厚生省「精神・神経疾患研究委託費」

筋ジストロフィー及び類縁疾患の病態と治療法に関する研究木班

平成5年度研究報告書

平成6年3月（1994年）

総

括

研

主任研究者

高

究

報

木

昭

告
夫

研究班の発足と一年のまとめA）研究目標と班構成
平成5年4月より当研究班が新たに発足した．班員34名，協力班員2名，顧問5名の構成である．本研究班は三好班，杉田班および荒木班の後継班である．これまでに輝かしい成果を挙げてきたことは周知であり，本年度の活動においても，随所にその伝統と遺産の恩恵を享受したといえる．
本研究班の目的は，筋ジストロフィーおよび類縁疾患について，診断，病態および治療に関する研究を行うことである．筋ジストロフィーとしては，Duchenne塑（DMD），

Becker型（BMD），顔面肩甲上腕型（FSH），肢帯型（LG），福山型（FCMD），遠位型などを対象とした．類縁疾患としては，ミトコンドリア脳筋症や筋緊張性ジストロフィー（MyD）を対象疾患とした．
班員各位から提出いただいた研究計画を以下の7群に分摂した．
i）DMD，BMDにおけるdystrophinとそのisoform，dystrophin related protein（DRP，
utrophin），dystrophinassociated glycoprotein（DAG）などの発現や病態に関する研究（担当幹事；若山吉弘，清水輝夫）
ii）FSH，FCMD，遠位型などの染色体や遺伝子解析（同：荒畑喜一）
iii）カルシウムイオン調節，自己貪食誘起物質など（同；高木昭夫）
iv）筋ジストロフィーの治療法開発（同；寺尾寿夫，高木昭夫）
Ⅴ）筋緊張性ジストロフィーの病態研究（同；後藤幾生）
Vi）ミトコンドリア脳筋症に関する研究（同；佐藤 猛，小澤高賂）Vii）SCARMD（Adhalin欠損症），筋炎などに関する研究（同；佐藤 猛，清水輝夫）

B）研究成果i）Dystrophin，DAG，Laminin，DRPなど
Dystrophin研究はDAGと称される一群の膜蛋白の発見につながり，細胞生物学の新しい頁を開いたといえる．現在dystrophinはDAGを介して，細胞外マトリックスと連結し，細胞の補強や信号伝達に関与する可能性が考慮されている．43正一DAGは形質膜内側でdystrophinと相対していることがdoubleimmunogoldlabelling法で証明された（若山ら）．
光顕レベルでは，43K−DAGはDMDで中等度に低下していた（若山ら）．50Ⅹ−DAG

（Adhalin）はSCARMD（Severechildhoodautosomalrecessivemusculardystrophy）で欠損することは既に報告されている．Adhalin欠損症は北アフリカのアラブ人において発見されたが，その後人種を越えて広く分布するとされた（清水ら），また本邦においても同一症例が報告された（納ら）．Adhalin欠損症は遺伝的には単一ではないといわれる（清水ら）．末梢神経にはDpl16（dystrophinisoform）やdystroglycanの発現をみたがadhalinの発現はなかった（清水ら）．
156KTDAG（a−dystroglycan）は細胞外マトリックスの1amininM鎖と結合している．
LamininM鎖の免疫組織染色によるとdy／dy筋ジストロフィーマウス骨格筋で染色性が消失していた（荒畑ら）．FCMDにおけるlamininsubunitの染色性も検討された（水野ら）．
DRP（Utrophin）はDMD女性保因者の心筋でdystrophinを欠く細胞で代償性に発現していた（川井ら）．ヒト培養筋細胞では未熟期には細胞質内に，成熟するとNMJに局在した（中林ら）．Utrophinは中枢神経では軟膜や血管壁に発現していたが，neurOnでの発現はなかった（内野ら）．Utrophinはまた血管内皮細胞に多く発現していた（清水ら）．
ii）遺伝子解析
BMDは多様な臨床症候を望することで知られる．この中には，拡張型心筋症を主徴とするものがあり，Ⅹ−1inked dilated cardiomyopathyとも呼ばれる．この群ではdystrophin遺伝子のexon1−2近傍の欠損が報告された．Intronlには転写調節機構が存在しその障害のための発病と推定された（吉田ら）．DMDのいわゆるrevertant fiberにおいては，dystrophin陰性筋線経と同一のDNA欠矢が証明された．発現している
dystrophin蛋白も不完全タイプのものであった（水野ら）．体細胞mosaicismを星する
DMD剖検症例が報告された．リンパ球ではexon1−7の欠矢を認めたが，胸鎖乳突筋，
側頭筋，横隔膜，腎からのDNAには欠矢を認めていない（斉藤ら）．FSHのDNA診断にはp13E−llprobeを使用するSouthern解析が行われている．新しいprobepFRlが開発された（荒畑ら）．
FCMDは本邦に多く，また中枢神経病変を伴うことで注目されている．ホモ接合性マッ
ピング法を応用した連鎖解析から，遺伝子局在は9q31−33と判明し，今後の発展が期待される（戸田ら）．
iii）筋ジストロフィーの治療
筋芽細胞移植による筋ジストロフィーの治療に関しては種々の検討が加えられている．
Myoblastが基底膜を通過しにくいことに鑑み，COllagenasel併用を行い，生者率を向上させた（寺尾ら）．本邦でもmdxマウスの実験的遺伝子治療が開始された．HVJ−リポゾーム法によりdystrophinの全cDNAを筋注して，dystrophinの発現をみた（岡田ら）．緩和的治療として，dantroleneやbestatinの効果が分析された（梶ら，栗原ら）．
iv）ミトコンドリア脳筋症

MitochondrialDNA欠矢の検索は主としてSouthern法で行なわれてきた．Multiplex

PCR法による検査法が開発された（湯浅ら）．3243変異を伴うMELASにおいて各種組織や細胞における変異mtDNAの比率が検討された．Raggedredfiber（RRF）ではmtDNA量はnon−RRFの5〜17倍に増加しており，かつ変異mtDNA比率は有意に増加していた（内野ら）．いわゆるSSVと呼ばれる筋内小動脈でも変異mtDNAが増加していた．変異
mtDNAによる細胞障害はその分配量に関係するとされる．MELAS症例の単一リンパ球における変異mtDNA量が検討された．各リンパ球におけるheteroplasmyの比率はほぼ一定であった（桃井ら）．MELASにおけるtRNAロイシン（UUR）の点変異として，3243（A→G）は80％，3271（T→C）は10％を占めている．残り10％はまだ不明である．32
91（T→C）が新しい変異として報告された（宝釆ら）．3291では種をこえて広く保存された塩基である．tRNA・チロシソ遺伝子近傍の挿入変異の病因的意義が検討された（後藤ら）．慢性腎不全を主徴としミトコンドリア病の疑われた症例で12SrRNA遺伝子において，827A→G変異が報告された（小澤ら）．
MELASの発症機序の解明を目的として，Cybridを応用した実験が行われた（太田ら）．
3271変異では呼吸鎖酵素活性の低下が，また3243変異では酵素蛋白合成の低下が観察された．
Ⅴ）その他
筋緊張性ジストロフィー（MyD）症例におけるCTGリピートの増大が分析された．いわゆるanticipationには世代間でのリピートの増幅が深く関係することが確認された．先天性MyDの出現機序にもCTGリピートの増加の関与が推定された（辻ら）．MyD剖検脳を使用して，MyD遺伝子のallele別発現を検討した．mRNA発現量の比較ではallele別に差を認めていない（後藤ら）．Ryanodine受容体遺伝子の1840（C→T）変異は一部の悪性高熱（MH）の病因とされている．本邦の4例のMHではこの変異は認められなかった（高木ら）．

C）総合班会議
平成5年度班会議は12月3日，4日（於：全共連ビル）で開催された．48題の研究報告があった．
「筋ジストロフィー」総合班会議は平成6年1月25日（於：日本都市センター）で行わ
れ，第2班からは以下の発表を行った．
1）Adhalin（50kDadystrophin−aSSOCiated glycoprotein）欠損症と筋ジストロフィー
松村喜一郎（帝京大学医学部）
2）福山型先天性筋ジストロフィーの遺伝子座
戸田 達史（癌研究会研究所）
3）顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーの分子遺伝学
荒畑 喜一（国立精神・神経センター）

4）ミトコンドリア脳筋症に関する最近の研究の進歩
後藤 雄一（国立精神・神経センター）5）Duchenne型筋ジストロフィーの遺伝子治療
乾幸治（大阪大学医学部）−現況と遺伝子導入法の開発−

追悼

本年報の冒頭で深い悲しみの中で九州大学後藤幾生教授を追悼することとなった．
後藤教授は平成6年3月2日夕刻に急逝された．昨年12月の班会議に於いては，常時と変わらぬ穏やかさで御発言や御指導をいただいた私共にとって，まさに夢幻のような出来事であり，とても信じることはできない．
後藤教授は昭和57年より班員として活躍されてきた．平成2年からは幹事として指導的役割を分担されている．本研究班の年報を播くだけでも，この分野における著明な御業績を伺い知ることが出来る．Rigid spine syndrome，Isaacs症侯群，SCapuloperoneal
syndromeなどの症例研究がある．筋ジストロフィーモデル動物，塩基性線維芽細胞成長因子，ミトコンドリア脳筋症などに関しては，パイオニア的研究をされた．筋緊張性ジスト
ロフィーの分子遺伝学的研究はまさに開花しつつあるお仕事であった．今後の研究班活動に生じた空自の大きさに茫然とするのみである．
ユーモアに富む優しいお人柄への哀惜は私共班員の共通の思いであろう．永年に亘る先生の御指導と御尽力に衷心よりの感謝を捧げるとともに，謹んで冥福をお祈りする次第で
ある．

目

次

I．臨床・病理
1）筋疾患における運動機能の評価

15

北海道大学医学部神経内科 田 代 邦 雄

2）常染色体優性肢帯型筋ジストロフィーの1家系：
臨床的・筋病理姐織学的検討
筑波大学臨床医学系神経内科

19

庄

司

進

一

3）筋緊張性ジストロフィーの糖鎖変化（Ⅲ）

23名古屋大学医療技術短期大学 杉 村 公 也

4）Marinesco−Sjogren症候群の筋病理所見

26

国立療養所犀潟病院神経内科

福

原

信

義

5）病的筋の細胞膜における免疫組織化学的検討

29

愛知医科大学第四内科

佐

橋

功

6）Danon disease（lysosomal glycogen storage disease with normalacid maltase）の膜異常について32

国立精神・神経センター武蔵病院 後 藤 雄 一7）福山型先天性筋ジストロフィーにおける細胞外マトリックスの免疫組織学的研究
東京都立神経病院神経内科

35

田

邊

等

8）筋ジストロフィーマウスにおける細胞外マトリックスの検討

38

国立精神・神経センター神経研究所 荒 畑 喜 一

Ⅱ．遺伝子（Part1）

9）筋ジストロフィー及びその類縁疾患に関する細胞遺伝学的研究
Ⅰ．リンパ芽球細胞株を用いた高精度分染法の検討

43

東京医科歯科大学難治疾患研究所遺伝疾患研究部門 斎 藤 深美子

10）拡張型心筋症を主徴とするベッカー型筋ジストロフィーとジストロフィン遺伝子異常について46

信州大学医学部第三内科

吉

田

邦

広

11）ジストロフィン分子の高システイン及びC末端領域が保持された

重症DMD症例49

国立精神・神経センター神経研究所 荒 畑 喜 一

12）Duchenne型筋ジストロフィーにおけるジストロフィン陽性筋線維の解析

51

順天堂大学医学部脳神経内科 水 野 美 邦13）ジストロフィンにおける体細胞モザイシズム
東京女子医科大学小児科 斎 藤 加代子

5414）福山型先天性筋ジストロフィー遺伝子は9q31−33に存在する

58

癌研究会癒研究所生化学部 戸 田 達 史

9Ⅲ．遺伝子（Part2）15）筋緊張性ジストロフィー─CTGリピートの増大に関する臨床遺伝学的研究
新潟大学脳研究所神経内科

辻

省

65

次

16）筋緊張性ジストロフィー症関連遺伝子の脳内発現の検討

68

九州大学医学部脳研神経内科 後 藤 幾 生17) Ryanodine受容体遺伝子突然変異の検討

71

虎の門病院神経内科 高 木 昭 夫18）顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（FSHD）の遺伝子解析

74

国立精神・神経センター神経研究所 荒 畑 喜 一19）顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーの臨床的多様性と遺伝子診断
鹿児島大学医学部第三内科

77

納

光

弘

Ⅳ．DRP

20）培養下におけるDRPの発現に関する免疫組織学的研究
東京医科歯科大学医学部神経内科

83

小

林

高

義

21)心症状を呈したDuchenne型筋ジストロフィーの症候性女性保因者2症例の骨格筋
ならびに心筋におけるジストロフィンとジストロフィン関連蛋白の発現
徳島大学医学部第一内科

川

87

井

尚

臣

22) Duchenne型筋ジストロフィーの中枢神経系におけるDystrophin (Dy)とDy関連蛋白91

熊本大学医学部第一内科

内

野

誠

23) Utrophin (dystrophin‑related protein)の抽出と血管内皮細胞における同定94

帝京大学医学部神経内科 清 水 輝 夫

Ⅴ．DAG

24)抗Dystrophin‑associated glycoproteinペプチド抗体によるヒト生検筋の免疫組織化学的検討

97

昭和大学藤が丘病院神経内科 若 山 吉 弘

25) Double immunogold labelling法による43kDa dystrophin‑associatedglycoproteinとdystrophinの正常骨格筋細胞における超微局在─免疫透過電顕的検討─
昭和大学藤が丘病院神経内科

100

若

山

吉

弘

26）末梢神経のdystroglycan複合体の検討

105

帝京大学医学部神経内科

清

水

輝

夫

27) 50kDa dystrophin‑associated glycoprotein欠損を認めた重症筋ジストロフィーの─症例鹿児島大学医学部第三内科

納

光

弘

28) Adhalin (50kDa dystrophin‑associated glycoprotein)欠損症の臨床病態
帝京大学医学部神経内科 清 水 輝 夫

10

107

110

Ⅵ．壊死・再生ほか
29）ジストロフィン欠損細胞のチャネル機能に関する研究

115

金沢大学医学部神経内科 高 守 正 治30) Duchenne型筋ジストロフィ‑の筋内血管壁におけるnerve growth factor receptor (NGFR)の発現について
東京都立神経病院

118

田

邊

等

31）外液Ca2＋による骨格筋崩壊現象

121

国立精神・神経センター神経研究所 吉 田 瑞 子32）筋細胞死と再生に伴う各種プロテアーゼ群の変動
順天堂大学医学部生化学第一講座

125

木

南

英

紀

Ⅶ．ミトコンドリア（Part1）

33）進行性外眼筋麻痺症候群の眼科的異常131

国立精神・神経センター国府台病院神経内科 佐 藤猛34) Kearns‑Sayre症候群患者の無症状の母親に認められた運動負荷時の高乳酸血症と134

筋ミトコンドリア異常

徳島大学医学部第一内科

川

井

尚

臣

35）MERRFにおけるミトコンドリアDNA異常と臨床症状
国立療養所犀潟病院神経内科

138

福

原

信

義

36）ミトコンドリア異常症の病態解析

141

自治医科大学小児科 桃 井 真里子37) Multiplex PCR法を用いたミトコンドリア病におけるmitochondrial DNA
deletionの検索

144

東京医科歯科大学医学部神経内科 湯 浅 龍 彦38）ミトコンドリア異常症の臨床亜型の検討

150

虎の門病院神経内科 高 木 昭 夫

39）全身性カルニチン欠乏マウス（jvsマウス）のミトコンドリアの変化に関する研究

153

国家公務員等共済姐合連合会大手前病院 垂 井 清一郎

Ⅷ．ミトコンドリア（Part2）
15940）MELASにおけるミトコンドリアDNAの変異
国立遺伝学研究所・人類遺伝研究部門 宝 来聰41）MELASの筋病理における変異mtDNAの役割
熊本大学医学部第一内科

163

内

野

太

田

誠

42）ミトコンドリア脳筋症MELASにおける複合体形成異常
自治医科大学生化学第一教室

165

成

男

43）ミトコンドリアチロシン転移RNA遺伝子近傍の挿入変異とミトコンドリア病

との関係

168

国立精神・神経センター武蔵病院 後 藤 雄 一

1144）ミトコンドリア病における12SリボゾームRNA遺伝子変異

170

埼玉医科大学総合医療センター第四内科 小 澤 高 將Ⅸ．治 療45）mdxマウスを用いた治療開発に関する研究175

東邦大学医学部第四内科

栗

原

照

幸

46）mdxマウスに対するダントロレンナトリウムの影響─CK値，運動量および組織学的検討178

京都大学医学部神経内科

梶

龍

兒

47) Myoblast transferに関する研究─collagenaseの効果─

18148) Duchenne型筋ジストロフィーにおける遺伝子治療の可能性に関する研究

184

大阪大学医学部小児科

平成5年度研究班名簿

岡

田

伸太郎

189

12

Ⅰ．臨床・病理

1）筋疾患における運動機能の評価
田 代 邦 雄◆

研究協力者

伊

藤

和

則■

牧

森

若

文

雄＊

島

はじめに
運動能力を客観的に把握する方法としてAT（anaerob−

野

均…
功

二…

例1，症例5に対して塩酸プロカインアマイド250曙／
day，他3例にはplacebo（胃薬）を投与し，1年間投与を継続した．その後VO2／W，HR，Load，、Peak時のLoad等を測定し，投与前借と比較した．
2．各症例に筋訓練測定装置（KIN／COM）を使用し，右下腿（Hamstring，Quadricepsmuscle）の筋力を測定し，1同様に塩酸プロカインアマイド投与前後での筋力差を検討した．

ic threshold），maXVO2（最大酸素摂取量）が代表的な指標であるが，運動処方を行う場合，peakV02や最大心拍数を基準とする方法は最大運動が必要となり，健常人でも困難な点が多いl）2）．また，種々の疾患を有する患者にはこの方法では判定できない．ATは最大運動を必要とせず，トレーニング効果，運動能力を鋭敏で安全な方法である．ATを考える場合，種々のパラメーターが存在し，それぞれの状態で区別して用いられているが，われわれが使用しているのはVT（換気閲値）を基準としている3）4）．今回われわれは筋疾患筋緊張性ジストロフ
ィー（MyD），多発筋炎の運動機能をVO2／W（AT），心拍数（HR），Load（W）．下腿（Hamstring，Quadriceps
muscle）の筋力を測定することで薬剤の効果，および運動処方の妥当性について検討したので報告する．

多発筋炎2例についてVOJwの50％程度のLoadで運動を処方し，運動を継続した場合，VO2／W，HR，Loadの変化，および筋力について検討した．症例は63歳，38歳女性，羅病期間は13年，2年であり，CKは68−
184IU／Ⅰであった．プレドニソロソ15mg〜17．5mg／day

で連日投与をおこなっていた（表1）．
VO，／W，HR，Load，筋力の測定
呼気ガス分析はMINATO医科製エアロモニター
AE280を使用しbreath bybreath法で3秒毎，酸素摂取量，二酸化炭素排出量，換気当量，心拍数等を連続して測定した．運動負荷はエルゴメーターを使用し，漸増運
動負荷（ramp負荷）でおこなった．
筋力測定は筋訓練測定装置（KIN／COM）を用い，右下腿（Hamstring，Quadricepsmuscle）の最大筋力を測定した．Isokinetic modeで角速度300，900にて
COnCentric contraction，eCCentric contractionの動作で対象と方法
筋緊張性ジストロフィー（MyD）5例について検討した．年齢は23歳−52歳（平均33．6歳）の男性4例，女性1例であり，5例とも歩行可能であり，握力は7〜19kg（平均11．2kg）であり，CK（creatinephosphokinase）
は154〜688IU／Ⅰ（平均369．2IU／Ⅰ）であった（表1）．
1．各症例についてVO2／W，HR，Loadを測定した．症

表1左：MyD5例のプロフィール．症例は23歳から52歳までの男性4例，女性1例である．
右：多発筋炎のプロフィール．63歳，38歳のともに女性であり，現在もステロイド治療を継続している．
筋緊張性ジストロフィー（MyD）

多

発

筋

炎

症例1

症例2

症例3

症例4

症例5

症例1

症例2

年齢

25歳

23歳

52歳

49歳

19歳

年

齢

63歳

38歳

性別

♂

♂

♂

♂

♀

性

別

♀

♀

体重

37kg

58kg

47kg

52kg

51kg

曜病期間

13年

2年

CK（川／Ⅰ）356 士45154 ±58

187 ±89

46 1±38688 ±15 7

C【（IU／Ⅰ）

184 ±64

68 士36Prednisolone

17．5mg／day

15mg／day♯北海道大学医学部神経内科■■美唄労災病院リハビリテーション科■■●国立療養所札幌両病院神経内科

ー15−

実施した．concentriccontractionとは蹴り挙げる運動，
eccentriccontractionとは膝関節を伸ばそうと努力する

ロカインアマイド投与前は13．5ml／kg／血，Load42W，
Peak時のLoadが55WとAT以降急速に運動能力が低下にもかかわらず，測定装置の力に負けて，膝関節が屈曲する．投与後はATが17．3mVkg／血Load60W，Peak時のVOノWが19．5と有意に上昇していた（図り．しかしAT以降の運動能力は依然として低下していた．
placebo投与群（症例2，3，4）は投与前後で比較してを強いられる運動である．
結果

MyD例に対して塩酸プロカインアマイドを投与した

14．5ml／k／血から15．3ml／短／血，11．2ml／k／血から12．1ml／k／血，症例4は投与前値がATまで測定できなかったが，1年後は10．2ml／k／血と著明に低下しており，ほとんど変化がないと考えられた（表2）．
右下腿の筋力に関しては症例1，2，5で施行した．
角速度300でconcentric contractionの動作で施行したものが再現性が見られ，これによると塩酸プロカインアマ
イド投与例の症例1，5はともにQuadriceps muscleの症例1はAT前値が15．1ml／k／血であり，年齢を考慮しても著明に低下していた．またLoad35Wと同様に低下
し，ATからpeakまでのHR，Loadは比較的に良好であった．投与後のVOノWは20．1ml／k／血と有意に上昇が認められAT時のLoadも59Wと上昇した．しかしATからpeakへの時間が短く，AT以降における運動の持続性が少ないことが見られた．症例5も同様に塩酸プ（MyD）塩酸プロカインアマイド投与例
604020∞806040200
1111

160

1

投与前

王 投与後

140

』l 投与前120【コ 投与後

†
■

1∝）

ゝ
lJ
ゝ
靂

80
60
40

き

1′

蔓

＿
ナ
イ
宮

；犯

【
V O訂W H R b ad

1
搾油V 血 Hが軋朗d

■ 可

上
‡

0

VO2M HR Load

リ

を

ノ
L

匹akVO2rW PeakLoad
匹akHR（MyD）placebo投与例
l

00

160

l
l

咽

ヽ
」

孤

葦

L

享

投与前

■

田 投与後

140

l■ 投与前．

∞120【コ 投与後

−

書
き
玉
章

∞
60
40
甜
0

■司

軍
書

■
l′
：
t
と
妄

t

100
t

80

t

圭
ヽ

VO訓〟HR L姐】

′
7
㌔
l

法
．
も

蔓

I
it
I
室

i
董

60
40

−

20

叫VO2州
叩瓜鵬
甲山HR

0

馳

■劉
VO2（
〟H

L∝d

㌫0匹膿H卵聖叫

図1上段：症例1，5．プロカインアマイド投与群，ATの上昇とpeak時のLoadの増加が認められた．
下段：症例2．3．placebo投与群，AT，HR，Loadともに変化を認めなかった．

一16−

表2

表3 上・中段：多発筋炎のAT．HR．Loadの鮭移を示す・
症例1は運動療法を毎日施行した場合12．7から15・l
ml／短／血まで上昇したが，その後，運動量が減少することでATはやや下降してきたが，peak時のLoadは平衡状態であった．症例2も同様な経過を推移した．
下段：症例2における筋力の経過を追い検討した一
角速度300，900で検討したが，比較的再現性が良好であり，筋力としての評価が可能であることが予想された．

上段：MyD例の塩酸プロカイソアマイド投与群とplacebo投与群におけるAT，HR，Loadである・
症例1，5は塩酸プロカイソアマイド投与群で投与
前ATが15．1，13．5から投与後1年経過した時点のATは20．1，17．3ml／鹿／血と有意な上昇が見られた・
下段：症例1，2，5の筋力を角速度30°でCOnCentric
contractionで検討したもの．
塩酸プロカインアマイド投与群がQuadriceps
muscleで上昇していることが認められた．

堀M蕊芸等菜摘

筋緊張牲ジストロフィー5例のまとめ
症例1 症例2
症例3
症例4
症例5

多

発

筋

炎

投

3
2

2
4

1

1

5

1

． A1

．

︼

7

皿

．

．

3
4

2

■

0
3

5

3

1

7

5

0

2
1

5

7
1

0

5

4

0

6／393

12．
7

15．
1

13．
8

12．
9

HR

137

138

Load

41

42

−

5

■

2

6／292

VO2川

●
5

7／1391

5

2

1

一

1

5

l

5

5／1291

−

2

9
3

5

T

0
3
1

9
3

A

5
A︼

2

2

7

5

3

■

5

6

U

9
2
1
0
6
5

9
1

1

3

0

9
3
7
7

4

1

0

■

2

−

2
7

一﹁

5
5
1

7
7

3
8
2
1− ．AT A﹁

7
1

2
5

6

1
3

匹

4

症 例 2

2 3 5 ／1 4 4

2 3 0 ／1 1 0

症例 5

5 7 ／9 8

8 8 ／1 5 8

17．
8

peak HR

166

peak Load

85

84

3

3

J︼

7
1

3

2

1

1

2

5
3

0

7
4

2
6

1

8
3

9
5

2
1

5
1

0
A︼

3

0
2

匹

投与前
投与後
Qtdriceps／随triDg QIJadriceps／ぬtString

1 5 8 ／5 8

18．
2
156

5

∧

6

匹

筋緊張性ジストロフィーの筋力変化症 例 1

peak VO2ノ佃

1 9 7 ／7 8

8／1992

9／1792

5／2493

11／1193

VO2川

16．
0

22．
0

18．
3

18．
8

皿

141

133

127

133

Load

41

71

69

69

peak VO2／
W

22．
0

27．
0

22．
0

25．
7

peak I
IR

150

146

150

153

peak Load

54

89

105

107

多

症例2

（Ⅳ）

concezLtric contracticdl（角速度30．）

多

発

筋

発

筋

炎

5／25

93

11／1193com／
con （角速度30●
）

280／
192

300／
179

＼
con／
con （
角速度90●）

2 15／161

23 1／
158

con／
ecc （
角速度30■
）

303／
473

293／
466

con／
ecc （
角速度90■
）

2 25／
492

254／
482 （
N）

炎

0
8
1
0 0 0 0
6
4
2
0
1
1
1

」
／
D

0
8
1

】『

5／12

91

こ乏

7／13

91

D

匹16／2

92

●

□ 6／3

93

0

貫
壬
i
享

0
6

l
t
r
1l

0
4

0

0 0
2

0
椚

≡
・
l
V O 2／W

H R

L oa d0

PeakVO 騨akH R paekL0

0

〜
t瀾

！
■董
l

l

■8／19

92

t
′
…
）
ヽ

E9／17

92

日5／24

93

Jr
吾
l
l
t
I
き
′
1

由11／1193！

tJl

VO訂WHR Load poalVO2〟lo濾HRpせakLoad

図2

左：症例1．AT，HR，Loadであるが，peak時のLoadは低下していなかった・
右：症例2．同様に運動継続はpeak時のLoadの維持に役立ち仁運動量に比例してATの増減が見られた・−17−

筋力増加が認められた．筋力測定は特に最大筋力を測定する場合，疲労が問題であり，そのためこの値が有意なものかは今後の症例の集積が必要であると考えられた（表2）．多発筋炎に関して症例1はATが運動処方をおこない，連日運動療法を継続した場合は12．7ml／k／血から15．1ml／k／血と比較的上昇傾向が見られたが，その後，日常生活の場での運動療法だけでは13．8〜12．9ml／
k／血と下降傾向となってきた．しかしATから以降の運動が比較的持続可能であり，AT時のLoadが41，42Wからpeak時の85，84Wと運動の持続性が見られた（図2）・症例2は運動療法開始以前はAT16．Oml／短／血，運動開始1か月で22．Oml／鹿／血と年齢を考慮してもほぼ正常なところまで改善していた．しかし日常生活と，週1回程度の運動量ではATが18．3，18．8ml／k／血と低下しているが，AT時のLoadは69Wと比較的高く維持されていた．またpeak時のLoadは105，107Wと上昇しており，AT以降における運動持続性の向上が考えられた（表3）．筋力の測定は症例2で施行したが，それぞれの角速度とconcentric，eCCentriccontractionの検討したが，約6か月での筋力を検討したが，20〜30Nの差はあるものの，有意な変化はなく，筋力は保持されていることが予想された（表3）．
考察
筋疾患の機能を呼気ガスを使用したATを指標として
薬札または運動機能自体を測定，検討してきた．筋緊張性ジストロフィーに対して塩酸プロカインアマイドの投与をおこなったが，この薬剤がmyotoniaにたいして効果があることは以前から知られており，臨床の場で使一18−用されている．この薬理学的特徴である細胞膜の安定化がmyotoniaの症状軽減に関与していることは周知であるが，今回われわれはこの薬剤が運動機能自体にも関与し，効果的であることが，AT，HR，Load，筋力から推察された・その薬理学的機構に関しては今後の課題ではあるが，長期間の投与で運動能力の改善が多少なりとも認められることは，今後の治療の指標として重要である
ことが考えられた．また多発筋炎の運動は週1−2度程度の運動療法ではATの低下が見られるが，運動を持続することでpeak時のLoadが低下せず，平衡状態が保持できることが予想された．このことでAT以降での運動でも比較的長時間持続可能である．
文献1）谷口興一：心肺運動負荷テスト．南江堂，東京，
1993，p155．

2）中村好男：乳酸閲値と換気閲値との関連についてのBeaver，Wasserman，Whippの主張に対する疑問．
体育の科学 40：453−460，1990．
3）田代邦雄，伊藤和則ほか：筋疾患の治療効果について一運動負荷試験によるAT（AnaerobicThreshold）の検討一． 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」
筋ジストロフィー及び関連疾患の成因と治療法開発
に関する研究 （荒木班）平成3年度研究報告書，
1992，pp59−61．

4）田代邦軌伊藤和則ほか：筋疾患の治療効果 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジストロフィー
及び関連疾患の成因と治療法開発に関する研究（荒木班）平成4年度研究報告乱1993，pp64−67．

2）常染色体優性肢帯型筋ジストロフィーの1家系
臨床的・筋病理組織学的検討
庄

研究協力者

小
林

国

英

司

一■

進

一●

大

越

敦

夫■

安

達

充

芳■

明 人事 水 澤 英 洋書

はじめに
我々は常染色体優性肢帯型筋ジストロフィーの1家系例を経験した．この家系は推定発症者を含め，両性に渡り7人の患者を認めた（図1）．この家系例の特徴を明らかにす￣るため，発端者を含めた同胞3例について，臨床所見，筋CTによる障害筋の分布，生検筋の筋病理覿
織を調べ，常染色体劣性肢帯型筋ジストロフィーの日放例と比較検討した．

の大小不同を認め，著明に肥大線経が増加し，中心核，
fibersplittingを認めた（図3A）．また，Phagocytosisを伴う壊死線経も認めた（図3B）．DYS3抗体を用いたジ
ストロフィン染色では正常に染色された（図3C）．また，DYSl，DYS2でも同様に正常パターンに染色され，DRPでは染色されなかった．以上より本例を肢帯型筋ジストロフィーと診断した．

対象
症例1（発端老）：44歳女性 筑大神内 234420−1
主訴：四肢筋力低下
現病歴：25歳頃から両下肢を重く感じ，走れなくなった．30歳時，第2子出産後，階段昇降が困難となった．
44歳時，当科外来を受診し，精査目的で当科入院となった．

症例2（発端者の姉）：49歳女性 筑大神内 238769−5
主訴：下肢筋力低下
現病歴：30歳頃より疲労時の下肢筋力低下を自覚したが，日常生活には支障なく，階段で4階までの新聞配達を続けていた．発端著の入院を契枚に，精査目的で入院した．
神経学的には上肢・上肢帯に筋力低下なく，下肢近位筋にMMT4，下腿屈筋MMT3の筋力低下を認めた．筋
トーヌスは全般性に低下し，歩行は動揺性歩行に加え鶏一般身体所見は身長153cm，体重55kg，血圧140／80皿
Hg，ほか胸腹部に異常なし．神経学的には意識は清明で高次機能は異常なし．上腕三頭筋に徒手筋力テスト（MMT）4，大腿四頭筋・膝屈筋・前脛骨筋にMMT3の筋力低下を認めた．筋トーヌスは低下し，誹腹部は肥大していた．深部反射は全般性に低下し，歩行は動揺性でGowers 徽侯を認めた．感覚系，協調運動，自律神経系には異常を認めなかった．

歩を認め，爪先立ちは可能だが，踵立ちi享不能であった．検査所見はCKl、19IU／mlと正常であった．筋CTでは症例1と同様に大腿は屈筋・内転筋群に著しい筋萎縮と脂肪変性を認め，伸筋群は比較的軽く，大腿直筋はよく保たれていた．同様に下腿は伸筋群に比べ屈筋群がより高度に障害されていた．
症例3（発端者の兄）：59歳男性 筑大神内 242478−9
現病歴：40歳頃から歩行時の疲労を感じるのみで，大工検査所見ではCKが165IU／mlと正常のほか，尿，血算，生化学，免疫系，髄液はいずれも異常を認めなかった．針筋電図では上下肢とも低振幅多相性運動単位放電を認めた．
筋CT（図2A）では，大腿部で全般性に著しい筋萎縮と脂肪変性を認めるが，その程度は伸筋群で比較的軽く，大腿直筋はよく保たれていた．下腿部では大腿に比べ全般性に障害の程度は軽く，誹腹筋やヒラメ筋に比べ仕事で梯子で屋根に登れ，日常生活に支障なかった．発前脛骨筋等甲屈筋群に強い筋萎縮と脂肪変性を認めた．
前脛骨筋で行った筋生検のHE染色標本では，筋線維

56

53

49

44
ノ

27

22

24

22

22

19

21

図1 家系図 発症者を黒，灰色で示す．男は本研究の対象例■筑波大学臨床医学系神経内科

−19−

1

誓 ￣きiき、3−こき3●sEVERE◎MODERATEOMlLDOsLIGHT

図2

下肢の筋CT
A：症例1 B：症例2 C：症例3 それぞれ上段は大腿，下段は下腿D：筋障害パターンの比較 各症例の上段は大腿，下段は下腿．ARl，AR4，AR7．AR8は表1のARl，AR4，
AR7，AR8と同一例．K．EXT．は膝伸筋群，K．FLX．は膝屈筋群，AD．は大腿内転筋群，F．FL．は足関節屈筋
群．F．EXT．は足関節伸筋群を表す．

肥大線繰

壌死線維

分業 線繕

RRF

RV

例 1

＋ ＋＋

＋

−

−

−

匡芸 喜

＋＋＋

−

ー

−

A R l

土

＋

＋

−

k R 2

＋

＋

＋

ー

R 3
R 4
k R 5

＋
十

十

ー

ー

＋

＋

−

−

−

＋＋

＋

−

−

十十十

＋

−

−

ー
＋

ヒ ≡ …
R 8

RRF；ragged red fiber
RY；rimed vacuole

図3 4：症例1の左前脛骨筋のHE染色標本．筋線経の大小不同，中心核，fibersplittingを認める．B：症例1の左前脛骨筋のHE染色標本．壊死線経を認める．C：症例1の左前脛骨筋のDys3抗体でのジストロフィン染色．
正常パターソの染色を示す．×40A，B，C．D：筋生検所見のまとめ．

ー20−

表2 常染色体優生筋ジストロフィーの報告例

表1 臨床像の比較−仕発 症年 齢

例 1
例 2
例 3
R l
R 2
R 3
雨

F
F
Y
X
l
F
l
†
1
I
l

25
30
40
18
22
29
19
30
30
16
24

R 5
R 6
豆う
R 8

愕病期間
20
19
12
19
17
4
15
28
22
10
5

ADL制 限
＋
−
十十＋
＋＋＋
＋
＋
＋＋
＋
＋
＋

CK個
165
11g
224
1109
1460
2 600
18 9 0
1270
2 172
2 91
8 12

版筋力 低下
土
一・
＋十十
＋＋
−
−
・
＋＋＋
＋＋
＋＋
＋＋
＋

舷 筋力低下
＋＋
＋
±
＋＋＋
十＋＋
±

報告者

発症 年齢

分布

経過

重症度

C K 櫨

生検

S ch rle ld e r ■3 0 −40

下 肢縛

援徐

中等度

正常

即◆

C h ut k oT

20 −6 0

下 肢樗
上 肢碍

援徐

中／ 高度

軽度上界

椚◆

＋＋＋
＋＋＋
＋
＋＋＋

G H c h r is t

20 −3 0

下 血樗

倭徐

中／ 高度

上昇

RY◆

1 0−4 0

下 肢符

焦徐

中等度

軽度上 昇

C T 検索上 肢縛S e rn tr Ic e

ー■
・

上 t支粁

端者の入院を横に要請に応じ，当科外来を受診した．
神経学的には上肢・上肢帯に筋力低下を認めず，下肢近位筋MMT4，前脛骨筋MMT3の筋力低下を認めた．
前2例同様，爪先立ちは可能で，踵立ちは不能だった．
検査所見はCK224IU／mlと正常上限の約1．2倍の上昇のほか正常であった．筋CTでは，症例1・2に比べ大腿の障害は軽度だが，その分布は類似し屈筋・内転筋群に高度で，伸筋群は保たれていた．また，下腿は屈筋群に障害を認めた．
他の患者は，発端老受診時にその父親は既に死亡していたが，生前に動揺性歩行を皇しており，発症が推定さ

S o te r

30

下 肢帯
上 肢軒
下 丘 前郷

援徐

中等反

軽度上 界

†8 rC O n i

2 0−5 0

下 肢帯
上 肢縛

ぱ徐

中 ／高度

鰐皮 上昇

本 家系

2 0−4 0下 腹縛
下 腿 前部ぜ徐軽 ／中度

正常／ 軽度 上昇

RY ◆

施行

施行

larCOni：lCtlⅣeur01Se■nd．Ⅰ991より改変

か，または極く軽度であり，下肢にはぼ限局する分布を望した．
下肢筋の障害パターンを比較するために，筋萎縮，脂肪変性の程度を筋CTで評価し，本家系例とAR群を比較した．その結果のまとめを図2Dに示した．各症例の障害筋分布を大腿では伸筋，屈筋，内転筋の3筋群，下腿では屈筋，伸筋の2筋群に分けて示した．
大腿での障害は，本家系例およびAR群共に，内転筋群・屈筋群が高度に障害され，伸筋群は比較的保たれていた．下腿ではAR群で屈筋群の障害に比べ伸筋群の障れた．発端者の長女，症例2の長男，症例3の次女は，いずれも筋力低下の自覚なく，日常生活に支障を認めなかったが，動揺性歩行を星し，踵立ち不能を確認した（図1）．以上より，両性3世代に渡る発症者の存在から，本家系が常染色体優性肢帯型筋ジストロフィーと診断した．
また，臨床的に肢帯塑筋ジストロフィーと診断した日放例のうち，家系内発症を認めるが，2世代以上の発症者を認めない例，4家系8例を常染色体劣性と診断し，比較対象とした．このうち筋生検施行の機会を得た4家系6例は全てジストロフィン染色（DYSl，2，3）で正常パターンに染色され，DRPで染色されないことを確認した．

害が高度であった．これとは逆に，本家系例では伸筋群に比べ屈筋群の障害が強いという，特徴的な所見を示した．
筋病理組織学的所見のうち肥大線経，壊死線経，分乗
線経，ragged red fiber（RRF）．rimmedvacuole（RV）
についてその出現頻度を半定量的に表（図3D）にまとめ比較した．
本家系例では著明な肥大線経の増加を認めた．壊死線
経，分業線経については本家系例とAR群に明らかな違いを認めなかった．またAR群に散見されるRRF，RV
は，本家系例に全く認めなかった．

方法・結果
本家系例の臨床的特徴を調べるため症例1，2，3を他の自験例と発症年齢，罷病期間，ADL制限の程度，
CK値，上肢・下肢の筋力低下の程度を表（表1）にし比較した．
発症年齢は本家系，常染色体劣性（AR）群共に青年期発症で，両者に明らかな差異を認めなかった．しかし，本家系例は曜病期間に比LADL制限が軽く，AR群
よりも進行が緩徐であり，かつCK値は正常ないし軽度上昇に止まっていた．MMTでの障害分布ではAR群で上肢のみに筋力低下を認める1例があり上肢の障害を望きない例も1例あり，同一家系例でも上肢と下肢での障害程度に一定の傾向を認めない家系例があった．これに対し本家系例では，どの例も上肢の筋力低下は認めない

考察・まとめ本家系例はAR群に比べ，緩徐進行性，CK値はほぼ正常，筋力低下が下肢にはぼ限局する特徴を有していた．
障害筋分布は大腿ではAR群と同じ分布パターンを望したが，下腿ではAR群とは逆に屈筋群で高度の障害を呈した．筋病理組織学的にはAR群に比べ著しい肥大線経の増加を認めた．この所見は筋力低下の代償機転を反映し，緩徐な進行様式と関係すると考えられた．
報告例が少ないとされる成人発症の常染色体優性肢帯型筋ジストロフィー1）と比較すると（表2），緩徐進行性で下肢から発症し，CK値が軽度の上昇に止まる点2）〜5）は−21一

同様の特徴と考えられる．しかし，早期から下腿屈筋のdominant conditions：Muscular dystrophy and障害を呈し，筋病理所見でRVを認めない例はSommer

Pelger−Huet anomaly．AmJMed46：380，1969．

らの報告例川）のみであり，本家系例は常染色体優性肢帯型筋ジストロフィーの中でも特異なタイプと考えられた．

3）ChutkowJG，Heffner RR，et al：Adult−OnSet
autosomal

dominantlimb一girdle

musculardystro−phy．Ann Neuro120：240，1986．
4）GilchristJM，Pericak−VanceM，etal：Clinicaland文

geneticinvestlgationin autosomal

献1）JeruSaremFand SiebJP：Thelimb girdle syn−dromes．

InHandbookof

by Rowland LP＆

ClinicalNeurology

dominantlimb−girdle muscular dystrophy．Neurology38：5，
1988．

（ed

5）MarconiG，PizziA，etal：Limbgirdle muscularDiMauro S）Myopathies，

dystrophy with autosomal dominantinheritance．

EIsevier，Amsterdam，1992，Vo162，P179．

ActaNeuroIScand83：234，1991．

2）Schneiderman LJ，Sampson WI，et al：Genetic
studies of a family with two unsusal autosomal

ー22−3）筋緊張性ジストロフィーの糖鎖変化（Ⅲ）
杉 村 公 也●研究協力者

伊 藤 慶 大■雷 青 木 真一郎◆■ 高 野 明 美■■
河

合

邦

幸筆書

本

田

仁◆★

高

橋

穫

子…

はじめに

type．complextypeに大別することができた（図1）．

筋緊張性ジストロフィー（以下MyD）は，近年，原因Mannosetypeは，この条件下ではelutiontimeの早い段

遺伝子がmyotonik kinase，及びその後に続くCTG

階で分離されてくるが，血清中のasparagine結合糖鎖の約15％を占めることが明らかになった（図1）．それにrepeatの延長による不安定領域であるl）と判明し，かつanticipation及び重症度もこのtriplet codonの異常な延対してelution timeの遅い時間にdetectされるcomplex

長で説明しうる2）といわれている．しかし，MyDの個々の多彩な病変がどのようにして形成されるかに関してtypeが約85％を占めていた．complextypeの中では2個のシァル酸を持ち，fucoseを持たない2本鎖構造が圧倒は，近年のmolecularbiologyの進歩にも関わらず，ほと的に多く．complextypeの約65％を占め，その次に，シァル酸を持たない2本鎖構造やfucoseを持った2本鎖んど解明されていないといっても過言ではない．

構造などが血清中のasparagine結合糖鎖の大きな割合を昨年度までに私達は，MyD患者血清immunoglobulin
G（以下IgG）においてgalactose含量の低下が認められ占めていた．Complextypeの中で3本鎖，4本鎖構造をる3）こと，かつ従来慢性炎症性疾患において報告されて取るものは，総和としてnegligiblelevelにとどまった．

きたIgGのgalactose含量の低下の様式とは異なった性

asial0−formで存在するものは，mannOSe typeを含め約格を持っている4）ことを報告した．今年度，私達は，他の45％に達していた．complex typeをcharged oligosacc−

血清糖蛋白質糖鎖部分に変化が起きている可能性を調べ

harideとneutraloligosaccharideに分けると，Charged

る目的で，血清そのものよりasparagine結合糖鎖を切りoligosaccharideでは，fucoseを持たない2本鎖構造が圧出して解析した．

倒的に大きな割合を占め，fucoseを持った2本鎖構造，
bisecting N−aCetylglucosamineを持った2本鎖の順で

方法

血清中のasparagine結合糖鎖は血清100ulを100℃，3分間処理し，熱変性させた後，pH8．20Vernightで＞l芯uヱulむUUgS20コ一山

trypsin，Chymotrypsinにより蛋白質を分解し糖ペプチドを得た．得られた糖ペプチドをglycoamidase Aにて処理をし，aSparagine結合糖鎖を遊離した．遊離した
asparagine結合糖鎖をBioGe1−P4にて粗精製した後，2−aminopyridineにて標識し，ODS−Silicaカラム，Amide−80
カラム，DEAEカラムを用い，高速液体chromatography
にて分析した．構造が推定されたものはexoglycosidase
method（sialidase，β一galactosidase，hexosaminidase）を用い，2次元map上で確認した．
結果

健常人血清より得られたasparagine結合糖鎖は，
ODS−Silicaカラム（Nakanopak）上でbutanolのgradientを用いた高速液体chromatographyにより，mannOSe

0

10

20

30

40

50

60

70

Elution Time（min）

事名古屋大学医療技術短期大学
州名古屋大学医学部神経内科●●●中野酢店高橋糖鎖研

図1HPLCproEilesof pyridylamino−derivatives ofoligosaccharidesofserum fromhealthycontroIs−23−

あった．neutraloligosaccharideは，Charged oligosacc−
harideとは異なり，fucoseを持った2本鎖が最も多く，
次にfucoseを持たない2本鎖，bisecting N−aCetylgluco−
samineを持った2本鎖の順であった．
健常人とMyD群とで血清全体におけるasparagine結
合糖鎖を比較すると，mannOSe typeとcomplex typeの割合や，COmplex type中におけるneutral01igosacchari−deとchargedoligosaccharideの割合，fucoseを持たない
2本鎖，fucoseを持つ2本鎖，bisecting N−aCetylgluco−
samineを持つ2本鎖の割合，そのいずれもに閑し統計学的有意差は認められなかった（図2，3）．一方，
charged oligosaccharideに閑し，fucoseを持たない2本鎖の割合が5％水準において有意にMyDにおいて増加していたが，他のものの割合に統計学的差異は認めなかった（図2，3）．
galactoseを2個とも持つ2本鎖構造の割合に関して
は，fucoseを持たない2本鎖，fucoseを持つ2本鎖，
bisectingGNを持つ2本鎖共に，MyD患者群と健常人との間に統計学的有意差は認められなかった（図2，4）．
考M C M C M C M C M C M C M C★pく0・05

図3

Comparison of the NLlinked oligosaccharides ofSerum between from the patientswith MyD and
COntrOIs・Man means mannose−type Oligosacchari−des，F（−）means complex type oligosaccharides

察With no fucose and with noβ1−4GIcNAc，F（＋）
means complex type oligosaccharideswith fucose

MyD患者血清IgGで認められるhypogalactosylation（健常人の約50％）が，今回の検討で血清全体の糖蛋白
質asparagine結合糖鎖において認められなかったことに関していくつかの可能性が考えられる．まず，血清糖蛋
白質糖鎖のうち2本鎖構造が約65％を占めていたが，そのうちのほとんどが2個ともgalactoseを持つ，いわば中性糖合成系の完了した状態のものであった．逆に言えば，血清中の糖蛋白質の中で，IgGは中性糖糖鎖合成系が完了しないままに血清中に放出されるものが多いといLg23U■Bu器笠﹂○⊃一山

H yD l

M yD 2

Co ntr011

C ontro12

and withnoβlL4GIcNAc，and bismeans complex
type oligosacchaTides with Eucose and withβ1−4
GIcNAc．

」

M
図4

C

M

C

M

C

Comparison of the digalactosyl oligosaccharides ofSerum between from the patientswith MyD and
COntrOIs．F（−）means complex type oligosacchari−
des with no fucose andwith no

β1−4

GIcNAc，F（＋）means complex type oligosaccharides withfucose and with no β1−4GIcNAc，and bis means

ElutionTime（min）

COmplex type oligosaccharides

図2 ComparisonofHPLC profiles of pyTidylamino−deri−

With

Vativesofoligosaccharidesof serum between fromthe patients with MyD and controIs

一24−

β1，4GIcNAc．

with fucose andう点で稀有な糖蛋白質である可能性が高い．健常人血清
IgGで糖鎖の特徴が他の多くの血清糖蛋白質と異なる理由として，IgGが形質細胞で作られるのに対し，他の多くの血清糖蛋白質が肝臓で作られるという差が影響している可能性や，IgGで糖鎖のつく部位であるFc部位が高次構造上，糖転移酵素の作用を受けにくいため，他の血
清糖蛋白質に比Lgalactoseが入りにくく5㌧結果として，中性糖合成系が完了する前に血清中に放出されてしまう可能性等が考えられる．そして．MyDにおける

bisectingN−aCetylglucosamineの有無等，他の01igosacc−
harideに，明らかな差異は認めなかった．

IgGのhypogalactosylationは上記のような，IgG生合成
過程の特異性が関与していると考えられる．
今後，MyDにおいて糖鎖変化がどんな糖蛋白質に生じているか，そして病態にどのように関わっているかを検討するために，mOlecular biologyの手法を用いて，
myotoninkinaseと糖転移酵素のmRNA量の変化，活性の変化等を検討する必要がある．

VP，ThirionJP，HudsonT，et al：Cel168：799−

3）galactose含有糖鎖の割合も，血清全体として明らかな差異は認められず，IgGに認められる変化は，多くの血清中の糖蛋白質には存在しないことが示唆された．
文

献1）BrookJD，McCurrach ME，Harley HG，Buckler
AJ，Church D，Aburatani H，Hunter K，Stanton
808，1992．

2）BuxtonJ，Shelbourne P，DaviesJ．Jones C，Van
TT，Aslanidis C，deJP，Jansen G，Anvret M，
RileyB，et al：Nature355：547−548，1992．
3）Ito K，TakahashiN，Hirayama M，Honda H and
TakahashiA：J Clin BiochemNutri14：60−69，
1993．

結

4）杉村公也，伊藤慶大，本田 仁，高橋 昭，高橋虚子： 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジス
トロフィー及び関連疾患の成因と治療法開発に関する研究 （荒木班）平成4年度研究報告書，1993，

語1）血清全体におけるアスパラギソ結合糖鎖はman−
nosetypeが約15％，COmplextypeが約85％であった．
complextypeのうち2本鎖構造を取り，かつシァル酸を

pp80−83．

持つものが約60％を占めていた・
2）健常人と比較して，筋緊張性ジストロフィー患者では，disialyldigalactosyloligosaccharideの割合の増加を認めたが（p＜0．05），Charged oligosaccharideとne。traloligosaccharideの割合や，fucoseの有無，

5）Fujii S，Nishiura T，Nishikawa A．Miura R，
TaniguchiN：JBioIChem265（11）：6009−6018，
1990．

一25−

4）Marinesco−Sj6gren症候群の筋病理所見
福 原 信 義＊

研究協力者

松

原

奈

絵＊

坂

Marinesco−Sj8gren症候群は，先天性白内障，小脳性失調，精神発達遅滞を主症状とする常染色体劣性遺伝疾
患だが，骨格異常や，二次性徴発育不全なども伴い，障害が多臓器に及ぶことが知られている．本症に筋病変を伴うことは，比較的近年になって注目され，本症の主症状として捉えられてきているが，その筋病理所見については必ずしも解釈が一致していない．
今回我々は，5例のMarinesco−Sjagren症候群の生検筋に，魁織化学的，電顕的観察を加え，その病態解析を試みたので報告する．
症
症例：Y．0．42歳，男性．

例

家族歴：両親いとこ婿，同胞4人中，兄（症例2），妹が同病．
現病歴：生下時正常分娩で精神運動発達遅滞があり，1
歳で先天性白内障と診断され，2歳で手術．小学校入学後に歩行可能となったが運動失調性であった．29歳で福祉施設へ入所した際には，杖歩行可能であったが，転倒による左大腿骨の骨折後は車椅子生活となっている．その後も筋力は徐々に低下し，42歳で入院時には車椅子駆動が何とか可能であった．
現症：ろうと胸，脊柱側琴を認める．知能は，鈴木ビ
ネ一式で67，内斜視，水平性限振，断綴性言語，両側盛者性難聴があり，四肢に著明な筋萎縮，筋力低下を認
め，腱反射は低下，上肢に協調運動障害が見られた．頭部CTで小脳，特に虫部に強い萎縮が見られた．骨格筋
CTでは，大腿では伸筋群に，下腿では屈筋群に強い筋萎縮が認められた．
症例■：Z．0．45歳，男性．
豪族歴：症例1の兄．
現病歴：生下時よりfloppyで，3歳で白内障の手術．小学校入学後，松葉杖歩行可能となったが，自力歩行は不能．31歳で福祉施設入所後より，車椅子生活となる．
現症：ろうと胸を認める．知能は，WAIS−RにてVIQ
64，PIQscaleout．内斜視，水平性限振，断綴性言語あり，四肢の筋萎縮，筋力低下著明，腱反射低下，上肢に■国立療養所犀潟病院神経内科

ー26一

尻

顕

一事

中

島

孝＊

協調運動障害を認める．
頭部CTにて小脳虫部に強い萎縮，骨格筋CTにて症
例1と同様のパターンを認めた．
症例3：S．Ⅰ．30歳 男性．
家族歴：血族結婚なし．
現病歴：3歳で白内障の手術，4歳時松葉杖にて歩行可能となった．18歳で施設へ入所．29歳より車椅子使用．
現症：ろうと胸を認める．知能はWAIS−Rにて，・VIQ
62，PIQscaleout・顔面にチック，四肢に中程度の筋萎
縮，筋力低下，腱反射低下，上肢に企図振戦を認める．
頭部CTにて，小脳虫部に強い萎縮，骨格筋CTにて症
例1と同様のパターンを認めた．
症例4：Y．Y．33歳 女性．
家族歴；両親いとこ婿．兄が同病．

現病歴：生下時よりfloppyで，4歳で白内障手術，6歳でつかまり立ち可能，20歳で施設入所時松葉杖歩行（失調性），33歳車椅子使用．
現症：低身長，鳩胸，脊柱側湾あり．知能は田中ビネ一式で精神年齢5歳2ケ月，内斜視，水平性限振，構音障
害，四肢の筋萎縮，筋力低下を認め，腱反射は低下，病的反射陽性，両上肢に協調運動障害，また体幹失調を認めた．
頭部CTにて，小脳虫部に強い萎縮，骨格筋CTでは症例1と同様のパターンを認めた．
症例5：T．Y．12歳 男性．
豪族歴：血族結婚あるが，詳細不明．
現病歴：生下時吸引分娩，5ケ月で先天性白内障と診断され，11カ月で手術．13カ月より一人歩き可能となり，3〜4歳から失調性歩行．
現症：潜在性二分脊椎，右胸心，内反尖足あり，知能
は，WISCにて，IQ45．水平性限振，上肢遠位部の筋力低下，下肢に協調運動障害．
頭部CTにて，小脳萎縮の所見．
これらの症例の1〜3は前脛骨筋より，4は大腿四頭
乱 5は下腿三頭筋より生検を施行し，組織化学的，電顕的検討を加えた．

結果
症例1，2においては，ほぼ同様の所見を皇していた．HE，Gomori−trichrome染色では著明な筋線経の大小不同，rOundatrophyを示し，問質の線維化，脂肪変性が強く，明らかな壊死，再生の所見は見られなかった．残存する筋線経には，多数のrimmed vacuole（RV）が，また1％程の筋線経にragged−red fiber（RRF）が認められた（図1）．Acid−Pase染色では，RVに一致して活性の上昇が認められ，NADHLTR染色では，RRFに一致して筋線維周辺が濃染，また，虫喰い線経が見られた．
CytOChromecoxidase染色では，RRFで活性が欠損し，
RRF以外にも活性欠損線椎が散在性に認められた．

8日ent nu工ber

1

2

8iopsied■uSCle8

Cl18ngeim†jber size
Y8ri8tioJlin†iber与はe†iber8trOPhy

3

4

TI

十十
811

十十
811

十十
8日

TI

Tl

5
qF

十

G8

十
■ll

†iber hypertrophy
Ch8ngein fiber diStribution
fiber type predolin8mee
fiber t押e defi￠iency

28

仙clei

十

intern81rluCIei
Degene灯8tl○n

十十ne（汀OSis Tith phagOCytO釦は十十＋十tOth一組tenliber＄ri■ted Y8CUO】e8

十＋ragged−red†ibers

十（11）htty degener且tiom
Regemer8tion

十regener81ing HberS
Change8in8r（；hite（：tWe

十十

十十

＋＋ l

ATPase染色では，症例1でtypel優位及びtype2B欠損（Type172％，2A26％，2B0％，2C2％）がみられたが，症例2では認めなかった（Type150％，
2A39％，2Bl1％）．
症例3では，同様に筋線経の大小不同，問質の線維化，脂肪変性，中心核の増加，多数のRVの出現が見られたが，RRFは見られず，少数だが壊死，再生線椎が認められた．

表l Lightmicroscopic findingsinbiopsied muscles

十

十

一

＋（11）

Tl＝TibhHs8nterlor，qF＝qu8dri（：epSI810riS，68＝688trO￠Unelius

症例4では，脂肪変性が著明で十分な検索が困難であったが，筋線経が島状に残存し，大小不同，RVを認めた．
症例5では，ごく軽度の大小不同が見られ，全体的に筋線維径が小さい以外，明らかな壊死，再生の所見は認
めず，RVの出現も見られなかった．
以上の光顕所見を，表1にまとめて示した．変化に乏しい症例5を除いて，筋線経の大小不同，脂肪変性といった慢性筋原性変化のほか，RVの出現が特徴的で，ほぼ同様の所見が認められた．
次に，RRFの認められた症例1，2に対し電顕観察を行った．最も目立った所見は，多数のmyelinfigureを有した自己会食胞で，形成初期段階のものから，多数の，debriSを有Lglycogen顆粒の蓄漬した完成されたものまで種々の段階のものが見られた（図2）．

図1著明な筋線経の大小不同，問質の線維化，脂肪変性，rimmed vacuole，raggedred fiberの出現がみられる（HE染色×110）

同一筋線椎のRVに近接する部位に，結晶様封入体を有する異常ミトコンドリアの集積が見られ（図3），結晶構造を有した変性ミトコンドリアが自己貴食胞に取り込まれる所見も認められた（図4）．

図2 グリコーゲン顆粒，ミェリン像，膜様構造物
よりなる多数の自己貪食胞がみられる

図3 結晶様構造物を有する巨大ミトコンドリアの集積（×11，300）（×4，400）−27−

注目した報告はなく，今回我々の症例では，異常結晶構造を有したミトコンドリアの集積と自己貴食胸が同一筋
線維上に見られ，またその異常ミトコンドリアがVaCuOleに取り込まれていく過程を捉えることができた．
この所見はrimmed vacuoleの成立磯序を考える上でも重要と思われる．MSSは，その病変の多彩さより，何らかの代謝性疾患を疑わせる症候群と思われるが，ライソゾーム異常症，ミトコンドリア異常症についてまた検討を加えていくことが必要と思われる．
文

図4 結晶様構造物を持つ変性ミトコンドリアを貪食している（×16，000）

献1）Skre H，et al：Linkage studies on Marinesco−
Sjagren syndrome and hyper，gOnadotropic hyp0−

gonadism，ClinGenetll：57，1977．
考察2）吉本 裕：Rebound nystagmusを認めたMari−
nesco−Sj6gren症候群（脊髄小脳変性症のまれな一例）．耳鼻咽喉科50：1037，1978．
3）山永裕明ら：末梢神経障害を呈したMarinesco−
Sj6gren症候群の1家系3例．臨床神経20：326，

