．LhLm【考 察】

Ggne乃er13：1631−46，2002．

（A）GSG−／−マウスの骨格筋の肥大は，筋重量・筋線維数の増加によるという結論を得た．この結果は，従来，筋肥大の成因とされていた，（1）線維組織・脂肪組織の増加による仮性肥大によるもの，および（2）筋線維自体の肥大によるものに加えて，（3）筋再生による筋線維数の増加によるものがあることを明らかにした．
（B）BSG−mdxマウス及びGSG−mdxマウスに観察される
筋ジストロフィーの所見は，単独の欠損マウスにはみられない外観の異常，進行した組織所見を示した．二重欠損マウスの筋ジストロフィーの所見を理解するため，今後，DYS欠損およびSG複合体欠損におけるDYS複合体の分子構築変化を明らかにしたい．
（C）BSG−／−マウス，GSG−／−マウス，mdxマウス，BSG−
mdxマウス及びGSG−mdxマウスをC57BL／6Jコンジェニック系統とした．遺伝背景を均一に揃えた上で二重欠損マウスの表現型を解析することが可能なマウス系統とした．
（D）ESGノックアウトマウスは，骨格筋に加えて，神経系におけるSG複合体の機能解析に貢献するものであ
る．

【結 論】
GSG−／−マウスの筋肥大の成因は，従来考えられていた成因とは異なるものであることが示された．sGとDYSの二重欠損マウスでは，進行した筋ジストロフィーの所見がみられ，DYS複合体の分子構築の変化と筋病変の関連の理解に寄与するものである．また，遺伝的背景を近交系としたコンジェニック系統を作成し，今後の研究に有用なモデルマウスとして確立した．
ESGが形成するSG複合体の骨格筋ならびに神経系における機能の理解のため，ESGノックアウトマウスを作成した．
【参考文献】
1）AraishiK，SasaokaT，lmamuraM，etal：Loss ofthe
SarCOglycan complexand sarCOSPanleads to muscular

dystrophyinbeta−SarCOglycan−dencientmice．HumMoL
Ge乃efS：1589−98，1999．

2）sasaokaT，ImamuraM，AraishiK，etal：PathologicalanalysIS Of muscle hypertrophy and degenerationinmuscular dystrophyin gamma−SarCOglycan−deficientmice．NeuTDmuSCulDisoTd13：193−206，2003．
3）DressmanD，AraishiK，ImamuraM，etal：Deliveryof−103−

遺伝性筋・神経疾患モデルマウスにおける高次脳機能障害についての研究−Dystrophinの中枢における役割の検討−
関
研究協力者

口

正 幸＊

坂本光伸＊，吉田 瑞子＊，上地さり＊，佐藤栄一＊，
山田祐子＊，山田 一之＊＊，和田圭司＊

【緒 言】

【方 法】

脳以外での機能異常が主な病因となる筋・神経疾患

動物：変異型アリルを持つ♂とその同腹兄弟の野生型には高次脳機能の異常を併発する場合が数多く報告さ♂を交配により作出し比較検討に用いた．免疫組織化れている．実際，それら疾患の原因遺伝子はその主な学を除く全ての実験は遺伝型に対してブラインドで行い，病変部位のみではなく脳にも発現が見られる場合が多い．

実験終了後PCR法で遺伝型の判定を行った3）．一部のDuchenne型筋ジストロフィーにおいても，およそ3分個体については前脛骨筋の切片観察（中心核の存在），の1の症例で精神遅滞・感情障害等の中枢症状を伴う

血中CK値の測定も行い遺伝型を確認した．

ことが報告されており，その原因遺伝子Dystrophinは脳でも発現が確認されている．興味深いことに動物行動：全ての動物行動実験には♂マウスを用い，

Dystrophinは海馬神経細胞においてGABAシナプス後試験1週間前から1ケージに1匹ずつ個別飼いした．

膜のpostsynapticdensity（PSD）に限局して存在するこ（∋記憶学習機能試験：1試行受動的回避試験（One−tdalとが報告されている1）．また，Dystrophin欠損マウスであるmdxマウスにおいて，海馬のGABAシナプスにおpassiveavoidancetest）を行った．試験1日目には明暗箱（室町器械製）への馴化を5分間行った．2日目にマウ

けるGABA受容体クラスタリング異常も報告されていスを明宝に入れ暗室に移動するまでの時間を測定する

る2）．GABAニューロンは神経細胞に抑制性のシグナルと共に，暗室に移動直後に電気刺激（0．3mA，3秒）をを伝達し，それ自身高次脳機能の発現に極めて重要で加えた．3日目に再びマウスを明室に入れ，暗室に移動ある．又，GABAシナプスからの入力は興奮性シナプするまでの時間を測定した．

スにおけるシナプス可塑性に強い影響を持つことも良（∋運動協調性：ロータロッド試験を行った．ロッドのく知られており，シナプス可塑性の調節系としても重回転速度は初速3rpmで終速30rpmまで5分間で直線的に加速した．試行を1日に1回3日連続して行った．

試験1週間前までは同腹兄弟と同一ケージで飼育した．

要である．以上の事実は，GABAシナプス異常を介して，
Dystrophinが高次脳機能又はシナプス可塑性に関与している可能性を想像させるが証明はされていない．

小原医科産業製の装置を用いた．
（∋情動性：新奇環境に対する情動応答を検討する目的

我々の目的はDystrophinの中枢神経系における役割

でオープンフィールド試験を行った．マウスを50cm四を見出すことであり，そのためにDuchenne型筋ジスト

方のフィールドに放し水平方向の自発運動量をコンピ

ロフィーモデルマウスであるm〔kマウスを用い，動物ュータにより画像解析して測定した（小原医科産業製）．

行動学的・電気生理学的・免疫組織化学的検討を行った．

フィールドは白色で，フィールド面の照度は約80ルッ

動物行動学的には①記憶学習機能，（∋運動協調性，（∋クスであった．テストにはこのフィールドが全く未経

情動性について異常の有無を検討した．電気生理学的

験のマウスを用いた．

には海馬CAl野シナプス可塑性について重点的に検討

電気生理：マウス脳（2〜3ケ月齢，ただしLTDの検討を加えた．また免疫組織化学的には特に動物の情動性においては1ケ月齢）から海馬を摘出し切片とした後，に重要とされる扁桃体におけるDsytrophinの発現を検

CAl野からfieldexcitatorypost−SynaPticpotential（fEPSP）

討した．

を記録した．この後，入力繊維をテタヌス刺激（100Ⅰ七，1秒）することによりLongtermpotentiation（LTP）を，
低頻度刺激（1Hz，15分）することによりLong tem＊国立精神・神経センター神経研究所 疾病研究第四部＊＊独立行政法人理化学研究所 先端技術開発グループー104−

depression（LTD）を，テタヌス刺激後10分経過時点で低とが広く知られている．従って，mdxマウスは新奇環

頻度刺激することによりDepotentiationを誘起した．

境に対する情動応答が野生型と異なる可能性が示唆さ

Depotentiationは，テタヌス刺激により増強されたシナプス伝達が，同一シナプスに再度印加された低頻度刺れた．具体的には新奇環境に対する探索行動の減少と激により増強前のレベルにまで抑制される現象であり，にフィールド導入直後の1分間においては，変異型で記憶学習過程での有意義性が指摘されている．免疫組

は22匹中8匹（36．4％）において運動停止が極めて顕越生掌：マウスを麻酔後，心臓からPBSを潅流し除血著であった．野生型ではこのような顕著な運動停止はした．脳を摘出・凍結し厚さ20mmのコロナールセク

見られなかった．この運動停止は②で運動機能障害がションを作成，定法に従い免疫染色を行った．1次抗体

兄いだせなかった点を考え合わせると中枢性である可にはマウス抗Dystrophin抗体（CIiEMICON社MAB1692）
を用い，その検出にはTSAキット（MolecularProbes社）

能性が高く，新奇環境への順応性の低下又は不安の克を用いた．核染色はPIで行った．

電気生理：

すくみ行動と思われる運動の停止が顕著であった．特進等が考えられる．
海馬CAl野のSha晩r側枝一錐体細胞間シナプスの人出【結果と考察】力関係，Paired−Pulsefacilitationの程度，シナプス可塑性

動物行動：（LTP，LTD，Depotentiation）の程度は野生型マウスと（∋1試行受動的回避試験：この実験に用いたマウスは変異型マウスで全く差がなかった（LTP：n＝8，LTD：n両遺伝型とも13匹（88−103日齢）であった．試験の成＝6，Depotentiation：n＝9）．また，その可塑性形成の初績は野生型と変異型マウスで有意な差がなかった（図期過程も，LTP，LTDでは全く差がなかったが，1−A，値は平均値＋標準誤差）．既報によれば，♀を用

Depotentiationでは有意な差が見出された．すなわち，

いた場合，mdxマウスはBlOマウスに比べ受動的回避

低頻度刺激後5分まで変異型マウスにおいて有意に（p試験の成績が低いことが知られている4）．今回♂マウス＜0．05）強いシナプス伝達の抑制が観察された．しかしでは差異が見られなかったことから，mdxマウスにおその差は顕著ではなく極く小さいものであった．LTP

いては記憶学習能力の異常に性差が存在する可能性もに関しては既に他の研究者によりmdxマウスをBlOマある．

ウスと比べた場合全く差がないことが報告されており5），
今回の結果はこれと一致する．

（参ロータロッド試験：この実験に用いたマウスは野生型8匹（体重28．7＋0．8g），変異型15匹（27．8＋0．6g）であった（7ト94日齢）．野生型と変異塑マウスで試験の免疫組織化学：

行動実験の結果を受け，情動性に中心的な役割を果た

成績に差は見られなかった（図1−B，値は平均値＋標準す脳領域である扇桃体におけるDystrophinの分布を検誤差）．従って今回使用したmdxマウスでは運動協調性討した．図3に示すように，野生型マウスではLateral−の異常による運動機能障害は検出できなかった．

Basolateralamygdalaに抗Dystrophin抗体の強いシグナル③オープンフィールド試験：この実験に用いたマウスが観察された．一方，mdxでは当該領域に殆どシグナ

は野生型24匹，変異型22匹（71−100日齢）であった．

ルを兄いだせなかったことから，野生型で見られたシ試験における自発運動量の時間経過は野生型と変異型

グナルはmdxで欠損する427kDの脳型Dystrophinに由マウスで顕著な差異が見出された（図2，倍は平均値＋来するものと思われた．扁桃体以外の脳部位では，海標準誤差）．すなわち，野生型マウスは試験開始直後に

