厚生

省

新薬開発研究費

低分子酵素阻害物質による難病治療薬の開発研究

江

橋

班

昭和61年度研究報告書

昭和62年3月

目

次

総括研究報告
低分子酵素阻害物質による難病治療薬の開発研究

3

江

橋

節

郎

江

橋

節

郎

大

倉

洋

甫

藤

井

節

郎

高

明

分担研究報告E‑64c のプロテアーゼ以外の系に対する作用

17

ホルフェニシンの生体内動態─蛍光HPLC用高感度蛍光試薬の開発─

19

蛋白分解酵素の役割とその阻害剤に関する研究

25

筋ジストロフィー症における各種筋肉内アミノべプチダーゼ活性の変化とその意義
青

柳

31

CANP阻害剤

37

大

関

正

弘

CANPの生物学的研究

41

川

島

誠

一

CANP阻害剤の設計及び合成に関する研究

45

向

山

光

昭

CANP遺伝子のクローニングに関する研究

49

鈴

木

紘

一

Lysosomal cysteine proteinase inhibitorと難病治療薬開発

53

勝

沼

信

彦

丸

山

工

作

筋ジストロフィー症の発症とトロポニンTのアイソフォーム変化ⅰ57

各種酵素阻害剤投与のmdxマウス病態に与える影響について

63

辻

繁 勝

実験的筋炎モデル動物の作成に関する研究

69

里

吉

栄二郎

北

川

晴

E‑64誘導体のグルタチオンS‑トランスフェラーゼ活性に及ぼす影響

75雄

CANP阻害剤の一般薬理学的研究
─スペクトル解析法を用いた筋電図および神経活動の定義的評価法─

79

福

原

武

彦

Duchenne型筋ジストロフィー患者血清中α‑アクチニン測定の試み

83

杉

田

秀

夫

血中骨格筋ミオシン軽鎖測定法の開発とその臨床的意義

87

矢

崎

義

雄

Duchenne型進行性筋ジストロフィー症の臨床経過:

日常生活動作能力（ADL）の経年推移

93

宮

武

正

治療薬の効果判定法における問題点

99

石

原

傳

幸

村

上

慶

郎

Duchenne PMDに対するベスタチン,ホルフェニシノールの効果

105

ベスタチンの臨床使用経験について

109

三吉野 産 治Duchenne型筋ジストロフィー症に対するベスタチンの使用経験

119

福

山

幸

夫

Duchenne型進行性筋ジストロフィーに対するベスタチンの効果

127

木

低分子酵素阻害物質による難病治療薬の開発研究班分担研究者一覧

ⅱ

下

真

男

135

総

括

研

究

報

告

低分子酵素阻害物質による難病治療薬の開発研究主任研究者 江 橋 節 郎「微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬である．

の開発研究」が，昭和54年度に厚生省薬務局よ1．E−64C のプロテアーゼ以外の系に対する作り新薬開発研究として発足し，筋ジストロフィー症に対する低分子酵素阻害物質の生化学的，薬理用学的，生理学的，病理学的研究ならびに臨床研究

江橋班員は筋崩壊の撥作を明らかにするため，において注目すべき多大の成果が得られ，昭和60

チオール・プロティナーゼ阻害物質であるE−64C

年度に7年間に亘る研究を終了した．

のプロテアーゼ以外の反応系に対する作用につい

さて，厚生省薬務局経済課に医薬品先端技術振て研究した．

興室が設置され，木江は昭和61年度から新課題

平滑筋の収縮調節に関与しているミオシン軽鎖として研究期間5年の予定で発足した．新薬推進

キナーゼ作用（以下M−作用と略称）と，ライオト会議の先生方のご好意により，本班の研究課題

ニソ作用（収縮作用，以下L一作用と略称）を取り「低分子酵素阻害物質による難病治療薬の開発研上げた．E−64CはL一作用をM一作用より強く抑究」がとりあげられ，梅沢浜夫先生が主任研究者制するが，既にこの事実はSH阻害剤で認められを引受けられた．本班は斯界の優れた研究者の協ている．それゆえ，E−64Cの誘導体を班員の協力

力により研究を開始したが，不幸にも梅沢浜夫先により合成し，M一作用，L−作用およびK−作用に生が昭和61年12月 25 日にご逝去になった．

特異的な阻害剤の探索研究を施行中である・本法の研究を進めるにあたり，厚生省薬務局なら
2．ホルフェニシンの生体内動態

びに新薬開発推進会議の先生方とご相談の結果，私が本班の主任研究者を引受けることになった・

一蛍光HPLC高感度蛍光試薬の開発一

本研究を重要課題としてとりあげられた厚生省薬大倉班員はホルフェニシソのプレカラム蛍光誘務局ならびに本班に積極的に協力されている班員

導体化HPLCによる薬物モニター法を設定する

各位に感謝する次第である．

目的で，その高感度な蛍光誘導体化試薬の開発研

本研究班は筋ジストロフィー症の治療薬開発を究を行った．

目的とし，低分子酵素阻害物質（べスタチソならホルフェニシン分子のアルデヒド基と反応し，びにE−64誘導体など）の開発とその基礎研究，

蛍光性のベンゾイミダゾール誘導体を与える芳香

前臨床研究ならびに臨床研究を行なう．

族アルデヒドの蛍光試薬1，2−ジアミノー4，5−ジメ
トッキシベンゼン（DOB）並びに今回新たに合成

各分担研究者により施行された研究は次の通り−

3−

して得た1，2−ジアミノー4，5−エチレンジオキシベ

び5ng／mJであり，従来のアルキルェステルでンゼン（EDB）を蛍光試薬として選択し，それらあるとホルフェニシンとの蛍光反応条件並びに EDB倍および 30 倍高感度である．Trypsin およびをプレカラム誘導体化試薬に用いるホルフユニシ

ChymotrypslnのZymogramについてITrypsln

ソの逆相HPLCを検討した．

では1本の活性帯が，Chymotrypsinでは3本の1．最適蛍光反応条件：用手法によって，EDB，MDBおよびMDBTAMEおよびATEE

よりそれぞれ200

活性帯が認められた．また合成基質としてPro−との反応条件（反応Phe−Arg−2→NEはPlasmaKallikreinに特異性時のpH，反応の温度と時間，各試薬濃度，最終を示し，従来特異的だと言われている D−Pro−

反応液のpHなど）を調べた結果，ホルフェニシ

Phe−Arg−PNAに比し約3倍，組織Kallikrein

ンは各3着の試薬．pH2の酸性水溶液中60℃に特異的だとされている D−Val−Leu−Arg−PNA

で15−30分間加熱することによっていずれも効に比L Pancreatic Kallikreinを用いた場合約8率よく蛍光物質に誘導され，生成した誘導体は倍高感度に測定できた．Urinary Kallikrein のpH6 6．5の中性溶液でそれぞれ最も強い蛍光を

Zymogram で pI3．8，3．9，4．0，4．2 および発することが分かった．中でもEDBによって生

4．3の6種の等電点の異なる活性帯が認められじる蛍光強度はMDBのそれより1．3倍およびた・今後これらの手法を用いて筋ジストロフィー

DDBのそれより1．6倍ほど高かった．

症に関与していると思われる酵素について検討し

2．プレカラム蛍光HPLC：EDB

とホルフユ

たい．

ニシソとの反応蛍光生成物は逆相HPLCで分離

蛋白分解酵素に対し弛力な阻害活性を示す

したとき単一の蛍光ピークを示し，それはEDB

FuT−175（6−Amidin0−2−naphthy1−4−guanidin0−と反応すると他の芳香族アルデヒド，α−ケト酸，

benzoatedimethane sulfanate）は血麓中の蛋白シァル酸などの蛍光ピークと容易に分離できた．

分解酵素を阻害（CIF：2．1×10．7M，CIs：5．1×

このHPLCによるホルフェニシ∵／の検出限界

10￣8M）し，補体溶血反応に対し独力に阻害（古（S／N＝2）は85fmol（100FL HPLC注入量）で典的経路：6・9×10￣8M，第2経路：5．1×10￣7M）

あった．以上から，EDBはホルフエニシンに対する・補体が関与しているアレルギー反応である

して高い感度と選択性を有しており，このHPLC

Ⅱ型（フォルスソマショック（およびⅢ型（アルサは充分ホルフェニシンの薬物モニターに利用できス反応）に著効を示した．以上の成績よりFuT−るものと考える．

175は補体の関与が考えられる疾患に対し有効性が示唆されたので，筋ジストロフィー症の動物モ

3．蛋白分解酵素の役割とその阻害剤に関する研デルおよび臨床効果について検討したい．

究
藤井班員は筋ジストロフィー症に関与している

4．品ジストロフィー症における各種筋肉内アミ

蛋白分解酵素の動態を究明し，蛋白分解酵素に対

ノぺプチダーゼ活性の変化とその意義する合成阻害剤を用いて病態モデルの治療および青柳班員は筋ジストロフィー症において，アミ臨床効果を目的として研究を行った．

ノべプチターゼの役割の重要性を示唆してきた

合成基質について，Trypsinに対するTos−
Lys−2−NE，Chymotrypsin

が，さらに筋ジスマウスの前肢筋，後肢筋およびに対するAc−Tyr−

心筋についてプロテアーゼの動態を研究した．

2−NEのそれぞれの測定限界濃度はIng／m仁およ−

以前に著者らが報告した筋ジストロフィー症患
4−低分子酵素阻害物質による難病治療薬の開発研究

老血清中のアミノペプチダーゼ活性は羅病初期に

protease）の選択的な阻害剤を合成的に得ること高く，進行にともない減少傾向にあることを認めを目的とし，チオールプロテアーゼ特異的阻害剤た．一方，エソドべプチダーゼ活性は初期にはむ

E−64およびその誘導体を合成し，CANPおよび

しろ低いが，病状の進行にともない増加する傾向

パパインに対する阻害活性を比較し，構造活性相にあることを認めた．

関について研究した．

患者血清中のアミノべプチダーゼ活性の動態は数十種の誘導体の中からパパインに対し作用が躍病期間と逆相関である．また，エンドべプチダ

弱く，かつCANPに強い作用を示す教程の化合ーゼ活性は頂相関であることを明らかにした．さ

物を得ることが出来た．中でも左図に示す Orn

らにアミノべプチダーゼ阻害物質であるべスタチ

およびGlu誘導体は天然 E−64 よりも CANP

ソは筋肉内アミノべプチダーゼを強く阻害するとに対する活性がかなり強く，本研究目的に適う有ともに，長期間投与により生体内酵素網に規則性力な化合物と考えられた・更に，これらの化合物をもった変動を与えることを明らかにした．本報を詳細に検討しdrugdesignすることにより秀

告では，さらに上記の知見を理解するため，筋ジれたCANP特異阻害剤を開発することが可能でスマウス筋肉内のプロテアーゼの動態を主成分分あると考えられる．

析法により解析し，前肢筋と後肢筋ではアミノべ

6．CANPの生物学的研究

プチダーゼが第1主成分と高い相関を示し，両者における酵素網の変化が極めて類似していること

川島班員はカルシウム依存性中性プロテアーゼを認めた．一方，心筋はェソドべプチダーゼと高い（CANP）の生理的機能を明らかにするため，相関を示し，前2者と異なることを明らかにした．

CANPの組織内存在部位の検討を抗体による免疫組織学的染色により研究した．

5．CANP阻害剤の研究

まず，ウサギ骨格筋から2種類の CANP（〃−

大関班員は CANP（Ca−aCtivated neutral

CANPとChemical StruCtureS Of Selected Compounds

としてモノクロナル抗体を作成した．mCANPを

mCANP）を精製し，それぞれを抗原抗原としたものからは15種類の，〃CANPを抗HO−ES一0m（Z）−OBzl

NH−COOCH2

原としたものからは30種類のモノクロナル抗体

7H2が得られた．その多くは各CANPの80K

CH2

サブ

ユニットに特異的なものであったが，両 CANPに共通に反応するクローンもあった．CANP の

H

＼
c

c

／CO−NH…：：0朝巧∋

全体像を把捉するために後者の抗体を用い，ウサ

HOOC／〉＼0／▼＼H

ギ各種臓器切片の抗体染色を行い，CANP の組
織内存在部位を決定した．
抗体染色後の巨視的にみた臓器ごとの色調の強HO−ES−Glu（OBzr）−OBzI

二∴‥‥一三さは，肺・脾・心・腎・精巣・脳・肝・骨格筋のCH2順となり，CANP の含量を反映しているものとJ
CO−NHCHCO一＼／

ocH2−◎

考えられる．徽視的にみると，多くの器官で上皮組織が強く反応した．例えは，全ての器官で血管／CくつC＼HOOCO￣

上皮が強く反応し，臓器特異的なものでも肺の肺

H

−

5

−

＊声。

Hが−C−COOH

（」＼

t

H

H。。芸域NH￣喜￣呂NH
H

0日

1，E164−C＊笹−C−CNH

H。。局N

l

ll

H

O

胞，胆のうの粘膜上皮，精巣の筋様細胞，肝臓の64関連化合物の構造活性相関に基づき，より有効

胆管，腎臓の糸球体・糸球体穿細胞・尿細管・集なシステイソプロテアーゼ阻害剤の開発を目的と合管・眼の角膜上皮などの上皮系組織が高濃度のして，5，5，5−トリフルオロ∵ロイシン（2，以下トリ

CANPの存在を示した．

フルオロロイシンと呼ぶ）を修飾基とする一連の化合物の合成を行った．

これらの結果は，従来CANPの撥能として推定されていたもの一細胞膜および細胞骨格タンパ

3−トリフルオPメチルーr−プチロラクトンの光

ク質の分解，タンパク質リン酸化酵素などの活性学分割が，入手容易な α−フユネチルアミンを用化，ステロイドホルモンや成長因子などの受容体いて行えることを兄い出し，さらに，トリフルオの活性調節，生体膜の融合一と密接な関係がある．

Pロイシン（2）の4つの可能な異性体への変換も行うことができた．CD−スペクトル，Ⅹ線解析に

7．CANP阻害剤の設計及び合成に関する研究

よって，絶対配置も決定し，さらに，ここで得ら

向山班員はCANP阻害剤の設計および合成にれた立体構造の明確な4範の2を修飾基として，1関する研究を行った．

の類縁物質の合成を試みた．まず，2のカルボン

システイソプロテアーゼに対して特異的な阻害

酸部分をイソアルミアミドとした後，しトランス作用をもつE−64−C（1）は，筋ジストロフィー症

エポキシコハク酸とのアミド化を行い，トリフル

治療薬としての有効性が著目されている．その構

オP EC−64−Cの4種の立体異性体（3）を合成

造活性相関の検討から，活性の発現にはェポキシ

し，生理活性試験の試料を供給することが出来た．

ド部分が必須であるが，アミノ酸残基として L一
ロイシンが重安であることも示唆された．

8．CANPの遺伝子のクローニング

一方，医薬品をはじめとする生理活性物質のフ鈴木班員は筋ジストロフィー症（DMD）時のッ素による化学修飾は，その強い電気陰性度，大CANP（カルシウム依存性中性プロテアーゼ）活

きなC−F結合エネルギー，脂溶性の増大などの性の昂進の原因をさぐるとともに，活性制御の研

特異性の故に，最近極めて活発な展開をみせてい究を通じて，CANPる．そこで，有機フッ素化化合物の特異性とE−薬の開発の基礎を築く目的で研究を行った．

−

6

−

活性を特異的に阻害する試

低分子酵素阻害物質による難病治療薬の開発研究

本年度はCANPの細胞内活性化機構の解析のり上昇したカテプシソ活性は抑制されているのはか，特に内在性のCANPインヒビターの構造で，投与量と投与方法を選べば有意義に阻害され解析を行った．即ち，ウサギ肝臓のインヒビター

ると思われる．筋ジストロフィー症以外の難病治に対応するCDNAのクローニングを行い，その療のためにシステイソプロテアーゼインヒビター

全アミノ酸配列を決定した．CANP

インヒビタ

を応用できる可能性はあるが，筋ジストロフィー

ーは718個のアミノ酸からなるが，肝細胞で見出における如く，基礎研究まず先行されるべきだとされるインヒビターは上記の翻訳産物のN末端側感ずる．

の79残基が欠けた639残基のものであった．このアミノ酸配列は従来のプロテアーゼインヒビタ

10．筋ジストロフィー症の発症とトロポ二ンTのーの構造とは全く違っていたので，その阻害機構

アイソフォーム変化

も従来のものとは違う可能性がある．

丸山班員は筋構造蛋白質の変化を筋ジストロフ

このアミノ酸配列はアミノ酸約140残基を単位ィー症の発症の指標にし，鶏とマウスの筋ジストとした繰返し構造が4個含まれていた．CANPイ

ロフィー発症にともなうトロポニソT（以下TNT

ンヒビターは以前から数分子のCANPを阻害すと略称）の発現変化について研究した・

ることが知られていたので，インヒビター1分子

種々のTNTアイソフォームを，いずれも検出

中に数個の阻害部位があることが予想された．こできるモノクローン抗体（NT−302）を作成した．

の140残基からなる繰返し単位がCANPを阻害

鶏胸筋，または，、マウス大腿直筋の小片からの全する単位であることを示すため，大腸菌で各繰返

抽出蛋白質を一次元，および，二次元電気泳動にし単位を発現したところ，各繰返し単位が1分子展開した後，NT−302を用いたイムノブロットにのCANPを阻害することが解った．

より，TNTのスポットを同定した．親の鶏正常胸筋には，ほとんど1個だけのTNTスポットが存在するのに対し，発症したジストロフィー鶏胸9．Lysosomal cysteine proteinaseinhibitor筋の場合，30個以上ものTNTと難病治療薬開発

アイソフォーム

勝沼班員は筋ジストロフィー症における筋変のスポットが出現した．これらの中には，親の胸性・壊死の進行において多段階に働くプロテアー筋，ヒヨコの胸筋，親の足筋のTNTスポットとゼの作用機構ならびにプロテアーゼ・インヒビタ

重複するものもあったが，ジストロフィー筋に特ーの役割について研究を行った．

徴的なスポットも存在した．一方，発症した筋ジ低分子システイソインヒビターであるロイペプ
チソおよびE−64の各種誘導体の玩乙融和ストロフィー（dy）マウスでも，正常マウスにみられない数個のTNTスポットが明確に認められ

およびわ2びわ0でのリソゾームシステイソプロテアー

た．TNT

ゼの活性阻害，各種薬効について報告してきた．

指標と言える．また，NT−302は，ほ乳頬の筋をしかし，ジストロフィー筋でみられた筋細胞内カ

含め，種々の筋のTNTの変異体を検出するのにテプシソ群の上昇をこれらのインヒビターが抑制

きわめて有効であるので，本実験での手法は，筋するかどうかを調べたことはない．なぜなら浸潤病変を蛋白質レベルでみる上で役立つと思われ細胞のプロテアーゼ活性を含まずに測定せねばなる．

らないからである．
Chlorogine myopathyではE−64の投与によ−

7−の変化は筋ジストロフィー症の一つの記3阻害剤については条件の改善を行って再度実験を行う必要があるものと考える．

11．各種プロテアーゼ・インヒビター投与のmdx
マウス病態に与える影響について

12．実験的筋炎モデル動物の作成に関する研究

辻班員は8種類の新しい酵素阻害物質の筋ジス
トロフィー症に対する疾病抑制効果について，疾里吉班員は多発性筋炎（PM），皮膚筋炎の実験

病モデル動物である C57BL／10−mdxマウスおよ

モデル動物を作製し，低分子酵素阻害物質の薬効

びC57BL／6J−dy2Jマウスを用いて研究した．

について研究した．

生後約2カ月齢のmdx

本研究は．PM，DM

マウスならびにdy2Jの実験モデル動物を作製

マウスを1組3頭ずつに別け，各阻害物質を，1し，低分子酵素阻害物質による薬効を検討するの

日 0．4mgずつ背部皮下に6週間にわたって投与が目的である．実験モデル動物作製のために，疾し，その間の血清中PK活性の変化を追跡した．

患特異的な抗原物質を同定しようと試みた．

また同時に投与終了後屠殺した各マウスの血清中

その方法として，PM，DM同様，筋に特異的および骨格筋中のPK，CPK，LDH，GOT，GPT

自己免疫疾患である重症筋無力症（MG）の患者などの疾病のマーカー酵素の活性変化を測定し，血清中に筋膜成分阻害性の抗体が，PM各阻害物質の疾病進行に対する抑制効果を判定しの血清より高値に出現している点に着目し，筋肉

た・更に，投与終了後の各マウスの後肢筋を固定

抽出物に対するモノクローナル抗体を作製した．

染色し，光顕レベルの組織学的検索を行った．そこの抗体産生ハイブリドーマライブラリーから，の結果投与期間中の血清 PK 活性の変動では，MGにおいて，抗原となっている物質をスクリー

Actinonin，Diprotin−AならびにFormestin−A

ニングし，3種の抗原認識モノクローナル抗体をが投与を続けるに従って活性を低下させたのに対得た．この抗体に結合する抗原物質は，電気泳動

しPost−Pr0−Inh，Benadrostin，FuF−175では的に比較的高分子のタンパク質であり，筋組織の次第に活性が増加した．またBactololinおよび

間接蛍光抗体法では，横絞構造に特異的に存在す

15−Deoxyspergualin 投与のマウスは投与期間中るように思われた．

やDMに全て死亡した．投与終了後の血清中および骨格

今後，さらに，これらのモノクローナル抗体の筋中のマーカー酵素活性の変動スペクいレから，認識する抗原物質を詳細に調べ，筋膜の障害活性Actinonin，Diprotin−A，Formestin−Aの投与の有無，PMとの関連性について検討する予定ででは血清中の酵素活性が低下し，骨格筋中の酵素ある．

活性が上昇する傾向，即ち，疾病の進行が抑制される傾向が認められた．他の阻害剤では，はっき

13．E−64誘導体のグルタチオンS−トランスフェ

りした改善傾向は認められなかった．一方，組織

ラーゼ活性に及ぼす影響

学的な検索では，マーカー酵素の変化とほは一致

北川班員はE−64誘導体のグルタチオンS−ト

した傾向は認められたが，全ての阻害剤について

ランスフェラーゼ活性に及ぼす影響について研究

判然たる改善を示す像は得られなかった．このこした．

とは恐らく投与開始が既に疾病の進行した時期で正常時の血簗中におけるグルタチオンS−トラあること，投与量がかならずLも適当でないかも

ンスフェラーゼ（GST）活性は極めて低いが，薬卿れないことなどが原因して，はっきりした結果

物誘発性の肝障害時には血渠GST活性が著しくをもたらさなかったものと思われる．従って，前上昇することが知られている．最近，ラットにお

−

8

−

低分子酵素阻害物質による難病治療薬の開発研究

いて高用量のE一朗連続投与により血中トランス

呼吸筋の筋電図ならびにそれを支配する遠心性

アミナーゼ活性が増加することが報告されてい神経の電気的活動の定量的な解析に基づいた呼吸る・そこで今回，低分子酵素阻害物質の代表的化

筋変性の進行とCANP阻害剤の治療効果を評価合物であるE−64CとE−64dについてラットに各する方法を確立するための基礎的知見を得る目的々400mg／kg7日間連続投与したところ，E−64dで，麻酔下のウサギから横隔膜自発性筋電図，な投与群においてのみ明らかな肝の障害を反映した

らびに／または横隔神経の自発性発射活動を導出ものと示唆された・この時，血菜中のGST活性し，その中に発現する約60についてもE−64d 投与群においてのみ活性の増期波に？いて定量解析を行って，ヒトへの応用可加がみられた・一方，肝サイトソール中のGST能性について検討した．

130Hzの高頻度同活性に関しては，E−64d投与群において顕著な活麻酔下非動化動物から導出された横隔神経遠心性の減少が認められた・そこで，E−64d投与群の性発射活動の自己パワースペクトルには約 80〜

血梁中にみられたGST活性の増加は肝サイトソ130Hzの帯域に高頻度同期波に相当する明瞭なールのGST活性の低下を反映したものか香かにどークが見出された．非線形最小二乗法によってついて検討した・ラット肝サイトソール由来の推定されたそのピーク周波数とピーク面積は換気

GST1−2と3−4に対する抗体を用いてWest−

レベルの変化に対し極めて鋭敏に変化した．

ern blot法による解析を行った．先ず，血菜を麻酔下自発呼吸下動物から同時導出された横隔GSHアフイニチイカラムにより前処理し，可溶

膜筋電図ならびに横隔神経発射活動の高頻度同期

化後SDS−PAGEを行った．泳動後，ニトロセル

波の周波数帯域成分（60−140Hz）において，横ロース膜に転写し，それぞれの抗体を用いてPAP

隔神経高頻度同期波に1対1に対応した明瞭な周染色を行った．その結果，コン1トロールおよびE−

期約10ms の波を横隔膜筋電図中に見出すこと

64C投与群の血菜には，ほとんど染色バンドがみが出来た．この杭隔神経高頻度同期波を同期信号られないが，E−64d投与群では明らかにGST1−とした加算平均法によって確認された．

2および3−4に相当する位置に染色バンドが認

このような高頻度同期波のスペクトル解析法のめられた・このことは肝サイトソールのGSTが応用によって，運動ニューロン以下，神経筋伝達，肝の障害により血梁中に漏出したことによると示筋収縮に至るまでの過程における病態生理学的変唆される．

化を定量的にかつ非侵襲的に評価し得るものと考以上により，薫物誘発性肝障害を判定する手段

えられる．この解析法が確立されれば，筋ジストとして，血菜中のGST活性さらにはそのWest−ロフィー症における呼吸筋変性の進行の程度およernblot法による解析は肝障害をより正確に判断

びCANP阻害剤の治療効果の非侵袋的な定量的する上で有力な指標となる可能性が示唆された．

評価の一方法と一つの臨床的に応用され得る可能性があるものと考える．

14，CANP阻書剤の一般薬理学的研究−スペク
トル解析法を用いた筋電図および神経活動の15・Ducllenne型筋ジストロフィー患者血清中定量的評価法一

か7クチ二ン測定の試み

福原班員はCANP阻害剤の一般薬理学的解析

杉田班員はアクチンと結合する骨格筋のZ帯にとしてスペクトル解析法を用いた筋電図および神存在するα−アクチニソを筋崩壊の指標として，血経活動の定量的評価法について研究した．

清中のα−アクチニソ測定に関する研究を行った．
−

9−

ヒト骨格筋より α−アクチニソを精製し，家兎

細胞質中に可溶性蛋白として存在するために，細に免疫して抗血清を得た．抗血清はアフイニティ

胞膜の透過性克進のみにより細胞中に逸脱して血ーカラムを用いて抗α−アクチニソIgGとした

中に流出することから，筋肉組織障害を検出する

後，架橋試薬meta−maleimido benzoyl−N−hy−

感度は高いが，筋細胞の構造崩壊過程を直接反映

drosuccinimide ester（MBS）を用いてβ一galac−する指標とはならない．一方，細胞構築を構成す

tosidaseとのCOnjugateを作成した・このCOn−

る構造蛋白が筋障害時に血中に流出し，これを測

jugateによりenzymeimmunOaSSayを行いα−定できれば，その血中濃度の変動が障害部筋組織

アクチニソ2ng／mJから2000mg／m仁にわたるの崩壊と治癒過程と直接反映する指標となり，筋検量線を作り，DMD患者10名，正常対照群10

肉障害の病態把捉にきわめて有用である・また新名の血清α−アクチニソを測定した・

しく開発された治療法の定量的な評価にも役立つ

この結果，DMDstageⅢの患者2名が正常対ものと期待される．

照群（26．0±27．2ng／mわと比較して有意に高値

そこでわれわれは，筋細胞の主な構築で，収縮を示した．他のStageの患者では有意な増加はなの最小単位である筋原線経を構成する構造蛋白ミ

かった．なお，α−アクチニソレベルとCK値のオシンに注目し，障害時に細胞外に逸脱しやすい

相関は，今回の検索の限りでは認められなかった．

分子量の小さなサブユニットの軽鎖のラジオイム

これまでの報告では，DMD患者血清中のミオシ

ノアッセイ法を確立して，血中軽鎖測定の臨床的ン軽鎖Ⅲを意義を検討した．

RIAに測定したものがある，Stage

マラソンなどの退散な運動により血中CPK値

ⅡとⅢで高値を示しており，今回のわれわれの結が上昇することが知られているが，われわれは93果に煩似している．
測定法の問題点として，①測定下限が20ng／

時間行軍訓練により，CPKばかりでなくミオシ領域の検量線ン軽鎖値も有意に上昇し，しかもその高値がCPKの傾きが小さいために測定値がrough である，

値が前値に戻った3日後にも持続することを示しということが挙げられる．特に②については抗体た．しかし最高値は筋肉変性疾患と比較して低値のa侃nityに原因があるかも知れず，今後の課題であった．すなわち，退散な筋肉運動により筋細と考えられる．測定条件を整え，症例数の追加，胞は，ごく一部に限られるが壊死し，筋原線経が病像，CK値との相関等につき検討する予定であ崩壊される可能性がある．Duchenne型筋ジスト

る．

ロフィー症では著しい血中軽鎖値の‡上昇を認め

mJであり，②200−2000ng／mJ

た．CPK値とより相関がみられたが，筋細胞の16．血中骨格筋ミオシン軽鎖測定法の開発とその変性崩壊を直接反映する指標になりうるはかりでなく，治療の評価判定にも有用と考えられた．

臨床的効果
矢崎班員は血中骨格筋ミオシン軽鎖測定法の開17．Duchemne型進行性筋ジストロフィー症の臨

発とその臨床的意義について研究を行った．
筋肉疾患において，変性ないし障害された筋肉

床経過一日常生活動作能力（ADL）の経年推
移細胞より血中に逸脱した蛋白を測定して生化学的

宮武班員はに診断する方法が，感度と特異性に優れているこ

Duchenne型進行性筋ジストロフとから臨床で広く用いられている．しかし従来よィー症の臨床経過について，生活動作（ADL）のり指標とされている CPK を中心とした酵素は，経年推移について研究を行った．

−10−

低分子酵素阻害物質による難病治療薬の開発研究

今回はADLを治療効果の判定に用いることが可能か香かについて検討を行った．

院平均より約6カ月の延長を見せたことから有効の可能性があることを発表してきた．しかし，こ1．材料と方法の結果は他施設との比較が出来なかったことから対象は国立療養所新潟病院に入院あるいはディ

公式には評価を受けなかった．今後は批判にたえ

ケアー外来で観察しているDMD73例で，ADL

うる客観的な指標を選ばなければならないと考えの変化を症例毎に観察した．また比較的初期からている．

ADLの観察を行ってある11症例を用い，ADL

英・米では1980年代に入り治療効果判定法を70点までの値を非線形最小二乗法で処理し，標準化しようという試みがなされてきた．両グル

CurVe丘ttingを行った．

ープ共，二重盲検試験の採用や自然歴を重視する

2．結果ならびに考察点で一致していた．英国では筋力を器械で測定しDMDのADLは年長になるに従って徐々に低筋力の推移を特に重視した．米国では筋力の低下

下し10歳前後で50点を割った．個々の症例の度の自然歴をMMT

ADLの経過は症例により異り，ADLが50点を者筋力の低下度と power表により治療効果判定

越える点も8歳前後から15歳頃までと広がってに要する患者数が算出できるとしているのが大きいた．比較的初期のステージから充分なADLのな特徴である．

資料がある11例では■70点までの値は指数関数曲

ESTより算定し，観測された患

薬効判定上の問題点としてほ，多くを線y＝−0．91／（1＋e8Ⅹ＋b）＋0．95に回帰された．

ADL，ROM，機能テストに重点をおいてきたこ

全症例において70点以降40点前後までのADLとがあげられる．これらに関与する因子は多く判の値は70点までのポイントから得られた指数関定には困難がつきまとう．障害度については施設

数曲線上に認められた．

間のばらつきが大きいという問題点があげられ

ADL70点までのサンプリングポイントでそれる．やはり，筋力測定に重点をおくべきであろう．

以後のその後の症例が取るべき推計値を予測でき

今後の方針としては，二重盲検試験の採用，患ることを示した．ADLによる評価を治療効果の者の障害度を揃え，特に歩行可能児のみにしぼっ判定に用いようとするならば，このような予想曲て試険を行い，できればpowerの概念にそう形

線をまず出しておいて，実際の症例で，これがどで試験投与をすべきであると考える．

の様に修飾されているかを観る必要があると思われた．

19．ぺスタチンおよびホルフェ二シノール投与について18．治療薬の効果判定法における問題点

村上班員はべスタチソ長期投与の一例および

石原班員は治療薬の効果判定法における問題点
について臨床の立場から研究を行った．

Duchenne PMDに対するホルフユニシノール投与について研究を行った．

ESTの臨床投与が開始され約3年間を経過し1．Pre−Clinical Duchenne PMDに対するべ

た・当初の予想通り筋力・ADL などの改善を客

スタチソ投与の一例

観的に示した例はないといってよい．しかし，依私どもはべスタチソを1歳8カ月の患児に然として DMD の進行を遅らせている可能性をカ月にわたって使用した一症例について以下に報否定しさることはできない．われわれは，これま告する．べスタテンは60mg／day

での投与結果から障害度4度平均通過期間が，当1500mg／day（100mg／kg／day）に至り，現在は

−11−

44

より漸増しての予防し得た症例は見られなかった．

600mg／day（30mg／kg／day）を投与している．
CKはべスタチン投与後下降するが再び元に復す

今回の臨床成績のまとめにおいて，べスタチソ

るようである．立ち上がり時間は投与開始時には服薬の有無にかかわらず，効果判定の際に対象児5秒台であったが，現在では2 3秒台である．登の精神発達の差の程度により，データ一に／ミラツ

はん性起立は投与開始後4カ月位見られたが，そキのみられる項目のあることを示唆した．このこの後現在まで見られない．また日常生活動作を示とは今後より年少児の投薬効果判定の際にも参考すバーテル指数は65点から90点まで増加した．

にすべきことと思われた．

血液，血清生化学，尿検査では異常は見られず，特別な副作用も見られなかった．この様な改善が21．Ducllenne型筋ジストロフィー症に対するぺ

薬物の効果なのか，自然経過なのか現時点では明スタテンの使用経験

らかでない．

福山班員は7歳以下の2．Duchenne PMDに対するホルフェニシノールの投与について

Duchenne型筋ジスト

ロフィー症（DMP）に対するべスタチソの治療効
果について研究を行った．

10歳以下の歩行可能なDuchennePMD7例

今回は特に，3例については6カ月間投与して，にホルフユニシノールを投与してその効果を検討

尿中 3−メチールヒスチジン／クレアチン比（3した．対象は年齢5 9歳でホルフユニシノール

MeH／Cr）に対する影響を1回採尿法で調べた・の投与量は50150mg／dayで投与期間は24週

また10例については，1年間ベスタチソまたはから64遇であった．結果は立ち上がり時間は一

プラセポを同量固定法でSingleblind法により投例を除いて増加の傾向にあった．CKなどの血清

与し，治療効果および副作用を検討した．

酵素は投与後一時的に減少するが，その後，元に尿中3MeH／Cr

は3例とも全経過で1日蓄尿復するものが多かった．一般血液，血清生化学，

時の正常範囲より高値を示していた．1歳5カ月

尿検査にも異常は見られなかった．副作用も特にの例ではプラセボ投与期間中よりべスタチソ投与

認められなかった．効果については5歳の症例を期間中の方が低下する傾向にあり，6歳0カ月，除いて，いずれも症状が進行していた・しかし，7歳6カ月の2例ではむしろ増加する傾向にあっ効果の判定は投与量，使用期間などの検討，さらた．尿中3MeH／Crは臨床評価，血清酵素値のには自然経過との比較等を行う必要がある．

