厚生

省

ノ神経疾患研究委託費

筋ジストロフィー症動物の開発・供給に関する研究野村班

昭和59年度研究報告書

昭 和 60 年 3 月

研究報告書作成にあたり
厚生省神経疾患研究依託費による「筋ジストロフィー症動物の開発・供給」玉狂は本
年度をもって初期の計画の3年間を終了することになりました。本研究班は神経疾患
ならびに筋ジストロフィー症のモデル動物の1）開発・改良、2）生産・供給、3）飼育管理方法の検討を目的として組織されたものであります。
3年間にわたる各班員の多大な努力によって、多くの神経・筋異常動物について、それらの成田の解明とヒト疾患との対比が行われ、それによっていくつかの有望なモデル動物が開発さ れました。また、従来から利用されていたモデル動物の改良や、それらの飼育管理、生産・供給体制の整備に関しても多くの成果をあげることができました。
しかし、モデル動物の開発には長い年月と、多くの経費がかかるものであります。
また、実験動物学分野、育種学分野の研究者と各疾患についての医学分野の専門的研究者との密接な連携が必要であります。今後も諸先生方のご協力をお餅い申しあげる次第であります。
3年間の研究班を終わるにあたり、多大の成果をあげていただいた班員各位、ならびに本研究依託費の取扱に種々お世話いただいた厚生省当局、国立神経センター、日本筋ジストロフィー協会の方々に感謝し、心から御礼申し上げます。

昭和60年3月

野

村

達

次

目

次

Ⅰ．「筋ジストロフィー症動物の開発・供給に関する研究」総括報告書
野

村

1

達

次

Ⅱ．筋ジストロフィー症に関する文献調査（1984）

5

野

村

達

次

Ⅲ−1．筋ジストロフィー症モデル動物の開発
13

mdx マウス骨格筋の病理学的研究

研究協力者

杉

田

秀

夫

田

辺

雄

三

埜

中

征

哉

江

崎

孝三邸

野

村

達

次

Ⅲ−2．進行性に筋力低下を示す突然変異マウスの骨格筋に見られる

Vacuole形成

33

辻

繁

勝

Ⅲ−3．筋ジストロフィー症マウスと小人症マウス：筋成熟成長障害の比較

研究協力者

戸

塚

渡

辺

45

武
貴

浦 本

美
勲

Ⅲ−4．キメラマウスを用いた筋ジストロフィー症の研究

53

勝

木

元

也

横

山

峯

介

Ⅲ−5．震えを伴う起立不能症鶏の病態と遺伝

57

研究協力者

富

田

武

若

菜

茂

晴

加

藤

重

夫

若

杉

昇

渡

辺

徹

77

Ⅲ−6．ファヨウミ種において出現した筋ジストロフィー鶏について

水

谷

誠

藤

田

武

久

埜

中

征

哉

杉

田

秀

夫

Ⅲ−7．筋ジストロフィー鶏骨格筋の脂質と血管系の構築

93

菊 池 建 機

研究協力者

斎

喜

明

原

幸

浩

大和田

修

一

菅

Ⅳ−1．筋ジストロフィーハムスターの計画繁殖ならびに系統育成について

研究協力者

斉

藤

田

中

松

崎

宗

111

男
亨

哲

也

Ⅳ−2．C57BL／10Sc−mdxの飼育・繁殖

研究協力者

115

斉

藤

宗

男

江

崎

孝三郎

日

置

恭

司

Ⅳ−3．体外受精法による筋ジストロフィーマウス

（C57BL／6−dy／dy）の作品

119

江 崎 孝三郎
研究協力者

横

山

峯

介

昭和59年度厚生省研究報告書，1−3，1985

Ⅰ．「筋ジストロフィー症動物の開発・供給に関する研究」総括報告書
野 村 達 次●研究目的ならびに日標研究成果

本研究班は神経疾患ならびに筋ジストロフィ

1．モデル動物の開発

ー症モデル動物の①開発・改良、㊥生産・供給、（1）新しいモデル動物の開発：マウスにおいて㊥飼育管理方法の検討を目的として、次の諸目

は、前外側下腿筋群萎縮（ク仇α）、dy遺伝子の標をたてた。

複対立突然変異（dyつ、脂質異常を伴う筋力弱

1．モデル動物の開発化症の3種の変異が、ウズラにおいては、梼原マウス、ウズラ、ニワトリを対象として、新病（∫∫）および頭部骨格異常の2種のミュータ

しいミュータント形質の探索とそれらの成因のントが、ニワトリにおいては2億の異なる神経解明、モデルとしての評価をおこなう。また、疾患および筋ジストロフィー（α爪）に類似する

外国で発見されたモデル動物についても積極的

筋疾患の計3種のミュータントが発見され、こに情報を収集し、必要な動物の導入をはかる。

れらの異常発現の現因の検索ならびにモデル動2．モデル動物の改良物としての評価がおこなわれた。

筋ジストPフィーニワトリおよびハムスター

前外側下腿筋群萎縮7ウスにおいては、神経における疾患動物と対照正常動物の遺伝的背景

病理学的検索によって、総俳骨神経が欠如してを均一化する。また、妨ジストロフィー遺伝子

いるが、それは変性脱落したものではなく、総と他の異常遺伝子の複合動物を作出しその特性

排骨神経に分枝すべきものが分枝せず他の神経を検索する。

内に迷走したものと判断された。また、筋の病

3．モデル動物の生産・供給

理険などと考えあわせると、このマウスは筋ジストロフィーマウス、ハムスター、ニワ

Werdnig−Hoffmann病の神経と筋の分化のトリの安定した生産・供給を行う。また、従来関連をみるうえで、あるいは先天性多発性関節は症状の発現によって、正常と異常を区別して拍縮症の病因を考えるうえで有用なモデルであ実験に供試していたdyマウスを、dyホモでると考えられた。

あることの確実な胎子および新生子の生産方法

筋ジストロフィーマウス（d㌔）に関しては退を確立し、発症以前のdyマウスの使用を可能

転分析の結果、dy遺伝子座の新しい突然変異にする。

であることが判明した。dy遺伝子座において

4．飼育管理方法の検討

はすでにdyとdy2Jの2つの突然変異が発見され、筋ジストロフィーニワトリの飼育における感発症時期や症状の程度が異なることが報告され染症の防禦対策を確立する。

ている。新しく発見されたdyKを加えて比較することによって、ヒト疾患の個体差などの解明●tl一日■一一一一一一一一一●一一一一一一一ト一一一一一一一一一一一一一■●●●●●−●

・（財）実験動物中央研究所

のてがかりになることが期待される。

瞳的に実施した。筋ジストロフィーニワトリは脂質代謝異常をともなう筋力弱化ミュータン

すでに導入されていたが、今期は筋ジストロフ

トにおいては、加齢と共に体重の異常増加ならィーハムスターBIO14．6系をアメリカから、

びに高血糖を示し、さらに高脂血症、骨格筋中UMX7．1系をカナダから導入し生産・供給をへの中性脂肪、コレステロール、ルソ脂質の蓄おこなった。さらに、性染色体上に位置する遺積がみとめられた。病理組織学的には筋線維中伝子によって支配され、ヒトのDushenneにautophagiaによるremmed型のVaCu−

型筋ジストロフィーとの相同性が期待される

01eの形成が認められた。これらの点からこの

C57BL／10−m血マウスをイギリスから導入

異常はヒトのdistal myopathyに類似す

し、生産を開始した。

るものと推察された。

2．モデル動物の改良

糖原病ウズラについては種々の検索によって、（1）筋ジストロフィーハムスターの改良：810

酸性マルターゼ欠乏による筋・肝臓へのグリコ

14．6ハムスターと コントロールとして使用さーゲン蓄積症であり、ヒトの梼原病皿型に類似れているB工OF工3ハムスターは遺伝的背景がし、モデル動物として極めて有用なものと考え互いに異なっている。そこで遺伝的背景が近似られた。

したコントロール系を作出するために、810

頭部骨格異常ウズラにおいては、耳口異常な14．6系のジストロフィー田子を除いた正常系をどが見られることから脳の形態あるいは機能異育成した。現在6世代を経過し、あと2−3世

常を伴なっていると期待されるが、さらに検索

代で実験に使用することが可能になる予定であを進める必要がある。

る。

ニワトリに発見された第1の神経疾患では中（笥筋ジストロフィーニワトリの改良：筋ジス

枢神経系とくに大脳における血管変性ならびにトロフィー413系と正常ニワトリ412系はそ

頚部脊髄の変性・脱落が特散であり、第2の神れらの育成過程で互いの遺臣的背景が異なって経疾患（trembier）では小脳のプルキニエ細きている。そこで、わが国で系統として確立さ胞の異常が特徴であることが判明したがいずれれているニワトリ、白色レクホーン岩谷系およもヒト疾患との比較が今後の課亀である。

び77イオミ一種へ筋ジス遺伝子（αm）を導入

筋ジストロフィー様の異常は、すでに報告さすることを実施した。

れている肪ジストロフィーニワトリ（αm）と同聞筋ジス遺伝子と楚小遺伝子の複合：マウス

じ遺伝子座の遺伝子に支配されていることが判およびニワトリにおいて、筋ジス遺伝子と楚小明した。しかし、従来の筋ジスニワトリと比較

遺伝子の両遺伝子を同時にもつ動物を作出した。

して、Ppaque fiber数が多いこと、胞体

これらの動物では筋ジストロフィーの発症所見

内空胞の少ないことが観察され、新しい系統のが異なることが判明した。

育成が期待される。
（2）モデル動物の導入：筋ジストロフィーのモデル動物としては外国で開発されたものも多い。
そこで研究者の要望に応じてそれらの導入も積（4）発生工学技術の応用：モデル動物の開発にこの技術を応用するために、キメラ動物の作出等の基礎的検討をおこなった。

3．モデル動物の生産・供給（2）筋ジスハムスターの飼育方法：Wet tail（1）動物の生産・供給：筋ジストロフィーマウ

病が筋ジスハムスター生産の障害になっている。

スおよびニワトリは一時期を除き順調に生産・その対策を検討中であるが満足できる対策はみ供給された。

つかっていない。

ハムスターについては、従来輸入に頼っていたが、生後5遇齢以上のオスに限られるという未解決の問題点制約があったので、国内での生産体制の確立を

1．モデル動物の開発改良での問題点検討した。その結果、来期からは国内での生産・（1）新しいミュータント形質が次々に発見され供給が可能になった。

たが、それらの成因の解析、ヒト疾患との比較

新たに導入した、m血マウスについては、種やモデル動物としての評価は十分におこなわれ動物の準備ができ、小規模であれば生産・供給たとはいえない。一方、異常形質の発見者はかできる体制にある。

ならずLもその異常形質についての専門家では（2）dyホモマウスの生産：発症後でかナればない。従って、異常形質についての上記の解析

dyホモを識別することが出来ないために、発や評価を行うことが困難なことが多い。各異常症前のdyマウスを用いる実験に大きな支障がについての医学分野からの協力を得て困難な点あった。そこで、dyホモマウスの卵および精を解決したい。

子を採取し、体外で人工的に受精させ、一定時（功′くイオテクノロジーはモデル動物の開発に期まで発生させた胚を正常偽妊娠メスの子宮内も有効な手段になると考えられる。しかし現在に移植した。移植鹿の約30界が生まれ離乳

ただちに応用するためには、未解決な点が多いまでそだった。この手法によって、dyホモのので、基礎的研究をさらに進める必要がある。

確実な胎子あるいは新生子を実験に使用するこ2．モデル動物生産・供給での問題点とが可能になった。

ハムスターの生産においてWet tail病が4．飼育管理方法の検討障害になっている。SPF化などによって解決（1）筋ジスニワトリの飼育方法：コクシジ1ウする必要がある。

ム症の感染によって、実験に大きな障害となっていたが、これの予防方法を検討し、解決した。

昭和59年度厚生省研究報告書，5−12，1985

Ⅰ．筋ジストロフィー症に関する文献調査（1984）
野 村 達 次＊H筋ジストロフィー症モデル動物の開発研究の関する動物実験」についての文献調査をおこな一環として「疾患モデル動物」、「哺乳頬、トった。それらの中から、海外における筋ジスト

リ頬における筋ジストロフィーとその近縁疾患1ロフィーに関する文献（1984年分）を以下にならびに「筋ジストロフィーとその近縁疾患に紹介する。1−5）

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Youngt

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−10

−

Johnsonr

D．D．r

Wilcox′R・′

Wengerr

B・‥

Precociousin

vitro

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費「筋ジストロフィー症動物の生産・開発

献に関する研究」班，昭和55年度研究報告

1）野村達次：筋ジストロフィー症に関する文

書，1−15，1981・

献調査（1978），厚生省神経疾患研究委託費「筋ジストロフィー症動物の生産・開発に関する研究」軌

3）野村達次：筋ジストロフィー症に関する文
献調査（1980，1981），厚生省神経疾患

昭和54年度研究報告

研究委託費「筋ジストロフィー症動物の生書，1−7，1980．
2）野村達次；筋ジストロフィー症に関する文産・開発に関する研究」艶 昭和56年度

献調査（1979），厚生省神経疾患研究委託−11

研究報告書，1−12，1982．

−

4）野村達次：筋ジストロフィー症に関する文

5）野村達次：筋ジストロフィ症に関する文献

献調査（1982），厚生省神経疾患研究委託調査（1983），厚生省神経疾患研究委託費費「筋ジストロフィー症動物の開発・供給「筋ジストロフィー症動物の開発・供給にに関する研究」班，昭和57年度研究報告

関する研究」班．昭和58年度研究報告亀告，1−5，1983．

1−9．1984．

ー12−昭和59年度厚生省報告書，13−31，1985

m−1．筋ジ．ストロフィー症モデル動物の開発
m血マウス骨格筋の病理学的研究
杉 田 秀 夫●
研究協力者 田辺雄三：埜中征歳事
江崎孝三郎㌻野村達次●●
対進行性筋ジストロフィー症の病態に関する知見は近年、急速に増加しその本態が次第に明ら

象・方法

C57BL／10Se一m血マウス並びにその対照かになってきている。しかしながら未だその究系であるC57BL／10Seマウスを使用した。

極的原因は不明であり、根本的治療法も確立さそれぞれ出生直後、5日、10日、15日、20

れていない。ヒト肪ジストロフィーにおける研日、30日、60日、90日、120日、180日の究には自ずから制約があり、より炉似した動物

各時点を選び両者10匹ずつの体重変化を調べ

モデルの研究を通して、病態生理、治療法を知た。，同時に臨床症状を観察し、陪床試験としてる事が実際的であると考えられる。

wire−netClimbingtest2）を施行Lもれ血マウスは、最近イギリスのBulfieldl）

testは約50℃のホットプレート上に金網をらがmutantのスクリーニング中にCreatine

被せ、それをよじ登ったマウスが10分間に落

kinase，pyruVate kinase活性が高値

下した絶時間を測定し、筋力低下を評価しようを示すmutantを発見し新たに確立した筋ジとするものである。
次いで上記各時期にm山マウス、対照マウ

ストロフィー動物である。
彼らによる遺伝解析の結果、これまでのジス

ス共5匹ずつを対象に右長持伸筋（自肪）、右トロフィーモデル動物と異なりⅩ染色体劣性のヒラメ筋（赤肪）をとり出し、液体窒素で冷却

遺伝形式をとり、hemizygoteとhomozy一

したイソペソタン中で固定し連続凍結切片を作

goteとの交配により出生したマウスの全例に成した。切片には、hemat0Ⅹylin and筋ジストロフィー様変化を見るという甲が一つ

eosin（HE），Gomori trichromeの特薇である。彼らは若干の筋病理学的検討を

変法、NAI）H一m、酸フォス77クーゼ染色を行っており、生後数週目に中心核線経が著明におこなった。120日目、180日目では長指伸出現してくると述べているが、その詳細は明ら筋、ヒラメ筋の他に、前脛骨筋、上腕二頭筋、かでない。

大腿直筋、浅胸筋よりも切片を作製し、アルカ

最近我々は本動物の検索の段会を得、筋病理

リフオス77クーゼ、ATPase（routine，pH4．5，4．3）aCetylcholinesterase

学的検討を行ったので報告する。

（Ach E），nOnSpeCific esterase（NSE）染色を行った。長持伸筋、ヒラメ筋に■●●●●●●一一一一一一一一一一一一一一一一一一一■＝■一一一一一一一一一●−■●●■●●●●国立武蔵療養所神経センター…実験動物中央研究所
一13−

おける中心核線経の比率を検討するため、訊ね

体重増加不良となるが、この様な現象はmd∬

マウスを生後5，10，15，20．30，60，

マウスには存在しなかった。

120日の各時点3匹ずつを選び＿（計21匹）（功 臨床症状各肪300本ずつの肪線推中の中心核線経の比180日目に至るまで、外見上明らかな筋力低率（界）を算定した。

下などの賢床症状は示さなかったので、Wire−

又、上記光顕標本を作製する際、左長指伸筋、net climbing testを行った。20日日

左ヒラメ筋を採取し、カコジル酸ナトリウム緩頃より次第に落下するマウスの数が増してゆき、衝グルタールアルデヒド固定を行らた。さらに

180日日では個体差はあるものの、全例が落Osq液にて後固定、アルコール脱水エポキシ

下した。なおこのtest

樹脂に包埋し、電頗検索用標本とした。払ぬ

日日以降であった。（図2）

が適応可応なのは15

マウス、対照マウスをそれぞれのヒラメ筋電顕用標本より1／ 厚切片を作製し、トルイジンブ

WIFIE−NET CuAIBINQ TEST

ルー染色を行い、最終倍率×1000の写真を作●

製、横断面での総肪線維数、肪線維直径を測定

●●●

●●●
●
●

した。

●

●●
●
●

結

●
●

果

●

●

●
●●

（1）体重変化●

mdJマウス、対照マウスの各時点における体●貨に重の推移を見ていくと、両者共差異なく、120

1＄

20

30

00

100

日目に至るまで次第に増加していた（図1）。

図2．金網よじ登り試験

120日目以降180日目までは体重変化は殆ん

20日日すぎ頃より落下するマウスが出現する。

どなかった。dyマウスでは発症したものは、

血y●

用 平均線維径・総線維数

CH▲HGE OF B0DY WEl（iHT

前記の如く、ヒラメ筋を対象に5日目より30日目における平均線維径並びに総線維数の推移について検討した（図3）。まず総線維数は（図3，下段）両者共大きな差異なく、5日よ
り30日目に至るまでしだいに増加して行き、
md∬マウスにおいて肪線維数の減少は認められなかった。平均線維径について見ると（図3，
0

10

20

さ○

○0

00

t20

1●O d▲y●

図1．爪d∬マウス、対照マウス両者の経時的体重変化。180日日まで差はない−14上段）やはり同様に20日目までは差異なく次第にその径が増大していった。しかしながら30
日目ともなるとれ血マウスの方が大となった−

が乱れた線経が存在したが、その他の構造異常
utAHFl■ERDl▲｝ETERは認められなかった。酸フォス77クーゼ染色▲TOT▲LF18ERHUu■ERS▲

Il180LEUさ｝U＄CLE

では壊死・再生線経に一致して高活性を示す線d経が存在した（図5，6）。しかしながら、アル●棚

カリフォスフ・Tクーゼ、AChE，NSE染色で

●md
O c01
8
10
15
20
甲
妻
ン
・
〉 ・
：
く
く
・

は異常は明らかでなかった。

30

これらの変化は長指伸筋にも同等に認められdt（図7）、赤肪・自筋問に明らかな差異はなか
C011
tr
［

った。さらに、前脛骨格（図8）、大腿直肪■＝さ（図9）、上腕二頭筋（図10）、浅胸筋（図11）でもほぼ同様の変化がみられ、肥大線経、

図3．ヒラ■メ肪絶縁維数（下段）平均直径（上段）
30日日ではm血マウスの方が平均径が大となるfiber splittingはこれらでなお一層明らかな傾向を示した。以上の如くいわゆるジス
トロフィー変化は全身に及んでいた。
120日日の心筋について検索したが肉眼的に（Pく0．05）。この事は、後述する肥大線経の肥大化、壊死巣、Ca沈着などもなく又、光顕出現にほぼ一致した結果であり、この傾向はそ的にも異常は明らかでなかった。

れ以降も続くと思われた。

対照マウスにも上記同様病理学的検索を行っ（4）組織学的・組織化学的所見

たが、赤筋・自筋共壊死線経、再生線経の存在

180日目のヒラメ筋では本マウスの典型的病はなく、肥大線経などその他の変化も全く認め

理所見をみた（図4）。すなわち明らかな筋線なかった。

維大小不同、染色性に乏しい填死線経、単核の次に経時的に見て病理変化がいつ頃から明ら

貪食細胞の出現があった。それに加えやや大型かになってくるかについて、主に、ヒラメ筋、核で胸体がbasophilicな、いわゆる再生線

長持伸筋、前脛骨筋について調べた。生後すぐ

経の存在があり、しかもその再生線経はしばし

では、筋線経は大型の核を持ち胸体がbaso−

ばグループを成して存在すらのが特散であった。

philic

また多くの線経は中心核線経で、中には肥大線像を皇しており（図12）、生後5日目では細経、fiber splittingの所見も見られた。

胞境界が明らかとなり、大型核は少数となってその時期でもendomysial fibrosisは軽いるが未だ壊死線経の存在は明らかでなかった

度に留まり、脂肪筏の増加はなかった。grOup（図13）。それに対し、10日日になると貪

atrophy，Smali angulated fiberなどの神経原性変化や空胞変性は認められなか

食反応を伴った壊死線経が集塊を成して認めらった。Gomori trichrome変法でも特に異やはり壊死再生線経が多くは、集塊をつくり現常なかった。NADH−TRでは壊死、再生線経われていたく図15）。

