National Institute of Technology (KOSEN), Kure college
Bio-conversion Laboratory (Kimura Lab.)

菌をこちらの都合に合わせる。
新たな微生物分離戦略
呉工業高等専門学校 環境都市工学分野
准教授 木村善一郎 （z-kimura@kure-nct.ac.jp）
2021年7月6日 於JST新技術説明会（オンライン）

本技術で何がしたいのか？

2

環境バイオテクノロジーのリソースを拡大したい
環境バイオテクノロジーの主役は微生物にもかかわらず潜在的リソースと現状の乖離は激しい
ほとんどの微生物は生きているが分離・培養出来ない
Viable but Non-Culturable (VBNC）の状態にある
バイオリソース

分離・培養
さわれない

さわれないから、いじれない、使えない→「さわれる」を増やせば必然的に「いじれる」「使える」が増える
育種

利用
テクノロジー発展

さわれる
フェイズ

いじれる
フェイズ

使えるフェイズ現行のバイオテクノロジーはほとんどこの部分だけで勝負「さわれる/さわれない」の比は1000倍を優に超える
逆に言えば1000倍の巨大な伸びしろがあるということ

なぜさわれないのか？

3

複数の要素が単独あるいは複合した結果として生じるもの
下記に4つの要素を図示
A：微生物群集内の存在比が小さい

B:従来の培地では増殖困難
A∪B∪C∪D-(C+D)

C：細胞が休眠状態

D：たまたままだ分離されていない

VBNCという概念はA∪B∪C∪Dの和集合
要素A/B/C/Dの割合を調べる術は（現状では）存在しない
本研究はA及びD（特にA）の解決に取り組むもの
A領域の微生物圏：レアバイオスフィア

4

なぜさわれないのか？
「さわれる」菌は種類が少なく数が多い「さわれない」菌は種類が多いが数が少ない、そして数が少ない菌を釣ることは単純に難しい

さわれる
さわれない

数が少ないがゆえに現状「さわれない」菌を釣り上げることを本技術は可能とするアクセス事例-1
集積培養法
古典的方法論にして現状でもほぼ唯一のアクセス方法→少ないままでは分離出来ないので「増やす」→生理活性が変数なので系統分類的に「狙って」は培養出来ない

セルソーターとLive-FISHの併用 （Batani et al., Sci. Rep., 2019）
FISHにより「狙った」系統の微生物を染色しFACSにより分取「生かしてきっちり染める」ことは困難→少数菌種の分取には不向き

複合系への遺伝子導入（加藤ら、科研費進学術領域ポストコッホで実施中）
複合系内の任意微生物に対し分離に有利な遺伝子を導入導入した遺伝子を「発現」するところで選択圧が生じると考えられる→「狙った菌を取る」技法としては強力だが特殊解的

5

ではどうやって？
ではどうしたら一般解たりうるか？
もしある一種の抗生物質耐性微生物が試料中に103個存在していたとする。
それ以外のすべての微生物がその抗生物質に感受性ならば、その一種はたやすく分離することが出来るであろう（鎌形, 科学と生物, 2008）
が、そのような都合の良いシチュエーションは存在することはごく稀
では後付けで作り出すことは出来ないか？それも全生物を対象にしうる一般性で。

普遍的なアクセス戦術（i.e. 一般解）を作りたいということで、、

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実施例-1 手順1①種類の純粋分離されている細菌を濁度（O.D. 600）が等しくなるように菌液を調整。培養した菌株はBacillus subtilis subs. subtilis NBRC13719株、Corynebacteriumstriatum NBRC15291株、Staphylococcus epidermidis NBRC100911株、
Comamonas terrigena NBRC13299株これらの細菌は全てLB培地で培養可②空の1.5mlチューブに濁度調整したBacillus subtilis subs. subtilis NBRC13719株、
Corynebacterium striatum NBRC15291株、Staphylococcus epidermidis
NBRC100911株、 Comamonas terrigena NBRC13299株を300μlずつ加え混合。
③上記②の菌液に濁度調整したEscherichia coli DH5α株を1μl加え、これを複合微生物系モデルとした。このモデルのE.coli DH5α存在比率は0.1%。
④E.coli DH5αのみが発現可能なプラスミドベクター：pUC19(Amp r )を用意。

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実施例-1 手順2・結果

8⑤ソルビトールバッファを複合微生物系に200μl加え、エレクトロコンピテントセル化⑥エレクトロコンピテントセルに対し0.5μgのpUC19を加え、エレクトロポレーション法によるプラスミド導入。（エレクトロポレーション法の条件は1.25kV/cm、25μF、200Ωで実施）⑦アンピシリン含有LB培地に塗布し、24時間培養。
⑧培養後に形成されたコロニーを16SrRNA遺伝子系統解析を行い、種を同定。
相同性(%)

strain

最類縁種

Escherichia coli

99.7

No.9

Escherichia coli

99.4

No.2

Escherichia coli

99.4

No.10

Escherichia coli

99.5

No.3

Escherichia coli

99.5

No.11

Escherichia coli

99.2

No.4

Escherichia coli

100

No.12

Escherichia coli

99.5

No.5

Escherichia coli

100

No.13

Escherichia coli

99.3

No.6

Escherichia coli

99.3

No.14

Escherichia coli

99.3

No.7

Escherichia coli

99.5

No.15

Escherichia coli

99.4

No.8

Escherichia coli

99.5

strain最類縁種

No.1

解析した全菌株がEscherichia coli
存在比率0.1%未満の希少微生物を選択的に培養可能

相同性(%)