変動と共に変動する憤向にあった．今後外来において施行可能な簡易法として検討する価値がある

20．ベスタテンの臨床使用経験についてとの印象をうけた．

三吉野班員はDuchenne musculardystrophy

1年間のSingle blind 法によるベスタチソの（DMD）息児に対する薬効判定を行うにあたり，効果は，臨床的にはプラセボ群の運動機能との差

息児の精神発達の程度に着目し，効果判定に閑しは明確でなかった．血清CPK，アルドラーゼな精神発達と症状との関連性について研究した．

どの酵素値は，4歳以下のべスタチソ投与群にお1）以前の報告をふまえ，今回べスタチソ服薬3

いて変動が著明な印象をうけた．しかし，必ずし名，placebo群3名の臨床使用経験より得らも低値を示すだけではなく，プラセボより高値をれたデークーの一部を報告した．

示すこともあった．ベスタチソを投与した症例の2）今回を含めて，当院におけるベスタチソの短血清酵素値の変動が著明なことは，発育による運期または長期服薬児において，明らかに進行

動機能の狂待段階における小児の単なる個体差な−12−低分子酵素阻害物質による難病治療薬の開発研究のか，べスタチソの投与による影響なのかは不明

検査値を指標とし，4週間ごとに観察することとである．

し，今回は亜週までを集計した．参加は八雲，
西多賀，箱根，中部，鈴鹿，宇多野，刀根山，原，

22・Duchenne型進行性筋ジストロフィーに対す

徳島，西別府の各国立病院，国立精神神経センタ

るぺスタチンの効果−プラセポを対照薬としー，東邦，東京女子医，熊本，鹿児島の各大学計

た群間比較試験一

15施設，症例はA実験群25，対照27，B実験群

木下班員は Duchenne型進行性筋ジストロフ

35，同対照40の計127例であった．

ィーに対するべスタチソの効果をプラセボを対照薬とした群間比較試験により研究した．

9カ月後，A群の階段昇り姿勢，降り姿勢，同
昇り時間，降り時間，20m直進走行時問，座位

べスクチソが筋疾患の治療薬として有効なことへの時間，頸筋背屈，股関節屈曲，伸展などの筋，は動物実験では確かめられているが，ヒトでは未脛反射など合計39項目中の11項目で実験群がだ結論は得られていない．我々は以前から本剤の優ることが統計学的に確かめられた．一方，血清治験を行ってきたが，最近の共同実験ではDuch−

CPK，LDHなどでは有意差は見られず，本剤がenne 型筋ジストPフィーの若年患者に有効性を筋ジストロフィー症の節線維破壊プロセスを防止示唆する成績が得られている．それに基づき今回していることを示唆する成績は得られなかった

A群4歳以下，B群5−7歳の2群のDuchennCが，何らかの横序により筋機能の状態を改善して型患者についてそれぞれべスタチソ150mg／日，

いることが明らかとなった．本剤が筋ジストロフ

300mg／日を連日投与し，各群のプラセポ群と比ィー治療薬剤たり得る可能性が示された成績と考較した．効果判定には階段昇降姿勢，同昇降時間，えられ，今後も検討を続行する必要があると判断

20m直進走行時間，臥位より坐位までの時間，した．

各関節屈伸筋九

各腱反射，血清CPK，LDH，GOT，GPT，クt／アチン，クレアチニソなどの

−13−

以 上

分

担

研

究

報

告

E−64Cのプロテアーゼ以外の系に対する作用

江 橋 節 郎＊場合，セリンとされている．また，SH基阻害剤
目

は多かれ少なかれMおよびL作用を抑制し，しか的

本研究班の基盤にある考えは，筋ジストロフィしその抑制度に差があり，L作用がM作用と直線ーによる筋崩壊過程がCa依存中性プロテアーゼ

的に関連しないことが明らかとなっている．NEM（CANP）によるものであり，これを阻止することはある条件下で，M作用をより強く押さえるが，

により，その経過を遅らせ得るのではないかといその他の阻害剤，例えばPCMS，DNTB，PI）S

うものである．この場合，勿論カテプシソの関与

等は，L作用をより強く押さえる傾向がある．従は否定できないばかりでなく，カテプシソが主役って，チオール・プロテアーゼ抑制物質であるE−を果しているという考え方にもそれなりの根拠が64Cがこの両作用を抑制し，しかもその程度が両あると思われる．従って，筋ジストロフィーの筋者で異なっていることは充分予期できることであの崩壊の撥作を明らかにする為にはにCANPにる．

特異的な阻害剤の出現が望まれるところである．
残念ながらE−64Cは他の阻害剤に比べれば
CANP

実 験 結 果に対する作用は強いが，しかしカテプシ

図1，および2にみるように，E−64Cは牛胃おソの方をより強く抑制するという現存の阻害剤のよびニワトリ筋胃の155Kおよび130K

一般的慣向を脱していない．

標本MおよびL作用に対して，異なった抑制効果

成分粗この様な目標に直結した研究は本班において強を示す．その効果はいずれもL作用により強く，力進められつつあるが，これと別個にプロテアー

また筋胃に対する効果は，牛胃に対するよりも弱ゼ以外の反応系に対する E−64Cの作用を検討す

い．

ることは，本問題を立体的に把握する為の一つの手がかりとなると考えられる．

考察

本研究には，平滑筋の収縮調節に関与している

E−64−Cは原則として，L作用をM作用より強とされるミオシン軽鎖キナーゼ作用（以下M作用

く抑えるが，これは既に多くのSH阻害剤で観察と略称）と，ライオトニソ作用（収縮作用，以下されていることであり，それ自体としては新味はL作用と略称）を取り上げた．その主な理由は，なく，またその必要濃度は非常に高いので，実用MLCK的価値は全くない．

による燐酸化の部位は少なくとも筋肉のしかし，本研究班において他の大関（花田）班＊岡崎国立共同研究機構．生理学研究所
−17−

100

100

0

1

2

5

●、＼．

＼0

10

＼
0

E−64C（mM）
図1牛胃155K成分（粗標本）に対するの効果○：L作用，●：M作用

0−−二一一−●ヽヽ

05

Sだlち；Uくり＞モ芸屋

0SU壬＞コU＜む＞石和一心∝

てこ∵ ＼

1

2

5

10

E−64C（mM）
図2 ニワトリ筋胃130K成分（粗標本）に対する
E−64Cの効果○：L作用 ●：M作用E一朗C

貝および向山班員らにより，カテプシソとCANPなった．

に対し，一方に著しく偏った抑制効果をもつもの

これらの阻害剤をKおよびL作用に就いても検が既に2，3発見されており，本研究班全体の目討することは，E−64系阻害剤の開発に一つの示標に向け，この面からの発展も期待されるように唆を与えるものと思われる．

−18−

ホルフェニシンの生体内動態
一蛍光HPLC用高感度蛍光試薬の開発−

大 倉 洋 甫＊
研究協力者 石田淳一，巣 文降，甲斐雅亮
用した．
は

じ

め

に

われわれは，高選択的かつ高感度な蛍光誘導体
化反応を利用した蛍光検出・高速液体クロマトグ

実

験

方

法

1）使用機器ラフィー（HPLC）を手段として，血液ならびに

a）分光蛍光光度計

筋肉中ロイペプチソl），ベスタチソ2，3），クーヒドP

日立MPF−4型を使用，スリット幅は励起およキシべスタチソり），ホルフェニシノール5・6），ア

び発光側ともに 5nm に設定し，角型石英セル

ソチパイン7）などの薬物モニター法を開発し，そ（1×1cm）を使用．

れらの体内動態を検討してきた．本年度はプレカb）クロマトグラフ

ラム蛍光誘導体化HPLCによるホルフェニシン

高速液体クロマトグラフには，東洋曹達803Dの薬物モニター法を確立するために，そのHPLC

型サソプルインジェククー（100／〝ループ）を備

用高感度蛍光試薬の開発研究を行った．

えたHPLC用ポンプ，12′JJ フローセルを装備

ホルフェニシンは分子構造のベンゼン核にアルした島津 RF−530 型蛍光検出器および理化電機

デヒド基を有しているので，芳香族アルデヒドのR−21型記録計を使用．

蛍光試薬によって蛍光性の物質に誘導し得る．本

2）基準操作（用手法）研究では，既に報告したべスタチソ2・8）および♪一試料の水溶液100両Fに50mMリン酸塩緩衝

ヒドロキシべスタチソり）の薬物モニター法に利液（pH2．0）100FLlおよび3mM EDB，2mM用している1，2−ジアミノー4，5一ジメトシキシペソ

DDBまたは2mM MDBlOOFLlを加え，60℃

ゼソ（DDB）・モノ塩酸塩ならびに今回新たに合で加熱する．EDBの場合は30分間，MDBの成して得た1，2−ジアミノー4，5−エチレンジオキシ

場合は15分間，DDBの場合は20分間反応さベンゼン（EDB）・ジ塩酸塩および1，2−ジアミノー

せる．反応後，EDBおよびDDBを用いた場合

4，5−メチレンジオキシベンゼン（MDB）・ジ塩酸

はpH6．5の塩を用い，まずホルフェニシンとの最適蛍光反応を用いた場合は pH6．0 の同緩衝液をそれぞれ

条件を用手法により検討した（図1）．次に，ホル3．5mg加えて，蛍光を測定する．

フェニシンに対して最大の蛍光を与えたEDBを・

3）ⅡPLC
試料は用手法と同様に蛍光反応を行い，反応後，プレカラム誘導体化試薬として逆相HPLCに適＊九州大学薬学部

0．2Mリン酸塩緩衝液を，MDB

中性の緩衝液を加えず100／fJの反応液をクロマ
−19−

∵言

・2HCl

EDB

HO
NH2

pH2．0

CH−COOH＋

600C，15−30min∴ミニ∴

CH−COOH

FJuorophore

Forphenicine

CH30

CH30

（mostintense at
PH6．0−6．5）∴二……・・
DDB

図1Fluorescence derivatization oHorphenicinewith EDB，MDB and DDB︵lモコゝLeJl至ヱ言suむlU忘UUむUS20⊃一﹂

300
図2

350

400

450

500

Excitation（a）and emission（b）spectraofthe丘nalreactionmiⅩture Of
forphenicine（10nmol／ml）withEDB，MDBor DDB．Portions（100pL）
Offorphenicine solution and water for the reagent blank were treatedasin therecommendedprocedure・Curves：aland bl，EDB；a2and b2，

MDB；a3and b3，DDB；a4and b4，reagent blanks of EDBandDDB；a5and b5，reagent blank of MDB．

トグラフに直接注入する．逆相分配型のTSKgel
ODS−120T（粒径5FLm）を充填した分離用カラム（150×4．6mmi．d．）を用い，アセトニトリル

結果及び考察1）蛍光反応条件と50mMリン酸塩緩衝液（pH6．5）の1：4混

ホルフェニシン標準液（10nmol／mJ）を基準

液からなる溶離液を流速1．OmJ／minで流す．蛍操作に従って反応したときに得られる蛍光の励起

光検出は励起および発光波長をそれぞれ 350nm

および発光スペクトルを図2に示す．各蛍光試薬

および430nmに設定して行う．

との反応によって生じた蛍光のスペクトルは3着とも類似しており，それらの励起および発光極大
波長はEDBおよびDDBではそれぞれ350nm
および430nmであり，MDBではそれぞれ355−20−

ホルフェニシ∵／の生体内動態︵≡コhL空l至ヱ与sugU二BUUUS20⊃一﹂

0

1

2

3

4

5

6

7

PH
図3

Effect ofpH on the 幻uorescence development from forphenicine．
Portions（100FLl）oflOnmol／mlforphenicine solution weretreatedasin therecommendedprocedure，butthe pH valueofthe月uores−
CenCe reaCtion mixture was adjustedwith50mM Phosphate bufferand O．6M HCl．Curves：a，EDB；b，MDB；C，DDB．

100

al

︵≡コご空言﹂忠言suugU忘UuUOS20⊃一山
0

10

20

30

40

50

60

Time（min）
図4

Effects of reaction time and temperature on the nuorescence development from for−phenicine．Portions（100FLL）oflOnmol／mlforphenicine solution were treated asin therecommended procedure for various times at37，60andlOOOc．curves：al−a3，EDB；

bl−b3，MI）B；Cl−C3，DDB．Temperatures ：alTCl，60℃；a2−C2，37℃；a3−C3，100℃．
nmおよび420nmであった．また，各極大波長

pH8以上のアルカリ性では進行せず，いずれもは最終反応液のpH（4〜10）を変化させても著し

pH2．0の酸性の緩衝液中で最大の蛍光強度を与くシフトしなかった．

えた（図3）．pH2．0の緩衝液としてリン酸塩緩蛍光反応時のpHの影響を調べた．EDB，MDB

衝液，酢酸ナトリウム・塩酸緩衝液およびBriton−

あるいはDDBとホルフェニシ∵／との蛍光反応はRobinson（リン酸塩，酢酸塩およびホウ酸塩から−21−

︵lモ⊃ご巴l至亘ゝ︸芯∪ヱu一心UuのUS20コ正︵lモコゝL再と五﹂ヱ

音sugu VUuUUS巴○コtL

0

1
0

1

2

3

4

Concentration（mM）
図5

3

5

7

9

11

PH

5

図6 Effect of pH of thefinal reaction mix−tures on thefluorescence from forpheni−

Effect of concentrations of EDB，MDB
and DDB on the nuorescence develop−
ment from forphenicine．Portions（100FLL）oflOnmol／ml forphenicine solution
were treated asin the recommended
procedurewith various concenrtationsof
EDB，MDBandDDB．Curves：a，EDB；
b，MDB；C，DDB．

cine．Portions（100FLL）oflOnmol／mlfor−
phenicine solution were treatedasinthe
recommended procedure，but the 五malreactionmixtureswereadjustedtovarious
pHswithBriton−Robinsonbuffer（40mM，variouspHs）．Curves：a，EDB；b，MDB；
C，DDB．

なる）緩衝液を用いて，それらの濃度を10〜100

用した．EDBは水溶液の状態で少なくとも6時

mMの範囲で変化させた場合，それら緩衝液の種間は安定で，得られる蛍光強度ならびに試薬ブラ類および濃度による蛍光強度の変化はみられなか

ンクは一定値を示した．一方，MDBおよびDDBった．従って，基準操作には，50mMリン酸塩

では試薬調製後2時間以内に使用しなくてはなら

緩衝液（pH2．0）を使用した．

ない．それ以後では著明にブランク値が上昇し，蛍光反応における反応時間と温度について検討

かつ反応収率も低くなる．

した結果を図4に示す．いずれの蛍光試薬を用い

図6に示すように，ホルフェニシンから生じる

た場合でも反応温度が高いほど速やかに反応が進

蛍光生成物は最終反応液のpHを6．0−6．5にし行したが，最大の蛍光強度を得るには60℃もしたとき，最も強い蛍光を発する．基準操作では，

くは37℃で反応混液を加温した方が良かった・

反応後大量の0．2Mリン酸塩緩衝液を加えて

特に，60℃では，EDB，MDBおよびDDBと

EDBおよびDDBの場合はpH6．5に，MDBもそれぞれ20−40分間，10〜20分間および10の場合はpH6．0に調整した．なお，緩衝液とし−30分間の反応時間で最大かつ一定の蛍光強度をて0．1 0．5Mのリン酸塩緩衝液又は Briton−

ホルフェニシンに与えた．基準操作ではEDB，

Robinson 緩衝液を用いたところ，いずれもほぼ

MDBおよびDDBに対する各反応温度をいずれ同じ蛍光強度を与えた．また，各試薬との最終反も60℃とし，反応時間はそれぞれ30，15およ

応液を室温で放置した場合，EDBとの反応液は

び20分間とした．

最も安定（4時間）であるが，MDBおよびI）DBとの反応液は比較的不安定（少なくとも1時間は各蛍光試薬の濃度について検討した（図 5）．
EDBでは2−4mMで最大かつ一定の蛍光が得安定）であった・
表1にEDBを用いる基準操作に従って反応しられた．MDBの場合は2mMで，DDBの場合は1′・′3mMで最大の蛍光が得られた．従って，た場合に得られる種々の化合物からの蛍光強度，

3mMのEDB，2mMのMDBおよびDDBを使励起および発光極大波長ならびに検出限界を示−22−

ホルフェニシンの生体内動態
表l Excitation andemissionmaxima ofthe飢rescencesofEDB from aldehydes andother
COmpOunds，and their relative fhorescenceintensities andlowerlimits of detection

Compound（10nrnol′mD Excitati等ぶaXimum Emissioでn詳imum R・F・I・＆）（よ鎧D
Benzaldehyde♪−Hydroxybenzaldehyde
Salicylaldehyde
3，4−Dihydroxybenzaldehyde
Vanillin
クーAnisaldehyde
2，3−Dimethoxybenzaldehyde
P−Chlorobenzaldehyde
P−Cyanobenzaldehyde

Phenylacetaldehyde
Cinnamicaldehyde
Pyruvic acidα−Ketoglutaric acidα−PhenylpyruVic acid
クーHydroxyphenylpyruvic acidN−Acetylneuramic acid＆）The

fhorescenceintensity

fromforphenicine

430

100

30

400

75

40

390

60

50

430

0．5

6000

385

1

3000

390

3

1000

390

1

3000

398

10

300

408

1．5

2000

475

30

100

440

15

400
457
452
454
397
390
457

was

taken

．
50015．3331掴
l0
l0
●0．
0

2−Naphthaldehyde

33
053033034533︒㍊3303337
33
36
28
33
57
4︒
33
42
45
33
32
94
33
572

Forphenicine

200
2000
30
20000
10000
9000
3000
80000

aslOO．

b）The concentration of the solution used for the reaction whichthat of the btank．

gives afluorescenceintensity twice

す．EDBは芳香族アルデヒド煩以外にもα−ケト混液を用いて行った．緩衝液のpHは，ホルフェ酸およびシァル酸とも反応し蛍光を発する．それ

ニシ∵／の蛍光生成物が最も強い蛍光を発する pH

らはDDBの場合8）と同様にキノキサリノン誘導6．5を選択した．図7にホルフェニシン，3，4−ジ体を形成するものと思われる．一方，脂肪族アルヒドロキシペソズアルデヒドおよび カーヒドロキ

デヒド（ホルムアルデヒド，アセトアルデヒド），

シペソズアルデヒドの混液をEDBと反応させた

ホルフェニシノール，カテコールアミン（ェピネときに得られるクロマトグラムを示す．これらのフリン，ノルエビネフリン），17種の化合物からの蛍光ピークはそれぞれ単一であり，α−アミノ酸，還元糖（グルコース，フルクトース）および20分以内に完全に分離された．このHPLC条件

ステロイド（ェストPソ，エストリオール，コルでホルフェニシソの検量線を作成したところ，少チゾソ）などは蛍光を発しなかった．

なくとも100nmol／mJまで原点を通る直線（相2）ホルフェニシンのHPLC

関係数＝0．997）を示した．S／N＝2における検出用手法による検討から，ホルフェニシンの優れ限界は2．5pmol／mlであり，HPLC注入量で表た蛍光誘導体化試薬としてEDBを選択し，そのすと85fmolである．

蛍光体をHPLCにより分離した．

なお，EDBと反応しうる化合物（表1に列記

HPLCによる分離は，逆相分配型カラム（TSKしたもの）のうちα−ケトグルタル酸，N−アセチ

gel ODS−120T）を用い溶離液にアセトニトリル

ルノイラミソ酸，ビルビン酸およびかヒドPキと50mMリン酸塩緩衝液（pH6．5）の1：4のシフェニルビルビソ酸は図7のHPLC条件では，−23−

MDBやDDB

両試薬よりそれぞれ1．3および1．6倍ほど強い蛍光強度を与え，かっより安定な蛍光誘導体を形成する．また，生体に存在するアミノ酸，糖，ステロイドなどの成分には蛍光性を
票uOds巴L010gUq

与えないので選択性も優れている．しかも，EDBの試薬溶液はMDBおよびEDBの試薬溶液よりも安定であるので扱い易い．EDB試薬を用いるホルフェニシンのプレカラムHPLCは高感度であるので，血液および筋肉中の傲量ホルフェニ
シンの定量に適用可能と思われる．今後，生体中に含まれる妨害物質（ケト酸や蛍光性化合物など）
44を除去あるいは分離する試料の前処理および

4

HPLC条件について検討し，ホルフェニシンの薬物モニター法を確立する予定である．
24

16

8

0

Time（min）

図7

文

Chromatograms of（a）the EDB deriva−
tives of forphenicine，3，4−dihydroxy−

献1）Kai，M．，Miura，T．，Ishida，J．and Ohkura，benzaldehyde and（b）thereagentblank．

Y．：′．Cカro沼αわgr．，345，259−265（1985）．

A portion（100FEl）of a mixture of thealdehydecompoundsorwaterwastreated

2）Ishida，J．，Yamaguchi，M．，Kai，M．and
Ohkura，Y．：J．Chromatogr．，305，381−389

asintherecommendedprocedure．Peaks（nmol perinjection volume）：1，for−（1984）．

3）Ishida，J．，Kai，M．andOhkura，Y．：Xenobio．
〟gわあoJ．βi坤0∫リ1，397−403（1986）．

Phenicine（0．17）；2，3，4−dihydroxybenzal−
dehyde（0．3）；3，jトhydroxy−benzaldehyde

4）Ishida，J．，Kai，M．and Ohkura，Y．：J．
Cか〃班αねgr．，344，267−㌘4（1985）．

（0．3）；4，reagent blank．

5）Tamura，K．，Kai，M．and Ohkura，Y．：ノ〃P．

それぞれ3．0，3．2，9．0および20分に溶出し，その他の化合物はいずれも40分までに溶出しな
かった．

お

あ

り

に

EDB蛍光試薬は，ホルフェニシンに対して−24−√CJi仇CJlgmリ13，195−201（1984）．
6）Kai，M．，Tamura，K．，Ohno，M．andOhkura，Y．：βわ椚gd．Cかo桝αわgrリ1，143−146（1986）．

7）甲斐雅亮，坂本靖浩，三浦哲朗，大倉洋甫：分析
化学，35，329−お1（1986）．
8）Hara，S．，Yamaguchi，M・，Nakamura，M．
and Ohkura，Y．：Chem．Pharm．Bull．，33，
3493−3498（1985）．

蛋白分解酵素の役割とその阻害剤に関する研究

藤 井 節 郎＊naphthylesterを合成し従来の合成基質と比較検
は

じ

め

に

討した・合成基質はTosyl−L−lysine一α−naph−

米国ニューヨーク州立大学のStracher博士が，thylester（Tos−Lys−α−NE），aCetyトL−tyrOSine−

筋ジストロフィーマウスの発症および症状の進行

α−naPhthylester（Ac−Tyr−α−NE），tOSyl−L−をロイペプチソが阻止することを発見して以来，

arginine−α−naphthylester（Tos−Arg−α−NE），

筋ジストロフィー症に，蛋白分解酵素が重要な役

acety1−glycyl−L−lysine−α−naPhthylester（Ac−

割を果していることが示唆され種々研究が展開さ

Gly−Lys−α−NE），L−PrOlyl−L−phenylalanyl−L−れている・われわれはすでに各種蛋白分解酵素にarginine−α−naphthylester

対する合成基質とその阻害剤について検討し，合NE）およびbenzoyl−L−leucyl−L−alanyl−LTargi−

成基質を使って蛋白分解酵素に対するザイモグラ

nine一α−naphthylester

ムによる分析方法を確立した．また合成阻害剤にNE）を用いて各種蛋白分解酵素に対して検討しついてはTrypsin，Plasmin，Thrombin，Kalli−

た．

（Pro−Phe−Arg−α−（Bz−Leu−Ala−Arg一α一kreinおよび補体系のClf，Cl岳に対して強い阻α−NE基質を用いて各種蛋白分解酵素は50mM

害活性をもつ合成剤を兄いだし，更に∴川！病0でリン酸緩衝液 pH7．0 に終濃度0．5J mOle／mJの薬効を示すものを兄い出した．そこで，筋ジスのそれぞれの基質を添加し，最終反応容量を1．0

トロフィー症に関与している蛋白分解酵素の動態

mgを解明し，蛋白分解酵素合成阻害剤による酵素の終了後氷冷下にて19もFastvioletBsalt（FVB）

阻害パターンを明確にし，病態モデルでの治療を

溶液1．OmJ

行い，臨床効果についても検討したい．今回は，1．0mgを加え，515nmの吸光度を測定した．

とした後25℃にて30分間反応した．反応を添加し10分間放置後，氷酢酸

合成基質の各種蛋白分解酵素に対する基質特異性

Zymogramの調整と，それぞれのザイモグラムの作製，更に合成阻

Zymogramの調製は電気泳動後のゲルディス

害剤の薬効について報告する．

クのpHを一定化するために，先ず0．25Mリン酸緩衝液pH7．0で37℃にて約5分間浸し，そ実験方の後，β−NE基質および0．19もFVBを含む同緩法

1）合成基質

衝液に浸し25℃に放置する．ゲルディスク表面

合成基質としてアミノ酸およびペプチドーα−に赤紫色の酵素活性帯の出現が鮮明に認められた＊（財）大阪基礎医学研究奨励会

後，反応液中よりゲルディスクを取り出し，流水−25−

され，諸種の疾患における病態生化学的研究に応慧C一己一昏coo

クNH・㍍H2S叩

用されており，間接的効果も大きい．蛋白分解酵

C＼NH！

素に対する合成基質は，1939年Bergmann4）に

図1FUT−175の構造式

ょるN一末端アミノ基を保護したtosyトarginine−にて反応溶液を除去し作製した．Trypsinおよび

methylester（TAME），Tos−Arg−ME）などのア

Chymotrypsinに対する電気泳動はルキルエステル基質に始まり現在でも利用されてDavisの方

法1）に従い7．5浄 ポリアクリルアミドゲルディス

いる．

ク電気泳動をpH9．5の条件で，4℃にて約渕1）かNE基質を用いた分間行った．

Trypsinおよび

Chymotrypsinの定量レ7）
Trypsin に対して Tos−Lys一α−NE，Chymo−2）蛋白分解酵素合成阻害剤
6−amin0−2−naphthyI−4−guanidinobenzoate−trypsinに対しては Ac−Tyr−α−NEをそれぞれ

dimethane−Sulfonat（FUT−175）については鳥居

基質として用い，検量線を作製してα−NE基質

薬品㈱研尭所より供給して戴いた．構造式は図1の定量性を検討した．なお対照としてTos−Arg−に示した．

ME（TAME）あるいはAc−Tyr−EE（ATEE）

補体が関与するアレルギー反応はCoombsと，Gellの分類によるとⅡ型とⅢ型である．Ⅱ型のを用いた図2に示すように，両酵素に対しても酵
素量に応じて，α−NE基質は水解され，FVBとをの反応過程を経て直線的に吸光度は増大した．こ

静江後30分にHemolysinを静注し延命効果でれらの結果より α−NE 基質を用いる測定法は定判定した．

量性が認められ，Trypsinに対するTos−Lys−α−

Forssman shockはモルモットにFUT−175

またⅢ型の Arthus reaction はラットに抗体

NE，Chymotrypsinに対するAc−Tyr−α−NEのを静注し30分後にFUT−175を静注し更に30それぞれ測定限界濃度は1mg／mJおよび5mg／

分後に抗原であるOvalbuminを皮下に投与し，mJであった．この値は従来のアルキルエステル

5時間後の浮腫および24時間後の出血傾向で効基質であるTos−Arg−ME（TAME）およびAc−

果判定を行った．最近補体が関与していると示唆

Tyr−EE（ATEE）よりそれぞれ約200倍およびされているEndotoxin shockのモデルはマウス

30倍高感度であることを示している・にFUT−175を静江後30分にEndotoxinを腹2）かNE基質を用いたTrypsinおよび腔内に投与し延命効果として判定した．

Chymotrypsinのザイモグラム
Trypsinに対しては終濃度0．5mM

結果および考察のTos−

Lys−α−NEをChymotrypsinに対しては終濃度

蛋白分解酵素の酵素学的研究は合成基質の出現の0．5mMAc−Tyr−α−NEをそれぞれ基質としにより飛躍的に進歩した．1942年Bergmann2）て用い，ポリアクリルアミドゲルディスク電気泳により，蛋白分解酵素はexopeptidaseとendo−

動により分離した試料について調製した結果をpeptidaseの2群に大別され，1960年Hartley3）

図3に示した．Trypsinでは一本の活性帯が鮮明によりその触媒残基でセリン，チオール，酸性おに認められ，Chymotrypsinでは3本の活性帯がよび金属蛋白分解酵素に分類できることが報告さ認められた．この3本の活性帯はChymotrypsin

れるなど，合成基質の出現は酵素学的研究に対すの自己分解生成酵素8）のα，β，γおよび∂型のいる直接的効果のみならず，臨床化学分析法に導入

づれかの出現であると考えられるがそれぞれの同−26−

蛋白分解酵素の役割とその阻害剤に関する研究

1

2

3

4

ngJ／ml（TLNE）
500

10001500

2000

ng∴ml（TAME）

図2

0

5

5

10
15
20
ng／ml（ATNE）

●
250

500

○

750

ngノ′m蔓（ATEE）

Hydrolytic activities of trypsin and chymotrypsin toward alkylester and

●

1000

○

α−naphthylestersub−

StrateS・TAME‥Tos−Arg−methylester，TLNE‥Tos−Lys−α−NE，ATEE‥Ac−TyrTtehylester，

ATNE：Ac−Tvr−αrNE．

定については不明である．

Tr沖Sin叫rmdr膵in3）トリペプチドα−NE基質に関する検討
Prolyl−L−phenylalanyl−L−argininepα−naph−thylester（Pro−Phe−Arg−α−NE）基質に関して，
α−Thrombin，Plasmin，FactorXa，Plasma

Kallikrein，Pancreatic Kallikrein，Urinary
KallikreinおよびUrokinaseに対する基質特異性を検討した．表1に示すように各酵素につき2×10￣9mol／mJ の濃度を用いた場合の吸光度をF t示している．Pro−Phe−Arg−α−NEのトリペプチ
ドはKallikrein

がKininogenを水解する際のt聖ここ′

水解部位のアミノ酸配列−Pro−Phe−Arg−Ser− の図3構造であり検討した7種類の酵素においてほてき≒±≠Zymogrampatternsoftrypsinandchymo−
trypsin．Substrate：trypsin＝Tos−Lys−α−
NE，Chymotrypsin＝Ac−Tyr−α−NE．

Kallikreinが最も高い活性を示していた．
また従来の感度のよいといわれている合成基質

た．

と比較してみると表 2 に示すようにPro−Phe−

Pro−Phe−ArgTα−NE基質は表1に示したよう

Arg−α−NEはPlasma Kallikreinに特異的だとにUrinarykallikreinに対しても高感度を示し，されるD−Pro−Phe−Arg−pNAに比し約3倍，組更にUrinary kallikrein として確認するため，

織Kallikreinに特異的だとされる D−Val−Leu−

Trasylol

ArgTpNAに比L Pancreatic kallikreinを用い（SBTI）を阻害物質として検討した結果，Trasy−

た場合約8倍高感度に測定できることが示唆されlol添加により本活性は98労阻害され，SBTIで

−

27

−

および

soybean trypslninhibitor

表l Hydrolysis of Pro−Phe−Arg−α−NE byvarious proteases
Ka11ikrein
Urokinase

Thrombin Factor Xa Plasmin

Plasma Pancreatic Urine

0．30

0．05

0．225

0．80

0．70

0．75

竿†一

＿

一背騎艶，ノー壌一触磁．

￣￣一￣￣￣→f瞥l劃r

N．D．：nOt detectable．

N・D・

I
I
l

5．0

1
1
1
1

000000l
100000くわd
＝
n

4．3

4．O

侶
Oも現
l

4．2
4．1
4．0

図4

Zymogram pattern ofcondensed human urine byusingPro−Phe−Arg一α−HE assubstrate

して検討した．

表2 Relativehydrolyticactivitiesofkallikreins
toward various substrates

図4に示すようにpI3．8，3．9，4．0，4．1，4．2
Kallikrein

および4．3の6種の等電点の異なる活性帯が認め

Substrate

Plasma Pancreaticられた．本活性帯に対するTrasylolおよびSBTIl

1

TosTArg−methylester
1
0
1

7
5

の影響について調べると，Trasylolでは6種の活

3
1
2
1

D−Val−Leu−ArgTpNA

性帯は全部消失したが，SBTIでは全く影響を受

1

D−Pro−Phe−Arg−PNA

0
2

Pro−Phe−Arg−α−NE

けていない．以上の成績よりヒト urinary kalli−kreinのmultiformを反映していると考えられは59ら阻害されたにすぎず，本活性は Urinary

る．これは Geiger らの報告9）と一致し，6種類

kal1ikreinを反映していると考えられる．次いでのmultiformが検出されている．その他にBen−

Urinary kallikrein

ZOyトL−leucyl−L−alanyl−L−arglnlne−α一naph−による

Zymogramについて検討した．透析後濃縮健常者尿を試料として，

thyl−eSter・（Bz−Leu−Ala−Arg−α−NE）について

Zymogram

はヒト血奨中のPrOthrombinおよびantithrom−

およびショ糖密度勾配等電点電気泳

bin

動による分離像をPro−Phe−ArgTα−NEを基質と
−

28

−

Ⅲ

の定量に関しても高感度の基質であるこ蛋白分解酵素の役割とその阻害剤に関する研究
表3 FUT−175の蛋白分解酵素阻害活性酵
補体系のプロテアーゼ

血貴中のプロテアーゼ

その他プt］チアーゼ

素基

補体溶血反応とが明らかになり50労阻害濃度（ID59：M）

Ci盲

Ac−Arg−methylester

2．1×10￣7C㍍

Ac−Tyr−ethylester

5．1×10￣8D

Factor B

1．4×10−5

B

Leu−Ata−Arg−α−naphthylester

5．8×10￣5

CVF・BbLeuTAla−ArgTα−naphthylester

4．3×10−5

ⅩⅠIa

Pro−Phe−Arg−PNA

Xa

Bz−Ile−Glu−Arg−pNA

2．1×10￣6

トロンビン

Phe−pip−Arg−pNA

8．8×10￣7

プラスミソ

Val−Leu−Lys−pNA

1．0×10￣7

カリクレイン

ProTPhe−Arg−pNA

3．0×10￣9膵カリクレイソTos−Arg一methylester

トリプシン
カテプシソ

質

3．3×10−7

8．4×10−6

Tos−Arg一methylester l．9×10−8

A，B，C，D，H，L＞10￣3−

G

7．1×10−4

古典的経路

6．9×10−8

第2経路

5．1×10−7

prothrombinのzymOgramに対する阻害は，古典的経路では6．9×10￣8M，においてヒト血梁を試料とした酵素の前駆体の第2経路では5．1×10￣7Mの濃度でおのおの溶血