に一致してintermyofibrillar network

一15な細胞が互いに融合し合った幼君なれた（図14）。20日目では、10日目同様

更に30日日頃になると壊死再生の変化に加−中心核線経が多数認められ、肥大線経も出現しる。heterozygoteの場合はCKの異常、肪ていた（図16）。以後これらの変化は、先に病理上共に明らかな異常はないと言う1三示した180日目の病理像へと続いていた。

体重増加不良などの発達異常もなく、臨床的30日日頃より中心核線経が明らかであったには軽度の筋力低下に留まり、dyマウスの如ので、ヒラメ筋、長持伸筋について中心核線経く3）後肢ひきずりやtwitchingも見られなの比率について定量的検討を加えた（図17）。

い。ただしWire−net Climbing test
によっては比較的早期に差が示されるマウスを見る事がある。何れにせよ著明な筋力低下はな

FIBEFIS YVITHINTEFtNAL NUCLEl

い。以上がmぬマウスの臨床的特徴であるが、これらの事はヒト筋ジストロフィー症、とりわ
けデ1シャンヌ型筋ジストロフィー症の臨床症状と大きな差異を示している。
病理学的変化としては、成熟マウスに至るま
でに明らかな筋ジストロフィー症の病理像が赤筋、自筋に等しく生じ全身が侵される。病理的
6

10

15

20

30

00

120

d■y■

図17． ヒラメ筋、長指伸筋での中心核線経の頻度を経時的に見たもの。肪線維
300本に対する比率で表わしてある

変化は生後10日日頃より出現し始め、20日目になると壊死線経は特徴的に集族を成す傾向となる。30日目すぎより中心核線雄が増加し始めさらに肥大線経、fiber splitting

それによると両肪共30日日頃より急速に増加の所見が加わってくる（図19参照）。

して行き、60日目では半分以上の線経が、120日目に至っては大部分の線経が中心核線維

MUSCLEHISTOCHEMISTRYIN mdx MOUSE
0

6

10

20

30

●0

00

120

山y●

となっていた。
この他の組織化学的変化として壊死線経の中にカルシウム染色（GBHA法）陽性線経の出現も見られたく図18）。

HECROTIG F帽ER＄
V■ll■‖011ln tlb●l■11●
Op■qu●tlb●l■
Hyo●rtlO hlq Hb●l●

REOEHER▲TIHQn8ERS以上の病理学的所見をまとめたのが図19である。

lnt●lh■llluCl●l
Flb●r tPHttlhO
FlblO山●▲dbo●●tl●●｝●考察m血マウスはイギリスのBulfieldらによ

図19．m血マウス骨格筋の経時的病理像を示したものって近年C57BL系より見出されたものである。

120日日頃には殆んどの肪線経が中心核線維

Ⅹ染色体性劣性の遺伝形式をとり、全てのとなっている事から、それまでに少なくとも一homozygoteは交配が可能で出生するマウ

度は殆んど全ての節線経が壊死に陥り、それにス全てにジストロフィーの変化を見る事ができ

続いて非常に活発な再生がほぼ完全な形で行わ−16・−

れると考えられる。この事は前述の如く著明な訊ねマウスの特徴をこれまでのジストロフィ

筋力低下を示さない臨床像をよくうらづけていー動物と比較すると（図20）臨床的には、dyる。無論180日日でも明らかな壊死線維塊は存

マウス、チキンとは違いハムスター5）類似の軽在し続ける訳であるから壊死→再生一十壊死のプ

度の筋力低下に留まり、病理的には他の動物とロセスが繰り返すが、ヒト筋ジストロフィーと同様なジストロフィー変化が赤筋、自肪共に出異なり、ほぼ完全な再生が常におこっているの現するが、チキンに見られる空胸化線経はなくが特異点である。

叉神経原性の変化もない。筋再生がほぼ完全でさらに生後よりの発達途上において肪線維径、あり、問質の結合綴化も軽度に留まる。明らか

線維総数、光原的形態変化を見る限り、ジスト

な心筋障害を除き、全体的にはハムスターに最ロフィーチキンの様に筋の分化の遅れ、それにも近いモデルと考えられる。

加えてジストロフィー様病理像を有してくる4）以上よりヒト筋ジストロフィーの直接のモデとは考えにくく、比較的急激に壊死線経の出現ルと考えるには諸種の難点があるが、これまでを見るのは大きな特徴で、その発生病理を考慮のモデルと異なり出生後全例にhomozygote

するにあたって撞めて興味深い。この点で進行が得られる事は今後の治療実験の有力な動物モ性の筋力低下を示すジストロフィーチキン並びデルとなるであろうし、又、ほぼ完全な再生がにdyマウスとmdJマウスの対比を、再生過程得られる事は筋病理学上不可欠な再生現象につの差異という観点に加え、未分化線経の存在のいてさらに多くの知見を与えてくれると期待さ有無とジストロフィー変化出現という視点で捉れる。

えて行く必要があるかもしれない。
文

C01仲ARATIVE MUSCLE HISTOCHfMISTRY川▲MMAL MUSCULARDY＄TROPHIES

献1）Bulfield，G．，Siller，W．G・，
md∬
・叫●■■h●Ⅳ■l●Cl●−●■kn…

士

WightI P・A・L・and MooreI K・d〆dy chltk H■M●t●l＋＋C■rdl▲01¶U●Ct●lIYOh〇m●nt

J．：X chromosome−linked

土＋＋Op■qU●仙●r●＋C■lGbm−10■d●dれb●r●＋＋ ＋ 土士 ＋ ＋＋f

Vtrl■tl011lnl的■▼■l王●＋ ＋ ＋ ＋I CC OO CFBER8V▲CUMTED R8ERS
Hyp●Mrophlel仙●r●＋

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円帥08は

士

＋

Adlpo●●tlI■u●

muscular dystropy（7nぬ）in＋■

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＋

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W：州●

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−18

−

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図4．mdxマウス

十・．・＿・●

180日Elの右ヒラメ筋。

HE染色。

筋線維大小不同、壊死線経、再生線経の存在。殆んどの線経
が中心核線経である。結合織増生は軽度に留まる。

鴨．二サー∴Y

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丁字写二十1㌢ゝん一々〕′イ」一＿上皇lJL

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図5．mdxマウス

180日目の右ヒラメ的。

壊死、再生線経が集塊を成す。

HE染色。

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図6．図5と同一部位。酸フイス77クーゼ染色。

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図7・mdxマウス 180日目の右長指伸筋。 HE染色。
ヒラメ的同様、壊死、再生線経、中心核線経を認める。

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幣鎚童ン〝

180日目の大腿直臥〕

図9・mdxマウス

・￣一二・．＿・壷1・ゝ・■∴．八．ブ ●︑いト凍結ヾ▼r∴ヽ・・▲ぺ

車・、i
ヽ−ヽ＿1曇HE染色。
180日目の前脛骨筋。
図8．mdxマウス

■＼ヽ

＿∴九：軒−ンニ■・

一虎−＼ト＿．．

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寸・！．t

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ヽ

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ヽ

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ゝ1−

図10．mdxマウス

180日日の上腕二頭筋。

，†

HE染色。

・て折

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図11．mdxマウス

か一ヂ一−∵拇J

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180日目の浅胸的。

HE染色。

￥古書

∵し・〆．仁▲．

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・、iJ Tr

図12．mdxマウス 0日目のヒラメ的。 HE染色。
大型核で細胞境界がはっきりしていない幼若な像を示す。

キ￣鍵？・嶋工▲′二・二千．・思・▲
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一、−−ー

図13．mdxマウス■−−

5日目のヒラメ筋。HE染色。

未だ填死線経の存在は明らかでない。

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図14．mdxマウス10日目のヒラメ筋。 HE染色。
貪食反応を伴った壊死緑経が集塊を成して認められる

ちb一一二∫

−

ポ二
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■−

図15．tndxマウス＿一㌧

20日目のヒラメ的。

卑・∴nd一HE染色．，

図16．mdxマウス

30日目のヒラメ筋。

HE染色。

壊死再生の変化に加え中心核線経が多数認められ、肥大線
経も出現。

■l

ご巧
＿せ■

■

′

雷二間「l■写．「許

1サ＿＿＿二＿図18・左図

雀∴

1

HE染色、

右図

Ca（GBHA法）染色。

昭和59年度厚生省研究報告書，33−43，1985

Ⅱ−2．進行性に筋力低下を示す突然変異マウスの骨格筋に見られるⅥlCuOle形成
辻

繁

勝●

B6・CBA／J系に見出された遅速進行性に筋変法によるtrichrome染色などを行った。

の弱力化を示す仮性肥大型の筋ジストロフィー

また、電頗用としては49もparaform aide−症に類似した症状を発現する突然変異体に就い

hyde，1界Osq固定標本を使用した。

て、昨年度の報告書で筋の脂質代謝に種々の異骨格筋中の蓄積物質の変化に就いてはglyc0−常が存在することを記述した。今年度は主としgenはanthrone法2ち定量し、Carni−て発現形質の遺伝様式および骨格筋中の蓄積物

tine含量の測定はRamsay＆Tubies法3）

質の変化、組織学的変化などに就いて検索を行に準じて行った。叉Carnitinepalmitoyl

った結果を報告する。

transferase（CPT）活性はDeuful＆

凪elandの方法4）に従って測定した。

材料と方法
使用動物は1980年発見以来、和歌山医大

括

黒第二生理学教室で飼育を続けているB6・CBA

まず、この突然変異形質がどの様な遺臣様式／J−mut系マウスで、生後3遇齢頃から尾を持を示すかを検討するためにC57BL／6J系マウってつり下げると四肢を腹側に折り曲げて体躯スとの間で交配実験を行った。結果は表1の如

全体をくの字型に極端に縮めるという特徴的なく疾病マウスとC57BL／6Jマウスとの交配で動作を示す異常個体と正常対照個体である1乙は全く発病が見られず、その仔（Fl）同志の交行動異常を示す個体は1ケ月齢頃まではケージ

配では約九、疾病個体同志の交配では全部、更を動かしたり、音を出したりしてわずかな刺激にFlと異常個体とのbackcrossからやや低を与えても故感に反応し飛びはねるような状態率であるが％に近い仔にそれぞれ発病が見られが見られるが、加齢と共に行動が緩慢になり、たこと、この比率は雌雄の組合せの違いによる体躯の横幅が広くなり、ケージの片隅にうずく差が見られないこと、などからこの疾病は常染

まってあまり運動しない状態になる。交配は異色体性劣性遺伝子1つによって継代される遺臣

常個体同志でも可能である。

形質であることが確かめられた。

組織学的検索用の骨格筋標本はgaStro

生後8ケ月齢を過ぎると疾病マウスは著しく

Cnemius，SOleus，およびGracilis

肥満の傾向を示し血糖値も高く骨格筋中のmuscleが用いられ、光顕用には10界

Aikaline protease活性が正常対照の2parahorm液或いはBotlin液による固定切倍以上に上昇して来ることは昨年度の報告書に片又は新鮮凍結切片を作製L．Hematoxylin−記載した。これらのマウスの後肢筋に就いて組

Easin染色、SudanBiack染色、Gomori

織学的検索を行った。図1はGastrocnemius

・和歌山県立医科大学 第二生理学教室

−

33

−

Tablel．Incldence ofmuscleweaknessln offsprlng from testmatlngS t11th
the mutant mlce

Parental

Sir

x

Dam

phenotypel化tersX C578L／6J

C578し／6J

X Affected

2・Fl（N）
3．Affected

X Fl（H）
X Affected

4・Fl（N）

X Affected

Offsprlng

A／T xlOO

Affected

NormdlTotal0（0．0）

45（22．23）

45（22，23）

10（3．7）29（15，14）

39（18，21）

25．6

28（12，16）0（0，0）

28（12，16）

100．0

18（7，1日

19（11，8）37（18，19）

48．6

42（19，23）

62（32，30）

104（51，53）

40．4

0．0

7

1．Affected

No・Of

6
8
9

5．．Affected

X Fl（H）

筋のHE染色標本であるが横断面（図1A）でれる。又、図2Bで見られる様に縦断面にする

各筋線維中に内容物を含む大小の空胞（Vacu0−と細長くVacuole形成が行われた部分は1e）が在ることが認められる。この写真では中Str−iationが消失し、その内部に筋細胞由央核は認められないが右下に完全に萎縮して且、来の赤色に染まる物質がもやもやした形で存在空胞を持つ線経が認められる。Vacuoleはほすることが判る。即ち、この物質は筋線維中のぼ円型で大きさはまちまちである。Vacuole

蛋白構造の一部が破壊され構造を失なった残髄中に存在する物質の型は多形を示し、Eosin

であろうと推定される。更に、凍結切片を用い染色性である。一方縦断面で見てみると（図1

た新鮮標本によるSudan Black染色を行う

8）、Vacuoleは長軸方向に長く延びておりと横断面では図3Aの如くはっきりしたVacu−

内部にはエオシソ染色性で、Striationを

01e ではなく濃染する物質の塊が筋細胞内に失なったもやもやとした物質が認やられる。又、存在する像が認められた。又、この状態が見らSalcolemmal mucleiが細長く、内部にれるのは主としてtype11線椎であることも観はっきりしたnucleoliが認められるが、察された。図3Bは同染色の縦断面を示したもVacuoleの周辺には反応細胞が全く見当らなのであるがstriationをわずかに残して比いのが特徴的である。筋全体で見るとdegene−較的薄く染っている部分と完全にstriation

rationを失い、intactな部分と境界がはっきり出来はあまり顕著でなく、図1の視野には見られないが、局所的にneCrOSisを形成ている濃染した部分とが認められる。

している筋線経もわずかながら存在し、その周電子疎放鏡を用いた骨格筋標本の観察では図辺にはリンパ球その他の著しい細胞浸潤が認め4の如くで−SyStemの一部と思われるチューられる。

ブ状の構造物が脂肪滴や膨潤してクリスデを失図2はGastrocnemius標本にGomori

なったミトコンドリアなどと一箱に集合してい変法によるTrichrome染色を行ったものでる像が認められた。又その中に同心円状のミエあるが、図2Aは横断面で、HE染色と同じく

ロイド小体が幾つか散在しているのが観察され円形をした明らかなVacuoleの形成が認めらヒトの遠位型ミオバナーのrimmed Vacuole

−

34

−

図4．電子鍍徴鏡像
所々にtubularな構造物が塊りをなして存在するのが認められる。
塊りの中にmyeloid eodiesが散見される（矢印）。（×5，000）
中に見出される1amellar bodies5）に対味で骨格筋中のglycogen含量の変化を生化応するものではないかと考えられる。

学的に測定してみた。結果は表2の如く、後肢

次に、Vacuole中の内容物の同定を行う意

筋ホモジネート中のglycogen量は正常対照

Table2．Glycogen contents of tissues from control andaffected mice

TissueMuscleHver

AffectedControI

A／C

18・3土6．5（4）19．4±6．2（5）834土94（3）

x100

Pr

94．3

N．S．

759土170（4）109．8

N．S．

Unit：mg／100g wet tissue weight
Parentheses show the numbers of mice used．

ー

35

−

との問に有意な差異は認められなかった。

に比較して明らかな減少が在ることが認められ一方、昨年度の報告で述べた如く、疾病マウた。

スの骨格筋などでは中性脂肪、コレステロール

更にCarnitine

リン脂質などの著しい蓄積が存在することが判

トコンドリア中に導入し、エネルギー産生を助っているので、種々の臓器について脂肪酸代謝

けているCarnitine palmitoyl一の要であるCarnitineの含量を測定した。

七ransferase（CPT）酵素の骨格筋中の活

その結果、表3の如く疾病マウスでは正常対照性を測定したところ、表4の如く正常個体に比と脂肪酸を結合させてミTable3．Carnitine concentratlons jn tissues of control andaffected mice

TissueFraction

Muscle Tota1

AffectedControl■

A／C

6．9土1．4（8）10．4士1．6（8）

x100

Pr

66．3

Pく0．01
Pく0．01
Pく0．01Free

2．4±0．6（8）9．0士1．9（8）

26．7

Acy1

4．6±1．4（8）1．4±0．7（8）328．6

12．3士1．8（5）13．3±4．5（5）

92．5

N．S．
Pく0．01
N．S．

Heart Total
Free

3．4士0．8（5）7．0±1．1（5）

48．6

Acy1

8．8±1．8（5）6．3土2．3（5）139．7

Liver Tota1

18．1士3．6（5）16．8士4．6（5）

107．7

N．S．

Free l1．3士1．3（5）10．6±1．6（5）

106．6

日．S．

Acy1

6．8士1．5（5）6．2土2．3（5）

109．7

N．S．

Unjt：nmOles／mg protein
Parentheses show the numbers of mice used．

Table4・Carnitine palmltoyl transferase activityin tissues ofCOntrOl and affected mice

TjssueAffectedControI

A／C

Muscle O・74±0．09（4）1．62土0．37（4）Ljver l・10土0．29（4）1．09土0．24（4）

x100

45．7
100．9

Unit：AE／mg protein
Parentheses show the numbers of mice used．

ー

36

一

Pr

Pく0．01日．S．

較して明らかに酵素活性が低下している給具がと考えられているAlkaline protease活得られた。

性が上昇している事は認められたが、rimmed
vacuole形成時に活性が高くなることが知ら考れている1ysosomal protease，特に案

86・CBA／J系マウスに見出された行動異常

Acid protease活性に就いてはpreli−

突然変異形質は交配実験の結果、常染色体性劣minary testでは有意な変化が認められな性遺伝子1ケによって継代される形質であるこかった。

とが明らかになった。然し、どの染色体に属し、一方、電鰯的観察からT−SyStem由来と考どの遺伝子に隣接しているかに就いては未だ検えられるtubularな構造物が多く集合してい討されていない。この変異体マウスは比較的遅るのが見られること、ミトコンドリアが膨潤しい速度で筋の弱力化が進行し、且骨格筋に於けクリステを失っている像が見られることなどかる脂肪代謝に著しい異常が見られることなどからエネルギー生産系に何らかの欠陥が在ること

ら、dyマウスなど従来の筋ジストロフィー症が予想されるが、生化学的検索によって得られモデルマウスとは異った病因に基づく疾病であたCarnitine含量の著しい減少、及びCPT

ろうと考えられるが、今回の組織学的検索によ

活性の低下などと合せて考えると、この疾病マって8ケ月齢以降の疾病マウス骨格筋中には高

ウスには脂肪酸代謝によるエネルギー生産系に頻度にVacuoleの形成が認められることが判

も欠陥が存在する可能性が充分に考えられる。

った。一方、筋線椎の壊痘或いは再生筋線経のいずれにしても、この変異体マウスはヒトの像などはあまり多く見られ加かっ払vacu。1edistal myopathy或いはCarnitineは中部にエオシソ染色性の内容物が認められた

deficiency myopathy

が、これはTrichrome染色で赤色に、又症状を示すことから、これら筋疾患のモデル動Sudan Black染色で漁色に染まることから、物として更に開発・改良を行う必要があるもの

脂質成分を含む蛋自性の物質であることが推定と考えられる。

などに頬似したされた。又筋中のglycogen量が変化していないことから考えて、生産物のStOI、ageとい謝

辞う可能性は否定された。更に、Vacuoleの局

電子顧徴鏡標本の作成、検索をして戴いた和辺には殆んどリンパ球などの浸潤が認められな

歌山県立医科大学総合研究室，広鰭但見博士にいことから考えて、一種のAutophagiaによ

感謝致します。

って起る現象と推測される。又、図4の電頭像に見られる如くIamella構造をした物質が存文

献在することなどから、ヒトのClistal myo− （1）辻繁勝：進行性に筋力低下を示す突然変pathyなどに認められるrimmed Vacuole

異マウスの脂質代謝異常 厚生省神経疾患

typeの疾患に類似した症状を示しているもの

研究委託費「筋ジストロフィー症動物の開と考えられる。但し、昨年度に報告した如くこ

発供給に関する研究」班 昭和58年度報の疾病マウスではmyofibrillar protease

告書P17−23，1984．

−

37

−

（2）Roe，J．H．；Determination

SpeCtrOphotometric method

Of．sugarin blood and spinai

for enzymatic carnitine

fluid withdetermination．Clin，Chim．

anthrone reagent．

J．BioI Chem，212：335，1954．

Acta135：247−251，1983．

（3）Ramsay，R．R．and Tubbs，P．

（5）Nonaka，工etal：Familiai

K．：The mechanism of fatty

distal myopathy with rimmed

acid uptake by heart

VaCuOieandlamellar（myeioid）

miyOVhonftis，An acylcarni−（myloid）body formation，

tinecarmitine exchage．FEBS

J Neural．Sci．51：141−155．

Lett

54（1）：21025，1975．

（4）Deufel，T．and Wieland，（6）塚越廣ら：Distal myopathyの臨

0．H．：Sensitive assay of

床的，形態学的検討と1ysasome酵素活

Carnitine palmitoyl transfe−性，厚生省神経疾患研究委達費「筋ジストrase activityin tissue

ロフィー症の発症横序に関する臨床的研究」
丑昭和58年度研究報告書，190→194，

homogenates with a modified

1984．

−

38

−

′

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一一■■一一・￣・■￣

二1一／「⊥

・jJ・

図1．

Vacu01e形成所見

8ケ月齢の疾病マウスgaStrOCnemiusでは殆んどの筋線経が1ケ月以上の空胞を含んでいる（A）。縦断面では空胞は細長く、内容物は、完全に構紋を消失している（B）。HE染色（×350）

「■■■▼￣『■「二一；＝ゝゴ′−▼
一■■−J㌢司攣攣
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＿＿＿ 塁盛党

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手篭宅章毎麗声琴A「「笥環夢

B

B〟
■

図3．
Sudan Black染色による組織化学的所見
凍結切片を染色すると、複数の濃染物質の集合が見られる（A）。従って
空胞内容物は脂質構造物を含んでいるものと思われる（B）。（×400）

