厚生省「精神・神経疾患研究委託費」

筋ジストロフィー症及び関連疾患の病態とその病因に関する研究杉田粧

昭和63年度研究報告書

平成元年3月（1989年）

研究報告書の作成にあたって
厚生省精神・神経疾患研究委託費「筋ジストロフィー症及び関連疾患の病態とその病因に関する研究」班が発足して第2年度の研究報告書を作成する運びとなりました．
今年は昭和43年，厚生省特別研究助成金により沖中重雄先生を珪長とする「進行性筋ジストロフィー症の成因と治療に関する研究」班が発足してから20年目にあたり，これを記念して1月14日に20周年記念講演会が開かれました．
この間にこの研究班が母体となり，我国における筋ジストロフィー症に対する病因，治療，療育等に関する研究は目覚ましく進歩致しました．また，デュシャンヌ
型筋ジストロフィー症の遺伝子産物，ジストロフィンが同定され，その局在も明らかとなり，ようやく分子レベルで病因が解明されるようになりました．しかしこの発見により全てが解決されたわけではなく，むしろ新しい研究の出発点と言うべきでありましょう．
筋ジストロフィー症の病態の完全解明と，治療法の一日も早い開発を目指し班月
各位の今後なお一層の努力と研究の発展を期待したいと思います．
20年という永い間筋ジストロフィー症研究に賜わった厚生省当局，そして日本筋ジストロフィー協会の深い御理解に心から感謝致しますと共に，今後共宜しく御支援の程お願い申し上げます．

平成元年3月く班長〉杉 田 秀 夫

目

昭和63年度総括研究報告

次7

分担研究報告

11

Ⅰ．臨床

19

Ⅱ．生化学

49

Ⅲ．形態，再生79

Ⅳ．ミトコンドリア（Part1）

117

Ⅴ．ミトコンドリア（Part2）

159

Ⅵ．ジストロフィン

183

Ⅶ．DMD遺伝子

199

Ⅷ．MDXマウスほか

221

昭和63年度研究班名簿263

昭和63年度

総括研究報告総括研究報告
班長

杉

田

秀

夫

〔はじめに〕
本研究報告書は「筋ジストロフィー症及び関連疾患の病態とその病因に関する研究」班の昭和63年度の報告書である．
当研究班は進行性筋ジストロフィー症及び関連疾患，特にミトコンドリア脳筋症の病態，
病因の解明と治療法の開発を最終目的としている．

〔研究組織〕
本研究班はその日的遂行の為，班長以下37名（監事1名，幹事6名，班月30名）より構成され，昨年同様4つの柱となるべき研究課題を設立し，各々の課題に対し2名の担当幹事を指名し，幹事の指導の基に総合的研究を行ないつつある．
1） 遺伝子診断と解析（荒木淑郎，鈴木紘一）
2） 筋変性と再生（寺尾寿夫，杉田秀夫）
3） 筋ジストロフィーの病態（宮武 正，高木昭夫）
4） ミトコンドリア脳筋症（垂井清一郎，佐藤 猛）（）内は担当幹事〔研究成果の要約〕
本年度班会議で発表された48題の報告の中から2，3のトピックについて述べる．
A．筋ジストロフィー症
筋ジストロフィー症，特にデュシャンヌ型（DMD）の病因が分子レベルで明らかにされた．即ちDMD遺伝子cDNAのN末端付近の一部から予測されるペブタイドやfusion蛋
白に対するポリクローナル抗体，或いはペブタイドのモノクローナル抗体は骨格筋，心筋の表面膜のみを認識する事が確認され，DMD遺伝子産物（ジストロフィン）は膜蛋白の一部である事がわかった．またこの抗体はDMDの骨格筋，心筋表面膜と全く反応しない事からDMDはジストロフィンの筋表面膜における欠損による疾患である事が明らかになった．この発見は従来より提唱されて来たDMDの病因に関する

ー9−

膜異常説 を分子レ

ベルで証明した事になり，DMD病因の全解明に向けて大きく前進した事になる．
一方DMDと同じ遺伝子座に異常のあると考えられるBecker型（BMD）ではジストロ
フィンは全体として発現が弱く，部分的に発現しており，また症例による差が著しい．この事はDMDより予後が良好であり，且つ臨床経過が多様である事を説明出来ると思われる．今後ジストロフィンの抗体染色は進行性筋ジストロフィー症の鑑別診断に極めて重要な意味を持つであろう．ジストロフィンの欠損が如何なる機序で進行性の筋萎縮をもたらすかの解明が今後の課題である．
B．ミトコンドリア脳筋症
ミトコンドリア（mt）脳筋症は多様な臨床症状を特徴としているが，当班月によりmtの全ゲノムをカバーする28種類のクローンが確立され，Kearns−SayreSyndrome（KSS）
は高頻度にmtDNAの部分欠矢が存在する事が明らかとなった．またMELASにおける多臓器電子伝達系酵素欠損との関連，複合体Ⅰの亜分画の欠損を主たる表現系質とする
mtDNAの欠失，或いはクローン化筋細胞を用いたCCOサブユニットを含むmtDNAの遺伝子発現調節機構の障害などその病因にせまる幾つかの研究が報告された．
今後は遺伝子欠矢の広がりと臨床症状の多様性との関連，及び当班眉により初めて記載されたFukuhara病（MERRF）に関する検索が進められるであろう．

−10−

分

担

研

究

報

告

目

次

Ⅰ．臨床

1）筋緊張性ジストロフィーにおける反復誘発M波の出現様式について
東京都立神経病院神経内科

田

邊

21

等

2）Duchenne型及びBecker型進行性筋ジストロフィー症における下腿の特異的筋エコー所見25

信州大学医学部第三内科

庄

司

進

一

3）神経筋疾患におけるUltrasound imaging−画像シミュレーションとフィルター最適化−

北海道大学医学部附属病院神経内科

田

30

代

邦

雄

4）筋委縮，皮疹，関節拘縮変形を伴うlipodystrophy症に類似する症例（山田ら）の筋病変の検討（2）
秋田大学医学部第一内科

豊島5）ゲルマニウム中毒ミオパチーの筋病理学的検討
鹿児島大学医学部第三内科

37

至
42

納

光

弘

Ⅱ．生化学

6）運動筋のプリン体異化亢進

−種々のミオパチーにおける分析−
大阪大学医学部第二内科

垂

井

51

清一郎

7）培養ラット筋管細胞におけるリソゾーム関与の蛋白分解
順天堂大学医学部生化学第一講座

木

56

南

英

紀

木

淑

郎

8）ラット骨格筋におけるCa依存性プロテアーゼ
およびそのインヒビーターの局在および動態について
熊本大学医学部第一内科

荒629）生検骨格筋におけるS−100a0蛋白質の測定：
CAⅢ，MSE，CK‑MM値との比較検討
名古屋大学医学部神経内科

68

杉

村

公

也

10）培養筋芽細胞の増殖，分化とリソゾーム酵素ならびにミトコンドリア酵素
徳島大学医学部第一内科
13

川

井

尚

臣

73

Ⅲ．形態，再生

11）無化学固定骨格筋の液体heliumによる急速凍結，deep etching，回転蒸着
replica観察の試み−特にmyosin filamentのcross bridgeについて−

昭和大学藤が丘病院神経内科

若

山

吉

弘

12）Localtetanus法の応用による実験的ミオパチーに関する研究−ランタン染色による管系の初期病変の検討
東京都立神経病院神経内科

第4報
86

田 邊

等

13）ラット骨格筋における雌雄差と性腺摘出の影響（Ⅱ）
国立療養所字多野病院臨床研究部

斎

92

田

孝

彦

14）脱神経による筋芽細胞増殖促進因子への影響
東北大学医学部神経内科

95

高

瀬

貞

夫

15）骨格筋の移植に関する研究
1）ヌードマウスに移植後の再生筋の収縮特性
2）再生筋の由来
帝京大学医学部第一内科

99

寺

尾

寿

夫

16）骨格筋とカルシトニン遺伝子関連ペプチドに関する研究−その受容体とシグナル伝達の解析を中心として−
金沢大学医学部神経内科

81

高

105

守

正

治

17）ヒト培養筋細胞のナトリウム及びカルシウムチャンネルの発達に関する検討111

東京医科歯科大学医学部神経内科

塚

越

廣

Ⅳ．ミトコンドリア（Part1）

18）ミトコンドリアDNAのクローニングと塩基配列の解析
国立遺伝学研究所

119

宝 来

聰

19）ミトコンドリア・サイトパチーにおける母系遺伝の分子遺伝学的解明
名古屋大学医学部第二生化学

小

澤

高

將

高

將

20）MELASにおけるミトコンドリアDNA変異と肥大型心筋症
外古屋大学医学部第二生化学

14

小

澤

125

130

21）核にコードされるヒトcytochrome c oxidase subunit VIc遺伝子のクローニングと臨床診断への適応
自治医科大学神経内科

水

野

美

22）ミトコンドリア・ミオパチー1家系におけるミトコンドリアDNA解析
筑波大学臨床医学系神経内科

中

西

孝

垂

井

145

清一郎

24）クローン化MELAS筋細胞におけるミトコンドリア異常の解析
自治医科大学小児科

149

桃 井 真里子

25）多臓器障害を呈したMELAS剖検例の臨床および生化学的研究
新潟大学脳研究所神経内科

139雄23）ミトコンドリア脳筋症におけるミトコンドリアDNAの解析
大阪大学医学部第二内科

135

邦

宮

武

153

正

Ⅴ．ミトコンドリア（Part2）

26）Kearns−Sayre症候群の剖検例におけるミトコンドリア電子伝達系酵素と遺伝子の異常161

順天堂大学医学部脳神経内科

佐

藤

猛

27）In situ hybridizationによるミトコンドリア電子伝達系酵素のmRNAの検出
順天堂大学医学部脳神経内科

佐

藤

165

猛

28）クロロキンミオパチーにおけるミトコンドリア代謝の検討
国立療養所犀潟病院神経内科 福 原 信

168義29）ミトコンドリアミオパチー生検筋内の血管変化
国立精神・神経センター神経研究所微細構造研究部

172

埜

中

征

哉

30）ミトコンドリア電子伝達系の検討（第3報）
北海道大学医学部附属病院神経内科

177

田

代

邦

雄

Ⅵ．ジストロフィン

31）Duchenne型筋ジストロフィーの欠損蛋白質−免疫組織化学的検討−

185

国立精神・神経センター神経研究所

15

杉

田

秀

夫

32）Duchenne型筋ジストロフィー症ならびに各種神経筋疾患におけるdystrophinの局在および疾患特異性について
熊本大学医学部第一内科

189

荒

木

淑

郎

33）DMDにおけるジストロフィン発現の一考察−モノクローン抗体による解析−
東京大学医学部脳研神経内科

195

清

水

輝

夫

Ⅶ．DMD遺伝子34）Xp21を切断点に持つ転座染色体を有する雑種細胞株作製の試み
東京医科歯科大学難治疾患研究所細胞遺伝部門 斎 藤 深美子

20135）DMD遺伝子の欠失の検索

205

東京都臨床医学総合研究所遺伝情報研究部門

鈴

木

紘

一

鈴

木

義

之

高

守

正

治

36）Duchenne型筋ジストロフィーの遺伝子診断
東京都臨床医学総合研究所臨床遺伝学研究部門

20937）Kennedy‑Alter‑Sung症候群の遺伝子解析の試み

金沢大学医学部神経内科

21338）筋緊張性ジストロフィー症のパルスフィールドゲル電気泳動による解析
九州大学医学部脳研神経内科

後

藤

幾

生

中

村

晴

臣

216

Ⅷ．MDXマウスほか

39）mdxマウスの筋再生能
マーカイン局注による筋壊死と再生
鳥取大学医学部神経病理

22340）mdxマウスの白内障
筋緊張性ジストロフィー症の白内障との異同
東邦大学医学部第四内科

227

栗

原

照

幸

吉

弘

41）mdxマウス長趾伸筋細胞膜のFreeze−Fracture法による微細構造の経時的変化について
昭和大学藤が丘病院神経内科

若

山

231

42）Mdxマウス骨格筋収縮の燐NMR

235

大分医科大学生理学教室
16

山

田

和

廣

43）筋ジストロフィーマウス（MDX）筋の高分子領域での欠損蛋白質について(財)東京都神経科学総合研究所神経生化学 堀

239

眞一郎

44）筋ジストロフィーマウス（MDX）筋のC‑プロテインの動態について(財)東京都神経科学総合研究所神経生化学

堀眞一郎45）mdxマウスのミオトニーに対するCa拮抗剤の効果
東邦大学医学部第四内科

243

247

栗

原

照

幸

46）mdxマウス骨格筋内のCa2+濃度

252

国立精神・神経センター神経研究所

吉

田

瑞

子

47）ジストロフィー筋の細胞内膜系と収縮
聖マリアンナ医科大学第2生理学教室

254

吉

岡

利

忠

48）mdxマウスの筋小胞体（SR）

258

冲中記念成人病研究所

17

高

木

昭

夫

Ⅰ．

臨

床

1）筋緊張性ジストロフィーにおける反復誘発M波の出現様式について

研究協力者

田

追

小

森

哲

夫＊ 高 橋 良 輔＊

宮

本

和

人＊ 長 嶋 淑 子＊

は じめに
筋緊張性ジストロフィー（MD）は，筋疾患としての位置付けのみならず，内分泌系，骨格系の異常，心伝導障害，中枢神経障害等の多様な異常が知られ，それぞれの病態生理について検索がなされている．また，末梢神経障害の存在を重視し，MDの1次的な異常と考えている報告3）も見られる．その中で，末梢神経を頻回刺激して得られる反復誘発M波に異常が見られることも示され，その病態生理について一応の説明がなされている2）が全容は明らかでない．今回，我々はMD及び種々の筋疾患で反復誘発M波を記録し，その変化を検討した．
対象と方法
対象は，18歳から53歳のMD12例，（男7例，女5例）と，疾患対照として肢帯型筋ジストロフ
ィー（LG）4例，多発筋炎3例，眼筋咽頭型ジストロフィーと先天性筋緊張症各1例の9例である．
方法は，尺骨神経を肘関節部で最大上刺激し，
M波は小指外転筋（ADM）と尺側手根屈筋（FCU）
からそれぞれbelly−tendon法にて記録した（図1）．刺激方法は，1Hz，3Hzの低頻度刺激と，10Hz，20Hzの高頻度刺激をそれぞれ約5秒
ずつ，10秒以上の間隔をあけて与えた後，50Hz，3秒間のtetanus刺激及びその直後の3Hz，2
分後の3Hzと1Hzをそれぞれ約5秒間とした．
誘発波の計測は，各連続刺激の最初の刺激に対す＊東京都立神経病院神経内科

等＊

るM波振幅を（C）とし，5発目の刺激に対するM
波振幅を（A），5秒後の刺激に対するM波振幅を（B）として，まず，（A）／（C）と（B）／（C）を計測しそれらが0．9以下になったときを異常と判定した．ただ，50Hzでのtetanus 刺激では
artifactの混入が見られ易いためこの検討からは除外した．加えて，刺激頻度による（C）の変化にも注目し，tetanuS刺激前，直後，2分後の3Hz刺激時の（C）を計測し，変化を検討した．また，対象患者の臨床的事項との対比も行った．
結果
MDでは，まず，刺激頻度と関係してtetanus刺激前のM波振幅の変化がみられた．即ち，1
Hz，3Hzの低頻度刺激では（A）／（C）も（B）／（C）もほぼ1．0で変化せず，10Hz，20Hzの高頻度刺激では，（A）／（C）や（B）／（C）が低下する例が見られた．また，tetanuS刺激直後の3Hz刺激では，最初のM波振幅が低値で，5秒後にかけて次第にM波振幅が増大し，2分後の3Hz刺激では，最初のM波振幅は，tetanuS刺激前の3Hz刺激時の最初のM披振幅とほぼ同等の振幅に回復する変化が見られた．その典型例を図2に示す．これらのうち高頻度刺激での（A）／（C）の変化は，10HzではFCUで4例（33．3％）に見られたのみでADMでは見られず，20Hzでは
ADMでもFCUでも，それぞれ2例（16．7％）で見られた．（B）／（C）の変化は，10HzではADM
で1例（8．3％）に，FCUで7例（58．3％）に見られ，20HzではADMもFCUも6例（50．0％）

−21−

E

図1

測定のシェーマ
尺骨神経を肘関節部で刺激し，AbductorDigitiMinimi（A）とFlexorCarpiUlnarlis（F）
よりbelly−tendon方にM波を導出した．

1．1十十日」＋一皿≠刷皿仙 Pt山」」拙廿a

3

1仙眺刷刷腑帖ト」＋刷刷出仕。。M禦聖書讐皿皿肛」＋‖＋‖
tlmV

図2

MDの反復誘発M波の変化．
40歳男性，MDのADMでの記録である．刺激頻度は，左列上から，1Hz，3Hz，10Hz，1
20Hz，そして，右列上から，50Hzのtetanus刺激，その直後の3Hz（pt3），2分後の3Hz（a3）と1Hz（al）が示してある．10Hz，20HzでのM汲振幅の漸減とpt3でのM波振幅の改善が特徴的である．

一22−

表1MDにおける反復誘発M波の異常頻度（対象例数12例）
刺 激頻 度

10 H z筋名

2 0H z

ADM

（
A ）／（
C）
（
B ）／（
C）

1例（
8．
3％）

FCU

ADM

FC U

4例 （
33．
3 ％）

2．
例（
16 ．
7％）

2例 （
16 ．
7％）

7例 （
58．
3（
沌）

6例 （
50 ．
0％）

6例 （
50 ．
0％）

ADM：小指外転筋，FCU：尺側手根屈筋（A）：5発目の刺激に対するM波振幅（B）：5秒後の刺激に対するM披振幅
（C）：最初の刺激に対するM波振幅に見られた（表）．このように，異常を示す例数は
ADMもFCUもほぼ同数であった．（A）／（C）と（B）／（C）を比較すると，（B）／（C）の方が異常率が高く，（A）／（C）で異常を示した例は全例，（B）／（C）は（A）／（C）より低値となった．次にtetanus刺激前後の（C）の変化を3Hzで見ると，ADMでは5例（41．7％）で，FCUでは7例（58．3％）でtetanus刺激直後の（C）が低下し，2分後にはすでに改善している所見が得られた．
以上のMDにおける反復誘発M波の異常をまとめると，高頻度刺激でのM波振幅の漸減と，teta−nus刺激直後のM波振幅の低下及びその改善で，ADMもFCUも共に対象症例の半数から2／3の症例で見られた．このような変化の見られる例と見られない例の問で，年令，性，臨床症状の軽重，
罷病期間等に明らかな差は認めなかった．
一方，今回疾患対象として検索した各種の筋疾
患のうち異常を認めたのは，1例のLGでFCU
においてのみで，この例では10Hzの（B）／（C），20Hzの（B）／（C）でM波振幅の低下が見られたが，tetanuS刺激後にはfacilitationand
exhaustionが見られた．他の症例では，全く変化が認められなかった．
考察MDでの反復誘発M波の異常の解釈は一般に，
1974年，AdrianandBryantl）がmyotonicGoutの筋で細胞内電極を用いて記録し，一部の筋でactionpotentialの振幅が漸減する現象と，SpOn−taneous action potentialが持続する現象について，tubular systemへのカリウムの集積によりaction potentialのafter−depolarizationが延長するためと説明したことが基礎となっている．また同年，Brown2）は，myOtOniacongenitaの4例と，MD2例の臨床例で，この現象を詳細に検討し，尺骨神経を頻回刺激してもその神経活動電位は変化せず，一方，筋線経を直接刺激するとM渡
振幅の漸減現象が得られることから，筋線経の異常が原因であると述べている．しかし，1975年
Mongiaら3）のように，MDの末梢神経障害を1次的と解釈し，組織学的に認められる神経筋接合部の萎縮を2次的な変化と考え，M披振幅の漸減を
神経筋接合部の異常によるとした説もある．
今回，我々が行った検索結果は，Brown2）が示した変化と同様であり，MDにおける反復誘発M波の所見が再確認された．また，今回は約2／3の症例でのみM波振幅の漸減が記録されたが，Brown2）は連続刺激の間隔をあけて行うとM波
振幅の漸減が起こりやすいと述べていることから，
今回異常所見の見られなかった例でも，その方法を再検することで，異常所見を得る可能性があると考えられた．これまで文献的2）・4）・5）にはこの現象について，MDと先天性筋緊張症で認められる以
外にほとんど検討されていないが，今回，他の筋疾患例も併せて検討し，この現象がMD以外の疾患では見られずかつMDには高頻度に見られ，比較的特異的であることを示した．また，この現象は本邦では松永ら4），栗原ら5）により報告されているが，多数例での検討はなく，さほど注目されていない．しかし，欧米の成書にすでに記載され，−23−

MDの診断に役立つとしたものさえある．そこで，

文

臨床的には，診断的価値についての検討を今後必要とし，一方ではこれらがMDの多様な異常のどことどのように関連するか等につき，同一例での経時的観察や，薬理学的・形態学的検索を行うことがさらに重要であると考えられた．

献1）AdrianRHetal：Ontherepetitivedischargein
myotonicmusclefibres．JPhysio124t）：505−515，
1974．

2）BrownJC：Muscle weakness after restin
myotonic disorders；an electrophysiologicalStudy．J NeuroINeurosurgPsychiat37：1336−

ま

と

め

1342，1974．

1）筋緊張性ジストロフィー（MD）12例と他の筋疾患9例の尺骨神経を刺激し，小指外転筋（ADM）と尺側手根屈筋（FCU）で反復誘発M
波の変化を観察した．
2）MDの9例でADMとFCUのどちらか又は両方で高頻度刺激時にM波振幅が漸減した．また，tetanuS刺激直後のM波振幅が低下し，2分
後にはtetanus刺激前の値に回復する所見が8例で見られた．
3）これらの現象は，他の疾患では観察されず，MDに比較的特異的と考えられた．

3）Mongia

SKetal：Electrophysiologicalabnor一

malitiesincasesofdystrophiamyotonica．Eur
Neurol13：360−376，1975．
4）松永宗雄ら：筋強直性ジストロフィー症の末梢神経機能について−電気生理学的所見の検討一．
【厚生省神経疾患研究委託費・筋ジストロフィー症の疫学，臨床及び治療に関する研究 昭和58年
度研究報告書，1984，pp423−428．
5）栗原照幸ら：先天性筋緊張症のミオトニーに対−24−

するdiphenylhydantoinの効果と筋生検所見．臨床神経16：661−666，1976．

2）Duchenne型及びBecker型進行性筋ジストロフィー症
における下腿の特異胸筋エコー所見
庄 司 進 一＊
研究協力者

朴

木

清

人＊

武

田

伸

一＊

松

下

茂

樹＊

吉

田

邦

広＊

表1

は じめに
我々は，今まで約220例の神経筋疾患患者に筋エコー法を実施し検討を重ねてきたが，今回Du−
Chenne型筋ジストロフィー症（以下DMDと略す）及びBecker型筋ジストロフィー症（以下BMDと略す）に特異的な下腿の筋エコー所見を兄いだした．これが，これら疾患のCarrierにも軽
度ないしその一部分が認められ，Carrier検出に役立てられる可能性があるので報告する．
対象と方法
対象は，DMDlO例（3〜9歳），BMD6例（5−35歳），DMD definite carrier4例（35〜43歳），BMDdefinitecarrier3例，（29〜40歳，内manifestingcarrierl例），DMDpossiblecar−
rier7例（9〜39歳，内manifestingcarrier2例），BMD possiblecarrierl例（28歳），その他の筋ジストロフイL症では，Limbgirdle型9例，FSH型7例，myOtOnicdystrophylO例，福山型3例，その他congenitalmyopathylO例，他の筋原性疾患54例，神経原性疾患95例である（表1）．

方法は，超音波断層装置日立EUB−40を用い，上肢帯・上腕中央・第3腰椎傍脊柱筋・大腿中央・下腿最大径部前後面で，GAIN 30dB，NEAR
GAIN−30dB，FARGAIN3．OdBと一定条件で記録した（表2）．

Numberofcasest）uchenne HD10（3−19）

Becker m）

6（5〜35）t）MD definite carrier4（35〜43）

BItD definite carrier3（29〜40）

DHD possible carrier7（9−39）B【D possible carrier

1（祖）Lilb girdleItD

9（3−53）

FSHItD

7（7〜61）【yotonic冊伽ngenital HD
Congenibl町0匹thy

10（か〜59）

Other LyOgenicdisease54

Neurogenic disease95

MD：1uSCular dystrophy3（4〜12）10（2−13）（）Range of age

結果
図1に代表的筋エコー像を示す．これらはいず
れも下腿後面からアプローチした筋エコー像で，右に模式図を示す．図1−1は正常対象者で，筋肉内エコーの増加は明らかではない．排腹筋，ヒラメ筋，脛骨，膵骨，皮下組織等が明瞭に区別できる．また筋肥大も認めない．
5歳のDMDでは，ヒラメ筋の肥大と筋肉内エコーの減少および俳腹筋の肥大と筋肉内エコーの増加を認めた（図ト2）．また，9歳のDMDでも同様のパターンを認めた（図1−3）．
20歳のBMDの下腿後面の筋エコー像では，著明なヒラメ筋の肥大を認め，膵腹筋の肥大と筋肉
内エコーの増加も伴っていた（図1−4）．
図2は，筋エコー像から下腿最大径部のヒラメ筋の断面積を測定し，患者年齢との関係をプロッ＊信州大学医学部第三内科

トしたものである．正常対象者では，小児期では
ー25−

㌫詣慈恵
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㌢忽最後

図1UltrasonogramofGastrocnemius−SoleusinpatientswithDMDorBMDandtheircarriers
1−1正常対象者（24歳男性）
1−2 5歳DMD
1−3 9歳DMD
1−4 20歳BMD
lr5 41歳DMDdefinitecarrier
lr6 40歳BMDdefinitecarrier

1−712歳DMDmanifestingcarrier
1−838歳BMDmanifestingcarrier」二LLL」

一26−

法

筋US
超 音波 断層 装 置
PRO BE条件

筋CT
日立 E U B −4 0

3．
5M H z C O N V E X

G A INN E A R G A IN
F A R G A IN

CT 装置

7．
5M H z L IN E A R

30d B

50d B

−30d B
3d B−3 0d B条件

2

L E V E L 25
W IN D O W

256

第五 頸椎 中央 部
三角 筋部

3d B

上腕 中央部

三角 筋部
部

上腕 中央 部部位

S IE M E N S S O M A T O M

位

第三 腰椎扱 突 起部
恥 骨 結合 中央 部

傍脊 柱 筋部 （第三 腰椎 ）大腿 前面 中央部

大腿 中央部下 腿 最大 径部 前後面

下 腿 最大 径部︵H R︻ヒ︵H

◇ム
ロ

◇△◇

︶
2
Vn
C
︵

◇

◇

ロ

ロ

◇
【コ

ロ

ロロ

▲川U

nU

28

自任（YEARS）□

図2

CONTROL◇

DrlD A BnD

Anareaofsoleus

年齢と共に増加し，成人になると大きな変化がな
い．DMD及びBMDでは，正常対象者に比べ明らかに増加している傾向が見られた．特にBMDでのヒラメ筋の肥大は，DMDにおける肥大よりさらに目だっていた．下腿におけるヒラメ筋の肥大と筋肉内エコーの減少および俳腹筋の肥大と筋肉
内エコーの増加という所見は，我々が検索した220
例の他の神経筋疾患の症例中では，myOtubular

myopathyl例のみで認めた．
DMDでは，年齢が増加するにつれ下肢近位部から筋肉内エコーの増加が強くなり，下腿におけるこのヒラメ筋の肥大と筋肉内エコーの減少および排腹筋の肥大と筋肉内エコーの増加という特異的パターンがはっきり認められるのは10歳位までで，15歳を過ぎると俳腹筋だけでなくヒラメ筋の筋肉内エコーの増加も強くなり，下腿の特異的

−27−

表3

筋エコー上の，DMD及びBMDにおける初期変化，DMD及びBMDdefinitecarrierの変化，
manifestingcarrier3例の変化
D iso rd e r

DM D

筋 エ コー像

Q uadriceps

T ibialis A nterior

Rectus fem oris V astus interm edius

T riceps sulae
G astrocnem ius

Soleus

N
↑

N

N

↑

↑

筋 肉内エ コー

↑

N

↑

↓

筋束 の厚 み

↑

↑

↑
↑

↑↑
↓

筋束 の厚 み筋 肉内エ コー

N

N

N
N

D M D d efin ite

筋束 の厚 み

N

N

N

↑

↑

C a rrler

筋 肉内エ コー

↑

↑

N

↑

↓

B M D d efin ite

筋束 の厚 み↑↑NC a rrler

N

N

N

↑
↑

↑↑

筋 肉内エ コーD M D m a n ifesting

筋 束の厚 み

↑

↑

↑

↑

C arrle r

筋 肉内エ コー

N

N

N
N

N

↓

B M D m a n ifesting

筋 束の厚 みC arrle r

N
↑

N
↑

N
N

↑

筋 肉内エ コー

↑
N 〜↑

BM D

↑

↓

↑↑：著しい増加 ↑：軽度増加 N：正常 ↓：減少

パターンは不鮮明になっていた．またBMDでも，けではなく，年齢，身長，体重，ヒラメ筋の形態，

年齢が増加するにつれ，次第に大腿部等の筋肉内すなわち肥大しているものではヒラメ筋の断面のエコーの増加がみられるようになり，DMDの変化に似通っていく傾向を認めた．

下腿後面に面する曲線が後方へ突き出す形となっ

DMDdefinitecarrierでは，ヒラメ筋の肥大とよびBMDの下肢の筋エコー上の初期変化，DMD

筋肉内エコーの減少を認めた（図1−5）．またおよびBMDのdefinite carrierの下肢の筋エコBMDdefinitecarrierでもDMDの場合と同様にー上の変化，manifestingcarrier3例の下肢の筋

ヒラメ筋の肥大と筋肉内エコーの減少を認めた

エコー上の変化をまとめて示す．

ていくことを加味して判別した．表3に，DMDお（図1−6）．
考

DMDmanifestingcarrierでは，ヒラメ筋の肥察

大と筋肉内エコーの減少および俳腹筋の肥大を認

筋エコー上，ヒラメ筋の肥大と筋肉内エコ丁のめた（図1−7）．なお2年後の再検査では，大腿減少および俳腹筋の肥大と筋肉内エコーの増加と部で筋肉内エコーの増加を認めた．

いう所見は，DMDおよびBMD以外の筋疾患でBMDmanifestingcarrierの下腿の筋エコー像
では，ヒラメ筋の肥大および肪腹筋の肥大と筋肉はcentronuclearmyopathyl例の下腿のみで同内エコーの増加という所見を認めた（図1−8）．

同じ所見はなく，比較的疾患特異的といえる．ここの症例では，大腿で筋肉内エコーの増加を認めた．

の所見は，DMDでは排腹筋外側頭から障害が始

Possiblecarrierでは，definitecarrier同様にヒラメ筋等に肥大を認めるものと，正常のパター

初期には排腹筋およびヒラメ筋どちらもが肥大していることを意味している．また，川井ら1）の筋Cンを示すものに分かれた．肥大しているかどうか

TによるDMDの筋障害の進展様式についての研については，下腿最大径部のヒラメ筋の断面積だ

究では，俳腹筋の障害が始まる時期は平均8．7歳様の所見を認めたものの，他の筋疾患ではこれとまりヒラメ筋がその後で障害されるということと，−28−

であるが，筋エコーでみると5歳のDMDで著し

ing carrier以外では大腿部の筋肉内エコーの増い俳腹筋の筋肉内エコーの増加を認め，5歳より加を認めなかった．Heckmattら4）が指摘していもっと早期から俳腹筋の障害が始まっていることになる．

るように，筋肉内エコーの増加および低下は撮影条件によって著しく変化する．Rottらおよびまた，ヒラメ筋の筋肉内エコーの低下する原因

Steinbickerらの報告には撮影条件の記載がないであるが，一つには俳腹筋の筋肉内エコーの増加

が，筋肉内エコーの増減の所見は，我々が行ってによるmaskingeffectと，もう一つは，筋肥大自いるように撮影条件を厳密に一定にして検討すべ体による筋肉内エコーの低下が考えられる．一般

きと考える．

に筋肉内エコーが増加する原因として，筋組織内への結合織および脂肪織の浸潤が筋線経の規則正
しい格子状配列を乱すことと，結合織のエコー輝要

約ヒラメ筋の肥大と筋肉内エコーの減少および排度が高いことが要因として考えられている．また，腹筋の肥大と筋肉内エコーの増加という所見は，減少する原因として，超音波を強く反射するもの

DMDおよびBMDに比較的特異的な下腿の筋エが上の層にある場合がある．これ以外に，我々はコー所見である．この特異的所見の軽度ないし一肥大している筋肉でよく筋肉内エコーの減少を認

部分がcarrierに認められ，Carrier検出に役立つ

めた．筋肥大自体が筋肉内エコーの減少を来す原可能性がある．

因としては，一本一本の筋線経が肥大して単位断面積あたりの筋線椎の接合面が減少することが考えられる．

1）川井充，国本雅也ほか：Duchenne型筋ジストロ

Definitecarrierについては，全例でヒラメ筋のフィー症の筋CT所見とこれにもとづく病気分肥大を認め，内1例では血清CK値が正常の例も文

献類．臨床神経25：578，1985．

含まれていた．また，pOSSiblecarrierでヒラメ筋

2）Hans−DieterRott，MagretSantellanietal：Du・の肥大を示すものとそうでないものに分かれたこ

Chennemusculardystrophy；Carrierdetectionとは，筋エコー法がcarrier検出に応用できる可

byultrasoundandcomputerisedtomography．

能性を示唆している．Duchenne型carrier検索に

Lancetii：1199，1983．

おける筋エコー法の有用性の検討は，Rottら2）お3）VolkerSteinbicker，LudwigvonRohdenetal：

よびSteinbickerら3）のものが知られている．1983

Duchenne muscular dystrophy；Carrier detec−

年，Rottらが最初にDuchenne型carrier検出に

tionbyultrasound．Lanceti：1463，1984．

筋エコー法の有用性を提唱し，1984年，Stein−4）JohnZHeckmatt，VictorDubowitz：Detecting

bickerらは，Duchenne型definitecarrier全例の

the Duchenne carrier by ultrasound and大腿部で筋肉内エコーが増加したと報告している．
しかし，我々の検索した症例の内では，manifest＿−29−

COmputedtomography．Lancetii：1364，1983．

3）神経筋疾患におけるtJltrasoundimaging−画像シミュレーションとフィルター最適化
田 代 邦 雄＊

研究協力者

松

浦

森

若

文

亨＊

佐

藤松

治＊

雄＊

島

功

二＊＊

のマトリックスを得る1）．

は じめに
前回までに，神経筋疾患の組織診断に超音波断5）4）で得られたマトリックスをもちいて14層法を適用するための基礎データとして，組織固

階調疑似カラースケーリングにより超音波画像の有音響インピーダンスの定量化と隣接する各組織

シミュレーションを行うとともに，超音波反射損

間での超音波信号反射損失を反射型超音波顕微鏡

失レベルの度数分布ヒストグラムを得る．
6）各病変を最も特異的に抽出可能な反射損失を用いることによって検討しその結果を報告してレベルに対して重みづけを行えるよう，今回は放きた．
今回は神経筋疾患のうち代表的な進行性筋ジス

物線フィルターおよび平方根フィルター処理を行

トロフィー（PMD）と筋萎縮性側索硬化症（ALS）

い，再度シミュレーション画像を作成し検討する．
以上の演算処理はEPSON PC286V

について生検筋組織像から超音波画像のシミュレ
ーションを行うとともに各疾患の組織学的特徴を

i80287より鋭敏に抽出するためのフィルター処理についVer3．1上のN88−BASIC（86）で記述後コンパても検討を加えたので併せて報告する．

イル処理して実行した．

方

＋

＋

40MBHDの動作環境で，MS−DOS

結

法

果

1）組織固有音響インピーダンスの算出は従来

図1にシミュレーションの対象としたPMD

報告してきた方法によった1）．
2）PMDおよびALS患者の生検筋組織標本横断像を1ピクセル25JJX25〟のマトリックスに展開し，各マトリックスに1）で得られた組織固有
音響インピーダンスを対応させる．
3）組織周有音響インピーダンスの度数分布ヒストグラムを得る．

（1a），ALS（1b）の組織像を示す．前者では筋線経の大小不同，発達した脂肪組織および結合組織の混在が特徴的であり，後者においては個々の筋線経は比較的良好に保たれているものの

4）Ⅹ−Y平面において，Y（＋）方向から探査用の超音波を入射すると仮定し，Y軸方向に隣接するピクセル間で生じると期待される超音波反射損失を既に述べた方法によって算出し反射損失−1，2b−1に，また，組織固有音響インピーダ
ンスのヒストグラムを図2a−2，2b−2にそれ＊北海道大学医学部附属病院神経内科＊＊国立療養所札幌南病院神経内科

fibertypegroupingと筋束間の増生した結合組織が日だつ．これらの組織像を組織固有インピー
ダンスに従ってマトリックス展開した像を図2aぞれ示したが，PMDでは，筋線経を反映する中間領域が少なく脂肪組織を反映する低インピーダ
ンス領域と結合組織を示す高インピーダンス領域に分布が偏っている．一方，ALSでは筋線維群の占める割合はPMDに比較して明らかに高く，かー30−図1PMD（1a），ALS（1b）の組織像．前者では筋線経の大小不同，発達した脂肪組織および結合組織の混在が特徴的であり，後者においては個々の筋線経は比較的良好に保たれているもののfibertypegroupingと筋束間の増生した結合組織が日だつ．

一31−

ごふ五本嘉品古フ壷蒜等ヾ㌫∵㌫てこ遠ギ

でで忘；忘芸で㌻孟蓋讐TeT上で了ニー︶帳り了やJ罫︸﹂室当り二日言d

芋讐讐芸還亘社琴警慧岩SJ4．時二巨ぐ墜簑据なり一軍繹ぺ予へ1山ヽ†腫下肢蘭磨塵豪産芯個蒜芯∵ご∵㌫てこふ莞

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．︵Z J・qm︶ Sゴ﹁ 云㌦T票︶ 凸≡d竺区

つ結合組織を反映する高インピーダンス領域にもされる超音波信号の反射損失を算出し，リニアフ分布が多いが，低インピーダンス領域への分布は少ない．

ィルターを介して再構成したBモード超音波画像

これらの固有音響インピーダンス分布を持つ組織に対して，Ⅹ−Y平面のY（＋）方向から超音波を入射した場合に各ピクセル間で生じると期待

図4のシミュレーション画像を14階調で図3a−1，
3b−1に，また，信号のヒストグラムを3a−2，3b−2にそれぞれ示す．ヒストグラム上，
PMDにおいては反射信号の損失の少ない，言葉

高輝度領域と低輝度領域のコントラストを強調し，PMDとALSの組織的特徴をより効率よく分稚するために放物線フィルター処理を行って再構成したシミュレーション画像．pMD（4a），ALS（4b）．

−34−

をかえれば高輝度領域に分布が集中し，再現され顕著であるがfiber type groupingを主体としたたシミュレーション画像ではこれを反映して高輝度信号が広く分布し，臨床上Bモード画像に認め筋束自体の内部はむしろ低輝度をしめし，Bモー
ド上認められるlaminar structure を再現していられるsnow storm patternの特徴をよく近似しる．

ている．これに対しALSにおいては増生した結高輝度領域と低輝度領域のコントラストを強調

合組織と筋線推群の境界領域では高輝度の反射がし，PMDとALSの組織的特徴をより効率よく分

図520dBに軸移動した放物線フィルターを介して再現した画像PMD（5a），
ALS（5b）．

−35−

能するために放物線フィルター処理を行って再構結論成したシミュレーション画像を図4a，4bに示組織固有音響インピーダンス分布をもとにして，したが，この結果PMDにおけるsnow storm

PMDおよびALSにおけるBモード超音波画像

patternはより顕著となり全体的に画面輝度も増をシミュレートした結果，SnOWStOrmpatternや加しているのに対して，ALSでは，筋組織自体のIaminar structureなど臨床上超音波画像で認め輝度は低下し結合組織の増生をしめすlaminar

られる特徴的所見がよく再現された．フィルタリ

structureが増強されている．平方根フィルター処

ング処理を行い疾患特異的な信号帯域を抽出する理を行うことによってこの抽出効率は更に増大すことによって，神経筋疾患の超音波画像診断の信る．

頼性をさらに高めることが可能であると考えられ

一方，放物線フィルターのY軸を平行移動する

る．

ことによって任意の信号強度からの分散の程度を反映する画像を構成することが可能である．この手法を用いると，例えば正常のモザイクパターンが存在する領域を高輝度に抽出し，巨視的には正文献1）田代邦雄，松浦亨，土井静樹，森若文雄，島功二：

常に見える筋束内でfiber typegroupingが生じ

神経筋疾患におけるUltrasoundimaging−超音波顕微鏡による組織固有音響インピーダンス定ていないかどうかなどの情報を得ることも可能で量化の試み−．【厚生省神経疾患研究委託費・筋ジある．例として20dBに軸移動した放物線フィル

ストロフィー症の臨床，病態と成因に関する研ターを介して再現した画像を図5a，5bに示し

究 （杉田蛙）昭和61年度研究報告書，1987，

た．

pplO0−105．

一36−4）筋萎縮，皮疹，問節拘縮変形を伴う
lipodystrophy症に類似する症例（山田ら）の筋病変の検討（2）
豊

研究協力者

至＊

島

小 林 良

二＊＊

山

勉＊＊＊＊桜 井

田

山

田

茂＊＊＊
勇＊＊＊＊

昨年，私達は本班会議で，本症の筋病変がrim一づけることができるかどうか，これまで不明であmedvacuoleを伴うmyopathyであることを報った．今回は，この2着の関係について検討した．

告した．今回は，その筋病変についてさらに検討した．
本症の特徴は多彩で，以下のようにまとめられ
る．1），2）1．常染色体劣性遺伝．
2．PartialLipodystrophy様の皮下脂肪組織の萎縮があり，多くの例では，顔面，上肢，体幹
上部，足指に限局してみられる．
3．皮下脂肪組織の萎縮部にほぼ一致して筋萎縮がみられ，線維化の軽度な筋にrimmed
VaCuOleを多く伴う．
4．関節の拘縮・変形が四肢遠位部につよくみられる．
5．発熱と痺痛を伴う紅斑が出没する（結節性紅斑を呈することが多い）．
6．高免疫グロブリン血症，赤沈克進，CRP高値など慢性炎症反応所見を示す．
7．大脳基底核石灰化，知能低下．
8．肝脾腫．
9．心筋障害．
3と9の骨格筋と心筋病変はおそらく同じ成因によるものと考えられ，また，5，6，8は免疫異常を示す所見と考えられるが，この2着を関連＊秋田大学医学部第一内科＊＊秋田大学医学部第二生化学＊＊＊秋田赤十字病院神経内科＊＊＊＊日本大学医学部病理学

剖検症例堀内ら3）・堀越ら2）の症例は1979年に死亡し，剖
検がなされた．死亡時38歳，女性，家族歴で類症なし．
3ヶ月頃に両手足の指がシモヤケ様にあかく浮腫状になり発症した．1歳半，発熱と疹痛を伴う紅斑出現．12歳頃，手足の指の変形，顔面，上半
身の皮下脂肪組織の萎縮がはじまり，その後筋萎縮も生じた．38歳，肺炎ののちに突然死した．
剖検所見
外観：顔面，上肢，体幹上部の皮下脂肪の減少と筋萎縮，手足の指の変形と拘絹が認められた．
147cm，32kg．

筋：大胸筋，助問筋，腹直筋の3筋のパラフィ
ン包理標本のみ検討可能であった．いずれの筋でも問質の軽度〜中等度の増加があり筋線経は大小不同を示す．問質への細胞浸潤は明らかでなく，血管壁の変化もない．肥大線椎はなく，また，神経原性萎縮を思わせる所見もなかったが，助間筋でvacuole を示すと考えられる萎縮筋線経が認められた（図1a）．
筋生検は，僧帽筋では著変をみないが2），1969年の眉毛内端の皮疹の生検では筋束間をおしひろげるような多数のリンパ球，組織球の浸潤が認められた3）（図1b）．
皮膚：剖検時の腹壁皮膚では，軽度の血管拡張

ー37−図1剖検例の骨格筋所見
a：肋間筋で，萎縮線経に空胞が認められる．b：顔面筋生検で，筋束内に多数のリンパ球，組織球の浸潤が認められる・Masson−trichrome染色bar：100JLm

図2

剖検例の心筋所見
a：右室壁内の巣状線推化．
b二房室結節の膿瘍様の強い細胞浸潤．
bar：100FEm−38−

と細胞浸潤が認められた．生検では，真皮深層，
血管周囲，皮膚付属器周囲にリンパ球，組織球の強い細胞浸潤を認めた2）・3）．
心：380g．慢性心筋炎を示す．散在性のfibrosisに敗血症の所見はなく，皮疹と同様の病変と推測される．

が，石室前壁，中隔右前方に多く認められ（図2a），心内膜も厚く肥厚していた．冠動脈は60〜80％の狭窄を示したが血栓は見られなかった．心外膜炎を伴っていた．

本症の免疫学的検討は，免疫グロブリンの定量とその高値の報告1ト3）のほか，山田らの症例で細房主結節からHis束にかけて，塞栓性膿瘍様の強い細胞浸潤を認め，リンパ球，好中球，好酸球，
マクロファージがみられた（図2b）．
骨：手足関節付近で局所的な骨髄線維化を認めた．

中枢神経：脳重量1080g．線状体，歯状核石灰化．脳実質，血管壁，周囲に石灰球を多数認めた．
視床下部，小脳皮質にも認めた．
肺：重量左右とも300g．陳旧性肺結核．
腎：左185g，右160g．髄質のうっ血．
肝：1440g．うっ血．ときに肝細胞の脂肪変性を認めた．中等度の月旦嚢炎と胆石．
脾：急性牌炎と髄外造血を認めた．460g．
胸腺：大部分脂肪変性し，Hassall小体と実質をわずかに認めた．
まとめ：本症では有痛性紅斑とともに筋肉痛をみることがあること，CK値が急上昇することがあることから，筋に炎症性病変が生じていることが考えられていたが，本例における筋肉内細胞浸潤がこのことを説明していると考えられる．皮疹に伴い，その深部の筋にまで達する細胞浸潤が生じ，筋線経を破壊することが考えられる．しかし，多くの部位では，筋内細胞浸潤は明らかでなく，筋病変のすべてを炎症性変化として理解すること

抗筋自己抗体胞性免疫の検討がなされている6）．今回は，抗筋自己抗体について検討した．
対象：プレドニゾロン使用以前の血清は，山田らの2症例（Ⅰ．，SリⅠ．，T．）1）のみで入手可能であった．
方法：イムノブロット法を用いて抗筋抗体をビ
オテン・アピジン法で検出した．抗原ははじめヒト骨格筋で行ったが，免疫グロブリンが構造蛋白
分画にも多量に存在するため判定困難であったので，ウサギ筋を用いた．ウサギ骨格筋（背筋，胸筋），心筋（左室），平滑筋（胃筋屑）から凍結乾燥切片をつくり，1レーンあたり100JJg乾燥重量
をSDS電気泳動した．また，ウサギ背筋をsub−
fractionationして抗原とした．10倍容の0．32M
蕉糖，10mMTris・HCl，pH7．4を加えホモジナ
イズし，10万g1時間遠心して筋肉楽蛋白質と構造蛋白質を得た．さらに後者から1％TritonX
可溶性分画を得た．血清は100倍希釈とした．
結果：山田らの2症例（ⅠリS．，Ⅰ．，T．）の血清は，ウサギ骨格筋，心筋，平滑筋のそれぞれにおいて，いくつかのbandに対し反応した（図3）．
互いに異なったbandが多くみられ，140kDa，120
kDaは共通しているが，対照例（図示せず）でも陽性になることがあり，意義は少ないものと考えられた．その他にも非特異的反応がみられる中では困雉である．前回は，本症の筋病変でrimmed
VaCuOleの多くにみられることを強調したが4），本
例では標本の制約から確定にはいたらなかった．
山田らの剖検例で示された血管変化5）も明らかでなかった．

特徴的と考えられたbandは，Ⅰ．，S．例で3筋に共通Lた72kDa，I．，T．例で骨格筋の86kDa，78
kDa，心筋の98kDa，96kDaであった．これらはいずれも，筋の主要蛋白質と一致せず，同定ができなかった．
これらbandのうち，骨格筋に対するものの心筋は巣状の線推化がみられ，一見血管性変化のようにも思われたが，血管と無関係と思われるところもあり，骨格筋病変と同様の成因と考えられた．死因である房室結節の膿瘍様変化も，全身

Subfractionationについて検討した（図4）．その結果，I．，S．例の76kDaは筋肉柴蛋白質に，I．，T．
例の86kDa と78kDaは筋構造蛋白質に属することが明らかとなった．TritonX可溶性分画に

ー39−

、．′

三・・ミラ

号； ；言

壬、；こ：：…；

蔓るgS

図3 抗筋自己抗体（1）書方タ嘗

図4 抗筋自己抗体（2）a−C：クマシーブルp染色．d−i：イムノブロッ

a−d：クマシーブルー染色，
e−j：イムノブロット，MHC：ミオシン重鎖，
A二アクチン，a，e，h：ウサギ骨格筋，b，f，

ト，Ck：クレアチンキナーゼ．a，d，g：筋肉渠
蛋白質，b，e，h：筋構造蛋白質，C，f，i：筋構

i：心筋，C，g，j：平滑筋．e−g：症例Ⅰ．，S．，h

造蛋白質からのTritonX可溶性成分．d−f：症−j：症例Ⅰ．，T．．e：マークは上から140kDa，120kDa．72kDa，h：86kDa，78kDa，i：98
kDa，96kDa．d：分子量マーカー．

例Ⅰ．，S．，g−i：症例Ⅰ．，T．，d：マークは72kDa，h二86kDa，78kDa，f，i：200kDa付近

は，高分子量域にあらたなbandの出現がみられた．

の困難も同時に示しているものと考えられる．また，本症でこれまで得られている，NK活性の低下5），血管変化6）のみで筋病変全体を説明することも困難と考えられ，今後の検討が必要と思われる．

まとめ：検討の可能であった2症例で，抗筋自己抗体を検討した．骨格筋，心筋，平滑筋のそれぞれに対し自己抗体が検出されたが，2症例の両者に共通する特異的な抗原がみつからなかったことから，これらの自己抗体は2次的な筋病変修飾因子の可能性を示唆するにとどまると考えられる．

の高分子量成分．

文献1）山田茂，豊島至ら：筋萎縮，皮疹，関節拘縮変形を伴うLipodystrophy症に類似する姉弟例．臨床考

察

神経24二703，1984．

本症は多彩な症状を呈するが，慢性炎症所見と，筋・皮下脂肪組織の限局性の萎縮が特徴的である．
この2着の相互関係について，今回検討を試みた．
免疫異常が本症の所見をどの程度まで説明可能であるかについて，これまでの剖検例の所見の見直しと，自己抗体の面から検討した．両者ともに，筋病変に関して免疫異常あ関与を示唆する所見を示したが，筋病変の全体を免疫異常に帰すること−40−2）堀越弛 岩淵走ら：PartialLipodystrophyに指址の変形，皮膚筋炎様皮疹を認め，広汎な基底核
石灰化と免疫異常，知能指数の低下を伴った症
例．臨床神経20：173，1980．
3）堀内篤，山口道也ら二皮膚紅斑，筋萎縮，牌艦，
γ−グロブリンの上昇，IgAの減少がみられた31歳の女性．臨床免疫3：362，1971．
4）豊島至，小松真史ら：筋萎縮，皮疹，関節拘縮変

形を伴うLipodystrophy症に類似する症例（山田glObulinemia：peCuliar vascular changes andら）の筋病変の検討．｛厚生省筋ジストロフィー症

muscle fiber degeneration，Acta Neuropathol

及び関連疾患の病態とその病因に関する研究（Berl）73：313，1987．

（杉田姓）昭和62年度研究報告書，1988，p．40．

6）佐久間かおり，田中正美ら：著明なNK活性の減

5）OyanagiK，SasakiKetal：Anautopsycaseof

少が認められたりポジストロフィーの姉弟例．神asyndromewithmuscularatrophy，decreased
Subcutaneousfat，Skineruptionandhyperγ−

ー41−

経内科24：415，1986．

5）ゲルマニウム中毒ミオパテーの筋病理学的検討
光 弘＊

納

出

雲

＊

中

川

宮

田

＊

＊

＊

坪

郎 人 介

原

逸 雅 修

口

樋 未 大

研究協力者

は じめに
近年，半導体元素として知られるゲルマニウムの有機化合物の一部に抗腫瘍効果や免疫調節作用のあることが報告され治験も行われている．一方，
最近ゲルマニウムが健康食品として一部の人に長期かつ大量に摂取されており，それによるゲルマ
ニウム中毒が臨床的社会的に大きな問題となっている．
今回我々はゲルマニウム含有食品を24ヶ月間服用し，多臓器不全により死亡した5歳男児症
例1）の筋病理学的検索を行った．また，ゲルマニウ
ムの筋に対する毒性を確認する目的で，実験動物を用いで慢性中毒実験を施行中であり，その途中経過も報告する．
症

例

症例：5歳，男
病歴：家族歴は特記すべきことはなく，既往に1歳4ヶ月発症のインスリン依存性糖尿病があり，その治療目的および健康増進のため，2歳6ヶ月時よりゲルマニウム含有食品を服用し始め，約
35〜70mgを連日24ヶ月間服用した．昭和62年1月に筋力低下，嘔吐が出現し3月には呼吸困難が出現，肺炎も併発し，5月に鹿大小児科に入院し人工呼吸を開始した．種々の治療にもかかわらず
7月には四肢麻痺の状態となり同年12月多臓器不全により死亡した．

＊鹿児島大学医学部第三内科＊＊鹿児島大学医学部小児科

周

二＊

栗

山

正

法＊

福

永

勝＊
秀

敏＊

晃一郎＊＊

現症：身長98cm，体重17kg，体温38℃，血圧120／90mHg，脈拍132／分．皮膚は乾燥し，右肺野でラ音を聴取し，心音は奔馬調律を呈した．腹部は陥凹し，肝を1横指触知した．意識は清明で視力，聴力は良好．四肢筋力の著明な低下があり，四肢末端に表在覚の軽度低下を認めた．四肢腱反射は低下していた．
検査所見：検尿では尿糖は陽性だが血尿，蛋白尿は認めず，末血ではRBC；334×104／mm3，
Hb：9．7g／dl，Ht27．7％，WBC：10500／mm3，
plt43×104／mm3と正球性正色素性貧血を認めた．
血糖は383mg／dlと上昇し，肝機能は，GOT；106
K．U．，GPT；62K．U．，LDH；1694W．U．，ChE；
0．54△pHと異常を示した．BUN；55．6mg／dl，ク
レアチニン；1．8mg／dlと腎不全の所見を呈し，尿酸も10．1mg／dlと上昇していた．血清脂質では中性脂肪が220mg／dlと上昇していた．血清C
Kは223mu／ml（正常55mu／ml以下）と中等皮上昇していた．白血球ライソゾーム酵素は正常であった．髄液では細胞数1／3，蛋白88mg／dl，糖51mg／dlであった．また，ゲルマニウム摂取時の毛髪と思われる毛髪先端部から175ppmのゲ
ルマニウムが検出された．
筋病理学的検索
入院後2ヶ月の時点で大腿直筋より筋生検を施行した．凍結切片の組織化学では，筋線経は大小不同が著明で多くの小径線経が散在ないし小集積
しており，小径線経を中心に著しい空胞変性を呈していた（図1A）．Acidphosphatase染色では−42−

空胞の一部および多くの筋線稚内において活性が克進していた（図1B）．SudanblackB染色にて小径線経の空胞部を中心に多量の脂質が蓄積していた（図1C）．またcytochromecoxidase染色
では小径線経の多くのもので著明な活性低下が認められた．
電顕的には多量の脂質の蓄積とともに，脂質滴の周辺部に電子密度の高い物質が高頻度に認められた（図2）．また，ミトコンドリアの変形腫大があり，一部のミトコンドリア内にも高電子密度の物質が確認された（図3）．さらにlysosomeあるいはglycogenosomeていた．

と思われる構造物も増加し

剖検時の腸腰筋では，生検筋に比べ変性はさらに高度となっており，ほとんどの筋線経は小径化
し，変性していた．
筋内に蓄積していた脂質を分析するため，クロロホルム・メタノールにより稔脂質を抽出し，TLCLFIDアナライザーにて各脂質成分を測定したところ，本症例では中性脂肪が著明に増加していた．
実験的ゲルマニウムミオパテtの作成
オスのウィスターラット（体重350g〜400g）4
匹に二酸化ゲルマニウムを約100〜150mg／kg，連日4ヶ月間投与した．EDLおよびSoleusを取り出し，組織化学的および電顕的観察を行った．
組織化学的には，EDLにおいてGomori tri＿
Chrome染色にて赤染する空胞がかなりの筋線経に出現し，Soleusにおいては，0Ⅹidativeenzymeの分布異常がみられ，CytOChromecoxidase染色では多くの筋線椎において著明な活性の低下が認められた．大量の脂質の蓄積は未だ認められなかった（図4）．
電顕では，autOphagicvacuoleの形成，ミトコ
ンドリアの変形，腫大およびミトコンドリア内の図1 生検筋の組織化学（×500）
A：Gomoritrichrome染色
B：acidphosphatase染色
C：sudanblack B染色

高電子密度物質の蓄積が認められた（図5）．

ー43−図2 生検筋の電顕像（×20000）
高電子密度物質を伴う脂質滴の蓄積

図3 生検筋の電顕像（×16000）
ミトコンドリア異常と高電子密度物質の蓄積−44−

図4 ラット骨格筋の組織化学
A：EDL，Gomoritrichrome染色（×400）
B：Soleus，CytOChromecoxidase染色（×250）

一45−

図5 ラット骨格筋の電顕像（×26000）
ミトコンドリア異常と高電子密度物質の蓄積
考察

今回検索した症例は，病歴，臨床症状，組織所
見およびゲルマニウムの蓄積などから，ゲルマニ
ウム中毒と考えられる．ゲルマニウム中毒は米山ら2）の報告以来本邦において十数例が報告されている．臓器障害の中では腎障害，貧血の頻度が高く全ての報告例で認められる．また，筋力低下や末梢神経障害も30〜40％の症例で報告されているが，ミオバナーに関する詳細な病理学的検索は未だ不充分である．太田ら3）は筋生検にて脂肪顆
粒およびグリコーゲン顆粒の蓄積およびミトコン
ドリアの形態異常を認めたゲルマニウム中毒の一例を報告しているが，原疾患の慢性アルコール中
毒の影響を無視できないとしている．他には筋線経の萎縮あるいは壊死を認めたとする報告が散見される2），4）・5）
本症例はacid phosphataseの活性上昇と著明な脂質蓄積を伴うvacuolarmyopathyの像を呈しており，従来のミオバナーではあまり例のない所見である．また，電顕で認められたミトコンド
リアの形態異常やミトコンドリア内の高電子密度物質の沈着は，ゲルマニウム中毒例の腎臓においても報告されており6），ゲルマニウム中毒に特徴的な所見である可能性が高いものと思われる．
また，ラットを用いて行ったゲルマニウム中毒
ミオパテー作成実験では，多量の脂質の蓄積は未だ認められか−ものの，autOphagicvacuoleの形
成やミトコンドリアの形態異常および高電子密度物質の蓄積，さらにcytochromecoxidaseの活性低下等，臨床例と類似した所見が認められ，ゲ
ルマニウムの骨格筋に対する毒性が明らかになったものと思われる．
臨床例および実験動物の筋病理所見より，ゲルマニウム中毒によるミオパテーの発生機序として，
ミトコンドリア異常および脂質代謝異常が関与している可能性があり，現在，生化学的に詳細に検討中である．

ー46−

文

献

素性貧血，筋力低下および末梢神経障害．内科

1）大坪修介，中村真，野村裕一，井上博之，富田晃
一郎：ゲルマニウム中毒による多臓器不全の1
例．日小児会誌92：1994−1999，1988．

58：1210−1214，1986．

5）NagataN，YoneyamaT，YanagidaK，UshioK，
Yanagihara S，Matsubara O and Eishi Y：2）米山孝，柳田孝彦，永田直−：全身に高濃度のゲ

Accumulationofgemaniuminthetissuesofa

ルマニウム沈着を認めた急性腎不全の一症例．日

longtermuserofgermaniumpreparationdied

腎会誌24：1355−1356，1982．

Of acute renal failure．J Toxicological Sci−

3）太田聡，佐藤猛，櫓林博太郎，林野久妃，大野丞
二：アルコールとゲルマニウム長期服用後1ipid
StOrage myOpathyの像を呈した急性ミオグロビ
ン尿症の1例．臨神経25：845，1985．
4）剛順口人，小阪昌明，先川知足，日浅光春，佐藤浩充，森住啓，森田秀芳，下村滋：ゲルマニウム
含有飲料水の服用者にみられた腎機能低下，正色

ー47−

encelO：333−341，1985．

6）小原克也，秋保直樹，佐藤博，斉藤喬雄，三浦幸雄，吉永馨，柿澤美保，多田啓也，塚本哲朗，本郷道夫：ゲルマニウム長期連用により多彩な症状と腎不全を呈した2症例．日内会誌77：1704−
1709，1988．

ⅠⅠ．

生

化

学

6）運動筋のプリン体異化克進−種々のミオパチ一における分析
垂

＊

子 郎 通

＊
＊

尚 孝 隆

♯

水 村

＊

原 清 西

＊
＊

＊大阪大学医学部第二内科

夫 朗 昭 郎リウム血症6例，低カルシウム血症8例，高カルシウム血症6例）を対象とした．このうち，グリコーゲン病，低カルシウム血症患者については，
これまでの報告に症例を追加している．
部分的阻血下前腕運動試験6）・7）：対象患者仝例に部分的阻血下前腕運動試験を施行した．本試験

史

図1，2に示すように，種々の筋疾患（グリコーゲン病ⅠⅠ型2例，ⅠⅠⅠ型2例，Ⅴ型4例，ⅥⅠ型4例，Kugelberg−Welander症候群2例，Kearns−
Sayre症候群4例，多発性筋炎1例，薬剤性筋症1例）や，ミオパテーを起こし得る病態であるホル
モン，電解質異常（甲状腺機能低下症4例，低カ

裕

＊

対象と方法

典

＊

基本病態はM筋エネルギー産生不全に起因する筋
プリン体の分解冗進 と考えられる．そこで今回，さらに広い範囲の筋疾患群や電解質，ホルモン異常に伴うミオバナーにおけるプリン体異化代謝を検討し，このような病態がどの程度の広がりをもって存在するかを分析した．

野 川 野 藤

＊

川

は じめに
私共は，筋グリコーゲン病あるいは副甲状腺機能低下症に伴うミオバナーにおいて，運動によって血中のプリン代謝物質やアンモニア濃度が増加することを報告してきたlト5）．これらに共通した

清一郎＊
河 清 大 依＊島也 典 道 郎知祐 雅 正 嘉田

山 川 桑 西研究協力者

井は，中間血圧で上腕を圧迫し2分間に計120回の掌握運動を行う．その後2分間完全阻血にした後，．肘静脈より経時的に採血し血中の乳酸，アンモニア，ヒポキサンチンを測定した．運動後の倍から前値をひいたものを△乳酸（△アンモニア，△ヒ
ポキサンチン）として表し，そのうち最大のもの
を，運動後の最大乳酸増加量（最大アンモニア増加量）とした．
自転車エルゴメーター運動試験：Kearns−
Sayre症候群3例に対しては自転車エルゴメータ
ーを用いた好気的な全身運動試験も施行した．本症候群では運動能力に限界があるため，能力に応じて15W，10−15分程度の非常に軽い運動を行った．運動前後の血柴アン、モニ7，イノシン，ヒポキサンチン，尿酸濃度，尿中尿酸濃度を測定した．
乳酸，アンモニア，尿酸は酵素法で，イノシン，
ヒポサンテンはHPLC法で測定した2）．
結果1）部分的阻血下前腕運動試験
図1，2に部分的阻血下前腕運動試験における最大乳酸増加量と最大アンモニア増加量を示す．
グリコーゲン病ⅠⅠⅠ，Ⅴ，ⅥⅠ型ではグリコーゲン分

解系あるいは解糖系障害のため，全例運動によっても乳酸はほとんど増加しなかった．逆にアンモニアは著明な過剰反応を呈しており，これは既に報告したようにプリン体の異化冗進を表してい−51−

