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C

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L o w Te m p e r a t u r e S c i e n c e

低温科学2021 Vol.79
ISSN 1880-7593

安定同位体を用いた
有機物・生物・生態系解析

北海道大学 低温科学研究所 編
Edited by Institute of Low Temperature Science,
Hokkaido Universityはじめに

地球惑星科学，とくに地球生命科学は，大気・陸・海洋と生物の間でおこる物質・エネ
ルギー収支を定量し，その変遷と生命の進化・多様化や，人間活動（化石燃料の消費・森林破壊など）が自然界へ与える影響を評価する学問分野である．例えば，植物や藻類による二酸化炭素の吸収と，その結果としての土壌・海洋への炭素の貯蔵に関する研究は，大気二酸化炭素の増減とも密接に関係しているため，将来の地球の姿や，人間社会の持続可能性を考えるうえで重要な意義を持つ．また，宇宙空間や初期地球における有機物生成に関する研究は，地球における生命の起源や，地球外生命の可能性など，生命誕生の根幹（生命分子の起源や生命のホモキラリティの謎）に関わる制約条件を与える．
これらの研究に共通する有効な解析手段の 1 つに，安定同位体がある．安定同位体とは，陽子の数が等しく中性子の数が異なる原子のことであり，生物を構成する水素・炭素・窒素・酸素などには，必ず安定同位体が存在する（例えば，炭素では 98.9％の 12C と 1.1％の 13C など）．そして，その比率（安定同位体比：例えば 13C/12C など）は，(1)地球上の物
理化学・生化学反応の基質・経路・フラックスに対して定量的に変化するため，(2)この基本原理が個々の反応スケールの研究から地球化学・地質学スケールの研究まで共通の一般則として広く適用できるため，古くから多くの研究で，反応素過程の 5W2H（Who，What，
When，Where，Why，How，How many）を読み解くツールとして用いられてきた．
また，同位体比の自然界での変化率を用いる研究に加え，安定同位体を標識として用いるトレーサー研究も盛んに行われている．実際に，基質（例えば，ブドウ糖など）の特定の部位を人工的に同位体標識し，その移動を単一の生物体内，生物群集内，あるいは海底の堆積場などにおいて，分子レベルもしくは分子内の個々の元素レベルで追う手法（Stable
Isotope Probing，SIP 法）は，生物の代謝合成経路の可視化，生物群集の機能・構造解析，
生物地球化学的プロセスの解明といった研究で利用が期待されている．
本特集は，生物学，生態学，宇宙地球化学などの分野で，最新の同位体技術を研究されている，もしくは，それらの技術を用いて研究を展開されている方々に，論文を執筆していただき，解説集として取りまとめたものである．これらの論文が，今後の研究の発展に資することになれば幸いである．
最後に，本巻の刊行にあたり，論文を執筆して下さった全ての著者と論文の査読を引き受けて頂いた全ての査読者に，この場をお借りして御礼申し上げる．
「低温科学」第 79 巻編集委員
力石嘉人（北海道大学・低温科学研究所)
布浦拓郎（海洋研究開発機構)
古川善博（東北大学・理学研究科)

目次
はじめに
安定同位体の天然存在量および安定同位体標識の検出法─ 1：ガスクロマトグラフ-同位体比質量分析計

アミノ酸の安定同位体比を用いた生態系解析

滝沢 侑子，力石 嘉人

1

力石 嘉人

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安定同位体の天然存在量および安定同位体標識の検出法─ 2：ガスクロマトグラフ-質量分析計と MassWorks
力石 嘉人，滝沢 侑子，布浦 拓郎

23

布浦 拓郎，力石 嘉人，跡見 晴幸

31

オービトラップ質量分析計を用いたアミノ酸解析の可能性

島村 繁，澄田 智美，布浦 拓郎

37

Orbitrap Fusion を用いた CE-MS と四重極 GC-MS でのアミノ酸分析の比較

澄田 智美，島村 繁，布浦 拓郎

43

マルチオミクス解析による好熱性水素酸化細菌からの可逆的 TCA 回路の発見

宇宙における安定窒素同位体比の多様性とその起源解明に向けた実験的アプローチ

菅原 春菜

51

炭素安定同位体組成で探る隕石有機物の生成反応と地球への運搬

古川 善博

59

低温科学 79 （2021） 1-11
doi: 10.14943/lowtemsci. 79. 1

安定同位体の天然存在量および安定同位体標識の検出法─ 1：ガスクロマトグラフ-同位体比質量分析計
滝沢 侑子1)，力石 嘉人1)
2020 年 11 月 25 日受付，2021 年 2 月 10 日受理

有機化合物に含まれる水素・炭素・窒素などの安定同位体の存在比を，分子レベル（化合物レベル），もしくは分子内の個々の元素レベルで測定するための主要な分析装置として，ガスクロマトグラフ同位体比質量分析計（GC-IRMS）がある．本稿では，GC-IRMS の原理と，生理・生態学分野への利用方法を解説する．

Stable isotope analysis-1: gas chromatograph-isotope ratio mass spectrometer
Yuko Takizawa and Yoshito Chikaraishi
One of the most general instruments for determining the inter- and intra-molecular isotopic heterogeneity innatural environments is gas chromatograph-isotope ratio mass spectrometer (GC-IRMS), which allows a rapid andprecise determination of stable hydrogen, carbon, and nitrogen isotope ratios of individual compounds even in complex
mixture of components. We review a brief outline of GC-IRMS and its application to physiological and ecologicalstudies.
キーワード：安定同位体，GC-IRMS，同位体生理学，同位体生態学，有機地球化学
Stable isotope, GC-IRMS, Isotope Physiology, Isotope Ecology, Isotope Geochemistry

ど）が優先的に反応し，その反応が非定量的＊1 である（原1. はじめに料の一部が反応せずに残存する）場合には，生成物に軽有機化合物を構成する水素・炭素・窒素・酸素などにい同位体が濃縮（例えば，ブドウ糖に 12C が濃縮）し，は 安 定 同 位 体 が 存 在 し，そ の 比 率（安 定 同 位 体 比：

残った原料に重い同位体が濃縮（例えば，二酸化炭素

D/H， C/ C， N/ N， O/ O など）は，自然界の様々に 13C が濃縮）する．この原理は，数秒スケールで起こな反応プロセス（過程）において僅かに変化する（Fry,

る生物化学的な反応から，数十・数百万年スケールで起2006 な ど）．例 え ば，大 気 二 酸 化 炭 素 の C/ C は 約

こる地質学的な反応まで，地球上で起こるあらゆる反応

0.01109 であるのに対して，その二酸化炭素を原料に植に共通する一般則として広く知られている．これらの法物 が 光 合 成 で 作 り 出 し た ブ ド ウ 糖 の 13 C/12 C は 約則に基づいて，安定同位体比は，反応素過程の 5W2H

0.01080 であり，原料の二酸化炭素に比べてわずかに（Who, What, When, Where, Why, How, How many）を読

C に富む．このように，原料の中の軽い同位体（ C な

み解くツールとして，古くから多くの研究で用いられて

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連絡先
滝沢 侑子
北海道大学低温科学研究所〒060-0819 札幌市北区北 19 条西 8 丁目
Tel. 011-706-5486
e-mail：takizaway@lowtem.hokudai.ac.jp⚑) 北海道大学低温科学研究所
Institute of Low Temperature Science,
University, Sapporo, Japanきた（詳しくは安定同位体地球化学などの書籍を参照していただきたい）．
本稿では，有機化合物の安定同位体比を，分子レベル（化合物レベル），もしくは分子内の個々の元素レベルで測定するための主要な分析装置である「ガスクロマトグ
ラフ-同位体比質量分析計（GC-IRMS：gas chromatoHokkaido＊1

http: //www. lowtem. hokudai. ac. jp/isophysiol/products/cn6/
pg171.html

滝沢 侑子，力石 嘉人

2

図 1：GC-IRMS の概念図

graph - isotope ratio mass spectrometer）」の，装置の概Standard Mean Ocean Water，
D/H＝0.000155576），

要と，その技術を利用した研究例（GC-IRMS を使った

Peedee 層ベレムナイト炭酸塩（V-PDB：Vienna-Peedee

研究で明らかになったこと）の一部を紹介したい．なお

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Belemnite，
C/12 C＝0.011180），
または大気窒素（Air：

本稿で説明する GC-IRMS は，著者らの研究室で運用し

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Atmospheric Nitrogen，
N/14N＝0.0036765）のいずれかている Thermo Fisher Scientific 社製の拡張型安定同位が用いられる．これらの標準物質は，国際原子力機関

体比質量分析計 Delta V advantage と，Agilent 社製のガ（IAEA）によって管理されている．試料の 値が，国際ス ク ロ マ ト グ ラ フ 7890B を ガ ス ク ロ 型 前 処 理 装 置

標準物質に対して「正」であればその試料は重い同位体

GC-C/TC III を介して接続した装置 であり，説明の多（D，13C，15N）を多く含むことを示し，「負」であれば軽くは著者らのこれまでの使用経験に基づいたものである

い同位体（H，12C，14N）を多く含むことを示す．なおことを予めご了承いただきたい．また GC-IRMS の機器

値は国際単位系（SI）ではないため， 値に代わる新しいそのものや使用条件，GC-IRMS の測定技術を利用した定義が提案されているものの，現時点ではどれも定着し研究例については，既にいくつかの論文や総説が発表さておらず， 値の使用が続いている．安定同位体比のれているため，それらも併せて参照されたい（例えば，「‰」という単位（表記）は，将来的に変わる可能性があSessions 2006; Evershed et al. 2007；力石・大場 2008）．

ることに留意されたい．

＊2

2.2．装置の概要

2．GC-IRMS の概要

GC-IRMS には主に 5 つの構成要素がある（図 1）：2.1．安定同位体比の定義(1) 試料に含まれる複数の有機化合物を分離する「GC」

安 定 同 位 体 の 組 成 比 の 表 記 は，平 均 存 在 度（例 えば， C：99.89％， C：1.1％）や存在比（例えば， C/ C＝
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(2) それぞれの有機化合物を H2，CO2，N2ガスに変換する「反応炉」

0.0111）などが一般的である．しかし，自然界の様々な(3) 測定に不要なガス成分や水分を除去する「トラップ」

反応プロセス（過程）における同位体比の僅かな変化を(4) 加圧系の装置（GC）と真空系の装置（IRMS）を接続捉える際には，国際標準物質の安定同位体存在比に対すする「スプリットシステム」

る「千分偏差（ 値，単位‰，式 1）」が，伝統的に用いら(5) H2，CO2，N2ガスの安定同位体比を測定する「IRMS」

れている．

測定の対象とする有機化合物は，揮発性を持たせるために前処理の段階で化学修飾され，ヘキサンやジクロロメ

値＝[（R試料/R国際標準物質)－1]×1000(式 1)タンなどの有機溶媒に溶かされた状態で GC へ導入される．溶液中に混在する有機化合物は，ガラス製の GC

R は水素・炭素・窒素いずれかの存在比（それぞれ，

キャピラリーカラム（長さ 30 または 60 m，内径 0.25 まD/H， C/ C， N/ N）
を示す．
国際標準物質は，測定した

たは 0.32 mm，膜圧 0.1 から 0.5 m が用いられること

い 元 素 に あ わ せ て，
標準平均海水
（V-SMOW：Vienna-が多い）によってそれぞれ分離され，その後は連続的に

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＊2

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http: //www. lowtem. hokudai. ac. jp/isophysiol/products/cn6/
pg233.html

セラミック製の反応炉（長さ 32-34 cm，内径 0.5 mm）に導入される．(2)～(4)の構成の子細は，測定対象とす

安定同位体の天然存在量および安定同位体標識の検出法─ 1：ガスクロマトグラフ-同位体比質量分析計3

図 2：GC-IRMS で得られたクロマトグラムの例

図 3：GC-IRMS の開発史

る分子や元素，また GC-IRMS の仕様（メーカーや，バー

論的同位体分別」の理論が完成した（同位体分別に関すジョン）によって異なるが，いずれの手段においても，る詳細は，著者らのウェブサイト＊3 や，安定同位体地球

最終的には，反応炉内で生成された試料由来の H2，CO2，

化学などの書籍を参照されたい）．その後 1960 年代にもしくは N2 ガスがキャリアーガス（He）と共に IRMS

は，米国等による宇宙開発（アポロ計画など）に伴って，に導入され，
同位体比が測定される仕組みとなっている．

真空技術や計算機（PC 技術）が発展し，同位体比質量分

実際に測定をおこなうと，図 2 に示すようなクロマトグ

析計（IRMS）が開発された経緯がある．開発当初の同ラムが得られ，試料に含まれる複数の有機化合物が，GC

位体比測定は，対象とする試料を石英管内で燃焼・還元によって分離され，1 つ 1 つのピークが示す有機化合物

し，生成したガスを手作業で真空ラインを用いて分離・の同位体比が測定されていることがわかる．

精製し，IRMS に導入するというもので，封管燃焼法，
Bulk 法，または Dual Inlet 法と呼ばれている．この方法

2.3．開発の歴史

は，試料全体に含まれる水素・炭素・窒素の同位体比を

同位体の研究（理論および測定技術）は，この 80 年間

精密に測定することが可能な現在も用いられている重要の社会情勢に強く影響を受けながら発展してきた歴史がな技術であり，特に標準試料の同位体比を決定するためある（図 3）．自然界における同位体存在比の変化（同位に欠かせないものである．ただし，封管燃焼法による測体 分 別）に 関 す る 理 論 は，原 子 爆 弾 の 開 発 に 伴 っ て定の特徴として，元素あたり数ミリモル（mmol）程度の1930-40 年代に集中的に研究され，Urey によって「平衡論的同位体分別」が，Bigelisen, Mayer によって「速度＊3

http: //www. lowtem. hokudai. ac. jp/isophysiol/products/cn6/
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滝沢 侑子，力石 嘉人

4

試料量が要求される上に，試料の燃焼・還元，および真機化合物は，熱分解によって H2，C（グラファイト）に加空ラインを用いたガスの分離・精製にかなり時間がかか

えて，有機化合物に酸素原子が含まれる場合は CO が生る（著者らの経験では「一週間で十数試料の測定」が限成される．炭素・窒素同位体比の測定には，燃焼炉（酸界である）．また，有機化合物の酸素同位体比の測定に化剤：NiO，CuO，触媒：Pt，温度：800-1150℃）と還元

関しては，試料から「有機化合物由来の酸素」を確実に

炉（還元剤：Cu，温度：550-650℃）が用いられる．導入

抽出する技術が未だに開発されておらず，優れた封管燃された有機化合物は，燃焼炉で，CO2，H2O，N2，種々の焼法が存在しないという点にも注意されたい（例えば，窒素酸化物（NXOY）に酸化分解され，その後還元炉にて，Saurer et al. 1998）．1970-80 年 代 に な る と，オ イ ル

窒素酸化物が N2 に還元される．

ショックの影響を受けて，世界的に「石油資源の成因や反応炉では，試料が炉に与える負荷の大きさに伴って起源」を理解するための研究が進むようになり，その手（例えば，分析数の多さや，測定試料の質など），触媒の段のひとつとして「化石燃料（石油・石炭）に含まれる劣化や，酸化・還元剤の消耗が起こることが一般的であ炭化水素の分子レベルでの同位体比分析」の需要が高る．炉の内部での反応効率の低下は，人為的な同位体分

まった（「有機地球化学」研究の黎明期である）．その後別をもたらす要因になり，クロマトグラム上でのピーク

は人間活動に伴う環境の変化を評価したり，生態系の構形状の悪化（テーリングなど）や，試料が持つ同位体比造を理解したりするために，多量の生物試料の同位体比を正しく測定できないなどといった，測定結果の不確か分析をより簡便に実施できる測定手法の需要が高まっさを増大させる要因にもなる．また分析数が増えていく

た．そこの背景を受けて，前述したような手間のかかると，水素同位体比測定においては試料由来のグラファイ「手作業でのガスの精製」を行わずに同位体比分析を可

トが，炭素・窒素同位体比測定においては酸化不足によっ能とするための「自動分析（オンライン）技術」の研究て CO2 ではなくグラファイトが生成され，炉内に蓄積しが進んだ．その結果，既存の GC や元素分析計（EA：てしまう．グラファイトの存在は，炉内の流路を塞ぐ（狭Elemental analyzer）などを改良して作られた「試料のくする）方向に働くため，流速の増大と，反応効率の低ガス化・生成したガスの分離・精製を行う前処理装置」

下をもたらす．加えてグラファイトそのものが「有機化と，「同位体比を測定する IRMS」とを，「スプリットシ

合物のグラファイト化の触媒」にもなるため，一度作らステム（詳細は後述）」で接続した GC-IRMS，EA-IRMS

れてしまうとグラファイト化反応が連鎖的に進行し，さが 開 発 さ れ た．こ の よ う に，現 在 用 い ら れ て い るらにグラファイト化そのものが同位体分別を伴うため，

GC-IRMS の基本的な原理は，1990 年代には既に完成し炭素同位体比の測定が極めて困難になる．また，フッ素ていたといえる（Hayes et al., 1990）．

（F）などのハロゲンが含まれる有機化合物の測定にも注

なお，GC-IRMS を示す表記として，論文等では様々意が必要である．水素同位体比測定では，熱分解炉内でな略記が使われている．isotope ratio monitoring-GC-

フッ化水素（HF）が生成され，GC-IRMS のキャピラリー

MS（irm-GC-MS）と表記されることや，炭素・窒素同位カラムなどの様々な部品を腐蝕する．炭素・窒素同位体

体 比 を 測 定 す る 条 件 の 装 置 を GC-combustion-IRMS

比測定では，炉内の酸化剤・還元剤と不可逆的に反応し（GC-C-IRMS），水素同位体比を測定する条件の装置を（CuF2 や NiF2 を生じる），酸化・還元力を低下させる．

GC-pyrolysis-IRMS（GC-P-IRMS），GC-thermal con-

上に挙げてきたこれらの問題は「炉の交換」によってのみ

version-IRMS（GC-TC-IRMS）と表記することもある．

改善されるため，試料の質や測定数にあわせて，メンテ

また，近年，測定装置を示す時には「GC-IRMS：gas

ナンスの必要性やその頻度について，よく注意されたい．

chromatograph - isotope ratio mass spectrometer」のよう に「-」を，測 定 法 を 示 す 時 に は「GC/IRMS：gas
chromatography/isotope ratio mass spectrometry」のよ
うに「/」を用いることが多くなっている．

2.4.2．バックフラッシュシステム
バックフラッシュシステムとは，試料あるいは GC 導入時に用いる溶媒に含まれている「反応炉に負荷をかけうる有機化合物」を，反応炉に入れることなく外部に排2.4．GC-IRMS を用いた安定同位体比の測定における出する仕組みである．図 4 に示すように，「開」時には，

重要事項

GC からのフローと，反応炉を逆流したフローが同時に

2.4.1．反応炉

GC 外部へと排出されるため，溶媒等の反応炉への侵入

水素同位体比の測定には，熱分解炉（触媒：グラファ

を防ぐことができる．一方「閉」時は，GC からのフロー

イト，温度：1400-1500℃）が用いられる．導入された有がそのまま反応炉に送られ，試料の有機化合物を熱分解，

安定同位体の天然存在量および安定同位体標識の検出法─ 1：ガスクロマトグラフ-同位体比質量分析計5

図 4：バックフラッシュシステム

あるいは酸化分解することができる．このように，バッである（図 6）．オープンスプリットシステムでは，GC

クフラッシュシステムを活用して，酸化剤・還元剤の消側（加圧系）から来たキャピラリーカラムの先端が開放

耗と，触媒の劣化を防ぐことは，安定的な（再現性の高系になっており，そこに，IRMS（減圧系）へとつながるい）測定をするうえで重要である．

キャピラリーカラムが挿入されている．この仕組みにより，反応炉で生成した試料由来のガスは，一部が IRMS

2.4.3．透水膜側のキャピラリーカラムに引きこまれそのまま IRMS

炭素・窒素同位体比測定では，有機化合物の燃焼により，水（H2O）が生成する．この H2O が試料由来の CO2等とともに IRMS でイオン化されると，式 2 の反応が起こり，に導入され，一方残りの大部分は測定機の系外に排出される．
この基本原理に従って，様々なタイプのオープンスプ
リットシステムが運用されている．例えば，内径 0.32mm のキャピラリーカラム（GC 側）に，0.1 mm のキャ

C16O2＋＋H2O → H12C16O2＋＋OH •

12

(式 2)

ピラリーカラム（IRMS 側）を挿入したシンプルなもの（図 6a）から，ヘリウムガスで満たされた円筒上のガラ

m/z 45 の H C O2 が生成する．m/z 45 は CO2 と同じス管に，GC 側のキャピラリーカラムと IRMS 側のキャであるため，分析計内の水の存在自体が，測定によってピラリーカラムとの双方を挿入し，IRMS 側のカラムを得られる同位体比を大きく見積もってしまう要因となる

上下に出し入れすることによって，IRMS へ導入するタ（Leckrone and Hayes, 1997, 1998）．これを防ぐために，イミングを制御したり，導入する濃度を調整したりする

還元炉とオープンスプリットの間などに，水を除去する

もの（図 6b）がある．

1216

透水膜（Nafion

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フィルター）を配置する必要がある

IRMS への導入量は，IRMS 側のキャピラリーカラム（図 5）．この透水膜は，経年劣化，とくに光により著しの長さと内径，IRMS の真空度により決定される．例え

く劣化する性質があるため，暗所に設置するか，あるいば，短いキャピラリーカラムを用いると，GC から来たはアルミ箔等で覆い遮光することが求められ，定期的な試料ガスの導入量が増加するが，IRMS の真空度が悪く交換も必須である（著者らの研究室では約 2 年毎に交換

なり，結果として IRMS のメンテナンス頻度を高くする

している）
．

必要がある．そのため，研究対象の試料量や，研究室でTM実施可能なメンテナンス頻度を考えたうえで，IRMS 側
2.4.4．スプリットシステム
GC は加圧系の分析機器であり，0.4 bar（＝約 10 psi，のキャピラリーカラムの長さと内径を調整することが推奨される．

40 kPa）以 上 の ガ ス 圧 で，試 料 を 分 離 す る．一 方 でIRMS は減圧系の分析機器であり，10－6 mbar の真空下2.4.5．分子ピークのベースライン分離

で，質量数の異なるイオンを分離する．これらの異なる

GC-IRMS での同位体比分析では，図 2 に示すように，

圧力系の分析機器同士を繋ぎ，加圧系から減圧系への試

クロマトグラム上で，同位体比を測定したい有機化合物料の導入をおこなうのが「オープンスプリットシステム」のピークが，ターゲットではない他の化合物や夾雑物等

滝沢 侑子，力石 嘉人

6

（a）

（b）

図 5：透水膜

図 6：オープンスプリットシステムに由来するピークから，確実に分離されている必要があ

酸をエステル化，もしくは，アルコールをアシル化）する．例えば，異なる同位体を持つガス（例えば， CO2

るときには，「カルボキシル基の炭素」と「アルコールのと CO2）が，キャピラリーカラム内を流れる時には，同酸素」の結合生成によって，同位体分別（軽い同位体で位体効果により溶出時間に僅かな差があることが報告さある 12C，16O の優先的な反応）が生じる（図 7）．カルボ

れており（Ricci et al., 1994），著者らの経験的には，二酸ン酸（試料）に対して，アルコール（誘導体化剤）が過化炭素の場合，m/z 45 の CO2 が m/z 44 の CO2 より剰量存在する「エステル化」をおこなう時には，反応がも僅かに先に溶出することがわかっている．このような100％進行した場合にヒドロキシル基の酸素に同位体分場合には，クロマトグラム上のピークの，前半部が同位別が生じる（図 7a，ただし，カルボキシル基の炭素は体的に重く，後半部が同位体的に軽くなると考えられる

100％反応するので，同位体分別は無い）．一方で，アル（図 2 の 45/44 を参照）
．実際に，キャピラリーカラム内

コール（試料）に対して，カルボン酸（誘導体化剤）がでの溶出時間に差が生まれる詳細なメカニズムは十分に過剰量存在する「アシル化」をおこなう時には，反応が解明されていないものの，同位体比を正確に測定するた

100％進行した場合にカルボキシル基の炭素に同位体分

めには，ピークの一部ではなく「ピーク全体」をより正別が生じる（図 7b，ただし，アルコールの酸素は 100％

確に積分する必要があるため，ベースラインの分離は慎反応するので，同位体分別は無い）．これらの誘導体化

重におこなわれるべきである．

に伴う人為的な同位体分別は，理論上は，有機化合物と

12

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誘導体化剤のモル比を調節することによって最小化でき
2.4.6．誘導体化における同位体分別

る＊4 が，例えば試料に含まれるマトリックス（誘導体化

同位体比を測定したい有機化合物が，極性官能基（ヒ剤と反応しうる，巨大な有機化合物：セルロースやリグ

ドロキシ基：-OH，カルボキシル基：-COOH，アミノ基：

ニンなど）の存在や，目的の有機化合物以外に混合して-NH2 など）を持つ場合には揮発性を持たせるために，いる化合物（夾雑物）の影響も受けるので注意されたい．

また，クロマトグラム上でのピーク分離能や S/N（シグまた，アミノ酸を対象とした場合は，アミノ基（-NH2）

ナル／ノイズ）比を向上させるために，官能基を化学的周辺の立体構造は生体を構成するアミノ酸 20 種類のあに修飾し極性を下げる処理がおこなわれる．これを「誘いだでそれぞれ異なっているため，誘導体化剤との反応導体化」という．しかし誘導体化においては，誘導体化性もそれぞれに差があると考えられる．アミノ酸の誘導剤と測定対象の有機化合物や元素の組み合わせによっ体化（アシル化）における同位体効果の大きさもまた，て，人為的な同位体分別が生じ，それが測定値に不確か

20 種それぞれで異なる（Corr et al., 2007）ことにも留意

さをもたらすため，十分に注意を払う必要がある（Rieley,

したい．加えて，アミノ酸同士での競争反応も起こるた

1994）．
例えば，カルボン酸（R1-COOH）とアルコール（R2-OH）を反応させ，エステル（R1-CO-OR2）を生成（カルボン＊4誘導体化における同位体分別は，有機化合物と誘導体化剤のモ
ル比が 1：∞のとき最大になり，1：1 のときゼロになる．

