動物を用いない皮膚感作性評価法｢ADRA｣の開発およびOECDテストガイドライン化
富士フイルム株式会社
ESG推進部

環境・品質マネジメント部
安全性評価センター山本裕介

皮膚感作性とADRAの原理

1

皮膚感作性発症機序
タンパク
結合

ハプテン再曝露
T細胞の皮膚浸潤複合体の内在化

炎症反応
抗原提示とT細胞活性化
LC細胞活性化

抗原特異的T細胞の増殖

T細胞の血液循環
Karlberg et al., Chem. Res. Toxicol., 2008, 21, 53-69.

2

皮膚感作のメカニズムとAOP
化学構造
物性

分子レベルの初期事象

細胞応答

親電子化合物：ハプテン化：表皮タンパクとの共有結合

表皮角化細胞または樹状細胞の活性化

Key Event 1

Key Event 2 + 3①化合物自身②自動酸化を経由③代謝を経由OECDが定めた
皮膚感作AOP *

組織応答

生体反応

樹状細胞によるハプテン化タンパクの細胞表面提示および抗原特異的T細胞の活性化と増殖

アレルギー性接触皮膚炎：
化合物の再暴露による表皮の炎症

Key Event 4

Adverse Outcome* AOP : (Adverse Outcome Pathway)
OECDが定義する種々の毒性における発現経路。
安全性試験はAOPに基づいた評価法であることが必要とされる“The Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitization” , OECD report 2012 および Reisinger et al. (2015). を改編 3

皮膚感作AOPと評価法
Key Event 2

感作性物質

Key Event 1

AdverseOutcome

Key Event 4

表皮角化細胞の活性化
KeratinoSens 等

情報記憶

Key Event 3

T細胞

タンパク質

樹状細胞による抗原提示&抗原特異的T細胞の活性化と増殖

表皮タンパクとの共有結合
樹状細胞の活性化

DPRA*1ADRA

アレルギー性接触皮膚炎：
化合物の再暴露による表皮の炎症
GPMT
Buehler 等

LLNA 等h-CLAT *2 等

代替法

動物実験*1 Direct Peptide Reactivity Assay*2 human Cell Line Activation Test4

既存法（DPRA）の概要
Key Event 1において、感作性物質はタンパク質中のシステイン(SH)とリジン(NH2)に結合する。
システインとリジンを含む2種のペプチドを求核試薬（検出試薬）として使用し、被験物質に対する反応性を評価することで皮膚感作性を予測。
H
N

H3C
O

O
N
H

O

CH3O

HN
H2N

O

H
N

NH

HO

CH3N
H

H
N

O
HN
HN

NH2O
CH3

CH3 O

Cysteine peptide

Lysine peptide

赤文字と赤線は、システインを示す。

青文字と青線は、リジンを示す。

DPRAにおける課題

Gerberick, et al., 2004, Toxicol.sci., 81, 332-343.

• ペプチドに特異的なUV吸収がないため、HPLCにおける定量感度が低い。
• 上記理由により低波長(220 nm)で検出する必要があるため、被験物質のピークによる夾雑の影響を受けやすい。
• 検出感度が低いため、比較的高濃度で試験する必要があり、疎水性物質などにおいて、反応液中で析出がみられる。

5

ADRAの求核試薬 (検出試薬)
DPRAの課題である測定における定量感度を上げるために検出部位としてナフタレン環をシステイン、リジンに導入した求核試薬（NAC, NAL）を開発

DPRAよりも高感度な測定（1/100の求核試薬濃度）が可能

COOH

HS
HN

O

NAC

NAL

N-2-(1-naphthyl)aceｚtylcystein

N-α-2-(1-naphthyl)acetyllysine

赤文字と赤線は、システインを示す。

青文字と青線は、リジンを示す。

Fujita, et al., 2014, J. Pharmacol.Toxicol. Methods, 70: 94-105.

