厚生

省

新薬開発研究費

自己免疫疾患治療薬の開発研究
一微生物二次代謝産物を中心として−

青

柳

班

平成元年度研究報告書

平成2年3月

研究報告書の作成にあたって

厚生省薬務局より昭和60年度に新薬開発研究として「自己免疫疾患治療薬の開発研究一微生物二次代謝産物
を中心として」がとりあげられ，青柳を班長として本研究班が発足して最終年度を迎えた．
本研究班は根本的治療法のない難病である膠原病，神経疾患など自己免疫疾患の患者ならびに病態モデル動物の病態解析を生化学，薬理学，生理学，病理学などの領域から究明し，さらに前臨床試験など広範囲の研究を施行し，治療薬を開発することを目的とした．本邦斯界の優れた研究者から構成された本班は各班員の努力により自己免疫疾患に対する治療薬の開発に大きく前進したと言えよう．即ち，膠原病，神経疾患を含む自己免疫疾患のモデル動物に対し，数種の酵素阻害物質，15−Deoxyspergualin，Bactobolin，Bactobolamineなどに顕著な予防効果あるいは治療効果のあることが見出され，自己免疫疾患に対する新しい治療薬開発の可能性を強く示唆した．
難病治療薬開発という使命を担った本班は班員各位の絶大の努力により，その任務を全うし得たことを幸せに思う．厚生省から与えられた研究期間は一応終了したが，この研究を通して培われた研究網を基として，さらに本研究班の目的達成に努力する．
本研究を重要課題としてとりあげた厚生省薬務局ならびに班員各位に衷心より感謝する次第である．
平成2年3月班長 青 柳 高 明

−1￣￣

目

次

研究報告書の作成にあたって

青

柳

高

明

ⅰ

総 括 研 究 報 告

自己免疫疾患治療薬の開発研究−微生物二次代謝産物を中心として−

3

青

柳

高

明

分 担 研 究 報 告

自己免疫疾患治療薬の開発研究

A．生理活性物質の概要

17

青

柳

高

明

自己免疫疾患治療薬の開発研究

B．光学異性体Deoxyspergualinの脾内酵素網におよぼす影響

25

青

柳

高

明

膠原病の基礎的解明とその治療への応用（Ⅴ）−エリテマトーデスモデﾙマウス（BXSB雄マウス，MRL/lprマウス）のペプチダーゼに及ぼす

15‑デオキシスパーガリンの効果と膠原病患者体液のプテリジン類の変化−

31

永

津

俊

治

イノシトールリン脂質代謝回転抑制物質のスクリーニングと免疫抑制作用

39

梅

澤

一

夫

免疫修飾に作用する微生物代謝産物の研究
A）15‑Deoxyspergualinの免疫修飾作用

47

石

塚

雅

章

免疫修飾に作用する微生物代謝産物の研究

B）免疫調節物質の探索

53

石

塚

雅

章

自己免疫性脳脊髄炎，神経炎の治療薬開発

55

田

平

武

Experimental Autoimmune Myasthenia Gravis（EAMG）ラットの治療実験

61

佐

ⅲ

藤

猛

67

15‑Deoxyspergualinの免疫抑制活性発現の機序に関する研究
徳永徹

Ⅰ型糖尿病モデルマウスに対するIFN‑γの効果

75

谷

口

克

ポリADP−リボース合成酵素阻害剤（ベナドロスチン）のin vivo抗体産生に及ぼす効果：
ループス（SLE）モデルマウスを用いた解析

83

金

井

芳

之

エリテマトーデスモデルマウスを用いた微生物代謝二次産物の治療効果に関する研究
藤

89

原

道

夫

各種微生物二次代謝産物による病変の修飾に関する神経病理学的研究

95

生

田

房

弘

実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）に関する二次代謝産物治療剤の検索

99

永

井

克

孝
103

インパルス応答から見た各種免疫調節剤の作用解析と比較
和

田

孝

雄

微生物二次代謝産物の免疫抑制効果，とくに腎炎発症・進展の抑制について

113

大 久 保 充 人
121

Bactobolin，Actinobolin，Foroxymithineの実験的アレルギー性神経炎に対する治療効果の検討

井

形

昭

弘

15‑DSG，methyl−DSG．Diplotin A，Foroxymithine，BestatineのHAM患者

末梢血リンパ球自己増殖反応（APR）への影響

127

井

形

昭

弘

ヒト末梢血単核球による抗核抗体産生におよぼす15‑deoxyspergualinの影響に関する研究
131−抗体産生抑制機序について−
本

間

光

夫

本研究班を終了するに当たって本研究班を終了するに当たって

137

青

柳

高

明

自己免疫疾患治療薬の開発研究−微生物二次代謝産物を中心として−開発研究班分担研究者一覧

149

iv

総

括

研

究

報

告

自己免疫疾患治療薬の開発研究
一微生物二次代謝産物を中心として−主任研究者 青 柳 高 明

本研究班は自己免疫疾患の治療薬を開発することを目的として，昭和60年度に厚生省薬務局よりを含む膠原病ならびに脱髄性神経疾患，重症筋無力症，ネフローゼ症候群などである．

新薬研究班として発足し，最終年度を迎えた．本

本年度の研究において，自己免疫疾患の病態解班は根本的治療法のない難病である全身性エリテ

析に著しい成果が認められ，この結果に基づく探マトーデス，進行性全身性硬化症，慢性関節リウ索法の開発研究が一段と進歩した．さらに，bena−

マチなどを含む膠原病また脱髄性神経疾患などをdrostin，dioctatin A，pOStStatinなどの酵素阻害対象とし，これらの疾病に対する治療薬を発見す物質および15−deoxyspergualin，bactobolin，ba−

ることを目的とした．この研究は医学界，薬学界

CtObolamineなどが自己免疫疾患モデ）t／動物に対にとって最大研究課題の一つと言えよう．

し，顕著な予防あるいは治療効果のあることが報

微生物代謝産物として発見された多くの酵素阻告された．自己免疫疾患症に対し治療効果を期待

害物質，抗菌物質，制癌物質などの低分子二次代できる可能性が示唆され，上記疾患の治療に大き

謝産物は新規な構造を有するとともに，免疫調節な光を与えたということができた．さらに病因の作用を有することで世界の注目を集めている．

解明に務め，臨床研究に貢献するよう努力する．

自己免疫疾患治療薬の開発研究を行うことを目

各分担研究者により施行された研究は次の通り

的とした本研究班は病態解析に基づく探索法を確である．

立し，治療効果を有する化合物の分離・精製，構1）青柳高明（微生物化学研究所）：自己免疫疾

造決定ならびに治療効果を検討した．各年度別に患治療薬の開発研究

施行した研究の大別は下記のSchemeにしめす．
年度A）生理活性物質の概要
B）光学異性体DSGの牌内酵素網におよぼす

昭和昭和昭和昭和平成平成
60

61

62

63

1

2

影響

新規治療薬の探索

2）永津俊治（名古屋大学医学部）：膠原病の基分離・精製・構造決定
自己免疫疾患の病態解析

礎的解明とその治療への応用（Ⅴ），エリテマトー

治療効果判定基準の設定

デスモデ）t／マウス（BXSB雄マウス，MRL／砂rマ誘導体の合成ウス）のペプチダーゼに及ぼす15−デオキシス

前臨床試験

パーガリンの効果と膠原病患者体液のプテリジン

本研究班の対象疾患としては，全身性エリテマ

顆の変化トーデス，進行性全身性硬化症，結節性多発性動3）梅澤一夫（慶応義塾大学理工学部）：イノシ

脈炎，皮膚筋炎，リウマチ熱，慢性関節リウマチ

トールリン脂質代謝回転抑制物質のスクリ一二ン−3−

グと免疫抑制作用

B）15−Deoxyspergualin，methyl−DSG，Di−

4）石塚雅章（化学療法研究所）：免疫修飾に作

plotin−A，foroxymithine，Bestatineの用する微生物代謝産物の研究

HAM患者末梢血リンパ球自己増殖反応（APR）への影響

A）15−Deoxyspergualinの免疫修飾作用（ⅠⅠⅠ）B）免疫修飾物質の探索

16）本間光夫（慶応義塾大学医学部）：ヒト末梢5）田平 武（国立精神・神経センター）：自己免

血単核球による抗核抗体産生におよぼす15−

疫性脳脊髄炎，神経炎治療薬の開発

deoxyspergualinの影響に関する研究一抗体産生

6）佐藤 猛（順天堂大学医学部）：Experimen−

抑制機序について

talAutoimmuneMyastheniaGravisラットの治

次に上記各班員の研究報告について要約する．

療実験
7）徳永 徹（国立予防衛生研究所）：15−Deox−

1．自己免疫疾患治療薬の開発研究
青柳班員は自己免疫疾患治療薬の開発研究にあyspergualinの免疫抑制活性発現の機序に関する
研究

たり，各班員の要望に答えるために二次代謝産物

8）谷口 克（千葉大学医学部）：Ⅰ型糖尿病モの構造および化学的性状などの概要を説明すると

デルマウスに対するIFN−γの効果

ともに，二次代謝産物の配布を行った．さらに，

9）金井芳之（東京大学医科学研究所）：ポリ自己免疫疾患の発病機序を究明することを目的と

ADP一リボース合成酵素阻害剤（ベナドロスチン）

して，強い免疫抑制能を有する15−DeoxysperTのわZわび0抗体産生に及ぼす効果，ループスモデ

gualin（DSG）の2種の光学異性体の脾内酵素網にルマウスを用いた解析

及ぼす影響について研究を行った．

10）藤原道夫（新潟大学医学部）：エリテマトー

A）生理活性物質の概要：自己免疫疾患治療薬のデスモデルマウスを用いた微生物代謝二次産物の開発研究を目的とした本研究班の各班員に二次代治療効果に関する研究

謝産物として得られた生理活性物質，即ちプロテ

11）生田房弘（新潟大学脳研究所）：各種微生物

アーゼ阻害物質を含むエクトエンザイム阻害物

二次代謝産物による病変の修飾に関する神経病理質，抗菌物質，制癌物質およびその他の生理活性学的研究

物質につき，それの構造，阻害活性，阻害機構，

12）永井克孝（東京大学医学部）：実験的アレル

毒性および溶解性などの周知を図り，また各班員

ギー性脳脊髄炎（EAE）に関する二次代謝産物治の要望する生理活性物質の配布を行った．

療剤の検索

B）光学異性体DSGの牌内酵素網におよぼす影

13）和田孝雄（慶応義塾大学医学部）：インパル

響：ス応答から見た各種免疫調節剤の作用解析と比較

免疫抑制作用を有するDSGの（−），（十ト14）大久保充人（北里大学医学部）：微生物二次

enantiomersの作用機序解明を目的とし，両−代謝産物の免疫抑制効果，特に腎炎発症・進展のenantiomersを連続授与したマウス脾内の酵素活抑制について性の動態を経時的に調べた．（−）−DSG群はDPP−

15）井形昭弘（鹿児島大学）：

ⅠVとGIcNAc−aSe活性が有意に抑制された．両A）Bactobolin，Actinobolin，Foroxymithine

酵素ともT細胞と密接な関係を有し，（−トDSGの実験的アレルギー性神経炎に対する治療効

はT細胞の異なったsubsetsに影響を与えるも果の検討のと思われる．一方，（十）DSGはAP−BとLeuTー4−

自己免疫疾患治療薬の開発研究

AP活性の有意な増加およびGIcNAcraseのみがが膠原病の全身性エリテマトーデス（SLE）で対有意に抑制された．上記両−enantiomersの作用機照正常者ビ比べて有意に増加すること，関節液の序についてさらに検討する．

ネオプチリンとネオプテリン／ビオブテリン比が膠原病の慢性関節リウマチ（RA）で対照の非自己2．膠原病の基礎的解明とその治療への応用（Ⅴ）

免疫疾患である骨関節症と比べて，有意に増加す

一エリテマトーデスモデルマウス（BXSB雄マることを見出した．関節液のネオプテリンとビオ

ウス，MRL／砂γマウス）のペプチダーゼに及ぼす

ブテリンは血清より有意に増加していた．この成

15−デオキシスパーガリンの効果と膠原病患者体績は関節液のネオプテリンは関節内でマクロ液のプテリジン類の変化一ファージから生成され，ネオプテリン／ビオブテリ

永津班員はエリテマトーデスモデルマウスのペプチダーゼに及ぼす15−デオキシスパーガリンのン比は自己免疫疾患の生化学的指標であることを示唆する．

効果と膠原病患者体液のプテリジン環の変化につ3．イノシトールリン脂質代謝回転抑制物質のス

いて研究した．
エリテマトーデスモデル動物のBXSB雄マウ

クリーニングと免疫抑制作用

ス（対照はBXSB雌マウス）とMRL／砂rマウス

梅澤班員は自己免疫疾患治療薬を検索するた（対照はMRL／＋＋マウス）に13週齢から免疫抑め，イノシトールリン脂質代謝回転抑制物質につ

制薬15−デオキシスパーガリン（DSP）を投与しいて研究した．

て，発症を抑制して，薬剤を投与しない発症したリンパ球活性の機構にイノシトールリン脂質代

マウスと比較して，ペプチダーゼ類の変化を検索

謝回転が含まれることから，前年度につづき微生した．20週齢の発症したマウスは脾臓のジペプチ

物二次代謝産物からイノシトールリン脂質代謝回

ジルアミノペプチダーゼ（DAP）−ⅠⅠが増加，転阻害物質をスクリーニングし，得られた化合物

DAP−IVが減少し，従ってDAP一ⅠⅠ／DAP一ⅠⅤ比の免疫系における作用を検討した．その結果，放が増加，ポストプロリンクリービングェンザイム

線菌から新規ポリエーテル構造を有する阻害物質（PPCE）の増加が認められた．DSP投与で発症をを単離し，inostamycinと命名した．inostamycin

抑制したマウスではこれらのペプチダーゼの変化は既知ポリエーテル化合物のlysocellinと構造がはなく，対照マウスとの間に有意差はなかった．

類似するが，阻害活性はより強く，IC5。，0．5〟g／

この成績は，エリテマトーデスモデルマウスのmlでEGFに誘導されるA431細胞のイノシ

DAPLII，DAP−IV，PPCEの変化は自己免疫疾患

トールリン脂質代謝回転を阻害した．イノシトーの原因と密接に関係しており，酵素阻害のある微ルリン酸の生成も阻害したが，添加時期により阻

生物二次代謝産物に自己免疫疾患治療薬を発見す

害効果が異なる実験結果から，inostamycinはおる可能性を示唆している．

そらくイノシトールリン脂質代謝回転経路の中で従来の研究でエリテマトーデスモデル動物の

CDPrDGイノシトールトランスフェラーゼを阻NZBマウス（対照はBALB／Cマウス）で脾臓な害することが示唆された．inostamycinはマウス

どの組織に微量に存在するネオプテリンが有意にのエーリッヒがんに対し，わ7ひね0で抗がん活性を増加し，ネオプテリン／ビオブテリン比が有意に増示した．inostamycinは線維芽細胞のPDGFによ加することを報告したが，本年度の研究で，血清るS期誘導を阻害したが，マウス脾細胞のconA，のネオプテリンとネオプチリン／ビオブテリン比

IL−2，またはMLCにより活性化されるDNA合−5−成は毒性の表れない濃度で阻害しなかった．またB）免疫修飾物質の探索

わ7びわβでマウスの抗体産生，遅延型過敏反応を微生物代謝産物中に自己免疫疾患に有用な物質

抑制しなかった．

として免疫担当細胞の修飾に作用する物質を探索

前年度報告したPIキナーゼ阻害物質，OrObol

し，抗生物質NocardaminおよびDeferoxamineと2，3−dihydroxy benzaldehydeはin situでもにその作用を見出した．これらの物質は混合リン

イノシトールリン脂質代謝回転とイノシトールリ

パ球培養反応およびIL−2誘導T細胞増殖を特異

ン酸の生成を阻害した．

的に阻害した．これらの鉄キレート物質の免疫疾患への応用が期待される．

4．15−Deoxyspergualinの免疫修飾作用および免

5．自己免疫性脳脊髄炎，神経炎の治療薬開発

疫修飾物質の探索

田平班員は自己免疫性脳脊髄炎，神経炎の治療

石塚班員は15−deoxyspergualin（15−DSG）の免
疫修飾作用について研究した．また，免疫修飾物

薬開発について研究した．

質の探索も行った．

（1）Bactobolin誘導体の検討
これまでにBactobolinがミエリン塩基性蛋白A）15−DSGの免疫修飾作用（III）
前年度までの本研究によって15−DSGはT細（BP）感作により誘発されるラットの自己免疫性胞に作用してIL−2産生を増強し，ConAによるT

脳脊髄炎（EAE）を抑制することを示し，しかし毒細胞のⅠし2受容体形成を抑制または増強するこ

性が強く効果域が狭いことから，その誘導体の合とを明らかにした．マウスへの投与は各種のT細成の必要性を指摘してきた．本年度は，明治製菓，

胞サブセット比に影響を与えず，腹腔浸出マクロ

微化研で開発されたBactobolinの誘導体である

ファージの活性化に作用することも認めた．本年

Actinobolin，Bactobolamine，NLAcetyトBactoT

度はT細胞の産生するIL−3あるいはマクロ

bolamineについて検討した．

ファージ活性化因子に対する15−DSGの作用に方法：LewiSラットをモルモットBPとプロイ

ついて検討した．その結果，T細胞を15−DSGでンド完全アジュバンドで感作し，各濃度の上記薬玩Z府川で処理することによってⅠし3産生誘導剤を連日腹腔内注射し，EAEの臨床的重症度を従およびその増強が見られた．15−DSGで直接処理

来の方法で評価した．

しても腹腔マクロファージの活性化は見られないことから，その作用はリンフォカインによって仲

結果：Actinobolinは120mg／kg，day1−17の投与で，EAEの発症を有意に遅延させた．

介されていると考えられたので，15−DSG投与マ

Batobolamineは40−50mg／kgでごく軽度のウスから採取したT細胞と正常マウスから得た発症遅延を示したが，有意ではなかった．更に高マクロファージを接触させずに培養し，その効果濃度の検討が必要である．Bactobolamineの毒性を調べたところ，マクロファージは活性化されTにlot差が見られ，あるlotでは40mg／kg以上で細胞によって仲介されていることを認めた．活性ラットが死亡した．N−Ac−Bactobolamineは40化因子を大量に採取することを目的にEL4細胞

mg／kgで毒性を示さず，EAE抑制効果も示さなを15−DSGで処理した後，その培養上清のマクロかった．

ファージに対する作用を調べたところ活性化因子

考案：今回テストした3つの誘導体はいずれも著の産生が見られた．

しい毒性の低下が見られたが，効果も低下した．
更に新しい誘導体の合成が必要である．
−6−

自己免疫疾患治療薬の開発研究（2）Bactobolinのサブレッサー誘導能の検討

Actinobolinと同様に毒性が非常に低いことで注Bactobolinがサブレッサーを誘導LEAEを抑目されている．25mg／kg／dayのBactobolamine

えるのか否かについて検討した．

は免疫直後から投与しても，十分に抗体価の上昇

方法：LewisラットをBP／CFAで感作し，を抑制することができず，免疫後10日目から5，Bactobolinを連日注射，day11−12の脾細胞を25，50mg／kg／dayいずれの投与量のBactobola・

naiverecipientに移入し，BP／CFAで感作した．

mineも有効に抗体産生の抑制をすることができ

結果：初期の2〜3回の実験でBactobolinによなかった．

るEAEの抑制が膵細胞で移入できるかの印象を得たが，その後の実験でWhole SPC，adherent

今後さらに安全かつ強力な免疫抑制剤が開発されることを期待したい．

VS．nOnadherent，Tvs．non−Tに分けて検討したが，サブレツサーの証明に到らなかった．

7．15−Deoxyspergualinの免疫抑制活性発現の機序に関する研究6．Experimental Autoimmune nIyasthenia
Gravisラットによる新免疫抑制剤の探索研究

徳永班員は15rDeoxyspergualinの免疫抑制活性発現の機序について研究した．

佐藤班員はExperimentalAutoimmuneMyas−

昨年までの研究で，15−deoxyspergualin（DSG）

theniaGravis（EAMG）ラットを用いて，新しい免および15LdeoxyTnethylspergualin（MeDSG）が，疫抑制剤を探索した．

マウスの二次CTLの誘導および骨髄細胞の分昨年度までは，抗腫瘍抗生物質である15−Deox−

化・増殖を抑制することを明らかにした．特に，

yspergualin（15−DSG），Bactobolin，Actinobolin

CTL誘導の系において，MeDSGによる抑制がイ

ならびにプロテアーゼ阻害剤であるArpha−

ンタ「フェロンγを添加することで回復するが，menine Aの重症筋無力症に対する治療効果を検MeDSGはMLRにおけるインターフェロンγ

討したが，今年度はこれらにBactobolamineを加を初めとするサイトカイン産生は抑制しないこえ，今まで行った治療実験について総括的に考察と，CTL前駆細胞の熟成CTLへの分化の過程がしてみた．

DSGおよびMeDSGに最も感受性が高いことを

15−DSGおよびActinobolinはEAMGの発症

兄い出した．DSG（MeDSG）の免疫抑制効果が分を有効に阻止したが，Bactobolin，Arphamenine

化誘導抑制によるものか否か，また，CTL以外の

Aは免疫直後から投与を開始しても抗体産生を細胞の分化もDSG（MeDSG）によって抑制され十分に抑制できず，EAMGの発症を阻止できるるか否かを明らかにするため，今回は骨髄性白血とは言えなかった．

病細胞（HL60，Ml）のマクロファージへの分化

急性期から慢性期に移行すると思われる免疫後（PC12），マクロファージ活性化（分化の一側面と10日目から治療を開始した場合，15−DSGおよび考える）に伴う表層蛋白質（Ia抗原）の変化に対す

Actinobolinの免疫抑制効果は十分に発揮されな

るMeDSGの効果を検討した．分化誘導の前後あかった．残念ながら，一旦免疫を獲得し抗体産生

るいは同時にMeDSGを添加し，HL−60および能を持ったEAMGラットに対して，それを有効

Ml細胞のFcレセプター発現，PC12細胞の神経に治療し得る薬剤は現在のところ開発されていな

突起伸展，マクロファージ（P388D，および腹腔マ

いようである．

クロファージ）のIa抗原発現を調べたが，全く抑BactobolamineはActinobolinの誘導体で，制効果は認められなかった．ところが，Ml細胞の−7−

DNA，RNA，蛋白合成はMeDSGにより著明に

NODマウスの自己免疫現象に対して，insulitisの低下し，特に，5日間共存培養した際の蛋白合成は促進と糖尿病発症の抑制（β細胞破壊の抑制）とい

1ng／mJ以上の濃度で50％以上抑制された．

う2つの異なった作用を有することが明らかとなった．IFN−γがどのような機序によりinsulitis

8．Ⅰ型糖尿病モデルマウスに対するIFNての効を促進し，逆にβ細胞の破壊を抑制するのかは不果明であるが，我々のこれまでのモノクローナル抗谷口班員はⅠ型糖尿病モデルマウスに対する体投与実験ならびに，これまで集積されてきたNODマウスの遺伝学的解析から， insulitisの存

IFN−γの効果について研究した．
NODマウスは，代表的な臓器特異的自己免疫

在 と β細胞の破壊 とは，それぞれ独立した事疾患であるⅠ型糖尿病を解析する上での格好のモ象であり，IFN−γは少なくともこの2つの自己免デル動物である．生後4〜6週齢までに，膵ラ氏島

疫現象に対して，・相異なった作用を示すと考えらへの限局性の細胞浸潤を認め，12適齢頃よりβ細れた．

胞の崩壊による顕性糖尿をきたす．発症動物は，多飲，多尿，高血糖，尿糖を呈し，体重が減少し，9．ループスモデルマウスを用いたペナドロステ

ketoacidosisをきたし死亡する．本症の発症はT

ンのhH油川抗核抗体産生に及ぼす効果の解析

細胞依存性であり，β細胞崩壊はMHCクラスⅠⅠ

金井班員はループスモデルマウスを用いてポリ限局性にCD4（L3T4）陽性T細胞により完遂されADP−リボース合成酵素阻害剤（ベナドロスチン）る．

のわ びゐ0抗体産生に及ぼす効果について研究し

γ−インターフェロン（IFN−γ）は，MHCクラス

た．

ⅠやクラスⅠⅠの発現，T及びB細胞機能の調節，全身性エリテマトーデス（SLE）合併妊娠で子NK細胞やマクロファージの活性化，IL−2の発現

宮内胎児死亡（IUFD），早・流産の頻度の高いこと促進等，多彩な免疫調節機能を有するペプチドでが知られている．我々はこの病態の研究および治ある．しかし，IFN−γの各種自己免疫疾患に対す療のための動物モデルをMRL／Jマウスの妊娠のる全身投与の効果は必ずしも一定ではない．すな

系に兄いだすことに成功した．すなわち当核妊娠

わち，SLEモデルマウスに対しては，ループス腎系で正常分娩と思われる高仔産例とIUFDによ炎をはじめとする各種病態を悪化させる．また，

ると思われる低仔産例があって，後者が妊娠1週

臨床的にも多発性硬化症が，IFN−γの投与によりにて血清抗ポリADP−リボース抗体に選択的上昇

悪化するとの報告もある．逆に，実験的アレルギーがみられ，IUFDの予知が出来るというものであ性脳脊髄炎は，IFN一γの投与により，病状の進行る．これに関して治療という側面からMRL／Jマが阻止されるという．

ウスを用いてのポリADP−リボース合成酵素阻害

今回はⅠ型糖尿病のモデル動物であるNODマ

剤投与による抗ポリADP−リボース抗体の選択的ウスにIFN一γを全身投与し，自己免疫病発症に抑制を検討してきた．雌MRL／Jマウス10週齢

対する同剤の効果を検討した．その結果，IFN−γ（通常我々は10週でmatingを行っている）にはは糖尿病発症前のいずれの時機から投与しても，抗ポリADP−リボース抗体価が相対的に抗NODマウスの顕性糖尿の発症を抑制した．しかssDNA抗体価より高値を示すものが約50％（そし，組織学的には，IFN−γはinsulitisを早期に誘のうち特に高いものは17％）存在することがわか導する作用を有していた．すなわち，IFN−γはり，そのようなマウス群でベナドロスチンの選択−8−自己免疫疾患治療薬の開発研究

的抗体抑制効果がみられることがわかった．また正常のTおよびB細胞は障害されないので，免一見ベナドロスチンによる抑制効果がないような疫応答性は温存される．このようにDSPは治療

マウスでも測定系に一本鎖DNA抗原を共存させ薬として期待できる．

ると抑制効果がみられるようになるという知見も

3）移植細胞対宿主反応（GVHR）の抑制得た．さらに前回は週3回投与法を用いたが，今C57BL／6（B6）マウスのCD4＋T細胞を（B6×

回週1回投与でも効果的であるという予備的知見

bm12＊）Flマウスに移入するとGVHRが起り，も得た．今回10週齢MRL／Jマウスのベナドロス

ループス腎炎や臓器特異的自己免疫疾患が発症す

テン投与による抗ポリADP−リボース抗体の選択ることが知られている．（＊bm12マウス：B6と的抑制の確認と，用いたMRL／／マウスの全例に

MHCクラスII（Ia）抗原のみ異なる）この系を用おいてポリADP−リボース感作による特異的抗体

いてDSPの効果を検討したところ，強い抑制効（IgG）が産生されたことから，MRL／lマウスにお果が示された．DSPの投与スケジュールとして，ける抗ポリADP−リボース抗体の産生にポリGVHRが進んでから投与しても抑制効果がもた

ADP−リボース抗原の関与が強く示唆された．以らされるが，初期（細胞移入直後）のみ投与すると，上の結果，MRL／Jマウスの妊娠前後でのベナド

GVHRは却って増強することが示されている．治

ロスチン投与と低仔産例の防止の実験的基盤が確療には持続的投与が必要なことが示唆された．

立したと考える．

11．各種微生物二次代謝産物による病変の佗飾に
10．エリテマトーデスモデルマウスを用いた微生関する神経病理学的研究

物代謝二次産物の治療効果に関する研究

生田班員はBactobolinのEAE抑制効果につ

藤原班員はエリテマトーデスモデルマウスを用いて研究した．

いて微生物代謝二次産物の治療効果について研究した．

BactobolinのラットEAEを抑制する最少有効量を知るために以下の実験を行った．

1）PoststatinおよびDioctatinの効果

6週齢雄LewiSラット，各群5例づつにモル

これら産物を5mg／kg MRL／砂rマウスに5モット脊髄を抗原としてEAEを惹起した．EAE

週齢から週3回7週間投与し，B細胞活性化現象

発症後Bactobolin O．1mg／kg，0．5mg／kg，とループス腎炎発症に対する影響を調べた．両者

0．01mg／kgの各量を，麻痺の認められる期間連とも抑制効果は認められなかった．

日腹腔内投与した．動物は全て感作29日目に，潅

2）15−デオキシスパーガリン（DSP）の作用機序

流固定し，全中枢神経系を組織学的に検討した．

これまでの実験から，DSPは強い免疫抑制活性

塵塁：Bactobolin O．1mg／kg投与群では，1例を持ち，エリテマトーデスモデルマウスMRL／

はcannibalismにより死亡した．比較的軽症に経／か′およびBXSB（♂）マウスに対して治療効果を過した1例のラットでは，対照5例の何れよりも示すことが示されている．MRL／砂γマウスで強いEAE病巣をみとめた．＿これ以外の3例では，DSPの作用様式を調べ，次のような結果を得てい

対照EAEラットに比べ病巣は明らかに少なく，る．①このマウスに特徴的なリンパ節の腫脹を抑微小かつ比較的古いものが多かった．

える．②それはThy−1．2＋（T細胞マーカー），

Bactobolin O，05mg／kg，0．01mg／kg夫々をCD4▼およびCD8L，B220＋（これは通常B細胞に投与した群では，両群とも同様の組織像を示した．

発現される）のT細胞の増殖を強く抑制する．③

すなわち，いずれも癒合性の広範な脱髄巣を示す−9−ラットが多く，大型から中等大の脱髄病巣も多数討中である．
さらに，MBP抗原感作ラットEAEに対する効認められた．いずれも対照群に比較し，強い病変果についても比較検討中である．

を示していた．
呈上＿旦：脊髄homogenateを抗原とするラットEAE系では，Bactobolinの最少有効量は0．1

13．インパルス反応から見た各種免疫調節剤の作

mg／kgと推定された．より少量の0．05mg／kg，

用解析と比較
和田班員はインパルス反応から見た各種免疫調および0．01mg／kgでは，逆にEAE病変を増強しているように思われた．

節剤の作用解析と比較研究を行った．
本班の過去4年間にわたる研究によって，自己12．実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）に関す回帰モデルによるフィードバック解析法を免疫る二次代謝産物治療剤の検索

ネットワーク解析に利用し，さらに免疫調節作用

永井班員は実験的アレルギー性脳脊髄炎をシステム論の立場から解明することを試みてき（EAE）に関する二次代謝産物治療剤の探索研究

た．今回の研究では各種免疫調節剤の作用を，イを行った．

ンパルス応答という手法を通して比較することをBactobolinのラットEAEへの治療効果は1

試みた．

mg／kg以下の濃度で認められた．昨年度は0．3

正常コントロール2名，全身性エリテマトーデ

mg／kgで有効性が確認されたが，今年度は0．1

ス1名，慢性関節リウマチ6名，慢性血液透析患

mg／kgで治療効果を検討した．本薬剤の毒性が強者3名について，30週ないし60週にわたり，毎週いために，使用には限界がある．なるべく毒性の1回，末梢静脈から採血し，IgG，CD4，CD8を検少ない薬剤の検索が今後必要と考えられる．今回査した．各種の免疫調節剤を投与し，サラゾピリ

は新しくbactobolamine，pOStStatinとdioctatin−

ンについては血中濃度を測定し，投与量または血Aについて比較検討した．

中濃度の変動が免疫ネットワークに及ぼす影響にラットEAEはルイスラットにモルモット脊髄

ついても研究した．

抗原を接種して作製した．これらの薬剤の投与は，ベスタテンを透析患者に投与した時の時系列変0．1mg，1．0mg，10mg／kgの濃度で発症直後か化を解析すると，この薬剤はIgGの産生異常を正ら開始し麻痔のみられる期間中行った．

常化させるが，その作用は恐らくB細胞を賦活化

評価判定基準としてEAEラットの臨床経過とさせることによって生じるものと考えられた．一

病変数を調べた．Bactobolin O．1mg／kg投与群

方，カルフェニール，サラゾピリンなどでは，たで症状の軽減がみられた．病変数はcontrol群としかに免疫ネットワークに影響するが，患者にの間に有意差は認められなかったが減少傾向を示

よってかなり差があり，ベスタテンのように明確した．また，病巣の大きさと新旧病変の比較からな機能を見出すに至らなかった．これら2薬剤はbactobolinは，いったん形成されたEAE病変のリウマチ患者において，臨床的に効果が認められ進行を抑制しているものと推測された．

ているが，その効果がリンパ球ネットワークに直Poststatinlmg／kg投与群ではbactobolin

接関係しているかどうか不明である．むしろ各種

O，1mg／kg投与群よりも抑制効果は低かった．その炎症因子などに作用し，その結果として間接的れに対してpoststatin O，1mg／kg投与群では病に免疫ネットワークに影響する可能性が強いと思変数は少なく．抑制効果を認めるようであり，検

われる．

−10−

自己免疫疾患治療薬の開発研究

ベスタテンには副作用がほとんど無いに等しい球体腎炎に対するbactobolamineの効果

ことから考えると，ベスタチンをリウマチ患者にBactobolamine（BBM）の免疫抑制効果を検討授与して，免疫機能異常にどう影響するかを検討するため，すでに腎症を発症した28週齢のニューすることは非常に有意義と考えられる．今後，専ジーランドB／W Flマウス（B／Wマウス）に門家の意見をいれてその是非について検討した

BBM3，5−30mg／kgx4／wkを投与した．40週齢

い．

で採尿，採血後に屠殺して，腎臓を摘出，腎糸球体の組織学的並びに免疫組織学的検討を行った．

14．微生物二次代謝産物の免疫抑制効果，特に腎蛋白尿はBBM15r30mg／kg群で対照群に比較炎発症・進展の抑制についてして有意に減少した．腎糸球体組織学的検査でも大久保班員はニュージーランドB／W Flマウ

BBM30mg／kg群で対照群に比して有意低値でスの進行した糸球体腎炎に対する15−deoxy−

あった．同様に腎糸球体におけるC3およびIgG

Spergualinおよびbactobolamineの効果についの沈着も15および30mg／kg群で有意に減少して研究した．

た．BBMの免疫抑制機序にかんして現在BALB／（1）ニュージーランドB／W Flマウスの進行しCマウスを用いて検討中である．

た糸球体腎炎に対する15Ldeoxyspergualinの効
果一同一マウスにおける検討−

15．Ractobolin，Actinobolin，ForoxymithinCの

15Ldeoxyspergualin（15−dsp）のB／Wマウス

実験的アレルギー性神経炎に対する治療効果の検の進行した糸球体腎炎に対する効果を昨年度に報討および15−Deoxyspergualin，methyl−DSG，

告したが，今回は同一やウスにおける変化を経時

Diplotin A，Foroxymithine，Bestatine

的に追求することにより，その効果を確認するとHAM患者末梢血リンパ球自己増殖反応（APR）

ともに，さらに詳細な検討を行った．32週齢のB／

への影響・

の

Wマウスに片側腎摘を施行した後，PBS，methyl−

井形班員はBactobolin，Actinobolin，Forox−

prednisolone20mg／kgまたは15−dsp6．7mg／

ymithineの実験的アレルギー性神経炎に対するkgの週4回皮下投与を開始した．40週齢で採尿，治療効果および15−Deoxyspergualin，methyl−

採血後にマウスを屠殺，腎を摘出して（免疫）組織

DSG，Diplotin A，Foroxymithine，Bestatineの学的に腎糸球体病変を評価した．マウス生存率は

HAM患者末梢血リンパ球自己増殖反応（APR）

38週齢以降15−Sep群で対照群に比較して有意にへの影響について研究した．

高値であった．また，群間の比較で，蛋白尿の推（A）Bactobolin，Actinobolin，Foroxymithine

移はコントロール群と有意に異なっていた．同様の実験的アレルギー性神経炎に対する治療効果のに，腎糸球体光顕所見の推移，IgGの腎糸球体への検討

沈着も対照群に比し有意に改善された．15−dsp群

末梢神経髄鞘に対する自己免疫疾患と考えられの血清抗DNA活性の変化も対照群と有意に異ているGuillain−Barre症候群の実験モデルであなっていた．以上の結果から，15−dspはB／WマるEANを用いてBactobolin，Actinobolin，For−

ウスの腎症発症を抑制するだけでなく，すでに進OXymithineのEAN発症後投与による治療効果

行した糸球体腎炎に対しても治療効果を有するこにつき臨床的，組織学的に検討した．EANはとが確認された．

LewiSラットに牛末梢ミエリン300jLg蛋白を完（2）ニュージーランドB／Wマウスの進行した糸全アジュバンドと共に接種し作成．Bactobolin1−11−

mg／kg・匹，Actinobolin200mg／kg・匹，Forox−

DSGの作用部位を調べるため，マイトーゲンによymithinelmg／匹，20mg／匹をEAN発症後よりる細胞内カルシウム濃度の変化を調べた．
方法：健常人とSLE患者の末梢血より単核球

連日5日間腹腔内投与し，臨床症状，組織所見のを得，サイクロスポリンAまたはDSGを添加し程度をスコアし，コントロールと比較した．
Bactobolinlmg／kgでは有意の治療効果はみ

24時間培養した．対照には，薬剤非添加で培養しられなかった．Actinobolin200mg／kgの大量投たものを用いた．培養終了後，カルシウム感受性

与で臨床的にも組織学的にも明らかにEAN所見

蛍光色素であるFura−2AMを加え，反応させたの軽減が認められ，治療効果ありと判断した．For−後，カルシウム緩衝液に浮遊し検体とした．細胞

oxymithineは両投与量でも明らかな治療効果は

内カルシウム濃度は Fluorescence Spectropho−

認められなかった．

tometerを用い測定した．検体にマイトーゲンと（B）15LDeoxyspergualin，methyトDSG，Di・

してPHAを加え，細胞内カルシウム濃度の上昇

plotinA，Foroxymithine，Bestatineの患者末梢反応を調べた．またカルシウム・イオノフォアを

血リンパ球自己増殖反応（APR）への影響

加えて上昇反応の指標とした．

HTLB−Ⅰが関与し，免疫学的機序により発症す

結果：健常人単核球では，PHA添加直後よりると考えられるHAMの治療薬の開発を目的に細胞内カルシウム濃度の上昇（初期上昇反応）があ

HAM患者に特有に認められるAPRを抑制する

り，5分後よりさらに軽度の上昇（後期上昇反応）

ことを指標として各種免疫修飾剤のスクリーニンが認められた．約10分後にイオノフォアを加えたグを行った．15LDSGとmethyトDSGはAPRをところ，著明な細胞内カルシウム濃度の上昇がみ抑制し，安定なmethyl−DSGがより低濃度で抑制られた（最大蛍光強度）．

した．また高濃度では逆に抑制が低下した．Di−

基礎値から最大蛍光強度までの上昇を100％とplotinAはAPRを抑制せず，むしろ高める方向

し，個々の成績を評価した．健常人対照では，初に作用した．Foroxymithineは用量依存性に期上昇反応は約40％であった．サイクロスポリン

APRを抑制した．Bestatineは10JLg／mlまではA処理では，25％であった．DSG処理単核球でも用量依存性にAPRを抑制したが，より高濃度に同様（約25％）の抑制が認められた．いずれも後期

してもそれ以上の抑制は認められなかった．以上

上昇反応には影響しなかった．一方SLEでは，初より，APRのこれらの薬剤に対する動態はEAE

期上昇反応は約40％と健常人と差がなかったが，〜EANなど自己免疫疾患動物モデルに対する抑後期上昇反応は逆に低下した．サイクロスポリン

制効果と類似しており，HAMの病態の解析と治A処理で，初期上昇反応は約50％となったが，後療薬の開発に本方法が有用と考えられる．

期上昇反応は認められなかった．DSG処理では，初期上昇反応は約30％で，後期上昇反応は僅かに16．ヒト末梢血単核球による抗核抗体産生におよ認められた．
結語：1）健常人において，DSGはサイクロス

ぽす157deoxyspergualinの影響に関する研究

ポリンAと同様PHA刺激による細胞内カルシ

一抗体産生抑制機序について一
本問班員はヒト末梢血単核球による抗核抗体産

ウム濃度の初期上昇反応を抑制した．2）SLE患

生におよぼす15−deoxyspergualin（DSG）の影響者では，PHA刺激後細胞内カルシウム濃度の初について研究した．

期上昇反応は健常人同様に認められたが，後期上

目的：本年度は，T細胞活性化経路における

昇反応はむしろ低下した．3）SLEにおける細胞−12−自己免疫疾患治療薬の開発研究
内カルシウム濃度の後期上昇反応の欠如は，DSG

員を抑制すると考えられた．細胞外からのカルシ処理で改善された．

ウム動員は，SLE患者単核球で低下していたが，以上より，DSGはサイクロスポリンA同様，健DSG処理により一部改善した．

常人単核球の細胞内小胞体からのカルシウムの動

−13−

分

担

研

究

報

告

自己免疫疾患治療薬の開発研究
A．生理活性物質の概要
青 柳 高 明＊
研究協力者 小川慶治書，小島蕗子＊，永井真知子書，原田滋子＊

自己免疫疾患治療薬の開発研究を行うことを目Aminopeptidases

に対する阻害物質として的とした本研究班は，微生物代謝産物として発見

amastatin，bestatin，arphamenines AとB，された多くの酵素阻害物質，抗菌物質，制癌物質

actinonin，ebelactones AとB，formestin Aとならびに新しい探索研究の結果，見出されたさま

B，prObestin，prOStatin，leuhistinなど，またざまの生理活性物質を用い治療薬の開発研究を

dipeptidylaminopeptidasesを阻害する物質とし行っている．

てdioctatins AとB，diprotins AとBなどを見これらの生理活性物質は新規な構造を有する低出した．一方，Carboxypeptidases阻害物質とし分子物質であるとともに，免疫調節作用を有するて，（S）一α−benzylmalic acidおよびhistarginなことで世界の注目を集めている．

ど，またdipeptidylcarboxypeptidases阻害物質

初めに，本研究班の班員の要望に答えるため，としてangiotensinconvertingenzymeを阻害す

エンドペプチダーゼ阻害物質，ユタトエンザイム

る（S，S）−N，N

阻害物質，その他の酵素阻害物質ならびに免疫修（EDDS），Foroxymithineおよびhistarginなど

飾物質を含む抗菌物質，抗癌物質などの化学構造，を見出した．上記exopeptidases阻害物質の構造

阻害活性，毒性および溶解性などの概要を述べる．

は図2−（1，2）に示す．

−ethylenediaminedisuccinic acid

Endopeptidasesに属するserine proteinases，

さらに ectoenzyme である alkaline phos−

CySteinproteinases，aSparticproteinases，metal

phataseの阻害物質としてforphenicineを，またproteinasesを阻害する物質として見出したleu−

esterase の阻害物質として esterastin および

peptin，antipain，pepStain，hydroxypepstatin，

ebelactonesAとBを，さらにphospholipaseのpepstanone，phosphoramidonなどの構造は図1

阻害物質としてplipastatins Al，A2，Bl，B2なに示す．

ど，さらにEDDSなどを見出した．これらの阻害

Ectoenzymeのうち，eXOpeptidasesに属する物質の構造は図2−（3）に示す．

aminopeptidases，dipeptidylaminopeptidases，

免疫修飾物質を含む抗腫瘍性物質の探索研究に

Carboxypeptidases，dipeptidylcarboxypepti−

おいて（±）−15−deoxyspergualin，bactobolin，

dasesならびにalkaline phosphatase，eSteraSebactobolamine，Ac−bactobolamine，Thr−bacto−

およびphospholipasesなどを阻害する多くの低bolamine，Suc−bactobolamine，Coformycin，Az0−

分子阻害物質を発見した．

mycinなどを，またpoly（ADP−ribose）−Synthe−
tase阻害物質としてbenadrostin，さらにsialid一■微生物化学研究所−17−lnhibitors of serine and cysteine proteinases．

