平成27年8月28日
日化協LRI研究報告会

化学物質の反復投与毒性をin silicoで評価するツール：HESS
製品評価技術基盤機構
化学物質管理センター
山田隆志

1

反復投与毒性試験
動物に被検物質を一定期間反復投与したときに現れる生体の機能及び形態の変化を観察することにより、被検物質の毒性を明らかにすることを目的とする。
齧歯類(原則 ラット)

高・中・低用量群、対照群

投与期間（4‐13週間）

回復期間

一般状態・体重・摂餌量・摂水量
無作用量 (NOEL)
無毒性量 (NOAEL)
最小影響量 (LOEL)
最小毒性量 (LOAEL)

血液学的検査血液生化学的検査
尿検査
臓器重量
病理学的検査 等
2Challenge for future
Rodent Repeated Dose Toxicity
有害性評価支援システム
統合プラットフォーム
Hazard Evaluation Support System(HESS) Integrated Platform
3

HESSの開発

4

NEDO/METI委託事業
構造活性相関手法による有害性評価手法開発
背景・目的動物実験を行わない評価手法の開発が求められていること、WSSD2020年目標実現のために効率的な予測手法が求められていることから、「28日間反復投与毒性」の評価について、試験データがない化学物質に対し構造活性相関手法やカテゴリーアプローチ等のin silicoの手法により、効率的に推定ができるシステムを開発する。
5

NEDO/METI委託事業
構造活性相関手法による有害性評価手法開発
 実施期間： 2007‐2011
 プロジェクトリーダー： 林 真 （食品農医薬品安全性評価センター） 参加機関（メンバー）：
国立医薬品食品衛生研究所（広瀬明彦、本間正充、吉田緑、鎌田栄一、簾内桃子）
製品評価技術基盤機構（山田隼、櫻谷祐企、阿部武丸、西川智、小林克己、前川昭彦、張 慧琪、田中雄四郎、長谷川隆一、山田隆志）
Bourges ”Prof. Assen Zlatarov” Univ. (O. Mekenyan, S. Dimitrov)関西学院大学（岡田孝）
富士通(株)（山下辰博、酒井宏太）
東北大学（山添康、吉成浩一）
6

開発方針
 専門家の判断をサポートするためのシステムを構築する（システムが判断を下すのではない）。
 毒性、病理そして総合的なリスク評価を行う専門家が主導的な役割を果たす(システムの専門家主導ではない）。
 国際的に利用されるものを目指す（OECD QSAR
Toolboxの開発者をメンバーに加え、OECDと連携しつつ研究開発を実施）。

7

開発システムの構成
有害性評価支援システム
統合プラットフォーム（HESS）

代謝知識情報DB
ラット代謝マップDB
及び代謝シミュレータ
ヒト・ラット代謝関連情報DB（P450代謝予測モデル）

OECD QSAR Toolbox

反復投与毒性を入力 評価したい化学物質の化学構造、物質名CAS番号など類似物質の反復投与試験情報
出力 作用機序情報
評価対象物質のカテゴリー情報、推定される毒性等

判断材料

毒性作用機序DB

ベイジアンネットを活用した毒性予測機能

ＨＥＳＳ ＤＢ

試験報告書DB

カテゴリーアプローチ支援機能（カテゴリーライブラリー等）

毒性知識情報DB

ユーザー

全て
英語表記

エキスパートジャッジ

(Web)

互換性

未試験物質の反復投与毒性8

1. 毒性知識情報 DB
1‐1. 試験報告書 DB 充実したデータセットを持つ我が国の化審法既存点検『28日反復投与毒性試験報告書』を中心に、GLP基準の試験報告書を採用（現在は750物質）
 用量反応データを収載（血液学、血液生化学、臓器重量、病理所見など）
 毒性・病理専門家の意見や化学物質審議会判定に基づく有意差マーク(フラグ)を付与して、毒性学的な注意喚起を図った。
Item

Unit

0 mg/kg

20 mg/kg

mean

SD

mean

SD

1.0 15.02.0

BUN

mg/dL

12.6

Creatinine

mg/dL

0.52 0.04 0.53 0.02

T.cholesterol

mg/dL

T.bilirubin

mg/dL

86

1786

190.37 0.04 0.42 0.03

sgnif.

100 mg/kg
F

mean

SD

12.9

1.3

sgnif.

500 mg/kg
F0.48 0.04
138

mean

SD

sgnif.

