学位論文内容の要旨
博士の専攻分野の名称

博士（医 学）

氏 名

野澤 篤史

学 位 論 文 題 名Invariant natural killer T cells are involved in aortic valvular calcification
via inhibiting osteoclastic differentiation in uremic apolipoprotein-E deficient mice
（インバリアントナチュラルキラーT 細胞は破骨細胞分化を抑制することで、腎不全アポリポ蛋白Ｅ欠損マウスにおける大動脈弁石灰化に関与する）【背景と目的】 大動脈弁狭窄症は、75 歳以上の高齢者の 3～5％に認められる有病率の高い疾患で、急速な高齢化と食生活の欧米化に伴って近年増加傾向にあり、症候性となると予後は極めて悪く臨床的に大きな問題となっている。現時点では外科的大動脈弁置換術が唯一の標準的な治療法であるが、高齢者では合併症のため手術リスクが高く、外科手術の適応外となる症例も少なくない。動脈硬化症に対して有効とされているスタチン製剤を用いた脂質低下療法も無効であり、大動脈弁狭窄症の分子メカニズムを解明して病変の進行を抑制ないしは退縮させる治療法の開発が望まれている。
大動脈弁狭窄症は病理学的に弁尖の強い石灰化を特徴とする。近年、石灰化は局所での骨芽細胞・破骨細胞の分化を基盤とした骨形成によって起こされる能動的な組織学的変化（リモデリング）であることが提唱され、局所での骨芽細胞と破骨細胞の活性のバランスの変化により、石灰化の病変が形成されると考えられている。これらの細胞の分化は活性化したマクロファージや T 細胞から分泌される多様なサイトカインにより調節されていることから、局所での慢性炎症が動脈硬化と同様に大動脈弁の石灰化に重要な役割を果たしていると考えられる。
ナチュラルキラーT（NKT）細胞は，ナチュラルキラー細胞と T 細胞双方の表面抗原を発現し，糖脂質を特異的に認識して多様な炎症性サイトカインを産生して自然免疫と獲得免疫をつなぐ免疫調節細胞である。NKT 細胞の多くは特異的な T 細胞受容体・Vα14/Jα18 を発現し invariant NKT（iNKT）細胞と呼ばれており、動脈硬化モデルマウスの動脈硬化病巣に存在し、iNKT 細胞活性化刺激によって動脈硬化病巣が増悪することから、iNKT 細胞は動脈硬化の発症・進展に重要な役割を果たしていることが明らかにされている。しかし、高度石灰化病変を特徴とする大動脈弁狭窄症において、iNKT 細胞が果たす役割についてはまったく不明である。
本研究では腎臓亜全摘 ApoE KO マウスを用いて、大動脈弁石灰化における iNKT 細胞の果たす役割を検討することを目的とした。また、マウス脾細胞を用いて iNKT 細胞活性化が破骨細胞に与える影響を検討した。
【材料と方法】 雌性 ApoE KO マウスを用い、8 週齢で右腎上極と下極を切除し 10 週齢で左腎摘出して腎不全を誘導した。12 週齢より高脂肪食へ変更し、同時に iNKT 細胞特異的刺激物質である α-ガラクトシルセラミド（αGC）（CRF-αGC; n=15）または、リン酸緩衝食
塩水（PBS）（CRF-PBS; n=16）を週 1 回、計 9 回腹腔内投与した。コントロールとして偽手術を施行する群（Sham; n=13）も作成した。さらに、ApoE 蛋白と iNKT 細胞を欠損する
ApoE/Jα18 DKO マウスを用いて同様に腎臓亜全摘し、αGC 投与群（CRF-DKO-αGC; n=10）あるいは未投与群（CRF-DKO; n=11）を作成した。すべてのマウスは 20 週齢で採血後屠殺し、大動脈弁を含む心臓と胸部大動脈を採取した。組織切片を作成したのち、フォンコッサ染色で大動脈弁石灰化を評価した。また、胸部大動脈からは RNA を抽出し、リアルタイ
ム RT-PCR を行った。
In vitro 実験では ApoE KO マウスから脾細胞を分離し、RANKL 及び M-CSF を添加した培地で培養して単球系前駆細胞から破骨細胞へ分化誘導し、培養上清に αGC を添加して iNKT細胞を活性化させ破骨細胞分化に与える影響を検討した。
