厚生

省

神経疾患研究委託費

筋の発生と分化に関する

基礎的研究
江

橋

三旺

昭和57年度研究報告書

昭和58年3月

目

次筋の発生と分化に関する基礎的研究班・総括報告

3

江

Ⅰ

橋

節

郎

筋移植と成長1．ジストロフィーハムスターと正常ハムスターの筋の交換移植についての研究

9

寺

尾

寿

夫

2．ジストロフィーおよび正常チキンにおける長橈側手根伸筋の交換移植
15−組織学的変化−
大

塚

正

徳

3．筋ジストロフィー症マウスと小人症マウスの骨格筋の未熟度

19

戸

Ⅱ

微

細

形

塚

武

態

4．骨格筋の小窩について

31

岩

崎

祐

三

5．細胞骨格の分化発達 −中間径フィラメントの存在様式

35

石

川

春

律

Ⅲ 細 胞 培 養

6．サテライト細胞の培養

41

香

川

務

7．ニワトリ胚抽出物中の筋芽細胞増殖促進因子

47

小 沢 鍈二郎

ⅱ

8．培養骨格筋における活動電位の発達に関与する神経性因子

52

加
Ⅳ

生

理

濃

正

明

学

9．骨格筋の発達過程の機能的，形態的追跡−鶏胸筋の正常とジストロフィー筋の比較−

59

堀

田

健

10．筋細胞膜における膜興奮機能の発生

65

高 橋 国太郎

11．除神経による活動電位の誘発

73

栗 山

熙

12．ジストロフィーハムスターの心臓機能と骨格筋々小胞体のCaの取り込み能に関する研究

76

酒

井

敏

夫

13．両生類骨格筋の遅筋と速筋：筋小胞体の性質と比較

80

遠

Ⅴ

生

化

藤

実

学

14．培養筋細胞のアセチルコリンレセプターの代謝91

萩 原 彌四郎
15．アセチルコリン受容体に対するモノクローナル抗体

94

杉

山

博

之

16．筋発生に伴なうミオシン分子isoformの変化

98

江

橋

節

郎

17．鶏ジストロフィー筋におけるC−蛋白質分子種の変化

102

大日方

昂

ⅲ

109

18．培養骨格筋および心筋細胞におけるトロポニンの分化嶋田裕

19．筋ジストロフィー症鶏浅胸筋の筋線維構成蛋白−筋ジス遺伝子の白レグ鶏への導入−

114

野々村

禎

昭

20．ジストロフィー鶏および正常鶏の発生過程におけるEF2
122

およびNAD含量の変化
真

崎

知

生

127

21．可溶性コネクチン
丸

山

工

作

22．骨格筋細いフィラメント上のトロポニンの局在及びハイブリッド
131

トロポニンの性質の検討
大

Ⅵ

槻

磐

男

プロテアーゼ137

23．筋発生分化におけるプロテアーゼの役割
今

堀

和

友

24．サル心筋Ca依存性中性プロテアーゼの性状と阻害物質の影響
高

141

橋

健

治

25．筋ジストロフィー・ハムスターにおけるリソゾームプロテアーゼ

活性調節の異常

145

勝

沼

信

彦

149

26．培養筋細胞における筋蛋白代謝
杉

田

秀

夫
153

27．筋ジストロフィー患者の血性酵素にみられる2種類の動態
青

柳

高

明

ⅳ

28．筋ジストロフィー症マウスに対する微生物プロテアーゼ・
インヒビター投与の影響

157

松
Ⅶ

関

連

領

下

宏

域

29．高分子物質の細胞内注入法の工夫

167

岡

田

善

雄

30．細胞接着分子と細胞収縮

168

岡

田

節

人

31．体幹部神経堤細胞からの間葉組織の分化

170

仲

村

春

和

筋の発生と分化に関する基礎的研究班・総括報告

筋の発生と分化に関する基礎的研究班
総 括 報 告班長 江 橋 節 郎

総論

ろ。こ、に於いて我々は本疾患の研究に於いて如本研究班では，筋ジストロフェー症という疾患

何にして分化が行われるかという発生生物学の基名を表面的には班の名称としては唱っていない。

本問題として広くとり組まれている問題の他に，

しかし我々の目的は，筋ジストロフィー症の病因

分化した状態が如何にして保たれているかというを現代の基礎医学，生物学の基盤において解明す問題が重要なものとして認識することになる。

ることを当面の目標としつつも，終局的には本疾第二点は，分化した状態の崩壊に対する別の面

患の根本的治療法確立と根絶を期するものである。

からの見方である。上述の分化の「若返り現象」

筋ジストロフィー症の研究の基礎として筋の発が遺伝子発現の質的な制御の乱れであるならば，生と分化の問題が重要であることは，世界的に広この場合は割り切三た言い方をすれば量的な乱れく認められて既にかなりな年月が経つが，その重である。健康な筋細胞がその正常な姿を保ち機能

要性は益々大きくなって来ている。この趨勢は，を発揮するためには，一定量の蛋白質が常に合成

1982年秋に開かれた第5回筋神経疾患学会のシされると共に分解されていくことが必要である。

ンポジウム，一般演題さらには教育講演などから

すなわち蛋白質の代謝が厳重なバランスのもとにも明瞭に読みとることができる。それでは何故に遂行されていることが要求される。これらの制御

本疾患の研究のために筋の発生や分化の問題が重は究極に於いては遺伝子の発現の問題であろうが，要なのであろうか。大きくいって三つの点があげ

筋ジストロフィー症羅患筋に於いては筋蛋白質代られると思われる。

謝の乱れが存在する。すなわち羅患筋に於ては，第一点は，本疾患では既に筋の発生期からはか蛋白質の合成が促進されているにも拘らず，分解なりの年月を経ているにも拘らず羅患筋に筋の発がそれを上まわっているという事実が知られてい生期に見られるような種々の現象がみられることる。このことは常識的には蛋白分解酵素作用の元である。このことは想像の翼を伸ばすと筋の分化進状態があって，それが分化の安定性を乱す要因が充分でないことに病因を求め得るかもしれないの一つとなっていることが考えられる。病的な機という期待を持たせたし，またそれを示唆する報転をこのような立場からみる時，逆に正常な筋は告も行われても来た。しかしながら我々の班員は，如何にして量的にも分化した状態を保つかを探る

全く新しい事実を過去においで観察している。すことが，本疾患研究への一つのアプローチになる

なわちジストロフィー筋では分化の停滞があるとであろう。

いうよりは，一度正常のように分化するにもかか

第三点は筋の再生の問題である。本疾患の過程

わらず何らかの原因によって分化し．た状態を保ちに於て再生がみられることは周知の事実である。

得ず，再び幼若時代に類似した状態に戻るのであいうまでもなく再生は筋の衛星細胞が活性化され4て増殖し，新に筋線経を形成するか，既存の筋線

フィーニワトリの胸筋を用いてC蛋白の動態を検経にとり込まれて行く過程である。多くの考えで討した。C蛋白にも遅筋型と速筋型とがあり，幼は，衛星細胞は，発生時期の筋芽細胞が活動を停

若細胞は両型のC蛋白を持つが，成長と共に遅筋止して筋線経に接触して存在するものである。こ型は消失する。これに対して筋ジス細胞では一且れが再生の時に如何にして活性化されるかは，発はヾ消えた遅筋型が再び多く作られることを示し

生生物学の根本問題の一つである。もしこの活性た。これはかつて野々村らがトロポミオシンで示化の本態が分かれば，不幸にして再生が停止あるしたのと同じ現象で，筋ジス細胞が幼若期に於けいは相対的に低下する本疾患の進行期の問題を解る遺伝子発現を再現している可能性を示唆するも明するのに大きな力を示すであろう。

のである。

第二点で述べた分化を保つために必要な要因，

野々村は，野村班菊地によって開発された白レ

また第三点で述べた再生を促すための要因を物質

グ筋ジス鶏が劣性遺伝であることをふまえて，ヘの形で把握できるならば，それは終局の目的であテロに筋ジス遺伝子をもつニワトリでは，上記のる治療法の確立に何等かの光を与えることになる遺伝子発現の幼若化が起こりにくいことを示し，であろう。

筋ジス発症と幼若化との間の因果関係を示唆した。

以上に述べたことは到達するには誠に困難な事
柄であるが，我々は此の難病の解決のアプローチ
として筋の発生と分化の問題を取り挙げることの必要性についての一端を披癒した。

また丸山，杉山，大槻らはこの様な線上の研究を発展させる足がかりを与える研究を行った。
この様にして出来上った蛋白も分解され，新しい蛋白が合成されるのは，遺伝子発現の基礎であ

実験のないところに科学は存在しない。本疾患

ると共に，またそれ故に筋ジストロフィー症の病の場合には通常の臨床実験のもつ困難さを遥かに態の成立の理解に重要であり，更に蛋白の代謝過超えた障碍が存在する。この困難さを回避するた

程のコントロールが可能になれば本症の治療に役

めには，できるだけ人間の筋ジストロフィー症に立つことが考えられる。

似た動物モデルを用いなければならない。本疾患

杉田と萩原は，それぞれ筋蛋白とアセチルコリとモデル動物の疾患が異った面を多く持っているンレセプターの代謝について研究し，諸種の薬物であろうことは充分に認識しつつも，我々はモデの代謝過程に及ぼす影響について検討した。蛋白

ル動物を重要な研究材料として，その病態の解明の分解過程には蛋白分解酵素が関与するが，それを上に述べた視点を踏まえて行ってきた。

らの分子機構については，Ca依存性中性プロテ
アーゼについて今堀と高橋（健）がそれぞれの見地

本年度の研究の概要

から研究を進め，カテプシンとその内存性インヒ

本年度の研究も前年度に引き続いて上記の原則

ビター（TPI）について勝沼が研究を行った。勝に基いて遂行された。
遺伝子発現の状況を調べるために最も単純な手段は一種のタンパク質に着眼しその経時的な変化

沼は筋ジストロフィーハムスターを行い，骨格筋，心筋に於いてカテプシンとTPIがはヾ平行して増加していることを認めた。

を詳細に記載することから始めることである。正また青柳は筋ジストロフィー症患者血清中の血常動物に於ける遺伝子発現の記載の比較が必要で

清動態を調べ，松下は筋ジストロフィー症マウス

あるが，その際にまず正常動物の正確な記載が重にベスタテン投与によって症状が改善すると報告要である。此の線上にあるものとして，ミオシン

した。これ等の他に，正常及び筋ジス動物を用い分子のアイソフォームの変化（江橋）トロポニンて，諸種の機能の変化が堀田，高橋（国），酒井，

分子の分化（嶋田）がある。大日方は筋ジストロ

遠藤，岩崎，石川，香川，仲村らによって研究さ

筋の発生と分化に関する基礎的研究班 総括報告れた。またそれらの研究のための基礎的手段につ発達のアンバランスに注目し，真崎は細胞内NA

いて岡田（善），岡田（節）から報告があった。

Dレベルの変化が発症の原因として深くかかわっ

以上のような蛋白，酵素蛋白その他諸機能の変ている可能性を指摘した。

動がどのようにして調節されるかを知ろうとする
結試みが行われて来ている。このことは疾患を理解

語しその解決法を求める上に重要であることはいう

個々の研究の進展の度合や，筋ジストロフィー

迄もない。筋の分化に関しては古くから神経因子症そのものとの直接のかヽわり合いの度合などにの関与が考えられており本研究班でも主として生はいろいろな違いがみられる。しかし研究班全体

理学的な立場から，除神経筋の分化状態の変動（栗としては，世界の筋ジストロフィー症研究に比し山）や，筋の興奮性の発現に及ぼす神経由来の物て勝るとも劣らないレベルを保ちながら，着実に質（加濃）の研究が行われた。特に加濃はこの物質前進しているといえる。そしてこれらの研究の間が高分子であり，おそらく蛋白質であることを報に，協同研究者として加わった若い研究者が，筋告している。

ジストロフィー症研究に深い関心を持つようにな

筋ジストロフィー症においては，上述のようにり，また既に出来上った研究室間にもお互いの連ある時期に筋の再生現象がみられる。その際には帯の気運が盛り上って来たことは，喜ばしいこと

衛星細胞の著しい増殖がみられる。衛星細胞の増である。

殖およびその後の変化を追うには色々な手法が考また特に本年度の行事の一つとして，本研究班

えられるが，大塚と寺尾はそれぞれニワトリ及びの業績を本格的な英文のモノグラフとして刊行しハムスターを用いて正常及びジストロフィー動物

た。過去において本班は毎年英文報告集として小間での筋の交換移植を行い，筋の正常な発育には冊子を刊行して来た。幸い内外の研究者から歓迎

環境因子が重要であることを報告した。環境因子されて来たが，何分にも小冊子であって充分に意には当然神経及び他の因子の関与が考えられるがをつくすことはできず文献として後々迄残ること

まだそれに関する知見は得られていない。小沢はは期待できなかった。今回各班員に各自の問題を筋芽細胞の増殖を促進する分画を，ニワトリ胚抽

自分の業績を中心とした総説を書くことを依頼し，出物から得たが，まだ精製は充分には進んでいな

一書となして，本研究班の研究成果を世に問うこい。筋芽細胞と衛星細胞とどこまで等価かというととした。

問題はあるにしても，再生が行われるには充分な増殖が必要であることに留意したい。
筋ジストロフィー症モデル動物を用いて発症の原因についての研究が行われた。戸塚は骨と筋の筋ジストロフィー症研究の道は峻しい。しかし我々は一歩一歩地道な努力を重ねてゆかなければ
ならない。

Ⅰ

筋移植と成長1．ジストロフィーハムスターと正常ハムスターの筋の交換移植についての研究

9

2．ジストロフィーおよび正常チキンにおける長槙側手根伸筋の交換移植

15−組織学的変化−3．筋ジストロフィー症マウスと小人症マウスの骨格筋の未熟度 19

1

ジストロフィーハムスターと正常ハムスターの筋の交換移植についての研究

＊

夫 子 昭

＊

＊

ジストロフィー筋肉を正常の動物に移植した場

＊

は じめに

寿 和 仲

尾 野沢

寺増大

研究協力者

筋，脚腹筋，ヒラメ筋などを脱血後採取し，
homogenize後，過塩素酸にて除蛋白したものを用合に，移植筋が如何なる再生をきたすかを明らかいた。

にすることはジストロフィーの成因を知る上に一

2）交換移植つの手掛りを与えるものとして注目されている。

これにはジストロフィーハムスターとコントロ

そのために古くよりジストロフィー筋の正常動物

ールハムスターの長指伸筋（EDL）を使用した。

への移植実験が行われてきた：4）

交換移植後，種々の時間を経てこれを取り出し，H。mb。，g。，為噂入したジスト。7．−ハムス

再生の状態を検討した。再生の指標には痙々の方

ターがヒトのジストロフィー症のすぐれたModel法が考えられるが，この研究では，再生筋線経の動物であることはよく知られている：）我々はこの数と直径を目標にした。移植後2ケ月目の再生筋

動物と正常コントロール動物との間に筋の交換移を上中下の3部分にわけ，その各々につきクリオス

植を行い，それぞれのgraftが新しいhost中で起

タットにより薄切後，種々の染色標本を作り，そのす再生現象を比較したので報告する。

各部ごとに2〜3枚の標本（主としてH・E 染色

また，ジストロフィーハムスターの血中，尿中，標本を使用）につき再生筋線経の数を数え，その骨格筋中のアミノ酸測定も併せ行なった。

平均値を求めてその筋の再生筋緑経の数とした。
また，各部分のcross section標本の中央部に含ま方法

れる筋線経の直径を上中下3部分より同数ずつ総

1）アミノ酸測定

計が1，000本になるまで測定し，その分布を調べ

血欒中アミノ酸についてはハムスターを絶食さた。染色にはH・Eの他Trichrome，ATPase，DP

せた後ヘパリン加採血し，血祭分離後ズルフォサ

NHを行った。

リチル酸で除蛋白し，アミノ酸自動分析機にて各
結

アミノ酸の濃度を測定した。
尿については，ラット用蓄尿ケージにて24時間
蓄尿したものを用いた。ハムスタ．一尿は蛋白を含
むため，ズルフォサリチル酸にて除蛋白し，その中の遊離アミノ酸を測定した。骨格筋は大腿四頑＊ 帝京大学医学部第1内科＊＊東京大学医学部第3内科

果

1．ジストロフィーハキスターのアミノ酸代謝異常a）血中アミノ酸
ハムスターの血安中にはグルタミン酸濃度がもっとも高く，次いでアラニン，グリシン，パリン，
リジン，タウリン，プロリンなどが高濃度に含ま

Ⅰ

10

筋

移

植

と

成

長

b）尿中遊離アミノ酸れる。これら血栄中遊離アミノ酸をジストロフィーハムスターとコントロールにつき比較したもの

ハムスターの尿中に排泄される遊離アミノ酸はが第1図である（n＝8）。これに示す様に，ジタウリンが著しく多く，次にグルタミン，グリシ

ストロフィーハムスターの血欒中にはコントロー

ン，1−および3−メチルヒスチヂン，スレオニ

ルに比し，濃度の低いアミノ酸が多いが，とくにン，アラニン，β−アラニンが多い。両者の比較

シスチン，トリプトファンは有意に低値を示してを第2図（n＝4）に示した。ジストロフィーハ

いた（P＜0．05）。これに反し，タウリンは有意ムスターではコントロールより排泄値の高いアミに高かった（P＜0．01）。

ノ酸が多い。とくに3−メチルヒスチヂン（P＜Free amino acidlevelsin Quadriceps of dystrophic hamster．

；署；一中主u∈＼の20E
u●p O OOl

●■

p

001

■●■

p O O5

第1図
Urinary free amino acidlevelsof dystrophichamster．

■：p＜0．001．

◆◆●：pr0．05

第 2図1ジストロフィーハムスターと正常ハムスターの筋の交換移掛こついての研究

110．001），グルタミン，リシン（P＜0．05）は2ケ月を経た再生筋の1例を第4図に，またこれ

有意に高かった。

と対をなし，コントロールハムスターのEDL をC）骨格筋の遊離アミノ酸

ジストロフィーハムスターに移植した場合（cont骨格筋の中の遊離アミノ酸はタウリンが極めて→dys）の再生筋を同倍率で第5図に示した。こ多く，次いでグルタミン，カルノシンが多い。まれでみる様に後者に細い筋線椎が多い。この様なたアラニン，アンセリンも比較的高濃度に含まれ交換移植筋を8組作り，2ケ月後それらの各々にる。大腿四頭筋についてジストロフィーハムスタ

つき再生筋線経の数を示したものが第6図である。

ーとコントロールの骨格筋の遊離アミノ酸を比較

また，その直径の分布を第7図に示した。これにしたのが第3図（n＝8）である。これに示す様示す如くジストロフィーのEDLをコントロール動にジストロフィーハムスターの大腿四頭筋中には物に移植した場合は再生筋線経は20〜40／tmの直遊離アミノ酸が低値を示すものが多い。とくにグ径のものがもっとも多いが，逆の移植では20／lm

リシン（P＜0．001），セリン，カルノシン（Pのものが圧倒的に多く，明らかな差を示した。第＜0．01），β一アラニン，アンセリン（P＜0．05）

7図はこれらをまとめたものである。上段は再生が有意に低値を示した。タウリンは逆に高い傾向

筋線経の数と直径を交換移植した再生筋の各群でを示した。また誹腹筋，ヒラメ筋でも同様な傾向

比較したものである（n＝8）。再生筋線経の数がみられた。

はdys→COntの方がcont→dysに比Lや、多か

2．ジストロフィーハムスターとコントロールハ

ったが，有意の差はなかった。しかし直径では前ムスター間のEDLの交換移植者が有意（P≦0．001）に大きかった。図の下

ハムスターのEDLを交換移植した場合も，昨年

段は交換移植した8対につも 各々のペアの再生まで報告したマウスやラットの場合と同じく，

筋線経の数と直径の比（dys．→COnt／そont．→dys）

graftの周辺から筋の再生が進む。

を求め，その平均とS．D．を示したものである。

ジストロフィーハムスターのEDLを

コントロ

数の比は1．3，直径の比は1．7である。

ールハムスターに移植し（以下dys→COntと示す）
FreeaminoacidlevelsinQuadricepsof dystrophichamster．

；署；一〇‡W∈＼冨一〇∈∪
雷−P O OOl●■二p・0＿Ol，第3図

Ⅰ筋 移 植 と 成 長

12

第4図
ジストロフィーハムスターのEDLをコントロールハムスターに移植後2ケ月目の再生筋

第5図
コントロー／レハムスターのEDLをジストロフィーハムスターに移植後2ケ月目の再生筋（第4、第5図は交換移植したもので同倍率）考案及び結語

ハムスターに比し，血中，尿中，骨格筋中の遊離

1）ジストロフィーハムスターではコントロール

アミノ酸に変化がみられる。血中の遊離アミノ酸

l

ジストロフィーハムスターと正常ハムスターの筋の交換移植についての研究
Number of regenerated muscle fibers．

︒︒T︒丁且00
4

0−0的コ∈−○

・丁・l・千・⊥

0
0
6

のhOq

・

0
0
2

．
O
Z

dys．一COnt．

COnt．一dys・

第6図

Distribution of diamelerOf regenerated muscJe fibers

0
0

の正︼空し
山一US⊃王

〇
〇

LO
0
0

∝︼d王⊃N

DtAl−ETER t rMI

第7図

13

Ⅰ筋 移 植 と 成 長

十CompaliiOn

0l numb●l and dlam●t●一〇ll●gOn●柑t●d mu■Cl●lib●rt．

︻Hu □︵∈ュ︶．．1．∈●− ・きー王●王一−●モー●IU●﹁ ヒー0 0Z

虹

右脚

14

dy暮，−COnt

COnl・一dy●

S．D．

叫・一t。叫・／ 〇・t−dy一

第8図はタウリンなどを除き，低値を示すものが多かった。また尿には部分的アミノ酸尿がみられた。これは血崇中の値より考えて0Verrlow によるもの
でないことは明らかである。また骨格筋中の遊離アミノ酸も低値を示すものが多かった。これらは筋膜のアミノ酸の透過性の変化を疑わせる。
2）ジストロフィーハムスターとコントロールハ

ムスターのEDLの交換移植を行った場合，移植後

文

献1）I・aird，J・LandTimmer，R・F・：HomotnnspLZnta・
め〃好みJかPP旭伽加0用材Jm〟∫CJe．Ar血此れ，
80：442，1965．
2）Hironaka，T・andMiyata，T．＝Transplmtationof

Skeletalmuscleinnormaland dystrophicmice．
助p．肋〟′0乙，47：1，1975．
3）Zalewski，A・A・：SurviYal，reinnervation，and
histochemical maturation of skeletal muscle
XenOgraftsin the nude mouse，助p．肋〟′0乙，58；261，1978．

2ケ月では再生筋線経の数には有意の差はないが，

4）Wakayama，Y・，Schotland，D．L．，andBonilla，E．：
Transplantationofhumanskeletalmuscletonude

直径ではdys→COntの方がその反対の場合より有

mice：Asequentialmorphologicstudy．NeuroZbgy，
30：740，1980．

意に太い。これがジストロフィーのhostにみられた低アミノ駿血栄などの低栄養によるものか，あるいは神経性因子など他の原因によるものか明らかではなく，今後の研究が必要である。

5）HomburgeI，F．etal．，〟ed放れ6：339，1962．
6）野々村禎昭：ジストロフィー・ハムスターに関する知見筋の発生と分化に関する基礎的研究（江橋班）
昭和56年度研究報告書，p．1，1981．

15

2

ジストロフィーおよび正常チキンにおける長横側手根伸筋の交換移植
一組織学的変化

＊

＊生

良

里
十
五

＊徳＊治＊平

正 哲雄

塚中 田

大弘宮

研究協力者

筋ジストロフィーの発症の原因を究明する有力ることが明らかとなった。このようなことから本な手段の一つとして筋の交換移植があり，我々は実験では，さらに，交換移植を行なった筋につい

これまでの研究において，交換移植の手法をジスてその筋繰経の数，大きさ，大きさのバラツキのトロフィーチキンに適用した。この場合，定員的程度につい亡組織学的検索を行なった。

実験を容易とするため，また筋に対する神経の栄
方養的影響の観察を可能とする目的で，比較的分離法

した小型の筋，すなわち，畠横側手根伸筋（EC貯化後2〜3日目の正常チキン（line412）とRL）を選び，その神経の再支配に注目しながら交ジストロフィーのチキンてIine413）を用いて交換移

換移植の実験を行なってきた。移植筋の重量や収植を行ない，移植後60〜65日目に移植筋について

縮の性質については，すでに，55年度の報告にま生理学的実験を行なった後，摘出し，ホルマリン

とめてある。その中でチキンの筋ジストロフィーで固定した。一筋の最大部の横断切片を作製し，HE症の発症の原因として筋外性の要因が重要である

染色を行ない，適当な大きさに拡大した顕微鏡写ことを示す結果を報告した。特に筋垂昌に関する

真について細胞数を数えた後，一つ一つの細胞を実験の結果はミンスした胸筋を用いて行なわれた切り取り，その重塁から横断面積を換算した。筋Cosmos彗辞換移植の央験の結果とは異なるものであった。■cosmOSらは交換移植の実験の結果，移植の方法その他については55年度の報告に詳述
してある曾チキンのジストロフィーは筋原性であると主張し
ている。

結

果

一方，神経性の栄養的影響を強く受けるcon−

移植ECRL筋：移植筋の筋線維細胞の数，大traction timeやhalf relaxation timeはジストロ

きさ，大きさのバラツキの程度（変動係数）およフィーのチキンと正常のチキンの問で交換移植をび小細胞による浸潤の度合について，測定の結果行なった後にも，有意な値の変化を生じなかった。

を表1にまと1めた。筋細胞の数はホストが正常ですなわち，ホスト側の要因にしても，調べるパラ

ある場合，移植筋が正常の方がジストロフィーでメタ一により異常を示すものと示さないものがあある場合よりも多く，筋原性の異常を示した。し＊ 東京医科歯科大学・医学部・薬理学教室＊＊帝京大学・医学部・薬理学教室

かし，正常の筋あるいはジストロフィーの筋同志の問でホストの影響を比較すると，ホストが正常

Ⅰ筋 移 植 と 成 長

16である場合の方が大きな値を示した。殊に前者に

図2は非移植筋について筋線維細胞の断面積のおいてはP＜0．02 の統計的に有意の差を示した。

変動係数の経時変化を示している。貯化直後はか細胞のサイズに関しては明らかにホスト側の影響なり大きな変動を示したが，正常とジストロフィを反映した結果であった。細胞のサイズの変動係

ーの間には有意差がなかった。成長がすすむにつ数に関しては4種の移植筋（Nn，Nd，Dn，Dd）

れ正常チキンでは次第にその係数が小さくなり，の問に有意差はみられなかった。また小細胞によ一方，ジストロフィーチキンでは一旦減少の傾向

る浸潤の程度にも差はみられなかったことから，を示すが10日日あたりから以降は再び増加し，2

免疫学的反応に関しても系統的な問題はなかった

ケ月後には両者の間に大きな差が生じた。これにと思われる。

対して移植筋の変動係数はいずれのタイプにおい非移植ECRL筋との比較：非移植ECRL筋のても大きな値を示し，お互の間に有意の差は存在

筋線維サイズの経時変化を図1に示した。ジストしなかった（表1）。この結果から移植筋の再生

ロフィーの筋線維はより大きな成長速度を示し，・分化の何らかの過程が著しく妨げられているこ筋化後62日目では平均の線維断面積は34．3×10とが示唆された。

爪題であったのに対して，正常の筋の断面積は11．3
×10郡題であり両者は有意の差（P＜0．01）を考察示した。一方，移植筋の線維断面積も60〜65日で，表1の結果は測定したそれぞれのパラメタ一に

Nn，Nd，は11．8，15．8×lb㌔遥；Dn，Ddはより筋原性あるいは筋外性の因子の関与が異なる

33．5，32．4×1舐題と，それぞれ，正常およびことを示している。移植筋細胞数はこの実験系にジストロフィーの非移植筋と同じ大きさに達し，おける筋の再生能を大きく反映しているものと思

正常とジストロフィーの間の成長速度の差異はホ

われ，移植筋群間の比較から，筋原性および筋外

スト側の影響によることが明らかとなった（表1）。

性の両方の要因が関係していることが示唆された。

㌃∈∈もーエぷS LOqに
2

5

10

20

60

A9eldaysI

図1非移植ECRL■筋の筋線維サイズの往時変化○，正常チキン；●．ジストロフィーチキン。縦棒はS．D‥斜めの直線は回帰線を示す。

2 ジストロフィーおよび正常チキンにおける長槙側手根伸筋の交換移植一組織学的変化

17

巴儀−Oq；U帽UO等属し巾＞−01uぷぷーー00U
2

30

5

60

AgeldaysI
図2

非移植ECRL筋における筋繰維サイズの変動係数の経時変化○，正常チキン；●，ジストロフィーチキン。縦棒はS．D．，曲線は3次のpolynomial
regressionを示す。

表1移植ECRL筋の変化における組織学的測定の結果
Nd

Number ofmuscle fibers
Fiber

size

（xl0−4m2）

SD′H％ area occupiedby smallinfiltrated ce11S

士2237

n＝6

n＝5

5927
土1791

3483
±760

4132
±493

15．8
±1．88

33．5
士2．47

32．4
±3．58

0．67
±0．0400．60
士0．0670．53±0．048士1．35
0．56
土0．044

Dd

n＝6

ll．8
−

Dn

n＝6

n＝6

n＝6

5．4

4．8
±1．31

！1．15

±0．65

5．3

n＝7

3．O

！0．61

Mean

ts．E．M．

術後60−65日目。Nn，Nd，Dn，Dd：N．Dはそれぞれ正常およびジストロフィーのホストをn・dは正常およびジストロフィーの筋を表わす。SD：Standard deviation；M‥mean・SD／M
は緑経の断面積における変動係数を示している。

3）筋線維細胞のサイズに関するパラメターは筋の成理的異常が存在することを示した。筋原性の要因

長および維持の機構に関係していると思われるが，が強いとされたチキンのジストロフィーにおいて

本実験ではホスト側に異常が存在することが示さ♂雫実験でみられたように，早期に神経支配が成立した条件下でホストの影響が筋線経の断面積れた。
我々は先にジストロフィーチキンの神経系に生に明瞭に表われたことは興味深くカ（表1），チキ

Ⅰ筋 移 植 と 成 長

18ンの筋ジストロフィー症の発症の原因に関して上記神経系の異常がどのように関与しているかが今後に残された興味ある問題の一つである。これに関連して，先に我々が筋ジストロフィーのマウスを用いて行なった交換移植の実験でも，ホスト側の要因がより重要であることを示す結巣が得られている≡）7）

文献1）大塚正徳，弘中哲治，五十里良生，宮田雄平：ジス
トロフィーおよび正常チキンにおける長暁側手根伸筋の交換移植。厚生省神経疾患研究委託費，筋ジス
トロフィー症の基礎的研究（江橋班）昭和55年度報告書，pp・16−19．
2）Cosmos，E．andButler，J．（1972）．Differentiationof muscle transplanted between normalanddystrophic chickens・InResearch b7MuscLe De−

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5）Linkhart，T．A．，Yee，G．W．，Nieberg，P．S．and
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6）Hironaka，T．and Miyata，Y．（1973）．Muscle
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7）HiTOnaka，T．and Miyata，Y．（1975）．TranSPlanta−tion ofskeletalmuscleinnormaland dystrophic
mice．g叩．〟e〟′0エ47，1・15．

19

3筋ジストロフィー症マウスと小人症
マウスの骨格筋の未熟度
＊

武美 幸

塚辺谷

本

浦

＊
＊
＊

貴俊

戸渡 熊

研究協力者

進行性筋ジストロフィー症は，病因，治療法はtt進行性＝加齢 （筋の成長停止のため，加齢におろか対症療法開発の糸口さえも見出されていな

伴い見掛け上筋萎縮が進行するように見える）とい，難病である。多数の研究者による長い研究のいう図式を設定し，筋ジストロフィー症（dy）マ

歴史を持ちながら，現在もこのような状態にあるウスを用いて研究を進めてきた。その結果，図1

ことは，この病気に対する根本的考え方，tt骨格に示すような結論に到達したP成長の止まった筋筋が進行性に変性萎縮する ，に間違いがあるとが，成長を続ける骨によって強制的に引き伸ばさ思われる。病状の進行が加齢と密接に開通していれることが，発症の直接的原因と考えられる。

ることは，周知の事実である。そこで我々は，NormaL Dystrophic
∨ノ

≠

d

Fbretimbenふ▼つ・IVe

J

G⑪

Arrested Growthof SkeletalMuscles（MaturationalDefectsof Fibers）

くHindlimb

血NormalGrowthof Bones1
Age−relatedIncreaseinBone−Muscle
Imbalance：
ProgressofDystrophkCondition

図1マウスの筋ジストロフィー発症機構に関するtt筋一骨不均衡＊ 愛知県心身障害者コロニー，発達障害研究所＊＊ 同，中央病院

仮説

Ⅰ

20

筋移植と成長後肢の引きずり症状の初発時が後肢骨の急激な伸ATPase染色した。ATPase染色は，あまりきれいに

長成長期にあたること，重症の後肢に比べて著しいかなかったので，今回の報告では除外した。筋く軽症（まったく正常だと言う人もいたが，我々線経の直径（短径）は，約100倍の顕微鏡写真には，前肢の耐久力が加齢に伴って著しく弱ること

より拡大鏡下で測定した（10〝m一実測値1mを明らかにした）の前肢の筋に後肢筋とはぼ同程一以下の線経は結果から除外した）。

度の病変が認められ品と，前肢の軽症の原因は骨伸長成長が後肢に比べて低い（正常マウスでも同じ）ことによるらしいこと，小人症（dw）遺伝

結果と考案
dy筋の疲労抵抗性と未熟さ子を導入してdyマウスの成長を止めることでdy

dyマウスの筋が，非力ながら一種の疲労抵抗性

症状を不顕化できること，などを本仮説の重要なを示すことが，SandowとBrust（筋の電気的直証拠として発表した。ヒトでも，Duchenne型筋

接的連続刺激による張力の経時的変化を調べた）

ジスー小人症（GH欠乏による）患児で筋ジス症
3．の状が著しく軽いことをZatzらが報告した。また，により発見された。一見矛盾するこの性質がどのdyニワトリも，抗甲状腺剤投与により一種の小人は，dy筋の疲労抵抗性（坐骨神経連続刺激による症にされると，dy症状が軽減されることをKing為職告している。

誘発筋電位の振幅の経時的変化を測定）が未熟さ

病因は，dy筋で成長の停止がなぜ起るのかをつなことに，典型的な成長障害モデル動物（現在できとめることで，解明されると期待される。本研は老化のモデル動物としても使われている）であ

究の目的は，dyマウス の筋成長障害の病態を浮る小人症（dw）マウスの筋は，誘発筋電位の特徴

彫りにすることである。

からみると，正常マウスとまったく同様に成熟す

9）

ような意味を持つのか，長く不明であった。我々からくるものであることを明らかれた㌘不思議ることを見出した㌘例えば，2〜3月齢のdwマ
材料と方法
動物

ウスと正常マウスでは，5Hzの坐骨神経連続刺激により誘発されるGastrocnemiusの筋電位の振dyマウス（C57BL／6Jdy／旬y），dwマウス

幅は，同様の経時的減少（数＋％）変化を示した（DW〃d勒／aw），dy−dwマウス（前二者の雑種（図2）。若い（例えば20〜30日齢）時は，dw

BL−DW dy／dy dw／dw）とそれぞれに対応

マウスでも正常マウスでも，誘発筋電位の経時的する正常マウスを用いた。ラットは2月齢の減少傾向は小さかった（10％程度）。dwマウスの

Wistar系のものを用いた。

筋には，形態的未熟（筋線経が細い：後述）と内電気生理学的検索

的成熟が併存するわけである。

ウレタン麻酔した動物の坐骨神経（S）letBの場

dy筋の内的成熟障害がdw筋の形態的成熟障害合は後述）を電気刺激し，Gastrocnemiusまたはに先行しているらしいことが，dy−dwマウス

鮎leusからの誘発筋電位（オシロろコープ）を写（dy症状はほとんどみられない）の筋が電気生理真記録した。5Hz連続刺激による筋電位の振幅

学的にdy筋の特徴を示す（図2，B）ことから，の経時的変化を中心に解析した。詳しい方法は既推察された㌘dy−dwマウスのこの性質は，別のに発表した三￣81

観点からも重要なこと，tt GH（成長ホルモン）

組織学的検索の質的異常がdy病変の発生誘因になっている可

ドライアイスーアセトン冷却下イソペンタン中能性は少ない〝，を示唆している。なぜなら，dyで凍結させた筋の連続横断切片（厚さ20〟m）を−dwマウスはdw遺伝子のためGHとT4（チロキHE，NADH−TR（Tbtrazolium Reductase）iシン）を欠いているはずである。

3 筋ジストロフィー症マウスと小人症マウスの骨格筋の未熟度

21C57㌢／6J￣ey＆Dr・
e

図2

●

10min

●

●

0

0

0

ロ

ロ

ロ

dy，dw，dy−dwマウスのGastrocnemiusの誘発筋電位の特徴
坐骨神経を5Hzで連続刺激した時の誘発筋電位の振幅の経時的変化を％（5Hz刺激の直前の値を100％）で表してある。A）2〜3月齢の，dy（●），dyの正常対照マウス（○），dw＋dwの正常対照マウス（ロ：両者はまったく同様であったのでまとめた）。正常マウスでも，
strainにより差がみられる（○と□）。B）2〜3月の雑種BL−DW（C57BL／6J XDW／J）のdy（∫），dw＋正常マウス（○：両者はまったく同様であった）。
dy−dwマウス（●）は1匹（98日齢）の値（現在は数匹で同様の結果を得ている）で．その他は数匹以上の平均値である。

dw筋の組織学的特徴

みた。マウスの鮎Ieusは細いので，今回は2月齢

dwマウスの筋は，その低体重に見合った程度にのラットを用いた。ラットのGastrocnemitBは，小さい。筋線経は，NADH−TR染色により，ほぼマウスのものとほぼ同様に，5Hzの坐骨神経連続

正常筋同様，大まかに三種類（染色の濃淡による）刺激で誘発筋電位の振幅に急激な減少がみられたに分けられるが，正常筋に比べると著しく細い（図（図6）。Soleusの場合，Gastrocnemius から3と4）。このことから，電気生理学的にみたdw

Soleusへ向う神経の筋枝を電気刺激することでは筋の内的成熟が，筋線経の分化と関連している可

じめてきれいな二相性（Negative−Positive）の能性が考えられる。典型的なtt Slow （赤，遅）誘発筋電位パタンが得られた。5Hzの連続刺激筋であるSoleusの筋線経がNADH−TRで濃，中を行うと，Gastroc托miusとは対照的に，筋電位間のほぼ二種類からなる一方，Gastrocnemiusのの振幅は徐々に，しかし確実に増大した。これら

筋線経は濃，中間，淡の三種頬からなりttFastのことから，電気生理学的にみた筋の成熟変化が（白，速）筋的（濃，中間線経が集中的にみられ

筋線経の分化と関連している可能性が高いことがるSlow筋的部域もある）である（図5）。そこで，うかがわれる。

SoleusとGastrocnemiusの誘発筋電位を比較してⅠ

22

筋移植と成長0．1mm
図3dw（右；150日齢）と正常DW／Jマウス（左；70日齢）の前肢筋（Triceps）の横断像（NAm−TR染色）

0

20
40
60
Diameter of MuscLeFiber（pm）80

図4dwと正常DW／Jマウス（2月齢）の前肢筋（Triceps）における筋線経の太さ分布
黒塗の部分は，NADH−TRで中間的に染まった線経を示す。
濃，淡染の頼経は，黒塗部分のそれぞれ左側（細い方），右側にきれいに分かれて分布した。

3筋ジストロフィー症マウスと小人症マウスの骨格筋の未熟度

Gastrocnemius

23

Soleus
・∴■テ
′

ゝ・一●

ーV
0．1mm
図5正常DW／Jマウス（2．5月齢）の後肢筋の横断像（NADH−TR染色）を保っていた。NADH−TR染色で濃，中間，淡とdy筋の組織学的特徴
dyマウスの筋は，体重に比べて著しく小さい。

三種類に線経を分類することは一応可能であった

大腿直筋を横断面の直径（凍結切片像の短径；図が，正常筋の場合はどすっきりしなかった。今回

7）でみても，20日齢（1．9士0．2m，n＝4），の実験では，dy筋の特徴がどのような線経の分化

30日齢（1．9±0．1mm，n＝5），二川0日齢（異常と関連するのか，特定することはできなかっ2．1±0．1m，n＝4）と細いままであり，加齢とた。

共に肥大する正常筋（20日齢で2．2±0．1Wl，
n＝4；30日齢で2．5±0．3m，n＝4；70日

齢では3m程になる）とは対照的であった。

dy筋の特徴である中心核線椎は一般に，変性線椎に代わる再生繰経と考えられてきた。もしそうであれば，大小不揃いのdy筋線経の中で，中心核dy筋の筋線経の太さは異常に不揃いで，全体的を持つ線経はNADH−TR濃染の細いものに比較には細い線経が多い反面，異常に肥大した線経も的限定されるはずである。しかし，実際は，あら散見された。また，NADH．TR染色で濃染（ミ

