技術紹介

アジレント・テクノロジー株式会社

2 次元 LC および 2 次元 LC/MS を用いた生体分子・バイオ医薬品の分析技術
内藤厚子

1 は じ め に
近年抗体医薬品や核酸医薬品などのバイオ医薬品が広く用いられるようになり，研究開発も活発に行われている．高速液体クロマトグラフィー（HPLC，LC）はバイオ医薬品の開発には必須の技術であり，LC の分離パフォー
マンスの向上は微小粒子径充填剤や表面多孔質充填剤を使用した超高速液体クロマトグラフィー（UHPLC）カ
ラムによる分離効率の向上によってこれまで多く議論さ
図1

れてきた1）．今日では，マトリクスの多様化やより複雑な組成のサンプルの分析が求められており，2 次元 LC（2D-LC）が高分離を実現する手法として注目されている．2D-LC は二つの異なる分析条件の LC 分析をオンライン，またはオフラインで組み合わせる手法である2）3）．理想条件では 2D-LC のピークキャパシティは 1
12次元目（ D）と 2 次元目（ D）のピークキャパシティり替えることにより 2D カラムに導入し分離，検出する．

検出は UV 検出器などの LC の一般的な検出器のほか，質量分析計（MS および MS/MS）も使用される．1D カラム分離の直後に検出器を接続し，1D クロマトグラムを得ることも可能である．の積となり，分離パフォーマンスを飛躍的に向上させる

3 コンプリヘンシブ 2D-LC

ことができる．

2D-LC は古くから行われてきた手法であり，例えば分取 LC により採取したフラクション（画分）を異なる分析条件で再分析することはオフライン 2D-LC と言える．一方で，オンライン 2D-LC はバルブを介して 1 次

Agilent InfinityLab 2D-LC の流路構成

コンプリヘンシブ 2D-LC は 1D カラムからの溶出液すべてを 2D カラムに導入する手法であり，サンプルに含まれる化合物の全体像を包括的に把握するのに有効である．コンプリヘンシブ 2D-LC では，一方のループに元目の溶出液を 2 次元目に導入する手法で，自動化が1可能である．しかしながら従来のオンライン 2D-LC はのループに溜めた画分がただちに 2D カラムに導入され制御が複雑であり実用は困難であった．そこで弊社では分離検出されて，バルブポジションが切り替わるというオンライン 2D-LC 専用のバルブや装置制御ソフトウェ動作が繰り返される．このバルブが切り替わる周期をモ

ソリューションを開発した．2D-LC は，医薬品，食品，μL 程度，モジュレーション時間はおおよそ 20 秒～ 1

化学材料等の多岐にわたる分野で適用されているが4），分程度であるため，1 次元目は低流速，2 次元目は超高

本稿では，複雑かつ多様な特性解析が求められる生体分速分析とする必要がある．したがって 1 次元目では低子 や バ イ オ 医 薬 品 に 焦 点 を 当 て，Agilent InfinityLab

流速でも流量精度が高いポンプ，2 次元目では超高速分アにより，簡便に利用できる Agilent InfinityLab 2D-LC

2D-LC ソリューションの特長および 2D-LC，2D-LC/MS による測定例を紹介する．

D カラムからの溶出液を溜めるのと同時に，もう一方ジュレーションと呼ぶ．ループの容量は通常 40～80

析が可能な UHPLC システムの使用が必須となる．

コンプリヘンシブ 2D-LC のデータは一定のモジュ2 装置概要

レーション時間ごとの 2D クロマトグラムの集合体とな

Agilent InfinityLab 2D-LC の流路構成を図 1 に示す．

細分化し，横軸を 1D 保持時間，縦軸を 2D 保持時間（モ2D-LC 専 用 バ ル ブ（2pos/4port Duo） に よ り，1 次 元
1目 D カラムからの溶出液をループに溜め，バルブを切108

るので，このクロマトグラムをモジュレーションごとにジュレーション開始からの時間）とする等高線プロットが得られる．図 2 に抗体医薬品のペプチドマッピング
ぶんせき 2023 3

ヘンシブ 2D-LC と異なりハートカット 2D-LC の 2 次元目は必ずしも超高速分析である必要はなく，1 次元目，2 次元目の分析条件の制約が少ない．
図 3 はモノクローナル抗体のサイズ排除（SEC）─弱陽イオン交換（WCX）の分析である6）．モノクローナル抗体をはじめとしたバイオ医薬品では安全性や効能を確保するために詳細な特性解析が重要であり，通常は複数の分析が必要とされる．2D-LC を用いて，SEC による凝集体分析，WCX による電荷変異体の分析を 1 回のインジェクションで行うことができた．