安定同位体の天然存在量および安定同位体標識の検出法─ 1：ガスクロマトグラフ-同位体比質量分析計7

図 7：誘導体化における同位体分別（＊印は同位体分別を起こす元素）

め（Chikaraishi and Ohkouchi, 2010），複数のアミノ酸をなされてきたが，残念ながら，優れた解決法は未だに開対象とした測定においては，前述したような，誘導体化

発されていない．

剤のモル比を調節する といった方法は現実的ではない．
＊4

一方で，炭素数の異なる直鎖アルコール（R-OH，R の炭

2.4.7．GC カラムの選択

素数が 16-30 など）の誘導体化（アシル化）反応におけるGC カラムは，測定対象の有機化合物の分子量や極性

同位体効果の大きさは，たとえ炭素数が異なっても，ヒドなどに応じて，様々なものが販売されている．それらのロキシ基周辺の立体構造はほとんど等しいため，試料中

うち，カラムの固定相にハロゲン（F など）が含まれての全アルコールと誘導体化剤のモル比で決定される．

いるものを除いたほとんどのカラムが，GC-IRMS で使誘導体化反応において，誘導体基に含まれる元素の同位体的な影響は，一般的に式 3 を用いて補正される．

用することができる．一般的に，無極性や微極性の内径0.32 mm×長さ 30 m もしくは 60 m の低ブリードカラム（例えば，Agilent 社製の HP-1 MS や HP-5 など）で，n誘導体化後× 誘導体化後＝n誘導体化前× 誘導体化前＋n誘導体基× 誘導体基

固定相の膜厚が薄いタイプ（0.1 から 0.32 m）が用い(式 3)られる．膜厚の厚いカラムは，GC オーブン温度の上昇に伴い，カラムから固定相が溶出し，クロマトグラムのn は，誘導体化前後の試料および誘導体基の「元素数」

バックグラウンドを上昇させるだけでなく，燃焼炉や還を示す． 誘導体化後 は測定によって得られるため， 誘導体化前

元炉内の反応剤の著しい劣化の原因になるため，その点を求めるにあたっては，予めに留意されたい．

誘導体基を知る必要がある．

一般的な手順として，同位体比（ 誘導体化前）既知の標品を

キャリアーガスの流速は，GC-MS などに比べると遅用いて試料と同じ条件で誘導体化をおこない，式 3 より

い 1.0 から 1.4 ml/分の範囲の定流量（constant flow）

を得る．次に，対象とする試料を同じ誘導体化剤に設定されることが多く，これは熱分解炉や燃焼炉におを用いて誘導体化し，実際に得られた測定値（ 誘導体化後）いて十分な反応時間を確保するためである．例えば，早からを求めることが多い．この際， 誘導体基 が一い流速（例えば，2.0 ml/分）では反応効率の著しい低下定であると計算しやすいが，誘導体化反応において同位に伴う同位体分別が生じることによって，正確な同位体体分別がある場合には（アミノ酸のアシル化における炭比を得ることが困難になり（Chikaraishi et al., 2010），ま素，アルコールのアセチル化における炭素など）， 誘導体基た極端に遅い流速（例えば，0.5 ml/分）では GC のピー

が一定にならないので， 誘導体化前 の計算が困難になる．

ク分離能の著しい低下によって，クロマトグラム上でのこの困難を克服するため，これまでに様々な取り組みがベースライン分離（2.4.6 章を参照）が難しくなるため

誘導体基

誘導体化前

滝沢 侑子，力石 嘉人

8である．
測定対象の有機化合物によってどの GC カラムを選択するべきかはケースバイケースであるが，以上の要素を参考に決定して頂きたい．
2.4.8．同位体比のキャリブレーション
試料に含まれる有機化合物の同位体比を得るためには，一般的に，同位体比既知の標準有機化合物（Referencematerials, Schimmelmann et al., 2016）を用意し，(1) 標準ガスの同位体比を 0‰として，標準有機化合物の測定を行い，測定値と標準有機化合物も持つ既知の値の関係式（1 次相関式）を作成する（図 8）(2) 標準有機化合物の測定時と同じ条件で試料を測定
し，(1)の関係式を用いて試料の同位体比を計算すると い う 方 法 が 一 般 的 で あ る．種々 の 標 準 有 機 化 合 物（Reference materials）は，IAEA やインディアナ大学＊5，

図 8：GC-IRMS で得られた測定値（x 軸）に対する同位体比
既知の標準有機化合物の 値（y 軸）の関係

昭光サイエンス＊6 などから販売されている．(1)の関係
式（図 8）の作成においては，測定対象の有機化合物の同からは，実際に測定して得られた安定同位体比の天然存

位体比の範囲を，できるだけ広くカバーできるように複在度から，何をどのように評価できるかについて，その数の標準有機化合物を用いることが重要であり，この作

利用方法の一部を紹介する．

業こそが得られた結果（補正値）の確度の担保になる．

安定同位体の天然存在度に差をもたらす要因のひとつ

また，(1)の関係式の傾きは，一般的に 1.0 にならないこが「同位体分別」であり，その変化の法則性は，2.3 で述との方が多く，これは「IRMS の装置固有の特性」やべたように「平衡論的同位体分別」または「速度論的同「GC-IRMS 系内での同位体分別」などに起因する．とく位体分別」のいずれかで説明可能である．特に，生物をに後者は有機化合物の種類や測定条件にも依存するた介する反応における同位体分別は，後者によって決定さめ，標準有機化合物として採用する有機化合物は，測定れることが多い．同位体分別は生物体内で起こるあらゆ

対象の有機化合物と同一のもの，またはできるだけ構造

る代謝（生合成や分解）の反応プロセスにおいて起こっが類似したものを採用する必要がある．

ているが，実際に私たちがその同位体比の変化を，観測

なお，同位体比既知の標準ガスを用いて，その標準ガしたり評価したりすることが可能な「有機化合物」と「元スの同位体比から試料の有機化合物の同位体比を計算す素」の組み合わせは，ごく一部に限られている．その組

るキャリブレーション法を用いている論文等が多く存在

み合わせの中で，近年頻繁に用いられるようになったもする．これは，「(1)の関係式の傾きを 1.0」と仮定したののひとつに「アミノ酸」の「安定窒素同位体比」で分上で算出された方法であり，同位体的に正しい値が得ら解量を評価するという手法がある．この方法論が成立すれてない（＝確度が十分に担保されていない）可能性にる理由は，生物体内におけるグルタミン酸（アミノ酸）

留意したい．

の分解（異化）プロセスの最初の反応である「脱アミノ酵素反応」における速度論的同位体分別が，式 4 に示す

3. 生理・生態学研究への利用

レイリーモデルに従うためである．

ここまでは，安定同位体比の天然存在度を測定するた

Δ 15N≒1000[F（ －1）－1］(式 4)めの装置：GC-IRMS の基本原理を解説してきた．ここΔ 15 N は，反 応 前 後 で の 同 位 体 比 の 変 化（ 15 Nt＝x－
https://hcnisotopes.earth.indiana.edu/reference-materials/inde
x.html＊6
https://www.shoko-sc.co.jp/products/stable_isotope/reagent/
standard/index.html＊5Nt＝0）を，F は，反応のフラックス（反応前を 1 とし

15て，全て反応すると 0）示す．また， は同位体効果を示し，およそ 0.9938 と見積もられている（図 9，Goto et al,安定同位体の天然存在量および安定同位体標識の検出法─ 1：ガスクロマトグラフ-同位体比質量分析計

9

2018）
．この理論に基づくと，例えば，生物同士の捕食─
被食関係，すなわち「捕食者がエサを食べて消化し，その養分に含まれているグルタミン酸を分解してエネルギーを獲得する」という過程においては，エサから摂取したグルタミン酸のうち，約 70％が分解された時，分解されずに残ったグルタミン酸の15

N 値は約 8‰上昇するという関係性が導き出される．
このような知見を応用することによって，生物の生理学的な現象（代謝の状態，エネルギーの獲得・蓄積・消費，それらの効率化や制限要因など）や，生態学的な現象（生態系ピラミッドにおける生物の位置，エネルギーの流れなど）を，定量的に理解することができる．前者の学問分野は「同位体生理学」，後者の学問分野は「同位体生態学」と呼ばれている．また，両者を合わせて，「同位体生理生態学」と呼ばれることもある．以下に，GCIRMS（正確には，GC-IRMS を用いて得られた有機化合

図 9：グルタミン酸の脱アミノ化における同位体分別

物，特にアミノ酸の同位体比）が理解に貢献した生理・生態学研究について紹介する．
まず，生物を構成するアミノ酸分子の「分解（異化）

ラミッドの上位の生物ほど Trophic アミノ酸のは高い値となり，一方で Source アミノ酸の

15

15

N値

N 値はピ

過程における窒素同位体分別」に着目したことによってラミッドの中のいずれの栄養段階に位置する生物であっ発展した同位体生態学研究の原理を紹介する（具体的なても，一次生産者（植物や植物プランクトン）とほとん

応用例は，本誌第 2 章「アミノ酸の安定同位体比を用いど変わらない（Chikaraishi et al., 2007）．これら 2 種類た生態系解析」を参照されたい）．生体を構成するアミのアミノ酸の同位体分別の特徴に基づいて作られたのノ酸は 20 種類あり，それぞれのアミノ酸がどのようなが，以下の一般式（式 5）であり，この式を用いること

分解（異化）のプロセスを経るかによって，アミノ酸ごで，生態系ピラミッドにおける生物の位置（栄養段階）との同位体分別に差がもたらされる．例えば，分解（異を正確に推定することができるようになった化）の初期反応が「脱アミノ酵素反応」であるアラニン，（Chikaraishi et al, 2009）．

バリン，イソロイシン，グルタミン酸などは，同位体生態学分野で「Trophic アミノ酸」と呼ばれ，これらのア

栄養段階＝( 15NTr－ 15NSrc＋ )/(ΔTr－ΔSrc)＋1

ミノ酸の窒素同位体比は，生物同士の捕食─被食関係の(式 5)

視点で見ると，被食者よりも捕食者の方が高くなる．これは，脱アミノ化がおこなわれる際に，14N を持つアミNTr， 15NSrcは，それぞれ，Trophic アミノ酸と Source

15ノ酸のアミノ基から優先的に反応することで同位体分別

アミノ酸のが起こること，その結果として捕食者の内部で15N が濃次生産者における

15

縮することによって説明できる．一方で，フェニルアラ

捕食─被食に伴う

15

ニンやメチオニンなどの，分解（異化）の初期反応が脱に伴うアミノ化ではない（ヒドロキシル化やアデノシル化であて用いることができるアミノ酸は，原理的にはいくつかる）アミノ酸は「Source アミノ酸」と呼ばれ，窒素同位の候補があるが，生物間でのアミノ酸組成の多様性や，体比に顕著な同位体分別は見られず，その結果として捕N 値（測定により得られる値）を， は一

15

NTr 値と15

NSrc 値の差を，ΔTr は

NTr 値の変化を，ΔSrc は捕食─被食

NSrc 値の変化を示す． 15NTr 値， 15NSrc 値とし15

N 値の測定のしやすさ（例えば，分子ピークのベース

15

食者と被食者とでアミノ酸の窒素同位体比がほとんど変ライン分離のしやすさなど）を考慮し，Trophic アミノ化しない．

酸として「グルタミン酸」，Source アミノ酸として「フェこれらの「分解（異化）に伴うエネルギーの確保」と，ニ ル ア ラ ニ ン」を 用 い る 場 合 が 多 い（例 え ば，

一部のアミノ酸にみられる「分解（脱アミノ化）に伴うChikaraishi et al., 2014）．グルタミン酸，フェニルアラ

窒素同位体分別」は，生産者から高次捕食者に至るまで

ニンのΔ値は，それぞれ 8.0‰，0.4‰であり，この値はの食物連鎖の中で連続的に起こっているため，生態系ピ

多くの生物の捕食─被食関係の中でおおよそ共通して見滝沢 侑子，力石 嘉人

10られる普遍的なものである． は，植物プランクトンや変化を矛盾無く説明できるとして，注目されている．

シアノバクテリアを一次生産者とする生態系で－3.4‰，
陸上の維管束植物を一次生産者とする生態系で＋8.4‰

4．おわりにと見積もられている（Chikaraishi et al., 2011）．この方

GC-IRMS が開発されてから約 30 年が経った．しか法論を実際に応用研究へ用いる際は，これらの値を式(5)しながら，私たちが測定可能な有機化合物や元素は，依に代入して生物の栄養段階を算出する．

然として，一部の脂質の水素・炭素やアミノ酸の窒素に続いて，生物を構成するアミノ酸の炭素同位体比に着限られている．そこには乗り越えなくてはならない方法

目して，最近明らかになった同位体生理生態学に関連す論的な課題（例えば，良い誘導体化法が見つかっていな

る研究の原理を紹介する．生物は多種多様な有機化合物

い，それを解決するためのアイデアがないなど）もある

によって構成され，その活動は，有機化合物が生体内でが，GC-IRMS を用いた測定では，GC-MS などに比べ，様々な反応を伴った代謝（生合成や分解）をすることで要求される試料量が多く（GC-MS が pmol であるのに維持されている．生体内における代謝プロセスは非常に対し，GC-IRMS は nmol），そもそも存在量の少ない試

多様かつ複雑であることから，その中から「同位体分別

料の同位体比を測定することができないという課題も無が生じる反応を特定し，どの分子の何の元素に記録され視できない．これは，GC-IRMS のオペレーション（確るかを特定する」ことは，困難であると考える研究者も度・精度を維持すること）が他の分析装置に比べて難し

少なくない．それに加えて，従来「有機化合物の同位体

いこと，そして，使用する研究者や学生が，複雑な装置

分別は，軽い同位体同士の結合（例えば C- N）の開裂の内部構造や機能を十分に理解することができないことが，重い同位体を含む結合の開裂（例えば C- N）よりなどに原因があると考えられる．これらの課題を一度にも優先して起こることによって発生する」（例えば，全て解決することは容易ではないが，本稿によって，

Chikaraishi 2014）と考えられてきたが，その理論では十GC-IRMS という装置のポテンシャルが少しでも伝えら分に説明することができない同位体比の変化が多く報告

れたら，これから先，様々な分野で重要な研究手段の一されていた ．この事実は，それまで同位体を用いて研つとして積極的に使われるようになること，そして，優究してきた多くの研究者の頭を悩ませるのみならず，「有れた研究成果をもたらすことに少しでも貢献出来れば幸機化合物の安定同位体」という評価手法そのものの信頼

いである．

12

14

13

15

＊7

性を揺るがす大きな要因のひとつとなっていた．
しかし近年になり，生物の代謝反応における同位体分
別は，主に，水素化，脱水素化，炭酸固定，脱炭酸，ア

謝辞

ミノ化，脱アミノ化などの「元素の付加」や「脱離」を本稿の内容は，日本学術振興会科学研究費，若手研究伴う反応や，巨大プール（貯蔵物質）が「分解（酵素分20K14590（研究代表者 滝沢侑子），基盤研究 A（一般）解）される際の初期反応」により生じることがわかって

20H00185（研究代表者 力石嘉人），挑戦的研究（萌芽）きた．とくに動物（従属栄養生物）は，エサから得た有19H21888（研究代表者 力石嘉人）及び，シリコーン工

機物を分解することによってエネルギーを獲得している業会（Silicon Industry Association of Japan）からの寄付

ため，エネルギーを取り出すための主な代謝機構である金で実施した研究成果の一部を取りまとめたものであ

中央代謝に関わる生化学的・生理学的な反応が，有機化

る．

合物の安定同位体比を決定すると考えることができる．
実際に Takizawa et al.（2020）では，これまでにも述べてきた「アミノ酸分解における脱アミノ化」に加えて，「中央代謝（解糖系とクエン酸回路）における脱炭酸」との，双方の同位体分別が，アミノ酸の窒素同位体比・炭素同位体比それぞれに色濃く反映されるという仮説を提唱した．この仮説は，生体内で生じる様々な同位体比の＊7

呼吸により排出される二酸化炭素の同位体比が基質に比べて低くならないことや，アミノ酸の脱アミノ化において炭素と窒素の同位体分別が同調しないことなど，「結合の開裂」による同位体分別では説明できない現象が多い．

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アミノ酸の安定同位体比を用いた生態系解析
力石 嘉人1)2020 年 12 月 5 日受付，2021 年 2 月 10 日受理

アミノ酸の安定窒素同位体比の測定法の開発と方法論の確立を経て，生物の栄養段階（生態系ピラ
ミッドにおける階層）が優れた精度で推定できるようになったことにより，生物・生態系の研究は飛躍的に発展した．実際に，複雑な食物連鎖網における捕食─被食の関係や，生態系の中で何が起こっているのか，環境変化に対する影響や生物の適応などが正確に理解できるようになった．本稿ではその原理と応用研究を解説する．

Food webs viewed via stable nitrogen isotopic composition of amino acids
Yoshito Chikaraishi
Stable nitrogen isotope analysis of individual amino acids can be useful to illustrate the trophic position oforganisms in food webs, and therefore has resulted in impressive advances in ecological studies. Indeed, this analysis
has provided unprecedented accuracy in predicting the trophic tendencies of organisms, describing their interactions
in complex food webs, elucidating the adaptation of organisms to environmental changes, etc. Here, we briefly review
the principal of this tool and its application.
キーワード：安定同位体，窒素，アミノ酸，栄養段階，食物連鎖
Stable isotope, Nitrogen, Amino acid, Trophic position, Food web

養段階」という概念を導入し，生態系ピラミッドにおけ1. はじめにる生物の位置（または，階層）を定量的な数字で捉える

自然界の生態系では，生物間の捕食─被食の関係が極ことで，複雑な生態系を単純化して理解してきた（図 1）．

めて複雑に絡み合っており，その全容を観察等から正確

実際に，この栄養段階（値）もしくはその変化を知るこに理解することは難しい．そこで生態学では，一次生産とで，我々は，生物が何を食べているのかといった食性者（例：植物プランクトン）を「1」として，それを食べ

解析のみならず，生態系におけるそれぞれの生物の機る一次消費者（例：動物プランクトン）を「2」，それを能・役割や，人類活動が自然界の生物・生態系に与えて食べる二次消費者（例：小さい魚）を「3」，さらにそれいる影響を評価してきた（例えば，VanderZanden et al.,を食べる三次消費者（例：大きい魚）を「4」とする「栄1999）．
栄養段階を求める（数値化する）ために，これまで生

連絡先
力石 嘉人
北海道大学低温科学研究所〒060-0819 札幌市北区北 19 条西 8 丁目
Tel. 011-706-5472
e-mail：ychikaraishi@lowtem.hokudai.ac.jp⚑) 北海道大学低温科学研究所
Institute of Low Temperature Science,
University, Sapporo, Japan

態学では様々な手法が用いられてきた．しかし，自然界
では，植物と草食動物を除く生物の多くが雑食者（omnivore：植物と動物の両方を食べる動物，multiple carnivore：様々な栄養段階の動物を食べる動物）であるた
めに，研究対象の生物の「エサ生物」の特定は容易ではない．また，たとえ数値化できたとしても，得られた値
Hokkaidoには大きな誤差（例えば，栄養段階で±1～2）が潜在的に含まれており，導き出した値の正確さを担保できな力石 嘉人14する）．
試料に含まれる安定同位体の比率の表記には，一般的に，国際的に定められた標準物質に対する千分率（ H 値，
単位‰，式 1）が用いられている．
H 値＝[（R試料/R標準物質)－1]×1000(式 1)

ただし，R＝H/L
H と L は，それぞれ重い（例えば，15N）と軽い（例えば，N）同位体の存在量を表す．従って， H 値は，窒素の

14

場合には

15

N 値と表記する．試料の H 値が正であれ

ば，標準物質に対して重い同位体（H）が富むことを意

図 1：生態系ピラミッドの概念図と栄養段階

味し，反対に負であれば，軽い同位体（L）が富むことを意味する．

かった．例えば，体や口の大きさ，歯の形などを観察することで，生物間の相互関係を推定することも可能では

2.2．食物連鎖におけるアミノ酸のN 値の変化

15あるものの，栄養段階の「数値化」に至るのは困難であ生物を構成する 20 種類のアミノ酸には，食物連鎖のる．また，胃内容物の解析は，研究対象の生物が実際に捕食者と被食者の間で， 15 N 値がほとんど変化しない摂食したものがわかる一方で，自然界における捕食活動

Source アミノ酸（Src-AA，例えば，フェニルアラニン，の一瞬のスナップショットでしかない．その上，胃の中メチオニンなど）と， 15N 値が 3-8‰上昇する Trophicに残存するものと捕食者が吸収したものは必ずしも一致

アミノ酸（Tr-AA，例えば，グルタミン酸，アラニン，

しないというという問題があった．そこで，これまでのバリンなど）の 2 種類がある（図 2，図 3)※1．Src-AA

手法のデメリットを克服しうる手法として，2007～2009

は，分解（エネルギーを取り出すための異化）の初期反年にかけて，アミノ酸の窒素同位体比に基づく生物の栄

応にアミノ酸のアミノ基（窒素）が関与しないため，捕養 段 階 解 析 法 が 提 案 さ れ た（Chikaraishi et al, 2009,

食者が Src-AA を分解してもMcCarthy et al., 2009, Popp et al., 2009）．これは，生物にない．一方で Tr-AA は，分解の初期反応がアミノ基の含まれている 2 種類のアミノ酸の安定同位体比（ N/

脱離反応であるために，14N が優先的に反応し，その結14N）の差を計測することによって生物の栄養段階を正果，分解されずに残されたアミノ酸（このアミノ酸は後確に推定する手法であり，提案されてから約 10 年の間に捕食者の体を構築する）に 15N が濃縮する（例えば，に様々な研究に応用されるようになった．本稿では，そChikaraishi et al., 2007, Takizawa et al., 2020）．そしてこの原理と代表的な研究例を紹介したい．

のプロセスが，魚，甲殻類，昆虫，哺乳類，バクテリア

1515

N 値がほとんど変化しなどの多くの生物の間で共通して成立するため
（例えば，

2. 原理
2.1．安定同位体比の表記
アミノ酸は，水素・炭素・窒素・酸素・硫黄などの元素で構成され，これらの元素には質量が僅かに異なる安Steffan et al., 2015, Yamaguchi et al., 2017, McMahon and
McCarthy, 2016），植物プランクトンから高次捕食者まで，生態系を構成する様々な生物の栄養段階が，以下の一 般 式（式 2）に よ り 推 定 で き る（Chikaraishi et al.,2009）．

定同位体が存在する．例えば，窒素の場合，99.6337％が
質量数 14 の窒素 14（14N）で，残りの 0.3663％が質量数

栄養段階＝( 15NTr－ 15NSrc＋ )/(ΔTr－ΔSrc)＋1

15 の窒素 15（15N）であり，安定同位体比の比率（15N/N）は 0.0036765 となる．しかしこの値は，地球上の

(式 2)

14

様々な生化学的反応において，質量が異なることに起因する「軽い同位体（例えば，窒素の場合には 14N）の優先的な反応」が起こるために，元素の起源，反応過程，反応量などで変化する（15N/14N の小数点 4，5 桁目が変化「Source アミノ酸，Trophic アミノ酸」の分類は，生体内でのアミノ酸の「分解反応」により決定される．一方で，一般的に使われている「必須アミノ酸，非必須アミノ酸」の分類は，生体内でのアミノ酸の「合成反応」により決まっている．また，
Source アミノ酸なのか Trophic アミノ酸なのか，もしくは，さらに別の分類になるのかがわかっていないアミノ酸も多い．

＊1アミノ酸の安定同位体比を用いた生態系解析

15

図 2：アミノ酸の分類

15

NSrc， 15 NTr はそれぞれ，Src-AA と Tr-AA の15N

値を， は一次生産者（植物や植物プランクトンなど）における両者のアミノ酸のN 値の差を，ΔSrc，ΔTr は，

15

Src-AA と Tr-AA の食物連鎖の捕食者と被食者の間での15

N 値の変化を示す（図 3）．Src-AA と Tr-AA には，原理的には，様々なアミノ酸を組み合わせて用いることも，いくつかのアミノ酸の15

N 値の平均値を用いることも可能であるが，個々の生物におけるバラツキや，
15

N 値の測定し易さを考慮すると，Src-AA にフェニル

アラニンを，Tr-AA にグルタミン酸を用いた場合において，最も優れた精度（1 ＝ 0.1～0.2）で栄養段階を求めることができると報告されている（Chikaraishi et al.,2009）．
栄養段階＝( 15Nグルタミン酸－ 15Nフェニルアラニン＋ )/(8.0－0.4)＋1(式 3)

フェニルアラニン，グルタミン酸のΔ値はそれぞれ
0.4‰，8.0‰である．フェニルアラニン，グルタミン酸

図 3：食物連鎖におけるアミノ酸の安定窒素同位体比の変化を用いた場合には， は陸上植物（正確には，水草も含む
維管束植物）を基点とする生態系では 8.4‰であり，海することは容易ではない．そのため，とくに，単一のエ

水・淡水における植物プランクトンやシアノバクテリア

サでの飼育が難しいとされる生物（爬虫類，鳥類，大型を基点とする生態系では－3.4‰となる（Chikaraishi etの動物など）や，寒冷域や無酸素環境などといった特殊

al., 2010）．

な条件下で生育する生物に関するデータが著しく不足しなおこの原理が，全ての生物において成立する（同じ，ている．

ΔSrc，ΔTr 値を持つ）かどうかは，残念ながら十分にわ
かっていない（例えば，McMahon and McCarthy, 2016）．

2.3．アミノ酸の測定法の信頼性を担保するうえで，様々な生物が持つ

アミノ酸の

15

N 値の測定15N 値の測定は一般的に，(1)試料の酸加ΔSrc，ΔTr 値やそのバラツキ（そしてその要因）を知る

水分解，(2)誘導体化と精製，(3)ガスクロマトグラフ─

必要があるが，同位体比が一定のエサを用いて，アミノ

同位体比質量分析計（gas chromatograph-isotope ratio

酸のターンオーバーを考慮したうえでの十分な期間の飼

mass spectrometer：GC-IRMS）による育を実施（これを controlled feeding experiment という）より実施される．
「(1)試料の酸加水分解」では，試料にN 値の測定に15

