３－１－２タンパク質の３次元構造を観る
概要

DNA やタンパク質など生体高分子の立体構造情報は，近年飛躍的に蓄積されてきています．
ここでは，これらの分子構造について，無料ソフトを用いて表示・操作などをする際のガイドを，簡単なアニメーション作成等いくつかのテーマに絞ってまとめました．視覚的にそれらの知的資源を最大限に活用したり，研究の様々な場面でのプレゼンテーションに用いたりするために，尐しでも参考になればと思います．
＞1 行ｱｹﾙ＜

１．はじめに，Protein Data Bank（以下 PDB, http://www.rcsb.org）
生体高分子（タンパク質，DNA，RNA，それらの複合体など）の３次元構造座標データは，このサイトで入手することができます．タンパク質というほど長くないインスリンなど，アミノ酸が数十残基のペプチドも含まれています．以前は理論計算モデルの登録も受け付けていましたが，現在は X 線・電子線結晶解析や核磁気共鳴（以下 NMR）などの実験から得られたものに限られています．英語のサイトはまだちょっと・・，という方には，日本で管理されている PDBj（http://www.pdbj.org/index_j.html）からもアクセスできます．
ダウンロードするファイルはいろいろな形式から選べますが，通常は PDB テキスト形式を選択します．すると，“英数字４文字.pdb”というファイル（以下 PDB ファイル）が保存でき，これを自分のＰＣ上で様々なソフトを使って利用するわけです．この英数字４文字コー
ドは，PDB ID と呼ばれるもので，生体高分子の立体構造解析の論文にはこれを記載することが義務付けられています．一方 PDBj からダウンロードすると，同じ PDB ID のファイルが，pdb+PDB ID.ent という名前になっていますが，中身は PDB ID.pdb と同じです．
おそらく最も厄介な問題は，例えば単純に myoglobin（ミオグロビン）という名前で簡易検索（PDB ID or keyword）すると３００個ほどヒットするので，どれを見ればいいのかわからない，といったことかもしれません．これらの違いには，変異導入の有無・種類，タンパク質の環境，結合している成分など，様々なものがあります．欲しい構造の PDB ID が分からない場合は，とりあえず名前の簡易検索結果を構造解析の分解能で並べ替えて上から（高分解能側から）見ていくのも一つの方法です（分解能での並べ替えは PDBj にはないようです）．
単に構造をちょっと眺めたいだけであれば，特にファイルを手元に保存しなくとも，PDB やPDBj のサイト上で３次元表示させることもできます．

２．使用するソフトとハード
２．１

ソフト

PDB ファイルを読み込むことのできるフリーソフトには様々あり，PDB サイトの Molecular
執筆者 生命科学科 教授 岡田哲二（tetsuji.okada@gakushuin.ac.jp）
生命科学科 助教 川元‐尾崎洋子 （yoko.ozaki@gakushuin.ac.jp）
物理学科 学生 後藤孟平（06041017@gakushuin.ac.jp）

Graphics Software Links には３０以上がリストアップされています．ここでは構造解析を専門とされない方々向けに２つを取り上げます．

２．１．１

Swiss-PdbViewer 4.0.1（以下 SPDBV，http://spdbv.vital-it.ch/disclaim.html）

Windows, Mac とも対応しています．上のアドレスにアクセスして免責事項に同意すると直接ダウンロードページに進みます．圧縮ファイル（.zip）を保存・解凍してできるホルダー
内に実行ファイル（Windows では spdbv.exe）が作成されますので，特にインストールは必要ありません．

２．１．２

Discovery Studio Visualizer 2.5（以下 DSV，http://accelrys.com/products/discovery-studio/visualization/index.html）
Mac には対応していません．上のアドレスにアクセスし，連絡先等を入力すると，メールでダウンロード情報が送られてきますので，プログラム本体（約１２０ＭＢ）と ActiveX コントロール（約２５ＭＢ）のセットアップファイルを使ってそれぞれインストールします．
（注）DSV は製品版の一部でもありますが，その購入を推奨するものではありません．SPDBV
は，東海大学の岡本明弘先生により日本語のマニュアルが作成されています（http://www2.ncc.u-tokai.ac.jp/okamoto/info/index.html，ここには RasMol という汎用ソフトのマニュアルも掲載されています）

