厚生

省

新薬開発研究費

微生物の二次代謝産物に由来する
難病治療薬（ロイぺプチン）の開発研究
梅沢班

昭和59年度研究報告書

昭和60年3月

研究報告書の作成にあたって「微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプチソ）の開発研究」
が，昭和54年度に厚生省薬務局より新薬開発研究としてとりあげられ・私が班長として本研究班が発足してから第6年度（昭和59年度）を迎え，これを終了した．
本年度（昭和59年度）は前年度までの研究に引き続き，ロイペプチソ・べスダチソ，ホルフェニシノール，アルファメニソ，ホルフェニシソなどにつき活発な基礎研究を行うとともに，ロイペプチソ，べスタチソおよびホルフェニ
シノールの臨床研究を行い，とくにべスタチソについてはSingleblindcrossover法による臨床試験が試みられた・
昭和54年から昭和59年度にわたり施行された筋ジストロフィー症に対す
る低分子酵素阻害物質の生化学的，薬理学的，生理学的，病理学的研究，ならびにモデル動物に対する効果などの広範囲な基礎的研究に注目すべき成果が得られ，また臨床研究において小児患者にベスダチソを投与することにより・治療効果を期待しうる可能性が示唆された・これは剖目すべき成果ということができる．かくして，昭和60年度にはべスタチソの無作為化比較試験およびホ
ルフェニシノールの臨床試験が行われることになった・難病治療薬開発という使命を担った本班は，各班員の努力により，筋ジストロフィー症に対する治療薬開発の門を拓いたということができる・
なお，べスタチソの無作為化比較試験とホルフェニシノールの臨床研究が本
班を縮少して継続されることになったが，極めて適切なことである・ここに，本研究を重要課題としてとりあげられた厚生省薬務局ならびに班員各位に感謝する次第である．
昭和60年3月
班
−■

l

￣￣■

長

梅

沢

浜

夫

目

次

ⅰ

研究報告書の作成にあたって

梅

沢

浜

夫

総括研究報告微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプチン）
の開発研究

3

梅

沢

浜

夫

分担研究報告ロイペプチンのプロテアーゼ阻害作用に関する研究

17

村

地

孝

螢光HPLCによるp‑ヒドロキシベスタチンとフォルフェニシノールの高感度定量法

25

大

倉

洋

甫

酵素網の動的平衡に及ぼすベスタチンの効果

37

青

柳

高

明

急性脊髄損傷に対するロイペプチンの効果

47

岩

崎

祐

三

ロイペプチンの薬理学的研究

53

大

ⅲ

塚

正

徳

ジストロフィー筋よりのcreatine kinase(CK)遊離に対する各種薬

剤の影響

65

高

木

昭

夫

Mdxマウスに対するロイペプチン,ベスタチンの投与成績

71

埜

中

征

哉

鶏ジストロフィー筋における新生児型構造蛋白質の出現─ベスタチ

ンの投与と除神経の影響

77

丸

山

工

作

筋ジストロフィー症マウスに対する高濃度べスタチンおよびアルファ

メニンB投与の効果

89

松

下

宏

体外受精法によって作出されたC57BL/6‑dyホモマウスに対する
ベスタチンおよびロイペプチン投与の影響

95

野

村

達

次

筋疾患に対するベスタチンの長期投与を中心に

99

村

上

慶

郎

DMD患者に対するべスタチン服用の臨床的検討について

105

三吉野 産 治Duchenne型筋ジストロフィー症(DMP)に対するベスタチンの使用経験─臨床的立場から

111

福

山

幸

夫

血清CPKの変動に対するベスタチンの効果

121

木

ⅳ

下

真

男

Duchenne型筋ジストロフィー患者に対するベスタチンの影響
127

─新しい筋障害のmarkerを用いて
祖父江 逸 郎筋ジストロフィー症に対するNK 421 (Bestatin)長期投与後の

経過報告

135

里 吉 栄二郎

ホルへニシノールの体内動態研究

143

松

本

郁

男

ロイペプチンおよびべスタチンの難病治療薬としての開発研究

155

田

中

亘

滝

田

智

久

石

井

靖

男

微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプチン）開発研究班分担研究者一覧

183

ⅴ

総

括

研

究

報

告

微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプチン）の開発研究主任研究者 梅沢浜夫

梅沢浜夫らは微生物がつくる低分子の酵素阻害

ルフェニシンを連続投与し，経時的に筋肉内の酵物質という新しい研究領域を開拓し，薬理活性を

素網の動態を調べた結果，アミノペプチターゼを有する50以上の阻害物質を発見し，世界の注目含む水解酵素活性が抑制されているという発見でを集めている．

も支持された．

これらの阻害物質の一つであるロイべプチソが，ベスタテンは癌治療の目的で詳細な前臨床試験

筋ジストロフィーマウスの発症および症状の進行が行われていたが，Duchenne型患者は小児であを阻止することを米国ニューヨーク州立大学のるので，さらに前臨床試験を行い臨床研究が始め

Stracber博士が発見した．ロイペプチソは筋蛋白られた．臨床研究においては，すでに症状の進行の崩壊に関与するセリソ・チオールプロティナー

した症例には，治療効果を望むことは難しいが，ゼを阻害するため，試みられたわけである．

Duchenne型のような遺伝的疾患には，生後速やかくして，ロイペプチソについては外国で臨床

かに細胞膜に作用する酵素阻害物質を投与するこ研究が計画され，本班の設立とともに，ロイべプとにより，治療効果を期待できる可能性が示唆さ

チソの毒性試験を含む前臨床研究を詳細に行い，れた．筋ジストロフィー症の治療に大きな光を与安全な経口投与量を設定した．

えたということができた．ベスタチソについては，

一方，梅沢らは細胞膜に結合する微生物代謝産

なお投与量，投与方法などを検討し効果を確かめ物の研究を始め，べスタチソ，ホルフェニシンな

るには最低3年の研究が必要である．また，ホルどを発見した．

フェニシノールなどの研究も行うべきであると考える．

すなわち，細胞膜に存在することを明らかにしたアミノペプチダーゼ，アルカリホスファクーゼ，本研究班はロイペプチソおよびベスタチソなどェステラーゼなどに対する阻害物質を土壌放線菌の筋ジストロフィー症に対する治療効果を研究す

中に探索し，上記阻害物質を発見したわけである．

るため，6年間にわたり生化学的研究，薬理学的なお，ホルフェニシンは経口投与では分解するの研究，生理学的研究，病理学的研究，製剤学的研で，より安定なホルフェニシノールが詳しく研究

究，前臨床研究ならびに臨床研究を行い，治療薬された．

の早期開発を目的としたが，その一端を完成したと考える．

松下班員によってベスタチソ，ホルフェニシノ

各分担研究者により施行された研究は次のとおールが筋ジストロフィーマウスの発症および症状りである．

の進行阻止に効果があることが確認された．青柳

1）村地 孝（京都大学医学部）：−ロイペプ

班員が筋ジストロフィーマウスにベスタチソ，ホ−3−

チソのプロテアーゼ阻害作用に関する研究

チソ長期投与後の臨床経過

2）大倉洋甫（九州大学薬学部）：一蛍光HPLC

17）松本郁男（万有製薬搾式会社）：−ホルフェニシノールめ体内動態研究

によるクーヒドロキシべスタチソとホルフェニシノールの高感度定量法18）、田中3）青柳高明（微生物化学研究所）：一酵素網亘・滝田智久（日本化薬株式会社）：−ロイペプチソおよびベスタチソの難病治の動的平衡におよはすべスタチソの効果療薬としての開発研究

4）岩崎祐三（東北大学医学部）：一急性脊髄次に上記各斑点の研究報告について要約する．

損傷に対するロイペプテンの効果
5）大塚正徳（東京医科歯科大学医学部）：−

1・ロイぺプチンのプロテアーゼ阻害作用に関

ロイペプテンの薬理学的研究

する研究6）高木昭夫（虎の門病院）：−ジストロフィ

村地班員はロイペプチンによって特異的阻害をー筋よりのCK遊離に対する各種薬剤の影響受ける酵素としてカルパインを選び，その諸性質

7）埜中征哉（国立武蔵療養所神経センター）：に，特に触媒作用特性および組織分布に関する研−mdxマウスに対するロイペプチン，べスタチ究を行った．

ソの投与成績

低Ca2十要求性カルパインⅠはブタ赤血球より，

8）．丸山工作（千葉大学理学部）；−鶏ジスト

また，高Ca2＋要求性カルノミインⅡはブタ腎臓よLPフィ十筋における新生児型構造蛋白の出現

りそれぞれ均質標品として精製した．

．9）松下 宏（和歌山県立医科大学）：一筋ジ（1）カルパインⅠおよびⅡの触媒作用特性

ネトロフィーマウスに対する高濃度べスタチソお数種オリゴペプチドの加水分解作用点を比較しよびアルファメニソB投与の効果た結果，両酵素ともに，Pl位置にはメチオニン，．10）野村達次（実験動物中央研究所）：−体外

チロシソ，リジン，またはアルギニソのようなか

受精法により作成したC57BL−dy／dyマウスにさ高い残基を，そしてP之にはロイアンまたはバ

対するベスタテンおよびロイペプチソ投与の影響

リソ残基を特に好む特性のあることが知られた．

￣11）村上慶郎（国立療養所箱根病院）：−ベス

さらにSucTLeu−Met−MCA始め数種のメチルク

タチソの長期投与を中心としてマリルアミド基質を合成し，それらを用いた蛍光▼12）三吉野産治（国立療養所西別府病院）：−

測定法によってgm，点…値を計測することがで

DMD患者に対するべスタチソ服用の臨床的検討

きた．また，合成基質を用いて，ロイペプチンおについてよびアンチパインのカル／くイン阻害作用が明瞭な

・13）福山幸夫一（東京女子医科大学）：−Duch−

競争阻害であること，また，−ロイペプテンのほう

enne型進行性筋ジストロフィー（DMP）症に対が3分の1ないし4分の1小さいKIを示すこと

するべスタチンの使用経験一臨床的立場から−を明らかにした．

．14）木下英男（東京大学医学部）：−運動負荷（2）カルパインⅠおよびⅡの免疫組織学的分後の血清CK上昇に対するベスタチソ投与の影響

布15）祖父江逸郎（国立療養所中央病院）：−

それぞれの酵素の80kDaサブユニットを免疫

Duchenne型筋ジストロフィー患者に対するべス

原として特異抗体を作製し，・これによって両酵素

タチソの影響の各組織細胞における分布を明らかにすることが16）里吉栄二郎（国立武蔵療養所神経センタできた．ベルオキシダ」ゼまたは蛍光標識抗体にー）：−各種筋ジス．トロフィ，−症に対するベスタ

よる検索の結果では，ブタまたはラット肝，腎．

−

4

−

微生物二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイべプチソ）の開発研究

筋肉，小腸等におけるカルパインⅠとⅡの分布に量法を開発した．血柴100／上Jおよび赤血球50／JJ

は大差のないこと，いずれの組織でもカルパイン

中のFcnolは，アセトニトリルで除蛋白後，直ちは実質細胞の細胞質にdiffuseに分布しているこに，Unisil／NH℡カラムおよびアセトニトリルととが知られた．

75mMクエン酸塩緩衝液（pH3．5）（3：1，Ⅴ／v）
からなる溶難波を用いたHPLCによって分離，

2．蛍光HPLCによるp一ヒドロキシベスタチ

蛍光検出された．この方法によって，血奨およびンとホルフェ二シノールの高感度定量法

赤血球にそれぞれ65pmol（13ng）／mJおよび大倉班員は血清中からペスタチソの主代謝物で160pmol（32ng）／ml以上の濃度で存在するあるクーヒドロキシべスタチソを，また血簗およFcnolを，12分以内に妨害物質と分離し，定量

び赤血球からホルフェニシノールを，それぞれ蛍した．この方法は，58年度に提出したFcnolの光HPLCにより高感度で定量する方法を確立し蛍光誘導体化HPLCよりも，前処理が極めて簡た．

便でかつ15倍はど感度も高い．

1）プレカラム蛍光誘導体化による血清クーヒ
3．酵素網の動的平衡におよぽすべスタチンのドロキシべスタチソのHPLC定量法：べスタチ

効果

ン（Best）の主代謝物であるクーヒドロキシべスタ
チソ（クーOH Best）の選択的蛍光誘導体化条件を

青柳班員はべスタチソの作用枚序を明らかにす

検討し，そのHPLC定量法を開発した．血清るために，べスタチソにより誘起される臓器内お200mgを試料とし，過塩素酸で除蛋白後，CHC18

よび血清中の酵素網の動態について研究を行った．
べスタチソほICRマウスに30存在下KOH溶液中70〇Cで8分間加熱し，クーOH

日間連続授与Bestのフェノール性水酸基のオルト位にホルミ

し，経時的に屠殺した臓器内の酵素網の動態ならル基を導入した．直ちに，その反応液を酢酸酸性

びにべスタチソを筋ジストロフィー患者に連続授（pH3．3）に導き，アルデヒドの蛍光試薬DDB

与した前後の血清中における酵素網の動態についを加え，H202存在下700Cで10分間加熱するこて検討した．
べスタチソ〔（2S，3R）AHPA−（S）−Leu〕投とによって，クーOH Bestの蛍光体を得た．この蛍光体は，TSKgelODS−120Tカラムおよびア

与群のマウス碑，腎で特徴的な変化が認められ，

セトニトリルと50mM酢酸Na・HCl緩衝液（pH一定な律動性を有する酵素活性の振動が認められ2．2）（9：41，Ⅴ／v）からなる溶離液を用いたHPLC

た．一方不活性体〔（2R，3R）AHPA−（S）−Leu〕

によって分離，蛍光検出された．このHPLCにではランダムな振動を示すだけであった．この結よって，Bestを経口授与した健常人および筋ジス

果はべスタチソが生体内の酵素網にシンクロナイ

トロフィー患者血清中のその代謝液クーOH Best

ズ効果を与え，細胞機能の変化を誘起したことをを定量した．クーOHBestの蛍光体は保持時間5．5

示唆する．

分に，妨害血清成分は32分以内にそれぞれ分離

また，患者血清中における酵素網の動態はべス

溶出する．♪一OH Bestの検出下限は，血清中62

タチソ投与群では，アミノペプチダーゼA（AP−

PmOl（20ng）／mlである．

A），AP−B，カルポキシペプチダーゼB（CP−B），

2）自然蛍光検出による血祭および赤血球ホル

アルカリホスファクーゼ，エステラーゼ活性が有

フェニシノールのHPLC定量法：ホルフェニシ

意に低下することを兄い出した．有意な変化を示

ノール（Fcnol）が発蛍光性であることを兄い出さない酵素においても，投与群と非投与群で異なし，この自然蛍光を検出するFcnolのHPLC定った振動が見られた．多変量解析により，この変

・一一15

−〔・

動を検討した結果，べスタチソほヒト体内の酵素

ソ25mg／kgを手術当日より1日2回連続投与し網にシンクロナイズ効果を与え，マウス臓器におた（3日日以降，半量に減量）．単位面積（5．174

ける知見と煩似した結果を得た．

×10￣2mm2）当りの変性軸索の占める割合は，対ベスタチソは細胞膜に作用するとともに，オリ照群（7匹）の28．4±0．77％（mean±S．E．）にゴペプチドの代謝に影響を与え，また間接的に蛋

対し投与群（10匹）では23．6±0．40％で，投与

白代謝全般に効果をおよはし，免疫担当細胞を含群で有意（♪＜0．001）に減少していた．

む細胞機能に変化をひき起すと考えられる．また筋ジストロフィー患者血清中の加水分解酵素活性

5．ロイベプチンの薬理学的研究にも，明らかな変動を与えるので，今後症例を増大塚班員はロイペプテンの薬理学的研究を行っやして検討する必要があると考える．

た．
1）ロイペプチソの平滑筋に対する作用

4．急性背髄損傷に対するロイベプテンの効果

a）ネコの大腿動脈ラセソ状条片標本にノル

岩崎班員は急性脊髄損傷に対するロイペプチン

アドレナリンを投与し，収縮力がプラトーに達しの効果に関する研究を行った．

た後，100〜400／唱／mJのロイペプチンを加えたと筋組織のみならず，中枢神経組織の損傷に対する蛋白分解酵素阻害剤の効果を検討してきたが，ころ，最大35％に達する収縮力の減少が認められた．

今回は，急性脊髄損傷でみられる軸索の変性がロb）モルモットの気管ラセソ状粂片標本におイペプチンの投与により有意に抑制し得ることをいて200／堵／mJのロイペプチンは，アセチルコリ

実験的に証明し得たので報告する．

ンによる収縮を増強した．

脊髄伝達路を構成する軸索の主要な細胞骨格系

2）交感神経節に対する作用の一つであるNeurofi1amentが脊髄損傷に際し昨年度，副交感神経節においてロイペプチソが高度に破壊されること，また，この破壊にはカルアセチルコリンの速い脱分極作用を抑制し，それシウム依存性プロテアーゼの関与が大きいことがに続く遅い時間経過の脱分極を増強することを報示唆されている．

告した．本年度はモルモット下腸間膜動脈神経節

脊髄損傷に対する薬物療法の効果判定の困難性において実験を行った．神経節細胞から細胞内記はしばしば指摘されている．われわれは，軸索終録を行い，アセチルコリンを圧パレスにより適用

末の初期変性をFink−Heimer法により組織化学

すると速い時間経過の脱分極と，これに続く遅い的にとらえ，これを自動画像解析装置により計測，

時間経過の脱分極とが発生した．括抗薬を用いた

脊髄損傷に伴う軸索変化の程度を定量的に表現す

分析によって，前者はニコチン作用，後者はムスる方法を新たに開発し，この実験系を用いてロイカリン作用であることが分かった．ロイペプチソ

ペプチソの薬効を判定した．

はアセチルコリンのニコチン作用を抑え，ムスカ

成熟ラットの第9，10胸椎の推弓を切除，脊髄リソ作用の時間経過を延長させた．

を一定圧で30秒間圧迫することにより脊髄損傷

3）摘出脳幹一脊髄一肺標本に対する作用を作製，これに伴う脊髄下行路の変性を検索する

新生ラットの摘出脳幹一脊鉱一肺標本を用いて実ため，術後7日目に第6腰髄のFink−Heimer染験を行った．空気を気管から入れて肺を拡張させ色を行い，RexedのLamina VIIIにおいて変性

ると一経過に呼吸の抑制が起った．この反射性呼軸索終末の占める面積をルーゼックス5000画像

吸抑制はロイペプチソ200／堵／mJを脳幹側に与え解析装置により計測した．実験群にはロイべプチても，また肺側に濯流適用しても影響を受けなか

−

6

−

微生物二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイべプチソ）の開発研究的であり，1指標として考えられた．この現象にった．

影響を及ぼす薬剤は発見されなかった．

4）脊髄運動ニューロンに対するべスタチソの効果

7．mdxマウスに対するロイぺプチン，ぺス

ラットの脊髄運動ニューロンから細胞内記録を

タチンの投与成績

行い，ベスタチソ20mg／kgを腹腔内に与えた．
Ia群線経の刺激によって内側排腹筋運動ニューロ

埜中鱒員はⅩ染色体性劣性遺伝をとる筋ジスト

ンに発生する興奮性シナプス後電位は軽度に増大

ロフィー（mdx）マウスの筋病変に対するプロテした．

アーゼイソヒビターの効果について研究を行った．
まずmdxマウスの臨床，病理学的特徴を明ら

6．ジストロフィー筋よりのCK遊離に対するかにするため，生後0，5，10，15，20，30，60，
90，120日目にmdxマウスとその対照（C57BL／

各種薬剤の影響高木班員はMDXマウスを用いて，長址伸筋

10ScSn）マウス各々5匹ずつにつき金網よじ登（EDL）からCKの遊離を，各種薬剤をin vivo

り試験，体重測定を行い，ヒラメ筋（赤筋），長指（慢性）に授与して，CK遊離に対する影響を検討

伸筋，前脛骨筋（自筋）を採取し病理学的検索をした．

行った．治療の対象としたのはmdxマウス11匹

ハムスターは筋ジス（BlO14．1）と対照（BlO

で生後3日目よりロイペプチソ10mg／kgとべス

FIB）を使用した．MDXマウスと対照（C57Bl）

タチソ10mg／kgを30日間連日皮下注射し，そのを使用した．実験法は既報（BiomedRes5：311，

効果をみた．同腹の16匹を対照とした．

1984）によった．還流液に混じ直接効果を検討しmdxマウスには生後10日目まで壊死線経はみた薬剤はLeupeptin，Bestatin，Pepstatin，me−

られず，筋線経の発育，分化は対照と何ら変らな

nadione，dantrolene，diamoxである．また1eu−

かったが，15〜20日日頃より壊死線経が群をなし

peptinとpepstatinを4〜6週腹腔内に授与してて出現し，壊死に続く再生線経をみるようになっ

慢性的効果を検討した・1側下腿筋の形態的検討

た．再生線経は中心核と塩基好性の胞体で特徴づを行った．

けられていて，30日目には中心核線経はいずれの筋でも筋線経の約40％を占めた．

1Hz単収縮反復中のCK遊離速度（∫〝びわro）は，対照マウス1．4±0．8（U／g／hr，刀＝16），MDX

治療群マウスでは外見的に非治療群と差はなく，

マウス36．0±25．8（乃＝28，ク＜0．001）であった・

1月治療後の体重は14．5±2．9g（対照：14．2±

1eupeptinとpepstatinを腹腔内授与したMDX3．0）であり，CK値は5．100±2．800IU（4．700±

では35．6±16．4（乃＝12）であり，未処理のものと1．980）で有意の差はなかった．病理学的にみる差は認めなかった．

と治療群にも筋線経の壊死と再生像はほぼ等しく存在し，筋線経の平均径は30．1±5．0／上（対照：

Eestatin，leupeplin，PepStatin，dantrolene，

menadione，diamoxの直接投与はいずれもCK

3．02±4．1）と有意差なく，また中心核線経の頻遊離に影響を与えなかった．1eupeptinとpeps−

度も43．6±9．7％（37．3±9．5）と両者間に差は認

tatin投与は形態的指標に対して影響を与えなかめられなかった．
mdxマウスに対して筋線経の壊死出現（発症）った．
今回使用した実験系において，CK遊離の撥序以前よりロイペプチソ，べスタチソを投与したが，として筋膜を通しての漏出が推定されている．し

壊死過程の抑制効果は認められなかった．

かしまだ確実ではない．ジストロフィー筋に特長−

7−

8．鶏ジストロフィー筋における新生児型構造とはできなかった．βトロポミオシンの出現や運蛋白質の出現−ぺスタチン投与と除神経動槙能の検定（フリップテスト）の結果も，遅筋の影響−

C蛋白質を指標とした結果と同じ傾向であった．

丸山班員は鶏ジストロフィー筋における新生児

前年度の結果と合わせ考えると，今回のべスタチ型構造蛋白質の出現を筋ジストロフィー症の発症

ソ投与方法では，鶏筋ジストロフィーの発症をやの指標として，べスタチソの効果について研究をや遅延させるものの，発症を抑えることはできな行った．

いと思われる．

筋構造蛋白質には異なる分子桂が存在し，その発現は胚から新生児，親への成長過程で著しく変9・筋ジストロフィーマウスに対する高濃度ペ化する．また，鶏のジストロフィー筋では，新生スタチンおよびアルファメ二ンB投与の効

児期を特散づける蛋白質（遅筋型C蛋白質，βト

果

ロポミオシンなど）が発現されること，および除松下班員は筋ジストロフィーマウスに対するべ神経筋でも同様の変化が起ることがすでに兄い出

スタテンおよびアルファメニソBの効果を，投与された．本研究では，これらの新生児型蛋白質の量ならびに投与時期などについて研究を行った．

出現を筋ジストロフィー症の発症の指標として，

筋ジスマウスに発症初期から投与を開始するこ

薬剤（べスタテン）投与が筋ジストロフィー症にとによって回復効果があることが認められている

対してどのような効果をもつかを検討した．前年

べスタチソを，従来の5倍（2mg／day）および10度，ふ化直後から1カ月齢までべスタチンを継続倍（4mg／day）の投与量で，症状のかなり進行し投与した時，筋ジストロフィー鶏胸筋における遅ている1か月齢の筋ジスマウスに短期間投与し，

筋塾C蛋白質を含む細胞の出現が抑制される傾向

症状進行を抑制する効果の有無を検討する実験をにあるという予備的結果を得た．本年度は，発症行った．その結果，4週間および6週間の投与でが顕著となる3か月齢までベスタチソを継続投与

は血清中のマーカー酵素（PK，CPK）活性は著した時の効果を，主として遅筋型C蛋白質の発見

しく低下し，骨格筋中のマーカー酵素（P！（，CPK，の面から検定した．ペスタチンは微化研青柳博士

GOT，GPTなど）はいずれも有意に増加していからご供与いただき1〜2週齢の期間は5mg／kg，た．また骨格筋中のAlkaline proteaseおよびそれ以降は10mg／kgを連日皮下に投与した．3

