奈医誌. (J.NaraMed.Ass.
) 40，5~9，平 1(5 )培養肝癌細胞に及ぼす DIBUTYRYLCYCLICAMPの影響
奈良県立医科大学病態検査学教室

悶本康幸，辻井啓之，中野博

奈良県立医科大学第 3内科学教室

松本真，中山雅樹，辻井正

EFFECTOFDIBUTYRYL CYCLICAMPO NTHE
お1ACELLSGROWTHOFCULTUREDHEPATOYASUYUKIOKAMOTO，HIROYUKITSUJII andHIROSHINAKANODe
φar
抑 制t0/Clinico‑Lαborato
ヮDiagnostics，NaraMedical Universi~yMAKOTO MATSUMOTO，MASAKINAKAYAMAandTADASUTSUJIIThirdDψartment0/InternalMedicine，NaraMedicalUniversir
yReceivedJanuary9，1989

S品
ωu
仰7
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he叩pat加omac
白el
肱llswerestu
diedwithr
atMorri
shepatomacells(HTC)andhumanhepatoma
cells (HepG2).
DBcAMP inhibited DNA synthesisin HTC withou
tcytotoxicity. DBcAMP a1soinducedtyrosineaminotransferase (TAT) inHTC. DBcAMPi
nhibitedDNAsynthesisteachtimepointduringthe24h・culture. DBcAMPdelayedth
epopu
1ationinHepG
2adoub
1ingtimeo
fHepG2 and thetimea
twhich thepercentageo
fthecellswith mi‑tosisreachedapeak.
Theseobservation
ssuggestedthatDBcAMPhasanin
hibitoryeffect on t
he growth
l
1sbye
lon
gatingt
hecellcycle.
ofhepatomac
eIndexTer
lllsdibutyry1cyclicAMP，culturedhepatomacells

緒 言として，ラットやマウスの培養肝癌細胞を用いた検討は多くみられているの ~15).

しかも，最近，臨床的に本剤

DibutyrylcyclicAMP(DBcAMP) は，最近，ショを切除不能な肝癌患者に投与することにより h 今まで有ックの治療薬として臨床応用が可能となった薬剤である

効な対策の乏しかった門脈腫場塞栓が消失したとする極yclicAMP のが1)21，本剤の主要な薬理作用はすべて c

めて興味ある報告が出され 16)，われわれも同様の効果を

analog としてのものであり， 当然，広範かっ多彩な作経験し得たことから 17)，本都の肝癌治療への応用が注目用を有することが予測される.本剤は，また，以前よりされる.

ある種の癌細胞に作用して増殖を抑制したり分化を誘導
腫や神経芽細胞腫については比較的詳細に検討されていorris肝癌細胞
そこで今回，われわれは， ラット M8HTCI)およびヒト肝癌細胞 HepG219) に対する DBc
AMPの増殖抑制効果，機能変化の指標としての誘導酵

るわめ，肝癌も，木剤の増殖抑制作用が期待されるもの

素への影響について検討をおこない，興味ある成僚を得することが知られておりわ阿久とくに，ヒトの悪性黒色岡 本 康 幸 ( 他 5名)(6 )feredsaline (PBS) にて細胞を 3回洗浄し，たので報告する.

I~I 完投乾燥

固定した後，組織化学的に tyrosiheaminotransferase

実験方法‑glutamyltranspeptidase(rGTP) を(TAT) および r22) の方染色した. TA
T:は Thompson と Thomkins
田A. 細胞および試薬
Hepatomat
issuecultu
recells(HTC，ラット Morris‑GTPは Harada ら32)の方法で染色した.判定に法， r

肝癌細胞 7288c)，newbornbov
ines
巴rum(NBS)，fi
巳tall
然しては，全く染色されない場合を陰性，一様な染色像

aglebovineserum (FBS)，非必須ア Eノ倣 (NEAA)，Eを得られた場合を陽性とした.の minimumessentialmedium(MEM) お よ び Dul‑， Flow L
aboratoriesInc. USAbecco の MEM20) はより購入した. [3H]thymidine.(TdR) は， [63H]thチ酬E.細胞数および核の mitosis を有する訓 1胞の出現本の算出