力石 嘉人16

図 4：アミノ酸の 15N 値より求められた相模湾沿岸の岩礁域の生態系構造（Chikaraishi etal., 2014 を改変）

濃塩酸（HCl）を加え加熱することで，試料中のタンパクンなどで固定されたもの，貝殻や骨，歯などの硬組織中質をアミノ酸に加水分解する．
「(2)粗精製と誘導体化」に含まれているタンパク質にも問題なく用いることがででは，
まず試料中の脂質成分を液─液抽出により除去し，きる（例えば，Ogawa et al., 2013, Chikaraishi et al. 2014）．

アミノ酸が持つ「高い親水性，極性」という性質を，誘

実際に，少なくとも数万年前の人骨や動物骨などの考古導体化（本誌，第 1 章，安定同位体の天然存在量および学的試料への応用も実施されている（例えば，Naito et

安定同位体標識の検出法─ 1：ガスクロマトグラフ─同位

al., 2010, 2013, 2016, Itahashi et al., 2018, 2019）．

体比質量分析計を参照）により低下させ，また，GCIRMS へ導入できるように精製する．これまでに，様々な誘導体化法が検討され用いられてきているが，試薬の毒性，誘導体化後のアミノ酸の安定性，GC-IRMS への3. 実試料への応用
3.1．岩礁域生態系の構造解析

負荷，誘導体化反応における同位体分別など様々（一長岩礁域では，多種多様な生物が生息し，また，捕食─一短）である（Ohkouchi et al., 2017）ため，それぞれの研

被食関係が絡み合っているため，複雑な生態系構造を持

究室の環境にあわせて誘導体化法を選択する必要があ

つ．Chikaraishi et al.（2014）は，相模湾沿岸の岩礁域にる．またそれと並行して，誘導体化剤の毒性が低く，誘生息する海藻，貝，カニ，エビ，魚などの様々な生物を導体化されたアミノ酸の安定性が高く，また GC-IRMS

採取し，アミノ酸のへ与える負荷と人為的な同位体分別の影響が最小限にとの生態系構造を視覚化した（図 4）．アミノ酸のどめられるような理想的な誘導体化法を開発する必要がから見積もられた栄養段階は，ワカメなどの海藻がある．なお著者の研究室では，アミノ酸のカルボキシル

0.9～1.1，アワビやサザエなどの海藻食の貝やウニなど基（-COOH）をイソプロピルエステル化し，アミノ基をが 1.7～2.0 であり，前者が一次生産者，後者が一次消費

ピバロイル化するピバロイル／イソプロピル（pivaloyl/者であることがわかる．また，カニ・ヤドカリ・牡蠣な

isopropylesters, Pv/iPr）エステル化を用いている．
「(3)

どの栄養段階は，2.2～2.6 であり，これらの値から彼ら

GC-IRMS による

N 値の測定」では，GC-IRMS によが omnivore（植物と動物の両方を食べる雑食動物）であN 値の測定では，1 度の試料導入に対して，そこにることがわかる．さらに様々な魚，伊勢エビ，マダコな

る

15

15

含まれる個々のアミノ酸の

15

N値

N

どの栄養段階は，それぞれ，2.9～4.6，3.9，3.8 に分布値の測定に必要な時間は一般的に 1 測定あたり約 1～

し，彼らはこの海域における multiple carnivore（様々な1.5 時間，試料量はアミノ酸一分子あたり窒素量で数ナ

栄養段階の動物を食べる雑食動物）であることがわかる．

ノモル，測定精度は 0.4～0.8‰（1 ）程度である．この

このように，アミノ酸の測定手法は，冷凍試料や乾燥試料だけでなく，ホルマリ

差が± 0.1～0.2）から，雑食性のカニの中でも藻食性が15

N 値が測定される．

N 値から栄養段階を求め，岩礁域

1515N 値から求めた栄養段階（誤15アミノ酸の安定同位体比を用いた生態系解析17

図 5：アミノ酸の 15N 値より求められた，植物葉，キノコ，ハキリアリ，ハキリアリの体に付いているバクテリアの栄養段階（Steffan et al., 2015）．写真：(A)植物葉を切り取っているハキリアリ，(B)切り取った葉を巣に運んでいるハキリアリ，(C)栽培されているキノコ（菌類），(D)アリの体に付いている白いバクテリア

強いものから肉食性の強いものがいることや，魚でも種類によって食性が多様であることを明らかとなった．
3.2．ハキリアリが構築する生態系
ハキリアリは，北アメリカの東南部や中南米の熱帯雨林に生息するアリである．
キノコ（菌類）
をエサとしているが，そのキノコはハキリアリ自らが，様々な木の葉を切り取り，巣に運び，巣の中で栽培したものである．
Steffanet al.,（2015）は，ハキリアリの生態系を実験室で飼育・再現し，基礎生産者である植物の葉（Quercus macrocarpa），それを基に育てられたキノコ（Leucoagaricus
gongylophorus），ハキリアリ（Acromyrmex echinatior），
そしてハキリアリの体に付いているバクテリア（Actinobacteria：Pseudonocardia）をそれぞれ採取し，
アミノ酸の

15

N 値から栄養段階を算出し，生態系構造を視覚化した（図 5）．アミノ酸の

15

図 6：2000-2500 年前，300-400 年前，現在の Hawaiian Petrelの骨コラーゲンに含まれるアミノ酸（グルタミン酸とフェニ
ルアラニン）の 15N 値，および求められた栄養段階（Ostrom
et al., 2017）

N 値から見積もら

れた栄養段階は，植物葉が 1.0±0.1，
キノコが 2.0±0.1，

いる．一般的に，生態系の上位にいる生物は，環境変化

アリが 3.0±0.2 であり，当初の予想通りに，「植物葉はに対して最も影響を受けやすいと考えられいるため，

キノコのエサ」であり，また，「キノコはアリのエサ」でOstrom et al.（2017）は，2000-2500 年前，300-400 年前，あることが証明された．さらに興味深いことに，ハキリ

現在の Hawaiian Petrel の骨から，骨コラーゲンに含まアリの体に付いているバクテリアの栄養段階は 4.0±

れるアミノ酸の0.2 であり，ハキリアリはバクテリアに食べられており，

Hawaiian Petrel の 栄 養 段 階 を 算 出 し た（図 6）．骨 コバクテリアはこの生態系において栄養段階の頂点にいる

ラーゲンに含まれるフェニルアラニンとグルタミン酸のことが明らかとなった．

1515N 値を測定し，それぞれの年代の

N 値および栄養段階は，2000-2500 年前と 300-400 年

前の試料の間ではほとんど変化しなかったのに対し，
3.3．海鳥の栄養段階の推移
ハワイ諸島には，Hawaiian Petrel（Pterodroma sand-300-400 年前と現在の試料の間では，フェニルアラニンの15

N 値が 1.0‰の上昇を，グルタミン酸の

15

N 値が

wichensis）という海鳥が生息しており，彼らはイカや魚

1.6‰の減少を示し，それに伴い栄養段階が 0.3 減少しなどを捕食する multiple omnivore であると考えられてた．この年代（300-400 年前～現代）は，ハワイ諸島周辺

いる．Hawaiian Petrel の体サイズは，この数百年間でにおいて産業漁業が発展した時期であり，
このことから，

著しく減少したことが骨格標本などの記録からわかって

Hawaiian Petrel と人間との間で，魚などのエサ資源の力石 嘉人18

図 7：アミノ酸の 15N 値より求められた，アメリカ・五大湖（Superior 湖とMichigan 湖）の Coregonus 種の栄養段階：灰色が絶滅前で赤色が現存種（Blanke et al., 2018）

競争が激化したこと，それに伴いハワイ近海の生態系ピ食して生きていくことが可能な生物は，「ジェネラリス

ラミッドのサイズが小さくなった（食物連鎖が短くなっト（generalist）」とよばれ，彼らの栄養段階は，環境の変た）ことが考えられた．

化（とくにエサ生物の多様性の変化）に対応して変化すると考えられている．一方で，限定的な，あるいは単一

3.4．五大湖の Coregonus 種の栄養段階の推移の種類の生物をエサとして食べる生物は，「スペシャリアメリカ合衆国の五大湖には，かつて多くの種類のスト（specialist）」とよばれ，彼らの栄養段階は，環境のCoregonus 種（サケ科の淡水魚）が生息していたが，現変化が起こったとしても変化せず，一定の値をもつと考在ではその多くが姿を消し，数種が確認できる程度であえられている．この概念に基づくと，先述の 3.3，3.4．

る．Blanke et al.（2018）は，絶滅前に捕獲され，ホルマ章で示した Hawaiian Petrel や C. hoyi と C. kiyi は，リン漬けで保管されていた 7 種，そして現在の湖から採

generalist であるがゆえに，人間活動（漁業）によって生取した 2 種の Coregonus 種を対象に，アミノ酸のN

息環境が著しく変化しても，食性（エサ生物のバランス）値を測定し，絶滅前後における栄養段階の変化を比較しを変化させることで生き残り，一方で絶滅してしまったた（図 7）．アミノ酸のN 値から見積もられた栄養段

多くの種類の Coregonus 種は，specialist であったため

階は，絶滅前の Coregonus 種では 3.4～4.2 と多様であに，生息環境の変化に対応できなかったと解釈すること

り，C. hoyi と C. kiyi の 2 種では 4.0 以上という高い値ができる．この仮説を証明するために，Choi et al.（2020）となった．一方で，現存する C. hoyi と C. kiyi の 2 種のは，韓国の河川に生息するカマツカ（Pseudogobio eso-

栄養段階は，それぞれ，3.8，3.4 であり，絶滅前に比べcinus，specialist の代表種）とブラックバス（Micropterusて栄養段階は著しく低下していることがわかった．このsalmoides，generalist の代表種）を，河川の複数地点か

結果は，Ostrom et al.（2017）で述べたように，生態系にら採取し，アミノ酸の対する人間の介入（過剰な漁業による大きな環境変化）

偏差（1 ）を求め，生息数と生息環境のエサ資源の多様によって，C. hoyi と C. kiyi の 2 種は，短い食物連鎖の性との関係を調べた（図 8）．その結果，カマツカの栄養中で生きることを強いられている（短い食物連鎖に適応

段階は，どのような生息環境であってもほとんど同じ値できたために生き残れた）ことを示唆している．一方で，を持つが（標準偏差は 1 ＝0.2 と非常に小さい），その

他の多くの Coregonus 種は，このような外圧や大きな環

個体数は，生息環境のエサ資源の多様性が小さくなると境変化に耐えられなかったために絶滅してしまったと考ともに，減少していることがわかった．一方でブラックえることができた．

バスについては，生息環境のエサ資源の多様性が小さく

15

15

15

N 値から栄養段階とその標準

なると栄養段階は上昇し，その際に標準偏差も小さくな
3.5．環境変化に伴う生物の栄養段階の変化

ることがわかった．また，ブラックバスの個体数は，生植物と草食動物を除く多くの生物の食性は，3.3．や息環境が変化してもほとんど変化しなかった．この結果

3.4．章で述べてきたように，環境の変遷に伴って変化

は，generalist は，食性の多様性が大きいために，環境のするポテンシャルを持っている．多様な種類の生物を摂変化（エサ資源の変化）に順応して個体数を維持するこアミノ酸の安定同位体比を用いた生態系解析

19

図 8：アミノ酸の 15N 値より求められた，カマツカとブラックバスの栄養段階とそのバリエーションの変化，生息数（標準分
布のサイズ）と生息環境のエサ資源の多様性との関係（Choi etal., 2020）．

とができるのに対して，specialist は食性の多様性が小(3) ΔTr 値が，様々な生物種で一定になる原理・科学的さいために，環境の変化（エサ資源の変化）に対応でき

根拠（または，一定にならない時の特異的な条件）

ずに個体数を維持できなくなっていることを，明確に示を明らかにすることした．

本誌第 1 章（安定同位体の天然存在量および安定同位体標識の検出法─ 1：ガスクロマトグラフ─同位体比質量分析計）で説明されているように，食物連鎖の捕食者と4. 今後の課題
研究対象の生物に含まれるアミノ酸の被食者の間での Trophic アミノ酸の15

N 値の上昇は，

N 値に基づ

捕食者が，エサ（被食者）由来のアミノ酸を，脱アミノ

いて，その生物の栄養段階を優れた精度（1 ＝0.1～0.2）

化する際に生じる速度論的同位体分別のためであり，そで推定できる解析手法を確立したことは，生態学分野にの程度（同位体分別の大きさ，ΔTr）はレイリーモデル

大きなブレイクスルーをもたらし，この手法は，生態学（式 4）に従う．

15

のみならず，考古学・海洋生物学・昆虫学・地球化学な
どの周辺分野の研究においても積極的に用いられるよう

ΔTr≒1000[F( －1)－1］(式 4)になった．しかし，この手法を広く，多様な生物・生態系に適用するためには，克服せねばならない以下の 3 つ

ΔTr が反応前後での同位体比の変化（ 15Nt＝x－ 15Nt＝0）の大きな課題がある．

を，F が反応のフラックス（脱アミノ化されずに残った(1) controlled feeding experiment により，様々な生物

アミノ酸の割合）を， が反応固有の同位体効果（例え種について，エサと飼育生物の間のΔSrc，ΔTr 値をばグルタミン酸の場合， ＝0.9938，Goto et al., 2018）を決定すること（2.2 参照）示す．この式 4 に基づくと，ΔTr 値は，脱アミノ化する(2) 用いる試薬の毒性が低く，化学的に安定な誘導体化

反応のフラックス（F），すなわち「捕食者がエサ（被食物を生じ，かつ GC-IRMS への負荷が少なく，さら者）由来のアミノ酸をどのくらい分解したか」の関数にに人為的な同位体分別を生じない誘導体化法を，開なる．シンプルに考えれば，F は，生物の成育環境や条発すること（2.3 参照）

件や，エネルギー消費量などにより多様になると考えら力石 嘉人20

れるが，実際には，魚，甲殻類，昆虫，哺乳類，バクテ
リアなどの多くの生物で，ΔTr 値（とくにグルタミン酸）
は，ほとんど一定の値を持ち（例えば，Steffan et al., 2015,
Yamaguchi et al., 2017, McMahon and McCarthy, 2016），
それ故，前述の 3.1～3.5 で述べたように，アミノ酸のN 値は，一次生産者から高次捕食者までの様々な生物

15の栄養段階の推定に適用することができる．それでは一体なぜ，多くの生物でΔTr 値が類似した値になる（例えば，グルタミン酸で 8.0‰という値が普遍的に見つかる）のか，一方で，一体どのような条件，環境で，このΔTr 値が変化するのかは，今後明らかにすべき課題である．

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謝辞
本稿の内容は，日本学術振興会科学研究費，基盤研究
A（一般）20H00185（研究代表者 力石嘉人），挑戦的研
究（萌芽）19H21888（研究代表者 力石嘉人）及び，シ
リコーン工業会（Silicon Industry Association of Japan）
からの寄付金で実施した研究成果の一部を取りまとめたものである．

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安定同位体の天然存在量および安定同位体標識の検出法─ 2：ガスクロマトグラフ-質量分析計とMassWorks
力石 嘉人1)＊，滝沢 侑子1)，布浦 拓郎2)2020 年 11 月 25 日受付，2021 年 1 月 11 日受理

分子内 Stable Isotope Probing 法とは，特定の部位を人工的に同位体標識した基質（ブドウ糖など）を用いて，その同位体標識の移動を，単一の生物体内，生物群集内，または海底の堆積場で追跡することで，試料中で起きている代謝合成経路の可視化や，生化学反応の特定を行う手法である．この手法は，近年，ガスクロクロマトグラフ-質量分析計（GC-MS）と質量のキャリブレーション用のソフト
ウェア MassWorks の組み合わせにより，大きく発展した．本稿では，この手法の原理について解説する．

Stable isotope analysis -1: MassWorks on conventional gas chromatograph-mass spectrometer
Yoshito Chikaraishi, Yuko Takiawa and Takuro Nunoura
MassWorks is an acquisition software that works on the mass spectra of conventional gas chromatograph-mass
spectrometer, to determine stable isotope labels in organic compounds. The analysis of the isotope labels at the level ofindividual positions in organic compounds is potentially highly useful as a novel ‘Position-Specific Stable Isotope
Probing’ to trace metabolic flow and associated function in diverse samples including single organisms and biotic
community as well as sedimentary site. We review a brief outline of MassWorks and its application.
キーワード：SIP 法，安定同位体，アミノ酸，代謝
SIP, Stable isotope, Amino acid, Metabolism

生物体内，生物群集内，または海底の堆積場などにおい

1. はじめにて，試料中で起きている代謝合成経路の可視化や，生化

水素・炭素・窒素などの有機化合物を構成する元素に学 反 応 の 特 定 を 行 う こ と が で き る．こ れ を Stable

は，安定同位体が存在するが，重い同位体の平均存在量

Isotope Probing 法（SIP 法）といい，とくに，代謝物（有は，それぞれ，約 0.0115％(D)，1.07％(13C)，0.364％

機化合物）の個々の部位（例えば，1 位の炭素，2 位の炭（ N）と，非常に僅かである．そこで，基質（ブドウ糖，素）ごとの同位体標識を追跡する手法を，分子内 Stable

ピルビン酸，酢酸など）の特定の部位を人工的に重い安Isotope Probing 法（分子内 SIP 法，図 1）という．

15

定同位体（D， C， N など）で標識し，培養や飼育後の

従 来 の SIP 法 は，
（1）高 速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ

代謝物に含まれる重い同位体を追跡することで，単一の（HPLC：High Performance Liquid Chromatograph）等

13

15

連絡先
力石 嘉人
北海道大学 低温科学研究所〒060-0819 札幌市北区北 19 条西 8 丁目
Tel. 011-706-5472
e-mail：ychikaraishi@lowtem.hokudai.ac.jp＊⚑）北海道大学 低温科学研究所
Institute of Low Temperature Science, Hokkaido
University, Sapporo, Japan⚒）国立研究開発法人海洋研究開発機構
Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology(JAMSTEC), Yokosuka, Japan力石 嘉人，滝沢 侑子，布浦 拓郎

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らの（1）
，
（2）の双方において，研究対象（目的）の代謝物（有機化合物）を単離・精製すること自体が困難な場合が多く，これらの理由から，SIP 法の活用・利用は
なかなか広がっていないのが現状である．
こ の よ う な 背 景 を 受 け て，近 年 で は，従 来 の 方 法（HPLC，NMR，EA-IRMS，GC-IRMS）を用いるのではなく，一般的なガスクロクロマトグラフ-質量分析計（GC-MS：Gas Chromatograph-Mass Spectrometer）で得られたデータに対して，質量キャリブレーション用のソフトウェア「MassWorks（Cerno Bioscience 社製，国
図 1：分子内 Stable isotope Probing 法（分子内 SIP 法）の概
念図．赤丸が安定同位体（13C）で標識した部位を示す．

内では Gerstel 社が販売）」を用いて，有機化合物の部位
ごとの同位体含有量を正確に（同位体の濃度で，1～2％の誤差で）解析する「分子内 SIP 法」の研究が積極的に行われるようになった．この手法の利点は，煩雑な単を用いて目的の化合物を単離・精製した後に，核磁気共離・精製プロセスを経ずに，研究対象の試料中に含まれ鳴スペクトル（NMR：Nuclear Magnetic Resonance）装ている数 ng の有機化合物について，その「分子内の同置で標識された部位を特定する，もしくは（2）抽出・精位体標識位置」
を正確に特定し，
またその濃度を，
2～99％

製等の前処理を施した後に，元素分析-同位体比質量分の同位体存在量の範囲であれば，1～2％の誤差で定量す

析 計（EA-IRMS：Elemental Analyzer-Isotope Ratio

ることができる．すなわち MassWorks を使うことで，

Mass Spectrometer）やガスクロマトグラフ-同位体比質

高濃度標識が必要な NMR 法と極低濃度標識しか分析で量分析計（GC-IRMS：Gas Chromatograph-Isotope Ratio

きない IRMS 法のちょうど中間（低～高濃度標識の）領

Mass Spectrometer）を用いて化合物ごとの標識率を調域で，分子内 SIP 法が利用できることになり，様々な研究

べる，のどちらかが一般的であった（図 2）．しかしこれへの応用が期待されている．
そして実際に，始原的系統群らの手法には一長一短があり，（1）NMR は，部位ごとのに属する水素酸化好熱細菌における可逆的な TCA 回路

標識を簡単に評価できるが，一般的に感度が悪く，測定の発見などに貢献している（Nunoura et al., 2018）．
本稿でには，高標識率の（例えば，測定したい部位の炭素の 50％

は，この MassWorks を使った解析法の原理を紹介する．

以上が C に置換されている）数 mg の有機化合物を必13要とする．一方で，（2）IRMS は，同位体の天然存在度を測定するために設計されている機器であるために，
極々低濃度の同位体標識（0.数％）は正確に測定できる

2. SIP 法に使用されてきた分析装置の例
2.1．ガスクロマトグラフ-質量分析計（GC-MS）

が，数％を超える濃度の標識の分析はできない．また，

一般的なガスクロマトグラフ-質量分析計（GC-MS）

有機化合物全体の同位体標識率は測定できるが，部位ごでは，試料（様々な有機化合物の混合物）はまず，ガスとの標識を測定することは非常に難しい．さらに，これクロマトグラフ（GC）で，1 つ 1 つの有機化合物に分離

図 2：SIP 法に用いる 3 つの手法と，それらが対応している分析対象の有機化合物の 13C の濃度

安定同位体の天然存在量および安定同位体標識の検出法─ 2：ガスクロマトグラフ-質量分析計と MassWorks25

において，有機化合物は，相対分子質量ではなく，モノ
アイソトピック質量に基づいて分離されるので，同じ化学組成式で示される有機化合物であっても，同位体組成の異なる分子イオン（例えば，12C13H22NO4，12C12[13C]H22
NO4 と 12C11[13C2]H22NO4）は分離され，それぞれの分子
イオンピークがマススペクトル上に観測される（図 4）．

図 3：質量分析計の基本概念図

また，イオン化された有機化合物は化学的に非常に不安される．そして，その後，質量分析計（MS）のイオン化定であるため，壊れた際に化合物構造に特異的なフラグ室に導入されてイオン化され，磁場（電極）によって異メントイオンを生じる．その際に生じたフラグメントイなる質量のイオンが分離される（図 3）．質量分離の基本

オンも，分子イオンと同様に，同位体組成の異なるイオ式（式 1）は，

ンピークが観測される（図 4）．
m/z ＝ B2r2e/(2V)（式 1)

このように，原理的には，同位体組成の異なる「分子イオン」と「フラグメントイオン」のピーク強度を比較

質量（m），電荷数（z），磁場強度（B），軌道の半径（r），することで，有機化合物の，どの元素に，どれくらい同電子の電荷（e），加速電圧（V）を用いて示され，m/z 値

位体標識が入っているのかを推定することが可能であの異なるイオンの軌道の半径（r）は，磁場強度（B）またる．一般的に，測定に必要な試料量は化合物あたり ng

は加速電圧（V）の関数になる．m/z 値は，電荷数（z）

オーダーである．しかし GC-MS を用いた SIP 法は，が 1 の場合には，そのまま質量（m）ということになる．

GC の条件（GC カラムのブリードや，汚れなど）により，すなわち，磁場強度（B）または加速電圧（V）をコント

観測されるフラグメントイオンの強度が変化しやすいこ

ロールし，軌道の半径（r）を連続的に変化させることで，とに加えて，異なる元素の同位体（2H，13C，15N）を区別

1 つの検出器で一定の範囲の m/z 値（例えば 50～500）

す る こ と が 困 難 で あ る（例 え ば，12 C13 H21 [2 H] NO4のイオンを検出する（スキャン）ことができる（詳細は，と 12C12[13C]H22NO4 は，少数点 1 桁の質量分解能では区

質量分析に関する様々な書籍があるので参照して頂きた

別できない）ために，低濃度（20～30％以下）の同位体

い，例えば，質量分析学─基礎編─など）．実際の MS で標識の検出は難しい．

は，様々なタイプの磁場（電極）が用いられており，例
えば一般的な GC-MS で使用されている四重極型の質量2.2．核磁気共鳴（NMR）装置

分析計では，4 本の電極を用いることで特定の質量（m/z

核磁気共鳴（NMR：nuclear magnetic resonance）装置値）のイオンが，連続的に検出器へ送られる．質量分析

では，有機化合物中の 1 つ 1 つ部位の炭素，あるいは窒

図 4：グルタミン酸誘導体化物を GC-MS で分析した際の質量スペクトル力石 嘉人，滝沢 侑子，布浦 拓郎

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例えば，一般的な共鳴周波数（磁場強度）が 400 MHz のNMR 装置では，1 mg のアラニンの 13C-NMR スペクトルを測定するために約 1 時間必要である．NMR 装置の感度は，共鳴周波数（磁場強度）の 3/2 乗に比例し，また測定時間の 1/2 乗に比例するため，磁場強度 900 MHzの NMR 装置を約 1ヶ月間用いることができれば，10 gのアラニンでも同位体標識の測定が可能であるが，膨大な時間と費用がかかる上，それでも GC-MS に比べると検出感度が 3～4 桁も低い．
2.3．ガスクロマトグラフ-同位体比質量分析計（GC-IRMS）
ガスクロマトグラフ-同位体比質量分析計（GC-IRMS）
は，試料（混合物）をガスクロマトグラフ（GC）で分離した後，GC に直結している反応炉で有機化合物を H2，
CO2，N2 等のガスに変換し，同位体比質量分析計（IRMS）
でガス中の同位体組成を測定する（詳細は，本誌の第一

図 5：アラニンの 13C-NMR スペクトル

章「安定同位体の天然存在量および安定同位体標識の検出法─ 1：ガスクロマトグラフ-同位体比質量分析計」を素の原子核の歳差運動の回転周期に共鳴するラジオ波を参照して頂きたい）．上記 2.1.1 で示したように，一般