馬CAl−CA3野，皮質が強く染色されたのに対し，海馬

最も高い自発運動性を示し時間と共に減衰一定化した

歯状回，脳幹は殆ど陰性であった．この染色パターンのに対し，変異型では多くの個体でこの自発運動量のは既報と良く一致する6）．高倍率で観察すると，

克進が弱いか，あるいは全く見られなかった．統計的Basolateralamygdalaにおけるシグナルは比較的大きな細にも，野生型では0−3分の自発運動量は3−6分の値より

胞の細胞体細胞膜付近や樹状突起と思われる構造に見有意（図2参照）に高いのに対し，変異型では平均値られた（データ図示せず）．Lateral−Basolateralamygdalaに殆ど差がなかった．また，0−3分における自発運動量

は情動性の発現に極めて重要な部位として知られており，は野生型と比べ変異型で有意に低かった（p＝0．0004，

この核におけるDystrophinの発現は行動解析による情

t−teSt）．更に，繰り返し測定ANOVAを用いて分析すると，

動性異常という結果と少なくとも矛盾はしない．

0−3分と3−6分の値の変動は遺伝型により有意な差のあることが見出された（図2参照）．本試験初期における【結 論】

自発運動量の克進はマウスの情動性を強く反映するこ

mdxマウスで欠損している脳型427kD Dystrophinのー105−

機能の一つとして情動性への関与が示唆された．その

2）KnueselI，etal：AlteredsynapticclusteringofGABAA

関与のメカニズムはこれからの研究課題であるが，receptorsinmicelackingdystrophin（mdxmice）・EurJ

Lateral−BasolateralamygdalaにおけるDystrophinの分布〃eMp∫CJll：4457−4462，1999．

はこの脳部位の情動性への関与の高さを考えると興味

3）AmalfitanOA，ChamberkainJS：Themdx−amPlification−

深い．この脳部位に存在する錐体細胞へのGABAニュ

resistant mutation system assay，a Simple and rapidーロンからの入力についてはmdxマウスにおける詳細

POlymerase chain reaction−based detection ofthe mdxな検討が必要と思われる．一万，本研究ではDystrophinallele．〟〟∫CJ〃〃rve19：1549−1553，1996．

の記憶学習やシナプス可塑性への関与は見出すことが4）MuntoniF．Mateddu A．Serra G：Passive avoidance

出来なかった．この点はこれまでの報告と一致する部

behaviour deficitin the mdx mouse．Neult）muSCular

分が多い5）．以上の結果はDystrophinの中枢における役

かf∫OJ滋ml：121−123，1991．

割について新たな可能性を示唆すると共に，mdxマウ5）sesayAK，etal：SpatialleamingandhippocamPallong−スがDuchenne型筋ジストロフィーに併発する中枢症状

temPOtentiationarenotimpairedinmdxmice．NeuTVSCiのうち新奇環境への順応の低下や高い不安レベル等をエg〝211：207−210，1996．

示す症例7）に対して病態モデルとなる可能性も示唆す

6）Lidov，HG，Byers，TJ．andKunkel，L．M．Thedistribution

ると考える．

OfdystrophininthemurinecentralnervOuS SyStem：an

immunohistochemicalstudy．Neun）SCience54：167−187，【参考文献】

1993．

1）LeviS，etal：Dystroglycanisselectivelyassociatedwith7）Roccella M，Pace R，De Gregorio M T：

inhibitory GABAergiC synapses butis dispensable for

Psychopathologicalassessmentin children affectedby

theirdifftrentiation．JNeulVSCi22：4274−4285，2002．

Duchenne de Boulogne muscular dystrophy，Minerva
飽dd汁55：267−276，2003．
BRota・rOdtest

AOne・trialpassiveavoidaneetest

mdx

wild

COnditionlng

50 00 50 00 50︵UOS︶亡Oで已コロ

755025005750250︵UO的︶かGO一dtnlJ

Wild

mdx

Triall Trial2

Tria13teSt

図1Comparisonoftheresultsofone・trial
passiveaYOidamceandrotかrOdteStSbetweem

malewildandmdxmice．Nosignincantdifferences
P＝0．0009（ANOVA，Fisher

WereObserved．

sPLSD）

2︒︒㈱ 8︒︒00 棚 卸︵20︶宮人でUd JO︼○∈OUO出

図2

Absenceorinitialaugmentationoftlle
rocomoteractivityim
mdxmiceinamopen・neldtest．

3−6

6−9

min

−106−

図3ImmllnOStainingofbrainsectionsincludingbasolateralamygdala（anarrOWhead）
byanti・dystrophinantibodies．NoteattenuationofthesignalSinmdxmouse．

−107−実験動物としての筋ジストロフィー犬の研究
一生殖工学技術を用いた繁殖及びコロニーの維持について−
谷 岡 功 邦＊
研究協力者 島津美樹＊＊，五十嵐真一榊，名倉政雄＊＊＊
法は既報7）に従った．

【緒 言】

2．発情開始後の日数と発情誘起

我々は，1998年に，筋ジストロフィー犬凍結精子由来となる第一世代に当たる保因犬2頭を作出し，翌繁殖に供さず発情開始から129±1．95日日及び160

1999年には，初めて筋ジストロフィー犬（以下，忠犬）±6．20日日に当たるピーグル5頭ずつ計10頭を用いた．

を得ることに成功した．さらなる患大作出を繰り返す

血中プロゲステロン濃度をオブチェック血液用EIAキ

ことで，日本における筋ジストロフィー犬コロニーをットにより測定し9），1mg／mJ以下の数値であることを確立した1）．

確認した後，カベルゴリン（カバザール㊥，キッセイ薬

筋ジストロフィー犬コロニー維持のためには，生殖工学技術は必要不可欠である．しかし，犬は，単発情品工業株式会社）処理を施した．5ドg／kg量のカベルゴ
リンを1日1回，最長42日間経口投与を継続し，外陰動物であり発情周期が非常に長い2），未成熟な段階で卵部からの出血の有無を確認した．発情出血が認められ子が排卵され成熟後に精子を受け入れる3）4）5）6）等の特性

た場合，繁殖能力の明確な雄ピーグルとの自然交配にを有することから，生殖工学技術の確立が立ち後れてより繁殖能力を検討した7）．

いるといわざるを得ない．

3．妊娠・分娩後の日数と発情誘起

今回，愚夫精子の凍結一融解後の受精能力と正常犬（ピ発情開始から161±6．42日目に当たるピーグル10頭（繁ーグル）を用いた発情誘起法について検討を行ったの殖に供さなかった個体5頭及び妊娠・分娩後の個体5頭）で報告する．

を用いた．既述に従い，発情誘起，繁殖能力について
検討した．
【方 法】

【結 果】

1．患犬精子の凍結一融解後の受精能力

12カ月齢と18カ月齢の患犬1頭ずつの射出精液を用患犬2頭の凍結一融解精子を用いた人工授精の成績は，手法により採取し，既報7）8）に従い精子の凍結保存を行それぞれ5例中4例ずつの分娩に成功し，産子数は5．0

った．融解後の受精能力を検討するために，2頭の精子±1．41及び6．0±0．82であった（表1）．

を5頭ずつ計10頭のピーグルに授精させた．人工授精

表l FertilizingabiJityoffrozen−thawedspermatozoafromtwodogsaffectedwith
X−Jinkedmusculardystrophy

AnimalNo．ofbeagles

no．

Litterwhelped／inseminated

size＊

CO4

4／5

5．0±1．41C124／5

6．0±0．82＊Valuesaremean±sD．

＊（財）実験動物中央研究所＊＊国立精神・神経センター神経研究所遺伝子疾患治療研究部，（株）中外医科学研究所＊＊＊（株）中外医科学研究所−108−

表2 RelationshipbetweendaysafterrastestrusandinductionofestrusbycabergoHne（5llg／kg）treatment

Days Treatmentperiod No．ofbeagles Litter
afterlastestruS（days）

inducedestruS／treated size

129±1．95＊

30＿42

2／5

4，6

160±6．20＊

14＿42

4／5

6．5±1．29＊＊Valuesaremean±sD．

表3 Relationship between wherping at Tast estrus andinduction of estrus by
Cabergorine（5ug／kg）treatment

Whelping Treatmentperiod No・Ofbeagles Litter
atlastestruS（days）＊

inducedestruS／treated

size

No

14−42

4／5

6．3±1．50＊＊

Yes

18−42

2／5

2，6

＊Cabergolinetreatmentstartedat161±6．42（mean±sD）daysafter
lastestruS．
＊＊Valueismean±sD．

発情開始後の日数と発情誘起に関して検討したところ，精子の凍結保存は有用な技術である．さらに，正常犬（ピ130日日前後のピーグル5例中2例の発情誘起に成功し，ーグル）における高率な発情誘起法は保因犬の発情コ