6

ADRAの試験概要
反応から測定までの流れ
NAC, NAL

被験物質

反応液中濃度NACまたはNAL：5 μM
被験物質：0.25 mM
被験物質溶液（50 μL）

96ウェルプレート上で、NAC, NALと被験物質を混合24時間反応(25℃)

NACまたはNAL溶液（150 μL）

定量波長：281 nm

反応停止液(2.5% TFA)
50 μL

反応停止液を添加後、HPLCでNAC, NALの残存量を測定
7測定結果と予測モデル
HPLCクロマトグラム

Depletionの算出
Depletion (%)

求核試薬 (反応前)

未反応求核試薬の減少率
Control

求核試薬

被験物質

with test chemical

Average score (mean % depletion)(NAC depletion + NAL depletion)/2Prediction model

反応液 (反応後)<Average score>
0%

未反応の求核試薬を定量

Neg

4.9%

100%Pos8

ADRAの特徴91. 反応液中での難溶解性物質の析出
82物質における反応液中の被験物質の析出・白濁■Cys/Lysのどちらか一方が白濁/析出 ; ■Cys/Lysの両方が白濁/析出
Yamamoto et al., 2019, J. Pharmacol.Toxicol. Methods, 100101. 反応液中での難溶解性物質の析出
82物質中の被験物質の析出・白濁比較

Yamamoto et al., 2019, J. Pharmacol.Toxicol. Methods, 100

111. 反応液中での難溶解性物質の析出82物質でのlogKow/MWと白濁/析出の相関
8Isopropyl myristate*
Palmitoyl chloride**

6Lauryl gallate

LogKow

4

DPRA：MW>180 かつ logKow>2.0
ADRA：MW>270 かつ logKow>6.2
200

100

200

300400●：Cys-peptideおよびLys-peptideで析出■：Cys-peptideのみで析出
◆：Lys-peptideのみで析出○：析出しない＊：ADRAでわずかに白濁-2-4MwYamamoto et al., 2019, J. Pharmacol.Toxicol. Methods, 100122. HPLC測定における共溶出HPLC条件と共溶出の関係（DPRAとの比較）
望ましい条件< DPRA >望ましい条件< ADRA >

要因

DPRA

ADRA

検出波長220nm

281nm

可能な限り長波長

注入試料中の被験物質濃度25000μM

200μM

数10-数100μM

注入試料の組成

H2O : 75%
ACN : 25%
TFA : 0%

H2O : 75%
ACN : 25%
TFA : 0.5%

溶離液組成と同じ溶離液組成と同じ<Cys-peptide>
H2O : 90%
ACN : 10%
TFA : ~0.1%<NAC>
H2O :70%
ACN : 30%
TFA : 0.1%

ADRAはDPRAと比較して被験物質濃度が低く、検出波長が長波長であるため、被験物質の夾雑ピークの影響を受けにくいと考えられる。
Fujita et al., 2019, J. Pharmacol. Toxicol Methods, 96, 95-105.

13

2. HPLC測定における共溶出DPRAとADRAの共溶出比較

1) EURL ECVAM DPRA Validation Study Report, 2012, 2) Takenouchi, at al., 2015, 3) Gerberick, at al., 2007, 4) Basketter, et al., 2007
･ "P", "R", and "I" indicate the data obtained from P&G, Ricerca, and IVMU (In-Vitro Methods Units/ ECVAM) in DPRA Validation study report (2012), respectively.
･ "co-elute" indicates that test chemicals did co-elute with cysteine peptide or lysine pepytide (pink cekks)., "N" indicates that test chemicals did not co-elute with cysteine
peptide or lysine peptide.

Fujita et al., 2019, J. Pharmacol. Toxicol Methods, 96, 95-105.

14

2. HPLC測定における共溶出共溶出時のクロマトグラム：DPRAとADRAの比較
DPRA - 220nm -Lys-peptide

Salicylic acidLys-peptide + Salicylic acid

Salicylic acid

NAL + Salicylic acid

ADRA - 281nm -NAL

Fujita et al., 2019, J. Pharmacol. Toxicol Methods, 96, 95-105.

15

ADRAのOECDテストガイドライン化

16OECDテストガイドライン化までの流れ
OECD GD34：試験法のOECDテストガイドライン (TG) 収載に関するガイダンス⇒このガイダンスに従いTG化が進められる

TG化の流れハザード評価試験法
研究開発

プレトレーニング試験
トレーニング試験リードラボ担当（開発者）

プレバリデーション試験
バリデーション試験

技術移転

バリデーション
チーム担当

第三者評価

行政的な受入履行17

ADRA バリデーション試験 組織体制
委員長 岡山大学：小野敦

JaCVAM
小島肇

専門家G
海外専門家

国内専門家

被験物質選定G
ICATM

総務・研究サポート
リードラボ
富士フイルム(株)Quality Check Group

海外専門家
・Dr. Nicole Kleinstreuer (USA)・Dr. Jon Richmond (UK)・Dr. Kim Bae-Hwan (Korea)
国内専門家
・河上強志 (国立医薬品食品衛生研究所)
・小島幸一 (一般財団法人食品薬品安全センター 秦野研究所)
JaCVAM
・国立医薬品食品衛生研究所
安全性予測評価部 第二室