Marinesco−Sj6gren症候群（MSS）の筋病変に関しては，比較的近年になって注目され，本症の進行性の筋力低下の原因と見なされてきている．当初は神経原性変化とするものが多く，剖検で脊髄前角細胞の変性を認めたとする例l），筋生検で群集萎縮のあった例2−，神経伝導速

1980．

度の遅延例3）などが報告されていたが，近年の報告では

4）Komiyama A，et al：Muscle pathologyin Mari−

筋原性とされており，その病理所見は，筋線経の大小不nesco−Sj6grensyndrome・JNeuroISci89：103，

同，壊死再生所見，問質の線椎化，脂肪変性のほか，多1989．

数のRVや，散発的なRRFの出現で，慢性に経過する筋

5）TachiN，etal：Congenitalmusculardystrophyin

原性変化が主体であり，今回我々の症例で認めた所見とMarinesco−Sj6gren syndrom．Pediatr Neuro17：

ほぼ同様であった．Komiyamaら4），TachiS｝は，若年例で296，1991．

は壊死，再生所見が目立つことより先天性筋ジストロ6）GotoY，etal：Myopathyin Marinesco−Sj6gren

フィー様所見と見なしており，Gotoら6）はそれに加え，若年例で光顕的にはRVを認めなくても，電顕的にはす

Syndrome：An ultrastructuralstudy．Acta Neuro−でに自己貪食胸が形成されていることにより，本症の筋7）WalkerPD，etal：Marinesco−Sj6grensyndrome：

patho180：123，1990．

病変にRVが重要な役割を果たしているだろうと推察しEvidence foralysosomalstorage disorder．Neurorている．自己貴食胞の出現に注目し本症を1ysosomal

logy35：415，1985．

StOragediseaseとみなした報告に，Walkerら71の報告が8）Torbergsen T，et al：Mitochondrialmyopathyinある．彼らは培養線維芽細胞内にもmyelinfigureが出現

Marinesco−Sjagren syndrome．JMent Defic Res

したことより想定しているが，欠損酵素は同定されていない．また，RRFに着目しミトコンドリアミオパチーと9）MarksHG，et al：Musclemitochondrialabnorma−

35：154，1991．

する報告がTorbeTgSenら8）よりあり，Marksらも同様の所見を報告しているが9）非特異的所見としている．いま1itiesin the Marinesco−Sj6gren syndrme．Ann
Neuro18：122，1980．

まで本症の筋病変に於けるRVとRRFの関係について−28−

5）病的筋の細胞膜における免疫組織化学的検討
佐

研究協力者

衣 斐

達＊

中

尾

直

樹＊

周

拡＊

荒

畑

喜

一＊＊

防

識するAIC抗体ではDMD筋の細胞膜，DMD保因者の筋細胞膜においても弱く染色されていた．
DMD例におけるrevertantsの各単クローン抗体の反応性は同一症例においても線維毎によりその染色性に相違が見られた．すなわちroddomain中央部では染色されず，N端およびC端抗体で染色される傾向にあり，ジス
トロフィン遺伝子解析での欠失部位に対応しない部分を認識する抗体に対し反応しないrevertantsが見られた（図1，表1）．
BMDでは欠失部位に相当する抗体では染色されず，はじめにDuchenne型筋ジストロフィー（DMD），Becker塑筋
ジストロフィー（BMD）を中心としたミオパチ一において筋細胞膜の異常がその病態と密接に関連している．
本研究は筋細胞膜の各種構成蛋白に対する単クローン抗体を用い，種々の神経筋疾患生検筋の凍結連続切片における免疫組織化学染色を実施しその臨床的意義を検討した．
対象および方法

またmultiplexPCR法にて欠矢が確認されなかった兄弟
例においてC末端抗体に反応がなかった．
なお主に神経原性疾患にみられるtarget fiberの

対象は神経筋疾患生検242筋を用いた．その主な疾患
はDMD

4，DMD保因者

ストロフィー性筋炎

功＊橋4，BMD12，肢帯塑筋ジ9，筋緊張性ジストロフィー13，多発37，慢性進行性外眼筋麻痔

7，筋萎縮性側索硬化症13，CharcotrMarie−Tooth病

6．球脊髄性筋

target部はC末端を認識するDys2，4C5で陽性所見を示した．
2．スぺクトリン：すべての対照筋，疾患筋の筋細胞膜は染色され，神経筋接合部や筋腫接合部でより濃染した．targetfiberのtarget部がジストロフィンC端部抗体と同様に染色される線経も見られた．
3．ユートロフィン：対照筋では筋細胞膜は陰性であったが，神経筋接合部，衛星細胞と考えられる部分で陽萎縮症 4，脊髄小脳変性症6などであった．
方法は新鮮凍結連続切片にて免疫観織化学をABC法により行なった．一次抗体として筋細胞膜の構成蛋白を認識する単クローン抗体を用いた．すなわち筋形質膜構成成分としてはジストロフィンはN末端よりAIC（Dia
Yatron），Dys3（Novocastra），2−5E2（富士レビオ），
Dysl（Novocastra），4−4C5（富士レビオ），Dys2（Novocastra）を用い，さらにスペクトリン（Novocastra），
ユートロフィン（Novocastra）を用いた．基底膜構成成分としてラミニンに対してはA，M，Bl，B2の各サ
ブユニットに対する抗体（Chemicon）を使用し，その

、
〟藤

、−
一

他ミオシン重鎖のfast twitch，Slow twitch，neOnatal，

鶉
：
メ

ト
二，
叩、
′
ご

developmentalの各アイソフォームの抗体（Novocastra）
を用いた．
結

＿
∴

果

1．ジストロフィン：ほぼ全抗体で既報告l）と同様に
DMDではいわゆるごく僅かに出現するジストロフィン
陽性線経であるrevertantsを除き筋細胞膜は陰性，
図1

DMD保因者では陽性・陰性線経のモザイクパターン，
BMDでは染色性の低下を示した．しかしN末端側を認＊愛知医科大学第四内科
綿国立精神・神経センター神経研究所

一29−

DMD revertantsの連続切片における各抗ジスT・ロフィン単クローン抗体による染色態度
同一症例においても線椎毎に各抗体の染色パターンが異なり，rOd domain中央部を認識する抗体に対する反応が消失している線経が多い．

衰1DMDrevertants連続切片における各抗ジストロフィ
ン単クローン抗体による染色態度
60kdはrod domainを認識する多クローン抗体．
％の列はそのrevertantsが全線経に占める比率．
N．D．：not detected．

2，Mで陽性，Aで弱陽性であった．筋内血管は中小血管ではA，B2で陽性，BlおよびMで内膜の一部のみ
弱陽性，毛細血管はM以外陽性であった（表2）．
病的掛こおいてはラミニンAの染色性に相違がみられたが，他の抗ラミニン抗体では疾患による差異は見られ欠失Exon AIC DYS35E260kd DYS14C5
DMD1

45

DMD249−52

DYS2

十十

＋＋

＋＋

＋＋

十十

＋＋

＋＋

0．19

＋＋

＋＋

＋＋

＋＋

一

十十

十十

0．06

＋

一

一

一

一

一

十

0．13

＋

＿

＿

●

＋＋

＋＋

＋＋

＿

￣

なかった．すなわちラミニソAではDMD筋，DMD保者
臥BMD再生筋ではその染色性が増強していた．また

％

＋

0．44

＋＋

＋←

0．05

他の疾患の再生筋においてもその染色性が増強していた．連続切片においてミオシン重鎖neonatalformによる染色と比較した再生筋での強陽性を示す線経の一致率

DMD3

N・D・＋＋＋DMD4N・D・

十十

●

＋＋
十

表2

−

−

■

■

￣

＋

0．05

＋＋

＋＋

一

十十

十＋

0．54

一

十

0．18

一

一

はラミニンAで高く，ユートロフィンでは低かった（図2，蓑2）．
また筋緊張性ジストロフィーの萎縮したtype1線経，

各疾患筋における各ラミニンサブユニットなどによる染色態度
Dys：dystrophin．Spee：spectrin，Utro：utrophin

DYS Spec Utro

M

Bl

⁝

＋
＋
＋

＋
十
十

日日？

＋

十

⁝

＋

■

＝⁝

⁝

対照筋
錘外線維
錘内線維
神経筋接合部
病的筋

LamininA

dystrophinopathy

DMD
BMD
その他の疾患
再生筋
筋内血管
毛細血管
中小血管
筋内神経
Perineurium
endonQurtUm

筋紡錘被膜

−
＋

＋＋

＋十
十十

十

十＋

十十

＋十

十十

＋／一

十十／十

十十

十十

＋＋

＋＋

＋＋

＋／一

十十

十＋

＋＋

＿

＋

＋＋

＿

＋＋

＋＋

−

＋

十十

±

＋

＋＋
＋＋

＿

十

＿

＋

＿

±

十＋
±

＋＋

十十

十

●

＋

十十

＿

＋

十十

性，筋紡錘の錘内線維および被膜，筋内神経，毛細血
管，筋内血管で陽性であった．
一方DMDでは大部分の筋線経が陽性であり，DMD保因者ではジストロフィン陰性線経を中心に陽性，BMD

再朋

♂ ・▼・
．
．

t

各

では再生線経に陽性であり，一部のBMDでは非再生線椎にも陽性所見をみた．また多発性筋炎などの他の筋疾患においても再生線経で陽性のものがあった．しかしそれら線経を連続切片でミオシン重鎖neonatalform陽性
線経と比較すると，ジストロフィノバチ一筋でユートロ

■′ ′
′J ＿
j・ ナ
Jr−
．・三 鮮
l

年 ㌔
i I＿
ノ

フィンの陽性線椎との一致率は高く，他の筋疾患では低かった（図2）．

▲

l

ヽ

l
ll
′
、・

図2 DMD．DMD保因者，BMD．多発性筋炎（上段から）に

4．ラミニン：筋細胞基底膜はラミニンAで薄く染まおける連続切片でのユートロフィン，ラミニソA，
ミオシン重鎖neonatalform（左列から）染色．
DMDを除きミオシン重鎖neonatalform陽性の再生筋ではラミニソA強陽性である．ユートロフィン陽性線経はジストロフィノバチ一において再生筋でその陽性率が高い．またラミニソAでは毛細血管が鮮明に染色され病的筋での観察に有用である．

り，他は濃染した．神経筋接合部ではラミニンA，M，
B2で強く染色されたが，Blは明らかではなかった．
筋紡錘は錘内線経は錘外線椎と同様の染色態度を示
し，被膜がラミニンA，B2で陽性，筋内神経は神経周膜園がA，Bl，B2で陽性，endneuriumがBl，B−30−

フィンの脆弱性あるいは欠損と深く関連しているものと神経原性疾患では群集萎縮線経で若干染色性が増加していた．

考えられた．また他疾患での再生筋線経におけるユート

ミトコンドリアミオパチーではragged−red fiber辺縁

ロフィンの発現は筋の発生過程と同様の機序によるものに存在する毛細血管の増加がよく観察でき，fiberと推察された．
ラミニンについてはラミニソAにおいて再生筋線椎がsplitting内に陥入した毛細血管が認められ，多発性筋炎
では毛細血管の拡張像がよく観察できた．
考

濃染されたことは，再生筋のひとつのマーカーとして有用であり，また病的筋における毛細血管の観察にも有用
であった．

察

本研究では骨格筋の筋膜（形質膜，基底膜）を構成す
る蛋白4種，計12単クローン抗体に一部筋原性線維構成

ま

と

め

ジストロフィノバチーを含む，多数の神経・筋疾患生蛋白を加えた免疫細胞染色を各種神経・筋疾患につき検

検筋において筋細胞膜構成蛋白に対する単クローン抗体

討した．

を用い免疫染色を行ない，その結果を比較検討した．

その結果抗ジストロフィン抗体の染色は大略既報告と同様の結果を確認したが，AIC抗体ではDMD筋が薄くジストロフィンではDMDrevertantsは同一症例にお染色された．これはN端側においてジストロフィンが部いても各筋線維毎に各抗体に対する染色態度が異なり，分的に発現している可能性あるいは，ユートロフィンなどのジストロフィン類似蛋白との交差反応を示している

rod domain中央部を認識する抗体で染色されない傾向

可能性が示唆された．

れた．Target部はC末端部およびスペクトリンで染色された．ユートロフィンではジストロフィノバチー以外のにあった．N末端側のAIC抗体はDMDでも弱く染色さつぎにreveretantsにおける各抗体の反応性の相違，
とくにrod domain中央部での抗体の反応が多くは陰性であり，N端およびC端部抗体でよく反応を見たことは疾患でも低頻度ながら再生筋細胞膜に陽性であった．ラ
ミニソ染色ではラミニソAにおいて再生筋線維基底膜で線維別に新たに欠矢などの変異が加わり，frameshiftか

濃染し，また毛細血管の検索に有用であった．
以上筋細胞膜構成蛋白の各抗体における免疫染色は病らin frameになったことが推察された．

的骨格筋の臨床・病理診断および病態の解析に重要な手

一万日験BMD例においてC末端部抗体に反応しない段と考えた．

症例があった．これは既報告ではC末端部欠損例でありDMDとなるが2㌧本症例のBMDとして良性な臨床所見

文を得たことは，ジストロフィンの欠損部位がdystrophin

献1）Arahata K，Hoffman EP，et al：Dystrophin

associatedglycoprotein（DAG）結合部位よりC末端側でdiagnosis：Comparisonofdystrophinabnormalities

欠損した可能性が考えられた．

byimmunofluorescence andimmunoblot analyses．
Proc NatlAcad Sci86：7154，1989．

なおtarget fiberのtarget部にジストロフィンC末端部抗体への反応が見られたことは同部位にジストロフィ
ンC末端部と類似の構造を持つ蛋白の存在が示唆された．

2）KoenigM，Beggs AH，et al：The molecular basis

つぎにユートロフィンについて，ジストロフィノバ

Correlation of severitywith type of deletion．Am

fbrDuchenneversusBeckermusculardystrophy：
J Hum Genet45：498，1989．

チ一筋でユートロフィンが発現しやすいのはジストロ

ー31−6）Danon disease（lysosomalglycogen storage disease

With normalacid maltase）の膜異常について
後

研究協力者

藤

雄

一＝■

村 上 信 行■・】■■埜 中 征 哉＊・■＊

はじめに（AChE）染色では，空胞および筋朝膜の陥入部に両酵

Lysosomal glycogen storage disease with normalacid maltaseは1981年にDanonら1）により最初に報告された疾患である．本症の臨床症状は，肥大型心筋症，精神発達遅滞，近位筋の筋力低下および高CK血症であり，遺伝形式は常染色体優性遺伝などの報告がされているが，確定していない．本症の筋病理所見では，筋線維内に多数の中空胞を有し，空胞内に糖の蓄着が認められる．また，電顕的には糖を含む自己貪食胞の集積が認められる．このことから，栃原病Ⅰ型に似た疾患であると考えられたが，酸マルターゼ活性が正常であることから本症の名称が付けられることとなった．その後，本症と同様の症例が報告された2）〜8）が，その病因は末だ明らかにされていない．今回，我々は組織化学，電顕および免疫組織化学的に検討し，本症の空胞形成について知見を得たので報告する．
対象と方法
対象は国立精神・神経センターにて臨床症状，組織化
学および生化学的に本症と診断した3例である（表1）．
この3例について組織化学，電顕および免疫組織化学的に検討した．免疫染色には，ジストロフィンのC末端の抗体である4−4C5，抗ユートロフィン抗体，膜貫通蛋
白である50kDaと43kDaのジストロフィン結合糖蛋白に対する抗体，Chemicon社のラットモノクローナル抗ラミニソ抗体および富士薬品のマウスモノクローナル抗ヒ
トコラーゲン（ⅠⅤ型）抗体を用いて間接法にて染色した．

素が高活性であった．
電顕所見では，多くの空胞が単位膜と基底膜により境界されていた．この中に自己貪食胞や細胞質の変性産物が認められた．時に∴筋鞘膜の陥人が認められ，この中に単核細胞が認められた．
ジストロフィン，ジストロフィン結合糖蛋白，ラミニ
ソおよびⅣ塾コラーゲンについての免疫染色では，空胞および陥入部は陽性所見が認められた．しかし，Ⅳ型コ
ラーゲン陽性空胞は他の免疫染色の陽性空胞に比して頻度の少ないものであった．また，ジストロフィン関連蛋
白の免疫染色では極弱い反応が認められた．これらの免
疫染色において，よく空胞と筋翰膜が陥入により連続する像が認められた．
考察
我々の検討した3例は，心筋症，精神発達遅滞，空胞を有するミオパチーを塁し，これまでの報告例と臨床症
状∴阻織化学および生化学的に類似しており，本症に合致するものであると考えられた．本症の組織化学では，
HE染色で筋線稚内に好塩基性の顆粒を有する中空胞が多数認められる．また，時に筋開院の陥人が認められる

表1
Patienll Patien12

Agclast examined／sex

16y／M

Patien1319y／M

Family his101y＋■

CaTdiomyopathy

hyp￠rlrophic co叩CSliYe hypcllrophic
mild

Muscle wCakmes＄

Menlal r￠lardalion

結果
HE染色では∴筋線経の大小不同に加えて，好塩基性の顆粒を含む中空胞を有する筋線経が散在性に認められた．時に∴筋鞘膜の陥人が認められた．PAS染色では中空胞にわずかな糖の蓄積が認められた．非特異エステ

26y／M

Scmm CK（＜185IU／L）
Acidmaltase actiYlty
i几muSCle（7，3土2．nmok4MU／

miId

moderate mod￠ralo bordcIlirle
Z004

514

1025

10．8

5．9

5．8

Ⅰ8．0

16．7

8．4

mg／30min）
NeutTal mallase
actiYllyimmusC1￠

ラーゼ（NSE）およびアセチルコリンエステラーゼ（18．1土5．1nm01奮／mh／
mg・prOl￠in）●国立精神・神経センター武道病院＝国立精神・神経センター神経研究所微細構造研究部

M：mak●molhcr diedI10m COngeStiYe Cardiomyopalhy

nOTmal Yalue5are Shown hIhe palentheses−32−

さ152ye打5．

（図1A）．糖原病Ⅰ型と異なり，中空胞を有する筋線経のPAS陽性物質の蓄積は極小量である（図1B）．また，
酸フォスファクーゼ活性の上昇もわずかであった．これに対して，NSE（図1C）およびAChE染色（図1D）
では本症の空胞および膜陥入部は共に高活性を示し，よくこれらを抽出するものであった．糖原病Ⅰ型では，空胞を有する筋線経でNSE活性が高いが，空胞それ自体は高活性は示さない．すなわち，これは本症の観織化学的特徴である．
電顕所見において本症の空胞の多くは単位膜と基底膜によって境界されており，この中に自己貪食胞および細胞質の変性産物が認められた（図2）．これは，梼原病Ⅰ

塾などに認められる自己貪食胞が集積して形成された空胞とは全く異なるものであった．本症の空胸膜および陥入膜の特性を検討するために免疫染色を行った．ジスト
ロフィンは筋朝膜の細胞骨格であり，50kDaと43kDaのジストロフィン結合糖蛋白は筋鞘膜の陵貫通蛋白とされている．本症の空胸膜にジストロフィンおよびジストロ
フィン結合糖蛋白免疫染色において陽性所見が認められた（図3）．すなわち，本症の空胞膜は筋鞠膜の特徴を有するものである．また，ラミニソおよびⅣ型コラーゲン
は基底膜の主な構成成分である．ラミニソおよびⅣ型コ
ラーゲン免疫染色において本症の空胸膜に陽性所見が認められたことから，本症の空胸膜は基底膜の特徴も有す

㍉十一■ヒ

ヽ

■A

◆

．

芸

ささ一一

ルー
・D

文

二

■

図1軽度の筋線経の大小不同に加えて，散在性に塩
基好性の顆粒を含んだ中空胞を有する筋線維（矢印）が認められる（A）．これらの筋線経にPAS陽性物質のわずかな蓄積がみられる（B）．小空胞は非特異エステラーゼ（NSE）（C）およびアセチルコリンエステラーゼ（AChE）（D）染色でともに高活性を示す．
Patient3A：H＆E染色，B：PAS染色，C：
NSE染色，I）：AChE染色，A−I）（連続切片）：×280．

図3

図2 中空胞は単位膜および基底膜（矢印）によって境界され，この中に糖を含む自己貪食胞や細胞質の変性産物がみられる．Patient3×4，200．

−33−

空胞膜はジストロフィン（A），ジストロフィ
ン結合糖蛋白（B），ラミニソ（C）および4塑
コラーゲン（D）陽性である．また，中空胞と筋開膜の連続がみられる（小矢印）．
Patient3A−I）（連続切片）×185．

表2Immunohistochemicalandhistochemicalcharacteristicsofvacuolarmembrane
andjunctionalfoldsinnormalneuromuscularandmyotendinousjunctions

D anon disease

D ystrophim＋

U lrophin±Ⅰ爪fanlile andchiIdhood Eorm
AM D

A dult form AM D

N eurom uscular
JunCtion

M yolendinous
JunCtion

±

＋

＋

＋

DAG

＋

＋

＋

L am inin

十十＋T ype 4 colIagen

＋

＋

A ChE

＋

＋

±

A O IR＋＋

AMD‥aCidmaltase

deficiency−

AChE：aCetylcholinesterase●

DAG：dystrophin−aSSOCiated

AChR：aCetylcholinc

glycoproteinsrcceptor

るものである．

2）RiggsJE，Schochet SSJr，et al：Lysosomal

以上の結果と栃原病Ⅱ型，神経筋接合部および筋腫接合部の所見を表2にまとめた．本症の空胞膜は，糖原病
Ⅱ型とは異なり，筋翰膜および基底膜の特徴を有していた．また，この基底膜はAChEをも含んでいた．このことから，表2に示したように本症の空胸膜は神経筋接合部または筋腱接合部に似るものであると考えられた．また，中空胞と筋鞠膜が陥入により連続する像が認められることから，本症の空胞形成には膜の陥人を引き起こす
ような膜の異常が関与するものと考えられた．

glycogen storage disease3）ByrneE，DennettX，et al：Dominantlyinherited
Cardioskeletalmyopathywithlysosomalglycogen
StOrage disease and normal acid maltaselevel．
Brain109：523，1986．
4）Hart ZH，Servidei S，et al：Cardiomyopathy．

mental retardation，and autophagic vacuolar
myopathy．Neurology37：1065，1987．
5）Tachi N，Tachi M，et

ま

と

め

without acid maltase

deficiency・Neurology33：873，1983．

al：Glycogen storage

disease with normal acid maltase：Skeletal and1）本症の空胞膜は筋翰膜および基底膜の特徴を有していた．

Cardiacmuscles・PediatrNeuro15：60，1989．
6）Kashio N，Usuki F，et al：Cardiomyopathy，

2）空胞と細胞膜が筋翰膜の陥入により連続した．

mental retardation，and autophagic vacuolar

3）基底膜はAChEを含み，神経筋接合部または筋腫接合部に似た．

myopathy：AbnormalMRIfindingsinthehead．J
NeuroIScilO5：1，1991．

4）本症は栃原病Ⅱ塾のようなライソソームの異常では

7）伊藤昌弘，浅野 優，ほか：酸マルターゼが正常な糖原病（lysosomalglycogenstoTagediseasewith

なく，陥人を引き起こすような膜の異常が病因であると考えられた．

normalacidmaltase）の1例．脳と発達25：459，
1993．

文

献

8）Muntoni F，Porcu M，et al：Cardiomyopathy，

1）Danon MJ，Oh SJ，et al：Lysosomal glycogen
StOrage disease with normal acid maltase．Neu−

mentalretardation and vacuolar myopathy assoc−

iatedrology31：51，1981．

with desmin typeintermediate filaments．

CanJNeuroISci20（supp14）：S159，1993．

−34−7）福山型先天性筋ジストロフィーにおける細胞外マトリックスの免疫組織学的研究
田

遽

研究協力者

等＊

水 野 美 彦＊＊はじめに点について検討を加え，特に筋変性の進行度との関係を検討したので報告する．

福山塑先天性筋ジストロフィー（FCMD）における筋病変の発生機転は末だ不明である．昨年の本会議で林ら1）

対象・方法
FCMD6例（Casel．1ヶ月男児，Case2．6ヶ月女児，Case3．1歳男児，Case4．1歳女児，Case5．1
歳男児，Case6．1歳男児）よりの生検筋，心不全にて死亡した21歳のFCMDの剖検例よりの喉頭筋（L），横隔膜（D），前脛骨筋（T）を用いた．対象としたのはDMD4例，その他の神経筋疾患6例（中枢神経疾患

はFCMDにおいて細胞外マトリックスであるラミニソの動態について免疫組織学的検索を行い，対照疾患では染色されないラミニソA鎖がFCMD，デュシェンヌ型筋
ジストロフィー（DMD）において染色されること，ラミ
ニソBl，B2がFCMDにおいて著明に染色性が低下していることを報告し，FCMDにおいては基底険に何らかの障害があることを示唆している．今回，我々もこの感酢一一一￣＿章￣岳喜＿芦＿一書

図1FCMDの組織所見．数字は症例番号．
＊東京都立神経病院神経内科
榊東京都立神経病院神経小児科

ー35一

L：喉頭筋，D：横隔膜，T：前脛骨筋

図2 FCMDにおけるラミニソAの免疫蛍光染色所見．
数字は症例番号．
C：CNS W：WH M：DM D：DMD
L：喉頭筋 T：前脛骨筋

図3

FCMDにおけるラミニソBlの免疫蛍光染色
所見．数字は症例番号．
C：CNS W：WH M：DM I）：DMD
l：喉頭筋 T：前脛骨筋（CNS）2例，皮膚筋炎（DM）2例，脊髄性進行性筋萎縮症（WH）2例）である．方法はヒストファインキット

ほぼ同様に染色されていたが，一部の肥大線椎では染色を使用した免疫蛍光法を用いた．使用した抗体は抗ヒト
ラミニソA，31，32，及び，抗ヒトコラーゲンタイ性の低下が認められた（図3）．ラミニンB2（図4），
ヒトコラーゲンタイプⅠⅤ（図5）に関しても同様の染色

プⅠVの各モノクローナル抗体を用いた．

態度が認められた．剖検例では喉頭筋，横隔膜が同様に1では対照群はよく染色され，一方，DMD，FCMDでもよく染色されたが前脛骨筋では染色性の低下の見られる

結果線経が認められた．表1に以上の染色性の比較を示す

まず一覿織学的所見ではFCMD生検筋では1ヶ月例（症例1），6ヶ月例（症例2）では比較的組織は良く保が，まとめるとラミニソほFCMDにおいてDMDと同様染色性が認められ，対照と態度を異にした．ラミニンBたれていたが，1歳例（症例4−6）ではかなり変性が強l，B2，コラーゲンタイプⅠVに関しては基本的に対照く見られた（図1a，b，C）．剖検例では喉頭筋，横隔と差はなく，筋変性が強くなると染色性の低下が認められる傾向があった．

膜ではよく保たれており，前脛骨筋ではきわめて高度の変性が認められた（図1d）．喉頭筋と横隔膜は免疫染
色性に殆ど差が認められなかったので，剖検例について
は喉頭筋と前脛骨筋について結果を示す．

考察

次に，免疫蛍光染色の結果では，ラミニソAは対照群

林らはFCMDにおいてやはりラミニンAの染色性の出現，ラミニソBl，32の染色性の減弱を指摘していでは殆ど染色されなかったがDMD，FCMDではいずれるが，今回の結果では，ラミニンAに関しては同様の所も明らかに染色性が認められた．DMDとFCMDの間には染色性に差は認められなかった．変性高度な剖検例の見であったが，ラミニンBl，32に関しては対照と差を認めず，一九変性の強い筋での染色性の低下は，変TAでは染色性の低下が認められた（図2）．ラミニンB性に伴う二次的な変化と考えられた．林らはその後ラミ

−36−

図4

FCMDにおけるラミニンB2の免疫蛍光染色
所見．数字は症例番号．
C：CNS W：WH M：DM D：DMD
l：喉頭筋 T：前脛骨筋

図5

FCMDにおけるヒtコラーゲンタイプⅠVの免疫蛍光染色所見．数字は症例番号．
C：CNS W：WH M：DM D：DMD
l：喉頭筋 T：前脛骨筋

ニンM鎖についても検討を加えており，FCMDにおいて染色性が欠如することを報告している．今回我々はM鎖の抗体が入手出来なかったので，この点の検討は出来なかったが，M鎖が筋特異性があり，A鎖はその他の細胞の基底膜に特異性があることを考えると，FCMDにおいてはM鎖の欠損に対してA鎖が代償するような機転が働いているのかも知れない．今後M鎖についても検討を加えてゆきたい．
文献1）林 由起子，荒畑喜一，平澤恵理，武田伸一，塚原俊文，埜中征歳，E．Engvall：筋ジストロフィーにおける細胞外マトリックスの変化． 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジストロフィー及び関連疾患の成因と治療法開発に関する研究（荒木班）平
成4年度研究報告書，1993，pp172−175．

OND：対照群−37−8）筋ジストロフィーマウスにおける細胞外マトリックスの検討

＊

評史㌣

済俊弘

原井

李壕石

千千

●

■
友律a ll

越賀Eng

宮古E

千千二

はじめに

●

菩

畑

荒
起奈
由加伸

藤田

林後武

研究協力者

ロール動物の骨格筋を用いた．dyマウスは実中研より入これまで我々は，ヒトのジストロフィー筋における基手した凍結受精卵を仮親に移植して得た．

底膜の変化を検討し，特に福山型先天性筋ジストロ

免疫組掛ヒ学：クリオスタットで6〃mの切片を作成

フィー（FCMD）におけるラミニソM鎖の異常を指摘しし，ラミニン（M鎖，EHS），ⅠⅤ型コラーゲン，フィプロてきた．すなわち，FCMDでは，ラミニンM鎖の免疫染

ネクチン，ジストロフィン，ユートロフィンに対するポ色性が他の疾患対照筋と比較して著しく低下しているl）．

リクローナル抗体を用いて免疫染色を行った．

細胞の基底膜は細胞外マトリックスが特殊な形態をイムノブロット：凍結筋組織より10mMEDTA加バッとったもので，筋線経においては，各筋細胞膜の周囲を被っている．これは主としてラミニソ，ⅠⅤ型コラーゲ

ファーにてラミニンM鎖を抽出し，そのC末端側を認識する抗体と反応させた．

ン，プロテオグリカソ等で構成されている．一方，細胞RNA分析：生後2週齢のdy及びコントロールマウスの骨格タンパクであるジストロフィンは，筋細胞膜の糖タ

凍結筋組織よりAGPC法によりRNAを抽出し，ラミニ

ンパクと複合体を形成しており，さらに，このうちの細胞外サブユニットである156Edystrophin−aSSOCiated

ンM鎖のC末端側塩基配列を認識するプライマーセットを用いてRT−PCRを行った．

glycoprotein（DAG）は基底荘笑の主成分であるラミニソと結合能をもつことが報告されている2）．

結果

ラミニソは3本のサブユニット鎖から構成されてお免疫組織化学：ラミニンM鎖は，コントロールマウスにり，多くの組織では1本のlongchainであるA鎖と2本のshortchain（Bl，B2鎖）からなるA−B1−B2とおいては筋線維周囲の基底膜に一致して明瞭に染色され，神経筋接合部ではより強い染色が認められた．さら

いう構成をとっている．しかしながら，正常筋組織においてはA鎖のかわりにM鎖が発現しており，M−B1−3に筋内末梢神経も明瞭に染色された．また，mdxマウ2という構成をとっている．このM鎖は骨格筋，シュワ

でも同様，筋周囲に明瞭な染色性が認められた．

ン細胞，及び胎盤のトロホブラストに特異的に存在する
ことが知られている3）．

の染色性は認められなかった．dyマウスは常染色体劣性

ス，ジストロフィーハムスター，ジストロフィーチキンところが，dyマウスで検討したところ，ラミニソM鎖

今回我々は，筋のジストロフィー変化に及ぼすラミニ
ソM鎖，およびその他の細胞外マトリックス成分の意義

遺伝形式をとるので，ヘテロのマウスは無症状であるが，ヘテロマウスではコントロールマウス同様ラミニン

をさらに詳細に解明する目的で，各種の筋ジストロ

M鎖が明瞭に認められた（図）．

フィーモデル動物を用いてこれらの変化を検討した．

dyマウスは，筋のジストロフィー変化に加え，もう1つの特徴として脊髄神経板付近の髄鞘形成不全が知られ対象および方法ている．そこで脊髄神経根についても検討した．コント対 象：筋ジストロフィーモデル動物（line413チキン，

ロールマウスではラミニンM鎖は脊髄軟膜，神経節周BIO14．6ハムスター，mdxマウス，C57BL／6J−dy／dy［いわゆるdyマウス］），およびそれぞれに対するコント

囲，脊髄神経板および脊髄周囲の傍脊柱筋群に明瞭に認められたが，dyマウスではいずれの部分にもM鎖は染色されなかった．

●国立精神・神経センター神経研究所＋■LaJo一方，dyマウスのジストロフィンはmdxマウスと異a Cancer Research Foundation＊■●都立東大和療育センター

なり，明らかな異常は認められず，また．ⅠⅤ型コラーゲー38−

Laminin M

dystrophin

dy／dy

Dy／dy

亘さ

Dy／Dy

r
te

d
y
h
a
m

dy
Chicken囲ン，フィプロネクチソにも異常は認められなかった．

巣であった．

さらに，dyマウスの遺伝子座は，ユー1トロフィン（DRP）と同じ染色体10番の上に存在するので，ユート

イムノブロット：凍結筋組織を用いてラミニンM鎖の抗ロフィンの変化を検討した．dyマウスのユートロフィン

dyのヘテロマウス，コントロールハムスター，およびジ変化は神経筋接合部に明瞭に認められ，一部再生筋にもストロフィーハムスターではいずれもラミニソM鎖を認存在するという，コン1トロールと同様の免疫染色パター

識するバンドが認められたが，ホモのdyマウスではバンが認められ，これまで報告されているものと同様の結ンドが認められなかった．

体でイムノブロットを施行したところ，コントロール，

一39−

RT−PCR：そこでRNAレベルでの検索を試みた．ラミ

2）本モデル動物は今後，筋ジストロフィーの発症とニソM鎖のC末端側塩基配列を認識するプライマーセッ

病態の解明に加えて，ラミニソM鎖の機能の解明

トを用いてPCRを施行したところ，PCRサイクル数がにも重要な意義を持ってくるものと考えられる．

増えるにつれ，コントロール，dyマウスともにシークエ

最後に，dyマウスを供給して下さいました実験

ンスより予想された468bpの位置に一致したバンドが増動物中央研究所の野村達治所長，抗ユートロフィ

幅された．現在，Northern blotによる検討を進めていン抗体を供与して下さいました東京大学分子生物学研究所の石摘草一助教授に深謝致します．

る．
ま

と

め

文

献

1）C57BL／6J−dy／dy（dyマウス）では，筋細胞基底

1）HayashiYK，EngvallE，et al：Abnormallocaliza−

膜のラミニンM鎖が免疫染色されなかったこと，
イムノブロットでもバンドが認められなかったこ

tion oflaminin subunitsin muscular dystrophies．

とより，M鎖が欠損しているものと考えられた．

2）Ibraghimov−Beskrovnaya O，ErvastiJM，et aI：2）dyマウスの遺伝子座は，ユートロフィンと同じマPrimary struCture Of dystrophin−aSSOCiated glyco−

ウス第10番染色体上にあるとされているが，免疫proteinslinking dystrophin to the extracellular

組織化学的にはユートロフィンに明らかな異常は認められなかった．

matrix．Nature355：696−702，1992．
3）LeivoIandEngvallE：Merosin，aprOteinSpecific

3）ジストロフィーハムスター，ジストロフィーチキ

for basement membranes of Schwann cells，ン，およびmdxマウスではラミニソM鎖の免疫

Striatedmuscles，andtrophoblast，isexpressedlate

染色性に異常は認められなかった．

innerveand muscledevelopment．ProcNatlAcad

J NeuroIScil19：53−64，1993．

SciUSA85：1544−1548，1988．

考4）Arahata K，Hayashi Y K，et al：Lamininin

察1）dyマウスにおけるラミニソM鎖欠損は．細胞外マ

animal models：Defect oflaminin Min skeletal

トリックスの異常によっても筋のジストロフィー

and cardiac muscles and peripheralnerve of the

変化が引き起こされうることを示唆しており重要

homozygous dystrophic dy／dymice．ProcJapan
Acad Ser B：259−264，1993．

である．

−40−

Ⅰ．遺伝子（Partl）

9）筋ジストロフィー及びその類縁疾患に関する
細胞遺伝学的研究
Ⅰ．リンパ芽球細胞株を用いた高精度分染法の検討
斎 藤 深美子暮

研究協力者

菓

美

華■

池

内

達

郎■

よく得る方法，特に細胞同調・BrdU処理による高精度
R分染法を検討し，良好な成績を得たので，その結果を報告する．

遺伝性疾患の中には，多くの研究者や医師の様々な角度からの検索にも関わらず，その原因遺伝子を解明できない疾患が，まだ数多く存在する．しかし，近年の分子生物学的手法の進歩により，その本体の遺伝子を直接同定する可能性がでてきた．この戦略法は，ポジショナル
クローニング法と呼ばれている．その原理は，資料と方法実験に用いたLCLは，3種煩の細胞株で，RPMI1640
培養液（20％牛胎児血清を含む）にて培養・保持されたものである．
図1に示されてある様に，最初に細胞数をカウントして，2×105個／m〃こ揃えてから培養をスタートする（0時間）．24時間日に，細胞同調剤としてチミジン（TdR，

1．まず，様々な多型マーカーを使用して，その疾患の患者の存在する家系に関して，Linkageanalysis（連鎖解析）を行い，疾患遺伝子が何番染色体のどの領域に存在するかを決定する．
2．次に，その領域周辺を詳細に解析し，PFGEを用いた制限酵素地図の作製，YAC（酵母人工染色体）による巨大DNA断片のクローニング，特定の領域における発現退伝子の同定等の手法を駆使して，その疾患に共通した変異の存在する遺伝子を決定する．
現在までの研究例を見ると，このポジショナルクロー
ニング法を成功させるか否かは，染色体レベルでの再配列（転座，部分欠失あるいは逆位等）を有する稀な症例を発見しているか否かに懸かっていることが多い．
我々の目的は∴筋ジストロフィー症およびその類縁疾患における細胞遺伝学的な検索を行い，疾患に関連する染色体異常の発見に努めること，および‥患者を含む家系の細胞を収集・保存することである．そこで，第一年目に相当する本年度は，リンパ芽球細胞株（lymphoblas−
toidcellline：LCL）を用いた，高精度染色体解析のための手法開発に関する基礎的な研究を計画した．
LCLは，DNA型EBウイルスにより形質転換したI3リンパ球で，半永久的に増殖し，凍結保存・DNA解析も容易なため，分子遺伝学的解析用資料としては大変に有用
で，最も一般的に用いられている細胞である．しかし細胞遺伝学的解析用としては，通常，染色体の凝縮性が強いために，構造異常等の詳細な分析が難しいという難点がある．そこで本研究では，その高精度染色体像を効率

300〟g／mJ）またはメソトレキ七一ト（MTX，10￣TM）を添加して，17時間培養する．これを洗浄して同調を解除した後に，BrdU（30FLg／Tnl）で5〜8時間培養し，経時的に細胞を収穫・固定して染色体標本を作製する1）．その際，（1）同調処理のみの場合：国定30分前にコルセミド（0．04〟g／mg）を添加する，（2）同調処理及びェチジウム
ブロマイド（EB：染色体凝縮阻害剤2〉）処理の併用の場
合：固定の1．5時間前にEB（7．5JJg／mJ）を，30分前にコルセミド（0．01〃g／mg）を添加する（図1），あるいは（3）EB単独処理の場合：同調処理は行わずEB処理のみすることにし，各々の効果を比較した．
作製した染色体標本をHoechst33258で染色した後，ホットプレート及びブラックライトで処理してから，ギムザ液で染色し3），光学麒徴鏡にて最低500〜1000の細胞をカウントして分裂頻度を算出し，その染色体像及び染色体分染像の観察を行った．

BrdU EB Cot

誓。諾

‰爪一

♪g／ml

1

I

1

2xlO5
tells／ml

24hr

17hr

見nl‰●
I

5−8h7訂 llarVeSt
JO．5

図1細胞同調及びEB処理併用法のプロトコール

蠣東京医科歯科大学難治疾患研究所遺伝疾患研究部門（細胞遺伝）

−43−

結

果

（1）の同調処理のみの場合，BrdU添加後，5〜8時間の間に経時的に染色体標本を作製し，その分裂頻度を算出した結果，TdRあるいはMTXのどちらで同調しても，分裂細胞の頻度が最高値を示す時期は，6．5時間目
であることが判った（図2）．その際の分裂頻度は，
TdR同調の場合の方（3〜4％）が，MTX同調の場合（2・5％）に比べて，一般に高値であった．しかし，高精度バンド解析に必要な分裂初期細胞（lP：lateprophase＋Pm：PrOmetaphase）の全分裂細胞中の頻度は10〜20％
で必ずしも高いとはいえなかった．
そこで次に，（2）のTdRによる同調処理及びEB処理併用法を試みたところ，分裂初期細胞（lP＋Pm）の頻度が著しく増加し，最高値は全分裂細胞中の60〜70％の割合にまで達した（図3）．このピークを示す時期は，分裂頻度の最高値を示す時期と同じ，6．5時間目であった（図3）．
一方，細胞同調を行わないEB単独処理（3）では，EBの染色体凝縮阻害効果により，分裂初期細胞を50〜55％の高頻度で得ることが可能であるが，染色体に粘着性が生じるため，標本を作製する際，スライドグラス上に染色体を良好に展開させるのが困難であった．
考察
今回の結果から，リンパ芽球細胞株においては，細胞同調培養及びェチジウムブロマイド処理の併用により，約70％の高頻度で，分裂初期の伸張した染色体を得ることが可能であることが判明した4）．その一番のピークは同調解除・BrdU添加後，6．5時間目に得られる4）．この
時間は，末梢血を用いた同調培養後に得られる同様のピーク（約5時間目）に比べて1．5時間程遅いが，これ

5

6

7

8

HRS．AFTERTdR RELEASE

図3

細胞同調（TdRによる）解除及びBrdU添加
後の，経時的な分裂初期細胞（lP＋Pm）の
全分裂細胞中の割合（○及び●は，実験に使用した細胞株の種煩を表す）は，これらの培養細胞に国有の細胞周期に依存するものと思われる．
また，得られた分裂初期の細長く伸張した染色体の展開については，エチジウムブロマイド単独処理の場合ではなかなか困難であるが，今回用いた，細胞同調・エチ
ジウムブロマイド処理併用法の場合では，かなり良好な成果が得られた4）．
上記の技法は，リンパ芽球細胞における染色体構造異常の詳細な解析のみならず，蛍光玩八頭知ハイブリダイ
ゼーション（FISH）法による，各種DNAクローンの高精度マッピングにも非常に有用と期待される5）．今後，
筋ジストロフィー症及びその類似疾患に関する分子細胞

訳■x岩≡UFO卜喜

遺伝学的研究に適応して行きたい．
文献1）Viegas−Pequignot E and Dutrillaux B：Unem6thode simple pourobtenirdesprophasesetdes
prometaphases．AnnGるnさt（Paris）21：1227125，
1978．

2）IkeuchiT：Inhibitory effect of ethidium bromide
On
5

図2

6

mitotic chromosome condensation．andits

7

HRS．AFTER MTX RELEASE

application．Cytogenet CellGenet38：56p61，

細胞同調（MTXによる）解除及びBrdU添加
後の経時的な細胞分裂頻度（○及び口は，実験に使用した細胞株の種類を表す）

3）Taknhashi E，Yamauchi M，Tsuji H，Hitomi A，

1984．

Meuth M and HoriT：Chromosome mapplng Of−44−

the human cytidine−5㌧triphosphate synthetase（CTPS）geneto bandlp34．1−34．3by fluorescence

第38回大会（1993）．
5）Sasaki S，Saito F，Fushimi

K MarumO F andin situ hybridization．Hum Genet88：119−121，

Ikeuchi T：Regional

1991．

COllecting duct water channel（WCH−CD）gene to4）英 美華，斎藤深美子，池内達郎：リンパ芽球細胞株を用いた高精度R分染法の検討：細胞同調とェチジウムブロマイド処理との併用．日本人類遺伝学会−45−

assignment of the human

Chromosomeband12q13．11，q13．12byfluorescencein situ hybridization．Human Gene Mapping

Workshop93：25，1993．

10）拡張型心筋症を主微とするベッカー型筋ジストロフィーとジストロフィン遺伝子異常について
吉 田 邦 広■研究協力若柳 浮 信 夫■ 小 林
武

田

伸

一■＊

荒

畑

慶ヤ 古 賀 律 子＝
喜

一＝

はじめに

れている．そこで心筋特異的なisoformの存在を確認す

我々は昨年の本班会議において拡張型心筋症を星したるために，正常心筋より抽出したmRNAと，ジストロ

べッカ＋型筋ジストロフィー（BMD）4症例の臨床像とフィンのexon2に対応するreverseprimerを用意し，逆遺伝子異常との対応を報告した1）．その中で明らかな筋転写酵素を用いてexon2の5萎縮，筋力低下を欠く2名はPCR法にてexonlが増幅されず，Southernblotの結果と合わせintronlを中心と片を合成した．次いでRNase処理により鋳型mRNAを分解した後，TdT（Terminaldeoxynucleotide Trans−

した欠矢と判断した．他の2名は典型的なBMDの筋症

ferase）により一本鎖cDNAの3状を有する症例でexon47の単独欠矢であった．この日
験例および文献例を踏まえて，我々は拡張型心筋症を皇けた．さらにこの一本鎖cDNAを鋳型にしてPCRを用端側に相当するcDNA断端にアンカーを取り付するBMD症例を2つのグループに大別することが妥当

いてこの部分のcDNA断片をクローニングし，その塩基配列を決定した．

ではないかと考えた．まず1つはBMDに典型的な骨格（2）ジストロフィン遺伝子のintronlに転写制御部位が筋障害を示すグループで，2つ目は拡張型心筋症を主体存在する可能性についてとし，明らかな筋力低下，筋萎縮を欠くグループであ

今回は，intronlの5■端寄りに存在するMEF2（Myo−る．後者の中には最近注目されているジストロフィン異Cyte−SpeCificEnhancer−bindingFactor2）の結合モチー常症であるXLlinked dilatedcardiomyopathy（XLCM）2持）症例が含まれるものと考えた．

フ5）に注目した．骨格筋型ジストロフィンのpromoterにはTATAボックスやCArGボックスと称される配列が一方，ジストロフィン遺伝子の欠失部位との対応を要ある．まず最初に，この部位のpromoterとしての機能を約すると，典型的なBMDの筋症状を備えたグループは見るために，部分的に削り取ったdeletion mutantを作成し，おのおのの下流にレポーター遺伝子としてBMDのhotspotであるexon45747の欠矢であることが多く，他方，筋症状を欠くグループは5 端のexon1−

Chloramphenicolacetyltransferase（CAT）遺伝子をつな

2近傍の欠矢である点が興味深いと思われる．そこで今ぎ，C2筋芽細胞系に導入してその活性を検討した．次にintronlのMEF2結合モチーフをつないだコンストラ

回はexon1−2近傍の欠矢がいかにして早期より心筋が選択的に強く障害されるような病型をもたらすのかとクトを作成し．同様にC2筋芽細胞系に導入し，CAT活性を測定した，いう点に注目し．以下の2つの可能性について検討し
た．

結

対象と方法

果

（1）正常心筋のmRNAを材料として5端のクローニン（1）ジストロ7ィン遺伝子の5 端のalternative trans−

グを行ったが，少しずつサイズの異なるいくつかのCriptonにより．心筋特異的なジストロフィンのCDNA断片が得られた．いずれもexon2に続いて骨格筋

如formが存在する可能性について
ジストロフィンのN端には3つのisoform（脳型，筋塾のexonlの塩基配列が確認された．
（2）TATAボックスやCArGボックスを含むコンスト型，プルキンエ細胞型）が知られており，それぞれ異なラクト100／＋68が最も転写活性が高いことが判明した

るpTOmOterにより転写の調節を受けている ）．ただすべ（図1）．次に．最も高い転写活性を示したこのコンストてのisoformにおいてexon2は共通していることが知ら

ラクトにintronlに認められたMEF2結合モチーフをつ■信州大学医学部第三内科＝国立精神t神経センター神経研究所疾病研究第一部

なぐと，さらに数倍の活性の上昇が確認された（図2）．
培養系の血清濃度を変えて同じコンストラクトを用いて−46−

CAT活性を測定してみたところ，MEF2結合モチーフ
をつないだコソストラクトでは血清の濃度が減少するにつれて活性が著増した（図3）．
考ReladYeCATACuYltleslnCZ

288

察

今回の検討により，ジストロフィンの心筋特異的な

134

isoformは少なくともmajorcomponentとしては存在せ

・1（鳩

十68

461

ず，心筋で発現するジストロフィンは骨格筋型と同一であると考えられる．

＋68

・1（旧

100

Intronlに転写制御部位が存在する可能性に関しては，今回はその5 端側に位置するMEF2結合モチーフに注目して検討した．MEF2結合モチーフは，AとTに

100

−

図1

富む配列で，転写を活性化する因子（MEF2）が結合する部位である5㌧MEF2はMyoDファミリーにより誘導され，分化した筋管細胞以降に発現する組織特異的な転写因子とされている5）．すでに骨格筋や心筋においていジストロフィン・プロモーターのdeletion mu−
tantsのCAT活性
deletionmutantsのCAT活性を，プロモーターを欠くCAT遺伝子の示すCAT活性に対する相対値として示した．

くつかのMEF2が同定されており，最近ではマウス

RelluVeCAT
AdYltlesMEF2に対応するヒトの遺伝子群もクローニングされたlOO

6）一方，血清中のFGFやTGF−βなどの成長因子は筋CAT芽細胞の増殖を促進し，筋管細胞への最終分化を抑制することが知られている．

−100

461
CAT

今回の実験からは少なくとも骨格筋においては，このMEF2結合モチーフが転写の活性化に関与していることが推測された．また培養系の血清濃度を下げ，筋芽細胞から筋管細胞への分化をすすめてやるとCAT活性が上

◆68

−100

◆68

◆276

◆326

1530
uT
†
HEf2blndhgmot∬

図2

昇したことは，MEF2が分化した筋管細胞以後に発現しMEF2結合モチーフの効果
ジストロフィン・プロモーターに対して．MEF2

結合モチーフを付加した際のCAT活性を相対値として示した．

てくるという事実とよく相応する所見と考えられ，この系でのMEF2の積極的な関与を示唆するものである．
以上よりintronlのMEF2結合モチーフは，単一のCis

Stmn
ConCen的uon

elementとして見た場合には骨格筋でのジストロフィン

20％
10，l

の転写を高める方向に作用していることが推測される．

CAT

O％

当然ながらこの結果を非常に選択的な心筋障害を特徴とするdystrophinopathyと直結させるにはいくつかの問題

2α■
−100

◆紬

◆276

◆326

10％

点がある．まず今回の実験系では骨格筋を使用しており，このMEF2結合モチーフが心筋でのジストロフィン

M王fZbln山n書mO也†の転写においてどのように機能しているかは今後の検討課題である．またね日直わ℃の実験系での結果がどの程度，個体での臨床症状として反映されるかという点がある．

図3

培養液中の血清濃度の効果
MEF2結合モチーフ付加ジストロフィン・プロ
モーターについて，C2細胞を異なった血清濃度で維持した場合のCAT活性の比較を示した．

ジストロフィンのintronlは巨大（200〜300kb）であ

まるため，その中のごく一部のcis elementだけでは全体の機能的意義を類推することは困難である．しかしながとめ心筋が早期より選択的に強く障害されるBMD型愚老
家系において，intronlを中心とする特異な欠矢を見出し，その意義について検討した．その結果，心筋特異的なisoformの存在は否定的であり，intronlの転写調節機構の障害に基づく可能性が高いと考えられた．今後は培養心筋細胞を用いた遺伝子導入実験により，MEF2結合モチーフの意義をさらに検討する予定である．

ら experirnent ofnature としてこのような特異な臨床例を詳細に検討することにより，種々の臓器でのジス
トロフィソの転写調節に関する新しい知見が得られるものと期待している．

−47−

文

献

with X−1inked dilated cardiomyopathy．N EnglJ

1）Yoshida K，Ikeda S，Nakamura A，et al：Molec−

Med329：921−925，1993．

ular analysis of theDuchenne muscular dystrophy4）Ahn AH and Kunkel LM：The structural andgenein patients with Becker muscular dystrophyfunctionaldiversity of dystrophin．Nature Genetpresenting

3：283−291，1993．

with dilated cardiomyopathy．Muscle

5）CserjesiPand OIson EN：Myogenininduces the＆Nerve16：1161−1166，1993．
2）TowbinJA，HejtmancikJF，Brink P，et al：

myocyte−SpeCific enhancer binding factor MEF−2

XTlinkeddilatedcardiomyopathy；mOleculargenetic

independently of other muscle−SpeCific geneevidence oflinkage to the Duchenne muscular

products．MoICellBio111：4854−4862，1991．

dystrophy（dystrophin）gene at the Xp21locus．

6）Yu YT，Breitbart RE，Smoot LB，et al：Human

Circulation87：1854−1865，1993．

myocyte−SpeCific enhancer factor

3）MuntoniF，Cau M，Ganau A，et al：Deletion of2comprises agroup of tissue−reStricted MADSboxtranscription
factors．Genes Dev6：1783−1798，1992．

the dystrophinmuscle−prOmOter region associated−48−11）ジストロフィン分子の高システイン及びC末端領域が保持された重症DMD症例
荒

畑

喜

一＊

研究協力者 古 賀 律 子■ 平 澤 恵 理＝■後 藤 加奈子・埜 中 征 哉… 塚 原 俊 文■ 武 田 伸 一・

はじめにした（Autoread sequence kit，A．LF．Autosequencer，Pharmacia社）．

一昨年の本研究班において我々は，ジストロフィン遺伝子の高システイソ及びC末端ドメインは保持しているが，N末端側にエクソン2から始まる巨大な欠矢を持結果ち，早期から重篤な臨床症状，経過を示したDMD症例を報告した．本症例ではゲノムDNAのマルチプレック

ⅠⅤ）を用いたイムノブロットで，正常対照筋では分子量スPCR解析の結果エクソン2−44の欠矢が認められて420kDaのジストロフィンが検出されたのに対し，本症

おり，フレームシフトを伴う欠矢であるにもかかわら例筋では分子量約110kDaの短いジストロフィンが検出された（図1）．

イムノプロット：抗ジストロフィンC末端抗体（抗体ず．抗ジストロフィン抗体による免疫組織化学染色ではジストロフィン分子のC末端部分を認識する抗体においRNA解析：totalRNAのRT−PCR増幅の結果，4種の産物が得られた（図2）．このうちProductl及び4はゲノて染色性が認められている．今回は本症例で発現しているジストロフィンについて，イムノブロットによるタンムDNAの欠矢と一致するェクソン2−44の欠矢をもつ

パク質レベルでの検討，及びRT−PCR，クローニング後

mRNAより増幅されてきたものであることが，そのサ
イズより予想された．またProduct2はアガロースゲルの塩基配列決定によるRNAレベルでの検討を行ったので報告する．
方より抽出後再度PCRによる確認実験を行った結果，非特異的増幅産物であることが確認された．Product3及法

び4をクローニングの後シークエンスを行った結果（図イムノプロットl）：生検筋の20FEm凍結切片10枚をSDS

3），Product4はゲノムDNAと同じ欠失（ェクソン2

電気泳動試料溶液とともにホモジナイズし，同様に調製−44）をもつmRNA由来であり，Product3はェクソンした正常対照筋とミオシン重鎖量を一定にした条件で電気泳動した．泳動後，ニトロセルロース膜に転写し，抗2−50の欠矢をもつmRNA由来であることが確認された．

体ⅠⅤ（ジストロフィンC末端部分に対するポリクローナル抗体）と反応させABC法で検出した（ABCキット，
Vector社）．

ジストロフィン遺伝子のエクソン2−44の巨大な遺伝

RNA解析：生検筋の20JLm凍結切片20枚よりAGPC法

子欠矢が存在し，臨床的に極めて重篤な経過をとっていによりtotalRNAを抽出した2）．上流と下流のプライるDMD症例において，イムノブロットにより分子量約110kDaのジストロフィンの存在が確認された．またマーをそれぞれェクソソ1とェクソン51，エクソン1とエクソン46に設定したプライマーセットを用してRT−

考察

PCRを行った．PCRは1回目の増幅の後，最初のプライ

RNA解析により，本症例にはゲノムDNAの欠矢と一致したエクソン2−44のフレームシフトを伴う欠矢をもつ

マーセットより内側のプライマーセットを用いて2回目

mRNAの他に，エクソン2−50のフレームシフトを伴のPCR増幅を行った3）．増幅産物をクローニング（TAわない欠矢をもつmRNAが検出され，分子量約110kDa

クローニングキット，Invitrogen社）の後，プラスミドのジストロフィンを発現するmRNAの存在が確認された．

DNAの精製（Qiagenカラム）を行い，塩基配列を決定■国立精神・神経センター神経研究所
叫順天堂大学医学部脳神経内科＊■＊国立精神・神経センター武蔵病院

本症例において発現しているジストロフィンは，免疫組織化学染色により筋細胞膜にそって存在していることが確認されている一）．また高システイソ及びC末端領域

−49−

Exon

Exorl I

Produc13

ccTACTCAGAC

G＿工AG＿皇ぷGA∫t旦J

ElOrl lProdllC14

図3
：ニ

ー，

−94

Exol145

AACTCCAGGATG

RT−PCR増幅産物の塩基配列
Product3はExonlとExon51，Product4はExonlとExon45の連結部分の塩基配列を示した。
Exonlの3 端（5㌧GACTGTT−3，）はProduct3ではExon51の5 端（5 −CTCCT−
A−3 ）と，Product4ではExon45の5，端（5㌧GACTGTT−3 ）と連結している．そのためProduct4ではStopcodonが生じている．

図1生検筋のイムノブロット
抗ジストロフィンペプチドIV抗体によるイム
ノブロット

GTAGAGGACTGT

5】C；コントロール筋，P；症例

筋，ジストロフィン（420kDa）及び分子量マーカーとしてミオシン垂鎖（220kDa），フォスているユートロフィソが筋細胞膜と結合して存在できな

フォリラーゼb（94kDa）の位置を示した．

いことに起因する可能性が示唆された（結果は示していないが，DAG及びユートロフィンの免疫組織化学染色
ではDAGはほぼ正常に近い染色像，ユートロフィンは
他のDMD例ほどには染色されず，ほとんどup regulatL
ionされていないことが示唆された）．

PrOdu￠tl
PrOduct2

謝辞：本研究にあたり，抗DAG抗体を供与して下さい●−PrOdu￠t4

ました国立精神・神経センター神経研究所 小沢鏡二郎
所長，並びに抗ユートロフィン抗体を供与して下さいまPrOduCt3

した東京大学分子細胞生物学研究所
深謝致します．

図2

文

RTrPCR増幅産物
1回目PCRはExonl（5㌧CTTTCCCCC−TACAGGACTCAG−3

石清孝一助教授に

献

1）Koga R，Ishiura S，Arahata K，Takakuwa T，）とExon51（5，−NonakaIand Sugita H：Quantitative analysis of

GTCACCCACCATCACCCTCTG−3■）のプ

dystrophinirl human and rodent muscles．Biome−

ライマーセットを用いて増幅し，2回目PCR

deicalResearch13（3）：215−219，1992．

はExonl（5㌧CTGGGAGGCAATTACCT−TCGG−32）ChomczynskiPandSacchiN：Singlestepmethod）とExon51（5㌧GGTAAGTTCr

TGTCCAAGCCCGG−3

Of RNAisolation by acid guanidium thiocyanate−）（a），Exonl（5−CTGGGAGGCAATTACCTTCGG−3

phenolrchoroloform extraction．Anal Biochem）と162：156−159，1987．

Exon46（5㌧GCAATGTTATCTGCTTCCT一

cc−3 ）（b）のプライマーセッtを用いて増幅した．

3）RobertsRG，Barby TFM，Manners E，Bobrow M
and Bentley DR：Direct detection of dystrophin
gene rearrangement by analysis of dystrophinを保持していることより，筋細胞膜のジストロフィン結

mRNAin peripheral bloodlymphocytes．AmJ

合性糖タンパク質（DAG）と結合しているものと思われ

HumGenet49：298−310，1991．

る・それにもかかわらず重篤な臨床症例を示しているの

4）荒畑喜一，有川恵理，松井 潔，林由起子，石浦章
一，埜中征哉：ジストロフィン分子におけるN末端ドメインの臨床的意義． 厚生省「精神・神経疾患
研究委託費」筋ジストロフィー及び関連疾患の成因と治療法開発に関する研究 （荒木班）平成3年度
研究報告書，1992，pp87−89．