HepG2を 35mm径の dish で培養し， 24日奇聞を 6midine (>15Cifmmol，NEN Researchl'roducts)を分割した各 24時間で細胞を Giemsa 染色し，光顕的に月J¥，、た.その他の試薬は，半井化学薬品側より購入し，

dish の任意の辺縁から中心にむかつて細胞をし 000個ず'1III
ヒ卜肝脳細胞 HepG2は，京都大学医学部第 2内や1国つ 2回観察し，核の mitosis の出現率を求めた.細胞数

善弘博士より供与されたものを用いた.また， DBcAMPflした後，血球算は，単層地養をトリプシンにて分散処 nは，第一製薬(附より供与された.

定盤にて測定した.

B.培養方法F. その他

HTC は，iabilityは，培養終了時の細胞の v

10% NBS と NEAA を含む EagleのM E M中にて培養した. HTCは，2X 105cellsfmlに浮トリバンプソレー染

色により光顕的に観察し，同医lに培養前後の medium6穴および 35mm径の plasticdishに 50，000遊し， 9中の lactatedehydrogenase(LDH) 活性の差を遊離酵

4時間培養した後 DBccellsfcm2となるように播種し，2ell の平素の lっとして測定した. データはすべて 6w

AMP を含んだ medium に交換し，実験に用いた.

tudent均(土標準偏差)で表現し，有意差検定には S

HepG2は， 10% FBSを含む Dulbecco の M E M 中の t‑testを用いた.

04cellsfml に浮遊し，にて培養した. HepG2は， 4X 1
HTC の場合と同様の dishに， 10，000cellsfcm2となるように播種し3日間培養した後 DBcAMP を含んだ

全土Eヨaロ : > 1 < :A. HTC の DNA合成能に対する DBcAMPの影響

medium ~こ交換し，実験に用いた.培養条件は， 3
7'CHTC の DNAに取り込まれた TdRの量は， Controlで， 5% CO2および 95%空気下で行った. なお DBcで290.
2
1土22.
07(dpmfngDNA，以下同じ)， DBcAMP

medium に終濃度 lmM となるよう添加し8.
62土 10.
17であった， DBcAMP投与
ImM投与では 9AMPはて用いた.によ り有意な DNA 合成能の低下が認められた (p<IC. DNA合成能の測定

0.
001)
.

DNA合成能は， DNAへの TdR の取り込みによっ

また，培養終了時の細胞の viabilityは， ControlおrP.rl:
tの LPH
よび DBcAMP投与群で差はなく， mediuて測定した.

HTC では， 96穴の dishで20時間培養し，さらに 4時間 lμcifwell の TdRを加えて培養し，その後トリプoldtrichrolicacidシン処:阻にて細胞を剥離し， 7 %の c活性は， Controlで 26土5(IUfl，以下向じ)， DBcAMP投与群で， 19土6であり，有意差はなかった.

B. HTC の誘導酵素に対する DBcAMPの影響

ellharvester を用い(TCA) を加え，酸不溶性部分を c

HTCにおける TATおよび r‑GTPの組織化学的染

lassfiber印刷、に吸着させ，そのよ七放射活性を液体て g

色像に対する DBcAMP の影響を検討した.その結果，シンチレーションカウンターにて測定した. HepG2でTATは， Controlでは染色されなかったが， DBcAMPも同じように測定したが， TdR の投与法は次のように投与により軽度の陽性像が得られ，本酸素の誘導が認め変えた.すなわち，投与量は .
o1μcifwell とし24時間をontrolで陽性で あった r‑GTP の発現られた.逆に， C6分割した各 4時間での取り込みを経時的に測定した.

は，DBcAMP投与により抑制された.

