Rasを標的とする革新的抗がん剤の開発
岐阜大学

大学院連合創薬医療情報研究科
助教 本田 諒2021年7月15日

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研究背景①
 全がんの20～30%がRAS遺伝子（HRAS, KRAS, NRAS）に活性型変異を有している。
 しかし、RASは創薬困難な標的である。

低分子化合物

RAS

抗体・従来のタンパク質医薬“GreasyBall”

RASシグナル伝達系
がんの発生・生存・増殖↑

RAS阻害剤の開発には「RAS結合性」と「細胞膜透過性」の両立が必須
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研究背景➁ RASシグナル伝達系の阻害剤
Nat Rev Drug Discov. 2020: RAS-targeted therapies: is the undruggable drugged?

RAS阻害剤EGFR阻害剤

RAF阻害剤
MEK阻害剤

p110(PI3K)阻害剤
mTOR阻害剤3

研究背景③ RAS阻害剤の開発概況
分類

詳細

RASプロセシング阻害剤

低分子 翻訳後修飾酵素（farnesyltransferase）を阻害す
るため、RAS以外のタンパク質にも作用する。
 2000年頃から臨床試験が行われているが、有害事象の発生のため中断したものが多い。

アレル特異的阻害剤

低分子

 KRAS-G12C変異型（全体の約10%）のみに作用する薬剤
 現在最も注目を集めている。2021年5月にルマクラスがFDAで承認。売上高は20億ドルに達すると見込まれる。

KRASアンチセンス鎖核酸

 ドラッグデリバリーシステムに課題があり、埋込型カプセルなどが評価されている。

現時点で、G12C以外の変異型RAS（non-G12C）を阻害する薬剤はない。
（ただし、Mirati社やRevolution Medicine社が non-G12C 阻害剤を開発し、臨床試験申請間近と発表している。）

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研究背景④ なぜG12C阻害剤は成功したのか？
● KRAS-G12CとAMG510の共結晶構造（PDB: 6OIM）
G12C
G12C阻害剤は、変異したCys残基と共有結合を形成することで、結合ポケットのないRASにも強く結合できる。

共有結合

AMG510低分子化合物の弱点である「RAS結合性」の克服に成功

しかし、共有結合を形成しにくい他の変異型RAS（G12D、G12Vなど）に同じ戦略を使うことは難しい
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本発明のコンセプト
RAS結合ドメイン（RBD）と細胞膜透過性ペプチド（CPP）の融合により、RAS結合性と細胞膜透過性の両立を図る。
RBD (RAS-binding domain)o RAS-effectorタンパク質の一部分
o RASに特異的に結合
o ユビキチン様の立体構造をもつ**Inomata et al., Nature 2009で CPP付
きユビキチンが細胞膜を透過するとの報告

CPP (cell-permeable peptide)o 高分子の細胞膜透過性を向上させる
10アミノ酸程度の短ペプチド
o 数百種類が知られているが、優劣関係は不明
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RBDとCPPの組み合わせ最適化

11 peptides × 12 proteins

Western blotting (ERK/AKTのリン酸化）とNanoBiT luciferase assay の二つで評価
Ala mutants of Protein-A, B, C

がん細胞に投与してRAS阻害活性を評価

3~6 個の融合タンパク質がヒット
アラニン変異解析による特異性・非特異的細胞毒性の評価

新規RAS阻害剤の同定（Pen-cRaf-v1）

p-AKT + p-ERK levels(relative to vehicle)

51個の融合タンパク質を合成

Protein-A, B, C
Luminescence(relative to vehicle)

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Pen-cRaf-v1の基本的性質・活性など
基本的性質 [クラス]: リコンビナントタンパク質 (MW≈15 kDa)、大腸菌発現系を使用
 [開発ステージ]: リード最適化段階
 [適応症]: すべてのRAS変異型がん活性など
 培養細胞モデルにおいて、すべての変異型RASをIC50≈10 µMで阻害する
 高い標的特異性をもつ（transcriptome解析とアラニン変異解析で証明済み）
 KRAS-GTP型にKd=32 nMで結合、KRAS-GDP型にKd=1.9 µMで結合
 KRAS-GTP型との共結晶構造が決定済み
 マウスモデルでの活性は確認できていない
 主要論文をCell姉妹紙で発表（T Nomura et al., Specific inhibition of oncogenic