4･2 マルチハートカット（MHC）2D-LC

ハートカット 2D-LC の問題点として，1 次元目で近接した時間に溶出する複数のピークを 2 次元目に導入し分離したい場合に，一度の測定では 2 次元目の分析が出来ないピークが発生することがある．そこで弊社では，2 個のマルチループバルブにより 1 次元目の溶出液を貯留するループを増やしたマルチハートカット

2D-LC を開発した（図 4）．これにより 2 次元目へ導入
図 2 コンプリヘンシブ 2D-LC によるペプチドマッピング
上段：インフリキシマブ，下段：バイオシミラー．
分析条件 1D：SCX（カラム：Agilent Bio SCX NP10）；2D：RP（カラム：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18）；検出：Q-TOF
MS（positive）．

できるピークの数が多くなり，効率よくハートカット

2D-LC を行うことが可能となった．

図 5 に MHC 2D-LC による合成核酸（オリゴヌクレオチド）の強陰イオン交換（SAX）─逆相（RP）の分析を示す7）．イオン交換クロマトグラフィーでは通常，不揮発性塩を含む緩衝液を移動相に用いるため，そのまま

5）の例を示す ．1 次元目で強カチオン交換（SCX），2 次元目で逆相（RP）分離を行い，等高線プロット上でインフリキシマブとそのバイオシミラーの差異を可視化した．Q-TOF MS にて差異ピークの配列確認を行った．

MS に接続することは困難であるが，1 次元目で溶出した各ピークを 2 次元目の RP にて脱塩を行い Q-TOF

MS に導入することで，MS による解析を可能にしている．MHC 2D-LC により近接している複数ピークを 1

4 ハートカット 2D-LC
4･1 （シングル）ハートカット 2D-LC

ハートカット 2D-LC は 1D カラムからの溶出液の一部を，ループを介して 2D カラムに導入する手法であり，特定のピークを詳細に分析することができる．コンプリ

図 3 ハートカット 2D-LC によるモノクローナル抗体の分析
分析条件 1D：SEC（カラム：Agilent AdvanceBio SEC 300A）；
2
D：WCX（カラム：Agilent Bio mAb WCX）；検出：UV 280
nm，ハートカット位置を灰色で示した．
ぶんせき 2023 3

図 4 マルチハートカット（MHC）2D-LC の流路図

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回の測定で 2D カラムに導入して分析することが可能であった．

5 ハイレゾリューションサンプリング 2D-LC
5･1 ハ イ レ ゾ リ ュ ー シ ョ ン サ ン プ リ ン グ（HRS）
2D-LC

MHC 2D-LC は 1 次元目の特定のピークを連続的に複数のループに貯留し 2 次元目へ導入することも可能であり，このような手法はハイレゾリューションサンプ
リング（HRS）2D-LC もしくは選択的コンプリヘンシ

ブ 2D-LC と 呼 ば れ て い る． シ ン グ ル ハ ー ト カ ッ ト

2D-LC ではターゲット成分の 1 次元目のピーク容量が2D-LC のループ容量を上回る場合，ピークの一部分しか 2 次元目に導入出来ないが，HRS 2D-LC ではピークを広範囲にわたって 2 次元目へ導入できるためピーク全体もしくは大部分の 2 次元分離が可能である．

図 6 に HRS 2D-LC による牛インスリンの RP-RP 分

析を示す8）．1 次元目で溶出したターゲットピークに対して，9 画分を連続的に貯留し 2 次元目で分離を行った（図 6A）ところ，主成分（c3）と 4 種の不純物を分離した（図 6B）．Q-TOF MS にて不純物はアラニン欠損体（c1）および脱アミド体（c2,c4,c5）と同定された．

5･2 マルチインジェクション
MHC 2D-LC による合成核酸のイオン交換分離及びオンライン脱塩
A：1D クロマトグラム（ハートカット位置を灰色で示した）；
B：ピーク脱塩後の MS デコンボリューション結果．
分析条件 1D：SAX（カラム：Agilent Bio SAX）；2D：RP（カラム：Agilent AdvanceBio Oligonucleotide）；検出：UV 260 nm
および Q-TOF MS（negative）．
図5

HRS 2D-LC では，ピーク全体または広範囲を 2D-LC 分析することが可能である一方で，ループに貯留している複数の画分をすべて 2 次元目に導入し測定するため分析条件の設定によっては測定時間が長大となる．
そこで弊社は HRS 2D-LC 分析時に貯留した複数のピー

図 6 HRS 2D-LC による牛インスリンの分析
A：1D クロマトグラムと HRS カット位置；B：各カットの 2D クロマトグラム；C：インスリンおよび脱アミド体のマススペクト
ル；D：マルチインジェクションを行った時の 2D クロマトグラム．
分析条件 1D：RP（カラム：Agilent InfinityLab Poroshell HPH-C18，移動相：0.1％ TFA/ アセトニトリル グラジエント溶離）；2
D：RP（カラム：Agilent InfinityLab Poroshell HPH-C18，移動相：0.1 ％ ギ酸／アセトニトリル グラジエント溶離）；検出：UV
214 nm および Q-TOF MS（positive）．