Leupeptin

H3
H−CH31？H3
CH−CH3

甲2

？H2

（5）

（5）

N Hh
HニHH
N−CTNIC−亭

Antipaln
H2N−C＝NHH2N￣？＝NHINH

NH H3C＼。吉H3（？H2）3 1（CH2）3
1

RLCO−NH−CH−CO−NH−CH−CO−Nl1−CH−CHO
（5）

（S）

（5）

（5）

（5）

R＝CH30rCH3−CH2

鷲夢二亭霊H3鷲等黍㌦‡NH2匹（S） （5） −L．．。。鳥．） （5） （S）（5）（S）

H00C−CH一NH−−CO−NH−CH−CO−NH−CH−CO−NH−CH−CHO

HOOC−CH−NH−COLNH−CH−CO−NH−CHrCO−NH−CH−CHO

lnhibitors ofcarboxylproteinases．
Pepstatin
CH3
9H3

9H3

？H3

9H￣CH3

笹H，eH−CH，eH29H？H3？H￣CH3eH2？H

R−CO−NH−CH−CO−NH−CH−CO−NH−CH−CH−CH2−CO−NH−CHLCO−NH−CHrCH−CH2COOH

（5）

（S）

（5日5）

（S）

JsovaleryトL−Valyl−L−ValyトAHMHA−L−alanyl−AHMHA
Hydroxypepstatin

甲20H
RCO−VaトVal−AHMHA−CO−NH−CH−CO−NH−AHMHA

Pepstanone cH3

軒cH3
9H3
9H39
RCO−Va卜Val−AHMHALCO−NH−CHrCO−NH−CH−C−CH3

R＝：；きcH−（CH2）n−・CH3r（CH2）n−（n＝0・1−20）
AHMHA：（3S，4S）−4−Amin0−6−methylheptanoic acid L
lnhibitors ot metal proteinases．
Phosphoramidon
HN

H3C＼。斤目3OH1？H20←P−NH−CH，CO−NHLCH−COOH…‡…葦三
図1エンドペプチダーゼ阻害物質

−18−

（5日S）

自己免疫疾患治療薬の開発研究
Inhibitors of amino匹Ptidases．

日
3
一

日日

c

2

H

c
一

HH

‖H

（5）

N

（5）

O
C

N

（月）（5）

H H
O・−C
2一
目
上L

H

監cH・監C帯cH，r2−。00。

。2N鹿：＿。。NH＿占H＿。。NH＿。H＿。。NH＿。H＿。。。H

C−？C−C日ソ

ご∴㍉

Bestatin（月）（S）

rS）

Arphamenjnes
H2N−C＝lNHl

N 早 R＝A：−◎
）3 匹

（CH2
1

B‥⑳H

H2N−CH−COrCH2−CH−COOH
（5）

（月）

Actinonin

rAminoacyIarglnine
CH3l

H2N−C＝NHIl

Val−Arg

H2
甲H
H−CH3 （qH2）3（5）

的笹碁岬NH−OH

LelrArg

J12N−CH−CO−NH−CHLCOOH

CH20H

（5）

Probestin−、t甘ti叩用 e柵∩雄∩＿？

H2N−CH−CH−C−NHLCH−C−N−CH−C−N−CH−C−OH（月）（S）（S） （5） （5）（5）（S）？H3 甲3 9H3 甲庸）甲3
R−CH−CH−CH−CH2−C＝CH−CH−C−CH−CH−CH−CH2−CH30＝トム（S）（g）（月）a（S）dH（月）R＝A：−CH3，B：−C2HS

FormestinsCH20
1・・一三：‥（5）CHOH
l

C＝0
1

門1

900H

？H H？￣R？H2

CH3CH2（CH2CH）3CONHCHCH2NHCONtlCH2CHCONHCHCONHCJiCOOH（S）（5）（月）は）

COOH
R＝A：OH

HCOH
I（S）−NH−CH−CO

B：H

（月）

図2−（1）細胞膜酵素阻害物質
ase阻害活性を示すとともに免疫修飾作用を呈す

物質の毒性，溶解性，阻害を受ける酵素などは表るα−Sialosylcholesterolを合成により得た．これ

1に，また免疫修飾物質を含む抗腫瘍物質の毒性

らの物質の構造は図3に示す．上述した酵素阻害および溶解性は表2に示す．

−19−

lnhibitoTS Of dipeptidyIaminopeptidases．

Dioctatins
H
CI

CHJ

CH3
1

（？H2）4苧 （？H2）4
H2NLCH−CH・CO・NH・CH−CH2・CO・NH−C・COOH
Doctatins

A：R＝CH3．B：R＝H

Diprotins
H

CICI？C

A

CH．t

CH二l

H
H

H
C
一一

（ilL

血。＿NH霊二慧H

甲▲CH

O
C

H

N
札−

S）

l

毎
（5）

CH−CH，lH2N−CH−CO
rS）

rS）

二

l

CH2
1

CO−NH−CH−COOH

rS）

rS）

lnhibitors of carboxypeptidases・

Hjstargln（S）−α一Benzylmalic acid

H2N−C＝NH

OH

I

NH

I

三一

；；二‥：．

CHリーC−COOH
IrCH2）。

HOOCJH二NH−CH2−CH2−NH一定占00H

CH2−COOH（SJ（S，S）−N．N−Ethylenediaminedisuccinic

〔5）

（SJ

acid（EDDS）（S）

HOOC−CH2−CH−NH−CHrCH2−NH−CH−CH2−COOH
H。。と

と00H

lnhibitors of djpeptjdylcarboxyp叩tidases．

胡OH222
軒下早川．川．

Foroxymjthjn

0（CH2）．rNCH

無二（CH2）言；監禁H2）・t一芸喜CH二．CONH−CHLCONHLCH−CON−（CH2）二l

rS）

l

0

図2−（2）細胞膜酵素阻害物質−20−

自己免疫疾患治療薬の開発研究
Forphenicine

HO

oHC②藍

CH−COOH

Esterastin

町明…盈MH2−震Ⅲ2−8H−CH21H普C醐
0−C＝0

9＝0

（S）？H￣Ⅲ￣CMHユCH2−CO−NH2

円ipastatins（い （β）（エ）（8−aIlo）（い（エ）（い（♪）（上）R−G−u「Om￣Tyr▼Thr−Glu￣−（Ⅹ）．Pro．Gln￣TyrrIlelO

Plipastatin R（X）
3−（月）−hydroxy hexadecanOiC aCid D−Ala

AI CH3（CH2）．2CHCH2CO−
r

OH

A2

14−（S）−methy）−3−（R）−hydroxy D−Ala
CH3CH2fH（CH2）10CHCH2CO￣
l

CH3

Bl

0H

CH3（CH2）12CHCH2C0−

hexade（：anOic acid3−（R）−hydroxy hexadecanoic acid D−Vall

B2

CH3CH2fH（CH2）10CHCH2CO−F

CH314−（S）Lmethyト3−rR）−hydroxy D−Val
hexadeCanOi（：aCid0H

図2−（3）細胞膜酵素阻害物質−21−

（±ト15−Deoxyspergualin

H2N・C・NH（CH2）4CH2・CH2・CONH・CH・CONH（CH2）．NH（CH2），NH2・3HCl
ll

￣

一

NH

一

l

OH

Bactobolin−HCl Actinobolin

Bactobolamine
OH

．輿望〝

HO鞄

HO

OH NHCOCHCH3

儲

O

︒
H
慧

‥‥．ニ二王CHC12H。盛も12OH

0H NHCOCH2？HCH3

OH NHCOCH30H

Coformycln Azomycln

町軋N。2
H

H
O

O
H

∴∴・・こ●J▲
図3 免疫修飾物質を含む抗菌および抗腫瘍物質

−22−

CH3
CHCI2

Suc−Bactobolamine

Ac−Bactobolamine Thr−Bactobolamine

OH

O

O

H2CH2COOH

自己免疫疾患治療薬の開発研究
表1酵素阻害物質の毒性および溶解性
酵素阻害物質LD5。（mg／kg）

溶

解

性

阻害を受ける酵素

Leupeptin・H2SO。

80（iv，マウス）

Phosphoramidon＞500（iv，マウス）

Bestatin＞500（iv，マウス）

ArphamenineA・200（iv，マウス）

水，Saline，PBS可溶（＞10mg／ml）
水，Saline，PBS可溶（2．5mg／ml，加温）
水，Saline，PBS可溶（＞10mg／ml）＞500（iv，マウス）

水，Saline，PBS可溶（＞10mg／ml）

水，Saline，PBS可溶（＞10mg／ml）

trypsin，plasmin，papain，CathepsinBなど
金属プロティナーゼ
AP−B，Leu・AP
AP−B

H2SO4
ArphamenineB・

AP・B

H2SO。
Dioctatin A・＞250（ip，マウス）水難溶，10％DMSDで白濁液（1mg／ml）DPP・II

H2SO。
DiprotinA＞250（iv，マウス）

Z−DiprotinA＞500（iv，マウス）

Poststatin＞125（iv，マウス）

Formestin A＞125（iv，マウス）

Actinonin＞125（iv，マウス）

Probestin＞250（iv，マウス）

Benzylmalicacid＞500（iv，マウス）

Histargln＞500（iv，マウス）

Foroxymithine＞500（iv，マウス）

Forphenicine＞500（iv，マウス）

Esterastin＞250（iv，マウス）

水，Saline，PBS可溶（＞5mg／ml）
水，Saline，PBS可溶（2mg／ml，白濁）
水，Saline，PBS可溶（＞5mg／ml）
水，Saline，PBS可溶（5mg／ml）
水，Saline，PBS可溶（5mg／ml）
水，Saline，PBS可溶（2mg／ml）
水，Saline，PBS可溶（5mg／ml）
水，Saline，PBS可溶（5mg／ml）▼
水，Saline，PBS可溶（5mg／ml）
水，Saline，PBS可溶（＞1mg／ml）
水難溶，10％DMSOで白濁液（1mg／mJ）

DPP−IV
Post−Pro−Enz
Post−Pro−Enz
fMet−AP
AP−M
AP−M
CP−A
CP−B，ACE
ACE
Alkalinephosphatase
Arylesterase

AP：aminopeptidase，CP：carboxypeptidase，ACE：angiotensinconvertingenzyme

表2 免疫修飾物質を含む抗菌と抗腫瘍物質の毒性および溶解性
抗生物質

LD5。（mg／kg）

15−Deoxyspergualin38．4（iv，マウス）

Bactobolin・HCI

6．0（iv，マウス）

Actinobolin
Bactobolamine
Coformycin
Azomycln
Benadrostin

α−Sialosylcholeterol

800．0（iv，マウス）＞100．0（iv，マウス）
25．0（iv，マウス）
80．0（iv，マウス）＞250，0（iv，マウス）
93．0（iv，マウス）

溶

解

性

水，Saline，PBS可溶（＞10mg／ml）
水，Saline，PBS可溶（5mg／ml）
水，Saline，PBS可溶（＞5mg／ml）
水，Saline，PBS可溶（＞5mg／ml）
水，Saline，PBS可溶（1mg／ml）
水，Saline，PBS可溶（1mg／ml）
水，Saline，PBS可溶（1mg／ml）
水，Saline，PBS可溶（5mg／ml）

−23−

備

考

Poly（ADP−ribose）
合成酵素を阻害
Sialidaseを阻害自己免疫疾患治療薬の開発研究
B・光学異性体Deoxyspergualinの腸内酵素網におよぼす影響
青 柳 高 明＊
研究協力者 小川慶治事，小島蕗子＊，永井真知子暮，原田滋子＊

抗腫瘍性抗生物質として見出された Sper−

大林班員らはDSGの11位の立体配置と生物

gualinl・2）は，その誘導体であるDeoxyspergualin

活性との相関を調べ，（−）−enantiomerに活性が（DSG）3，4）が強い免疫抑制能を有することで注目認められ，DSG活性発現に11位の立体配置が重されている．DSGの薬理作用は「自己免疫疾患治要な役割を果たすことを報告した6，9）．本報告は療薬の開発研究」の報告書（厚生省新薬開発研究青DSGの（−），（＋）−enantiomersを長期間投与し，柳班，昭和60年度〜63年度）5￣8）に報告されてい経時的に脾内の酵素網の動態を調べたのでその結るように，ラット急性実験的アレルギー性脳脊髄果を述べる．

炎（EAE），エリテマトーデスモデルマウス（NZB／
WFl，MRL／MP−lpr／1pr，BXSB／雄），重症筋無力

実

験

方

法

症ラットなどの治療に有効である．さらに，皮膚，動物および光学異性体DSG：ICRマウス（7適

甲状腺移植などの実験同種臓器移植に優れた効果

齢，雄）は静岡県実験動物農業協同組合から購入しが認められ，移植免疫抑制物質として期待されてた．DSG（−），（＋）・enantiomersの構造は以下に示す．

H2N亙：H〉＼へ／〈鼠巫N／（＼／＼／N＼／＼、／NH2●3HCI
00

H

上記光学異性体（20／Jg／マウス）は連続33日間，腹腔内に授与した．対照マウスは生食水を同期間

基質：酵素活性測定用の基質ならびに略語は下記に示す．

腹腔に投与した．マウスは毎日あるいは2日間隔

L−arginineで屠殺し，脾を摘出した後直ちに−700Cで保存し

L−glutamic acid

β−naphthylamide・HCl（Glu・た．脾は10倍量の phosphate buffered salineNA），L−leucine

β−naphthylamide・HCl（Leu・（PBS，pH7，2）中で，組織ホモジナイザー（ultra−NA），andL−methionineβ・naphthylamide（Met・

turrax）を用い，1分間ホモジナイズした．酵素活NA）fromMannResearch，N．Y．，U．S．A．；glycyl−性の測定には，ホモジネートの3，000×g，20分間

L−prOlineβ−naphthylamide（Gly−Pro・NA），L−の遠心上清を用いた．

lysyl−L−alanineβ−naphthylamide（Lys−Ala・NA）

β−naphthylamide・HCl（Arg・NA），

and acetyl−L−alany1−L−alany1−L・alanine methyl■微生物化学研究所

ester（Ac（Ala），・ME）fromBachemFeinchemi．
−25−

kalienAg．，Budendorf，Switzerland；N−Benzoy1−
L−arglnlne ethylester，，N−aCetyltyrosine ethyl

結果および考察ester，and p−nitrophenylacetate（NPA）from

DSGの11位立体配置と生物活性との相関を理TokyoKaseiKogyoC0．，Tokyo，Japan；PTnitro−

解することを目的として，DSGの（−），（＋）一

phenyl−α−D−glucopyranoside（NP−GIc），P−nitro−enantiomersを連続投与し，経時的に脾内酵素網

phenyl−α一D・mannOpyranOSide（NP−Man），andの動態を調べた．

P−nitrophenyl−N−aCetyl−βTD−glucosaminide

両enantiomersを連続投与したマウス牌内の（NP−GIcNAc）from BDH chemicals Ltd．，

酵素活性の変動を図1，2および表2に示す．（−）

Poole，England．Formyl L−methionineβ−

DSG群では，DPP−IVとGIcNAc−aSe活性が有意

naphthylamide（fMet・NA）and carbobenzox−に抑制された．DPP−IVはT細胞表面に存在する

yglycyl−L−prOlineβ−naphthylamide（Z−Gly−Pro・・

ことが知られ15▼17），またDPP−IVとともにGIc−NA）weresynthesizedfromMet・NAandGlyT

NAc−aSeもT細胞に関係する酵素であることを

Pro・NA，reSpeCtively，inourlaboratory・

報告した18）．（−）DSGはT細胞の異なったsub−

緩衝液：酵素活性測定用の緩衝液は0．02mIsetsに影響を与えるものと思われる．一方，（＋）

PBS（pH 7．2）を用いた．ただし，pOSt−prOline−

DSG群はAP−BとLeu−AP活性の有意な増加おcleavingenzyme（Post−Pro−Enz）の測定には0．2

よびGIcNAc−aSeのみが有意に抑制されること

MTris−HClbuffer（pH7．8）を用いた．

が認められた．AP−BとLeu−APの変動は脾内の酵素活性の測定：臓器ホモジネートの遠心上清T，B両細胞の比率の変化によりもたらされたも分画は，それぞれの基質溶液および緩衝液を含むのと考える．上記薬剤の作用機序についてはさら反応試験管（1．5×10cm）に分注し，370Cで1時間に検討する予定である．

の反応を行った．Post−Pro−Enzについては，前述の緩衝液を用いて測定した．すべての酵素活性の

ま

と

め

測定には3本宛の試験管を用い，その平均値を記

免疫抑制作用を有するDSGの（−），（＋）−

載した．6種類のaminopeptidase，4種類のenantiomersの作用秩序を解明することを目的と

endopeptidase，3種類のglycosidaseおよび

して，連続投与したマウス脾内の酵素活性の動態

arylesteraseについて活性を測定した．各酵素活を経時的に調べた．（−）DSG群はDPP・ⅠⅤと性の測定法および基質は表1に示す．

GIcNAc・aSe活性が有意に抑制された．一方，（＋）

蛋白の測定：標準蛋白としてウシ血清アルブミ
ンを用い，Lowry法14）で測定した．

DSG群ではGIcNAc−aSe活性のみが有意に抑制された．既に報告した結果を併せ考えると，上記
2酵素はTリンパ球の機能と密接な関係を有することを示唆した．

−26−

自己免疫疾患治療薬の開発研究
表I ListoftheEnzymesMeasuredandtheirSubstrates
EnzymeAbbreviation

Reference for

Substrate

assaymethod

Aspartateaminopeptidase（EC3．4．11．7）

AP−A

Glu−NA

Arginineaminopeptidase（EC3．4．11．6）

AP・B

Prolineiminopeptidase（EC3．4．11．5）

Pr0−IP

Arg・NA
Pro・NA

Leucineaminopeptidase（EC3．4．11．1）

Leu・AP

Leu・NA

FormylmethionineaminopeptidasefMet−APfMet−NA

DipeptidylpeptidaseII（EC3．4．14．2）

DPP−ⅠI

Lys−Ala・NA

Prolylendopeptidase（EC3．4．21．26）

PostTPro−Enz

Z−Gly−Pro・NA

Serineproteinase（EC3．4．21）

Trypsin−1ike

BAEE

Serineproteinase（EC3．4．21）

ChymotrypsinTlike

ATEE

SerineProteinase（EC3．4．21）

Elastase−like

Ac（Ala）。・ME

α−D−Glucosidase（EC3．2．1．20）

Glucosidase

NP−GIcα−D−Mannosidase（EC3．2．1．24）

Mannosidase

NP・Manβ−N・Acetyl−DTglucosaminidase（EC3．2．1．30）

GIcNAc・aSe

NP・GIcNAc

Arylesterase（EC3．1．1．2）

Esterase

NPA

▲

▲

Control00（−）DSG●一一一−●（＋）DSG●
Il︵∪至OLduE＼∪盲＼一〇Eu︶言＞膏mU莞Uas

ll
l
l
l

▲

﹂

J
I
J

1

l

¶

●、

l l

／l

ノ
u

／

T
●

′ ヽ

O＼〇一〇／○＼〇一〇

5

10

15

20

25

30

35

days

図1EffectoftwoenantiomersofDSGonthetimecourseofDPP−IVactivityinspleen

−27−

▲

▲

Control00（−）DSG

●一一一一一●（＋）DSG︵u至OLdu∈＼u盲＼一〇Eu︶喜＞竜m U≡U乱S

了≠／了＼
、ひ＼ヾ′

5

10

15

20

25

30

35

days

図2

表2

EffectoftwoenantiomersofDSGonthetimecourseofGIcNAc−aSeaCtivityinspleen

ChangesinsplenicenzymeactivitiesinducedbytheadministrationoftwoenantiomersofDSG
Specificactivity（Mean±SD，n＝15）（nmol／min／mgprotein）

EnzymeControl（−）DSG（＋）DSG

AP−A

0．48± 0．09

0．50± 0．08

0．45± 0．90

AP−B

7．56±1．18

8．43±1．24

8．85±1．42＊

Pr0−IP

0．80± 0．38

0．66± 0．22

0．81± 0．32

Leu−AP

7．11± 0．73

7．52± 0．67

7．89±1．10＊

fMet−AP11．68±1．32

11．47±1．49

11．60±1，10

DPP−ⅠV

3．75± 0．56

3．24± 0．38H

3．72± 0．64

Post−ProTEnz

2．78±1．34

2．52±1．24

2．38±1．13

Trypsin−1ike

39．15± 4．69

37．56± 6．39

38，60± 6．00

Chy−try−like52．88±45．77

48．76±52．77

60．58±91．19

Elastase−like39．28± 8．98

35．15±13．73

36．67±12．10

Glucosidase

1．25± 0．28

1．20± 0．24

1．27± 0．29

Mannosidase

0．45± 0．11

0．41± 0．13

0．39± 0．12

GIcNAc−aSe

5．00±1．27

3．22±

Esterase

39．47± 5．82

0．76■■＊

42．03± 3．46

書：♪＜0．05，＊＊：♪＜0．01，…＊：♪＜0．001−28−

3．10± 0．59書目
40．39± 3．80

自己免疫疾患治療薬の開発研究
Umezawa，H．：J Antibiotics 40，1361−1324
文（1987）．

献1）Takeuchi，T・，Iinuma，H．，Kunimoto，S．，
Masuda，T・，Ishizuka，M・，Takeuchi，M．，
Hamada，M．，Naganawa，H．，Kondo，S．and
Umezawa，H．：J Antibiotics 34，1619−1621

10）Aoyagi，T．，Wada，T．，Kojima，F．，Nagai，M．
and Umezawa，H．：J Clin，Invest．，67，51L59（1981）．

11）McDonald，J．K．，Leibach，F．H．，Grindeland，R．
E・andEllis，S．：J Biol．Chem．，243，4143−4150（1968）．

（1981）．

2）Umezawa，H．，Kondo，S．，Iimura，H．，Kunimoto，
S，，Ikeda，Y．，Iwasawa，H．，Ikeda，D．andTakeu−
Chi，T∴」∵A拙焼庇南d34，1622−1624（1981）．

12）Yoshimoto，T．，Fischl，M．，Orlowski，R．C．and

3日wasawa，H．，Kondo，SJkeda，D．，Takeuchi，T．

13）Aoyagi，T．，Nagai，M．，Iwabuchi，M．，Liaw，W．
S・，Andoh，T．andUmezawa，H．：CbncerRes．，

andUmezawa，H．：J Antibiotics35，1665−1669

Walter，R．：J

Biol．Chemリ

253，3708−3716（1978）．

38，3505−3508（1978）．

（1982）．

4）Umeda，Y．，Moriguchi，M．，Kuroda，H．，Na−kamura，T・，Iinuma，H・，Takeuchi，T．and
Umezawa，H．：J Antibiotics 38，886−898（1985）．

5）厚生省新薬開発研究費「青柳班」：自己免疫疾患
治療薬の開発研究．→微生物二次代謝産物を中心として一昭和60年度研究報告書（1986）．
6）厚生省新薬開発研究費「青柳班」：自己免疫疾患
治療薬の開発研究．一微生物二次代謝産物を中心として▼昭和61年度研究報告書（1987）．
7）厚生省新薬開発研究費「青柳班」：自己免疫疾患
治療薬の開発研究．一一微生物二次代謝産物を中心として一昭和62年度研究報告書（1988）．
8）厚生省新薬開発研究費「青柳班」：自己免疫疾患
治療薬の開発研究．一微生物二次代謝産物を中心として一昭和63年度研究報告書（1989）．
9）Umeda，Y・，Moriguchi，M．，Ikai，K．，Kuroda，K．，
Nakamura，T．，Fujii，A．，Takeuchi，T．and

14）Lowry，0．H．，Rosebrough，N．J．，Farr，A．Land
Randall，R．J．：J Biol．Chem．，193，265−275（1951）．

15）Schoen，E．，Demuth，H．U．，Barth，A．andAnsor−
ge，S∴βわCカg仇．J，223，255−258（1984）．
16）Ansorge，S．and Schoen，E．：Aduancesin thebiosciencesVol．65，pp．3LlO（1987），Pergamon
Press．

17）F】ad，H．D．，Gruber，M．，SchoIz，W．，Feller，A．C．，
Ulmer，A．J．andHeymann，E．：Aduancesinthe
biosciencesVol．65，pp．19L25（1987），Pergamon
Press．

18）Aoyagi，T．，Wada，T．，Kojima，F．，Yoshida，S．，
Sasagawa，S．，Tamura，M．andUmezawa，H．：
βわC／zg7乱九gリ18，383−389（1989）．

−29−

膠原病の基礎的解明とその治療への応用（Ⅴ）−エリテマトーデスモデルマウス（BXSB雄マウス，MRL／砂rマウス）のペプチダーゼに及ぼす15−デオキシスパーガリンの効果と膠原病患者体液のプテリジン類の変化「永 津 俊 治■研究協力者 萩原昌子書，藤原道夫＊■

膠原病は，全身性エリテマトーデス（systemic

た．生化学的マーカーとしてペプチダーゼ類とプ

lupuserythematosus，SLE），進行性全身性硬化症

テリジン類を検索した結果，膠原病モデル動物と（progressive systemic sclerosis，PSS），結節性SLEおよびRA患者で特異的な変化のあること

多発性動脈炎（polyarteritisnodosa，PN），皮膚筋を発見した．

炎（dermatomyositosis），リウマチ熟（rheumatic

ペプチダーゼ類では次の知見を得た．（1）コラー

fever，RF），慢性関節リウマチ（rheumaticarthri−

ゲン由来のペプチドの水解に働くと推定される，

tis，RA）などの96疾患の総称名で，全身性，非感

いわゆるコラゲナーゼ様ペプチダーゼ（collagen−

染性，非悪性腫瘍性，自己永続性の炎症疾患であase−likepeptidase，CL−ペプチダーゼ）と，CL−ペり，多臓器障害性で間欠的に再発と緩解を示す，

プチダーゼの次の段階に働く，ペプチドのアミノなどの共通した特徴をもっている．汎発性結合組末端のⅩ−Proのジペプチドを水解遊離するジペ

織疾患ともよばれて，全身系統的に結合組織のプチジル（アミノ）ペプチダーゼIV〔dipeptidyl

フイブリノイド変化がみられる．膠原病は自己成（amino）peptidase，DAP−IV〕が膠原病のSLEと分に対する抗体が高率に証明されるので自己免疫RAの患者の血清で著明に低下していた1〜3）．（2）自疾患と考えられており，免疫複合体やある種の抗己免疫疾患モデル動物のエリテマトーデスマウス

体が疾患の進行に関連している．膠原病ではT細のNZBマウスでも血梁中のCL−ペプチダーゼと胞の機能に欠陥がおこり，自己抗体を産生するB

DAP−IVが低下していた．（3）NZBマウスで，DAP−

細胞の分裂・成熟のコントロールが破綻して自己ⅠⅤと類似のペプチダーゼで，アミノ末端のLys−

抗体が不必要に産生されて発症すると推定されてAlaに比較的特異的なDAP−IIと，Proの後でペいる．

プチドを水解するプロリルエンドペプチダーゼの著者らは昭和60〜62年度の3年間の研究で，血いわゆるpost−prOlinecleaving enzyme（PPCE）

液（血清，血祭），組織の自己免疫疾患に特有な生の活性とが，NZBマウスの脾臓で成長発病と共化学的マーカーを，膠原病のSLEとRAの患者に増加していた．DAP−ⅠⅤが減少しているので，その血清，膠原病モデル動物のエリテマトーデスマの結果DAP−II／DAP−ⅠⅤの比が増加していた．（4）ウス（NZBマウス）の血液と組織について検索しヒトのSLEやRAでも血清のDAP−IIが増加し■名古屋大学医学部生化学第一講座ており，DAP−IVが減少しているので，DAP−II／

H新潟大学医学部医動物免疫講座

DAP−IVの比はSLEやRAで著明に増加してい−31−

た4）．（5）NZBマウスのDAP−II，DAP−ⅠⅤ，PPCE，

オブテリン三リン酸よりネオプテリンを生成する

CL・ペプチダーゼの4種のぺプチダーゼの成長発と推定されている．マクロファージがT細胞に抗病に伴う変化を，血祭，脾臓の他に腎臓，肝臓，原を提示してT細胞が活性化されるとインター脳で検索すると，DAP−IIの増加とPPCEの増加

フェロンーγを介してマクロファージを活性化すが認められた．PPCEの増加は，1986年青柳ら5）る．マクロファージのGTPシクロヒドロラーゼが最初に報告したが，これを支持した．

（（丑の酵素）が活性化されてGTPよりジヒドロネ

プテリジン類は自己免疫疾患のマーカーとして

オプテリン三リン酸が大量に生成し，脱リン酸つ

最近急速に関心が高まっているが，本研究では，

いで酸化されてネオプテリンとなりマクロファー

NZBマウスでネオプテリンとビオブテリンの変ジから分泌されると推定される．著者らは昭和62

化を初めて検索報告した．高等生物のプテリジン

年度の研究で，自己免疫疾患モデル動物のエリテは2−アミノー4ヒドロキシプテリジンの構造を

マトーデスマウスのNZBマウスを対照の一般にとっておりプテリンとよばれる．生化学

BALB／Cマウスと比べたところ，組織のビオブテ

的に機能の明らかなプテリンはテトラヒドロビオ

リンと比べてネオプテリンは極めて少いが，ネオ

ブテリン〔（6R）一L−e7yth7t）−5，6，7，87tetrahydrobio−

プテリンとネオプテリン／ビオブテリン比が発症

pterin〕であり，プテリン要求モノオキシゲナーゼと共に増加することを報告した．

であるフェニルアラニン水酸化酵素，チロシン水

本年平成元年度の研究でさらに次の課題を検討

酸化酵素，トリプトファン水酸化酵素の補酵素とした．（1）著者らはエリテマトーデスモデルマウス

して，神経伝達物質のカテコールアミン（ドーパミ（BXSB雄マウス，MRL／砂r雄マウス）のDAP−

ン，ノルアドレナリン，アドレナリン）とインドー

ⅠⅠ／DAP−ⅠⅤ比が発症と共に上昇することを発見

ルアミン（セロトニン）の生合成に働いている6）．

したが，他方，藤原道夫ら8）は微生物二次代謝産物

免疫系とのかかわりで注目されているプテリンはの免疫抑制物質15−デオキシスパーガリン（DSP）

テトラヒドロビオブテリン生合成の中間体であるがエリテマトーデスモデルマウスの発症を抑制す

ネオプテリンである．テトラヒドロビオブテリン

ることを発見したので，藤原と共同して，エリテは次の推定経路で生合成される．GTP里D＿

マトーデスモデルマウスの発症をデオキシスパー

叩伽−7，8−ジヒドロネオプテリン三リン酸望6−

ガリンで抑制してペプチダーゼ類の変化を検索しピルボイルテトラヒドロブテリン竺6＿ラクトイ

た．（2）NZBエリテマトーデスモデルマウスで発ルテトラヒドロブテリン里テトラヒドロビオブテ

見したネオプテリン／ビオブテリン比の増加が，リン．この生合成中間体のD・叩班ワー7，8−ジヒドロ

SLEやRAの患者の血清や関節液でも認められ

ネオプテリン三リン酸より脱リン酸，酸化されてるかを検索した．

ネオプテリンが生成される．ヒト七サルでは，テ研

トラヒドロビオブテリンの酸化物のしのγ兢和一ビ

究

方

法

オブテリンと共に，かなりの量のD−セり班和一ネオプ

エリテマトーデスモデルマウスのMRL／砂γマ

テリンが組織，血液，尿に存在する．しかしラッウスとBXSB雄マウスはすべてJackson Labo−トなどの小動物ではネオプテリンの量はビオブテ

ratory（Bar Harber，ME）に由来するもので，新リンと比べて極めて小さい7）．T細胞はGTPから

潟大学医学部動物実験施設，藤原研究室で繁殖維テトラとドロビオブテリンを合成できるが，マク持された動物である．ループス腎炎を13週齢で発ロファージは③，④の酵素がないのセジヒドロネ症し始め，20週齢で症状が進行した8）．DSPを生−32−

腰原病の基礎的解明とその治療への応用（Ⅴ）

理的食塩水に溶かし5mg／kgをマウスの腹腔内

ダーゼの活性は，SU−Gly−Pro−Leu−Gly−Pr0−4−メチに，13週〜14週（2週間）注射，2週間休み，17〜18

ルクマリンー7−アミドを基質として，CL−ペプチ

週（2週間）注射，1週間休み，20週齢で屠殺した．

ダーゼによりまずSU−Gly−Pro−LeuとGly−Pr0−4−

脾臓．腎臓，肝臓を採取し凍結して−800Cに測定

メチルクマリンー7−アミドを生成させ，ついで反応まで保存した．組織を0．25Mショ糖溶液でホモジ系に添加してあるヒト顎下腺より精製したDAP−

ネートとし，3，000×g20分間遠沈して上清を酵素

ⅠⅤの作用により，Gly−Proと7−アミノー4−メチ）レク

材料とした．

マリンに分解して後者の蛍光を測定した12）．

酵素活性測定のためのペプチド基質はペプチド

血清，関節液のプテリジン類（ビオブテリン，ネ研究所より購入した．DAP−IIにはLys−Ala−4−メ

オプテリン）の濃度は高速液体クロマトグラ

チルクマリンアミド9），DAP−IVには7−Gly−Pro・4−

フィー／蛍光法13）により測定した．血清は健康対照

メチルクマリンアミド10），PPCEにはスクシニル者21例とRA患者21例とSLE患者23例より，（SU）−Gly−Pr0−4一メチJt／クマリンアミド11），CL−ペ

関節液は骨関節症（osteoarthritis，OA）患者21

プチダーゼにはSU−Gly−Pro・Leu−Gly−Pr0−4−メチ

例，RA患者21例より，それぞれ得られた．症例

ルクマリンアミド12）を基質に用いた．酵素活性測の年齢は，健康対照者（血清）55．8歳（36−78歳），

定のための緩衝液は，DAP−IIには0．2Mホウ酸ナ

OA（関節液）65．5歳（43−84歳），RA56．1歳（血清とトリウム＋0．05mtクエン酸を0．1Mリン酸ナトリ

関節液）（28−75歳），SLE（血清）48．5歳（38−65歳）

ウムでpH5．3に調製した広域緩衝液，DAP−IVはであった．血清，関節液はトリタロル酢酸存在下

0．15MグリシンーNaOH緩衝液（pH8．7），PPCEにに酸性条件下でヨウ素酸化して酸化型で強い蛍光は0．2Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH6．8）（1mMを発するビオブテリンとネオプテリンにしてか

EDTAを含む），CL−ペプチダーゼは0．2Mトリスー

ら，Dowex−50−H＋カラムで部分精製し，NH。OH

マレイン酸緩衝液（pH8．0）（20mMCaC12を含む）

で溶出して凍結乾燥後，高速液体クロマトグラ

をそれぞれ用いた．

フィーで分離し，蛍光検出器で励起波長350nm，酵素活性の測定はすべて基質よりペプチダーゼ
反応により遊離する7−アミノー4一メチルクマリン

蛍光波長450nmでビオブテリンとネオプチリンのピークを検出定量した．

の蛍光を，励起波長380nm，蛍光波長460nmで
研 究 結 果測定した．
DAP−IIの活性は7−Lys−Ala−4一メチJt／クマリン（1）エリテマトーデスモデルマウス（BXSB雄

アミドを基質として，アミノぺプチダーゼの阻害

マウス，MRL／わrマウス）のぺプチダーゼに及ぼ剤1mMオルトフェナントロリンの存在下，Lys−

す15・デオキシスパーガリン（DSP）の効果

Alaと共に生成する7−アミノー4一メチルクマリン

藤原ら8・14）は，エリテマトーデスモデルマウスとを高速液体クロマトグラフィーで分離して蛍光検

しそBXSB雄マウスとMRL／砂rマウスを用い出をした9）．DAP−IVの活性は7−Gly−Pr0−4一メチルて，DSPがこれらマウスにみられる免疫異常とクマリンアミドを基質として，Gly−Proと共に生

ループス腎炎の発症を，発症前に授与することに成する7−アミノー4−メチルクマリンの蛍光を測定

より予防できるのみならず，発症してからも抑制

した10）．PPCEの活性はSU−Gly−Pr0−4一メチルクする治療効果があることを発見している．今年度

マリンー7−アミドを基質として生成する7−アミノーの研究では，藤原らと共同して，エリテマトーデ

4−メチルクマリンを蛍光測定した11）．CL−ペプチ

スを発症した20適齢のBXSB雄マウスと−33−

表1Effectof15−Deoxyspargualin（DSP）onPeptidaseActivitiesfromBXSB MicewithLupusErythe−matosus−1ikeSyndrome
DSP

Species

DAPII

DAPIV

DAPIⅠ／PPCE

CL−P（5mg／kg）（nmol／min／mgprotein）DAPIV（nmol／min／mgprotein）

SpleenFemaleBXSB（control）

untreated 2．02±0．16 4．84±0．21 0．41±0．02 2．01±0．24 2．84±0．25

Male BXSB（control）

untreated 2．57±0．17 2．79±0．09 0．92±0．10 1．72±0．11 2．08±0．12treated1．62±0．08日2．60±0．12■

untreated

1二39±0．122．72±0．15

0．15±0．02

2．76±0．15

FemaleBXSB（control）

untreated

2．03±0．14

4．49±0．26

0．46±0．04

1．54±0．11

1．04±0．13

MaleBXSB（control）

untreated

2．41±0．14

3．90±0．52

0．62±0．06

1．60±0．09

0．98±0．08

treated2．27±0．08

3．78±0．45

0，60±0．06

1．71±0．15

0．97±0．07

untreated

2．64±0．26

2．37±0．18

1．11±0．08

2．00±0．19

1．07±0．03

FemaleBXSB（control）

untreated

1．93±0．15

2．57±0．30

0．82±0．06

3．22±0．35

1．30±0．13

MaleBXSB（control）

untreated

3．38±0．35

3．00±0．53

1．16±0．11

2．51±0．57

1．55±0．29

treated2．91±0．58

3．11±0．76

0．95±0．16

2．76±0．52

1．66±0．46

untreated

2．78±0．30

2．94±0．10

0．94±0．07

3．11±0．12

1．40±0．10（experiment）
FemaleBALB／C（control）

0．61±0．04日2．26±0．09■■2．80±0．24日

0．92±0．03

Kidney（experiment）
FemaleBALB／C（control）
Liver（experiment）
FemaleBALB／C（control）

mean±SD（n＝5）．SignificantlydifferentfromcontroIs（MaleBXSB）．暮p＜0．05，Hp＜0．001．

表2

Effectof15・Deoxyspargualin（DSP）onPeptidaseActivitiesfromMRL／砂rMicewithLupusErythe−matosusTlikeSyndrome

DSP DAPII DAPIV DAPII／PPCE CL−P（5mg／kg）（nmol／min／mgprotein）DAPIV（nmol／min／mgprotein）

Species

SpleenMaleMRL／＋＋（control）

untreated

2．08±0．19

4．40±0．19

0．47±0．03 1．50±0．08

2．69±0．25

MaleMRL／砂r（control）

untreated

2．58±0．14

3．97±0．16

0．64±0．05

3．21±0．27

treated1．31±0．14日暮4．86±0．11日■0．42±0．03日■1．27±0．21書目2．27±0，23日●

untreated

1．39±0．122．72±0．15

0．51±0．02

2．76±0．15

0，92±0．03

FemaleMRL／＋＋

untreated

3．99±0．44

6．41±0．39

0．61±0．04

1．40±0．15

2．94±0．37

MaleMRL／砂r（control）

untreated

4．56±0．22

5．44±0．70

0．84±0．05

1．40±0．02

3．30±0．18

treated4．00±0．30◆ 4．65±0．51●

0．86±0．03

1．42±0．02

3．47±0．16

untreated

2．64±0．26

2．37±0．18

1．11±0．08

2．00±0．19

1．07±0．03

MaleMRL／＋＋（control）

untreated

2．26±0．27

4．21±0．29

0．53±0．06

1，99±0．32

3．21±0．31

MaleMRL／H）r（control）

untreated

2．75±0．53

4．03±0．21

0．68±0．12

2．60±0．16

3．54±0．54

treated1．58±0．41日 4．08±0．99

0．39±0．12日

2．68±0．77

3．71±1．07

untreated

2．78±0．30

0．94±0．07

3．11±0．12

1．40±0．10（experiment）
FemaleBALB／C（control）

2．21±0．12

Kidney（experiment）
FemaleBALB／C（control）
Liver（experiment）
FemaleBALB／C（control）

2．94±0．10

mean±SD（n＝5）．SignificantlydifferentfromcontroIs（MaleMRL／H）r）．●p＜0．02，Hp＜0．01．日♪＜0．001．

MRL／H）rマウスを対照（control）として，DSPのを実験群（experiment）として，脾臓，腎臓，肝臓

13週齢よりの投与により発症の著明な抑制が免のペプチダーゼ類の変化を検索した．エリテマ

疫学，病理組織化学で証明された20週齢のマウス トーデスマウスの対照として，BXSB雄マウスに−34−

膠原病の基礎的解明とその治療への応用（Ⅴ）
表3

NeopterinandBiopterinConcentrationsandtheirRatiosinControIs，andRA，OA，andSLEPatients
MeanandSDconcn，nmOl／L

Neopterin／blopterin
ratio

Neopterin

Blopterin

26．13（9．72）

11．32（3．00）

2．23（0．54）

21．63（3．32）

10．02（1．68）

2．32（0．40）

43．08（13．3）8

9．71（3．47）

4．88（2．68）8

25．64（9．99）

16．61（7．47）

1．63（0．81）

74．96（35．88）b

22．11（7．57）C

3．62（1．68）CふソTJ川封川中h

3
2

SLE

1
2

RA

l
2

ControISlリ〟り・んJりJJJんJ申し、（イ川川J
1
2

RA

l
2

OA

aSigniBcantlydifferentfromcontroIs：P＜0．001．b・CSignificantlydifferentfromOA：bp＜0．001andCp＜0．02．

はBXSB雌マウス，MRL／砂rマウスには

加，DAP−IIの増加，PPCEの増加はいずれも認め

MRL／＋＋マウスを用いた．また正常対照マウス

られず，発症しない対照のMRL／＋＋マウスと等としてBALB／C雌マウスを用いた．

しい値となった．

表1にBXSB雄マウスのエリテマトーデス発症に伴うペプチダーゼの変化に及ぼすDSPによ（2）膠原病患者体液（血清，関節液）のプテリジン類（ネオプテリン，ビオブテリン）の変化17）
表3に，対照正常者，RA患者，SLE患者の血る発症抑制の影響を示す．
BXSB雄マウスのペプチダーゼ類のエリテマ

清のネオプテリン，ビオブテリン，ネオプテリン／

トーデス発症に伴う変化で著明なものは，DAP−

ビオブテリン比，およびOA患者とRA患者の関II／DAP−IV比の増加とDAP−IIの増加であった．

節液のネオプテリン，ビオブテリン，ネオプテリ

この変化は脾臓で最も著明であった．この結果は，ン／ビオブテリン比を示す．血清ではRA患者で前報のNZBマウス4），BXSB雄マウス15・16）の成績

は正常対照者と比べて有意な変化はないが，SLEと一致した．DSPで発症を抑制したBXSB雄マ

患者ではネオプテリンが著明に増加しており，ネ

ウスの脾臓のDAP−II／DAP−IV比の増加とDAP−

オプテリン／ビオブテリン比も有意に増加した．関ⅠⅠの増加は認められず，発症しない対照のBXSB

節液で炎症性の自己免疫疾患であるRA患者を，雌マウスと等しい値となった．

非炎症性の非自己免疫疾患であるOA患者と比表2にMRL／砂γマウスのエリテマトーデス発

較すると，ネオプテリンが約3倍に高度に増加し症に伴うペプチダーゼの変化に及ぼすDSPによており，ビオブテリンも軽度であるが有意に増加

る発症抑制の影響を示す．

し，従ってネオプテリン／ビオブテリン比も著明に

MRL／砂γマウスのペプチダーゼ類のエリテマ増加した．

トーデス発症に伴う変化で著明なものは，BXSB
考雄マウスと等しく，DAP−II／DAP・ⅠⅤ比の増加と察

DAP−IIの増加であった．PPCE活性は脾臓で有（1）自己免疫疾患モデル動物と患者におけるペ意に増加して，青柳ら5）の前報を支持した．これら

プチダ丁ゼ類の変化と，自己免疫疾患治療薬15−のMRL／砂γマウスでのペプチダーゼ類の変化

デオキシスパーガリンのペプチダーゼに及ぼす影は，前報のNZBマウス4），MRL／砂rマウス15・16）の響

成績と一致した．DSPで発症を抑制したMRL／

昭和60年度より本年平成元年度の研究で，自己砂rマウスの脾臓でのDAP−II／DAP−IV比の増免疫疾患モデル動物のNZBマウス，BXSB雄マ

ー35−

ウス，MRL／砂γマウスの血祭，牌臓，腎臓，肝臓

この変化が自己免疫疾患の原因と密接に関係したのペプチダーゼ類の発病前（6週齢），発症初期（13変化であり，自己免疫疾患の重要な生化学的指標週），症状進行期（20週齢）における変化を検索しであることを示している．DAP・IIの増加とDAP−てきた．その結果．自己免疫疾患モデル動物のペ