は，エクソン2に始まるN末端のアクチン結合ドメインを含む領域を欠損しているため，ジストロフィンが正常に機能していないことに起因する可能性，またこの短い
ジストロフィンが筋細胞膜と結合して存在しているた
め，DMDでジストロフィンの補填をしているといわれ−50−12）Duchenne型筋ジストロフィーにおけるジストロフィン陽性筋線経の解析
水 野 美 邦＊
研究協力者

平

澤

恵

理＝＊

古

後 藤 加奈子拍

はじめに

賀

律

子＝

荒 畑 喜 一＊攣おけるジストロフィンの解析を試みた．

ジストロフィンの欠損しているmdxマウスやDMD患者筋では免疫組織化学染色にて，少数（＜1％）ながら対象及び方法対象は，2ヶ月から26歳までの42名のDMDで，疾患明瞭に抗ジストロフィン抗体によって染色される筋線維
いわゆるrevertantfiber（RF）が観察される1）〜3）．しかし，対照としてその他の神経筋疾患5名，DMD保因者1名を検索した．ジストロフィンの検索は，1）RFを筋切片より実体顕微鏡下で取りだしたPCR解析，2）欠矢を含む領域のRT−PCR，neSted PCR解析4），3）N端からC端

その存在様式は各症例ごとに異なり発現幾序についても一様ではないことが推定される．そこで我々はジストロ
フィン遺伝子に欠矢の判明している症例を中心にRFに

Dy8

4・4CS

3−4C4

EXON

50

Dy4

3−4C4

4−4C5

Dy8

60

D肝

∵．し∴

図1

6種類の抗ジストロフィン抗体の認識部位と免疫組織化学染色の例
症例1（Ptl）はエクソン45，症例2（Pt2）はエクソン50が欠失している．Pt2のRFはエクソン50に一致する部位を認識する抗体3−4C4で染色されない．

＊順天堂大学医学部脳神経内科
輌国立精神・神経センター神経研究所

ー51−

M12

3

4

5

6

C

一eXOn45−eXOn17

図3 剖検例でのPCR解析一筋種差の検討
Ianel．2；腹直筋，3，4；肋間軌
二頭筋，C；controllane

5，6；上腕lanel，3，5のRF，2，4，6のジストロフィン陰性筋線維何れもェクソン45が欠失している．
M一一▲▲一一一二二二・二一一一王立主動晦匹嘉

図2

Ptl

Pt2

C

一・一一くイ ■RFのPCR解析−エクソン50と52に対するprimerを用いたPCR解析3％NuSieveagarosegel使用
疾患対照として同時に検索したDMD保因者（欠失：エクソン45−52）のジストロフィン陽性筋線維（lanel）ではェクソソ50．52の増幅を認めジストロフィン
陰性筋線維（lane2）ではエクソン50，52とも認めなかった．DMD例（欠失；エクソン50）ではRF（lane3），ジストロフィン陰性筋線維（lane4）ともにエクソン50は認めず，エクソン52の増幅のみを認めた．

までの異なるドメインに対して調整された6種類の抗ジ

図4ジストロフィンmRNAのRT−PCRの例
4％polyacrylamidegel使用
Iane1−4はRT−PCRによりcDNAを後nested PCRを行っている．
Ptl：ェクソン45欠失，Pt2；エクソン50欠失，C；controllane．Pt1，2では各々の欠矢に対応した短いCDNAが増幅されている．

PCR解析ではジストロフィンDNAの欠矢に一致した短いcDNAが増幅された（図4）．

ストロフィン抗体（図1）を用いた免疫組織化学染色等を実施した．
結C3）RFでのジストロフィン免疫組織化学染色パターン
はこれまでの報告同様，欠矢と一致した部位の抗体では陰性であったがその他の部位を認識する抗体では染色さ果1）PCR解析の結果，ジストロフィン陰性の筋線経，ジストロフィン陽性のRFとも同じ欠矢がジストロフィン

れ，RFのDNA解析の結果と一致するものであった．まDNA上に確認された．・一一万，疾患対照として検討した＆patchypatternを呈した．連続切片にて検索したジス

DMD保因者ではジストロフィン陰性の筋線経では欠矢を認めジストロフィン陽性の線経では欠矢を認めなかっトロフィン関連タンパク質はRFの約80％で陰性であった．

た（図2）．ェクソン45に欠矢を認めた1剖検例で3種4）RFの出現頻度は42例中35例で1％以下と少数で（上腕二頭筋，腹直筋，肋間筋）の筋で検討したが，何れの筋においても同じ欠矢が存在した（図3）．

あったが比較的年齢の高い患者群で多数認める例があった（図5）．

た，一部の抗体では，染色性がBMDで観察されるfaint2）凍結切片から抽出したRNAのRT−PCR，neSted−52−

RF出現頻度

併存する可能性が強いと考えられた．また，一部の抗体（％） 25での染色性がfaint＆patchypatternを呈したが，これはRFに存在するジストロフィンが不完全かつ不安定で20あるBMDでの染色性と共通しDNA変異をskipした短
15いジストロフィンの存在を裏付ける所見と考えられた．
10

文

5

献

1）Hoffman EP，Brown RHJr，et al：Somatic

0

0

5

10

15

20

25

30

revertion／suppression of the mouse mdx phen0−Age（yrS）

typeinvivo．JournaloftheNeurosciences

図5 RFの出現頻度と愚老年齢の相関

99：9−25，1990．
2）Burrow K，Coovert DD，et al：Dystrophin expresT

考

sion and somatic reversionin prednisoneTtreated察

anduntreatedDuchennedystrophy．Neurology41：

今回検索したRFには免疫組織化学的にジスロトフィンが存在するがPCR解析ではジストロフィン陰性の筋

662−666，1991．

線経と同じエクソンの欠矢を認めゲノムDNAの修復は

3）KleinJK，Coovert DD，et al：Somatic revertion／

ないこと，体細胞モザイシズムではないことが解った．

suppressionin Duchenne muscular dystrophy

DMD保因者1例で行ったPCR解析ではジストロフィン（DMD）：Evidence supporting a frame−reStOring

陽性の線経では欠矢を認めず，メチル化を受けて不活化

mechanismin raredystrophinTpOSitivefibers．Am

したⅩ染色体からはPCR増幅が行われない可能性が示J Hum Genet50：950−959，1992．

唆された．今回行ったRT−PCR，neStedPCR産物のシークエンスでは欠矢に一致したout−Of−frameのCDNAが4）Roberts RG，Barby TFM，et al：Direct detection

確認されたが，RFは欠失部位の下流にあたる領域を認

dystrophinmRNAin peri−pheral bloodlymphocy−

識する抗体でも染色されin−frameのスプライシングがtes．AmJ Hum Genet49：298−310，1991．

of dystrophingene rearrange−mentS byanalysis of−53−13）ジストロフィンにおける体細胞モゲイシズム
斎 藤 加代子■

■

代泉子

隆

■

久

田間倉

●

■

啓

■

木

真幸

●

鈴 木 陽 子■

原佐宍

●

里聡子夫

恵

藤峯澤山

山 内 ＿あけみ●
小 峯 真 紀■近小大福

研究協力者 池 谷 紀代子・Duchenne塑およびBecker型筋ジストロフィー（DMD／BMD）患者の遺伝子変異，ジストロフィン異常，
臨床症状との関連を解明することにより，genOtypeとphenotypeの関係やそれらのheterogeneityを明らかにしていくことを我々の研究目標の1つとしている．

Southernblot法による遺伝子診断を行い，エクソン1−

DMD／BMDの変異を人類遺伝学，発生生物学的見地から考察することも重要なことであると考えている．

よってプロモーター領域の変異を調べたところ，筋塑プ

遺伝子モザイクとは，個体が遺伝子構成の異なる2種以上の細胞群からなる場合をいう．発生途上の細胞群の1つPこ遺伝子の突然変異が起こることによって生じる．
体細胞に生じる場合を体細胞モザイシズムという．
生前にリンパ球由来のDNA検査でDMDと診断していた1症例において，剖検時に得られた各臓器でDMD
遺伝子およびジストロフィンレベルで体細胞モザイシズ

結果1）DNA検査：18歳時，血液よりリンパ球を分離して，7の欠矢を認めた．母親，姉ともに，遺伝子欠矢を示さず，患者はnewmutationであろうと推定した．PCRにロモーターとさらに上流の脳型プロモーターの欠矢を示していた1）．
2）剖検臓器のジストロフィンとDNA検査：呼吸不全にて本症例が死亡し．剖検時に採取した筋組織に抗ジス
トロフィン抗体を用いた免疫蛍光抗体法を施行した（図1，2）・青筋では抗スペクトリン抗体では細胞膜にス
ペクトリンが認められるが，ジストロフィンは細胞膜に陰性であった・肋間筋，腹膜筋でもジストロフィンは陰ムを証明したので，発生学的考察とrevertantとの関連の考察を行った，性であった・しかし，胸鎖乳突筋ではジストロフィン陽

症例と方法在していた・横隔膜は全ての細胞はジストロフィン陽性性細胞と陰性細胞がグループとして認められた．心筋ではジストロフィン陰性細胞の中に陽性細胞群が島状に存

症例：4歳時に転びやすいことを主訴に，他院を受診し，骨格筋生検にてDMDと診断された．6歳まで早歩き可臥10歳より歩行不能，革イスとなった．7歳11カ月に行ったIQテストは鈴木ビネ一式で98，知能障害を認めない・21歳6カ月の肺炎罷息時より夜間に体外式人工呼吸装置を使用した．在宅にて療養するも次第に装着時間は増加し！22歳10カ月，呼吸不全にて死亡した．
方法：生前のDNA検査は血液よりリンパ球を分離して，DNAを調製LI DMDのcDNAプローブを用いた
Southerrlblot法により遺伝子変異を同定した．また
polymerasechainreaction（PCR）増幅法によって，プ
ロモーターの変異も調べた．
剖検時に採取した筋組織に抗ジストロフィン抗体を用いた免疫蛍光抗体法を施行した．
各臓器よりDNAを調製し，multiplexPCRを行った．

であった・各臓器よりDNAを調製し，multiplexPCRを行った・胸鎖乳突筋，側頭筋，横隔膜，腎臓由来のDNAではDMD遺伝子の欠矢を兄いだせなかった（図3）・脳型プロモーター∴筋型プロモーターに関しても，PCRでは胸鎖乳突筋，側頭筋，横隔膜，腎臓由来の
DNAにおいてDMD遺伝子の欠矢を兄いだせなかった（図4）・抗ジストPフィン抗体を用いたイムノブロッ
ト法では側頭臥胸鎖乳突筋，腸腹筋で約400kD．横隔膜，腹直筋で380kDのバンドが認められた（図5）．
考察

この症例は体細胞モザイシズムであると考えられる．
本症例の成 り立ちについて以下のように考えた（図6）．
患者の両親の生殖細胞においては変異がなかったが，受精後のある昧臥

しかも器官形成以前の時期にDMD遺伝子の突然変異が生じ，その後の細胞分裂によって1ジストロフィンの陽性細胞群と陰性細胞群がモザイク状に●東京女子医科大学小児科

ー54−

0

1000

2000

3000

Eヨdeletion

POO PO4』廟ildystrophin

dysIrophin

SPeCtrjn

図1剖検時に採取した筋組織の免疫蛍光抗体法によるジストロフィンとスペクーリン

0

1000

2000

3000

図2

−55−

剖検筋のジスt Pフィン

む∪領空∪二一の∈S
訂upヱ
∈⊃ニOq巴ひじ
むqO二男d一000
30 空Od∈む︼
UqO 巾lUOL−∈謬主d村石

肝343
35
60
42
︐
7605
一二二 一

n
O

肝33
450月647餌52
一二二二一一U〇一〇〇
む∪扁塵∪ 一再∈S
ゝ2Pヱ
∈ココのq望むU
むqO一一眉d一〇〇〇

OqO 男uOとむqO 空OdE￠︸∈謬主音p．ESニ空0EgS⊃lUOL．ES巾OSd．ESニ巾∪盲OPqqS⊃lU巴61一心P．∈一望SOUJgU叫．∈P．

．∈Sニ空Od∈り︸．EP．6︼Sd∈OP埜UO∈望S

むqO qlUOJ−

む一OS⊃EU眉PL巾U

LO甘∈S壱0−誠d

Lむ＞ニS望ゝUOエdEゝ一

S

ー56一

．ESニ空OEgS⊃lU巴むqO 望UOL−∈当20−
0一OS⊃∈0月PJdOJむ＞ES望ゝUOエd∈とS

BP：brain promoter

CONTROL

・ESdOSd．∈一再lSOULgU一．∈Sニ巾∪一∈OPqdのつ102．∈P．61一心P．EPちlS帽∈OP旬一〇〇∈望S

JOす∈S壱0膏d∈Sニ空OdEg

・∈雪ぎOlU一OS⊃∈U虐PJqOS望ゝUOエdEとLむ＞ニS望ゝ8五∈ゝ一

S

L0＞ニ

S

T
N
厄
T
A
P

PCRによる脳型，筋塾プロモーターの欠失．内部標準としてエクソン12を同時に増幅した，

図4

各臓器由来のDNAにおけるmultiplex PCRによる遺伝子部分欠失
図3

山一US⊃EU眉PL帽U

T
N
E
¶
・A
P

CONTROL

MP：muscle promoter

〇一も丁⑧ーdystrophin

卑＿一一．、・嶋

mutation

儀へ

二二二三恋岳姦壷盛感藍

儲／

ぜ

盛・
す

肇
一叫■

OrganS／tissue

一一・し−叫−i■〈（、爪…〈 轡掛翠r

DMDgene義驚澤輿詔関野撃革帯∴碍二∴ト：▲▲鱒O ceIIwithnormarDMDgene●celLwithdeEetedDMDgene

control

図5

J

caseK（DMD）−」￣￣￣云ontrol

図6 本症例における休細胞モザイシズムの成立椀序

剖検筋における抗ジストロフィン抗体を用いた
イムノブロット法

配列した．各魁織において陰性細胞と陽性細胞の分布のにおけるジストロフィンの脳型及び筋型プロモー割合の差によって，ジストロフィーの変化が多様になっているのであろう．
DMD／BMDの骨格筋において．revertant fiberを示す
症例が認められる2）．その磯序の1つとして体細胞モザ

ターの検討． 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジストロフィー及び関連疾患の成因と治療法開発に関する研究 （荒木班）平成4年度研究報告
書，1993，pp153−156．

イシズムが考えられているが．revertant fiberの発生メ2）Klein CJ，Coovert DD，Bulman DE，Ray PN，

カニズムを考える上で，本症例のような体細胞モザイシ

MendellJR

ズムの証明できる例は興味深いと考えた．

andBurghes

AHM：Somatic

rever→

sion／suppressioninDuchenne muscular dystrophy
DMD）：Evidence supporting a frame−reStOring文献mechanismin rare dystrophin−pOSitive fibers．Am1）斎藤加代子，佐久間泉，山内あけみ，原田隆代，池谷紀代子，森田玲子，福山幸夫：筋ジストロフィー−57−

J Hum Genet50：950−959，1992．

14）福山型先天性筋ジストロフィー遺伝子は9q31−33に存在する
戸

研究協力者

要

金

澤

一

田

郎＝

達

史いい…

中

村

旨

祐

輔■

高

木

昭

夫…

する．運動障害はDuchenne型より重症で，通常，起立福山型先天性筋ジストロフィー（FCMD）の病因を解

歩行能力を獲得せず生涯歩行不能であり，また同時に高明する第一歩として，主にホモ接合性マッピングの方法

度の知能・言語発達遅延を伴い，全面的な介護を必要とする．決定的な治療法はない．本症患者の運命はを用いて連鎖解析を行い，FCMD遺伝子座を明らかにすることを試みた．近親婿13家系を含む21家系58名を対象

Duchenne型筋ジストロフィー患者のそれより更に悲惨である．

にし，マイクロサテライトDNA多形マーカーを用いて各人のアレルを決定し，LINKAGEプログラムにて解析

このように日本に多く，悲惨な病気であるにもかかわした．その結果，第9番染色体長腕31−33に存在する

らず，Duchenne型に比べ本態はほとんどわかっておらマーカーD9S58，D9S59，HXBにて有意な連鎖を認めた．

ず，一日も早い病態の解明が望まれている．またさらさらに多点連鎖解析により，FCMD遺伝子座は，D9S58とD9S59の間の約8cMの領域に置かれた．これらのに，なぜ脳と筋肉が同時に障害されるのかも不明である

マーカーはFCMD家系において，出生前診断，発症前診断，保因者診断に有用なだけでなく，FCMD原因遺伝子子を追求することは∴筋ジストロフィーの病態を考える

が，両者とも発生異常を示しており，FCMDの原因遺伝

単離へむけての重要なアンカーポイントとなると考えられる．

だけでなく，脳や筋肉の正常の発生を考える上でも重要なことである．
我々はFCMDの原因遺伝子を追求する第一歩として，おもに近親婚を利用した解析法（ホモ接合性マッピ

はじめにDuchennC型筋ジストロフィーの遺伝子産物であるジング）を用いてFCMDの連鎖解析を行った．そしてFCMD遺伝子を第9番染色体長腕31−33にマップした2）のでここに報告する．

ストロフィンが，ポジショナルクローニングにより発見されて以来∴筋ジストロフィーの病態解明とその治療的対象と方法アプローチに向けて，精力的な研究が行われている．
福山型先天性筋ジストロフィーl）（Fukuyama type

ホモ接合性マッピングの原理を示す3）．図1のように，

CongenitalMuscularDystrophy，FCMD）は，先天性筋ジ

常染色体劣性遺伝病の場合，いとこ婚家系で，仮にあるストロフィーに，知能障害や痙攣発作などの中枢神経症

共通祖先の片方の染色体にFCMD変異（ここではFと状を伴う常染色体性劣性遺伝をとる特異な疾患であり，1960年福山らにより一臨床単位として提唱されたものでFが両側に伝わり‥患者ではじめてF，Fのホモになりある．本症は骨格筋の広範囲な筋ジストロフィー病変の病気が出現する場合が多く考えられる．その疾患遺伝子

みならず，小多脳回を基本とする高度の脳奇形（神経細にごく近いマーカーのアレルが仮に1である場合，近く胞遊走障害）が必発である．

て組み換えがおきにくいので，この1はFとともに動い

日本人の筋ジストロフィーとしては，すでに遺伝子がし，正常をプラスとする）をもつとすると，その一個の発見されているDuchenne型筋ジストロフィーに次いでて患者において同視ホモになる．逆に言えば近親婚により生まれた患者において，常にホモとなるようなマー

多く，その発生率は10万人当り2〜4人，一般集団におカーを探せば，それは原因遺伝子に近いことが示唆され

いて約100人に1人が保因者である．

るわけである．しかし正常日本人の多くがホモとなるよ

患児は生後1年以内に筋緊張低下，筋力低下にて発病

うな，すなわちheterozygosityが低いマーカーでは，
FCMDと連鎖していなくてもホモになるので，マイクロ■癌研究会癌研究所生化学部＊＊東京大学医学部脳研神経内科■■■虎の門病院神経内科……現）東京大学医学部人類遺伝学

サテライト多型DNAマーカーのような多塑性の高いものが必要である．

ー58−

故に我々は，日本中からなるべく近親婚で生まれた患者と，また非近親婚でも退伝学的に情報の多い兄弟例をおもに集め，マイクロサテライトDNA多形マーカーを用いて各人のアレルを決定し，LINKAGEプログラムにて連鎖解析を行った．図2に解析した家系を示すが，21
家系58名（点者29名）中，13家系が近親婚であり，15人の近親婚患者を含む．
結

：に

果

さて近年dystrophinは筋翰膜の糖蛋白（dystrophin−

図1Principle of homozygosity mapping・Hypothe−

associated proteinS，DAPs）と大きな01igomericcomplex

ticalinbred pedigree demonstrating cosegre−を形成し，Duchenne型ではdystrophinとともにこれらのgationof a desease（with2alleles d and＋）

DAPsも崩壊し，筋細胞死につながるといわれている4）．

with aninformative DNA marker（with

さらに最近Matsumuraらはこの糖蛋白のうちとくに43

alleles）．The patient hasinherited two copies

DAGの染色性が大きく低下していることを報告しておof anidentical chromosomal fragment fromり5），またHayashiらは，その外側の extracelIular
matrixであるLamininのmuscle formであるmerosinの

her great grandEather．

れらはFCMDのprimarydefectの一つの候補といわれている．

貿

そこで9番染色体長腕遠位端に存在するマイクロサテ
ライトマーカー，D9S59（ref，10）を用いて解析したとき
近親婚患者において皆ホモであった（図2）．一方，非近

■1
23
2ュ

図2

■l J■

賃 某
喜一∴・妄

▼J Jl
3▲ 2t Zュ

Pedigrees of●コ

わらず，一緒に両側へ伝わり患者でホモ，ホモとなって両者が合併した可能性を考えた．

・∵

詣

● コ

たことである．この病気は9q32−34．1にマップされてい≡FCMD患者が色素性乾皮症A群（XPA）を合併してい︑では不明であった．もう一つは近親婚により生まれた一

伝子はごく最近6q22−23にマップされたが8㌧ この時点

一

′

コ

■l

行ったが，有意な連鎖は認めなかった．またmerosin遺る9）．ここで我々は先程の図1でFに近いマーカーを
XPAとおきかえてFCMDとXPAがごく近くて組み換J存在するマイクロサテライトマーカーを用いて解析を

・

■1

÷≡⁚i義

遺伝子7）が，3p21にマップされているので，まず3p21に

汀

薫

色性の低下している糖蛋白である43DAGをコードする

∵

凹1Il

故に，連鎖解析を行う手がかりとして，FCMD筋で染

⁚
一
．
爪
⁝
⁚
・
︑
⁚
‖
⁚
⁝
絹
⁝
⁝
⁝

量

染色性が大きく低下していることを報告している6）．こ6

21FCMD families showing

親婚患者ではホモの割合は一般集団と同じであった．こdisease status ahd segregation of the two

れは先ほどホモ接合性マッピングの原理のところで述べclosest markers，D9S58（top）and D9S59

たように，このマーカーがFCMD遺伝子と近いことを（bottom）．AllelesforD9S58are：A．147bp；

意味している．

B，145bp；C．143bp；D．137bp；E，135bp：
F，133bp：G，131bp；H，129bp；t，127

さらにLINKAGEプログラムを用いて2点連鎖解析を

bp；J，125bp；K，123bp；L．121bp：M・行った．疾患遺伝子頻度は以前の報告に沿って0．0052と119bp；N，117bp；0，115bp・Alleles for

し11近親婚はループを中断して，doubleindividualを想D9S59are：1，116bp；2，114bp；3，112bp；4，

定した．このマーカーD9S59で組み換え率2％で最大

96

ロッド得点4．33を得た．さらにこの周辺のマーカー

subjects，and a slashindicates that the

D9S58（ref．10）でも6％で5．81，HXB（ref．11）でも9％subjectis deceased．

bp．Solid symboIs represent afEected＊and L＃

indicatesecond−COuSin marriage and first and half−で3．28と有意な連鎖を認めた（表1）．
これらのマーカーは蛍光in situ hybridization法によcousinmarriage．respectively；Other

gulneOuSmarrlageSarefirst−COuSins・−59−

consan一

表1Pairwiselod scoresofchromosome9markerswithFCMD
Ret30mblnation fractlon（0）ぬrker O・00

0・010・05

D9558

3・29

4．53

5．77

♪9859

−0

4．25

m

−￠

1●21

D9560

一〇

一3・78

0・10

0・15

0・20

0・30

0・40

5．53

4．73

3．84

1．98

0．65

5．81

0．06

4．03

3．35

2．31

1．74

0．86

0．28

4．33

0．02

3．00

3．27

2．96

2．44

1．33

0．46

3．28

0．09

0．06

0．63

0．17

−0・83

0・24

0●57

0●59

0．30

主

8

4321 321
2222 111
Pり，9q31−33にマップされている．D9S58とS59の間が7．7cM，S59とHXBが2．4cM離れている（図3）．

1・2
1 1

﹂
ハ
〃
喝

さらにすでに公表されたデータから遺伝的距離を固定して，病気のPhenotypeと各マーカーとの間で多点連鎖解析を行った（図4）．コンピューターソフトウェアー
上の制限から．考えられるすべてのハプロタイプを数えq123123
1 7J33111222123 4 441222222333 3 33

D9SZ9ることは不可能だったので，連鎖の情報を損なわないよ
うに注意しておのおののマーカーでのアレルの数を減らD9S58

し，さらに2つのマーカーと病気，また別の2つのマー

D9S59

カーと病気との間で解析を行い，その2つを重ね合わせ

日XBる形をとった．実線はD9S58，S59とFCMD，破線はS59，HXBとFCMDでの結果を示す．実線の結果より，

GSN
D9S60

FCMD遺伝子は最大ロッド得点16．9でS58とS59の間に存在し，破線の結果もこれを支持している．すなわち，

9

図3

FCMD遺伝子はD9S58とS59の約8cMの領域に存在すると思われる．

Physicaland geneticlocations of markers on
Chromosome9q．

考察

我々はおもにホモ接合性マッピングを使って，FCMD遺伝子座位を9q31−33に決定した，この方法は多数の患者を含む大家系がほとんどみられない常染色体性
劣性遺伝病の連鎖解析に有用である．これらの連鎖しているマーカーは，FCMD家系において出生前診断，発症
前診断，保因者診断に使えるだけでなく，Walker−
Warburg syndrome，muSCle−eye−braindiseaseのような
・60

−40

・20

0

20

40

類似の病気がallelicであるかを検討するのに有用であ

60

十。主芸；

り，さらにFCMD原因遺伝子単雛へむけての重要なアd

ンカーポイントとなると考えられる．今後はさらに症例

図4 Diagrammatic representation ofthe results oEを増やし，有用なマーカーを増やして，この領域をせば

multipointlinkage analysis of three markers

め，FCMD遺伝子の単離，蛋白レベルでの解析へと進みたい．

and thediseasephenotype．Solidline．analysis
using map oflD9S58−7．7−CM−D9S59】．Dotted
line，analysis using map of【D9S59−2．4−CM−
HXB】．

−60−

文

6）Hayashi YK，et al：Abnormallocalization of献lamininsubunitsinmusculardystrophies．JNeuroIl）FukuyamaY，Osawa Mand SuzukiH：Congeni−

Sci119：53−64，1993．

tal muscular dystrophy of the Fukuyama type7）Ibraghimov−BeskrovnayaO，etal：Human dystr0−−Clinical，genetic and pathologlCalconsiderations・

glycan：skeletalmusclecDNA，genOmicstructure，Brain Dev3：1−30，1981．

originoftissuespecificisoformsand chromosome

2）Toda T，et al：Localizationof a gene for Fuku−

localization．Hum MoIGenet2：1651−1657，1993．

yama type congenital muscular dystrophy to8）Tryggvason K：Thelaminin family・Current

chromosome9q31−33．NatureGenet5：283−286，

OpinioninCellBiology5：8777882，1993・

1993．
3）Lander ES and Botstein D：Homozygosity map−

9）Tanaka K，et al：Analysis of a human DNA

plng：aWaytOmap human recessive traitswith

excisionrepalrgeneinvoIvedingroupA xeroder，

the DNA ofinbred children．Science236：1567−

ma plgmentOSum and containing a zinc−finger

1570，1987．

domain．Nature348：73−76，1990．
10）KwiatkowskiDJ，et al：Construction of a GT

4）ErvastiJM and CampbellKP：Membrane orga−
nizationofthedystrophin一glycoprotein

polymorphism map of human9q・Genomics12：

complex・

229−240，1992．

Cel166：1121−1131，1991．
5）Matsumura K，NonakaI and Campbell KP：11）OzeliusL，etal：Dinucleotiderepeatpolymorphism

Abnormal expression of dystrophin−aSSOCiatedforthe hexabrachiongene（HXB）on chromosome

proteinSinFukuyama−type COngenital muscular

9q32−34．HumMoIGenetl：141，1992・

dystrophy．LanCet341：521−522，1993・

一61−

Ⅱ．遺伝子（Part2）15）筋緊張性ジストロフィー−CTGリピートの増大に関する臨床遺伝学的研亮一
省

紆

小近新桃

池藤田井

■

代子義倫
●

■

▲事

■
◆ ■

中原形

辻

口

田福山

郁恵信崇

江

研究協力者

亮 子■ 小野寺
浩…

中

理事

島

孝…

初 美…■東 候

恵…＊

真里子†

供与されたpM10M−6をさらに制限酵素〃加Ⅱで消化しCTGの繰り返し構造を除いて使用した．使用酵素P∫日を使用することで100塩基対程度の軽度のリピート増大の検出は容易となる．また，よく使用されるのはEcoRIであるが この消化で見られるような挿入欠失はじめに本症の原因遺伝子は，DavidBrookらをはじめとする
複数のグループにより，1992年に明らかにされたl卜3）・これは19番染色体長腕の13−3領域に位置し，塩基配列の解析から，CyClicAMPdependentのproteinkinaseに相補多型部位を含まないため，より正確な評価が可能である．異常バンドはsmearとなって増大するためこの中間値をとり，これから正常バンドとして認められる1・1キロ塩基対を引いた値をCTGリピートの増加値とした・性が高い領域が存在し，リン酸化機能を有する蛋白をコードしているのではないかと推定されている．このmyotonin−prOteinkinase遺伝子の3 非翻訳領域にCTGの3塩基繰り返し構造が存在し，その数は健常者においても5から36と変動があり，患者では50以上，ときに結

3，000コピー以上にまで達し，これが本症の病因と密接に関連していると考えられている．昨年は，この遺伝子

果1．親子間のCTGリピート増大程度を検討した．22組のうち，子の方が減少していたのは1組の母子例である．他の21魁で子の世代でさらなる増大が認められた・
図1に父から子，母から子へのリピートの増加値を比較した．父子間でのリピートの差は2．20士1．43（M±SD）
キロ塩基対，母子は1．60±1．31キロ塩基対であった．有意差は認められなかったが，父から子に伝わる過程で増大程度は強い傾向にあった．
2．患者親子の発症年齢とリピート増大の関連について

不安定領域が増大するほど発症年齢が早くなる傾向があ
ること，40〜45歳での日常生活動作でみた筋力の重症度
や知的機能の重症度と良く相関することを報告した．
今回は従来からの臨床遺伝学的観察から知られている
anticipationとリピートの増大がどう関連しているか，
また先天性筋緊張性ジストロフィーの発症機序においてリピートの増大がどの程度関連するかについて検討した．
対象と方法
対象は生後4カ月から81歳までの女性32名，男性25名の患者57名である．母子症例は17組で，このなかに先天型10組を含む．父子症例は7組である．遺伝子解析は次のように行った‥患者白血球のゲノムDNAを常法により抽出し，制限酵素P∫fIで消化した後，アガロースゲ
ルに電気泳動しニトロセルロース膜にトランスプロット
した．これを32pでラベルしたプローブでサザンハイブ
リダイゼーショソを行った．プローブはDr．Brookより■新潟大学脳研究所神経内科＝国立療養所新潟病院神経内科…国立療養所犀潟病院神経内科■榊■新潟県立はまぐみ小児療育センター小児科†自治医科大学小児科

ー65−

8組で検討した．発症年齢はミオトニア，または筋力低下を最初に自覚した年齢とした．8組の親子で発症年齢
は子の世代では29．0±1．97（M士SD）歳早くなっていた．一方リピート増大は，子の方がむしろ減少していた
先の母子症例を除いた7組で，子の世代でさらに増大
し，この増大差の平均は1．74±0．28（M士SD）キロ塩基対だった．図2に，親子間でのリピート差と発症年齢の差を示す．x軸に各親子でのリピート増大の差を，y軸に発症年齢の差をとっているが，危険率10％以下で，親子のリピート差が大きくなるほど発症年齢の差も広がる傾向にあるということができた．
3．子の世代でのリピート増大とIQscoreの関連を検討した．全例の親が社会生活上支障のなかったのに対し，
子はほとんどが特殊教育を必要とする程度のつよい知能

uO苛ua×むU↑U

非先天型
母由来 M士SD＝1．60士1．31（キロ塩基対） n＝16
父由来 M士SD＝2．20±1．43（キロ塩基対） n＝7

非先天型 M土SD＝1．85士1．14（キロ塩基対） n＝6
先天型 M士SD＝2．37士1．23（キロ塩基対） n37

図1親子間のCTGリピートの増大差

図4

非先天型と先天型の子をもつ母のCTG
リピート増大親子のリピート増大の差
0

15

20

25

30

35

40

45

50

親子の発症年齢の差（年）r21・0．45970

0

p＜0．1

1．5

2

2．5

r2≡0．3545

3

3．5

4

kbp

Pく0．01

図5 親のCTGリピート増大と次世代への増幅の程度の関連P＜0．005

uO扇ua×Uu↑U低下を示しIQの平均値は75±12（M±SD）であった．
リピートが増大するほどIQscoreが低下する傾向が認められた．
4．先天性筋緊張性ジストロフィーの発症機序においてリピートの増大がどの程度関連するかについて検討した．先天性筋緊張性ジストロフィーは，胎児期の羊水過多，発育不全に始まり，出生直後の横隔膜挙上を伴う呼吸不全，哺乳障害，全身のhypotonia，顔面脱力筋脱力に特徴付けられる．これらはやがて軽快し，思春期以降に成人型で発症する．我々は病歴から，明らかに新生児期に呼吸不全，哺乳障害，全身のhypotoniaを望したもの
を先天型とした．我々が経験した症例は全て母親が発症者の場合であった．図3に示すように先天型のリピートの平均値は4．13±1．03（キロ塩基対）で非先天型の2．90±1．47（キロ塩基対）に比べ，t検定により危険率0．5％で有意に増加しているといえた．しかし先天型，非先天

非先天型

先天型
M士SD＝4．13土1．03（キロ塩基対） n＝10
非先天型 H士SD＝2．62士1．47（キロ塩基対） n＝47

図31

親のCTGリピート増大

図2 親子のリピート差と発症年齢の差

先天型

．5

先天型，非先天塾のCTGリピート増大−66−

型ではオーバーラップする症例もかなり認められた．
一方患者である母親について，非先天型の子を持つ母

かし，先天型は同胞発症が多いと指摘されていること4），
先天型と非先天型のCTGリピートはオーバーラップし親と，先天型の子を持つ母のリピートを比較したが，図ている症例もあること，先天型の子を持つ母親のCTG4に示したように明らかな差は認められなかった．
5．最後に親のCTGリピートと次世代への増幅程度とリピートが，必ずしも非先天型の子を持つ母親のCTGの関連をみた．図5はⅩ軸に親のCTGリピート値を，Y軸に各親子間でのリピートの差を示している．これよ

ら言われている胎内環境などの他の要因も大きく関与する可能性があると思われた．従って，本症の最重症型でり，親のCTGリピートが小さいほど，次世代での増幅ある先天型に対しての遺伝子による出生前診断には慎重の程度は強くなり，逆に親のリピートが大きいほど子のを要する．

リピートに比べて大きいとはいえないことから，以前か

リピートとの差が小さい傾向が認められた．
結文献1）BrookJD，McCurrach ME．et al：Molecular basis

論

筋緊張性ジストロフィー親子の臨床症状とCTGリ

Of myotonic dystrophy：Expansion of a trinucleo−

ピートについて検討した．CTGリピートは子の世代でtide（CTG）repeat

1組を除いて更に増大していた．しかし，この母子例もencoding aproteinkinasemember．Ce1168：799，

含めて発症年齢は，全て子の世代で早くなっていた．親1992．

子のリピート差が大きいほど発症年齢の差も広がる傾向にあったことは，親の発症年齢と親子のリピート差をも

at

the3

end

of

a

transcript2）Fu YTH，Pizzuti A，et al：An unstable triplet
repeatin a gene related to myotonic muscular
dystrophy．Science255：1256，1992．

とに，子の予後がある程度予想できることを示した．ま3）BuxtonJ，Shelbourne P，et al：Detection of an

た，親のCTGリピートが軽度の場合は，その子のリ
ピートは大きく増幅する憤向を示したが，軽症の親でunstable fragment of DNA specific toindividuals

あっても次世代には重症化する可能性の十分あることがWith myotonic dystrophy．Nature355：547，1992．

明らかになった点，今後の遺伝相談において重要な問題

4）Koch MC，Grimm T，et al：Genetic risks forとなろう．

Children of womenwith myotonic dystrophy．Am

先天性筋緊張性ジストロフィーの発症機序にはCTG

J Hum Genet48：1084，1991．

リピートの増大が関与していることは明らかである．し−67−16）筋緊張性ジストロフィー症関連遺伝子の脳内発現の検討
後 藤 発 生■研究協力者

古 谷 博 和■ 小 林 卓 郎書 林

健 志暮■

はじめに

テンプレートとしてそれぞれのエクソン領域を［α筋緊張性ジストロフィー症（以下MyDと略す）は近年−32p］dCTPでラベルしてPCR後，5％ダリセロールを

ミオトニンカイネース遺伝子（以下MK遺伝子）3

非含むアクリルアミドネイティブゲルでPCR産物を分離

翻訳領域の（CTG）繰り返し配列の延長が疾患発症およして，その移動度の違いによりポリモルフィズムの有無

びその症状の程度と関連していることが解明され，実質を正常人コントロールとMyD群との間で比較検討した上の遺伝子診断も可能となっている1）．しかしMK遺伝（SSCP法）2）．その結果として移動度の違いが兄いださ

子自体の機能，その組織別の発現に関してはいまだに不れた場合には，SSCP−PCRに用いたのと同じプライ明であるとともに，常染色体優性の発現形式をとる

マーを用いて正・逆両方向から塩基配列を決定して，ポMyDと，（CTG）繰り返し配列延長のメカニズムとの関連も現在までのところ全く解明されていない．これらのリモルフィズムの部位を同定した．
またこのようにして同定されたポリモルフィズムのう解析を行うための第一歩として，我々はMyDで筋組織同様に病変の認められる中枢神経系に関して，MK遺伝

ち，RFLPであるものは制限酵素を用いて，そうでない
ものについてはSSCP法を用いて正常コントPpル群お子のallele別の発現を検討したので報告を行う．

よびMyD群の解析を行い．allele frequencyの算出を
行った．

対象・方法

3）RT−PCR法によるaHele別mRNA発現主の解析

1）ゲノムDNAおよびtotalRNAの抽出

このようにして解析したサンプルのうち，エクソン内

MK遺伝子ハプロタイプ解析のためのゲノムDNAのポリモルフィズムをへテロで有する凍結脳サンプルには，MyD患者末梢血白血球（9例）および一20℃で凍結

関して，RTTPCR法によるallele別mRNA発現量の比較保存されたMyD剖検脳（4例）から抽出した．またコン定量を試みた．

トロールとして，正常人の末梢血白血球（18例）およまず．延長した（CTG）繰り返し配列のあるalleleとび，凍結保有されたアルツハイマー病（以下AD）患者

ポリモルフィズムとの関連を調べるために，ポリモル

剖検脳（4例），正常人脳（2例）からゲノムDNAを抽フィズムをへテロで有する凍結脳サンプルのゲノム出した．またこれと同時に，凍結脳サンプルからはtotal

DNAを制限酵素〟f乃dⅢ，ⅩあdIで処理してサザンブ

RNAを抽出し，RT−PCRによるmRNA発現量解析に用いた．

ロッティングを行い，延長した（CTG）繰り返し配列の
表1 Allele frequencyof polymorphism

2）SSCP法およびダイレクトシーケンシング法によるポリモルフィズムの検出【工ntron工Ⅹ】
G

MK遺伝子のエクソン内に存在するポリモルフィズム
をSSCP法2）によって検出し，そのハプロタイプを解析

Japanese（13でmembers）17（0．8）

することでalleleを区別することにした．
MK遺伝子は全長約10kbで．15個のエクソンから形成

Japanese（20members）20（0．5）
Cocasian（3）されている3）．このうちの転写開始コドンより下流の部（0．47）

分のエクソン内のポリモルフィズムを検出するために．
エクソン領域が約200〜400bpの長さで特異的に増幅出【Exon X】

来るよう，エクソン，イントロン接合部位近くのイント

C

ロン内に25個のプライマーを設計した．
Japanese（13次に，MyDおよび正常コントFトールのゲノムDNAを

members）22（0．85）

Japanese（20members）36（0．9）

事九州大学医学部脳研神経内科…九州大学医学部遺伝情報実験施設・ゲノム解析部門

Cocasian日日ー68−（0．85）

G

結果・考察1）MK遺伝子エクソン内ポリモルフィズムの検出

サイズを同定した後に，同時にゲル電気泳動を行ったサンプルから正常allele周辺（5．8kb）を切り出し，ポリモ
ルフィズムの有無を検出して，ポリモルフィズムが延長

日本人MyD患者13例をSSCP法とダイレクトシーケ
ンシソグ法により解析した結果，第10ェクソソ（G→した（CTG）繰り返し配列のある側か，正常のalleleの

C；Val→Leu）と第9イントロ（T→G）の中に既報側にあるかを検討した．

のポリモルフィズムがそれぞれ1個ずつ確認された．こルフィズム周辺の領域（257bp）を増幅した後にポリモ

次にCDNA合成キット（ファーマシア社）を用いて，のうちェクソン内のポリモルフィズムは変異塾（C；totalRNAよりcDNAを合成した後，これをテンプレー

Leu）の場合が制限酵素β∫rIの認識部位に相当しておトとしてポリモルフィズム周辺の領域（257bp）を［αり，この制限酵素を用いることで容易に変異が同定され−32p］dCTPでアイソトープラベルして40サイクルのた．一方イントロン内の変異はSSCP法により同定可能

PCRを行った．
5サイクルごとに一部のサンプルを取り出し，ポリモであった．これにより算出されたallelefrequencyは衰1に示したが，エクソン内の変異は日本人MyD患者群，正ルフィズムを認識する制限酵素（β∫rI）で切断して10％
アクリルアミドゲルで電気泳動後オートラジオグラ

genotype

フィーを行い，バンドの濃度をデンシトメーターで測定Aすることによって，正常群とMyD患者群との間のmRNA発現量の差異を比較した．

B
H

C
D

−トー：‖・・：。r。b∴＼、′亮両…

■卜I t

■■

＼

BratR

Br訓n

89005

8閲11

581（b
歳
b＿

W8C

WBC

Braln

CNT MyD添遜＋．∴ 紐

Braln

8900589011

ノ・1

一食

■・．■

−づト

・・ 一・個妙■・・1 −●■

haplotype

蠣｝■

B

CB

B

図2（CTG）繰り返し配列とBsrI RFLPとの相関．MyD患者のDNA診断と同様にしてアガロースゲル電気流動を行い，正常alleleの5．8
kbバンドをゲルから切り出した後にβ∫rI
RFLPを含む領域（矢印で示した）をPCRで

だ老臣−

■■●

CB

車・パ柏木

増幅後，β∫rIで処理した．MyD患者脳組織から抽出したゲノムDNAをテンプレートとしたものをレーンa，切り出した正常a11eleの5．8kbバンドをテソプレートとしたものをレーソbに置いた．その結果，この2例の正常alleleは，（a．）のgenotype Bに相当する
ことがわかる．従って延長した（CTG）繰り返し配列のあるalleleは，genOtype Cに相当すると考えられた．

図1MyD患者のDNA診断．正常人，MyD患者末
梢血，MyD患者脳組織から抽出したゲノム
DNAを制限酵素ⅩあαⅠ，月有感Ⅲで処理後，MK遺伝子イントロン10をプローブとしてサザンブロッティングを行った．MyD患者では正常alleleの5．8kbバソ・ドに加えて，（CTG）繰り返し配列の延長したallele（＊で示す）のバンドが認められる．

−69−

ためにallele別の発現量の差も筋組織ほどでなく，
RT−PCR法では定量しにくいこと，③脳組織中でも灰自廃車轡

質と白質との間でallele別の発現に差異があり，今回の方法ではその微妙な差異を検出できなかったこと，④中昏卓−

枢神経系の異常は（CTG）繰り返し配列の延長と直接的には関連しないこと，などが考えられる．

▲D
▲D
叫D
叫D AD AD叫D MYU
CllT CllT 書棚 dWH CNT CNT 8軸05 890日

図3

近年MyD同様に（CTG）繰り返し配列の延長が病因

allele別MK遺伝子mRNA発現量の比較．
RT−PCR後にBsrIで処理した．257bpのバンドが図2aのgenotypeB，162bpのバンドがgenotype Cに相当する．この2本のバンド濃度の比にコントロールとMyDとの間で有意な差は認められなかった．

常日本人群，Sabouri4）らによる正常人群の報告の間に大きな差はなく，この変異が遺伝子多型である可能性が高となっていると考えられる疾患として，ハソチソトン舞
踏病，脊髄小脳変性症，脆弱Ⅹ染色体症候群，球脊髄性筋萎縮症，DRPLAなどがわかっているが，いずれの疾患でもその発症機序の解明はまだ行われていない．今後
MK遺伝子の覿織・allele別の発現を検討することで，その発現制御に関与する因子を解明することが可能になると考えられ，ひいてはそれが疾患発症のメカニズムを解明する上で有力な手がかりになると予想される．

いと考えられた．一方，イントロン内の変異では4㌧正常
日本人群，白人正常人群の報告の間ではほぼ（G／T＝

参考文献

0．5／0．5）と大きな差はなかったのに対して，日本人
MyD患者群では（G／T＝0．8／0．2）とやや偏りが認められた．

1）Fu YH，PizzutiA and Fenwick RG：An unstable
trlplet repeatin a gene related to myotonic
muscular dystrophy．Science255：1256−1258，

2）MK遺伝子の釧ele別発現の検討

1992．

MyD患者14名車6名にMK遺伝子エクソン上のBsrI2）HayashiK：PCR−SSCP：A Simple and sensitive

RFLPが確認され，MyD剖検脳4例中2例がこの変異をmethods for detection of mutationsin the gen0−

ヘテロで有していた．サザンブロッティングによる解析

mic DNA．PCR：Methodsandapplicationsl：34の結果，これら2例では7〜10kbの（CTG）繰り返し配列の延長が確認された（図1）．

3）MahadevanMS，AmemiyaC，Jansen G，Sabourin−38，1991．

また，（CTG）繰り返し配列とBsrI RFLPとの相関

L，Baird S，NevilleCE，Wormskamp N，Sefers B，に関する解析の結果，ともに（CTG）繰り返し配列とBatzer M，LamerdinJ，Jong P，Wieringa B and

RFLPとが同じallele上にあることが判明した（図2）．
さらにこのRFLPをヘテロで有するコントロール3例

KornelukRG：Structureand genetic sequence ofthe myotonic dystrophy（DM kinase）gene．Hum（AD2例，正常人1例）とMyD2例との間でMK遺伝
子mRNA発現量を比較したが（図3），allele別の発現に

4）SabouriLA，MahadevanMS，NarangM，Lee DS，〟ogGe乃gf2：299−304，1993．

コントロールとMyD患者との間で大きな差は認められなかった．

Surh LCandKornelukRG：Effect of the myoto−
nic dystrophy（DM）mutation on mRNAlevels of

これまでに先天性筋緊張性ジストロフィー症の筋組織

the DM・〃αf Gg花e￡4：233−238，1993．

や，MyD患者の筋組織でMK遺伝子mRNAの発現量が5）Fu YH，FriedmanDL，Richards S，PearlmanJA，

al1ele別に検討されており，（CTG）繰り返し配列の延長

GibbsRA，PizzutiA，AshizawaT，PerrymanMB，があるallele側のmRNAの発現量が正常alleleに比べてScarlato G，Fenwick RJr，and et al：Decreased

増加することとMyD発症との相関が考えられている4）5）．

expression of myotonin−prOtein kinase messenger

しかし，今回の我々の検討結果からは筋魁織で認められたような明らかな差異は脳組織では認められなかった．

RNA and proteinin adult form of myotonic
dystrophy・Science260：235−238，1993．

この原田として，①（CTG）繰り返し配列の延長があるallele側のMyD遺伝子の発現は範織別に異なること，②MyDの中枢神経系での異常が筋組織ほど著明でない

ー70−17）Ryanodine受容体遺伝子突然変異の検討
高 木 昭 夫＊

研究協力者

小 島
井

田

進＊■ 松 村 多 可■＊ 中 瀬 浩 史書
雅

祥■

渡

悪性高熱は，麻酔薬に起因する重篤な合併症で致死率が高い．その予防のためには麻酔前に本症の保因者であるか否かを的確に診断する必要がある．最近，常染色体性優性遺伝を示す本疾患の家系において，連鎖解析により責任退伝子が第19染色体上のライアノジン受容体（筋小胞体カルシウム遊離チャンネル）遺伝子にあることが報告された1）2）．また悪性高熱を合併することの多いセン
トラルコア病においても，連鎖解析によりその責任遺伝
子がRyanodine受容体遺伝子にあることが指摘された3）4）．その後この遺伝子のone point mutation（C1840→T：Arg614→Cys）が確認された5）・6）．現在悪性高熱の確定診断には生検筋を用いた生理学的検討（Skinned
fiber法）が必要であるが侵聾的な検査であり，白血球を用いたDNA診断ができればその有用性は非常に高い．
そこで今回上記の突然変異が日本人でも認められるか否か，認められればその解析で本症の発症の予測が可能か否かを検討することを目的とした．

辺

知

司書

真

先

敏

弘◆

レン遠沈管に3mlの核溶解緩衝液（10mMTris−HCl，400mMNaCl，2mMNa2EDTA，pH8．2）を加え，一晩消化液（0．2mlの10％SDS＋0．5mlprotease K solution；
proteaseKlmgin1％SDS＋2mM Na2EDTA；37℃）
で消化，消化終了後1mlの飽和食塩（6M相当）を各々
遠沈管に入れ15秒間激しく混和し遠心（2500rpm，15分間）．塩析された蛋白pelletは管底に残り，DNAを含む
上澄み液を他の15mlポリプロピレン遠沈管に入れ，正確に2倍量の室温の純アルコールを加え，管をDNAが析出するまで転倒混和，析出したDNA糸をピペットにとり100〜200FLlのTE緩衝液（10mMTris−HCl，0．2mM
Na2EDTA，pH7．5）を含むミクロ遠沈管（1．5ml）に移した．DNAは37℃，2時間で溶解し使用した．
PCRはFujiiら5），Gillardら6）の方法の準じて施行した．
Primerはforward：CCCTGTGTGTGTGTAATGGTG−
3，reVerSe primerが5−ATCTCTAG・AGCCAGGGA−GCAAGTTCTCAGTAAT−3を作成精製し各々100ng

用いた．そのほかの試薬はGeneAmp PCRReagentKit

対象・方法
対象は悪性高熱との関連が疑われ，かつdeep freezerに筋生検検体が保存されている15例を対象とした．その臨床的特徴とskinned fiber法によるcaffeine拘縮試験の結果は表1に示した．最長6年間の保存期間である．悪性高熱の既往もしくは家族歴のあるものが4例，悪性症
候群2例，高CK血症4例，先天性ミオパチー3例，家族性周期性四肢麻痺1例，正常対照1例の計15例である．悪性高熱例で家族歴がはっきりしているのは症例
12，14の2例でskinnedfiber法で明らかな異常を望したのは症例14の1例である．先天性ミオパチ一例のなかには典型的なセントラルコア病と思われる症例はなく，ネ
マリンとコアが共存した症例7，ネマリンミオパチーの（Perkin−Elmer CetusInstruments：Takara）を用いた．
PCRの条件としては，熱変性96℃，45秒，アニーリング
55℃．1分，eXtenSion72℃，2分で40回の条件で施行した．
その後制限酵素RsaI（BRL−5424SA）で消化後，ミュービッドー2（コスモバイオ）を用いて，4％
NuSieveGTGagaroseもしくは4％ポリアクリルアミド

患者番号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15

症例8，組織化学上minimalchange（数本の線経にコアあり）と考えられる症例13の3例である．
筋生検cryostat標本からのgenomic DNAの抽出はMillerらT）の塩析法に準じて行った．すなわちcryostatにて10〃の筋生検薄切切片を20枚とり，15mlポリプロピ●虎の門病院神経内科★●三宿病院神経内科

−71−

年齢

性別
男性
42
女性
60
男性
45
女性
13
男性
16
男性
48
男性
20
女性
72
男性
53
男性
21 女性
31 女性
20
女性
64
女性
43
女性

Skinned
診断
正常対照
家族性低K血症性周期性四肢麻痺
高CK血症
高CK血症
悪性高熱の既往
悪性高熱
先天性ミ小一ト（i刊ン十コア）
先天性ミか●ト（わリン）悪性症候群
高Clく血痘
苗CK血症
悪性高熱の家族歴1
先天性ミオバチー（mimimal〔hl叩）
悪性高熱の家族歴
悪性症候群

十二・∴・⁚

表1対象患者

高熱，セントラルコア病の確定診断には筋生検という侵讐÷●雷妄鴨■■151415121118

9

8

7

嚢的検査が必要であることから遺伝子診断の確立が重要
と考える．
＊

6

5

4

5

21＊

ま

図11）CR産物を制限酵素RsaIでdigestL4％ア
ガロースゲル上で電気泳動した．＊印は制限酵素を加えていない未消化のもの，1から15の番号は各々，表1に示した症例番号である．各症例とも，すべて41，33bpの二つのバンドに消化された．即ち，C1840Tの変異は認められなかった．

とめ1）骨格筋ryanodine受容体（RYRl）遺伝子のC1840T（Arg614Cys）の突然変異の有無に関してdeep freezer
保存筋よりDNAを抽出しPCR法により検討したが，今回の対象例ではこの突然変異は認めなかった．
2）悪性高熱，セントラルコア病共にgenetic heter0−
geneityが存在し，遺伝子診断の臨床応用のためにはより多くの症例の蓄積が必要である．

上で電気泳動し，エチジウムプロミドで染色LAGT−AC1840からAGTAT1840へのpoint mutationの有無を参考文献調べた．DNAのサイズマーカーは￠Ⅹ174HaeⅢdigestを用いた．

1）MacLennanDH，etal：Ryanodinereceptorgeneis
a candidate for predisposition to malignant

結果

hyperthermia．Nature343：559，1990．

Genomic DNAは上記方法で電気泳動後エチジウムブ
2）ロマイドで染色し単一のバンドであることを確認した．

McCarthyTV，etal：Localizationofthemaligna−

nt hyperthermia susceptibilitylocus to human

図1に示したように今回の対象例はすべて41，33bpの二つのバソドに消化された．即ち，C1840Tの点変異は認められなかった．

Chromosome19q12−13，2．Nature343：562，1990．
3）Kausch K，etal：Evidence forlinkage of theCentralcorediseaselocustotheproximallongarm
Of human chromosome19，GenomicslO：765，

考

嚢

1991．

現在までのところ本邦でRyanodine受容体遺伝子の4）MulleyJC，et al：Refined geneticlocalization for

C1840T（Arg614Cys）へのpointmutationを確認したとCentralcore disease．AmJ Hum Genet52：398，

言う報告はされていない．この変異は悪性高熱の家系の1993．

2〜5％に認められるとされている6）8㌧ その後Gly248

5）FujiiJ，et al：Identification of a mutationin

Arg：C742Aが報告されたが97，この変異は45家系中1

porcine ryanodine receptor associated with

家系のみとやはり少数であり追試確認した報告はない．

malignanthyperthermia．Science253：448，1991．

最近になり新たにRyanodine受容体遺伝子異常として

6）Gillard EF，et al：A substitution of cysteine forG7301A（Arg2434His），C487T（Arg163Cys），C1209G

arglnine614intheryanodinereceptorispotential−（Ile403Met）の3つの変異が報告されたu）u）．G7301A

ly causative of human malignant hyperthermia．

とC1209Gの変異はセントラルコア病の各々1家系に認められたが，C487Tはセントラルコア病と悪性高熱の両Genomicsll：751，1991．
7）Miller SA，et al：A simple salting out procedure

疾患の家系にまたがり認められた初めての変異である．

for extracting DNA from human nucleated cells．

しかし，その頻度はやはり低い．現在までのところ，多Nucleic Acids Research16：1215，1988．

くの症例に認められる共通の遺伝子異常は発見されてい8）Hogan，etal：Acysteine−for−argininesubstitution（R614C）in the human skeletal muscle calcium

ない．
むしろ，近年になり悪性高熱，セントラルコア病共に

release channel cosegregates with malignant

他の遺伝子異常を指摘する報告がある．すなわち第17染

hyperthermia．AnesthAnalg75：441，1992．

色体上のナトリウムチャンネルα−Subunitの遺伝子異常9）Gillard，etal：Polymorphismsand deduced aminoが悪性高熱の原因であるとする報告も見られている通．

acid substitutionsinthe coding sequence of the

セントラルコア病では第14染色体上のβ一myOSinheavyrryanodine receptor（RYRl）genein

chain遺伝子の突然変異が報告された脚．すなわち，遺伝Withmalignanthyperthermia．Genomics13：1247，

子の立場からみても悪性高熱，セントラルコア病が単一の疾患でないことが確認されてきており，本症の遺伝子診断は今後新たな展開があると予想される．現在，悪性ー72−

individuals

1992．

10）Zhang Y，etal：A mutationin the humanryanodine receptor gene associated with centralsusceptibility．Genomics14：829，1992．

core disease．Nature genetics5：46，1993．

13）FananapazirL，etal：Missense mutationsin the11）Quane KA，et al：Mutationsin the ryanodine
receptor genein centralcore disease and malig−

β−myOSin heavy chaingene cause central core

nanthyperthermia．Naturegenetics5：51，1993．

diseaseinhypertrophiccardiomyopathy．ProcNatl
Acad SciUSA90：3993，1993．

12）01ckersA，etal：Adultmusclesodiumchannel−asubunitis acandidate formalignanthyperthermia−73−18）顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（FSHD）の遺伝子解析
荒

研究協力者

目

李

済

畑

賢＊

後

藤

加奈子＊

小

林

塚

原

俊

文＊

武

田

伸

一＊

功榊

野

村

芳

子＊…

中

村

昭

則＊

古

川

哲

雄＊＊

佐

橋

瀬 川 昌 也＝＊＊松R．R．Frants††

原

四

郎†

慶＊

C．Wijmenga††

びFSHDゲノムライブラリーの作製を報告する．

的FSHDは顔面と上肢帯〜上腕の筋肉が主として障害される常染色体優性の筋ジストロフィーであり，浸透率は方法及び結果極めて高い（〜98％）．曜患率は10万人に0．2〜2人で筋コスミドクローンC51（Wijmengaら，1992）1一．プラ

ジストロフィー全休の1〜8％を占める．本症は高率（70〜80％）に網膜症や神経性難聴等の合併が，またしスミドpSMl（Weiffenbachら，1993）について制限酵
素マッピング及びサブクローン化を行い，FSHD関連

ばしば組織のリンパ球浸潤が出現することでも知られて

EcoRI断片に特異性が高い新しいプローブpFRlを作製

おり，一日も早い発症機構の解明が待たれている．しかした（図2）．またFSHD関連ゲノム断片はEcoRI，

し本症についての病因は末だ解明されておらず，早期診断法も確立されていない．

HindⅢの二重消化によりさらに短くなる事が分かった

最近の研究から．ヒトの染色体4q35−qterにマップさ（図3）．現在，FSHD症例ST13についてEcoRI，
HindⅢの二重消化による断片のゲノムライブラリーをれているp13E−11のプローブを用いた遺伝子解析の結果，FSHDでは制限酵素EcoRI切断断片サイズに差があ

作製して，新しいプロTブpFRlを用い，PCR法，コロ
ニハイブリダイゼイショソ法，サザン法でスクリーニン

り，おそらくFSHDの発病に関与する遺伝子には遺伝子グを行っている．

欠失また突然変異が生じている可能性があるものと推測されている（Wijmengaら．1992）い．また荒畑ら（1993）
は日本人FSHDにおいてもこれを確認した2ゝ（図1）．さSOUTHERN ANALYS工S W工TH p13E−11
0F EcoRエーD工GESTED DNA