Neutralproteaseは共に有意に活性低下を示して

月齢の鶏胸筋の凍結切片にC蛋白質に対する抗体

いた．さらにその間の体重変化を見ると，投与開を作用させて免疫組織化学的に調べた結果，正常

始から1週間位の間に急敦に体重が増加するのが鶏ではこの月齢では全く遅筋型C蛋白質は検出さ認められたが，その後は対照マウスと同様にゆるれないが，筋ジストロフィー鶏（無処理または生やかな減少傾向を示した．これらの結果から，す

理食塩水投与）ではかなり多くの細胞（雄ではでに症状の進行している筋ジスマウスに対しても15〜50％の細胞）に遅筋型C蛋白質，さらに少高濃度のべスタチソを投与することで症状の進行

数の小型細胞に心筋型C蛋白質も検出された．遅をある程度抑制することが可能であること，なら

筋型C蛋白質の出現は明らかに雌より雄に多く，びに，その効果は連続投与よりも，むしろ時々休筋ジストロフィー症は雄に顕著であることを示唆

む断続的な投与方法の方が良いかも知れないことした．ベスタチソ投与された鶏では，対照鶏よりが示唆された．

やゝ遅筋型C蛋白質をもつ細胞の出現率が低い傾

次にアルファメニソBの投与量を変えて疾病マ向があるが，遅筋型C蛋白質の出現を阻止するこ

ウスに6週間および12週間投与する実験を行っ

ー

8

−

微生物二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイべプチソ）の開発研究

た．その結果0．4mg／day，0．8mg／day，1．2mg／

モマウスを用い，メスにホルモソ処理をして排卵day投与で，いずれも血清中および骨格筋中のマを誘起した後に卵管膨大部から未受精卵を採取しーカー酵素の活性変化，あるいは尿中のクレアチ

た．一方，オスの精巣上体から精子を採取して，ン排泄量の変化などから症状改善効果があること

試験管内で受精能を獲得させた．これらの卵と精が認められたが，全般的に0．8mg／day投与の場

子の浮遊液体を体外で混合して，受精を成立させ，合が最も大きな効果を示していた．同じアルファ

さらに細胞期まで培養した．このα細胞期の胚を∴メニソBの連続投与による延命効果をしらべる実

あらかじめ擬妊娠を起させた借腹親の卵管内に移験を各投与量について平均15頭ずつの疾病マウ植して胎仔あるいは出生仔まで発生させた．

スを用いて行った．その結果食塩水投与の対照マ

べスタチソおよびロイペプチソほ2mg／mJのウスに比較して，いずれの投与群も明らかな延命

濃度に溶かし，dyホモマウス（生後1〜2週齢）効果を示したが，やはり0．8mg／day doseで最もの頭部皮下に連日授与した．対照群は生理食塩水

効果が認められた．1．2mg／day投与では，平均を同様に投与した．経時的に体重，発症時期など

寿命としては延命効果があるが，全投与マウスがを調べた結果，ベスタチソおよびロイペプチソと数日内に死亡するという他の場合とはやや異なっも，dy￣筋ジスIPフィーマウスの症状改善に，た傾向を示した．これらの結果から，アルファメ

はっきりとした効果は認められなかった．今後さニソBをすでに症状の進行した筋ジスマウスに投らに詳細な検討が必要と考える．

与すると症状改善効果が認められ，寿命の延長が得られるが，1日投与量は0．8mgが最も効果的

11．ベスタチンの長期投与を中心としてであるという結論が得られた．

村上班員は筋疾患のうちDuchenne型筋ジスト
ロフィー症を中心にべスタチソの長期投与の影響

10．体外受精法によって作成されたC57BLの検討を行った．
対象は肢体型筋ジストロフィー症3例，顔面肩16−dy／dyマウスに対するぺスタテンおよびロイぺプチン投与の影響

甲上腕型筋ジストロフィー症2例，筋強直ジスト

野村班員は体外受精法により得られたC57BL

ロフィー症4例，多発生筋炎2例，Duchenne型

16−dy／dyマウスを用いて，べスタチソおよびロ筋ジストロフィー症10例，計21例で男性17例，イペプチソ投与の効果を研究した．

女性4例であった．使用期間は2カ月から42カ月で，使用量は60mgから1．500mg（体重1kg

従来，筋ジストロフィーdyホモマウスを得る

当り

ためには，dy遺伝子をヘテロにもつ保田マウス

2mgから100mg）に及んでいる．

のメス，オスを交配する方法がとられている．し長期間の投与成績は血清酵素（CPK，LDH，

かし，この交配では，その仔の4分の1にdyホ

GOT，GPT）はベスタチソ使用開始後暫くの問モマウスが現れるのみであり，しかも生後2〜3は低下するが，その後は徐々に増加の傾向が多く

週齢にならないと正常と筋ジストロフィーを区別見られる．しかし，そうでないものも見られる・することが出来ないために胎生期や生後の早い時

長期間の投与で症状の改善の見られたものは期にホモのマウスを実験に使用することができな

PreclinicalのDuchenne塑筋ジストロフィー症

かった．そこで，体外受精の技術を用いてdyホの1例のみで多発性筋炎2例はステロイドの節約

モマウスを作出し，べスタチソおよびロイペプチ作用が見られたが病状は進行していた．尿検査，

ソ投与の影響を調べた．

血液一般検査に異常は認められず，認むべき副作〔成用もなかった．

果〕筋ジストロフィーを発症したdyホ−

9−

12．DMD患者に対するベスタテン服用の臨

13．Duchenne型進行性筋ジストロフィー症

床的検討について（DnIP）に対するベスタチンの使用経験一三吉野班員はべスタチソの臨床効果を評価する

一臨床的立場から−ため，Duchenne muscular dystrophy（DMD）

福山班員は進行性筋ジストロフィー症に対する症患者（10歳以下）にべスタチソを投与し，臨床

ベスタチンの治療効果を検討する目的で，東京女

効果および副作用の検討を行った．

子医科大学小児科通院中のDuchenne型進行性筋

10歳以下のDuchennC型筋ジストロフィー症

ジストロフィー症（以下DMP）12例（年齢2歳の入院患者6例にベスタチソ，プラセボ，べスタ〜8歳）および非典型的な良性DMPl名（12歳）

チソの順で，20mg／kg／日（1．000mg／日／成人）分に，ベスタチソ20mg／kg／日

3（7時，15時，21時）で8週間ずつを授与し，Single blind cross over法に従い1日3回に分血中濃度（4W，6W，8W），血液生化学所見，

けて投与した．べスタチン投与歴のある例では2

運動校能，ADLなどについて，臨床効果を検討

週間以上休薬後，投与を開始した．また偽薬投与

した．

後に家族が悪化を訴えてきた場合には，2〜4週

その結果1）朝服薬1時間後の血中濃度は18を8週間交代の間で真薬に戻して検討した．

週目の1例を除き，安定な状態を皇した．2）CPK

服用前と投与開始後4週間ごとに採血および1は，ほぼ不変が1名，低下したまま1名，低下後日採尿を行い，クレアチン・フォスフォカイネー

上昇が2名，上昇後低下が2名であった．平均とス（CPK）などの血清酵素，血中・尿中のクレア

して，べスタチソ投与で低下し，プラセボに変更

チン・クレアチニソ，尿中3−メチルヒスチジンの後，上昇を示した．3）GOT，GPT，LDHなど測定を行った．

では，有意な変動はなかった．4）10m往復歩行

各運動機能所用時間（20m走行・階段昇降・起時間，立ち上り時間，階段昇降時間，握力などで立・起坐・寝返り）の測定および運動機能・筋力は，変動があったが，有意差は認められなかった．

の変化につき評価した．
〔結

ADLは一時改善があり，その後低下していた．
5）皮診，嘔気などの副作用は見られなかった．

果〕1・血清CPK億：DMP新鮮例5

例中4例では，投与開始後4週の時点で全例低下

まとめとして，CPKは，血中濃度の上昇にしたがって，下降してきた．重回帰分析により，した．使用経験有の例ではこの傾向は明確でなかった．

CPKはADLに最も相関する変数であったが，2・運動機能の変化：1）Preclinicalstageの5％の有意差は認められなかった．臨床効果につ2歳の2例では，使用経験有の例も新鮮例も共にいては，10m往復歩行，立ち上り，握力，ADL

投与開始後の運動機能は上昇していた．

などは一過性に運動撥能の改善が見られる例があ2） 4歳以上の使用経験有の例では，休薬前・ったが，全体として運動機能が悪化する傾向にあ

開始前・開始後・偽薬後の変化につき検討した．

った．

a）3例では休薬後悪化し，投与開始後もさ

今回のべスタチン治験はまだ進行中なので，中間報告として発表する．

らに悪化，偽薬後著明な悪化をみたが，1例では其薬再投与後軽度改善，1例では英薬再投与後4
週で改善8週で再び悪化，他の1例では4週も8週も更に悪化した．
b）3例では休薬の変化は明確でなかったが，偽薬後悪化があり，真薬再投与後軽度改善した．

−10−

微生物二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプチソ）の開発研究

いずれの症例も全体の撥能はa）の3例より良好

加えるとさらに低下の傾向が見られたが，安静をであった．

守らない場合には明らかな効果は見られなかった．

3）新鮮例では，2例のみ偽薬投与まで観察し

2）健康成人に種々の種類の運動を負荷し，血得た．5歳の1例は投与後改善，偽薬後悪化，真清CKが上昇することを確認してから，べスタチ薬再投与後改善した．7歳の1例は投与後も軽度ソ投与で，これがどう変動するかを検討した．

悪化していたが，偽薬4遇後，明らかな悪化を示

CKは負荷後24時間で最高に達するが，ベスク

し，8週でもさらに悪化し続けた．

チソ非服用時には平均51．0単位の上昇を示すの

3．使用経験有の例の休薬前と新鮮例の投与前に対し，服用を1週間続けた後では平均28t57埠の運動機能を比較したが，年齢を合致させてみて位の上昇で，前借に比して減少の幌向を示した．
運動負荷後の血清CKの上昇の機序は明らかで前者の方が良好という傾向は無かった．
以上べスタチソ投与により著明な臨床効果の認はなく，細胞膜からの透過，筋線経の断裂などのめられた例はなかったが，一時的な改善を示す例

楼序が想定されているが，通常の程度の運動でははみられた．進行が急速な6〜7歳例では，休薬

形態学的変化は確認されておらず，膜の透過の可および偽薬に変更後の悪化が服薬中よりも目立つ

能性が高い．今回の研究の結果，べスタチソがこ印象を受けた．また軽症例では偽薬で悪化しても，れを抑制する作用を有することが示唆され，本剤真薬投与後改善する傾向がみられた．しかしながの筋ジストロフィー症の血清CK低下作用には，ら，使用経験有の例の休薬前と新鮮例の投与前のこうした非特異的な膜の安定作用も加わっている

運動機能を比較し，年齢を合致させてみた場合，のではないかと推定した．

前者のそれの方が，良好という傾向は無く，現時15．Duchenne型筋ジストロフィー（PユID）

点では本剤の治療効果について結論し難い．

患者に対するべスタテンの影響−新しい筋障害のmarkerを用いて−

14．：運動負荷後の血清CK上昇に対するベス

祖父江班員は進行性筋ジストロフィー（PMD）

タチン投与の影響
木下班員は運動負荷後の血清CK上昇に対する患者に対するべスタチソの影響を検討するため，

べスタチソ投与の影響および6施設での評価につ血清CKと新しい筋障害のmarkerであるmascle−

いて集計を行った．

specific enolase（MSE），Carbonic anhydrase

進行性筋ジストロフィーの患者において，血清III（CA−ⅠⅠⅠ）について研究を行った．

CKが高値を示すことは良く知られているが，最1）143例のPMD患者で調べた血清CA−ITⅠ

近べスダチソ投与でこれが低下憤向を示すことがの異常値出現率は，CKやMSEと同程度かそれ相次いで報告されている．その作用機序について以上であった．

は未だ詳細が明らかではないので，これに関する

2）血清CA−ⅠⅠⅠ値とCK活性値の相関係数は解明の手がかりを得る目的で次の研究を行った．

0．8471，MSE値とでは0．7818といずれも高い

1）筋ジストロフィー症患者について長期間血値を示した（♪＜0．001）

清CKを連日測定し，小量投与，大量投与，薬剤3）10例の歩行可能なDuchenne型PMD患なしの安静保持，大量投与で安静保持の十期に分者に8週間べスタチソ投与（20mg／kg／日）を行っ・

けてベスタチソの影響を比較検討したところ，血た結果，6週目に血清CK活性値は薬剤投与前に清CKは安静によっても大きな影響を受け，有意比べ有意に低い値を示した．しかし血清CA−ⅠⅠⅠ，な低下を示した．また，これにべスタチソ投与をMSEでは有意な変化はみられなかった．

−11−4）ベスタチソ投与終了後ひきつづきPlaceboの例でも臨床的には明らかに症状の進行がみられを8週間授与した．Placeboに変更後4週間の時ており，CPK血清値の動きと臨床的変化との間に相関はみられなかった．

点で薬剤投与中止時に比べ，CK，MSE，CA−ⅠIIのいずれの酵素も有意に高い値を示した．

NK421投与中，3例に悪心，食欲低下，下痢

5）血清CA」IIはCK，MSEとほぼ同様のなどの消化器症状を訴えたものがあった．（240

推移をとり，べスタチソ投与によって特別な変化を示さなかった．

mg，450mg，1．000mg服用中）しかしこれらの

6）血清酵素の変動に平行した運動機能の改善はみられなかった．

その後もNK421の投与を続けることが出来た．

7）特記すべき副作用はみられなかった．

例でも，減量，一時的休薬にて自然に症状消失，血清，血液生化学，尿所見では異常がみられず，重篤な副作用はみられなかった．
NK421・投与により，明らかな症状改善を示す

16・各種筋ジストロフィー症に対するベスタ

例はなかったが，多くの例でCPKの低下を認めており，症状の進行を遅らせている可能性は否定

チン長期投与後の臨床経過
里吉班員はベスタチソ（NK421）を各種筋ジス

出来ず，今後，二重吉検法などによる検討がさらトロフィー症の患者に長期投与を行い，その臨床に必要と思われた．

経過について研究した．
約4年間にわたる長期NK421投与を続け，臨17・ホル7二二シノール（Bト121）の体内動

床経過を観察中の9例．内訳は，肢帯型筋ジスト

態研究

ロフィー（LG PMD）5例，顔面肩甲上腕型筋ジ

松本班員はれレフェニシノールの体内動態を調ストロフィー（FSH PMD）2例，Duchenne型

べるため，ラット，ウサギ，イヌおよびヒトに単筋ジストPフィー（Duchenne PMD）2例であ回投与を行い，血中濃度，尿，糞中排泄，代謝物

る．以上の症例に対し，NK421を少量より経口を測定し，動物種差の体内動態の比較検討を行っ投与開始し，副作用の発現に注意した上で症例にた・また，ラットに単回経口投与した時の組織内より1カ月単位で漸増させた．昭和60年3月現

分布についても研究した．

在での最大投与量は，200〜1．000mg／dayでNK

1）測定法：ラットの体内動態はすべて〔3H〕−

421投与期間は7〜45カ月（平均32．7カ月）であBF−121を用いて行った．他の実験は，M−1（未る．

変化体），M−3はRIA法（前年度報告），M−2，

臨床症状の判定には定期的な全身の筋力評価，

M−4，M−5，M−6はHPLC法で分析したが，10m歩行時間，階段昇降時間を用いた．血液生化

M−2についてはその不安定性のためにメトキシ

学的指標にはCPKを用い，その他副作用監視のイミノ体に誘導したのち測定した．

ため，末梢血液，肝，腎機能，尿所見を観察した．

2）結 果：ホルフェニシノールほ，いずれの〔結 果〕臨床的に改善を示した例はなく，臨動物種においても消化管から速やかに吸収され，床的に不変のFSH，PMDの1例とsubclinical投与30分〜1時間で最高血中濃度に達し，またなDuchenne PMDの計2例を除き全例に症状の血中からの消失も早い．いずれの動物桂において進行がみられた．一方血清CPK値はLG PMD

も血中代謝物は，大部分が未変化体である．

の1例を除き低下傾向がみられた．この傾向は

総排泄率は80％前後であるが，そのほとんど

Duchenne PMDなどの，従来よりCPKが著しが尿中に排泄され，経口吸収性は良く，また蓄積性は認められなかった．

く高値を示す例で顕著にみられた．しかしこれら−12−

微生物二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプチン）の開発研究伴って減少した．

尿中代謝物については大きく種差が認められ，ラットではM−6，ウサギではM−4，イヌでは筋肉内濃度を投与後1時間で比較すると，ベスM−1，ヒトではM−3が主代謝物で，それぞれ尿タチソは血中濃度の30〜40％に達し，AHPAは中代謝物の50％以上を占めた．

血中より高いが，発症マウスのAHPA存在比は組織への移行性は良く，多くの組織では血中よ非発症のそれより低かった．また，筋ホモジネー

りも高濃度に分布し，特に脳下垂体，腎臓，膵臓

トとべスタチソを反応させたときのAHPA生成が高い値を示したが，排泄も早く，血中からの消は発症マウスでは非発症のそれの半分であった．

失とほぼ並行する．しかし肝臓にはあまり分布せ発症マウスでの尿・糞中回収率は前報までに報ず，免疫系に関与するリンパ節，胸腺，骨髄，脾

告した他動物種のそれと同様に高く，代謝型も正臓に比較的高濃度に分布するのが特徴的である．

常マウスと同様であった．
2−2）幼君ラット（3週齢）の亜急性毒性試験

また筋肉中へはあまり高濃度に分布せず，投与1時間後で血中濃度のほぼ3分の1であるが，筋肉に併行してbioavailabilityを調べた．

中からの消失は他の臓器と比べて大変遅い．

投与量117mg／kgにおいて，最高血中濃度は30J堵／mJに達し，24時間後も0．1／Jg／mJの末代

18． ロイぺプチンおよびぺスタチンの難病治

謝型ベスタチソが検出された．P−hydroxy−besta・
tinは2桁低かった．以上の傾向は3週間連続投療藁としての開発研究
田中，滝田，石井班員はロイペプチソおよびべ与後も変らなかった．

スタチソの難病治療薬としての開発研究を行った．

2−3）Duchenne型筋ジストロフィー小児2例

また各班員にロイペプチソ，べスタチソを提供すの130mgx3回／日投与期間における尿中の代謝

るとともに，臨床試料の分析を担当し臨床研究の物組成を福山班員と共同で測定したが，健康成人支援を行った．

のそれと同様に大部分のベスタチソは小量の♪一1）ロイべプチソのbioavailabilityと製剤研究

hydroxy bestatinと微量の（2S，3R）AHPA

腸溶顆粒をつくり，イヌに経口授与したときのから成り，代謝物は連続投与により増加した．

bioavailabilityは在来製剤のそれと異ならなかっ

3）ベスタチソの安定性た．

室温密栓下に2年半保存したときの臨床試験用

室温密栓下に3年半保存した後のL−ロイペプ
チソ残存率は，原末92．0〜95．6％，臨床試験用

ドライシロップのベスタテン残存率は98．9％であり，分解物は検出されなかった．
4）べスタチソの幼君ラット（3遇齢）に対す

10倍散94．7％，カプセル91．6％であり，低下る経口毒性の原因はラセミ化であった．

0．5，1．0，2．0g／kgを1回投与したときの急性

2）べスタチソのbioavailability2−1）筋ジストロフィー雄性マウス（C57BL／

毒性は一般状態・体重・病理学的検査のいずれに

6J dy（−））とその同腹非発症マウスにつき調べ

も著変はなく，また死亡例もなかった．39，117，

た．血中ピークは両者同様であり，減衰は発症マ

350，700mg／kgを連日13週間授与したときの一ウスで遅かった．連続投与により，ピークは不動

般状態・尿検査・血液検査・病理学的検査のいずで減衰が遅くなることはヒトを含めた他動物種とれにも著変なく，また死亡例も認められず，成獣共通しており，発症マウスでは減衰がさらに遅れにおけると同様にべスタチンは幼若ラットにも低た．マウスの主代謝物である（2S，3R）AHPA

毒性であった．

の存在比は両者で同水準であり，投与量の増加に
−13−

分

担

研

究

報

告

ロイペプテンのプロテアーゼ阻害作用に関する研究

村

研

究

目

地

孝＊

研

的

究

方

法

ニワトリ骨格筋のCa2＋依存性中性プロテアー

カルパインⅠおよびⅡは，それぞれブタ赤血球

ゼ（CANP）がロイべプチソによって強く阻害さおよびブタ腎臓より均質蛋白質として精製した1）・れることはよく知られている．われわれは，ラッ

精製酵素は20mMイミダゾール緩衝液（pH7・5，

ト肝臓，脳，腎臓，脾臓，赤血球，胸腺などに広2mM EGTAおよび5mM2−メルカプトエタノー

く分布する同種のプロテアーゼが，そのCa2十要ル含有）に40Cで十分透析した後使用した．

求性およびSH還元剤要求性においてCANPとカルパインのカゼイン加水分解活性は，50mM

著しく類似していることを知り，これらに対するトリス・HCl緩衝液を用い，通常，pH7．5，30

放線菌由来の一群のプロテアーゼ阻害剤の効果を0Cで30分間温置によるトリクロル酢酸可溶性ペ検討したところ，とくにロイべプチソによって強プチドなどの増量をFolin−Lowry法により，750

い阻害を受けることを兄い出した．

mmの吸光度増加として計測した．カルパインⅠ

そこで，骨格筋のCANPに関する進んだ知見の定量には0．1mM CaC12を，カルパインⅡの定と並行して，上記の全身組織細胞に広く分布して量には5mM CaC12を活性化剤として加えた．いいるCa2＋依存性システイソプロティナーゼ（以ずれの場合も5mM L−システイソを共存させた．

下カルパインCalpainと総称する）について，そプロテアーゼの1単位は750nmの吸光度1・0のの精製と性質の研究を系統的に行った．とくに，増加を30分間で与えるべき酵素量と定義した．

カルパインを特異的に阻害する細胞内インヒビタ

各種オリゴペプチド基質に対するカルパインⅠ

ー蛋白質の存在を発見したので，これをカルパス

およびⅡの分解作用は，次の方法によって検討し

タチソ（calpastatin）と名づけ，その精製と性質た．反応液1mg中にカルパイン9−150粕，基質についても研究を行った．

ペプチド57−107nmolを加え，5mMシステイ

これらの研究を通じて，ロイべプチソのプロテ

ソ，2．5mM2−メルカプトエタノール，およびアーゼ阻害作用の一般的分子撥構を解明するとと

5mMCaC12存在下に300Cで反応を進行させ，2hもに，その生理的病態的意義を明らかにすること以内の適当時分にEGTAを9mMになるようにが本研究の目的である．

加えて反応を停止させた後，生成物を高速液体ク
ロマトグラフィー（HPLC）によって定量的に分＊京都大学医学部附属病院検査部

析した．
−17−

蛍光基質に対するカルパインの作用は，0．5mg

1・各種ペプチドに対するカルパインの作用の反応液中にカルパイン11−26／g，基質0．002

図1には3種の代表的ペプチドのカルパインⅠ−8〝mOlを含む系で300Cにて反応を進行させ，（上段）およびⅡ（下段）による加水分解の結果を遊離してくる7−アミノー4−メチルクマリンの蛍光掲げる．一見してこれらの3柾ペプチドがカルパ（380nmにて励起，460nmの発光）を連続記録することにより計測した．

インによってかなりよく分解されること，また，分解の様相がⅠとⅡで大差のないことがわかる．
上記3種を含む9種のペプチドに対するカルパ

研

究

結

果

インⅠおよびⅡの作用を比較して示したのが図2である・図の左欄横棒で示すように，各基質の切カルパインはカゼインのような蛋白基質をよく断個所はカルパインⅠとⅡで同じであるが，基質分解するが，オリゴペプチドや一般に広く使用さによっては生成物の量に若干の差異（図の右欄数れているプロテアーゼ用合成基質にはほとんど全字）が認められた．図2の結果から一般則として，く作用しないというのが従来の知識であった．とカルパインはPl位置にTyr，MetまたはArg

ころが，今回カルパインを大量に精製して，各種（おそらくはLysも）をもち，P2位置にLeuまの天然に存在するオリゴペプチドに作用させてそたはValをもったペプチドを好んで加水分解すの生成物をHPLCで検討してみたところ，意外るといえる・P3位置は必ずしもふさがれていなくに多数のペプチドが加水分解を受けることがわかてもよく，また，Pl′位置はアミド基でもよいこり，その分解切断位置の研究から，基質特異性にとがわかる．