外部から加えることによって共鳴させ，その時に生じる的な GC-MS では，磁場強度（B）または加速電圧（V）

エネルギーの吸収量を「NMR スペクトル」として測定を連続的に変化させ，1 の検出器を用いて，広い範囲のする．この時，与えられた周波数に対して検出された

m/z をスクリーニング的に検出する．一方で GC-IRMS

ピークが出現する領域を化学シフト（単位は ppm）と呼では，磁場強度（B）または加速電圧（V）を一定に設定

ぶ．共鳴周波数は，対象とする原子周辺の物理・化学的

し，複数の検出器を用いて，イオン化されたガスに含まな構造，例えば，有機化合物の構造がどのような形か，れる主要な同位体分子種（例えば二酸化炭素では，m/z

みている元素が化合物の中でどこに位置するか，周囲に44＝12C16O2，m/z 45＝13C16O2，12C17O16O，m/z 46＝12C18

どのような官能基があるか，などで決定されるため，有O16O）を定量的に検出する．さらに，同位体分子種の存機化合物の 1 つ 1 つの部位の炭素あるいは窒素は，異な在量に合わせて，検出されるシグナルを電気的に増幅さる化学シフトを示し，また各々のスペクトルの強度かせており（例えば，m/z 45 で約 100 倍，m/z 46 で約ら C や N の含有量を推定することができる（詳細は，10,000 倍），存在量の少ない重い同位体を持つ分子種のNMR 装置に関する様々な書籍があるので参照して頂き測定感度が高い．そして，この複数の m/z の同時検出

たい，例えば，NMR 入門：必須ツール 基礎の基礎なにより，GC-IRMS は，安定同位体組成の自然界での僅ど）．例えば，アラニンの 13C-NMR スペクトルを測定すかな変動でも正確に測定することができる．

13

15

ると，カルボキシル炭素， 炭素， 炭素は，それぞれ

このように，GC-IRMS を用いることで「有機化合物

175～180 ppm，50～55 ppm，15～20 ppm の化学シフト全体」として同位体標識がどれくらい入っているのかをで検出される（図 5a）．また，このアラニンの炭素を測定することができる．測定に必要な試料量は，一般的2％の C で標識化すると， 炭素のシグナル強度が Cに，化合物あたり ng から g オーダーである．ただし，の含有量に比例して高くなる（図 5b）．

GC-IRMS を使った SIP 法は，GC-IRMS が安定同位体1313

このように NMR 装置を用いることで，同位体標識が組成の自然界での変動の測定用に作られていることもあ

有機化合物のどの元素にどれくらい入っているのかを推り，極めて低い濃度（13C で約 2％以下）に標識化された定することが可能である．ただし，SIP 法として利用す試料を用いる必要がある．また，同位体標識された位置

るには，13C-NMR および 15N-NMR は感度が十分でないが有機化合物のどの元素に入っているかを推定するも困ため，特定の部位に，高濃度（50％以上）の同位体標識難である．

が導入された有機化合物が mg オーダーで必要になる．

安定同位体の天然存在量および安定同位体標識の検出法─ 2：ガスクロマトグラフ-質量分析計と MassWorks27

図 6：アラニン誘導体化物の質量スペクトル：（a）全体，（b）m/z 128 付近，（c）MassWork による
質量キャリブレーション後の m/z 128 付近

3. MassWorks を用いた SIP 法
3.1．MassWorks の原理
MassWorks（Cerno Bioscience 社 製，国 内 で はGerstel 社が販売）は，一般的な GC-MS で得られたデータ（質量スペクトル）を，（1）独自の補正関数でガウス分
布に変換し，また（2）安定同位体の天然存在度の補正を行うことで，精密質量を得ることができる「質量キャリブレーション」用のソフトウェアである（図 6）．一般的には，未知の有機化合物の精密質量の測定に用いられているため，質量スペクトル，安定同位体の天然存在度との関係性は，以下のように示される：[質量スペクトル]＋[安定同位体の天然存在度]⇨[未知化合物の精密質量]

図 7：アラニン誘導体化物の質量スペクトル（m/z 128 付近を拡大）と，MassWorks で求めた同位体分子種の割合

一方で SIP 法では，知りたい情報が「代謝産物（有機化合物）の，どの部位に，どの程度の同位体標識が含まオンフラグメント（C7H14NO）について，質量スペクトれているか」であるため，研究対象の有機化合物の化学

ルを MassWorks で解析すると，含まれている主な同位構造は既知であることが多い．そこで，

体分子種：C7H14NO：C6[13C]H14NO：C6[13C2]H14NO の存在割合が，それぞれ 0.969：0.006：0.026 と計算される[質量スペクトル]－[化合物の既知の精密質量]（図 7a）．これに対し，同じ化合物の 1 つの炭素を数％⇨[同位体標識の存在量]の 13 C で 標 識 し た も の は，そ れ ぞ れ，0.752：0.168：
0.080 と計算され，13 C の標識率に対応して C6 [13 C]H14に示すように，MassWorks の解析において，ガウス分

NO の存在量が増加する（図 7b）．

布に変換した質量スペクトルに，既知の精密質量の情報

このように，MassWorks を用いることで，上記（2.1を与えることで，分子イオンおよびフラグメントイオン

章）の GC-MS の欠点（観測されるフラグメントイオン

中の同位体標識の存在量を求めることができる．例えの強度が変化しやすいことや，異なる元素の同位体を区ば，アミノ酸の 1 種であるアラニン（誘導体化物）のイ

別することが困難なこと，など）を克服することができ，

力石 嘉人，滝沢 侑子，布浦 拓郎

28

図 8：13C％の補正の例

理論的には，同位体組成の異なる分子及びフラグメント
イオンのピーク強度を比較することで，有機化合物の部

4. おわりに

位ごとの同位体標識率を 2～99％の範囲であれば，正確

NMR 装置を用いた SIP 法は，同位体標識が有機化合に特定することができる．また，GC-MS の分析感度で物の「どの部位にどれくらい入っているのか」を推定す

測定が行えるため，研究対象の試料中に数 ng オーダー

ることができる強力な手法であるが，試料として，高濃で含まれている有機化合物について，同位体標識率を測度（50％以上）で同位体標識された有機化合物が mg オー

定することができる．

ダーで必要である．GC-IRMS を用いた SIP 法は，測定に必要な試料量が，化合物あたり ng から g オーダーで3.2．キャリブレーションある．しかし，同位体標識が有機化合物に「化合物全体

上述のように，MassWorks では，例えば，アラニン

としてどれくらい入っているのか」を推定することがで（誘導体化物）のフラグメントイオン（C7H14NO）の 3 つきるが，1 つ 1 つの元素の標識率にはアクセスできない．

の同位体分子種：C7H14NO：C6[13C]H14NO：C6[13C2]H14

また，極めて低い濃度（13C で約 2％以下）で同位体標識

NO の存在割合は，それぞれ 0.752：0.168：0.080 と計を使用する必要がある．従って，NMR や GC-IRMS を算され，合計すると 1.0 になる．しかし，標識される元用いた SIP 法は，残念ながら多くの研究にとって，実用

素の数が多い場合や，質量スペクトル上で同じ（あるい

的ではなかった．

は近い）m/z 値を持つフラグメントが重なるなどの原因

一方で，MassWorks を用いることは，高濃度標識がによって，得られた同位体分子種の存在割合の合計値が必要な NMR 法と極低濃度標識しか分析できない GC-

1.0 にならなかったり，マイナス値（例えば，－0.03 な

IRMS 法のちょうど中間（低～高濃度標識の）領域で，ど）になったりすることがある．従って，MassWorksSIP 法が利用できることを意味する．また，数 ng オーを用いて解析をおこなうためには，あらかじめ標品（非ダーの有機化合物について，その「分子内の標識位」を標識体）を用いて，得られた値（測定値）が適切なスケー

特定することが可能である．従って，試料量が限られてルになるようにキャリブレーションする必要がある．

いる，試料量は十分にあるが目的の有機化合物の含有量

実際に，アラニンの誘導体化物に関して，非標識のもが少ない，高濃度標識が入手できない，などの研究でも，のと， 位に C を 16％導入した標識のものとの分析結SIP 法の利用が現実的になる．本誌 4 章（マルチオミク

果を MassWorks で解析すると，分子種 C6 [ C]H14 NO

ス解析による好熱性水素酸化細菌からの可逆的 TCA 回の存在割合は，非標識のもので－0.032，16％標識のもの

路の発見）に，この手法を用いて明らかにした最新の研で 0.125 と計算される（図 7a）．このような場合には，究成果を紹介する．

13

13－0.032 から 1.0 の計算値が，1.1％（天然存在度）から100％の 13 C 濃度に対応するように補正を行うことで，
C6[13C]H14NO の正確な存在量を求めることができる（図8）．

謝辞
本稿の内容は，日本学術振興会科学研究費（基盤研究A：研究代表者 布浦拓郎）（19H00988）及び，シリコー

安定同位体の天然存在量および安定同位体標識の検出法─ 2：ガスクロマトグラフ-質量分析計と MassWorks

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ン工業会（Silicon Industry Association of Japan）からのHarada, T., Mori, K., Kato, Y., Miyazaki, M., Shimamura, S.,

寄付金で実施した研究成果の一部を取りまとめたもので

Yanagawa, K., Shuto, A., Ohkouchi, N., Fujita, N., Takaki, Y.,
Atomi, H. and Takai, K. (2017) A primordial and reversibleある．

TCA cycle in a facultatively chemolithoautotrophic thermophile, Science 359, 559-563.

引用文献

Hore, P.J.（著）.，岩下孝，大井高，楠見武徳（翻訳）（2017）

Nunoura, T., Chikaraishi, Y., Izaki, R., Suwa, T., Sato, T.,

豊田岐聡（2016）質量分析学─基礎編─，日本質量分析学会

NMR 入門：必須ツール 基礎の基礎．化学同人

低温科学 79 （2021） 31-36
doi: 10.14943/lowtemsci. 79. 31

マルチオミクス解析による好熱性水素酸化細菌からの可逆的 TCA 回路の発見
布浦 拓郎1)，力石 嘉人2)，跡見 晴幸3)2020 年 12 月 9 日受付，2021 年 1 月 22 日受理

生物による炭素固定は地球上の生命そして生態系の維持において必須の機能であり，還元的 TCA
回路（reductive tricarboxylic acid cycle）は，ウッドリュンガル（Wood-Ljungdahl）経路（アセチルCoA 経路）と並び，最も始原的な炭酸固定経路ではないかと考えられてきた．我々は始原的系統群に属す好熱性水素酸化細菌 Thermosulfidibacter takaii に対するマルチオミクス解析を実施し，二酸化炭素や有機酸等，入手可能な炭素源により機能方向が変化する可逆的 TCA 回路を発見した．更に，
この TCA 回路の性質を基に，初期生命が還元的 TCA 回路でなく，可逆的 TCA 回路を保持した可能性を提唱した．

A primordial and reversible TCA cycle in a facultatively
chemolithoautotrophic thermophile revealed by multi-omics
Takuro Nunoura, Yoshito Chikaraishi, Haruyuki Atomi
Inorganic carbon fixation is essential to sustain life and ecosystem on Earth. The reductive tricarboxylic acid(rTCA) cycle, also known as the citric acid cycle, and the Wood-Ljungdahl pathway, also known as the acetyl-CoA
pathway, are the most ancient carbon fixation metabolisms. A combination of multi-omics analyses revealed apreviously unknown reversible TCA cycle whose direction was regulated by available carbon sources such as
inorganic carbon and organic acids. Moreover, we hypothesized that primordial life harbored the reversible TCA cycle
but not rTCA cycle.
キーワード：好熱菌，TCA 回路，代謝解析，安定同位体
Thermophile, TCA cycle, Metabolomics, Stable isotope

1. はじめに連絡先
布浦 拓郎
海洋研究開発機構 生命理工学センター〒237-0061 神奈川県横須賀市夏島町 2-15
Tel. 046-867-9707
e-mail：takuron@jamstec.go.jp⚑) 国立研究開発法人海洋研究開発機構
Japan Agency for Marine-Earth Science & Technology(JAMSTEC), Yokosuka, Japan⚒) 北海道大学 低温科学研究所
Institute of Low Temperature Science, Hokkaido
University, Sapporo, Japan⚓) 京都大学大学院工学研究科
Graduate School of Engineering, Kyoto University, Kyoto,
Japan

教科書にはミトコンドリアにおけるエネルギー生産の主要経路として，クエン酸回路，つまり酸化的 TCA 回路（oxidative tricarboxylic acid cycle）が記述されている．
勿論，酸化的 TCA 回路はミトコンドリアだけでなく，好気性細菌にも広く分布する．その一方で，微生物における TCA 回路を見渡せば，回転方向の異なるもの，部
分的に欠失した経路やバイパス経路も知られており，更に，回路を担う個々の化学反応を担う酵素にも多様性が存在する．このように TCA 回路は全生物に共通する基
本的な代謝系であるため，回路を構成する化合物のネッ
トワークとしての保存性は非常に高いが，生命現象としては柔軟であり，教科書に書かれている「好気性生物に

布浦 拓郎，力石 嘉人，跡見 晴幸

32

図 1：完全型 TCA 回路の多様性

おけるエネルギー獲得経路」とは，その 1 つの型，そしまた，熱力学的に TCA 回路の多様性を比較すると，て 1 つの役割に過ぎない．多様な TCA 回路が有す機能

最も安定な完全型 TCA 回路は分岐型経路である．酸化の本質は，「アミノ酸や核酸等の前駆体となる中間代謝

的，還元的回路のいずれも，他の酵素反応との共役等を

物 の 生 産」で あ る（Smith and Morowitz 2004;

必要とする非自発的な反応（吸エルゴン反応）を含む．

Wächtershäuser 1990）．そして，その起源は生命の誕生

特に，酸化的回路におけるリンゴ酸脱水素酵素（malate

以前の「化学進化の時代」にまで遡る可能性が指摘されdehydrogenase）が触媒する反応は，極めて非自発的なており，TCA 回路の非生物学的な再現は，現在，化学進

吸エルゴン反応である（ΔG0ʼ＋30 kJ）．なお，還元的回化の再現・実証研究における最も競争的な研究対象の一路においては，ピルビン酸：フェレドキシンオキシドレ

つとなっている．

ダクターゼ（ピルビン酸合成酵素）（pyruvate ferredoxin oxidoreductase）及び 2-オキソグルタル酸：フェレド

2. TCA 回路の多様性
完全型の TCA 回路として，酸化的 TCA 回路，酸化的回路とは真逆に回転することで炭酸固定に機能する還キシンオキシドレダクターゼ（2-オキソグルタル酸合成酵素）oxoglutarate ferredoxin oxidoreductase（いずれも
G0ʼ＋19 kJ）が吸エルゴン反応で機能する（Fuchs 2011）（図 1）．

元的 TCA 回路の他，分岐型経路が知られている（図 1）．

更に近年，生命進化，生態学的観点から，還元的 TCA

酸化的 TCA 回路は好気性生物だけでなく嫌気性微生物

回路に注目が集まっている．生命進化において，還元的にも広く分布し，還元的 TCA 回路も後述の通り嫌気性

TCA 回路はメタン菌等の炭酸固定経路として知られる微生物だけでなく好気性微生物にも分布する．そして完

ウッドリュンガル（Wood-Ljungdahl）経路（アセチル

全型の分岐型 TCA 回路は嫌気性従属栄養微生物から見CoA 経路）と並び，最も始原的な炭酸固定経路であると出 さ れ て い る．一 方，回 路 を 担 う 酵 素 群 の 分 布 か ら考えられている（Smith and Morowitz 2004; Braakman

TCA 回路の多様性を見ると，教科書にクエン酸回路とand Smith 2012）．そして，現在の地球環境においても，して記述される主に好気条件下で機能する酵素群がむし

還元的 TCA 回路は水圏・陸圏に広範に生息する亜硝酸ろ例外的であり，嫌気性微生物に分布する酸化的 TCA

酸化菌等へも分布することが近年の研究で明らかにさ回路を担う酵素群は，還元的 TCA 回路や分岐型 TCA

れ，酸素が豊富に存在するグローバルな生態系において回路を担う酵素群と共通性が高い．還元的 TCA 回路とも改めてその重要性が再評価された（Lücker et al. 2010;

他の TCA 回路を分けるのは，還元的 TCA 回路におけ

Pachiadaki et al. 2017）．従来，還元的 TCA 回路は限らる ク エ ン 酸 開 裂 反 応 を 担 う ATP ク エ ン 酸 リ ア ー ゼ

れた嫌気環境や貧酸素環境における主要炭酸固定経路の（ATP citrate lyase）（クエン酸＋CoA＋ATP-＞アセチ

一つと考えられてきたが，もはや，特殊な炭酸固定経路

ル CoA＋オキサロ酢酸＋ADP）やその機能を 2 段階でという認識は誤りとなった．

担うシトリル CoA 合成酵素（citryl-CoA synthetase）（ク
エン酸＋CoA＋ATP-＞シトリル CoA＋ADP）及びシト
リ ル CoA リ ア ー ゼ（citryl-CoA lyase）（シ ト リ ル
CoA-＞アセチル CoA＋オキサロ酢酸）の存在のみである（Aoshima et al. 2004ab）．

3．Thermosulfidibacter における可逆的 TCA 回路
上述のように，TCA 回路は古典的でありながら，なマルチオミクス解析による好熱性水素酸化細菌からの可逆的 TCA 回路の発見

33

おかつ新しい研究対象であり続けている．筆者らは好熱性は示している．しかし，TCA 回路の機能方向を直接性水素酸化菌の生理生態を研究する中で，始原的バクテ

証明するものではないからである．T. takaii においてリ ア 系 統 Aquificae 門 に 属 す 嫌 気 性 好 熱 菌

TCA 回路を構成する酵素反応は，全て可逆的であり，

Thermosulfidibacter takaii より，新たな形の TCA 回路

また，同様に TCA 回路が機能するであろう混合栄養条を見出し報告した（Nunoura et al. 2018）．T. takaii は高件でも回路が還元方向に機能するのか等，疑問は尽きな温環境（至適増殖温度 70℃）において，水素を酸化してい．従来，このような場合，安定同位体標識した基質を硫黄を還元することでエネルギーを獲得し，炭酸固定に投与し，鍵となる中間代謝産物の標識を評価する解析が依存する独立栄養条件の他，水素をエネルギー源，酢酸

NMR や LC-MS 等を用いて行われてきた．しかし，力やコハク酸等の有機酸等を炭素源とする混合栄養条件で石ら（本誌 3 章）がまとめるように，NMR は多量の試料も増殖することが出来る（注：混合栄養増殖には複数のを必要とし，T. takaii のように細胞収量が低い菌株への意味が存在するが，本報における“混合栄養生物”は，無適用は極めて困難である．また，LC-MS を用いて細胞機化合物を電子供与体，有機化合物を少なくとも一部の内の遊離有機酸を測定する手法も大腸菌等よく増殖する

炭素源として利用し，増殖する生物を意味する）．研究

微生物を対象に利用されているが，この手法も細胞収量開始当初，筆者らは他の Aquificae 門細菌と同様，T.

の低い菌株への適用は現実的ではなかった．そこで現れtakaii は独立栄養条件では還元的 TCA 回路により炭素たのが，筆者（力石）らが有機地球化学の新しい研究手固定を行うと予想した．しかし，本菌のゲノムには，段として検討してきた，GC-MS と解析ソフトウェア

TCA 回路に関する完全な遺伝子が揃う一方，還元的

MassWorks を組み合わせた新たな手法である．一見異TCA 回路に不可欠なクエン酸開裂反応を担う ATP ク

なる研究分野の融合により，低い細胞収量が故に代謝解

エン酸リアーゼやその機能を 2 段階で担うシトリル

析が困難であった環境微生物を対象とし得る新しいオミ

CoA 合成酵素及びシトリル CoA リアーゼをコードする

クス研究の手段が誕生したのである．

遺伝子が存在せず，また，既知の他の炭素固定経路（ウッ

新手法では，力石ら及び澄田らに詳述されている通り

ドリュンガル経路やカルビンベンソン回路等）を担う遺（本誌 3 章及び 6 章）
，既存の手法と同様，培養基質に含伝 子 セ ッ ト も 見 出 さ れ な か っ た．そ こ で，筆 者 等 はまれる特定の炭素原子を「炭素 13」で標識し，T. takaii「ATP クエン酸リアーゼを代替する何らかの仕組みで還がピルビン酸，オキサロ酢酸，2-オキソグルタル酸を前元的 TCA 回路が機能する」と仮説し，独立栄養条件及駆体として生産したアミノ酸，即ち，アラニン，アスパ

び混合栄養条件で培養した細胞を用い，細胞粗抽出液のラギン酸，グルタミン酸の「どの炭素原子」に「炭素 13」

酵素活性測定，トランスクリプトーム及びプロテオーム

が取り込まれているのかを，以下のように定量し，代謝解析を実施した．その結果，TCA 回路が試験した全て

経路の流れを判断する．

の培養条件で恒常的に発現し機能していること，
そして，(1) 安定同位体標識した基質を用いた培養非常に高いクエン酸合成酵素（citrate synthase）活性（ア(2) 全菌体蛋白質の加水分解とアミノ酸の誘導体化

セチル CoA＋オキサロ酢酸-＞クエン酸＋CoA）が常に(3) ガスクロマトグラフ─質量分析計（GC-MS）による存在することが明らかとなった．また，独立栄養細胞においても，ATP クエン酸リアーゼ活性が認められない
一方，独立栄養，混合栄養いずれの細胞においても，クエン酸合成酵素の逆反応によるクエン酸開裂反応は検出

分析(4) ソフトウェア（MassWorks）による炭素 13 の標識率を算出(5) TCA 回路の反応方向の確定された．そして，このクエン酸合成酵素の逆反応活性は

この結果，T. takaii において，以下のように，TCA 回

還元的 TCA 回路を有す Aquificae 門細菌の ATP クエ

路は増殖条件により，極めて柔軟な振る舞いをすること

ン酸リアーゼ活性とほぼ同等であった．つまり，吸エルが明らかになった（図 2）．

ゴン反応（ G ＝＋37.6 kJ）であり（Guynn et al. 1973）(1) 独立栄養条件においては還元的 TCA 回路と同様に

0

生体内では生じ得ないとされてきたクエン酸合成酵素の逆反応により，T. takaii 細胞内では還元的 TCA 回路が機能していることが強く示唆されたのである．

機能する．
(2) コハク酸あるいは酢酸を添加した混合栄養条件では，それぞれの基質で，酸化方向，還元方向に機能

ところが，ここで問題が生じた．一連の解析結果は，する部位が異なる分岐型の経路が機能する（注：いT. takaii が独立栄養増殖において，クエン酸合成酵素のず れ 分 岐 パ タ ー ン も，従 来 知 ら れ て い る 分 岐 型

逆反応により，還元的 TCA 回路を機能させている可能TCA 回路とは異なる）．その結果，炭酸固定と脱炭布浦 拓郎，力石 嘉人，跡見 晴幸

34

図 2：代謝解析によって示された各種培養条件下での T. takaii TCA 回路の振る舞い．点線は，本研究における代謝解析からの解釈では明示されなかった経路．

酸が生じる経路がそれぞれの分岐型経路で入れ替わTCA 回路は，アミノ酸や核酸生合成の起点となる中間る．

代謝産物の生合成に不可欠であり，少なくともその原型(3) コハク酸と酢酸の双方を添加した混合栄養条件でのような経路が化学進化の時代より存在したであろうとは，アナプロレティック経路（典型的 TCA 回路に考えられている．この二つの視点は，従来，従属栄養か

おいては，ピルビン酸あるいはホスホエノルピルビ

独立栄養の何れかで誕生したと議論されてきた生命誕生

ン酸をカルボキシル化してオキサロ酢酸を生成する

論争に新たな視点を与える．即ち，独立栄養と混合栄養

還元方向の反応経路）を含め，酸化的に TCA 回路

を使い分ける通性混合栄養として生命が誕生した可能性が機能する．つまり，TCA 回路での炭酸固定能がである．生命の起源論争において，従属栄養で誕生した

消失する．

生命は，自らによる有機物消費により絶滅してしまう可能性が指摘され，一方で，生命誕生には有機物の濃集しさらに，T. takaii のクエン酸合成酵素がクエン酸開裂た環境が必要であるにも関わらず，そのような条件下で反応に適した酵素学的性状を有すか否か検証するため，

独立栄養生物が生じる不可思議さも指摘されてきた大腸菌で発現した酵素を用いて検討した．その結果，T.