図１．SPDBV ツールバー（Windows での表示）

２．２

ハード

分子量の大きなタンパク質などの構造を３次元グラフィックスで操作する場合，ＰＣの性能によっては動きが遅いなどの不都合が生じるかもしれません．参考までに，このガイドを作成する際に構造表示やアニメーション動作の確認などを行ったＰＣの簡単なスペックを記載しておきます．
（１） ＯＳ： Windows Vista Home Premium 32bit， プロセッサ： Intel Core 2 Duo Mobile
Processor P8600 (2.4 GHz)，

メモリ：

3 GB，

グラフィックス：NVIDIA

GeForce 9300M GS（２） ＯＳ： Windows Vista Enterprise 32bit， プロセッサ： AMD Turion X2 Dual-Core
Mobile Processor RM-70 (2.0 GHz)， メモリ： 2 GB， グラフィックス： ATI
Radeon HD3200

参考文献2[1] Guex, N. and Peitsch, M.C. (1997) SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: An environment
for comparative protein modeling. Electrophoresis 18, 2714-2723.

３．PDB ファイルの基本
３．１

ファイルの構成

PDB ファイルの中身はワードパッドなどテキスト表示・編集ソフトで見ることができます．
あるいは，SPDBV を起動してツールバー（図１）のメニューで File→Open PDB File としてファイルを読み込み，ツールバー左下のマークをクリックすればテキスト表示されます．１行目（HEADER）から様々な付随情報が記されて（これらの座標情報前の行の全てをまとめて HEADER 部分ともいいます），次に ATOM 行として実際の座標データが原子の数だけ続きます．１つのポリペプチド鎖，ポリヌクレオチド鎖は，末端の原子座標の次にある TER 行で区切られています．
各 ATOM 行は，左から原子の通し番号，原子タイプの分類，アミノ酸（またはヌクレオチドなど）の種類，の次に ChainID が示されていて，インスリンのように２本のポリペプチド鎖でできている場合には，ここに A か B と示されています．２本鎖 DNA の場合も同様です．
続いてアミノ酸（またはヌクレオチドなどの）番号，３つの座標値，占有率，温度因子，と並んでいます．図２の例は，1BRX.pdb という PDB ファイルの座標データ開始部分ですが，アミノ酸配列の１番目から５番目までの構造が欠けていて、６番目のアミノ酸であるグリシンから始まっていることがわかります．

図２．PDB ファイル中の座標データ

因みに ChainID は糖鎖などにも付けられますが，その場合には ATOM 行が全て終わったあとに HETATM 行としてまとめて書かれています．この HETATM 行は，アミノ酸・ヌクレオチド以外の成分全て（結合低分子、イオンなど）に用いられます．HETATM の内容がどのような成分か，ということは HEADER 部分に記載されています．また PDB サイトの各構造ファ
イルのメインページの下の方にも Ligand Chemical Component としてリストアップされているので確認できます．但し，水分子も HOH という名前で HETATM に含まれますが，リストには記載されません．
NMR による構造の場合は複数モデルのアンサンブルとしてまとめられているので，ATOM行の前に MODEL 行があって番号が付けられており，最後の原子座標の次の ENDMDL 行までが１つのモデルです．
3３．２

Biological Assembly（または Biological Unit）

結晶解析による PDB ファイルの場合には， “非対称単位（Asymmetric Unit）”という部分が登録されるため，実際に機能する会合状態（Biological Assembly，以下 BA）との対応関係に注意が必要です．PDBj には見当たりませんが，PDB の方には，ダウンロード項目の中に，BA として作成されたものが用意されています．但し，圧縮ファイル（.gz）形式のみですので解凍ツール・操作が必要です．BA に２種類選択肢が用意されている場合は，非対称単位が BA を２つ含んでいることを意味します．この２つのモデルは必ずしも同一ではありませんので，できれば重ね合わせるなどの構造比較をしてから一方を選択した方がよいでしょう．
（注）PDB サイトで BA とされているものが必ずしも正しくない場合もあります．

４．構造表示と比較（インスリンの場合）
まず一例として，インスリンのＸ線解析モデル（PDB ID: 3e7z）を取り上げます．この PDB
テキストファイル 3E7Z.pdb にはインスリンの BA（ポリペプチド鎖が２本）が２つ含まれています．従って，BA の圧縮ファイルも 3E7Z.pdb1.gz と 3E7Z.pdb2.gz の２つあり，各々を解凍したホルダー内から 3e7z.pdb1 と 3e7z.pdb2 が得られます．これらの名前を 3e7z1.pdb と3e7z2.pdb などと付け替えて，拡張子を.pdb にします．
ここで SPDBV を立ち上げて，まずメニューの Prefs→Loading Proteins に進み，読み込み設定をします．