適合したジーまたはトリペプチジル合成基質を調製して，カルパイン活性を蛍光測定することがで

2．蛍光合成基質の調製

きるようになった．以下にその結果の概要を報告

上記のペプチド基質に対する特異性を念頭に置

する2）．

いて，Pll位置にMCA（4−メチルクマリルー7−7

■
k
j

0
6

B −Ⅰ

C −Ⅰ
0

／

ノ

qr

＿′一一 ′￣

e

h

l

p
0

l
k

l 雫

0 −ⅠI
m

O

L ノ
′

＿一ノ ー￣

o

／ノ

′一一′

f g h

t

e

20

400

Time 帥in）

20

q

O
2

＿′′一

一一一

0

nU
4

j

6

B 一I l︵訳︶些﹂小宅芯宣′′一一一 一一一′一 n

02′ 一一一 ′ −′ l
． f g

0．2

0
4

︵EUONN︶BudqLOSq＜

m

400

n

20

Time（min）

p

lr
40

Time小1in）

図1Chromatographic patterns following digestionofdynorphin，glucagon，and oxidizedinsulin
BchainbycaIpainsIandII・Upperrow・CaJpainI；lowerrow，CaJpainII・DynorphininA−I
and A−ⅠⅠ（57nmol），glucagoninB−IandB−II（57nmol），andoxidizedins。lin Bch。inin C＿I
andC」Ⅰ（57nmol）werehydrolyzed

with20，9，and9FLg

yieldsofpeptides a tor are shownin Fig．2．
−18

−

Of

calpain（eitherIorII）．The

ロイペプチソのプロテアーゼ阻害作用に関する研究
1

HexQPeP†ide

5

10

15

20

25

30

LⅥんRFA：：

EledoisinTreIo†ed KFIGLMNH2
PePfidea−Neo−endorphin

YGGFLdKYPL

Angio†ensinl

DRV

LH−RH

zHWS膏．LRPGNH2

56．8
12．4

65．3
l．2

62．8

芸：；

64．1
23．4
24．7

78．6
4．5
4．6

35．1
7．4
38．3

64．4
3．6
9．1

＝HPFHL

Dynorphin

YGGFLRIRIR

69．1
12．6
16．1
ト」

一・・・・．・．・．・lb．・．・．・．・．・．・一

HSEGTFTSDYSKY LdsR↓RAEDFVEWLhJNT

Oxidizedins山in
B choin

FVNQHLCGSHILVEIALYILVCGERGFFYIT

l

69．8
10．1
15．0
l．5
45．2
30．9
3l．5
†rOCe
53．5
10．7
4．6
2．5
Ir（】Cel、ll：95489−457−802010
23

G山cqgon−529 7053955 6724515

zLノENKPRRPYIL

63．5
77．3
13．0
2．1
日．l l．3
4．3
2．9

詣雪47ほ塁皇2互訂7皇Neurotensin：

Yield（％）
CoIpomI CdpoinⅡ

図2 Cleavage sitesin oligo−and polypeptides by calpainI or calpain II and theyieldof eachfragment．The amountsofcalpain（eitherIorII）usedwere：60
FLgforα−neOendorphin（110nmol），neurOtenSin（110nmol），and LH−RH（110nmol）；20FLgforeledoisin−related peptide（141nmol）；150／gfor hexapeptide（207nmol）；50FLg for angiotensinI（77nmol）・Forseparationoffragmentsa
tor，See Fig．1．Thick or thin arrows show major or minor cleavage sites，
respectively・NH2LterminalZ of neurotensin and LH−RIlrepresents pyrogluta−

myl；C of oxidizedinsulin B chain is a cysteic acid residue．

ミド）を有するジーおよびトリペプチドに対すると異なる．

カルパインの作用を検討した．一定の条件下で得カルパインⅠとⅡはカゼイン基質に対し，そのられたMCA基質群に対する比活性を表1にまと

Ca2＋要求性を約100倍異にすることが知られてめて掲げる．

いるが1），このような差異は，蛍光合成基質を用

カルパインⅠのほうがカルパインⅡに比して一いても同様に観察された（図4）・

般にやや高い比活性を示したが，これはⅠのほうがCa2＋存在下での活性持続がⅡよりも良好であ

3．カルパインの反応動力学ることを反映しているかもしれない（図3）・

先の実験で良い基質であると認められた4種の表1の最初の3種の基質についてのデータから，MCA基質について，通常の方法によって求めた

カルパインはP2位置にアミノ酸の存在すること

ミカエリス定数（gm），見かけの反応速度定数を絶対的に要求していること，また，P2にはLeu（点。ht）を表2に掲げる．比較のためにパパインを≫Valの頂で選択性があることがわかる．パパイ

酵素とした場合のデータも含めてある．

ンはPlにArgのある基質を好み，この点はカルカルパインⅡのgmおよび点。atは，カルパイ

パインも似ているが，後者の場合はさらにP2のンⅠのそれより，それぞれ1．2〜4．0倍および種類によって決定的な支配を受けている点で前著

1．6〜3．1倍大きい（Suc−Leu−Tyr−MCAの場合−19−

表l Specificity of calpainI，CalpainII，and papain on various peptidyl MCA
derivatives as substrates

102×specific activityb

ConFen−trat10n

Substrate＆CaIpainI CalpainII Papain

Suc−Met−MCA

mMe
4．0

0．0

0．0

2．02±0．04

Suc−Leu−Met−MCA

4．0

6．84±0．06

5．05±0．12

3鵬±1．80

Suc−Val−Met−MCA

4．0

0．43±0．04

0．31±0．01554±43．3

Suc−Tyr（C12−Bzl）−MCA

0．4

0．0

0．0

0．0

Suc−Leu−Tyr（C12−Bzl）−MCA O．4

0．42±0．03

0．33±0．04

0．58±0．01

Suc−Val−Tyr（CJrBzl）−MCA O．4

0．07±0．01

0．04±0．01

1．58±0．09

0．0

0．0

0．63±0．04〟mOlmin￣1mg￣1

Suc−Tyr−MCA
Suc−Leu−TyrLMCA

2．O
2．O

7．63±0．45

4．00士0．28

38．3±3．48

Suc−Val−Tyr−MCA

2．O

0．81±0．01

0．37±0．01

30．7±4．10

Suc−Leu−Leu−Val−Tyr−MCA O．2

1．81±0．36

1．79±0．29

161±6．90

Boc−Val−Leu−Lys−MCA

2．0

4．64

8．00

1220

Boc−Leu−Thr−Arg−MCA

4．0

0．84

0．36

860

Boc−Phe−Ser−Arg−MCA

4．0

0．0

0．0

Boc−Val−Pro−Arg−MCA

4．0

0．0

0．0

Boc−Leu，Gly−Arg−MCA

4．0

0．0

0．0

＆No

cleavageIookplace

elswhere

than

at

Pl

aS

detectedbyultraviolet

51．7
240
12．0

absorptionand

ninhydrin

Staining on TLC．
b Thevalue represents the mean of four separate determination±S．E．
CHighsubstrateconcentration（4．00r2．OmM）wasusedtoens云rethemaximum rateofhydrolysis
in most cases，Whilewith a few substrates a muchlower concentration（0．40r O．2mM）had to be
employed due to theirlimited solubilities．

表2 Comparison of kineticparameters for calpainI，CalpainII，and
Papaln at30OC

Substrate乱Enzymeb

mM

Km

kcat

s￣1

M￣ls￣1

Suc−Leu−Met−MCA CalpainI

1．21

0．062

CalpainII

4．78

0．194

0．405

Papain

0．343

0．926

27．0

Sue−Leu−Tyr−MCA CalpainI

4．74

0．369

0．779

CalpainII

2．21

0．092

0．417

Papaine

0．711

0．158

2．22

Suc−Leu−Leu−Val−Try−MCA CaJpainI

0．203

0．029

1．41

CalpainII

0．466

0．065

Papain

0．013

0．783

Boc−Val−Leu−Lys−MCA CalpainI

5．92

0．491

CalpainII

7．08

0．805

Papain13．0＆Seventotendifferent

208

concentrations（0．001to4mM）for

each

0．510

1．39
603
0．830
1．14

160
substrate

weretlSedfor Lineweaver−Burk plots．
bTheamountsaddedpertube were：llFEgOfcaJpainI，26FLgOfcalpainII，andlFLg Of papain．
C Ten FLgOfpapajn was used．
−20−

ロイべプチソのプロテアーゼ阻害作用に関する研究

0︵訳︶uOで空目∂

0

60

120

0

60

120

¶me（min）

図3

Time course of the hydrolysis ofdynorphinbyealpain
IandcalpalnIL In a totalvolumeof6ml，dyi10rphin（262nmol）wasincubated at

30OC with5mM CaC12・

One−mlaliquots werewithdrawn from the assaymiⅩ−ture afterincubation for O，10，30，60and120min，
and the reaction was stopped by adding9mM EGTA・
The peptidefragmentsfromdymOrPhinwerequantified
by HPLC with a reversed phase TSK ODS−120T
column and a Shimazuintegrator C−RIB．A，Calpain
I；B，CalpainII，○，dynorphin；●，ArgT…・HGln17；■，Tyrl …・Arg6；▲，Tyrl…‥・Lys13・0︵訳︶言〇〇一望①＞甚遥

「詔
10▼7

10−6

10￣5

10￣4

10￣3【

】0【2

CaTciumconcentration（M）

図4

Ca2＋requirement of calpainI and calpainII for thehydrolysisoftwodifferentsyntheticsubstrates・Calpain
I（11Fg）or calpainII（26fLg）wasincubated at300C
in

Ca2＋／EGTA

bufferwith

2mM

Suc−Leu−Tyr−MCA

and4mM Suc−Leu−Me卜MCA．The rate of hydrolysis
was determined by measuring fluorometrically theamountof7−amin0−4−methylcoumarinliberated．Closed
symbo】S，CalpainI；Open SymboIs，CalpainII・● andO，Suc−Leu−Tyr−MCA；A and △，Suc−Leu−Me卜
MCA．・

−21−

︵の72︶T＞×千〇一

0

0．5

0

2．0

4．0

［Antipa呵（〟M）［Leupepth］（FLM）

図51nhibition of calpain L Or CalpainII−Catalyzed hydrolysis of peptidylMCA derivatives
byleupeptin and antipain．The assay was performed at300C and at two different
COnCentrations，［S］，Of SucLLeu−Met−MCA as substrate and with varying amounts，［Ⅰ］，OfinhibitorinllOmMimidazoleHClbuffer，PH7．3，COntaining5mM LTCySteine，

2・5mM2−merCaptOethanol，5mM CaCl22％Me2SO，2％methanol，and calpainI（11FLg）or calpainII（13fLg）・The rate of hydTOlysis，V，WaS Calculated from the amoumt
Of7−amin0−4−methylcoumarinreleasedin5min・DixonplotsandCornish−Bowdenplots
Were uSed to determine the KL Value and the mode ofinhibition，reSpeCtively．A
and C，inhibitions of caIpainsIandII，reSpeCtively，byleupeptin；B and D，inhibitions
OfcalpainsIandII，reSpeCtively，by antipain．［S］used are：●，0．2mM；▲，2mM，○，0．4mM；△，2mM．

を除く）．点。at／ぶ も値でみると，テトラペプジル

討した結果が図5である．各国の別枠内でみられMCAのほうが，ジペプチジルMCAより最高

るように，阻害形式はいずれも競争阻害であった．

3．5倍良好な基質であることになる．しかしカル

Lineweaver−Burkプロットから求めた阻害定数

パインの点。8t／gm値は一般にパ／くイソのそれに比足立は，カルパインⅠに対してロイペプチン0．32

して低値（5〜433分の1）にとどまっている．ま〟M，アンチパイン1．41〟叫 また，カルパインⅡた，カルパインの五m値は10−3〜104の水準にとに対してロイペプチン0．43／叫

どまっていて，カルパインの蛋白質基質に対する1．45JjMであった．すなわち，ロイペプチソのほ

アンチパイン

gm値が10￣7〜10￣8であるといわれるのに比してうがアンチパインより3〜4倍強い阻害能を示しはるかに高値である．

たことになる．
ロイペプチソはR−Leu−Argininalの構造を持

4．ロイベプチンおよびアンチパインの作用

ち，一方アンチパインはR−Val−Argininalの構

Suc−LeuTMet−MCAを基質としてロイペプチ

造を有する．Argininal部位が合成基質のペプチ

ソおよびアンチパインのカルパイン阻害作用を検ジル部分のアミノ末端残基（すなわちPl）に相当−22−

ロイペプチソのプロテアーゼ阻害作用に関する研究

すると仮定すると，その上流位のLeuまたはVal

Kawaguehi，N．，and Murachi，T．Intracel・はP2に相当することとなる．そうであれば，Leu

luJarlocaIizationを持ったロイペプチソがValを持ったアンチパイ

ted by using discrjminative antibodies．J．
βわJ．CJlgm．，259，9847−9852（1984）．

of

two

distinct

Ca2十一PrOte・

ases（caJpainI and calpainII）as demonstra・ンより数倍カルパインに対する親和力を高く示し

4）Yoshimura，NりOhtuki，H．，Hamakubo，T．，Ki−

たとしても不思議がないことになる．このように，

tahara，A．，Kannagi，R．，and Murachi，T．Dis−

今回のカルパインの基質特異性の研究は，実験的

tribution of calpainin various organs of the
rat：animmunohistochemical study．，Biom−にかねて知られていたロイペプテンの強いカルパ

gd．Rg∫．，5，419−424（1984）．
5）Yoshida，H．，Murachi，T．，and Tsukahara，I．

イン阻害作用を，その模作のうえからもより一歩

Limited proteolysis of bovinelensα−CrySta1−

ふみこんで解くこととなったのである．

1in

by

calpain，aCa2十一dependent

cysteine

proteinase，isolated from the same tissue．

しかし，今回明らかにされた特異性のデータだ

βわC力如．βわ〆ユ′∫・Acfd，798，252−259（1984）．

けからではカルパインの生理学的意義を明確にす

6）Yoshida，H．，Murachi，T．，and Tsukahara，Ⅰ．

ることはできなかった．ことに，カルパインⅠとDegradationofactin andvimentin bycalpain
II，a Ca2＋−dependent cysteine proteinase，in

Ⅱとの間で，特に目立った基質特異性の差が発見

bovinelens・FEBSLett・，170，259−262（1984）・できなかったことは，このCa2＋要求性を異にし

7）Yoshimura，NリTsukahara，LandMurachi，T．

Ca】pain and calpastatinin procine retina．

た2つの分子種の同時存在の意義については依然

Identification

としてその解明の手がかりがつかまれていないこ

andactionon

microtubule−aS＿sociated proteins．Biochem．J．，223，47−51（1984）．

とを示している．

8）Hatanaka，M．，Yoshimura，N．，Murakami，T．，
Kannagi，R．，and Murachi，T．Evidence for

カルパインおよびカルパスタチソに関して，われわれは以上の研究のほかに，特異抗体を用いた

membraneLaSSOCiatedcalpainIin humanery−throcytes．Detection by animmunoelectro−

組織分布い），限水晶体5・6）および網膜7）におけるphoretic bJotting methodusingmonospecificantibody・Biochemistry，23，3272−3276（1984）．

分布と作用，ヒト赤血球膜結合性カルパイン8）の9）Takano，E．，Kitahara，AりKannagi，R．，and研究，カルパインおよびカルパスタテンの酵素免

Murachi，T・Enzymeimmunoassay ofcalpain

疫測定法9），カルパインサブユニッ吊誇造10，11），

I and calpastatin andits application to theanalysis of human erythrocyte hemolysate．

カルパスタチソの分子多形性12）およびカルパイソによる断片化13），エストロゲン結合蛋白質へのカ
ルパインの作用14）などの研究を行い，また，解説

J・A♪〆 βroc九g〃L，6，117−125（1984）．
10）Yumoto，N．，Kiknchi，T．，Sasaki，T．，and Mu−
rachi，T・Comparisonoftrypticpeptidesfrom
the heavyandlightsubunitsofcalpainIand

CalpainII by highperformanceliquid ehro・

論文15・16）を発表した．

matography．J．Biochem．，96，1531−1537（1984）．

文11）Kikuchi，T．，Yumoto，N．，Sasaki，T．，and Mu−

献rachi，T．Reconstitution ofca】painIand ca1−
painIIfrom their subunits：interchangeabil・
ity of thelight subunits．Ar・Ch．Biochem．

1）Kitahara，A．，Sasaki，T．，Kikuchi，T．，Yumoto，N．，Yoshimura，N．，Hatanaka，M．，and Mura−

βわ♪んプ∫．，234，639−645（1984）．

chi，T．Large−SCale purification of poreine
calpainI and calpainII and comparison ofproteolytic fragments of their subunits．Jl
βわ亡加77I．，95，1759−1766（1984）．

12）Takano，E．，Yumoto，N．，Kannagi，R．，andMu−
rachi，T・Molecular diversity of calpastatin
in mammalian organs・Bioche77l．BioPhys．

2）Sasaki，T．，Kikuchi，T．，Yumoto，N．，Yoshimu−ra，N．，and Murachi，T．Comparativespecific−13）Shigeta，K・，Yumoto，N・，andMurachi，T．Frag−ity and kinetic studies on porcine calpainI

mentation ofa70000−dalton caZpastatin mole−and calpainII with naturaHy occurring pep−

Cule uponits complex formation with calpa・

R打．Co′乃77はれ，122，912−917（1984）．

tides and synthetic fluorogenic substrates．
J．βわJ．CJlem．，259，12489−12494（1984）．
3）Yoshimura，Nin・βわC九g77〜・∫′加r机，9，327−333（1984）．
14）Murayama，AりHatanaka，M．，Kitahara，A．，−23−

Fukai，F

and

Murachi，T．

Action of calpain on the basic estrogen re−CePtOr mOlecule of porcine uterus・J．Bi0−
16）Murachi，T．Regulation ofintracellularpro−chem．，95，1697−1704（1984）．
tein degradation：caIpain and calpastatin．
15）Murachi，T．Calcium−dependent proteinases Abstr．，Fourth Symposium of the Federationand specificinhibitors：caJpain and caJpastat・
Of Asian andOceaneanBiochemists（October，in・Biochem．Soc・Sympo5．，49，149−167
1984），Manila，Philippines，p．21．
（1984）．

−24−

蛍光HPLCによるクーヒドロキシべスタチンとフォルフェ二シノールの高感度定量法
大 倉 洋 甫＊
研究協力者

石田淳一＊・田村和彦＊・甲斐雅亮＊

光分析法の開発研究を行ってきた．
はじめ

本年度は，Bestの主代謝物であるクーヒド口車にシべスタテン（P−OH Best）の蛍光HPLCを開
われわれは，筋ジストロフィー症の治療薬とし発した．この方法は，ホルミル化反応とアルデヒて検討されているロイペプチソ1・2），べスタチソ

ドの蛍光ラベル化剤〔4，5−ジメトキシー1，2−ジア（Best）3・4），フォルフェニシノール（FCnol）5・6）

ミノペソゼソ（DDB）〕を用いる反応によって，および関連化合物を，高速液体クロマトグラフィ

クーOH Bestを蛍光誘導体化し（図1），その蛍光ー（HPLC）を利用して，高感度に定量できる蛍体を逆相分配HPLCによって分離，測定するもCH（CH3）2H◎cH2−㌫H

CHごCH2−CH−CH−CONH−CH−COOH

OH

P−hydroxybestatin

CHCl3
0H■

鞄cH2

CH（CH3）2
NH2

cH2−CH−CH−

CONH−CH−COOH

二三二・一二DDB

CH（CH3）2

ツH2
CH2−CH−CH−CONH

やHZ−CH−COOH

10H

F山0rOPhore

図l Schemeofthe fluorescence derivatization ofpLhydro−
Ⅹybestatin with DDB・

＊九州大学薬学部−

25−

のである．この方法によってBestを投与した筋ホルム100βを加え，70ccで8分間加熱する．

ジストロフィー患者および健常人血清中のクーOH

C）蛍光反応Bestを，また，57年度に開発したBestの蛍光

上記反応液に，14M酢酸50pl，1．3mM DDB

HPLCa・4）によって同試料中のBestをそれぞれモニターした．

300JJJおよび1．OmM過酸化水素50〟を氷水中

また，58年度にアルカリ性酸化によるFCnol

ロロホルム層と分離している上層の最終反応水溶で順次加え，700Cで10分間加熱する．冷後，ク液100〟をHPLCに付す．

の選択的蛍光誘導体化HPLC5・6）を提出したが，今回，FCnol自身が弱酸性溶液中で蛍光を発するd）HPLC

ことを兄い出し，この自然蛍光を検出するFCnol

高速液体クロマトグラフは，東洋曹達803D型のより簡便で，かつ高感度なHPLC定量法を新

サンプルインジェククー（100plル，プ）付HPLC

たに開発した・この方法によって，FCnol投与後用ポンプ，TSKgel ODS−120T（粒径5pm）をの血清および赤血球中のその濃度をモニターした．

充填したカラム（150×4mmi．d．），12plフローセルを装備した島津RF−530型蛍光検出器およびⅠ・プレカラム蛍光誘導体化による血清

日立056型レコーダーからなる．溶離液はアセ

P−OH BestのHPLC定量法

トニトリルおよび50mhI酢酸ナトリウム・塩酸

緩衝液（pH2．2）からなる．9−OH Best標準液
実験

方を用いて蛍光誘導体化条件を検討する場合は，そ法の割合を1：4（Ⅴ／v），また，血清試料を測定する

1）試料溶液の調製場合は，9：41にする．流速0．8mg／minで溶離

a）1・3mM DDB溶液

液を送液し，溶出液の蛍光検出は，励起波長350

DDB・HC15・3mgを水にとかし，全量20ml

nmおよび発光波長425nmで行う．カラム温度
は室温（20〜27cc）である．

とする・調製後，2時間以内に使用する．
b）50mhⅠ酢酸ナトリウム・塩酸緩衝液（pH2．2）

結果および考察

酢酸ナトリウム6．9gを蒸留水900mgに溶かし，濃塩酸でpH2．2に調整後，全量1gとする．

クーOH Bestは，ク。ロホルム存在下アルカリ溶液中でホルミル化され，DDBによって定量的

2）基 準 操 作に蛍光ラベル化された．この方法は，チロシソをa）除含むペプチドに対してもDDB蛍光体を与え得る

蛋

白血清（または血梁）200βに水（検量線作成時ので，最近オピオイドペプチドとして注目されてには，クーOH Best標準液）100〆および2．5M

いるロイシンエンケファリン（LEK，Tyr−Gly−

過塩素酸200〟Jを加え，1100gで10分間遠心

Gly−Phe−Leu）とメチオニンエンケファリン

する．上活200〟を次の反応に用いる．

（MEK，Tyr−Gly−Gly−Phe−Met）についても

b）ホルミル化反応

クーOH Bestと同様に蛍光誘導体化条件を検討し上清200〟Jに2．5M水酸化カリウム200〟仁をた．

加え，混和後，1100gで5分間遠心する（過塩素酸カリウムの除去）．上清250〟仁をテフロンキャ

1）HPLCによる分離と蛍光検出

ップ付試験管（45×15mmi．d．）に移し，クロロ

P−OH Best，LEKおよびMEKのDDB蛍光

−

26

−

蛍光HPLCによる♪一ヒドロキシべスタチソとフォルフェニシノールの高感度定量法

2）蛍光誘導体化条件
クーOH Bestおよびチロシソ含有ペプチドをDDBによって蛍光誘導体に導くために，まず，
ライマーチーマン反応7）を利用し，それらのフェノール性水酸基のオル下位にホルミル基を導入しSUOds巴3UOOSOJOコ一山

た．
この反応は，クロロ汁りレム存在下，強アルカリ性で加熱することにより速かに進行する・図3は，0．8M水酸化カリウム溶液中で反応したときの反応温度と時間について調べたものである・ホルミ
ル化反応はクロロホルムの沸点より高い温度で特に速かに進行し，70または800Cで加熱したとき，
P−OHBestのホルミル化体の生成は，8分間で
0

16

8

24

最大となった．一方，LEKおよびMEKでは，
70あるいは80ccで5分間以上加熱すると，それらのペプチド結合の開裂によって生じる副反応物

Time（m叫）
図2with the reactionの蛍光ピーク（図2，b）が増大した・なお，クー

miⅩture Of p−hydroxybestatin，leucine

OHBestでは，検討した反応時間および温度におChromatogram obtained

enkephalin and methionine enkephalin・A
portion（200fLl）of the standard solution（5nmol／ml，eaCh）was treated by the rec−ommended procedure・HPLC conditions：column，TSKgelODS−120T；mObile phase，いて，副反応物に由来する蛍光ピークは観察されなかった．定量操作には，クーOH Bestに対して最大の反応収率を与え，かつ，チロシソ含有ペプ

CH3CNr50mM CH3COONa HCl buffer（pH2．2）（1：4，V／V）；flow rate，0・8ml／min；fluorescence detection，Ex 350nm and Em

チドからの副反応物の生成をできるだけ少なくす

425nm．Peaks：1，P−hydroxybestatin；2，

この条件において，反応に必要な水酸化カリウ

methionine enkephalin；3，leucine enkep−
halin；a，reagent blank；b，byrproducts
from methionine enkephalin andJeucine
enkephalin；C，by−prOduct from methionine

るために，700C8分間の反応条件を選択した・
ム濃度を調べた．図4に示すように，反応液中の水酸化カリウム濃度を0・8Mより高くすると，いずれもホルミル化体の生成率は減少した．LEK

enkephalin．

体は，道相分配型充填剤TSKgelODS−120TのおよびMEKでは，この場合も，ペプチド結合がカラムによって分離された（図2）・

開裂した副反応物の生成が著しく増加したが，これらの蛍光体は，pHl．3〜3・5の酸性溶液中

P−OHBestでは，蛍光体を与える副反応物の生で強く発蛍光し，それらの蛍光スペクトルは，い成は認められなかった．したがって，ホルミル化

ずれも350および425mm付近にそれぞれ励起お

クーOHBestのペプチド結合は，これらの条件でよび発光極大波長を有する．HPLCの移動相に分解しないものと推察される．基準操作では，血は，アセトニトリルを含むpH2・2の酢酸ナトリ

