Crystal Big Bang, SOSHO

新規タンパク質結晶マウント法の開発
北谷友也1,4, 杉山成1,4, 松村浩由1,3,4, 吉川洋史1,4, 牧祥1,4, 村上聡2,3,4,,
安達宏昭1,3,4, 井上豪1,3,4, 高野和文1,3,4, 森勇介1,3,4
大学院工学研究科, 2大阪大学 産業科学研究所, 3株式会社創晶, 4JST-CREST

1大阪大学

www.sowww.so--sho.
sho.jpResults and Discussion

Introduction
X線結晶構造解析において、タンパク質結晶の品質は、回折反射の分解能や強度に大きく影響する。しかし、タンパク質結晶はその含水率の高さ （通常40～70％）などから、構造的に非常に脆く、物理的接触によって品質の劣化を生じやすい。
タンパク質結晶の取り 扱いについては

【新手法】

【従来法】

＜Lysozyme＞ 沈殿剤 : 1.0 M Sodium chloride , 抗凍結剤 : 25% glycerol
P43212

P43212

Resolution 50.00 – 1.68
(1.74 – 1.68)
a = b = 78.5 Å, c = 37.0 ÅI/σ(I) 17.4 (1.81)
Rmerge 3.6 (30.2)
Mosaicity 0.64 °Resolution 50.00 – 1.46
(1.51 – 1.46)
a = b = 78.7 Å, c = 36.7 ÅI/σ(I) 61.2 (7.14)
Rmerge 4.6 (31.8)
Mosaicity 0.32 °現在、ループ状のマウント器具を用いた移動および測定が主流である。この方式
では左図の様にタンパク質結晶を周囲の溶液ごと掬い取り、表面張力でループ内に結晶を保持した状態に出来ることから＜Thaumatin＞ 沈殿剤 : 1.0 M Potasium Sodium tartrate , 抗凍結剤 : 15% (v/v) ethylene glycol
P41212

P41212

Resolution 50.00 – 1.50
(1.55 – 1.50)
a = b = 57.9 Å, c = 150.2 ÅI/σ(I) 36.3 (6.7)
Rmerge 7.2 (35.5)
Mosaicity 0.43 °Resolution 50.00 – 1.43
(1.48 – 1.43)
a = b = 57.9 Å, c = 150.2 ÅI/σ(I) 16.7 (1.6)
Rmerge 4.9 (30.6)
Mosaicity 0.46 °脆いタンパク質結晶に対する非接触での保持が利点として挙げられる。
しかし、その一方で、ループ内の溶液の非弾性散乱によるバックグラウンドの上昇や結晶にダメージを与えずに取り出すには熟練の技術が要求されるなどの不都合な点も存在する。
そこで我々は、より簡便かつ安定して結晶の取り出し、および保持が可能な新規マウント法として、粘着剤で直接結晶を捕獲するマウントデバイスを開発した。

粘着剤によるタンパク質結晶のマウント法＜Elastase＞ 沈殿剤 : 0.05 M Sodium sulfate , 抗凍結剤 : 30% glycerol
P212121

Resolution 50.00 – 1.43
(1.48 – 1.43)
a = 50.0 Å, b = 57.7 Å, c = 74.4 ÅI/σ(I) 56.2 (13.4)
Rmerge 2.9 (9.7)
Mosaicity 0.32 °P212121

Resolution 50.00 – 1.43
(1.48 – 1.43)
a = 50.0 Å, b = 57.7 Å, c = 74.4 ÅI/σ(I) 30.1 (11.2)
Rmerge 1.6 (6.0)
Mosaicity 0.32 °＜GI＞ 沈殿剤 : 22% (v/v) MPD , 0.2M Magnesium chloride
I222