ⅠⅠ／DAP−ⅠⅤ比の増加が自己免疫疾患の原因か結プチダーゼ類の発症に伴う特異的な変化は，①血果かが問題となるが，DAP−ⅠⅠの酵素阻害剤を微祭と膵臓におけるDAPJIの増加とDAP−IVの減生物の二次代謝産物中に探索して，自己免疫疾患

少，従ってDAPTII／DAP−IV比の増加，②膵臓のモデル動物で新しい免疫疾患治療薬を開発する研PPCEの増加であった．（参のPPCEの増加は青柳究を進めている．

ら5）の前報と一致した．①のDAP−ⅠⅠの増加，DAP−（2）自己免疫疾患患者の体液（血清と関節液）にIVの減少，DAP−II／DAP−ⅠⅤの増加は，RAとSLE

おけるプテリジン類の変化の患者の血清，ことにSLE患者の血清で明瞭に

昭和62年度の研究で，自己免疫疾患モデル

認められた．本年度の研究で，藤原らと共同して，

NZBマウスの組織のプテリジン類の発症に伴う

BXSB雄マウスとMRL／H）rマウスにDSPを発変化を検索した．晴乳動物組織のプテリジン類は病症期（13週）より投与して発病を抑制すると，大部分テトラヒドロ型のビオブテリンであり，そDAP−II，DAP−II／DAP−IV比の発病に伴う変化はの生合成中間体由来のネオプテリンはヒトとサル抑制されて，対照無症状のBXSB雌マウスと以外の小動物ではほとんど検出されない．NZB

MRL／＋＋マウスと等しい値となった．MRL／砂r

マウスの対照のBALB／Cマウスでも組織のプテ

マウスの牌臓のPPCEの活性の増加も抑制されリジンはほとんどビオブテリンであったが極めてて対照MRL／＋＋マウスと等しい値となった．

少量のネオプテリンも検出され，NZBマウスのこれらの成績は，自己免疫モデル動物に共通にすべての組織でネオプテリンとネオプテリン／ビ認められる特徴的なペプチダーゼ類の変化は牌臓

オブテリン比が高値を示すことを報告した．本年と血液（血祭，血清）のDAP−ⅠⅠの増加，DAP−IVの平成元年度の研究で，RAとSLA患者の血清と関減少，DAP−II／DAP−ⅠⅤ比の増加，脾臓のPPCEの節液のプテリジンを検索した．ヒトではネオプテ増加であり，これらの変化はDSPで発症を抑制

リンがビオブテリンと等しく主要な組織プテリジ

すると正常化することを示している．DAP−ⅠⅠのンである．血清ではSLE患者で著明にネオプテ増加とDAP−II／DAP−ⅠⅤ比の増加はRAとSLE

リンとネオプテリン／ビオブテリン比が増加しての患者血清でも認められるので，DSPのような自いた．関節液はRA患者のみで認められるが，非己免疫疾患治療薬で治療すればこの血清ペプチ

自己免疫疾患のOA患者と比べるとネオプテリ

ダーゼの変化も正常化することが期待される．

ン，ネオプテリン／ビオブテリン比が著明に増加し

DAP−ⅠⅤは中性セリンペプチダーゼでリンパ球のていた．この成績はネオプテリン／ビオブテリン比

T細胞に局在することがわかっている．DAP−II

が自己免疫疾患の生化学的マーカーであることをはリソソーム酵素であり組織の免疫系における役示す．ネオプテリンは，マクロファージがT細胞割は末だ明らかでない．DAP−IIもDAP−ⅠⅤも血液に抗原を提示するとT細胞が活性化されて，イン（血祭・血清）に存在し，脾臓の酵素と平行して変ターフェロンーγが放出され，インターフェロンーγ

化するが，由来組織は未定である．本年度の研究

受容体を介してマクロファージでGTPよりシク

で，自己免疫疾患治療薬DSPがDSP−ⅠⅠの増加とロヒドロラーゼが活性化されて生合成される7，8−

DSP−II／DSP−IV比の増加が正常化される知見は，ジヒドロネオプテリン三リン酸に由来する．本研−36−

膠原病の基礎的解明とその治療への応用（Ⅴ）

究で，RA患者で血清のネオプテリンは変化ない
のに関節液のネオプテリンは著明に増加している
ことは，関節液のネオプテリンが血清よりはるかに高くなることと考えて，関節内でマクロファー
ジより生成されることを示唆している．つまり局所でのT細胞の活性化を示している．従ってネオ
プテリン／ビオブテリン比は，DAP−II／DAP−IV比liver of animals and man．In：Cooper，B．A．，
Whitehead，Ⅴ．M．（Eds．）：Chemistryand Bi01−
0gy Of Pteridines1986，Walter de Gruyter，Berlin，1986，pp．319−322．
8）Makin0，M．，Fujiwara，M．，Aoyagi，T．and
Umezawa，H．：Immunosuppressive activities
Ofdeoxyspergualin．I．Effectofthelongterm
administrationofthedrugonthedevelopment
Ofmurinelupus．immunqpharmacol吃り，14，107（1987）．
9）Nagatsu，TリSakai，T．，Kojima，K．，Arai，E．，

と共に，微生物の生産する二次代謝産物中に自己

Sakakibara，SFukasawa，K．and

Harada，

免疫疾患の治療薬を開発するスクリーニングに有M．：Asensitiveandspecificassay fordipepti−
dyl−aminopeptidaseIIinserumandtissuesby

用と考えられる．

liquidchromatography一再uorometry．Ana＆tical文

献1）Iwase−Okada，K．，Kojima，K．，Kato，T．，Kaku，H．，Okazaki，T．，Wago，K．，Sakakibara，S．and
Nagatsu，T．：Collagenase・likepeptidaseactiv−
ityin serum from patients with rheumatoid

arthritis．Eゆerientia，41，487−488（1985）．
2）Iwase−Okada，K．，Nagatsu，T．，Fujita，KリTori−

kai，K．，Hashimoto，T．，Shibata，T．，Maeno，Y．
and Sakakibara，S．：Serum collagenake・1ike
peptidase activityinrheumatoidarthritis and

SyStemiclupuserythematosus．ClinicaChim
Acね，146，75−79（1985）．
3）Fujita，K．，Hirano，M．，Ochiai，J．，Funabashi，M．，Nagatsu，I．，Nagatsu，T．and Sakakibara，
S．：SerumglycylprolineP−nitroanilidaseactiv−
ityinrheumatoidarthritisandsystemiclupus
erythematosus．ClinicaChimicaAcia，88，15−20（1978）．

4）Hagihara，M．，Ohhashi，M．andNagatsu，T．：
Activities ofdipeptidylpeptidaseIIand dipe−ptidyl peptidaseIVinmice withlupus

erythematosus−like syndrome andin patients

withlupus erythematosus and rheumatoid
arthritis．Clinical Chemist7y，33，1463−1465（1987）．

5）Aoyagi，T．，Wada，T．，Kojima，F．，Nagai，M．，
Okubo，M．，Masaki，Y．and Umezawa，H．：
Abnormality of the post−prOline−Cleaving
enzyme activityin micewith systemiclupus
erythematosus−1ike syndrome．Joltrnal q／A坤JわdβわC如77めり，7，273−281（1985）．
6）Nagatsu，T．：Biopterin cofactor and monoa・
mine−Synthesizing monooxygenases．Neuro−
Cカβ∽たわ加わγ乃αJわMJ，5，ト27（1982）．
7）Hasler，Th．and Niederwieser，A．：Tetrahy−

βわC如乃たり，147，80−85（1985）．
10）Kato，T．，Nagatsu，T．，Kimura，T．and Saka−kibara，S．：Fluorescence assay of X・prOlyl
dipeptidyl−aminopeptidase activities with a
newfluorogenic substrate．Biochemical Medi−cf〃β，19，35ト359（1978）．

11）Kato，T．，Okada，M．and Nagatsu，T．：Distri・
bution of post−prOline clearing enzymein
humanbrainandperipheraltissues Molecuhlr
d乃d Cg肋J血rβわCゐg〃7如け，32，117−121（1980）．
12）Kojima，K．，Kinoshita，H．，Kato，T．，Nagatsu，
T．，Takada，K．andSakakibara，S．：Anewand
highly sensitivefluorescence assay for colla−
genase−1ike peptidase activity．Anab，lical Bio，Cカ27刀ね的，100，43−50（1979）．
13）Fukushima，T．and Nixon，J．C．：Analysis of
reducedformsofbiopterininbiologicaltissues
andfluids．AnaかticalBiochemist7y，102，176−188（1980）．

14）藤原道夫，伊藤 聡，渡辺久美：エリテマトーデ
スモデルマウスを用いた微生物代謝二次産物の治療効果に関する研究．青柳班，昭和63年度報告書，p．89−96（1989）．
15）永浄俊治，萩原昌子，藤原道夫：膠原病の基礎的解明とその治療への応用（ⅠⅤ）−エリテマトーデ
スモデルマウス（BXSB雄マウス，MRL／砂rマウス）のペプチダーゼの変化−
16）Hagihara，M．，Fujiwara，M．andNagatsu，T．：
Activities of dipeptidyl peptidasesin BXSB
mice and MRL／砂r micewithlupus erythe−matosus−1ike syndrome．Biochemical Medicine
α〃d〟gおろoJgcβわ7秒，42，224−231（1989）．
17）Hagihara，M．，Nagatsu，T．，Ohhashi，M．and
Miura，T．：Concentrations of neopterin anddrobiopterin−prOducing enzyme activitiesin−37−

biopterinin serum from patients withrheumatoid arthritis or systemiclupus eryth・ematosus andin synovialfluid from patientswith rheumatoid and osteoarthritis．Clinical
ChemtsiTy，inpress（1990）．

イノシトールリン脂質代謝回転抑制物質のスクリーニングと免疫抑制作用
梅 澤 一 夫＊
共同研究者 井本正哉書，西岡 浩＊事，水田実洋子＊書，沢力＊＊，

竹内富雄H，石塚雅章＊＊＊

がん遺伝子ras，SrC，erbB，fms，fesなどで形質転換した細胞はそのイノシトールリン脂質代謝回

方法

転（PIturnover）が上昇している．PIturnoverのイノスタマイシン・Na塩の単離精製：5γ柁一活性化によりイノシトール3リン酸とジアシルグ

Pto，り・CeSSp．MH816−AF15株を，2．0％ガラクトー

リセロールが生産され，それぞれは細胞内カルシ

ス，2．0％デキストリン，1．0％ソイペプトン，0．5％

ウムイオンの移動とプロテインキナーゼCの活コーン・スティーブ・リカー，0．2％硫安及び0．2％

性化を引き起こし，細胞増殖が活性化される．一炭酸カルシウムを含む培地（pH7．4）中で300C，5

方，PI turnoverは免疫系細胞の活性化機構に関

日間種母培養後，その培養液を2．0％グリセロー

与することが示唆されている1・2）．そこでPI turn−ル，2．0％デキストリン，1．0％ソイペプトン，0．3％

0Ver阻害物質には免疫抑制物質，自己免疫疾患治

酵母エキス，0．2％硫安及び0．02％炭酸カルシウム

療物質としての可能性が期待される．私達は微生を含む生産培地（pH7．4）に3％植菌し，270Cで6物二次代謝産物中から低分子PIturnover阻害物

日間培養を行った．その培養液（5g）は遠心分離質のスクリーニングを試み，昨年度までにイソフ

後，菌体のアセトン抽出液を培養上清と混ぜ，3．5

ラボン構造のpsi−teCtOrigenin3），pendolmycin4）おgの酢酸エチルで抽出を行った．酢酸エチル抽出

よび2，3−dihydroxybenzoicacid5）を単離した．さ物（1．03g）はシリカゲルカラムクロマトグラ

らに psi−teCtOrigenin はin situ でリンパ球のフィー（50gシリカゲJt／）にかけ，inostamycinをconA，IL−2，MLR等による活性化を抑制した．今含む画分をCHC13：MeOH＝100：1で溶出し年度はPIturnover阻害物質のスクリーニングをた．得られた溶出液よりacetonitrile沈澱法及び続け，新規物質のinostamycinを単離した6）．そし遠心向流分配クロマトグラフィーにて精製後，て，inostamycin，pSi−teCtOrigenin，2，3・dihydroxy−hexane−dichloromethaneによる結晶化，更に1N

benzoicacidのアルデヒド体の生物活性を調べ，

NaOH処理，hexane・dichloromethaneによる再特にinostamycinの免疫抑制に関して考察を結晶を経て，最終的にinostamycinNa塩の板状行った．

結晶（112．4mg）を得た．
ホスフアチジルイノシトール（PI）turnover：■慶応義塾大学理工学部＝微生物化学研究所
書目化学療法研究所

3×105のA431細胞を5％のCalfserumを含む
ダルベツコ培養液で16時間培養し，その後，
mediumを除き，1mlのHepes buffered saline−39−（20mMHepespH7．4，150mMNaCl，5mMKCl，

時間前に3H一チミジンを添加し，取り込みを液体

1mMCaCl2，1mMMgC12，0．1％glycerolを含む）

シンチレーションカウンターで測定した．

に3H−inositol（1pCi／ml，14Ci／mmol）を加え

nIixedlymphocyte culture（AILC）：WKY

370C，30分培養した．次に，teStChemicalと400

ラット牌細胞を50FLg／mlのmitomycin Cと共

ng／mlのEGFを加え，さらに370C，60分培養をに20分間370Cでincubate L，不活性化してつづけた．次に，0．01MSOdiumpyrophosphateを

Stimulatorとして用いた．それらの細胞（2×105／

含む0．5mlの10％trichloroacetic acid（TCA）

mJ）とナイロンウールカラム処理したF344ラッを加え，TCA不溶画分を1mlの水と共にかきトの牌細胞（responder）1：1に混合し，0．2mlのとった．lipid画分はクロロホルム／メタノール

medium中で5日間培養して3H−チミジンの18（1：1）で抽出して．その放射能をカウントした．

時間取り込みを測定した．

イノシトールリン酸産生：3H・inositol（1JLCi／

抗体産生反応：一群5匹の8週齢雌CDFlマウ

ml）でプレラベルしたA431細胞を30mM LiCl

スに108のヒツジ赤血球をDayOに静脈注射しを含むinositol−free DMEM中で培養し，所定のた．4日後（Day4）に脾臓を取り出し，脾細胞のサ

時間にChemical及びEGF（400ng／ml）を添加しスペンジョンを調整し，ヒツジ赤血球，モルモッ

た．反応は100／JJの10％HClO。で停止後，HClO。

トの補体存在下で，Jerneのプラークフォーミン

抽出液を75mM HEPESを含む1．53M KOHにグアッセイを行った．inostamycinはDaylからて中和し，遠心分離して，上活をAmprepTMSAX

Day3まで連日腹腔内投与した．

カラム（Amersham）にチャージした．水洗により遅延型過敏反応：遅延型過敏反応はLagrange

遊離の3H−inositolを除去した後，5mlの0．17M

らに報告された方法で行った．一群5匹の8週齢

KHC03でイノシトールリン酸（IP＋IP2＋IP3）を

雌，CDFlマウスを用い，DayOに尾静脈から105溶出させ，その溶出液の放射活性を液体シンチのヒツジ赤血球を注射した．Day4に右hind

レーションカウンターで測定した．

footpadに108のヒトジ赤血球を皮下に注射し，24

Concanavalin A blast細胞の増殖：ナイロン

時間後右footpadの厚さを測定した．inos−

ウールカラム処理したラット脾細胞（1×106細胞／

tamycinはDaylからDay3まで連日腹腔内投mJ）を0．2mgずつ96穴プレートに分注し1％牛与した．

胎児血清を含むRPMI1640中concanavalin A

結

O．5JLg／mlで4時間処理した．次にconcanavalin

果Aを除き，mediumを加えサンプルを添加し，1．inostamycinの単離と生物活性

370C，72時間培養後3H−チミジン取り込みを測定

放線菌St7′ゆtonひCeS Sp．MH816−AF15株の培した．3H−チミジンは培養終了18時間前に添加し養上清に強いイノシトールリン脂質代謝回転阻害た．

活性がみられ，活性本体の単離，精製を行った．

IL−2添加concanavalinAblast細胞の増殖：

lHおよび13C−nmrスペクトルにより平面構造を

上記のナイロンウールカラム通過ラット脾細胞を決定し，さらにナトリウム塩の結晶解析を行って96穴プレート中concanavalinA（5JJg／ml）処理

相対構造を決定した．検索の結果，新規構造物質

し，4時間後concanavalinAを除いた．5％牛胎でありinostamycinと命名した．Fig．1に示すよ児血清を含むRPMI1640培地中にサンプルと

うにinostamycinの構造は既知のポリエーテル

Ⅰし2を加え，370Cで3日間培養した．培養終了18

化合物lysocellinの構造と類似する．ただし，−40−

イノシトールリン脂質代謝回転抑制物質のスクリーニングと免疫抑制作用

OH
Lysocellin
Fig．l Relativestructureofinostamycln

notshown）又，Tablelに示すように5FLg／mlの
inostamycinはA431細胞のイノシトールリン酸の生成を阻害した．この時，Exp．1のようにinos−

示さなかったが，Exp．2のように3H−inositolと同0︵辞︶uO王q三u一

tamycinをEGFと同時に添加すると阻害効果を時に添加すると阻害効果を示した．
Table2に示すようにinostamycinはエー）t／
リッヒがんに対して腫瘍の増殖を有意に抑制した．一方，マウスL1210白血病に対しては6−200
0．4

1．56

6．25

JLg／mouse，daylL9連日腹腔内投与で全く阻害効

25

果を示さなかった（datanotshown）．

Chemical（FLg／ml）

Table3−7にinostamycinのinsitlt，inuiuo免

Fig．21nhibitionofPIturnoverbyinostamycin

疫系における効果を示す．Table3に示すように
lysocellinとは炭素番号36のメチル基の立体配

inostamycinは0．1〜100FLg／mlでconcanavalin

置が逆になっているなどの点で異なっている．

A blast細胞のチミジン取り込みを強く阻害しinostamycinはFig．2に示すようにIC5。0．5JLg／

た．0．39〃g／mJ以上の濃度では，検鏡下で細胞のmlでEGFに誘導されるA431細胞のイノシ死滅を認めたが，0．1JJg／mJでは認められなかっトールリン脂質代謝回転を阻害し，1ysocellinよた．Table4に示すようにinostamycinは0．39

り活性が強かった．より構造の異なるポリエーテ〜6．25JLg／mlの濃度範囲でIL・2存在下のcon−

ルのmonensinには阻害活性はみられなかった．

canavalinA blast細胞のチミジン取り込みを強A431細胞をラベルした正リン酸と共にプレインく抑制したが，検鏡の結果，0．39Jg／mJ以上ではキュベートした後，400ng／mlのEGFを1時間

細胞の死滅を認めた．Table5に示すように同様添加してPIおよびホスフアチジル酸（PA）をクにMLCによるチミジン取り込みも0．39FLg／ml

ロロホルムで抽出し，薄層クロマトグラフィーで以上で強く阻害したが，同じ濃度で毒性も認めら分析したところ，inostamycinは1．6および6．4

れた．玩∴正和においてはTable6に示すように

JLg／mlでPIおよびPAの生成を阻害した．（datainostamycinは抗体産生に対する抑制作用を示さ−41−

Tablel Effectofinostamycinoninositolphosphatesformation
3H−inositolphosphates［dpm］

Treatment

Exp．l

Exp．2

None

234．79±91．87

126．89±15．4＋EGF

478．04±198．96

252．75±33．7

十EGF十Inostamycin（5Jg／ml）

484．44±86．74

168．15±41．2■＊♪＜0．05

Exp．1

3H−Ins EGF＆inostamycinll↓Assay

18hr

Exp．2

3H−Ins＆inostamycln
EGF

13。mi。

Table25min

160min J Assay

AntitumouractivityofinostamyclnOnEhrlichsolidtumour

Dose Solidweight Inhibition
ULg／mouse）（％）

1，164±295

一49Inostamycln

一989
．．6．5
06
352
1

ControI（mg±SD）

587±29653

537±28968372±1696

401±1375

SC（2×106）Tip，qldx9Tumourswereweighedafter15daysofimplantation．

Table3InhibitionofconcanavalinATinducedDNAsynthesisinratspleencellsbyinostamycin

In器諾；ln cpm±SD

諾

p
0
0
0
0
＜ ＜ ＜ ＜

31±10

1
1

0
0
1

0
＜

41±18

0
1

5
2

0
＜

3
1

5
2
6

5
1

6
5
1

49±29

2
1

9
3
0

37±20

4
2

1
0

77±36

34±20

なかった．同様に遅延型過敏反応に対しても効果がなかった（Table7）．

一01 01 01 01 旧 01

0
0
1

0

317±63

2．PIキナーゼ阻害物質によるPIturnoverの障害
OrObolはA431のPIキナーゼをIC5。0．25JLg／−42−

イノントールリン脂質代謝回転抑制物質のスクリーニングと免疫抑制作用
Table4InhibitionofIL−2一inducedDNAsynthesisinratspleencellsbyinostamycin

Inostamycm

cpm±SD（〝g／mJ）

10，457± 388

0．0063

9，913± 431

0．025

8，855± 555

0．1

8，541±1，950

01，156±140

IL−2

p

一

None

諾
0

1

5
8
5

NS0
O5
・
SNOOlOOlOOl

＜朝刊

9
8
2

0．39

255±

1．56

222±

56

6．25

98±

23

41
2
2
1

Table5Inhibitionofmixedlymphocyteculturereactionbyinostamycin

In器㌫ln cpm±SD

諾
0
0
1

0

9，742±1，909

7
8

1
0

8，428±1，740

50

41±

14

56±

3

＜0．001＜0．001

5
2

0

54

73±

0

5
2
6

97±

NS
＜0．001

0

6
5
1

20

0

9
3
0

62±

♪

＜0．001

Effectofinostamycinonantibodyproductioninmice

Inostamycln（JLg／mouse）

0

0
0
1

Table6＜0．001

PFC／spleen（×10￣3）

T／C
（％）
5
7

5
9
1

205±201
987249±23

6
9

5
2
1
3

262±67

8
1

5
2
1
0
0
5

一 NS N S N S N S

000274±42

312±42Toxicmlで阻害する5）．orobolはin sitlEでA431細胞

2，3−dihydroxybenzaldehydeは両者とも10JLg／にEGFと同時に添加したところPI turnoverをmJで有意に約60％阻害した．

IC5。，15JLg／mlで阻害した．一万2，3−dihydroxy−考

benzaldehydeはIC5。，0．45FEg／mlでPIキナーゼ

察を阻害する5）．2，3−dihydroxybenzaldehydeはin放線菌からのPIturnover阻害物質スクリーニ

SitlEPIturnoverをICS。，7FEg／mlで阻害した．

ングを続けた結果，今までに単離した阻害物質とA431細胞におけるイノシトールリン酸の生成全く異なる構造のinostamycinを兄い出した．分を調べたところTable8に示すようにorobolと光分析，ナトリウム塩の結晶解析で決定した構造−43−

Table7

Effectofinostamycinondelayed−typehypersensitivityreactioninmice

Inostamycln Footpadthickness T／C
レg／mJ）（×0．1mm）

（％）
7
0
1

5
9
1

16．7±1．7

0
9

QU
7

14．0±0．4

5
2
1

8
2
0
6
1

5
2
1
3

16．8±0．6
9．6±0．600
5−NSNSNS
0O
1・

0
0
1

0

15．6±1．0

Toxic＜

Table8

EffectofPIkinaseinhibitorsoninositolphDSphatesformation

3H・inositolphosphates

Chemical（10JJg／mJ）

77．21± 8．98

None
＋EGF

1415．37±102．80＋EGF十Orobol

632．46±88．80＊＋EGF＋2，3−Dihydroxybenzaldehyde

580．96±53．08■＊♪＜0．05

3H−inositol＆chemicall仇∴E？F，。n∴雪ay
30min l120mi。

は相対構造であるが，今後，絶対構造を決めるた

認するため，invitYVでのCDP−DGイノシトール

めルビジウム等，大きなイオンとの塩を結晶化さトランスフェラーゼの阻害効果を調べている．

せたいと考えている．

Inostamycinは静止期にあるNIH−3T3細胞の

私達のPIturnoverのアッセイではラベルした

PDGFによるS期誘導を細胞毒性を示さない濃イノシトールを細胞に取り込ませ，その後，EGF度で阻害し，そのS期誘導にPIturnoverが関与

でPIturnoverを刺激し，脂溶性画分に入る放射することを確認した（datanotshown）．又，エー活性を測定する．EGFは主にphospholipaseCを

リッヒがんに対して抗がん効果を示したが，inos−

活性化して，PIP2の分解を促進すると考えられて

tamycinががん細胞のPIturnoverを阻害して抗いる．Tablelのイノシトールリン酸生成阻害のがん活性を示すのか検討したいと考えている．

結果からinostamycinはイノシトールからPIの一方，リンパ球のS期誘導に相当する3つのわ7

生成，つまりCDP−DGイノシトールトランスフェ

uitroの実験（Table3，4，5）で，inostamycinは毒ラーゼを阻害すると考えられる．イノシトールと性を示さない濃度で，殆んど阻害効果を示さな共に添加すればPI，PIP，PIP2のプールを減少さかった．又，わ7めβの抗体産性，遅延型過敏反応

せることになり，EGFで刺激した後のイノシトーにも全く効果がなかった．より特異的な免疫系でルリン酸の生成を低下させる．一方，EGFと共に阻害効果を示すか，さらに調べたいと考えている．

添加したのでは既にPIP2のプールがあるために・昨年度，OrObolと2，3−dihydroxybenzaldehyde阻害効果はみられない．現在，この阻害機構を確のPIキナーゼ阻害活性を兄い出したが，わ757g〝−44−イノシトールリン脂質代謝回転抑制物質のスクリーニングと免疫抑制作用

でPIturnoverおよびイノシトールリン酸生成に対する効果を調べたところ，いずれも阻害効果を示した．特に，2，3−dihydroxybenzaldehydeは阻害効果が強く，毒性も低いと考えられるのでオ乃〃ねβの抗がん，免疫抑制作用を調べたいと考えている．
Referencesl）Fisher，D．B．andMueller，G．C．：Studiesonthe
mechanismbywhichphytohemagglutininrap・
idly stimulates phospholipid metabolism of
humanlymphocytes．Biochem．Biqphys．Acia，
248，434−448（1971）．

2）Maino，V．C．，Hayman，M．J．，andCrumpton，M．
J．：Relationshipbetweenenhancedturnoverof
phosphatidylinositol andlymphocyte activa−tion by mitogens．Biochem．J，146，247−252（1975）．

3）Imoto，M．，Yamashita，T．，Sawa，T．，Kurasawa，
S・，Naganawa，HリTakeuchi，T．，Bao−quan，Z．，−45−

andUmezawa，K．：Inhibitionofcellularphos−
phatidylinositol turnover by psi・teCtOrigenin．
fERSエg地相，230，43−46（1988）．

4）Yamashita，T．，lmoto，M．，Ishhiki，K．，Sawa，T．，
Naganawa，H．，Kurasawa，S．，Bao−quan，Z．，and
Umezawa，K．：Isolationofanewindolealka・
loid，pendolmycin，from Noca7dippsts．J Nbi．
Pmd，51，1184−1187（1988）．
5）Nishioka，H．，Imoto，M．，Sawa，T．，Hamada，
M．，Naganawa，H．，Takeuchi，T．，and Ume−
ZaWa，K．：Screening of phosphatidylinositol
kinaseinhibitorsfrom St7′ゆton砂CeS．J Antibi−
OJfd，42，823−825（1989）．
6）Imoto，M．，Umezawa，K．，Takahashi，Y．，
Naganawa，H．，Iitake，Y．，Nakamura，H．，Ko−
izumi，Y．，Sasaki，Y．，Hamada，M．，Sawa，T．，
and Takeuchi，T．：Isolation and structure
determinationofinostamycln，anOVelinhibitor
Ofphosphatidylinositolturnover．J．Nbt．Pnd，inpress．

免疫修飾に作用する微生物代謝産物の研究A）15−Deoxyspergualinの免疫修飾作用
石 塚 雅 章＊
共同研究者 増田 徹暮，大菌三千代事，飯島正富＊

は

じ

め

実 験 方 法に昨年度まで15−Deoxyspergualin（15−DSG）のIL2およびIL3活性の測定：Intercell（倉紡）を

免疫抑制作用ならびに抗L−1210作用について報用いてマイクロプレートに腹腔浸出細胞

告してきた．免疫抑制作用は投与量に依存してみ（PEC），Intercell中に正常マウスより採取したナられるが，細胞毒性の作用機構についてはまだ明

イロンウール通過脾細胞を15−DSGと共に5日

らかにされていない．15−DSGを3日間連続投与

間培養し，その培養上清中のIL2およびIL3活

後24時間で免疫応答を調べると著明な免疫抑制

性をCTLL2細胞およびIC2細胞を用いて測定作用を示すが1・2），投与後24時間目に各種のリンした．

パ器官におけるT細胞subsetに対する影響を検15−I）SG投与マウスPECのcytostatic活性の討した結果，T細胞数ならびにリンフォカイン産測定：CDFlマウス（10適齢，雌性）に15−DSGを生機能に対する著明な変化は見られなかった3）．

1日間隔で2回腹腔注射して24時間後，PECを

このことは15−DSGの免疫抑制作用は免疫担当

採取し洗源，EL4細胞を各割合に加え24時間培細胞に対する直接の細胞毒性によるものではない

養した後，3H−thymidineで4時間パルスし，そのことを示唆している．一万，15−DSGはL1210に培養細胞への取り込みを指標として活性を測定し著明な抗腫瘍効果を示すとともに，抗腫瘍免疫をた．

誘導することが明らかにされている4）．15−DSGは

培養T細胞あるいはEu細胞培養上清によるT細胞に特異的に作用してそのリンフォカイン

PECの活性化：15−DSG投与マウスから採取し産生を調節することにより免疫調節作用を示すこた脾細胞をナイロンウール処理後，3×106個をとが明らかにされつつある．15LDSGはIL2誘導Intercell中に正常マウスから採取したPECをマ物質であることを明らかにLl・2・4），そのIL2受容イクロプレート中に5日間，CO．Culture後，T細体形成に対する作用も検討してきたが3㌧ T細胞

胞を除きPECにEL4細胞を添加して24時間培の産生する他のリンフォカインについての詳細な

養LEL4細胞への3H−thymidineの取り込みを検討はなされていない．今年度の本研究ではこれ測定してPECのCytOStatic活性を調べた．また，らの点を明らかにすることを目的に実験を行っ

EL4細胞を15−DSGで4時間加温後，1×106細た．

胞／mlを3日間培養し透析，その20％をPECに添加して3日間培養し，洗源後，標的細胞として＊微生物化学研究会化学療法研究所

EL4細胞を加え24時間後前述のようにcyto一
−47−

0
0
0
8
6

︵巴つ雪U＼∈dO︶倉＞膏巾N Jl

0
0
0
4
0
0
0
．2
0
0
0
0

0

1

0．1

10

100

15−DSG（〃g／mJ）

図1Enl1anCementOfIL2Productionby15−DSG

0
0
0
0
2

0
0
0

川

︵巴コl一⊃U＼∈dU︶ゝg＞膏巾の﹂■

0

0．1

1

10

100

15−DSG（〝g／mJ）

図2

EnhancementofIL3activityby15・DSG

後，肺細胞からナイロンウール通過T細胞を得てStatic活性を調べた．

15−DSGで4時間加温した後，Intercellを用いて
実 験 結 果各々を接触しないように培養し，その培養上清中

培養T細胞によるIL2およびIu産生：15−のリンフォカイン活性を調べた．その結果は図1，

DSG投与正常あるいはL1210担癌マウス細胞に2に示すように15−DSGは10−100JLg／mlの濃度よるIL2産生にづいては既に報告した2）．今回はでIL2を，0．ト100〟g／mJでIL3産生を増強しマクロファージ共存下における正常T細胞に対た．この時P丘Cを除いたT細胞のみの培養ではする15−DSGによるIL2およびIL3産生につい増強活性は弱かった．

て検討した．

15−DSG投与マウスより得たT細胞による正常マウスよりPECおよび脾細胞を採取した

pEとの活性化：前年度の本研究によって15−−48−

免疫修飾に作用する微生物代謝産物の研究︵課︶倉0岬益︶Olゝ0
Normal

T

ce‖s

l

lO

lOO

T cells from15−DSG（LLg／mouse）

図3

StimulationofCytostaticActivityinNormalPECCulturedwithTCells
from Mice Given15TDSG

DSG投与マウスより得たPECがEL4細胞に対たT細胞とco−CultureしたPECに著明なしてcytostatic活性を示すことを報告したが3），

CytOStatic活性が見られ，in vit7Vで15rDSGで15−DSGはin uitnで直接PECを活性化しない処理したT細胞でもPECを活性化することが明ことから，15−DSGのこの活性はT細胞によってらかにされた（図4）．

仲介されていると考え，15−DSG投与マウスより

これらの結果から，15−DSGはT細胞のマクロ採取したT細胞とIntercellを用いてco−Culture

ファージ活性化因子の産生を促進すると考えられしたPECについてそのcytostatic活性を検討したので，T細胞としてEL4細胞を用いて液性因た．

子の産生につし■ゝて検討した．EL4細胞を15−DSG

正常マウスより採取したPECをIntercell中ので4時間加温して洗源後，3日間培養し，その培養

15−DSG投与マウスのT細胞と共に培養した後，上清を採取した．正常マウスより採取したPEC

T細胞を除きPECのcytostatic活性を調べた．

をこの上清と共に3日間培養して培養液を除き，その結果は図3に示すように1−10／Jg／マウスを標的細胞としてのEL4細胞を加えて24時間後，投与したマウスより得たT細胞によってPECのCytOStatic活性を検討した．その結果，図5に示す＿活性化が見られた．そこでみそがgJ和で15−DSGに様に15−DSGは0．1rlO／Jg／mlでEL4細胞のよって処理したT細胞を用いてPECの活性化を

PEC活性化因子の産生増強に作用した．

試みた．
正常マウスより得たT細胞を15−DSGで4時

考察

間加温，このT細胞をIntercell中に，また正常マ

T細胞のリンフォカイン産生に対する15−DSG

ウスより得たPECをマイクロプレート中でco−の作用について検討した．その作用については既

Cultureした後，前述のようにPECのcytostaticに混合リンパ球培養や正常あるいは担癌マウスで活性を調べた．その結果，0．1−1／Jg／mJで処理しも明らかにされているが，今回はIntercellを用い−49−

p ＜0 ．
001︵㌔︶倉U旧さl01∂

p ＜0 ．
05

Non−treated O．1

1

10Treated with15−DSG（FLg／ml）

図41nductionofCytostaticActivityinPECCulturedwithTCellsTreatedwith
157DSGinIntercell

0︵訳︶倉U鵬×○︼OlhU

0

0．1

1

10

15−DSGin FLg／ml

図5InductionofMAFLikeActivityinCulturedFluidofEL4Cellswith15・DSG

た実験によりマクロファージ存在下にT細胞に存在下で実験を行った．各々の細胞の接触を避け

よるIL2およびIL3産生に対する15−DSGの作

るためにIntercellを用いて培養し15−DSGの効用を調べた．15−DSGはT細胞に作用してリン采を調べた．IL2産生0．1−10JLg／mlでは効果をフォカイン産生を刺激するが，T細胞は感作され 示さなかったが，10−100FEg／mlではdose−depen・ていることが必要であることからマクロファージ

dentにその産生を増強した．一方，IL3産生に対−50−

免疫修飾に作用する微生物代謝産物の研究

しては0．1rlOOJLg／mlの処理でdose−indepen−

これらの結果は15−DSGのし1210に対する腫dentにその産生を冗進させた．このことは15−瘍免疫形成などの作用がリンフォカインの産生をDSGが細胞のリンフォカイン産生の誘導ならび調節した結果であることが示唆された．一万，に増強に働いていることを示している．

15LDSGの免疫抑制作用はT細胞のIL2受容体

我々は前年度の本研究において15−DSGの腹形成への阻害3）およびB細胞に対する抑制2）によ腔投与がPECの活性化を増強することを報告しるものと思われ，さらに抗腫瘍作用を示す量の投た．しかし15−DSGはinvihvにおいて直接PEC

与では細胞性免疫増強作用による免疫担当細胞へを活性化しなかったので，その作用はリンフォカの抑制効果も考えられるが，これは今後の課題でインを介していると考え，15−DSG投与マウスよある。

り得たT細胞と正常マウスより得たPECを接触
文させずに培養し，PECの活性化が得られるか否かを検討した．その結果，正常マウスのPECは15−DSG投与マウスより得たT細胞によって活性化され，さらに正常マウスより得たT細胞を
15−DSGで処理しても同様の作用を示し，その作
用はリンフォカインによって仲介されていると考えられた．そこで培養に十分なリンフォカインを採取するためEL4細胞を15−DSGで処理した
後，EL4細胞培養上清中のPEC活性化作用を調べた結果，著明な効果を認めた．このことから

献1）Masuda，T．：S．Mizutani，M．Iijima，H．Odai，H．
Suda，M．Ishizuka，T．Takeuchi＆H．Ume−
zawa：Immunosuppressive activity of15−de−oxyspergualinanditseffectonskinallografts
inrat．J Antibiotics40：342−359，1987．
2）石塚雅雄，大菌三千代，水谷滋利：15−デオキシス
パガリンの免疫修飾作用．厚生省新薬開発研究．
青柳班．昭和62年度報告書．5卜55，1988．
3）石塚雅雄，大薗三千代，水谷滋利：15−デオキシスパガリンの免疫修飾作用（ⅠⅠ）厚生省新薬開発
研究．青柳班．昭和63年度報告書．43−48，1989．
4）Ishizuka，M．：T．Masuda，S．Mizutani，M．
Osono，H．Kumagai，T．Takeuchi＆H．Ume−

15−DSGはT細胞のPEC活性化に作用するリン
フォカイン産生を誘導し，間接的にその作用を示すことが明らかにされた．

−51−

zawa：Induction of antitumor resistance tomouseleukemiaL・1210byspergualins．J Anti−
わだcs39：1736−1743，1986．

免疫修飾に作用する微生物代謝産物の研究
B）免疫調節物質の探索
石 塚 雅 章＊
共同研究者 飯島正富＊，山崎勝久書，増田 徹＊

微生物代謝産物中に自己免疫疾患に有用な免疫担当細胞に特異的に作用する免疫調節物質を探索

実することを目的に，混合リンパ球培養ならびにリ

験

結

果

NocardaminおよびDeferoxamineはMLCR

ンパ芽球の培養に対してスクリーニングを行に添加したとき，その反応を著明に抑制した．

ない，抗生物質Nocardaminl）およびDeferox−

ICS。はNocardiaminで0．ト0．4JLg／ml，Deferox−amine2）にその作用を見出した．

amineでは＜0．1JLg／mlであった．IL2によるT
リンパ芽球の増殖に対するIC5。は，Nocardamin

実 験 方 法が20−50JLg／ml，Deferoxamineが1．56−6．25JLg／

ナイロンウール通過F344ラット脾細胞を反応mJであった（表1）．

細胞，マイトマイシンC処理WKYラット膵細胞

一方，L1210に対する細胞毒性はNocardaminを刺激細胞として混合リンパ球培養（MLCR）をが＞50JLg／ml，Deferoxamineでは＞200JLg／ml

行ない，その反応に対する影響を検討した．またで細胞毒性を示さなかった．

ナイロンウール通過F344ラット脾細胞をConA

以上の結果から，これらの物質は免疫担当細胞で4時間加温，洗源後，Tリンパ芽球としてIL2に特異的な抑制を示すと思われたのでマウスのを添加あるいは無添加で培養，その反応に対するDTH反応に対する効果を検討した．50mg／kgを効果を検討した．対照として，L1210細胞培養に対羊赤血球で免疫後より4日間投与したが，有為なする効果も調べた．

抑制または増強を示さなかった．また，ラットをCDF．マウスの羊赤血球に対する遅延型過敏症（DTH），ならびにラット皮膚移植に対する効果に用いた皮膚移植に対しても50mg／kgでは効果は見られなかった．

ついても検討した3）．
考NocardaminおよびDeferoxamineは放線菌

免疫応答を特異的に抑制るる物質を微生物代謝

培養濾液より常法に従って化学療法研究所において調製した．

察

産物中に探索し，鉄キレート物質，Nocardamin
およびDeferoxamineを見出した．これらの物質
はMLCRおよびTリンパ芽球のIL2による増殖を低濃度で抑制したが，L1210の培養細胞に対しては 50〃g／m耳でも抑制を示さず，免疫応答■微生物化学研究会化学療法研究所

系あるいは免疫担当細胞に特異的な抑制を示すと−53−

表1Ⅰnl1ibitionofImmuneResponseinvitYVbyNocardaminandDeferoxamine

Testsystem

NocardaminDeferoxamine

IC5。（〟g／mJ）
MLCR O．4
IL2／Tblasts
LI210

0．1
25．0

2．5

＞50．0

＞200

思われた．そこでマウスあるいはラットを用いてDTHまたは皮膚移植に応用したが，50mg／kgの投与では効果は見られなかった．しかし，今回用
いた投与量は比較的少量なので，この実験でこれ
らの物質の乃〝ゐβにおける効果を評価することはできない．今後さらに大量を用いて，さらに効果を追求する価値があると思われる．

文

献1）Stoll，A．gfαム：Z月7血ム払励Cわめよ，14：225，
1951．

2）Bickel，H．：R．Bosshart，E．Gaumann，P．Reus−
Ser，E．Vischer，W．Voser，A．WettesteinundH．
Z去hner：Uber dieisolierung und charakter−isierung der ferrioxamine A−F，neuer
WuChsstoffedersideramin・gruppe．Helv．Chim．
Acね，43：2118，1960．

3）石塚雅章：スパガリンの免疫修飾作用．厚生省新薬開発研究．青柳班．昭和61年度報告書．37−42．
1987．

ー54−

自己免疫性脳脊髄炎，神経炎の治療薬開発
田 平

式事

研究協力者 田平順子書，挑 大林＊，西澤正豊＊

腹腔内に毎日注射し，PBSコントロールと比較し
日

た．

的

これまで実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）

2）実験2（Actinobolin・［2］，Bactobolin）

を用いて，自己免疫性脳脊髄炎，神経炎の治療薬

感作後Actinobolin120mg／kg（n＝4）をday

開発のスクリーニングを行ってきた．その中で，1−17に腹腔内注射して，Bactobolinlmg／kg（n＝パクトボリンがEAEの発症を抑制することを兄4），PBSコントロー）t／（n＝4）と比較した．

い出し報告した．しかし，パクトボリンは毒性が

3）実験3（Bactobolamine−［1］）強く，効果域が狭いので，誘導体の開発が必要で感作後day1−14にBactobolamine40mg／kg

あることを指摘した．本年度は明治製菓，微化研（n＝4）をPBSに溶解し腹腔内に連日注射し，で開発されたいくつかの誘導体について検討する

PBSコントローJt／（n＝4）と比較した．

ことを目的とする．また，パクトボリンがサブレッ

4）実験4（Bactobolamine・［2］）感作後daylT17にBactobolamine60mg／kg

サーT細胞を誘導するか否かについて検討する．
1．実験的アレルギー性脳脊髄炎を用いたパクト
ポリン誘導体のスクリーニングを連日腹腔内に注射した．
5）実験5（Bactobolamine−［4］）Bactobolin，Actinobolin，Bactobolamine，N−Ac−
Bactobolamine

実験3においてBactobolamine−［2］のグルー
プはday2に3匹，day5に1匹死亡した．よっ

LewiSラット（チャー）レズリバー，8〜11週，雌）て本実験ではGPBP感作したLewisラットにをモルモットミエリン塩基性蛋白（GPBP）50FLg

Lotは異なるがBactobolamine−［4］を用いて毒性とフロインド完全アジュバント（結核死菌H37Raを調べた．即ちBactobolamine一［4］30mg／kg（n＝200ノJg）で感作し（両後肢足舵）微化研から提供を

4），40mg／kg（n＝4），50mg／kg（n＝4），60mg／

受けた以下の新薬についてその効果を検討した．

kg（n＝1）をday1−8に腹腔内投与した．コント

EAEの評価は0−5の6段階によった（0，正常：1，

ロールにはPBS（n＝4）を用いた．

尾の低緊張；2，後肢脱力；3，完全対麻痔；4，四6）実験6（Bactobolamine−［2］，［3］，［4］）肢麻痔；5，死亡）．

感作後のLewisラットに各々Lotの異なる
Bactobolamineを用いてその毒性を比較した．

1）実験1（Actinobolin−［1］）感作後day1−17にActinobolin120mg／kgをBactobolamine−［2］50mg／kg（n＝4），Bactobol−
amine−［3］40mg／kg（n＝4），Bactobolamine一［4］■国立精神・神経センター神経研究所