産子数は4及び6を示した．160日日前後の時期では，

ントロールに利用可能な手法となりうる．本研究により，これら生殖工学技術を確立することができた．

5例中4例の発情が誘起され，6．5±1．29頭の産子を得た（表2）．
妊娠・分娩後の日数と発情誘起に関する検討では，【結 論】

繁殖に供さず発情開始後160日日前後のピーグル5例中患犬精子の凍結保存が可能となった．さらに，正常4例の発情誘起に成功し，産子数は6．3±1．50であった．

犬（ピーグル）における高率な発情誘起に成功し，保一方，妊娠・分娩後の個体では，5例中2例の発情が誘

因犬の発情コントロールに有用な手法を確立した．こ起され，それぞれ2頭，6頸ずつの産子を得た（表3）．

れら生殖工学技術は，筋ジストロフィー犬コロニー維
持のために必須なものである．

【考 察】
患犬の凍結一融解精子による人工授精の成績は，ピー【参考文献】

グル精子を用いた場合7）8）と同様であった．このような

1）shimatsuY，KatagiriK，FurutaT，etal：CanineX−linked

結果から，忠犬精子の凍結保存が可能となった．

musculardystrophyinJapan（CXMDJ）．ExpAnim52：93−

一方，発情誘起法については，発情開始後160日目

7，2003．

前後に当たるピーグルの方が130日日前後の場合に比2）AndersenAC．Reproduction：InAndersenAC（eds．），nLe

較して高率に誘起できることがわかった．さらに，繁BeagleasanExperimentalDog．Ames，neIowaState

殖に供さず妊娠・分娩後からの日数が長い個体である

UniversityPress：31−39，1970．

ほど高い誘起率を示した．なお，誘起発情時の繁殖能

3）HoIstPA，PhemisterRD：Theprenataldevelopmentofthe

力に問題は生じなかったことから7），カベルゴリンを用

dog：Preimplantation events．BioIRqlVd5：194−206，

いた発情誘起法は有用であることが示唆された．

1971．

筋ジストロフィー犬コロニー維持のためには，忠犬4）phemisterRD，HoIstPA，SpanoJS，etal：Timeofー109−

ovulationinthebeaglebitch．BioIR甲ZVd8：74−82，1973・
5）TsutsuiT：Studiesonthereproductioninthedog．V．on
Cleavage andtranSPOrtOffertilizedovaintheoviduct・々nAnimR甲rVd21：70−5，1975（InJapanese）・
6）van der Stricht O：Etude comparie des ovules desmammiferes aux diff＆entes piriodes de rovogenese，d．aprとsles travaux du Laboratoire d−Histologie etdIEmbryologie de rUniversitg deGand・ATrhBio133：
229−300，1923．
7）shimatsuY，KatagiriK，ArakawaH，etal：Fertilitiesfrom
matlngandartificialinsemination with frozen−thawed
SPermatOZOabyindexingLHsurgeinbeaglebitches・J
R甲mdかgv46：315−8，2000・

8）shimatsu Y，Yuzawa H，Amga K，et al：，hificial
insemination with frozen−thawed spermatozoaindogs・
l融点gc153：369，2003．
9）EckersallPD，HarveyMJA：neuSeOfabovineplasma
PrOgeSterOne ELISA kit to measure progesteronein
equlne，OVineandcanineplasmas・陀tRecl20：5−8，1987・

一110−

筋ジストロフィーモデル犬における健康管理と病態解析

高 橋 明 男＊研究協力者 安蔵友美＊・掴，下屋真弓＊・＊＊，植竹勝治榊，田中智夫＊＊
浦澤延幸書，湯浅勝敏榊，島津美樹綿＊，武田伸一榊
Ⅰ．筋ジストロフィー犬における定量的行動解析の検討

時点灯・19時消灯）及び設置温度20−22℃，設定湿度【緒 言】

らの自由摂取，また給餌は9時から10時の間で1日1筋ジストロフィーモデル犬（筋ジス犬）はヒトにお50−60％をそのまま適用した．給水は自動給水装置か回とした．

けるDuchenne型筋ジストロフィーと酷似した症状発現

上記環境において対象犬の行動画像を各ケージ対面

及び病態進行を示す優れたモデル動物l）2）であることから，斜め上方に個別に取り付けた4台の無線ビデオカメラ

従来マウスを主なモデル動物として行われてきたで同時撮影し，別室に設置した受信機に接続されたタ

Duchenne型筋ジストロフィー研究3）4）5）をさらに治療研

イムラブス・ビデオレコーダーへその画像を記録した．

究応用へと進展させる上で，その有用性について期待が高い．そこで，筋ジス犬における非侵襲的な病態解画像記録は24時間連続撮影とし，筋ジス犬では22日間，正常犬では11日間の連続記録を行った．

析ならびに治療効果評価方法として定量的行動解析手初めに正常犬及び筋ジス犬全ての個体のビデオ記録法の応用を試みた．また一方，筋ジス犬においては全から，記録期間中に発現する全ての行動を抽出するこ身的な筋障害の進行が，高次脳機能である精神活動へとで定量的解析の基盤となる行動カテゴリを作製した．

も影響を及ぼすと考えられることから，精神活動が加次に記録開始1，5，10日日の3日間＝72時間分の画像味された演出型表現形解析手法としての観点からも，定量的行動解析手法の応用を検討した．

データについて行動カテゴリに基づく目視定量化により，各対象犬毎に1時間当りの生起回数及び持続時間を算出した．さらに算出した行動カテゴリ毎の生起回数及【方 法】

び持続時間の24時間集計値から1日当りの平均を求め，

国立精神・神経センター神経研究所中型実験動物研

これをそれぞれ平均総生起回数（Bout）ならびに平均究施設（以下，中型施設）で飼育3）されている14ケ月

総持続時間（Duration）とした．最終的に，正常犬と筋

齢同腹の筋ジス犬♂1頭と正常犬♂2頭さらに同月齢異ジス犬の間で定量的な行動比較を行うため，Non−

腹の筋ジス犬1頭，合計4頭を選抜し，筋ジス犬2頭をParametriC検定法による統計解析をこれら定量化データ

実験群，正常犬2頭を対照群とした．なお，正常犬とは，に対して適用した．即ち，行動カテゴリ毎のBout及び筋ジス犬繁殖コロニーにおいて，発症しない（Ⅹ染色Durationに対し，有意差の有無のみを検出するKruSkal＿

体上のジストロフィン遺伝子異常を保有しない）♂犬と，同様に発症を見ないキャリア♀犬との交配で生まれる

WM1is一元配置解析を施し，有意差を内含する行動カテ

同一コロニー内の未発症♂個体である．

テゴリに対しSteel多重比較を用いて正常犬2頭の平均ゴリを検出し，有意差を内含すると検定された行動カ

行動データ採取期間中は周辺環境の均一化を図る目

定量化データと客筋ジス大間での有意差検定を行った．

的で，全ての対象犬を同一飼育室内において同型の犬用ケージ（W960×D1652×H1570m，ステンレス製）【結 果】

による単独飼育とした．また，他の犬の行動から受け

1．行動カテゴリの作製：仝頭全期間のビデオ画像を基る視覚誘発刺激を回避するため，相互に他の犬が視野に，表1に示す新規な筋ジス犬行動解析用カテゴリをに入らないようケージ位置を選択した．飼育環境は中作製した．筋ジス犬特有の行動カテゴリとして，嘔吐及び身震いを含むことが今回樹立した行動カテゴリの型施設での標準的環境であり，12時間明暗サイクル（7＊国立精神・神経センター 神経研究所 実験動物管理室＊＊麻布大学 動物応用科学科 動物行動管理学研究室＊＊＊国立精神・神経センター 神経研究所 遺伝子疾患治療研究部

ー111−特徴であった．
2．KruSCal＿Wallis一元配置解析により四足立位，二足立【考 察】

位，犬座位，休息，摂食，排泄様行動，嘔吐，ジャンプ，

今回の定量的行動解析結果において示された筋ジス

発声，移動，OralGroomingが有意差を内含することが犬の行動の特徴は次の3点であると考えられた．第一に，検出された（表1）．

全身性特に四肢における筋力低下が原因と推定される3．有意差を内合する各行動カテゴリに対しSteel多重

抗重力姿勢，即ち立位の減少である．これは，重力に比較を通用することで，対照群（正常犬平均化データ）

逆らう姿勢を雄持するために必要とされる持続的な筋と客筋ジス犬における定量化データとの間で，表2に緊張において，筋ジス犬ではその生理学的な筋の張力示すような有意差を検出した．

低下が速やかに低下する器質的な原因のほかに，疲労4．暗期（夜間）と比較し，明期（昼間）において有意感が急速に意識レベルにあがる可能性も考えられた．

差を示す行動カテゴリが多く認められた．

第二に，筋ジス犬において特異的な病態であることが報告されている巨舌を原因とする嘆下障害を反映する

姿勢

行動形

四足立位●
二足立位■
犬座位★
伏臥位・横臥位
仰臥位
中間姿勢

四肢での立位後肢での立位前肢を立てた状態での座位
ケージ底面に腹部・体側部を着けて横たわった姿勢
ケージ底面に背部を着けて横たわった姿勢
その他の姿勢または移行姿勢

休息一
摂食●
飲水
排泄前事区行動
排便
排泄桜行動▲
嘔吐●
探査
ジャンプ●
発声暮
移動●
身震い
伸び・あくび

一定の姿勢で不動化し、他の行動が観察されない状態
紀餌器から餌をくわえる、岨哺する、喋下する
ニップルの先端をくわえて吸う、給水皿から飲水する
排泄前に床面を嗅ぎながら、せわしなく周回する糞塊が確認できる排泄行動
糞塊が確認できない排泄行動及び排尿様行動
口から胃内容物を吐出する行動
他の物体を探すような行動及び他の物体への接触等
主に後肢での跳躍
関口し発声が確認できる状芯
特定の目標がなく歩行等を行う妖雲身体や頭を振る行動
頸茄や体幹を書芸的に伸展する。あくびをする
ロ・舌を使い、身体を舐める、噛む及び嗅ぐ行動
他の物体に身体を擦り付ける及び四肢で身体を描く

OralGroommg（OG）■
Non−OrdGroommg（NOG）と考えられた摂食の生起回数の上昇と持続時間の延長である．これは一定量の飼料を全て摂食しようとした
時に，1口での摂取量が少ないにも関わらず，その阻噂から喋下までに費やす時間が延長していることを示しており，阻噂筋，舌，喉咽頭構成筋，さらには食道構成筋における機能低下を示唆している．第三には探査行動の低下・短縮に代表される自発行動の低下である．
これも全身性の筋力低下による直接的な影響が大きいと考えられるが，人の入室により誘発される行動や強制歩行などは可能な状態で自発的な行動が低下するこ

表1筋ジス犬行動解析用行動カテゴリ及びKruskal−Wallis一元配置解析結果＊：Kmskal＿Wallis一元配置解析により検出された有意差を内含するカテゴリ（P＜0．05）を示す．

とは，行動や運動により引起されると推測される疲労感や不快感の発生及びそれらが行動することにより引起されることを学習した結果としての，意識的な行動
回避の現われとも推測される．