ZymOgramの調製の可能性が得られた．今後こ反応を50界阻害する．この阻害活性は現在報告

れらの手法を用いて筋ジストロフィー症に関与しされている抗補体物質の中で最も強い10）．また本ていると思われる酵素について検討したい．

物質は細胞内に存在する蛋白分解酵素であるカテ

4）蛋白分解酵素阻書物質（FUT−175）10−11）

プシソ群に対する阻害は認められずCrinde12）にa）FUT−175（6−amidin0−2−naphthyト4−gua−より肝細胞内における蛋白質の分解および生合成

nidino−benzoatedimethanesulfonate）の構造式に本物質は影響を与えないことが認められていは先の図1に示した．本物質は血奨中の蛋白分解

る．

酵素およびTrypsinを阻害し，その阻害機構はb）FUT−175 の動物における実験的免疫反応

本物質のエステル部位が酵素により切断され，そに対する効果の酵素の活性中心であるセリソ残基と結合するこ補体の関与するアレルギー反応は，Coombsととにより不活化する．また構造特異性等により，Gellらによる分類ではⅡ型とⅢ塾である．これら

本物質は活性型のTrypsin 様のセリソ蛋白分解

Ⅱ塑（フォルスマンショック）およびⅢ塾（アル酵素を阻害し，その作用は時間依存性で可逆的でサス反応）に対するFUT−175の効果を検討したある．FUT−175 の各種蛋白分解酵素に対する阻結果，図5に示すように，フォルスマンショック

害活性を表3に示した．その特徴は補体系の蛋白に対しては明らかな致死時間の延長が認められ，分解酵素を阻害し，補体溶血反応に対して強力なアルサス反応においてもヒドロコーチゾン以上の阻害活性を有していることである．補体溶血反応効果が認められるなど，著明な抑制効果を認めた．

−29−

フォルスマンショック（モルモット）
●●

●●

●●

●●●

21 08612﹇﹈ 聖臣皆SG堪璧埜●●●・・︵⁚串・

4

団︵∈∈︶撃臣誓NG相転句玉

1

●ト㌢

8

︵垂︶ 臣皆だ裔2

対照12．5mgkg

50mgkg

i．p．

p・0・

対照

ll・P・

FUT・175

図5

しかしⅠ型（PCA

50mgkg250mg′九g40mgkg
P・〇・l i・P・

FUT−175

ヒドロ
コルチゾン

FUT−175のⅡ型およびⅢ型アレルギーモデルに対する効果

反応：Passive cutaneous

FUT−175の出現は，補体の病態における意義のanaphylaxis），Ⅳ型（塩化ピクリル接触性皮膚炎）

研究あるいは生化学的な研究に対し有益な材料とに対する効果は弱く，Ⅱ型およびⅢ型の病態におなることのみならず，抗補体物質の治療薬としてける補体の生物学的意義は重要であることが示唆の可能性へのアプローチである．

された．また現在，補体の関与が示唆されている
文ェソドトキシソショック（マウス）に対しても本

1）DaviS，B．J．：Ann，N．y∴Acad．Sci．，121，404−
4訂（1964）．
2）Bergmann，M．：Adz，．EnりmOl・，2，49−68

物質は著明な致死防御効果を示し，ヒドロコーチ
ゾンと同程度あるいはより優れていた11）．腎炎の（1942）．

実験モデルである馬杉腎炎（ラッ日，慢性関節リ3）Hartley，B．S．：Amu．Rev．BEochem・，29，45−
72（1960）．

ウマチの実験モデルであるアジュバント関節炎4）Bergmann，M．，FrutOn，J・S・，Rollack，H・：J・
βわJ．CJigm．，127，朗3−648（1939）．

（ラッ日に対しても，デキサメサゾソあるいはイ

5）Niinobe，M．，Hitomi，Yリ

ンドメサシソを対照薬剤として本物質の効果を検6）Hitomi，Y．，Niinobe，M．，Fujii，S・：CLin・C那加．Acね．，100，㌘5−公3（1980）．
7）Hitomi，Y．，Kanda，T．，Niinobe，M・，Fujii，

以上の成績等により，本物質は，補体の関与がS．：C〟机Cゐ加．Acね，119，157−164（1981）．

考えられる疾患に対し有効であることが示唆され

8）Wright，H．T．，Kraut，J．，Wilcox，P・E・：J・る．

〟OJ．βわ7．，37，363−366（1968）．
9）Geiger，R．，Stackstedte，U．，Fritz，H．：HoZ，♪e−
5gJJgrざ Z．勒∫わJ．C血Z桝．，361，1003−1016

補体の示す作用は多面的であり，病態における者の努力により，その意義は解明されつつある．

Fujii，S．：′．Bio−

Cカg肌．，87，779−783（1980）．

討した結果，著明な抑制効果が認められている．

意義もまた多様性を示すこととなる．多くの研究

献（1980）．

10）Fujii，S．，Hitomi，Y．：Btochim．BLophys．Acta，
661，342−345（1981）．

しかし，生体に応用し得る適当な抗補体物質が得11）Hitomi，Y．Fujii，S．：ZnE．Arch．AtEergy・A♪〆β．血桝〟仇69，262−267（1982）．

られていない現在，その証明は限られている．

12）Grinde，B．：私信（1983）．
−30−

筋ジストロフィー症における各種筋肉内アミノ
ペプチダーゼ活性の変化とその意義

青 柳 高 明＊
研究協力者 和田孝雄＊，小島蕗子＊，永井真知子＊，原田滋子＊
た低分子酵素阻害物質の投与時に誘起される酵素はじめ

網の変動ならびに活性体べスクチソ連続投与によに筋ジストロフィー症の発症ならびに進展の機構に，プロテアーゼの異常による筋蛋白崩壊が重要り誘起される酵素網の動態などとの関係について考察を加える．

な役割を演じていることが可成り明らかになって

実 験 方 法きた．筆者らは病態モデル動物として筋ジストロ
フィー症のマウスおよびハムスターなどの筋肉を実験動物

含む各種臓器内の酵素活性の変動を経時的に調べ

7週齢（雄）の筋ジスマウス（C57BL／6Jdy／

た結果，従来注目されていたェソドべプチダーゼdy）および対照マウス（C57BL／6Jdy／＋and十／の異常のみでなく，アミノベプチダーゼ，グリコ＋）は実験動物中央研究所より購入した・動物はシダーゼ，ホスファクーゼ，エステラーゼなどの

屠殺後，直ちに前肢筋，後肢筋，心，脾，肝およ

広範囲な酵素活性に異常が誘起されていることもび腎を摘出し，−70℃で保有した・臓器は10倍報告したレ3）．さらに，長期間患者血清中の酵素

量のphosphate bufferedsaline（PBS）の中で，活性の動態を解析し，病因にェキソべプチダーゼ

組織ホモジナイザー（Ultraturrax）を用いて1分がェソドペプチダーゼと異なる役割を果している間ホモジナイズした．酵素活性の測定には，組織ことを明らかにしたも5）．

ホモジェネートの3，000×g，20分間の遠心上清正常および病態モデル動物における酵素網の変動を経時的に長期間調べ，また酵素阻害物質投与

を用いた．
基質
酵素活性測定用の基質は下記のものを用いた．

により誘起される酵素網の動態を究明することは，ホメオスタシス機構を明らかにするとともに，

L−glutamic acid

筋ジストロフィー症の治療への応用を可能にする

ride（Glu・NA），L−arginine

ものと考える6）．

（Arg・NA），L−prOlineβ−naphthylamide（Pro・

本報告は筋ジストロフィーマウスの前肢筋，後β−naphthylamide hydrochlo−
β−naphthylamide

NA），L−leucineβ一naphthylamide（Leu・NA），

肢筋および心筋におけるエンドペプチダーゼなら

L−Seryl−L−tyrOSine

びにユキソべプチダーゼの動態について検討した

Tyr・NA），glycyl−L−prOline

ので，その結果について述べる7）．すでに報告し（Gly−Pro・NA），Na−benzoyl−L−arginine ethyl＊微生物化学研究所

β−naphthylamide（Ser−β−naphthylamide

ester（BAEE），Nq−aCetyl−L−tyrOSine ethyl−31−

表1List of the Enzymes Measured and Their Substrates
EnzymeAbbreviation

Reference forassay method

Substrate

Aspartate aminopeptidase（EC3．4．11．7）

AP−A

Glu・Nal，8Arginine aminopeptidase（EC3．4．11．6）

AP−B

Arg・NAl，9Prolineiminopeptidase（EC3．4．11．5）

Pr0−IP

Pro・NA

l，10

Leucine aminopeptidase（EC3．4．11．1）

Le11−AP

Leu・NAl，9Dipeptidyl aminopeptidaseI（EC3．4．14．1）

DAP一I

Ser−Tyr・NA ll

Dipeptidyl aminopeptidaseⅣ（EC3．4．14．5）

DAP−ⅠV

Gly−Pro・NA

Serine proteinase（EC3．4．21）

Trypsin−like

BAEE

l，13

Serine proteinase（EC3．4．21）

Chymotrypsin−like

ATEE

l，14

Serine Proteinase（EC3．4．21）

Elastase−1ike

Ac（Ala）3・ME l，15

12

Carboxylproteinase（EC3．4．23．5）

Cathepsin D

Hemoglobin

β−N−Acetyl−D−glucosaminidase（EC3．2．1．30）

GIcNAc−aSe

NP−GIcNAc l，17

Alkaline phosphatase（EC3．1．3．1）

Phosphatase

NPP

Arylesterase（EC3．1．1．2）

Esterase

NPA

l，19

Ribonuclease（EC3．1．27）

RNase

RNA

l，20

1，16

l，18

ester（ATEE），aCetyl−L−alanyl−L−alanyl−L−

報告した方法1，8￣12）で反応を止め，525nmの吸光

alanine methyl ester（Ac（Ala）3ME），hem0−度を測定した．セリソプロティナーゼ活性の測定

globin，♪−nitrophenyl−N−aCetyl−β−D一glucosa−

は，75mMペプチドェスチルあるいはN−アセチ

minide（NP−GIcNAc），9−nitrophenyl phos−

ルアミノ酸を基質として用い，すでに報告した方

phate（NPP），9−nitrophenylacetate（NPA），

法1・13￣15）で反応を止め，525nmの吸光度を測定

ribonucleic acid（RNA）．

した．カテプシソD活性の測定は，0．59らヘモグ

緩衝液

ロビン（1．0mg，pH3．2）を基質として用い，既

酵素活性測定用の緩衝液は 0．02M PBS を用いた．ただし，カテプシソDの測定には0．2M

報の方法1，16）で反応を止め，280nmの吸光度を測定した．グリコシダーゼ，ホスフアクーゼおよびSOdiumaCetate buffer（pH3．2）を用いた．

エステラーゼ活性の測定は，2．5mM♪−nitro−

酵素活性の測定

Phenyl誘導体（0．1ml）を基質として用い，既組織ホモジュネートの遠心上清分画は，それぞ報の方法1，17￣19）で反応を止め，400nmの吸光度

れの基質溶液およびPBSを含む反応試験管（1．5を測定した．RNase活性の測定はMeyerl，20）ら

×10cm）に分注し，37℃で1時間の反応を行っの方法によって測定した．

た．カテプシソDは前述の緩衝液を用い，pH3．2

蛋白の測定の条件下で反応を行った．すべての酵素活性の測標準蛋白として，ウシ血清アルブミンを用い，定には3本宛の反応試験管を用い，その平均値をLowry法21）で測定した．

記載した．各酵素活性の基質および測定方法は表

統計1に記載する．すなわち，6種類のアミノべプチ
ダーゼ活性の測定は，2mMβ−naphthylamide誘多変量解析の一手法である主成分分析法22）を用いて解析した．

導体（0．25ml），PBS（0．65ml）および上清分画（0．1mg，適宜希釈）を用いて反応を行い，すでに−32−

筋ジストロフィー症における各種筋肉内アミノペプチダーゼ活性の変化とその意義

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33

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ト也．〇十lトや．t−

UヨdOとSh白

前肢筋，後肢筋および心筋における酵素活性を筋ジスマウスと対照マウスとの問で比較した結果を表2に示す．前肢筋についてみると，AP−A，
Leu−AP，DAP−I，trypSin−like，Chymotrypsin（Chy−try）−like，Cathepsin D，β−N−aCetyl−D−のト．〇¶Cの．0−

St．t刊寸0．0

glucosaminidase（GIcNAc−aSe），RNaseなどが筋ジスマウスで有意に上昇していることがわかる．また後肢筋についてみると，AP−A，AP−B，
Leu−AP，DAP−Ⅰ，trypSin−like，Chy−try−like，

elastase−like，CathepsinD，GIcNAc−aSe，RNaseなどが筋ジスマウスで有意に上昇していることがのの．〇＋l受︶．tの9．0刊ト1．tl

寸9．0羽Mの．01

tOとuOU

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03dOJ︶のh白認められた．一方，心筋においてはRNaseのみ
が筋ジスマウスで有意に上昇している．
これらの各種酵素活性の変化を一括して論じる
ために多変量解析の一手法である主成分分析法を用いて解析を行った．この方法を用いることによって，各種酵素問における相関関係に基づいて，それらの酵素の中からいくつかの重要な成分を抽出することが可能に成る．第1主成分は標本分散の最大部分を説明する成分である．第1主成分とは無関係ではあるが，次の大きな部分を説明する
成分が第2，第3主成分ということになる．上述
した各成分の説明する分散の割合は，それぞれ
35．19も，26．19乙，15．1野である（表3）．第1主
成分は主とし七ァミノペプチダーゼを代表する成寸り．〇＝レ ビーむく⁝Sト．〇＝L．d70占⁚MU§邑ぎ三選蔓ミ8

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結果および考案

分であり，これと相関の高い酵素はLeu−AP（r＝0．95），DAP−Ⅰ（r＝0．88），AP−A（r＝0．87），
AP−B（r＝0．65），GIcNAc−aSe（r＝0．63），DAP−

Ⅳ（r＝0．60）である．第2主成分はセリソプロテ
ィナーゼを代表する成分であり，これと相関の高い酵素はtrypsin−like（r＝0．96），Chy−try−like（r＝0．96），elastase−Iike（r＝0．94）などであり，これに次いでRNase（r＝0．69）が比較的高い相関を示した．
表3には筋ジスマウスと対照マウスの前肢筋，後肢筋および心筋について，これら主成分に閑し−31−

筋ジストロフィー症における各種筋肉内アミノべプチダーゼ活性の変化とその意義

図1Comparison betweenthepathologiC andcontrolmusclesontheplanes composed bythe
axesfor the丘rst（Ⅰ），SeCOnd（II），and third（III）principalcomponents・f，COntrOlfore−

limb；F，dystrophic forelimb；h，COntrOlhindlimb；H，dystrophic hindlimb；C・COntrOI
cardiac；C，dystrophic cardiac．

て比較した．前肢筋においては，筋ジスマウスはPフィー群の酵素変化は，この楕円の位置から判第1主成分値について有意な高値を示し，第3主断して前肢および後肢の筋肉におけるそれと同じ成分値については有意な低値を示した．後肢筋に方向性を示している．第3主成分に関しても，前ついては，同様に第1主成分値が高値を示したが，肢の筋肉における酵素変化の方向性は同じであ

他の成分値は有意な変化を示さなかった．心筋にる．心筋においては第3主成分の明かな変化は認

ついては，第2主成分値のみが筋ジスマウスで有められなかった．
以前に，著者らが報告した筋ジストロフィー症

意に上昇することが認められた．
図1はこれらの主成分と各群のマウスとの関連

患者血清中のアミノべプチダーゼ活性は罷病初期性を図示したものである．この図においてⅩ軸おに高く，進行とともに減少する傾向にあった．一

よびY軸は各主成分についてのサンプルスコアを方，エンドペプチダーゼ活性は初期には，むしろ示す．ここでサンプルスコアとは，各マウスにお低いが，病状の進行にともない増加する傾向にあける酵素活性に重みづけをして総和したものであることを認めた．患者血清中のアミノペプチダーる．この時に用いる重みづけの係数は，固有ベク

ゼ活性の動態は羅病期間と逆相関である．また，トルから得られる．各群のマウスは楕円で表現さェソドペプチダーゼ活性は順相関であることを明れるが，その半径はその群に関する標準偏差を示らかにした4）．さらに，アミノべプチダーゼ阻害し，その中心点は平均値を示す．

物質であるべスタチソほ筋肉内アミノベプチダー

第1主成分軸と第2主成分軸についてみると，

ゼ活性を強く阻害するとともに，長期間投与によジストロフィー群と対照群の間の差は各群内におり生体内酵素網に規則性をもった変動を与えるこける前肢と後肢の差よりも大きいことがわかる．

とを明かにした28）．本報告では，さらに上記の知

また心筋に相当する楕円は前肢および後肢に相当見を理解するため，筋ジスマウス筋肉内のプロテする楕円とは可成り離れてクラスターを形成す

アーゼの動態を主成分分析法により解析し，前肢る．それにもかかわらず，対照群に比べたジスト筋と後肢筋ではアミノペプチダーゼが第1主成分−35−8）Aoyagi，T．，Tobe，H．，Kojima，F．，Hamada，M．，Takeuchi，T．，and Umezawa，H．：J．
A舶肋加．31，636−638（1978）．
9）Umezawa，H．，Aoyagi，T．，Suda，H．，Hamada，M．，and Takeuchi，T．：J．AllLibioL．29，97−99と高い相関を示し，両者における酵素網の変化が極めて類似していることを認めた．一方，心筋はエンドペプチダーゼと高い相関を示し，前2着とは異なることを明らかにした7）．

（1976）．

10）Aoyagi，T．，Suda，H．，Nagai，M．，Ogawa，K．，

まとSuzuki．J．，Takeuchi，T．，andUmezawa，H．：
且加血涙．βわ♪わざ．Acね452，131−143（1976）．

め11）McDonald，J．K．，and Schwabe，C．：in Pro−
teinasesin Mammalian Cells and Tissues

筋ジストロフィー症の筋肉内アミノべプチダー
ゼの役割を明かにするため，筋ジスマウスの前肢（Barrett，A．J．，ed．），pp．314−322，EIsevier／筋，後肢筋および心筋における14種類の酵素活North−Ho11and BiomedicalPress，Amsterdam（1977）．

性の変動を調べ，対照マウスと比較した．筋肉内12）Oya，H．，Nagatsu，Ⅰ．，and Nagatsu，T．：

風加血加．βf噌カブ∫．Ack258，591−599（1972）．
13）Aoyagi，T．，Miyata，S．，Nanbo，M．，Kojima，のプロテアーゼの動態を多変量解析の一手法であF．，Matsuzaki，M．，Ishizuka，Mリる主成分分析法により解析し，アミノペプチダー

Takeuchi，T．，and Umezawa，H．：J．Aniibiot．22，558−
568（1969）．

ゼが関与する第1主成分が前肢筋と後肢筋で有意14）Umezawa，H．，Aoyagi，T．．Morishima，H．，
Kunimoto，S．，Matsuzaki，M．，Hamada，M．，
and Takeuchi，T．：J．Aniibiot．23，425−427に増加した．一方，心筋ではセリソ・プロティナーゼが関与する第2主成分のみ有意に増加するこ（1970）．

とが認められた．前肢筋と後肢筋におけるアミノ15）Ume2：aWa，H．，Aoyagi，T．，Okura，A．，Mori−
Shima，H．，Takeuchi，T．，and Okami，Y．：J．
A血肋加．26，787−789（1973）．
16）Aoyagi，T．，Kunimoto，S．，Morishima，H．，
Takeuchi，T．，andUmezawa，H．：LAnEibioE．

べプチダーゼおよび心筋におけるセリソ・プロテ
ィナーゼの変化は筋ジスマウスにおいて特徴的である．筋ジストロフィー症において，アミノべプ

24，687−694（1971）．

チダーゼの役割を重視する必要がある．

17）Aoyagi，TリNagai，M．，Iwabuchi，M．，Liaw，

W．S．，Andoh．T．，and Umezawa，H．：Cancer
月が．38，3505−3508（1978）．

文献1）Aoyagi，T．，Wada，T．，Kojima，F．，Nagai，M．，and Umezawa，H．：J．CLin．ZnzJeSE．67，
51−59（1981）．

2）Wada，T．，Kojima，F．，Nagai，M．，Aoyagi，T．，and Umezawa，H．：J．PhaYm．Py72．4，
184−190（1981）．

3）Aoyagi，T．，Wada，T．，Yamamoto，K．，
Kojima，F．，Nagai，M．，and Umezawa，H．：′．f坊αr桝．功仇7，312−321（1984）．
4）Aoyagi，T．．Wada，T．，Kojima，F．，Nagai，18）Aoyagi．T．，Yamamoto，T．，Kojiri，K．，
Kojima，F．，Hamada，M．，Takeuchi，T．，and
Umezawa，H．：J．AnLibiot．31，244−246（1976）．
19）Umezawa，H．，Aoyagi，T．，Hazato，T・，Uotani，K．，Kojima，F．，Hamada，M．，and Takeuchi，
T．：J．A拙眉流軋31，639−641（1978）．
20）Meyer，D．H．，Meyer，W．L．，and Kakulas，
B．A．：in Recent Advances in Myology（Bradley，W．G．，Gardner−Medwin，D．，and
Walton，J．N．，eds．），Pp．277−282，Excerpta
Medica，Amsterdam（1975）．

21）Lowry，0．H．，Rosebrough，N．J．，Farr，A・L・，

M．，Miyoshino，Sリand Umezawa，H．：Clin．

and Randal1，R．J．：J．Biol．Chem．193，265−

Cか玖‥心血129，165−173（1983）．
5）Aoyagi，T．，Wada，T．，Kojima，F．，Nagai，
M・，Harada，S．，Kinoshita，M．，Yamada，N．，
and Umezawa，H．：J．Clin．Biochem．肋Lr．1，

22）Kendal1，M．：in Multivariate Analysis，pp・
13−29，Charles Grif範n and Co．，London

65−72（1986）．

6）青柳高明．自然10月号．39−47（1983）．
7）Aoyagi，Tリ

Wada．T．，Kojima，F．，Nagai，㌘5（1951）．

く1975）．

23）Aoyagi，T．，Wada，T．，Yamamoto，K・，
Kojima，F．，Nagai，M．，Harada，S．，and
Umezawa，H．：′．A♪〆．βわC舶用．6，212−221

M．，Harada，S．，and Umezawa，H．：BioEech．
ApL）Z．Biochem．in press．

−36−（1984）．

CANP阻害剤

大 関 正 弘＊
研究協力者 花田和紀＊，玉井正晴＊，横尾千尋＊，鈴木紘一＊＊

もとに，CANP により選択性の高い阻害剤を合緒

成的に創製し，DMD等の筋疾患の治療薬として

言

筋蛋白分解には複数の蛋白分解酵素（プロテア

開発することにある．

ーゼ）が作用して分解が完了するものと思われる
材料及び方法が，今日，生理的，病理的を問わず筋蛋白の分解には非リソゾーム系とリソゾーム系の二系統のプ

1．CANP及び阻害活性測定法

ロテアーゼが働くものと考えられる．前者に属す

ニワトリ CANPを骨格筋より石浦ら4）の方法

るものとしてカルシウム依存性中性プロテアーゼで調製した．電気泳動的にはは均一で，比活性（Ca−aCtivatedneutralprotease：CANPまたは570U／mg（A280＝0．321）の標品を使用した．阻

calpainの名で呼ばれている）．後者に属するもの

害活性の測定は基本的に石滑らの方法に準じ以下としてカテプシソ群がある．筋疾患，とりわけ進の方法によった．

行性筋ジストロフィー（DMD）では遺伝性の素因

反応溶液

として筋細胞膜に異常があり，これが引き金とな

0．1M TriS−HCl，pH7．5

460FL1って筋細胞内へのCaイオソの流入，CANPの7M2−Mercaptoethanol

1．5FL1

活性化，Z帯の消化，筋原線経の分節化といった

1M CaC12

1．5J〝

一連の筋分解のカスケードが惹起され，本疾患にCasein（30mg／mlin O．1M

特徴的な筋線経の壊死，崩壊が起るとする病因説

Tris−HCl，pH7．5）

40FLlがある1）．従って，CANPを選択的に阻害するこの割合で混合したもの500／JJ に阻害溶液80／JJとによって本症の進行を喰い止め得ると期待されを加える．CANP溶液5−10′∠Jを加えて反応をる．事実，われわれはCANP，カテプシソB，L，

開始し，30℃，20分反応後，500／′Jの109らト

H等のシステイソプロテアーゼを選択的に阻害すリク。ロ酢酸を加えて反応をとめ，室温で約 20

るE−64誘導体，EST

分放置後15，000rpmxl0分遠心し上清の280nmが筋ジストPフィーハム

スターUMx7．1の病気の進行を遅延せしめ，延の吸収を測定する．

命効果をもたらすことを報告した2）．本研究の目

2．バパイン及び阻書活性測定法

的はE一弘関連化合物3）で得られた上記の知見を′パイン活性はSigma社製2回結晶標品を用＊大正製薬総合研究所＊＊東京都臨床医学総合研究所

い，Z−Phe−Arg−MCA（蛋白研究奨励会製）を基質としてBarrettS）の方法によった・−37−

Tablel CANPInhibitoryActivity of EpoxysuccinylAmino Acid（Ⅰ）

H。芸〉ccフCくご￣ROⅠnhibitory activityID50

CANP／Papain

Papain（n mol）

CANP（mol／mol）

Pbe−OEt

570

Leu−OEt

41
642

Leu−OEt（D）
bu−OBzl

38

He−OBzl

20
1

6

6

8

Orn（Z）−OBZl
Lys（Z）−OBzI

0
0
7
5

Arg−OMe2

3

Glu（OBzlトOBzI

5
8

Pr0−OBzl

1）縮合法

そ／一一一五聖と竺空㌔cocl）20−ES−OH

RlO−ES−OK（10mmol）をトリエチルアミン

R．0−ES一Cl

HAA−OR2HAA−OR2

WSC，HOBt（Et）3N（11mmol）のエチルエーテル溶液（10mg）に懸濁しオキザリルクPリド（11mmol）のエチルエーテル溶液（10mg）を水冷授拝下に滴下．3h室

Lrf
RlO−ES−AA−OR2

温で撹拝した後，生じた沈澱を炉別L RlO−ES−￣1㌃

Clのエチルエpテル溶液を得る．これをH−AA−

KO−ES−AA−OR2

OR2（10mmol）およびトリエチルアミン（11mmol）のエチルエーテル溶液（50mg）に氷冷撹

KO−ES−AA−OK，

拝下に滴下．室温放置後，氷水に注ぎ酢エチで抽
乱酔エチ層を洗浄後濃縮乾固．残睦をシリカゲ

ES∴。：）C▽Cく：0￣

ルカラムで精製L RlO−ES−AA−OR2を得る．

AA：Amino acid residue
WSC：Water soluble DCC

2）加水分解法
RlO−ES−AA−OR2（2mmol）をR20HまたはFig．1Synthetic Scheme

3．E−64類縁体の合成

アセトン（5mJ）に溶解し，KOH（2mmol）のFig．1に合成法の概要を示す．DL−トランスエ

R20H

または水溶液（1ポキシコハク酸モノエステルK塩（RlO−ES−OK）

るとRlが選択的に切断されKO−ES−AA−OR2とカルポキシル基をエステルで保護したアミノ酸の結晶が生じる．結晶が得られない場合は反応液（H−AA−OR2）をFig．1に示す二つの方法で結合を塩酸々性下酢エチで抽出しHO−ES−AA−OR2

した．更に，必要に応じ苛性カリを用いてエステを得る．KO−ES−AA−OKを得る場合はKOHを

ルを切断L KO−ES−AA−OR2またはKO−ES−

6mmol使用する．

AA−OKを得た．
−38−

3mわを水冷下滴下す

CANP阻害剤
Tab］e2CANPInhibitoryActivity ofEpoxysuccinylAminoAcid（ⅠⅠ）

Rl●。芸〉ccフCくご￣R20hhibitory activityID50
CANP／Papain

Papain（n mol）

CANP（mol／mol）

Phe−OEt
Phe−OEt

Leu−OEt
Leu−OEt

Table3

1bu−OH

000012 53 7795L
25 19
4 ㌘ 1

Phe−OEt

000m66飢剛4
1︒．

74

8530
63
51362172050002

H H Et 鮎 mn H Et

Phe−OHCANPInhibitoryActivity ofEpoxysuccinylAminoAcid（ⅠⅠⅠ）

H。芸〉ccフC〈ご￣ROhhibitory ActivityID50
CANP／Papain

Papain（n mol）

4
8
8

6

Lys（Z）−OBzl．9 6 0 0 3 6
5 1 53
4お 1 5

1 6

0
4
1

Lys（Z）−OEt

065

Lys（Z）−OMe

85

Lys（Z）−OH

1

Orn（Z）−NH2

5

Orn（Z）−OBzl

8

Orn（Z）−0−nBut

5

Orn（Z）−OEt

192517㌘3736
05
55Ⅳ
000001001

Orn（Z）−OMe

CANP（mol／mol）

端，あるいはエポキシコハク酸のエステル化によ

結果及び考察る影響をTable2に示した．パパイソ，CANP

Tablelにエポキシコハク酸に結合したアミノに対する活性ともC末端のエステル化によって増酸を変えた時のパパインおよびCANPに対する大し，エポキシコハク酸のェステル化によりパパ阻害活性を示した．CANP／papain

が小さい程インに対する活性は滅弱するが逆にCANP作用CANPに対する選択性が高いことを示す．Orn

は強くなる．しかもエチル基の様に小さい方がペあるいは Lys およびGlu の遊離のアミノ基をソジル基の様な比較的 bulky なものよりも効果

Z基で，カルポキシル基をBz基で保護することがある．一方，Orn，LysのC端はbulkyな基でによりェスチル化した方がCANPに対してより選択性

CANPに対する阻害活性が極めて強くなる．

が強くなることがわかった．アミド化はエステル

中でもGlu弱くの場合はパパインに対する作用は化とほぼ同等の効果がある（Table3）．

CANP特異性が高い．更に，アミノ酸C末−39−

以上E−64に関してこれまで得られた知見をもとにCANPに対してより選択性の高い阻害剤をノ酸誘導体を合成L CANPおよびパパインに対得る目的でェポキシコハク酸，アミノ酸誘導体のする阻害活性を比較した結果，CANP

合成を試み，代表的なチオールプロテアーゼであ比較的特異性の強い数種の化合物を得ることが出るパパインと比較しながら構造活性を検討した．

来た．

に対して

Orn，Glu，Lysの例でみられる様にCANPに対してかなり選択性の高い化合物が得られ今後更に詳細な検討を進めることにより

CANP特異阻害剤を合成的に得ることも可能と考えられた・

結語

CANPの選択阻害剤を得ることを目的にチオールプロテアーゼの特異阻害剤，E−64 の活性基であるエポキシコハク酸を基本骨格とし各種アミ

−40−

文

献

1）杉田秀夫：〟ゼ血f〝α，22，（2），㌶7（1985）．
2）M．Tamai eL al．：Proceeding of theInter−nationalSymposium on Cysteine Proteinase

and theirInhibitors．ed．by V．Turk，Walterde Gruyter＆Co．，Berlin．NewYork（1985）．
3）花田和紀他：基礎と臨床，20，（12），7（1986）．
4）S．Ishiura eEal．：J．Biochem，，84，225（1978）．
5）A．J．Barrett：Biochem．J．，187，909（1980）．

CANPの生物学的研究

川

島

誠

一＊

研究協力者 林 昌美＊，斉藤祐見子＊
能なので，CANP
はじめ

に対するモノクロナル抗体の作成から始めた．

にカルシウム依存性中性プロテアーゼ（以下CANP）は中性pHで活性を示す主要な細胞内プ

方

ロテアーゼであり，広く動物界に分布している．

法

抗原として用いるFLCANPとmCANPはウ

本酵素はカルシウムイオンにより活性化される

サギ骨格筋より従来の方法で精製した．各CANPが，生体内にはカルシウム感受性の異なる2種類

でマウスを免疫し，その脾細胞とマウスミュローのCANP（高感受性型のFLCANPと低感受性型

ス細胞をPEG法で融合させた．できたハイブリのmCANP）が存在する．筋ジストロフィーや心ドーマをHAT培地で選別したのち筋梗塞などの病的状態では筋肉の細胞内カルシウにより抗CANP抗体を産生する細胞をスクリー

ム濃度が上昇することが知られており，これらのニングし，クロン化した．その結果，mCANPを疾病における筋タンパク質の異常分解は本酵素に抗原とした15種類の抗mCANP抗体産生クロよりひき起こされると推定されている．したがっンおよび〝CANPを抗原とした30種類の抗て，本酵素の活性を制御することによりこれらの〝CANP抗体産生クロンが得られた．

ELISA

法

疾病の抑止的治療が可能となることが期待され組織の抗CANP抗体染色は以下の方法によりる．一万，本酵素には本来の生理的撥能が存在す行った．ウサギの各種臓器を摘出後，一部はパラ

るはずである．この機能は，CANPの活性を制

ホルムアルデヒドで固定し，一部は液体窒素で急御する薬剤を実用化する上で大いに考慮されるべ速凍結した．前者からはパラフィン切片および固きものであるが，その実体は不明である．そこで，

定凍結切片を作成し，後者からほ未固定凍結切片

CANPの生理的横能を明らかにする手掛りを得を作成した．各切片を抗CANP抗体で標識し，るために，本酵素の組織局在性の検討を試みた．

ビオチニル化抗マウスIgGウマ免疫グロブリン

方法としては抗CANP抗体による免疫組織学的と反応させたのちイミダゾール法を用いたアピジ

手法を用いることになるが，CANP

ンビオチソ複合体法により検出した．

には似て非なる2種塀のCANPが存在するため，各CANPに特異的な抗体が必要とされる．これはモノクロ結ナル抗体をスクリーニングすることにより実現可＊東京都老人総合研究所

果

mCANPおよびFLCANPを抗原として得られたモノクロナル抗体の多くはそれぞれの80K

−41−

サ

SpモC抒如yofA鵬−CANPMono￠ぬ旭IA鵬Ibod始＄
38惚

88K

1人8A2

やⅦA7

585H7

m

m

5A9尉

−●

30K一●

m

p

m

p

ll

p

m

p

図1抗CANPモノクロナル抗体の特異性
プユニットに特異的なものであったが，抗mCANP抗体類の1種類（1DlOA7）はmCANP

と

〃CANP

反応し，抗

の80Kサブユニットのいずれとも〃CANP

抗体類の中には30Kサブ

ユニット（iLCANPとmCANPで同一）に特異的なもの（5B5H7）や30KサブユニットとFLCANPの80Kサブユニットと反応するが

mCANP

の

80Kサブユニットとは反応しないもの（5A9G3）もあった（図1）．以下に述べる組織の抗体染色

図3 ′」、脳には，CANPの全体像を探るためにFLCANPとmCANPのいずれとも強く反応する1DlOA7を
用いた．
■￣＿

抗体染色後の巨視的にみた臓器ごとの色調の強・■1「′〆．

さは，肺・脾・心・腎・精巣・脳・肝・骨格筋の順となり，CANPの含量を反映しているものと考えられる．また，3種類の方法で作成した標本
での組織内局在性は本質的には余り差はないが，二・予工■㍉＿．l．一