ゆる太さの（NADHニTRでの濃淡とも関係なく）トコンドリアに富む）する細い線経が，比較的一線経に，中心核を持つものが認められた（図9）。

部都城に集中している（偏在）傾向がみられた。

この結果は，1枚の切片（図8：筋の全体像）に

それと関連して注目すべきことは，110日齢（後よって中心核緑経を同定したものであり，それで肢は既に麻痺）でも，一部のそのような異常都城も20〜35％もみられたことから，もし連続切片

以外のところの線経は，比較的しっかりした様子

で検討すればほとんど全部の筋線経が中心核を持

24

Ⅰ

筋移植と成長っているのではないかと思われる。このことは， からなることを示唆している。
dy筋が未熟な（または脱分化的に若返った）線維GGS

図6ラット（2月齢）のGastrocnemiusとSoleusの誘発筋電位の比較
A）坐骨神経（GasとSo（写真左）または，Soleusの近くの神経の筋枝（Sol写真右）を刺激した時の誘発筋電位パタン（Calibration：20mV−4msec）。B）坐骨神経（Gastrocne一
mius，○）または，Soleusの近くの神経の筋枝（Soleus，●）を5Hz連続刺激した時の，誘発筋電位の振幅の経時的変化（連続刺激開始直前の振幅値を100％とした）。

14）に）ことを報告している。本研究班の杉田と埜中ながると思われる）は不明であるが，我々は先のは，dyニワトリ筋で実験的に変性させられた都城報品中で，コレステ。−ル（代乱分布）異音）で再生してきた筋線経が大小不揃いであることをを候補として，一つの可能と思われるmechanism

見出し，このような事実などから，筋線経の大小を討論した。また，異常肥大線経の原因は，筋が不同がdy筋の本質的異常によるだろうと結論して

も

カ
る
ヽ一

こ

あ

さ

と
こ
る
れ

′■つ−

しれない。Solaら

ー・・︶ま
弓u′H

骨により強制的にば
申き

dy筋線経の大小不揃いの原因（dyの病因についる（私信）。

正常筋でも，強制的持続的dy筋の成熟（分化）障害は，成獣レベルで正引き伸ばしにより異常肥大が誘発される（実験的常筋と比較した場合，見掛け上dy Fast筋のSlow

3筋ジストロフィー症マウスと小人症マウスの骨格筋の未熟度

25化またはdy Slow筋のFast化現象として観察さは既にこのような現象を報告している（説明は異れるであろう（図10）。実際，Parsl。WとP。reなる）。

図7dyマウス大腿直筋の横断像（NADH−TR染色）
上段：正常C57BL／6Jマウス．下段：dyマウス
正常マウスの筋でも濃染線経の偏在がみられる。dyマウスの筋で濃染線経が集中している部域があり，このような部分に特に異常が目立つ。

結論熱さ）によると考えられる（加齢に伴う筋一骨不1）小人症マウスの骨格筋は，電気生理学的にみ均衡の増大からくる筋代謝の活性化による見掛けると，ほぼ正常な成熟をする。その筋線経は，細の脱分化または若返りによるという可能性は否定

いままであるが，NADH−TR染色でみるかぎりできない）。

ほぼ正常に分化している。

4）筋ジスマウスの筋が未熟であることは，見掛2）筋ジスー小人症マウスの筋は，電気生理学的

け上dyFast筋のSlow化dySlow筋のFast化にみて，筋ジス筋の特徴をもっている。

現象としても観察されるだろうということを討論

3）筋ジス筋の中心核筋線経は，再生線経を意味した。

するのではなく，筋ジス筋頼経の本質的特傲（未Ⅰ

26

筋移植と成長

Day30

0．5mm
図8dyマウス大腿直筋の横断像（HE染色）

NADH−TR Stainmg

DyslrophiC HindLimb RectusMuscLe（day30）06SLむqにーO JむqE⊃N

10

30

10

30

5010

30

50

70

Diameter ot MusCle Fibers（Hm）
DarkShading：Centrauy−NucLeatedFibers（HE）

図9dyマウス大腿直筋における筋線経の太さ分布
NADH−TR染色により濃（左），中臥淡（右）染線経に分U，HE染色により中心核のある（黒塗り部分）なしを調べた。

3筋ジストロフィー症マウスと小人症マウスの骨格筋の末熟度

27Differentiation of Muscles
NormalFast一一旬Pe Muscles− − ⁚ − ⁚ ⁝ − †ApparentShift？
to…S10W…

DystrophicMuscLes

図日Ody筋が未熟であることから予想されるdyFast筋の見掛けのSlow化現象の模式図

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twitch musclein the dystrophic mouse．Ekp．
〃e〟′0工，73：686−699．

Ⅰ

微

細

形

4．骨格筋の小高について

31

5．細胞骨格の分化発達−中間径フィラメントの存在様式

態

35

31

4

骨格筋の小高について

岩

崎

祐

1ハムスター骨格筋の小高ィーハムスター筋には細い再生線経が多数みられ

実験動物中央研究所より供給された，5週令雄たので，Figs．3や4は恐らくこれらの再生線経でジストロフィーハムスター（BIO14．6）と対照ハある可能性が大きいと思われるが今後更に検討をムスター（BIOFIB）のひらめ筋（Sol）と長指伸つヾける予定である。

筋（EDL）について，凍結割断法による観察を行

2 ジストロフィー鶏の骨格筋の小筒について
ジストロフィー鶏では加令にともない筋細胞膜

試料固定と凍結割断の条件は前報注準じた。正
常ハムスターの骨格筋では筋細胞膜における小高の小高の密度が増加，またその配列に規則性が失なわれていることを既に報告したヲの配列に，正常ニワトリ骨格筋にみられたと同様

そこで，この小高の本態を明らかにする目的でな規則性がみられた。つまり，小高の集団が一定

小高の直径の計測を行なった。まず培養筋管ではの距離をへだてて配列している（Figl）細胞膜

すべての小高が50mm以下の径であった。次に正常上の小高の密度は10／上があたりはヾ300で同週

鶏の骨格筋についてみると，鶏化時の浅胸筋を除令の正常ニワトリのそれより高い傾向がみられた。

くと50n汀以下の小高の占める割合ははヾ30％で個々の小高の形態はニワトリのそれに極めて類似ある（ hblel）。ここで，筋管や極めて未熟な鶏しており，その直径も30〜100nmと，ニワトリ

化時の浅胸筋では槙管系が完成されていないこと

骨格筋の場合と同様かなりばらつきがある（Fig2）

から，これらの未熟な細胞や線椎にみられる5脚m

小高の配列様式をもって，SolとEDLを識別す

以下の小さな小高はpinocytotie vesicleである可ることは困難であった。

能性が大きい。また，成熟筋においては，pino−

ジストロフィーハムスターについてみると，ジcytosisは，ほとんどみられないと考えられている

ストロフィー鶏にみられたような小高の配列に規ので，成熟筋にみられ大きな径をもつ小高は恐ら則性が失なわれている筋細胞膜が一部にみられた

く横管系の細胞膜表面への開口部と考えるのが妥が，多くの筋膜ではFigs．3および4にみられるよ当であろう。

うに小高が一定の方向性をもって配列していた。

そこで，ジストロフィー鶏についてみると，曜

しかし，これらの線経では単位面積あたりの小高

患筋における・小高の増加は，直径50nm以下のJヽさの数が同週令の正常ハムスター（Figl）より明らな小高の増加によることが明らかになった（Table

かに減少していた。Fig3，4のような所見は，22）。更に興味深いのは，擢患筋では単に小さな週令の幼弱正常ニワトリの筋細胞膜の構造に項似′ト嵩が増加しているのみならず，50nm以上の大型している。今回，凍結割断を行なったジストロフの小高の密度が低下しているようである。つまり東北大 医学部．脳研

正常成熟鶏では10〟㌦あたりの50nm以上の大型小高の数のはヾ100であるのに対し，ジストロフィ

Ⅱ

32

微

細

形

態

Fig15過令正常ハムスター長指伸筋の筋膜P面。小高のグルーピングがみられる○×10，000

Fig2

Figlの高倍像。

×60，000

4

Fig3

骨格筋の小高について

5週令ジストロフィーハムスター長指伸筋の凍結割断像

33

×22，000√

Fig4

5週令ジストロフィーハムスター長指伸筋の凍結割断像

×15，000

n

34

微

細

形

態

Table．l Caveolar density dnd fl er dia¶￠terin COntr0l chlekenS

Huseles2

Sup．pect．

108．6＋3．6●
2．7

bt．addllCt．

＋

0．2

106．4
8．3

＋1．4

◆

（98It●

128．1＋14．8

■●●

10．2

（14tI

0．2

◆

◆

t

veek8

140・1土4・0（29tI

29tI

26．8

0．7

140．0＋9．2
11．3

5

treekS＋1．3

139・7土8・0（31t）

（281）

26．6

0．4

＋1．5

●thent血erofcaveolaeperlOp20fplasMme−血ane｛眠an土S封…亡he percentage Of cave01ae vith a diamett汀Of50nm orless…fiberdiameterinP（mean土SE）

Table

2

Caveolar density and flber diameterln dystrophieく：hlckenS

HuSCles

A9eS

day
Sup．pect．

2veeks111．5＋5．3■（97t）●●2．4
Lat．adduct．

O
199．7＋17●3（71ヽ）

241．5＋

8．8＋

31．3

十0．2…

105．3＋2．9
7．1＋

（14も）

Sveeks0．S

131．1＋9．3

0．4

11．1◆

5．2

（84ヽ）

◆1．9

261．8◆11．7（59ヽ）

（26t）

30．8

0．6

◆

2．2

◆the nuぬerofcaveolaeperlOPOfplasmamembrane（mean土SE）
H the percentagQ Of caveolae wlth a diameter of50mm orless…flberdiameterinpm（mean土SEI

ー鶏の浅胸筋のそれは，2過令で平均58，5過令で39に減少していた。B。nk。r品未熟な筋で桟管系が充分機能していない場合にPinocytasisの
元進がみられることを報告しているが，Lit光lius
あいうジスト。フ．一筋のT−t。b。l。。nd。Cy−
tosisなる状態が，必らずLも横管系の機能元進にともなう槙管の拡大なのではなく，むしろ桟管系の変性にともなう代償作用としてのpinocytosisの元進状態と考えることもできるように思う。

文献1）Iwasaki，Y．（1982）．A freeze−fracture electron
miCroscoplC Study of dystrophic chicken・In
MuscuLbr4ystrophy Ebashi，S．edit．UniYerSityof
TokyoPress，Tokyo．
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Calstudyofmuscleinthedystrophicmouse．Ann．
几1y∴4α通∴飢豆，317：630−648．
3）Libelius，R．，JirmanOYa，1．，Lundquist，Ⅰ，Thesleff，S．andBamard，E．A．（1979）．T−tubuleendocytosis
in dystrophic chicken muscle antits relationto
muscle nber degeneration．Acta Neuropoth．，
48：31・38．

35

5

細胞骨格の分化発達一中間径フィラメントの存在様式

田

律郎

川

月

春針

石

研究協力者

細胞骨格の主な構成要素の一つである中間径フ

月 田早智子

白 倉治郎

めとして記載されている。

ィラメントはほとんどすべての真核細胞に存在す

われわれは中間径フィラメントの存在様式を明るが，それを構成する蛋白質は細胞特異性が高い。

らかにするために，まず，ヒト筋をはじめいろいろ筋細胞ではデスミン（desmin，スケレチンskeletin）な動物の筋について電子顕微鏡的に検索を行なっと呼ばれる分子量約53，000の蛋白質からなる中間

たので，その結果を報告する。

径フィラメントが特異的に存在す 去㌘デスミンはしたがって分化した筋細胞のみが合成する蛋白質といえる。

材料 と 方法
材料として，ヒト誹腹鼠 サル横隔膜・外眼筋，

骨格筋細胞において，中間径フィラメントは筋

マウス誹腹筋・横隔膜・外眼筋・耳筋，ニワトリ

発達期に豊富に出現す羞発達が進むにつれ，そ胸筋，広背筋を主な観察対象とした。型のごとくの数は減少し，成熟した筋細胞では趣く少数見出

グルタルアルデヒド一四酸化オスミウム固定を施されるのみである。一方，抗デスミン抗体を使っし，脱水・包理ののち，超薄切片を作製し，電子た蛍光抗体法では，成熟筋細胞にも多量のデスミ

顕微鏡により観察した。

ンが検出され，その上Z帯のレベルに一致して明瞭な横紋をなして分布することが示されを喜，のこ

結果と

考察

のことから，デスミンが筋原線経の横紋の位相を検索された筋のうち，サル横隔膜を除くすべて

揃えるなどの重要な役割を果すと唱えられるに至の筋では，中間径フィラメントは極く少数見出さ、言：れるのみであった。これに対し，サル横隔膜の筋

蛍光抗体法で成熟骨格筋細胞に多量のデスミン

細胞には散在性ではあるが，よく発達した中間径が示されるにかかわらず，電子顕微鏡下に中間径フィラメントを観察することができた。

フィラメントが極く少数しか見出されないことは健常と考えられたサルの横隔膜筋細胞は筋原線興味深い。この蛋白質が中間径フィラメント以外

維問に比較的多量の筋形質を有していた。特徴的の形で存在する可能性もあり，その存在様式が一な像は，筋細胞の縦断切片で，Z帯のレベルで筋つの重要な課題となってきた。

原線維相互間を横に結ぶように中間径フィラメン

また，最近，この中間径フィラメントが増量す

トが集合束をなして分布することであった（図1）。

る筋疾患が見出され，新しい型のdistalmyQPathy

この束は切片が筋原綿維表面を通る場合に明瞭に観察されたが，すべてのZ帯レベルに規則的に分東京大学医学部解剖学教室

布することはなく，散在性に見出されるのみであ

36

圧

微

細

形

態

図1サル横隔膜の筋細胞縦断像。
筋原緑経のZ帯（Z）のレベルを横走する中間径フィラメ
ントの束が散在性に観察される（矢印）。

った。

線維性網目は通常その外側に位置していた。

この中間径フィラメントとZ帯との関係を見る

以上の観察結果から，サル横隔膜では典型的なと（図2），Z帯のレベルに限定して見出されたこ

中間径フィラメントがZ帯のレベルを槙走していと，直接Z帯に付着する像も得られたことから両者ることを示すことができた。このフィラメントはの密接な相互関係が推論できる。しかし，付着様隣接筋原線経のZ帯間を結ぶように配列しており，

式の詳細は明らかにできなかった。また，このフ横紋の位相を揃えるのに役立っているように見えィラメント集合束に密接して筋小胞体も見出され，る。しかし散在性に存在するのみであること」他

膜系との相互関係も興味深い。筋細胞の横断切片の多くの筋でこのような明確なフィラメント束がでも中間径フィラメントはZ帯のレベルで筋原線見出されないことは問題として残る。また，蛍光維間に見出された。散在性に束をなして構走する

抗体法で示されたデスミンの分布を十分説明できのに加えて，Z帯のレベルの筋形質には線維性構るものではない。これに関連して．Z帯レベルの造の網目も認められた。繰維構造の直径を正確に筋形質内の線推性網目の存在は興味深い。デスミ

測定することは困難であったが，その一部は約10ンの別の存在様式か，固定時の人工産物か今後のmmの直径を有していた。この部位では筋小胞体

詳細な検索が必要である。デスミンなどの中間径と考えられる膜構造がZ帯を直接的に囲んでおり．

フィラメントは化学抽出に対して比較的安定であ5 細胞骨格の分化発達一中間径フィラメントの存在様式

37

図2 サル横隔膜筋細胞。 中間径フィラメント（作）とZ帯との密接な位置関係に注目されたい（矢印）。

るが，蛋白分解酵素にて分解されやすいので化学固定時に注意する必要もある。
サル横隔膜に発達した中間径フィラメント束が見出されたが，これほど発達した束は骨格筋では記載がない。この筋に出現した理由は明らかでな
いが，Z帯や膜系との相互関係を詳細に分析する好材である。今後，超薄切片法のみならず，急速凍結エッチングレプリカ法により検索を進めたい。
なお，この研究と平行して，平滑筋における中間径フィラメントの分布様式を検索し，アクチン
フィラメントとは部位特異性にdense bodyやdense plaql児に付着することを明らかにした。
この付着様式により細胞骨格系が筋の収縮機能に密接な関係をもつことが可能となる。

文

献1）Lazarides，E．andHubbard，B．M．：ImmunologiCal
Cha∫aCterization ofthe subunit of thelOOA fila−

ments ffom muscle ce11S．伽C．肋t．Acad ScL脳，73：4344（1976）．

2）Smal1，J．V．，and Sobieszek，A．：Studies on thefunctionand composition ofthe10−nm（100Å）
filaments of vertebrate smooth muscle．J．Cbll

gd，23：243（1977）．
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and intermediate−Sized nlaments in developing
並eletalmuscle．J Cb〃βわよ，38：555（1968）．
4）Gard，D．L．，Bell，P．B．，and Lazarides，E．：Co−
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mediateand the丘broblasticinter−

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5）Bennett，G．S．，Fellini，S．AリToyama，Y．，andHoltzer，H．：Redistribution ofintemediate fila−
ment subunits during skeletal myogenesis and

38

Ⅱ

微

maturationinYitro・LCbZtBLoL，82：577（1979）．

細

形

態

7）Lazarides，E．：Intemediatefilamentsasmechani＿6）Thornell，L−E・・Edstr6m．！L・，Eriksson，A・，

Cal htegratofS Of ceuulaT SpaCe．肋餌re，283：

distribution ofintermediate Eilament protein（skeletin）innormaland diseased humanmuSCle．

8）Tsukita，S・，Tsukita，S．，andIshikawa，H．：The
modeofassociationofactionandlOTnmfilaments

Hemiksson，K・6・，and Anggvist，K．−A．：The

AnimmunohistochemiCalandelectronmicro＿

SCOpicstudy・LNeunLScL，47：153（1980）．

249（1980）．

With the dense bodyinchickengizzard smoothmusclece鮎・Ck〃rね∫．月蝕，（Inpresわ．

Ⅱ

細6．サテライト細胞の培養

胞

培

養

41

7．ニワトリ胚抽出物中の筋芽細胞増殖促進因子

47

8．培養骨格筋における活動電位の発達に関与する神経性因子

52

41

6

＊

務治之

＋
＊
＊
＊

司 二

博孝

＊
＊

野本

北橋

＊

英典

川片

番智巽

研究協力者

サテライト細胞の培養

我々は正常（＋／＋）及び筋ジストロフィ（dル句y）

マウス胚筋芽細胞のそれに比べて，はるかに小さ

発症マウス骨格筋に再生を誘起し，各再生筋からく，一般的な生化学的解析の材料としては必ずし

単核筋芽細胞を容易に得る方法を確立し定2主E常も適しているとは言えない。我々はマウス再生筋

及び筋ジス筋芽細胞の多細胞培養下における筋線

芽細胞のクロン培養の利用範囲を拡げる為の一つ

維分化の過程を比較し，両者の間で，少なくともの試みとして，筋コロニーのCKIz解析の方法を

形態的な相異の認められない事を報告し震2盲に，開発した。なお，予備実験として行った正常及び両者の分化の過程を定量的に比較するため，マウ筋ジスマウスの筋及び血清CKIzの解析結果につス再生筋芽細胞のクロン培養技術を開発だ両者

いても報告する。

の一定培養期間における細胞分裂回数を比較し，
筋ジス筋芽細胞の分裂回数は正常のそれに比し，有意に減少している郵）分裂回数の減少は筋ジス

材料と方法
HI 血清及び骨格筋酵素標品

筋芽細胞の世代時間の延長でなく，それは正常筋

正常（C57Bl／6＋／＋，121日令）及び筋ジ芽細胞よりも早期に分裂能を失う事による事を明ス（C57Bl／6J dy／匂y，101日令）の各マウスらかにした。以上の結果に基づき，今年度は以下

を瞬間的に断頭，採血し，その後，大腿部皮膚をの各研究を行った。

はくりして，各大腰直筋を採取した。血液を5℃，（‖ 成熟マウス骨格筋単一筋線経の分離とその培養。

2時間放置して後，3000rpm，30分間遠心沈澱（2）筋コロニー単位の筋線維クレアチンキナーゼを行い，血清を分離した。筋を細切し，湿筋重量（CK）のアイソザイム（Iz）解析法の開発。

の20倍のMOPSOバッファー〔3−（N−mOrph0−（3）In vivoにおける正常及び筋ジストロフイマ

1ino）−prOpane−SuJphonic acid，50mM，pH7．8〕

ウス骨格筋の再生能の比較。

を加え，2回の凍結融解を行い，5℃，10，000rpm（日は）についての実験結果は未だ発表の段階に至30分間遠心沈澱をし，その上清を筋酵素標品（×20）っていないため，今年度はほ こついて報告する。

とし，適宜稀釈して使用した。

筋クロン培養は定量性の他，種々の特性を有し，

ほ）単一筋コロニー酵素標品

筋の発生生物学上の重要な研究手段である：）しか正常マウス（C57Bl／6 ＋／＋）再生筋由来筋

し．ウウス再生筋芽細胞の形成する筋コロニーは芽細胞を我々の方遠さクロン培養し，筋コロニーを得た。培地を棄て，多核筋線維だけからなるコ＊ 国立療養所刀根山病院＊＊大阪市立大学医学部
十現住所国立循環器病センター

ロニーを選び，厚さ1mm，内径4mのシリコンラ
バーのリングで囲い（図1の1），EarIe液で2回洗源後，10mM MOPSOバッファを10／lL加

Ⅲ 細胞培養42

え，針で筋線経をかき落し，Ht（ヘマトクリット）

ドを認めた（図4B，C）。この成分を仮にⅩ′成分

管で吸引し（図1の2），2回の凍結融解の後，Htと呼ぶ。Ⅹ′成分は，その耐熱性から考えて，CK用遠心機で，10．000rpm，5分間遠心沈澱を行っとは認め難い。筋ジス筋酵素標品のMB，BBの比た（図1の3）。Ht管の先端を切り，上宿をシリコ

率は正常筋のそれに比し，いづれも高い（表1）。

ンラバー上に水玉状に置き，5℃の冷蔵庫内で全（3）単一筋コロニー筋CKIz

量が2JJ上に濃縮するまで放置（図1の4）（約1

結果は図5に示した。Aは標準人血清CKIz〜2時間）して，電気泳動を行った。この濃縮のB，C，Dは各々一個の筋コロニー筋繰経のCKIz

過程で酵素活性の濃縮を確認している。

である。B，CはMBとBB，DはMB，BBの他に（引 電気泳動

淡いMMのバンドを示している。MM，MB，BB

電気泳動はコーニング杜のアガロース電気泳動
5）システムを用いて行った。酵素反応はRosalkiのは各々前記正常筋酵素標品のそれらと同じ位置を占めていた。

コ一二ング変法によって行った。これはLohman
検の逆反応で最終的に生成されるNADPHに紫外線

討を当て，その蛍光により，酸素活性を定量する。

単一筋コロニー筋線経のCKアイソザイム解析

各アイソザイムの比率はコーニング社の蛍光測定が可能であることを示したのは本報が最初である。

機でスキャンする事により求めた。

以上の結果はマウス再生筋芽細胞の作る小さな筋
コロニーの筋線維からでも，以上述べた方法によ結果って，充分に明瞭なアイソザイムバンドを作り得（1）血清CKIz（クレアチンキナーゼアイソザイム）

る活性を持った酸素標品を得る事が可能である事

正常及び筋ジス血清の竃気泳動により，各々，を示している。この方法によって，クロン培養下

次の各位置に蛍光を発するバンドを認めた。ra）標における筋分化の進行をCKアイソザイムのパタ

準人血活のMMより僅かに（＋はりの位置，（b汀司Mーンの変化によって解析する事が可能である。又，Bに相当する位置，（cHbJの少し（＋娘Uで，明らかに筋コロニー筋線経を材料にする事により，線維芽（b）と異なる位置，（dI同BBに相当する位置。（a），

細胞を含まない純すいの筋クレアチンキナーゼの（b），（d）の各位置のバンドは，各々，MM，MB，

アイソザイム解析が可能になる。単一コロニー筋BBであると考えられる。（C）の成分は不明である

線維アイソザイム解析が可能になる事により，筋が，仮にⅩ成分と呼ぶ（図2）。Izパターンのスキ

発生生物学の研究手段としての筋クロン培養の利ャンの結果，MB，BB，Ⅹ成分の比率は筋ジス血

用範囲は更に拡がるものと考える。

清で高かった（表1）。

筋酵素標品の電気泳動で認吟られたⅩ′成分は筋（2）筋抽出液のCKIz

コロニー酵素標品の電気泳動では認められなかっ

正常，筋ジスいづれの筋酵素標品も，各々の血た。その理由として，（a）筋コロニー酵素標品の濃清同様，MM，MB，BB，の三つのIzに分離した

度が低い，（b）X′成分は筋組織中の筋線維以外の（図3）。各アイソザイムの電気泳動上の位置は血成分に由来する，の二つが考えられる。筋コロニ

清と同じであった。X成分は認めなかったがMM

ー酵素標品のⅩ〝成分の存否は未だ験べていない。

のト側に一つのバンドが認められた。仮に与れをいづれにしても，アガロース電気泳動，Rosalki

Ⅹ′成分と呼ぶ（図3）。濃厚な筋酵素標品（×20）をのコ一二ング変法で筋CKアイソザイム解析を行

90℃，10分間加熱すると，MMの大部分，MB，

う場合，Ⅹ′，r成分の存在を念頭におく必要が

BB，Ⅹ′成分の活性は失われたが，元のMMバンある。

ド内の（＋側のはしに，明らかに蛍光を発するバン

最後に，本報で述べた酵素標品の濃縮法は微量

6 サテライト細胞の培養

aratlon of Sam

43

le for Electro

hore815

10f MOPSO buffer
4mm

円 伍ヨ＝王1mm

四辺

下、

ノl

Sillconrubbe工・二rin

（4）

恵三等慧酔

rubberHOpSO buffer3−（雨−Horpholino卜2−hydroxypropane

8ulfonic acid．10m勘pIi7．8

図1

BB

MB

MM
A
図2

B

C

マウス血清CKアイソザイム
A：標準人血清（1〟・β） B：正常マウス血清（2ルg），C：筋ジスマウス
血清（2ルゼ）Ⅱ 細胞培養

44

BB

MB

MM
A
図3

B

C

マウス大腿直筋CKアイソザイム
A：標準人血清（lJ上β），B：正常筋酵素標品（×100），C：筋ジス筋酵素標品（×100）

BB

MB

MM
A

B

C

図4 正常マウス筋CKアイソザイムの熱処理
A：標準人血清（1〟ゼ），B：正常筋酵素標品（×20），C二加熱（90℃，10分）処理した正常筋酵素標品（×20）

6 サテライト細胞の培養

BB

MB

MM
A
図5

B

C

D

単一筋コロニー筋線維CKアイソザイム
A：標準人血清（ユ〟ゼ），B〜D：単一コロニー筋酵素標品

Table lCreatine Kinase zsoenzYme Distributionsin Serum and in Muscles either from
Normal or DYStrOPhic Mice（％）
Serum

HuscleNormal Dystrophy
BB ll．2
18．6
Ⅹ
1．4
2．1

Normal Dystrophy
1．2
4．1

HB
MM

2．8
96．0

2．3
85．1

2．5
76．8

3．7
92．2

Ⅲ 細胞培養

46の不安定な物質の簡単且つ確実な濃縮法として利 戴きました0感謝致します0
用する事が可能であろう。
文

ま

と

献

1） Kagawa，T．，Chikata，E．，andTani，J．（1977）．Dey．

めβわし55，402．

単一筋コロニー筋線経のクレアチンキナーゼ解T．（1978）．βey．βわ上，65，526．
Kagawa，T．，Chikata，E．，and Hamano，R．（Inpress）．lnβfomedkdJ月朗．血〟〟∫蝕kr砂∫JrOp々γ（Ebashi，S．，andOzawa，E．eds．）．pp．19−27．

折の方法を開発した。
謝
刀根山結核研究所

辞楠瀬正道教授2） Kagawa，T．，Chikata，E．，Tani，J．，andTsutamune，

楠瀬恵美両

氏にクレアチンアイソザイム解析について助言を

4）香川務 印刷中「筋の発生生物学」（小沢鋲二郎，
嶋田裕，眞崎知生編）pp・57−63．
5）Rosalki，S．B．（1967）．Jエめ．C〃几〟ed．，69，696・

47

7

ニワトリ胚抽出物中の筋芽細胞増殖促進因子
小 沢 瑛二郎＊
研究協力者 伊 井 一 夫＊筋細胞の培養には，Eagleのminimumessen−tial medium（MEM）と馬血清そしてニワトリ胚因子の組成分布，部分精製とその性質について報告する。

抽出物（Chick embryoextract，EE）の混合液が広く用いられてい去 ご）この混合液は，鳥類だけで材料と方法なく哺乳類の筋細胞の培養にも用いられ，また高培養細胞：9日目ウズラ，11日日ニワトリ胚胸

細胞密度での培養にもクローン培養にも用いられ筋からK。nigsb。rgの方法で：）また生後1日目ラる。我々は，この混合物のうちEEの筋成長に関ット後肢筋からY。rf。の方巌それぞれ単細胞を与する因子を明らかにすべく研究を進めて，まず得，80％MEM15％馬血清5％EEから成る培第一にEE中のトランスフェリン（Tr）が鳥煩の養液で初代培養を行なった。16−20時間後に低筋成長に必須であることを明らかにしてき震4）こ濃度でのトリプシン処理により筋芽細胞を選択的

れは，Tfの作用には類特異性があり，馬血清中に集め定ブのTfは鳥類の細胞には無効であるためであるご）

筋芽細胞増殖促進活性の測定：活性測定には，

しかしEEは哺乳類の筋細胞の培養にも用いられ

線維芽細胞の混入を最も少なくできるウズラの細ており，EEが哺乳類の筋細胞の増殖を促進し，EE

胞を主に用いた。上記の方法で得たウズラ筋芽細の濃度を増すと筋芽細胞の融合を遅らせる効果が胞を10JLMヒポキサンチンを含む84％MEM，15

ぁることも知られているご7妄たEEのかわりにニ％馬血清，−1％ニワトリ血清，0．1％EEの混合

ワトリTfを用いた系では高細胞密度での鳥類の液に浮遊し，ゼラチンをぬった35mmのプラスチッ

筋芽細胞の培養は可能であるが，クローン培養は困難である。これらのことは，EE中にTf以外のクシャーりこ0・5〜2xlOcellsAishに播いた。1日後に培養液を1．45れβの10／ Mヒポキサンチン，

筋成長促進因子が存在し，それは種特異性の高く

10／上抽オヴオトランスフェリンを含む85％MEないものであることを示唆する。

M，15％馬血清（B（：MTH）に換えて，これに適当員の添加物を加えて1．5仇βにして培養を行なっ

今回，我々はEE中のTT以外の筋芽細胞増殖促
進活性を分析し，第二の因子としてプリン塩基類の関与さらに第三の因子としてタンパク様増殖因

た。培養琴48−72時間後に細胞を集めて，DN
A量を測定した。DNA定量はHinegardnerの方子の存在を明らかにした。この因子は，ニワトリ

越を行ない，0．9％N。Cl水溶液を添加した上記やウズラだけではなくラットの筋芽細胞に対して液中で培養したコントロールのDNA量との差をも増殖促進効果を示す。以下このタンパク様増殖

活性の指標とした。

＊国立武威療養所神経センター，機能研究部

筋芽細胞増殖促進因子の部分精製：EEをつくる

Ⅲ 細胞培養48

原材料である12日日ニワトリ胚から増殖促進因子

延：SephadexG−75からの活性の流出パターンを精製した。ニワトリ胚に5倍容0．9％NaCl をから因子の見かけの分子量は16Kから20Kダル

加え，ホモゲナイズLlNHClを加えてpH3．5トンであった。この因子によるウズラ及びラットにし，1〜2時間撹拝した。遠心上宿のpHをlの筋芽細胞に対する増殖促進効果をEEとタンパ

N NaOHで6．0に合わせ，0．9％NaC1，．0．1MNa

ク濃度を基準にして比較したのが，第1図及び2

phosphate（pH6．0）に平衡化した。CMSepha−図である。この因子はいずれの場合も0．1／上戸／戒dexC−50を加えて活性を吸着させ，0．2MNaClの濃度で効果を発揮し，ウズラの場合は10／上組を含む0．1MNa phosphate（pH6．0）で洗ったのでラットの場合は1／上佃で活性はプラトーに達ち，0．5MNaClを含む緩衝液で活性を流出させた。

した。EEのDoseresponse曲線と比較すると，

DiaFlo（PMlO膜）で濃縮，50倍容蒸留水に透析

1／100〜1／500の濃度で有効であるが，プラトし不溶物を除き，塩濃度を0．15MNaClO．lMNa

ーの活性レベルはずっと低かった。ラットの培養

phosphate（pH6．0）に合わせてCMSephadex

筋芽細胞は線維芽細胞の混入がかなりあったのでC−50カラムに添加し，0．2M−0．6MNaClの直クレアチンキナーゼ（CK）活性も測定し，この因線勾配で展開し，0．3−0．4MNaClの活性分画を子が筋原細胞の成長を促進することを確認した。

濃縮した。この分画をSephadexG−75カラムに高い濃度の因子やEEを加えた場合かえってCK

添加し，0．1MNH▲HCO3（pH8．5）で展開した。

蓄積量の低下が見られたが，これはこの因子が融活性はタンパクMarker a−Chymotrypsinogen

合を遅延させるためである。ウズラの培養細胞の（分子量25Kダルトン）より後，Cytochrome C

写真を第3図に示す。24時間Platingの後，培養（12．5Kダルトン）より前に流出した。活性の高液を換えた直後は，単核のものしか見られないが，い分画を濃縮し，Sephadex G−75で再分画し，34時間後にはEEや因子を含まない培養液中のも

1mMNaHC03を含む0．9％NaClに透析して部のは融合がかなり進んでいる。EEや因子を含ん分精製標本とした。500才のニワトリ胚から3野でいるものでは，筋芽細胞が増殖し，多核の細胞のタンパクが得られた。

はほとんど見あたらない。この融合の遅延効果は，分化の生化学的指標としてよく用いられるCK活

結果性／DNA値の経時変化を求めることによっても一届芽細胞増殖促進活性の組織分布：12日日鶏胚確かめた。即ち，因子の濃度を高めるほどCK活及び成鶏（4ケ月令，？）の各組織に5倍容0．9％

性／DNA値の立ちあがりは遅れた。

NaCl を加えたホモジェネートの遠心上宿の活性を比較検討した。12日目鶏胚ではいろいろな組織

考察

抽出液で活性が認められたが，胸筋，足筋，砂の我々は前年度報告において，馬血清を含む培養

う，眼の活性が比較的高かった。成鶏では，胸筋液でEEが鳥類の筋細胞の成長に対して果たす最や脳に高い活性が認められたが，肝臓や血清では大の役割として，EE中のTfの役割一鉄の同頬低い活性しか認められなかった占′の細胞への供与−を明らかにし謹今回はEE

EE中の増殖促進活性の性質：飽和量のTf とヒ

中にTr以外のタンパク様増殖因子が存在するこポキサンチンを加えた培養系でのEEの筋芽細胞とを明らかにした。この因子は未だ部分精製の段

増殖促進活性は，透析や1％メルカプトエタノー

階であるが，ウズラやニワトリだけではなくラッル処理ではほとんど失宿しないが，70℃5分の熱

トの筋芽細胞の増殖も促進する。即ちTfとは異処理や8M尿素処理で失宿した。

なり細胞に対する特異性は高くない。

部分精製因子による筋芽細胞増殖促進と融合遅ここで活性測定に用いた基本培養液は，馬血清

7 ニワトリ胚抽出物中の筋芽細胞増殖促進因子

49

DoseresponseforMPFandEE（quailmyob］ast．104cells／dish；52hrincubation）

10︵毒P︑竺︶≦凸5
図1筋芽細胞増殖促進因子（MPF）とEEのウズラ筋芽細胞に対する用量反応曲線を含んでいる。従って馬血清中に充分量含まれてれるが，牛の脳下垂体から精製されているFGF

いるものの活性は除外される。ソマトメジン頬やと作用上，性質上似ている点がある。しかしFGF

インシュリンの増殖促進活性は一般的に認められの本性については，現在いくつかのグループからているが，我々の系では活性としては現われない。

疑義が投げかけられてお舅0毎々の因子との関連

言い換えると，このassay系で見出された増殖因についても今後の研究を待たなければならない。

子は馬血清中には低い濃度でしか存在しないと思EEの筋芽細胞増殖促進活性は筋芽細胞融合のわれる。実際ニワトリ血清や胎児牛血清もEEと時期の決定との関連で注目されてきた。そして培上t薮すると1／10以下の活性しか示さなかった。そ養液中のある種の増殖促進因子が消費され，筋芽れに対して，筋や脳抽出物に高い活性が認められ細胞のGl期が長びくにつれ融合への確率が高まるので，神経一筋相互作用や筋の再生に重要な役ると考えられている：）我々の因子は筋芽細胞の増割を果たす因子である可能性もあろう。

殖を促進するとともに融合の時期を遅延させるのこの因子とこれまで知られている成長因子との関連であるが，ソマトメジン類，EFGとは区別さ

で融合時期の決定に重要な役割を果たす因子である可能性もあろう。

Ⅲ 細胞培養

50

Dose response for MPF and EE
10（ratmyoblast，104cells／dish，69hrincubation）
DNA︵エS苛︑竺︶＜Z凸／ノ千°≡≡
10−210−1110

102103

Protein concentration（Jlg／mt）

100︵エS至lモコ∈︶主＞票岩︶6

CK activity

M㌘′㌔

／ノ
10−210−1110102103

図2 萌芽細胞増殖促進因子．（MPF）とEEのラット筋芽細胞に対する用量反応曲線

7 ニワトリ胚抽出物中の筋芽細胞増殖促進因子

51

図3 筋芽細胞増殖促進因子とEEによる，ウズラ筋芽細胞の増殖促進と融合遅延。
A）10個の細胞を357Tm dishに播き，24時間培養後培養液をBCMrHに換えた
直乳 B−D）はそれから34時間後 B）BCMTH C）筋芽細胞増殖促進因子（1／上戸／／棚）を含むもの D）EE（350〟摘）を含むもの
Bar：200／tm）

筋芽細胞の増殖促進に関与する因子を明らかにしていくことは筋の発生，分化そして再生の機構

511−527，1979．

3）Kimura，Ⅰ．et al∴伽y．Grow班か脾た，24，369−
379，1982．

を解明するために重要なことである。そして我々

4）Ii，Ⅰ．etal．：Dey．Biol．，94，inpress，1982．

は培養系に用いられるEEの増殖促進活性の本性

57（B），406，1981．
6）Yaffe，D．：Exp．CellRes．，66，3348，1971．
7）Linkhart，T．A．etal．：Dev．BioL，86，1g130，1981．
8）Hinegardner，R．T．：Anal．Biochem．，39，197−201，1971．

のいくつかを明らかにしてきた。しかし部分精製
因子を加えてもまだEEの活性には及ばず，さらに未知の増殖因子の関与が示唆される。

文

献1）Richler，C．and Yaffe，D．：Dev．Bio7．，23，1−22，
1970．
2）Konigsberg，Ⅰ．R．：肋班odg加g花町椚OJoの′，58，

5）Ozawa．El and HaBiwafa，Y．：丹oc．Jopo11Acod．，

9）Thomぉ，K．A．et al．：エβわエαe椚．，255，5517−
5520，1980．
10）Komet，J．G．et al∴J
1981．

βわムC鮎肌．，256，54−58，

11）Kon短sberg，Ⅰ．R．：血流0卵乃e血 qr 仇J〝∽乃Muscular Lb7StrOPhies （Excerpta Medica，
Amsterdam），779−798，1976．

52

8 培養骨格筋における活動電位の発達に関与する神経性因子
加 濃 正 明＊
研究協力者 山 崎 捨 夫＊ 佐 藤 諦 吉＊

骨格筋細胞の分化や，分化した性質の維持には

本研究の目的は，骨格筋細胞膜の機能蛋白であそれを支配する神経細胞が重要な役割を果たしてるTTX感受性Naチャンネルの遺伝情報発現に関おり，神経の栄養的効果と呼ばれているが，この係すると思われる活性物質の化学的性質を明らか