時期
伽2
臼足立位

DlO IXI2

DlO

【結 論】

Bout lDurallOrl

今回，筋ジス犬の病態を解析するために検討を行っ

二足立位

Bout lDuTadoIl

犬座位

Boul

休息

Bout
DuTa血n

摂食

Bout tDuradoIl

今後，筋ジストロフィーの病態進行ならびに治療効果

排泄関連

Bout lDW山onの判定において，客観的な評価手法として有用である

I嘔吐

Bout

ことを明らかにした．示された．また，器質的な障害

た定量的行動解析手法は，これまで報告されている筋

Durabon l

Dumdon探査

ジス犬の病態を良好に反映するものであったことから，††

Boul lを反映するだけではなく，それらが原因となって発現

DⅧ柑心On l

Boul

l

Dura

l

すると考えられる精神活動を加味した演出型表現形の発声

Boul tDuradon

解析手法としても応用可能であることが示された．今移動

Bout lDurauon

後はさらに解析例数を増やすとともに，器質学的な病

伸び・あくびBouton

態解析との相互比較により病態解析手法としての精度

DuratlOn
OG

Bout

向上ならびに演出型表現形の評価手法としての確立に

Dufahon

DuTatlOn

努める．

†

表2 Steel多重解析結果
DO2及びDlOは筋ジス犬の個体番号．KruSkal一Wallis一元配置
解析で有意差を内含すると検定されたカテゴリに対するSteel
多重解析を用いた2次解析結果を示す．正常犬の平均定量化データに対する有意な増加（†，P＜0．05）及び有意な減少（1，P＜0．05）を示す．

【参考文献】
1）KornegayJn，TulerSM，MillerDM，etal‥Muscular

DystrophyinaLitterofGoldenRetrieverDogs・Muscle〃ervgll：1056−64，1988．

一112−

Ⅰ．筋ジストロフィー犬における心筋障害の分子病理

2）Ⅵ1entineBA，CooperBJ，deLahuntaA，etal：CanineX−

学的検討

Iinked Muscular Dystrophy・An Animal Model of【緒 言】

Duchenne Muscular Dystrophy：Clinical Studies．J

筋ジストロフィーの中で，最も頻度が高くしかも重〃e〟rJpJ∫ci88：69−81，1988．

3）GradyRM，TbngH，NicoIMC，etal：SkeltalandCardiac症な経過を辿るDuchenne型筋ジストロフィー（以下，MyopathiesinMiceLackingUtrophinandDystrophin：A

DMD）はジストロフィン遺伝子の異常に伴って，筋形

ModelforDuchenneMuscularDystrophy・Cel190：729−

質膜直下の細胞骨格蛋白質ジストロフィンの発現を欠

38，1977．

損することにより，進行性の筋委鮪と筋力低下を示す

4）BulneldG，SillerWG，WightfAL，etal：X−Chromosome−

Ⅹ連鎖性劣性の遺伝性疾患である．DMDでは，全身のLinkedmuscular（max）intheMouse．PIVCNatAcadSci

骨格筋，心筋の障害から重篤な呼吸不全，心不全を生

81：1189−92，1984．

ずるが，近年の呼吸筋障害に対する治療の進歩により，

5）stedmanHH：ThemdxMouseDiaphragmReproduced

寿命が延長する傾向にある．代わって心不全が死因のthe Degenerative Change of Duchenne Muscular

第一位を占め，ジストロフィン欠損における心筋障害

Dystrophy．Nature352：536−9，1991が注目されつつある．

6）shimatsuY，KatagiriK，FurutaT，etal：CanineX−linked

DMDの心障害の特徴として心電図上の深く先鋭な異MuscularDystrophyinJapan（CXMDJ）．EbAnim52：

常Q波および左重後壁を中心とした心筋組織の線維化

93−7，2003．

が挙げられる1）．DMDにおける異常Q波は1952年にRubinとBuchbergによって指摘され，その後の多くの研究者によってDMDの実に65−80％に認められる普遍的な現象であることが確認されている2）3）4）．この異常
Q波は左室後壁の線維化による起電力の低下に起因すると考えられているが5）6），正確な機序は明らかにされていない．また，異常q波の他にも様々な不整脈，伝導障害が指摘され，死因の12％は突然死であるとの報告がありながら7），ジストロフィン欠損における刺激伝
導系の障害について詳細な検討を行った報告は皆無と言って良い．
我々はゴールデンレトリバー種に見出されたDMDと同様にジストロフィンを欠損する筋ジストロフィー犬の凍結精子を用いて人工授精を行うことにより，ピー
グル種の筋ジストロフィー犬（以下，筋ジス犬）コロ
ニーを確立した島）．この大型のモデル動物は従来のマウ
スモデルに比べ，よりヒトに近い表現型を呈し，ヒトと同等の生理学的検査も可能である．我々は若齢筋ジス犬の臨床経過を観察する過程で，心エコー上は作業
心筋の障害が非較的軽度であるにも拘らず，早期から心電図上異常q波を呈すること，しかも少数ではあるが運動誘発性の突然死を呈する個体が存在することを見出した．そこでジストロフィン欠損における異常Q波，
心臓突然死の発生機序に対し刺激伝導系の障害に注目し検討を行った．

【方 法】
1．材料
国立精神・神経センター内に設立された中型実験動物研究施設で維持されている筋ジス犬コロニーの中か一113−

ら筋ジス犬13頭，正常対照犬9頭（ともに1−15ケ月齢）

量はミオシン重鎖の染色により調整した．ジストロフ

を対象とし，国立精神・神経センター中型動物実験倫

ィン，ユートロフィン，α−サルコグリカン，け−カルパ

理問題検討委員会の規定に則し，心電図および心エコインに対する抗体（それぞれDYS2，UT−2，α−SG2，

ー解析施行後1週間以内にパルビタールの静脈内投与

anti−CalpainllargesubunitdomainIV）と反応させた後，による深麻酔を施しNecropsyを施行した．

西洋ワサビ・ベルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgG

2．組織学的解析

抗体（Bio−Rad）または抗ウサギIgG抗体（Jackson）と心臓をホルマリン固定後，洞結節を含む右心房，房ECLplusWestemBlottingdetectionsystem（Amersham）

で検出した．

室結節およびHis束を切り出し，Purkinje線経を含む左心室は基底部，乳頭筋レベル，心尖部の三層に横断面で全劃した．大割組織片は通常のパラフィン切片作製後，【結 果】

10匹mに薄切Lへマトキシリン／エオシン（H＆E）で染

1．若齢筋ジス犬ではPurklnje線椎の選択的空胞変性を生じる色した．さらに4ケ月齢の筋ジス犬，正常対照犬各1頭
では一部の左心室で電顕固定を行い，エボン包埋後に対象とした全ての筋ジス犬で心電図上異常q波を認

超薄切片を作製し酢酸ウラン，クエン酸鉛による電子めたにも拘らず，H＆E染色による病理組織学的検討では，染色を施した後，H−7000transmissionelectronmicroscopy

ほとんどの個体で作業心筋の変性所見は認めなかった（Hitachi）を用いて観察した．

最高齢となる15ケ月齢の1頭でのみ心室中隔から左室

3．免疫組織化学染色

後壁にかけ小線維化巣が散在していた．刺激伝導系で左心室の一部から凍結標本を作製し横断切片（7トIm）

は房室結節とHis束に硝子化を認めた1頭を除き，洞結をスライドガラス上に準備し，乾燥後にアセトン固定

節からHis束まで変性所見は認められなかった．一方でした．一次抗体としてジストロフィンに対するマウス

Purkinje線経では仝頭で辺縁不整なおびただしい空胞が観察された．このことはジストロフィン欠損の病初期

モノクローナル抗体であるMANEXIA（筋型ジストロフィンamino acid（aa）3−10を認識，North East Walesに叫e線椎の選択的変性を生じていることを示す（表1，図1上

InstituteG．E．MomiS博士からの供与）9），NCL−DYSB（aa321−494，Novocastra），F22．9C5（aa1840r2266，Alexis），
NCL−DYS2（aa3669−3685，Novocastra），α−，β一ジスト

透過型電子顕微鏡では，筋ジス犬のPurkinje線経で筋原線経の断裂，崩壊が顕著であり，筋原線椎が消失しログリカン，β−，Y−，8−サルコグリカンに対するマウス

残骸のみとなった部位が光顕上空胞として観察されるモノクローナル抗体であるVIA4−1（Upstate），NCL−β−DG，ことが示唆された（あわれOf∫ゐow乃）．

NCLやSG，NCL−Y，SG（Novocastra），DSG−1（国立精神・神経センター神経研究所 今村博士からの供与）10），α−

サルコグリカン，ユートロフィン，ドーカルパインに対

表1変性所見が認められた筋ジス犬の個体数（6−15ケ月齢）するウサギポリクローナル抗体であるα−SG2，UlL2（今作業心筋村博士からの供与）11）12），anti−Calpainllarge subunit

刺激伝導系

右心房 左心室 洞結節 房重結節His束Purkinje線維

domainIV（Sigma−aldrich）を反応させ，ヤギFITC標識

1／6

抗マウスまたは抗ウサギIgG抗体（Molecular probes）

1／8

0／6

1／6

1／6

8／8

単位；頭

を用いて検出した．シグナルはconfocallaser scanningmicroscopyTCSSPTM（Leica）を用いて記録した．
4．ウエスタン・プロット解析

正常対照犬

筋ジス犬

左心室の凍結標本をスライドグラス上に薄切し（15岬l）
エタノール／キシレンによる脱水処理を施した後，lasercapture microdissection法によりLM200（Arcturus）
を用いてCapSureTMMacroLCMCaps（ArcturuS）上に作業心筋とPurk叫e線経を分離し採取した．得られた検体からサンプルバッファー（10％SDS，70mMTriS−HCl，PH
6．8，5％2−merCaPtOethanol，10mMEDTA）によって蛋白質を抽出し，9％SDS一払GEで分離，PVDF膜（hTmObilon；
Milipore）にエレクトロ・トランスファーさせた．蛋白−114−

図1正常対照犬（12ケ月齢）および筋ジス犬（9ケ月齢）の左室心筋心内膜側のH＆E染色．p．purkinje線維

筋ジス犬

2．筋ジス犬Purkinje線経では形質膜直下および空胞内に匹−カルパインの発現が増加する

DMDのモデル動物である∽（玩マウスの骨格筋においてCa2＋依存性蛋白分解酵素であるドーカルパインの発現増加および活性化が古くから知られている13）．そこで筋ジス犬Purk叫e線経で観察される筋原線経の断裂，消失に対し匹−カルパインの発現との関係を検討した．免
疫組織化学染色では筋ジス犬Purkinje線経に限局して∴−■一一∴・しい−カルパインの発現増加が認められ，空胞を伴わない細胞では形質膜直下に（図2A），空砲を伴う細胞では＼空胞内に（図2B）局在性がみられた．ウエスタン・プ