40mg／kg（n＝4）をday1−8に腹腔内投与した．対−55−

照にはPBSコントロール（n＝4）を用いた．

摘出し，3−5×108個の全脾細胞（SPC）をnaiver−

7）実験7（Bactobolamine−［2］）ecipientratに移入した．その翌日recipientを同感作しないLewisラットにBactobolamine−

様にGPBP／CFAで感作し，経過を観察した．対［2］40mg／kg，50mg／kg，60mg／kg（各n＝4）を照はPBSのみ注射したラットの脾細胞を用い腹腔内投与し，PBSコントロール（n＝4）と比較した．また牌細胞をadherent cellとnon−adherentてその毒性を調べた．

cell，Tcellとnon−Tcellに分けて同様の実験を

8）実験8（N−Ac−Bactobolamine）

行なった．

Lewisラットを感作し，N−Ac・Bactobolamine

結40mg／kg（n＝4）をtween202r3滴に混和し，5％

果

アラビアゴムに懸濁し，感作後1日目より14日間

1．Bactobolin誘導体の評価

腹腔内投与LPBSコントローJL／（n＝4）と比較し実験1．Actinobolin120mg／kg（n＝4）のday

た．

1−17の連日腹腔内投与で，PBSコントロール

2．パクトポリンの作用機序の検討：サブレッ（n＝4）に比し明らかな発症遅延を認めた．この結サー誘導能の検討

果は昨年度報告したが，もう一度図1に示す．

雌Lewisラット（8−12過）を同様にGPBPと実験2．Actinobolin120mg／kg（n＝4）のday

CFAで後肢足蹴に感作し（dayO），PBSに潜解し1−17連日腹腔内投与で，再びPBS対照（n＝4）にたBactobolin0．5−1．0mg／kg／dayを腹腔内に毎比し明らかな発症遅延を認めた（図2）．今回パク

日注射し（7−11日間），11または12日目に脾臓をトボリン1mg／kg（n＝4）は更に発症が遅延した

4
3．5

◆

台2・5
誌

Actinobolin（120m g ／kg ，d．ト 17）2ぺ〉−P BS

品1．5
1

0．5
0

1

3

5

7

9

11

13

15

17

Day P．l．

図1ラットEAEに対するActinobolinの効果（daylA17注射）

4◆

A c t in o b o H n n ＝ 4（1 2 0 m g ／k g ， d ． ト 1 7 ）32−g﹂望むS

一一◇− B a c t o b o lin n ＝ 4（1 m g ／k g ， d ． 1 −1 7 ）1ノ／フ召ミ＼

1ト PB S

0

3

5

7

9

11

13

15

17

19

Day P⊥

図2

ラットEAEに対するActinobolin，Bactobolinの効果（daylT17注射）
−56−

n ＝4

自己免疫性脳脊髄炎，神経炎の治療薬開発

2

3

4

5

6

7

8

9

ゝ鳶

ノノ

︒／〟〃

︑gLぎ拐
1

◆

B actoboram ine n ＝4（
40 m g／kg，d．1−14）

一◇−PB S

n＝4101112131415・

Day P．L

図3

ラットEAEに対するBactobolamine−［1］の効果（dayト14注射）＋Bactobolamine n＝4（30mg／kg，kg，d．1−8）
一〇・・BactoboFamine n＝4（40mg／kg，kg，d．ト8）−Bactobolamine n＝4（50mg／kg，kg，d．1−8）−⊂トBactobolamine n＝1（60mg／kg，kg．d．ト8）
1▲−PBS

1

3

5

7

9

13

11

n＝4

15

Day P．l．

図4

ラットEAEに対するBactobolamine−［4］の効果（daylL8注射）が，全例対照と同じ程度のEAEを発症した．

4），40mg／kg（n＝4），50mg／kg（n＝4），60mg／

実験3．Bactobolamine−［1］（数字はlot番号をkg（n＝1）をdaylr8に連日腹腔内投与し，PBS示す）40mg／kg（n＝4）daylr14連日腹腔内投与（n＝4）と比較した．50mg／kgでごく軽度の抑制

は，ごく軽度のEAE抑制傾向を示したが，PBS傾向を認めたが，doseresponseを認めず，有意な対照（n＝4）に比し有意といえる程ではなかった

差とは言えない（図4）．Bactobolamine・［4］は50（図3）．

mg／kg，60mg／kgでも死亡しなかった．

実験4．Bactobolamine−［2］を60mg／kg（n＝4）

実験6．Bactobolamine−［2］50mg／kgを毎日腹に増量し連日腹腔内投与した所，day2に3匹，腔内に注射した所，day2に1匹，day3に1匹，day5に1匹，計4匹全例が死亡した．この時PBS

day5に1匹，day7に1匹の計4匹全例が死亡しコントロールおよび他の薬剤投与ラットには死亡た．Bactobolamine−［3］40mg／kg（n＝2），Bacto−は見られなかった．

bolamine−［4］40mg／kg（n＝2）のday8−14の腹腔実験5．Bactobolamine一［4］を30mg／kg（n＝

内注射は全くEAEを抑制しなかった（図5）．

−57−

4

◆

2

倉﹂￠＞拐

3

B actobolam lne−
3 n ＝2（40 m g／kg，d．8 −14）−くト Bactobolam lne−
4 n ＝2（40 m g／kg ．d．8 −
14 ）

1

一
■−PB S

n ＝2

0

1

3

5

7

9

11

13

15

17

Day P．t．

図5 ラットEAE・に対するBactobolamine・［3］，−［4］の効果（day8−14注射）4

一●− N −A c TB a cto b o ram in e n ＝4
（4 0 m g ／k g ，d ．ト 1 4 ）

n ＝4

2

書 聖 畠

3

→◇− P B S

1
0

1

3

5

7

9

11

13

15

17

Day P．l．

図6

ラットEAEに対するN−Ac−Bactobolamineの効果（day1−14注射）実験7．実験4と6でBactobolamine−［2］に毒考性が見られたので，感作しないラットを用いて，

察

40mg／kg（n＝1），50mg／kg（n＝1），60mg／kg

Bactobolinの誘導体としてActinobolin，Bac−（n＝1）を注射した所，それぞれday7，day9，day

tobolamine，N−Ac−Bactobolamineを検討した結8に死亡した．このことから明らかなlot差がある

果，120mg／kg投与でActinobolinに軽度のEAEことが明らかになった．

抑制効果を認めた．Bactobolamineは毒性にlot

実験8．N−Acetyl Bactobolamine

40mg／kg

差があり，40mg／kg以上で死亡が見られるもの（n＝4）をday1−14に連日腹腔内注射したが，であった．毒性を示さないものは40mg／kgで無PBSコントロールとの問に全く差を認めなかっ効であった．N−Ac−Bactobolamineも40mg／kg

た（図6）．

で無効であった．後2着についてはhighdoseと2．Bactobolinの作用機序の検討

した時の効果については不明であり，更に検討が表lに示す如く，Bactobolin投与ラット脾細胞必要である．Bactobolinの毒性は，これらの誘導の移入を受けたrecipientは，GPBP／CFA感作に体によって著しく改善されたが，効果も低下した．

よるEAEが初期の実験では遅延する傾向が見らBactobolinは以前の実験で，day15までの観察でれた．しかし，後期の実験では抑制傾向が見られ完全にEAEを抑えたが，今回やや早く発症したず，adherentcellとnon・adherentcell，あるいは

為観察を続けた所，重症度は変わらないEAEがT cellとnon−T cellに分けて検討したが対照と遅れて発症することが分かった．初期のBacto・の間に差を認められなかったので，明らかなサブbolinは1mg／kgで死亡する例が見られたが，最レッサー細胞誘導は認められないと結論した．

近では1mg／kgで死亡することはなく，効果もや−58−

自己免疫性脳脊髄炎，神経炎の治療薬開発
表1Bactobolinのサブレツサー誘導能の検討
Experiment

20

in Donor Rats

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0，5mg／kgd．1−8

0

0

3

1

0

0

2

3

1

0

2

3

2

0

3

0

1

0

1

1

3

1

1

1

0

0

0

0

0

0

0

0

2

0

2

1

0

0

2

1

2

1

2

1

2

1

1

1

2

2

1

0

1

0

1

0

1

1

1

0

1

0

1

2

0

0

0

1

0

0

1

3

0

0

2

1

3

0

0

3

1

3

4

0

0

3

3

1

0

0

1

0

0

0

0

0

0

0

O

ハ

3

0

O

0

2

0

O

0

0

〃

0

0

O

0

0

0

O

0

0

1

O

0

0

0

0

0

O

0

0

0

3
0

2

0

0
2

0

3
3

4

1

3

3

0

1

1

0

3

0

0

0

0

2

4

3

3

0

1

0

3

3

1

3

4

1

0

4

3

1

3

0

1

3

3

4

3

3

4

4

0

4

1

0

0

3

0

3

0

0．5mg／kgd．1−8

0．5mg／kgd∴ト8〝

0．5mg／kgd．1−8

1．0mg／kgd．1−8
〝

0
4
4

1．0mg／kgd．1−8

3

0

4

1

4

3

0

1
0

1

0

0

3

4

1

1

3

2

2

3
0

3

3

0

3

2

0

0
0

4

0．5mg／kgd．1−7

3

3

1

0

0

2

4

0

3

3

0

2

3

3

1
0

〃

3
3

2

0

0

2

3
2

4

0

0

1

3

3

0

1

2

0

1・3

0

2

4

0
0

0．75mg／kgd．1−8
0

1

3

1

1

4

3

2

1

0

3

2

2

4

3

2

0

3

1

1

2

1

3

3

0

3

3

2

0

0

0

3

1

3

3

1

2

1

2

3

1

1

3

2

3

2

1

0

1

1

0

0

1

1

1

1

3

1

1

1

3

3

1

3

1

2

2

3

1

3

2

3

3

0

0

3

0

2

2

0

0

1

1

0
3

0

3

1

1

1

3

1

1

1

4

4

1

2

0

0

3

0

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

Bact−24
PBS−14U

Bact−23

2

1

1

1

1

0

0

3

2

1

3

4

1

0

0

0

O

O

O

O

Non−T PBS−15

0

0

0

Bact−22Bact−25

10111213141516171819
00O

Non−adherent Bact−21

2×108

0

0

PBS−13

2×108

0

O

PBS・12Bact−20

3×108

T
12

0

11

O

10

0

Bact−19O

Bact−180Bact−16

Adherent Bact−17O

3−4×1070Bact−15OSPC

0Bact・14

O

9

5×108

0

PBS−11
8O

PBS−100Bact−13O

SPC

0Bact−12O

3r4×108

PBS−9
7

0

Bact．11O

Bact−10SPC

0

2．5−4×108

O

PBS−8
6

0

PBS−7

O

Bact−90

SPC

O

Bact−8

0

4×108

PBS−6
5

O

Bact．7

0

Bacト6

SPC

O

4−5×108

0

PBS−5
4

O

PBS−4

1

Bact−4Bact−5

O

4×108
SPC

0

PBS−3

O

SPC

0

Bact−3

O

3

5×108

0

PBS−2
2

9

O

PBS−1

0

Bact−2O

BactTI

SPC

8
0

5×108

Treatment
7
O

1

Transferred No．

Bactobolin

Dayafterimmunization

No．Cells Animal

0．63mg／kgd．1−10

0．75mg／kgd．1−11〃

0．63mg／kgd．1−10
0．75mg／kgd．1−11
0．75mg／kgd．1−11
0．75mg／kgd．ト11

0

3

1

GPBP／CFAで感作したdonorラットにBactobolinまたはPBSを上記投与量，投与期間注射し，dayllまたは12に脾細胞（SPC）をrecipientに移入し，翌日recipintをGPBP／BFAで感作し，Clinicalscoreの経過を見た．
一部はSPCをadherentとnon−adherent，Tとnon−Tに分けて移入した．

ー59−

や低下しているように見受けられ，lot差があるとかった．昨年，一昨年の本報告で，感作動物のリ思われる．

ンパ節細胞のBPに対する増殖反応が低いこと，

今回BactobolinのCl基を残してアミノ基を起炎性T細胞クローンのBPに対する反応およつけたBactobolamineで毒性の低下が見られたび脾細胞のクレチンに対する反応を濃度依存的に事により，Cl基が毒性の本態でないことが分かっ低下させること，玩J正和におけるIL−2に対するた．またCl基をはずしたActinobolinに軽度の効

反応を抑えること，しかしIL−2産生は抑えないこ果が見られたので，Cl基が作用の本態でないことと，脾細胞のT細胞分画に大きな変化をきたさなも分かった．これらのことをヒントに今後更に誘いことを示した．またin uii7Vでcytotoxicに作導体の検討が行われることが期待される．

用し，活性化されたリンパ球がより強く障害されBactobolinの作用機序について今回サブレツることを示した．従ってBactobolinは抗原非特サー誘導能をみたが，Bactobolin投与ラット脾細

異的な細胞障害性機序によりエフェクターT細胞の移入により，初期の実験でEAEの抑制傾向胞の誘導を抑え，その結果EAEを抑えている可を認めたが，サブレツサーを証明するに到らな能性が最も高い．

−60−

ExperimentalAutoimmuneMyastheniaGravis（EAMG）ラットの治療実験
佐 藤

猛＊

共同研究者 石垣泰則書，宋 東林＊，服部信孝＊，林 恭三＊＊

4）抗AChR抗体価測定
はじめ

抗AChR抗体価の測定は，従来通りラット筋に

実験的自己免疫性重症筋無力症（EAMG）ラッ

AChRを用いた二抗体法で行った．

トを用いて，新しい免疫抑制剤のスクリーニングを行った．昨年度までは，抗腫瘍抗生物質である

結15−Deoxyspergualin，Bactobolin，Actinobolinな

1）15−Deoxyspergualin（15−DSP）

果

らびにプロテアーゼ阻害剤であるArphamenine

15−DSPを初回免疫直後から投与すると，投与

Aの重症筋無力症に対する治療効果を検討した量と相関して抗体産生を抑制することが可能でが，今年度はこれらにBactobolamineを加え，今あった．すなわち，EAMGラットの場合，2．5mg／まで行った治療実験について総括的に考察してみkg／day以上の15−DSPを投与することにより完た．

全に抗体産生を抑制することができた（図2）．しかし，5．0mg／kg／dayの投与量では投与開始24
方日以内に全ての実験動物が死亡した．

法1）EAnIGの作成

15−DSPの毒性が最も少なく，かつ免疫抑制作

従来通り，7L9週齢の雌LewiSラットを用い，用が最も有効に発揮できる薬剤の投与方法を兄いカリフォルニア・シビレエイの電気器官から精製だすために，15−DSPの間欠的投与法を試みた．連

された250pmol・tOXin binding siteのアセチル日投与では抗体産生は完全に抑制することができコリン受容体（AChR）蛋白を免疫した．．必要に応たが毒性も強く現われた5．0mg／kg／dayのじて，初回免疫4週後に追加免疫を行った．

15−DSPを，週1回ないし2回投与した．この投与

2）薬剤の投与

法では初回免疫後4週まで抗体価は低値を示した

薬剤はPBSに溶解し，ラット腹腔内に注射した．投与スケジュールは図1の様に行った．

が，追加免疫を行うと著しい抗体価の上昇を認め，効果は不十分であった（図3）．

3）EAnIGの評価

初回免疫後10日目から2．5mg／kg／dayの15−

連日臨床症状の観察と体重測定を行い，2週に1回尾静脈より採血した．

DSPで治療を始めた群では，免疫後4週目から抗体価が上昇し始めた．そして，追加免疫により著しいブースター効果を認め（図4），追加免疫をー順天堂大学脳神経内科
H岐阜薬科大学薬剤学

行ったEAMGラット5匹中3匹が死亡した．すなわち，一度免疫を獲得してしまうと，それを抑−61−

lBooster

lB∞Ster
0

2

4

6

0
2
Ⅱ．Actinobolin

8weeksl．157DeoxysperguaLjn

4

6

8weeks

dayl

dayl

m且／kg

kg

Ⅳ．Arphan裾nineA
dayl
100mg／kg

V．Bactobolaminedayl

図1薬剤の投与スケジュール

制することはかなり困難であった．

の投与量との間に相関関係は兄いだせなかった

2）Bactobolin（図6）．15−DSPと同様に，一度免疫を得た場合のO．5mg／kg／dayのBactobolinを免疫直後から治療は困難であった．

投与したところ，抗体価は初回免疫後4週後より

4）ArphamenineA
lOOmg／kg／dayのArphamenine Aを免疫直上昇し始め，追加免疫後著明に上昇した．5匹中3匹のラットが8週の実験期間中生存し得た．

後から投与したが，免疫2週後から抗AChR抗体

3）Actinobolin

価が上昇するラットがみられ，追加免疫後著明な15ならびに30mg／kg／dayのActinobolinを

抗体産生を示したものもいた．筋無力症状のため，初回免疫直後から投与した群では，薬剤の投与量

発育も不良であった．

に相関して抗AChR抗体価の上昇は抑制された

5）Bactobolamine（図5）．いずれの群のラットも8週の実験期間中順調に生育した．

25mg／kg／dayのBactobolamineを免疫直後から投与を開始したラットにおいて，抗体価の上一方，免疫後10日後より治療を開始したラットには，30，60，120mg／kg／dayの薬剤を授与した3

昇が観察されたものがいた．特に2匹のラットの抗体価の上昇は著しかった（図7）．

群を設定した．抗AChR抗体価は各群とも各個体

一方，免疫後10日目より治療を開始したラット

毎にばらつきがあり，抗体産生の抑制程度と薬剤において，5，25，50mg／kg／dayの治療群を設定−62−

ExperimentalAutoimmuneMyastheniaGraviS（EAMG）ラットの治療実験した．いずれの投与量でも，個体差はあるものの十分な抗体産生抑制は得られず，また抗体価と薬考

剤投与量との問に相関関係は認められなかった察

これまでに，抗腫瘍抗生物質である15−DSP，（図8）．

Bactobolin，Actinobolin，Bactobolamineならびにプロテアーゼ阻害剤であるArphamenineAの15−DSP（2．5mg／kg／day）
15・DSP（5，0mg／kg／day）

AChR︵一∈＼一eu己︶ qくαこじく

l

2W

2W

4W

6W

8W

6W

8W

4W

2W

4W

6W

2

8W

図215−DSPは免疫直後から投与すると，投与量と相関して抗体産生を抑制する（文献2より引用）

2

図3

4

6

8weeks

図4 2．5mg／kg／dayの15−DSPを，免疫後10日日から投与すると，追加免疫後著しく抗体価が増
加した

4

6

8weeks5．0mg／kg／dayの15−DSPを週1回ないし2回間欠的に投与すると追加免疫後抗体価の上昇が観察された−63−

EAMGに対する治療実験を行った．

抑制することが可能であり，またそれ以下の1．2，

15−DSPのEAMGの発症抑制効果は，実験的0．6mg／kg／dayの投与量でも，その投与量に応じアレルギー性脳脊髄炎（EAE）と同様に効果的で，て抗体産生抑制効果を示した2）．一方，急性期から薬剤の投与量に依存した1）．2．5mg／kg／day以上

慢性期に移行すると思われる免疫後10日日頃かの15−DSPを投与すると，ほぼ完全に抗体産生をら治療を開始した場合，15−DSPの免疫抑制効果
は十分に発揮されなかった．免疫後，治療群ラットの抗体価は非治療群に比してわずかに産生が抑制されているかに見えるが，過半数のラットは発症し，抗体価が上昇，死亡したものもみられた．
すなわち，15−DSPは免疫担当細胞が抗原を認識し抗体を産生しようというところに作用するので，免疫の獲得が起こる時点で投与を開始されれ︵︑∈＼一〇∈d︶q＜∝エU＜

ば強力にEAMGラットの抗体価が上昇するのを抑制するが，一旦免疫を獲得してしまったあとに投与を開始しても十分な抗体産生抑制作用は得られなかった．5．0mg／kg／dayの15−DSPを免疫直後から投与すると抗体産生は完全に抑制できたが，この投与量ではEAMGラットは3過ほどで死亡してしまった．そこで，その免疫抑制効果は保持したままでかつ安全に15−DSPを投与することを期待して，間欠投与法を試みた．しかし期待に反し，十分な免疫抑制効果は得られず，MGが246発症して死亡したラットも存在した．

8weeksBactobolinはEAEに対しては15−DSPより

上

図5 Actinobolinを免疫直後より投与すると，薬剤の投与量と相関して抗体価の上昇を抑制する

daylO

Actinobolin（60mg／kg／day）∵

目 ▼Actinoboljn（128mgハg／day）

′

0

名望Uく

一 皿 ﹁

且

2

0

0

daylO

daylO

Act血bo‖∩（38mg／kg／day）
叩0レm／
60「

も強力にその発症を抑制すると言われている3）．

2

4

6

8week502

46

帥eeks O

2

4

6

8weeks

図6 Actinobolinを免疫後10日目から投与すると，抗体価は個体毎にばらつきがあり，薬剤の効果は十分とい
えなかった
−64−

ExperimentalAutoimmuneMyastheniaGraviS（EAMG）ラットの治療実験

そこで，EAEの発症を抑制する0．5mg／kg／day

較して弱いように思われた．
ActinobolinのBactobolinをEAMGに投与してみた．しかはBactobolinの類縁体で毒性し，この投与量では追加免疫後の抗体価の上昇はを著しく抑えた物質であるが，EAEの実験では抑えきれない上に，筋無力症状に全身状態の悪化

Bactobolinほどの効果を得ることが出来なかっをともない死亡する動物がみられた．Bactobolinた4−5）．しかしEAMGに対しては，薬剤を免疫直後のEAMG発症抑制効果は，15−DSPのそれと比から投与すれば有効に抗体産生を抑制することができ，抗体産生抑制能は薬剤の投与量に相関してdaylいた．そこで，免疫獲得後の治療効果を検定するために，免疫後10日目からの投与群を設定したと
ころ，動物個体により抗体価の上昇程度にばらつきはあるが，十分な抗体産生抑制効果があるとはいえず，薬剤の投与量と抗体上昇の抑制程度との間には相関関係は兄いだせなかった．
免疫異常の発病機序にプロテアーゼなどの酵素が関与することが注目されている6）．Arphame−nineAはアミノペプチダーゼBの阻害物質で，これをEAMGラットに投与し，その薬剤のEAMG発症に対する影響を調べた．しかし，100mg／kg／
dayのArphamenine Aでは全く抗体産生阻止効
果はなかった．EAMGラットのようなinviuoの

0

図7

2

4

6

8weeks

25mg／kg／dayのBactobolamineを免疫直後から投与したが，著しい抗体価の上昇を認めた
ラットが存在した

pmo冊I daYlO

02

実験系ではArphamenineAの微妙な免疫系への関与は評価することが難しいと思われた．
BactobolamineはActinobolinの誘導体で，

pmDl／mJdaylO

4

6

8weeb O

2

4

6

8weeks O Z

46

8weeks

図8 Bactobolamineを免疫後10日目から投与すると，効果は個体毎にばらつきがあり，薬剤の効果は十分とい
えなかった
−65−

540：55ト553，1988．
2）Ishigaki，Y．，Sato，T．，Song，T．−L．，Hayashi，
K．：Newimmunosuppressive therapy with

Actinobolinと同様に毒性が非常に低いことで注目されている．EAEの治療実験では，まだ一定の評価を得ていないが，発症をみなかった個体が存

15rdeoxyspergualin of experimental autoT
immune myasthenia gravisin rats．Neuro−
immunological diseases，Recent advancesin
pathogenesis and treatment．ed．byIgata，A．，
UniversityofTokyopress，403−406，1988．

在した7）．25mg／kg／dayのBactobolamineは免疫直後から投与しても，十分に抗体価の上昇を抑制することができず，免疫後10日目から5，25，
50mg／kg／dayいずれの投与量のBactobol−

amineも有効に抗体産生の抑制をすることができなかった．
15−DSPおよびActinobolinはEAMGの発症を有効に阻止しうると思われた．しかし残念ながら，一旦免疫を獲得し抗体産生能を持ったEAMG
ラットに対して，それを有効に治療し得る薬剤は

101．

現在のところ開発されていない．今後の研究で，さらに安全かつ強力な免疫抑制剤が開発されることを期待したい．

文3）田平 武：自己免疫性能脊髄炎の治療薬開発研
究，（2）ラット急性EAEモデルを用いた免疫抑制物質の評価：bactobolinとarphamenine Aの
EAE抑制効果について．厚生省新薬開発研究費，青柳班，昭和61年度報告書51−53．
4）田平 武：自己免疫性能脊髄炎，神経炎の治療薬
開発，厚生省新薬開発研究費，青柳班，昭和63年度報告書，49−55．
5）生田房弘：各種微生物二次代謝産物による病変の修飾に関する神経病理学的研究，ActinobolinとDiprotinAの急性EAEに対する影響．厚生省
新薬開発研究費，青柳班，昭和63年度報告書，97−

献1）Ishigaki，Y．，Sato，T．，Song，T．−L．，Hayashi，K．：Treatment of experimental allergic
myasthenia gravis with a newimmuno−
Suppreant：15−Deoxyspergualin．Adu．NeuYVl

6）永津俊治：膠原病の基礎的解明とその治療への応用（ⅠⅤ）−エリテマトーデスモデルマウス（BXSB雄マウス，MKL／砂rマウス）のペプチ
ダーゼの変化一．厚生省新薬開発研究費，青柳班，
昭和63年度報告書，29−35．
7）永井克孝：実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）
に関する二次代謝産物治療剤の検索．厚生省新薬開発研究費，青柳班，昭和63年度報告書，103−

−66−

106．

15−Deoxyspergualinの免疫抑制活性発現の機序に
関する研究
徳 永

徹＊

協力研究者 西村恵子＊

かにすることを目的とした．そのため分化誘導のはじ

め

機序が明らかにされている白血病細胞のマクロに昨年度までの研究で我々は，15−Deoxysper−

ファージへの分化4，5），神経細胞の分化6）をモデル

gualin（DSG）およびその誘導体15，Deoxymeth−

実験系として用いた．また成熟マクロファージ活

ylspergualin（MeDSG）がマウスの細胞障害性T性化（分化の一側面と考える）に伴う表層抗原の変リンパ球（cytotoxic Tlymphocyte：CTL）の誘化についても検討した．

導および未熟骨髄細胞の分化・増殖を抑制するこ

材料 と 方法と，in vihvでのMeDSGによるCTL誘導抑制

はインターフェロ ンγ（IFN一γ）を加えることで実験動物回復することを明らかにした1・2・3）．ところが，Me−

日本エスエルシー株式会社より購入した7〜9

DSGはCTL誘導が抑制される培養系において週齢のDBA／2雌マウスを用いた．

も，IFN−γを初めインターロイキン2およびイン株化細胞

ターロイキン6等の産生そのものは抑制しないな

ヒトおよびマウス骨髄性白血病細胞（HL−60おど矛盾する点が多く，その作用機序は未だ謎に包よびMl），マウスマクロファージ様株化細胞

まれている．さらに，DSGおよびMeDSGの免疫（P388Dl）は，国立予防衛生研究所の赤川博士よ抑制活性は，作用時間および作用容量に強く依存り供与された．ラットフェオクロモサイトーマ

しており，生体内あるいは培養系からこれら薬剤（PC12）は三菱化成生命研の水落博士より供与さを除くとその抑制効果が失われることから，れた．

Reversibleな作用であると考えられる．我々は，マウス腹腔マクロファージ

CTL誘導の系で，CTL前駆細胞から成熟CTL

DBA／2マウス腹腔内に10％プロテオースペプ

への分化の過程がDSGおよびMeDSGに最も感トン1．5mgを投与し，4日後に腹腔洗浄によりマ受性が高いことを玩目元加およびあ乙滋和の実験

クロファージを回収した．CO2インキュベーター

で明らかにLl・2），本薬剤のターゲットが分化過程

中に2時間静置し，非付着細胞を除いた後，マクにある細胞である可能性を示唆してきた．

ロファージ単層培養として以後の実験に供した．
免疫抑制剤

そこで，本年度はDSGおよびMeDSGの免疫

MeDSGは生理食塩水に10mg／mlの濃度に抑制活性が分化誘導抑制によるものか否かを明ら

溶解後，−800Cで保存し，使用直前に解凍，＊国立予防衛生研究所

RPMI1640培地（日水製薬）にて希釈し用いた．
−67−

リンフォカインおよび試薬

PC12細胞のNGFによる突起伸展の検出

リコンビナン斗マウスインターフェロンγ

PC12細胞（2×104／ml）にNGF（100ng／ml）を（IFN−γ：東レより供与），LPS（E．coli 由来，

添加し，3日間培養後，位相差顕微鏡下で神経突起

SerOtypeO55：B5；Sigma），PMA（phorbol12−

伸展細胞の数をカウントした．細胞体の2倍以上

myristate13−aCetate：Sigma），7S−NGF（nerveの長さの突起を有する細胞を陽性細胞とした．
マクロファージ活性化に伴うIa抗原発現の検

growthfactor；CollaborativeResearch，Inc．）を用いた．

出

白血病細胞のマクロファージへの分化誘導

P388Dl細胞（2×105／ml）は10U／mlのIFN−

HL−60細胞（5×104m／）およびMl細胞（2．5×γで，ペプトン誘導腹腔マクロファージ（4×105／

104／ml）にPMA（10ng／ml）およびLPS（100ng／ml）はLPS（100ng／ml）と50U／mlのIFN−γでml）とIFN−γ（5U／ml）を添加し3日間培養し刺激後2日間培養した．培養終了後，0．4％EDTA

た．遠心により細胞を回収し，抗血清で感作したを含むリン酸緩衝生理食塩水で細胞をはがし，遠羊赤血球（EA）とのロゼット形成能よりFcレセ

心，洗浄して免疫蛍光染色に供した．ラットIgG

プター（FcR）陽性細胞をカウントした．200個以であらかじめFcRをブロックした後，マウス抗上の細胞をカウントし，FcR陽性細胞の割合を百

Iadモノクローナル抗体（MK−D6）を反応させ，次分率で表示した．

いでFITC標識抗マウスIgGで染色した．常法にTablel EffcetofMeDSGonthedifferentiationofHL・60cellsinducedbyPMAinuihv
Inducera TreatmentwithMeDSG（period）b FcRexpressione
5．8±2．0
十十46．9±9．7

十＋（day−1〜3）42．3±6．2

十十＋（day O〜3）

46．5±0．7＋（day l〜3）45．3±6．2十（day36．0±3．0

2〜3）

aPMA（10ng／ml）wasaddedtoeachcultureondayO．bHL−60cells（5×104／ml）weretreatedwithMeDSG（10JLg／ml）foraperiodasindicared．CExpressionofFcreceptor（FcR）wasdeterminedonday3．Results
areexpressedasmean±Standarddeviation（S．D．）oftriplicateculturesineachgroup．

Table2EffcetofMeDSGonthedifferentiationofMIcellsinducedbyLPSandIFN−γinvii7V

Inducera TreatmentwithMeDSG（period）b FcRexpressione
一十 ＋ ＋ ＋ ＋

1．4±0．540．3±5．5＋（day−1〜3）51．9±3．9＋（day O〜3）55．8±3．5＋（day l〜3）43．4±1．6＋（day

37．8±3．9

2〜3）

aLPS（100ng／ml）andINF−γ（5U／ml）wereaddedtoeachcultureondayO．bMIcells（2．5×104／ml）weretreatedwithMeDSG（10JLg／ml）foraperiodasindicated．CExpressionofFcRwasdeterminedonday3．
Resultsareexpressedasmean±S．D．oftriplicateculturesineachgroup．
−68−

15rDeoxyspergualinの免疫抑制活性発現の機序に関する研究
Table3

EffectofMeDSGonthedifferentiationofPC12cellsinducedbyNGF tn uitYV

Inducera TreatmentwithMeDSG（period）b NeuriteexpressionC
1．6±0．6
十66．2±3．3

十51．7±12．9＋（day O〜3）

57．6±7．5＋（day l〜3）54．1±10．4

十（day56．3±6．8

十＋（day−1〜3）

十
十

﹁∴﹁﹁

2〜3）

a7S−NGF（100ng／ml）wasaddedtoeachcultureondayO．bPC12cells（2×104／ml）weretreatedwith

MeDSG（10JLg／ml）foraperiodasindicared．CExpressionofneuritewas determinedonday3・Resultsare
expressedasmean±S．D．oftriplicateculturesineachgroup・∝国のEnZ JJHU

Figprel EffectofMeDSGontheinductionofIaantigenonP388DI
cellsstimulatedwithIFN・γ．P388DICells（2×105／ml）were
cultured with a）medium alone，b）IFN・γ（10U／ml），C）
IFN−γ（10U／ml）plusMeDSG（1JLg／ml）ord）IFN−γ（10U／ml）plus MeDSG（100JLg／ml）for2days．The solidlines
representcellsstainedwithanti−Iadmonoclonalanti−body（MK−D6）and FITC−gOat anti−mOuSeimmunoglobulin（GAMIG）．DottedlinesrepresentcellsstainedwithFITCTlog

FLUORESCENCE工NTENSITYGAMIGalone・−69−

∝HmEnZ JJHU

Figure2

EffectofMeDSGontheinductionofIaantigenonpepton−
induced peritoneal macrophages（pM￠）Stimulatedwith
LPSandIFN・γ．
PM￠（4×105／ml）wereculturedwitha）mediumcontaining
lOOng／mlofLPS，b）LPSandIFNTγ（50U／ml），C）LPSand
IFN−γplusMeDSG（1JLg／ml）ord）LPS andIFN−γplus

MeDSG（100／Jg／ml）for2days．Thesolidlinesrepresent

1Ctg FLUORESCENCEINTENSITY

Cellsstainedwithanti−IadmonoclonalantibodyandFITC−GAMIG．Dottedlined represent cells stainedwith FITC−GAMIG alone．

従い，Flowcytometry（日本分光，CytoAce−150）
にて解析した．

結

nIl細胞によるDNA，RNA，蛋白合成の検出
Ml細胞（1×104／0．1mg）を96穴平底マイクロ

果

白血病細胞のマクロファージへの分化に対する
nIeDSGの効果

タイタープレートで1，3および5日間培養し，培

骨髄性白血病細胞HL−60およびMlが種々の養終了4時間前に3H−thymidine，3H−uridineお

化学物質あるいはサイトカイン刺激によりマクロよび3H−1qucine（0．5J Ci／well）をパルスし，それファージへと分化することが知られている4・5）．今ぞれの取り込みを液体シンチレーションカウン

回，我々はPMAによるHL−60細胞の分化およターにて測定したびLPSとIFN−γによるMl細胞の分化をFcR
発現を指標に検討した．分化誘導2日前から−70−

15−Deoxyspergualinの免疫抑制活性発現の機序に関する研究

0JO出↑写PU L巴︶ M

010−310t210−11010−310−210−1110102

MeDSG（FLg／m／）

MeDSG（LLg／ml）

Figure310102

EffectofMeDSGonthesynthesisofDNA，RNAandproteininMIcells．MIcells（1×104／0．1ml）

WereCulturedwithorwithoutMeDSG for3（a）or5（b）daysinmicrotiterplates．Cellswere
pulsedwithO．5FECiof3H・thymidine（●），3H−uridine（▲）or3H−leucine（□）forthelast4hoursof

incubation．Resultsareexpressedasmean％ofcontrol（mediumalone）oftriplicatewellsineach
grOup．

MeDSGを加えると（合計5日間作用），FcR測定

く用いられている6）．NGF添加後にPC12細胞は時に生細胞がほとんど残っておらず（Figure3−bDNA合成を停止し，神経突起および軸索形成にを参照），検出が不可能であったため，1日前から必要な新たな蛋白質を合成する．MeDSGをNGF

2日後の各日にMeDSGを加え，FcR発現に対す

添加1日前より2日後まで各日加えその効果を調る効果を調べた．TablelおよびTable2に示す

べたが，神経突起伸展に全く影響しなかった

ように，MeDSGはFcR発現を抑制しなかった．

（Table3）．NGFを添加しない通常の培養時にお分化誘導1日前よりMeDSGを加えた群の生細いては，PC12細胞に対してMeDSGは100Jg／

胞回収率は著しく減少したが，残存細胞内でのmJという高濃度で3日以上共存培養した際にのFcR陽性率にはほとんど影響しなかった．また，み，DNA合成を50％以上抑制した（3日および5分化誘導物質非存在下でMeDSGはFcR発現に日間培養での抑制率はそれぞれ63％および73％

何ら効果を示さなかった．

であった）．
マクロファージ活性化に伴うIa抗原発現に対

神経細胞分化に対するMeDSGの効果
ラットのフェオクロモサイトーマ（PC12）はするMeDSGの効果

NGFに応答し神経細胞に特徴的な種々の形質をマウスのマクロファージ様株化細胞P388Dl

発現することから，神経細胞分化誘導因子あるいをIFN−γ（10U／ml）で2日間処理するとIa抗原

は神経栄養因子のインディケーター細胞として広が出現してくる（Figurel−b：陽性率39．1％）．

−71−

この系にIFNLγ添加と同時にMeDSGを1FEg／

検討中であるが，昨年の我々の研究3）から，

mJあるいは100JJg／mJの濃度で加えたが，いず

MeDSGはMLRによるIFN−γ産生を抑制しなれの濃度においてもIa発現は抑制されなかった

いことが明らかにされており，今回の実験結果と（Figure1−C，d：陽性率はC：39．9％，d：

考え合わせると直接マクロファージへ抑制効果を45．6％）．ペプトン誘導腹腔マクロファージを用い示す可能性は低いと予想される．また，MLR成立た実験でも同様に，MeDSGはLPSおよびIFN

がIa抗原発現だけでは説明されないことが最近−γ刺激によるマクロファージ活性化に伴うIa抗明らかにされつつあり，別の局面からのアプロー

原発現を全く抑制しなかった（Figure2）．

チも必要と思われる．
今後解決すべき問題として，DSGおよび考察

MeDSGによるCTL誘導抑制が，

分化

抑制に

ヒトおよびマウスの株化細胞，ペプトン誘導マ

よるものか，あるいは全く異なる機序によるもの

ウス腹腔マクロファージを用いて，分化および活

なのか，これら薬剤の抑制効果のReversibilityの性化（活性化も分化の一側面と考えられる）に伴う原因は何か，が挙げられる．

新たな形質発現（FcR，神経突起伸長およびIa抗これまで．我々が研究した限りでは，DSGおよ原の発現）に対するMeDSGの効果を検討した．

びMeDSGの抑制効果はIFN一γやIL−2等の液

MeDSGは，今回用いた実験系および細胞種に対性因子産生抑制やIa抗原の発現抑制ではないこ

しては全く抑制効果を示さないことが明らかにさとが明らかである．これまでの免疫抑制剤の常識れた．実際に本実験系でMeDSGが作用しているからは，DSG（MeDSG）の作用機序を説明するこことは，Ml細胞のDNA，RNAおよび蛋白合成とは困難と思われるが，全く新しいタイプの免疫が3日ないし5日間培養した際に，dose−depen−抑制剤として今後更なる検討が期待される．

dentに抑制される（Figure3）ことより明らかである． 特に，5日間培養後の蛋白合成は，1ng／
ml以上の濃度で50％以上抑制され，RNAやDNA合成に比LMeDSGにより感受性であるこ

文1）Nishimura，K．andTokunaga，T．：Mechanism
Ofactionof15−deoxyspergualin．I．Suppressiveとが兄い出された．当初，DSGおよびMeDSGの

effectontheinductionofalloreactivecytotoxic

親化合物であるSpergualinは白血病に対する抗腫瘍活性が注目され，その作用機序は蛋白合成阻
害であることが示唆されている．しかしながら，本研究で示されたように，MeDSGによる蛋白合
成阻害は分化に伴い新たに合成される特定の蛋白質というよりは，細胞の生存維持に必要な蛋白質
全般に向かうものと考えられる．データには示さ

Tlymphocytesin uiz）O andin uii7℃，．Im−

タメ7JJ即座汐，68，66−71，1989．

2）徳永 徹，西村恵子，：15−Deoxyspergualinの免疫抑制活性発現の機序に関する研究．厚生省新薬開発研究費，青柳班，昭和62年度報告書，p．75−82，
1988．

3）徳永 徹，西村恵子，：15−Deoxyspergualinの免疫抑制活性発現の機序に関する研究．厚生省新薬開発研究費，青柳班，昭和63年度報告書，p．67−72，
1989．

4）Lotem，J．andSachs，L．：Regulatiohofnormal

ないが，Ml細胞をLSPとIFN−γで分化誘導した際にMeDSGを加えても，DNA，RNA蛋白合
成に大きな変化は認められなかった．
現在，混合リンパ球反応（MLR）における抗原提献differentiationin mouse and human myeloid
leukemiccellsbyphorbolestersandthemechaT

nismoftumorpromotion．aJOC．Natl．Acad．Sci．
USA，76，5158−5162，1979．
5）Weiss，B．andSachs，L．：Indirectinduction ofdifferentiationin myeloidleukemic ce11s by

示細胞のIa抗原発現に対するMeDSGの効果を−72−

lipid A．PJ℃C．Ab払Acαd ScJ．USA75，1374−

15−Deoxyspergualinの免疫抑制活性発現の機序に関する研究
pheochromocytoma cells which respond to1378，1978．

6）Greene，LA．andTischler，A．S．：Establishment
Of a noradrenergic clonalline of rat adrenal

ー73−

nerve grOWth factor．Proc．Abtl．Acad．Sci．
［侶473，2424−2428，1976．

Ⅰ型糖尿病モデルマウスに対するIFN−γの効果

谷 口

克＊

研究協力者 小池隆夫＊＊，倉沢和宏＊＊

糖尿病発症におよぼすIFN一γの効果を，全身投与はじめにより検討した．

にγ−インターフェロン（IFN−γ）は主要組織適合抗原（MHC）クラスⅠ及びクラスⅠⅠの発現誘導，マ方法

クロファージやNK細胞の活性化など，多くの免

マウス：シオノギ研究所より入手し，千葉大学動疫調整作用を持つペブタイドである1）．一般に物実験施設で繁殖した雌NODマウスを使用しIFN−γの全身投与によって免疫反応は促進された．

る事が知られている．実際，IFN一γの投与によりIFN−γ：IFN−γはGenentech，Inc．，より供与さ

SLEモデルマウス（B／WF．）の腎炎をはじめ多くれたrecombinantmouseIFN−γを2．5×105U／の自己免疫疾患は悪化することが知られている．

mJに調整し使用した．

逆に．抗IFN・γ抗体の投与によって，B／WFlマウ

投与方法：（ヨラ氏島炎未発症の生後2適齢よりスのループス腎炎の進展は抑制されると報告され10匹の雌NODマウスに週3回，5×104UのているZ）．

IFN−γを腹腔内投与し，生後6週齢で組織学的検

NODマウスは，Ⅰ型糖尿病のモデルマウスで，雄，雌とも，生後4−6遇齢までに単核細胞のラ氏索をおこなった．対照群には同量のPBSを投与した．

島への浸潤（ラ氏島炎，insulitis）がおこり，ついで②生後2適齢より各群11匹の雌NODマウス

12週齢頃より雌NODマウスに，顕性糖尿病が発に同様に，5×104UのIFN一γまたはPBSを遇3症してくる3）．

回投与し，血糖，尿糖を週1回測定し，その推移

新生時期胸腺摘出，抗Thy−1抗体の投与，nude

を生後20過齢まで観察した．

遺伝子のNODマウスへの導入等によりラ氏島炎（診ラ氏島炎は発症しているが，糖尿病末発症でならびに糖尿病の発症は抑制されることより，

ある8週齢より，各群10匹の雌NODマウスに週NODマウスにおけるラ氏島炎ならびに糖尿病の3回，IFN−γまたはPBSを投与し，血糖，尿糖を発症機序は，T細胞依存性の自己免疫現象である

週1回測定し，その推移を生後24週齢まで観察しと考えられている4，5・6）．

た．

今回，我々は，NODマウスのラ氏島炎ならびに＊千葉大学医学部附属高次機能制御研究センター
免疫機能分野ヰ■千葉大学医学部第2内科

糖尿病発症の定義：血糖値200mg／dJ以上かつ尿糖陽性を示した個体を糖尿病発症マウスと定義した．
組織学的検索：実験終了時にマウス膵臓を取出

ー75−

図1IFN−γを2週齢から投与されたNODマウス（♀）の膵組織像（6遇齢）し，10％ホルマリンで固定し，へマトキシリン エ

ラ氏島の構造は保たれているもの．

オジンで染色し，検鏡した．ラ氏島炎の程度は，Score3：ラ氏島の変性をともなった単核球のラ以下のようにスコアリングした．

氏島への浸潤を認めるもの．

Score O：単核球浸潤が認められないもの．

Sc（）1−el：単核球にラ氏島が置き変わっているも

Scorel：ラ氏島周囲の弱い単核球の浸潤を認めの．変性し内分泌細胞の消失したラ氏島．

るもの．

ラ氏島炎の程度＝Scoreの合計／ラ氏島の数

Score2：ラ氏島内に単核球の浸潤を認めるが，76

Ⅰ型糖尿病モデルマウスに対するIFN−γの効果Max．

また，膵臓組織の一部は凍結切片とし，抗Thy−
1，抗Lyt−2，抗L3T4，抗Ia抗体（10−2・16）を用い
免疫組織学的検索をおこなった．
膵臓リンパ球表面マーカーの検索：実験終了時に膵臓リンパ球表面マーカーを抗Thy−1，抗Lyt−2，
抗L3T4，抗Ia抗体および抗マウスIgs抗体を用い，FACSにて解析した．
結果