また酸不溶性部分の DNA量はSetaroと Morley21)の蛍光法により測定した.

C. HepG2の増殖に対する DBcAMP の影響
HepG2の DNAへの TdRの取り込みの投移を Fig.
lD. 誘導酵素の組織化学的染色に示した. ，¥ 、ずれの時点でも DBcAMP は TdR の取HTC を 3日間培養後， Dulbecco の phoshate‑bu
f‑り込みを抑制jし ま た そ れ は DBcAMP が 100μM お培養 IfI癌細胞に及ぼす DIBUTYRYLCYCLIC AMP の影響(7 )Control5ω心EコE一¥守口一﹀︿)﹂c=ωUD8cAMP
100μMーーームー‑一ー‑12162024Hoursa
fterthebeginnin
gofexperimentalculturenu(dHZOMC¥E立 百 ﹀ 切E 工判亡︑月間4zo

Controlbh///

1020Fig.3.E
ffectofDBcAMPonchangeo
fcellnumbero
fHepG2・るように作用するものと考えられた.
また，細胞数の推移では， Fig.3 に示すように，前値
4812162024Hoursafterthebeginnin
gofexPerimentalculture4.25土 2.8(x104cells/ml，以下同じ)に対して， Control

Fig.1.E
ffectofDBcAMP on DNAs
ynthesisof
HepG2・
DNAs
ysthesiswasdcterminedi
neveryιhinterval duringt
heculture.

が， DBcAMP投与では 2011，)閉まで噌加せず， 24時間後，では実験培養開始 16時間後に 8.
45土 7.0とほぼ倍加したに8.75士7.1 となり，倍加する 11~:i点の遅延が認められた.

察考nUFhd(次)EEHE 工 ゼ ﹀ ﹀ 旦 ωωピω且一 O 半0 0田町村亡

HTC の増般に対する DBcAMP の影響については諸家により報告されているが9)‑11)13)，とくに vanWijk
らのは，高濃度 (1‑2mM) で、みられる増殖の抑制は非特異的な毒性によるものとし， • Reuber H 35 すなわちラット肝癌細胞 H‑4・E EC3 などでみられる特異的な聞幽ト増殖抑制とは異なるとした.さらに Hargrove とGrarnerl3) は，培養に用いる血清中の酵素が DBcA
MPから adenosine 様毒性物質を生じることが増殖抑制の要因であることを報告している. しかいわれわれの成績
土，培養細胞から medium 中に遊離された酵素活性てtや細胞の viability の違いなどの毒性を示唆する所見は12162024土ureHoursafterthebeginningo
fexperimentalculFig.2.E
ffectofDBcAMPonm
itoticphaseof
HepG2cells.

得られなかった.ただし，今回の検討では DBcAMPの時間と短期であり，また細胞の増殖機能の投与則間は 24
うちでも DNA への TdR の取り込みについてのみの検討であるため，毒性があまり前回に出なかったのかも

よび lmM の 2点でほぼ濃度依存性の作用を示した.
光顕的に認められる核の mitosis像の出現の比率の推しれない.今後細胞密度や培養期間などの実験条件の変化も合めた多角的な検討が必要であろう.

移は， .
Fig.
2 に示すように， Control では実験培養開始

DBcAMP による TAT の誘導については Reuber

12時間後に最大値 8.3%を示したが， DBcAMP投与でH35においては認められているが24)‑26)，HTC におい

6時間後に最大値 7.5%を示した.なお，その他の i時は1てはその作用があるとする成績 27)とないとする成績2めが点では，いずれも比率はほぼ 1‑2%にとどまっていた.

あり，一致した見解は得られていない.ただし，同じよDBcAMP投与は，核の mitosis 出現の比率そのもののうに TAT を誘導することの知られているステロイド低下に作用するよりは，むしろそのピーク時期を遅らせホルモンが HTC で本酵素を誘導することは報告され

岡 本 康 幸 ( 他 5名)(8 )ている22).われわれの成績では vanRijnらの報告27)とHepG2 に対する DBcAMP の影響について検討をおこ同様に，軽度の TAT誘導を認めた. DBcAMPによるない，次の成績を得た.