ノし

作業心筋

ノ

Purkinje線維

ロット解析でも筋ジス犬Purkinje線経でH．−カルパインの発現増加が確認された（図2C）．
（ドーCalpaユn）

3．筋ジス犬Purkinje線経の形質膜では全長型ジストロ

フィンが欠損LDp71が過剰発現する
筋ジス犬Purkinje線経に限局したけ−カルパインの発
現増加および空胞変性の背景を明らかにするため，ジストロフィン欠損との関係を検討した．エピトープの異なる抗ジストロフィン抗体を用いた免疫組織化学染

図2 心筋組織における匹一カルパインの発現
正常対照犬および筋ジス犬（ともに4ケ月齢）の作業心筋とPurkinje線経のp−カルパインに対する抗体（anti−Calpainllarge
subunitdomainIV）を用いた免疫組織化学染色（A），およびウエスタン・プロット解析（C）．（B）は筋ジス犬（上記Aと同一個体）purkinje線経の空胞変性を伴う細胞のH＆E染色（上段）および巨−カルパインの免疫組織化学染色（下段）を示す．
P，nl血可e線維

色では，正常犬の作業心筋，Purkiqje線経では全ての抗dystrophin

み染色性された（図3A）．この分子はジストロフィンC

P一■

Actin−bjnding
domainA

色性はなく，Purk叫e線経ではC端を認識する抗体でのMANEXla端型アイソフォームと考えられ，さらにウエスタン・
プロット解析により確認した．結果，筋ジス犬では作業心筋，Purkinje線椎とも全長型ジストロフィンが欠損するが，Purkinje線経でのみDp71の過剰発現が見出された（図3B）．

露t

体で染色性がみられたが，筋ジス犬の作業心筋では染

Rod Cysteine−rlCh CTtemlinal

DYSB

F22．9C5

4．筋ジス犬Purk叫e線経ではユートロフィンが強く発現しジストロフィン結合糖蛋白質の発現も保持される
Dp71の発現はジストロフィンのホモログであるユー
トロフィンの発現と競合することが予想され，筋ジス

ミ 了十三一・一

犬Purkinje線経におけるユートロフィンおよびジストロ

認諾◆

フィン結合糖蛋白質（DAG）の発現状況を免疫組織化
学染色およびウエスタン・プロット解析にて検討した．
筋ジス犬では作業心筋，Purkinje線経ともユートロフィンの発現が増加し，特にPurkinje線経ではDp71の過剰

脳 作業心筋 Purkinje線維発現にも拘らずユートロフィンはむしろ作業心筋より強く発現していた．またDp71やユートロフィンの発現に呼応して，DAGの一つであるα−サルコグリカンの発現は筋ジス犬Purkhtje線経で保持されていた（図4A，4B）．
他のα−，β−ジストログリカン，β−，Y−，8−サルコグリ
カンも同様の結果だった（成拍＝∽日南卯㈹）．

図3 心筋組織におけるジストロフィンの発現（A）正常対照犬および筋ジス犬（ともに4ケ月齢）の作業心筋とPurkinje線経のジストロフィンに対する抗体（MAEXla，
NCLDYSB，F22．9C5，NCL−DYS2）を用いた免疫組織化学染
色．p，Purkinje線経．上段のシェーマは完全長ジストロフィンおよびそれぞれの抗体が認識する部位を示す（B）上記Aと同一個体の作業心筋およびPurkinje線経のジス
トロフィンC端を認識する抗体（NCL−DYS2）を用いたウエ
スタン・プロット解析．脳はDp71の陽性コントロール

−115−

A

正常対照犬

筋ジス犬

工㍉十一

3．筋ジス犬Purkinje線経における空胞変性の分子機構
幼君筋ジス犬（1−4ケ月齢）での経時変化を観察した
ところ，4ケ月齢から空胞変性とDp71の過剰発現が観察され（庇批日和＝戒の用），い−カルパインの免疫染色でもし作業心おしpu血je線誌

4ケ月齢から形質膜直下または空胞内に強い信号強度が得られた．蛋白量自体の増加は認められなかったことから，LL−カルパインは4ケ月齢でtranslocationを生じていると考えられる（成油日∽＝血卯川）．

図4 心筋組織におけるユートロフィンおよびジストロフィ
ン結合糖蛋白質の発現
正常対照犬および筋ジス犬（ともに4ケ月齢）の作業心筋とPurkinje線経のユートロフィン，α−サルコグリカンに対する抗体（UT−2，α−SG2）を用いた免疫組織化学染色（A），およびウエスタン・プロット解析（B）p，Purk叫e線維以上の結果およびDp71のトランスジェニック勒血マ
ウスは筋変性が増強するという報告16）や椚血マウスの骨格筋ではけ−カルパインが発現増加するとともに形質膜直下へのtranslocationによって活性化するという報告15）から，筋ジス犬PuYkinje線経の空胞変性においてDp71の過剰発現および匹−カルパインのtranslocationが【考 察】

重要な役割を果たしていると考えられる．

1・ジストロフィン欠損Purkinje線経における選択的空胞変性

業心筋より先に変性を生じることは，この変性がジス

我々は本研究によりジストロフィン欠損におけるトロフィン欠損による機械的抵抗の障害のみに起因す

Purkinje線経の特徴的な変化を報告した．正常Purkinje

るものではないことを示しており，ジストロフィン欠

線経においても辺縁の整った空胞が若干観察されるが，損またはDp71の過剰発現に由来するシグナル伝達の異筋ジス犬Purkinje線経の空砲は辺縁不整でかつ広範に及常やCa2＋チャンネルの機能障害，い−カルパインによるび進行性である．さらに超徴構造では筋原線経の構造

膜蛋白質の修飾などが関与している可能性がある．今後，が崩壊している．以上から我々は筋ジス犬Purkinje線経にみられる空胞は変性であると結論した．

これらの問題を明らかにするためにPurkinje線経の培養

更にユートロフィンが過剰発現するnl血叫e線椎が作細胞を用いたf乃Vg加での検討を進める必要がある．

我々が知り得た範囲では，本研究はジストロフィン
欠損の心臓において選択的にPurki両e線椎が変性するこ【結 論】とを指摘した最初の報告である．purkinje線経の空胞変

我々はDMDのモデル動物である筋ジス犬の刺激伝導性を指摘した報告は2報存在するが3）14），剖検例での検系障害を検討したことにより以下の知見を得た．

討であることから，作業心筋の線維化も顕著でPurkinje
線経の選択的変性を指摘することは不可能であった．

（A）筋ジス犬の病初期の心臓ではPurkinje線椎の選択

今回見出されたジストロフィン欠損におけるPurk叫e（B）筋ジス犬のPurkinje線経では完全長ジストロフィ

線経の選択的空胞変性は，若年DMD患者に対して，心ンが欠損する一方，Dp71とユートロフィンの過剰不全を生ずる以前から，不整脈や伝導障害といった刺発現がみられジストロフィン結合糖蛋白質の発現

激伝導系の障害を慎重に観察する必要性があることをは保持されていた．

示唆するものと考えられる．

的空胞変性が観察された．

（C）Dp71の過剰発現とLL−カルパインのtranslocationに

2．Purkinje線椎の空砲変性と異常Q波より筋ジス犬Purkinje線経の選択的空胞変性を生

既にゴールデンレトリバー種の筋ジス犬で報告されじていることが示唆された．

ている通りZ），今回対象とした筋ジス犬においても，DMDと同様の異常q波が仝頭で観察された．これまで【参考文献】の報告では異常Q波は左室後壁の線維化による起電力1）perloffJK，Moise NS，StevensonWG，et al：Cardiac低下の鏡像と考えられてきたが5）6），今回の検討ではほElectrophysiologyin

DuchenneMuscular

Dystrophy‥

とんどの個体で作業心筋の線維化が認められないにもFromBasicSciencetoClinicalExpression．JCaYdiovasc

拘らず異常Q波が観察された．この結果からdystrophin

gJgc眈pカッ∫わ73：394−409，1992．

欠損における異常Q波が，Purkinje線経の選択的空胞変2）sanyal性に起因する可能性を検討する必要があると考えている．

SK，Johnson

WW‥

Cardiacconduction

abnormalitiesin children with Duchennels progressive
musculardystrophy：electrocardiographicfeaturesand

一116−

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11）Imamura

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associatedproteinsbutdoesnotalleviatemuscledanage
inmdxmice．NatGenet8：340−4，1994．

Ⅴ．遺伝子医療に関する社会医学的研究

筋ジストロフィー患者の遺伝子医療に対する知識と態度の検討−2070名へのアンケート調査および31名への聞き取り調査の結果一
月 谷 久 宣＊研究協力者 河端静子＊，福澤利夫書，貝谷嘉洋＊＊＊，野村 忍＊＊，陳 唆安＊＊，松尾 雅＊＊，今里条枝榊，山崎幸手＊，山田栄吉事，佐藤隆雄＊，榊枝清書＊，名倉由紀子＊，
田口智久＊，藤井康久＊，山下ヤス子＊他，大学院生冊
【緒 言】

【結 果】

筋ジストロフィーの遺伝子治療の可能な日が着々とアンケートの回収率は在宅者で56％（1106名），入所

迫りつつある．この画期的な治療法が実現したときに者で67．2％（1007名）であった．回答者の平均年齢は生じる様々な倫理的および社会的問題について十分に在宅者36．1±16．4歳，入所者34．5±19．3歳であった．

認識を深め，この医療が円滑に社会に受け入れられる

在宅者の最も多い年代は20代でこれが峰をなしていた．

ようにする必要がある．そのためにまず，被験者自身

入所者の多い年代順は10代，20代，50代および40代がこれらの問題について理解と自覚を高め，さらには，

で年代での差が比較的少なかった．診断されていた病社会的啓発が必要である．このような目的で遺伝子医

名は，在宅者ではデシャンヌ型，肢体型，福山型，顔療に関するアンケート調査を患者・家族に行った．こ面肩肝上腕型の順に多く，入所者ではデシャンヌ型，の結果を社会全体に広く情報発信することにより，遺肢体型，筋緊張性筋ジストロフィー，福山型の順に多伝子医療に関する社会全体のコンセンサスが得られ，かった．デシャンヌ型は在宅者より入所者の割合が高く，ひいては遺伝子医療の円滑な実施が期待される．