（Lazcano 2010）．この永遠に続くかに思える議論に対takaii のクエン酸合成酵素は，単独でも，あるいはクエ

し，通性混合栄養として生命が誕生したと仮説すると，ン酸開裂反応で生じたオキサロ酢酸を消費するリンゴ酸

所与の環境条件において，無機物からエネルギーを獲得

脱水素酵素の存在下でも，還元的反応を触媒することをする一方，炭素源については，有機物同化（脱炭酸）と確認した．また，クエン酸開裂反応においては，クエン炭酸同化を柔軟に使い分ける，即ち混合栄養と独立栄養酸に対する Km 値（速度 v＝1/2 Vmax（最大速度）とすを使い分ける通性混合栄養の形で生命が誕生し，継続しるときの基質濃度，Km 値が低い程基質との親和性が高たと説明することが可能となる．この通性混合栄養生物

いことを意味する）が既報の ATP クエン酸リアーゼととしての生命誕生仮説は，両説の利点を統合し，それぞ比較すると明らかに低いこと，更に，kcat/Km 値（分子れへの批判を克服し得るものであると考える．

活性 kcat が Km に対して高いほど触媒効率が高いことを示す）もクエン酸に対し，比較的高いことが明らかになった．これらはこの酵素が，T. takaii の TCA 回路を

5. その後

還元的な方向に回転させるために十分に高い触媒効率を

T. takaii の可逆的 TCA 回路は，Deltaproteobacteria

有すこと，更に言えば TCA 回路が柔軟に回転方向を変に属す Desulfurella acetivorans から見出された同様の化させることに適した性状を有すことを示す．

可逆的 TCA 回路と並べて発表された（Mall et al. 2018）．
D. acetivorans は T. takaii と同様に，水素を電子供与体

4．生命誕生と可逆的 TCA 回路

として硫黄を還元する独立栄養条件下で増殖する他，酢酸を電子供与体及び炭素源として用い増殖する．この両T. takaii より見出された可逆的 TCA 回路は，TCA

増殖条件下にて，それぞれ還元的 TCA 回路と酸化的

回 路 が 本 質 的 に 持 つ 柔 軟 性 を 明 ら か に し た．一 方，

TCA 回路を使い分けることが示されたのである．まマルチオミクス解析による好熱性水素酸化細菌からの可逆的 TCA 回路の発見

35

た，D. acetivorans のゲノム情報からは，ATP クエン酸
リアーゼ遺伝子が偽遺伝子化し，クエン酸合成酵素がその機能を代替したことが示されている．その後，ゲノム解析により，水素を電子供与体とする化学合成独立栄養
細菌 Deferribacter autotrophicus が同様にクエン酸合成
酵素を用いた炭素固定を行う可能性が示唆された（Slobodkinet al. 2019）他，鉄還元菌 Geobacter sulfurreducens に人為的なゲノム変異を誘起することで，新たにクエン酸合成酵素の逆反応を用いる炭素固定能を獲得したことが報告されている（Zhang et al. 2020）．これらの報告は，クエン酸合成酵素を用いた可逆的 TCA 回路が自然環境に広く分布している可能性を示している．
一方，クエン酸合成酵素と ATP クエン酸リアーゼの関係について，重要な知見が ATP クエン酸リアーゼの構 造 解 析 に よ り も た ら さ れ た（Verschueren et al.,2019）
．筆者らは，クエン酸合成酵素と ATP クエン酸リアーゼ，シトリル CoA リアーゼの系統関係をクエン酸合成酵素ドメインの系統解析により議論し，クエン酸合
成酵素より citryl-CoA リアーゼや ATP クエン酸リアー

図 3：スクシニル CoA 合成酵素，シトリル CoA 合成酵素
（CCS）
，シトリル CoA リアーゼ（CCL）と，クエン酸合成酵
素（CS）におけるドメイン構造の分布と，TCA 回路の進化モ
デル．始原型 TCA 回路からの還元型 TCA 回路（CCS/CCL
型 TCA 回路及び ACL 型 TCA 回路）の進化過程と，クエン酸合成酵素（CS）を含む TCA 回路を比較した．CS 型 TCA回路の誕生段階や，始原型回路の機能方向を現時点において決定することは困難である．

ゼが生じた可能性を指摘していた（Nunoura et al. 2018）．
これに対し，Verschueren らは ATP クエン酸リアーゼ

アーゼと共に機能していたと推測されるのである．

の結晶構造解析を行うと共に，その構造に基づくアライ(2) ATP クエン酸リアーゼの熱力学

メント解析を行い，シトリル CoA リアーゼのドメイン

ATP クエン酸リアーゼ（あるいはシトリル CoA 合成

重複とその部分欠失により，クエン酸合成酵素が誕生し

酵素＋シトリル CoA リアーゼ）の熱力学的性質（ΔG0ʼ

たことを示したのである（図 3）．さらに，このクエン酸＋4 kJ）（Fuchs 2011）を考慮すると，還元的 TCA 回路

合成酵素の起源を根拠に，還元的 TCA 回路が酸化的の回転方向を決定するのは，ATP クエン酸リアーゼでTCA 回路より先に誕生したと考察した．これに加え，はなく，回路全体の物質フラックスであり，また，フェATP クエン酸リアーゼのドメイン構造の進化及びそのレドキシンを補酵素とする酸化還元酵素の機能方向を担

熱力学的性質を考えることで，TCA 回路の起源につい保する還元力供給のフローであることが分かる．実際，ては新たな側面が見えてくる．

ATP クエン酸リアーゼが酸化方向に機能し，酸化的リ(1) ATP クエン酸リアーゼのドメイン構造

ン酸化による ATP 供給に貢献する報告もある（Möller

Verschueren らは，シトリル CoA 合成酵素＋シトリ

et al. 1987）．更に，シトリル CoA リアーゼ自体もクエ

ル CoA リアーゼが機能する還元的 TCA 回路を最も始ン酸合成酵素活性を有すことが知られる（Aoshima et al.

原的な TCA 回路として定義した．一方，ATP クエン酸

2004b）．つまり，ATP 依存的なクエン酸開裂反応の熱リアーゼとシトリル CoA 合成酵素が共有する 2 つのド力学を考慮すると，少なくとも，T. takaii や D. aceti-

メイン構造は，スクシニル CoA 合成酵素と起源を共に

vorans において TCA 回路の可逆性が担保された条件がし（Aoshima et al. 2004a），ATP クエン酸リアーゼ，シ

存在すれば，始原的な還元的 TCA 回路も可逆的に機能

トリル CoA リアーゼ，シトリル CoA 合成酵素，スクシした可能性は十分にあり得る．

ニル CoA 合成酵素，クエン酸合成酵素のドメイン構造

蛋白質立体構造解析に基づき，クエン酸合成酵素の進を比較すると図 3 のようになる．つまり，シトリル CoA

化過程が明らかにされたことにより，我々が提唱したク

合成酵素＋シトリル CoA リアーゼが機能する還元的

エン酸合成酵素を含む可逆的 TCA 回路が最も始原的

TCA 回路が誕生する前に，より始原的な TCA 回路のTCA 回路であるという仮説は否定された．一方，ATP

存在が仮説できる．そして，そのもっとも始原的な回路

クエン酸リアーゼ（ATP 依存のクエン酸開裂は反応）のにおいては，スクシニル CoA 合成酵素とシトリル CoA

熱力学的性質を考慮すると，シトリル CoA リアーゼを合成酵素の機能を一つの酵素が担い，シトリル CoA リ

含む始原型 “還元的” TCA 回路が，初期生命において還36

布浦 拓郎，力石 嘉人，跡見 晴幸

元方向に回転し，炭酸固定のみに機能していたと結論す
る に 十 分 で は な い．筆 者 ら は，生 命 の 起 源 に お け る
TCA 回路の可逆性，そして，その生命が通性混合栄養であった可能性は十分にあり得ると考えている．
この他，一般的なクエン酸合成酵素の他，立体特異性が異なり，また進化的にも全く異なるクエン酸合成酵素［（re)-citrate synthase］も一部の嫌気性細菌から見出されている（Gottschalk 1968）［一般的なクエン酸合成酵素
は，（re)-citrate synthase に対し，（si)-citrate synthaseと記述される］．生命誕生時の TCA 回路において，（re)-citrate synthase が機能していた可能性も現時点では排除することが出来ない．今後も多角的な研究の進展が期待される．

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謝辞

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本研究の一部は，文部科学省科学研究費補助金・新学

Nunoura, T., Chikaraishi, Y., Izaki, R., Suwa, T., Sato, T.,

術領域研究「超地球生命体を解き明かすポストコッホ機

Harada, T., Mori, K., Kato, Y., Miyazaki, M., Shimamura, S.,

能生態学」（課題番号：19H05684），日本学術振興会化学研究費補助金・基盤研究（A）「TCA 回路の多様性とその起源の解明」（課題番号：19H00988）で行われた．また，本稿の完成には亀谷将史氏，千葉洋子氏より，示唆に富む指摘をいただいた．感謝申し上げる．

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低温科学 79 （2021） 37-42
doi: 10.14943/lowtemsci. 79. 37

オービトラップ質量分析計を用いたアミノ酸解析の可能性
島村 繁1)＊，澄田 智美1)，布浦 拓郎1)2020 年 11 月 6 日受付，2021 年 1 月 23 日受理

キャピラリー電気泳動インターフェイス（ZipChipTM）を備えたオービトラップ搭載質量分析計（Orbitrap Fusion）をアミノ酸分析へ適用すると，ガスクロマトグラフ-質量分析計（GC-MS）での分
析と同程度あるいはそれ以下の試料量でも測定が可能なだけでなく，非常に簡便かつ短時間で解析することができる．更に，菌体を超音波破砕し得られた溶液に含まれる遊離アミノ酸を，ほとんど未調
整のままで測定する事も可能である．これにより GC-MS 法における技術的課題：試料調製における（1）加水分解過程でのアスパラギン，グルタミンからのアスパラギン酸，グルタミン酸への変換（2）
試料調製におけるプロリンの低い回収率，（3）GC-MS 解析におけるアルギニン，システイン，ヒスチ
ジン，トリプトファンの検出不可，などの改善が期待される．本報では一般的なバクテリア培養菌体を用いて，遊離アミノ酸と総アミノ酸，それぞれの基本的な試料調整方法や測定条件等を紹介する．

Analysis of amino acids by Orbitrap mass spectrometry.
Shigeru Shimamura, Tomomi Sumida and Takuro Nunoura
Combination of a capillary electrophoresis interface ZipChipTM and Orbitrap Fusion mass spectrometer (FusionMS) is applicable to amino acid analysis even from tiny amounts of biological samples, in the similar sensitivity to theconventional method using a gas chromatograph-mass spectrometer (GC-MS). Moreover, Fusion MS analysis canachieve simple preparation of samples and rapid detection of amino acids, which allow us to access cellular free aminoacids with almost no preparation. Fusion MS analysis indeed potentially resolve the technical issues associated withthe conventional GC-MS analysis, such as (1) conversion of asparagine and glutamine to asparaginate and glutamate,respectively, in protein hydrolysis and (2) low recovery of proline in sample preparation and no detection of arginine,
cysteine, histidine, and tryptophan in GC-MS analysis. Here, we introduce sample preparation procedure for the
analysis of free and total amino acids in bacterial cells and analytical conditions for the amino acid measurement in the
Fusion MS method.
キーワード：アミノ酸，同位体，キャピラリー電気泳動，質量分析
Amino acid, Stable isotope, Capillary electrophoresis, Mass spectrometry

1. はじめに能使用時）の質量精度で容易に分析対象物の精密質量を得ることが可能である（窪田，2007；MÄOHRING，2018）．

オ ー ビ ト ラ ッ プ（Orbitrap）質 量 分 析 計（Thermo
Fisher Scientific 社製）は，イオントラップ質量分析計の一種であり，イオンを中心電極の周りで回転，振動運動させることでより長い距離を飛行させ，その際の荷電粒子の回転運動を高速フーリエ変換によって解析する超高分解能フーリエ変換型質量分析装置である．m/z 200 で最大 500,000 FWHM という極めて高い質量分解能を持
つとともに，サブ 1 ppm（内部標準による LockMass 機

連絡先
島村 繁
国立研究開発法人海洋研究開発機構（JAMSTEC）〒237-0061 神奈川県横須賀市夏島町 2 番地 15
e-mail：shimas@jamstec.go.jp＊⚑)海洋研究開発機構（JAMSTEC）
Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology

38

島村 繁，澄田 智美，布浦 拓郎

図 1：OrbitrapFusion と ZipChip システム
1）分析機器全体像
a OrbitrapFusion 本体，b ZipChip インターフェイス，c ZipChip オートサンプラー＆送液ユニット
2）ZipChip 電気泳動チップ
d BGE resevoir，e ESI pump，f Sample reservoir，g Sample waste

また，研究対象の試料に合わせた分離機器やイオンソー

一方で，今回紹介するキャピラリー電気泳動インタースを組み合わせることが可能であることから，化合物同

フェイス ZipChipTM（908 devices 社製）と，オービトラッ

定に留まらず，プロテオーム解析を含む様々な分野で，プ搭載機種 Orbitrap Fusion（図 1）を組み合わせた分析

分析対象物の質量分析に広く利用されている．

手法では，精密質量による分子同定が可能なだけでなく，一方，試料を塩酸加水分解し，得られたアミノ酸を誘

アミノ酸を誘導体化することなく，簡便かつ短時間で測導体化を経てガスクロマトグラフ-質量分析計（GC-MS）

定することが可能である．特に，菌体を超音波破砕してにより分析する手法は，簡便で高感度な解析手法として得た細胞内の遊離アミノ酸を測定する場合，塩酸加水分知られる（高野ら，2016）．この手法は，本誌 3 章（安定解や誘導体化に伴う技術的な課題の多くを改善できる．

同位体の天然存在量および安定同位体標識の検出法─

また，測定に必要な試料液量が最小 10 L と非常に少な

2：ガスクロマトグラフ-質量分析計と MassWorks）にい為（実際に解析ラインへ導入される量は 5 nL 程度で詳述されるように，GC-MS で得たデータを質量キャリあるため，測定後に試料を回収して別の分析の為に再利

ブレーション用ソフトウェア MassWorks により解析す用する事も可能），GC-MS を用いる手法と同様に微量試ることで，アミノ酸分子内の安定同位体標識を定量する料への適用が可能である．なお，本誌 6 章にある通り，ことが可能である．そして，この解析技術は，これまで

この手法で塩酸加水分解した試料を解析する場合は，代謝解析が困難であった難培養微生物の代謝機構の研究

GC-MS より少ない試料での解析が可能となる．本報でへの適用が可能である（Nunoura et al., 2018）．さらに，は，この新たな解析手法の概要と共に，従属栄養細菌をGC-MS の質量分析装置にオービトラップを採用した機モデルとして用い，塩酸加水分解して得た総アミノ酸と，

種では，精密質量による化合物同定は勿論，MassWorks

細胞の超音波破砕により得た細胞内遊離アミノ酸についを用いなくとも，分子内の安定同位体標識を同定するこての解析結果を比較して紹介する．

とが可能となる．しかし，これら GC-MS を用いた生物試料の解析には，試料を塩酸加水分解する過程で，アス
パラギン，グルタミンがそれぞれアスパラギン酸，グルタミン酸に変換されてしまうこと，前処理過程における

2. 試料調整と測定
2.1 塩酸加水分解による総アミノ酸分析試料の調整

プロリンの回収率が 10％以下になってしまうこと，そしリアクティバイアル 1.0 mL（GL サイエンス）に塩酸て GC-MS 解析自体がアルギニン・システイン・ヒスチ（アミノ酸自動分析用，富士フイルム和光純薬）300 L

ジン・トリプトファンなどのアミノ酸が検出できないな

にて懸濁した菌体を入れて，クローズドトップスク

どの技術的課題も内包する．
（力石ら，2009）リューキャップ（GL サイエンス）で蓋をし，ドラフト内

オービトラップ質量分析計を用いたアミノ酸解析の可能性

で 110℃のヒートブロック上で一晩反応させる．
塩酸加水分解後のバイアルをヒートブロックから取り出して室温に戻し，ジクロロメタン（ダイオキシン類分39

Scientific 社）を用い，Field Strength Start 1000 V/cm，Injection Volume 5 nL，Pressure Assist “Disabled”の条
件にて，3 分間の設定で行った．

析用，富士フイルム和光純薬）200 L，ヘキサン（ダイオキシン類分析用，富士フイルム和光純薬）400 L（ジク

2.4 質量分析

ロロメタン：ヘキサン＝ 1：2）を加え，フタを締めて良試 料 の 測 定 は Orbitrap Fusion を 用 い て，MS 及 び

く混ぜた後，バイアルから上層の溶媒層を除き脂質の除MS/MS それぞれ下記の条件にて測定した．Targeted

去を行う．この操作を計 3 回繰り返した後，メタノール

Mass リストをフィルターとして登録し，Scan Priority（ダイオキシン類分析用もしくは LC/MS 用，富士フイを高く設定することで，13C を含む全パターンの各アミ

ルム和光純薬）400 L を加え，窒素ガスの吹き付けを用

ノ酸 m/z を優先的に MS/MS 測定を実施した．また，いて乾固する．得た総アミノ酸は超純水（QTofMS 用，

MS および MS/MS は Data Dependent Mode を Cycle

富士フイルム和光純薬）50 L にて再懸濁し，ZipChip

Time 0.6 秒にて測定した．

Metabolites Assay Kit（Thermo Fisher Scientific 社）の［MS 測定条件］Detector：Orbitrap，Resolution：15,000，

サンプルバッファーにて 10 倍に希釈して解析試料とし

Quadrupole Isolation：ON，Scan Range（m/z）：70-500，

た（高野ら，2016 を改変）
．しかし，澄田らの解析結果

RF Lens（％）：60，AGC Target：Standard，Maximum（本誌 6 章，Orbitrap Fusion を用いた CE-MS と四重極

Injection

GC-MS でのアミノ酸分析の比較）に示されるように，

Positive，EASY-ICTM：ON

Time

Mode：Custom（50 ms），Polarity：

メタノールを加えて乾固する過程において，非特異的な反応が起こることが判明しており，改変後の試料調整方［MS/MS 測 定 条 件］Isolation Mode：Quadrupole，

法は澄田ら（本誌 6 章）を参照されたい．

Isolation Window（m/z）：0.7，Activation Type：HCD，
Collision Energy Mode：Stepped（25,35,50），Detector

2.2 細胞内の遊離アミノ酸分析試料の調整
菌体を 70％メタノール 700 L に懸濁後，超音波ホモジナイザー Q 700（水冷チラー付きカップホーンタイプ，

Type：Orbitrap，Resolution：15,000，Scan Range Mode：
Define First Mass（m/z 50），AGC Target：Standard，Maximum Injection Time Mode：Dynamic

QSonica 社）に て 循 環 水 温 度 2℃，Amplitude：40，
Process Time：3 分，Pulse-OFF Time：15 秒の条件で破砕した．そして，菌体破砕液にクロロホルム 400 L を加えて 5 分間しっかりと攪拌した後，20,000 g，－8℃で3. 従属栄養細菌より抽出したアミノ酸の測定結果

10 分間遠心し，上層（水層）を 2 mL チューブに移した．

一般的な従属栄養細菌の菌体を，塩酸加水分解して得

さらに，回収率向上のため，残った下層（有機溶媒層）

た総アミノ酸と，超音波破砕で得た細胞内遊離アミノ酸

へ超純水 200 L を加えて，同条件で攪拌，遠心し，さらの各試料それぞれのマスクロマトグラムを図 2 に示す．

に上層を回収した．その後，回収液へ窒素ガスを吹き付

また，表 1 に各アミノ酸の検出の有無と保持時間（RT），

けて乾固し，ZipChip Metabolites Assay Kit のサンプル

MS/MS 時に得られるプロダクトイオンピークなどの情

バッファー 30 L にて懸濁して測定試料とした．

報をまとめた．
総アミノ酸測定では，アスパラギン，グルタミンが検2.3 キャピラリー電気泳動

出されていないが，これは，塩酸加水分解の過程で，アBGE（background electrolyte）及 び，サ ン プ ル バ ッ

スパラギン，グルタミンがそれぞれアスパラギン酸，グフ ァ ー は ZipChip Metabolites Assay Kit（Thermo

ルタミン酸に変換されたことによる．一方，プロリン，

Fisher Scientific 社）を用いた．なお，自身で調製する場

アルギニン，ヒスチジンはピーク強度も高く検出されて合は，LC/MS グレードの試薬を用い，それぞれ以下のいる．システインは，検出はされるもののピーク強度は組成の BGE，サンプルバッファーを準備する．BGE（超低く，また，トリプトファンは検出されなかった．シス

純水：イソプロパノール：アセトニトリル：ギ酸＝ 68：

テイン及びトリプトファンにおける低い検出効率は，測20：10：2（％，v/v）），サンプルバッファー（超純水：定系における検出感度だけでなく，今回解析した従属栄

メタノール：酢酸アンモニウム＝ 80：19：1（％，v/v））．

養細菌における利用頻度が低いことも影響しているので

電 気 泳 動 は ZipChip HS チ ッ プ（Thermo Fisher

はないかと推察される．

島村 繁，澄田 智美，布浦 拓郎

40

図 2：バクテリア培養菌体から抽出したアミノ酸測定結果のマスクロマトグラムa）総アミノ酸測定結果b）遊離アミノ酸測定結果，ND（未検出），各アミノ酸の一文字標記は表 1 参照．

表 1：CE-MS 測定時の各アミノ酸保持時間とプロダクトイオン
Retention time (min)Abbreviation

FormulaCalculated
Exact mass

Calculated
Precursor ion[M + H] (m/z)

LysineLys (K)C6H14N2O2

146.1050

147.1128

0.89

1.02

56.0490，67.0536，84.0801，130.0852，147.1126

Arginine

Arg (R)

C6H14N4O2

174.1111

175.1190

0.94

1.05

60.0553，70.0648，116.0701，130.097，158.0919，
175.1201

Histidine

His (H)C6H9N3O2

155.0689

156.0768

0.98

1.07

56.0491，81.0442，82.0520，83.0598，93.0441，
110.0705，156.0767

GlycineGly (G)C2H5NO2

73.031576.0393

1.09

1.19

76.0392

AlanineAla (A)C3H7NO2

89.047190.0550

1.16

1.25

60.1084，90.0547

ValineVal (V)C5H11NO2

117.0784

118.0863

1.30

1.38

53.0382，55.0539，56.0491，57.0569，59.0488，
72.0802，118.0862

Isoleucine

Ile (I)C6H13NO2

131.0941

132.1019

1.33

1.40

55.0540，56.0495，69.0695，86.0960，132.1017

LeucineLeu (L)

C6H13NO2

131.0941

132.1019

1.36

1.43

55.0538，56.0493，69.0694，86.0957，132.1017

SerineSer (S)C3H7NO3

105.0420

106.0499

1.41

1.48

60.0439，70.0283，88.0386，106.0499

ThreonineThr (T)

C4H9NO3

119.0577

120.0655

1.49

1.50

56.0492，57.0332，74.0597，84.0441，102.0544，
120.0655

Methionine

Met (M)

C5H11NO2S

149.0505

150.0583

1.49

1.56

56.0492，61.0103，74.0232，84.0439，85.0278，
87.0258，102.0544，104.0523，133.0311，150.0589

Asparagine

Asn (N)

C4H8N2O3

132.0529

133.0608

ND

ND

－

PhenylalaninePhe (F)

C9H11NO2

165.0784

166.0863

1.57

1.63

79.0637，93.0694，103.0533，120.0797，166.0866

Tryptophan

Trp (W)

C11H12N2O2

204.0893

205.0972

ND

1.66

91.0536，115.0534，118.0643，146.0591，159.0903，
170.0591，188.0696，205.0971

AminoAcid

Total
amino acid

Intracellular Free
amino acid

Measured accurate Product ions (m/z)

ProlinePro (P)C5H9NO2

115.0628

116.0706

1.59

1.67

70.0647，116.0704

GlutamineGln (Q)

C5H10N2O3

146.0686

147.0764

ND

1.68

84.0438，130.0490，147.0763

Glutamic Acid

Glu (E)

C5H9NO4147.0526

148.0604

1.65

1.70

56.0491，84.0438，102.0543，130.0490，148.0602

Cysteine

Cys (C)C3H7NO2S

121.0192

122.0270

1.69

1.76

58.9945，76.0209，86.9893，104.9997，122.0270

Tyrosine

Tyr (Y)C9H11NO3

181.0733

182.0812

1.75

1.79

91.0536，95.0485，107.0485，119.0483，123.0433，
136.0748，147.0431，165.0538，182.0822

Aspartic Acid

Asp (D)

C4H7NO4

133.0370

134.0450

1.83

1.87

70.0283，74.0231，88.0387，116.0334，134.0446

オービトラップ質量分析計を用いたアミノ酸解析の可能性

41

図 3：グルタミン酸の MS および MS/MS スペクトルa：グルタミン酸 MS スペクトル，b：グルタミン酸 MS/MS スペクトル，c：13C を 1 つ含むグルタ
ミン酸 MS/MS スペクトル，NL（Normalized Level），hcd（Higher energy Collisional Dissociation）

一方で，遊離アミノ酸の測定では，アスパラギンを除る事とする）の MS スペクトル（図 3-a）と，そこに検出

く全てのアミノ酸が検出された．但し，保持時間が総アされた自然存在度の同位体ピーク m/z 149.0634，それ

ミノ酸の測定に比べ，全体的に遅くなる現象がみられた．

ぞれの MS/MS スペクトル（図 3-b，c）を示した．

これは，遊離アミノ酸解析における試料調製が破砕処理

両ピークの差は 12C と 13C の質量差（m/z 1.0032）
であのみによる為，総アミノ酸試料に比べて，アミノ酸以外

り，
まさに同位体のピークを検出している．
更にそれぞれの有機化合物が解析試料に混在し，それらが電気泳動時

を MS/MS 測 定 し た 結 果 の 構 造 情 報 か ら（Thermoに干渉した結果であると考えられる．

Fisher Scientific 社提供の mzCloud スペクトルライブラ

今回の解析結果は，Orbitrap Fusion を用いた遊離アリーを参照，
https://www.mzcloud.org/），
m/z 149.0634

ミノ酸の分析は，従来の GC-MS を用いた解析におけるのグルタミン酸には 1 つの 13C が構造中のいずれかに導技術的課題を克服しうることを示す．ただし，微生物試

入されており，さらに図 3-c のピーク情報から 1 位の炭料を取り扱う場合には，菌体内の化合物の多様性は培養素が抜けた［M＋H-H2O-HCOOH]＋m/z 84.0440，［M＋

条件や使用する菌種により変化し，それらが MS におけH-HCOOH]＋ m/z 102.0545 にそれぞれ m/z 85.0474，

るイオン化時に競合することにより検出感度の低下に繋

m/z 103.0579 の同位体ピークが見られていることから，がる事がある．従って，新たな生物試料を測定する際に1 位の炭素が 12C と 13C になっているものが，どちらもは，まず総アミノ酸と遊離アミノ酸を予察的に解析し，存在していることがわかる（高野ら，2015）．また，5 位それぞれの解析手法に由来する技術的課題を考慮の上の炭素が抜けた［M＋H-H2O-HCOOH-HCOOH]＋ m/zで，解析対象・手法を選択することが望ましい．

56.0492 にも m/z 57.0526 がみられるため，同様に 5 位の炭素にも 12C と 13C どちらも存在していることがわか

4. アイソトポマーの検出

る，同時に 2～4 位の炭素に関しては個々が抜ける分子構造に該当するピークは検出されていない為，いずれの

図 3 に総アミノ酸の測定におけるのグルタミン酸

炭素が 13C であるか判別できないが，m/z 57.0526 の数（［M＋H]＋m/z 148.0602：有効数字は小数点以下 3 桁で値からいずれか 1 つが 13C であることが示唆される．つ

あ る が，本 報 で は 炭 素 の 同 位 体 ピ ー ク の 質 量 差 m/z

まり，この天然同位体を含むグルタミン酸では，特定の1.003 を扱う上で，敢えて実測の数値をそのまま表記す

炭素が 13C となっている訳ではなく，各位の炭素にラン42

島村 繁，澄田 智美，布浦 拓郎

ダムに 13C が入っていることが明らかになった．

謝辞
本研究を進めるにあたり，福山宥斗ポストドクトラル

5．まとめ

研究員（海洋研究開発機構）に一部のサンプル調整にご本章にて紹介した結果は，CE-MS を用いた分析手法

協力頂いた．また，技術的な助言を頂くと共に，本稿執が，安定同位体で標識した基質を用いたトレーサー代謝

筆の機会を頂いた，力石嘉人教授（北海道大学低温科学

解析を行う上で，非常に有用なデータをもたらす可能性

研究所）に深くお礼を申しあげます．

を示す．試料調製の簡便さと短時間での測定が可能なこ

本項で紹介した研究の一部は，文部科学省科学研究費とからも，CE-MS を用いた分析手法は，今後，GC-MS

補助金・新学術領域研究「超地球生命体を解き明かすポを用いた従来法と合わせて，トレーサー代謝解析法の重ストコッホ機能生態学」（課題番号：19H05684），日本学

要な手段の一つとなっていくことが期待される．なお，

術振興会化学研究費補助金・基盤研究(A)「TCA 回路の本報の結果から概算すると，一般的な従属栄養細菌の細多様性とその起源の解明」（課題番号：19H00988）で行

胞内遊離アミノ酸を測定する場合，必要な菌体は 10 ～

われた．

6

107 細胞であると推定される．更に，細菌細胞を構成す
る総蛋白質の塩酸加水分解によって得た総アミノ酸を測定する場合，104～105 細胞程度でも良好な結果を得ることができると推定される．実際に同位体を用い培養した菌体での詳細な解析については本誌 6 章を参照された
い．
更に，Thermo Fisher Scientific 社提供の低分子解析用
ソフトウェア Compound Discoverer がバージョン 3.1
からトレーサー代謝解析に対応したことにより，より広範囲な代謝系を対象としたトレーサーメタボロミクス解
析の可能性が広がった．高感度・高分解能であり，かつ精密質量が取得できるオービトラップ搭載の質量分析計
は，アミノ酸だけではなく解糖系や TCA 回路（クエン

参考文献
窪田雅之（2007）電場型フーリエ変換質量分析計 Orbitrap の仕組みと性能，そして LTQ Orbitrap について 生物物理
科学 ,51，53-58
Thomas MÄOHRING，Tomoko Vincent（2018）「オービト
ラップ型イオントラップを有する質量分析計の原理と応用研究」．ぶんせき ,12，526-531
Nunoura, T., Chikaraishi, Y., Izaki, R., Suwa, T., Sato, T.,
Harada, T., Mori, K., Kato, Y., Miyazaki, M., Shimamura, S.,
Yanagawa, K., Shuto, A., Ohkouchi, N., Fujita, N., Takaki, Y.,
Atomi, H.and Takai, K. (2018) A primordial and reversible
TCA cycle in a facultatively chemolithoautotrophic thermophile. Science, 359, 559-563.