未固定切片ではやや分散した様相を皇し，またパ

＿

・．−、

＿ト

．J二㌧ て∵■、．●ごJ■■

く1、て∴・．も∴ に！

図4 脊髄

ラフィン切片では発色しない部位も認められた．
したがって，固定凍結切片が最も正しい局在性を

肺臓：肺胞上皮細胞が極めて強く反応する．

示していると解釈し，以下にその結果を示す．

胆のう：粘膜上皮細胞が強く反応する・

大脳：星状膠細胞と血管が強く反応する．

精巣：曲細精管を囲む筋様細胞が反応する．

小脳：プルキニエ細胞および分子層が淡く反応

肝臓：小葉間動脈，小葉問静脈，小葉間胆管が極めて強く反応するが，肝細胞自身は反する．
脊髄：灰自質の神経細胞と自質の軸索が強く反応しない．
骨格筋：血管以外には特に強く反応する部位は

応する．

ない．

坐骨神経：軸索および神経周膜が反応する．
ー42−

CANPの生物学的研究

図5 坐骨神経

図8 精巣

図6 肺臓

図9 肝臓

芯 独Y

∵整

丈一一・、

図7 胆のう図10 骨格筋

腎臓：皮質では糸球体や糸球体穿細胞が，髄質では遠位尿細管や集合細管が反応する．

ソバク質の分解，（2）タンパク貿リン酸化酵素などの活性化，（3）ステロイドホルモンや成長国子など

眼：角膜上皮が極めて強く反応する．

の受容体の活性調節，（4）生体膜の融合などに関与していると考えられている．一万，本研究の結果

考
生体内における

察

からCANPは一般的に上皮系細胞に多く存在し

CANPの横能として現在考えていることが明らかになった．これらの細胞に共られているものの多くは試験管内反応に基づく結通な機能として物質の吸収・放出および外部刺激

果からの推定であり，（1）細胞膜および細胞骨格クの伝達・応答がある．ェソドサイトシスやェキソ

一43−

こ

−身Y．ヽ′

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図13 限

図11腎臓（皮質）

従来予想されていたCANPの機能について多くの面で支持を与えるものである．
しかし，ここで得られた光学顕微鏡レベルでの観察では細胞における局在部位にまでは言及できない．今後は免疫電顔を駆使したより詳細な検討

麗㌧鵠吟が必要とされる．また，最近主張され始めたように，CANP の細胞内存在部位は動的であり，これを追跡するためには単なる組織の抗体染色では不充分である．CANP の機能をより明確にする

図12 腎臓（髄質）には，発生・分化の過程における存在量および存
サイトシスによる吸収・放出は生体膜の融合を介在部位を決定し，さらには培養細胞系を用いた動した過程であり，一方受容体を通した情報伝達に的な解析も必要となる．その達成のために，本研

は細胞膜の裏打ちタンパク質や細胞骨格タンパク究で得られたモノクロナル抗体や本研究班の目的質が大きな役割を果たし，タンパク質リン酸化酵の一つであるCANP活性阻害薬剤は有力な武器

素なども関与している．したがって，上皮系細胞になり得ると期待される．

にCANPが多く存在するという今回の結果は，−44−

CANP阻害剤の設計及び合成に関する研究

向 山 光 昭＊筋ジストロフィー症にみられる筋崩壊には細胞64株の培養物中から単離され，これはパパインや中に存在しカルシウムによって活性化される中性

カテプシソなどのシステイソプロテアーゼに対しプロテアーゼ（CANP），ライソゾーム性のカテプて，特異的阻害活性を示すことが明らかになって

シソB，H，Lなどのシステイソプロテアーゼのいる．さらに，これまでの構造活性相関の検討に関与が示唆されており，これら酵素の特異的阻害

よって，EC−64（1）の高活性誘導体EC−64−C（2）剤の筋ジストロフィー症治療薬としての有効性がが兄い出されている．活性の発現には，エポキシ

注目されている．

ド部分が必須であるが，アミノ酸残基として ト
ロイシソが重要であることも示唆されている．

EC−64（1）は，AsPe7gillusj（ゆOnicus TPR−ノ＼C−NIトQ−GNH（CH2）4NHCNH2
≡

目

白 0

1

EC−64

人 ／、人

川

CNH−C−CNH
≡

11

云0
2

EC−64−C

医薬品をはじめとする生理活性物質のフッ素に子で置換しても，分子の立体的な変化が殆んどなよる化学修飾は，その特異性の故に薬理効果など

いため，もとの分子と同様に生体系に取り込まれの改善が期待できるため，最近極めて活発な展開る場合が多い．

をみせている．一般的に，生理活性を考慮する際

2）フッ素原子は立体的には水素原子に近いが，有機フッ素化合物の特異的な性質は以下の如くでその電気陰性度は全元素中最大である．従ってフある．

ッ素原子による修飾は，分子内の静電的分布には

1）フッ素原子は立体的には水素原子に次いで小大きな変化をもたらす．フッ素基の強い電子吸引さく，ある生理活性物質中の水素原子をフッ素原性は近傍の官能基の性質（例えは，カルポキシル＊東京大学理学部

基の酸性度の増加）や水素結合の形成による分子−45−

のコソホメーショソの変化をもたらす場合があ

大させ，また脂質部分への偏在を容易にする．
以上述べた有機フッ素化合物の特異性と，EC−り，それに基づく生理活性の変化が論じられている例もある．

64関連物質の構造活性相関に基づき，より有効な

3）C−F結合の結合エネルギーはC−H結合のそ

システイソプロテアーゼ阻害剤の開発を目的とし

れよりも大きく，通常C−F結合の閑裂を伴ったて，5，5，5−トリフルオロ■ロイシン（3，以下トリフ代謝は起り難い．

ルオPロイシンとよぶ）を修飾基とする一連の化

4）有機分子にフッ素を導入すると脂溶性が増大

合物の合成を行った．

し，生体内の血中濃度の上昇速度や輸送速度を増

トリフルオロロイシン（3）の2位および4位は
CF3

。H。絹

COOIi

0

Ph H

HO、J）へNH久

Cb。

5−S

3

CF3

0

Ph H

H。、j〉人N。jく、5−R

不斉炭素であるので，四種の立体異性体が存在すえることを兄い出した．すなわち，4と光学活性る．従って，3を修飾基とする生理活性物質のア（1Sトα−フェネチルアミンからアミド（5）を生成

ナログの生理活性を評価する場合には，異性体混させ，再結晶およびシリカゲルカラムクロマトグ

合物を導入したのでは意味がなく，それぞれの異ラフィーによってジアステレオマー分離を行う

性体を作り分け導入する必要がある．

と，二種のジアステレオマーが純粋に得られる．

従来，トリフルオロ∵ロイシンのようにトリフル

つづいて，アミド（5）の一方のジアステレオマー

オロメチル（CF3）基を有するキラルな分子の有（5−S）にフェニルチオ基を導入し，アミド部分を効な合成法とその絶対配置の決定法は，未解決な除去，還元すると，光学活性（3R）−3−トリフルオ分野であった．一方，我々は，3−トリフルオロメ

ロメチルー4−7ェニルチオブクノール（6−R）が生

チルーγ−プチPラクトン（4）の光学分割が，入手成する．このキラルなアルコール（6−R）にSwern

容易な α−フェネチルアミンを用いて効率良く行

酸化，Strecker反応を行い，生じるアミノニ11

CF3

CF3 NH2

CF3

NH2phS〉1、、／へ。H−トー＿／大人。。。H ＋／し人C。。H
6−R

3−RR

3−SR

phS、芸／、。H→→／ニ荒。。H ＋失笑。。。。
6−S

3−RS
−46−

3−SS

CANP阻蕃剤の設計及び合成に関する研究

リルのジアステレオマー分離を行ったのち，酸性（3）のカルポソ酸部分に，イソアミルアミンを導加水分解を行うと，トリフルオPロイシンの二種

入し，さらに，トラソスエポキシコハク酸と，トの異性体（3−RR，3−SR）が，光学的に純粋に得リフルオロロイシンのアミノ基を結合させること

られる．

とした．

また，アミド（5）の他のジアステレオマー（5−そこで，N−トリフルオロロイシン（3）のアミR）から，同様にトリフルオロ∵ロイシンの他の立ノ基をペソジルオキシカルポニル化し，アミノ基体異性体（3−RS，3−S）が合成できる．

に保護基を導入した．これに塩化ジメチルホスフ

また，ここで得られる各異性体の絶対立体配置

ィノチオイルを縮合剤に用い，さらにイソアミル

は，トリフルオロ・ロイシノールのペソゾイル体にアミンを作用し，イソアミルアミド（8）に変換し変換し，そのCD−スべクいレ，NMRおよびⅩ一

た．アミノ基の保護基として導入したペソジルオ

線解析により決定した・

キシカルポニル基を，10ヲらパラジウム／活性炭存

以上，トリフナオロ■ロイシノールの四種の異性

在下水添し除去する（9）．これをトランスエポキ

体の合成および立体構造の決定を行うことができ

シコハク酸エチルクーニトロフェニルエステルとたので，これらを修飾基とするプロテアーゼ阻害

反応させると，目的とするEC−64−Cトリフルオ剤EC−64−C誘導体の合成を行った・

ロロイシン誘導体（10）が合成できた・
トリフルオロ∵ロイシンの四種の異性体を用い合成計画としては，まずトリフルオPロイシン

イソアミルアミン

Et。。ご》ニ00￣訪NO2

祈0Et。。奉読NH離N−1岬l。
て，上記合成ルートに従ってEC−64−Cトリフル

た・これらの化合物合成の各ステップの収率およオロ∵ロイシンの全異性体を合成することができ

び比施光度を以下の表に示す．

−47−

2S，4S

quant・￣設喜；

2S，4R
2R，4S

2R，4R

quant・て…ぶ訂＊83＋24・50（3．5）＋22・00（2．4）＊塩基としてNaOHのかありに，NaHC03を使用
以上，EC−64−C のアナログとしてトリフルオ

きた・今後，生理活性部位として必須であるエポ

ロロイシンを導入した四種の立体異性体を合成

キシコハク酸部位のフッ素原子による修飾を試み

し，生理活性調査の試料として供給することがでる予定である．

−48−

CANP遺伝子のクローニングに関する研究

鈴

木

紘

一＊

媒サブユニット，30Kはリン脂質結合ドメインとはじめ

カルモデュリソドメインを持つ制御サブユニットにカルシウム依存性中性プロテアーゼ（CANP）

である．cDNAの構造解析から明らかになったは筋ジストロフィー症（DMD）時の筋肉の崩壊

これらのドメイン構造，特にカルモデュリンドメ

の引金を引く酵素である．CANP 遺伝子はⅩ染インの機能の解析を行った．

色体上にはないので，CANPはDMDの遺伝子

CANPのカルシウムの感受性は，分子中の2個産物ではない．しかし，DMD時には何らかの原のカルモデュリンドメインに対するカルシウムの因でCANPの活性が上昇し，それが筋崩壊に結結合により規定されるであろう．これを実証する

びつく．即ち，I）MDの表現塾はCANP活性のため，CANP

異常な昂進といえよう．そこで，CANPの活性腸菌で発現，精製し，そのカルシウム結合能を推昂進の原因を究明するためCANPの活性制御系

定した・ウサギm，FLCANPの80K，30K中のを解析した．また，CANP活性に大きな影響を

カルモデュリン，およびニワトリ 80K のカルモ

与える内在性のCANPインヒビターの研究も行

デュリンの計4個のカルモデュリンドメインを合った．CANP インヒビターの阻害機構が解明で成した．これらはいずれも分子量約2．5万で，ウ

きれば，CANP に特異的なインヒビターの開発

サギm80Kは4個，それ以外は各2個のカルシが可能で，これは筋肉の崩壊を停止する試薬の開ウムを結合し，見かけのカルシウムの解離定数は発に直結する．このような考えにもとずきインヒ

35，61，128，149／上Mで，この値はCANPが活

ビターの研究を行った．

性を発現するのに必要なカルシウム濃度とほぼ対中のカルモデュリンドメインを大応していた．この結果，CANP中のカルモデュ

結 果・討 論リンドメインが実際にカルシウムを結合し，この1．CANPの活性制御系の解析

ときの感受性でCANPのカルシウム感受性が規

CANPには2種のアイソザイムがあり，〝Mお

定されていることが判明した（表1，図1）．
プロテアーゼドメインについても解析を行ってよびmMカルシウムで活性を発現し，FLCANP，と呼ばれる．両者とも2個のサブユニ

いるが，今のところ，活性を持つプロテアーゼド

ット，80Kと30K，からなり，80Kはプロテア

メインが発現できない．しかし，CANPのプロ

ーゼドメインとカルモデュリンドメインを持つ触テアーゼ消化物中には，カルシウム非存在下でもmCANP

プロテアーゼ活性を出すものがあるので，プロテ東京都臨床医学総合研究所−49−

表l Binding of Ca2＋to Calmodulin DomainsinCANP

20

u至2dむ一〇∈＼＋N円O PU⊃Oq SgOE

100

200

0

300

100

200

300

Ca2十（〟M）
図I Binding of Ca2＋to Calmodulin Domainsin CANP

アーゼドメインは単独でもプロテアーゼ活性を発に自己消化が進んで30KのN末端のリン脂質結現するが，この活性はカルモデュリンドメインに合ドメインがきれると活性型CANPが細胞質によって阻害され，カルモデュリンドメインにカル遊離する．〃CANPは膜を介さずに細胞内でも活シウムが結合することで誘起される構造変化によ性化される可能性がある．この活性化モデにル関って阻害がはずれ，プロテアーゼ活性が発現する．

しても妥当性の検討を急いでいる．

このモデルの妥当性をさらに検討している．

2．CANPインヒビターの構造解析

CANPがリン脂質の存在下で自己消化をおこす現象をさらに検討し，CANP

ウサギ肝臓からSDS電気泳動で均一なインヒの細胞内活性化

ビターを精製した（図2）．分子量は107Kであ機構を調べた．細胞質中に存在するCANPは生った．これをトリプシンで切断し，ペプチドを理的条件下では活性がないので不活性なチモーゲ

HPLCで分離し，幾つかのペプチドのアミノ酸配ソと考える．カルシウム濃度が〃M程度になる

列を決定した．決定したアミノ酸配列の1部に相と30Kのリン脂質結合ドメインを通じてCANP

当する18は細胞膜と結合する．リン脂質とカルシウムによ（128通りの配列の混合物）を合成してプローブとって細胞膜でCANPの自己消化がおこり，80K

した．

のN末端側が切れて活性型CANPとなる．さら−50−

マーのオリゴヌクレオチドプローブ

一方ウサギ肺，心臓からグアニジンチオシアネ

CANP遺伝子のクローニングに関する研究

1

2

勝

一←一125K
一一68K

憲二警空賢

一トー40K
一■−35K

1．erythrocyte
2．1iver

図2

SDS−PAGE of CANPInhibitorート法でRNAを抽出し，オリゴdTセルロードが検出された．3′非翻訳領域にはポリA付加シ

スカラムでpolyA−RNAをえた1これをもとに2

グナルが3ヶ所見出されたので，ポリAが付加す

本鎖のCDNAを作り，2kb以上の長さのものをる部位を異にする3種のmRNAの存在が確認さ集めて施tlOファージベクターにつないでれた．3種の中では3．0のものが最も多く，次い

cDNAバンクを調製した．

で3．8で，2．5のものは最も少なかった・

ライブラリーの約30万個精製したCANPインヒビターのN末端アミノのファージクローンからヌクレオチドプローブで酸配列はGlu−Lys−Thr−AlaTSer−…… で，推定3個のクローンを選択し，さらに，このCDNAした80番目からのアミノ酸配列と一致した．従インサートをプローブとして，心臓のライブラリって，肝臓のCANPは639残基で，分子量は68，

ーをスクリーニングし，種々のクローンをえた・

133である．

ウサガ肺のCDNA

今までCANPインヒビターは種々の分子種か

これらのCDNAクローンの塩基配列を解析し，約3．8kbのCANPインヒピタ〜のmRNAの

ら単離され性質が調べられている・その結果，構造を決定した．この構造中には2154個のヌク

CANPインヒビターは大別して2群に分けられ

レオチドからなる翻訳領域があった．これから推る．分子量約110Kで肝臓や心臓から分離される

定される718個のアミノ酸配列中には，肝臓のイ

ものと，分子量約70K

ソヒビターを使って決定したペプチドのアミノ酸である．いずれも1分子で数分子（3配列が全て含まれていた・

CANPを阻害する．従って，CANPインヒビタ

このCDNAの翻訳領域をプローブにしてウサで赤血球からとれるもの8個）のーにはこれを反映した構造がみられるはずであ

プロットを行った

る．CANPのアミノ酸反列を検討した結果，次ところ，3．8，3．0，および2．5kbの3本のバンのような特徴が見出された．（i）成熟CANPイ

ギ心臓のRNAのNorthernー51−ソヒビター中には4回の繰返し構造があり，そのインヒビターの解析の2つを同時に行っている．

基本単位は140残基であった．この繰返し構造の前者に関しては，ドメイン構造とその槙能を明ら

中央には約50残基の相同性の高い配列がある．

かにすることに力をそそぐと共に，細胞膜におけこの繰返しドメインが阻害の基本単位と考えられるプロ酵素の活性化とCANP分子種の役割分担

たので，これを大腸菌で発現させ，その阻害活性を明らかにする．CANPを調べたところ，各繰返しドメインが阻害活性をはこの点が最も重要と考えている．後者について持つことが明らかになった．（ii）CANP インヒ

は，繰返しドメインが阻害の単位であると一応同

ビターのアミノ酸配列は，シスタチソやキニノー

定したが，アミノ酸の相同性だけでは繰返しドメ

ゲソなどを含む構造研知のタンパク質とは類似性

インを一義的に決められなかった．現在，大腸菌がなかった．そのためプロテアーゼ活性の阻害機で発現させたり，種々のプロテアーゼを用いたり構も違う可能性がある．特に，カルモデュリンド

して，インヒビターの断片を調製しその阻害効果

メインにカルシウムが結合してCANP活性が発をみている．この結果から阻害ドメインの基本単現するので，この過程を阻害するインヒビターの位が決まり，さらにこれを出発点としてインヒビ可能性もある．勿論，他のプロテアーゼインヒビ

ターを小分子化し，薬として使えるものを開発す

ターのようにプロテアーゼドメインとインヒビタ

ると同時に，阻害機構を解明することをめざしてーが直接結合する可能性が最も大きい．その場合いる．

の生体内機能の解明にでも，インヒビター中に反応部位があるのか，単に活性中心を物理的にふさぐだけなのかなど多くの機構が考えられ，目下検討中である．（iii）アミノ酸配列から計算したCANPインヒビターの分子量は，SDS電気泳動で推定した分子量と大きく異る．即ち，肝臓のインヒビターは計算した分子量が98，133であるのに対し110K，赤血球のイ
ンヒビターが約47，000であるのに対し70K

である・大腸菌で作っ声インヒビターのドメインがアミノ酸配列から推定した値とSDSでの値が比

発

表

論

文

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3）Y．Emori，H．Kawasaki，S．Imajoh，S．Kawa−
Shima＆K．Suzuki：J．BiotChem．，261，9472−
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5）H．Kawasaki，S．Imajoh，S．Kawashima，H．
Hayashi＆K．Suzuki：J．Biochem．，99，1522−
1532（1986）．

較的よく一致するので，この分子量の差は主に翻訳後の修飾のためと考えられる．現在，この修飾がどのようなものであるかを検討しているが，大腸菌で発現させたものが完全な阻害活性を持っているので，この修飾が阻害とは直接関係しない．

結語

現在，CANP自体の活性制御系の解析とCANP−−52−6）S．Imajoh，H．Kawasaki＆ K．Suzuki：J．
βわC加桝．，100，633一朗2（1986）．
7）K．Aoki，S．Imajoh，S．Ohno，Y．Emori，M．
Koike，G．Kosaki＆K．Suzuki：FEBSLetters，
205，313−316（1936）．

8）S．Ohno，Y．Emori＆ K．Suzuki：Nucteic
A血ね月お．，14，5559−5559（1986）．
9）S．Miyake，Y．Emori ＆K．Suzuki：NucLeic
Acね励お．，14，8805−8817（1986）．

Lysosomalcysteine proteinaseinhibitorと難病治療薬開発

勝

沼

研究協力者

信 彦＊
木南英紀＊
−ハムスター，mdx

は

じ

め

マウス）の病理組織像は筋細胞の変性・萎縮・壊死と共に，細胞浸潤・問質に細胞の変性・壊死を伴う疾患・病態では何が原の増加さらに再生像が同一標本内にみられ，極め因であれ，二次的にはプロテアーゼ（細胞内のみて不均一であることが一つの特徴である．以前よならず，浸潤細胞より分泌されるものも含む）のりこのジストロフィー筋のホモジネート中のリソ作用によって細胞の不可逆的な変化が進行するとゾームのシステイソプロテアーゼ群（カテプシソ

考えられる．進行性筋ジストロフィー症は退伝性

B，H，L），カテプシソD，マスト細胞のセリソ疾患ではあるが，病態の進行のみならず，症状の性プロテアーゼなどの活性が著明に上昇している

発現以前からプロテアーゼが活動している示唆もことが報告されている．その活性上昇のばらつき

あり，プロテアーゼインヒビターを用いた症状のは非常に大きい．われわれは免疫組織学的手法で進行阻止が期待される所似である．本症におけるジストロフィー筋で増加したリソゾームカテプシ

筋変性・壊死の進行の過程においてプロテアーゼ

ソ群は主として浸潤してきたマクロファージに由は多段階で働いており，作用するプロテアーゼも来することを証明した1）．筋ジストロフィー症以異なった複数が関与していると思われる．そのプ

外でもPolymyositisなど炎症を伴う疾患でのカ

ロテアーゼの関与する機構を明らかにすることはテプシソ群の著明な活性上昇は浸潤マクロファー

プロテアーゼインヒビターの投与の適切な時期をジに由来する．浸潤細胞群は強力なカテプシソ活

決めるにもぜひ必要である．

性を有しており，壊死細胞に入り込み，これを清

ここでは主として Duchenne 型筋ジストロフ

浄除去して再生のための準備状態をつくると想定

ィー症（DMD）を含む消耗性筋疾患におけるリされている．従ってこのマクロファージのプロテ

ソゾームのシステイソプロテアーゼ群の役割に関アーゼ群を阻害することは必ずしも機能維持の点するわれわれのデータから低分子プロテアーゼイ

では良策とは言えないかもしれない．

ンヒビターの応用について若干考察して，今後の研究の指針としたい．

筋細胞内のプロテアーゼの作用を調べるためには不均一な細胞群からなる病的筋組織を用いると解析が難かしくなる．Rodemann

結果

と考察

らは2）DMD

患者の皮膚生検材料から分離した培養線維芽細胞

DMDあるいはその動物モデル（ジストロフイを用いて細胞内タンパク質の分解速度を調べた．

＊徳島大学酵素科学研究センター酵素化学部門

ジストロフィー細胞では正常細胞より全タンパクー53−

の分解速度は509も増加していること，二次元の電line（opaque）線経のあるものにカテプシソの染

気泳動を用いて細胞の全タンパク質を分離してそ色性が著しく増加していることがわかった5）．又の各スポットの分解速度を比較したところ，とくmdxマウスでもopaqueに限定された10種のタンパクの分解が克進してカテプシソが異常に増加していることが兄い出さいることが明らかになった．しかし彼らはジスト

れた5）．しかし同じ標本中に散在する正常と思わ

ロフィー細胞中のタンパク分解冗進に関与するプれる細胞にはカテプシソの増加はみられなかっロテアーゼを全く調べていない．勿論たとえ関与た．筋細胞内におけるカテプシソの増加は①リソするプロテアーゼを同定できたとしても 加が加

ゾームの数が増える ②1個のリソゾーム中のカでの病態に直ちに応用できるものではないが，細テプシソ含量が増える ③プロ酵素の活性化（成胞の変性のプロセスの一断面を知るには役立つよ

熟酵素の抗体がプロ酵素と交叉しない場合）など

うに思われる．今後培養細胞を用いてプロテアーの可能性がある．いずれにしてもカテプシソの増ゼと細胞の変性壊死の関係を詳細に調べる必要が加は生きた細胞の反応であり，マクロファージのあろう．

浸入による壊死細胞の除去より前段階の細胞の反線維および萎縮線経に一方，わ川加からのアプローチであるが，マ応であることは間違いがない．しかし遺伝子の異クロファージなどの細胞浸潤を伴わない筋細胞の常に基づく細胞の障害からリソゾームの活性化そ変性疾患であるRimmedvacuoleを伴うDistal

して細胞壊死に至るプロセスにおける生化学的及

Myopathy（DMRV）におけるリソゾームプロテ

び形態学的変化の機構は全く不明であり，このた

アーゼの動態を調べることからはじめた．その結めにはこのプロセスを遂時的に追究できる実験系

果カテプシソB，HおよびLいずれもRimmedの確立と免疫電顕的手法の導入が要求されよう．

vacuoleに一致して局在すること，又より前段階

筋細胞内のリソゾームの活性化という現象は勿論と思われる筋細胞内に散在する小胞が強く染色さ筋ジストロフィー症に特有なものではなく，れることがわかった8）．二次リソゾームあるいはDMRV

その融合したものが小胞であると思われるが，る細胞反応であり，本来は repair process であRimmed vacuoleはリソゾーム由来であること

ろう．しかしより強い障害因子が作用している病は誤りのないとしてもその成田はさらに研究が必的筋細胞では，これが細胞の変性・壊死へと導く要である．本症ではカテプシソ活性が上昇していのに大きな役割をしていると想像される．従っることが知られているので，リソゾームの活性化て，障害は受けてはいるが，壊死までには至ってによる自己消化が病態と考えられる．DMRVのいない筋細胞を多く有する時期にはシステイソプ

動物モデルとされている．Chloroquinemyopathy

ロテアーゼインヒビターは症状の進行阻止に有効では，その症状，筋病変がE−64の投与によってであると期待できる．システイソプロテアーゼイ

著しく改善されたとする杉田らのグループによる

ンヒビターのもう一つの標的であるCANPの作

報告はl）この考えを支持している．では，筋ジス用するプロセスはカテプシソ系より以前と推定さトロフィー症でも同じように筋細胞のリソゾーム

れており，そのためにもできるだけ早期からイン系が活性化される時期はないのであろうか．このヒビターを投与することが望ましいことは言えよ

時期にE−46などを投与すれば，症状の改善が期う．

待されるからである．ヒト

DMD

筋変性とプロテアーゼの研究でもう一つ見述がの標本を抗力

テプシソB，H，Lで染色し丹念にみると，hya−

でも観察されたように，細胞障害に対すせないのは内在性インヒビターの存在である6）．

−54−

Lysosomalcysteine proteinaseinhibitorと難病治療薬開発

プロテアーゼの存在するところには必ずインヒビ
文

ターが共存しており，リソゾームのシステイソプ

献ロテアーゼにも特異的なインヒビター（シスタチ1）Kominami，E．，Bando，Y．，Ki，K・，Hizawa，K．andKatunuma，N．：IncreasesinCathepsin

ソと総称）が存在する．これらとカテプシソ群のB and L and thiol proteinaseinhibitorin

細胞内における作用の仕方はまだ明らかではない

muscle of dystrophic hamsters，J．Biochem．
96，1841−1848（1984】．

が，プロテアーゼ活性の制御系として平行して調2）Rodemann，H．P．and Bayreuther，K・：I）iffer−ential degradation of（35S）−methionine poly−
peptidesin Duchenne muscular dystrophyskin 負broblastsin vitro，Hoc．mLE．Acad．

べていく必要はある．

お

わ

り

立J．〃5A，83，2086−却90（1986）．

に3）Ii，K．，Hizawa，K．，Nonaka，Ⅰ・，Sugita，H・，

低分子システイソプロテアーゼインヒビターであるロイべプチソおよびE一朗の各種誘導体のわ7
むめ′0および加目元州でのリソゾームシステイソ

プロテアーゼの活性阻害，各種薬効について報告
してきた7）．しかし，ジストロフィー筋でみられた筋細胞内カテプシソ群の上昇をこれらのインヒ
ビターが抑制するかどうか調べたことはない・な

Kominami，E．andKatunuma，N，：Abnormal
increases oflysosomalcysteineproteinasesin
rimmedvacuolesintheskeletalmuscle，Amer．
J．fbJ加J．122，193−198（1986）．
4）桶口逸醇，石油章一，杉田秀夫，伊井邦雄，勝沼
信彦：実験的クPPキソミオバチ一に対する，システイソプロテアーゼ阻害剤，ESTの治療効果，
臨床神経学，第26巻，928−936（1986）．
5）Kominami，E．，Ii，K・and Katunuma，N・：Activation of theintramyofibralautophagiC−
lysosomal systemin muscular dystrophyI

ぜなら浸潤細胞のプロテアーゼ活性を含まずにA桝er．′．劫J加7．，127，21−26（1987）．
6）Katunuma，N・andKominami，E：Molecular

測定せねばならないからである．Chloroquine

basis ofintracellular regulation by thiolpro−
teinaseinhibitors，Curr．7b♪．CelL．Regut．−
SpecialIssue of Modulation by Covalent
Modification（Shaltiel，S．and Chock，P．B．，
eds．）27，345−360（1985），AcademicPress・
7）Katunuma，N・andKominami，E・：Abnormal

myopathyではE−64の投与により上昇したカテ
プシソ活性は抑制されているので，投与量と投与方法を選べば有意義に阻害されると思われる・筋
ジストロフィー症以外の難病治療のためにシステ
イソプロテアーゼインヒビターを応用できる可能

expression oflysosomal cysteine proteinases
in muscle wasting diseases，Rez，．Physiot．
Biochem．PharmacoZ

Verlag．

性はあるが，筋ジストロフィー症における如く，基礎研究がまず先行されるべきだと感ずる・−55−

inpress（1987）Springer−

筋ジストロフィー症の発症とトロポニンTのアイソフォーム変化

丸 山 工 作＊研究協力者 大日方昂＊，大島寿美子＊，小官 透＊，戸塚 武＊＊

筋構造蛋白質は筋の主要蛋白質であり，筋を特ていたよりも複雑に変化することが考えられ，ま徴ずけるものである．筋構造蛋白質の発現様式にた，アイソフォームの解析により発現制御レベル

は可塑性があり，筋成長過程で蛋白質アイソフォでの異常を推定できると思われる．

ームの原著な変化が起こることが知られている．

われわれは，種々のTNTアイソフォームをい

鶏筋ジストロフィー症の場合，発症に伴って筋構ずれも検出できるモノクローン抗体（NT−302）を造蛋白質に変化が生ずることが，既にいくつかの作成した9）．本研究ではこの抗体を用い，二次元研究によって示されている．その変化の特徴とし電気泳動法により，まず，鶏の筋ジストロフィーて，発症に伴なって発現される蛋白質のタイプが発症に伴うTNTの発現変化について，1）発症筋

幼君筋型化することであるとされているト5）．蛋のTNTが幼君筋型と言えるのか，2）ジストロフ

白質の変化は，電気泳動や免疫学的手法で容易にィー筋に特散的なアイソフォームがあるのか，3）

とらえることができる．従って，筋構造蛋白質のどのくらい多くのTNT変異体が生ずるかに着日

変化を，筋ジストロフィー症の発症をみる一つのして検討し，次に，4）は乳類の筋ジストロフィー

指標に使える可能性がある．本研究では，トロポ症でもTNTの変化が起こるか香かについて，筋ニソT（以下TNT

ジストロフィーマウスを対象として予備的な検討と略す）に着日して検討し

た．

を加えた．

TNTについて，最近，遺伝子レベルの研究が進み，単一遺伝子由来のmRNAのスプライシン

実 験 方 法グにより多数のTNTアイソフォームが生じうる

電気泳動：種々の成長段階の筋ジストロフィー

ことが示され6・7），現実に多数のTNTアイソフ

鶏（NH413）と対照鶏（NH412）の胸筋，およォームが，発生途上の鶏骨格筋に出現することがび，筋ジストロフィーマウス（dy）と対照マウス

二次元電気泳動法により見出された8，9）．われわれの大腿直筋から，全蛋白質を熱SDS溶液，または，以前，鶏筋ジストロフィー症において，TNT

は8MグアニジンーHCl液9）で抽出した．前者はの発現変化が起こることを報告したl）が，最近のそのままSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動

新しい観察を考慮すると，TNTのアイソフォー（SDS−PAGE と略）の試料とし，後者の場合にムは，ジストロフィー筋において，従来考えられは，尿素溶液に透析し，8M二次元電気泳動用試＊千葉大学理学部生物学科＊＊愛知県心身障害者コロニー，発達障害研料とした．一次元電気泳動の場合には，13．59もゲルを用いたSDS−PAGE（Laemmliの緩衝液系），−57−

Ampholineをlpholineを1．6笹，PH7−9の暑い

一

二次元電気泳動の場合には，pH3．5〜10のAm−

■

−

■

l

0．4隼含むアクリルアミドゲル中で，非平衡pH
勾配電気泳動（NEPHGE）10）を行なった後，二次T

元目のSDS−PAGEに展開した．
抗体：ヒヨコ胸筋より抽出したTNTを免疫原として，モノクローン抗体，NT−302を作成した．

gh

LK

ef

図1抗体，NT−302の特性
鶏胸筋のTNT（a，b），または胸筋（C，d），
足筋（e．f），前広背筋（g，h），心筋（i，j，k）の全抽出蛋白質を SDS−PAGE により分離した後，ニトロセルロース膜に転写し，抗体
くNT−302）の反応するバンドを検定した．kでは心筋 TNT に特異的なポリクローン抗体，他はすべて，NT−302を作用させた．それぞれの場合，左側にCBB染色による蛋白質の電気泳動パターン，右側にイムノプロッ
トのパターソを示す．いずれの場合も TNT
のみが抗体を結合した．

イムノブロット：電気泳動ゲルから蛋白質をニ
トロセルロース膜に転写した後，まず抗TNTモ
ノクローン抗体（NT−302）を，次にベルオキシ
ダーゼ標識の抗マウスIgG抗体を反応させ，ニッケル，コバルトの存在下でDABを基質として反応させlU NT−302の結合したTNTのスポットを同定した．

結

cd

■■一■■

ab

法により確かめた．

ll抗体の特異性はイムノブロッティングと蛍光抗体をさけるため，まず最も単純な操作でジストロフ

果抗体，NT−302の特性

ィー筋のTNTアイソフォームを調べた．即ち，一次元SDS−PAGEと組合わせたイムノブロッ

新鮮な筋からの熟SDS溶液による全抽出蛋白質

ト法により調べた結果，この抗体はTNT以外のを一次元蛋白質とは反応しないことが確められた（Abe〆抗体を用い，イムノブロット法によりTNTを検α7．，1986）．更に，この抗体は速筋塾の種々のTNT出した．図2に示すように，ふ化直後のヒヨコ胸アイソフォーム，遅筋型，心筋型TNTなど種々筋では，正常（N），ジストロフィー（D）鶏いずの脊椎動物横紋筋のTNTアイソフォムを認識す