らにp13E−11に反応するFSHD関連EcoRI断片には3．2kbのKpnI断片のrepeatがあり，その中にhomeo−domain

くFSHD yamily2〉の配列とCpGsislandなどの特殊配列が存在することが解明されつつあり，その機能とFSHDの関連が注目されている1−．

■音陰・i川−＝＝ニー■−■

我々はFSHDの原因遺伝子をクローン化し，その構造と機能を明らかにするために研究を進めている．しか

一

一

一

一

し，p13E−11プローブは非特異的に反応する部分が多く，クローニングベクターにも弱いながらも反応するのでライブラリースクリーニングに適当ではなかった．本
研究ではFSHDに特異性の高い新しいプローブの作製及★国立精神・神経センター神経研究所
榊東京医科歯科大学医学部保健衛生学科
輌＊愛知医科大学第四内科…＊＊瀬川小児神経学クリニック†金沢大学医学部神経内科††Leiden U而versity，The Netherlan由…；莞三二二五一●−●−」
15．2kb−

図1サザンプロッ＝法によるFSHDの遺伝子診断
FSHD患者では，健常家族には認めない27kb
以下の短いバンドが検出された．

一74−

12

3

12

3

12

PFR5lp13E−11

3EcoRl，1，2：ControI，3：FSHD ST13
H

B
Probe

6

Hc

P

Pn
・…・t……＝……
1．1

1．1

0．5

B

S

日Hll日日1

2
111111111111111Illllllll（PFR）＝l＝●＝llM日日＝日日■＝■

1．2kb

P

P

4

l11111Illllll

31」」目し∴」∴1ト∴日日日日日日日日‖「

0．7

0．3

卵つ三・lJ
hlhlhl州
0．8

図2

プローブの開発
FSHD関連EcoRI断片により特異性の高いプローブpFRlが得られた．

．≠・應瞥iFSHD ST13
1．fCO月Ⅰ／〃fnd＝2．〃加d＝−うト
20kb

3．EeO月日
−−
14kb

−＞・篭
12kb

1

E。。Fl）Hi。d＝2

3

FSHD regIOn E。。F71

12

〃加dH

8kb

図3 制限酵素地図
FSH関連ゲノムDNA断片はEcoRlとHindIIの二重消化によりさらに短く切られた．

ー75−

文

考察および結論
FSHD関連遺伝子は4q35−qterにマップされ，その領域にはhomeodomain配列，3．2kbのタンデムリピート
等が存在するが，現在その構造と践能が注目されている．

献1）Wijmenga C，HewittJ．et al：Chromosome

4q

DNA rearrangements associated with facios−
Capulohumeralmusculardystrophy．NatureGenet
2：26−30，1992．

2）荒畑喜一，古川哲雄ほか：染色体4q35−qterマー
カーp13E−11による顔面肩甲上腕型筋ジストロ
フィーの遺伝子診断．医学のあゆみ164：865−

本研究によって．FSHDの遺伝子診断と遺伝子クロー
ニングに有効に使用できる新しいプローブpFRlが得られて意義は大きいものと考えている．今後FSHD関連遺伝子部分に存在する3．2kb反復配列の決定と，break

866，1993．

pointの検索を進めることが重要になろう・さらにmRNAと原因蛋白の解析を予定している．

ー76−19）顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーの臨床的多様性と
遺伝子診断
納

研究協力者

中

川

正

法＊

大

窪

隆

一＊

樋

口

逸

郎＊

山

田

博

久■

末

原

雅

人＊

松

崎

敏

男…

C．Wijmenga…

目

光 弘＊

R．R．Frants＊＊＊

後，両上肢の挙上困難を自覚している．
現症：知能，眼底．聴力は正常．顔面，頸部，肩甲（異状肩甲），大腿，前頸骨筋群を中心とする筋力低下・萎縮と，下腿筋群の仮性肥大を認める．感覚障害なし．筋生検では，血管周囲を中心に炎症細胞と考えられる小円形単核球の浸潤が見られた．
症例3：56歳，男性．
主訴：右上肢挙上困難，下肢冷感．
家族歴：母親，弟，長男に同病の疑いあり．
現病歴：小学校の頃より懸垂が苦手であった以外には，小児期に異常を自覚してない．25歳頃より右上肢の筋力低下を自覚．51歳頃より腹を突き出して歩くようになり，階段昇降が不安定となる．その後，左肩甲部にも筋力低下・萎縮を自覚している．54歳頃より，両下肢の冷的

顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（以下FSHD）は，
顔面・肩甲・上腕筋の障害を主症状とする常染色体優性
退伝を示す疾患である．家系内または家系間でその臨床症状が多様であることがひとつの特徴でありl）・2㌧非定型的な臨床症状を示す孤発例の場合などは確定診断が困難な場合がある．
今回，Leiden大学のDrFrantsより供与された第4染
色体長腕末端部の遺伝子マーカーp13E−113）を用いて，非定型的な臨床症状を呈したFSHDを中心に遺伝子診断を行ったので報告する．
対象

症例1：41歳，男性（図1）．
主訴：四肢筋力低下，構語障害，難聴．
豪族歴：同様の疾患なし．
現病歴：乳児期より顔面筋力低下，聴力障害あり．発語
は4，5歳頃．14歳頃より上肢挙上困難，腰帯部筋力低下，脊柱前撃が出現．
現症：知能正常範臥両側混合性難聴，構音障害，顔面筋力の著明な低下，網膜動脈の走行異常（蛇行）と末梢での過剰分枝を認める（図2）．肩甲・上腕・前脛骨筋を中心とする高度の筋力低下・萎縮と著明な脊柱前轡を認める4）．筋生検を施行したが，endstagemuscleであった．
症例2：22歳，女性（図3）．
主訴：階段昇降困難，上肢挙上困難．
家族歴：同様の疾患なし．
現病歴：幼児期より顔面筋の筋力低下，肩甲部，大腿部の筋萎縮あり．中学校の頃より下腿が太くなったのを自覚．高校3年の頃より，右下腿の筋力低下（dropfoot）
が出現し，階段昇降困難，歩行困難が徐々に進行．その図1症例1の全身像．肩甲・上腕・前脛骨筋を中心とする高度の筋力低下・萎縮と著明な脊柱前撃を認める．

♯鹿児島大学医学部第三内科
榊国立療養所沖縄病院神経内科＊＊＊Leiden University−77−現病歴：20歳頃より上肢挙上困難出現．43歳頃より腰帯部の筋力低下を自覚し徐々に進行．現在，自力歩行可敵現症：知能正常．眼底，聴力正常．顔面筋の軽度筋力低下肩甲上腕腰帯部の筋力低下．異状肩甲あり．下腿の仮性肥大を認める．筋生検にて，lobulatedfibersを多数認めた．
症例5：66歳，女性．
主訴：四肢筋力低下，呼吸困難．
家族歴：症例4の姉．
現病歴：21歳頃より下肢筋力低下を自覚．39歳頃より歩行不能となり，同時期より上肢挙上困難，肥満傾向も出
現・59歳時に呼吸困難となり，Pickwickian症候群，単純性肥満（身長155cm，体重90kg）と診断される．
現症：知能，眼底，聴力正常範囲．顔面筋，頸軋肩甲の筋力低下，筋萎縮．下腿近位筋の著明な筋力低下，筋萎縮，下腿の軽度の仮性肥大．歩行不能．筋生検にて，lobulated fibersを多数認めた．
症例6：77歳，女性．
主訴：四肢筋力低下．
家族歴：父親と長男が同病．

図2 症例1の眼底写真．網膜動脈の蛇行と末梢での過剰分枝を認める．

現病歴：33歳頃より左上肢の筋力低下を自覚．徐々に右上肢，両下肢へと筋力低下が出現し，62歳頃より歩行困難が著明となり，現在，車椅子使用中．
現症：顔面，両側肩甲部（異状肩甲），上腕，下肢近位筋の筋力低下・筋萎縮，下腿筋の仮性肥大を認める．速力
右10kg，左13kg．
症例7：17歳，男性．
主訴：右上肢挙上困難．
家族歴：兄が同病．

図3 症例2の全身像．翼状肩甲，下肢近位筋群の筋萎縮，下腿の仮性肥大を認める．
感が出現している．
現症：知能，眼底正常．聴力：軽度低下，耳鳴あり．顔面筋の軽度筋力低下・筋萎縮．左胸鎖乳突臥両肩甲および右上腕二頭筋の著明な筋萎縮・筋力低下，翼状肩甲，漏斗胸，脊柱前攣，下肢近位筋と左下腿筋群の軽度の筋力低下・撞力右16kg，左42kg．右前腕部表在覚の軽度低下と下肢振動覚の軽度低下．筋生検では，筋線経の大小不軌typegrouping，nuClearclumps等の所見を示し，神経原性変化と考えられた．
症例4：61歳，女性．
主訴：四肢筋力低下．
豪族歴：姉（症例5）と従兄弟に同病あり．

現病歴：中学校までほ特に異常を自覚していない．16歳になって右上肢の挙上困難が出現し，徐々に進行．
現症：瞳孔不整．ごく軽度の顔面筋筋力低下．右側優位の三角臥上腕二頭筋の筋力低下，萎縮と右側のみに翼状肩甲を認める．握力右25kg，左42kg．筋生検では，血管周囲を中心に炎症細胞と考えられる小円形単核球の浸潤とタイプⅠ線維萎縮を認めた．
表に今回検索したFSHD症例の特徴と検査所見のまとめを示す．
サザンプロット解析
以上の7例について，サザンプロット解析を行った．
末梢血または生検筋よりフェノール法にてゲノムDNAを抽出し，制限酵素EcoRIと2〜4時間反応後，0．5％
アガロースゲル，15〜20Vにて電気泳動を行い，ナイロン膜（BIODYNEB①）にblottingL，α32prdCTPにて標識したプローブp13E−11と65℃で16時間ハイブリダイ
ゼーションを行った．ナイロン膜を1％SSC，0．5％
SDSにて洗浄後，r70℃で3〜7日間autoradiographyを

−78−

行った．
結

があることが示された．EcoRI消化による異常バンドのサイズとFSHDの重症度との相関は言われていないが，今回の検討では最も若年発症であった症例1，2にて，特に短いEcoRIfTagmentが検出された．患者家族の検討から，症例2は新突然変異であることが確認されたが，症例1については今後家族の検索にて新突然変異であるか否かを確認する必要がある．症例3は，EcoRl消化による異常バンドの出現が見られなかった．本例は臨床的にはFSHDの特徴がそろっていたが，筋生検を行った6例中本例のみ神経原性変化を示していた点が注目される．同様の症例は，Weiffenbachらにより24家系中1
家系に認められており引，彼らはその家系では28kbより

果

症例1，2では約14kbのEcoRIfragmentがみられたが，症例3では男性に見られる8．9kbのバンド以外に28kbと9kbの間には異常バンドは見られなかった（図4）．
症例4，5では24kb，症例6では20kb前後の異常バンドが検出された．症例7では，約24kbのバンドが患者本人と兄および無症状の母親に認められたが，父親と弟には異常は認められなかった．なお，正常対照10例には，28kbと9kbの間には異常バンドを認めなかった（表）．
考察

大きいサイズのEcoRIfragmentが疾患とco−Segregate
している可能性は否定できないとしている．われわれの例でも，EcoRlの異常バンドが検出されなかった原因として，今回のサザンプロット法にて検出できないようなサイズの異常の可能性が考えられるが，そのはか，他の遺伝子異常に基づくもの，FSHD類似の他の筋疾患などの可能性も否定できない．症例7では，臨床的に無症状と考えられて母親に思児と同じサイズの異常バンドが認められた．今後，本家系の詳細な臨床的∴筋組織学的検討が必要である．
今回の検討では，各家系の神経学的所見，臨床検査およびDNA検査に不十分な点もあり，今後さらに詳細な家系調査とDNA診断を行い，FSHDの臨床的多様性と遺伝子異常の関連について検討して行きたい．

今回検討したFSHD例はいずれも非典型例であったが，症例3を除く6例で，EcoRl消化にて異常バンドの出現がみられ，プローブp13E−11に連鎖した遺伝子異常

kb

←23．1
←19．4

←12．2

蕾㌍齢←9●4

8

7

6

5

4

3

2

結
論
1．第4染色体長腕末端部のマーカーであるp13E−11を用いて，FSHDの7例中Coats症候群を合併した例や非定型孤発例を含む6例に28kbより短いEcoRI断片が検出され，本マーカーと連鎖した遺伝子異常が存在することが示された．
2．臨床的にFSHDと診断された1家族発症例で，28kbより短いEcoRI断片が検出されなかった．この原因としてサザンプロット法にて検出できないような大きなサ

1

図4 Southern blot analysis of FSHD
Lanel：正常女性
Lane5：症例2の姉
Lane2：正常男性
Lane6：症例2の母親
Lane3：症例3
Lane7：症例2
Lane4：症例2の父親 Lane8：症例1

表 検討したFSHDの臨床的特徴と遺伝子分析のまとめ

2
﹀
2
2
2

0

一

− t

2

一

1

炎症細胞浸潤
タイ70Ⅰ線推萎桁

〉28

S
t

1

一

A 一 ・ A 一 〇 〇 ・ 4 ・ ・ A ︼l一Lobulated fibers

n
e
m川

一

Lobulated fibers

I1

︵

一

結合組織の著明な増加炎症細胞の浸潤神経原牲変化

レ 几

一

r

■ ▲

十

C

筋生検所見

E

十

十

一 ＋ 一 ＋ ＋ ＋ 一

義甑蛸品

一一＋＋＋十7

期期頃頃頃頃
児児歳歳歳歳歳
乳幼2520213315

1 2 6 1 6 7 7．・d7 2−．ヽV 6 6／ ／ ／ ／ ／ ／ ／男女男女女女男

1 2 34 5 6 ︼7

正常対照10例

家族歴 CX値 仮性 網膜血管 難聴 知能
肥大 走行異常
低下

R g︶
O a b

症例 性／年齢 発症
年齢イズの異常か，他の遺伝子異常に基づくものか，FSHD

impact of genetic research．Clin NeuroI Neuro−

類似の他の筋疾患などの可能性が考えられた．

Surg95：9−21，1993．

3）Wijmenga C，HewittJE，Sandkuijl LA．et al：
謝辞：症例7およびその家族の遺伝子診断をして頂きま

Chromosome4q DNA rearrangements associated

した国立精神・神経センター後藤加奈子先生，荒畑喜一

with facioscapulohumeral muscular dystrophy・
Nature Genetics2：26−30，1992．

先生に深謝致します．
文4）末原雅人，中原啓一，川平 稔ほか：難聴，眼底血管走行異常を伴った顔面肩甲上腕型筋萎縮症．
神経内科25：268−272，1986．
5）Weiffenbach B，DuboisJ，Storvick D，et al：

献1）TawilR，Storvick D，Feasby TE，et al：Extreme
Variabilityofexpressioninmonozygotictwinswith
FSH muscular dystrophy．Neurology43：345−

Mapping the facioscapulohumeral

348，1993．

dystTOphy geneis complicated by chromosome2）Brouwer OF，Wijmenga C，Frants RR．et al：
Facioscapulohumeral

muscular

4q35recombination events．Nature Genetics
165−169，1993．

muscular dystrophy：The

−80−

4：

Ⅳ．

D R P

20）培養下におけるDRPの発現に関する免疫組織学的研究
小 林 高 義＊

研究協力者

亀

田

典

佳＊

大

野

伸

一＊＊

3次元的な超徴構造的局在を急速凍結−deep etching

DRPは石浦章一博士（東京大学分子細胞生物学研究所）から供与を受けたポリクロ∴−ナル抗体を使用した．

（QFrDE）法によって明らかにし，アクチン（AC）及

電顕レプリカ膜作成のために，10％メタノール浸漬

びスペクトリン（SP）との相互関係に関して検討して後，液体窒素で冷却し．液体窒素中で凍結割断を加えた．Eiko社製FD−3S装置内（−95℃，2〜6×10￣7

今までに．我々はジストロフィン（DP）の細胞内のきた．今回は，ヒト及びマウス培養骨格筋細胞を使用して．蛍光二重染色によるDP，AC及びSPの相互関係，
innervationによるDP及びdystrophinLrelated protein

Torr）で15〜30分間deepetching後，白金と炭素で回転蒸着した．型の如くレプリカを作成して，日立HS−9，（DRP）の局在を検討すると共に，培養マウス筋細胞に

H−700竜顔で観察した2）．

おけるDRPの超徴構造的局在をQF㌧DE法による検討を結行ったので報告する．

果1）ヒト筋細胞，SCn，mdxマウス筋細胞の免疫蛍光二重材料及び方法
1．ヒト筋細胞−ラット脊髄片併置培養系
4例のヒト生検筋から，eXplantLre−eXPlantation法
によって，筋芽細胞，筋管細胞を作成し，更に13日目胎児ラット脊髄片を併置培養し，innervation cultureを作成した．この培養系を使用して，DP及びDRPの筋細胞の発達段階における局在を免疫組織化学的に検討したl）．
2．マウス単独筋細胞
DMDのmodel動物であるmdxマウス及びそのCOntrOl
マウスであるscnを使用した．新生マウス下肢筋より無菌的に筋組織を取り出し，コラーゲン塗布カバースリッ
プ上にexplant cultureした．培養液は，Dulbeccosmodified Eagle．sMEM67％，medium19923％，fetal
bovine seruml0％の観成のものを使用した．培養は，約1週間行い，免疫組織化学的に検討した．培養細胞を2％パラホルムアルデヒドで5分間固定し，その後0．5％
サポニンで15分間処理した．
光顕的免疫染色には，DPはC末端に対するモノク

図11mmunofluorescent double labelling of

ローナル抗体，SPは抗ヒトあるいはチキンポリクロー

dystrophin，SpeCtrin or F L aCtin on scn

ナル抗体，ACは，F−aCtinを認識するrhodamine−

myotubes atlZ days of culture．
Dystrophin（a．C），SpeCtrin（d，e）and F−

palloidinを使用し，DPとSP，DPとAC，SPとACとのactin（b，f）are diffusely distributedin scn

相互関係をみる目的で，FITCとrodamineによる蛍光免
疫二重染色を行った．また，DP，DRPとacetylcholine

myotubeswithdiscontinuouslinearpa＿tternSon the sarcolemma．

receptors（AChRs）との相互関係をみる目的で，
rodamineでラベルしたa−Bungarotoxin（α−BGT）を使

Dystrophin and F−aCtin are coJocalizedin

用した．

a，b）．Insomeareasdystrophinarldspectrin

most areas of scn myotubes（arrowheadsin
Or SPeCtrin and F−aCtin are not c0−local−ized（arrowheadsin c，d，e＆f）．

＊東京医科歯科大学医学部神経内科
綿山梨医科大学第一解剖

Bar＝50JJm．

ー83−

進的局在（図5）
マウス培養筋管細胞では，超徴構造的には，DRPは細胞質内及び細胞膜直下に顆粒状に存在し，他の細胞骨格蛋白との関係は明らかでなかった31．
考察

DPは，筋細胞膜の裏打ち蛋白として，N末端側でACと，C末端側でdystrophinrelatedglycoprotein（DRG）と結合し，更にDRGは細胞外でlamininと結合し，筋細胞の骨格維持に重要な役割を果たしていると考えられているが，SPあるいはDRPなどの蛋白との相互関係は明かではない．
成熟した骨格筋では，DPは細胞膜直下にperiodicityを有してlinearに存在し，神経筋接合部および腱終末部に威く発現し，DRPは神経筋接合部に限局して存在する
ことが報告されている．またSPあるいはACは細胞膜に存在し，光顕レベルでは，DP，AC．SPはC0−1ocaliza−

図21mmunofluoreseent doublelabe ing ofdystrophin．spectrin or F− aCtin on mdx

tionしていると考えられている．一方，我々の培養法をNo dystrophin expressionis detectedin

使用した筋細胞の発達段階による筋細胞骨格蛋白の発現，局在の検討では，DRPが筋芽細胞及び筋管細胞で強mdx myotubes（a，C）．Spectrin（d，e）and

く発現するのに対して，DPは筋芽細胞では発現せず，

myotubes at12days of eu圧ure．

F−aCtin（b，f）are diffusely distributedin
mdx myotubes．There were no difference
Of thelocalization of speCtrin and Fractin
between cultured scn（図1）and mdx（図2）myotubes．Bar＝50JLm．

染色による観察（図1，2）．
mdx培養筋管細胞においては，DPの発現はなく，SP及びACは細胞質内に洒掛侶こあるいは，細胞膜にIinearに存在した．SPとACでは．C0−localization Lない
部分がかなり認められた．
Scn培養筋管細胞においてほ，DPとACでは細胞膜において，多くの部位でC0−localizationしていた．一方．
DPとSPあるいはSPとACではC0−localizationしない部
位がかなり認められた3）．
2）ヒト培養筋細胞におけるDP，DRPの局在（図3．4）
DPは培養筋芽細胞では，発現はなく．未熟な筋管細図31mmunofluorescentlabelling of dystrophin

胞では，滴漫性に細胞質全体に染色され，innervationを（aqc）and doubleLlabelling（d−f）of

受けた筋細胞においては，細胞膜にIinearに染色される

dystrophin and

αrBGT oninnervatedと同時に，神経筋接合部に一致してpletzel様の構造を望

human muscle fibers with nerve terminals

していた．一方，DRPはDPと異なり，筋芽細胞，未熟（arrows）．

な筋管細胞において細胞質全体に強く滴漫性に発現してLinear and discontinuous patterns of dys−

おり，innervationした細胞では，細胞膜上にIinearに発trophin are also observed on the sarcolem−ma（arrowheads）．（d，e．f）A nerve termi−

現し，細胞質内の発現は低下した．更に，神経筋接合部

nal（arrowsin f：the proximal portion ofにおいてDRPはDPと同様に強く発現しており，αL

the nerveis out of focusin this phaser

BGTとの二重染色では，AChRs clustersと一致した発現が認められた3−．

COntraSt Photomicrograph）has positive
reaction of dystrophin（d）and

3）DRPのマウス培養筋細胞における3次元的超徴構（e）．Bar＝10J上m．

ー84−

α−BGT

未熟な筋管細胞で細胞質内に欄漫性に発現し，次第に細胞膜に限局していくこと，筋細胞の発達段階では，DPとSPあるいはDPとACは必ずしもC0−localizationせず，筋細胞の発達過程でのDRP，DP，SPの発現様式は異なることが明かにされた．三次元的な超徴構造による観察では，SPは未熟な筋細胞においても赤血球膜の裏打ち構造にみられるようなIattice−like structureを既に有しており，一万DPは，invivoで見られるfilamentous
networkは認められず．むしろ顆粒状に存在し，ACと考えられるmicrofilamentsがDPと結合される像が観察される．しかしながらDRPは，innervationされていな
い未熟なマウス培養骨格筋では，細胞内のfilamentous
networkとの関係は明らかでなく，細胞内に顆粒状に存在していた．筋細胞が神経支配を受け，自発収縮を開始
し，生体の中で運動器官としての機能を完成させていく過程でDP，SPあるいはDRPなどの細胞骨格蛋白の構
図5

造的相互関係を史に詳細に検討していくことが，これらReplicaelectronmicrographforimmunoper−
OXidaselabelling of DRPin scn myotubesの蛋白の生理的役割及びDMD／BMDなどの筋細胞の変at7days of culture．
The upper side of the plasma membrane
has been removed and the cytoplasm andthe plasma membrane ofculturedmyotubes
can be seen．Granular DAB immuno−
PrOducts（large arrows）arelocalizedirreg−
ularly under the plasma membrane and also
in the cytoplasm．Sma11arrowsindicate
actin−likefilaments．Bar＝0．5JLm．×90000．

PM：Plasma membrane．
性，壊死の磯序を解明するうえで重要と考えられる．
結論
培養下において，DRPはin vivoのdevelopmentalな発現と同様な経過で，成熟すると神経筋接合部に局在するようになる．しかし未熟な筋管細胞を使用した三次元的超倣構造的検討では，DRPは細胞内に顆粒状に存在し，他の細胞骨格蛋白との関係はあきちかではなく骨格筋細胞において，発達段階でのDP．DRP，SPの発現様式は異なると考えられた．
文献l）Park−Matsumoto YC，Kameda N，Kobayashi T
and Tsukagoshi H：Developmental study of theexpression of dystrophinin cultured humanmuscle aneurally andinnervated
図41mmunofluorescentlabelling of dystrophin
reLated protein（DRP）on aneurally（a）and

2）Park−Matsumoto YC，Ohno S，Baba T，Kobayashi

innervated human muscle fibers（b）anddoublelabeuing of DRP andwith fetal rat

Spinalcord．Brain Res565：280−289，1991．

T and TsukagoshiH：Immunocytochemical study

α−BGT onan

Of dystrophinin cultured mouse muscle cells by

innervated human muscle fiber at14days

the quick−freezing and deep−etChing method．

of co−Culture（C，d）．

−85−

HistochemJ24：383−392，1992．

dystrophin and other cytoskeletal proteinSincultured muscle cells．Microsco ResTech（1994in

3）Kobayashi T，Ohno S，Park−Matsumoto YC，KamedaN and BabaT：Developmentalstudiesof

press）．

ー86一21）心症状を呈したDuchenne型筋ジストロフィー甲
症候性女性保因者2症例の骨格筋ならびに心筋における、ジストロフィンとジストロフィン関連蛋白の発現
川 井 尚 臣■研究協力者

鳴尾 隆 子＊ 足 立
西 田 善 彦＊ 乾

はじめにDuchenne型筋ジストロフィー（DMD）は，骨格筋障
害に加え心筋障害もあるため心機能障害をきたすが，DMDの女性保因者の心病変や心機能についてはまだ殆どわかっていない．本研究では，心症状を訴えたDMDの症候性女性保因者2例について，骨格筋と心掛こおけるジストロフィン（Dys）並びにジストロフィン関連蛋

白（DRP）（utrophin）を調べ，これら蛋白質の筋細胞における発現の相互関係，並びにこれらと女性保因者における心症状との関係について述べる．
対象と方法
対象は心症状を望したDMDの症侯性女性保因者の2症例である．
1．症 例
症例1：51歳女性．主訴は胸部圧迫感と動障．長男はDMD患者で22歳にて死亡した．両親の近親婚はない・
本例は幼少より徒競走が遅かった．平成4年5月頃より胸部圧迫感，動侍が出現し，同年6月国療徳島病院に入院した．血圧は160／90皿Hgとやや高かったが，胸腹部には異常を認めなかった．四肢の筋萎縮や筋力低下はな
かったが，誹腹掛こ軽度の肥大が認められた．血清クレァチソキナーゼ（CK）活性値は886IU／ML（正常値38L

克 仁事＊ 赤 池 雅 史＊
俊 夫… 柏 木 節 子＊＊

シソチグラムで後下壁の欠損像が認められた．冠動脈造影では異常所見はみられなかったが，この時右室心室中隔の心筋生検を施行した．骨格筋の病理組織所見では軽度のジストロフィー性変化がみられた（後述）．母親とDMDの長男の両方ともサザンプロット法あるいはPCR
法でジストロフィン遺伝子の欠矢は検出されなかった・
しかし長男の生検筋の免疫組織学ではジストロフィンは欠失していた．
症例2：32歳女性，主訴は不整舵と息切れ．両親の近親婚はない．弟はDMDのため18歳で死亡しており，10歳の長男はDMD患者である．本例は幼少時より徒競走は遅かった．平成3年3月頃より胸部圧迫感と動侍が出現した．32歳時（外来受診時）脈拍60／分，不整脈があったが一般理学所見には異常所見はみられなかった．四肢の筋萎縮は明らかでなかったが，筋力テストで下肢に軽度の筋力低下が認められた．排腹筋の肥大はみられなかった．血清CK活性値は1032IU／ML，血清Mb値150
ng／mlと上昇しており，筋電図は筋原性変化を示した，
心電図ではaVLにQ波および心室性期外収縮がみられた．心エコー検査では左房径は26mm，左室拡張末期径は53mmと拡大し，拡張型心筋症様の所見を示した．駆出率は35％と低下していた．僧帽弁における逆流も認められた．またタリウム201心筋シソチグラムでは前壁，後下壁の欠損像が認められた．骨格筋の病理組織所見で軽度のジストロフィー性変化が認められた（後述）．母親とDMDの長男はサザンプロット法あるいはPCR法でジス
トロフィン遺伝子の欠矢は検出されなかった．しかし長lO9）と上昇，血清ミオグロビン（Mb）値も410ng／ml（正常値50＜）と上昇していた．筋電図では筋原性変化がみられ，心電図では，Ⅰ，II，aVFのST低下，aVLにQ波が認められた．心胸郭比は56％と拡大していた・心ェコー検査では左房径は38m，左室拡張末期径は58mと拡大し，左室後壁のび漫性壁運動の低下もあり拡張型心筋症様の所見がみられた．駆出率は48％と低下しており，僧帽弁における逆流もみられた．タリウム201心筋

男の生検筋（大腿四頭筋）のジストロフィン染色は陰性であった．
以上の成績より，これらの2症例は心症状を望し．心機能低下が認められたDMDの症候性女性保因者と診断した．

★徳島大学医学部第一内科＊■国立療養所徳島病院内科
ヰ国立療養所徳島病院神経内科−87一

2・生検骨格筋組織標本の骨格筋ならびに心筋におけるジストロフィン（Dys）染色ノl

骨格筋および心筋のジストロフィンはNOVO castra

●

一

一

撃

社のDys2抗体を用いてABC法（Avidin−Biotin−
peroxidase Complex method）により検出した．骨格筋
では横断面で細胞膜が一様に全周性に染色される細胞を恕

Dys正常陽性細胞，部分的に染色される細胞をDys−限lPatChy陽性細胞，染色されない細胞をDys陰性細胞とし凛′

た・心筋では，横断面で心筋細胞の全周のうち1／2以t、

上にジストロフィンが染色される細胞をDys陽性細胞，
1／2以下の細胞をDys−PatChy陽性細胞，染色されない細胞をDys陰性細胞とした．抗DRP抗体はMorris博士1一より供与をうけたものを用いた．
成
1．骨格筋と心筋の組織所見

績

田川
図2

DMD女性保因者（症例1）の生検骨格筋（左三角筋）のジストロフィン染色（左）とDRP染色（右）．300倍．Dys陰性細胞のうち少数のDRP
陽性細胞（＊）が認められる．

骨格筋：図l aに症例1の生検三角筋のHematoxylin−
Eosin染色（HE染色）を示した．筋線経の軽度の大小不同，円形化がみられたが，壊死・変性細胞や再生細胞はほとんどみられなかった．症例2でも同じ所見がみられた．
心筋：図3aほ症例1のHE染色であるが，筋線経の軽度の大小不同がみられたが，問質の増殖はごくわずかであった．
2．骨格筋と心筋のジストロフィン染色像およびDRP
染色像
骨格筋：図1bに骨格筋のDys染色像を示した．横断面で細胞膜が一様に染色されるDys正常陽性細胞，部分的に染色されるDys−patChy陽性細胞，全く染色されない
ヽ

十㌦慧

H

的

図3a DMD保因者（症例1）の生検心筋（右心室）の染色．370倍．筋線経の軽度の大小不同が認められるが，変性，壊死細胞はみられない
問質の線維化はごくわずかである．
b DMD女性保因者（症例1）の生検心筋（右心室）のジストロフィン染色．370倍．Dys陽性
細胞，Dys−PatChy陽性細胞，Dys陰性細胞が認められるが，Dys陰性細胞が多い．

J＼．

図1a DMD女性保因者（症例1）の生検骨格筋（左三角筋）の染色．250倍．筋線経の軽度の大小
不同，円形化が認められる．壊死・変性細胞や再生細胞はほとんど認められない．
b DMD女性保因者（症例1）の生検骨格筋（左三角筋）のDys染色．250倍．Dys正常陽性細胞（＋），Dys−patChy陽性細胞（±），Dys陰性細胞（−）がみられる．

図4 DMD女性保因者（症例1）の生検心筋（右心室）のジストロフィソ染色（左）とDRP染色（右）・370臥一部のDys陰性細胞にDRPが認
められる．

−88−

が多くみられた．Dys陰性細胞ではDRP陽性細胞がDys陰性細胞などが認められた．図2は連続切片のDys
染色とDRP染色であるが，Dys陰性細胞のうち極少数（8％）にDRPが認められた．症例2でも同様の所見が1．5％と少なかった（図6）．
考認められた．
心筋：心筋のDys染色像（図3b）では，Dys陽性細胞，
Dys−patChy陽性細胞，Dys陰性細胞が認められた．図4
は連続組織切片のDys染色とDRP染色であるが，心筋細胞のDys陰性細胞の少数（2％）にDRPの染色が認められた．
3．Dys染色性の異なる筋細胞の比率
骨格筋：D夕S正常陽性細胞がこれら2症例で，それぞれ18．2％，36．5％，Dys−patChy陽性細胞が79．3％，52．
2％，Dys陰性細胞が2．5％，11．3％認められた．このよ
うにDys−patChy陽性細胞が多く，必ずしもDys陽性細胞と陰性細胞のモザイク様の様相は示さなかった．Dys陰性細胞のうちでDRP陽性細胞はそれぞれ0．2％，2．6％と少数認められた（図5）．
心筋：Dys陽性細胞は23．3％，Dys−patChy陽性細胞は1．3％，Dys陰性細胞75．4％と骨格掛こ比べDys陰性細胞

察

本文で述べたDMD保因者の2症例は心電図，心臓超音波検査，心臓核医学検査などの所見から左室後下壁を中心としたDMDと同部位に心筋障害のあることが示唆された．心症状を示したDMD保因者の報告は，文献的には少なく，それらのうち生検心筋組織についてジスト
ロフィン染色を行った報告はわずか2例祁）である．
本2症例の骨格筋では従来報告一）されているようなジ
ストロフィン陽性細胞と陰性細胞のモザイクではなく，
Dys−patChy陽性細胞が多くみられ，そして正常陽性細胞が比較的少なかった．
Lyon仮説5号こよると胎生期の初期に雌の2本のⅩ染色体のどちらか一方のⅩ染色体が不活化される．従ってDMD保因者の骨格筋の核にはジストロフィンの生成に関与している核と関与していない核があると推定される．骨格筋は多核細胞であるため，上記の2種煩の核が混在している筈であり，ジストロフィンがpatchyに染色される細胞が存在すると推定される．一方，心筋ではDys陽性細胞は約25％と少なく，Dys陰性細胞が75％と多かった．このことが木例の心症状の発現および心機能低下の主原因になっているのではないかと考えられる．
SchmidtLAchertら6）は心症状のないDMD保因者の心筋の60％がDys陰性細胞であると報告していることから，心筋におけるDys陰性細胞の割合がある一定の割合を越えると心症状を現すものと考えられる．勿論，血圧，そ図5

症例1症例2

症例1症例2

症例1症例2

DYS（＋）

DYS（±）

DYS（−）の他の因子も心機能に影響を与えることは考慮しなければならない．心筋細胞は単核細胞であるので，25％の心筋細胞の核は正常に働き，残りの75％には不活化が生じ

骨格筋細胞のジストロフィン染色像とDRP染色像の成績．Dys−patChy陽性細胞がそれぞれ79．3％，52．2％と多くみられる．

ていることが考えられる．
一万DRPは，第6染色体6q24上にコードされ，Dysとほぼ同じ分子量でありC末端部の80％のアミノ酸配列がジストロフィンと同じ蛋白である7）．DMD保因者の骨格筋ではDys陰性細胞のうち15．5％はDRP陽性であっ
たが，残りの84．5％はDRP陰性であった．加えて心筋ではDys陰性細胞のほとんどがDRP陰性であった．DRP
はDys欠矢に対して代償的に増加すると報告されているが，我々の症例ではDys陰性細胞の大部分がDRP陰性であることから，必ずしもDRPはDysに代償性に増加するものであるとは言えない．

DYS（＋）DYS（±）DYSト）

DYS（＋）DYS吐）DYS（−）

骨格筋

心 筋

図6

ま

と

め

心症状を星したDMD症供性女性保因者2例の骨格筋
並びに心筋におけるジストロフィンとDRPの発現を検

DMD女性保因者（症例1）の骨格筋細胞および心筋細胞のジストロフィン染色像とDRP染色像の成績．骨格筋に比べ心筋ではDys陰性細胞が75．4％と多い．

討し，これらの例の骨格筋症状や心症状は骨格筋や心筋のDys陰性細胞が比較的多いことによると思われた．まー89−

筋ジストロフィン．日本心臓病学会雑誌22（supp1

たDys陰性細胞の大部分はDRP陰性であることから，
DRPはジストロフィンの欠矢に対して必ずしも代償性29）：151，1992．

に増加したものではないと考えられた．

4）Arahata K，Ishihara T，Kamakura K，Tsukahara
T，Ishiura S，Baba C and Matsumoto T：Mosaic

文献expression of dystrophinin symptomatic carriers

1）Man N，EllisJM，Love DR，Davies KE，Gatter
KC，Dickson G and Morris GE：Localization of

Of Duchenne muscular dystrophy．N EnglJ Med

theDMDLgene−enCOdeddystrophin−relatedprotein5）Lyon MF：X，Chromosome inactivation andusing a panelof nineteen monoclonalantibodies：developmentalpattersinmammals．BioIRev47：

Jan19：138，1989．

1．1972．

Presenceat neuromuscularJunCtion，in the sarc0−
1emma of dystrophic skeletal muscle，in vascular6）Schmidt−Achert M，Fischer P，Muller−Felba W，and other smooth muscles，andin proliferating

Mudra H and Pongratz D：Heterozygotic genebrain celllines．J CellBiol115：1695，1991．

expressionin endomyocardial biopsleS：A new2）山崎元義，松原奈絵，神田武政，夏井正明，渡辺賢−：心不全にて発症したDMD manifesting carrierの一例一骨格筋および心筋の免疫組織学的検討−．

diagnostic tooI confirms the Duchenne carrier
StatuS．ClinInvestig71：247，1993．
7）Love DR，Hill DF，Dickson G，Spurr NK，Byth筋ジストロフィーの臨床病態と迫伝および疫学に関する研究 平成2年度研究報告書，1991，p258．
3）猪又孝元，鈴木正孝，官北靖，小山仙，渡辺賢一：Duchenne型筋ジストロフィー保因者の心筋と骨格

BC，Marsden RF．Walsh FS，Edwards YH and
Davies KE：An autosomal transcriptin skeletal
musclewithhomologytodystrophin．Nature339：
55，1989．

ー90−22）Duchenne型筋ジストロフィーの中枢神経系におけるDystrophin（Dy）とDy閑適蛋白
内

研究協力者

徳 永

野

誠＊

誠＊ 箕 田 修 治＊ 三 池 輝 久㌘＊＊寺 本 仁 郎＊＊ 安 藤 正 幸＊

1987年にHoffmanら1）によりdystrophinが発見されて体表面及び樹状突起に小斑点状に局在がみられたが，知以来，最近の6年間に得られた多くの知見から，能低下を望したDMDでは全例欠如していた（図1）．

dystrophinは筋の収縮と弛緩の過程で形質掛こ弾力を与DRPは検索した全例で脳軟膜や血管壁，あるいは脈絡膜

え，またイオンチャンネルやレセプターなどの膜構成成に局在がみられたが，neurOnには局在はみられなかった分を細胞骨格に結びつける幌骨格構造として参加し，これらの成分に対して構造的かつ規制的役割を果している（図2）．Immuno blotでは正常対照及びDMD以外の神経筋疾患患者では427kDのdystrophin bandがみられた可能性が推定されている2ゝ3㌧ ただその正確な生理機能は
今日なお不明であり，近年モデル動物を用いた研究では筋肉組織のみならず，収縮・弛緩に無関係と考えられる
中枢神経系でもdystrophinの局在が明らかにされ，これらの組織においてはdystrophinはさらに多様な生理機能に関与している可能性がでてきている．
Dystrophinの発見以前よりDuchenne型筋ジストロ
フィー（DMD）では低IQないし精神発達遅滞児の頻度が高いことが知られていたが4），本症の疾患過程に密接した一次的現象か，教育機会の不足などによる二次的影
響なのか，意見の一致をみていない．
今回まだ明らかになっていないヒトの中枢神経系におけるdystrophin，及び第6染色体にコードされ，dystro−
phinと頬似の役割が推定されているdystrophin−related
protein（DRP）の局在並びに特性を明らかにするため，免疫組織科学及びlmmuno blotによる検索を行った．
対象と方法
正常対照5例（42〜74歳），運動ニューロン疾患4例
図1Immunohistochemicallocalization of dys−

（53〜71歳），筋緊張性ジストロフィー1例（54歳），
DMD3例（17〜26歳，全例低IQ）の剖検脳（前頭葉，頭trophin and dystrophin−related protein

項菜，後頭葉，小脳，脊髄）について，7種の抗（DRP）in the cerebral cortex（frontallobe）

Of normalcontroIs（A−C且F）and a patientwith amyotrophic lateral sclerosis（D），
1abelledwith preimmune serum（A），antト

dystrophin抗体，2種の抗DRP抗体による免疫覿織化学
染色，Immuno blotによる検索を行った．

body6−10（B，C，D），antibody

結果
正常対照及びDMD以外の神経筋疾患患者では，

LDP（E，F）．

Note the punctateimmunoreactivity along
the cell bodies and dendrites of the cereb−

ralcorticalneurons（arrows）．With antibody

dystrophinは大脳のneuronや小脳のpurkinje細胞の胞

LDP■，Small

arteties

werepositively

Stained，but neuronal cells were negative．

＊熊本大学医学部第一内科
桝国立療養所再審荘病院＊＊＊熊本大学医学部発達小児科

A，C，D，F x785：B，E x238

−91−

㍉ A

㌔♂㌔♂㌔♂㌔♂㌔♂

●

■

●

・−

l

D

圧

才一−

∴ミ

∬﹁羊 ．二才㌧

■
I

■畢

▲＿

＿組

1

antibody

ILDP

6

7

8

9

6LlO）．no

Stainedwith antibody6−10（lanesl to4）．

，the

10

and2・frontallobe；lanes3and4，parietal
lobe；lanes5to10，frontallobe．Blotswere

apparentimmunoreactivlty WaS nOtedin
DMD・With5anti−（C−F）．With

dystrophin antibody（antibody

4

COntrOIs and DMD．Normal control，lanes
l，3，5．7，9：DMD，lanes 2，4，6，8，10．Lanesl（frontalJobe）of Duchenne muscular dys−
trophy（DMD），labe11edwith antibody6−10
LDP3

図3Immunoblot of the brains from normal

図21mmunohistochemicaHocalization of dysr
trophin and DRPin the cerebral cortex（A，B）．antibody

2

antibody

LDP（lanes5，6），Dys−2（lanes

7，8），and antibodyIV（lanes

vascularWalls（C），pia mater（D），andchoroidplexus（E．F）were positive，but the neuronal cells

9，10）．The

dystrophin bandis clearin the normal

COntrOl brain（lanesl，3）・With antibody

Were negative．A，C，D．Ex238：BX785：F

LDP

at

X476

427

・DRP

band

was

noted

very

faintlykDa on the actual nitrocellulose

membraneinbothnormal（lane5）andDMD

が，DMDでは欠如していた．DRPは痕跡的に認められ，正常対照とDMD間で明らかな量的違いはみられなかった（図3）．
考

brain（1ane6）．

る可能性が充分考えられる．共同研究者の池田らが，
DMD患者ではagematchedcontrolに比較して，聴覚刺激P−300に異常が認められることを明らかにしている

察

著者らは1989年にマウスの脳にもdystrophinが局在

が，dystrophinはpostsynapticmembraneにおいてレセ

し，一方mdxマウス脳ではdystrophinを欠如することをプターのようなシナッブスの構成成分を正しく配置する

報告した5）・同様の報告は既にHoffmanらによっても行のに関与している可能性があり，DMD患者では本来われている6）・ただヒトの脳についての成績は，検体入neuronに存在すべき脳型dystrophinを欠如しているた

手が困難なこともあって，殆んど報告がない．今回健常

め，レセプターの不安定化を招き，ひいては認知機能の対照，DMD，及びDMD以外の神経筋疾患の中枢神経系について検索したが，dystrophinは健常者及びDMD以DMD，BMDの脳における各種のレセプターの分布，知外の神経筋疾患患者では，neurOnの胸体表面に小斑点状

能障害程度とdystrophinの質的・量的異常の関連を詳細に局在し，知能低下を有するDMDでは全例dystrophinを欠くことが明らかになった．正常マウス脳の免疫電顕に検討することが，まだ明らかになっていない脳型
dystrophinの生理機能を解明する上でも重要と考えられによる検索でLidovら丁）はneuronのpost synaptic
membraneにdystrophinが局在することを報告している

る8トID）

が，Lidovらの我々の免疫染色パターンの類似性から，ヒトでもdyS土rPP址一はpost野naPticmembraneに存在す−92−

異常やIQ異常が生じる可能性が示唆された．今後，謝辞：抗DRP抗体を供与いただいた石浦章一先生（東京大学応用微生物研究所）に深謝いたします．

文

Pollina CM and Kunkel LM：Cell and fiber−tyPe

献distribution of dystrophin．Neuronl：411−420，

1）Hoffman EP，Knudson CM，Campbell KP and1988．

KunkelLM：Subcellular fraction of dystrophin to
the triads of skeletal muscle．Nature

7）Lidov HGW，Byers TJ，Watkins SC and Kunkel

330：754−

LM：Localization of dystrophin to postsynaptic

758，1987．

2）Koenig M and KankelLM：Detailed analysis ofreg10nS Of nervous nevrons system corticalneurons．Nature348：725−728，1990．

the repeat domain of dystrophin reveals four8）Uchino M，TeramotoH，Naoe H，Miike T，Yoshi−

potentialhingesegmentsthatmayconferflexibili−
ty．J BioIChemoka K and Ando M：Dystrophin and dystrophinー

265：4560−4566，1990．

3）Byers TJ，kurkel LM and Watkins SC：The

related proteinin the centralnervous system ofsubcellular distribution of dystrophinin mousenormal controIs and Duchenne muscular dystro−
phy．Acta Neuropatho11993（inpress）．

skeletal，Cardiac，and smooth muscle．J CellBiol

9）Uchino M，Teramoto H，Naoe M．Yoshioka K，

115：411−421．1991．

4）Prosser EJ，Murphy EJ and Thornpson MW：

Miike T and Ando M：Localization and charac

Intelligenceand the gene for Duchenne muscularteri−Zation of dystrophinin the central nervous

dystrophy．ArchDis Child44：221−230，1969．

systemofnormalcontroIsandDuchennemuscular
dystrophy．JNeuroINeurosurg Psych（in press）

5）Uchino M，Araki S，Miike T，Teramoto H，Nakamura T and Yasutake T：Localization and10）Uchino M，Yoshioka K，Miike T，Ando M，characterization of dystrophinin muscle biopsy

Tokunaga M，Uyama E，Teramoto H and Naoe

specimensfromDuchennemusculardystrophyand

H：Dystrophin and dystrophin−related proteinin

variousneuromusculardisorders．MuscleNerve12：

the brains of nomaland mdxmice．MuscleNerve

1009−1016，1989．

（in press）．

6）Hoffmann EP，Hudecki MS，Rosenberg PA・−93一23）Utrophin（dystrophin−related protein）の抽出と血管内皮細胞における同定
清 水 輝 夫■

研究協力者

松

村

喜一郎＊

山

Douglas M．Shasby■■

田

広

樹＊

Kevin P．Campbell…

bindingassay，形態分析等に有用であろう．

Utrophin（dystrophin−reIatedprotein）はdystrophinの常染色体性ホモローグであるが，F−aCtin結合部位のあUtrophinが肺に多い理由として，血管内皮細胞に発現るN−terminaldomainと．細胞膜糖蛋白複合体との結合している可能性が考えられた．肺動脈血管内皮細胞を培部位のあるcysteineTrichandC−terminaldomainsにおい養，digitoninもしくはTriton−Ⅹ100で可溶化後，anti−て特にホモロジーが高い1）2）

utrophinimmunoaffinitybeadsで免疫沈降実験を行った
結果，同細胞におけるutrophinの発現を確認した5）．

我々はutrophinが神経筋結合部において，dystrophin
群と複合体を形成していることを報告した3）一）．またUtrophinは静脈系，毛細管系血管内皮細胞にも発現していた5）．

Duchenne型筋ジストロフィー（DMD），mdxマウスのUtrophinが血管内皮細胞に発現していることはDMD

大径骨格筋ではdystrophinの欠如がdystrophin結合細胞治療としてのutrophin upregulationに重大な問題を投げ

膜糖蛋白の著明な減少を釆たすのに対して，障害の軽いかける．すなわち筋のみでなく血管内皮細胞でも細胞骨

小径骨格筋や心筋ではutrophinが筋細胞膜全体に分布

格蛋白であるutrophinが過剰発現した場合，血流に影響し，dystrophin結合細胞膜糖蛋白も良く保たれているこを与えかねないからである．よってDMD治療法としてとより，utrOphinがdystrophin欠損をある程度代償できる可能性を指摘した3）．このことはutrophinをdystrophin

応用するには筋特異的にutrophinをupregulateする手法

欠損筋すべてで高度にupregulateすることができれば，upregulationを観察する系の開発．②各組織におけるDMD治療の1つになり得る可能性を示唆する．そのた

utrophinの生理機能の解明6）に取り組んでいる．

と同一，もしくは免疫学的に析似した筋細胞膜蛋白の一の開発が必要であろう．現在我々は，①utrophin

めにはutrophinの組織・細胞内分布，生理琉能等の特徴

文を明らかにすることが必要である．

献l）TinsleyJM，Blake DJ，Roche A．et al：Nature

我々はまずutrophinの組織分布を知るために，各組織の膜分画をイムノブロット法で検討した．その結果，

360：591−592，1992．

2）SuzukiA，Yoshida M，Yamamoto H，etal：FEBS

utrophinの最も多い組織は肺であり，筋がこれに続いLett308：154−160，1992．

た5）．そこで骨格筋，肺よりのutrophinの抽出，生化学的

3）Matsumura K，ErvastiJM，Ohlendieck K，et al：

特徴付けを試みた5）．Utrophinとdystrophinは骨格筋よNature360：588−591，1992．

りpHllのアルカリ処理で抽出され，heparin−agarOSe

4）ErvastiJM．Ohlendieck K，Kahl SD，et al：columnに吸着した．これはutrophinがdystrophin同様

Nature345：315−319，1990．

細胞骨格蛋白であることを示唆する．肺のutrophinも同じ挙動を示した一方，肺にdystrophinは認められなかっ

5）Matsumura K，Shasby DM，CampbeII KP．FEBS

た．Heparin−agarOSe COlumnの0．6M NaCl溶出分画を
anti−utrOphinimmunoaffinitycolumnにかけpH3で溶出6）Matsumura K，Yamada H，Shimizu T，et al：

Lett326：289−293，1993．

した．その結果，骨格筋，肺両組織より抽出された

FEBS Lett334：281−285，1993．

utrophinはともに分子量約400kDaの蛋白であった5）．抽出されたutrophinはF−aCtinや細胞膜糖蛋白複合体との■帝京大学医学部神経内科
桝University oflowa■■■HHMl．University ofIowa−94−

V． D A G

24）抗dystrophin−aSSOCiatedglycoproteinペプチド抗体によるヒト生検筋の免疫組織化学的検討

誠ゆ俊

谷木谷

●

貯

■

吉

●
﹂■

■

貯甘才子

隆拓義信

泣鈴熊

山

若

見林岩杉

自小黒三

研究協力者

二● 武 田篤■■

め…■長谷川修…■

幸† 山 下 純 正††するために，ヒト生検骨格筋に免疫染色とイムノブロッ

例，小児正常対照8例，計68生検筋を使用した・DAGの抗体は，DAGprecursorproteincDNAの43KDAGに相当する部分のC末端15個のアミノ酸（アミノ酸番号880−894）2）よりペプチドを合成し（図1），これにthyroglo−
bulinをハブテンとしてつけ羊に免疫して得た．抗43K
DAG抗体のELISAtiterは72000倍であった．43EDAGの他，Hoffman博士より供与された羊抗60Kジストロ
フィン抗体，ウサギ抗ラミニソ抗体（マウスEHS
sarcoma由来）にても免疫染色した．43KDAGの免疫染
色は約6／jm凍結切片をアセトン固定，正常ウサギ血清
により非特異的染色をブロックした後，200倍希釈した
同抗体を室温1時間，蛍光標識2次抗体を室温1時間反応させ観察した．イムノブロットは，一部の正常対照筋にて施行した．凍結状態で粉砕した生検筋（約100mg）
を約10倍量の処理buffer（0．1MTris−HCl，pH8・0含10％

トを施行した．

SDS，10mM EDTA，1％

はじめにジストロフィンはそのN末端側でF−アクチンとリンクLC末端側ではdystrophin−aSSOCiated glycoproteins（DAG）と複合体を形成している1㌧DAGは筋細胞膜を貫通し，細胞外マトリックスであるラミニソとリンクすることによりジストロフィンとともに筋細胞膜の安定性に重要な働きを担っているものと考えられる2〉・また，
ァフリカのSeVere Childhood autosomal recessive

musculardystrophy（SCARMD）では50KDAGの欠損が一次的な原因と想定されている3）・さらにDuchennC型
筋ジストロフィー症（DMD）とそのモデル動物である
mdxマウスでもDAGの減少が指摘され4）．その病態との関連が注目されている．我々は，dystrophinopathyおよび他のヒト筋疾患におけるDAGの存在様式を明らかに

2−メルカプトエタノール，

10％グリセロール）で抽出し，2分間煮沸水中で処理

対象及び方法後，遠心上清として得た．SDSポリアクリルアミドゲル

DMD，Becker（BMD），福山（FCMD）型筋ジストロ
フィー症それぞれ10，6，9乱DMD保因者1例，他の電気泳動は5〜20％濃度勾配ゲルを用いてLaemmliの方法によって行った．泳動後蛋白質はホライズプロット
法によりゲルからP膜（アトー社製）に転写し，抗43K

神経筋疾患19例（肢帯型筋ジストロフィー症1，顔面肩DAG抗体と反応後，発色するバンドを得た．

甲上腕型筋ジストロフィー症1，筋緊張性ジストロ
フィー症3，多発筋炎又は皮膚筋炎3，rimmed

結vac。。1eを伴う遠位型筋症2，ミトコンドリア筋症2，

果

ネマリンミオパチー1．アルコールミオパチー1，筋萎

抗60Ⅹジストロフィン抗体に対する免疫染色性はこれ

縮性側索硬化症3，末梢神経疾患2），成人正常対照15までの諸家の報告と一致した．免疫染色で，43EDAG

43X DAG Pro−Lys−Asn−Het−Thr−Pro−nr−r用−Ser−Pro−Pro−Pro−Tyr−V81−Pro
図1合成ペプチドのアミノ酸配列■昭和大学藤が丘病院神経内科＊■昭和大学藤が丘病院臨床病理■■■横浜市立大学医学部小児科
事＝■横浜市立大学医学部神経内科†愛知県コロニー中央病院小児神経科††神奈川県こども医療センター神経内科†††神奈川県こども医療センター整形外科

ー97−

図2

ヒト生検筋の43EDAG免疫染色
A：正常対照筋．全周性，明瞭に染色されている
C：BMD筋．patchy，faintに染色されている

ー98−

B：DMD筋．染色性が低下している
D：FCMD筋．染色性は比較的保たれている

に対する抗体は，正常対照およびdystrophinopathy以外

してはHayashiら8）がFCMDにおいてMサブユニッTlのの疾患対照筋の筋表面膜を連続性に，明瞭に認識した減少を指摘しているが，今回我々が使用した抗体はサブ（図2A）．DMD筋では正常対照と比較し，染色性が中ユニットを特異的に認識する抗体ではないため異常を認めなかったものと思われた．

等度から高度に低下していた（図2B）．抗60Ⅹジスト
ロフィン抗体陽性で，ジストロフィンC末端に対する抗文

体で陰性に染色されるDMDl例でも，DAGの染色性は

献1）ETVaStiJM and Campbell KP：Membrane orga−

高度に低下していた．BMD筋では正常と区別できない染色性を示す症例と，抗60Ⅹジストロフィン抗体の染色nizationofthedystrophin一glycoprotein

complex．

Cel166：1121−1131，1991．

性と同様のfaint，PatChyな染色性を示す症例とが存在した（図2C）．FCMDでは染色性が，軽度低下するもか

2）Ibraghimov−Beskrovnaya O，ErvastiJM，Leveille

なり保たれている症例が多かった（図2D）．ラミニン

CJ，et al：Primary structure of dystrophin−の免疫染色性は正常対照，疾患対照，DMD，BMD，

associated glycoproteinsIinking to the extracellu−

lar matrix．Nature355：696−702，1992．

FCMDとも筋線維周囲，基底膜に一致して明瞭に染色さ

3）Matsumura K，Tom6

れ，明らかな異常を認めなかったが，DMD，FCMDでは染色部分の幅がやや厚い印象を受けた．DMD保因者のDeficiency of the

FMS，Collin H，et al：
50K dystrophin−aSSOCiated

1例では，ジストロフィン欠損線椎には，43EDAGの

glycoprotein in severe childhood autosomal

染色性が低下している筋線経と，かなり保たれている筋

recessive muscular dystrophy．Nature359：320−

線経と両者が存在した．イムノブロットでは43kDaの位

322．1992．

4）Ohlendieck K，Matsumura K，Ionasescu VV，et

置に1本のバンドを検出した．

al：Duchenne muscular dystrophy．Deficiency of考

dystrophin−aSSOCiated proteinsinthe sarcolemma．

察

Neurology43：795−800．1993．

Ohlendieckら4）は，DMDおよびmdxマウスの筋細胞膜でdystrophin−aSSOCiatedproteinS（DAP）が著減していることを示し，これはジストロフィン欠損の二次的現象

5）Yoshida M，Mizuno Y，NonakaI，et al：A dys−
trophin−aSSOCiated glycoprotein，A3a（one ofと考えている．一方，Yoshidaら5）はDMDでは43K

43DAG doublets），is retained

DAGがかなり保たれていることを示し，前者との違い

musculardystrophymuscle，JBiocheml14：634−

inDuchenne

639，1993．

は抗体の差に起因するものと推定している．我々は，今回43KDAGのC末端の一部に対応する合成ペプチドを6）Matsumura K，NonakaI and Campbell KP：

羊に免疫して得た抗体でDMD筋を免疫染色したとこ

Abnormal expression of dystrophin−aSSOCiatedろ，DMD筋では43KDAGは存在するも′のの正常対照とproteinsinFukuyama−type COngenital muscular

比較するとかなり染色性が低下していた．また，BMD
では43EDAGはかなり保たれている症例が多かった．

7）Arahata K，Hayashi YK，Mizuno Y，et al：

我々の結果からは，dystrophinopathyにおける43K

Dystrophin−aSSOCiated glycoprotein and dystrophin

DAGは，ジストロフィンほどではないが，ジストロフィ

c0−localisation at sarcolemmain Fukuyama

ンと関連した何らかの量的変化を生じているものと考えられた．また，Matsumuraら6）はFCMDでDAGが著減

congenitalmusculardystrophy．Lancet342：623−

していることを示し病態との関連を指摘している．今回

8）HayashiYK，EngvallE，Arikawa−Hirasawa E，etdystrophy．Lancet341：521−522，1993．

624，1993．

の我々の結果はArahataら7）と同様に，FCMDにおける

al：Abnormallocalization oflaminin

43EDAGは若干の低下を見るものの比較的保たれていmuscular dystrophies．J NeuroIScil19：53−64，

たが，FCMDにおける43KDAGの存在様式については，

1993．

今後更に検討を要するものと考えられた．ラミニソに閑ー99−

subunitsin25）Doubleimmunogoldlabelling法による43kDa
dystrophin−aSSOCiated glycoproteinとdystrophinの正常骨格筋細胞における超微局在
一免疫透過電顕的検討一
若 山 菖 弘＊
研究協力者

泣

谷

誠

二韓

武 田

緒

日

見

隆

弘＊

篤招 鬼 木 弘 明粕＊に免疫して得た．ELISA抗体価は×72，000であった．

言

Duchenne筋ジストロフィー症で欠損するdystrophin

lmmunoblotの試料は，凍結状態で粉砕したマウス骨格と骨格筋細胞膜でlinkすると考えられているものには筋（約100mg）を約10倍量の処理buffer（0．1M Tris−

dystrophin associated glycoproteins（DAG）とdystrophin

HCl，pH8．0含10％SDS，10mMEDTA，1％2−メルカ

associated proteins（DAP）とがある．その分子量は156，59，50，43，35，25kDaであり，それぞれ156−
DAG，59−DAP，50−DAG，43−DAG，35−DAG，25−
DAPと呼ばれている．59−DAG（Al）は骨格筋細胞膜の周辺蛋白であるが，50−DAG（A2），43TDAG（A3），35−DAG（A4），25−DAG（A5）は膜内粒子であるとされる．一方156−DAGは骨格筋細胞外の膜周辺蛋白であり，この156−DAGと43−DAG（A3）は1つのcDNAよプトエタノール，10％グリセロール）で抽出し，2分間煮沸水中で処理後遠心上宿として得た．SDSポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動は5−20％の濃度勾配ゲルを用いてLaemmIiの方法によって行った．泳動後蛋白質はホラ
イズプロット法でゲルからP膜（アトー社製）に転写
し，抗体と反応後発色させた．
正常マウス骨格筋の光顕レベルでの免疫蛍光抗体法による標本は，6FLmの厚さの骨格筋のcryostat横断標本