清試料の除蛋白に過塩素酸を使用しているので，

ウム・塩酸緩衝液を用いているが，同pHのリソ

ホルミル化反応液中約0．72Mの濃度となるよう

酸塩あるいは塩化カリウム・塩酸緩衝液も同様にに水酸化カリウムを加えている．
反応において，添加したクロロホルムの量（10使用できた．図2のHPLC条件により，後述する蛍光誘導体化条件を検討した．

〜200β）は副反応物の生成には影響を与えず，−27−

︵lモコと雲至竺l上切石上意巴︶をsuむ三〇2BS2∃一山
0

8

2

川

12

The（雨∩）

図3

Effectsofreaction timeandtemperatureontheformylation．Aportion（200FLl）of each standard solution（5nmol／ml）was treated by therecommended procedure，for various times at different reaction
temperatures・al−a3，P−hydroxybestatin；bl−b3，leucine enkephalin；
Cl−C3・methionine enkephalin・al−Cl，80つC；a2−C2，70℃；arC3，60QC．

︵一号こ旨妾宅こも盲二項鼻音suOlU岬8UBS巴○⊃一山
0

0．4

0．8

1．2

XOH（M）

図4

Effect of potassium hydroxide concentration on theformyJation．A portion （200FLl）of each standard
SOIution（5nmol／mJ）was treated by the recommended
procedure with various COnCentrations of potassiumhydroxide，and the pH of the fluorescence reaction
miⅩture WaS adjusted to

3．3with5−17M acetic acid．

a，P−hydroxybestatin；b， leucine enkephalin；C，me−
thionine enkephalin．
−28−

蛍光HPLCによる♪一ヒドロキシべスタチソとフォルフェニシノールの高感度定量法て蛍光反応を行うと，過酸化水素を添加しなくても，反応のラグタイムは生じなかった．したがって，クロロホルム中に蛍光反応を阻害する還元性をsuOl忘8uOOSOJO⊃一山︵苫⊃ゝL空l至dゴ晋工焉乳︶物質が存在していることが示唆された．蛍光反応を700Cで10分間行う場合，過酸化水素は反応液中0．06〜0．1mMの濃度で，P−OH Best，LEK
およびMEKに対して最大の蛍光ピークを与えた．また，過ヨウ素酸ナトリウム（反応液中4〜
10〟M）でも，ほは同様な結果を得た．
蛍光反応の温度は高いほど，蛍光体は早く生成するが（100OCでは7分間で最大値に達する），蛍
1

2

3

4

5

6

光体の生成率には著しい差はないので，ホルミルPH

図5

Effect of pHon the fluorescence derivatiza−tion．A portion（200FLl）of each standard
solution（5nmoJ／ml）was treated by therecommended procedure，but the pH of the
fJuorescence reaction mixture was adjustedwith a mixture of14M acetic acid andconcentrated hydrochloricacid．a，クーhydro−

化反応と同じ反応温度に設定している．
3）血清p−0ⅠI Bestの定量
生体内には，フェノール性水酸基を有する化合物が多く存在するので，血清中のP−OH Bestを

xybestatin；b，leucine enkephalin；C，me−
thionine enkephalin．

検出するには，HPLCによりそれらの妨害物質を50pl以上で，P−OH Best，LEKおよびMEKーに用いた溶離液のアセトニトリルおよび50mMに対して，いずれも最大のホルミル化収率を与え

酢酸ナトリウム・塩酸緩衝液（pH2・2）の組成をた．クロロホルムは反応液中水溶液と分離してい9：41に変化させた場合，すなわち，P−OH Bestるので，反応液を振迄させた場合とさせない場合の蛍光体を遅く溶出させた場合に（その保持時間におけるホルミル化生成率の変化を調べたが，両は5．5分から16分になる），良好な結果を得た．

分離する必要があった．図2のクロマトグラフィ

条件におけるホルミル化体の生成量は，ほぼ等し

図7は，Bestを健常人に経口授与し，投与前かった．基準操作では，反応は静置して行っていと投与後（4時間）における血清中のクーOHBest

る．

〔165ng（0．51nmol）／mりを検出したタロ・マトグ

上述したホルミル化条件で生成したクーOHラムである．Bestを投与していない血清から得たBestおよびチロシソ含有ペプチドのホルミル化

クロマトグラムと比較することによって，クーOH

体は，いずれもpH3．3の酢酸酸性溶液中でBestの蛍光ピークは，内在する妨害物質の蛍光

DDBと反応し，それぞれ蛍光体を与えた（図5）・

ピークと完全に分離されていることが分かる．な

このとき，蛍光反応の促進剤として，過酸化水

お，この蛍光誘導体化HPLCでは，Bestは蛍光

素や過ヨウ素酸ナトリウムなどの酸化剤を必要と体を形成しないので，全く検出されない．また，した．図6に示すように，蛍光反応時に過酸化水

MEKおよびLEKの蛍光体は，このHPLC分素が存在する場合，蛍光体の生成は透かに進行し，離条件でそれぞれ23．0分および34・0分の保持時

10分間で最大となる．しかし，存在しないときで間に溶出される．

は，少なくとも20分間，蛍光反応は進行しない・

基準操作に従い，ヒト血清に添加したクーOH

この反応液に残存しているクロロホルムを分離しBestの蛍光ピーク高さから作成した絶対検量線−29−

︵lモコご空l至d■l奉呈葛監︶
言suUlU二岩uOOS巴○⊃一山

0

10

20

30

40

50

T如e（雨∩）

図6 Effect of reaction time on the fluorescence derivati−
2＝ation．

A

portion（200FEl）of

each

standard

solution（5nmol／ml）wastreatedbythe recommended procedurefor various reaction timesat70℃（al−Cl），but withouthydrogen peroxide（a2−C2）．al，2，P−hydroxybestatin；
bl．2，leucine enkephalin；C．．2，methionine enkephalin．

ほ，少なくとも，25nmol／mJまで原点を通る直の血清濃度はBest投与後4時間後に，Bestのそ線性を示す．このとき，除蛋白操作における♪一れは3時間後にそれぞれ最高値を示した．

OHBestの添加回収率は良好で98±1．8％（n＝5）

また，三吉野班員らにより Bestを連続投与しであった．検量線の回帰直線式による相関係数ている筋ジストロフィー患者血清中の♪−OH（r）は0・999であった．また，刃Ⅳ＝2におけるBestおよびBestについても，同様に測定した血清中の2−OH Best濃度の検出下限は62pmol（表2）．血清試料は投与開始後6週間目の朝に服（20ng）／mlであった．これはHPLC注入量で用し，1時間後に採血して得たものである．その480fmolに相当する．

試料のP−OH Best／Bestの濃度比は，投与後1Bestを投与した健常人血清を処理し，7回繰り

時間後における健常人血清から得た比に比べてか返して測定した定量値（165ng／mりの変動係数は3．9％であった．

なり高い値を示している．これは，患者体内のヒBest（4・17mg／kg）を投与した位常人血清中のP−OH Bestがすでに蓄積されていることも推察

P−OH Bestの経時的濃度変化を本法によりモニされるが，筋ジストロフィー患者血清のベスタチ

ドロキシダーゼの活性が高いこと，あるいは，ターした（表1）．同試料中のBest濃度は，57

ン濃度は，投与後0．5〜1時間で最大値を示して年度に開発した蛍光HPLCによって定量したもいる3・川ことから，測定した患者のクーOH Best／のである．健常人において，代謝体かOH Best

Bestの濃度比は，健常人の投与後3ないし4時−30−蛍光HPLCによるクーヒドロキシべスタチソとフォルフェニシノールの高感度定量法

OSUOds28UOOS巴○⊃正

0

8

16

24

32

0

図7

8

I6

24

32

¶me（min）¶me（min）

Chromatograms obtainedwith（A）drug−freeserum and（B）serum at4h after oral administration of bestatin
to a healthy man．Dose：4．17mg／kg．HPLC condi−
tions：mobile phase，CH3CN−50mM CH3COONa HCl
buffer（pH2．2）（9：41，V／V）；Other conditions are the
same

as

those

describedin

Fig．2．Peaks：1，2−hydro一Ⅹybestatin：others，endogenous substances andreagent

blank．

Serum concentration of p−hydroxybestatin（ng／mJ）：A，0．0；B，165・

表1Concentrationsofp−hydroxybestatin andbestatinin serum after oral administra−

ⅠⅠ．自然蛍光検出による血葉および赤血球

tion of bestatin to a healthy man

FCnolのHPLC定量法
Concentration（FLg／ml）＆）

Time（h）
P−hydroxybestatin bestatin

1
0

8）

8

8

0．045

9

6

0．100

4

4

0．165

0

3

0065

︵U 5 0 0 0 0
7 6 3 1 6 ．4

2

0．020

0
2

1

O．010

0

5

0

ND

実

0

方

法

0．014

1）試料溶液の調製

0．004
0，007

a）75mMクエン酸塩緩衝液（pH3．5）

0．020
0．063

75mMクエン酸および75mMクエン酸3ナトリ

0．113

ウム溶液を混合しpH3．5に調整したものを使用∴

Concentrations of p−hydroxybestatin andbestatin were determinedin sera obtained

2）基 準 操 作

periodicallyatO．5to8h after the admini−a）除蛋白Stration of bestatin with a single dose of
4．17mg／kg to the subject of験

60kg body①血桑一血菓100〆に水（検量線作成時にはFC

weight．

nol標準液）25〆およびアセトニトリル200／上Jb）The concentration of pThydroxybestatin
was dividedbythatofbestatininthesame

を加え，1100gで10分間遠心する．上清100β

sample・間で得たその比に匹適していることも考えられる．

をHPLCに付す．㊤赤血球一赤血球を約4倍量の生理食塩水で洗浄し，800gで遠心した赤血球
50iLlに，水（検量線作成時にはFCnolの標準液）
100扉を加え，ソニケーショソにより溶血させる∴−31−

表2 Concentrations of p−hydroxybestatin and bestatinin sera after
Oral administration of bestatin to patients with Duchenne，smuscular dystrophy
Concentration（FEg／ml）＆）

Patient（year，kg）C）♪一hydroxybestatin

0．053

8
1

orally

0．072

0
2

6
1

0．350

0．032

6
0

︶
︶
︶
︶
0
4
0
6

0．275

0．055

6
2

3
2

0．365

0．045

8
9

︶
5

9
1

9
8
5
︵
︵
︵

0．200

8
1

︶
0

2
2

7
︵

0．330

＆）Bestatin（6・67mg／kg）was

bestatin

4 5 6 5 5．4

0
2

7
︵

0
2

9
︵

A B C D E F

0．190

0．084

administered

three

times

a

day

（morning，nOOn and evening）for six weeks．Concentrations ofP−hydroxybestatin and bestatin were determinedin sera obtained
atlh after thelast administrationin the morning．
b）The concentration of p−hydroxybestatin was divided by that of
bestatinin the same sample．

C）Age and body weight of the patient are shownin parenthesis，
respectiveJy．

この溶血液にアセトニトリル250〟を加え，1100

填したカラム（150×4mmi．d．），18plのフロー

g10分間遠心する．上清100〟をHPLCに付セルを装備した日立650−10S分光蛍光光度計おす．

よび理化電横レコーダーからなる．アセトニトリb）HPLC

ルと75mMクエン酸塩緩衝液（pH3．5）の3：1

高速液体クロマトグラフは，日立655型HPLC（Ⅴ／v）の混液を溶鹿波として用い，流速1．0mg／

用ポンプ，7120Rheodyne試料インジェクター

minで送液する．蛍光検出は，励起波長275mm（100plループ），UnisilNH2（粒径5pm）を充および発光波長313mmで行う．カラム温度は室0︵lモコを芸事亙
倉su茎忘28S20⊃一山

2

4

8

6

10

は

PH

図8

Effect of pH of the forphenicinoI solution onits
native fluorescenceintensity．The pH of the solution
WaS adjusted with a mixture of（a）0．1M citric acidand O・1M disodium hydrogen phosphate，Or（b）0．1M
disodium hydrogen phosphate and O．1M soldiumhydroxide．
−

32−

蛍光HPLCによる♪−ヒドロキシべスタチソとフォル7ェニシノールの高感度定量法
表3

Nativefluorescencesofsomebiologicalsubstances
ReJative fluorescenceintensitya）

Compound（100nmoりmり

ForfenicinoI

atEx275nmand atmaXimumExandEm

Em313nm（Ex宝器昔だ霊ax．）

100．0も）122．2（283／313）

Dopa

52．6

79．0（282／320）

Dopamine

53．0

78．0（282／320）

Epinephrine

89．4

122．0（282／318）

88・0

118．2（282／320）

Norepinephrine
Tyrosine

135．6（278／308）

Tyramine

144．0（278／308）

Serotonin

802．0（302／342）

Tryptophan

362．0（282／350）a）The flu。reSCenCeintensities were measuredin75mM sodium citratebuffer（pH3．5）used for HPLC・b）Thefluorescenceintensity from forphenicinoIwas taken aslOO・

温（20〜270C）である．

結果および考察OSUOds巴の28S巴∃一山

FCnol自身は，PH4〜5の弱酸性溶液中で強く発蛍光する（図8）．この蛍光スペクトルは，
283および313mmにそれぞれ励起および発光極
大波長を有する．しかし，種々の蛍光性生体成分（カテコールアミン類，テロシソ，チラミソやトリプトファンなど）も，FCnolの蛍光と極めて煩似した蛍光スペクトルを有する（表3）．したがって，生体試料中のFCnolを測定するには，少なくともそれらの生体成分からFCnolをHPLC

0によって分離する必要がある．

4

8

12

Time（而∩）図91）HPLCによる分離と蛍光検出
アミノプロピル基をシリカゲル表面に化学結合させたUnisilNH2カラムは，類似自然蛍光を発する生体成分とFCnolを良好に分離した（図9）・
このHPLCの溶離液には，アセトニトリルおよび75mMクエン酸塩緩衝液（pH3．5）（3：1，
Ⅴ／v）の混液を用いている．クエソ酸塩緩衝液のChromatogram ofa standardmiXtureOf
forphenicinol and some biological sub−stances．HPLCconditions：cOlumn，Unisil
NH2（5FLm，150×4mmi・d・）；mObilephase，75mMsodium citrate buffer（pH3．5）−CH3CN（1：3，V／V）；flow rate，1．Oml／min；fluorescence detection，Ex
275nm，Em313nm．Peaks：1，SerOtOnin＋tyramine；2，epinephrine＋dopamine＋
tryptophan；3，nOrepinephrine＋tyrosine；

pHを3．5より高くすると，検討した化合物は全4，dopa；5，forphenicinol；6，artifact・
Amounts：25pmol each perlOOfLl of

体的に遅く溶出し，特にカテコールアミン類がよ

injection volume・−33−

り遅く溶出するため，pH4．5ではそれらのピー

察され，クロマトグラムのベースラインノイズがクはFCnolのそれと完全に重なった．また，ア七大きくなった．なお，275mmの励起波長では，トニトリルの濃度をより高くした場合も，全体的水のラマン光は300mmの波長に現われる．

に遅く溶出してくる．したがって，UnisilNH2
カラムによるこれらの分離は，陰イオン交換と順

2）血柴および赤血球FCmolの定量相分配によって行われているものと考えられる．

図10は，FCnolを健常人に経口授与し，投与

HPLCに注入する試料は，移動相と類似した組前と投与後（4時間）における血菓および赤血球

成のアセトニトリルと水の温液にする必要があっ

中のFCnolを検出したクロマトグラムである．

た．試料を水溶液にすると検討した化合物の各ピ

FCnolを投与した血渠および赤血球のクローマト

ークは著しくブロードになる．

グラム（図10のBおよびD）には，ともに保持

溶出液中のFCnolの蛍光は，275nmの波長で時間7・6分に，FCnolのピークが明らかに観察

励起し313nmの発光波長で測定されている．FC

されている．また，投与前のそれらの試料には，nolの蛍光が示す励起極大波長283nmで励起しFCnolが溶出する保持時間には，内在性の妨害

た場合，水のラマン光が313nmの発光波長に観ピークは検出されていない．

OSUOds23∪8S巴○コに
0

8

16

0

8

16

0

8

16

0

8

Time（min）

図10

Chromatograms obtained with human plasma and erythro−
CyteS beEore or after oral administration of forphenicinol．
Samples：（A），drug−free plasma；（B），pJasma at4h after
Oral administration；（C），drug−free erythrocytes；（D），
erythrocytes at4h after oraladministration．Dose：60mg／
man．Peaks：1，forphenicinol；Others，endogenous sub−
StanCeS．ForphenicinoI concentrationsin plasma and eryth−rocytes（nmol／ml）：（A），0．0；（B），5．9；（C），0．0；（D），
0．95．
−34

−

蛍光HPLCによる♪−ヒドロキシべスタチソとフォルフェニシノールの高感度定量法

基準操作に従い，ヒト血莱および赤血球に添加では約15倍高い．また，このHPLCでは，溶出したFCnolの検量線を作成した．両試料に添加

液中のFCnolをUV検出することも可能である

したFCnolのピーク高さは，少なくとも250nが，図11に示すように，本法の蛍光検出は，UV

mol／mJまで原点を通る直線を示す．回帰直線式

検出より少なくとも5倍以上高感度である．
FCnolを経口投与した健常人血菜および赤血における両検量線の相関係数（r）はともに1・000

球中のFCnol濃度の経時的変化を本法によりモであった．
試料は2〜5倍容量のアセトニトリルによってニターした（図12）．投与後の血梁FCnolの濃度除蛋白されているが，このときFCnolの添加回変化は，58年度に提出した結果とほぼ同様であっ

収率は，両試料とも91±1．5％（刀＝10）であった・

た．一方，赤血球中のFCnol濃度は，投与後少なくとも8時間まで増大する結果を得た．

FCnol投与後，4時間において得た血祭および赤血球中のFCnolの濃度を10回繰り返して求め本法および58年度に提出したFCnolのアルカ

た定量値（それぞれ2．38および1．24nmol／mJ）

リ性酸化による蛍光誘導体化HPLCによって，に対する変動係数は，それぞれ2．12および1・88

それぞれ同じ血奨試料（n＝7）中のFCnol（13〜％であった．

1．2nmol／mJ）を定量し，両定量法の相関を求めた．両者によって求めた定量値には著しい違いはぶ／Ⅳ＝2における本法の検出下限値は，血梁でなく，その相関係数（r）は0．996であった．

は65pmol（13ng）／ml，赤血球では160pmol（32ng）／mlであった．これらの値は，HPLC注入量
でともに2．Opmolに相当する．この感度は，58

お

あ

り

に

年度に提出した蛍光誘導体化HPLCよりも，本研究によって，Bestを投与したヒト血清中

HPLC注入量で4倍，実際試料を測定する場合

∵
へ
l

5

0

02月LOSq＜ 00

OSUOds23UBの巴○⊃一山（2．5nmoり

l

0

l

l

1

8

∴
l

I

0

l

1

8

0

8

¶me（m了∩）図1l Comparison of fluorescence detection

with UV detection forforphenicinolin HPLC using a Unisil NH2COlumn・Detec−
tions：（A），fluorescencedetection at Ex275nm and Em313
nm；（B），UV detection at210nm；（C），UV detection at280
nm．Peaks：1，forphenicinol；others，artifact．
−35−

︵盲＼ちEU 2℃一uむ与○ O

UO葛LlUの200S呈02エlごO PUの▲些巨示由一d

O

l

2

3

4

6

Time after administration（h）

図12

Concentrations of forphenicinolin plasma and erythrocytes
after oral administration of forphenicinolto three healthy
men・ Samples：Pr（a）−（C），P】asma；E−（a）−（C），erythro−
CyteS；（a），administration at5h after feeding；（b）and（C），administration at30min after feeding．Dose：60mg／
man・Body weight and age：（a），57kg，32years；（b），
56kg，23years；（C），57kg， 22years．

のその代謝体P−OH Bestを蛍光HPLCによって定量することが可能となった．この方法は，血清200plを必要とし，62pmol（20ng）／ml以上の濃度で存在するクーOH Bestを定量できる．
また，新たに開発したFCnolの自然蛍光を検出するHPLCは，58年度に提出したFCnol蛍
光誘導体化HPLCよりも，実際試料を測定する
場合，約15倍高感度であり，前処理も極めて簡便である．この方法によって，血祭（100〟J）および赤血球（50／JJ）に，それぞれ65pmol（13ng）／
mlおよび160pmol（32ng）／ml以上の濃度で存在するFCnolを定量することが可能となった．

文

献1）大倉洋甫，甲斐雅亮，三浦暫朗．微生物の二次代謝物に由来する難病治療薬の開発研究．昭和55
年度報告雷，p．25（1981）．
2）大倉洋南，三浦薯朗，甲斐雅亮，山口政俊，石田
淳一・微生物の二次代謝物に由来する難病治療薬の開発研究．昭和56年度報告書，p．21（1982），
3）大倉洋甫，石田淳一，山口政俊，弓場郁代．微生
物の二次代謝物に由来する難病治療薬の開発研究．
昭和57年度報告書，p．21（1983）．
4）Ishida，J．，Yamaguchi，MりKai，M．，and

Ohku−ra，Y・J．Cムromαわgr．，305，381−389（1984）．

5）大倉洋前，田村和彦，石田淳一，甲斐雅亮．微生
物の二次代謝物に由来する難病治療薬の開発研究．
昭和58年度報告書，p．25（1984）．
6）Tamura，K・，Kai，M．，and Ohkura，Y．Jap．
J・C〃軋C加〝〜．，13，195−201（1984）．

7）Wynberg，H・Chem．Rev

60，169−184（1960）．

8）三吉野産治，樋口重典，金子 薫，羽田 明，菜徳也，谷山品彦，原口洋吾，折口美弘．徴生物の二次代謝物に由来する難病治療薬の開発研究．昭和58年度報告書，p．93（1984）．

−36−酵素網の動的平衡に及ぼすべスタチンの効果

青 柳 高 明＊
研究協力者

和田孝雄＊・小島蕗子＊・永井真知子＊・原田滋子＊

ルフェニシン，エステラスチソ，エベラクトンA

は

じ

め

とBなどを兄い出したい10）に本報告は免疫調節作用を有し13〜18），かつ筋ジス

生命の維持にホメオスタシスが重要な役割を演トロフィーマウスの発症阻止効果19−20）のあることじていることは周知の事実である．生化学を基盤が報告されているべスタチソの作用秩序を明らかとして多面的なホメオスタシスの上に成り立ってにすることを目的として，べスタチソおよびそのいる生体を捉えるには，代謝を中心課題として考立体異性体をマウスに連続投与し，経時的に採取えるのが妥当である．筆者らは代謝系からみた動した臓器内の酵素網の動態およびヒトにべスタチ

的平衡という立場からさまざまの酵素に対する阻ソを連続投与した前後における血清中の酵素網の害物質を探索し，また細胞レベルから生体の全体

経時的変化について検討したので，その結果につ像を生化学的に捕え，複雑な生体反応を明らかにいて述べる．

する新しい探索法を開発し，微生物培養液中から多くの低分子酵素阻害物質を発見したト10）．酵素

実

験

方

法

阻害物質の研究は炎症，免疫，補体反応，発がん，
がん転移，ホルモン産生および筋ジストロフィー

動物およびヒト血清症，脱磁疾患症，自己免疫症を含むさまざまの難

1）ICRマウス（7週齢，雄）は静岡県実験動物農業協同組合から購入した．べスタチソおよび病を理解する鍵になると思われる．
細胞膜の諸現象と細胞機能との相関性を研究す

その立体異性体（200／Jg／マウス）は連続30日間，ることは，生命現象を明らかにするために分子生

腹腔内に投与した．動物は2日ないし3日間隔で物学が指向する新しい重要な研究分野である．筆屠殺し，前肢筋，後肢筋，心，脾，肝および腎を者らは各種の単層培養細胞，懸濁細胞ならびに腫摘出したのち，直ちに−700Cで保存した．投与瘍細胞などの細胞表面の酵素活性を調べた結果，

法および臓器摘出は図1に示す．臓器は10倍量

アミノペプチダーゼ，ホスファクーゼ，エステラのPBS（phosphate buffered saline，pH7．2）ーゼなどが存在することを明らかにした11〜12）．細中で，組織ホモジナイザー（ultraturrax）を用い胞表面に存在する酵素を指標にして阻害物質を探て1分間ホモジナイズした．酵素活性の測定には，索し，それぞれの酵素を特異的に阻害するアマス

ホモジネートの3，000×g，20分間の遠心上清をタチソ，べスタチソ，アルファメニソAとB，ホ用いた．
2）ヒト血清（T．A．，38y．0．，男）は木下班員＊微生物化学研究所−