れでも，多数のTNTのバンドが検出された．こることが明らかになった（図1）．TNTは，キモ

れらは分子量の大きい胸型TNTと分子量の小さ

トリプシンの限定分解によりN一端側のTlフラい足型TNTに分けられる．これらのいずれもがグメソトとC一端のT2フラグメソトに切断され親骨格筋のTNTとは異なる．ふ化1カ月後にはることが知られているが，NT−302の抗原決定基

足型TNTはほとんど消失するが，胸型TNTにはTlにあることもわかっている．NT−302は電は，なお複数のバンドが認められた．この時点で

気泳動法によりTNTのアイソフォーム変化を探はN，D間でほとんど差は見られない．ふ化2カる場合の有力な免疫学的なプローブといえる．

月以後には，足型TNTの再出現がジストロフィ

鶏ジストロフィー筋におけるTNTの変化

ー鶏（N）胸筋にのみ認められた．これらの点は

1）一次元電気泳動による解析

われわれの以前の報告と一致している．

TNT

TNT

ジストロフィー鶏胸筋のTNTを二次元電気泳ィー筋ではプロテアーゼ活性が高まっていること−で分離した後，抗2）二次元電気泳動による解析

はプロテアーゼに弱いこと，ジストロフを考慮して，TNTの分解によるアーチファクト

SDS−PAGE

動により，ヒヨコ胸筋のTNTと比較しながら，
58−

筋ジストロフィー症の発症とトロポニソTのアイソフォーム変化

1由蝉
訊逮

l

ト

CBB NT−302
Neonatal
図2I）
1−mOnthN D N D N

2−mOnth3−mOnth

一次元電気泳動によるジストロフィー筋TNTの解析
SDS溶液による筋抽出全蛋白質を SDS−PAGEにより分離した後，ニトロセ
ルロース掟に転写し，抗体（NT−302）により TNTを次出した．ヒヨコ（Neo−natal）と，1，2，3 ケ月齢のジストロフィー（D），正常（N）胸筋の TNTを示す．ヒヨコの場合のみCBBにより染色した電気泳動パターンとイムノプ
ロットを対比させた．他はすべてイムノプロットの結果．

さらに詳しく解析した．NT−302の使用により，正常胸筋（いずれも速筋）のTNT相互の関連性

二次元ゲル上の多数の蛋白質スポットの中からを，より詳しく比較するために，各筋よりトロポ

TNTのスポットだけを選択的に検出できた．ヒ

ニソを部分精製し，TNTスポットを二次元電気

ヨコでは沢山のアイソフォームが検出さ泳動で調べた（図4）．基本的なTNTスポット

れるが，正常胸筋では，1カ月齢以降ほぼ単一のの／くターンは全抽出蛋白質の場合と同じであった

TNTスポットであった．ところが，ジストロフ

が分離能が改善され比較が容易となった．はば単ィー鶏では発症した2カ月齢以降拘型および足型

一スポットとなる親胸筋TNTを，他のものに加TNT領域に多数のスポットが見出された（図3）．

えて，等電点と大きさを比較する基準とした．ジ

特に，足型に相当するTNTには等電点と分子量

ストロフィー筋には，40ケ弱のTNTの異なる沢山のアイソフォームが存在した．ヒヨが認められた．そのうちのかなりのものは親の足

コのパターンとは異なるようである．この事実

筋のものに一致し，親の胸型TNTに一致するもは，筋ジストロフィー症発症に伴うTNTの発現のもあった．しかし，ヒヨコ胸筋のTNTはジス変化が従来考えられていた以上に複雑であること

トロフィー筋のTNTのものより等電点が酸性側を示唆した．また，微量の筋組織を出発材料としにずれており，両者のスポットのごく一部が二次て高感度で元ゲル上で重なったにすぎない．二次元ゲル上の

TNT

TNT

の変化をとらえることができ

た．

スポット

パターンだけから判断するとジストロフィー筋に3）分離したトロポニンの解析のみに特徴的に存在する数個のTNTスポットがジストロフィー胸筋，ヒヨコ胸筋，親足筋，親見出された．

一59−

一三ニ

●

ー

ィ一一

●

、■打

￣

∴ニ

＿

￣1i二．￣

1−
■■−

イ￣

N

■
■

B

叶

●・鸞・●■l＿

う艶 で

巴てこ
「転ぶ凛鶴

D
Neonatal

園33−Montb

2−Month1−Month

二次元電気泳動によるTNTの解析
筋抽出全蛋白質をNEpHGEとSDS−PAGE の組合わせにより，二次元展開した後，ニトロセルロース
膜に転写し，抗体（NTT302）によりTNTを検出した．左端にヒヨコ（Neonatal），右側に1，2，3ケ
月齢のジストロフィー（下段，D），正常胸筋（上段，N）の TNTを示す．ヒヨコの場合のみCBBにより染色した電気泳動パターン（A）とイムノブロット（B）を対比させた．他はすべてイムノプロットの結果のみを示す．電気泳動パターン中の矢じりはヒヨコ筋のTNTを示す．

NEpHGE→0ⅠⅠ￣

凹UqdlS口S

一隻主旨

■』「

単一蜃鰻蕎bi●一

−

1トー●●

▼

a

㌦竃と
i J尊号嘉一−

■一≒邑
1−＿

／dys＼

義士ここ

l

J −′●
neO イ

⊥▲
恨、

d
図4

部分精製したトロポニソを用いたTNTの解析
二次元電気泳動ゲル上の TNTスポットのみを示す．a：ジストPフィー胸筋（2ケ月齢），b：ヒココ胸筋，C：親足筋，d：a＋親胸筋，e：b＋親胸筋，f：ジストロフィー筋＋ヒヨコ胸筋．下向きの矢じり（dとe）は親胸筋のTNT，上向きの矢じり（f）はヒヨコ胸筋（neo）のTNT，下向きの矢印（f）はジスト
ロフィー胸筋（dys）のTNTスポットを示す．
−60−

筋ジストロフィー症の発症とトロポエソTのアイソフォーム変化
NormalDyOH

H◆b・．＿．．
随増『■一・1−鵬■ー
戒

増齢
示＋ ．ヒト＝F
l l

壇■

シ■■

▲

lも

▲▲
●

蠣齢

CBB

CBB

汽

㍗∵磯鯵嗅湖戦l▲l‥

NT−302NT−302図5■■筋ジストロフィー症マウスにみられるTNTの変化
3ケ月齢の正常（Normal）と筋ジストロフィー（Dy）マウスの大腿直筋からの抽出全蛋白質を NEpHGEとSDS−PAGE の組合わせ匿より，二次元展開した後，ニトロセルロース掛こ転写し，抗体（NT−302）によりTNTを検出した．CBBにより染色した電気泳動パターン（上段）とイム
ノプロット（下段）を対比させた． 矢じりはTNTのスポットを示す．

マウスジストロフィー筋におけるTNTの変化

染色でも検出され，正常筋のTNTスポットは相筋ジストロフィー症がかなりひどく発症してい対的に減少していることがわかる．筋ジストロフ

る3カ月齢のジストロフィーマウス（dyマウス），

ィー筋に現れた新しいスポッ．トは，遅筋型TNT

および，同齢の正常マウスの大腿直筋について調ではない．幼君筋型TNTであるかどうか目下検

べた．筋ジストロフィー症の発症に伴い，この筋討中である．

の萎縮が痍著にみられるからである．鶏の場合と考

全く同様に全抽出蛋白質を得，二次元電気泳動に

鶏では筋ジストロフィー症の発症に伴い，TNT

展開し，イムノプロット法でTNTのスポットを4ケのの発現が変化することを，われわれは以前に報告

スポットが検出された．これらは，かなりした1）．今回，二次元電気泳動とイムノブロット

解析した（図TNT察5）．正常マウスでは，3した．一方，筋ジス法を組みあわせて，より詳しく検討した結果，トロフィーマウスの場合には，正常マウスには見TNTの発現変化は以前考えた以上に複雑である

られない数ケのスポットが，より酸性側ことがわかった．即ち，1）発症した筋ジストロフ

pH領域に存在した．これらのスポットはクーマ

ィー鶏胸筋の場合，約40ケものTNTアイソフ

ジーブリリアントブルー（CBB）による蛋白質のォームのスポットが出現した．正常胸筋にはほと塩基性のPH領域に

focus

TNT

−

61−

んど1ケだけのTNTスポットのみが存在するこの変化は発症後の二次的，三次的現象かも知れなとと比べると，大変な差である．ジストロフィー

いが，TNTの変化を筋ジストロフィー症発症の筋のTNTスポットのすべてが一次構造を異にす

指標にできるのではないかと考えている．TNT

るのかどうか，蛋白質の二次的な修飾によるものなど構造蛋白質の変化が筋ジストロフィー症の指も含まれるか否かは，今後慎重に検討されねばな

標として定着すれば，それは筋ジストロフィー症

らない．2）ジストロフィー筋のTNTは，親の胸に対する薬剤投与の効果などの評価の目安として筋，ヒヨコの胸筋，親の足筋のいずれのTNTと役立つかもしれない．その場合，NT−302はモノも部分的に類似しており，かつジストロフィー筋

クローン抗体なので，その再生産は容易であり役に特徴的なスポットも見出された．従って，筋ジ立つであろう．

ストロフィー症における筋の幼君化だけで，TNTの変化を説明するわけにはいかない．

文

今まで，ほ乳煩のジストロフィー筋での構造蛋
白質の変化は，必ずしも明瞭ではなかった．今回，少なくとも筋ジストロフィーマウス（dyマウス）

献1）Obinata，T．，Takan0−Ohmuro，H．＆Matsuda，R．：ダ且85エg払120：195−198，（1980）．
2）Takeda，S．＆ Nonomura，Y．：Biomed．Res．
1，931−935（1980）．
3）Bandman，E．：Science，227，780−782（1985）．

ではTNTアイソフォームの変化が認められた．
mdxマウスその他，ほ乳煩のジストロフィー筋

4）Huszar，G．，Vigue，L．＆Haines，J．：J．Biol．
C加桝．260，9957−9960（1985）．

についてさらに注意深く検討されることが必要で

5）Obinata，T．＆Shinbo，K．：MuscLeandNerzJe．
10，351−358（1987）．

ある．
変化の内容的な複雑さはともかく，鶏とマウス
で筋ジストロフィーの発症した筋において，TNT
アイソフォームの厩著な変化が起こることは明瞭である．まっれiっれの作成したモノクローン抗体（NT−302）を用いて，二次元電気泳動と組合わせてイムノブロットを行うと，小量の筋組織を出発材料として，比較的簡単に，感度よくTNTこの発現異常をとらえることができる．収縮構造蛋白質−62−6）Breitbart，R．E．，Nuguen，H．T．，Medford，
R．M．，Destree，A．T．，Mahdavi，V．＆Nadal−
Ginard，B．：Cell，41，67−82（1985）．
7）Hastings，K．E．M．，Bucher，E．A．＆Emerson，
Jr C．P．：′．βわJ．C力g班．260，13699−13703（1985）．
8）Imai，H．，Hirai，S．，Hirono，H．＆Hirabayashi，T．：′．βわC九g桝．99，923−930（1986）．
9）Abe，H．，Komiya，T．＆Obinata，T．：Dez，．
βわ7．18，42−51（1986）．
10）0Farrell，P．Z・，Goodman，H・M・＆0

Farrell，P．H．：CdJ12，1133−1142（1977）．
11）De Blas，A．L．＆ Cherwinski，H．M．：AnaZ．
βわC加桝．133，214−219（1983）．

各極酵素阻害剤投与のmdxマウス病態に与える影響について

辻

繋 勝＊

計4回尾部より採血し血清PK活性を測定した・
研

究目

更に投与期間終了後，屠殺した各マウスに就いて，的われわれは当斑において従来より，種々の新し

血清中ならびに骨格筋中の疾病進行のマーカー酵い酵素阻害物質を筋ジストロフィー症モデル動物

素であるPKl），CPK2），LDH8），GOT ），GPT4）のに連続投与する事によって玩鉄血）に於ける疾患活性を測定した．対照として生理食塩水のみを授抑制効果を検討する研究を行っている．本年度は与したマウスを各実験区に1頭づっ作り，同様の8種類の酵素阻害物質に就いてmdxマウスなら測定を行った．dy2Jマウスに就いてはActinonin

びにdy2Jマウスを用いて筋ジストロフィー症におよびDiprotin−Aのみを投与し，同様の実験を対する改善効果の有無を検査する実験を行った・

行った．又各マウスから屠殺後直ちに誹脹筋を採使用された酵素阻害物質はaminopeptidase−M

出し，光顕用標本を作製し，組織学的検索を行っのインヒビターであるActinonin，pOly（ADP−

た．各酵素阻害物質は使用直前に1mg／1mgのribose）synthetaseのインヒビターであるBena−濃度で生理食塩水中に溶解し，0・2mgづっを1日

drostin，dipeptidyl aminopeptidaseIVのイン

2回背部皮下に注射した・

ヒビターであるDiprotin−A，f．Meトaminopepti−
結daseのインヒビターであるFormestin−A，pOSt−

果

図1は，各酵素阻害物質の投与期間中に見られproline clearing enzymeのイソヒビターである
Post−Pro−Inhibitor，kallikrein のインヒビター

たmdxマウス血清

PK活性の変動を示したもであるFUT−175，抗菌物質の一種であるBacto−のである．8種類のうちbolin，免疫抑制物質である15−Deoxyspergualin

Deoxyspergualinに就いては被検マウスが投与の8種類である．

期間中に死滅した為，結果が得られなかった・投Bactobolinと15−

与開始後10日日頃では，全ての阻害物質で，PK

材料 と 方法

活性が一旦低下傾向を示していたが，その後次第実験に使用された動物は約2カ月齢のC57BL／に活性が低下するグループ（Actinonin，Dipro−

10−mdx，およびC57BL／釘−dy2J系の疾病マウス

tin−A，Formestin−A）と活性が上昇するグルーである．mdx マウス3頭づっを一組として各酵

プ（Post−pr0−Inh，Benadrostin，FUT−175）に素阻害物質を6週間にわたり授与し，10日間隔で大別される変化が認められた．血清 PK活性は＊和歌山県立医科大学，第二生理学教室

mdx マウスで発病に伴って正常対照の約6倍にー63−

倉＞票岩⁚VE ∈コ﹂拐
10

20

30

40

Administration Period（day）
図l Changes of serum PK activitiesin mdxmice byinhibitor administration

表1Effects ofinhibitor administrations on serum PK and CPK activitiesin mdx mice
Inhibitor

Benadrostin

8．30±2．45

Diprotin−A

3．21±1．18

FormeStin−A

3．34±0．54

Post−Pr0−Inh8．73±0．47

FUT−1759．86±1．81

Bactobolin

8．52±1．68

15−Deoxy spergualin

6．12±0．64

2．70±1．90
3．38±0．53
5．29±2．70
4．67±1．16
2．57±0．38
2．72±1．37
2．60±1．04

一缶9673950196一3．82±0．13CPKll10107．74±0．41

Actinonin

I／S

4907
14
43132710乃
01001110

SalinePK

Unit：NADH FLmOle／min／mEserum

上昇し，症状進行を示す最も特散的なマーカー酵変化は見られない．表 2 は血清中の LDH と素である．従って投与によって，活性低下を示す

GOT 活性を示したものであるが，Benadrostin

グループでは疾病の進行が抑制されている事が推投与群では両酵素が共に活性上昇し，Formestin−

測される．表1は各阻害物質を6週間投与した後AとPost−ProlinInhibitorでは活性低下の傾向の血清PK活性とCPK活性を示したものである．

が認められる．又，FUT−175投与群では対照群との比較では，PK活性は図1の経日的変活性は対照群よりも低下していたが，GOT活性化とよく一致して，活性が著しく低下するグルーは測定出来なかった．次に，各マウスの後肢筋中プと，上昇ないし，無変化のグループにはっきりの疾病マーカー酵素の活性に就いて測定を行っ別れている．又，Bactobolinと15−Deoxysper−

た．表3はそのうちPK活性とgualinに就いての結果は 3週間投与後のものでしたものであるがPK活性はActinoninとある．一方，CPK活性はBenadrostinとDipro−

Benadrostin の投与群で上昇し，Post−PrOline−

tin−Aで活性増加が見られる他は，あまり大きな

inhibitor投与群で低下の偵向が認められる．こ

ー64−

LDH

CPK活性を示

各種酵素阻害剤投与のmdxマウス病態に与える影響について
表2

Effects ofinhibitor administrations on serum LDH and GOT activitiesin mdx mi〇eInhibitor

LDH

2．99±0．06

Benadrostin

3．59±1．59

Diprotin−A

3．24±0．96

FormeStin−A

1．67±0．41

PosトPro−Inh1．48±0．26

FUT−1752．26±0．59

一．
907．70．38
．08
．4
01100

2．94±0．34

Actinonin

GPT

一．
022
．21．05．750．．77
111000

SalineI／S

0．61±0．11
0．55±0．06
1．08±0．64
0．63±0．04
0．49±0．23
0．51±0．15

Unit：NADH FLmOle／min／mlserum
表3

Effects ofinhibitor administrations on muscle PK and CPK activitiesin mdx mice

Inhibitor

PK

Post−Pr0−Inh

0．43±0．13

FUT−1750．69±0．08

8．62±1．49
13．40±1．69
9．67±0．93

10，58±0．12

0Formestin−A

12．48±5．79

10．59±0．04

00．87±0．07

Diprotin−A

14．10±0．56

1

Benadrostin

9．70±0．84
10．79±0．07

12．60±1．12

一45甜89389930

0．58±0．16

Actinonin

CPK

一36500200円19111101

SalineI／S

Unit：NADH FLmOle／min／mg protein
表4

Effects ofinhibitor administrationsonmuscle LI）H，GOT and GPT activitiesinmdx
mice

Inhibitor

LDH

I／S

GOT

I／S

GPT

2．72±0．55

Actinonin

3．42±0．45

1．26

0．44±0．02

1．02

0．018±0．006

Benadrostin

3．11±1．25

1．14

0．42±0．05

0．98

0．017±0．007

DiprotinTA

2．04±0．02

0．75

0．45±0．02

1．05

0．060±0．012

Formestin−A

3．06±0．02

1．13

0．45±0．04

1．05

0．052±0．019

PosトPro−Inh2．62±0．04

0．96

0．54±0．06

1．26

0．106±0．008

FUT−1751．30±0．03

0．48

0．46±0．07

1．07

0．105±0．012

0．43±0．10

0．019±0．005

一958916m5835
003255

SalineUnit：NADH FLmOle／min／mg protein
れに対して CPK 活性は Diprotinin と Posト

上昇傾向が認められるのみで他の群では変化が見

proline−inhibitorの投与群でやや低下傾向を示しられず，GPT 活性は Actinonin，Benadrostin

た以外は，いずれの投与群でも上昇傾向が認めら投与群でわずかに低下傾向が見られた以外は大幅れる．又，LDH，GOT，およびGPT活性に就に活性上昇している事が認められる．

いても，表4の如く，LDHはDiprotin−A，FUT−

次にdy2Jマウスに対する投与実験では表5の175およびPost−prOline−inhibitor投与群で活性如く，ActinoninおよびDiprotin−Aの投与によ低下し，他の群は活性上昇する傾向を示している．

って血清中のPK活性とGOT活性はPost−prOline−inhibitorでわずかに低下傾向を示したが，CPK 活性はやや増加して

−65−

LDH

活性がいずれも表5

Effectsofinhibitoradministrationsonserumenzymeactivitiesindystrophicmice

Inhibit。rSalinePK

I／S

2．09±0．04

Actin。nin l．09±0．03

CPK

I／S

1．20±0．21
0．52

Diprotin−A l・67±0・12

1．35±0．23

0・80

1・40±0・18

LDH

I／S

1．97±0．18
1．13

1．77±0．14

0・90

1・17

1・86±0・26

0・94

Unit：NAI）H FLmOle／min／mt serum
表6
EnzymeEffectsofinhibitoradministrationsonmuscleenzymeaCtivitiesin dystrophicmiceNon−treated

Actinonin

7
2

2

1
8

1

7
7

1

9
3

0．030±0．002

1

00．090±0．009

48

0．41±0．08

0．81±0．06

10．03±0．02

12．78±0．46

18．68±0．98

1．40±0．68

17．95±0．39

10．68±0．04

Diprotin−A
55 脚 99 37 33

0．44±0．01

A／N

10．10±0．86
3．94±0．51
0．53±0．07
0．125±0．011

Unit：NADH FLmOle／min／mg protein

いる事が認められる．又，骨格筋中での酵素活性考

変化は，Actinonin投与群でGPTが著しく低下

察している以外は全て活性が増加し，Diprotin−A

8種杭の新らしい酵素阻害物質に就いて，筋ジでは測定された全てのマーカー酵素に就いて活性ストロフィー症に対する治療効果の有無を検討す

上昇傾向が認められる．

る為，疾患モデル動物であるmdxマウスとdy三J以上の疾病進行のマーカーと考えられている酵

マウスに6週間にわたる連続投与を行い ゐ川かO

素群の活性変動から，血清中の活性低下と骨格筋における影響をしらべる実験を行った．阻害物質

中の活性増加を疾病の改善傾向を示すものと考えのうちBactolobinおよび15−Deoxyspergualin

た場合，総合的に判断すると，Actinonin，Dipro−を授与したmdxマウスは，いずれも投与期間途

tin−AおよびFormestin−Aの投与群では改善効

中で死滅したので，その効果を知る為の結果は得果が有ったものと認められる．従って，この3種られなかった．この理由は恐らく投与量が過剰だの阻害物質を投与したmdxマウスの誹脹筋に就った事（約20mg／kg体重）に依るものと考えら

いてH・E染色標本による組織学的検索を行った・

れる．又，残りの6種類の阻害物質に就いては，

結果はいずれも生理食塩水投与mdxマウスとのmdxマウスで疾病の進行に伴って特徴的に活性問に判然たる差異は得られなかったが，例えは，上昇を示す事が知られている血清PK6）をマーカ

necrosis を示す部位の分布，ヒアリソ化細胞のーとして投与期間中の活性変動を見たところ，投数，中央咳を持ち，再生筋と思われる小型の筋細与開始後3週間頃から明らかに活性が低下を示す

胞の密集度などを指標として判断すると5），やは群として Actinonin，Diprotin−A およびFor−り，マーカー酵素の活性変動パターンと同様な傾

mestin−A投与群が認められたが，この傾向は6向が認められた．

週間の投与終了後に測定された幾つかの疾病進行のマーカー酵素の活性変化に就いてもはぼ同様の傾向が認められた．即ち上記3種の阻害物質投与−66−

各種酵素阻害剤投与のmdxマウス病掛こ与える影響について

群ではいずれの場合も全体として各マーカー酵素
で，血中に遊出される酵素活性が低下し，骨格筋中に存在する酵素活性が増加し，正常対照の活性値に近づくという傾向を示していた．更に，この傾向は組織学的検索による組織像の悪化の程度の軽減という結果によっても支持された・この3種類の物質がなぜ，改善傾向をもたらしたかに就いては，その理由は不明である・然し，これらがいずれもaminopeptidaseのinhibitorである事で，他の酵素阻害物質とその作用撥序がやや異る事に原因の一つが在る可能性が考えられる・いずれにしても今回の実験は，約2カ月齢で疾病が既にか

文献1）Tanaka，T．，Harano，Y・，Sue，F・andMori−mura，H．：Crystallization，Characterizationand metabolic regulation of two typeS Of
pyruvate kinasesisolatedfromrattissues・J・
βわC加桝．62，71−91（1967）．
2）Hess，J．W．，Murdock，K・J・andNatho，G・J・W・：
Creatinephosphokinase・Aspectrophotometricmethod withimproved sensitivity．Am．J．
C〃机劫f如J．50，89（1968）．
3）Wroblewski，F．andLaI）ue，J・S・：Lactic de−hydrogenaseactivityinblood．Lケoc．Soc．励タ・
βわJ．〟gd．90，210−213（1955）．
4）Karmen，A．，Wroblewski，F・andLaDue．J・S・：Transaminase activity in human blood．J．
CJi机∫即がf．34，126（1955）．

た．然しながら上記3種類の阻害物質に就いては

5）杉田秀夫，田辺雄三，埜中征哉，江崎孝三郎，野村達次：筋ジストロフィー症モデル動物の開発，
mdx マウス骨格筋の病理学的研究．厚生省神経疾患研究委託費「筋ジストロフィー症動物の開発供給に関する研究」昭和59年度研究報告書pp・

適正な投与量により，発症前或いは発症直後から

6）Bulfield，G．，Siller，W・G・，Wight，P・A・L・andなり進行した状態の動物を使用したためか，はっ
きりした疾病抑制効果を示す結果は得られなかっ連続投与を行なえば，より明白な改善効果を得る
可能性は充分考えられる・−67−

13−32（1985）．

Moore，K．J．：ⅩChromosome−linkedmuscular
dystrophy（mdx）in the mouse・fケoc・NaLt・
AcαJ．立f．USA，81，1189−1192（1984）．

実験的筋炎モデル動物の作成に関する研究

里

舌

栄二郎＊

多発性筋炎（polymyositis：PM），皮膚筋炎

古

川

昭

栄＊

コリソ受容体劣化促進作用があることを見出し，（dermatomyositis：DM）は筋肉に特異的に細胞PMと性免疫反応が認められ1，2），自己免疫疾患の角度かが存在すると報告している．著者らはこの抗体のら研究されているが，発症機構はいまだ不明であ出現が PM の病因と関連しているのではないか

る．本研究はPM，DMの実験モデル動物を作成と考え，アセチルコリソ受容体以外の筋肉成分にし，低分子酵素阻害物質による薬効を検討するの対して高抗体価を示すMG 患者血清を指標としが目的である．

て，筋肉成分に対するモノクローナル抗体を作成

PM，DMでは筋肉が特異的に免疫細胞の浸潤，MGには筋細胞膜成分障害性の類似抗体

し，抗原の同定を試みた．

攻撃を受けることから，筋肉にのみ存在する何等方かの構成成分が自己免疫反応の標的になっていると推定される．これまでに見出されている PM

法

筋肉抽出物の作成

やDM に特徴的な自己抗体としてほ抗ミオグロすでに報告した方法8）に従った．すなわち，ラピソ抗体8），抗ミオシン抗体4），抗核抗体5）がある

ットの腹部，下肢部の筋肉を10労（W／v）で冷が，前二者は疾患特異性が低いとされている・一

PBS にてホモジナイズし，100000×g で遠心し方，PMやDMと同じく，筋肉に特異的な自己た．沈殿物について同じ操作を2回繰り返し，そ免疫疾患である重症筋無力症（myastheniaの遠心上清を集め，筋肉抽出物（musCle ex−gravis：MG）は神経筋接合部のアセチルコリン

tracts：ME）とした・

受容体の障害によって引き起こされると考えられ

筋肉抽出物に対する血中抗体価の測定ており，実際，患者血中には，抗アセチルコリン

すでに報告したELISA法8）で行った・MEを

受容体抗体が高頻度に見出される・また，アセチ

抗原として96穴マルチウェルプレートに被覆し，ルコリソ受容体以外の筋肉成分に対する抗体も検順次，患者または正常人血清（1000×希釈），ビ

出され，これらの抗体にアセチルコリン受容体のオチソ化抗ヒトIgG抗体，アビジソービオチソパ

劣化を促進し，アセチルコリン受容体の数を減少

ーオキシダーゼ複合体を反応させ，マルチウェルさせる作用があることが報告されている6）・最近

プレートに結合したパーオキシダーゼ活性を測定

Drachman7）らは作用は弱いが，8例中7例の高した（ABC法）．

率で，PMの患者血中IgGにも同様のアセチル

筋肉抽出物に対するモノクローナル抗体の作成＊国立精神・神経センター

3週間間隔で4回，1mgタ∵／バク量のME液

神経研究所
−69−

を等容量のFreund‡

scompleteadjuvantで乳化

●
●●

●

●●

●

●

●

●

∈u00の︼和むUUぷLOSq＜

●

●

●

●
●
PM

MG

NC
M uscle extract（
P B S）

ポリアクリルアミドゲル電気泳動（polyacryl・

●

5
0
0

●

0

をもちいるABC法で検出した．

V

1
0

11

●●
●
●

ち

に，100JJJのハイブリドーマ培養液を加えて1時●●●NC
P M ；M G
M uscle extract（
0．
5 M N aC トP B S ）図1ラット骨格筋抽出物に対する重症筋無力症（MG），多発性筋炎（PM），正常人（NC）血清中抗体の測定

amidegelelectropllOreSis：PAGE）とウエスタ
ンプロット
ポリアクリルアミドゲ●●）

インキュべ−トした96穴マルチウェルプレート

したマウスIgGをビオチソ化抗マウスIgG抗体

0

●
1

●

間反応させた．96穴マルチウェルプレートに結合

5

かじめMEを被覆後，正常人またはMG血清で

●「
●￣￣
●
●

一書 −

0

HAT選択培養液で培養した．2週間後に，あらSDSを含まない59も

●

●

0

穴ずつまき，

1（P3Ul株）を細胞融合した．融合細胞を8枚の∈U00のJq OUu再qLOSq＜

3日後に脾臓を摘出し，脾臓細胞と ミェローマ

穴マルチウェルプレートに60

●
⊃

0

ヽ

疫から3週間後に，MEのみを腹隆内に投与し，

96

●
●●●

●

してBalb／Cマウスの背部に注射した．最後の免出された．また，PM患者血清でも，正常人よりPAGE L，PAGE

明らかに高い値を示すものがあった（図1）．し後，0．1MトリスーHCl緩衝液（pH7．6）に浸しかし，MEと同様の方法で調製した心筋抽出物をたニトロセルロース膜にゲルを一夜密着させて，抗原として測定すると，正常人，MG，PM問でゲル中のタンパクをニトロセルロースに転写し全く差を認めなかった．脳，肝臓抽出物でも陰性た．そのニトロセルロースは抗体と反応させたであった．MEをPAGE後転写したニトロセル

後，4−クPPナフトールを発色剤として，ABC

ロースに，高抗体価を示した法によって可視化した．

PM血清を反応させ，抗体の結合分布を調べたと

筋肉組織染色ころ，MGでは明確なバンドを含めタンパク泳動

ル，PH9．4の系でMEをMG血清または

凍結ラット下肢筋をクライオスタットで筋線経部の上の部分が染色され，PM血清では，特定のと平行方向に10／Jm厚で切り，切片を4労パラ

バンドの染色は見られなかったが，正常人血清にホルムアルデヒドで固定した．固定組織切片に，比べ，全体的に濃く発色した．これらの結果は，順次，19ら ウシ血清アルブミン，作成したモノク

MG患者血清はかりでなく，一部のPM患者血

ローナル抗体（腹水を100倍希釈して使用），109も清中にも抗ME抗体が存在すること，しかも筋ラット血清，ローダミソ標識抗マウスIgGウサ

肉抽出物に特異的な抗体が存在することを示してギ抗体を反応させ，蛍光顕微鏡下で蛍光分布を観いると考えられる．
ME中の抗原活性は，1）pH3以下，11以上察した．マウス血清IgGをモノクローナル抗体

で完全に失活，2）8M尿素存在下で完全に失活，と同じ濃度に調製し，コン1トロールとした．

3）プロナーゼ処理で50野矢活，4）SDS処理で

結果

と考察

完全に失活することなどから，抗原物質の実体はMG患者血清中には高頻度に抗ME抗体が検タンパク貿であると考えられる．

−70−

実験的筋炎モデル動物の作成に関する研究
rnultiwelI plates

coatedwithmuscTeextracts（㊥⊂］▲）COntaihingantigen（▲）
incubated withpatientornormat Sera

norma・se／ ＼tientsera
antibodiesin sera

（humanlgG）閃conditioned medium（CM）
Ofhybridoma cells

真実●諾 邑』
detection of mouse1gG boundtotheplatebyABCmethod

図2

筋肉抗原に対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング原理

MEを免疫したマウスの脾臓細胞とミェローマ

対する用量依存性の結合を示したのが図3であ細胞との融合によって，480個のウェルすべてにる．1E7，2B2，3D8の3種のモノクローナル抗ハイブリドーマコロニーの形成を認めた．図2に体は，それ以外のモノクローナ′レ抗体（4GlO，

示した原理に従い抗原特異性を持つハイブリドー

7D9）と異なり，MG血清でウニルをプレインキ

マを検索した．MEを固相化したウェルに，順ュべ−トすると，MEとの結合が阻害される．こ次，高抗ME抗体価MG患者血清または正常人の結果は，MG血清中のある抗体と，得られたモ

血清，ハイブリドーマの培養液を反応させ，正常

ノクローナル抗体の認識部位が構造的に一致，ま人血清で陽性となり，かつ，MG血清で陰性またたは，極めて近傍であることを示していると考えは，シグナルが減弱するハイブリドーマが抗原をられる．

認識するモノクローナル抗体を産生していると考MEをPAGE後転写したニトロセルロースでえられる．このようなハイブリドーマは480個中

認識抗原の分布を見たのが図4である．抗原認識

35個のウニルに見出された．差の顕著なウェル15

モノクローナル抗体は3種とも上端部を巾広く認個についてハイブリドーマをクローニングし，増識しており，4GlOや7D9と異なるパターンを示殖させてマウスの腹脛へ移入した・最終的に3種した．

のモノクローナル抗体を得た（抗体名1E7，2B2，

間接蛍光抗体法を用いて，2B2，3D8で筋肉組

3D8）．この3種のモノクP−ナル抗体のMEに織を染色した．図5に示すように，2B2，＿3D8は−71−

EU00の 忘∴岩UqqLOSq＜

0∈U00の一元 8umqJOSq＜

50035313：；3230353t33323

03534333230
Di山tion35313i3230

353133323

図3 筋肉抽出物へのモノクローナル抗体の結合の用量依存性
横軸はハイブリドーマ培養液の希釈培数を示す．●：MG患者血清存在下，○：正常人血清存在下，◆：○の値から●の値をひいたもの

ANALYSISOFMONOCLONALANTIBODJESAGAJNSTMUSCLEAN¶GENSBYlMMIJNOBLmNG
2B2

図4

3D84GlO

7D9

C prot●h●叫a muや十十を十一÷十一十一十十∴※十十︒

IE7

イムノブロッティングによるモノクローナル抗体の解析−72−

実験的筋炎モデル動物の作成に関する研究

図5 筋抗原認識モノクローナル抗体による筋組織蛍光染色

筋肉の横紋構造に特異的に結合しているように見える．組織の固定に用いた49もパラホルムアルデ

Referemces

ヒドはELISAで調べると，抗原活性を部分的にl）Goust，J．M．，Castaigne，A．and Moulias，R・：C伽．且坤．J∽肌〟乃OLl8，39（1974）．
2）Haas，D．C．and Arnason，G．B．W．：Archs．