実施例-2 手順1
複合微生物系からの未培養微生物の選択的培養→実環境資料への実装①活性汚泥サンプルを貧栄養培地 ( 1/10R2A培地 )に塗抹
②7日間培養後コロニーを全て獲得し滅菌生理食塩水に懸濁→複合微生物系サンプル③複合微生物サンプルを洗浄後、25mMのCaCl 2 と10%のPEG8000混合溶液100μlに懸濁④にEscherichia coliを宿主とするプラスミド：pgRNA ( Str r )（前述したpUC19を元とした改変プラスミド、アンピシリン耐性ではなくストレプトマイシン耐性をコード） を懸濁液に添加しケミカル法で形質転換⑤ストレプトマイシン含有1/10R2A培地 で培養⑥ 培養後に形成されたコロニーを16SrRNA遺伝子系統解析、種同定

9

実施例-2 結果-110

プラスミドの宿主特異性による系統選択的形質付与が一般解となると着想
Host Specific Plasmid induced Screening (HosPiS)と命名
いくつかの環境微生物が分離されつつあります。
straintransformation

Enrichment withstreptomycin

closest relative

HOS①-3Y

YEnterobacter kobei

HOS①-4Y

YEnterobacter kobei

HOS①-5Y

YEnterobacter kobei

HOS①-6Y

YEnterobacter kobei

HOS①-7

YY

Enterobacter kobei

HOS①-8YY

Enterobacter kobei

accessionNo.
AJ508301
AJ508301
AJ508301
AJ508301
AJ508301
AJ508301

similarity(%)
97.6
99.3
99.3
99.1
98.999.3

活性汚泥中から低存在比率のEnterobacter属細菌を分離することに成功

straintransformation

Enrichment withstreptomycin

HOS③-2YN

Bacillus cereus

HOS③-3YN

Bacillus cereus

HOS③-4YN

Bacillus cereus

HOS③-5YN

Bacillus cereus

HOS③-6YN

Bacillus toyonensis

HOS③-7

YN

Bacillus cereus

HOS③-9YN

Enterobacter kobei

HOS③-10YN

Bacillus toyonensis

HOS③-11YN

Bacillus toyonensis

HOS③-14YNBacillus cereus

HOS③-15

YN

Bacillus cereus

HOS③-16

YN

Bacillus toyonensis

HOS③-17

YN

Enterobacter kobei

HOS③-19

YN

Bacillus toyonensis

HOS③-21

YN

Bacillus toyonensis

HOS③-22

YN

Bacillus toyonensis

HOS③-23

YN

Bacillus cereus

HOS③-24

YN

Bacillus cereus

closest relative

accessionNo.
AE016877
AE016877
AE016877
AE016877
AJ310100
AE016880
AJ508301
AJ310100
AJ310100
AE016880
AE016880
AJ310101
AJ508301
AJ310101
AJ310101
AJ310101
AE016881
AE016881

similarity(%)

straintransformation

Enrichment withstreptomycin

closest relative

99.9

HOS④-4NN

Bacillus toyonensis

99.9

HOS④-8NN

Bacillus toyonensis

99.9

HOS④-10NN

Bacillus toyonensis

99.5

HOS④-11N

N

Bacillus cereus

99.7

HOS④-12NN

Bacillus toyonensis

99.9

HOS④-14N

N

Bacillus cereus

99.2

HOS④-15

NN

Bacillus toyonensis

99.6

HOS④-16

NN

Bacillus toyonensis

99.4

HOS④-23

NN

Bacillus cereus

99.5

HOS④-24

NN

Bacillus cereus99.4
100.0
99.2
99.1
99.9
99.9
99.1
99.5

acc
essi
onNo.
AJ310101
AJ310101
AJ310101
AE016881
AJ310101
AE016881
AJ310101
AJ310101
AE016881
AE016881

similarit
y(%)
98.5
100.0
99.7
99.3
99.3
99.9
99.9
99.9
99.6
99.6

実施例-2 結果-2

Multolocus Sequence TypingによりEnterobacter chengduensisの基準株と最類縁であることが判明

11

実施例-2 結果-2
GenusEnterobacterSpecies (Subspecies)"ologotoropha"
aerogenes
asburiae
bugandensis
cancerogenus
chengduensis
cloacae ssp. cloacae
hormaechei ssp. hormaechei
hormaechei ssp. oharae
hormaechei ssp. steigerwaltii
kobei
ludwigii
mori
muelleriroggenkampii
sichanensis
solitabacixiangfangensis