生後2週齢よりのIFN−γの投与：NODマウス
ラ氏島に単核細胞の浸潤のおこり始める生後6週

図2 抗Ia抗体（10−2−16）による脾細胞の染色パ

齢に組織学的検索をおこなった．対照群では一部

ターン

ラ氏島に軽度から中等度の細胞浸潤がみられるのにすぎないが，IFN−γ投与群では大多数のラ氏島

糖尿病の発症が抑制されることが示された．

に中等度以上の単核球浸潤が認められ〔スコアリ

20週齢での対照群の膵ラ氏島組織像は大多数

ング：対照群：IFN−γ投与群＝0．32±0．25：のラ氏島への中等度以上の単核球浸潤を認めた

1．78±0．37（m±se），（P＜0．01）〕（図1），IFNTγのが，IFN−γ投与群においても同程度のラ氏島炎を投与によりラ氏島炎の発症が促進されることが示認め〔スコアリング：対照群：IFN−γ投与群＝された．

2．4±0．78：2．2±0．47（♪＜0．1）〕（図5），両群間にはNODマウスのMHCクラスⅠⅠ抗原は特殊で有意差を認めなかった．

（IaNOL）），10−2−16抗体のみがNODマウスのMHC

20週齢時におこなった免疫組織学的検索では，クラスⅠⅠ抗原を認識する．図2は，同抗体を用い，両群ともラ氏島炎はThy−1陽性細胞より成り，そNODマウス脾臓リンパ球における染色パターンの多くはL3T4陽性細胞であり，一部Lyt−2陽性をFACSにより解析した結果を示している．

細胞も存在しており，これらにも有意の差を認め

IFN−γ投与マウスに認められたラ氏島炎発症なかった．

の促進が，IFN−γによるラ氏島上のMHCの異所脾臓リンパ球表面マーカーの解析を20週齢時性発現によるものか否かを調べるために，上述のにおこなった．IFN一γ投与群では，対照群に比し抗Ia抗体で酵素抗体法により染色した（図3）．してThy−1陽性細胞が有意に減少していた．しかかし，IFN−γ投与群，対照群ともにラ氏島細胞上

し，T細胞内の各サブセットの割合には両群間でにはIa抗原の異所性発現をみとめなかった．

有意な偏りは認められなかった．

つぎに糖尿病の発症におよぼすIFN一γの効果

生後8適齢よりのIFN−γの投与：ラ氏島炎はすについて検討した．対照群では生後12週齢より糖でに発症しているが，糖尿病末発症である8週齢尿病を発症してくる個体が出現しはじめ，実験終の雌NODマウスに24週齢までIFN−γを投与

了時の20週までには82％の個体が糖尿病を発症

し，糖尿病発症へ及ぼす効果を検討した．対照群

したのに対し，IFN−γ投与群では18％の個体に高では生後13週齢頃より糖尿病を発症する個体が血糖を認めたのみであり（♪＜0．01）（図4），ラ氏島

出現しはじめ，実験終了時の24週齢までに80％炎発症以前よりIFN−γを投与することによっての個体に顕性糖尿病を認めた．しかし，IFN−γ投−77−

図3IFN−γを2週齢から投与されたNODマウスの膵組織の抗Ia抗体（10−2−16）による染色与群では24週齢までに糖尿病を発症する個体を有意な差は認められなかった〔スコアリング：対認めず（♪＜0．01）（図6），IFN−γはラ氏島炎がすで

照群：IFN−γ投与群＝2．70±0．31：2．52±0．51におこっているマウスに投与しても糖尿病の発症（♪＜0．1）〕（図7）．

与川刷りすることが示された．

ラ氏島炎構成細胞について免疫組織学的に検索

美験終■了帖の24週齢におこなった膵臓の組織したところ両群ともにThy−1，L3T4陽性細胞が主学的検索では，対照群，IFN−γ投与群とも中等度

で，一部Lyt−2陽性細胞より成立しており，これら

以上のラ氏鳥炎が観察され，両群のあいだには，にも有意な差は認めなかった．
−78−

Ⅰ型糖尿病モデルマウスに対するIFN・γの効果
％

0
8
0
6
0
4

掛慢群喋畔撃0％

掛慢ば喋畦聖0
2

8W lOW12W

10W

15W

74W16W

図4IFN−γを2週齢から投与されたNODマウス

20W

22W

24W

運

20W

週

18W

図6IFN・シを8週齢から投与されたNODマウス（♀）累積糖尿病発症率の累積糖尿病発症率

しかしながら我々のNODマウスを用いた実験終了時におこなった脾臓リンパ球サブセッ

IFN一γの投与実験からは，組織レベルでは膵ラ氏

トの解析では，生後2週齢よりのIFN一γ投与実験

島上での異所性MHCクラスⅠⅠ抗原の発現を認時と同様にThy−1陽性細胞が減少していた（対照

めることはできなかった．

群：IFN−γ投与群＝46．2±7．0％：30．2±4．8％

IFN−γの自己免疫疾患モデルマウスへの投与
は，SLEモデルマウスの腎炎，マウスコラーゲン（♪＜0．01）．

誘発関節炎，StreOtOZOtOSin誘発マウス糖尿病を考察

それぞれ悪化させることが知られている2皿11）．逆IFNTγはT細胞より産生されるcytokineでに抗IFN−γ抗体の投与によって，B／WFlマウス

T細胞，B細胞機能の調節，NK細胞，マクロのループス腎炎の進展は抑制されることが報告さ

ファージの活性化，MHCクラスⅠⅠ抗原の発現のれている2）．臨床的にも，多発硬化症がIFN−γの誘導など多くの免疫調節作用を持つこまた，tumOr

投与により悪化したり12），IFN・γで治療中の悪性necrosisfactor（TNF），ILlなどとともに，サイ腫瘍患者に自己免疫現症が出現するという事実がトカインネットワークを形成している1）．

ある13）．

Ⅰ型糖尿病に代表される臓器特異性自己免疫疾

しかし，これらの報告とは反対に実験的アレル

患の発症メカニズムを推察するのに，IFN−γによギー性脳脊髄炎はIFN−γの投与により，病状の進るMHCクラスⅠⅠ抗原の発現の誘導作用が注目

行が阻止され，抗IFN−γ抗体の投与によって促進されている．すなわち，IFN−γは，単独で，またされる14）．臨床的にもIFN−γの投与によって慢性はTNFの共存下に，正常では発現されていない

関節リウマチが改善するという報告もある15）．

甲状腺淀胞細胞や膵β細胞上にMHCクラスⅠⅠ

これらの相反する現象は，IFN・γの作用の多彩抗原を誘導することができる7−8）．標的臓器のさと自己免疫疾患の原因の多様性を反映している

MHCクラスⅠⅠ抗原の発現により，当該臓器が抗のかもしれない．

原提示細胞としての機能を有し，MHCプラス自

今回の実験から，IFN−γはNODマウスの自己

己抗原をT細胞に提示することによって，自己免免疫現象に対して，2つの異なった作用を持つこ

疫反応がおこるという考えである9）．

とが明らかとなった．すなわちラ氏島炎の発症の−79−

図5IFN−γを2週齢から投与されたNODマウス（♀）の膵組織像（20週齢）促進と糖尿病発症の抑制（＝β細胞破壊の抑制）とNODマウスに同様の抗体を投与し，抗L3T4抗である．

体投与によっては，糖尿病の発症は抑制できるが，花々はラ氏島炎発症以前の2適齢より雌NOD

抗Lyt−2抗体投与によっては糖尿病の発症は抑制−、′1ンスに，抗IJ：汀4または，抗Lyt−2抗体を投与しできない事実を報告してきた16・17・18）．これらの結標的剃目地を除去することにより，ラ氏島炎および果は，ラ氏島炎の発症にはL3T4陽性，および

粕届病の発症を抑制できることを，また，ラ氏島

Lyt−2陽性の両T細胞の存在が必要だが，糖尿病炎は発症しているが糖尿病末発症の12週齢のの発症（β細胞破壊）はL3T4陽性細胞のみにより80

Ⅰ目測沈痛モテルマーl／1に吏十㌢るIF＼−γの効果

図7IFN−γを8週齢から授与されたNODマウス（♀）の膵組織像（24週齢）

くともこの2つの自己免疫現象に対して，相異遂行されることを意味している．
IFN−γがどのような機序により，ラ氏島炎を促なった作用を持っていると考えられた．

進し，逆にβ細胞の破壊を抑制するかは不明であしかし，IFN−γの投与によるβ細胞の破壊の抑るが，我々のモノクローナル抗体投与実験ならび

制は，ラ氏島炎の有無に関わらず認められ，あるに，これまで集積されてきたNODマウスの遺伝

種のⅠ型糖尿病の治療に応用される可能性が示さ学的解析から，「ラ氏島炎の発症」と「β細胞の崩れた．

壊」とは，異なった事象であり，IFN−γは，少な一一トl・10）Cooper，S・M：，Sriram，S・，Ranges，G・E・：Sup−文

pression of murine collagen−induced arthritis

献with monoclonal anti−Ia antibodies and aug−
mentationwithIFN−γJImmunol．141：1958−

1）Trinchieri，G．Perussia，B．：IFN−γ，a pleio・tropiclymphokine．1mmunol．7b如＿6：13ト

1962，1988．
11）Campbell，Ⅰ．L．，Oxbrow，L．，Koulmanda，M．，

136，1985．

2）Jacob，C．0．，VOn der Meide，P．H．，McDevitt，
H．D．：In uivo treatment of（NZBxNZW）Fl
lupus−1ikenephritiswithmonoclonalantibody
to γ−interferron．J EQ．Med166：798−803，
1987．

Harrison，LC．：IFN−γinducesisletcellMHC
antigens and enhances autoimmune streptozo・
tosin・induced diabetesin the mouse．J．Im−∽〝犯OJ．140：1111−1116，1988．
12）Panitch，H．S．，Haley，A．S．，Hirsch，R．LリJhons−3）Makino，S．，Kunimoto，K．，Muraoka，Y．，Mizu−
Shima，Y．，Katagiri，K．，Tochino，Y．：Breeding
Ofnon−Obesediaeticstrainofmice．E坤．Anim．
29：1−13，1980．

4）Ogawa，M．，Maruyama，T．，Hasegawa，T．，
Kanaya，T．，Kobayashi，F．，Tochino，Y．，Uda，H．：Theinhibitoryeffect ofneonatalthymec−
tomyontheincidenceofinsulitisinnon−Obesediabetes（NOD）mice．BiomedRes．6：103−105，
1985．

5）Harada，M．，Makino，S．：Suppressionofovert
diabetesinNODmicebyantithymocyteserum
Or anti−Thy・1antibody ExP．Anim．35：495−

SOn，K．P．：Exacerbation of multiple screlosis
in patients treated with gammainterferon．
エα乃CgJl：893−894，1987．

13）Schattner，A．：Review：interferonandautoim−
munity．Am．J Med Sti．295：532−544，1988．
14）Billiau，A．，Heremans，H．，Vandskerckhove，F．，
Dijkmans，R．，Sobis，H．，Meulepas，E．，Carton，
H．：EnhancementofexperimentalallerglCen−
Cepharomyelltisinmicebyantibodiesagainst
IFN−γ．′血′朋′〝07140：1506−1510，1988．
15）Veys，E．M．，Mielants，H．，Verbruggen，G．，Gros−
Claude，JTPリMeyer，W．，Galazka，A．，Schindler，

J．：Interferongammainrheumatoidarthritis．
Adouble．blindstudycomparinghumanreCOm−
binantinterferon gamma with placebo．J．
Rheumatol．15：570−574，1988．

498，1986．

6）Makino，S．，Harada，M．，Kishimoto，Y．，Haya・Shi，Y．：Absenceofinsulitisandovertdiabetes
inathymicnudemicewitrhNODgeneticback16）Koike，T．，Itoh，Y．，Ishii，Ⅰ．，Ito，Ⅰ．，Takabayashi，K．，Maruyama，N．，Tomioka，H．，Yoshida，S．：

ground．E＊．Anim．35：495−498，1986．

Preventiveeffectofmonoclonalanti・L3T4anti・

7）Todd，I．，Pujol・Borrell，R．，Hammond，L．Jリ

Bottazzo，G．F．，Feldmann，M．：Interferon・γ
induces HLATDRexpressionbythyroid epith−eliumCltn．EQ．1mmunol．61：265−273，1985．
8）Pujol−Borrell，R．，Todd，I．，Doshi，M．，Bottazo，
G．F．，Sutton，R．，Gray，D．，Adolf，R．，Feldmann，
M．：HLAclassIIinductioninhumanisletcells
byinterferon・γplus tumor necrosis factor or

lymphotoxin．Natu7V326：304−306，1987．
9）Bottazo，G．F．，Pujero−Borrell，R．，Hanafusa，R．，
Feldmann，M．：Role of aberrent HLA−DR
expression and antigen presentationininduc−tion of endocrine autoimmunity．Lancet 2：

bodyondevelopmentofdiabetesinNODmice．
かねろβわざ36：539−541，1987．

17）伊藤洋次郎，小池隆夫，倉沢和宏，石井連子，伊藤勇夫，富岡玖夫，吉田 尚：抗L3T4抗体および抗Ly・2抗体投与によるNODマウスINSULI−TIS局所のT細胞サブセットの変化と糖尿病の発症．糖尿病 31：257−260，1988．
18）倉沢和宏，小池隆夫，伊藤洋次郎，松村龍太郎，
宇津木連子，伊藤勇夫，富岡玖夫，吉田 尚，NOD
マウスの糖尿病発症に関与するL3T4陽性細胞とLyt−2陽性細胞の役割．糖尿病 31：937−939，

1115−1119，1983．

−82−

1988．

ポリADP−リボース合成酵素阻害剤（ベナドロステン）の
玩目元川抗体産生に及ぼす効果：ループス（SLE）
モデルマウスを用いた解析
金 井 芳 之＊協同研究者 山内茂人暮，今岡浩一一＊＊

ポリADP−リボース抗体の上昇とポリADP−リ
はじめ

ボース抗原感作との関連性も調べた．

に

全身性エリテマトーデス（SLE）患者が妊娠した場合，健常人に比べて子宮内胎児死亡（IUFD），

材料 と 方法

流産・早産の頻度が高いことが指摘されている1）．

薬剤：ベナドロスチン（Bd）は微生物化学研究

我々はSLEの流産モデルをSLEモデルマウス

所青柳高明博士より恵与された．Bdは0．5％のア（MRL／ので作出することに成功した．すなわち

ラビアゴムを含有する生理食塩水にて2mg／mJ

MRL／Jマウスの妊娠例で低仔産（リッターサイに溶解し，−200Cで保存した．

ズが4以下）の場合は高い確率でIUFDを伴ってマウスおよびBdの投与法：マウスは米国いることがわかり，その場合妊娠7日で抗ポリJacksonLaboratoriesより入取し，東京大学医科

ADP−リボース抗体（IgG2a）の選択的上昇が見ら学研究所で繁殖・維持しているMRL／Jを用いた．

れ，本抗体はIUFDを予知するのに都合の長い実験には10週齢雌MRL／〃原則として）を用い，マーカー抗体になることをつきとめた2）．この現

前回の実験では10mg／kgを遇3回腹腔内投与し象はヒトSLE妊娠6例中4例にも認められ，抗たが，今回は妊娠中の薬剤投与のストレスを考慮

ポリADP−リボース抗体がSLEモデル動物のみし，週1回投与法も検討した．尚実験期問は4週ならず，ヒトSLEでもIUFDや流産予知の為に間とした．

良いマーカー抗体になることが示された3）．以上

ポリADP−リポースによるnIRL／JマウスののことからポリADP−リボース異常代謝，特に，そ感作：抗原の調製及び感作法は既法5・6）に従った．

の過剰産生と抗ポリADP−リボース抗体の選択的対照実験としてポリADP−リボースを含まない溶上昇の関連性を予想し，昨年度非妊娠MRL／Jマ媒とFreund

ウスに対するポリADP一リボース合成阻害剤ベナ法を用いた．

Sアジュバントの混合液による感作

ドロスチン（Bd）投与効果を調べ，Bdには抗ポリEnzyme−linkedimmunosorbent assay

ADP−リボースIgG抗体産生の選択的抑制作用が（ELISA）：ポリL−リジンで前処理したマイクロみられる知見を得た4）．今回はその基礎実験をさタイターウェル（FalconNo3912）にポリADP−リ

らに追加し，あわせてMRL／Jマウスにおける抗ボース，二本鎖（ds）DNA，あるいは一本鎖（ss）■東京大学医科学研究所癌生物学研究部

DNAを各ウェルに50ng加え，蒸発乾固したマ＝東京大学医科学研究所実験動物研究施設

イクロタイタープレートを固相抗原として用い，ー83−

既法に従って抗ポリADP−リボース抗体，抗dsDNA，抗ssDNA抗体を測定した7）．また抗体の結特異性はcompetitiveELISAにて調べた7）．

果

10週齢AIRL／lマウスにおける抗ポリADP＿

リポース抗体価：雌雄のMRL／Jマウス（雌20匹，雄20匹）における抗ポリADP−リボースIgG
抗体の上昇度を抗ssDNAIgG抗体と比較して調べた．抗ポリADP−リボース抗体，A。。5ユニットが0．5以上で且つ抗ssDNA抗体に対する見かけの比が1．5以上のもの（図1，上部破線より上）が7dN凸のの去uq＼u︵∝d凸王立uq

匹（17．5％）であったことから，遺伝的背景が均一であるにもかかわらず10週齢の各々のマウスで
ポリADP−リボースに対する感作状態に差のあることがわかった．

●●●●

Bd1回投与で見られる抗ポリADP−リポース

n＝7（17．5％）

抗体価の変動と特異性：図2，3にBd投与による●●●●抗ポリADP・リボース抗体産生の抑制例とBd投

n＝13（32．5％）●●

鬼与に対して無反応の例を示した．左のカラムは抗や体の変化を右のカラムには抗体の特異性が示され●●●ている．Bd投与時（10週齢）に既に高力価の場合

．〜
n＝40

には，その抗体はポリADP−リボースに特異的で

ノ0

図110週齢MRL／Jマウス（雌雄）における抗ポリ
ADP−リボースと抗ssDNA抗体との相対的関係あるのに対して，低力価で無反応の場合は特異性に乏しいことがわかる．
Bd投与効果の判定法：抗ポリADP・リボース
抗体にはssDNAと交叉反応性のものが多く存在

＼／・＼

0
5

0．5

PUコ0ロ■0上uO0−0㌔■u冨d白V︶⊥lU＜

／

SSDNA

0
0

P−0／0＼。

二二二二・

0

5

10

15

20

days aIter adminjstration

図2

1

3

6

12

25

Competitor（LLg／mI）

ベナドロスチンの1回投与後の抗ポリADP・リボース抗体価の変化（左）と投与時点における抗ポリADP−リボース抗体の特異性（右）：効果例−84−

ポリADP−リボース合成酵素阻害剤（べナドロスナン）の玩目元畑抗体産生に及ぼす効果

3

6

︑

〜

．／・一・ノノ0−0▲辞■∪冨d凸VT；uく（ADPR）n90＼● 1 1 1 1 1 ︑

0
0

Pu⊃0ロ︼0−1UOU。／0−0／〇一霊Å

0

0

5

10

15

1

20

ベナドロステンの1回投与後の抗ポリADP・リボース抗体価の変化（左）と投与時点における抗ポリADP−リボース抗体の特異性（右）：無効果例
Poly（ADP−

no addition

ribose）▲／▲−▲−一一・一

0
2

3

4

0

4
lJ

g

SSDNA／mJUOコ巴lS盲岬EP帽u；SOIP帽upm l

▲／

0

l

0

■

3

0

3寸く■︵30qニーd凸V︶とOd⊥︼uく

ロー一一一一ロー一一一月一一一一』

＼＼＿

10

1

20

0

30

0

10

20

30

図510週齢雌MRL／Jマウス（4匹）におけるポリー
リボース感作とそれに対する免疫応答一一∪．昌：一二■ニー一宇′′

ロー一一一一￣＼JDays afterlstlmmunization●一・一・・一・一一一●▲

UO；Uエリ 02月一l

3†く ■︵むSOqニーdqVVとOdI；∪く●／●＼・／二メ
0．125Competitor（〃g／mJ）

daYS atter admn両Stration

図312▲′▲＼＿▲＼．

＼．
Bd投与中における抗ポリADP−リボース抗体の

0

1

2

3

4

変化を比較した．この方法によると抑制のみられ（weeks）

図4 ベナドロステン連続投与と抗ポリADP・リボー
ス抗体の変動ないもの（▲）（図4上段）でも抑制が見られるようになり（図4下段）また軽度の抑制効果のあるもの（●）（図4上段）では一層抑制効果が明瞭になるこすることから7）Bd投与効果の判定が必ずしも容とがわかる（図4下段）．なお（□）はBdを投与し易でない．この判定を容易ならしめるために，抗ていない対照マウスである．

ポリADP−リボース抗体測定の際の希釈液中に抗nIRL／JマウスにおけるポリADP・リポース抗ssDNA抗体を吸収する目的で1JLg／mlの濃度で原感作と抗ポリADP−リポース免疫応答：図5

ssDNAを加えてみた．異なる3匹のMRL／lにつに10週齢雌MRL／Jマウスに観察されたポリいて希釈液中にDNAを含まない系と含む系でADP−リボース感作と抗ポリADP−リボース免疫

−85−

100

100

確≡垂≡担踪≡萄05

Pu⊃0日−○上七〇0−0一歩

トLTテ‡
Poly（ADP−ribose）▲
dsDNA

●

SSDNA o（dT）nl■（りn ●Anti−SSDNA

1．56

5

10

25

1．56

5

10

25

Competitor，LLg／mI

図6 図5にみられた免疫応答の特異性

応答の経過を示した．図左にみられる如く，2回目

度ではあるが，抗ssDNA抗体と凌駕するものをの感作でIgMからIgGへの明瞭なクラス転換が含めると，33％にも及んだ（図1）．10週齢で低値認められ，ポリADP−リボース抗原に対して強いの抗ポリADP−リボース抗体価を示すものはBd

応答が示された．一方図右にみられるようにア投与効果が認められないが，逆に高値を示すもの

ジュバントを用いた対照実験ではクラス転換は認

ではBdによる抗体抑制を受け易いということはめられなかった．

（図2，図3）MRL／Jマウス妊娠例での高仔産群と抗原感作によって増強された抗ポリADP．リ

低仔産群（流産又はIUFD）の存在の説明に都合がポース抗体の特異性：図6左に示されている如良く，Bdの投与による流産・IUFD等の防止の理

く，増強抗体は当該抗原によってのみ固相抗原ポ論的可能性を示唆するものである．Bd投与法のリADP−リボースとの結合が抑制され，特異性の基礎実験として前回は週3回の投与を行い，抗ポ強いことがわかった．なお同様にssDNAの感作、リADP−リボース抗体の選択的抑制効果を得たでも認められる抗ssDNA抗体は図6右に示されが，今回の検索の結果，過1回投与でもその効果ている如く，SSDNAに特異性の乏しいことがわが期待できそうな知見を得た．

かった．

一方SLEのような全身性自己免疫疾患では抗原，例えばDNAが抗体産生のトリガーになって考察いるかどうか未解決のままである．ポリADP−リ

抗ポリADP−リボース抗体は最初当該抗原に特ボースは抗原性が強く6），SLE合併妊娠で，その経異性の高い抗体としてヒトSLE血清中に見出さ過中ポリADP−リボースに対する選択的免疫応答れたものであるが8），後にMRL／Jマウスでの検索の増強がみられる3）などSLEまたはSLEモデルの結果，抗ポリADP−リポース抗体と抗ssDNA

マウスにおいてポリADP−リボース抗原感作が充抗体は相互に交叉する場合の多いことが明らかに分考えられる．これを鹿かめる実験のひとつとしされた7）．しかし今回40匹の10週齢MRL／Jマウて，10適齢MRL／lマウスをポリADP−リボーススの検索では抗ssDNA抗体よりも高値を示すもで感作してみたところ数回の抗原感作でIgMかのが17％程度存在することがわかった．さらに軽らIgGへのクラス転換がみられ，明らかに外来の−86−

ポリADP−リポース合成酵素阻害剤（べナドロスナン）の九日血相抗体産生に及ぼす効果

ポリADP−リボース抗原に対応するB細胞群のplicationin autoimmune MRL／Mp一砂r／砂r
mice：Basis forits application to pregnant
patientswith systemiclupus erythematosus．
血研〝乃OJ．エビは，18，61（1988）

存在することが示唆された．

3）Kanai，YリIsonishi，S．and

ま

と

め

1）10週齢MRL／Jマウス40匹の検索でその17％に抗ssDNA抗体に比して明らかに高値を示す抗ポリADP−リボース抗体の存在が認められた．
2）10週齢で高力価抗ポリADP−リボース抗体を有するMRL／lマウスではBdの抗体抑制効果がみられた．
3）Bd効果は週1回投与でもみられる．

Terashima，Y．：

Antibodytopoly（ADP−ribose）is anindicator
Ofobstetriccomplicationinpregnantpatients

WithSystemiclupuserythematosus．1mmunol．
エe払，21，217（1989）
4）金井芳之，山内茂人：ポリADP−リボース合成酵
素阻害剤（ベナドロスチン）のね目元畑抗体産生に及ぼす効果：ループス（SLE）モデルマウスを用いた解析，厚生省新薬開発青柳班昭和63年度研究報告書，p．83，1989．
5）Kanai，Y．，Kawamitsu，H．，Tanaka，M．，Matsu−
Shima，T．andMiwa，M．：Anovelmethodfor
purificationofpoly（ADP−ribose）．J Biochem．，
88，917（1980）

4）MRL／Jマウスにおける選択的な抗ポリADP−リボース抗体の産生にはポリADP−リボース抗原の関与が強く示唆された．

6）Kanai，Y．，Miwa，M．，Matsushima，T．and
Sugimura，T．：Comparative studies on anti−
body and antibody production to poly（ADP−ribose）inmice．1mmunol唱γ．34，501，（1978）

7）Kanai，Y．andFujiwara，M．：Naturallyoccur−
ringantibodiestopoly（ADP−ribose）inautoim一

mune MRL／Mp一秒r／妙rmice．Clin．E＊．Im−文献

mZJ乃O7．，59，132．（1985）

1）横張龍一：共通テーマ，全身性エリテマトーデス（SLE）と妊娠．厚生省特定疾患自己免疫疾患調査
研究班昭和62年度研究業績，p．26，1988．
2）Isonishi，S．and Kanai，Y．：Antibody to poly
（ADPTribose）asapredictorofobstetriccom・

8）Kanai，Y．，Kawaminami，Y．，Miwa，M．Matsu−−87−

Shima，T．Sugimura，TMoroi，T．and

Yoko−hari，R．：Naturally−OCCurrlng antibodies topoly（ADP−ribose）in patientswith Systemic
lupus erythematosus．Natu柁（London）．265，
175（1977）

エリテマトーデスモデルマウスを用いた微生物代謝
二次産物の治療効果に関する研究
藤 原 道 夫＊
研究協力者 伊藤 聡事，斉藤忠雄＊，渡部久実＊

I．ProstatinおよびDioctatinの効果

牌中の免疫グロブリン，特にIgG産生細胞数を算

エリテマトーデスを自然発症するMRL／砂γマ

定することによって推し測ることができる1，2）．実ウスの多クローン性B細胞活性化とループス腎

験各群の牌中IgG産生細胞数を表2に示す．DSP炎の発症に対する上記代謝産物の効果を調べた．

投与群では著しく低下していたが，他群は未処置

両者とも不溶性なので，一定量の粉末を乳鉢にとマウスに比して有意差はなかった．
3）腎糸球体への免疫複合体の沈着に対する影り，Tween20を2，3滴々下して乳棒でよく粉砕墾

し，5％アラビアゴムを加え，1mgないし0．1mg／
mJの懸濁液とした．これらを10ないし1mg／kg

腎凍結切片を常法通りFITC一標識抗マウスC3になるようにマウス腹腔内に投与した．マウス5で染色し，腎糸球体への免疫複合体の沈着の程度

週齢から投与を開始し，週3回，7週間に捗って投を調べた．螢光初見は0から＋4までの5段階に与を行い，13週齢目に屠殺して免疫学的検索を分けた．DSP投与群では蛍光初見が弱くなってい

行った．既に有効性の示されているデオキシス

た（平均1．4）が，他の群は2．8−3．3で有意差はみ

パーガリン（DSP）5mg／kgも同様に投与した．

られなかった．

1）腹腔リンパ節重量に対する影響

以上の結果からProstatinおよびDioctatinと

MRL／砂γマウスは加齢に伴って全身のリンパ節腫脹をきたし，それが抑えられるかどうかはこもにループス腎炎の発症に対する予防効果はみられないと判定された．

のマウスを用いて治療効果を検定する場合のよい指標となる1・2）．上記のプロトコールに従って授与

ⅠⅠ．MRL／わrマウスのリンパ節腫脹に対するデして13週齢で処分したときの各群の腹腔リンパオキシスパーガリン（DSP）の効果

節の重量を表1に示す．DSP投与群ではリンパ節

DSPがMRL／砂rマウスにみられるリンパ節

腫脹が殆んどみられなかったのに対して，Pros−の腫脹を抑制することは既に述べた．リンパ節のtatinならびにDioctatin投与群では腫脹は全く

腫脹はThy−1，2＋，L3T4−，Lyt−2￣，B220＋細胞

抑えられていなかった．

の著しい増殖によっていることが分っている．

2）牌中IgG産生細胞数に対する影響

DSPがこの細胞群に対してどのような影響を及MRL／砂γマウスではリンパ腫脹に伴って多ク

ぼすかについて検討した．Thy−1，2はbiotin標識

ローン性にBリンパ球の活性化がおこり，これは抗Thy−1，2→PE標識avidinで染色し，B220は
FITC−標識抗B220（Dr．Morse，NIHより供与さ■新潟大学医学部医動物学

れた）で染色した．Flowcytometerによって末梢ー89−

表l Prostatin，Dioctatin投与のMRL／砂rマウス
リンパ節腫脹に対する影響．
マウス数

表2

腹腔リンパ節重量（g）

Prostatin，Dioctatin投与のMRL／砂rマウスにみられる多クローン性Bリンパ球活性化に対する影響．

±S．E．

マウス数

IgGPC（×104）／脾
±S．E．

10mg／kg4

308±461mg／kg4367±76lOmg／kg4425±101

1mg／kg4383± 72

Prostatin
lOmg／kg
1mg／kg40．84±0．2140．82±0．12

Prostatin

Dioctatin
lOmg／kg4

1．24±0．39

1mg／kg4

1．21±0．24

Dioctatin

DSP
5mg／kgUntreated

40．31±0．04

41．01±0．20

DSP
5mg／kgUntreated

4

97±

4

341± 677

血より分離したリンパ球について調べた二重染色パターンを図1に示す．未処理MRL／砂γマウス

この実験系を用いてDSPlOmg／kgi．p．の効果

でdoublepositivecellsは37．9％だったのに対しを調べた．このとき比較のためシクロスポリンAて，DSP5mg／kg投与群（C：13−15遇および（CyA，100mg／kgperos），シクロフオスフアミ

17−19週，d：17−19週）で各15．0％，20．1％と減少

ド（CP，100mg／kgi．p．）ロイケラン（Leu200JLg／

していた．最も著しい変化はThy−1，2￣，B220＋細kgperos）も用いた．以下に代表的な実験例を示

胞の減少だったが，図2に示すようにこれはす．

sIgM十のB細胞の減少によるものではない．全体

bm12マウスにB6脾細胞5×107を0日と7としてB220十のThy−1，2−pOSitive又はThy−1，2日目に移入した．上に述べたサンプルを0日から

weakly positive T細胞を減少させており，これ連日13日目まで投与し，14日目に屠殺して検索がエリテマトーデスの発症を阻止する原因となっを行った．GVHRが起こっている一つの指標としていると考えられる．

て多クローン性Bリンパ球活性化が挙げられる．
ここでは牌中のIgMおよびIgG産生細胞数にⅠⅠⅠ．DSPの移植細胞対宿主反応（GVHR）に対す

よって測定した．図3に示すように，末処置（VT，る影響

GVHRを起こし，サンプルは投与しない）マウス

GVHRはさまざまな条件によって起こり，多彩に比してDSPおよびCP投与群では有意にな免疫学的異常をもたらす．その中にはエリテマ

IgMPC，IgGPCとも抑制されていた．CyAの場合トーデスを含む自己免疫疾患を発症する例も知らは逆にIgPCの著しい増加が観察された．腎糸球れている．我々はC57BL／6（B6）マウス牌細胞な体への免疫複合体の沈着程度を免疫蛍光法で調べいしそれより得たL3T4＋T細胞（1〜5×107ケ）をた．結果は図4に示す．CPで最も弱くなっていた（B6×bm12＋）Flないしbm12マウスも移入するがDSPでもC3の沈着は完全に抑えられてい実験系を用いた．この系では自然発症マウスよりた．IgGの沈着は弱いながら観察されたが有意には軽度ではあるがループス腎炎を発症してくる3・4）．また肝5・6）・膵7）にも自己免疫疾患様病変が■bm12マウス：B6マウスの〟1（Aβ）変異マウスで，起ってくることが分ってきた．
−90−

ここのみ異なる．従って移入B6L3T4＋T細胞はIa抗原の差を認識し，GVHRを起こす．

エリテマトーデスモデルマウスを用いた微生物代謝二次産物の治療効果に関する研究
MRL／Ipr−Untreated
1
辞

】

2

1

2

・

．％

a

b

．A

＜＞

・

し・
…
●
● ●●

￣
、1 ￠

3

●
●

4

0

0

●
■

●
■3

●

含

． 匁

4
●

●〇・

●

■
■
●

●
◆

●

〇
く
＞

●
■

●：
孝

○

●

● ●

●

・
l

◆ ●

．l J：
，I
■t一
・
〇

4 ．■ ●

●
l
rl

●
・

■ ●

ふ√ ・

▲
く勇

● ●

＿ ．弾
ゝ．
●
日．
1 ‥

‥ ‥■
l

100

101

一 日 … ll＿

一 一 日 ＝ ■l102

■ ■ 日 日 ■

103

一一
一一一
ヽ
■
■一一
■
■
1−ヽ
．
■

一 ‥

104

■…

100

■l

■

■‥

101

＿

■川 l

■ ■ ‖ …

102

■l

103

一 日

■H

l

104

N
▼●く
＞ヽ
J＝
トー

MRL／／Pr−DSP（13−18W）

MRL／／P，LDSP（17．18W）

1
こ

毎

2

1

●1

成

C
▲
「）

2

許

●

d

．
．
．・
㌧ヽ

●

●

：：哲

も

。ウ ・‥

・
◆二
●l
3
■

‥＆

・

● ◆○
． ．も
●■

▼一 ・〝

4

璃
＜
ク
・
．
ち ∴
J○
小
爪
叫
さ
．

l

l

●◆

0

． ◆ ●3

4

聾

ケ

4

・．′
◆ ■

◆

・ ◆

●小

◆◆

ヽ9

●

◆

ヲ
…E 、＼．
■ 日

100

ー●●
ヽ

日川 l

▲一 ¶ コ 」 ＿‖川l‥ 日川 l

101

102

103

●
＿ ＿
＿
■

104

100

日

日

川

101

l

一

日

＿＿ノヽヽ一一■・
■￣h
‥

一日l

■

102

B220

回l DSP投与の末栴血リンパ球ポピュレーションに対する影響（1）a．末処置MRL／妙′マウス末檜リンパ球ポピレーション
b．対照としてのMRL／nマウス
C．DSP投与（13−14，17−18週齢）MRL／砂rマウス
d．DSP投与（17L18週齢）MRL／砂rマウス

−91−

＝

■＝

103

■l

104

MRL／／pl−Untreated
1

2

1

a

b
◆
●

・ ○
り
・●
・

∴

・㌢

V
衰

◆◆
9

9

●
♂ ●

V

●

軋

由

4

・

2

￣
・
ヽ■
tt11
、
り

〇・
○

■
、
・
・
・
−
●

●

睨 ．
d
◆ ・ ●◆

4

，

■・●

l

l

「

l

l

l

100

l

●

101

：芸

H

1

H

l

■リ

一

日

102

■ ＝

■l

103

■

一

日

ヽ

l

一
・
．
托
｛
．
．
．
j〝
I−
い
・
ユ
′
・
■
†
ノ／
l H …■
l

．．＿

I

4

ll
●
′
′
：
ll・
・
∴▲
■
）

●

ヽ一 一′

ノ
、●

・．
レ3

＝

− 日 日■
l■
l

101

104

■ 日 日川I

102

103

2

1

1

2
d

C
勺

●
l

も

h

4

・●
も
燕rl

．：

・

三言
子＋
常
− 日 日川 l

100

101

匁 二二

■ 日 日…l

102

◆・

．爺

p ・。 ピ
●．
。モ針

． tn

●
√㌢

○

○

104

MRL／／Pr−DSP（17，18W）

MRL／／Pr−DSP（13−18W）●♪

I ＝ 日 日■ ■＝ … ll

103

∴

一 ■
■l：
J・ ＼、
▲
7 ．人
．
．
欝

4

・
○
○
。

肇

・

●1
●㌔

4

●

○
◆ ○ ●
◆
日 日川 l

H

104

．

100

◆

一 日 ■… リ■ 日 日川 l

102

103

101

8220

図2 DSP投与の末檜血リンパ球ポピュレーションに対する影響（2）a．末処置MRL／砂γマウス末梢リンパ球ポピレーション
b．対照としてのMRL／nマウス
C．DSP投与（13−14，17−18週齢）MRL／砂rマウス
d．DSP投与（17−18週齢）MRL／砂rマウス−92−●＝ ● ■
104

エリテマトーデスモデルマウスを用いた微生物代謝二次産物の治療効果に関する研究
Prevention of GVHR・

Numbers oHgPC per Spleen（×104）

●

0
0
5

︵寸01×︶∪遥ds La OdゴーO SLg∈コZ

●

0
0
4

UT：untreated
CyA：CyCl0SpOrin A
DSP：deoxyspergualin
CP：cyclophosphamide

0
0
3

●

Leu：leukeran（Chlorambucil）

●

0
0
2

●●

00

●●ヽ

100

⊂b
（：b
O

●●

IgM lgG lgM lgG lgM lgG lgM lgG lgM
UT

図3
Prevention

of

CyA

DSP

CP

Leu

DSPのGVHR抑制効果（1）脾IgPC数に対する効果

GVHR…lFlntensities

of

brn12

Grade with or without tmmunosuppressant

文

‡

0

巨；；呂

献

1）Shiraki，M．，Fujiwara，M．and Tomura，S．：
Longtermadministrationofcyclophosphamide
inMRL／lmice．I．Theeffectsonthedevelop−
ment ofimmunological abnormalities andlupus nephritis．Clin．ExP．Immunol．55，333（1984）．

2）Makino，M．，Fujiwara，M．，Aoyagi，T．and童：！

Umezawa，H．：Immunosuppressive activities
Ofdeoxyspergualin．I．Effect ofthelongTterm
administrationofthedrugonthedevelopment
ofmurinelupus．Immun（ゆharmacoIcw14，107

ミ：

lgG C3lgG C3lgG C31gG C3lgG C3
UT

CyA

DSP

CP

（1987）．

Leu

3）Gleichmann，E．，Van EIven，E．H．and Gleich−mann，H．：Immunoblasticlymphodenopathy，
SyStemiclupuserythematosus，andrelateddis−

図4 DSPのGVHR抑制効果（2）腎蛍光所見○：蛍光陰性，1：弱陽性，2：中程度陽性，
3：強陽性，4：最強陽性

低下していた．CyAおよびLeuでは抑制は認められなかった．
以上のように，DSPはGVHRによる自己免疫の発現にも抑制的に働くことが示された．その働orders．Am．J．Clin．月7thol．72，708（1979）．
4）伊藤 聡，斉藤忠雄，渡部久実，藤原道夫，荒川正昭：MHCクラスⅠ移植細胞対宿主反応による
lupus nephritisの抑制．第19回日本免疫学会総会記録．p．457，1989年11月札幌．
5）Saitoh，T．，Fujiwara，M．，Nomoto，M．，Makino，M．，Watanabe，H．，Ishihara，K．，Kamimura，T．
andIchida，F．：Hepaticlesionsinduced bygraft・VerSuS−hostreactionacrossMHCclassII
antigens：Animplicationforanimalmodelof

きはCPに比適していた．現在免疫抑制剤として知られているCyAにはこの系では抑制効果は全
くなく，逆に症状を悪化させる面があった．

primarybiliary

cirrhosis．Clin．1mmlLnOl．Im一

m‡′〃呼α′如7．49，166（1988）．

6）Saitoh，T．，Fujiwara，M．，Nomoto，M．，Kami−
mura，T．，Ishihara，K．and Asakura，H．：His・
tologlC Studies on thehepaticlesionsinduced−93−

bygraftTVerSuS−host reactioninMHC classII
disparatehostscomparedwithprimarybiliary
Cirrhosis．Ame71J．f助thol．135，301（1989）．
7）斉藤忠雄，五十嵐美徳，藤原道夫：L3T4十細胞移−94−

人によるMHCクラスⅠⅠ移植細胞対宿主反応（GVHR）−NODマウス類似の膵島炎および外分泌腺導管の変化．第19回日本免疫学会総会記録．
p．82．1989年11月札幌．

各種微生物二次代謝産物による病変の修飾に関する神経病理学的研究
生 田 房 弘＊
研究協力者 武田茂樹事，永井克孝＊＊

Bactobolinは，ミエリン分画を抗原とするラッ染色を施し組織学的に検討した．

トEAEに対する抑制効果9）ばかりでなく，脊髄2．結果とまとめhomogenateを抗原とするラットEAEに対し治臨床的にいずれの薬剤投与群のラットも，対照療効果を有する6）．しかしながら，Bactobolinは急

EAEラットに比較し，麻痔の持続時間が短かっ

性毒性が強いことが難点であり1，2），より微量で有た．しかし，Bactobolin単独投与と，併用投与群

効な治療効果を上げる薬剤が望まれる．そこでの間に，差は認められなかった（表1）．

我々は，まずBactobolinと他剤を併用すること

各群におけるEAE病変の数を表2に示した．

によるEAEの抑制増強効果の有無について検討

Bactobolin単独投与，Benadrostinとの併用投与を加えた．ついで，Bactobolin単独投与の際の最いずれも，形成されるEAE病巣は比較的多い

少有効量について検討した．

が，個々のEAE病変は小さく，また，対照群に比べて，より慢性化したものが目立つ．一万，15−

Ⅰ．Bactobolinと他剤併用によるEAE抑制効果

Deoxyspergualinとの併用投与群では，3例とも，

1．実験材料と方法

小脳や間脳に癒合性の広範なEAE病変が認めら

Bactobolinは，一昨年の我々の実験6）で，治療効れ，対照群よりも，むしろ強いEAE病変を示し果が明らかに認められた0．1mg／kg量を用いた．

た．
すなわち，Bactobolinは単独では0．1mg／kg量

併用した薬剤は，Benadrostin10mg／kg4・5）と15−でも，EAE発症後投与により，RatEAEを臨床

Deoxyspergualin5mg／kg3）である．
EAEは6週齢雄Lewisrat各々3匹にモJt／モ

的にも，病理組織学的にも抑制した．また，Bena−

ツト脊髄homogenateを抗原として作製した．感

drostinや15−Deoxyspergualinと併用しても，そ作目をdayOとし，薬剤はPBSに溶解し，いずれの効果は増強されず，特に15−Deoxyspergualinも発症後から臨床症状の認められる期間腹腔内投とめ併用は，EAEを悪化させる．むしろ，単独投与した．動物は全てday29で漂流固定した．表1

与の方が有効であると思われた．

に対照EAEラットと薬剤投与群の臨床経過を示した．

ⅠⅠ．Bactobolinの最少有効量の検討
1．実験材料と方法

EAE病変の検討は，一昨年と同様5・6）嘆球から脊髄円錐に至る全中枢神経系を標本化し，HE，KB＊新潟大学胞研究所実験神経病理学部門
川新潟大学脳研究所神経生物学（客員）部門