昭和59年度厚生省研究報告書，45−52，1985

Ⅷ−3．筋ジストロフィー症マウスと小人症

マウス：筋成熟成長障害の比較
戸

塚

武●

研究協力者 渡辺貴美：浦本 勲●
マウスの筋ジストロフィー症は、世界的通説

し、不思議なことに、dw筋は正常筋と殆ど同＿である筋の進行性変性による疾患ではなく、筋様な加齢変化を示した。また、dy−dw筋は、の成熟成長障害による疾患であることを、実験

dy筋と同様な性質を示した。そして、組織学的に明らかにしてきた。発症と症状増悪は、成的分析から、筋線経の大小不同と中心核がdy−長の止った筋が成長し続ける骨により引き伸ばdw筋の特徴として抽出された。

されるためであると考えられる。実際、骨を含今回の研究は、dy−dwマウスの生化学的同む全身の成長も抑制されたdy−dw（dw：小人定法の開発と、dy筋の成熟成長障害が筋線経症）重複疾患マウスでは、dy症状が不慮化すの分化の障害を伴っているかどうか明らかにすることを先に報告した。同じ年（1981），ヒト

ることを目的とし、dyマウスとdwマウスのとニワトリで、同じような結果が報告された。

筋中NADH−dehydrogenase（NADH−DH）

最近、成長ホルモン阻害剤の投与により、活性の加齢変化を比べた。

Duchenne型筋ジストPフィー症息児を治療材料と方法しようという試みが発表された三）しかし、成長抑制による dy症状軽減は、あくまでも対症療動法でしかないと考えられる。完全な治療法開発

dyマウス（C57BL／6J dy／Zy）dwマには、前臨床期のdy筋病変を描まえる必要がウス（DW／J dW旬び）と、それぞれに対応しぁる≡）

た正常マウスを用いた。dyマウス（遺伝子型物dy症状の不疏化したdy−dwマウスの筋に：dy／匂y）は、後肢の発症（14日齢頃）によ

dy筋の特徴が認められるなら、その特徴は、って初めて、正常同腹仔（遺伝子型：dy／午と前臨床期のdy筋病変と考えられる。dy−dw七4−）と区別できるようになる。逆に言えば、

マウスは、外見上dwマウスと区別できない。

それ以前にはdyマウスの同定ができない。し成長ホルモンとチロキシソを授与しdw症の治たがって、以下の実験で14日齢以前の各結果療を行うと、dy−dwマウスは成長に伴いdy（各図中、半分黒塗りの九）には、邦の確率で症（後肢の引きずり）を発症することで初めて

dy マウスの値が含まれていると考えられる。

同定が可能であった。最近になって我々は、電NADH−DH酵素活性の測定

気生理学的方法により dy−dvマウスを同定す摘出した組織を、30mM potassium

ることに成功した≡）同時に、電気生理学的にも

phosphate buffer（pH7．5）で洗浄

dy筋の成熟成長障害が明らかになった曾しか後、ハサミで細斬した。100mM potassium●愛知県コロニー・研究所・生理

ー

45

−

phosphate bufferを加えてPolytron
PT−10でホモジナイズし、低速遠心による上；二五百声音○ロ

清を試料とした。
酵素活性の測定は、基本的にGalanteとHafetiの方法に従った：）5mMNADH，7mM potassium ferricyanide，40mM potassium phosphate buffer（pH7．5）を基本反応液とし、37℃で、410nmにおける吸光度の減少（ferricya−
60

nideの減少）を測定した。試料非存在下の吸人9●Ot Mou■●（d叫−）

光度の減少を非酵素的分解として差し引いた値

図1・筋ジストロフィー症（dy）マウスの体重成長障害。

を、酵素活性とした。1分間に0．001の吸光度の減少（光掩長：10m）を示した場合、反応

白丸：対照正常マウス。黒丸：dyマ
ウス。黒白の九：発症前のdyマウス（力の確率）を含む同腹仔。各丸は、一匹の結果である。

液1畑中の酵素量を、1酵素単位（unit）とした。各組織の酵素活性値は、組織湿重量呼あたりのunitで表わした。

前肢筋はdy遺伝子の影響をあまり受けていな
結果

いと考えられていた。しかし我々は、前肢の耐dyマウスの体重成長障害

久力が、1月齢以降急速に減衰すること、前肢先に我々は、dyマウスの体重成長障害に特筋が、生化学的にも、組織学的にも、後肢筋同徴があること￣を報告した。すなわち、正常マウ様な病変を示す（時期的にも同様）ことを明らスの体重は、生後20日から30日頃にかけてかにした。また、前肢筋、後肢筋の初期病変は、特に目立った増加を示すのに、dyマウスでは、変性ではなく、成熟成長障害であることを、兄

これが殆ど見られない。体重成長障害は、dy

いだした。

マウスの発症按構が成長障害であると考えられdyマウス前肢、後肢において、筋の成長障

る一つの証拠であり、重要であるので、再度調害が見られることを、先に報告した。今回さら査し、ほぼ前回と同様の結果を得た（図1）。

に、前肢と後肢の成長障害発生時期が同じであdyマウスの前肢筋と後肢筋の成長障害

るかどうかを確認するため、肪湿重量の加齢変dyマウスの前肢筋も、症状が進行増悪した化を再点検した。前肢筋（図2）、後肢筋（図段階では、後肢筋同様に病変を示すことは、dy3）とも、やはり同様に、30−40日齢頃以マウスが初めて報告された時から明らかにされ降、殆ど成長が止っていることが、確認された。

ている。しかし、後肢の発症後かなりの時期

前肢の症状が軽いのは、筋の相違によるので（例えば3月齢以降：後肢の扱能は完全に麻痔）はないことが、この結果からも明らかである。

になっても前肢機能は一見正常に見える。実際、

これは、後肢骨に比べて前肢骨の伸長成長が著前肢で餌を抱えて食べるし、体を移動させる。

しく低い（正常マウスでも同じ）ことによるこ

一

46

−

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8

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‡一；1−‡」dy…
L撫︼lゴ70l○；●−︑○∈二三号室−●主

○

0
60

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8

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l

；＋一二」一一d，
●

60

120

Ag●○t Hou事●（d■叩）

Age ot Mouse（d▲yS）

図2．筋ジストロフィー症（dy）マウスの前肢筋の成長障害。

図3・筋ジストロフィー症（dy）マウスの後肢筋の成長障害。

正常マウスで、20日齢前に急激な筋成長が見られる。dyマウスでは、20
日齢以前にすでに筋成長障害が観察される。しかも、30日齢頃以降、殆ど筋成長は停止してしまっている。

図2の前肢筋の場合と同様に、正常マ
ウスで、20日齢前に急激な筋成長が見られる。10−20日齢軌ま、体重
成長の小休止期にあたることから、20
日齢頃は体重の割に筋力が強まっていると思われる。実際、この弓削ま、飼育
ケージの中で跳躍運動がよく見られる。

とを、すでに明らかにしている。
dyマウスの脳と心臓の成長dyマウスで、骨格筋以外の組織の成長はどは、長さ、太さとも、ある程度の時期までは、

■■

r
t

H

の骨の方がかえって良く伸長するという結果に

00

重あたりの相対成長としてみると、dyマウス∞

ほぼ正常であることを、先に明らかにした。体

折目dy・
00

︵ロ∈︶≡亘●章一●妻うであろうか。前肢、後肢とも長管骨について；手なった。葦丸についても、似たような結果を得

書‡

；！；日，

ている。
60

今回、脳と心臓を調べたところ、湿重量でみAg●るかぎり、dyマウスにおける脳の成長障害が

図4・筋ジストロフィー症（dy）マウスの脳と心腋の成長。

非常に軽いこと、心臓の成長障害は顕著である
ことがわかった（図4）。心臓は、骨格筋と同脳に関しては、dyマウスでも殆ど正常に近い成長が見られる。しかし、dy
マウスの心臓に関しては、前肢筋、後肢筋程ではないけれど、明らかに成長障害を受けていることがわかる。

じく横紋筋でありながら、骨格筋（多核の細胞体）と異なり単核細胸であることから、dy症の発症段梓を考えるうえで重要な情報を提供し−

120

OI MouS●（血yt）47

一性についても、脳、肝施と共に骨格筋と比較検討した。
dYマウスの後肢筋におけるNADH−DH活
性の加齢変化
正常マウスのNADH−DH

活性値は、14日一一

齢から25日齢頃にかけて顕著に減少し、それ0以後、低いレベルに落着いた。これは、組織化学的にみて、未熟な0Xidative0活︵●n茨︼一〇∈︑宅コ︶を主U＜てくれるかもしれない。そこでNADH＿DH

0

60

筋線経が

Age QI Housモ（由yS）

glycolytic筋線経へと成熟分化することと

図5．筋ジストロフィー症（dy）マウス後肢
筋の：JADH−dehydrogenase．

一致している。最近のSilverman＆At◆−
WOOdの報告でも、生後2週齢から1月齢にか正常筋では、25日齢頃まで、急速に活性値が低下し、それ以降は低値に落着いている。ところが、dy肪では目立った減少が見られず、14日齢から110日齢にかけてずっと高値のままである。

けてマウス（C57BL／6J）の俳腹筋で、ミトコンドリアの容積界が顕著に減少することが明らかにされている。
dyマウスでは、14日齢から110日齢まで、
ほぼ同様な高いNADH−DH

活性が観察された。

動の大きい時期にあたるからかもしれない。

正常マウスと比べて、2−3倍と高く、全体にバラツキが大きいことが目立つ。この結果からSiiverman＆Atwoodは、dyZI筋のミも、加齢と共に変化するのは正常筋の方であり、トコンドリア容積界は、正常筋の場合と同様にdy筋は若い状態に止っていることがわかる。

2遇齢から1月齢にかけて減少すること、しか最小二乗法で引いた直線（図5：dy筋の値）

しその後、低値で落ち着く正常筋と異なり、再を参考にしながら、正常マウスの加齢変化を大び増大することを報告している。今回 dyマウ

まかに外挿していくと、10日齢頃に両者は同スの値はバラツキが大きく、実際には、全く加じ値をとるのではないかと思われる。発症前の齢変化がないのか、それとも、ある程度の加齢マウスでの分析結果（12日齢）は、国中で半変化はあるのか、はっきりとはわからない。し分黒塗りの九として表わしてある。各九は、一かし、ある程度の加齢変動がある可能性は否定

検体の結果であり、これらの結果の一部（確率できないにしても、本質的にはやはり成熟成長

的には％）は、dyマウスの値のはずである。

が殆ど止ってしまっていることを示しているとこれらの結果の．ミラツキが大きいことは、一ち思われる。

には、このように正常マウスと dyマウスの値

dYマウスの前肢筋におけるNADH−DH活が混在しているためであろう。また、正常マウ

性の加齢変化スの加齢変化がこの頃急激であることも反映し前肢筋における

NADH＿DH活性の加齢変化ていると思われる。dyマウスの結果にバラツ

は、図6に示す。後肢筋の値に比べると、前肢キが大きいのは、成熟成長停止時期が、活性変筋の値は、正常筋でも dy筋でも少し高めであ

−

48

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Ag●Ot Hou暮●（血ys）十i〇・ 白くN

0

120

60

書dy

図6．筋ジ＿ストロフィー症（dy）マウス前肢筋のNADH−dehydrogenase．
後肢筋（図5）と殆ど同じ現象が見ら
れる。

‡…

…；dy

60

120

Ag●Of Mous●（days）

図7．筋ジストロフィー症（dy）マウスの脳、心臓、肝臓におけるNADH−dehydr0−
genaSe・った。その他については、はっきりとした加齢変化を示すのは正常筋の方であること、バラツキが大きいもののdy筋の値は14日齢から正常マウスにおける加齢変動が、前肢筋、後肢筋ほど目立たない。また、dy
マウスの値にとくに異常は見られない。

110日齢の長期にわたりほぼ一定であることなど、後肢筋の結果（図5）と殆ど同じであることがわかる。
dyマウスの脳、心臓、肝席におけるNADH−

30日齢頃から110日齢過ぎにかけて、dy．マ
ウスと正常マウスの値に殆ど差は認められなか

DH活性の加齢変化
正常筋で見られたNADH＿DH

った。

活性の加齢変dwマウスの後肢筋におけるNADH−DH活

化が、筋の成熟分化に特徴的なものであるのか、性の加齢変化

また、正常筋とは異なり dy筋では殆ど加齢変化が見られなかったけれど、この特徴がdyマ

正常マウス（57BL／もJ）の筋で見られたウスで筋だけのものなのか、あるいは他の組織

NADH＿DHでも見られるのか、を明らかにするために、脳、のマウスでも同様に見られるかどうか、筋線経

心臓、肝臓を調べた。結果は、まとめて図7にの如ヒと開通したものであるかどうかをはっき示す。まず成獣で調べたところ、脳、心減、肝りさせるために、dwマウスと、その同腹正常

臓ともに、dyマウスで異常値は観察されなかマウス（DW／J）の後肢筋の分析を行った（図ったので、20日齢前後は検討しなかった。念8）。

活性の加齢変化が、他のStrainのため、若いマウスとしては、発症前の3匹

正常筋では、やはり加齢と共にNADH−DH（確率的には1匹位dyマウスが混入している活性の減少が見られた。典型的な成長障害モデ可能性あり）を分析した。図からわかるように、ル動物で、体重も正常マウスの％位にしかなら

一

49

−

下垂体萎縮により、成長ホルモン（GH）もテロ〇〇筋で観察されたこのような成熟成長はGHや爪には依存していないと考えられる。dw筋と異

18

0

●竃

00 ● 暮〇なり、dy筋では筋線経の肥大伸長成長障害と同時に内的成熟成長障害も見られることを明ら■嘉もUO

7コ霊；DE︑l−uコ︶−−≡−U＜

キシソ（T4）も殆ど欠如していることから、血かにしてきた。今回の結果でも、dy筋で内的8dw

成熟成長障害があることが確かめられた。
dw筋で見られるGHとT4非依存性成熟変化

0120がdy筋では見られないことは、dy遺伝子の240作用がGHやnの量的、質的異常に関係したもAg●Ot Houso（days）のではなく、またそれらに対する受け入れ態勢
図8．小人症（dw）マウス後肢筋のNADH−（例えば、受容器）異常にも無関係で、もっとdehydrogenase．
白丸：対照正常マウス。黒丸：dwマウス。dwマウスでも正常マウスと同様、加齢と共に活性減少が見られる。

基本的な筋の自力成熟機構（神経には依存しているかもしれない）に関係している可能性を示唆している。

ないdwマウスの筋でも、殆ど正常筋と同様な

dy−dw重複疾患マウスの筋にはdy筋の特加齢変化が観察された。dwマウスの筋線経は、散が見られることから、もし筋成熟成長が直線正常マウスの筋線経と比べると著しく細い状態

的プログラムに従って起こるとすれば、少なくに止っていることから、加齢に伴うNADH−DH

とも筋に対してはdw遺伝子より活性（筋湿重量あたりの）の減少は、筋線経が方が先に影響を及ぼしていると思われる。とこ肥大伸長するために酵素の濃度が薄くなるためろが、体重成長障害時期から見ると、dw遺伝ではなく、筋線経の内的成熟変化の反映であろ子の影響の方が早い。すなわち、dyマウスのうと考えられる。

体重成長は、生後20日齢以降顕著に抑制されdy遺伝子のるものの、それ以後も徐々に進行するのに対し考

察て、dwマウスの体重成長は、それよりかなり同じく成長障害を受けているものの、dy筋

早く5−6日齢頃から抑制され始め、20月齢とdw筋では、その様子がかなり異なっている

前には殆ど停止してしまう。 dy遺伝子は成熟ことがはっきりしてきた。現在のところ、dw

成長機構に関与していると思われるが、もし筋筋の成長障害は殆ど筋線経の肥大伸長成長阻害（あるいは神経一筋）以外の組織にもひとしくだけが特徴として挙げられる。電気生理学的に影響しているとしたら、このようにはならない

も、組織化学的にも、ほぼ正常な内的成熟成長であろう。従って、現在のところ我々は、dy（筋線経の分化）をしていることを先に報告し

退伝子の作用は筋の成熟成長綴槙に特異的なもたが、このことは、今回のNADH−DH活性に関のだろうと考えている。

する結果からも確かめられた。dwマウスでは、−dy症の発症機構に筋の成熟成長障害が関係50−していることは、今回の結果によりさらに確か

成獣レベルでは、前肢筋、後肢筋で殆ど同様められた。筋ジストロフィー症ニワトリでも、に、対照正常マウスの値に比べて異常に高い活

筋分化の遅れがあることが報告されている6三性（湿重量あたりで）が筋ジストロフィー症マ

成熟成長障害の原田を追求することが病田の究ウスで観察された。しかし、加齢変化を調べた

明につながるであろう。残念ながら現在のとこ

ところ、筋ジストロフィー症マウスの値が加齢

ろ、筋成熟成長障害に先行する確実な異常は兄と共に進行性に異常になっていくためではないいだされていない。前臨床期の筋病態をまず明ことが確かめられた。すなわち、正常マウスのらかにしなければならない。このために、dy−活性値が14日齢から25日齢頃にかけて原著

dw重複疾患マウスは有用と思われる。dydwに減少するため、正常マウスの値と比べると見マウスは外見上dwマウスと区別できないが、掛け上、筋ジストロフィー症マウスの活性値が電気生理学的、組織学的に同定する方法を先に異常に上昇するように見えるだけであることが報告した。今回のrJADH−DH活性の分析により、わかった。

dyマウスとdwマウスが区別できることから、

筋ジストロフィー症マウスで、脳、心臓、肝dy−dwマウスの生化学的同定も可能になると臓におけるNADH−DH活性には、とくに異常は思われる。また、本研究班での横山と江崎の報認められなかった。ただ、心臓の成長（湿重量）

告は、前臨床期のdyマウスの検索を可能にす

はかなり抑制されていた。

るもので、期待される7三成長ホルモンとチロキシソの欠如による典型

dy筋線経の特定の細胞成分だけに成熟障害があるのなら、成熟成長障害機構解明への接近

的、全身性成長障害モデル動物である小人症マ
ウスでは、不思議なことに、後肢筋におけるは比較的容易であろう。しかし残念ながら、形

NADH−DH活性はほぼ正常な加齢変化を示した。

態学的に、大多数の肪線経は細いままであるし、小人症マウスと筋ジストロフィー症マウスにお中心核を持つ筋線経が多いこと、生化学的に、ける筋成熟成長障害の相違を追究することで、DNAあた．りの各種細胞成分含量は幼君のまま筋成熟成長校構解明の手掛かりが得られるのでであること、さらに膜の電気生理学的性質にもはないかと考えられることを討論した。

幼若さが観察されることなど、現在まで調べた範囲では、細胞の全体的成熟成長障害の可能性
が高い。

文

献

1．Co11ipp，P．J．，Kelemen，J・，Chen，S．Y．，Castro−Magana，

結論
M．IAmguloI

M・and

マウスの筋ジストロフィー症は、筋の進行性Derenoncourt，A：Growth

変性ではなく、筋の成熟成長障害による疾患でhormone inhibition causes

あることをさらに確かめるために、前肢筋、後increased seleniumlevelsin

肢薪、脳、心臓、肝膿におけるNADH−dehy−

Duchenne muscular dystrophy：

drogenase．（rJAI）H−DH）活性の加齢変化を
調べた。

−

51−

a possible new approach topotentials at medial

therapy．J．Med．Genet．，21：

gastrocnemius muscles of

254−256，1984．

dystrophic mice due topro10nged stimulation．

2．戸塚 武，渡辺貴美，浦本 勲：筋ジス
トロフィー症マウス．遺伝，38巻10号

J．〃e祝rOl．βetり

43−49貢，1984．

1984．

5．Galante，Y．M．and Hafeti，Y・：

3．Totsuka，T．，Watanabe，K．

Resolution of complex

and Uramoto，Z．：Differences

工andisolation of NADH dehydrogenase

among dystrophic，dwarf，andand anion−Sulphur protein

their crossbred mice in the〃e七九．加Zym‥

time course of changesin

6．其崎知生，吉川

extracellular muscle action
potentialsinduced by

66：59−66，

52：15−21，1978・

昭：筋ジストロフィー

および正常鶏における筋細胞内NADおよび

5−Hz

poly−ADP−ribose含量とStimulation・：Exp・Neur，0乙・，pOiy−

ADP−ribose合成酵素活性（筋発達過程

84：616−62611984．

におけるその変化）．江橋班報告集，117

4・Watanabe，K．，Uramoto，Z．

−121，1984．

and Totsukai T．：Ontogenetic
aspects of changesin muscular・7・

横山峯介．江崎孝三郎：体外受精法による筋ジストロフィー症マウス（C57BL／

6J−dy／dy）の作札本報告集，101，
1985．

−

52

−

昭和59年度厚生省研究報告書，53−55，1985

Ⅱ−4・キメラマウスを用いた筋ジストロフィー症の研究
勝木元庇…横山峯介●
1．研究日的性として存在する。キメラマウスを用いること

筋ジストロフィー症は遺伝性疾患であり、症の重要な点は以上のような組み合わせが一つの状については臨床的によく調べられている。し個体の中で実現されることから、筋ジストロフ

かし、疾患の本体である遺伝子の変異について

ィーに特有の病変が、キメラの個体の中でも部は、いまだによくわからないし、その結果、真分的に起り得るのか否か、もし起るならばどのの病因については不明の点が多い。ヒトの肪ジ細胞に起るのか、あるいは遺伝的に健常なもの