Gl匹0genOSisぎll

GIYCO酢nO封SV

G毎co㌍nOSisⅧGIYCOgenO封Sll

鱒癖蝕相澤触細妙
Sy川ナ○†鴨K88rr嶋−Saye
Syrlかolnや

恥妙軸感晦
阿藤頑録画
Myopathy50△

Lactate（mmol／C）

180△Ammoniaレ

158

mO招）

図1部分的阻血下前腕運動試験における血中最大乳酸増加量と最大アンモニア増加量（Ⅰ）
圏正常値（平均±SD，。＝19）

鞠画桝卵油師
Hvpcレニ】le、・六HypocaIcemia

噂函極細鱒軸
8

△

6

4

2

8

0

Lactate（mmolノ里

50

100

150

△AmmoniaかmoけI）

図2 部分的阻血下前腕運動試験における血中最大乳酸増加量と最大アンモニア増加量（ⅠⅠ）
団正常値（平均±SD，n＝19）

る2）．このようなアンモニアの過剰増加反応は，甲れた．一方，ミオバナーを呈しても解糖系に異常状腺機能低下症1例，低カリウム血症3例，低カを認めないグリコーゲン病ⅠⅠ型（リソゾームのαルシウム血症3例，薬剤性ミオパテー1例においグルコングーゼ欠損症）やKugelberg−Welanderても，グリコーゲン病ほど著明ではないが認めら症候群，KearnsrSayre症候群，多発性筋炎では，−52−

運動による乳酸増加量，アンモニア増加量はともにほぼ正常領域であり，従ってプリン体異化冗進はないと判断された．高カルシウム血症でも仝例正常であった．
一般に乳酸の増加量，アンモニアの増加量はともに運動量や強度と密接に関連すると考えられている5）．本研究においても正常対照では，部分的阻
血下前腕運動試験における乳酸とアンモニアの増加量の間には強い正相関が認められた（図3）．このことから，乳酸産生とアンモニア産生は運動量に応じて平行して進むことが明らかとなった．そこで，部分的阻血下前腕運動試験の結果を，運動による乳酸とアンモニアの増加量の関連という点

ニア，ヒポキサンチンの経時的変化を図4に示す．
これらの症例では運動後アンモニアが過剰反応するだけでなく，血渠ヒポキサンチン濃度も著明な過大反応を示した．
2）自転車エルゴメーター運動試験
KearnS−Sayre症候群患者にエルゴメーター運動試験を施行した時の血菜アンモニア濃度の変動について図5に示す．非常に軽い運動であるに＿もかかわらず，3例のうち1例にアンモニアの過剰反応を認めた．一万，本症例は部分的阻血下前腕運動試験では乳酸増加と比較してもアンモニア反
応は正常範囲であった．本症例ではエルゴメータ

からみたのが図3である．グリコーゲン病ⅠⅠⅠ，Ⅴ，
ⅥⅠ型では，乳酸産生がほとんどなく，アンモニアー運動によって血菜イノシン，ヒポキサンチンにも著明な増加反応を認め，好気的運動時にはプリン体の異化が冗進していると考えられた．血中尿が過剰産生されるので，対照群より左上方にプロットされる．対象症例のうち甲状腺機能低下症1
例，低カリウム血症2例，低カルシウム血症4例において，正常対照の95％信頼限界より上方にプロットされた．すなわち運動後の乳酸の増分に比較してアンモニアの増分が多いことが明らかとなった．代表的な例について，前腕運動時のアンモ酸値も運動前5．4mg／dlから運動終了後には6．4
mg／dlまで上昇した．この間，尿中尿酸排泄量（ク
レアチニン比）は運動前0．39mg／mgクレアチニ
ンに対し運動終了後0．46とむしろ増加しており，血中尿酸の上昇は腎での排泄低下に基づく変化ではなく，筋でのプリン体異化冗進に基づく尿酸合成の冗進によるものと考えられた．

EZZか5％con¶dencelimib
ofcontroIs（∩＝1！）

r三日6，P＜Ml●Hypocalcemia▲Hy匹kalemia■Hypothyroidism
OGlycogenosis
ln．V andⅦ

図3 部分的阻血下前腕運動試験における乳酸とアンモニアの最大増加量の関連−53−

︵ミロES噂で0∈∈く可Time（min）

図4 部分的阻血下前腕運動試験における血中アンモニア，ヒポキサンチン濃度の経時的変化
園正常値（平均±SD，。＝25）● ▲低カリウム血症○ △低カルシウム血症

考察た（図3）．これらの疾患ではヒポキサンチンも過本研究では，種々の先天性，後天性ミオバナー

剰反応を呈しており（図4），プリン体異化は確か

や，ホルモン，電解質異常の運動筋におけるプリに克進していることが明らかとなった．

ン体異化代謝をまず部分的阻血下前腕運動試験におけるアンモニア反応を指標として検討した．血中アンモニアの増加は筋内AMPがAMP
deaminaseによってIMPに異化される時に産生されたものを反映していると考えられる．筋グリコーゲン病において運動時にアンモニアの過反応が認められることをすでに報告してきた1ト3）ように，アンモニアの増加反応はプリン体異化の良い指標である．さらに，アンモニアの増加が運動量や強度の影響を強く受けることを考慮して，本研究では運動による乳酸増分（正常状態では運動量を反映する）で補正して分析した．この結果，甲状腺機能低下症，低カリウム血症，低カルシウム血症の一部に，血祭アンモニアの過剰反応を認め

一般に筋のATPが産生を上まわって消費されると，2ADP→ATP＋AMP（adenylatekinase）の反応が促進され，増加したAMPが基質となってdeaminationが冗進する．すなわち筋グリコー
ゲン病に代表されるように，ATP産生不全はプリン体異化克進を引き起こす．従って今回プリン体異化が明らかとなった疾患群においても，運動
時のエネルギー産生機構に何らかの異常が存在することが示唆される．甲状腺機能低下症では骨格筋のホスホリラ一・ゼの異常8）あるいは低カルシウ
ム血症では，ホスホリラーゼキナーゼの異常9）が報告されており，そのためのグリコーゲン分解系の異常がエネルギー供給を障害している可能性が考えられる．

−54−

進の存在する例が認められた．運動筋の70リン体
異化冗進は筋ATP産生不全に起因することを考慮すると，これらの疾患においても，運動時のエ
ネルギー代謝機構に異常のあることが示唆された．

Exercise

hM

臨御

献

1）垂井清一郎：グリコーゲン病の臨床．筋，肝，血球をめぐって．日本内科学会雑誌76：1347，50︵三〇∈3爪学岩∈∈＜

文

1987．・

2）MineoI，KonoNetal：Excesspurinedegrada−tioninexercISlngmuSClesofglycogenstorage
diseasetypesVandⅥLJClinInvest76：556，
1985．

3）MineoI，Kono N et al：Myogenic hyper−
uricemia；aCOmmOnpathophysiologiC feature
befαe O lO
Time（min）

ofglycogenosistypeslII，V andvu．NEnglJ
Med317：75，1987．

204）Hara N，MineoI et al：Enl1anCed release of
図5

Kearns−Sayre症候群におけるエルゴメーター

ammonia and hypoxanthine from exercising

運動時の血中アンモニア濃度の変化

musclesinpatientswithidiopathichypopara−

匡ヨ正常値（平均±SD，n＝4）

thyroidism．MuscleNervelO：599，1987．
5）垂井清一郎：副甲状腺機能低下性ミオバナーにおける運動筋のプリン体異化克進．【厚生省精神・一方，Kearns−Sayre症候群では，部分的阻血下神経疾患研究委託費・筋ジストロフィー症及び関前腕運動試験においては正常であったが，全身性連疾患の病態とその病因に関する研究 （杉田班）のエルゴメーター運動を行った場合，1例で著明なプリン体異化冗進を認めた．この結果は，本症候群が解糖系に異常がなく、ミトコンドリア内の昭和62年度研究報告書，1988，158．
6）MineoI，KonoNetal：Acomparativestudyon

好気的代謝に異常があることと関連していると考

glucagoneffectbetweenMcArdlediseaseand
Taruidisease．MuscleNerve7：552，1984．

えられる．正常反応であった症例については，運7）Kono N，MineoIetal：Metabolicbasisofim−

動量が少なかった可能性がある．本来本症候群でproved exercise tolerance；muSCle phosphor−は乳酸の処理能力に限界があるため，運動量の基

ylasedeficiencyafterglucagonadministration．

準として乳酸以外の指標についても今後検討していきたい．

8）豊倉康夫：いわゆるhypothyroidmyopathyのNeurology34：1471，1984．
臨床と筋組織像．【厚生省神経疾患研究委託費・筋

ま と め

ジストロフィー症の発症機序に関する臨床的研

種々の先天性，後天性ミオバナーの運動筋にお究 （三好姓）昭和56年度研究報告書，1982，123．

けるプリン体異化代謝を検討した結果，Kearns−
Sayre症候群，甲状腺機能低下症，低カリウム血9）CapeCA：Phosphorylaseadeficiencyinpseudo・症，低カルシウム血症例の中にもプリン体異化冗−55−

hypoparathyroidism．Neurology19：167，1969．

7）培養ラット筋管細胞におけるリソゾーム関与の蛋白分解
木 南 英 紀＊
研究協力者

武

野

大

策＊

上

野

隆＊

岡本

洋＊

は じめに

間培養した後，細胞を採取した．細胞を1mlのDuchenne型筋ジストロフィー症の研究は最近急速に進み，CDNAのシークエンス1）や原因蛋白の局在も明らかになってきた2）．しかし筋細胞膜

0．25M庶液中でDounceのホモゲナイザーを用いの異常からはじまり，最終的に筋崩壊に至るプロ
セスは全くわかっていない．この筋の崩壊・壊死に関連してジストロフィー症ではマクロフア￣ジの侵入前に筋細胞内のリソゾーム系が活性化していることを以前指摘した3）．ところが，正常および合わせ，10，000×g，20分間遠心する．沈澱（ミ障害を受けた筋細胞におけるオート77ゴゾー
ム・リソゾーム系の動態や機序に関する研究は極た．カテプシンLとBはBarrettらの方法4），グリコシダーゼはGlaserらの方法5），ミトコンドリア

めて少なく，筋原線椎がリソゾームで壊されているという直接的証拠もない．
今回ラット骨格筋由来の培養細胞を用いてオー
トファジーの機序と制御機構について検討した．
対象と方法
本研究には国立精神・神経センター・神経研究て懸濁化し，650×g，2分間遠心後，その上清を集める．同じ操作を4回くり返し，遠心上清をトコンドリアーリソゾーム分画）を1mlの0．25
M庶糖液に懸濁し，庶糖を含む28％パコール液8mlの上に重層して28，000回転，40分間遠心する．
底から0．6mlずつ分画し，各種酵素活性を測定しのマーカー・SuccinicINT reductaseはMorreの方法6），蛋白量はLowryらの方法7）によった．ウェスタンブロッテイングは12．5％（カテプシン
L，シスタテンーβ）および7．5％（ミオシン）のSDS−PAGEを行った後，ニトロセルロース膜に転写し，特異抗体と反応させ，ベルオキシター
ゼ標識一次抗体を用いて検出した．抗ミオシン抗所の小沢銭二郎先生より御供与頂いたラット筋芽捌包（L8E63）を用いた．筋芽細胞をはじめ100mm径のシャーレに1．5×106／dishの細胞を播種し，これを10％の牛胎児血清と3％馬血清を含む
DME液で増植させ，Confluentに達した後4％
馬血清を含むDME液に変え，分化誘導させた．培体には抗ウサギ肝細胞ミオシン抗体8）を使用した．

養液は2日毎に交換した．分化後3日日頃より
CKの活性は急速に増加するが，この頃筋管細胞がうにカテプシンBは分化と共にその活性が上昇し，現れる．自己会食の実験は分化液に変え12日目の細胞を用いた．血清を0−10％まで変えたDMEの氷解活性はカテプシンLのみならずカテプシン

液にESTを40JLg／mlになるように加え，18時

結果

1．カテプシンB，H，Lおよびその他のリソゾーム酵素の筋細胞分化の過程における変化
筋芽細胞を分化させていると図1−Aに示すよ
7日目以後には約3倍となる．Z−Phe−Arg−MCA
Bにもよるが，この細胞ではカテプシンLの量がむしろカテプシンBを上回っていることが免疫化学的方法で明らかになっているので，この基質の＊順天堂大学医学部生化学第一講座

水解活性は大部分カテプシンL活性を意味すると

−56−

■
5
4
3
2

ンーβが主なものであり，その量は分化のプロセスでほとんど変化がない（図2）．
2．オートファジーの機構と調節
骨格筋細胞は肝細胞などと比べ，リソゾームの数は少なく，蛋白質の代謝回転速度も遅い．そのたA

1︵u彗Oa切E︑⊃∈ eJU叫毘〇三qO

る．L8E63細胞に存在するシスタナンはシスタテ

翳＝豊富琵

0

u芯10Ld切E︑コ∈

0

脚 −29KDay8lnCulture

銅鉾 二一・コト

図1L8E6。細胞の分化過程におけるリソゾーム酵素
活性の変化．（A）プロテアーゼ活性，（B）非プ
ロテアーゼ活性．4シャーレの平均値±標準偏差考えてよい．カテプシンLの分化の過程における増加率はカテプシンBよりも低いが，これはカテプシンLが分化の初期段階から相当量存在することによる．この点はカテプシンL抗体を用いたウ
エスタンブロッテイングの結果から確認できる（図2）．細胞中のカテ70シンHの含量は低いが，分化のプロセスではカテプシンLと似た動態を示−12Kした．一方，非プロテアーゼ系のリソゾーム酵素
活性の変動を示したのが図1−Bであり，プロテアーゼ群と同様分化と共にそれらの活性は著明に1

図2増加した．しかし，分化につれて全く変化しないものもある．シスタテンは内在性の低分子量のシステインプロテアーゼインヒビターで，標的プロ
テアーゼは上述のカテプシンB，H，Lなどであ
−57−

0

2

4

7

10

Days

分化過程におけるカテプシンB，Lおよびシス
タナンーβの量の変化．12．5％のSDS−PAGE
後 ウェスタンブロッティングを行った．同量の蛋白量を用いている．（A）カテプシンB，（B）
カテプシンL，（C）シスタナンーβ

め正常細胞におけるオートファジー（自己貪食）の研究は極めて少ない．我々はリソゾームに取り込まれた細胞内の内在性蛋白質の量あるいは活性を測定し，直接自己貪食胞−リソゾーム系の働きと制御について調べることにした．図3はEST処理細胞と非処理細胞から調整したミトコンドリ
ア・リソゾーム画分をパコール密度勾配遠心で分画し，各種酵素活性の分布を調べたものである．
ミトランドリアのマーカーの分布パターンはES

T処理・非処理細胞の間で差はない（図3−B）が，リソゾームのマーカー・β−グルクロニダーゼはEST処理によって軽い画分の酵素活性のかなりの部分が重い画分にシフトしているのがわかる．
（図3−A）．その重い画分に細胞質の酵素LDH活性が検出できるが，活性はEST処理細胞の方が圧倒的に高い（図3−B）．この結果はリソゾーを調べるため，TritonX−100処理前後で，LDHとピルビン酸キナーゼの活性がどう変化するのかを調べたのが表1，である．Triton処理によって3−4倍の活性上昇がみられ，これらの酵素は会食胞内に封じ込められていることがわかる．
次に，LDHの自己会食月包への取り込みを指標に自己会食の血清およびインシュリンによる調節を調べた．図4に示すように血清濃度を下げると自己会食胞中のLDH活性は増加し，血清濃度を上げると共に減少し，10％ではほとんどオートフ
ァジーは抑制される．この濃度ではEST処理によっても会食胞のLpHはほとんど検出できない．

uO；コqてl∽岩ボ

0
20

uO；⊃qてlの岩

図3

ム酵素陽性で，内在性蛋白質を取り込んだオート
リソゾームがEST処理によって重い画分に蓄積していることを意味する．LDHなどの細胞質の酵素が本当に膜内に封じ込められているかどうか

EST処理および非処理細胞より調整したミトコンドリア・リソゾーム分画のパコール密度勾配遠心における酵素活性の分布．4％の馬血清を含むDME液にEST（40JLg／ml）を添加し，18時間培養後・細胞よりミトコンドリアーリソゾーム分画を調製した．その懸濁液をパコールの上に乗せ，遠心し，底より0・6mlずつ採取した．無処理（一〇一，−ロー），EST処理（一一一●−‥，‥−｝‥う

−58−

表1

自己会食胞のLDHおよびPK（ピルビン酸キナーゼ）活性に及ぼすTritonX−100の影響

Enzymes

TritonAutolysosomes

U／m1
LDII

Cytosol％Increase U／m1

％Increase

（−）

0．190

（100）

2．31

（100）

（＋）

0．431

（227）

2．．30

（100）

（−）

0．025

（100）

0．605

（100）

（＋）

0．110

（440）

0．602

（99）

1

2

3

4

−MHC

攣轡轡‥磯覿癖紛

0

5

10Serumin Culture Medium（％）
図4

自己会食胞へのLDHの取り込みに及ぼす血清の効果．牛胎児血清を図のように変え，EST添加（〇一〇）あるいは無添加（一一一●一日）で18時間培養した．以後の操作は図3と同様で，底の画図5分のLDHの総和を細胞質のLDHとの比率で表現してある．

ミオシンの自己会食胞への取り込み．レーン
1：標準ミオシン，レーン2：非処理細胞から調製した自己会食胞中のミオシン，レーン3：
EST処理細胞の自己貪食胞中のミオシン，
レーン4：細胞抽出液中のミオシン

無血清によって誘起されたオートファジーはインシュリンによっても濃度依存的に抑制される（図ームヘ取り込まれることは証明できたが，筋構成なし）・0・015IU／mlでほぼ完全な阻害がみられた．

蛋白はどうか．今回は単純にL8E63細胞中のミオ

3・ミオシンの自己会食胞への取り込み

シンが自己合食胞へ取り込まれるかどうかをウェ

細胞質の酵素LDHとPKが筋細胞でも・）ソゾ

スタンプロット法で調べた．図5に示すように培−59−

今回の結果を踏まえ，障害細胞についても調べて

養12日目の細胞のミオシン重鎖は約20万の1本のバンドを示す（レーン4）．自己会食胞にもミオ

いきたい．

シン重鎖に一致するバンドとそれに加えて限定分
文解を受けたと思われる2本のバンドがみられる

献（レーン3）．自己会食胞中のミオシンのバンドは

1）KoenigM，HoffmanEP，BertelsonCJ，Monaco

EST処理細胞の方が非処理細胞より圧倒的に強AP，FeenerCandKunkelLM：Completeclon−い（レーン2，3）点はLDHの取り込み量の差（図ing ofthe Duchenne muscular dystrophy4）と同じであった．

（DMD）cDNAandpreliminarygenomicorga−
nization of the DMD genein normal and考

affectedindividuals．Cel150：509r517，1987・

察

オートファジーの機構と調節の研究は肝濯流や

2）ArahataK，IshiuraS，IshiguroT，Tsukahara

肝培養細胞を用いた実験結果から得られたもの

T，SuharaY，IshiharaT，NonakaLOzawaEで9）・10），そのプロセスは①細胞内蛋白質の細胞質

andSugitaH‥Immunostainingofskeletalandからの隔離，②隔離膜の閉鎖による自己会食胞のcardiac muscle surfacemembrane with anti−

形成，③自己会食胞とリソゾームとの融合，④リ
ソゾーム内蛋白分解と生じたアミノ酸の遊離から

body against Duchenne muscular dystrophy
peptide・Nature330：861−863・1988・

なる．自己合食胞の寿命は約10分で，そのため定3）KominamiE，IiKandKatunumaN：Activation

常状態では細胞質中の会食胞の数は革めて少ない．

。f theintramyofibral autophagiclysosomal

本実験ではESTにより旬の過程を阻害したため

systeminmusculardystrophy・AmerJPathol

自己貪食胞の寿命が著しく延び，会食胞が蓄積し，取り込まれたLDH，ミオシンなどを検出できた

127：21−26，1987．
4）Barrett

AJ

andKirschke

H‥Cathepsin

B・

Cathepsin H and CathepsinL Methods En−

わけである．L9E63細胞では肝細胞と同様血清濃度

zymo180：553−561，1981・の低い低栄養状態では生命に必須な蛋白質を合成

5）GlaserJHandSlyWS：β−Glucuronidasedefi・するのに必要なアミノ酸やエネルギーを供給する
ため蛋白異化が冗進すると考えられる．筋細胞のciency mucopolysaccharidosis；Methods for

分化は血清濃度を4％から2％に落としてもイン

enzymaticdiagnosis．JLabClinMed

シュリンを加えれば進行する理由の一つにこのイ

82：969−977，1973．

ンシュリンの蛋白分解抑制効果があるかもしれな

6）Merro DT：Isolation of Golgi

apparatus・

MethodsEnzymo122：130−148，1971・

い．オートリソゾーム中にミオシン重鎖のnative型が検出できる（図5）のはこの細胞のミオシン

7）Lowry DH：RosebroughNJ，Farr AL andも低栄養条件ではリソゾームヘそのまま取り込ま

RandallRJ：Proteinmeasurementwithfolin

れ分解されることを示唆する．しかし細胞内では

phenolreagent．J

BioIChem193：265▼275・

1951．

ミオシンはアクトミオシンとして筋線維構造に組み込まれており，どのような形で取り込まれるか

8）UenoT，YasuuraS，WatanabeS，HiroseM・は今回明らかにできなかった．オートファジーの克進は飢餓状態ばかりでなく，筋蛋白の崩壊のみ

Sekine T and Namihisa T：Immunocyto・られるDMDやmdxマウスでも観察できる．こcell．JHistoCytochem36：803−806，1988・の反応は元来異常蛋白の除去のための修復機転とchemicallocalizationofmyosininrabbitliver

9）MortimoreGE＝Mechanismandregulationof

して位置づけられるが，過剰反応になることもあinducedandbasalproteindegradationinliver・

ろう．正常細胞と同様障害細胞におけるオートフ

Lysosomesandthierroleinproteinbreakdown

ァジーの誘起の機序の詳細は全くわかっていない．

（eds by Glaumann H and Ballard FJ）

ー60−

London，Academicpress，1987，pp415−443．

enzymesin an autophagic vacuole−lysosomal10）KominamiE，Hashida S，Khairallah EA and

SySteminducedbyinjectionofleupeptin．JBioI

Katunuma

N＝SequestrationofcytoplasmiCー61−

Chem258：6093−6100，1983．

8）ラット骨格筋におけるCa依存性プロテアーゼ
およびそのインヒビターの局在および動態について
荒 木 淑 郎＊
研究協力者

熊

本

俊

秀＊

Ca依存性proteasesは筋組織をはじめあらゆる生体細胞の構造タンパク質の代謝回転に重要な役割を演じ，特に筋ジストロフィー症（以下，筋ジスと略す）の筋崩壊に深く関与していることが示唆されている1）．しかしながら，その九日戒叩レ
ベルにおける生理学的・病理学的役割は勿論，細胞内分布すら十分には検討されていない．
今回，我々はCDPsおよびそのinl1ibitorの正常ラット骨格筋における細胞内分布，さらに絶食および脱神経筋における動態をimmun0−gOldを用いた定量的電顕法により検討したので報告する．
なお，Ca依存性proteaseは，これまで個々の研究者によ りCANP2），Calpain3）あるいはCa−
dependent protease（CDP）と呼ばれてきたが，ここでは，共同研究者の一人であるGollの命名に従って，CDPおよびそのinhibitorをCDPI4）と記載する．
方LZ・Stern＊＊＊

7日間再絶食させた．絶食後7日目，再摂食後7日目，さらに再絶食後2および7日目に検索した．
これらのラットはsodium barbiturate160mg／kgで麻酔後，左心室より1％glutaraldehyde，4％paraformaldehydein O．1−M phosphatebuffer（pH7．4）で濯流固定後，右ヒラメ筋を摘出し，検索に供した．
免疫組織化学：摘出したヒラメ筋はアルコー
ル脱水後，LR−Whiteresinに包埋し，超薄切片を作成後，300mesh銅グリッドにすくい取り，免疫染色は全てテフロン板の上で行った．すなわち，
blocksolutionに10％nonAfatdrymilkを用い，37℃で10分間incubateL，PBS（0．5％Tween
20および0．1％non−fat daymilk加）でjet
washing後，一次抗体にmonoclonalantirthe80−KDa ofJLMおよびmMCDP，あるいはmonospecific polyclonal anti−CDP及びCDPI
againstrabbitと各々37℃で30分間反応させた・
さらにPBSで洗浄後，二次抗体にcolloidalgold

法

実験動物：正常ラットに加え，絶食および脱神経処理ラット各5匹を用いた．脱神経処理ラッ
トは右坐骨神経を坐骨神経結節直下で結繋後，2，
4，8および15日目に検索した．一方，絶食ラッ
トは，はじめ7日間だけ水のみを与えて絶食させ，ついで7日間自由に人工固形飼料を与え，さらに＊熊本大学医学部第一内科＊＊Arizona大学筋肉生物学＊＊＊Arizona大学内科神経筋疾患部門

D．E．Goll＊＊

加goatAnti−rabbitAIgGまたはmouse」gGを用い，各々37℃で30分間反応させた．反応後は，PBS ついで蒸留水で洗浄し，uranyl acetateで
counterstainを行った．なお，抗体作成に用いられたJLMおよびmMDCP，さらにCDPIはいず
れもbovinemuscleよりGolletal．（1986）5）の方法で得られた．
定量的検討：定量的検討では，各標本について10，000倍の分割電顕写真を撮り，最終倍率
30，000倍の拡大写真を作成後，BioquartII付き−62−

AppleMarkIIコンピューターを用いて，筋原線であった．また，同一線維内であっても，部位に推（Z−disk，I−band およびA−bandの各f，aC＿

よってはその分布態度が異なることもあり，例えば，筋線経の中心部では，gOldは主にZ−diskおよびトbandに存在するが，その末梢の筋鞘膜近く
では，さらにA−bandにもhomogeneousに存在するもの，あるいは中心部はgoldは粗であるが，筋鞘膜近くでは密を示す筋線経もみられた．また，

tion），筋原線絶間腔，ミトコンドリア，核，筋翰
膜・endomysiumのextracellarspaceの面積を算定し，総colloidalgold数をcountL，単位面積当たりの密度を算定した．
結果

monoclonalanti−the80qKDaofFEMCDPおよ

CDPsおよびCDPI結合immun0−gOldは僅かながら，筋原線維間腔にも、認められた．しかしながら，筋小胞体およびT管膜には，多かれ少なか

びmMCDP・さらにmonospecific polyclonalanti−CDPおよびCDPIは，いずれもラット骨格れ見られたが，とくに密に集族しては認められなかった．

筋とcross reactionすることがimmun。−bl。t＿ting法で確かめられているが，免疫組織化学的に筋鞘膜上にもCDPsおよびCDPIは共に存在したが，FEMCDPIよりmMCDPがより多く存在も確認された．すなわち，これらの各抗体を反応させたラット骨格筋では，pre−immuno−Serumにして認められた．また，神経終板のpostsynaptic
Cleft上にも僅かながら散見された．

比し有意にimmun0−gOldを認めた．

表1は，筋原線経の各fragment，すなわちZ−
disk，ILband，ALbandおよび筋鞘膜における正常ラット骨格筋の検討：使用された正常ラット骨格筋では，CDPsおよびCDPIは共にほぼ同じ分布を示し，定性的には殆ど筋原線に存在するもの，あるいは全てのfractionに存在

polyclonalanti−CDP，CDPI，FEMCDPおよび
mMCDP結合のimmun0−gOld顆粒の分布密度を算定したものであるが，定性的には筋原線維上にび慢性に認められるものの，定量的には表1に示す如くCDPsおよびCDPIは共に約64％がZr

するもの，A−band有意にみられるものなど様々

diskを含むI−bandに存在して認められた．なか

維上にび慢性にみられた．しかしながら，個々の筋線経によって，その細胞内分布態度にはいくつかの多様性がみられ，主にZ−diskおよびⅠ−band

表1ThedensityofcolloidalgoldparticlescombinedwithCDPsorCDPIinthemyofibrilsandsarcolemmaof
skeletal muscleofnormalrat§

Anti−（コ）p
Structural
Compartment

Anti−

HCDp

Ant1−mMCDp

polyclonals
No．ルnュ

t of℡otal

No．ルnユt ofTotal

No．ルm三12．0＋0．8

58．2●

5．8＋0．6

37．3●

3．7＋0．5

18．0

3．0＋0．4

19．■3

2．5◆0．4

12．0

2．8◆0．4

18．2

2．4◆0．4

11．7

3．9＋0．7

25．2

宅 Of
Total

聾yOfibrl18
2−diskエーbandA−bandSarcolema

41・5◆1・2

43・9●

7・7＋0・8

42．5●

19・5＋1・5

20・5

3・9＋0・421●519・1◆0・920・1

4・小〇・6

14・4＋1・3

15・5

1・6◆0●4

24．1
11．9§；Fi9ureS are mean8＋S．E．
＋；Back9rOundcountSVerel・7◆0・4for2−d18k′0・7＋0・3forエーband′1．1＋0．3forA−band′・and

O・5＋0・4count8′〃がfor sarc01etlna．

＊：Si9nificantlydifferent fronthecountSin theA−bandandエーbandregions atP＜0．01．
All eountS differed at p＜0・01fromback9rOund counts．

−63−

serumに比べ有意に多数のgoldを認め，核内にでも両酵素ともZ−diskに高頻度に認められた．

も存在することが示された．それは基本的にび慢

CDPsの比率分配では〟MCDPはmMCDPに比し，より多く筋原線維上，とりわけZ−diskに分布する傾向を認めた．
一方，筋鞘膜には，CDPsおよびCDPIは各々
15．1および11．9％の割合で存在したが，CDPs

性に認められ，とくに核小体に集族することはな
く，また，核膜には明らかではなかった・
また，ミトコンドリアでもCDP，CDPI・JLMCDPおよびmMCDPは共に有意に認められの内，FLMCDPがその11．7％，mMCDPがその25．2％分布し，筋鞘膜にはJLMCDPに比し，より
mMCDPが存在することが示唆された．

た（表2）．しかし，その多くはミトコンドリアの周囲膜上に認められる傾向を示した・一方，ライ筋鞘核でも，表2に示す如くCDP，CDPI，

Endomyslumでは，pOlyclonal anti−CDP，

JLMCDPおよびmMCDP

ソゾーム内および膜には殆ど認められなかった．
CDPI，JLMCDPおよびmMCDPは共に筋肉内血とも全てpreimmunoL

表2ThedensityofcolloidalgoldparticlescombinedwithCI）PsorCDPIinthenucleiandmitochondriaof
skeletalmuscleofnormalrat§

Anti−CDP

Structuralcompartment
Nucleus

叫旦（No・／〆）

叫旦（¶〇・／〆）

15・7＋0・4■

Hitochondria§‥

Anti−CDP工

4●1＋0・3■

4・5＋0・9●

6・3＋0・5●Anti−1朗CDP Anti−mMCDP（No．／Um2）（No・／Hm2）

4．6＋0．3★

2．7＋0．6●

5．6＋0．4★

3．0＋0・3★

FigureS are meanS＋S・E‥＃：BackgroundcountsWereO・4＋0・4foranti−CDPandanti−CDPIonthenuclei，

1．6＋0．3brantトCDpand00PIonmitochondria−0・4＋0・S forantトPMCDp
and−anti−mHCDPonnuClei．andO・Ocounts／〃m2fora＝ti−PLICDPand
ant1−mMCDp on mitochondria・＊：SignificantlydifferentfrombackgroundcountsatPく0・01・

表3ThedensityofcolloidalgoldparticlescombinedwithCDPsorCDPIintheendomysiumorextracellularspacesurroundingskeletalmuscleofnormalrat§

Anti−CDP Anti−CDP工Anti一岬CDp Anti−mhCDP

structural Polyclonals polyclonals

COmpartment（¶0．ルna）

Endomysium O・1＋0・3§：Figures are meanS＋S・E

No・〃m0・小0・3

封〇・〃m No・岬

0・2＋0・20・3＋0・1

Background counts O・3＋0・3for anti−CDP，0・4土0・3foranti−CDP工andO・1土0・3counts／umZ．foranti−uMCDP
and anti−mHCDP．None of the experimentalcounts differedsignificantly from the background counts・−64−√∈†ON言一〇望OP至OU−○言Ug

0

0

2

4

8

15

2

4

8

15

O Z

DoysAIterDenervotion

4

0

15

DoysAlterDenervotion

図1EffectofdenervationonthedensityoftheCDPsandCDPIinsections
Ofratsoleus muscles

管内皮細胞，COllagenfiberさらに組織球の顆粒
球内にしばしば認められたが，表3に示すように，定量的検討でもextracellularspaceにはいずれもbackgroundを超えるほどのimmuno一gOldは認められなかった．
脱神経筋の検討：図1は脱神経筋の各筋線維内およびendomysiumのextra−CellularspaceにおけるCDP，CDPI，FEMCDPおよびmMCDPのimmun0−gOldの密度を経時的に示したものである．脱神経筋の筋線維内におけるCDPsは脱神経
処理後2，4，8，15日目と漸次著しく増加した．CDPIも同様に徐々に増加したが，CDPs程ではなかった．CDPsの内訳ではpMCDPおよび
mMCDP 共に増加した．一方extra−Cellular
SpaCeのこれら酵素のimmuno一gOldの密度も経時的に増加した．そこではpMCDPより
mMCDPの増加が著しかった．
一般電昆紬勺観察では，CDPs・CDPIの細胞内分布ではそのgoldの数は正常筋に比し，著明に増加して見られたが，基本的には筋原線推上にび慢性に認められ，とくに特別のCOmpartmentに集族することはなかった．しかし，局所的に筋原線経が軽微な崩壊を示す部位などでは，未だその筋線
維全体のimmun0−gOldが増加していない時期で−65−

︵N∈寸〇三害望OP至OU−○倉〜Ug

7

1115

18

11は

18

Endomy呈辿空
くExtroce11山orI

0

T lll318

l SIorv亡d lR亡・Iedl Storv亡d

0
暮

Dqys

7

I Storv亡d IR亡・l亡dl Storv亡d lDqys

図2 Effectofstarvation，refeeding，andrestarvationonthedensityofthe
CDPsand CDPIinsectionsofratsoleus musCle

も，しばしばその部位にCDPs−gOldが島状に集族してみられた．一方，筋原線経が著しく崩壊した線経では，CDPsおよびCDPIはむしろ減少する傾向を示した．また，各immuno一gOldは，しばしば拡大したT管または筋小胞体腔内にも散見されたが，この所見とも相成って，多分に筋線稚内のCDPs・CDPIのいく つかがextracellularspaceにleakしたものと思われた．
絶食筋の検討：絶食後7日目，再摂食後7日目，
再絶食後2および7日目におけるCDPsおよび
CDPI結合immun0−gOldの密度を経時的に図2に示した．いずれも絶食，すなわち飢餓状態で

CDPsおよびCDPIは増加し，再摂食後で幾分酵素が低下する傾向を認めた．また，脱神経筋と同様にextracellular space
goldが見られた．
考にも有意にimmun0−察

これまでCDPsの骨格筋内の局在に関しては蛍光抗体法による研究が主で，電顕レベルにおける検討は極めて少なく，mOnOClonal抗体を使ったFEMおよびmMCDP，さらにCDPIについて・
しかも同時にCOlloidalgoldをもちいて電顕レベ
ルで定量的に検討した報告はない．

一66−

CDPsおよびCDPIは，筋線維内にあっては極めて動きやすく，また，検索筋を摘出する際の条件も加わってその細胞内分布態度は同一標本内で得たが，基本的に天然型のCDPsと活性型のCDPsとを区別することが出来ず，本法に加えさらに微量測定法の開発による検討が望まれる．しあっても，個々の線経によって若干異なるパターンを示した．従って，画像解析装置を用い定量的検討を行ったが，CDPsおよびCDPIは筋原線維上にび慢性に認められるものの，基本的にはZ−
diskを含むI−bandに多く，一方，筋鞘院にも比較

かも，dystrophinの欠損が明らかになった現在，
筋ジスの発症機構の解明および治療の開発のためにも，筋ジス筋におけるCDPsおよびCDPIのか
かわり合いを検討する必要がある．

的認められた．そのJLMおよびmMCDPの分布比率からは，筋原線維上によりJLMCDPが，また，筋小膜にはmMCDPがより多く存在する傾向を認めた．これはmMCDP がよ・り高濃度の，文

献1）Kar NC，Pearson CM：A calcium activatedproteasein normal and dystrophic humanmuscle．ClinChemActa73：293L297，1976．

pMCDPがより低濃度のCaで活性化されるという生化学的特性からも，その分布パターンはrea−

2）IshiuraS，MurofushiH，SuzukiKandImahori

SPnableのように思われた．
一方，これまで生化学的に疑問のあったミトコンド））アにもCDPs・CDPIは，その外膜中心に僅
かながら存在することが示された．
さらに脱神経筋及び絶食筋でもCDPsおよびprotease from chicken skeletal muscle；Ⅰ．

K：Studies of a calcium activated neutral

Purification and characterization．J Bio−
Chem84：225−230，1978．

3）Murachi T：Calapin and calpastatin．Treds
BiochemSci8：167L169，1983．

CDPIは比較的病変の軽微な早期から増加したが，このことは筋ジス筋のみならずこれらの筋の変性においても，特に早期に本酵素が深く関与していることが示唆された．

4）GollDE，ShannonJD，Edmunds T，Sathe SK，

いずれにしても，これまで筋ジスの発症機構にBernardB，SottocasaGL，SandriG，Carafolia

本酵素の関与が強調され，CANPtheoryなるものまで提唱されたが，その根拠となったデータはE，TaylorAN，VanamanTC，WilliamsRJP），

基本的に 搾油和によるいわば試験管レベルのものであり，筋ジス筋は勿論，玩＝病児レベルにおける筋肉内の本酵素の生理学的，病理学的役割についての確実な知見は殆ど皆無と言ってよい．我々は，JLMCDP，mMCDPおよびCDPIの骨格筋細月包内の分布と病的筋における動態を定量的に示しー67−

KleeseWC，ANDNagainisPA：Propertiesand
regulationoftheCa2＋rdependentprotease・InやCalcium

Binding

Proteins

（ed

by

de

EIservier Science Publisher，BV，Amsterdam
1983，pp17−35．

5）GollDE，Kleese WC，SloanDA，ShannonJD，
EdmundT：prOperties

ofthe

Ca2＋−dependent

proteinases and their proteininhibitor．Cienc
Biol（Portugal）11：75−83，1986．

9）生検骨格筋におけるS−100a。蛋白質の測定
CAIII，MSE，CK−MM値との比較検討
杉 村 公 也＊
研究協力者

村 山 知 行＊ 高 橋
古日寛＊＊ 加 藤 兼 房＊＊＊閑

行った．イソペンタン・ドライアイス中で急速凍的

我々は，以前，筋ジストロフィー患者で血清S−100a。蛋白質（S−100a。）が増加し，特に筋緊張性ジストロフィー（MyD）でその異常率が高かった1）ことを示した．免疫組織化学的にS−100a。はtypel fiberに多い2）とされていることから，
それが単にtypel fiberの異常を示すものか，疾患特異性があるものかを調べるために，生検骨格筋におけるS−100a。を測定した．同時にtypel
fiber に特異的多量に存在するcarbonic anhy−
draseIII（CAIII）3），逆にtype2fiberに多いとされるmuscle−SpeCificenolase（MSE）4）および広く筋疾患の指標とされているcreatine kinaseのMM型（CK−MM）を測定し，比較検討した．
対象

症例は30例で，年齢は48±16歳，男23例，女7例であった．その内訳は，MyDll例，mOtOrneurondisease（MND）9例（ALS5例，SPMA
4例），pOlymyositis（Myositis）10例であった．
対照は手術時採取した非神経筋疾患または神経筋症状を訴え一般光顕的観察にて明らかな異常筋病
理所見を認めない9例（年齢45±13歳，男7例，女2例）を用いた．
方法

生検は大腿四頭筋外側広筋または上腕三頭筋で＊名古屋大学医学部神経内科＊＊藤田学園保健衛生大学医学部神経内科＊＊＊愛知県心身障書者コロニー発達障害研究所生化学部

昭＊

結し，−80℃で保有した生検筋をほぼ中央で二分し，一方を光顕的観察，他方を測定に用いた．測定に用いた筋の重量は43〜228mgで，これに4℃，10倍量（V／W）の50mMTrisHClbuffer（pH 7．5，5mM MgC12 含）を加え，0℃で
homogenizeL，15000rpm，20min，4℃で遠沈した．その上澄を測定に用いた．上澄中の可溶性
蛋白質の測定は，BIORADproteinassay用キッドを用いて行った．S−100a。，CAIII，MSE，CK−MMの測定は，すでに報告されているサンド
イッチ型enzymeimmunoassay法5）〜8）で行った．
ここでは，S−100a。のEIA系についてのみ述べる．まずbuffer A（10mM／1））ン酸ナトリウム（pH7．0，0．1M／lNaCl，1mM／lMgC12，0．1％
bovineserumalbumine，0．1％NaN。）液で希釈した上澄または標準ヒトS−100a。溶液10〝1を含むbufferE（10mM／1リン酸ナトリウム（pH7．0，0．3M／lNaCl，1mM／lMgC12，0．5％egg
albumine，0．1％NaN3，1mMCa2＋）液0．5mlに，抗ヒトS−100α抗体結合ポリスチレン球を加え，30℃，5hrs振盟．その後結合球を，4℃の
bufferA液で2回洗浄し，抗体一ガラクトシデー
ス複合体1mUを含むbufferA′（bufferA汲＋1
mMCa2＋）液0．2mlに移し，4℃で一夜静置．
翌日bufferA液で2回洗浄後，球上に結合したガラクトシデースの活性を蛍光光度計で測定した．
CAIII，MSE，CK−MMの測定も，抗体および
buffer液が若干異なるのみで，ほぼ同様な方法で行った．測定はすべて二重測定で行い平均値を−68−

表1各測定値の平均±標準偏差
S −1 0 0 a 8

CA Ⅲ

ⅩS E

C E −ⅩⅩn g ／m g ・P r o ．

〟 g ／m g ・P r o ．

〟 g ／m g ・P r o ．

〟 g ／m g ・P r o ．

C o n t r o l （9 ）60 6 士 2 3 6

7 5 ．5 ± 2 0 ．8

7 3 ．7 ± 1 5 ．7

18 4 士

3 7 ．5

X yD（1 1 ）

63 1 ± 2 3 9

10 1

士 5 5．4

6 8 ．8 ± 3 1．7

205士

9 4 ．7lⅢD（9 ）

7 4 1 ± 3 25

1 17

士 9 4 ．7

4 2 ．9 士 2 4 ．2 ●18 6 ± 12 6

9 32 士 4 76 ●10 8

± 3 9 ．1

6 1 ．0 ± 2 8 ．6

19 6 士Ⅹy o s i t i s （1 0 ）3 4 ．7‥ P〈0．05（Vilcoxon検定）

tリ○○l Hb「
撲）

8

卯

4試I
馳
澗
S−1馳0椚・Pr0．

l猶

12硯

58

11犯

158
2祝
C沌 〟ymg・Po．

知識

図1対照群およびMNDにおけるtypelfiberの比とS−100a。．CAIIIとの相関係数とった．測定値は，それぞれヒトS−100a。，ヒト
結果CAIII，ヒトβエノラーゼ，ヒトMM型のCK等対照群および疾患群における測定値を表1に示価として，上澄中の可溶性蛋白質1mg当りで表し した．対照群との有意差検定をnon−paramCtriC
た．
なWilcoxon検定で行った．MyositisにおいてS
−69−

表2

S−100a。とCAIIl，MSEおよびCK−MM値との相関係数

CA Ⅲ

址S E

CE −
XH

9例

0 ．7 2 3 ●0 ．2 1 1

0 ．5 2 8

Ⅹy D

l l例

0 ．2 7 0

0 ．5 6 0

0 ．5 8 9 ●

ⅡN D

g例

0 ．6 6 7

0 ．2 6 8

0 ．4 6 4

l O例

0 ．2 2 0−0 ．6 5 1

0 ，0 6 0

C o nt ro 1

Ⅱy o s i t i s

◆

表3

P

く

0．05

Typelfiberの比とS−100a。，CAIII，MSEおよびCK−MM値との相関係数

S −10 0a B

CA Ⅲ

XSE

C E −1 Ⅹ

9例

0．48 00．1 83−0．10 1

0 ．23 1

HyD

lO 例

−0．4 12−0．1 44−0．8 4 1 ●−0 ．25 0

馴D

7例

0．5 640．4 14−0．2 3 1

0 ．09 1

C o nt r o1

●

P

く

−100a。が有意に高く，MNDにおいてMSEが有意に低値を示した．MyDではいずれも対照群と有意差を認めなかった．
次にS−100a。と各蛋白質の測定値の相関係数を表2に示した．対照群とMNDとはいずれも同様な傾向を示し，同じtypelfiberに多いとされているCAIII3）とのみ有意な相関を示し，type2

0．01

fiber4）に多いとされているMSE とは最も低い値を示し，CK−MM とはその中間の値を示した．
MyD，Myositisでは，これらとは異なり，MyD
ではMSE，CKLMM と有意な相関を示し，
MyositisはMSEと有意な逆相関を示した．
次にtypel fiberの数の比とそれぞれの蛋白質との相関係数を表3に示した．変性線経などが

−70−

表4

Typelfiberの面積比とS−100a。，CAIII，MSEおよびCK−MM値との相関係数
S −1 0 0 a O

C o nt ro l

C A Ⅲ ・、

XS E

C E −Ⅹ甘g例

0 ．4 8 5

0 ．1 8 2−0 ．10 8

0 ．2 3 5

Hy D

lO 例

−0 ．1 7 6−0 ．0 5 1

−0 ．7 2 9 ●−0 ．2 9 0m D

7例

0 ．5 9 5

0 ．4 9 8−0 ．2 4 9

0 ．3 0 7●

p〈多く，typel，type2がわかりにくいものは外し，Myositisでは同様な理由から除外した．MyD
でtype2fiberに多いとされているMSEと有意な逆相関を認めたが，期待したS−100a。，CAIII
ではいずれも有意な相関を認めなかった．しかし対照群とMNDの両群を合わせた場合，S−100
ao，CAIIIともに，typelfiberの比と有意な相関を認めた（図1）．

0．01

これに対し，MyDやMyositisではS−100a。とCAIIIとは解敵を示し，typel fiberの比とも全く相関を示さなかったことは，これらの筋疾患においては，筋線経の障害または再生の過程において形態やfibertypingだけではなく，これらの蛋白質の構成そのものに変化が生じていることが考えられた．

次にtype別の筋線維径の分布から，筋線雑を円と考えて，計算上求めた面積比とそれぞれの蛋白質との相関を表4に示した．typelfiberの数の比とほぼ同様な結果となった．
考

察

ま

と

め

1．生検骨格筋においてS−100a。を測定し，CAIII，MSE，およびCK−MM との比較検討を行った．
2．MyDではS−100ao，CAIII，MSEおよびCK−MMのいずれにおいても対照群と有意差を認めなかった．

今回は症例数も少なく，性差，生検部位による違いも考えられ，MyDにおける差異を示すことはできなかった．また全体としてかなりバラツキ

3．対照群およびMNDでは，S−100a。とCAIIIは有意な相関を示し，また両群を合わせたものが大きく，個人差も大きいように思われた．ただ，対照群とMNDでS−100a。とCAIIIが有意な相関を持って変化し，またこの両群を合わせたもの

ではS−100a。，CAIIIともにtypel fiberの比と有意な相関を示し，免疫組織化学的な染色の結果と一致した．

ではS−100a。，CAIIIともtypelfiberの比と有意な相関を示したことは，免疫組織化学的にS−100a。，CAIIIがtypel fiberに多いとされるこ4．MyDおよびMyositisでは，S−100a。とCAIIIは有意な相関を認めず，またS−100a。，CAIIIとtypel fiberの比も有意な相関を認めなかったことから，これらの蛋白質の構成に変化が生じている可能性が考えられた．

とと一致し，MNDでは筋線経の病理学的な変化があっても，これらの蛋白質の構成は正常と変わらず，基本的には保たれていることが考えられた．

−71−

文

5）KatoK，HaimotoHetal：Enzymeimmunoas・献1）村山知行，杢野談次ら：筋ジストロフィー患者で

say measurement of theαSubunit of SlOO

増加する血清S−100a。蛋白質−Carbonic anhy−

proteininhumanbiologlCalfluids．Biomedical
Res8：119，1987．

draseIII，Creatine kinase，muSCle−SpeCific

6）Kato K and Mokuno K：Distribution ofim−

enolaseとの比較検討．神経内科28：179，1985．
2）HaimotoHandKatoK：S−100a。（αα）protein，munoreactive carbonic anl1ydrasein various

acalcium−bindingprotein，islocalizedinthe

human tissues determinated by a sensitive

Slow・twitchmusclefiber．JNeurochem48：917，

enzymeimmunoassaymethod．ClinChimActa
141：169，1984．

1987．

3）ShimaK：Humanmusclecarbonicanhydrase

7）KatoK，Okagawa Y etal．：Immunoassayof（CA）purification，immunohistochemicallocal−

humanmuscleenolaesubunitinserum；Anovelizationin the human skeletal muscle andits

markerantigenformusclediseases．ClinChim
Acta131：75，1983．

Clinicalapplication to the neuromuscular dis−

8）Kato K，Shimizu A et al：Highly sensitiveease．HokkaidoJMedSci59：98，1984．
4）IbiT．SahashiKetal：Immunohistochemical

enzymeimmunoassay for human creatine

demonstrationofβ・enOlaseinhumanskeletal

kinaseMMandMBisozymQS・ClinChimActa

muscle．MuscleNerve6：661，1983．

158：99，1986．

ー72−10）培養筋芽細胞の増殖，分化とリソゾーム酵素
ならびにミトコンドリア酵素
川 井 尚 臣＊研究協力者

佐藤 幸 一一一＊ 鳩 尾 隆 子＊ 西 田
増 田 健二郎＊ 須 原 芳 宏＊ 山 口

は じめに

furaL2AMを添加して30分間静置し，細胞を洗浄後，顕微蛍光測定により各細胞の340nM と昨年度は，培養筋芽細胞の分化に伴って細胞中のクレアチンキナーゼ（CK）やミオグロビン

380nMの波長の吸光度を測定し，340／380の比と，別に作成した較正曲線よりCa濃度を求めた．

（Mb）などの筋固有の蛋白が増加することを報告した．本年度は，筋固有蛋白ではないリソゾー

校正曲線はイオン強度0．19，温度30℃，pH7．0（150mM KCl，20mM PIPES−KOH，1−10mM EGTA，0．1−1mM CaC12）でCa2＋濃度

ム酵素やミトコンドリア酵素の変化を検討し，併せて細胞内Ca濃度の変動も検索した．また，Caionophore（A23187）やcytochalasinBの影響についても検討した．

が10−2000nMの標準液をつくり，これと理論値より作成した5）．培養筋芽細胞の分化に対するCa
ionophoreやcytochalasinBの影響をみるため，
まず培養液にCaionophoreを20nM／L，40nM／
Lまたは100nM／L，CytOChalasinBを200nM／
Lまたは600nM／Lを加えて培養し，筋細胞の増対象と方法
ATCCより入手した筋芽細胞（L6）を培養細胞として用いた．この細月包を60mm径のシャーレに1×105個／dish播種し，2％馬血清と6JLg／ml
インスリンを含むDME（Dulbeccos Modified
Eagle）液を用いて培養した．細胞の培養は9〜10日間行い，その形態的変化を観察するとともに，
2−3日ごとに細胞を採取し，DNA量1），CK活性値，Mb量を測定した．なおCK活性低Mb量については細胞当たりの量を表すためにDNA当たりの数値（mUCK／JLgDNA，ngMb／JLgDNA）を示した．同時にリソゾーム酵素の1つであるα

善 彦＊
久 雄＊＊

殖に及ぼす影響を調べた．そして，培養6日目にこれらの試薬を加えない対照群の培養細胞に比べ，それぞれDNA量を約70〜80％に抑制する濃度の試薬を加えた．すなわちCaionophoreの濃度は40nM／L，CytOChalasinBは200nM／Lとし，9−10日目まで培養を行った．細胞は前述と同様の日程で採取し，同様にDNA量，CK活性値，Mb量を測定した．この場合も平行して細胞の形態的観察を行った．

−D一mannOSidase活性を測定2）し，ミトコンドリア
酵素としてはsuccinatedehydrogenase（SDH）3）とcytochromeoxidase（COX）4）の活性を測定した．また，培養細胞内のCa濃度も測定した5）が，成績

1．培圭細胞の形態的分化と細胞内のMb量，
CK活性値ならびにCa濃度：ラット筋芽細胞は

この場合は培養液に3／Jg／mlの蛍光プローブ

培養6日日頃より筋管細胞を形成しはじめ，9日
日〜10日目には殆どが筋管細胞にまで分化した＊徳島大学医学部第一内科＊＊徳島大学医学部第一生理（図1）．しかし，それ以後，細胞は培養皿より剥維した．細胞内のDNA当たりのCK活性値や−73−

図1培養5日目の筋芽細胞（A）と9日目の筋管細胞（B）（×350）．

みられた（図2）．
2．筋非固有蛋白：リソゾーム酵素のα−D

Mb量は培養6日目までは極めて低値であったが，それ以後は急速に増加した．とくにCKの増加は著明で9日目には38mUCK／JLgDNAであった・−mannOSidaseの活性（pH4．3）は形態的に筋管細胞へと分化が始まる6日目以後に急速に増加し，8日削二は190nmol／mgprotein／hrになった．

細胞内Ca濃度は3日目22nM／L，6日目62
nM／L，10日日108nM／Lと分化に伴ない上昇が

Hb／DHA CK川HA Ca
（州／し）

培

養

日

数

図2 筋芽細胞（L6）の分化に伴うMb量，CK活性値，Ca濃度の変化

ー74−ミトコンドリア酵素のSDHやCOXも培養日数に比例して急速に増加し，6日目以降もさらに増加した（図3）．

あった．Mb量はionophore添加群では対胤こ比
べ急速に増加したが，CytOChalasinB添加群ではむしろ増加が抑制された（図5）．

3．α−D−mannOSidase活性のpH依存性活性：培養1日目，3日目，ついで6日日とpH6．0
近辺の中性領域の活性が急速に上昇したが，8日
日にはpH6．0に比べpH4．8近辺の酸性領域の考

筋疾患の多くは筋萎縮を伴っている．従って，これら疾患の治療は筋萎縮をいかに改善するかにかかっていると言っても過言でない．筋の発達と分化を促進する因子は生体内に存在すると考えられ，この因子を明らかにすれば筋萎縮の治療に役立つものと思われる．そのためには筋の発達・分化の機序やそれに作用する因子を明らかにする必要があり，培養筋芽細胞を用いて研究を行ってい活性が高くなった（図4）．pH4．4とpH5．8の活性の比では培養1日目1．3±0．09（平均値±標準偏差），3日目2．4±0．1，6日日1．7±0．13，
8日日0．9±0．09と8日日が最も低値を示した．
4・CaionophoreおよびcytochalasinBの影
響：Caionophore添加群とcytochalasinB添加
群では，筋芽細胞から筋管細胞への分化の時期および細胞の形態の点で対照群との間に明らかな違いは見られなかった．CK活性値は，Caionophore
添加群では8日目より急速に増加したがcyto−
Chalasin B添加群は対照に比べわずかに低値で察る．昨年の本研究では，筋芽細胞の分化と筋固有蛋白のCKやMbの増加または分化との関係について報告した．これに対し，本論文では主として筋非固有蛋白の変化についての成績を示した．
われわれの用いた細胞培養の条件では，L6細胞は培養6日目以後に筋芽細胞から筋管細胞へと分化するが，この時期に一致して細胞中のCKや︵主＼u芯；Ld冨＼一芸u︶三三︼Uく
3．0

図3

筋芽細胞のsuccinatedehydrogenase（SDH），
CytOChrome oxidase（COX），およびα−D−mannOSidase（Man）の活性の上昇．

4．0

5．0

6．0

7．O

pH
図4

筋芽細胞の分化に伴うα−D−mannOSidase活性のpH依存性の変化．

−75−

過とともに増加したが，とくに形態的に筋管細胞に分化した直後より急速な増加を示した．また，

併／肌l

これに伴い同酵素のpH依存性活性も，中性優位から酸性優位へ変化した．このことはリソゾーム
酵素のαLD．mannosidaseが細胞質型からいわゆるプロセッシングを行うリソゾーム型9）に変化したことを示すもので，筋細胞の形態的変化とともに細胞内小器官も分化，発達することを示すものである．一方，ミトコンドリア酵素の増加は，リソゾーム酵素の増加に比べやや緩やかではあるが
0

1

6

3
培

養

日

8

川

確実に増加しており，やはり形態の分化に平行してミトコンドリアの増加，あるいは細胞内呼吸の活発化を示した．

数的／DH

膜作用物質のCaionophoreと細胞骨格作用物
質のCytOChalasin Bの筋芽細胞分化に及ぼす影響については，成績の項で示したごとく，両試薬の濃度は細胞の増殖を若干抑制する濃度であったが，CKの増加はionophoreを作用させた場合，

0

1

3

図5

8

6

堵

乗

日

対照やcytochalasin Bに比べやや大きい程度であったが，Mbはionophoreの添加により培養8日目以後急速に増加し，高値を示した．Cyto−chalasin Bでは対照と比べ差が見られなかった．

10

数

筋芽細胞の分化に伴うCK活性値とMb量の増加に及ぼすCaionophoreとcytochalasinBの影響の比較．

Mbが増加を開始し，その後急速に増加した．とくにCKはすでに発表したごとく6），アイソザイム
パターンは培養9日目の筋管細胞ではMM型優位に変化しており，筋収縮がおこる前段階にまで
発育・分化していることを示した．このため，筋収縮に関連の深い培養細胞中のCa濃度を測定し，形態の分化に伴うCa濃度の上昇が見られ，Ca濃度は筋芽細胞の分化と関係が深いと考えられる．
筋芽細胞のCa濃度は20〜60nM／Lであり，筋管細胞のそれは成熟筋線経の80−100nM／L7）にほぼ同じであるが，1000nM／L8）との報告もあり，L6細胞も筋線維にまで分化するとなお細胞内のCa濃度が増加する可能性がある．
筋非固有蛋白の変化についてみると，リソゾー
ム酵素のαLD−mannOSidase活性は培養日数の経

Mbは筋芽細胞ではきわめて少ないが，成熟筋細胞の筋固有蛋白であり，ratの骨格筋では0．06〜0．7mg／gwetweight含まれている10）．従ってMbを筋細胞の分化の1つの指標とすると，CytO−
chalasin Bは筋芽細胞の分化にあまり影響は及
ぼさないが，ionophoreは分化を促進させると考えられる．すなわち，筋芽細胞の分化と細胞膜の機能とは密接に関係していると推定される．
まとめ

筋芽細胞から筋管細胞への分化の途上で，CK，Mbなどの筋固有蛋白の著しい増加とともに，リソゾーム酵素やミトコンドリア酵素などの筋非固有蛋白にも同様の変化がみられ，筋芽細胞の形態的分化と同時期に，細胞生理学的にも分化が起こっていることが示唆された．またCaionophore
が筋固有蛋白の増加を促進させたことより，筋芽細胞の分化と細胞膜の機能とは密接に関係していることが推定された．

−76−

文

献

の影響．【厚生省精神・神経疾患研究委託費・筋ジ

1）ErwinBG，StoscheckCMetal：Arapidfluoromet−

ストロフィー症及び関連疾患の病態とその病因

ricmethodfortheestimationofDNAincultured

に関する研究 （杉田班）昭和62年度研究報告

Ce11S．AnalBiochemllO：291−294，1981．

書，1988，p265．
7）吉田精子，菊池建機：mdx2）HindmanJandCotlierE：Glycosidasesinnormal

マウス骨格筋内のhumanleukocytes and abnormalitiesin

Ca2＋濃度．什厚生省精神・神経疾患研究委託費・筋GM1−gangliosidosis．ClinChem18：971−975，1972．

ジストロフィー症及び関連疾患の病態とその病因に関する研究 昭和63年度抄録集，1988年12月．

3）KingTE‥Preparationofsuccinatedehydrogenase

andreconstitutionofsuccinateoxidase．Methods
inEnzymology，10：322−331，1967．

8）塩屋敬一，大井長和ら：カルシウム選択性微小電4）WhartonDCandTzagoloffA：Cytochromeoxidase

極による筋細胞内カルシウムイオン濃度の測定．

frombeefheartmitochondria・MethodsinEnzy−

第29回日本神経学会総会抄録．1988，p424．

mology，10：245−250，1967．
9）WinchesterB：Role ofαTD−mannOSidasesin the5）GrynkiewiczG，PoenieMandTsienRY：Anew
generationofCa2＋indicators

withbiosynthesis and catabolism of glycoproteins．

greatlyim−

provedfluorescenceproperties．JBioIChem260：
3440−3450，1985．

BiochemSocTrans12：522−524，1984．
10）PerkoffGTandTylerFH：Estimationandphysi0−6）川井尚臣，佐藤幸一ら‥筋芽細胞（L6）の増殖，分化とCaイオノフォアおよびサイトカラシンB

ー77−

10giCalpropertiesofmyoglobininvariousspecies．
Metabolism7：751，1958．

ⅠⅠⅠ．

形

態，

再

生

11）無化学固定骨格筋の液体heliumによる急速凍結，
deepetching，回転蒸着replica観察の試み−特にmyosinfilamentのcrossbridgeについて
若 山 吉 弘＊
研究協力者

緒泣 谷 誠 二＊する．

言3）上記標本をEiko FD−5A凍結割断装置に装着し−110℃で凍結面の表層近辺を割断する．
4）割断後，試料台の温度を−90℃まで上昇し真Heuserにより開発された急速凍結，deepetch一
ing回転蒸着法によるreplica膜の観察は細胞の3次元的観察に適しており，membrane cyto−
Skeletalinteractionやcytoskeletalelementsの

空度1−2×10．7Torrで約30分間deepetch−
ingをおこなう．
5）Deepetching後試料台に装着した標本の温度を−160℃前後まで冷やす．

微細構造の詳細を研究するのに極めて有用である．
特に細胞膜と細胞膜関連細胞骨格との相互関係を究明するにはきわめて有力な手段となりうると考6）その後電子銃に装着した白金を膜庄計でその厚さを監視しながら，また試料台を回転しながら蒸着し，次に同じく電子銃に装着したカーボえられる．従来，我々はヒト筋ジストロフィー症
やMDXmouse

骨格筋の細胞膜を中心にfreeze

fracture法にてその膜内微細構造を観察してきたが，この方法では細胞内の細胞骨格や細胞膜直下の微細構造が観察不能であった．今回，我々は無化学固定骨格筋標本を液体ヘリウムにて急速凍結し，その試料の表面を割断後deepetchingを施し，更に回転蒸着法にてプラチナとカーボンを蒸着し，replica膜を作製し，電顕的に筋原線維とくンを試料の上の白金膜に回転蒸着してreplica
膜を作製する．
7）次に試料のついたreplica膜を凍結割断装置
から取り出し，塩素系漂白剤で筋肉だけを消化
しreplica膜を得る．

にmyosinfilamentのCrOSS bridgeの詳細につき観察し，興味ある知見を得たので，若干の文献的考察を加え報告する．

8）Replica膜を蒸留水で3分ずつ3回洗浄する．
9）Replica膜を鋼メッシュにすくい取る．
10）得られたreplica膜を乾燥後，電子顕微鏡にて観察し，写真を撮影する．

材料と方法

なお，Heuserらはcytoskeletalelementの写
真は白黒反転して論文に発表している．こうする

MDX mouseの成熟controlmouseの長址伸筋（EDL筋）を用いた．方法は
1）正常MDXmouseのEDL筋を採取する．
2）急速試料凍結装置EikoRF−23型に液体窒素と液体ヘリウムを入れ−269℃まで冷えた純鋼
blockに採取した筋の小片を圧着し，急速凍結＊昭和大学藤が丘病院神経内科とcytoskeletalelementが黒のback groundから浮き出したように白く観察され，より良く見えるので多くの発表でこの方法が採用されている．
しかしreplica膜の電顕写真はもともとcontrast
が強く，そのうえこのように白黒反転させるため
何度も写真を焼き直すと更にcontrastが増加するため，当論文では電顕ネガをそのまま印画紙に焼き付け，CytOSkeletal elementsは白のback−81−図1無化学固定骨格筋標本の液体ヘリウムによる急速凍結・deepetching，回転蒸着replica法による
replica膜の電顕所見・写真上部よりcollagenなどよりなる基底膜，緋包膜直下領域筋原線経などが見られる．（×40，000）

groundに黒い構造物として観察されるようにした．
結果

従来の凍結割断法は膜内の分子構築など膜の超微構造の観察には通しているが，筋原線経などのいわゆるcytoskeletalelementsは図2Aのようにほとんど観察できず，replica睦によっては目を凝らして観察するとわずかに筋原線経の走行がそれとなくわかる程度である．これに比Lglycer−
inationを施していない標本をdeep etchingするとcytoskeletalelements周囲の水分が昇華され，膜内部，細胞質側の細胞膜表面なども立体的に観察される（図1）．他方，glutaraldehydeなどの化学固定標本と無化学固定骨格筋標本との本法による比較観察では，今迄のところ構造に大差はなさそうであるが，無化学固定標本の方が筋原線経などがよりしなやかに見える（図3B）．
さて，無化学国定骨格筋標本replica膜の高倍電顕像では筋原線経がはっきりと認識可能で，図4の右上太線より右側がⅠ帯，左側がA帯でA帯のmyosin filamentにはcross bridgeが沢山存在することが観察される．図4でみられるように，
mouse EDL筋のcross bridgeはactin filamentる（図2B，図3A，B）．更にdeepetchingを施（矢印）の長軸に対する角度，すなわちdistal
angleが一定ではなく，その角度にかなり大きなばらつきが見られ，またactinfilamentのtarget

