DNA 採取キット Oragene・DISCOVER 使用方法（OGR-675:スポンジ付きタイプ）
はじめに
DNA 採取キット Oragene・DISCOVER は、唾液中の DNA を採取、保存するために開発された研究用試薬です。病気の診断や創薬を人に施すような目的での使用はできません。取り扱いには十分ご注意頂きますようお願い致します。
※商品に同梱されているすべての添付資料（安全データシート：SDS など)を確認の上、本製品をご利用ください。
※本書および SDS を常に一緒に保管してください。
SDS ダウンロード用 URL：https://www.kyodo-inc.co.jp/bio/nucleic_acid/sds.html※Oragene・DISCOVER は、採取前、採取後ともに室温(15～30℃)で管理、保存してください。

唾液の採取方法
・唾液を採取する 30 分前から飲食（ガム等含む）、歯磨き、うがい、喫煙等をしないで下さい。
・漏斗のフタについているプラスチックフィルムは剥がさないで下さい。
・Oragene 溶液が目や皮膚に付着した場合は、大量の水で洗い流してください。また飲み込んだりしないで下さい。
・使い終わった容器などは各自治体の規則に従い廃棄して下さい。
・小さいキャップ等はのどに詰まらせると窒息する危険性があります、十分にご注意下さい。

1. 頬の内側にスポンジを挿入します。歯茎と頬の内側に沿ってスポンジを優しく 30 秒間動かし、できるだけ多くの唾液をスポンジに吸収させて下さい。

2. スポンジに唾液が染み込んだら、漏斗の V ノッチ(V 字型の切れ込み)にスポンジを挿入します。
V ノッチに対してスポンジをねじったり、押し付けたりして、スポンジから唾液を絞り出します。
唾液はチューブの中に回収されます。

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ライフサイエンス部

神奈川県川崎市宮前区宮崎 2-10-9 TEL:044-853-2958

FAX:044-854-2958

URL:http://www.kyodo-inc.co.jp E-mail: life@kyodo-inc.co.jp Ver:PD-PR-006 Issue 12/2018-10p. 1

3. 唾液がチューブ側面の充填ライン（FILL TO と表示）に到達するまで、スポンジを使用して約0.75ml の唾液を採取チューブに注入します。唾液には泡が含まれるかもしれませんが、チューブの底を軽く叩いて泡を減らし、できるだけ泡のない状態で充填ラインまで唾液を採取してください。スポンジをドナーの口の中に挿入する前にスポンジ自体が破損していないか確認してください。破損している場合は 2 本目の新しいスポンジを使用してください。

4. チューブを片手で垂直に立てて、もう片方の手で漏斗のふたをカチッと音がするまで、しっかりと閉めます。ふたの中にある保存溶液のシールが破れ、保存溶液がチューブ内に流れ込み、唾液と混ざり合います。

5. 漏斗のふたが閉まっていることを再確認し、チューブを垂直に立てたまま、漏斗を外します。
外した漏斗は廃棄します。

6. キットに同梱されている小さいキャップでチューブにしっかりふたをします。

7. ふたをしたチューブを約 5 秒間よく撹拌します。使用したスポンジは廃棄してください。

唾液が Oragene・DISCOVER の保存溶液と混ざり合うと直ちに DNA は安定した状態になります。
この状態のまま室温（15～30℃）で数年間保存が可能です。
⾧期的に保存する場合は、-15℃～-20℃での凍結保存が可能です。
凍結保存について、詳細プロトコルは下記 DNAgenotek 社のウェブサイトをご参照下さい。
https://www.dnagenotek.com/ROW/pdf/PD-PR-012.pdf㈱協同インターナショナル〒216-0033

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DNA 精製方法

唾液サンプル(500µL)からの精製方法

以下は精製溶液(PT-L2P-5)を用いた DNA 精製用のマニュアルです。
Oragene・DISCOVER から DNA を精製する場合は P.3～5 を参照下さい。簡易マニュアルは P.6を参照下さい。
【必要な機器/試薬】
・唾液検体を採取した Oragene・DISCOVER(型番 OGR-600、OGR-675 等)
・prepIT・L2P(型番 PT-L2P-5)
・遠心分離器(15,000xg で運転可能なもの)
・ウォーター/エアーインキュベーター(50℃で運転可能なもの)
・1.5mL マイクロチューブ
・95～100%エタノール（室温）・70%エタノール（室温）・DNA 保存用 TE buffer(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH8.0)または類似 Buffer唾液サンプル(唾液と保存溶液の混合溶液)500µL からの精製方法

精製手順

備考

1. Oragene を数秒間静かに転倒撹拌させ、チューブ ・粘性の高い唾液と保存溶液を十分に混合す内のサンプルを混合します。

るためです。
・この加熱処理は、DNA を十分に抽出するために行われ、

2. サンプルを 50℃でウォーターバスでは最低 1 時間、 ヌクレアーゼを完全に不活性化させるために必ず行ってく
エアーインキュベーターでは最低 2 時間インキュベートします。
注意：ウォーターバスの場合、サンプルの入ったチューブが浮いてしまうのため、エアーインキュベーションを推奨します。ウォーターバスを使用する場合は、チューブが常に水に浸かっていることを確認して下さい。

