（論文要様式３）

旨A Morphological Analysis of Thalamocortical Axon Fibersof Rat Posterior Thalamic Nuclei:
A Single Neuron Tracing Study with Viral Vectors
視床後核群ニューロンの皮質投射：
ウイルスベクターを用いた単一ニューロンの形態学的解析

大野

幸

【序論】
齧歯類において視床後核群(POm)は、後腹側核群(VP)と共に体性感覚情報の伝達に関わっている。POmは脊髄と三叉神経核から入力を受け、大脳皮質の第一次体性感覚野(S1)やその他の領野に投射している。S1 において VP ニューロンの軸索は第４層に明瞭なカラム構造を持ち密な投射をするのに対し、POm は１層と 5 層上部 (5a)に投射することが知られている。また、VP ニューロンは単一ニューロンレベルでの研究においても 4 層に密な投射をするという特徴が示されてきたが、単一 POm ニューロンの軸索投射様式はこれまで明らかにされていない。そこで、本研究ではラットの単一 POm ニューロンを、近年開発されたシンドビスウイルスベクターを用いて細胞体から軸索末端に至るまで明瞭に可視化した後で再構築し、形態学的解析を行った。また、先行研究により calbindin D28K(CB)という化学マーカーを用いて染色した場合 POm は均一の組織ではなく、化学的属性上少なくともさらに２つに分けられることが示唆されていた為、POm 前方と POm 後方に分け両ニューロングループ間の形態学的特徴を比較した。その結果両者の間に差異が認められたので、シンドビスウイルスベクターによる単一ニューロンレベルでの結果を確認する目的で従来から用いられてきた順行性トレーサーの１つである PHA-L(Phaseolus vulgaris leucoagglutinin)を用いて確認実験を行った。
【材料お よび方 法】＜単一の POm ニューロンの解析実験＞
膜移行性シグナルを付加した緑色蛍光蛋白(pal-GFP)あるいは赤色蛍光蛋白(pal-mRFP)を発現するよう遺伝子改変した 2 種類のシンドビスウイルスベクターを適切に希釈して混ぜ、SD ラットの両側の POmに注入し、48–52 時間後にそれらのラットを灌流固定した。取り出した脳を 40µm の厚さで冠状断に薄切した後、切片を蛍光顕微鏡で観察し、POm ニューロンが pal-GFP または pal-mRFP シンドビスウイ
ルスに１つだけ感染しているサンプルを解析の対象とした。感染した細胞体を含む切片を、CB 抗体を用いて蛍光免疫染色し、そのニューロンの CB に対する免疫反応性を共焦点レーザー顕微鏡下に判断した。その後、蛍光 Nissl 様染色をして感染ニューロンの位置を再確認した。次いで pal-GFP またはpal-mRFP に対する抗体と、皮質における層構造とカラム構造を可視化する目的で VGluT2（vesicularglutamate transpoter 2）に対する抗体を用いて、明視野免疫二重染色を行った。全切片を連続的にスライドガラスにマウントし、封入した後、スライドスキャナーで写真をとり、コンピューター上で軸索を再構築した。また、投射軸索の分布について皮質領野・皮質層ごとに長さを測定するなど形態学的な解析を行い統計学的に比較した。
＜PHA-L による確認実験＞
PHA-L を両側 POm に注入し、14 日後に灌流固定し、取り出した脳を 40µm に薄切した。PHA-L に対する抗体を用いて免疫染色をし、マウント封入後、軸索投射量について半定量的な解析を行った。