Bactobolin O．1mg／kg，0．05mg／kg，0．01mg／

kgの3段階の量を腹腔内投与し，対照EAEと比較検討した．BactobolinはEAE発症当日より臨
−95−

表1
Severity of＝」丁寧≡………窄Su諾rS管10．7±0．6543210

表2

SuppressionofRatEAEbyBactobolinwithorwithoutOtherDrugsafterOnset
Mean No．oflesions（mg芯。y，慧 Survivors［
2／3＞13．0±5．6

3／3

8．6±1．911．3±0．6

3／3

8．8±3．7

11．0±0

3／3＞12．4±3．6

Control l0．7±0．6
Bactobolin O．1
Bactobolin

11．0±00．1

Benadrostin lO．O
Bactobolin O．1
15−DSG

5．0

No．oflesionsfoundNo．ofspecimensexamined

床症状発現期間中，各々上記量を連日投与した．

投与群のNo．2ラットがcannlbalismによりday

表3に対照EAEラットと薬剤投与群の臨床経過12で死亡した以外，全例回復した．組織学的検索を示した．

は，0．1mg／kg投与群のNo．2ラットを除いてEAE感作はこれまでと同様に行い，EAE病変行った．

の組織学的検討も全中枢神経系について行った．

対照群ではいずれも癒合性の大病巣は少なかっ

2．結 果

た．血管周囲性のgliosisを伴う比較的古い脱髄病

Bactobolinを投与した3群は，いずれも，ほぼ巣も多いが，単核細胞の浸潤像を示す新しい病巣同様かつ同程度のEAE症状を呈した．0．1mg／kgも目立った（図1）．

ー96−各種微生物二次代謝産物による病変の修鰍こ関する神経病理学的研究
表3
Severjty of酬…翫準甑．／彗S
9．4±0．5

5432105 4 3 2 ュ 0

9．2±0．4
543210● − −− − −9．4±0．9

BactobolinO．1mg／kg投与群では，臨床的に原としたラットEAE系では，感作当日からの投比較的軽症に経過したNo．1ラットに，対照5例

与では本剤の抑制効果は期待できず，むしろEAE

いずれのラットよりも強いEAE病巣を認めた．

発症後の連日投与で初めて抑制効果が得られるこ

検索した全ての切片で，病変は癒合性で大型ないとを示した6）．

し中等大であり，比較的古い病変が目立つが，新また，EAE系に対し，現在まで検討された

しい病巣も混在していた．これ以外の3例では，Bactobolinの投与量は，体重1kgあたり3mg，1

病巣は微小かつ比較的古いものが多かった（図mg，0．6mg，0．5mg，0．3mg，0．1mgの各量であ2）．

る6・8・9）．本剤の誘導体であるActinobolinは安全域

Bactobolin O．05mg／kg，0．01mg／kg各々を投が広いものの，EAEに対する有効な治療効果は見与した群は，同様の組織像を示した．両群ともに，出されておらず7・10），急性毒性の強い本剤の最少有

癒合性の広範な脱髄病巣（図3）を示すラットが多効量を知ることは重要である．

く，それ以外でも，大型から中等大の脱髄病巣を今回の実験で，0．1mg／kg投与群4例中の3例多数認めた．いずれも対照群に比較し，強い病巣

で．は，殆どは微小なEAE病変を認めるのみであを示した．

り，有効な治療効果を示していた．しかしながら

3．考 案

1例に強いEAE病変を認めたことは，注意しておBactobolinが牛脳塩基性蛋白（MBP）を抗原とく必要があると思われた．

するラットEAEに対し，感作当日より連日，およまた，0．05mg／kgおよび0．01mg／kg群で，対び発症後連日投与いずれでも，抑制効果を有する

照例でも認められない癒合性の広範な脱髄巣を多ことは田平らにより示された9）．

くのラットで認めたことは重要と思われた．なぜ他方我々は，モルモット脊髄homogenateを抗なら，Bactobolinはこのような少量では，逆に−97−

ていく上で，考慮しておかなければならない所見と思われた．
4．まとめ

脊髄homogenateを抗原とするラットEAE系
J

では，Bactobolinの最少有効量は0．1mg／kgと推1・∵．・こ ∵．十・㌦∴∵つー⁚対訳等・■言．﹂．㍉㌦■㌻∴汀畢∴ ∵㍉二一∵一∵草信組

馳

鍼彫

定された．より少量である0．05mg／kg，および0．01mg／kgでは逆にEAE病変を増強させる効
果のあることを認めた・

文

献1）青柳高明，小川慶治，小島蕗子，永井真知子，原田滋子：生理活性物質の概要．厚生省新薬開発研究費，青柳班，昭和62年度研究報告書，17−
23（1988）．

2）深津俊三，魚沼和遺，武部英日，今井 敏：微生物二次代謝産物の開発研究．厚生省新薬開発研究費，青柳班，昭和62年度研究報告書，151−
157（1988）．

3）生田房弘，武田茂樹，永田伴子，永井克孝：Sper−gualin（SPG）による急性EAEの抑制．厚生省新薬開発研究費，青柳班，昭和60年度研究報告書，
59−64（1986）．

4）生田房弘，武田茂樹，永田伴子，永井克孝：15−
Deoxyspergualinの急性EAEに対する抑制一長期観察とBenadrostinとの併用L．厚生省新薬開発研究費，青柳班，昭和61年度研究報告書，
69−76（1987）．

∴3
図1対照EAEラット．中等大の病変が多い．大脳．
HE染色．×45．
図2 Bactobolin O．1mg／kg投与ラット．微小なEAE病変を少数認めるにすぎない．大脳．HE
染色．×45．
図3 BactobolinO．05mg／kg投与ラット．癒合性の広範な脱髄病巣を認める．小脳．HE染色．
×45．

ト二八卜病変を増強することをこの結果は示してい
ろ．Lうに思われるからである．0．6mg／kg投与例8）
亡も，川様な癒合性の広範なEAE病変を多くの）、ソトで認めており，Bactobolinの薬効を追求し

5）生田房弘，武田茂樹，永井克孝：15−Deoxysper−
gualinとBenadrostinの併用投与による急性
EAEの抑制．厚生省新薬開発研究費，青柳班，昭
和62年度研究報告書，89−91（1988）．
6）生田房弘，武田茂樹，永井克孝：Bactobolinによる急性EAEの抑制．厚生省新薬開発研究費，青柳班，昭和62年度研究報告書，93−95（1988）．
7）生田房弘，武田茂樹，永井克孝：ActinobolinとDiprotinAの急性EAEに対する影響．厚生省新薬開発研究費，青柳班，昭和63年度研究報告書，
97−101（1989）．

8）永井克孝，小山内たか，村上隆稔，武田茂樹，生
田房弘：実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）に関する二次代謝産物治療剤の検索．厚生省新薬開発研究費，青柳班，昭和63年度研究報告書，
103−106（1989）．

9）田平 武，挑 大林，山村 隆：BactobolinとarphamenineAのEAE抑制効果について．厚生省新薬開発研究費，青柳班，昭和61年度研究報告書，51−53（1987）．
10）田平 武，本山和徳，田平順子，西澤正豊，宇宿
功市郎：自己免疫性脳脊髄炎，神経炎の治療薬開発．厚生省新薬開発研究費，青柳班，昭和63年度
研究報告書，49−55（1989）．

−98−実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）に関する二次代謝産物治療剤の検索
永 井 克 孝＊・＊＊
研究協力者 小山内たか書，村上隆稔＊，武田茂樹＊＊＊，生田房弘＊＊＊

bactobolinはラットEAEに対して0．3mg／kg

bactobolin（0．1mg／kg）とpoststatin（1．0mg／kg）

以下の投与でも治療効果を有していることが認め投与群ではすべて4％paraformaldehydeによるられた1）．なるべく低濃度での投与が望まれ，その潅流固定を，pOStStatin（0．1mg／kg）投与群は10％

結果0．1mg／kgの濃度でも治療効果を認めた2）のformalinによる浸潤固定を行った．喚球から馬尾でその効果の再現性について検討した．しかしなにいたる全中枢神経系に約2mm厚の，43〜54のがら，この薬剤は毒性が強いために，その使用に割を加え，parafhn包埋後，得られた切片にHE，は限界が予想される．その為に，bactobolinで認KB染色を施行した．組織検索は前例について，血められた治療効果と同等あるいはそれ以上の効果

管周囲性のEAE病変をかぞえるとともに，病変を示す薬剤の検索が急務である．今回は新しくの新旧と，その大きさにも着目し，比較検討した．

bactobolamine，pOStStatin，dioctatinAをとりあげ，ラットEAEへの治療効果を比較検討した．

結果 と 考察EAEラットの臨床経過と病変数を調べた結果を実験材料と方法

表1と表2に示した．ラットは全例11日目に発症

7週齢ルイスラット雌にモルモット脊髄抗原をし，薬剤の投与は同日から開始した．11〜30日目

感作した．使用した薬剤の種類と鱒与量を表1にまでの各群（5匹分）についてtotalclinicalscores示した．薬剤はPBS溶液あるいはtween

80とで比較した時，COntrOl群に対して有意な治療効

0．5％アラビアゴム・PBS溶液として調整し腹腔果を示したのはbactobolin0．1mg／kg投与群で内投与を行った．投与は発症直後から開始し，麻あった．しかし，1．0mg／kg投与群では5匹中2匹痺のみられる期間中行った．EAE症状の評価は動がこの期間中に死亡した．これは本剤の強い毒性

作緩慢，立毛等の一般状態の悪化を1，歩行障害をによるものと思われた．

2，下肢麻痔を3，四肢麻痔を4とし，これらに失bactobolamine，pOStStatin，dioctatinAの投与

禁，下痢等が加わった場合に1を加えた5段階評

では，tOtalclinicalscoresからは有意な治療効果価とした．

は認められなかった．今回は，比較的totalclini−

EAE病変程度の評価は次のように行った．すな

calscoresの少なかったbactobolinO．1mg／kgとわち，感作後38日目に表2で示されたcontrol，

poststatin（0．1mg／kg，1．0mg／kg）投与群につい■東京大学医学部生化学
書■新潟大学脳研究所神経生物学（客員）部門
H■新潟大学脳研究所実験神経病理学部門て病理組織学的に検討した．
Control群について：5例の1切片あたりのEAE病変数は30．6±10．6であった．No．1，2は病
−99−

くつ

寸

く＝〉

、

亡つ

N

ぐつ

く⊃

叩

く⊃

ノ￣￣＼

′■、

くつ

■・■

⊂⊃

N

▼・・」 ⊂⊃ ⊂＝〉

ぐつ

く＝〉

トN

N r／つ

▼−■

ぐつ

N N T．・■

ぐつ

ぐ1つ

岩

∞N

く＝〉

−■

肌N
寸N

ぐつ

CN

寸

NN
IN
ON

N N

く＝〉

⊂1つ

一・・イ ⊂つ

▼・・」

N

亡1つ

⊂⊃

▼・・■

寸

寸

▼・．■ I．・■ 寸
●
●

N

⊂⊃

▼・・■

▼・・」

「」

N

■−」

くつ

▼一・■

ぐつ

Fつ く＝〉 くつ

く⊃

く⊃

▼・．■

く＝〉

⊂⊃

I．一

くつ

N

M N I．」

I．・」 ▼−■ ▼−■

▼・・」

くつ

くつ

I．」

く＝〉

寸 ￣

⊂⊃

N

⊂⊃

，・J N N

▼・・」

ぐつ

N

⊂⊃ ▼・．■

▼γ 寸

M

くつ

くつ

くつ

くつ

く．D Pつ

れ

くつ

くつ

⊂⊃

⊂⊃

（．C・く⊃

m

−■

⊂⊃

くつ

⊂⊃

【−

くつ

くつ

⊂⊃

巴

÷・
のl
トt

巴

二

二千

ぐつ

く⊃

くつ

N

叩

く＝〉

⊂⊃

くつ ▼・・−l T．・■

寸

ぐつ

く⊃

▼・・」

Lr）

N M

Ln

寸

下が

Llつ

■寸

ぐつ

Lr）

いつ

▼・・」

くつ
寸

⊂⊃

寸

Lrつ

くつ

寸t

の

【」

▼・・■

▼・・・■

コ︶

句
トー

Ln

寸
▼・．■

1J）

▼−イ

㌘王ら＋∞

Ot

01 ヨ

Ln

巴

ヨ MI ZT

l∫つ

の

St

SJ巴u∵凹d山UOS旨︶⁝qM竜完S謡︼○邑−OS︺U遥凹 t捕︵U︒焉ZでコEE二岩内S詮pO？コ︶をp＼SJ巴の＼S巴OUSle⁝uコU

Lr）

ノ■■ヽ

の

寸

Ch

Ln

⊂つ

く＝〉

Ln N

くつ

Uつ

ぐつ

トー

Lr）

Ln Ln

（：に〉

t−

ぐつ
N
▼−イ I．・・」

l寸一
▼・．」

寸
▼・．■

ぐつ

＿D

Ch

．凸
∪つ L∫つ く工〉▼・．■ ▼−」 ▼−」N

寸ぐつ▼−」 ▼・．■

▼・．■

▼・．」
▼・・−1

N Lr
▼・．■
▼−■
、ヽ■ノ
）

ぐつ
▼−■

ぐq
▼−1
ヽ一一′

【、 寸

（：に〉 Ln

r−1

▼−■

▼・．■

Cb

▼・．」

▼・．」

d
ぐつ
N Lrつ
t．」
▼・．■
I．・■
▼一・ィ

．亡t
．凸
Ch Ln■
ヽ−・′

ヽ−．■′

d
【■−
−−｛
ヽ＿＿′
ヽ−′

h〇．ON

S︻dE⁝ud

澄＼朝23：亘u叫︺雲UO己

毎号餌Et．〇

如き瑚2凸二餌ミ瑚E1．0★u⁝︺雲S︺SOd

毎号餌2〇．Ol

址モ餌E≡

餌草加29一茸＼洋三Uu⁝∈ヱOqO︺U再的瑚ミ餌∈︻．〇uHOqO︸U内田加美餌Et．OlOとUOU︵盲UE小謡上告Ou︶

ShOJ叫qコuH

100

苫SコpUSSUSS害しむきSdコOJ‡曇だ言責至PU＝○壱OUuU選ぶS20USl眉uHUu壱Uuだ萎PU声・S⁝＞三qゴ⊇＞三内・p岩S︸2−○増○⁚⁝口．長3壱叫US遥盲dOu召意p官省？三qu焉琶石・旨雲毒芯S遷宮dOPu号tOよ⁚≒︸扁膏d・田2已○空くUhg書誌020JpLOUl眉ds登−票u葛⁚暑

宍

′

くつ

のト

︵OC

（

N

T
N
l

寸 く．D ぐつく⊃ 【■、− 【、
▼−1

qq

違 法】

ぐつ

N

Oト

霊t

SUJOUStdU⁝u U︻雲○↑．亡実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）に関する二次代謝産物治療剤の検索
表2
Inhibitors

EffectsofproteaseinhibitorsonEAEinrats

No．of

Lesion／Section Mean±SD

animals
02

Control

961／43＝22．3

30．6±10．6

4
1

852／49＝17．4（nonetreatment）
9
1

2097／48＝43．7
22

1747／49＝35．7
431556／46＝33．8
01

550／46＝12，0

5
0
2 1

Bactobolin（0．1mg／kg）

17．6±6．9

1059／51＝20．8
823／51＝16．1

81370／49＝28．0
2
1

753／51＝11．2

6

Poststatin

786／45＝17．5

21．4±13．4

3
2

799／45＝17．8
2
1（1．0mg／kg）

3
1

211／46＝4．6〔No．1，2，3では1177／45＝26．2

13．3±7．5〕212045／50＝40．9

3
1

Poststatin

697／54＝12．9
11＞1133／51＝22．2

71（0．1mg／kg）

418／46＝9．1／〔No．1，3，4，5では12．0±2．8〕

4
1561／53＝10．6

51

714／46＝15．5

変数が少なく，癒合性の病変も少ない．gliosisを21．4±13．4であった．N0．3のように極めて少数の伴う慢性期にあると思われる病変が多いが，単核EAE病変を示す例やN0．5のようにCOntrOlと球の浸潤を伴なう新しい病変も認められた．他の同程度の病変を認める例があった．control群の3例では，癒合性で比較的大きな病変が多く，単核

No．3，4，5に認めた癒合性の大病変を示す例はな

球の浸潤を伴なうものが目立っていた．小さな病

いが，No．3以外では中等大の病変が目についた

変でも新しいものが混在していた（図1）．

（図3）．単核球の浸潤を伴なう病変がbactobolin

Bactobolin0．1mg／kg投与群について：5例の投与例よりも目立っていた．

1切片あたりのEAE病変数は，COntrOl群との間

Poststatin0．1mg／kg投与群について：この群に有意差は認めなかった．しかしながら，癒合性は10％formalinによる浸潤固定の為に他の3群の病変は明らかに少なく，COntrOl群より単核細よりも標本がよみにくい．No．2以外の1切片あ胞の浸潤を伴なわない古いものが目立っていたたりの病変数は12．0±2．8でcontrol群にくらべ（図2）．病巣の大きさと新旧病変の比較から明らかにEAE病変数は少なかった．1mg／kg投

bactobolinは，いったん形成されたEAE病変の与群より叫、さな病巣が目立っていた．新旧の病進行を抑制している可能性が推測された．

巣の混在は，ここでも認められた（図4）．

Poststatin1．0mg／kg投与群について：1切片

1mg／kg投与群では，N0．3のように，極端にあたりの病変数はばらつきを示し，平均値はEAE病変が軽い例もあるが，他の4例の結果から−101−

図1対照EAEラット．癒合性で比較的大きな病変を認める．小脳．KB染色．×45．
図2 Bactobolin0・1mg／kg投与ラット．癒合性の病変はなく，小型ないし中等大の病変が多い．大脳．KB染
色．×45．
図3 Poststatinl・Omg／kg投与ラット．癒合性の大病変はない．多くの病変は中等大で，数も多い．大脳．KB
染色．×45．
図4 PoststatinO・1mg／kg投与ラット．微小病変（矢印）を少数認めるにすぎない．大脳．KB染色．×45．

はこの量では抑制効果があるとはいえない．一万，0・1mg／kg投与群では，No．2以外はEAE病変は明らかに少なく，抑制効果が得られた可能性がある．しかしながら，組織固定の問題もあり，追試で確認することが望まれた．
以上の結果より，ラットEAEに対してbacto−bolin O．1mg／kgで再現性ある治療効果が認められた．病理組織学的所見から，pOStStatinについて

文献1）永井克孝，小山内たか，村上隆稔，武田茂樹，生
田房弘：実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）に関する二次代謝産物治療剤の検索．厚生省新薬開発青柳班，昭和63年度研究報告書．p．103−106，
1989．

2）生田房弘，武田茂樹，永井克孝：各種微生物代謝産物による病変の修飾に関する神経病理学的研
究．B．Bactobolinによる急性EAEの抑制．厚生省新薬開発青柳班，昭和62年度研究報告書．p．

EAI川棚制効果が予想される結果が得られたので，さらに検討を加える．

−102−

93−95，1988．

インパルス応答から見た各種免疫調節剤の作用解析と比較和 田 孝 雄＊研究協力者 小森正樹＊，黒田重臣＊＊

緒

論

方

免疫学の領域においては，Jerneに代表される法

1．対象患者と検査項目ようなネットワーク理論に基づくシステム論的な正常コントロール2名，全身性エリテマトーデ

考えかたが根づいている．またそれを反映して，

ス1名，慢性関節リウマチ6名，慢性血液透析患

システム工学的な立場から免疫系にアプローチし者3名について，30週ないし60週にわたり，毎週ようとする試みも決して少なくはない1・2）．しか1回，末梢静脈から採血し，血祭IgG，CD4，CD8

し，この10年間における生化学の急速な進歩とあを検査した．各種の免疫調節剤を授与し，サラゾ

いまって，免疫制御に関与する因子が次々と知らピリンについては血中濃度を測定し，投与量またれるようになり，従来の微分方程式を中心としたは血中濃度の変動が免疫ネットーワークに及ぼすモデリング手法では，免疫ネットークの取扱いが影響についても研究した．

きわめて困難な状況が出来上ってきている．

2．多変量自己回帰モデルのあてはめ
多変量自己回帰モデルは以下の式によって表わ和田らは7年間にわたって，文部省統計数理研究所所長．赤池弘次博士が開発した自己回帰モデされる．

ルによるフィードバック解析法3▼5）をライフサイ

Xi（S）＝∑∑aij（m）xij（sLm）＋ni（S）

エンスに取入れる試みを行なってきた．それによって，この方法は内分泌学，代謝学，免疫学なこの式の意味するところは，ある変数Xiの現在

どのデータ解析に適用可能であるという証明が得の値を他のいくつか（K個）の変数Ⅹj（自己をもふられてきている6￣12）くむ）の過去のm時点における値の重み付け総この方法を用いて，われわれは昨年までの青柳

和，つまり線形和として表現することにある．こ班の研究で免疫調節剤の作用幾序について研究をの時の重み付け係数を自己回帰係数と呼ぶ．n沃S）

推し進めてきた．今回の研究では，ベスタテン，

は上記の線形和ではうまくあてはまらない誤差部

カルフェニール，サラゾピリンなどの各種免疫調分であり，これをホワイトノイズと呼ぶ．
まず実測値からなる時系列データに対して式1

節剤の免疫ネットワークに及ぼす影響について探求した．

のあてはめを行なう．その原理は一般的な統計手■慶応大学腎臓センター法において，たとえばXとYの観測値からY＝＊■国立大蔵病院内科

aX＋bという形の理論的回帰曲線を求めるのと−103−

同じである．つまり最小自乗法を用いて実測値と行列Ⅹ（S）から次の式で求められる．

理論値との誤差つまりホワイトノイズni（S）が小X（S）＝HZ（S）

さくなるように自己回帰係数を選べばよいのであH＝［I O O……0］

る．ただし，式1において，過去のいくつの時点

またⅤはホワイトノイズに相当する部分の行列（m）までさかのぼればよいかを決めること，つま

である．
k
N
O

り最適次数Mを決定するのが難しく，この点につO

いては赤池が考案したAIC（赤池情報基準量）を用いた高度な計算法が用いられる．
こうして自己回帰係数が決定すれば，その時系
列データに最適の自己回帰モデルが決定したことになる．これを用いて赤池のパワー寄与率を算出
し，また以下の方法でインパルス応答を求めたが，今回はパワー寄与率についての検討は省略する．

ここでⅠ・および0は上記の式と同じく，単位行
列ならびにゼロ行列である．上記の状態方程式に

3．インパルス応答
自己回帰係数aij（m）はXlの過去の動きがXjのおいて，まずZとVの要素をすべてゼロの状態に現在の動きに対して影響を与える程度を規定するしておき，ある時点Sでホワイ トノイズ行列の中係数である．したがって自己回帰係数行列を利用のある特定の変数に該当する要素にインパルスとして系のダイナミクスを表現する状態方程式を作して1．0というような値を入力する．こうしてることが出来る．

Z（S），Z（S＋1），Z（S＋2）を，1段階前の状態変数か以下の式は赤池の状態空間表示として知られるものである．

ら次々に求めて行き，その行列の各要素をプロットして行けば，各変数の変化を図示することが出来る．これがインパルス応答と呼ばれるものであ

Z（S）＝甘Z（sTl）十Vる．

ここでZ，V，中は全て行列である．ことに甘は結

以下のごとく自己回帰係数からなる行列である．
A
A（1）A（2）……………A（M−1）

I

O

O

I

O

O

1）リウマチ性疾患患者と透析患者における免疫

伽0 0 0Ⅴ＝

果

調節異常の相違点
図1の上半分にはリウマチ性疾患患者におけるIgG対CD4の応答を示す．IgGにホワイトノイズの2SDに相当する大きさのインパルス入力を行なった時のCD4の応答を見ると，コントロールではCD4が陰性の応答を示すのに対して，RA患者

0

0

0

では陽性の応答を示している．またSLEでは0

ここで行列の要素A（1），A（2）‥．などは，それ自CD4が低下と上昇をくりかえし，系の不安定性を身も行列である．またⅠおよび0は上記の式と同示している．図の下半分には透析患者における応じく，単位行列ならびにゼロ行列である．また上答を比較のために示してある．

記の式においてZ（S）は状態変数と呼ばれ，観測値

透析患者においてはCD4の応答が非常に遅延しー104−インパルス応答から見た各種免疫調節剤の作用解析と比較
IMPULSE RESPONSE：lGG−CD4
1MPULSE＝2SD

1．5

／・
（＼＼
／
■
＼
′・
／／ R2 ノ ′ 、 言

1

0．5

▲。．
エ フ／ ／

訂

了

、
＼・
＼、 ．
−．
、
．
＿
．
．
＿・
へ
＼ ＼

．
、．
、．
、

、

二

二二

0
・・、

．．＿．．．・．・‥ ・さ・； …ぺ● ・、 ・・ 、霊

．．＿

二

二

二

●二

二

ン

こて

∴

∴

・ ■ ●

′．一一・一・・・・・一・・●−■′●●● ■ 一l1．1．

︵課︶山SNOdS山∝寸凸0

・

l

．◆

l

S

l

l

l

l

1

1

′ 一一 ノノーへ

丁 ●、 ・一 ・ ＼
・・： 二

c

ノ
＼

て

一 ・一 二・・‥．．．．
l ，2●■■●−￣ ・

l

0

l

1

／
ノ ・一

＼

一・・一●●
一
一

l

2

嘉

一

グ

′

■

一

‥
■ヽ
・−●−

■

．‥

l

5

1

一一

一一

一一 ・一

￣

￣

￣

… …

一

一●●−■

I

4

■■
一一・・一 ・￣H ●D￣3

1．【 ．＿ 一・一 ・三二 ・二 二二 ‥ 一一…
フ／、品ヽ ●H2 ■■
D l

l

3

1

一一′

′

．一・づ

1

l

l

l

6

7

8

‥

‥

● ‥

￣

．・‥

l

9

WEEKS

図1IgGにインパルスを与えた時のCD4の応答．凡例は以下のごとし．
Cl：コントロール1C2：コントロール2

Sl：SLE患者
Rl：RA患者lR2：RA患者2
HD：透析患者ていることが一見して認められる．

類似性に一致する所見である．透析患者では2例

図2はCD4にインパJL／スを与えた時のIgGのにおいて陰性応答が見られるが，残りの1例では応答を示す．2例のコントロールにおいては陽性

逆応答になってしる．しかし，いずれにせよ応答

応答を示したのに対し，RA2では応答が弱く，様式は3例ともに非常に援徐であり，これが透析

SLEおよびRAlでは陰性応答が見られた．この患者における大きな特徴となっているように思わことはこれらの疾患においてCD4細胞にヘルれる．

パー細胞の機能が失われている可能性を示してい以上のごとき各病態に特有な免疫ネットワーク

るが，CD4／8比の点から見たSLEとRAl症例の異常様式は，当然ながら免疫調節剤の効果発現に−105−

JMPULSE RESPONSE：CD4−IGG
IMPULSE＝2SD

C2
■
●
一
●
HH一
一
一
●
−
■
●
●
、
、
■
■
●
cl
●
■
、
、
・
・
・
・
▲
・
、
・
、・
．
、
■
■
、
．
′
・
ノ・ 、
こ●
、
・
・
・
・
・
、
、
．
．
．
．
．
＿
．
′
・
r′
．
ノ＿
．
＿
：
火
■
も
：
一
・
一
一
七
・
二
：
・
・
・
七
三
山
肌＿
…．
∴
・
・
、
ぐ

、㌫ノ 「

／／／

＼
ヾ′
sl

、
、￣
一
￣
●
￣
●
′
■
′

￣
、

￣
￣
叫

／／

＼
／
＼、／／
Rl

l

l

l

l

l

l

l

l

l

l

l

／
￣
■
、
／
一
、
・
、HD3
．
／
、
＼
′
、
＼
／
■
・
・
・
・
‥
●
■
‥
●
C2・
・
・
・
・
・
・
、
、
、
＼
．
諺′
■

cl

■
、
●
、
−
■
■
、
・
・
・
・
・
二
・
㌔

．
、
、
、
．

、
、●
●
・
ヽ
・
ヽ
・
＿
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
・
一
・
…
・
・
㌣
∵
七．
一
号
霊
：
二
：
二一
・
一
ヽ
−
＼
■
・
．
＼
＼、
、

／′一一サ
工

＼

図2

二
二

7

8

二

二
■
こ
■
二

、
・
．
ノ／ ．

し
、−）／

1

二
二

HD2 ／

＼

0

二

2

・
・
●HDl

3

4

5

6

9

WEEKS

CD4にインパルスを与えた時のIgGの応答．凡例は図1に同じ．

も影響を与えると思われる．このような背景をふ（RAl）ではむしろ陰性の応答が見られる．これはまえて以下の解析を進める．

先にのべたIgGの応答と結びつけて考えるとよ2）各免疫調節剤の作用解析

く説明される．すなわちRA2ではIgGの応答が

図3−5にカルフェニールによるIgG，CD4，CD8のインパルス応答を示す．図3はIgGの応答であ強いためにCD8がそれを抑制しようとして，強く陽性に応答したように思われる．
図6−8にコントロールおよび透析患者におけるるが，2例のリウマチ患者ではコントロールに比ベスタテンによるインパルス応答を示す．図6はしてかなり強い陽性応答が見られる．
図4はCD4の応答であるが，コントロールではベスタテンに対するIgGの応答である．透析患者

陰性応答であるのに対して，リウマチ患者では2では3例ともに強い陽性応答を示すのに対して，

例ともに陽性応答を示している．

コントロールではごく弱い陰性応答を示してい

図5はCD8の応答である．コントロールおよびる．

1例のリウマチ患者（RA2）では強い陽性応答が

図7はベスタテンに対するCD4の応答を示す．

見られるのに対して，もう1例のリウマチ患者

この応答はIgGの応答に対してほぼ逆方向の応−106−インパルス応答から見た各校免疫調節剤の作用解析と比較
IMPULSE RESPONSE：CARPHENYL TOIGGIMPULSE＝100mg

25
● ■
′

ヽ

20

15
1⊃
＼＼
b8
∈

10

ロ
くつ
■■

一

一

一 ●

5

、−■
・
・・ 一一 一 十 ノへ■ ・・一 ・ 一

・ 、 一・ 一・ ・・ …

一一 一一 ・・ ・二

‥∴

＝ニ

‥ニ

：∴

：∴

：∴

：∴

＝ ． …．： ■＝ ＿ ＝＿． ■． ＿． ．．■ ＿ ■＿．

0

−5

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10111213141516171819

20

WEEKS
−CONT（F．Y．） ・・・・・RAl（K．T．） ・・・RA2（M．Y．）

図3

カルフェニールに対するIgGのインパルス応答．
lMPULSE RESPONSE：SP TO CD8［MPULSE＝1．0

′
′■
、
ヽ

′ ‥

ヽ●●
●
− ゝ…

0

1

2

3

4

5

‥

‥

一 一一

一 、−

− ●■

一
一・
■
●
■一
一
・
●
−′■
■
■●一
一‥

6

7

8

9

10111213141516171819

20

×3．5DAYS−RAl（S．T．）

・・RA2（K．S．）

・・・RA3（S．H．）

図4 カルフェニールに対するCD4のインパルス応答．
答を示しており，しかもそのタイミングから見てて動かされているとすれば，むしろ陽性の応答とIgGによって動かされている部分が多い．

なるべきところであるが，そうはなっていない．

図8はベスタチンに対するCD8の応答を示す．

これらの状況を矛盾なく説明するには，ベスタチ

CD4の場合とは異なりIgGの応答によって動かンはむしろB細胞に作用すると考えるのが妥当されている部分は少ない．もしIgGの応答によっ

であろう．

−107−

IMPULSE RESPONSE：CARPHENYL TO CD8
IMPULSE＝100mg

l
L
1
O
9
O
8
7
6
5
4
3
2
O
O
O
O
O
O

㌔の凸U

′−■●

ヽ‥

− ‥

一一■−‥

‥

＝

■＝

一 一一 一 日

一

1
O
0
O

・
、・
・
・

、

′
■

．
ノ

ノ・
●■

−い
■
●…

・…

…

…

一

1
O
2

一

0

1

2

3

4

5

6

7

8

910111213141516171819

20

WEEKS
−CONT（F．Y．）・・・・・RAl（K・T・）

図5‥・RA2（M・Y・）

カルフェニールに対するCD8のインパルス応答．
lMPULSE RESPONSE：BESTATIN TO tGG
tMPULSE＝20mg

70

h
ハ
J ＼
＿
＿、
J
L ／
＼

60
50

／

￣
叫、
＼
＼ 、
、

40
て）
＼
bO
∈

30

U
U

20

Jノ
■
・
、
、
、
、
1．
け
＼
、
豆
■
●
￣
● ￣
・
、
・
一
・
日
−
＿
．
．
．
＼
、
1
−
‥‥・
一
：
●
：
￣
：
・
二
・
‥
・
＝
・
；
・
い
．
．
＿
、
＼
ヽ
弓

10
0

リ
（
、
≠

−10

ヾ
／
J

−20

￣
●
t
■
●
●
t
￣
；
・
＝
−
：
・
二
・
二
・
：
・
：
こ
‥
ゝ：
㌫＿
．
．
＿
‥
＿

．
ィ

l
0

l
1

l
2

、
●
こ
￣
●
●
●
￣
￣
￣
・
…
・
・
、
、

l
3

1
4

−■1
5 6 7

1
8

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
9 10 11 1
2 13 1
4 15 16 17 18 19 20

WEEKS−CONT（T．W．）・・・・・HDl・‥HD2

図6

−−HD3

ベスタテンに対するIgGのインパルス応答．

図9−11はサラゾピリンの血中濃度がIgG，
CD4，CD8に対して影響する様式を示す．いずれ

考えると，他の炎症因子などに影響している可能性のほうが高い．

の場合も3例の間に多少の解離が見られ，この免疫調節剤が直接にこれらの免疫因子に作用していると考えるには根拠が薄弱である．この結果から
−108−

考

案

リウマチ性疾患患者においてはTリンパ球のインパルス応答から見た各種免疫調節剤の作用解析と比較
IMPULSE RESPONSE：BESTATIN TO CD4
1MPULSE＝20mg

耳

＼

吉 ′

一
・
・
一
・
‥
＿
＿
●
、
＿
．
、
＿
●
．
…．
＿
．
．
．
．
．
＿
…
＿
，
＿
＿
…
，
＝
＿

山一
一
一一
一一
一
・
一
一￣

−
い

・
‥
一
・
一
一
だ
＿
…
．
．
＿
…
＿
．
−
…
．
＿
川．

、
芦

言 ∴了

●

l ／＼
／
、
、
／、
／
り
も
0

1

2

3

4

5

6

7

8

l l l l l171819
l l l20l
10111213141516

9

WEEKS
−CONT（T．W．）・・・・・HDl

図7

‥・HD2

−−HD3

ベスタテンに対するCD4のインパルス応答．
1MPULSE RESPONSE：BESTATIN TO CD8
1MPULSE＝20mg

l 一
八
六
日∴
Jl
／‖ 、
．

′
、

●
㍑
荘
二
二
：
二
二
二
￣
二
一

l

l

0

1

l

2

、

V

l

l

3

l

4

l

5

l

l

l

l

6

7

8

9

l

l

l

l

l

l

l

l

10111213141516171819

l

l

20

WEEKS
−CONT（T．W．）・・

・HDl

‥・HD2

−−HD3

図8 ベスタテンに対するCD8のインパルス応答．
機能異常があることが多くの研究者によって指摘

ただし，このCD4／8比の意味するところはかな

されてきた．臨床の場ではこの機能異常を示唆す

らずLも明確ではない．この比のみならず，CD4

る最も単純な指標として，末梢血液中のCD4細胞

細胞ならびにCD8細胞そのものも，従来いわれてとCD8細胞の比（CD4／8比）がよく用いられていきたへ）レバー細胞，サブレツサー細胞という単鈍る．

な分類では説明出来ない点があり，一般臨床家の−109−

lMPULSE RESPONSE：SP TOIGGIMPULSE＝1．0

20

15

10
て）
＼
bβ
E

5

U
U

■

0

パ

・ ・ノ

…

●

、■■●
■ ・一 ・…

…

…

・ …

…

− …

▲・・一 ・日

●

■

一

一

■

■

￣ ￣ …

−5
′ ′

＼

ノ

ー ／

／

−10

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10111213141516171819

20

×3．5DAYS−RAl（S．T．）

図9・・・・・RA2（K．S．）

・・・RA3（S．H．）

サラゾピリンに対するIgGのインパルス応答．
lMPULSE RESPONSE：SP TO CD4
IMPULSE＝1，0

0．4
0．3

J

・

′

ヽ

′

一

一

一

■

■

◆

−

●

●

−

■

■

−

●

■

−

0．2
0．1
ae
寸
⊂】
U

0

、、、

、

、、ヽ

■…

■−

●−

●■一

一

■●

■●′

一

■−

■

、

−

●

、

−

■

￣

−0．1

−0．2

−0．3
−0．4
0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10111213

14151617181920

×3．5DAYS−RAl（S．T．）

図10

・・

・RA2（K・S・）

日・RA3（S．H．）

サラゾピリンに対するCD4のインパルス応答．

た．しかし臨床検査においては情報取得に限界が間に混乱を生じている．
そもそもへ／レバー，サブレツサーという制御論あり，わずか1回の採血でCD4とCD8の間にあ的な立場から生まれた動的な概念を，両者の比とる関係をある程度推察しようとするためにやむをいう静的な概念におきかえることには無理があっ得ず生まれた臨床的な知恵であったとはいえよ−110−インパルス応答から見た各種免疫調節剤の作用解析と比較
lMPULSE RESPONSE：CARPHENYL TO CD498765432．
10．12345
00000000000000
一一一−一
㌔寸凸U

1MPULSE＝100mg

ヽ ＿一一 ■●￣−、●、 、 一一 、− − −●− ●、 一、 三● 三一＝ 、− ●、一 一 ，一 一‥

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

一 一 一■ ●●一 一・日・一一 …

一 一●一 ●一 一一 …

‥

一 一…

■●● − …

●…

10111213141516171819

・− …

20

WEEKS
−CONT（F．Y．）

・・…RAl（K．T．）

・

RA2（M．Y．）

図11サラゾピリンに対するCD8のインパルス応答．

う．

いようである．しかし，たとえセカンダリーなもこの方法を用いてまず，正常人，リウマチ性疾患患者，透析患者についてのネットワークの相違のとはいえ，免疫ネットワークにも作用していることはほぼ間違えなさそうである．

点を明らかにした．このような病態による基礎状

今後，これらの成績をふまえて，免疫調節剤の態の差が厳然として存在するかぎり，その時に投開発のありかたをより深く探求してみたい．こと与される免疫調節剤の効果もまた異なるのが当然にベスタテンをリウマチ疾患患者に投与してみるであろう．ことにベスタチンが透析患者においてことは非常に興味深いものがあるが，そのためにのみIgGの代謝に明らかな影響をおよぽすのも，はトライアルをするための理論的根拠が現時点にこの状態においてIgGの代謝異常が存在すればおいていささか薄弱であることが障害となっていこそであるといえる．またこの薬剤の効果がTリる．少なくとも副作用はほとんど無に近いものでンパ球機能を介するものと考えるよりは，むしろあるので，専門家ともう少し討議して，治験の方

Bリンパ球を介するものと考えるほうが妥当であ針を決定したいと考えている．

ろう．
カルフェニール，サラゾピリンについても，イ

結論

ンパルス応答の様式から見てかなり一定の免疫作

ベスタチン，カルフェニール，サラゾピリンな用が考えられたが，ベスタチンほどの明らかな作

どの免疫調節剤の作用機序を自己回帰モデルによ用は見られなかった．この2薬剤共に，抗リウマり解析し，インパルス応答という形で視覚化してチ作用はよく臨床的に確認されているので，その比較した．これによって抽象的な表現として用い作用をTリンパ球と結びつけて考えるよりはむられてきた免疫調節作用を具体的な概念として表しろ抗炎症作用などに関係づけた方が説明しやす

現することが可能となった．この3薬剤ともに，−111−

免疫調節と呼ばれるべき作用があることは肯定的に確認された．またベスタテンについてはIgGの産生異常を正常化するという証拠が得られた．他の2薬剤に？いてはB細胞の機能を介してT細胞に影響する可能性が考えられたが，この免疫調節作用とこれまで知られている臨床的な効果とを

5）赤池弘次，中川東一郎，ダイナミックシステムの統計的解析と制御，サイエンス社，1972．
6）Wada，T．etal．Autoregressivemodelsprovide
StOChasticdescriptionofhomeostaticprocesses
inthebody．ノ砂．J．NephYOl．28：263．268，1985．
7）Wada，T．et al．Frequency dependency of
CauSalfactorsforhypertensioninhemodialysIS

patients．ノ砂．J NQh7Vl．28：1231L1248，1985．
8）Matuo，N．andWada，T．：Spectralanalysisin
analyzing the data of SIADH．1n Recent
AdvancesinPediatricNephrology（Murakami，K．et al．eds．）．Erceゆhl Medica，New York，

直接結びつけるべきか否かについて疑問が残る．
各種炎症因子などに直接作用し，間接的に免疫調1987．pp．595−598．

節に影響している可能性を否定し得ない．

9）Wada．T．，Aoyagi，T．，Kojima，F．，Umezawa，
H．：Dynamic relationship between hydrolytic

文

enzymesandtheimmunesysteminrheumatic献diseasesJ Clin．Biochem．JuLtY12：71−81，1987．

1）Jilek，M．，Prikrylova，D．：Somenotesonmath−ematical modelling．In Immunology andEpidemiology，Lecture Notesin Biomath・
ematics．，Vol．65（Eds．G．W．Hoffman and T．
Hraba），pp．8−14．Springer，Berlin（1985）．
2）Bell，G．I．，Perelson，A．S．and Pimbley，G．H．
（Eds．）TheoreticalImmunology．Dekker，New
York（1978）．
3）Akaike，H．：Someproblemsintheapplication
Ofthecrossspectralmethod．InSpectralanaly−
Sisoftimeseries（Edit．B．Harris），Wiley，New
York，1967，p．81−107．
4）Akaike，H．：Ontheuseofalinearmodelfor
theidenti丘cation of feedback systems．Ann．
九扉∴弘頭扉．∽〟肋．20：425−439，1969．

10）WadaT．，Yamada，H．，Iso，T．，Udagawa，E．：

Application of multivariate autoregressivemodelling for analysis ofimmunologic net−

WOrks．Co〃ゆut．Math．Applic．9：713L722，1988．
11）Wada，T．，Jinnouchi，M．，andMatumura，Y．：
Applicationofautoregressivemodellingforthe
analysis ofclinicaland other biologicaldata．
A犯払血S，■肋班．血Sと20：425−439，1968．
12）Wada，T．，Aoyagi，T．，Kojima，F

−112−

and

Umez・

awa，H．：Feedbackanalysisofrenin−angioten−
Sin system under the effects of angiotensin
COnVerting enzymeinhibitors．Biotech．4秒l．
βわC毎払10：435−446，1988．

微生物二次代謝産物の免疫抑制効果，とくに腎炎発症・進展の抑制について
大 久 保 充 人＊
共同研究者 鎌田貢寿春，真崎義彦＊

1．ニュージーランドB／W Flマウスの進行したを週4回，皮下投与した．15−dsp群9匹には，50

糸球体腎炎に体する15−deoxyspergualinの効

JLlのPBSに溶解した15−dsp6．7mg／kgを週4

果．一同−マウスにおける検討−

回，皮下投与した．40週齢で治療後の検討を行った．

目

観察項目は表1に示すごとくである．蛋白尿の的これまでに，ニュージーランドB／WF．マウス

評価はヘマコンビスティックスⅠⅠⅠを用い，随意尿（B／Wマウス）に発症するループス腎炎に対しを0−4十の四段階に分けた，血清中抗DNA抗て，腎炎が発症する14週齢より15−deoxysper−

体価は，double stranded DNAを抗原とした

gualin（15−dsp）を投与すると，）t／−ブス腎炎の発

ELISA法にて行った．腎組織所見の評価では，す症・進展が抑制され，生命予後はコントロール群

でに報告2）したごとく，管内細胞増生所見は，そのの平均40週に比べて，99週まで延命することを程度に応じて，0−3点の評価を与えた．係蹄壊死お報告した1）．本研究では，すでに発症したB／マウ