り翻訳され，156−DAGはその後dystroglycanとも呼ばを間接蛍光抗体法により作製した．

れ基底膜のIamininと結合し1㌧43−DAGは細胞膜を貫通（2）lmmunogoldJabelling法による2重免疫電顕壕本のし細胞膜の内側でdystrophinと結合していると考えられている．今回我々は156−DAGと43−DAGの前駆体蛋白作製について6匹のmdxコントロールマウス大腿四頭筋を冷却しのcDNAより，それぞれのアミノ酸配列の一部を読取りた4％パラフォルムアルデヒド0．1Mリン酸バッファーペプチドを合成し，ニュージーランドにて羊に免疫しそ

液で氷漬して1時間固定後，4回PBSで洗浄，液体窒素で冷却したイソペソタン中で凍結後，CryOStatで厚さ約の抗体を得た．これらの抗体の超徴局在とdystrophinとの相互関係を検討する目的で本研究を行ったが，156−
DAGはimmunoblotが今ひとつうまくいかなかったの

kDa
97−

で，ここでは43−DAGの所見を述べたい．

66−
45−書●．

材料と方法（り 合成ペプチドとその性状分析

31−

ペプチドは，DAG precursor protein cDNAより
Ibraghimov−BeskrovnayaO2）らにより決定されたアミノ酸配列の43−DAGについて，アミノ酸番号880−894に相

21−
14−

当する部分（PKNMTPYRSPPPYVP）を合成し，ハブテンとしてthyroglobulinをつけニュージーランドにて羊
図1mdxコントロールマウス骨格筋のイムノブロットでは43kDaの分子量の蛋白を認識するバンドが得られた．

■昭和大学藤が丘病院神経内科
綿昭和大学藤が丘病院臨床病理…＊昭和大学藤が丘病院電覇室

ー100−

−

●

■

粧
図2 A−C：Doubleimmunogoldlabelling法によるウサギ抗6−10dystrophin抗体と羊抗43−DAG抗体の存在部位を示す．
A：10nm（dystrophin），5nm（43−DAG）金粒子は正常マウス骨格筋の細胞膜の内側に細胞膜に随伴して認められた．2Aの写真右半の大きい矢印は10nm，小さい矢印は5nm 金粒子を示す．×168，000
B：2Aと同様な所見であるが，それに加え5nm，10nm金粒子が20nm前後の間隔を置きdoubletの形で存在している．×188，000

一101−

∩■∪
恥，ノ▼、、■

図2

C，C′：2CはC′の矢印の部分の拡大像で，骨格筋細胞膜の内側に細胞膜に随伴して5nm，10nm金粒子がdoubletの形で3細．存在している．CX188，000，C′×20，000
D：Doubleimmunogoldlabelling法による正常ウサギ．正常羊血清による免疫電車所見．この正常血清による対照標本には金粒子のsignalは認められない．×168，000

ー102−lFLmに細切した．この標本を冷却したPBSで更に4回洗浄し，5％正常ヤギ，ロバ血清混合液で30分間室温にて反応させ非特異的反応を除去した．次に1次抗体として（トa）100倍希釈羊抗43−DAG抗体，（Ⅰ−a）500倍
又は1000倍希釈ウサギ抗6−10dystrophin抗体3）（Dr．
Byersらより供与）を使用し，（Ⅰ−a）のみ又は（1−a）（Ⅱ−a）の混合液とColdroomで24時間反応させた．
反応後試料を冷却PBSで1次抗体を十分洗浄除去する
ため4回よく洗浄した．2次抗体は（Ⅰ−b）20倍希釈5nm金コロイド標識ロバ抗羊抗体（Bio Cell），（Ⅰ−b）
20倍希釈10nm金コロイド標識ヤギ抗ウサギ抗体（Amersham）を使用し，1次抗体で（I−a）のみを使用した標本は2次抗体は（トb）を使用．1次抗体で（トa）と（Ⅰ−a）を使用した試料は2次抗体では（I−b）と（Ⅱ−b）を使用し，その混合液とcoldroomで24時間反応させた．また免疫対照標本として抗43−DAG
抗体のみの染色標本に対しては正常羊血清で，また抗43−DAG抗体と抗6−10dystrophin抗体染色標本に対しては正常のウサギと羊血清と反応させた骨格筋標本を作製した．
これらすべての標本を冷却PBSで4回洗浄し，更に冷却2．5％グルタールアルデヒド溶液で30分間固定し，洗浄した．後固定は冷却した1％オスミウム酸液で1時間行い，上昇系列のアルコールとプロピレンオキサイドにて脱水，エボンに包哩し，厚切り，薄切後，無染色にて電顕にて観察した．

た（図2D）．
考察

正常骨格筋細胞膜蛋白であるdystrophinと，これにlinkしている膜蛋白や他の細胞骨格やその細胞外基質との関係を検討することは，dystrophinの機能を追及する意味においても重要と考えられる．これらの関係は生理学的また生化学的手法を用いてよく研究されているが，
超徽形態学的側面よりの研究は少ない．この点を研究する一環として我々は，今回156−DAGと43−DAGの前駆体蛋白をコードするcDNAから156−DAGや43−DAGのアミノ酸配列の一部を読取り合成ペプチドを作製，
thyroglobulinをハブテンとしてつけ羊に免疫し抗体を待たが，156−DAGに対するものはimmunoblot解析が今ひとつうまくゆかず，現在156−DAGの別の部位のアミノ酸配列を読み，合成ペプチドを作製し，同様にしてニュージーランドにて羊に免疫中であり，平成6年初頭には入手出来る予定である．一万43−DAGに対する抗体はすでに以上で記したように使用可能であり，結果の項のような研究成果を得た．
抗6−10dystrophin抗体はdystrophinのアミノ酸配列の約2000〜3100部分を認識するので，この抗dystrophin
抗体と抗43−DAG抗体を用いた金コロイド標識2重免疫
電顕所見で見られた約15〜30nmの間隔を置き，5nm，10nm金粒子がdoubletの形で存在する所見はdystrophinと43TDAGがlinkしていることを示唆する所見として興
味深い．

結
果
（1）rmmunoblot及び光顕蛍光抗体染色所見
Immunoblotでは骨格筋の43−kDaの成分を認識する
bandが認められた（図1）．光顕蛍光抗体染色標本では骨格筋の周辺部に抗体の認識部位が認められた．
（2）lmmunogoldlabe ing法による2重免疫電顕標本
所見
抗43−DAGだけの免疫染色標本では抗体の存在を示す
5nmの金粒子は骨格筋細胞膜の内側に細胞膜に随伴して認められた．筋細胞の筋原線経，小胞体，横管などの内部構造には有意なシグナルは認められなかった．ま今後同様な金コロイド標識法を用いた2垂免疫電顕法l）を用いて，43−DAGとspectrin等，他の細胞膜細胞骨格成分との相互関係の研究や156−DAG，更には他のDAG，
DAP成分との関係，またそれらのdystrophinとの関係をdeepetchingreplica法をも含めて研究し，骨格筋細胞
膜とその周辺構造の超微形態的研究を進めてゆきたい．
まとめ（1）抗43−DAG抗体は正常骨格筋細胞膜の内側に細胞膜に随伴して認められた．
（2）抗43−DAG抗体と抗6−10dystrophin抗体による2た，細胞外基質例えば基底膜や基底膜側の細胞膜近辺にも有意なシグナルは認められなかった．

重免疫染色でも両抗体は正常骨格筋細胞膜の内側に筋細次に，抗43−DAGと抗6−10dystrophin抗体との2重免疫染色標本では，それぞれの抗体の存在を示す5nm
金粒子と10nm金粒子はいずれも骨格筋細胞膜の内側で細胞膜に随伴して認められた（図2A）．興味ある所見
として5nm金粒子と10nm金粒子が約15〜30nmの間隔を置きdoubletで存在する所見がしばしば認められた（図2B，2C）．なお，抗体を正常血清と置き換えて作製した免疫対照標本では金粒子の存在は認められなかっ（3）抗43−DAG抗体と抗6−10dystrophin抗体の存在を−103−

胞膜に随伴して認められた．
示すそれぞれ5nm，10nm金粒子は，しばしば約15〜30nmの間隔を置きdoubletの形で存在するのが認められた．
文

献1）Ahn AH and Kunkel LM：The structural andfunctional diversity of dystrophin．Nature Gene−cardiac andsmoothmuscle．J CellBiol115：411−

tics3：283−291，1993．

2）Ibraghimov−Beskrovnaya O，ErvastiJM，et al：Primary structure of dystrophin−aSSOCiated421，1991．

4）Wakayama Y，Shibuya S，et al：Size andlocali−

glycoproteinslinking dystrophin to the extracellu−

zation of dystrophin molecule：immunoelectron

1ar matrix．Nature355：696−702，1992．

miCroscoplC and freeze etching studies of muscle

3）Byers TJ．Kunkel LM，etal：The subcellular

plasma membranes of murine skeletal myofibers・

Acta Neuropatho186：567−577，1993．

distribution of dystrophinin mouse skeletal，

ー104−26）末梢神経のdystroglycan複合体の検討
清 水 輝 夫■
研究協力者

山

田

広

樹■

KevinP・Campbell●■

松

村

喜一郎●

表 Componentsof dystroglycan

Dystrophinは筋細胞膜において，α／βTdystroglycan（156／43kDadystrophin−aSSOCiated glycoprotein）を含
むこれまで未知の複数の細胞膜蛋白（dystrophin−associatedproteins）と結合，複合体を形成している1ト6）．
筋のaTdystroglycanは細胞膜外側に存在するプロテオ
ダリカソと推定され，細胞外基質の主要構成要素である
Iamininと特異的に結合する4州．筋においてa−dystr0−

Complex（DGLC）

glycanと結合するlaminin3イソフォームはmerosinである5）．
本複合体は全く新しいタイプの筋細胞laminin受容体
であり，実際にlamininと結合するのがdystroglycanであることにより，dystroglycan複合体と呼ぶのが合理的である．Integrinに代表される既知のlaminin受容体は，
単に細胞膜の構築維持のみならず，細胞の成長・分化，
移動・接着，信号伝達，等各種の機能に関与すると考えられており8），今後dystroglycan複合体の機能の解明が待たれる所である．
では同様な細胞膜Iaminin受容体・細胞接着田子は筋以外の観織・細胞にも存在するだろうか？またその場
合その桟能は何であろうか？現在我々は末梢神経のdystroglycan複合体の機能解析を行っているが，本研究ではまずdystroglycan複合体の構成要素の末梢神経における発現様式を検討した9）．
（1）末梢神経のシュワン細胞・髄鞘最外層にα／β−S ke letalm uscleP erip heral

D ys廿
OPhin

＋

−

nerVe

D p116−＋

U廿OPhin
（
DRP〉

＋
（
NM J）

＋

α−
D ystrog 吋Can（
156DAG）＋（
158 kDaI＋（
120 kDa）

針Dys廿
OgレCan（43DAG）
59D A P（S仰in？
）
A d halin（
50DAG）

＋

＋

＋

＋？

＋

−

35D A G＋＋？

鞠）にもdystroglycan複合体が存在し，1aminin受容体である可能性を示唆する9）．しかし複合体の組成は筋と異なり，従ってその横能も末梢神経と筋で異なるものと推定される．今後我々はこれらの点を検討し，dystrogly−
can複合体の末梢神経における生理機能を解明したい・
Adhalin欠損症ではDuchenne型筋ジストロフィーと頬似した臨床像を呈するが，神経症状は欠如する10）・これ

dystroglycan，59kDa dystrophin−aSSOCiated protein・はadhalinの発現が筋特異的であることと関連があるの35kDa dystrophin−aSSOCiated glycoprotein，utrOphin，

かも知れない9）11）．

Dp116（分子量116kDaのdystrophin遺伝子産物）の発現を認めた．ほぼ同部位に1amininサブユニットのM，Bl，B2も発現していた．

文献（2）末梢神経にadhalin（50kDa dystrophinTaSSOCiated

1）ErvastiJM，Ohlendieck K，Kahl SD，et al：
Nature345：315−319，1990．

glycoprotein），フルサイズのdystrophinは発現してい2）YoshidaMandOzawaE：JBiochemlO8：748−

なかった．

752，1990．

（3）末梢神経のa−dystroglycanの分子量は約120kDaであり∴筋型の156kDaと異なった．これはglycosyla−
tionの差によるのかも知れない．β一Dystroglycanの分子量は筋とほぼ同じで約43kDaであった．
以上の結果（表）は，末梢神経（シュワン細胞・髄3）ErvastiJM

andCampbellKP・Cel166：1211￣

1131，1991．

4）Ibraghimov−Beskrovnaya O，ErvastiJM，Leveille
CJ，et al：Nature355：696−702，1992・
5）ErvastiJMandCampbe11KP・J CellBiol122：809−823，1993．

■帝京大学医学部神経内科

6）Ibraghimov−BeskrovnayaO，MilatovichA，Ozcelik＋＋HHMl．UniversityofIowa−105一

T，etal：HumMolecGenet2：1651−1657，1993．
7）Gee SH．Blacher RW，DouvilleJ，et al：J BioI

FEBS Lett334：281−285，1993．
10）Matsumura K，Tome FMS，Collin H，et al：
Nature359：320−322，1992．

Chem268：14972−14980，1993．
8）Tryggvason K：Current Opinion．CellBiology5：11）Roberds SL，Anderson RD，Ibraghimov−Beskrov−
naya O，et al：J BioIChem268：23739−23742，

877−882，1993．

9）Matsumura K，Yamada H，Shimizu T，et al：

1993．

−106−

27）50kDa dystrophin−aSSOCiated glycoprotein

欠損を認めた重症筋ジストロフィーの一症例
光 弘＊

納

研究協力者

樋

口

逸

郎＊

中

松

村

喜一郎事＊＊

川

正

法＊

福

永

秀

敏＊＊

K．P．Campbell＊＊＊＊Dystrophin−aSSOCiatedglycoprotein（DAG）はジスト
ロフィンのC末端側と結合し，また細胞外ではラミニンと結合することが明らかになり日，筋細胞膜の保持に不可欠であると考えられている．最近，松村らは北アフリ
カのアラブ人にみられる重症小児常染色体性劣性筋ジス
トロフィー2）において，50Ⅹ−DAGの欠損が存在することを明らかにした3㌧ 今回我々は，日本人で最初の50Ⅹ−
DAGを経験したので臨床的，筋病理学的検索結果を報告する．
症例
患者は33歳男で出身地は鹿児島県喜界島である．家族
歴では，両親がまたいとこ結婚であり，父のおじが17歳時に筋疾患で死亡している．現病歴は，5歳時歩行障害が出現し，9歳時階段昇降困難となり13歳で歩行困難で車椅子となった．13歳時に国療南九州病院に第1回目の入院となった．20歳時に退院し以後自宅療養をしていたが，27歳時肺炎を併発し呼吸困難となり2回目の入院となった．翌年には気管切開し，以後陽圧式人工呼吸器を使用している．30歳時に前脛骨筋において筋生検を施行した．現症及び検査所見では，初回入院時には近位筋優位の筋萎縮，筋力低下及び下腿筋の仮性肥大が認められた．腱反射は低下していたが，感覚系及び知能は正常であった．血清CK値は940U／L（正常＜195）と中等度上昇していた．2回目入院時には筋萎縮はびまん性となっており，四肢の関節拘縮，側撃もみられ呼吸不全，心不全の状態であった．血清CK値は335U／1とかなり正常値に近づいていた．尚，現在のCK値は正常範囲となっている．神経伝導速度は正常であり，針筋電図では筋原性変化を認めた．心電図は左室肥大を認め血液ガスでは，pH：7．43，P。。2：63，P。2：67であった．骨格筋のCTでは，最近まで比較的筋力が保たれていた下腿筋にも著明な脂肪変性が認められた（図1）．ジストロフィ＊鹿児島大学医学部第三内科
相国療南九州病院＊輌帝京大学医学部神経内科
綿＊＊HHMl＆University oflowa

図1

下腿部のCT
伸筋優位に脂肪変性がみられる．

ン遺伝子のPCR分析では異常は認められなかった．
方法

生検筋の凍結切片に対して通常の組織学的∴組織化学
的染色とともに各種抗体を用いた免疫観織化学的染色を施行した．使用した抗体は，抗ジストロフィンモノク
ローナル抗体（N末端，rOd，C末端）及び，抗DAGポリ
クローナル抗体（156E，59E，50E，43K，35Ⅹ）である．
結果

組織化学的には，筋線経の大小不同，fibersplitting，
中心核の軽度増加及び結合織の著明な増殖が認められたが，壊死線経は稀であった．明らかなopaquefiberは認
められなかった（図2）．
免疫魁織化学的には，3種類の抗ジストロフィンモノ
クローナル抗体を用いた染色では正常であり，156Ⅹ−
DAG，59Ⅹ一DAP及び43K−DAGに対する抗体を用いた染色でも正常であった．一方∴筋膜上の50Ⅹ一DAGは著明に減少しており，Duchenne型筋ジストロフィー患者の生検筋における減少の程度より著明であった．しかし，本患者においては50正一DAGの欠損は完全欠損ではなく，少量の50K−DAGのpatchyな染色性が筋線推上にー107−

認められた（図3）．35Ⅹ十DAGは本症例では正常筋に比のような著明な低下ではなかった．

べ中等度低下していたが，Duchenne型筋ジストロィー

図2

HE染色×130筋線経の大小不同，fiberspLitting，著明な結合織の増殖がみられる．

図3 免疫組織化学的染色A：本症例の抗ジストロフィン染色
B：本症例の抗50E−DAG染色
C：正常対照例の抗50K−DAG染色I）：Duchenne型筋ジスト。フィー例の抗50K−DAG染色

ー108−

考

ジストロフィーとの鑑別が困難であった．

察

本症例は筋生検によりジストロフィンが正常であり，50Ⅹ−DAGの欠損が存在することが証明されるまでは（3）50Ⅹ−DAGの欠損の程度と臨床症状に多様性が存在

Duchenne型，あるいは重症のBecker型筋ジストロ
フィーと診断されていた．これまでの50Ⅹ−DAG欠損症（4）50E−DAG欠損症は特定の人種のみに見られるもの
ではなく，本邦においてもDuchenne型あるいはBeckerの報告例に比べ，本例では血清CK値の上昇が比較的軽型筋ジストロフィーの鑑別疾患のひとつとして重要であ度であり，また50K−DAGは完全欠損ではなく少量のる．

する可能性がある．

patchyな発現が筋膜上に認められた．これらの事実は50
Ⅹ−DAGの欠損の程度と臨床症状に多様性があることを文

献示唆している．50Ⅹ−DAGの欠損の程度と臨床的重症度1）Ibraghimov−Beskrovnaya O，ErvastiJM，Leveilleの間に相関があるか否かについて症例数を増やし検討する必要がある．

CJ，et al：Primary structure of dystrophin−

今回の報告により，50Ⅹ−DAG欠損症は特定の人種のextracellularmatrix，Nature355：696−702，1992．

みに存在する疾患ではなく，世界的な広がりを持つもの

2）BenHamidaM，FardeauNandAttiaN：Severe

であることが明らかになった．今後，本邦においてもDuchenne型及びBecker型筋ジストロ7−の鑑別疾患のchildhoodmusculardystrophyaffectingbothsexes

ひとつとして，50Ⅹ−DAG欠損症に留意する必要がある．

480，1983．

associated glycoproteinlinking dystrophin to theandfrequentinTunisia・MuscleNerve6：469−

3）Matsumura K，Tome FMS，Collin H，et al：
Deficiency of the

50K dystrophin−aSSOCiated

ま と め

glycoproteinin severe childhood autosomal（1）50Ⅹ−DAG欠損症の最初の日本人例を報告した・（2）臨床症状からはDuchenne型あるいはBecker型筋

recessive musculardystrophy．Nature359：320−−109−

322，1992．

28）Adhalin（50kDadystrophin−aSSOCiated glycoprotein）

欠損症の臨床病態
清 水 輝 夫◆
研究協力者

松

村

喜一郎■

山

田

広

樹■

KevinP・Campbell＋＋

Dystrophinは筋細胞膜において，dystroglycan（156／43
kDadystrophin−aSSOCiatedglycoproteinS）を含む複数の

Pl℃rk）tyPe：

細胞膜蛋白と結合している1）〜6）．Dystrophinは細胞内でF−aCtin細胞骨格と結合し，dystroglycanは細胞外で細PTimaTyDcfect：

胞外基質の主要構成要素であるlamininと結合する一）〜6）．

SCARMD？（0叩m00○r■1013q）＼

このことは，dystrophin−glycoproteincomplexが筋細胞？

DMD

Dys廿OPhinGenel

Adh劇nDe他eI

膜を介して細胞の内外の骨格／基質を連携する構造体であることを意味する5）．本復合体は全く新しいタイプの

SCARMD

D血仰山町血憾OnOI
Dys廿OPhin・Gけ00PrOteinCompIex

laminin受容体であり，従来知られる代表的なIaminin受I

容体と同様，単に筋細胞膜の構築維持のみならず，筋細777胞の分化，成長，移動・接着，信号伝達など各種の機能Iに関与する可能性が考えられるが7㌧ その実態は今後の研究によって解明されねばならない．本複合体の構成要

MuscleCellDea廿1

図素の中で実際にlamininと結合するのがdystroglycanであることより，本復合体はdystroglycan複合体と呼ぶのが合理的であろう．

adhalinが二次的に著減していることより10）11㌧adhalinのDystroglycan複合体中の50kDa dystrophin−aSSOCiated

欠損がこれら2疾患における筋細胞死の分子機構において重要な役割を果たしているものと考えられるg）．

glycoproteinは現在adhalinと呼ばれている8）．昨年我々は，北アフリカのアラブ人に多発し，Duchenne型筋ジ乱を招きやすいので，その生化学的特徴に基づいて我々

さてSCARMDという病態名は必ずしも明確でなく混ストロフィー（DMD）と類似した臨床像を皇する常染はこれをadhalin欠損症と呼びたい．Adhalin欠損症の臨

色体劣性遺伝の重症筋ジストロフィー（SCARMD，床的特徴は表に示す通りである．本症はその臨床的煩似

SeVere Childhood autosomal recessive muscular

性のために男性の場合DMD／重症のBecker塾筋ジスト

dystrophyの略）でadhalinが特異的に欠損していること

ロフィーと，女性の場合有症候性DMD保因者と誤診・を報告しt9）．DMDではdystrophinの欠如のため暫定診断されやすいので注意を要する．
昨年DMD／SCARMD類似の臨床像を皇するチュニジ

表 Adhalin欠損症（SCARMD）の臨床病態学的特徴

ア人の重症筋ジストロフィーが第13番染色体にリンクす＊DMDに類似する点

ることが示された12）．しかしこの疾患がadhalin欠損症と＃1発症は5才前後．僻腹筋仮性肥大を高頻度に詰める＃2 血清CK著明高値＃3 重症の場合．10才で歩行不能．20才で死亡することあり＃4 進行期に心筋障害かJ得る＃5 筋生検上著明なジストロフィー性変化あり

同一かは不明であった．我々は同様の病像を皇するアルジェリア人患者多数例を検索した結果，これらの患者はadhalinを欠損していることを発見した13）．また連鎖解析
可能例は全例第13番染色体にリンクしていた13）．このこ＊DMDと異なる点とは北アフリカのアラブ人のSCARMDはadhalin欠損＃1常染色体性劣性遺伝（血族結婚高頻嵐男女同頻度）＃2 人種差あり（アラブ人に多発）？
＃3 重症度は患者間でばらつく（同一家系内でも）＃4 知能願書はない＃5 Dy抽OPhinは良く保たれる（進行期には二次的減少あり）

症であり，原因退伝子は第13番染色体上に存在することを示唆する．
SCARMDの臨床像を呈する患者はアラブ人以外の人種にも存在するが，これらの患者がadhalinを欠損する＊帝京大学医学部神経内科

か検討した．その結果我々はadhalin欠損症がフランス■●HHMl．University oflowa

ー110一CJ，et al：Nature355：696−702，1992．

人，イタリア人，ギリシャ人などの南ヨーロッパ人，またパキスタン人，ブラジル人にも存在することを発見し

5）ErvastiJM and CampbellKP：J CellBio1122：

た‖ト岬．すなわちadhalin欠損症はアラブ人以外の人種に809−823，1993．

も存在する．興味深いことに連鎖解析可能であったブラ

6）Ibraghimov−Beskrovnaya O，Milatovich A，Ozcelik

ジル人家系は第13番染色体にリンクしていなかった15㌧

T，etal：HumMolecGenet2：1651−1657，1993．

このことは，adhalin欠損症には遺伝的多塑性がある，つ7）TryggvasonK：CurrentOpinioninCellBiology5：877−882，1993．

まり筋におけるadhalin欠損を引き起こす原因遺伝子は複数あることを示唆する．最近adhalin欠損症の本邦初8）Roberds SL，Anderson RD，Ibraghimov−Beskrov−

例が鹿児島にて発見され，本症は日本人にも存在することが示された．よって本症は人種・地域を問わず世界中

naya O，et al：J BioIChem268：23739−23742，に分布するらしい．人種間で原因遺伝子が異なる可能性

9）Matsumura K，Tome FMS，Collin H，et al：も考えられる．

Nature359：320−322，1992．
10）OhlendieckK，MatsumuraK，IonasescuVVetal：

1993．

Adhalinの欠損が何故筋細胞死を引き起こすのかは未だ不明である（図）．我々は，adhalinの欠損がdystr0−

Neurology43：795−800，1993．

glycan複合体のIaminin受容体としての機能障害・崩壊

11）Matsumura K，Tome FMS，IonasescuVV，et al：をもたらし，これが筋細胞膜の不安定性を引き起こすの

J ClinInvest92：866−871，1993．

ではないかと考え，現在これを検証中である．

12）Ben Othmane K，BenHamidaM，Pericack−Vance
MA，etal：Nature Genet2：315−317，1992．

文

献

1劫

Azibi K，Bachner L，BeckmannJS，et al：Hum1）ErvastiJM，Ohlendieck K，Kahl SD，et al：
Nature345：315−319，1990．

Molec Genet2：1423−1428，1993．
14）Fardeau M．Matsumura K，Tome FMS，et2）Yoshida M and Ozawa E：J BiochemlO8：748−

CRAcad SciParis316：799−804，1993．
15）Passos−Bueno MR，01iveiraJR，Bakker E，et al：

752，1990．

3）ErvastiJM and Campbe11KP：Cel166：1121−

al：

Hum Molec Genet2：1945−1947，1993．

1131，1991．

16）Sewry CA，Sansome A，Matsumura K，et al：4）Ibraghimov−Beskrovnaya O，ErvastiJM，Leveille

一111−

Neuromusc Dis，in Press，

Ⅵ．壊死・再生ほか

29）ジストロフィン欠損細胞のチャネル機能に関する研究
高 守 正 治事
研究協力者

浅

賀

知

也●

岩

佐

和

夫■

結

はじめに

果

筋ジストロフィー症では筋力低下や筋萎縮など骨格筋

本研究では胃平滑筋細胞はmdxマウス，BlOマウスの症状が主体となるが，不整脈や拡張型心筋症などの心共に少なくともA−likeチャネル，Ca依存性Kチャネ

筋症状や急性胃拡張，便秘といった消化器症状も比較的

ル，L型Caチャネル及び電位依存性Naチャネルを有す多く見られる．今までのジストロフィン欠損細胞の生理ると思われた．

機能に関する研究は，主に骨格筋細胞中心に行われてき

外向き電流にはTEAにless sensitiveで，Ca−free

たが，心筋や腸管平滑筋1潤においても症状を星することから，ジストロフィンが各細胞に於いて同一のチャネル

Ringerで減少傾向を示し，更にCsC12により完全に抑制されるA−1ikeカレントその後にTEAにsensitiveで，やレセプター機能と関係しているとすれば，心筋や腸管

Ca−freeRingerで減少傾向を示し，やはりCsC12により平滑筋でも骨格筋に於いて認められたのと同様の生理学

完全に抑制されるCa依存性Ⅹチャネルが認められた的機能異常を呈する可能性がある．心筋或いは腸管平滑が，これらのチャネル電流に関してはmdx胃平滑筋細胞，BlO胃平滑筋細胞の間に有意差は認められなかった筋では既にジストロフィンの発現が確認されており3㌧（p＜0．05）（図1）．

更にデュシャンヌ型筋ジストロフィー症では腸管平滑筋がジストロフィックな変化を呈するとの報告 ）もあるこ

内向き電流には細胞外液をCa−freeRingerに置換してとから，ジストロフィンの持つ生理的役割を評価する目も不変で，テトロドトキシンにより抑制される電位依存的で，本研究では特に胃平滑筋に注目しそのチャネル機

性Naチャネル電流とCa−freeRingerに置換することで能の検討を行った．

減少し，ニフェジピソでも抑制される1塾Caチャネル
電流が認められた．このうちも型カルシウムチャネルに方

ついてはBlO胃平滑筋細胞では−20mVからOmVで開法

胃平滑筋細胞は筒井等の方法に従って，mdxマウス及き始めるのに対して，mdx胃平滑筋細胞では−40mVかび対照としてBlOマウスよりコラーゲナーゼとトリプシら−20mVで開き始める傾向が認められた（n＝5）（図

ンを用いて単離し．直ぐに使用するか或いはCa−free2）．

Ringer液中に4℃で保存し3時間以内に使用した．生理

胃平滑筋細胞内カルシウム濃度はmdxマウスで36．9
nM，対照のBlOマウスが38．3nMであり，両者の間には有意差を認めなかった（図3）．

学的にはホールセルクランプ法を用い，ホールディング
ポテンシャルを−60mVとし，＋40mVまで10mVずつの脱分極刺激を加え電位依存性のチャネルについて検討した．細胞外液は評価するチャネルの種類によりそれぞ

考案

本研究は，骨格筋ではなく胃平滑筋を用いることによれ正常Ringer，Ca−freeRinger，TEAを含むRinger液を使用し，同様に電極内液も評価するチャネルによりアス
パラギン酸カリウム或いはセシウムクロライドを使用した．

りジストロフィン蛋白の持つ生理機能の普遍性の検討を行った．電位依存性チャネルについては，L型カルシウ
ムチャネル電流がやや低い膜電位で開く傾向を持つ以外

更に，胃平滑筋の浮遊している1000JLlのCa−freeにジストロフィン欠損細胞に特徴的な所見を見出し得な

Ringer液に対してDMSOに溶いたFuraT2AMを5J上g

かった．このL型カルシウムチャネルの差についての意

加え，37℃で40分インキュべ−トした後340nm及び380

味は検討中であるが，骨格筋でも同様の異常報告5）があることから，ジストロフィン欠損が各取結において共通

mmの紫外線を用いて細胞内カルシウム濃度を測定した．

に認められる現象とすれば，ジストロフィンの持つ生理■金沢大学医学部神経内科的役割の1つと考えられる．従って，今後心筋細胞，そ

−115−

pA

b

0

10

ヱ0

30

40

︵くd︶lUとJコUだ≡Ⅵ已dU︵↓d︶盲りヒヨUぎ苫⊇ddU
・●〇・50・40・3〇・20−10l50MembrailePotenthl（mV）

ノ○・l
O m dxb●8 10Type V D C C・2︵＜d︶盲だ旨Uぎ票数疇U

図2

a．内向き電流b．⊥型Caチャネルの電流電圧曲線○がmdx胃平滑筋細胞，●がBlO胃平滑筋細胞
Gastric smooth muscle cells

10．50．40．30，20

−10

0

10

20

30

40

50

Membr射IePotenlial（mV）
C

図1

a．外向き電流b．A−likeチャネルの電流電圧曲線
C．Ca依存性Ⅹチャネルの電流電圧曲線○がmdx胃平滑筋細胞，●がBlO胃平滑筋細胞

mdx（皿＝14）

図3

ー116−

BlO
（皿＝12）

mdx及びBlO胃平滑筋細胞内カルシウム濃度

の他のジストロフィン欠損細胞についても検討する必要があるものと思われる．また本研究の結果では少なくとdilatationin progressive muscular dystrophy・も安静時の状態では細胞内カルシウム濃度の異常は確認
できず，L型カルシウムチャネルのpeak電流量にも有3）Byers TJ，et al：The subcellular distribution ofLancetl：171−172，1963．

dystrophininmouseskeletal，Cardiac，and smoothmuscle．J CellBioll15：411−421，1991．

意差を見ないことから，ジストロフィン欠損細胞崩壊の原因を細胞内カルシウム上昇に求めるとする場合，細胞4）Miyatake M，et al：Possible systemic smooth

膜内のカルシウム放出機構と細胞骨格蛋白であるジスト

musclelayer dysfunction due to a deficiency of

ロフィンの関係にも注目する必要があると思われた．

dystrophinin Duchenne muscular dystrophy・J
NeulSci93：11−17，1989．

文

献1）JaffeKM，etal：Symptoms of upper gastrointes−
tinal dysfunctionin Duchenne muscular dystroT
phy：Case−COntrOIstudy．ArchPhysMedRehabi1
71：742−744，1990．

5）吉田瑞子ほか：mdx胎仔骨格筋の電位依存性カル
シウムチャネルについて． 厚生省「精神・神経疾
患研究委託費」筋ジストロフィー及び関連疾患の成因と治療法開発に関する研究 （荒木班）平成3年
度研究報告書，1992，pp111−113．

2）Robin GC and Falewski GL：Acute gastricー117−30）Duchenne型筋ジストロフィーの筋内血管壁におけるnerve growth factorreceptor（NGFR）の発現について
田

研究協力者

追

等■

磯 崎 英 治＊■ 官 本 和 人■＊um）より強い蛍光を発した場合をNGFR陽性とし，陽性血管数を，数えた全血管数（20本以上）で除した百分率を，NGFR陽性率として算出した．

はじめに
Nervegrowthfactor（NGF）は，末梢神経系においては主として交感神経節，後板神経節細胞の分化，機能維
持に関与し，その受容体であるNGFRにはhighおよび

結果
抗NGFR抗体による単染色のみでは，血管とperineuriumとは，しばしば鑑別困難であったが，同時にaxonを染色することにより両者の鑑別は容易になっ

lowaffinitytypeが存在する．特に，lowaffinitytypeのNGFRは，全身の非神経細胞にも広く分布することから様々な作用が考えられている．近年，Duchenne型筋ジストロフィー（DMD）においてもNGFの役割について研究されており，血清NGFの見かけ上の低値1㌧mdxマ
ウスの顎下腺中の著明なNGF高値2）などが報告されている．加えてZhaoら3）は，特にDMDにおいて，筋内血管の周囲（外膜）にNGFRの発現が認められることを述べている．
我々は，生検神経におけるNGFRの発現を検討しているが4㌧その際しばしばperineuriumに加え，血管周囲にもNGFR活性を認めている．そこで今回，こう した血管壁のNGFR発現がDMDに特異的であるのか否かを検討するため，以下の研究を行った．
対象および方法
対象は，DMD7例および疾患対照として13例（多発性筋炎5例，先天性ミオパチー2例およびWerdnig−
Hoffmann症侯群，ミトコンドリアミオパチ一，polymyalgia rheumatica，低カリウム性ミオパチ一，
Churg−Strauss症峡群，筋緊張性ジストロフィーの各一例）である．これらの生検筋の凍結切片（10／Jm）を，
冷アセトンにて10分間固定した後，以下の免疫染色を行った．正常ヤギ血清（10分間）で処理した後，抗ヒト
NGFR抗体（ベーリンガーマンハイム，1：20，2時間）をおき，FITC一抗マウスIg（Amersham，1：20，
1時間）で標識した後，抗ニューロフィラメント抗体た（図1）．疾患対照群では，神経原性疾患（Werdnig−
Hoffmann症侯群）および筋原性疾患（先天性ミオパ
チ一，ミトコンドリアミオパチ一，低カリウム性ミオパ
チ一，筋緊張性ジストロフィー），さらに組織学的には軽度のtype2fiber atrophy以外に著変をみなかった
polymyalgia rheumaticaの各症例における筋内血管壁のNGFR陽性率は，0〜14％であった（表）．図2上段は，先天性ミオパチー（非特異型）の例であるが，NGFR活性は陰性である．一方，DMD群では7例の平均が43％と，明らかに疾患対照群より高値を示し，血管外膜に一致して強いNGFR活性を認め，時に問質（perimysium
またはepimysium）にまで一部広がっていた（図2下段）．
Endomysiumにある毛細血管は常にNGFR陰性であった．Churg−Strauss症候群の例でも同様に，血管周囲のNGFR発現は42％と高率であった（表および図3上段）．さらに多発性筋炎の5例でも平均25％と，DMDよりNGFR陽性率は低いものの，疾患対照群よりは高値であった（表および図3下段）．今回の検索においては，動脈と静脈あるいは血管の太さによるNGFR活性の違いについては特に検討しなかったが，観察した限りではこれらの間で大差は認められなかった．
考（Sigma，1：200，−一晩）をおき，ビオテン化した抗ウ察

サギIg（1：50，1時間）ついでTexas Red−ストレプ

Zhaoら3）によれば，DMDではかなり特異的に筋内血

トアピジン（Amersham，1：200，1時間）で標識し管壁にNGFRの発現を認めるとしており，血管中膜（平た．判定は，個々の血管壁において，問質（perimysi一滑筋細胞）のジストロフィン欠損が，血管障害を招き，その結果NGFRを発現すると述べている．しかし，我々■東京都立神経病院
榊東京都立神経病院神経内科の結果では，検索した種々な疾患の中では，確かに

ー118−

蓑

各疾患における血管壁のNGFR陽性率症

例

DMD（7例）Churg−Strauss症候群
PoIymyositis（5例）
先天性ミオパチー（2例）
Werdnig−Hoffmann症侯群

NGFR陽性率
平均43％（22〜83％）42％
平均25％（2〜39％）
0％
10％

ミトコンドリアミオパチー

14％低カリウム性ミオパチー

14％Polymyalgia rheumatica lO％

図1

Myotonic dystrophy

筋内血管と神経（Werdnig．Hoffmann症候群×50）
NGFR陽性の構造（大きい矢印）は，その中に多数のaxonを有することから，Perineuriumであることがわかる．一方，隣接する血管（小さい矢印）は，NGFR陰性である．

図3

図2

4％

筋内血管壁のNGFR発現
ChurgAStrauss症候群（上段，×50）では，血管周囲に強いNGFR発現を認める．矢印は．
axonを有したNGFR陽性のperineuriumを示す．多発性筋炎（下段，×100）でも血管周囲に著明なNGFR陽性所見を示す．

筋内血管壁のNGFR発現
先天性ミオパテー（上段，×25）では，血管壁のNGFRは陰性であるが，DMD（下段，×100）
では強い活性を有する．

を示した3つの疾患−DMD，多発性筋炎，Churg−

DMDが最も高率に血管壁のNGFR陽性率を示したが，Strauss症候群Lに共通する筋病理所見として，筋線経

この他，血管炎（Churg−Strauss症候群）や多発性筋炎の種々な程度の壊死，再生現象および問質の線椎化を挙げることができる．筋線経に著明な壊死がおこると，でも高率であり，血管壁のNGFR発現は少なくともDMDに特異的ではなかった．Churg−Strauss症候群例でのHE標本では，いわゆる血管炎vasculitisとしての所見の他に，ischemicmyopathyによると思われる筋の壊死，再生所見も強く認められた．従って，高いNGFR陽性率

scavengerとしてのmacrophageが動員される．通常そのoriginは，血球成分であるmonocyte由来とされているが，その他，血管外膜に存在するfibroblastが活性化

ー119−

され，maCrOPhageの性質を獲得するようになることが

報告されている5）．

pp186−188．

一方，血管外膜には交感神経終末がnet workを形成

2）林 恭三，篠田一三ほか：筋ジストロフィーマウス

し，平滑筋細胞にterminateしているが，それとともに（mdxマウス）顎下腹中のEGFとNGFレベル．

多数のSchwanncellも存在している．こうした血管外膜

厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジストロに存在する活性化細胞は，Schwanncellから直接的に，フィー症の遺伝，疫学，臨床及び治療開発に関する

あるいはmacrophageから分泌されるinterleukin−1を介研究 平成元年度研究報告書，1989，p184．

することによって間接的に，NGFの分泌を促すと考え

3）ZhaoJ，YoshiokaK，MiikeT，etal：Nervegrowth

られる．さらに，交感神経終末ではノルエビネフリンがfactor receptorimmunoreactivity on the tunica

神経伝達物質として分泌されるが，そのノルエビネフリadventitia of

ンそのものがNGFをup−regulateしているとの報告があChildhood muscular dystrophies．Neuromuscularる6）．この様にして血管外膜で活性化細胞から分泌されたNGFは，同時にそれらの細胞表面において，NGFを
captureすべくNGFRが発現することは容易に想像される．NGFの機能の一つに，白血球遊走能があり，組織の修復機能と深く関連することが分かっている丁）．従って，

intramuscular blood vessels in

Disordersl：1135−141，1991．

4）磯崎英治，宮本和人ほか：Onion bulbにおけるnervegrowthfactorreceptorの発現一免疫蛍光組織
化学的検討−．神経内科，1994（印刷中）．
5）BrierleyJB and Brown AW：The origin oflipid

前述したように筋線経の壊死が起これば広い意味で炎症

Phagocytes

機転が働き，組織修復のためのプロセスが開始される．

The adventitia of blood vessels．J Comp Neuro1

NGFおよびNGFRは，単に神経細胞の分化，維持機能だ
けでなく，浮腫，壊死，線維化といった一連の炎症修復過程に関連した役割も有していると思われる．

inthe central nervous system：II．

211：407−417，1992．

6）Furukawa Y，Tomioka N et al：Cathecolamines
increase nerve growth factor mRNA contentin
both mouse astroglial cells and fibroblast cells．

文

FEBS Lett247：463−467，1989．

献1）林 恭三，村瀬勝人ほか：筋ジストロフィー疾患者

7）Boyle MD，Lawman MJP，et al：Nerve growth

血清中のNGFレペルーヒトNGFに対する酵素免疫

factor．A chemotactic factorforpolymorphonucle−

測定法の確立−． 厚生省「精神・神経疾患研究委

arleucocytesinvivo．JImmunol134：564−568，

託費」筋ジストロフィーの臨床病態と遺伝及び疫学

1985．

に関する研究 平成2年度研究報告書，1990，

一120−31）強縮刺激時に於ける外液Ca2＋による骨格筋崩壊現象
吉

研究協力者

松

田

崎

哲

昨年，私達は正常骨格筋細胞が，強い電気刺激で崩壊する事を見出し，報告した．この筋崩壊像は，Duchen−
ne型筋ジストロフィー症（DMD）やそのモデルマウス（mdx）の崩壊した骨格筋に酷似していた．そこでこの筋崩壊現象の原因を追求すれば，未だに解明されていな
いDMDやmdxの骨格筋崩壊の原因を，究明する手がかりが得られると考えた．
DMDやmdxの筋細胞の崩壊に，細胞外液のCa2＋が関与していると考えられている．そこで，電気刺激による筋崩壊現象と，それに対する細胞外液CaZ＋の影響を，正常状態にあると考えられているBlOマウス（mdxの対照マウス）を用いて，画像解析した．
試料と方法
試料は，約3〜4週齢のBlOマウスの長指伸筋を用いた．無傷の筋細胞を必要とするため∴睦と結合組織を付けたまま束で使用した．緩衝液は，Krebs−HEPES（147：
NaCl，2：KCl，2：CaCl2，1：MgC12，10：HEPES，
11：Glucose（mM），pH7．4）又はCaC12の代わりに，2mMのEGTAを含むCa2＋−freeのKrebs−HEPES（pH7．4）を使用した．興奮を防ぐために，10JJMのTTxを使用し，L型Ca2＋−Channel阻害の為に，2．5mM CoC12及び40fLMのnifedipineを使用した．
長指伸筋はKrebs−HEPESを満たしたセルに入れ，ピソで脛を押さえて，倒立顕微鏡下に設置した．酸素を液面にそよがせ，温度を約25度に保ち，外液は10分おきに置換した．
電気刺激は，強縮電流刺激（30msinterval．l ms
duration）を与え，電流値は，オッシロスコープ上で測定した．電流の増加は，50JLAまで10JJA／2sec，50FL
A以上は10JLA／secの割合で増加した．刺激電極は先端10〃mのガラス管に外液を満たし，白金黒電極を挿入した．その電極は，観測する筋細胞に電流を効果的に作用させる為に，先端を観測する筋細胞表面に接触させた
後，その表面から25〃mの位置に固定した（写真トa，b）．対極には白金窯電極を用いた．
電流刺激に応答する筋細胞の速いかつ微細な形態変化■国立精神・神経センター神経研究所

瑞

子■

也＊

和

田

圭

司■

は，倒立顕微鏡にCCDカメラを設置，画像解析装置を経
由し，ビデオレコーダーで記録，モニター上で510倍に拡大して観測した．
結果
電流刺激に依る筋崩壊現象
BlOマウス（3週齢）の筋細胞は，刺激電流の増加に従い，収縮，こぶの膨立，過収縮を起こし崩壊に至った（写真1）．即ち筋細胞の静止状態に（写真1−b）電流
刺激を与え，その電流を増加して行くと約33JJA位のところで，Huxley等1）が，見出した様な収縮が始まった（写真1には示していない）．さらに電流を増加すると，筋細胞は収縮が進み膨化した（写真では分かりにくい）．
約175〃Aのところで，こぶの膨らみが飛び出して来た（C）．写真では分かりにくいが，こぶと同じ幅でより収縮した部分が細胞内に生じた．さらに電流を増加すると，こぶの膨立部分が大きくなった（d）．この状態で電流を固定すると，筋細胞はこの変形のまま維持していた．またこの状態で，電流刺激を切り放置すると，こぶは無くなり静止状態の形態に戻った．（d）の状態からさらに電流を増加すると，約500JJAで急激かつ衝撃的な過収縮が生じた（f）．即ち両側からサルコメアの幅はそのままに，筋原線経，細胞内物質が過収縮部位に寄ってきて，過収縮の中に吸い込まれて行った．過収縮を起こしている筋細胞は過収縮を起こしているところから，遠く離れるに従って細くなっていた．しかし筋細胞内には，断裂や空洞は無かった．さらに電流を700／JA
位に増加すると，過収縮を塵こしている両側の，外液に接している表面の部分から筋原線経の断裂が始まり（g），筋原線経は逆の方向に，即ち両端に引っ張られた（h）．その時断裂部位は，袖口をまくり上げるような状態を望した（i，矢印）．過収縮部位の両側は筋鞘を残したまま空洞化した（写真1（j）＊）．引っ張られていった
先の断裂部位は，過収縮を起こしたままで（写真1（j）＊＊），それより先は，正常状態の筋細胞の様相を示していた（写真1（j）＊＊＊）．
以上の実験を3〜3．5週齢で，平均体重9．0gのマウス
筋細胞で行った結果を表1に示した（TTx）．筋収縮開始から筋崩壊まで，4の段階的閲値があることが明らか

ー121−

写真1筋細胞（BlOマウス：3．5適齢）の電流刺激（強度）による崩壊過程a）観測する細胞に電流が効果的に作用する為の電極の位置決定 b）静止状態
C）こぶの膨立（電流強度；約175′ A） d）．e）電流の増加に伴うこぶの膨大f）急激かつ衝撃的過収縮（電流強度；5001上A） g）筋原線経の断裂開始（電流強度；700〃A）h），i），g）の電流刺激を切った後の崩壊過程 j）崩壊した筋細胞 矢印，＊，＊＊，＊＊＊は本文参臥ー122−

表 筋細胞（BlOマウス：3〜3．5週齢）の電流刺激による形態変化の園値
外溶液（Krebs−HEPES）に10JJMTTx（TTx），
2．5mM CoC12＋10FLM TTx（Co2＋＋TTx），40
JJM nifedipine＋10FLMTTx（nifedipine＋TTx）のそれぞれが含まれている場合の形態変化に対す
る閲値．ND：観測不可能，＊：急激かつ衝撃的な過収縮及び筋原線経の断裂は生じなかった．

三三・一二三三と，￣二蒜一郭で二一一一▼二二二・￣−

▲乙縄

￣

・

￣

−

￣￣

￣＿￣

￣￣￣二：

卵蒜主意弐表表等蓼
一一L一・二二二：「＝こ芋Tr￣∵一二二▼一一二■1＝云±莞ご⊇i■「：闇芸≡一 ．▼， 壷等−＿＿￣・b

伊C血 melCOmtraCtion

Tenhyper−

〝A

〟A

〟A

Trx

（
b 21 十Trxm ptureCOntraC tion

blo ckers〝A

34 ± 3 （SD）

174 ± 2 （SD）

400 〜 500

＞ 600

m＝
35

n＝
31

n＝10

n＝10

ⅣD

231 ± 13 （
SD）

＊

＊

事

‡

n＝
22
tlifedipine I T rx

ⅣD

237 ± 13 （SD ）
n＝27

になった．
このような筋崩壊は写真1で見るように，常に複数の隣接した筋細胞のグループで派生した．
筋崩壊に対する細胞外液Ca2＋の影響
KrebsrHPESの2mMCa2†の代わりに2mM EGTAを加えた，Ca2T−free溶液（10FLM TTxを含む）中で，筋細胞を電流刺激した．電流を増加すると，筋細胞は収縮を起こし膨化した．これは電流刺激により，膜電位の変化が生じ，筋小胞体からCaZ十が放出され，収縮が生じるためと考えた．しかし筋崩壊が生じる600〜700／JAの電流刺激を加えても，筋細胞はこぶの膨立，急激かつ衝
撃的な過収縮，筋原線経の断裂を生じなかった．電流刺激を停止すると，筋細胞は静止状態の形態と変わらなかった．
この実験結果から，写真1で示されるような，筋崩壊
現象は，細胞外のCa2＋の流入によって生じることが明らかになった．
細胞外Ca2↓の流入channelと筋崩壊抑制
強縮電流刺激（30msinterval）を筋細胞に与えたた
め，T型Ca2＋一Channelが不活化されていた．従って細胞外から細胞内に流入するCa2十の殆どは，T−管にある電写真2 筋細胞（BlOマウス：3．5週齢）の崩壊に対するL型Ca2＋−Channel阻害（2．5mM CoCl2）
効果a）静止状態 b）こぶの膨立（電流強度；

位依存性L型Ca2＋−Channelを通って，細胞内に流入すると考えられた．そこで2．5mM Co2十と40JJM nifedip−
ineのそれぞれで，L型Ca2＋一Channelを阻害し，電流刺激を行った．

約225〜250〃A）

Ca2十存在下での結果を写真2に示す．Ca2＋rchannelC），d）こぶの膨大過程（電流強度；C）400JJA d）600〃Ae），d）の電流刺激を停止15分後の筋形態．

が阻害されているために，約33FLAでのHuxley等が見出したような筋収縮の開始は見られなかった．電流を増加するとしだいに筋細胞が膨化し，225〜250〃Aのとこ
ろで．こぶが飛び出した（写真2−b）．しかし，さらに電流を増加しても，こぶが膨大するだけで，最大電流ー123−（600〃A）を加えても，筋細胞の急激かつ衝撃的な過収やかな収縮を開始し，膨化，こぶの膨立膨大を順次生縮，空洞化は生じなかった．電流刺激を切って15分後もじ，遂には急激かつ衝撃的な過収縮∴筋原線経の断裂を（写真2−e）の形態を示していた．

起こし，崩壊することが明らかになった．即ち筋細胞がNifedipineの場合も，筋細胞の形態変化は，Ca2＋の場
合とまったく同じだった．

刺敵電流の増加に伴い，収縮，膨化，過収縮，断裂を起こした．この一連の変化は，細胞外から流入したカルシ同様の実験を3〜3．5週齢，平均体重9．0gのマウスでウムの蓄積が考えられる．何故なら，Ca2十一free溶液中行った結果を表1に示した．Ca2＋−Channel阻害剤を加えでは筋崩壊が生じなかったこと，L型Ca2十一Channelの阻害により，こぶが生じる電流が高電流強度にシフトし，ると，こぶの膨立は173JJAから約237〃Aの高電流強度にシフトした．明確な閲値は，この一つだけだった．

筋崩壊の抑制が見られたことなどによる．
この研究がDMDの筋崩壊のメカニズムの解明に寄与

考察出来るよう，mdxを用いてさらに本研究を進める．

DMDやmdxの骨格筋には，ZTlineの乱れやカルシウ
ムの蓄積があり，また脱神経筋は筋崩壊を起こさないと

ま と．めの報告がある．また私達はmdxの静止状態の骨格筋細電流刺激に依る筋崩壊は，細胞外のCa2＋の流入，蓄積

胞内のCa2十濃度は正常値2）であるが，L型Ca2十一により，4つの閉値を以て穏やかな収縮に始まり，こぶ

Channelは，正常骨格筋のそれよりも低い電位で活性化の膨立膨大，急激かつ衝撃的な過収縮，そして筋原線経の断裂を生じて崩壊に至った．

し，細胞内に対照よりも多くのCa2十が流入する3）ことを報告した．

筋崩壊は，常に複数の隣接する筋細胞にも及んだ．

これらの報告から，私達は，DMD或いはmdxの骨格筋が崩壊する過程を，次のように予想している．筋細胞が刺激を受けたとき，T一管のCa2＋−ChannelからCa2＋が細胞内に対照よりも多く流入し，そのCa2十の一部が細胞内に徐々に蓄積して行く（細胞内のCa2＋濃度を正常に保つ為に）．そのために，筋細胞の一部が収縮したままの状態であったり（膨化），或いはZ−lineの乱れが生じた
りする．さらにカルシウムの蓄積が進み，ある時期に衝撃的な過収縮が生じ，空洞が生じるような筋崩壊が起きると予想している．
この予想から，正常マウスでも筋細胞に刺激を与え，細胞外から細胞内にCa2＋−Channelを通し，Ca2＋を流入し続けると，カルシウムが細胞内に蓄積し，過収縮を起こし，DMDの様な筋細胞の崩壊を招くことが出来ると考えた．実験の結果，昨年は電気刺激による筋崩壊を実現させた．
今回この筋崩壊現象を究明した結果，筋細胞は，強締刺激の電流を増加すると，段階的4つの閲値を以て，穏ー124−

筋原線経の断裂を引き起こす筋崩壊は，L型のCaZ十一
channelの阻害剤で抑制された．
文献1）Huxley AF and Taylor RE：Local activation ofStriated muscle fibres．JPhysiol144：426−441，
1958．

2）吉田瑞子，柴崎 浩：mdx骨格筋内のCaイオン濃度． 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジス
トロフィー症及び関連疾患の病態とその病因に関する研究 （杉田班）平成元年度研究報告書，1990，
pp145−146．

3）吉田瑞子，井上 勲，松崎哲也：mdx胎仔骨格筋の電位依存性カルシウムチャンネル． 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジストロフィー及び関連疾患の成因と治療法開発に関する研究 （荒木班）平
成3年度研究報告書，1992，ppll1−113．

32）筋細胞死と再生に伴う各種プロテアーゼ群の変動
木 南 英 紀◆

研究協力者

上

野

隆■

武

野

大

策■

江

崎

光

江＊

酵素活性測定法

はじめに
DMDの病因の研究は大幅に進歩したが，ジストロ

カテプシソBおよびLの活性はZ−Arg−Arg−MCA，Z−

フィンの欠損がどのようにして最終的に筋肉の崩壊に結Phe−Arg−MCAをそれぞれ基質として測定した1）．β−へ

びつくかは依然として不明である．筋細胞死とそれに続

キソサミニダーゼ活性はGlaserらの方法2），プロテア

く再生に細胞内，外の種々のプロテアーゼとインヒビゾーム活性はSuc−Leu−Leu−Tyr−MCAを基質として田ターが大きな役割を担っていることは間違いない．最近，次第に明らかになりつつあるプロテアーゼがもつ多中らの方法3），キマーゼ活性は木戸らの方法4㌧ コラーゲ
ナーゼ活性はDNP−Pro−Gln−Gly一Ile−Ala−Gly−Gln−D−

種多様なバイオモジュレーター機能を考慮すると次のよArgを基質として早川の方法5）にそれぞれよった．

うなことが想定される：筋細胞死に至るプロセスには
結

種々のプロテアーゼが協同的に働き筋崩壊をもたらすこ果1）筋細胞死に伴う種々のプロテアーゼ活性の変動と，再生の促進にも蛋白質分解が必要なこと，さらに筋前駆細胞の増殖にプロテアーゼとインヒビター自体が促

リソソームのカテプシソ群（カテプシソB，L）およ

進活性をもつことなどである．しかし，これらプロテアーゼ群の働きを系統的に調べた研究がない．

びβ−へキソサミニダーゼは以前報告したように，ブビ

これらの課題の解析を進めるため，今回はブビバカイ

10倍まで増加し，その後漸減した（図1）．今回の実験でンによる急性筋壊死実験モデルにおける細胞内・外の各は注入後1日目にカテプシソBおよびLの小さな活性上

種プロテアーゼ群の活性変動を調べてみた．

昇のピークがみられるが，これはおそらく筋細胞内の自バカイン注入後2日目に上昇しはじめ，3日目には5〜

食作用の克進に由来すると思われる．次に，細胞内蛋白

材料と方法

質の分解系としてリソソーム経路と並んで重要な役割をもつプロテアゾーム活性を測定した．SDS非存在で8週齢のウィスク一系ラットを用いた．ネソブタール

ATP存在下およびSDS存在下で測定したプロテアゾー

麻酔下に右後脚を切開し，ヒラメ筋を露出し直祝下にム活性を図2に示す．いずれの活性もカテプシソ群と同0．5％塩酸ブビバカイン200〃lを注入し，皮膚を縫合し様にブビバカイン注入後3日目には著明に上昇していた．1，2，3，4，5，6，10日目に屠殺しヒラメ筋を採取した．

た．対照群やブビバカイン注入後1日目および6日目以

酸素活性測定材料の調整法
ヒラメ筋を9倍量の0．025M蕉糖の中でポリトロソホ

ではSDSの添加効果はまったくみられない．細胞外のプ

モゲナイザーを用いてホモダナイズした．このホモジェ

ナーゼ活性はブビバカイン注入後の時間経過では大きなネートをコラーゲナーゼ活性測定の材料とした．ホモ

変化はなく，注入後2〜3日目にむしろ活性は低下した

ジェネートを15，000×g，20分間遠心し，その上活をプ（図3）．

ロテアゾーム活性測定に用いた．遠心沈澱を0．6MKCl2）筋再生とプロテアーゼ

を含む50mMリン酸バッファーPH8．0に懸濁，ホモゲナ

筋再生に働く種々の増殖因子の一つとしてプロカテプ
シソLに我々は注目している．ブビバカイン注入後2〜

実験的急性壊死筋作成

イズ後15，000×g，20分間遠心し，その上清をマスト細降ではSDS添加による活性増加が認められるが，3日目
ロテアーゼであるマスト細胞キマーゼおよびコラーゲ

3日目にみられる筋壊死巣には高いカテプシソもレベル

胞キマーゼの活性測定に供した．リソソーム酵素の活性はホモジェネートに終濃度0．25％のトリトンⅩ−100を加をもった多数のマクロファージが浸潤してきており，マえ，撹拝後15，000×g，20分間遠心し，その上清を用い

クロファージは大量のプロカテプシソLを細胞外に放出している．プロカテプシソLが種々の細胞に対して増殖て測定した．

促進活性を示すことを最近明らかにしており，筋芽細胞■順天堂大学医学部生化学第一講座

に対して増殖効果を示すかどうか現在検討中である．

−125−

︵UⅦ︼2d￠∈盲∈︶︑g＞pU巾U雲Uas
0

2

4

6

8

10

12

0

2

Time（day）

4

6

8

10

12

0

2

Time（day）

4

6

8

10

12

Time（day）

図1ブビバカイン注入後のヒラメ筋のリソソーム酵素活性の変動
2回の独立した実験の結果．各1点は2匹の平均値

考察

筋ジストロフィー症および貴縁疾一むにおける筋細胞膜︵∪薯edm∈︑⊃∈︶倉＞もdU⊆誠ds︵u誉2dひ長⊃∈︶倉＞石嶋0∈邑Sの異常は細胞内カルシウムの上昇をもたらし，細胞骨格の破綻，ミトコンドリア呼吸の阻害，スーパーオキサイ
ドの産生などを介して筋細胞の障害・死を導く．変性・崩壊細胞はマクロファージにより貪食・清浄された後，種々の増殖因子・遊走因子を介して筋前駆細胞は活性化され，増殖し，筋再生がおこる．この細胞膜の異常に基づく筋細胞死，再生のプロセスにおけるプロテアーゼ系の働きの仮設を図4に示す．筋細胞内で初期に働くと推