効果の少なくとも一部は，神経細胞で合成され，にし，栄養効果の本態を解明しようとするもので

神経筋接合部を経て筋に移行しているところの栄ある。

養物質の作用によるものであるということを示す
報告が最近多くみられるようになった。

ニワトリ胚由来細胞培養骨格筋におけるTTX
感受性Naチャンネルの発達を促進する活性物質は，脊椎動物成体の骨格筋細胞膜にはテトロドトキ

昭和55年度研究報告劃こ述べたどとく，蛋白質でシン（TTX）感受性Naチャンネルが発達しており．

あると考えられる。本年度はニワトリ胚の脳抽出

その細胞の発生する活動電位はこのチャンネルの液を出発材料として，硫安塩折，ゲルクロマトグ作用によるものである。またこのチャンネルは生

ラフィー，イオン交換クロマトグラフィーを行い，後，神経支配の完成と共に発達して，筋細胞にお活性物質の分離精製を行った。

けるその密度が増加し，逆に，成体筋で神経支配を断たれると，その密度が減少することがラット

材料と方法

骨格筋でみられてお坑㌔のチャンネルの発達お細胞培養の方法は昭和55年度研究報告書に述べよび維持が，神経による栄養的影響のもとにあるた通りである。すなわち，僻卵11日目のニワトリことを示している。

胚から胸筋を摘出し，これをトリプシン処理してニワトリ胚由来の細胞培養骨格筋では神経支配

筋原細胞の浮遊液を得る。これをコラーゲン塗布なしの状態でもTTX感受性Naチャンネルが発達した培養皿に単層培養して筋細胞を形成させる。

するかぎ，）しかしこの際ニワトリの神経組織抽出液

用いた基本培養液はイーグルの合成培養液にウマが培養液中に存在することが必要で，それが存在

血清（10％），神経組織を除いたニワトリ胚の抽出しないとTTX感受性Naチャンネルの発達が著し液（2〜5％），L−グルタミン（1mM）およびく低下することが確かめられ震5享昭組織抽出液

抗生物質を加えたものである。

中に，TTX感受性Naチャンネルの発達を促進す

ニワトリ胚（僻卵19日）の脳を2倍量のタイロイ

る活性物質が含まれており，in vivoにおいてもド液と共にホモジナイズした後，2000×デ，10分；

このような物質が栄養物質として働き，このチャ

20Kxタ，30分；100KxF，60分の3回の遠心、ンネルの発達，維持に関与していると考えられる。

を行って得られた上宿を出発材料として，TTX感＊北里大学医学部生理

受性Naチャンネルの発達を促進する活性物質の分8 培養骨格筋における活動電位の発達に関与する神経性因子

53

離精製を行った。分離精製の段階での活性物質の沈澱分画を塩類溶液に再び溶解し，透析によって分解，失宿を防ぐ目的で，3種の蛋白分離酵素阻

硫安を除いた後，培養液に加えてTTX感受性Na

害剤の存在下で分離精製を行った。用いた阻害剤

チャンネルの発達を促進する活性を調べた成績をはロイペプチン（10／ M），アンチパイン（10／lM）

表1に示す。活性は主に50〜67％飽和硫安分画

ペブスタチンーA（1／lM）の3種類である。

に回収されている。

蛋白分解酵素阻害剤の存在下での硫安塩折，ゲ2）ゲルクロマトグラフィー

ルクロマトグラフィーおよびイオン交換クロマト

上述の50〜67％飽和硫安分画をSephacrylS−

グラフィーによる分画は，Lowry法によってそれ300を用いてゲルクロマトグラフィーを行い，図ぞれの蛋白塁を測定し，培養液1mg当りの各分画1に示すどとくに，全体を5つの分画に再び集めの蛋白量が3．3JlFになるように培養の全期間にて，同様にして各分画の活性を調べた結果が表2わたって培養液に加えて，その活性を測定した。

である。分子量の低い分画ⅠVに活性が回収されてある実験ではその1／10量を加えた場合もある。

いる。

各分画中に存在する蛋白分解酵素阻害剤は，各分3）イオン交換クロマトグラフィー

画を培養液に加える段階でさらに30〜300倍に稀Sephacryl S−300による分画ⅣをDEAEセル

釈されこの濃度では阻害剤それ自身による測定に

ロースイオン交換クロマトグラフィーによってさ

対する影響のないことは，予備実険で確認した。

らに分離を進めた。図2に示したように最初NaCl

TTX感受性Naチャンネルの発達の指標として，濃度を0．15Mにした時に吸着せずに素通りする

TTX感受性Naスパイク電位の最大立上り速度を

分画Ⅰ，0．25M−NaClで溶出される分画Ⅱ，0．325M測定した。これが大きいということは細胞膜にお」VaClで溶出される分画Ⅲ．0．45M−NaClで溶けるTTX感受性Naチャンネルの発達がよく，そ出される分画Ⅳの4つの分画に分け，各分画の活の密度が高いということを示している。

性を調べたのが表3である。分画Ⅱ，Ⅲ，Ⅳに清2週目の培養を用い，倒立顕微鏡下で1本の筋細胞に2本のガラス管微小電極を刺入し，その一一性が認められたが，特に分画Ⅲ，Ⅳに強い活性がみられている。

方より脱分極性のパルス電流を通電して刺激を行い，それに応じて発生するスパイク電位を他方の考案

電極で導出し，これを電気回路で微分して，その以上の成績から脳抽出液中に含まれる活性物質

立上り速度を測定した。ニワトリ培養骨格筋細胞

は，比較的分子量の低い蛋白質であることが解っの場合，スパイク電位はTTXにより殆んど完全た。生体内での神経支配によるTTX感受性Naチに遮断され，その立上り速度の最大値はTTX感

ャンネルの発達や維持に対する栄養効果の担い手

受性Naチャンネルの密度を反映している。TTX

として，このような蛋白質が栄養物質として働い

感受性Naチャンネルは，低い静止電位では不活性ているものと考えられる。脳抽出液中の活性物質化されるので，最大のスパイク応答をうるためにによるTTX感受性Naチャンネルの促進作用は，細胞膜に定電流通電を行い，予め−80hVの常に培養液中に同時にmRNA合成阻害剤であるα−ア一定の膜電位にした後，パルス電流による刺激を

マニチンを加えておくことによって抑制されるの行ってスパイク電位を発生させた。

でこの活性物質の作用点はTTX感受性Naチャン

8）

ネル蛋白の合成に関係した遺伝子の転写レベルで
成

果1）硫安塩析
脳抽出液の超遠心上宿を硫安塩折して得られるはないかと考えている。

Ⅲ 細胞培養54

表1培養骨格筋のTTX感受性スパイク電位の最大立上り速度（Ⅴ／S∝）に対する硫安分画の効果

Dilution0−33％

1（48日25．5±3・51033−50％

50−67％（48日26・8±3・4★（50）142・3士．3・2★★

（48）121．9±3．3（48）124．8±3．5（48日36．3±3．5★★

Mean±SE．＊indicates significantincrease from the control（118．0±
2．4，日＝64）at p＜0．05；★★p

く0．001．

硫安分画は蛋白分解酵素阻害剤の存在下で行った。培養液1血Z当り3．3／lgの分画蛋白塁を加えた場合が希釈1である。その1／10量の場合が希釈10である。

50

60・

70

80

Tube No．

図150〜67％飽和硫安分画のSedlaCryl S−300によるゲルクロマトグラフィー
蛋白分解酵素阻害剤を含む緩衝液で濾過を行った。図に示したごとく全体を5つの分画に集めてそれぞれの活性を調べた。破線は分子量を表わしている。

90

8 培養骨格筋における活動電位の発達に関与する神経性因子
蓑2 培養骨格筋のTTX感受性スパイク電位の最大立上り速度に対するゲルクロマトグラフ
ィーによる分画の効果

Fraction

Maximum rate of rise（V／SeC）
6
9

ControI

81．4±1．7
8
4

F−O

77．6
0
7

F−I

2
7

F−ⅠI

0
7

F−ⅠⅠI

0
7

F−IV

Mean±SE・

±

2．7

84．8±

2．4

86．6

±

2．1

84．9

±

2．1

95．8±

2．3

★

＊indicates slgnif円cantincrease from theCOntrOl at p＜0．001．
培養液1mg当り3．3Jl牙の分画蛋白量を加えて活性を調べた。

10

20

30

40

50

60

Tube NO．
図2

Sephacryl S−300による分画IVのDEAEセルロース（DE52）イオン交換クロマ
トグラフィー

蛋白分解酵素阻害剤を含む緩衝液で行った。0．15M−NaClを含むリン酸緩衝液（さH7．2）
でカラムを平衡化し，同じ液で試料を吸着させた後，0．25M，仇325M，0．45Mの3段階のNaCl濃度で溶出を行った。

55

Ⅱ 細胞培養56

裏3

培養骨格筋のTTX感受性スパイク電位の最大立上り速度に対するイオン交換クロマト
グラフィーによる分画の効果

Fraction

Maximum rate of rise（V／SeC）
4
6

ControI

66．2±1．7
8
4

F−I

2．6

74．3±

2．7

★

87．6

±

2．3

★★

88．6

±

3．0★★

8
4

71．1±

F一ⅠI

8
4

F−ⅠⅠI

8
4

F一IV

Mean±SE．★indicates slgnificantincrease from theCOntrOl at p

＜0．01；★★p＜0．001．

分画ⅠおよびⅡは培養液1mg当り3．3Jげの分画蛋白が加えられた。しかし分画Ⅲ お
よびⅠⅤは蛋白濃度が低く，それぞれ0．3J 摘，0．1〟紬の蛋白濃度で加えられた。

文献1）Ha汀is，J．B．＆MaIShau，M．W．（1973）．肋餌re〟gw
βわ上，243：191−192．

2）Redfem，P．＆Thesle托S．（1971）．血血戯耶混
gcd〝d，82：70−78．

3）Kano，M．＆ Yamamoto，M．（1977）．J．（k乱用γ虚。1，90：439444．
4）Kano，M．，Suzuki，N．＆Qjima，H．（1979）．JICbLL
凡γよね上，99：327・332．

5）Yamazaki，S・＆Kan0，M．（1981）．政pL NeuroL，
74：408418．

6）加濃正明，山崎捨夫，佐藤諦吉，山本三恵，筋ジス
トロフィー症の基礎的研究（江橋班）昭和55年度研究報告書，40−44．
7）Kano，M．，Shimada，Y．＆Ishikawa，K．（1972）．
J Cb几勒血工，79：363−366．
8）Kano，M・＆Suzuki，N．（1982）．伽γめク．β相加Re鼠，3：674・678．

Ⅳ

生

理

学

9．骨格筋の発達過程の機能的，形態的追跡−鶏胸筋の正常とジストロフィー筋の比較−

10．筋細胞膜における膜興奮機能の発生
11．除神経による活動電位の誘発

59

65
73

12．ジストロフィーハムスターの心臓機能と骨格筋
筋小胞体のCa取り込み能に関する研究

13．両生類骨格筋の遅筋と速筋：筋小胞体の性質の比較

76

80

59

9 骨格筋の発達過程の機能的，形態的追跡
一鶏胸筋の正常とジストロフィー筋の比較−

堀

田

健

大 羽 利 治・山 本 まり子

私共は鶏胚胸部から得た筋細胞の培養標本につ結果

いてその性状を電気生理学的，形態的に観察し，培養細胞の初期発育過程：植付けた細胞は培地

正常とジストロフィー筋の細胞膜機能のちがいを中で融合し，急速に筋管形成が進み，2［］問経過報告し震今回は同じ標品を用い，培養初期からしたのちには第2図aに示されるようなmyotu−

細胞膜電位，興奮に伴う膜電流を測定し，イオン

buleに成長した。このとき細胞内には，細いフィチャネルの形成発達過程及びそれに対する脊髄神

ラメントがあらわれ，Side−by−Sideに配列した場

経の影響等を追跡した。

所があることが電子顕微鏡で観察された（第2図b）。Dystrophyの筋も同じような経過をたどっ

材料及び方法て成長することが確められた。然しながら細胞内

ジストロフィー（N．H413）及びコントロールに細い繰経の出現がみとめられるもの，全く出現（412）の受精卵370Cで12日間辟化して得た鶏していない細胞も多く，正常筋に比して成長が不胚の胸部から筋原細胞をとり出し，コラーゲン揃いであった。

を塗付した培養皿で95％air−5％CO2，37℃の環細胞内部構造の形成：培養開始後4〜5日で光境下で培養を開始，2日目から約2週間にわたっ

顎的に横紋があらわれ，7〜8日で殆んどすべててその成長を位相差顕微鏡及び電子顕微鏡で経時の線経が横紋をもつようになった。このとき細胞的に観察した。一万7〜8日間照化して得た正内に太いフィラメントが細いフィラメントに附着

常胚の脊髄を破砕し，脊髄神経細胞を筋管形成がするようにあらわれはじめ，Z帯がみとめられる

進行しっヽある筋培養標本に加え，その筋細胞のようになり明帯，暗帯の構造が完成する。つヾい

成長に及ぼす効果をみた。

て内部膜構造（SR，T−SyStem）がところどころに3）

電気生理的測定の装置は前に報告した成鶏筋線観察されるようになり，終末槽とtriadが形成さ経のとき用いたものを改良したもので膜電位の測れたことを示す所見が得られる。第3図は筋細胞定と通電のために2連電極を用い，電極抵抗はおとして完成した培養10日の標品で，aは光昭，b

よそそれぞれ10Mn，5Mrlであった。又測定はは電顕の写真を示す。Dystrophy筋の場合，培養

0rCO2（95−5％）飽和の正常クレブス液中で初期と同じく，正常とかわらない細胞と全く内部行った。第一図は実験の日程，形態ならびに機能構造の形成のない細胞が混在していた。

的な成長過程の概要を示す。

膜電位と電流：筋管が形成された直後から微小電極が刺入出来るがその時点での静止膿電位は極＊名古屋市立大学医学部第一生理学教室

めて浅く，通電によっても反応はあらわれない。

Ⅳ 生理学60

入告370C lll21，1▲

17

18

日

10

21

3†4†5

6

7

8

91011121314日

15

日

22

21

21

25

巨→′
増・姜†12

液交換鮒

。神経冨

0

0

0
一

闇観察

電摘察

融霊長

踊形成自芸総

3240

ぉそい
内向き流

活動電放
く脱分雉）

4555

一＞

踊完成

m霊11amentm誌rl加nt内部膜器膜完成

静止膜電位卜mV）1012

0

5666

6265

→
−→

はやい くmはやいー＋
内向き流 8en81tlve）内向き放く神経あわ）（神経なし）

第1図
実験観察の経過，形態及び電気生理的性質の発達過程の大要

5E］程度経過したSampleは膜電位が深くなり，

考察

脱分極電流によって顕微鏡下で収縮がみられるよ筋細胞が融合をはじめると直ちに筋管内には細うになる。又ところどころ自発的な収縮があらわ

いフィラメントがあらわれ，横にならぶ。これはれる。

アクチンの線状重合体と思われる。これにミオシ

膜電位を静止電位に固定し，脱分極パルスを与ンが附著し，会合を作ってAバンドが形成され，えてそのときに膜を通して流れる電流は成長の初収縮装置が完成されるがE−Cカップリングに主期の段階では第4図aのような経過の長い内向き1役を果すSR，T−SyStemはそのあとで配列が完了

電流が記録される。このような電流は成鶏の場合すると推測される。刺激によっての収縮は内部膜観察されていないヲ成長が進むにつれ，脱分極パの形成以前にも認められる。これはこのとき，細ルスによって速い内向き電流があらわれる（第4胞膜にカルシウムチャネルがあり，外液からの流図b）。この電流は脊髄の共存によってその出現

入が恐らく収縮蛋白を活性化するためであろう。

が著しくはや吟られることが分った。第5図は植細胞の静止膜電位は数日間で−50−−60mVに付け後6【］（脊髄植付後3日）の標品について種達する。これはK＋チャネルの形成過程を表現し々の脱分極パルスによる内向き，外向き電流を示ていると考えられる。膜電位を固定し脱分極パルす。この電流はTTXによって消滅し，この電流スを与えると，第4図に示すように経過時間によはNa＋のinfluxによることが確められた。顕微って区別される2種の内向き電流が誘発される。

鏡下では速い収縮がみられ，この時期ではすでに最初あらわれるのはおそい経過の電流で，さらに内部膜を介してE−Cカップリングがあることを培養をつヾけるとはやい電流があらわれてくる。

示唆している云竃鞄観察によるとこの時期に内部神経が入力すると後者の電流出現がはやめられる膜が形成されているので，この点からもはやい収が，DystrophyとNormalとの間には目立った縮のおこることが裏付けられる。

差異はなかった。速い経過の内向き電流はN㌔チ

9 骨格筋の発達過程の機能軌形態的追跡

第 2 図
培養開始後3日間経過した標本，正常筋
a．位相差顕微鏡 ×200
b・電子顕微鏡
×35，000
多数の細いfilamentが出現している。

61

62

Ⅳ 生理学

第

3

図

培養開始後10日目の標本，正常筋
a．位相差顕微鏡 ×200
すべての線経に構紋構造がみられ筋細胞として完成している。
b．電子顕微鏡 ×15，000
A，Ⅰ帯が規則正しく配列して，Z帯及びこれと共にT管が走行している。

63

9 骨格筋の発達過程の機能的，形態的追跡

restin9

pOtentia1
−45

50

mV

−56
50

msec

mV

msec

第 4 図
膜電位固定下で観察される膜電流，正常筋
上段，脱分極パレス
下段，脹電流a．培養開始後3日，経過のおそい内向き電流b．培養開始後5日，経過のはやい内向き電流とそれにつづく外向き電流

文

ヤネルを通るので，神経はその形成を促進する効果があるといえる。一方，おそい経過の電流はカルシウムの流入を反映している可能性が考えられるが直接の証明はない。
今後何らかの方法で培養標本について興奮と収縮の関連を定量的に測定し，dystrophyとNor−malの筋について，相違があるかどうかを検討してゆきたい。

献1）堀田健，冨田伸子，杉山博之：培養法による鶏ジス
トロフィー筋の電気生理的，形態的及び代謝的特性について，筋ジストロフィー症の基礎的研究，昭和55年度報告書，89−96（1981）2）堀田健∴冨田伸子：発生初期におけるジストロフィー筋のアセチルコリンレセプターの代謝速度，筋の発生と分化に関する基礎的研究，昭和56年度報告書，
91−97（1982）

3）堀田健，大羽利治，越田信，西原己栄子，小鹿幸生：ジストロフィー筋の生理学的研究，筋ジストロフィー症の基礎的研究，昭和53年度報告書，52−58（1979）

Ⅳ 生理学64a

トー50msec一一一−一一1

restin9pOtentia1−66
mV

う目しdelay

第5

回

種々の脱分極パルスによる膜電流
ジストロフィー筋に正常脊髄を植付けたもの。培養開始後6日，神経植付後3日
a．膜電流，更正はbに同じ
b・電流一電圧曲線，脱分極パルスは右方が正，内向き電流は下方65

10 筋細胞膜における膜興奮機能の発生
高 橋 国太郎
研究協力者 平 野 丈 夫

発生分化につれて同一機能を担うと考えられる

域の運命にしたがって興奮性膜に分化する。とく蛋白分子種の交替がおこることは，筋収縮系などに末分裂の1細胞胚をサイトカラシンBで処理しでよく知られている。イオンチャンネルが発生過飼育した場合は細胞膜は表皮細胞型に分化し，Ca程で交替する可能性は，ニワトリ骨格筋の筋管発活動電位を発生する。この膜のCaチャンネルは生時にCa活動電位がまづ出現し，のちにNa活分化した興奮膜のCaチャンネルとよくにた性質

動電位があらわれミ）またNa活動電位のティロドを示すので，この1細胞胚の分化を解析すること

トキン感受性の増遇暢こる等の事実から推測さによりCaチャンネルの分化にともなう性質の変れている。この場合はCaチャンネルからNaチャ化を解析できることを示した。本年度はこの発生

ンネルへの交替が考えられる。

系をもちいて，さらにCaチャンネルの二型の性

一方，同じ膜電位依存性のCa流入を惹起すCa・チャンネルも−種類ではなく，動物種により，発質の相違を明らかにし，またこの変化の発生時問に従った解析をおこなったので報告する。

生時期により異るものがある可能性が指摘されているヲとくに最近報告されている各種の卵細胞に研究方法見られるCaチャンネルはSrイオンに対して透低温海水槽（1．5〜2．5℃）に保存してある抱過性が高く，かつ不活性化過程もNaチャンネル

卵マボヤ個体を一昼夜高温海水（11〜12℃）で飼に見られる様な膜電位依存性のものであると考えうと放精放卵をおこなう。この卵と他の個体が放られている㌘このことは他の多くの興奮性細胞膜

精した精子海水を混合して受精をおこなった。受で見られるCaチャンネルがBaに対して透過性

精後は8℃の恒温槽に受精卵を入れたシャーレをが高く，不活性化過程がCa電流依存性であるこ入れて発生させた。受精卵の一部は対照としてそとと対照的である。したがって，卵細胞型のCaのまま正常発生させ，残りは第一卵割開始前にサチャンネルは明らかに他の分化した興奮膜のもの

イトカラシンB2Jf9／mlを含有する海水中で飼とは異っている。これが分化にともなうCaチャ

育した。また必要があれば16細胞胚で分裂を停止

ンネルの変化であることを明らかにするためにホしたものも飼育した。これらの分裂停止胚を対照

ヤ分裂停止胚をもちいて行った解析を昨年度報告の正常発生卵から幼生が貯化する時点まで飼育すした。

ると細胞膜が分化して興奮膜となる。このようにホヤ発生卵は卵割初期に細胞分裂を停止しても，して得られた未分裂1細胞分化胚と対照として未大型の割球のままで，それぞれの細胞膜は予定領

受精卵のコリオン膜をプロネース10m9／nlを含む
海水に30分以上浸してから解剖針をもちいて除去＊東京大学医学部脳研究施設神経生物学研究室した。これらの裸かにした卵および分化1細胞胚

Ⅳ

66

生理学

を10mMKCl，5mMPIPES−Na（pH7．0），10Ⅲ9／と図1Cに見られるようにCa＜Sr＜Baのml BSA，2J上9／山サイトカラシンB，及び主要順に増大する。またCa溶液中では不活性化が一価塩として400mMのNaClあるいはTEACl，

認められた。B。＿1割球は1細胞胚にくらべて主要二価塩として100mMのCaCl2，SrC12ある

小さいので，時間を追って電流が減少する傾向

いはBaC12を組成とする人工海水に入れ，電圧固定法により膜電流の解析をおこなった。電圧固定があるが，本質的には分化1細胞胚に見られたCaチャンネルと相同のものが存在すると結論は通常の二本の3MKClガラス微小電極を刺入しできた。

ておこない，必要に応じてlMEGTACs2をつめ（2）分化型と卵細胞型のCaチャンネルでは不活た微小電極を刺入した。EGTAを未受精卵に注入性化過程がことなることは昨年報告した。電流して卵賦活を防ぎ，分化一細胞胚にはCs，および振巾が減少する陽性膜電位の範囲でも，電流経EGTAを注入して外向き電流とりわけCa依存性

過の各点で一定の負の膜電位のテストパルスをに電流を抑制した。また外液も必要に応じてNa与えてTail電流を測定するとコングクタンス

ClのかわりにTEAClを含むものをもちい，可及の時間経過を推定することができる。図2のA的に外向き電流を押えて，純粋なCaチャンネルとBに示すように，分化型と卵細胞型ではCa

電流を解析しうるように努力した。またCaチャ

溶液中でのコングクタンスの時間経過に明瞭なンネルのTail電流を測定し，Caチャンネル電流差があり，卵細胞型は単に不活性化が早いだけの少ない陽性膜電位範囲におけるCaチャンネル

でなく，膜電位が高くなると時間経過はより早コンダクタンスの時間経過を推定して，不活性化

くなる。しかし，分化型では膜電位の上昇につ過程の解析をおこなった。

れて，不活性化は少くなり時間経過は延長する。
このことで分化型ではCa電流の振巾に不活性研究結果（1）昨年度の研究結果から，分化1細胞胚のCa＿化が依存するが，卵細胞では膜電位に依存することがさらに確められた。

チャンネルは二価イオン選択持性としてBa＞（3）図3AとBに示すように分化型と卵細胞型の

Sr＞Caの系列をなし，BaあるいはSr溶液中

Caチャンネルの電流電圧曲線を比較すると，では電流が持続し不活性化が少いが，Ca溶液

Ca，Sr，Baの間の選択特性だけでなく安定化効

中では不活性化が明瞭となることがわかった。

果の差もあることがわかる。それぞれの二価イ

そして，このCaチャンネルは分化した興奮膜

オン溶液中での最大電流時の膜電位，閲膜電位の特長であることを示唆した。このことをさらが異づている。安定化効果は分化型・卵細胞型とに確かめるために，筋細胞型に分化した分裂停

もにBa＜Sr＜Caの順であるが，調べてみ止8細胞胚のB4十割球をもちいて，そのCaると分化型の場合Caの結合が少ない。そのたチャンネルの電流を解析した（図1A）。筋細胞

めにCa溶液中でとくに閲値が下っている。Ba型に分化した場合の膜電流はCa内向き流のはのように結合力の殆んどないものの場合でも電かにCa依存性K電流と著明な遅延整流性電流

流電圧曲線は分化型で負方向に10wVほど移動がある。そこで，EGTA及びCsを注入するとしているので，本質的なチャンネル活性化の開図1Bのように持続の長い内向き流が著明とな

値のずれも考えられる。

る。さらに外液のNaをTEAにおきかえると（4）分化型と卵細胞型のCaチャンネルは，二価

図1Cに見られるように，分化1細胞胚のSr

イオン選択特性，不活性化過程，安定化効果に電流と同様の長い持続を示す。この内向き電流

おいて異り，明瞭な二型と考えられる。この二は外液をSr溶液からCa，Ba溶液と交換する

型は分化過程のある時点で交替するはずであり，

10 筋細胞膜における脹興奮機能の発生

67

量］50nA 亡＝鋳20rnsec

C

sr

20mseC

ca

16

t＝

Ba
16

6

□［二戸

「

100msec

Sr
16

二二

l
L＿ノ．．＿

100msec

図1分裂停止8細胞胚の分化したB4−1割球の膜電流記録。皇Sr溶液中での記録。旦EGTA
およびCsを細胞内に注入後の記録。⊆外液のNaをTEAにかえて，さらに外向き電流を抑制したあと，筋細胞型に分化した場合のCaチャンネルの二価イオン選択特性を調べたもの。各電流記録上の数字は膜電位。

これを実際に調べたのが図4である。8℃にお中で測定したCaチャンネルの安定化効果を電ける発生時問のそれぞれの点で，Caチャンネ

流が最大値の半値になる股電位で表し，その変ルの員をSr電流の最大値で示してある。未受化を調べたものである。安定化効果が17時間の精卵すなわち発生時間零で存在していたCaチ

時点で明際に変化することがわかる。

ャンネル（黒丸）は10時間以内に一旦消失し，（5）発生過程におけるチャンネル型の変化はCa

20時間ほどで再び出現する。Caチャンネルはチャンネルの場合だけでなく，Naチャンネル

まだ卵細胞型であるが，40時間を境にして分化についても観察される。図6は分裂停止16細胞型にかわる。附図に示すように37時間ではBa

胚でのNaチャンネル電流電圧曲線の発生に伴

溶液中の電流はSr電流より少なく，40時間でう変化を示している。すべて曲線はCa溶液中は逆にBa溶液中で大きい。すなわち選択特性でもとめたもので6時点の発生時問で計測した。

の逆転がみられる。この40時間という発生時問

これからわかるように19時間以後のものは電流は正常発生の場合Ca活動電位が出現し，筋細電圧曲線が陽性方向に5mV程度移動している。

胞上にACh感受性があらわれる時点に一致す

すなわち安定化効果の増加がある。このことをる。また15℃で発生させた場合は形態変化の観発生時問に対する最大電流値の半値となる膜電点から，17時間に相当する。図5のAは分裂位の変化で示したのが図5のBである。やはり，

停止16細胞胚を15℃で飼育した場合にCa溶液

15℃17時間でNaチャンネルの活性化の閥値変

68

Ⅳ 生理学

A EPIDERM．TYPE

1000
mSeC

図2 分化型LA）と卵細胞型（B）のCaチャンネルのCa溶液中におけるコングクタンスの時間経
過をtail電流の測定により推定したもの。

10筋細胞膜における膜興奮機能の発生

69

A EPIDERM．TYPE
10 nA

Hミ
。
彦
40
l．
一
．

m中

−
10

日

−
20
Sr

−
30

Ba
図3 分化型（刃と卵細胞型（B）のCaチャンネルの電流電圧曲線の比較，とくに二価イオンの安定化効果の差を比較するため，溶液は100mMCa，Sr，Baおよび5mMMnと95mMMgの溶液をそれぞれもちいて測定した。

化があることがわかる。Naチャンネルではこ

二価イオンのCaチャンネルに対する安定化効果，の他に性質の大きな変化はみられないが，卵細不活性化過程の膜電位との関係など多面的な変化

胞型から分化型への変化ということではCaチとも考えられるが，選択特性におけるCa選択性

ャンネルと共通するところがあると思われる。

の相対的低下，Caの安定化効果の相対的低下などの面を総合して考えると，不活性化過程につい研究の考察ては別として，チャンネルへのCa結合能の低下

Caチャンネルの二型は二価イオン選択特性，という点で統一的に考えられるかも知れない。ま70lV 生理学図4 分裂停止1細胞胚におけるCaチャンネルの発達を受精後の8℃における発生時間を横軸にとって表示したもの。測定はすべてSrNa溶液中でおこない，黒丸は発生各時点での卵細胞型のSr電流の最大値である。二重丸は同様にSr電流の最大値であるが分化型のCaチャンネルによると考えられるもの。黒三角は比較のために卵細胞型のNa電流の最大値の変化をましている。分化にともなって卵細胞型Naチャンネルは消失する。附図AとBは各発生時点でのCaチャンネルの選択特性の変化を示すために，Sr電流を比較したものである。

た，分化によって新らしく出てくるCa−＋ヤンネ

は重要な点である。これらの点について昼RNA

ルは卵細胞型のものとはまったく異った分子種で 合成阻害剤，蛋白合成阻害剤，糖鎖合成阻害剤なあるのか，糖鎖などで修飾されただけであるのか

どをもちいてさらに検討する必要がある。

10 筋細胞膜における膜興席機能の発生

71

CA CuRRENTLJL一一…一一一日・−…………‥・−

●
●て￣●

△
●

●●

ACh−E

ACh−r

Syn

NA CuRRENT

▲

●＿●

●■

△

●●

Li肇釘￣●

●

●

▲
hr
20

ACh−E

ACh−r

￣．

30
syn

図5 CaチャンネルLA）とNaチャンネル（B）の安定化効果の発生にともなう変化。30mMCa，．50mMMgを含むNaCa溶液中で分裂停止16細胞胚をもちいて測定し，安定化効果の指標としてCa電流およびNa電流について，それぞれの最大電流値の半値となる膜電位をもちいた。発生時問は15℃のもので，8℃40時間は15℃17時間にあたる。△は電圧固定下でなく，通常の定電流刺激による活動電位出現の閲値から換算した。

文

献l）Kano，M．（1975）．Development ofexcitabilityin
embryonic chick d（eletal muscle cells，JI Cdt．
劫γわし86：503「510．
2）Kano，M．，Suzuki，N．＆Ojima，H．（1979）．Neuro−

trophic effectofnerveextractondevelopmentof
tetrodotoxin−SenSitive spike potentialin skeletal
musclece11Sinculture．J．Cdt．mysioL

99：327−

331．
3）Hagiwara，S．＆Byerly，L．（1981）．Calciumchannel．
d〝几月ey．〟e〟r（）gd，4：69−125．

72lV 生理学図6 分裂停止16細胞胚（点線）のNa電流の電流電圧曲線の発生時問による変化。実線は分裂
一を停止していない胚で16細胞期にいたるまでの初期変化をしらべたもの。測定した溶液
はすべて，30mMCaC12．430mMNaCl，50mM MgC12，10mM KCl，5mM
PIPES−Na（pH7．4）。

4）Okamoto，H．，Takahashi，K．＆ Yamashita，N．
（1977）．Ionic currents throughthe membrane Of
themammalianoocyteandtheircompaJisonwith
thoseinthe tunicateand seaurchin，J．L％ysioL，267：465495．

5）Takal1aShi，K．（1981）．DevelopmentofCachannels
in thecleaYage−arreStedembryoofacertainascid−
ian．The mechanism of gated calcium transport

across biologiCalmembranes．以it．Ohnishi andEndo．AcademicPress，Pp．9・16・

73

11 除神経による活動電位の誘発

進

永

是

照之

的

祐強

山東 勝

目

栗伊高

研究協力者

筋（M．levator pinnae pectoralis）を用い，その運動神経は脊髄から骨格筋へ興奮を伝導するだ

支配神経（′nll及びm2）を陶ビレへの進入部位でけではなく，支配筋組織の生理学的，生化学的性

外科的に切除した。外科処置は右側で行い反対側

質を規定し維持する役割をも有している。従っての胸ビレ筋を対照とした。術後1−5週間後に両運動神経の軸索の一部を外科的又は化学的に切除

側の胸ビレ筋を摘出し，人工潜流液中で微小電極すると軸索や髄鞘が変性するばかりでなく，神経による実質斜こ供した。記録用及び通電用微小電極

細胞体と筋組織に於て著るしい生理学的，生化学はそれぞれ3M KCl及び2M K−aCetateを充て的変化が引き起こされる。

んし，微小電極用増巾器と接続し，通電した電流

筋細胞の電気的膜性質のうち活動電位を例にと及び筋細胞膜の電気現象を記録した。用いたリン

ると，カエルの遅筋は正常神経支配下では活動電ゲル液の組成はNaCl，129．6mM．，KCl，27mM，位を発生しないことが知られているが（1）除神経に

CaC12，1．8mM，NaHCO3 2．5mMであった。

より活動電位を発生する能力を獲得すると報告されている（2）しかし現在まで活動電位の除神経による誘発現象はカエル遅筋に於てしか知られていな

結果

外科処置の後，神経一筋伝導が停止する時期を検索する目的でまず微小終板電位（m．e．p．p）を記い。
一方フナ陶ビレ筋細胞は運動神経による多重神録した。対照側の同定した筋細胞でm．e．p．p．の頻経支配を受けており，正常条件下では筋直接刺激

度を径時的に観察すると，晦ビレ筋摘出後30〜50

あるいは運動神経刺激により活動電位を発生しな

時間では80−120／minと安定した値を示した。

い（3）一方，除神経側で同様の実験をくり返すと術後44

そこで除神経による活動電位誘発現象がカェル

時間後m．e．p．p．の頻度の減少が観察され，45−50

遅筋に特有な現象であるか否か，さらにフナ胸ビ

時間後にその発生は完全に停止した。15個の同定

レ筋に於て運動神経がその興奮性を制御する因子

した筋細胞に於てその平均値を求めると47．6±0．8であるか否かを検討する目的で，除神経のフナ胸時間（±S．D．）であった。このときフィールド刺激

ビレ筋に及ぼす効果を検討した。

（期間50／上SeC）を与えると，対照側では終板電位（e．j．p．）とそれに引き続くれん縞が発生するが，検方法．E］本産フナ（CarassiusAuratusLinne）胸ビレ

九州大学医学部薬理学教室

側ではe．j．p．の発生は全く観察されなかった。すな
わち本実験では術後約47時間後に運動神経の変性が完了し，神経一筋伝達は完全に遮断されたと考

74

Ⅳ 生理学

えられる。
カエル骨格筋では除神経によりm．e．p．p．が完全に消失した後，低頻度のm．e．p．p．の再出現が報告

ー51．4士2．1及び−55．3士3．5mVと徐々に低下し，除神経30日以降では一定値を示した。
除神経後に観察される活動電位はテトロドトキ

されているが（シュワン細胞m．巳p．P．；4）本実験

シン（10篭カ11）によって，また外液中のNa十を正ではm．e．p．p．の再出現は観察されなかった。

常時の132．1mMから2．5mMに減少することによ

運動神経の変性に伴い，両生類や哺乳類の骨格筋では電気的膜性質が変化することが知られている。そこで運動神経変性後のフナ胸ビレ筋の電気的膜性質を検討した。

って完全に消失したのでNa十の内向き電流によって発生すると考えられる。
カエル遅筋における除神経による活動電位の誘発現象や，カエル速筋で除神経後に見られるシュ

フナ的ビレ筋の静止膜電位は正常時には，−87．5

ワン細胞由来のm．e．p．p．発生現象はアクチノマイ±2．1mV（‡S．Dリn＝50）で，除神経30日後に−88．3

シンの投与により消失することが知られている（5，±3．OmV（±S．D．，n＝30）と除神経により正常時に比6）。

しわずかに増加する傾向を示したが，統計的有意差は見られなかった。

そこで除神経によるフナ胸ビレ筋での活動電位誘発現象の機構を検討する目的で除神経後5日目

さらに除神経後7日目までは膜実効抵抗（Rin），

及び6日目にアクチノマイシンD（5×1b￣レnl）

空間定数（ス），膜時定数（rm）及び筋細胞の直径をリンゲル液に溶解しその0．5mlをフナ腹腔内に（β）とこれらの値から計算した単位面積当りの膜

注入し，その活動電位発生に及ぼす効果を観察し抵抗（Rm；KJ2cd），細胞内抵抗（Ri；9cm）及び膜

た。一方，対照としてリンゲル液のみを腹腔内に容量（cm；jLF／cd）に変化は認められなかった。

注入した胸ビレ筋を用いた。対照とした筋組織で除神経後10日位よりRinの増加傾向が認められ，は除神経後経時的に活動電位を発生する筋細胞数

約30日目に最大値を示し（対照の約1．3倍）その後が増加した。すなわち除神経10日目に，検索した

この値は一定値を示した。一万，人及びTmはわ

40例の筋細胞のうち活動電位を発生した筋細胞はずかな増加を示したが（対照の約1．1−1．2倍），Ri

25，発生しない細胞は15例であった。除神経後20に変化は認められなかった。しかし，除神経後20

日目には24個の筋細胞のうち21個の細胞で活動電

日目まで筋細胞の直径に殆んど変化は認められな位発生が観察され，30日目には検索したすべてのかったので，除神経による筋萎縮がRin，Tm増大細胞（22個）が活動電位を発生した。

の直接原因ではないと推定できる。

一万，7クチノマイシンDを除神経後5日目及対照側胸ビレ筋では筋直接刺激あるいは運動神

び10日目に2回注入した筋組織では，除神経20日

経刺激により活動電位の発生は見られないが，検後に検索したすべての筋細胞（13例）で活動電位の側では除神経後3〜4日目に筋直接刺激により局発生が見られず．さらに25日目に検索した4例の所応答が観察され，その大きさと立ち上り速度は筋細胞も全く活動電位を発生しなかった。しかし

経時的に増加し，約3週後にほぼ最大値を示し，

除神経後20日目及び25日目にアクチノマイシンD

allor none型の活動電位となった。ちなみに除神を注入したフナ噛ビレ筋では検索した7例の筋細経後7，10，20，30日目に観察された活動電位の胞（除神経後30日目）のうち4例の筋細胞が活動電

平均立ち上り速度は27．1士16．0，55，8±23且84．4

位を発生した。

±14．3及びぬ2±11．5嘱ecであった。さらに静止

この実験結果はフナ胸ビレ筋に於ては，除神経

膜電位は前述のように除神経により影響を受け■な後早い時期に注入したアクチノマイシンDによりいが，活動電位発生の闘値は除神経後7，10，20

活動電位の誘発現象が抑制されることを示していそして30日後にそれぞれ−35．0±4，0，−42．1士6．5，る。

11除神経による活動電位の誘発
考察

フナ的ビレ筋は正常神経支配条件下では，神経刺激あるいは筋直接刺激により活動電位を発生し75れることは，フナ晦ビレ筋に於ても，活動電位発生機構の獲得にはRNA合成が必要条件であることを示している。

ない。■しかしこの筋細胞は多重神経支配を受けてこれらの実験事実から，フナ陶ビレ筋やカエル

おり神経刺激により発生するe．p．p．の大きさが機遅筋を支配する運動神経末端から未知の栄養因子

械的閥値より大きく，e．p．P．により収縮が発生する。

が放出され，この因子はNa−チャネルの合成に不

しかし本実験によりフナ噛ビレ筋はカエル遅筋可決である蛋白合成系を阻害し活動電位の発生をと同様，除神経により活動電位発生機構を獲得す

抑制している可能性が推定出来る。

ることが明らかとなった。
この変化がどのような除神経効果により発生するのか種々の可能性，例えば①神経の興奮伝導の阻害，①筋収縮の抑制，⑬軸索輸送の阻害による、栄養因子〝の消失などが考えられる。
カエル遅筋ではこ＿れらの可能性を検討した種々の実験がある。カェル速筋及び遅筋はそれぞれ伝導速度の速い運動神経と遅い運動神経によって支配されているが，遅筋が速筋を支配する速い運動神経により支配される実験条件下でも活動電位の発生が観索されていること（71や，さらにカエル遅筋を組織培養した条件下でも活動電位が発生すること（8）が報告されている。しかしボツリスス毒
素で神経一筋伝達を完全に遮断した条件下では，遅筋は活動電位を発生しない（9）。またこの実験で
は遅筋を支配する運動神経の興奮伝導と神経一筋
接合部の形態は正常に保たれている。これらの実