37−

一一一一一一一一一ーーーーBestatin

administration−−−−−q−−−−−一・＿

■

一

︳

−

■

−

l

−

1

⊥
1

−
1

2

tIーtI30

■

−

1

1

11− −−1−l

1−−−・⊥l−■一−⊥▼

1

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⁝

l

−

一

● ● ■ ▲ l l llll●ll⊥▼ll5− − ⁝ ・ − 2 0■

11■ll⊥ll

llllll−⊥．．．−●■⊥▼■t一−

I−−−・▼15■−1−−−⊥ll

一l1−−−1■−1 1 一 ■ ■ 一 T l

t

1

一l

1 − − − 1 ■ − 0

・

lllll

■ll＝▼

tl ll・lStI・．■・・−−・15l■1−−⁚■ll

ll l l⊥l■la■ I I ■ l T l−−−・・・lD

V ︐…川川川Il…川…11日†十十††††††††††十十††十†十†十十日††
Experimentalanimals：ICR mice，i．p．injection
Inhibitors：（2S，3R）一bestatin，（2R，3R）−bestatin

Organs：forelimbmuscle，hindlimbmuscle，heartmuscle，
SPleenliver，kidney
Enzymaticassays：aminopeptidase（5），endopeptidase（7），GJcNAc−aSe，phosphatase，eSteraSe
図1Effectsofbestatin stereoisomers on enZyme netWOrksinmurine organs

から提供された．投与前103日およびべスタチソ

タチソおよび立体異性体の構造ならびに阻害活性（180mg／日，経口投与）投与後85日間にわたり，は表1に示す．

2日ないし3日間隔で採血した．採血法および投与法は図8に示した方法で行った．

基

質

酵素活性測定用の基質は下記のものを用いた．

阻害物質

L−glutamic acidβ−naphthylamide hydrochlo−

べスタチソ〔（2S，3R）−3−aminoT2−hydroxy−ride（Glu・NA），L−arginineβ−naphthylamide

4−Phenylbutanoyト（S）−leucine，（2S，3R）AH（Arg・NA），L−PrOlineβ−naphthylamide（Pro・PA−（S）−Leu〕およびその立体異性体〔（2S，3S）

NA），L」eucineβ−naPhthylamide（Leu・NA），gly−

AHPA−（S）−Leu〕，〔（2R，3S）AHPA−（S）−Leu〕

Cyl−L−prOlyl−L−leucineβ−naPhthylamide（Gly−と〔（2R，3R）AHPA−（S）−Leu〕を用いた．べス

Pro−Leu・NA），hippuryl−L−Phenylalanine（Hip−

表1Inhibitory Activities of Bestatin andits Stereoisomers
Bestatin

CH3
CH−CH3

CH20H

CH2

H2N−CH，TCH−CO−NH−CH−COOH（R）（S）（S）

Stereoisomer IC30（FLg／ml）

2

Q

CH20H

3

AP−B Leu−AP Gly−Pro−Leu−AP AP−AS R O．05
S S

0．01
4．1

0．23

3
40

R S

＞200

＞200

＞200

R R

＞200

＞200

＞200

H2N−CH−CH一（3）（2）−38−

酵素網の動的平衡に及ぼすべスタチンの効果
表2

List of the Enzymes Measured and their Substrates

Enzyme Abbreviation Substrate

Leu・NA

Gly−Pro−LeurAP

Gly−ProLLeu・NA

Carboxypeptidase A（EC3．4．17．1）

CP−A

Hip−PheCarboxypeptidaseB（EC3．4．17．2）

CP−B

Hip−Lys

Dipeptidyl carboxypeptidase（EC3．4．15．1）

ACE

Hip−His−Leu

Prolyl endopeptidase（EC3．4．21．26）

Post−Pro−EnZ

Z−GlyTPro

Plasma kaJlikrein（EC3．4．21．34）

Kallikrein

BAEE

l
2

Carboxyl proteinase（EC3．4．23．5）

Cathepsin D

HemogIobin

Alkaline phosphatase（EC3．1．3．1）

Phosphatase

NPP

l 1
2
1

Arylesterase（EC3．1．1．2）

Esterase

NPA

1

6 2 2
2 1 1

Phe），hippuryl−L−lysine（Hip−Lys），hippuryl−L−

l l 1
2 2 2

Leu−AP

4
2

Leucine aminopeptidase（EC3．4．11．1）

Tripeptide aminopeptidase（EC3．4．11．4）

13 l
2
2

l
2

Arg・NA
Pro・NA

Pro−APl2

Glu・NA

AP−B

1 1 1 1 2 3
1
1
1
1
2

AP−A

1
1

Aspartate aminopeptidase（EC3．4．11．7）
Arginine aminopeptidase（EC3．4．11．6）
Prolineiminopeptidase（EC3．4．11．5）

慧禁認

素活性の測定法および基質は表2に示す．

histidyl−L−leucine（Hip−His−Leu），Carbobenzoxy−
glycyl−L−PrOline（Z−Gly−Pro），Na−benzoyl−L−

蛋白の測定

arginine ethyl ester hydrochloride（BAEE），

標準蛋白として，ウシ血清アルブミンを用い，Lowry法27）で測定した．

hemoglobin，P−nitrophenylphosphate（NPP），
9−nitrophenylacetate（NPA）．

統
緩

衝

液

計

多変量解析の一手法である主成分分析法を用い

酵素活性測定用の緩衝液は0．02M phosphateて解析した28）．

buffered saline（PBS，pH7．2）を用いた．ただし，Carboxypeptidase A（CP−A）の測定には結果および考察0．05M Tris−HClbuffer（0．9M NaCl含有，pH7．5），Carboxypeptidase B（CP−B）の測定には0．05M Tris−HClbuffer（pH8．0）およびカテプ
シソDの測定には0．2M SOdium acetate bufEer（pH3．2）を用いた．

筆者らは正常および筋ジストロフィーマウスに低分子酵素阻害物質を授与し，筋肉を含む各種臓
器内の酵素活性の変化を経時的に調べた結果，
f乃びわナ0の抗酵素スペクトラムを反映しないことを報告した29￣32）．今回はベスタチソを連続投与す

酵素活性の測定
臓器ホモジネートの遠心上清分画およびヒト血清は，それぞれの基質溶液および緩衝液を含む反応試験管（1．5×10cm）に分注し，370Cで1時間ることにより誘起される酵素網の動態を経時的に調べ，またヒトに連続投与した前後における血清中の酵素網の動態について述べる．

の反応を行った．CP−A，CP−Bおよびカテプシ
ソDは前述の緩衝液を用い，それぞれの条件下で反応を行った・すべての酵素活性の測定にl羊3本宛の試験管を用い，その平均値を記載した．各酵−39−1）ぺスタチンおよびその異性体による酵素網の動態88）
べスタチソはその構造に3個の不斉炭素を含んでいる．各種の立体異性体を合成し，構造と活性

Leu−AP活性はべスタチソの連続投与にもかかわの相関を検討した．各種の立体異性体の阻害活性

らずほとんど阻害されない．そして，1週と3週は表1に示す．AHPA（3−amin0−2−hydroxy−4−に2つのPeakが認められた．また不活性体（2R，Phenylbutanoic acid）の2位の配位がSである

3R）AHPA−（S）−Leu投与の場合は特徴的な振動立体異性体はAP−B（aminopeptidase B），Leu−を示さない．一方，AP−A活性はLeu−APおよAP，Gly−Pro−Leu−AP活性を阻害するが2位のびGly−Pro−Leu−APと異なる振動が認められ，配位がRの異性体はいずれの酵素に対しても阻害また不活性体の振動は小さい．

活性を示さない．ベスタチソの阻害活性発現には，腎の酵素網の動態は図3に示す．ベスタチソ投

AHPAの2位の配位がSであることが重要であ

与群は脾と類似した振動を示し，いずれの酵素にる．

おいても2つのpeakが観察された．一方，肝に上述した結果に基づき，活性体である（25，おける酵素網の動態は脾，腎と異なり，いずれの3R）AHPA−（S）−Leu（ベスタチソ）と不活性体

投与群もランダムな振動であった（図4）．

である（2R，3R）AHPA−（S）−Leuを図1に示

図2，3および図4に示した酵素活性の振動のした方法で授与し，経時的に脾，腎，肝における意義を明らかにするため自己相関係数をプロット

酵素活性の動態を調べた．

して図を作成した（図5，6，7）．脾（図5）およ脾，腎および肝における経時的な酵素活性の動び腎（図6）に示したように，べスタチソ投与群

態を図2，3および図4に示す．べスタチソはf乃の自己相関係数はいずれの酵素の場合においても，

vitroでLeu−APとGlyqPro−Leu−APを強く阻

Sine curve型の振動をしていることを明らかにし害するがAP−Aは阻害しない（表1）．図2に示た．一方，肝（図7）ではAP−AのみSine curve

したように，脾内におけるLeu−APとGly−Pro−型の振動を示した．

1

5

0

9

︵．︸OJd g＼∪盲＼一〇EU︶．10＜ds

62．

2．0

20

10

30

days
ol＿0（2S．3R）AhpA−（S）TLeu（Bestatin），●一一一（2R，3R）AHPA−（S）LLeu

図2 Comparison oftheenzymatic oscillationsin spleeninduced
by bestatin and one ofits stereoisomers．
−40−

酵素網の動的平衡に及ぼすべスタチソの効果

nU
5
0
5
6
5
4

︵．12dg＼U篭＼一〇∈U︶﹂0く・ds

Gly−Pro−Leu−AP

3
5

10

20

30

days
0−−−0（2S．3R）AHPA−（S）−Leu（Bestatin），●−−−4（2R，3R）AHPA−（S）−Leu

図3

ComparisonoftheenzymaticoscilIationsin kidneyinducedbybestatin and one ofits stereoisomers・

5
S

3

nU
3
2

5

2

0

︵・l︒Ldぎ＼∪∈＼一〇∈U︶．雲．ds

10

20

30

Days
o一一一一（2S，3R）AHPAr（S）−Leu（Bestatin），●−−・4（2R，3R）AHPA−（S）rLeu

図4Comparison of the enzymatic oscilJationsinliverinduced
by bestatin and one ofits stereoisomers，−41−

（2S．3R）AHPA−（S）−Leu（Bestatin）
Days −0．50

COrretation

COrrelation
0．00
0，50

l．00

−0．50

O．00

0，50

1．00

−0．50

COrrelation
O．00
0．50

1．00

O
＝●●●■●●●l5●●●●■■HHH■■●＝●l……＝…●l●■●●■■川■l

10
15

●■●l

AP−A

●■●■●●■◆●●I●◆……＝●●1………

■●tH……l●■●＝●■‖■●●●◆●l20●●

Gly−Pro−Leu−AP●＝■■Hl●川▲●日●1
●●●●1
lt▲

25

l■■●

（2R，3R）AHPA−（S）−Leu
05●■●●■■▲●l■■■■■日◆●l10●■■●●l▲●●■●●■●●l■●■●●■●◆t

15■■▲●−●■●●■l●●＝●1■■■■◆l
●●■●l
−●●■l

20

Gly−Pro−Leu−AP

l●■

■●●●l

l■●●●■

25●◆■■●＝■●●l

■l

l●●

30

■■−●●…●l鱒●■l

図5 Autocorrelation curvesfor enzymaticactivitiesin spJeen treatedwith bestatin or。neofits stereoisomers．

（2S，3R）AHPA一（S）LLeu（Bestatin）

correIati10n

COrrelation

ー0．50

0．80

J

●

…

1）．50

l．00・−0．50

0．00

COrrelation

0．5D l．00−0．50

0．00

0．50

●

●●●●●HMl■● ●＝■●●●◆l

AP−A

Gly−Pro−Leu−AP

Leu−AP

ー…●■●日■●●l●●●日日■●1●1lH■●■●■l◆……＝◆
l■■●H…＝◆lH■●●●●●■■

l●●▲●●●■■■■
l●●●■●●●■●●■l◆■●●●●■■●●●
l−●●●●●●●

l●

25

：

（2R，3R）AHPA−（S）−Leu

5
人
U
5

20
25
30

■●●−●一▲一日Ml

35

図6 Autocorrelation curves for enzymatic activitiesin kidney treated with bestatin or one
oEits stereoisomers．

−

42

−

I．00

酵素網の動的平衡に及ぼすべスタチソの効果（ZS．3R）AHPA−（S）−Leu（Bestatin）
Day

−0．50

correlation
0．00
0．50

t．00−0．50

COrreration
0．00
0．50

1．。0＿。．S。

0．。∂0rre■a一畳50■．00

l川■●−◆●●−…………●■H・●■●＝●日日……日日■●t●■lM●■……●●−●HHH■●日●一日＝●−…●●●●●●◆●●●◆

O

l…………………一●・●●●…■●■■●●一・…●▲l●◆＝●◆■■■日日●●■●日●■●日…＝◆●●■●■●●●■

t●…●……▲日日…●…り●川●●＝●●●

l…◆日…●H…＝…＝●●●●●

l▲…＝…一一一一…HMH−

lMHt■●■●■●■日●●

lH●■■●■■日日●◆

lH●●● ■■●●●

5l■●●■●●●川●lH●●●＝●

10

Gu−ProrLeu−AP

15
■MM…●

20
●●●●●l

●●●l

l●

25

（2凡3R）AHPA−（S）TLeu●●■●■1

Gly−Pro−LeurAP
1
l■◆●●

l▲●

一■

l●■●■●l■●●

図7 Autocorrelation curves for enzymaticactivitiesinliver treatedwithbestatinoroneof
its stereoisomers．

2）ヒト血清の酵素網に対するベスタチンの効

べスタチソ投与群はSine curve型の振動を表わす酵素群が，対照に比べ同調（synchronize）し果ていると考えられる．このことは，外界から異物

べスタチソ投与前後における血清中の酵素網のを投与することにより起る非特異的な効果ではな

変動について，木下班員から提供された患者血清

く，臓器内の酵素網に一定な律動性のある変動をについて検討した．べスタチソ投与法ならびに採与えたことを表わしている．筆者らにより兄い出

血方法は図8に示した方法で行い，また酵素活性された酵素の振動現象は細胞内の動的な酵素網のの測定法および基質は表2の方法で施行した．
患者血清中のAP−BおよびPro−AP活性の変制御を明らかにし，生体を理解する上に重要であ動は図9に，またLeu−AP，Kallikreinおよびると考える．

Esterase活性の変動は図10に示す．酵素活性の一一一一一一一一一一Bestatin

150

50

days

∴川∴∴∴∴二二∴∴…∴∴∴∴∴
Patient：T．A．38y．0，male

Administration：Bestatin，180mg／day，P・0・
Enzymaticassay：AP−A7APrB・Pro−AP・Leu−AP・G−y−Pro−AP・Gly−Pro−LeurAP・
CP−A CP−B
ACE，Post−ProLEnz，Kallikrein，Cathepsin D
Alkaline phosphatase，Esterase

図8

Effectsofbestatin on plasma enzymeJevelsin man
−43−

16．0
∈
＼
−∈14．0＼
く⊃∈⊂倉＞葛再0篭監S
days

図9

50

100

150

Enzymatic oscillationsin human serumwith orwithout bestatin
administration

Days

図10

50

川0

Enzymatic oscillationsin human serum150with or without

bestatin administration．

動態はいずれの酵素においても非投与群と投与群を検討した結果，ベスタチソはヒト体内の酵素網では異なった振動が認められた．べスタチソ投与にシンクロナイズ効果を与え，前述したマウス臓群ではAP−A，AP−B，CP−B，Alkaline，phos−器における知見と類似した結果を得た．

phatase，Esterase活性などが有意に低下することを兄い出した．また有意な変化を示さない酵素

ま

と

め

においても，非投与群と投与群では振動が異なっている．さらに，多変量解析の一つの方法である

ベスタチソの作用枚序を明らかにすることを目

主成分分析法によって各種の酵素活性の相互関係

的とし，ベスタチソおよびその立体異性体をマウ

−

44

−

酵素網の動的平衡に及ぼすベスタチソの効果

スに連続授与することによる各種臓器内の酵素網

15）Jarstrand，C．andBlomgren，H・J・Cll71・L・ab・の変動ならびにべスタチソをヒトに連続投与した

16）Jarstrand，C．andBlomgren，H・J・Clin・Lab・′7乃〝‡〟〝OJリ5，67−69（1981）・

J，那花〟〝O7．，7，115−118（1982）・前後の患者血清中の酵素網の動態について調べたt
べスタチソは細胞膜に作用するとともに，オリゴペプチドの代謝に影響を与え，また間接的に蛋
白代謝全般に効果をおよほし，免疫担当細胞を含17）Saito，M．，Aoyagi，T．，Umezawa，H・and
Nagai，Y．βoc如刑．βわ〆ッ∫・Rg∫・Comm〝札，
76，526−533（1977）．
18）Saito，M．，Takegoshi，K．，Aoyagi，Twa，H．and Nagai，Y．Cell．ZmmtLT

む細胞機能に変化をひき起すと考えられる．また筋ジストロフィー患者血清中の加水分解酵素にもUmeza−

l．，40，

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31）Aoyagi，T．，Wada，T．，Ohuchi，S・，Kojima，F・，
Nagai，M．，Kawahara，F・and Umezawa，H・βわrろgm．九九，9，405−411（1984）．
32）Aoyagi，T．，Wada，T．，Ohuchi，S・，Kojima，F・，
Nagai，M．，Harada，S．and Umezawa，H・J・−45−

グムdr〝即0鋸0−頻れ，7，681−687（1984）．
33）Aoyagi，T・，Wada，T．，Yamamoto，K．，Kojima，−46−

F・，Nagai，M．，Harada，S．and Umezawa，H．
よ Aメ・〆βわどんど明り6，212−221（1984）．

急性脊髄損傷に対するロイペプテンの効果

岩 崎 祐 三＊研究協力者

飯塚秀明＊・山本悌司＊・今野秀彦＊

的に測定することにより ，軸索正対する薬効を客

神経軸索の細胞骨格系の主要構成成分のひとつであるneuro丘lamentに対し特異的に働く蛋白

観的に把握する方法を開発した．

分解酵素が，広く中枢神経，末梢神経に存在する
ことが知られており，それがカルシウム依存性中方法

性プロテアーゼであることが最近明らかにされつつある1〜。．また，急性脊髄損傷に際して傷害部

実験には雄ウィスターラット17匹（体重，160

位のカルシウム濃度が急速に上昇することも報告〜220g）を使用した．ベントパルビタールソーダ

されている卜7）．上記のような事実をもとに，脊（40mg／kg体重）の腹腔内投与による麻酔後，手髄損傷における組織破壊の楼序の一つとして，神術用顕微鏡下に第9・10胸椎の椎弓を切除しち経組織に内在するカルシウム依存性プロテアーゼ（図1）．次いで，第11胸髄のレベルで，硬膜外の活性化が最近注目されており，実験的脊髄損傷においても，傷害部位より遠位にある軸索が著明から脊髄をピーマーの血流二時遮断用クリ・−ツア（先端圧40g）で30秒間圧迫して損傷を作製したに減少していることが報告されている8）．

（図2）．

カルシウム依存性中性プロテアーゼの阻害剤で脊髄動物を二群に分け，10匹にはロイペプテン

あるロイペプテンやE64が，神経組織に内在すを腹腔内投与，残る7匹には生理的食塩水を投与∴

るプロテアーゼによるneuroLlamentの崩壊を対照群とした．ロイペプチソ（Lot No・39）は，阻止することは，f乃びわroの実験ではすでに確か

脊髄に損傷を加える10〜15分前に初回投与，以められている．しかし，これらの酵素阻害剤の脊後，一日二回腹艦内投与を行った．一回の投与量

髄損傷に対する作用については末だ報告がない．

は手術当日および術後第1，2日は25mg／kg，術

そこでわれわれは，ラットの実験的急性脊髄損傷

後3日目からは12．5mg／kgとし，標本作製日まに対するロイペプチソ投与の効果を検討した．

で継続した．

脊髄損傷に対する薬剤投与の効果判定法につい術後7日目に，10％ホルマリンで経心的に濯洗ては，多くの議論がなされてきた＝0）．特に，運固定した．固定後摘出した脊髄は，更に10％ホル

動機能，膀胱直腸機能やSomato−SenSOryeVOked

マリンで3〜4週間固定したのち，第6億髄の横responseなどを指標とする判定には批判が強い・

断凍結切片を35pmの厚さで作製，Fink−Heimer

そこで，われわれはFink−Heimer法11）により軸の方法に準じて鎮銀染色した．鍍銀染色標本の像

索の初期変性をとらえ，傷害部より遠位に出現すはテレビカメラにより顕微鏡から直接Luzex500

る変性軸索の量を，自動画像解析装置により定量

Tu型画像解析装置に送りこみ，画像の解析を行った．

＊東北大学医学部脳疾患研究施設脳敵組構造部門
−

47

−

−lE壷岳岳垂11号、
ヰサー一一一一 写

図1椎弓切除により脊髄を露出した図・

図3 非損傷脊髄第6腰髄のFiTlk，Heimer標本・血管壁が共染しているが，実質内には銀粒子が全くみられない．（×75）

図2 脊髄にクリップによる損傷を加えている図・

4

図4 胸髄横断後にみられた変性軸索・銀粒子は脊髄下行路，前角などに広範に分布しているt
第6腰隠Fink−Heimer標本・（×30）
結果

ぅな変性軸索の出現は，ロイペプチソ投与群，非投与群に共通な所見であったが，投与群と非投与

FinkTHeimer標本では，非脊損動物には全く見られない銀粒子が，脊損動物の白質では脊髄損群の間にはその出現頻度に大きな差が見られた・
図5に，第6陳髄，RexedのLaminaVIIIの傷部位より遠位の脊髄下行路に限局して，また，
灰白質では，脊髄下行路および脊髄固有路の神経

FinkTHeimer標本を示す．左はロイペプチソ非投与例，右はロイペプチソ投与例のもので，銀粒終末に一致して多数みられた
図3は，非脊損動物の第6隙髄前角のFink−

子の量が投与例で明らかに減少している・
薬効をより定量的にとらえるために・単位面積H。imer鍍銀標本で，血管壁の共染が見られるが・
変性軸索に特異的な銀粒子は全く見られか、・図4は，脊髄動物の第6隈髄の横断切片のFink−
Heimer標本で，ここには多数の銀粒子が出現し，後索の錐体路，前・側索内の脊髄下行路が選択的に染め出されているほか，脳幹からの下行路，脊髄固有路の神経終末がある前角のRexedのLaminaVII，VIIIが染め出されている・このよー

で銀粒子の占める面積を自動画像解析装置を用いて計測した．図6左は画像解析装置のテレビ映像
で右はその二価像である・計測は・この画面の中央に見える円に囲まれた部分（5・174×10￣2mm2）について行った．個々の動物について，少なくとも三枚の標本の計測を行い，その相加平均値をその個体の面積率として表現したものが図7で，非48−

急性脊髄損傷に対するロイペプチンの効果

図5

クリップによる脊髄損傷後7日目の第6腰髄，RexedのLamina
VIII．

非投与例（左）に比べ，ロイべプチソ投与例（右）では明らかに銀粒子の量が減少している．Fink−Heimer標本，（×150）

図6

Fink−Heimer標本のテレビ像 （左）とその二価像（右）．図中，円で囲まれた部分で銀粒子が占める面積を自動計測した．

投与群7匹の平均が28．4±0．77％（mean±S．E．）にみられた軸索終末の変性像の電顔写真である．

であるのに対し，ロイへプチン投与群10匹の平均は23．6±0．40％ と投与群のそれは有意に減少考察していた（ク＜0．001）．つまり，ロイペプチソ投
与例では非投与例に比べ，変性した軸索の量が平脊髄損傷において，自質を構成する脊髄伝達路

均16％減少していたことになる．図8は，Fink−の障害が機能予後を左右することはいうまでもな

Heimer法で見られる銀粒子に対応して脊髄前角い．この脊髄伝達路を構成する軸索の主たる細胞−49−

身状態の悪化が多くの個体でみられたため，対照群と臨床症状を比較することは妥当性を欠くと考えられ検討から除いた．
れは，組織学的に重症度を定量化する試みとし

0て，損傷後の軸索および終末の変性像をFink−：．貢28・4±0・77％■■

Heimer法でとらえ，その変性の程度で重症度を表現する方法を開発し，今回の治療効果の検討に㌢萱23．6±0．40鱒●用いた．

（mean±S．E．）

今回の実験結果は，ロイペプチソの脊髄損傷に

0

SU葡Lu L聖一偏ぶp且⊃80雷Ld O芦

以上のような，種々の問題点をふまえ，われわ■

対する有効性を示唆するものといえるが，既述しセ＜0．00tたように，ロイペプチソ投与群では，全身状態の悪化が多くの例でみられ，投与量や，投与期間の問題をさらに検討する必要があると考えられる．
また，今回は急性期の実験であるが，数力月単位●

anLmals treated p untreatedWithleupeptlnの慢性期の判定も当然必要であり，今後の課題とanimals

考えている．

図7 銀粒子（変性軸索）の面積率分布．

骨格の一つであるneuro丘lamentが，損傷急性期

文に高度に破壊され12），この破壊の機序として，損

献1）Shlapfer，WW．，Freemen，L．Mburoscinece．，5，2305−2314（1980）．

傷時に細胞外カルシウムの急敢な細胞内流入7）に

2）Tshiro，T．，Ishizaki，Y．FEBSLetter5．，141，

よる，カルシウム依存性プロテアーゼの活性化が41−44（1982）

3）Ishizaki，Y．，Tshiro，T．，Kurokawa，M．，J．
Ⅳ紺rOC力札，41，（SUPPL），S155（1983）．
4）Kamakura，K．，Ishiura，S．，Sugita，H．，To−
yokura・，Y．J・Neurochem，40，87−92（1983）．
5）Happel，RD．，Smith，KP．，Banik，NL．，etal，