酸回路）など有機酸を直接対象とするトレーサー代謝解高野淑識，力石嘉人，大河内直彦（2016）アミノ酸（ピバロ析においても，非常にパワフルなツールとなる可能性がイル／イソブチルエステル誘導体）の GC/MS による解析．

高い．なお，現在，我々は，CE や UPLC などの分離手法を併用し，中央代謝系に関わる有機酸のトレーサー代
謝解析法のより高感度・高精度な手法を確立すべく条件

Res. Org. Geochem., 32，1-18．
力石嘉人・高野淑識・大河内直彦（2009）アミノ酸（N-ピバ
ロイル-イソプロピルエステル誘導体）の GC/MS による解析．Res. Org. Goechem., 25，61-70．

検討を進めている．今回紹介したアミノ酸トレーサー代

高野淑識，力石嘉人，大河内直彦（2015）イオンペアクロマ

謝解析と共に，生物の代謝機構の研究における有力な選

トグラフィー／電子スプレーイオン化質量分析法（LC/

択肢の一つとなることを期待している．

ESI-MS）によるアミノ酸のマススペクトル解析．Res.
Org. Geochem., 31，33-49．

低温科学 79 （2021） 43-49
doi: 10.14943/lowtemsci. 79. 43

Orbitrap Fusion を用いた CE-MS と四重極 GC-MS でのアミノ酸分析の比較
澄田 智美1)＊，島村 繁1)，布浦 拓郎1)2020 年 11 月 9 日受付，2021 年 1 月 23 日受理

微量メタボローム解析技術（アミノ酸のピバロイル / イソプロピルエステル誘導体を用いた GCMS での分析及び質量キャリブレーション用のソフトウェアである MassWorks を用いた解析）によるアミノ酸のアイソトポマー解析は，アミノ酸生合成経路だけでなく，前駆体となる有機酸を生産す
る TCA 回路等周辺の主要代謝経路の解明にも有効な手段である．しかし，この僅かなバイオマスで解析可能な手法であっても，その適用に十分なバイオマスを得ることが困難な環境微生物も存在する．
また，GC-MS での解像度では，他の化合物との十分な分離が困難な場合もある．そこで，より高精度で高感度な解析手法の開発を目指し，キャピラリー電気泳動インターフェイス ZipChipTM とオービトラップ搭載機種 Orbitrap Fusion を用いた CE-MS での分析及び解析ソフトウェア Xcalibur Qual
Browser を用いた代謝解析技術の基盤構築を進めている．本報では微量メタボローム解析における，従来の GC-MS と新技術の CE-MS の両者を比較しつつ紹介する．

Detection of tracing of stable isotope labelled amino acids using
Orbitrap-Fusion CE-MS and Quadrupole GC-MS
Tomomi Sumida1, Shigeru Shimamura1 and Takuro Nunoura1
Isotopomer analysis for amino acids in tracer-based metabolomics is useful to identify major metabolic pathways
producing amino acid precursors such as the TCA cycle in addition to amino acid biosynthetic pathways. A novel
method of tracer-based metabolomics that consists of quadrupole GC-MS analysis for pivaloyl/isopropyl derivatives ofamino acids and MassWorks software for identification of stable isotope probing required less amount of samples
comparing with the methods available previously. However, even with the novel method, isotopomer analysis of aminoacids for some of environmental microbes is not applicable because of the difficulty in obtaining sufficient biomass.
Thus, we are developing an accurate and sensitive analysis by CE-MS analysis with an Orbitrap Fusion MS compoundwith a capillary electrophoresis interface ZipChipTM. Here, we report the comparison of current GC-MS and developing
CE-MS methods to identify isotopomers of aminio acids.
キーワード：メタボローム解析，安定同位体，質量分析
Metabolomics, 13C tracer analysis, Stable isotope, Mass spectrometry

1. 解析手法
GC-MS での測定分析は Agilent Technologies 社製の
連絡先
澄田 智美
国立研究開発法人海洋研究開発機構（JAMSTEC）〒237-0061 神奈川県横須賀市夏島町 2 番地 15
e-mail：sumidat@jamstec.go.jp⚑）海洋研究開発機構（JAMSTEC）
Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology＊

ガスクロマトグラフィー質量分析計 6890 N GC-5973 A
MSD（HP-5 ms カ ラ ム）を 用 い て 行 い，Cerno
Bioscience 社製の質量キャリブレーションソフトウェア
MassWorks により同位体標識率を算出した．CE-MS
での分析は 908 devices 社製の ZipChip CE System とThermo Fisher Scientific 社製のオービトラップ質量分

澄田 智美，島村 繁，布浦 拓郎

44

図 1：アミノ酸試料の調製法の比較．

析 計 Orbitrap Fusion を 用 い て 測 定 を 行 い，同 じ くと想定されるピークが検出された．そこで，濃塩酸処理

Thermo Fisher Scientific 社 製 の 解 析 ソ フ ト ウ ェ ア

後の試料にメタノールを加えることで，実際にエステル

Xcalibur Qual Browser により同位体標識率を算出した．

化が生じるのか否か，標品のアスパラギン酸を用いた検測定原理に関する詳細は，本特集号「3．安定同位体の天証を以下のように実施した（図 2）．

然存在量及び安定同位体標識の検出法─ 2：ガスクロマ

濃塩酸に溶かした標品のアスパラギン酸を用い，メタ

トグラフ-質量分析計と MassWorks」と「5．オービト

ノールの添加・非添加で N2 乾固を行った試料用いてラップ質量分析計を用いたアミノ酸解析の可能性」を併

CE-MS のポジティブイオンモードで測定した結果，メ

せて参照されたい．

タノールを加えた試料ではアスパラギン酸の［M＋H]＋
m/z 134.045 の他に，主鎖もしくは側鎖の COOH 基の

2. 全アミノ酸試料調製方法の改善

どちらかがエステル化された［M＋H＋CH2]＋ の m/z
148.060 と，主鎖と側鎖の両方がエステル化された［M＋本研究では，試料検体として CO2 を添加して培養標

H＋CH2＋CH2]＋ の m/z 162.076 が 検 出 さ れ た（図 2

識した化学合成独立栄養細菌（Aquificae 門）の菌体を用(A)）．この検証の結果，一連の試料処理に伴うエステ

いた．GC-MS 分析用のアミノ酸の抽出と誘導体化は，ル化により生じる技術的な問題も明確になった．なかでChikaraishi et al., 2009 の方法を一部改変して行なった．

も顕著な事象は，エステル化したアスパラギン酸とグル

GC-MS 分析用の試料調製は，全菌体のタンパク質をア

タミン酸の識別において生じる．主鎖もしくは側鎖のミノ酸に加水分解するため，濃塩酸で処理後，脱脂，イ

COOH 基のどちらかがエステル化されたアスパラギン

ソプロピルエステル誘導体化及びピバロイル誘導体化の酸［M＋H＋CH2]＋ は，グルタミン酸［M＋H]＋ の m/z

工程を経る（図 1(A)）．一方で，CE-MS での分析用の値（m/z 148.060）と等しくなり，また，CE-MS 分析に

試料は，誘導体化が不要であり，加水分解および脱脂のよる保持時間もグルタミン酸の［M＋H]＋ と非常に近い

みにより調製されるため（図 1(B)），GC-MS 用の試料ため，解析時のピークの同定を難しくする（図 2(B)）．

調製に比べて非常に簡便である．

このようなエステル化はメタノールの非添加試料では生13Chikaraishi et al., 2009 の方法での試料調整では，脱脂じないため，アミノ酸の試料調製では，脱脂後の乾固時

後の窒素ガス気流下での乾固時に，試料バイアルにメタにメタノールを添加せずに乾固することを推奨する．

ノールを加えて共沸させていた．しかし，その方法で調製した試料を CE-MS で分析したところ，アミノ酸の主鎖および側鎖のカルボキシル基がエステル化されている

Orbitrap Fusion を用いた CE-MS と四重極 GC-MS でのアミノ酸分析の比較

45

図 2：全アミノ酸試料調製時の塩酸とメタノール処理によるエステル化の影響．

析 さ れ た［M＋H]＋ も サ ブ 1 ppm（内 部 標 準 に よ る

3. アイソトポマー分析手法の比較

LockMass 機能使用時）の質量精度で精密質量を得るこTCA 回路の反応方向の確定を行う際には，それぞれ，とができ，解析ピークの同定精度は非常に高い．図 3 のピルビン酸，オキサロ酢酸，オキソグルタル酸を前駆体

同位体標識試料は 13 CO2 が十分に取り込まれているたとするアミノ酸であるアラニン，アスパラギン酸，グルめ，各アミノ酸に複数個の 13C の取り込みが確認できる．

タミン酸が鍵となる．そのため，これら 3 つのアミノ酸非標識試料をコントロールとして用いた GC-MS 及びのアイソトポマー解析が多くの研究で行われている

CE-MS の解析結果を比較すると（図 3(A，E)），GC-MS（Nunoura et al., 2018）．GC-MS での分析の場合，ピバロ

では夾雑物由来のピークが確認された（図 3(A)の青枠

イル / イソプロピルエステル誘導体化アミノ酸のイオン内）．13 C の天然存在比は約 1.1％であり，13 C が分子内化時にそれぞれの構造に特異的なフラグメンテーションに 2 個存在する［13 C]2 標識されたアミノ酸の天然存在が生じる（Chikaraishi et al., 2009）．従って，アミノ酸に比は非常に少ないはずであり，非標識コンロトールの試取り込まれている安定同位体標識率を算出するには，プ

料では［13 C]2 の位置に同位体標識ピークは検出されなリカーサーイオン[M]＋ の代わりに［M]＋ からプロピル

いはずである（図 3(E)）．このように，GC-MS を用い

エステル基が脱離した［M－59] に対応したイオンフて試料を解析する際には夾雑物の影響を受けるアミノ酸

ラグメントの安定同位体標識率が解析される．例えば，が存在することを留意する必要があり，同位体標識試料＋

アラニン，アスパラギン酸，グルタミン酸の場合，［M]（図 3(B)）を解析する際には，非標識コントロール（図 3がそれぞれ m/z 215, 301, 315 のため，
［M－59] は m/z(A)）の［13C]1 及び［13C]2 の存在量を引くことにより実156, 242, 256 となる．それに対し，CE-MS ではフラグ際の存在量を計算する必要がある．一方で CE-MS の解

メンテーションが起きにくい ESI によるイオン化での

析では，Orbitrap の質量分解能が高いため，アミノ酸由

ポジティブイオンモード測定のため，［M＋H] を解析

来のピークと夾雑物由来のピークを精密質量で分けるこしており，アラニン，アスパラギン酸，グルタミン酸のとが可能である．また，CE-MS では安定同位体が複数［M＋H]＋ はそれぞれ m/z 90.055, 134.045, 148.060 と個アミノ酸に取り込まれた際，それぞれの安定同位体標なる．Orbitrap では精密質量での測定が可能なため，分識されたアミノ酸のピークは，12 C と 13 C の精密質量差

＋

＋

＋

澄田 智美，島村 繁，布浦 拓郎

46

図 3：アイソポマー解析の比較．

である 1.003 の質量で正確にピークがシフトするため

出下限値（m/z 50）を下回るため解析ができなかった．

（図 3(F)），より精度の高い解析が可能となる．実際，図 3

一方で，アスパラギン酸及びグルタミン酸に関しては，(G)に示すように，［ C]1，［ C]2 のピークを近傍に検出

MS/MS によるフラグメントイオンの解析が可能であっされる夾雑物のピークと区別して解析する事ができる．

た（それぞれ図 4 と図 5）．アミノ酸の主鎖のカルボキシ1313ル基（-COOH）の脱離により生成したイオン（［M＋H－
HCOOH]＋＝［M＋H－46]＋，アスパラギン酸では m/z

4. 標品を用いた CE-MS での MS/MS 分析

88.039，グルタミン酸では 102.055）は，図 4，5 の星のGC-MS を用いてアミノ酸の 1 位の炭素の安定同位体

位置に 13 C の安定同位体標識が入っており，それぞれ標識率を解析する場合，プリカーサーイオン［M]＋ から［M＋H－46]＋＋1.003 の m/z で検出される．それに加プロピルエステル基が脱離した［M－59]＋ のフラグメ

え て，ア ス パ ラ ギ ン 酸 で は 3 位 と 4 位 の 側 鎖（-CH3ントイオンの量比（分子全体に含まれる安定同位体標識-COOH）の脱離により生成したイオン（［M＋H－CH3－＋率に対応）と，1 位のカルボニル基が脱離した［M－87]

COOH]＋＝［M＋H－60]＋，m/z 74.024＋1.003）が，グのフラグメントイオンの量比（1 位の炭素を除いた残り

ルタミン酸では 1 位と 5 位のカルボキシル基の脱離によの構造に含まれる安定同位体標識率に対応）とを比較す

り 生 成 し た イ オ ン（
［M＋H－HCOOH－HCOOH]＋＝

ることでおこなわれる．一方で，同様の解析を CE-MS［M＋H－92]＋，m/z 56.050）が検出された．

で行う場合には，プリカーサーイオン［M＋H]＋ をさら

1 位のカルボキシル基の炭素の安定同位体標識率の解に MS/MS 分析して得られたフラグメントイオンの安定

析には，［M＋H－HCOOH]＋＝［M＋H－46]＋ のマスス

同位体標識率を解析する必要がある．従って両者の比較

ペクトルが利用される．現行の CE-MS の分析方法でのため CE-MS での MS/MS 測定で得られるフラグメン

は，プリカーサーイオンのエリア値は算出できるが，残トイオンの解析を行った．

念ながら MS/MS 分析のエリア値は算出することができ

Cambridge Isotope Laboratories, Inc より入手したアないため，主鎖の標識率の解析はエリア値ではなくピー

ラニン（L-ALANIN（1- C，99％）），アスパラギン酸

ク強度を用いる．例えば図 3(G)のアスパラギン酸の分（L-ASPARTIC ACID（1,4- C2，99％））及びグルタミ

析では（図 6），標識の数が 1 個［13C]1 の 135.048（［M＋ン酸（L-GLUTAMIC ACID（5-13 C，99％））を用いてH]＋＋1.003）のプリカーサーイオンに対する MS/MS

MS/MS 測定を行った結果，アラニンでは MS/MS によ分析の［M＋H－46]＋ のピークは，m/z 88.040（［M＋

り生じるフラグメントイオンのうち，カルボキシル基のH－46]＋）と 89.043（［M＋H－46]＋＋1.003）の 2 つが脱離により生成するフラグメントイオンが CE-MS の検確認される（図 6(A)赤枠内）．この 2 つのピーク強度を

13

13

Orbitrap Fusion を用いた CE-MS と四重極 GC-MS でのアミノ酸分析の比較

47

図 4：アスパラギン酸の(A)マスクロマトグラム及び(B)MS/MS スペクトルとフラグメンテー
ションパターン．

図 5：グルタミン酸の(A)マスクロマトグラム及び(B)MS/MS スペクトルとフラグメンテーショ
ンパターン．

比較することにより，カルボキシル基の同位体標識率を（＋MassWorks）と CE-MS（＋Xcalibur Qual Browser）

見積もる事ができる．実際に，CE-MS のプリカーサーとの同位体標識率解析の結果を表 1 にまとめた．この結イオン［M]＋ のエリア値からの算出された，1 つの炭素

果，GC-MS と CE-MS で解析方法の相違に起因するとがC で 標 識 さ れ て い る ア ス パ ラ ギ ン 酸（存 在 比推測される差異はあるものの，検出された同位体標識率22.8％）のうち（表 1），約 28％に 1 位のカルボキシル基は従来の GC-MS での解析結果と新技術の CE-MS でのが標識されており，残りの 72％は主鎖以外の炭素が標識

解析結果はほぼ一致していることがわかる．このようにされている事が分かる．複数の炭素が C で標識されてCE-MS を用いた解析は，より微量な試料での解析が可いる場合にも m/z 136.051（2 個標識［ C]2，
［M] ＋

能で試料調製が容易であり，且つ，従来の GC-MS での2.007，図 6(B)），m/z 137.055（3 個標識［ C]3，
［M] ＋

分析と同程度，もしくはそれ以上の精度で同位体標識率3.010，図 6(C)）を MS/MS 分析し，
［M＋H－46] のフを解析することができる可能性が高い．今後，分析条件

ラグメントイオンを解析することで，同位体標識化率ををさらに検討し，簡便で優れた精度で代謝解析が可能な解析することができる，

技術基盤の構築を進めたい．

13

13

13

＋

13

＋

＋

ア ラ ニ ン と ア ス パ ラ ギ ン 酸 に 関 し て，GC-MS

澄田 智美，島村 繁，布浦 拓郎

48

図 6：図 3(G)のアスパラギン酸の MS/MS スペクトル．
表 1：GC-MS 及び CE-MS 解析によるアミノ酸の［13C］の標識の数と存在量（％）の比較．
GC-MS
CE-MS
［M-59]+から ［M＋H]+から
算出
算出
標識の数
[ C]0
13

アラニン

[13C]1

存在量(％)
62.0

46.4

18.8

28.1

10.8

20.6

[ C]3

8.5

4.8

標識の数
[13C]0[13C]1
アスパラギン酸

主鎖[13C]2
13[13C]2

存在量(％)
49.8
20.6
15.3

側鎖
[ C]0
[ C]0

4.8

[13C]0[13C]1

14.0

[ C]1

[ C]1

10.8

[13C]0[13C]2

0.0

13

13

13

[ C]3

24.4

10.1

12.0

[ C]4

4.2

2.5

謝辞
本研究を行うにあたり，ご助言とご指導をいただくと

46.4
MS/MS から算出できない

8.5

13

38.4
22.8

存在量(％)

[ C]1
13

CE-MS
［M＋H]+とMS/MS か ら
算出

62.0

13

主鎖

[13C]3
13

GC-MS［M-59]+とアミノ酸の主鎖と側鎖の標識の数［M-87]+から算出

側鎖[13C]04.8
存在量(％)

49.8

38.4

11.5

6.3

[ C]1

9.1

16.5

[13C]1

14.4

11.9

[ C]0

[ C]2

0.9

12.5

[13C]1[13C]2

9.9

11.4

[ C]0

[ C]3

0.2

0.6

4.2

2.5

[13C]1[13C]0[ C]0[13C]1

13

13

13

13

13

13

[ C]4
13

共に本稿の執筆の機会をいただいた，北海道大学低温科学研究所の力石嘉人教授に深くお礼を申し上げます．また，理化学研究所の千葉洋子研究員には一部の解析にごOrbitrap Fusion を用いた CE-MS と四重極 GC-MS でのアミノ酸分析の比較

協力いただきました．本項の研究の一部は，日本学術振興会科学研究費（基盤研究 A：研究代表者 布浦拓郎）（19H00988）及び，（新学術領域研究（研究領域提案型）：
研 究 代 表 者 跡 見 晴 幸，研 究 分 担 者 布 浦 拓 郎（19H05684），北 海 道 大 学 低 温 科 学 研 究 所 共 同 研 究（20G043）からの支援を受けて行われました．

イル/イソプロピルエステル誘導体）の GC/MS による解析．Res. Org. Geochem., 25，61-70．
Nunoura, T., Chikaraishi, Y., Izaki, R., Suwa, T., Sato, T.,
Harada, T., Mori, K., Kato, Y., Miyazaki, M., Shimamura, S.,
Yanagawa, K., Shuto, A., Ohkouchi, N., Fujita, N., Takaki, Y.,
Atomi, H.and Takai K. (2018) A primordial and reversible
TCA cycle in a facultatively chemolithoautotrophic thermophile. Science, 359, 559-563.

参考文献
力石嘉人・高野淑識・大河内直彦（2009）アミノ酸（ピバロ49低温科学 79 （2021） 51-58
doi: 10.14943/lowtemsci. 79. 51

宇宙における安定窒素同位体比の多様性とその起源解明に向けた実験的アプローチ菅原 春菜
2021 年 2 月 2 日受付，2021 年 2 月 12 日受理

窒素は有機分子を形成する重要な元素の 1 つであるが，その安定同位体比（15N/14N）は宇宙において，地球上での変動幅を遥かに超えるような非常に大きな変動幅を示す．本稿ではまず，銀河スケー
ルから太陽系スケール，さらには始原的太陽系物質のミクロスケールに至るまで，窒素同位体比の多様性について議論する．さらに，彗星や隕石のような始原的太陽系物質において15N の濃集がいかにして生じたのかを解明するための実験的研究について紹介し，特に始原的な窒素であるアンモニアが 15N 濃集の重要な鍵となる可能性について議論する．

Diversity of stable nitrogen isotopic ratio in the universe and theexperimental approaches to understand the origins
Haruna Sugahara
Nitrogen is one of the important constituent elements of organic molecuels. In the universe, the stable isotopic
ratio of nitrogen (15N/14N) shows a huge variation compered with the terrestrial one. In this paper, the variation of thenitrogen isotopic ratio from in the garactic scale to the solar system scale, and in the micro scale in the pristine solar
system materials are reviewed. In addition, the experimental studies to understand the anomalous accumulation of 15N
in the pristine solar system marials such as comets and chondrites are described. Especially, the possible role ofammonia in the accumulation of 15N is discussed.