TAT 誘導の機序についてはかなり研究されており，
gene の transcriptionおよび trans1ationの両方に作用しているものと考えられている 29). TATは， ラット肝細胞での検討などでは，静止期細胞に出現することが特徴的であるが，r‑GTP は逆に増殖期細胞に出現することを特徴としており 30)，腫場細胞の特性の 1っとして霊視される23). DBcAMPは，この r‑GTPの発現を抑制する傾向を示した. これらの酵素に対する DBcAMPの態度は，特異的な誘導および誘導抑制というよりはむ①DBcAMP(1mM) は， HTC の DNA合成能を抑制したが，明らかな毒性は示さなかった.
②DBcAMPは， HTCに TAT誘導作用を示したが，逆に HTCにみられる③r‑GTP の発現を抑制した.

DBcAMP は， 24時間経時的に測定した HepG2の DNA合成能を，いずれの時点でも抑制した.
④DBcAMP は， HepG2 の細胞数の倍化時期ぉょ

び mitbsis期細胞数がピークとなる時期を遅延させた.
⑤以上より， DBcAMPは，肝癌細胞の細胞周期にしろ細胞の増殖を抑制し，分化に導くことによる副次的影響することにより，増殖の抑制に働く傾向が認められな現象のようにも思われる.

た.

以上のようなラット肝癌細胞に対する DBcAMP の文作用からみて，ヒト肝癌細胞においでも類似した作用が期待される. しかし，ヒト培養肝癌細胞について DBc

献1) 吉武潤ー:日本臨休 38:1914，1980.

AMP の影響を検討した報告は，われわれが検索し得た2) 西川英郎3 森本美典，岡野秀治，市川毅彦，藤田公

範囲では認められておらず，その詳細は明らかにされて明，小寺崇，金丸正泰，中野魁，竹沢英郎:心いない.

臓 16:450，1984.

そこでまず今回，われわれは， HepG2 を用いて 248寺
閉経時的に DBcAMP の増殖への影響を検討した. その結果， DNA への TdR の取り込みはどの時点せもDBcAMPにより抑制を受け，3) 及川淳:代謝 17:1427，1980.

4) ChoChung，Yふ， C
lair，T.，Bodwin，Jふ and圃Berghoffer，B.
:Science214: 77，1981.

また細胞の分裂期が遅延5) SherD1an， M.
L.
， Shaf
D1an， T.D. andKufe，する傾向が認められた. しかも， mitosis のピーク時でD.W.: Biochem. Biophys.Res. Commun. 134:の比率そのものに対する明らかな抑制作用はみられなか

845，1986.

った.このことは， DBcAMPは，細胞周期の 1部ある6) Yoshida，H.，Azu
D1a，M.，Yanagawa，T.，.Yura，

いはすべての時期を延長させることにより増殖を抑制す

Y.，Hayashi，Y.andSato，M.: Canc
巴r57:1011，るものであることを示唆しており，一般の抗癌剤のような toxic な作用の関与は少ないものと考えられる
以上の成績および本剤の性質から考えて， DBcAMPが培養肝癌細胞に示す作用の主体は，おそらく細胞内情報伝達機構や代謝系などを介したものであろうと推測される.またそれは，細胞を分化に導く方向に作用している可能性が強い.今回われわれは， DBcAMP の長期投与による影響や形態学的な検討はおこなわなかづたが1986.
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形態学的に分化を示すものも矢口られているめ 31)• 現時点

601，1975.

で、は，本薬剤を単独で癌治療に臨床応用できる可能性は少ないが，今後，他の薬剤jとの併用や投与方法の工夫などによってユニーグなメカニズムをもっ抗癌剤の lっとしてさらに積極的な臨床応用が可能となることが期待さ

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