15.6

2.2 *F▲0.47 0.04

25 **

▲

21215 **▲

0.48 0.04 **▲0.59 0.08 **▲9病理所見用語の統一（病理所見のシソーラス）
試験報告書DB

試験報告書記載

Liverhypertrophy

hypertrophy of centrilobular
hepatocyte
hypertrophy, hepatocyte, centrilobularperilobular

hypertrophy of hepatocyte, groundgrass appearance in the central zone

・・・・・・

centrilobular

・ 83臓器・11302所見のシソーラスを作成
・ DBの検索エンジンに搭載
10

1. 毒性知識情報 DB
1‐2. 毒性作用機序DB変性・壊死など重篤な毒性のメカニズム情報を収載（標的：赤血球、肝臓、腎臓、精巣、神経、膀胱、甲状腺）<レファレンス情報>• Reference<試験情報>• Cell line/ Species• Experimental design• in vitro / in vivo / ex vivo
• Concentration / dose employed<メカニズム要約>• Summary<メカニズム情報>• Possible chemical reaction /metabolism• Possible toxicant• Possible interaction with bio‐molecule• Effects• Target cell/ tissue/ organ etc.

<その他>
• Effective concentration/ Dose
• Related compounds studied• Additional information• Authors’ proposal (opinion)（130物質、260 レファレンス）11

メカニズムに基づいたカテゴリー（溶血性物質）
赤血球 代謝活性化SS

Thiophenol

Diphenyl disulfide

直接作用
肝 代謝活性化
AnilineN‐Hydroxyaniline

ヘモグロビンの酸化

H2N‐NH2Hydrazine活性酸素分子種の産生
赤血球の酸化的障害
メトヘモグロビン血症を伴う溶血Nitrobenzene

肝 代謝活性化
OHO

Ethylene glycol
Monobutyl ether

Alkoxyacetic acid

赤血球の膨張溶血

赤血球は工業化学物質の主要な標的の一つ
12

2. 代謝知識情報 DB
2‐1. ラット代謝マップと代謝シミュレータ
ラット肝を中心とした代謝マップのDB(1000 化合物, 1200 マップ)

Liver Metabolism
Simulator

13

2. 代謝知識情報 DB
2‐2. ヒト / ラット 代謝関連情報DB
ABSORPTION Absorption rate, Cmax, Tmax
Involvement of transporter
DISTRIBUTION Apparent volume of distribution
Time-dependent changes by repeated doses
Brain → Blood-brain barrier, Adipocyte → strage
Liver → Metabolism, Kidney → Urinary excretionKidney → Binding to protein
Organs with higher concentrationof chemicals than blood
Involvement of transporter
METABOLISM Related enzyme and molecular information
Contribution ratio, Cellular fraction, Metabolite
Species differences, Strain differences
EXCRETION
Excretion rate, Involvement of transporter
Species differences, Strain differences
Result of interaction, inhibition, enhanced of enzyme
Relationship of toxicity test

リガンド構造に基づいた
P450代謝予測モデル

EAEB

EAB

122
B

A

31

Red: 3 points
Green: 2 points
Blue: 1 point

232DC1E

13131

ヒト CYP2E1 モデル(Yamazoe et al, 2011)(60 chemicals, 130 references)14

Adverse Outcome Pathwayに基づいた
反復投与毒性カテゴリーの構築

15

物質間の比較を容易にする毒性DBの構築
Item

Unit0 mg/kg

20 mg/kg

mean

SD

mean

SD

1.0 15.02.0

BUN

mg/dL

12.6

Creatinine

mg/dL

0.52 0.04 0.53 0.02

T.cholesterol

mg/dL

T.bilirubin

mg/dL

86

1786

190.37 0.04 0.42 0.03

BUN・・・・・・・・
Creatinine・・・・・
T. cholesterol・・・
T. bilirubin・・・・・

sgnif.

100 mg/kg
F

mean

SD

12.9

1.3

sgnif.

500 mg/kg
F

0.48 0.04
138meanSDsgnif.

15.6

2.2 *F▲0.47 0.04

25 **

▲

21215 **▲

0.48 0.04 **▲0.59 0.08 **▲NOEL 100mg/kg, LOEL 500mg/kg
NOEL 500mg/kg
NOEL 20mg/kg, LOEL 100mg/kg
NOEL 20mg/kg, LOEL 100mg/kg

各所見のNOELとLOELをDB化
16

各所見のNOELとLOELをDB化するためのデータ構造
NOEL/LOEL

General signs

21 Findings

NOEL/LOEL

Urinalysis

14 Findings

NOEL/LOEL

Hematological exam.