よび管外細胞増生所見は，糸球体にその所見の無スのループス腎炎の治療の可能性について検討をいものを0点，0−30％の糸球体に所見の有るもの行った．

を1点，30−60％の糸球体に所見のあるものを2
点，60％以上の糸球体に所見のあるものを3点と対象および方法

して，それぞれ得点を与えた．蛍光抗体法所見で日本チャールズリバー（株）より購入した32適

は，メサンギウム領域への沈着と，末梢血管係蹄

齢のB／Wマウスを用い，32週齢で片側腎摘し，壁への沈着に分け，それぞれ陰性を0点，陽性を治療前の組織学的検討に用いた．片側腎摘後一週

1点，強陽性を2点として評価した．統計学的処

間以内に死亡したマウスは，腎摘による侵巽の影
響が強いと判断し本実験より除外した．腎摘後一週間以上生存した32匹のマウスについて32週齢より40週齢まで実験を行った．マウスは3群に分け，コントロール群14匹には，50／JJのPBSを
週4回，皮下投与した．PSL群9匹には50／JJのPBSに溶解したメチJt／プレドニソロン20mg／kg■北里大学内科−113−

表1観察項目1）マウス生存率
2）蛋白尿
3）腎糸球体の光顕所見a）管内細胞増生b）係蹄壊死C）管外細胞増生
4）腎糸球体の蛍光抗体法所見a）IgG沈着b）C3沈着p＜0．05

COntrOI PSLtreat．
図215−dsptreat．

蛋白尿に対するPSLおよび15−dspによる治療の効果

理は，マウス生存率はchisquaretest，その他はを示し，コントロール群と差異を認めない．15−dsp

Wilcoxonsignedranktestで比較検討した．

群のマウスは，40週齢まで一匹も死亡せず，38週
齢以降，コントロール群に比し，有意な変化を示

結

した．

果

1．マウス生存率：結果を図1に示す．コント

2．蛋白尿の推移：治療前後の蛋白尿の経過を

ロール群マウスは，35週齢より死亡するものが現

図2に示す．各群のマウスの治療前後の比較では，れ，40週齢では14匹中4匹のみが生存し，生存率

いずれの群でも有意差を認めないが，群問の比較は28．5％であった．PSL群もほぼ同様の生存曲線

では，コントロール群と15−dsp群に差異（♪＜−114−

微生物∴次代謝産物の免疫抑制効果，とくに腎炎発JJl三・進展の抑r帖二ついて
pく0．05

Smu苛u写≡﹂−0巴00S一男○ト
beforeafter

beforeCOntrOI PSLtreat．

after

beforeafter

15−dsptreat．

図3 腎糸球体病変（光顕スコア）に対するPSLおよび15−dspによる治療の効果

Photol．LightmiCrograph oftheglomerulitakenfromtheindividualmicebefore（uppercolumn）andafter（lowercolumn）thetreatment．

Theleft：COntrOlmouse；thecenter：PSL−treatedmouse；theright：DSP．treatedmouse．

0．05）を認めた．すなわち，コントロール群では，なかった．上記三つの所見に与えられた得点の総蛋白尿が増加ないし不変の傾向であるのに比べ，和を比較検討した結果を図3に示す．各群の治療

15−dsp群では減少傾向であった．

前後の比較では有意な差異は認められなかった

3．腎糸球体の光顕所見の比較：管内細胞増生が，群間の比較では，15−dsp群がコントロール群

所見，係蹄壊死所見，管外細胞増生所見を，それに比し有意（♪＜0．05）な変化を示した．コントロー

ぞれ独立に評価した結果では，各群の治療前後のル群では全例で組織得点が増加したが15−dsp群

比較，群間の比較で，いずれも有意な差異を認めではほぼ変化が見られなかった．Photolに各群−115−

Sl扇Od名言量−0200ヱ巾10ト
before after before after before after

COntrOl PSLtreat．

図415−dsptreat．

腎糸球体沈着IgG（IFスコア）に対するPSLおよび15−dspによる治療の効果
p＜0．01盲0︶ゝpOq；uqくN？岬luV

図5

血清抗DNA抗体活性に対するPSLおよび15−dspによる治療の効果の治療前後の光顕写真を示した．

認められなかったが，群間の比較では，15−dsp群

4．蛍光抗体法所見の比較：IgGの糸球体へのはコントロール群に比し有意（♪＜0．05）な変化を沈着は．メサンギウム領域および末梢血管係蹄壁示した．すなわち，コントロール群では，全例でへの沈着を，それぞれ独立に検討すると，各群の得点増加がみとめられたのに比し，15−dsp群で治療前後の比較，群間の比較でいずれも有意差はは，大きな変化を示さなかった．補体成分C3の糸見られなかった．メサンギウム領域，末梢血管係球体への沈着は，メサンギウム領域，末梢係蹄壁，

蹄壁への沈着の総和を比較検討した結果を図4にあるいはその両方の総和について検討したが，い示す．各群の治療前後の比較では，有意な差異はずれも有意差がみられなかった．

−116−

微生物二次代謝産物の免疫抑制効果，とくに腎炎発症・進展の抑制について

5．血清中抗DNA抗体価の比較：結果を図5

炎の進展を抑制し，延命治療効果をもたらした．

に示す．各群のマウスの治療前．治療後の抗DNA抗体価の比較では有意差は認められないが，群間の比較では，15−dsp群で，コントロール群に比し有意な差異が見られた．コントロール群では，全例の抗DNA抗体価が上昇するが，15−dsp群では，上昇傾向は見られなかった．
考察

15−dspは，B／Wマウスのループス腎炎の発症・進展を抑制するだけでなく，すでに発症したループス腎炎の治療にも有効で，有意な延命効果をもたらした．この延命効果は，コントロール群に見文

献1）Okubo，M．，Masaki，Y．，Kamata，K．，Sato，N．，
Inoue，K．，Umetani，N．：Immunosuppressive
modeofactionofdeoxyspergualininmice，aS
comparedwithcyclosporineAandmizoribine．
㍑タ〜車エP和C．21：1085−1087，1989．
2）Kamata，K．，Okubo，M．，Uchiyama，T．，Masaki，Y．，Kobayashi，Y．，Tanaka，T．：Effect ofmizoribine onlupus nephropathy of New
Zealand Black／White Fl hybridmice．Clin．
力刀川gJ〃OJ．九研削叩卵塊正33：31−38，1984，3）Okubo，M．，Inoue，K．，Umetani，N．，Sato，N．，
Kamata，K．，Masaki，Y．，Uchiyama，T．，Yan，
Ⅹ−J．，Aoyagi，T．，Shirai，T．：Lupusnephropath・
yinNew Zealand F．hybridmice treated by（−）15・deoxyspergualin．KidnqyInt．34：467r
473，1988．

られる腎糸球体への免疫グロブリンの沈着増加と糸球体障害の進展が，15−dspにより抑制された結果と考えられる．さらに，15−dspが血清中抗DNA

2．ニュージーランドB／W Flマウスの進行した

抗体価の上昇を抑制したことは，15−dspが，腎炎

糸球体腎炎に対するbactobolamineの効果

関連抗体の増加を抑制し，腎糸球体への抗体沈着を抑制したことで，糸球体障害抑制効果が得られ目的たと推察される．15−dspは，抗体産生細胞の分化

Bactobolamine（BBM）は当研究班で開発され増殖を直接的に抑制する1）だけでなく，T細胞亜た微生物二次代謝産物の一つで，bactobolinや分画のⅠし2産生に関わらない細胞（TH・2細胞）

actinobolinなどと類似の構造を有する（図1）．永の分化増殖を抑制することから3），抗体産生細胞

井らはEAEのモデルでBBMが免疫抑制効果を抑制効果だけでなく，T細胞に直接影響を与える有することを報告している1）．われわれは進行しことにより，腎炎治療効果を発揮することが考えたニュージーランドB／W Flマウス（B／Wマウられる．

ス）にBBMを投与し，その治療効果を検討した．
結材料ならびに方法論

28週齢メスB／Wマウス（日本チャールズリ

15−dspは，B／Wマウスに発症したループス腎

Bactobotamine

Bactobolin−HCI Actinobolin

O o H赴OH O

CH3OH NHCCNHCOCHCH3

NH（S）

CHC12

ム㌔NH2

l

COCHCH3
NH2

図1Bactobolin，ActinobolinおよびBactobolamineの構造式−117−バー）を4群に分け，PBS50／JJ（コントロール群）の程度に従って，各0−3点を与えた．また，凍結あるいは，BBM3．5，7．5，15または30mg／kg体

試料よりクリオスタットで4ノJの切片を作り，重相当量をPBS50J〟に溶解したものを週4日

FITC標識抗マウスIgG，IgMまたはC3（Cap−

腹部皮下に投与した．毎2週体重測定を行い，40pel）と反応させ，蛍光抗体法により糸球体沈着Ig

週齢で屠殺し，採尿．採血後，腎臓を摘出し，以および補体を検索した．沈着の程度は，メサンギ

下の検査を行った．尿蛋白はHaemacombistixIII

ウムおよび末梢係蹄にかんして0−2点に評価し（三共・マイルス）で半定量し，血清IgG抗DNAた．データはM±S．e．m∴で表示し，差の検定はStu−

抗体活性はELISA法で測定した．摘出した腎は

dent sttestで行った．

一部をドライアイス・アセトンで迅速凍結し，残りをバッファー・ホルマリンで固定した．ホルマ

結

果

リン固定試料より2ノノ切片を作成，ヘマトキシリ

40週齢屠殺時において各群の蛋白尿の程度をン・エオシンおよびPAS染色し，光学顕微鏡を用比較した（Tablel）．BBM15および30mg／kg群

いて腎糸球体の病変を観察した．評価はすでににおける蛋白尿は各0．6±0．22および0．8±0．27で報告した方法2）に準じて行い，intracapillarypr0−

あり，対照群の2．7±1．11に比して有意に低値で1iferation，eXtraCapillary proliferationおよびあった．一方，抗DNA抗体価にかんして，30mg／

tuft nerosisにかんして病変の程度または広がり

kg群の0．20±0．079は対照群の0．46±0．365に比Tablel Thelevels ofproteinuria and serumIgG anti−ds DNA antibodiesin B／Wmice treated withbactobolamine．

Micegiven，S．C．，4times／week，bactobolamineat：Controlmice

3・5mg／kg

No．ofmiceProteinuria＃
Anti−DNA，OD＃＃

757．5mg／kg
515mg／kg
530mg／kg5

2．7±1．11

2．1±1．43

1．6±1．29

0．6±0．22＊

0．8±0．27事

0．46±0．365

0．78±0．390

0．65±0．259

0．37±0．267

0．20±0．079日＃‥Proteinuriawassemi−quantitatedasOto4＋．DatawereshownasM±S．e．m．；＃＃：anti−DNAactivitieswere
measuredwithELISA（seetext），andexpressedasOD．■：P＜0．05vcontrolmice；Hp＜0．05V3．5mg−and7．5

mg−grOupSOfmice．

Table2

ThehistologicalandimmunohistologicalfindingsinB／Wmicetreatedwithbactobolamine．
Micegiven，S．C．，4times／week，bactobolamineat：Controlmice

3・5mg／kg

7・5mg／kg

15mg／kg

30mg／kg

No．ofmice

7

5

LMscore＃6．5±2．07

7．0±1．15

6．6±1．34

6．0±0．00

3．0±1．00＊

C3

2．4±0．79

2．6±0．55

1．8±1．50

0．9±0．74■

0．3±0．45＊

IgG

3．2±0．57

2．8±0．96

1．9±1．34

1．0±0．71■

0．6±0．42■

5

5

5

IFscore＃＃＃：LMscorewasthesumofintrcapillaryandextracapillaryproliferationandtuftnecrosis，tOtalingOto9（seetext）；＃＃：IFscorewasthesumofdepositioninthemesangiumandalongtheperipheralcapillaryloops，
totalingOto4（seetext）．＊：P＜0．05vcontrolmice．

−118−

微生物二次代謝産物の免疫抑制効果，とくに腎炎発症・進展の抑制について較して差を認めなかった．腎の組織学的所見にかはなく，不明である．われわれがBALB／Cマウス

んして，BBM30mg／kg投与群における腎糸球体

脾細胞を用いて行った予備実験の結果，BBM20の光学顕微鏡的スコア3．0±1．00は，対照群の〃g／mJを培養開始時に玩油川で添加すること

6．5±2．07に比べて有意に低値であった（Table

により，IL−2産生の抑制やCon A，Enterotoxin2）．また，免疫組織学的所見にかんしても，腎糸A，PHAPなどに対するIectin反応性の抑制が対球体におけるC3およびIgGの沈着はBBM15照に選んだcyclosporinA200ng／mlと同程度にmg／kg群および30mg／kg群において，対照群に認められた．この結果から，BBMはヘルパーT細比較して有意に減少していた．

胞機能を抑制すると思われるので，現在BALB／C
マウスでの検討を続けている．

考察

BBMはすでに進行したB／Wマウス糸球体腎炎に対して15−30mg／kg週4回授与することにより，蛋白尿の抑制，腎組織および免疫組織学的所見の改善を認めたことより，腎炎の進行阻止な
いし改善効果を有すると考えられる．有効投与量15−30mg／kgは同マウス糸球体腎炎に対する15−deoxyspergualinの有効量1．5−6．0mg／kg，週

文献1）永井克孝ほか：実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）に関する二次代謝産物治療剤の検索．厚生省新薬開発青柳班，昭和63年度研究報告書p．
103−106，1989．

2）Kamata，K．，Okubo，M．，Uchiyama，T．etal．：
Effect ofmizoribine onlupus nephropathy of
New Zealand Black／White F．hybrid mice．
CJg〃．力77〃77g卯J．ム77777gJ〃（ゆα才力0ム33：3ト38，1984．
3）Okubo，MリMasaki，Y．，Kamata，K．etal．：

4回投与3）に比べて約5−10倍である．一方，マウス

Immunosuppressive mode of action of deox−

におけるBBMのLD5。＞100．0mg／kgも15−deo−cyclosporineAandmizoribine．77tlnQl．伽C．

xyspergualinの38．4mg／kgに比較して約3倍で4）青柳高明ら：自己免疫疾患治療薬の開発研究．A．
生理活性物質の概要．厚生省新薬開発青柳班，昭
和63年度研究報告書p．15−22，1989．

あり4），BBMは比較的毒性の少ない薬剤であると考えられる．BBM免疫抑制機序にかんする報告

yspergualinin mice，aS COmparedwith

21：1085−1087，1989．

−119−

Bactobolin，Actinobolin，Foroxymithineの実験的アレルギー性神経炎に対する治療効果の検討
井 形 昭 弘＊
共同研究者 出雲周二＊＊，田代アリシアH，高橋浩一日，伊地智俊暗＊＊
三村芳弘暮春，納 光弘＊＊，植村慶一＊＊＊

末梢神経に対する自己免疫がその病態として考症して初めて治療の対象となる。治療薬の開発にえられているGuillain−Barre症候群の病態解明

おいても発症後投与にて治療効果の判定をする必と治療薬の開発を目的として，その疾患動物モデ要があると考えられる．治療的投与に関する報ルである実験的アレルギー性神経炎（EAN）1，2）を

告は実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）に対用いて本研究班で開発された微生物二次代謝産物

してBactobolinが治療効果を示したことが報告

がEANに対してどの様な効果を及ぼすかを検討されたが6），昭和62年度，我々はEANに対してしてきた3・4・5）．その結果，（1）15−Deoxyspergualin

BactobolinO．5mg／kg・day，Foroxymithine400

がEANのinduction phaseに対する投与にて臨〟g／匹・dayの投与量で治療実験を行ない，その量

床的，組織学的にEANの発症を遅らせ，病変の程では有意の治療効果は兄い出せなかったことを報

度も軽度で明らかな抑制効果が認められた．（2）

告した4）．今回我々は，さらに投与量を増やして検Bactobolinはinductionphaseに対する投与で著討するとともに，Bactobolinの誘導体でより毒性

明なEAN抑制効果が認められ，発症後の治療的の少ないactinobolinについてもその大量投与で投与では0．5mg／kg・dayの投与量で有意の効果のEAN治療効果について検討した．

をみいだせなかった．（3）ForoxymithineはEAN
材料・方法の進行を遅らせ，軸索変性を減じる効果がみられた．（4）ForphenicineにEAN抑制効果はみられ〔実験1〕ず，また，（5）T細胞分画にrichで，自己免疫疾患

EANの惹起：雄成熟Lewisラット14匹を使の発症，進行とともにその活性の低下がみられる用した．抗原は植村らにより牛馬尾神経より精製

DAP−IVの阻害剤であるDiprotin Aの投与では，された末梢神経ミエリンを用い，その300J g蛋

EANの発症をむしろ早め，病変も高度で，自己免白／0．1ml PBSに溶解，同量のFreund s com・

疫現象を増強することが示唆された．

pleteadjuvantと混合し，1匹当り0．2mlをラッGuillain−Barre症候群は感冒様症状を前馬区とす

ト後肢足背に接種した．

る例はあるものの，その発症の予測は難しく，通投与薬剤及び投与量は以下の通りで，常急性発症し，再発はみられない疾患であり，発A群：Bactobolin1mg／kg・匹（n＝4）
B群：Foroxymithinelmg／匹（n＝5）＊鹿児島大学C群：生理食塩水1mg／匹（n＝5）■■鹿児島大学医学部第三内科…慶応大学医学部生理学教室

EAN発症後1−5日目まで連日腹腔内投与を行−121−

なった．さらに2日目後の感作後第20日に全動物

7：死亡を濯流固定し，組織学的に検索した．

組織学的検索：実験1では感作後20日目，実験
2では17日目に全例を0．1Mphosphatebufferに〔実験2〕
雌成熟Lewisラット15匹を実験1と同様に潜解した3％ glutaraldehyde，1％ paraformal−

EAN感作し，以下の3群に分け治療実験を行

dehyde液にて濯流ないし浸潤固定し，胸髄中央なった．

部，腰髄膨大部，腰髄神経根，後根神経節，坐骨A群：Actinobolin200mg／kg・匹（n＝5）

神経近位部，同遠位部を切り出し，1％オスミウム

B群：Foroxymithine20mg／匹（n＝5）

固定後アルコールにて脱水，Epon包埋し，1／〟nC群：生理食塩水1mg／匹（n＝5）

厚切片を作製，トルイジンブルー・サフラニン染

発症後1′、5日（感作後第12へ′16日日）に連日腹腔色を施し，光顕にて観察した．EAN病変の程度を内投与し，感作後第17日目に全動物を組織学的に比較するため，胸髄中部の後索，坐骨神経遠位部

検索した．

に生じている軸索変性所見の程度を0′、4点で評価した．

臨床症状の評価：実験1，2共に以下の基準によりスコアリングを行なった．
1：軽度の尾の脱力

結果

2：中等度の尾の脱力〔実験1〕第14日目に発症し薬剤の投与を開始し3：軽度の後肢脱力が加わる

た．15日目には全例がEAN症状を呈し16日目

4：中等度の後肢脱力にコントロールの1例が死亡した．各群の臨床ス

5：後肢を引きずって歩く

コアの変動を図1に示す．コントロールに比L

6：前肢の脱力が加わる

Bactobolin，Foroxymithine投与ではピーク時のCIinicaIscore

D

R

U

G

s

Bactobolin，Actinobolin，Foroxymithineの実験的アレルギー性神経炎に対する治療効果の検討
表1実験1の病理組織変化（PathologicalScore）
胸髄後索

坐骨神経遠位TOTAL

Bactobolin l．75（1−2）

1．75（0．5−4）

3．5（2．5−5）

Foroxymithine l．90（1−2．5）

1．60（0−3）

3．5（1−5．5）

COntrO12．00（0−4）

4．0（2−7）2．00（1L3）

Clinicalscore

D R U G s

12

13

14

15

16

17

days
afterinoculation

図2 実験2の臨床スコアの経時的変化
表2 実験2の病理組織変化（PathologicalScore）
胸髄後索

坐骨神経遠位TOTAL

Actinobolin O．8（0−2）

0．2（0−1）

1．0（0−2）

Foroxymithine

2．4（2−3）

2．8（0−4）

5．2（2−7）

COntrO1

2．0（1−3）

2．4（0−4）

4．4（1−7）

症状が軽い傾向が認められるが，後半では有意の投与群は臨床スコア1〜3の軽度のEAN症状に差はみられなかった．

とどまった．Foroxymithine投与群とコントロー

組織学的には全例にてEAN病変が観察され，ル群に有意の差はみられなかった（図2）．

病勢の程度を反映すると考えられる胸髄，坐骨神

組織学的にもActinobolin投与群は軽微の軸索

経遠位部の軸索変性程度は表1に示すごとくコン

変性にとどまり，Foroxymithine投与群はコント

トロールに比し両薬剤投与群でやや軽度であった

ロールに比し同等，ないし，より高度の軸索変性が，有意の差とは考えられなかった．

所見を示した（表2）．

〔実験2〕第12日日に発症し，薬剤の投与を開始
した．全例でEAN症状を示したが，Actinobolin−123−

Foroxymithineは永井らによりEAEの抑制効
考果が報告され，我々はEANにおいて多少の抑制

察

Guillain−Barrさ症候群の治療法の検討において効果と軸索変性所見の軽減を示唆する所見が得らは，前述のごとく疾患の性格上，発症後の治療効れたことを報告したが4），今回その投与量を増量

果の有無が重要と思われる．今回我々はEAE6），

し，1mg／匹，20mg／匹にて治療効果を検討した．

EAN4），あるいはEAMG7）においてその発症抑制

しかしながら有意の効果は認められなかった．こ

効果が認められているBactobolin，Foroxymith−の様な酵素阻害剤は自己免疫疾患における病変のine，Actinobolinについてそれらの治療効果を検二次的進展を阻止する可能性があり，病変の進展討した．

にかかわる酵素群の解明と，その阻害物質の開発

BactobolinはEAEにおいてその治療投与によが必要と思われる．

る効果が報告されているが6），我々は一昨年度
EAEで効果が認められた0．5mg／kg・匹の投与量

ま

と

め

ではEANに対して有意の治療効果を示さないこ

1，EANに対するBactobolin，Actinobolin，とを報告した4）．今回は倍の投与量の1mg／kg・匹Foroxymithineの発症後投与による治療効果にに増量して検討したが，臨床的にも組織学的にもついて検討した．

有意の治療は認められなかった．永井ら8）は昨年

2．Actinobolin200mg／kgの大量連日投与に度むしろ低濃度（0．3mg／kg）の投与量により明らよりEANの臨床的・組織学的軽減が認められた．

かなEAE抑制効果をみており，Bactobolinの治

3．Bactobolinlmg／kg，Foroxymithinel

療効果についてはその投与量，方法の検討が必要

mg／kg，20mg／kgの投与では有意の治療効果はと思われる．

みられなかった．

ActinobolinはBactobolinの誘導体で，その毒性が著しく減少していると共に，EAEに対してその大量120mg／kgの感作後連日投与で多少の抑制効果が認められている．またEAMGに対する効果も報告されている7）．今回，EANを用いた治

文1）ShujiIzumo，Christopher Linington，Hartmut
Wekerle，RichardMeyerman．：AmorphologlC
StudyonexperimentalallerglCneuritismediat−
edbyT−CelllinespecificforbovineP2prOtein

in Lewis rats．LabaltZtOryInues痩tltion，53（2），

療実験で200mg／kgという大量のActinobolin投与により臨床的にも組織学的にも明らかな治療
効果が認められ，大量投与にても外見上明らかな

209−218，1985．

2）ChritsopherLinington，ShujiIzumo，Masaru
Suzuki，KeiichiUyemura，RichardMeyermann，Hartmut Wekerle．：A permanent rat T・CelllinethatmediatesexperimentalallerglCneuri−

副作用はみられなかった．Actinobolinの作用機

tisinthe Lewis ratin vivo．Jlmmunol．，133，

序はBactobolinのそれと同様であると考えられるが，Bactobolinでは1mg／kgの投与量にてEAN治療効果は認められていない．ActinobolinとBactobolinのEANとEAEに対する効果の差は両疾患の発症機序や作用機序の差によるもの
ではなく，毒性の差による投与量の違いが大きな意味を持っているものと思われ，より低濃度で作献

1946−1951，1984．

3）井形昭弘，出雲周二，梅原藤雄，他：実験的アレ
ルギー性神経炎に対するdeoxyspergalinの抑制効果．自己免疫疾患治療薬の開発研究青柳班，昭
和61年度報告書，p．111−116，1987．
4）井形昭弘，出雲周二，松室健士，他：実験的アレ
ルギー性神経炎に対する Bactobolin，For−
phenicine，Foroxymithineの抑制効果についての検討．自己免疫疾患治療薬の開発研究青柳班，
昭和62年度報告書，p．125−131，1988．
5）井形昭弘，出雲周二，樋口逸郎，田代アリシア，

用し，毒性の少ない誘導体の開発が望まれる．
−124−

Bactobolin，Actinobolin，Foroxymithineの実験的アレルギー性神経炎に対する治療効果の検討

納 光弘，植村慶一：DipeptidylpeplidaseIV阻
害剤Diprotin Aの実験的アレJt／ギー性神経炎に及ぼす影響．厚生省新薬開発青柳班，昭和63年度
報告書，pp．125−129，1989．
6）田平 武，挑 大林，山村 隆：自己免疫性脳脊髄炎治療薬開発研究．（2）ラット急性EAEモデルを用いた免疫抑制物質の評価：bactobolinとar−
phamenineAのEAE抑制効果について．自己免疫疾患治療薬の開発研究青柳班，昭和61年度報告書，p．51−53，1987年．
7）佐藤 猛，石垣泰則，宋 東林，池辺紳一郎，林泰三：Experimental autoimmune myasthenia

gravis（EAMG）ラットの治療実験．厚生省新薬開発青柳班，昭和63年度報告書，pp．57−66，1989．
8）永井克孝，小山内たか，村上隆稔，武田茂樹，生
田房弘：実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）に関する二次代謝産物治療剤の検索．厚生省新薬開発青柳班，昭和63年度研究報告書，pp．103−106，
1989．

9）田平 武，本山和徳，田平順子，西沢正豊，宇宿
功市郎：自己免疫性脳脊髄炎，神経炎の治療薬開発，厚生省新薬開発青柳班，昭和63年度研究報告書，pp．49−55，1989．

−125−

15−DSG，methyl−DSG，DiplotinA，Foroxymithine，BestatineのHAM患者末梢血リンパ球自己増殖反応（APR）への影響
井 形 昭 弘＊
共同研究者 町頭幸一＊＊，栄楽信隆H，出雲周二日，園田俊郎書目，納 光弘＊＊を含む）を分離凍結保存した．これを用時解凍し目て，非働化したヒトプール血清を加えたRPM1−

的

HAMは，HTLV−Iが関与し，免疫学的桟序に1640培地中で6日間培養し，その自己増殖機能より発症すると考えられている，痙性対麻痔を主（APR）をトリチウム．サイミジンの取り込みによ徴とする神経疾患である．

り測定した．この培養系は，5×104cells／well／200

Usukuらは，HAM患者の末梢血リンパ球をin

JLlで行い，被検薬剤の濃度は，15−I）eoxysper−〃存rP培養すると，何等の外来抗原刺激なしで

gualin（DSG）とmethyl−DSGは，0．1，1，10，100

T細胞が増殖することを兄いだし，この現象をJLg／mlで反応させ，またDiplotin AとForoxy−autologous proliferative response（APR）と呼mithine，Bestatineは，1，10，100，1，000JLg／ml

び，HAMおよびHTLV一Ⅰ無症候性キャリアーの各濃度で反応させてAPRに対する抑制効果をでの自己免疫に関連する指標として，その有用性評価した．薬剤は，培養初日に添加し，6日間培養を提唱した1）．

後に効果を判定した．

昨年我々は，Predonisolone（PSL），Interferon

結果（図1，図2，表2）

alpha（IFN−α）がin uit7Vの系及び，治療前後のリンパ球を用いた系（玩目元叩）で，共にAPRを抑1．15−I）SG，methy1−DSG制し，その治療効果と相関することを報告した2）．

15・DSGは，10JLg／mlの濃度で有意（5％以下）

今回我々は，15−Deoxyspergualin（DSG），methTにAPRを抑制したが，それより低い濃度や高い

y1−DSG，DiplotinA，Foroxymithine，Bestatine

濃度では，抑制しなかった．

について（表1），これらの薬剤がHAM患者末梢methy1−DSGは，1，10，100JLg／mlの濃度で有血リンパ球のAPRに及ぼす影響を評価し，HAM

意にAPRを抑制した．抑制の強さは，10JLg／mlの治療薬としての可能性について検討した．

の濃度でピークを呈した．
2．DiplotinA

対象 と 方法

DiplotinAは，APRを抑制せず，むしろ完進さ

末治療のHAM患者よりヘパリン加末梢血を採取し，Ficoll−Hypaque法で単核細胞（リンパ球せる傾向にあったが，有意差はなかった．
3．Foroxymithine

Foroxymithineは，100FLg／ml以上の濃度で■鹿児島大学＊＊鹿児島大学医学部第三内科

APRを抑制し特に1，000pg／mlでは，著明に抑＝＊鹿児島大学医学部ウイルス学制した（有意差1％以下）．
−127−表1本実験で用いた免疫修飾物質と酵素阻害物質の一覧

薬

剤

名

阻害を受ける酵素名，その他

15−Deoxyspergualin（DSG）

Bリンパ球活性化を抑制

methyl・Deoxyspergualin（methyl・DSG）

水溶性，DSGよりわ‡γかPで安定

DiplotinA

DipeptidylaminopeptidaseIVを阻害

Foroxymithine

angiotensineconvertingenzymeを阻害

Bestatineaminopeptidaseを阻害︵∈dOTOLX︶ 9扇ld⊃∝P↑− C︵∈dOTOrX︶ ￠葛ld⊃∝P↑−工の
0

g
〃

度

泊

．︒ ︒ ル

0

1

10
濃

日川
度

10t川
〃g／m／

l

図

図2

表2 薬剤投与前に対する各種薬剤投与後の3H−TdR取り込みの有意差検定結果（studentttest）

0．1JLg／ml

DiplotinA
Foroxymithine
Bestatine

4．Bestatine

100JLg／ml

1000／g／ml

S．05S．
0501
m ∴凡朝刊

N．S．

methyl−DSG N．S．

10JLg／ml

S．05SCa∬05
m 言八m甜

DSG

1FLg／ml

N．S．：nOtSignificant

有用である．特にHAMではAPRの高値とAPR

Bestatineは，lJLg／ml以上の濃度で有意にでのCD8陽性T細胞サブセット比率の上昇がみ

APRを抑制したが，10FEg／ml以上の濃度では，

られ3），APRがHAMの病態と関連することが示

抑制の程度はplateauとなり，用量依存性の関係

唆されている．

はなかった．

PSLやIFN−αは，HAMにおいてよく用いられる治療薬であるが，いずれも玩㍑正和及び玩考察

APRは，HTLV−Ⅰ感染の免疫学的指標として

めβで，APRを抑制し2），治療効果と相関してい

た．
−128−

15−DSG，methyl・DSG，DiplotinA，Foroxymithine，BestatineのHAM患者末梢血リンパ球自己増殖反応

今回我々は，15TDSG，methyl−DSG，DiplotinA，

るかは，今後の検討が必要であるが，EAEやForoxymithine，Bestatineが各濃度で，APRにEANなどの動物実験に対する有効性の評価と及ぼす影響を評価することで，HAMに対する新は，かなりな程度相関していると考えられた．

しい治療薬剤としての有効性を判定した．
15−DSGとmethyl−DSGは，実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）4）や実験的アレルギー性神経炎

文1）Usuku，K．，Sonoda，S．，Osame，Mリetal．：HLA

haplotypeTlinked highimmune responsivenessagainst HTLV−Iin HTLV−I−aSSOCiated・myelopathy：ComparisonwithadultT−Cellleu−（EAN）5）の発症を抑制する効果を認める．いずれ
もAPRに対しては同様の傾向を示した（図1）が，kemia／lymphoma．Ann．Neurolリ1988；23

methyl−DSGの方が，より低濃度で有意な抑制を示した．これは，methyl化することでDSGがより安定化するためと考えられる．また，用量依存性に抑制するのではなく，高濃度で逆に抑制が低下することは，作用機序を考える上で興味ある所見であった．
Diplotin Aは，T細胞特有の酵素であるdipe−ptidylaminopeptidaseIVを阻害する薬剤であるが，EAEやEANの抑制効果を認めない6）7）．本実
験でもAPRの抑制を認めずむしろ高値を呈し（図2），EAEやEANでの病変の遷延化との関連が疑われる．
Foroxymitineは，angiotensine converting
enzymeを阻害する薬剤であり，EAE8），EAN9）に対して，多少の抑制効果が認められているが，ほぼ用量依存性にAPRを抑制した（図2）．
Bestatineは，aminopeptidase阻害作用があり，免疫調節剤として，使用されている．これは，10／Jg／mlまでは，用量依存性にAPRを抑制したが，より高濃度にしても，それ以上の抑制は認められなかった（図2）．

結論

種々の自己免疫疾患治療薬（候補）のHAMに対する有効性をAPRにたいする抑制効果を指標としてわ乙府和で評価した．

献（suppl．）：143−150．

2）井■形昭弘，栄楽信隆，伊地知信二，他：Pred・
nisolone，Interferonalpha，15−Deoxyspergualin

によるHAM患者末梢血リンパ球自己増殖反応（APR）への影響．自己免疫疾患治療薬の開発研究
青柳班，昭和63年度研究報告書，p．131−133，1988
年．
3）井形昭弘，栄楽信隆，園田俊郎，他：HAM患者
末梢血リンパ球の自己増殖反応におけるT細胞
サブセットの検討．厚生省特定疾患免疫性神経疾
患調査研究班，昭和62年度研究報告書，p．319−
322，1987年．
4）田平 武，山村 隆，並河 正，他：Deoxysper−
gualinの実験的アレルギー性脳脊髄炎に対する治療効果，自己免疫疾患治療薬の開発研究青柳班，昭和60年度研究報告書，p．47−51，1985年．
5）井形昭弘，出雲周二，梅原藤雄，他：実験的アレ）t／ギー性神経炎に対するdeoxyspergualinの抑制効果．自己免疫疾患治療薬の開発研究青柳班，
昭和61年度研究報告書，p．111−116，1986年．
6）生田房弘，武田茂樹，永井克孝：各種微生物に次代謝産物による病変の修飾に関する神経病理学的研究．ActinobolinとDiprotin Aの急性EAEに対する影響．自己免疫疾患治療薬の開発研究青柳班，昭和63年度研究報告書，p．97−101，1988年．
7）井形昭弘，出雲周二，樋口逸郎，他：Dipeptidyl
peptidaseIV阻害剤DiplotinAの実験的アレル
ギー性神経炎に及ぼす影響．自己免疫疾患治療薬の開発研究青柳班，昭和63年度研究報告書，p．
125−129，1988年．
8）永井克孝，小山内たか，村上隆稔：EAEに対するプロテアーゼインヒビターの治療効果の検討とその意義．自己免疫疾患治療薬の開発研究青柳．班，昭和61年度研究報告書，p．77−84，1987年．
9）井形昭弘，出雲周二，松室健士，他：実験的アレ
ルギー性神経炎に対する Bactobolin，For−
phenicine，Foroxymithineの抑制効果についての検討．自己免疫疾患治療薬の開発研究青柳班，
昭和62年度研究報告書，p．125−131，1988年．

HAMに対する有効性の評価が妥当なものであ−129−

ヒト末梢血単核球による抗核抗体産生におよぼす
15−deoxyspergualinの影響に関する研究
一抗体産生抑制機序について−

本 間 光 夫＊
共同研究者 秋月正史＊，天野宏一＊の作用部位を，T細胞マイトーゲンによる細胞内員

カルシウム濃度の変化を指標とし調べた．また，的膠原病は抗核抗体など種々の自己抗体産生を特SLE患者末梢血を用い，SLEで見られる免疫異徴とする自己免疫疾患である1）．その組織障害に常をDSGが改善しうるかどうかを調べ，SLEのは，これらの自己抗体が関与することが示唆され治療薬としての可能性を調べることを目的としている2）．したがって，自己抗体産生機序の追究

た．

は，膠原病の病態解明に大切な課題である．さらに自己抗体産生の制御は膠原病の治療への応用が

方

法

1）細胞の分離および培養：ヘパリン加末梢血考えられる．
15−deoxyspergualin（以下DSG）は種々の免疫より，FicollConray比重遠心法にて単核球を得抑制作用を有することが知られている．すなわち，た．末梢血単核球をRPMI1640培地に1×106／

ループスマウスの腎病変の進行や抗DNA抗体産

mJに浮遊し，370C，5％CO2下で24時間培養した．

生垣抑制し生命予後を改善すること3），ラットのサイクロスポリンAおよびDSGは，ともに終濃

実験的アレルギー性脳脊髄膜炎の臨床症状および度10J g／mJで添加した．対照には，薬剤非添加で病理学的所見を改善すること4）などが報告されて同様の条件で培養したものを用いた．

いる．そして，かかる免疫抑制作用は，免疫担当2）細胞内カルシウム濃度の測定9）：培養が終細胞を介するものであるこ−とが知られてい了した細胞（1×107）をRPMI培地2mlに浮遊る5人7）．

し，カルシウム感受性蛍光色素であるFura−2AM

昨年までに教室では，SLE患者末梢血単核球を（50／ Mを2／〟加え，370Cで30分反応させた．

用い，DSGの免疫抑制作用をわ7〃言わ竹で証明し

RPMIで洗浄後，3×106個の細胞をとり，0．6mgのた．さらにDSGがどの免疫担当細胞を介して作カルシウム緩衝液（137mM NaCl，2．7mM KCl，

用するかを明らかにするため種々の実験を試み，

1．OmMMgC12，1．OmMCaC12，20mM Hepes，25

主にT細胞を介したものであると報告してきmMglucose，pH7．4）に浮遊し検体とした．細胞た8）．本年度は，T細胞活性化経路におけるDSG

内カルシウム濃度は，HITACHIF−4010Fluores・
cence spectrophotometerを用いて，励起波長■慶応義塾大学内科

335nm，測定波長500nmの条件で測定した．測定
−131−

蛍光強度

0

5

10

0

15 時間（分）図1健常人末梢血単核球をRPMI培地に浮遊し，5％CO2，370Cの条件で24時間培養する．
Fura・2AMを加え30分反応させ，培地で洗浄後，3×106個をとり，0．6mgのカルシウム緩衝液に浮遊した．HITACHIF−4010を用い，蛍光強度の基礎値を確認した後，PHA（1mg／ml）
を4J J加えた（終濃度6．7／Jg／mJ）．この時を0分とし，蛍光強度の変化を時間をおって観察した．PHA添加直後より，速やかな蛍光強度の上昇（初期上昇反応）が認められた．引き続いて約5分後より，僅かながら第二の上昇反応（後期上昇反応）がみられた．10分後にカルシウム・イオ

5

10

15 時間（分）図2 健常人末梢血単核球を，24時間サイクロスポリンA（10／Jg／mJ）とともに培養し，同様に
Fura・2AMと反応させた後，RPMI培地で洗浄，0．6mgのカルシウム緩衝液に浮遊した．図1と同様にPHAを添加し，蛍光強度の変化を
観察した．
蛍光強度

ノフォア（100ノg／mJ）を4JJJ加え（終濃度670ng／mJ），最大蛍光強度を得た．

開始後2〜3分間で蛍光強度の基礎値を確認した
後，検体にPHA（Phytohemagglutinin，1mg／mJ）を4J H終濃度6．7〃g／mわを加えた時の細胞
内カルシウム濃度の上昇反応を調べた．またカ
ルシウム・イオノフォア（4−Bromo・CalciumIono−
phore，100JLg／ml）を4JLl（終濃度670ng／ml）を用いて最大蛍光強度を得，上昇反応の指標とし
た10）．

結

果

健常人単核球では，図1のようにPHA添加直後より細胞内カルシウム濃度の上昇がみられ（初

0

5

10

15 時間（分）図3 健常人末梢血単核球を，24時間15−deoxysper−
gualin（DSG，10JLg／ml）とともに培養し，同様にFura・2AMと反応させた後，RPMI培地で洗浄，0．6mgのカルシウム緩衝液に浮遊した．
図1と同様にPHAを添加し，蛍光強度の変化を観察した．

−132−

ヒト末梢血埠核球による抗核抗体産生におよぼす157deoxyspergualinの影響に関する研究
蛍光強度

蛍光強度

0

図4

5

10

15 時間（分）SLE患者末梢血単核球をRPMI培地に浮遊し，5％CO2，370Cの条件で24時間培養する．
Fura−2AMを加え30分反応させ，培地で洗浄後，3×106個をとり，0．6mgのカルシウム緩衝液に浮遊した．図1と同様にPHAを添加し，蛍光強度の変化を観察した．

0

5

10

15 時間（分）図6 SLE患者末梢血単核球を，24時間15−deoxys・
pergualin（DSG，10JLg／ml）とともに培養し，同様にFura−2AMと反応させた後，RPMI培
地で洗浄，0．6mgのかレシウム緩衝液に浮遊した．図1と同様にPHAを添加し，蛍光強度の変化を観察した．

蛍光強度期上昇反応），約5分後よりさらに軽度の上昇（後期上昇反応）が認められた．これはまず細胞内カル
シウム・プールからの動員後，細胞外からの流入が引き続いて起こることによるとされている9）．
約10分後にイオノフォアを加えたところ，著明な
細胞内カルシウム濃度の上昇がみられ最大蛍光強度を得た．
基礎値から最大蛍光強度までの上昇反応を100％とした時，PHA添加後の上昇は約40％であった．サイクロスポリンA処理単核球では，図2のように，PHA刺激後の把胞内カルシウム濃度の初期上昇反応は約25％と抑制された．DSG処
0
図5

5

10

15 時間（分）SLE患者末梢血単核球を，24時間サイクロス
ポリンA（10〟g／mJ）とともに培養し，同様に
Fura−2AMと反応させた後，RPMI培地で洗浄，0．6mgのカルシウム緩衝液に浮遊した．図1と同様にPHAを添加し，蛍光強度の変化を観察した．

理単核球でも同様（約25％）の抑制が認められた（図3）．しかし，後期上昇反応にはほとんど影響を及ぼさなかった．
一方SLEでは，初期上昇反応は約40％とほぼ健常人と差がなかったが，後期上昇反応は全く認められず，むしろカルシウム濃度は低下した（図ー133−4）．辻らは9），SLE患者リンパ球ではPHA刺激後は健常人単核球に影響しなかったが，SLEで低下の細胞内カルシウム濃度の上昇反応は初期，後期

した反応を回復させることが示唆された．

とも抑制されるが，後期上昇反応のみ抑制される場合もあることを示した．サイクロスポリンA処

文理した場合，最大蛍光強度が低かったため，初期

1）本間光夫：膠原病の臨床．日内会誌，70：1−15，1981．

上昇反応は約50％となったが，後期上昇反応は全2）Komer，Dリ

く認められなかった（図5）．DSG処理では，図6

etal．：Systemiclupus

eryth一

cmatosus：prototype ofimmune complex

nephritisinmanJ E砂．Medl，134：1695−1705，のように，初期上昇反応は最大蛍光強度の約30％

1971．

3）OkuboM．，InoueK．，UmetaniN．，etal．：Lupus
nephropathyinNewZealand Flhybridmicetreated by（−）15−deoxyspergualin．Kidney

であったが，後期上昇反応は僅かに認められた．
結献九才リ34：467−473，1988．

語1）健常人単核球において，DSGはサイクロス
ポリンAと同様に，PHA刺激による細胞内カル
シウム濃度の初期上昇反応を抑制した．
2）SLE患者単核球では，PHA刺激後，細胞内カルシウム濃度の初期上昇反応は健常人同様に認められたが，後期上昇反応はみられず，むしろ低4）井形昭弘，他：厚生省新薬開発研究費．自己免疫疾患治療薬の開発研究，青柳班，昭和61年度研究報告書．pp．111−116，1987．
5）藤原道夫，他：厚生省新薬開発研究費．自己免疫疾患治療薬の開発研究，青柳班，昭和61年度研究報告書．pp．61−67，1987．
6）徳永 徹，他：厚生省新薬開発研究費．自己免疫疾患治療薬の開発研究，青柳班，昭和63年度研究報告書．pp．67−72，1989．
7）FujiiH，TakadaT．，NemotoK．，etal．：Inuitft）

下した．

immunosuppressive properties of spergualins
to murine T cell response．J Antibioticも423）サイクロスポリンA処理は，SLEにおける細胞内カルシウム濃度の後期上昇反応の欠如を是正しなかったが，DSG処理ではこれを改善した．
以上より，DSGはサイクロスポリンA同様，初期の細胞内カルシウム濃度の上昇反応，すなわち
細胞内小胞体からカルシウムの動員を抑制する可能性が考えられた．また後期上昇反応，すなわち（5）：788−749，1989．

