2020 年度研究助成報告書

脳梗塞後と脳出血後における理学療法効果の比較検証による脳卒中病型別理学療法の開発

1

対象と方法
1．実験動物と実験群
本研究には，Wistar 系雄性ラット（n=15）を用いた。
全ラットは 12 時間の明暗サイクルの下，餌と水を自由摂取できる標準ケージで飼育した。すべての処置は新潟1）

玉越敬悟（PT）

医療福祉大学動物実験委員会の承認（承認番号：26021）を得て行った。実験群には偽手術群（n=14）
，脳出血群

1）

新潟医療福祉大学リハビリテーション学部理学療法学科（n=14），脳梗塞群（n=14），脳出血＋運動群（n=14），
脳梗塞＋運動群（n=14）を設けた。

キーワード：脳出血，脳梗塞，運動介入
2．脳卒中モデルラットの作製
はじめに

ペントバルビタールナトリウム腹腔内投与麻酔下に脳卒中は，我が国における死亡の原因として悪性新生て，ラットを脳定位固定器に固定した。頭部の皮膚を切物，心疾患，肺炎に次いで第 4 位である。また，要介護開して頭蓋骨を露出させた後，ドリルでブレグマ縫合状態に至る原因としては認知症に次いで多い。脳卒中から左外側 3.6 mm の位置に小穴を開けた。ステンレスは，脳出血および脳梗塞に大きく分類される。脳梗塞で製カニューレを頭蓋骨表面から深度 6.0 mm まで挿入しは，脳血管の閉塞により脳血流量が低下し，虚血状態がた。脳出血モデルラットの作製には血管壁を脆弱化させ持続することによって脳損傷を引き起こす。一方，脳出るコラゲナーゼ（TypeIV，200 U，2.0 ul，Sigma 社），血は，脳血管の破裂によって脳内の血腫が脳損傷の要因

脳梗塞モデルラットの作製には血管を攣縮させるエンとなる。このように脳梗塞と脳出血では病態の発症機序

ドセリン -1（400 pmol，2.0 ul，Calbiochem 社）を，マが異なるため，機能予後も異なる。脳卒中モデルラット

イクロシリンジポンプ（Eicom 社）を用いて 0.2 µ l/minを用いた基礎研究では，損傷部位を大脳皮質と線条体にの流速で 10 分間注入した。注入終了後，切開した頭部限局し，同程度の大きさの脳損傷を呈した脳出血ラットの皮膚を縫合し，切開部を消毒した。と脳梗塞ラットの自然回復における運動機能回復を比較検証した研究があり，その研究では脳出血の方が脳梗塞
1）

3．運動機能評価より機能回復が早いことが示されている 。線条体に限運動機能評価には Rota-rod test を使用した。5 分間局した同程度の大きさの脳傷害をもつ脳出血モデルラッ

で 40 rpm まで加速回転する円柱の上にラットを乗せ，トと脳梗塞モデルラットを比較検証した報告において円柱から落下するまでの時間を計測した。個体あたり 5も，脳出血は脳梗塞と比較して機能回復が早く，脳萎縮回実施し，平均値を算出した。の進行が遅いことが示されている

2）。また，同程度の脳傷害を負った脳梗塞と脳出血の患者にリハビリテーショ

4．組織学的評価ンを行い，機能回復の程度を比較した臨床研究では，脳術後 29 日目に深麻酔下にて 0.9% 生理食塩水で経心的梗塞患者の機能回復は脳出血患者と比較して遅いことがに脱血を行った後，4% パラフォルムアルデヒドで灌流

3‒5）。このことから，脳出血と脳梗塞では固定を行った。脳組織を採取し，同溶液で後固定を行っ脳内改善機序が異なり，リハビリテーションによる効果た。ブレグマを起点に前方 +1.4 mm から 500 um ごとも異なる可能性があると考えられる。しかし，脳卒中ガに 6 枚の凍結切片を作製し，クレシルバイオレット溶液

イドラインでは，病型別リハビリテーションは推奨グを用いて染色を行った。画像解析ソフト ImageJ を用い

レードが低く，病型別に治療方針を記載していないたて傷害体積およびペナンブラ体積を解析した。また，蛍め，病型別リハビリテーションの治療方針を策定する必光免疫組織化学染色法を用いて GFAP（glial ﬁbrillary