キーワード：安定窒素同位体比，同位体異常，同位体分別，地球外有機物，始原的太陽系物質
Stable nitorogen isotopic ratio, Isotopic anomaly, Isotopic fractionation, Extraterrestrial organic
materials, Pristine solar system materials

1. はじめにきた進化プロセスや生成環境を理解するための重要な指標となる．これらの元素において，安定同位体は質量数

有機分子は炭素（C）を骨格として，主として宇宙におが最も小さいものの存在度が圧倒的に多く，また，地球

いても存在量の多い水素（H），酸素（O），窒素（N）の上での安定同位体比の変動は極僅かであるため，以下の4 元素から構成される．これらの元素にはそれぞれ質量

ように地球の標準物質を基準とした千分率として表され数の異なる安定同位体が存在するが，その比は様々な物

る．

理化学的プロセスにより変動するため，有機分子が経てN(‰)＝(R試料/R標準物質－ 1)×1000

15

R ＝15N/14N
連絡先
菅原 春菜
〒252-5210 神奈川県相模原市中央区由野台 3-1-1
e-mail：sugahara.haruna@jaxa.jp
国立研究開発法人 宇宙航空研究開発機構 宇宙科学研究所
ISAS, JAXA, Sagamihara, Japan

この式は窒素を例にしたが，窒素には 14N と 15N の 2＊

つの安定同位体があり，標準物質である地球大気のN/14 N 比は 0.0036765 である．地球物質の安定同位体

15比の変動幅は数十‰程度であるが，地球外物質は地球物
質と比べ，変動幅が大きい．特に，水素と窒素は数千‰菅原 春菜52を超える大きな変動幅を持つため，天文学分野では地球±130‰，14N/15N＝290±40）とは一致しない．この相違物質を基準とした千分率ではなく，単に D/H や 14N/15Nの要因としては，45.6 億年前に星間分子雲が収縮し，原のように表されることも多い．

始太陽系円盤が形成される過程で局所的に同位体分別が本稿では，宇宙における安定窒素同位体比の多様性やその起源解明に向けた研究について紹介する．

生じた可能性が考えられる（e.g., Füri and Marty, 2015）．
また，銀河系内の星間分子雲の窒素同位体比の測定分子種は多くがニトリル（CN，HNC，HCN）であるが，太陽系に近い星間分子雲 Barnard 1 のアンモニアやそのアイ

2. 宇宙における安定窒素同位体比の多様性

ソトポログの（NH3，NH2D）の窒素同位体比はそれぞれ

2.1. 銀河系の安定窒素同位体比15窒素の 2 つの安定同位体（ N， N）の詳細な生成プロ14

15

N＝－186±125‰（14N/15N＝334±50），±155‰（ N/ N＝470
14

15

15

N＝－421）とニトリルよりもより太陽

􎨫170
􎸒170

セスについてはまだ議論も多いが，両者ともに質量の大系に近い値を示す（Lis et al., 2010; Gerin et al., 2009）．そき な（M＞1M⊙）恒 星 内 部 に お け る CNO（carbon-のため，星間分子雲内において，ニトリル分子種とアミnitrogen-oxygen）サイクルの副生成物として生成されるン分子種（アンモニア）との間で同位体分別が生じ，そと考えられている．14N は主系列星や赤色巨星の水素燃のソースの相違が太陽系の値に反映されている可能性も焼殻における cold-CNO サイクルや新星アウトバースト

考えられている（e.g., Hily-Blant et al., 2013）．

の hot-CNO サイクルおよび AGB 星（Asymptotic Giant
Branch star：漸 近 巨 星 分 枝 星）に お け る HBB（Hot2.3. 太陽系天体の安定窒素同位体比

Bottom Burning）により生成されると考えられ，特に前述の通り，太陽の窒素同位体比は

N＝－383±8‰15HBB が主要な生成プロセスとされるのに対し， N の主

（ N/ N＝441±5）であるが，太陽系天体は多様な窒素

な 生 成 プ ロ セ ス は hot-CNO サ イ ク ル や 超 新 星 爆 発

同位体比を示す（図 1）．太陽系で最も大きな惑星である（Type Ⅰa および Type Ⅱ）のみと考えられている（e.g.,

木星については欧州宇宙機関（ESA）の赤外線天文衛星

Wiescher et al., 2010; Adande and Ziurys, 2012; Romano（Infrared Space Observatory Short Wavelength Spectro-

and Matteucci, 2003）．このように， N の起源には一次

meter, ISO-SWS）や NASA/ESA のカッシーニ（Cassini）

的および二次的ソースの両方が存在するのに対し，15N

探査機による天文観測，NASA のガリレオ（Galileo）探は二次的ソースのみであり，この起源の相違が銀河内に査機によるその場質量分析等により，大気中のアンモニ

おける N/ N 比の勾配を生み出す．銀河中心は金属元

アの窒素同位体比が測定されている．求められた窒素同素の多い星が多いため，新星や超新星爆発により生成す

位体比はそれぞれ，ISO-SWS：

る 15 N の存在量が多く，銀河中心からの距離に応じて

15

15

14

14

15

14

15

15

14
N＝－483 􎨫245
􎸒272‰（ N/

N＝ 526 􎨫585
（Fouchet et al., 2000），Cassini：
􎸒169）

15

N＝

N/ N 比は上昇する（Adande and Ziurys, 2012）．銀河－393±86‰（ N/ N＝448±62）（Abbas et al., 2004），

内に存在する様々な星間分子雲のニトリル（CN，HNC，Galileo： 15N＝－375±80‰（14N/15N＝435±60）（OwenHCN）の天文学的観測結果により，14N/15N 比と銀河中

et al., 2001）である．このように木星の窒素同位体比は心からの距離との関係式が得られ，そこから太陽系が形

太陽とほぼ同じ値を示し，原始太陽系円盤と同様の値を成された位置の星間分子雲（Local ISM: Local interstel-

保持していると考えられる．同じく巨大惑星である土星

lar medium）の 14 N/15 N 比 は 290±40（は天文観測から14N/15N＝～500（

14

15

15

N＝－60

±130‰）と算出される（Adande and Ziurys, 2012）
．

14

15

N＝－460‰）程度と15

木星と同様の窒素同位体比を持つことから，土星と木星
は原始太陽系円盤内の同じ窒素リザーバーから形成され2.2. 太陽系の安定窒素同位体比

たと考えられている（Fletcher et al., 2014; Mousis et al.,

太陽系において最も大きな窒素リザーバーは太陽であ2014）．しかし，興味深いことに土星の衛星であるタイ

るため，太陽系のバルクの窒素同位体比は太陽の値に等

タンは土星とは異なる窒素同位体比を示す．タイタンはし い．ア メ リ カ 航 空 宇 宙 局（NASA）の ジ ェ ネ シ ス

カッシーニ探査機から投下されたホイヘンス小型探査機（Genesis）探査機により持ち帰られた太陽風サンプルの（Huygens）に搭載されたガスクロマトグラフ質量分析

分析から，現在の太陽の計（GC-MS）により，窒素同位体比の測定が行われたが，

15

N 値は－383±8‰（ N/ N
1415＝441±5）であることが明らかになった（Marty et al.,N2 の 14N/15N 比は 167.7±0.6（

2011）．し か し，こ の 太 陽 系 の 値 は 前 述 の 銀 河 系 のり，土 星 よ り も 遥 か に 15 N に 富 む 同 位 体 組 成 を 持 つN/15N 比 の 勾 配 か ら 想 定 さ れ る 値（

（Niemann et al., 2010）．これはタイタンが原始太陽系円

14

N＝－60

15

N＝621.9±6‰）であ15

宇宙における安定窒素同位体比の多様性とその起源解明に向けた実験的アプローチ53

図 1：太陽系天体および星間分子雲の多様な窒素同位体比．Füri and Marty（2019）を改変．

盤内のアンモニア氷から形成された可能性を示唆するの値であろうと報告している（Hoffman et al., 1979）．

（Mandt et al., 2014）．
一方，地球のような岩石惑星は太陽や巨大惑星と異なり， N に 富 む．前 述 の 通 り，地 球 大 気 は
15

15

N＝0‰

2.4. 始原的太陽系物質(隕石，彗星)の安定窒素同位体比
隕石や彗星などの始原的太陽系物質は，岩石惑星と同（ N/ N＝272）である．月については，NASA のアポロ

様に太陽よりも15 N に富むが，岩石惑星がほぼ（Apollo）計画や旧ソ連のルナ（Luna）計画により持ち帰～0‰（ N/ N＝270）付近の窒素同位体比を持つのに対られた月のレゴリス試料の詳細分析がなされている．月

し，始原的太陽系物質の値は多様で，さらに＋1,000‰をには大気や磁気圏による遮蔽効果がほとんど働かないた

超えるような非常に高い窒素同位体比を示すものが存在

め，月の表層は太陽風の影響を強く受け，月表層の窒素する（図 1）．始原的太陽系物質の窒素は主に有機物，特同位体比は 15N に乏しい太陽風起源の窒素（

N＝＜に不溶性有機物（Insoluble Organic Matter：IOM）といN＝う形態で存在する．有機物や揮発性成分を多く含む始原＋50～100‰， N/ N＝265±5）の混合により幅広い値的な隕石である炭素質コンドライトは，化学組成や酸素を示す（Hashizume et al., 2000; Füri and Marty, 2015）．

同位体比によって CI，CM，CO，CV，CK，CR，CH，

後 者 の 起 源 と し て は 惑 星 間 塵（IDPs：Interplanetary

CB に分類されるが，IOM のバルクの窒素同位体比は特dust particles）や微隕石などが考えられている．次に，殊な CM コンドライトである Bells 隕石と CR コンドラ

火星は NASA のバイキング（Viking）探査機 1 号と 2 号

イトを除き，全てのコンドライトはほぼ 0±30‰というに搭載された質量分析計により，現在の火星大気（N2）

岩石惑星と同様のの窒素同位体組成が直接測定され，その値は2007）．一方，CR コンドライトは＋150～310‰，Bells

14

15

15

－200‰，14 N/15 N＝＞340）と 15 N に富む窒素（
14

15

15

15

N＝

14

15

N 値を示す（e.g., Alexander et al.,隕石は＋415‰という高い富む（Nier and McElroy, 1977; Owen et al., 1977）．また，

al., 2006; Alexander et al., 2007）
．

15

15

N＝

15

＋648±65‰（ N/ N＝165±17）と，地球よりも N に
14

15

15

N 値を持つ（Busemann et

火星隕石の衝突ガラスに閉じ込められた過去の火星大気

さらに，炭素質コンドライトの中には，ミクロスケー

は，同様に N に富む値を示すが（e.g., Zagami 隕石：

ルで 15 N が局所的に濃集したホットスポットが存在す

N＝＋ 244.7±17.4‰，Marti et al., 1995），火星隕石

る．例えば，バルクレベルでは Murchison 隕石（CM2）

15

15

の中には

N＝－30‰という低い窒素同位体比を持つ

15成分が存在し，この値は火星内部の窒素の値を示すと考えられている（e.g., Mathew and Marti, 2001）
．これらの

の

15

N 値 は －1.0±0. 4‰ で あ る が（Alexander et al.,

2007）
，局 所 的 に は ＋2590±250‰ と い う 非 常 に 高 い
N 値を持つホットスポットが存在する（Hashiguchi

15

窒素同位体比の相違は，火星大気の進化や大気と岩石圏

et al., 2015）．前 述 の Bells 隕 石 も 最 大 で ＋3,200との間の相互作用の存在を示唆する．それから金星につ±700‰，複 数 の CR コ ン ド ラ イ ト に も＋1,500～

い て は，NASA の パ イ オ ニ ア・ヴ ィ ー ナ ス（Pioneer＋2,000‰というVenus）探査機に搭載の質量分析計による測定例があり，する（Busemann et al., 2006）．また，Tagish Lake 隕石

窒素同位体比の測定精度は高くないが，地球とほぼ同様にはナノグロビュールの形態を持つ有機物に 15N の濃集

N 値を持つホットスポットが存在

15

菅原 春菜54が見られる（Nakamura-Messenger et al., 2006）．これらまでの過程で，何らかの同位体分別が生じていると考えの N ホットスポットは冷たい星間分子雲や原始太陽系

られる．

15

円盤の外縁部に起源をもつと考えられているが，詳細についてまだわかっていない．また，必ずしも重水素（D）の濃集とは相関しないため，15N と D のキャリアが異なる可能性や原始太陽系円盤や隕石母天体上での水質変成作用により同位体比が変化する可能性が示唆されている

3. 始原的太陽系物質の 15N の濃集の要因解明に向けた検証実験
3.1. 星間分子雲内や原始太陽系円盤での光化学反応による窒素同位体分別（Busemann et al., 2006; Hashiguchi et al., 2015）．それから，金 属（Fe-Ni）に 富 む 炭 素 質 コ ン ド ラ イ ト で あ る

2 章で述べたように，太陽系天体は多様な窒素同位体

Isheyevo 隕石は，主に CB と CH の 2 つの岩相が混合し比を示し，特に彗星や隕石のような始原的太陽系物質はた砕石岩とされるが，バルクでも＋1,122‰という非常太陽や他の太陽系惑星と比べ高いに高い

N 値 を 持 つ（Ivanova et al., 2008）．ま た，に局所的に N が異常に濃集したホットスポットも存在

Isheyevo 隕石には始原的なゼノリスが含まれ，このゼノする．このような 15N の濃集は太陽系形成以前の冷たい

リスのN 値は非常に不均質で，太陽のような低い

星間分子雲に起源を持つと考えられているが，その生成N 値（－310±20‰）から太陽系内で最高値となるプロセスについてはあまり理解が進んでいない．星間分＋4,900±300‰というホットスポットまで，太陽系内全子雲内にて同位体分別を引き起こす要因の 1 つとされる

体の変動幅を表すような非常に幅広い

N 値を示すのがイオン分子反応であるが，この反応は動的にではな（Briani et al., 2009）．これは N の少ない原始太陽系円

く熱力学的に同位体分別が引き起こされる反応であり，盤の物質（N2）と N に富むカイパーベルト天体や彗星

極低温で大きな同位体分別が生じる（e.g., Terzieva andのような非常に始原的な原始太陽系円盤外縁部の物質がHerbst, 2000）．特に，水素は窒素を超える 10,000‰以

混合したことを示唆する（Briani et al., 2009）．

上の同位体異常を示すが，この D の濃集の要因は極低

15

15

15

15

15

15

15

N 値を持ち，さら15

次に，彗星については，地球上で手に入る彗星物質は温の星間分子雲におけるイオン分子反応であると考えらNASA のスターダスト（Stardust）計画により持ち帰られている．しかし，窒素については，イオン分子反応にれた 81P/Wild2 彗星（木星族）のリターンサンプルに限より生じさせることのできる同位体分別の程度は小さ

られる．81P/Wild2 彗星塵の分析から，バルクのく，始原的太陽系物質の持つ非常に高い

値 は 多 く が 0‰ で あ り，一 部 の 粒 子 が

15

N

15

N 値を説明N に富むできない（Terzieva and Herbst, 2000）．この異常な 15N＋100～500‰という値を持つが，ミクロスケールでは，の濃集をイオン分子反応により生じさせるためには，例

最大＋1,300±400‰の N ホットスポットが存在するこ

えば 10K 以下の気相中に窒素原子（N）が大量に存在すとが明らかになった（McKeegan et al., 2006）．また，炭るといったような特殊な生成環境を考える必要がある

素質コンドライトに見つかったような N に富む（N（e.g., Rodgers and Charnley, 2008）．さらに，2.3 章で述＝＋1,120±30‰）有機ナノグロビュールも発見されてべたように，15N の濃集と D の濃集が必ずしも相関しないる（De Gregorio et al., 2010）．しかし，スターダスト

いことも窒素同位体分別プロセスを理解する上で重要なサンプルはサンプル捕集時の高速衝突により，氷成分は

問 題 の 1 つ で あ る が（e. g., Busemann et al., 2006;

消失している．彗星の氷に含まれる窒素含有分子の窒素

Hashiguchi et al., 2015），イオン分子反応における水素の同位体比の測定は，彗星の天文学的観測から行われてお原子核スピン状態（オルソ・パラ）により説明できるとり，複数の彗星（木星族およびオールトの雲起源）のいう説もある（Wirström et al., 2012）
．

15

15

15

N/ N 比はほぼ同じで CN と HCN が～150（14

15＋810‰），NH3（NH2）が～130（

15

15

N＝～

15

N の濃集を引き起こすもう 1 つの主要因は紫外線に

N＝～＋ 1,100‰）で

よる N2 の自己遮蔽効果による同位体選択的光解離反応ある（e.g., Manfroid et al. 2009; Bockelée-Morvan et al.,である．星形成領域や原始太陽系円盤にて，恒星からの2008; Rousselot et al., 2014; Shinnaka et al., 2014）．しか紫外線が表面に照射されると，存在量の多い 14N14N は自し，CN，HCN と NH3 がほぼ同じ同位体比を持ち，かつ，

己遮蔽効果によりごく表層に存在する分子のみが解離さそれらが太陽（原始太陽系円盤）の値と異なることは，れるが，存在量の少ない 14N15N や 15N15N は自己遮蔽効

2.1 章で述べた星間分子雲におけるニトリル分子種とア果が効きにくいため，より深部の領域の分子まで解離さミン分子種との間での同位体分別のモデルと矛盾する．

れる．この選択的光解離により生成された 15N 原子がア

そのため，原始太陽系円盤や星間分子雲からそこに至る

ンモニアのような分子となって星間塵表面に凍結される

15

宇宙における安定窒素同位体比の多様性とその起源解明に向けた実験的アプローチ55

図 2：星間氷模擬実験のセットアップおよび生成した試料の例．Sugahara et al.（2019）を改変．

ことにより， N に富む星間氷が形成されると考えられ
15て い る（e. g., Heays et al., 2017; Furuya and Aikawa,2018）．これらの研究は理論的計算に基づくものであり，

図 3：星間氷模擬試料の窒素同位体比測定結果．
（a）ガスクロマトグラフ／燃焼／同位体比質量分析計（GC/C/IRMS）
によるサンプル P1-C の m/z 28 クロマトグラム．
（b）試料のバルクおよびアミノ酸の窒素同位体比測定結果．Sugahara
et al.（2019）を改変．

実験的研究は極めて少ないが，Chakraborty et al.（2014）はシンクロトロンを用いた実験を行い，N2 の選択的光解離によって非常に大きな窒素同位体分別が生じること（図 3）．本結果は，星間氷にて光化学反応によりアンモを実証している．彼らは，H2 と N2 を入れたチャンバー

ニアから有機分子が生成する際には，窒素に同位体分別に，シンクロトロンを用いて様々な波長の真空紫外線は生じず，アンモニアが 15N の濃集プロセスの重要な鍵（VUV）を照射することで N2 を光分解し，極低温（195K）

であることを示す．

にて生成したアンモニアに＋10,000‰を超える非常に大き な 15 N の 濃 集 が 生 じ る こ と を 報 告 し て い る．こ の3.2. アンモニアの吸着による窒素同位体分別

VUV に よ る 選 択 的 光 分 解 は 波 長 依 存 性 が 大 き く，

アンモニアが始原的太陽系物質の 15N 濃集を理解する＋10,000‰を超える同位体分別が生じるのは 90.0nm で上での重要な鍵となりうる可能性について前節で述べたあるが，それ以外の波長では＋1,000～＋3,000‰程度でが，私たちの研究グループではさらに，アンモニアが星ある．また，この 90 nm でのピークは自己遮蔽効果のみ

間塵表面に吸着する際に窒素同位体分別が生じるか否かでは説明できないため，上位の電子状態での摂動が重要

検証を行った（Sugahara et al., 2017）．この検証実験でな役割を担っていると考えられている（Muskatel et al.,は，モンモリロナイトやサポナイトのようなケイ酸塩鉱

2011）
．

物を封入したガラスバイアルにアンモニアガスを導入

また，私たちの研究グループでは，アンモニアを出発し，吸着したアンモニアの窒素同位体比の測定を行った．

分子として，高真空チャンバー内に模擬星間ガス（水，その結果，吸着したアンモニアは 15 N に富み，＋50‰を

メタノール，アンモニア）を導入して，～10K の基板上超える大きな同位体分別が生じることが明らかになったに凍結させ，重水素ランプを用いて紫外線を照射し，星（図 4）．本結果は吸着という非常に基礎的な素過程が窒間氷模擬物質を生成する実験を行い（図 2），生成した有素に同位体分別を生じさせることを示している．

機物のバルクレベルおよびアミノ酸の分子レベル窒素同位体比測定を行った（Sugahara et al., 2019）．その結果，
生成した有機物はバルクレベルおよび分子レベルでアンモニアと同じ窒素同位体比を示すことが明らかになった

4. おわりに
本稿では窒素の同位体比に着目し，銀河スケールから，

菅原 春菜56

図 4：（a）アンモニアガスのケイ酸塩鉱物への吸着実験結果．図中のパーセンテージは水の含有量を示す．
（b），（c）吸着実験後，真空に引いた実験の結果．真空引きする時間は 1-8hまで変化させた．Sugahara et al.（2017）を改変．

太陽系スケール，さらには始原的太陽系物質のミクロス

星 Ryugu から帰還したはやぶさ 2 リターンサンプルのケールでの窒素同位体異常についてレビューし，宇宙にような地球外物質の詳細な分析を重ねていくことで，謎おける窒素同位体比の多様性とその起源について議論しの多い窒素の同位体分別プロセスの総合的な理解が進んた．銀河スケールでは，銀河中心から縁辺部に向かっでいくと期待される．

て， N が減少していく傾向があり，その中に太陽系が
15

位置付けられるが，この銀河の傾向から導き出される窒素同位体比と太陽系の窒素同位体比は一致しないという謝辞問題がある．また，太陽系スケールでは，太陽と木星，

本稿の執筆の機会をくださった北海道大学低温科学研

土星はほぼ同様の窒素同位体比を持つが，岩石惑星は究所の力石嘉人教授に心からお礼申し上げます．また，

N に富み，さらに彗星や隕石のような始原的太陽系物

本稿で紹介した著者の研究の共同研究者である海洋研究

質は数＋1,000‰以上ものN 値を示す．このように開発機構の高野淑識博士，小川奈々子博士，大河内直彦

窒素同位体比は非常に多様であり，その同位体分別プロ

博士，東京大学の橘省吾教授，北海道大学低温科学研究

セスもおそらく 1 つではなく複数のプロセスが関与して所の香内晃教授，菅原いよさん，北海道大学の圦本尚義いると考えられるが，窒素は他の元素と比較してもあま教授に感謝いたします．本研究は，文部科学省科学研究り理解が進んでいない．本稿では，未だ謎の多い窒素同費補助金 新学術領域研究「宇宙における分子進化：星位体分別プロセスを理解するための試みとして，著者の間分子雲から原始惑星系へ」（課題番号：JP25108006），

研究も含め，いくつかの実験的研究についても紹介した

挑戦的萌芽研究（課題番号：16K13916）および日本学術が，1 つ 1 つの素過程において分子レベルで窒素同位体振興会 海外特別研究員制度の助成を受けて行われまし

分別について検証を行っていくと共に，昨年，C 型小惑

たので，ここに感謝申し上げます．また，北海道大学低1515

宇宙における安定窒素同位体比の多様性とその起源解明に向けた実験的アプローチ

温科学研究所の共同利用（一般共同研究）の援助を受け

57

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ました．

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炭素安定同位体組成で探る
隕石有機物の生成反応と地球への運搬
古川 善博
2020 年 11 月 25 日受付，2021 年 1 月 28 日受理

近年，著者らのグループによって炭素質コンドライトからリボースなどの生命を構成する糖が見つかった．このことは，宇宙に生命を構成する糖が存在し，それが地球にもたらされていたことを示す
事実で，地球生命の材料となる糖の起源を考える上で，隕石が考慮すべき供給源であることを示している．この糖の炭素同位体組成は地球生物によって作られる糖に比べて優位に 13C に富んでいた．これは，アミノ酸やホルムアルデヒド，アミンなどの炭素質コンドライトに含まれる他の水溶性有機物と同様の特徴であり，炭素質コンドライトに含まれる 12C に富む不溶性有機物の炭素同位体組成とは大きく異なる．地球外有機物の炭素安定同位体組成には，その生成反応や生成環境に応じた情報が記録されている．糖が生成する反応であるホルモース型反応に関連した複数の反応の速度には大きな差がある可能性があり，水溶性有機物と不溶性有機物の炭素同位体組成の特徴は，それら一連の反応の中での動的同位体分別によって説明できる可能性がある．その場合，ホルモース型反応は隕石有機物
全体の生成に大きな影響を及ぼした可能性がある．隕石には地球有機物よりもはるかに多種多様な有機物が含まれており，それらの有機物生成と地球への運搬を理解するには，網羅的な測定とともに，特定の分子ごとに精密に同位体組成を測定することが不可欠であり，その精密化と隕石有機物のような多種多様な有機物を含む試料へのより良い応用が地球外有機物の全貌を理解するために大きく貢献するであろう．

Investigations on the formation and delivery of meteorite organic matterbased on the carbon isotope compositions
Yoshihiro Furukawa
The recent finding of ribose and other bio-important sugars in carbonaceous chondrites indicates that meteorites
were a potential source of sugars on the prebiotic Earth. The detected sugars were enriched in 13C. This enrichment issimilar to other solvent-soluble organic matter such as amino acids but distinct from terrestrial biota and meteoritic
solvent-insoluble organic matter. Carbon isotope compositions record the type of formation reaction and the formation
environment of the organic matter. The large difference in the carbon isotope compositions between soluble organic
matter and insoluble organic matter may be formed by kinetic isotope effects through many steps of the formose
reaction because a large difference in the reaction rate can be expected related to the formose reaction. In such a case,the formose reaction might significantly affect the bulk organic syntheses of the meteorite organic matter. Sincemeteorites contain a huge variety of organic compounds, coordinated analysis with non-target analyses and highprecision target analyses such as compound-specific isotope analysis would be more important to understand the bulk
organic syntheses in the early solar system and their delivery to the prebiotic Earth.