した標本では，図1の上方に見られるようにcn1−

zone

1agenなどの細胞外matrixや細胞膜真表面，細胞Cross bridgeもmyosinへの付着部位が双頭の筋細胞内微細構造がはっきりと明瞭に観察され，
筋原線経のA帯Ⅰ帯の区別が一見して明らかであ−82−に対し約30nmの間隔で存在している．

図2

図Aは従来のfreeze fracture法，図Bはglutaraldehyde固定alcohol浸透骨格筋標本の本法によるreplica隈の電顕所見．Bでは筋原線経がきれいに観察される．（ABとも×20，000）

doubleheaded，いわゆるdoubletではなく本動物では単頭のSingletであり，その形態もmyosin
への付着部位がくびれ細くなった三角形ないしCOmma状をしたもの（矢尻）や一定の太さの梓状をしたものまで種々であった（図4）．
考察

我々は今迄凍結割断法を用いヒト筋ジストロ
フィー症1）やMDX mouse2）骨格筋細胞膜の変化について報告してきた．しかしこのような凍結割
断法では試料凍結時にicecrystalが形成されることを防止するため，CryOprOteCtantとして通常
glycerinを使用しており，glycerin浸軟標本を凍結割断してきたが，glycerinは昇華されにくく
deepetchingされない．従ってdeepetching標本にはglycerinは使用出来ないのでそのまま急速凍結するが，本研究のような金属庄着法では金属への圧着面より遠くなるに従い水晶形成が激しくなる．一般に生の試料ではicecrystalfreeの理想的な凍結状態は，液体窒素温度（約−196℃）では圧着面より数〝mであり，この極く薄い屑を凍結割断装置の刃で割断するのは非常に難しい．一方，液体ヘリウム温度（約−269℃）では，この厚さが金属庄着面より約20耳mくらいになるといわれており，最近の凍結割断装置で割断用の刃が〃m単位で微妙に作動するものを用いれば，この20JJmくらいの厚さの屑を通り割断することは可能である．
今迄の急速凍結，deep etching，回転蒸着rep−lica法を応用した研究報告は，みつばちの羽根を動かす筋や魚類の筋などについてのものが若干3）4）5）みられるが，これらは化学固定筋標本をmethylalcoholに通し昇華し易い状態でreplica
月実を作製している．これらの報告でもcrossbridgeのdistalangleは我々の結果と同様かなりばらつきがあるとされているが，CrOSSbridgeはMDXmouseと異なりcrayfishの速筋ではdou−
bletを形成していることが報告されている．
骨格筋のcross bridgeは化学エネルギーを滑り現象いい換えれば運動エネルギーに変換する構
造物として特に重要であり，この詳細は不明な点が多い．また高等動物のmyosincrossbridgeの

一83−

図3

図Aは2Bの拡大像，図Bは無化学固定骨格筋標本の液体ヘリウムによる急速凍結，deep
etching，回転蒸着法によるreplica膜の電顕所見・化学国定骨格筋標本より無化学固定標本の方が筋原線経がしなやかに見える．（ABとも×40・000）

本法による観察はまだなされておらず，従って赤筋自筋によるcrossbridgeの性状の相違なども不明である．収縮特性の異なるこのような筋線経のCrOSSbridgeの詳細を研究することは滑り現象の詳細の解明にも貢献するので，更に今後研究を進めていきたい．

1）crossbridgeのdistalangleは一定していな
かった。
2）crossbridgeはactinfilanentのtargetzone
に対し約30nmの間隔で存在していた。
3）crossbridgeの形態はSingletであり，myOSin
への付着部がくびれ細くなった三角形ないしcomma状をしたものや一定の太さの梓状のも

まとのまで種々であった。

め

MDX mouseのCOntrOlmouse長址伸筋の無文

化学固定標本の液体ヘリウムによる急速凍結，
deepetching，回転蒸着法にて作製したreplica膜
でmyosinfilamentのCrOSSbridgeを観察し次の結果を得た。

献1）WaknyamaY，JimiT，MisugiNetal：Dystrophin−84−

immunOStainingandfreezefracturestudiesofmus−
clesinearlystagepatientswithamyotrophiclateral図4 無化学国定骨格筋標本の液体ヘリウムによる急速凍結，deepetching，回転蒸着replica法による
replica膜の高倍電顕像．右上の黒い太線より右側がI帯，左側がA帯でA帯のmyosinfilamentには多数のcross bridgeが観察される．矢印のactin filamentに対するcrossbridgeのdistal
angleは一定の角度ではなく，CrOSSbridgeの形態もsingletでありmyosinfilamentへの付着がくびれ（矢尻）comma状ないし三角形をしたものや一定の太さの梓状のものなど種々である．（×160，000）

SClerosisandDuchennemusculardystrophy．JNeu−
roISci（Inpress）

ty5：363，1984．
4）Trombit孟sK，BaatsenPHWWetal：Rigorbridge2）Shibuya S，WakayamaYetal：Freezefracture

angle；Effectsofappliedstressandpreparative

Studyofmyofiberplasm早membraneinX−1inked

procedure．JUltrastruCtMolecStruCtRes97：39，

muscular dystrophy（mdx）mouse．Acta Neu−

1986．

ropathol（Berl）76：179，1988．

5）BardF，Franzini−ArmStrOngCetal：RigorCross

3）VarrianoTMarstonE，Franzini−ArmstrongCetal：
ThestruCtureanddispositionofcrossbridgeindeep−etChedfishmuscle．JMuscResCellMotili−

一85−

bridgearedouble−beadedinfastmusClefromcray
fish，JCellBiollO5：2225，1987．

12）Localtetanus法の応用による実験的ミオパテ一に関する研究 第4報−ランタン染色による管系の初期病変の検討
田 遠
研究協力者

等＊

水 野 美 彦＊＊2．ランタン染色による電顕的所見

は じめに
これまでの研究でlocaltetanusに陥ったヒラメ筋（SOL）を過伸展することによって生じた
筋ジストロフィー様の病変の発生機序として捌実の傷害を考えてきた．しかしながら筋膜にはっきりとしたholeを認めたわけではなく，筋線経の歪みによるartifactの可能性も否定できなかった．

先ず対照側のSOLではランタンはT管に局在し，小胞体（SR）には取り込まれていなかった（図2A）．一方，直後より6時間目迄の病側のS
OLでは変化はほぼ似通っており，筋膜やsar−comereの構築は良く保たれている一方，筋膜下にミトコンドリアが集積しその間にT管の変性しそこで，今回はランタンを使用した電顕的観察により短く初期の病変を検索したので報告する．

たものと思われる管状構造物が不規則にランタンを取り込んでいる所見が認められた（図2B）．筋線経の内部ではSRの構築は比較的良く保たれランタンの侵入も認められなかったが，筋膜下と同様で管の変性と思われる構造物が認められた（図2B）．48時間後では馴莫下に変性したT管起始

対象及び方法
14匹のadultalbinoratを用い，従来の方法に
よりlocaltetanusを作製し，罷患肢の足関節に50回の他動的背屈刺激を1度与えた．その直後，
1，3，6時間後，更に24時間後に再度50回の背屈刺激を与え，その24時間後に各々両側SOLを採取し，組織学的，およびランタン染色による電顕的検索を行った．ランタン染色はRevel ＆Karnovskyl）の方法によった．血清CKの測定も行った．
結部（図3A，3B）および再生したT管の混在と思われる不規則な管状構造物（図3C），あるいは
myeline figureを伴った多数のautophagic
vacuole（図3D）などが認められた．ランタンの筋内部への取り込みは一般に悪いが，場所によってはかなり取り込まれており，一部SRへも取り込まれている所見が認められた（図4）．
3．血清CK
始めの6時間目迄の経過を見ると，直後に最も高く，その後徐々に低下する傾向が認められた（図果1．組織所見
背屈刺激開始直後の検体において既に一部の筋線経に変性が認められ（図1A），6時間目にかけ徐々に程度が増した（図1B，1C）．48時間後にはかなりの筋線経に変性が認められた（図1D）．
＊東京都立神経病院＊＊東京都立神経病院神経小児科

5）．

考
察
これまでの研究で本法における筋変性の機序として，筋の過伸展による筋膜の傷害を考えてきた．
しかしながら，病変初期の筋膜の電顕による病理所見では，一部に構築の乱れはあったが，DMD

−86−

図1A

図1C

右SOL（直後）HE XlOO

図1B

右SOL（6hr後）HE XlOO

図1D
−87−

右SOL（3hr後）HE XlOO

右SOL（48hr後）HE XlOO

図2A X9，000

図2B X15，000−88−図3A X30，000

図3B X18，000

図3C X9，000

図3D X15，000
−89−

図4

×13，800

CK（IU／L）

で報告されているようなはっきりとした筋鞘の欠損孔は認められなかった．この様な病変は筋線経の歪み，標本の切断面の影響などによる人工産物の可能性も考える必要がある．一方，今回のランタンを用いた検索では病変の極く初期より筋膜下のT管に異常がみられ，筋膜，筋原線絶，筋小暇
体にはその時点では異常は見られなかった．またランタンの筋線維内部への取り込みも悪かった．
これらの所見から推察されることは，T管が極めて伸展力に弱く，他の構造物が変化を受ける前に最初に変性を生じるのではないかということである．血清CKが直後に最も高く，その後徐々に減少していることは，この断裂したT管よI）の漏出を示唆しており，またそこからの細胞外カルシウ
ムの流入を考えれば筋線経の変性も説明が可能で
0

1

3

6
（hrs）

図5血清CKの推移ある．近年，DMDの欠損蛋白としてジストロフ
ィンが発見され，その局在が問題となっているが，免疫電顕を用いた方法でWatkins2）らはそれが筋ー90−

膜下にperiodicityをもって存在することを示唆している．この事はジストロフィンの局在部位としてT管の起始部も可能性の高いことが考えられ，
この蛋白が外力に脆く筋線経の過伸展により容易に傷害を受けたと考えれば，筋変性の発生機序として本モテリレとDMDは極めて密接な関係を有することになる．今後免疫電顕の手法を取り入れてこの点を検索していきたい．

文献1）RevelJ P and Karnovsky MJ：Hexagonalarray ofsubunitsinintercellularjunctions ofthemouseheartandliver．JCellBiology33：
C7−C12，1967．

2）Watkins SC，Hoffman EP，Slayter HS andKunkel LM：Immunoelectronmicroscopic
localization of dystrophinin myofibers．
Nature 333：863−866，1988．

−91−13）ラット骨格筋における雌雄差と性腺摘出の影響（ⅠⅠ）
斎 田 孝 彦＊

研究協力者

骨格筋の分化成長と維持に関する栄養因子の研究の一環として，私達は性ホルモンが骨格筋に与える影響を調べてきた．骨格筋には，著明な性差が認められ，その性差の発現には性ホルモンが関与していることは確かと考えられる．男女性ホルモンが骨格筋の成長分化維持に及ぼす作用を調べ，どのタイプにどのように働いているのかを知る目
的で昨年度は生後10過の時点と性成熟期に達したラットを用い，雌雄差，性腺摘出の影響について報告した．
即ち成熟期に達したラットでは筋線維径はTypelでは雌雄差が少なく，Type2Aと2Bでは雄で大であること，また生後10週の時点では性腺摘出により，雄では径が減少し，雌では径の増大が見られ，雌雄差が減少することを報告した．
今回は各種性ホルモンの長期投与の骨格筋に与える影響を検討した．即ち，プロゲステロン，エストロゲン各々の単独投与及びエストロゲン・プ
ロゲステロン同時投与が骨格筋に及ぼす影響を検
討した．
方

法

ラットの骨格筋は酵素組織化学的にType1，
2A，2Bの3種に大別され，ヒトと異なり，1はNADH−TR染色でタイプ2Aと2Bの中間の染色性を有する．線維型の識別は，NADH−TR染色等により，単一染色で3種の識別は可能であるが，様々な中間型が，存在しているため，識別に困難を感じることが多い．
また同一筋肉内においてもそのパターンが著しく異なり，筋線維径も中心部と周辺部では差があ＊国立療養所宇多野病院臨床研究部

真＊

小 堀

酒

井

規

雄＊

り，筋の形状，採取高位によっても異なる．従って筋を比較する際には，細い紡錘状の筋腹をもつ筋を選び，同一高位での全筋横断切片を作製し，それを構成する全ての筋線経の計測を行うことが誤差を少なくするために必要である．
こうした条件を満たすものとして，3種の筋線
維型のうち2種のみから成る筋であるsoleusと大腿二頭筋内側頭の2種の筋を選定し使用した
soleusは総線維数は約3，000本，約80％がタイ
701，残りがタイ702Aで，2Bは含まれない．
大腿二頭筋内側頭（BFM）は総線維数約3，500
本，タイプ1を含まず，タイプ2Aが約30％，タ
イプ2Bが約70％で構成されている．soleusを用いてタイ701，大腿二頭筋内側頭（BFM）を用いて，タイプ2Aと2Bの計測を行い，左右両側の筋の値を加算して，その個体の値とし，ヒストグラムを作製し平均値，標準偏差，中間値を求め，比較検討した．
実験には同一系の生後3週のSDラット29匹を用い，以下の3群に分けた．エストロゲン群（EB群）は雌10匹を用い生後3週で性腺摘出後エス
トラデイオルベンゾェイト20JJgをゴマ抽0．1
mlに溶かし週2回皮下投与した．プロゲステロン
群（P群）も雌10匹を用い，同様に性腺摘出後，プロゲステロン2mgを週2回皮下授与した．エ
ストロゲン・プロゲステロン併用群（EB＋P群）
は，雌10匹を用い性腺摘出後エストラディオルベ
ンゾェイト20JJgとプロゲステロン2mgを週2回皮下投与した．生後20週で同条件下に両側のsoleusとhamstringを摘出，凍結，薄切し，全筋横断切片を作製した．体重と筋線維径の関係を見ると性腺摘出した雄と雌を比べる時，体重差は残るが径は差がない．また性腺摘出した雄では正常

−92−

表

Effectofgonadectomyandestrogenadministrationonratskeletalmuscle

Body Welgbt

Sex NuⅡ】ber

Control

GX−011GX−EB

Musele Flbre DlaⅢeter（〝）

Typel Type（gI

2A Type28；10403±1654．1±1．0

42．0±1．0

57．5±1．4

‡

10

274±9

50．5±0．9

35．3土0．950．4±1．4‡10394±1154．6±0．642．4±1．052．9±1．2

‡

10

315±8

53．3±0．7

40．6±0．9

53．2土1．1

‡

10

228土6

47．6±0．834．1±1．0

44．2土1．0

♀

10

200±5

47．1±0．9

32．9±0．942．9±1．0

Values are：meanS±SEの雄に比し体重減少は見られないがType2Bが・減少するのが解る．

められる．
性腺摘出後のプロゲステロン投与により，性腺染色はNADH−TR染色，SDH染色，ATPase

摘出のみのGX−Oil群に比し全てのタイプの径の染色，pH9．4，4．5，4．2で行い，タイプ1，2A，2Bの3型を識別同定した．計測はNADH−TR

有意の減少が認められ，タイ701，2Bでは特に高染色標本で行い，100倍の全筋横断合成写真を作製し，それを構成する全ての筋線経のlessorfiber

独投与に比べて，エストロゲン，プロゲステロン

diameterを計測し，数，平均値，標準偏差，中間値及び5〝単位のヒストグラムを作製し，t検定により有意水準5％で有意差を求め比較検討した．

減少が認められた．

度に有意の減少を示す．また，プロゲステロン単同時投与では全タイプにさらに高度に有意の径の性腺摘出後のエストロゲン・プロゲステロン同時投与効果をエストロゲン単独投与やプロゲステ
ロン単独投与の効果と比較して見ると，タイプ1

結果ではエストロゲン（EB）群とプロゲステロン（P）

雄の骨格筋に対する性腺摘出の影響を各タイプ
別の径の変化で見ると，タイ701では性腺を摘出
しごま油のみ投与したGX−Oil群では性腺摘出の後変化が見られず，タイプ2Aでも性腺摘出により変化ない．タイプ2Bは性腺摘出GX−Oil群で高度に有意に減少する．
雌の骨格筋に対する性腺摘出，プロゲステロン
及びエストロゲン，プロゲステロン投与の影響を
各タイプ別の径の変化で見ると性腺摘出のみの
GX−Oil群は，タイプ1で有意にタイ702Aでは群が同程度に有意の径の減少を示し，EB＋P群
はさらに高度な減少を示す．Type2Aではエスト
ロゲン単独EB群とエストロゲン，プロゲステロン同時投与のEB＋P群がP群に比し高度に減少している．Type2Bではいずれの群も高度に有意な径の減少を示し，同時投与のEB＋P群が最も高度で，つづいてEB群，P群の順となる．
筋線維数およびType別の構成比率を各種の処
置，ホルモン投与群問で比較したが，Ham−
String，SOleusともに有意な差異を認めない．

高度に有意にタイプ2Bでは有意に径の増大が認
ー93−

考

た性腺摘出した雄ではほとんど体重の減少は見ら察

本実験の結果をまとめると，先ず第一に雄の骨格筋線経に対するテストステロンの影響は性腺摘出すなわち生理的に存在するテストステロンの除れないが，Type2Bを中心とする筋線維径の著明な減少が見られた．こうしたことは一般的な体重増減とは直接関係のない機序で性ホルモンが筋線

去によって，Typel，2Aには変化をきたさない経に影響を与えていることを示している．ケリー

が，Type2Bすなわちfasttwitchwhiteあるいらは1985年にモルモットの側頭筋における観察はfastglicolytic typeの筋線経の径が著明に減少した．

oxidative glicolytic）からType2B（fast

第二に雌の性腺摘出による生理的に存在するエでテストステロンの投与はType2A（fastストロゲン，プロゲステロンの除去は全てのタイ

glycolitic）fiberへの移行を促し，甲状腺ホルモンの作用と類似していることを指摘している．しプの筋線推径の殊にType2Aすなわちfast

かしながら今回の実験結果は性ホルモンの影響は

twitchredあるいは0Ⅹidativeglycolitic筋の径

筋線維数ではなくその径の増大，減少という形で，の増大を持たらす．

現れることを明らかにした．

第三に雌の骨格筋線経に対するエストロゲン，
文

プロゲステロン及び両剤同時投与の影響としては，

献

両ホルモンの単独投与により全てのタイプの筋線

1）Kochakian CD：Definition of androgens and

推径の減少が見られ，両剤の併用によって加算的に著明な減少が認められた．

proteinanabolicsteroids．Pharmac Therap B
Voll．No2，PergamonPress，1975，149−177．

第四に筋線維総数，タイプ別構成比率は性腺摘

2）Max SR：Effects ofestrogen on denervated

出，テストステロン，エストロゲン，プロゲステ
ロンなどの投与により影響を受けなかった．
テストステロン類似体がanabolicdrugとしてまたエストロゲン剤が畜産業に広く用いられているにもかかわらず性ホルモンの動物や培養筋組織

muscle．JNeurochemistry36：1077−1082，1981．
3）PeterJB，BarnardVR，EdgertonVR，Gillespie
CA and StempelKE：Metabolic profiles ofthreefibertypesofskeletalmuscleinguinea
pigsandrabbits．Biochemistryll：2627，1972．
4）SuzukiSetal：Long−termeffectsofestrogen
On ratSkeletalmuscle．Experimental Neurol・
Ogy87：291−299，1985．

に対する作用の研究は多くない．性ホルモンの骨格筋に対する影響はこれまでしばしばanabolic
な作用による体重増大に基づく2次的な現象に過ぎないのではないかという議論がなされてきた．
然しながら今回の実験結果は体重増減と筋線維数の増減分化の間には関係のないことを示唆してい5）TrenkleA：Theanaboliceffectofestrogenson
nitrogenmetabolismofgrowingandfinishing
Cattleandsheep．In ttAnabolicAgentsinAni−

る．即ち性腺摘出により雌の体重増加が起こるが依然雄との体重差が残るにもかかわらず筋線維数や径，typeなどにはほとんど差は見られない．まー94−

malProduction

（edby

Lu

FC，RendelJ），

Stuttgart，Georg Thieme Publishers，1976，
pp79−88．

14）脱神経による筋芽細胞増殖促進因子への影響
高 瀬 貞 夫＊

研究協力者

小 林 和 夫＊は じめに個培養し（DMEM99％，牛胎児血清1％，Penici1−
1in20単位／ml，Streptomycin20JLg／ml，Fung−
izoneO．5／Jg／ml），24時間後筋抽出液を含む培養液（DMEM99．6％，牛胎児血清0．4％，筋抽出液1．35−2．1％，Penicillin20単位／ml，Strept0−

我々はこれまで本班会議において，筋損傷後の筋再生を賦活化させる因子について研究を行ってきた結果，筋損傷6〜48時間（12時間に最大）の筋組織中に筋芽細胞増殖促進因子（分子量96Kの蛋白質）の存在する事がわかった1）．今回は筋芽細胞増殖促進因子（MPF）が脱神経により，どのように影響を受けるか①非損傷筋，②損傷筋において検討を行った．
対象・方法（1）脱神経筋の作製
250gウィスター系雄ラットの一側の坐骨神経を坐骨結節部で切断（5mm切断後近位側を結紫）し，経時的（12時間，1，3，6日後）に前脛骨筋を採取した．対側の脱神経を行わない前脛骨筋を対照とした．
（2）脱神経筋における凍結損傷の作製
ラットの一側の坐骨神経を切断後，直ちに前脛骨筋に液体窒素で20秒間冷却した7gの鉄棒（径7mm）を15秒間押し当てて凍結損傷を加えた．12
時間後に損傷筋を採取した．対側は脱神経せず凍結損傷を加えた前脛骨筋を対照とした．
（3）筋抽出液の作製
採取筋に25W％になるようにPBSを加えてホモジナイズした．凍結融解を3回くり返した後に，18，000gにて30分間遠心し，上清を0．45J∠
フィルターで濾過したものを筋抽出液として用いた．′（4）筋芽細胞増殖の測定
筋芽細胞L6を15mm径シャーレに5−7×104＊東北大学医学部神経内科

mycin20JLg／ml，FungizoneO．5JLg／ml）と取り替え3日間培養した．トリプシンにて細胞浮遊液を作製し，血球計算盤にて細胞数を算出した．各
値は3検体の平均及び標準偏差をもって表した．
（5）採取筋の組織学的検索
脱神経12時間後の損傷筋，非損傷筋の凍結切片標本を作製し，種々の組織化学的染色を行い光顕的に観察した．
結果（1）脱神経後の非損傷筋
脱神経12時間後の非損傷筋におけるMPF活性（×104／dish）は24．17±5．69であり，脱神経を行わないもの（26．50±5．00）と比較し，有意差を認めなかった．脱神経後1日（22．26±5．22，
対照：20．75±2．13），3日（27．50±8．05，対照；32．00±5．29），6日（22．67±6．03，対照；24．
67±4．65）にても有意差を認めなかった（図1）．
（2）脱神経後の損傷筋
脱神経，筋損傷後12時間の損傷筋のMPF活性は53．67±6．81であり，脱神経を行わない損傷筋（55．67±3．79）と有意差を認めなかった．しかし脱神経を行った非損傷筋（29．67±5．03）と比較し著しく（P＜0．01）高値であった（図2）．
（3）組織学的検討
脱神経を行った場合（脱神経12時間後）と行わない場合の損傷筋，非損傷筋において，組織学的な差異はみられなかった（図3）．

−95−

2

3

4

5

▲U

0
2

︵TO；︶忘■P︑芸00

0
4㌻もーと上空P︑三一〇ひ

16tlmo altor donorvoHon tdさyID

図1脱神経筋抽出液による筋芽細胞L6の増殖．実線：脱神経筋，点線；神経支配筋．

Inonln伸OdmuSC一〇D

llnluMd■¶uaClo

図2 脱神経および凍結損傷筋抽出液による筋芽細胞L6の増殖．D；脱神経筋，Ⅰ：神経支配‡乱

図3 脱神経12時間後の筋組級像．脱神経を行った場合（損傷筋；3，非損傷筋；1）と脱神経を行わない場合（損傷筋：4，非損傷筋；2）とで組織学的差異はみられない．（1，2；×50，NADH−
TR染色，3，4；×25，HE染色）

一96−

考

察

ないものと比較し増加する事を報告している8）．
このように筋損傷後の筋芽細胞の増殖に及ぼす脱筋衛星細胞に及ぼす神経性因子の影響について
は，筋再生過程を明らかにする上で，検討してゆかねばならない課題である．1978年McGeachie

神経の影響については，いまだ一定した結果は得られていない．今後，脱神経後より筋損傷を行うまでの期間を考慮して，増殖する筋芽細胞の定量＼やMPF活性を検討してゆく必要があろう．

らは3H−thymidineを用いたオートラジオグラ
フィーの研究より，脱神経後48時間より支配筋の衛星細胞が活性化され，7日後に最大となり，その後減少する事を指摘している2）3）．小口らも同様に脱神経後48時間に衛星細胞が活性化される事を報告している4）．1971年Thompsonは骨格筋の自家移植において，前もって脱神経をしていた筋を移植した場合により成功しやすい事を報告し，脱神経による筋再生の既活化の可能性を指摘し
た5）．

ま

と

め

脱神経による支配筋の筋芽細胞増殖促進因子（MPF）に及ぼす影響について検討した結果，①脱神経後経時的に採取した支配筋のMPF活性は，脱神経を行わないものと比較し有意の差を認めなかった．
②脱神経，筋損傷後12時間の損傷筋のMPF活性は，脱神経しない損傷筋と比較し，有意差を認めなかった．しかし脱神経を行った非損傷筋と比較し著しく高値であった．

しかしながら今回の実験では脱神経後経時的にMPF活性を検討したが，脱神経によるMPFの活性化は認められなかった．この結果とMcGea＿
Chieらのオートラジオグラフィーの結果より考えると，脱神経後一過性に衛星細胞が活性化されるのはMPFによるものではなく，おそらく抑制
性の神経因子が断たれたための一過性の衛星細胞の活性化であり，脱神経は筋の増殖をひきおこす

以上より，損傷筋及び非損傷筋中に存在する筋芽細胞増殖促進因子は脱神経の影響を受けない事がわかった．

ものではないと推察される．このように考えると，
臨床病理学的に脱神経筋組織において，一部にR

1）小林和夫，高瀬貞夫はか：実験的再生筋における筋芽細胞増殖促進因子の研究．臨床神経27：

文

NAに富む賦活化された筋線椎を認めるが6），一般的に筋芽細胞の増殖や再生線経がみられないという事実も理解し易いと思われる．

献

1602，1987．

2）McGeachieJandAllbrookD：Cellprolifera−
tioninskeletalmuscle followingdenervation

一方筋損傷後の再生過程（①筋芽細胞の増殖，②筋線経の分化）が脱神経にどのように影響をう
けるかも検討すべき重要な課題である．脱神経により筋線経の分化が障害を受ける事は従来より指摘されているが，筋芽細胞の増殖が脱神経によりOrtenOtOmy・CellTissRes193：259L267，1978．
3）McGeachieJandGroundsMD：CellproliferaT
tionin denervated skeletalmuscle；Doesit
provideapoolofpotentialcircuratingmyob−
lasts？BiblthcaAnat29‥173−193，1986．

どのように影響されるか検討した報告は少ない．
木下らは脱神経後に筋損傷を行った場合，損傷3日までの筋芽細胞の増殖は，脱神経を行わないものと同様に著しい事を報告している7）．今回の我々の実験でも，脱神経と筋損傷を同時に行い12時間後のMPF活性をしらべたが，脱神経による影響はみられなかった．

4）小口喜三夫，羽生憲直ほか；神経切断による衛星
細胞の活性化について一光顕オートラジオグラ
フィーによる検討−【厚生省神経疾患研究委託
費・筋ジストロフィー症の発生機序に関する臨床研究（三好班）昭和57年度研究報告書 1983，
pp44−47．
5）Thompson

しかしCernyらは脱神経後に筋損傷を加え，3日後の筋組織所見について，筋芽細胞が脱神経しー97−

N‥Aotogenous

free

graftsof

Skeletalmuscle・PlasticreconstrSurg48‥11−

27，1971．

6）PerlDP

andLittleBW：Acridine

orange￣8）Cerny LC and Bandman E：Expression of

Nucleic acid fluorescence，Its usein routine

myosinheavychainisoformsinregenerating

diagnosticmusclebiopsies・ArchNeuro137：

myotubes ofinnervated and denervated641−644，1980．

chickenpectoralmuscle・Dev Biol119：350，

7）木下真男，川崎研一：神経支配の筋線推再生に及ぼす影響．臨床神経18：16−21，1978．

一98−

362，1987．

15）骨格筋の移植に問する研究
1）ヌードマウスに移植後の再生筋の収縮特性
2）再生筋の由来
寺 尾．寿 夫＊
研究協力者

高

津

成

美＊

加

藤

洋

司＊

岡

下

恭

子＊

永 井 由紀子＊ 弘 中 哲 治＊＊ 五十里 良 生＊＊

は じめに
我々は骨格筋の移植について研究しているが，今回の研究は次の3つに要約できる．

tensionは100Hz31回の刺激を行った．
3）Dystrophin抗体による染色まず昨年度と同様の方法でmdxとC57BLの1）ヌードマウスにmdxマウスとC57BL／10

EDLの交換移植を行った．交換移植後1，2，3

ScSn（以下単にC57BL）の長指伸節（EDL）を移植し，その再生筋の収縮力の経時的測定．2）
dystrophin抗体による移植後の再生筋の由来についての研究．3）inlaygraft後の再生筋の長期観察．
方法

ケ月に取り出し，クリオスタットで6〟の切片を作製した．切片は2％BSAと，5％熟不活性化ヤ
ギ血清を含むPBSでpreincubate L，その後，
37℃2時間抗dystrophin抗体（1／300）中でincu−
bateした．その後FITCラベルの抗ウサギIgG
ヤギ抗体で45分室温でincubateした後，蛍光顕

1）ヌードマウスへの移植

微鏡を用いて観察した（精神神経センター，杉田・荒畑先生に依頼）．

ヌードマウスは生後2ヶ月のものを使用し，ヌードマウスのEDLを取り去った後に，mdxとC57BL（生後2ヶ月）のEDLを移植した．この際，近位端は固定し，遠位端は残っているhostの

4）1nraygrdft

2g以上の重量を有する比較的大型筋の移植では，血流の途絶により許aft中心部の再生が不良

EDLの腱の断端に国定した．移植後1ヶ月，2ヶ月，4ヶ月で再生筋の直接電気刺激を行い収縮特性を測定した後，これを取り出しクリオスタット
でcross−SeCtionを作り，HLE染色後最大直径部
断面の写真撮影を行い，その断面積を測定した．
2）再生筋の電気刺激である．これを防ぐためinlaygraftを行った．ネコを用いて前脛骨筋の一部を細い有茎のgraftとして，その先端をEDLのfreegraftの中心部に埋め込んだ．1年後にinlaygraftを行ったEDLを取り出し，再生状態を他側に行った単なるfree
graftの再生筋と比較した．

ヌードマウス内での再生筋の電気刺激はinVivoで行い，38℃のパラフィンプール中で白金電極を用いて筋の直接刺激を行った．twitch ten＿

結果1．ヌードマウスへの移植後の再生筋の組織学的特徴
1）再生筋線経の数

Sionの測定には0．2msecのsupramaximal
Squarepulseを使用して刺激を行い，またtetanic＊帝京大学医学部第一内科＊＊帝京大学医学部薬理移植後1ヶ月〜4ヶ月までの間，mdxの再生筋中の筋線維数はC57BLの再生筋中のそれよりも常に多い値を示していた．又時間の経過と共にー99−表1ContrActilepropertiesofregeneratednormal（C57BL／10Sc）anddystrophic（mdx）EDLinnudemouse
2months afteT tranSPIantation

Regenerated

Non−treatedNorm a川 2） lDYStrO帥k （12）

Norm al （9）

D vstro帥ic （10）

Tw itch tension （
g）

」
4．
4±0．
7

＊
l＊
＿
」
2．
8±1．
2

1．
7±0．
7

1．
9±0 ．
9

Tetanic tension （
9）

14 ．
5±2．
8

13 ．
6 ±4 ．
3

4．
13±1．
4

3．
0 ±0．
6

134 ．
8 ±56．
6130．
9±46 ．
2100 ．
7±40 ．
2

Tw jtch tension／（g／cm 2） 192．
2±57 ．
4
area of m usle section」
Tetanictension／（g／cm 2） 690モ 聖area of m uscle sectl0n

＊
・
．
・
．
・
．
・
・
− 」
量
竺 望
52 ・
6 385．
9±132．
9266．
9±80 ．
0
＊
一
・
・
・
・
・
一
一
・
・
・
・
・
」
l

C ontraction tjme
（
m．
sec．
）

15．
5 ±2 ．
8

13．
4±1．
5

20．
8 ±3 ．
1

21．
9 ±4 ．
3

Half−
reIaxation （
tm
im．
esec．
）

29 ．
1±3 ．
7

17．
6 ±3．
9

32 ．
5±9．
6

30 ．
2±8．
5

＊P＜8．85

表2＊＊P＜0．川5n＝（）Contractilepropertiesofregeneratednormal（C57BL／10Sc）anddystrophic（mdx）EDLinnudemouse
4months after transplantation

Regenerated川） tDYStr叫Iic（10）
DYStrOPhic （7） N orm al（Non−treatedNorm at （6）
T w ich tension （
g）

4．
4±1．
0

3．
4±1．
0

1．
5±0 ．
4

1．
3±0 ．
3

Tetanic tensi
on （
g）

19．
3±4．
7

18．
0±5．
1

3．
3±1．
3

3．
1±0 ．
6

Tw itch tension／（g／cm 2） 189．
9±44 ．
7

146 ．
8±10．
3

area ofm uscl
e section
Tetanjc tension／（g／cm 2） 798 ．
9 ±115．
1738 ．
5±77 ．
8

137．
」
3±5．
2 ＊
＊
一
・
79
一
一一
．
0±
」14．
7
335空

也

聖 二
讐

・
1

area ofm uscIe sectionContraction time
（
m．
sec．
） 25 ．
8 ±2 ．
5

19 ．
3±2．
1

28．
0±3．
2

27．
7±5．
8

Hal
fィel
axation t（i汀mLSeC．
e） 30 ．
5±0 ．
8

24 ．
7±1．
7

32 ．
6±3．
2

26 ．
6 ±3 ．
4＊＊P＜0．005

4ヶ月までは再生筋線経の数は減少する傾向にあった．
2）再生筋線経の直径
ヌードマウス中でのmdxのEDLの再生筋線
経の直径はC57BLのそれに比し，有意に小さかった．
3）再生筋線経の直径の変動係数

n＝（）

再生筋線経の直径のバラツキを示す変動係数は，
移植後4ヶ月間の全期間を通じ，mdxの再生筋の方が大きかった．とくに4ヶ月目ではその差は有意であった（P＜0．05）．
2．再生筋の電気刺激
表1は移植後2ヶ月の再生筋の直接刺激による収縮特性を示したものである．移植前のEDLで−100一

図1Dystrophin抗体による再生筋の染色（移植後2カ月）．左半分はC57BLのEDLをmdxに移植した後の再生乱 右半分はmdxのEDLをC57BLに移植後の再生筋を示す．

もmdx

はC57BLより単位断面積当たりのtwichtension，tetanictensionともに低かった．
また再生筋においても，単位断面積当たりのtetanic tensionはmdxの再生筋の方がC57BLのそれより有意に低かった（P＜0．05）．
表2は移植後4ヶ月目の収縮特性を示している．
再生筋の単位断面積当たりのtwitch tension，
tetanic tension

はともにmdxの再生筋はC57

BLのそれより有意に低かった（P＜0．005）．

されたが，逆にdonorがmdxの場合は蛍光は全くみられなかった．この事実は再生筋線経がdonor由来であることを示している．
DonorのEDLがC57BLの場合は蛍光陽性の線経はgraft 中の再生筋線椎に限られ，hostのmdx側の線経は全く染色されず，明確な対比をなす（図2）．しかし少数ではあるが，host側に1本または島状に数本の蛍光陽性の線経が散見されることがあり，hybrid形成を思わせた．

3．再生筋線経の由来

4．lnlay graft

mdxマウスとC57BLマウスの間にEDLの昨年度も報告した如く，ネコのEDLのfree交換移植を行い，1〜3ヶ月後に取り出しdystro−graftは一時的な血流の遮断により，その中心部は壊死となり空洞が形成されることが多い．これ

phin抗体で染色した．図1は交換移植後2ヶ月で取り出したもので，図の左半分はmdxのhostに
C57BLのEDLを移植した再生筋線経であり，に前脛骨筋から細いInlaygraftを埋め込むと，空洞形成が防がれる．このようなInlaygraft後の再右半分は逆にC57BLのhostにmdxのEDLを生筋を1年間追跡した．図3は1年目のinlay

移植した後の再生筋である．この図で明らかなようにdonorがC57BLの場合には再生筋線経は筋graftを示すが，このように大きい筋が形成されている．また神経も元の位置にかなり大きな線維

細胞膜を中心にdystrophin抗体により良く染色となって再生しているのがみられた．再生筋の重−101−

図2Dystrophin抗体による再生筋の染色（移植後2カ月）・C57BLのEDLをmdxに移植Lたもので訂aft部分のみに螢光がみられる． 周辺の螢光陰性の部分はhost側である．
J、

J

／7、一′

．．

」」．＿

＿．

量でみると，移植前のEDLが平均2．12±0．05g

が明らかになった．もっとも今回使用したmdxあったのに対し，1年後のinlaygraft側のEDLのEDLは生後2ヶ月目のもので，この時点のは1・63±0・25g，freegraftl．21±0．06gでありEDLは主として再生筋線経より成るため，その移（各々3例），in1ay側がfree側より有意に大きか

植筋は再々生の過程をとることになる．この点にった・またATPase，DPNH染色では両者とも関しては，より幼若なmdxマウスの筋の移植実験による確認が必要である．

typel，tyPe2線椎の再分化が明瞭にみられた．
筋線経の直径はinlay側がやや大きい傾向があるが，例数を増し検討中である．
考移植された筋は一旦壊死におちいった後に，
myoblastの分裂により新しい筋線経が形成されてくることが知られている．筋再生時のmyoblastの由来についてはdonor由来とする説とhost側察

ヌードマウスにmdxマウスまたはC57BLマから遊走してくるという説3）がある．

ウスのEDLを移植した場合，それらが新しい

我々はかつてヌードマウスにヒト筋を移植し，host内で良く再生することは既に報告した1）2）．そその再生筋線椎を抗ヒトミオシン抗体で染色して，の再生筋線経はdonorの筋の性質を引きついで

再生筋線経がすべて蛍光を発することを観察し，いる．mdxのEDLの再生筋線経はC57BLのそ再生筋線椎はヒト筋由来すなわちdonor由来でれに比べ，直径が小さく，その変動係数が大きく，
またその数が多いというmdxのEDLの本来のBLマウスのEDL交換移植後の再生筋について性質を保っているようにみえる．今回の研究ではのdystrophin抗体による染色の結果は，再生筋線

その収縮力もC57BLの再生筋より小さいこと

経がdonor由来であることを再確認したものとあることを証明した4）．今回のmdxマウスとC57

−102−

結

語

今回の研究で得られた結果をまとめると次の如

くなる．
1）ヌードマウスにmdxマウスとC57BLマ
ウスのEDLを移植した．4ヶ月までの再生筋にっきその収縮特性を筋の直接刺激で観察した．その結果，mdxのEDLの再生筋の収縮力はC57
BLのそれより小さいことが明らかになった．
2）mdxマウスとC57BLの間にEDLの交
換移植を行い，その再生筋をdystrophin抗体で染めるとdonorがC57BLの再生筋では良く染色されるが，mdxがdonorの時は全く染色されなかった．これは再生筋がdonorのmyoblastに由来することを示している．
3）ネコのEDLを用いてinlay graftを行い，その再生状態を移植後1年を経て観察した．Inlay
graftを行ったEDLはfreegraftのEDL再生筋
より重量が重く，再生状態は良好であった．
本研究のdystrophin抗体による再生筋の染色を行っていただいた国立精神神経センターの杉田
図3

ネコEDLのinlaygraft後1年目の再生筋．筋

秀夫先生，荒畑喜一先生に感謝の意を表します．

の再生は良好でinlayされた前脛骨筋の一部もそのまま保たれている．

文献1）寺尾寿夫，高津成美，平口峰子：ジストロフィー
ハムスターと正常ハムスター間の筋の交換移植考えられる．最近Lawら5）6）は正常のmyoblastをについての研究（第3報）およびmdxマウスの幼君なジストロフィー筋に注入し，その再生筋を

骨格筋のヌードマウスへの移植についての研究．
厚生省神経疾患・筋ジストロフィー症の臨床，

みると正常とジストロフィーの部分よりなるモザ

病態と成因に関する研究（杉田姓）昭和59年度研

イック状の線経が形成されると報告している．

究報告書 ，1985，pp249−259．

我々の移植実験では，再生筋は明瞭にdonor由来
であることを示していたが，graft周辺でhybrid2）寺尾寿夫，高津成美，平口峰子，加藤洋司，永井形成と思わせる線経が少数存在していたことは興由紀子：ジストロフィー筋の再生と種々の萎縮

味深い．

筋中の遊稚アミノ酸の変動．■ 厚生省神経疾患・筋ジストロフィー症の臨床，病態と成因に関する研最後にinlaygraftの結果であるが，1年後ではinlaygraftを受けたEDLは大きく発達しており，

究（杉田班）昭和60年度研究報告書

inlay側のEDLの方がfree graft側のそれより

pp162−165．

，1986，

有意に大きかった．Inlayによる移植初期の血流

3）SloperJ C，Bateson R B and Warren HJ：の確保が1年後の筋の再生状態にも影響している

Muscle regenerationin man and the mouse：

ことを示している．

evidencederivedfromtissuecultureandfrom
the evolution of experimental and surglCal−103−

1979，pp95−101．

injuriesin theirradiated and non−irradiatedsubject．t

Regenerationofstriatedmuscle，and

5）LawPKandYapJL：Newmuscletransplantal）method produces normal twitch tensionin

Excerpta Medica，Amsterdam，1970，pp157−

dystrophicmuscle．MuscleandNerve2：356−

164．

363，1979．

myogenesis（edited

by

Mauro

A

et

4）寺尾寿夫，稲垣直，近藤行男，大沢仲昭：ジスト

6）Law P K，Goodwin T G and Wang M G：

ロフィー筋肉のヌードマウスへの異種移植に関Normal myoblastinjections provide genetic

する研究M厚生省神経疾患・筋ジストロフィー症

treatment for murine dystrophy．Muscle andの基礎的研究（江橋蛙）昭和53年度研究報告書

Nervell：525−533，1988．

ー104−16）骨格筋とかレシトニン遺伝子問連ペプチドに問する研究−その受容体とシグナル伝達の解析を中心として−
高 守 正 治＊研究協力者

吉 川 弘 明＊

筋疾患の病態を明らかにするうえで，筋のneurotrophic factorについて検討することは重要な問題の一つである．Neurotrophicfactorの候補としてDrachmanら1）はアセテルコ））ン（ACh）を重要視しているが近年多くのニューロンにおいて古典的神経伝達物質とニューロペプ
チドが共有することが知られるようになり，神経終末部においてもAChにカルシトニン遺伝子関連ペ7サド（Calcitoningene−related peptide，
CGRP）が共存することが明らかにされた．
CGRPは37個のアミノ酸よりなる分子量約3800のペプチドで，Calcitonin遺伝子上にオーバーラ
ップしてコードされており，mRNAのスプライ
シングの過程でCGRPとcalcitoninの2種類のmRNAが作られそれぞれの蛋白が臓器特異的に発現する2）．著者らは筋膜上のCGRPとシグナ
ル伝達機構の解析をレセプター結合実験と電気生の関与を見るためにはMgC12（25mM）存在下にGTPγS（100JLM）を添加し，CGRP結合部位の親和性の変化を見た．
2．電気生理実験
ウィスター系雄ラット横隔膜神経筋標本を等尺張力系にセットし，ガス（02：CO2＝95：5）負荷
リンゲル液（122mM NaCl，4．7mM KCl，
15．5mM NaHCO3，1．2mM MgCl2，1．2mM
KH2PO。，2．6mM CaCl2，11．5mM glucose；筋内神経線絶刺激の可能性を除去するため6FLg／mlのD−tubocurarine chloride添加）にて濯
流しつつ白金電極により，0．5msecの矩形波にて筋を直接刺激した．単収縮張力（Pt）とその一次微分（dPt／dt，時定数30msec），二次微分（d2Pt／
dt2，時定数1msec），時間要素（Tl′2R，T。Pt′。t），
強縮張力（Po）を指標（図2参照）として濯流液
にCGRP（10￣7M）を負荷した場合の変化を検討

理実験を用いて行いneurotrophic factorの−つとしてCGRPの重要性を示す知見を得た．

した．次にテオフイリン（2×10￣3M）負荷リンゲ
ル液にて濯流した場合，コレラ毒素（10￣7M）にて1時間処理した横隔膜標本を用いた場合，摘出3

材料及び方法日前に百日咳毒素（5Jg／kg）を静脈内投与したラットから得た横隔膜標本を用いた場合についても検討した．さらに微小電極を用い静止膜電位，
刺入抵抗を測定，またDantrolene sodium（20

1．レセプター結合実験
ウィスター系雄ラット下肢筋を一晩臭化リチウ
ム処理した後，超遠心，ショ糖密度勾配遠心にて筋膜標本を分社した3）．この筋膜標本について〔125I〕−CGRPとCGRPを用いたbinding
Study，displacement studyを行った．結果はScatchard解析をして結合パラメーターを求めた．
CGRP結合部位へのGTP結合蛋白質（G蛋白質）

JLg／ml）で筋収縮を，D−tubocurarinchloride（6〝g／ml）で神経刺激を阻止した状態下で，筋直接刺激による誘発筋活動電位およびその一次微分（dV／dt，時定数30msec）を記録し，膜レベルにおよぼすCGRP（10，7M）の影響を検討した．

＊金沢大学医学部神経内科

ー105−

A

結

果

8
■ U
0

Displacement studyにては筋膜標本上にCGRP特異的結合部位があることが示された（図

8
0
0
6

1A）．Bindingstudyの結果をScatchard解析
すると，この高親和性結合部位は−種類のもので結合パラメーターはKd＝6．3nM，Bmax＝94

04

胃とUOu−q−U召し邑︶

空っ⊆q詰りUTL掌り中臣

1．レセプター結合実験

ク ー

0

12

11

10

9

8

7

図1A Specificityof【125I］−CGRPbinding．Displace−
mentofl125I］TCGRPbindingbynonradioac−

tive CGRPin the sarcolemmalmembrane．
ValuesrepresentmeansofduplicatedeterT
minations．

fmol／mgproteinであることがわかった（図1
B）．MgC12（25mM）存在下にGTPγS（100JJM）を添加すると，CGRPに対する筋膜標本の親和性は著明に低下した（図1C）．
2．電気生理実験
CGRP含有濯流液で10分間処理すると筋標本の単収縮張力（Pt）は濯流前に比べて増強し，二次微分ピーク値（d2Pt／dt2）の増大と時間要素（T。Pt′。t，Tl，2R）の延長を伴っていた（図2，表1）．しかし強縮張力（Po）には変化は認められなかった（図2，表1）．テオフイリンも単収縮張力（Pt）を増強させたが，CGRPとの併用によりその効果はさらに増大した，（図3，表2）．コレラ
毒素処理筋にてはCGRPは単収縮張力（Pt）をさらに大きく増強したが，百日咳毒素処理筋では
CGRP添加前後で特に変化は見られなかった（図5080UND（Im。l／mgp仰e山

図1B Scatchardplotsofl125Ⅰ1−CGRPbindingin
thesarcolemmalmembrane・Eachpointisthemeanofduplicatedeterminations・
05

示された（図4）．
0

C︿∪一言Ld言−︒∈こPUコ︒三日等tこ3，表2）．以上の薬理学的修飾において強縮張力（Po）にはいずれも変化は認められなかった（図3，表2）．静止膜電位，刺入抵抗，直接刺激誘発
活動電位とその一次微分（dV／dt）はいずれも
CGRPの影響を受けず，筋張力の変化が筋表面膜レベルの修飾による二次的なものでは無いことが考察

thepresenceorabsenceofGTPγS（100pM）・

者はまずレセプター結合実験にて筋膜上に高親和

MgC12（25mM）wasaddedtotheassaytube

性CGRP特異的結合部位があることそ示した．結合パラメーターは神経伝達物質として妥当な値であり5），他臓器におけるCGRP結合実験にても同

5

図1C Affinityspecificforl125I］−CGRPbindingin

CGRPが骨格筋を支配する神経終末部にAChとともに存在することはすでに知られていたが4），
その骨格筋の受容体，細胞内への情報転換機構についてはまったく知られておらず，さらに生理作用についても十分明らかにされていなかった．著

0

0．1

0．2

0・3

0・4

0・5

tominimizethedissociationofGTPTSfrom
theα−SubunitofGsprotein．

−106−controI CGRP（10−TM）

暫9

瓢S。。
﹂

八日目．1．．．二dPt／dt

2

dt
／
Pt

JU

声価恥S。

tog

払S。。
図2Isometrictwitch（Pt）andtetanus（Po）analyzedbydifferentiationsincontrolandCGRP（10−7M）−treatedmuscle・Measurementsofeachoftheactivestatepropertiesaredepicted・Contractileresponseswere
elictedbymassivestimulationinthesolutioncontainingD−tubocurarinechloride（6ILg／ml）．Twitchpoten−
tiationbylOminimmersionwithCGRPwasassociatedwithincreasedd2pt′dt2・andprolongationof
TdPt′dtandTl／2R・NoalterationwasinducedinPobyCGRP．

様な値を取っている6）．さらに，MgC12存在下の
GTPγS添加実験7）によりこの高親和性CGRP結合部位にはG蛋白質がカップリングしていることが明らかとなった．以上より，筋膜上のCGRP結合部位はG蛋白質にカッ70））ングしたCGRP受
容体と考えられた．

張力をその張力発生加速度と時間要素の変化を伴って増強したが，強縮張力には影響はなく，微小電極を用いた筋膜のCable propertyの評価においても変化はなかった．よってCGRPが筋膜の脱分極反応に修飾を与える事無く，aCtive state

次に筋張力に注目しCGRPの生理作用についintensityofshorteningの増強とactive state時
間要素の延長をもたらすことがあさらかとなった．

て検討した．濯流液中へのCGRP添加は，単収縮

Active stateの概念8）にもとづくとこれらの結果

一107−

表1Effect。fCGRP（10−7M）Onactivestatepropertiesdetermenedbytwitchanalysis，eXpreSSed
inpercentofthepre−treatedlevels・Pt

dPt／dt

105土2

d2pt／dt2

110土2

TdPt／dt

105土3

Tl′2R

109土5

113土7

Means土S．D．valuesareindicated；7musclesweretested．

EffectofCGRPonpassiveandactivemusclemembraneprOPertiesc。ntrOl CGRP（16−7M）
RestingmembranepotentiaL（mV）

Lnputresistance（Mn）

77土2．3（n：20）

0．18土0．06（汀20）

77士2．3（n：20）

0．18士0．07（Ⅳ20）（mean土S．D．）

DirectJyelicitedactionpotential
andfirstderivative（dV／dt）

IlOmV

tv／100ms

：

図4

：4mS

PassiveandactivemembranepropertiesincontrolandCGRP−treatedmuscle・Muscleactionpotential
anditsIstderivative（dV／dt），directlyelictedinDantrolenesodium−COntaingsolution（20ILg／ml），areShownasexamplesofresultsfrom15fibersineachmuscle・CablepropertieswereallunaffectedbyCGRP・

表2

EffectsofpharmacologiCagentsontwitch（Pt），eXpreSSedinpercentofthepre−treatedlevels．

CGRP（1077M）andtheophylline（2×10￣3M）

125±2＊
112±3＊＊

theophylline（2×10￣3M）alone

CGRP（1077M）andcholeratoxin（10−7M）
CGRP（10−M）andpertussistoxin（IAP）（5FLg／kg）

130±1＊＊＊
105±2＊＊＊＊

means±S．D．valuesareindicated；6musClesweretestedforeach・＊morepotentiatdthanCGRPortheophy11inealone（p＜0・001）；＊＊lesspotentiatedthanCGRPplustheophylline（p＜0・001）；＊＊＊morepotentiatedthanCGRPalone（p＜0・001）；＊＊＊＊notsignificantlydifferentfromCGRPalone・−108−

CGRPandControI CGRP（1d．TM）

Theophyine（2xlO

JM）

暫9

訊se。

上0g

払se。
ControlchoreratoxinlO−TM，1hr．）CGRP（10￣TM）

fog

おmse。

（pretre豊蒜kg）CGRP（10TTM）

1109
：

：

400msec

図3

Alterationsoftwitch（Pt）bypharmacologiC
manlpulations to modify CGRP effect．The
CGRP−inducedPtpotentiationwasaugmented
bytheophyllineandcholeratoxin，butwasnot
modifiedbypertussistoxin（IAP）・Nochange
WaSSeenintetanus（Po）．

一109−

はCGRPが興奮収縮連関に作用し筋張力を増強

2）AmaraSG，JonasVetal：AltemativeRNAprocess−

させ，強縮張力で表現されるアクチンーミオシン

inglnCalCitoningeneexpressiongeneratesmRNAs

架橋形成過程には影響を与えないことを意味する．

encodingdifferentpolypeptideproducts・Nature

また，ホスフォジエステラーゼ阻害剤のテオフイ

298：240，1982．

リンはCGRPの筋張力増加作用に相加性があり，

3）MickelsonJRandLouisC：Componentsofpuri−

アデニレートシクラーゼにカップリングした促進

fiedsarcolemmafromporcinskeletalmuscle・Arch

性G蛋白質（Gs）を持続的に活性化するコレラ毒

BiochemBiophys242：112，1985・

素もCGRPの筋張力増加作用に相加性があった

4）TakamiK，KawaiYetal：EffectofcalCitoningeneTが，抑制性G蛋白質（Gi）を介する情報伝達を遮

relatedpeptideofcontractionofstriatedmuscle

断する百日咳毒素はCGRPの効果に何ら影響をinthemouse．NeurosciLett60：227，1985．

与えなかったことより，レセプター結合実験で存5）HardenTK，WolfeBBetal：Bindingofiodinated在が示されたG蛋白質はGsであり，CGRPはセ

betaadrenerglCantagOniststoproteinsderived

カンドメッセンジャーとしてcAMPを介するもfromratheart．MoIPharmaCOl12：1，1976．
6）NakamatsuH，FukudaYetal：Bindingsitesofcal−のと考えられた．
以上より，CGRPは馴莫上の「特異的受容体・

citoningene−relatedpeptide（CGRP）：Abundantoc−

Gs・アデニレートシクラーゼ」という情報転換ユ

currenceinvisceralograns．JapanJPharmaco142：

ニットを介して興奮収縮連関を修飾することによ

175，1986．

り筋張力を増強することがわかった．今後CGRP

7）HigashijimaT，FergusonKMetal＝Effectsof

Mg2＋andtheβrsubunitcomplexontheinterac−は骨格筋のneurotrophic factorの一つとして注目していく必要があると思われる．

tionsofguaninenucleotideswithGproteins・JBioIChem262：762，1987．

文

献8）TakamoriM，HazamaRetal‥Activestateproper−

tiesofdenervatedandimmobilizedmuscle：COm−

1）PestronkA，DrachmanDBetal：Cholinergictrans−parisonwithdystrophicmuscle・Neurology28：603・

mission regurates extrajunctionalacetylcholine

1978．

receptors．ExpNeuro170：690，1980・

一110−17）ヒト培養筋細胞のナトリウム及びカルシウムチャンネルの発達に問する検討
塚
研究協力者

小

林

高

越

義＊

贋＊
宮

崎

弘＊

道

川

誠＊

一般に骨格筋細胞のNa channelは，innerva−
tionによりtetrodotoxin（TTX）感受性channnelが増加し，除神経によりTTX抵抗性channelがml，epidermalgrowthfactor（EGF）10ng／ml，
insulinlOJLg／mlの組成のものを使用．脊髄との併置培養は，筋単独培養液に最終濃度としてぶどう増加することが知られている．一方，幼君な培養
鶏あるいはラット骨格筋細胞では，機能的なCa
ChannelのSlowcomponent（Ca−SC）が早い活動
電位（Ap）の後に存在することが知られ七いるが，ヒト培養筋細胞では，これらのChannelの発達に関して未だ明らかではない．種々の神経筋疾
患でNa及びCa channelなどに異常があるかど

糖6g／1を入れ，FGF，EGFを除いた液を使用した．電気生理学的検討では，3MKClを充鎖した
先端抵抗15−30Mnのガラス管微小電極を使用し，通電及び細胞内記録を行った．かん流液は，うかは，特に筋外膜系及びTsystemの病態生理を知る上で興味が持たれるところである．今回はCOntrOlとして，内因性筋疾患を有しないと考えられたヒト生検筋より培養を行い，筋単独培養筋細胞（AM）及びinnervationさせ持続的に収縮しん流液中で，種々の電気生理学的parameterを測定すると同時に，Nachannelのdensityの指標として活動電位の最大立ち上がり速度（Apdv／dt）ている筋細胞（ICM）のNa及びCachannelに関して検討を行ったので報告する．
材料及び方法16−73歳の神経原性筋萎縮症と診断された11例の生検筋を使用した．Explant−reeXplantation
法（Askanas＆Engel，1975）により筋単独培養を行い，筋芽細胞が融合を始め幼若な筋管細胞が形成されつつある段階の筋単層培養上に，後根神
経節をつけた13日日妊娠ラット（Sprague−Dow−ley）脊髄片を併置培養した1）．筋単独培養液は，
Dulbecco，s mbdifiedEagle，smedium63％，
medium19923％，fetalbovineserum（FBS）

Na150mM，K4，Ca2．2，Mg1．1，glucose
5．6，HepeslO（pI17．2），bovineserumalbumin（BSA）0．1％の組成のものを使用した．通常かを使用し，1JLMTTX添加前，中，及びwashing
Out後のApdv／dtを測定し，実験中細胞の変性がなく，TTX添加前及びwashingout後のAp
dv／dtがほぼ同一となった実験におけるTTX添加
前及び添加中のApdv／dtについて比較検討を行った．また，Ca−SCの出現の有無を早い掃引速度で観察すると同時に10mMBaC12を使用し，Ca
LSCの出現の有無，Ca−SCのdurationなどについて検討を行った．また，Ca−ChannelblockerとしてlJLMnifedipineを使用した．
結果10％，fibroblast growth factor（FGF）25ng／

筋単独培養では，eXplant後一週間位で遊走した筋芽細胞が融合を始め，横径の不規則な筋管細胞が形成された．一方，筋と脊髄との併置培養では，脊髄片を添加させた2日目には神経線推終末＊東京医科歯科大学医学部神経内科を有する筋管細胞よりminiature endoplate
potential及びendoplatepotentialが記録された．
−111−

時に筋収縮の開始する前に自発性活動電位が記録されたが，一般には併置培養10日前後で筋収縮がおこり，これに一致して，自発性活動電位が記録された．筋収縮開始後数日して横紋が形成されるが，このICMは長く，横径は均一であった．
電気生理学的parameterでは，静止膜電位（Er）
はICMで62±1（SEM）mV（n＝34），AMで55±1（n＝71）；活動電位振幅（AmAp）は，ICM
で83±3mV（n＝26），AMで72±1mV（n＝47）；活動電位最大立ち上がり速度（Apdv／dt）は
ICMで224±20V／sec（n＝15），AMで163±

dv／dtがほとんど変化しない細胞が多く存在したが，中には，AM2の如くTTX下で70％位Ap
dv／dtが低下する細胞も存在した．一方，ICMでは図2のCMlで示す如くTTX下で約60％
dv／dtが低下する細胞が存在すると同時に，CM2に示す如くTTX下で完全に活動電位が消失する細胞が15例中6例に存在した．まとめとして，
AMではTTX添加前のAp dv／dtは，126．2±
11．0（SEM）Ⅴ／sec（n＝14），1JJMTTX下では104．6±9．1（n＝14）であり，11．7±1．1％10（n＝45）と，三者ともAMに対しICMで有意ほどTTX下ではAp dv／dtの低下を認め，AMにおいてもTTX感受性Na channelの存在が示に増加し（p＜0．01），一方，刺入抵抗（Rin）は唆された．一方，ICMでは，TTX添加前のICMで9±1．O Mfl（n＝21），AMで14±1

Apdv／dtは，226．5±20．5V／sec（n＝15），1（n＝48）と有意にICMがAMに比し低下していた．

FLMTTX下では57．1±19．8V／sec（n＝15）とl．TTX感受性NachanneJの発達についてなり，TTX添加後Apdv／dtは76．7±7．4％の減少を認めた．このことは，innervation後，有意にAMでは図1のAMlの如きTTX下でApTTX感受性Na channelが増加したことを示し

COntrOl lTXl〃H washout

TTX hJH washout

AMl」」し′■￣￣￣l∝hl封t5血血；三 ‥＿ふ；… ∴ ‥こ．：
dv／戯tv／鎗亡〉

1日

122

捏＼二町、、二世二126

AM2．，Ll一一血／即Y／sec）269
「

186

￣Ⅰ㌔Y

CM2

茎に七三臣二三に上紙
巨二蔓巨二蔓巨二
か／仙V／SC〉 117

83

117

図1筋単独培養筋細胞の活動電位に対するTTXの効果
各々の図の最上段はcurrentを表示．2段目はanodalbreak excitationにより生じる活動電位，3段目は上段の活動電位を早い掃引で表示．
最下段の数値は各々のdv／dtの値を示す．

図2

−112−

脊髄との併置培養で持続的に収縮している培
養筋細胞の活動電位に対するTTXの効果（表示は図1と同じ）ている（p＜0．01）．
ll．Ca−Slowcomponentの検討た．またICMにおいてもAMと同様に10mMBa添加後，Erは脱分極し，durationの長い

図3に示す如くヒト培養筋細胞ではAM，ICM

Ca−SC が出現した（図4）．一方そのCa−SC のとも一般にCaLSCは存在しないが，数％の筋細胞

durationは，AMで2．8±0．4秒（n＝23），ICMにおいて，掃引速度を早くして活動電位をみるとで2．0±0．8（n＝10）であり，有意差はなかっ

10msec以内のdurationを持つCaLSCが認めらた．また，通常かん流液より10mMBaC12液へ変更するとErはAMで56．4±3．4mVから44．1

れた．
一方Baイオンは，Ca channelを通るinward±3．9mVと78．0±5．2％低下し，ICMで66±

Currentを増強させることが知られている2）が，Ca

1．3から48．8±1．6と74．0±2．7％の低下を認め

イオンを除いた10mMBaC12添加の実験では，図た．一一万，Rinは，AMでは，COntrOlで18．7±

4に示す如くBaイオン添加後，刺入抵抗は深く

4．5Mr2，Baイオンかん流中で33．7±10．8Mtl

なり，Erは脱分極し，数秒のdurationを持つCaとなり161．1±15．0％の増加を認めた．

−SCが容易に出現した．また，このCa−SCは1FLM

考

nifedipineで可逆的にblockされCa channel

察を通るinward currとntであることが裏づけられ今回の我々の培養系を使用した研究では，TTX
感受性Na channelがAMにおいても存在してAneura岬C此uredHumanMuscte

いることを示している．一方，Pr6bstle3）らは，ヒ

15nl

mYl

ト生検筋を培養し，筋管細胞からmyoballを作成

rI5∩▲

Lwholecellrecording法によりNachannelの検討を行っているが，彼らのmyoballにおいてもTTX感受性及び抵抗性Na channelが存在する
ことが明らかにされており，培養下ではinnerva−
tionを受ける前でも量は少ないが，TTX感受性
Nachannelが存在していると考えられる．
一方，innervation後，TTXによって完全に消失する活動電位が出現し，また統計学的には，

lnnerYatedContractingHumanMuscle」＿＿「一卸TTX添加後Ap dv／dtが76％ほど低下し有意に

ⅠSn▲
mvl

「

TTX感受性Nachannelが増加した．このことか
ら，TTX感受性Nachannelの発達には，培養下でもinnervationが重要な役割を果していると考えられる．Neuronalfactorが，どのような機序でTTX抵抗性Na channelを抑えTTX感受性
Channelを発現させるのかを分子生物学的に研究する上でも，今後このような培養系は有用な道具
図3

培養筋細胞の活動電位となり得ると思われる．また，Riidelらによる患各々の図の最上段はcurrentを表示．2段目はanodalbreakexcitationにより生じる活動電位．3段目は，上段の活動電位を早い掃引で表示．筋単独培養，脊髄との併置培養において，各々の右の図の如く，10msec未満のslowre．
polarization componentを通常かん流液中で数％の細胞に認めた．