図３．SPDBV の構造読み込み設定

図３のウィンドウで，Magic Fit onto…をチェックすると，連続して読み込んだ２つの構造の重ね合わせを自動的に行ってくれます．Center It も有効にしておけば，２つの重ね合わされ4たモデルが画面の中心に表示されます．
また，Default Appearance や Colour を変えておけば，構造が見やすくなります．ここでは，Carbon C-alpha Trace と B-Factor を選んでおきます．これらは，ポリペプチド主鎖をα炭素原子の繋がりのみとして表示し，各原子を温度因子で色分けするという意味です．

図４．２つの構造の自動重ね合わせ結果

次に File→Open PDB File で 3e7z1.pdb と 3e7z2.pdb を続けて開くと，図４のようになり，微妙に構造が異なっているのがわかります（背景色は，Prefs→Colors の Background 設定で白くしてあります）．温度因子は構造の不確定さの目安となるもので，青色の度合いが強い（数値が小さい）方のモデルがベターといえます．また，必ずしも本来ポリペプチドを構成する全てのアミノ酸・原子が構造に含まれているとは限りませんので，欠けている部分が尐ない方がよいでしょう．但し、よほど高分解能解析（１Å程度）の構造でない限り、水素原子は通常含まれていません。
（注）3e7z には ATOM 行ごとに ANISOU 行という異方性温度因子の情報が付随していますが，色分けに使う温度因子は ATOM 行中の等方性温度因子を指しています．また，3e7z1.pdbと 3e7z2.pdb は各１つずつのモデルしか含まれていませんが，MODEL/ENDMDL でくくられているために，ファイルを開く際に複数モデルがあるかのようなメッセージが出ます．因みに，このメッセージは SPDBV で主に NMR による PDB ファイルに含まれている複数モデルを表示させるときに機能するものです．

５．簡易ホモロジーモデリング
５．１

アミノ酸配列の自動差し替え

次に SPDBV の機能を使って，自分が興味のあるタンパク質のアミノ酸配列を，相同性のある構造既知のタンパク質に当てはめ，簡単なホモロジーモデリングを行ってみます．まず，上記の要領で，Default Appearance を Backbone+Sidechains に戻し，側鎖も表示されるように5しておきます．次にモデル化したいタンパク質のアミノ酸配列ファイルを先に読み込みます．
これは，メニューの SwissModel→Load raw sequence from amino acids を選択し，FASTA 形式ファイルを指定して行います．すると１本の棒状（ヘリックス）構造が表示されます（図５）．
ここでは，プロテオロドプシンという海洋微生物に広く存在する光受容タンパク質のファイ
ル Q9F7P4.fas を用いています（http://us.expasy.org/などでアミノ酸配列ファイルを入手すると，拡張子が.fasta となっていますので，.fas に変えておきます）．全体が赤くなっているのは，温度因子の情報がないためです．

図５．配列を読み込み後

図６．構造読み込み後

図７．配列のモデル化後

次にこれと相同性のあるタンパク質で結晶構造が既知の光駆動プロトンポンプ，バクテリオロドプシンのファイル 1BRX.pdb を読み込むと，図６の右上のように小さく表示されますが，温度因子が全体的に低いので青っぽくなっています ．ここで，２つの配列情報を示す
Alignment ウィンドウが表示されていなければ，メニューの Wind→Alignment を選択します．
すると，横長のポップアップ画面が現れ，上の行に構造未知のタンパク質，下の行に構造既知のタンパク質のアミノ酸配列が１文字表記で示されます．
次に，メニューの Fit→Magic Fit を選択すると，赤い棒が消えて，右上の構造にモデル化された構造が重なって表示され，Alignment ウィンドウも配列合わせの計算結果を示すように変化します（図８）．File メニュー文字の下にあるセンタリングボタンを押して構造を拡大し，回転させると図７のようになります．アミノ酸配列の異なる部位は赤色がはみ出していることでわかります．