文1）Kufner，S．W．＆VaughanWiuiams，E．M．（1953）．
Propertiesofthe．slow

配神経から放出される栄養因子の放出の停止により活動電位が誘発される可能性を示しており，フナ胸ビレ筋でもおそらく同様のメカニズムで活動電位を発生させると考えられる。さらに除神経の後，RNA合成阻害薬であるアクチノマイシンDを投与することにより活動電位誘発現象が抑制さ

skeletalmuscleofthefrog．

J用γ血よ，121：318−340．
2）Miledi，R．＆Orkand，P．（1966）．Effectofa
nerve

on

slow

musclefast

fibresinthehog．Nature，

209：717−718．
3）Hidaka，T．＆Toida，N．（1969）．Biophysicaldnd
mechanicalproperties of red and white muscle
nbreshnsh．上 竹γわし201；49−59．
4）Birks，R．Ⅰ．，Katz，B．＆Miledi，R．（1960）．Physio−
logical and struCtural Changes at the amphibian
myoneural junction， h the course or nerve de−generation．J．mysEo7．， 150：145−168．

5）Schmidt，H．＆Tong， E．Y．（1973）．Inhibitionby
actinomycin D of the denervation−induced action
POtentialinfrogslow muscle nbres．jケoc．凡∫0仁
上0〃d．且，184：9ト95．
6）Bevan，S．，Muedi，R．＆Grampp，W．（1973）．In−
duced transmitter release from Schwann ce11sandits suppression by actinomycin D．，Nhture，Newβfob幻′，241：85−86．
7）Miledi，R．，Stefani，E．＆Steinbach，A．B．（1971）．
Induction of the action potentialmechanismin
Slow験結果は除神経効果のうち⑬の効果，すなわち支献

muscle

nbres

of

the

frog．J．mysiot

217：

737−754．

8）Cu11−Candy，S．G，，Miledi，R．＆Uchitel，0．D．
（1980）．Induction ofactionpotentialsincultured
Slow muscle丘bres of the frog．J．mysiot．，299：
197−202．

9）Miledi，R．＆Spitzer，N．C．（1974）．Absence ofactionpotentialsin frog slow muscle fibrespara−
1ysed bybotulinum toxin．J．PhysioL．，241：183−
199．

76

12

ジストロフィーハムスターの心臓機能と骨格筋々小胞体のCa取り込み能に関
する研究

明 三

博啓

島林

西小

夫敏人

真

言

敏

緒

井原西

1

酒栗小

研究協力者

した。張力測定と同時に，微小電極法により膜電位，

ジストロフィーハムスター（BIO14．6）は，人間活動電位を測定した。用いた溶液はKrebs氏液で，の筋ジストロフィーの疾患モデルとして注目され，

97％02と3％C02により，PHを7．2に調節した。温

幼若期から心筋に病変が現われることが知られて度は36℃に保った。薬物としては，トアドレナリン，

いる。我々は，ジストロフィーハムスターの心臓

カフェインをKrebs氏液に溶解して用いた。

機能と心筋の興奮一収縮連関機構に注目し，正常

分離筋小胞体膜の分離及びCa−uPtake能の測

ハムスターとの機能性差異について，また，下肢定はNishijima et al（1978）によって行なった。

辺骨格筋から得られた分離筋小胞体のCa uptake能を検討した。

3 結果

A 心臓機能に関する実験

2

方

法

a）体重と心重量実験に用いたハムスターは，正常群吼BIOFIB，

第Ⅰ群の正常群の平均体重は124．0gで，ジスト

ジストロフィー群はBIO14．6で，第Ⅰ群は正常，

ロフィー群のそれは116．8gであった。第Ⅱ群の正ジストロフィー群とも36週齢のものを，第Ⅱ群

常群の平均体重は127．0gで，ジストロフィー群は，としては28週齢のものを用いた。心臓機能と112．7gであり，正常群，ジストロフィー群との間しては，軽度エーテル麻酔下で心電図（第Ⅱまたに差異が認められた。

は第I誘導）を記録し（室温25℃）SignalProcessor

摘出心臓の重要は，ジストロフィー群の方が，正常でR−R間隔のintervalhistogramを観察し，変よりも重く有意差が認められた。（正常群一平均0．49g，

動係数を算出して比較した。心電図記録後，心臓ジストロフィー群一平均0．67g）。体重に対する心重を摘出し，湿重量を計測した後に，心筋内カテコ

量の割合いも，ジストロフィー群で大きかった。

ールアミンをhighperformanceliquidchroma−b）心電図の測定とR−R間隔の変動

tographyにより分離した後，electrochemical

軽度エーテル麻酔下では，安定した心電図記録

l）detectionによって測定した。また，右室から比較が得られた。R−R間隔は正常群で146．9士16．3

的無傷の肉柱を得て（直径0．2−0．4mm 長さ1．2〜

msec，ジストロフィー群では136．9士13．27msec

2．0m），両端をナイロン糸で結条し，張力を測定であり両者の間には有意差はなかった。

12 ジストロフィーハムスターの心臓機能と骨格筋々小胞体のCa取り込み能に関する研究

77

しかし，R−R間隔を正常群，ジストロフィー

し，刺激頻度レ1S，1／旬．5S，1／旬．翁と増すに従い，群について，それぞれ200心拍について計測し，張力は減少しnegative staircaseを示した。刺激CV（％）＝SD／Mx150（SD：標準偏差，M：平均

頻度が増加するに伴い，活動電位の振幅は増加し，値）の式により変動係数を算出すると，正常群では持続時間は逆に短縮しプラトー相の減少がみられ

5．34士3．94％で，ジストロフィー群では0．79±た。この様な張力と活動電位の刺激頻度依存性は，0．26％で両者の問には有意差があった。このこと

正常ハムスター，ジストロフィーハムスターの両は，正常群の方がジストロフィー群よりも，R−R者に見られ，定性的には差異を認められなかった。

間隔の変動が大きいことを示唆している。

e）アドレナリンの作用

C）心筋カテコールアミン含有塁の測定10」M，10−7M，Hr6Mのアドレナリンをそれぞ

ハムスターをクロロホルム麻酔後，断頭脱血し，れ3分間隔で次々の作用させた。10￣‰ァドレナ

0℃のクレブス氏液に摘出した心臓を浸漬した。

リン作用直後から，張力の減少がみられ10■厄，

心室内の血液を可能な限り除去してから，湿重量

10￣甑と次第に，張力は回復傾向にあるものの，を測定した後カテコールアミンの測定を行った。

アドレナリン作用前よりも張力は低くかった。ア

正常ハムスターのドーパミン（Dm），アドレナリ

ドレナリン投与は，活動電位の持続時間の延長と，ン（Ad），ノルアドレナリン（Norad），はそれぞれプラト相の増加をもたらした。10−厄，10￣6M，

45，37，1221（n取去組織）（n＝5）であった。これアドレナリンでは弛緩速度はやや速くなった。アに対し，ジストロフィー群のDm，Ad，Noradは，

ドレナリンのこれらの効果は，正常ハムスター，

24，16，695（n＝5）であり．カテコールアミンはジストロフィーハムスターの両者で定性的に同じ

いずれも，正常ハムスターよりも低値を示し，有様に見られた。

意差が認められた。
d）摘出肉柱における活動電位と収縮の特性

B 下肢骨格筋内部膜に関する実験a）下肢骨格筋の重量変化

白金電極を介して矩形波刺激を与え，単収縮と正常時の体重100g当りのEDLの平均重量は活動電位を観察した。正常ハムスターの膜電位は87．5gであった，しかし，ジストロフィー群では−72．7士6．1mV（n＝27）（m土S．D．）で，ジストロフ

68．9gであり正常群の 78％であった。また，M．

ィーハムスターの膜電位は−72．8士3．8mV（n＝28）

soleusでは正常群では57．5g，ジストロフィー群であった。活動電位のオーバーシュートは数mV

では47．5gであり正常群の82．6％であった。これであり，初期のスパイク相と，それに続くプラトはジストロフィー群の骨格筋重量の方が正常群よー相が明瞭に分かれ，スパイク相の振幅の約50％

りも軽ぐ，この傾向は赤筋よりも白筋の方に顕著のところから，プラトー相に移行した。ジストロに差が現われている事を示している。

フィーハムスターでは，初期のスパイク相が約30b）分離筋小胞体膜の収量とCa−uPtake能％程，再分極したところから，ゆるやかなプラト

分離筋小胞体膜収量は筋1g（wetweight）当り正ー相へ移行した。再分極完了時点での活動電位持常群とジストロフィー群とでは各筋（EDL，M．

続時間は，ジストロフィーハムスターが，正常ハSOleus，M．gracilis）共に有意差はなかった。まムスターよりも延長していた。

たジストロフィー鶏で見られた様なlight fraction

通常，沌Sの頻度で刺激したが，その時の発生
張力は，正常ハムスターで15．7士4．3g／td（n＝3），（36000×g以上で得られる分画）の増大は認められなかった。

ジストロフィーハムスターで55．4土22．4g止水n

ジストロフィーハムスター下肢筋の分離筋小胞＝5）であり，ジストロフィーハムスターの方が発体膜のCa−uPtake能は正常筋と顕著な相異はな

生張力は大きかった。発生張力は刺激頻度に依存かった。ジストロフィーEDL筋の分離筋小胞体膜

Ⅳ 生理学78

Ca−uptake能は正常筋に比べて17％程度の抑制 思われたM．gracillisではinitialrateの強い抑制が観察されたが，M．soleus筋では，6〜7％程度 と，最大Ca−uPtake量の減少が見られた（Fig2）。
であった（Figl）。しかし，比較的障害の強いと

15sec
C

30sec

D

C

D

60Sec
C

D

A160・3133・6178．6156．3182．7149．9

EDL

B O・830．83

0．82

A130・4125・0150．4142．3167．5156．1

M．S0leus

B O・96

0．95

0．93

A：×−0￣lmo−es／mgprotein

B：D／C
Figl

ジストロ〜フィーハムスター下肢骨格筋別、胞体膜のCa−uptake能︵︒膏2dぎ＼遥○∈TOC ○よきdコ・8

150●一一一一・・一●

100

．／／

30

60

90

120

150

180

Timein seconds

Fig2

M．gracillisからの分離筋小胞休膜のCa−uptake能H fractionによるCa−uptake能，−〇一は正常ハ
ムスター，−●−はジストロフィーハムスター。

12 ジストロフィーハムスターの心臓機能と骨格筋々小胞体のCa取り込み能に関する研究

4

考

察

79

常群の問に見られた，活動電位波形の差異は，交筋ジストロフィーハムスターの特徴は，①体重感神経末端から，分泌されるカテコールアミン員増加が遅くかつ，体重が正常ハムスターに比べてがジストロフィー群で低いため，膜のイオンチャ

約30％程低い。㊥心臓重員が大きく，体重あたり

ンネルが二次的に修飾されている可能性があり，の心重量は，正常ハムスターの約1．5倍である。

今後の電流解析が待たれる。

この様な心重量の変化は心筋そのものに原因があ

正常，ジストロフィー両群で，アドレナリン作

ると同時に，血管病変があり，二次的に心肥大を用後，活動電位のわずかな延長と，プラトー相のきたしていることが考えられる。これらの心筋の増加が見られたが，収縮は，むしろ抑制された。

異常と共に，心電図のR−R間隔変動が，筋ジス

これは，ハムスターの心筋収縮系のC飽受性が，トロフィー群で少ないことは，自律神経系の機能

アドレナリンにより低下しているものと考えられ障害がジストロフィー群にあり，呼吸性のR−R

この点，他の心筋と異なる性質をもっている。

間隔変動が少ないと考えられる。自律神経系の機下肢骨格筋の内部膜系機能については，ジスト

能的障害を示唆するものとして，心筋内カテコー

ロフィー鶏で得られた様な収量の増大がみられな

ルアミン含有量は，ジストロフィー群で明らかにかったので，筋の披破壊性も正常筋と同様であっ

低値を示した。これは，交感神経末端におけるカた。またCa−uPtake能も，、ジストロフイT鶏で示

テコールアミンの合成が障害されているか，カテされた様なuptake能の抑制が見られず，むしろ除コールアミンの分解が元進しているかのいづれか

神経筋で得られ結果と類似していた。

であることが考えられる。これらの結果は，ジス
トロフィーハムスターでは，心筋の障害と共に，自律神経の障害が生じている可能性を強く示している。
しかし，摘出心筋の要験では，発生張力はジス
トロフィー群でむしろ大きく，我々が用いた心筋
条片には十分ジストロフィーが進行しておらず，代償性に収縮系が正常より大きな張力発生を行い得たものと考えられる。ジストロフィー群と，正文

献1）K．Ⅰriyama，M．Y．oshiura＆T．Iwamoto．Determi−

nationofcatecholaminesinrat tissuesby high−
Performanceliquid chromatographywith electro−

ChemiCaldetection（Analysisofcatecholaminesin
rat tissues）．JikeikaiMed．J．，30（1）：in press．
2）N．Nishijima，R．ShibaandY．Ogino．Themethod
for the preparation of fragmented sarcoplasmic
reticulumfromsmal1piecesoflegskeletalmuscles

OfratS．此e伽f〟gdよ，25：287−290，1978．

80

13 両生類骨格筋の遅筋と速筋：筋小胞体の性質の比較
遠藤賓

研究協力者 堀 内 桂 輔

普通によく知られている骨格筋細胞すなわち骨度0．17M（Kメタンスルホン酸で調整）の組成のも

格筋線経は，短い単発の電気刺激で細胞膜に活動のを4℃で用いた。なお，実験には，遊離カルシ電位を発生し，それに伴って素早い収縮すなわち

ウムイオンの濃度を種々の値に固定した液も用い攣綿を起こす。これを速筋線経という。しかし，

たが，それには10mMのEGTAを用いてカルシウ

脊椎動物の骨格筋には，この速筋線経とは著しくムを緩衝した。

異なる性質を持つよう分化をとげた筋線経，遅筋

筋′ト胞休内のカルシウムの定量には，ごくわず線経がある。この遅筋線経は活動電位を発生せず，かのカルシウムで筋肉が収縮することを利用した

連続的に長く刺激を繰返えしたときにのみ収縮し，一種のバイオアッセーの方法を用いた。

しかもその収縮は緊張性で緩徐である。

充分に濃くカフェインを溶かした弛緩液を標本

従来われわれは，この筋細胞の2種類の分化型に適用すると，小胞体に蓄積していたカルシウムの性質を，スキンドファイバ標本を用いて生理学が一気にほとんどすべて小胞体外に遊離してしま的に比較検討してきており，収縮系については，う。すると，標本のなかに′ト胞体と共に存在する

その結果を既に報告した2本報ではそれに続けて，収縮系が，この遊離してきたカルシウムで活性化

筋小胞体について比較検討した結果を報告する。

されて張力を発生する。（図1）ただし，このスキンドファイバ標本は表面細胞膜を除去して弛緩液

実 験 方 法の中に浸してあるので，液の中のカルシウムキレ

スキンドファイバ標本は，成長したアフリカツ

ート剤EGTAとカルシウムは次々に結合して標本

メガェルの腸骨誹骨筋から遅筋線維あるいは速筋の外に拡散してしまうから，このカフェインによ緑経を一本切出し，ピンセットで引裂いて細胞膜る拘縞は一過性に終わる。この拘縞の大きさは，を除去するという方法で作った∩遅筋線経と速筋

従って，弛緩液の中のEGTAの濃度に依存して変線経の弁別は，両者の収縮系のストロンチウム感化しうるものであるが，いつも一定の条件の下でl）

受性にはっきりとした差のあることを利用して行

カフェイン拘綿を起こすことにすれば，その拘縞った。

の大きさから，遊離してきたカルシウムの量すな作製した標本は弛緩液のはいった実験槽に移し，わち小胞体に蓄積していたカルシウムの量が，大発生する張力の測定のためにストレンゲージに接

まかに推定できることlごなる。そこで我われは，続した。弛緩液はMg21mM・MgA′Ⅳ4mM・この，カフェイン拘綿の大きさから小胞体内カル

EGTA2mM・PIPES20mM（pH7．0）・イオン強シウムを半定量的に推定する方法を用いた。

東北大学医学部薬理学第一講座

13 両生頬骨格筋の遅筋と速筋：筋小胞体の性質の比較＋cafNuu■GO．−G−O

naO．Nu図1遅筋線経のスキンドファイバにおけるカフェイン拘桁の言己録例。標本を，0，25JIMのカル
シウムの液に3分間ひたしたあと，10mMのEGTAの液で洗い，次にEGTAを0．1mMに下げ，最後にカフェインを25mM適用した。横軸1目盛は1分，拘縞の頂上での張力は約33mg垂。

LS．〇〇

巴⊃lU空lUOUちむP⊃苫田巾∑

SLOW
CaO・25．3−
GO．1

FAST
CaO・25．2−
G2

図2 カフェイン拘緒によって発生する張力の大きさ。左：遅筋緑経に0．25／上Mのカルシウムを3分間とりこませたあとにEGTAO．lmMのなかで拘宿を起こした場合。右：速筋線経に2分間とりこませたあとに2mMのEGTAのなかで拘桁を起こした場合。縦軸は，濃いカルシウムの液で標本を収縮させたときに発生する最大の張力を1としたときの相対値。

81

Ⅳ 生理学82

結カルシウム蓄積の能力が低いと考えられる。

果

21 筋小胞体のカルシウム蓄積の能力

遅筋繰経の筋小胞体のカルシウム取込みの時間経過

遅筋線経のスキンドファイバを0．25／上Mのカルシウムを含む液に3分間ひたし，その小胞体にカ

カフェインによって予め空にした遅筋線経の小ルシウムを取込ませた後に，蓄積したカルシウム胞体に，3分間だけ，種々の濃度のカルシウムををカフェインで遊離させるとき，カルシウムキレ取込ませた（図3）。取込ませるカルシウムの濃度

ート剤のEGTAを0．1mMに下げておけばはっきりが1／JMより稀薄である場合には，カルシウムが濃とした拘綿を観察できた（図1）。この拘縮曲線のいほど，′ト胞体に溜るカルシウムの塁が多くなり，頂上での張力の大きさは，濃いカルシウムで標本

これは当然のことと考えられる。ところが．カルを活性化したときに発生する最大の張力の約旭でシウムが1／jMより濃い場合には，カルシウムが濃あった（図2左）。一方，同じような実験を速筋線

いほどかえって，溜る量が減少してしまった。例経で行うと，2mMのEGTAの中ででも，むしろえば，10／上Mでは1甘Mでの量の約半分しか潜らな

もっと大きな拘綿が観察できた（図2右）。

い。

収縮系のカルシウム感受性の点では，遅筋線経取込ませるカルシウムの濃度を固定して，取込と速筋線維とにあまり差がないことが判っている

ませる時間を種々変化させて，小胞体のカルシウ

1）（前報）。したがって，上の結果を解釈すると，遅ム取込みの時間経過を調べてみた（図4下）。カル

筋線経と速筋線経の，小胞体に蓄積されたカルシ

シウム濃度を，0．25・1．6・10J上Mと次第に高めてウムの量の比は，ごく大まかにおよそ0．1対2，即ゆくと，初期の取込み速度は速くなってゆくが，ち，遅筋線経の筋′ト胞体は速筋線経でよりも1桁一定値に達したときの最終的な小胞体内カルシウ．∝S u；⊃ ∪む葛l 巾U

3min

、▲
＼＼＼＼

10−7

10−6

10−5

10−4

r▲

10−8M

［、Ca◆十］図3 遅筋線経の筋小胞体に3分の間いろいろな濃度のカルシウムを取込ませたときに小胞体に蓄積するカルシウムの量。横軸は取り込みに用いた液のカルシウム濃度，縦軸は蓄積したカルシウムの量。後者は，0．25／上Mでの畠を1としたときの相対値。

13 両生類骨格筋の遅筋と速筋：筋小胞体の性質の比較

速筋線経のカルシウム取込みの経過には，半分になった。すなわち，初期のはやい取込み速ような雫離の現象のあることが既に判ってし度と，一定値に達したときの最終的な取込み量とこれも確認できた（図4上）。

批心細

ム量は，10J Mにすると，1．餌Mのときのわずか83の問に帝離が起こった。

Fast fiber●

g巨／一「●￣．∝S Z一d⊃Z山ごくト∑⊇U﹂くU

1・6PM▲ノーー￣丁．
▲

まロブ霊劇
l／

●
／

0
3

18

6

27min

LOADING TlME

図4 筋小胞体のカルシウム取込みの時間経乱下は遅筋繰経での例，シンボルを結んだ緑に付してあるのは取込みに用いた液のカルシウム濃度，縦軸は3図に同じ。上は速筋線経で同じ実験をしたときの結果．シンボルも遅筋線経でと同じ。

3 筋小胞体のカルシウム取込みの速度

カルシウム0．25JIMでの初期取込み速度を1と小胞体のカルシウムの取込みの初期速度は，少なくすると，0．04／上Mでの速度は約0，05で この程度

とも10／上Mくらいまで カルシウムの濃度とともにに稀薄なカルシウム濃度の範囲では，速度が濃度どんどん速くなる（図4）。そこで，この初期のはの約1．6乗に比例していた。またカルシウム10／jM

やい取込み速度は，カルシウムポンプの真の取込付近で最も速い取込みが見られたが，その域の速みの活性を反映しているものと仮定して，これと度は約1〜2〃Mで達成された。

カルシウム濃度との関係を調べた。比較のために，ストロンチウムをカルシウムのかわりに′ト胞体

実験は速筋緑経でも遅筋線経でも行ったが，双方に取込ませて同様の実験をした（図5，黒四角）。

の結果にほとんど差が認められなかった。したがここではカルシウムのときとは別に，ストロンチって実験結果は，繁雑を避けるために，ひとつのウム10／fMでの初期取込み速度を1としたので，データとしてまとめて図5に示す。

カルシウムのときの速度とストロンチウムのとき

Ⅳ 生理学84の速度を比較するのは無意味である。しかし，最度とストロンチウム取込みの最大速度とを大まか

大速度の班を与える濃度をカルシウムのときとスに推定してみたところ，両者の間に大きな差は無

トロンチウムのときとで比較することによって，

く，概ね，速筋線経で1×10mM／hin・遅筋線経

カルシウムポンプのストロンチウム感受性を推定

で3×10￣kM．舟Iinの程度であるらしかった。

できる。実際，ストロンチウムの場合には，最大（ここではカルシウムやストロンチウムの量を，筋の姥の速度を与える濃度が約40／lMで，これはカ

繰維体積あたりの濃度として言及したので，そのルシウムの場合よりも数十倍たかい値であった。

取込み速度の単位がmM／／1血nとなった。）

なお，別の実験で，カルシウム取込みの最大速言＞膏巾 d∈⊃d 聖竜一む∝

ca〆0ず雷も
ノ
■

10−7

10−6

Conc．of

10−5

10−4

10−3M

the free metalion

図5 カルシウムポンプの，C㌔ts，211こよる活性化。縦軸は，C。あるいはSrを小胞休が取込
むときの初期のはやい取込みの速度の相対値で，Ca2十ごは0．25JLM・Sr2十では10jLMでの値を基準としてある。横軸は取込みに用いたCa2十またはSr2十の濃度。遅筋線経での結果と速筋線経での結果はほとんど同じだったのでひとつのデータとしてまとめた。

4 カルシウムによる，小胞体からのカルシウ
ムの遊離小胞休に予め一定量のカルシウムを取込ませた
あと，ATPを含まない液に標本を浸して種々の濃るSrの遊離」を調べたものであるが，本質的には「CaによるCaの遊離」と同じと考えられる。実際，
その点については速筋線経における二・三の実験で多少の確認をしている。

度のカルシウムを適用し，このときの小胞体内のいずれにせよ，結果は次のようになった。速筋

カルシウムの減少する速さを測定した。すなわち，線維（図6上）でも遅筋線維（図6下）でも，カルシ

カルシウム取込みの機能の働らかない条件の下でウムによる遊離は，ATPが無いと（図6R）きわめ

カルシウムによるカルシウムの遊離の現象を調べて起こりにく・く，両筋線維型の間に差があるのかた。ここに示す結果（図6）は，小胞体にカルシ

否か不明だった。そこで，従来カルシウムによるケムのかわりにストロンチウムを詰めて，「Caによ遊離を起こり易くするとされてきたAMPやカフェ

13 両生類骨格筋の遅筋と速筋：筋小胞体の性質の比較
罰

85

インを，遊離に用いるATP無しのカルシウム液に

筋線経においては僅かであり，両者に対するカフ加えてみた。AMP存在下では（図6AMP），たしェインの効果に差があると考えられた。実既AMP

かにカルシウムによる遊離が著しくなり，しかも存在下でカフェインの効果をみても（図6，AMP

その程度の上からは速筋線経と遅筋線維とに大差とAMP＋Cafとを比較），遅筋線椎に対するカフがなかった。これに対してカフェインの効果は（図ェインの効果は速筋線経でよりも僅かであった。

6Car），速筋緑経においては著しかったのに，遅qOS O︻Tu盲一一●一一一一●一一一「●……−「一一●fast♂．′ト台二⊂：︻d C？ヽ
○︻むS巾山一むL LS IO むl巾∝＼

10￣810−710−610−510−4M［Ca◆◆］

図6 ATPの存在しない環境における「CaによるSrの遊離」。上は速筋繰経，下は遅筋線経での結果。横軸は，ストロンチウムを遊離させるのに用いたカルシウムの濃度で，縦軸は，小胞体内ストロンチウムの減少する速さを．時間あたりの率として測定したもの。「R」が対照，「AMP」はAMPllmM存在下，「Caf」はカフェイン25mM存在下，「AMP＋Caf」
は両者が同時に存在したときの結果。いずれの試薬も，遊離させるのに用いたカルシウム
液に混じた。

考察1）が，速筋緑経と比べると，そり量は1桁すく

1遅筋線経の筋小胞体のカルシウム蓄積能ないらしい（図2）ことが判った。このような違い

遅筋線経の小胞体にも，その収縮系を活性化すが両線経の問に存在するかもしれないこと▲は，るのに充分な量のカルシウムが蓄積されうる（図C。St。ntin等転よっても間接的な証拠から推測さⅣ 生理学86れていたが，今回のように比較的に定量的に示しがあまりなかったから，このATP存在下での「Caた実験はこれまでになかった。実際，図2・図4

によるCaの遊離」に関しても，速筋線経と遅筋線経の結果と，カフェイン存在下での収縮系のカルシの問に大差がないのだろうと考えられる。

ウム感受性についての前報カの結果（前報の図5・図6）とから，小胞体に蓄積されうる最大のカルシ
ウム量を，筋線維体積あたりの濃度として推定す

3 カルシウムポンプのCa2＋感受性とSr2＋感受性

ると，概ね，遅筋線経では高だか0．2mM程度，速′ト胞体のカルシウムポンプのCa21tSr2十に対す

筋線経では少なくとも2mM程度であろうと考えらる感受性を，これらのイオンを小胞体が取込む速れる。

度を指標として測ると，両者の間には数十倍の差

ここでの議論は，図1に示したような一過性に発生する張力を基としている点で，定量性に少しがある（図5）が，この点に関して，遅筋線経と速筋線維とに大差がなかった。

疑問がある。そこで，カフェインの適用の直後に一方，収縮系のCa2＋とSr2＋とに対する感受性を，

標本の周囲の溶液を全部ぬき取って空気に置換す発生する張力を指標として測ると，速筋線経ではることで，カフェインにより遊離するカルシウム

両者の間に約30倍のひらきがあるのに，遅筒線経が標本外に拡散しないようにし，この時に発生すにはあまり差がか（前報たすなわち，C。2・とる定常性の張力を測定してみるという実験を行っ

Sr2＋に対する収縮系の感受性に関して，遅筋線経てみた。しかし，この実験から得られた結論も，と速筋線経との間に大きな差がある。

上述のものとほとんどかわらなかった。

この収縮系での事情と，先のカルシウムポンプ
での事情の違いを考え合わせると，カルシウムに2 筋′ト胞体のカルシウム取込みの経過からみた「CaによるCaの遊離」
遅筋線経の筋小胞体にカルシウムを取込ませる
ときの，その初期のはやい取込みの速度と，一定対して同じように高い感受性を示す系ではあっても，収縮系のカルシウム感受部位とカルシウムポ
ンプのカルシウム感受部位とはかなり異なる由来のものであろうと考えられる。

値に達したときの最終的な取込みの量とを分けて考えると，適当なカルシウム濃度の範臥こおいて両者の問に帝離の起こることが判った（図4下）。

4 「CaによるCaの遊離」に対するカフェインの効果とAMPの効果

この事離は．カルシウムに2つの作用，例えはCaによるCaの遊離に対する，ATPアナログとしカルシウム取込みを促進する作用とカルシウム遊てのAMPの効果は遅筋線経と速筋線稚とで大差離を促進する作用との2つを仮定すれば説明が可がないのに，カフェインの効果には大きな差があ能になる。実際4項に述べるように，ATPが無くることが判った（図6）。

カルシウム取込みの起こらない条件のもとでは，

従来，いくつかの理由から？AMPとカフェイン

カルシウムが小胞体からのカルシウムの遊離を促の「CaによるCaの遊離」に対する作用の仕組みは異進することが確かめられた。それで，上述のカルるとされてきた。今回の結果は，AMPとカフェイ

シウム取込みにおける軍離の現象は，ATP存在下ンの効果の程度の比率が速筋線経と遅筋線維とででのカルシウムによるカルシウム遊離を反映して著しく異なることを示しているので，このことも，いるものと考えられる。

2つの薬物の作用の仕組みが異なると考える根拠

また，速筋線経でも（図4上）遅筋線経と同じよのひとつと言えよう。

うにこの事離の現象が起こり，しかも3項に述べ

また，ATPアナログとしてのAMPの効果に，遅るよう・にカルシウム取込みの方にも両線維型の差

筋線経と速筋緑維とで大した差がなかったので，

13 両生類骨格筋の遅筋と速筋：筋小胞体の性質の比較

2項で考えたことと合わせて，生理的環境における「CaによるCaの遊離」は，遅筋線経と速筋線維とで同じ程度に働きうると考えても，現在のところはよいだろう。この点を目下，実験的に検討し
ている。

文

87

献

1）遠藤賓はか：筋の発生と分化に関する基礎的研究，
昭和56年度報告書，69−75，1982．
2）Costantin，L L．，PodoIsky，R．J．＆Tice，L．W．
エ用γわし188：261−271，1967・
3）Endo，M．h7伽肋C血刀f∫m qrCαred C故山椚
7ね乃岬0′rαCr0∫∫βわわgfd〃g〝め〝〝Ce∫，pp・257−
264．AcademicPress，NewYork，1981．
4）Endo，M．丹oc．九戸．dcd，51：467472，1975・

Ⅴ

生

化

学

14．培養筋細胞のアセチルコリンレセプターの代謝

91

15．アセチルコリン受容体に対するモノクローナル抗体

16．筋発生に伴なうミオシン分子isoformの変化

94

98

17．鶏ジストロフィー筋におけるC−蛋白質分子種の変化

10218．培養骨格筋および心筋細胞におけるトロポニンの分化

109

19．筋ジストロフィー症鶏浅胸筋の筋線維構成蛋白−筋ジス遺伝子の白レグ鶏への導入−

114

20．ジストロフィー鶏および正常鶏の発生過程におけるEF2およびNAD含量の変化
21．可溶性コネクチン

122

127

22．骨格筋細いフィラメント上のトロポニンの局在及びハイブリッドトロポニンの性質の検討

131

91

14

培養筋細胞のアセチルコリンレセプターの代謝

萩 原 禰四郎
研究協力者 長谷川 修 司

骨格筋のアセチルコリンレセプター（AChR）ので置換した。

筋線維上での分布とその代謝安定性は筋の発生，AChRの半減時間の測定・・・…7−10日の筋培養

分化の段階で変化することが知られている（1）。幼を10nMの125トα−ブンガロトキシン（ABT）と45

若な筋では半減時間のみじかいAChRが筋膜全−60分保温し結合させる。過剰のトキシンを洗い体にひろがって存在するが，成熟するにつれACh

ながしたのち一定時間毎にメディウム中に放出されRの半減時間がながくなり神経筋接合部に限局

る125I−ABT−AChR複合体の分解産物を測定しAして存在するようになる。このようなAChR

ChRの半減時間をもとめた。

の分解を遅くする因子が培養神経細胞の条件培養液（NCM）中に存在することと，NCMはAChR

実験結果

が細胞表面から細胞内部へ移行するステップを遅（1）培養筋細胞に代謝速度の異なるAChRの集延することを報告した（2）。今回はAChRの分解団が混在するのかどうか検討するためにAChRの機序とNCMがAChRの細胞内移行のステッの一部をD−ツボクラリンでブロックしたのちプを遅延するメカニズムをさぐるためにAChRのに残りのAChRの分解速度を測定した。1−100

分解にたいするいくつかの薬剤の効果を検討した。

〝MのD一ツボクラリンとプレインキュベーシ
ョンすることにより125Ⅰ−ABTの結合員はコン

実験方法

トロールの80−36％に減少したが1251−ABT−ACh

筋培養…・・・ラット胎仔骨格筋の培養はChristi−

R複合体の半減時間はコント？−ルと差がなかanらの方薗3）にしたがっておこなった。20−21

った（表1）。この実験からは代謝速度の異な

E］胎仔の後肢筋の筋芽細胞を80％Dulbecco一V0−

るAChRが培養筋に混在するという積極的な証

gtmodifiedEagle′sminimumessentialmedium

拠は得られなかった。

（DMEM）−10％馬血清−10％牛胎児血清中に浮（2）レクチン等の効果：コンカナバリンAは50／上

遊し1．5×105の細胞を16mmプラスチックマルチウ

9／mlで半減時間を180％延長したが一価の誘

エルに播き培養した。培養第4E】に50／上Mフルオ導体であるサクシニルコンカナバリンAは同濃

ロデオキシウリジンを24時間作用させ，そののち度でわずかに114％延長したにすぎない（表2）。

90％DMEM−10％馬血清−0．5J上9／mlテトロ

架橋試薬である1，5−ジフルオロー2，7−ドトキシン中で培養した。培養筋を実験に供する

ジニトロベンゼン，N，N′−フェニレンジマレイ

1日まえに馬血清を2m9／mlの牛血清アルブミン

ミド，N−メチルマレイミドもそれぞれ半減時間を延長した（表2）。またメチラミン，エテラ＊千真大学医学部脳機能研究施設神経薬理研究部

ミン，プロビラミンはいずれも5mMで半減時

Ⅴ 生化学92

表l D−ツポクラリンとプレインキュベーションした培養筋細胞
125Ⅰ一ABTpAChR複合体の半減時間−−−■■−−−−−−−−−−−−−■−−−−−−−−−−−−−−−−−−■−−−−−−■−−−−−−−−−−−−−−−−−■−−■1−−−−−−

EXP．NO PREZNCUBAT工ON WZTH

125−トABT BOUND Tl／2

RELAT工VE
TO CONでRO工．

】

2

（CpM）

（亀）

（亀）

45．747】00

d一TUBOCURAR工NE O．001mH

36．441

80．0

100
101．9

O．01mM

23．908

52．3

101．6

62．313100

100

40．08764．3

96．4

22．710

36．4

99．6

ONE

NONE
d−TUBOCURAR工NE O．01mM
O．1 mm表2

AChRの分解におよぼす架橋試薬の効果

CROSSLINKING AGENT

CONCENTRATION Tl／2RELATIVE TO CONTROL
mM
％

0．001
0．02

N，N暮−P一拍ENYLENE−DIMALEIMIDEN−METHYLMALEIMIDE

0．1
0．01
0．1

CONCANAVALIN A（50〃g／ml）
SUCCINYL CONCANAVALINA（50yg／ml）

間を延長する効果を示した（表3）。

9772 614
93 79381
1 6
611

1，5−DIFLUOR0−2，7−DINITROBENZENEる。〃〃 わ加の筋では接合部のレセプターと接合部外のレセプターでは代謝速度が異なり，D−ツボ考

察NCMによるAChRの細胞内部への移行の遅延のメカニズムを考えるとき，代謝速度にかんしてAChRは均一なのか不均一なのかがまず問題となクラリンにたいする感受性も異なる。しかし表1に示した実験結果からは不均一性はあさらかではない。
NCMはAChRの異化を遅らすはかにAChR

93

14 培養筋細胞のアセチルコリンレセプターの代謝

蓑3AChRの分解におよぽす諸種薬物の効果

COMPOUND CONCENTRATION

Tl／2

RELATIVE TO CONTROL汀州％

METHYLAMINE

103・0 土1・3
143・8 土 3・2
105．2 土 4・6

ETHYLAMINE

132．2

PROPYLAMINE

＋

4．9

EGTA
SODIUM AZIDE

107．4 王10．0
161・9 土 28・5
238．4 土 5・2
130・9 土 4・0

CHLOROQUINE

882．1

＋

99．6

の凝集を促進する効果をもつ（3L もしレセプター

Rの分解もトランスグルタミナーゼの阻害剤で分子が形質膜を移動するのを実験的に妨げるならあるアルキJLァミンとEGTAで抑制された。こばNCMと同じ効果が生じるであろうか。膜タン

れらの成績は筋細胞においてAChRが細胞表面

パク質を架橋する物質はいずれも半減時間を延長

から内部へ顔行する機構にトランスグルタミナーした。しかしAChRにたいする抗体を作用させゼが関与している可能性を思わせるが用いた阻害た場合には逆に短縮する（4b またコンカナパリン剤の特異性の程度がそれほど高くないので別の証

Aはクラスター形成に影響をおよぼさない（4）。こ拠が必要であろう。

のようにレクチンと抗体の効果は必ずしもNCMの効果と一致しないのでNCM中にレクチン様の文

献分子を想定し，その作用でAChRにたいするN

1）Fambrough，D．M．劫γ血上月en，59；165−227

CMの効果を説明するのは困難である。

2）萩原弥四郎，長谷川修司：筋の発生と分化に関する基礎的研究班昭和56年度報告書，82−85（1981）．
3）Christian，C・N・etaLHoc．NblLAcGd．Sc日収4，
75：40114015（1978）．
4）P−ives；J／etal・，上的ぶれ24：1713−1718（1979）．
5）Davies，P．J．A．ctal．，JVbtuTe，283：162・167（1980）．

最近，リガンドが結合したレセプターが細胞内へとりこまれる機構にトランスグルタミナーゼが関与していることが線維芽細胞などのホルモンレ
セプターで報告されている（5b 培養筋細胞のACh（1979）．

94

15

アセチルコリン受容体に対するモノクローナル抗体

杉 山 博 之＊研究協力者 山 下 幸 子＊

我々はこれまでに，骨格筋のアセチルコリン受培地によりハイブリドーマを選択した。

容体（AChR）の発生．分化の問題を検討して罷。

特異抗体活性は固相プロティンA法iこよって行

このような目的のためには，AChRに対する特異った。すなわち，あらかじめ3H標識したα−ブ

抗体，特にモノクローナル抗体が極めて有力な手

ンガロトキシンと結合させておいたAChRをハ段を提供すると考え，その作製を試みた。ただ筋

イブリドーマ培養上活と反応させた後，熱処理固組織におけるAChR含量は極めて低いため，十分定したgfα〆γJococc〟gα捗re比丘菌体（プロティン

量を得ることは容易でないので，本研究においてA）を加えて遠心し，上宿よりの3H減少の程度

はシビレエイ発電器官よりのAChRを出発材料

を特異抗体活性の指標とした。

とし，骨格筋AChRと交叉反応をするモノクローナル抗体が得られるか否かを試みることを第一

クローニングは限定希釈法を最低2回は繰り返
すことによって行った。

の目的とした。
一方，この目的とは別に，モノクローナル抗体

結果と考察が幾つか得られたならば，それによってシビレエ
イAChRの構造・膜内存在様式等を検討すること

これまで7種頬のハイブリドーマ・クローンを確立した（NAR−1−NAR−7）。それらのモノができると期待される。この点を第二の目的としてクローナル抗体について，幾つか特徴を検討した。

本研究を行った。

結果を表1にまとめる。
（1）骨格筋AChR等との交叉反応性：ラットお材料と方法

よびニワトリ骨格筋培養細胞AChRとの反応

シビレエイ（肋r鬼eJ呼0花王Cα）発電器官よりTri−

性を調べたが，7種のモノクローナル抗体はい

tonxTlOO（2％）で抽出したAChR粗抽出物

ずれもこれらと有効に反応しなかった。NARを，海へどα−ニューロトキシンLsⅢを用いた−4とNAR−6が電気ウナギのAChRと交叉ァフイニテ．、．ク。マトで精組たものを抗原と反応を示した。