ストロフィー症と類似の症状を塁する実験動物にも起るのかを知り得ることにある。例えば神を用いて、病因をさぐり、治療法を検討しよう

経が突然変異細胞であって、その神経終末につとする試みは過去長く続けられてきたが、症状らなる筋肉がすべて遺伝的性質に拘らず筋ジス

モデルが必ずしもヒト疾患のモデルになるとはトロフィー症を示すなら、その突然変異は神経

限らないことも明らかとなってきた。本研究の性のものであることになる。すなわちヒト疾患

目的は、一つの個体が遺伝的にことなる2種類の直接のモデルとはなり得ないことを示すであ以上の細胞によって成り立つキメラマウスを用ろう。

いて、病因がヒトと類似しているかどうかをさ

以上のようにキメラマウスを用いる目的は、

ぐる方法の確立をめざすものである。

マウスから分離された筋ジストPフィー症モデ

ヒトの筋ジストロフィー症の多くは、肪原性

ル候補の診断をすることにある。

の病気であって、神経の変異に由来するものでないことが知られている。いま、筋ジストロフ

2．研究の方法

ィー様の症状を示す突然変異マウスと健常マウ

キメラマウスの作成については、横山らによスとの間にキメラを作成したとする。このキメってきわめて高率にできることがすでに報告さ

ラは、神経、筋ともに突然変異由来の細胞およれている。しかし系統問の差は著しいものがあび健常由来の細胞の両者より成り立っているかり、組み合わせ方にも工夫がいる場合もあるから、それらの相互の接触の様式には、突然変異

ら、用いる系統毎に吟味する必要がある。

神経細胞と突然変異筋細胞、突然変異神経細胞

また、dy／dyのように、それ自体では生殖と健常筋細胞、健常神経細胞と突然変異筋細胞、能力のないものは、体外受精によって胚を得る

健常神経細胞と健常筋細胞という4種類が存在必要がある。

するはずである。さらに、筋ジストロフィー症

キメラ作出法の概略は次の通りである。今回の病因が、神経や筋肉以外のところにある場合の実験に用いたのは、C57BL／10−m血も想定されるし、液性の田子による場合も可能

BALB／eAであった。l唯のmdJおよび・（財）実鮫動物中央研究所…東海大学医学部
−

53

−

と

BALB／cAをそれぞれ椎のmぬおよびBALB

とくに病理、生化学、生理学等について重点的／。Aと交配し、膣栓がっいた日を第1日目とに調べられる予定である。

して、第3日日に、卵管および子宮を渾流して、

3．研究成果それぞれの8細胞期の胚を集める。8細胞期の胚をプロナーゼで処理し、透明帯を除去した後、本研究は、まず訊ね十→BALB／cAキメラ5

培養液で3回洗浄し、PHAを含む培養液中で、匹を得ることから始められた。訊ねは、体外授2種の胚を、それぞれ1個ずつ、物理的に接触精の必要もなく、胚採集および、キメラ作成にさせ、37℃で約4−6時間培養する。2つのっいては、とくに他の系統とことなる点はみら胚は集合し、1つの桑実胚状の胚になる。さられなかった。作成の成鏡は次の通りである0に1夜培養を続けると胚盤胞に達するから、こ（表1，2）

れを偽妊娠雌マウスの子宮に移植しこ19日後

それぞれのキメラ個体の、キメラ性のノミターにキメラマウスを得ることができる。キメラ性

ンには偏よりがみられた。しかし得られた個体の判定は、被毛の色（れ山一黒、BALB／cA一数が少ないことから、何らかの結論を出すには日）を指標とすれば、最も簡単である。アイソ

時期尚早と思われる。

表1．mぬ・→BALB／Cキメラマウス作成の成綴

集合胚数

移植数

13

13

BlO＿・初山

産仔数
7（39：38：1食殺）◆→BALB／cA

表2．得られたキメラマウスの外見

胤

性別

被毛の割合（劾白茶

黒0

キメラの判定

1

8

0

100

m血

2

8

10

10

80

キメラ

3

8

40

40

20

キメラ

4

9

0

0

100

mdJ

5

9

0

5

95

キメラ

6

9

5

10

85

キメラ

備

考

離乳後死亡

dy．旬y・→BALB／cA問、およ甲7ndG◆￣→

ザイムとしてはGpiが簡単で、m山一b，BALB／eA−aであるから、誕生後すぐに尾端（約1dyパly間でのキメラ作出を現在計画中七あり・m以下）を切りとれば、検出することができる。

そのためのマウスを繁殖中である。

作成したキメラマウスの解析は、第1班の基礎班を通して専門領域の研究者に配布された。

−

54

−

4．考

5．おわりに

察

本研究班の役割は、実験動物の供給と開発改

ヒト疾患のモデルとして実験動物を考えると良であるから、目的の項で述べたような研究がき、症状モデルから出発することは当然の方法

最終的に遂行されるのは、専門技術を有する研の一つではあるが、症状モデルがすべて疾患モ

究者による。したがって、キメラマウスが、目

デルとはならないし、むしろ慎重に解折をした的に沿った使われ方をするならば、突然変異でうえで、其のヒト疾患モデルを選ぶべきである。

ある訊ねや dッ の病因がどの組織に由来する

その過程では、勇気をもって、症状モデルであかを決定することができるであろう。

っても疾患モデルたり得ないと判断されるもの

キメラマウス作出の方法は、訊ね，dyとは棄てるべきであると考える。すなわち突然変

BALB／cAとの間に関しても完全に確立された異研究のために有用であることと、治療法開発と云える。

を目的とした動物実験のためのモデル動物の開発とは、研究戦略においてことなると考えるべきである。その一つの診断法として、キメラマ
ウス法を用い得ると考える。

−

55

−

昭和59年度厚生省研究報告書，57−75，1985

Ⅷ−5．震えを伴う起立不能症鶏の病態と遺伝
富

田

武●

研究協力者 若菜茂晴二 加藤重夫●
若杉 昇：渡辺 徹●
鶏では、Knowlton（1929）の先天性ロコ

胸に明らかな退化が認められている。

以来、多くの遺伝性神経疾患が報告されている。

また、Winterfield（1953）のcere−

そのなかで、震えを伴うものは、7例ある。

be11ar hypoplasia、河原（1955）のSeX−linked nervous disorder及びHutt and Child（1934）は、先天性震え（congenitai tremor）と名付けられ、Marksonら（1959）の変更遺伝子の影響を受け、低い浸透度を示す常degenerationはScottら（1950）の染色体性劣性半致死遺伝子に支配される異常を

shakerと遺伝様式、症状が近似しているが、報告している。この異常は震えで特徴づけられ

その表現時期や致死作用などに多少の相違が見

震えの強さは将化後2日で衰えるが、ほとんどられる。

の雛は死亡する。

Cerebe11ar

Winterfield（1953）らによって報告

Scottら（1950）は、性染色体性劣性遺伝

されているCerebellar hypoplasiaは子に支配されるHshaker−Iを報告している。

12遇齢頃に頭と首のうなづき運動及び左右のShaker

震えが見られ始め、興奮すると運動失調に陥いは僻化時は正常であるが4遇齢頃より特有の小さな素早い首や頭の動きが発現する。

る。しかし、激しい症状や致死作用は見られな

その症状は、発育につれひどくなり、ほとんどい。

のshaker

個体は栄養失調で死亡するが少数

河原（1955）の報告によるSeX−linkedの個体は性成熟まで生存する。この症状は、小n畠rvous disorderは、頭部及び頚部で小脳のプルキニエ細胞の退行性の欠損によること

さな速い振幅の震動を示す。震動の発現時期にが明らかにされている。

は変異があり、将化当時すでに発現しているもGodfreyら（1953）は、性染色体性劣性のから、将化後1ケ月を経過した後現われるも遺伝子に支配されるjitteryについて報告しのまである。異常雛は性成熟までに約半数が死ている。jitteryは頭が後へ引き込まれる症

亡するが、性成熟に達するものはほとんど正常状によって特徴づけられ、それに頭の素早い左と異ならない発育を示す。

右への震えを伴っている。この難は立っている

Marksonら（1959）によって報告されて事が困難であり症状の克進とともに採食不能といるCerebe11ar degenerationでは、なり、貯化後1週間で約90界の雛が死亡する

2ケ月齢頃に、頭と首の弱い運動失調と震えがが少数の鶏は性成熟まで達する。組織学的研究見られ始めるが、致死作用は見られない。

によりShakerと同様に小脳のプルキニエ細これらの異常鷲はどれも、小脳プルキニエ細・名古屋大学農学部

−

57

−

胸に退化が観察されている。またCerbe11ar℃に保ち、その後30℃の育雛器へ移動し、

hypopiasia及びCerebellar degene−

28日齢以後は、室温状態にした。餌付けは、

rationは、小脳発育不全や小脳の萎縮及び僻化後2日日に行ない、ゆで卵の卵黄をつぶし

顆粒層の神経細胞の退化が観察されている。

て粒状にしたもの、又は、チックフード（日本Somes

ら（1978）は、常染色体性劣性遺

農産仏製）の練り餌を散布給与した。2日目以伝子に支配されるShaker−2を報告している。

後より4週齢までチックフードを与え、その後

これは、特化当時には観察されず、4遇齢頃に10週齢までは中雛用飼料（日本農産仏製）、

小さな素早い震えが観察され始めるなど症状、

10遇齢より20適齢までは大雛用飼料（日本

発現時期等においてShaker に近似している。

農産は製）、20遇齢以後は成鶏用飼料（L−

その他、七面鳥のVibrator、ウズラの暗110，日本農産姐製）を給与した。水は随時新色羽神経異常突然変異などで、震えを伴う神経

鮮なものを与えた。
3）症状の観察異常が報告されている。
本研究では、国立遺伝学研究所より導入した発症時期、症状の変化、及び死亡時期を随時

横斑プリマスロック種に兄い出された、震えを観察して記録した。

伴う起立不能症の突然変異について、その病態

4）遺伝様式と遺伝に関する基礎的研究を行なった。

交配記録より症状の発現率を求め退転様式を推定した。

材料及び方法5）体重測定1）実験鶏各個体を1週毎に体重測定し、その推移を発実験に使用した鶏は、国立遺伝学研究所より症個体と正常群とに分け比較した。

1981年に種卵で導入された横斑プリマスロ6）骨格の観察

ック種の後代で、当教室でClosed colony

12遇齢時に体表より尺骨の長さ及び脛骨の長さを測定し、この症状が骨に影響を及ぼしてとして維持されているものである。

2）飼育方法

いるか否かを検討した。

雄1羽に対して、雌1−2羽を交配し、・種卵7）血液検査を得た。種卵は12℃の冷蔵庫に保存し、2週

赤血球数、白血球数及び血菜蛋白量をそれぞ

間分を同時に僻卵器へ入卵した。僻卵器は立体れ計測し、この症状が血液成分に対し影響を及

式僻卵器を使用し、摂氏38℃に調整し、適当ぼしているか否かを検討した。血液はヘパリンな換気を行ない、湿度は60−70珍とした。

で内壁を湿らせた注射器を用いて翼下静脈より

1回日の倹卵は入卵後10日日、2回日の険卵採取したものを用い、以下の血液検査を行なっは18日目に行ない、2回目の検卵後、下段のた。赤血球数、白血球数は14適齢時の個体よ

発生座に移動し、加湿した。僻化後、雛の羽毛り採血し、稀釈液としてNatt＆Herrick

が完全に乾くまで発生座に置き、入卵後23日

液を用い、採血ピペットで100倍に稀釈し、血目に個体別に脚帯をつけ、育雛器へ移動した。

球計算盤を用いて計測した。血疑蛋白量は13

育雛器の温度は、生後14日齢まで35−40

齢時の個体より採血し、12，000G、5分間違

−

58

−

心分離を行ない血菜と血球に分離し、血環であ方法によった。泳動に用いたゲル濃度及び泳動る上澄液を試料として屈折式血清蛋白計を用い条件を表1に示した。なお、電気泳動は4℃のて測定した。

低温室内で行なった。

8）筋電図

C．蛋白質及び酵素染色法

正常個体及び発症個体についてそれぞれ、横蛋白質及び酵素の染色法を表2に示した。ま

突間筋（頚部）、浅胸筋、大腿二頭筋の活動電

た、アイソザイムの発色は、37℃の恒温器内、位を召出した。電極としては、％又は烏の皮下

遮光条件下で行なった。

注射針の中に、％の針には直径0．25mmのエナ10）組織学的観察

メル絶縁銅線を、亮の針には直径0．15mのエ屠体より小脳を取り出し、正中線で切断した。

ナメル絶縁銅線をそれぞれェポシキ樹脂系接着

その後、固定、ノミラフイン包哩を行ない、正中剤で封入固定して、封入線の先端を露出したも断面より15／▲m毎にミクロトームを用いて切のを用いた。測定に当っては鶏の肩関節の付近片を作成した。染色後の組織切片は光学顕微鏡と足板問関節の付近とを固定した。

で観察した 。染色法は、・KIGver−Barrera

9）電気泳動法、Bodian法の大塚変法、Cajala．試料の調整の神経

渡銀法の第皿法をそれぞれ用いた。なお、各染色法は佐野豊の著書・「組織学研究法」（1965）

へノミリンで内壁を湿らせたテルモシリンジ注に基づいて行なった。

射針付の1戒注射器を用いて翼下静脈から採血

KIGver−Barrera法ではホルマリン固定、し、直ちに4℃の低温室中で12，000G、5分
間遠心分離の後、血菜と血球に分離した。赤血

プアン固定で、発症鶏をそれぞれ1例ずつ、球はその後、生理的食塩液（09界NaCl）でBodian法の大塚変法では発症鶏を1例、3回洗浄した。各試料は、−20℃の冷蔵車で保存した。各試料は泳動前に解凍し、蒸留水でCajalの渡銀法では発症鶏を2例、正常鶏を1例、それぞれ組織切片を作成した。

稀釈後、Sample diluting solution

Cajalの渡銀法で染色した切片は、正中断（pH6．8，0．5H Tris−HCl）と1：1の面を基準とし、90Jlm毎の切片を360／用

割合で混合した。蒸留水との稀釈割合（試料：まで、50倍の拡大鏡を用いてトレース紙に投蒸留水）は、血策の蛋白泳動で1：20、血球

影し、プルキニエ細胞をプロットした。プロッの蛋白泳動で1：50、血渠エステラーゼで1トの方法は、プルキニエ細胞間の間隔が100：2、血球乳酸脱水素酵素（LDH）で2：5と〃m以上のものは空自とし、間隔がそれ以下のした。

ものを実線で結んだ。発症鶏2例のうち1例は、

b．ポリアクリルアミドゲル垂直式微量電気泳さらに45ノ m毎の切片についてトレースし、動法

プロットをした。

電気泳動は、今までのポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法に比べ、ゲル及び試料が少量で済

結み、経済的な方法として開発され解像力も優れ

1）病態の観察ている、Ogita＆Markert（1979）の発症は、頭部及び頭部が小さな速い振幅で霹

−

59

−

果

表1． 泳 動 条 件

表2． 蛋白質及び酵素の染色法−ポリアクリルアミドゲル垂直式数量電気■白す

C・B・さ・R・101utloれtln鵬叫1

泳動法−＿、（Ogita＆Markert，1979）▲1eoh011

25■1

九〇tlvl▲1eohoI

15

H20

G●l pH O・82・St■dt nさG●l pH O・8

0．75●Th● ●l■叫r●d●■hln●dby叫●▲t●dV血ln■lnlαl■eOtlc ■eld．

H，Trl−hC1

0．125■■1

5■1

8ufT●r Sy事t●■

1・R■皿nln

5■1

25t Trld110rO■eOtle▲Cld

Trl■−HC1

L D H
8ufr●rpIt6・80●5pけ8・30・0129t Trl●一°1y￠18●

1

山叫叫叫■115■2劫

3・S▲■pl●dllutlntS01・■．El●￠trOd0

Trl■」忙l…Sodlu■L▲tt■●
〝▲♪
H T T

Con■t叫tturr〇八tl■▲／61■ldthorG●1
PII S

Pmt山▲如叩▲旦靂白

慧慧：諾…：；Tl岬他山
121

O．lII Trl■−HCl

hrrtr．pH8．0

2．5

▲尊王白

101

2．5

▲仁一入り−ゼ

8暮

2．5

6暮

■．0

1鷺

■・′−れ岬h叫l butJr■t●●

Fut81u●RR

lt

lO←■

む！旦−pOt且的lu叩h叩h■t●burr●r・pH・…聖上●1几▲￠●bn●■0111tlon

動するという神経症状で観察された。発症時期

んど全ての発症個体は、衰弱の為、性成熟までには変異があり、多くの個体では酵化当時すでに死亡した。しかし、性成熟に達した個体も1に観察できたが、好化後1ケ月を経過してから現われるものもあり、遅いものでは7遇齢と8例あり、その後1年以上生存した。．この個体の性校能は冠が発達していること、及び腹部マッ遇齢の問で発症した。また、梅雨期過ぎに僻化

サージにより精液射出を認めたことより正常でした発症個体は全て、将化当時に発症が認めらあると思われた。なお、全般的にみて雌の発症れた。発症後、成長するにつれ、どの個体も震個体の方が雄の発症個体よりも各症状が強く現

えは増加的に激しくなった。震えの程度には若われたようであった。

干の変異が認められた。震えは左右の動きが基2）遺伝様式礎になっているが、それに加え前後のうなづき

表3．に各交配よりの遺伝解析の結果を示した。

運動を伴うものもあった。また、震えは緊張や交配は全て見かけ上は正常な鶏同士で行なった。

怯えにより一層激しくなるようであった。震え発症個体が生まれた交配と正常鶏のみが生まれは、7−9週齢で最も激しくなり、その頃からた交配を比較すると、受精率、将化率ともに差

脚弱症状が見られ始め、10適齢を過ぎる頃かは認められなかった。LXXX皿と雌105の交配

ら、普通には立ってい，られず、足棍問関節で体およびLXXXと97，98

を支える様になった（図1）。また、普通に立体の発現率は22．19もであった。これらの交配っていても、バランスが悪く、つまづき、よろから雌雄両性の発症個体が出現した事と正常鶏めき、転倒なしには歩くことが出来なくなった。

と発症個体との比（81：23）から、これら症状がさらに進むと、転倒後、なかなか起き上の発症は常染色体性劣性遺伝子によって支配さがれない様になった。しかし、震えは、20週れるものと推定された。なお、8月以前の交配

齢を過ぎる頃から緩やかになっていった。ほと

記録と9月以降の交配記録を比較すると、8月

−

60

−

の交配での発症個表3． 起立不能鶏の遺伝分析（▲）

4）骨格の観察12週齢時において体表から尺骨の長さ及びBErORE▲UGUST▲rFECTED

SIRE D▲■皿Ⅰェ脛骨の長さを測定し、その結果を表4に示した。

PERCET▲GE

は】

105

15

皿l；；

35

3

20

25．0

なお、雌において、9遇齢時における比較が示

2

39

10・3

されているが、これは9遇齢で死亡した発症個（8〉mR SEPTE甑ER

体がいたためである。また、正常個体と発症個

22LmII lO5

13

3

■

20

35．O

Lm

18

3

4

25

28・0

23

104

22．1

冒；

TOT▲L

81

体とでは、体重に大きな差があり、実測値そのものの比較では骨に影響が及んでいるか否かは判断できないと考えられた。そこで、実測値を体重の立方根で除した値を補正値として示した。
発症群と正常群の補正値を比較すると、その以前に比べ9月以降では、発症個体の発現率が値には有意差は見られなかった。

上昇していることが判った。

5）血液検査3）体重測定14遇齢時における赤血球数及び白血球数を

各個体を1週毎に体重測定し、正常群の95

表5に示した。また、13遇齢時における血渠

秒信頼分布域と各発症個体の体重の推移を図2

蛋白量を表6に示した。どちらも雄についてのに示した。雄では、正常群とほぼ変わらない体

み示してあるが、これは、その遇齢において雌重の推移を示す個体と、正常群より低い推移をが生存していなかったためである。

示す個体とがあった。雌では2個体とも正常群

赤血球数、白血球教及び血渠蛋白量は、それより低い体重の推移を示した。なお、雄発症個

ぞれ正常群と発症群との間に有意差は見られな体において、大きな体重の谷を示しているもの

かった。

があるが、これは転倒時に巽がケージにはさま

6）筋電図

り、その影響により体重が激減したものである。

正常個体及び発症個体の筋電図を図3に示し

表4． 正常鶏と発症鶏の尺骨及び鎖骨の計測値（長さ）供試
右例数
実測値h）士SJE肌
補正値●士S．E加．
11 尺骨
7．57士0．193
0．830士0．0291
8正常鶏（平均体毛7吋〉●●
整骨10．49士0．219
1．148士0．0343
8発症鶏
5 尺骨
7．06士0．244
0．817士0．0286（平均体重688）
座骨
9．86士0．446
1．138±0．0184

9正常鶏（平均体重乃6）
9発症鶏
（体 東
減）

？是認
（平均体重492）

9星雲芸
（体盃

430）

7

尺骨

6．57士0．167

0．739士0．0208

脛骨
1 尺骨
脛骨

9．83士0．358
6．10
8．80

1．102士0．0223
0．740
1．068

6．25士0．171
8．63士0．111
5．90
8．50

4

尺骨
尾骨

1 尺骨
尾骨

左
実測値（m）±已E几
7．40士0．189
10．60士0．223
7．03士0．265
9．88±0．402

補正信士已E．M．
0．811士0．0286
1．154士0．0373
0．814士0．0276
1．142士0．0256

6．47士0．171
9．77士0．341

0．729士0．0247
1．096士0．0191

6．10

0．740

8．70

1．056

0．800士0．0199
1．107±0．0439

6．13士0．125
8．75士0．166

0．785士0．0248
1．121士0．0367

0．781
1．126

鼠80
8．40

0．768
1．113

● 補正値暮実測値÷〟体重●● 単位一g

−

61−

β

∫

／J

図2． 正常群の体重と発症個体の体重
ⅢⅢⅡ口正常群の体重平均の95界信頼分布域を表わす。
8−0−−0−発症個体

撤3927

一十一十一発症個体

他4302

9

￣夫．￣犬￣発症個体 撤3923 −●−●−発症個体 鳳4324 −0−0−発症個体 撤3926−4−ムー発症個体

撤4033−▲」L一発症個体

一

62

−

他4328

−人一打発症個体

胤4303

Jす
くH仰れ卯

表5． 正常鶏と発症鶏の血球数（14週給）
例数 赤血球数（×10シうふり士鼠E．M． 白血球数（×10ソhり土S．E．M．

正常鶏くる）10
発症鶏（8） 5

2766．4±64．86
2787．2士76．13

29．4±0．805
30．4±0．886

表6． 正常鶏と発症鶏の血策蛋白量（13週齢）

▲ 0

鶏 鶏

常症

● 0

正 発

例 数
14
−6

血妓蛋白量（gパ加）± aE即．
3．80 ± 0．107
3．87 士 0．070

しい（a），（d）；発症鶏の筋電図 （b），（e）；正常鶏の筋電図（a），（b）で、上部は横突間筋（頚部），下部は浅胸筋より導出（e），（d）で、上部は横突間筋（頚部），下部は大腿二頭筋より導出
・1日盛1秒…較正電圧200ノlV
−