37 Findings

NOEL/LOEL

Blood biochem. exam.

38 Findings

NOEL/LOEL

Organ weights

14 Organs

56 Findings

NOEL/LOEL

Necropsy

23 Organs

39 Findings

NOEL/LOEL

Histopathological exam.

28 Organs

197 Findings

NOEL/LOEL17Adverse Outcome Pathwayをベースにした反復投与毒性のカテゴリーの構築
化学
構造

代謝
毒性メカニズム

毒性試験で観察される関連所見のセット

代謝DB
毒性作用機序DB

試験報告書DB共通のAOPを活性化する物質をカテゴリー化する。

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アニリン溶血性貧血カテゴリー
AOP
肝臓

脾臓

赤血球[O]

Structuralboundary

ROS

R2ROS
formation

Cell damage

NHemolysis

Met-HbHb

N=O

反復投与毒性試験における関連所見
RBC↓, HGB↓,HTC↓
Re culocyte↑
Met‐Hb↑, T‐bil↑Spleen‐hemosiderinpigmentation etc.

R1R3R7R4R6R1, R2 = H, methyl or ethyl.
R3～R7 = H, alkyl, halo, alkoxy, NO2 or NH2R519

試験データなしの対象物質を試験済みの類似物質と共にカテゴリー化する
対象物質

毒性所見試験データなし

試験済みの類似物質

反復投与毒性のデータ(NOEL/LOEL)

関連情報へ
カテゴリーの候補

20

関連情報へのリンク（１）：代謝マップ

21

関連情報へのリンク（２）：
試験報告書DBの用量反応相関データ
血液学データ22

関連情報へのリンク（３）
毒性作用機序 DBヒト/ ラット ADME DB

23

OECD QSARプログラムとの連携
 OECD QSAR Toolbox ver.1
 化学物質の各種有害性試験について各国が開発したDBや予測モデルを集積 2008年に公開
 当初反復投与毒性には対応しておらず、DBや予測手法の提供が望まれていた。

 QSAR Toolbox ver.2, ver.3の開発への協力
 反復投与毒性試験データの提供 (ver.2、2010年公開)
 反復投与毒性の予測支援機能の提供 (ver.3、2012年公開)

24

HESSの運用・普及
 NITEのHPからスタンドアロン版を無料で公開*
 データ更新（年2回）
 海外の毒性DBとデータ交換を実施（ToxRef DB, COSMOS DB）
 講習会（国内）、ブース展示（海外）を実施
 ケーススタディの実施、発表*http://www.nite.go.jp/chem/qsar/hess.html

25ケーススタディ：
化学物質の反復投与毒性を予測するためのAOPをベースにしたカテゴリーアプローチ手法の開発

26

Ethylene Glycol Monomethyl Ether (EGME)

EGME
CAS: 109‐86‐4

主な毒性影響：雄性生殖器への影響
精巣萎縮： 750 ppm以上
血液系への影響
胸腺萎縮： 750 ppm以上
脾臓被膜線維化： 1500 ppm以上(F344 rats, 13‐w, 飲水試験, NTP TOX26, 1993)

REACH：
高懸念物質（SVHC）の候補としてリスト化
本研究の目的：EGMEと構造的に関連し、精巣毒性を誘発する可能性がある物質をHESSを用いて検索する。
27

EGMEの精巣毒性: Simplified AOPLiverEGME

BloodTestis▪ Perturbation ofendogenous metabolism▪ Energy shortage▪ Histone modification▪ Modulation of
hormonal responses

Spermatocyte
degeneration/
cell death

Atrophy/weight loss

（メトキシ酢酸）

重要な証拠(in rats)
主要な代謝 EGME → → メトキシ酢酸(in rats)+メトキシ酢酸 →変性・壊死↑(Miller et al., 1984)(Foster et al., 1987)(in rats)
EGME + pyrazole →メトキシ酢酸 ↓ 変性・壊死↓(in rat primary testicular cultures)+メトキシ酢酸 → 変性↑(Foster et al., 1984)(Gray et al., 1985)
28

HESSを用いたカテゴリーの構築
アルコキシ酢酸の生成

精巣毒性影響EGME+Methoxyacetic acid(in vivo)

Degeneration, seminiferous
tubules, ≥ 750 ppm
Weight↓, ≥ 1500 ppm

F344 rats, 13 weeks,drinking water,750, 1500, 3000, 4500 ppm

EGEE+
Ethoxyacetic acid(in vitro/in vivo)