した。純度は約46％（重量比）程度であった。

（2）膜結合型AChRとの反応性：7種のモノク

免疫動物はBALB／Cマウスを用い，その脾細胞

ローナル抗体は，界面活性剤で可溶化したACとマウス・ミエローマNS−1細胞とをポリエチレ

hRを抗原として得られたものであるが，これングリコール＃1500によって融合させ，HATらはいずれも，シビレエイ発電器官の膜断片と結合した。すなわち，それらの抗体の識別する＊生理学研究所 細胞器官研究系

抗原決定基はいずれも，膜外空間に露出してい15

アセチルコリン受容体に対するモノクローナル抗体95

表1Abr鳥eノ叩0几ねαAChRlこ対するモノクローナル抗体の諸性質。
Cross−reaCtlvlty wlth
AChR from：

Reactlvlty Max．blndlng Subunlt
Monoclonal with AChR
（TnOIsIgG／
speclflclty

rat chlck Electrophorus

an亡lbody ln membrane moI AChR）

ュ
1
α

2
⊥

α

2
1
⊥

＋

NAR−7

＋

NAR−6

＋

NAR−5

＋

NAR−4

十

NAR−3

十

NAR−2

＋

NAR−l

NAR

1

1

2

3

4

5

6

7

2

2

2

2

2

2

2

1

2

1

1

2

2

2

2

2

1

1

2

2

2

2

3

2

2

4

2

1

2

5

2

2

2

2

6

2

1

2

1

2

7

2

1

2

1

2

1
1

表2 シビレエイ AChRに対するモノクローナル抗体問の競合的結合。
タテ軸およびヨコ軸に示されるモ■ノクローナル抗体を同時に反応させたとき．表中その交点に示された数だけのIgG分子が最大1分子当りのAChRに結合することを表わす。

ると考えられる。

それ以外のモノクローナル抗体は1分子のIgG（3）最大結合数とサブユニット特異性：可溶化しが結合し得ることが分った（表1）。AChR はたシビレエイAChRに大過剰の抗体を反応さ

α2βr∂というサブユーニット構成をもつことかせ，反応生成物の沈降係数をショ糖密度匂配遠ら，NAR−3とNAR−5はaサブユニットに対心法で測定することによ って，各抗体の最大結する抗体であると考えられる。

合数を見積った。典型的な結果を図1に示す。
図1の場合，AChRモノマー1分子当り（4）抗体間の競合：2種（以上）の抗体を同時にNAR反応させたとき，最大何分子のIgGが結合し72は1分子，NAR−3は2分子のIgGが結合得るかを，上と同様ショ糖密度匂配遠心法で調し得ることが示されている。このような方法でべた。このような抗体間の競合的結合を調べる

調べた結果，NAR−3とNAR−5は2分子，ことによって，各抗体の認識する抗原決定部位、

レし

学

生

Ⅴ

96

︵EdU︶ ×HJdEOU L呂召−∝ Ud

10

20
FRACT工ON NUMBER

図1抗原抗体校合休のショ糖密度匂配遠心分析。各ピークは右より遊離α一プンガロトキシン（t），
トキシンーAChR複合体（Rt），およびRtに抗体が1分子（RtA）または2分子（RtA2）結合したもの。図中の数字はモノクローナル抗体の番号。

の相互位置関係を知ることができる。結果を表

α−サブユニット以外と結合。4つの抗体の決2にまとめた。これらの結果から，7種のモノ

定部位は相互に近接しており，かつ，グループ

クローナル抗休は次の3つのグループに分類でAの2つの決定部位領域のうち，グループBときることが分った。

近接していない方の領域と近接している。グルグループA：NART3および−5。α−サブユープBとCの間では決定部位領域が離れており，ニットに結合。両抗体の決定部位は相互に近接括抗は起きない。

しており，同一の決定部位領域内にある。両者

今後更に，各モノクローナル抗体のサブユニッが同時に，両方とも結合するということはでき

ト特異性を明らかにし，これらの知見とあわせて，ない。このような決定部位領域がα−サブユニ

AChR分子のサブユニット配位や抗原決定基の分ット上に1箇所，従ってAChRl分子上に2布等に関して検討を加えて行きたいと考えている。

箇所ある。
グループB：NAR−1。α−サブユニット以外と結合。その抗原決定部位はグケープAの2つの決定部位領域の一方とのみ近接している。
グループC：NAR−2，−4，−6および−7。

文献1）H．Sugiyama（1980）．lsoelectric focusing analysis
Of acetylcholine receptorsinmouseand chickmusclecellsinculture，BiomedRes．，1，91−95．
2）H．Sugiyama，S．Yamagishi，＆ Y．Yamashita15 アセチルコリン受容体に対するモノクローナル抗体（1982）．CharacteTizationofacetylcholinereceptor
PreCurSOrSandrelatedcomponentsinculturedrat
muscleceus．丹oc．ム甲α〃dcα止，588，4043．
3）H．Sugiyama，Y．Yamashita，＆ F．Murakami（1982）．Multiplemolecularfomsofacetylcholine
receptorsincultured muscle cells：Subceuular97

localization and characterization．J．NeuTOChem．．
39，1038−1046．
4）Y．Ishikawa，H．Yoshida，＆N．Tamiya（1980）・
Purincation and properties of the acetylcholine
receptorproteinftom肋TkejdponEcq．J．BiocheTTZ．，
87，313・321．

98

16

筋発生に伴なうミオシン分子isoformの変化

江 橋 節 郎＊研究協力者 三 川
大日方

隆＊ 大 室 弘 美＊＊
昂＊＊＊真 崎 知 生＊＊＊＊筋肉をはじめ細胞一般の≠動き〝が分子レベル

実験方法

では，アクチンとミオシンという2種類の蛋白が1）材料：胚および貯化後各stageのニワトリよ主に担っていることは最早言うまでもない。しかり速筋（浅胸筋），遅筋（ALD筋）心筋（心室し生体を構成する組織・細胞の種類は多く，筋肉筋）および平滑筋（筋胃）を実体顕微鏡下で採に限っても骨格筋には速筋と遅筋があり，骨格筋

取，トリミングし試料とした。50％グリセリン

以外にも心筋・平滑筋とその種類は多く，収縮持pH7．0，−200の条件で保存した。

性はまちまちである。この特性は神経支配，細胞2）ミオシン・アイソフォームの分析

膜の性質の差異等の他に，収縮蛋白系の特異性が各stageの組織から，ハッセルバッハ・シュ

その分子的背景となっている。

ナイダー液を使用して，ミオシンを粗抽出し，細胞運動におけるエネルギー転換と深くかかわ

これを50mMピロリン酸ナトリウム，1mM D

るATP分解能を有するミオシン分子については

TT，2．5mMEGTA，50％グリセリン，pH8．8

近年特に詳細な研究が進み，酵素系にアイソザイに希釈した。これらの各試量を，20mMピロリ

ムが存在すると同様，多くのアイソフォーム（iso−ン酸ナトリウム（pH8．8）および10％グリセform）が存在することが明らかとなっている。細リンを含む3．8％のアクリルアミドゲルを用い胞機能の特異性に応じ，異なったアイソフォームて，約16時間の電気泳動をおこなった。このピが利用されている。ミオシン分子は分子量約20万

ロリン酸ゲル電気泳動（PPi−PAGE）の条件下のheavychain（HC）2分子と．分子量2−3万のでは，ミオシンはHCおよびLCを含むホロ蛋

最低2種類のlight chain（LC）が2分子ずつ会合

白として挙動し，HCおよびLC組成の差異にし構成される6サブユニットからなる複合蛋白でより，その移動度が異なることが知られているある。ニワトリにおいては8種類以上のアイソ（文献1）。

フォームが知られている。細胞の分化過程でこれ各アイソフォームのサブユニットの分析は，らのアイソフォーム群の中から細胞特異型を選択

PPi−PAGEをおこなったゲルをクーマシーブ

してゆくパターンを，速筋，遅筋，心筋，平滑筋

リリアントブルーで染色し，各アイソフォーム

について比較した。

のバンドを切り出し，2次元目の電気泳動とし＊（東大・医）＊＊（東京都臨床医学総合研究所）＊＊＊（千葉大・理）＊＊＊＊（筑波大・基礎医）てSDS電気泳動（SDS−PAGE）によりおこな

った。HCは約20万ダルトンのペプチドであり，
SDS−PAGEだけでは詳細な分析が困難なため，Clevelandらの方法（文献2）によるペプチド

99

16 筋発生に伴なうミオシン分子isoformの変化

甥■

宵

鱒

■■

題詠

】■

I

てこ＝㌫

ALD Bl．Card．Q．
図1成鶏各筋組織のミオシンのPPi−PAGEパターン：ALD（遅筋），Br（速筋），Card（心筋），G（平滑筋）

噌畿嬢−．．．．−㌫ぷmご：≡

AuDBlLCard．Q．F．

図2

各組織のミオシンH．C．のペプチドマップPPi−PAGE後，バンドを切り出L，−キモトリ

プシンと共にSDS−PAGE Lペプチドマップを得た（文献2）。F培養ファイブロブラストのミオシンを示す。他は図1と同じ。

マップによる比較をおこなった。

ターンを比べると（図1），速筋が3本のバンドを示す以外，他の筋のミオシンは1本のバンドし結果と考案か示さない。また平滑筋が最も早い移動度を示し，成鶏の速筋・遅筋・心筋・平滑筋より得たミオ

遅筋のミオシンの移動度が最も小さい。各々の筋シンをPPiPAGEにかけその移動度とバンドパに含まれるミオシンは全て異なる移動度を示す。

100

V 生化学

Bh

AuI

■■■

C訂d

一■

ili 『胃
衰弓
L

i亭

■■−

図3

b■L▲亀

鱒攣
璧蜜】ご

1．dF．．︸む

−郡

一

！！一己

■■」▲▲

仁

−

●■

▼‖『

G．

も■■．▲L E■■．▲d．

胚および成体各筋由来ミオシンのPPi−PAGEパターン（上段）とミオシンfI．C．のペプチドマッフ′（下段）速筋（Br）．遅筋（ALI）），心筋（Card），平滑筋（G）の左のゲルパターンが胚由来，右が成体由来。

速筋が3本のバンドを示すのは，LC組成の違い

量の移動度の速い成分も認められる。HCのペプによることが既に明らかとなっている（文献1）。

チドマップを見ると胚心筋では，成体型と区別でき

LCの組成が遅筋と心筋では同一である以外（文ないパターンが得られた。9体節期の頃に心拍動献3），各筋のミオシンは異なっている。LC組が観察されるが，この時期のミオシンのPPi−PA

成が一致するにもかかわらず，遅筋と心筋のミオ

GEおよびHCペプチドマップのパターンも成体

シンがPPirPAGEで異なる移動度を示すのはHとほとんど差がなく，心筋のミオシン・アイソフCの差異と考えられる。実際図2に示す様に遅筋

ォームの分化は既にこの時期に終りつつあると考と心筋のHCの一次元ペプチドマップは全く異なえられる。さて胚速筋および胚遅筋に存在するミオっている。また速筋，平滑筋のミオシンHCも異シンHCのペプチドマップは非常に良く一致し，なるパターンを示し，組織特異的なHCが発現さ

胚の骨格筋に特有の胚型HCが発現されているこ

れていることが示された。また各組織にはファイとが考えられる。細胞分化に伴い，共通の胚型H

ブロブラストが混在し，その関与が考えられるが，Cが速筋型あるいは遅筋型へと置換されてゆく様

そのペプチドマップを見ると筋由来ミオシンHCである。平滑筋の胚ミオシンのPPトPAGEパタとは別種のペプチドであることがわかった（図2）。

ーンは成体のそれと一致するバンドの他に移動度

さて胚における各筋組織のミオシンについての小さい2本のバンドが存在する。しかしどのア

上述と同様の分析をおこなった。図3に示したよ

イソフォームのHCペプチドマップも成体のマップ

うに，速筋・遅筋・平滑筋の場合，胚におけるミと差異がなく（文献4），胚特有のLCが存在しオシンの主構成アイソフォームのPPi−PAGEにていることを予想させた。

おける移動度は，成体のそれとは異なっていた。

胚ミオシンのLC組成を見ると（図4），平滑心筋の主構成成分は，成体のものと一致したが少筋の場合成体には20Kダルトンと17Kダルトンの

101

16 筋発生に伴なうミオシン分子isoformの変化

Embryo

【し ■
8r●糾t

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ヽ・ヽ
ALD

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tヽ

C■r劇■￠uPP、●

Gl王王■rd

、．一
LlT

図4

胚および成体の各筋組織のミオシンLC．組成。シリンダーゲルはPPi−PAGE平盤ゲルは2次元電気泳動の酸性低分子である。f：速筋型，S：遅筋型，C：心筋型，L：平滑筋L．C．を示
し数字はキロダルトンを示す。

2種のLC Lかないが，胚には23Kダルトンのも現させており，分化過程で親型への置換，あるいのが存在する（文献5）。①23K＋20K㊥23K十20は胚型の抑制という調節をおこない，細胞特異ミ

K17K，③20K＋17Kという3種のLCの組合

オシンアイソフォームの選択をおこなっている。

せを持ったミオシンがPPi−PAGEの3本のバン

現在のところ，胚における特有のアイソフォーム

ドに対応することがわかった（文献4）。心筋のの機能とその意義については不明で，今後の研究

場合成体型以外に胚では少量速筋型のLCが検出が待たれる。

され（図4），PPi−PAGEの成体型の下に認められる少量のバンドがこのLCを持つアイソフォー
ムに由来する可能性も考えられる。骨格筋の場合，速筋，遅筋を問わず胚の時期では共に両方の型のLCを発現させており，分化過程で一方の型が抑制されてゆくことが考えられる。
以上の様に心筋の場合を除き他の筋組織では発生初期には多量の胚特有のHCあるいはLCを発文献1）Hoh，J・F・Y・，用 上上f玖98，267−270，（1979）．
2）Cleveland，D・W・，Fischer，S．G．，Kirschner，M．W．
＆Laemmli，U・K・（1977）・J．BioL C乃em．，252，
1102−1106．
3）Mikawa，T・，Takeda，S．，Shimizu，T．＆Kitaura，T・（1981）．上月わC加明．，89，1951−1962．
4）Takan0−Ohmuro，H．，Obinata，T．，Mikawa，T．＆
Mas止i，T・（1981）・Jβわe如椚リhpress．
5）Katob，N・＆Kubo，S．βoc e椚．βわp如ぶ．dc叫
535，401−411（1978）．

102

17

鶏ジストロフィー筋におけるC一蛋白質分子種の変化
大日方筋ジストロフィーの発症に際して，筋原線経の

昂＊・＊＊

10日後には速筋型のみになることを既に報告し是。

構造蛋白質のレベルで，どのような変化が起るかを知る目的で，ジストロフィー鶏を用いて，既に

実験方法

いくつかの実験を行なってきた。その結果，（1）ジ

標本：ジストロフィー鶏（413系）および正常

ストロフィー筋では，筋原線維蛋白質の分子種が，鶏（412系）について，ふ化後の種々の時期の浅

幼若な筋のタイプに近づくこと，即ち，発症に伴胸筋のほぼ中央部，かつ，やや表層近傍の部分をい，トロポニンTでは，足型分子種の出現，ミオ

主に解析に用いた。

シンでは，3種のアイソザイムの量比の幼若筋型

間接蛍光抗体法：筋の横断連続凍結切片を3．5への移行と，ミオシンL鎖の1つ（FL3）の減少％ホルマリンで固定し，これを1％血清アルブミなどを確認し 毅ト。ポミオシン分子種の変化もン溶液で処理した後，抗C蛋白質抗体（一次抗体）

Takeda＆Nonomura（1980）により報告され ￡ ．：．

および，FITC−標識・抗マウス，又は，抗ウサギ

又，（2）線維構造へのアクチンの集合度，即ち，筋IgG抗体を反応させ，蛍光顕微鏡で観察した。

組織内でのFアクチン（ポリマー）量と，Gアクイムノブロット法：筋の小片から，蛋白質を2

チン（モノマー）量との相対比がジストロフィー％SDS，2％メルカプトエタノールを含む溶液で筋において顕著に減少することを観察し男。

抽出し，これをSDS−アクリルアミドゲル電気泳

このような筋ジストロフィーに伴う蛋白質の変動（7．5％アクリルアミドゲルを使用）にかけて，化が，他の構造蛋白質においても普遍的かつ，協蛋白質を分離した後，ニトロセルロース膜に転写調的に起るのか，又，蛋白質の変化が個々の細胞し，これに抗C蛋白質モノクローン抗体および1レベルでどのように起るかなどが検討される必要−標識抗マウスIgG抗体を反応させ，オートラジがある。本研究では，このような観点から，主にオグラフィー法を行なった。

C−蛋白質を指標として研究を行なった。C蛋白

抗体：速筋型C蛋白質を特異的に認識するモノ質は，筋原緑稚内では，ミオシンフェラメントにク。−ン抗体（MF撰及びポリク。−ン抗体，

結合して存在し，こ一のフィラメントの維持に関与

遅筋型C蛋白質のみを特異的に認識するモノクロ

しているともいわれる。最近，速筋型，遅筋型分ーン抗体（ALD66 デ を用いた。これらの抗体の子種が存在することが明らかになり，鶏胸筋では，特異性は，既に別に確められている。又，本研究

ふ化数日までは，速筋型，遅筋型両種が共存し，で用いているモノクローン抗体は，コーネル大学のFischman筑波大学真崎両教授の御厚意により供＊千棄大学理学部生物学科

与されたものである。ミオシンL鎖に対する抗体＊＊東京都臨床医学総合研究所

は，鶏胸筋ミオシンL鎖（FLl）（速筋型）と心筋

17

鶏ジストロフィー筋におけるC一蛋白質分子種の変化

U lのqL靡・た−＿lDystrophy
6dU ■≧〇一の図1ふ化後1日（ld），6日（6d），14日（14d）目の正常（412系）と筋ジス鶏（413系）胸筋の凍結横断切片の抗速筋型C蛋白質（FastC），及び抗遅筋型C蛋白質抗体（SlowC）との反応性。
間接蛍光抗体法による。×140103

Ⅴ 生化学104

ミオシンL鎖（CLl）（心筋型）をウサギに注射しが知られた。2過令になると，正常鶏胸筋では，て得，IgGを分画後，抗速筋L鎖は，JL、筋筋原線

速筋型C蛋白質のみを含む細胞だけになった。以経で，抗心筋L鎖抗体は，胸筋筋原線経で吸収し後の成長過程を通じて，正常鶏の胸筋に遅筋型Cた後，それぞれの免疫原のアフィヒティーカラム

蛋白質は検出されなかった。それに対して，筋ジで精製した。抗CLl抗体は，遅筋ミオシンL鎖ス鶏の場合，ふ化直後には正常鶏と同様，ほとんをも認識する警

どすべての細胞が2種のC蛋白質を含み，1週間程で遅筋型C蛋白質をもつ細胞は減少していく。
結ところが，2過令になると，正常鶏と筋ジス鶏の果

既に，前年度にも一部報告したように，鶏胸筋問で若干の違いが現われはじめた。即ち，2遇令

では，胚の時期から，ふ化後数日まで，速筋型おの筋ジス鶏胸筋の多くの細胞は，速筋型C蛋白質

よび遅筋型C蛋白質が共存してい戎このことは，のみをもつが，少数ながら，明瞭に遅筋型C蛋白

胸筋の凍結横断切片を用いた間接蛍光抗体法によ質をも併せもつ細胞が認められた。このような2り，個々の細胞レベルで，更に明確となった。ほ

種のC蛋白質を共有する細胞の数は，筋ジス鶏のとんどの細胞は，両種のC一蛋白質と共有してい成長とともに増加した。図2に1カ月令，図3にた。ところが，ふ化後6日目には，抗遅筋型C蛋

4カ月令の場合を示す。1カ月令の筋ジス鶏では，白質抗体と強く反応する細胞は少数で，多くの細胸筋のほぼ全域にわたって，遅筋型C蛋白質を含胞は弱く反応するのみで，遅筋型C蛋白質の減少

む細胞が存在するのがより顕著になった。興味あ1

O ISdL
●

﹂㌧競漕

m N

1m D
・下．＼∴、1．■二㌢∵1†．∴、∴t

鉱∴ ノ ＿

0 ▲き〇一の図2

ふ化後1カ月令の正常（1mM）と筋ジス鶏（lmD）胸筋細胞に存在するC蛋白質のタイプ。
手法は図1と同じ。×180

17

3

鶏ジストロフィー筋におけるC−蛋白質分子種の変化

m N

4

m D

0
▲≧〇一S
■︑ヾ

0﹂≡
lSdJ
U﹂≡
き〇一S
図3

ふ化後3カ月令の正常鶏（3mN）と4カ月令の筋ジス鶏（4mD）の胸筋に存在するC蛋白質とミオシンL鎖（MLC）のタイプ。手法は図1の場合と同様。×200

105

V

106

生化学

ることに，この場合抗遅筋型C蛋白質抗体（ALD

抗体（ALD66）とは全く反応しなかった。とこ66）との反応性は，反応するか，反応しないかろが，筋ジス鶏胸筋からの抽出物は，MFl，ALに明らかに2分され，弱く反応する例はほとんど

D66いずれとも反応し，それぞれ1本のバンドをなかった。筋ジストロフィー症がかなり発症した与えた。検出感度の問題から，2過令や1カ月令

4カ月令の胸筋では，細胞の径はかなり不揃いでの筋ジス鶏胸筋に，遅筋型C蛋白質を検出するこあるが，これらの大部分は，遅筋型C蛋白質を含とは，イムノブロット法ではできなかった。

むに至る（図3）。しかし・，4カ月令でも，少数以上のべてきたC蛋白質の場合と比較する目的

ながら遅筋型C蛋白質を含まない細胞もみられた。

で，ミオシンL鎖の速筋型・遅筋型分子種が，筋又，速筋型C蛋白質は，これらの成長期を通じて，

ジスおよび正常鶏胸筋細胞に，どう分布するかをすべての細胞に含まれていた。ジストロフィー筋

蛍光抗体法で調べたところ，若い胚の胸筋では，に遅筋型C蛋白質が存在することは，イムノブロ

遅筋及び速筋ミオシンL鎖が共存するが，ふ化以ット法でも確認された（橿ト4）。即ち，1年令の降には，筋ジス・正常鶏を問わず，胸筋には速筋

正常鶏，筋ジス鶏の胸筋から抽出した蛋白質を検型分子種のみしか検出されず，筋ジストロフィー

定したところ，前者では抗速筋抗体（MFl）と陽症に併い，ミオシンL鎖の遅筋型分子種の出現は性反応を示し，単一のバンドを与えたが，抗遅筋否定された。この点C蛋白質の場合と明らかに異
なる。

2W

「2W

D一

N￣

づ

蒜
12

1Y
N

1Y
￣

3

．−MHC

D■■

￣C

√￣￣￣￣二

脚

■

123
図4

12

3

2過令（ZW）と1年令（lY）の筋ジスと正常胸筋に存在するC蛋白質のイムノブロット法による解析。1，抗速筋C蛋白質抗体（MFl）で処理＝ 2，抗遅筋C蛋白質抗体（ALD66）で処理；3，クマージー染色した電気流動のパターン，ミオシンH鎖（MHC）との蛋白質（C）の泳動位置を示した。

17 鶏ジストロフィー筋におけるC−蛋白質分子種の変化

Normal107

Dystrophy
Ago（m）

0

1

2

3

Ago（m）
4

0

1

2

3

4

F88t

C−PrOt

TN一丁

TM

鷺

Sbw

ト

Log

ト

α

β

ト

MLC
鷺
図5

AccoRDtNG TOTAKEDAANDHoNOMURA（193り）

筋ジスおよび正常鶏の胸筋成長にともなうC蛋白質（C−prOt）分子種の変化とトロポニンT（TN−T）・トロポミオシン（TM）とミオシンL鎖（MLC）の分子種の変化の時間経過の比較。

考察

つことは，基本的には，幼若期の細胞の特性に一特異性の高い抗体を使用することにより，筋ジ致する。初期には，ごく少数の細胞に変化がみら

ストロフィー症に併う胸筋におけるC蛋白質分子

れ，除々にその数が増していくとみなされる。又，種の変化を明瞭にとらえることが出来た。特に，胸筋の前・中・後部について調べたところ，若干

凍結連続切片を用いることにより，単一細胞につの差はあれ，いずれの部位でも細胞の変化はみら

いて，存在する分子種を吟味することが出来た。

れ，筋ジストロフィーに併う遅筋C蛋白質の出現

筋ジストロフィーにおける筋構造蛋白質の変化はは，胸筋全域にわたる現象とみなされる。このよト。ポニンT，ミオシンアイソザイムワト。ポミ

うな変化が，筋の再生現象を反映していることなォシ為どで明らかにされたが，これらの場合，のか，既存の細胞自身が幼若化するのか，本研究

蛋白質分子種を特異的に識別するための抗体が得だけでは解答は得られない。ただ，4カ月令の筋られていないので，細胞レベルでの解析が容易でジス胸筋には，遅筋型C蛋白質を含むかなり多数ない。C蛋白質の場合，免疫組織化学的に分子種の細胞があり，これらすべての細胞が，再生細胞を判別できるので，筋ジストロフィーにおける変とすると，細胞レベルのturnoverがかなり速い

化を，遅筋型C蛋白質の出現として，細胞レベルことになる。

でとらえることができる利点がある。
筋ジストロフィーの細胞が遅筋型C蛋白質をも筋ジストロフィー症に併うC蛋白質の変化を，
既に筋ジストロフィーに併う変化が知られている

Ⅴ 生化学108

トロポニンT，トロポミオシンの場合と比較すると，変化の経過に若干の違いはあっても，全体的にはよく似かよっているといえる（図5参照）。これら3種の蛋白質はいずれも，鶏胸筋では，正常にはふ化後10日程の問に幼若型蛋白質組成から親型蛋白質組成へ移行するものである㌘ところが，ふ化前に蛋白質組成が幼若型（速筋型＋遅筋型）
から親型（速筋型のみ）への移行を終えるミオシ
ンL鎖のような場合には，筋ジストロフィーの発症に際して，ほとんど変化が起らない。アクチンの場合も同様である誉これらを考えると，筋の発生，成長の比較的後期に親型に移行するC蛋白質，
トロポニンT，トロポミオシンなどの場合の方が，より分子種の変異が起りやすい。いいかえれば，可塑性があるのではなかろうか。
謝辞

モノクローン抗体をど恵与下さった筑波大兵崎教授，コーネル大学Fischman教授に感謝いたし
ます。

文

献

1）Obinata，T．，Takano・Ohmuro，H．andMatsuda，R．
（1980）．ChangeSintroponihTand myosiniso−
ZymeS during development of nomaland dy−
StrOphic chicken muscles．FEBSLet1．，120：195−
198．
2）Takeda，S．andNonomura，Y．（1980）．Presenceof
the tropomyosin

β・Chainindystrophic chicken

breastmuscle．βわmedReR，1：176−179．
3）Obinata，T．，Shimizu，N．andOkamoto，K．（1983）．
Quantitative changeSinmonomer and polymer
actins dming development of normal and dy−
StrOPhic chicken 並eletal muscle．BiomedicGL
Reseorch qr＾1uscutGT LhJStrOPhy，Ebashi，S．and
Ozawa，E．，eds．JapanSci．Soc．PleSS，Inpress．

4）大日方昂，大室弘美，真崎知生：骨格筋の発生・成長に伴うミオシンアインザイム及びC−蛋白質の分子種変異，筋ジストロフィー症の基礎研究（江橋班）
56年度報告書，135−140．
5）Reinach，F．C．，Masaki，T．，Shafiq，S．，Obinata，T．
andFischman，D．A．（1982）．IsofomsofC−pTOtein
in adult chicken skeletalmuscle：Detection withmonoclonalantibodies．J CbJJβfo乙，95：78−84．
6）Obinata，T．，Masaki，T．and Takano，H．（1980）．
Types of myosinlight chains present duringde−
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上月ねde肌．，87：9ト88．

7）Matsuda，R．，Obinata，T．andShimada，Y．（1981）．
Types of troponincomponents during develop−
ment ofchicken skeletalmuscle．DeyetOP．BioL，
82；11・19．

109

18 培養骨格筋および心筋細胞におけるトロポニンの分化

嶋 田裕＊

研究協力者 豊 田 直 二＊＊は じめに用いることにした。

われわれはすでにニワトリ胚子の骨格筋と心筋を材料として，筋調節蛋白質であるトロポニン（T

材料と方法

N）成分の性質は各筋の発生にともないどのよう

骨格筋細胞の培養には11日目ニワトリ胚の胸筋に交換して行くかについて，免疫反応を利用したを，心筋細胞の培養には7日胚の心室筋を用い，蛍光抗体法を用いて調べた㌘すなわち，親の骨格それぞれトリプシン処理により単一細胞に解離し，筋および心筋のTN−T，Ⅰ，C成分とそれぞれ特異

35mmシャーレに8×105個の細胞を培養した。

的に結合する抗体を用いて調べたところ，胚の骨神経を含む筋培養はつぎのように行なった。①

格筋と心筋はそれぞれの親の骨格筋と心筋のTN

3〜12時間培養の骨格筋細胞と心筋細胞に，脊髄−T，Ⅰ，e抗体と反応するが，その他に骨格筋は（コリン作動性神経）あるいは上頸神経節（アド心筋のTNTT，Cと，心筋は骨格筋のTN−Ⅰ抗体

レナリン作動性神経）を加えた。脊髄は60〜66時

とも強く反応した。すなわち胚の筋細胞内で合成

間胚の脊髄断片を10／上M1−6−D−arabinofu−

されるTN成分は，骨格筋とも心筋とも免疫学的

ranosylcytosineを含む培養液に24時間旋回培養に見分けのつかない性質を持っていることを示し

し，α運動神経細胞を多く含むようにしたものでている。したがって胚の時期には骨格筋と心筋とぁる㌘上頸神経節は11〜13日胚のものを用いた。

ではTNはかなり似かよった性質を持っており，

培養液には頭部と脊髄を除去した7〜11日胚より発生が進むにつれてそれぞれの筋特有のTNが合作製した胚抽出液を加えた。㊥骨格筋と心筋細胞成されるようになると考えられる。

の培養のうちのあるものには，神経組織および胚これらの蛋白質の胚子型から親型への変換は，抽出液のかわりに，7〜11胚の脳と脊髄より作製

どのような機構によるのであろうか。成体筋の性した神経抽出液を加えた。胚抽出液および神経抽質はその支配神経に依存していることが多くの実

出液ともに，蛋白質濃度は7m9／mlに調節し，い験により知られているもで，われわれは骨格筋とずれも培養液には5％の割合で加えた。④心筋細心筋の発生に対する神経の影響について調べた。

胞を神経のconditionedmedium（NCM）中で培胚子における骨格筋と心筋の支配神経を操作する

養することも行なった。NCMは4日胚から摘出ことは不可能に近いので，この実験には培養系をした脊髄をトリプシン処理して，35皿の培養皿に10勉の割合で培養し，3日ごとに採取した培養液＊千糞大学医学部解剖学第1講座＊＊東京都精神医学総合研究所神経化学部門

上宿である。④骨格筋と心筋細胞に非神経性の組織片（11日胚の肝臓，腎臓および肺）を加える培V 生化学110

TABLEI
TNln Skeletal and Cardlac Huscle Cells Cultured vlttl and vlthout Nerves

Addltlon tO S亡andard cul亡ures
Cultures

An tlbody亡es ted．
agalns t

Skeletal TN−
T

None

Splnal Synp ． Nerve
cordggl． ext．

Nerve u ver
cotld ・
med ．

Kldney Lung

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

skele亡
al ・

TN一
Ⅰ

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

muscleCell s

TN−
C
TN一
丁

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

十

＋

＋

cardlac

TN一
工
TN−
C
Skeletal TN二で
card lac
musc■
le
Cells

cardlae

TN一
Ⅰ

十

TN−
C
TN−
T

＋

＋

十

十

十

十

＋

TN一
工

＋

＋

＋

十

十

十

＋

＋

TN−
C

＋

＋

＋

＋

＋

十

十

十

毒も行なった。

より染色されるだけでなく，心筋のTN−T，C抗体とも反応した。このような反応性は長期間（3結果週間）培養しても変化がみられなかった（図1）。

このような方法で培養した細胞を光学顕微鏡にしかし，脊髄，上頸神経節または神経抽出液とより観察すると，筋細胞培養に加えた脊髄および共に骨格筋細胞を培養した場合には，1週間後に上頸神経節はそれぞれ突起を伸ばし，骨格筋や心はTN抗体に対する反応性に変化が現われた。す

筋細胞と接触しているのが見られた。しかしすべ

なわち，心筋のTN−TとC抗体に対する反応性がての筋細胞が神経と接触してはいなかったが，接消失し，骨格筋のTN抗体とのみしか反応しなく触した筋細胞としない細胞との間に分化の程度に相なった（図2）。これらの変化は神経がある一定違は認められなかった。また神経の影響下（神経

量（運動神経細胞数が1．8×104胤上頸神経節細組織，神経抽出液，NCM）に培養した筋細胞と，胞数が2×105個，神経抽出液濃度が3．5m9／ml）

その存在しない条件下に培養した筋細胞との間に以上の時に起こった。それ以下の時にはTN抗体

も著明な差異はみられなかった。

に対する反応性に変化は現われなかった。

神経の非存在下に培養した骨格筋細胞を親の骨

つぎに，心筋細胞を神経細胞あるいは神経抽出

格筋および心筋に特異的なTN成分の抗体を用い液の影響のない状態下で培養した場合のTN抗体て間接蛍光抗体法により観察した。骨格筋細胞はとの反応性を調べた。心筋細胞は培養後3時間目

培養の2日目から抗体に対する反応が現われ始めから心筋のTN−T，Ⅰ，C抗体と反応すると同時た。骨格筋細胞は骨格筋のTN−T，Ⅰ，C抗体にに，骨格筋のTN−Ⅰ抗体によっても染色された。

18 培養骨格筋および心筋細胞におけるトロポニンの分化

図1
間接蛍光抗体法による培養胚骨格筋（1，2）および心筋（3，4）細胞の観察。神経の影響の非存在下の培養（1，3）と脊髄の存在下の培養（2，4）。骨格筋のTN−T（a），TN−Ⅰ（b），
TNLC（C）および心筋のTN−T（d），TN−Ⅰ（e），TN−C（f）抗体により染色。培養14日目。ス
ケール＝50／上皿。

111

Ⅴ 生化学112

この反応性は培養期間を長くしても変化しなかっち神経要素の存在下で培養した筋細胞のTN成分

た（図3）。

は，それぞれ親の各筋のものと同じ反応性を示メ）

しカナし，脊髄，交感神経節または神経抽出液を加えて培養した心筋細胞は，培養1週間後には心ようになった。このような混合培養系での胚子型筋のTN抗体とのみ反応し，骨格筋のTN−Ⅰ抗体

胞の接触の有無にかかわりなく，また生きた神経とは反応しなくなった（図4）。この反応性の変化

細胞のない状態下（神経抽出液あるいはNCM）では神経がある一定量（運動神経細胞，上頸神経細も起こるので，機能的なシナプスの形成や，神経胞，神経抽出液がそれぞれ3×104個，4．5×104個，と筋の物理的な接触が必要であるとは考えられなから親型へのTN成分の変化は，神経突起と筋細0．7m9／ml）以上の時に起こり，それ以下の細胞い。また腎臓や肺などの非神経性の組織を加えて数または蛋白質濃度では起こらなかった。さらにも，このような変換は起らなかった。したがって，心筋細胞にNCMを加えて培養した場合にも抗体

このような蛋白質の抗原性の変換は，神経液性のに対する反応性は同様に変化した。107個の運動因子に依存しているのではないかと想像される。

神経細胞で培養したNCMを心筋培養細胞に加えこのような物質の解明は，これからの問題である

ると，骨格筋のTN−Ⅰ抗体に対する反応性は消えが，神経以外の組織である肝臓も心筋のTNを親たが，106個の運動神経細胞で作製したNcMで型に変換させたので，肝臓には心筋を分化させるはそのような効果は現われなかった。

因子が存在していることが予想される。

非神経性の組織（肝臓，腎臓，肺）を加えた場

ミオシンの抗体を用いた免疫組織学的実験では，合には，各培養筋細胞の抗体に対する反応性はコ

生後間もないラットの誹腹筋（速筋）を除神経しントロールの培養と同じであった。ただし，心筋ても，正常な発生をするという報告がある㌘これの培養に肝臓を加えた場合には，神経性の要素を

は筋の分化に神経の関係がみられなかったことを加えた時と同様の結果が出た。

示しているが，この点に関しては，鳥類や哺乳類

これらの結果を表1に示した。

の筋発生の仕組の相違や，invivoとinvitroの実験系の違い，さらには観察している蛋白質の分考察化様式が異なることも考えられる。この報告では，以上の結果をまとめるとつぎのようになる。神

神経の影響の非存在下でも培養の期間を長くする

経細胞および神経抽出液の存在しない状態で培養ことによって，各筋の反応性を親型に変換させる

した骨格筋細胞は，親の骨格筋に特異的なTN抗ことができるか否かについては，解明することが体のほかに，心筋のTN−T，C抗体とも反応し，できなかった。しかし，少なくとも神経の影響下

また心筋は心筋のTN抗体以外に骨格筋のTN−Ⅰ

ではTN分子の変換を早期にひき起こさせること

抗体とも反応した。すなわち培養骨格筋細胞のTN−T，は明らかで，神経性因子は骨格筋および心筋細胞

Cおよび培養心筋細胞のTN一Ⅰは，免疫学的に親の遺伝子発現に影響を与えていることが想像されの骨格筋と心筋の両方の性質を持っていることをる。

示しているJすなわち，培養系で合成されるTNl）

成分はニワトリの胚子期に存在するものと同じ性質をもつものであることを表わしている。
本実験ではさらに運動神経細胞，交感神経節細胞，神経抽出液，あるいはNCMと共に培養した骨格筋と心筋細胞は，それぞれ親の骨格筋と心筋に特異的な抗体と反応するようになった。すなわ

文献1）Toyota，N．and Shimada，Y．：Differentiation of
troponinincardiacandskeletalmusclesinchicken
embryosasstudiedbyimmunofluorescencemicro−
SCOpy．J CeJJβわ上，91，497−504，1981．
2）Buller，A．J．，Eccles，J．C．and Eccles，R．M．：
Interactions between motoneurons and muscles
inrespeCt Ofthe characteristic speeds oftheir
feSpOnSeS．エ 用γ血と 匹OJI（わ可，150，399416，

18 培養骨格筋および心筋細胞におけるトロポニンの分化
1960．

3）Masuko，S．，Kuromi，H・andShimada，Y・：Isola−tionand cultureofmotoneuronsfromembryonicchickenspinalcords・丹oc・肋t・Acad・ScHLS・A・・
76，3537−3541，1979・

1134）Butler−BFOWne，G．S．，Bugaisky，LB・，Cu6noud，S．，SchwaLtS，K．andWhalenR．G・：Denervation
ofnewbomratmusclesdoesnotblocktheappear−
ance of adult fast myosinheavy chain．NbtuTe

笹OJIdo叫，299，830−833，1982・

114

19

筋ジストロフィー症鶏浅胸筋の筋線推構成蛋白
一筋ジス遺伝子の自レグ鶏への導入−
野々村 禎 昭研究協力者 武 田 伸 一 菊 池 建 機＊

は じめにで作出された鶏群（図1）のうち，白レグ対照鶏筋ジストロフィー症鶏（以下，筋ジス鶏）の晦著（＋／＋），白レグ筋ジス鶏（am／am）及び雑種な羅患筋である胸筋については，幾つかの筋原線

第1代鶏（ヘテロ鶏，am／＋）の3種である。生経を構成する蛋白に異常が兄い出され，殊に発生後1年半以上経過した白レグ対照鶏1羽，白レグ

・成長過程での分子種の変換の上から注目されて

筋ジス鶏，ヘテロ鶏各2羽について，後頸部打撲，きた。

放血後，浅胸筋，縫工筋等を採取し，筋組織を液

1−弟

我々は，筋ジス鶏胸筋のトロポミオシンについ体窒素，イソペンタン下で急速凍結し，ドライアて，解化後早期のβ−トロポミオシンの減少〜消イス完全密封下に東京へ輸送し−20℃で凍結保存