バリデーション参加ラボ
ライオン(株)三井化学(株)住友化学(株)日産化学(株)

後援(研究費提供）
実験記録確認JaCVAM

統計解析
東京理科大学：寒水孝司

バリデーション実行委員会 (VMT)

日本化学工業協会 (JCIA)
日本動物実験代替法学会JaCVAM：日本動物実験代替法評価センター
VMT：Validation Management Team18

バリデーション試験の概要と結果
バリデーション試験とは試験法の妥当性を検証するための試験。コード化された化合物を用いて主に3施設以上の参加施設により施設内再現性、施設間再現性の2種の再現性確認を行う。

ADRAにおけるバリデーション試験
全40物質について4施設で試験を実施。

施設内再現性10物質×3回の試験を実施し、各施設内再現性を算出

施設間再現性上記 + 30物質×1回の試験結果から、計40物質における施設間再現性を算出

結果
施設内再現性ADRA (10物質) = 90-100% (全体：97.3% [=36/37])

施設間再現性ADRA (40物質) = 91.9%

DPRA (15物質) = 86.7% (84.6%)*

DPRA (24物質) = 75.0% (81.8%)**( ) 内は、適用範囲外の2物質を除いた値
19

ADRAのガイドライン化まで
2016年

2017年

2018年

二次バリデーション試験

国際

11月

3月

4月

6月

公示
OECD TG

国際

7月

会議で承認
OECD WNT

一次バリデーション試験

5月との会議②OECD

国際

3月との会議①OECD

参加ラボへの技術移転

1月

各種資料提出TG案( )&からの承認
JaCVAM

10月

国際専門家評価会議②

9月

国際専門家評価会議①2月

報告書 案( 提)出

１月

提出
SPSF

10月

会議
VMT

9月

会議
VMT

3月

会議
VMT

2月

2019年

世界中からのコメント対応
JaCVAM：日本動物実験代替法評価センター
VMT：Validation Management TeamSPSF：Standard Project Submission Form
TG ：Test guidline
WNT：The Working Group of National Coordinatorsof the Test Guidelines Programme

再現性の高い結果専門家から高評価

3年4ヶ月でテストガイドラインに収載
20

ADRAの利用範囲を広げるための取組み

211. 重量濃度法による分子量不明成分の評価
ADRAやDPRAの試験条件では求核試薬と被験物質の、モル比が一定となるように調製した反応液で試験を行う。

反応液中のモル比(NAC/NALまたはペプチド：被験物質)
ADRA法

被験物質の分子量が分からないと評価することができない。

DPRA法

NAC/NAL

Cyspeptide

Lyspeptide

1:50

1:10

1:50

化粧品原料は分子量が不明なものや混合物が多い

分子量情報を必要としない試験法として、重量濃度（w/v）で調製した被験物質溶液を用いた試験系を開発
22

1. 重量濃度法による分子量不明成分の評価

A+

求核試薬

B→

感作性物質

C
反応生成物

A ≪B であれば、速度定数 kは、[CA]に依存し、[CB]には依存しない。
ADRA (1mM)

1:50
ほぼ変わらない
ADRA (0.5mg/mL)

50倍ADRA (1mM)
23

1. 重量濃度法による分子量不明成分の評価
重量濃度法とモル濃度法（従来法）の予測精度比較

Yamamoto et al., 2019, J. Pharmacol. Toxicol. Methods, 97. 67-79.

24

2. 蛍光測定法
NAC, NALに含まれるナフタレン環は蛍光を持つため、蛍光検出による、より選択的な測定が可能
NAC, NALの蛍光スペクトル
NAC

NAL

Ex: 284 nm
Em: 300-400 nm

Ex: 284 nm
Em: 300-400 nm

Fujita et al., 2019, Toxicol. In Vitro, 59, 161-178.

25

2. 蛍光測定法
Licorice (甘草) 抽出液とNACの反応における検出方法の比較

NAC

Licorice

NAC + Licorice

NAC + Licorice(0 hr)(24 hr)

NAC

NAC

HPLC-UVNAC
No peak(NAC)

HPLC-FL
Fujita et al., 2019, Toxicol. In Vitro, 59, 161-178.