63

−

た。正常個体の筋電図と発症個体の筋電図は一り、横突間筋（頚部）、浅胸筋及び大腿二頭筋

見して明らかに異なっていた。しかし、発症個の全ての波が低振幅になった。しかし、胸や足体の筋電図は、本来の活動電位の他に、震えがに手を置いても震えは止まらず、構突間筋（頚大きすぎる為に電柾や導線がその影響を受け、部）、浅胸筋及び大腿二頭筋の全ての波は高振

その結果、波が増幅されている可能性が高い。

幅のまま継続した。これらの成績を図4に示した。

発症個体の首の上に手を置くと、震えは止ま
l仇l

首の上に手を置いた

足の上に手を置いた

▲

■

上 水

首の上に手を置いた
図4． 発症鶏筋電図（a）；上部が構突問筋（頚部）下部が大腿二頭筋より導出（b）；上部が横突問筋（頚部）下部が浅胸筋より導出
・1目盛1秒＝校正電圧200JlV

胸の上に手を置いた

−

64

−

発症個体の構突問筋（頚部）及び浅胸筋の活なかった。

動電位を導出している時に、一見睡眠状態にあホルマリン固定の後、Kliiver−Barrera

るかのように、全身の力が抜けた安静状態にな法で染色した組織切片像の観察では、分子層、る場合があったが、この時には震えが止まり、顆粒層に異常は認められなかった。しかしプア

その後普通の状態に戻った時には震えが再発しン固定の後KIGver−Barrera法で染色た。

した組織切片像、Bodian法の大塚変法を用発症個体の連続した筋電図測定において、そいた組織切片陵およびCajalの渡銀法を用いの振幅は高くなったり低くなったりしたが、そた組織切片像では、どの切片の観察でもプルキの変化に規則性は見られなかった。しかし、横ニエ細胞の欠損が認められた（図8）。

突間筋（頚部）、浅胸筋、大腿二頭筋相互の筋

Cajalの渡銀法を用いた切片を拡大鏡で拡電図の振幅の変化には関連性が見られた。

大し、トレース紙にプルキニエ細胞をプロ■ット7）電気泳動した結果、プルキニエ細胞の欠損個所は発症個

血渠蛋白の泳動像を図5に示した。バンドが体、正常鷲のどちらにも認められた。しかし、うすくて見にくい所もあるが、これは発症群内

発症個体の方がその数が多く認められた。ただでも正常群内でも見られ、発症群国有の変異はし、この場合、小脳の菜と菜の間の溝の深部に見られなかった。

おける欠損は考慮に入れないものとした。これ

血渠蛋白の泳動像には成長に伴って現われるは、Braitenberg（1967）の小脳の葉と葉変異は見られなかった。血渠蛋白および血球の問の溝の深部より葉の頂上部の方がプルキニ

LDHの泳動像に変異は全く見られなかった。

エ細胞間の間隔が狭いという報告に基づいたも血渠エステラーゼの泳動像には活性の違いがのである。

認められるものがあったが、この違いは、発症

また、発症個体のプルキニエ細胞の欠損は面群の中でも、正常群の中でも見られた。従って、としての広がりを持っており、それに対して、発症帯固有の変異とは考えられなかった。

正常鶏のそれは線としての広がりでしかなかっ

8）組織学的観察

た。発症個体における欠損はどの葉においても

屠体より小脳を取り出した後に主要臓器の観見られたが、特にⅢ菜とⅨ葉で顧著であった。

察をおこなったが、発症鶏特有の異常は見られ

さらに、発症鶏ではdendriteが正常な方なかった。しかし、仙骨神経叢にはリンパ球浸向へ伸びていないプルキニエ細胞も観察された潤が見られた（図6）。脳の全体像を図7に示（図9）。正常なdendriteは分子層の方向した。正常鶏の脳に比べて発症鶏の脳はやや小へ向かって樹枝状構造を広げていくが、この型であった。（湿重量で約シ句）。これは、適

dendriteは顆粒層の方向へ向かっていた。

齢、性別も同」でなく、また、例数もこの1組

なお、プルキニエ細胞の収縮や、dendriteのものだけであるので脳の大きさについては今の正常、異常はGolgi−Cox法による組織切後の調査が必要である。しかLtWinterfield

片像の観察結果を待たなければならない。

（1953）やMarksonら（1959）の異常鶏で見られたような小脳の著しい萎縮は認められ

−

65

−

図8・

Cajalの神経渡銀法第皿法による異常鶏小脳組織切片像（8）×50

一

66（b）×100−考くなるのではないかと考えられる。つまり、脱察本研究に使用した鶏の震えの発症時期に変異力状態では、筋肉の緊張はあまり見られず、そが見られる事は結果において述べたが、その中れにより震えは止まる。逆に、怯えた時には体で、最も発症の遅かった個体においては症状のに力が入り、筋肉の緊張度が高まり、それによ進行も他の発症個体より3、4遇遅れていた。

り震えが激しくなるということである。なお、この個体は、頭部、背面に綿毛が残存し、まく

震えが止まるという事は、Hutt

れ上った羽毛が巽に少々存在するだけで、他の（1934）の先天性震えでも報告されている。影腹部等の羽毛は存在しなかった。この症状が震響を受けた鶏は、しゃがんで休息している時にえ症状を遅らせた原因であるかも知れない。

は震えが止まると報告されている。しかし、本交配記録よりの遺伝解析で、発症個体が生ま

＆

Child

研究の発症鶏は、しゃがんで休息している時にれた交配において、9月以降、受精率、将化率

は震えは止まらなかった。

が減少したにもかかわらず発現率が増加した。

今回の電気泳動では、血菜蛋白、血球蛋白、

これは、発症鶏の発現に、季節による温度、湿血策エステラーゼ、血球LDHについて検索し度、日照時間等の影響が関係しているのかも知

たが、発症鶏固有の変異は見られなかった。これない。また、この結果から、発症個体の死にの症状は何等かの致死作用を伴っているようでごもりは考慮しなくても良いと考えられる。

あり、発症鶏の系統を維持するには、保困鶏

正常鶏に対する発症鶏の発育の遅れの原田は、（Carrier）の状態で維持する事も検討しなけ

震えによる消耗、衰弱及び飼料摂取の阻害などればならない。血策や血球の電気泳動により発が考えられる。しかし、正常鶏と異ならない発症群国有の変異を見つけ出し、鶏を殺すことな育を示す鶏と、正常群より劣った発育を示す鶏くCarrierを判別する事ができれば、発症鶏とにおいて、その震え等の症状や、飼料摂取のの系統の維持を容易にすることであろう。

様子に違いは見られなかったので、その点に疑組織学的観察の項において、正常鶏にもプル問が残る。

キニエ細胞の欠損が認められたと述べたが、本また、転倒時にケージに異がはさまり、その実験では発症鶏を生む可能性のある交配のみを影響で体重が激減するという事もあったので、・組んでいる為、表現型は正常でも保田鶏（ca−発症鶏の飼育ケージには安全の為に敷き物をしrrier）の状態であった可能性も考えられる。

たり、ケージの目を細かくするなどの考慮をしまた、発症鶏小脳のⅢ，Ⅸ葉でプルキニエ細胞

なければならない。さらに、震えや脚弱症状にの欠損が苦しいと述べたが、小脳の各葉の働きよる飼料摂取不足を補う為に、口の低い皿状のについては、まだ詳しく分かっておらず、様々

飼料入れの使用、水飲みの位置を低くする、練な報告がなされ七いる。Pearsonの著書

り餌、強制給与等も考慮しかナればならない。

「The Avian Brain」（1972）では、筋電図の結果において、完全な脱力状態ではⅢ葉は後肢を、Ⅸ葉は平衡感覚の統合をそれぞ

震えが止まる事を述べた。また、症状の観察でれつかさどっていることを示している。また、は怯えによって震えが激しくなる事も述べた。

Ⅲ葉からⅨ薫までのどの葉を電樋刺敦しても、これらから、震えは筋肉の緊張度に伴って赦し

鶏の首に、伸展や退蹄のどちらか、あるいは両

−

67

−

方の動きが認められることを記述している。
Scottら（1950）のShaker

次に転倒が見られ、最後には起き上がれないよ
うになる。ほとんどの発症個体は性成熟までにや河原・（1955）、Winterfield（1953）、

衰弱し、死亡した。しかし、牲成熟に達し、11Marksonら（1959）の異常鶏でも小脳プル

ケ月齢を過ぎてまだ生存している個体もいる。

キニエ細胞の退化及びその他の小脳異常が観察

この鶏は、性轢能も正常であると思われる。こされている。小脳は筋肉の共調作用を支配しての鶏を含め、少数の鶏は正常群と異ならない発おり、それがうまく作用しない為に震えや脚弱育を示したが、ほとんどの発症個体の発育は、という症状が起こるのではないかと推定される。

正常群より劣っていた。交配記録により、本研究における症状は、河原（1955）の報告

Trembler症状は常染色体性劣性遺伝子によしたSeX−1inked nervous disorderって支配されると推定され、遺伝子記号を γとと発症時期、症状等において最も近似している。

した。

しかし、河原の異常鶏は性染色体性劣性遺伝子

赤血球数、白血球数及び血掟蛋白量には、に由来しており、本研究における神経異常は常trembler遺伝子の影響は見られなかった。

染色体性劣性遺伝子に由来していると考えられまた、尺骨、脛骨にも影響はないと思われる。

るので、この点において明らかに異なっている。

電気泳動による検索では、血策、蛋白、血球蛋

そこで、今回の神経疾患形質をTremblerと白、血疑エステラーゼ及び血球LDHでは、発命名し、遺伝子記号をfrとした。Trembler

症個体固有の変異は見られなかった。

はSomes（1978）の報告したShaker−2発症個体の主要臓器には異常は見られなかっと症状、遺伝様式において近似しているが、発たが仙骨神経叢にリンパ球浸潤が見られた。小症時期において違いが認められることより、異脳においてはプルキニエ細胞の欠損が見られ、なった遺伝形質と考えられる。

特にⅢ、Ⅸ葉において著しかった。また、deh−driteが分子層へ向かわず、顆粒層へ向かっ要約

横斑プリマスロック種の1colonyているプルキニエ細胞も観察された。
に認められたTrembler症状は、頭部及び頚部の文

小さな素早い震動によって特徴づけられ、その献

Braitenberg，V．（1967）工s the

発症時期には変異があり、酵化当時すでに観察・Cerbellar cortex a biologi−

できるものから7遇齢と8週齢の間で発症した

Cal−Clockin the millisecond

ものまである。どの個体も成長するにつれ震え

range？tn Progress Zn Brain

は激しくなった。震えの程度には若干の変異がResearch Vol．25，The Cerebe−

あった。また、震えは、怯え、興奮、緊強など、

11um（Fox，C．A．and Snider，

筋肉の緊強度が高まるに伴って、激しくなった。

・R・S．，eds．）．pp．334−346．

逆に、完全な脱力状態では、震えは止まった。

EIsevier Publishing Company，

症状が進むと、脚弱症状が見られるようになっ

Amsterdam／I．ondon／New York．

Coleman，T．H．，Ringer，R・K・，，た。まず足板間関節で体を支えるようにな り、

−

68

−

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a recessive sex−1inked

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Avian cerebellar hypoplasia

degeneration and atrophy−aand degeneration．Joui．Am．

SeX−linked disease affecting−

69

Vet．Med．123；136−138

−

﹁
．
．
−
ト
：1ト才
一′￣￣￣■−−iiL

図1．

正常鶏と起立不能鶏（何れも雄で生後6か月）

0

▲千・・瑚

寧芦■iji卓i論i一書芦縞霹「⇒

什雪．T

L

連覇・甲
8

8

9

8

9

8

正

発

正

正

先

発

芸

憲

芸

芸

裏

芸

図5． 鶏の血蝶蛋白の電気泳動像（12％Gel，C．C．15mA，2．5h）図6． 正常鶏及び発症鶏の仙骨神経叢（a）正常鶏（b）発症鶏叩叩岬−11岬l￣llll岬Il岬岬
．∧

l

L

12＿＿＿＿HJj

図7．正常鶏及び発症鶏の脳の写真像上から見た像。左は発症鶴14適齢雌。
右は正常鶏12週齢雄。

丁で￣ ＼
t一

、・・一

譲で傭 ∴
チ†

ト←＼−′

彗・、■h

l−

、

才●
ヽ●

一・「11■

■

・ノーl

ヽ

∵†一箪二

1㌧㌦了一1こ・Lg彗（b） 異 常 鶏（a） 正 常 鶏
図9．

も1
J∴

Cajalの神経渡銀法第u法による鶏の小脳の組織切片像（×400）（a）dendriteが正常に分子層の方向へ向かっている，（b）dendriteが額粒層の方向へ向かっているし）

●

≠・
IT′′

小
ナ

′・

■
●I

L

1

昭和59年度厚生省研究報告書，77−91．1985

Ⅱ−6．7ァヨウミ種において出現した筋ジス
トロフィー鶏について
水谷 誠二 藤田武久
埜中征哉：●杉田秀夫●●
1983年9月OPN系において胸筋の肥大

12遇齢以後Flip test陽性になったもの

している雄2羽（約10カ月齢）を見出した。

（7個体）。
4．胸筋の肥大が3−6遇齢時にのみ観察さこの2羽を雄親として同系統の雌と交配し、後代をとったところ、正常鶏とともに若干の筋ジれ、Flip test

陰性のもの（27個体）。

ストロフィー鶏と思われる個体が出現した。そこれら4型のトリのうち1型のものは正常鶏、こで、これら後代において以下の3項目につい2と3型のものは筋ジストロフィー鶏、4型のて検索した。

ものはヘテロ鶏と思われた。3型において7−11週齢で胸筋の肥大が軽くなった理由は不明

1．OPN系における胸筋の肥大の有無および血清CPK値の検索であるが、Flip test陽性になる時期と関連があるのかもしれない。

2．413系の筋ジストロフィー遺伝子（am）との同座性の検定

OPN系において見出された胸筋の肥大雄の血清CPK値を測定するとともに肥大の観察さ3．OPN系およびOPNX413のFlにおけれなかったOPN系の成鶏個体およびOPN系

る筋ジストロフィー鶏骨格筋の組織学的検索
以下項目別に研究結果を記載する。

以外の3系統の成鶏の血清CPK値を測定した。
結果は表1に示したごとく、OPN系の胸筋肥Ⅰ．OPN系における胸筋の肥大の有無およ

大雄の値が最も高く、筋肉の異常が示験された。

び血清CPK値の検索
表1．胸筋肥大堆および種々の系統の血清CPK値

前述の2羽の堆親から得られたOPN系の子においてふ化時から13遇齢まで胸筋の肥大の系統名

有無を触診により調査した結果、次の4型に区性血清CPK値（U／の1890．16分された。

OPN胸筋肥大i…

1．すべての調査遇齢において肥大が観察さ

胸筋正常t…
▲〇

れず、Flip test陰性のもの（54個体）。

〇十2．3遇齢頃より胸筋の肥大が観察され、5▲0■9T−6遇齢においてFiip test陽性になったもの（12個体）。

▲09T

3．3−6週齢までは胸筋の肥大が観察されたが、その後7−11遇齢では肥大が軽くなり、・（財）日本生物科学研究所…国立武蔵療養所神経センター
ー

77

−

1353．00

391．54± 184．06
376．43士 143．60
929．99± 208．10
690．64± 157．42
743．44± 177．64
500．96± 115．9
450．25士 108．16
319．15± 32．60

表2．胸筋肥大雄との交配から得られた子の型別血清CPK値

子の型
筋ジストロフィー鶏

血清CPK値
1407．9（2，3型）

851．6 士 412．9
550．7 ± 323．4

へテロと思われるもの（4型）正常と思われるもの±1013．7（1型）

表3．413系およびOPN系の筋ジストロ
フィー遺伝子の同座性の検定

また、後代をとった後、これら2羽の雄の胸筋を組織学的に検索したところ、筋線経の大小不交配

同性が観察され∴筋ジストロフィー遺伝子に関

8子
9筋ジストロフィー

正常

してへテロの可能性が示唆された。また、これ413×OPN

55

0

ら2羽の雄から得られた子の血清CPK値を測

0PNX41321

0

定し、前述の各型別に平均値を算出した。結果は表2に示したごとく、2と3型が最も高値を

Ⅲ．OPN系筋ジストロフィー鶏、OPN系と示し、ヘテロ群と思われる4型が中間値を、正line413筋ジストロフィー鶏との交配

常鶏と思われる1型が低値をそれぞれ示した。

一代Flの両者の骨格筋の組織学的及び組織化学的検索皿．413系の筋ジストロフィー遺伝子（am）

対象と方法との同座性の検定対象とした筋ジストロフィー曳く以下、筋ジOPN系に出現した筋ジストロフィー遺伝子

ス鳥と略す）は、ふ化後2か月のOPN系でが413系のam遺伝子と同じ遺伝子であるか否

Flip test陽性2羽とFlip test陰性

かを検索するため、OPN系より出現した筋ジ

2羽、1ineストロフィー鶏（図1）を用い、413×（堆）配一代（Fl）6羽（雄のOPN系と雌の413と×OPN（雌）およびOPN（堆）×413（雌）の両の交配Flが1羽、雄の413と雌のOPN系と交配を行い、子における筋ジストロフィー鶏のの交配Flが5羽）である。

413とOPN系筋ジス鶏との交出現頻度を調査した。結果は表3に示したごと

筋ジス鶏では主として白筋である浅胸筋や後く、両交配からの子（図2）すべてが筋ジスト

広背筋が侵されるので、両筋を主として検索しロフィー鶏となり、両筋ジストロフィー遺伝子た。浅胸筋は大きな筋で、その部位によって侵の同座性が示された。このことは413のam

され方が異なるので、鎖骨直下で胸骨に最も近遺伝子のOPN系への混入の可能性が強く示唆

く、外表筋膜直下の部分の筋を選んだ。また、された。

自筋との比較のため赤筋である前広背筋をも同時に採取した。
筋は採取後、直ちに液体ちっ素で冷却したイ
ソペンタン液中で凍結し、厚さ10J の連続切片を作製した。凍結切片は室温にて凰乾した後、組織学的、組織化学的検索と−して、Hematoxy・

ー

78

−

1ine and Eosin（HE），mOdified

った。筋線稚内に空胞を認める線経が散在してGomori trichrome，NADH−TR，

みられたが、この空胞はPASやOil red O

Periodic acid Schiff（PAS）

染色で染色されず、aCid phosphatase

Oil red O，nOnSpeCific esterase

染色にも活性を認めなかった。比較的特異な所

phosphatase，aCetyl￣

見として神経原性変化の初期にみられるSmallcholine esterase（AchE），myOSin

angular fiberが認められた（図3−A）。

（NSE），aCid

preincuba−

正常鶏の後広背筋は組織化学的にdW，dRtion at pH4．6，4．2）の各染色及びカの2種類の白筋と少数の赤筋であるβR線経よ

ルシウム染色（GBHA）を行なった。

りなり、それらはNADH−TR 染色により、ATPase（routine及びdR線維はやや大型のdiformazan．顆粒が尚、Line413肪ジス鶏との組織化学的比
較検討のため、ふ化後1か月半の1ine

みられ、dW線経では小顆粒が粗に散在し、413

筋ジス鶏の前広背筋と後広背筋についても同様

βR線経は大型顆粒が密に存在して染めわけらの染色を行なった。

れる1と筋ジス鶏では正常対照よりdiformazan
顆粒が増加し濃染する線経が多く認められた（図結3−8）。また、PAS，NSE染色で強陽性

果に染まる線経が多かった。

1．Line413筋ジストロフィー鶏骨蕗筋

一方、赤筋である前広背筋では肪線経に軽いの組織化学的特徴（図3）
今回発見されたOPN系筋ジス鶏と大小不同がみられるほかは組織化学的にはほとLineんど異常を認めなかった（図3−C，D）。

413筋ジス鶏とを比較するため、まずLine
413筋ジス鶏骨格筋の組織化学的特徴を検討

2．OPN糸筋ジストロフィー鶏骨格筋の組した。

織化学的特徴Line413筋ジス鶏は早期より自筋が侵され、形態学的に対照と明らかな差が出現するの（1）Flip test 陰性筋ジス鶏筋の特故

は、ふ化後10日目をすぎてからで、筋ジスト（図4）

ロフィー症としての特徴が認められるのは、ふ

ふ化後2か月のFlip test陰性のOPN化後3遇頃からといわれている。今回検討した

系筋ジス鶏では、自筋である浅胸筋や揆広背筋

ふ化後1か月半の肪ジス鶏でも明らかな特徴がは筋線経に大小不同性を認めるのみで、壊死線認められた。自筋である後広背筋では筋線経の経や再生線経はみられず、筋線稚内の空胸は全