失過程の遅延と，その後の再出現があ㍍筋ジスした。一方，同部から採取した筋組織をドライア

成鶏胸筋の単一筋線経の分析では，個々の筋線維

イス・アセトンにて急速凍結，10／上クリオスター

雛を報告してト切片を作製し，Hematoxylin−Eosin（H−E）染上にβ−トロポミオシンが存在した

色を行ない検討した。

きた。
一方，筋ジス鶏の発症を解明する一つの方向と筋線維構成蛋白の分析は，全筋線維抽出蛋白として，ヘテロタイプ鶏（ヘテロ鶏）の解析が重要

粗活性トロポミオシンを材料とした。全筋緑維抽であるが，白色レグホン種鶏（白レグ鶏）と筋ジ

出蛋白は，Miknwaの方法に依ったが，粗活性トス鶏（line413）とのヘテロ鶏は，組織化学的及

ロボミオシンは，Ebashiの方法を一部改変して抽び血清酵素学的にキャリアー鶏であるとの位置付出した。即ち，凍結保存した筋組織の1ブロック

4）

8）

5−6）

けがなされてきた。

は，3−49と少量で肉ひさが困難のため，20倍

今回我々は，筋原綿経を構成する蛋白の上から，量の0．1MKCl，5mMK−Pi（pH7．0）下で細か

筋ジス鶏の形質がどのように白レグ鶏に導入されく裂いた筋組織をWaringblenderで短時間ホモるのかを，殊にへテロ鶏に注目しながら分析した。

ジナイズし，15，000回転20分遠沈後得た筋残恋を出発点とした。

材料と方法

筋構成蛋白の分析は，通常のSDS−PAGE（La−

実験鶏は，筋ジス鶏（ニューハンプシャー種line

emmli）の他，3種類の二次元電気泳動を用いプこ。

413）と白レグ鶏との交配により東北大学農学部

それらは，①SDS−UREA−PAGE→SDS−PAGdI

9）②IEF→SDS−UREA−P云謎ヲ㊥NEPHGE→SD
東京大学医学部薬理＊東北大学農学部

s−PAGd）であり，㊤④の場合，Am。h。lineは。H
4〜6を80％，pH3．5〜10を20％とし，㊥のNE−

19筋ジストロフィー症鶏浅胸筋の筋繰維構成蛋白一筋ジス遺伝子の白レグ鶏への導入−

WL
什／十）

WL

NH（line413）

丁（am／am）

am／＋）

（＋／＋）

TF〜

Bl

115

…T′＋
C
（＋／＋）

Bl

am川丁帥
Dy
（am／am）

図1 筋ジス鶏遺伝子（am）の白レグ鶏（＋／＋）への導入
ニューハンプシャー種（NH）筋ジス鶏（line 413）と自レグ鶏（WL）の交配により，雑種第l代へテロタイプ鶏（am／＋）（n）を得た。 凡とWLの戻し交配により得たBl鶏同士を交配する事により，自レグ対照鶏（＋／＋）（C） 及び自レグ筋ジス鶏（am／am）（Dy）を得た。
PHGEは250Vhとした。㊥の場合，Acrylamide

ス鶏（line413）程目立たず，むしろ小径の萎縮12．5％に対し，Ureaを3．5M加え二次元日とし線経が大半を占める。中心核の増加はあるが高度

た。

ではない。
前2者に対しヘテロ鶏浅胸筋では，筋線経の大結果小不同が顕著で，多数の肥大線維及び小径で角ぼ1．組織学的研究ったangul左rfiberを混ずる。結合織や脂肪織の

図2に白レグ対照鶏，筋ジス鶏，ヘテロ鶏浅胸増加もあるが，壊死緑経はあるものの非常に稀で，筋の組織学的所見を示した。

中心核の増加も顕著では無い。所見をまとめると，

自レグ対照鶏浅胸筋では，筋の基本構築は良く

ヘテロ鶏浅胸筋は，壊死繰経が少ないという特徴

保たれ，結合織や脂肪織の増加は無い。個々の筋はあるが，筋線経の大小不同，肥大線経，結合織，緑経をみると，比較的直径も均一で，筋緑経の大脂肪織の増加等の点については，筋ジス鶏の形質

小不同，壊死，中心核の増加も認められない。

を受け継いでいる事が判る。

白レグ筋ジス鶏浅胸筋では，壊死線維及び貪食

2．全筋線維抽出蛋白の検索細胞による清掃現象が目立ち，結合織や脂肪織

白レグ対照鶏，廟ジス鶏，ヘテロ鶏浅胸筋のIも高度に増加し，筋の基本構築に乱れを生じてい

EfL→SDS−UREA−PAGEの結果を図3に示した。

る。筋緑経の大小不同はあるが，肥大緑経は筋ジ

この系では，酸性側の￣ミオシン軽鎖，アクチン，Ⅴ 生化学

116

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図2 白レグ対照鶏（C），ヘテロ鶏（Fl），白レグ筋ジス鶏（Dy）浅胸筋の組織学的所見
筋ジス鶏での壊死線経と貪食，小径の萎縮線経，ヘテロ鶏での大径の肥大線経が目立つ。
Hematoxylin，Eosin染色，×211。

19 筋ジストロフィー症鶏浅胸筋の筋線維構成蛋白一筋ジス遺伝子の自レグ鶏への導入−

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白レグ対照鶏（C），ヘテロ鶏（Fl），自レグ筋ジス鶏（Dy）浅胸筋の全筋線維抽出蛋白の比較
等電点電気泳動（IEF）からUrea存在下のSDS電気泳動（SI）S−UREA−PAGE）への二次元電気泳動で示す。fLC−1，2，3：ミオシン軽鎖の速筋タイプ。TM：トロポミオシン。
fTN−C：トロポニンCの速筋タイプ。

117

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Ⅴ 生化学

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図4

白レグ対照鶏（C），ヘテロ鶏（Fl）．自レグ筋ジス鶏（Dy）浅胸筋から抽出した粗活性トロ
ポミオシンの比較
SDS−PAGEで比較した。S：自レグ対照鶏縫工筋，fbTN−T：トロポニンT速筋タイプの胸型，TN−Ⅰ，C：トロポニンⅠ，C。mOlecularweightmarker（MW）は分子量94，000，67．000，
43，000，30，000，20，100，14，400に相当するbandを示している。

トロポミオシン，トロポニンC及び骨格蛋白であについて検討するために，3種の鶏の浅胸筋からるデスミン，ビメンチンの比較が可能である。ミ

粗活性トロポミオシンを抽出して比較した。

オシンの軽鎖，トロホニンCについては，何れも図4にSDS−PAGEによる比較を示した。蛋白

速筋由来の分子種より構成され，アクチンも同一量が均一ではないが，白レグ筋ジス鶏では抽出性である。トロポミオシンについては，白レグ筋ジが悪い事を反映している。白レグ筋ジス鶏では，

ス魂浅胸筋のみでβ−トロポミオシンの出現があ対照鶏縫工筋に明らかなβ−トロポミオシンに一り，自レグ対照鶏やヘテロ鶏とは区別できる。更致するバンドが兄い出される。しかし近傍に足型に同鶏では筋ジス鶏の単一筋線経でMikaw㌔ら

トロポニンTの混在が予想されるので，次の2種の指摘したようにデスミンやビメンチンも増加し類の二次元電気泳動により分析した。

ていた。但し，この全筋線維抽出蛋白は，ごく少

図5にUrea存在下のSDS−PAGEから，Urea

量の筋組織を材料としているため，各ブロックかなしのSDS−PAGEへの二次元電気泳動の結果を

ら複数のSampleを作製し比較したが，白レグ対示した。この二次元電気泳動ではトロポミオシン

照鶏，ヘテロ鶏ではβ一トロポミオシンは無いか，を容易に同定することができるご縫工筋を対照と存在してもどくわずかであり，相当量存在する自すると，白レグ筋ジス鶏にのみ，β一トロポミ■ォ

レグ筋ジス鶏とは明瞭に区別された。

シンが存在する事が明らかである。トロポ÷ンT

3．粗活性トロポミオシンの検索についてみると，対照鶏浅胸筋にはその胸型が，前項のトロポミオシンの結果及びトロポニンT

縫工筋には足型が存在するが，白レグ筋ジス鶏で

19筋ジストロフィー症鶏浅胸筋の筋線維構成蛋白一筋ジス遺伝子の自レグ鶏への導入−

119

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図5†TN−C・．●

一一●

浅胸筋粗活性トロポミオシンの二次元電気泳動による比較
Urea存在下のSDS−PAGEからUreaなしのSDS−PAGEへの二次元電気泳動で示す。
筋ジス鶏（Dy）浅胸筋では，対照鶏（C）やヘテロ鶏（Fl）には無いβ−トロポミオシン（β−TM）が存在し．胸型トロポニンT（fbTN−T）の減少と，足型トロポニンT（flTN−T）も認められる。

は，胸型の減少と足型の出現があり，01）inataの事である。他の1項はトロポミオシンに関して白超と一致している。へテ。鶏は，卜。ポ二ンT

レグ筋ジス鶏の両サブユニットの酸性側にリン酸に関しても対照鶏と一致したパターンである。

化型と考えられるスポパ競察された事である。

こうした結果を図6ではNEPHGE→SDS−PA
GEの二次元電気泳動で確認した。この系では短考察

時間で広いpHの範囲の蛋白について検索が可能

筋ジス鶏の筋線経を構成する蛋白については，である。結果は，前の二次元電気泳動に一致し，その幾つかについて異常が知ら辟殊に筋化後そ白レグ筋ジス鶏のトロポミオシン，トロポニンTの分子種の間で変換を生ずる蛋白が注目されてきに関する異常は，ヘテロ鶏では検出されなかった。

た。しかし，病因につながる生化学的な一次欠損

但し，この電気泳動では，幾つか興味深い点を指はいまだ不明である。

摘できた。1つはトロポこンTに関する事項で，ヘテロ鶏を分析する事は，単に遺伝形式を検討対照とした縫工筋で胸型のトロポニンTに一致すするばかりでなく，一次欠損を推測する上でも重るスポットが存在した事と，ヘテロ鶏の場合に最要である。幾つかの試みの鈴，筋ジス鶏の白レも明らかであったが，胸型のスポットより，わずグ鶏への導入については，ヘテロ鶏の解析が進んでかに酸性側低分子側に随伴するスポットを認めたいる。雑種第一世代及び交配を繰り返して作出さⅤ 生化学120

れた第二世代以下のヘテロ鶏に共通する特徴とし
5−6）

これらの特徴は兄い出されなかった。

て，菊池らは，組織学的な筋線経の大小不同や肥ここで，ヘテロ鶏の臨床所見，組織学的，血清

大線維及び血清学的なpyruvatekinase（PK）の学的所見と今回の筋線維構成蛋白の結果をまとめ増加を認めている。但し，フリップテストによる

ると，筋線経の大小不同や肥大線経，PKの値は発症は検出されず壊死線経は非常に稀で，CPKも優性遺伝の形式をとり，筋の壊死，CPK値，筋構

正常群と分離できない。

成蛋白の異常及びフリップテスト上の発症は劣性

こうした組織所見の上で変化を認めるヘテロ鶏

遺伝の形式をとる事がわかる。蛋白の異常が劣が，筋線経を構成する蛋白の上でどのような変化性遺伝子の直接の反映との可能性も生まれて来を示すかという事が注目された。今回の検索では，るが筋の壊死こそは，筋ジス鶏の一次的欠損とご白レグ筋ジス鶏には少なくともトロポミオシン，

く近い現象であろうから，蛋白の異常が，壊死及トロポニンT，デスミン及びビメンチンという3

びそれに随伴する事項の二次的現象との見方もつの蛋白上の異常が導入されたが，ヘテロ鶏では残る。

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非平衡pH匂配ゲル（NEPHGE）からSDS−PAGEへの二次元電気泳動で示す○対照鶏縫工筋（S）では胸型トロポニンT（小矢印）に一致するスポットが存在し，ヘテロ鶏（Fl）では，
胸型トロポニンTのやや酸性側低分子側に混在する小成分（小矢印）がある。筋ジス鶏（Dy）
トロポミオシンの酸性側には，リン酸化型と思われるスポット（大矢印）を認める0

19筋ジストロフィー症鶏浅胸筋の筋線維構成蛋白一筋ジス退伝子の白レグ鶏への導入−
文

特に，筋線経の壊死は真金細胞による清掃と同時に，一部では言わゆる再生を伴うであろうから，蛋白の異常がこの筋線経の崩壊〜再生に伴う現象か否かが重要な課題となる。
但し，ヘテロ鶏の検索の結果，蛋白の異常が，筋の肥大現象によるとの可能性は低くなった。肥
大の多いヘテロ鶏で蛋白異常はなく，既に大半が萎縮に陥っていた筋ジス鶏でも蛋白の異常は明瞭であったからである。
こうしたへテロ鶏の結果とは別に，今回の分析
では興味深い点が兄い出された。それは，白レグ
筋ジス鶏のトロポミオシンに少量のリン酸化型が11）認められた事である。最近，鶏胚の骨格筋及び成長期ラット心筋淫おいて，幼若期程，ト。ポミオ
シンのリン酸化型の占める割合が高いとの報告があり，白レグ筋ジス鶏のみで，リン酸化型が検出された事が注目される。
結論

筋ジス鶏（line413）の形質が，どのように白レグ矧こ導入されるのかを，浅胸筋の筋線経を構成する蛋白の上から検討した。
1．筋ジス鶏（line413）浅胸筋の筋線経を構成する蛋白の異常の内，トロポミオシン，トロポニ
ンT，デスミン及びビメンチンに関しては，白レ
グ筋ジス鶏に完全に導入された。
2．日レグ鶏と筋ジス鶏との間に作出されたヘテ
ロ鶏には，上記の蛋白の異常は兄い出されなかった。
3．こうした筋蛋白の異常は，ジストロフィーの劣性遺伝子により直接あるいは間接に支配されていると考えられた。

121

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122

20 ジストロフィー鶏および正常鶏の発生過程におけるEF2およびNAD含量の変化

真 崎 知 生＊，＊＊
研究協力者 吉 川

筋ジストロフィー鶏の特徴である初期の

昭＊＊の方法により分画した核を含む溶液を，25℃，15

hypertrophy，後期のatrophyの現象について我minインキュベーションし，〔3H〕ADPリボース塁々は蛋白代謝，特に蛋白合成能の面から検討してを測定することにより行った。DNA含量はジフきた。その結果筋ジス鶏の蛋白合成能は正常鶏に

ェニルアミ

ン

により測定した。

比較し，胚の時期より高いこと，この原因として結果と蛋白合成延長因子（EFlおよびEF2）の活性が元進していることを既に報告してき逮本報告では
先づEF2の活性元進が量的なものか質的なもの

考察

1）ジストロフィー筋と正常筋EF2の質的・量的比較かを明らかにし，次にジストロフィー筋の蛋白合

ジフテリアトキシンにより，1分子のNADお成能元進の意味について，NAD含量の変化とのよび1分子のEF2から1分子のADPリボシル

関連において考察する。

EF2が生成されるのでEF2の定量が可能である。図1tA）は部分的に精製した親の筋肉上宿，20

材料と方法

日胚の筋肉上宿およびポリゾームのEF2を〔14C）

ジストロフィー鶏（413系統）および正常鶏

ADPリボシル化した試料を，10％SDSポリアク（412系統）の15日胚から生後6ケ月の胸筋を用

リルアミド電気泳動したパターンで，図11B：lはIA）

いた。胸筋より上宿およびポリゾ＿ムを調製Jヲのオートラジオグラムである。いずれの試料も約

上宿中のfreeのEF2およびポリゾームに結合し10万分子量の位置に〔14C〕ADPl）ボシルEF2のたEF2含量を測定した。EF2含量の定量は．

バンドが認められた。上宿中のEF2もポリゾー〔14C〕NADおよびジフテリアトキシン存在下にEF

ムに結合したEF．2も差が認められなかった。ジ2を〔14C〕ADPリボシル化し，その生成量を測定

ストロフィー筋と正常筋のEF2分子に差があるすることにより行った1）。筋肉中のNAD含量はかどうかを確かめるため，Cl。V。1。ndi）の方法

Kling。nl）erg2b方法により測定した。ポリADPリにより図1に示したEF2のバンドを切り取り蛋

ボース合成酵素活性は，反応液0．1ml中に，10／上m

白分解酵素による限定分解を行った。トリプシン

oITris−HCl（pH8．0），2．5JLmOIMgC12，0・08／t

処理では差はなく，V8プロテアーゼ処理で僅か

moIDTT，0．2JLCi（3H〕NADおよびChauveau3）な差が認められた（図2）。しかし本質的な差ではなく，ブタ肝，正常およびジストロフィー筋のE＊筑波大・薬理＊＊都・臨床研

F2分子の問には差はないと思われる。図3に20日胚の上活中のfreeのEF2含量とポリゾーム

20

ジストロフィー鶏および正常鶏の発生過程におけるEF2およびNAD含量の変化

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竣＋＋て∵溺図1〔14C〕ADPリボシルEF2の10％SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動パターン（A）およびオートラジオグラム旧）。（A），（a）：ブタ肝EF2，（b，C）：部分的に精製した正常（b）
および筋ジス（C）親鶏胸筋上宿EF2，（d，e）：正常（d）および筋ジス（e）20日胚筋肉上宿（f，g）：正常（f）および筋ジス（g）20日胚筋肉ポリゾTム。BSA：ウシ血清アルブミン。
FA（FB）：ジフテリアトキシンララグメントA旧）。（B）：（劫のオートラジオグラム。

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図2〔14C〕ADPリボシルEF2部分を切り取り，V8プロテアーゼで限定分解した15％SDSポ
リアクリルアミドゲル電気泳動したパターン。（Aいa）：V8プロテアーゼ未処理の正常筋
EF2，（b）‥ブタ肝EF2．（C）：正常筋上宿EF2，（d）：ジストロフィー筋EF2。※：ジストロフィー筋にのみ特徴的なバンド，※※：ブタ肝EF2と鶏筋上宿EF2で異るバンド。
旧日A）のオートラジオグラム，mf：〔14C〕ADPリボシルEF2の主な限定分解フラクヨン。

123

Ⅴ 生化学

124

0．1

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1

Sup．orRib．tmg′ml）

図3

20日胚胸筋上宿EF2およびポリゾーム結合EF2含塁
上清（Sup）は，上清蛋白（m5V反応溶液（祀）を・ポリゾーム（Rib）は・ポリゾーム（20＿A260＝1呼）（m〆反応溶液（祀））を示す0／○：正常筋上宿EF2，●：ジストロフイP筋上宿EF2，△：正常ポリゾーム結合EF2，△：ジストロフィー筋ポリゾーム結合EF2。

表1発生過程における正常筋およびジストロフィー筋上活中のEF2含量の比値は，ジストロフイT筋上宿EF2含量／正常筋上宿EF2含量示す。
EmbryoAfterの平均値±標準誤差を

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15．th day20th day

2week

4week

・adult1．04土0，15

1．52±0．10

1・72土0・48

1・78±0・17

2・53土0・69

（n＝7）

（n＝7）

（n＝6）

（n＝5）

（n＝4）

20

ジストロフィー鶏および正常鶏の発生過程におけるEF2およびNAD含量の変化

125︵ぞ︻○∈j OVZ

図4

発生過程における筋肉細胞内NAD含量の変化
NAD含量は湿重量当りの値を示す。
白：正常筋，黒点：ジストロフィー筋※‥5％の危険率で正常筋とジストロフィー筋の間に有意差あり。バーは標準誤差の値を示す。

に結合したEF2含量を示した。上宿中の蛋はジストロフィー筋上沼中のEF2含量は低いか

白当りのEF2含量はジストロフィー筋で高等しいことになる。これはwet weight当りのいが，ポリゾームに結合したEF2含量はRNA

DNA含量およびRNA含量の動能と一致してお当りで両者に差は認められなかった。このことかり，発症前の4週令までは蛋白合成能が元進してらEF2のリポゾームへの結合能には差●はないと

hypertrophyになり，8週令以降徐々にatrophy

思われる。なお20日胚では上宿中のEF．2含量とになる原因と考えられる。

ポリゾーム結合EF2含員の比は，正常筋で約22）細胞内NADレベルと発生分化：1であった。20日胚の心筋では上宿中およびポ筋ジストロフィー鶏胸筋では，蛋白合成能が元リゾームに結合したEF2含量とも差は認められ進しているが，これは先に述べてきたように蛋白なかった。表1に発生過程の正常筋に対するジス合成に関与する因子が質的に実るのではなく量的トロフィー筋EF2含量の比を示した。15日胚でに増加してい−るのに過ぎない。この原因の一つとは差は認められなかったが20日胚以降8週令までして，ジストロフィー筋の幼若性が考えられる。

ジストロフィー筋上宿中のEF2含量は有意に増即ち幼若性のため蛋白合成能が高いまま持続して加していた。しかし8週令ではジストロフィー筋いると考えられる。ジストロフィー筋の幼若性に関上宿中の蛋白濃度は正常筋の約レつであるのでしては，乳酸脱水素酵素（LDH）アイソザイムパター

ジストロフィー筋上宿中の蛋白当りのEF2含量

ンに関して詳しく報告されている。ジストロフィーが正常筋の2倍であっても，Wet Weight当りで筋では親型であるLDH4，LDH5が現われず，

126

V q三化学LDHl，LDH2，LDH3のみのままである6・㌔合成酵素活性は増加しており，先に述べた仮説と細胞レベルでは埜申請こよる幼若型線経から親型符合する。但しポリADPリボース合成酵素活性

線経への分化障害が報告されている。最近では大とポリADPリボース含量との関係等更に検討す

日方㌔，武田己めによるト。ポミオシン，ト。ポ

る必要がある。

ニン等のアイソフォームの研究からジストロフィ

ジストロフィー筋では，幼君型から親型への分ー筋には幼若型アイソフォームが存在しているこ化に必要な遺伝子の発現が障害されている可能性とが報告されている。現象的にはジストロフィーがあるが，今後更に遺伝子レベルでの解析，およ筋の分化障害が明らかになりつつあるが，この原

び幼若性と筋ジストロフィー発症との関係の検討

因は現在のところ不明である。我々は分化に関与が必要であろう。一方発症前後の蛋白合成能元進する可能性がある筋肉内NAD含量の変化を測定

は幼若性で説明出来ても，20日胚ですでにEF2した。Ca。l。ndl）は間充織細胞が筋肉に分化す含量が高いことは幼若性だけでは説明出来ず別のる際，細胞内NAD含量が増加することを報告して面からの検討も更に続ける必要があると思われる。

いる。図4に示すように，鶏胸筋細胞中のNAD
含量は，生後1週令の時点で正常筋に比較し有意

謝 辞
ジフテリアトキシンを頂いた大阪大学 内田に減少していた。この有意な減少は，1週令の時

先生，ブタ肝EF2を頂いた東京大学にのみ認められたことから細胞膜変性による細胞

先生に感謝いたします。

水本晴久

からのNADの漏出によるものとは考えにくい。
大日方㌔の構造蛋白アイソフォームの研究によれば，正常筋の場合1週令付近で幼若型と親型が混在し，これ以降幼若型が消え親型にのみ限定さ
れてくるとのことである。1週令でジストロフィー筋の細胞内NAD含量が有意に低いことは，分化と何らかの関係を持っているとも考えられる。
一方心筋細胞内NAD含量の成長による変化は少いものの，やはり1週令で有意な差が認められた。
骨格筋に比較し心筋の分化は早期に終わり骨格筋はどの影響を受けないとも考えられる。
NAD含量と分化との関係に関しては．NADを基質とするポリADPリボース合成酵素の関与が推察される。ポリADPリポースはヒストンに結合しており，DNAの修復や遺伝子発現の調節を行っていることが示唆されて、昔，1警筋肉の分化に関しては，間充組織細胞から筋肉に分化する
際ポリADPリポース含量が減少する結果，基質であるNAD含量の増加が示唆されてい夏1ミ逆に分化が抑制されていればポリADPリボース含量の増加とそれに伴うNAD含量の減少が考えられる。ジストロフィー筋の核中ポリADPリボース

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1102−1106．

6）Kaplan，N．0．＆Cahn，R．D．（1962）・創加九州血り′，
48，2123．
7）Dawson，D．M．，Goodfriend，T．L．，＆Kaplan，N．0．
（1964）．gci帥Ce，143，929．

8）埜中征乱春原経彦，杉田秀夫，石浦章：（1979）
神経内科，11，259．
9）Obinata，T．，Ohmuro，T．H．，＆Matsuda，R．（1980）．
月田ば上e托，120，195．
10）Takeda，S．＆Nonomura，Y．（1980）．BiomedRes．，
1，176．
11）Caplan，A．Ⅰ．and Rosenberg，M．J．（1975）．〝oc．
〟正月αd．gCL72，1852．
12）Nishizuka，Y．，Ueda，K．，Hordo，T．＆Hayaishi，0．
（1968）．JβfoムC加朋．，243，3765．
13）Terada，M．，Fujiki，H．，Marks，P．A．＆Sugimura，T．（1979）．伽ぐ．血沈Acβd∫d tは，76，6411．

127

21可溶性コネクチン

丸 山 工 作＊
研究協力者

木

村

澄

子＊

沢

田

元＊＊

ずっと昔から，骨格筋には収縮性要素のほかに材料と方法

弾性要素が存在すると生理学者が主張してきたが，実験材料としては，ニワトリ胸鼠 ウサギ骨格

その実体は不明のままであった。筋緑経をおおっ筋，コイ骨格筋を用いた。いずれも同様な結果がているコラーゲン線経のシートによるのではない得られたが，どちらかというと，コイの筋肉の標

かともいわれた。1954年に名取礼二はスキンド・品が混在物が少なかった。

ファイバーを用いて，たしかに弾性のあることを筋肉を50mMKC卜1mM NaHCO3溶液でホモ示し，弾性内部膜の存在を仮定し辺というのは，

ジナイズし，5，000rpm5分の遠心で沈殿をあつミオシンとアクチンフィラメントの重なりがなくめた。これをふたたびホモジナイズし，遠心をくなるほど引っぼってもはなせば，ゆっくりともと

りかえし，8回つづけたbそののち，0．5％Tritonの長さにもどっていくからである。

X−100溶液で0℃30分処理して，膜成分を可

1975年来，私たちは脊椎動物骨格筋には，塩で溶化した。黄色い上活が無色になるまで洗いをく

溶出されない細いフィラメントの網目構造が存在りかえした。しかるのち，10mM NaHC03で5することを主張し，その本体を弾性タンパク質コ

回，5mM NaHC03で洗って，水溶性タンパク質

ネクチンと名づけ選コネクチンは，分子凱00を徹底的に除去する。最后にガラス蒸留水で数回万におよぶ高分子量成分と43，000ダルトン成分か洗う。このさいは，10，000rpm20分遠心した。

らなると報告したカミ・め最近，後者は変性アクチン

ぼうじゅんした筋原綿経に3M NaClをtA0量加にはかならないことが明らかにされ選したがって，

え，1時間0℃でかくはんする。そして，ワット

コネクチンは高分子量成分からなっている。

マンNn2のろ紙でろ過する。ろ過に4〜5時間かコネクチンは，SDSなどタンパク質変性剤の存在下で単離されてきJAカそのため，nativ。なかる。このろ液が粗コネクテン溶液で，70−90％
は，100万ダルトン成分が占める。

標品が得られなかった。したがってミオシンやアコネクチンの精製は，ロータリー・エバボレー

クチンなどとの相互作用が研究できなかった。私

ターで濃縮した粗コネクテン溶液（〜1円〝如）をたちは，1981年からコネクテンの一部を塩溶液でゲルろ過することによってなされた。Toyo

可溶することに成功し，その単離法を確立するこPearlHW−65のカラム（1．8×90cm）に6mlのサンとに努力してきた。今回，純粋に得られた可溶性

プルをのせ，0．1MNa phosphate（pH7．0）でコネクチンとアクチンとの相互作用を報告する。

溶出し，素通りの画分につづくピークをあつめた。
アミノ酸は，110℃，24時間，6NHC￠中で加＊千葉大学理学部生物学科
叫東京大学医学部解剖学教室

水分解したのち，日立835分析計で定量した。流
動復屈折はRao杜装置，枯度はLow ShearLlOO

V 生化学128

粘度計を用いて測定した。電子顕微鏡は，日本電を示唆する。ただし，1〝1㌢旬1でも，流動複屈折

子100Sを使用した。

はみられなかった。
可溶性コネクチンが細いフィラメントからでき結ていることは，酢酸ウランによる逆染色法では電果

可溶性コネクチンの性質

子顕微鏡から明確には観察されなかった。しかし，可溶性コネクチンは，3％ポリアクリルアミド

ロータリー・エバボレーターで濃縮してゆくと，

SDSゲル電気泳動で，ほんの少し移動する高分

ついには，ファイバー状のものが折出し，これを子量成分から成っている。280nmにピークを示

引っぼって，急速凍結エッチングレプリカ ㌔によし，核酸などは含まれていない。また，糖もほとって電子顕微鏡下で観察すると，細いフィラメン

んど含んでいなかった。表1に示すように，これトが配向しているのが見られた（図1）。フィラメまで得られていた不溶性コネクチンとアミノ酸組

ントの太さは明らかでないが，アクチンフィラメ

成がほとんど同じであった。可溶性コネクテンは，ントより細いようである。これらは，筋残査中に

ふつうのオストワルト型粘度計で測ると，粘度はみられるフィラメント網目構造と同様である。しごく小さいが，低速皮勾配（0．0ls−1以下）では高たがって，可溶化コネクチンは細いフィラメント

い粘度を示した。このことは，細長いフィラメン

が本体であるといえよう。

トがからまりあい，外力でよういにこわれること

表1可溶性コネクチンのアミノ酸組成

可溶性コネクチン
粗標品

精製標品

塩不溶性コネクチン（SDS可溶化）

7

6

5

8

6

6

7

9

7

7

6

6

8

6

7

2

6

1

3

2
1

6

1

7

6

7

6

2

8

9

0

8

7

A

7

6

1

G

3

1

P

3

6

G

3

7

S

0

1

1

T

6

3

3

C

7

8

3

6

8

1

4

2

1

7

9

1

8

5

0

3

1

2

⊥

5

9

8

1

3

■

3

8

2

7

7

H

0

2

3

0

0

L

7

6

3

P

6

5

4

T

5

6

6

L

6

3

1

I

6

1

M

6

8

V

4

SPhrerlur︒1yla㌘：euyrhe誓柑rg

A

5

2

A
1

1000残基あたりの残基数

21可溶性コネクチン

129

図1可溶性コネクテンのファイバーの凍結レプリカ像

アクチンとの相互作用ことを示唆している。

F−アクチンにコネクテンを重量比で5−10％加えると，アクチンフィラメントをよりあっめる

考察

効果がみられた。0．1M KCl存在下では，アク本研究は，不溶性とみなされていたコネクテン

チンフィラメントの構造粘性を増加させた。しかが可溶化され，native stateで単離されること

し，α−アクチニンやフィラミンのようなゲル化を示した。おそらく，筋原線経にあって，ミオシ

効果ではなかった。流動複屈折を測定したところ，

ンフィラメントの両端部（A−Ⅰジャンクション）

速度勾配が10S￣1以下で，アクチンフィラメント

に密集しているコネクチンフィラメントの一部がの流れによる配向を促進した。したがって，消光機械的に取りだされたものと思われる。これらは角が減少し，複屈折度が増加した。1000S￣1ではミオシン抽出のさいにも可溶化するが，あとの単差がみられなかった。電子顕微鏡下でみると，フ離がこれまでできなかったものである。しかし，

ィラメントのからまりあいが強くなっていた。

濃縮すればコネクチンフィラメントは会合して塩20mM KClという低イオン強度になると，コネ

不溶性のファイバーを形成する。

クチン自体会合するが，同時にアクチンフィラメ

コネクテンフィラメントは，溶液内でアクチン

ントもよりあつまり，無定形の束が形成された。

フィラメントと弱い親和性をもつ。これは，細長これらの結果は，コネクチンフィラメントがアいフィラメント間の機械的なからまりあいではな

クチンフィラメントと弱い相互作用をもっている

いかと思われるが，塩濃度依存性からみて妥当で

Ⅴ 生化学130ある。すなわち0．2MKCl以上では相互作用はみられず，0．1MKClでは弱いからまりあい，0．02
MKClでは束形成がおこるからである。この弱い親和性は生体内の機能からも想像されることである。アクチンフィラメントはコネクチン・ネッ
ト間をスライドするからである。
コネクチンとミオシンとの相互作用は，次の研究テーマである。

文

献1）Natori，R．（1954）．ThepropertyandcontIaCtion
process

ofisolated

1，119−126．

myofibri1S・JikeikGiMed・J

2）Maruyama，K．，Matsubara，Sリ

Natori，R．，

Nonomura，Y．，Kimura，S．，Ohashi，K．，Handa，S．＆Eguchi，G．（1977）．Connection，anelasticproteinof muscle，ChaTaCterization and function．J．
月払dgmリ82，317−337．
3）Maruyama，KリKimura，S．，Kuwano，Y．＆Ohashi，K．（1981）．Connectin，anelasticproteinofmuscle．
Identificationoftitinwithconnectin．J．Biochem．，
89，701−709．
4）Maruyama，K．，Yamada，N．，Ikeya，H．＆Kinura，S．
（1983）．Connectin，Onem山iondaltonelasticpro−
tein，OfchickenbreastmusclewithaIeferenceto
dystrophic muscle．In Biomedicat Research qf
肋scuhzTLDstTOPhy（Ebashi，S．＆Ozawa，E．eds．），
pp．201−208，JapanSci．Soc．，Press，Tokyo．
5）Ishikawa，H．，Usukura，J．＆Yamada，E．（1981）．
Application ofcryomicrotomy to the freeze−etChreplica method for unfixedtissues．J，Etectron〟fcr0∫COの′，30，215．

131

22

骨格筋細いフィラメント上のトロポニンの局
在及びハイブリッドトロポニンの性質の検討

大 槻 磐 男
研究協力者

小野山

住

トロポニソートロボミオシンーアクチンのフィ
ラメント状複合体である横紋筋の細いフィラメン

道

山

本

和

彦

サギ骨格筋でも誕生の前後でフィラメント長の変化がおこることが見出されてい五三トの分子配置については以下の通りであることがここでは，前年度にひきつづいて貯化直後の正明らかにされている。すなわちアクチン分子が形

常及びジストロフィーチキン胸筋及び脚筋につい成する二重ラセン構造の二つの溝に沿って長さてフィラメント長の分布を追跡した。また，分子400Aのせんい状分子であるトロポミオシンが端機構についての手掛りを得ることを目的として，々状に配列し，トロポニンはトロポミオシン分子

骨格筋と心筋から調製したハイブリッドトロポニの一定部分に結合している。実際，免疫電子顕微ンの性質についても検討を行った。

鏡的にトロポニンが細いフィラメント全長にわたって，380A間隔に分布することが見出されてい方法る。細いフィラメント上での抗トロポニン結合部

筋ジストロフィーチキン（413）とコントロール

位は，ニワトリ骨格筋の場合についてみると常にチキン（412）の醇化後1週から5週までの胸筋と24個所であり，これは細いフィラメントが約1ミ

脚筋を使用した。抗トロポニン染色はサポニン法

クロンの一定の長さに揃っていることを示すものと解離フィラメント法によって行った。筋束を解である。形成途上にある細いフィラメントについ離溶液（0．1MKC止．10mMMgC且2．10mMK￣ては，筋原線経がきわめてこわれやすいこともあ

phosphate（pH7・0）．3mMATP，0・4mMEGTA）って観察が難しかったが，サポニン法によってこに浸し，サポニン1㌔針も色で10分間処理したのち，れが可能であることが示され，ニワトリ胚胸筋でやはり解離溶液に溶解した抗トロポニン抗体で処はトロポニン局在部位が25〜31と完成した細いフ

理し固定包埋した。包埋標本から超薄切片を作製

ィラメントより多いこと，つまり長い細いフィラし二重染色を施すか，解離フィラメントの場合にメントが形成されていることが判明した。醇化後はネガティブ染色を施して電子頗微鏡で観察した。

3週間程度で一定の長さに揃うこともわかった。

ハイブリッドトロポニンを用いた実験は次の通また筋ジストロフィーチキンを用いて検討したとりの方法で行った。ウサギ骨格筋，ブタ心筋からころ，僻化後5週を経てもなお，長いフィラメン

トロポニンを江橋の方法にしたがって調製したのトが観察され短縮化の過程が正常の場合に比ち吸着カラムで三成分に分離した。これらの三成

べて著しく遅れることも見出されている。またウ

分から8種のハイブリッドトロポニン投合体を作製し，各々についてブタ心筋脱感作アクトミオシ

九大医・臨床薬理

ンとウサギ骨格筋トロポミオシンを含む系でCa

Ⅴ 生化学132とSr感受性アクトミオシンATPase活性を測定

例だけではあるが中央のZ帯から一側に伸びるフした。

ィラメント上には抗トロポニン横縞が24個形成されているのに対して，他側では25本の横縞を形成

結果と

考察

する場合が観察され戎これはフィラメントの短細いフィラメント抗トロポニン染色については縮化が細胞単位あるいは筋原線経を単位としてお今回はZ帯から両側にのびるフィラメントの縞のこる過程ではなく，むしろ単一の細いフィラメン

数の相互関係に主力をおいて検討した。その結果，

ト束ないしは単一のサルコメア単位の過程である片側が未成熟型つまりトロボニン横縞の数が25まことを示唆している。この点に関しては現在観察たはそれ以上の場合には他側も殆んど横縞の数はを続行中である。脚筋では正常ジストロフィーと25以上であることがわかった。横縞の数は週を経もに第一週でも既に殆んどの細いフィラメントのるにつれて減る傾向がみられた。

抗トロポニン横縞が24本であることが見出された第3週のジストロフィーチキン胸筋で，まだ一（第1図）。

×13，000

第1図

22

骨格筋細いフィラメント上のトロポニン局在及びハイブリッドトロポニンの性質の検討

133

この細いフィラメントの短縮の機構については的な研究として，両筋のトロポニン三成分を組み現在の所なお明らかでないが，二つの説明が考え合わせたハイブリッドトロポニンを作製し収縮反られる。一つは実際に長いフィラメントが形成さ応に対する作用の差異について検討した（第1表，

れ先端部が何らかの過程で切断されて一定に揃う第2表）。先ずCa感受性についてみると，低Caことである。もう一つは，照化後に形成されるフ濃度ではいずれの場合もATPase活性は抑制されィラメントの長さが一定であるというものである。

ていた。高Ca濃度における活性化はすべ七の組

現在の所両者とも可能である。ただ，ある種のカ

み合わせについてみることができたものの，そのニの筋肉では同一細胞内でも種々の長さの太いフ程度は組み合わせによってかなり変動した。元のィラメントが存在しているが，細いフィラメント

組み合わせであるIcCcTcとIsCsTsに比べるとハイブリッドの活性化は総じて低かったが，長はこの場合太いフィラメント長と相関していることが見出されている。また，アクトミオシン糸を何回も収縮反応をくり返させるとアクチンの長IsCsTcの場合だけは50％も高値を示した0こ
れは超沈殿法により得られた従来の知見に一致しさが一様になることが見出されている。これらのていた。また，Ca親和性の指標である50％活性化

所見は，細いフィラメントの構造形成が収縮反応

Ca濃度はトロポニンⅠの種類に従って二つのグルと密接に関連していることを示しており，万一のープに分れる傾向を示した。
Sr感受性に対する影響については，Ca感受生

可能性を予想させるものである。
骨格筋と心筋のトロポニン三成分は色々な点での場合とかなり異る点のあることがわかった。Ca

差異のあることが知られている。今後，両筋の細の場合に高値を示したIsCsTcの組み合わせはいフィラメントの構造形成を分子的にさぐる基礎

元のトロポニンより低値を示した。また，IcCsTb，

第1蓑

ハイブリッドトロポニンのアクトミオシンATPase Ca感受性に対する影響

2十Ca concentration
at half maximum

ATPase activity（n mole Pi／min／／／hg）

Troponin
COmpOnent

activation（XlJ6MCa2＋）

ー5
1．0×10

2十M Ca（maximum）

2

4

2

8

2

1

2

5

2

2

5

5

2

5

1

4

1

0

6

1

1

1

7

1

1

5

4− 1

7

4

S

S

1

C

6

S

2

S

C

8

C

4．4

6

C

C

4

1

C

5．8

1

S

C

9．6

5

8

2

C

5

2

C

S

9．4

2＋
M Ca

（minimum）
1

3

S

2．8

9

2

C

S

5

2

2

C

6．2
3．2

3

S

S

5
9

3

S

C

S

61．0

−7
1．1×101

Ⅴ 生化学134

第2表

ハイブリッドトロポニンのアクトミオシンATPase Sr感受性に対する影響

2＋
Sr concentration

Troponin

ATPase activity at half maximum

COmpOnent（nmolePihin／hg） aC崇完sr，
3．6×1√4MS，2＋（maximum）

8．5×16−7MS㌔＋（minimum）

1
3

8

1

6

7

4

6

8

4

3

6

2

1

1

9

9

1

7

5

3

6

6

0

6

3

0

3

3

1

3

1

7

9

1

1

1

6

5

2

7

9

1

2

7

7

6

1

9

1

1

7

5

1

0

1

5

3

3

S

6

C

C

S

3

S

C

S

4

C

C

C

9

2

S

C

C

6

2

C

S

C

5

2

C

S

S

2

S

S

C

3

S

5

S

1

IcCsTcは元のトロポニンに比べてわずか50％のく予定である0

活性化を示すのみであり，Srによってうまく賦宿されないことを示している。また，50％活性化Sr
濃度はトロポニンCの由来によって二つに分けることができた。心筋トロポニンCを含むハイプリ