【結果】 Sham 群に比し、CRF-PBS 群 及び CRF-αGC 群で血漿中の尿素窒素値と総コレステロール値の有意な上昇を認めた。大動脈弁尖の総面積に対する大動脈弁尖石灰化病変面積の割合は、Sham 群に比し CRF-PBS 群で有意に大きく、CRF-αGC 群でさらに増加した（1.6±0.3 対 2.5±0.2 対 3.5±0.2%, P<0.05）。一方、CRF-DKO 群および CRF-DKO-αGC 群での石灰化病変の割合は CRF-PBS 群と同等であった。大動脈弁尖への Mac3 陽性マクロファージの浸潤は、
CRF-PBS 群に比し CRF-αGC 群で有意に増加した（16±3 対 24±2%, P<0.05）。
胸部大動脈での遺伝子発現は、CRF-PBS 群に比し CRF-αGC 群において、Vα14 /Jα18（iNKT細胞マーカー, 1.9 倍, P<0.05）、MHC classII（マクロファージ活性化マーカー, 1.5 倍, P<0.05）、IFN-γ（4.0 倍, P<0.001） および、IL-4 （17 倍, P<0.05）が有意に亢進していた。Runx2、BMP2、BMP4、OPN（骨芽細胞マーカー）は CRF-PBS 群と CRF-αGC 群で差を認めなかったが、Calcitonin receptor（破骨細胞マーカー）は CRF-αGC 群で有意に発現が低下していた（0.2 倍, P<0.05）。以上より、iNKT 細胞活性化によって大動脈弁で IFN-γ と IL-4 が発現亢進し、破骨細胞の分化が抑制されたと考えられた。
マウス脾細胞を分離し、RANKL と M-CSF で破骨細胞分化を誘導し、培養上清に αGC（0,0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1 ng/mL）を加え iNKT 細胞を活性化すると濃度依存的に培養上清中のIFN-γ、IL-4 は増加し（IFN-γ; 1.3, 46, 210, 974, 2541, 4711 pg/mL, IL-4; 0.6, 4.0, 6.8, 57, 114, 125
pg/mL）、TRAP 染色陽性破骨細胞への分化は有意に抑制された（TRAP 染色陽性面積; 12, 9.1,4.9, 1.6, 0.9, 0.2 mm2, P<0.05）。培養上清に αGC と共に IFN-γ、IL-4 中和抗体を添加すると、αGC による破骨細胞分化抑制作用は消失した。
【考察】 高脂血症発症 ApoE KO マウスに腎不全を誘導すると大動脈弁石灰化を認め、さらに αGC を投与し iNKT 細胞を活性化すると大動脈弁石灰化が進行した。大動脈組織での遺伝子解析や in vitro 実験から、iNKT 細胞活性化で IFN-γ や IL-4 の発現が亢進し、破骨細胞分化抑制が確認された。一方、骨芽細胞分化は変化なく、骨芽細胞／破骨細胞分化バランスが骨芽細胞分化優位となった結果、局所での石灰化が進行したものと考えられた。
In vitro 実験において IFN-γ と IL-4 に対する中和抗体の添加で iNKT 細胞活性化による破骨細胞分化抑制作用は消失したが、部分的なものであった。IFN-γ・IL-4 を介した機序のほか、iNKT 細胞表面に発現する CTLA-4 などの分子を介した細胞間の直接作用が関与している可能性が示唆される。本研究の結果から大動脈弁尖における破骨細胞の分化促進やその上流の iNKT 細胞の活性化制御が大動脈弁狭窄症に対する新たな治療介入点として有望と思われた。
【結論】 高脂肪食投与腎不全 ApoE KO マウスで αGC による iNKT 細胞活性化で大動脈弁の石灰化が進行した。これは iNKT 細胞により分泌された IFN-γ と IL-4 により局所における破骨細胞の分化が抑制され骨芽細胞分化が優位となるためであった。免疫調節細胞である iNKT 細胞と骨吸収を担う破骨細胞の制御が大動脈弁狭窄症と心血管石灰化の新たな治療ターゲットとなる可能性があると考えられた。