26

3. 混合物の評価（重量濃度法と蛍光法の組合せ）
混合物評価における課題
1. 被験物質の分子量情報がない

重量濃度法で評価可能

2. 被験物質の夾雑ピークが多い

蛍光検出で夾雑ピークを回避

重量濃度法による疑似混合液評価
感作性物質< 単独系 >

感作性物質/非感作性物質< 混合系 >

非感作性物質
感作性物質

ADRAで評価27

3. 混合物の評価（重量濃度法と蛍光法の組合せ）
重量濃度法による疑似混合液評価

感作性物質単体と同様に疑似混合液中に含まれる感作性物質も検出可能
Yamamoto et al., 2019, J. Pharmacol. Toxicol. Methods, 97. 67-79.

28

4. 被験物質濃度の最適化
現在の被験物質濃度 (1mM) よりも高い濃度で試験を実施することで、クライテリア付近の偽陰性化合物を正しく評価できることが判明。
被験物質濃度とDepletion
30
Resorcinol
1‐(4‐Methoxyyphenyl)‐1‐pentene‐3‐ol25

Average of depletion

Cyclamen aldehyde
20

Ethleneglycol dimethacrylate
3‐Dimethylamino propylamine

15

Diethylenetriamine
3‐Propylidenephthalide

10

N‐Butyl glycidyl ether
Criteria
54.9%

m‐Aminophenol
2‐Methoxy‐4‐methylphenol

00123
4
Concentration of sample (mM)

56

Imamura et al., 2021, J. Appl. Toxicol., 41. 303-329.

4mMの被験物質濃度が最適であると判断29

4. 被験物質濃度の最適化
4mM被験物質濃度における予測精度 (136物質)
ADRA

DPRA

1mM (従来)

4mM

100mM

Accuracy (%)

727675

Sensitivity (%)

6576

72

Specificity (%)

897976Imamura et al., 2021, J. Appl. Toxicol., 41. 303-329.

被験物質濃度を1mM→4mMとすることで予測精度が向上

・4mMの被験物質濃度・混合物の評価条件

ガイドライン改訂申請中30

他の毒性評価へのADRAの応用

31

1. ADRAを用いた光アレルギー評価法
光化学反応と光アレルギー

Photosensitivechemicals
・励起状態の物質がタンパクと反応
Excited substances
・生成した活性種がタンパクと反応

ROS
・分解生成物がタンパクと反応

Photoreactive

Photoirritation

Photoallergy

Damage of membrane,lipoids and proteins

Binding to proteins

Photogenotoxicity
etc.
Damage of DNA
Less common, etc.

Yamamoto et al., 2020, J. Applied Toxicol., 40, 655-678. Tokura Y., 2018, Cutaneous Immunology and Allergy, 1(2), 48-57.

32

1. ADRAを用いた光アレルギー評価法
Photo-ADRA - 測定手順と判定方法 光照射群
NAC

光照射(2000 μW/cm2, 1時間)

2.5% TFA

25℃
23時間
23NAL

非光照射群
被験物質25℃，24時間
UV測定：281 nm
蛍光測定：Ex/Em =284/333 nm【 光アレルギーの判定方法（クライテリア）】
1) 光照射群と光非照射群における平均Depletionの差≧10%2) 光照射群と光非照射群におけるNACまたはNALどちらかにおけるDepletionの差≧ 15%
1 または 2 のとちらかを満たす場合: Positive
1 および 2 のどちらも満たさない場合: Negative

Yamamoto et al., 2020, J. Appl. Toxicol., 40. 655-678.

33

1. ADRAを用いた光アレルギー評価法
Photo-ADRAによる光アレルギー物質の評価結果
PosNegTotal

Pos28533Neg

72027Total

35

2560

Sensitivity : 84.8%
Specificity : 74.1%

Accuracy : 80.0%
クロマトグラムの例（8-Methoxypsoralen 光照射群）
NAC + 8-Methoxypsoralen

NAL + 8-Methoxypsoralen
NAL

NAL

UV

NAC

FL

UVFL

NAC

Yamamoto et al., 2020, J. Appl. Toxicol., 40. 655-678.

34

2. ADRAによる呼吸器感作性の評価
呼吸器感作性のメカニズム

Kuroda et al., (2016), Immunity, 45(6), 1299-1310.