0

2

4

6

0

8

12

0

2

図2

4

6

8

10

定されるのは細胞内Ca2十の増加によって活性化される

12カルパインである．カルパインの大部分は不活性型で存Time（day）

Tjme（day）

在すると考えられるので，活性化されたカルパインだけ

ブビバカイン注入後のヒラメ筋のプロテアゾーム
活性の変動を測定する必要がある．最近カルパインのN末部分が限︵∪苫edO∈う∈︶倉＞召：⊆U乳S・・ ・．・・●・∴・・●●●

0

2

4

6

8

10

12

¶me（day）

図3

0

2

4

6

8

¶me（day）

プビバカイン注入後のヒラメ筋の細胞外プロテアーゼ活性の変動（A）マスト細胞キマーゼ（B）コラーゲナーゼ

−126−

10

12

細胞膜の異常う■細胞内Ca2＋の増加→細胞死うーマクロファージ遊走貪食
カテプシンの増加
プロカテプシンL

自食作用の冗進異常蛋白の除去？

マトリックスの破壊
プロテオダリカンの減少

MMP一丁I MP

マスト初胞キマーゼ

捕体系の活性化
幸二ン、プラスミノーケンの活性化

セリンプロテアーゼ

増殖因子の活性化

図4 筋細胞死と再生におけるプロテアーゼの働き

定分解された活性型カルパインに特異的な抗体が作成さ

ゼ，マスト細胞キマーゼ，プラスミノゲソアクチベー

れており，カルパインの活性化がいつ，どの程度おこっ

ター，補体系，増殖因子（例えば，TGF−β）の活性化プ
ロテアーゼなどが細胞の障害，細胞外マトリックスの破ているか明らかになることが期待される．カルパインの壊，さらに再生に働いていると考えられる・今回はコラーゲナーゼとマスト細胞キマーゼ活性を調べたが，大持続的な活性化は細胞骨格タンパクの分解，不可逆的な細胞骨格の破綻をもたらすだろう．ジストロフィー筋の変性細胞内にはカテプシソの染色性が増加し，自食作用

きな変動は捉えられなかった．前者は不活性型として分克進像がみられることは以前に報告した6）．ブビバカイ
ン注入による急性筋崩壊では，カテプシソ活性，プロテ泌され，正確な活性測定は容易でないので，さらに測定法を吟味する必要がある．

アゾーム活性ともに3日目に活性増加のピークがある．

筋前駆体細胞の増殖には種々の増殖国子が関与していカテプシソの著明な増加は浸潤してきたマクロファージ

る．コンピテンス作用をもつFGF，PGDFに加えて由来であることは以前免疫組織学的手法で明らかにし

EGF，IGF−Ⅰ，IGFニⅡ等のプログレッショソ因子が必た．プロテアゾーム活性の上昇が筋細胞由来か，マクロ要だといわれている．今臥我々はそれらに加えてプロファージ由来か今後調べる必要がある．正常細胞内の20

カテプシソLも重要であることを示唆した．プロカテプ

Sプロテアゾームは不活性であり，試験管内での活性化

シソLの分泌源としては量的には浸潤マクロファージとにはSDSがよく用いられる．SDSの添加により，実際正思われるが，筋細胞，筋芽細胞由来のものも否定はでき

常筋では5倍以上，肝臓では10倍程度の活性上昇が観察

ない∴筋細胞の再生に実際，どのような増殖因子，ホルされた．しかし，ブビバカイン注入後3日目の筋ではモンが重要であるのか培養細胞のレベルおよび玩t諭川でプロカテプシソLを含め調べる必要がある．筋ジスト

SDSを添加せずとも，ATPlmMがあれば，SDS添加時と同じ程度の活性の強さを示した（図2）．これはブビ

ロフィーの治療を遺伝子治療以外の方法で考える場合，

バカイン注入後3日目の筋での活性増加は20Sではな

筋細胞の変性・壊死が始まれば種々のプロテアーゼの活

く，26Sプロテアゾームが主体である可能性を示唆す
る．20Sと26Sプロテアゾームの基本的な相違はユビキ性化など筋崩壊に向けてのカスケード反応が進行するた

チン化タンパク質を分解するか否かの差であるので，これを調べる必要がある．勿論，プロテアゾームの分子サ

害の初期の段階での抑制か，むしろ再生を促進するアプ
ローチの方が可能性は高いと思われるので，増殖国子のイズの検討，mRNAと蛋白量の変化を合わせ解析しなければならない．26Sプロテアゾームほ寿命が極めて短研究は重要である．

め，この段階を阻止するのは難しいと思われる・細胞障

文

いのでmRNAは増加しても，蛋白量の増加は捉えられ

献ないこともありうる．昨年度筋内のユビキチン化タンパ

1）木南英紀，板東祥晃：チオールプロテアーゼ，蛋白

ク質は壊死巣の拡大に伴い減少していることを報告した

質分解酵素Ⅰ．生物化学実験法30（鶴大典，船津勝

が7㌧ これにはマクロファージのカテプシソばかりでな

編）学会出版センター．1993，pp39−56・

く，プロテアゾームも関与している可能性が高いことを

2）GlaserJHand SlyWS：β−Glucuronidase defici−
ency mucopoly−SaCCharidosis・Methods for enzy−

今回の結果は支持する．

maticdiagnosis．JLabClinMed

細胞外プロテアーゼとしては種々のメタロプロテアー

一127−

82：969−977，

1973．

1993，pp130−169．

3）田村具博，田中啓二：高分子多機能プロテアーゼ（プロテアゾーム），蛋白質分解酵素Ⅰ．生物化学実
験法30（鶴大典，船津勝編）学会出版センター．

6）KominamiE，IiK and Katunuma N：Activation
Of theintramyofibralautophagiclysosomalsystem

in muscular dystrophy．AmerJ Pathol127：21−
26，1987．

1993，pp170−223．

4）木戸 博：蛋白質分解酵素Ⅰ．生物化学実験法30（鶴大典，船津勝編）学会出版センター．1993，
pp5−38．

5）来任準一，早川太郎：蛋白質分解酵素1．生物化学
実験法30（鶴大典，船津勝編）学会出版センター．

／

−128−

7）木南英紀，上野隆，武野大策ほか：筋細胞死と自食作用および再生． 厚生省「精神・神経疾患研究委
託費」筋ジストロフィー及び関連疾患の成因と治療法開発に関する研究 （荒木班）平成4年度研究報
告書，1993，pp92−95．

トコンドリア（Partl）

33）進行性外眼筋麻痺症候群の眼科的異常
佐

研究協力者

目

藤

宗 像

的

Kearns−Sayre症候群（KSS）を含む進行性外眼筋麻痺症峡群（progressiveexternalophthalmoplegia，PEO）
では，ミトコンドリアの形態的，組織化学的異常に加え，ミトコンドリアDNA（mtDNA）の部分的欠矢が指摘されており，一連の疾患群と考えられている．KSSでは網膜色素変性症がtriasの1つとされているが，PEO
では検限銃的に異常はみられないとされている．
このたび，ミトコンドリアの形態的，組織化学的異常

猛■

紳■＊

山

崎

広

子＝

以上の症例につき，視力∴細際灯顕微鏡，限底，ゴー
ルドマン動的量的視野，蛍光限底造影，網膜電図
electroretinogram（ERG），視覚誘発電位visualevokedcorticalpotential（VECP），暗順応の諸検査を施行した．
ERGは30分暗順応後，角膜電極を用いて，キセノンフ
ラッシュランプ20Jで限前30cmにて発光させ，暗順応下で記録した．刺激記録装置は日本光電社製のERG
PHOTIC STIMULATORを用いた．
VECP記録には，白黒テレビモニター上に白黒市松模を認め，検眼鏡的に網膜の異常の見られなかったPEO
6例12限につき，限科的検査を行った．

様を2回／秒で反転させるtransientのパターン視覚刺激

対象及び方法し対象は男性1名，女性5名の計6例である．初診時の年齢は25〜54歳，経過は6〜18年，初症時の年齢は13〜
44歳となっている．全例に外眼筋麻痺を認めたが，網膜色素変性，心電導障害は認めなかった．全身のミオパ
チーを認めるものが 2例あった（表1）．
mtDNAの解析を5例に行ったが，4例にmtDNAの欠矢がみられた．そのうち3例は欠失部位の同定がされており，症例1は8035〜11433の3399塩基対，症例5は10050〜15293の5244塩基対，症例6は8483〜13459の4977におき，増幅器の電気フィルター1．5Ikから100Hzの帯域にて増幅したのち，解析時間500msecにて100回加算平塩基対の欠矢がそれぞれみられた．症例3は現在部位を同定中である．

症例も明らかな異常はみられなかった．ゴールドマン動表1全身ミオパチーを2例に，外眼筋麻痺を全例に認める．網膜色素変性および心電図異常は全例で認めていない．

表2 眼科的検査の結果＼
年齢 経 過全 身の ミオ バナ ー

外眼 筋

綱 瞑 色素心電 図

性別 年 数（四肢筋 力 低下 ）

麻揮

変性

異常

一

l

54F

18年

＋

＋

2

29F

13年

十

十

3

54M

lO年

＋

4

49 F

9年

＋

5

25F

6年

＋

6

29F

l0年

＋

＊国立精神・神経センター国府台病院神経内科…国立精神・神経センター質府台病院眼科−を用いた．刺激視野は110×70，チェックサイズ21分，
コントラスト80％とし，関電極をOzに，不関電極を耳だ

均した．刺激，増幅，加算装置は日本光電社製のNEURO−PACK FOURを用いた．
暗順応はゴールドマンウイーカーズ暗順応計にて5分
間明順応したのち測定した．
結

果

表2にまとめる．矯正視力は0．6から1．2の間に分布
し，比較的良好であった．相隣灯軒徴鏡検査はいずれの的量的視野では，1例に中心部視野感度の低下を認めた

が，他の症例では正常であった．
眼底は症例2で両眼の軽度視神経萎縮を認めたが，網膜の明らかな変性はいずれの症例にもみられなかった．
しかし，蛍光眼底造影検査では，検査の施行できた5
例10眼中∴3例6眼で後梅部を中心に顆粒状の過蛍光がみられた（図l）．これは，Windowdefectによるものと思われ，網膜色素上皮の萎縮が疑われた．
ERGは6例12眼中，4例8眼でb波の減弱を認めた（図2）．VECPは6例12眼中，2例4眼でPlOO頂点潜時の延長を認めた（図3）．
暗順応は6例中4例で梓体最終閲値の上昇を認めた．

Casel

Case

2

Case

Case

4

R、一

3

、十一

′ノー一．．−．＿−◆＿り＿＿−＿【▼

￣

L粟≡竿≡
V

R

＿＿▲＿

一切軋加納キL

rt＿．−＿＿＿−＿．‖＿−

一一一・一・

Case

5

Case

甘虹

L

﹁lト1J

R

R‥

6

予、￣、．一￣￣、l￣丁■一一￣＋−￣】．・一・一正常コントロール／ぐ、一m、、＿▲＿＿く、′′

200

㌘8」
ノ正

50msec■︶（Case3のみ100msec）

図1症例5の蛍光眼底造影．window defectと思われる顆粒状の過蛍光を認める．

図2

ERG．症例1，2，3および6にb波の減弱を認める．

PlOO頂点潜時（msec）

PlOO頂点潜時（msec）
R

Casel
Case

85

4
LlO8

＝三S三三：二二：二．∴∴二二二三号二￣−∴＿R130十㌢、♪・†■㌧了∵㌦∵J予・1．7・

正常
コントロール100﹂

Case3L131頼甘言彗箭−＼。。Se6RlO8庸へJ畔WW」115刷り一・一・一一l㍉∴∴一一
正常

5HVL

コントロール100

5uVL

lOOrnsoclOOmsQC

図3 VECP．症例3および5でPlOO頂点溶暗の延長を認める．

−132−

考

が必ずしも暗順応検査で梓体最終閲値の上界が認められていたわけではなかった．
VECPに関しては，PlOOl罰点潜時の延長のみられた報告があり4），本研究の結果と一致する．中心視野から大脳視覚領域に至るいずれかの部位での障害が示唆されるが，部位の同定はできない．症例2では両眼視神経の軽度萎縮を認めたが，PlOO風点潜時は正常であった・
今まで報告されたKSSの網膜色素変性は，1958年にKearnsおよびSayreらが報告した症例も含めて，骨小体様変性や網膜血管の狭粗化などを認める，いわゆる典型
的な網膜色素変性症の報告はほとんどない2）．多くは網膜の顆粒状の色素沈着ないしは色素脱失，萎縮である・
網膜血管の太さも正常であったというものが多い・

察

KSSは外限筋麻掛こ加え，網膜色素変性，心伝導障害
を3主徴とし，ミトコンドリアの形態的，組織化学的異常を認め，mtDNAの部分的欠矢がその原因と考えられている．PEOは上記3主徴のうち外限筋麻痺を認めるにすぎないが，やはり多くの症例でミトコンドリア異常を認め，mtDNAの欠矢がみられる症例がある1 ・
本報告において眼科的検査を行った症例でも，全例に骨格筋のragged−red fiberおよび，CytOChrome coxydase欠損線経を認めており，うち5例には電子顕微
鏡的にミトコンドリアの形態異常を認めた・また，
mtDNAの解析を行った5例のうち4例にmtDNAの欠矢を認めている．臨床的には2例に全身のミオパチーを認めるものの，外眼筋麻痺のみであり，検限鏡的には網膜色素変性を認めなかった．

結論

検査したPEO6例12限は，検眼鏡的に網膜色素変性などの網膜の異常を認めなかったにもかかわらず，蛍光

しかし，蛍光限底造影検査の結果では，後極部を中心にwindow defectによるものと思われる顆粒状の過蛍光

眼底造影，ERG，VECP，暗順応などの限科的検査にて，
眼筋ミオパチーのみのPEOにおいても潜在的な網膜，
特に網膜色素上皮の異常および祝路の異常が示唆され
KSS同様mtDNAの部分的欠矢が原因と考えられた・を認めており，網膜色素上皮の変性，あるいは萎縮が示唆される．このような過蛍光を認めたという報告は，
KSSおよびPEOについてもいくつかみられる．実際，
KSSについていえば，病理学的にも網膜色素上皮ではメラニンの量が減少しており，踵大したミトコンドリアが文
献1）宗像 押，山崎広子，佐藤 猛：ミトコンドリア遺伝子の欠矢を伴う進行性外限筋麻痺の1例．日限，
1993，投稿中．

みられ，さらに祝細胞の集まる網膜外層にマクロファー
ジの遊走が認められ，二次的な炎症性の網膜色素変性であろうと考えられている3）．ERGについては，a波減弱，
b波減弱，両方の減弱，律動様小波の消失などさまざまな報告がなされているが4）5），もっとも多いものはわれわれの症例同様，b波の減弱である．KSSについては，典2）Kearns TP and Sayre GP：Retinitis pigmentosa．
external ophthalmoplegia，and complete heart

型的な網膜色素変性症と同様a，b両波ともほぼ消失がblock．Arch Ophthalmo160：280−289，1958・

みられた症例の報告もある．通常b波の減弱は網膜内層

3）EagleJr RC，Hedges TR and Yanoff M：Theの障害で起こるとされており，網膜外層に位置する網膜

atypicalplgmentary retinopathyof Kearns−Sayre

色素上皮の萎縮，変性では説明がつかない．これについsyndrome．AlightandelectronmicroscopICStudy・ては，網膜内の細胞間のneurotransmitterの異常による

Ophthalmology89：1433−1440，1982・

もの，あるいは網膜内層に位置する細胞，つまり内顆粒4）BerdjisH，Heider W and Demisch K：ERG and層のミトコンドリアの機能異常によるものなど，さまざVECPinchronic progressive externalophthalm0−

まな原因が考えられているが，はっきりしていない．

plegia（CPEO）．DocumentaOphthalmologica60：
427−434，1985．

暗順応下でのsingleflashERGのb波は梓体系の機能

5）星野育男，山本嘉彦，武田憲夫：Kearns−Shy症候群
における電気性理学的検討．臨限45：593−596，

異常を反映しており，網膜色素上皮ないし祝細胞，特に梓体を含めた異常も考えられる．
これは，暗順応検査においても梓体の最終閉値が上昇していることからもうかがえるが，b波の減弱した症例

−133−

1991．

34）Kearns−Sayre症候群患者の無症状の母親に認められた
運動負荷時の高乳酸血症と筋ミトコンドリア異常

井藤

貯彦

寿善

原 田

市西

紆紆

健美

はじめに

●

臣

横斎

貯安静

雅貴史

尚

井

ノ

池井藤

赤 三蔚

研究協力者

ミトコンドリアDNA（mtDNA）は母から子へ伝えられは異常所見はなかった．髄液では蛋白62mg／dl，乳酸
18．4mg／dlと軽度の上昇がみられた．筋電図には軽いるため，ミトコンドリア病には母系遺伝を示す家系例の筋原性変化が認められた．骨格筋（三角筋）のミトコンあるのが特徴であるl）．しかし，Kearns−Sayre症院群

ドリア酵素の活性値は復合体Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，およびⅣのい（KSS）を含む慢性進行性外眼筋麻痔（CPEO）ではそずれも正常範囲であった．生検骨格筋の病理組織像ではの殆どが孤発例であり1），その遺伝型や発生機序についGomori−Trichrome染色変法で筋細胞の9．7％にraggedては末だ不明な点が多い．本研究では無症状の母親に筋ミトコンドリア異常が認められたKSSの1家系につい

red fiberが認められ（図2），電顕像では異常クリスタ，て報告する．

れた（図3）．生検三角筋から抽出したDNAを鋳型とし結晶様封入体を有する異常ミトコンドリアの増加がみらての polymerase chain reaction（PCR）法によ り症

例

発端者：56歳，男性．家系内に患者と同様の症状を示す者はなく，両親の近親婚はない（図1）．30歳から限瞼下垂，易疲労感，35歳から眼球運動障害，40歳から難聴，
瞑声があり，48歳時に当科で三角筋の筋生検をうけ，ミトコンドリアミオパチーと診断された．上記の諸症状
は，その後徐々に増強している．
一般理学所見：身長は150．7cmと低身長である．脈拍60／分，整．血圧112／80mHg．眼底に網膜色素変性が認められた．胸腹部に異常所見はなく，下腿の浮腫もない．
神経学的所見：知能は正常．両側の限瞼下垂と外眼筋麻痺がみられ，難聴，声帯萎縮，殴声，嘩下障害などもある．不随意運動はない．筋萎縮は明らかでないが，頸筋に軽い筋力低下が認められた．耐運動能の低下も認められた．協調運動は正常で，Romberg徽侯は陰性である．
四肢の深部反射は正常で，病的反射はなく，知覚系，自律神経系にも異常所見はなかった．
検査成績：血清クレアチンキナーゼ（CK）活性は正常値を示したが，安静時の血中乳酸値は20．1mg／dlと軽度に上昇していた．そして，この値は好気的運動負荷（ェルゴメータにて15ワット，15分間）により最高45．0
mg／dlまで上昇した．心電図では1度房室ブロックと不完全左脚ブロックが認められた．頭部CT，MRI，脳波に

mtDNAの塩基番号7，311−13，733，7，897713，733，7，
311−13，613，7，897−13，613を増幅し，それぞれ1．4
kbp，860bp，1．3kbp，740bpの異常バンドが認められ，これらの塩基配列から塩基番号8，483から13，459までの4，977bpの欠矢が存在することが確認された（図4）．
以上の臨床症状，筋生検所見，ならびに骨格筋のmtDNA欠失などより本症例はKSSと考えられた．
発端者の母：78歳，女性．76歳時に老人性白内障の診断

図1 Ni家家系図．口，○：ェルゴメータ運動負荷施行例．数字は年齢を示す．

事徳島大学医学部第一内科

−134−

M

l

3

4

b

0671
︶3156
P1453
︵3964

2

・
︐
一

27
22
30
22

図2 発端者の骨格筋（三角筋）の病理組織像．
GomoLi−Trichrome染色変法．Ragged red
fiberが認められる．150倍．

図4

PCRによる発端者の骨格筋ミトコンドリア
DNA解析．レーン1から4において短い異常バンドが認められた．primershift PCRを行うと，それらに応じて異常バンドの長さが変化した．増幅領域：レーン1：7，311−
13，733，レーン2：7，897㌧13，733，レーン
3：7，311−13，613，レーン4：7，897−13，613．
M：入−HindII digest．

図3

発端者の骨格筋（三角筋）のミトコンドリ
アの電顕像．ミトコンドリアの増加と大小不同があり，内部に複雑に増殖したクリス
タや結晶様封入体などを含有するミトコン
ドリアが認められる．

のもとに水晶体摘出術をうけた．眼瞼下垂，外眼筋麻
痔，網膜色素変性，運動機能障害などほない．検査成績
では血清CK活性値は212IU／L（正常値30〜200）と軽度の上昇がみられたが，安静時の血中乳酸は正常値を示した．心電図や筋電図に異常所見はなく，三角筋のミトコンドリア酵素の活性値は複合体Ⅰ，Ⅰ，Ⅲ，およびⅣのいずれも正常範囲であった．生検三角筋の病理観．織像
ではGomorトTrichrome染色変法で筋細胞の0．3％にragged red fiberが認められ，ragged red fiberでは
cytochromeoxidase活性が陰性であった（図5）．電顕像
ではミトコンドリアの増加や大小不同，クリスタの形態異常などが認められた（図6）．骨格筋のmtDNA欠矢はPCR法では検出できなかった．
運動負荷による家系員の血中乳酸値上昇の検索
発端者の母，姉，弟，長女，次男にエルゴメータによる15ワット，15分間の好気的運動負荷を行い，血中乳酸値を運動開始後5分，10分，15分，20分，および30分に

−135−

ー5

0

5

10

15

20

30

時間（分）
図5 ェルゴメータによる運動負荷試験．発端老および母親では運動負荷により血中乳酸値の著明な上昇が認められた．網掛けは正常
対照（年齢22〜80歳，n＝10）の成績を示す．

図6 母親の筋病理机織像（三角筋）．左：GomolirTrichrome染色変法．0．3％と少数であるがragged red riberがみられる．
li：cytochromeoxidase（COX）染色．Raggedredfiberに一致してCOX活性の陰性線経がみられる．130倍．

図7 母親の生検筋の電顕像（三角筋）．ミトコンドリア数の増加，大小不同，変形およびクリス
タの形態異常が認められる．

測定した．発端者の姉，弟，長女，次男では血中乳酸値

は加齢のみでは説明できない．発端者の母には骨格筋のの上昇はわずかであったが．発端者の母では巌高37．6

mtDNAに欠矢が検出されなかったが，これは生検筋中mg／dlと著明な上昇が認められた（図7）．

のmtDNAに欠失mtDNAがきわめて微量であることにもよると思われるが，一方，発端者と母のmtDNA欠失

考察

発端者の母は生検骨格筋にragged red fiberが認めら部位が大きく異なり，本研究で用いたプライマーでは異常バンドが増幅されなかった可能性もある．

れ，電顕像でもミトコンドリアの増加と形態異常がみら

本家系の発端者は孤発のKSS症例であるが，母親のれたことから，骨格筋にミトコンドリア異常が存在する
ことが知られているが2㌧ 発端者の母では運動負荷によ

骨格筋に形態的にミトコンドリア異常があることより，
発端者の異常mtDNAは母から伝わったものと考えられる．

る血中乳酸値の上昇が対照群の約2倍と高く，この上昇孤発のKSS／CPEO症例ではその母や同胞の骨格掛こと考えられた．ミトコンドリアの異常は加齢でも生じる

ー136−

mtDNAの欠矢が見られないとする報告が多く，KSS／
CPEOの多くは受精卵から個体が形成されていく過程で新たにmtDNAに欠矢が生じ，それが骨格臥心臓，神経組織などに分配され発症すると考えられてきた3）4）．本
症例のように孤発のKSS／CPEO症例にて無症状の親に筋ミトコンドリア異常が認められる家系は，現在までに
Cormierらの1家系5）とLarssonの1家系6）の報告があるのみである．Cormierらの家系では母と母方叔母の骨格

red fiberが認められたことより，この母親例では筋ミト筋mtDNAに多重欠矢が認められる5）．この家系では発端者の弟にはmtDNA欠矢がないことから，常染色体優性遺伝によると報告されており，受精卵が分裂・増殖する過程で異常な核遺伝子がmtDNAに作用し，欠矢を生じたと報告されているT）．一方，Larssonらの家系では母と妹の骨格筋において発端者と同じ部位の単一欠矢が認められたことから，germlineでmtDNAの欠矢があり，それが母から子へ伝えられたと考察されている6）．以上のように孤発のKSS／CPEO症例では個体発生の過程で新たにmtDNA欠矢が生じたものだけでなく，核遺伝子の異常によるものや，母に生じた欠失mtDNAが母系遺伝によりその子へ伝わり発症したものなど，その発症機序は単一でなく，遺伝子異常のおこり方からみると均一な疾患ではないことが示唆される．無症状の家系員にお2）TrounceI，Byrne E，et al：Declinein skeletal

ける骨格筋のミトコンドリア異常についてはまだ充分な検討がなされていないのが現状である．我々の症例に適用した好気的運動負荷試験を用いることにより，本論文の母親のような症例は多くなるものと思われる．
本家系例は孤発のKSS／CPEO症例が遺伝的に発症することを示した症例であり，KSS／CPEOの発症機序を

deletions of themitochondrial genomein a case

コンドリア異常が存在することが示唆された．本家系の存在は孤発のKSS／CPEO症例の中に遺伝性のものがあることを示唆する，
文l）DiMauro S，Bonilla E，et al：Mitochondrial
myopathies．Ann Neurol17：521，1985．

とmuscle mitochondrial respiratory chain function：
POSSible factorin aging．Lancetl：637，1989．
3）Moraes CT，DiMauroS．etal：MitochondrialDNA
deletionsin progressive external ophthalmoplegia

and Kearns−Sayresyndrome．NEnglJMed320：
1293，1989．

4）ShoffnerJM，Lott MT，et al：Spontaneous
Kearns−Sayre／chronic externalophthalmoplegia
Plus syndrome associatedwith a mitochondrial

DNA deletion：A slip−

replication model andmetabolic therapy．ProcNatlAcadSciUSA86：
7952，1989．

5）Cormier V，Rotig A，et al：Autosomal dominant
Of progressive encephalomyopathy．AmJ Hum
Genet48：643，1991，
6）PoultonJ，Deadman ME，et al：Germ−linedeletions of mtDNAin mitochondrial

myopathy，

AmJ Hum Genet48：649，1991．
7）川井尚臣，赤池雅史ほか：常染色体優性の遺伝型を示すミトコンドリアミオパチ一一日験例と文献例に解明する上で貴重と考えられる．
ま献おける臨床的特徴とミトコンドリアDNA異常．臨め

孤発のKSS症例の無症状の母親に好気的運動負荷により，高乳酸血症が認められ，また筋組織像でragged

一137−

床神経学33：162，1993．

35）MERRFにおけるミトコンドリアDNA異常と臨床症状
福 原 信 義＊
研究協力者

中

島

孝■

坂

尻

顕

一書

松 原 奈 絵＊ 巻 渕 隆 夫■＊

緒言

MERRF（myoclonus epilepsy associated withragged−redfibers）はFukuharal）により母系遺伝形式をとり，ミトコンドリアミオパチーと進行性ミオクローヌス

てんかんを主症状とする疾患で，平均発症年齢16．8歳，ミオクローヌス，小脳失調，痴呆，痙攣発作，ミオパチーなどが認められるものとして報告されてきた．1990
年にShoffner2）らおよびYoneda3ちによりtRNALy，の塩
基番号8344番A→Gの変異によるMERRFの発症が報告されて以来，この点変異をもつ症例の症例間の臨床症状の差や発症年齢の多様性についての検討が行われてきている．個体間や臓器間のミトコンドリア遺伝子のヘテロ
プラスミーの割合の違いにより臨床多型が作られるという考え方が報告されてきている．
Tanno4）らの報告のように，tRNALYSの塩基番号8344番
A→Gの変異の臓器間のヘテロプラスミーの割合がほぼ一定であるならば白血球レベルでミトコンドリア遺伝子のヘテロプラスミーを分析し，臨床症状に一定の傾向があるかどうか検討することは重要であると思われる．今回の発表では，MERRFの一家系7人について臨床症状とミトコンドリア遺伝子異常の関係を比較検討し，その臨床的意味について考察した．
症

例

家系図に基づいて，症例1，2，3および神経学的所
見で異常を認めない4人の計7人について検討した．
症例1（ST）DNA−8：60歳，男性．母が30歳代からよく転倒したことと，いとこ婚の家族歴があった．生来健康であったが45歳頃から構音障害があり，47歳頃より右手のミオクローヌス，50歳頃からconvulsion，小脳失調症が出現し，徐々に痴呆が進行した．58歳まで筋萎縮は目立たなかった．頸部筋を中心に筋萎縮が始まり，急速に全身に広がり，60歳肺炎で死亡した．神経学的所見として中程度の痴呆，構音障害，四肢体幹の小脳性失調症，深部腱反射克進，全身の筋萎縮，神経困性膀胱を認めた．
頭部CTで小脳脳幹の萎縮を認め，筋生検所見では大腿直筋の生検でmuscle fiberの大小不同は認めたが，ragged−red fiberは認めなかった．剖検脳肉眼所見は小脳脳幹の萎縮が著明であった．
症例2（KT）DNA−95：40歳女性．症例1の姪．大学を優秀な成績で卒業したが，33歳頃より性格の変化があり，
次第に痴呆症状が明らかになった．全身痙攣，手のミオ
クローヌス，ふらつきが進行した．神経学的所見は会話可能だが痴呆を認め（WAISで測定不能）左右の注視眼
振，四肢体幹失調，MMT4レベルの筋力低下，手のミオ
クローヌス，aSterixisを認めた．歩行は失調性だが可能だった．頭部MRI所見は小脳虫部の軽度の萎縮のみだった．上腕二頭筋の生検でmuscle fiberの大小不同とragged−red Eiberを認めた．
症例3（MT）DNA−17：17歳男性，症例2の長男．満期
産．独歩は15ヶ月で尖足歩行であった．3歳より転倒や意識消失あり，6歳頃より明らかな全身痙攣発作を認めた．精神遅澤あり，中学校より特殊学級であった．神経学的所見はビネー式IQ69，dysarthria（＋），小脳失調（＋），
四肢体幹のミオクローヌスが運動時に出現，筋力低下と萎縮は全身性だった．DTR軽度先進し，Babinski反射は両側陽性で，転倒しやすいが歩行可能であった．脳MRI所見は年齢に比して全体に萎縮していた．
無症状老（神経学的所見で異常がないのを確認したもの）は以下の4人で，KTs（DNAT65）65歳女性：症例
3の母，症例1の姉．JT（DNA−112）14歳男性，症例3の弟．NT（DNA−114）7歳男性，症例3の弟．KS（DNA−111）27歳女性，症例2の妹であった．
方法

1．ミスマッチプライマーを用いたPCRによるsimple
detection

Yoneda5）らの方法を用い末梢血の白血球分画からフェノール・クロロフォルム法で全ヒトDNAを抽出した．Primerl：5㌧TCACTGTAAAGAGGTGCCGG−3（塩基番号8345−8364），Primer2：5㌧AACCACAGT−TTCATGCCCA−3（塩基番号8191−8210）を使いPCRを93℃30sec，50℃1min，72℃3minの条件で25■国立療養所犀潟病院神経内科…国立療養所犀潟病院神経病理

CyClesで行った．NaeIdigestion後2．5％agarosegelにて−138−

電気泳動し，エチゾウムブロマイド染色のDNAのバンちかであった（図2）．症例2の母親は臨床症状に欠け

ドを写虎視影した．

変異DNAはagarosegelでは明らかに認めなかった．症

2．ヘテロプラスミーの分析

例3の兄弟のJTは軽度変異DNAが認められたが，NT

Tannoわらの方法を用いてPrimer2に対してγ−32pではまったく変異DNAを検出できなかった．KSは非発

ATPを使いPQlynucLeotide kinaseでエンドラベルL症者であるが変異DNAを認めた．

PCRの最後のcycleに入れ，一回反応させた．8％の非ヘテロプラスミーの割合をェソドラベルしたprimer

変性polyacrylamide gelにで電気泳動し，geldryerで乾を使い分析した（図3）．コント。一一ルであるTNの燥後にX rayフィルムにexposureした．同時にBAS
2000による走最も試みた．

uncut，Cutと比較検討すると，症例1（ST）ではコント

結ロールと同じサイズの174bpのwildtypeと，アジア人に果

今回家系内7人について検討したが，家系lヌl（図1）

TN

KTS

14

97

U

より母系遺伝により全員が発病する1−†能性があると思わ

C

U

KT

MT

95
C

U

JT

NT

112

114

113

C

U

C

U

C

U

KS

C

Sで

111
U

C

8
U

C

れた．症例1ほ高齢になるまでミトコンドリアミオパ
チーが明らかにならず，MERRFとしての症状が典型的となったのほ病末期であった．また，明らかなragged−
red fiberを認めなかった．症例2は33歳に発症とやや発
症年齢が高かったが，臨床症状所見からは典型的と思われた．症例2の母は65歳であるが神経学的所見や臨床症状はまったく正常で非発症のまま経過していた．症例2の妹（KS）は27歳の時点ではまったく神経学的所見，臨床症状に異常を認めなかった．2人の子がいるが今のと

図2

ころ異常がない．症例3は症例2の第一子で1歳時より

agarosegelによるPCR診断．C：NaeIcut，U：uncutを示す．TNは正常コントロール．

異常があり，MERRFの発症としては判明であるといえた．症例3の兄弟の14歳のJTと7歳のNTについては現

rN

時点での症状は認められなかった．ミスマッチプライ

L497

マーを用いたPCR法による制限酵素NaeI消化によJ（＝Uり，tRNAL｝■Sの塩基番号8344のA→Gの点変異を検出可

疇静狩静

lくTS

KT

く＝

MT

95

J

T

Nで

壬くS

113

112

114

U C lJ C U

く＝

tJ C三

舗静瞬
珊

疇舗絆

能で，点変異があると通常174bpの部分が156bpと18

111
U C U

STr
a
くコ

肝

bpに切断されgel上で156bpの短バンドが認められる．
正常コントロールと家系内の7人を含め計8人について検索を行った．図2に示すように，症例1（ST），症例

図32（KT）．症例3（MT）は明らかにNaelで切断されtRNALysの塩基番号8344にA→Gの変異があることが明TN tくTs IくT MT

図4

図1家系図

ー139一

へテロプラスミーの分析，32pを利用したPCR，
acrylamide gel電気泳動．

14

97

c

c

95113
c

c

へテロプラスミーの分析，32pを利用したPCR．
acrylamidegel電気泳動．図3で不明瞭なもの・
cutのみを示す．

表1ヘテロプラスミーと発症年齢，臨床症状の比較

K l￣
5 97 （症 例 3 の母 ） 6 5才
KT

95 （
症例2 ）

棚才

M T

l13 （症 例 3 ）17 才

JT 1 12 （症 例 3 の 弟 ） 14才
NT

11 4

KS

ll l （症 例 2 の 妹 ） 27 才

ST

8

（
症 例 3 の 弟 ） 7才

（症例 1 ）

60 才となったが，ヘテロプラスミーを分析すると165bpのA→Gmutationを持たないバンドがmutationのある147W ‖dde letion

d e】
e on

症状

V PO

W 肘10 Ut

W i廿1

発症

A ・
→G

A →G

年令

m uは io nm utab 0∩

agarosegelでは十分に判別できないことがあるといえた．臨床症状の多塑性については．ミトコンドリア退伝

十十十十

十十

無症状

子の卵細胞レベルで細胞間のヘテロプラスミーの割合が

＋＋十十

33 才

異なることによる可能性と∴臓器間のヘテロプラスミー

1−3 才の割合が異なる可能性の両者について検討することが重無症状要である．Tannoらの報告によれはMERRFの臓器間，無症状

白血球のヘテロプラスミーの割合はほぼ一定であるとの

＋
＋

十十

＋

＋

十十十十十

十十十

＋＋

十十

＋＋十十

十十

＋

＋＋

十＋

＋十十

十

十＋十＋

bpのバンドより多く認められた．このような場合は無症状ことであるが，もしこれが普遍的であるとすれば，白血45 −50 才

球遺伝子レベルでMERRFを退伝子解析することで脳や筋などの異常も同様に推定できるといえ，今回の研究の約16％認められる9base deletionがnt8272−8280にあように白血球レベルのヘテロプラスミーの分析と臨床症

る165bpのuncutのバンドと一147bpのcutされた
mutantのバンドの3種煩が認められた．uncutの165bp

状の対比が臨床的に意味があると思われる．症例3で明らかなようにmutationのバンドの割合が多いほど発症のバンドは存在するが量的に少なかった．一方症例3でが早期である傾向が見出された．また本家系のように3は3種桝のバンドは同様に認められたが147bpのcutさ種貝バンドからなるへテロプラスミーは今まで報告がな
いが，これにより微妙な臨床症状の差が出ているようにれたバンドが一番多かった．症例Zでも3桂頬のバンドがあり，同様の傾向にあった．発症していないNTも3
種煩のバンドがあったが174bpのwild typeがほとんどで165bp，147bpとも撞少量であった．KSはまったく174
bpのバンドを持たず，165bpと147bpのバンドのみであった．臨床経過発症年齢とヘテロプラスミーの割合を相対的に評価した表にまとめた（表1）．gelごとの条件の差があるため今回はBAS2000による正確な定量は行わなかった．

思われる．
今後本家系の継続的な観察と他の家系を含む症例数の増加によ ㌢，より正確な分析をすることが必要である．
同じ母親 ら生まれた者の発症または非発症予測が可能であるか否か，今後検討されるべきであると思われる．

参考文献
1）Fukuhara N：MERRF：A cIinicopahologicalStudy．Relationships between myoclonusepilepsleS

考察

and mitochondrialmyopathies．Rev Neruol147：

共通の母親からつながる同一家系のなかで，1歳より476−479，1991．

発症した早期発症者から発症者を子にもちながら65歳に

2）SchoffnerJM，et al：Myoclonus epilepsy and

なっても臨床的に発症していない者まで，発症年齢や症

ragged−red fiber disease（MERRF）is associated状の多様性が認められた．またPCR法agarose gelを用

with a mitochondrialDNA tRNALysmutation．Cel1

いたsimple detectionでは発症者を陰性と判定すること

61：931−937，1990．

はなかったが，同じ母親である兄弟や発症者の母親にお3）Yoneda M，et al：A commonmitochondrialDNA

いて制限酵素による切断が明らかにできない症例があっmutationin tRNALy，of patientswith myoclonus

た．ところがprimerに32pでェソドラベルして最後の1

epilepsy associated

回にいれPCRを行い，POlyacryl gelで分析すると
agarose gelのエチジウム染色では明らかにされないバンドが見えることが確認できた．NTではほとんどがwith ragged−red fibers．

BiochemInt21：789−796．1990．
4）Tanno Y，etal：Uniform tissue distribution oftRNALys mutationin mitochondrialDNAin MER−

174bpのバンドで165bpのバンドが少なかった．Nael

RF patients．Neurology43：1198−1200，1993．

で切断される割り合いもわずかに見えるのみで，

5）Yoneda M，et al：Simple detection of tRNALys

MERRFの変異を持つことは明らかであるがその割合が少ないことが明らかにされた．量的に少ないため，

mutationin myoclonus epilepsy associated withagarosegelではNaelで切断されたバンドを明らかに

ragged−red fibers（MERRF）by polymerase chain
reactionwithamismatchedprimer．Neurology41：

することができなかった．またKTsのように発症者の母

1838−1840，1991．

親がagarosegelのみでは異常が見出せずfalse negative−140一

トコンドリア異常症の病態解析
桃 井 真里子＊

研究協力者

斎

藤

茂

子♯

山

形

崇

倫■

藤 井 幹 久■■ 中 内 啓 光…

目

図1に示す．1細胞から，標識しない状態でも検出可能

的ミトコンドリア異常症は変異ミトコンドリア遺伝子

なPCR産物が得られた．サザン解析の結果は，非標識の（mtDNA）が患者においてヘテロプラスミーであるこ

結果と呼応した．定量解析の結果，正常mtDNAのみ．

とが基本であり，核遺伝子支配疾患と本質的に異なる点

変異mtDNAのみの細胞はなく，どの細胞も正常である．MELASにおいてもわれわれが3243変異

mtDNAと変異mtDNAのヘテロプラスミーであった．

mtDNAの定量的解析で示したように，正常遺伝子と変定量結果を図2に示す．比較的幅の広い分布を示し，細異遺伝子が組織により量比は異なるがヘテロプラスミー
である1）．各細胞内ではどのようなヘテロプラスミーを胞集団の変異mtDNAの割合55％を中心にした割合分布を示した．

形成するのか，または，Segregationの結果，ホモプラス

MELAS屈老母親のリンパ球におけるmtDNAの解析

ミーの状態であるのかは不明である．ミトコンドリア異結果を図3に示す．細胞集団では約10％の変異mtDNA

常症における組織障害性の発現を考えるとき，各々の細であり，個々の細胞内では10％前後の変異mtDNAを持
つヘテロプラスミーであった．正常mtDNAのみ，変異

胞内における変異退伝子の量は重要な因子である．

mtDNAのみの細胞は検出されなかった．

この視点から，ミトコンドリア異常症における細胞内IDDM家系の患者の結果を図4に示す．MELAS母親

変異mtDNAの定量的検討を行った．

と同様のパターンを示し∴細胞集団の26％周辺の比較的方

均一なヘテロプラスミーを示した．

法

1細胞分取：3243変異を有するMELAS患者，その母親，3243変異を有するIDDM家系の忍者より，研究目的を明らかにしたinformedconsentを得て採血し，リンパ球を分離し，RPMI1640に浮遊保存した．24時間以内に遠心後，PBSに浮遊させ，FIuorescence−aCtivated cell
sorter（FACSterPlus，BectonDickinson，CA）で1細胞毎に0．15％Triton溶液中に分離採取した2）．
PCRによる変異mtDNAの定量：96穴プレTトに採取した細胞溶液10〃1を直接PCR反応に使用した．プライ
マーは塩基番号3153〜3172，2551〜3531を使用し，PCR反応はすでに報告した方法で行った3）．PCR産物を
Apal処理後，アルカリプロットし，サザン解析を行った．プローブは，正常筋細胞より得た正常mtDNAの同考察

ミトコンドリア遺伝子の細胞内へテロプラスミーは不安定と考えられており，細胞分裂にともない，継代後には，おのおのの遺伝子からなるホモプラスミーを形成
し，細胞集団としてのヘテロプラスミーは，細胞内ホモ
プラスミーの集団と想定されていたが，本研究の結果
は，3243変異においては，細胞内へテロプラスミーが愚老，およびその母におけるリンパ球での変異mtDNAの存在様式であることが判明した．
MELAS母親における比較的均一な変異ミトコンドリ
アの割合は，StOChasticsegregationの過程とは考えにく
い存在様式であり，ヒト細胞内で，変異ミトコンドリア

様のPCR産物399bpを32pdCTP標識後，使用した．検出されたバンドはBAS2000にて定量後，分子量換算を

DNAは正常遺伝子と安定した状態でヘテロプラスミー

行い，変異mtDNAの割合を求めた．

初期に変異mtDNAは細胞内で均一に分布している状態を形成し得ることを示唆している．また．リンパ球発生が考えられる．すなわち，母親に見るような均一の分布

結果
MELAS患者リンパ球におけるmtDNA解析の結果をは，変異mtDNAが限られたミトコンドリアに局在するような状態では早期にsegregationがかかることが予想され，変異mtDNAは各ミトコンドリアに正常mtDNA■自治医科大学小児科■■自治医科大学大宮医療センター循環器内科■●■理化学研究所ライフサイエンス筑波研究センター造血制御部門と混在する形で分配されていることが推定される．
3243変異を有するIDDM家系の愚老においても

一141一

IJンパ球1個における変異mtDNAの分配

mtDNA3243変異のMELAS患者
リンパ球内へテロプラスミー

リンパ球集団
；55％

REF
1

1

2

3・4

5

6

7

8

9

1

1011121314

1∞503243変異mtDNA／総mtDNA（％）
図2

MELAS患者リンパ球の変異
mtDNAの割合の分布．平均値中心に分布しており，正常，変異mtDNAのど，クには分離していないことを示す．

リンパ球1個における変異mtDNAの分配
リンパ球集団唱16171819如釘22幻は4aHお272d●■●●■■ご−●−● 義●○

図13243変異を持つMELAS患者のリンパ球における1細胞mtDNA解析．各々，上段は非標識
PCR産物のアガロースゲル電気泳動結果，下段はサザン解析の結果を示す．1〜12，15〜25，
1細胞のPCR産物：13，27，変異mtDNA．正常mtDNA．非標識とサザンの結果が呼応していることを示す．

10

20

30

3243変異mtDNA／総mtDNA（％）
図3

MELAS母親と同様の結果であったことは，少なくとMELAS母親のリンパ球における変異
mtDNAの割合の分布．細胞集団平均値
11％周辺の均一な割合を示す．

リンパ球1個における変異mtDNAの分配

も，リンパ球における変異mtDNAの存在様式は
MELASとIDDMとは大きく異ならないことを意味してリンパ球集団：26％

いる．リンパ球においてほ同様の変異mtDNAの分配様式で，他組織においては異なるという病態は考えにく】

く，MELASとDMの病態の差は，変異mtDNAの分配様式の差では説明し難いと考えられる．3243変異の有す
るNIDDM家系やIDDM家系の報告が相次いでおり4・，盛8

MELASとDM家系を分ける因子は何かが重要課題であるが，変異mtDNAの分配様式の差ではないことが示唆

25された．この病像の差の解析は今後の課題である．
mtDNA点変異が細胞内へテロプラスミーを主としているということは．病態発現には細胞内の変異mtDNAの量が主要因子であり，その治療には，細胞内正常
mtDNAの増加，または，発現増強の方向性が必要であることを意味している．

−142−

50

3243変異mtDNA／総mtDNA（％）

図4

3243変異を有するmDM家系患者のリンパ球における変異mtDNAの割合の分
布．MELAS患者母親に疑似した分布であり，Segregation過程の分布を示して
いない．

100

文

献

ration−deficient cells are caused by a single point

1）KobayashiY，MomoiMY，OhtaS，KagawaYand

mutataionin the mitochondrial tRNA−Leu（UUR）

YanaglSaWa M：The mutant genesin mitochon−

geneinmitochondrial myopathy，enCePhaopathy，

drialmyopathy，enCePhalopathy，lacticacidosisandlactic acidosis and strokelike episodes（MELAS）・

strokelike episodes are selectively amplified

AmJ Hum Genet49：590−599，1991．

thhroughgenerations．JInherMetabDis15：803−

4）vanden OuwelandJMW，Lemkes HHPJ，Ruiten−
beek W，Sandkuijil LA，de Vijlder MF，Struy−

808，1992．

2）Ema H，Suda T，Miura Y and Nakauchi H：

venberg PAA，Ven de KampJJP and Maassen

Colony formation of clone−SOrted humajn hematT

JA：MutationinmitochondrialtRNA−Leu（UUR）

opoietic progenitors．Blood75：1841−1846，1990．

geneinalarge3）KobayashiY，MomoiMY，ShimoizumiH，NiheiK，

pedigreewithmaternallytrans一mitted typeII diabetes mellitus and deafness・
Nature Geneticsl：368−371，1992．

Yanagisawa M，Kagawa Y and Ohta S：Respi−−143−37）MultiplexPCR法を用いたミトコンドリア病におけるmitochondrialDNA deletionの検索
湯 浅 龍 彦■

研究協力者

濱

田

恭

子■

はじめに

山

本

雅

彦■

宮

武

正■

Oligonucleotide primers

慢性進行性外眼筋麻痺症瞑群（CPEO）の多くでミトコ∵／ドリアDNA（rntDNA）の大欠失，多重欠矢の存在が認められている．

これまで報告されたミトコンドリアDNA欠朱6）〜9）をはさんで，2Kb以下のPCR産物が得られるようにプライマーの位置を設定し（図1），11個のプライマーを作

CPEO恩者のmtDNAではサザン解析によれば，50〜70％の患者にmtDNAの大欠矢を認められるが．残りは，筋病理でragged−redfiber（RRF）やCCO欠損線経を製した．KLはL鎖，KHはH鎖を増幅するためのプライ呈する臨床的に典型的なCPEO患者であってもmtDNAの大欠矢を認められなかったlト3）．cpEOの欠失
mtDNA非検出例には，mtDNAの点変異例，あるいは，非常に小さい欠矢のため分離できない例が含まれると想定されている1）．cpEO患者で進化上保存された
tRNALLu（UAG）のnt12308AからGへの点変異が特異的として報告された4）が，後にこの点変異は正常人口の中に，

widely−interspaced primer PCR（Multiplex WISP−

約1696存在しており，ヒトmtDNAの多塑性は進化上保存されている部位にも起こり得ることが示された5）．
従って，欠失ミトコンドリアの非検担例に関しては‥点
変異のみ亭こよるわけではなく，サザン解析の検出の感度が劣るために，見逃された欠朱によるものも含まれているのではないかと考えられる．欠矢を有するmtDNAはヘテロプラスミーの状態で存在する，mitotic segrega−tionによって欠矢を持ったmtDNAが各組織に不均一にマーである．
Multiplex
PCR）．MultiplexWISP−PCR反応は，10mMトリスCl（pH8．8），2．5mMMgC12，50mMKCl，100mg／mlウ
シ血清アルブミンの反応液50ml中でTaq DNA poly一
merase2．5U／50mlを250mMの各dNTP，25pmolの各
01igonucleotideprimer，10から250ngの骨格筋総DNAとともに行った．反応時間は，93℃1分，58℃1分，70℃
3分で33サイクル行った．
Single widely−interspaced primer PCR（SingleTWISP−PCR）
Multiplex WISPLPCRでミトコンドリアDNA欠矢の存在が示された場合，表1に示すような2個ずつのプラ
イマーのセットで欠矢の両端をはさむようにPCRを行い，欠矢の部位と大きさを同定した．

対象と方法■車亭医科単科大学医学部神経内科

T144丁Single WISPrPCRのためのプライマーセット

Tube

1．1

愚者及び対照患者
患者は外限軍麻痺を伴い，臨床的にCPEOと診断されたlP例1平均年齢42．5歳．対照は筋萎締性側索酸化症8例，甲状腺嘩箪低下性ミオパチー2例．平均年齢は64歳．

表11234567・890−1

分配されるため．欠朱mtDNA量の少ない生検組織片では欠矢を見逃すことがありうる．したがって，サザン解析に優る感度のよい方法が必要となってくる．
そこでわれわれは従来のサザン解析よりも感度の高い．朱欠ミトコンドリアDNA神経筋疾患の診断法を樹立するため一PCRを用いて，mtDNAの欠矢を感度よく検出すろ方法の開発を試みた，

Primers
KL32

￣

KL568
KL568
KL742

−

−
−
−

lfamplified
KH561

5361bp

KH1364
KH1481
KH11067959bp9130bp

KH1481
KH1612
KH13647386bp

KL829 − KH1481
KL829 −
KH1612KL914 −
KH1106KL914， KH1481
KL914 −
KH16126519bp7924bp

KL742 −KL742 −
KL829 −

3638bp8791bp5348bp1915bp5663bp

1くL1133T KH1364

7068bp2309bp

KL1133−
KL1133 −3480bp4885bp

KH1481
KH1612

ATPase8／6CO3

N。
Z ll

l
1ZS

16S

。
。
，

ND3

ND4L／4l ／ ／l J ／l

＼
＼

N。
5
ND

CO

NDl
■・1■

KL568

一・1■

KL742

一一■■

一・J■

KL8291くu14

KLl133

KHllO801

2

3Primers

図1

4

5

6

7

8

9

Cytb

■■●

10

5■−3−Sequence

1112

KH136413

14

KH1481KH1612

15

16（Kb）

PosMon（np
321−→

345

KL32

TGGCCACAGCACTTAAACACATCTC

KL568

CAAACACTTAGTTAACAGCTAAGCA

5681−→5705

KL742

ccCGTATACATAAAATCTAGACAA

7425→7458

KL829

GCCCACTGTAAAGCTAACTTAGCA

8292→8315

KL914

でTAATCCAAGCCTACGmTCACA

9148→

9171

11331→11354

KLl133

ccAATAACTTAATATGACTAGCTT

KH561

CAGAGTGGGGTTTTGCAGTCCTTAG

KHl106GGAGATTAGTATAGAGAGGTAGAG

11062→11039

KH1364GTTGACCTGmGGGTGAGAAGAA

13639−→13616

KH1481GGAGGTCGATGAATGAGTGGTTAAT

14810−→14786

KH1621TGCTGTACTTGCTTGTAAGCATGGG

16215→16191

5610一一5586

CPEO愚老で報告されたミトコンドリアDNA欠失部位とMultiplex WISP−PCRのためのオリゴヌクレオチド・プライマー位置及びプライマー塩基配列0。：重鎖（H鎖）の複製開始点．12S，16S：リボゾpムRNA遺伝子．NDl．
ND2，ND3，ND4L／4，ND5．ND6：複合体Ⅰのサブユニッ ト COl，CO2．
CO3：複合体Ⅳのサブユニット．ATPase8／6：複合体Vのサブユニット Cytb：
複合体Ⅲのチトクロームb遺伝子．

−145−

図2

CPEO患者10例，対照患者10例のmultiplexWISP−PCR
M：分子量マーカー1DNA−HindⅢの断片．m：分子量マー
カーfX174DNALHaeⅢ断片．pl〜PlO：CPEO患者1〜10．
Cl〜ClO：対照患者1〜10．

直接DNA塩基配列決定法

1800bpのPCR産物が得られた（図3：P8）．患者9では欠失部位をはさんでPCR産物が得られた場合，同じ

図3のP9に示すように，各組み合わせで複数のバンド

プライマーを用いて，dideoxyterminatercycle塩基配列が出現し，多重欠矢と考えられた．以上の結果から‥患決走法でABI社373ADNAオートシNクェンサーにより，塩基配列を決定した．

者1から6‥患者10では，np8292とnp13639との間に約

サザン解析

4・9Kbの欠失，患者7ではnp8292とnp13639との間に骨格筋DNAは制限酵素PvuIIにより消化し．標識した

約3・6Kbの欠失，患者8ではnp9148とnp16215との間に約7．4Kbの欠矢が‥患者9では多重欠矢があることがヒト胎盤mtDNAをプローブとしてサザン解析を行っわかった・いずれも，MultiplexWISP−PCRで得られた

た・オートラジオグラフィは6時間ないし60時間行っ

異常バンドはSingleWISPLPCRでも対応する長さにバンドが出現しており，特異的な増幅産物である．

た．BAS2000イメージアナライザー（富士フィルム社）
にて欠失mtDNA半定量を行った．

3）直接塩基配列決定法では，患者1から6，患者10の7例では全てnp8483からnp13459までのいわゆる

結果

COmmOndeletion

1）CPEOの患者10例にMultiplexWISP−PCRを行い，約2300bp，約1900bpのバンドが得られた．プライマーと呼ばれる4977bpの欠失‥患者7ではnp8640からnp12208までの3569bpの欠失，患者8ではnp7383からnp14412までの7030bpの欠矢であった．

KL1133〜KH1364間2309bp，プライマーKL914〜KH

4）サザン解析を行った結果，図4に示すように，全llO6間1915bpはこの条件下で増幅され得るため，内部
コントロールとして用いることができる．ミトコンドリ

DNA50ngで行うと，患者7，患者8，歳老10でそれぞれ13Kb，9Kb，11．5Kbの欠失ミトコソドリ7のヘテ

アDNA欠矢がある場合，バンドは2Kb以内に出現すロプラスミーが検出された．全体に対する欠失mtDNAる．患者1から患者6と患者10ではそれぞれ約400bp，患者7と患者8では約1800bpのPCR産物が得られたの比率は，各々42％，27％，49％と算定された．欠矢を（図2）．患者9では複数のバンドが出現した．対照患検出できなかった愚老についてDNA量を500ngに増量すると患者1で11．5Kbの欠失DNAミトコンドリアが者ではKLl133〜KH1481間，KL829〜KHllO6間，KL検出され，欠失ミトコンドリアの割合は7％であった．

1133〜KH1364間，KL914〜KHllO6間に相当するそれ対照患者10例では欠失mtDNAは検出されなかった．サ

ぞれ3480bp，2800bp，2300bp，1900bpの4本のバンドザン解析で検出できた患者1，7，8，10の欠矢の長さとPCRで検出した欠矢の長さは一致していた．臨床的が得られた．CPEO患者で見られた400bp，1800bpのバ
ンドはどの対照患者でも見られなかった．
2）次に，欠失部位を同定するために表1に示すようなプライマーの姐合せでSingleWISP−PCRを行い，患者
1から6，患者10ではKL829〜KH1364プライマーでレーン7に約400bpのバンドが得られた．（図3：Pl〜
P6，PlO）．患者7ではレーン7にKL829〜KH1364プラにCPEOと診断されたが，サザン解析でmtDNAの欠矢の認められなかった6例で，PCR法によりミトコンドリ
ア欠矢が証明された．
考察

イマーで約1800bpのPCR産物が得られた（図3；P7）．

多重PCR法は，ジストロフィン遺伝子の欠矢の診断に実用化されているが10−，本報告では，この多重PCR法

患者8ではレーン12にKL914〜KH1612プライマーで約をmtDNAの欠矢を検出するために応用した．ミトコソ

−146−

＝

＿−

Ⅳ）n12日507日101112131415

図3

！

−

P8Mml 2 3 4 5 6 7 8 9101112131415

CPEO患者10例のSingLe WISP−PCR
Pl〜PlO：CPEO患者1〜10．M：分子量マーカーl DNArHind Ⅲ断片．
m：分子量マーカーfX174DNA−Hae m断片．1〜15：表1のチューブ1〜15と対応する．

−147−

一方，PCR法に伴う注意点もいくつか考えられる．
A P1■2円M P5P〇円内円PlOCI C2C3C4
2雄

一

10．●K

■

−■

−

−■−−

●−■

PCRのサイクル数，スタートの鋳型DNA量，プライ
マーのanneal温度や，eXtenSionの時間が不適切な場合，−■−非特異的な増幅の起こる原因となる．本報告の方法は，−
lt●JK・．一■

様々な条件を検討して得たもっとも妥当な条件である．

■

また，今回使用したプライマーは，これまでの報告で知られているCPEOのmtDNAの欠矢は全てカバーでき

D pI P2円P4P5恥■7円円PlOCI C2C3C4
羽状

1MK

■

−1『

るよう設計したものである．本報告の患者7，患者8の
欄■

〉−

■■■h＝

−■■F−■■

2例では新しい型の欠矢が兄いだされたが，これらは今回設計したプライマーにより検出される部位に存在して

1卓Il■

●JK

−

●

いた．今後，CPEOにおいて，サザン解析により，新しいmtDNAの欠矢の型が報告され，もしその欠矢が，これらのプライマーでカバーできないところにあるならば，プライマーも変更・改善しなければならない．しかし，現在のところは，本法で既知の欠矢はすべてカバー

C pl P2円P4円関門CI C2c c4C与CもC7e8COmO

でき，今回10例中10例の欠矢を診断できた．本法は現時
点では十分実用に耐え得ると考える．

，芸：●ヨ
■1

●JK

−

mtDNA欠失により生じる病態はCPEO以外にも様々な症状を呈することが知られ，今後，様々な神経筋疾患の各組織で，mtDNA欠矢を検索する必要があると考えられる．その際も，本法はその感度の高さからサザン・

加 −1■．〇六 ●

●JK

−

図4

由。

ハイブリダイゼーショソを補う実用的な診断方法として併用されるべきであろう．
文

CPEO患者と対照患者のミトコソドリア
DNAサザン・ハイブリダイゼーショソ

献1）Moraes CT，DiMauro S，Zeviani M，Lombes A，

A：全DNA50ng．6時間曝露．B：全
DNA50mg．60時間曝露．C：全DNA
500ng．6時間曝露．D：全DNA500ng．
60時間曝露．Pl〜PlO：CPEO患者1〜
10．Cl〜ClO：対照愚老1〜10．23R，9．4Ⅹ：lDNA−Hindm断片より得られた23130bp，9416bpのマーカー位置．
16，6Ⅹ：正常ミトコンドリアDNA全長
16569bpの出現位置．