者肋間筋を使用した実験によって，低カリウム血性周期性四肢麻痺では，膜の興奮性の低下及びTTXでblock

されないSteady−State Na con−ductance増加4），高カリウム血性周期性四肢麻痺
では，VOltage 依存性のSlowly activating Na
inwardcurrentの増加5）が病気の本態と考えられ−113−

justaftertheapplication

COntrOl

BalOmM，CaOmM washout

OIBalOm帆CaOmM

15月AmvL「Ⅰ5nl

m吉日

0

，し

40

、
ll．・■
500msec

88

ト・→108msec

貰い二

120
20

＼＼

蛇

J

8alOmM，CatImM

HifedipinelJ州

mVOr−￣￣、−、

50
100
150

図4

LJノ

筋単独培養筋細胞に対するBaイオンの効果
左端下段は上段の活動電位の掃引を早くして表示．上段で10mMBa
添加後，刺入抵抗の増加，脱分極が生じ，その後slowcomponentが出，現することを示す。下段ではこのslowcomponentが1JLMnifedipine
でblockされることを示す．

justa仙汀theapplication
OfBalOmM，CaOmM

COntrO

㌻
■
■

＝

■

O

．

．

−

㌻
．

−

⊥

−

■

■
︑

／

﹂

n V
8

・11

．

O
4

− − ノ

V
m

−

∵

∴∵二
血血gwashingout

WaSh out

さ忘

図5 脊髄との併置培養で，持続的に収縮している培養細胞の活動電位に対するBaイオンの効果
10mMBaイオン添加により静止膜電位は脱分極し，Slowcomponentが出現することを示す．

−114−

ているが，培養系を使用し，そのようなNa
inward currentの異常が周期性四肢麻痺のAM

文1）KobayashiT，AskanasVandEngelWK：Human

あるいはICMで存在するのか否か，もし存在するとすれば発達のいかなる段階でその異常が明らかになるかを検討することは，周期性四肢麻痺のi9nChannelの異常の発現機序を知る上で重要な手がかりになると考えられる．
一方，ヒト培養筋細胞では，CachannelのSlow
COmpOnentは，鶏あるいはラット培養筋と異なり，幼若な筋管細胞の段階から存在しなかった．
Baイオン添加によって，このCa−SCがAM，ICM
で出現したことは両者の膜にCa channelが存在
し，Ca−SCは不活化された状態であることを示している．一方Desnuelleら6）は，筋単独培養ヒト培養筋で，nitrendipineでblockされるCachannel
が，insulinを添加したmedium中で培養した筋でCOntrOlに比べ有意に増加していることを示しており，膜自身に存在しているCachannelの量は発献

musCle culturedin monolayer and co−Cultured
Withfetalratsplnalcord：Importanceofdorsal
root ganglia for achieving successfulinnerva−
tion．JNeurosci7：3131−3141，1987．
2）Caputo C：Pharmacologicalinvestigations of
excitation−COntraCtioncoupling．In Handbookof
Physiology，SeclO Skeletal muscle．Bethesda：

AmericanPhysiologicalSociety，1983，pp381−415．
3）Pr6bstleT，RddelRandRuppersbergJP：Hodgkin−
Huxleyparametersofthesodiumchannelsinhu−
manmyOballs．PmgersArchiv412：264−269，1988．
4）RtidelR，Lehmann−HornF，RickerKandKtither
G＝Hypokalemicperiodicparalysis：invitroinves−tigation ofmuscle fibermembrane parameters．

MuscleandNerve7：110−120，1984．
5）Lehmann−HornF，KBtherG，RickerK，GrafeP，達あるいはある種の条件下で増加する可能性がある．現在，このようなCachannelが機能的な役割を果していると考える訂Oupと，生理的意義はな
いと考える訂Oupがあり，その役割は依然として

Ballany K and Rtidel R：Adynamia episodica

不明である．一方，我々の各種神経筋疾患の培養
筋の電気生理学的検討からparamyotonia con−

6）DesnuelleC，AskanasVandEngelWK：Insulinen−

genitaの父子例において，Erが深く，AmAp，Ap
dv／dtが大きいにもかかわらず，このCa−SCが頻dependantCa2＋channelsinaneurallyculturedhu−

回に認められたが，このCa−SCの残存が，膜の異常な興奮性，myOtOniaの出現に何らかの役割を果している可能性があり今後更に検討を加える必要があると思われる．

hereditariawithmyotonia：Anon−inactivatingso−
diumcurrentandtheeffectofextracellularpH．
MuscleandNervelO：363−374，1984．

hances developments of functional voltage−

manmuscle．JNeurochem49：1133−1138，1987．
7）KobayashiT，AskanasVandEngelWK：Elec−trophysiologicalabnormalitiesofaneurallycultured
muscle fibers（ACMFs．）from2patientswith
paramyotoniacongenita（PC）．Neurology（Suppl．）
37：184，1987．

ー115−

IV．

ミトコンドリア（Partl）

18）ミトコンドリアDNAのクローニングと塩基配列の解析
宝

研究協力者

早

来

坂

謙

聴＊

二＊

五候堀

孝＊

ヒトのミトコンド））アDNA（mtDNA）は，約Ⅰ）による消化で得た小断片をクローニングした．

16，560塩基対の環状DNAで，Andersonら（1981）

この結果，全ゲノムをカバーする28種類のクローンの採取に成功した（図1，表1）．Ozawaら

によって一個体の全塩基配列が決定されている1）．

異（多型）の分析や近縁種間の比較には，極めて（1988）は，ミトコンドリアミオバナーの母子症例において，これらのクローンをプローブとして，
筋組織mtDNA中の大きな欠失部位のマッピン有効な研究対象である．本研究では，mtDNAと核

グと，その特異な遺伝様式に関して報告した4）．

mtDNAは核DNAに比べて，塩基置換速度がかなり速いことが知られており2），種内の個体間変DNA多型解析の比較，霊長類mtDNAの柱間変異を解析した．さらに，ミトコンドリアミオパテーの病因解明の一助にすべく，ヒトmtDNA全ゲノ
ムのクローニングを行った．
1）ヒトミトコンドリアDNA全ゲノムのクロー
ニング
最近Holtら（1988）によって，ミトコンドリア
ミオバナーでは，筋組織由来のmtDNAに大きな欠失のある症例が報告された3）．これら欠失部位のマッピングを明らかにするには，mtDNAの各部分領域をプローブに用いて，サザンプロット法
による分析が必要となる．このため，mtDNA全ゲ
ノムを数種類の制限酵素を用いて，単独あるいは二重消化によって小断片を得，pUC19にクローニングした．6塩基認識の制限酵素6種類（SacI，
ⅩbaI，EcoRI，HindIII，PstI，KpnI）の消化により得た断片により，仝ゲノムの約80％は比較的容易にクローニングが行えた．しかしND5，ND6，Cytbの3種の構造遺伝子を含む領域（bp12640−16048）は，この方法では，クローニ
ングが非常に困難であった．このため，この領域は，4塩基認識の制限酵素（HpaII，HaeIII，Taq＊国立遺伝学研究所

2）ミトコンドリアDNA（mtDNA）と核DNA多型解析の比較
日本人集団（静岡・沖縄・青森）におけるmtDNA
多型分析について，既に報告してきた5ト8）．今回は核DNA多型に関する分析について報告する．上記3地域において収集した各々60検体の胎盤より，核DNAを精製した．さらに，各人種（白人，アフリカ黒人，アジア人，パプアニューギニア人）
約30検体の胎盤より精製した核DNAを各種制限酵素で切断後，種々の染色体由来のDNAをprobeとして，サザンプロット法によるRFLPを分析した．調べた各種probeのうちpHs−49（C−H−raS）およびpAWlOl（D14Sl）では，各人種によって特徴的な対立遺伝子に支配される切断型が検出された．これらのprobeを用いて上記の3地域より得た日本人180検体のDNAのRFLP分
析を行った．このうちpHs−49での分析では特に多型性が著しく，TaqIでの反応では静岡で7種類，沖縄で8種顆，青森で4種類の切断型が観察され，これらは4種類の対立遺伝子（断片サイズ：
3．7kb，2．7kb，2．6kb，2．3kb）によって支配される多型現象と考えられる．またそれぞれの遺伝子頻度は日本の地理的に艶れた3地域において，かなり類似していることが明らかとなり（表2），

一119−

OH

図1

ヒトmtDNA仝ゲノムをカバーする28種類のクローン化DNAのマッピング

mtDNA多型分析で得られた所見とは，様相を異にすることが示唆された（表3）．これはmtDNAの母性遺伝という特徴と関連するのではないかと考えられる．

界ザル・マカタ4種（ニホンザル，アカゲザル，
カニクイザル，バーバリーマカタ），新世界ザル1種（コモンリスザル），原猿2種（フィリピンメガ
ネザル，ワオキツネザル）のmtDNAを精製し，相同な約900塩基対の断片（ND4，ND5および

3）霊長類mtDNAの分子進化と系統関係

3種類のtRNA遺伝子を含む領域）の塩基配列を霊長類の系統関係を明らかにするために，旧世決定した．これらの配列を，ヒトを含む5種の類−120−

表1HumaIimtDNAclonesinpUC19coveringthewholemitochondrialgenome■■一一■■一一■■■●■一一・■■■−■■t一一・一一一一一一・一・一一一一・一一一一一・一一一一一一一一一一一一■一一一・一・一一・一・一一一一一一一・一・一一一・■■一●Clone No．

EIIZyme−Enzyme Cloning site Fr．size bp No・−

bp N〇・

l

−

I
i

−

つ︼
3つ︼

●
−

C a a a a a

−
−
■
−

KpnI

■
−

人猿の既知の塩基配列と比較して，霊長類における進化系統樹とmtDNAの塩基置換速度を推定した．塩基配列の相同性は，67．7％から96．4％までの範囲にあった．類人猿と旧世界ザル間で平均75．3％，類人猿，旧世界ザルと新世界ザル問で71．
9％，真猿と原猿問で69．6％の相同性が見られ，真猿と原猿間の相同性は，ほぼ類人猿とマウス，あるいはウシとの間の相同性に等しいものだった。
このことは真猿と原猿との間ですでに塩基置換が飽和に達していることを示唆している．また，類人猿の配列を比較した研究でも見られたように，比較した種間の分岐年代が古くなればなるほど，塩基置換に占めるトランジションの割合が減る傾向が観察された．3つのtRNAをコードする領域
では，いくつかの塩基の挿入・欠失および塩基置換が観察されたが，アンチコドンはすべての種で保11■a p p p P p p a h a a a−l l 1 3 3 i 1 3 i 2 2 2 2 2 2 Ⅰ Ⅰ 3 3 3

●

e

e

l

−

S H HH HH H T XH HHl ： ︐ 1 3 3 1 − ▲ つ ﹂ 2 2 2 2 2 Ⅰ ︐ 1 3 3 3ell − ︐ l

O

−

l l

q

312

■

l i

つ ﹂ 2 2 2 つ ﹂ 3a− SacI
AccI
AccI
AccI
AccI
AccI
AccI
AccI
KpllI − SalISIIlaI
SmaI
SmaI

111つ﹂

l

■

ー Xba
− EcR
− Xba
− Hirl
− Hin
− PSt
− Sac
− Hin

XbaI
− EcRI
EcRI
P5tI
PStI − XbaI
XbaI
PstI − EcRI
P5tI − XbaI
XbaI − EcRI
SacI − XbaI
PStI − HiI13
EcRI − Hin3
Hin3 − PstI
Hin3 − SacI
Sacl − Hin3
XbaI

0 8 3 0 0 6 n 6 4 7 0 9 7 〇 7 7 5 1 8 8 0 7 4 3 0 6 1665134238562nU
J3534422259903
7 1 1 1 5 8 6 2 3 1 6 9 7 4 0 5 1 2 3 5 2 8 1 0 0 9 7

l

■

l ● l

a R R⊥L a a R︼

b C C S b b C
X E E P V∧V∧︻ヒー︐ l

2 2 2 2a aR tt at t a Ct R n n C n a a a a a a q n e e e
b b C S S b S Sb a S Ci l a pp pp pp p a pa a a
X XE PP XP PX SPEH HS KHHH HH HT KH HH

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1123567901234567890134567890

一■■■■・■■■■−■■■■■一一■一一一・一一一・一一一一一一一日一一・一一一一一■一一・一・一一一一一一・一一一一一一一一・一一一一一一一一一一一■一一

1193 − 2953
2953 − 4121
4121−
5274
6910 − 9〔I206910 − 7440
7440 − 8286
9020
−126409020−1025610256−1264036．− 1193
9（】20 −11680
5274 − 6203
6203 − 6910
62〔）3 − 9643
9643
−1168016048 −
36
11688
−1212312123−1336413364−13712
15925−16453
1645：3 −
1∩4

104 −

9：引

14802
−1495614955−1604813957−1504713051−13957
15152−15883

存されており，さらに，かなりの数の代償的塩基置換が見られ，tRNAの機能はよく保有されているものと考えられた．
解析の結果得られた系統関係は，従来の種々の解析から得られた知見とほぼ一致するものである．
マカカ属霊長類の系統関係に関しては，制限酵素
切断型による分析結果9）とも非常によく一致した．
Neighbor−joining法で作成した系統樹によると，類人猿，マカタが各々のクラスターを形成し，つぎに，この二つのクラスターが狭鼻猿クラスターを作る．さらにリスザルが，狭鼻猿クラスターとともに真猿クラスターを形成し，一方，メガネザルとキツネザルは原猿クラスターを作る．
UPGMA法，Distance−Wagner法からも同じ系
統関係が得られたので，この系統関係が信頼に足るものであると考えられた．マカタの中では，バー

ー121−

表2

NuclearDNApolymorphismsin3JapaneSepOpulations．

Allele Fragrnent FrequellCyin per。eIlt．
SlZe

（kb）

Aomori Shizuoka〔扶inziL．；；i

Total

●
●

O．コ

】0．口
71．7
10．0
8．3

●

D14SI Allelic Frequencyin

・

10．0

0

0 2 3 52．30

FJ．48りん
7
1

0．8
6．7
76．7
5．8

0

A A B C D

＋

3．85
3．70
2．60
2．50

′7
J

′1
●．＿

7こl．2

8．1
10．3

3Japanese Populations

Allele Fragment FrequencyiII PerCellt
SlZe

（kb）

昌・

…：≡

43：喜

4喜：3

7．8

55．0

54．2

B

表3

地域

個体数
61

静岡
沖縄

全体

Aomori Sllizuoka Okinaua

116

82

259

53：≡
48．3

Tota1
4G．7
0．8
52．5

日本人3地域集団におけるミトコンドリアDNA多型

タイプ数
43

62

39

117

塩基配列
3地域に
の多様性 共通なタイプ

各地域に特有なタイプ

0．0026

20人

27タイプ

33％

28人（46％）

45人
39％

45タイプ
49人（42％）0．00260．00160．0023

ー122−

27人

25タイプ

33％

29人（35％）

92人
36％

97タイプ
106人（41％）

バリーマカタが他のアジア産マカタに比べて系統的に離れており，アジア産のマカタの中では，ニホンザルとアカゲザルがより近縁だった．この系
統関係は，化石，形態の解析，およびmtDNAの制限酵素による解析とは一致するものであったが，血液タンパク質多型の解析結果とは差異が見られた．血液タンパク質多型のような核遺伝子から得られた系統関係と，mtDNAから得られた系統関係との間に差異があることは，他の動物種でも観察されており，核とミトコンドリアの遺伝様式の違いによるものと説明されてきた．ただし，メガ
ネザルの系統的位置に関しては，従来の分子生物学的手法による解析結果と異なり，真猿類に比べて，原猿であるキツネザルに近縁であるという結果が得られた．
また，2種類の蛋白コード領域の分析では，ND5の非同義置換速度が，ND4のそれに比べてかなり高いことが明らかになった．このことは，ND
5がND4に比べて，機能的制約の程度が低いことを示唆している（表4）．
次に，霊長類の各系統における塩基置換速度を比較するため，古生物学的解析より得られた種の分岐の絶対年代と，塩基置換数の関係を調べた．
バーバリーマカタとアジア産マカタの分岐を
300−600万年前と仮定し，ヒト・チンパンジー・
ゴリラの分岐を500−1000万年前と仮定すると，
マカタの系統では，系統当たり，年当たり，サイ
ト当たりの塩基置換数が，2．24−1．12×10￣8と推表4

定され，ヒト，チンパンジー，ゴリラの系統では，
1．05−0．53×10￣8と推定された．このように，マカ
タにおけるmtDNAの塩基置換速度は，ヒト，チンパンジー，ゴリラにおけるより約2倍高いことが明らかになった．マウス柱間，および，ヤギ，
ヒツジの比較から，系統当たり，年当たり，座位当たりの塩基置換数は，1−2×10￣8と推定されている．したがって，類人猿の系統で，他のは乳類に比べて，塩基置換速度が低下しているものと考えられる．
さらに，マカクと類人猿の系統における塩基置
換速度の差を検定するために，リスザルを参照種
として5種の類人猿と4種のマカタ，各々の組合せについて，塩基置換の相対速度テストを行った．
その結果，すべての組合せにおいて，その差は統計的有意差はなかったものの，マカタの系統で類人猿の系統に比べて，多くの塩基置換が蓄積されてきたこと，すなわち，前者における塩基置換速度が，後者より高いことがわかった．
上記の相対速度テストの結果が，類人猿におけるmtDNAの塩基置換速度の低下を支持してはいるものの，この解析における塩基置換速度に関する議論は，比較した柱間の絶対分岐年代の信頼性に大きく依存している．絶対分岐年代を推定するためには，現在までに知られている化石のデータは充分であるとは言えないが，ここで用いた分
岐年代一バーバリーマカタとアジア産のマカタ間の300−600万年前，ヒト・チンパンジー・ゴリラ

SynonymousandnonsynonymousnucleotidesubstitutionsinND4andND5genes

Specie5COmparedAmon9 hominirleS
Hominine5 − 0rangutar）
Great ape5 − gibbon
Among Asian macaque5A5ian − Barbary macaque5
Hominoid5 − maCaqueS
Catarrhine5 − 5quirrel mor）key
Anthropoid5 − prOSimians
Tar5ier −lemur

No．synonymouS No．nonSynOnymOu5
5ub5titutionS／Site sub5titutionS／Site
ND4

ND5

ND4

ND5

0．511

0．437
0．816

0．026

0．049

0．068
0．102

0．182
0．148

0．020
0．025
0．133

0．022
0．087
0．319

0．203
0．206
0．167

0．363
0．421
0．307

0．646
0．825
0．334
0．639
1．020
1．503
1．991
1．147

−123−

1．111

0．270
0．591
1．266
1．009
1．697
2．153

の500−1000万年前−の幅の中に化石から推測し5）HoraiS，GojoboriT，MatsunagaE：Mitochondrial

た分岐年代も，分子生物学的手法を用いて推定しDNApolymOrphisminJapanese；I．Analysiswith

た分岐年代もほぼ含まれており，信頼できるもの

restrictionenzymeSOfsixbasepalrreCOgnition．

であると考えられる．したがって，分子進化速度

HumGenet68：324−332，1984．

についての結論も信頼できるものと考えられる10）．

6）HoraiS，MatsunagaE：MitochondrialDNApoly−morphisminJapanese；II．Analysiswithrestriction

文

enzymeSOffourorfivebasepalrreCOgnition．Hum

献

Genet72：105−117，1986．

1）AndersonS，BankierAT，BarrellBG，deBruijn
MHL，CoulsbnAR，DrouinJ，EperonIC，Nierlich7）HoraiS，GojoboriT，MatsunagaE：Evolutionary

DP，RoeBA，SangerF，SchreierPH，SmithAJH，

implicationsofmitochondrialDNApolymorphism

StadenR，YoungIG：・Sequenceandorganizationin human populations．Human Genetics（ed by

Ofthehumanmitochondrialgenome．Nature290：

VogelF，SperlingK）Proc7thIntCongHumGe−
net，Berlin，1987，pp1777181．

457−465，1981．

2）BrownWM，GeorgeJrM，WilsonAC：Rapidev0−8）HoraiS，GojoboriT，MatsunagaE：Distinctcluster−

1ution of animal mitochondrialDNA．Proc NatlingofmitochondrialDNAtypesamongJapanese，

AcadSciUSA76：1967−1971，1979．

CaucasiansandNegroes．JpnJGenet61：271−275，
1986．

3）HoltIJ，HardingAE，Morgan−HughesJA：Dele−tionsofmusclemitochondrialDNAinpatientswith

9）Hayasaka K，HoraiS，GojoboriT，Shotake T，mitochondrialmyopathies．Nature331：717−719，

NozawaK，MatsunagaE：Phylogeneticrelation−

1988．

shipsamongJapanese，rhesus，FormOSan，andcrab−4）OzawaT，YonedaM，TanakaM，OhnoK，SatoW，

eatingmonkeys，inferredfromrestriction−enZyme

SuzukiH，NishikimiM，YamamotoM，NonakaI，

analysisofmitochondrialDNAs．MoIBioIEvo15（3）：270−281，1988．

HoraiS：Matemalinl1eritanceofdeletedmitochon−
drialDNAinafamilywithmitochondrialmyopa−

10）Hayasaka

K，GojoboriT，Hofai

S＝Molecular

thy．Biochem Biophy Res Commun154（3）：phylogenyandevolutionofprimatemitochondrial

1240−1247，1988．

DNA．MoIBioIEvo15（6）：626−644，1988．

−124−19）ミトコンドリア・サイトパテ一における母系遺伝の分子遺伝学的解明
小 澤 高 賂＊

＊

＊

＊

藤 斐 釆

＊

＊

佐 衣 宝

＊

雅

＊

＊

＊

誠 功 彦

＊

田 橋 本

米 佐 山

＊

中

嗣 司 哉

野

雅 欽 征

中

田 大 埜

研究協力者

は じめに

めて実証することができた2）．また，さらに一見，

ミトコンドリアの異常に起因するミオパテーは孤発性と考えられた患者の母親においても組織化

ミトコンドリア・ミオバナーないし，多臓器障害

学的異常が見出され，何等かのmtDNAの異常がを伴うことが多いためミトコンドリア・サイトパ

母系遺伝しているととを示唆する結果が得られた．

テーと呼ばれている．Egger＆Wilsonl）はミトコ

対

ンドリアサイトバナーの家系分析を行い，この疾患群の多くが非メンデル型の遺伝様式をとることを示し，いわゆる細胞質遺伝として，母親から子に伝えられたミトコンドリアDNA（mtDNA）の異常がその病因であるとの仮説を示した．しかし，一見，孤発性の患者も多く，仮説の証明はされていなかった．

慢性進行性外眼筋麻痺（CPEO）は，Kearns−Sayre症候群の不全型と考えられており，ミトコ
ンドリアミオバナーの中でも軽症でかつ頻度の高い病型である．我々は，CPEOの病像を呈した母
娘例，および特記すべき家族歴を有しない3例のCPEO患者において，生検骨格筋について組織
化学的検索を行うと同時に，その骨格筋mtDNAについて，mtDNA全体およびクローン化された
mtDNAの各断片をプローブとして用いたサザン
プロット法により分析を行った．
その結果，CPEOの母娘例において，異常mtDNAが世代を越えて母系遺伝され疾患を惹き起こすことを分子遺伝学的手法によって世界で初＊名古屋大学医学部第二生化学＊＊愛知医科大学第四内科＊＊＊国立精神神経センター神経研究所＊＊＊＊国立遺伝学研究所

象

患者1（70歳，母）は30歳から，患者2（32歳，患者1の娘）は14歳から外眼筋麻痺を発症した3）．四肢筋力低下，低身長があったが，その他の神経学的異常は認めなかった．血清・髄液中の乳酸値は正常であった．母の両親は，いとこ結婚であった．母の兄の子は進行性の歩行障害をもち10歳時に死亡している．
患者3−5においては特記すべき家族歴はない．
患者3（15歳・女）は15歳時に右眼瞼下垂にて発症した．患者4（20歳・男）は15歳時に限瞼下垂にて発症．患者5（26歳・男）は21歳時に左眼瞼下垂にて発症した．患者3〜5はいずれも高度の
両眼瞼下垂・慢性進行性外眼筋麻痺を呈している．
患者3−5の母親については，同意を得た上で筋生検を行い，その骨格筋の組織化学的および分子生物学的検索を行った．
方法

組織化学：生検骨格筋より10JJmの凍結切片を作製し，mOdifiedGomori Strichrome染色およびCCO活性染色を行った．
ミトコンドリアの単離：ミトコンドリアを生検
骨格筋からChance＆Hagiharaの方法に従って

ー125−

表1慢性進行性外眼筋麻痺の母娘例（患者1，2）のミトコンドリアにおける電子伝達系酵素活性
NADH−

SuCCjnate−
CytOChrome
reductase

CytOChrome coxidase

Subject

CytOChrome creductase

Mother330（145）意

166

（71）

159

（59）

Daughter

250（ll0）

183

（79）

219

（80）

227

±120

233

±

97

114−432

128

−

487

Control（mean±S．D．）（range）c

271±133
105

−

434

Actjvjtie！are eXPreSSed jn nmol／mjn／mgofmjtochondrjalproteinr
X

Fjguresln

Parenthesesarepercentages

of

mean

cortrolvalues．

単離した．

浄した．オートラジオグラフィーは室温で6−24

酵素活性測定：ロテノン感受性NADHLCytO−
Chrome c reductase，SuCCinate−CytOChrome
C reductase，およびCytOChrome coxidaseの酵素活性を既報に従って測定した2）．
ミトコンドリアDNA：日本人において典型的に観察されるmorphlのmtDNAはDrouinら時間行った．ヒトmtDNAおよび組み換えpUCの方法に準じて調製した．mtDNAを適当な制限
酵素によって切断し，得られた27種の異なった断片をpUC19ベクター中にクローン化した（宝来ら，未発表）．
Southernblot分析：凍結生検筋標品から抽出したDNA（50ng）を制限酵素（AtIまたは
助mHI，2−3units）により消化した後，0．6％ア
ガロースゲルを用いて電気泳動的に分匪した．ゲ
ル中のDNAを変性させた後，GeneScreenPlus
膜（DuPont−NewEnglandNuclear）に移した．
ハイプ））ダイゼーションは，10％ dextran sul−fate，1％SDS，1M NaCl，変性￣させたサケ精
巣DNA（100JJg）および32pでラベルしたプ
ローブDNA（2L3×105cpm）を含む溶液中で65℃で15時間行った．0．3M NaCl と30mM
SOdiumcitrate（pH7．0）を用いて5分間，室温で2度，ついで1％SDSを含む同溶液を用いて65℃で30分間，15mMNaClと1．5mMsodium
Citrate（pH7．0）膜を用いて30分間，室温で洗19プラスミッドから切り出したmtDNA断片は
multiprimelabellingsystem（Amersham）を用
いて〔α−32p〕dCTP（3000Ci／mmol）によってラベルし，プローブとして使用した．
結果

RRFの出現頻度は患者1で7％，患者2で3％であった．CCO活性陰性の筋線経の頻度は母で11％，娘で13％であった．単駈ミトコンドリ
アにおける複合体Ⅰ−ⅠⅠⅠ活性は患者1で正常の145％，患者2で110％，複合体ⅠⅠ−ⅠⅠⅠ活性はそ
れぞれ71％，79％，複合体ⅠⅤ活性は患者1で51％，患者2で80％であった（表1）．
患者骨格筋のDNAのSouthernblot分析では，
16．6kbの正常mtDNAに加えて，患者1では正常より2．5kb短い異常mtDNAが検出され，患者2では正常より5kb短い異常mtDNAが見出された．欠矢をもったmtDNAの全mtDNAに対する割合は患者1で36％，患者2で53％であった（図1）．
クローン化したmtDNA断片を用いた分析では，患者1と患者2の間で欠夫の範囲が一部重複しながら異なっていることが明らかになった（図2）．すなわち患者1の異常mtDNA欠失領域に

ー126−

轟
区＝

き

慢性進行性外眼筋麻痺の母娘例（患者1，2）における全長ミトコンドリアDNAをプローブとして用いたサザンプロット分析．A：AtI消化．B：励mHI消化Nは正常コントロール，Mは母親，Dは娘を示す．DNA鎖の大大きさをkb単位で示した．（文献2より引用）

は少なくとも複合体Ⅰの2種のサブユニット（ND5，ND6）と3種のtRNAの遺伝子が含まれていた（図3）．一方，患者2の異常mtDNAの欠失領域には複合体Ⅰの4種のサブユニット（ND3，ND4L，ND4，ND5），複合体ⅠⅤの1ないし2種のサブユニット（ⅠⅠ，ⅠⅠⅠ），複合体
Vの2種のサブユニット（ATPase6，ATPase8），および5ないし8種のtRNA遺伝子が含まれていた．しかしながら，mtDNAのH鎖とL鎖の複製開始点（OriHとOriL）は欠失領域に含まれず，異常mtDNAが自己複製能を有していることが示唆された．

さらに生検骨格筋のmodified Gomoris triT

Chrome染色において，患者3・患者4では少数の，患者5では多数のragged−redfiberが認められた．cytochrome c oxidase染色においては，
患者3〜5では酵素活性欠損線経を認めた．
患者3〜5の母親の生検骨格筋のmodified
Gomori Strichrome染色において，筋鞘膜下に好塩基性物質の集積を認めた．
患者3〜5の骨格筋mtDNAのSouthern blot
分析では，それぞれ正常より4．Okb，5．9kb，3．4
kb短い，大きな欠夫を有する異常mtDNAが，正常の長さのmtDNAと共存していることが見出

ー127−

3

尋

6

1

7

2

尋

慧

：∴．ト岬
▼J、

−

盈
図2

整

慢性進行性外眼筋麻痺の母娘例（患者1．2）における種々のミトコンドリアDNAフラグメントをプローブとして用いたサザン7小ロット分析．A：PstI消化した母親のDNA．B：上おmHI消化した娘の
DNA．DNA鎖の大きさをkb単位で示した．プローブ1〜7の領域はそれぞれ，1：8，005−8，957；2：
9，020−12，640；3：11，688−12，123；4二12，123−13，364：5：13，364−13，712；6：13，051−13，957；7：

13，957−15，047である．（文献2より引用）

図3

慢性進行性外眼筋麻痺の母娘例（患者1，2）におけるミトコンドリアDNAの欠失領域−128−

だされた．

た．しかし，その3例の母親において骨格筋ミト患者3〜5の母親のSouthern blot 分析では
mtDNAの大きな欠夫は存在しなかったが，患者3の母親においては制限酵素PJI，励∽HIによる切断が困雉であった．

コンドリアの異常集積を認め，1例の母親においては，制限酵素（助mHIおよびP好Ⅰ）によるDNA切断部位の消失といった塩基置換に基づくと考えられる小さな異常が母親のmtDNAにあることが判明した．すなわち，ミトコンドリア・

考察

サイトバナーは，数世代に亘って母系遺伝され蓄ミトコンドリア・サイトパテーの家系分析から推測されていた，異常mtDNAが世代を越えて伝達され疾患を惹き起こすという仮説を，CPEOの母娘例（患者1，2）において分子遺伝学レベルで初めて実証した．CPEOの病因はmtDNA欠夫

積された異常が患者の世代になって大きく発現さとそれに伴うミトコンドリア機能障害にあると考えられた．酵母では，mtDNAの塩基置換あるいは

amitochondriallymediateddisease．NEngJMed

小さな欠夫をもった変異株（mitJmutant）から大きなmtDNAの欠夫をもった変異株（pJmutant）
が生じてくることが知られている．同一家系内においてmtDNAの欠失領域に相違が見られたことは，母から子へ伝えられた共通の欠夫がそれぞ

2）OzawaT，YonedaM，TanakaM，OhnoK，Sato，れたものと考えられる．
文献1）EggerJ，Wilson，J：Mitochondrialinheritancein309：142−146，1983．

W，SuzukiH，NishikimiM，YamamotoM，Nona−
kaI，Horai S：Maternalinheritance ofdeleted
mitochondrialDNAinafamilywithmitochondri−
almyopathy．BiochemBiophysResCommun154：

れの個体において異なった拡大をしたためと解釈される（図3）．

3）Yamamoto M，and NonakaI：Skepetalmuscle

さらに同症の患者3例（患者3−4）においてPathologyin chronic progressive external

も3〜5kbの欠損を証明した．この場合，患者の母親は無症状で，患者は，一見，孤発例と思われOphthalmoplegiawithragged−redfibers．ActaNeu−

ー129−1240−1247，1988．

ropathol（Berlin）76：558−563，1988．

20）MELASにおけるミトコンドリアDNA変異と肥大型心筋症および冠動脈病変
小 澤 高 絡＊
雅

＊

康

＊

徳

＊

司

中 山林

田 杉小

＊

弥
欽 靖

藤 野 浦

佐 大 三

研究協力者

嗣＊

米

田

誠＊

理＊

根

本

大

輔＊＊

子＊＊高

田

五

郎＊＊

は じめに

MELASにおけるミトコンドリアDNA異常のミトコンドリア脳筋症（MELAS）は骨格筋と中枢神経系を主体に障害が報告されている．我々は，検討本教室において複合体の活性測定およびSU分

ウェスタンプロットを中心とした分子レベルの分析により複合体Ⅰの異常が明らかにされた析で，MELAS4症例において，その病因がミトコンドリア電子伝達系酵素複合体Ⅰのサブユニッ

MELASの症例の生検および剖検骨格筋からト（SU）の異常にあることを明らかにした1）．す

ローブとしてサザンプロットによる分析を行った．

なわち，鉄−イオウ蛋白質画分に属する75−kDa
SU，フラビン蛋白質画分に属する51−kDaSUお

その結果，正常の長さ（16．5kb）のmtDNAが一本のbandを形成し，大きな欠矢を持ったDNAを抽出し，ヒト胎盤より精製mtDNAをプ

よび疎水性蛋白質画分に属するいくつかのSUが，mtDNAは認められなかった．しかし，文部省海外著しい減少を示していた．また，EPRスペクトル

学術研究によるオーストラリアのLinnaneグ

による解析によっても，複合体Ⅰの鉄−イオウク

ループとの協同研究の結果，MERRFとMELAS

ラスターのうちN−2およびN−3が著しく減少の臨床的特徴をあわせ持った症例で，mtDNAのしていた2）．これらの事実から，MELASにおいて

ND5遺伝子中に400塩基対の欠夫が兄いだされは複合体ⅠのSUの異常あるいは減少によって分た3）．しかも，その異常mtDNAは単独で存在して子構築の異常をきたしているものと考えられた．
その病因はミトコンド））アDNA（mtDNA）の異おり（homoplasmy），Kearns−Sayre症候群ある
いは慢性進行性外眼筋麻痔の患者において観察さ常にあると推定される．本研究の第1の目的は，れるような，正常の大きさのmtDNAと欠矢を臨床的にMELASと診断された症例のmtDNA

持った異常mtDNAの混在（heteroplasmy）は見の異常を明らかにすることにある．一方，これまられなかった．複合体Ⅰの抗体を用いたウェスタ

で本教室で検討しえた複合体Ⅰ欠損の症例およびンプロットによる分析では，患者ミトコンドリア

文献に報告されている症例の臨床症状に注目し検討したところ，MELASを呈する以外に，心病変複合体Ⅰ中のND5SUの欠損があり，他のいく
つかのSU量も減少していることが明らかになっの合併が多く認められた．本研究の第2の目的は，た．このことから，MELASの他の症例において

MELASにおける心筋および冠動脈病変を臨床もその病因はmtDNAのわずかな欠失ないしは的・生化学的に明らかにすることにある．

点変異にあるものと考えられた．

＊名古屋大学医学部第二生化学＊＊秋田大学医学部小児科学ー130−

MELASにおける心筋および冠動脈病変

P4に心電図上で波の平低化と，エコー上左室壁【症例】対象とした4例は，全例で脳卒中様発作があり，頭部CTscan上で低吸収域を，生検骨格筋でraggedLredfiber（RRF）を認め，臨床的にMELASと診断した．表1に臨床症状を，表2に心電図，エコーおよび心筋シンチ所見を示した．

の肥厚を認めた．症例P2以外の3例では，dipyr−
idamole負荷心筋シンチで初期に低濯流を，再分
布期に fillingin の像を認めた．症例PlとP4においてPlとP2の心カテーテル検査を行った．
それぞれLVEDPの上昇，右室系の圧の上昇が認められた．心内膜生検組織のmodified Gomori

症例P3とP4は兄弟例である．症例Pl，P2，

表1MELASの4症例の臨床症状および検査所見

M

＋
●

＋

一

Episodic vomiting

⁚ ヽ V

十

r

Short stature

1

十

3

Dement．ia

10yr F

ーT

＋

十

IT

Seizure

−T

十

M

y「

UeakneSS

r
VV

19

1

毎e／SeY

3

症例Pl
F

Fpatrl汗P

lT

＋

−T

■

■

十

Cortical b＝ndness

一
＋

＋

1T

Hemiparesis or

hel両anopia
Sensorineural
hearingIoss
Lactic acidosis

Positive fam＝yhistory
Ragged−red fibers
Low density areain CT scan

表2

症例

MELASの4症例の心電図，エコーおよび心筋シンチ所見

ECG

低濯流／F‖lingin
正常 ／正常低濯流／F‖ling
低濯流／Fi‖ing

n

左室壁肥厚
左室壁肥厚
正常
左室壁肥厚

負荷心筋シンチ（初期／再分布期）n

PI T波平低化
P2
T波平低化
P3
正常
P4
T波平低化

エコー

−131一

図1

症例1の心内膜標品の電路像

trichromestainでは核の周辺に赤染が認められ，【方法】生検骨格筋よりミトコンドリアを単駈

ragged−redfiberに類似した所見が得られた．電顕では両症例において共に巨大化した，あるいは封入体をもった異常ミトコンドリアを認めた（図1）．冠動脈造影では，拡張も狭窄も認めなかった．

し，電子伝達系の酵素活性を測定した．複合体Ⅰ〜ⅤのSUの分析はWesternblot法を用いた．すなわちミトコンド））ア蛋白をSDS−PAGEにより分離後，Duraporeフィルターに電気泳動的に移

一132−

表3

MELASの4症例における骨格筋ミトコンド））アの複合体I〜Ⅴの酵素活性

3

672

nd‡

607

457

P2

36

nd

397

421

nd lO2

nd

958

157

nd

730

145±59731±319613±276

P3

36

P4

39

nd

Contr01日46±59日317±64
（∩）

（7）

（5）

Ⅳ

（3）

（7）

Ⅴ

（7）

2

P1

765

Ⅲ

′ l ヽ

Ⅲ−Ⅲ

3

Ⅱ

7

Ⅰ

48565983±わ

症例

Enzymic activities are expressedin nmo．／min／mg of mitochondriaI protein．
Xnd：not determined
XXmean±SD

lV

額縁

頚

75−蝉細

Co−●−疇■→←−き2亡■●一一

C
図2

P

Cl■
壷SP−

C

ll■■、■−｝−

C

P

P

C

P

症例1の骨格筋ミトコンドリアにおける複合体Ⅰのサブユニット欠損

し，各複合体に対する特異抗体と反応させたのち， 電子伝達系複合体の酵素活性を示した．仝例にお〔125I〕proteinAを用いて検出した．
【結果】表3に4症例におけるミトコンドリア

いて複合体Ⅰの酵素活性は著明に低下していた．
症例Pl，P2では複合体ⅠⅤの酵素活性の軽度低−133−

下も認められた．これに対し複合体ⅠⅠ，ⅠⅠⅠ，Ⅴの活性は仝例において正常であった．SUの分析では，いずれの症例においても複合体ⅠのSU量の減少が認められ，特に75−kDa SU，51−kDa SU
および疎水性蛋白質画分に属するSUの減少が見られた．
【考察】従来よりMELASは中枢神経系と骨格筋の症状が注目されてきたが，Tanakaら4）は，
MELAS剖検例の，心，肝，腎でも複合体IのSU
量の低下がみられたと報告しており，酵素欠損が全身性に存在していることが知られている．複合体Ⅰの異常の確認された症例について，その臨床症状をみると明らかな心病変が存在する例，ある
いはその存在がうかがわれる例が多く認められ
る5）．今回報告した4症例のうち3例は明らかに心筋の肥大を認めており，MELASでは心筋症の合併は稀でないと考えられた．Ohamaら6）はMELASの骨格筋や脳の中小動脈内皮細胞に電顕的にミトコンドリアの異常があると報告している．我々の症例のdipyridamole負荷心筋シンチ
グラムで初期像にhypoperfusionが，再分布期に什fillingin のパターンが認められたことは心筋
循環血液量の低下があることを示しており，心筋内中小動脈にアンギオバナーが存在していることを示唆している．循環血液量の低下は，電顕的ミ
トコンドリア異常でみられる複合体Ⅰの異常によると考えられた．
これらの結果から，肥大型心筋症と心筋内中小動脈病変の合併は，複合体Ⅰ欠損を病因とする
MELASの特徴的所見であると考えられた．
MELAS症例には心不全による死亡例があり，本教室においても2例については生化学的分析を終了し，ともに心筋より単維したミトコンドリアにおいては，複合体Ⅰの活性の低下とSU量の異常を認めている．この症候群においては心筋症が予後を左右する大きな要因と考えられる．また，複合体Ⅰ異常による肥大型心筋症のみをしめす症例も存在する可能性が考えられた．

例のほかに祖母・母・娘の発症例も報告されている．MERRFと同様にMELASも母系遺伝により異常が伝達されるものと考えられる．本研究により
MELASの1例においてmtDNAの複合体Iサ
ブユニット遺伝子の中に小さな欠矢が見出され，そのサブユニットの欠損が証明された．他の
MELASの症例においてもmtDNAの変異がその病因と考えられ，その詳細な解析をすすめている．
一方，MELASにおいて肥大型心筋症ならびに冠動脈病変は，これまで注目されていなかった異常である．神経・筋症状ばかりでなく循環器の症状を呈する患者についてもミトコンドリア異常を疑い検索をすすめる必要があろう．
文

献1）IchikiT，TanakaM，NishikimiM，SuzukiH，Oza−
waT，KobayashiMandWadaY：Deficiencyof
subunitsofComplexIandmitochondrialmyopa−
thy．AnnNeuro123：287，1988．
2）IchikiT，TanakaM，KobayashiM，SugiyamaN，
SuzukiH，NishikimiM，OhnishiT，NonakaI，
WadaYandOzawaT：Disproportionatedeficien−
cyofiron−SulfurclustersandsubunitsofComplex
Iinmitochondrialencephalopathy（MELAS）．Pedi−
atrRes25：194，1989．
3）SaifuddinNoerA，MarzukiS，TrounceI，Byrne
E：Mitochondrial DNA deletion in en−
Cephalomyopathy．Lancetii：1253，1988・

4）Tanaka M，NishikimiM，SuzukiH，Ozawa T，NishizawaM，TanakaK，MiyatakeT：Deficiencyof subunitsin heart mitochondrial NADH−
ubiquinone oxidoreductase of a patientwith
mitochondrialencephalopathyandcardiomyopa−
thy．BiochemBiophysResCommun140：88−93，
1986．

5）小澤高路，田中雅嗣：ミトコンドリア病の生化学．小児医学21：879−908．1988．
6）OhamaE，OharaS，IkutaF，TanakaK，Nishizawa
M，Miyatake T：Mitochondrial anglOpathyin
Cerebralbloodvesselsofmitochondrialencephal0−

おわ り にMELASにおいては，ここに報告した兄妹発症−134−

myopathy．ActaNeuropatho174：226−233，1987・

21）核にコードされるヒトcytochromecoxidasesubunit
VIc遺伝子のクローニングと臨床診断への適応
水 野 美 邦＊
研究協力者

大 家 美恵子＊・＊＊太 田 成 男＊＊

グしたので報告し，その特徴について述べたい．

は じめに
ミトコンドリア脳筋症において，部分欠損を含方めて数多くのCytOChromecoxidase（CCO）欠損例が報告されている．CCOは13のサブユニット

法

CCOsubunit VIcをコードするcDNAをhumanから構成され，その10は核DNAにコードされている．Kadenbachらはさらにその中で核にコードされているサブユニットのいくつかは牛あるいはfibroblast cDNAlibrary（Okayama−Berg

豚で臓器特異性があると報告しており1），また，

れはErdwegらが決めた6）牛心臓CCOsubunit

DiMauroらは胎児のサブユニットの発現は出生

VIcのタンパク質から決定したアミノ酸配列の一後と異なることを推論している2）．したがってヒ部に一致したものである．Thirdletterはひとつ

トでも臓器特異性があると思われ，そのためにミの塩基で決定されないのでイノシンを代用した．

トコンドリア脳筋症に現れる臓器特異的な発症，
あるいはモザイク状の発症，さらには時間的酵素このオ））ゴヌクレオチドをγ−32PATPでラベル
し，プローブとしてクローニングした．Okayama

活性の変動はこれらの遺伝子の発現の変化による，Berglibraryから，COlonyhybridizationによりものとも考えられるが未だ明らかになっていない．
図1はTakamiyaらの報告3）によるCCOのSDS

positive cloneをとり出し，そのプラスミドベク
ターからPstI，Bam HIを使ってcDNA断片をポリアクリルアミド電気泳動であり，これによる切り出し，連結反応によってクローニングベクと牛心臓と肝臓でASA（subunitVIa），ⅥIa，ⅦⅠ

ターM13に組み込み，形質転換しM13組み換えで見かけ上の分子量に差が現れており，心臓と肝体をつくり，一本鎖M13を精製した．一本鎖M13臓に特異的なサブユニットが存在することを示唆している．このようにCCOのいくつかのサブユをアニール反応でプライマーをアニールさせ，dideoxyシークエンス法により反応させ，ゲル電ニットの多様性は以前より疑われており，最近，

気泳動後オートラジオグラフィーし，シークエン

Kadenbachらによってラットの心臓型，肝臓型のスを解読した．

library）5）からクローニングした．図2はプローブとして用いた合成オリゴヌクレオチドである．こSubunit VIaのCDNAクローンが別々にクロー結ン化された4）．したがってまず臨床診断に必要な果

ヒトの各サブユニットのCDNAをクローニング

図3はその塩基配列とアミノ酸配列の結果であすることが重要と思われる．今回，わたしたちはる．subunitVIcのCDNAのタンパク質をコード

ヒトsubunit VIcのCDNAを初めてタロ一二ン

する部分は225塩基，75のアミノ酸で構成されることが明らかとなった．二重線の部分はプローブ＊自治医科大学神経内科＊＊自治医科大学第一生化学にしたアミノ酸配列である．図4はヒト，牛，ラットのアミノ酸配列を比較したものである．アルー135−

ファベット文字はアミノ酸の略号を示す．図4のボックスは，ヒト，牛，ラットの相同部分を示し，約67％の相同性がみられ，クローン化した．DNA
はサブユニットVIcのものであることを示して
いる．
考

察

表1は，組織特異的発現に関して現在までのところ確認されている
CDNAであミト

コンドリア酵素のる．この中でATPsynthase

proteolipidで2以上のcDNAが，またATP／
ADPtranslocatorで3以上のcDNAがクローニングされており，それぞれ前者では2以上のmRNA，後者では3以上のmRNAが組織特異的
図1AcomparisonofthesubunitstruCtureSOfbeefに発現することが確認されている．一方ATP

heartandbeeflivercytochromecoxidaseto

Synthaseβsubunit，CytOChrome Cl，PDHαShowthealteredmigrationsofASA．CvIIand

Subunitではゲノム遺伝子のクローン化の結果，CIX（reproducedfromTakamiyaetal．，1986）

発現可能な遺伝子は1コピーであることが確認されている（太田ら，未発表）．またここに書いた
pseudogeneは発現できない遺伝子，偽遺伝子である．さて，おおまかな遺伝子の数を知るために

0tigonucfeotide

total Southern blot が有効である．図5はDiMauro らによってクローン化されたヒトd（ATGAAIGAITTrGAlGAJATG）

CCOsubunitIVのtotalSouthernblotの結果であ

図 2

GGGGGGGGGGGGGTCAGGAAGGACGTTGGTGTTGAGGTTAGCATACGTATCAAGGACAGT60

AACTACCATGGCTCCCGAAGTTTTGCCAAAACCTCGGATGCGTGGCCTTCTGGCCAGGCG120
M A P E V L P K P R M R G L L A R R
TCTGCGAAATCATATGGCTGTAGCATTCGTGCTATCCCTGGGGGTTGCAGCTTTGTATAA180
L

R

N

H

M

A

V

A

F

V

L

S

L

G

V

A

A

L

Y

K

GTTTCGTGTGGCTGATCAAAGAAAGAAGGCATACGCAGATTCCTACAGAAACTACGATGT
F

R

V

A

D

（）

R

K

K

A

Y

A

D

S

Y

R

N

Y

D

CATGAAAGATTTTGAGGAGATGAGGAAGGCTGGTATCTTTCAGAGTGTAAAGTAATCTTG
M

K

D

F

E

E

M

R

K

A

G

I

F

Q

S

V

K

240

V
300

首

GAATATAAAGAATTTCTTCAGGTTGAATTACCTAGAAGTTTGTCACTGACTTGTGTTCCT360

GAACTATGCCACATGAATATGTGGGCTAAGAATAGTTCCTCTTGATAAATAAACAATTAA

420

C（A）∩

図3

NucleotidesequenceofhumancytochromecoxidasesubunitVIc

ー136−

M

F
R
L
R

V

V
A
M
i
N
R
L
R

A
L
L
G
R
M
Q
P
K

l bona fjde

V

G
V
−
昔
V
R
L
R

A
L
L
G
R
M
Q
P
K

P

師＝柚日出

A
L
L
G
R
M
R
P
K

A

G
V
1

P

mnu 困
V
A
L
E
T
A
P
S
G
A
S
M
S
M

D

R
A

（
1）

P「
OteOlipid（
W aF
ker et al
．
）

＞2

（
？
）

1

（
0）

＞3

（
？
）

1

（
1）

E

G

V
S

AT P／
A DP transl0CatOr （
Atta「
di）

S

n
e
a
n
m．Ⅵ t
U
O
a
H
B
R

1

CytOChrom e cl （S uzukiet al．
）

PD H C a subunit（O hta et al．
）

閂QA

PSeUdogene

ATP synthetase βsubunit（
O hta et al
．
）

亡 L

A

L

V

円両＝幽

F

L

し

V

﹇細目m＝過

L

e
n

L

n
a

m．M t
U
O
a
H
B
R

仰山超

n
e
a
n
m．Ⅵ t
u
O
a
H
B
R

表1Tissuespecificexpression

図4AminoacidssequenceofsubunitVIc

トj

E

Ei

図6

Evidence for a multigene family of the
CytOChrome c oxidasesubunitVIc

する．このプローブはフィルター上の相補的な塩基配列をもつDNA断片とハイブリッドを形成す
図5

GenomicsouthernblothybridizationHindⅢ（H），EcoRI（E），BamHI（B）

る．このハイブリッド形成したDNA断片をオー
トラジオグラフィーで検出する．これをtotal
Southernblotという．DiMauroらの結果（図5）る6）．制限酵素で切断した仝DNAの断片をアガでは比較的単純なバンドの数を示していた．図6

ロースゲル電気泳動でその大きさにより分画したはわたしたちがクローニングしたCCO subunit

ものをゲルからナイロン膜に移しとる．一方目的

VIcをプローブとしたtotal Southern blotとする遺伝子に対応するDNAを標識プローブとる．これによると，17−22本のバンドがみられ，

−137−

であ

巨大な遺伝子群を形成していることがわかる．発結論

現しない遺伝子，pSeudogeneも含まれていると核にコードされたcytochrome c oxidase

仮定しても例外的に多い遺伝子群であるといえる．

Subunit VIcのCDNAを初めてクローニングしこれらのバンドがどのようなところで発現する

た．このcDNAをプローブとしたtotalSouthern

Subunit VIcの遺伝子を示しているか，さらにはblot

ミトコンドリア脳筋症における特異な欠損状態とNorthern blotの結果では，ATP synthase

どのような関係があるかは今後の課題である．

Subunit，CytOChrc）me Clの発現と異なる転写制

図7はレテノール酸で処理したヒト白血病細胞の結果，巨大な遺伝子群を示唆した．また
β

御をうけていることが明らかとなり，疾患におけHL60のNorthern blotの結果である．HL60

る特異な挙動との関連は今後の課題であると思わはレテノール酸によって顆粒球へ分化し，それにれた．

伴いミトコンドリアタンパクの遺伝子の転写の程度も変化する（新井，太田ら，未発表）．それぞれ，ATPsynthaseβsubunit，CytOChromeCl，
CCOsubunitVIcをプローブとし，経時的変化を

文1）KadenbachB，HartmannR，GlanvilleRandBuse
G：Tissue−SpeCificgenescodeforpolypeptideVIa

みたものであるが，CCOsubunitVIcをプローブ

Ofbovineliverandheartcytochromecoxidase．

としたものは，他の2つのものと異なり1−3日で転写レベルに変化がみられなかった．このこと

献

FEBSletters138：236−238，1982．
2）DiMauro S，Zeviani M，Servidei S，Bonilla E，

はCCOsubunitVIcが明らかに他の2つの酵素

MirandaAF，PrelleAandSchonEA：Cytochromeとは異なった転写制御をうけていることを示している．

OXidasedeficiency：Clinicalandbiochemicalhetero一

geneity．AnnNYAcadSci488：19−27，1986．
3）Takamiya S，Yanamura W and Capaldi R A：
Mitochondrialmyopathiesinvolvingtherespiratory

012345ddyS

Chain：abiochemicalanalysis．AnnNYAcadSci
488：33−43，1986．

4）SchlerfA，DerofsteM，WinterMandKadenbach
八一TF s、・r−！：〜dミ；eミ

S．∴つ・jn：

B：Characterizationoftwodifferentgenes（cDNA）
forcytochromecoxidasesubunitVIafromheart
andliveroftherat，EMBOJ7：2387−2391，1988．

つyt（JCト1rL）rl嶋

5）OkayamaHandBergP：AcDNAcloningvector

Cて

thatpermitsexpressionofcDNAinsertsinmam−
maliancells．MoICellBio13：280−289，1983．
6）ErdwegMandBuseG：Studiesoncytochromec
OXidase，XI．Theamino−aCidsequenceofbovine
heart polypeptide VIc．Bio Chem Hoppe−Seyler√・パリ、∴‖・．い．七一 r一・．りりしい日中、

366：257−263，1985．

：・、：．丁）．：●：、！、．一一∴

図7NorthernblotofHL−60treatedwithretinoic−138−22）ミトコンドリア・ミオパチー1家系における
ミトコンドリアDNAの解析
中 西 孝 雄＊
研究協力者

大

越

敦

夫＊

金

澤

一

郎＊

針 原 伸 二＊＊ 原 田 勝 二＊＊

はじめに
ミトコンドリア・ミオパテーの発症には，電子伝達系酵素の障害が強く関与しており，またその電子伝達系酵素の一部の遺伝支配がミトコンドリ
ア（mt）DNAおよび核DNAにあることが明らかにされている．一方，mtDNAは母親の卵細月包由来
であり，母系遺伝により伝播するとされている．
従って，ミトコンドリア・ミオパテーの遺伝形式には核DNAとmtDNAの両者の複雑な機構が存在するものと考えられていも．近年，Holtら1）
は，ミトコンドリア・ミオパテーの症例で筋のmtDNAに部分欠矢があることを報告した．以後，
Kearns−Sayre症候群の症例にmtDNAの欠夫がみられたとする報告2）や母系遺伝を示唆する症例の報告3）がみられ，本症の遺伝子レベルでの解析が注目されている．そこで我々は，本症の兄弟例
およびその無症状の母親について筋のmtDNAの解析を行い，その結果母親には明らかな異常を認めなかったが，兄弟例ではいずれも筋mtDNAに欠夫を認めた．このことは，本家系の遺伝様式を推定するうえに興味ある結果と考え報告する．
症例

症例：症例1（51歳，男性），症例2（49嵐 男性）は，Mizusawaらが什Familialmitochondrial
myopathy associated with peripheral neuro−

pathy として既に報告した兄弟例である3）．両親＊筑波大学臨床医学系神経内科＊＊筑波大学社会医学系法医学はいとこ婚で，母親，両症例の弟，母親は同じで父親の異なる3人の子供はすべて臨床的には無症状であった（図1）．両症例とも，20歳以前に眼瞼
下垂，視力障害で発症し，以後30歳代には四肢筋
力低下・筋萎縮，40歳代に四肢のしびれ感，歩行障害などを里した．臨床的特徴は，限症状として，
眼瞼下垂，きわめて軽度の外眼筋麻痺，視神経萎縮を認めたが，網膜色素変性はなかった．四肢筋力低下および筋萎縮，末梢神経障害，軽度の知能障害を認め，心伝導障害は症例2にのみ存在した．
低身長，ミオクローヌス，小脳失調，神経性難聴，
髄液蛋白増加，乳酸性アンドーシスなどは認めな
かった．筋生検所見（図2）：症例1および2では，mOdifiedGomoritrichrome染色にてragged−red fiberが多数散在していた．また，CytO−
Chrome c oxidase（CCO）染色では，症例1，
2とも染色性が低下した筋線経が多数みられ，C
COの部分欠損を示唆する所見であった．症例1，
2の母親ではmodified Gomori trichrome染色で明らかな異常を認めず，CCO染色でも染色性の低下した筋線経は調べた範囲では全く見出すことはできなかった．なお，母親の筋生検に関しては，母親自身は無症状であり，本家系が一見常染
色体劣性遺伝をとるように思われるものの，患者のmtDNAに欠夫があることが期待され，かつ母系遺伝を示すとされる本症の遺伝様式をこの家系について推定するには，母親のmtDNAの検索が必要と考え，この点を母親および家族の人々に十分に説明し，理解を得た上で施行した．
生検筋の生化学的分析（表1）：ミトコンドリア−139−

図1家系図．』が症例1，2を示す・
電子伝達系の酵素活性は，CytOChromecoxidaseの活性低下，SuCCinate−CytOChromecreductase〝gを各種制限酵素（BamHI，EcoRI，HindIII，
PstI，ⅩbaI）にて消化後，0．7％agarosegel電は正常，rOtenOne−SenSitiveNADH−CytOChromec reductaseの活性低下を認め，すなわちCOm−

気泳動にて分散，nitrocellulose膜へ転写後，ヒト

plexIおよびCOmplexIVの活性低下を呈した．

Southernblottinghybridizationを行ったのち，胎盤から採取したmtDNAをプローブに用いてオートラジオグラフィーにて検索した．

方法

材料：mtDNA分析には，症例1，2，母親，対照としてごく軽度の多発筋炎の1症例，計4例の生検筋を用いた．
bNAの抽出：それぞれ約100」150mgの凍結生検筋よりDavisらの方法＠上5）により高分子DNAを抽出した．
mtDNA分析：抽出したそれぞれのDNA約5

表1筋の生化学的分析
生検筋のミトコンドリア電子伝達系酵素活性（。mOl／minperm90fmitochondrialprotein）

症例1症例2 Control（炬10）
Cytochromecoxidase

373

438

1554

±753

（601−2837）

Succi雨一CYt。C血eCreductaSe1317 619（；：；＿諾
Rotenone−SenSitive
NADH−CYtOChrmeCreductaSe3051249±174（82−637）

結果

図3は，症例1，2，母親，対照例の計4例のそれぞれの制限酵素で切断したSouthernhybrid−izationのパターンである．なお，それぞれの制限酵素のmtDNAにおける切断部位を図4aに示す．mtDNAは環状であり，BamHIlヵ所のみを切断し，仝例に16．6kbのbandがみられたが，さらに症例1，2では12．5kbのextrabandを認めた．EcoRIは正常例では3カ所を切断し，8．1，
7．4，1．2kbのbandを認めるが，症例1，2ではその他に11．4kbのeXtrabandを認めた．Hind
IIIも正常例では3カ所を切断し，10．2，5．5，0．9
kbの3つのbandがみられ，さらに症例1，2では12．5kbのextrabandを認めた．PstIは2ヵ所を切断し，14．5，2；1kbの2つのbandを認め，
症例1，2ではさらに10．4kbのextrabandを認めた．XbaIは5カ所を切断し，7．5，4．5，2．0，

一140−

図2

症例2の筋生検所見
a．ModifiedGomori−trichrome染色（×30）
Ragged−redfiberが散在性に認める．
b．Cytochromecoxidase（CCO）染色（×30）
染色性の低下した筋線経が多数みられ，CCO活性の部分欠損の所見を呈する．

ー141−

ふ云眉産層図3

ミトコンド））アDNAのSou−
thernhybridization

C：対照例，M：母親
Pl：症例1，P2：症例2
ⅩbaIにおける＊は制限酵素による切断が不十分な部位

1・8，0．8kbのbandを認め，症例1，2では5．4

ような可能性が考えられる．第−には，母親の体kbのextrabandが出現していた．以上の5種類

細胞に我々が用いた方法では検出できない程度のの制限酵素による検索の結果は，症例1，2の筋

ごく少量の異常mtDNAが存在しており，それがには，正常のmtDNAの他に図4bに示すように発症の兄弟に母系遺伝により伝播した可能性であ

約4・1kbの欠矢を有するmtDNAが存在するこり，第2には母親の体細胞に異常ミトコンドリアとが強く示唆された．と同時に，母親には明らかが存在すると考えるよりも，むしろ母親の生殖細なmtDNAの欠矢を見出すことができなかった

胞のミトコンドリア遺伝子の一部に突然変異が生ことが明らかになった．なおここでは示さないが，じた可能性である．これまでの研究の多くはこの

母親のmtDNAについては大量のmtDNAを上うち第一の可能性に組するものが多いが，本研究述の方法で分析し，症例1，2がもつと考えられのように臨床的に正常な母親の筋ミトコンドリア

た欠夫を示すextrabandを認めないことをみている．

を検索したものはない．その意味で我々のここに示した結果はきわめて大きな意味をもつと思われる．我々の調べた母親の筋にはCCO染色によっ考

察ても染色性の低下した線椎を一本も見出すことが本研究によって明らかになった最も注目すべきできなかったことから考えても，少なくともそのことは，母親は調べた範囲では正常のmtDNA塩

子供である症例1，2と同じ欠矢をもつ異常ミト

基配列のみを有していると推定されるのに対して，その子供である患者2例はいずれも正常mtDNA

コンドリアが母親の体細胞，とくに筋に存在するの他にその一部が欠失したmtDNAをも有していることである．

の可能性を支持する結果は得られなかったとすべ

従って，本症例の遺伝様式に関しては，以下のれまでの報告の中に実例がない以上推測の域を出図4とは考えにくい．少なくとも我々の家系では第一きであろう．一方，第二の可能性については，こ

本症例のミトコンドリアDNA欠失部位
黒塗り部は確実な欠矢部を示し，白抜き部は欠夫の可能性がある部位を表す．
a・ヒトミトコンドリアゲノムにおける各種制限酵素の切断部位
B：BamHI・E：EcoRI，H‥HindIII，P‥PstI，Ⅹ：ⅩbaIb・ヒトミトコンドリアゲノムにコードされている各種サブユニット
OH：Originofheavy−Strand，CO：cytochromecoxidases。b。nits
ND：NADHdehydrogenase（NADH−ubiquinoneoxidoreductase）
Cytb：cytochromeb．

−143−

ま

ない．しかし，ホルスタインのミトコンドリアとめ

DNAの変異を9代にわたって調べたHauswirth

1） ミトコンドリア・ミオパテーの兄弟例およびらは，意外にもミトコンドリアのDNAは代を経その母親の生検筋におけるミトコンドリアDNA

るにつれて変異が生じ易いことを示しており6），の解析を行った．

このことを考慮に入れるとヒトにおいてもこのよ

2）対照例および母親の筋のmtDNAには明らか

うな子供の代に生じる変異も十分起こりうるもの

な異常は認めなかったが，患者2例の筋には正常と考えられる．

mtDNAの他に約4．1kbの欠矢を有する

mtDNAが存在していた．

なお，本症例1，2のextrabandが，これまでに報告されている欠失ミトコンドリアDNAの文

bandよりも明らかに幅広いbandとして認められたことについては，欠失部分がおおよそ同じで

献

1）HoltIJ，HardingAE，Morgan−HughesJA＝Delitions

はあるが，細かくみると欠矢部が少しずつ異なる

ofmitochondrialDNAinpatientswithmitochon−

異常ミトコンドリア群の集合であることを意味しdrialmyopathies・Nature331：717−719・1988・ている可能性があり興味深い．今回の検索で得ら

2）ZevianiM，MoraesCT，DimauroS，etal：Deletions

れた欠失部分は，これまで報告されている欠失ミ

ofmitochondrialDNAinKearnSTSayresyndrome・
Neurology38：1339−1346，1988・

トコンドリアDNAとしてはよく認める部位であり，欠矢に関するhotregionであると思われ，そ3）OzawaT，YonedaM，TanakaM・etal‥Maternal

こには数多くのhotspotが存在することは十分

inheritanceofdeletedmitochondrialI）NAinafa−に考えられることである．

milywithmitochondrialmyopathy・BiochemBiT

今回の検索から得られたmtDNAの欠失部位とmtDNAにより支配されている電子伝達系酵ophysResCommun154：1240−1247・1988・
4）MizusaWaH，WatanabeM，KanazawaI，etal：
Fami1ialmitochondrialmyopathyassociatedwith

素の関連をみると，，NADH−dehydrogenasesubunit3，4L，4，5は確実に欠失部位に含まれ，CytochromecoxidasesubunitIIIは欠失部位に含まれる可能性を有していた．このことから本症

peripheralneuropathy‥partialdeficienciesofcom−

plexIandIV・JNeuroISci86‥1717184，1988・

5）I）avisLG，DibnerMD，BatteyJF・eds：Basic
methodsinmolecularbiology・EIsevier，NewYork：