I222

Resolution 50.0 – 1.43
(1.48 – 1.43)
a = 92.8 Å , b = 98.8 Å, c = 102.6 ÅI/σ(I) 54.0 (7.4)
Rmerge 3.1 (19.8)
Mosaicity 0.33 °Resolution 50.00 – 1.43
(1.48 – 1.43)
a = 92.7 Å b = 98.4 Å, c = 102.6 ÅI/σ(I) 27.1 (5.2)
Rmerge 2.1 (10.2)

Mosaicity 0.29 °＜Trypsin＞ 沈殿剤 : 30% (w/v) PEG4000, 0.2M Ammonium sulfate
チップ

本体

製造 ： ㈲ シバタシステムサービス

P212121
Resolution 50.00 – 1.48
(1.53 – 1.48)
a = 54.7 Å, b = 58.3 Å, c = 66.6 ÅI/σ(I) 19.8 (1.9)
Rmerge 2.9 (26.5)
Mosaicity 0.50 °P212121

Resolution 50.00 – 1.43(1.48 – 1.43)
a = 54.7 Å, b = 58.3 Å, c = 66.6 ÅI/σ(I) 27.8 (3.13)
Rmerge 2.2 (17.5)
Mosaicity 0.48 °結晶＜PML＞ 沈殿剤 : 10% (w/v) PEG20000, 0.2M Calcium acetate, 抗凍結剤 : 20% (v/v) ethylene glycol
P21

粘着剤

下からの圧力で粘着剤が迫り出す

チップ
先端

Resolution 50.00 – 2.1(2.18 – 2.1)
a = 49.0 Å, b = 84.1 Å, c = 87.0 Å
β = 96.1 °I/σ(I) 20.7 (6.9)
Rmerge 9.6 (27.4)
Mosaicity 0.60 °P21Resolution 50.00 – 2.15(2.23 – 2.15)
a = 49.4 Å, b = 84.3 Å, c = 87.1 Å
β = 96.3 °I/σ(I) 8.9 (2.7)
Rmerge 8.2 (32.0)
Mosaicity 0.65 °＊先端径 0.2 mm
上記の結果より、分解能および Mosaicity において、ループと粘着剤の間に大きな差が見れないことから、接触及び粘着剤成分によるタンパク質結晶の大きな品質劣

Experiments
xperiments
粘着剤で直接結晶を捕獲するにあたり、接触および粘着剤成分による結晶へのダメージを考慮しなくてはならない。そこで、Lysozyme,化は発生していないと考えられる。 また、本実験ではサイズが 0.1 ～ 1.0 mm 内の結晶に対して 溶液からの取り出しとXRD測定中の保持が可能であった。

Thaumatin, Elastase, Glucose Isomerase （GI）, Trypsin, Family1.3 lipase from Pseudomonas sp. MIS38（PML） の結晶を用いて、粘着剤の結晶に対する影響を、 X線回折測定（XRD測定）から得られたデータの統計値より確認した。
＜測定装置＞

X線源 ： Ultrax-18 (Cu対陰極)＊現在、以下のサンプルをはじめとして種々のタンパク質結晶に対して粘着剤の影響を確認中である。
1) 多剤性排出トランスポーター AcrB

2) 炭酸固定酵素 PEPC

R32
Resolution 50.0 – 7.55
a = b = 142.4 Å, c = 517.3 ÅI/σ(I) 12.6
Rmerge 9.9
Mosaicity 0.840 °P212121
Resolution 50.0 – 8.9
a = 154.7 Å , b = 167.6 Å, c = 243.4 ÅI/σ(I) 6.5
Rmerge 21.3
Mosaicity 0.736 °

検出器 ： R-AXIS IV++測定電圧、電流 ： 50 kV, 100 mA
ビーム径 ： 0.3mm＜測定条件＞

距離 ： 75 mm
振動角 ： 1°
温度 ： 100 Ｋ

Acknowledgement
・宇治市
・京都リサーチパーク株式会社

・京都府（京都府中小企業研究開発等応援事業費補助金）
・ＮＥＤＯ（産業技術研究助成事業）