ッドの方がSr感受性が高いことがわかった。

文

献1）Ⅰ．OhtsukiandY．Onoyama．BiomedicatResearch

今後，トロポニンの構造と機能を中心として和O／〟〟∫蝕血′砂∫汁叩妙（Ebashi，S．andOzawa，E・eds）．pp．193−200（1983）．

いフィラメント形成の機構を分子的に追究してい2）K．Yam描10tO．JβわC加刑．，93，（4）inpreSS（1983）．

Ⅵ

プロ

テアーゼ

23．筋発生分化におけるプロテアーゼの役割

137

24．サル心筋Ca依存性中性プロテアーゼの性状と阻害物質の影響141

25．筋ジストロフィー・ハムスターにおけるリソゾームプロテアーゼ活性調節の異常

26．培養筋細胞における筋蛋白代謝

145

149

27．筋ジストロフィー患者の血性酵素にみられる2種類の動態

28．筋ジストロフィー症マウスに対する微生物
プロテアーゼ・インヒビター投与の影響

157

153

137

23 筋発生分化におけるプロテアーゼの役割

今 堀 和 友＊研究協力者 鈴 木 紘 一＊＊ 川 島 誠 一＊

は

じ

め

に

材料および方法

筋蛋白の代謝回転は筋の変性，再生といった発JL−CANPの精製の材料としてはウサギ骨格筋

生分化において重要な役割を果たしていると考えを用いた。精製の方法と結果とは表1に示す通りられる。代謝回転のうち分解に関しては，カルシ

であ震この方法の特徴は，m−CANP，〟−C

ウムで活性化される中性プロテアーゼ（CANP）

ANPおよび内在性インヒビターを分取精製できの役割が注目されるようになってきた。例えば，る点である。すなわちDEAEセルロース（DE52）

Salpeterらはアセチルコリンのアゴニストを筋細のカラムクロマトグラフィーで，〃−CANPとイ胞に投与した際みられる筋蛋白の分解がCANPに

ンヒビターとは低イオン強度で，m−CANPは高ょることを示している？その際CANPを活性化す

イオン強度で溶出される。ついでフェニルセフア

るのはアゴニストによるCa2十の流入である。

ロースカラムを用いると，インヒビターは素通り

他方CANPには，mM程度のCa2十で活性化さ画分に来るが，FL−CANPは0．3M NaClで始めれるm−CANPと，FeM程度のCa2＋で活性化さて溶出される。さらにDEAEセルロース（DE53）

れるp−CANPとがあるが，前記Ca2十の流入ににより共雑蛋白の大部分を除き，最後にフユニー

ょっても細胞内のCa2十濃度がmMに達するとは

ルセフアロースカラムから二重勾配〔NaCl（0．3M

思われないので，主役を演ずるのはJL−CANPで→0．OM），エチレングリコール（0→50％）〕であろうと思われる。

溶出することにより，Fe−CANPを単一に精製す

昨年度の報告において，m−CANPが自己消化ることに成功した。

によりFE−CANPに変換することを示した。今年
度は筋組織より直接Fi−CANPを抽出し精製する

実験結果ことに成功したので，これにつき報告する。区別

1）天然型jL−CANPの性質を明らかにするため，m−CANPの自己消化によ

このようにして得られたウサギ骨格筋のm−Cり得られたものを誘導型p−CANP，筋組織より

ANPおよびJL−CANP活性のCa2＋依存性を図

直接精製したものを天然型〟−CANPと呼ぶこと1に示す。最大活性の半分を示すに必要なC㌃濃にする。以下には，誘導型および天然型〟−CA

度（Ka）はpLCANPでは約40FEMであり，m−NPの異同ならびにこれらとm−CANPとの関係

CANPのKa（700JLM）の／である。この値は，についても論ずることとする。

誘導型〟一CAN責）ぉよびブタ骨格筋の天然型〃−
cAN〆b）Ka値にはぼ一致する。

＊東京都老人総合研究所＊＊東京大学医学部第二生化学教室

次にSDS存在下および非存在下でのポリアク
リルアミド電気泳動の結果を図2に示す。まずSⅥ プロテアーゼ

138

去1Jl−CANPの精製（5Kg）段

階総 蛋 白畠
（
mg）

総 括 性
（
単位）

比 活 性
（
単位／m g ）2 6 7，
500

−

−

粗抽 出液
D E A E セルロース（
D E −52 ）

4，
820

−

−

フユニルセフアロース

1 93

1，
377

7．
1

D E A E セルロース（
D E −5 3 ）

2 8．
5

1，
9 16

6 7．
2

2．
7

436

16 1．
5

フユニルセフアロース

2十Effect of Ci▼0n the Activity of〃CAIや

aTd mCANP0000︵ざ︶ hl三一U巾 聖篭−む∝

0・5

18

15

6（）

Concentration of C3＋（rnM）

図1P−CANP（●）およびm−CANP（▲）癌性のCF依存性

DS非存在下での電気泳動では，天然型FE−CAN

80K，30Kのサブユニットからなるが，80Kサ

Pはm−CANPより移動皮が小さいので，前者はブユニットはJL−CANPの方がm−CANPのもの

後者より塩基性が強いことが示される。このこと

より大きいことを示している。2種のCANP

はDEAEセルロースからの溶出の結果と一致する。

共泳動させた結果はこのことを明らかに証明して誘導型JL−CANPも，m−CANPより塩基性が強いる。さらにこの事実は，天然型〟−CANPは誘

く，これまでの結果は天然型および誘導型〟−C

導型のものとは異なり，m−CANPの自己消化に

ANPの性質が類似していることを示している。

よるものでないことを示した点で重要である。

しかしながらSDS存在下でのゲル電気泳動の結果は，天然型FL−CANPはm−CANPと同様，

2）Mn2＋によるm−CANPの活性化
このように天然型p−CANPの存在が明らかに

23 筋発生分化におけるプロテアーゼの役割

139

El∝tr叩hyetk鮎血咽日加nlS Ot mW ald mW

in tk恥me Or AbPlte Ot SDS
ーSDS

●SDS

7．5％

15％
．：．ヽJ・・・ミ■・■

一一‥−■・＝＝■ 一■− ■■−■
■−
■

■■●

▼

■

￣

−

p

m

−

〃
m
さt

図2

−

〃

m

〃

〃一m

m

JJ

m

8t

m−CANP，P−CANPのポリアクリルアミド電気泳動
左より第1，第2列は−SDS，第3列，第6列はマーカー，
3〜5列は15％，6〜9列は7．5％ゲル，9列は〟とmとの共泳動⊂losed form

Openform
十⊂02−レ叫rCANP

図3

AClive form

m−CANP活性化機構の模式図

Ⅵ

140

プロテアーゼなると，m−CANPの生理学的意義はますます疑ca2＋感受性が上昇することもよく理解される。

問視されるようになる。しかしながら注目すべき

さらには自己消化により，活性部位を掩う部分がことは，m−CANPのMn2＋による活性化である。

除去されたとすれば，当然〟M程度のCa2十で活Mn2＋はそれ自体ではm−CANPもp−CANPも性化されるようになる。これが誘導型Fl−CANP

活性化する作用はもたず，その濃度を20mM程である。

度まで上げても活性はみられない。ところが，2

最後に天然型Fe−CANPであるが，次のように

mMMn2＋の存在下で，m−CANP活性のCa2＋

想像することもできる。すなわち部位1に何等か依存性をしらべてみると，図1のP−CANPのもの化学修飾が起こり，この修飾が部位1に対するのとはぼ同一の曲線を与えるのである？勿論2m

ca2＋またはMn2十の結合と同じ効果をもたらせ

MMn汁というのは非生理学的濃度ではあるが，ば，やはり〟M程度のCa打で活性化されること

Mrf＋と同様にm−CANPのCa2＋感受性を上げになる。これは天然型JL−CANPがm−CANPよる因子が細胞内に存在する可能性はあるであろう。

り分子量が大きいという事実とも一致する。しかそのような因子の同定もCANPの生理作用を明らしながらこれはあくまで想像の域を脱せず，今後かにする上で重要なことである。

の研究にまつ他ない。
CANPの研究はごく最近世界中で多くの研究者

考察が手をつけるようになった。m−CANPとJL−C

図1に示したm−CANP活性のCa2＋依存性がANPとの関係や，CANPの生理学的活性化機構等

S字型を示すことは，m−CANPの活性発現にはが解明される日もそう遠くはないように思われる。

複数個のCa2十が協同的に作用することを示唆し筋の発生分化との関連はその後で明らかにされるている。これを模式的に示したのが図3である。

ものであろう。

m−CANPにはCa2＋結合部位が2個あり，部位
1（外側）と部位2（内側）のKaがmM，JLMであったとする。しかし，図から明らかなように，部位1にCa2＋が結合してコンホーメーション変化が起きない限り，部位2にはCa2＋の結合が起らない。逆にいえば，部位1にCa2十が結合するや
否や，部位2への結合も起こる。これが協同現象である。一方，部位1に結合するCa2十の作用はMn2十で代用できるが，部位2にはMn2十は結合しないと考えれば，Mn2十の添加でm−CANPの文

献1）Salpeter，M・M・，LeonardJ．P．md KaspfZak，H．，〟e〟′0∫Cね〃CeCbmme〃ね′如，1，73−83（1982）．
2）Inomata，M．，Hayashi，M．，Nakamura，M．，Imahori，K・・andKawash血a，S・Jβわdem．，93，29ト293（1983）．

3）Suzuki，K．，Ts可i，S．，Kubota，S．，Kimura，Y．，and
Imahori，Ⅹ・エβわC加mり90，275−278（1981）．
4）Dayton，W．R．，Schoumeyer，J．V．Lepley，R．A．
and Cortes，LI R・Btochim．Biophys．Acta．659，
48・61（1981）．
5）Suzuki，K・andTsuji，S．，FEBSLetter，140，16・18（1982）．

141

24

サル心筋Ca依存性中性プロテアーゼの性状と阻害物質の影響

高

橋

健

研究協力者 原テ台＊

薫＊ 市 原 慶 和＊

最近，筋組織に依存するCa依存性中性プロテに通す。0．22MNaCl附近で溶出する宿性分画ァーゼ（以下CANPと省略）liと関する研究が進み，を集め，さらに，♪−アミノフェニルメルクリ酢

筋組織の病態との関連が推定されて来ている。C

酸をプロムシアン活性化セファロース4Bに結合

ANPの生理的役割や病態との関係を追究する上させたアフィニティーカラム（1．0×5．6cm）にで，CANP自身の精製ならびに諸性質の検索が基吸着させる。20〜40mM2−メルカプトエタノ

本的に重要である。骨格筋CANPについてはすでールで溶出される分画を集め，さらにセファデッに，種々の動物からの精製と性質の解明が進めら

クスG−150カラム（1．3×90cm）を通し，活性れ，活性発現にmMオーダーのCaイオン濃度を必要とするものと，〟MオーダーのCaイオン濃

酵素活性の測定−T。y。．。kaとMasakiの方窟）度で活性を示すものとの2種が存在することが知を若干改変して用いた。すなわち，アルカリ変性

られてきている。しかし，骨格筋にくらペて，心カゼイン（0．5％溶液，pH7．5）を基質として，筋に関するこの種の研究はまだ大変遅れている。

10mM2−メルカプトエタノール，5mMCaC12本研究では，サル心筋よりCANPを精製し，その存在下で，25℃，60分間酵素と反応させ，過塩素

諸性質を究明するとともに，種々の低分子量阻害

酸可溶性上宿の280nmにおける吸光度の増加を剤の影響を比較検索し震3）測定した。他の蛋白基質に対する活性もこれに準じた方法で測定した。

実験材料および方法
CANPの精製一二ホンザル心筋500gを4倍

実験結果

容量の20mMTris−HCl（pH7．5）一1mM ED
m中でホモジナイズし，上宿をpH4．7に調整し，

表1にC皐NPの精製の結果を示した。この方法
によりpH処理のステップから，見かけ上約1駁）倍

1夜放置する。沈澱を集め．20mMltis−HClに精製された標品が得られた。精製標品はセファ（pH7．5）−0．1MNaC卜1mMEIm−5mM2一デックスG−150カラムを用いる方法で，分子量メルカプトエタノールに溶かし，DE−32セルロ

が約110，000と算出された。ポリアクリルアミド

ースカラム（3×36cm）にかけて分別する。0．25

電気泳動では近接する2本のバンドに分離し，いMNaClで溶出される分画を集め，セファロース

ずれも活性を示した。SDS存在下では，さらに一CL−6Bカラム（1．6×104cm）を通し，宿性分

方は分子量74000と28，000のバンドに，また他画をさらにDEAE−セファセルカラム（1．3×30cm）

方は分子量74，000と26，000のバンドに分かれた。

＊京都大学霊長類研究所生化学研究部門

この結果は，両者とも2個のサブユニットから構Ⅵプロテアーゼ142

表1

サル心筋CANPの精製

26，500

pH処理

70

976

DE−32

180

91．0

セファロースCL−6B

18

13．7

DEAE−セファセル

40

6．7

有機水銀セファロース4B

12

1．6

4
6
1

2，290

8
4
2

粗抽出液

全 活 性
比 活 性
（単位） （単位／mg）

0
8
2

全蛋白量
（mg）

4
1
5

容 量
（mL）

6
5

ステ ッ プ

出発試料：500g
蓑2

CANP活性に対する種々の阻害剤の影響
酵素と阻害剤は活性測定前に25℃で15分間インキュベートした。

阻 害 剤

濃度（mM）

p一クロルメルクリフェニル
スルホン酸

1

TLCK

1

TPCK

1

阻害度（％）

EDTA
DFP

ヨード酢酸

1

キモスタチン

0．16

アンチノヾイン0．16

ロイペプチン

0．21

E−64

0．28

NP−176（・R，R）a

0．19

NC0−700

0．18

大豆トリプシン
インヒビター

0．005〔

8随00C・㌔とゝ。ヂ
ヽH＿

0−Leu−N N
」

′

〔

b

㌔△♂

H5C200C−H

0−bu−N■＼≡：窯33：N−CH2

J

24．サル心筋Ca依存性中性プロテアーゼの性状と阻害物質の影響

143

成されることを示している。両CANP典比活性は30，000，89，000および110，000の分解産物の生同じであり，以後の実験には両者を分離せずに用成が認められ，また分子量54，000，41，000およいた。カゼイン基質に対する最適pHは約8．0で

び28，000の筋蛋白成分の分解がみられた。これら

あり，活性発現には還元剤が必要である。10mMの分解はEDTAやNP−176（R，R）等により阻害

2一メルカプトエタノール存在下での活性を100とされた。なおCANPを4mMC指在下にインキ

した場合，天然の還元剤である還元型グルタチオ

ュベートすると．0．2mMCa2十で活性を示す分

ンでは1mMで34％，10mMで111％，またシ子種の出現が認められた。

ステインでは1mMで77％，10mMで152％の活性を示した。表2には，種々の阻害剤の効果を考察示してある。活性はEDTA，ヨード酢酸，キモス

以上の結果から明らかなように，本研究で精製

タチン，アンチパイン，ロイペプチン，またエポされたCANPはmMオーダーのCa2＋を必要とキシコハク酸誘導体であるE−64やNP−176（R，するいわゆるm−CANPである。

R）等によって強く阻害された。表3には，エポのCa2＋で活性化されるLE−CANPは，自己消化キシコハク酸の各種誘導体の阻害効果を示してあでも生ずることが示されたが，天然のJL−CANPる。この結果は，エポキシコハク酸がトランス型の存在は検知できなかった。これは，おそらく天であることと，その2個のカルポキシル基の一方然のJL−CANPが存在塁が少ない上に，内在性のが遊離カルポキシル基であること（Rl＝OH）が阻害剤と結合して存在するためであろうと思われ必須であることを示している。また，他方のカルる。m−CANPは，精製の初段階に活性が検知でLLMオーダー

ポキシル基側にL型の疎水性アミノ酸が存在するきなかったり，あるいは低いことから，天然の阻ことが阻害活性の増強に重要である。これらの誘害剤と結合して存在することは明らかである。実導体によるCANPの阻害効果は∴同じSHプロテ際，この阻害剤はDEAE−セルロースカラムからアーゼであるパパインのそれにくらべて20〜1500

CANPの溶出位置（0．25MNaCl）より前，1．2

倍弱く，阻害の濃度依存性等にも若干差異があり，

MNaCl濃度で溶出された。本研究で得られた2阻害様式が両者で多少異なることが示唆された。

種のm−CANPについては両者とも本来から存在

CANPのCaイオン要求性は極めて高く．それ以外するものなのか，あるいは⊥方は他方の自己消化の金属イオンではSr，Mn，Niの存在下で若干産物であるのか，いずれの可能性もあり，今後のの活性が認められたのみである。一万，0．4mM問題として残されている。分子量約7万と3万のca2＋存在下（この濃度では活性はない）に，2mM

サブユニットからなるという結果は，哺乳動物ののSrまたはMnイオンを加えると5mMCg＋存骨格筋CANPの場合と類似している。また，活性在下での活性の約50％程度の活性があらわれた。

のpH依存性，阻害剤の効果，金属イオンの影響

これは両金属イオンが協同的に作用していることと協同効果，自己消化によるFL−CANP活性の出を示唆している。

現なども，微妙な差異はあるが，大まかにみて骨種々の蛋白質に対する作用を調べたところ，カ格筋CANPの場合と非常に似ているといえよう。

ゼインはよく分解するが，血清アルブミン，オバ

したがってまた，サルに最も近いヒトの心筋CA

ルブミン，フイブリノーゲン，ヘモグロビンにはNPもサル心筋CANPと非常に類似した性質を有ほとんど作用せず，また筋肉蛋白質では，トロポするものと予想される。サル心筋CANPについて

ミオシン，トロポニン，ミオシンH鎖に作用するは当面FE−CANPの精製と同定，またこれらCAがミオシンL鎖には作用しないことが知られた。

NPの天然の阻害剤の検索，同定などの問題が残サル心筋ミオフイブリルに作用させると，分子量っており，また心筋CANP全体から見ると，今後

Ⅵ

144

蓑3

RlOC
RI

プロテアーゼCANP活性に対する種々のエポキシコハク酸誘導体の阻害度∠ゝcoR2R2

ID50（〟M）
8
1

Leu−Leu−OEt

93

LeuJ寸H2
4
8

Leu−OEt

8
8

Leu−Leu−Leu−OEt

5
1

Val−N−Et

7
1

Tyr−OEt

4
3

Leu−OK

9
3

D−Leu−OEt

0
0
0
0
1 3
2 4
1

OEt
β一山a−OEt

Leu−OEt

＞

0
0
0
2
0 0
4
1
6
1
2

Leu−OK

Leu−OKや心筋梗塞などの疾患との関連の解明が特に重要
である。

文

献

1）今堀和友：Ca依存性プロテアーゼと生体制御，蛋
白質核酸酵素，25，483−489．1980．
2）Hara，K．，Ichihara，Y．，andTakahashi，K・：Purifica−

0
0
6
1

その生理的意義の究明，また筋ジストロフィー症＞

Leu−OEt（Cfg）

＞

OH

0
0
00
3

OEt

tion and Characterization ofa Calcium−ActivatedNeutralProtease fiom Monkey CaLdiac Muscle，
エβfoc鮎川．，93，1983，inpIeSS．
3）Hara，K．，andTakal1aShi，K．：Inhibitionofcalcium−
activated neutral protease of monkey ca∫diacmusclebyepoxysuccinicacidderivatives，BLomed．
凡舘，4，121・124，1983．
4）Toy0−Oka，T．，and Masaki，T．：Calcium−aCtiYated
NeutralProtease from BovineVentricularMuscle：
Isolation and Some oflts Properties，J．Mol．
αmCbdわL11，769・786，1979．

145

25

筋ジストロフィー・ハムスターにおけるリソゾームプロテアーゼ活性調節の異常
勝 沼 信 彦＊研究協力者 木 南 英 紀＊

は

じ

め

に

テプシン及びTPI活性測定の材料とした。筋細胞

骨格筋の平均的なタンパク分解の速度は肝，腎分画は以下のように行った。ジストロフィーハムなどの臓器と比べると極めて遅く，その一因は細スターのひらめ筋を5倍量の上記バッファー中で胞内タンパク質分解系としてのリソゾームが少な

Polytronホモゲナイザーを用い，Maxspeedの80

く，従ってリソゾーム・カテプシン類の活性が極％，5秒ホモゲナイズし，800×g，5分の遠心

めて低いことにあると思われる。昨年度はこのリを行った。沈澱分画を同バッファーで洗候遠心を

ソゾームのチオール性カテプシンに群特異的に作くり返し，沈澱分画をMyotibrillar分画とし，併用する内在性インヒビター（TPI）の諸性質についせた上宿は15，000×g，20分遠心し，沈澱分画をて報告すると共に，ジストロフィーハムスター骨

ミトコンドリアーリソゾーム分画，上活をリソゾ格筋におけるチオール性カテプシンの活性増加とーム後上宿分画とした。カテプシンB＆LはSuc−

インヒビターの増加について報告した。今回はジ

Tyr−Met−PNAを用いて，カテプシンCはGly−

ストロフィーハムスターでのカテプシンとTPI活

Arg−PNAを用いて．B。，r。ttの方巌測定した。

性の変動の詳細を述べ，筋ジストロフィーハムス

βTglucuronidaseはp−nitropheny1−6で1ucuro−

ターにおけるリソゾームプロテアーゼの活性調節

nid。を用いてK。ld。V。kyらの加鎧周フオスフの異常を考察する。

ァターゼはIg。raShiらの方連星測定した。TPIは
ラット肝より精製したカテプシンHに対する阻害材料 と 方法

で測定し漂ジストロフィーハムスター（BIO14．6系）及び対照動物としてのFIBは18週令のものを使用した。

結果

骨格筋，心筋，平滑筋はPol舛ronを用いて，5倍ジストロフィー症におけるTPIの測定に先立ち，量の0．1mMEDTA，20mMKCl，10mMIもpes

筋粗抽出液を用いての測定法の検討を行った。骨pH7．5を含む0．25Msucroseでホモゲナイズし，格筋，心筋などの臓器ではリソゾームを破壊せず

12000×g，20分遠心し，上宿をTPIの測定に，に上宿分画を調製することは極めて困難であり，

沈澱は元と同量のバッファーにけん淘後，もう一ホモゲナイズ中に上宿に存在するTPIとリソゾー

皮ホモゲナイズし，リソゾーム水解酵素の測定にム中のカテプシンが結合する可能性が高い。そこ供した。肝及び脳はPotterTEIvehjeim型ホモゲ

でTPIが熱処理に耐性であり，pH3．0以下ではナイザーでホモゲナイズ後，ミトコンドリアーリ

TPIとカテプシン複合物が解離しやすい性質を利

ソゾーム分画及び上宿分画を調製し，それぞれカ

用して，筋ホモジネ⊥ト上宿分画をpH2．5，各＊徳島大学医学部酵素研・酵素化学

種温度で1分熟処理してTPIの活性を測定した。

146

Ⅵ

プロテアーゼ図1に示す如く，pH2．5での熱処理にはTPIはカテプシンB＆Lの特異的な上昇とはいえない。

安定であり，以下の実験では8げ，1分の熱処理

そこで，骨格筋の細胞分画を行い，実際にリソゾを行った。熱処理なし，あるいは500以下の熱処

ーム分画の活性が増えているかを検討した。骨格

理では，カテプシン活性が残存しており，TPIを筋の細胞分画は極めて難しく，確立した方法はな

定量的に測定することは難しい。そこで，筋ジスが．敢えて方法の項に記載した如く分画を行った。

トロフィー・ハムスター18週令のひらめ筋（赤筋），（表3）リソゾームの標識酵素β−グルクロニダー

長指伸筋（白筋），横隔膜，心筋，食道平滑筋，空ゼは今回の分画法では全ての分画に活性の分布が腸平滑筋，肝及び脳におけるカテプシンB＆Lと認められるが，比活性でみるとミトコンドリアー

TPIの活性を測定した。（表1）昨年度の報告のリソゾーム（ML）分画が圧倒的に高い。ジストロ

ように骨格筋ではどの筋においても，カテプシンフィー症でみられるβ一ダルクロニダーゼの活性活性の上昇が認められる。赤筋の方が白筋より上上昇は活性分布のパターンに変化なく，ML分画昇率が高いようにみられるが，他の筋についても

ではその活性上昇に相応して比活性の上昇が認め検討する必要があると思われる。TPlの測定法のられる。この結果はジストロフィー症ではリソゾ

笹立により，TPIもカテプシン活性と平行して増ームの数あるいは量が増えていることを示唆してえていることが確認された。食道平滑筋と空腸平いる。しかし，骨格筋中のリソゾームの数が増え

滑筋ではカテプシン活性で著しい差がみられ，空るとすれば，骨格筋中の各種リソゾームの酵素活

腸の方が圧倒的に高い。空腸では真にSvc一骨r−性が平行して増えねばならないが，そうではない。

Met−PNAがカテプシンBとLだけを測定してい（表2）従って，外来性のリソゾームが増えたと考るかどうか検討してみる必要がある。食道平滑筋

えられる。

がなぜTPIが高いのか現在のところ意味は不明である。平滑筋では食道のカテプシンがジストロフ

考察

ィーでやや上昇しているが，空腸では変化がなく，我々の教室ではカテプシンB及びHの構造に関

TPIはどちらの組織でも上昇していない。心筋はする研究を進め，その全一次構造を千谷，滝尾ら

ジストロフィーハムスターでは骨格筋と並んで障の共同研究で決定してい震又，その内在任イン

害を受ける組織であり，事実，カテプシン，TPI

ヒビターの詳しい性格づけも行ったポ）最近このとも有意の活性上昇が認められるが，骨格筋ほど

TPIは酸化型と還元型があり，前者は不活性，後

著明ではない。脳ではカテプシン，TPI両活性と者が活性型であることが明らかになってきた。ジも正常とジストロフィー症に全く差はない。肝臓

ストロフィー骨格筋にみられるTPIの上昇ゐ機作

では約2倍のカテプシン活性の上昇がある。単一及びTPIのin vivoの役割りはまだわからないが，細胞でカテプシン活性の上昇がみられるかどうか

ジストロフィー筋内のGSH，GSSG，バランスのを調べるため，フイコールパックを用いてリンパ変化もTPIの活性型の塁を知る上で重要となって球を集め，カテプシン活性を測定したが，正常，きた。ジストロフィー症におけるカテプシン活性ジストロフィー症間には差が認められなかった。

の上昇は骨格筋で最も強く，もう一つの障害部でジストロフィー症骨格筋におけるカテプシン活である心筋では著明でない。TPIの変動もほぼカ

・性の上昇がリソゾームの数の増加に基づくものか，

テプシン活性と平行している。骨格筋のカテプシ

それ．ともカテプシン活性のみの上昇かを調べるた

ン活性の上昇は筋内のリソゾームの増加というよめ，各種のリソゾーム酵素活性を測定した。表2

りも，外来性のたとえば．強いカテプシン活性をに示す如く，ジストロフィー症で活性の上昇するもつマクロファージのリソゾームに由来すること

ものとほとんど上昇しない酵素に分けられるが，が示唆された。（蓑2．3）従って，ジストロフイ

25筋ジストロフィー・ハムスターにおけるリソゾームプロテアーゼ活性調節の異常The

centrifugedsupernatant

at12∫000xg■

20min

of

the

homogenate of soleus muscle from dystrophic hamster washeated at theindicated temperature forl min・After thecentrifugation and adjusting pH

7，TPI was determined・Fig・1・Heat Stability of TPI・

Tablel．Activities of Cathepsin B G L and ThioI Proteinase
Inhibitorin Various Tissues of Normal（FIB）and
I）ystrophic Hamster

TissueCathepsin

B

G

L

TPI

mU／g tissue mU／g tissue
Soleus M．

40．9±6108±40132±14341±72

Ext．Dig．Long．M．

58．8

101

123

205

Diaphrag．H．

34．5

81．1

130

467

Esophagus M．

16．5

30．6

754

826

Jejunum M．

416±41438±35279±20269±13Heart233±17289±101

182±6

236±8

Lung

548±901072±202426±19414±13

Brain

252±18253±23234±14238±10

147

Ⅵ

148

Table

プロテアーゼ2．Activities of Lysosomal Hydrolases and TPIin

Biceps Femoris Muscle and Myocardium of Dystrophic Hamsters

BicepsFemoris

Myocardium

Enzymes
NormalDystrophy

NormalDystrophy

mU／g tissue
Cathepsin B

8

L

540土6．8

Cathepsin C

274±34β−Glucuronidase

9．1±4．2

Acid phosphatase
TpI

97．6±30．2

233±17289±101504±37976±911620±38049±9．9758±68743±601510±1101490±120144±39539±57

182±6

236±8

N芸10

Table

3．

Subcellular Distribution of

8−Glucuronidasein

Soleus Muscle of Normal and Dystrophic Hamsters

NormalFraction

Dystrophy

Total Specific Total Specificactivity activity activity activity
mU

亀

mU／mg

mU

宅

mU／mg

Homogenate

51．0（100）0．11

152（100）

0．31

Myofibrillar

24．5（48）

0．087

78（51）

0．26

日い

3．64（14）0．70

20（13）

2．11

PS…

19．4（38）0．14

54（35）

0．37＊＊＊

Mitochondria1−1ysosomalー症における筋タンパクの崩壊がリソゾームのチ
オール性カテプシンの活性増加と密切な関係があるとしても，発症の初期過程への関与はなく，症状の進展過程への関与と考えるべきだろう。

文

献1）Ba∫rett，A．J．：d〝正βfoc加刑．，47：280，1971．
2）Koldovsky，0．＆Pdmied，M．：βわdem．ん125：697．1971．

fraction

Postmitochondria1−1ysosomal

supernatantb3）IgafaShi，H・＆Hollander，V．P：⊥βわ止（e印リ
243：6084，1968．
4）Kominami，E・，Wakamatsu，N．＆Katunuma，N．：
βわd加桝．βi叩妙見Rg且Cbm椚〟乱．99：568，1981．

5）Takio，K・，Towatari，T．，Xominami，E．，
Wakamatsu，N．，Katunuma，N．＆Titani，K．：In
丹oJeかα∫e 九九鋸わ和一肋d血J d〃d βわわが。
Aspects（edited by Umezawa，H．，HoIzer，H．＆Katunuma，N・），SpringerNerlag，Heiderberg，inpress，1983．
6）Kominami，E．，Wakamatsu，N．，＆Katunuma，N．：
エβわとC乃e取り1．4648，1982．

1・49

26 培養筋細胞における筋蛋白代謝

杉 田 秀 夫＊
研究協力者 石 浦 章 一＊

目

いた後，一定時間培養を続け，外液0．8m且に25

的骨格筋の蛋白代謝の詳細な機構を知る目的で，％PCAO．2mLを加えて4℃1時間放置した後，ニワトリ胚より単離した筋細胞の蛋白合成，並び

3000rpm5分間遠心し上活のpHを中性にあわに分解を測定した。また，種々のプロテアーゼ阻せた後，カウントを測定した。実験終了後，PCA害剤の効果もあわせて測定した。

にて全蛋白を沈澱させ残存放射活性を測定した後，次式にて分解量を計算し％表示した。

材料および方法

外液に流出した総カウント（11培養方法

分解量（％）≡

ニワトリ12日胚から胸筋をとり出し，江橋，小残存カウント＋外液に流出した
総カウント

浜の方法で6日間培養し定条件は，80％Eagl。′s

B法は，感度の点ではA法に劣るが，特定の蛋

Minimum Essential Medium（MEM），馬血清

白質の挙動が測定できるため，一便法だと考えら

10％，ニワトリ胚抽出物10％で培養を始め，2れる。実験終了後，Guba−Straub溶液，10mMA

日目からMEM80％，馬血清15％，胚抽出物5TP，10mMMg溶液を細胞に加え，4℃2時間％に切りかえた。このような培養条件（37℃，5抽出することによって粗アクトミオシン分画を得％CO2−95％air）では，筋芽細胞は3日日頃からた。塩濃度を下げ，蛋白を沈澱させた後，SDS電

fuse Lはじめ，6日目には太い筋菅細胞で皿がお気泳動を行い，ミオシンH鎖とアクチンの部分をおわれるまでになった。

切りとり，25％ピリジン抽出でCBB一タンパク員（2）蛋白代謝の測定を定量し，H202にて溶解させ放射活性を測定した。

培養7日目に1FeCi／mLの3H−Leuを加え，24

誤差を最小限にする目的で，同一サンプルの塁を

時間培養を続けることによって蛋白質を標識した。

変化させて泳動し少なくとも5回の平均をとってこの時点でのPCA不溶性カウントを合成量と仮1点とした。また，個々のゲルの蛋白量は，同一定した。次いで，培養液を除き，10mgのMEM

ゲル内の標準蛋白量から逆算した。

で3回洗條して過剰のH−Leuを除いたKO．1％）
後，1晩培養を続け，標識された（遊離）アミノ酸

結果 と 考 察の外液への遊離（A），並びに蛋白にとりこまれ（lI A法による，システィンプロテアーゼインヒ

た標識アミノ酸の減少（B）の2つを指標に蛋白ビター，E−64−C，の蛋白代謝に及ぼす効果の質の分解塁を計算した。

判定

A法はより感度の高い方法で，

H−Leuを除＊国立武蔵療養所神経センター 疾病研究第一部

E−64−Cは細胞内の代表的なエンドプロテアーゼであるカテプシンB．L及びCa依存性プロⅥ

プロテアーゼuO；QP巴mOPが

0

3

10

30

E64C（pg／ml）
図1 E−64−Cの蛋白分解に及ぼす影響
縦軸は前処理（24時臥lpCi／m13H−Leu）にて合成された蛋白質の，次の24時間における分解量（％）を表す。

テアーゼを不可逆的に阻害することが知られていず，阻害の程度が低いことから次のことが考えらる。我々は，培養外液にE−64−Cを添加し，24れる。HE−64−Cは細胞内のどこかに濃縮され時間の培養における蛋白分解の阻害の程度を調べ

プロテアーゼを阻害していない。（2）システインプ

た。図1はE−64−Cの濃度依存性を見たものでロテアーゼは細胞内蛋白質の代謝に関与していなある。縦軸は24時間の問に標識された蛋白質（PCい。ほ）A法で見ているのは，24時間の問に標識さA不溶性のもの）に対する次の24時間での分解量れたいわばshort−1ivedproteinであるから，こ（％表示）を示したもので，E−64−Cの濃度を上

れらの分解についてはシステインプロテアーゼはげると明らかに分解量が低下していくのがわかる。

関与しない。などが考えられる。

外液に遊離する放射活性はその大部分がPCA可溶（2I B法によるE−64rcの蛋白代謝に及ぼす効性分画に回収され，薄層クロマトグラフィーで遊果の判定

離ロイシンであることから，ロイシンの生体内でB法（図2）は，蛋白にとり込まれた放射活性がの代謝はあまり行われていないようであった。

いつまで残存しているかを判定する方法で，縦軸はまた，H−E−64−Cを使った実験により，24

比活性（arbitraryunit）である。槙軸はSDSケル

時間の培養では外液の40％が細胞内にとり込まれを2mmの等間隔に切ったもので．sliceNnlがミオることが明らかになっナ￡これらの結果はE−64−

シンH鎖（分子量20万），SliceNu9がアクチン（分子Cがプロテアーゼの氾（〜2〟M）3）より十分に細量4．3万）である。実線は阻害剤を添加しない場合

胞内にとり込まれていることを示している（特にの実験で，一見分解量と分子量の問には既報のどと10／唱／mヱ以上の添加の場合）。にもかかわらくの関係は見られない。分子量が極端に大きいと分26．培養筋細胞における筋蛋白代謝151

・一・10E−OE
一一一3E

9elSlice
図2E−64−Cの粗アクトミオシン分解に及ぼす影響
E−64−C（E）の濃度はpg／ml。

uO；qP巴mOPボ

0

駁O L2

L20

図3 ペスタチン（B），ロイペプチン（L）の蛋白分解に及ぼす影響
縦軸は図1と同じ，濃度は〝g／ml。

152

Ⅵ

プロテアーゼ解が速い傾向はあるようである。E−64−C3J甘h且，

アミノペプチダーゼ抑制の効果はこの方法では見10／上g／mヱ外液に添加したときの図もあわせてられない可能性もあり，今後検討の余地がある。

示した。分子量が20万付近の蛋白質の分解を阻害

一方，ロイペプチンは明らかに20／唱／h上 で剤が抑制しているように見えるが，有意差はなか

蛋白分解を抑制した。しかし抑制量は培養肝細胞った。その理由として考えられるのは前述した感で報告されているものよりも低くミ）筋膜の薬剤透度の問題で，B法の分母が，A法のような標識さ過性，ロイペプテンの細胞内濃縮機構の差など，れた総蛋白量ではなく，未標識のものも含む全蛋

筋と肝臓ではかなり性質に違いがあるためであろ白畠であるため，差が出にくいものと思われる。

うと考えられた。

ほ）その他のプロテアーゼインヒビターの効果の判定
次にアミノペプチダーゼB棟酵素の阻害物質であるベスタチンと，セリン・システインプロテアーゼ阻害剤であるロイペプチンの効果をA法で検索し王さ
まずベスタテン（図3参照）であるが，本法では20／ g／m上の添加では有意な分解抑制は見られなかった。方法として，PCA可溶性分画を見ているため，短いペプチドはPCA上宿に来ることから，

文

献1）江橋節郎，小浜一弘，白尾智明，三谷昌平：微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究報告書，昭和55年度，pp．82−92，1981．
2）石浦章一，山下茂，小浜一弘，杉田秀夫，江橋節郎：同上昭和56年度報告書，pp．91−95，1982．
3）Ishiura，S，，Hanada，K．，Tamai，M．，Kashiwagi，K．
indSugita，H．：J．Biochem．，90，1557−1560，1981．
4）梅沢浜夫編：微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプチン）の開発研究，昭和56年度相
月二∃巨5）Seglen，P．0．，Grinde，B．andSouleim，A．E．：nL几Jβわdem．，95，215−225，1974．

153

27 筋ジストロフィー患者の血性酵素にみられる2種類の動態青 柳 高 明＊
研究協力者 和 田 孝 雄＊ 三吉野 産 治＊＊緒言に測定法は既に報告した通りであ震 6）筋ジストロフィーマウスおよびニワトリの筋肉

患者は病状の進行に応じて3群に分けた。すなを含む各職器内の酵素活性の変動を調べ，従来注

わち，第1度は歩行可能な9名，第2度は車椅子目されていたエンドペプチダーゼの異常のみでなを利用している10名，第3度はベッド臥床の5名

く，アミノペプチダーゼ，グリコシダーゼ，フオである。

スファクーゼ，エステラーゼなどの異常も関与し結果および考察ていることを明らかにし正二3⊥方，筋ジストロフ
ィー患者血清中の酵素活性についてはCK，GOT，酵素活性の測定にあたって，予め酵素濃度およ

GPT，LDH，Aldolaseなどについては調べられ

び経時変化と活性との間に直線関係のあることをているが，その他の酵素群については未だ報告が確認し定三重症度に関して分類した3群の患者とない。

正常被検者との酵素活性の比較を行ない，以下の本報告は細胞膜酵素および臓器内で異常な変動結果を得た。

が認められた酵素群を指標にしてDuchenne mu−

第1度の患者群ではAP−A，Gly−AP，Ser−AP，

sculardistrophy（DMD）患者血清中の酵素活性

Leu−AP，Phe−AP，Trp−AP，Gly−Pro−APなどを経時的に調べ，同時に臨床的指標として用いらほとんどのアミノペプチダーゼが有意な活性上昇

れている酵素群との関連性について報告する？

を示した。しかし，第2度，第3度と病状の進行にともない，これらの酵素群の活性は低下する傾

実験材料および方法

向にあることが認められた。一方，トリプシン様DMD患者24名，気管支喘息患者14名および酵素，カテプシンC，エステラーゼ，RNaseなど

正常者9名より採取した静脈血清について，11種は第1度の患者群では有意な低下が認められた。

頬のアミノペプチダーゼ（AP），エンドペプチダ

しかし，病状の進行にともない，これらの活性はーゼ，アンジオテンシソ転換酵素（Conv−Enz），

上昇する傾向を示した。

スルファターゼ，フオスファターゼ，エステラー

次に，病状の進行にともなう酵素変化の推移を

ゼ．リボヌクレアーゼ（RNase）などの活性を測定

別の角度から検討するために，回帰分析を行なっした。CK，GOT，GPT，LDH，Aldolaseは臨床

定この分析に際しては，重症度に関係なく全て検査法（東芝キット）により測定した。基質ならぴの患者を一群にまとめ，病状の持続期間の指標と＊微生物化学研究所＊＊国立療養所 西別府病院

