【別紙5】

胆汁排泄路を備えた新規肝オルガノイドの開発
札幌医科大学
医学部附属フロンティア医学研究所
組織再生学部門
准教授

谷水直樹
2019年11月28日
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従来技術とその問題点
治療薬開発における肝細胞の需要
薬剤開発の過程において、培養細胞や実験動物を用いて毒性試験を行う必要がある
多くの薬剤は肝細胞で代謝され、生理活性を失ったり毒性を示したりする

従来使用されている細胞の特徴
凍結ヒト肝細胞：高価、ロット間での差、長期間の培養は困難
ヒト肝癌細胞株：肝機能が低い
ヒト肝細胞キメラマウス：非常に高価 (置換率70%の場合、～50万円/匹）
従来の培養方法の問題点
ヒトiPS細胞から誘導された肝細胞
Reprogramming human Hepatocyte (hCLiP)
オルガノイド培養で増幅したヒト肝細胞
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細胞の「自己組織化能力」に依存したOrganoid誘導「３次元的な培養の方が、生体に近い機能を誘導できる」のではないか？
LiverKidney
ネフロン

Huch M. and Koo BK. Development 2015

Optic cupEiraku M. et al. Nature 2011

Hu H. et al. Cell 2018

Intestine

Sato T. et al. Nature 2009

集合管Takasato M Nature 20153

高い肝細胞機能が誘導できれば良いのか？
培養肝細胞の薬物動態アッセイや創薬スクリーニングへの応用
肝細胞はEx vivoで機能を失う

３次元的に培養する方が肝機能は高くなる肝細胞が産生する胆汁は、毒性がある肝細胞組織から胆汁を排泄する必要がある

肝細胞の代謝産物の回収が困難

胆汁を回収できることが好ましい

肝臓の組織構造(肝小葉構造）CVPV

胆管 (bd, bile duct)

胆汁排泄路である胆管構造を伴った肝組織の構築が必要である

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新技術の特徴・従来技術との比較（１）
肝細胞の平面培養

肝機能が低い長期培養が難しい

肝細胞のスフェロイド培養

胆管組織を持った肝オルガノイド(Hepatobiliary organoid)

肝機能の向上培養可能期間の延長

高度な肝機能の誘導
肝機能の長期維持
肝細胞代謝産物の組織内動態の再現 5

マウス Hepatobiliary organoidの誘導方法
3~4 days

胆管上皮細胞EpCAM(+) BEC(1x105 cells/12 well)OSM
2 days 1 day

20% MG/Collagen Overlay

肝前駆細胞
Small Hepatocyte (SH)
(1x105 cells/12 well)Type I collagen (4mg/ml)

SH 播種１日後

20% MG/Type I
collagenType I collagen

MG 重層２週間後

胆管構造を伴う肝オルガノイド

Hepatobiliary Organoid

6胆管と毛細胆管の接続の解析
Actin HNF4a CK19 Nuclei

Actin HNF4a Nuclei

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Hepatobiliary organoid での高度な肝細胞機能の誘導と維持
肝細胞機能の亢進

肝細胞機能の維持
アルブミン分泌

CYP活性CYP1B1CYP1A21005050010000Hep+BEC

Hep+BEC

Hep+BEC

Hep

002050Hep

5100HEP+BEC

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機能維持期間150100HEPCYP activity (AU)15Hep

ALB (mg/ml/h)

2030

CYP3A4ALB (mg/ml/hour)

アルブミン分泌1234567820 % MG overlay (week)

Hep : 小型肝細胞単独培養
Hep + BEC : 小型肝細胞と胆管上皮細胞の共培養
8Hepatobiliary organoid による胆汁酸アナログの取り込み
Fluorescein

Merge

肝細胞

胆管FDA (Fluorescein diacetate )は肝細胞に取り込まれてFluoresceinに分解されて毛細胆管に排泄される。Hepatobiliary organoidでは毛細胆管と胆管が接続しているので、Fluoresceinが胆管に流入している。
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Hepatobiliary Organoid によるビリルビンの取り込み
10 mg/ml bilirubinを含む培地で3日～5日間培養
中性ホルマリン溶液で固定
Fouchest’s reagent (20% TCA/1% Ferric chloride)を加えて発色

Biliverdin
肝細胞

胆管

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新規 Hepatobiliary organoidの特徴
マウス成体肝臓から分離した胆管上皮細胞と肝前駆細胞の共培養を行うことで、胆管組織を伴った肝組織(Hepatobiliary organoid)の構築に成功した。
Hepatobiliary Organoidの構築によって、肝細胞が高度に分化した状態を一ヶ月程度維持することが可能になった。
肝細胞に取り込まれ代謝されたビリルビンや胆汁酸が、毛細胆管に排泄された後、胆管に輸送されて蓄積する。肝細胞組織と胆管が機能的に接続しており、肝細胞代謝産物が生体肝組織と類似した経路でOrganoid内を輸送されることを示している。
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新技術の特徴・従来技術との比較（２）従来の胆管・肝細胞の共培養方法との比較
Hepato-biliary Organoid(Hepatology 2018)