大小不同が著明で、肥大線経が多く認められ、く認められなかった（図4−A，C）。組織化

筋核の増加、貪食反応を伴う壊死線経がみられ学的にもほとんど異常な所見はみられず、dW，た。胞体が塩基好性で大型の核と明瞭な核小体

dR，′Rの三種煩の筋線経の分布にも正常とをもつ再生線経も散在した。また、ヒト筋ジス差は認めなかった（図4−B，D）。また、赤トロフィー症特にDuchenne型で多く認めら筋である前広背筋には異常はほとんど認められれる、いわゆるOpaqueなかった（図4−E，F）。

線経はほとんど認め

今回検討したFlip test陰性のOPN系

られず、問質結合織や脂肪織の増加も認めなか

−

79

−

図3．Line 413 筋ジストロフィー鶏の骨格筋
後広背筋（A，B）では節線経の大小不同、dR線経の増加を認め、節線稚内にしばしば空胞を認める。前広背筋に異常はない。
（A，C；HE染色、B，D：NADH−TR染色×140）

筋ジス鶏は組織学的に正常とほとんど差を認め

著明な筋線経の大小不同、肥大線経やSmall

ないことから、恐らく正常鶏である可能性が強angular fiberの存在が認められた。さらい。

に、貪食反応を伴う壊死線経や胞体が塩基好性で明瞭な核小体と大型の核をもつ再生線経が認（2）Fiip test

陽性筋ジス幾筋の特徴められた。11ne

413筋ジス鶏とやや異なる（図5）

点は、筋線維内の空砲があまり目立たないこと

ふ化後2か月のFlip test陽性のOPNと、いわゆるOpaque線経が散在性にやや多く

系筋ジス鶏は筋ジストロフィー症としての特徴認められたことである（図5−A）。NADH−TRを有していた。すなわち自筋である浅胸筋には染色ではdiformazan顆粒活性の高い線経が

−

80

−

図4・Flip test陰性のOPN系ジストロフィー駕の骨格筋
浅胸筋（A，B）、後広背筋（C，D）、前広背筋（E，F）いずれも軽い
大小不同がみられるのみで、筋線維内空胞や壊死線経は認めない。
（A，C，E：HE染色、B，D，F：NADH−TR染色

−

81−

×140）

図5．

Flip test陽性のOPN系ジストロフィー鶏の骨格筋

浅胸筋（A，B）では筋線経の大小不同、筋核の増加が著明で、Opaque
線維（星印）や貪食反応を伴う壊死線経を認める。NADH−TR染色では、
dR線経が増加し、稀に筋線維内に中空胞を認める。後広背筋（C，D）でも筋線経の大小不同、dR線経の増加を認める。前広背筋には異常所見はない。（A，C，E：HE染色、B，D，F：NADH−TR染色 ×140）

−

82

−

図6．OPN系雄と413雌の交配Flの骨格筋
浅胸筋（A，B）、後広背筋（C，D）いずれも筋線経の大小不同、dR
線経の増加を認める。筋線稚内にしばしば中空胞を認める。前広背筋（E，F）に異常所見はない。
（A，C，E：HE染色、B，D，F：NAI）H−TR染色 X140）

一

83

−

図7．413雄とOPN系雌の交配Flの骨格筋
浅胸筋（A，B）と後広背筋（C，D）では筋線経の大小不同、貪食反応を伴う壊死線経、dR線経の増加を認める。肪線維内中空胞はわずかに認められるのみである。前広背筋に異常所見はない。
（A，C，E：HE染色、B，D，F：NADH−TR染色 ×140）

ー

84

−

多く認められ、HE染色では筋線稚内空砲はほ

大小不同、貪食反応を伴う壊死線経や再生線経

とんど目立たないが、この染色では中空胸のみの存在、肥大線経やSmall angular

られる線経がわずかに散在して認められた（図fiberなどが認められ、1ine4135−B）。PASやNSE染色で全体が強く陽系とほぼ同様の所見を示した。肪線維内の空胸性に染色される線経も散在した。

はOPN系よりはやや多く認められたが、1ine

同様の所見は後広背筋にも認められた（図5やOPN413より少なくOPNx413とほぼ同程度であ−C，D）が、赤筋である前広背筋には異常をった（図7−A，B，C，D）。

認めなかった（図5−E，F）。

前広背筋に異常所見はみられなかった（図7−E，F）。

3．Line413とOPN系筋ジストロフィー鶏との交配一代Fl骨格筋の組織化学的特徴

4．1ine413

OPN系にLine413筋ジス鶏の遺伝子がとOPN系筋ジストロフィー鶏との組織化学的比較

混在している可能性も考えられるためOPN系

今回検討を行なった筋ジス鶏は例数が少なくとLine 413筋ジス鶏とを交配したF．につい

直ちに一般的な結論を導き出すことはできないて、その骨格筋を組織化学的に検討した。

が、1ine413、OPN系いずれも自筋のみ（1）雄のOPN系と雌のLine413との交が選択的に侵されており、筋線経の大小不同、配Fl筋ジス鶏筋の特致（図6）

肥大線雄やSmall angular fiberの存在

雄のOPN系と雌のLine413との交配F，は両者とも認められ、NADH−TR染色で活性のふ化2か月日の筋ジス鶏はFlip test陽性

高い線経が多く認められた点も両者で変りがな

で1ine

い。肪線維内空胸とOpaque線経の所見が両者

413やOPN系と同様に発症していた。その骨格筋の組綴化学的所見は、自筋であでやや異なっている。すなわち、1ine

る浅胸筋や後広背筋では筋線経の大小不同、肥では筋線維内空胞は比較的大きく多数認められ

大線経、填死線経、再生線経の存在などの肪ジたのに対し、OPN系ではHE染色では空砲はストロフィー症としての特徴を有していた。筋ほとんど認められず、NADH−TR染色で中空胞

線維内の空胸はOPN系筋ジス鶏より多く存在が散在する線経が認められるにすぎない。またしたが、Opaque線経はほとんど認められなか

OPaque線経はIineった（図6−A，B，C，D）。

られないが、OPN系や413×OPNのFlでは

413

413ではほとんど認め

赤筋である前広背筋には異常を認めなかった

1ine 413よりわずかだが多く認められた。

（図6−E，F）。

Line413、413×OPNのFl、OPN系肪
・ジス鶏三者の骨格筋の組織学的、組織化学的相（2）雄の1ine413と雌のOPN系との交違点を表4に示した。

配Fl筋ジス鶏筋の特徴（図7）
雄の1ine413と雌のOPN系の交配Fl

考察

ふ化2か月日筋ジス鶏もFlip test陽性で進行性筋ジストロフィー症の実験モデル動物あった。骨格筋の組織所見も自筋では筋線経のとして使われる1ine

−

85

−

413筋ジス鶏骨格筋の

表4．Line 413、413×OPN系、OPN系筋ジストロフィー鶏三者の組織学的、組織化学的相違点
Comparatlve mu8Cle hi＄tOChem18try
413

VarJatIonln引ber8Jze■ト

413×OPN

OPN

■l

■ト

Flber necroala

十

十

＋ト

Regene「atJon

＋

十

十

VacuoIat10n

＋l

＋

＋

Opaque tlber

土

＋

＋

Increa8ed
NADH−TFt actIYIty

■

＋

＋

Flbro●la．nY霊こ：雲（．仙。，t，．．Wh−te W…e Whlt・

主な病理所見は、肪線経の変性壊死とそれに続るCaVeOlaeを含めて横管はさかんに蜂巣状

く再生の像である。しかし、組織学的、組織化

構造（honeycomb stracture）を作り、学的には、ヒト肪ジストロフィー症（特に新しい横管の形成とともに蜂巣状構造物は融合

Duchenne型）と異なる点が多い。例えば、して一つの空胞となり、空胞は次第にその大きヒトDuchenne型では自筋赤肪両者とも同じさを増して、光学顕微鏡でも十分に認められる

ように侵されるのに対し、肪ジス鶏では白筋が程の大きさになる4）ヲこの空胞は肪細胞外睦と選択的に侵されること、ヒトではほとんど認め

交通しているので空胞の膜の一部が欠損すればない筋線維内の空胸が筋ジス鶏ではしばしば認

細胞外液中のカルシウムイオンが細胞内に流入

められること、ヒトDuchenne型で筋の崩壊し細胞内のカルシウム依存性中性プロテアーゼ

過程で重要な存在と考えられている。paque（calcium activated neutral pro−

線経がほとんど存在しないこと、カルシウム染

tease：CANP）のような蛋白融解酵素が活

色陽性線雄が存在しないことなどである。これ性化されて筋の崩壊を引きおこすと考えられ要らのことから、筋変性壊死の過程がヒトと鶏で一方、ヒトDuchenne型筋ジストロフィー

は異なるのではないかと考えられている2）㌘症の肪変性過掛こおいてOpaque線経は重要な

筋ジス鶏の骨格筋を電子顕微鏡を用いて詳細役割を果していると考えられる。筋線経の膜系に検討すると、初期変化として横管系の異常増のなんらかの異常により細胞外液中に多量に含殖像が認められる。すなわち、肪膜下に配列すまれているカルシウムイオンが肪線雄内に入る

−

86

−

と筋線経は過度に収縮する。この過度に収縮しExp．Neuro1．，30；431，1971

た線経がOpaque線経である。カルシウムイオ

2）MendellJ，R，Higgins．，

ンが筋線雉内に大量に流入するとCANPのよ

Sahenk Z．et al：RelevanCe

うな蛋白融解酵素がまずZ線を融解させ、次いof genetic animal models of

で節線経は壊死に陥り、それが貪食細胞によりmuscular dystrophy to human

清掃され、引き続いて再生が行なわれると考えmuscular dystrophy．Ann N Y

られる三）Acad Sci，317：409，1979

3）埜中征哉，春原経彦，杉田秀夫ほか：

今回新たに発見されたFlip test陽性の
OPN系鶏の骨格筋は、筋線経の壊死と再生と

肪ジストロフィー鶏骨格筋の組織学的，組いう筋ジストロフィー症としての組織学的特徴

織化学的研究，−Duchenne型筋ジスを有しており、肪ジス鶏として間違いはない。

トロフィー症との対比−，神経内科，3

このOPN系肪ジス鶏は従来のline：259，1979．

413ジ

ス鶏とやや異なり、いわゆるOpaque線経がや

4）Nonaka Z，and Sugita H・：

や多い点で筋の変性壊死の過程がヒトDucりenne

Zntracytoplasmic vacuolesin型肪ジストロフィー症により近い可能性がある。

a W fibers of dystrophic

しかし、筋ジス鶏の初期変化と考えられる肪線

Chcken muscle，−prObable

維内の空砲がOPN系筋ジス鶏でも認められる

eaェ、1yことは、1ine413と本質的に差がないのか

initiates massive fiber

patho10gic

event

もしれない。Age matChinした1ine413と比較すると、OPN系で空胞が小さく、かつActa Neuropathol（Berl），

数が少ないことは、肪病理所見の発現時期が異55：173．1981

なっていて、1ine413より遅れていることも考えられる。ただ、line5）Malou N．，＆SommerJ・R・：

413とOPN系

Chicken dystrophy．Theの交配一代の肪病理が両者の中間的組織所見を

geometry of the tranSVerSe

示したことは興味深い事実と思われる。

tubules．

いずれにせよ、OPN糸筋ジス鶏が新たな筋

AmJ Patho1．，84：

299，1976

ジストロフィー症鶏の系統であるか否かは、今

6）Lihelius R．，Jirman0Va Z．，

後さらに例数を多くすることと、交配を重ねる

Lundquistなどの検討が必要と思われる。

七ubles endocytosisin

工．，et al．：T一

dystrophic chicken muscle

文

献andits relation tomuscle

1）Ashmore C．R．，＆Dorre L．：

fiber degenaration．

Acta

Postnatal development Of fiber

Neuropathol（Berl），48：

typesin normal and dystrophic

31，1979skeletal muscle of the chick．

ー

87

−

7）埜中征哉，杉田秀夫：進行性肪ジストロ
フィー症の肪病理．神経研究の進歩，24：
718，

1980

−

88

−

図1．OPN系から出現した筋ジストロフィー鶏の雌雄図2．413（雄）×OPN雁）およびOPN（雄）×413（雌）両交配から得られた
筋ジストロフィー鶏、上段（413XOPN）の雌は413系の雄の羽色が十字遺伝をしたため413の茶色を皇している。

昭和59年度厚生省研究報告書，93−109，1985

Ⅲ−7．筋ジストロフィー鶏骨格筋の脂質と血管系の構築
菊 池 建 幾●研究協力者 斎 喜明，菅原幸浩■
大和田修一
鶏の筋ジストロフィー（以下筋ジスと略）遺伝子（am）は常染色体性不完全優性1）の遺伝様した自レク筋ジス鶏（WL−am）と楚中筋ジス
鶏（WL−am，dw）を用いた。

式に従う。著者等は、これまで、この遺伝子が発現する場としての遺伝的背景を、品種を変え

1．四酸化オスミウム・パラフィン包理法にることにより変化させ、筋組織のレベルでの発よる脂質染色症過程の品種間差を比較検討してきた㌔2）昨年

採取筋は10珍中性ホルマリン溶液で24時は、性染色体に楚性遺伝子（dw）をホモにもつ間固定する。固定終了後、組織は四酸化オスミ

賛小鶏に、筋ジス遺伝子が導入された場合の結ウムの浸透を容易にするため、できるだけ小さ果を報告した≡）正常別、鶏雄と肪ジス別、鶏雄

くする。次いで、組織は流水で充分洗い、1界の生体重は、それぞれ白色レクホン種鶏雄の55

四酸化オスミウム固定液で再固定する。四酸化界と499あへと減少する（図1）。

オスミウムは高価なため、電顧材料の作製に使

筋ジス楚小鶏では、筋組織に異常を惹起する用した溶液を保存しておき、再利用する。一度筋ジス遺伝子（am）が体細胞の常染色体群のい固定に使用した溶液は四酸化オスミウムが還元

ずれかに、また体躯を小型化する賃性遺伝子されて黒く濁っている。この濁りは0．5−1．0（dw）はこの細胞の性染色体のどこかに位置し罪過沃素酸（KIO4・2H20）を数滴加えると消ている…）須性遺伝子は筋ジス遺伝子に対し、強失し透明となる。固定時間は一般に24時間でい変更遺伝子として作用し∴遺伝子の形質発見充分であるが、組織の大きさによっては2−3を強調する。賃性遺伝子は、筋線経の急敢な萎

日におよぶ場合もある。国定液の均一な浸透は、縮と消失、それに付随する著しい脂肪組織の増

電顧用振逸機で液を撹拝すると効果的である。

殖を起こし、症状を悪化する。

固定組織は純水で洗い、70−999もェクノー

本報告は、筋ジス賛小鶏浅胸筋の発症に伴うル系列で各30分脱水し、無水エタノールを20

脂肪組織の増殖に焦点をあて、組織の構築と密分、2回通してヘキサン（Hexame）へ移す。組接に関連する血管系の発達を検討したものであ織は30分、3回ヘキサンで透徹する。次いで．

る。

常法通り、パラフィンに30分、3回浸透し、包埋する。パラフィン切片の脱水、透徹は包理

材料および方法と同様に、エタノール系列、ヘキサンを用いる。

実験鶏は白色レクホン種（WL）と賃小鶏

切片はEntellan（Merk）で封入する直前に30（WL−dw）のそれぞれに筋ジス遺伝子を導入

秒間キシレン（Xylene）に馴じませる。標本●東北大学農学部ー93−

中の脂質はオスミウムとの化学反応ゼすでに黒

赤味を帯びる。注入後、筋は収縮を最小限にし、染しているが、他の染色を加えることもできる。

かつ固定液の浸透を容易にするため、肪線経の走行に沿って巾約1仰の間隔で切開し、腱に付

2．筋ジストロフィー鶏の筋組織内脂質着したままでホルマリン溶液で固定した。脂質

白色レクホン種（WL）および自レク肪ジス

染色は前項の要領である。包埋された浅胸筋の鶏（WL−am）、簾中（WL−dw）および賃中筋

一部は、約1mmにおよぷ5Jlm連続横断切片をジス鶏（WL一肌1，dw）を僻化後1，2．3，

作製し、ABBE描画装置で記録した後、血管

4，6，8および16適齢にて各2−3羽を放系の走行と脂質の分布を三次元的に作図した。

血屠殺し、浅胸筋（M．pectoralis
superficialis）と大内転筋（M．adduc一

結果

tor magnus）を採取した。浅胸筋は上腕骨

1．脂質染色稜と胸骨稜を結ぶほぼ中央を採取した。脂質は第一項の四酸化オスミウム・ノミラフイン包理法

動物組厳は′くラフインに包埋される際、アルにより染色した。脂質含量はABBE描画装置

コール系列による脱水、次いでトルエンやキシを用い、紙重量・面積換算法で求めた。筋線維

レンによる透徹が行われ、最終的にパラフィン

径は顕徽鏡接限ミクロメーターで測定した。ニに置換、包埋される。組織中の脂質は、これらューハンプシi一種正常（NH）と筋ジス鶏の溶媒を通る時に大部分溶出する。このため、．（NH−am）で得られた筋線維径の成鏡は以前

染色標本中の脂質は空胞となって分布するのみ実施された実験結果を加えた。

である。
四酸化オスミウム（OsO．）は脂質を構成する

3．脂質と血管系の同時証明法

脂肪酸の一部を酸化し、自身は還元されて悪化

将化後1，4，5，8，13遇齢の漢小およする。この化学反応産物はアルコールでは殆んび須中筋ジス鶏を各1−3羽ずつ供試した。各

ど溶出しないが、トルエンやキシレンでは多量

鶏は放血屠殺後、右側胸部を切開し、胸睦を言に溶出し、最終的に′ミラフィンに包捜された時出した。心臓より頭部へ向う右腕頭動脈およびには、その大部分を失ってしまう。ヘキサンは

左総頚動脈は結染し、左腕頭動脈よりカニュー

多くの脂質溶媒の中で最も脂質溶出能が低いもレを挿入した。次いで血管拡張剤塩酸ヒドララのの一つで、かつアルコールやノミラフインと馴ジン（Apresoline）を0．4研9含む0．0ト

じみやすい特徴をもっている。われわれはトル

0・1Mリン酸緩衝液（pH7．3）、37℃で血管エンやキシレンの代りにヘキサンを用いて脂質を濯流して左浅胸筋より血液を消失させた。血をオスミック酸との反応産物の組織内保存に良管の着色剤は赤インク（Rotring社）である。

好な結果を得た（図3）。組織中の脂質はオス

着色剤は緩衝液で3倍に希釈し、使用直前に濾ミック酸で黒染し、バックグラウンドの全体の過した。着色剤の注入は、緩衝液の場合と同じ組織は黄褐色に染色される。細胞核はクロマチ

カニューレを通して行われ、いずれも手加減でンや仁がよく染まるため、特に核染色を必要との注射器操作によった。浅胸筋は注入後数秒で

しない。

−94−

2．筋線推（NH−am）浅胸筋の線維径は、大小不同や、

賃中筋ジス鶏（WL−am，血）の浅胸筋でみ肥大線経の出現が目立ち、分布に大きな変動がられる特徴的な病変は、筋線経の急激な萎縮、みられる。16遇齢での平均値を比較すると、消失、そして、早期からの肪内脂肪組織の増殖

筋ジス鶏は37．9士18．3Jlm、正常鶏（NH）の2点である。ニューハンプシャー種筋ジス鶏は30．／3±7．9／ 爪である（図2−8）。線維④」。．

貢；Ui⊃ど丘

富まど●さ●丘図2．ニューハンプシャー種fa）、白色レクホン種（b）および禁中矧e）における正常および筋ジス浅胸筋の筋線維径分布−95−図3．16適齢自レク筋ジス篤くa）、自レク憩も）および賛中筋ジス
矧e）、簾中鶏は）の浅胸筋の脂質、組織中に脂質は黒染する。
四酸化オスミウム・パラフィン包理法。 ×118−96−

径の平均値は、筋ジス遺伝子が白レグ種（WL−

自レク筋ジス鶏筋は、筋束をとりまく内筋周膜am）、贋小鶏（WL−am，dw）へと移行するに（問質部）の血管周囲で脂肪組織が増殖しはじ

従い、次第に減少する。度中筋ジス鶏の筋線経

めているが、筋束の内部への浸潤は軽度である。

の萎縮は4週齢ですでに認められ、16遇齢で一方、壊中筋ジス鶏では脂質は問質部のみならの平均値は、23．3士7．6′lmとなり、正常鶏のず、筋線経の周辺でも著しく増加し、ほぼ全域

39．6±12．4J川に比べると有意に低い（図2−にわたって分布する。筋線経はこの脂肪組織のb，e）。NH−am鶏でみられた線維径の広い

異常な増加と並行して、萎縮と消失に陥いる

分布や、肥大線経の残存は認められない。

（図3−e）。正常鶏の浅胸筋の脂質は、両品
種とも、問質部を走行する比較的太い小動・静2．筋組織内の脂質の分布

脈の周囲にわずかに分布するのみである（図316遇齢の自レクおよび楚小鶏浅胸筋の脂質−b，d）。

染色標本を図3に示す。いずれの写真も、浅胸筋ジス鶏浅胸筋は成長とともに脂質含量を増筋の表層の同一部位の所見である。筋ジス筋はし、16遇齢の自レク種で約129も、壊小鶏で黒染した多量の脂質を含んでいる（図3−a，C）。