障害することから，固定法を改善して再度調べる〃飽和Jリ31，192（1974）．

必要がある．

3）Nishikai，M．and Homma，M．：Lancet

今後，このモノクローナル抗体と，その認識抗2，1205（1972）．

原を詳細に調べ，筋膜成分の障害活性の有無，PM

4）Wada，Ⅹ．gf d∴CJ玩．且坤．力捌矧㈲拍れ52，との関連性，について検討する予定である．また，

5）Nishikai，M．and Reichlin，M．：Arihritis

本研究と同じ手法によって，PMにおける筋肉抗R毎朝桝．，23，881（1980）．
6）Mossman，S．，Vincent，A．andNewsom，Davis，

297（1983）．

原を認識するモノクローナル抗体の作成を試みるJ∴エα乃Cgfl，116（1986）．

7）Pestronk，A．and Drachman，D．B．：Muscle

予定である．

Ⅳgrがβ，8，233（1985）．
8）Akazawa，S．，Furukawa，S．，Kamo，Ⅰ．，Furu−

kawa，Y．，Satoyoshi，E．and Hayashi，K．：J．
J桝桝〟〃OJ．〟が如血94，16Ⅰ（1986）．

−73−

E−64誘導体のグルタチオンS−トランスフェラーゼ

活性に及ぼす影響北 川 晴 雄＊してE−64の誘導体であるE−64Cと E−64d を目

ラットに高用量連続投与した場合の血奨トランス

的

一般に，多くの薬物は主に肝臓の薬物代謝酵素

アミナーゼ（GOT，GPT）活性に対する影響と系により代謝された後，抱合を受け排泄されるが，血梁および肝サイトソールGST活性への影響を

近年，代謝されて活性中間体となり毒性を発現す比較検討した．

る例も多く報告されている．生体は活性代謝物の毒性に対する防御機構の一つとしてグルタチオン

実験材料および方法

抱合系を備えている．グルタチオン S−トランス

動物はWistar系雄性ラット（8週齢）を用い，フェラーゼ（GST）はこのグルタチオン抱合反応

約1週間予備飼育した後，実験に供した・E一朗Cを触媒する重要な酵素である．本酵素は肝臓に多およびE−64dは5界アラビアゴム溶液に用時懸く存在し，サイトソール総蛋白の約5−109もを占

濁し，400mg／kg を7日間連続経口投与した．

める．最近，GSTには複数のアイソザイムの存

なお，対照群には59もアラビアゴム溶液を5mg／

在が明らかとなって以来，次々と新しいアイソザ

kgの割合で経口投与した・最終投与24時間後イムが発見されている．正常時の血渠中におけるに動物は犠殺した．血液はェーテル麻酔下，開腹GST活性は極めて低いが，四塩化炭素などによし腹部大動脈より採血し，ヘパリン処理のチュー

る薬物誘発性肝障害時には血菜GST活性が著しブに移し，遠心して血菜を得た．肝臓は可及的速く上昇すると報告されている1）．このことから，

やかに取り出し，その湿重量を秤量した．秤量

血殊 GST 活性はトランスアミナーゼ（GOT，後，1．15珍KClにて港流し，肝重量の3倍容のGPT）活性と同様，肝障害の良い指標となること

冷1．159らKClを加えて259らホモジネートとしが示唆されている2）．

た．ホモジネ一日は105，000×g60分超遠心分

一方，カルシウム依存性プロテアーゼ（CANP）

離を行い，その上清をサイトソールとして用いた．

阻害剤の一つであるE一弘d はラットにおいて高GST活性の測定はHabig らの方法4）に従い，サ

用量の連続投与により血中トランスアミナーゼ活

イトソールの場合は基質として1−クロロー2，4−ジ性が上昇することが報告されている8）．このこと

ニトロベンゼン（CDNB），1，2−ジクロ∵ロー4−ニトからE一朗dによる肝への障害が示唆されている．

ロベンゼン（DCNB）およびトフェニルブチノン

そこで，低分子酵素阻害物質の代表的化合物と（t−PBO）を用い，血梁の場合は CDNB を用い＊千葉大学薬学部て行った．また，血梁トランスアミナーゼ（GOT，
−

75

−

Tablel Effect of treatmentwith E−64cand E−64d onthe activityofplasma transaminase
andglutathioneS−tranSferasein rats
GOT

GPT

Glutathione

STtranSferase

Treatment

KarmenUnit／mlmunit／ml

73．9±4．524．2±1．4

67．71±2．94

73．4±3．4

22．3± 0．8

66．67±2．16

60．4±11．8＊

79．69±8．48

175．2±24．8＊＊

Each value represents mean±S・E・Obtained from8rats・Rats were treated orallywith400mg／kg／day ofE−64c orE−64d for7days・＊p＜0．05，＊＊p＜0．01vs control．

Table2

Effect of treatment with E−64c and E−64d on the activity of hepatic cytosolic
glutathione S−tranSferasein rats
Glutathione S−tranSferase activity towards

CDNB

Treatment

DCNB

t−PBO

（mU／mgplot）（U／gliver）（mU／mgprot）（U／gliver）（mU／mgprot）（U／gliver）
1．19±0．05

109．39±4．93

1．12±0．02

90．75±2．3152．96±1．81

53．02±2．48

1．30±0．05

101．36±3．4156．15±2．72

4．81±0・21

13・24±1・37

1・21±0・13

4・29±0・15

12・03±1・38

0・98±0・11

8・49±0・31＊

0・66±0・02＊

4．36±0．15

Each value represents mean±S・E・Obtained from8rats・Rats were treated orallywith400mg／kg／day ofE−64c orE−64d for7days・＊♪＜0．05vs control．

GPT）活性はヤトロン社製のキットを用いて測定用いた場合には，いずれの投与群でもほとんど活した．Western blot法はTowbin らの方法5）に性の変動はみられなかった．しかし，t−PBOに準じPAP染色法6）により行った．なお，蛋白定

対する活性ではE−64d投与群においてmg蛋白

量はLowryらの方法7）により行った・あたりの活性でコントロールの約65野，g肝あたりの活性では約559乙 と蹟著に減少した．そこで

実 験 結 果TablelはE−64C

および

E−64d投与群にみられた血鷺 GST 活性の増加

E−64d連続投与には，肝サイトソールの酵素活性の減少を反映した

よる血菜トランスアミナーゼおよびGST活性にものか否か，更に検討した．コントロール，E−

対する影響を示している．トランスアミナーゼ活64C性に関しては，GOT，GPTいずれの活性におい

GSH−アフイニティーカラムによりてもE一朗d投与群で約2−3倍の有意な上昇が得た．これを各々同蛋白量だけ可溶化後，12．5降みられた．それに対し，E−64C投与群では何ら活のSDS−ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を性の変動は認められなかった．一方，この時の血行い，その後ニトロセルロース膜へ転写した．こ黛GST活性の変動ではE−64d群においてのみれにラット肝サイトソールから得られたGSTl

約20労の活性増加がみられた．次に肝サイトソ〜2およびGST3ールのGST活性に対するE−64CおよびE−64d

色を行った．その結果，E−64d群においてGST投与の影響を検討した．その結果は Table2 にl示す．GST活性の基質としてCDNB，DCNBをバンドが認められた．

−76−

およびE−64d投与群の3群における血梁をGST画分を4の抗血清を用いてPAP染2および3−4に相当する位置に明らかな染色E一朗誘導体のダルクチオソS−トランスフェラーゼ活性に及ぼす影響のことは E一朗d投与群において肝サイトソール
考のGSTが肝の障害により血梁中に漏出したこと

察

最近，高用量のE一朗d連続投与により血中トによると示唆される．これらの知見より薬物誘発

ランスアミナーゼ活性が増加することが報告され性の肝障害を判定する手段として血中トランスアている3）が，今回，E−64Cおよびそのエステル体

ミナーゼ活性の変動のみならず，血凍中のGSTであるE一朗d両化合物について，各々400mg／

活性の測定さらにはWesternblot法による解析

kg

は肝臓の障害の有無をより正確に判断する有力な

7日間連続投与により，E一朗d投与群においてのみ明らかな

GOT，GPT

活性の上昇が認め指標となる可能性が示唆される．

られた．これは肝の障害を反映したものと示唆さ文れる．この時，血菜中のGST活性の変動ではE一1）Aniya，Y．and Anders，H．W．：Biochem．

朗d投与群においてのみ活性の上昇がみられた．

f竹dr桝αCO7．，34，4239−4244（1985）．

一方，ラット肝サイトソールにおけるGSTには複数のアイソザイムが存在することが知られている．最近の酵素化学的，免疫化学的研究から主
要なアイソザイムとして免疫学的に交叉しない
GSTl〜2グループ（GSTl

1，1−2，2−2の3種）とGST3−4グループ（GST3−3，3−4，
4−4の3種）が存在することが明らかになった．

体を用いてWestern blot 法による解析の結果，投与群の血梁中には明らかに

2）Bass，N．M．，Kirsch，R．E．，Tuff，S．A．and
Saunders，S．J．：GasLrocnEerology，75，589−594（1978）．

3）大関正弘：厚生省新薬開発研究事菜「微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E一朗）の開発研究」昭和57年度研究報告喜pp．27−54（1983）．
4）Habig，W．H．，Pabst，M．J．andJakoby，W．B．：√βわJ．C如朋．，249，7130−7139（1974）．
5）Towbin，H．，Staehlin，T．and Gordon，J．：
fわC．肋払Acαd．ぶが．〝．ぶ．A．，76，435（ト4354（1979）．

そこで今回，GSTl〜2およびGST3−4の抗

E−64d

献

GSTl〜2および3′｝4が出現していることが判明した．こ−77−6）Guengerich，F．P．，Wang．P．and Davidson，N．K．：βわCカg別如け，21，1698−1706（1982）．

7）Lowry，0．H．，Rosebrough，N．J．，Farr，A．L．
and Randall，R．L．：J．BloZ．Chemリ193，265−㌘5（1951）．

CANP阻害剤の一般薬理学的研究−スぺクレレ解析法を用いた筋電図および神経活動の定量的評価法−

福 原 武 彦＊研究協力者 高野一夫＊，木村直史＊，加藤総夫＊

ることが示されており5），高頻度同期波は呼吸運
目動の中枢性調節において主要な役割を演じている

的

ヒト筋ジストロフィー症に対する治療薬の有効ものと考えられる．従って呼吸筋筋電図中の高頻性評価に関する研究推進の基礎として，疾患モデ度同期波の定量的解析は将来，筋ジストロフィー

ル動物においてヒトに応用可能な可及的に非侵裏のような骨格筋の変性をきたす疾患，重症筋無力的な薬効評価方法を確立することが必要である．

症など神経筋伝達の障害をきたす疾患，および筋

われわれは既に，心電図の定量的解析に基づいた

萎縮性側索硬化症（ALS）などの運動ニューロン

心筋変性の非侵襲的評価法を確立するための基礎の障害をきたす疾患の病態の進行の程度，さらに的知見を報告しているが4），今年度は，呼吸筋のはこれらの疾患の治療薬の薬効を，機能的かつ非筋電図ならびに呼吸筋を支配する遠心性神経の活

侵襲的に評価し得る方法として期待されるもので動電位の定量的な解析に基づいた，呼吸筋変性のある．

進行とCANP阻害剤の治療効果を評価する方法

今回われわれは麻酔下のウサギ横隔膜自発性筋を確立するための基礎的知見を動物実験によって

電図，ならびに横隔神経の自発性発射活動電位を得ることを目的とした．

導出し，その高頻度同期波成分について定量的解横隔神経活動電位中の遠心性吸息性発射が約60〜130Hzの高い周波数で同期している現象は析を行なって，ヒトへの応用可能性について検討した．

ウサギ，ネコおよびイヌにおいて確認されており，
これは高頻度同期波（high frequency oscilla−tions）と呼ばれている2，3）．高頻度同期波は神経

実

験

方

法

1．実験動物筋伝達を介して呼吸筋の筋電図中にも発現するこ体重2．0−3．4kgの成熟，両性のウサギを用いとが知られており3），随意呼吸中の健常人の肋間た．

筋電図から検出した報告もあるl）．この高頻度同2．実験条件

期波の生理的機能的意義については未だ十分に確i）非動化動物における横隔神経遠心性発射活

定されていないが，これまでのわれわれの研究か

動導出実験：Diethylether 麻酔下に gallamine

ら，これが呼吸運動に開通する骨格筋を支配する

triethiodide（5mg／kg，i．V．）により非動化後，遠心性神経の電気的活動に特徴的な活動成分であ

呼気ガス二酸化炭素および酸素濃度の連続監視下＊東京慈恵会医科大学第2薬理学教室に人工呼吸により換気条件を適正レベルに維持しー79−

た・途中，換気回数の変化によって過換気と換気除去した後に行った．浜算された自己パワースペ

低下状態を起こした．直腸温を37℃前後に維持

クトル上の高頻度同期波のピークを背景雑音性成した．両側の迷走，減圧および頸部交感神経を頸分より分離し，そのピーク周波数およびピーク面部で切断した後，頸部において坊隔神経の切断中積を，ピーク波形がコーシー分布に従うという仮枢端からその遠心性発射活動を双極電極を用いて定の下にガウスーニュートン法に基づく非線形最導出した．

小二乗法を用いて推定した．

ii）麻酔下自発呼吸下動物における横隔膜自発2）加算平均法：横隔神経活動および横隔膜筋性筋電図ならびに横隔神経発射活動同時導出実

電図の高頻度同期波の周波数帯域成分（60 140

験：Urethan（600mg／kg）と α−Chloralose（50Hz）をアナログ・フィルター（ェヌェフ回路設計

mg／kg）の腹腔内適用によって，もしくはdi−

ブロック，FV−604T）によって抽出したのち，横ethyletherによる導入麻酔後，thiamylal（4−8隔神経活動に現れる高頻度同期波のピークを数学

mg／kg）の静脈内適用によって，麻酔を維持し的に検出し，それを同期信号として同時に導出さた．気管挿管後，自発呼吸下に呼気ガス二酸化炭れた横隔神経活動および横隔膜筋電図を加算平均

素および酸素濃度を連続監祝した．93界02 とした（勤0回）．

7野C02の混合ガス吸入によってCO2負荷を行った．直腸温を37℃前後に維持した．小型留置

実

験

成

績

式双桓電極を右頸部にて横隔神経に装着し自発性i）非動化動物における横隔神経遠心性発射活動

発射活動電位を導出した．胸部第Ⅶ肋骨直下，剣導出実験状突起から約1〜2cm離れた両側に約1cmの間横隔神経活動の自己パワースペクトルには約隔で経皮的に左右各一対の針電極（長さ：15mm，80

直径：200′Jm）を刺入し双極性に横隔膜自発性筋

瞭などークが見出された．非線形最小二乗法によ電図を導出した．

って推定されたその平均ピーク周波数は 95．5±

3．信号解析

10．4Hz（n＝15，呼気炭酸ガス終末濃度：3．7±

130Hzの帯域に高頻度同期波に対応する明横隔神経自発性発射活動ならびに横隔膜筋電図

0．195，平均値±標準偏差）であった．ピーク面積を呼気ガス炭酸ガス濃度と共にデータレコーダー

は高炭酸状態（5．2±0．19も）で有意に増加し，低（TEAC，R−81）を用いて磁気テープに収録した．

炭酸（2．4±0．19も）により有意に減少した．また

実験終了後，医用電算横（日本電気三栄，7T17）

ピーク周波数は高炭酸で98．7±10．5Hz まで有を用いて，以下の解析を行った．解析には本教室

意に上昇し，低炭酸により 91．59±8．0Hz まで

において本研究のために作成されたプログラムを有意に下降した．

用いた．

ii）麻酔下自発呼吸下動物における横隔膜筋電図1）パワースペクトル法：0200Hzの周波数

ならびに横隔神経発射活動同時導出実験

帯域における神経活動もしくは横隔膜筋電図の自横隔神経活動および横隔膜筋電図には，互いに己パワースペクトル密度関数，ならびに神経活動同期した明瞭な呼吸リズム性の放電群を観察すると筋電図間の相互パワースペクトル，コヒーレン

ことができた．この呼吸性放電群はCO2負荷にス，およびに位相角を FFT 法により浜算した

よってその振幅を増し，著明になった．

（0．25Hz／bin，20 30回加算）．演算は筋電図原

同時導出された横隔神経活動および横隔膜筋電信号中に混入する心電図QRS波成分を数学的に図の高頻度同期波の周波数帯域成分（60−140−80−

CANP阻害剤の一般薬理学的研究

Hz）を時間軸を延長して措記したところ横隔神考経活動の周期性振動に一対一に対応した明瞭な周察

非線形最小二乗法によって推定された高頻度同期約10ms の波を横隔膜筋電図中に見出すこと

期波の2つのパラメーター，すなわちピーク面積ができた．
1）パワースペクトル法による解析結果

およびピーク周波数は各々，高頻度同期波の総エ

横隔膜筋電図から心電図QRS波成分を除去しネルギー値ならびに中心周波数を反映するものとたのちに高速フーリエ変換を行ったところ，心拍考えられる．これらのパラメーターが，CO2レベ

リズム性成分の混入が極めて少ないパワースペク

ルの変化によって極めて鋭敏に変化した事実は，トルを得ることができた．横隔神経活動ならびにわれわれのこれまでの研究成果5）と考え併せると，

横隔膜筋電図のパワースペクトルには，上述の，

この高頻度同期波が呼吸中枢からの出力のなかで非動化された迷走神経切断動物から導出された横も，とくに呼吸運動の調節における最も主要な成隔神経活動のパワースペクトルにおいて観察され分として，呼吸筋を支配する神経の遠心性活動にたような明瞭な高頻度周期波のピークは認められ含まれている成分であることを示唆するものであなかった．しかしながら約50−170Hzの帯域にる．

おいて，著明な単峰性のピークは形成しないもの

自発性筋電図は，非侵襲的に導出されうる電気の，一側の横隔神経活動と両側の筋電図各々の間

生理学的指標の中でも，最もその定量化が難しいに，共通の同期した成分が非定常的に存在する可ものの一つである．その原因の一つとして信号中能性を示唆する所見が相互パワースペクトル，コに様々な発生源を持つ活動電位が非定常的に混入

ヒーレソス，ならびに位相角のスペクトルから得し，従来の積分法などの解析法によってはそれらられた．またCO2 負荷によって横隔膜筋電図のを弁別して定量化することが困難であったことをパワースペクトルの，高頻度同期波の帯域におけ挙げることができる．特に呼吸筋の筋電図を解析

る総パワー値（自己パワースペクトル密度関数のする場合，大きな影響を及ぼすのは心電図である．

周波数積分値）が増加する例が認められた．

本研究においては生体信号をディジタル信号化し2）加算平均法による解析結果て記憶素子に蓄えたのちに，数学的処理によって，横隔神経活動中の高頻度同期波を同期信号とし混在する心電図QRS波成分を除去することに成て，一側の横隔神経活動および両側横隔膜筋電図

功した．これはヒトの呼吸筋筋電図の定量的解析の高頻度同期波の周波数帯域成分（60 140Hz）を試みる上で重要な基礎技術となり得よう．まを500回加算平均したところ，いずれの活動にも，た，本研究において加算平均法によって確認され互いに同期した周期約10msの波が見出された．

た横隔膜筋電図中の高頻度同期波の存在は，それ加算平均された横隔神経活動の高頻度同期波は横が第一に，呼吸運動に関連した骨格筋を支配する

隔膜筋電図のそれに対し，約1

先行して神経活動に特異的に同期して含まれる成分である

いた．この加算平均結果に見出された高頻度同期こと5），第二に，常に一定の周波数領域に発現す波成分は，CO2負荷によって，横隔神経活動およる成分であることを利用すれば，スペクトル解析

び横隔膜筋電図ともにその振幅が増大し，明瞭に法を用いることによって，呼吸以外の運動や姿勢なった．また横隔膜筋電図中のこの成分は，筋弛保持などに由来する筋電図成分との弁別が可能と緩薬（gallamine triethiodide，5mg／kg，i．V．）

なり，従来よりも精度と信頼性のはるかに高い自適用後，検出されなくなった．

発性筋電図の定量的解析の可能性を示すものであ

4ms

−81−

る．
このような高頻度同期波のスペクトル解析法の応用によって，運動ニューロン以下，神経筋伝達，筋収縮に至るまでの過程における病態生理学的変化を定量的にかつ非佼襲的に評価し得る可能性があるものと考えられる．既に，随意呼吸下のヒト
呼吸筋筋電図に発現する高頻度同期波をコヒーレ
ンス・スペクトル解析によって定量的に検出した
報告1）や，健常人の横隔膜筋電図のパワースペク
トルの中心周波数が，動物の高頻度同期波に近い
88−97Hzの帯域に発現することを見出した報告があり6），本研究の動物実験で得られた成果をふまえてヒトにおける知見を積み重ねることが次の課題である・この解析法が確立されれば，筋ジス
トロフィー症における呼吸筋変性の進行の程度およびCANP阻害剤の治療効果の非侵襲的な定量的評価方法として臨床的に応用され得るものと期
待される．

文

1）Bruce，E・N・and Goldman，M．D．：High−frequency oscillationsin human respiratory
electromyograms duringvoluntary breathing，
8mα〝丘gggαrCカ，269，お9−265（1983）．

2）Cohen，M．I．：Synchronization ofdischarges，
SpOntaneOuS and evoked，betweeninspiratoryneurons，Acta NeurobLol．軸．，33，189−218（1973）．

3）Dittler，R．and Garten，S．：Die zeitliche
Folge der Aktionsstr6mein Phrenicus undZwerchfell bei der nattirlichenInnervation，
Z．βわ7．133，420−450（1912）．

4）福原武彦，木村直史，高野一夫，加藤総夫，中川辰郎，山田順子：EST（E−64−d）の筋ジストロフィーハムスター（UM−Ⅹ7．1系）の心電図に及ぼす影響，慈恵医大誌，100，1233−1240（1985）．
5）加藤総夫，木村直史，高野一夫，福原武彦：呼吸リズムを持つ神経活動に見出される高頻度同期波の機能的役割−その定量的スペクトル解析−，′・f鳩プ∫わJ・goc．♪ゆα〝，47，688−槌9（1985）．
6）Schweitzer，T・W・，Fitzgerald，J．W．，Bowden，
J．A．and Lynne−I）avies，P．：Spectralanalysis
Of humaninspiratory diaphragmatic electr0−
myograms，J．AppL．Physiol．，46，152−165（1979）．

−82−献Duchenne型筋ジストロフィー患者血清中
α−アクチニン測定の試み

杉 田 秀 夫＊
研究協力者 山本剛司＊①

抗α−アクチニソIgGの作成

α−アクチニソはヒト骨格筋から抽出，精製し2），は じ め に型筋ジストロフィー症（DMD）で

SDS電気泳動にて分子量約95，000付近にバンド

は，血清中にミオグロピソや筋渠内酵素であるを認めた．精製されたα−アクチニソをFreundcreatine kinase（CK）が増加することが知られcompleteadjuvantと共に家兎にくり返し免疫しているが，この流出の機序は明らかでなく，筋崩て抗血清を得た．抗体の確認は，immunodiffusion

壊以外の要因も関与するものと考えられている・

およびimmunoblotting

われわれは，本症の病態および病像の把握には筋

清は次にproteinAsepharose4BによりIgG

崩壊現象を直接反映する指標が必要であるとの観溶液とし，リガソドとしてα−アクチニソを結合点から，筋蛋白そのものを血清中で測定することさせたa氏nity columnを用いて抗α−アクチニを検討した．

ソIgG とした．

Duchenneα−アクチニソは分子量95，000の調節蛋白であ②により行なった．抗血Enzyme−antibodyconjugateの作成

り，骨格筋ではZ帯に存在してアクチンに結合し抗α−アクチニソTgGl．Omg／PBSに対してている．最近，われわれは，このα−アクチニソ

0．32mgのmeta−maleimidobenzoyl−N−hydro・

を健常人およびDMD患者血清中で定量，比較

succinimide（MBS）／15FL11−4dioxanを加え，することを試みたので報告する．

30℃，lh反応させた後SephadexG25column
にかけて未反応のMBSを除去する．架橋試薬で対象と方法あるMBSの結合したIgGを0．1Mphosphate

1．対象

buffer（pH6．2）に置換し，1．5mgのβ一galac−

健常人男性（18 25歳）10名を正常対照群とtosidase

を加え，再び30℃，lh反応させた後した．DMD患者は，今回予報として10名を検10mM mercaptoethan010．8FLl／mlで反応を停索した．その内訳はSwinyardの分煩1）でStage

止させ，Sepharose CL−6B column

IからⅤまで各2名であった．

conjugate fractionを得た．本法は，0 sullivan

2．方法（酵素抗体法）

ら8）によるものであるが，この他に架橋試薬をにかけて

N，N，−0−phenylenedimaleimide に代えて COn−
＊国立精神・神経セソクー神経研究所疾病研究第1部

jugateを作成する方法もある・−83−

a−aCtjnin（humanskeTetar muscre）

l
irnmunizationl
SPeCjfic antibody toα−aCtinin

N

N−0−Phenylene−dimaTeimidemeta−maleimidobenzoyl−N−hydrosuccinimideester（MBS）

β一galactosidase、、「
Enzym−antibody conJugate

Antibody toLr−aCtini＞ヲ7−

fluorometry

SamPle serum substrate

図1α−アクチニソの郵定法
α−アクチニソの定量

0
0
8

③

（栄研2号）に200jLl入れ30分かけてCOating
する．BSAにてblockingした後，SamPle血清
をtubeに入れて4℃overnightで反応させる．
buLferでWaShした後，Enzyme−antibodycon−

006

Uでコ0円と IO．OUOU

抗α一アクチニンIgG（50FLg／ml）をEIAtube

jugateを200〜20，000倍希釈で3h反応させ再びWaShする．この後β−galactosidaseの基質である4−methylumbelliferyl−β−D−galactosideを加え，1h後に蛍光を測定した（図1）．

COntrOl l ll

‖

lV V

Stage

結

図3 DM患者血清中のα−アクチニンレベル

果

α−アクチニソの検量線を図2に示す．精製した±27．2ng／ml（n＝10）であった．DMD群ではα−アクチニソを 2，20，200，2，000ng／mJ の濃StageI，Ⅱ，Ⅳ，Vの8症例については正常対度に希釈し，蛍光光度計の示値を得た．横軸を対照群と比較して有意な上昇は認められなかった

数表示としたが，2ng／mJではα−アクチニソをが，StageⅢについては600ng／ml以上の有意含まないコントロールとの差がほとんどなく，本な増加を認めた．なお，今回測定したDMDlO

法による測定限界は 20ng／mJ 以上と考えられ例については，そのα−アクチニン量とCK値とた・また，検量線はα−アクチニソ濃度の増加にに相関はなかった．

伴って上昇したが，200から2，000ng／mJの餌域では上昇幅が小さくなった．

考

この検量線を用いて正常対照群およびDMD患

α−アクチニソほ察
DMD骨格筋中で減少するこ者血清中の α−アクチニソの定量を実施した（図とが知られておりl），またELISA法を用いて測3）．正常対照群の血清中α一アクチニンは，26．0

定した抗骨格筋α−アクチニソ抗体価もDMD血−糾−

Duchenne型筋ジストロフィー患者血清中α−アクチニソ測定の試み
表l Content of structuralproteinsin skeletalmuscle
Prote王ns

MW

Content（％）

Localization

Myosinheavy−Chain

200，000

light−Chain LI

25，000L2

20，000L3

16，000Actin

42．000Tropomyosin

65，000Troponin

70，000α−aCtinin

95，000A−band

清中で高値を示した点5）からみて，筋崩壊に伴っわれるが，その程度については実際にはもっと低て α−アクチニソが血清中に流出している可能性

いのではないかと考えている．予備実験から抗血が大きい．stageI，Ⅱ，Ⅳ，Vで正常値をとり，清の抗体価は十分と考えられるが抗体の a魚nity

stageⅢで高値を示した点も筋崩壊の程度と関連に原因があるのかも知れない．

して興味深い．

上記の点を改良した上で症例数を追加し，Stage

DMD患者血清中の筋蛋白の定量は，これまで
心筋ミオシン6）や骨格筋ミオシン軽鎖Ⅲ7）についとの関連，CK値との相関等を検討してゆく予定である．

て行なわれており，いずれもDMD患者血清中で高値を示すことが報告されている．このうち後者

文についてはStageⅡ とⅢで特に高値を示す症例

献1）Swinyard，C．A．，Deaven，G．G．etat．：GradientOf functional ability ofimportancein reha−bilitation of patients with progressive mus−cular and nellrOmuSCular diseases． Arch．

が多く，今回のα−アクチニソの結果と類似している．ミオシン軽鎖Ⅲの検出量は1，000 3，500

翔プ血．〟ed．38，574（1957）．

ng／mJで，α−アクチニソの3−5倍であるが，骨2）Ebashi，S．，Ebashi，F．：α−Actinin，a neW

格筋中の各々の含量（表1）を考慮すると，およStruCturalprotein from skeletal

そ合理的な結果と考えられる．

interaction．J．Btochem．58，7712（1965）．

酵素抗体法による血清中 α−アクチニソの測定

3）0

at．：Comparison

oftwo

jugates：Application of these conjugates for
enzymeimmunoassay．Anal．Biochem．100，

第1に，測定し得る最少量が20ng／mJである点

100−108（1979）．

である．stageI，II，Ⅳ，Vで正確な定量を行4）杉田秀夫：疾患筋（筋ジストロフィー筋）．日本
生化学会編，生化学実験講座筋肉，東京化学同人
東京p．133（1975）．
5）山本剛司，杉田秀夫：私信による．
6）矢崎義雄，永井良三：ミオシン軽鎖．日本臨床40（秋季増刊），107（1982）．
7）小長谷正明：他血清ミオシン軽鎖値の測定法開発と Duchenne塑筋ジストロフィー症での検討．
臨床神経26，783−791（1986）．

なうには，さらに検出感度を鋭敏にする必要があ
2，000ng／mJでの検量線の上昇が鈍く，この領域での定量がroughになる点が挙げられる．今回検索したStageⅢの2症例は，正常対照群および他の Stage の8症例と比較して α−アクチニソが高値を示す点は問題ないと思−85

Sullivan，M．J．et

methods of preparlng enZyme−antibody con−法については，今後いくつかの問題点を残した．

る．第2に200

muscle．Ⅰ．

Preparation and action on actomyosin−ATP−

血中骨格筋ミオシン軽鎖測定法の開発とその臨床的意義

矢 崎 義 雄＊筋肉疾患において，変性ないし障害された筋肉

境と治癒過程を直接反映するために，筋肉障害の細胞より血中に逸脱した蛋白を測定して生化学的病態把握に臨床的にきわめて有用な方法となり，に診断する方法が，感度と特異性にすぐれている

また新しく開発された治療法の定量的な効果判定

ことから臨床に広く用いられている．とくに筋肉に役立つことが期待される．このような観点から組織の障害されている程度を，その蛋白の血中流

われわれが開発したのがミオシン軽鎖測定法であ出量から定量的に推定されるとして注目されている．そこで骨格筋疾患における血中ミオシン軽鎖る．このような生化学的診断法の指標となる蛋白測定の臨床的意義を，心筋梗塞症における検討をとして，従来から筋肉細胞に存在する CPK やもあわせて述べる．

GOT などの酵素やミオグロビンなどが検討され
Ⅰ ミオシンおよび軽鎖の生化学的特性

た．
しかし，これらの指標物質は細胞質中に可溶性

そもそもミオシンは，筋原線経の太いフィラメ蛋白として存在しているために，筋組織の障害にントを構成し，収縮機序の中心的な役割を担ってよる細胞膜の透過性克進によって細胞外に逸脱しいる蛋白である．ミオシン分子は分子量の大きなて血中に流出するものであり，筋肉組織の障害を重鎖と小さな軽鎖のサブユニットからなってい検出する感度は高いが，筋肉細胞の構造崩壊過程

る．その中で，軽鎖はフィラメントを構成していを直接反映する指標とはならない．さらに骨格筋る重鎖の頭部に，非共有結合により緩く結合して組織の場合には，生理的ではあるが，過度の運動いる．このようなミオシンのサブユニットであるによってもこれら蛋白が血中に逸脱してくること

軽鎖は，筋肉の細胞障害を反映する生化学的指標も知られている．

として以下のような適した特性を有している．

一方，筋肉細胞における主たる細胞構築は，収

1）ミオシンは筋細胞における構造蛋白の約609も縮の最小単位である筋原線経であり，特異的な構を占め，最も含有量の多い蛋白である．2）心筋と造蛋白によって構成されている．もし，筋肉疾患

骨格筋では，ミオシンのサブユニット構成が異なにおいて障害された筋組織からこのような構造蛋

り，とくにその中で，軽鎖は分子量ばかりでなく，白が血中に流出し，しかもこれを測定できれば，アミノ酸組成を中心とした一次分子構造が異なっ特異性にすぐれた診断法になるばかりでなく，そている．3）そして軽鎖はpHなどの変化によりの血中濃度の経時的な変動が，障害部筋組織の崩容易にミオシン分子より解放する．したがって，＊東京大学医学部第三内科

障害時により筋原線経より直接ミオシン軽鎖が遊ー87−

B／Bo（％）
100

■●

、

＼

●骨格筋軽鎖
○試料血清

0

＼

●

＼

0

＼

＼
0．1

1．0

10，0

100．0

1000．0ng／tube

試料血清の希釈け501／20 り101／5 り2 1

図1骨格筋ミオシン軽鎖（アルカリ軽鎖Ⅰ）のラジオイムノアッセイによる標温曲線

離してくる可能性がある．4）さらにミオシン軽鎖

ソによりミオシン分子から分離し，分画電気泳動

は分子量が小さく，障害時に細胞外に逸脱しやす法にて軽鎖ⅠとⅡに分画した．モルモットを精製い．5）しかもSH基などの含有量が少なく生化した軽鎖Ⅰにて免疫することにより抗軽鎖Ⅰ抗体

学的にみて安定した蛋白であり，血中において分を作製した．そのRIAの方法は，軽鎖Ⅰをクロ解され難いために，試料血液の処理と保存が簡便

ラミソT法により125Ⅰで標識し，B／F分離は二にできる．

抗体法を用いて行った・その測定感度は，心筋おこのようなミオシン軽鎖の生化学的な特性に注よび骨格筋ミオシン軽鎖ともに1ng／mJと十分目し，筋組織障害の診断とその拡がりの判定，さに臨床応用できるものであった（図1）．成人健らには筋細胞構築崩壊に関する情報をうる目的

常者20名の血中軽鎖Ⅰ値は3．1±0．6ng／mJ（骨で，ミオシン軽鎖のラジオイムノアッセイ（RIA）

格筋ミオシン軽鎖としては2．4±0．6ng／mりでによる測定法を確立し，その測定の臨床的意義を，あった．

骨格筋疾患において検討した．

Ⅲ 急性心筋梗塞における血中軽鎖の変動
Ⅱ ミオシン軽鎖のラジオイムノ7ッセイ法

図2は急性心筋梗塞患者におけるCPK，およ

われわれは軽鎖のRIA法を確立するにあたり，

び軽鎖値の典型例を示す・軽鎖値は構造蛋白であ

まず急性心筋梗塞症での検討を考えて，ヒトむ筋

るにもかかわらず，発作6時間後の比較的早期にミオシン軽鎖に対する抗体を作成してその測定法

出現し，その値は徐々に上昇して2日ないし5日を開発し，次いで骨格筋ミオシン軽鎖と1009も交後に最高値に達し，再び徐々に低下するが，1週叉する抗体を選択して，骨格筋ミオシン軽鎖の測間以上の長期間にわたって高値を保つ特数ある変定法を確立した．