Shanske S．Miranda AF，Nakase H，Bonilla E，Werneck LC，ServideiS．NonakaI．KogaY，Spiro
A，Brownell KW，Schmidt B，Schtland DL，
Zupang M，DeVivo DC，Schon EA and Rowland
LP：MitochondrialDNA deletionsin progressive
external ophthalmoplegia and Kearns Sayre

Syndrome・N EnglJMed320：1293J299，1989．
2）HoltIJ，Harding AE，CooperJM，Schapira HV，
Toscano A，ClarkJB and Morgan−HughesJA：

ドリアの場合，正常なmtDNAと欠矢のあるmtDNAとMitochondrialMyopathies：Clinicalandbiochemic−

はヘテロプラスミーの状態で存在している．したがっ

alfeaturesof30patients with major deletions ofて，ジストロフィン遺伝子と同様に多重PCR法を行う

muscle mitochondrialDNA．AnnNeuro126：699Lと，正常mtDNAも混在するために正常のバンドが増幅されて出現してしまい，単に欠失部位がPCR法で増幅されないということで欠矢が存在しないとは言えない．

708，1989．

3）Goto Y，KogaI，HoraiS and NonakaI：Chronic
prgressiveexternalophthalmoplegea：acorrelative

そのため，本報告では想定欠失部位をはさんだWISP−

Study of

PCRを，1本のチューブ内で行うこととした．

phenotypic expressionin muscle biopsies．J

これまでCPEOの診断は，臨床症状，筋生検所見から

mitochondrial DNA deletion and their

NeuroIScilOO：64L69，1990．

行われ，さらにサザン解析によるDNA診断により確定

4）LauberJ，Marsac C，KadenbachBand SeibelP：診断されてきた．サザン解析で確定診断に至らなかった

Mutationsin

患者がこの方法で診断でき，CoenzymeQlOなどの治療の恩恵に浴することができるようになった．

frequent cause of neuromuscular diseases．NucI−148−

mitochondrial tRNA gerleS：a

Acid Res19：1393−1397，1991．

5）van den OuwelandJMW，Bruining GJ．Lindhout
D，WitJ−M，Veldhuyzen BFE，MaassenJA：
Mutationsin mitochondrial tRNA genes：non−linkage with syndromes of Wolfram and chronicof deleted mtDNA from a women with Kearns−
Sayre syndrome to her child．AmJ Hum Genet
50：360−363，1992．

9）Rotig A，BessisJL Romero N，Corrrlier V，SaudubrayJM，Narcy P，Lenoir G，Rustin P andprogressive

externalophthaImoplegea

NucIAcid

Munnich A：Maternallyinherited duplication of

Res20：679−682，1992．

the6）WallaceDC，Lott MT．TorroniA，SchoffnerJM：

proximal tubulopathy，diabetes mellitus andReportofthecommitteeon human mitochondrial
DNA．CytogenetCellGenet58：1103−1123，1991・
7）Moraes CT，RicciE，Petruzzella V，Shanske S，DiMauro S，Schon EA and Bonilla E：Molecular

mitochondrial genomein a syndrome of

Cerebellarataxia．AmJHumGenet50：3647370，
1992．

10）ChamberlainJS．GibbsRA，RanierJE，NguyenPN
and Caskey CTT：Deletion screening of theanalysISOfthe muscle pathoIogy associatedwith
mitochondrialDNA deletions．Nature Genetl：

Duchenne muscular dystrophylocus via multiplex
DNAamplification．NucIAcids Res16：11141−

359−367，1992．

11156，1988．

8）Larsson NG，Eiken HG，Boman H，Holme E・
01dforsAandTuliniusMH：Lackoftransmission−149−

トコンドリア異常症の臨床亜型の検討
高 木 昭 夫■

研究協力老中 漱 浩 史■

ミトコンドリア異常症の診断に関してはミトコンドリ
アDNAの変異が明らかになり，遺伝子診断が重要となっており，典型的な臨床病型との間に一定の対応があることが知られている．一方，ミトコンドリア異常症の臨床病型の広がりを見ていくと，このような一定の対応がつかず問題となる場合もあることが知られてきた．また，ミトコンドリアDNAの異常が既知の変異のSCreeningにおいて明らかでない場合には形態的に判断をしなければならない場合がある．このような場合においては従来どおりragged−red fibersやCCO染色における欠損線経の有無が診断の手がかりとなる．その場合においても従来の診断基準が問題となることがある．一つには高齢者の場合であり，ragged−redfibersが高率で認められることである．また他疾患に合併してミトコンド
リアDNAの異常が存在し，その症状発現と必ずしも結びつかないと思われる場合もある．ここに2症例を星示
し，ミトコンドリア異常症の診断に関して考察したい．
症

例

症例1：75歳，女性
主訴：四肢筋痛，脱力
既往歴，豪族歴：ともに特記すべきことなし．
現病歴：1992年2月 両肩の痔痛が出現し，上肢挙上困
難が緩徐に出現する．1992年4月両側大腿痺痛が出現
し，四肢脱力を認める．鎮痛剤（非ステロイド系）の効
果が十分でなく，頻回投与により消化性潰瘍をもたらした．1992年7月入院となる．
現症：全身症状に異常はなく，平熱であり，側頭部に圧痛はない．軽度眼瞼下垂を認める．四肢近位筋に運動時痛，把握痛を認める．筋力は遠位において4，近位で3十であった．筋萎縮はきわめて軽度，腱反射も正常であっ
た．知覚障害はない．
検査所見：血算，生化学に関してはCK，pyruVate，
lactateを含めて異常なし．ESR，CRP，ANA，CH5。などに異常なく，炎症所見を認めなかった．筋電図は筋原性変化を認めるが，末梢神経伝導速度は正常であった．
Tensilon試験は陰性．mtDNAに関する塩基置換（3243＊虎の門病院神経内科−150−

A−Gなどの6変異）及び欠矢に関するSouthernblottingによるScreeningは異常を認めなかった．
骨格筋生検所見：炎症細胞の浸潤はなく，筋線経の大小不同とともにGomori−TR染色においてragged−redfibersを多数認めた（図1参照）．
経過：本例は治療を行わず，安静を保っていたが，回復が遅いためUbiquinone300喝投与により，経過を見ていたが，次第に回復した．診断的にはPMR類似の病態を考えたが，ミトコンドリア異常が一次的に生じた可能性も考えられた．
症例2：85歳 女性
既往歴，家族歴：いずれも特記すべきことなし．
現病歴：65歳 両下肢より始まる痙性麻痺を認めた．
67歳 上肢より始まる筋萎縮．構音障害を認めた．筋電図，上腕二頭筋生検においても神経原性変化を認めた．
73歳 起立時の動揺を認めた．77歳 伝い歩き不能，記名力低下が出現した．83歳 痴呆症状進行するが，失見
当誠，記憶障害が主体であり，人格変化．異常行動は見られなかった．85歳 時下性肺炎にて入院．
入院時神経所見：高度の痴呆（発語はほとんどなく，覚醒時には常に笑い顔を示し，視線が合うと表情に反応が認められるが，何らかの意思の疎通はなく，また合目的的な運動はほとんど認められない．軽度ではあるが舌の萎縮を認める．構音障害著明であり，瞭下は不可．四肢の痙性は著しく，下顎反射，四肢捉反射は高度の克進を示した．筋力は3ないし3＋であった．筋萎縮は上肢主体に軽度認められる．膀胱直腸障害は失禁を認めた．
検査所見：血液生化学CK，pyruVate，lactateを含め正常，髄液異常なし．
MRl：広範な大脳皮質の萎縮を認める．大脳白質，小脳，
脳幹部には異常は認めない（図2参照）．
SPECT：前頭糞及び側頭葉に血流の低下を認める．頭
頂薬も軽度低下はしているが著明ではない．
EEG：8〜9Hz a wave．6Hz e wave

ABR：正常EMG：神経原性変化
筋生検所見：神経原性変化を認めるが，ragged−redfibersなどのミトコンドリア異常を示唆する所見はない．
DNA解析：非典型的な痴呆症を来す疾患としてprion異

1

2

3

4

1：marker

2：MERRF
3：COntrO1
4：Patient

図1症例1の筋生検像
Raggedrredfibersを多数認める．Gomori−TR染色
図3

症例2におけるmtDNA変異（8344A−G）の検討
米田らの方法4）によりmismatched primerを用い，
PCR後Dra▲t＿こ切断し，変異mtDNAは173bp（正常191bp）となる．

1

図2

2

3

1：COtrO1
2：MERRF
3：75M

症例2のMRl像
広範な大脳皮質の萎縮を認めるが，白質には大きな変化を認めない．

常症があげられるが，prion geneには既知の変異は認められなかった．一方，mtDNAの検索においては欠矢はなく他の変異も認められなかったが，いわゆるMERRFに認められる8344A−Gの変異が白血球の解析におい

図4

4

5

6

4：57M
5：66M
6：64M

臨床症状が類似する4症例におけるmtDNA変異の検討
図3と同様に検索したが，変異mtDNAは認められなかった．

て認められた（図3参照）．また，このような所見が本症に類似の症例（光山型と異なり経過が緩徐である痴呆症

るものである．この場合異常所見と正常高齢者の所見とを伴う運動ニューロン疾患で痙性が主体のもの）で認められるかを4症例において検討したが同様の変化は認めを区別する基準として，Muller−Hockerは正常者で認められたCCO欠損線経の頻度を示しているがl）（最大50〜

られなかった（図4参照）．

60／d），本例のような多数の線経に認められる場合は少なく，魁織所見において一つの診断基準を決定すること考の困難さを示している．

察

症例1に関して：本例の臨床症状はミトコンドリア異常症の中でも筋痛を主症状とする筋症状を室するものがあ

症例2に関して：本例の臨床症状は原発性側索硬化症にり，必ずしも本症の臨床症状とするに否定されるもので期になって痴呆症状が全景にたった症例である．臨床的はない．しかし，本症の診断には筋組織所見あるいは遺には光山型とは異なる痴呆症状を伴う運動神経疾患の一伝子診断によるが，本例においてほ遺伝子異常の同定は型と考えられるが，末梢血白血球DNAの検索において類似した臨床経過をたどっていた症例であるが，その末なされておらず，覿織学的診断による．本例におけるミトコンドリア遺伝子異常が認められたことが問題とな

ragged−red fibersの頻度は高く，示していないがCCO
染色における欠損線経の頻度も高い．高齢者においてはる．本例をミトコンドリア異常症と考えるには問題が多い．この点を列挙すると，① 神経症状にミオクローヌ

このようなミトコンドリア異常を示唆する所見は正常者

スを欠く．8344A−G変異の神経症状で根幹をなすもの

においても，また他の疾患においてもしばしば認められはミオクローヌスと考えられる．② 筋生検所見が異な−151−

りTag等ed−redfibersなどのミトコンドリア異常を示唆す
る所見を欠く．③

ま と め

異常mtDNAの割合が少ない．8344

2症例を星示して特に高齢者におけるミトコンドリア

変異は臓器間の異変PNAの差が少ないとされ2㌧その白異常症の診断の困難さに関して述べた．従来提唱されて血琴異常ミトコンドリアの割合は多くは80％以上であきた組織学的，数量的な判断基準，あるいはDNA診断

り3㌧本例のような少量の異常ミトコンドリアで発症している例では白血球以外の各臓器においてどのような割も必ずしも絶対でないと考えた，合で存在するか明らかでなく，直ちに罷患臓器での症状

文

献を出現しうる割合で存在するといいがたい．④ 類似症l）J Muller−Hocker：Cytochrome c oxidase defient

例4例で陰性であり，本病型がミトコンドリア異常によるとする根拠はない．⑤ 類似症例はすべて孤発例であWithout muscular disease：an age−related alterat−

り，母性遺伝の報告はない．⑥ 本例を含め全身的な合iom．JNeuroIScilOO：14−21，1990．

fibersin thelimb muscle and diaphragm of man

併症がない．このような点から本例をミトコンドリア異2）Y Tanno，etal：Uniform tissue distribution oftRNALy，mutationinmitochondrialDNAin MER−

常症し断定するには慎重でなければならないと考える，
ミトコンドリア異常症と臨床亜型はナつの問題点と考RF patierltS．Neurology43：1198−1200，1993．

えられるが，どのような症状が本症において認められるのかはさらに個々の症例において慎重に検討されなけれ

3）YTanno，etal：QuantitationofmitochondrialDNA

ばならず，特に高齢者の場合には判断が難しい．一つのBiochem BiophysResCommun179：8807885，

Carrying tRNALp mutationin

基準として頸似症例が多数あることは一次性にせよ二次性にせよミトコンドリア異常の関与を考えさせるものであり，今後の検索−こよりここにあげた症例と類似の症例があるか否かが問題となる，

MERRF patieTltS．

1991．
4）MYpneda：SimpledetectionoftRNALyS印utation
inmyoc！orluSepilepsyassociatedwith ragged−redfibers（MERRF）by polymerase chain reaction
withmismatched primer．Neurology
1840，1991．

−152一二41：1938−

39）全身性カルニチン欠乏マウス（jvsマウス）のミトコンドリアの変化に関する研究
■
けKド

nh
■

活

↑r
J↓／

垂

●

肝封
■

﹂事

郁

野尾

大嶺

■

﹁肘

久
紀

▲﹁

■

田島

■

堀中

●

道郎次

＊

正澗佑

島川沢

桑宮松

研究協力者

■

を用いた．

はじめに
カルニチソは，筋肉での長銀脂肪酸のミトユソドリア

屠殺時大腿二頭筋，前頸骨筋，ヒラメ筋を摘出，迅速内転送に必須の物質である．従ってカルニチソ欠乏に陥凍結切片を作製し組織化学的検索を行った．また上記諸ると，筋組織は脂肪酸代謝障害にもとづくェネルギー代筋および外眼筋，横隔膜を電節用に固定し電顕的観察を行った．さらに骨格筋と心筋よりAGPC法にてtotal

謝異常をひきおこすと考えられる日．
しかし，実際には臨床の場において，カルニチソにつRNAを抽出し，COXlのcDNA断片をプローブとしていての関心は薄く，カルニチソの重要性についても否定

ドットプロット法にてミトコンドリアmRNA量を分析的意見が多い．その理由の一つとしてカルニチソ欠乏とわかってもいくつかの臓器の障害を経時的に分析したした．
結り，治療の効果を評価することは，ヒトの場合には難しいことがあげられる．
1988年，金沢大学の小泉らにより常染色体劣性の遺伝形式を示し，脂肪肝・低血糖・高アンモニア血症を呈す

果

2週齢のhomozygoteの骨格筋のHE染色ではheter−
ozygoteや母系C3Hマウスに比し，比較的小さい肪組織に微細な空胸が多数みられた．次に電鋳的に分析するとるC3H系マウスが報告された2）．私共は，これら症状がミトコンドリアが巨大化し，数が増えており，またミト

ヒトにおける全身性カルニチソ欠乏症と似ていることにコンドリアに接して脂肪滴が多く見られた（図1，A）．

注目し分析したところ，血清，肝，骨格筋において遊離

この様な形態変化は骨格筋では4週，8週を迫ってみて

カルニチソ，アシルカルニチソ共に低下していることをも大きな違いはなかった．

見出した3㌧ その後の分析により心筋においても同様の

次に心臓について分析すると，HE染色では心筋細胞結果を得た．このマウスは後にJuvenile visceralの肥大が見られ，また核が大きくなる傾向があった．電steatosis（jvs）マウスと呼ばれるようになった一）が，私共顕像では核はやや拡大しミトコンドリア増加の著明な細の分析によりその病態は全身性カルニチソ欠乏によりお胞も少なくなかった．（図1，B）．

こっていると考えられた．

この2週齢に見られた心筋のミトコンドリアの増加は

目

骨格筋の場合と異なり加齢と共に進み，生後2ケ月の心臓では細胞質の大部分がミトコンドリアによって占めら的れるようになり，電子密度の高いリソゾーム様の顆粒も本研究は，このjvsマウスを用いカルニチン欠乏に見られた（図1，C）．

よって各組織中のミトコンドリアがいかなる変化をこうむるかを分析し，カルニチソ欠乏などの代謝変動に対す

ミトコンドリアを詳しく見ると，jvsマウスではミトるミトコンドリアの特性を明らかにすることを目的とした．

は大きな異常は見られなかった（図1，D）．またミトコ

コンドリアは細長くなる傾向がみられたが，クリステにンドリアの変性像やミェリン様の構造物も多数見られた（図1，E）．

対象と方法
2，4，8週齢のhomozygote（jvs／jvs），heterozygote

他の筋線経，例えば外眼筋でもミトコンドリアの著し（＋／jvs）およびjvsの母系であるC3Hマウス（＋／＋）

い増加はみられたが，脳血管を含め冠動脈内の血管平滑筋細胞には異常増加は見られなかった．

◆国家公務員等共済組合連合会大手前病院
事■大阪大学医学部第二内科

骨格筋をゴモリトリクロム染色するとragged red

ー153−

A

．・・J∵ 帆l．．＿●阜
・・・．一・＿ご一一二￣

一・

一・ 一二だ；・斗・こ．ご立言fiberが見られたが，陽性細胞は筋線経の約12％程度あった．また心掛こついて同様の分析を行うとほとんど全て

重厚鬼遣過言恕聴・■二の筋線経は赤く染まり，骨格筋で見られるragged red
fiberと同様の形態異常を示していた．
このように心筋，骨格筋においてミトコンドリア異常を伴っていたので，次にミトコンドリアDNAの量的異常を伴っているかどうか，を分析した．
まず，心筋より，tOtalDNAを抽出し，20FLgのtotal
DNAをEcoRIで切断後，COXIのcDNAをプローブとしてサザン分析を行った．母系C3日マウス，heterozygote，
homozygote，カルニチン治療を行ったhomozygote群の4群の間には著明な変化は認められなかった．次に心筋よりAGPC法にてtotaIRNAを抽出しCOXIのcDNA断片をプローブとしてサザン分析を行い，ミトコンドリア
mRNA量を分析したが，心筋のtotalRNAあたりの
COXImRNAは4つの群の間に明確な差を認めなかった．骨格筋においても同様であった．
考察とまとめカルニチソほ長鎖脂肪酸のミトコンドリア内転送には必須の物質であり，全身組織に存在する．しかし生体におけるカルニチソの役割の重要性については一般的には否定的意見が多く，特に内科の分野では注目されることは少ない・その理由の1つとして，生体から材料を得る
ことに限界があり，分析も十分にされないことがあげられる．
今回私共は，全身性カルニチン欠乏マウスを用い，
1）心筋，骨格臥外眼筋では，ミトコンドリアの増加が著明であった．血管平滑筋においては変化がみられなかった．
2）心掛こおいては，加齢と共にミトコンドリアの増加は進み，リソゾーム様顆粒の増加，ミェリン様構造物の出現などが見られた．
3）心筋，骨格掛こおけるミトコンドリアのDNA量，RNA量については，COXIを選び分析したが，著明な変化はみられないことなども明らかにした．
今回得られた結果が，ヒトの場合にもあてはまるかど
うかは，今後の検討をまたなければならない．また増加しているミトコンドリアの呼吸機能の分析や，ミトコン
ドリアの増殖のメカニズムについて更に今後検討する予定である．

議澤 柴寧ナノ文1）Bieber

図1

全身性カルニチソ欠乏マウスの骨格筋．心筋の電顕像（A〜D：左は＋／＋，右はjvs／jvs．
E：jvs／jvs）

A．大腿二頭筋（2適齢），B．心臓（2遇齢）
C，D．E．心臓（8週齢）

LL：Carnitine

献
Ann

Rev

Biochem1988（ed by Richardson CC，Boyen PD，DawidIB＆MeisterA），AnnualReviewsInc，PaloAlto，1988，
pp261−283．

2）Koizumi T，Nikaido H，et al：Infantile diseaseー154−with microvesicular fattyinfil tration of viscera

H−20strain of mouse associatedspontaneouslyoccurrlngin the C3H−Hr20strain

visceralsteatosis．BiochemBiophysResCommun

of

mouse

with

similarities

to

Reye

s

syndrome．

Lab Animals22：83−87，1988．

carnitine

deficiency：Analysisin

174：1090−1094，1991．
4）HayakawaJ，Nikaido H，et al：Ⅰnheritance of3）Kuwajima M，Kono N，et al：Animal model ofsystemic

with juvenile

C3H一

ー155−

juvenilevisceralsteatosis（jvs）foundin C3H−II−
20mice．Mouse Genom86：261，1990．

トコンドリア（Part2）40）MELASにおけるミトコンドリアDNAの変異
宝

研究協力者

目

来

聴＊

栂

板

一

夫■

作

田

亮

一…

後
埜

藤
中

雄
征

一●●
哉＝

た．図1には，ミトコンドリア脳筋症および正常対照におけるミス・マッチプライマーを用いたPCRおよびNheI消化による11084変異の検査結果の一部を示した．表1には，今回用いた全症例におけるタイプ分類と11084変異の有無を示した．日本人のミトコンドリア脳的ミトコンドリア脳筋症MELASにおいては，tRNA・ロイシン（UUR）遺伝子の塩基番号3243の変異が約80％の患者に，同遺伝子上の塩基番号3271の変異が10％の患者に見出されている．しかし，約10％の患者はいず
れの変異も検出されていない．昨年，白人患者において筋症患者計90例については，3例のMELAS患者，4例のCPEO患者および分類不明のミトコンドリア脳筋症
患者2例にこの変異が観察されたが，いずれもホモプラ
スミィーの変異であった．さらに正常対照105例を検討した結果，15例（14％）にホモプラスミィーな変異として見出された．この結果，11084変異は白人においては極めて頻度が低く，日本人では高頻度に存在する正常の多型である可能性が高く，MELASに特異的な変異でないと結論した．

ND4遺伝子上の塩基番号11084におけるA→G置換が報告された．本研究では，この11084変異に関する検討を行うとともに，3243および3271の検出されない症例に関して，全tRNA領域の塩基配列の解析を行った．
結果と考察
ND4遺伝子11084変異
昨年Lertritらにより，ミトコンドリアDNAにコードされる複合体ⅠのサブユニットのひとつであるND4の11084塩基部位のAからGへの塩基置換が，MELASに関連するとの報告がされた．この変異は，スレオニソからアラニンへのアミノ酸置換を生じること，正常白人集団には存在しないこと，およびへテロプラスミィーな
DNA変異であることから，著者らはMELASの発症に特異的なミトコンドリアタンパク質をコードする遺伝子変異であると推定した．しかしこの変異は，MELASの白人一患者にのみしか見出されず，正常対照も白人集団に限られていることから，その疾患特異性に問題がある
こと，およびスレオニソ・アラニソ間のアミノ酸置換

本邦MELASにおける第3の変異
典型的MELAS症状を呈し，かつ3243および3271変異
わ検出されない6例に関して全tRNA領域の塩基配列を決定した．その結果，1例において新たにtRNA・ロイ
シン（UUR）遺伝子上の塩基番号3291におけるT→C
変異を見出した（図2）．前述の変異と同様にして，この変異を同定するために．ミスマッチプライマーを用いた
PCRとBamHI消化による簡便な遺伝子診断法を導入した．さらに患者の母親および姉の血液よりDNAを抽出し，上述の遺伝子診断法により遺伝性の検討を行ったは，正常人集団でも高頻度に生じる置換であることから（宝来ら，未発表），再検討の必要が感じられた．我々は本邦における症例に関して，50例のMELAS患者を検討したところ，3243変異が34例，3271変異が4例，11084変
異が3例に観察された．このうち2例においては，3243
変異と11084変異を併せ持っていた．11084変異に関し

去三≠三三三I l l■［
S12345678910111213141516て，この変異がMELASに特異的かどうかを検討するた
めMELAS以外のミトコンドリア脳筋症40例（MER−
RF：7例，CPEO：19例，分類不明のミトコンドリア脳筋症：14例）および正常対照105例に関する検討を行っ■国立遺伝学研究所・人頸遺伝研究部門
事■国立精神・神経センター武蔵病院…国立精神・神経センター神経研究所

図1・ミスマッチプライマーPCRおよびNheI消化にょる11084変異の同定−159−

表1各種臨床型と11084変異の関係（図3）．この結果，3291変異は，患者の筋肉，血液，BNo．withCliniはlFeaturesand No．or ntllO84
0bservedMutations patients Mubtiom

が，母親および姉の血液DNAでは，検出できうる異常

MELAS：

明らかとなった．この変異の特異性を検討した結果，セルラインでは，いずれもヘテロプラスミィーであった
型は見出されず，この変異は新生突然変異であることがWith3243mutation

‥‥‥

34

2

3243（＋）および3271（＋）のMELAS患者での複合変WitI13271mutation

‥‥‥

4

0

異はなく，正常対照には見出されないことより，本邦

‥‥‥‥‥

12

1

Ⅵ用血no32430r3271
mutation

MELAS患者における第3の変異と考えられた（表2）．
またこの変異はtRNA・ロイシン（UUR）遺伝子における2次構造上では，TvCループの最後の塩基である（園MERRF：‥．‥．

40Withno8344mutation．‥‥

3

0

With8344mutatioll

CPEO：
2

WithdeIetion．‥．‥‥‥‥
Withnodeletion

‥．‥‥‥

3
1

1

14

2

Witb3243mutation‥‥．‥

長よきこ

0

1

Miscellameousmitodondrial
myopatbies．‥．‥‥‥

TotaI

‥‥‥‥‥

州

9（10％）

NormaIconlroIs

………．

105

15（14％）
一疇309bp
一■280bp

表2 3291変異の特異性の検討
N0．0t N0．With＄amPt05 3291mut劇On％mutant o

MELAS（N＝46）
Wlth3243mutat事On…

36

0

4

0

6

1

With3271mutation．

図3

Withn032430r3271
mutation

86

30

20

0

0

0

患者および家族試料に関する3291変異の示す
ポリアクリルアミド電気泳動

Normal￠Ontr01＄（N＝55）
JaPane＄033

Europ朗n
AⅢ￠an

15
7

aCCO〆qrdom

MELAS ControI
A

図2

G

C

T

A

G

C

T

tRNA・ロイシン（UUR）領域のH鎖シークエンス．
MELAS患者ではControlと比較して，3291部位にAからGへの置換（1鎖ではTからCへの置換）が
観察された

mRNA

3■

図4A tRNA・ロイシン（UUR）遺伝子の2次構造を示す図．3291部位はTvCループの最後の塩基−160−

AA DHU DHU DHU A．C． A．C． A．C．V． TvC TvC TvC A・A．
StOm
舶m b叩
或Om StOm k旧P StOmIoop stom l00P StOm StOml l 「「

［ 「「

［

「「

［l t

JZtM−C GTTAAGATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAAAACTTAAAAC℡TTACAGTCAGAGGTTCAAT℡ccTCTTCTTAACA
ZZtM−XI GTTAAGATGGCAG亀；CCCGGTAATCGCATAAAACTTAAAAC℡TTACAGTCAGAGGTTCAAT℡CCTCTTCTTAACA
JZtZKLF−N2GTTAAGATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAAAACTTAAAAC＠ITACAGTCAGAGGTTCAAT℡ccTCTTCTTAACA

ZZtM−K3
GTTAAGATGGCAGAGCCCGGTAATCGCATAAAACTTAAAAC℡TTACAGTCAGAGGTTCAAT◎：CTCTTCTTAACA
CZlェMp．
GTTAAGATGGCAGAGCCCGGTAATTGCATAAAACTTAAAAC℡TTACAATCAGAGGTTCAAT℡CCTCTTCTTGACAGORZLZA GTTAAGATGGCAG▲GCCCGGTAATCGCATAAAACTTAAAAC℡TTATAGTCAGAGGTTCAAT℡ccTCTTCTTAACACM￠．
GTTAAGATGGCAG▲GCCCGGTAATTGCATAAAATTTAAAGC℡TTACAGTCAGAGGTTCAAC℡CCTCTTCTTAACA
Zm GTTAAGGTGGCAGAGCCCGGTAATTGCATAAAACTTAAACT℡TTATATCCAGAGATTCAAA℡ccTCTCCTTAACA脚St ATTAGGGTGGCAGAGCCAGGAAATTGCGTAAGACTTAAAACCTTGTTCCCAGAGGTTCAAA℡CCTCTCCCTAATA
ZtAT ATTAGGGTGGCAG▲GCCAAGTAATTGCGTAAGCATTAAAACCTTGTTCCCAGAGGTTCAAA℡ccTCTCCCTAATA
CE＝⊂m GCTAGCGTGGCAG▲GCTCGGCAAATGCAAAAGGCTTAAGCCCTTTAT−ccAGAGGTTCAAA℡CCTCTCCCTAGCTrRn GCTAGCGTGGCAGAGCCTGGCTAATGCGAAAGACCTAAGCTCTTTTTATCAGGGGTTCAAA℡CCCCTCGCTAACTD．YJLm TCTAATATGGCAGAT−−−一一一TAGTCCAATGGATTTAAGCTCCATAT−ATAAAGTAT−−TT℡ACTTTTATTAGAA
D．hEEL．
TCTAATATGGCAGAT−一一−−−TAGTGCAATAGATTTAAGCTCTATAT−ATAAAGTAT−−TT℡ACTTTTATTAGAA
S．tl．（pZ．） GCTAAAATAGCAAAG−−TGGTTAATGCAGAAGGCCTAAGACCTTCCTATCAAAGGTTCAAC℡CCCTTTTTTAGCT
l
l
1
3243

3271

3291

図4B tRNA・ロイシン（UUR）遺伝子の種々の動物種の塩基配列のアライメント
HUMAN−C：正常人，HUMAN−Ml；MELAS3243変異，HUMAN−M2；MELAS3271
変異，HUMAN−M3；MELAS3291変異4A）．この部位は生物進化上，ヒトを含む霊長摂，ウAnalysis of mitochondrial ND4シ，マウス，ラットの晴乳類，鳥類，両生類，ショウ
ジョウバェからウニまで厳密に保有されていることが明quencein Finnish fami1ieswith Leber hereditary
Optic neuropathy．Genomics8：583−585，1990．

らかとなった（図4B）．このことは，この塩基部位が5）Lertrit P，Noer AS，Jean−Francois MJB，et al：AtRNA・ロイシン（UUR）の機能に関して極めて重要であることを示している．以上より，3291変異はMELAS

new disease−related mutation for mitochondrialの発症と強く関連していることが示唆された．tRNA・ロイシン（UUR）遺伝子の疾患特異的な変異に関して

episodes（MELAS）syndrome affects the ND4gene DNA seT

encephalopathy，lactic acidosis and strokelike

Subunit of the respiratorycomplexI．AmJHum

は，今回の3291変異を含めて，MELASにおいては3部

Genet51：457−468，1992．

位（3243，3271，3291）が同定された．さらに他のミト

6）Ozawa T，Tanaka M，SugiyamaS，etal：Patients

コンドリア脳筋症においては，3250，3260，3302部位でwithidiopathic cardiomyopathy belong to theの変異が報告されており，tRNA・ロイシン（UUR）遺Samemitochondrial DNA gene family of parkin−

伝子は，種々のミトコンドリア脳筋症に関連した変異発

son

生のホットスポットであることが示唆された．

thy Biochem Biophys Res Commun177：518−sdiseaseandmitochondrial

encephalomyopa−

525，1991．

文

7）

献

Sakuta R，Goto Y，Horai S，et al：Mitochondrial1）Goto Y，NonakaIandHoraiS：Amutationinthe

DNA mutations at nucleotide positions3243andtRNAl−urUUR）gene associated with the MELAS

3271in mitochondrial myopathy，enCephalopathy，

subgroup of mitochondrial encephalomyopathies．

lactic acidosis，and strokeTlike episodes：A

Nature348：651−653，1990．

comparative study．J NeuroIScil15：158−160，2）Goto Y，NonakaI and Horai S：A new mtDNA
mutation associatedwithmitochondrialmyopathy，

8）ShoffnerJM，Lott MT，Lezza AMS，et al：encephalomyopathy，lactic acidosis and strokelike

Myoclonic epilepsy and ragged−red fiber disease

episodes（MELAS）．Biochem Biophys Acta

（MERRF）isassociatedwithamitochondrialDNA

1993．

tRNALys mutation．Cel161：931−937，1990．

lO97：238−240，1990．

3）Howell N and McCullough

D：An example of9）Wallace DC，Singh G，Lott MT，et al：Mito−

Leber hereditaryoptic neuropathy notinvoIving a

Chondrial

mutationinthemitochondrial ND4gene．AnnJ

herediataryopticneuropathy．Science242：1427−

Hum Genet47：629−634，1990．
4）Huoponen K，VilkkiJ，Savontaus M−L，et al：DNAmutationassociatedwith

Leber

s

1430．1988．

10）ZevianiM，GelleraC，AntozziC，etal：Maternally−161−

Ann Neuro131：672−675，1992．

inherited myopathy and cardiomyopathy：associa−

tion with mutationinmitochondrial DNA tRNA−

12）Bindoff

LA，Howell

N，PoultonJ，etal：Abnor一

malRNAprocessingassociatedwithanoveltRNA

Leu（UUR）．Lancet338：143−147，1991．

mutationinmitochondrialDNA．JBioIChem268：

11）GotoY，TojoM，TohyamaJ，etal：Anovelpoint
mutationin the mitochondrial tRNA−Leu（UUR）

19559−19564，1993．

genein a familywithmitochondrial myopathy・−162−41）MELASの筋病理における変異mtDNAの役割
内

研究協力者

箕

野

田

修

誠■

治■

徳

永

誠＊

安 藤 正 幸■ 埜 中 征 歳事＊

はじめに
我々はミトコンドリア（mt）脳筋症における筋病理学的特徴であるragged−red fibers（RRF），および
cytochrome c oxidase（CCO）活性欠損線経と変異
mtDNAとの関係を明らかにし，mt脳筋症の各病型における変異mtDNAの役割を明らかにすることを目標に研究を進めている1）2）．今回は．RRFおよびCCO活性欠損
線経が，実際は各病型間で少しずつ異なった所見を星している点1トー）に着目し，MELAS患者筋における変異
mtDNAの役割について検討した5｝．

2）RRFにおいてtotalmtDNAはnon−RRFに比べ著明

対象と方法
1）対象としてmtDNA tRNALeu（3243）変異を有する
MELAS患者3例を用いた．
2）これら生検筋の連続切片を用いてCCO染色，SDH
染色ATPase染色等のhistochemistryを行い，またmtDNA断片をプp−ブにiTZ Situ hybridization（ISH）
を行い，各筋線経におけるRRF，CCO活性，fibertypeお
よびtotal（正常と変異）mtDNAの関係を検討した．
3）RRFおよびnon−RRFにおける正常と変異mtDNAの割合を明らかにするために，SDH染色した20FLmの筋切片から1個の筋線経を採取し，primer pairの一方の5 端を放射性同位元素（RI）［γ−32p］ATPでラベルしてpolymerase chain reaction（PCR）法にてmtDNA変異部を含む領域のmtDNA断片を増幅した．変異部認識の制限酵素（Cfr13Ⅰ）で切断し，pOlyacrylamidegelにて電気泳動後，そのDNA断片のRIの強さで正常と変異
mtDNAの割合を検討した（single fiber PCR）．

MELAS患者筋のtypel−RRFとtype2−RRFにおいてtotalmtDNAの量や分布状態，変異mtDNAの割合にに増加しており（non−RRFの約5〜17倍），変異mtDNAの割合もnonpRRFに比べ有意に高かった（RRFで88．1±5．5％，nOn−RRFで63，2±21．6％）（図2）が，tOtalmtDNA量の増加に比し軽度であった．
3）筋内小動脈においてはSDHにて濃染する血管（SSV：stronglySDH−reaCtive blood vessels）でtotal
mtDNAの著明な増加を認めたが，その多くは変異
mtDNA由来であった．
考察おいて有意な変化は認められないにもかかわらず，tyPel−RRFとtype2−RRFのCCO活性が異なっていたことは，本来fiber typeがneuron支配によって行われていることを考慮すると，CCO活性の有無には何らかの核由来の因子が関与している可能性を示唆した．RRFのtotalmtDNAの増加量に比較して，変異mtDNAの割合
はnon−RRFにおいてRRFとほとんど変わらないものか
ら，少なくとも1／2〜1／3程度とその差異が軽度であった．このことは絶対量としての正常mtDNA最もまたRRFにおいてnon−RRFに比較して増加していることを示唆した．この結果は，先に，Cybrid cellclonesを用いて変異mtDNAに著明な複製上の利点（a marked
replicativeadvantage）があったとする報告6）と異なり，
MELAS患者筋においてはそれほど著明な複製上の利点はないことを示唆した．またMELASではSSVにおける変異mtDNAの役割は基本的にはRRFのそれとほぼ結果1）MELAS慮老筋では，typelLRRFの多くはCCO活
性陽性であったが，type2−RRFはそのほとんどがCCO
活性陰性であった，しかしながら，tyPelTRRFとtype2−RRFにおいてtotal mtDNAの量や分布状態，変異mtDNAの割合において有意な変化は認められなかった（図1，2）．

同様と考えられ，全身的に血管系，特に小動脈系の障害への関与が示唆され，脳内でのstrokelikeepisodes発症に深く関与しているものと思われた．
文

献1）Mita S．Schmidt B，Schon EA，et al：Detection
Of

deletedmitochondrial

genomesin

cyto，chrome−C OXidase−deficient muscle fibers of a

■熊本大学医学部第一内科＝国立精神・神権センター武蔵病院

patientwith Kearns−Sayre syndrome．Proc Natl

→1631

図1MELAS患者筋の連続切片におけるhistochemistryおよびinsituhybridization（ISH）
a・SDH染色 b・CCO染色 C・ISHによるtotalmtDNAの検出 d．ATPase（pHlO．7）染色1：typelLRRF・2：type2−RRF，3：typel−nOn−RRF，4：type2−nOnLRRF
∩−
0

0
9

mitochondrialDNAin blood vessels and ragged−

0
8

さludlコ∈

Acad SciUSA86：9509−9513，1989．
2）Tokunaga M．Mita S，Sakuta R，et al：Increased
red fibersin mitochondrial myopathy，enCePhalo−
pathy，1actic acidosis，and stroke−like episodes（MELAS）．Ann Neuro133：275−280，1993．
3）Johnson MA，TurnbullDM，DickDJandScherratt
HSA：A partial deficiency of cytochrome c
OXidaseinChTOnicprogressiveexternalophthalm0→

plegia，J NeuroISci60：31−53，1983．
4）Goto Y，HoraiS，MatsuokaT．etal：MitochondriT
almyopathy，enCephalopathy，lactic acidosis and

StrOke−like episodes（MELAS）：a correlative
Study of the clinical features and mitochondrial

DNA mutation．Neurology42：545L550，1992．
5）TokunagaM，MitaS，MurakamiT，et al：Single
1

図2

2

3

muscle fiber analysis ofmitochondrialmyopathy，

4

encephalopathy，lactic acidosis and stroke−like

MELAS患者3症例の個々の筋線経における変異mtDNA割合
RRFでは88．1±5．5％，nOn−RRFでは63．2±
21．6％であった

6）Yoneda M，Chomyn A，Martinuzzi A，et al：1：type1−RRF，2：type2−RRF，3：

Carryinga point mutation thatcausestheMELAS

typel−nOn−RRF，4：type2−nOn−RRF●▲■各々の症例を示す．

encephalomyopathy．ProcNatlAcadSciUSA89：

episodes（MELAS）．AnnNeurol．in press．
Marked replicative advantage of human mtDNA

11164−11168，1992．

−164−42）ミトコンドリア脳筋症MELAS／における複合体形成異常太 田 成 男◆

研究協力者

鷲

見

正

人＝

吉

作

田

亮

一…＊林

田

はじめに

貿

右＊＊

純

一†

埜

中

征

哉…

表1MELAS3271変異を持つサイブリドの作製
変異mtDNAと正常mtDNAの比率はミスマッチPCRを用いて行った．定量には変異を持つ断片と持たない断片をクローン化
して標準試料とした．

ミトコンドリア脳筋症MELASの約80％の患者はミトコンドリアDNA（mtDNA）の塩基番号3243の変異によって発症するがl）〜3），約10％の患者は塩基番号3271の変異によっても発症する4）．ミトコンドリア脳筋症の各々の病型の特徴がどの様にして生じるかは，発症のメカニズ

CclIs

ムを知るうえで極めて重要である．MELASでは3243変
異と3271変異では臨床症状の上では区別できないので，
3243変異と3271変異の共通な現象と各々独自の現象を見

Relaliveconten10r
MELAS3271mlDNA（％）

mlDNArccipICnl
JpHeljCeHS
mlDNAdonor
skinribroblasts

出せば発症機構解明の糸口になる可能性が期待される．

12

rromaMELASFntlCnl

今までにCPEOのmtDNAの大欠矢では，変異訂90000糾000016000000095

mtDNAと正常mtDNAの比率がある閲値を超えると急

CybridcIoncs
ML5−1

激にミトコンドリアのタンパク質合成が低下すること5㌧−2

MERRF8344変異ではミトコンドリア内で未同定のタン−3−4

パク質が合成されること，MELAS3243変異では高分子−5−6側のタンパク質が顕著に低下することを示した6）．この分子レベルでの差異と臨床症状の違いになんらかの関連がある可能性もあり，興味深い点であった．そこで，今回は双方ともMELASの変異である3243変異と3271変異を比較した．
サイブリドの作製
ミトコンドリア呼吸鎖酵素複合体Ⅰ，Ⅲ，ⅣとATP両者のサブユニットから構成される．そのため，

−8
−9
−10
−11
−12
−13
−14
−15
−16
−17
−19
−20
−1−13義＞合成酵素はミトコンドリア遺伝子産物と核遺伝子産物の＿7

霊ML〜1−13issukIoneorMLSl

mtDNAの変異の効果を調べるには共通の核を持つ細胞を人為的に作製する必要がある．3243変異あるいは3271
変異をもつ患者由来線維芽細胞とmtDNAを完全に失っによって95％以上変異mtDNAをもつ細胞を選択した（表1）．

たHeLa細胞を融合した7）．これは細胞質との融合である
ので，サイブリドと呼ぶ．変異mtDNAを主に持つサイ酵素活性の測定
シトクロム酸化酵素（複合体Ⅳ）活性は，培養細胞をブリドと正常mtDNAのみを持つサイブリドを選択した．さらに変異mtDNAを90％持つ細胞を再クローン化■自治医科大学生化学第一教室＊■東京工業大学資源化学研究所＊■＊国立精神・神経センター武蔵病院＊■■＊国立精神・神経センター神経研究所†筑波大学生物科学系

活性染色することによって酵素活性の有無を判定した．
3243変異あるいは3271変異を95％以上持つサイブリドはシトクロム酸化酵素では陰性であった．また，複合体Ⅰの活性を測定した．3243変異あるいは3271変異を95％以上もつ細胞は複合体Ⅳ（シトクロム酸化酵素）と複合体

一165−

Ⅰ活性いずれも著しく低卜していた（図1）．このサイ
ブリドはHeLa細胞の核を共通に持つのでmtDNAの変

3271変異では間違ったアミノ酸を運ぶことによって酵素活性を低下させることが示唆された7−．

異によって呼吸鎖酵素活性が低下することが3243変異と感同様に3271変異でも明らかとなった．3271変異はMELAS患者にのみ認められること，ヘテロプラズミー

▲冨善書●
■−轡も−

●−■・−エー・しこと 琵−

チン存在下で，35Sメチオニンをとりこませ，ミトコン
ドリアを分画後，SDSポリアクリルアミド電気泳動

増

︑

■

ミトコンドリア内でのタンパク質合成
サイブリドに細胞質タンパク質合成阻害剤であるェメ

旧説Cy
t︒眼識

／シ﹂︼ノ

1嶋

が，ここに3271変異によって呼吸鎖酵素活性が低下する
ことがはじめて証明された7㌧

適齢が
嘩嬬鵬

であることが，MELASの原因遺伝7−の根拠であった

・・一山・
＝￣

触一一／鱒

二ご

■・一遍i二＿ND3−r（PAGE）で解析した，図2に6M尿素存在TSDS−
PAGEと非存在下での結果を示す．

＿一・一慮一誌EE二三＿ここ

3243変異ではタンパク質合成速度が著しく低Fしてい〃ELAざ

た・特に高分了・側の合成が低下していた．→万，3271変
異ではタンパク質合成速度には殆ど変化はなかった．とSDSgel

図2

6Murea／SDSgel

3243変異あるいは3271変異を措つサイブリドのミトコンドリア内タンパク質合成

ころが，矢印で示されるようなバンドが新たに検出されMutant3271．mutant3243は変異mtDNAをた・とりわけ，複合体Iのサブユニット6（ND6）のバ95％以上持つサイブリド．WT（3271T）とWT（3243A）は同じ患者より分離した細胞から得たサイブリドで正常mtDNAのみを有す
る．NDは複合体Ⅰ，Cytbは複合体Ⅲ，COは複合体Ⅳ，ATPは復合休Vで数字はサブユ

ンドは顕著に移動していた（矢印のバンド上また，シト
クロム酸化酵素のバンド（CO）のバンドでもいくつかのバンドで移動度の異なるバンドが見られた．3243変異と3271変異はtRNA，Leu（UUR）遺伝子上に相当する．ロ

ニットの番号である．6M urea／SDSは0．1％SDSのほかに6M尿素を含むゲルである．矢印は3271変異サイブリドに出現あるいは消失したバンドである．

イシンをコードする遺伝子暗号はUURとAUNの2種類がある・ND6ほUURの頻度がもっとも高く，もし変異tRNA−Leu（UUR）が別のアミノ酸を運ぶとすれば，タン
パク質の性質が異なり電気泳動においても移動度が異な

1stelectrophoresis（NativeGel）

ることが推定できる．すなわち，3243変異ではタンパク＝質合成を停止させ，酵素活性を低Fさせるのに対し，

（
訝 Q

8

○
○

0 0 0︒

N⊃de一ectrOPhOreS訂︵W享SロS︶

図1

ML
ML
5−15 5−1

−I

ML
ML
ML
5−15 5−1 5−1−13○︵D︹U O囁ML
5−1−133271変異を持つサイブリドの複合体tの酵素
活性とタンパク質合成速度
ML5．15は100％正常mtDNAを，KL5−1
は87％の変異mtDNAを，ML5Ll13は95％以上変異mtDNAを持つ．

図3

二次元電気泳動の原理
一次元ゲルは複合体を形成したまま泳動
L，二次元目はSDS存在下で泳動する．同じ復合体由来のサブユニットは縦に一列に並ぶので解析が容易である．

−166−

MELASが酵素活性は低下していた．

control

3243

3271

結

「l

滋
鐘

論

3243変異と同様に3271変異によっても酵素活性が低下￣■¶『

し，MELASの原因遺伝子変異であることが証明され▲・−■た．しかし，3243変異ではミトコンドリア内のタンパク二竺」ノj裏芸∴i長江qF∴※㌦：二￣ヰ−

質合成速度が低下し，複合体形成にまで影響を及ぼした．一万．3271変異では全体的なタンパク質合成速度は

J￣＿＿￣

−

ほぼ汀三常で複合体もほぼ正常に形成した．これはロイシ
ンの代わりに別のアミノ酸を運ぶために酵素活性に影響

一■■←

●一一■■

＿●・．＿「＿＿

￣二￣

二＝＝」

＿

ニ

を及ぼすものと推定された．
文

献1）KobayashiY，Momoi MY，Tominaga K，et al：A
polnt mutationin the mitochondrial tRNA−
Leu（UUR）gene in MELAS．Biochem Biophys
Res Commun173：816r822，1990．

2）Kobayashi Y，Momoi MY，Tominaga K，et al：
Resplration−deficient cells are caused by a slngle
point mutationin the mitochondrial tRNA−
Leu（UUR）genein MELAS．AmJ Hum Genet

図4 二次元電気泳動の一部
Controlは正常細胞，3243と3271はそれぞれの変異mtDNAをもつサイブリドから得たミトコ
ンドリアである．細い矢印は復合体Ⅲ，太い矢印は複合体V（ATP合成酵素）を示す．

49：590−599，1991．

3）Goto Y，NonakaI and Horai S：mutationin thetRNA−Leu（UUR）gene associated with the
MELAS subgroup of mitochondrial encephol0−
myopathies．Nature348：651−653，1990．

複合体の解析

4）Goto Y．NonakaI and Horai S：A new mtDNA

ミトコンドリア遺伝子のコードされるタンパク質はす
べて核遺伝子産物のサブユニットと複合体を形成しては

mutation associated with MELAS．

じめて機能を持つ．そこで，実際上は複合体の形成状況

Biophys Actal097：238−240，1991．

Biochim

解析する方法を開発した．この方法は，二次元電気泳動

5）HayashiJJ，Ohta S．Kikuchi A，et al：Introduc−tion of diseaserrelated mitochondrialDNA deletion

を用いる方法で，一次元Ilは穏やかな可溶化剤で溶解

into HeLa ce11SlackingmitochondrialDNAresults

し，俊介体を形成させたままで電気泳動する．￣二次元目

in mitochondrialdysfunction．Proc Natl Acad Sci

が重要となってくる．そこで複合体の形成状況を一度にはSDS存在卜で泳動し，サブユニットを完全に分離する（原理は図3）．こうすることによって同一復合体由来のサブユニットは一列に並ぶことになり，解析が容易で

USA88：10614−10618，1991．
6）太田成男，林ア脳筋症変異mtDNAによるタンパク質合成低F．
厚生省「精神・神経疾患研究委託費」筋ジストロある．二次元電気泳動図の一部を図4に示す．3243変異
では複合体Ⅲの移動度が速くなり，複合体が小さくなっていることを示唆した．また，量的にも少なくなっている．複合体Ⅴのサブユニットも少なくなっており，複合体が正常に形成されていないことを示す．その他複合体
Ⅳにおいても同様に形成されているサブユニットは少な

純一，埜中征哉ほか：ミトコンドリ

フィー及び関連疾患の成因と治療法開発に関する研究（荒木班）平成3年度研究報告書1992，pp211−

215．
7）HayashiJ−Ⅰ．OhtaS，TakaiD，etal：Accumulation

od mtDNAwith a mutation at position

3271intRNA−Leu（UUR）geneintroduced from a ME−

くなっている．
一万，3271変異では複合体Ⅲの形成量はやや少ない傾LAS patient toHeLa dellslacking mtDNA results

向を示したが，その他の複合体の量は対照に比して錬磨in progresssjveinhibition of mitochondrial respira−な差異は認められなかった．すなわち，3271変異ではタ

toryfunction．BiochemBiophysResCommun197：

ンパク質合成だけでなく複合体までほぼ正常に形成する

1049−1055，1993．

一167−43）ミトコンドリアチロシン転移RNA遺伝子近傍の挿入変異とミトコンドリア病との関係
後

研究協力者

埜

中

征

藤

哉■

雄

一一一書

宝

来

聴＝

DavidAClayton…

はじめに

mtDNAに欠矢のあるCPEO患者58例（うち3例は多重MELAS（mitochondrialmyopathy，enCephalopathy，欠失），欠矢のないCPEOの患老24例，3243変異を有す

lacticacidosis，andstroke−likeepisodes）患者では，ミるMELAS患者68例，および3243変異を有するミオパ
チ一息老4例である．

トコンドリアDNA（mtDNA）3243変異が約80％に，3271変異が約10％に認められることを我々はすでに報告

結した1卜功．また一方で，我々は3243変異がCPEO（chron−icprogressiveexternalophthalmoplegia）患者にも存在果

1．挿入変異の発見することを見出しl），その後同様な症例の報告が相次いOS例の全ミトコンドリア転移RNA領域の塩基配列のだト6）．同一変異が，明らかに異なる臨床病型を表現する決定を行ったが，3243変異以外の新たな変異は認めなかった．しかし，チロシソ転移RNAとCOIサブユニッ

理由を明らかにするために，3243変異を持つCPEO患者（OS例）について，mtDNA内の他の部位に変異がないかどうかを検討した．その結果OS例は，3243変異ととトの間のnon−COding領域に，10塩基の挿入変異を偶然見出した（図1）．このチロシソ転移RNAとCOIサブユ

もにチロシソ転移RNAとCOIサブユニットの間に約10ニットの間の領域は，bovine，mOuSe，rat，Chickenでは1塩基の挿入変異を有していた．今回は，この挿入変異の塩基のみ，Xenopusでは2塩基しかなく，ヒトで認めら

ミトコンドリア病患者と正常コントロールでの頻度を調べ，そのミトコンドリア病との関係を検討した．

れる12塩基は例外的に数が多い．OS例では，この部位にさらに10塩基の挿入があるため，正常ではグアニン（G）が5個並ぶものが，13個に増加していた（図1）．

対象と方法

2．CPEO患者での挿入変異の頻度

3243変異を有するCPEO例である患者OS例l切骨格

挿入変異を含むような位置に，一組のプライマーを作筋からDNAを分離し，mtDNAの全転移RNA領域の塩製し（プライマー504と505），PCR法を用いて挿入変異

基配列をすでに報告した方法で11決定した．

の有無を検討した（表1）．サザン法で欠矢のあった58例

新たに発見できた挿入変異（結果の項を参照）を検出するには，プライマー504：5（5757）GGGAGAAGC一ccCGGCAGGTTTGAAGCTGCT（5786）3とプライには1例も認めなかった．欠矢のない24例のうち，3243
変異を有する2例にこの挿入変異を認め，残りの3243変
異を持たない22例には認めなかった．

を用いてPCR法を行い，4％NuSieve3：1

3・3243変異を有する患者での挿入変異の頻度
表2に示すように，典型的な臨床症状と筋病理所見を

Agarose（FMC）上で，電気泳動を行った．対象は，示したMELAS患者68例の中に2例の挿入変異を有する

表1 CPEO患者での挿入変異の頻度例を認めた．また，3243変異を持ちながら，ミオパチー
のみの4例には認めなかった．

欠失あり

単一欠失
多重欠失

0／55
0／3

表2 3243変異を有する患者と正常対照での挿入変異の
頻度

欠失なし

3243あり3243なし

2／2
0／22

症

マー505：5（5909）3（5928）AGAATAGTCAACGGTCGGCG

状

例

数

挿入変異陽性者数

hM
ミオバチーのみ■国立精神・神経センター武蔵病院…国立遺伝学研究所■■＊スタンフォード大学

CPEO

正常コントロールー168−

言］74 …］
116

1

4（5．4％）（0．9％）

＝二5Gs

L・Origln

HUMAN
IViId−サ匹

COlantisense

CAGTGGGGGTGA

HUMAN
mubnt

COIantisense

CAGTGGGGGG伍缶（G⑬C￠（BT（GTGABOVINE

COIantisensetRNA−Tyr

MOUSE
RAT
CHICKEN

COIantisensetRNA−TyrXENOPUSCOIandsCnSetRNA・TyrtRNA−Cys

13Gs

tRNA・TyrlRNA・Tyr

図1 挿入変異近傍の塩基配列を示す（H鎖）矢印がチロシソ（Tyr）およびシスチソ（Cys）転移（t−）RNAの転写方向を示す．
白抜きの塩基が挿入されたもの．詳細は本文参照．
たりうるかという問題の結論はでていない．さらに詳細

4．正常コントロールでの挿入変異の頻度な細胞生理学的な発現研究を行い，この問題を追及する

Horaiらは，日本人116例を対象に種々の制限酵素を用必要がある．

いた切断パターンを調べている7㌧ 今回の挿入変異は，HaeIIIを用いた多型の検討で1例に認めており，プライ
マー504と505を用いたPCR法でも確認した．ただし，こ文

献1）Goto Y，NonakaIand HoraiS：Amutationintheの例は3243変共を有していない．

tRNA−Leu（UUR）gene associated考察with theMELAS subgroup of mitochondrialencephalomyo−
Pathies．Nature348：651−653，1990．

臨床病型がCPEOであるのに，3243変異を有するOS
例が見つかった時，我々は，（1）3243変異をもつ変異型ゲノムが，MELASの症状を引き起こす程十分な量がない

2）Goto Y，HoraiS，MatsuokaT，et al：Mitochondri−

可能性（晶の問題）と，（2）別のCPEOを引き起こす異常

stroke−like episodes（MELAS）：A correlativeの方が，MELASを引き起こす3243変異よりも大きい効果を持った可能性（質の問題）を考えた日．量の問題は，

study of the clinical features and mitochondrial
DNA mutation．Neurology42：545−550，1992．

その後のOS例の剖検臓器での検討で，骨格筋での変異

3）Goto Y，NonakaI and Horai S：A new mtDNA型ゲノムの比率が通常のMELAS例に比較してやや低い

mutation associatedwith mitochondrialmyopathy，ものの，中枢神経では90％近くであり，他のMELAS剖

encephalopathy，lactic acidosis，and stroke−like

検例と大差のないことが判明している（詳細は省く）．

episodes（MELAS）．BiochimBiophysActalO97：

al myopathy，enCePhalopathy，lactic acidosis and238−240，1991．

その意味では，単なる変異型ゲノムの塁的差異だけでは，CPEOを表現することを説明するのはむずかしい．

4）Hammans SR，Sweeney MG，Brockington M，et

したがって，別の質的異常がOS例に存在するかどう

al：Mitochondrial encephalopathies：Molecularかが問題になり，それが今回の研究の出発点である．そ

genetics diagnosis from blood samples．Lancet
337：1311−1313，1991．

の結果，mtDNAの中に，新たに挿入変異が見出された．

5）Johns DR and Hurko O：Mitochondrialleucine

しかし，最も重要なことは，この挿入変異が質的異常た
りうるかという点である．

tRNAamutationinneurologicaldiseases．Lancet
337：927−928（letter），1991．

その点を検討するために，多くの症例と正常コソト
ロールでの頻度を検討した．その結果，3243変異を有す
るCPEO例2例ともにこの挿入変異を認めた．この事実

6）Moraes CT，CiacciF，SilvestriG，et al：Atypicalは，挿入変異の病気への関わりを強く示唆した．しかmutation at position32430f humanmitochondrial

clinicalpresentations associatedwith the MELAS

し，次の2つの点で，病気への関わりを疑わせることに

DNA．Neuromusc Disordl：43−50，1993．

なった．（1）典型的MELASの症状をもつ患者2例（2／7）Horai S and Matsunaga E：Mitochondrial poly−68）にこの挿入変異が見つかった．（2）正常コントロール

morphisminJapanese：II．Analysiswith restric−の中の1例（1／116）にこの挿入変異が見つかった．

tion enzymes of four or fivebase palr reCOgnition．

したがって，現在のところ，この挿入変異が質的異常

ー169−

Hum Genet72：105−117，1986．

44）ミトコンドリア病における12SリボゾームRNA

遺伝子変異
小 澤 高 賂■■

研究協力者

田

中

雅

嗣■

相

楽

達

男■

糸

山

進

次…

成 田 奈緒子…＊布 田 伸 一†

はじめに
これまでにミトコンドリアDNA（mtDNA）のtRNAした．気管からの急性出血のため死亡．
剖検所見：腎では巣状糸球体硬化が見られた，小脳と大脳には多発性の軟化巣を認めた．心臓の左室と中隔が著明に肥厚し（510g／34kg），電顕上，異常ミトコンドリアの集積を認めた．

遺伝子および翻訳領域における塩基置換がミトコンドリ
ア脳筋症において報告されてきた，リボゾームRNA（rRNA）遺伝子の変異としては，母系遺伝を示すアミノグリコシド誘発性難聴において12S rRNA退伝子の塩基番号1555のAからGへの変異が関わっていることが明らかにされているがl），ミトコンドリア脳筋症に関連した変異は解明されていない．我々は既に約50例の個体のmtDNAの全塩基配列を決定している．これらの個体で観察された12S rRNA遺伝子の変異の中で病態に関連する可能性のあるものを検索した．

症例2：7カ月，女児．
分娩歴：39週，3760g，自然分娩，仮死（−）
現病歴：1カ月検診時，体重増加不良を指摘され，入院．高乳酸血症（乳酸149mg／dl，ピルビン酸4，8mg／dl）
筋力低下（＋）．
筋生検所見：Ragged−red fibers（＋），CytOChrome
COXidase活性染色低下．気管支炎・呼吸不全のため人工換気を開始．
治療；代謝性アシドーシスの補正，カルニチンとCoQの症例および方法
症例1：20歳，男．
主訴；全身倦怠感，下駆浮腫．
豪族歴：特記すべきことなし．
現病歴；15歳で蛋白尿を指摘されたが放置した．18歳で全身倦怠感を訴え，近医で腎機能障害を指摘された，19
歳時に心肥大．貧血を指摘され，下腿の浮腫を自覚した，慢性腎不全の診断で他院で治痕を受けた．全身性強直性痙攣が出現したが，頭部CT上で異常所見を認めなかった．
入院時所見：慢性腎不全仁心肥大，低身長（151cm），知能低下（IQ51），小脳症状，ミオクローヌス様発作，強直性痙攣，両側錐体外路徽朕，視力低下，角膜混濁，両側感音性難聴を認めた．血液透析を開始．心電図は著明な
高電位，巨大な陰性で波，WPW症恢群を示した．心エコー図ではび漫性の壁肥厚が著明であった．髄液の乳酸値は18mg／dlと上昇していた．
経過：全身性強直性痙攣が頻発しト頭部CT上で多発性の低吸収域を認めた．痙攣発作出現後，意識状態が低下■名古屋大学医学部第二生化学■＊埼玉医科大学総合医療センター第四内科
事■■埼玉医科大学総合医療センター病理郎■桝＊神戸大学医学部小児科†国立甲府病院内科

