医薬品開発等に役立つ特定分子の生細胞内での機能解析法
国立研究開発法人 情報通信研究機構
フロンティア創造総合研究室
研究マネージャー 小林 昇平
2019年7月18日
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生きた細胞への物質導入
Ø生きた細胞（生細胞）への物質導入は、様々な分野の研究開発で使われる基盤技術
例）• 遺伝子導入（遺伝子組換え）実験• 病原体感染経路の解析• 薬剤スクリーニング 等①薬剤等の外来物質の細胞への導入機構の解明や、②その作用機構（細胞応答）の解明は、効率良い（副作用の少ない）医薬品の開発等に貢献すると考えられる
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従来技術とその問題点
例①. 生細胞への外来物質（薬剤等）の導入実験
外来物質
細胞内反応

薬剤DNA・・・※DDS分野で用いられる物質の多くはf150 nm以下

細胞への導入？
ブラックボックス

結果の観察
数時間〜数日外来遺伝子発現、細胞生存率 等

ü 外来物質が小さい場合、生細胞内への導入（侵入）過程および導入直後の細胞内動態解析が困難
ü 外来物質側の反応（形態変化等）と、細胞側の反応との区別が困難
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従来技術とその問題点
例②. 試験管内反応系を用いた特定分子の作用機構の解析
生体分子結合ビーズ（DNAビーズ等）

ATP, Ca2+ü 生細胞内環境での反応を反映しているかどうか不明
ü 使用可能な実験材料（細胞種等）が限られる

アフリカツメガエル
卵抽出液（卵をすりつぶして調製）

ビーズ表面で起こる核膜形成を解析

ü 細胞へ与える影響を直接調べることはできない
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人工ビーズを用いた新しい実験系の開発
生細胞内環境でビーズ周囲に望みの細胞内現象を再構成させる

生きた細胞

In vivo+
In vitro
生体分子（DNA、タンパク等）

導入

顕微鏡法による観察
特徴

人工ビーズ（ポリスチレンビーズ等）

・生細胞内環境で計測可能・条件設定が自在・観察が容易（ビーズを目印に）
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ビーズの導入過程の可視化とオートファジー誘導
脂質コートした
pHセンサー結合
ビーズ

HeLa/GFP-LC3（安定発現株）
細胞外（培地中）

細胞膜
細胞内

エンドソーム内の酸性化（pHセンサー陽性）

pHセンサー
蛍光の消失

細胞質
pH〜7

約5分
GFPLC3
Green：GFP-LC3, Red：pHセンサー (every 30 sec, total 2 h）

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DNAセンサー分子（BAFタンパク質）に検出されてから1時間後のDNA結合ビーズのCLEM観察結果
電子顕微鏡像
核膜様の膜構造

細胞核重ね合わせ

BAF

オートファジーDNA

蛍光像

オートファジー

Kobayashi et al.,
PNAS, 2015

DNA結合ビーズ周囲に核膜様の膜構造が形成されており、ビーズはオートファジーを回避していた。
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外来DNAがオートファジーによる分解を回避するメカニズム
非貪食細胞

DNA
ビーズ細胞への導入（取り込み）

コントロールビーズ

エンドソーム崩壊後~ 1 min

エンドソー
ム内

エンドソーム崩壊後~ 10 min

最終的な運命オートファジーによる捕捉（分解）

ビーズが細胞質内に露出（侵入）Kobayashi, et al. (2010) Autophagy 6, 36-45.

BAFの働きにより外来DNAはオートファ
ジーを回避
DNAセンサー分子（BAF）が外来DNAを即座に検出
DNA BAF

核膜様の膜構造

やや遅れてオートファジー開始
Kobayashi, et al. (2015) PNAS 112, 7027-32.

エンドソーム膜

オートファジー膜構造

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新技術の概要
Ø バイオ薬品、病原体等の外来物質が細胞に入ったときに起こる細胞応答を人為的に誘導・観察する方法
Ø 具体的には、標識した目的分子を有する細胞に、標識を特異的に認識する分子を付けた微小ビーズを導入し、ビーズに集積した目的分子の周囲で起こる細胞内膜構造の形成過程を観察

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新技術における実験系の概要
抗GFP抗体結合ビーズ

GFP等で標識された目的分子を保持する細胞標識を特異的に認識する分子（抗GFP抗体等）

トランスフェクション試薬

ポリスチレン
ビーズ等

エンドソーム酸性化
エンドソーム崩壊〜3 µm

生細胞内環境において、目的分子を特異的にビーズ表面に集積させ、その周辺で起こる細胞応答を観察する
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生細胞への生体分子結合ビーズ導入・観察法
生体分子結合ビーズ（抗GFP抗体結合ビーズ等）
目的分子を保持した細胞（例：GFP-BAFを発現するHeLa細胞）
37℃, 1 h