動パターンを呈した．血中から軽鎖は迅速に消失

ミオシンは死後4時間以内に剖検された正常心することから，梗塵部心筋からその間軽鎖が流出筋より改良せる希釈法により抽出し，DEAEA25

しつづけていることが示された．したがって，血のカラムで精製した．軽鎖は 5M 塩酸グアニジ

中軽鎖値を経時的に測定することにより，梗塞部−88−血中骨格筋ミオシン軽鎖測定法の開発とその臨床的意義

CPK呵htchainI（lU／l）（ng／ml）

2

4

6

8

10

12

14

Daysatterattack

図2 心筋梗塞発症後の血中ミオシン軽鎖 （lightchainI）とCPK値の変動パターソ（●軽鎖値，O CPK倍）
心筋の崩壊と治癒過程を知ることが可能となっシソ亜鎖を測定し，その臨床的意義を検討した．

た．その他に，1）血中軽鎖値が梗塞心筋量とよ1）運動負荷が骨格筋に及ぼす影響

い相関を示す．2）血中濃度の変動パターンが緩

過激な筋肉運動，例えばマラソンなどにより，やかなために，1日1回の採血で最高値を正確に血中のCPK値が有意に上昇することが報告され捉えることが可能である．3）発作後経過してている．しかし，先に述べたようにCPKは細胞CPKなどの指標が正常化してしまった症例でも，質中に存在する蛋白で，軽度な細胞障害による細軽鎖値は高値を持続するために，retrOSpeCtive

胞膜の透過性冗進により逸脱して血中に出現してに診断が可能である．4）心室瘡形成など，心筋組くる可能性があり，必ずしも壊死に至る細胞障害

織の崩壊が高度であった症例では，血中軽鎖値のの存在を示さない．そこで，過度の運動が骨格筋著しい高値を認めた．

をはたして損傷しうるものであるか，臨床的にもこのように従来の指標であるCPKなどでは得解明すべき重要な課題である．われわれは防衛医

られなかった，梗塞部心筋の病態に直接関連した

大第三内科との協同研究により，93 時間の連続

多くの情報を，血中軽鎖の測定により知ることがした激しい行軍訓練の前後で，CPK，CPK・MB，できるようになった．そして，現在急性心筋梗塞

LDH そしてミオシン軽鎖を測定して比較した．

の積極的な治療法として注目されている，冠動脈

CPK値は行軍訓練開始後徐々に上昇をはじめ，

内血栓溶解療法の治療効果を非夜襲的に，しかも93時間後訓練終了時に最高値に達し，3日後には定量的に評価できる唯一の指標として期待されて訓練前の値に戻った（表1）．CPK・MBの占めるいる．

割合は5界前後で，訓練により影響を受けることはなかった．LDH も同様の変化を示し，訓練終Ⅳ 骨格筋疾患における血中軽銭値

了時に最高値に達し，3日後には前値に戻った．

同様の方法で，骨格筋疾患において骨格筋ミオ

しかし，最高値の上昇程度はCPKと比べて低か−89−

A・Before trainJng

C．3days after
5

500

5

1000

0

5

5

0∈＼ぎ︶u罵エUござり芯○ゝ≡10ぐ∈＼ぎ︶∪馬上U lもヒu芯0ゝ三0ご∈＼ぎ︶∪石工U︺竜三u芯○ゝ≡

500

CK activity（U／L）

1000
1500
CK activity（U／L）

500
1000
CK activity（U／t．）

図3 93時間行軍訓練による血中 CPK，ミオシン転鎖値の変動
A．訓練前，B．訓練直後， C．訓練終了3日後
った・またアイソザイムもLDHlの割合は増加

520ng／mJ の広い範囲に分布していた（図4）．

せず，CPKとともに骨格筋より流出したもので心筋梗塞の場合には，最も大きな梗塞でも最高値あることが示された．一方，軽鎖値は訓練終了時

は100ng／mJ 以下であることから，相当量の骨には有意に上昇し，興味あることにはCPK値が格筋組織が崩壊過程にあることが示された．また前値に戻った3日後においても高値を保っていた

血中軽鎖値はCPK値とも比較的よい相関を保っ（図3）．しかし血中監鎖値の上昇は，最高でも15ていた．流出横序の異なるCPK値と軽鎖値を比mg／m仁以下で，次に述べる骨格筋疾患例と比較較することにより，患者の病態，すなわち筋組織

すると極めて低値である．

の崩壊の状況を的確に把捉することが可能になる以上の結果より，退散な運動によって骨格筋細ものと期待される．また筋組織の崩壊を抑制する

胞の膜透過性冗進をきたす代謝障害が生じ，CPK

ような治療法の効果を正確に定量的に評価できるが逸脱してくるものと考えられる．このようなと考えられる．

CPK値の上昇に伴って，軽度ながら軽鎖値の増3）多発性筋炎加を認め，しかも3日後にも高値を保っていたこ

CPK値の上昇している活動期の症例では，15とから，障害された肪細胞のごく一部が壊死に陥−25ng／mJ と上昇し，筋原線経の崩壊が生じてっている可能性が示唆された．すなわち，運動もいることが生化学的に示された．しかしその値は退散になると筋細胞の壊死を起こしうることが示

Duchenne型筋ジストロフィー症のような骨格筋されたわけである．心筋障害を伴っている可能性の変性疾患と比較して低値であることから，筋組

は，アイソザイムの検討などを含めて認めなかっ織の崩壊の程度は軽いものと考えられる．

た．

4）神経性筋疾患
背髄性進行性筋萎縮症などでも，CPK ととも

2）Duchenne塾筋ジストロフィー症
4歳から20歳までの55例について血中軽鎖に血中軽鎖値の上昇を認めたが，やはり骨格筋変値を測定したところ，殆んどすべての症例で著し性疾患と異なり，その上昇は軽度にとどまった

い上昇が認められた．その値は（10−24ng／mわ．

20ng／mJから−90−

血中骨格筋ミオシン軽鎖測定法の開発とその臨床的意義
●

500

図4

1000

CPKIU／

Duchenne型筋ジスト。フィー症における血中ミオシン軽鎖値とCPK活性値の相関

お

あ

り

文

に

筋組織の障害度を非侵襲的に推定する方法として，筋肉細胞の主たる構造蛋白のミオシソ，とくに分子量が小さく細胞外に逸脱しやすいサブユニ
ットの軽鎖の測定法を開発し，急性心筋梗塞症や骨格筋疾患において実際に血中の軽鎖値を測定し，その病態と比較して検討を行った．このようなわれわれの方法は，筋組織障害の進展を的確に把握することを可能ならしめ，また，新しく開発される骨格筋変性疾患に対する治療薬の評価にきわめて有用であることが明らかとなった．

−91−

献

1）永井良三ほか：ラジオイムノアッセイによる血中
ヒトむ筋ミオシソ軽鎖Ⅰの測定および急性心筋梗塞症におけるその臨床的意義，日本内科学会雑誌70，1098（1981）．
2）Nagai，R．，eEat．：Evaluation of methodsfor
estimatinginfarct size by myosin LC2：COm−
parisonwithcardiacenzymes．Am．J．Phystol．
245，H413（1983）．
3）矢崎義雄ほか：ミオシン軽鎖，日本臨床43，134（1985）．

4）Kosano，H．，eEal．：Changesin concentrationsof myogenic componentsofserumduring93hof strenous physical
32，346（1986）．

exercise．Clin．Chem．

Duchenne型進行性筋ジストロフィー症の臨床経過：
日常生活動作能力（ADL）の経年推移

官 武

正＊

研究協力者 桑原武夫＊＊， 近藤隆春＊＊，湯浅龍彦＊
進行性筋ジストロフィー症にはいくつかの病型なった．

が含まれるが，中でもDuchenne型筋ジストロ
結フィー症は患者数も多く，急敦な経過をたどるこ

DMDのADLとが知られている1）．
この Duchenne 型筋ジストロフィー症（以下DMD）は2−3歳で発症し，一般に10歳前後での平均値の年次推移を図1に示す．ADLは年長になるに従って徐々に低下し10歳前後で訓点を割った．
個々の症例での歩行不能となり，20歳前後で死亡するとされてい

る1）．

果

ADLの経年変化を図2に示す．経過は症例により異なり，ADLが低下して今日，このような DMD に対していくつかの測点を通過する点は8歳前後から15歳頃までと治療的試みがなされ，どのような指標を用いてこ広がっていた．また大多数の症例においてADL

れの効果を判定するのかということが一つの問題が70点くらいまで緩徐に低下し，その後急激にであると思われる．

低下し，次に30点頃から非常になだらかな低下

今回は，日常生活動作能力（ADL）がどの様にを示した．

推移するのか，このADLの推移は予測可能か否

比較的初期のステージから充分なADLの資料

か，この様なADLを治療効果の判定に用いるこがある11例では70点までの値は指数関数曲線とが可能か香かについて検討を行った．

y＝−0．9／（1＋e札Ⅹ＋b）＋0．95に回帰された（図
3）．

材料と方法

全症例において 70 点以降亜 点前後までの対象は国立療養所新潟病院に入院あるいはデイ
ケアー外来で観察しているDMD73例で，ADL

ADLの値は70点までのポイントから得られた指数関数曲線の延長線上に認められた（図3）．

の変化を症例毎に観察した．ADLは厚生省研究考班制定のものを用いた．

案

比較的初期のステージからADLの観察を行な

DMDの臨床経過を追跡するために，われわれってある11症例を用い，ADL70点までの値をが日常的に用いている指標は，校能評価法として，非線形最小二乗法で処理し，CurVefitting を行

日常生活動作能力（ADL），Stage分解，そして歩＊新潟大学脳研究所神経内科＊＊国立療養所新潟病院

行群では歩行速度の測定などがあり，その他，心肺機能検査やCreatinekinase（CK）の測定など
−93−

点
100

80
A
60

L40

20

0

5

10

15

20

25

30

（歳）
図1ADLの平均値の年次推移

5

10

図2

15

25

（歳）

個々の症例でのADLの年次推移がある．

の経過を示す．症例により差があるが，年を経る

図4にDMDの歩行速度の経年推移を示す．

に従ってPEP／ETは悪化してくる．しかし，中速度は一旦ピークに達したのち暫時低下して来には心機能が殆ど悪化しない例もある．

る．低下は，一般には，ここでも示されている様にlinearに起り，Cohen

20

らはこれを治療効果の指標に用いている2）．

呼吸撥能の指標となる動脈血液ガス分析値の推移を図6に示す．DMDの末期になると換気能力低下による呼吸不全を呈して来る．

図二＿5には心肺機能のうち頸動脈脈波PEP／ET−94

CKの年次推移を図7に示す．小長谷らは長期−Duchenne塾進行性筋ジストロフィー症の臨床経過‥日常生活動作能力（ADL）の経年推移
ADLCasell S．K．
0 0 0 nV 0 0 nU O O
9 8 7 6 5 4 3 2 1

6
図3

12

．

〜 1 J t

ItI1−−日HT

●●

0
1
6
0

∴ ㌦い√．

80

迅雷n㌣茂捏七・・一一l

●■

2
1

l・−1・〜；‖蟻川∵il離⁝腰汚巨

√J

4
1

⁚．了⁚⁚遥づ才．∫．

61l ⁝ ≡ ⁝ ． r t ． ． ． ． ． i I 暮 ． T l l ！ T I I T ・ − − ⊥ 1 − − ！ ⊥

8
1

パ

⁝目⁚
＝
︒
︒
竃‖＝竃瑠璃眉
■＝
川澤
打∫
．．

0
2

Gait speed

20− ・ − T − ！ T 1 − T − ！ ！

4
0

05

10
図4

15（歳）

歩行速度の経年推移

CK値の推移は，毎回の測定ごとの変動があるものの，10歳代初期に変曲点を有する指ソトでそれ以後の症例が取るべき推計値を予測できることを示した・
このシュミレーションを行なうためには，70点数関数状に低下して行くと報告していが）・
これらの指標のうち，今回は ADL をとりあげ，（1）DMDの（歳）

ADL70点までのサンプリングでそれ以降のその症例が取るべき推計値を予測できる

m／SeC

観察例の

18

ADLはどのように推移するのまでの観察点が多ければ多いほど予想曲線が正確になり，最低6ポイント，理想的には8

10ポイ

か．（2）このADLは予測可能か否か．（3）このよ

ント，しかも70点代と鋪点代で均等なサンプ

うなADLを治療効果の判定に用いることが出来

リソクが必要である．
しかしながら，われわれがこのようなADL評

るかどうか検討した．
その結果，ADL70点までのサンプリングポイ−95

価の方法を治療効果の判定に用いようとするなら
−

T
E
／
P
︻
．
E
P

I・丁＝・−ナー1！与・IIItT1−一−！丁＝−−！丁！⁝−！T−−T！II・％80 70 60 50 40 30 20 10

0

15

図5

20

25

（歳）

二頸動脈脈波PEP／ETの経年変化

＼

／

■

＼

−

mmHg

−

PaCO2

1

／

T

l

−24

−18

−12

−6

−3

0m0nth
死亡

図6 呼吸不全で死亡した症例の日中活動時のP■02，P．C02の推移

許′m′
0

−5■

10

15

図7 CKの経年推移
−96−

20

25 （歳）

Duchenne型進行性筋ジストロフィー症の臨床経過：日常生活動作能力（ADL）の経年推移

は，このような予想曲線をまず出しておいて，実際の症例でこれがどのように修飾されているかを観る必要があると思われた・

文

臨床．医歯薬出版．1985
2）Cohen．L．，Morgan，J・，eEaL・：First walking
velocityin health and Duchenne muscular
dystrophy：A statisticalanalysis．A，Ch．Phys．
〃gd．斤β烏α∂払65，573−578（19糾）．

3）小長谷正明，高柳哲也：Duchenne塾筋ジストロ
フィー症筋崩壊の進行経過一血清Creatine
kinase推移の指数方程式による解析．臨床神経（抄）24（12），1422（1984）・

献1）祖父江逸郎，西谷 裕福‥筋ジストロフィー症の−97−

治療薬の効果判定法における問題点

石 原 侍 幸＊
共同研究者 宮川雅仁＊，儀武三郎＊，青柳昭雄＊，杉田秀夫＊＊Duchenne型筋ジストロフィー（DMD）．は，か期待できなかった．このため，開始時より薬効従来決定的な治療手段が兄い出せなかったこともの判定が可能かどうかということが，われわれ臨あり，これまで行なわれてきた薬剤効果の判定に床家にとっての最大関心事であった・以下にE一

っいてもまちまちの方法がとられてきた・しか朗研究班での臨床試験の結果を述べ，治療判定法

し，1980年，Dubowitzらにより標準化の試みがの問題点を明らかにしたい・

なされた1）．彼らは効果判定に必要な条件として，①診断基準の作成，⑧適当な対照群の設定，③二E一朗・研究班での経過

重盲検試験，④簡単な臨床検査に加え詳細な検査

当院入院患児27名を対象に，ESTを4mgによる評価，⑤2年またはそれ以上の期間，の58mg／kgの量で授与した・うちA群14名は1984

点をあげた．Brooke らは，治療効果判定に必要

年5月より，B群13名は1985年6月より投与な条件として，①診断の確実性を増すための診断中である．開始時にA群は歩行可能児が13名，基準の作成，②二重盲検試験，③Power算出，

B群は歩行可能児2名のみであった・観察項目は④データの収集や各評価者問のばらつきをモニタ

表1に示す通りである．臨床検査値の推移に閑しーできることの4点をあげている2）・

そは表2の通りであり，γ−GTPの上昇を別にす

わが国でも厚生省新薬開発事業研究班が組織されば，特に大きな変動をみとめなかった・効果判

れ，べスタチソやE一組による治療が開始され定のため，まず当院開棟以来のデ，タをhistori−

た．E一朗研究班では，1984年度より第二相臨床

caldataとして各パラメーターとの比較を試みよ

試験が開始され，われわれも第二相臨床試験の開うとした．CKは7年分，ADL，撥能障害度は13

始時よりE一朗治療に関与してきた8）・

年分のデータをコンピューターで集計した（表3，DMDが常に進行性の経過をとることは周知の

4，5）．両群間で比較を試みたが，治療患者はこの事実である上E−64（EST）のような蛋白分解酵

historicaldataの範囲内に全て入ってしまい，特素阻害剤は，DMDの本態を直接攻撃する薬剤でに有効であるという結論を導き出すことはできなはない．したがって，中核症状である筋力低下をかった．MMTでは，筋力の回復が一時的に認め逆転させる効果は期待できず，当初より進行性のられる例もあるものの，検者の側の測定誤差の問

経過を遅らせることが可能かという程度の効果し題があり，平均すると測定したすべての筋肉で下＊国立療養所東埼玉病院内科＊＊国立精神・神経センター

降傾向をみせた．なお，MMT，ROMについてのhistoricaldataは見出せなかった・−99−

表1−1患者の背景（1）

群

症例No．

年齢（歳）

障害度

体重（kg）

投与量（mg／kg／日）
開始時
1
1
1
1
1
1

1

5
1

2

2

1

6

2

2

2

2

2

1
1

2

2

6

2

2

2

1

002525 00 00 00 75 00 00 乃乃250075

2

0

5

平均±S．D．

4

1
7
1 1

114

2

4

0

113

2

2

9

112

2

4

8

111

2

4

0
1

110

2

3

0
1

109

2

8

108

3

2

7

107

6

1

4

2

106

2

4

1

105

0

4

1

104

a L 8．6．6．0．㌃ 6．5．0．L 8．5．0．

4

1
1

103

3
1

lO2

4

lOl

1
1

A

増量後
200
250
250
200
200
200
150
200
200
150
150
250
200
150

10±1．824・3±4・0

98±19

196±37

表1−2 患者の背景（2）

群

症例No・

年齢（歳）

障害虔

体重（kg）

投与量（mg／kg／日）
開始時

5
2
5

32．5±10．2

00 00 75 25 00 75 25 50
1 1
1 2
1 1

5

12±2．024 25 19 36 55 22 37 40 42 3731 31 21601

平均±S．D．

0
1

513

3
1

512

2
1

511

5

7
1
1

509
510

5

2

508

4

9

507

5

2
1

506

5

3
1

505

5

0
1

504

6

1
1

503

5

501
502

l
1

B

増量後
200
200
150
250
400
150
250
300

150

300

125

250

125

250

125

250

75

150

119±36239±71

そこでわれわれは，当院閲棟以来（昭和45年） が，EST投与群で表7の通り的半年延長していの各障害虔通過期間を算定し（表6），特に障害皮 た・しかし，両群間には統計学上有意な差が見ら
4度の通過期間をEST投与者のそれと比較した れなかった．当院での結果は以上であった．他に（表7）・障害度4度通過期間は当院では装具歩行 国立療養所新潟病院，国立療養所下志津病院，国も4度と算定してあるため他院よりも一段と長い 立療養所医王病院でもEST投与を行なったが，−100−

治療薬の効果判定法における問題点
表2 投与開始時と各時期における臨床検査値の比
較

群

検査項目

48遇

A ICDH N．S．

†

N．S．

N．S．

N．S．

N．S．

N．S．

N．S．

100

N．S．

†

Al−P＊

（点）

増量24遇

N．S．

r−GTP＊GPT＊

増量4遇

表5 ADLの自然歴
ADL 総点（Historical data一束埼玉病院一）CK I N．S．

80

†

60

N．S．
40

群

検査項目

4週

増量4遇

B ICDH N．S．
γ−GTP

N．S．
†

GPT N．S．

†

N．S．

Al−P N．S．
CK N．S．

N．S．
N．S．

増量24週

20

N．S．
0

†

N．S．
N．S．

表6 東埼玉病院における各障害虔通過期間（昭和45年10月一昭和59年12月）

N．S．

＊：投与開始4過日と比較

障害度 症例数 通過期間（ヶ月：平均±S．D．）
1†，1：♪＜0．05
N．S．：nOt Signi丘cant

16．8士も5（10〜24）18．4±11．3（1−51）

2

12
39

血清CKの自然歴

3

CK（Historial data・東埼玉病院−）

4

表3

5
6

5000「（mU／mり

7
8

4000

39

9．7±6．5（1−34）3612．6±10．2（3−39）9724．1±17．1（18923．3±19．7（2−80）6225．5±20．4（2〜93）3924．5±18．1（2〜61）

73）

3000

表7 障害虔4度通過期間

9101112131415（年齢・才）表4 障害皮の自然歴

■

7
0
2 2

−
■
■
r
．

7

t
■
l
T
■

6

6
■
■
■
L
T
−
■

2
6
1 1

■

n＝12

3

（Historical data一束埼玉病院−）

1

劇8

Stage

2
1
2
3
1 3 4 1

8

1
3

7

O

0

4度通過期間（ヶ月）

01020304050608∞10111
620
111111111115

1000

N

例
症

2000

18．3±12．0（平均±S．D．）

有効性を確定できるような良い判定法を兄い出せ
5

10

15

20

25（年齢・才）なかったのが現状である．

−101−

実行時間と簡単な臨床検査のみで成っていた．

poworTab10
1一丁■lL●1．彷

l．
0

l

某効判定上の問題

60
50
l．
8

以上にESTの薬効判定と外国の判定法の実情40を述べてきた．EST については昨年，薬事審議
く
ね

l
．
6

会での審査の際問題となった一つの点は，有効性

r
l
L
】

の判定について，すべての施設において共通の判

20

l
．
4

断基準を設定し得なかったことであった．施設間lによる過去のデータの集積がバラバラであり，批

1
1
．
2

判に充分たえうるn？turalhistoryの集積がなかlJった．また，開始時期の障害度も全くバラパラで
0

l
】

0．1

比較しようがなかった．われわれが採用した障害
0．2

0．3

0．4

0．5

0．6

0．7

0．8

0．9

1．0

度についても判断基準があいまいで各施設問で比F／9UreT3・Po−VeHab／eJ佃／Ca血9析eprc加bJ′JyGJ即e〝ecrJn
的／5√eJ〕0rLC仙／CaHmpJOyemenJbe／∩gdeJeCJedafa／eve／0／

較ができなかった．英米の薬効評価基準と ESTS′9山鹿即CeO／P＜0・05・meCUrVeS′eJ）√eS即rgrOUp50／d′′′eトの場合を比較してみると，確実な診断基準の設定

8ELTA

eれ川U爪be／SO／par／e／1J5ね／／0ルed／oJJyea「．

については，これまでの参加施設が筋ジストロフ

図1Power表（文献2）より）

ィー専門施設であり DMD という診断には問題ないと考えられる．

外国での現状1981年より Brooke らにより発表された臨床

次の二重盲検試験については，DMDのような評価法は，E−64研究班と細目では多少の差があ

悲惨な疾患に二重盲検試験を行なうのは倫理的なるものの殆ど同様である．当然ではあるが，彼ら問題があるとする意見もあるが，学問的には対照はまず疾患のnaturalhistoryの把捉の重要性を群との比較が必要なことは自明の理である．デー

強調した．多くのパラメーターの中でMMTをタ収集の施設間でのばらつきについては，今回の特に重視し，筋力テストの結果を点数化し，一年

EST試験で，各施設の医師，看護婦，PT，OT

間に 0．40±0．39（平均±S．D．）の割合で低下すが開始時期に集まり評価法を一定にすることを試ることを兄い出した．この数値からPower表をみてきたので，それ程問題はなかったものと考え

使い薬効判定に役立てようという Powerの概念られる．Dubowitz

を導入した（図1）．

々の筋肉の筋力を測定し，大腿四頭筋のトルクをらはelectromyometerで種

イギリスのDubowitzらは同様のプロトコール

測定している．われわれも筋力の推移に評価の中を作成したが，彼らの特徴はやはり筋力測定を重心をおくことには賛成である．障害皮の判定は各視し，electromyometerで筋力を判定し，さらに施設のばらつきが多い．ADLや動作時間を測る

大腿四頭筋でトルクを判定していることである．

機能テストについては筋力だけでなく，運動発達，やはり知能，／くランス，拘綿などの要因が加味されるか

natural historyの把捉を重要視していらである．ROMについては，マッサージによりる．
イタリアのAngeliniのプロトコールは，四頭余りに違う値をとりうるなどの問題点が多い．

筋のmyometerによる筋力測定と，三頭筋，三又，臨床検査については尿中クレアチン，3→メチ角筋，四頭筋，大殿筋の MMTと粒々の動作のルヒスチジンなどに対する効果はあったものの，−102−

治療薬の効果判定法における問題点

これらの指標が臨床的にどのような意義があるのの項目を多くすること，臨床検査についてはこれかという問題については議論のあるところであろまで通り行うこと，二重盲検試験にすること，症う．最後はPower概念の導入であるが，40例の例数によってはPowerの概念を導入し薬効判定

症例で70パーセント位の進行をおさえるとすれに役立てたり，期間は1年間とすることなどを提ば，一年間で対照群との差を算出しうるし，00パ

案したい．

ーセント程度の抑制率であれば，00名程の患者をフォローすることが必要となる．二重盲枚で行なうとすれば，80から160名程度の患者数が必要となり，各施設における協力が必要となる．

参 考 文 献1）Dubowitz，V．，Heckmatt，J．：Managementof
muscular dyatrophy：Pharmacological andPhysicalaspects．Br．Med．Bult．36，139−144（1980）．

2）Brooke，M．H．，Fenichel，G．M・，etat．：Clini−
Calinvestigationin Duchenne muscular dys−

今後の対策trophy：2．Determination

ofthe

Power

of

今後の方針としては，患者の対象をしぼること，Therapeutic trials based on the natural his−

即ち効果は筋肉量の多い患者に著しく出るだろう

3）石原停幸他：EST臨床試験，厚生省新薬開発研究事業「微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E一朗）の開発研究」昭和60年度研究報告書，123（1986）．

tory．〃〟∬Jg〃β′pg．6，91−103（1983）．

という想定のもとに，歩行可能児のみを対象にす
る．ADL の項目を減らすこと，その分動作時間−103−Duchenne PMDに対するベスタチン，
ホルフェニシノールの効果

村 上 慶 郎＊共同研究者 岡崎 隆，林 英人，斉藤 有，馬場繋二症

例

患 者：1歳8カ月，男性
主 訴：一人立ちの遅れ
家族歴：

1．PreclinicalI）uchenneI，MD に対するぺス
タチンの長期投与の一例
私どもは，べスタチソを1歳8カ月Preclinicalの時点から亜カ月にわたって使用した，
DuchennePMDの一症例について報告する．（本症例は，昭和59年度梅沢班の研究報告の症例のその後の経過である）．

患者

症例は1歳8カ月（初診時）の男子

既往歴：特記するものなし
現病歴：満期安産：
昭和58年6月，保健所の健診で下肢筋力低下，両下腿に仮性肥大，血清CK高値

主訴は一人立ちの遅れ，
家族歴では息児の母親の兄弟に，2名のDuchennePMDがおり，兄は22歳で，弟は当のため6月22 日当院受診
外来受診時所見：
体重12kg，脈拍110，血圧100／60
四肢近位筋筋力低下，両脚腹筋部に仮性肥大，起立はつかまり立ち可能
昭和58年6月27日よりべスタチソ60mg より投与開始
図1

病院で18歳で死亡している．
現病歴は同胞2人の次男として，満期安産，生下時体重3000g，頸定4カ月，一人すわり7カ

月，生後13カ月頃，姉に比し一人立ちが遅れたので，保健所と相談の上本院を受診．
初診時は体重11kg，脈拍100，血圧110／76，
歩行は不能であったが，這い這いは可能であった．

ソ

また，つかまり立ちも可能であった．精神面での増して1500mg／day（100mg／kg／day）にいた

遅れは見られなかった．両下腿に仮性肥大をみとり，現在ではめ，さらに下肢筋力の低下を思わしめた．

投与している．

60mg／day（5mg／kg／day）より開始し，漸600mg／day（30mg／kg／day）を

検査成績は表1に示す如くで，GOT，GPT，

生後1年9カ月（ベスクチソ開始後1カ月）でLDH，CKの高値を認めた．特にCKは20000

数歩位歩く様になり，生後2年（べスタテン開始

単位を越えていた．

後7カ月位で，一人立ち可能となった．（Gower

経過では昭和58年6月28日より，ベスタチ

Sign陰性）その後1年位で再び登はん性起立をし＊国立療養所箱根病院

たり，しなかったりするようになったが，べスク−105一

表1検査成績（初診時）チソ使用開始後24カ月（生後3年6カ月）頃よ

赤血球

477×105

り，手を使用せず起立可能となり現在に至ってい

白血球

7200

る．

血色素

11．2g／dJ

ヘマトクリ

ット

歩行は最初の頃はWaddlinggaitが著明であ34．99も26．2×105

ったが，現在ではかなり改善されている．階段はGOT

325Ⅰ．U．

てすりを使用して登る時が多いが，降りる時は使GPT

241Ⅰ．U．

用しない．

LDH

1276Ⅰ．U．

ALP

361Ⅰ．U．

LAP

361Ⅰ．U．

向を示したが，一度減量して再度繰返して増量し

r−GPT

4Ⅰ．U．

た場合は低下の程度は少なくなる傾向にある・

BUN

15mg／dJ

クレアチニソ

O．4mg／dJ

CK

20470Ⅰ．U．

たが，最初は5−4秒台から現在では2Total Protein

6．6g／Jに減少してきた．

Albumin72．595

l

α

■

α
3
−

β

CK，LDHはべスタチソの増量により低下の傾起立時間は投与開始後16カ月から測定を始め
3秒台

日常生活動作を表わすノミーテル指数では開始時

3．2野

65点であったのが現在は90点と改善を示してい

9．79も

る．

9．3浄

小括

5．39も

■

α

Gl欄GI Gl

血小板

松下，辻班員らにより，べスタチソを発症直後の筋ジスマウスに連続投与することにより，症状進行が完全に抑制されることが示されたが，人では証明されていない．私どものこの成績は1例のみで，自然経過も考えられ，効果の有無は断定できず，更に長期間の観察と症例の積み重ねが必要となる．

2．DuchennePAIDに対するホルフェニシノー
ル投与について次に私どもは10歳以下で歩行可能なDuchenne
642

起立時間（SeC）

PMDの患者7例にプロテアーゼインヒビターであるホルフェニシノール（BF−121）を投与してその効果を検討した．

062
2 1 1

（体重（kg）

対象はDuchennePMDの患者7例，年齢5−9歳でホルフェソニシノールの投与量は50−150
mg／day（1．5mg／kg／day〜8mg／kg／day），使用

Gower Signt●◆十十十土一

一一一

土

土1上

期間は24から64週間である．

土

検査は一般血液，CKを含む血清生化学，尿検02468101214161820222426283032343638404244ヶ月

図2査を行い，更に立上がり時間などの運動機能を含−106−Duchenne PMDに対するべスクチソ，ホルフェニシノールの効果
表2

Duchenne型筋ジスト。フィー症に対するBF−121の効果

No・症例年齢（開始時）体重（開始時）（濫猛）投与期間
CKの動き 起立時間の動き効果副作用（歳）（kg）（unit／t）
（秒）

4
2
9
1

2．28→3．60

563898→2774

16．15→不能

4414630→11∞5

5．92→10．85

50

247314→7911

4．84→3．89

50−→1504814750一→5976

3．56→7．69

5ひ→150648660−→6044

4．41→6．47

一8
150→1003．92→5．22

8962−→8995

一

0
2

7

50→15010840→5185

行 行
進 進

2
3

7

A

5

H

6

6

S

5

9

K
4

40

一

5
2

8

K

3

48遇

50→100

行行行行
進進進進

6
2

8

D

2

T I K M O K S

N

1

5ひ→1007

む臨床症状をチェックした．

について断定は出来ないが，5歳の症例を除いい

結果ては症状はいずれも多少の差は有るが，進行して1例に歩行不能になったものを除いて，残り6例いた．しかし，これらの進行した例でも，全く無は歩行可能であった．立上がり時間は1例を除い効とはいいがたい面もあり，特に患者の両親は薬て増加した．血清CK等の酵素値は投与後，1時の使用により，運動が活発になった等のことを述減少したが，その後は増加すもるのが多く見られべるものも多く，又薬の使用により感冒にかかりた．その他の血清生化学，電解質，一般血液，尿難くなったなどと申し述べる場合もあり，このよ

検査では，特に薬物によると思われる変動は見らうな点からも検討の必要があり，更に症例の増やれなかった．

し，薬用量，患者の年齢についてもべスタチソ同小指様若年者に就いての検討が必要である．

本研究は Preliminary の研究であるので効果−107−

ベスタチンの臨床使用経験について

三吉野 産 治＊共同研究者 江田伊勢松＊，田上昭人＊，三渕 浩＊，日高 健＊，青田祐三＊，守田和正＊，小堀良治＊

よび症例3ほ以前よりべスタチソを服用しておりはじ

今回当院においてめ

若干の空自期間はあるも長期服用症例である．診にDuchenne型筋ジスト。フ断はいずれもDMDであり，診断に問題はない・

ィー症（以下DMDと略す）6名についてベスタ

結チソの盲検試験を行ない若干の知見を得たので報以下今回得られた多くの判定項目の中から，デ告をする．ただし本研究の盲検試験の結果は全国
集計がなされ，全体としてのデークーは既に出て

果ークーの一部を記載する．
図1は血清いるため，本文は当院の個々の症例の動きを中心

CPKの動きをみたものである．

に述べる．又この研究の効果判定を行なう際に若●はべスタチソ服用，○は非服薬の症例である．

干の注目すべき点があり，その点についても述べ0の2症例のていく．

残りの1人は高い変動を示しており，服薬，非服CPK値がしだいに落ちているが，薬群の差はないと思われる．
症

同様に図2は血清GPTの変化を示したもの

例

表1は今回のべスタチン服用，非服用を含めたである．CPK値同様に両者間の差はない．血清6名の患者のリストである．服用患者の症例1おGOT，LDH値も同様であり，やはり両者間に差表1症例の一覧表
治験番号

生年月日

7B組1番
7B組5番
7B組4番

53．10．27
54．10．19
55．9．20

7B組2番
7A組1番
7B組3番

53．

2．21

56．

8．25

53．

2．15

●べスタチソ投与群

症例1（Y．T）
症例2（S．0）
症例3（T．T）○ベスタチソ非投与群

症例4（T．E）
症例5（Y．G）
症例6（H．K）＊国立療養所西別府病院

−109−

診察区分

● Bestatin
O Placebo

0

4

8

12

16

20

24

28

32

36

40

44

48

52

Ws

図1CPKの動き●

Bestatin

O PJacebo

0

4

8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 Ws
図2

GPTの動きはなかった．ただ図1，図2の全体の変動からもており，又採血も外来又は病棟では同時に実施しわかるように，べスタチソの服用，非服用にも閑ているも，採血から血清分離の時間，分離から活係なく，各血清逸脱酵素の高い時と低い時が一致性測定までは厳密に管理しておらず今後の注意点