例のcomplexIおよびⅠⅤの活性低下にmtDNAの欠夫が関与している可能性もあるが，これまで

1986pp47−50・の報告では電子伝達系の酵素異常とmtDNAの6）HauswirthWW，LaipisP：MitochondrialDNA

欠矢が必ずしも対応していないことからさらに検polymOrPhisminamaternallineageofHoIstein

討が必要と思われる．

cows．procNatlAcadSciUSA79＝4686−4690・1982−144−23）ミトコンドリア脳筋症におけるミトコンドリア
DNAの解析
垂 井 清一郎
研究協力者

曽

我

文

久＊

高

橋信

行＊

巽

西

川

嘉

郎＊

上

野

聡＊

依

は じめに

千賀夫＊
藤

史

肘

最近，ミトコンドリア脳筋症におけるミトコン

筋ジストロフィー症各1例，遠位型筋症3例，OCularmyopathy2例，甲状腺機能低下性筋症3

ドリアDNA（mtDNA）の部分欠矢が報告さ
れ1）2）3），特にKearnsLSayre症候群においては高率に2−7kbにおよぶ大きな欠矢の存在が報告さ例，McArdle病，nemalinemyopathy各1例の計20例である．
Kearns−Sayre症侯群4例の臨床的特徴を表1に示す．症例1は外眼筋麻痺，網膜色素変性，心伝導ブロックを伴う完全型，他の3例は心伝導ブれている（Zevianietal）3）．その欠矢の成因，欠夫と病態との関連を考えるうえで，より多数例での検討が必要である．そこで我々は Kearns

ロックを欠く不全型であり，仝例でraggedTredfibers，好気的運動負荷の乳酸，ピルビン酸の異常−Sayre症候群を含むミトコンドリア脳筋症および種々の筋疾患におけるmtDNA異常について

増加4）を認めている．中枢神経症状については，症
例1で軽度の痴呆が認められた．頭部CT，脳波でSouthern blotting法による解析に着手した．今回は，まずミトコンドリア脳筋症および各種筋疾患自験例において，これまでの報告にあるような大きな欠矢の有無についてのスクリーニングを主目的とした．すなわち，生検骨格筋から総DNAを抽出して制限酵素BamHI で消化した後，精製は，Kearns−Sayre症候群で通常見られる所見以外の特別な異常は見られなかった．
これら4症例のミトコンドリア内膜電子伝達系
酵素活性測定5）結果を表2に示す．症例2でNADH−CytOChromecreductaseの活性が低下していたが，他の3例では有意な低下は認められていない．

mtDNAをプローブとしてSouthernblotting法
により検討した．
対象

方対象とした症例はミトコンドリア脳筋症17例，その他の筋疾患20例である．検索したミトコンド
リア脳筋症はKearns−Sayre症候群4例，
MELAS2例，MERRFl例，分類困難な10例にはraggedrredfibersを伴うocularmyopathy2
例，FSH型筋症2例，小脳性失調を伴う筋症3例が含まれている．ミトコンドリア脳筋症以外の筋疾患は多発性筋炎8例，FSH型および眼筋咽頭型＊大阪大学医学部第二内科

法

生検骨格筋20−30mgをDaviSらの方法6）に従いSDSおよびProteinaseKで処理し，約20jLgの稔DNAを抽出した．ヒト胎盤組織約500gを
Potter−EIvehjem型ホモジナイザーで破砕後，分画遠心法，ショ糖密度勾配遠心分画法にてミトコ
ンドリアを分散した．分社したミトコンドリアを
SDS，prOteinaseK処理後DNAを抽出し，CsCl
平衡密度勾配遠心法で環状DNA分画を得て，フェノール抽出により高純度mtDNA約100FLgを得た．このmtDNA25ngをrandomprimer法

ー145−表1Kearns・Sayre症候群臨床的特徴
4

3

Case

〃5＋＋＋一二＋70＋

Dementia

71
4

Hearing Loss

レ22＋＋＋一十一寸5Retinal degeneration

3

Ophthalmoplegia

レ20．＋．ニー．51．

Age Of onset

5M／4＋＋＋＋一＋＋801
2

Age（Yr）／sex

Limb muscle weakness
Heart block8．

2＋

RaggedTred fibers
CSF protein（mg／dl）
Exerciseinducedlactacidemia

表2 Kearns−Sayre症候群症例の骨格筋ミトコンドリア内膜電子伝達系酵素活性
case

1NADH−CYtOChrome c reductase

2

3

4

Control（n＝12）

2・3

0・13

0・73

0・78

1・4±0・6

Succinate−CytOChrome c reductase l・5

0・36

0・78

0・49

0・9±0・3

cytochrome c oxidase l・6
Activities

areexpressed

asJ

0・85

mOl／minute／gram

0・910・90
wet

wei9htof

1・3±0・5

muscle・Control values are mean±SD．

で32P標識したものをプローブとして用いた．
SouthernblottingはBamHI50unitsで完全消化した骨格筋総DNA約5〟gを0．7％アガロー
スゲルに40volt，10時間泳動展開し，ナイロンメ
ンブレン（Amersham社，Hybond−N）に転写した．このメンブレンを3時間prehybridization
後，3×SSC，55℃，OVernightでmtDNAプロー
ブとのhybridizationを行った．次いで0・1×
SSC，55℃，3時間洗浄後に行ったオートラジオグ
ラフィーは，増感スクリーンを使用し，一80℃，3
時間曝写で明瞭な像を検出することができた・
結果

調製したmtDNAのアガロース電気泳動ではBamHI消化で16．5kb，EcoRI消化で8・0，7・4，
1．2kbの3つの断片に切断されており個1左）
これはmtDNAが16．5kbの環状DNAであり，BamHIで1カ所，EcoRIでは3カ所の切断部位を有する事と⊥致する．このプローブを用いてコントロール筋DNAをBamHIで完全消化したものをSouthernblotting法で解析した・オート
ラジオグラフィーでは16．5kbの位置に1本のバンドとしてmtDNAが検出できる（図1右）．
Kearns−Sayre症候群4例のSouthernblottingのオートラジオグラフィー像を図2に示す．
mtDNAのサイズは上述した条件では正常コント
ロールのそれと差がなく，従来の報告にあるような2kb以上におよぶ大きなmtDNAの欠矢は認−146−

二はeU山一工∈呵皿ノ1ZCとヒCOntrdmuSC雪eMH＿〇C卜10rldr這j DNA

坪野銑癒餅翫融飯野膏海路瑠

図1胎盤より抽出したmtDANのアガロース電気泳動像（左）とmtDNAプローブを用いた骨格筋DNAのSouthernblotting像（右）1Pat塘ntS

CnntrDl
1

2

3

2

3

4

5

6

7

8

4

ヽ
9．J−′

9，4−

4」巨

2．0−

▲1．・1−

jゝ2：Hyp胱hyr堺d my呼名とhy

図2

Kearns−Sayre症候群症例における骨格筋

図3

mtDNAc7）Southernblotting像

甲状線機能低下性筋症，多発性筋炎症例における骨格筋mtDNAのSouthern blotT
ting像

ー147−

められなかった．他のミトコンドリア脳筋症13
例，その他の筋疾患においても明らかなmtDNAの欠矢を認めなかった．図3は甲状腺機能低下性

ま

と

め

1．KearnsrSayre症候群4例を含むミトコンド
リア脳筋症17例の骨格筋ミトコンドリア
DNAをSouthernblotting法により解析し筋症，多発性筋炎症例のSouthern blotting解
析の結果であるが，mtDNAは約16．5kbの大きさで一本の明瞭なバンドを示した．

た結果，ミトコンドリアDNA部分欠矢は認められなかった．
2．多発性筋炎8例およびその他のミオパテ￣，

考筋ジストロフィー症12例においてもミトコ

案

Kearns−Sayre症候群では高率にmtDNA部分
欠夫が存在し，その欠夫は2−7kbにおよぶ大きなものであると報告されている2）3）．そこで，
Kearns−Sayre症候群をはじめとするミトコンド））ア脳筋症17例における大きなmtDNA欠矢の有無を解析したが，報告にあるような欠矢を見出すことはできなかった．ただし今回のSouthernblottingの条件，つまり制限酵素BamHIで消化，
mtDNA全体を一本のバンドとし，この泳動皮の差から欠矢の有無，程度を判定するという条件では1kb以下の比較的小さな欠夫の検出は困難である．したがって今回の症例においては，1kbあるいはより狭い範囲のmtDNAの欠矢が存在する可能性は残っている．ミトコンドリア内膜電子伝達系酵素活性低下とmtDNA欠失部位とは必ずしも一致しない症例の報告もあるが）3），今回対象としたKearnsrSayre 症候群症例2ではrotenone−SenSitive NADH−CytOChrome creductase活性の低下が見られており，COmplex
Iを構成する酵素のサブユニットのうちmtDNA

ンドリアDNA部分欠矢を認めなかった・
3．ミトコンドリアDNAのより詳細な解析のために，正常ミトコンドリアDNAのグロ￣ニングを行っている．
文1）HoltIJ，HardingAE，Morgan−HughesJA：Deletion。fmuscle mitochondrialDNAinpatients withmitochondrialmyopathies・Nature331＝717−719・1988．

2）LestienneP，PonsotG：KeamS−Sayresyndrome
withmusclemitochondrialDNAdeletion・Lancet
l：885，1988．

3）ZevianiM，MoraesCT，DiMauroSetal：Deletions
ofmitochondrialDNAinKearns−Sayresymdrome・
Neurology38＝1339−1346，1988・

4）OgasaharaS，NishikawaY，YorifujiSetal：Treat−
mentofKearnS−Sayresyndromewithcoenzyme
QlO．Neurology36：45−53，1986・
5）YorifujiS，Ogasahara

S，TaknhashiM

et

al‥

I）ecreasedactivitiesinmitochondrialinnermem−にコードされている領域での小さな欠矢の検索はbraneelectrontransportsysteminmusclefrompa−

必須である．現在，いくつかの制限酵素，より短

tientswithKeamS−Sayresyndrome．JNeuroISci

いmtDNAプローブ，高濃度アガロースゲルを用いた解析を行っている．さらに高純度，均一なプローブを得るためにmtDNAのクローニングを献

71：65−75，1985．
6）DavisLG，DibnerMD，BatteyJF・eds＝Basic

試みており，すでにEcoRI消化による1・2kb
fragmentを得，8．0，7．4kb断片についてはコロ
ニーをスクリーニング中である．

一148−

methodsinmolecularbiology．EIsevier，NewYork，
1986，pp47−50．

24）クローン化MELAS筋細胞におけるミトコンドリアの異常の解析
桃 井 真里子＊
研究協力者

下

泉

秀

夫＊

太

田

成

男＊＊

小 林 葉 子＊ 中三川 晃 利＊

ミトコンドリア脳筋症の一部はミトコンドリア

Seligmanの方法3）にて染色し，Osmium酸で後固DNAに欠夫が兄いだされ，細月包質遺伝が明らか

定後，epOn包埋した．④細胞の電子伝達系酵素欠
損のスクリーニング法として，グルコース欠損培
地での生存率を求めた．24wellプレートに陽性細胞，陰性細胞を等数，4wellずつ培養し，2wellをグルコース欠損培地（極東DM170；グルコー
スの代わりにピルビン酸を含む）に置換した．置になったが，MELASおよびその他の病型では欠夫は検出されていない．我々は，ミトコンドリア
脳筋症の解析のために，筋細胞のクローン化を進めてきたが），筋組織に於いてチトクロームC酸化酵素の部分欠損を示すMELASの細胞をクローン化し，ミトコンドリア電子伝達系酵素の発現に関する知見を得た2）．培養細胞における蛋白合成系の検討は，欠矢の兄いだされないMELASなどの病型の病態に関して重要な示唆を与えると思われる．
方⑤ミトコンドリア内蛋白合成の検討：細胞をメチ
オニン欠損培地で培養後，エメチン（150JJg／ml）
2時間処理し，35S−メチオニンで合成蛋白を標識し，12．5％SDS−PAGE上に分駈し，フルオログ
ラフィーで検出した．

法①骨格筋でチトクロームC酸化酵素部分欠損を示すMELAS患者筋の初代培養系に複製起始部欠損SV40・DNAを導入し，形質転換した細胞をクローン化した．クローンは，筋型CK，多核形成，を指標に1），筋細胞由来を確認し，組織化学染色にてチトクロームC酸化酵素陽性細胞と陰性細胞を選択した．
②椚包培養は，通常は，HamF12，10％FCS，中で行った．
③細胞の電子伝達系酵素活性は，ミトコンドリア
を分離後，通常の方法で測定した．
④チトクロームC酸化酵素組織化学電顕は，細胞を2％グルタールアルデヒドにて60分固定後，＊自治医科大学小児科＊＊自治医科大学生化学

換後，72時間後に，おのおののWell内細胞の生存率を求めた．

結果①チトクロームC酸化酵素陽性クローンと陰性ク
ローンの確立は，昨年報告したが，酵素活性測定
にても，陰性クローンは，検出感度以下であり，中間値を取るクローンは無かった．
②チトクロームC酸化酵素活性の組織化学電顕では，陽性クローン内のミトコンドリアはすべて活性陽性であり，陰性クローン内のミトコンドリア
はすべて活性陰性であった（図日）．
③ミトコンドリア内蛋白合成：合成蛋白の泳動パ
ターンは陽性，陰性クローン間で差はなく，陰性クローンにおいては，チトクロームC酸化酵素サ
ブユニットII，III（COII，COIII）と，ATP合成
酵素サブユニット6（ATP6）の合成低下が認め−149−

図1 チトクロームC酸化酵素組織化学電顕チトクロームC酸化酵素陽性細胞（A），陰性細胞（B）を，2％グルタールアルデヒドで60分固定後，染色した．

られた．おのおののゲル上の移動度は，陽性，陰性クローン間で有意の差は認めなかった（図2）．
④陰性クローンは，グルコース欠損培地では72時
間後には，約10％の生存率であり，グルコース（＋）培地中の生存率の15％であったが，陽性ク
ローンは，グルコース欠損培地中でもグルコース（＋）中と同様の生存率を示した（図3）．
考察

チトクロームC酸化酵素部分欠損を示す
MELAS患者骨格筋より，酵素活性陽性細胞と陰性細胞をクローン化した事は，筋組織内では，チトクロームC酸化酵素陽性細胞と陰性細胞がモザイク状に存在することを示している．筋細胞が，チトクロームC酸化酵素発現の核遺伝子支配に関して，本来，ヘテロな系であれば，その一部の細a

LJ胞群が核遺伝子変異によって活性低下を示している可能性は否定できない．筋組織がチトクローム

図2

C酸化酵素の核支配に関して，均一な細胞集団の系であるならば，陽性細胞，陰性細胞の存在は，
ミトコンドリア遺伝子の変異を示唆していると考えられる．
昨年報告したように，陰性クローンのミトコン−150−

ミトコンドリア内蛋白合成の検討
チトクロームC酸化酵素陽性細胞（a），陰性細胞（b）を，細胞質内蛋白合成抑制条件下で，培養し，35S−メチオニン標識後，ミトコンドリア
画分を12．5％ SDS−PAGE上に泳動した．
CO：チトクロームC酸化酵素，ATP：ATP合成酵素，ND：NADH脱水素酵素

図3 グルコース欠損培地による電子伝達系酵素欠損細胞のスクリーニング
チトクロームC酸化酵素陽性細胞（A，B）陰性細胞（C，D）をHamF12（A，C），DM170（B，D）中で72時間培養した．

ドリアDNAに大きな欠夫は認めなかったが，小さい欠失あるいは，塩基置換は否定できない．核
遺伝子支配による蛋白合成を抑制した条件下で，ミトコンドリア内蛋白合成を検討した結果，るからである．但し，上述したように，核遺伝子支配である可能性は，筋細胞が核遺伝子支配に於いて本来へテロな集団であるという場合のみであり，本来均一な集団であれば，核遺伝子のキメラ

COII，COIII，ATP6に，検出し得る範囲内では分の状態が患者と兄とに遺伝的に発現している可能

子量に差はなく，合成量の低下を認めたことは，ミトコンドリア遺伝子の発現の調節機構異常が，陰性細胞の酵素欠損の背後にあることを示唆している．このミトコンドリア遺伝子発現調節機構が核遺伝子により支配されているか，ミトコンドリ
ア遺伝子の支配下かは，現在までのデータでは確定できない．ここに示した実験条件下では，核遺伝子による蛋白合成の抑制は2時間であり，それ以前の核遺伝子効果が現れていることも考えられ性は無いので，ミトコンドリア遺伝子異常と確定し得る．
細胞内のミトコンドリアに，正常，異常の混在状態がなく，均一であった事は，ミトコンドリア
遺伝子支配の異常としては説明し得るであろうか．
細胞内の異常ミトコンドリアがランダムに分配を繰り返す結果，正常，異常ミトコンドリアが集束し，均一な細胞群に分かれる（Stochasticsegrega−tion）という現象が報告されている4）．1個のミト

一151−

コンドリア遺伝子に生じた変異が，細胞が何回成の発現異常の機構を明らかにすると思われる．

熟分裂を繰り返すと異常ミトコンドリア遺伝子をまた，組織の酵素活性測定で低下を認めない
MELAS筋細胞をクローン化し，その一部の筋細もつミトコンドリアのみの細胞群が生じるかが計算されれば，A％の筋組織内部分欠損を示すためには，母親の，あるいは，その前の代のどの生殖細胞に1ミトコンドリアの変異が生じたかを推定

胞にグルコース欠損培地で死滅するクローンを兄
いだしたことは，電子伝達系酵素の欠損細胞のス
クリーニング法として有用であると思われる．

し得るはずである．
本研究で示した筋細胞のモザイクが，ミトコン

文

献

ドリア遺伝子支配異常によるとすると，臨床上は1）NakamigawaT，MomoiMY，MomoiTandY加感−

常染色体劣性遺伝にみえる遺伝形式も，ミトコン

sawa M：ENeuroISci83：305−319，1988．

ドリア遺伝子の母系遺伝であり，母親の体細胞の2）ShimoizumiH，MomoiMY，OhtaS，KagawaY，

異常ミトコンドリアはSubclinicalであると考え

YanagisawaM：AnnNeuro11989（inpress）・

られる．
陰性クローンにおけるmRNAの解析，DNA3）SeligmanM，etal：JCellBio138：1，1968・
4）HayashiJ，TagashiraY，Yoshida M C，Ajiro K，の解析が，ここに示されたミトコンドリア遺伝子

一152−

SekiguchiT：ExpCellRes147：51・61，1983・

25）多臓器障害を呈したMELAS剖検例の臨床および生化学的研究
宮

沢

正

豊

＊

小

澤

高

将

⁝

＊

＊新潟大学脳研究所神経内科＊＊名古屋大学医学部第二生化学＊＊＊新潟大学脳研究所実験神経病理＊＊＊＊国立遺伝研究所人頸遺伝学

西肥大型心筋症，WPW症候群と診断された．原病精査の目的で．新潟大学神経内科に入院した．入院時の現症では，全身所見として低身長，心雑音を認めた．神経学的には知能低下，視神経萎縮，＊14歳の男性で，両親がいとこ結婚であった．2
歳時，精神運動発達遅延，四肢のやせが出現．9
歳時，健診で難聴，蛋白尿，心臓障害を指摘された．さらにこの頃より，頭痛，嘔吐を伴う間代性痙撃，片麻痺発作を繰り返す様になった．12歳時，心タンボナーデとなり，この際の精査により

＊

例

＊

症

聡

今回我々は，多臓器障害を呈したMELASの一部検例2）を生化学的，免疫組織化学的に分析し，本症の電子伝達系酵素欠損の臓器分布について検討を加えた．

＊

釆

大 浜 栄 作＊＊＊ 宝Mitochondrial myopathy，enCephalopathy，
lactic acidosis，andstrokelikeepisodes（以下MELAS）は，ミトコンドリア脳筋症の中でも，脳卒中様発作，筋症状，乳酸アシドーシスを主徴とする−疾患単位である．最近，本症において電子伝達系酵素複合体Ⅰの欠損した症例が多く報告され病因として注目されている1）．

＊

田

嗣

至＊

＊

哲

子

美

田

雅

渥

誠＊

恵

田

中

米

正＊

中

研究協力者

武

視力障害，交代性外斜視，感音性雉聴，びまん性筋萎縮，筋力低下を認めた．腱反射は正常で病的反射も認めなかった．感覚障害，協調運動障害，
膀胱直腸障害，不随意運動も認めなかった．網膜
色素変性症，外眼筋麻痺は認めなかった．検査所
見では，血中・髄液中の乳酸・ピルビン酸の上昇を認め，筋生検ではragged−red fiberを認めた．
さらに本例においては，血清蛋白の低下，蛋白尿を認めネフローゼ症候群と診断された．また，心電図・心エコーより，肥大型心筋症，WPW症候群と診断された．さらに，低Ca血症・高P血症の存在とEllsworth−Howard testの結果より偽性
副甲状腺機能低下症と診断された．以上のように，本例は典型的なMELASの徴候の他にネフローゼ症候群・肥大型心筋症・偽性副甲状腺機能低下症などの多臓器障害を呈した一例であった．腎不全の増悪により14歳で死亡した．剖検は死後2時間で行われた．
方法
剖検後すみやかに−70℃で凍結保有されていた組織からミトコンドリアを単駈し，電子伝達系酵素の各酵素複合体Ⅰ〜Ⅴ活性を測定した．ミトコ
ンドリア蛋白をSDS一尿素・濃度勾配ポリアクリ
ルアミド電気泳動により分維後，WesternblotによりDuraporefilterに移し，ウシ心筋ミトコンド
リアから精製した複合体Ⅰ，ⅠⅠⅠ，ⅠⅤ，Vに対する抗体と反応させPAP法により免疫化学的に各サ−153−

表1骨格筋および脳における電子伝達系および酸化的リン酸化系酵素活性．複合体Ⅰ活性の低下が認められた．骨格筋においては複合体ⅠⅤおよび複合体Vの活性の低下も伴っていた．
EnzymeComplexI
Patjent（Z）
Control（n）
Range
ComplexII
Patjent（Z）
Contr01（∩）
Range
CornplexIII
Patjent（Z）
Contr01（n）
Range

Co叩1exIV
Patjent（Z）
Control（刀）RangeComplex V
Patient（Z）
Control（n）
Range

Skeletal

サブユニットの分析では，すべてのサブユニットの低下が認められたが，特に，矢印で示した75
kDaおよび51kDaのサブユニットおよび疎水性
画分の低分子量のサブユニットの低下が著明であった（図2）．複合体ⅠⅤおよび複合体Ⅴのサブユ
ニットも活性低下と平行した減少が認められた．

muscle

Brajn

（16）

146± 59（7）82−24677（42）184± 55（3）155 −168165（58）
317土 64（5）216 −350126（180）
70土15（3）52 − 89340（47）
731土319（3）411−1117

464・
（107）
431±208（3）212 −711

ChromeGが軽度に低下していた．本例の心筋パラフィン包埋標本の複合体Ⅰ特異抗体を用いた免疫染色（図3A）では，コントロール（図3B）に比べ，心筋線経の染色性が不均一に低下してお

112
（18）
613±276（7）325−1143

107（78）
137± 51（3）
89 −250

り，心筋においても骨格筋同様に免疫反応性物質の低下が認められた．さらに，エボン包埋トルイ

23

19
73±
30−

（26）
22く7）
97

17
26±
24−

複合体ⅠⅠⅠのサブユニット量は心臓，骨格筋，肝臓で比較的良く保たれていたが，腎臓，脳ではCytO−

（65）
2（3）
29

ブユニットを検出した．心臓のパラフィン包埋標
本を複合体Ⅰ特異抗体を用いて免疫組織化学的に検討した．骨格筋，脳より全DNAを抽出後，ヒト
胎盤より抽出したミトコンドリアDNAをプロー
ブとして用いSouthernblot分析によりミトコンド））アDNA（mtDNA）の欠夫の有無を検討した．
結ジンブルー染色では，心筋内の血管平滑筋細胞において空砲を伴ったり変性した細胞が認められ，内皮細胞においても脂肪滴の蓄積が一部に認められた．本例の心臓の血管の複合体Ⅰ特異抗体を用いた免疫染色（図3C）では，コントロール（図3D）に比べ，染色性が不規則に増しており，心筋内の血管においても，本症の脳血管で認められたのと同様なミトコンドリアの異常集族の存在が推察された．骨格筋，脳のDNAを励∽HI，PfⅠ
切断後，ヒト胎盤より精製したmtDNAをプロー
ブとして用いたSouthernblot分析の結果（図4）では，mtDNAの大きな欠夫は認められなかった．

果

本例の骨格筋，脳の複合体酵素活性では，複合体Ⅰの活性が16％，42％と低下しており，骨格筋においては複合体ⅠⅤ，Ⅴの低下も認められた（表1）．心臓，腎臓においても複合体Ⅰの活性の低下の他に他の複合体にも活性の低下が認められた．
さらに，臨床症状を呈きなかった肝臓においても複合体活性の低下が認められた．しかしながら，
ミトコンドリア由来のサブユニットを持たない複合体ⅠⅠの活性は各臓器ともほぼ正常範囲内であった．臓器間で酵素活性の低下の程度は異なっていたが複合体Ⅰ，ⅠⅤ，Ⅴの低下が比較的共通に認められ，臓器間での低下のパターンは類似していた（図1）．
Western blot法による各剖検組織の複合体Ⅰ

考察

MELASは，これまでその中枢神経症状と筋症状が注目されてきたが，今回分析した症例では心筋症，ネフローゼ，偽性副甲状腺機能低下症などの多臓器障害を伴っていた．
Morgan−Hugherら3）は，複合体I欠損を呈した
ミトコンドリア脳筋症15例中の5例に心筋症を伴っていることを見出している．また，我々は心筋症を呈したMELASの別の一例4）をすでに一昨
年の本姓会議で報告しておりMELASにおける心筋症はけっして稀なものではないと思われる．
ミトコンドリア脳筋症において腎臓障害を呈した
例は，そのほとんどがde Toni−Fanconi−Debre症候群でネフローゼ症候群を呈した例は極めて稀ー154−Muscle

Heart

I H

‖

lV V

椚

】V V

Liver

Kidney

l ll

l

ll

M

lV

V

図1各臓器の電子伝達系および酸化的リン酸化系酵素活性の正常平均に対するパーセント．複合体Ⅰ活性がすべての臓器で低下していた．複合体ⅠⅠ活性は良く保たれていた．一部の臓器で複合体ⅠⅤあるいは複合体Ⅴの活性の低下を伴っていた．

である．また，偽性副甲状腺機能低下症は，
Bresolinら5）が致死性乳児型cytochrome C欠損の筋の電子伝達系酵素活性を経時的に測定し，経過が長くなると伴に欠損の程度も強くなりさらに症において一例報告があるのみである．本例においては生化学的にも脳筋以外に電子伝達系酵素欠損が広く全身性に存在し，脳・骨格筋以外の症状もミトコンドリア恵子伝達系酵素欠掛こよるものであり，臨床面においてMELASを広く全身臓器

複数の複合体の欠損を伴ってくる事を見出してい障害としてとらえる事が必要と考えられた．
MELASにおける生化学的異常については，電子伝達系酵素複合体Ⅰの障害が主体であると考えられている．しかしながら，特に進行した例においては他の複合体の欠損をともなった例が報告されている．古賀ら6）は，ミトコンドリア脳筋症患者

常に求めやすいと考えられる．最近，Kearns

る．複数の酵素複合体のサブユニットに欠損が認められたことやミトコンドリアDNAで規定されない複合体ⅠⅠ活性が保たれていたことは本症の病
因を核のDNAよりもミトコンドリアDNAの異−Sayre症候群あるいは慢性進行性外眼筋麻痺の臨床病型をとるミトコンドリア脳筋症患者の筋のmtDNAにおいて正常の長さを持つmtDNAの他に欠矢を持つmtDNAが存在し，heteroplasmyをなす事が見出されミトコンドリア脳筋症の原因−155−

図2 複合体Ⅰのサブユニット分析．酵素活性と平行してサブユニットの不均衡な減少が認められた．

図3 心筋の複合体Ⅰ特異抗体を用いた免疫染色A：本例の心筋線経．B：コントロールの心筋線経．C：本例の心筋内血管．D：コントロールの心筋内血管．

ー156−

文

献

1）IchikiT，TanakaMetal：Deficiencyofsubunitsof
ComplexIandmitochondrialencephalomyopathy．Ann
Neuro123：287，1988．

2）田中恵子，上野光博ら：ネフローゼ症候群を合併したミトコンドリア脳筋症の一例．臨床神経26：
1190，1986．

3）Morgan−HughesJA，SchapiraAHVetal：mOlecular
defectsofNADH−ubiquinoneoxidoreductase（Com−plexI）inmitochondrialdisease・JBioenergBiomembr
20：365，1988．

4）NishizawaM，TanakaKetal：Amitochondrialen−
cephalomyopathywithcardiomyopathy，Acaserev−
ealingadefectofcomplexIintheresplratOryChain・
J NeuroISci78：189，1987．
5）BresolinN，ZevianiMetal：Fatalinfantilecytochrome
Coxidasedeficiency：decreaseofimmun010glCallyde−
tectableenzymeinmuscle．Neurology35：802，1985・
6）KogaY，NonakaIetal：Variabilityintheactivityof

図4

resplratOryChainenzymesinmitochondrialmyopa−

ミトコンドリアDNAのSOuthern blot分析．
C：コントロールDNA．B：本例の脳のDNA．

thies．ActaNeuropatho176：135，1988・
7）HoltIJ，Harding AE et al：Deletion of muscle

M：本例の骨格筋のDNA．

mitochondrialDNAinpatientswithmitochondrialmy−opathies．Nature311：717，1988・の一部を成すものとして注目されている7）8）．本例のSouthernblot分析の結果ではmtDNAの欠夫は存在せずmtDNAの微細な変異の有無をさら

8）OzawaT，YonedaMetal：Maternalinheritanceofに今後検討する必要があると思われる．

deletedmitochondrialI）NAinafami1ywithmitochon−
drialmyopathy．BiochemBiophysResCommun154：
1240，1988．

−157−

Ⅴ．ミトコンドリア（Part2）26）Kearns−Sayre症候群の剖検例におけるミトコンドリア
電子伝達系酵素と遺伝子の異常
佐

47歳，男性．家族歴：1人の妹は27歳時，すでに認められていた腎不全，聴力低下にくも膜下出血を併発し死亡した．他の妹は40歳，Kearns−
Sayre症候群不全型．現病歴‥3歳まで正常に発育していたが，その頃から難聴が生じた．34歳頃
から四肢筋の萎縮が漸次進行し，昭和59年7月
19日当科に入院した．一般理学所見は正常．神経学的には眼瞼下垂，眼球運動制限が著明，四肢筋
はびまん性萎縮が著明，知能は正常，眼底には異＊順天堂大学医学部脳神経内科＊＊順天堂大学医学部第一病理＊＊＊国立辻伝学研究所＊＊＊＊名古屋大学医学部生化学第二

只

例

＊
書
nKH

症

＊
目U

ット欠損および遺伝子の欠矢を証明したので報告する．

R只（mtDNA）の異常を詳細に解析することが次の問題点となっている．われわれはKearns−Sayre症候群の1剖検例を神経病理学的に検索し，骨格鼠末梢神経，脊髄に異常所見を見出した．さらに生化学的に骨格筋の電子伝達系酵素のサブユニ

泰 芳

Kearns−Sayre症候群では骨格筋などにおいて，ミトコンドリアの電子伝達系酵素の活性低下，
サブユニットの欠損，さらに最近では遺伝子の欠矢が見出されている1ト3）．ミトコンドリアDNA

田

は じめに

＊

聴＊＊＊小

＊

宝 来

垣

松

石 福

紳一郎＊

＊

辺

＊

池

＊

平

＊

子＊

＊

悦

子 治 将

田

浩 俊 高

内

猛＊

訳 本 澤

研究協力者

藤

骨なし，知覚障害，小脳症状なども認めない．
検査成績：血清CK132u，乳酸23．2，ピルビン酸1．51mg／dl，髄液乳酸51．5，ピルビン酸1．93
mg／dlと上昇．血中テストステロン1．9ng／ml（正常40〜100），FSH120ng／ml（正常4〜42），
LH190ng／ml（正常2−32），HCG負荷試験にてテストステロンの上昇がみられず，原発性性腺機能低下症と診断，他にhyperinsulinism，腎近位尿細管障害を認めた．脳CTスキャンでは大脳自質のびまん性低吸収城，脳波では基礎律動の徐汲化，
筋電図では筋原性と神経原性変化の混在，神経伝導速度では排腹神経41m／secにて軽度遅延などを認めた．
筋生検ではragged−redfiber，小径線維群，CytO−
Chromecoxidaseの組織化学にて5〜7％の陰性線経などがみられた．電顕では筋鞘下に結晶状封入体を有する異常ミトコンドリアが多数集積していた．

神経病理学的所見：KB染色では大脳自質のび
まん性淡明化，光学顕微鏡では前頭葉皮質，歯状核，プルキンエ細胞，下オリーブ核，脊髄前角の神経細胞の軽度〜中等度脱落，前根に多数のglial
isletsを認めた．電顕では骨格筋，外眼筋，心筋のミトコンドリア異常，末梢神経の軸索の変性，脊髄灰自質では毛細血管のpericytesの異常な増生と細胞質内に無数の異常ミトコンドリアの集積，
無髄神経終末のミトコンドリア集積などを認めた．
（図1）．

ー161−

図1胸髄前角部の電顕写真．
前角細胞の軸索突起周辺（A）に多数のミトコンドリアを含む
pericytes（P），および種類不明の細胞が認められる（×5，600）．

表l Activitiesofmitochondrialenzymes

MuscleCyt．c oxid．矢0．00135（0．05−0．11）

Succ．cyt．c red．＊＊
NADH cyt．c red．央＊
ComplexⅡ衷太
Citra亡e

央央
（

）

11

24

（147）

54

（46．3）

220

（46）

80）

26

（58）

47

（60−190）

99

（123）

（38−

sec−l・mg−1・m1−1
nmol／min／mg of protein
control

ー162−

83

0．0025（0．038）（101．3）（70−240）

30

Liver

0．013（0．0639）（30−170）35
47

sythase＊＊

央

Brain

32

（254）
（55）

生化学的検索らにrotenone−SenSitive NADH cytochrome c

その結果，EcoRIでは9．4，PvuIIでは9．8，
KpnIでは9．8kbのextra bandが出現，PstIでは2．1kbのbandが減少していた．従って本例の骨格筋のミトコンドリアでは約5−6kbの欠夫を有する異常mtDNAの混在が考えられた（図reductaseの著明な活性低下を認めた（表1）．

3）．

骨格乱大脳，肝臓のミトコンドリアを抽出し，酵素活性を二波長分光光度計で測定した．骨格筋と肝臓ではCytOChromecoxidase，骨格筋ではさ抗体を用いたWesternblottingでは骨格筋において複合体ⅠⅠⅠのサブユニット1，6，複合体ⅠⅤのサブユニット2，5の反応性の低下が認められた．
（図2）．複合体Ⅰではサブユニットの低下は明ら

鋸弧兼闇弘餅‖済副将○野済腰闇濾
COrnが耶川かでなかった．大脳および肝臓ではサブユニッ
ト・パターンの異常は認めなかった．この結果，

b08†
ml打

骨格筋ではミトコンドリアの内膜における複合体
ⅠⅠⅠおよびⅠⅤの成熟酵素のサブユニット生成に異常があることが推定された．

connpkx FV

OrS

b00†

色art C P

h08rI C p

KD言
130
TS
SP
9
年W
7
受

mtDNAの解析
剖検時得た骨格筋を凍結保存しておき，Boo−kelman法でミトコンドリアを分画後，DNAを抽出し，制限酵素（EcoRI，PstI，PvuII，KpnI）
にて切断後，0．7％

agarose gelで電気泳動した．ヒト胎盤から精製したmtDNAをPvuIIで
1inearize後，〔α−32P−dCTP〕または〔α．32P−
dATP〕をmulti−primeDNAlabeling法で標識してブローフナとした．gelからDNAをニトロセ

図2 骨格筋，Westernblot
C：対照筋，P：患者

ルロース膜に転写後，SOuthernblothybridizationを施行した．

【cPRI P，t■
ぐ

P

ぐ

F旬日
P

亡

h叩1
P r P

23＿ll一

一：●
◆．1−

乳さ一
書＜◎｝

犠鯵嘲ぬ

図3

骨格筋のmtDNAのSouthernblothybridization
制限酵素EcoRI，PvuIおよびKpnI切断にてextraband（矢印）が認められる．mtDNAのシェーマにて推定欠失部を示す．（E：EcoRI，Pt：PstI，P：PvuII，K：KpnI）−163−

が報告されているが4），Kearns−Sayre症候群の脊考察と結論
最近，ミトコンドリア脳筋症のうち，特にKearns−Sayre症候群において高率にmtDNA欠夫が報告されている1ト3）．われわれのKearns−
Sayre症候群の剖検例の骨格筋においても約5−6kbの欠失を示す異常mtDNAが認められた．
自験例では異常mtDNAの欠失領域には電子伝達系の複合体Ⅰのサブユニット（ND3，4，4L，

髄でも認められたことは興味深い．
本例では骨格筋だけでなく，他の臓器のmtDNAの検索も行う予定である．
文

献1）HoltIJ，HardingAEandMorgan−HughesJ
A：DeletionsofmusclemitochondrialDNAin5），複合体lVのサブユニット（COIII），ATPaseのサブユニット6の遺伝子が含まれている．骨格

patientswithmitochondrialmyopathies・Lan−筋で認められた複合体ⅠおよびⅠⅤの活性低下，およびWestern blotで認められたサブユニットの著明な減少はこの異常mtDNAの欠矢部に対応していると推定された．
Western blotでは複合体IVのサブユニット52）OzawaT，YonedaM，TanakaMetal：Mater−の減少も認められたが，このサブユニットは核由来の遺伝子によって生成される．従ってmtDNA
由来の複合体ⅠⅤのサブユニット1，2，3の生成障害が，核由来のサブユニJソトへも影響を与え，成
熟酵素の生成が阻害されることが示唆される．
神経病理学的検索では骨格筋，心筋だけでなく，

3）ZevianiM，MoreasC T，DiMauro S et al：

脊髄灰白質の毛細血管周囲のpericytesにも異常ミトコンドリアの集積が認められた．MELASでは大脳の血管壁の平滑筋内のミトコンドリア異常

mitochondrialencephalomyopathy・ActaNeur・

cetl：717−719，1988．

nalinl1eritenceofdeletedmitochondrialDNA
in a family with mitochondrial myopathy・Biochem Biophys Res Commun154：1240−
1247，1988．

Deletions of mitochondrial DNAin Kearns−
Sayre syndrome．Neurology38：1339−1346，
1988．

4）OhamaE，OharaS，IkutaFetal：Mitochon−−164−

drialangiOpathyincerebralbloodvesselsof
Opatho174：226−233，1987・

27）Insituhybridizationによるミトコンドリア

電子伝達系酵素のmRNAの検出

研究協力者

中

村
宝

眞

来

佐

藤

二＊＊

関

聴＊＊＊＊氏猛＊公
家一一＊
寛＊書目＊川

小
村

林

了＊＊＊

純一郎＊＊＊＊＊＊は じめにと症例3に見られ 症例1では多数認められた．

ミトコンドリア脳筋症では電子伝達系酵素の活

電子伝達系の酵素活性は症例1ではCytO−
Chrome c oxidase，症例2ではrotenone−性低下，サブユニット異常，さらに遺伝子異常が報告されている1）．ミトコンドリア（mt）DNAの欠夫は4−6kbとかなり広範囲にわたっており，

SenSitiveNADHcytochromecreductaseが低下していた（表1）．

骨格筋内では正常と異常mtDNAとが混在して方いることが推定されている．その場合，一本の筋線維内で混在しているのか，正常mtDNAを有す

法

Probe：プローブはヒトmtDNAの複合体ⅠⅤのる筋線経と異常mtDNAを有するものとが個別

サブユニットⅠとND2のそれぞれ一部を含む領に存在しているのか問題になっている．この点を域と対応するものを明らかにするため筋線経におけるmtDNAない

multi−primeDNAlabeling法にて標識した．

しmRNAの存在を直接観察できるようin situ

ln situ hybridization：生検により得られた患者

35S・dATP，35S−dCTPを

hybridizationの方法を開発し，ミトコンドリアの骨格筋から凍結切片を作成した．Insituhybrid−mRNAの部分欠損例を見出したので報告する．

ization（ISH）の方法はNakaneらの方法に基いた2）．先ず，切片を4％paraformaldehydeで固定症

例した後，前処理を0．2NHCl，prOteinasek（5JLg／

症例1は26歳男性．慢性進行性外眼筋麻痺，複合体ⅠⅤ欠損症（岡山大・氏家 寛）．症例2は41歳
男性．Mit．脳筋症・。高乳酸血症，脳卒中様発作（MELAS），複合体I欠損症（天理よろず病院・川ml）で行い，次いで4％paraformaldehydeで再村純一郎）．症例3は45歳男性，Kearns−Sayre症
候群不全型．（演題26の症例）

nuclease（500unit／ml）で非特異的なプローブをまた，生検筋のGomori・trichrome染色では全症例にragged−red fiberを認め，CytOChrome c
OXidase染色においては少数の陰性線経が症例2出した．コントロールとしてRNaseA（100JLg／＊順天堂大学医学部脳神経内科＊＊順天堂大学医学部共同病理＊＊＊順天堂大学医学部法医学＊＊＊＊国立遺伝学研究所＊＊＊＊＊岡山大学医学部精神科＊＊＊＊＊＊天理よろず相談病院神経内科

固定，2mg／mlglycineで順次処理し脱水，乾燥した後，hybridization（37℃，15hr）させた．洗浄を50％formamide−2ⅩSSCで行った後Sl除去し3），autOradiographyによりシグナルを検ml）処理した切片を用いた．また別に，ミトコン
ドリア

CDNAにnick translasion法によりビオナン標識したものと，対照としてY染色体特異的プローブにビオナン標識したものも用い，パラ
フィン包埋切片でもinsituhybridizationを施行
した．

−165−

図1〜3Insituhybridizationによる生検筋のミト
コンド［）アmRNAの検出．

症例2（図1），症例3（図2）では全ての筋線経に密度の高い反応粒子が見られ，症例
2では筋鞘膜下に粒子の集積が存在する．
症例1（図3）では2本の筋線維以外は反応が陰性である．（×600）−166−

表1Activitiesofmitochondorialelectrontransportenzymes
NADH CytOCbrome Succlnate
C

reduCtaSe●

Complex

Ⅱ●

CytoChrome
OXldase●cytochromec−

CltrateSynthase＝

C reductaset

177

90

54

0．084

147

83

166

48

0．216

113

0．271±0．070

227．1±126．6

Control（n：15）198・4±89．4

243．0±117．8

79．8±29．4★：n m01／mln／mg Of mltochondorlal proteln
H；SeC一㌧mrl．ml￣1

結

果

結

論

ビオテン標識プローブを用い，腎臓，小脳のパミトコンドリアCDNAのプローブを用いたin

ラフィン切片でinsituhybridizationを施行した

Situ hybridizationにて，ミトコンドリア脳筋症

ものでは，細胞内に陽性反応を呈した顆粒が検出の生検筋における個々の筋線経の遺伝子の局在をされた．その分布はミトコンドリアの複合体ⅠⅤの観察する方法を開発した．本法にてragged・red抗体を用いて免疫組織化学を行った成績と大体一

fiberに対応したミトコンドリアmRNAの集積，致していた．またY染色体特異的プローブを用い

CytOChrome c oxidase欠損例におけるmRNA

たinsituhybridizationでは核内にやや大きな顆欠損線経の混在をはじめて明らかにした．

粒として陽性反応が認められた．
ミトコンドリアおよびY染色体プローブでは文

献

陽性反応の分布が全く異なっていることからin

1）HoltIJ，HardingAEandMorgan−HughesJ

Situ hybridizationの結果はかなり特異性のある

A：DeletionsofmusclemitochondrialDNAin

ものと考えた．

patients with mitochondrial myopathies．

ミトコンドリア脳筋症の生検筋では症例2，3では全ての筋線経に強く反応した粒子が密に分布しNature331：717−719，1988．
2）小路武彦，中根一穂：ハ70テン標識DNA probeていた．（図1，2）症例2では筋革朋莫下に反応粒子を用いたHistoinSitu Hybridization法．細胞の密な集積が認められ，ragged−red fiberと対応

18：224−228，1986．

していると推定された．症例2，3ともcyto−

3）JVPriestleyetal：Insituhybridizationusing

Chrome c oxidase陰性線経が数％存在していた

32Plabe11edoligodeoxyribonucleotides fortheが，用いたプローブの範囲では異常線経はみられ

cellularlocalisationofmRNAinneuronaland

なかった．

endocrinetissue．Histochemistry89：467−479，

症例1では陽性反応した粒子が存在している筋
線経は少数で，大多数の線経は陰性であった．（図3）本例はCytOChromecoxidase染色でも80−90％の線椎は陰性であり，これらの線経はmRNA形成の段階で既に異常のあることが推定された．

−167−

1988．

28）タロロキンミオパテ一におけるミトコンドリア代謝の検討
福 原 信 義＊

研究協力者

島

は じめに
Rimmedvacuole（RV）は主にRV型遠位型ミオパテ一，封入体筋炎などにおける中心的な筋病
理所見としてしられている1）．このRVは自己会食胞であり，CathepsinB，Hなどのリソゾーム酵
素の活性克進により形成される2）ことが明らかにされている．一方，封入体筋炎では，最初の報告

孝 仁＊＊ア蛋白），呼吸調節率（RCI）（state3のState4に対する酸素消費率の比），P：0比（使用したADPの量とそれに対する酸素消費量の比）を求めた．
蛋白測定はLowry法によった．
また，大腿四頭筋，前脛骨筋，俳腹筋については通常のごとく光顕，電顕で観察した．対照としては7匹を用いた．

者Chouの症例3）で結晶様封入体などミトコンド

結

リアの形態異常が特徴的であったようにしばしば果

1．臨床所見ミトコンドリアの形態異常を伴っている．RV型
遠位型ミオパチーでもしばしば異常形態のミトコ

クロロキンラットは四肢麻痺は明らかではなか

ンドリアが観察される．RVをきたす疾患の実験モデルであるクロロキンミオパテー4）におけるミ

ったが，次第にやせが目立ち，特に3か月日には対照に比べ筋萎縮が明らかとなった（区‖）．

トコンドリア代謝について検討を行った．
方法

ウィスター系雄性ラット（150〜160g）12匹に燐酸クロロキン（10mg／mlの割で生食に溶解）50mg／kg／日を連日腹腔内に注射した．投与開始1か月日（5匹），2か月日（3匹），3か月日（4匹）に骨格筋と脳についてそのミトコンドリア代謝を検討した．
骨格筋のミトコンドリア分画は，大腿屈筋群よりMakinen＆Lee5）の方法により調整し，脳のミ図1クロロキンラット（矢印：3か月日）と対照ラットトコンドリア分画は関頭1分以内に大脳をとり出し，Ozawaら6）の方法により調整した．
クラーク型酸素電極により30℃でのState4での酸素消費率（natomO／min．／mgミトコンドリ＊国立療羞所犀潟病院神経内科＊＊金沢大学医学部神経内科

2．形態的変化
クロロキンラットでは筋線経の大小不同が目立
つが（図2），特にNADH−TR染色で濃染するタ
イプⅠ線経の萎縮が明らかであった．筋線経の細胞質には好塩基性顆粒状物質が多数出現してき，
RVも多数みられる（図3）が，特にタイプⅠ線維

−168−

図2

図3

クロロキン投与3カ月目，排腹臥HE染色．×950

クロロキン投与3か月日，大腿四頭筋．×950−169−

に多くみられた．顆粒状物質の蓄積のしかたは1か月のラットと2か月日のラットでは差はみられず，大腿四頭筋，前脛骨筋，俳腹筋の間にも差はなかった．一部の筋線経であったが，筋線経の壊死，貪食細胞の浸潤もみられた．
3．骨格筋のミトコンドリア代謝
1）酸素消費率（単位：natomO／min．／mg

4．脳のミトコンドリア代謝
1）酸素消費率（単位：natomO／min．／mgミトコンドリア蛋白）
Glutamate＋malate，pyruVate十malate，SuC−

cinateを基質としたstate4での酸素消費率は，対照がそれぞれ78．97±17．29，93．44±25．01，
113．89±30．66，1か月日がそれぞれ79．80±13．71，

ミトコンドリア蛋白）73．60±7．32，106．64±13．02といずれも有意差

Glutamate十malateを基質としたものでは，対はないが，2〜3か月日にはそれぞれ，51．79±

照603．66±327．47（SD）に対し，1か月日のもの

10．37（p＜0．025），58．34±7．95（p＜0．01），89．28

では417．63±72．56（p＞0．05），2−3か月日のも±16．59（p＜0．05）といずれも有意に低下していのでは235．34±116．39（p＜0．05）と低下していた．

た．Pyruvate＋malateを基質としたものでは，対

2）RCI

照508．38±281．52に対し，1か月日のものでは

Glutamate十malateを基質としたものは対照

395．42±61．72，2−3か月日のものでは176．16±

が4．42±0．36に対し，1か月日3．96±0．25（p＜71．78といずれも有意に低下（p＜0．025）してい0．05），2−3か月日3．00±0．90（p＜0．01）といずた．Succinateを基質としたものでも，対照539．25

れも有意に低下し，pyruVate＋malateを基質と±247．60に対し，1か月日のもの462．35±75．79，

したものでは対照が3．48±0．46に対し，1か月日

2−3か月日のもの201．02±128．90（p＜0．05）と低下していた．

3．24±0．50，2−3か月日2．92±0．54といずれも有意差はなかった．Succinateを基質としたもの

2）RCIでは対照が2．28±0．27に対し，1か月日1．56±

Glutamate十malateを基質としたものでは，対0．12と低下（p＜0．005）していたが，2−3か月日には1．85±0．34と有意差が認められなくなってい照が711±0．86に対し，1−か月日5．81±0．56，2−3
か月日3．15±1．00といずれも有意に低下（p＜0．025，p＜0．005）していた．Pyruvate十malate

る．

3）P：0比を基質としたものも，対照が6．73±0．74に対し

Glutamate十malateを基質としたものは対照

1か月日5．37±0．91，2−3か月日2．67±0．31とが2．34±0．49，1か月日2．42±0．12，2−3か月

いずれも有意に低下（p＜0．05，p＜0．005）していた．一方，SuCCinateを基質としたものでは対照が日2．70±0．67，pyruVate＋malateを基質としたものは対照が2．23±0．25に対し，1か月日2．64

3．44±4．24に対し，1か月日3．34±0．56，2−3か±0．12，2−3か月日2．42±0．29，SuCCinateを基

月日2．40±0．65と有意差は認められなかった．
3）P：0比質としたものは対照が1．62±0．28に対し，1か月
日1．50±0．15，2−3か月日1．48±0．17であり，

Glutamate＋malateを基質としたものでは，対pyruvate＋malateを基質とした1か月日で一時照2．53±0．36，に比べ，1か月日2．93±0．31，2〜3増加（p＜0．01）しているほかは，いずれも有意差

か月日2．59±0．43と有意差はなく，pyruVate＋は認められなかった．

malateを基質としたものでも対照2．49±0．32ぐ，

考

1か月日3．06±0．18と増加（p＜0．005）したが，察

2−3か月日には2．80±0．54と対照に比べ有意差

クロロキンはリソゾーム系蛋白分解酵素の活性がなくなっている．Succinateを基質としたもの

を著明に冗進することが知られているが，ミトコも対照1．83±0．28，1か月日2．06±0．19，2−3か

ンドリア代謝に対する影響は知られていない．
本実験では，例数が少ないため，2か月日，3か

月日2．65±1．45と有意差は認められない．
−170−

結

月日のラットはまとめて比較したが，個々のデー論

ターをみると経時的に酸素消費率が低下してきてタロロキンミオパテーでは原因としてリソゾー

おり，ミトコンドリア代謝の障害のあることは明

ム酵素の異常が注目されてきたが，ミトコンドリ

らかである．ミトコンドリアミオバナー以外の進ア機能も低下してくる．

行性筋ジストロフィー症などの筋疾患で検討した文

報告ではミトコンドリア代謝の障害は認められて献いない．また，比較のため測定した脳のミトコン

1）Fukuhara N，Kumamoto T and Tsubaki T：

ドリア代謝の検討結果も筋肉の結果とほぼ一致しRimmedvacuoles．Acta Neuropathol（Berl）ており，タロロキンミオパテーのミトコンドリア

51：229，1980．

2）佐野元規，石浦章一，杉田秀夫ほか：rimmed

異常は筋変性による二次的な異常というよりは，
タロロキン自体によるミトコンドリア代謝の一次

VaCuOleを伴うdistalmyopathyにおけるリソゾーム系酵素活性の検討．神経内科 21：391，1984．

的な障害と考えた方がよいように思われる．
本実験では3種類の基質のいずれでも酸素消費

3）ChouS

M：

Megaconial

mitochondria率が低下してきており，ミトコンドリア呼吸鎖全Observedina case of chronic polymyositis．

体に障害が生じている可能性が強いが，ActaNeuropathol（Berl）12：68，1964．

pyruvate＋malateを基質としたもので最も低下
が強4）熊本俊秀，荒木淑郎，豊島至ほか：VaCuOlar

myopathyの成因に関する実験的研究−Chloro−

く，RCIがglutamate＋malateやquineLinducedautophagicvacuoleの過剰形成

pyruvate＋malateを基質としたもので低下し，について．臨床神経 24：505，1984．

loose couplingをきたしているのに，SuCCinateを基質としたもののRCIには変化を生じないこ

5）Makinen M W and Lee C−P：Biochemicalとから，COmplexIで特に障害されやすいこと

studies of skeletal muscle mitochondria．1．

が考えられる．

microanalysIS Of cytochrome content，

タロロキンミオパテ一における骨格筋の病理変OXidative and phosphorylative activities of

化がRV型の遠位型ミオパテ一に類似し，どちらmammalian skeletal muscle mitochondria．

も同様のリソゾーム系酵素の活性元進が原因と考ArchBiochemBiophys126：75，1968．
6）Ozawa K，Seta K，Takeda H et al：On the

えられているが，本実験で認められたタロロキン
ミオバナーにおけるミトコンドリア代謝の異常がisolationofmitochondriawithhighrespiratory

RV型の遠位型ミオバナーにも認められるかどう

COntrOlfromratbrain．JBiochem59：501，1966．

かは今後の検討課題である．しかし，RV型遠位型

7）中西孝雄，尾崎行雄，金澤一郎ほか：ragged・red

ミオパテーでは電顕的にミトコンドリアの形態異fiberとvacuolar changeとを認めたdistal

常がしばしば認められ，ときにragged−red fiberのみられた症例も報告されている7）．

myopathyの1孤発例．什厚生省「神経疾患委託研
究費，筋ジストロフィー症の原因に関する臨床的研究（三好班）． 昭和54年度報告書，1979，p．95．

−171−29）ミトコンドリアミオパチー生検筋内の血管変化
埜 中 征 哉＊
研究協力著

作

田

亮

＊

古

賀

靖

敏＊

後

藤

雄

＊

石

井

弘

子＊

卒中様発作をともなうミトコンドリアミオバナー（mitochondrial myopathy，enCephalopathy，
lactic acidosis and stroke−like episodes，

MELAS）では中枢神経系内の中小動脈，特にその平滑筋細胞のミトコンドリアに変化のあることが大浜ら1）により明らかにされた．くり返す卒中様発作は血管変化に由来すると考えられ，ミトコン
ドリア異常は筋内だけでなく血管をも含む広汎なものであることが分かった．最近の研究ではMELASは複合体Iの欠損に多くみられ、複合体Ⅰ欠損では血管変化を起こし易いと考えられる．
本研究の目的はMELASを伴う複合体I欠損の血管変化は，はたして全身性のものであるかど
うかを確かめることにあった．もし全身性のものであるならば，生検筋の血管にも何らかの変化があるはずである．さらに血管変化は複合体Ⅰ欠損に限らず，他の電子伝達系異常にもみられる可能性を確かめるため，複合体IV （cytochrome c
OXidase，CCO）欠損の生検筋についても検討した．さらに血管壁内のミトコンドリアにも酵素欠損が存在しうるかどうか電子顕微鏡レベルでの細胞組織化学染色で確かめた．

皮細胞，平滑筋細胞のミトコンドリア数を数え，さらに個々の細胞あたりに占めるミトコンドリアの面積も計測した．核のある細胞は細胞の中心に近く，核のないものは細胞の周辺部であって，各々
ミトコンドリアの分布は異なると考えられる．そこで核のある部位，ない部位に分けて検討した．
2）CCO電顔組織化学による血管内酵素活性の分布
生検筋を組織ブロックのままグルタール固定し，その後CCO染色を行っても，反応液は表面から50JJm以上はなかなか浸透しないといわれている．ゆえにブロックの中心部でミトコンドリアが染色されない時は人工的なものか，病的なものかは判断できない．そこで我々は図1に示すような方法を考案した．それは①検体をグルタール固定
後，筋線経をときほぐして，その後CCO染色，
OsO4固定する方法と，②凍結切片（約20JJm厚）をグルタール固定，CCO染色，OsO4固定するものである．
上記の方法で，乳児致死型，良性型，脳筋型（急性増悪例2例，慢性型1例）の生検筋内の血管のCCO陽性，陰性ミトコンドリアの分布について検
討した．

対象と方法
1）筋生検中に含まれる小動脈内ミトコンドリア

結果の形態学的，数量的検討
複合体I欠損を伴うMELAS6例，複合体ⅠⅤ
欠損1例，複合体Ⅰ＋ⅠⅤ欠損3例，計10例と対照
6例について，その生検筋内の動脈系を検討した．

1）筋生検中に含まれる小動脈内ミトコンドリアの形態学的，数量的検討（む血管内皮細胞（表1）MELASを伴う複合体I欠損（症例1−6），CCO

生検筋内の小動脈の10，000倍の写真を作成し，内欠損（症例7），複合体Ⅰ＋ⅠⅤ欠損（症例8−10），
いずれの例でも内皮細胞1個あたりのミトコンド＊国立精神・神経センター神経研究所微細構造研究部

リア数は核のレベル，それ以外の何れでも正常対−172−

血管壁内のミトコンドリアのCCO活性は症例

METHODS／匠≡）

Fix hn G．A．

WiIh PBS
I
Toaslngヒ亡∴
C：＝＝＝＝＝ゴI
CCO＄tah（Se旬man）
I
OsO4円xaH0n
I
Epoxy R88ln

＼＼
図1

＼
畠

FrozenmaIorialI／の ／／ノ20慢三島。
I∠堅 ＿∠ノFixin蕊。。SI′軌／γcc謡鵠an，l∠∈丸 ／ノ。S。一Fi相．i。。
nI助

Epoxy Rosin

J

Cytochromecoxidase活性の電顕細胞化学的検出法．SeligmanAM，KarnovskyMJetal：
JCellBio138：1，1968．

照と比較して差はなく，またミトコンドリア面積／
内皮細胞面積でも差はなかった．
（∋血管平滑筋細胞（表2）MELASを伴う複合体I欠損では患者生検筋内に19本の血管を見出した．2症例（症例1，3）を除く4症例で，計11本の血管平滑筋細胞に異常を見出した．核のあるレベルでも，ない部分でも，平滑筋細胞1個あたりのミトコンドリアの数は正
常対照の2〜6倍（平均3倍前後）に増加していた．さらにミトコンドリア面積／平滑筋細胞面積は著しく大きく，個々のミトコンドリアもその形が大きくなっていることを反映した．
同様の血管変化はCCO欠損，複合体Ⅰ＋ⅠⅤ欠
損でもみられた．
2）CCO電顕組織化学による血管内酵素活性の分布方法で述べた2つの方法（ときほぐし法，凍結切片法）いずれでも，正常対照の骨格筋線推，血管壁内のミトコンドリアは全てCCO染色で濃染した．CCOはミトコンドリア内膜に局在する酵素であるのでクリステが特に濃染した．

ごとにより異なった．症状が相反する乳児致死型，
乳児良性型では，筋線稚内のミトコンドリアには差があったが，血管内皮細胞，平滑筋細胞内のミトコンドリアは正常であった．
脳筋型で急性増悪をとった2例では両者とも平滑筋細胞には活性がなく，1例では内皮細胞にも活性がなかった．慢性型では内皮細胞には活性があったが，平滑筋細胞では活性のある血管と，ない血管がモザイクをなしていた（図2）．
以上血管内のCCO活性の有無を表3に示した．
考察
MELASではその中枢神経系内の中小動脈に著明な変化があり，卒中（stroke）は血管変化に由来することが大浜ら1）により明らかにされた．すな
わちミトコンドリアミオバナーでは筋内だけでなく，血管壁内のミトコンドリアも侵されていることが明らかにされたのである．血管変化は全身性のものであるかどうかを確認することが本研究の目的であった．その結果はMELASでは全身の血管に変化がある可能性を示していた．その変化は
大浜らの中枢神経内でみられたものと同じであっ
た．
MELASの多くの患者で複合体I欠損が見出されていて，MELASと複合体Ⅰ欠損は密接に関係していると思われている2），3）．我々は今回複合体Ⅰ欠損でMELASを伴った例を中心に検索したが，我々が経験した複合体Ⅰ欠損はほとんど例外なく卒中発作を伴った．複合体Ⅰ欠損は小動脈内の平滑筋細胞内のミトコンドリアにも酵素欠損があり，その異常は全身性で，中枢神経系には症状として卒中を伴うと考えられる．
血管平滑筋内のミトコ王ドリア異常は複合体Ⅰ欠損だけでなく，複合体ⅠⅤ，Ⅰ＋ⅠⅤ欠損でも認められた．すなわちミトコンドリアミオバナーは血管の変化は普遍的現象であることが分かった．それは複合体ⅠⅤ欠損でもまれに卒中様症状を伴うことから分かる4）．
複合体ⅠⅤ（CCO）活性は組織化学的，電顕細胞化学的に活性が証明できた．この方法でみると

−173−

表1

Morphometricanalysisofmitochondriainendothelialcellsofsmallarteries．

Patient Nurnber of Number of Mitochondria Mitochondrial Area toArteries

Cells

主he Total Cell Area（％）

Examined with nuclei withouヒ nuclei

perVith nuclei without nuclei

CornplexI deficiencY With MELAS
b

′

′

2

3

1

3
2

0

4

4

3

5
7

3

3

1

3
5

4
3

．

′ D

0

2．9士0．7★

′ b

19

3

3．8

2

2．3

4

2

3．2

5

4
4

3

2．1

′ b

1

0 ノ

3．5

3
4

2．5

1

3

2

3

2

2

1

★
′b

2

3．8！0．4チ

S

tL
O

r
e
t L

0
十一
4

l
a

0
T

3．6士0．7★

7

h

パ﹁

﹁ −
0 0

7

9

10
3
2

Total

2．8

3．6

3．4

2．8

2．5

3．8

2．4

1．9

1．5

2．2

2．9

1．7

2．2

2．4

2．5

2．2士0．5★

2．3壬0．6★

1
2

2．5リ．0Control

2．OtO．8

3．6

3．0土0．8★

3．1±0．g

3．2！1．0

3．5±0．64（N＝6）

Patient

7：ComplexIV deficiency．Patients

8−10：Primary biochemical defects not

ClearlY defined，ControI＊No

valueslere

stastical

eXPreSSedsignificanceasas

MeantsD

using

comparedvithaone−tailed

Student●s

t

test．

controIs．

表2 Morphometricanalysisofmitochondriainsmoothmusclecellsofsmallarteries・Patient NurTlber of Number of Number of Mitochondria Mitochondrial Area toArteries

AbnormalExamined−一一L−−−−−一一一一−−−−−−−一一一一一一一一一一一一一一一一一−−−一一一−−−−−一一一一一−

Arteries

per

Ce11s

the

Total

Cell

Area（％）

with nuclei、Without nuclei with nuclei without nuclei
Complex Z deficiency with MELAS
0
3
0
3

Total

19

言

10．2
47．6
6．8
42．1

6．2

4．2

3．6

33．2
4．9
24．5

31．3
3．1
33．6

18．2
2．6
22．4

29．93：・告．2★2。．…4こ512．3モ 2，言7ニ2，3．7★13．告58．。★

0thers
7

7

パ︼

8

5
4

23．5
51．4

11．0
36．1

19．4
38．3

20．2
19．3

7

9
10

つJ
2

Toとal

言 31．61：一号5．6★24．三5主013．1★ 28．告714．9★22言2ニ31。．1★

I
2

（N

＝

6）

J︼

Contr01

0

7・6土

4・5

7．5土

Patient
7：Complex ZV deficiency．Patientsnot clearly defined．
ControI values were expressed asトIean

8

3・9

3・0

＋

0・9

3・4

1・0

−10−；PrimarY biochemical defects＋SD using a one−tailed Studentls t＝★stasticallY Significant as compared石ith controIs（pく0．001）．