関与していることが示唆されている12）．このことは，この酵素の括抗剤であるロイペプチソが，損傷後の軸索変性を減少させる可能性をもつと考え▲jられる．

βrαJ乃Rg∫．，211，476−479（1981）．

6）Young，W・，Yen，V．，Blight，A．，BrainRe5．，

脊髄損傷に対する薬物療法としては，従来より，

235，105−113（1982）．

ステロイドや，マニトールなどの浸透圧利尿剤が7）Stokes，BT・，Fox，PりHoHinden，G．，ExperⅣg〟rO7．，80，561−572（1983）．

主として用いられ1‡），また，最近はナロキソソ，

8）Tator，CH・，Rivlin，AS・，Lewis，AJ．，Schmoll，TRHなどが，実験的および臨床的にも試みられている13・14）．各々の薬剤で，有効性も報告されているが，いずれの場合も，損傷の重症度の判定法が問題とされてきたい0）．臨床症状や，電気生理

B・，J，Ⅳど〟rO∫〟rg．，61，118−123（1984）．

9）Eidelberg，E・，J・Neurosurg．，43，646（1975）．
10）Rivlin，AS・，Tator，AH．，J．NeurosuT・g．，47，
577−581（1977）．

11）Fink，RP・，Heimer，L Brai7ZRe5．，4，369−374（1967）．

学的判定法については，従来より多くの問題点の12）Braughler，JMりットなどの自動能の回復の良好な動物で判定する

13）De La Torre，JC・，Spi7Ze．，6，315−335（1981）．
14）Faden，AI．，Jacobs，TP．，Smith，MT．Neurol＿

ことは困難と考えられる9）．今回の実験では，こOgツのような問題に加え，ロイペプチソ投与により全−Hall，ED．J．Neurosurg．，

61，290−295（1984）．

指摘があり，特に，損傷後の神経脱落症状を，ラ50−34，1280−1284（1984）．

急性脊髄損傷に対するロイペプチソの効果

図8 脊髄損傷後7日日の第6胸髄前角で，銀粒子に対応してみられた
変性軸索終末．（×45，000）−

51−ロイペブテンの薬理学的研究

大 塚 正 徳＊研究協力者

宮田雄平＊・小西史朗＊・柳澤光彦＊・村越隆之＊

岡本司＊・松戸隆之＊・宋時栄＊

これまでの研究にひき続きロイペプチソおよび58年度）について調べられ，著明な影響のないこ

ベスタチソの薬理作用を研究したが，今年度はととが知られているが，気管平滑筋に対する影響に

くに次の7桂の標本について実験を行った．

ついてはこれまで報告がない．ロイペプチンはア
セチルコリソのムスカリン作用を増強させること

1）血管平滑筋がラット副交感神経節において兄いだされた（昭ロイペプテンの血圧下降作用については昭和54

和58年度報告）．そこでモルモットの気管ラセン

年度にイヌおよびネコで田中らによって兄いださ

状条片標本を用い，気管平滑筋に対するロイペプ

れ1），昭和57年度にはわれわれもウサギで観察しチンの作用を検討した．・

報告した．この降圧作用の枚序として当初は神経

3）虹彩括約筋

節遮断作用（昭和54，55年度報告）が考えられた．しかし，昭和58年度の研究でα型遮断薬（フ上記の二種の平滑筋標本に加えて，今年度はウェントラミソ）の前処置下にロイぺプチソを投与

サギ虹彩括約筋に対するロイペプチソおよびベス

しても降正作用が消失しないことが判明し，ロイ

タチソの効果を検討した．

ペプテンの降圧作用秩序について再検討することが必要になり，本年度は血管平滑筋に対する作用

4）交感神経節を調べた．この問題については，ロイペプチソが自律神経節に対する作用としては，昭和54年

モルモットの大動脈ラ七ン状条件片標本の収縮に度および55年度にロイペプチソが下腸間膜動脈

影響しないことをすでに昭和57年度に報告して神経節においてコリン作動性伝達をシナプス後性いる．今回は弾性型動脈とされる大動脈ではなく，に抑制することを報告し，また昨年度はラット副血圧調節の主役であると考えられる筋型動脈とし交感神経節においてロイペプチソがアセチルコリてモルモット，ウサギ，およびネコの大腿動脈をンの速い脱分極作用を抑制し，それに続く遅い時

用い，ロイぺプチソの血管平滑筋に対する作用を

間経過の脱分極を増強することを報告した．本年調べた．

度は交感神経節であるモルモット下腸間膜動脈神経節において実験を行った．

2）気管平滑筋
5）摘出脳幹一脊髄一肺標本

ロイペプテンの呼吸機能に対する効果としては，呼吸数の変化が丸ごとの動物（ウサギ，昭和57

昨年度は新生ラットの摘出脳幹一脊髄標本にお年度）および摘出延髄一脊髄標本（ラット，昭和

いて，呼吸活動に対するロイペプチソの効果を研究した．本年度はこの標本をさらに改変して摘出＊東京医科歯科大学医学部薬理
−

53

−

0．5gとした．

脳幹一脊髄一肺標本とし，呼吸反射に対する薬物の効果を検討した．

3）ウサギ虹彩括約筋
体重2．5kg前後の家兎を，致死量のNembutal

6）摘出脊髄一尾標本
この標本は昨年度の研究で初めて用いたもので，の静脈内投与により薬殺し，眼球を摘出した・各

昨年は尾に圧刺激を加えたが，本年度は化学的刺眼球につき一片の虹彩括約筋標本を作製し，8mg激を与え，これによって誘発される侵害反射に対のbath中に一端を固定，他端をforce−displace・するロイべプチソの作用を調べた．

menttransducerに結びつけ，150mgの初期負荷をかけて，張力の記録を行った．液槽は，95％7）ラット脊髄02，5％C02の混合ガスで飽和したKrebs液で昨年はね＝症旭のラット脊髄においてロイぺプ

満たし，37ccに保った．

チソの脊髄反射および脊髄運動ニューロンに対する効果を研究した．今年度は同様の実験をべスタ

4）交感神経節

チン丹こついて行った．

モルモット（雄，体重150〜200g）から下腸間膜動脈神経節を摘出し，記録槽に固定してTyrode

実

験

方

液（350C）で港流した．顕微鏡下に観察しながら法

神経節細胞に微小ガラス電極（3MKCl，50〜1001）血管平滑筋

MQ）を刺入して細胞内電位を記録した．コリソ

大腿動脈は体重2・5kg前後のウサギ，ネコお作動性fastEPSP（興奮性シナプス後電位，

よび体重1．2kg前後のモルモットから採取した・

excitatorypostsynaptic potential）を誘発する

ウサギおよびネコはネソプタール麻酔下に，モルため，腸間膜間神経（intermesentericnerve）を

モットは撲殺後ただちに大腿部を切開し，大腿動，

吸引電極を介して矩形波パルス（0・1〜0・2msec，

静脈および神経を一括して摘出した．摘出後ただ5〜8V）で刺激した．薬物（ロイペプチソ，ヘキ

ちに95％02，5％C02で十分に通気したKrebs

サメソニウム・ブローマイド，硫酸アトロピソ）は液中で大腿動脈のみを分離し，長さ約3cmのラ濯流によって適用した．アセチルコリン（ACh，

セソ状条片標本を作製した．

acetylcholinechloride，3×10￣4g／ml）は微小ピ

ペット（先端外径約3／皿）に充填し，神経節紐2）気管平滑筋胞の近傍に圧力パルス・（0・2〜0・5kg／cm2）によっ

モルモットを撲殺後，ただちに頚部を切開してて適用した．

気管を摘出し，血管平滑筋標本の場合と同じよう
5）摘出脳幹一脊髄一肺標本にラセソ状粂片標本を作製した．
作製した大腿動脈あるいは気管のラセソ状条片

0〜3日齢Wistar系ラットからェーテル麻酔下

標本は95％02，5％CO2混合ガスを通気したに脳一脊髄一胸郭を摘出して四丘体レベルで除脳し，Krebs液5m仁を満たしたマグヌス管内につるし小脳も除去した．気管一気管支一肺と脳幹一脊髄をた．標本の一端に結んだ糸をストレンゲージ（新一側の迷走神経でのみ連結された状態で周囲から

興通信，UL−2−240）に連結し，ひずみ測定器（三単離した．図1に示すように中枢神経系と気管一栄測器，RCTI−HORIZ−8K）上に張力の変化を肺とを別々に濯流できるような液槽内に固定した．

記録した．初期負荷は大腿動脈で0・1g，気管で第4ないし第5頸髄前板から吸引電極で細胞外記

−

54

−

ロイべプチソの薬理学的研究↓
図1反射性呼吸抑制を観察するための標本の模式図．
標本の作製法は本文参照．小さな帯でつながった
大小2つの液槽の大きい方（右）に脳幹一頸敬を腹側面を上にして固定し，小さい方（左）に気管一気
管支一肺を固定する．両者は一側（右）の迷走神経で連絡されている．気管に挿入したガラスキャピ
ラリー梨カニューレにより気管支一肺に空気圧をかけ，その圧力を側管から圧トランスデューサー
によりモニターした．自発的呼吸活動は右下に示すガラス吸引電極により第4ないし第5頸髄前根より細胞外記録した．左に示した吸引電極は迷走神経の求心性活動を記録するためのものであるが今回の実験には用いなかった．

図2 脊髄一尾標本と実験装置．2〜4日齢ラットより脊誼と尾を連続した状態でとり出し，それぞれを別々の濯流槽に固定した．15分に1回の割合でCapSaicin（0．5／川〜2／川）を100〜200JJ 尾に適用した．Capsaicinにより誘発される侵害反射
電位は腰髄（L3〜L5）の前板（VR）から細胞外吸引電極を介して記録した．DR：後払★：逆流防止弁．

録を行い，気管にはガラスカニューレを介して空気圧を加えられるようにした．また，カニューレ

して腰部脊髄を露出し，脊髄固定装置に固定した．

には側管を設けて，気管内圧をモニターした．薬

また，左後肢において，外側俳腹ヒラメ筋（以下物は濯流により適用した．

LGSと略す）および内側俳腹筋（以下MGと略す）の支配神経を露出し，末梢側で切断して，末6）摘出脊髄一尾標本

端をそれぞれの白金刺激電極上に置いた．細胞内生後1〜3日齢のラットから脊髄と尾を連続し記録など実験方法の詳細は昨年と同様である．

た状態でとり出し，それぞれを別々の濯流槽内に固定し，酸素を十分含んだ人工脳脊髄液で濯流し

実

験

結

果

た．運動ニューロンに発生する電位変化は腰髄（L3〜L5）前板から吸引電極を介して記録した

1）ロイぺプチンの血管平滑筋に対する作用（図2）．

ネコの大腿動脈ラセン状粂片標本にノルアドレ
ナリソ0．06〜0．4〟g／mJを投与して大腿動脈を収7）ラット背髄縮させ，収縮力がプラトーに達した時点で100〜

1カ月齢のWistar系ラットをベントパルピタ

1000〟g／mJのロイペプチンを投与したところ，，ル（50mg／kg，i．p．）麻酔下に，Th8〜9の高対照に比べて収縮力の減少が観察された（図3）．

さで脊髄を切断し，脊髄動物とした．椎骨を除去

この収縮力の減少はロイペプチンの濃度100Jg／

−

55

−

÷︹﹁︹

Leu 皿

0ノ名／mJ

40

0．06

＿ノーー

「

．・．￣了

紹／mJ

二二／へ
Nor

C

O．24

25mgL
IOmin

0．4

図3

ノルアドレナリン（Nor）0．06，0．12．0．24，0，4〟g／mJ投与によるネコの大腿動脈ラ七ソ状条片の収縮に対するロイペプチン（Leu）40〜1000〟g／mJ投与の影響．ノルアドレナリンは△印の，ロイペプチンは▲印の時点で投与した．Cはノルアドレナリン単独投与のコントロール．

Leu（−）

Leu200FLg／ml

ごアr2弓㍉予5。。gL
2mln

ごアこ4〃gノ′m㌧「＼＿」二
△

▲

△

・OmgL
5mul
Leu

Leu

200JJg／mJ

400J

e

g／mJ

f

図4 ノルアドレナリン0．12〟g／mJ（b），0．04〃g／mJ（d）投与による
大腿動脈ラ七ソ状粂片の収縮に対するロイべプチソ200〟g／mJ投与の影響．a，Cは対照．e，fはロイぺプチン200〟g／mJ（e），
400／g／mJ（f）単独投与の効果．
−

56−

ロイべプチソの薬理学的研究

mJから明らかにみられ，その程度は同一量のノ

上記の結果に対して，モルモット，ウサギ，ネルアドレナリン投与下ではロイペプチソ投与量のコの大腿動脈ラセソ状粂片標本にロイペプチソ

増大とともに強まった．またノルアドレナリン投

200〜400／Jg／mJを前処置した後に0・04〜4／g／mJ

与量が少ないほど同一量のロイペプチソによる収のノルアドレナリンを投与した場合には最大収縮

縮力の減少は顕著で，たとえば0・06／g／mJのノ力の減少は観察されなかった（図4）．またロイ

ルアドレナリン投与後ロイペプチソ200／Jg／mJ。投ペプチソ200〟g／mJの単独投与でも血管平滑筋の・

与した場合35％の収縮力の減少が観察された．

張力に目立った変化は認められなかった（図4）・

一方，ウサギでは0．04／g／mJのノルアドレナリン投与下でもロイペプチソ100／堵／mJにより収縮

2）ロイベプチンの気管平滑筋に対する影響力の減少は兄いだされなかった．

モルモット気管ラセソ状粂片標本にロイペプチ
Leu（−）

Leu200／虐ノ／ml

50mg・L五 了
Leu Ach

b

a

50mg」
5min

Ach

10mg」
10min

了＼−＼（．、．
ム

Ach Atr Leu

30sec

T＿

￣

At．h Atr Leu
e

d

SmgL

′＼＼
r

tH

一一一

Leu
f

図5

モルモット気管ラセン状粂片のアセチルコリンによる収縮に対するロイべプチンの影響．aが対照例でアセチルコリンは△印の時点で授与されており，最終濃度は順に0．1，0．3，0・5，0・8，1・0〟g／mJ・b
ほロイぺプチソ200／g／mJ前投与の後同様の手順
でアセチルコリンを投与している．Cはアセチルコ
リ ン0．2′g／mJ投与による気管の収縮がプラトーに達した後ロイべプチン400〟g／m仁を投与した例・
d，eはアトロピソ存在下でのロイべプチソの気管平滑筋収縮に対する影響を示している．アトロピソ
はアセチルコリン5〟g／mJ投与による収縮がプラトーに達した時点で10￣8g／mJ投与した・ロイべプ
チソは▲の時点で各400／g／m仁授与している．fはロイペプチソ400／上g／mJ単独投与の影響を示し
ている．
−57−

ソ200／堵／mJを授与し，アセチルコリン0．02〜のロイペプテンを投与したところ張力の再上昇が0．2〟g／mJ投与による収縮を検討したところ，対観察され，その影響は10〜20分持続した（図5

照に比べて収縮力の増強が認められた（図5a，C）．このロイペプチソによるアセチルコリン作b）．また0．1〜1〃g／mJのアセチルコリンを投与用の増強は，10￣8g／mJのアトロピソ添加後は認し張力がプラトーに達してから400〜800／g／mJ

められなかった（図5d，e）．ロイペプチソ400
BestatinContrOI Leupept−n12・SJIM

12．5ノJM

下心卜
ーJ qJ
▲

図6

△

ト「50mg
l

叫

▲

5min

△

▲

ウサギ虹彩括約筋のアセチルコリン収縮に対するロイべ
プチソ，ベスタチソの影響． ▲：アセチルコリン125
抑止 を適用．△：ロイペプチソおよびべスタチソ12．5
抑止 を適用．各薬物は，記号から各記録の右端まで持続的に適用されている．

Ⅰ事八teupeptin＿胤l■00′喀／mJぺ

ヨ∴距皇ご。∨

図7 下腸間膜動脈神経節細胞から細胞内電極で記録したアセチルコリンで誘発される反応とコリン作動性fast EPSPに対するロイペプチンの効果・A：ACh（3×10￣4g／ml）を微小ピペットから圧力パルス（0，3kg／cm2，1・6sec）によって節後ニューロン近傍に局所適用した．
1，正常溶液中でのAChによる2相性の脱分極反応，2，ロイべプチ
ソを適用して3〜4分後・3，ロイペプチソを洗い去って約3分後．
1〜3の矢印はそれぞれ遅い脱分極反応の半減時間を示す．B：腸間膜間神経を100秒かこ1Hzで10回刺放して誘発されたコリン作動性fast EPSP・（5回の反応を重ねて記録した）1，正常溶液中のfast
EPSP・2，ロイペプチンを適用して3〜4分後．3，ロイべプチンを洗い去って約10分後．AとBは同一細胞から記録した．
−

58−

ロイべプチソの薬理学的研究〟g／mJの単独投与では気管平滑筋の張力に目立した．この抑制率はfast EPSPに対する抑制率

った変化はみられなかった．

とほぼ一致していた（図7A，B）．一方，AChの遅い脱分極反応に対してロイペプチソは，反応の3）虹彩括約筋に対する作用

大きさをほとんど変化させなかったが，持続時間

ロイペプチソ，べスタチソ10〟Mおよび100／上Mを明らかに延長させた．ロイペプチソのこれらのの投与では，虹彩括約筋の張力に影響をおよはさ

効果は可逆的で，薬物を洗い去って数分以内に効なかった．図6に示すようにアセチルコリン10￣

果は消失した．

htによる虹彩括約筋の収縮はロイペプチソ，べス

AChで誘発される速い反応は，ヘキサメソニ

タチソそれぞれ12．5〟Mの3分間前投与によってウム（2×101M）で完全に消失した（図8A）．

は影響を受けなかった．

この濃度のヘキサメソニウムはfastEPSPもほぼ完全に抑制した（図8Ⅰ主）．一方AChの遅い脱4）交感神経節に対する作用

分極反応は，ヘキサメソニウムでは影響を受けず

すでに報告したようにロイペプチソ（100／堵／（図8A），アトロピソ（10￣8M）によって完全に消mJ）は，節前神経刺数で誘発されるコリソ作動性失した．ヘキサメソニウム処理後にAChで誘発

fast EPSPを抑制した（図7B）．AChを神経される遅い脱分極反応も，ロイペプチソ（2×10￣4節細胞に圧力パルス（0．2〜1．6sec）で適用する

g／mJ）によって大きさはほとんど変化しなかったと，多くの場合立ち上がりが速く持続の短い脱分が，持続時間は約2倍に延長した（図9）・2，3

極と数秒間持続する遅い脱分極から成る2相性反の細胞では，AChによって速い脱分極に続いて応が記録された（図7A）．ロイペプチソ（100／g／

過分極および長い脱分極（約1分間持続）が誘発

mJ）は，AChの速い脱分極反応を約40％抑制

された．このような細胞では実験を行わなかった．

A

C

B

」㍉
図8 下腸間膜動脈神経節細胞から記録したアセチルコリンで誘発される反応およびコリン作動性fastEPSPに対するコリン作動性アンタゴニストの効果・実験
は図7とほぼ同様に行った．AとB：アセチルコリンで誘発される脱分極反応（A）と神経刺激で引き起されるコリン作動性fast EPSP（B）に対するヘキ
サメソニウムの効果．1：正常溶液中．2：ヘキサメソニウム（2×101ユⅠ）を適用して約4分後．C：AChで誘発される遅い脱分極に対するアトロピソの効
果．1：正常溶液中．2：アトロビン（10−8M）を適用して約2分後・A，B，C
はそれぞれ別の神経細胞から記録した．電位と時間のスケール：上段はAとCに，下段はBに対応する．▲の時点でAChを圧パルスにより適用した・Alの矢印はAChによる速い脱分枝を示す・
−59

−

A

A

皿皿JJ皿
2

卜

3

ト＿

L

上皿山上皿
図9 下腸閉瞑動脈神経節細胞からヘキサメソニウム
存在下に記録したアセチルコリンの遅い脱分極反応に対するロイべプテンの効果．実験は図7とほは同様に行った．▲の時点でAChを圧力パルスにより適用した．A：ヘキサメソニウム（2×1011【）含有溶液中でアセチルコリンにより誘発された遅い脱分極反応．B：ヘキサメソニウム
存在下にロイペプチソ（2×101g／mりを適用して約4分後． C：ロイべプチソを洗い去って約2分後．1〜3の矢印はそれぞれ遅い脱分極反応の半減時間を示す．
5）摘出脳幹一脊髄一肺標本に対する作用
本標本の一部である摘出脳幹一脊髄標本が自発的呼吸活動を示すことは昨年度の研究報告に述べた．本標本では気管内圧を上げ肺を拡張させると，」∴ニ声■5mVm三拝SmV
図10 脳幹呼吸中枢に投与したロイペプチンの反射性呼吸抑制に対する影響．各々の上段は呼吸活動を示す頸髄前板の電位変化．下段は同時に記録した気管内正．圧の上昇により呼吸リズムが一過性に抑制されることがわかる．A：0日齢ラット，第4頸髄前板より記録．（1）Control．
（2）ロイべプチソ200／Jg／mJ，5分潅流直後に加圧．（3）投与終了6分後に加圧．B：3日齢
ラット，第5頸髄前板より記録．（1）Control．
（2）ロイペプチン400〟g／mJ，4分涯流直後に加圧．（4）投与終了後4分後に加圧．

その間一過性に呼吸活動が抑制された（図10，11）．

たほ400／Jg／mJを脳幹側に乱流したが反射性抑制

この反射性抑制は中枢神経系と気管一肺をつなぐの顕著な変化は認められなかった．次に伸張受容迷走神経の切断により消失し，また，肺側液槽を器のある気管一肺系の液槽内にロイペプチソ200

テトロドトキシン1／川で潅流すると可逆的に消〟g／mJを適用したのが図11であるが，やはり反失した．よって，この反射性抑制は，気管支の受射性呼吸抑制に著しい変化はみられなかった．

容器が内圧上昇に応じ，迷走神経を求心路として

6）摘出脊髄一尾標本に対するロイぺブテンの起していることがわかり，わ川ね0動物において効果

肺拡張により呼吸抑制を惹起するHering−Breuerのin且ation re月exに相当すると考えられる．こ発病物質であり，またC一五berを特異的に刺激の肺拡張による呼吸抑制反射に対するロイペプチ

することが知られているCapSaicinを，尾の乱流

ソの影響を調べた．

液中に短時間注入すると，約30秒持続する脱分図10に示すようにロイペプチソ200／Jg／mJま極性の電位が腰髄前根から記録された．この電位−60−ロイペプチソの薬理学的研究

巨5mV

Leupeptin200JLg／ml」・00mmHg
lmln

図11気管一肺側に授与したロイべプチソの反射性呼吸抑制に対する影響・
0日齢ラット上段は第4頸髄前粒よりの細胞外記録・下段は同時に記録した気管内圧．黒縁に示した期間ロイペプチソ200／ g／mJを
気管一肺側液槽に濯流授与した．

は注入するCapSaicinの量を増すことにより増大〟Mでは侵害反射の抑制がみられた（図13）・した．Capsaicinの刺激の性質を知るため，intactの新生ラットの尾に潅流槽を装着し，CapSaicin

7）ラット脊髄に対するベスタチンの効果を短期間適用すると，噂鳴および逃避反射などの図14はMGおよびLGS運動ニューPソの電仮性疹痛反応がみられ，この反応はmorphineに気的性質に対するべスタチソの作用を示している・

より消失し，naloxoneにより回復した．このf乃

べスタチソ投与後LGS運動ニューロソの伝導速vivoでの成績からCapSaicinにより誘発される電度に軽度の増加が見られた．しかし，Ca依存性

位は侵害反射の一種と考えられる．

K電位の関与が示唆されている後退分極には電位

Capsaicinによって誘発される侵害反射はロイ
べプチソ200／JMを尾の濯流液に加えることによの振幅および持続期間ともにべスタチソの影響は見られなかった．

って明らかな影響を受けなかった（図12）．一方，

図15は末梢筋枝神経刺激に応じて発生するIa

ロイペプチソを脊髄側の潅流液に加えた場合には，

EPSPに対するべスタチソの効果を検討したもの

20〟Mでは明らかな効果がみられなかったが，200である．MG運動ニューロンに発生するEPSPは
べスタチソ投与後に有意の増大が見られたのに対し，LGS運動ニューロンに発生するEPSPは増

畑斬

図12

Capsaicin誘発侵害反射電位に対するロイペプ
チソの作用（末梢側適用）．ロイペプチソ200′川を尾側漂流液に適用した．0・5／川のCapSaicin
を0．4kg／cm2の圧で0・4秒間尾側に港流適用し誘発される反射電位をL3前眼から記録した
aは正常液中での侵害反射電位．bはロイべプ
チソ港流通用後・大傾向は見られたもののコントロール群との間に有意の差は認められなかった．