Remove unattachedbeads

Incubate at 37℃

蛍光観察※CLEM: correlative lightand electron microscopy

Attached(extracellular)
GFP-BAF
陽性ビーズ

蛍光観察したのと同じビーズを電子顕微鏡観察（CLEM法）

Incorporated(intracellular)

免疫染色法による特定因子の局在解析
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生細胞内へ導入したビーズの表面への目的分子の集積

細胞核

陰性

陽性

10 µm

細胞質に存在する抗GFP
抗体結合ビーズの表面にGFP-BAFが集積

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ビーズ表面に集積させる目的分子に応じた膜タンパク質(emerin)の局在の有無
AB

生体分子結合ビーズ
抗GFP抗体ポリスチレンビーズ(f 3 µm)
生細胞への導入（トランスフェクション）

GFP-BAF
HeLa/GFP-BAF(GFP-BAF)

GFP

HeLa/GFP(Control)※emerinはBAFへの結合能を有することが知られている膜タンパク質C

GFP-BAFを集積させた場合のみ、ビーズ周辺にemerinが局在

13生体分子結合ビーズ周辺に形成された膜構造のCLEM観察結果
蛍光像

電子顕微鏡像
拡大図

模式図
膜構造

GFP-BAF
Control（GFPのみ）

ビーズ表面に集積させた目的分子

全体像

B

B

目的分子依存的に形成された
膜構造

オートファジー
関連膜構造※白抜き矢印は、ビーズに集積させた目的分子（ここではGFP-BAF）と思われる電子密度の領域を示す。

Kobayashi et al., PNAS, 201514

集積させる分子の種類に応じた膜構造の形成制御
ビーズに集積させた目的タンパク質
Ran

Importin-b

電子顕微鏡像BAF

100 nm

100 nm

100 nm

模式図

bead
bead

bead

RanやImportin-b等のタンパク質を集積させた場合には、核膜孔複合体様の構造体（矢印）を含む膜構造がビーズ周辺に形成された。
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新技術の特徴• 「生細胞内環境」において目的分子が集積したビーズを作製し、その機能を調べることが可能となった。
• 生細胞内の「特定位置（ビーズ表面）」での解析が可能となった。
• 目的分子の種類に応じた「細胞内膜構造の作り分け」が可能となった。
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従来技術との比較• 細胞内膜構造の人為的な形成誘導・解析に関して、従来技術では主に細胞抽出液等の試験管内反応系が用いられてきた。
• 本技術は、以下の点で従来技術にはない特徴を有する。
1. 生細胞内の特定位置（ビーズ表面）に目的分子を集積させ、2. その分子に応じて起こる細胞応答（細胞内膜構造の形成等）を人為的に誘導し、3. 一連の過程を「生細胞内環境」において解析できる
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想定される用途• 生細胞内環境における特定分子の機能解析（ビーズに集積させた因子、予めビーズに結合させておいた因子の機能解析等）• 生細胞への効率的な物質導入試薬のスクリー二ング• 細胞生物学研究における基盤的な研究ツールの提供（外来物質の細胞内運命の解析、核膜形成機構の解析等）

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実用化に向けた課題• 本技術を用いた目的分子の集積及び細胞内膜構造形成については、HeLa細胞を用いた実験まで検証済み。
→ 他の細胞種への適用については、実験条件の最適化が必要。

• ビーズ導入法自体については、マウス胚性線維芽細胞（MEF）への適用例あり。
→ Tsuchiya, et al. (2018) FEBS Open Bio 8, 470-480.

• 生体分子結合ビーズを使った細胞内膜構造（核膜）形成については、マウス卵での実施例あり。
→ Suzuki, et al (2019) Sci. Rep. 9: 8461.
19企業への期待• 培養細胞を用いた薬剤スクリーニングを実施している企業には、本技術の導入により、新たな指標でのスクリーニング法を提供可能と思われる。

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本技術に関する知的財産権• 発明の名称• 出願番号• 公開番号• 出願人• 発明者：細胞内膜構造形成方法および細胞内膜構造観察方法：特願2015-126296：特開2017-6070：情報通信研究機構：小林 昇平、原口 徳子

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問い合わせ先
情報通信研究機構
イノベーション推進部門知財活用推進室
技術移転コーディネータ 三和 祐一
ＴＥＬ
ＦＡＸ

０４２－３２７－６９５０
０４２－３２７－６６５９

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