Degeneration, seminiferoustubules, ≥ 5000 ppm
Weight↓, 10,000 ppm

F344 rats, 13 weeks,drinking water,
1250, 2500, 5000, 10,000 ppm

化合物

EGiPE

+
Isopropoxyacetic acid No toxic effects(in vivo)

EGtBE+
tert‐Butoxyaceticacid(in silico)

EGBE+
Butoxyacetic acid(in vitro/in vivo)

PGMEA‐(in vivo)

試験情報

SD rats, 28 days,
gavage,30, 125, 500 mg/kg/dNo toxic effects

SD rats, 42 days,gavage,
4, 20, 100 mg/kg/d

No toxic effects

F344 rats, 13 weeks,drinking water,
750, 1500, 3000, 4500, 6000 ppm

No toxic effects

SD rats, 44 days,
gavage,30, 100, 300, 1000 mg/kg/d

カテゴリーの定義：代謝されてメトキシ酢酸又はエトキシ酢酸を生成する物質群 29

外部データを用いたカテゴリーの検証
Chemicals

EGME
EGEE

EGMEA

EGEEA
EGDME

DEGDME

EGPE

Methoxy‐ orethoxyaceticacid

Testicular
toxicity(in silico)

Testicular
toxicity(in vivo)+(in vitro)

++

++

+
(in vitro)+++(in vitro)

++

++

+
(in vitro)+++(in silico)

++

++

+
(in vitro)(in vivo)

++

++

‐
(in silico)‐‐

Methoxy‐ orethoxyaceticacid

Testiculartoxicity(in silico)

Testiculartoxicity(in vivo)‐(in vitro)(in vivo)‐‐‐(in vivo)‐‐‐(in silico)

‐

‐

HGDE

+(in vivo)

++

++

MHE

‐
(in vivo)

‐

‐

EHE

‐
(in vivo)

‐

‐

BE

‐
(in vivo)‐‐

Chemicals

EGBE

EG

EGA

Nagano et al., 1984, Cheever et al., 1989, Poon et al., 200530

インベントリーのスクリーニング
化審法既存化学物質 約16,000物質 （MITIインベントリー）(CAS No. Chemical name, Smiles)
HESSへロード

代謝シミュレータで想定される代謝物を作出
メトキシ酢酸又はエトキシ酢酸を生成する可能性がある物質を検索
関連物質の代謝情報を精査しエキスパートジャッジ

31

代謝シミュレータがメトキシ酢酸又はエトキシ酢酸を生成する可能性があることを示唆した物質
Basic group
1Group 12(EGME)
3O
O

[H2O]

[H2O]

8(EGEE)

O

[H2O]

7

4

[H2O]

(EGMEA)(EGEEA)

5

[H2O]

9

[H2O]

10

[H2O]

6

[H2O]

11

[H2O]

12

[H2O]

OO
O

Group 213

14[O]

[O]

(EGDME)
[‐2H]

18

20[O]

Group 315[O]

(DEGDME)
19

[‐2H]

[‐2H]

16[O]

21

22

17

[H2O]

[H2O]
[‐2H]

[‐2H]
32

Hexamethylene Glycol Dimethyl Ether(HGDE)の想定される代謝経路OO

O‐脱メチル化

HGDE

精巣毒性影響あり (Poon et al., 2005)
MITIインベントリーには存在せず。

OOH

カルボン酸への酸化

‐酸化
関連情報
実測代謝データ(Richards et al., 1993)

CYP2E1代謝予測モデル(Yamazoe et al., 2011)14

DEGDME
P450

[O]

HGDE

O
O

[O]

メトキシ酢酸（尿中主要代謝物）
33

メトキシ酢酸・エトキシ酢酸の生成に関連する代謝経路
Group 1

Group 2

加水分解

酸化EGME又はEGEEGroup 3加水分解

酸化(n=1 and 2)

Group 4カルボン酸への酸化
→‐酸化

精巣毒性
メトキシ酢酸又はエトキシ酢酸

本ケーススタディでは、毒性情報が不足する関連物質の毒性を類推するためにAOPをカテゴリーの構築に利用し、その適用範囲を拡大できることが示された。
（Yamada et al., Regul Toxicol Pharmacol. 2014; 70: 711‐719.）
34まとめHESSは公開されている信頼性の高い反復投与毒性試験データを収載している。
HESSの毒性カテゴリーは、AOPと上記の毒性試験データをもとに構築される。
AOPをベースにしたカテゴリーアプローチは、化学物質の反復投与毒性の予測に適用可能である。
35

ご清聴ありがとうございました。

36