福山型は逆に入所者より在宅者の割合がやや高かった．

本報告書においては，平成13年に施行した調査①お「筋ジストロフィーが遺伝子変異による病気であること

よび，平成15年度に実施した調査（参についてまとめ，を知っているか？」の設問に対し知っていると答えた

遺伝子治療の社会的啓蒙活動の一環として実施したシのは全回答者（2070）の79％であった。知っている割

ンポジウムの報告を行う．

合の最も高いのは福山型の86％であった．「筋ジストロ
フィーの遺伝子診断が出来ることを知っているか？」【調査（D】の設問に対し知っていると答えたのは，仝回答者の2070名の筋ジストロフィー患者に対して遺伝子医療

71．2％であった．知っている割合の最も高いのは福山型の85％であった．

に関するアンケート調査を実施した．

「筋ジストロフィーの医療として遺伝子診断が必要だ【方 法】と思うか？」の設問に対し全回答者の52．2％が必要だ

社団法人 日本筋ジストロフィー協会の会員であると答えた．デシャンヌ型患者の60％が必要と答え，そ

在宅患者・入所患者（各1797名，1645名）に対して平の比率は最も高かった．「遺伝子診断を受けたことがあ

成13年秋にアンケート調査を実施した。質問項目の大るか？」の設問に対して在宅者の25％，入所者の15％部分は医学的・社会的・心理的な現状調査で，追加的が受けたと答え，在宅者に統計学的有意に多かった．

に遺伝子医療に関する質問を加えた．アンケート用紙

また男性は女性より多く，福山型の比率が最も高かっは在宅者と入所者にはそれぞれ異なったものが用意され，た（42％）．「臨床実験の段階でも遺伝子治療を受けたい

質問を始める前にアンケートの結果が協会の運営方針か？」に対して受けたいと回答したのは全体の21％で，決定の重要な資料になることを記した．回答者は患者受けたくないと回答した23．7％より少なかった．「遺伝と限らず家族が回答することも認めた．

子診断結果および検査した後の遺伝子（血液）は、どこが管理するのがよいか」国立神経センターと答えたのは全体の46．3％，受診している医療機関と答えたのは＊社団法人 日本筋ジストロフィー協会＊＊早稲田大学大学院 人間科学＊＊＊上智大学大学院 社会福祉ー121−

22．9％であった．遺伝子医療に対する法的規制に関する

オームドコンセントの内容は十分だったか？」の設問

賛否の比率は在宅者50：9％、入所者44：7％であった．

に対しては，3名が十分，4名が不十分または分からないと回答した．「遺伝子検査の結果伝達を受けたか？」【結 論】の設問に対しては，6名が受けたと回答し，1名が伝1．自分たちの病気が遺伝子の変異によるものであり，達なしと回答した．結果伝達をうけた6名は全員が医遺伝子診断ができることを知っていたのは全回答

師から結果伝達を受けていた．結果伝達を受けた6名者の71．2％であった．

を対象に行った「遺伝子検査結果の説明は十分だったか？」

2．実験段階でも遺伝子治療を受けたいと思う回答者は，の設問に対して3名が十分，3名が不十分または分か受けたくないと答えた回答者より少なく，それぞ

らないと回答し，「結果の説明は理解できたか？」の設

れ21．0％、23．7％であった．

問に対して2名が理解できた，4名が理解できなかっ

3．47％の人は遺伝子医療に法的規制が必要であるとたと回答した．

考えていた．

2．病気の診断・理解と年齢との関連「遺伝子検査をもし行うとすれば，何歳ぐらいの時が【調査②】

最も適当だと思うか？」の設問に対して，44％が着床

31名の入所患者に対して，対面式の聞き取り調査に

前診断，26％が症状の発現後，15％が1歳未満，11％よる調査を実施した．

が妊娠中，4％が10歳前後と回答した．「自分の病気の診断・説明を理解できた年齢はい何歳だったか？」の【方 法】設問に対して，診断時に20歳以上であった11名を除く

埼玉県・宮城県・京都府・愛知県・宮崎県の5府県20名では，22％が12歳，15％が20歳，11％が15・16歳，にて，主に施設に入所中の筋ジストロフィー患者31名（男11％が10歳未満と回答した．「本人に遺伝診断の結果

性20名，女性11名：平均年齢42±15歳）を対象にを伝達・説明するのに適した年齢は何歳ぐらいだと思

2003年6月から2003年11月にかけて調査を実施した．

うか？ またそれは何故か？」の設問に対して，57％

調査は医師，心理士および心理学を専攻する大学院生が10歳〜16歳（理由：病気の内容を理解できる時期），

による1対1の対面方式の半構造化面接法（所用時間23％が18歳以上（理由：病気に対処可能になる時期），

は約50分）で実施された．調査内容はこれまでの筋ジ12％が5・6歳（理由：自分と他の子どもの違いを意

ストロフィー患者への調査結果及び本研究の目的を考識する時期），8％が回答不可能（理由：個人差がある）

慮し，基本事項，心理社会的要因，遺伝子診断，遺伝と回答した．

子治療，カウンセリングの5要因から構成された．調

3．遺伝子治療に対する知識と態度

査対象者は，事前に調査の趣旨と内容に関する説明を「遺伝子治療という治療法があることを知っているか？

受け，同意した者を対象とした．

またどこから情報を得たか？」の設問にたいし，79％（24名）が知っている，21％（7名）が知らないと【結 果】回答した．知っていると回答した24名の内，18名がテ調査2の対象者の平均年齢は，調査1における入所

レビ，新聞，雑誌，インターネットなどのマスメディ

患者の平均年齢よりやや高く，40代（8名），30代（7アから，8名が（社）筋ジストロフィー協会から，5名），20代5名），50代（4名），10代（2名），60代以名が医師や病院スタッフ，家族や知人その他から情報上（5名）の順に多かった．調査対象者31名の病型別を得たと回答した（複数回答）．「遺伝子治療の方法をの内訳は，デュシェンヌ型10名（32％），ベッカー型，

知っているか？」という設問に対して，58％が知って筋緊張性型，顔面肩月甲上腕型がぞれぞれ3名（各10％），

いる，42％が知らない，分からないと回答した．具体

肢体型が2名（6％），Kugelberg−Welander型が5名（16％）
であった．

的には，遺伝子の配列を変える（6名），遺伝子組み換

1．遺伝子検査の実施・伝達状況

修復（各2名）などの回答が多かった．「遺伝子治療にえ食品のようなもの（3名），遺伝子の異常，遺伝子の「遺伝子診断を受けたことがあるか？」の設問に対し対して期待しているか？」の設問に対して，74％が期ては，23％が受けた，58％が受けていない，19％が不待している，26％が期待していない，分からないと回明と回答した．受けたと回答した7名を対象に行った「遺答した．期待内容としては，若い人や子どもの治療に

伝診断時のインフォームドコンセントを受けたか？」

期待（8名），進行を止める・現状維持に期待（7名），の設問に対しては全員が受けたと回答したが，「インフ自分の治療に役立てたい（6名）などの回答が多かった．
ー122−

3．実験段階の遺伝子治療への参加希望「遺伝子治療に対して不安を感じているか？」の設問に対して67％が不安である，33％が不安ではない，分か

臨床実験の段階でも遺伝子治療を受けたいと回答しらないと回答した．不安内容としては，副作用が心配（6た患者と受けたくない・分からないと回答して患者の名），遺伝子組み換え食品との違いが不明（5名），よ割合いは21％：23％（2070名中），52％：48％（31名中）

く分からないので不安，失敗した時の悪化（各4名），

であり，遺伝子治療希望者と非希望者の割合は，有効治療に使用する遺伝子の悪影響（2名）などの回答が回答者のほぼ半数ずつであることが示された．

多かった．「臨床実験の段階でも遺伝子治療を受けたい

4．遺伝子診断前後の説明についてか？」の設問に対しては，52％が受けたい，48％が受現状の遺伝子検査前後のインフォームドコンセント

けたくない，分からないと回答した．

と結果説明は，約半数の患者にとって内容が不十分または理解困難であることが示された．これらの結果から，【結 論】

患者・家族にとって理解可能な内容と手続きの開発，

1．現状の遺伝子検査前後のインフォームドコンセン

および説明する医師に対する訓練プログラムなど，遺トと結果説明は，約半数の患者にとって内容が不伝子診断前後の説明と結果伝達に関する研究の必要性

十分または理解困難である．

が示唆された．

2．自分の病気に関して理解できたのは12歳の頃が最5．病気の診断・理解と年齢との関連も多い．

病型による差はあるが，自己の病気の理解が可能な

3．病気の認識に関して発達段階に応じた3段階の時

年齢としては12歳が最も多く，病気の認識に関して発期があることが示唆された（6歳前後：自他の違達段階に応じた3段階の時期があることが示唆された．

いを意識する時期，10代前半：病気を理解できる

これらの結果から，本人への告知と説明に関しては，

時期：18歳以上：病気に対処可能になる時期）．

年齢を考慮した段階的な説明の必要性が示唆された．
6．遺伝子治療に対する社会的啓蒙の必要性

4．79％の患者は遺伝子治療の存在を知っており，58％の患者が方法を知っていると回答した．74％の62％の患者（31名中）は遺伝子治療に対して不安を患者は遺伝子治療に期待を感じており，67％は不感じており，治療の失敗や副作用などの治療への不安と，安を感じている．

内容や遺伝子組み換え食品との違いが分からないなど

5．遺伝子治療に関する情報はマスメディアや（社）の正確な知識の不足による不安が同程度に多いことが

日本筋ジストロフィー協会から待ている割が高い．

示された．これらの結果から，遺伝子治療の実施に際

6．52％の入所患者が実験段階でも遺伝子治療を受けしては正確な知識と理解の促進が重要であると考えらたいと思っていた．

れる．また，遺伝子治療に関する知識は，マスメディ
アや（社）日本筋ジストロフィー協会から得ている割【調査①・②についての総合考察】

合が高いことが示されたため，このような媒体を通じ

1．遺伝子医療に対する認知度て社会的な啓蒙活動を行うことの有用性が示唆された．

遺伝子診断ができることを知っている患者は71．2％（2070名中），遺伝子治療の存在を知っている患者は79％（31名中）であったことから，遺伝子診断，遺伝【調査①・②についての総合結論】