−174−

＋

teSt・

図2

ccO欠損脳筋型（慢性進行例）の小動脈壁．内皮細胞（E）内のミトコンドリアには酵素活性があって濃染しているが，平筋筋細胞（M）内のミトコンドリアには活性がない．CCO染色．横線＝1／
ラニール染色のみで鉛染色は省いてある）
表3

Summaryofcytochromecoxidaseactivityonelectronmicroscopy．
Blood Vessels

Patients Muscle Fibers Fibroblasts Endothelium Smooth Muscle
FatalInfantj1elBenignInfantj1e
2

Encephalomyopaythic
Acute
3
4
Chronic
5

ControIs
1
2
3

M：Mosaic distribution ofcytochrome c oxidase positive and negative Cells

−175−

m．（ウ

組織特異性がよく表現できた．その組織特異性は臨床症状とは必ずしも相関していない．なぜならば乳児良性型でも，致死型でも血管内のミトコン
ドリアCCO活性はよく保たれていたのに，乳児致死型より軽症の脳筋型の方で欠損例が多かったからである．ただ，線維芽細胞にも，血管壁内のも全てのミトコンドリアでCCO活性が存在しな（CCO）欠損でもみられ，酵素欠損が電顕細胞化
学染色で証明された．
④血管壁内にも組織特異性が証明された．

かった例は急激な経過をとった．今後この組織特異性がミトコンドリアミオバナーの病因を知る上で重要な鍵をもっていると考えられる．

drial encephalomyopathy．Acta Neuropatho1

文献1）Ohama E，Ohara S et al：Mitochondrial an−
giOpathyincerebralbloodvesselsofmitochon・

74：226，1987．

2）KobayashiM，MorishitaHetal：Twocasesof
NADH−COenZymeQreductasedeficiency：rela−

まとtionship to MELAS syndrome．J PediatrllO：

め①MELASを伴う複合体I欠損の血管変化は筋内でも存在し，血管病変は中枢神経系に限らず全身性のものと思われた．
②血管変化は小動脈の平滑筋細胞内のミトコンド
リアの変化が中心で，内皮細胞はよく保たれていた．

223，1987．

3）KogaY，NonakaIetal：FindingsinmuscleincomplexI（NADH coenzyme Q reductase）
deficiency．AnnNeuro124：749，1988．
4）NonakaI，KogaYetal：Musclepathologyin③血管壁内のミトコンドリア変化は複合体ⅠⅤー176−

cytochrome c oxidase deficiency．Acta Neur・Opatho177：152，1988．

30）ミトコンドリア電子伝達系の検討（第3報）
田 代 邦 雄＊
研究協力者

伊

藤
島

和

則＊

斉

藤

敏

之＊＊

森

若

文

雄＊

功 二＊＊＊菅 野 富 夫＊＊

は じめにミトコンドリアの異常に起因する疾患に対して，

fiberが見られた．電顕にてミトコンドリアの形態の異常，数の増加を認めた．

生化学的，遺伝子的検索が行われているが，われわれはミトコンドリア電子伝達系の障害を吸光度分析を用いて，検討してきたが，特に筋肉内ミオ

方法

グロビン，ヘモグロビンの影響を完全に除去する

症例2の生検筋約10mgを用いて，Scanhing
OrganSpeCtrOphometer（SOSP）にて筋肉内のミことはできず，しかしこれらの干渉因子を最大限

トコンドリア電子伝達系を検討した．

にブロックする目的で今回NaCNを用いて実験

家人支J是した1）・2）．また最近筋肉内のエネルギー代謝の面で㌶

無侵襲的に施行可能な3lPNMRspectroscopyを用い，ATP，Pi（無機リン），PCr（クレアチンリン酸）の測定が可能になってきた．
症

例

家族歴を有する症例1（74歳），症例2（44歳），症例3（41歳）について報告する．

48

M

41

症例1（74歳男性）：50歳頃より眼瞼下垂，眼球運動障害を自覚し，以後徐々に進行した．今回精査のため入院中に突然のAV70ロックを起こ

★ 7

4 才

し，心停止，呼吸停止となるも現在は独歩可能なまでに改善した．

4

6 才

8 ．3

1 ．0 2 †★ 4

4 才

1 2 ．2

0 ．7 4 †★ 4

1 才

1 8 ．0 †0 ．9 0 †3

6 才

1 3 ・1

0 ．8 5 †乳 猥

症例2（44歳），症例3（41歳）は症例1の子供であり，同様に眼瞼下垂，眼球運動障害にて発症した．家族歴，それぞれの血清乳酸，ピルビン酸値を示す（図1）．今回症例2（44歳）に対して，左上腕二頭筋の筋生検を施行した．光顕では結合組織の増加，中心核の軽度増加を認め，
Gomori Trichrome染色で中等度のragged red（9 −1 6 m 文／ d t ）l
2 3 ．8 日

36

ピ ル ビ ン 級
（0 ．3 6 −0 ．5 9 m 又／d l ）1 ．。2 日図1 家族歴と検査値∫はミトコンドリア＊北海道大学医学部附属病院神経内科＊＊北海道大学獣医学部生理学講座＊＊＊国立療萱所札幌南病院神経内科

ミオバナーの症例を示し，検査値では★が症例を示す．74才の症例1を含めてピルビン酸値の上昇を認めた．
−177−

基質をそれぞれ10mMpyruvate，10mMsuc−cinateを用い，室温にて，まずpyruvateを基質として酸素を通気した後，窒素還元 AntimycinAを添加した．その後10mMNaCNを添加した．

Siemens社Magnetom（磁場強度1．5Tesla）を用いて，5インチのSurfacecoilを被検者の排腹筋に置き，安静時および運動負荷後の筋肉内のエ
ネルギー代謝を経時的に測定した．ATP，無機リ

次に基質をsuccinateに代えて同様に窒素還元，Antimycin A，Rotenonを加えた後，10mM
NaCNを添加した．

ン，クレアチンリン酸のSpeCtrOSCOpyをchemi−
calshiftの像よりPCr／Piを計算し，時間による

0

10

20

40

10 か
1

N2

推移を検討した．

60

120

Pym Vate

N
2

」

声
司

」
帖CN

8
．0

︵qO︶むU⊂帽qLOSqe

wwELENGTH（nm）
図2

SOSPによるSpectrumを示す．
上段はプロトコールを下段はspectrumを示す．基質を10mMのpyruvateを用い，窒素還元を行い，10mM NaCNを添加した時点のspectrumであるが，CytOChrome b，aa3は理論値に出現しているが・
cytochrome c＋clの波長は短波長へ連れている・

−178−

結

果

SOSPによるミトコンドリアの吸光度分析にて基質の差（pyruvate，SuCCinate）は認められず，
前回，われわれは筋肉内のミオグロビン，ヘモグ
ロビンはミトコンドリアの電子伝達系（cyto−
Chromec＋cl，b，aa3）の吸収スペクトルに干渉しないであろうことを報告した2）．しかし特に

0

510

20

40

I
Om
M

ミオグロビンは筋肉細胞内に存在し，分解除去できず，多少なりとも吸収率に影響する．そこで今回ミトコンドリアの電子伝達系の直接阻害剤である10mMNaCNと窒素還元を添加することで真の電子伝達系の動態を観察可能と思われた．症例2の検討にてはcytochromeb，CytOChromeaa3は理論値として認められ，波長のずれは認められ

60

120

S
u
c
ci
n
at
e
l

R
ot
e
n
o
n
e
N
2

N
2
N
a
C
N l
O
m
M

an
t
i
m
yci
nA

WAVELENGTH（nm）
図3

SOSPによるSpectrumを示す．
上段はプロトコール，下段はspectrumであり，10mMsuccinateを基質として用い，窒素還元施行後，10mMNaCNを添加時のspectrumである．
Cytochromeb，aa3は理論値として出現しているが，CytOChromec＋clは理想値より短波長側へ偏位し
ている．

ー179−

HACJJ≡TOHl．5

丁H

HロKKAID8 UNfV三言SITY HOSP．
lSP≡［】500三g．DAT

ー10．
−〜0
CnE爪1⊂三！Snl代／′障爪＞∈ ＼ tqUヱS

Cheal；al訂豆往／F〇m

図43lPNMRspectroscopyによるChemicalshift
症例2のspectroscopyであり，左上段は安静時のもので，右上段は運動負荷中，左下段は運動負荷直後，運動負荷3分後のChemicalshiftを示す．

なかった．しかLcytochromec＋clは短波長側に移動していた（図2，図3）．このずれがミトコ
ンドリア電子伝達系の異常を示唆するものと推察された．
3lPNMRspectroscopyは安静時と運動負荷後を連続的，経時的に測定し，Chemicalshiftとして表した（図4）．安静時のSpeCtrOSCOpyを示す．Pi（無機））ン），PCr（クレアチンリン酸），γATP，
αATP，βATPのそれぞれの波形が分離される．
運動負荷によるPCr／Piの比を示す．★は正常者，●は症例2のものを示す．症例はPCr／Piの著し
い低下と回復の遅延が認められた（図5）．

考察ミトコンドリアの異常にも、とづく疾患を生体内にもっとも近い状態で観察可能な方法として・現在われわれが用いているScanning Organ
spectrophtometer（SOSP）と3lPNMRspectro−

scopyがある．SOSPは生検筋を約10mg程度を用い，還流装置にて酸素，窒素を通気しながら，基質を還流しつつ，それぞれの阻害物質を添加し，反射光にてCytOChromeの各成分の吸光度を測定するものであるが，特に問題になるのが，筋肉内のミオグロビン，ヘモグロビンであるが，前回の本研究報告にてそれらの影響を比較的受けづらいことを指摘したが，今回の実験系にて，吸収率に−180−

例も運動負荷でPCr／Piは低下し，安静時の値まP C r／Pi

で回復する時間の遅延を認めた．このことから
PCr／Piはミトコンドリアの機能異常を類推するための特異的指標となる可能性を示唆した．また今後ミトコンドリアの障害例に対する薬剤の治療
効果判定をScreeningする手段として応用されることが期待される．
文献1）田代邦雄，伊藤和則，森若文雄，島 功二，斉藤
O pre

5

敏之，菅野富夫：Scanning Organ Spectroph−
tometerによるミトコンドリア電子伝達系の検10（mi n〉

討． 厚生省神経疾患・筋ジストロフィー症の臨
図5 PCr／Piの時間的推移★は正常コントロール，●は症例2のPCr／Piの安静時，運動負荷による経時的変化を示す．
症例のPCr／Piは運動負荷にて低下し，安静時まで回復するのに6〜8分程度の時間を要している．一方コントロールは運動負荷にてもPCr／Pi値の変化は認められなかった．

床，病態と成因に関する研究（杉田珪）昭和61年
度研究報告書 ，1986，pp244−250．
2）田代邦雄，伊藤和則，斉藤敏之，森若文雄，島 功
二，菅野富夫：ミトコンドリア電子伝達系の検討． 厚生省精神・神経疾患・筋ジストロフィー症
及び関連疾患の病態とその成因に関する研究（杉田班）．昭和62年度研究報告書 ，1987，pp147−
152．

影響していることが観察され，窒素還元を行い，
NaCNを投与することで，真の筋肉内ミトコンド
1）アのREDOX STATEを観察可能であることが認められた1）・2）．
3lPNMRspectroscopyは細胞内のエネルギー

3）Arn01dDL，TaylorDJandRaddaGK：Investi−
gationofhumanmitochondorialmyopathiesby
phosphorus magnetic resonance spectroscopy．

AnnNeurol18：189−196，1985．

4）ChanceB，EleffS，LeighJS，SokolowDand

代謝を非侵襲的に観察でき，また細胞内のpHの経時的変化も抽出できる．ミトコンドリアの活動状態を観察するにはATP／ADPxPiでエネルギ
ー状態を測定する．しかし実際にはPCr／Piにて

Sapega A：Mitochondrialregulation ofphos−
phocreatine／inorganic phosphate ratiosin

exercisinghumanmuscle：Agated31P NMR
Study．ProcNatlAcadSci78：6714−6718，1981．

間接的に類推している．PCr／Pi値は正常人で安静時，運動負荷時，ともに変化を認めないが，ミトコンドリアの障害を認める症例は安静時，運動負荷時に低下を認めている3）・4），5）

5）ArgovZ，BankWJ，MarisJ，PetersonPand

ATP signal値はATPが5．5mM／kgとして換算して表現されるが，ATPの正常値を検討していないので今回は計算できなかった．運動負荷

6）岡澤 均，川井 充，伊藤正光，本吉慶史，作田時にPCr／Piの回復状態がミトコンドリアの機能に左右され，非常に敏感に反映される．今回の症

NMR spectroscopyによる検討．臨床神経学

Chance B：Bioenergetic heterogeneity ofhumanmitochondrial myopathies．Neurology
37：257−262，1987．

−181一

学：組織化学的にfocal cytochrome C oxidase
deficiencyを認めた慢性進行性外眼筋麻痺の3lP
28：923−927，1988．

ⅤⅠ． ジストロフィン

31）Duchenne型筋ジストロフィーの欠損蛋白質
一免疫組織化学的検討一
杉
研究協力者

荒

畑

目

喜

田

秀

夫＊

一一一＊

石

浦

的

DMDに関する最近の分子遺伝学的研究の進歩は目覚ましく，なかでもHarvard大学のKunkel，Monaco，Koenig，Hoffmanらのグループにより

章

一＊

塚

原

俊

文＊

プロット法と免疫組織化学的方法により検討した．
③検索対象はDMD28例，Becker型9例，その他の筋ジストロフィー24例，各種神経筋疾患24
例および正常筋9例などである（表1）．

遺伝子のCDNAシークエンスおよび欠損蛋白質（ジストロフィン）が明らかにされた事は特筆される1）・2）・我々は今回DMDのcDNA配列に基づいてペプチドを合成し，これに対する抗体を得てジストロフィンの局在，生化学的特性等を検討した・これによって臨床病理学的な有用性を明らかにし得たので報告する3）・4）・7）

表1 ヒトおよびマウスの骨格筋および心筋表面膜のDMD遺伝子産物の発現（免疫組織化学的解析）（文献4より引用）

遺伝子産物発現臨 床 診 断法

DMD

①我々は，Kunkelらにより発表されたDMD
CDNAマップをもとに，その一部分に対応する

0

5

0

5

10ⅦLySGluPr︒Arg

5

9ArgLeuThrGluLyS

0

8HiSLySLySGluLeu

5

7LeuGlnThrGluASp

Leu
Gln

6ASnAS
tn
GL
le
uuMe

Glu
Glu

5SerGlnTrpLySLeu

Tyr
Leu

4GILeASArASl

3LySASpASnThrPrO

2Gl︒慧諾mナル抗体を調製した．②抗体の特異性は，イムノ

0

YEKQSNLHRVLMDLQNQKLKELNDWLTKTEERTRKMEEEPLGPDLEDLKRQ−NH2
MW：6267
回1抗原として用いたペプチドのアミノ酸シーク
エンス＊国立精神・神経センター神経研究所

22

発症前DMD
女性DMD（Ⅹ；5転座）
BMD

5
1

9

−／

Emery−Dreifuss型
先天性福山型

1

＋

5

一十

肢

型

5

＋

顔面・肩甲・上昧型8＋

節緊張性ジストロフィー
皮膚筋炎（小児）
多発性筋炎

5

＋

6

＋

5

＋

脊髄性筋萎縮症

6＋その他の疾患＊正常コントロール＊＊

7

＋

9

＋

mdxマウス5

コントロールマウス

5

帯

計

＋

（N一末端より1526−1675）ポリペプチド（分子量6，267）を合成し（図1），これに対するポリクロー

骨格筋

＋

心筋
▲NDNDNDNDNDNDNDNDNDNDNDND＋■＋

方

症例数

104

−：陰性，＋：陽性，一／＋：部分発現，ND：末施行＊：ネマリンミオバナー，セントラルコア病，強皮症および、
甲状腺機能低下性ミオバナーなど＊＊：神経筋疾患を伴わない剖検例

−185−

結
果
に反応したが，Ⅹ；5転座の女児例を含むDMD
図2及び表1はこれらの結果をまとめたもので 仝例で免疫反応を示さなかった．またBMDある．即ち我々の抗体は正常筋の表面膜と特異的

図2（Beckermusculardystrophy）を除くその他の抗DMDペプチド抗体による各種神経筋疾患のジストロフィン染色（文献4より一部改変）
a〜C：H＋E染色
d〜1：FITCr螢光抗体法によるジストロフィンの免疫染色a，d：正常，b，e：BMD，C，f：DMD，正常筋の表面膜に染色されるジストロフィンはDMD筋では認められない．しかし部分的染色がBMDでは見られる．その他の神経筋疾患はいずれも免疫反応が陽性である． （×185）
g：Emery−Dreifuss筋ジストロフィー
h：先天性福山型筋ジストロフィー
i：肢帯型筋ジストロフィー
j：顔面一肩甲一上腕型筋ジストロフィー
k：筋緊張性ジストロフィー
1：Kugelberg−Welander病

一186−

神経筋疾患では筋細胞表面膜はすべて陽性に染色された．さらにDMDの動物モデルとされるmdx

分子量の異常なジストロフィンが発現していることをウエスタンプロット法により明らかにしていマウスでも陰性反応が，そのコントロこルであるる6）．このようなタンパク質レベルで生ずるDMD

BlOマウスでは陽性反応が同様に確認された．なとBMDの差異が遺伝子レベルではどうなっていお，ジストロフィンは正常心筋の表面膜に一様にるのか，なお未知な部分も多く残されているが，発現していたが，DMDの心筋には欠損していた．

一つの考え方はKunkelらの言うDNAレベルの

またBMDの骨格筋では免疫染色のムラや部分欠

フレームシフト仮説であろう．これに従えば，ジ損が認められた．しかし，その他の疾患では正常

ストロフィンの欠損の有無は欠失DNAの大小と筋同様，陽性反応を見た．これらの結果はイムノ
ブロットでも確認された．ジストロフィンは，TXは関係せず，DNAのreading frameがシフトしてしまえば誓え僅かのDNA欠夫であってもジス−100不溶性，SDS可溶性であった事から筋表面

トロフィンの欠損を来すし，他方readingframe

膜細胞骨格の構成成分であるものと推察された．

がシフトせずに残っていれば，internal deletionが存在してもジストロフィンは（不完全ながらも）考察

発現することが説明できる．BMDは後者の場合

Kunkelらは（1987）DMDcDNAの一部分（Nに相当しよう．免疫組織化学的に見てもDMDと一末端より1．3〜2．7kbと3．7−4．4kbの2種類）

BMDが異なる事は，我々の今回の結果によってを発現ベクターと共に大腸菌に組み込んでDMD明らかになった．即ち，DMDでは陰性であった免タンパク質断片（それぞれ60kdと30kd）を得，これに対する抗体を調製した後ウエスタンプロッ

疫反応が，BMDでは部分的ながら反応を筋表面膜に認めたことである（陽性線維数は0．1〜91．3

ト法により，分子量約400kdに相当するタンパク％）．このことはBMDにジストロフィンが発現し質がDMD患者の筋肉には欠損している事を発見ていることを示すものである．と同時にその発現し（正常筋には存在する） ジストロフィン と命は正常と異なり，量的または質的に不完全である

名した（このDMDタンパク質は非常に微量で，
仝筋肉タンパク質の僅か0．002％程度に過ぎないことを示している．これらの事実は前述したHof−fmanらの結果とも矛盾しないものであろう．さと推定されている）．彼らは，当初ジストロフィン

らにこの事実はBMDがDMDと比べて臨床的にが正常骨格筋と心筋の細胞分画中 重い ミクロ

良性であることを裏付けるものと考えられる．

ソームを中心とした分画に検出されたことから，ジストロフィンはこの分画に含まれているtriad

結論に存在すると考えた．しかし既に記した様に，

このようにDMDで特異的に欠損している蛋白

DMDタンパク質の局在部位が主として筋細胞の質が明らかになった意義は極めて大きいと言えよ

表面膜にある事は疑いの無い事実である3）・4）．むろう．中でも，これまで必ずしも容易ではなかった，んのことこれはジストロフィンがtriadにも存在する可能性を完全に否定するものではない．Wat＿①DMDとBMDの鑑別，②DMDとFukuyama型筋ジストロフィーの鑑別，（診DMDといわゆるkinsらは（1988）金コロイド標識二次抗体を用い

肢帯型筋ジストロフィーの鑑別などが可能になった免疫電顕により，ジストロフィンが筋細胞表面た点である．また④DMDキャリアー診断の手段

膜の内側（細胞質面）に存在する事を示している．

として，どの程度有用であるのかなども今後検討

ところがtriadとの関連は必ずしも明確では無い
ように思われる5）．

すべき課題となる7）．今回の結果は，本症の膜異常

BMDは，良性DMDとも言われているごとく，

後さらにジストロフィンの欠損がいかにして表面

分子遺伝学的にもD叩Dと同一遺伝子の欠損（変異）を認める．Hoffmanらは（1988），BMDでは膜異常という結果をもたらすのか等について追求

説を分子レベルから支持するものと考えられ，今して行くことが新たな研究テーマとなった．

ー187−

文

献

Skeletalandcardiacmusclesurfacemembrane

1）KoenigM，HoffmanEPetal：Completeclon・

tionofdystrophininmusclebiopsyspecimens

ing of the Duchenne muscular dystrophy

frompatients

withDuchenne

Sand

Beckers（DMD）cDNA and preliminary genomic

muscular dystrophy．New EnglJ Med318：

organizationoftheDMDgeneinnormalandaffectedindividuals．Cel150：509−517，1987．

7）ArahataK，IshiharaTetal：Mosaicexpression2）KoenigM，MonacoAPetal：Thecomplete

ofdystrophininsymptomaticcarriers ofDu−

sequenceofdystrophinpredictsarod−Shaped

chenne，smusculardystrophy．NewEnglJMed

cytoskeletalprotein．Cel153：219r228，1988・

320：138−142，1989．

1363−1368，1988．

WithantibodyagainstDuchennemusculardys・3）SugitaH，ArahataKetal：Negativeimmunos−
taining of Duchenne muscular dystrophy

trophypeptide．Nature333：466−469，1988．

（DMD）and mdx mouse muscle surface5）Watkins S C，Hoffman E P et al：Im・

antibody against synthetic

munoelectronmicroscoplClocalization of

peptidefragmentpredictedfromDMDcDNA・

dystrophininmyofibers．Nature333：863L866，

ProcJapanAcad64：210−212，1988・

1988．

membrane with4）ArahataK，IshiuraSetal：Immunostainingof

6）HoffmanEP，FishbeckKHetal：Characteriza−−188−32）Duchenne型筋ジストロフィー症ならびに各種神経筋疾患におけるdystrophinの局在および疾患特異性について
荒 木 淑 郎＊

研究協力者

は

じ

め

内 野

に

Kunkelら1ト4）の最近の研究によると，Duchen・
ne型筋ジストロフィー症（DMD）の遺伝子座はⅩ
染色体短晩ⅩP21の約2，000kilobase（kb）にわたるDNA鎖上にあり，この中に含まれる約60個のexon（平均200basepairs）の一部あるいは大部分が欠失することにより，DMDが発症することが明らかにされている．この60個のexonはmRNAサイズとしては14kbに相当するが，既にcDNAとしてクローニングされており4），最近同じ研究グループのHoffmanら5）6）により，この遺伝子産物として分子量400kdのMdystrophin（叶dつ と呼ばれる蛋白の存在が明らかにされ，
DMDおよびmdx mouseではこれを欠失することが報告された．
今回我々は什d の細胞内局在および各疾患における特徴を明らかにするため，抗 d 抗体を用いて，DMD，女性DMD，Becker型筋ジストロフィー症（BMD）およびその他の各種神経筋疾患について検討を加えたので報告する．
対象並びに方法
対象はDMD6例（2−12歳），女性DMDl例（6歳），BMD5例（13−40歳），その他の各種神経筋疾患39例および正常対照7例の計58例の生検筋について，抗什d 抗体を用いて，Westernblot
ならびに免疫組織化学染色による検索を行った．
＊熊本大学医学部第一内科＊＊国立療茸所再春荘病院神経内科＊＊＊熊本大学医学部発達小児科

誠＊＊ 三 池 輝 久＊＊＊なお抗Md 抗体はHoffmanより供与された羊抗
dystrophin抗血清（30kdおよび60kdの二種類の抗原に対する抗血清）を用い，biotinylatedrab−
bit anti−SheepIgGを二次抗体としたAvidin
Biotinperoxidasecomplex（ABC）法にて行った．
結果
l．Weste「nbTottingによる分析
1）正常対照：SDSに可溶性の全筋蛋白のSDS−
PAGEを行った後，前述の方法に従って抗【d 抗体による抗原（〝dつの検出を行ったが，30kd抗体および60kd抗体のいずれにおいても，分子量400kdの部位に一致して明瞭なbandの発現がみられた（図1）．
2）DMD：検索した6例全例で30kd抗体および60kd抗体のいずれにおいても【d は検出できなかった（図1，2）．
3）女性DMD：Md は検出されたが，正常対照やその他の神経筋疾患患者と比較すると明らかに減少していた（図2）．
4）BMD：女性DMDと同様にMd は検出されたが，正常対照と比較すると d は明らかに減少していた（図2）．
5）その他の神経筋疾患：先天型筋ジストロフィー症（非福山型），筋緊張性ジストロフィー症，多発性筋炎を含め，DMD・女性DMD・BMD以外の神経筋疾患においては正常対照と同様に分子量400kdの部位に一致して，明らかな什d の発現がみられた（図1）．

−189−

，：

′■

こ

こ二

．

さ土

工1

ト〕

・∴・・・・

図1Immuno−blotanalysisofdystrophininmusclebiopsyspecimensfromDuT
Chennemusculardystrophy（DMD），amyOtrOphiclateralsclerosis（ALS），
andnormalcontroIs（C）usingsheepanti−mOuSedystrophinantibodies．
Lanel‥tOtalSDSLSOlubilizedmuscleproteins（amidoblackstain）；lanes2−5‥immuno−blotusing30kdsheepanti−dystrophinantibody；lanes6LlO：

immuno−blotuslng60kdsheepanti−dystrophinantibody．
NotethecleardetectionofdystrophininthemuscleofnormalcontroIsandpatientswithALS・Bycontrast，themuscles ofDMDpatientsshowan
absenceofdystrophin・MHC：myOSinheavychain，α−Act：α−aCtinin，Act：
actin．

ll．免疫組織化学
1）正常対照：横断像および縦断像にて，筋鞘に一致し，全周性に明瞭な抗体の沈着がみられた（図3−B，C）．

2）DMD：検索した6例全例で，横断および縦断像
にて筋線推鞘には抗体の沈着はみられず，筋線維内部にも明らかな 甘 の局在はみられなかった（図3−E）．
3）BMD：筋鞘に一致して抗体の沈着がみられたが，正常対照に比較して量的に少なく，また仝周性に均等な分布ではなく，断続してみられた（図3−F）．

4）その他の神経筋疾患：正常対照と同様に筋線経の表面膜に一致して仝周性に明瞭な抗体の沈着がみられた．この他多発性筋炎など検索した一部の症例で筋線維内部にも顆粒状に抗体の沈着を示唆する所見が認められたが，筋表面膜と比較すると極少量であり，また横紋との関係は明らかではな

ー190−

∈

鍾農

齢

招瑚

摘鵜

粧

錘8

g

∈

図2Immuno−blotanalysisofdystrophininmusclebiopsyspecimensfromDMD，femaleDMD，Becker

smusculardystrophy（BMD），andcontroIs（C）usinganti−dystrophinantibody．

ThemusclesofDMDpatientsshowanabsenceofdystrophin．InBMDandfemale DMD，the density of dystrophinis clearlylower thanin normal
COntrOIs．

Lanel：tOtalSDSLSOlubilizedmuscleproteins（amidoblackstain），lanes2￣10：immuno−blotusingsheepanti−dystrophin（60kdpolyclonals）．

常と思われる筋線経でも筋表面膜に抗体の沈着がかった（図3−D）．

みられないことを報告した．その後同じ研究グル
考案

最近Sugitaら7）は既に報告されているヒトⅩ

ープのArahataら8）は更に多数例で検索を行い，BMDでは表面膜に部分的に抗体の沈着がみられ染色体のCDNA mapをもとに51個のアミノ酸

ること，筋緊張性ジストロフィー症では正常対照からなる分子量6，267dのpeptideを合成し，こよりも抗体の沈着が著明であること，およびim−のpeptideに対する抗体を用いて，正常対照では

munoblotによる検索でこの抗体が結合する蛋白

筋線経の表面膜に仝周性に均等な抗体の沈着がみが分子量210kdの蛋白であることを報告した．まられるのに対し，DMDおよびmdx mouseではたZubryckaLGaarnら9）も独自にDMDの原因遺壊死線経やopaque線推のみならず，明らかに正伝子の遺伝子産物が筋形質膜に局在することを報

−191−

図3

Frozensectionsofbiopsiedskeletalmusclesfromvariousneuromusculardiseasesstainedwith
antトdystrophinantiserumusingtheavidin−biotinperoxidasecomplex（ABC）method．A，B，D，E，F，tranSVerSeSeCtion；C，longitudinalsection．B，C，D，E，F，immuneserum；A，preimmune
Serum・Note the complete absence ofimmuno−Stainingin DMD（E）Compared with thehomogeneousstainingofthemembrane（arrows）inallthenormalmusclefibers（B，C）．
InpatientswithBMD，Onlypartialstainingofthesurfacemembrane（arrows）isobserved（F）・Someofthepatientswithpolymyositisshowfinegranularspotsinsidethemuscle
fibers，tOgetherwithpositiveimmuno−Stainingofthesurfacemembranes（arrows，D）．Bar＝50／Jm．

−192−

告しており，DMDの原因蛋白が形質膜に局在するものと思われる．

る膜蛋白である可能性が有力になってきている．

以上DMDの原因遺伝子の単離に続き，原因蛋

一方Hoffman．らは筋homogenateのSubfrac−

白の発見，および細胞内局在部位の判明とDMD

tionにより，【dの成因究明にむけての研究は近年飛躍的な進歩をがheavymicrosomalfractionに最も大量に含まれるところから，triad付近に局在するのではないかと当初推定していたが5），その後の免疫電顕による検索により，やはり形質膜お
よびT−tubulesに抗体の沈着がみられることを報告している10）．今回の我々の検索結果でもSugitaら，ZubryckaLGaarnらと同様に正常対照の骨格筋においては筋表面膜に明瞭な抗体の沈着がみられており，什d は主として筋線雑報に局在しているものと思われる．ただ検索した症例の一部においては少量ながら筋線維内部にも顆粒状に抗体の沈着が示唆され，今後さらに免疫電顕による細月包内局在の検索が必要と思われる．
一方DMDにおいてはHoffmanらの報告と同様にWesternblotで全例Md の発現はみられず，免疫組織化学所見でも形質膜に d は欠如していた．正常対照およびDMD以外の神経筋疾患
患者では全例筋形質膜にMd の局在が認められるところから， d の欠如はDMDに極めて特異的な，かつ成因に直結する変化と考えられた．また女性DMDおよびBMDでは【d の発現はみられるものの，量的に減少していた．この量的減少の機序は女性DMDの場合はいわゆるLyonの仮説で説明可能とも思われるが，BMDにおいては量的減少よりも若干分子量の異なる蛋白が産生されているという意見11）もあり，DMDの遺伝子欠矢との違いの解明にも関連するため，今後症例を増しての検討が必要と思われる．
膜を構成する蛋白が欠如することはDMDの成因に関するこれまでの膜説12）￣14）あるいはCANP
説15ト17）を裏づける有力な根拠となるが，恐らくDMDにおいては形質膜の障害のために細胞の正常な機能を維持できなくなり，筋線経の変性・壊とげているが，同じ筋表面膜に局在する膜蛋白な
がらSugitaら7），Arahataら8）が報告した分子量210kdの蛋白とHoffmanら5）のMd（Mr400kd）の関係，同じく筋表面膜に什d を欠く病態でありながらDMDとmdx mouseの臨床像が全く異なり，一方は筋萎縮が常に進行して死に至るのに対し，他方は臨床的に殆ど無症状である理由，またdのmRNAは骨格筋や心筋のみならず，平滑筋や脳などにも含まれていることが知られており19）20），これらの細胞機能維持に什d がいかなる役割を果しているのかなど，まだ未解決の問題も多く，今後これらの残された問題の解明にむけての詳細な研究が必要と思われる．
要約ならびに結論
1）dystrophinの細胞内局在および疾患特異性を明らかにするため，抗dystrophin抗体を用いて，DMDおよび各種神経筋疾患の生検筋について
Western blotならびに免疫組織化学染色による検索を行った．
2）正常対照およびDMD以外の神経筋疾患では筋表面膜に全周性にdystrophinが局在し，DMDでは欠失していた．女性DMDおよびBMDではdystrophinは量的に減少していた．
3）dystrophinの欠如はDMDに特異的な変化であり，形質膜の障害のため，筋線経の変性・壊死をきたすことが示唆され，今後dystrophinの生理的役割の解明が重要と考えられた．
文

献1）KuhkelLMandco，authors：Analysisofdele−tionsinDNAfrompatients with Becker and

死をきたしているのは間違いないものと思われる．
既に〝d のアミノ酸組成および分子構造も明らか

Duchennemusculardystrophy．Nature322：73，にされており18），近い将来 d の生理的役割が明らかになれば，DMDがこれを欠失することによって筋線経の崩壊がおこる詳細な機序も解明され

2）Monako AP，Bertelson CJ et al：Detection of

1986．

−193−

deletionsspannlngtheDuchennemusculardys−
trophylocus

using

a

tightlylinked

DNA

seg一

smusculardystrophy．NEnglJMed318：1363，

ment．Nature316：842，1985．
3）MonakoAP，NeveRLetal：Isolationofcandi−
datecDNAforportionsoftheDuchennemus−

1988．

12）Carpenter S，Karpati G：Duchenne muscular

culardystrophygene．Nature323：646，1986・

dystrophy；plasmamembranelossinitiatemus・

4）KoenigM，HoffmanEPetal：Completecloningcle cell necrosis unlessitis repaired．Brain
189：147，1979．

oftlleDuchennemusculardystrophy（DMD）
cDNA and preliminarygenomiC organization

13）MokriB，EngelAG：Duchennedystrophy；elec−

oftheDMDgeneinnormalandaffectedindi−tronmicroscopicfindingspointingtoabasicorviduals．Cel150：509，1987．

earlyabnormalityintheplasmamembraneof
themusclefiber．Neurology25：1111，1975・

5）Hoffman EP，Kundson CM etal：Subcellular
fractionofdystrophintothetriadsofskeletal

14）SchotlandDL，BonillaEetal：Duchennedystro−

muscle．Nature330：754，1987．

phy；alterationinplasmamembranestructure・
Science196：1005，1977．

6）HoffmanEP，BrownRHetal：Dystrophin；The
proteinproductoftheDuchennemusculardys−

15）Kar NC，Pearson CM：A calcium−aCtivatedtrophylocus．Cel151：919，1987・

neutral proteasein normal and dystrophic

7）SugitaH，ArahataKetal：Negativeimmunos・

humanmuscle．ClinChimActa73：293，1976．

taining of Duchenne muscular dystrophy16）SuzukiA，NonamiY et al：Proteinsreleased（DMD）and mdx muscle surface membranefrommyofibrilsby

CASF（Ca＋十一aCtivatedsarcoplasmic factor）and trypsin・Agric BioI

with antibody against synthetic peptide frag−Chem39：1461，1975．

mentpredictedfromDMDcDNA．ProcJapan17）SuzukiK，Ishiura S et al：Calcium activatedAcad64：210，1988．

neutralproteasefromhumanskeletalmuscle・8）ArahataK，IshiuraSetal：Immunostainingof

FEBSLettlO4：355，1979．

skeletalandcardiacmusclesurfacemembranewithantibodyagainstDuchennemusculardys−18）Koenig

M，Monako

APetal‥Thecompletesequenceofdystrophinpredictsarod−Shaped

trophypeptide．Nature333：861，1988・
9）Zubrzycka−GaarnEE，Bulman DE et al：The

cytoskeletalprotein．Cel153：219，1988・

Duchennemusculardystrophygeneproductis19）NudelU，Robzyk Ket al：Expression ofthe

localizedin sarcolemma of human skeletal

putativeDuchennemusculardystrophygenein

muscle．Nature333：466，1988．

differentiatedmyogeniccellculturesandinthe

brain．Nature331：635，1988．

10）Watkins SC，Hoffman EP et al：ImT
microscoplClocalization of20）ChamberlainJS，PearlmanJAetal：Expression

dystrophininmyofibres．Nature333：863，1988・of the murine Duchenne muscular dystrophy11）HoffmanEP，FischbeckKHetal：Characteri−genein muscle andbrain・Science239：1416・

munoelectron

zation of dystrophinin muscle−biopsy speci・
mensfrompatientswithDuchenne

sorBecker

−194−

1988．

33）

DMDにおけるジストロフィン発現の一考察−モノクローン抗体による解析−
清 水 輝 夫＊

研究協力者

橋

本

和

李＊

寓

埜 中 征 哉＊＊＊小

年

徹＊

松

村

喜一郎＊＊

沢 鋲二郎＊＊＊石 黒 恒 夫＊＊＊＊

江 口 親比古＊＊＊＊は じめに1988年KoenigらはDMD遺伝子のmRNA構
造を明らかにし，その産物であるジストロフィン
蛋白の全アミノ酸配列を予想した1）．これにもとづき現在までに4種の抗血清がえられ2ト6），ジス
トロフィンが筋表面膜に局在すること，DMDでその発現がないことが判明してきている．我々は恒久的で同一の性質をもつ単クローン抗体を確立し，ジストロフィンの生理機能解明のため以下の実験を行った7）．

結果
単クローン抗体AICはヒト骨格筋ホモジェネ
ートでイムノブロットすると，分子量約400kd蛋
白に選択的に反応をした．アクチン，α−アクチニンなど他の筋蛋白とは反応しなかった．DMD筋のホモジェネートではこの蛋白は全く検出されなかった（図1）．
免疫組織化学的にジストロフィンの細胞内局在をみた所，筋線経のタイプとは関係なくすべての線経の表面膜に存在していた（図2D）．細胞内膜系への染色性はみとめられなかった．その他の臓方法・材料
ヒト・ジストロフィンの予想されたアミノ酸配器の染色性を調べたが，神経系・血管平滑筋・肝にはなく赤血球表面膜を染めるのみであった．赤列のうち，N末端より215〜264番アミノ酸50個

血球のイムノブロットをみるとα一スペクトリンに相当するペプチドを固相法により合成．逆相と弱い反応性を示し交差反応と考えられた．
正常ヒト骨格筋発生過程におけるジストロフィンの発現様式をみると，生後8ケ月では，少数のHPLCにて単維後，0．1mgをcompleteadjuvant
とともにBalb／Cマウスに免疫．その後2回のbooster後3日目に牌臓細胞をとり出し，
PEG4000を使用して通常の方法によりP3NP
ミエローマ細胞と融合した．この中よりモノクローン抗体産生株AICを確立した．
抗体のアッセイは酵素抗体法，抗体の反応性はイムノブロットおよび間接蛍光抗体法をもちいた．

＊東京大学医学部脳研神経内科＊＊国立療萱所下志津病院＊＊＊国立精神・神経センター神経研究所＊＊＊＊味の素中央研究所

タイプ2C線経と分化したタイプ1，2A，2B線
経がみられたが，そのすべての線経にジストロフ
ィン発現がみられた（図2C）．胎生35週をみると約4％がタイ701線経でそのすべてがAIC陽性であった．残りの96％はタイプ2C線経でありその少数例（＜1％）でAIC陰性であったが大部分は陽性であった（図2B）．従ってこの時期にはすでに多くの線経でジストロフィン発現があると考えられる．胎児17週では，すべてがタイプ2C
線経でありそのうちAIC陽性線経は約31％であった．多くの線経は陰性であった（図2A）．
従ってこの時期ではジストロフィンの発現が始ま−195−

る断面では一部にしか出現していなかったりさらに別の断面では全く陰性であったりした．従って
モザイクというよりもpartially expressed

fiber，，と考えられる．この部分発現は今までに全く報告がなく今回AICで確認された所見である．
考察

諸家の報告では，いくつかの異論はあるものの，ジストロフィンは分子量約400kdの蛋白で骨格筋表面膜に局在することが指摘されている．今回
我々が確立した単クローン抗体AICはこれらの特徴をそなえた蛋白を選択的に認識しており確実にジストロフィンに対する抗体である．Im−
munogenとしたペプチドはジストロフィンのN末端に最も近く，aCtinbindingdomainに含まれる場所であり，塩基配列からの予想ではα−アクチニンやスペクトリンとの類似性が示唆されていたので検討した所，α−アクチニンには交差反応はなかったがスペクトリンと弱い交差反応を認めた．
その他には反応性はなかった．諸家の報告にはな
く我々の抗体だけがスぺクトリンとの相同性を示した．
ジストロフィンの筋発生上の発現を調べたもの
では，myOblastにはジストロフィンmRNAがな
いこと，fusionをするとまもなくmRNAが出現
図1

ヒト骨格筋ホモジェネートのイムノブロット．
コントロールでは分子両約400kd蛋白と反応することが知られる．今回我々のデータではヒト

したが（B），DMDでは全くみられなかった（A）．

染め，約70％は陰性であった．この陰性線経はの胎生17週筋で約30％の線経をAICが陽性に
myotubeもあるが，すでに筋線維となっているものもあった．従ってジストロフィン蛋白は初期のってきている時期と考えられる．換言すれば，初myotubeには細胞膜に局在していないようであ期のmyotubeにはジストロフィンの発現がなく，分化するにつれて筋蛋白の分化とは相関なく出現

る．mRNAは出来ているのでこの時期のジストすると考えられる．

とが予想される．ヒトの場合妊娠後期にはほとん

DMDでの発現様式を検討した所，検索した18
例中5例で諸家の報告同様にすべての筋線経で陰ロフィン動態は成熟筋とはかなり異なっているこ
ど成人と同様になっており，この時期のタイプ2
C線経でも細胞操に局在していた．

性であった（図3B）．これに対し7例はうすく陽ジストロフィン発現の疾患特異性をみると多発性線経が陰性線経に混在し，さらに別の6例では，筋炎，運動ニューロン疾患，筋緊張性ジストロフ

正常者とかわらない位にはっきりした陽性の線椎ィー，顔面肩上腕型ジストロフィー，肢帯型ジスが色々の割合で混在していた（図3A）．このはっトロフィーでは細胞険にきれいに発現されている

きりした陽性線経をさらに連続切片でみた所，あのに対し，DMDでは発現の欠損している例があ一196−

図2 ヒト上腕二頭筋の関節螢光抗体法．
9歳時（D），8ケ月時（C）では成人のコントロール筋と同様にすべての筋表面膜を染色した．胎児35週では1％以下の少数の筋線推（タイプ2C線維）でAIC陰性であった．ほとんどの線椎で表面膜が染色されていた（B）・胎児17週では31％の線経がAIC陽性で，69％は陰性であった（A）．

図3

DMD筋の関節螢光抗体法．
18例のDMD筋のうち6例はすべての筋線経でAIC陰性であった（B）．5例では一部の線経でその全局又は一部が陽性であった（A）．

ー197−

った．これは諸家の報告とよく一致しており検索した18例中5例は全く発現がみられなかった．ところが残りの13例は一部にAIC陽性細胞があり7例は弱い染色性であったが，6例はコントロールと同じ程度に著明に陽性な線経を混在していた．この陽性線経の頻度は症例により異なり，生検筋の全視野中数本位から数10本が群をなしている例まで色々であった．このことはDMDの中で部分的にせよジストロフィンのN末端が蛋白として発現し筋表面膜に集積していることがある
可能性を示唆している．
このような部分的発現をしている線経を連続切片で検討した結果，ある断面で筋表面膜全周がAIC陽性であっても別の断面では全く陰性であったり，または一部の表面膜が陽性であったりしていた．従って，ジストロフィンまたはその一部を発現しているDMD線経であっても発現量は極めて限定されており，線維全体が陽性になる程はないことが示唆される．今までの報告でこれ程はっきり部分限定発現をしていることを示した報告はなく，DMDにおけるジストロフィン発現を蛋

自レベルで検討するのに極めて有用なプローブと考えられる．
ジストロフィンの最もN末端側に対する単ク
ローン抗体AICを確立し，DMDにおけるジス
トロフィン発現欠損を支持するが，一部の線経でジストロフィンまたはその一部が部分，限定発現されている例もあることを確認し，今後ベッカー型・保因者の検討を行う予定である．
文

献1）KoenigMetal：Ce1153：219−228，1988・
2）HoffmanEPetal：Cel151：919r928，1988・
3）Zubrzycka−GaarnEetal：Nature333：466▲469，

1988．

4）SugitaHetal：ProcJapanAcad64B：37J39・
1988．

5）ArahataKetal：Nature333：861−863，1988・
6）KaoLatal：ProcNatlAcadSci85：4491r
4495，1988．
7）ShimizuTetal：ProcJapanAcad64B：205￣ー198−

208，1988．

ⅥⅠ．DMD遺伝子

34）Ⅹp21を切断点に持つ転座染色体を有する
雑種細胞株作製の試み
斎 藤 深美子＊

研究協力者

外 村

日 ＊
日日

伴性劣性のDuchenne型筋ジストロフィー症（以下DMDと略す）の遺伝子は，RFLPsを用いたlinkage studyl），2）の結果より大体予想されてはいたが，Ⅹ染色体と常染色体との相互転座（Ⅹ／A転座）を有する幾人かの女性患者での細胞遺伝学的研究により3）ナ4），Ⅹ染色体短腕の中間（Ⅹp21）に存在することが初めて指摘された．転座を有する
女性患者は正常なⅩ染色体が選択的に不活性化していることによって発症したと考えられ，この場合転座染色体に関与しているⅩp21内の切断部位がDMD遺伝子の発現に変化を与えたためと思われる．この女性例に関しては，我々の発見した6例5）胤7）も含めて，臨床症状に多様性の見られる20例程の報告がある（表1）．より精度の高い分染法を用いた細胞遺伝学的検索により，その切断点はⅩp21．1かp21．2付近で一定しておらず8），
またこの切断点の相違と臨床症状との関連性は兄いだされていない．一方，男児患者では，クローニングされたDMD遺伝子のCDNAを用いての詳細な検討がなされており，50％以上の男児例に欠矢が兄いだされ9），またdeletion−prOne領域が存在することが報告されている9）・10）・11）．男児患者
では，切断部位と症状に関する詳細な検索が行われているが12），女性転座例においては，症例が少な
いことおよび，同一個体内で少数だが活性を持つ
正常なⅩ染色体からの遺伝子産物の関与が考えられるため分析が困雉となっている．
そこで，現在得られているDMD関連の様々なDNAプローブを用いて分子レベルでⅩ／A転座＊東京医科歯科大学難治疾患研究所細胞遺伝部門＊＊東京医科歯科大学難治疾患研究所ウイルス／免疫疾患

山 本 興太郎＊＊に関する比較検討を行う事は，上記問題解決のために意義のあることと思われるので，本年度はその一段階として，Ⅹ／A転座を正常なⅩ染色体と分離するため，体細胞融合による雑種細胞の作成を試みたので，その結果を報告する．
材料および方法
一細胞と培葦条件一用いた細胞は，Ⅹ染色体と15番染色体との相互転座を有する女性DMD患者由来のリンパ芽球
細胞株LCL−Ⅹ／15および8−aZaguanine（8AG）
耐性を示すマウスミエローマ細胞（P3Ⅹ63−Ag8−Ul）である（図1a）．LCL−Ⅹ／15は10％の牛胎児血清（FBS）を含むRPMI1640培地で培養したもので，一方，P3Ⅹ63−Ag8−Ulは，30JLg／mlの8AGを含む同様の培地で増殖させたものである．融合細胞はHAT培地（10FEg／mlhypoxanth−ine，1FLg／ml

amethopterin，5J

g／ml

thymidine）にて選択した．
一細胞融合−DavidsonとGeraldの改良法を用いた．P3
Ⅹ63−Ag8−Ulは付着性のある細胞だが，物理的刺激により剥牡しやすい性状があるためトリプシンを用いずにpipettingにより細胞を剥がし，浮遊細胞系のLCL−Ⅹ／15もpipettingして細胞をほぐした．各々細胞数を調整し，1対10の割合になる様混合して，細胞を血清freeの培地で2回洗浄した．細胞を遠沈後，上清を静かに吸引し，pOly−
ethyleneglycol（PEG）1000で1〜2分間処理した．血清freeの培地を足して遠沈した後，20％
FBS人の培養液で2回洗浄して37℃で2−3日−201−表1SummaryofnineteenDMD／translocationcases●一一一一■−■一一一■一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一・一・一・一一一一一・・一一一・・一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一・一一一一一一・一一一一一・一一■■■■■￣■

References

Additionalfeatures

Late Exchange points
replicating after detailed
normal X anさ1ysis

一一一一一●●●■■■−t■一・一一●●一一・■−■■■一・一一一一一一一一・一一一一■一一一一一一一一一・一一・一一一一・一一・一一一一一一一一一・一一・一一一一■一一一■一一■・一一一一一一一一一一一一一一・■−■■■l■■一一Canki et al．（1979）

mental retardation

Xp212：3q132

54／58

dysmorphism
Lindenbaum et al．（1979）

Ⅹp2105：11q13

Non−random●■Greenstein et al．（1977）

0r

75／75

invXpllO6−2107

Xp212：1p3410r343＊

Xp211：5q353

576／586

Jacobs et al．（1981）

0r

Zatz et al．（1981）

Xp213：3q1332■

Xp212：5q353暮

55／56

Xp212三6q2い84／86

Xp212：9p223＊

Emanuel et al．（1983】

mental retardation

MacLeod et al．（1983）

mental retardation

Xp212：2q373■

Nielsen et al．（1983）

less severe

Xp212：11q233◆

Perez−Vidal et al．（1983）

Xp21：6q16

Nevin et al．（1984，1985）

Xp212：5q311■

Xp21：9p21

Nielsen et al．（1984）
Verellen−Dumoulin et al．

1ess severe；21（1984）

breakpointin rRNA
loci

Xp211：21p12
0r

Narasaki et al．（1985）

Saito et al．（1986）

mental re亡arda亡ion

86／91

al．（1986）

Salto et al．（1986）

Xp21：15q26
Xp211：3q28
0r Xp212：3q29

104／104

Saito et al．（1986）
でomi e亡Xp211：Bq243

12／15

92．的

Ribeiro et al．（1986）

1ess severe

mental retardation

Xp211：4q26

70／70

Xp211：5ql〕2
0r Xp212：5q131

134／139

Xp211：15q262
0r Xp212：15q263
Xp211；19q12

SaiヒO et al．（1987）

＊
＋■

BoYd

and

Xp212：21p12■

0r131

Buckle，1986■一Non−randominactivation

of

the

normalX．．（nodata

provided）

間培養した．その後HAT培地を添加し，細胞の増殖を観察しながら培地交換を行った．

でincubatorにて培養し，細胞のコロニーの増殖

一染色体分析一

して液体培地内で増殖させた．

染色体標本は通常の方法で作製して，QM−
33258Hoechst法14）により二重染色し，蛍光顕微鏡にて染色体を観察した．
一軟寒天培地による雑種細胞のクローニングー

状態を確認した後，各々のコロニー細胞を拾い出結果

PEGlOOOを用いた細胞融合後のQMr33258
Hoechst法による染色体分析により，雑種細月包のプラスチックシャーレにbaselayer （0．4％
agar）およびseedlayer（0．3％agar）が二層になる様に軟寒天培地を作成し，その際，1シャーレ
当たり細胞数が100〜200個となるようseed形成が確認された．その後の軟寒天培地による細layerに細胞を混合する．5％CO2，37℃の条件下

コロニーの細胞はその後すべて液体培地で増殖し胞のクローニングも成功し，そのクローニング効率は1．1−5．7×10￣2であった．これらから液体培
地に拾い出したコロニー数は合計45個で，各々の

−202−

図1

QM−33258Hoechst法による染色体写真

a：マウスミエローマ細胞（P3Ⅹ63−Ag8−Ul）
b：細胞融合により形成された雑種細胞（大きな矢印は転座Ⅹ染色体，小さな矢印はそれ以外のヒトの染色体を示す．）

た．現在，これら雑種細胞コロニーの染色体を分されるゲノムの標的は最小176kbであることが析中であるが，転座型のⅩ染色体（Ⅹp21−Cen一

報告されている．

Ⅹqterを含む）を保持する雑種細胞の存在を確認している（図1b）．

今回，Ⅹ／15転座染色体を含む雑種細胞作成を行ったが，今後の分子生物学的手段による切断点の比較検討をするためには，その他の転座を含む

考察

雑種細胞も作成する必要がある．また，最近行わ

DMDおよびその軽症型のBecker型（BMD）

れているPFGE改良法やFIGE法あるいはinは同一遺伝子の変異によるものと判明しているが，situ hybridyzationを用いた検索も，適切なプロ

分子生物学的検索によりこれらの患者で検出されーブの選択により有力な手段と成り得るため，検る欠夫や転座の切断点には多様性がみられる．こ討を要すると思われる．

のことは，DMD遺伝子が非常に巨大なものであることを示しており15），最近の研究により，この遺伝子は2100kbにもおよぶことが報告されてい文

献1）MurrayJM，DaviesKE，HarperPS，Meredith

る16）．

L，Mueller CR and Williamson R：Linkage

一方女性転座例に関しては，プローブⅩJ1．1，

relationshipofaclonedDNAsequenceonthe
short arm of the X chromosome to Duchenne

pERT87等を用いたBoydら17）の検索により，彼らの所有している5人の転座例の切断点は3つのmusculardystrophy．Nature300：69，1982・

カテゴリーに分けられ，転座染色体によって破壊

2）Davies KE，Pearson PL，Harper PS，Murray

−203−

JM，0

Brien

T，SarfaraziMandaffectedindividuals．Ce1150：509，1987．

Williamson

R：Linkage analysis of two cloned DNA

10）DenDunnenJT，BakkerE，KleinBretelerEG，

sequences flanking the Duchenne muscular

PearsonPLandvanOmmenGJB二Directdetec−

dystrophylocusontheshortarmofthehumantionofmorethan50％oftheDuchennemuscu−

X chromosome．Nucleic Acids Resll：2303，

lardystrophymutationsbyfieldinversiongels・

1983．

Nature329：640，1987．

3）VerellenrDumoulinC，FreundM，DeMeyerR，

11）WapenaarMC，KievitsT，HartKA，Abbs S，Laterre C，FredricJ，Thompson MW，Mar−

BlomdenLAJ，DenDunnenJT，Grootscholten

kovicVDandWortonRG：ExpressionofanX

PM，BakkerE，Verellen−DumoulinCh，Bobrow−1inkedmusculardystrophyinafemaledueto

M，VanOmmenandPearsonPL：Adeletionhot

translocationinvoIvingXp21andnon−random

spotintheDuchennemusculardystrophygene・
Genomics2：101，1988．

inactivation of the normal X chromosomes．

12）Monaco AP，Bertelson CJ，Liechti−Gallati S，

HumGenet67：115，1984．
4）Eldalde BR and Elejalde MM：Phenotypic

MoserHandKunkelLM：Anexplanationfor

manifestations of X−autOSOme tranSlocations．

the phenotypic difference between patients

InCytogenetics ofthe X chromosome，edby

bearing partial deletions of the DMDlocus・

Sandberg AA，Alan R LissInc，New York，

Genomics2：90，1988．
13）ForrestSM，CrossGS，FlintT，SpeerA，Rob−

1983，pp225．

5）SaitoF，TonomuraA，KimuraS，MisugiNand

son KJH and Davies KE：Further studies of

SugitaH：High−reSOlutionbandingstudyofan

genedeletionsthatcauseDuchenneandBecker

X／4translocationina femalewith Duchenne

musculardystrophies．Genomics2：109，1988・

musculardystrophy．HumGenet71：370，1985・

14）YoshidaMC，IkeuchiTandSasakiM：Differ−6）TomiH，NonakaI，SugitaH，SatoyoshiEand

ential staining of parental chromosomesin

SaitoF：Musculardystrophyinagirlwithaninterspecific cell hybrids with a combined

X−autOSOme tranSlocation．Clin Neuro126：

qulnaCrineand33258Hoechsttechnique・Proc

965，1986．

JpnAcad51：184，1975．

7）斎藤深美子，外村 晶，山本興太郎：女性筋ジ15）MonacoAPandKunkelLM：Agiantlocusfor

ストロフィー患者における細胞遺伝学的研究並

theDuchenneandBeckermusculardystrophy
gene．TrendsGenet3：33，1987・

びにリンパ芽球細胞株の樹立． 厚生省 精神・神経疾患・筋ジストロフィー症及び関連疾患の痛態

16）Ginjaar HB，Den DunnenJT，Van Paassenとその病因に関する研究 （杉田班）昭和62年度

HMB，BakkerE，BertelsonC，BoydY，Pearson

研究報告書，1988，p194．

PLandvanOmmenGJB：Cosmidcloning，FIGE

8）Boyd Y and Buckle VJ：Cytogenetic heter・．mapping，Chromosome walking and RFLP

ogeneityoftranslocationsassociatedwithDu・study of a distal，intragenic DMD−deletion

chennemusculardystrophy．ClinGenet29：108，

endopoint，eXpandingtheDMDgenet02mi1−
1ionbp．CytogenetCellGenet，inpress・

1986．

9）KoenigM，HoffmanEP，BertelsonCJ，Monaco17）BoydY，MunroE，RayP，WortonR，Monaco

AP，FeenerCandKunkelLM：Completeclon−

T，Kunkel L and CraigI：Molecular heter−

1ng Of the Duchenne muscular dystrophy

ogeneity of translocations associated with（DMD）cDNAandpreliminarygenomicorga−

musculardystrophy．ClinGenet31：265，1987・

nization of the DMD genein normal andー204−35）DMD遺伝子の欠矢の検索
鈴 木 紘 一＊
研究協力者

大
今

は

野
野

茂

男＊

秋

田

保

彦＊

和

田

じめに

Kunkelら1），2）によりジストロフィンのCDNAの全構造が決定し，その結果をもとに，DNAレベ
ルで病因を解明することが可能になった．これまでの解析によれば，ドシャンヌ型筋ジストロフィー症（DMD）の約半数例でDNAの欠夫が見られるが，欠夫の位置や大きさは様々で一定せず，共通の部位が欠失している像は見られない．またDNAレベルではDMDとBMD（ベッカー型筋ジ
ストロフィー症）を区別する明確な差は見出せな
い．しかしタンパク質レベルではDMDとBMDははっきり異なり，DMDではほぼ全例でジスト
ロフィンが完全に欠損しているのに対し3），4），
BMDでは欠損は部分的で，異常な分子量を持つものが見出される3）．DNAレベルの異常とタンパ
クレベルの異常の相関を明らかにすることはDMDやBMDの病因の解明や両者を区別する遺伝子診断には必須で，緊急に解決すべき重要な問題である．
我々はRFLPを使ってDNA診断を行った家系の中から適当な家系を選び5），6），ジストロフィンのCDNAプローブを使ってジストロフィン遺伝
子の欠矢を検索し，DNAの欠矢とジストロフィンの欠損の関係，および，一見DNAが正常にみえる症例とジストロフィンの欠損との関係を解析することを目的に研究を行った．
対象および方法
1．対象
主にpERT87プローブを用いてRFLP分析を＊東京都臨床医学総合研究所遺伝情報研究部

朗

子＊
仁＊

行ったDMD17家系，BMDl家系5），および，DMDと思われたが87プローブの分析では同一
家系中の2名以上の患者間で遺伝的な相関が認めにくかった2家系（共に女性患者）を選び，その中の代表的な患者1名を分析した．
2．方法
血液リンパ球から単放したDNAのEcoRI断片をアガロース電気泳動で分推し，サザンプロットを行った．メンブランを米国ATCCライブラリーから得たジストロフィンのCDNAプローブ（仝翻訳領域約14kbをカバーする6種芙頁のプロー
ブ）とハイプリグイズさせ，ジストロフィン遺伝子に対応するバンドをオートラジオグラムで検出し，正常人で得られるバンドのパターンと比較し，バンドの欠失，移動度の差，バンドの濃淡等をもとにDNAの欠矢を判定した．
結果

分析結果を表1，2にまとめた．図1には1例として欠損が認められた例を含む電気泳動図を示した．
全20症例のうち，正常と判定したもの5例，明らかな欠損を持つもの4例で，欠損を含むと思われる3例や，今回の分析では確定できなかった5
例中に含まれる若干の欠損例を合わせると全体の約半数に欠矢が存在することになる．これはKun−kelらの結果とよく一致している1）．検出できた欠矢はいずれも比較的短いもので，図1のE2（No．5）の場合のように正常と比べて1本のバンドのみが欠失していた．ただ，BMDの家系（No．16）では3種類のプローブ（4−5a，5b−7，8）に対して欠夫が認められたが，3種の70ロー70

ー205−

表1cDNAブロー7小を使ったDNAの欠損の解析＾nalysis of Delct・ionsin Dyst・rOphin Gene
0ノ

4
1

8

N

？

7・
N
N

N

7・
N

N

つ・
N

N

D

N

N

D

5

2
E

N

N

N

N

N

N

フ・
N

N

N

1
D

4

N

？

N

N

N

D

つ・
N

っ●

D

7

N
N

N

D

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N

N
N

N

D

N
N

N
N

D

N

D

N

N

N

D

6

D

D

N

1

7
N

D

5

N

N

1

N

N

P

4

N

N

1

フ●
D
N

2
O

3

N

D

フ一

N

D

1

？・

2
M

2

7
N

N

1

7ー
N

1

2
K

N

1

？

N

N

N

N

0

2
J

N

1

N

1
工

9

つ・

つ ・ N

D

7

N

？

N

7
N

？

8

3
4
2
G
l l

h

つ●
？
？

N

D

7

N

N

N

N

D

3
F

′

N

N

N

7

N

N

N

1

S4

？

？

7

？

つ ・ N

？

7

2
C

3

92
R5（BMD）

5b−7
N

ワ・
N

4−5a
フ・
N

2bL3

7

1−2a
7
N

ResultS

N
N

N

？一

N
N

⁚

N

N

‖

PF3−2＃N

20

N

PF2−4＃

N

N

N

N

8

N

1

PF1−5

19

N
N

＃ ＝ female N：正常 D：欠損有N

表2

DNAの欠損の解析まとめ

Detection ofJ）eletions inI）MJ）and BMD
DMD

1
8

ニこげ

3

2

A BC DE

2
0 ノ

Tota1

︹ J

Not clear・3

Deletlon？

■︽〝一電〝一思

4

Deletion

Female

叉〝

0 ノ

2

く J

NormalBMD

17（100男）

1

2のうち中央に存在するプローブ（5b−7）に対しても1本のバンドの欠失しか認められなかったので，3つのプローブにまたがる大きな欠損ではなく，2個又は3個の小さな欠夫と考えられる．また，No．19，20の女性患者では欠夫が見出せなかっ
た．

−206−

Sb−7

図1

DNAの欠壬員の検出

欠夫が認められた位置をジストロフィンの模式
図と共に図2にまとめた．欠矢が検出されたのはいずれもロッド状のトリプルへリックス部分のほぼ中央に相当する3つのプローブである1）・2）．Kun−
kelらはプローブ8で全体の欠矢の約50％を，プ
ローブ1bで約30％を検出したとしているが1），
ここで検出した欠夫はブロー708近辺の欠失だけであった．1b近辺の欠夫が見出せなかったのは，
1bを含むプローブ（1−2a）で検出した際に不明確な結果が多く正確な判定ができなかったためと思
われ，今後の分析によってこの近辺の欠夫が検出される可能性は大きい．また，プローブ9−14の領域では欠矢が発見されなかったが，Kunkelらもこの領域では欠夫を認めていない1）．

もごく一部の小さな領域なのに，何故DMDではジストロフィンが完全に欠損するのか？
今回の症例についてはまだジストロフィンの検索をしていないが，おそらく従来の症例と同様に
DMDの場合には完全にジストロフィンが欠けていると思われる．即ち，ユキソン領域が完全に，
または，ほぼ完全に保存されているのに，ユキソンに対応するジストロフィンは検出できない．1
つの可能性としてユキソン部分に欠矢を含む何らかの変異がおこるとmRNAまたはタンパク質が不安定になり検出できないことが考えられる．これはmRNAを検査すればよいが，分析には数百mgの骨格筋が必要で簡単に調べるわけにはいかない．しかし，BMDの場合には，量的な問題はあっても，分子量が異常なジストロフィンでも検出

考察

できることを考えると，変異したDNAから生じ今回分析した家系はいずれも既にRFLPを使った分析で一応の結論を得ているものであるが，るmRNAやタンパク質がすべて不安定であることはない．

今回得られた結果は従来の結果を確認するもので，
前回の結果と矛盾することはなかった．また，得られた結果はKunkelらが得ている結果と大筋では同じといえる．次に得られた結果をもとに幾つかの点について考察する．

また，DMDの場合には変異や欠失により翻訳の読み枠がずれるが，BMDでは枠がずれないた
めにジストロフィンが検出できるとの説もある．
もしそうなら，変異よりN末端に近い部位を認識する抗体ではジストロフィンがDMDの場合でも検出できるはずである．現在使われている抗体の1．一見DNAの欠損がない場合や欠損があってほとんどは図2のロッド部分のはじめの部分に対Positions of DeIetjonsin Dystrophin GenelI日