５．２

モデルの修正このようにして自動で行われた配列合わせを自分で修正したいときは，Alignment ウィンド
ウ内の動かしたいアミノ酸部位をクリックして，Ctrl キー＋スペースキーでギャップが挿入でき，Ctrl キー＋backspace キーでギャップを消せます．これと連動してモデル構造も変化します．
ここまでで作成されたモデル構造は，特にエネルギー的に最小化されているわけではなく，
6単に既知の構造のアミノ酸配列を差し替えただけなので，随所に原子どうしがぶつかってしまっている部位があり得ます．これは，メニューの Select→Residues Making Clashes を選択す
れば見つけることができます．また，Tools→Energy Minimization を実行すれば，側鎖の向きが動いて多尐ぶつかり合いの数が減尐します．

図８．モデル化後に配列合わせされた状態のウィンドウ（1BRX の配列が自動的に右にシフトして、右側の LA のように上下で一致する部位が多くなるように計算されます）

６．パワーポイントで構造を動かす
６．１

DSV での構造ファイル作成

パワーポイントのコントロール機能を使って，生体高分子構造ファイルをプレゼンテーションの一部として自由に動かすことができますが，この目的には，DSV が適しています．DSV
本体とパワーポイント用の ActiveX コントロールをインストールすれば準備完了です．
まず DSV を起動してメインメニューの Edit→Preferences→Molecule Window→Graphics と進んで Background color を白に指定しましょう（デフォルト設定の黒が好みの場合は不要です）．
次に File→Open で PDB ファイルを読み込みます．ここではミオグロビン（1MBN.pdb）を例にすると，図９の全原子表示になります．この構造表示画面内で右クリックするとポップア
ップメニューが現れ，Display Style を選択して，Atom-Display Style=None， Protein-Display
Style=Flat ribbon，Coloring=Secondary Type，とすると，図１０のようになります．このとき，色は２次構造で分けられていますが，ヘリックスやシート，ターンの同定方法は，Preferences→Molecule Window→Import を選択すれば確認・変更することができます．
ミオグロビンは酸素を結合するヘム分子をもっていますが，Atom-Display Style=None としたので，ヘムも消えてしまっています．そこで，メインメニューの View→Hierarchy を有効にすると，左枠として構造の階層表示が現れます．この中の，Hetatm の文字上をクリック選択
して View→Display Style→Atom-Display Style=Stick とすると，図１１のようになります．ここまでで編集を一旦止めて，File→Save As を選択して.msv 形式で保存します．
（注）この Hetatm にはヘムと結合した OH-イオンも含まれていて，OH154，HEM155 という別々のユニットになっていますが，ここでは簡単のためにまとめて扱いました．

7

図９．全原子表示６．２

図１０．二次構造表示

図１１．二次構造＋ヘム

パワーポイントでの設定

次にパワーポイントですが，DSV の ActiveX コントロールがインストールされていれば，以下の手順で.msv ファイルを読み込めます．
(1)画像を挿入したいスライドを表示する(2)［コントロールの選択］ボタン（金槌とスパナがクロスした絵柄）をクリックする＊このボタンが表示されていないときは，PowerPoint のオプション→ユーザー設定→コマンドの選択，と進んで「すべてのコマンド」の中から［コントロールの選択］をクイックア
クセスツールバーに追加して下さい．
(3)使用可能なコントロールのリストが表示されるので［Accelrys DSVisualizer Control R1］を選択する(4)カーソルが＋になるので，マウスで矩形領域を作成します（始点で左クリック→押しながらマウスを動かし，適当な形にしたらクリック解除）(5)矩形領域の内部で右クリックし，［プロパティ］を選びます(6)［プロパティ］ウィンドウが開くので，［Source］行の右端のボタンをクリックして，.msv
ファイルを指定します．
以上で，図１１の画像がスライド上に現れますから，プレゼンテーションモードに移り，まず構造の近くで１回クリックして，その領域をアクティブにします．あとはクリックしたま
まマウスを動かば回転しますし，マウスのローラーを回せば拡大・縮小，ローラーを押したままマウスを動かせば並進します．簡単な自動回転のアニメーションも，右クリックして現れるメニューで Spin を選ぶだけで実行されます．あるいは(5)と同様に編集モードで，［プロパティ］→［Spin］行を True にしておけば，スライド開始時から回り始めます．次のスライドに進みたいときはカーソルを画像から十分離した位置でクリックします．