35

2. ADRAによる呼吸器感作性の評価
職業性喘息について• 成人の喘息患者数：約700,000人*• 職業性喘息の患者は上記の9～15% (63,000～105,000人)と言われている。
• 呼吸器感作性物質は喘息の原因となることから、取り扱いには防護マスク等、皮膚感作性物質よりも厳重な保護具の着用が必要となる。
*平成29年患者調査(政策統括官付参事官付保健統計室) より算出

in vivo testin vitro test36

2. ADRAによる呼吸器感作性の評価
皮膚感作性と呼吸器感作性の比較

皮膚感作性物質

呼吸器感作性物質

免疫細胞

Th1細胞が優勢

Th2細胞が優勢

IgE

関与なし

関与の有無は未解決サイトカイン

TNF-α，IFN-γの産生増加

IL-4，IL-5，IL-10およびIL-γの産生増加－

肺胞マクロファージ，肺胞Ⅱ型上皮細胞，気管支上皮細胞－

代謝Ⅰ相，Ⅱ相酵素を発現

ハードおよびソフトな求電子物質

ハードな求電子物質例）アクリレート，アルデヒド例）アシル化剤，シッフ塩基－

揮発性，クロスリンク

分子量500以下

分子量1000以下

細胞タンパクと結合

血清タンパクと結合

呼吸器感作性を示すとは限らない

皮膚感作性を示す

代謝活性化

被験物質

Mekenyan, et al., Chem Res Toxicol., 2014, 27:219-39, Chary, et al., Arch Toxicol., 2018, 92:803-822, Enoch, “Grouping and Read-Across for Respiratory Sensitization”. 37

2. ADRAによる呼吸器感作性の評価
ソフト/ハードな求電子物質とはハードな求電子物質

ソフトな求電子物質

アルデヒド

α,β-不飽和カルボニル類(Schiff base former)(Michael acceptor)

酸無水物

キノン類

(acylating agent)(Michael acceptor)

酸ハライド

アリルハライド(acylatig agent)(SN2 electrophile)

イソシアネート類

アリル硫酸，リン酸エステル(acylating agent)(SN2 electorophile)

適当な離脱基を持つカルボニル基エポキシ(acylating agent)(SN2 electorophile)

主にNH2基と反応

主にSH基と反応
Mekenyan, et al., 2014, Chem. Res. Toxicol., 27: 219-239.

382. ADRAによる呼吸器感作性の評価
ADRAによる呼吸器感作性物質の評価

ADRA

DPRA

0.9
Diisocyanates
Skin

Skin

Respiratory

Respiratory
第47回日本毒性学会学術年会 ﾎﾟｽﾀｰ番号 P-88E39

最後にADRA OECDガイドライン化にご協力いただいた方々【バリデーション委員長】【バリデーション参加ラボ】【第三者評価会議】

・ 小野 敦 （岡山大学)

・渡辺真一 (ライオン)・ David Basketter(UK)・菅原 経継(ライオン)・ Steven Enoch(UK)・山鹿 宏彰(ライオン)・ Joanna Matheson(USA)・吉田 浩介(ライオン）・ Stanislav Vukmanovic(USA)【免疫専門家】

・若林 晃次 （三井化学）

・ Kyung-Min Lim(Korea)

・ Jon Richmond(UK)・田原 宥 （三井化学）

・ Nicole Kleinstreuer(USA)・堀江 宣行(住友化学)

・板垣 宏(元横浜国立大学
ITACSコンサルティング）

・ Bae-Hwa Kim(Korea)

・藤本 恵一 (住友化学）

・足利 太可雄(NIHS)・ 河上 強志(NIHS)・草苅 啓 (日産化学）

・ 小島 幸一(FDSC)・黒川 嘉彦(日産化学)【JaCVAM】
・ 小島 肇 （NIHS)【統計解析】
・ 寒水 孝司 (東京理科大学)

・竹内 和也(日産化学）
・神谷孝平(日産化学）(東京理科大学)・ 藤田 正晴

・ 鰐渕彩花・ 秋元 美由紀

・ 佐藤彩子・ 今村 弥佳・ 笠原 利彦

・ 勝岡 尉浩・ 中山 拓人(東京理科大学)
・ 草生 武【リードラボ：富士フイルム】

NIHS：国立医薬品食品衛生研究所

FDSC：一般財団法人食品薬品安全センター秦野研究所

ガイドライン化プロジェクトにおける研究助成
・日本化学工業協会「LRI（長期自主研究）指定課題」（2016, 2017年度）
・日本動物実験代替法学会「試験法評価に関する研究助成金」（2016年度）
40