して年令を用いた。年令の増加にともなう血清酵
素活性の推移を検討した結果，酵素活性の変動は

Ⅵ

154

プロテアーゼ

TableI
Relationship between Serun Enzyne Activjty and Age of Patients
With Duchenne Muscular Dystrophy
EnzymeRegressjonljnes

AP−A

r

Signjficancenlog Y三一0．934log X＋1．810−0．732★★★

24

1og Y三一0．047log X＋1．190−0．143NS

24

1og Yニー0．425log X＋1．373−0．519★★

24

1og Y；−0．10110g X＋1．930−0．217NS

24

1og Y＝一0．27710g X＋0．814−0．473★

24

1og Y＝一0．1891og X＋1．648−0．355（★）

24

log Y＝−0．001109X＋1．626−0．004NS

24

109Yニー0．1131og X＋1．736−0．299NS

24

Trp−APlog Y＝−0．197log X＋1．384−0．418★

24

Gly−Pro−AP

log Y三一0．7421og X＋1．979−0．603★★

24

Gly−Pro−Leu−AP

log Yニ0．1321og X＋0．537

0．183

NS

24

Trypsin−1ike

1og Y＝0．2311og X＋2．702

0．643

★★★

24

Cathepsin C

1og Y；1．0631og X−0．643

0．773

★★★

24

Converting Enzyme

1og Y＝−0．419log X＋1．282−0．493★

24

1og Y＝一1．062log X＋0．536−0．437★

24

Phosphataselog Y＝−0．466log X＋0．877−0．578★★

24

Ac−Cholinesterase

1og Y＝−0．0591og X＋0．793−0．025

Esterase

10g Y＝0．2251og X＋2．943

RNase
CK

AP−8
Gly−AP
Ala−AP
Ser−AP
Leu−AP
Met−AP
Phe−AP

Sulfatase

GOT
GPT
LDH
Aldolase

NS

24

0．281

NS

24

109Y；0．4021og X＋1．215

0．469

★

24

1og Yニー1．6761og X＋4．274−0．884★★★

24

1og Yニー1．0651og X＋3．04！−0．841

★★★

24

10g Y三一1．0931og X＋3．112−0．755★★★

24

log Y＝−0．7341og X＋3．769−0．792★★★

23

log Y＝−0．777log X＋2．169−0．722★★★

23（★）：Pく0．1．★：Pく0．05，★★：Pく0．01．日★：Pく0．001

27．筋ジストロフィー患者の血清酵素にみられる2種頬の動態

155

Relationship between Serum Enzyme Activjty andAge of Patients with Astha
EnzymeRegressionlinesrSignifjcancen−0．517

（★）

14

AP−A

log Y＝一0．1001og X＋0．712

AP−B

log Y＝0．0791og X＋1．107

0．293

NS

14

Gly−AP

1og Y＝0．0981og X＋0．705

0．333

NS

14

Ala−AP

10g Y三0．052log X＋1．733

0．178

NS

14

Ser−AP

1og Y＝−0．0771og X＋0．355−0．243NS

14

Leu−AP

10g Y＝0．0731og X＋1．313

0．250

NS

14

MeトAP

1og Y＝0．0381og X＋1．631

0．117

NS

14

Phe−AP

1og Y＝0．1681og X＋1．436

0．623

★

14

Trp−APlog Y＝0．0691og X＋1．036

0．229

NS

14

Gly−Pro−AP

log Y＝0．0181og X＋1．111

0．044

NS

14

Gly−Pro−Leu−AP

109Y…0．0521og X＋0．955

0・087

NS

14

Trypsin−1jkelog Y三一0．063log X＋3．038−0．076NS

14

Cathepsin C

1og Y＝0．6021og X＋0．465

0．320

NS

14

Convertjng Enzyme

1og Y＝−0．1051og X＋0．935−0．294NS

14

Sulfatase

1og Y三一0．3851og X＋0．201−0．357

NS14

Phosphataselog Y＝−0．140log X十0．828

Ac−Cholinesterase

NS

14

1og Y三一0．16810g X＋1．300JO．522

（★）

14

Esteraselog Y＝0．065log X＋3．203

0．194

NS

14

RNase

1og Y＝0．1241og X＋1．663

0．363

NS

14

GOT

1og Y＝−0．4271og X＋1．727−0．644★

12GPT

log Yニー0．1431og X＋1．288−0・265

NS

12

LDH

1og Y三一0．1981og X＋2．832−0．402（★）：P●く0．1，★：Pく0．05，★★：Pく0．01，−0．231NS

ll★★★：Pく0．001

直線的ではなく双曲線的であることが推察された。 の関係にあることが認められたが，トリプシン様そこで，年令および酵素活性を対数に換算して回

酵素，カテプシソC，RNaseなどは正相関を示し

帰分析を行なった結果，多数の酵素に関して有意た。つまり大多数の酵素は年令の増加につれ活性な相関がみられた（表1）。大部分の酵素は負相関低下の傾向を示したが，ごく少数の酵素はそれと

Ⅵ

156

プロテアーゼ

逆の変動を示すことが明らかになった。

スルファターゼ，フオスファターゼを含む大多数

上述した結果から，次の点が指摘される。すなの酵素が臨床的指標として用いられているCK，

わち，第1には負の相関を示す酵素群には大多数

GOT，GPT，LDH，Aldolaseなどと平行した動の酵素が属し，しかも臨床的指標として用いられきを示した。しかし，エンドペプチダーゼ，RNaseているCK，GOT．GPT，LDH，Aldolaseも同様などの少数の酵素は逆の動きを示すことを明らかな傾向を示した。第2に，この年令との相関は，にした。この知見を基にして，筋肉内酵素活性の病気の持続期間との相関と同じ意味を有している

変動および筋肉細胞膜の透過性の変化などを検討

ことを明らかにした。第3に，エキソペプチダー

し，難病解決の緒口としたい。

ゼの動きとエンドペプチダーゼの動きは逆の推移
文であるように思われる。
さらに，これらの酵素レベルの経時的推移がD
MD患者に特有なものであるか否かが問題となる。
そこで，対照患者として気管支喘息患者の血清酵素について同様の検討を行なった。表2に示した
ように，Phe−APおよびGOTにおいて有意な時間に対する回帰がみられたが，DMD患者にみられたような変化は認められなかった。

献1）Aoyagi，T．，Wada，T．，Kqiima，F．，Nagai，M．and
Umezawa，H（1981）．エロ血．血ye止，67，51，59．
2）Wada，T・，Kqjima，F．，Nagai，M．，Aoyagi，T．and
Umezawa，H．（1981）．人用β′研．砂仇，4，184・190．
3）Aoyagi，T・，Wada，T．and Umezawa，H．（1982）．
Catal）01ic enzymes in dystrophic muscle．In：

EbaShi，S・d・，肋JC〟ね′砂∫什Op妙．Univ．orTokyoPress，Tokyo．pp．239−252．
4）Aoyagi，TりSuda，H．，Nagai，M．，Ogawa，K．，Suzuki，J・，Takeuchi，T・and UmeZ．aWa，H．（1976）．
βfoc力かI．βfop妙見Acれ452，131−143．
5）Aoyagi，T・，Nagai，M．，Iwabuchi，M．，Liaw，W．S．，
Andoh，T・andUmezawa，H．（1978）．CbncerRe鼠，結論

DMD患者血清内酵素は，この病気の重症度および持続期間の両面から検討した結果，2つの型に分類されることを明らかにした。アミノペプチ
ダーゼ，ジペプチジルカルポキシペプチターゼ，

38，3505−3508．

6）Aoyagi，T・，Wada，T．，Kqjima，F．，Nagai，M．，
Miyoshin0，S．and Umezawa，H．（1983）．ain．
C海かt．dc吼hpIeSS．
7）Steel，R・G・D・andTorrie，J・H．（1960）．乃血亡車Zes〃〃dJサoce血reJqrgぬめ政見NewYo止／McGraw−
HillBookCompany，Inc．，PP．332−345．

157

28

筋ジストロフィー症マウスに対する微生物
プロテアーゼ・インヒビター投与の影響

松 下
研究協力者 辻宏＊
繁 勝＊

進行性筋ジストロフィー症では一般に骨格筋中ロイペプチンおよびベスタテンは厚生省新薬開発の分解系酵素の活性が増加しており，中でもリソ

梅沢班より供与されたものである。両インヒビタ

ゾーム・プロテアーゼ活性の著しい上昇が見られーは生理食塩水にそれぞれ1mg／hヱ濃度に溶解ることから，これら酵素の活性増加が症状進行のして使用した。投与量は1回0．2mヱづつ1日2原因の一つになっているという考え方がある。

回，背部皮下又は筋肉内に注射した。対照群には一方，放線菌などから分離抽出されたプロテア
ーゼ・インヒビターがカテプシンB，CANPなど

それぞれ0．2mヱづつの生理食塩水を同様に注射した。

の活性を抑制することが知られているので，これ被検マウスは8週令に至ると酵素活性測定のたらのインヒビターを投与することによって筋ジス

め断頭採血し，分離した血清および後肢筋を標品

トロフィー症の症状進行を抑制しようとする試み

として使用した。後肢筋の0．32M庶糖液ホモジが各種の動物モデルを用いて行われているlこ2義々

ネートは通常のSchneider法に従って細胞質分画は今回，筋ジストロフィー症マウスを用いて，発とミトコンドリア分画に分離し，それぞれの酵素症初期からロイペプチン又はベスタチンを連続投活性測定に用いられた。

与した場合の血清中および骨格筋中の疾病の進行

酵素活性の測定は以下の方法によって行われた。

に強い相関を示す幾つかの酵素活性の変化に対す

即ちCANPはD。yt。nらの邦苑準じて行い，Cる影響，並びに具体的な症状の改善或いは延命効

pKはH。SSらのUV浸）GOTおよびGPTはKa，−果の有無等について検討を行った。

m。nd，）LAPはT。ppy諾？pKはTbn。kaらの方法にそれぞれ準じて行った。

材料と＿方法ベスタチン長期投与に依る病状抑制実験には，実験には自家繁殖を行っているC57BL／即rlydy／1−個体同志の交配によって生まれた仔マウス

系マウスの疾病個体（dy／匂y）および同腹正常個体を10日令より連日，尾を持ってつり下げるテス（＋／−）が用いられた。インヒビター投与によるトを行い，後肢を内側に縮めるなど完全に発症が血清中並びに骨格筋中のマーカー酵素群の活性変認められた個体について直ちに投与を開始した。

動を検討する実験には4過令又は6週令の疾病マ

平均発病日は、14〜20日令である。

ウス各20頭を一実験区とし，10頭づつを1ケージに入れ，それぞれインヒビター投与群と食塩水投与対照群とした。インヒビターとして使用した＊和歌山県立医科大学第二生理学

結

果

表1は4過令および6過令の比較的未だ軽症の疾病マウスにプロテアーゼ・インヒビターをそれ

158

Ⅵ

プロテアーゼ

ぞれ4週間および2週間連続投与した後，血清遊化を示し，症状の消えないマウスでは5週令迄は出酵素の幾つかに就いて活性変化を対照マウスのはば正常マウスに近い体重増加を示すがその後，それと比較した結果を示したものであるが，いず

体重増加が停止し，12過令以降は急激に減少し，れの酵素の場合も，食塩水投与疾病個体よりも活17過令に至ると無処置の疾病マウスと全く変わら性低下していることが認められる。又2週間投与ない状態になることが認められる。然し，症状のよりも4週間投与の方が変化が大きく，特にベス

消えないマウスも連続してベスタテンの投与を行

タチンの4週間投与によってCPK，PK，LAPなっていると無処置の疾病マウスに比較して有意などが大巾に活性低下していることが注目される。

程度の寿命の延長があることがわかった。即ち表

表2は表1の条件下に於ける骨格筋中の酵素活性4の如く，筋ジストロフィー症マウスの平均寿命変化を測定したものであるが，CANP活性が両イ

は約5ケ月であるのに対して，ベスタテン投与群

ンヒビターの投与によっていずれも著しく活性低では平均8ケ月令迄生き延びること，個体によっ下していることおよび投与期間が長い方が変化のては1年以上の寿命を示すものも認められた。

程度が大きいことが認められる。又，CANP以外

一方，症状消失マウスは，外見的には確かに正の酵素の活性はベスタテン4週間投与群でのイLA

常マウスと区別できなくなるが，はたして実際にP活性を除いていずれも活性上昇の傾向を示して骨格筋の筋力が正常並みになっているか否かを知いた。以上の結果は，比較的軽症の筋ジストロフ

るために運動強制負荷による耐久力テストを行っィーマウスに両インヒビターを連続投与することた。60℃のホットプレート上に天蓋付きの円筒状によって，症状の改善及至は進行の抑制に効果が金網を置き，その中に披検マウスを入れてやるとあることを示唆しているものと考えられたので，足が熟いため金網によじ登る。この状態を7分間次に出来るだけ発病の初期から投与を開始した場

継続して，ホットプレートから四肢を離していた合の変化に就いてベスタチンを用いて検討した。

時間の総和を筋の耐久力として示したものが表5

表3は発症直後からベスタチン投与を開始した疾である。無処置の筋ジストロフィー症マウスでは病マウスの1ケ月令および2ケ月令に於ける体重半分以上の時間プレート上に落ちていたのに対し変化を示したものであるが，1ケ月令で既に同令てベスタテン投与群では殆んど正常マウスに近いの無処置疾病マウスに比較して著しく体重が増加

耐久力を示していた。以上の如く，ベスタチン投していることが認められる。又，投与マウス群は与に皐？て体重，筋力などの面で2つの違った変個体jこよって体重に大きなバ．ラ付きが認められii、化を示すグ／レてプが得られたこ．．とから，症状消失

大まかに，正常マウスと同様な体重変化を示すグ
ループと．無処置疾病マ・ウスと正常マウスの中間マウスがはたして遺伝的にもdyホモ個体であっ的体重増加を示すグループに別けられることが判た。表6はその結果を示したものであるが，ベスる。この傾向は2ケ月令に至ると更に顕著になり，タテン投与マウスとdyへテロマウスとの交配に体重増加の著しいグループは臨床症状が全く消失

よって得られた75頭の仔マウスのうち，発病個体

し，正常マウスと外見的に区別出来なくなるのにが33頭で，ベスタチン投与マウスがdyホモ個体

対して，体重増加の少ないグループは，無処置のと一仮定した場合の期待値によく一致する結果にな

疾病マウスよりはやや症状進行が遅いが，次第にっていた。又，ベスタナン投与マウス同志の交配

病状が悪化する傾向が認められた。図1は各グルによって得られた仔マウスはわずか5頭であるが，ープ中の典型的な個体に就いてそれぞれの体重変全て発病したことから，ベスタテン投与によって化を過令順にプロットしたものであるが，症状を症状の消失したマウスは遺伝的にも発病すべきdy

消失したマウスは殆んど正常マウスと同じ体重変

ホモ個休であったことが確かめられた。

たか否かを確かめるために，交配テストを実施し

28．筋ジストロフィー症マウスに対する微生物プロテアーゼ・インヒビター投与の影響︵三 三ご墨書〇日
2

10

⊃

15

20

25

30

Age（lヾeek）

Growth curve of bestatin treated dystrophic mjce．
三

一・一：Bestatin△一一一d：Bestatjn

treatedtreatedandandsymptomatica．11yimproved

non−improvedケ一山」■：Non−treated mice．

図日

mice．

mice．

159

Ⅵ

160

プロテアーゼ表1
Effects of proteaseinhibitors on the enzyme activities
in serulIl Of dystrophic nlice

Bestatin2

weeks★

4

Leupeptin

weeks

2

weeks

4

weeks

75．4

21．9

95．2

80．5

97．4

84．6

98．7

84．3

95．0

92．2

93．3

59．3

93．4

84．5

83．8

76．1

73．9

81．0

Units！Treated／Non−treatedx100

All mlCe Were SaCrificed at
8
Meeks of age
and prepared for enzynle aSSay．
★：Treatnlent

Perjod

表2
Effects of proteaseinhibitors on the enzyn−e aCtivities
in skeletall11USCle of dystrophic nlice

Bestatin

2

weeks
77．4

4

weeks
35．5

Leupeptin

2

weeks

4

43．4

weeks
36．9

156．3

102．6

113．7

109．2

107．7

117．2

115．4

104．6

112．6

107．9

日1．0

78．5

104．9

161．5

136．8

139．4

108．4

118．7

UnitsミTreatcd／Non−treated x100

A11mlCe、ere

SaCrificed

at8日eeksand prcpared for enzynle aSSay．
＊：Treatnlent

periodof

a9e

28．筋ジストロフィー症マウスに対する微生物プロテアーゼ・インヒビター投与の影響
表3
Effect of bestatin adl11inistration on weight gain of dystrophic mice

Trcatment l month2

n10nth

−10．0］（20）

10．4【6．5−13．5］（25）Treated l1・3［7・0＿−18・0日34）15．2［8．5−27．5］（38）12．3［8．5−14．0］（20）18．4［14．5−

Non−treatCd

7．7〔6．0

9．8［7．0−11．0］（20）13．5［11．5−18．0］（14）27．5］（18）＊：Average body weight（g）
Parcnthcses s．how the nulllbers oflnice tested．
Brackets show the range of each data．

蓑4
Effect of t3estatin adl再nistration onlife span of dystrophic mice

No

129．8

treated±23．4（20）187．6［73−152］

Fellは1e130．3土TrcatedPr．

土69．7（21）Pく0．01［102−373］

31．4（22）244．6‡64．1（14）Pく0．01［68−161］［140−362］

Brackets show the range of each data．
Parentheses show the numbers of mice used．
Unit：eXistcnt days

蓑5
Durability test on bestatin treated dystrophic mice

Dyagnosis

Treatnlent

NorIlは1

Total

Saljneholding407．2

ti・一1e（second）±

Pr・

4．3（5）

N．S．
Dystrophic Bestatin
Dystrophic

Saline374．0±22．5（5）l51．6土18．6（5）Testing period：420
SecondParenthcses show the nunlbers of mice tested．

Pく0．01

161

Ⅵ

162

プロテアーゼ表6
InCjdence of nlUSCular dystrophyln the of†sprln90f test matln9i

with bestaHn treated dystrophlC mlce

No．of pro9eny
Phenotype

Oystrophy
一J

t

■Ur

︼▲

r
r
−

e

【xpect．

〇 一

1

4

1

9

3

■ J

8

5

5

5

5

7
3

tJ

dy：N

…1：1

5

2

一・・・．一・．一・一→

0

7
1

9

0
2

0

案・

2
d﹁

0

考

1
2

2

0

へ J

ExpeCt．：dy／dy x dy／十

l
2

0
1
2

2
1

0
2

■ 勺

Bestatjn x BestaHn

1
1

′ ○

Total

9

x BestaHn

BestaHn x dy／◆

∧ じ

dy／◆

Total

な役割を果していること，ベスタテンが膜構造に比較的軽症の筋ジストロフィー症マウスに微生附着することによってこの状態が改善されること物プロテアーゼ・インヒビターであるロイペプチなどが推測される。従って発症以前にさかのぼっン，或いはベスタチンを2週間又は4週間連続投て，この膜機能異常を抑えることが出来れば，マ与することによって，症状進行に強い相関を示す

ウスの筋ジストロフィー症の発症および進行を完

幾つかの酵素の血清中並びに骨格筋中の活性が症

全に抑止出来る可能性があるものと思われる。

状改善を示す方向に変化することが認められた。
又，細胞質プロテアーゼであるCANPおよび膜

要約

局在ペプチターゼであるLAPの活性がそれぞれロ

1）微生物プロテアーゼ・インヒビターであるロ

イペプチンおよびベスタチンの投与によって強くイペプチン並びにベスタチンを軽症期の筋ジスト抑制されることが認められた。これらの結果は，ロフィー症マウスに連続投与することによって疾両インヒビターのin vivoに於ける症状改善効果

病の進行と相関性の強い幾つかの酵素の血清中へを示すと同時に直接，蛋白分解酵素の活性を抑制の遊出を減少させ，骨格筋中での活性低下を抑制することに依る改善効果と共に，筋細胞の生理状させることが認められた。

態，特に膜機能を正常化させることによって間接

2）発症直後の約2週令からベスタチンを長期間的に症状進行を抑制させる効果があることを示唆

連続投与することによって，体重の増加，症状のしているものと考えられる。更に，ベスタチンを消失を示す個体が得られた。これらのマウスは遺発症直後の約2週令から連続投与すると，症状が伝的に発病すべきdyホモ個体であることが確か

全く消失し，正常と外見的に区別出来なくなるマめられた。又，ベスタテン投与によって症状の消ウスが得られること，並びに？スタチン投与を続けることによって症状の進行が遅れ，著しい延命失は見られなかった個体も，投与を続けることに効果が認められることなどから，筋ジストロフィ

して明らかな寿命の延長が認められた。

ー症マウスでは一般的な膜機能の異常が発症前から既に存在し，これが発症並びに症状進行に重要

よって無処置の筋ジストロフィー症マウスに比較

28．筋ジストロフィー症マウスに対する微生物プロテアーゼ・インヒビター投与の影響
文

献1）Stracher，S．，McGowan，E・B・and Shafiq，S・A・
Muscular dystrophy；lnhibition of degeneration
inview with proteaseinhibitors・Science，200：
50−51（1978）．
2）Sher，J．H．，Stracher，A．，Shafiq，S・A・andHardy−

Stashin，J．Successfultreatmentofmu血emuscu・
lardystrophywiththeproteinaseinhibitorleupep−tin．伽C．〃β丑dc〃d ge乙 比良，78：7742−7744（1981）．

3）Dayton，W．R．，Revme，W・J・，Goll，D・E・and
Stromer，M．H．AC㌔十一aCtiYatedproteasepossibly
invoIvedinmyonbrillaJ prOtein turnOVer・Partial
chaLaCterization of the purified enzyme．Bio−
C如椚如け，15：2159−2167（1976）・

163

4）Hess，J．W．，Murdock，K．J．and Natho，G．J．W．
Creatine phosphokinase，A spectrophotometricmethodwithimproved sensitiYity．Am．Jl ain．
劫班01，50：89（1968）．
5）KaLmen，A．，Wroblew永i，F．，and LaDue，T．S．
Transaminase activityin human blood．J．CYin．
血ye止，34：126（1955）．
6）Tappy，H．，Wied）aner，U．，Wintersberger，E．Aminoacid−p−nitroannide as a substrate for aminopepti−
dasesandotherproteclyticenzymes．HoppeSeylerZ．，劫γ如上C乃emり329：278−288（1962）．
7）Tanaka，T．，Harano，Y．，Sue，F．，and Morimura，H．Crystallization，Characterizationandmetabolic
regulation of two types of pyruVate kinasesis0−1ated from rat tissues．J．Biochim．，62：71−91（1967）．

Ⅶ

関

連

領

29．高分子物質の細胞内注入法の工夫

30．細胞接着分子と細胞収縮

域

167

168

31．体幹部神経堤細胞からの間葉組織の分化

170

167

29 高分子物質の細胞内注入法の工夫
岡 田 善 雄＊研究協力者 内 田

現在迄我々の研究室で開発されてきた高分子物

境＊由は不明であるが，リン酸カルシウムが強い細胞質注入法は以下の3種類である。

毒性をもつこと，細胞内への取込みが受動的で細① 細胞融合初期におこる細胞膜構造の乱れを利胞まかせであることなど，この方法の欠点を指摘用する方法。

することができる。

㊤ 人工リポゾーム内に高分子物質を封印し，リ

我々はリン酸カルシウムゲルを用いずに，もっポゾーム膜にウィルススパイクを植込んで，細胞と積極的に細胞内にDNAを注入したいのである。

膜とリポゾーム膜との融合を介して物質を注入す

上記の3種頬の方法から㊥赤血球ゴースト法をこる方法。

の目的に使うこととした。赤血球ゴースト内に高㊥ 内部に高分子物質を封印した赤血球ゴースト

分子物質を封印する方法として，従来は赤血球のと細胞とをウィルスで融合させる方法。

低桐処理による封印を行っていたが，この方法でこれ等を用いて＿，非ヒストンタンパク質，紫外は凡んどDNAは封印できない。如何にして封印線特異的エンドヌクレアーゼ，IgG，毒素などのさすかというのが一番の問題である。色々の試行

細胞内注入による細胞解析を進めてきた。今回の錯誤の末，最近になってやっと可能性が考えられ努力はDNAをこのような形で細胞内に注入したるようになった。

いという事である。

赤血球を表面活性剤で部分的に溶かし，燐脂質

遺伝病細胞を用いて遺伝子解析を進めてゆく場

を加え表面活性剤を抜いて赤血球ゴーストを再構

合の1つの大きな壁が，細胞内への遺伝子注入に成する時にDNAを加えておくとDNAがうまくある。現在一般に用いられているDNA注入法は，

封印できそうである。この方法では，DNAの他，

DNAをリン酸カルシウムゲル内に組込んだドロ

分子量900，000のIgMも容易に封印できるし，ドロの液を培養細胞に，ふりかけるものである。

Aファージ粒子そのものも封印さすことができる。

この方法は確かに有効でL細胞や3T3細胞ではこの方法で作ったt斤geneを含むDNAを封印

10￣6〜10￣5の頻度でトランスフォーマントを観察した赤血球ゴーストと細胞とを融合させることでできるが，残念なことに，細胞によりこの頻度はt〟￣のし細胞からt艦十のトランスフォーマントを大きく変動する。上記の細胞以外では凡んどの細高頻度で出現させることができた。これからもう胞の頻度は10￣7以下となり実用性がない。その理

少し具体的な解析データーを集め正式に発表した
いと考えている。

＊大阪大学細胞工学センター

168

30 細胞接着分子と細胞収縮
岡 田 節 人＊研究協力者 竹 市 雅 俊＊

筋肉以外の細胞が収縮系をもつことは今や常識であるが，その収縮の調節機構は筋肉の場合ほど示すような活性を示す単クローン抗体（ECCD−1）を産生するクローンを分離した。

にはわかっていない。細胞を培養すると，基質上ECCD−1は，EC細胞相互の結合を破壊すに伸展し，一見弛緩したかのような形態をとる。

るが，同時に，個々の細胞を球状にする。この現

このような細胞に，ある種の薬剤（たとえばEG

象は，細胞間結合破壊の二次的結果であると見な

TA）を与えると，細胞は球状となり 収縮〝す

すこともできるが，しかし，それだけでは細胞のる。このような現象が，筋肉の収縮と対応するも極端な球状化を説明しにくい。抗体が，積極的にのであるかどうかは別にして，細胞の収縮系と何細胞の収縮を引き起こしている可能性が大である。

らかの関わりがあることには間違いない。
私たちは，細胞表面上に存在する≠C計依存細ECCD−1の細胞への結合の特性

胞間接着因子（CDS）〝の分子的本体の研究す

放射性ラベルしたECCD−1を，さまざまなるための一環として，CDSの機能を阻害する単条件下でEC細胞に与え，ECCD−1の結合のクローン抗体を得た。この単クローン抗体は，細特性を調べると，C計が存在する時にのみ細胞に胞間の接着を阻害するが，それだけでなく，細胞結合することがわかった。ECCD−1の結合はの収縮をも引き起すことが明らかとなった。そこ

可逆的で，抗体が結合している細胞を，抗体を含で，この抗体の標的分子の性状について述べ，そ

まない液の中で培養すると，短時間のうちにすべれが細胞収縮系の調節因子であるという可能性をての抗体が細胞から遊離してしまう。この時，Cよト

考察してみたい。

のキレート剤であるEGTAで細胞を洗うと，抗体の遊離は著しく促進される。すなわち，抗体の単クローン抗体の調製

細胞への結合はCよI依存である。

実験の材料は，マウスのテラトカルシノーマ細胞（EC細胞と略す）である。EC細胞を，ラッECCD−1の標的分子

トに注射して免疫し，この動物のリンパ球とミエ

ECCD−1の標的分子を，Western

ブロッ

ローマⅩ63細胞を融合して，多数のハイブリドー

テイング法により同定することを試みた。EC細マを得た。それぞれのハイブリドーマの培養液を，胞の表面抗原を集め，これを電気泳動にかけてタ

EC細胞の培養に加え，EC細胞の形態に何らか

ンパク質を分離する。次に，タンパク質をニトロの変化を引き起こすような抗体を産生するハイブ

セルロース紙に写しとり，ECCD−1に浸す。

リドーマクローンを探した。その中から，図1に次いで，二次抗体として，放射性ヨードでラベルした抗ラットIgで処理し，ECCD−1が結合＊京都大学理学部したバンドを検出した。その結果，分子量約30 細胞接着分子と細胞収縮

169

124，000のタンパク質（p124）が，ECCD−1

p124が，C計と反応し， 形〝を変えるということ特異的に反応することがわかった。

とを意味する。この分子の構造上の変化こそp124

興味深いことに，ECCD−1とp124との反の生理活性と密接な関連があると考えられる。

応はC計依存であることがわかった。ニトロセル
ロース紙に写しとった抗原試料をECCD−1とp124と細胞収縮

反応させる時，C云けが存在しないとp124との結筋収縮がC拙こよって統御されていることは周合が起きない。また，P124に結合したECCD知の事実であるが，非筋細胞の収縮系にもC㌔一−1は，EGTAで洗うことにより遊離してしまが関与していて不思議はない。その観点から，Pう。前述したように，ECCD−1の細胞に対す124がCが受容タンパク質であるという事実は大る結合はC計依存であった。これは，抗体と抗原変興味深い。P124とC計の反応が，どのように分子そのものの反応がC云什依存であることの反映

細胞接着と細胞収縮に関わっているかは，まだ不であったわけである。

明であるが，今回得られた結果は，細胞表面の以上の実験結果から，次のような結論が導き出

Cが受容タンパクが細胞内収縮系の調節因子であされる。P124は，Cよ十の依存下において初めてるという可能性を示唆する初めての実験結果であECCD−1により認識される。このことは，

るといえよう。

図1

EC細胞のECCD−1に対する反応。

（左）正常なEC細胞（AT805株）のコロニー。
（右）ECCD−1の中で4時間培養したEC細胞。

170

31体幹部神経堤細胞からの間葉組織の分化
仲 村 春 和＊1． は じめに幹部神経堤由来の間葉細胞は宿主の細胞と混合し神経堤は神経管が閉じるときにその背側に見らている（Nakamura and Ayer−Le Lievre，れるが，神経堤細胞はそこから移動していき，色1982）。このことから，神経堤細胞が問葉組織に素細胞，末梢神経細胞，間彙細胞，内分泌細胞等分化するためには頭部神経堤あるいは頭部神経管へ分化していく。この神経堤細胞の移動，分化のが必要だと思われる。すなわち体幹部神経堤細胞

解析にはウズラの細胞を生物学的マーカーとしては頭部神経堤細胞と一緒に移動することにより閉

ニワトリーウズラのキメラ法による研究がたいへ

業組織に分化できるのではないかと考えられる。

ん有効である（Le Douarin，1969）。このキメラ法により神経堤細胞の分化は頭尾方向での出発点

2．材料と方法の位置によって決まることが明らかにされている。

ふ卵約50時間のニワトリ胚（約20体節期）の尾またある位置の神経管を頭尾軸上のちがうレベル

方の5体節分の神経管の片側を切りとり，そこにに移植することにより，神経堤細胞の分化にはそ

およそ10体節期のニワトリ胚の同側の菱脳部神経の移動中，あるいは最終位置に到達してからの環管を0．5％ディスパーゼで処理してまわりの問糞境要因の影響が強く働くことが示されている細胞をとり除いた後に移植した。さらにその外側（Le Douarin，1980）。

におよそ20体節期のウズラ胚体幹部神経管の片側問責組織に分化するのは頭部の神経堤細胞で，を移植した（図1）。移植5日後にZenker液でこれは他の細胞のラインから早期に分れる。すな

固定し，パラフィン包埋後8ル仇の連続切片を作

わち頭部の神経管を体幹部に移植すると，移植さ製して，Rulgen染色を施した。

れた神経堤細胞は間彙組織に分化し，椎骨等の中にも神経堤由来の細胞が見られる。また逆に体幹3．結果と考案部の神経管を頭部に移植すると問彙組織が不足す移植を受けた胚ではLe Douarin（1977）らるためにあたかも神経堤を切りとったときのようが頭部神経管を体幹部に移植したときのような問な顎骨等の異常をおこす（Le Douarin，etal．

彙系細胞が過剰になるための椎骨等の奇形が見ら

1977）。

れる（図2）。注意深く観察を行うと少量ではあところが体幹部の神経管を片側的に菱脳域に移るが，椎骨原基の中にニワトリの細胞に混じって植すると移植された体幹部神経堤から聞彙組織のウズラの細胞が存在することがわかる（図3）。

分化が見られ，両側的に移植した場合には移植さすなわち移植されたウズラ体幹部神経堤から間糞れた東方あるいは尾方の端の神経堤のみが問彙組

組織が分化してきたわけである。

織に分化できる。いずれの場合にも移植された体正常の発生過程では体幹部神経堤は間彙組織に分化しない。ところが頭部に移植されたときは頭＊広島大学医学部 第一解剖学教室

部神経堤細胞と一緒に移動する細胞のみが問彙細31体幹部神経堤細胞からの問菓組織の分化

図1実験方法の模式図

171

Ⅶ 関連領域

172

タ
イ

●

1mm

図2 図1に示したような移植を受けた胚をふ卵7日に固定したものの
横断像。

・一

＿

′′一〆．・

■一

一．ヽ

ヽ

竃こ．

感琴

卑

韓11

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㌦ ▲′

′i′￣

li・伊
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・

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一

図3 図2の椎骨の一部の高倍像。
椎骨原基の中にニワトリ細胞に混じってウズラの細胞が存在する（矢印）。これは移植されたウズラ体幹部神経堤由来の細胞である。ウズラの細胞はヘテロクロマチンが凝集している。

31体幹部神経堤細胞からの問菓組織の分化

173

胞になることができる。また本実験で示したよう

4．神経管移植法のジストロフィー研究への応用に体幹部神経堤細胞は，体幹部においてさえも頭ジストロフィーの発症には筋肉にその原因があ部神経堤細胞と一緒に移動すれば間葉組織に分化るとする筋原説と神経に原因があるとする神経原

できるということは神経堤からの問彙組織の分化説とがある。そこで現在筋ジストロフィーニワト

に頭部神経堤の影響が大きいことを示している。

リと正常ウズラあるいはニワトリとの間で腕神経以上のことをまとめると，神経堤細胞の運命は叢領域の神経管の交換移植と，肢芽の交換移植を正常の発生では頭尾軸のどの位置から出発するか行い解析を進めている。

によって決まるが，その分化の方向性は出発前にすでに決定されているのではなく，移動中あるい文

献は最終位置に到達してからの環境要因との相互作

1）LeDouarin，N．（1969）Particuhitgs du noyau

用によって決まるということができる。すなわち

interphasique chezla caille japonaise（Coturnix
COtumix japonica）．Ut止ization de ces parti−

移動前の神経堤細胞は多分化能をもっているということができる。
一方頭部の神経管は体幹部に移植されても問葉組織に分化する（Le Douarin，1977）ということは頭部の神経堤細胞の一部は移動前にすでに問葉組織としての決定を受けているように思われる。
これらの細胞の分化の決定がいつおこなわれるかは今後に残された問題である。いずれにしても神経堤細胞のラインのうちで，間彙組織に分化する
ラインがいちばん早く分化の決定がおこるように思われる。

Cularitgs

commesrecherches surles

marquage

biologique，dansles

interaction tissulaires etles

migrations cellulaires au cours delontogen主se．

β〟JJβ由仁fhβeな．，103，435452．
2）Le Douarin，N．（1980）Migration and differentia−
tion of neuralCrest cells．CtLTた

TbpicsDevetop．

βわJ．，16，31−85．
3）Le Douarin，N．，Teillet，M．−A．and Le Li色vre，C．

（1977）hnuenceofthetissueenvironmentonthe
differentiation of neuralcrest ceus．In：CbtLGnd

TYssue hterqclion（ed．J．W．bsh and M．M．
Burger），Pp．11−27RavenPress，NewYork．
4）Nakamura，H．and Ayer−Le Lievre，C・S・（1982）
Mesectodemal capabilities of the trunk neural
CreStOrbirds．J g椚あけ0エgxp．〃0岬九，70，1・18．

175「筋の発生と分化に関する基礎的研究」班分担研究者一覧
氏

所

名

住

属

所

班長

江橋

節郎

東京大学医学部第一薬理学教室

113

東京都文京 区本郷03 （87−3−112）2 1 1 1

監事

今堀

和友

東京 都老人総合研 究所

173

東 京都板橋区栄町
03 （96435−2）113 1

幹事

勝沼信彦

徳島大学医学部酵素研 究施設

770

徳島市蔵本町088
3 −18
6 （3−151）3 11 1

野 々 村禎 昭

東京大学医学部第二薬理学教室

113

東京都文京区本郷03 （812
7−3−1）2 11 1

霊宝

小沢 瑛 二 郎

国立武蔵療養所神経 セ ンター
機能研究部

1訂

東京都小平市小川東町 2620
04 2 3 （41 ）27 1 1

班員

青柳

高明

微生物化学研究所141

東京都品川区上大崎
03 （44 1）
3−14−
4 17
一
三
B3

石川

春律

東京大学医学部解剖学教室

113

東京都文京区本郷
0 3 （87−3−1
12 ）2 1 11岩崎祐三

国立 武蔵療養所神経セ ンター
微細構造研究所

187

東京都小平市小川東町 2620
04 23 （4 1 ）2 7 11遠藤実

東北大学医学部薬理学 教室

粟0

仙台市星陵町
0 222
2 −1（7 4 ）11 1 1

大塚正徳

東京医科歯科大学医学 部薬理学教室

113

東京 都文京区湯島03 （81−5−45
13 ）6 11 1

大 日方

昂

千葉大学理学 部生物学 教室

260

千葉市弥生町0 472
1−33（5 1）1 11 1岡田節人

京都大学理学部生物物理学教 室

6彷

京都市左京区北0 75 白川追分町（7 5 1）21 1 1岡田善雄

大阪大学微生物病研究所565

大阪府吹田市山田丘
0 6 （8 773 ）−1
5 12 1香川務

国立療養所刀根山病院

560

豊 中市刀根山05−1−1
6 （8 5 3 ）2 00 1

加濃正明

北里大学医学部生理学教室

228

相模原市北里0 42
1−15−17 （7 8 ）8 11 1栗山

楳

九州大学医学部薬理学教室

812

福岡市東区馬0 92
出 3（6−1
4 1）−1115 1酒井敏夫

東京慈恵会医科大学生 理学教室

105

東京都港区西新橋
03 （4333
−5）11
−811

嶋田

裕

千葉大学医学部解剖学教室

2餌

千葉市亥鼻 01−8
47 2−1（2 2 ）7 17 1

杉田秀夫

国立武蔵療養所神経セ ンター
疾病研究第一 部

187

東京都小平市小川東町 2620
0 423 （4 1 ）27 1 1

杉山博之

岡 崎国立共同研究機構生理学研究所
細 胞器官研究系

444

愛知県岡崎碑38
0 56 4 （52 ）9 770

176

氏

名

所

班員 高橋 健治

住属所

京都大学霊長類研究所

4糾

愛知県犬山市0568（
宮林 61）
2891

高橋園太郎

東京大学医学部脳研神経生物学教室

113

東京都文京区本郷7−3−1

寺尾 寿夫

帝京大学医学部第一内科学教室

03（
812）
2111

戸塚

愛知県心身障害者コロニー
発達障害研

0568（
88）
0811

武

萩原禰四郎

千葉大学医学部脳機能研究施設

2
80
173

千
8−
1 11−1
東葉
京市
都亥
板鼻1−
橋区加
賀2−
0472（
22）
7171

堀田

名古屋市立大医学部生理学教室

467

愛知県名古
珊
Il
超町1．
052（
851）
5511

真崎 知生

筑波大学基礎医学系

300−
31 茨城県新治郡03（
桜村964）
1211
0298（
53）
3061

松下

宏

和歌山県立医大生理学教室

640

和歌山
市九番丁9
0734（
31）
2151

丸山 工作

千葉大学理学部生物学教室

260

千葉市弥生町1−33
0472（
51）
1111

釜芸 大槻 磐男

九州大学医学部臨床薬理学教室

81
2H迫愛
福知
岡県
馬市
出
3−
13一
亜
和
県東
春区
日
井
神
国1−
町71
個
092（
641）
1151

仲村 春和

広島大学医学部第一解剖学教室734

健

広島市南区霞1−2−
3

二S −Ll︑