ださい。
・この加熱処理は、どの段階(唾液採取後、精製直前)でも行うことが可能です。
・サンプルの均一性を保つため、チューブから唾液を分注する前に Oragene のチューブのまま加熱処理を行ってください。
・この加熱処理は、オーバーナイトで実施することも可能です。
・エアーインキュベーターでは、ウォーターバスよりも熱伝導性が低いため、より⾧めの加熱処理が必要です。

3. Oragene のチューブから 500µL のサンプルを ・残ったサンプルは、室温または凍結（-15℃1.5mL のマイクロチューブへ移します。

～-20℃）で保存することができます。

4. マイクロチューブに PT-L2P-5 を 20µL（サンプル ・不純物や阻害物質が沈殿し、サンプルが混容量の 1/25）添加し、数秒よく攪拌させます。
5. 氷上で 10 分間冷却させます。

濁することもあります。
・室温で処理することも可能ですが、氷上よりも不純物を取り除く効果が多少劣ります。
・より⾧い時間(最⾧ 15 分間まで)遠心させる

6. 室温で 5 分間、遠心分離( 15,000 x g)させます。

ことで、最終的な DNA 溶液の濁度(A320)を下げる可能性があります。

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7. 上澄みを新しいマイクロチューブに移します。不純物を含んだペレットは廃棄します。

・ペレットは不純物を含んでいます。誤って沈殿をかき乱してしまった場合は、もう一度遠心することを推奨します。
・エタノールを加えることで DNA が沈殿しま

8. 室温 95-100%エタノール 600µL を上澄み 500µL に添加します。静かに 10 回、転倒撹拌します。

す。サンプル中の DNA 量によっては DNA が沈殿物として確認できます。
・沈殿物が見えない場合も、以降の手順に従い DNA を回収してください。

9. サンプルを室温で 10 分間静置し、DNA を沈殿させ ・不純物と DNA が共に沈殿するため、-20℃ます。

で冷却しないで下さい。
・チューブのキャップのヒンジ部がローター

10. 室温で 2 分間、遠心分離(15,000 x g)させます。の中心に対して逆方向となるよう配置します。遠心分離させた際に DNA 沈殿物がヒンジ部の下に沈殿し、簡単に見つけられます。
・沈殿したペレットには DNA を含んでいます。ペレットを失うことで、最終的な DNA 収量も減る可能性があります。

11. ピペットにより上澄みのみを取り除きます。沈殿したペレット状の DNA に触れないよう注意してください。

・ペレットをチューブ壁に残すように、ピペットで上澄みを取り除いてください。
・上澄みには不純物が含まれている可能性があり、できる限り全て取り除いてください。
・ペレットの過度な乾燥は、以降の手順において DNA の溶解を困難にさせます。
・残留したエタノールが、アプリケーションに影響を及ぼす可能性があります。
・ペレットを乱さないように気をつけてください。

12. ペレットに 70%エタノール 250µl を静かに添加し、 ・DNA 量によりペレットは小さいかもしれません。
室温で 1 分間静置します。ペレットを乱さないよう・ペレットをかき乱してしまったら 13,000rpm（15,000 x g）に、エタノールを完全に除去します。

で 5 分間遠心分離させてください。
・サンプルから 70%エタノールを除去後、チューブをスピンダウンさせることで残留エタノールを除去することができます。
・より高濃度の DNA を必要とする場合は、TE Buffer を 50µL

13. TE buffer100µL(または類似の低塩 Buffer)を添加添加するように調整して下さい。
・DNA が多い場合、完全に水和(溶解)させるには時間を要し、ペレットを溶解させます。最低 5 秒間撹拌させすることがあります。

ます。

・DNA が完全に水和されなかった場合、DNA 濃度の測定が不正確になる原因となり、PCR などのアプリケーションのエラーに繋がる恐れがあります。

14. DNA を完全に再び水和させるために、室温でオー ・DNA の不完全な再水和は DNA 濃度の測定バーナイトした後によく攪拌してください。また が不正確になる原因となり、PCR などのアプは、時々チューブを撹拌させながら、50℃で 1 時 リケーションのエラーに繋がる恐れがありま間インキュベートしてください。

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す。

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・⾧期的な保存は-20℃での凍結をお勧めしま
15. 完全に再水和した DNA の保存方法a)TE Buffer に溶解した状態で-20℃で一定期間保存b)TE Buffer に溶解した状態で 4℃で 2 ヶ月間保存す。
・TE Buffer に溶解した DNA を凍結するとDNA は沈殿します。解凍する際は、ステップ
14 以降からプロトコルに従って処理してください。