日

川I Hllll

肌1111

9−14

BMD

＋
図2

＋

＋ 十 十

＋
（＋）＋
（＋） （＋）＋（＋）

DNAの欠損の位置とジストロフィン−207−

するもので3）・4），欠矢が頻繁におこる70ローブ8の領域より明らかにN末端側にあるが，実際にはジストロフィンが検出できない．
もう1つの可能性として，DNAの転写を制御する領域の異常が考えられる．例えば，プロモー
ター領域に異常が生じmRNAが全く発現しない

合も遺伝子診断ができない．これらの診断を可能にするためには単に欠失だけでなく点変異を検出する詳細な解析が必要である．BMDとDMDの双方で，欠矢を含む場合と含まない場合につき，DNAレベル，RNAレベル，タンパクレベルで相互に比較しながら分析を進める必要がある．

のがDMDで，BMDはユキソン部分の変異とも文考えられる．DMDではジストロフィンに対応す

献るDNA領域が不安定で，転写制御領域のほかに

1）KoenigM，HoffmanEPetal：Completecloning

もユキソン部分等でも変異が生じやすいが，ユキof the Duchenne muscular dystrophy（DMD）

ソン部分の変異はジストロフィンの欠除とは直接関係しないとすればよい．DMDではDNAの欠

cDNA and preliminary genomic organization
oftheDMDgeneinnormalandaffectedindi・
viduals．Cel150：509，1987．

矢の位置や大きさに共通性がないこともこのように考えれば理解できる．また，CDNAプローブを2）Koenig M，Monaco AP et al：The complete

使った検査では一見正常と区別できない全体の約

SequenCe Ofdystrophinpredicts a rod−Shaped

半数をしめる症例についても，CDNAプローブでcytoskeletalprotein．Cel153：219，1988．

は検出できない転写制御領域の異常と考えれば異3）HoffmanEP，FischbeckKH et al：Characteri−

常が発見されなかったことも一応納得がゆく．いzation of dystrophinin muscle−biopsy speci−

ずれにせよ転写制御領域に焦点をしぼって解析を

mensfrompatientswithDuchenne

sorBecker

進める必要がある．

smusculardystrophy．NewEnglJ Med318：

2．DNAの欠矢の大きさ，位置と発現するジスト

1363，1988．

ロフィンの量，重篤度の関係

4）ArahataK，IshiuraSetal：Immunostainingof

ここで得られた結果も従来の結果と同じく欠矢

skeletalandcardiacmusclesurfacemembraneの大きさ，位置と発現するジストロフィン量とのwithantibodyagainstDuchennemuscledystro−

間には明らかな関係はなさそうである．上述した
ように，この事実もDMDでは欠夫が直接の病因

phypeptide．Nature333：861，1988．
5）AkitaY，OhnoSetal：DiagnosisofDuchenne

であることを疑問視させる1つの理由である．しand Becker muscular dystrophies by DNA

かし，発現するジストロフィンの量と重篤度とはある程度の相関がある．

polymorphism．JpnJHumanGent32：71，1987．
6）KonnoK，OhnoSetal：Detectionofdeletionin

現在DNAレベルではDMDとBMDをはっきり区別できないし，一見正常にみえるDMDの場−208−

DNAbyslotblothybridization．BiomedResinpreSS・

36）Duchenne型筋ジストロフィーの遺伝子診断
鈴 木 義 之＊研究協力者

新 本 美智枝＊ 楊嶋 成＊

大 島 章 弘＊ 桜 庭

均＊

は じめに

プラスミドに挿入されている．cDNAの各断片はDuchenne型筋ジストロフィー（DMD）及び便宜上ATCCの番号をそのまま用いている．

Becker型筋ジストロフィー（BMD）は，Kunkel

CDNAの各断片と従来のRFLPによる診断で用らにより遺伝子座が解明され1），そのCDNAもク

いられるgenomic DNAプローブとのおおまか

ローニングされた2）．またその塩基配列から，原因な位置関係を図1に示す．

となるタンパク質ジストロフィンの構造が推定さ

2）DNAの抽出れており3），合成ペプチドから抗ジストロフィン
抗体も得られ，これを用いた組織学的研究も行わ

臨床的に診断の確立したDMD，BMD患者およ
びその家族から得られた末梢血白血球，またはれている4ト6）．

Epstein−Barrウィルス（EBV）により株化したリ

我々はDMD及びBMDの遺伝子診断を
Restriction fragmentlength polymorphism

ンパ球よりDNAを抽出した．そのDNA5JLgを3倍過剰の各種制限酵素で切断した．

（RFLP）を用いて行っており，現在までに両疾患

3）サザンプロット

合わせて65家系の分析を行っている．昨年本班会

0．7％アガロースゲル電気泳動後，サザンプロ

議において，我々はこれまでに分析した家系の中に認められたgenomic DNAブロー7轟に対するット法によりDNA断片をニトロセルロース膜へ転写した．

欠矢について報告した7）．今回我々は，先に欠夫を4）ハイブリッド形成

報告した家系を含めた27家系のDMD患者及びニッタトランスレーションにより32Pラベルし8家系のBMD患者について，DMDのCDNAにたDNAプローブを用いてハイプリグイゼーショ

対する欠夫の有無及び範囲をさらに詳しく検討しン後，−80℃でオートラジオグラフィーを行った．

た．また昨年報告したDMD遺伝子座の外にある

5）Pulsedfieldgel電気泳動（PFGE）

プローブ754に対する部位が欠失している，非定EBVにより株化した正常人，患者およびその家

型的筋ジストロフィー患者について，欠夫の末端

族のリンパ球を低融点アガロースゲルに包埋し，を明らかにする目的でpulsed field gel電気泳動

Kenwrickら8）の方法に従ってDNAを調製した．

（PFGE）を用いさらに詳しく検討した．

得られたアガロースゲルブロック中のDNAを
SfiIで切断LPFGE後，サザンプロット，ハイブ

対象および方法
1）cDNAプローブ

リッド形成を行った．

DMDのCDNAはAmerican Type Culture
Collection（ATCC）により入手した．14kbのCDNAは，図1に示すように6種類の断片として＊東京都臨床医学総合研究所臨床通伝学研究部門

結果1）DMD患者のCDNAに対する欠失27家系のDMD患者について，6種のCDNA断片全てに対して欠夫の有無を検討した．制限酵素
はEcoRIおよびHindIIIを用いた．図2に・CDNA−209−

DMD cDNA
10
74

」．＿」

Dズ567
LOCI

C7

し1

」．」

︵0
6

PROBES
B24

2

76

7

576

」⊥

亡）ズS28Cズ568

S†H FRAGMENTS

lpter patie。t
璽寧

＿

章

−￣￣￣

■

図1cDNAのgenomic DNA上での分布とDMD遺伝子座近傍のSfiIフラグメント

Shamatic Representation of DeIetion

dej

DMD cDNA Probesdel蒜㍉81†980

88126m，コ91。？

二言：・トナー‥−．→DMD￣70（

DMD−118，119
DMD−130，131（）−
DMD−142
DMD−155

DMD−216
DMD−270

図3

DMD患者のCDNAに対する欠夫例による切断で，このCDNAに対する全てのバンドが欠失していた．一方同一家系の患者である症例
130，131は，25kb，13kbのバンドが共通して欠失していた．他のCDNA断片に対するサザン70ロ

二言r＼丁■丁目∴′・∴ットの図は省略するが，調べた27家系のDMD患者のうち9家系の患者は，何らかのCDNA断片に

図2

DMD患者のCDNAに対するサザンプロット
分析

対する欠夫を示した．図3に欠夫の認められた患者の欠夫の範囲をまとめて示す．
2）BMD患者のCDNAに対する欠失

断片57674に対する分析の結果を示す．各レーン

図4にBMD患者のCDNA断片57674に対すの番号は患者の番号を示している．EcoRIによるるサザンプロットの結果を示す．調べた8家系の切断で正常人は，このCDNA断片に対し25，13，
7．8，6．Okbのバンドを示した．症例70はEcoRI

このCDNA断片に対するバンドのうち10kbのうち5家系の患者は，HindIIIによる切断により

一210−

′

・

ConL
轡
1

2

∴

Pt．
4

3

5

6

7

〜
−

∴

′

′

、

図5 非定型的筋ジストロフィー患者のPFGE分析
ドは検出されなかった．正常人の754に対するバ

57674拍手rld冊
図4

ンドは770kbであった（図は省略）．

BMD患者のCDNAに対するサザンプロット
分析

図5にCDNA断片57666に対するPFGE，サザンプロットの結果を示す．正常人コントロール（1，2，3）は850kbのバンドを示した．これに対し患者は700kbの異常なバンドを示した（5）．まバンドが共通して欠失していた．図には示さない

た保因者と診断された母親は850kbの正常なバが，EcoRI断片に対しても13kbのバンドが共通

ンドと，患者と同じ700kbの2本のバンドを示しして欠失していた．調べたBMD患者の中には，た（4）．またRFLPによる連鎖解析から保因者でその他のCDNA断片に対する欠夫は検出されなはないと考えられる2人の叔母は，共に850kbのかった．

正常なバンドを示した（6，7）．同様な結果がDMD

3）プローブ754に対し欠夫を示す患者の遺伝子座内のgenomic DNAプローブXJ1．1に対しても得られた（図は省略）．

PFGEによる分析
DMD遺伝子座の外にあるgenomicDNAプロ

考ーブ754に対して欠夫を示した非定型的筋ジスト

察

ロフィー患者について，その欠夫の末端を明らか

DMDのCDNAを診断に用いた場合，患者の約にする目的でPFGEによる分析を行った．この患50％に欠夫が検出されると報告されている2）．

者のCDNAに対するバンドは全て正常で，欠矢は検出されなかった（図は省略）．PFGEを用いた患我々も，分析した27家系の患者のうち9家系の患者のSfiI断片の分析の結果，DMD遺伝子座内のるこの欠夫の割合は，今後分析の精度を上げるこgenomic DNAプローブpERT87−1に対してと，家系数を増やすことで，さらに増加すると考えている．患者における欠夫の部位，範囲は家系

350kbのバンドが検出され，これは正常人のそれ者にCDNAに対する欠夫を見出した．患者におけと一致した（図は省略）．またプローブ754に対しにより様々であったがCDNA断片のうち57666，ては，予想されるように患者のSfiI断片中にバン

57668および57672，57674近傍の2箇所に欠失頻−211−

度の高い部位が存在する（図3）．この結果はKoenigら2）の結果ともよく一致している．患者において欠夫が見出される場合，その家系の出生前診断は容易で，かつ正確に行うことが出来る．従ってこの2箇所のCDNAは，DMDの遺伝子診断に有効である．
BMD患者に対しては，DMDとは異なり，調べた8家系のうち5家系の患者において，CDNA断片のうち57674に対する特定のバンドが共通して欠失していた（HindIII断片の10kb，EcoRI断片の13kb，図4）．このBMD患者において高率で欠失している部位が，BMDに特徴的なものかどうか，またもしそうであるならば，BMDの臨床像とどのように関連しているのか，今後さらに検討を要する．
昨年本姓会議においてgenomic DNAプロー
ブ754に対し欠夫を示す非定型的筋ジストロフィー患者を見出し報告した7）．ブロー70754はDMD
遺伝子座の外，5′末端の上流に位置している（図1）．この患者の筋肉組織は，抗ジストロフィン抗体で染色されなかった．この患者のCDNAに対するサザンプロットの結果は正常であることより，
この患者の欠夫がDMD遺伝子座の5′末端上流域のどのあたりにまでかかっているかを調べること
は，DMD遺伝子座の調節部位を知る上で重要であると考えている．DMD遺伝子座近傍のSfiIサイトについては，PFGEを用いてVanOmmenら9）やKenwrickら8）により分析されている（図1）．そこで我々は，この患者の欠夫の末端を明らかにするためにPFGEによる分析を行った．その結果，
この患者のプローブpERT87−1で検出される
SfiI断片は正常であった（350kb）．genomicDNA
プローブⅩJl．1およびCDNA断片57666で検出される患者の700kbの異常なバンドの中に，この患者の欠夫の末端は含まれていると推測できる．
そして，そのDMD遺伝子座側の末端は正常人の860kbのバンドの中に含まれていると考えられる．この患者の欠夫の考えられる最も短い可能性
は，正常人のプローブ754に対して検出される900kbと推定される．しかし，欠夫がこのSfiIサ
イトを含んでいる場合には，現在のところ適当なプローブを入手しておらず，この患者の欠夫がどこまでかかっているかは推測できない（図1）．
DMD遺伝子座との関連を考える上では，DMD遺伝子座側の欠夫の末端がより重要である．
今後，この患者については，さらにPFGEにより切断頻度の低いいくつかの制限酵素を用いることで，さらに詳しく検討していく予定である．また最終的には塩基配列の分析により，この患者の欠失部位を明らかにしたいと考えている．

文献1）MonacoAPandKunkelLM：TrendsGenet3：
33−37，1987．

2）KoenigM，HoffmanEP，BertelsonCJ，Monaco
AP，Feener C and Kunkel LM：Cel15D：509−
517，1987．

3）Koenig M，Monaco AP andKunkelLM：Cel1
53：219−228，1987．

4）HoffmanEP，BrownJr RH and KunkelLM：
Cel151：919−928，1987．
5）HoffmanEP，Knudson■cM，CampbellKPand

KunkelLM：Nature330：754−758，1987．
6）Arahata K，Ishiura S，Ishiguro T，Tsukahara
T，SuharaY，EguchiS，IshiharaT，NonakaI，
OzawaEandSugitaH：Nature333：861A863，
1988．

7）鈴木義之，新本美智枝，辻 明彦，楊 嶋成：厚生省「神経疾患研究委託費」筋ジストロフィー症
及び関連疾患の病態とその病因に関する研究（杉田班）昭和62年度研究報告書，1988，pp202−207．

8）KenwrickS，PattersonM，SpeerA，Fischbeck
KandDaviesK：Ce1148：351−357，1987．
9）vanOmmenGJB，KunkelLM，RayP，Worton

770kbのSfiI断片の中心節側のSfiIサイトが残っている場合で，この場合には欠矢の範囲は約

一212−

R，WieringaB，BakkerEandPearsonLP：Cel1
47：499−504，1986．

37）Kennedy−Alter−Sung症候群の遺伝子解析の試み
高 守 正 治＊研究協力者

松 原 四 郎＊ 横 地 英 博＊ 島 孝

仁＊

は じめに

ール・クロロフォルム抽出を繰返して除蛋白した．

遺伝性神経筋疾患に対する分子遺伝学的なアプ

こうして得られたDNAを制限酵素TaqIで消化した．続いてアガロースゲル電気泳動で展開後，ローチは，今後次第に重要性を増すとおもわれる．
KennedyLAlter−Sung症候群（KAS）は遺伝性運動ノイロン疾患の1つで，Ⅹ染色体劣性遺伝形式を示し，臨床的には球脊髄型筋萎縮症をきたす

サザン法にてDNAをナイロン膜に転写，固定し（Kennedyetal，1968）．KAS自体はまれな疾患で，しかも経過は比較的良性であるが，筋萎縮性側索硬化症に代表される運動ノイロン疾患全体と7日間オートラジオグラフィーを行った．プロー

してみると，その病因解明の糸口を得ることは重要な意味を持つものと思われる．KASに関して，
既に欧米では染色体上の多形を利用した遺伝子解
析により遺伝子座が推定されている．Fischbeck
ら（1986）は，種々のⅩ染色体に関連するマーカ
ーのうち，DXYSlと呼ばれるⅩ染色体長腕近位

た．プレハイプリグイゼションおよびハイプリタ
イゼションのあと洗浄し，最後に−80℃で1ないしブとしてATCCを通じてD．C．Page博士より供与して頂いたDXYSlを32Pで予めラベルしたものを用いた．
結果

正常人コントロールで得られた結果の一部を図に示す．左のレーンが男性，右の2レ∵ンが女性である．男性では約15kbのバンドが共通して認部，Ⅹq13−21に位置するプローブで検知される多形とKASの発現の問にLod score3．53と有意のめられ，くわえて約11kbのバンドまたは本図で連関が認められたと報告した．またこのDXYSlとⅩ染色体性優性型CharcotLMarie−Toothニューロパテー（lonasescu et al，1988）の連関も報告されている．我々は本邦での解析を開始するにあたり，まず日本人における染色体上の多形の有無について検討した．

女性では12kbまたは11kbと12kbの両者が認は示さないが約12kbのバンドが認められ，一方められた．なおこうして観察されたバンドの大きさはPageらによって報告されたバンドのそれと一致すると推定されたので図では彼らの報告と同
じ14．6kb，11．8kb，10．6kbの数値を示した．
現在までに得られた男女合わせて14名の結果を表に示す．男性ではいずれも約15kbのバンド

材料と方法が認められ，加えて12または11kbのバンドが1

ヒト末梢血より分離した白血球に対し，Maniatis
ら（1982）の方法に従って以下の処理を行った．

本存在した．女性では15kbのバンドはなく，11と12kbのバンドの両者または12kbのバンドのまずproteinkinaseKで処理後フェノール・クロ
ロフォルム抽出を繰返して除蛋白を行いDNAを得た．この後RNA分解酵素で処理後再び7ェノ

みが存在した．男性では11kbのバンドを有する者と12kbを示す者の比は5：3であった．一本のバンドを示す女性をホモ，2本のバンドの者をヘテロと呼ぶと，女性のホモとヘテロの比は1：1と＊金沢大学医学部神経内科

なった．

−213−

M

図
表

F

F

一■−14．6

kb→■−11．8kb

一■−10．6

kb

Hybridizationpatternofmale（M）andtwofemales（F）

LengthofTaqI fragmentshomologousto

得た以上の結果は，すでに欧米で報告された成績

DXYSlIndividual
Individual Sex Length（kb）

く1：1であった，日本人においてもPageらの説と矛盾せず15kbの断片はY染色体由来，11kb

QU
9
0
1
1
2
3
4
1
1
1

6
6
6
6
6
8
8
4
4
4
4
4
1
1
1
1
1
1
1
1
1

7

6
4
1

6

6
4
1

5

6
4
1

4

8
6
6
8
8
6
6
6
8
8
8
6
1
0
0
1
1
0
0
0
1
1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1

3

6
0
1

2

6
0
1

M M M M M M M M F F F F F F

1とほぼ一致する．Pageら（1982）の報告した6名の女性でもホモとヘテロの比は本シリーズと同じと12kbの断片はⅩ染色体に由来し，多形を示していると考えられた．このような結果からDXYSlをプローブとして，TaqIdigestと組合せて行う遺伝子解析は日本人においても有用と思
われる．
ま

め

日本人男女14名より得た末梢血白血球DNAのTaqI digestとDXYSlをハイプ））ダイズし
た．

1

1

考

と

男性では約15kbのバンドが共通して存在し，

察

DXYSlと呼ばれるPageら（1982）により加えて約11kbまたは約12kbのバンドのいずれ

humangenomiclibraryより見出されたDNA断片の特異な点は，それがⅩ染色体とY染色体のかが認められた．

両者に相補性を持ち，両染色体の間に99％以上のまたは約12kbのバンドのみが認められた．

女性では約11kbと約12kbのバンドの両者，

homologyが存在するsequenceを含むと考えら

この結果は欧米人の結果とほぼ一致し，15kb

れる点である．Pageら（1984）がinsituhybridiza−はY染色体由来，11kbと12kbのバンドはⅩ染tionによりヒトのkaryotype中でのDXYSlの局在を調べた結果，Ⅹ染色体長腕近位部およびY色体由来で多形を表すとの説明と矛盾しない．

染色体短航上に存在することを見出した．
このプローブを用いて現在まで我々が日本人でDXYSlをプローブとして，TaqIdigestと組み合せて行う遺伝子解析は日本人においても有用と
思われる．

ー214−

文

献

4）ManiatisT，FritschEF，SambrookJ：Molecu−

1）FischbeckKH，lonasescuV，RitterAWetal：

lar

Localization ofthe gene for X−linked spinal
muscula atrophy・Neurology

36：1595−1598，

A

Laboratory

ManualCold5）Page D，De Martinville B，Barker D et al：

1986．

Single−COpy SequenCe hybridizes to polymor−

2）IonasescuVV，BumsTL，SearbyCetal：Ⅹ−
linkedCloning．

SpringHarborLaboratory，NewYork，1982．

dominantCharcotLMarielbothphic andhomologouslocionhumanX and Y
Chromosomes．Proc Nat Acad Sci USA79：

neuro＿

pathywith15Casesina fami1ygeneticlink−
agestudy・Muscle and Nervell：1154−1156，

5352−5356，1982．

6）PageDC，HarperME，LoveJetal：Occurrence

1988．

Of a transposition from the X−Chromosome3）KennedyWR，AlterM，SungJH：Progressive

long arm to the Y−Chromosome short arm

proximalspinalandbulbarmuscularatrophyduringhumanevolution．Nature311：119．123，

Oflate onset・A sex−linked trait・Neurology

1984．

（Minneap）18：671−680，1968．

ー215−

38）筋緊張性ジストロフィー症のパルスフィールドゲル
電気泳動による解析
後 藤 幾 生＊
研究協力者

山

田

猛＊

古

は じめに
筋緊張性ジストロフィー症（MyD）は，常染色体優性遺伝性疾患であり，補体C3遺伝子やApolipoproteinC2（ApoC2）遺伝子との連鎖解
析により，病因遺伝子が第19染色体のセントロメ
ア付近に存在すると推定されている（図1）1）・2）

CH

19

研，＊＊榊

佳

之＊＊

MyD遺伝子とApoC2遺伝子との連鎖は多くの報告において認められ，ApoC2遺伝子をプロー
ブに用いた間接診断の有用性が示されている3）・4）．
欧米の報告では，MyD遺伝子とApoC2遺伝子の間の組み換え率は2〜4％とされており4），組み換
え率1％は遺伝子上の距離1000kbに相当することから，両遺伝子間の距経は少なく とも2000〜4000kbはあることになり，ApoC2遺伝子さからみると，DNAシーケンシング法は1kb以
下，通常のアガロースゲル電気泳動法では20kb
以下が対象であり，また分染法などの染色体分析
法では数千kb以上が解析対象である．Schwarz，Cantorらにより考案されたパルスフィールドゲ

13．1

V■

D

M

■ ■ ● ● ● ■ ■ ■ ■ ● ● ● ■ ■ ■

・‥＝・ト

12

ル電気泳動法（pulsedfieldgelelectrophoresis，
PFG）では，数十kb〜数千kbのDNAを解析することが可能である5）．DNAは溶液中ではランダ
ムコイルの形状をしており，20kb以下のDNA

12
13．1

は，アガロースゲル電気泳動の際，アガロースマ
トリックスの分子筋効果により分子量にしたがって分画されるが，20kb以上のDNAはアガロー
スマトリックスの孔より大きいため，そのままの形状ではゲルの中に入りきらず，図2上のように

13．2
13．3
13．4

図1第19染色体上のC3遺伝子，ApoC2遺伝子および推定されるMyD痛因遺伝子の位置を示す．
＊九州大学医学部脳研神経内科＊＊九州大学遺伝情報実験施設

博からMyD遺伝子に直接到達することは困難と考えられる．
遺伝子の解析方法をその扱い得るDNAの大き

13．2

ApoC2

谷

線状に変形し，ゲルの中を分子量によらずに泳動されるようになる．このとき図2下のように電場の方向を変えるとDNAの移動方向も変わるわけであるが，長いDNA程新しい電場の方向に向かって移動できる形に変形するのに時間がかかり，分子量に応じた方向転換の時間差を生ずる．PFG
では電場の方向を一定時間ごとに変え，DNA分

−216−

図3
図2

20kb以上のDNAがアガロースゲル中を泳動される様子を示す．上に通常の電気泳動の場
合を示し，下にPFGの場合を示す．

Contour−Clamped homogeneous electricfieldgelelectrophoresisの装置を示す．

2）PFG：ゲノムDNAは比較的切断部位の少ない制限酵素（NotI，SfiI，SmaIなど）を子が方向転換する際の時間差を累積することにより，巨大なDNAでも分子量に応じて分画するこ

DNAIJLgあたり20−40units加え，12時間反応
した後泳動した．また，サイズマーカーとしてイとを可能にしている．

ーストSaccharomyces cerevisiaeの染色体

現在までMyDにおける染色体欠夫の報告はな

DNAを泳動した．図3の様な泳動装置を用い，1

く，またApoC2遺伝子をプローブに用いた通常のサザンプロット解析でも遺伝子欠矢は兄いださ

5．⊂ereVisiae

れていないが，PFGとApoC2遺伝子をプローブに用いたサザンプロット解析を併用することにより，染色体分析では検出困難な遺伝子欠夫を兄いだし得る可能性がある．そこで今回はまず実験条
件について検討した．
方法1）DNAの調整：末梢血白血球からアガロー
スブロック法によりDNAを調整した．すなわち
ヘパリン加仝血10mlに3％デキストラン，0．9％NaCl溶液を等量加え，室温にて1時間放置し白血球層を分離した．遠沈後白血球ペレットを0．
5mlのPBSに浮遊させ，等量の1％低融点アガロースを加えゲルブロックとした．ブロックを10等分し，6倍量の0．5M EDTA，1％SDS，0．5
mg／mlproteinase K溶液中で，55℃，一晩保温した．TEにて2回洗浄し，0．6FEg／mlpAPMSF
中で，50℃，1時間保温し，prOteinaseKを失活させた．末梢血白血球数を5000／m扉とするとゲル

図4

ブロック1個あたり約5JJgのDNAが得られる．
ー217−

左にイーストS．cerevisiae染色体DNAのPFGを示し，右にLeu2cDNAをプロ一一ブに用いたサザンプロット解析の結果を示す．

％LEアガロースゲル，泳動バッファーは0．5×

ヒトゲノムDNAを図5左に示す制限酵素で切TBE，12℃，200V定電圧，パルスタイム60秒の断後泳動し，アルツハイマー病のアミロイド蛋白

条件で，20⊥〉24時間泳動した．

前駆体遺伝子のCDNAを用いてサザンプロット

3）サザンプロット解析：ゲルを0．25N HCl
にて30分処理後，アルカリ変性，中和を行い，ナ解析を行うと，図5右の様にSfiIでは460kb

イロン膜に20×SSCにてトランスファーした．ハの，SmaIでは400kbのバンドが認められた．
NotI，MluIでは泳動上端にバンドがあり，バ

イプリ

ンドの長さは確定できなかった．

グイゼーショ

ンは5×SSC，50mM

SDS，100JLg／mlの変性herring bone sperm

MyD患者について検討するため，ApoC2
cDNAを用いて解析を試みたが，NotI，Mlu

DNA，50％ホルムアミド溶液中で，32P標識したプローブを加え，42℃，12時間行った．洗いはもバンドが固定できなかった．

NaPO4（pH6．5），5×Denhardt

S，0．5％

I，SmaI，SacII，SfiI消化のいずれにおいて0．2×SSC，0．1％SDS溶液にて1時間行い，オー考

トラジオグラフィーを行った．

察

MyD患者における遺伝子欠夫の有無を検討す

結るために，末梢血白血球DNAを使いPFGとサ果イーストS．cerevisiaeの染色体は15本あるが，ザンプロット解析を行ったが，ApoC2cDNAを

図4左のようにPFGでは260kb〜1500kbの13

プローブに用いた場合，同定できるバンドが得ら本のバンドに分離された．サザンプロット後，第3染色体上にあるLeu2遺伝子のCDNAをプロれず，遺伝子欠夫に関する結論は得られなかった．

ーブに用いてハイプリデイゼーションを行うと，

DNAについても他のCDNAプローブを用いた

図4右の様に370kbの第3染色体のバンドが同場合にはバンドが認められ，基本的な実験方法に定された．

っいては問題はないと考えられた．バンドが得ら

イーストDNAを用いた場合や，ヒトゲノム

れなかった理由としては，1）ゲノムDNAの精製が不十分，あるいは収量が少ない，2）DNAの制限酵素による消化が不完全である，3）DNAのフィルターへのトランスファーの効率が低い，
4）プローブの比活性が低いなどが考えられ，今後これらの点を中心に検討していきたい．プローブについては，ApoC2遺伝子よりMyDとの連鎖の強いD19S196）を用いる，あるいは新しく開発することも必要と考えられる．
文献1）DaviesKE，JacksonJetal：Linkageanalysisof
myotonicdystrophyandsequence onchromo−
some19using a cloned complement3geneprobe．JMedGenet20：259p263，1983・

図5

左にヒトゲノムDNAのPFGの例を示し，右2）Shaw DJ，Meredith AL et al：The apolipo−にアルツハイマー病のβ蛋白前駆体遺伝子のcDNAをプローブに用いたサザンプロット解

protein CII gene；Subchromosomallocaliza−

析の結果を示す．

locus．HumGenet70：271−273，1985．

ー218−

tion andlinkage to the myotonic dystrophy

3）Pericak−VanceMA，YamaokaLetal：Tightfragmentation，and separation oflarge DNA

linkageofapolipoproteinC2tomyotonicdys−

molecules．In

MethodsinEnzymology（edby

trophyonchromosome19・Neurology36‥1418

WuR），RecombinantDNA，partF，Academic−1423，1986．

Press，SanDiego，1987，Vol155，pp449r467．

4）BirdTD，BoenkeMetal：Theuseofapolipo−6）BartlettRJ，Pericak−VanceMAetal：Anew

proteinCIIasageneticmarkerformyotonic

probeforthe diagnosis ofmyotonicmuscular

dystrophy．ArchNeuro144：273−275，1987．

dystrophy．Science235：1648−1650，1987．

5）Smith CL，CantorCR：Purifications，SpeCific

ー219−

ⅤⅠlL MDXマウスほか

39）mdxマウスの筋再生能
マーカイン局注による筋壊死と再生
中村 晴 臣＊

研究協力者

正常者やその他の疾患の骨格筋では筋形質膜に局在するDMD蛋白（dystrophin）が，Duchenne型筋ジストロフィー（DMD）とmdxマウス（mdx）の両者で欠損することが証明された．しかし，dystrophinの欠損がなぜ筋形質膜の脆弱性につながるかは依然解決されていない．
また，mdxでは筋線推再生が活発なため，臨床症状を殆ど示さず，動物の寿命もほぼ正常である．
この事実は，同じく広範な筋線椎の壊死・再生を繰り返しながら，進行性に筋萎縮が悪化し，死に至るDMDとの大きな相違点である．しかしながら，mdxの筋線維再生能が対照動物と全く同等か否かについて，検討した研究はまだ見あたらない．
本実験では，血管や末梢神経に殆ど影響せず選
択的に筋線維壊死をきたすとされる局所麻酔剤マーカイン（塩酸ブビバカイン：BPVC）をmdxおよび対照マウスのヒラメ筋に注射して筋壊死を惹起し，その後の筋再生の状態を検討して，mdxのマーカインに対する反応，筋線維再生能を対照と比較してみた．
方法

実験には生後35−45週のmdxマウスおよび同時期の対照マウスを用いた．その理由はこの時期でのmdxは，若年期に活発に起こる筋の変性・再生が一段落し，中心核をもつ再生筋が大部分を占め，筋線経の性状が比較的均一であること，またヒラメ筋が太いため薬液が漏れ出しにくく，比較的一定の結果が得られやすいためである．ネン＊鳥取大学医学部神経病理

高 田 邦 安■ブタールで全身麻酔した後，下腿の皮膚を切開し，ヒラメ筋を露出し，左側には0．5％BPVCo．1ml
を，右側には同量生食水をそれぞれ直視下に注射し，十分筋が膨張するのを確認して，皮膚を縫合した．注射後6時間，24時間，4日，7日，10日，20日後にエーテル麻酔下に屠殺，両側ヒラメ筋を採取して，カコジル酸緩衝液加2．5％グルタール
溶液で固定し，型のごとくエポキシ樹脂に包埋し，1JJ切片・超薄切片をそれぞれ光顕・電顕で観察した．動物数は各時点でmdx，対照各々3ないし5
匹である．
結

果

BPVC注射側のヒラメ筋は，mdx・対照とも注
射後6時間で既に筋線維壊死を認めた．光顕では，
opaquefiber 様に濃染する筋線経が散在し，一部には既にmyofibrilを失った，空虚な筋線経も兄いだされた．個々の筋線経の変性所見は，mdx・対照の間でほぼ同一の像を示したが，mdxでは概ねヒラメ筋のほぼ全体が壊死・変性に陥ったと見なされるのに対し，対照マウスではその範囲が50ないし60％程度にとどまった．電顕的にはmdx・対照の両者で，筋形質膜の一部欠損（基底膜は保たれる），表層へのミトコンドリアおよび
VeSicleの集積，myOfibrilの断裂等を認めた（図1）．注射24時間後には筋線経の壊死・崩壊所見はより顕著となり，問質の浮腫，細胞浸潤（主として単球，組織球）が日だつようになった．しかし
筋線推合食像はまだ明瞭ではなかった．これらの組織反応，とくに問質の浮脛と細胞浸潤は対照よりもmdxでより顕著であった．6時間，24時間後−223−

図1BPVC注射6時間後のmdxマウスヒラメ筋．
筋形質膜が一部欠損し（挿入図：矢じりの間），表層にミトコンドリアやVeSicleが集積している．×11，000；挿入図のいずれにおいても，生食水注射側では，少数の壊死筋線経が散在するのみで，問質の浮腫・細胞浸潤はごく軽度なことから，BPVC注射側にみられた組織反応は筋崩壊に伴うもので，単なる注射液の貯留ではない．BPVC注射4日後は、mdx・

×17，500った（図4）．同様の傾向は20日後でもまだ幾分残存していたが、再生筋線椎の直径を計測すると，生食水注射側と殆ど変わらない程度にまで回復していることが示された（図5）．

対照とも活発な筋線推会食像を認め，とくにmdx
では問質に多数の単球・マクロファージさらに線維芽細胞の浸潤と膠原線推増生，また一部に活性考察mdxマウス骨格筋は生後20日以前は明らかな異常所見を示さないが，この頃から各所で小壊死化された筋衛星細胞も認められた（図2）．対照群
では問質の膠原線維増生・細胞浸潤は比較的軽度であり，逆に活性化された筋衛星細胞はやや多数認められた．7日後ではmdxでも対照動物と同巣が散見されはじめ，20〜30日にかけて活発な壊死・再生が見られるようになる1）．再生筋は概ね中心核を持つので，その後繰り返し起こる壊死・再生の結果，筋線経の大多数が中心核を持つようになるが，問質の線維増生は一般にごく軽度である．
mdxにおいて筋線推再生が活発な理由として

様，myOtubeおよび，中心核をもつ多数の再生筋
線椎が見られるようになったが，なお一部には筋合食像も残存していた．また，この時点では
mdx・対照マウスともまだ問質の細胞浸潤が明らかであった．10日後にはnldxで再生筋直径の大小不同がまだかなり顕著で，問質の細胞浸潤も明らか（図3）なのに比べ，対照マウスでは直径分布のバラツキも小さく問質の組織反応もわずかであ問質の線推増生が少ないことが挙げられている．
しかし，今回の実験や，坐骨神経切断による萎縮
下腿筋の検討（未発表）では，mdxマウスで小径線維間にかなり明瞭な問質線推症を観察しており，
線推増生の多寡は再生筋の発育や成熟度に影響される可能性も示唆された．

−224−

図2

BPVC注射4日後のmdxマウスヒラメ筋．

図3

多数の筋線維会食像，問質の細胞浸潤と線維増生が著明．toluidineblue，×450
BPVCは，基底膜を損傷せず，筋形質膜を部分的に損傷することにより筋線維壊死を起こすとされ，筋ジストロフィーにおける筋線経の変性と類似のメカニズムと考えられている2）．また，末梢神経や血管には直接損傷を与えないため，凍結や挫減による筋損傷と比べ，純粋に筋線維のみを損傷できる点で優れている．
今回の実験では，BPVC注射直後の筋線経の壊死・変性過程は，mdxと対照マウスとの間で質的な差が認められなかった．しかし，壊死・変性はmdxでより広範に起こっていた．
マウスのヒラメ筋はかなり細く，今回使用した
26ゲージの注射針では一部薬液が漏れ出すことがあり，そのため薬液が筋束全体に及ばなかった
可能性も否定Lがたいが，mdxの方がBPVCに
対して感受性が高いため広範な壊死が惹起された可能性も考えられる．
4日後では，mdx・対照とも問質にマクロファー

BPVC注射10日後のmdxマウスヒラメ筋．
まだかなり小径線経があり，問質に線推芽細胞が目だつ．tOluidineblue，×300

ジ浸潤，筋線維会食像，膠原線維増生が見られた
が，これらの組織反応は概して，mdxの方が高度であり，最初の筋線維壊死がmdxでより広範に起こったことに相関していると思われた．また，
筋線経の平均直径は7日目ではまだ幾分小さいが，10日，20日では，対照動物とほとんど同様に推移しており，直径に関する限り，筋再生能は概ね対照動物と同等であると結論された．
しかし，7日，10日目で問質の組織反応はmdxの方で明らかに遷延しており，また筋線維直径分
布のバラツキも大で，小径線経の集まる部分でと
くに問質線維症が明らかをことなど，mdxと対照
動物では問質の組織反応が若干相違することも考えられ、今後検討を要する．
今回の実験では，筋線経の性状が比較的均一であることから，生後日数の経過した動物を用いたが、老齢動物は当然若年動物とは筋再生能が異なる可能性があり（老齢ラットでは若年より再生能−225−

が劣る3）），更に時期を違えた検討が必要であろう．また，神経や血管など，筋肉に対しtrophicな働きをもつ因子に種々の傷害を与えて，筋再生能に及ぼす影響がmdxと対照との間でいかに変化するかなどの問題も今後検討しなければならない．
結論

BPVC局部注射による筋壊死は対照よりもmdxでより顕著であり，筋線維合食像や問質の組織反応も対照より遷延していたが，20日後までには再生筋線経の直径は対照側とほぼ同等に回復しており，筋線維再生能に著しい差はないものと考
えられた．
文

献

1）Tanabe Y，EsakiK and Nomura T：Skeletal
muscle pathologyin X chromosomerlinked
musculardystrophy（mdx）mouse．ActaNeur−
opathol（Berl）69：9ト95，1986．
図42）NonakaI，TakagiA，IshiuraS，NakaseHand

BPVC注射10日後の対照マウスヒラメ筋．
中心核を持つ再生筋が殆どだが，筋線経の直Sugita H：Pathophysiology of muscle fiber

径は揃っている．toluidineblue，×300

necrosisinducedbybupivacainehydrochloride（Marcaine）．ActaNeuropathol（Berl）60：
167，174，1983．

3）SadehM：Effectsofagingonskeletalmuscle

Pm

regeneration．J NeuroISci87：67−74，1988．

87

10

20

図5 再生筋線経の平均直径の推移．
M＝mdxマウス；C＝対照マウス

Sは生食水注射側−226−40）mdxマウスの白内障
筋緊張性ジストロフィー症の白内障との異同
栗 原 照 幸＊
研究協力者

暫 藤 伸 行＊＊ 山 下晃＊＊ 河 本 道 次＊＊

は じめに
ヒト老人性白内障の水晶体ではCaイオン，Na
イオンの増加とKイオンの低下が認められる．ヒト筋ジストロフィー症では筋緊張性ジストロフィー症に白内障の頻度が高くJungel）は約95％に合併すると報告している．筋ジストロフィーモデル
動物の一つであるmdxマウスには細胞内記録でミオトニーがみられ，また水晶体の混濁も認められたので眼科的に水晶体を経時的に観察し，筋緊張性ジストロフィー症の白内障との異同について検討した．

図11日齢mdxマウスの水晶体核のみの混濁を認める．
方法

対照には生後1，2，3，4日齢のmdxマウ

myotonicdystrophyの患者の両眼にMydrinP⑧

ス，各1匹，8眼，生後14日，21日，28日，120
日，150日齢のmdxマウス各2匹，20眼およびそを点眼し散瞳後，細隊灯顕微鏡による水晶体の観察を行った．

の対照の生後112日齢のC57BL／10◆マウス1匹，2眼（合計15匹，30眼）を用いた．各マウスの両眼にMydrinP⑧（塩酸フェニレフ・）ン，トロピカマイド）の点眼を行い，散瞳後ネンブタール注射液（ベントパルビタールナトリウム）を腹腔内注射
し，麻酔下にて細隙灯顕微鏡による観察を行った．
1〜4日齢マウスは開眼していないため眼瞼切開を行って観察したが，MydrinP⑧点眼によっても散瞳が不十分であったため水晶体を摘出し，細隊
灯顕微鏡および実体顕微鏡による観察を行った．
水晶体の部位を前垂下，皮質，核，後嚢下に分類し，混濁の状態を観察した．また，31歳の＊東邦大学医学部第四内科＊＊東邦大学医学部附属大森病院眼科結果
1，2，3日齢のmdxマウスは散瞳が不十分であり，細隙灯顕微鏡では水晶体の混濁は不明であった．水晶体摘出後，実体顕微鏡下の観察ではいずれも同程度に核のみの混濁を認めた（図1）．4
日齢においては核の混濁の他に微細な前嚢下の混濁も認められた（図2）．14日齢水晶体は軽度の前嚢下混濁を認めたが，水晶体前極部中央は透明性が保たれていた．微照法で観察すると水晶体中央部に軽度の前垂下の樹枝状混濁を認めた．21−120
日齢と経時的に観察すると前嚢下混濁はしだいに求心性に水晶体前極部中央へと進行し，前嚢下の樹枝状混濁も著明となってきた．150日齢になると水晶体前嚢下の混濁が前極部全面に生じている

ー227−

図2

図4112日齢C57BL／10マウスの水晶体
ほとんど混濁を認めない．

4日齢mdxマウスの水晶体核の混濁と微細な前垂下の混濁を認める．

図5 Myotonicdystrophy31歳女性の水晶体
後嚢下の放射状混濁を認める．

図3150日齢mdxマウスの水晶体
融極部全面を満たす前嚢下の混濁を認める．
例も存在した（図3）．

に赤，緑など 多彩な色調を呈する閃輝性小点状のC57BL／10マウスは112日齢であっても水晶体混濁および，白色点状混濁を特徴とする．この時の混濁は殆ど認められなかった（図4）．Myotonic

期は一般に視力は良好で数年同じ状態が続いた後，

dystrophyの31歳女性は初診時は視力右1．0（n．

皮質浅層の混濁はびまん性になり，後嚢下皮質のC．），左0．6（n．C．）で細隊灯顕微鏡で観察すると左放射状ないしは星空状混濁も出現する．この型を右眼とも後垂下に軽度の放射状混濁を認めた．初Fleischer型白内障という．我々が経験した診から経時的な水晶体後嚢下混濁の増強を示し，

myotonic cataractもこのFleischer型白内障に1年9ケ月経た時点では視力右0．7（n．C∴左0．07（0．1×−4．OD）となった（図5）．

分類できると思われる．この時期になると視力障害も出現し，さらに進行すると，核，皮質の混濁も出現し，やがて仝白内障となる．これに対し

考察

mdxマウスの白内障の進行過程は，まず核の混濁

典型的な筋緊張性ジストロフィー症の白内障は，から出現した．やがて水晶体の前極部と赤道部の水晶体の混濁の進行程度および形態から，Vogot型

中間に微細な前垂下混濁が出現し，以後前嚢下混およびFleisher型に分類される．Vogot型白内障

濁は求心性に水晶体前極部へ拡張しており，ヒトの細隊灯顕微鏡所見は水晶体皮質部の短く狭い層

筋緊張性ジストロフィーの白内障とはかなり異な

一228−

た進行過程を示していた．

peptidaselevelの低下について検討したが現在動物による白内障のモデル実験から岩田ら2）は，
1）遺伝性の誘発因子や先天性の因子があると水晶体は核より混濁する．2）外部環境の異常性に発生要因がある場合には赤道部の皮質から混濁が進行し，前嚢下，後嚢下へと混濁の範囲が拡張していく．3）細胞配列を乱す化学物質の影響による白内障では水晶体赤道部から混濁が始まり次第

なお不明である．
形態学的な検討では，ヒト筋緊張性ジストロフ
ィー症の白内障の多色閃輝性混濁をVogot6）はコに皮質へと混濁が進行する．4）膜の能動輸送系の活性の低下があれば前妻下の混濁から始まり，
水晶体前極部全体が混濁した後，後垂下混濁も出現する．5）代謝異常による白内障は後垂下から混濁が出現し，次第に混濁の部位が広がっていく，としている．
筋緊張性ジストロフィー症の白内障は，主な混
濁部位が後垂下であり経時的増加を示したことか
ら代謝異常による白内障に最も類似していたが，典型例では前嚢下に近い皮質浅層より白内障が始まるとされておりかなり複雑な要因が存在していると思われた．また，mdxマウスの白内障は，出生時には核の混濁を認め，1）の遺伝性の誘発因

レステリンであるとしている．また，矢島ら7）は細隙灯顕微鏡で混濁として認められる部分の水晶体線
確聞には小球状ないしは滴状の変性物が認められ，上皮細胞は，小塙形成，核の濃縮，変性萎縮を生じて消失の傾向があったとしている．電顕的には，
野田ら8）は水晶体嚢内に突起構造が観察され，前嚢下で水晶体線経は細く，全般に圧縮されていた．
空胞形成や滴状の変性物が認められた他，電子密度の高い部分も認められたと報告している．今回
我々はmdxマウスの白内障とヒト筋緊張性ジス
トロフィー症の白内障との組織学的な比較は行わなかったが，今後この面からの検討も行いたいと考えている．
結語

mdxマウス14匹，28眼の水晶体を細隙灯顕微鏡を用い観察を行った．mdxマウスの白内障は子が原因で生じたモデルと同様の状態であった．
出生後は前垂下の混濁が出現し，やがて水晶体前極面全体を満たした．この後の後妻下の混濁は不明だが我々が観察した時点までは膜の能動輸送系の活性の低下による白内障に類似した進行を示し
た．水晶体の膜の能動輸送には，Na，K，ATPase
やCaATPaseが関与しているといわれている．
岩田3）らによるとCaイオンは，水晶体中で膜構造

核より混濁が出現するが，生後4日齢で前嚢下混の安定化作用，膜透過性の制御，細胞間接着因子として重要な働きをし，タンパク質の会合作用もあるとされている．また，水晶体中のCaイオン輸
送の大半はCalmodulinに依存したCa ATPase

た進行過程を示した．

によるとされており，膜の能動輸送系が要因となっていると考えた場合，mdxマウスの白内障においては，Calmodulinを阻害する因子を有している可能性も示唆される．今後Caイオン濃度の変動など生化学的な検討が必要であると思われる．
ヒト筋緊張性ジストロフィー症の白内障に関する原因について，K血nら4）は，低眼圧との関係を示唆し，Vassilopoulosら5）はγ−glutamyltrans−

濁が出現し，経時的な前垂下混濁の進行を示した．
これはmdxマウスは先天的な水晶体混濁を生じる因子を持つとともに膜の能動輸送系が障奮される因子が存在することを示唆するものであった．
ヒト筋緊張性ジストロフィー症の白内障進行過程
は代謝異常による白内障と類似した進行過程を示しておりmdxマウスの白内障とはかなり異なっ

文献1）Junge J：Ocular changesin dystrophia
myotomica，paramyOtOnia and myotonia con・
genita．DocOphthalmo121：1r115，1966．
2）岩田修造：水晶体その生化学的機構．メディカル
葵出版，東京，1986．
3）岩田修造：水晶体混濁に関する生化学的解析．日
限86：109−133，1943．
4）KuhnEand Piesbergen HJ：Hypotensiondes

ー229−

BulbusundKataraktbeimyotonischerDystro−sentrubungen．GraefesArchOphthalmo1108：

phie．KlinMblAugenheilk130：329−335，1957・
5）VassilopoulosD，AlevizosBandSpengosM：

192−218，1922．

dystrophy．Ophthalmologia（Basel）174：

7）矢島保通，沖坂 邦：筋強直性ジストロフィーにみられる白内障．眼科27：1586−1887，1985・

167−169，1976．

8）野田幸作，作村 恵，上野修幸，割石三郎，玉井Cataracta andγrglutamylcyclein myotonic

6）Vogot A：Weitere Ergebnisse der Spalt−
1ampenmikroskopiedesvorderenBulbusabsch・nittes，ⅠⅤ：Abschnitt・PrasenileundsenileLin・ー230−

嗣彦：筋緊張性ジストロフィー白内障の一1札あたらしい眼科5：322−324，1988・

41）mdxマウス長政伸筋細胞膜のFreeze−Fracture法
による微細構造の経時的変化について
若

山

研究協力者

二ヒ
【二Ⅰ

溢

弘＊
谷

誠

二＊

X chromosomeLlinked muscular dystrophy

匹につき，最低10本の筋線維（5P面および5E（mdx）マウスはヒトDuchenne型筋ジストロフ

面）について，各群それぞれ60枚ずつ，最終倍率16万倍の写真をcodeL，すべて混ぜ合わせ，mdx
群かCOntrOl群か不明にした後，intramem−

ィー症（DMD）と欠損遺伝子部位が近似し，その遺伝子産物（dystrophin）も欠損しているといわれている・またdystrophinが筋細胞膜に関連して存

branous particle（IMP），Orthogonal array（OA），Orthogonal array subunit particle（OASP）のそれぞれについて，IMPは1本の筋線経の0．25／JmZの細胞表面積をもつ領域内の，OAは1〜1．85／ m2の領域内の粒子数を，さらにOASPはカウントしたすべてのOAについて算

在する蛋白であることが最近報告されており1），
DMDの発症機序と筋細胞膜変化は従来以上に重要な関連性をもつと考えられる．昨年度はそのmdxマウス筋細胞膜のCaveolae密度につき検討したが，今年度は筋細胞膜の膜内粒子を中心に検討をおこなった．
方出した．これらはdecodingした後，各群間で統計的に検討した．

法

生後8週，16週および24週の成熟雄mdxマウスならびにそのCOntrOl（C57BL／10ScSn）マウ
スを各々6匹ずつ使用し，摘出した右側長址伸筋（EDL筋）はisopentanおよび液体窒素で凍結固定後，光顕組織化学標本，特にATPase染色においてはfibertypeの分析をおこなった．左側EDL筋は十分に露出し，下腿骨につけたまま，直ちに
2・5％glutaraldehyde solutionin o，1M phos−
phatebuffer（pH7・4）の中で2時間固定し，実体顕微鏡下でEDL筋の筋膜を注意深く取り除いた後，小さなblockに切り，10％から30％のglycerolに浸し，Freeze−Fracture（F−F）法により筋細胞膜電顕標本を作製した．F−F法による標本割断は，EikoFDIIA（−120℃，2．5−4×10−7
Torrの条件下）を用いた．また電顕にて観察し，撮影された筋細胞膜写真中の膜内粒子数は各々1

結果

光顕的にmdxマウスはどのStageも中心核線経を主体とし，その中に合食細胞の浸潤を伴った壊死再生線経の集塊がみられた．またATPase染
色によるfiber typeの分析では，その多くがtype2線維（99％）よりなり，そのうちtype2C
線経は7％以下とDMDと比較しても少数であった．
F−F標本におけるIMPの密度をmdx群とCOntrOl群とで比較すると，OASPに含まれる粒子は含めないでカウントした場合のP面の粒子数は，生後8週では差を認めなかったが，生後16週および24週ではmdx群で減少がみられた．またOASP内の粒子を含めた場合には，どのStageもmdx群で減少を示し，一方，E面の粒子数はmdx群およびCOntrOl群の間に有意な差は認めなかった（表1）．

＊昭和大学藤が丘病院神経内科

1／−げあたりのOA密度は生後8週，16週およ−231−

表1Particledensity／pm2inEDLmuscleplasmamembranesfromControlandMDXmiceat
differentstages（Groupmean土Standarderrorofthemean）
ControlAgepfacebPfacea8weeks2291＋96★

2625＋112★★

E

2233＋100★

764＋53★★★

−■■■＝■‥一一一一‥一一一一一一…一一一…一一一一一…一一…一一一一一一一一一一…

16weeks

2461＋128†2608＋114十十988＋39†十十1844＋95十＿＿＿＿＿＿＿−■■一2053＋95幸

2246＋114幸手

914＋71十††1854＋140幸1936＋134幸手

783＋60榊

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く

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⊥十

⊥十

▲十

▲十

▲十

t

表3

0rthogonalarraydensity／pm2inEDLmuscle

1915＋104十十一一■一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一■■Hl−●一■●●

00 2

く

nr P P

▲十

t

t t t
S S S
e e e
t t t

t

Ju．一U．Hu
e e e

＞

a︑d−d
t t t

P

く

Z つ L 2

P

5
2 02

P

★
★
★

＞

★
★

0 00

★

表2

0

with OASP

744＋30★★★

￣▼￣−￣￣￣￣￣727＋20榊

†
IT 十
十IT−T

両thout OASP

2288＋99★★

−日日一一一一一一一一一一一‥一一一一一一一…一一…一■■一日■■■■■■1．■一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一■●■■●■●

24weeks

p faceb E facep faceaface

Subunitparticlenumberperoneorthbgonalar−
rayinEDLmuscleplasmamembranesfrom
Control and MDX mice at different stages

plasmamembranesfromControlandMDX
miceatdifferentstages（Groupmean土Standarderrorofthemean）

Age

ControI
Median

3．89＊

MDX
Age

ControI

8weeks

18．5土0．3＊

12．4士0．7＊16weeks

18．1士0．6＊＊

13．4土1．1＊＊

24weeks

17．7土0．4＊＊＊

17．0土0．9＊＊＊

8weeksMidrange l・61−11・30

MDX

1．61＊

0・54−2・95（25％to75％）
Median

3．77H

0．54…

16weeks＊

Midrange l・61−6・80

0−1・61（25％to75％）
Medianp＜0．01（2tailedttest）＊＊＊p＞0．2（2tailedttest）

3．54＊＝

0．54…＊（P＜0．01）とmdx群ではどのStageも明らかな減少を示した（表2および図A−D）．

24weeks

Midrange l・61−7・00（25％to75％）＊

p＜0．001（2tailedttest）＊＊

0−1・13

OASPの数，すなわち各々のOAひとつあたりに含まれる粒子数の平均を比較すると，生後8週，16週のmdx群では，その構成する粒子数はCOn−trol群に比べて少なく，SmallsizeのOAよりなっていたが，生後24週では差はみられなかった

p＜0．01（Wilcoxonranksumtest）

H p＜0．01（Wilcoxonranksumtest）…p＜0．01（Wilcoxonranksumtest）

び24週の順にそのMedian値およびMidrange（25％〜75％）（括弧内）が，COntrOl群では3・89

（表3）．
考

（1．61〜11．30），3．77（1．61−6．80），3．54（1・61

昨年度報告したCaveolae密度の結果2）を含め〜7．00）であり，一方mdx群では同様に1・61（0．54〜2．95）（P＜0．01bywilcoxonranksumtest），0．54（0〜1．61）（P＜0．01），0．54（0〜1・13）

察て，mdxマウスの筋細胞膜は超微形態学上，
Caveolaeの増加，P面のIMPの減少，OAおよびー232−

図A−DHighmagnificationelectronmicrographsoffreezeTfracturepreparationsillustrating
Orthogonalarraydensityinextensordigitorumlongus（EDL）muscleplasmamembraneof
normalcontrolandmdxmiceafter24weeksofbirth・Fig・A・Normalprotoplasmic（P）face；
Fig・B・ⅩChromosome−linkedmusculardystrophy（mdx）Pface；Fig．C．Nomalexternal（E）face；Fig・D・mdxEface・Decreaseddensityofbothorthogonalarraysandtheirpits（arrows）areapparentinmdxmembrane・C＝Caveolae．Bar＝0．2pm−233−

x160，000OASPの減少よりなっていたが，この中でもOA

ほとんどOAがみられない線経も多数みられた．

の減少はCOnStantにみられ，ほとんどOAがみら
れない線経も多数みられた．この結果は従来よりいわれているDMD筋細胞膜変化3）5）とほぼ同様な変化といえ，またこの中でもOAの減少は特に顕著な所見といえた．
mdxマウスの臨床症状は軽い筋力低下を示す

3．DMDを規制する遺伝子による産物（dystro−

のみで，その予後も良好であることや光顕病理組
織学的にもmdxマウスでは再生が旺盛で壊死再生のプロセスが繰り返し起きている点などDMDと異なる面も多い．しかしながら，異常遺伝子部位の類似とdystrophin欠損というその本質においてDMDと同質のこのmdxマウスが筋細胞膜変化に関しても，ややOA密度がDMDより多いかという印象を受けるが，同様の所見であったことは興味深い．
Hoffmanら6）は，Becker型筋ジストロフィー症（BMD）においてdystrophinの分子量の質的異常を報告しており，mdxマウスにおいても同様の異常が推測されるが，荒畑ら7）の免疫組織化学染
色の結果はBMDでは部分的な筋線経のdystro−
phin陽性を認めたが，mdxマウスでは全く認めていない．それゆえに，dystrophinの異常のみでDMDとmdxマウスの臨床像と病理組織像の違いを論ずることは難しく，今後の課題であろう．
その一方，dystrophinの欠如とDMDおよびmdx
マウスの筋細胞膜変化，特にOAの減少との関係
は，この蛋白が筋細胞膜の裏打構造的細胞骨格であることから，またOAが筋細胞膜内の中でも，特に細胞質側（P面）に存在することより，強く影響をうけている可能性が考えられ，OAがこの
dystrophinとlinkした細胞骨格である可能性も示唆された．

phin）とOAの関係に関して興味がもたれ，さらに研究を進めたい．
文献1）SugitaH，ArahataKetal＝Negativeimmuno−

StainingofDuchennemusculardystrophy（DMD）
and mdx muscle surface membrane with anti−
body against synthetic peptide fragment

predictedfromDMDcDNA・ProcJapanAcad
64：37，1988．

2）若山吉弘，泣谷誠二：成熟mdxマウス長址伸筋
細胞膜のCaveolae密度のFreeze−Fracture法による検討−ヒト筋ジストロフィー症との比較一【厚生省筋ジストロフィー症の発症機序に関する臨床的研究（杉田班）昭和62年度報告書 ，1988，
p296．
3）SchotlandDL，BonillaEetal：Freezefracturestudiesofmuscleplasmamembraneinhumanmusculardystrophy．ActaNeuropathol（Berl）
54：189，1981，

4）BonillaE，FischbechKetal：Freezefracturestudiesofmusclecaveolaeinhumanmuscular
dystrophy．AmJPatho1104：167，1981・
5）Wakayama Y，Okayasu H et al：Duchenne
dystrophy；reduced density of orthogonalarraysubunitparticlesinmuscleplasmamem・brane．Neurology（Cleveland）34：1313，1984・
6）HoffmanEP，FischbeckKHetal＝Characteri・

zation of dystrophinin musclerbiopsy speci−
mensfrompatientswithDuchenne，sorBeckersmusculardystrophy．NEnglJMed318：1363，
1988．

結

7）ArahataK，IshiuraSetaHmmunostainingof

論

1．mdxマウスの筋細胞膜は超微形態学上，DMDと類似していた．
2．その中でもOAの減少はCOnStantにみられ，−234−

skeletalandcardiacmusclesurfacemembranewithantibodyagainstDuchennemusculardys−
trophypeptide．Nature333：861，1988・

42）m血マウス骨格筋収縮の燐NMR
山 田 和 贋＊研究協力者

米谷快男児＊

中村大群

武居光雄＊

スザンヌ・フィリップス＊

Duchenne型筋ジストロフィー症では，その筋ている・一万・上に述べた研究によって収縮・弛

線経の変性および壊死が生じていることが，組織緩の時間経過がとくにEDLで延長して居り，筋
小胞体機能における異常が示唆されている．

学的によく知られている・また，ジストロフィンの筋線経における局在と，ジストロフィー症におmdxマウス筋肉のエネルギー代謝については，
上に述べたように燐NMRによる研究が特に有用であると考えられるが，対象とする筋肉が非常に小さいため，研究が非常に困難である．山田ら8）
は，EDLを用いて，mdxjウスと正常対照マウス

けるその欠如については，最近明らかにされた1）2）3）・しかし，筋ジストロフィー発症前の筋線維
あるいは発症後再生した筋線経について，そのエ
ネルギー代謝に異常がみられるかどうかについて
は，明らかにされていない．

の燐NMR測定を行ったが，4匹のマウスより摘出したEDL筋（総重量約50mg）を用い，信号／雑音比のよいスペクトルを得るのに約3万回測定を繰り返して得られた信号を加算することが必要
であり・1つのスペクトルを得るのに10−20時間を要している・したがって，測定は静止筋に限られることになるが，その結果はmdxマウス筋と正常対照マウス筋の間に静止状態における燐
NMRスペクトルには，特に差異が認められなかった．

このような問題について，主に筋生検を用いて多くの研究が行われているが，線雄の壊死に伴う組織の変性のために研究が大変困雉であった．このため燐NMR法による研究が試みられている4）．
筋ジストロフィーマウス（mdx）は，ヒトのDuchenneまたはBecker型筋ジストロフィー症のモデル動物として注目されている．ジストロフ
ィンの欠掛こついてもヒトDuchenne型ジストロ
フィーと類似している・一方，mdxマウスでは，壊死に続く再生が早期から活発にみられることが，ヒトの筋ジストロフィー症と異なっている．
1・mdxマウス筋の生理学研究
mdxマウスは，上に述べたように疾患モデル動物として有用な性質を持っている．mdxマウスの摘出筋肉は・その生理学的性質について調べるた
めのよい対象である5）6）7）．とくに山田ら6）はmdx
マウスの長址伸筋（EDL）およびヒラメ筋（soleus）
を摘出し，力学的およびエネルギー論的研究を行っているが，正常および再生筋線経については対
照マウスの筋と相違がみられないことが示唆され＊大分医科大学生理学教室

2・最大エンロビーイメージ再構成法によるNMR
スペクトルの信号／雑書比の改善
1980年代の初めから，最大エントロピー法と呼ばれる，雑音にかくれている弱い信号を抽出する
数学的方法が，NMRスペクトルにも適用されるようになっが）10）11）・NMR法はもともと感度の悪い方法である・生体組織を対象とするときのように特に組織の量や測定時間による制限を受ける場
合には，上に述べたイメージ再構成法を適用する
ことは非常に有効であると考えられる．また，このような方法を用いると，mdxマウス筋を対象とする場合にも，収縮・弛緩による燐化合物の量の変化を知るための・動的測定が可能となると考え−235−

トー」」1」−LLトー上山⊥」−Ⅰェ山」山一巨日日日日＝‥日日日日＝日日ヰ⊥」．⊥」⊥
5．00

0．00

−5・00

−10・00−15・00−2〇・〇〇

図1mdxマウスEDL（4匹分）を対象とし，1024回信号を加算して得られた燐NMRスペクトル（下図）と，これに，最大エントロピーイメ「ジ再構成法を通用した結果（上図）を示す．
約30分）に，上に述べた最大エントロピー法に基られる．

図1は1024回の測定による信号を加算するこ づくイメージ再構成を行った結果を示している・とによって得られた，mdxマウスEDL筋を対象 信号を約3万回加算（必要時間は16時間）することする燐NMRスペクトル（測定に必要な時間はとによって得られたスペクトルとを比較したもの

一236−

ト］］］霊］］山霊山］霊］⊥一」忠告⊥］「慧ヒ］⊥⊥当たL］」」−1〇・〇0−15．00−20．00
図2

mdxおよび正常対照マウスEDL（4匹分）を対象として，約3万回信号を加算して得られた燐NMRスペクトルに，さらに最大エントロビ￣イメージ再構成法を適用した結果を示す．正常マウス筋より得たスペ
クトル（下方）に認められる燐酸ジエステル領域のピーク（＊印）が，mdxマウス筋（上方）では認められない．

である．イメージ再構成を行った結果，約30分の加算によるスペクトルの信号／雑書比は，約16時間を要したスペクトルのものよりも良くなっていて，その結果，測定の時間分解能はおよそ100倍
程度改善されることが期待されるに至った．
図2は，約16時間を要して加算したスペクトル（この程度の信号／雑音比からは，mdxマウスと来するのかという，燐NMRスペクトルのピーク

正常マウスとの間の燐化合物のわずかの差異は検出できない）に，さらにイメージ再構成法を通用した結果を示す．その結果mdxマウスと正常対照マウスのEDLの静止状態における燐スペクト

照マウスEDLにおいて認められるピークが，ルにはかなりの差異が認められる．これらの差異については，ここで用いたイメージ再構成法上の問題，および各ピークがどのような燐化合物に由の同定についての非常に困難な問題があり，今後の研究にまたねばならない．しかし図2に示すように，燐酸ジエステルに由来することが明らかにされているスペクトル線の領域において，正常対
mdxマウス筋では消失している．Burtら12）は筋ジストロフィー症ニワトリの胸筋を対象として，ー237−燐NMR測定を行い，燐酸ジエステルに由来する
ピークの出現するスペクトル領域に，正常対照筋に認められない特異なピークの出現することを報測定法によるmdxマウス骨格筋のエネルギー論

告し，これをL−Serine ethanolamine phos−
phodiesters（SEP）と同定しているが，この事実と関連して，上に述べた結果は大変興味深い．