約68界に達する（図4）。一方、赤筋として

H．p∝tmlis叩erticiolis

0

2

4

6

8

10

12

1ム

16

Weeks

図4．日レク正常（WL）、筋ジス鶏（WL−am）および演小正常（WL−dw）、
筋ジス鶏（WL−am，dw）の浅胸筋の脂質含量の経時的変化−97−

知られる大内転筋は、系統問や、正常と筋ジス

網を形成する。筋線経の周囲の毛細血管は、再鶏間でも値の変化に差は認められない（図5）。

び、細静脈に合流し、細動脈の侵入部位とほぼ

赤筋の脂質含量は経時的に増加し、16遇齢の同じ位置で筋束を離れる。細静脈はいくつかが白レク筋ジス鶏は約7．0界、壊中筋ジス鶏は約合流して、小動脈に並走する小静脈へと連絡す

8．6界に達する。

る（図6−a）。正常筋の血管系は成長に伴い、複雑になり、毛細血管の密度が増してくるが、前述の基本構造は変わらない。脂肪組織は主に小動・静脈、場合によっては細動・静脈の周辺で増殖するのみである。
一方、筋ジス筋は早期より内筋局膜の太い血管の周囲に発達した脂肪組織がみられる。末梢ン▲一一：一丁
0l宕LO．ざ uヱU00−丘血管の変化は、3−4適齢に起り、筋束の近傍に一本の毛細血管が出現することではじまる（図6−b）。血管は筋束の最外層を走行していた毛細血管の一つが筋束内から外の問質領域へ離れていったものであり、通常一つの肪束に一本の単位で出現し、同時に何個所にも形成することはない。また、ある筋束の近傍に位置していた血管が、走行中に隣接する他の肪束へ近ずく場合がある。その時は、もとの肪束の他の場所に新しい毛細血管が形成される。4週給以前の毛細血管は一本であることが多く、周辺で脂質を含有する脂肪細胞をみることは少ない。
筋束の近傍に毛細血管が出現する時期には、よ図5．日レク正常（WL）、筋ジス鶏（WL−am）および萩中正常（WL−dw）、筋ジス鶏（WL−am，dw）の大内転筋の脂質含量の経時的変化

り高次の小動脈や細動脈の周辺で急激に脂肪組織が発達している（図6−e）。4−5週齢にかけて血管周囲の脂肪細胞の増殖は次第に末梢に及ぶようになり、毛細血管の走行も複雑化し3．脂肪組織と血管系てくる（図6−b，d）。連続横断切片により、

疑中筋ジス鶏浅胸筋の筋線経は、僻化後1遇

血管の観察部位を変えてみると、筋束の近傍に齢ですでに、わずかに大小不同を示しはじめるある毛細血管は、脂肪組織の発達している部位

が、血管系に異常はみられない。厚い内筋局膜

では網目状に、脂肪細胞がみられない部位ではに分布する小動脈は、より細い細動脈枝を肪束一本しかみられない（図7）。5遇齢以後、脂と筋束の狭い間接へ送る。細動脈は肪束に対し

肪細胞は筋束の外縁の血管局臥こ出現し、次第て垂直に侵入し、さらに細い、緻密な毛細血管に筋束の内部へ浸潤してくる（図6−d，f）。

−98−

筋ジス筋の毛細血管壁は肥厚が目立ち、周辺で経に沿って走るが、正常筋に比べて密度は低く、の線維化が進む（図6−e，f）。

曲折や吻合は目立たなくなり、途中で連絡の途

正常筋の毛細血管数は成長に伴い筋線経の周切れるものもある。脂肪組織への毛細血管の連辺で増加する。4−13遇齢にかけて、筋線維

絡は、細動・静脈からの分枝が主であるが、筋当りの教（capillaries／fiber）は束内の毛細血管がそのまま連絡することもある。

0．15から0．37へ増加する。筋ジス筋の毛細血管の発達は悪く、0．13から0．17へ増加するに考察止まる。13遇齢の単位面積当りの数（capi−

一般に使われるOil redOやSu血m等の脂質

1laries／mm2）は正常筋で298、筋ジ染色法は染色剤の脂質内溶解性を利用したもの

ス筋で212である（表1）。このように、筋で、化学反応による染色ではない。従って、染ジス筋の筋線経を取りまく毛細血管は病変とと色剤は脂質から次第にしみ出し、組織の他の場

もに次第に失われる。十方、問質部の血管系は、所に人工産物をつくり、永久標本とすることは脂肪組織の増殖とともに複雑に発達してくる。

できない。四酸化オスミウムによる脂質染色は、

表1．摩小鶏および須中筋ジス鶏浅胸筋の筋線維当りの毛細血管数（cap．／fiber）と単位面積当りの毛細血管数（Cap．／mm2）の経時的変化
Capiilaries／．fiber2
Weeks
4

Normaln

Dystrophy

0．15±0．04

13

10

n

0．22±0．07
0．37±0β712

n＝numberofNormal

0．13士0．04

0．15±0．05

58capi11aries／mm2

6

10

Dystrophy

390±4110100．15±0．0380．17±0月7＊15

fasciclesnevaiuatedin332±416298±4912

eachn

405士72

10352士5410289±61

8

212士51＊15

muscle＊＝pく0・05

13遇齢の正常、筋ジス浅胸筋の血管系の構造

脂質に含まれる不飽和脂肪酸との化学反ちによを約1mmにおよぶ連続切片から解析した（図8）。

り脂質を褐一黒色に染色する。四酸化ススミウ

正常筋の細動脈は規則的な一定間隔で筋束へ侵ムは古くから固定剤としても利用され、組織を入し、緻密な毛細血管網からなる床を形成する。

ブロックのまま固定と同時に脂質染色も行うこ筋線経を囲む毛細血管は主に線経の走行に沿っとができる。筋組織は採取時にメスで切断するて走るが、しばしばL字型の曲折やH字型の吻と強い収縮を起こし、組織内の構造を著しく害合を示す。筋ジス筋の細動脈の筋束への浸入はう。われわれは筋を骨に付着させたままin

不規則である。筋線雄の周辺の毛細血管は、線situの位置で前国定し、それを防いだ。固定ー99−

︒包吏J琵蝿0冨tP︽甘心喋軽．︵腫︶粟野e葛篭毒血呵刃喋軌召e蜂蜜班がKへ蜃刃︵凋︶鱒寧号里撃筆警撃烹慧慧聖二．￠区

一100−

後の筋線経の構成や、周囲の血管系の構築はよを維持するが、品種間や正常および筋ジス鶏問

く保たれ、後述する血管着色剤を用いた血管網での目立った差はみられない。このことは、筋の解析にも良好な結果を得た。

ジス浅胸筋でみられる脂肪組織の異常な増殖は、筋ジス鶏はAsmundson

脂胞細胞そのものの欠陥による変化とするより

andJulian（1956）4）によって初めて報告されて以来、選は、脂肪細胞以外の何らかの環境変化に対応し抜による改良、異なる品種への筋ジス遺伝子のようとする2次的変化である可能性が高い。

導入が行われてきたミ6）最初の実験鶏はニュー

古くから、伴性劣性遺伝の様式に従がう壊小

ハンプシャー種301系統である。この鶏は浅農の矯化の原田は甲状睨機能の低下によるとさ胸筋の肥大を指標に選抜され、組織内への脂肪れていた。最近、それに関する詳細な報告が出の増加はおくれる。現在国内で広く使われていされた。矯小鶏は僻化後早期より血中の甲状曝る筋ジス鶏413系統は筋病変に関してはこのホルモン、特にT3倍が低レベルにとどまってタイプに属する。これに対し、307系統は発いる誉この低下の原因は、甲状腺の轢能障害に症とともに浅胸筋に早期に、かつ多量に脂肪のよるものではなく、肝臓での5l−mOnOdeio−

増加する鶏群である。組織レベルで観察すると、

dinase活性が阻害されるため、甲状腺で生浅胸筋の脂肪の増加は筋線経の萎縮、消失を伴産されるT4をT3へ分解できないためである。

うため、高脂肪、萎縮（high fat atrophy）

楚小鶏の血中n値は正常域にあるものの、直接型といわれる≡）さらに筋ジス遺伝子は白色レク

成長に深く関わるT！値が慢性的に低いため、鶏

ホン種鶏へ導入され、肪ジス鶏433系統と対体は小特化する9割潤の筋の蛋白質代謝回転

照正常鶏03系統が確立した曾われわれが今回は、SH＿methionin

用いた白色レアホン種筋ジス鶏は、岩谷系白レ

早くなっている。

ク種へ筋ジス遺伝子を導入したものである9を用いた測定によると、鶏の脂肪生合成の場は主に肝臓であり、合成

6−8遇齢で浅胸筋の脂質含量を測定すると、された脂肪酸は必要に応じて末梢の皮下や腹嵯

307系統は比体重債で約6．9界、433系統

内の脂肪組織へ送られ、エネルギー源として利で約3．49乙であり、正常値に比べるとそれぞれ用される。鶏の脂肪組織は脂肪酸を合成する能5倍と2倍であった。筋の肥大を主病変とする力は殆んどなく、リボ蛋白質として肝臓から送413系統は2．19もであり、正常値の1．5倍でられてきた脂肪酸を利用している。甲状囁ホルある聖われわれは脂質染色後の標本において、モンの作用は肝臓での脂肪生合成、そして分解組織に占める脂質の割合から脂質含量を測定しを制御している。須小鶏の肝臓は、脂肪生合成

た。その結果、自レグ筋ジス鶏浅胸筋は正常のを支配する一連の酵素活性が低く、その原因と2．7倍、また賃小鶏では正常の14．3倍に達しして、ホルモンに対する細胞側のレセプターにていた。自レク肪ジス鶏の成績は他の報告6）と何らかの欠陥があることが推定されている。ま一致するが、賃小鶏の値は、高脂肪萎縮型とした、賃小鶏の肝臓は脂肪の分解能も低下していて開発された307系統のそれをはるかに上まるとする報告もある㌘）

わっている。赤筋の一つである大内転筋の脂質

一方、筋ジス掛こおいても血中の甲状腺ホル

含量は加齢とともに増加し、浅胸筋より高い値

モン（T，）値が低下している慧）甲状腺ホルモン−101−

と筋ジストロフィー症との関わりは明らかではる。Peterson等（1971）はこの種の実験によないが、最近、筋の衛星細胞（satellite

り、浅胸筋から脂質を減少させることはできたcell）の増殖が甲状腺ホルモンの作用によりが、いずれの場合も肪線経の萎縮を防ぐことは直接影響をうけるとする報告が出された誓）筋できなかったと報告している三7）本実験の結果

線経の成長点は両端の腱側にあると一般に考えからは、壊中筋ジス鶏の肝臓の脂肪生合成が克られているが、甲状腺ホルモンは、この両端で進し、大量の脂肪酸を末梢の筋、特に浅胸筋への衛星細胞の増殖を特に強く刺観する。笈中筋

送ったことが、直接筋中の脂質を増加させた原

ジス鶏の筋線維病勢進展とともに急激に萎縮し、田かどうかは明らかではない。しかし、他の報次第に消失する。この萎縮と消失の間には、筋告16・17）を参考にすると、筋線維自身に起る病変、線経の壊死とそれに伴う再生反応も同時に進行

特に激しい萎縮と消失というプロセスが線経のしているものと思われる。甲状腺ホルモンの作

エネルギー代謝異常を起し、次いで周辺での脂用が衛星細胞の増殖と直接関わっているとする

肪細胞の増殖と脂質蓄積を促進すると考えうると、そのレベルの低下は筋線経の再生能の低下、のが妥当である。

成長の悪化による萎縮を惹起する原因となる。

脂肪細胞の発生、分化については多くの研究

また、発症に伴う脂肪組織の浸潤は、浅胸筋のがなされているが、未だ結論に至っていない禦

中央部、すなわち長い筋線経のほぼ中央部で集しかも、研究の殆んどは一般の脂肪組織に集中

中的にはじまり、両端の腱側での脂肪は少ない

し、肪中に発達する脂肪組織についての報告はとする報告がある誓）これは、筋線経の萎縮、少い。発症とともに急激に脂質を蓄積した脂肪一消失が中央ではじまり、次第に腱側へ向って短細胞を分化・増殖させる度中筋ジス鶏の骨格筋縮してゆくプロセスを反映している。

は、その意味でよい実験材料となる。

筋ジス鶏の脂質代謝異常は古くから指摘され筋ジス浅胸筋の筋線経の形態異常は4週給以ている。筋ジス鶏胚の血中コレステロール、前に起っている。脂肪細胞は肪線経の周辺から

VLDL、トリグリセライド値は正常鶏胚のそ遠く離れた問質部の太い血管の周囲で増殖しはれらに比べて著しく高い三4）しかし、このこと

じめ、時に脂肪組織へ発達する。4適齢以後、がどのように筋ジス症発症と関連してくるかは

脂肪細胞は太い血管から出される細い血管枝に解明されていない。僻化後、筋ジス症が進行す沿って発生し、5適齢以後、筋束内の毛細血管るに伴い、肝臓の脂肪生合成が促進する。さらの周囲へ及んでくる。われわれは、肪束の近傍に、浅胸筋の脂質含量も次第に増加する。発症に突然形成される毛細血管に注目し、連続切片に伴う脂肪組成の増殖と筋の脂質含量の増加は、によって、血管の発達と脂肪細胞の増殖の関係

筋ジス筋の脂肪組成そのものに何らかの異常がを調べた。光顕レベルで脂肪細胞と確認できるあることが予想された。これを証明するため、細胞は、この毛細血管が出現したあとに増殖し筋の脂肪組織と皮下脂肪組織で脂肪合成能に差てくる。電疎レベルでの詳しい細胞同定が必要があるかが検討されたま6）結果は否定的で、両であるが、脂肪細胞は未分化な毛細血管周囲の者に差はみられなかった。肪中の脂質は、栄養

ある種の間葉細胞が前脂肪細胞へ分化して形成

や運動条件を変えて減少させることも可能であされるとする説を支持したい誉・叫

ー102−

結

論

：248，1956

自レク鶏、須小鶏の間で、筋ジストロフィー

5）Wilson，B．W．et al．：症に伴う筋の脂質分布、筋線経の径の経時的変

Major physiologic and化を比較検討した。また、脂質増加の著しい鶏

histochemical characteristics

中筋ジス鶏において、血管系の構築と脂肪細胞
Ofinherited dystrophy ofの分化について考察した。

the chicken．

1）漆中筋ジス鶏の筋線経の萎縮は各品種問でAcad．Sci．，317：224，1979

最も頗著である。また、脂肪組織の増殖は筋線経の消失を伴っている。

Ann．N．Y．

6）Randall，W．R．and B．W．

2）演中筋ジス鶏の大内転筋の脂質分布は正常

Wilson：Properties ofである。

muscles from chickens with

3）筋ジス浅胸筋の脂肪細胞の増殖は、はじめ

inherited muscular dystrophy．

問質部の太い血管の周囲で起り、発症ととも

J．Neurol．Sci．，46：145，に細い血管枝に及び、さらに筋束内の毛細血1980．

管の周辺に至る。

7）scanes，C．G．et al．：
Abnormalitiesin the plasma

引用文献
1）Kikuchi．T．et al．：

COnCentrations of thyroxine，

Genetic heterozygous

tri−iodothyronine and growth
hormone in sex−linked dwarf

Carriersin hereditary

and autosomal dwarf Whiternuscular dystrophy ofChickens．TohokuJ．Agr．

Leghorn domestic fowi（Gails

Res・，32：14・1981

domesticus）．J．Endocr．，97：
127，1983

2・）菊池建機等：筋ジストロフィー鶏の発症過程の品種間差一特に倭小鶏をめぐって一．

8）Kuhn，E．R．et al．：

昭和58年度厚生省研究報告書．29，

Posthatch growth and1984

development of a circadian3）菊池連携：筋ジストロフィー鶏−その多rhythmfor thyroid hormones

面的生物反応−．日本疾患モデル動物研究in chicksincubated at会．1984different temperatures．

4）Asmundson．V．S．and L．

Poult・Sci．，61：540，1982

M．Julian：Znheritedmuscle abnormalityin the9）wood，A．et al．：Amaspect
Of protein biosynthetic

domestic fowl．J．Hered．47−103−

activity by the dwarf and

Lett．，8：151，1978

nondwarf White Leghorn chicken・15）

Chio，L．F．et al．：

Poult．Sci．，5：982，1971・

Lipid composition and10）Stewart，P．A．and K．W・Synthesisin the muscies

Washburn：Hormone andOf normal and dystrophic

lipogenic enzyme response

Chickens．Can．J．Biochem．，

of the heterozygous dw chick

50：1267，1972

to dietary proteinlevel・16）vallyanthan，N．V．：

J．Nutr．，114：132，1984

Lipogenesisin muscle，1iver，

11）King，D．B．et al・：Avian

and adipose tissue of normal

muscular dystrophy：thyroidal

and dystrophic chickens．Can．

influence on pectoraiis muscle

J．Biochem．，54：488，1976

growth and glucose−6−phosphate17）peterson，D．W．et al．：

dehydrogenase activity・Reterdation of fatty

Life Sc1．，28：577，1981

infiltrationin atrophic

12）King，D．B．andJ・D・May：

muscle of gentically dystrophic

Thyroidinfiuence on body

Chickens by diet or excercise．

growth・J・Exp・Zool・I

J．Nutr．，101，：453，1971

232：

453，1984

18）Hausman，G．J．et ai．：

13）Mitche11，D．J．and L．M．

Search for the adipocyte

Juiian・Variation of fat

precursor cell and factors

distribution in pectoralthat promoteits differentia−

muscles of chickens withtion．J．Lipid Res．，21：

hereditary muscular
657，1980

dystrophy．Proc．Soc．Exp．

19・）宇宿源太郎等：脂肪細胞の発生とその異Biol．Med．，137：68，1971

常．細胞．12：2，1980

14）Werstiuk，E．S．et al．：

畠0）Richardson，R．L．et al．‥

Alteredlipoprotein

Respons80f pericytes to

COmPOSition and elevatedtherma11esionin theinguinai

Serumlipidsin chicken

fat pad oflO−day−Old rats・

embryos with hereditary
muscular dystrophy．Neurosci．

−104−

Acta anat．，114：41，1982

図−1．白色レクホン種鶏（左）と賃小鶏（右）。

∴∴

1
．
㌧﹂
か㌧．′・こ′笹己 −図r6・4（a，b），5（C，d）および13（e，f）週齢における澤′」、鶏（a，e）および
筋ジス鶏（b−d，f）浅胸筋の脂質分布と血管系。矢頭印：筋束近傍の問質部に新生した毛細血管，a，b：×264，e：×132，d−f：×400

、ヽ．Jト■￣∵∴∴∴∴云∴■∴＋∴（：＝・￣il

jb＿

・′′、一

斗

図−7．5週齢賛小節ジス鶏浅胸筋の脂質分布と血管系，血管と周辺で増殖する脂肪細胞をちがった位置で観察する（矢頭印）。×140

昭和59年度厚生省研究報告書，111−113，1985

Ⅳ−1・筋ジストロフィーハヤスターの計画繁殖ならびに系統育成について
斉 藤 宗 男●研究協力者 田中 亨：松崎哲也●
1982年より、BIO14．6系筋ジストロフ

よる環境の変化で多くの種動物が死亡したことィーハムスターおよびUM−Ⅹ7．1系筋ジストロもあり、コロニーの増殖がおもうようにできな

フィーハムスターの生産供給体制の確立を目的かった。後半には、徐々に種動物も増加し12として増殖を行なっている。本年度は、Wet

月には162匹の離乳仔が得られるようになっtail病の抑制や不良個体の淘汰、交配期間をた。

短縮するなどの改善を加えたことにより、基礎（参 UMトⅩ7．1系ハムスターとなる若い撞動物を充分に確保することができ、BIO14．6系と同様、年間の繁殖成績を表2

計画繁殖が可能となった。さらに、コントローに示した。延交配数216匹に対し出産数はル動物のコロニー拡大に努め、それの増殖も可

125匹、出産率57．89も、総産仔数767匹、能となったので、これらの繁殖状況について報

平均産仔数6．1匹、総離乳数580匹、離乳率

告する。

75．6ヲもであった。これらの生産指数は2．6となりBIO14．6系より良好であった。なお、経Ⅰ．筋ジストロフィーハムスターの繁殖成績産別にみた生産指数では1産目3．2、2産員①

2．3、3定日1．0であった。生産数も10月以

81014．6系ハムスター

1984年1月から12月までの1年間の繁降は100匹以上の生産ができるようになった。

殖成績を表1に示した。延交配数228匹に対㊥ コントロ．ル系の育成

し出産数は106匹、出産率46．4界、総産仔

筋ジストロフィーハムスクrと遺伝的背景が数719匹、平均産仔数7．8匹、総離乳数431

近似したコントロール系ハムスターを育成する

匹、離乳率59．9界であった。これらの生産指ため1982年よりBIO14．6筋ジス系統から数は1．8であった。なお、経産別繁殖成績につmy因子を除く戻し交配方法を用いて作出し、いてみると、初産を経験したメス親82匹の2

現在までに5世代を経過した。本年度は、4世産目が得られたメス親は47匹（57．39ら）で代目のコロニーを基に増殖を行なった。ちなみあり、3産目は15匹（18．2界）となり減少に、このコントロール系の10月−12月までした。また、生産指数も1産日3．3、2産目の3ケ月間の繁殖成績をみてみると延交配数61

2．8、3産目0．8と経産が進むにつれ低下した。

匹に対する出産数は51匹、出産率83．6界、このように、肪ジスハムスターの繁殖期間が庫

総産仔数395匹、平均産仔数7．7匹、総離乳

めて短かいことが増殖を困難にしている大きな数266匹．離乳率67．39もであった。この成原因でもある。年度前半は、飼育室の移転等に績を今後も維持向上させると共に継代を進めて●（財）実験動物中央研究所−111−