子治療に対する患者の認知度は比較的高いと考えられる．

1．患者における遺伝子診断，遺伝子治療への認知度

しかし，遺伝子治療の方法を知っている患者は58％（31は比較的高い（71〜7，％）が，内容に関する正確名中）であり，正確な内容を理解している割合は認知な知識の有無は不明である．
2．遺伝子診断による診断へのニーズを感じている患している割合よりも低いことが考えられる．

者は52％だが，遺伝子治療への期待は高い（79％）．

2．遺伝子医療に対するニーズ
52％（2070名中）の患者が筋ジストロフィーの医療としての遺伝子診段が必要であると回答し，74％（31

3二 実験段階の遺伝子治療への参加希望者，非希望者の割合は約半数ずつである．

名中）が遺伝子治療に対して期待していると回答して4．遺伝子診断の説明・結果の伝達は，現状では約半いる．これらの結果から，患者は遺伝子診断によって数のケースで不十分，あるいは理解困難であり，診断すること自体の必要性はそれほど高く感じていな

患者に理解可能な説明内容および，伝達者の訓練

いが治療への期待度は高いと考えられる．

プログラムの開発などの必要性が示唆された．
5．遺伝子医療の円滑な実施のためには，社会的な啓−123−

蒙活動による正確な知識と理解の促進が重要である可能性が示された．

【結 果】
出席者に対して，シンポジウムに対するアンケート

6．患者の遺伝子治療の知識はマスメディアや（社）
日本筋ジストロフィー協会から得ている割合が高く，調査を実施した．回答の得られた22名の結果について報告する．

このような媒体を通じて社会的な啓蒙活動を行う
ことの有用性が示唆された．

「このシンポジウムの満足度は5段階評価では何点くらいか？ その理由はなにか？」の設問に対しては，【シンポジウム開催の報告】

平均して3．6点という回答であった．
理由として多かった回答は，様々な立場からの話が【緒 言】

開けてよかった（7名），フロアからの討論時間が短す

筋ジストロフィーの遺伝子治療の実現に際しては様々

ぎる，最新の話が開けた，治療の現実が分かった（各な倫理的および社会的問題が生じることが指摘されており，これらの予想される問題について十分に認識を深めることは重要な課題である．

3名）などであった．
「このシンポジウムに関心をもったきっかけは何か？」の設問に対して多かった回答は，筋ジストロフィー協

遺伝子医療の円滑な実施のためには社会全体のコン会の媒体で知った（9名），自身の子どもが筋ジストロ

センサスを得ることが必要であり，患者のみならず，

フィーであるため（8名），自身が医師・研究者で関心社会全体への啓蒙活動が重要であると考えられる．そがあるため（4名），背生命倫理・遺伝子の問題に関心

こで，社会全体に広く情報を発信し，遺伝子医療の円がある（3名），新聞を見て（2名）などであった（複滑な実施を促進する社会的啓蒙活動の一環として，本

数回答）．

研究班および，社団法人日本筋ジストロフィー協会，「シンポジウムに出席してどのような感想を持ったか？」

日本生命倫理学会の共催によるシンポジウムを開催した．

の設問に対して多かった回答は，当事者である患者の話を開けてよかった（4名），治療の早い実現を望んだ（3【シンポジウム内容】名），医師以外の話を開けて良かった，当事者と研究者，

第15回日本生命倫理学会年次大会の二日目（2003年

他の専門家間の連絡調整の必要性を感じた，治療の実

11月16日）に，大会関連シンポジウムとして「遺伝子現のために周囲や社会の理解が必要であると感じた（各治療が可能になったときに‥」を開催した．シンポジ2名）などであった．

ウムの開催に関しては，日本生命倫理学会，社団法人「遺伝子治療に対する疑問やもっと深く知りたい点に

日本筋ジストロフィー協会のホームページおよび，はどのようなものがあるか？」の設問に対しては，安産経新聞，朝日新聞に予告を掲載した．

全性と副作用，企業などの特許問題，医学部の倫理委

司会は貝谷久宣（社団法人 日本筋ジストロフィー

員会の役割と位置づけ（各2名），遺伝子治療・遺伝子協会 理事）が務めた．開会時の挨拶は河端静子（社

診断・妊娠中絶の位置づけ，治験への参加方法，エク団法人 日本筋ジストロフィー協会 理事長），石原

ソンスキップ法の適用患者，デュシェンヌ型以外の研博幸（平成15年度 厚生労働省 精神・神経疾患研究

究の進み具合，一般の人や患者の理解度，期待度，誤依託費 筋ジストロフィー研究連絡協議会副議長），閉解度を知りたい（医療者として）などの回答が得られた．

会の挨拶は福揮利夫（社団法人 日本筋ジストロフィー協会 副理事）が行った．

【結 論】

シンポジストは，小澤敏也（自治医科大学医学部教授）

1．シンポジウムの満足度は平均3．6点であり，比較的満足度の高いシンポジウムであった．

が医学的な立場から，青木 活（上智が医学教授，日本生命倫理学会代表理事・会長）が生命倫理の立場から，

2．様々な立場からの講演内容は，患者・患家医師・専門家の双方から概ね好評であった．

杉浦美香（産経新聞社会部記者）が一般社会の立場から，
名倉由紀子（患）が遺伝子治療の実現を願う患者の立3．アンケート回答者内では，患者・患家その他の割場から，月谷嘉洋（上智大学大学院生）が遺伝子治療

合が医師・専門家より多く（15名：7名）社会的を基本的に否定している患者の立場から講演を行った．

啓蒙活動として有用であったと考えられた．

その後，金澤一郎（国立精神・神経センター総長）による指定討論の後，フロアからの討論を行った．

【参考文献】
1）月谷久宣：DNA診断に対する患者・家族の意識．
ー124−からだの科学181：118−122，1995．
2）月谷久宣、他：日本筋ジストロフィー協会 患者・
家族討論会「遺伝子・胎児診断に対する期待と疑問」
からだの科学191：2−16，1996．
3）月谷久宣／日本筋ジストロフィー協会 編集 遺伝子医療と生命倫理 日本評論社 東京 2001

−125−

Summary13B−1DevelopmentofMolecularTherapyonHereditaryMuscleDiseases
ActivityReportofaNationalResearchGroupOrganizedbyNationalCenterofNeurologyand
Psychiatry（NCNP），andtheMinistryofHealth，LaborandWtlfare
Shin．ichiTbkeda，M・D，，Ph．D．（PrincipalInvestigator）
The causative genes ofmuscular dystrophies have beenlargelyidentified，howeverneither
molecularPathogenesis noressentialtreatment ofthe diseases has beenfound・Tb develop
moleculartherapyofthediseases，WeOrganizedanationalresearchgroupandIbrieflysummariZe
theprogresspursuedbyourgroup．

1・Genetherapytowardvarioushereditarymusclediseases
Efftctivegenetransftrintoskeletalmuscleisachievedbyusingadeno−aSSOSCiatedviruS（AAV）
VeCtOr，howeverthisvectorhasalimitationinthesizeofincorporatedgene・Dr・恥keda，sgroup（NCNP）previously found that small sized−dystrophin（micro−dystrophin）can effectively
amelioratedystrophicphenotypesintransgenicmdxmicestudy・Then，theymadeanAAVvector
encodingmicro−dystrophin cDNAandinjectedthevectorinto skeletalmuscle ofdystrophin−deficientmdxmice・Theyfbundthelong−termeXPreSSionofmicro−dystrophinatleastunti124
Weeks aftertheirtiectionandimprovementofhistology andspecinctetanicforceofinjectedmuscle・TheyalsoIIt）eCtedtheAAVvectorintoskeletalmusclesofdystrophicdogs，butthey
encountered excessimmune responsesininjected muscles．Ⅰtisindispensable toknOw themolecularbackgroundofimmuneresponseandtonndthewaytosuppresstheresponse・2．

Stemcelltransfbrbrmusclediseases

Stemcelltransftrcanbeapplicableasageneralizedtreatmentofhereditarymusclediseases・The
StemCellofthemusclelineagehasbeenfoundnotonlyinbonemarrowbutalsoinskeletalmuscle
itself・Dr・Hashimoto

sgroup（MitsubishiLiftScienceInstitute）establishedaclonalcultureof

mouse skeletalmuscle satellitecells andfbundthecellhas amulti−lineagepotentialand candifftrentiateintoskeletalmusclecellsaswellasbonecells・Dr・Tbkeda，sgrouphadisolatedSide
Population（SP）cellsfrombonemarrowandskeletalmuscleitselfandtheytriedtoelucidatethe
localizationandfunctionofSPcells・TheyfoundthattheSPcellswerelocalizedatinterstitial
tissuebetweenmusclefibers．Therefbre，thelocalizationwasdistinctfromthatofsatellitecells．
TheyalsofoundthatbonemarrowSPcellsweremlgratedintoanearlierstageofregeneratingmuscle・Theemciencyofbonemarrowtransplantationisverylow，therefbretheytriedtofind
ParticularSPcellfranctions，Whichcaneffbctivelydifftrentiateintomusclecells・CD45＋Mac−1low

SPcells，Whichwerefbundatearlystageofmuscleregeneration，areOneOfcandidates・

3・Development ofnew therapy based on elucidation ofmolecularPathogenesis ofmusculardystrophy
Imparimentofcognitivefunctionindystrophin−de缶cientDuchennemusculardystrophywaswell

recognized，but the molecularbackground oftheimpalrmenthas notbeenidentified・Dr・
Sekiguchi（NCNP）examinedtheabilityofmemoryandleamingindystrophin−de丘cientmdrmice，

andfoundthatthesefunctionswerewellmaintainedinthemice．Healsoexaminedemotiona1−129−

conditionofthemiceandfbundthatthosemicewerefragiletoemotionalstress・Thesemndings
mightbekeyphenomenontounderstandthecentralnervOuSSyStemSymPtOmSOfthedystrophic
Patients．