７．構造変化のアニメーション
７．１

２つの構造ファイルの交互表示
8タンパク質の働きをイメージするために，やはり形が変わる様子を観てみたいと思うのではないでしょうか．PDB に登録されている構造などから生体高分子の動きを作成したアニメーションを集めたサイトもあります（http://www.molmovdb.org/）．ここでは DSV を使って，がん遺伝子 ras がコードする Ras タンパク質の GTP 結合型（1LF0.pdb）と GDP 結合型（1LF5.pdb）という２状態間の構造変化をアニメーションにして観てみます．因みに、この Ras タンパク質は、GTP を結合しているときに別のタンパク質への活性を示しますが、自らの触媒機能により GTP を GDP に加水分解することで活性を失います。
まず１つめの構造ファイル 1LF0.pdb を File→Open で開いて，次に File→Insert From で，２つめのファイル 1LF5.pdb を指定します．このとき，必ずしも２つめの構造が１つめに重なって表示されるとは限らず，ウィンドウからはみ出てしまっているかもしれません．そこで，２つの構造を Structure→Superimpose→By Residue でフィッティングさせます．あとは，Structure→Animation→Create を選択するだけです．動作の実行には，Structure→Animation→Play とするか，ツールバーの再生ボタン ▶ を押せば，２つの構造が交互に表示されて，活性型－不活性型の構造変化を観ることができます．

７．２

仮想的な中間状態を含めた構造変化の連続表示

更にいわゆる morphing という操作を行って，２つの構造の中間状態を補えば，より連続的な変化として動かすこともできます．
この morphing には，上記の molmovdb サイト内の Morph
Server を利用できます．Ras のようにポリペプチド鎖が１本の場合は，Single chain server を選択して，作りたいフレーム数（初期値８，最大３０まで）と２つの PDB ファイル（または PDB ID）を指定すれば自動的にファイルの作成が開始され，計算が終了するとメールで知らせてくれます．
メール中のリンク先へ行くと，molmovdb サイト内で動いている様子が表示されますが，画面右下部分にデータへのリンク ”Download PDB coordinate file” もあり，movie.pdb.gz という圧縮ファイルとして入手できます．これを解凍すると，movie.pdb ホルダー中に temp.txtというファイルがありますので，拡張子を.pdb に変更します．このファイルには，NMR の構造ファイルと同様に複数（用いた構造１＋指定したフレーム数の中間構造＋用いた構造２）のモデルが MODEL/ENDMDL を区切りとして収められています．
これを DSV で読み込む前に，Edit→Preferences→Molecule Window→Import と進んで，Createanimation from multiple molecules をチェックしておきます．あとはファイルを開いて，上記のように Play とするか再生ボタンを押せば動作します．
（注）この Morph Server では，現在 HETATM の処理が DISABLED になっているので，GTPと GDP は含まないアニメーションになります．因みに、上記のようにして作成したファイルは、molmovdb サイト内の Motion Databases→Movie Gallery に残るので誰でも観ることができます。

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以上のように，２つの別々の PDB ファイルを用いた交互表示，または１つの PDB ファイル中の複数モデルを用いた連続表示のアニメーションを DSV で作成してから，.msv ファイルとして保存すれば，パワーポイント中でこれらのアニメーションを実行することもできます．
基本的な手順は前節６で説明したのと同様で，違いは［プロパティ］で［Animate］行を Trueにすることだけです．あとは，［AnimationPeriod］行の数値を変えることで動きのスピードが調節できます．交互表示には初期値の１０００で問題ないですが，連続表示では遅くなるので１００くらいに下げる必要があるかもしれません．

参考文献[1] W.G. Krebs, M. Gerstein, The morph server: a standardized system for analyzing and visualizing
macromolecular motions in a database framework. (2000) Nucleic Acids Res 28: 1665-75.

８．ステレオ図の作り方
SPDBV に表示されている構造をウィンドウの中心に置いておけば，ステレオ画像として保存することができます．メニューの File→Save→Image(Stereo)を選択するだけです．但し，左右の画像の距離が必ずしも適切になっていないので，別途画像処理ソフトで編集する必要があるでしょう．図１２には，NMR によるインスリンの構造モデル１０個のアンサンブルを示しています（2HIU.pdb）．眠い時のような感じで眺めていると、左右の図がそれぞれ２つに分かれて、内側の２つが重なったときに立体的に見えることでしょう。未経験の方は一度お試し下さい。

図１２．NMR によるインスリン主鎖構造アンサンブルのステレオ図

９．おわりに以上，一般的に興味をもって頂けそうなテーマを取り上げて，生体高分子を立体的に体感するためのガイドと致しました．Mac ユーザーには本章の６割くらいしか参考にならないかと思いますが、どうぞご容赦下さい。
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