ていく予定である。
表1筋ジストロフィーハムスターの繁殖成績−BIO14．6系−

計

交配 ？

出

匹

産

産

仔

離

乳 仔

匹

珍

匹

平均

匹

界

27

9

3 3．
3

4 8

5．
3

3 2

6 6．
6

24

5

2 0．
8

2 7

5．
4

14

5 1月

19

6

3 1．
5

2 5

4．
1

16

6 4．
0

6

0

■
0

0

11

6

5 4．
5

0

3 4

5．
6
0

0

0

28

8 2．
3

3

0

0

0

0

0

13

4

3 0．
7

2 6

6．
5

2 1

8 0．
7

9

6

6 6．
6

49

8．
1

44

8 9．
7

3

1

3 33

6

6．
0

5

8 3．
3

11

7

6 3．
6

53

7．
5

46

8 6．
7

3 0

2 2

7 3．
3

167

7．
5

63

3 7．
7

7 2

4 0

5 5．
5

2 84

7．
1

162

5 7．
0

228

106

4 6．
4

7 19

回

※ 飼育室の移動

表2肪ジストロフィーハムスターの繁殖成蹟−UM−Ⅹ7．1系−

交配年月
1 984
1
2
※ 3
4
5
6
7
8
9
10
1
1
11
1
2
12

計

交配 ？

出

産

仔

離 字

匹

匹

界

匹

平均

匹

11
13

3
6

2 7．
2
4 6．
1

15
33

5．
0
5．
5

■ 15

6
0
7
1

4 0．
0
0
6 3．
6
3 3．
3

16
0

2．
6
0

5
27
1
0

8
2

6 1．
5
3 3．
3

46
5
45
14

4．
1
5．
0
5．
6
7．
0

l

1
11
3
13
6
′
2
24
3
； 333
4
i 884
216

！
l
1

0
17
鳥2 5三

産

0
0
7 0．
8
118
巨87
7
5
．
0
三
…
：
…；

50

5 9．
5

125

57．
8

42
4
44
13
0

0
6．
9 l109
−
7・
4
13
−6
5．
7
1 99

28 8

※ 飼育室の移動考

tail病などで充分な繁殖成績を得ることがで

察

BIO14．6系ハムスターならびにUM−Ⅹ7．1

きなかった。しかし、今年度は交配期間の短縮、系ハムスターの繁殖において、繁殖不良、Wet

交配使用月齢の延長、哺育中のメス親には離乳−112−

食またはねり餌を給与し、不良個体の淘汰を厳参考文献

格に行なうなどの飼育繁殖方法を改善し、さら

1）斉藤宗男：筋ジストロフィーハムスターに、Wet tail病の発症抑制には抗生物質のの繁殖ならびに改良について，昭和57，

投与を行なって繁殖コロニーを拡大することが58年度厚生省神経疾患委託研究「筋ジスできた。また、コントロ −ル系動物の繁殖成績

トロフィー症動物の開発・供給に関する研においても、通常のハムスク㌧−のそれと同様の究」報告書．

成績が得られていることから繁殖も容易と考えられる。今後、肪ジス系またコントロール系共に安定した生産供給体制を継続してゆく予定で
ある。

一113一

昭和59年度厚生省研究報告書，115−117，1985

Ⅳ−2．C57BL／10Sc−Tndxの飼育・繁殖
斉藤宗男：江崎孝三郎●
研究協力者

日

置恭司●

新らたに発見された筋ジストロフィーマウス

繁殖は良好で、延15回の出産によって938

C57BL／10Se一m血を、1983年11月英匹840匹の計78匹の仔を得ることができた。

より次々世代にも3ペアを残した。現在繁殖継続

導入し、その飼育繁殖を行っている。以下、そ中であるが、前の世代同様の成績が得られていの状況について報告する。

る。

国のPoultry Research Centar

約1ヶ年問の成績をまとめると、11匹の交
飼育繁殖方法配9のうち9匹が出産し、延31回（平均3．4

導入した動物は、C57BL／10Se一m血95回）の出産がみられた。稔産仔数は165匹85である。

（平均5．3匹）で、総離乳仔数は144匹、離飼育は、微生物的統御を確実におこなうため乳率は87ご39らであった。

にビニールアイソレータ内で行なった。飼育室

故生物検査：C57BL／10Se一訊ねの微生

は温度23±2℃、湿度55士5界、照明時間

物的状態を確認するために、当研究所教生物モ

は8時−20時迄の12時間明とした。飼育ケ

ニタリングセンターにおいて、培養検査5項目、ージは日本クレア製の縦17．5cm横24．5cm高血清反応検査8項目、鏡検3項目の計16項目

さ12．58Ⅵのプラスチックケージを用い、床敦の徽生物検査を実施した。（表2）その結果、にはカンナクズを用いた。飼料は3Mrdr線照培養検査において緑膿菌が検出されたのみであ射滅菌したCA−1回型飼料（日本クレア製）をった。従って、C57BL／10Se一m血の微生物給与した。飲水は水道水を高圧蒸気滅菌し給水状態は通常のSPF動物と同等と考えられる。

瓶で与えた。

遺伝的検査：C57BL／10Se一m血の遺伝

繁殖はメス1オス1の連続同居交配によった。

的背景を確認するために、当研究所遺伝的モニ
タリングセンターにおいて、19の遺伝子座の

成

績

繁殖成績：

遺伝子型について検査し、C578L／10SeN系

C57BL／10Se一m血の昭和58と比較した。（表3） その結果、すべての座

年11月から60年2月迄の、世代別繁殖成溝の遺伝子型がC57BL／10SeNと一致していた。

を表1に示す。

従って、C57BL／10Se一m血の遺伝的背景は初代の5ペアにおいては、3ペアに延6回の出産がみられ、913匹912匹の仔を得るこ

C57BL／10SeNとほゞ同等であると考えられる。

供給実績：繁殖されたC57BL／10Se一とができた。
次世代には、3ペアを残した。この3ペアのm血は当研究所内外の研究者に配布された。昭・（財）実験動物中央研究所−115−和58年11月から60年2月の供給総数は991897の計188匹であった。

表1．C57BL／10−m血の繁殖成績
1983．11−1985．2

世代

交配？数

総出産回数 （平均） 総産仔数 （平均） 離仔数 9
回
（
2．
0）

匹
（
4．
1）

匹

匹

界

25

25

13

12

10 0．
0

3

15

（
5．
0）

82

（
5．
5）

78

38

40

9 5．
1

2

3

10

（
3．
3）

58

（
5．
8）

41

22

19

70．
7

計

9 （
11）

31

（
3．
4）

165

（
5．
3）

144

73

71

87．
3

3

1

回

匹

匹

離乳率

6

P

匹
（
5）
●

8

備

考

繁殖継続中

・ 95匹中3匹が出産した。

表2．

微生物検査成績応反．dds d可Ud上dhs

仏でn∈SコのTOnuOJJds

SJhコE dTpLd一日

Snと盲．還puOS

SnJ可＞S召可pddU上 のgコ0富∽nTTA d可Tむ∈OhpU凹のコh可A Ouのpd USn〇三の可uOETコd dE∽dTdOEぎESTud叫JO SIL￠NNh↑

En可JnEJ d合二月豆岩OEldS

一Jむ占OS︸nぷ∈コJLのPOdqのuhhOU

SJuOETnd dESdTdOOさー・．dd∽dTTUuOETdS

dTTむJコのpSdd

84．1

一

一

十

一

一

一

一

一

一

一

一

一

一

一

一

一

℃4．9

一

一

＋

一

一

一

一

一

一

一

一

一

一

一

一

一

も4．9

一

一

＋

一

一

一

一

一

一

一

一

一

一

一

一

一

C57BL／10Se一刀■dJ

表3．
染色体鳳
遺伝子座

SduOEOpnqのd

統 ・ 検査日

C57BL／10SeN

dのOu■叫コJUd

dOTdOhP0∈nUud

系

養のTTO TTOU d山上〇一h0月Uの凹

日

項

清

血

培

1

遺伝学的検査成綴
2

： ‡ ：

3

4

5 ・
6

7

8

9

11

17

ご ‡ ： 盲 ： ‡ 一 丁 ？ ： ‡ 、 ？ 当 日勺 O
P d 戸 口■b
一 山 く H U ヨ U hl 色 ．
勺8 m の占 0 h d I l
J U H H H 日 昌 ト H H H※
C 57B L ／10 S e 一
m dJ

8

8

8

1 ■a

b

a

a

a

b

S

a

b

b

b

b

a

b

b

C 5 7B L ／10 S cN

a

a

a

l

b

a

a

a

b

8

8

b

b

b

b

a

b

b

系

※

統

C57BL／10Se一m血：a84．7．9検査
−116−

考

参考文献

察

ビニールアイソレータを用いて、9585の1）Bulfield G．，W．G．Siller，

C57BL／10Sc一m血マウスを基に、これらマ

P．A．L Wight，and KarenJ・

ウスの飼育繁殖を試みた。

Moore；X chromosome−linked

C57BL／10Se一m血の外見所見はC57BL

muscular dystrophy（md∬）in／10SeNと差がみられず、約一ヶ年の経験で
the mouse，Proc．Natl．Acad．

あるが、飼育も同一の方法で行なうことができ

Sci・USA．81；1189−1192，（1984）た。
繁殖成績についてみると、平均出産回数3．4
回、平均産仔教5．3回、離乳率87．3界と比較

2）DangainJ．and Vrbova G，：的良好で、C57BL／6−dyと比べ、飼育繁殖

Muscle developmentin

が容易であることが確認された。

mutant mice．Muscle and

今後、C57BL／10Se一m血を繁殖し、研究班に配布すると共に、実験動物としての改良を加える予定である。

−117−

7n血

Nerve，7：700−704，（1984）

昭和59年度厚生省研究報告書，119−122，1985

Ⅳ−3．体外受精法による筋ジストロフィーマウス
（C57BL／6−dy匂γ）の作出
江 崎 孝三郎●
研究協力者 横 山 峯 介●
はじめに

5珍02，90界N2とした。なお、これらの筋ジストロフィー症のモデル動物として使用

メディウムは、プラスチックシャーレ（35×15

されるC57BL／6−dyマウスは、劣性のホモでm）に分注し、上面をノミラフインオイルで被っ発症する。dyホモマウスは、生後2−3週齢て使用した。
卵子の採取：メスマウスに5IUので発症しはじめ．、性成熟時に達しても自然交配

PMSG

が不能なので仔を得ることはできない。このた（Pregnant mare Serum gOnadotropin）

め、dyホモマウスを得るには、dy遺伝子をとhCG（human chorionic gonadotro−

ヘテロで持つメス・オスを交配するのが従来おpin）を48時間間隔で腹睦内注射し、排卵をこなわれている方法1）である。しかし、この交誘起した。bCG注射後16、18時間にこのメ

配では、その仔の4分の1に如ホモマウスがスを頚椎脱白法で殺処分して卵管を摘出し、メ現われるのみであり、しかも生後2、3遇齢にディウムを配したプラスチックシャーレ内のパならないと正常と筋ジストロフィーを区別する

ラフィンオイル中に入れた。つぎに実体顕微鏡

ことが出来ないために、胎生期や生後の早い時下で、解剖針を用いて卵管膨大部を切開し、卵期に丘細胞に包まれた卵の集塊を得、0．4mgの受精

dyホモのマウスを実験に使用することができなかった。本研究では、体外受精の技術を用メディウム中に導入した。
精子の採取と精子液の調整：十分に成熟した

用いて dyホモマウスの作出を検討した。

健康状態の良好なオスを頚椎脱臼法により殺処
材料および方法

分し、直ちに精巣上体を取り出した。滅菌炉紙

マウス：体外受精には、当研究所で生産され上で血液や脂肪などを取り除き、尾部の精巣上

たC57BL／6一旬ノ旬γマウスを使用した。また、体管が白く精子で充満している部分を選び、鋭体外受精によって得られた胚を移植するための利なハサミで切開して精子の集塊の一滴を解剖

レシピェソトは、日本クレアから購入したJcl針で受け、0．4mgのメディウム中に導入して精：工CRマウスを用いた。

子懸濁液を作製した。精子液は炭酸ガス培養装

メディウム：精子の懸濁ならびに受精から前置内に静置し、温度が37℃、気相が5界CO，核期までの培養にはTYHメディウム2）を用い、95秒空気の条件下で1−1．5時間インキュベ

気相は5界CO2，95界空気とした。また、前ーションした。

核期から2細胞期までの培養にはMWメディウ

授精：卵を含んだ0．4mgのメディウムに、5ム3）を使用した。この場合の気相は、5界CO，−10〟上の精子液を加えることによっておこ■●一一●−●一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一■●−●■■一■●●一・（財）実験動物中央研究所−119−なった。受精の場の最終精子濃度は、精子液のた如ホモオスの精巣上体尾部から採取したが、濃度および添加量から100−150精子／㌦m3

表1に示すごとく、1回の実験に必要とする十と推定される。精子液を加えたシャーレは、直分な量を1匹の個体から得ることができた。まちに炭酸ガス培養装置内に移して、所定の時刻

た、卵はホルモン（PMSG−hCG）処理したメスまで培養した。

43匹のうち、32匹（74．4界）から採取でき卵の検査と培養：授精後4−7時間にシャーた。排卵陽性率で実験群の間に差が見られたが、レを取り出し、倒立頗徴鏡下で卵を検査して受とのことについては使用したマウスの日齢の違精の有無を調べた。判定の基準としては、第2いや、筋ジストロフィー症の病状の程度などが極体が放出され、卵細胞質内に雌堆2個の前核影響していることが思考された。

が認められたものを受精卵とした。受精卵と判定したものは、MWメディウムで2回洗浄した

2．体外受精および培養による発生

のち、′ミラフィンオイル下の新しい0．2鳳gMWメディ採取された未受精卵の大多数は、体外受精すウムに移して約20時間培養し、2細胞期へのることにより、前核期の受精卵として得ること発生を調べた。

ができた。その値は、表1に示したように、排レシピェントへの移植：培養により2細胞期

卵陽性メスあたりでみると平均6．9個、全体でへと発生した卵は、精管絃衆オスとの不妊交配

222個であった。さらにこれらの受精卵は、によって偽妊娠を誘起しておいたDaylおよび培養によって209個（94．19ら）が形態的にDay2（膣栓観察日を妊娠第1日とした）のレ

正常な2細胞期胚へと発生した。2細胞期胚とシピェントメスの卵管内に移植した。すなわち、ならなかった13個の内訳は、1細胞期にとどベントパルビタールで麻酔したレシピェントにまっていたものが5個（2．3界）、不等卵割等

対して、片側の卵管あたり5、7個、両側で10の異常発生を呈したものが8個（3．69も）であ−14個の胚を卵管釆をとうして注入した。

った。

結果および考察

3．移植による仔への発生

1．精子および卵の採取

2細胞期胚をレシピェントメスの卵管内に移授精用の精子は、筋ジストロフィーを発症し植したさいの成績は表2に示したとうりである。

表1．C57BL／6−dyマウスにおける体外受精成績
実験

使用 動 物数

排 卵 陽性得 られた前 核期

2 細胞 期 へ発 生

撤

オス

メス

メス数例

卵数

した 卵 数1

1

16

9 （5 6．
3）40 （ 4A ）40 （1 0 0

2

1

9

7 （7 7 ．
8 ）

20 （ 2．
9 ）

1 9 （ 9 5．
0）

3

1

18

1 6 （8 8 ．
9）

1 6 2 （1 0 ．
1 ）

1 50 （ 92．
6）

合計

3

4 3

3 2 （74 ．
4）

2 22 （ 6．
9 ）

209 （ 94．
1）

−120−

（平 均 ）（界 ））表2．C57BL／6一旬マウス体外受精卵の2細胞期胚での卵管内移植成績
妊 娠 成 立出生仔 数

レシピェン ト数の（界）

3

2 （ 66 ．
7）

1 0 （2 5 ．
0）

5

19

2

2 （1 0 0）

11 （5 7 ．
9）

6 ： 5

1 12

8

7 （ 8 7．
5）

38 （3 3 ．
9）

1 7 ：2 1

3

0 （

0 （ 0

実験

偽 妊娠

移 植

レシ ピェ ン ト

札

日

齢

胚 数

数

1

D a y −1

40

2

m

y −1

3

D a y −1

4

m

y −2

38

0

）

？ ： 8

）

l

： 5

−

すなわち、偽妊娠日齢の第1日目のレシピェソ

dy2J）・疾患モデルハンドブック（川俣順

トに移植した場合には、13匹中の11匹（84．

一，松下 宏 編），医歯薬出版，PP．

69も）で妊娠が成立し、59匹（34．5界）の419−424，1979．

仔が得られた。一方、第2日目のレシピェント

2）豊田 裕，横山峯介，星 冬四郎：マウに移植した場合では、全例（3匹中3匹）ともス卵子の体外受精に関する研究Ⅰ．精巣妊娠が不成立に終り、仔は得られなかった。実

上体精子による受精成績．家畜繁殖誌，16

験1−3において得られた仔の性比は、メス28

147−151，1971．

匹：オス31匹とほぼ同数で、著しい片寄りは

3）Whitten，W・K・：Nutrient

認められなかった。またこれらは、外表的な観

requirements for the cuiture

察においても、とくに異常は認められず、全例

of preimplantation embryo

とも正常であった。

i恥骨山γ0．Advan．Biosci・，

これまでの報告によると、マウス体外受精卵

6．129−139，197−1．

の移植による仔への発生率は、2細胞期で卵管4）Whittingham，D・G・：Fertili−

内移植したさいには約10−20か5，6ミさら

zation of mouse eggsin vitro．

に培養して桑実胚期から胚盤胸期まで発育させNature，220I592−593I1968・て子宮内移植したさいには約30−40が8）5）Cross，P．C．and R・L・Brinster：の値であも。今回得られた成熟は、如ホモマ

Zn vitro development Of mouse

ウス同士によるものであることを考えれば十分

oocytes・Biol・Reprod・3Iに満足し得るものである。しかし、dyホモマ

298−307，1970．

ウスの使用時期（筋ジストロフィーの発症の程6）Miyamot0，H・and M・C・Chang：

度など）や実験操作上のいくつかの点に改良を

Deveiopment of mouse eggS

加えることにより、さらに効率よく dyホモマ

fertilizedin vitro by epidi−

ウスを作出できると考えている。

dymal spermatozOa・J・Reprod・
Fert・I文1）辻献

30，135−137I1972・

7）Hoppe，P．C．and S・Pitts：

繁勝：筋ジストロフィーマウス（dy，ー121−

FertilizationinサitrOanddevelopment of mouse ova．

Produced by the Parents

Biol．ReprOd・，8，420−426，

derived from mouse eggs

1973．
fertili2：edin

8）Kasai，K．，M．Sugimoto andY．Toyoda：Normal Progeny

vitro・Jap●J●Zootech・Sci．，50，885−890，
1979．

−122−

昭和59年度第5班（野村班）名簿
区

分

班

長

氏

野

村

所
所

名

達

次

財 団法 人〒 2 13

運営幹事

江

崎

孝三郎

幹

事

野 々村 禎

昭

田

秀

夫

員

辻

繋

勝

池 連

携

田

武

谷

誠

宗

木

元

戸 塚

04 4 −
7 5 5 −5 4 4 1

03 −
812 −
2 1 11

東 京 都文 京 区本 郷 7 −3 −1
0 4 2 3 −4 1−2 7 1 1

東 京 都小 平 市小 川 東町 2 6 2 0
0 7 3 4 −3 1 −2 1 5 1

和 歌 山市 九番 丁 9
0 2 22 −72−
4 32 1

仙 台 市堤 通雨 宮 町 1 −1
0 5 2 −7 8 1 −5 1 1 1

名 古 良 市 千種 区不 老町

財団法人

堆 ◆ 財団法人〒 2 13勝実 験動 物 中央 研 究所

川 崎 市宮 前 区野 川 1 4 3 0〒 4 09 −16′
斉 藤

0 4 4 −7 5 5 −5 4 4 1

名 古 屋 大学 農学 部 家畜 育 種 学〒4別水実 験動 物 中央 研 究所

東 北 大 学農 学 部家畜 形 態 学〒 9 80

富電 話番 号

和 歌 山 県立 医 科 大学 医学 部 第 二生 理 学〒 6 40菊

名地

国立 武蔵 療 養所 神 経 セ ン タ ー〒 18 7丑関

東 京 大 学医 学 部薬 理学〒 1 13杉機
在

川 崎 市宮 前 区野 川 14 3 0

財 団法 人〒 2 13属

日本生 物科 学 研 究所

0 5 5 1 3 6 −2 3 3 3

山梨 県小 渕 沢 町 上笹 尾
実験 動 物 中央 研 究所044−
7 5 5 −5 4 4 1

川 崎 市宮 前 区野 川 1 4 3 0也

財 団法 人 実験 動 物 中央 研 究所
〒 2 13 川 崎市 宮 前区 野川 1 4 3 0

0 4 4 −7 5 5 −5 4 4 1

武

愛 知 県心 身 障害 者 コロニー発 達障 害 研 究所

0 5 6 8 −8 8 −0 8 1 1〒4紳−
03 春 日井 市神 尾町 7 1 M
協 力 者

江

橋

節

郎

早

川

純一 郎

岡 崎 国立共 同研 究機 構 生学 研 究 所〒 4 44 岡崎 市 明大寺 町字 西 郷 3 8

0 5 6 4 −5 4 −1 1 1 1

金 沢大学 医学 部 動物 実験 施設

0 7 6 2 −6 2 −8 1 5 1〒 9 20

金 沢 市室 町 1 3 −1

松

崎

哲

也

財 団 法 人 実 験動 物 中 央研 究所〒 2 13 ■川 崎 市宮 前区野 川 1 4 3 0

0 4 4 −7 5 5 −5 4 4 1

横

山

峯

介

財 団 法 人 実験 動 物 中央 研 究所
〒 2 13 川 崎市 宮 前区 野川 1 4 3 0

0 4 4 −7 5 5 −5 4 4 1