RAS using cell-permeable RAS-binding domains, Cell Chemical Biology, 2021）
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Pen-cRaf-v1のRAS阻害活性（1）●等温滴定カロリメトリー（ITC）

活性型KRAS（GTP）にKd=34 nMで結合

RAS結合に関わる2アミノ酸をアラニン● Western blottingに置換したネガコン

RAS下流分子のリン酸化を
IC50 = 6–11 μMで阻害

9Pen-cRaf-v1のRAS阻害活性（2）● NanoBiTⓇ assay• non-G12C含めたすべての変異型RASを阻害できる。
• BI2852 と同程度の活性●がん細胞の生存率

すべてのRAS変異がんの生存率を減少

10Pen-cRaf-v1の細胞膜透過性●共焦点顕微鏡像●改変型NanoBiTⓇ assay

Pen-cRaf-v1にCy3蛍光色素を付加して、共焦点顕微鏡で局在を解析

o 細胞質内でLgBiT-KRASを発現させ、 SmBiTタグ付きPen-cRaf-v1を投与
o 発光強度から細胞内へのデリバリー効率を推定
細胞内へのデリバリー効率は4～10%程度

11Pen-cRaf-v1の in vivo 活性と血中安定性●がん細胞移植マウスへの尾静脈投与(Colon-26)●尾静脈投与後の血中安定性

30 mg/Kg

血中安定性を改善し、in vivo 活性を示すことが最重要課題
12新技術の特徴・従来技術との比較• 従来技術では困難であったnon-G12C変異型RASにも有効な阻害剤を開発した。
• 本剤は抗がん剤としてはまだ開発初期段階であるが、あらゆる変異型RASを阻害できるため、全がんの20~30%に適応可能な革新的抗がん剤に発展する可能性がある。

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想定される用途• 抗がん剤
• RASシグナル伝達系の研究ツールとして使用

14実用化に向けた課題• 現在、培養細胞モデルでRASの特異的阻害と抗がん作用を確認できているが、マウスモデルでは未確認。
• 今後、Pen-cRaf-v1を基本骨格とする誘導体を多数合成し、マウスモデルでの活性の証明を目指す。その後非臨床試験を実施する。

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具体的な開発計画
Pen-cRaf-v1のアミノ酸配列：

Penetratin (CPP)

MRGSHHHHHHGMASLVPRGSMRQIKIWFQNRRMKWKKGSTMSGYPYDVPDYAGSMGPSKTSNTIRVLLPNQEWTVVKVRNGMSLHDSLMKALKRHG
LQPESSAVFRLLHEHKGKKARLDWNTDAASLIGEELQVDFL
cRaf-v1 (RBD)
開発計画
N末端領域

・最適化

リンカー領域・最適化

cRaf-v1領域

・ファージディスプレイによる結合親和性↑
・-S-S-結合導入による安定性↑

C末端領域・第二のCPP付加により細胞膜透過性↑

タンパク質に化学的修飾を加える

・リポソーム化、PEG化による安定性↑
・PROTAC化（RAS分解性の付加）

赤字は発明者側では実施困難なため、共同研究を模索している。
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企業への期待• ファージディスプレイ、DDSの技術をもつ企業との共同研究を希望。
• また、抗がん剤・タンパク質製剤・ペプチド製剤を開発中の企業には、本技術＜細胞膜透過性融合タンパク質＞の導入が有効と思われる。

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本技術に関する知的財産権• 発明の名称 ：人工タンパク質、Ｒａｓ阻害剤及び抗がん剤• 出願番号：特願2020-137653• 出願人：国立大学法人東海国立大学機構• 発明者：本田諒、赤尾幸博
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お問い合わせ先
岐阜大学
学術研究・産学官連携推進本部
ＴＥＬ ０５８－２９３－ ２０２５
ＦＡＸ ０５８－２９３－ ２０２２
e-mail chizai＠gifu-u.ac.jp

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