考察1）血管平滑筋に対するロイぺプチンの作用今回用いたモルモット，ウサギ，ネコの大腿動脈ラセソ状条片標本のいずれにおいてもロイペプ
チソ単独では明らかな作用を示さず，ロイペプチ
ソ前処置下でのノルアドレナリンによる血管収縮
力にも目立った変化は認められなかった．この結

−61−

抽﹁
V
m

信凡．

A

図13

Capsaicin誘発侵害反射電位に対するロイペプチンの作用（中枢側適用）．図12と同様の実験，ただしロイべプチソは脊髄側に潅流適用した．AaおよびBaはCOntrOlの反射電位．Abはロイべプチン20〟叫 Bbは200J川の侵害反射電位に対する効果．
Bcは沈澱後の回復を示す．

巣は57年度のモルモット大動脈ラセソ状条片標得られた結果と考え合わせると興味深い．アセチ

本を用いた結果に一致するものである．しかしウルコリンによる気管収縮作用はアトロピンで括抗サギおよびネコではノルアドレナリン投与によっされ，ムスカリソ作用と考えられるが，ロイペプて血管収縮がおこった後，ロイペプチソを投与す

チソがアセチルコリンのムスカリソ作用を増強さると収縮力の減少が観察された．この収縮力の減せることは顎下腹神経節および下腸間膜動脈神経

少をひき起すロイペプチソの最小有効量は100

節（昭和58年度および本年度報告）で観察され〃g／mJ程度であった．ネコ，イヌ，ウサギで観察ている．ロイペプチソ単独投与では気管の収縮はされた血圧下降作用はロイペプチソ10mg／kgに起さないことからロイペプチソはエドロフォニウ

よってひき起されている．今回用いたウサギおよ

ムのように抗コリンエステラーゼ作用によりアセ

びネコは体重2．5kg前後であるが，体重の1／13

チルコリンの作用を増強している可能性が考えら

が全血液量とすると10mg／kgのロイペプチソ投れるが，今回は結論を得るまでには至らなかった．

与によって血中ロイペプチソ濃度が100／唱／mg程
度になることは期待し得る．しかしながらロイペ

3）交感神経節に対するロイベプチンの作用

プチソの降圧作用を今回観察されたノルアドレナ

下腸間膜動脈神経節において，ロイペプチソはリンによる血管収縮力の減少で説明し得るかどう

神経刺激で誘発されるコリン作動性fast EPSP

かはなお検討を要する．

とACh投与で誘発される速い脱分極反応（ヘキサメソニウム感受性）の両方を同程度に抑制した．

2）気管平滑筋に対するロイぺブテンの作用

これらの結果から，ロイペプチソは神経節細胞の今回観察されたロイペプチソのアセチルコリン

ニコチン性ACh受容体に対してクラーレ様括抗による気管収縮に対する増強作用は自律神経節で作用を持っていると結論される．この結論は，先

−62−

0402
002

︵SE︶uO葛﹂⊃P︵＞∈︶．dE巾MM0︵S＼∈︶．＞．〇

UO焉Nてd豆﹂乳首﹂きく

三二二●一﹁■ロイベプチンの薬理学的研究で誘発される遅い脱分極反応（アトロピン感受性）の持続時間を延長させた．この結果は，昭和58
年度報告したラット副交感神経節（顎下腺神経節）
でみられた効果と一致している．AChの遅い脱分極は，今回のコリン作動性アンタゴニストを用いた実験からムスカリソ性ACh受容体を介する反応と考えられる．以上より，ロイべプチソはニ
コチン性ACh受容体に選択的な阻害作用を持つと結論される．一方ロイべプチソはムスカリソ性
ACh受容体反応に対しては増強作用を示すが，

三
G

MG

B

この効果の機序として2つの可能性が考えられる∴
第1は，ロイペプチソがコリンエステラーゼ阻害作用を持っている可能性であり，第2はムスカリソ受容体反応への直接的な増強作用の可能性である．今回の実験ではこの点を明らかにすることはLGSできなかった（前節参照）．

図14 ラット脊髄運動ニューロンに対するべスタチソの効果．伝導速度（C．Ⅴ）．後退分極の持続時間（duration）および大きさ（amp）をそれぞれ（）内の単位で縦軸に示した・MG：MG運4）ラット脊髄に対するベスタチンの効果
ベスタチソ投与後，MG運動ニューロンでみら

動ニューロ■ン，LGS：LGS運動ニューロ∵／，
C：コントロール，

B：Bestatin（20mg／kg）

適用後．縦棒はS・D・，＊ほ危険率5％で有意の差を示す．

れたIa EPSPの増大の解釈として，1）運動ニ
ューロンの膜抵抗の増大，2）運動ニューロンのに報告したfast EPSPの量子的解析によってロ

静止電位の増大，3）Ia伝達物質の放出量の増加，イペプチソの作用を調べた実験結果と良く一致しなどの可能性が考えられる．1）の可能性は後過ている（昭和55年度報告）．ロイペプチソはACh

分極の大きさに変化がみられなかったことから考
MG

LGS

EPSP

EPSP

︵＞∈︶名っ宣EくMG motoneuron LGS motoneuron

図15IaEPSPに対するベスタチソの効果・EPSPの振幅を縦軸にmVで示す．MG EPSP：MG筋枝神経刺激に応じて発生するEPSP．LGS EPSP：LGS筋枝神経刺激に応じて発生するEPSP．他は図14に同じ−63−

えて，少ないと思われる（図14）．2），3）のいずはアセチルコリンのニコチン作用を抑え，ムスカ

れにしても，MG運動ニューロンではEPSPの増リソ作用の時間経過を延長させた．

大がみられ，LGS運動ニューロンではEPSPの大きさが変らなかったことの説明は困難である．

3）摘出脳幹一脊髄一肺標本に対する作用
新生ラットの摘出脳幹一脊髄一肺標本を用いて実総験を行った．空気を気管から入れて肺を拡張させ括ると一過性に呼吸の抑制が起った．この反射性呼1）ロイぺプチンの平滑筋に対する作用

吸抑制はロイペプチソ200〟g／mJを脳幹側に与えa）ネコの大腿動脈ラセソ状条片標本にノルても，また肺側に潅流適用しても影響を受けなかった．

アドレナリンを授与し，収縮力がプラトーに達した後，100〜400〟g／mJのロイペプテンを加えた
ところ，最大35％に達する収縮力の減少が認め

4）摘出脊髄一尾標本に対する作用られた．

新生ラットの摘出脊髄一尾標本で，尾にCapSai−b）モルモットの気管ラセソ状条片標本におCinを与えたときに腰髄前根から記録される侵害

いて200／g／mJのロイペプチンは，アセチルコリ

反射は，ロイペプチソ20〟Mを脊髄側に，あるいンによる収縮力を増強した．

は200〟Mを尾側に潅流適用しても影響を受けなかった．

C）ウサギ虹彩括約筋のアセチルコリン収縮に対しロイペプチソ（12．5〟M）およびべスタチソ（12．5〟M）はいずれも影響を与えなかった．

5）脊髄運動ニューロンに対するペスタテンの効果

2）交感神経節に対する作用

ラットの脊髄運動ニューロンから細胞内記録を昨年度，副交感神経節においてロイペプチソが行い，べスタチソ20mg／kgを腹腔内に与えた．

アセチルコリンの速い脱分極作用を抑制し，それIa群線経の刺激によって内側排腹筋運動ニューに続く遅い時間経過の脱分極を増強することを報

ロンに発生する興奮性シナプス後電位は軽度に増告した．本年度はモルモット下腸間膜動脈神経節

大した．

において実験を行った．神経節細胞から細胞内記録を行い，アセチルコリンを圧パルスにより適用
すると速い時間経過の脱分極と，これに続く遅い
時間経過の脱分極とが発生した．括抗薬を用いた分析によって，前者はニコチン作用，後者はムスカリン作用であることが分かった．ロイペプチソ

−64−

文

献

1）田中 亘．ロイべプチンの難病治療薬としての開発研究．厚生省新薬開発研究費，微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプチン）の開発研究，昭和54年度研究報告書，pp．63−116（1979）．

ジストロフィー筋よりのCreatine kinase（CK）

遊離に対する各種薬剤の影響

高 木 昭 夫＊，＊＊
研究協力者

荒木

誠＊・藤田武久＊・埜中征哉＊

ヒトや動物モデルの筋ジストロフィーでは血清

し，ストレインゲージを介して等尺性張力を記録

CK活性は著明に上昇している．この現象は筋ジした．30分毎に還流液を交換し，液中のCK活

ストロフィー病因に関する膜異常仮説の論拠の1性を測定した．電気刺激は筋束に平行に対置したつとなっている1）．血清CK増加の校序はまだ完

白金板により行い，収縮に際して筋表面が損傷を全には解明されていない．われわれは骨格筋からうけないよう配慮した．筋長は最大の単収縮張力のCK遊離を六日直川で検討した．その結果，を発生するように調節した．

電気刺激により単収縮を反復する時，ジストロフ
結ィー筋からのみ著明なCK遊離が発生することが果判明した2）．筋ジストロフィーハムスターと筋ジストロフィーマウスに関係する結果を報告すると

1）筋ジストロフィーハムスター

ともに，2〜3の薬剤のこの現象に対する影響を筋ジスハムスターの血清CK活性やEDLの諸特性を対照と対比した（表1）．血清CK値は対検討した．

照の14倍に増加していた．EDLのCK活性は
方筋ジスで有意に低下していた．EDLの強縮張力

法（f㌔）は両者で差違はなかった．
ハムスターとしては筋ジス（BIO14．1）と対照

ZnvitroにおけるEDLよりのCK遊離をまず（BIO FIB）を生後3ないし6カ月間に使用した．

静止時において検討した（図1）．最初の1時間

マウスは筋ジスとしてmdx，対照としてC57B

は筋ジスと対照のいずれにおいても，CK遊離速を生後2ないし3カ月間に使用した．動物をベン度は大きいが，その後減少し一定の遊離速度を塁

トパルビタールで麻酔し，動脈血を採取後，主とし，両者間に差はみとめられない．95％02＋5％

して長址伸筋（EDL）を摘出した．一部の筋肉でC02の混合ガスの代りに95％N2＋5％C02をは凍結切片を使用して，組織化学染色を行った．

通気して，低酸素状態のCK遊離に対する影響を

CK遊離の実験には実体顕微鏡下でEDLを脛か調べた．低酸素下ではCK遊離速度は2〜3倍にら陸まで無傷の状態で摘出した．実験法の詳細は増大した．対照筋の方が無酸素の影響は大きくよ

既報に示したとおりである2）．概略としては，2・O

り多量のCK遊離が発生した．別の実験ではCK

mJクレブスリンゲル液を含む実験槽に筋を固定

遊離速度が定常状態になった時点から，1Hzの＊国立武蔵療養所神経センター＊＊虎ノ門病院神経内科

等尺性単収縮を4時間にわたって継続した．その間のCK遊離を比較した．筋ジスにおいてのみ−65−

表1血清CK値やその他指標の筋ジスおよび対照ハムスターにおける比較

対血清CK（U／L）
EDL湿重量（mg）
可溶性蛋白（mg／g）
筋CK活性（U／g）

照

筋ジス

P値

802±896（7）＊11，716±7，236（10）＊0．001

28．2±4．5（15）35．7±8．1（20）

0．003
n，S．

54．3±7．3（14）54．3±13．8（20）2，202±433（15）1，941±310（19）0．05

Tetanus tension（Po，g／cm2）

101±47（9）89±25（10）n．S．

為at4h（g／cm2）

42±11（9）46±14（10）n．S．

＊mean±S．D．（例数）rate ofrate of

CK reIease

CK release（∪／30min／g）（∪／30min／g）

1

2

3

4

5

0

1

2

3

4

hcubation（h）
lncubation（h）

図1筋ジスおよび対照ハムスターEDL筋からの静止時におけるCK遊離速度．縦軸：単位湿重量あた
りのCK遊離速度，横軸，incubationの時間．
●：筋ジス，○：対照．最初の1時間はCK遊離
は大きいがその後一定値となり両者間に差はない．（mean

土S．D．，n＝

図21Hzの単収縮を反復した際のCK遊離速度の時間経過．●：筋ジスハムスターEDL，○：対照EDL．筋ジスではCK遊離速度が著増してきた．（mean土S．D．，n＝ ））の場合と同様に少量であり，mdxと対照の間にCK遊離速度が時間とともに増加してきた（図差を認めていない．電気刺敢実験は摘出筋を約

2）．4時間後には筋ジスではf㌔は最初の52％

100mgのクレブスリンゲル液で30〜60分洗推しに減少し，対照では42％に減少した．4時間刺た後に開始した．mdxでは初め2時間にCK遊敢後の筋の形態を検討した．対照では組織は浮腫

離速度は著増していたが，その後はぼ一定値とな状となり，浪染する筋線経が散在した．筋ジスでった（図3）・経過中のいずれの時点においても，は対照とほぼ同様な所見であり，筋崩壊がより著
明との印象は与えない．

mdxのCK遊離は対照より著明に高値であった．
電気刺激開始2時間以後のCK遊離の平均速度は
対照1・4±0．6U／g／h，mdx31．2±25．8であっ

2）筋ジストロフィーマウス（mdx）

た（表2）．

静止状態のEDLからのCK遊掛はハムスター−66

mdxの血清CK値は12，556±4，853U／L，対−ジストロフィー筋よりのCreatine kinase（CK）遊離に対する各種薬剤の影響
表3

U／g／30min

mdxおよび対照マウスの血清CK伯（S−CK），範縮張力（Po）など．twitch／tetanus，
等尺性単収縮と強縮張力の比．為at5h，5時間単収縮を反復した後に測定した強縮張力を初回の為に対する％で表わした・
normalmdx

S−CK（U／L）

534±527（3）12，556±4，853＊（8）為（kg／cm2）

0．09±0．02（6）0・11±0・04（14）twitch／tetanus O．51±0．08（6） 0．46±0．04（16）P。at5h

20±28（6）76±29＊（16）（％initialPo）＊」P＝0．03

下したのみで，両者間には著明な差がみとめられた．すなわちmdxでは張力の減衰が著明に少な
かった．

COn−5

3）薬剤の効果
0

1

2

3

4

5

hrs

生後1カ月のmdxマウスにleupeptin（25mg／

図3 mdxおよび対照マウスEDL筋からの反復Eii
収縮中のCK遊離速度．●，mdx：○，対照．代表的実験例を呈示した．mdxは最初2時間はCK遊離速度は大きく，その後ほは一定となる．いずれの時点においてもCK遊離は対照より大きい．

kg／日）とpepstatin（1mg／kg）を4〜6遇にわたって，腹腔内授与した．その後薬剤投与群と非投
与群問においてCK遊離を比較した．CK遊離速
度は投与群32．9±16．2U／g／h，非投与群31・2±

照では534±527であり，20倍以上の増加があった（表3）．残債は両者間に差をみとめなかった・
連続電気刺激開始後5時間では，対照の残債は20％に減少した．一方，mdxのク。は76％に低表225．8であり，両者間に差をみとめなかった（表4）．またleupeptin とpepstatinの慢性投与の影響を筋組織学的に検討した．筋細胞壊死巣の頻度は投与群0〜3／筋，非投与群2〜3／筋であり，
表4

mdxおよび対照マウスEDLよりのCK遊
離速度．連続電気刺激による単収縮開始後，2時間から4時間までの平均値±S・D・を示した．

ロイべプチソ長期投与後のEDLからのCK遊離の比較．電気刺激中のCK遊離を比較したが，投与群と非投与群に差は認められなかった．

ControI一

2

0．8± 0．4（4）

1

m

一

一

1．4±0．6（4）

3

一

2

一

2．2±0．8（4）

4

一

3

一

1．4±0．8（4）

5

一

4

一

normal meanXd1

normal

1
一

X
d
m

2

1．4± 0．6

Total mean37．8± 4．6（4）

1
1
一

3
一

4

2
1

16．0±4．3（4）

t

一

5

3
1

一

23．8±5．6（4）一72．4±19．0（4）一41

31．2±25．8＊

Total mean＊37．8±4．6（4）5．8±2．0（4）16．0±4．3（4）23．8± 5．6（4）72．4±19．0（4）31，2±25．8

Leupeptin＋Pepstatin

5．8±2．0（4）

X
d
m

t

mdx mean

U／g／hr

一P＝0．001−67−41．6±3．2（4）50．4±6．8（4）14．6±2．0（4）24．8±10．4（4）32．9±16．2（n．S．）

表5

CK遊鰍こ対する各種薬剤の影響．還流液にdantrolenc（25iLM），bestatin（10FLg／ml）＋
leupeptin（25FEg／ml），menadione（23FLM），
diamox（0．1mg／mりあるいはethanol（0．04％Ⅴ／v）を加え，CK遊掛こ対する効果を観察した．

46．0±11．1（5）

dantrolene

26．2± 3．8

（4）

bestatin＋leupeptin

108．2±10．5 （4）（♪＝0．001）

menadione

122．2± 9．9（4）（♪＜0．001）

diamox92．1±17．5（4）（♪＝0．01）

ethanol

37．8＝ヒ（4）

4．5

ない．しかし単収縮を反復させた時，筋ジスでのみCK遊離は著明に増加した．mdxマウスの方がCK遊離量はより著明に増加した．これはマウ
スEDL湿重量が7〜15mgであり，ハムスター

Addition U／g／hr
nOne

静止時のCK遊離速度は筋ジスと対照では異ならの28〜35mg より小さいためかもしれない．
反復する単収縮によりなぜCK遊離が増大した
かが一番の問題であろう．ハムスターのジストロ
フィー筋には壊死筋経が1．5％前後存在しており，収縮によりこれら壊死筋経からCK遊離が生ずるのかもしれない．しかし遊離速度の時間経過

両者に本質的差違はないと推定した．血清CK値

では，速度は漸増ないし一定であり，この考えをは投与群8，254±6，880（乃＝3），対照群12，556±

支持しないであろう．反復する筋収縮により筋細4，853（乃＝6）と，両者間に差をみとめていない．

胞が撥枕的損傷をうけ，この債向は筋ジスでより別の実験では還流液に各種薬剤を混入して，著明なのかもしれない．実験終了後の筋の組織学

CK遊離に対する直接的影響を観察した．dant−

的検査や吊の時間経過は筋ジスと対照の間に差

rolene（25pM）と Ethanol（0．04V／V％）はCKはなく，必ずしもこの仮定は支持されないであろ遊離速度に影響を与えない．diamox（0．1mg／ml）

う．第3は枚能（収縮）している筋細胞からCKやmenadione（23pM）は遊離速度を増加させた．

遊離の増大が筋ジスにおいてのみ発生する可能性

またbestatin（10pg／ml）とleupeptin（25pg／ml）

である．この仮説は直接証明されていないが，今はやはりCK遊離を増加させた（表5）．

回の成績はこれを支持していると思う．ジストロ
フィー筋に関して注目された点として，anOXiaに考察

対して対照より抵抗性が大きい．あるいは連続刺激中の張力減少は筋ジスの方がはるかに少ないな

ヒト筋ジストロフィーことにDuchenne型の場どの現象である．しかしこれはジストロフィー筋

合には血清CK活性は著増している．このCK活性増加の機序として，次の2つが提唱されている．

中に相当量存在する再生筋線経の特性を反映しているのかもしれない．

まず変性筋線経の筋細胞膜に断裂が生じ，そこよ

前述のようにジストロフィー筋からのCK遊離りCKなどの筋繁酵素が血中に出てくる．第2は冗進の機序は未だ特定されていない．しかし筋ジ筋細胞膜は機能的に異常であり，表面膜から筋渠

ストロフィーの特散の1つを構成すると考えられ酵素が漏出してくる（1eaky membrane theory）1）．

た．今回はこの現象に対する各種薬剤の効果を検

後者は本症の病因に関する仮説の1つである．こ討した．もちろんこの種のわがJか・0の成績を筋ジの仮説に関連して，九日兢九つにおける骨格筋からストロフィー個体への治療に飛躍させることはでのCKなどの酵素漏出が検討されてきている．無きないであろう．もしi〃めroにおけるCK遊離

傷のカェル骨格筋から一定速度でCK遊離が生ずを抑制するような薬剤が選別されるなら，毎日め0

ること，また筋が小さい程，CK遊離が多くなる

における有効性の期待が大きくなるであろう．

ことが報告された3）．ハムスターやマウスEDL

Leupeptin＋pepstatinを一定期間腹腔内に投から静止時にも定常的CK遊離の存在を観察した．

与したmdxマウスEDLでは，CK遊離冗進は−68−

ジストロフィ，筋よりのCreatine kinase（CK）遊離に対する各種薬剤の影響

依然として観察された．〜乃〝わroで還流液中に諸Leupeptin＋pepstatinを4〜6遇投与したmdx

種の薬剤を加えてCK遊離への影響を観察した．

マウスにおいても，CK遊離克進は不変であった．

Dantrolene添加によりCK遊離はやや減少傾向

還流液にethanol，dantrolene，diamox，mena−を呈したが，統計的に有意ではなかった．Dant−

dione，bestatin，leupeptinを各々添加して，CK

roleneにより単収縮張力は約50％に減少した．

遊離への影響を調べた．CK遊離克進を抑制する

これがCK遊離減少に関連するかもしれない．

薬剤は確認されなかった．

Diamox，menadione，bestatin，leupeptinでは文

CK遊離はむしろ増大した．この理由は不明であ1）Rowland，った．

献

L．P．：Biochemistry of muscIe

membranesin Duehenne muscular diptro−

結

phy，八九∫rJgⅣemg．，3，3−20（1980）．
2）Takagi，A．，Ikai，T．，Fujita，T．，Sugita，H．Re−

論

lease

of

creatinekinaseinvitro

fromexten＿

sordigitorumlongusmuscleofthedystrophic

筋ジスハムスターあるいはmdxマウスのEDL

hamster．βわ〝！gd．Rg∫リ

3，311−316（1984）．

3）Suarez−Kurtz，G．，Eastwood，A．B．Release ofからのCK遊離（わ7川〟ro）を分析した．連続的電sarcoplasmic enzymes from frog skeletal
muscle．Amer．J．Physial．，241．C98−ClO5

気刺激により単収縮を長時間反復させた時，ジス（1981）．

トロフィー筋からのみ著明なCK遊離が生じた．

−69−

Mdxマウスに対するロイペプチン，べスタチンの

投与成績
埜

中

征

哉＊

研究協力者 田 辺 雄 三＊進行性筋ジストロフィーの骨格筋の病理学的特対 象・方 法徴は筋線経の壊死と再生である．節線経が壊死する時にはカルシウム依存性中性プロテアーゼ

Mdxマウスの臨床像，病理組織像の特徴をみ（CANP）のようなチオールプロテアーゼが働くるため，生直後，生後5，10，15，20，30，60，と考えられている．
われわれは過去にプロテアーゼインヒビターで90，120日目にmdxマウスとその対照（C75BL／あるロイペプチソやべスタチソを使用し，ジスト

10ScSn）マウスを各々5匹ずつ（計：mdxマウ

ロフィー鶏やハムスター骨格筋の壊死がどの程度ス40匹；対照マウス40匹）検索した．臨床的に抑制されるか検索してきたが，明らかな効果は兄は体重の変化と，ケージ内での動きを観察したが，い出し得なかった．松下らl），Sherら2）は筋ジス

外見上ではmdxと対照マウス間にはあまり差がトロフィーマウスの病初期，あるいは生直後よりなかったため，筋ジストロフィーマウスに使用さべスタチソ1），ロイべプチソ2）を授与し，きわめれている金網よじ登り試験を行った．これは500Cて良好な結果を得ている．このことは筋ジストロに熟したホットプレートに細かい目の金網のかご

フィーに対しては筋線経の崩壊がまだ進行していをかぶせ，その中にマウスを入れるとマウスは下ない早期より治療開始することが治療効果をあげが熱いので金網によじ登りしがみつく．正常対照るのに優利であることを示している．

では決して落ちないが筋力低下があると落下する．

最近入手可能となったⅩ染色体性劣性遺伝形式

マウスを10分間かごの中に入れ，その間に何分をとる筋ジストロフィー（mdx）マウスはhomo−で落下するかその総時間を算出し筋力の示標としzygoteた．病理学的にはヒラメ筋（赤筋），前置骨筋，とhemizygoteをかけあわせることにより全例筋ジストロフィーが得られる3）．本動物を長指伸筋（自筋）をとり出し直ちに凍結固定し，連使用すれば早期よりの治療実験が可能であるので，

続切片を作成し，へマトキシリンエオジン（HE），

プロテアーゼインヒビターの有効性が確かめられ

Gomoriトリクローム変法，酸フォスファクーゼ，るのではないかと期待された．mdxマウスはまNADH−TR，ATPase染色を行った．

だ臨床像，病理像が十分明らかにされていないの

プロテアーゼインヒビターの効果をみるためにで，それを明らかにするためます経時的な検索を7匹の母親より生まれた計40匹のmdxマウスを行い，次にロイペプチソとべスタチソを使用して20匹ずつの2群に分けた．1群にはロイペプチソ治療を試みた．