110

ぶんせき 2023 3

クをまとめて 2 次元目に導入するバルブの制御プログ
ラムを開発し，マルチインジェクション機能とした．こ

緩和することが可能となった．図 7 に ASM バルブの構

造 と 概 念， 図 8 に ペ プ チ ド を HILIC-RP（MHC 2D-

れは大容量ループを使用したハートカット 2D-LC を行LC）で測定した結果9）を示す．ASM を使用すると 2 次うのと同一であるが，マルチインジェクションではルー元目でブレークスルーが生じず，ピーク形状も改善してプの付け替えを必要とせずソフトウェアによってループいる．

容量を柔軟に設定できる．またマルチインジェクション
は 2 次元目に導入される画分の容量が増大するため，後述の Active Solvent Modulation（ASM）と組み合わせて使用するとより良い結果が得られやすい．
前述の牛インスリンの RP-RP 分析において，1 次元目でのピークの画分を 1～5 および 6～9 の二つのカットに分けてマルチインジェクションを行った結果を図6D に示す．マルチインジェクションを行った場合でも2D ピークの保持時間は通常の HRS 2D-LC と同様であり分離能は損なわれなかった．またマルチインジェクションで得られた 2D ピークの面積値は，HRS 2D-LCのカットごとのピーク面積の合計とほぼ一致した．一方
で，通常の HRS 2D-LC と比較し分析時間を 68 分から39 分に短縮することができた．

6 2D-LC の最新技術
6･1 2D-LC の最新技術

弊社のオンライン 2D-LC ソリューションは発表から約 10 年が経過したが，その間複数回のハードウェア，ソフトウェアの改良に加えて，測定モードの多様化，関連技術の開発等が進み，それに伴って適用分野が拡大して き た．2D-LC の 最 新 技 術 と し て， 本 項 で は Active

Solvent Modulation（ASM），ダイナミックピークパーキング，Bio 2D-LC を紹介する．

6･2 Active Solvent Modulation（ASM）

2D-LC でピークキャパシティをより大きくするには

図 7 ASM バルブの構造および概念図
ASM バルブに導入された 2D 移動相は，マルチループバルブ（Deck A/B）のループおよび ASM キャピラリにスプリット（分岐）され，再び合流しミキシングされる．これにより 1 次元目の溶出液は 2D 移動相に希釈されて 2D カラムに導入される．

1 次元目と 2 次元目で異なる分析条件を設定することが重要であり，中でも異なる分離モードを用いることは有効である．しかし異なる分離モードを組み合わせる場合に移動相の適合性が問題となることがある．1 次元目に親水性相互作用クロマトグラフィー（HILIC），2 次元目に RP を用いた 2D-LC はその一例である．オンライン 2D-LC ではループと同容量の 1 次元目の移動相が 2次元目に導入されるため，1 次元目の HILIC で用いられるアセトニトリル比率が高い溶出液が 2 次元目の RPに大量に導入されることになり，2 次元目においてブレークスルーやピーク形状の悪化が引き起こされる原因となる．この問題は 1 次元目の溶出液を適当な溶媒で希釈しながら 2D カラムに導入することで緩和できる．
弊社では 2 次元目の移動相をスプリットしその一部で 1次元目の溶出液を希釈しながら 2 次元目へ導入することができる 2D-LC 用バルブ（ASM バルブ）を開発した．この ASM バルブにより，簡便に移動相の不適合をぶんせき 2023 3

図 8 ASM バルブを用いた MHC 2D-LC によるペプチドの分析
A：1D クロマトグラム（ハートカット位置を灰色で示した），
B：カット 3 の 2D クロマトグラム．
分析条件 1D：HILIC（カラム：Agilent ZORBAX HILIC Plus）；
2
D：RP（カラム：Agilent AdvanceBio Peptide Mapping）；検出：
UV 220 nm および MS（positive）．

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図 9 ダイナミックピークパーキング機能を用いた MHC 2D-LC 分析
A：1D クロマトグラムおよび設定したハートカット位置；B.1 および B.2：別日に測定した 1D クロマトグラムおよびハートカット位置；C：別日に測定した 2D クロマトグラム重ね書き，分析条件は図 6 と同様．

6･3 ダイナミックピークパーキング
ハートカットおよび HRS 2D-LC において 1 次元目のピーク保持時間が変動したとき，保持時間が想定と異なってしまい意図しない画分を 2 次元目に導入してし（MP35N）を接液部に使用している．前述の図 6，図 9の分析は Bio 2D-LC を使用した分析である．