DNA の定量化
唾液中 DNA サンプルの DNA 定量は、260nm での吸光度測定よりも蛍光色素を使用した測定の方が正確です。
RNA のコンタミが少ない為、PicoGreen や SYBRgreen などの蛍光色素を使用し、DNA 定 量 す る こ と を 推 奨 し ま す 。 SYBRgreen を 使 用 し た 場 合 の プ ロ ト コ ル は 下 記 のDNAgenotek 社ウェブサイトより入手可能です。
http://www.dnagenotek.com/US/pdf/PD-PR-075.pdf

吸光度測定におけるアドバイス
DNA を吸光度で定量する場合は、まずは精製された DNA を RNase で処理し、RNA を分解させてからエタノール沈殿により RNA 断片を除去することを推奨いたします。詳細プロトコルは下記 DNAgenotek 社のウェブサイトをご参照下さい。
http://www.dnagenotek.com/US/pdf/PD-PR-040.pdf
唾液由来の DNA サンプルは、一般的に血液サンプルと比較して RNA が多く含まれている点にご注意下さい。

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p. 5簡易マニュアル

下記はサンプル溶液 0.5mL を精製する場合
検体が採取された Oragene のキットを数秒間静かに攪拌させ、容器内のサンプルを混合する。

50℃でインキュベートします。
ウォーターバスでは最低 1 時間、エアーインキュベーターでは最低 2 時間加熱する。
500µL をマイクロチューブへ移す。
20µL の PT-L2P-5 を添加して、数秒間攪拌する。
氷上で 10 分間冷却させる。
室温で 5 分間遠心(15,000xg)する。
上澄みを新しいチューブに移し、沈殿分は廃棄する。上澄みに 600µL の 95～100%エタノールを添加する。
10 回転倒撹拌する。
室温で 10 分間静置する。
室温で 2 分間遠心(15,000xg)する。
上澄みを除去し廃棄する。
ペレットに 250 µL の 70%エタノールを添加し、1 分間静置する。
100 µL の TE Buffer を添加し、溶解する。
最低 5 秒間撹拌する。
精製された DNA は 4℃または、-20℃で保存㈱協同インターナショナル〒216-0033

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Oragene・DISCOVER で DNA を多量に採取するためのポイント
1. 推奨する唾液量を採取してください。
OGR-500 で推奨する唾液採取量は 2mL です。DNA 収量は唾液量と比例するため、唾液の採取量が少ないと DNA 収量も少なくなります。漏斗のふた部には 2mL の保存溶液が含まれております。従って、唾液 2mL と Oragene・DNA 溶液の全量は約 4mL になります。
（OGR-675 は唾液
採取量が、0.75mL になります。
）
2. 唾液採取時に砂糖を使用することも可能です。
唾液を採取できない場合は、砂糖をほんの少し舌の上に乗せるなどして、唾液を採取してください。ただし、飴やガムなどは口にしないで下さい。
その他、口を閉じて 30 秒ほど舌を動かしたり、頬を擦ったりすることで唾液の分泌が促されます。
3. 唾液採取は 30 分以内に行って下さい。
検体となる唾液は 30 分以内に採取し、すぐに容器のふたを閉めて保存溶液と混合して下さい。
唾液の採取に 30 分以上かかると DNA 採取量、質の低下に繋がってしまいます。
4. 必ず 50℃のインキュベートを行ってから DNA を精製してください。
唾液は粘性が高く、DNA を閉じ込めやすくなっています。50℃でのインキュベートによりOragene 保存溶液と唾液混合サンプルから DNA を引き出します。インキュベートせずに検体を精製すると DNA 収量が低くなります。
5. DNA を精製するために適量のエタノールを加えてください
遠心分離の後、上清に適量(上清の 1.2 倍量)の室温のエタノール(95～100%)を加えることが重要です。例えば 500µL の上清に対しては、600 µL と混合してください。DNA を精製するため上清にエタノールを、静かに完全に混合する必要があります。通常上清にエタノールを混合するにつれ、白い沈殿物（DNA）が現れることがあります。適量以上のエタノール、または冷えたエタノールを加えると DNA 回収率が落ち、逆に不純物の混入を増加させてしまいます。
6. DNA を Buffer に溶解するには十分な時間を設けて下さい
Oragene・DISCOVER から抽出した DNA は高分子のため TE Buffer に完全に溶けるまで時間を要します。Buffer は低塩 Buffer や TE Buffer などをお勧めします。DNA の完全な溶解のために可能であれば室温で一晩インキュベート、または時々チューブを撹拌させながら 50℃で 1 時間インキュベートし DNA の最終濃度は 200µg/mL(200ng/µL)以下に調整することを推奨します。
エタノール沈殿を行った後、サンプルを乾燥させることはお勧めしません。これは溶解時間を延ばす原因となります。DNA が溶解したら使用する前にサンプルを軽く攪拌またはピペッティングしてください。

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