する研究（杉田班）昭和62年度研究報告書．1988，

文的研免厚生省「神経疾患研究委託費」筋ジスト
ロフィー症及び関連疾患の病態とその病因に関pp162−167．

7）KometaniK，Tsugeno H and Yamada K：
Mechanical and energetical properties ofdystrophic（mdx）micemuscles・（投稿準備中）

献1）ChellyJ，KaplanJC，MaireP，GautronSand

8）山郎口虞，米谷快男児，北野敬明，河野義久：mdx

KahnA：Transcriptionofthedystrophingene

マウス骨格筋収縮のエナージェティクス．厚生省

in human muscle and non−muSCle tissues・「神経疾患研究委託費」筋ジストロフィー症及びNature333：858−860，1988，

関連疾患の病態とその病因に関する研究（杉田班）昭和61年度研究報告書，1987，pp42￣46．

2）ArahataK，IshiuraS，IshiguroT，Tsukahara
T，SuharaY，EguchiC，IshiharaT，NonakaI，

9）SibisiS，SkillingJ，BreretonRG，LaueED

Ozawa E and Sugita H：tmmunostaining ofand StauntonJ：Maximum entropy signal

skeletalandcardiacmusclesurfacemembraneprocesslngin practical NMR spectroscopy・
Nature311：446r447，1984

withantibodyagainstDuchennemusculardys−

10）SkillingJandBryanRK：Maximumentropy

trophypeptide，Nature333：861−863，1988・

3）WatkinsSC，HoffmanEP，SlayterHSand
Kunkel L M：Immunoelectron microscoplC
localization of dystrophinin myofibres・

imagereconstruction＝generalalgorithm・Mon

NotRAstrSoc211：111−124，1984．
11）NiF，Levy GC，and Scheraga H A：
Stimultaneous resolution enhanCement andNature333：863r866，1988．
4）GriffithsRD，CadyEB，Edwards RHT，

noisesuppressioninNMRsignalprocessingby

Wilkie D R：Muscle energy metabolismin

combineduseofmaximumentropyandFourier

Duchenne dystrophy studied by31P−NMR：

self−deconvolutionmethods．JMagResonance
66：385−390，1986．

controlledtrialsshownoeffectofallopurinol

orribose，MuscleandNerve8：760−767，1985・

12）BurtCT，GlonekTandBaranyM：Phospho−5）DangainJ and Vrobova G：Muscle develop−

rusr31nuclearmagneticresonanCedetectionof

mentinmdxmutantmice．MuscleandNerve

unexpected phosphodiestersin muscle・Bio・

7：700−704，1984．

chemistry15：4850L4853，1976・

6）山田和風米谷快男児，柘野浩史，河野義久：熟一238−43）筋ジストロフィーマウス（MDX）筋の高分子領域での欠損蛋白質について
堀
研究協力者

杉

浦

弘

子＊

眞一郎＊
大

谷

Duchenne型筋ジストロフィーの遺伝子異常の研究が著しい進展をみせ，欠損遺伝子の単離から，それにコードされている蛋白質（dystrophin）が推定され，それに対する抗体を使って組織化学的に局在が検討されるに至っている．しかし，この蛋白質の化学的性質，生理的役割は推測の域を全く出ていない・私達はDuchenne型筋ジストロフィーと類似の遺伝子異常をもつとされている筋ジス
トロフィーマウス（MDX）を用いて，筋蛋白質の異常を二次元電気泳動と銀染色の併用によって検索したところ，高分子蛋白質の欠損を兄いだしたので報告する．
実験方法
大部分の筋線経に中心核が出現する1）生後120日の雄の筋ジストロフィーマウス（C57BL／10
ScSn−MDX，以下MDX−マウスと略す）および正常対照マウス（C57BL／10ScSn）の長指伸筋，ヒラメ筋及び心筋を使用した．
蛋白質の可溶化および抽出：摘出した筋組織を8M塩酸グアニジンLO．1MTris−HCl，pH7．5−10％

β−merCaptOthano1−2％NP−40LlOmMピロ

リン酸ナトリウム液中にglasshomogenizerで懸濁し，この懸濁液を5Murea−1．5Mthiourea−0．
5％ β−merCaptOethanol液に対して透析した後，遠心し，得られた上清を可溶化された蛋白質標品として用いた．
二次元電気泳動：平林の開発した二次元電気泳動
法2）により抽出された蛋白質を分離し，銀染色し＊東京都神経科学総合研究所神経生化学＊＊筑波大学生物科学系

幸

子＊

平

林

民

雄＊＊

た後，観察した．
結果
図1は長指伸筋の筋蛋白質の二次元電気泳動図
であるが，大部分の蛋白質はMDX−マウス，正常対照マウス共に認められたが，中性領域で，ミオ
シン重鎖よりはややアルカリよりで分子量350kDと推定される蛋白質は正常対照マウスでは認められるが，MDX−マウスでは認められなかった．この領域は電気泳動に際して，筋組織に多量に含まれるミオシン蛋白により，蛋白質の分経が影響を受け易いところである．そこで，ミオシン
蛋白が低イオン濃度で沈澱することを利用して，筋組織を8M塩酸グアニジンで処理した後，0．15
MKCl溶液に対して透析した．ミオシン蛋白の大部分は沈澱分画に回収されたが，正常対照マウス
で認められた分子量350kDの蛋白質は上清分画に回収された．図2はこうした低イオン濃度処理をした試料を実験方法で述べた常法に従って，等電点電気泳動したのち，二次元目のアクリルアミ
ドの濃度を4％の均一にして泳動したものである．
正常対照マウスでは存在する蛋白質がMDX一マ
ウスでは消失していることが，確認された．MDX−マウスにおける筋ジストロフィーの発症は長指伸筋のみなられずヒラメ筋あるいは心筋においても認められることが知られている．これらの筋組
織についても同様に検索したところ，図3，図4に示す様に，長指伸筋で認められたと同じ蛋白質の欠損がヒラメ筋（図3）及び心筋（図4）においても兄いだされた．

一239−

図1 長指伸筋の蛋白質の二次元電気泳動．
二次元目のSDS−PAGEにおけるアク））ルアミドは5％〜12％の濃度勾配にしてある．正常対照マウスの長指伸筋で認められる蛋白質（矢印）が，MDX−マウスの長指伸筋では欠損している．

準鱒攣攣轡嘩轡準率画鱒固郎軸隠鞠幽離軸癖牒勘

図2

長指伸筋の蛋白質の二次元電気泳軌
8M塩酸グアニジン処理した後，0．15MKCl溶液に対して透析し，ミオシン蛋白の多くを沈澱させた上清分画を電気泳動したもの．二次元目のSDS−PAGEにおけるアクリルアミドの濃度は4％の均一である．正常対照マウスの長指伸筋で認められる蛋白質（矢印）が，MDX−マウスの長指伸筋では欠損している．

一240−

図3 ヒラメ筋の蛋白質の二次元電気泳動．
泳動条件は図2と同じ・中央の図（mixed）は二次元電気泳動上に検出される蛋白質相互の位置の確認のため，電気泳動する直前に正常対照マウスからの試料とMDX−マウスからの試料とを混ぜ合わせて，泳動したものである・正常対照マウスのヒラメ筋で認められる蛋白質（矢印）が，MDX−マウスのヒラメ筋では欠損している．

′

・、モ

ー

一．●・、二、・、・・・・l＼▲ノ・、・．い．t′・）Con汀〇日C57BL10S（、Sn．まMiX匂d

図4 心筋の蛋白質に二次元電気泳動．
泳動条件は図2と同じ．中央の図（mixed）は二次元電気泳動上に検出される蛋白質相互の位置の確認のため，電気泳動する直前に正常対照マウスからの試料とMDX−マウスからの試料とを混ぜ合わせて，泳動したものである．正常対照マウスの心筋で認められる蛋白質（矢印）が，MDX−マウスの心筋では欠損している．

ー241−

考

察

二次元電気泳動で，兄いだされた欠損高分子蛋
白は分子量350kDと推定されたが，この分子量はDuchenne muscular dystrophyの原因遺伝子にコードされている蛋白質であるdystrophinの
分子量約400kDと一致している．また，この欠損

ウスの筋組織には存在するが，MDX−マウスの筋組織には欠損している蛋白質を兄いだした．この蛋白質の欠損は長指伸筋のみならず，ヒラメ筋及び心筋においても認められた．この蛋白質の分子量は350kDで，等電点はミオシン重鎖よりややアルカリよりの中性であると推定された．

はMDX−マウスの骨格筋，心筋に共通していた．
文

これらの結果はここで兄いだした欠損蛋白質が献

dystrophinであることを示唆している．この蛋白

1）杉田秀夫：筋ジストロフィー症モデル動物の開質がdystrophinと同一のものであるのか否かに

発：mdxマウス骨格筋の病理学的研究．【厚生省ついて，dystrophinに対する抗体を用いて，反応

神経疾患委託費筋ジストロフィー症動物の開発・性を検討する必要がある．Dystrophinは筋細胞の供給に関する研究（野村班）昭和59年度研究報告

SarCOlemmaに局在している3）4）．Knudson等5）は

書 ，1985，p13．

dystrophinの筋細胞内の局在と遺伝子から推測

2）HirabayashiT：Two−dimensionalgelelectr0−

される蛋白質のアミノ酸配列から，この蛋白質はphoresis of chicken skeletal muscle proteins

NH2端末にアクチンを結合し，筋小胞体（sarco−

withagarosegelsinthefirst dimension．Anal

plasmiC reticulum）の終末槽とT管で構成されBiochem117：443，1981．

るtriadの構造の中に埋もれて存在して，triadの3）ArahataK，IshiuraSetal：Immunostainingof

構成因子相互の安定化に働いていると推察していskeletalandcardiacmusclesurfacemembraneる．この蛋白質の化学的性状，生理的役割を，更withantibodyagainstDuchennemusculardysT
trophypeptide．Nature333：861，1988．

に明らかにするために，蛋白質そのものを出来る
限り生理的状態で抽出単艶することが必要である．

4）BonillaE，SamittCEetal：Duchennemuscular

ここでは8M塩酸グアニジンと，5M尿素とで処

dystrophy：Deficiency of dystrophin at the

理することによって可溶化している．この可溶化

musclecellsurface．Cel154：447，1988．

の条件では蛋白質の立体構造は破壊されるので，

5）KnudsonCM，HoffmannEPetal：Evidencefor

今後より適切な可溶化の条件を工夫する必要があ

the association of dystrophin with the trans−

る．

VerSetubularsysteminskeletalmuscle．JBioIChem263：8480，1988．
まとめ

二次元電気泳動と銀染色によって，正常対照マ−242−

44）筋ジストロフィーマウス（MDX）筋のC−プロテインの動態について

研究協力者

杉

浦

弘

堀

眞一郎＊

子＊

大

筋ジストロフィーマウス（MDX）は人のDu＿
Chenne型筋ジストロフィーと類似した遺伝子異常をもった動物モデルであることが明らかになっ

谷

幸

子＊

平

林

民

雄＊＊

16，000gX20minで遠心し，上清と沈澱に分離した．マウスの骨格筋からのC−プロテインの分離精
製はOffer等（1973）2）の方法によった．

ている・このマウスを用いて，筋蛋白質における遺伝子の情報発現の異常を二次元電気泳動で検討している過程で，ミオシン重鎖より分子量が少し小さく，等電点のややアルカリよりの蛋白質（145KD）に正常対照マウスとMDX−マウスとの問に量的差があった・しかし，この蛋白質は5M尿素処理に先だって，8M塩酸グアニジンで処理するとMDX一マウスでも正常マウスとほぼ同程度認められた・このことから，8M塩酸グアニジンで失活する因子がMDX−マウスに存在するのではないかと推測されることを昨年報告した．ここではこの蛋白質の同定と変化の動態について検討した．

実験方法
大部分の筋線雑に中心核が出現する生後120日の雄の筋ジストロフィーマウス（C57BL／10
ScSn−MDX・以下MDX−マウスと略す）および正常対照マウス（C57BL／10ScSn）の長指伸筋を使用した・摘出した筋組織を5M尿素−1．5M
thiourea−0．5％β一merCaptOethanol液（以下5M
urea含溶解液と略す）で，可溶化後，平林の改良した二次元電気泳動法l）により分匪し，C。。maSSie
BrilliantBlueRで染色した後，観察した．筋蛋
白質の可溶性については0．6M KCト0．01M
TrisLHCl，pH7・8にホモゲナイズした後，＊東京都神経科学総合研究所神経生化学＊＊筑波大学生物科学系

結果
異常を示した蛋白質の同定：二次元電気泳動での，この蛋白質の出現する位置から，いわゆるC−
プロテインではないかと推測されるので，Offer
ら（1973）の方法で，部分精製したCrude CLプロ
テインと，はたして二次元電気泳動上，一致するのか否か検討してみた．図1に示す様に，精製したC−プロテインと全く一致する蛋白であることが解った．
C−プロテインの変イ亡を促進する因子：先に報告したように，筋組織中には8M塩酸グアニジンで失活する変換因子が存在することが示唆されている．
このC−プロテインを変換する因子は可溶性のものか否かを検討するため，0．6MKCl溶液に筋組織をホモゲナイズした後，16，000gX20minで遠心し，上清と沈澱に分錐した．図2は筋組織のホ
モゲナイズ，あるいは上清と沈澱に分旺した後，上清のみでインキュベートしたものを5Murea
含溶解液で処理した後，二次元電気泳動にかけ観察したものですが，ホモゲナイズでは認められた
C−プロテインの変化が上清のみのインキュベー
ションでは認められなかった．つまり，変換因子は沈澱分画に回収されるのではないかと推測される．そこで，先に採っておいたC−プロテインと沈澱分画とでこの点を検討してみた．図3に示す様にC−プロテインと沈澱分画をまぜてインキュベートすると，C−プロテインは消失した．このことはこの変換因子が0．6MKCl溶液では沈澱分画−243−

CrudeC−PrO励n

臣密造霊感数学或感誠USCe

図1

長指伸筋の蛋白質の二次元電気泳動．二次元目のSDS−PAGEにおけるアク））ルアミドは5％−12％の濃度勾配にしてある．中央の図（mixed）は二次元電気泳動上に検出される蛋白質相互の位置の確認のため，電気泳動する直前に精製したC−プロテインと長指伸筋の抽出液を混ぜ合わして，泳動したものである．長指伸筋の抽出液で認められる蛋白質（矢印）は精製したC−プロテインと一致することを示す．

図2

長指伸筋の蛋白質の二次元電気泳動．摘出した長指伸筋を0．6MKCl溶液に懸濁した状態でインキュ
ベーションした場合と遠心して上清と沈澱に分画し，上清のみでインキュベーションした場合におけるC−プロテインの変化の差を示す．

−244−

、ヽ

図3

長指伸筋の筋組織中のC一プロテイン変換因子．筋組織を0．6M KCl溶液に懸濁した後，遠心して上清と沈澱に分画した．図は精製したC−プロテイン（左），長指伸筋の0．6M KCl溶液沈澱分画（右），C−プロテインと沈澱分画とを混和してインキュベーションしたもの（中央）のそれぞれを二次元電気泳動したものである．

の存在することを示している．なお，このC−プロ

組織中に存在することが示唆されることから，こテインを変換する因子はMDX−マウスのみならのC−プロテインの変換は遺伝子発現の変化によるものではない．なお，この変換因子は正常対照

ず正常対照マウスにも存在した．

マウスにも存在することからこの因子の筋肉にお考察MDX−マウスで顕著な変化を示したミオシン重ける生理的役割および筋ジストロフィーの発症との関連は今後の検討課題である．

鎖よりやや低分子量で，アルカリよりにある蛋白ま質はC−プロテインであることが解った．C−プロとめ

テインには自筋型，赤筋型及び心筋型と3種の1．MDX−マウスで顕著な変化を示したミオシ

isoformがあり，それぞれ抗原性及び分子量が異ン重鎖よりやや低分子量で，アルカリよりにあるなっている．これらのisoformは個体発生の過程

蛋白質はC−プロテインであることが解った．

で，発現が変化することが知られている．大日方
ら3）は筋ジストロフィー鶏の胸筋では．正常対照

2．C−プロテインを特異的に変化させる因子が筋組織中に存在することが解った．

鶏で胎時期にしか見られない赤筋型が成鶏におい

3．C−プロテイン変換因子は0．6MKCl溶液でても認められることを報告している．さて，ここ

沈澱分画に回収され，8M塩酸グア二ジンで不活で兄いだしたC一プロテインの変化が，C−プロテ性化することから酵素ではないかと推定される．

インのisoformへの変換であるのか否か，また，

4．このC−プロテイン変換因子は，正常対照マウヒラメ筋（赤筋）及び心筋のC一プロテインでも観スにも存在することからこの因子の筋肉における察されるものか否かについては，今後の検討課題

生理的役割および筋ジストロフィーの発症との関連は今後の検討課題である．

であるが，C−プロテインに特異的な変換因子が筋

−245−

文

the thick filaments of vertebrate skeletal

献myofibrils．JMoIBio174：653，1973・

1）HirabayashiT：Two−dimensionalgelelectr0−
phoresis of chicken skeletal muscle proteins3）ObinataTandShinboK‥Slow−typeC−prOtein

withagarosegelsinthefirstdimension，Analin dystrophic chiken fast pectoralis muscle・

Biochem117：443，1981．

Muscle＆NervelO：351，1987・

2）OfferG，MoosCandStarrR：Anewproteinof−246−45）mdxマウスのミオトニーに対するCa措抗剤の効果
栗 原 照 幸＊

研究協力着

岸雅 彦＊ 木 下 眞 男＊

は じめに

mdxマウスにみられるミオトニーの抑制効果を
筋細胞内記録によって検索した．哺乳動物へ神経筋標本に対してCa括抗剤がどのような効果を及
ぼすかについてはラットの横隔膜一神経標本を用いて神経刺激の開催，静止膜電位，筋活動電位を記録し，メモリースコープより写真をとり，立ち
上がり時間や振幅の計測をした．微小電極は3M

筋緊張性ジストロフィー症にCa括抗剤（nifedipine30mg／day）を投与したところ，ミオ
トニーが改善したという報告が1987年Grantら
によって記載された1）・著者らは筋緊張性ジスト
ロフィー症患者に塩酸ニカルジピン（ベルジピン）
20mgを1日3回投与したところgripmyotonia
が改善し，日常生活動作で手指の運動が楽になり，のKCl溶液を満たしたガラス管微小電極を自作して用いた．筋標本はTyrode溶液中に常時95％02と5％C02の混合ガスを通じることによって酸素化した．

今までできなかったビンのふたを開けることが可能になった症例を経験した．Ca括抗剤が何故ミオトニーに有効であるかは未だ明らかでない．そこでミオトニーに対する本剤の作用機序を明らかにするためmdxマウスにみられるミオトニー2）

結に対して本剤を用いて筋細胞内記録を行って検討した・又哺乳動物の骨格筋に対するCa括抗剤の効果について，ラットの横隔膜一神経標本を用いてmdxマウスの横隔膜標本に微小電極を刺入する時や細胞内から微小電極が細胞外に出る時の機械的刺激によって生後4日以後どの日齢のmdx
マウスでもmyotonicburstが認められる．図1

神経刺激の閥値，筋活動電位の立ち上がり時間と振幅，静止膜電位に対する作用を検討し，Ca括抗剤にはNachannelのpartialblockerとしての作用が神経及び筋細胞膜に対してあることを明らかにした・そしてCa括抗剤のミオトニーに対する阻止作用は，Na channelに対するpartial

果（1）mdxマウスのミオトニーに対するC。括抗剤の効果は36日齢のmdxマウスにnicardipineを10−7
M／Lの濃度でTyrode溶液に用いると，この濃度

blockerとしての作用が関与していることを明らかにしたので報告する．

ではミオトニーを阻止できないが，10−6M／Lの濃度になるとミオトニーの発火を減少させることを示す・2×10−5M／Lの濃度に増加させると微小電

対象と方法

極刺入時にも・微小電極抜去時にもmyotonic
burstを阻止できる（図2）．

対象としては生後4日−65日のmdxマウスとウィスター系ラットを用いた．Ca括抗剤として別のCa括抗剤verapamilを用いると，図3の上図2つのようにTyrode溶液中でみられたはnicardipineとverapami1を用い，10−6−10−4

insertionmyotoniaが2×10−5M／LのVerapami1

M／Lの種々の濃度でTyrode溶液中に加えて，＊東邦大学医学部第四内科

によって阻止され，微小電極が細胞内から外へ出る際にも発火は起こらない．
静止膜電位は表1の様に65日齢のmdxマウ
ー247−

nicardipi11e

Ca antagonisHnicardipine〉

2xlO￣5M／L

mdx mousei48daYS）

mdx mouse136days）

eJectrodeinsertion

1xlO￣7M／L

1xlr6呵／L樗璽

eIectrode withdrawaJ

．10mV
50nlS

図136日齢のmdxマウスの横隔膜標本を用い・微小電極が筋細胞内へ入る時に生じるミオト
ニー放電を，Ca桔抗剤（ニカルジピン）が阻止できるか否かを検索した．1×10￣TM／Lの濃度
でTyrode溶液にニカルジピンを加えても，ミオトニーは抑制されない（上図）．
1×10−6M／Lの濃度になると，下図のようにミオトニーを抑制する作用が出てくるが，完全には阻止しない．

」10汀Ⅳ
10ms
図2 mdxマウスの横隔膜標本．
ニカルジピンを2×10−5M／LでTyrode溶液中に加えると，上図のように微小電極の挿入時にも，ミオトニー放電は抑制され，下図のように微小電極を細胞内から外へ抜去する時の機械的刺激によっても，一つの活動電位が見られた他は，連続する発火は抑制される．

スでTyrode溶液中では，76．0±7．03（S．D・）mVのものが，VeraPamilを10￣5〜10−4M／Lで加えてもー73．3〜76．1mVの範囲にあり，低下は認めら

次にラットの横隔膜標本の筋の静止膜電位を計れなかった．
（2）哺乳動物の骨格筋に対するCa桔抗剤の効
果測すると，Tyrode溶液では−87・6±2，18（S・D・）

ラットの横隔膜一神経標本に対するverapami1と−88．6±2．36mV（N＝30），VerapamillXlO￣4の作用について，まず横隔膜神経刺激の問値をみ

M／Lを加えると．86・3±2・61mV（N＝30）と変化は認められなかった．

るとTyrode溶液中では0・02msec，1・4Vであったものが，2×10r5M／LのVerapamilを加える

mv（N＝40），Verapami12×10r5M／Lを加えると間借が0．02msec，2．5Vに増し，1×10．4M／L

筋活動電位の立ち上がりは骨格筋ではNacon−
ductanceの急激な増加によって生じるが，のVerapamilでは閥値が更に上昇して0・02msec，
4．4Vになった．

Tyrode溶液中では0・98±0・068msecであるが，2×10−5M／LのVerapamilを加えると1・19±

ー248−

表1mdxマウスの静止膜電位は，ベラパミルを1×10．5−1×10￣4M／Lの濃度でTyrode溶液に加えても有意な変化は見られない．
mdxmouse（65日齢）の膜電位（RMP）
S o lut io n s

RM P （m e a n 土S ．
D こ）
−7 6 ．
0 ±7 ．
03 m vT y ro d e S
S o h」
t io n（N ＝4 0 ）V e ra p a m il
1 ×10 −
5M ／L
in T y rod e i S o Iu tio n
V e ra p a m il
2 ×10 ■
5 M ／Lin T y ro d e s s o lu t io n
V e ra p a m H
5 ×10 ▼
5M ／L
in T yr od e s S o rut io n

−7 4 ．
1 ±8 ．
38 m v（N ＝4 0 ）−7 5 ．
3 ±8 ．
28 m v（N ＝4 0 ）− 76 ．
1 ±6 ．
46 m v（N ＝4 0 ）＿＿梅rapami葦2㍍0−5M／L
V e ra P a m il
1 ×1 0￣
4 M ／Lin T y ro d e s S o Iu t io n＿＿＿＿」10rnV

lOOmsec−7 3 ．
25 ± 6 ．
42 m v（N ＝4 0 ）0・14msecに延長し，1×10L4M／Lのverapamilを加えると更に1．34±0．28msecに延長した．代
表的な図を速い掃引速度で示したのが図4である．
筋活動電位の振幅もverapami1によって20mV以上低下させる作用か認められた．
考察

mdxマウスのミオトニーはNachannelbl。Ck−er（tetrodotoxin）で阻止されるが，低Ca溶液では阻止されないことからmyotonicburstの筋活
動電位の発火はNachannelを介することを著者
らが昨年報告した．今回Ca桔抗剤を用いたところnicardipineでもverapami1でもmdxマウスのミオトニーを阻止することができ．膜電位には影響を与えないことが示された．Ca桔抗剤はラットの横隔膜一神経標本を用いた哺乳動物の末梢神経と骨格筋に対しては，末梢神経の刺激問値を上昇させ，又筋活動電位の立ち上がり時間を遅延させ，活動電位の振幅も低下させる作用のあることが今回の一連の実験で示された．これらはCa
括抗剤が上記の興奮膜に対して抑制的に働いてい

20mSeC

図3 mdxマウスの横隔膜標本．
上二つの図は，Tyrode溶液中では微小電極が筋細胞内へ入る時に，ミオトニー放電が認められることを示す．下図はベラパミルを2×10−5
M／Lの濃度でTyrode溶液に加えると，微小電極が筋細胞内から外へ抜去される時（矢印）に，
ミオトニー放電が抑制されることを示す．
ることを示すものであり，完全には興奮を阻止しないが，2×10￣SM／Lや1×10−4M／Lの濃度ではNachannelのpartialblockerとして作用している．
Ca括抗剤は何故ミオトニーを阻止する効果がヒトの筋緊張性ジストロフィー症で認められるかについてはGrantらは今のところ不明であるが，仮説として1）筋細胞膜のCa輸送を抑制すること，2）T−tubulesからSRJunctionの刺激伝達を抑制することのどれかではないかと推論している．著者は今回の筋細胞内記録により，Ca桔抗剤−249−

みている．両筋共に睦電位は低下させないが筋活

Action Potential

動電位の持続を延長させると報告している．筋活
動電位の立ち上がりは0．69から0．81msecに延長したり，0．87から1．09msecに延長しているが，統計的には有意ではなかったと報告している・
その他VanDerKlootら4）や，Bondiら5）はカエルの骨格筋でverapami1は膜電位を下げずに膜の興奮性を低下させ，Na＋とK＋の透過性を下げていると述べている．これは筋活動電位の上行脚も，下行脚も両方遅くなることからNachannelとK
channelの両方がCa桔抗剤によって阻止されていると考えたのである．このようにカエル及び哺乳動物の骨格筋に対してはCa桔抗剤が純粋にCachannelだけでなくNachannelやKchannelに対しても阻止的に働くという文献は散見され，著者らの実験とも合致する．
テトロドトキシンはミオトニーを阻止するが治療薬としては用いることができない．しかしCa
桔抗剤は副作用も少なく抗ミオトニー剤の1つとしてヒトのミオトニー疾患に用い得る可能性があり，今回その作用機序としてはCa括抗剤のもつ筋細胞膜に対するNachannelのpartialblocker
としての働きが関与していることを明らかにした．

二二 」 −OmV
結語

図4 ラットの横隔膜一神経標本．
横隔膜神経を刺激して速い掃引速度で筋活動電位の立ち上がりを筋細胞内記録でみる．最上図の対照に比して，ベラパミルを2×10￣5M／L，

1）nicardipineとverapamilは，mdxマウスの1×10r4M／Lの濃度でTyrode溶液に加えると
筋活動電位の立ち上がり時間が遅くなり，振幅も低下することを示す．

立ち上がり時間を遅延し，振幅も低下させる作

ミオトニーを阻止する効果が認められる．
2）Ca桔抗剤は哺乳動物の神経筋標本に対しては，神経刺激の閥値を上昇させ，筋活動電位の用がある．これは興奮膜に対するNa channelのpartialblockerとして働いていることを示す．

が微小電極刺入時に起こる筋活動電位の連続発火を阻止していることから，Ca桔抗剤は筋細胞膜の3）mdxマウスのミオトニーを阻止する作用もレベルでNa channelのpartialblockerとしてCa括抗剤が筋細胞膜にけおるNa channelの働くことによってミオトニー放電を阻止している

partialblockerとして働いているためと考え
られる．

と考える．
哺乳動物の骨格筋に対するCa桔抗剤の作用に文関する論文は心筋に対する効果の論文ほど多くは献ないが，1979年にSkirbollら3）はネコの排腹筋と1）Grant R and Weir AI：Severe myGtOnia

ヒラメ筋を用いてverapamilを動注して効果を

relieved by nifedipine．Ann Neuro122：395，

ー250−

4）VanDerKlootWandKitaH：Theeffectsof2）栗原照幸‥微小電極法によるmdxmouseのミオ
トニーに関する研究・東邦医会誌34‥503−507，
1988．

the

calcium−antagOnistHverapamilonmuscle

actionpotentialsinthefrogandcrayfishandOnneurOmuSCulartransmissioninthecrayfish．

3）SkirbollLR，HowardRAandDretchenKL：CompBiochemPhysio150C：121−125，1973．

Theeffectofverapamilonthegastrocnemius5）BondiAY：Effectsofverapamilonexcitation

andsoleusmusclesofthecatinvivo・European−COntraCtioncouplinginfrogsartoriusmuscle．

JPharmaco160：15−21，1979．

JPharmacoIExpTher205：49−57，1978．

−251−46）mdxマウス骨格筋内のCa2＋濃度
吉

田

研究協力者

瑞

子＊

菊

池 建 機＊

ながら，37℃で25分間浮置した・他肢を自己発光測定に用いた．fura−2rAMを負荷した場合と同様に，負荷溶液からfura−2−AMを除いた溶液中で浮置した．
furar2を負荷した筋束あるいは自己発光測定

Duchenne型筋ジストロフィー症（DMD）は，
膜異常のために細胞外から細胞内にCa2十が流入
し，細胞内のCa2＋濃度が高くなり，筋細胞が壊死に陥るといわれてきた．実際表面膜に存在するジストロフィンの欠損による膜異常であることが最近明らかになったl）．
そこで我々は筋ジストロフィー症のモデルマウ

用の筋束は，0．1mmの厚さの培養用カバーグラ
スの上にシリコン製の梱（フレキシムパーム）■をス（mdx）の骨格筋内のCa2十濃度を測定することを試みた．
試料および方法
3週齢と16週齢のmdxマウスとその対照のBlOマウスを用いた．共に雄で，各ケースで4匹ずつ検索した．骨格筋は，長指伸筋を腱から腱まで取り出し，緩衝液中でできる限り結合組織を除去した．緩衝溶液の組成は，118．4mMNaCl，4・7mMKCl，2．52mMCaC12，25・01mMNaCO3，
1．18mMKH2PO4，1．18mMMgSO4，11・OmM
glucose（pH7．4）を用いた．
細胞内のCa2十の検出は螢光プローブfurar2を用いた．DMSOに溶解した1mM−fura−2−AMと25％−pluronicF−127を，上記緩衝液に加え，最終
濃度10〃Mと0．08％とし，fura−2負荷溶液とした．
この負荷溶液に1肢の長指伸筋を入れ，02：
CO2＝95：5の混合ガスを吹き込みながら，10℃
で1時間45分浮置した．次に細胞外に付着しているfura−2−AMとpluronicF−127を除去し，細胞

接着し，その中に置いた．筋束は直接カバーグラ
スに接着し，両端の腱を両面テープで押さえた・
緩衝液を溝し，螢光測定のため螢光顕微鏡下に置いた．螢光測定中は，酸素一炭酸ガスの混合ガスを吹き込んだ緩衝液を環流した．測定時の試料の温度は，25℃とした．
細胞内Ca2＋濃度測定は，Xe光源付倒立型螢光
顕微鏡を用い，340と360nmの励起波長で照射した．筋束からの螢光像（510mm）を超高感度カメラ（SIT：浜松ホトニクス）で撮影，その像をモニ
ターテレビ（PVM−1371Q，ソニー）で観察しながらビデオテープ（U・マナック用KSP，ソニー）にとり，画像解析装置（アルガス100，浜松ホトニクス）で解析した．励起光量は極少量にし，SITカ
メラの感度を最高にして測定した．
画像解析でCa2十濃度を擬似カラーで表現するための標準化は，EGTAを用いたCa2＋緩衝液2）で行った（25℃，pH7．00）．
螢光プローブによる実測光量から自己発光光量を差引いて細胞内Ca2十濃度を算出した・
結果と考察内に入ったfura−2−AMをエステラーゼで分解するために，緩衝溶液中に入れ混合ガスを吹き込み＊国立精神・神経センター神経研究所

3週齢のmdxマウスの長指伸筋内のCa2＋濃度は，80〜100nM・を示す線経と200nMを示す線経が存在した．16週齢の筋線経は80〜100nMを示−252−

し，スポット的に200nMを示す部位があった．
BlOマウスの長指伸筋内のCa2＋濃度は，3週
齢，16週齢ともに80−100nMを示した．
mdx，BlOマウスの各週齢で，わずか4匹ずつの検索のため，静止状態の骨格筋内Ca2＋濃度の結論は出せない．しかし正常マウスの骨格筋内のCa2＋濃度は，昨年の結果も合わせて，100nM以下であることは確かであり，他の方法で測定された結果と一致する．

にしなければならない．

文

献1）Zubrzycka−Gaarn Elizabeth E et al：The Du−
Chenne muscular dystrophy gene productis
localizedinSarcolemma of human skeletal

muscle．Nature333：466−469，1988．
ArahataKet

al＝Immunostaining

ofskeletaland cardiac muscle surface membranewith

最近，mdxマウスと正常マウスの屈筋線稚内に，fura−2を注入して，筋細胞内のCa2＋濃度を測定した結果が報告されが）．その結果はmdxマウ2）HoriuchiK：Somepropertiesofthecontractile

スのCa2＋濃度は92nMで，正常マウスの約2．3

SyStemandsarcoplasmicreticulumofskinned

倍であった・mdxマウスの筋細胞内Ca2十濃度が，中骨マウスに比較して高いとはいえ，我々の結果と同様に現在いわれている生理的Ca2＋濃度である．
細胞内の生理的Ca2＋濃度の範囲内で，mdxマ
ウスと正常マウス骨格筋内Ca2＋濃度の違いが，細胞壊死にどのように関与しているか，今後明らかー253−

antibodyagainstDuchennemusculardystrophy
peptide．Nature333：861−863，1988．

Slow fibres from Xenopus muscle．J Physio1
373：1−23，1986．
3）TurnerPRetal：Increasedproteindegradation
resultsfromelevatedfreecalciumlevelsfoundin muscle from mdx
735−738，1988．

mice．Nature

335：47）ジストロフィー筋の細胞内膜系と収縮
吉 岡 利 息＊・

研究協力者

緒

田 中

竹

倉

宏

明＊＊

で前固定し，2％オスミウム酸で後固定，その後脱言

再生筋が多数を占めている週齢のmdxマウス
であっても，その下肢骨格筋細胞の形質中やミトコンドリアに高濃度のカルシウムイオンが電子線
プローブ微量元素分析法によって測定された8）．
筋中蛋白分解酵素（CANP，CDP）は，細胞内の高濃度カルシウムイオンによって賦活されるが，これまでの実験で用いた週齢マウス骨格筋では収縮蛋白系の崩壊像は少ない．また張力発揮についても対照群とほぼ同じ傾向が示されたが，刺激頻度による結果では速筋から遅筋への性質移行も示
唆された8）．細胞内高カルシウムの原因が，筋鞘を介する細胞外からの流入によるものかあるいは細胞内貯蔵部位からのカルシウム放出によるものか不明である3）．
最近の知見によると5），横行小菅系に存在する
ryanodinereceptorはカルシウム遊維機構に影響を持つとされ，横行小菅系および筋小胞体の終槽，
および両者間に存在する連結構造などの形態学的知見を重要視し，収縮様式との関連性について研
究した．
実験方法
当研究室で繁殖し，飼育している筋ジストロフィーモデル動物であるmdxマウスとそのコントロールのヒラメ筋（SOL）および長址伸筋（EDL）
を用いた．生後4日，2週齢および4週齢の片側摘
出筋から収縮様式の特徴を記録し，他側は4℃の2．5％グルタールアルデヒド0．1Mリン酸緩衝液＊聖マリアンナ医科大学第二生理学教室＊＊鹿屋体育大学体力科学講座

みどり＊

水，包埋，薄切が施された．電子顕微鏡像は直接
倍率5，000，10，000，および20，000倍で撮影し，3．3倍のプリントを得た．細胞内小器官の容積はweibelによって提唱された pointcounting法7）によって分析され，横行小菅と筋小胞体の終槽の間に存在するfeetあるいはjunctionalgapの幅は0．1mm精度のルーペを用い測定した．この場合，feet構造が明瞭なものをランダムに選出して行った．この計測は2万倍の像から3．3倍のプリン
ト写真を用いて行われた．
結果

Stereologicalに計測された筋線維1本当りの細胞内小器官の容積変動は表1に示されており，
生後4日目のSOLおよびEDLの筋小胞体（SR）
においてmdxおよびcontrolとも2．5−2・9％に減少したが，EDLでは変動が小さかった．mdxマウスのミトコンドリア（MIT），および筋原線維（MYO）の容積は，横行小菅（T−T）を除いて同様に変動が無かった．これまでに多くの報告があるように4），一般に細胞内膜系は対照，mdxともに若い週齢で筋線経に占める比率が高く，幼君なものでは粗面筋小胞体および豊富なリポゾーム顆粒
が認められた．またサテライト細胞の散在も観察された．
図1にはmdxマウス生後2週目のSOLおよびEDLの筋鞘の電子顕微鏡像が示されている．
広義的に筋草創ま形質瞑，基底膜，グリコカリック
ス層（糖皮）を含むが，細胞膜の微細構造は壊死
線経を除いて対照と変わらず，筋鞘下には多くの小胞が存在し，かつ多量のグリコーゲン頼粒が筋−254−

表1mdxおよび対照マウス骨格筋細胞の細胞内小器官の筋線経に占める比率
VoIume Fraclion or CellElementin mdx and controIMouse SkeIetalMuscle
mdx

4d
MnlO

SOL
EDL

T

T

soL

R

soL

10

O．6土0．4

2w＋

COntrO）

10土2

5

8士2

8±3
7

mdx

4w

COntrO1

7

±5

8±4

6土2

6士4

土3

0．5±0．2

0．4土0．1

0．2土0．2

0．3±0．2

0．6±0．4

0．5±0．3

0．4±0．2

0．4 ＋ 0．2

0．4 ＋ 0．1

4．2土0．3

4．7 ± 0．4

2．7±1．0

2．5＋0．7

2．8±0．2

2．9 ± 0．5

5．1±0．2

4．5±0．3

4．8土0．9

4．7±0．3

4．5土0．6

81±ll

78±11

79土13

80土

8

79土

80＋13

78土14

75土

9

82！13
75 ＋1180 王 974 ＋ ‖

EDL

MYO

mdx

15◆7

9土3

EDL O．6

S

COntrOl

12±6

soL

4．6

EDL

±0．5

6

土0．1

0．2

±0．1

ResuItsareexpressedasMean±SD（％）andoblainedbythemethodof・・pointcounting

B

．

l
脈i妄t

O．5トIm

図12週齢mdxマウス骨格筋形質膜
A：ひらめ筋，B：長址伸鼠 sl：筋鞘，mit：ミトコンドリア，Z：Z一帯

原線稚内に認められ，活動性の高い細胞の様子が
図2には4白目の対照マウス（A，C）および
示されている．生後4日臥 4週目の試料も同様 mdxマウス（B，D）のSOLおよびEDLから得の像が示されるが，mdxでは筋原線経の直径が縮 られた三連構造（triads）が示されている．成熟骨
小する傾向にあった．

格筋のtriadsと異なる微細構造は認められない．
−255−

図2 4日齢マウス骨格筋細胞の三連構造（Triads）・
A：対照ひらめ筋，B：mdxひらめ筋，
C：対照長址伸筋，D：mdx長址伸筋．

筋小胞体および横行小菅の間にあるfeet構造も明瞭であった．Feet部位が興奮収縮連関のプロセスの一部であるとすれば，筋収縮機構は既に完成されている．Feet構造の幅，すなわちjunctionalの有意な増加がみられ，週齢が経過するに従いそ

gapの幅を測定した結果，mdxマウスの4日齢，
2週齢および4週齢は対照群に比較して7−27％

ろ30±5nm（mean±S．D．，n＝151）であり，この特徴が明らかになった（表2）．全ての試料は同じ緩衝液が用いられその浸透圧も規定されている．
一部対照マウス筋の横行小菅の径を測定したとこの値は多くの報告と一致することから，mdxでのjunctionalgapの幅の拡大は特徴的な結果であった．

表2

mdxおよび対照マウス骨格筋細胞三連構造のjunctionalgap幅．

考

mdx and conlrOl mouse skeletal muscle
（mean

三

察

得られた結果の最も特徴的なことは，mdxマウ

The width oflhe．junc【ional gapin
SD，nm）

ス骨格筋細胞のtriadsにおいてjunctionalgap
幅が拡大していることと，それが週齢の経過する

mdx

15

±

3．2

（81）
19

±

6．5

（99）
19

±

5．5

（95）

contrOl

14

±

2．1

（152）
16 ± 3．1（113）
15 土 2．6（163）

に従い増大することである．2週齢のmdxマウス
骨格筋では壊死線経が混在しているが，表2に示されている結果はその中でもintactな線経から得られたものである．細胞膜の脱分極は横行小菅を介して筋小胞体に伝えられるが，その機構について多くの議論があり，いずれも仮説の域を出な
い．

−256−

最近，junctional gapのfeet構造物が文

ryanodinereceptorであるという報告がなされ5），
それがカルシウム放出の際に重要な受容器蛋白で

1）ArahataK，IshiuraS，IshiguroT，Tsukahara
T，SuharaY，EguchiC，IshiharaT，NonakaI，あるとしている．mdxマウスの筋収縮張力の低下はほとんど認められないので，果してgapの幅の拡大がどの程度興奮収縮連関に係わりがあるかどうか不明である．しかしながら筋形質中やミトコ
ンドリアのカルシウムイオン含有量が上昇しているというこれまでの報告8）から，gapの拡大はカル

Ozawa E and Sugita H：Immunostaining ofSkeletalandcardiacmusclesurfacemembrane
WithantibodyagainstDuchennemusculardys−
trophypeptide・Nature333‥861L863，1988．

2）HoffmanEP，BrownJrRHandKunkelLM＝Dystrophin；The proteinproduct ofthe Du−

シウムイオンの調節機構に対してなんらかの影響を与えているように考えられる．Duchenne型筋
ジストロフィー（DMD）では，その筋形質膜に

Chennemusculardystrophylocus．Cel151：919−928，1987．

3）Turner P R，Westwood T，Regen C M anddystrophinの欠落を伴い1）・2），Orthogonal array
Submitparticleも減少しており6），横行小菅が筋
鞘から湾入する小器官とすれば，mdxでそのtriadsに形態的異常を認めても不思議ではない．
筋鞘の微細構造からは異常所見は得られなかったが，Turnerら3）の報告によると細胞内カルシウム
イオン濃度の上昇は形質膜を介して行われているという・結論として横行小菅系の微細構造的変化
がトリガーとなり細胞内へのカルシウムイオン流入を増加させ，その結果カルシウム依存性プロテ

献SteinhardtRA＝Increasedproteindegradation

results from elevated free caluciumlevels

foundinmusclefrommdxmice．Nature335：735−738，1988．

4）SchneiderMFandChandlerWK：Voltage
dependentchargemovementinskeletalmuscle；
a possible stepin excitation−COntraCtion cou−pling・Nature242‥244L246，1973．

5）SmithJS，ImagawaT，MaJ，FillM，Campbell
KPandCoronadoR‥Purifiedryanodinerece−

アーゼ活性の上昇をきたし，筋収縮蛋白やその他の細胞内小器官の崩壊を助長するものと考えられpterfromrabbitskeletalmuscleisthecalcium

る・静止状態のmdx骨格筋細胞の筋小月包体に貯蔵しているカルシウムイオン濃度を測定できれば，この仮説をより強くサポートするものとなろう．

GenPhysio192：1L26，1988．

Lreleasechannelofsarcoplasmicreticulum．J6）若山吉弘，泣谷誠二：mdxマウス長址伸筋細胞膜のFreeze−Fracture法による微細構造変化について． 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジ

結語

ストロフィー症および関連疾患の病態とその病

mdxマウスの各日齢のヒラメ筋および長址伸筋を用いその収縮様式と微細構造について報告した・収縮様式，張力は対照群と類似していた．筋
形質膜の微細構造についても同様であった．筋小胞体の細胞に占める率は幼君なもので4．2−5．1％であり，緩筋，速筋の性質が分化するに従いそ

因に関する研究（杉田班）昭和63年度抄録集

1988，p41．

7）Weibel E R：A stereological method for
estimatingvolumeandsurfaceofsarcoplasmic

reticulum．JMicroc（Oxf）95：229L242，1972．
8）吉岡利忠，玉木哲朗，竹倉宏明：ジストロフィーの特徴を示すようになった．横行小菅および筋小胞体問に存在するjunctionalgapの幅がmdxマ

筋の収縮特性と細胞内小器官の元素分析． 厚生

ウスで拡大する傾向にあり，ryanOdinereceptorとの関連性および細胞内カルシウムイオン濃度の上昇について論じた．

ー症および関連疾患の病態とその病因に関するー257−

省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジストロフィ
研究 （杉田班）昭和62年度研究報告書1988，
pp219−222．

48）mdxマウスの筋小胞体（SR）
高 木 昭 夫＊・＊＊

研究協力者

小

島

進＊＊ 井 田 雅 祥＊＊

荒

木

誠＊

最近の知見によるとDuchenne型筋ジストロフ
ィー（DMD）の欠損蛋白質，dystrophinは主として筋表面膜に分布しており，筋小胞体（SR）とは無関係とされた1）．従来よりDMDのSRには種々の異常が指摘された2）．我々はDMDのSR・Ca−
ATPase蛋白の減少やCaffeine拘錆の克進を報告した2）−3）．今回mdxマウスを使用して，この間題を再検討した．またdystrophinの生理的機能解析を目的として，1−2の実験を追加した．
方法

生後8−20週のmdxマウス（C57BL／10ScSn−mdx）および対照（C57BL／10ScSn）の長址伸筋を使用した．凍結切片を使用して通常の組織化学と免疫組織化学染色を行った．グリセリン筋から蛋白溶解液中でホモジュネートを作製し，その上活（3000×G，20分）のSDSゲル電気泳動を行った．Immunoblotは既報のように行った3）．使用した抗体は抗ヒトSR・Ca−ATPase抗体あるいは抗ラットheavySR（HSR）抗体である3）・7）．染色にはVectastainキットを使用した．筋線経の収縮力，SRのCa摂取あるいはCa遊離はスキンドフ
ァイバー法により分析した4）．筋節長はヘリウムレーザービームの回折より計算した．
結果1）免疫組織化学およびimmunoblot
抗SR・Ca−ATPase蛋白抗体を使用して，免疫＊沖中記念成人病研究所＊＊虎の門病院神経内科

紫

芝

良

昌＊

組織化学を行った．対照ではtype2線推がより濃染した．mdxではやはりtype2線維がより強く染色された．しかし対照に比してmdxの染色性は減弱していた（図1）．MyosinATPase（pHlO．4）染色との比較を行った．対照およびmdxのいずれでもtypelとtype2線経はよく分別される．ただ同一条件の染色にもかかわらず，硫化コ
バルト沈澱は示dxより対照で強い（図2）．すな
わちmyosinATPase活性はmdxで減弱している可能性がある．
グ1）セリン筋のimmunoblotを対照とmdxの問で比較した．染色は抗HSR抗体によった（図3）．両者において100Kダルトン（Ca−ATPase），60K（Calsequestrin），50K（Carbindingprotein）が認められた．他に38K，34K，
31K，28K，21．5Kのバンドが染色された．この
うち34K，31K，21．5KはCa−ATPaseの分解産物と推定された．抗HSR抗体を使用した染色では対照とmdxの間に差異は観察されなかった．
2）スキンドファイバーa）収縮系：外液のCaイオン濃度を3×10rSM
以上に上昇させて，最大収縮力（Po）を測定した．mdxは0．92±0．27（n＝8，平均±S．D．，Kg／戯），対照は0．81±0．41（n＝8）で差をみとめな
い．Srイオンによる活性化を検討すると，typelとtype 2の線経の中間的反応を呈するいわゆるtypeX線経は認められない．
b）筋小胞体のCa摂取能：SRがCaイオン最大
摂取後のCaffeine拘露の大きさをPoと比較して，Ca摂取指数を比較した．この指数はmdx
O．68±0．21（n＝15），対照0．67±0．20（n＝14）で

−258−

図1

抗ヒトSR・Ca．ATPase蛋白抗体による免疫組織化学．対照（C）およびmdx（X）の両者で，type2線維がより染色される．mdxでは対照より染色性が低下している．

図2

MyosinATPase（pHlO，4）染色．対照（C）およびmdx（Ⅹ）の両者で，type2
線経が濃染，typelは淡染される．mdxの染色性は対照より弱い．

−259−

ご蔓…三 …亨享云竃
EGTA（mM）

0

●

1r

O
O

●

○

●●

0

7●

○

mdx control

図4

種々の濃度のEGTA溶液中でのCaffeine拘縮．Caffeineにより張力発生が観察されるEGTAの最高濃度をプロットした．この濃度はmdxと対照（control）の問で有意差をみとめなしヽ

図3

抗ラットHSR抗体によるimmunoblot．対照（C）およびmdxの筋ホモジェネートを10％
SDS・PAGEで分画した．右側の（数字）は分
子量マーカー．100K付近のバンドはCa−
ATPase，60K：calsequestrin，50K（faintband）：Ca−binding蛋白．他のminor bandsは分解産物あるいは未同定．

あった．両者間に有意差をみとめない．SRのCa
摂取は別の方法でも評価した．SRにCaイオンを負荷後EGTA濃度の異なる溶液中でCaffeine拘縞を発生させた．張力発生をみるEGTAの最大濃度を比較した（図4）．mdxは0．66±0．36mM（n＝7）対照は0．85±0．49mM（n＝6）であり，両者間に有意差をみとめない．
C）Caffeine拘縮（図5）：SRに一定条件下でCaを負荷後，Caffeine拘縮の濃度・作用曲線を比較した．mdxではより低濃度のCaffeineにより筋拘縞が開始した．1mMCaffeineによる拘縞の大きさはmdxO．43±0．39（arbitoryunit，n＝6），対照0．03±0．06（n＝6）であり，mdxが有意に大きい．このようにmdxでCaffeine拘綿の克進をみとめた．
3）伸展による筋機能変化
単一筋線経を弛緩溶液中で伸展し，発生する静止張力と筋節長の関係を検討した（図6）．筋節長
3．0〃m付近で張力の発生が始まり，43〃mまで，ほぼ直線的に張力は増加した．この関係はmdxと対照の間で差を呈きない．
SRのCa摂取能を筋節長2FLmと4FLmの状態で比較した．対照筋では4／Jmの筋節長では2
FEmの時の平均86％（n＝3）に減少した．mdxではやはり平均91％（n＝3）に減少し，両者間に差をみとめなかった．

−260−

mdxマウスの四肢筋においてもほぼ類似の異常を観察した．SR・Ca−ATPase抗体による染色

1．0

2．5

性の低下，Caffeine拘絹の異常元進などである．
ただ，typeX線経はmdxマウスにおいては観察されなかった．またSDSゲル電気泳動によるim−
munoblotでは，mdxマウスにおいても，対照とほぼ同様にCa−ATPase蛋白，Calsequestrinある
いはCa結合蛋白が検出され，定性的異常は観察されなかった．MyosinATPaseの組織化学では，
mdxマウスで全体的な染色性の低下傾向をみと

5．O mM

図5 Caffeine拘縞の濃度・作用曲線．横軸：Caf−feine濃度．縦軸：Caffeine拘縞のpeak tenTsion（30mM Caffeineの張力に対する比率）．
mdxは0．5mMで拘縞が開始し，1．OmMの拘絹は対照より有意に大きい．

めた．このようにmdxマウスの筋肉では，SRのみならず収縮系に関しても，対照との間に差がみられ，ジストロフィー筋の特徴の1つと考えられた．mdxマウスでは中心核が多数観察されるように，分化や成熟の停止の可能性が推定される．これが，dystrophin欠損とどのように関連するかは
興味ある問題である．Caffeine拘縮克進の機序に関しても，類似の問題が考慮される．即ちSRの分化停止に由来するのか，あるいは膜変性に基づくのかの問題である．mdxマウスにおいてもDMDと同じように筋の興奮と収縮の基本的プロセスには異常は指摘できない．両者の骨格筋にはdystrophin欠損が共通して存在することは指摘

2・5

3．0

3．5

4．04．3 叩

図6 単一筋線経を伸展した際の静止張力．横軸：筋節昆 縦軸：静止時張力の大きさ（その筋線経の最大収縮力Poに対する比として表現）．mdxと対照間に有意差をみとめない．

考案

昨年度の報告において，Duchenne型筋ジスト
ロフィー（DMD）の生検筋でSR・Ca−ATPase蛋されているところである5）．Dystrophinは細胞骨格蛋白として，表面膜とZ帯のような内部構造との連結に関与するとの仮説もある6）．今回，我々は筋線経を過伸展した際の反応において，mdxマウスと対照間に差があるかどうかを検討した．筋節長を約2倍の4．3J mまで伸展した際の静止張力の大きさは両者で異ならないことが判明した．また過伸展した際のSRのCa摂取能を検討した．
対照においてはCa摂取能は若干低下したが，この現象はmdxにおいてもみとめられた．このようにdystrophinの生理的機能に関する手がかり
は現在まで得られず，今後の問題として残っている．

白の減少を報告した3）．既にDMDでtypex線維（トロポニンのCaやSrイオン感受性異常を呈する）の頻発やCaffeine拘縞の異常冗進を指摘した4）．後者はDMD患者が時として悪性高熱類似の麻酔作用を呈することと対応している．

ま

と

め

mdxマウスの骨格筋機能を筋小胞体中心に検討して，DMDの場合と比較した．免疫組織化学的に観察されるCa−ATPase蛋白の減少とCaf−−261−

feine拘縮元進は両者に共通した．TypeX線経は
mdxマウスには出現しない．筋小胞体にみられた異常は分化停止あるいは変性に由来する現象と推4）高木昭夫：skinnedfiber法による筋病態の研究．
新生理学大系（4）筋肉の生理学，医学書院1986，

定した．Dystrophin欠損の生理学的意義につき若干の考察を行った．

5）ArahataK．IshiuraS．IshiguroTetal：Im・

pp356−368．

munostaining ofskeletaland cardiac muscle
surface membrane with antibody against Du−

文

献Chenne muscular dystrophy peptide．Nature
333：861−863，1988．

1）Knudson CM，Hoffman EP，KahlSD et al：
Evidencefortheassociationofdystrophinwith

6）KoenigM，MonacoAPandKunkelLM：The

thetransversetubularsysteminskeletalmusT

completesequenceofdystrophinpredictsarod

cle．JBioIChem263：8480−8484，1988．

rshapedcytoskeletalprotein・Cel153：219−228，2）高木昭夫：T−SyStemとsarcoplasmic

1988．

7）DamianiE，MargrethA，FurlanAetal：Com−

reticulum．臨床科学24：95rlO3，1988．
3）高木昭夫，小島進，井田雅祥ほか：抗Capump蛋
白抗体による免疫組織化学， 厚生省「精神神経疾mon structural domainsin the sarcoplasmic

患研究委託費了（杉田班）昭和62年研究報告書

tubuleMgLATPase．J CellBiollO4：461−472，

1988，pp303−310．

1987．

−262−

reticulum Ca−ATPaseand the transverse

昭和63年度研究班名簿

昭和63年度 杉田班 名簿
区

分

班

氏

長

杉

所
名

田

秀

夫

事

荒

木

淑

郎

事

垂

井

清一 郎

寺

尾

寿

夫

〝

藤

猛

鈴

木

紘

一

宮

武

正

高

木

昭

夫

班

員

〝

〝

木

南

英

紀

順 天 堂大 学 医 学部 第一 生 化学 教 室

孝

彦

〝

鈴

木

義

之

〒 1 13
〝

田

過

等

JJ

埜

中

征

哉

J／

堀

眞一郎

〝

水

野

実

邦

桃

井

真里子

府 中 市 武蔵 台 2 − 6

自治 医科 大 学 神 経 内科

吉

岡

利

息

部

長

0 3 −8 2 3 − 2 10 1（
内 5 4 1 6）

教授

0 2 5 2 −2 3 − 6 16 1（
内 5180）主任研究員

0 3 −5 8 8 − 1 1 1 1教

授

0 3 −4 6 8 − 12 5 1教

授

0 3 − 8 13 − 3 1 1 1（
内 2016）（
内 2 3 15 ）（内 3 5 14 ）部

長

0 7 5 − 4 6 1− 5 1 2 1（
内 2 7 5 ，2 76 ）副 所 長

0 3 − 8 2 3 − 2 10 1

院

長

0 4 23 − 2 3 − 5 11 1部

長

0 4 23 − 4 1 − 2 7 1 1（
内 3 2 0 1）（
内 5 2 1 1）
副 参 事

0 4 2 3 −2 5 − 3 88 1

研 究 員

（
内 4 0 2 0）

助 教 授

0 2 8 5 −4 4 − 2 1 1 1（
内 3524）助 教 授

川 崎 市 宮 前 区菅 生 2 − 16 − 1

一265−

0 2 8 5 −4 4 − 2 1 1 1（
内 3448）

栃
3 3木
1 1県
−河内
1 郡南河内町薬師寺

聖 マ リア ンナ 医 科 大学 第二 生 理〒 2 13（内 3 3 22 ）

栃
3 3木
1 1県
−河内
1 郡 南 河 内 町薬 師 寺

自治 医科 大 学 小 児 科〒 329− 04

J／（内 15 62 ）小 平 市小 川東 町 4 − 1 − 1〒 329− 04

JJ

03 −8 1 3 − 3 11 1

府 中 市武 蔵 台 2 − 6 − 1

東 京 都神 経 科 学 総 合研 究 所 神 経生 化 学〒 18 3肋 教 授

文 京 区本 駒 込 3 − 18 − 2 2

国 立 精神 ・神 経 セ ン ター 神 経研 究 所〒 18 70 3 − 9 6 4 − 12 1 1

京都 市右 京 区喝 滝昔 戸 山

東 京都 立 神 経 病 院〒 18 30 6 − 4 5 1− 0 0 5 1

授教

文 京 区本 郷 2 − 1 − 1

東 京都 臨 床 医 学総 合研 究 所 臨床 遺 伝 学

0 9 6 − 3 44 − 2 1 1 1（
内 2 2 2 1 ，2 2 2 8 ）目黒 区大 橋 2 − 17 − 6

国 立療 養 所 宇 多 野病 院 臨 床 研究 部 神 経 内科
〒 6 16授

港 区 虎 ノ門 2 −2 −2

東 邦 大学 医 学 部大 橋 病 院 第 四 内科

田教

新 潟 市旭 町 通 1 番 町 7 5 7幸

0 4 2 3 −4 1− 2 7 1 1（
内 5 6 11 ）文 京 区本 駒 込 3 − 1 8 −2 2

照

君

授

文 京 区本 郷 2 − 1 − 1

原〒 1 13教

板橋 区加 賀 2 − 1 1 − 1

栗連 絡 の 際 の電 話（
内 5 1 11 ）大 阪市 福 島 区福 島 1 − 1 − 50

沖 中 記念 成 人病 研 究 所〒 15 3長

熊本 市 本 庄 1 − 1 − 1

新 潟大 学 脳 研神 経 内科

〒 10 5所

小 平 市 小 川 東町 4 − 1 − 1

東 京都 臨 床 医 学総 合 研 究所 遺 伝情 報

〒 951
〝

け る地 位

順 天堂 大 学 医学 部 脳 神 経 内科

〒 113
〝

地

帝 京大 学 医 学部 第一 内科

〒 113
JJ

所属 にお

大 阪大 学 医 学部 第 二 内科

〒 173
佐

在

名

熊 本大 学 医 学部 第 一 内科

〒 553
〝

設

国 立精 神 ・神 経 セ ン ター 神 経 研究 所

〒 860
幹

施

所

〒 187
監

属

教

授

0 4 4 − 9 77 −8 11 1（
内 3 40 8 ）

区

分

班

氏

月

富

所

名

田

瑞

子

〝

山

吉

弘

福

原

信

義

納

〝

小

川

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鹿 児 島大 学 医学 部 第 三 内科

高絡

名 古 屋 大 学 医学 部 第 二生 化 学

臣

JJ

後

藤

幾

生

〒 812
J／

深美子

東 京 医科 歯 科 大 学 難 治研 細 胞遺 伝

〝

清

水

輝

東 京 大学 医 学 書即還研 神 経 内科

〒 113

〒 113
〝

庄

司

進

一

〝

杉

村

公

也

〝

高

瀬

貞

夫

〝

正

治

金 沢 大学 医 学 部神 経 内科

〝

田

代

邦

雄

北 海 道大 学 医 学部 神 経 内科

〝

塚

越

廣

〝

中

西

孝

雄

〝

中

村

〝

宝

来

晴

〝

山

田

和

聴

国立 遺 伝 学研 究 所

廣052− 74 1− 2111（
内 2148）（
内 2031）
助 教 授

教

授

092−64 1− 115 1

助

手

03−813− 6111

講師

03−815− 5411（
内 2281）（
内 6132）（内 8763）
助 教 授

助

手

大分
1 −県大
1506分郡 狭 間 町 医大 が丘−266一052− 741−2 111（内 2297）

助 教 授

022− 274− 1111

教

授

0 762− 62≠8 151

教授

0 11− 716− 1161

（内 2323）（内 3950）（内 6027）
教

授

教

授

03− 813−6 111

0298− 53−3196

教授0859−3 3− 1111

助

手0559− 75− 0771（
内 3380）（直通 ）（内 2371）

三 島市 谷 田 111〒 879 −56

0 263 −35− 4600
（内 5321）米子 市 西 町 86

大 分 医 科大 学 生 理 学

0886−3 1− 3111（
内 3204）

つ くば市 天 王 台

鳥取 大 学 医 学部 脳 研神 経 病 理

〒 411

授

文 京 区湯 島 1 − 5 − 45

臣

〒 683

教

札 幌 市北 区 北 14 条 西 5 丁 目

筑 波大 学 臨 床 医学 系 神経 内科〒 3050992−64− 2211

金 沢 市宝 町 13− 1

東 京 医科 歯 科大 学 医 学部 神 経 内科
〒 113

授

仙 台 市星 陵 町 1 − 1

守

〒 060

教

名 古 屋市 昭 和 区鶴 舞 町 65

高

〒 920

（
内 553）

松 本 市旭 3 − 1 − 1

東 北大 学 医 学 部脳 研 神 経 内科
〒 980（
内 269）

文 京 区本 郷 7 − 3 − 1

名 古 屋大 学 医 学部 神 経 内科
〒 4660255− 34−3131

長

文 京 区湯 島 1 − 5 − 45

信 州 大学 医 学 部 第三 内科
〒 390

医

福 岡市東 区 馬出 3− 1− 1

藤夫

045− 971− 1151

徳 島市歳 本 町 3 丁 目斎

0423− 41−2711（
内 5 143）

名 古 屋 市 昭和 区 鶴 舞町 65

九州 大 学 医学 苦闘送研 神 経 内 科

連絡 の際 の 電 話

助 教 授

鹿 児 島市 宇宿 町 1208− 1

徳 島大 学 医学 部 第一 内科
〒 770

研 究 月

新
468−
潟 県1中 頸 城 郡 大 潟 町 犀 潟

弘

尚

け る地位

横 浜市 緑 区 藤 が丘 1 −30

光

〒 466
〝

所属にお

国 立療 養 所 犀 潟病 院 神 経 内科

〒 890
澤

名
地

小 平市 小 川 東町 4 − 1 − 1〒 949− 31〝

設在

昭 和 大学 藤 が丘 病 院 神 経 内科
〒 227

J／

施

国 立 精神 ・神 経 セ ン ター神 経 研 究 所
〒 187

若

属

所

（
内 568）
教授0975−49− 4411（
内 2640）

区

分

氏

所

名

所
二
旺

月

豊

島

至

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和

夫

徳 島大学 医学 部 第 一 内科

豊

倉

康

夫

東 京都 老 人 医 療 セ ン ター

宇尾野

公

義

安

部

和

子

所属にお

地

け る地 位師

0188− 34− 1111

名誉教授

0886−3 1−3111

院長

03 −964− 113 1

院

長

0 542 −45− 010 1（
内 2563）

板 橋 区栄 町 3 5− 2

静 岡市 城 東 町 24− 1

沖 中記 念成 人病 研 究所
〒 105

講

連 絡 の際 の 電 話

徳 島 市蔵 本 町 3 丁 目

国 立静 岡 病 院〒 420

事務 担 当者

名

秋 田市 本 道 1 − 1 − 1

好

〒 173
〝

設

在

三

〒 770
〝

施

秋 田大 学 医 学部 神 経 内科
〒 010

顧

属

港 区 虎 ノ門 2 − 2 − 2−267−

03− 588− 1111（
内 2 168）