7 お わ り にまうという問題がある．そこで弊社では，ソフトウェア

オンライン 2D-LC は装置や周辺技術の進歩とともにで設定した内部保持時間標準ピーク（IRTS）の保持時適用分野が拡大している．分離能の高い手法である

間変動により，IRTS 以降のハートカットおよび HRSの画分のカット時間を補正する制御プログラムを開発

2D-LC と，質量分析計を組み合わせることにより，サンプルのさらなる詳細解析が可能である．今後も Bioし，ダイナミックピークパーキング機能とした．この機

2D-LC をはじめとした最新技術の進歩とともに，生体能は保持時間が変動しやすい生体分子の分析において特分子，バイオ医薬品を含めたさらに幅広いサンプルへのに重要である．図 9 はダイナミックピークパーキング応用が期待される．

を使用した牛インスリンとその不純物の RP-RP（MHC2D-LC）分析例である．図 9A のピーク 1 をその他のハートカット時間の IRTS として設定している．それぞ
1れ別日に測定した結果を比較したところ， D ピークの保持時間が異なってもカット時間が補正され，同一の2D クロマトグラムが得られた．

6･4 Bio 2D-LC
生体分子やバイオ医薬品の中には，一般的な（U）HPLC に使用されているステンレス鋼（SUS）に対して吸着する試料がある．対策として接液部に SUS を使用しないシステムが開発されており，弊社でもバイオイ
ナート LC，Bio LC を開発している10）11）．2D-LC においても Bio LC をベースとした Bio 2D-LC を開発した．
Bio 2D-LC は SUS の 代 替 と し て 鉄 を 含 ま な い 合 金112

文献1） S. Feketea, E. Oláhb, J. Feketea : J. Chromatogr. A, 1228, 57（2012）.
2） D.R. Stoll, X. Li, X. Wang, P.W. Carr, S.E.G. Porter, S.C.
Rutan : J. Chromatogr., A, 1168, 3（2007）.
3） P. W. Carr, D.R. Stoll： TWO-DIMENTIO’NAL LIQUID
CHROMATOGRAPHY-PRICIPLES, PRACTICALIMPREMENTATION AND APPLICATIONS, Primer,
5991-2359EN, Agilent Technologies（2015）.
4） B.W.J. Pirok, D.R. Stoll, P.J. Schoenmakers : Anal Chem., 91,240（2019）5） Application Note : 5991-8077EN, Identifying Monoclonal
Antibody Mutation Sites Using the Agilent 1290 Infinity II
2D-LC Solution with Q-TOF LC/MS, Agilent Technologies（2017）.
6） Application Note : 5991-6906EN, Online 2D-LC Characterization of Monoclonal Antibodies with Size Exclusion andぶんせき 2023 3

Weak Cation Exchange Chromatography, Agilent Technologies（2016）.
7） アプリケーションノート：LC-MS-202004NA-001, 2DLC/MS を用いた合成核酸のイオン交換分離およびオンラ
イン脱塩 , アジレント・テクノロジー（2020）.
8） Technical Overview : 5994-4743EN, Analysis of Peptide/
Protein＊-Related Impurities Using the Integrated Solution ofBio 2 D-LC/Q-TOF in Agilent MassHunter Software（2022）.
9） Technical Overview : 5991-8785EN, The Agilent InfinityLab2D-LC Solution with Active Solvent Modulation, Agilent
Technologies（2017）.
10）Application Note : 5994-4392EN, Comparability Studies for
the Analysis of Nucleotides on Four Different LC Systems,Agilent Technologies（2021）.
11）Application Note : 5994-4617EN, Enhanced Sensitivity for
Phosphopeptide Analysis, Agilent Technologies（2022）.
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内藤 厚子（Atsuko Naito）
ア ジ レ ン ト・ テ ク ノ ロ ジ ー 株 式 会 社（〒192─8510 東京都八王子市高倉町 9─1）．東京都立大学大学院理学研究科修士課程修了．《現在の業務》HPLC，LC/MS
セールスサポート，アプリケーション開発．《趣味》旅行．
E─mail : atsuko_naito@agilent.com

会社ホームページ URL：

https://www.chem-agilent.com

関連製品ページ URL：

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ぶんせき 2023 3

報など
新規性：本記事の内容に関しては，新規性は一切問いません．新規の装置や技術である必要はなく，既存の装置や技術に関わるもので構いません．また，社会的要求が高いテーマや関連技術については，データや知見の追加などにより繰り返し紹介していただいても構いません．
お問い合わせ先：
日本分析化学会『ぶんせき』編集委員会〔E ─ mail : bunseki@jsac.or.jp〕

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