Hepato-biliary Organoid(J Hep. 2019)

Hepato-biliary Organoid(SH + BEC culture)

細胞

Human fetal liverprogenitor cells

ヒトiPS細胞マウスSHとマウスBEC
ラットSHとマウスBEC

肝細胞の分化Cypを遺伝子レベルで検出可能

Fetal liver程度

SH単独培養より高い分化度

毛細胆管?

？

肝細胞クラスターで形成

胆管

成熟した胆管構造

大部分シスト？

大部分が細い管、少数のシスト

肝細胞と胆管の接続?

シスト内腔に胆汁酸が蓄積

肝細胞が取り込んだFDA, Bilirubin,CLF (bile acid)の胆管への流入

新規 Hepatobiliary Organoid では、肝細胞の代謝機能が高く、毛細胆管形成が明瞭である。
毛細胆管と胆管が構造的・機能的に明確に接続している。
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想定される用途
治療薬候補化合物の毒性試験、特に長期間にわたる肝毒性のモニタリング
肝細胞代謝産物の同定や輸送経路の検証
薬効薬理試験受託企業における提供技術の幅を拡げる
ことができる
薬効薬理試験に用いる動物の数を減らすことができる

慢性肝疾患モデルの構築
13実用化に向けた課題
Hepatobiliary Organoidから肝細胞代謝産物を回収する方法の確立
ヒトの肝細胞を用いたHepatobiliary Organoid
誘導方法の確立
肝障害モデルを構築するために、免疫細胞や線維芽細胞を共存させたOrganoidの作成
14肝細胞代謝産物の回収
タイト結合構成分子であるクローディンを膜から解離させる
細胞構造が完全に破壊されない
Cholesterol

CLDN3

Ecad

Methyl-b-cyclodextrin(MbCD)

Shigetomi K et al. J. Cell BIol. 2018

CLFの取り込み培養液の蛍光を測定
MbCD

Fluorescence Intensity (AU)

Christroforides E et al. J. Org. Chem. 2018
1500

Control
25 mM MbCD
75 mM MbCD

1000500001530

Incubation (min)6015

ヒトReprogramming HepatocyteとマウスBECの共培養
ヒトReprogramming Hepatocyteの肝分化能
Primary human hepatocyte

Human chemically induced
liver progenitors(hCLiP)
Katsuda T. et al. Cell Stem Cell 2017; eLife 2019

hCLiP と msTomtoBECの共培養
マトリゲルの重層

16Hepatobliary Organoidの構築についてのマイルストーン
Hepatobiliary Organoidの構築
マウス肝細胞＋
マウス胆管上皮細胞

ヒト肝細胞＋
マウス胆管上皮細胞

ヒト肝細胞＋
ヒト胆管上皮細胞

ヒト型薬物代謝アッセイ系の確立

肝細胞代謝産物の回収

Organoidの上皮バリア機能の抑制による代謝産物の取り出し

肝細胞代謝産物の検出・同定方法の確立

Hepatobiliary Organoidの活用方法の開拓

星細胞の導入慢性肝障害モデルの構築
アッセイのハイスル―プット化を可能にするための培養デバイスの開発

17企業への期待薬剤スクリーニング、毒性試験のアッセイ系構築の支援。
共同研究のイメージ：新規Hepatobiliary organoidが毒性試験に使用可能であることを示すため、必要なデータ収集を協力して行う。テストすべき化合物の提示、毒性評価のためにチェックすべき項目の提示、技術的な支援など。

薬物・化合物のライブラリーの提供。
共同研究のイメージ：肝毒性が既知あるいは未知の化合物をHepatobiliary organoidに添加して代謝産物を回収。共同研究先の企業において代謝産物の同定を行う。
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本技術に関する知的財産権• 発明の名称 ：肝細胞と胆管上皮細胞との接続部構造を有する肝上皮様組織の培養方法• 出願番号 ：特願2019-052282• 出願人：札幌医科大学• 発明者：谷水 直樹、三高 俊広

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お問い合わせ先
札幌医科大学附属産学・地域連携センター
産学連携コーディネーター
特任准教授 板垣史郎
ＴＥＬ 011-611-2111 (21570)
ＦＡＸ 011-611-2185
e-mail itagakis@sapmed.ac.jp20