12ANI (%)
86.80779.15092.69590.18885.951
94.78387.69186.86087.09486.96879.60687.46088.34792.50592.06390.20585.31988.63386.917最類縁種であるEncterobacter chengduensisとのAverage Nucleotide Identity (ANI) valueの値が<96%新種であることが判明→新種分離に使用可能

使用できるプラスミド例

13

使用プラスミド

分離対象細菌系統

使用プラスミド

分離対象細菌系統

pUC18

Enterobacteriaceae科

pKP1141Enterobacteriaceae科

pUC19Enterobacteriaceae科

pSEVA3b67Rb

Bacillus属

pgRNA-bacteriaEnterobacteriaceae科

pDL278Enterococcus属

pIKM1

Thermoanaerobacteriaceae科

pBSJL1

Veillonella属

pGM190Streptomyces属

pYUB28b series

Mycrobacterium属

pRAD1

Deinococcus属

pMM1520 serise

Bacillus属

pMM579Bcteroides属

pRBBm series

Bacillus属

pNBU2

Bcteroides属

pUS116

Mycrobacterium属

pNICKclos1.0

Clostridium属

pHT01 series

Bacillus属

pdCASclos

Clostridium属

pBSG03 series

Bacillus属

pCBEclos-cbei2385-g2-opt

Clostridium属

pAD123 seies

Bacillus属

pWJ1

Clostridium属

pUWL201PW series

Streptomyces属

pNICKclos2.0

Clostridium属

pRMC2

Staphylococcsu属

pMo130Burkholderia属

pJUMP24-1A

Pseudomonas属

pAM-beta-1

Streptococaceae科

pMU131

Thermoanaerobacterium属

pIL series

Streptococaceae科

pMV762 series

Mycobacterium属

pTRK series

Streptococaceae科

pAL5000 series

Rhodococcus属

pIB serise

Streptococaceae科

pMB1 series

Rhodococcus属

pG1AK series

Geobacillus属

pJOE7706.1 series

Corynebacterium属

pL9X series

Streptomycse属

pMycoFos

Mycobacterium属

pSUM series

Mycobacterium属

pMSP3545 series

Enterococcus属

実施例-3 結果（手順略）

好熱性Clostridia綱細菌のコロニーを獲得
過去プラスミドの発現例の無い系統の株の獲得に成功

14

売りはなにか？

15

技術の独創性、新規性・優位性
現在の微生物分離戦略は総当たり（→チカラワザ的）かつ菌種毎の「特殊解」的→本研究はプラスミドの宿主特異性を使用するという「一般解」を与える

HosPiS法はプラスミドの発現性を選択圧に微生物を釣り上げる技術→分離成立時点で遺伝子改変可能→HosPiS法は分離株の遺伝子改変可能性を試行錯誤する必要ない→最初から遺伝子改変可能な株を環境中から獲得できる→つまり本技法により拡張された「さわれる」は「いじれる」と同義

なにに繋がるか？

16

学術基盤

産業的応用性アスガルド古細菌群を含めた高次未分類系統の分離・生理解明

未分離放線菌の獲得による抗菌・抗ウイルス物質資源の拡大

従来
・膨大な試行錯誤が必要→Lokiarchaeotaは分離に10余年

従来

本研究の達成「分離戦略すら立たない」未分離系統に対し強力な一般解法を提供
培養工学的技術革新との併用ですべての菌を可培養化
・生命進化史の理解を超加速化
・微生態系構成種の性質を網羅的に理解

・古典的培養法による分離株獲得→生理活性物質生産性試験で選別
本研究を下敷きとする応用
・HoSPis法を抗生物質分離源となる放線菌門の未培養細菌の分離に応用
新興・再興細菌性感染症に有効な抗菌剤、抗ウイルス剤の探索源を拡大
・上記例に限らず微生物由来の潜在的バイオリソースを最大限利用出来る時代

微生物生態系の還元論的理解

環境バイテク新時代へ！

分類学・生態学の学問的完成へ顕在バイオリソースの最大化へ

最後に

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実用化への壁企業との協働に期待すること

未培養系統の複製起点の予測実装にあたってのターゲット選定

・現状としては既知の複製起点を利用した分離技法

・環境微生物を分離するにあたって「誰を」標的とすることに商業的価値があるのか？

・未培養系統の分離への応用にはメタゲノム情報から分離対象菌種のプラスミド複製起点を高精度に予測する技術が必要→実は現状でもある程度は可能→高精度化が必要

・前述の放線菌門細菌の分離は未だ商業的価値があるのか？
→抗生物質の探索はリスクが大きすぎる？
・メタゲノム情報内に存在するoriを高精度に予測する技術が欲しい。現状でもゲノムシーケンスからoriを予想できる。
→これをメタに拡張したい

本技術に関する知的財産権
発明の名称：希少微生物の選択的培養方法,出願番号：特願2021-045341,
出願人：国立高等専門学校機構, 発明者：木村善一郎
お問い合わせ先： 国立高等専門学校機構 本部事務局 研究推進課
TEL 03-4212-6832 e-mail KRA-contact@kosen-k.go.jp