連絡先
古川 善博
東北大学理学研究科 地学専攻
〒980-0833 仙台市青葉区荒巻字青葉 6-3
Tel. 022-795-3453＊

e-mail：furukawa@tohoku.ac.jp
東北大学理学研究院 地学専攻
Department of Earth Science, Tohoku University, Sendai,Japan古川 善博60

キーワード：隕石，糖，アミノ酸，動的同位体効果，
Meteorite, Sugar, Amino acid, Kinetic isotopic fractionation

1. はじめに

2. コンドライトに含まれる有機物の量と性質

地球で回収された隕石の大部分は，その反射スペクト

大部分のコンドライトは有機炭素を含んでおり，そのル（可視から近赤外領域）の類似性から火星と木星の間含有量は，普通コンドライトでは典型的には 0.1－0.3に軌道を持つ様々な小惑星に由来する岩石と考えられてwt％程度であるが，炭素質コンドライトではその割合がいる（Zellner et al., 1985）．このことは，小惑星探査機は高く，典型的には 0.1－2 wt％である（Alexander et al.,

やぶさがイトカワから持ち帰った試料の分析により決定

2007）．普通コンドライトではこの有機炭素のうち全て付けられた（Nakamura et al., 2011）．地球などの惑星はが，酸にも有機溶媒にも溶けない不溶性有機物と呼ばれその成長過程で，より小さな天体が激しく合体成長し，る，複雑な分子構造を持つ有機物であると認識されてい高温で生成した岩石によって構成されている．一方，小る．炭素質コンドライトでも，熱変質を受けた炭素質コ惑星ではその程度が低く，地球のように金属の核とケインドライトでは有機炭素の大部分が不溶性有機物として酸塩鉱物のマントルのような分化した構造を持たない小含まれる（Alexander et al., 2015）．一方で，水質変質を惑星も多い．そのような小惑星から飛来した隕石は，コ受けた炭素質コンドライトではその量はやや低く，70

ンドリュールと呼ばれる球粒状物質を含むことからコン

wt％程度が不溶性有機物として含まれ，残りの 30 wt％

ドライトと呼ばれ，地球上で回収された隕石のうち，3％程度は水や有機溶媒に可溶な低分子有機物として含まれ程度が有機物を含むコンドライト（炭素質コンドライト）

る場合がある（Pizzarello et al., 2006）．

である．このような隕石は熱による変質の程度が特に低
いため，太陽系最初期の情報を記録している貴重な試料となっている．隕石に残される太陽系の始原的な情報
は，主に鉱物に関する研究で明らかにされてきた．一方

3. 炭素質コンドライトを構成する
不溶性有機物とその安定同位体組成で，炭素質コンドライトに含まれる有機物に関しても，

炭素質コンドライト中の不溶性有機物は，主に，C，長年研究が行われてきた歴史がある．それは，炭素質コ

H，N，O から構成されており，例えばマーチソン隕石のンドライトからアミノ酸や核酸塩基などの生命を構成す

不溶性有機物の組成は C100H70N3O12S2 程度であると報告

る有機化合物（極性有機化合物）が見つかるため，小惑されている（Hayatsu et al., 1980）．この炭素は芳香族炭星からの隕石の飛来が，地球の生命の起源に繋がる可能

素が脂肪族炭素よりも多い化学状態となっており，実に性があると考えられているためである．しかし，そのよ

複雑な炭素骨格を持っていると推定されている（Cody

うな極性有機化合物の含有量は低く，それらを対象とし

and Alexander, 2005; Cody et al., 2002）．不溶性有機物

た研究だけでは初期太陽系でどの様な有機化学反応が起

炭素の安定同位体組成は大部分の炭素質隕石でこったのかを推定することはできない．また，隕石には－30‰から－10‰の値をとる（Alexander et al., 2007）．

5 万種類以上の有機分子が含まれており未だに同定され中でも，CI コンドライトではていない有機分子も多いことが，さらに問題を複雑にしIvuna），CM コンドライトでは，二次加熱を受けた隕石ている（Schmitt-Kopplin et al., 2010）．初期太陽系でのと Bells 隕石を除いて，ほとんどが化学反応の条件や環境を推定するには，隕石中に数 wt％－17‰（n＝8），CR 隕石では含まれ主要な炭素質物質である溶媒不溶性有機物の含有（n＝7）と，狭い範囲に分布している（Alexander et al.,

量や化学的特徴と整合的な成因を検討していく必要があ

2015; Alexander et al., 2007）．これらの値は地球生物がる．本総説では，著者らが近年行った隕石からの糖の検作り出す有機物の値に近いが，小惑星ではそのような生出と隕石有機物生成の模擬実験，および近年明らかにな

化学的な反応は考えられず，この値がどのような現象にりつつある隕石有機物生成の主要な反応について紹介す由来するものかは不明である．一方で炭素質コンドライ

る．

トの窒素同位体組成（ 15N）と水素同位体組成（ D）に

13

13

13

C＝

C＝－17‰（Orgueil，
13

C＝－19‰から

C＝－27‰から－20‰

関 し て は，CR コ ン ド ラ イ ト で15

N＝＋153‰ か ら＋309‰， D＝＋2619‰から＋3527‰と極めて高く，それ以外の炭素質コンドライトでは，CM コンドライトの炭素安定同位体組成で探る隕石有機物の生成反応と地球への運搬

61

Bells 隕石を例外として，概ね CR コンドライトよりもかなり低い値をとる（Alexander et al., 2007）．分子雲や太陽系の外側の極低温領域で生成する分子に含まれる窒素と水素は，15N に富むことが知られているため，CR コ
ンドライトの 15 N と D に富む有機物の由来の一つはそのような極低温環境とも考えられている（Aleon, 2010）．

4. 炭素質コンドライトから検出された可溶性分子とその安定同位体組成
炭素質コンドライトに含まれる可溶性有機物について
は，古くは 1960 年代から研究が行われ，当時はアミノ酸や糖の存在が示唆されていた（Degens and Bajor, 1962;
Kaplan et al., 1963）．しかし，このような生命に関係の深い有機分子の分析には，地球物質（地球上での生命活動に由来する有機分子）の混入が非常に大きな問題であった．実際にその当時出版された論文では炭素質コン
ドライト以上に普通コンドライトから多くのアミノ酸と糖が検出されたと報告しており，著者自身が論文中で混入物の可能性を指摘している（Degens and Bajor, 1962;

図 1：隕石・彗星有機物の炭素同位体組成．
Figure 1：aElsila et al., 2012; bFurukawa et al., 2019;cAlexander et al, 2005; d De Gregorio et al., 2010; e Elsila et al.,2009; fSimkus et al., 2019.

Kaplan et al., 1963）．普通コンドライトにアミノ酸などの極性有機分子がほとんど含まれていないことは，現在組成をもつ不溶性有機分子とは異なり，幸いなことに地ではよく知られた事実である（Chan et al., 2012）．

球外由来のアミノ酸はそれよりもかなり高い炭素同位体

その後，NASA がアポロ計画で月から持ち帰った岩石

組成を持つことが明らかになった（Elsila et al., 2012;の分析などを通して，サンプルの注意深い取り扱いや，Engel et al., 1990; Pizzarello et al., 2004）．このことは同分析過程での地球物質の混入を防ぐ工夫が行われ，混入時に，炭素同位体組成が地球のアミノ酸と地球外のアミ物と思われる有機物の報告が激減し，炭素質コンドライノ酸を区別するための有用な指標となることを意味してトからは，アミノ酸，カルボン酸，アミン，炭化水素ないる．その後，炭素質コンドライトに含まれる他の有機

ど多様な有機分子が改めて検出されるようになった．そ化合物の分子ごとの炭素や窒素，水素の安定同位体組成の頃には，初期地球でのアミノ酸の生成を模擬したミの測定が行われ，例えば，マーチソン隕石の炭化水素でラーの実験の出発物質が，初期地球の大気組成とは大きは，不溶性有機物（－19‰）よりやや高い－10‰から 0‰，

く異なることが指摘され（Abelson, 1966），初期地球でカルボン酸はそれよりもやや高い 0 から＋10‰，アミノ

アミノ酸は生成しないと考えられるようになっていたの

酸はさらに高い＋10 から＋40‰であることが明らかにで，隕石から見つかる地球外有機物は，生命の起源といなった（Alexander et al., 2007; Aponte et al., 2019; Elsila

う意味でも存在感を増していたと思われる．

et al., 2012; Pizzarello et al., 2004）（図 1）．アルデヒド類

一方で，大部分の隕石は地上に落下して，年月が経っも＋20‰から＋66‰と高い値を示し，特にホルムアルデてから回収されるため，隕石表面に関してはその間の地

ヒ ド は ＋66‰ と 極 め て 高 い 値 を 持 つ（Simkus et al.,球物質による汚染が避けられない．実験室でサンプルの

2019）
（図 1）
．また，核酸塩基についてはマーチソン隕

注意深い取り扱いや，分析過程での地球物質の混入を防石中のウラシルのみが測定されており， 13C＝＋44.5‰

ぐ工夫が行われたとしても，個々の隕石岩片ごとに汚染という炭素同位体組成が報告されている（Martins et al.,の頻度や程度は大きく異なり，検出した有機分子が地球

2008）
（図 1）
．

外由来の有機分子である決定的な証拠を得ることは困難

一方で，アミノ酸の窒素同位体組成は CR コンドライであった．しかし，1990 年にアミノ酸の分子ごとの安定

トが CM コンドライトよりもやや高いが，共に＋80‰か

炭素同位体組成が分析され，その問題は解決した（Engel

ら＋200‰程度に分布し，その差は小さい（Elsila et al.,

et al., 1990）．地球の生物が持つ炭素同位体組成に近い

2012）．アミノ酸の水素同位体組成は CM コンドライト古川 善博62

図 2：（A）RNA の構造．
（B）ATP の構造．

のマーチソン隕石で分析が行われ，十分な精度で測定で盛んに行われてきた．電波望遠鏡観測では，糖の前駆体

きていないデータのようだが，＋数百‰の高い値を持つであるグリセルアルデヒドが検出されている（Jes et al.,と報告されている（Pizzarello et al., 1991）．

2012）．炭素質コンドライトからは，2000 年に Cooperらによって最小の糖であるジヒドロキシアセトンが検出

5. 隕石からの糖の検出されている（Cooper et al., 2001）．また，この研究では他に，糖のアルデヒド基がカルボキシル基になっている複糖は生体内で非常に重要な役割を担っている．例え数の糖酸，糖のアルデヒド基が水酸基になっている複数ば，リボースとデオキシリボースは生命の基本原理を支の糖アルコールが検出された（Cooper et al., 2001）．こえる RNA と DNA の構成分子であり，グルコースは呼れらの糖アルコールは後に分子ごとの炭素同位体比が測

吸のエネルギー源として使われる（図 2A）．リボースは定され，最高で 2-Methylglyceric acid のさらに，生命のエネルギー通貨とみなされる ATP や

Glyceric acid は

ADP の構成分子でもある（図 2B）．植物の構造体であかになった（Cooper and Rios, 2016）．

C＝＋82‰，

13

C＝＋60‰と高い値を示すことが明ら

13

るセルロースやヘミセルロースも糖が主成分である．こ糖には D 体と L 体の鏡像異性体が存在する．糖酸，のように，糖は現在の生命にとって不可欠な有機分子で糖アルコールにも不斉炭素があるので，同様に鏡像異性ある．

体が存在する．化学的に糖を合成すると，特殊な場合を糖を含む分子の中でも，RNA は最初期の生命に非常

除いて D 体と L 体は 1：1 の量比で生成するが，生命をに関連の深い分子として注目を集めている．現在の生命構成する糖は D 体であり（ただし，アラビノースは L

では DNA が遺伝情報を記録し，その記録に基づいて，

体），この性質はホモキラリティーと呼ばれ，生命を特徴

RNA を介してタンパク質が合成される．そして，その付ける重要な性質となっている．Cooper らは，炭素質タンパク質が生体内の多くの反応を駆動する，DNA-

コンドライトに含まれる糖酸の光学異性体比を分析し，RNA-タンパク質システムが生命の基本となっている．

D 体が L 体の何倍も多いと報告している（Cooper andしかし，初期の生命ではこれらの働きを全て RNA が行

Rios, 2016）．隕石に含まれる糖酸が D 体を多く含んでなっていたとする RNA world 仮説が支持を集めているいるという報告は，地球生命のホモキラリティーの起源

ことから，RNA を構成する糖であるリボースは生命のという観点からも注目されている．

起源にとって非常に重要な分子であると考えられている糖の生成に関しては，室内模擬実験による研究も進ん（Benner et al., 1989; Joyce, 1989; Joyce and Orgel, 1993）．

でいる．分子雲中に存在するメタノールを含む氷に紫外

そのため，地球外で糖の存在を探す研究はこれまでに線が照射される反応を模擬した室内実験において，リ炭素安定同位体組成で探る隕石有機物の生成反応と地球への運搬

63

図 3：リボースと他の五炭糖の構造式．

ボースを含む複数の糖の生成が確認されている

際にマーチソン隕石が落下した地域の土壌に含まれる五（Meinert et al., 2016）．また，同様の条件でデオキシロ

炭糖の炭素同位体組成がボースの生成も確認されている（Nuevo et al., 2018）．こたことから，これらの隕石から検出した糖は，地球外由れらの実験結果は，宇宙に生命を構成する糖が存在して来であることが明らかになった（Furukawa et al., 2019）．

もおかしくないことを示している．

13

C＝－60 から－40‰であっ

また，非生物的糖生成反応によって生成する糖の組成

非生物的反応で生成される糖の研究は，有機化学的研を，隕石から検出された糖と比較するために，ホルムア

究として古くから行われており，ホルムアルデヒドをア

ルデヒド，グリコールアルデヒド，アンモニア，水酸化

ルカリ性溶液中で加熱すると，ホルモース反応と呼ばれカルシウムを含む水溶液を加熱して，アンモニアが関与る逐次的なアルドール縮合を基本とする反応によって，するホルモース型反応実験を行った．その結果，生成物

多様な糖が生成することが知られている（Breslow, 1959;の五炭糖組成はマーチソン隕石と NWA801 隕石から検Butlerow, 1860）．そのような研究では，液体クロマトグ

出された五炭糖組成と類似する傾向が見られた

ラ フ ィ ー 質 量 分 析 計（LC/MS）や ガ ス ク ロ マ ト グ ラ（Furukawa et al., 2019）．このことはアンモニアが関与

フィー質量分析計（GC/MS）を用いた分析が行われていするホルモース型反応によって炭素質コンドライト中のる．一般的に，液体クロマトグラフィーよりもガスクロ糖が生成したことを示唆している．しかし，ホルモース

マトグラフィーの方が化合物の分離は良いが，糖は不揮

型反応は熱エネルギーだけではなく，光化学エネルギー

発性の有機物なので，ガスクロマトグラフィーで分析すでも促進されることが知られている（Shigemasa et al.,

るには誘導体化（揮発性を付与する化学修飾）が必要に

1977）．したかって，糖を生成したアンモニアが関与すなる．しかし，糖の誘導体化で典型的に用いられている

るホルモース型反応が，小惑星内部の水熱反応によってトリメチルシリル化などの方法では，一つの糖分子から引き起こされたのか，それとも，小惑星集積前の分子雲

4 種類程度の誘導体化物を生成してしまう．さらに，ホや原始太陽系円盤内の低温環境での光化学反応によってルモース反応生成物が異性体を含むあまりに多様な糖を引き起こされたのかは，この結果だけでは明らかではな

含むことから，誘導体化で検出される分子の種類が増え

い．

ることと相まって，GC/MS を用いた分析は困難であっ測定した 3 つの隕石に含まれる珪酸塩鉱物の水質変質た（Meinert et al., 2016）．一方で著者らは，1 つの糖分の程度，および不溶性有機物の炭素の化学状態を比較す

子から 1 つの誘導体化物を形成するアルドニトリルアセ

ると，糖が検出された CR コンドライトである NWA801

テート誘導体化を用いて，典型的な隕石有機物分析より

隕石は，糖が検出されなかった CR コンドライトであるも多くの試料を用いて，隕石の糖分析を行った．測定しNWA7020 隕石よりも変質の程度が低かったが，糖が検た隕石は CM コンドライトであるマーチソン隕石と，出された CM コンドライトであるマーチソン隕石はCR コンドライトである NWA801 隕石および NWA7020

NWA7020 隕石よりも変質の程度が高かった．従って，隕石である．その結果，マーチソン隕石と NWA801 隕隕石母天体での鉱物や有機物の変質と糖の有無の関係に石からリボース，キシロース，アラビノース，リキソー

ついては，明らかでなく，更なる研究が必要である．こスを検出した（図 3）．これらの糖のうち，リボース，ア

れには，南極から回収された保存状態の良い炭素質隕石

ラビノース，キシロースの炭素同位体組成を測定するこやサンプルリターンで得られる試料など，地球の汚染がとができ，その値はマーチソン隕石のリボースで少ない多くの試料の分析が必要になるであろう．

＋38‰，アラビノースで

C＝13

C＝＋43‰という非常に高い13値を持つことが明らかになった．地球の生物が作る糖の炭素同位体組成は，一般的に13C＜0‰であり，また実

64

古川 善博

6. 隕石有機物の生成モデル

2017; Koga and Naraoka, 2017）．また，奈良岡らは，この反応で生成する種々のイミダゾールや種々のピリミジ

隕石に含まれる不溶性有機物と可溶性有機物の起源

ンを隕石から検出した（Naraoka and Hashiguchi, 2019;

は，長らく議論が行われてきた．両者の炭素同位体組成

Naraoka et al., 2017）．さらに大場らは，ホルムアルデヒ

が全く異なることから，それらは別々の起源であるとす

ドとアンモニアの反応で生成するヘキサメチレンテトラる説がある（Derenne and Robert, 2010; Remusat et al.,ミンの存在をマーチソン隕石などの炭素質コンドライト

2005）．不溶性有機物の生成については，高温で金属やで明らかにした（Oba et al., 2020）．また，先述の通り著

酸化物等を触媒とした一酸化炭素と水素からの生成であ

者らは，アンモニアが関与するホルモース型反応で生成るフィッシャー・トロプッシュ型反応（FTT 反応）が議する五炭糖の組成が，マーチソン隕石と NWA801 隕石

論 さ れ て き た（Lancet and Anders, 1970）．し か し，に含まれる五炭糖の組成と類似していることを明らかに

FTT 反応で生成する炭素質物質はほとんどが直鎖の炭した（Furukawa et al., 2019）．これらの研究によって，化水素であるのに対し，隕石から検出される不溶性有機

アンモニアが関与するホルモース型反応によって，炭素物は主に芳香族炭素から成るという違いがある（Cody

質コンドライトに含まれるアミノ酸と糖および不溶性有and Alexander, 2005; Cody et al., 2002）．さらにこの反機物が生成した可能性は示されたが，実際に起こった主応では，反応残存物の CO は生成する炭化水素より高い

要な反応が，アンモニアが関与するホルモース型反応で炭素同位体組成を持つが，実際の炭素質コンドライトであったのかどうかを判断するには，さらなる制約が必要検出される CO と炭化水素の同位体組成はこの逆になるである．

（Lancet and Anders, 1970; Yuen et al., 1984）．このようなことは，不溶性有機物生成の主要な生成反応が FTT反応であるとする考えとは整合的でない．
可溶性有機物，特にアミノ酸の生成反応は，ホルムア

7. ホルモース型反応に伴う炭素同位体分別の可能性

ルデヒド，シアン化水素，アンモニアが水溶液中で反応

隕石有機物のうち可溶性有機分子が不溶性有機物よりし -アミノ酸を生成するストレッカー反応が古くからも13C に富むことは，それらの炭素源が異なるという可議論されてきた（Peltzer and Bada, 1978; Pizzarello et al.,

能性と，それらの生成の際の同位体分別がその差を生み2006）．しかし，アミノ酸を生成するこの反応と，隕石中出したという可能性が考えられる．ホルモース型反応のの主要有機物である不溶性有機物を作った反応または，基本的な反応はアルドール縮合で，この反応で単素数 1

多様な隕石有機物を作った様々な反応との関係はほとんのホルムアルデヒドから巨大分子である不溶性有機物がど議論されてこなかった．また，不溶性有機物の変質に形成されるとすると，その反応速度は極めて高いことによって水溶性の有機物が生成するという考えも報告さなる．また，アルカリ溶液中でのホルモース型反応は，れ，カ ル ボ ン 酸 の 生 成 が 確 認 さ れ て い る（Oba and

正反応の反応速度が逆反応の反応速度に比べて極めて高Naraoka, 2006）．

いため，ほとんど不可逆的に縮合反応が進む．もし，こ近年，小惑星内部でのアンモニアが関与するホルモーの反応で 12C と 13C の間に同位体分別が起こるに十分なス型反応によって，炭素質コンドライトの不溶性有機物

反応速度の差が生じれば，12C からなるホルムアルデヒや彗星から見つかっている炭素質物質に近い化学構造のドが優先的に消費され，不可逆的に系から取り除かれる．

炭 素 質 物 質 が 生 成 す る と 提 案 さ れ た（Cody and

多段階反応の最終生成物である不溶性有機物は，反応初

Alexander, 2005）．この反応の原料となるホルムアルデ

期では原料アルデヒドの炭素同位体組成より 12C に富む

ヒドとアンモニアは，分子雲の低温環境で生成しやすいが，反応が進むにつれ原料の炭素同位体組成に近づき，分子であり，炭素質コンドライトからも検出されている

反応残渣のホルムアルデヒドは反応が進むにつれ，急激（Pizzarello and Groy, 2011; Simkus et al., 2019; Watanabeに 13C に富むようになる可能性がある．この 13C に富む

and Kouchi, 2002）．ホルムアルデヒドとアンモニアからホルムアルデヒドとやはり 13C に富むグルコールアルデ

アミノ酸が生成することは古くから知られていたがヒドからアミノ酸が生成されれば，その炭素同位体組成（Yanagawa et al., 1980），癸生川ら（2017）と古賀，奈良は 13C に富むものとなるであろう．そうだとすれば，こ岡（2017）ではさらに，アンモニアが関与するホルモーのことは炭素質コンドライトに含まれるホルモース反応

ス型反応で生成するアミノ酸の組成が，隕石アミノ酸のの反応物であるホルムアルデヒドと，ホルモース反応の組成に似ていることも明らかにした（Kebukawa et al.,

最初期の生成物の一つである五炭糖が 13C に富むことの炭素安定同位体組成で探る隕石有機物の生成反応と地球への運搬理由となる可能性もある．
過去の研究では，隕石中に見つかるアミノ酸が 13C に65

8. まとめ富む理由として，10 K 以下の環境でのイオン分子反応

始原的な隕石に含まれる極性の低分子有機物は，地球によって生成した有機物を材料にアミノ酸生成が起こっ

生命が作り出す有機分子に比べて 13C に富んでいる．こたという解釈が行われてきた（Elsila et al., 2012; Epsteinの炭素同位体組成の特徴は，地球外から地球への生命材

et al., 1987; Pizzarello et al., 2004）．極低温領域で生成す料分子供給の強力な証拠となり，これまでにアミノ酸，

る有機物は N と D に富むと考えられ，CR コンドライ

核酸塩基，そして近年にはリボースを含む糖が地球外でトに含まれる有機物からはこの様な特徴が見つかってい非生物学的に作られた有機物として見出されている．そる（Aleon, 2010; Watanabe and Kouchi, 2008）．しかし，の様な隕石に含まれる多様な有機物の同位体組成は，有CR コンドライトに含まれるアミノ酸や IOM は C に富機物生成反応での同位体分別を記録している可能性があむ特徴は持っていない（Alexander et al., 2015; Elsila et

る．炭素や窒素，水素などの軽元素同位体組成は地球外

al., 2012）．このことからも，隕石有機物の C 濃集は必

有機物の成因や生成環境を制約するために不可欠な特徴

ずしも極低温環境と関連するとは限らないと推察できとなっている．

15

13

13

る．
アンモニアが関与するホルモース型反応が隕石有機物生成の主要生成反応だったとすると，それは小惑星内部

謝辞の数十℃の水熱反応でも起こり得ることは，多くのホル

本稿の執筆機会を頂いた，北海道大学低温科学研究所

モース反応の条件が示している（Furukawa et al., 2019）．

の力石嘉人教授に深くお礼申し上げます．また，本稿で一方で，ホルモース型反応は光化学エネルギーでも進行

紹介した著者らの研究は，北海道大学低温科学研究所のすることから（Shigemasa et al., 1977），小惑星集積以前

力石嘉人教授，東北大学理学研究科の中村智樹教授，岩の極低温環境での光化学反応でもホルモース型反応が進佐義也さん，阿部千晶さん，海洋研究開発機構の大河内行した可能性がある．NASA の Stardust 計画で回収さ直 彦 博 士，小 川 奈々 子 博 士，NASA Goddard Space

れた Comet 81P/Wild 2 のコマ物質からは，隕石の IOM

Flight Center の Daniel P. Glavin 博士，Jason P. Dworkinにも含まれる様なグロビュール状の炭素質物質が見つ

博 士 と 共 に，科 研 費（18H03728，19K21888 andかっており，その炭素同位体組成は， 13 C＝－35±3‰

20H00185），NINS アストロバイオロジーセンター，北海と C に富むものであった（De Gregorio et al., 2010）．

道大学低温科学研究所（18G046，20G049）からの支援を一方で，不確定性は高いが同じ彗星のコマ物質に暴露さ受けて実施しました．

12

れたサンプラーから抽出されたグリシンは

C＝13＋29±6‰と C に富む値を示した（Elsila et al., 2009）．
13

これらの同位体組成の差は，小惑星集積前の分子雲や原
始太陽系円盤の極低温環境において，光化学反応でホルモース型反応が進行し，同位体組成の差を生み出したと考えると，隕石有機物と統一的に解釈できるかもしれな
い．光化学反応でどの様なホルモース型反応が進行し，どの程度の炭素同位体組成の違いを生み出すのかは，極低温環境を模擬した今後の研究が期待される．
近年の隕石有機物分析および有機物合成実験を通して，初期太陽系での有機物生成反応に関する理解は着実に進んでいる．今後はどのような環境でどのような反応により有機物が生成しているのかの理解を追える段階になるであろう．これに向けては，鉱物分布と有機物分布を相補的に理解するための隕石分析や，彗星サンプルリ
ターンによって初期太陽系の高温過程を経験していない
有機物の入手がその理解を大きく前進させるであろう．

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■紀要「低温科学」の変遷
・低温科學，第 1 輯（1944 年）－第 10 輯（1953 年）
・低温科學．生物篇，第 11 輯（1954 年）－第 35 輯（1978 年）
・低温科学．物理篇，第 11 輯（1953 年）－第 53 輯（1995 年）
・低温科学．物理篇．資料集，第 27 輯（1970 年）－第 63 輯（2005 年）（このうち，第 1 輯（1944 年 12 月）〜第 3 輯（1950 年 12 月）は岩波書店発行，第 4 輯（1948 年 10月）は北方出版社発行，第 5 輯（1950 年 12 月）以降は低温科学研究所発行）
・低温科学．第 64 巻（2005 年）〜※第 68 巻（2009 年）Supplement Issue（英文増刊号発行）■著作権・本紀要に掲載された論文の著作権は，北海道大学低温科学研究所に属する．
・ただし，原著者が出典を明示して再利用することは妨げない．
・また，掲載論文の一部または全部を電子的に蓄積し，北海道大学低温科学研究所が行う情報提供
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2021 年 3 月 20 日
発

行

者

北海道大学
〒060-0819

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札幌市北区北 19 条西 8 丁目

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集

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C

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