する煩向にあった．検査室での精度管理は実施し

としたい．

−110−

ベスタチソの臨床使用経験について● Bestatin
O Placebo

0

4

8

1216

20
図3

24

28

32

36

40

44

48

52

Ws

44

48

52

Ws

体重の変化に関して● Bestatin
O Placebo

0

4

8

1216

20

24

28

32

36

40

図4 捏力に関して

図3，図4は体重および握力の変化を示した図

デークーでもこの少ない症例では両者間の差で目である．体重はこの年齢の子はベスタチソ服用，につくものはないと思われた．ただ今回われわれ

非服用にかかわらず自然に増加するようである．

は偶然にも，6名の患者の理解度いいかえれば患蛭力にも両者間の差はない．図5，6，7は20m

者の精神発達の程度が割りと良好なる3名，不良走行，仰臥位から坐位，階段昇りの変化を示す図

なる3名の2群に分けられることに気ずき，今まである．いずれもやはりべスタチソ服用，非服用で示してきたデークーの一部をこの2群に分け比間の差はないものと思われる．

較検討したのでその結果を以下に示す・

以上今回のべスタチソの服用，非服用両者の一

表2は先の表1の患者を精神発達の程度に大部のデークーを継時的に述べた．その他の項目のきく2つに分けたものである．●は精神発達良好−111−

表2 症例の一覧表
生年月日

診察区分

精神発達

●理解良好群WISC−R

症例1（Y．T）
症例2（S．0）
症例6（H．K）

53．10．27

IQ（63）

54．10．19

IQ（82）

53．

IQ（80）

2．15○理解不良群
︶

T

︶

E

55．

9．20

DQ（29）53．

2．21

DQ（34）56．

8．25

DQ（39）︶

G

症例3（T．
症例4（T．
症例5（Y．

遠城寺式● 理解良好群
0理解不良群

0

4

8

1216

20
図5

24

28

32

36

40

44

48

52

Ws

20m走行に関して群であり，そのIQは表の右に示してある．0は

図12は仰臥位から坐位への時間を表わしたも精神発達不良群であり，WISC−RにてIQは測のである．これをみると理解良好群と理解不良群

定不能（IQ40以下に相当）であるためDQを右の間にやや差がみられ，不良群で示した個々の症に示してある．以下先に示したデークーの一部を例の差が（変動が）週ごとで激しい傾向がみられこの両者に分けて示していく．

る．不良群でもっともこの時間の短かい症例の変図8，9はCPK，GPTの血清中の変化を示し

動は国でみる限り少ないようにみえるが，実際はたものである．理解良好群，理解不良群の両者間測定不可能な遇がいくつかみられ，この値を実際の差はないと思われる．同様に図10，11に示す

この症例にあてはめていくと，理解不良群は3名

体重の変化，握力の変化にも両者間に差は認めら

とも変動の激しいものとなってしまう．

れない．

図13は20m走行の変化を，図14は階段昇−112−

べスタチソの臨床使用経験について

0

4

8

1216

20

24

28

32

36

40

44

48

52

Ws

40

44

48

52

Ws

図6 仰臥位→坐位に関して

0

4

8

1216

20

24

28

32

36

図7 階段昇りに関して−113−

● 理解良好群○ 理解不良群

0

4

8

1216

20
図8

24

28

32

36

40

44

48

52

Ws

36

40

44

48

52

Ws

CPKの動き

U O
O
6

0

4

8

1216

20
図9

24

28

32

GPTの動き−114−ベスタチソの臨床使用経験について●理解良好群○理解不良群

0

4

8

1216

20
図10

24

28

32

36

40

44

48

52

Ws

44

48

52

Ws

体重の変化に関して● 理解良好群○ 理解不良群

0

4

81216

20

24

28

32

36

40

図11握力に関してりの変化を示したものである．これらの2つの図

この少ない症例数では結論が出ず，全国的集計がは理解良好群と不良群の差を如実に示しており，またれる．

良好群（内1名は歩行不能のため2名となってい

又われわれは今回の判定表の中で患児の精神発る）は極めて変動が少なく，不良群は各々のデー達の程度が多少なりとも影響することがあるので

タの過ごとの′ミラツキが多くなっている・はないかという可能性について述べた・このこと
は DMD にこのような項目をするのは無意味と考いっているのではなく，判定する際に各検査項目

案

以上DMD6名の盲検試験の結果を述べてきに対する患者の理解度を把捉しておく必要がある

た．べスクチソ服薬，非服薬という点からみれば，のではないかということである．61年度の厚生省−115一一

0

4

8

1216

20

24

28

32

36

40

44

48

52

Ws

図12 仰臥位→坐位に関して●理解良好群○理解不良群

只︑l

月︑
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′ − ′

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′

′ − − ′

′

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＼了、℃一一万／／ヽヽ⁚bP＼廿′／ββ、ノ′月、′′ふくy′、、

15

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、、、ノー〇一一〇一心〇一一〇￣て′ノ月、、、、Lと二…〇一一〆瓜、、、〆／、、b

ヶ一七

t＝榊醜二i＝j
0

4

8

1216

20
図13

24

28

32

36

20m走行に関して

−116−

40

44

48

52

Ws

べスタチソの臨床使用経験について

17茅、、、、n＿諾7
′′モ

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／J

● 理解良好群○ 理解不良群
J
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了、モ叫ポ二へ、℃℃

とこt二王＝＝［＝‡＞⇒ト＜亡＝壬＝1＝コEコ＝壬＝ユr弓
0481216．20

24

28

32

36

40

44

48

52

Ws

図14 階段昇りに関して

筋ジス班会議でも，DMDに知能障害を合併する

く，今回の全国集計のごとくそれらを全体として症例が多く存在することは既に衆知の事実であとらえることはもちろん必要である．さらに知能

り，われわれの症例のみが特殊ではないと考える．

障害の程度により各項目を再評価することもまたただ知能障害の程度が軽症で理解良好でも，重度必要なことかもしれないと思われた．

で不良であってもDMDということには変りな−117−

Duchenne型筋ジストロフィー症に対するベスタチンの使用経験

福 山 幸 夫＊

研究協力者 斎藤加代子，大沢真木子，岡田典子，宍倉啓子，鈴木場子，平山義人，中田恵久子

的対象および方法

Duchenne塑進行性筋ジストロフ

当科外来通院中のDMP13例である．内訳は

日

7歳以下の

ィー症（DMP）に対するべスタチソの治療効果に表に示す．

ついて，臨床的に検討した．今回は特に，3例に

1）尿中3MeH／Cr比測定例

ついては6カ月間投与して，尿中3−メチルヒスチ

3例で行なった．べスタチソの開始前4週間はジン／クレアチニソ比（3MeH／Cr比）に対するplaceboを授与し，その後6カ月間ベスタチソを影響を調べた．また，10例については，1年間べ

4歳以下は150mg／日，5歳以上では300mg／日

スタチソまたはPlaceboを同量固定法でSingleの同量固定法で授与した．
検査は，placebo投与前，投与後2週間目，4

blind法により投与し，治療効果および副作用を週間目に，べスタチソ開始後は4週ごとに採血お検討した．

よび1回採尿を行ない，CPK，Aldolase，GOT
表 対象および投与法方
Ca Se

ag e

S ta g e

1

1y 5 mⅠ− 1

2

6 y O mⅡ − 133

7 y 6 mⅡ − 144

4 y O mⅠ− 1

55 y O mⅡ − 156

6 y 6 mⅠ一2

7

7 y 5 mⅠ
Ⅱ8

7 y 8 mⅡ − 149

3 y 2 mⅢ

10

3 y 3 mⅡ − 1511

5 y

Ⅱ − 1412

6 y 6 mⅠ
Ⅱ

13

7 y 4 mⅡ − 14lm

S C h e d u ledos e
150 m g ／日

2W 2W 4W
l
l
。
．
三。
細長

l 3 00 m g ／日■

B esta tin 投与

15 0 m g ／日
4叫ll

B e statin 投与

l
l

4W
l
l

p lace bo 投与ll

3 0 0 m g ／日

0にて来院し，臨床坪価と捜査を行なう＊東京女子医科大学小児科−119−Casel （1y5m．ト1）−4W−2w O

4W

8W

12W

16W

20W

24W

Bost
mat
g／
inday■

；
ご

ロ
…目口 ■
−■
Ald
CPK 腔
UU ／
引（
m U／
m 丘
）
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20000
360
18000
320
16000

■

ロ
300
200
100
0

120
80
40
0

6000
4000
2000
0
SeG 12
10
8
6
4
2
0

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岩

／

ク
′ ＼ 1
＼＼鞋 二

二

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望 ／／ ／ へ

3M肌′
Cr
＼ ＼＼訟
＼ ＝＝ ＝ご
ニ
＝
＝志
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〇
・
一
・
一
〇
・
MeHrC
（
m g／
g）
100
80
＝≡
暮 60
40
20
0

itandingup

図1Caselの臨床経過などの血清酵素，血中・尿中のクレアチン，クレ

くい，活発になったとの印象である（図1）．同

アチニソ，尿中3−メチルヒスチジンの測定を行な

時に立ち上がり時間の短縮と血清酵素値の低下をった．尿3MeH／Cr比は日本化薬株式会社の御認めた．しかし，何ら原田なく，12週では血清酵協力により，相互生物医学研究所でNIN法1）に素値の著明な上昇と立ち上がり所要時間の延長がより測定をしていただいた．患児は，採血日前日みられた．尿中3MeH／Cr比は3．5週において，の肉魚等の摂取を控えるようにして，尿は外来に

placebo 投与時より低下し，12遇で増加していて一回採尿を行なった．

る．この症例では尿3MeH／Cr比は経過中，血臨床評価は，各運動機能所要時間（20m走行，

清酵素および立ち上がり所要時間の変動と同じよ

階段昇降，起立，起坐，寝返り）の測定および，

うな変動を示していた．Case2は臨床的には緩運動枚能，筋力の変化について，問診および診察

除な進行を示し，20m走行，立ち上がり所要時により評価した．

間の軽度な延長を認めた（図2）．血清酵素値の

2）べスタチソまたは placebo の1年間継続投

変動は Casel ほど著明ではなかった．尿中3与例

MeH／Cr比は Casel と同程度の変動を示した

5例のベスタチソ投与と，5例のPlacebo投与が，臨床像，血清酵素の動きとの関連は明らかでの Single blind 方式で行なった．投与方式は表はなかった．Case3ではべスタチソ使用前にすのように同量固定法で1年間継続投与し，検査はでに血清酵素も2，000 14，000台と変化がみとめ

尿中3MeH−Cr以外は上記と同様，臨床評価もられ，尿3MeH／Cr比，臨床評価も同じように同様に行なった．

変動した（図3）．べスタチソ使用開始後4遇に
血清酵素値は低下し，立ち上がり所要時間が短縮
結果したが，尿3MeH／Cr比はむしろ上昇していた．

1）ベスタチソの尿中3MeH／Cr比への影響

臨床的には徐々に運動所要時間の延長があり，血3例共ベスタチソ初回投与である．臨床的には
Caselが，使用開始3

清酵素値の変動はCaselほどではなかった．

8．5週において転びにー120−

尿中3MeH／Cr比をこれら3例でグラフにしDuchenne型筋ジストロフィー症に対するべスタチソの使用経験
Case2
−4W

−2W O

B estati
m g／
nday

丁

目Y i 岩…

芯

岩

（
K U ）

120

12000

500

100

10000

400

80

8000

300

60

6000

200

40

4000

4W

8W

12W

†
享
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（6yOm，Ⅱ−13）日
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一

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一 ・一
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24W

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140
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一
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120
100
80
60
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■
− − − −

10 0

20

2000

0

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0

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120

12

100

10

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4 0

4

20

2

0

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2 0
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一

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叩 UP

Case2の臨床経過

Case3
−2 W

ノ ノ ￣

、
□・

図2

−4 W

一
ノ 誹 一一
一一
一一
一一
一一一
・
〇 ％V C（7y6m，Ⅱ−14）

4 W

．8 W

12 W

16 W

20W

24W

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m U ／M の160
1 6 00 0
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14 00 0120

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10 0 0 0

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8000

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l
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80
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40
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一一
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一
一一
一一
一一
一一
一●
−＿
＿
ヽV C

図3

￣
−●
●ロ

Case3の臨床経過てみると図4のように，全例で，既に述べられて中よりべスタチソ投与中の方が低下していたが，いる正常値より高値を示していた．各々の症例のCase2，3ではベスタチソ投与後，尿中3MeH／

回帰直線を比較すると，べスタチソは使用後，年Cr比は増加した．しかし，これらの間に有意差

長のCase2，3に対し1歳5カ月のCasel

はなかった．

では低下傾向があった．さらに placebo 投与期間

2）ベスタチソの1年間継続投与による影響

中と，べスタチソ投与期間中において，それぞれ
尿3MeH／Cr

値の平均値と標準偏差を各々の症例で比べると（図5），CaselではPlacebo投与

登録時4歳以下のべスタチソ投与2例，placebo投与2例，5歳以上のべスクチソ投与3例，Placebo投与3例の計10例で検討した．

−121−

訓抽

腑
笠
1
2
︒
日
︒
1
︒
︒
9
︒
8
︒
7
︒
0
6
0
5
0
4
0
3
0
2
0
1
0

−4−2

0

4W

8W12W16W

20W

24W

W W
duration after beginningof bestatin

図4Bestatin投与による尿中3MeH／Crの変化
図の中の直線は回帰直線をあらわす

140

120

3MeH／Cr
100

80

mg／g
60

40

20

0

Pracebo Bestatin Placebo Bestatin Placebo Bestatin
1

図5

①

20m

2

3

Case

Placebo投与とBestatin投与による尿3MeH／Crの変化

走行所要時間（図6）：4歳以下の例

以降，所要時間の延長の程度は少ない．Case 5で，べスタチソ投与群（B群）も placebo投与群（5歳0カ月，StageII−15，ベスタチソ投与例）（P群）も時間経過と共に改善傾向を示した．べと Casell（5歳1カ月，StageII−14，placebo

スタチソ投与後初期にB群特にCase5において投与例）の2例を比べると開始前にむしろ運動機

短縮が著しかった．1年間の効果をP群，B群で能レベルのよかったCasellよりも，ベスタチ

比較すると著明な差は認めなかった．5歳以上で

ソ投与をうけたCase5の方が8週目より逆転しは，同じ運動機能レベルによる患児2例を比べるて20m走行時問の短指を示し経過している．

と，Case7，12がstageⅢであり，ベスタチソ（2）立ち上がり所要時間（図7）：4歳以下では，投与の Case 7 の方がむしろ遅くなっていた．

B群，P群とも1年間に著明な改善も悪化も認め

Case8 と Case13はStageII−14 であるが，られなかった．5歳以上では，P群の1例Case

べスタチソ投与をうけたCase8の方が24週目

12は投与前より 78．5秒かかり，12遇以降立ち一122−

Duchenne型筋ジスト。フィー症に対するベスタチソの使用経験
20m走行所要時間（4歳以下）

0

48121620242832364014朝

52
WOeks

duratbnaltorbotlnnin■○†8●〜tatin

図6 Bestatin投与群，Placebo投与群の運動機能評価（20m走行所要時間）
立ち上がり所要時間（4歳以下）
SOC
帥

80Statin投与鐸●一一一

51

PlaCebo投与群〇・・〇

56
54
52
50
48
46
14
42
40
38
36
34
32
30
28
26
24
22
20
川
16
11
12
10
8
6
4
2
0

0

4

81216

20

2128

32

36

4014

48

52

0

4

812162021283236亜1418

−●●kt

52
W●tk事

duratkInaItorbeginnin■OI80Statln

dur●tion■ltorb叩innintOIB●Statin

図7 Bestatin投与群，Placebo投与群の運動機能評価（立ち上がり所要時間）

上がりは不能となった．べスタチソ投与例，とplacebo投与例とも経時的に立ち上がり所要時間

ベスタチソ投与をうけているCase8，7の方が起の延長が認められた．改善例は1例もなかった．

坐所要時間は短い傾向があったが，これは投与前③ 起坐所要時間（図8）：4歳以下では，使用前値でも同様であり，べスタチソの効果と断定する

よりべスタチソ投与群はplacebo投与群より低値ことはできない．

を示していたが，1年間終始P群より低値であっ④

た．5歳以上では，同じ運動機能レベルを有するが著明に変動し，placebo群を下まわる低値を示

症例どうLを比較すると，StageII−14のCase8

す場合が6回，上まわる高値をしめす場合が3回−123−

Case13，StageⅢのCase7とCase12で，血清CPK値（図9）：4歳以下ではCabe4

起坐所要時間（4歳以下）

起坐所要時間く5歳以上）

SeC
32

8

2

Placebo投与群0−−く〉0Bestatin投与群●一一

28

3

30

6

2

26

2

4

24

2

2

22

2

0
0

20

9

1

18

6

1

16

▲

1

﹁

14

1

▲

12

1

7
0

10

8

8

Ca〜eS

44

52
tVeeks

2

C■SO川

4

；憲子二：ミニ霊一一二。
Cas亡I

2

6

6
4

0

0

0

4

81216

20

24

28

32

36

40

48

0

4

81216

20

24

28

32

36

40

44

48

52
Weやks

durationallerbegnningof Bestatln

durationaIterbeginnin五〇†Bestatin

図8 Bestatin投与群，Placebo投与群の運動校能評価（起坐所要時間）
Bestatin投与によるCPKの変動（4歳以下）

Bestatin投与によるCPKの変動（5歳以上）

mU／m￡

mU′m2

lはP■acebo群の上下限

35000

18000

いまP■acebo群の上下限

16000

30000

14000

25000
12000

20000
口CaSe5

10000

l

15000

珊：蝿軸

ロ

8000

CaSe6

●Case4

10000
5000
0

6000

人こ．．．＿

4000
2000

0

4

81216202428323640444852

図9

0

weeks

0481216202428323640444852

weeks

Bestatin投与によるCPKの変動みられた．Case5も変動を示し，P群の下限以⑤下を示した場合が8回，上限以上を示した場合は同様の傾向があった．

Aldolase（図10）：4歳以下では，CPKと4回みられた．5歳以上の症例では，Case7で5歳以上では，Case6が終始P群より高い値を経過中CPKはP群より低値を示しており，Case

示す傾向にあったが，有意ではなかった．Aldolase

6，8ではP群と同様の動きを示す傾向にあった．

の変動幅は（図1トb），4歳以下のべスタチソ投

べスタチソ投与全期間のCPK値の平均値と標与例で大きい傾向にあった．平均値は4歳以下，準偏差を示すと（図11−a），平均値は4歳以下，5歳以上ともB群，P群の間で有意差はなかった．

5歳以上ともB群，P群で有意差はなかった．しかし標準偏差に関しては，4歳以下のベスタチソ

副

作

用

投与群で変動が大きい傾向にあった．5歳以上でCase2において，経過中1回／2退位の頻度では，べスタチソ投与，placebo投与にかかわらず，

腹痛を訴えることがあった．特に腹部の局所所見

CPK が高い例は変動幅も大きい傾向にあった．

なく，プロトコール終了後にべスタチソを中止し−124−

Duchenne型筋ジストtlフィー症に対するべスタチソの使用経験

二

Bestatin投与によるAldolaseの変動（4歳以下）

Bestatin投与によるAldoraseの変動（5歳以上）⁝3002502001
05001

恒placebo群の上関

160

▼

140
120
100
．

80
J u ■

60
40
20
0

04

81216202428323640444852

図10

weeks

04

weeks

b．Bestatin投与，Pracebo投与による血清
Aldolaseの変動

mU／m〜

lU 亡

25000

A】ddase250

20000

200

15000

150

川000

100

5000

50

0

81216202428323640444852

Bestatin投与によるAldolaseの変動

a・t3estatin投与．placebo投与による血清
CPKの変動CPIく

恒p■acebo群の上下限

lU／e

4

5

918

6

7

81112130

Case

BestaUnRaceb Bestatin Placebo

4

5

910

BeSbm Racebo

678111213Case

8e或aun RaCebo

図11Bestatin投与，Placebo投与による血清酵素の変動
a．CPK， b，Aldolase

た後も，症状は継続し，べスタチソ以外の原因がりむしろ増加する傾向にあった．また，臨床経過，考えられた．その他には，べスタチソによる副作

血清酵素値の変動と同様に変動する傾向もあっ用と考えられる異常は認められなかった．

た．さらに1日蓄尿と1回採尿の比較を行ない，外来において施行可能な簡易法として検討する価考

値はあるとの印象をうけた．

察

ベスタチソ投与中の尿中 3−メチルヒスチジン

1年間の Single blind 法によるべスタチソの量の測定は，従来1日蓄尿で行ない2，叫，5），小児

効果は，臨床的にはplacebo群の運動機能との差

で外来で行なうのに，困難な事も多い．今回われは明確ではなかった．血清CPK，Aldolaseなど

われは1回採尿法を3例のべスタチソ新規投与患の酵素値は，べスタチソ投与群の方が変動が著明者でおこない，3MeH／Cr比を調べた．全例で1な印象をうけたが，必ずしも低値を示すだけでは

日蓄尿時の正常範囲より高値を示していた．まなく，placeboより高値を示すこともあった．ア

た，べスタチソ投与により，1歳4カ月の例では

ミノべプチダーゼBおよび，ロイシンアミノべプ

placebo投与中より低下する傾向がみられ，6歳

チダーゼ活性を浩抗阻害する作用を有するべスタ

0カ月，7歳6カ月の2例ではplacebo投与中よチソは筋線維膜の表面に結合し，筋の崩壊を予防−125−

するのではないかと考えられている．べスタチソ

ではなかった．血清酵素値は4歳以下のべスを投与した4歳以下の2症例の血清酵素値の変動

タチソ投与群で変動が著明な傾向があり，必が著明なことと，べスタチソの筋線維膜に対するずしも低値を示すだけではなく，placebo群

保護作用の存在との関連性は不明である．血清酵より高値を示すこともあった．

素値の変動が，発育による運動機能の猛待段階に
文ある低年齢群における，べスタテン投与による変動なのか，または単なる個体差なのかという検討には，今後の低年齢群の全国的な症例の蓄積が必

献1）Berridge，B．J．Jr．，Chao，W．R．and Peters，J．H．：Analysis of plasmaand urinary aminoacids byion−eXChange column chromatog−

raphy．J．Ctin．NuETit．24，934（1971）．
2）Elia，M．，Carter，A．，Bacon，S．，Wineals，C．G．

要であると考える．

and Smith R．：Clinicalusefulness of urinary結1）3−methylhistidine excretioninindicating

語

muscle protein breakdown．Br．Mcd．J．282，

7歳以下のDMP13例に対してべスタチソを経口投与し，検討した．

2）尿中3−MeH／Crは，3例で測定した．1歳5カ月の例でPlacebo投与期間中よりベスタ
チソ投与期間中の方が低下する傾向にあった．また6歳0カ月，7歳6カ月の2例では351−4（1981）．

3）熊谷俊幸，竹内達生，原紀美子他：小児神経疾患の尿中3−メチルヒスチジン，脳と発達16，445−
9（1984）．

4）Ballard，F．J．，Tomas，F．M．andStern，L．M．：
Increased turnoverof musclecontractile pro−teinsin Duchenne muscular dystrophy asassessed by3−methylhistidine and creatinine
excretion．Ctin．Scl．56，347−52（1979）．
5）Mussini，E．，Cornelio，F．，Colombo，eL al．：

むしろ増加する候向にあった．

Increased myo丘brillar protein catabolismin

3）1年間のSingleblind法によるべスタチソの効果は，臨床的にはplacebo群との差は明確−126−

Duchenne muscular dystrophy measured by
3−methyl histidine excretionin the urine．
〟〝5CJe肋rpg．7，388−91（1984）．

Duchenne型進行性筋ジストロフィーに対する
ベスタチンの効果

木 下 英 男1）
共同研究若 里菅栄二郎2），福山幸ガ），三吉野産治4），村上慶肝）表1研究参加施設

ベスダチソが筋疾患の治療薬として有効である
ことは動物実験で確かめられている1）が，ヒトで

施

設

名

研究担当者

は未だ正確なデークーはない・われわれは従来か

国立療養所八雲病院

南良二

ら種々の筋萎縮症疾患に本剤を用いて釆たが，最国立療養所西多賀病院

佐藤元

近の共同研究では2），Duchenne型筋ジストロフ

国立精神・神経セソタ一

里書栄二郎

東邦大学医学部付属大橋病院第四内科 木下 英男

ィー患者のうち若年者に有効性が示唆されたの

東京女子医科大学病院小児科

で，今回，同症若年者に限定して本試験を実施し国立療養所箱根病院

福山 幸夫
村上 慶郎

た．

国立療養所中部病院

祖父江逸郎

国立療養所鈴鹿病院

飯田 光男

国立療養所刀根山病院

姜進

国立療養所宇多野病院

西谷裕

表1に示す15施設の外来及び入院Duchenne

国立療養所原病院

亀尾等

型筋ジストロフィー患者を対象とした・試験開始

国立療養所徳島病院

松家

豊

国立療養所西別府病院

三吉野産治

熊本大学医学部附属病院小児発達科

三池 輝久

鹿児島大学医学部附属病院第三内科

井形 昭弘

1．方

法

時5歳未満をA群，5−8歳未満をB群とし，両群共に対照群と実験群に分けた．種々な条件を設けて対象としての適格性を検討の後，登録センター
において番号順に実験群，プラセポ群に分けた．実2．成績

験群にはA群に対して1日150mg，B群に対し9カ月終了の時点で表2に示す症例数となってて1日300mgを3回に分服授与し，対照群にはいる．これらについての年齢，症状，既往歴，併

外観，味，においなどの識別不能な剤型とした乳用薬，合併症，発育歴などの背景田子はいずれも糖を授与した．研究期間は52週間とし，そのう

対照群，実験群の間で有意差のないことが確認さ

ち亜週間までの成績が本報告書に集計された．

れた．

効果を判定する調査項目としては，運動能，筋試験期間中の調査項目の変動については，詳細力，血清酵素値など図1に示す調査表を用いた・

は省略し，概略のみを示す．試験開始時を0とした場合のその後の変化を主な所見について表す

1）東邦大学2）国立精神・神経センタ
3）東京女子医科大学
4）国立療養所西別府病院
5）国立療養所箱根病院と，図2〜4のようになる・
有意な改善を示したのはA群のみで，階段昇り
姿勢，降り姿勢，上腕三頭筋，抗骨，膝蓋などの
−127−

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Duchenne型進行性筋ジストロフィーに対するべスタチソの効果
表2

登録及び解析症例数A群
5歳未満
50mgx3／日投与
べスタチソ

登録症例

25

9ケ月中間解析症例

25

プラセボ

B群
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べスタチソ

27

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A群＋B群

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図2 臨床所見の変化（1）脛反射，頚筋背屈，股関節屈曲，同伸展など24

ないが，血清LDH及びCPK活性で対照群より

項目中8項目で対照群に優る成貴が見られた．し

低値を示している．

かし足関節の筋力は特に底屈において悪化が見ら副作用としては僅かに消化器症状を示す例があれ−た．これに対してB群では起立動作，動揺性歩ったが（蓑3），全体としては重篤なものはなく，行，挟骨腔反射，肘関節伸展，手関節屈曲，股関本剤の安全性にはとりあえず問題はないと判断さ

節屈曲，同伸展，膝関節屈曲，同伸展など9項目れた．

で一時的あるいは最終調査時点で対照群に劣る結果が出ている．また諸検査数値の変化としては図3．考

投5−8に示す通りで，有意差としては20m直進

Duchenne型筋ジストロフィーの筋中にカルシ

走行時間，階段昇り時間，同降り時間，仰臥位かウム依存性中性プロテアーゼの活性上昇が知られら座位への時間などいずれもA群で対照に優る結て以来，プロテアーゼ阻害剤が治療剤として有効果を示している．B群ではこれらに大きな変化はではないかとの考えがいわれて来た．べスタチソ

ー129−

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もプロテアーゼ阻害作用を有するために有効であする作用も正確には未知の機序によるものであると考えられているが1），免疫性疾患に効果を有る・今回の観察では5歳未満の若年群で，階段昇する可能性も知られており，ジストロフィーに対り姿勢など6項目の日常運動機能，頸筋，股関節−130−Duchenne塑進行性肪ジストロフィーに対するべスタチソの効果
体轟（B椚）

かm鮎■走行印（▲椚）却m改進走行時間（別m

馳？l
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精良葬り時間（All）〜1

Sll血lトes ●：P旬．（61叩旬．1

抄29

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図6 同（5）筋の筋力改善，3つの腱反射において対照群に比チソ効果は若年のみに限られることが明らかとな校して有意の成績が見られた．しかし5−8歳末った．このことが何を示唆しているのかは不明で

蒲の年長群ではこうした傾向は見られず，べスク

あるが，少くとも二つの可能性が考えられる．ひと−131−

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勝信霊（A㈹■l脾清曽（BII）

図8 同（7）つは本剤が早期の筋ジストロフィー症の筋破壊過つの可能性は，この時期の小児はたとえ筋ジス．ト

程に効果を有する可能性である．しかし筋破壊量

ロフィーであれ，疾患の進行よりも自然の発育ののひとつの目安と見なされている血清中の筋逸脱方が優り，運動機能は向上の一途をたどるが，べ酵素はベスタチソ投与によって有意な影響を受け

スタチソ投与によりこの発育曲線が多少とも正常ていないことを考えるとこの可能性は必ずしも重に近くなるのではないかということである．20m

要視できず，今後の検討が必要である．もうひと

直進走行時間，階段昇降時間の変化（図5）など−132−

Duchenne型進行性筋ジストロフィーに対するベスタチソの効果
表3 副 作 用
No．

状

発現時期

程 度

薬剤との因果関係

4

A
1

5
6

A B
6
2
1

ベスタチ・ソ症

し無明 り し 明 明 明∵明＝明 明

不有無 不 不 不 不 不 不度度
皮虔虔 度度 度等等 圧
盤軽軽軽軽軽中中軽

手の浮腫
下痢
下痢
下痢
掻痔感
下痢

度
等
中

14A l
3B 5
3B 6
8B 4＊
12B 4
16B 3

遇

8A 3
12A 2

食欲不振
腹痛
発疹
嘔吐，下痢，発熱

遇

下痢
下痢，腹痛
異常痛

爛凋調川柑柑凋柑摘帽⁝凋澗柑闇

3A 5
8A l

＊：副作用により中止

を見るとその可能性が推測される．ではこの運動授与して対照群と比較した．5歳未満の患児では横能発育正常化の機序は何かとなるとこれも現時

階段昇降姿勢，頸筋，股関節筋の改善を認め，20

点では不明であるが，筋自体に対する作用か，他

m直進走行，階段昇降，仰臥位から起坐などに要の全身性作用か今後充分検討を重ねる必要があする時間も短縮した．以上の結果から本剤が筋ジる．血清LDH，CPKの変化（図7）を見ると，

ストロフィーの治療薬たり得る可能性が存在する

値そのものに有意差はなくても変動の幅が小さくと推定した．

なり，比較的一定してくる傾向も見られ，生体における何らかの安定化傾向をうかがうこともできる．筋ジストロフィーに対する本剤長期投与による生体中の代謝サイクルの変化3）とも考えあわせ，今後の研究が期待される．

結語

Duchenne型筋ジスト。フィーにべスタチソを

−133−

文

献

1）Tsuji，S．and Matsushita，H．：Successfultreatmentofmurinemuscular dystrophywith
the proteaseinhibitor bestatin．J．Neurol．
gcfリ72：183（1986）．

2）里書栄二郎ほか：Bestatin臨床応用の歩み，未刊行
3）Aoyagi，T．ei al．：Bestatin suppresses theSerumlevels of several hydrolytic enzymes
in a patient with progressive muscular dys−
trophy．√C〟れβわCカgm．Ⅳ〝れ1，65（1986）．

低分子酵素阻害物質による難病治療薬の開発研究班
分担研究者一覧
氏

名

所

属

所

在

地

電話番号

T

班長 江橋 節郎 岡崎国立共同研究概括
生理学研究所

444 岡崎市明大寺西郷中380564−54−1111
0564−53−7345

班員 大倉 洋甫 九州大学薬学部
薬品分析化学教室

812 福岡市東区馬出3−1−1

092−641−1151〝 藤井 節郎 大阪基礎医学研究奨励会

520−01大津市唐崎ト1−1
141東京都品川区上大崎

0775−79−2280（直）幹事 青柳 高明 微生物化学研究所・酵素研究部

内6151
03−441−4173

3−14t23

班員 大関 正弘 大正製薬株式会社総合研究所

330 大官市吉野町1−403

0486−63−1111／／ 川島 誠一 東京都老人総合研究所
生化学部臨床第一研究室

173 東京都板橋区栄町35−2

03−964−1131〝

113 東京都文京区本郷7−3−1

03−812−2111〝 鈴木 紘一 東京都臨床医学総合研究所
退伝情報研究部

113 東京都文京区本駒込03−823−2101

幹事 勝沼 信彦 徳島大学医学部附属
酵素研究施設酵素化学部門
班員 丸山 工作 千葉大学理学部生物学科

770 徳島市歳本町3−18−15

0886−31−3111

260 千葉市弥生町ト33

0472−51−1111

／／ 辻

640

0734−31−2151

向山 光昭 東京大学理学部化学科
有機化学第二講座

内351

内3068
内4343

3−18−22

繁勝 和歌山県立医科大学
第二生理学教室

和歌山市9番丁9〝 里舌栄二郎 国立精神神経センター神経研究所 187 小平市小川東町4−1−1

260 千葉市弥生町1−33

監事 北川 晴雄 千葉大学薬学部
薬効・安全性学講座薬物学

105 東京都港区酉新橋3−25−8
班員 福原 武彦 東京慈恵会医科大学
第二薬理学教室
幹事 杉田 秀夫 国立精神神経センター神経研究所 187 小平市小川東町4−1−1
疾病研究第一部

内2550
内2622

内319
0423−41−2711
0472−51−1111

内2711−2
03−433−1111

内2255
0423−41−2711

班員 矢崎 義雄 東京大学医学部内科学第三133 東京都文京区本郷7−3−1

03−815−5411〝 官武951新潟市旭町通一番町757

0252−23−6161

国立療養所東埼玉病院第三内科
国立療養所箱根病院
国立療養所西別府病院

349−01蓮田市大字黒浜4147
250 小田原市風祭412
874 別府市大字鶴見4548

0487−68−1161

東京女子医科大学小児科教室
東邦大学医学部附属大橋病院
第四内科
班友 伊藤 信平 日本化薬株式会社医薬事業本部

162 東京都新宿区河田町8−1
153 東京都目黒区大橋2−17−6

03−353−8111

102 東京都千代田区富士見03−237−5154

正 新潟大学脳研究所神経内科／／ 石原 博幸／／ 村上 慶郎〝

三青野産治

〝 福山 幸夫
幹事 木下 英男

内8274，8278

内5180
0465−22−3196
0977−24−1221

03−468−1251

1−11−2

〝

岩城

正広

〝

今期

和友

鳥居薬品株式会社研究所
株式会社三菱化成生命学研究所−135−

272 市川市南八幡3−14−3
194 町田市南大谷110473−78−4121
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