【結 果 】
＜POm における CB の免疫反応性＞
先行研究にもあるように CB に対する免疫反応性は POm の全領域で陽性であったが、POm 後方のほうが前方に比べてより強い免疫反応性を示した。従って POm は CB に対して弱い免疫反応性を示す前方と中等度の反応性を示す後方の２つの領域に分けられることがわかった。また、今回の研究において全部で１０個のニューロンを単一標識したが、そのうち５個は前方の、５個は後方の領域に位置していた。
＜単一 POm ニューロンの細胞体と樹状突起＞
POm 前方ニューロンと後方ニューロンを比べて細胞体の大きさに有意差はみられなかったが、樹状突起の広がりは前方ニューロンに比べて後方ニューロンの方が内外側方向に大きかった。さらに、樹状突起の分岐の数は細胞体から 20–100µm の位置において POm 前方ニューロンのほうが後方ニューロンに比べて有意に多かった。
＜単一 POm ニューロンの軸索分布＞１）皮質下において、再構築した 10 個全ての POm ニューロンは視床網様核に側枝を出し、線条体には 2/5 の前方ニューロンと、全ての後方ニューロンが側枝を出した。２）皮質における投射領野に関しては、10 個全てのニューロンが S1 に軸索投射をしており、さらに第一次、二次運動野、第二次体性感覚野、島皮質、聴覚野など他の領野にも同時に投射をしていた。また POm 前方ニューロンでは後方ニューロンに比べて狭い範囲に密な投射をしていた。３）次に S1 における投射層に関しては、先行研究にあるように１層と５層への投射が多かったが、１層へは POm 後方ニューロンがより多く投射し、５層へは前方ニューロンがより多く投射している傾向が見られた。そこで、実際にシナプス結合に重要な部位であると考えられている終末様構造（ブトン）の数を算出したところ、POm 前方ニューロンでは 1–6 層に分布している全ブトン数のうち 6.1–38.5% (mean ± SD = 20.6± 14.6%)が 1 層に分布していたのに対し、後方ニューロンでは 40.0–91.7% (64.1 ± 19.4%)が１層に分布していた。この差は t 検定をしたところ p=0.008 で POm 後方ニューロンのほうが有意に多く１層に投射することが示された。
一方、５層に対するブトンの割合は POm 前方ニューロンでは 40.8–54.4% (48.2 ± 6.4%)、後方ニューロンでは 3.9–38.9% (24.7 ± 13.6%)であり、こちらに関しても p=0.016 で有意差が認められた。
＜PHA-L による確認実験＞
PHA-L を、CB 免疫反応性の弱い POm 前方に注入した場合、S1 の 2–5 層、中でも特に 5 層に密な投射が見られたが、CB 免疫反応性が中等度な POm 後方に注入した場合は１層に密な投射が見られた。
さらに、前方と後方の境界領域に注入した場合、投射軸索は１層５層の両方に見られた。これらは、今回シンドビスウイルスベクターを用いて得られた単一ニューロンレベルでの結果を支持する結果であった。
【結論及 び考察 】
今回の研究で、POm は CB 免疫反応性が弱陽性か中等度陽性であるかによって POm 前方と後方の２つに分けられたが、この分類は両グループ間の樹状突起および軸索分布という他の指標にも違いが存在したことにより支持された。また両グループとも大脳皮質における重要なターゲット領野は S1 であるにもかかわらず、前方ニューロンでは S1 の５層へ、後方ニューロンでは１層へより多くの軸索が投射していた。この違いは POm 前方ニューロンと POm 後方ニューロンの体性感覚情報伝達過程における機能的な違いを反映していると考えられる。POm 前方ニューロンは S1 の比較的狭い領域の 5a 層に密な投射をしており、これら軸索のターゲットは 5a 層錐体細胞の基底樹状突起であると考えられ、5a層錐体細胞の主な投射先として線条体が良く知られていることから、POm 前方は運動制御に関わっていることが示唆された。一方、POm 後方ニューロンは皮質１層に多く軸索投射しており、１層には 2/3層及び５層錐体細胞の先端樹状突起が存在していることから、これらの軸索のターゲットは 2/3 層及び５層の錐体細胞と考えられる。さらに、POm 後方ニューロンは１層の広範囲にわたって軸索投射していたため、これら視床から皮質への情報入力は S1 において精緻な情報処理に関わるというよりは、S1 全体を広範囲にわたって活動させる必要が生じたときなどにその役割を果たすのではないか、例えば、POm 後方の少なくともある部分では侵害刺激情報を受けているという報告があることからも、侵害刺激受容時に触覚入力に対する注意を促す働きなどが考えられる。
（Cerebral Cortex, in press）