8）本間光夫，他：厚生省新薬開発研究費．自己免疫疾患治療薬の開発研究，青柳班，昭和63年度研究報告書．pp．135−139，1989．
9）辻 秀一，鈴木康夫，山田秀裕，松岡康夫，入交昭一郎，市川陽一，本間光夫：全身性エリテマ
トーデス（SLE）患者のリンパ球活性化における初期情報伝達系異常に関する研究．一細胞内Ca2十上昇反応の低下−．第33回日本リウマチ学会総会抄録集．p．137，1989．
10）PersonalconsultationtoDr．Tsuji．

細胞外からのカルシウムの動員については，DSG−134−

本研究班を終了するに当たって

本研究班を終了するに当たって

班

長

青

短かったこの5年間を簡単に取りまとめてみ

柳

高

明

代謝産物の探索2）永津俊治（名古屋大学医学部・5年）：膠原病

る．
本研究班の発足の経緯については先に述べたのの基礎的解明とその治療への応用
3）梅澤一夫（慶応義塾大学理工学部・5年）：がで省略する．
班の構成メンバーには幾つかの変更があった．

ん遺伝子作用阻害物質による免疫抑制の試み

班員では2年目から順天堂大学の佐藤猛博士

4）石塚雅章（化学療法研究所・5年）：免疫修飾に，3年目から国立予防衛生研究所の徳永徹博士に作用する微生物代謝産物の研究に，そして最後の2年間には更に千葉大学の谷口

5）田平 武（国立精神・神経センター・5年）：自克博士と東京大学医科学研究所の金井芳之博士に

己免疫性脳炎・神経炎の治療薬開発

もご協力いただいた．その反面，班員の人数の都

6）佐藤 猛（順天堂大学医学部・4年）：新しい合で，本研究班の発足以来微生物二次代謝産物と免疫抑制剤による実験的自己免疫性筋無力症ラッその誘導体の作製と試料の提供にご協力願っていトの治療実験

た明治製菓株式会社の深津俊三博士，日本化薬株7）徳永 徹（国立予防衛生研究所・3年）：15−

式会社の滝田智久博士，宝酒造株式会社の大林晃

Deoxyspergualinの免疫抑制活性発現の機序に

博士には4年目以後は班友会社としてご協力いた関する研究だくことになってしまった．誠に申し訳なく思っ

8）谷口 克（千葉大学医学部・2年）：自己免疫ている．改めてお礼申し上げる次第である．

疾患モデルマウスに対するFK−506ならびに一方，班友では悲しい2つの思い出がある．そIFN−γの効果

れは，本研究班の生みの親でもある微生物化学研

9）金井芳之（東京大学医科学研究所・2年）：ポ究所長の梅澤浜夫先生が昭和61年12月25日に，

リADP−リボース合成酵素阻害剤（ベナドロスチ

また日本化薬株式会社の松田明先生が昭和62年

ン）と抗ポリADP−リボース抗体

3月4日に逝去されたことである．班員，班友一同10）藤原道夫（新潟大学医学部・5年）：エリテマ

とともに慎んでご冥福をお祈り申し上げる．

トーデスモデルマウスを用いた微生物代謝二次産

さて最後に，班員各位の研究期間における成果

物の治療効果に関する研究
11）生田房弘（新潟大学脳研究所・5年）：各種微を要約して本報告書を終わることにする．

生物二次代謝産物によるEAE病変の修飾に関す班員が施行された研究は次のとおりである．
1）青柳高明（微生物化学研究所・研究期間5る神経病理学的研究

年）：自己免疫異常における酵素網の解明と二次

12）永井克孝（東京大学医学部・5年）：実験的ア−137−

レルギー性脳脊髄炎（EAE）に関する二次代謝産構造並びに薬理活性を研究した．

物の治療剤の検索

SLE腎症を呈するNZB／WFlマウス脾内の13）和田孝雄（慶応義塾大学医学部・5年）：自己

prolylendopeptidase（PPCE）は病状の進行とと回帰モデル解析による免疫ネットワーク解析と免もに増加することが注目された．PPCEに対する疫調節剤の作用評価

阻害物質を探索し，pOStStatinを琴見した．免疫不14）大久保充人（北里大学医学部・5年）：微生物

全におけるPPCEおよびpoststatinの役割を研

二次代謝産物の免疫抑制効果，特に腎炎発症・進究している（昭和60年度）．さらに，MRL／砂γマ

展の抑制についてウス脾内のセリン・プロテアーゼとプロリン関連

15）井形昭弘（鹿児島大学・5年）：自己免疫性神酵素の病因的意義を調べた．脾内の酵素活性のう

経疾患治療薬の開発研究

ち，第一主成分に高い相関を有するセリン・プロ

16）本間光夫（慶応義塾大学医学部・5年）：ヒト

テアーゼが年齢に伴い減少する．この関係は末梢血単核球による抗核抗体産生におよぼす15−

NZB／WFlおよび老化マウスにも認められ，病

deoxyspergualinの影響に関する研究

因との関係を研究中である（昭和61年度）．一方ヒトリンパ球のサブポピュレーションとプロテアー

次に，上記各分担研究者の研究成果について要ゼを含む酵素網との関連性を調べ，T細胞特有の

約する．

酵素として

1．自己免疫異常における酵素網の解明と二次代Saminidase），PPCE，DPP−ⅠⅤ（dipeptidyl pe−

謝産物の探索（青柳高明）

ptidaseIV）が，またB細胞特有の酵素としてGIcNAcrase（N−aCetyトβ−DLgluco−

本班は全身性エリテマトーデス，進行性全身性Poly（ADfLribose）synthetase，Leu−AP，AP−B，硬化症，慢性関節リウマチなどを含む膠原病，まCathepsin Bなどが作用していることを明らかにた脱髄性神経疾患などの自己免疫疾患治療薬を開した．DPP−IV阻害物質としてDiprotinsAとB，

発することを目的として，昭和60年度に厚生省薬

またPoly（ADfLribose）synthetase阻害物質と務局より新薬開発研究班として発足し現在に至っしてBenadrostinなどを発見した．これら阻害物ている．

質の薬理作用は研究中であるが，EAEに有効であ難病治療薬開発という使命を担った本班の主旨ることが報告されている（昭和62年度）．SLEモに沿い，微生物二次代謝産物から有効と思われる

デル動物（NZB／WFl，MRL／H）Y，BXSB／雄）の多くの低分子化合物を検索した．即ち，酵素阻害脾内セリン・プロテアーゼの動態を発病前，発病物質としては，エンドペプチダーゼ阻害物質，ユ時，発病後の各時期について比較検討した．牌内

タソペプチダーゼ阻害物質，ユタトエンザイム阻

セリン・プロテアーゼ活性は発病前後から低下す

害物質ならびに免疫修飾物質を含む抗菌物質，抗る傾向が認められ，この低下が中心的役割を果た

癌物質などを微生物培養液中に発見し，班員の要していることを明らかにした（昭和63年度）．強い望に答え配布した（昭和60年度〜平成元年度）．

免疫抑制能を有するDeoxyspergualin（DSG）の

一方，自己免疫疾患の病態を解明し，その治療（−），（＋）Aenantiomersを連続33日間マウス腹薬の開発を志し，病態モデル動物の血清を含む各腔に投与し，脾内の酵素網の動態を調べた．（−）−

臓器ならびに患者血清中の酵素網の動態を調べ，DSG群はDPP−ⅠVとGIcNAc−aSe活性を有意に病因に密接に関係すると考えられる新しい探索法抑制した．（＋）LDSG群はGIcNAc−aSe活性のみを考案し，この方法により発見された活性物質のが有意に抑制された．（−）−DSGの活性発現と−138−

本研究姓を終了するに当たって

DPP−ⅠⅤ活性が密接な関係にあることを明らかの二次代謝産物は自己免疫疾患の治療薬となるこにした．DPP一ⅠⅤ阻害物質DiprotinsAとB，まとを示す．inuivoの系では，DAP−ⅠⅠとPPCEのた永津班員らが報告したDPP−ⅠⅠの役割を明らか

酵素阻害薬のスクリーニングで自己免疫疾患の治にするため，DPPLII阻害物質Dioctatinを発見し療薬を開発できることを示唆する．

た．これら阻害物質の薬理作用を研究中である（平成元年度）．

本研究で，初期の目的をほぼ達成できたが，
DAP−IIとPPCEの酵素阻害物質を微生物の二次代謝産物に発見して，自己免疫疾患モデル動物

2．膠原病の基礎的解明とその治療への応用（永で治療の有効性をみてさらにヒトの自己免疫疾患津俊治）への応用を研究していく予定である．ネオプテリ

膠原病の原因の基礎的解明と，微生物が生産すンの増加はマクロファージの活性化の結果と考える二次代謝産物に自己免疫疾患である膠原病の治られるが自己免疫疾患治療薬をモデル動物でスク療薬を開発するスクリーニング法を確立する目的

リーニングするために有用な生化学的指標と考えで，膠原病に特異的な生化学的指標を研究した．

られる．

自己免疫疾患モデル動物としてNZBマウス，
BXSB雄マウス，MRL／砂rマウスを用いて，発症

3．がん遺伝子作用阻害物質による免疫抑制の試前，発症直後，発症進行中の期間における脾臓なみ（梅澤一夫）どの組織と血祭を検索した．患者では膠原病の代発がんプロモーターやがん遺伝子の作用機構と表疾患の慢性関節リウマチ（RA）と全身性エリテ

リンパ球やマクロファージ活性化の機構に多くのマトーデス（SLE）の血清と関節液を検索した．生

共通点があることから，放線菌など微生物より新

化学的指標として，永津ら，青柳らが膠原病に特しいがん遺伝子作用阻害物質を単離し，免疫抑制

異的な変化を見出しているペプチダーゼ類と，マ物質，さらに自己免疫疾患治療薬に発展させるこ

クロファージがT細胞の活性化により生成するとを目的とした．その結果，イノシトールリン脂と推定されているネオプテリンなどのプテリジン

質代謝回転阻害物質として新規物質のイノスタマ

類を検索した．本研究の結論として，モデル動物

イシンとペンドールマイシン，既知物質のプシテと患者とで一致した膠原病に特異的な生化学的変

クトリゲニン，オロボール，2，3−ジヒドロキシベ

化は，ペプチダーゼ類では，ジペプチジル（アミノ）ンゾイックアシッドをスクリーニングすることがペプチダーゼ（DAPトIIの増加，DAP−ⅠVの減少，さでた．この中でプシテクトリゲニンはわ7がか0

ポストプロリンクリービングェンザイム（PPCE）

実験系で免疫抑制作用を示した．一方で既に発がの増加，DAfLII／DAP−IV比の増加であり，プテんプロモーション抑制やEAEを抑制することがリジン類では，ネオプテリンの増加，ネオプテリ

知られているSD170を抗発がんプロモーションン／ビオブテリン比の増加であった．モデル動物の活性を指標により効果的に修飾することを試み，

ペプチダーゼの変化は15−デオキシスパーガリン

SD714を見出した．SD714はin vitroおよびinで発症を抑制すると正常化された．以上の成績は，正和マウス免疫系で抑制作用がみられた．

ペプチダーゼ額とプテリジン類の生化学的変化は

分担研究期間の成果として免疫抑制の機構に基自己免疫疾患の原因と密接に関連しており，自己づいて新物質を含むいくつかの生理活性物質が微免疫疾患モデル動物でDAP−II／DAfLIV比とネ

生物から得られたことがあげられる．残したこと

オプテリン／ビオブテリン比を正常化する微生物

は動物を用いた免疫抑制の実験を充分に行っては−139−いないこと，得られた生理活性物質を自己免疫疾

和63年度）

患治療薬に発展させるに至らなかったことであ（5）L1210移植マウスへ0．4−12．5mg／kgの腹腔る．しかし自己免疫疾患治療薬の開発における本内投与で治癒ならびに腫瘍免疫を誘導した．抗腫研究の意味は，イノシトールリン脂質代謝回転阻

瘍効果は免疫抑制効果より比較的少量でも得られ害物質には免疫抑制を示すものも得られたことかる．

ら，現代の免疫学の知識に基づく新しい自己免疫（6）腹腔内投与でIa陽性腹腔内浸出細胞比の上疾患治療薬の開発の可能性を示したことと考えて昇が見られた．（昭和62・63年度）

いる．

（7）15−DSG腹腔内投与マウスから採取した腹腔マクロファージはCytostatic活性を示した．（昭4．免疫修飾に作用する微生物代謝産物の研究

和63年度）（石塚雅章）（8）15−DSGは玩‡流用でマクロファージ存在A）15−Deoxyspergualinの免疫修飾作用

下，T細胞のIL−3およびMAF（macrophage

研究目的：15−DSGはL1210に著明な抗腫瘍効果を示すとともに腫瘍免疫を誘導する．また強activatingfactor）産生を増強した．（平成元年度）
まとめ：
現在までに得られた結果から15−DSGの作用

い免疫抑制作用を示し皮膚移植あるいは各種の免疫疾患のモデルに効果を示すことが明らかにされ機構は以下のように考えられる．
免疫抑制作用は，15−DSGの比較的大量投与にている．本研究は相反すると思われる15−DSGの作用機構を明らかにすることを目的とする．

よって見られ，細胞数およびsubset比に著明な影

研究成果：

響を示さないが，特にT細胞のIL・2受容体形成（1）15−DSGはマウスの羊赤血球に対する遅延型の阻害に働くことによって得られる．また，B細過敏症（DTH）および抗体産生などの免疫応答を胞の抗体産生抑制にも働くと思われるが直接の証

1．6−25mg／kg，3日間の投与で著明に抑制し，脾

明は得られていない．
一方，腹腔内移植L1210に対し，腹腔内投与さ細胞培養による抗体産生系では生細胞数に影響を与えずこれを強く抑制した．（昭和61年度）

れた15−DSGはT細胞に働き，そのMAF産生を（2）15−DSGは混合リンパ球培養反応を濃度に依刺激し，MAFは腹腔内マクロファージのIa陽性存してこれを抑制したが，培養上清のIL−2産生

細胞数を増加させ抗原提示細胞としての機能を増を抑制せず増強した．15−DSG投与マウスの脾細

強するとともに，T細胞のIL−2およびIL−3など

胞は，正常あるいは坦癌マウスのいずれにおいてのリンフォカイン産生を増強した結果，抗腫瘍エ

もIL−2産生能の増強を示した．CyclosporinAはフェクターの生成に働き腫瘍免疫の成立に作用す

これを強く抑制した．（昭和61・62年度）

ると思われる．

（3）15−DSG投与マウスの脾細胞およびリンパ節B）免疫調節物質の検索（平成元年度）

中T細胞のLy2，L3T4，Thyl．2比には著明な

微生物代謝産物中に自己免疫疾患に有効な免疫変化は見られなかった．CyclosporinAではT細調節物質を探索することを目的に混合リンパ球培

胞subsetに著明な減少が見られる．（昭和62・63

養（MLCR）ならびにIL−2のTリンパ芽球増殖

年度）

刺激反応に対してスクリーニングを行い抗生物質（4）15−DSGはCon AでT細胞に誘導される

NocardaminおよびDeferoxamineにその作用

IL−2受容体形成を濃度に依存して抑制した．（昭を見出した．

−140−−

本研究王圧を終了するに当たってこれらの物質はMLCRおよびIL−2反応を低抗原非特異的に特に活性化リンパ球に対し濃度で抑制したが，L1210培養細胞に対しては抑Cytotoxicに作用している可能性が最も高いこと

制が極めて弱く免疫反応に特異的な抑制作用と思を指摘したが，作用機序の検討も引き続き必要でわれた．これらの物質はいずれも鉄キレート剤である．また，薬剤の安定性，投与方法の改善に関あり，免疫応答系に対する鉄イオンの存在が重要する検討も必要と思われる．

と思われ，今後検討する価値があると思われる．

最近自己免疫疾患の発症機序は分子レベルで明らかにされてきており，その理論にもとづく新し5．自己免疫性脳炎・神経炎の治療薬開発（田平い免疫療法の開発研究が盛んに行われている．例

武）

えば，T細胞受容体抗体，ワクチネーション，抗

多発性硬化症（MS）は我が国では特定疾患に指イディオタイプ抗体，抗原ペプチドに類似のペプ定されており，我が国で人口10万対5人，欧米でチドによる競合的抑制などである．今後は二次代

人口10万対50〜80人の患者がいる．しかし，そ謝産物からのスクリーニングのみでなく，新しいの発病機序は末だ不明で，的確な治療法もない．

免疫理論にもとづく治療法開発研究が必要であろ

実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）は自己免疫

つ．

が本態の脱髄性脳炎であり，MSの動物モデルとして治療開発のために用いられている．本研究者

6．新しい免疫抑制剤による実験的自己免疫性筋

はEAEを用いて，それを抑制する薬物を特に微無力症ラットの治療実験（佐藤 猛）

生物二次代謝産物の中からスクリーニングするこ

重症筋無力症の治療には胸腺摘出術，ステロイとを目的に研究に取り組んできた．その結果，15−

ド大量療法，その他の免疫抑制剤の投与などが行

Deoxyspergualin，Bactobolin，FK−506に有意なわれているが，より安全で有効性の高い免疫抑制

EAE抑制効果があることを見出した．特に剤の開発を目的として，動物モデルを用い，4種のBactobolinは本研究者らのoriginalな発見であ

新しい免疫抑制剤の投与実験を行った．

り，BactobolinについてはEAEの予防効果ばか

15−Deoxyspergualin，Bactobolin，Actinobolin，

りでなく，発症後の投与でも有効であることを見

Bactobolamineは近年開発された抗腫瘍性抗生出した．このことは，患者は発症後病院を訪れる

物質で，ともに免疫抑制作用を持つことが知られので，このような薬剤の発見は最も期待されるとている．そこで，これらの薬剤を実験的自己免疫ころである．しかしBactobolinは残念ながら毒性筋無力症（EAMG）ラットに投与し，その有用性性が強く，かつ効果域が狭いという欠点があった．

を検討した．

そのため毒性の低い効果域の広い誘導体の合成の15−Deoxyspergualinは0．6〜5．0mg／kg／day

必要性を指摘した．これまでにActinobolin，

投与量を設定し，免疫後1日並びに10日日から投Bactobolamine，N−Acetylbactobolamineのテス与開始した．Bactobolinは0．5mg／kg／dayおよトが可能となり，テストした結果，いずれも著し

び5．0mg／kg／dayの投与群を設定し，免疫後1い毒性の低下を認めたが，効果も減弱し，わずか日目から投与開始した．Actinobolinは15〜120にActinobolinが120mg／kgという高濃度でmg／kg／dayの投与量を設定し，免疫後1日並び

EAEの軽度抑制を示すことが分かった．今後更にに10日目から投与開始した．Bactobolamineは新しい誘導体を合成し，テストを重ねていく必要

5〜50mg／kg／dayの投与量を設定し，免疫後1日がある．またBactobolinの作用機序については，

目および10日目から投与した．2週毎に採血を行−141一一

い抗AChR抗体価を測定した．また，8週の臨床CTL前馬区細胞から成熟CTLへの分化のステッ観察を終えた後，後肢伸筋を採取し電顕による観プが本薬剤に最も感受性が高く，成熟CTLのef−

察を一部について行った．

fectorphaseでの機能は抑制しないことが明らか

15−Deoxyspergualin並びにActinobolinを免にされた．inuiuoでのMeDSGによるCTL誘導

疫後1日目から授与した群では，薬剤の投与量に抑制はIL−2では完全には回復せず，IFN−γ（50対して抗AChR抗体価の上昇が抑制された．一u／ml）で完全に回復した．しかしながら，MeDSG

方，免疫後10日目から投与開始した群では抗体価

は二次MLRによるIL−6およびIFN一γの産生の上昇を抑制することは可能であったが，十分なそのものは抑制しなかった．

治療効果を得られなかった．

DSG投与マウス骨髄細胞のCSF応答性，正常4種類の新しい免疫抑制剤の重症筋無力症への骨髄細胞のCSFによる増殖に対するMeDSGの応用を目的としてEAMGラットの治療実験を効果を検討した結果，本薬剤は骨髄幹細胞の分行ったが，初日より免疫抑制剤を投与した群では化・増殖を損なうことなく一時的に細胞を凍結す

15−DeoxyspergualinとActinobolinで効果が認る作用のあることを見出した．

められた．

MeDSGは，骨髄性白血病細胞のマクロファー

実際の患者では発症し，抗AChR抗体が上昇している時期に治療を始める．EAMGラットでは慢ジへの分化，神経細胞の分化，マクロファージのIa抗原発現を抑制しなかった．

性期に相当すると考えられている．EAMGラット

以上の研究成果からDSGの作用機序が十分にでは，7〜10日後に抗体が検出され，神経筋接合部

解明されたとは言えないが，従来の免疫抑制剤

ではマクロファージの浸潤が認められ，急性期に（CyclosporinA，FK−506）とは明らかに作用機序相当する．そこで2種の免疫抑制剤を免疫10日目を異にすることは明らかにされたと思われる．

から投与したが，15−Deoxyspergualin O．6mg／

DSGの利点は，MLRおよびCTL誘導を抑制

kg／dayにて抗体抑制効果が認められ，臨床的有するものの，IL−2を初めとするサイトカイン産生用性が期待された．しかし15−Deoxyspergualinは抑制しないこと，胸腺髄質細胞を障害しないこは5mg／kg／dayではラットに著しい毒性が認めと，抑制効果がReversibleであること等が挙げら

られ，臨床応用面ではなお問題があるので，よりれる．他の免疫抑制剤との併用など効果的な使い安全性の高い誘導体の開発が期待される．

方をすることで，相乗効果が期待される．

7．15−Deoxyspergualinの免疫抑制活性発現の機8．自己免疫疾患モデルマウスに対するFK−506

序に関する研究（徳永 徹）

ならびにIFNての効果（谷口 克）

15．Deoxyspergualin（DSG）による免疫抑制の（昭和63年度）

機序を明らかにするため，マウスのCTL誘導，骨代表的な全身性自己免疫疾患である全身性エリ髄細胞の分化・増殖，各種株化細胞の分化の糸をテマトーデス（SLE）のモデル動物のNZBx

用いて検討した．在日油川の実験では，溶液中で安NZWFl（B／WFl）マウスとMRL／砂rマウスな

定なDSGの誘導体15−deoxymethylspergualin

らびに臓器特異的自己免疫疾患であるⅠ型糖尿病（MeDSG）を用いた．

のモデル動物のNODマウスに，新たに開発され二次CTL誘導の系を用い，DSGおよびた免疫抑制剤，FK−506を全身投与し，同剤の自己MeDSGの投与（処理）時期を検討したところ，免疫疾患に対する効果を検討した．その結果，ー142−本研究姓を終了するに当たって

SLEモデル動物に対しては，生存率の有意な延スチンの選択的免疫抑制作用を検討し，SLE妊娠

長，蛋白尿出現の抑制，ループス腎炎発症の抑制

合併時の早・流産治療薬開発のための基盤確立の等が認められた．特にMRL／如′マウスにおいて目的で以下の実験を行った．

は，このマウスに特徴的に認められるリンパ節腫

先ずMRL／Jマウスにおけるベナドロステン投脹の抑制効果を発揮した．しかし，抗DNA抗体

与法の検討を行い10mg／kgで週1〜3回のip投等，自己抗体価には変化は見られず，免疫グロブ

与で病理組織学的変化のないことを確認した．こリンのレベルも，投与群とコントロール群問にはれに基づいて10週齢のMRL／Jマウスの抗核抗有意な差は認めなかった．以上の結果から，FK−

体産生に対するベナドロステンの効果を調べ，抗506は直接B細胞もしくは抗体産生を制御する

ポリADP一リボース抗体に対する選択的抑制作用

T細胞には関与せずに免疫抑制効果を示すと考のあることをつきとめた．この抑制作用は10週齢えられた．

の時点で抗ssDNA抗体よりも抗ポリADPLリ

Ⅰ型糖尿病に対する効果も顕著で，NODマウ

ボース抗体が高値であるマウスで著明であった．

スの顕性糖尿の出現を完全に抑制し，通常生後

ちなみに10遇齢で抗ポリADP一リボースIgG抗3カ月齢までには認められるinsulitisも完全に消体が抗ssDNAIgG抗体よりも高いマウスの頻度失していた．

を調べたところ約50％であった．このように10以上のようにFK−506はSLEならびにⅠ型糖週齢で既に高力価の抗ポリADP−リボース抗体を尿病のモデルマウスの自己免疫病の発症を抑制し有するマウスは当該抗原に対して特異的であり，た．組織学的レベルでは，明らかな副作用は認め

ベナドロスチンによる抗体産生抑制効果がよく現なかったが，唯一NODマウスにおいて食事摂取

われるところから，MRL／Jマウスの低仔産例での低下に起因する体重減少が認められた．

の選択的抗ポリADP−リボース抗体の異常上昇に（平成元年度）はポリADP−リボース合成酵素の関与が強く示唆

Ⅰ型糖尿病のモデル動物であるNPDマウスにされる．また10週齢MRL／lマウスのポリADP−

IFN−γを全身投与し，自己免疫発症に対する効果

リボース感作で全例に強いIgG抗体応答がみらを検討した．その結果，IFN一γは糖尿病発症前のれたことからも以上のことが支持されよう．

いずれの時機から投与しても，NODマウスの顕以上の結果から，ベナドロスチン投与実験は抗性糖尿病の発症を抑制する効果を有していた．し原つまり揖リADP一リポースのB細胞への提供

かし，組織学的には，IFNrγはinsulitisを早期にを物質の産生レベルで低下させ，免疫調節できる

誘導する作用を有していた．すなわち，IFN一γは，ことを示したものである．また本研究は全身性自NODマウスの自己免疫現象に対して，insulitisの

己免疫疾患において自己抗原が重要な作用をに促進と糖尿病発症の抑制（β細胞破壊の抑制）といなっている場合のあることを明瞭に示すことが出う，2つの異なった作用を有することが明らかと来た初めてのケースであろう．今回は基礎実験になった．

重点を置いたが，次に来る実験計画ではMRL／J
マウスを用いた妊娠系での臨床実験が可能となろ9．ポリADP−リポース合成酵素阻害剤（ベナドロう．

スチン）と抗ポリADP−リポース抗体（金井芳之）SLEモデルマウスの妊娠系に対するベナドロ−143−

10．エリテマトーデスモデルマウスを用いた微生えられる．T依存性および非依存性（B細胞依存

物代謝二次産物の治療効果に関する研究（藤原道性）の免疫応答を共に著しく抑制するからである．

夫）

MRL／砂γマウスでは，異常に増殖するT細胞ポ

上記タイト／レを遂行する目的で以下のようなス

ピュレーションを選択的に障害し，正常のT細胞は保持される．

テップで試験を実施した．
（1）免疫応答に対する産物の効果

以上のようにDSPはエリテマトーデスに対しこれまでに知られている治療薬（ステロイド類，て治療効果があることがモデルマウスで示されサイタロフオスフアミド）は強い免疫抑制効果をた．しかも異常な細胞増殖を選択的に障害すると持つことから，簡便で定量性のあるヒツジ赤血球

いう好ましい側面も示された．

に対するマウスのブラック形成能に対する影響を（5）今後の問題点

指標に．して産物のスクリーニングを行った．調べ

これは更に詳しい作用機序と副作用の追求といた産物の中で15−デオキシスパーガリン（DSP）の

う点にしぼられてくる．投与プロトコールと他剤

みが強い抑制活性を示すことが確かめられた．

との併用効果も検討する余地が残されている．

（2）次のステップとしてエリテマトーデスモデル
マウスを用いて発症抑制効果を調べた．

またエリテマトーデスの他のモデルを用いた効果，臓器特異的自己免疫疾患に対する効果も検討

ヒトへの応用を考える場合，疾患モデル動物のを進める必要がある．

妥当性が問題となる．エリテマトーデスには優れたマウスモデルがあるので，それを用いて産物の11．各種微生物二次代謝産物によるEAE病変の効果を検索した．MRL／砂rおよびBXSB（♂）マ

修飾に関する神経病理学的研究（生田房弘）

ウスは8週齢までは異常は認められないが，13適本班で有する各種薬剤に関し，脊髄hom0−

齢位でB細胞の自発的活性化が顕著になり，自己

genateを抗原とするラットEAEに対するそれら

抗体（抗核抗体など）が検出されるようになり，の抑制効果を組織学的に検討した．

ループス腎炎が発症してくる．20週には諸症状が（1）15−Deoxyspergualin（DSP）

顕著になり，マウスは死亡し始める．

感作当日から5mg／kg連日投与することで発これらマウスに5週齢から7週間DSP（2．5〜5症は遅延し，症状の回復率も高まり，形成病変もmg／kg）投与すると免疫異常とループス腎炎の発軽かった．感作後5日目以後，ないし発症後投与

現が完全に防止できた．

では，抑制効果はない．感作当日から連日投与し，（3）次に発症後にDSPを投与してエリテマトー

感作後59日目での結果は，DSP投与によりEAE

デスの進展に対する効果を調べた．13過齢から病変はかなりな程度に治癒し得る可能性を示して

DSP5mg／kg2週間投与し，2週間休み，再び次いた．

の2週間投与するというプロトコールで，エリテ（2）Benadrostin

マトーデスの進展は著しく抑制されていた．さら感作当日より10mg／kgあるいは20mg／kgをに17過齢から同量を2週間投与した場合にも抑連日投与しても，発症遅延効果は認めない．脱髄制効果が示された．他の産物でこのような効果は巣も多数認められたが，その程度は無処置対照

示されていない．

EAEラットより軽く，組織学的に，ある程度の抑（4）DSPの作用機序の検討

制効果が得られた．

DSPはTおよびB細胞の両者に作用すると考−144−

本研究三旺を終了するに当たって（3）DSP−Benadrostin併用

二次代謝産物を，疾患モデル動物（実験的アレル

感作当日以後10日間併用投与を試みた．組織学

ギー性脳脊髄炎；EAE）でスクリーニングし，発的には抑制効果が認められた．一方，発症直後か症抑制，疾患の治療を可能にする物質を見出し，らの投与では，組織学的に抑制効果は軽度であっ新薬として臨床での実現を図ることを目的として

た．

いる．

（4）Bactobolin

これまでに数十種類の薬剤をスク＿リーニングし

lmg，0．1mg／kg量では感作当日，あるいは，てきた．デオキシスパーガリンとパクトボリンが感作後5日目からの連続投与でも病変形成の抑制

有望な薬剤として登場した．デオキシスパーガリ

効果は認められなかった．一方，発症後の同量連ンはどちらかというと，発症の抑制により効果的日投与では，EAE病変形成は強く抑制された．治であった．これに対してパクトポリンは発症後も療薬としての本剤の最少有効量を知るために更に効果がある点で治療剤として期待できた．しかし

0．05mg／kg，0．01mg／kgの各量を発症後投与

動物種によっては極めて強い毒性がみられ問題がし，検定したが，いずれの量でも，対照としたEAE

あった．

ラットの病変よりも強い病変が形成された．以上

他方，毒性のない誘導体では治療効果も減少し

4doseでの検定では，0．1mg／kgが最少有効量とた．脳・神経疾患には脳・血管関門の障壁の克服考えられた．

という問題があり，その疾患治療にはドラッグ・（5）Bactobolinと他剤併用デリバリーシステムの開発が要求されているが満BactobolinO．1mg／kgにBenadrostin10mg／

足すべき解答がえられていない．それに対する方

kgまたは，DSP5mg／kgを発症後連日投与し検策としてリポソーム投与法を取り上げた．ロイペ

討したが，Bactobolinの抑制効果は増強されず，プテンや，抑制性T−細胞誘導能をもつペプチド

むしろ単独投与が有効であった．

である血清胸腺因子（FTS）を，スルフアチド・リ（6）Actinobolin

ポソームに抱合してEAE動物に投与した時，顕5mg／kg，20mg／kg量を感作目および発症後著な治療効果をみとめた．このリポソーム法の利に連日投与した．抑制効果を認めなかった．

点は薬剤の毒性の軽減，投与薬剤の生体内半減期（7）DiprotinAの制御，脳・血液関門通過の増強などにあるもの

lmg／kg，20mg／kg量を感作目および発症後と考えられる．

より連日授与した．抑制効果を認めない．

EAEを検定系として用いた場合に，動物種，抗以上から，EAEに対するDSPの予防効果と原などの相異から統一した見解が得られるのに困

Bactobolinの治療効果が示された．Bactobolin

難が生じた．班員の研究結果を整理し，有効性のの最少有効量は0．1mg／kgと考えれらた．より少判定，投与法，使用動物種，抗原等について一定量投与では逆にEAEを増強する，このことは重の方式を決めていく必要がある．

要である．

課題としては有効薬剤の検索とリポソーム法など投与法の開発を図ることが引き続き必要であ12．実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）に関する．本プロジェクトで開発される新薬が，多くのる二次代謝産物の治療剤の検索（永井克孝）

自己免疫疾患の病理の理解を助けるとともに臨床

多発性硬化症など免疫性要因が関与する難治性
脱髄性脳・神経疾患を治療対象疾患とした微生物への実験的応用へと進展してゆくことを期待して
いる．

−145−

13．自己回帰モデル解析による免疫ネットワーク

リーを明確にさせるためにも，このようなフィー

解析と免疫調節剤の作用評価（和田孝雄）

ドバック解析法を用いる必要があると考えられ

従来，自己免疫疾患の治療薬において，中心的る．

役割を演じてきたのは，主としてステロイドと免疫抑制剤であった．しかし，これらは免疫系全体

14．微生物二次代謝産物の免疫抑制効果，特に腎に抑制的なために，必然的に生体の抵抗力を弱め炎発症・進展の抑制について（大久保充人）

るという副作用をもっている．そこで特定の免疫■ 微生物二次代謝産物のうち，免疫抑制作用を有

担当細胞の機能障害を正常化させる期待をもってするものをスクリーニングして，腎疾患に対する免疫調節剤といわれる薬剤の開発がなされるよう効果を検討し，ヒトへの応用を最終の目的とした．

になってきた．しかし，免疫系は全体としてネッ

まず，糸球体腎炎を自然発症するマウスである

トワークを形成しているために，いわゆる免疫調

ニュージーランドB／W Flマウス（B／Wマウ

節とよばれる作用は具体的にどのようなものをさス）を対象に選び，マウスに対する延命効果を指標

すのかということになると，不明な点が多い．そにして，当研究班で開発された20数種類の微生物

こで，この分野に自己回帰モデルを用いたネット

二次代謝産物に関してスクリーニングを行った．

ワーク解析法を導入し，免疫調節作用の実態をあ

これらの薬剤のうち，延命効果を認めたものにつさらかにし，ついで免疫調節剤の作用を客観的にいて，腎炎への影響および免疫抑制機序を中心に評価する方法の開発からとりかかった．最初の2詳細な検討を試みた．また，BALB／Cマウスを用

年間で赤池のパワー寄与率およびインパルス応答

いて，該当薬剤の毒性試験，作用機序の検討や同がCD4，CD8細胞を中心とするフィードバック制

種免疫反応への抑制効果の有無の検索などを行っ

御を具体的に表示し得ることを証明した．3年目

た．最後にヒト腎移植患者への臨床応用も試みつ

は健康人においてベスタテンの免疫調節作用につつある．

いて調査を行い，この薬剤が従来生体外で確認さスクリーニングを行った薬剤のうち，15−

れた作用と，生体内作用との関係を明らかにし，

deoxyspergualin（DSP）で明らかな延命効果が認

また同時にこの薬剤の安全性の確認を行った．4められた．また，bactobolinで軽度の延命効果を，

年目は免疫異常のある透析患者において，ベスタ

bactobolamineで腎症への治療効果を認めた．

テンを投与し，この薬剤がIgGの異常を正常化さDSPに関して，さらに検討した結果，B／Wマウス

せる作用を持つことを明らかにした．5年目がベの糸球体腎炎に対して発症だけでなく，すでに進スタテンと他の免疫調節剤，すなわちロベンザ

行した腎炎に対する治療効果も認められた．また，

リッド，サラゾピリンなどの調節作用との比較研

DSPはマウスの同種甲状腺移植片の生着延長も究をおこなった．その結果，免疫調節という面か来した．一方で，DSPは白血球減少や貧血など骨らみると，ベスタテンはかなり直接的に免疫担当髄抑制作用を呈することが判明した．これは，ヒ細胞の機能回復を実現するが，他の2薬剤の作用

ト腎移植患者で急性拒絶反応のrescue therapyは，炎症因子などに対する作用を介して免疫ネッにSDPを応用する際にも，今後の間麺として残トワークに間接的に影響すると思われた．従って，されている．

この2薬剤の投与下では個体によってさまざまな

B／Wマウスでの成績は今後DSPをSLEや腎動的変化が見られ，あまり一定な作用がみられな炎を初めとする各種の自己免疫疾患の治療に応用いことが分った．今後，免疫調節剤というカテゴする根拠を提供する．また，DSPはIL2産生に影−146−

本研究］証を終了するに当たって響を与えずに，ヘルパーT細胞を抑制，すなわちかに抑制されることより，本研究班で開発された

TH−2クローンを抑制するものと推定させる結果

各種薬剤がHAMの治療薬となり得るかをAPRが得られたので，この点をさらに追求することにの抑制を指標に検討した．その結果，15−DSG，より，B／Wマウス腎炎発症メカニズム解明の有methylLDSG，Foroxymithine，BestatinにAPR

力な手段となり得よう．

抑制効果が認められ，Diplotin−AはAPRを増強した．

15．自己免疫性神経疾患治療薬の開発研究（井形考察：Guillain−Barre症候群の治療薬として15−昭弘）

DSG，Bactobolin，Actinobolinにその可能性が示

免疫学的機序がその癖態として考えられている唆されたが，発症後の治療効果は不充分で，投与

各種神経疾患の治療薬の開発を目的とした．

量，投与方法の検討，さらに新しい薬剤の開発が方法：（1）末梢神経ミエリンに対する自己免疫がまたれる．また，自己免疫疾患の病態が明らかに病態として考えられているGuillain−Barre症候

なりつつあり，その免疫学的過程に対応した薬効

群の動物実験モデルである実験的アレルギー性神を持つ薬剤の開発により，その病態に則した治療

経炎（EAN）をもちいて本研究班で開発された各が可能となるものと期待される．

種薬剤を投与し，EAN抑制効果及び，発症後の治

HAMの病態における免疫学的機序の役割がか

療効果を臨床的，組織学的に検討した．（2）なり明らかとなり，さらにAPRの抑制を指標とHTLV一Ⅰが関与する慢性進行性のミエロパする治療薬スクリーニングはHAMの治療薬開テ一・HAMの病態に免疫学的機序が想定されて発の突破口として期待される．今後より多数の薬おり，その臨床像，各種免疫学的パラメータを検剤につき検討を進めたい．

討した．さらに本症に特徴的にみられる末梢リン
パ球の自己増殖反応（APR）の分析を行い，それを16．ヒト末梢血単核球による抗核抗体産生におよ指標としてHAMの治療薬のスクリーニングをぽす15−deoxyspergualinの影響に関する研究試みた．

一抗体産生抑制機序について−（本間光夫）

結果：（1）EANは15−Deoxyspergualin（15−種々の動物実験で15−deoxyspergualin（以下DSG），Bactobolinによりその発症が抑制された．

DSG）は免疫抑制作用を有することか示された．

Foroxymithineでは病変は軽度である傾向が示

本研究は，DSGがヒトの膠原病の治療に使用されされた．Forphenicine，Diplotin一Aに抑制効果はることを念頭に，その作用機序を明らかにするた

みられず，Diplotin−Aはむしろ病変を増殖した．

めわ7〃言わ℃での実験を行った．

発症後の治療的投与では15−DSG，Bactobolinのまず，膠原病患者末梢血単核球による無刺激

0．5mg，1mg／kg・匹，Foroxymithineの400Jg，IgG産生ならびに自己抗体産生を，DSGが抑制す

1mg，20mg／匹の投与にて有意の治療効果は見出るかどうかを調べた．その結果，DSGはこれらをせなかった．Actinobolin200mg／kgではEAN

抑制することが判明した．同時にマイトゲン刺激

病変の軽減が認められた．（2）HAM患者ではによる健常人末梢血単核球の増殖およびIgG産

IgG・IgAの増加，活性化T細胞の増加，APRに生も抑制することが判明した．

おけるCD8陽性細胞の優位などの免疫学的特徴

次に，この抑制作用が免疫担当細胞のどの細胞が明らかとなり，プレドニゾロン，IFN一γが治療を介したものであるかを明らかにするため，健常効果を示した．更にAPRはこの2剤により明ら

人末梢血単核球を用い，細胞の組合せ培養実験を−147−行った．その結果，T細胞，B細胞いずれもDSG

リンAおよびDSGで一部抑制された．

処理により，増殖反応ならびにIgG産生が低下し〔結果の評価〕

たが，主としてT細胞に作用することがわかった．

DSGは，健常人では主としてT細胞に，SLEでは主にB細胞に作用し，これら免疫担当細胞の増さらに，T細胞をT4およびT8の亜分画に分殖反応を抑制することにより抗体産生を抑制した

け，それぞれのマイトゲンに対する増殖反応を調と考えられた．また，この細胞増殖反応抑制には，べたところ，主にT4細胞の増殖が抑制された．

初期の細胞内カルシウム濃度の変化が関与してい一方，SLE患者（抗SSB／La抗体陽性）末梢血
単核球を用いた特異抗体産生（抗SSB／La抗体陽る可能性が示唆された．
〔今後の展開〕性）は，むしろB細胞をDSG処理した方が強く抑制された．

細胞内カルシウム動態をさらに詳しく調べることにより，既にサイクロスポリンAで明らかにさ最後に．最近T細胞増殖反応の初期段階としてれつつある細胞内での作用機序が，DSGについて注目されているT細胞活性化機構において，健常も明らかにされることが期待される．また，将来

人末梢血単核球を用い，細胞内カルシウム濃度を膠原病など自己免疫疾患患者で，DSGのかかる抗指標としてその影響を調べた．

体産生抑制作用が自己抗体産生を抑え治療につな

その結果，PHA（Phytohemagglutinin）で刺激がる可能性がある．

した時のカルシウム濃度の上昇は，サイクロスポ−148−自己免疫疾患治療薬の開発研究
一微生物二次代謝産物を中心として−開発研究班分担研究者一覧
氏

名

所

属

T

住

班長 青柳

高明 微生物化学研究所

141

東京都 品川区上大崎 3−14−
23

03−441−
4173
内 233

幹事

永井

克孝

東京大学医学部
生化学113

東京都文京区本郷 7−
3−1

03−
812−
2111
内 3448〃和田孝雄

慶応義塾大学医学部
腎臓センター160

東京都新宿 区信濃町 35

03−
353−
1211
内 2257

監事

本間光夫

慶応義塾大学医学部
内科

160

東京都新宿 区信濃町 35

03−
353−
1211

班員

井形

昭弘 鹿児島大学

890

鹿児島市郡元 ト21−24

0992−
54−
7141

〃

生田

房弘

新潟大学脳研究所

951

新潟市旭町通 ト757

0252−
23−
6161
内 5151〃

石塚雅章

化学療法研究所

410−
03

沼津市宮本字元野 18−
24

0559−
24−
0601

〃

梅澤

一夫 慶応義塾大学理工学部
応用化学科

223

横浜市港北区 日吉・
3−
14−1

044−
63−
1141
内 3481〝

大久保充人 北里大学医学部
内科

228

相模原市北里 1−
15−1

0427−
78−
8111

〃

金井

108

東京都港区白金台 4−
6−
1

03−
443−
8111

〃

佐藤

113

東京都文京区本郷 2−1−
1

03−813−3111
内 3322〃田平

小平市小川東町 4−
ト1

0423−
41−
2711
内 5161〃谷口

千葉市亥鼻 1−
8−1

0472．
22−
7171

芳之 東京大学医科学研究所
癌生物学研究部
猛 順天堂大学医学部
脳神経 内科武国立精神 ・神経センタ 187
ー神経研究所克 千葉大学医学部
280
高次機能制御研究
センター

所

T EL

〃 ．
徳永
〃 永津

徹 国立予防衛生研究所
俊治 名古屋大学医学部

141

東京都品川区上大崎 2−10−35

03−441−2181

466

名古屋市昭和区鶴舞町 65

052−
741−
2111

〝

藤原

道夫

新潟大学医学部
医動物学

951

新潟市旭町通 1−
757

0252−
23−
6161

班友

石井

靖男

日本化薬株式会社

102

東京都千代 田区富士見 1−11−203−237−
5153

〃

大宮

久

宝酒造株式会社

600

京都市下京 区四条通

075−
211−
7131

乗洞院東入立売西町 60
明治製菓株式会社

104

東京都 中央 区京橋 2−
4−16

03−
273−
3414

メタ ト株式会社

163

東京都新宿区西新宿 2−1−
1
三井 ビル 5 F

03−
344−
5411

141

東京都品川区上大崎 3−14−2303−
44ト4173

〃
〃

北里 一郎
志鳥 善保

〃

竹内 富雄 微生物化学研究所（五十音順）−149−