要があると考えられる。

acidic protein）陽性細胞を標識した。解析範囲は，ペ示されている

我々はこれまでの研究で，脳傷害の部位や大きさを統一化させた脳梗塞と脳出血のモデル動物を開発した。そナンブラ領域の平均範囲とした。GFAP 陽性細胞数のカウントは ImageJ を用いた。

して，両者の運動機能障害を比較検証したところ，脳梗塞と脳出血は自然回復過程が異なることを明らかにし

5．タンパク発現量解析2）
た 。しかし，病型別理学療法の開発には至っていない

ラットを深麻酔下におき，生理食塩水を用いて灌流脱ため，本研究では傷害の部位と大きさを同程度にした脳梗塞と脳出血のモデル動物を用いて，同運動療法の効果血を行った後，脳を採取し，on ice にて線条体をトリミングした。採取した組織は急速凍結後に ‒ 80℃の超低温を比較検証することを目的とした。

冷凍庫で保存した。タンパ発現量解析にはウェスタンブロッティング法を用いた。はじめに，Protein inhibiterを含んだ RIPA buﬀer 内で組織のホモジナイズを行い液22020 年度研究助成報告書状化した。その後，Biospec-nano（SHIMADZU）で総タGFAP 発現量がペナンブラ領域の縮小に関与している可ンパク質濃度を測定した。全サンプル 10 ng 量のタンパ能性が高い。一方，脳出血後にトレッドミル運動介入をクを電気泳動装置で分離した後，PVDF（poly vinylidene

実施した群では，運動機能の改善および GFAP 陽性細di-ﬂuoride）膜にブロッティングした。抗 PSD95 抗体を胞数に変化は見られなかった。Caliaperumal らは，出用いて標識し，化学発光により発現量解析を行った。発血発症 7 日後から 2 週間のリーチトレーニングは血腫周現量解析には画像解析ソフト imageJ を用いて行った。

囲の GFAP 陽性細胞数を変化させないことを報告している

6．統計学的手法8）。そのため，本研究の結果と類似しているといえる。しかし，本研究では，脳出血，脳梗塞ともに運動介

Rota-rod の結果は，二元配置分散分析および Turkey

入によって PSD95 発現量の変化が見られなかったため，法にて統計処理を行った。組織損傷体積，GFAP 陽性細シナプスへの影響はなかった可能性がある。アストロサ胞数，PSD95（postsynaptic density protein 95）タンパ

イトによる脳内改善機序への関与についてさらなる検証

ク発現量の結果は，一元配置分散分析および Turkey 法が必要であるが，本研究から脳出血と脳梗塞では，運動にて統計処理を行った。

介入による脳内改善機序が異なることが示唆された。

結文

果発症 28 日目において，脳出血群および脳出血＋運動群の運動機能障害は脳梗塞群と比較して有意な改善を認めた。脳出血＋運動群および脳梗塞＋運動群は，それぞれの対照群と比較して運動機能障害の有意な改善は見られなかった。組織損傷体積は全群間に有意差はなかった。
しかし，脳梗塞＋運動群のペナンブラ体積は脳梗塞群と比較して有意に低値を示した。脳梗塞＋運動群の GFAP
陽性細胞数は脳梗塞群と比較して増加傾向にあった。
PSD95 タンパク発現量は全群間に有意差はなかった。
考察
本研究は，脳損傷を同部位，同程度の大きさにした脳梗塞モデルラットと脳出血モデルラットを用いて同運動条件の介入効果を検証した。脳梗塞および脳出血ともに運動介入による運動機能改善効果は認められなったが，脳梗塞ではペナンブラの縮小と GFAP 陽性細胞数の増加が認められた。ペナンブラ領域は，血流量が低下しているが神経細胞死を免れている細胞もあり，運動によって改善を期待できる領域である。先行研究では，ペナン
ブラ領域周辺の回復は脳梗塞の機能回復に寄与しているといわれており，特に，GFAP 発現量の増加が機能回
6）復に関与していることが報告されている 。また，梗塞巣周囲のアストロサイトが血管のリモデリングを促進させ，脳卒中後の機能回復促進に関与している可能性が示
唆されている

7）。そのため，運動介入によって増加した

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