経口投与の後に全身状態が改善し，人工換気を離脱した．
現症：乳酸14．7mg／dl，ピルビン酸1．19mg／dL筋力の改善が見られた．
診断：乳児一過性CCO欠損症疑い．
症例3：7歳，女児．
主訴：呼吸困難，食欲不振，全身倦怠感．
豪族歴：両親ははとこ結婚．兄は4歳で突然死（拡張型心筋症）．
既往歴：特記すべきことなし．
規病歴：1991年4月上旬より体動時呼吸困難，食欲不振，全身倦怠感が出現したため，M病院受診し，4月15日に同病院に入院．家族性拡張型心筋症が疑われ治涼を受けるも症状は一進一退を繰り返した．1991年6月26日，心不全症状の急激な悪化が認められたため．精査および強化療法目的で国立甲府病院内科に入院．
入院時現症：身長120cm，体重27kg．脈拍116／分，整．血圧120／70mmHg．結膜：貧血（−）∴黄症（−）．頸部：頸静脈怒張（＋），肺野：両側下肺野で湿性ラ音を聴取，心濁音界：拡大（＋）．心雑音：全収縮期吹鳴様逆流性雑音を心尖部（Ⅰ／Ⅵ）および第4肋間胸骨左縁（Ⅲ／Ⅵ）にて聴取．心音：Ⅲ音（＋），Ⅳ音（＋），腹部：右鎖骨中線

一170−

l

で肝臓を3横指触知．四肢：浮腫（＋）．神経学的検査：

＝

Ⅳ

V

異常なし．1992年1月ユタ大学で心臓移植を受け帰国・

㌍示・W
方

法

√電J′一伝達系の複合体l〜Vの活性測定およびウェスタ

渉やヤーー

ンプロット分析は既報に従って行った．mtDNAの塩基■トー

配列は蛍光法21によりAutomated DNA sequencer

果

J一一

q肝−

C

P

823−S30

圧の酵素活性は正常の122％であったが，複合体Ⅰの酵
素活性は正常の24％に低下しており，複合体Vの酵素活
性もⅠ￣［常の54％に低下していた（表1）．心筋ミトコン
ドリアのウェスタンプロットを図1に示す．複合体Ⅲのサブユニットの量の減少は軽度であったが，複合体Ⅰと複合体Vのサブユニット量の減少は顕著であった．腎臓のミトコンドリアでは，複合体Ⅳ，複合体Ⅲの酵素活性はlE常よりはるかに高い値を示したが，複合体Ⅰの酵素活性は正常の48％に低下しており，相対的に複合体Ⅰの酵素活性の減少が存在すると考えられた（表2）．腎臓

ミトコンドリアにおいて複合体の間でサブユニット量の減少程度が異なることが観察された．
症例1の心筋DNAからmtDNAを増幅し，全塩基配

CP

C

P

CP

360−367

観察されなかった．対照群において頻度の高い変異を除Humanmitochon血血12SrRNA
Bodne12SrRNA
Mouse12SrRNAR瓜12SrRNA
ズg乃呼以∫ke血12SrRNA加e〃れ）板目fvid〟∫12SrRNA伽即g〆∝朗飢）J揖p叩血12SrRNA
8m∫（甲板血ッdb血112SrRNA∫8cc舶用7秒Ce∫CergV由idgmil∝hondda
A甲g摺JJJ揖扉d血郁miochon血a
P別冊C〟椚pn〝址以柁肋mit∝hondna
M衰zEmitochonddaの血叩血㈲鶴川血吻劇ch10rOplastg昭JgI∽gJW血chloroplast
M血EChloroplast
AIはα∫血涙血Jd∫
だ．∝沼

図212SrRNA遺伝子のドメインⅠのループ構造の種間比較
塩基番号827のA分子進化的保存を示す．

外すると，翻訳領域では同義置換が8箇所に，非同義置
換が1箇所（15236A→G：Ile→Val）に見られた．I）r
ループ領域および非翻訳領域には8箇所の塩基置換と9塩基対の欠失（8272−8280）が見られた，12SrRNA遺伝

Padentmitochondrial12SrRNA坤C呼血一肌ロC甲nC（血爪列を蛍光法を用いて決定した．tRNA遺伝子には変異は16S rRNA遺伝子には2831G→A塩基転位が存在した．

子には827A→Gおよび961T→C塩基転位が見られた．

症例1に加えて，他の2例においても827A→G変異が観察された．症例2は827A→G変異に加えて，16S

表1症例1の心筋におけるミトコンドリア電子伝達系
複合体の酵素活性rRNA遺伝子の変異（2463A→G）とtRNA−Glu遺伝子の変異（14674T→C）を伴っていた．症例3は827A→
G変異に加えて，mtDNAの翻訳領域に3箇所の非同義

4′
′1
03
10
7ノ
97
0
9
70
ノ′
01
一一一一一
1t
7J
▲O
79UQノ
8
4
94
4O50ノ

3tJtJつJつJ
7h
0V
09
32
22
つ4
ん
ノ
つ
ーつ
︼l

＋一＋一＋−＋一＋一
柳榊728
35
19
33

凋7
37706516甜

㈲ 封121978752

n
e
．
h
u

h

表2

脚絆

岬
岬
卿
岬
岬
岬
岬
岬
岬
叩
叩
叩
叩
叩
叩
叩
叩
叩
叩

を単離し，複合体トVの酵素活性を測定した．複合体

ComplexⅢT
ComplexⅣ

V−■■−■

図1症例1の心筋ミトコソドリアの電子伝達系複合体のサブユニット分析

症例1の剖検心筋および腎臓組織からミトコンドリア0）mplexI
CompkxⅡ

1卜

Ⅳ・■■■一■−15−（ABImode1373A）を用いて決定した．
結

lSPH脚■・−

置換を伴っていた．
考察

症例1において12SrRNA遺伝子に2箇所の塩基転位が見られた．塩基番号827のAは12S rRNA分子のドメ
インⅠのループ構造の中央掛こあった．塩基番号961の症例1の腎臓におけるミトコソドリア電子伝達系
複合体の酵素活性

Tは12S rRNA分子のドメインⅠの大きなループ構造の中に存在した．この塩基番号961のTがCに塩基転位す（％）Con打01

48
159
296
520
204

1

146
1624
1458
1627
98

4 033 00
0
つ ん
9
1
4
3 04 3e Padent

ComplexI
ComplexII
ComplexII1G）mplexIV
leXV

ることにより，大きなループ構造にC塩基の連続が生じた．この961T→C塩基転位はParkinson病の患者でも観察された．
16−S−like rRNAに関しては分子進化の観点から多く−171−

子と考えられた．ミトコンドリア脳筋症においてrRNAの種に関する塩基配列が決定されており，進化において保存されている飢域と種間の変異の頻度の高い領域が明

遺伝子変異の有無を検察する必要があろう．

らかになっている3）．ヒトのミトコンドリア12S rRNA

遺伝子の塩基番号827のAは，E．coliの16S rRNAの塩文

基番号364のAに相当する．症例1においてA→G塩基1）

献Prezant TR，AgapianJV，Bohlman C，Bu X，転位が観察された塩基番号827のAは，晒乳類，カエル，
ウニ，昆虫，酵母，カビ，ゾウリムシ，植物のミトコン

Oztas S，Qiu WrQ，Arnos KS，Cortopassi GA，Jaber L，RotterJL Shohat M and Fischel−Ghod

ドリアで保存されているばかりでなく，線藻類，原生動Sian N：Mitochondrial ribosomal RNA mutation

物，トウモロコシの葉緑体でも保存されていた．さらに

associated with both antibiotic−induced and non−

藍藻類，マイコプラズマ，大腸菌でも保存されていた（図2）．

Syndromic deafness．Nature Genetics 4：289−

Sternら4）は，大腸菌の364Aはリボゾームのサブユ
ニットS16によって化学修朗から保護されることから，

2）TanakaM，InoH，OhnoK，OhbayashiT，IkebeS，Sano T，Ichiki T，・Kobayashi M，Wada Y and

このループの塩基がサブユニットS16の結合部位になっOzawa T：Mitochondrial DNA mutationsinていると推定している．さらに，大腸菌の塩基番号364

mitochondrial myopathy，enCePhalopathy，lacticのAは塩基番号397のAとの間で架橋され，16S rRNA

acidosis，and stroke−like episodes（MELAS）．

の立体構造の保持に重要な役割を浜じていることが示唆

Biochem BiophysResCommun174：861−868，

294，1993．

1991．

されている．このように塩基番号827のAが種間保存され，サブユニットとの結合に関与し，立体構造の保持にも寄与していることから，ヒトのミトコンドリア12S

3）Guthe11RR，WeiserB，Woese CRand No11erHF：

rRNAにおいて塩基番号827のAからGへの塩基転位しRNA．Progressin Nucleic Acid Research andた場合に何らかの機能異常がもたらされる可能性が考えられた．

Molecular Biology，Vol．32，Academic Press，New

症例1は，MELASあるいはMERRFに類似した臨床

4）Stern S，WeiserBand Noller HF：Modelfor the

症状および電子伝達系欠損が見られたが，tRNA遺伝子には変異を認めず，12SrRNA遺伝子の種保存性の百品、

three−dimensionalfolding of16S ribosomal RNA．

Comprehensive anatomy of16−S−like ribosomal

York，1985，pp155−216．

塩基に置換を見出し，この塩基置換が本症発症の危険囚−172−

J MoIBio1204：447−481，1988．

Ⅸ．治45）mdxマウスを用いた治療開発に関する研究
栗 原 照 幸＊

研究協力着

岸

雅

彦■

大

迫

正

行■

木

下

眞

男＊

はじめに

られた（図日）．Lidocaineは，電気的ミオトニーの頻度

我々はDuchenne型筋ジストロフィー症（DMD）の治は低下させるが，膜電位には影響しなかった．Bestatin

療薬としての可能性を探る意味で，dystrophinが欠損しの追加により，さらに電気的ミオトニーが低下し，軽度ているmdxマウスの筋細胞膜にみられる電気生理学的
異常を改善する薬剤の検索を続けてきている．これまで

喝／1の濃度では，電気的ミオトニーを抑制するが，完の膜電位の改善が認められた（図2）．Mexiletineは20にも，電気的ミオトニーと，静止膜電位の低下という客観的示標を持って，これらを改善する薬剤について，報全に阻止するほどの効果はない（図3）．しかし，80mg／lの濃度では電気的ミオトニーは完全に阻止された．これ

告してきているが，その作用機序が解らないものも存在にbestatinを追加すると，さらに膜電位の改善が認めらする．Bestatinは，mdxマウスの膜電位の低下を改善すれた（図4）．

ると報告したが，この作用機序も不明のままである．今回は，有効と考えられる薬剤と，このbestatinを同時に1987年のBrookeらの報告ではプレドニンの1．51g／kg
体重の大量投与を6カ月間DMD慮老33人に用いてい作用させ，有用な相互作用の有無を検討した．また，る．今回我々は水溶性predonisoloneを1．5mg／lの濃度

DMDに対して臨床的にもある程度の有効性があると報でTyrodeに添加した．しかし膜電位は数値上改善する

告されている副腎皮質ステロイド剤に，mdxマウスの電ものの有意差は認められなかった．電気的ミオトニーの気生理学的異常を改善する効果があるのかどうかを検討

頻度にも変化はなかった．さらにその10倍の濃度（15したので併せて報告する．

喝／l）のprednisoloneを作用させたが，濃度依存的に増強する効果は認められなかった（図5）．

対象および方法

結果として，Naチャンネル阻害剤を作用させた状態

mdxマウスの横隔膜標本を作成し，95％02およびでも，Ca括抗剤を作用させた状態でも，bestatinの電気

5％C02で酸素化したTyrode溶液に浸し，3MKClで満的ミオトニーを抑制する効果，膜電位を改善する作用は認められ，これはbestatinを単独で用いた時とはぼ同等

たしたガラス管微小電極を自作して，静止膜電位（RMPs）および電気的ミオトニーの頻度を測定した．
対象：生後4週齢のmdxマウスを用い，Tyrode溶液に薬剤を投入し，その前後で各50本の静止膜電位を測定すであった．そして，ステロイドはmdxマウスの筋細胞膜異常には影響しなかった．

ることにより，効果判定を行った．薬剤としては，Ca括考察抗剤であるnicardipine，Naチャンネル阻害剤である

DMDの治療法に対するアプローチには様々な方面で

lidocaine，meXiletineを用いた．これらの薬剤を作用させ試みられていて，治療薬として，候補に上がった．ものはた後，さらにbestatinを40mg／1の濃度で作用させ．効果数多くある．しかし，治療として副作用がなく，その有を判定した．また，副腎皮質ステロイドの筋細胞膜への効性が明確であると言えるものは末だ存在しない1）．

直接作用を見る目的で，Prednisoloneを1．5mg／1，15mg／l

mdxマウスでは，電気的ミオトニーが見られることかの濃度で作用させ，同様に効果を判定した．

ら，我々はMdxマウスの膜異常を改善するものとして，

結果

このようなミオトニーを抑制する薬剤の効果を試みている．Naチャンネル阻害剤はこの電気的ミオトニーを抑Nicardipineを作用させることによる静止膜電位の変化はほとんど見られず，電気的ミオトニーの頻度もほと制する．Bestatinの効果の機序は不明であるが，この効んど低下しなかった．Bestatinの追加により電気的ミオ態でも，単独使用時と同等の効果を発揮した．

果はNaチャンネル阻害剤や，Ca括抗剤を作用させた状副腎皮質ステロイドが，DMDに有効であるという報トニーの頻度の低下，軽度の静止膜電位改善作用が認め

告は，1974年のDrachmanらの報告以来いくつか見られ■東邦大学医学部第四内科

るが2）3㌧ ステロイド剤の副作用との兼合いで，大晶を6

−175−

馳＿

ごC

鮎．

CoIltrOl mdx mouse

25

恥．

Control mdx mouse

RMP：−75．3±9．3mV
20

n＝50．日urst freq．3D，右Control mdx mouse

為25

RMP：−70．0±10．1mV
n＝＝50．Burst freq．34％

RMP：−72．8士10．1mV
n＝50，8urst freq．26％

さ0

15

号5

ほ

は′

柑

10

5

5

5

040

50

繍

■J、・

70

80

三・J

恥．
25
20

60

70

堅0

硝Pト耐）

90

紬Pト憫V二机cardipinel伽1gl

如一

lidoc8ine2伽1g・・

25
RMP：一74．2±9．7mV
n＝50，Burst freq．38％

90

批）．

l

15

15

10

10

5

5

70
翻附く−鷹里60

70

Bestatin4伽1g．

25

RMP：−75．1士9．5mV
n＝50．Burst freq．24％

80

90

j、

L・

触．響けe痛e 細か や

Jl

Bestatine4伽1g．．・￣11
RMP：−68．1±7．6mV
n＝50，Burst freq．12％

RMP：−71．2±8．7mV
n＝50．日urst freq．606

20

90

細P h弼

こ一¶V）

LidoGaine2伽g了l・

恥．

ほ

15

l

謂

l
l

l

一

n

l

S

ユ烏」

：￣l 卜．￣■

1
⊥

︻ ﹂餓

50

誉誓で−㌢−︷

04◎

10

誓

10

隠

5

RIP

触．鞘極町酢軒碑1蝕g／暮す掛
鮎さ鈍痛 如月
28

4こ

80

も−

、；筆−

・

80

70

RMP：一70．2±9．1mV
n＝50．Burst freq．8％

評ト

沌

60

60

−exi‡etine2伽唱パ

25

15

8−釘、弱

50

RIP L一mV、

RMP：−69．3士7．6mV
n＝50，Burst freq．12％

20

840

70
柏炉卜狩V）

80

紳 正二

0職

80

90

帥P：1¶〉：＝

図2

RMP：−72．4±8．5mV

図3
図1

80
80

r−mV￣：

7088

図2

Lidocaineにより電気的ミオト
ニーの頻度は低下したが映電位には影響しなかった．Bestatinの追加により電気的ミオトニーの頻度の低下，軽度の膜電位の改善が認められた．

図3

20mg／lのMexiletineは電気的
ミオトニーを抑制するが，完全には阻止しない．

図4

80昭／1のMexiletineでは電気的ミオトニーは完全に阻止さ

90

繍P（劇）

触．

賢・板目et血8如月

PrednisoIone1．5mg．・ノl

25

RMPニー71．1±7．2mV

RMP：−72．8±9．4mV
n＝50．BurstIreq．40％

iO

n＝50，8urst freq．0％

15
IO
5

SO

60
印P

70
一mV）

90

m樽

餌
閣Ph蛸）

鵬1．
25

隠鮎蒜と蕊？害…監…≦巨
25

Prednisotone151【gパれ，bestatinの追加により，膜電位が改善した．

祁Yj誓認諾芸当％

図5 1．5mg／lのprednisoloneでは有意な膜電位の改善はなぐ電気的
ミオトニーの頻度にも変化はな
かった．

‡5
相

的

Nicardipineによる静LL膜電位の変化，電気的ミオトニーの頻度の低下はなく，Bestatinの追加により電気的ミオトニーの頻度の低卜，軽度の静lL膜電位改善作用が認められた．

RMP：−70．3±9．3mV
n＝58．Burst freq．38％

n＝＝50．Burst freq．30％

70

78

Contro‡mdx mouse

25

R】P

名8

軸附 く憎献図1
録nt oImdxmouse

60

50

840

50

錦

70
柵PtrmV：

図5

ー176−

為0

90

15囁／1でも．濃度依存的に増強する効果は認められなかった．

させた後，圧力を除去しても元に戻らないような，異常なチャンネルを指摘する報告7）8）もあり，今後，mdxマウ

カ月以上の長期に渡って使用することは困難である．
1987年のBrookeらの粗告で6カ月間に限ってステロイ
加，③行動只常，食欲先進，多動，不眠，情緒障害がみ

スの筋細胞膜の電気生理学的検索を行うことにより，この不明な部分が明らかになってゆく可能性があり，またられたが，生命に関係するような副作用は6カ月間といそれに対する改善効果のある薬剤を見出して行くことう限られた投与期間では起こらなかった．ステロイドのが，治療開発に役立つと考えられた．

ド剤を用いた際には，副作用として①痘瘡，②体重増作用機序としては，筋肉が崩壊する機序を根本的に抑制文している訳ではなく，むしろ準純に筋肉の急性壊死，変献1）栗原照幸：進行性筋ジストロフィー症治療の展望．

性，および再生過程を抑制すると考えられている．実際

神経治療学，10（3）：203−210，1993．

に，筋細胞にステロイドがどのように作用しているのかは不明であるが，神経細胞の場合，ステロイドには直接

2）Drachman BD，Toyka KV et al：Predonisonein

的な膜安定作用が有ることが報告されている4）．しかし，

Duchenne muscular dystrophy．Lancet2：1409−
1412，1974．

その機序も不明である．今回，mdxマウスの筋細胞膜に対するステロイドの直接的作用が有るか否かを確認する

3）Brooke

目的で，検索を行ったが，低下した膜電位を改善した

MH，FenickelGMetal：Clinicalinvesti一

gation of Duchenne muscular dystrophy・Interest−

り，電気的ミオトニーを阻止する作用は認められなかっing resultin a trialof predonisone・Arch Neuro1

た．ステロイドもbestatinと同じく，特定のイオンチャ

44：812−817，1987．

ンネルに作用することなく，細胞膜安定化作用をあらわす可能性を考えたが，以上の結果より，ステロイドに

4）Michael S：Rapid membrane effects of steroid
hormones：An emerglng COnCeptin neuroendocri−
nology．TINS13：359−362，1990．

は，bestatinのような筋細胞膜に対する直接的効果は存在しないと思われた．

5）栗原照幸，岸雅彦ほか：ダソトロレンNaを用いたmdxマウスの治療的研究．

その他の有望な治療薬として，dantroleneがあるが，厚生省「精神・神経

これは昨年の報告にて，電気生理学的にも，机織学的に疾患研究委託費」筋ジストロフィー症及び関連疾患

も効果は認められないことを報告した5）．しかし，機械の成因と治療法開発に関する研究 （荒木班）平成

的な負荷がDMDにおいての筋崩壊を促進する可能性を

4年度研究報告書，1993，pP184−187．

考えると，無駄な筋収縮を抑制する可能性のある筋弛緩

6）FrancoJr A and LansmanJB：Calcium entry

剤の効果は，今後も検討してゆく必要があると考えられた．

throughstretchinactivateion channelsin mdx
mouse．Nature344：670−673，1990．

DMDの筋細胞膜はジストロフィンが欠損しているこ

7）McBrideJrDWandHamillOP：Pressure−Clamp：とは理解されているが，そこから筋崩壊への過程に関し

A method for rapid step perturbation of mecha−ては，まだ不明な点が多く存在する．単一チャンネルのnosensitive channels．Pfliユgers Arch

検索では，mdxマウスにおいてmechanosensitiveチャ

612，1992．

ンネルの開口頻度が高かったり，圧力をかけて一度開口−177−

421：606−

46）mdxマウスに対するダントロレンナトリウムの影響−CK値， 運動量および組織学的検討
梶
■

▲▼

■

・事

これらのことから，前回我々はダソトロレンナトリウ︼▼

与して，血清CK値が低下し，筋力はやや改善をみたと報告している3）．

樹之人

ロレンを実際にDuchenne型筋ジストロフィー患者に投正理和することを報告している2）．1991年Bertoriniらはダント

本

mdxマウスにダソトロレンを投与し，血清CK値が低下

村塑筋ジストロフィーと同様にジストロフィン蛋白を欠く

西林宮る．近年，この薬物を筋ジストロフィーの治療に応用した報告がいくつかある．1990年Quinlanらは，Duchenne●■

ダントロレンナトリウムは骨格筋の興奮一収縮連関に作用し，筋小胞体からのCa放出を抑制する薬物であ■め細胞内へ過剰のCaが流入し，筋壊死を起こすと推察されているl）．

■

いることが示唆されており，ジストロフィンの欠損のた明淳治

あるジストロフィ＿ソが欠損していることが知られている．ジストロフィン蛋白はCaのhomeostasisに関係して

英Duchenne型筋ジストロフィーでは，細胞骨格蛋白で

利

﹂▼

▲▼

はじめに

野村崎

▲事

濱木磯

■

祐百 三

康早一

島田野

小鴨西

研究協力者

した．体重及び運動量は投与前と投与後1週間ごとに測定した．投与開始4週間後，ケタミンで深麻酔下で心脛
穿刺にて採血を行い，血清CK値を測定した．
実験に使用したマウスは投与群47匹，対照群46匹で，合計93匹を用いた．投与群にて薬物投与とは無関係に3匹，対照群にて1匹が死亡したため，残り89匹（投与群44匹，対照群45匹）にて検討を行った．
組織学的検討は以下のように行った．ダントロレン投
与群．対照群各4匹よりそれぞれ前脛骨筋，誹腹筋の2筋ずつを採取した．筋組織は迅速凍結後，CryOStatで10〃の切片を作成し，HE染色にて壊死再生現象を中心に観察した．各検体につき2視野（合計面積1．4虚）に出現する総線維数および壊死線経，basophilicfiber，中心核線経，Opaquefiberの数を4人の検者で数え，その平均値を検討に用いた．検者にはダソトロレン投与の有無，
および採取した筋名を伏せ，blindの条件で行った．
統計学的検討には，unpaired t testおよびMann−
WhitneyUtestを用い，p＜0．05を有意とした．

ムをmdxマウスに投与し，血清CK値，運動量に及ぼす影響を報告した4）．ダントロレン投与により血清CKは低下する傾向を示したが，有意差は得られなかった．
今回我々は例数を増やして同様の検討を行い，さらに組織学的な検討を加えた．
方法

4週齢mdxマウスを，ダントロレン投与群，対照群に分けた．投与群にはダントロレンナトリウム0．3mgを4週間連日腹腔内に投与した．ダントロレンナトリウムは0．667mg／mLになるよう蒸留水で溶解し，その0．45mLを投与した．対照群には同量の生理食塩水を同様に
4週間腹腔内投与した．
効果の判定には，体重，運動量，血清CK値を用いた．
運動量は回転ケージに1時間放置し，その回転数で評価●京都大学医学部神経内科■●東京都立神経病院神経内科

−178−

結
果
1）体重，運動量に対する影響（図1）
投与前および投与後の体重は，ダントロレン投与群，対照群間で差を認めなかった．
運動量は，投与2週後，4週後でダントロレン投与群にて低下する傾向を示したが，統計学的な有意差を認めなかった．
2）血清CK値（図2）

血清CK値は投与群で平均7484IU／L，対照群で9122
IU／Lと，平均値ではダントロレン投与群で低下する傾向が認められた．CK値は正規分布をしていなかったた
め，MannTWhitneyUtestで検討を行ったが，統計学的な有意差を認めなかった．
正規化のため対数変換を行った．LogCKの値は投与群で3．71，対照群で3．80と投与群でやや低値であった
が，統計学的な有意差は認めなかった．

3）運動量とCKの関係
投与群では運動量が少ないため，血清CK値が低下傾向を示したとも考えられるため，投与4週後の運動量と血清CK値の相関につき検討したが，両者の間には相関関係は認められなかった．

0

喜宣言妻合点

0

Bel㈹

1W

4）組織学的検討（図3）a）総綾稚数
2視野の合計の総線維数は，前脛骨筋では投与群で302，対照群で254∴排腹筋では投与群で409，対照群で287であり，ダソトロレン投与群にて総線維数は増する
傾向を認めた．誹腹筋では統計学的に有意差を認めた．
（Mann−WhitneyU；p＜0．05）b）壊死線推
総線維数に対する壊死線維数の割合は，前脛骨筋では投与群で6．3％，対照群で7．2％，誹腹筋では投与群で2．8％，対照群で7．1％であった．例数が少ないため統計学的な有意差は認められなかったが，ダソトロレン投与
群にて壊死線維数は低下する傾向を示した．この傾向は
誹腹筋にてより著明であった．
C）Opaque fiber
総線維数に対するopaquefiberの割合は，前脛骨筋では投与群で0．8％，対照群で1．3％，俳腹筋では投与群で郁1．0％，対照群で1．6％であり，投与群にてopaque fiberは低下する傾向が認められた．
d）中心核緑稚
総線維数に対する中心核線経の割合は，ダントロレン
投与群，対照群間で大きな差を認めなかった．

相総線維数に対するbasophilic fiberの割合は，前脛骨筋では投与群で19．5％，対照群で18．2％，誹腹筋では投与群で23．9％，対照群で18．8％であった．Basophilic fiberの数はダントロレン投与群にて増加する傾向を認めた．

川︵主bOの召0Xue）Basophilic fiber

BdOr0

1W

2W

3W

考
察
ダントロレン投与により血清CK値は低下する憤向を示したが，有意差は得られなかった．今回の我々の実験条件では，ダントロレンの投与量は約12〜20mg／kgと比較的臨床量に近い量を用いたが，Quinlanらの報告2）で

図1 体重，運動量に対する影響
上段：体重は両群間で差を認めなかった．
下段：ダソトロレン投与2週後，4週後で運動量はやや低下する傾向を示した．

は30mg／kgと高用量を疫与しており，この差がCK値が有意差にいたらなかった一つの要因とも考えられる．
運動量はダントロレン投与群でやや低下する傾向が認められた．この薬剤を筋ジストロフィー患者に実際に投与する場合には，もともと弱い筋力をさらに低下させる可能性があり，注意を要する点と考えられる．血清CKが低下傾向を示したのは，単に運動量が少ないために筋崩壊が起こりにくいという可能性も考えられるが，運動Dantrolene

図2

量と血清CK値との間に相関はなく，運動量の差だけでは説明できない．
組織学的には，ダソトロレン投与により総線維数は増加し，壊死線経は減少する傾向を認めた．また，Opaquefiberも投与群で減少する傾向を示した．Opaque fiberは細胞内にCaが流入し，過収縮を起こした線経で，壊死の前段階と考えられている．投与群にて減少傾向がみControl

血清CK値
投与群で血清CKはやや低下する傾向を認
めた．

ー179−

a）Totab）NecrotictiberC）OpaqueIiber
5
1

期

5

Ⅷ

︵芭一男○ヒLOqG雪bd史U

卸︵luコ8︶一d10ト︵ボ︶一男○ヒLOqGO等ObON

棚

0

TA

GC

m

TA
e）BaSOPhilic朋ber
5悶Control

5
0

側

5

甜
0

0

TA

【コDan廿OlOnO

000︵芭一月0ヒLOq写り≡五〇のqd

00︵ボ︶一d10ヒ一〇一〇コu−dLluB工だきし￠q江d）FiberwithcentraInuclej

GCGC

図3 組級学的検討
ダソトロレン投与により，a）総線維数は増加，b）C）壊死線維およびopaquefiberは減少憤向を示した．d）中心核線経は両群間で差を認めなかった．e）Baso−philic fiberは増加傾向を示した．（TA：前脛骨筋，GC：胱腹筋）

られたことは，筋小胞体からのCa遊離抑制というダントロレンの薬理効果を反映したものと考えられる．
Basophilicfiberは再生初期に出現する線経であり，誹腹筋において投与群に増加傾向がみられたことは，ダント
ロレンが再生を促進する可能性を示すものとも考えられる．ただし今回はHE染色のみしか行っておらず，また両群での差もわずかであり，今後さらに検討を続ける必要がある．
筋ジストロフィーにおいては細胞内Caが筋線経の壊死に関与していることが推察されている．ダントロレン
は筋小胸体からのCa遊離を抑制する作用があり，これ

文1）Turner LFG，Westwood T，et al：Increased
protein degradation results from elevated freecalciumlevels foundin muscle from mdx mice．
Nature335：735−738，1988．
2）QuinlanJG，Johnson SR，et al：Dantrolene

normalizes serum creatine kinasein mdx mice．
Muscle＆Nerve13：268−269，1990．
3）Bertorini TE，Palmieri GMA，et al：Effect ofdantrolenein Duchenne muscular dystrophy．
Muscle＆Nerve14：503−507，1991．
4）梶が筋ジストロフィーにおいて欠損しているジストロフィ献龍兄，小島康祐ほか：mdxマウスにおけるダソンの機能を一部代償し，血清CK値を低下させ，組織学的にも筋壊死を抑制した可能性が推察される．

す影響．頂生省「精神・神経疾患鱒究委託費」筋

ま と め

ジストロフィー及び関連疾患の成因と治療法開発に関する研究 （荒木班），平成4年度研究報告書，

ダソトロレン投与により，有意差にはいたらなかったが，血清CK値は低下する傾向を示した．運動量は投与群でやや低下する傾向がみられた．組織学的には投与群
にて壊死線経は減少し，再生線経は増加する傾向を認め
た．

ー180−

トロレンナトリウムのCK値およ軍運動能力に及ぼ1993，pp188−191．

47）Myoblasttransferに関する研究−COllagenaseの効果一
寺 尾 寿 夫＊

研究協力者

清
山

水 輝 夫■ 臼 杵 扶佐子■ 松 村 喜一郎＊田 広 樹■ 藤 田 幸 子◆ 大 井 博 子■

はじめに

従来の方法と異なるのはcollagenaseを注射したこと

正常のmyoblastをジストロフィー筋に注射し，病的である．これにはcollagenaseIを0．0002％になるようにメヂウムに溶解し，これをmyoblasttransferと同時にな筋のgeneticconstitutionを正常化しようとする試みが行なわれるようになってからすでに約5年の歳月が経過した．最近では，ジストロフィンのcDNAを直接に掛こ

筋肉内に注射した．しかし，一部にはcollagenase注射24

注射して，ジストロフィー筋を正常化しようとする

Myoblasttransfer後のEDLは1カ月後に取り出し，
cross−SeCtion標本作製後，抗ジストロフィン抗体

時間後にmyoblast transferを行なったものもある．

genetherapyも行なわれるようになっているl）・
しかし，これらのmyoblast transferまたはgene（DYS2）を用いて染色した．

transferを実際に行なうに当っては，さまざまな障害が結指摘されるようになってきた．そのうちのひとつに果transfer実施後のジストロフィン陽性線経の出現率がすでに報告した如く，mdxマウスのEDLにBlO由来

genetherapyを行なうにはあまりにも低いことがあげられる．この効率を上げるためには，注射されたmyoblast

作って出現するが，その中に含まれる陽性線経の数は少のSarCOlemmaへの接近を促し，さらに細胞外マトリッ

なく，教本〜10数本程度である．そしてEDLの横断標本

クスや基底膜の通過を容易にさせることが必要である．

中のジストロフィン陽性線経の全線経に占める比率は，のmyoblastを注射した場合には，陽性線経はclusterを

その後動物数を増して18匹の平均を求めると2．0±1．1％（コントロールは0．7±0．6％）であった．

このためにはいくつかの方法が考えられるが，今回はcollagenaseを使用し，この注射がmyoblasttransfer後のジストロフィン陽性線経の出現に如何なる効果を及ぼす

また，mdx／nudeマウスに，同様にBlO由来のかを検討したので現在までの結果を報告する．

myoblastをEDLに注射して，1カ月目に観察したジスト
ロフィン陽性線経の出現率は，12匹の平均が4．7±3．0％

方であり，Partridgeらの報告4）にみる10〜40％には遠く及ばなかった．

法

今回の実験方法は基本的には従来の方法2）と同じである．

元来，幼若なBlOマウスの筋から採取し，培養・増殖したmyoblastの中には，fibroblastも含まれている・そ使用した動物はmdxマウスおよびmdx／nudeマウス※
であり，ターゲットとした筋はすべて長指伸筋（EDL）のためmyoblastのみより成るC2C12細胞をtransferして陽性線経の出現率を測定してみた．

である．
注射したmyoblastは幼君なB10マウスより採取し，

1）mdx／nudeマウスのEDLへのC2C12細胞のtransfer

DulbeccoのmodifiedEaglemediumを用いて培養・増殖

mdx／nudeマウスのEDLにライン化されたC2C12細胞を3×106注射し，1か月日に観察すると，BlOのしたものである．また今回はライン化したC2C12細胞も発されたもの3）で，ATCCより購入し，これを培養増殖

myoblastを注射した時よりも大きなジストロフィン陽
性線経のClusterが形成される．図1はそれを示したもして用いた．

のである．C2C．2細胞注射後に再生した革径の小さな筋注射する細胞数は■1本のEDL当り3×108前後である．

線維群がジストロフィン陽性に染まっている・‥
われわれが観察した9匹のmdx／nudeについてみると●帝京大学医学部神経内科※ mdx／nudeマウスは国立精神・神経センター竹光先生及び
昭和大学若山先生より頂いたものを自繁している￣二

使用して実験を行なった．C2C12細胞はYaffeにより開−181−

表l DystrophinpositivefibersinmdxEDLs
l month after C2C12tranSferwith O，0002％
COllagenaseI
Numberofpositivefibers／Tota目地ers
C O lla g e n a ＄ee o lb g 帥 a ＄e

C O 拍 ge naS e

c oH age n8Se

（＋ ）

（− ）

（＋）

（− ）

1

1 1 4 ／4 2 1

6 3 ／5 0 3

2 7 ．1

1 2 ．52

1 2 9 ／5 糾

7 2 ／4 糾

2 2 ．1

1 4 ．93

4 4 ／2 6 9

6 9 ／5 8 9

1 6 ．4

1 1 ．74

1 0 2 ／6 3 9

3 4 ／3 9 0

5

3 3 ／3 0 2

3 3 ／4 0 6

a Ve ra g e

図1C2Cl2細胞をmdx／nudeマウスのEDLに

1 6 ．08 ．7

1 0 ．98 ．1

1 8 ．5 ± 6 ．
2

1 1 ．2 ± 2 ．
8JtransferL1か月日のジストロフィン染色」

してくることが多いため，この実験ではmdxマウスを使用している．0，0002％collagenaseTのみをmdxマウスに注射し，1週後に取り出したEDLのH−E染色を見ると，注射部位中心の筋線経は壊死をきたしており，その周辺の筋線経も構築が乱れ，変性に陥っているのが観察された．
図2はcollagenaseとともにC2C12細胞を注射し，1か月を経たEDLのジストロフィン染色である．この図に見る如く．注射部位に再生してきた小径の筋線経はその
図2

ほとんどがジストロフィン陽性に染色されており，周辺の陰性筋線維群との間に明瞭な対比を示していた．ただC2Cl2細胞をcollagenaseとともにmdxマウスのEDLに注射し1か月日のジストロフィン染
色

し・この陽性線維群が注射されたC2C．2のmyoblast同士が融合してできたものであるか，またはC2C．2細胞とmdxのジストロフィン陰性筋線経の衛星細胞と融合して生じたものであるかは，これだけでは明らかでな
表lは，このようにcollagenaseとともにC2C12細胞を注射し，1か月日のマウス5例の陽性線経の数および比率を示したものである．動物により差があるが，10・9〜27・1％，平均18．5±6．2％に陽性線経がみられた．
これらのmdxマウスの他側のEDLはcollagenaseを注射
せずC2ClZ細胞のみを注射したもの（麦ではcollage−nase−で示す）であるが，これらの陽性線経の平均は

図311・2±2・8％であり，COllagenaseを同時に注射した方が有意に高率であった．

BlOマウスのmyoblastをcollagenaseとともに
mdxマウスのEDLに注射Llか月日のジスト
ロフィン染色次に幼若なB10より採取し培養増殖したmyoblastを
COllagenaseIと共に注射し実験を行なった．

C2C12細胞注射後の1か月のジストロフィン陽性線経の比率は平均6．3±4．6％（コントロール0．4±0．3％）であった．

図3は0・0002％collagenaseIとBlOのmyoblastを注射し1か月日のEDLのジストロフィン染色である．ジ2）collagenaseの効果

ストロフィン陽性線椎のclusterはcollagenaseを使用しなかった場合に比し，大きくなるものが多かった．

さらに陽性率を上げる目的でcollagenaseIを使用して実験を行なった．

EDLの横断標本につき，観察した筋線経の何％をジスト

しかし，mdx／nudeにcollagenaseとともにC2C12細る・これに示すようにジストロフィン陽性線経の出現率
は平均7・6±2・9％であった．この数値はcollagenaseを胞を注射し，長時間経過すると，注射部位に腫癌を形成

ロフィン陽性線経が占めるかを計算したものが表2であー182−

あるが，COllagenaseの同時注射が，myOblastの筋細胞膜

表2 Dystrophin positive fibersin mdx EDLsl monthafter normal（BlO）myoblast transferの透過性を増し，またmdxマウス筋の衛星細胞の活性with O．0002％collagenaseI

化を引き起したことがジストロフィン陽性線経の出現率を高めた一国であることは否定できない．

N um b e r o t p o sitiv e fib e rs／T o ta l tぬers％

39 ／558

7．
0

32 ／31110 ．
3

66 ／6999．
4

24 ／810

今後collagenaseの濃度を変えて検討するとともに，他の蛋白分解酵素についても効果を調べる予定である．

3．
9av e rag e

ま7．
6 土2 ．
9とめ1）幼君なBlOマウスより採取し，培養・増殖した
myoblastまたはCZC12細胞をmdxマウスまたはmdx／

用いず，BlOのmyoblastのみを注射した以前の研究では2．0％であったことを考えると明らかな上昇と考えられる．

nudeマウスのEDLにcollagenaseとともに注射し，ジス
トロフィン陽性線経の出現率をcollagenaseを注射しなかった場合と比較した．
2）collagenaseの注射の有無に拘らず，BlOマウス由来

考察

ジストロフィー筋に正常myoblastを注射した後のジ
ストロフィン陽性線経の出現は，1）transferされた正常のmyoblastよりもC2C12細胞を注射した場合の方が一般に陽性線経の出現率は高かった．
3）0．0002％collagenase溶液を同時に注射するとBlOのmyoblastから生ずる正常の筋管細胞同士が互いに融のmyoblasttransferの場合でも，C2C12細胞のtransfer

合して正常の筋線経を形成するかまたは，2）注射時に損の場合でも，CO11agenaseを注射しなかった場合より，ジストロフィン陽性線経の出現率が増加した．

傷されたジスロトフィー筋線経の衛星細胞から生ずる筋管細胞とtransferされたmyoblast由来の筋管細胞との融文合が起るかの何れかによると考えられる．さらにLaw
ら5）の言う如く，3）注射された正常myoblastより生ずる
corrective factor がジストロフィー筋に働く可能性もある．いずれにしても，myOblastの注射後生ずるジス
トロフィン陽性線経のclusterの大きさを増し，ジスト
ロフィン陽性線経の全筋線維中に占める比率を増すこと

献l）AcsadiG，Dickson G．et al：Human dystrophin
expressionin mdx

mice after

intramuscular

injection of DNA constructs．Nature352：815−
818，1991．

とや，注射されたmyoblastの移動を促すことなどが必

2）寺尾寿夫ほか：ジストロフィー筋への正常マイオブ
ラストの注射に関する研究． 厚生省「精神・神経疾患研究委託費」ジストロフィー症及び関連疾患の病態とその病因に関する研究 （杉田班）平成元年
度研究報告書，1990，pp177−182．

要であるが，これらの他に筋細胞の強固な細胞外マト

3）Yaffe D and Saxel O：Serial passaging andリックスや基底膜に対するmyoblastの透過を容易に

differentiation of myogenic cellsisolated from

し，同時にジストロフィー筋の衛星細胞を活性化することが必要になってくる．

dystrophicmousemuscle，Natureが，将来myoblasttransferを治療に利用する上で大切である．
これにはtransfer時のmyoblastの洩れを少なくするこ

270：725−727，

1977．

最近，Acsardiら1）はfulllengthのジストロフィン
cDNAをvectorと共に筋に注射し．ジストロフィン陽性4）Partridge TA，MorganJA，et al：Conversion of
mdx myofibres from dystrophin−negative to

線経の出現を報告しているが，この場合も陽性線経の出

positive byinjection of normalmyoblasts．Nature

現率は低く，1〜2％程度であったと言う．そしてこの337：176−179，1989．

場合collagenaseまたはDMSOと共にcDNAを注射する

5）Law PK，Goodwin TG，et al：Normal myoblastと陽性線経の出現率が著しく増加すると報告している6）．

injections provide genetic treatment for murine

これは注射されたcDNAが細胞外マトリックスや

dystrophy．Muscle＆Nervell：525−533，1988．

plasma membraneを通過して筋細胞内に移動し易くなったためと考えられる．

6）AcsadiC，JaniA，et al：Toward the optimization
Of direct gene transfer（DGT）intoskeletalmuscle

今回のわれわれの研究はmyoblastそのものの注射でー183一

fibers．Neurology 43：A294，1993．

48）Duchenne型筋ジストロフィーにおける遺伝子治療の可能性に関する研究
岡 田 仲太郎＊

研究協力者

要

柳

原

西

本

潤

格■

金

田

安

史＊＊

塚

史■

福

島

久

雄＊

乾

本

浩

子＊

幸

治＊

UMDSのG．Dickson博士らの開発された，pRSV−Dy，

旨Duchenne型筋ジストロフィーの治療として，正常筋

pDMD8，pDyDyを用いた．これらのベクターはそれぞ

芽細胞移植やジストロフィン遺伝子の導入などが検討されRous sarcomavirus，マウス白血病ウイルス，ヒト筋

れつつある．これまでジストロフィン遺伝子は巨大であ型ジストロフィンプロモーターを持つ．
2．mdxマウスるため一般に全道伝子の発現は困難であった．退伝子治療を考えた場合，安全かつ高効率な遺伝子発現系の開発

実験動物中央研究所斎藤宗雄先生より供与されたは重要課題である．我々はHVJ（Sendaivirus）−リポソー
ム法によってmdx筋内で全ジストロフィンCDNAの遺SPF化mdxマウスを当動物実験施設内にて繁殖したも伝子発現に成功したので報告する．

3．HV」−リポソーム法のを用いた．
各種プラスミドDNAとして50，200FLgとDNA結合蛋

目

白で核移行性のあるHMGl（highmobilitygroupl）蛋白

的与れまでに行われたジストアフィン遺伝子発現実験で

質64〃gと混和，複合体を形成させた．リポソームはフは全遺伝子卑用いた場合，発現効率は1％以下と低かっ
た1）．Becker型のミニ遺伝子を導入した場合には効率はォスファチジルコリン，フォスファチジルセリン，コレ・−よかったが2）3），構造蛋白としての、不完全さを問題視する

ステロールを重量比48：10：20に混ぜ合わせた脂質溶液を調整した．プラスミドHMGl複合体はボルテックス

向きも参った．従って，Duchenne型筋ジストロフィーの遺伝子治療を行う場合の条件として第1に安全で組織法を用いてリポソーム内に封入し，これに不括化した細障害が少ないこと，第2に巨大遺伝子の発現が可能で発現効率が良く，広範囲な筋線経に遺伝子発現が可能であ

最終的に約2mlのリポソーム液を得た．

胞融合能を有するHVJを震迄混和，密度勾配遠心にて4．遺伝子導入および発現

ること，第3に発現期間が長期であること，などの条件

A）J乃びわro発現実験を満たす発現系の開発が必須であった．本研究においてmdxマウス培養筋芽細胞（5×105個）にE．Colilac

我々はHVJ一リポソーム法を用いることとした．リポ

Z退伝子を持つベクター（200〃g）をHVJ一リポソーム

ソーム法はリポソーム内に封入可能な遺伝子の大きさに法にて導入X一gal染色を行った．
B）筋肉内玩1諭ル発現実験

制限がなく，ジストロフィン遺伝子発現に適し，また組．織障害が少ないという利点がある．反面レトロウイルスと異なりゲノム内にインテグレートされにくく，一過性

12〜18週齢のmdxマウス大腿四頭筋にプラスミド

発現系であるという欠点がある．またHVJはリポソー

DNAとして5ないし20JLg以下を含むHVJ−リポソーム液を26ゲージ注射針にて直視下に注入した．注入後3，ムと細胞膜とり融合能を高め，核移行蛋白は発現効率を

5，7，10日後に大腿四頭筋を取りだし10〃mの厚さの上昇させる4）5）との報告があり，我々はこのHVJ−リポ
ソーム核移行蛋白系を用いた．

凍結連続切片を作成しHE，NADH，ジストロフィン染色

方

法

を行った．
結

1．DNA

果

lnvitroでのmdxマウス培養筋芽細胞へのIac Z遺伝

全ジストロフィンCDNAを含む発現ベクターは英国

子導入実験の結果，局所的に青色に染色される酵素活性部位を認めた．このことにより，HVJ−リポソーム法を■大阪大学医学部小児科■＊大阪大学細胞生体工学センター

用いて筋芽細胞への遺伝子導入が可能であることが判明

−184−

d

■＼−．亮ノ

−ヂ、
ヽ 軸サ
暮 ト．
ヽ
・・

ヽ−●・

＼

ヽ、ミ
ヽ

・、＼

図1

ニ

a NCL DYS−3（N端）ジストPフィン抗体染色光顕像
b NCL DYS−2（C端）共焦点レ〜ザー顕微鏡像 Bar＝】OjLm画像処理により斜め方向より観察し，筋膜を強調した
C HE染色像．鼠織障害を認めない
d NADH染色像．筋線稚内細網構造の乱れを認める

表1Summaryof dystrophin positive fibers

した．
mdxマウス大腿四頭筋内遺伝子導入後のN端，C端に対するジストロフィン染色の結果，光学顕微鏡レベル

m OuSENo．

Y e ttO r

1

PR S V −Dy

2

で筋細胞質内にリング状のジストロフィン陽性線経と，

3

a m ountd ay s a 鮎 r
m tG −Or D N廿a n S fec tio n（P g ）

d y Str Op h in p os iliY e n b e rs
亡
亡ll m em b r a m e
P a tter n

20
20

＋

3

＋

＋

3

十

20

＋

3

20

＋

3

＋

＋

5

十十十 （
2 6 ％）川 唱・lik e
P a tte rl】
＋
＋／
．
＋＋ （
1 6 ％）

筋細胞膜がジストロフィン陽性となる線経を導入後10日

4目まで認めた（図1a）．さらに，共焦点レーザー顕微鏡

6

20
20

＋

7

＋
＋／＿

7

20

＋

10

＋／＿

5
5

＋

3

＋

＋

3

5

＋

3

＋
？

−

3

−

−
−

●
−

3

ー

−

−

3

−

−

PR S V −Dy

5での検索によっても筋細胞内及び膜と一致して染色が認89められた（図1b）．また，同部位でのHE，NADH染色の結果，正常，壊死再生，オパーク線経には，観察されない染色性の濃淡や網目構造の乱れを認め，過剰な蛋白合成が示唆された（図1C，d）．一次抗体として，マウ

P R S V −D y

10

PDM D8
P Dy D y

1 1

P R S V −D y

12

PDMD 85
5

13

P Dy D y

5

十
＋／
一
＋／
＿
ー
＋／
＿

〇・1％シー，1−3％：＋／−，3・5％：＋，5・20％：＋十，20％＞：＋十十甘MG−1：h短h・mObilitygroup・l

スジストロフィンと交差しない，ノポカストラ社のNCLLDYS3抗体を用いた時の遺伝子発現頻度を示す

DNA20FLg直接注入したときの遺伝子発現を示した∴最（表1）．当施設におけるDYS3抗体を用いてのコント

大で323本の筋線維中，84本の筋線経の筋細胞膜がジス

ロ∴一ルmdxマウスのジストロフィン陽性線経の出現頻

トロフィン陽性を示し，52本の筋線経でリング状のジス

度は，約1．2％であった．ジストロフィン陽性線経の評

トロフィン陽性像を示した．マウスナンバー4〜7は，価は1％未満を一，1〜3％を±，3〜5％を＋，5〜20％を＋＋，20％以上を＋＋＋とした．

遺伝子導入後の経時変化に対して，ジストロフィン陽性
線経の割合が減少することを示している．通常mdx筋

マウスナンバTl〜3はベクターpRSV−Dyを用い，には認めることのできないリング状陽性線経は，1％以ー185−下と頻度は低いものの10日目にも認められた．マウスナていきたい．

ンバー8〜10は，導入プラスミドDNAの量を5J上gとし

文．

たときのジストロフィン発現頻度の比較である．pRSV−

献

Dyベクターの場合，DNA量20JLgに比べ発現量が減少

1）AcsadiG，etal：Human dystrophin expressionin

する煩向が得られた．ベクターpRSV−Dyが最も発現率

mdx mice afterintramuscularinjection of DNAが良かった．マウスナンバー11〜13は，核移行蛋白であるHMGlを用いなかった際の遺伝子発現の割合を示し

COnStruCtS．Nature352：815L818，1991．
2）RagotT，etal：Efficientadenovirus一mediated

た．何れのベクターを用いた場合でも，ジストロフィン

transfer of a human minidystrophinの発現は認められなかった．

Skeletalmuscle of mdx mice．Nature

gene to361：647−

650，1993．

考察3）Dunckley MG，et al：Direct retrovira1−mediated

遺伝子治療の標的として，マウス筋組織は注入したプ

transferof adystrophinmlnlgeneintomdxmouse

ラスミドが安定であるという優れた特質を持つ6）．これmuscleinvivo．HumMoIGenet2（6）：717−723，

が，筋芽細胞が多くの遺伝子発現実験に用いられる根拠

1993．

となっている．しかしジストロフィン遺伝子は，大きさの問題で，既存のレトロ，アデノウイルスベクターを用いて全ジストロフィンCDNAを組み込むことはできな

4）Kaneda Y，etal：Increased expression of DNA
COintroducedwith nuclear proteinin adult rat

liver．Science243：375−378，1989．

い．このため我々は，HVJ−リポソーム法を用いて全ジ

5）TomitaN，etal：Directin vivo geneintroduction

ストロフィン遺伝子の発現を確認した．我々の方法は従

into rat kidney．Biochem Biophys Res Commun

来の方法と異なり，HVJ，核移行蛋白を用い発現を行っ186：129−134，1992．

た．今後，免疫組織学染色以外にもウェスタンプロット

6）WolffJA．etal：Direct gene transferinto mouseや他の方法を用いて蛋白レベル，DNAレベルでの発現

muscleinvivo．Science247：1465−1468，1990．

の確認をし，さらに発現効率を上げる方法の開発を行っ一186−

平成5年度研究班名簿

平成5年度 高木班 名簿
区

分

氏

所
所

名

属

施
在

主

任

高

木

昭

夫

虎 の 門病院神 経 内科

監

事

寺

尾

寿

夫

帝 京大学 医学 部神経 内科

幹

事

小

澤

高

婿

後

藤

幾

生

教

授

03 −3964 −12 11

名 古屋 大学 医学部 第二 生化学

教

授〒466 名古屋 市 昭和 区鶴 舞町65
九 州大学 医学 部神経 内科

052 −741 −2111（内2031）

教授092 −641 −115 1

副 院 長

0473 −72 −35 01（内2 112）

教授

03 −3 964 −12 11（内1911）

教授045 −971 −115 1（内269）

部長

0423 −41 −27 11（内5 111）

助 教 授

096 −344 −2111（内5612）自治 医科 大学 第一生 化学〒329−04 薬
栃 師寺
木県 33
河 11
内郡南
− 1 河 内町

助 教 授

0285 −44 −2111

伸太 郎

大 阪大学 医学 部小児 科教

授06 −875 −7111（内2930）

藤

猛

清

水

輝

夫

若

山

吉

弘

荒

畑

喜

一

員

内

野

誠

（内2284）

市 川市 国府 台 1 − 7 − 1
東 京都 板橋 区加 賀 2 −11 −∴1
横浜市 緑 区藤 が丘 1 −30

国立 精神 ・神経 セ ンター神経 研究 所
〒187

班

福 岡市 東 区馬 出 3 − 1 − 1

昭 和大学 藤が 丘病院 神経 内科〒227

運 営 幹 事

東京都 板橋 区加 賀 2 −11 − 1

帝京 大学 医学 部神経 内科
〒173

J／

東京都 港 区虎 ノ門 2 − 2 − 2

国立 精神 ・神経 セ ンター国府 台病 院
〒272〝

小平市 小川東 町 4 − 1 −−1

熊本 大学 医学 部第一 内科〒86 1 熊 本市 本荘 1 − 1 − 1

〝

太

田

田

連絡 の際 の電 話
03 −3588 −1111（内2016）

〒812
佐

所属 にお
け る地位
長

〒 173

〝

名
地

部

〒 105

〝

設

成

男

（内3 151）

J／

岡

〝

納

光

弘

鹿児 島大学 医学 部第 三 内科

教授0992 −75 −5330

〝

梶

龍

兄

〒890 鹿 児 島市 桜 ヶ丘 8 −35 − 1
京都 大学 医学部神 経 内科

講師

075 −751 −3772

J／

川

井

尚

臣

徳 島大学 医学部 第一 内科〒770 徳 島市歳 本町 3 −18

助 教 授

0886 −31 −3 111（内3204）

J／

栗

原

照

幸

東 邦 大学 医学部 第 四内科教

授

03 −3468 −125 1

〒565

〒606

〒153

吹 田市 山 田丘 2 − 2

京 都市左 京 区聖護 院河 原 町

東 京都 目黒 区大橋 2 −17 − 6（内2322）

l／

後

藤

雄

一

国立精 神 ・神経 セ ン ター武 蔵 病院

医長0423 −41 −27 11

l／

小

林

高

義

〒187 小 平市小 川東 町 4 − 1 − 1
東 京 医科歯 科大学 医学 部神 経 内科

講師

03 −3813 −6111（内3386）

教授

03 −3813 −3111（内3514）

〒 113
l／

木

南

英

紀

順 天堂 大学 医学 部第一 生化 学
〒 113

l／
〝

斎
斎

藤
藤

東 京都文 京 区湯 島 1 − 5 −45
東 京都文 京 区本郷 2 − 1 − 1

加代子

東 京 女子 医科大学 小児 科講師

03 −3353 −8 111（内3 1230）

深美子〒 162 東京 都新 宿 区河 田町 8 − 1
東 京 医科歯 科大学 難治 疾患 研 究所助

手

03 −3813 −6111（内6 132）

助 教 授

0561 −62 −33 11

遺 伝疾 患研 究部 門
〝

佐

橋

功

〒 113 東京 都文 京 区湯 島 1 − 5 −45
愛 知 医科大 学第 四 内科
〒480−11 愛知 県長 久手 町岩 作雁 又21

ー189−（内2 176）

区

氏

分

班

員
〝

所
所

名

属

施
在

設

名
地

所 属 におけ る地 位庄司

進

一

筑 波大学 臨床 医学 系神経 内科

教授0298 −53 −3 192

杉

村

公

也

〒305 つ くば市 天王 台 1 − 1 − 1
名 古屋 大学 医療 技術短 期大学 部

教

授052 −723 −1111（内303）

教授0762 −62 −8 151（内3950）授

011 −7 16 −1161

作 業療 法学 科
高

〝

守

正

治

〒461 名古 屋市 東 区大幸 南 1 − 1 −20
金 沢大 学 医学部 神経 内科
〒920

田

J／

田

〝

代

邦

過

垂

井

辻

J／

金沢 市宝 町 13 − 1

雄北 海道 大学 医学 部付属 病院 神経 内科〒060 札幌 市北 区北 14条 西 5 丁 目

教等

東 京都 立神 経病 院

院

長

〒 183
〝

（内6028）

府 中市武 蔵 台 2 − 6 − 1

福原（内3201）

国家 公務 員等 共済組 合連 合会 大手前 病院

院長

06 −941 −0484

省〒540 大 阪市 中央 区大手 前 1 − 5 −34
新 潟 大学脳 研 究所神経 内科

教

授025 −223 −6 161（内5180）副 院 長0255 −34 −3 131（内553）

助 教 授0559 −75 −0771

次

信

義

国立療 養所 犀 潟病院〒 949−31 新468潟県− 1中頭 城郡 大潟町 犀潟

宝〝0423 −23 −5 110

清一郎〒 95 1 新 潟市旭 町通 1 −757〝

連絡 の際 の電 話

来聴

国立 遺伝学 研 究所人 類遺 伝研 究部 門
〒 411 三 島市 谷 田1111

J／

水

野

美

邦

J／

桃

井

真里 子

（内568）

順 天 堂大 学医学 部脳 神経 内科〒 113 東 京都 文京 区本郷 2 − 1 − 1

教

授

03 −38 13 −3 111（内3321）自治 医科 大学 小児科

助 教 授

0285 −44 −2 111（内3445）

助 教 授

03 −38 13 −6111（内3386）〒 329−04

栃
薬師寺
木県 33
河 1ト
内郡南
1 河 内町

J／

湯

浅

龍

彦

東京 医科 歯科 大学 医学部 神経 内科

〝

吉

田

端

子

国立 精神 ・神 経 セ ンター神経 研究所室長

0423 −4 1 −27 11

〝

戸

田

達

史

〒187 小平市 小川 東町 4 − 1 − 1
癌研 究会 癌研 究所生 化学 部

研 究 生

03 −3918 −0111

〒113

〒170

顧

問
J／

〝

事務 担 当者（内4506）田邦

広

信州 大学 医学 部第三 内科

助

手0263 −35 −4600

荒

木

淑

郎

〒390 松 本 市旭 3 − 1 − 1
熊本 大学

名誉 教授

096 −344 −2111

宇 尾野

公

義

〒860 熊 本 市本荘 1 − 1 − 1
国立 静 岡病院

名誉 院長

0542 −45 −0101

豊
三

倉
好

康
和

杉
光

田
村

秀
征

静岡 市城東 町24 − 1夫

東京 都老 人 医療 セ ンター

名誉 院長

03 −3964 −1131

夫〒173 東京 都板橋 区栄 町35 − 2
徳 島大学

名誉 教授

0886 −3 1 −3111

総0423 −4 1 −27 11〒770〝

東京 都豊 島区上池 袋 1 −37 − 1

吉

〒420
〝

東 京都 文京 区湯 島 1 − 5 −45

徳 島市 蔵本 町 3 −18

夫

国立 精神 ・神 経 セ ンター

子〒187 小平 市小川 東町 4 − 1 − 1
国立 精神 ・神 経 セ ンター神経 研究所〒187

小平 市小川 東町 4 − 1 − 1

ー190−

長

0423 −4 1 −27 11（内5111）