4．Newamimalmodelsfbrtherapeuticapproachofmusclediseases
ThemdxmicehavebeenusedasamodelofDuchennemusculardystrophy（DMD）fbralongtime，howeveramildphenotypeofthismodelisnotsuitablefbrtheassessmentofthetreatment・
Dystrophicdog（CXMD）revealsseverephenotypesseeninDMD・Dr・1もnioka（ResearChCenterofExperimentalAnimalModels），his colleagues（Chu−gaiMedicalInstitute）andNCNPhaveestablishedabeagledog−basedCXMDcolonyinJapan・InthenewlybuiltfacilityinNCNIlthey
startednotonlyclinical，andpathologicalexaminationofdystrophicdogs，butalsointroductionof
therapeuticgeneintoskeletalmuscleofthedogs・SelectiveinvoIvementofPu止irdefibersinthe
heartconductionsystemhasbeennoticedatearlierstageofdystrophicdogs・
5．Socialmedicalaspectsofmusclardystrophies
Dr．Kaiya（MuscularDystrophyAssociationofJapan）forwarded

aresearchrelatedto

socio一medicalaspectsofmusculardystrophicpatientsandtheirfamilies・Mostofpatientshavenoticed
thatthey weresufftringfrOmgeneticdiseaseandcertainnumbers ofpatientshadanideato

receiveanopportunltyOfgenetherapy・ItisverylmPOrtanttOdistributerecentknowledgeaboutmolecularPathogenesisandmoleculartherapyofthediseasesamOngPatientsandfamilies・ー130−平成13〜15年度研究班員名簿

遺伝性筋疾患に対する分子治療の基盤研究
平成13〜15年度

区分

氏

主任

名

研究者一覧表所属施設所在地（
Tel ・Fax ・E−
m ail ア ドレス）所 属 施 設

職 名

武田 伸一

国立精神 ・神経センター
神経研究所
遺伝子疾患治療研究部

部 長

〒187−
8502
東京都小平市小川東町4−
1−
1
T E L 042●
346＿
1720
F A X 042−
346−
1750
E −
m ailtakeda（
夢ncnp．
go．
jp分担

井上 正 康大阪市立大学大学院
医学研究科
分子病態学

教 授

〒545−
8585
大阪市阿倍野区旭町 1−
4−
3
T E L O 6−
6645−
3720
F A X O 6−
6645−
372 1
E −
m ailinoue＠m ed．
osaka−
Cu．
aC．
jp

分担

遠藤 仁 司自治医科大学
医学部
生化学

助教授

〒329−
0498
栃木県河内郡南河内町薬師寺3311−
1
T E L O285−
58−
7322
F A X O285−
44−
1827
E −
m ailhendo＠jichi．
acjp

分担

小澤 敬 也自治医科大学医学部
分子病態治療研究センター
遺伝子治療研究部

教 授

〒329−
0498
栃木県河内郡南河内町薬師寺331ト1
T E L O285−
58−7402
F A X O285−
44−
8675
E 一
ma
i lkozaw a＠jichi．
ac．
jp

分担

月谷 久 宣他日本筋ジス トロフィー協会

理 事

〒102−
0084
東京都千代 田区二番町 11−1−505
T E L 03 −52 15−1485
F A X O3 ＿52 15＿
1735
E 一mai lofnce＠f
u anclin
l C．
com

分担

金田 安史

大阪大学大学院
医学系研究科
遺伝子治療学

教 授

〒565−
0871
大阪府吹田市山田丘2−
2
T E L 0 6−
6879−
390 1
F A X O 6−
6879−
3909
E −
m ailkaneday＠gts．
m ed．
osaka−
u．
aC．
jp

分担

菊池 建 機
（13 年度）

国立精神 ・神経センター
神経研究所
モデル動物開発部

部 長

〒187−
8502
東京都小平市小川東町4−
1−
1
T E L 042−
34 1−
2711

分担

木村 重 美熊本大学医学部附属病院
発達小児科

助 手

分担

後藤 雄 一国立精神 ・神経センター
神経研究所
疾病研究第二部

部 長

〒860−
0811
熊本県熊本市本荘 1−
1−
1
T E L 096−
373−
5 197
F A X 096−
373−
5200
E −
rFa
i lkim usige＠ka
i ju・
m edic・
kum am oto−
u・
aC・
Jp
〒187−
8502
東京都小平市小川東町4−
1−
1
T E L 042＿
346＿
1713
F A X 042−
346−
1743
E −
m ailgoto＠ncnp．
go．
jp

分担

斎 藤深美 子（小原）（
13 年度）

東京医科歯科大学
難治疾患研究所
分子細胞遺伝

助 手

一133−

〒187−
850 2
東京都小平市小川東町4−
ト1
T E L 042−
346−
1720
F A X O42＿
346＿
1750
E −
m ailtak eda＠ncnp．
go．
jp

区分

氏

名

分担

笹岡

俊邦

分担

所

属

施

設

職

所属施設所在 地（
Tel ・Fax ・E −m ail ア ドレス）助教授

〒 444−
8585
愛知県 岡崎市 明大寺 町西郷 中 38
T E L O564−
55−
7569
F A X O564−
55−
7523 ・7569
E 一
m ai lsasaoka＠nibb．
acjp

日本医科大学医学部
鈴木聡（
13 〜 14 年度 ） 第二生化学教室助

手〒 113−
0032
東京都文京区千駄木 1−
1−
5
T E L O3−3822−
2131（内 5240）
F A X O3−
58 14−
8156
E −m ailbm bsat＠nm s．
ac．
jp

分担

関 口 正幸国立精神 ・神 経セ ンター
神経研 究所
疾病研 究第四部

室長〒 187−
8502
東京都小平市」、
川東町 4−
1−
1
T E L O42−346−
2711（内 5142）
F A X O42−
346−
1745
E 一
m ai lsekiguch＠ncnp ．
gojp

分担

高橋

国立 精神 ・神経 セ ンター
神経研 究所
実験動物 管理室室

長〒 187−
8502
東京都小 平市小 川東町 4−
1−
1
T E L 042−
346−
14 17
F A X 042−
346−
14 18
E −
m ai lakio＿tk＠ncnp．
go．
jp

分担

谷 岡 功邦肘実験動物中央研 究所
動物 実験 セ ンター

分担

塚原

俊文

北陸先端科学技術大学院大学
ナノマテ リアルテクノロジー
セン ター

教

授

〒923−
1292
石川県能美郡辰 口町旭台 1−
1
T E L O761−
51−
1440
F A X 0761−
51−
1149
E −
m ailtukahara＠jaist．
ac．
jp

分担

辻野

精一

国立精神 ・神経セ ンター
神経研究所
疾病研究第五部

室長〒 187−
8502
東京都小平市小川東町 4−
1−
1
T E L 042−
34ト27 11（内 5 152）F A X 042●
346＿
1746
E 一
m ai 1tsujin 0＠ncnp．
go．
jp

分担

角田 幸雄

近畿大学農学部
分子発生工学教授〒 63 1−8505
奈 良県奈 良市 中町 3327−
204
T E L 0742−
43−
15 11（内 3 112）F A X O742＿
43＿
1155
E 一
m ai ltsunoda＠nara．
kin dai ．
acjp

分担

鍋島

陽一

京都大学大学院
医学研究科

教

授

〒 606−
8501
京都府京都市左京区吉 田近衛町
T E L O75−
753−
4422
F A X O75−
753−
4676
E −
m ailnabem r＠1m ls．
m ed．
kyoto−
u．
aC．
jp

分担

西川 元也
（
15 年度）

京都大学大学院
薬学研 究科

助教授

分担

橋本

三菱化 学生命科 学研 究所
幹細胞研 究ユニ ッ ト

明男有弘

岡崎 国立共 同研究機構
基礎生物学研究所
形質転換生物研究施設

名

セ ンター長

主任研究員

−134−

〒2 16−
0001
神奈川県川崎市宮前 区野川 1430
T E L O44−
754−
4480
F A X 044−
754−
4454
E −
m ailtanioka＠ciea．
orjp〒 606−
8501
京都府京都市左 京区吉 田下阿達 町 46−
29
T E L 075−
753−
4616
F A X 075−
753−
46 14
E −
m ailm akiya＠pharm ．
kyoto−
u．
aCjp〒 194−
85 11
東京都町 田市南大谷 ll
T E L O42−
724−
6250
F A X 042−
724−
6316
E 一
m ai lnao＠libra．
1S．
m−kagaku．
cojp

区分

氏

名

分担

原

孝彦

分担

属

施

設

所 属施 設所在 地（
T el ・Fax ・E −m ailア ドレス）職

名㈲東京都医学研 究機構
東 京都 臨床 医学総合研究所
腫 瘍生化学研究部 門室長〒 113−
8613
文京 区本駒込 3−
18−
22
T E L 03−3823−
2105（内 5410）
F A X 03−
3823−
14 18
E −
m ailthara＠ri nshoken．
orjp

日置 恭 司㈲実験動物中央研 究所
飼 育技術研 究室

室

長

〒216−
000 1
神奈 川県川 崎市宮前 区野川 1430
T E L 044＿
754−
4485
F A X 044−
754−
4454
E −
m ai lhioki（
夢ciea．
or．
jp

分担

福田 恵一

慶 歴義 塾大 学医学部
心臓病先進 治療学

講師

〒 160−
8582
東京都新宿 区信濃 町 35
T E L 03−
5363−
3874
F A X 03＿
5363−
3875
E 一
m ai lkfu kuda（
夢sc．
itc．
keio．
acjp

分担

平 家 俊男
京都大 学大 学院医学研究科（
14 〜 15 年度） 発 生発達 医学講座 （
発達小児科
学）

助教授

〒606−
8507
京都市左京 区聖護 院川原 町 54
T E L O75−
751−
3305
F A X 075−
752−
2361
E 一
m ai lheike＠K uhp．
kyotoTu．
aC．
jp

分担

北條 浩彦
（
15 年度）

国立精神 ・神経 セ ンター
神 経研 究所
疾 病研 究第三部

室〒 187−
8502
東京都小平市小 川東 町 4−
1−
1
T E L O42−
341−
2711（内5 132）F A X O42＿
346＿
1744
E −
m ailhohjohh＠ncnp．
gojp

分担

三好 浩之
（
14 年度）

理化学研 究所筑波研 究所
バ イオ リソースセ ンター
生体情報統 合技術 開発 チーム

研究員

〒305−
0074
茨城県つ くば市高野 台 3−1−
1
T E L O298−
36−9056 ・
0298−
36−
9185
F A X 0298−
36−
9 144
E 一
m ai lm iyoshi＠brc．
ri ken．
go．
jp

分担

山元

大阪大学大学院
薬学研 究科
細 胞生理学分野

教

〒565−
087 1
大阪府吹田市山田丘 1−
6T E L 06−
6879−
8190
F A X 06−
6879−
8194
E −
m ailhiroshiy＠phs．
osaka−
u．
aC．
jp

弘

所

ー135−

長

授