10mg／kg＊国立武蔵療養所神経センター徽細構造研究部

とべスタチソ10mg／kg同時に生後2〜3日目より背部皮下注を連日行い，他の群は対
ー71−

鶉管

サ≠∵．ヾ・・
ミ塵．ヽ︑l●一照とした．生後30 日目まで生存したのは治療群
11匹，対照群16匹でその生存例に金網よじ登り
試験．クレアチンキナーゼ（CK）の測定を行い，組織化学的染色を行った．壊死の程度は酸フォス
ファターゼ染色標本より判定した．また各個体の薄蛮㌔笹￣・ヰ甘言三
と

．

■

−

■二
＿、
−1＿

ト1、
▲

ゝ

′

算出した．

−J■

ヽ一

●
q

ヽ

警準

前脛骨筋の横断切片より無差別に200本の筋線経を選び，その直径を計測し，中心核線椎の頻度を

ー

ノ

、、．・●

詩了

ポミ攣嘉，
ヽ

−亨■＼−

、■一一ふ才一、
ノ、f■㌧

結

果

図2

1）Mdxマウスの臨床像，病理所見の経時的指

生後20日目のmdxマウス前脛骨筋．貪食反
応を伴う壊死巣がみられる（左上方）．壊死の部以外の筋緑経には中心核もなく正常である，HE，×250．

変化
Mdxマウスは外見でみる限り対照てウスと何ら変らず成長し，動きもすばやく異常は認められなかった．体重増加はmdxマウスと対照間に有意の差はなく，また雌雄間でも大きな差はなかった（図1）．
金網よじ登り試験では生後30日目には10分間の試行で落下するものはほとんどなかったが，60，
120 日目と次第に落下するものが増加し，180 日
目では10分間の試行で全てのマウスは落下し，
金網にLが泉ついている時間は平均約5分であった．
病理学的には生直後の筋はまだ未分化で細胞の輪鰍よ明瞭でなく，大型の核をもっていて，その像は正常対照と全く異なるところはなかった．

図38

0

10

20

30

60

90120

図3 生後20日目のmdx（A）と正常対照（B）マウ
スの前脛骨筋．mdxマウスでも非壊死部は対照マウスの筋と同じように酸化酵素活性の高い線経と低い繰経がモザイクをなしていて筋線経の発育，分化の遅れはみられな

柑O days

図1mdxおよび正常対照（C57BL／10ScSn）マウ
スの体重増加曲線．

い，NADH−TR，×500．
−

72

−

Md）こマウスに対するロイペプチソ，ベスタチンの投与成績

mdxマウスに変化がみられるのは生後20

表l Clinicalobservation（1month old）

日日

で，この時期には壊死線経が群をなして出現する

Body
No．Weight

ようになった（図2）．少数ではあるが胞体の中心に核をもつ小径の線経も群をなして出現するよ

Treated ll14．5±2．9g lOmin

5，100±2，800

Untreated1614．2±3．0

4，700±1，980と変らず，また組織化学的にも筋線維タイフの分

10＊Wirenet climbing test＊＊

布は正常対照と変らなかった（図3）．
をなしていて，初期の壊死巣には過収縮した線維

CK＊＊

mdx Mouse

うになっていた．壊死以外の部の筋線維径は正常

壊死線経はしばしば数10ないし数100本が群

WNCT＊

Creatine kinase

∵iテ
■、
◆

￣1●

（Opaque線維）があり，その多くはCa2十染色（GBHA）で陽性であった．壊死の進んだところ

加し，平均40％の線椎には中心核がみられ，120

1∴㌧一号㌶．尊か．上︑︷一■い／．㌧ゝ

た．再生線経の示標である中心核をもつ線経が増

ナ鹿と・︑

生後30 日目以降にも壊死，再生の像がみちか・・・饉
喪

では単核の貪食細胞が多数浸潤している像がみら
れた．

ヽ

ヽ．●

ノ

′

■ヽ

㌧

日目になるとほとんど全ての筋線経は中心核をも

図4

つようになっていた．壊死線経は散在性にみられたが，その強さは60 日目以降軽減する傾向にあった．

生後30日目のmdxマウスの前脛骨筋．貪食
細胞の集合をみる壊死線経の群と中心核をもった線維群が散在している．HE，×250．

克禁誓壷軽・圭捏声

潤 離 錐 綾●2）ロイぺプチン，ぺスタチン投与による影響
上記薬10mg／kg連日皮下投与したが，注射開始後4〜5日以内に数l些死亡した以外，体重増加は正常対照と変りなく，生後1月日まで生存した11匹の平均体重は14．5土2．9g（対照：14．2±
3．0g）と有意の差はなかった．また生後1月目にヽI行った金網よじ登り試験では，治療群，非治療群￣1−￣−一′′とも10分間の試行で落下するものなく差はなか

図5った．血清クレ了チンキナーゼ（CKJ値は治療群で5，100±2，200IU（対照：4，700±1，980）と有ロイペプチンとベスタチンで1カ月間治療
したmdコくマウスのヒラメ筋．壊死線経は多く存在し，中心核線経も多く，形態学的に改善した所見は得られていない．HE，×250．

意な差は認められなかった（表1）．
表2

病理学的に克ても，治療群の骨格筋には多くのFiber diameter and central nuclei（TA muscle）

壊死線経が存在し，治療により壊死が抑制されてCentral Fiber
No．
Nuelei Diameter

いる事実はなか′）た（図4，5）．中心核線経の頻度は治療群で43．6±9．7％（対照：37．3±9．5％），

mdx Mouse

筋線維径は30．1±5．0／上（対照：30．2±4．1〟）と，

Treated l1
Untreated
16

いずれにとっても有意に改善した徴侯はみられな
ー73−

43．6±9．7％37．3±9．530．1±5．0P
30．2±4．1

かった（表2）．

プロセスは遅れて中心核線経は当然少ないはずである・しかし治療群でも中心核線経の頻度は対照
考察と同じであり，壊死，再生のプロセスには何らの影響もみられないことが分かった．

今回われわれが使用したmdxマウスはⅩ染色

ロイべプチンやべスタチンが筋ジストロフィー

体性劣性遺伝をとり，ヒトDuchenne型筋ジスト
ロフィーの動物モデルとして利用しうるのではな

動物に対して有効であり，特に発症前からの投与が有効であったとの報告が散見される1−2）．

いかと脚光をあびている3）．血清ピルピソ酸やしかしわれわれが過去に行った筋ジストロフィ

CK値は高く，病理学的には筋線経の壊死と再生

ー鶏，ハムスターへの投与では何らの治療効果をがみられている．しかし常染色体性劣性遺伝をとも兄い出すことができず，また薬物（マーカイン）

る筋ジストロフィーマウス（C57BL／6Jdy＋／dy・）による筋壊死に対しても抑制効果はみられなかっと異なり，進行性の筋力低下やるいそうがなく外た・個体差の大きい，しかも臨床効果の判定が難

見上はほとんど変化がない．金網よじ登り試験なしい動物が対象なので，われわれのデータからすどをすると生後60日日頃より，筋力低下を証明

ぐロイペプテンやべスタチソは筋ジストロフィー

することができるが程度は軽い．筋力低下の少なに対し全く有効性がないとは断言できない．われいのは筋ジストロフィーハムスターと似ている．

われが使用した鶏，ハムスター，mdxマウスで筋ジストロフィーマウスでは生後2週間は臨床

は筋の壊死や再生の状態がDuchenne塑筋ジスト

症状は少なく，2週日以降でないと筋ジストロフ

ロフィーと大きく異なり，病因的に同一視してよィーマウスか否か判定できず，治療開始も遅れる

いか否かにも疑問が残っている5）．特にわれわれという欠点があった．しかしmdxマウスでは筋はヒトに最も筋病理が相似しているといわれる筋

力低下が少ないために，hemizygoteとhomozy−

ジストロフィーマウスでの実験を行っていない．

goteの交尾が可能で筋ジストロフィーマウスを

松下ら1），Sherら2）が著効をみたのは全て筋ジス

確実に得ることができることは薬剤の効果をみる

トロフィーマウスであり，それも早期から治療を上に大きな利点であった．しかもmdxマウスで開始したものに限られている．卵巣移植などで筋は筋の壊死が生後15日〜20日目より始まるので，ジストロフィーマウスが発症前に大量に入手可能

それ以前に治療を開始することにより，筋の壊死となった時点で追試を行い，病理学的に確認したが抑制ないし遅延するのではないかと期待がもた

いと考えている．

れた．そこで少数例ではあったが，ロイペプチソ
とべスタチソ各10mg／kgずつをmdxマウスの皮下に連日授与し，病理像がほぼ完成する生後1カ月に臨床像とその病理像を検討した．
臨床的には体重，CKなどに対照と差はなく，また壊死の程度にも差はなかった．筋線経は壊死
すると，貪食細胞により清掃され，再生する．この再生してきた線経は中心核をもっていて，その中心核は長く細胞の中央にとどまり，周辺には移動しない．もしロイペプチソやべスタチソなどの文（1981）．
2）Sher，J．H−74−

Stracher，AShafiq

S．A．and

Hardy−Stashin，J．Successful treatment ofmurine musculardystrophywiththeprotein−

aseinhibitorleupeptin．Pl・OC．Natl．Acad．
Jcf．ひざA．，78，7742−7744（1981）．
3）Bulfield，G

薬剤が壊死を抑えていたとすると，壊死，再生の献1）松下 宏，辻 繁膵：筋ジストロフィーマウスにみられる種々な酵素の活性変動に対するロイぺプ
チンおよびベスタチン投与の影響．微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプチソ）の開発研究，昭和55年度報告書， pp．55−61

Siller，W．G．，Wight，P．A．L

andMoore，K．J．X chromosome−Iinked muscularMdxマウスに対するロイべプチソ，べスタチソの投与成績

dystrophy（mdx）in the mouse．Proc．Natl．
Acdd，grJ．ぴ∫A．，81，1189−1192（1984），
4）Nonaka，Ⅰ．，Ishiura，S．，Takagi，A．andSugita，

H．Therapeutic trialwith proteaseinhibitor（leupeptin）in chicken muscular dystrophy，A histologic and histochemical study．Acta−75−

Ⅳg〟rO♪α拍oJ．（βgrJ．）．，58，279−285（1982）・
5）Nonaka，I．and Sugita，H．Intracytoplasmic
vacuolesin aWfibersofdystrophicchicken；
probableearJy pathologiceventinitiatesmas−
sive fiber necrosis． Acta Neuropathol．
（βerり．，55，173−181（1981）．

鶏ジストロフィー筋における新生児塑構造蛋白質の出現
ベスタチンの投与と除神経の影響
丸 山 工 作＊研究協力者 大日方 昂＊・新保和彦＊にみえることから，少なくとも鶏の場合には筋構研

究

目

造蛋白質の変化を筋ジストロフィー症発症の指標的としうると思われる．

鶏ではふ化後の成長期に，胸筋に存在する筋蛋

本研究では，筋ジストロフィー鶏をモデル動物

白質のタイプが著しく変化する．顕著な例として

として，べスタチソ投与が収縮構造蛋白質系にど

ふ化直後には遅筋型C蛋白質，βトロポミオシン，のような影響を与えるか，とくに筋ジストロフィ

足型トロポニソTが存在するが，2遇齢位までにー症発症に特徴的にみられる新生児型蛋白質の再いずれも消失してしまうことがすでに知られl），

出現がべスタチソにより抑制されるかどうかに着これらを胸筋における新生児型蛋白質とみなすこ

目して研究した．次に筋ジストロフィー症によくとができる．それに対して，速筋型C蛋白質，α−似た状態を示す除神経筋での筋構造蛋白質の変化

トロポミオシン，胸型トロポニソTはふ化直後かがどの程度広範に及ぶかを知るために，最も主要ら親に至るまで存在し，成鶏胸筋を特徴づける蛋

な筋構造蛋白質であるミオシンについて解析した．

白質となっている．このような蛋白質にみられる変化は免疫化学的手法や，電気泳動法により容易

実験材料と方法にとらえることができる．
最近鶏ジストロフィー胸筋では，親型への蛋白1）ベスタテンの投与

質の変化が遅延したり，新生児型蛋白質の発現がべスタチソは，微化研青柳博士から御供与いた

引き起されることが明らかになってきた2・3）・一方，だいた．筋ジストロフィー鶏（NH413系）にふ化

われわれは除神経された鶏胸筋でもみかけ上ジス

1遇齢から2週齢まで，ベスタチソ（0．9％食塩

トロフィー筋の場合に類似した筋構造蛋白質の変水溶液）を5mg／kg／日となるように，2適齢以降化が起ることを兄い出したl）．このように，筋肉は10mg／kg／日となるように連日皮下注射によりにおける構造蛋白質の発現は筋の成熟度，病変，投与した．対照としては生理食塩水のみを注射しその他の生理的要因により変りうる可塑性をもつたものを用いた．

ことが明らかになってきた．そのような変化が種々の筋構造蛋白質に一様に起るのかどうか明らか

2）神経支配の除去ではない．しかし，C蛋白質を含め，数種の蛋白

ふ化直後または2月齢の鶏胸筋を支配する神経質の変化がジストロフィー症に相応して起るよう（14，15，16頸椎神経）を脊髄に近い部位でまとめて切断し，神経の再生を妨げるために，神経末＊千葉大学理学部−77−

端部を背部の皮膚に縫いつけて固定した4）・手術（C315）を用い，免疫組織化学的に行った・すな

は胸筋の片側の泉について行い，他方は対照とし

ゎち，筋の凍結連続切片を一次抗体として前述のて用いた．

抗C蛋白質抗体，二次抗体としてFITCで標識された抗マウスまたは抗ラビットIgG抗体を反応

3）蚤自質の解析させ，間接蛍光抗体法により筋線維中に存在する

筋ジストロフィー症および除神経に伴う変化の蛋白質のタイプを調べた さらに，量的な解析の指標として，筋構造蛋白質であるC蛋白質・トロ

ためにラジオイムノアッセイを行った・この場合

ポミオシンおよびミオシンのアイソフォームを用は筋から得られた粗ミオシン画分をマイクロタイ

いた．C蛋白質のタイプの解析はすでに作成されターフレートに乾燥固定した後，抗C蛋白質抗体ている抗速筋型C蛋白質抗体（ホリクローナル抗および125ト抗マウスIgG抗体を順次作用させ，体），抗遅筋型C蛋白質抗体（モノクローナル抗測定した．トロポミオシンのタイプは0，Farrell

体，ALD66、）も），および抗心筋型C蛋白質抗体の二次元電気泳動法によりα型およびβ型トロポ

3m otd Male（NH413）
Controt
None

0︼のdL

︵
O
L 琶亘

0＞昌一S

︵①OD﹂＜︶図13カ月齢雄ジストロフィー鶏にみられるC蛋白質の変化・無処理（None）および生理食塩水（Saline）を授与された鶏胸筋の凍結切片を抗速筋C蛋白質抗体（antiFC）．抗遅筋C蛋白質抗体（ALD66）および抗C蛋白質抗体（C315）で処理した．C315に反応性をもつ小型細胞の存在に注乱
−

78

−

鶏ジストロフィー筋における新生児型構造蛋白質の出現
表1雄鶏筋ジストロフィーに対するべスタチソの効果
一連筋型C蛋白質の出現を指標として−＋＋という杉田らの報告10）を参考にして，雌雄それぞれについてべスタチソ投与の効果を検討した．ふ

︶
8

．

4
9
．

0
1
︵

︶
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︵

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6 1 7 8 6 3 3 3 2 1 6 1 3 3 1
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︵
︵
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︵
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︵

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︵

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︶
3

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（100％）＃45

158（100％）‡3．

261（100％）
＃2

3 1
1
︵

＃1

5

221

（100％）
Bestatin．

（100％）
＃2

3 3
1
︵

265

5

＃1

2

Saline．

190（100．％）

6
2
︵

茅2

5

133

（100％）

ストロフィー症の発症に関して雌雄間で差がある

Total

3

3

＃1

を続けた時の効果を調べた．特に本実験では，ジ

Stainedwith ALDr66

No of Cells
COuntedNone

ストロフィー症が更に蹄著になる3月齢まで投与

無処理，生理食塩水，べスタチンを注射したものについて調べた．＃1，＃2などは鶏個体の番号をしめす．ALD−66は抗遅筋C蛋白質抗体．

卵後2日目に鑑定師に依頼して，雌雄の確認をした後，雌雄それぞれを3群にわけ，無処理，生理食塩水のみ投与，ベスタチソを含む食塩水の投与を行った．
3カ月齢に到達した時点で胸筋の表層中央部を採取し，8／上mの連続凍結切片を作成し，各標本を抗速筋C蛋白質抗体，抗遅筋C蛋白質抗体（ALD−66），および抗心筋C蛋白質抗体（C−315）のいずれかで処理，更にFITC標識2次抗体を反応させ，蛍光疏微鏡で観察した．図1〜3に典型的な観察例を示す．ここにみられるように，無処理または生理食塩水のみを注射された3カ月齢の雄鶏では遅筋型C蛋白質がかなりの細胞にみられた（図1）．（今回は示さないが，正常鶏（NH412）
ではこの月齢では遅筋C蛋白質を全くもたない）．

ミオシンの存在の有無に着目して分析した．
ミオシンについては，すでに作成されている3全体の筋細胞の中で遅筋型C蛋白質を含む細胞の種のモノクローン抗体（MF20：胚，新生児およパーセントは個体差があり，少ないもので15％，び親型ミオシンH鎖を認識．MF30：新生児およ多いもので50％程度であった（表1）．この時期，

び親型ミオシンH鎖を認識．MF14：親型ミオシ

ジストロフィー筋に特徴的な細胞の大きさの不均

ンH鎖のみを認識）5）を用いてラジオイムノアッ

一性がみられたが，遅筋C蛋白質は細胞の大小をセイおよび筋凍結切片を用いた免疫組織化学法に問わず出現していた．位相差顕微鏡像と対比させより解析した．

た結果，速筋型C蛋白質はほとんどすべての細胞に含まれているのが認められた．ジストロフィー
結筋にはかなり小さい細胞があり，ここでは心筋型

果

C蛋白質が含まれる場合がある（後述）が，このよ
1）ベスタチン投与による影響

うな小さい細胞のすべてが速筋C蛋白質を含むか

べスタチソの継続投与が，鶏筋ジストロフィー

どうかは確認できない．ベスタチンをふ化後1週症にどのような効果をもつかについて，主として，から3カ月齢まで投与した場合でも，遅筋C蛋白

新生児型構造蛋白質（特に遅筋型C蛋白質）の出質の出現が十分抑制されることはなかった（図現を指標として検討した．前年度，ジストロフィ2）．べスタチソ投与の場合でも細胞の肥大化，ー鶏（NH413）に1月齢までべスタチソ投与したまたは小型化したものが混在し両者とも抗遅筋C場合，ジストロフィー症の発症がやや遅延する憤蛋白質抗体により染まる．べスタチソ授与された

向にあることを観察した7）．そこで本年度は筋ジ

4羽の雄ジストロフィー鶏について遅筋C蛋白質−79−

3moJd MaIe（NH413）
Bestatin＝10︶昌一S︵器凸﹂＜︶

図2 雄ジストロフィー鶏胸筋におけるC蛋白質の発現に対するベスタチソ投与の効
果・べスタチソ授与された3カ月齢の鶏．2個体（札＃4）の例を示す．その他の説明は図1参月軋を含む細胞のパーセントを検数したところ，1例

し，その数はそう多くはない．成鶏では心筋型Cだけ42％と高い値を示したが，他の3例は14％

蛋白質は心筋のみにしか存在しない．しかし，胚以下で対照鶏（無処理または生理食塩水のみ投発生途上の若い骨格筋では心筋C蛋白質が一時的与）の場合に比べてやや低い傾向にあった（表1，に発現されることがすでに知られている8）．さら

図4参照）．しかし，対照群，実験群ともに個体に，筋の凍結損傷などによって引き起される再生差もかなりあるのでベスタチンの効果をどの程度筋細胞でも，この蛋白質の発現が起ることが観察評価できるか断定的にはいえない．

されている．心筋C蛋白質の存在は幼君骨格筋の一方，ジストロフィー筋における心筋型C蛋白指標である．ジストロフィー筋にみられる抗心筋質の出現の有無を抗心筋型C蛋白質モノクローン

C蛋白質抗体に陽性の細胞はジストロフィー筋に抗体（C−315）を用いて免疫組織化学的に調べたと出現している再生細胞や）であろう．このような細ころ，ジストロフィー筋中に存在する主として小胞は対照筋でもべスタチソ投与された場合にも兄型の細胞が抗体と反応するのが認められた．しかい出され，両者で特に差があるようにはみられな

ー80一鶉ジストロフィー筋における新生児型構造蛋白質の出現

一〇とUOO．リ匡り 区曇罫満e翌
裏ゲ壷ぷ金言︵Uu dS︶ヰ塾ぢ遥亜壁ざる月童︵gOu︶蜜惑廣︸﹂刃 ︵tOとuOU︶挙繋誓完還㍗†トチ＝べ
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81−

−

表2

雌鶏筋ジストロフィーに対するべスタチンの効果
一遅筋型C蛋白質の出現を指標として一1

雌雄の差は歴然としている．雌鶏の場合でも，べ

l

︶
8

︵

6
︐

スタチソ投与によりジストロフィー筋内への遅筋

・
9

︶
9

︵

3

4

8

■

︶
7

7

3
1
︵

4

4

2

︶

●

．

︶

︵

9

′ ． ＼

っ

3

︶
4

3

︵

1

一

．

︶

1

︵

た．

2

︵

9

8

9

3

9

︶

筋ジストロフィー鶏の胸筋では，もう一つの構

．

︶

︵

（100％）（4．3）

さらに，ベスタチソ投与の有無に関わらず，雌胸筋内に心筋C蛋白質を含む少数の細胞が観察され

．

3

1

︶

一′■＼

〇

4

0

10

C蛋白質の出現を食いとめることはできなかった．

3

︶

︐

し

232

︶
7

︐

︶
6

9

1 1
︵

2

＃1

4

■

5
︵

．

し

Bestatin

︵

︶
7

1
︵

2

︶
2

5

215

（100％）質を含む細胞を検数した結果（表2，図4）から，●＃3． ′ ■ ＼

270

（100％）

8

1

茅2

3

︶
2

228

（100％）

合，全細胞中の10％以下であった．遅筋C蛋白

5

2

＃1

Total

■

162

（100％）
Saline■ l ＼＃2

場合に比して少なく，3月齢の時点でも多くの場

＋＋

︶
9

172

（100％）

応する細胞が認められるが，その数は雄鶏胸筋の

＋
2

＃1

筋にも，抗遅筋C蛋白質抗体（ALD66）と強く反

Stainedwith ALD−66

No of Cells
COuntedNoneられた・図3にみられるように，3カ月齢の雌鶏胸．

︵造蛋白質トロポミオシンにも変化が起ることがす．

（100％）（1．8）（ 0）

4

4

1

219

0

＃2

でに指摘されている2）．すなわち，発症に伴い．

無処理，生理食塩水，べスタチンを注射したものについて調べた．礼 ＃2などは鶏個体の番号をしめす．ALD−66は抗遅筋C蛋白質抗体．

ふ化直後のヒヨコ胸筋と同様に，βトロポミオシ

かった．いいかえれば，べスタチソ投与が筋の再よりジストロフィー筋におけるβトロポミオシン

生に大きな影響を与えるようには思えない．

の出現が影響されるかどうかを2次元電気泳動法

ンが発現されるようになる．べスタチソの投与にすでに杉田ら10）によれば，筋ジストロフィー症

により調べた．正常鶏（NH412）では1カ月齢での進行は雌鶏より雄鶏でより顕著である．遅筋Cはαトロポミオシンのみで，βトロポミオシンは蛋白質の出現の面からみても，このことは確かめ検出されないのに，1カ月齢および3カ月齢いず＋l ＋2＋l＋2 十l＋2＋3＋4＋l ＋2 ＋l ＋2 ＋l ＋2
None SalLne Bestatin None Saline Bestatin

図4 鶏筋ジストロフィー症における遅筋型C蛋白質の発現，無処理（none）．生理食塩水（saline）またはべスタチン投与（Bestatin）の各場合について，全細胞中の抗遅筋C蛋白質抗体（ALD66）陽性細胞のパーセントを示す．
−82−

鶏ジストロフィー筋における新生児型構造蛋白質の出現

れのジストロフィー鶏でも微量βトロポミオシ

蛋白質抗体を作用させ，間接蛍光抗体法で検定しンが兄い出さjl，ベスタチン投与した場合でも，たところ，除神経筋中のほとんどすべての細胞がβトロホミオシンが消失することは認められなか

抗速筋および抗遅筋C蛋白質と反応性を示すもの

った．

の，抗心筋型C蛋白質抗体（モノクローン抗体
C−315）とは反応性はみられなかった（図5）．

2）除神経筋にみられる蛋白質の変化

対照筋では速筋C蛋白質しか検出されない．この（1）心筋型C蛋白質の発現

事実は除神経により筋の幼君化が引き起されるもすでに述べたように，心筋型C蛋白質は骨格筋のの，その変化は新生児型への変化であり，胚子では胚や再生時にのみ発現されるので，骨格筋の期の状態が再現されるような変化ではないことを幼君度の一つの指標ともいえる8）．一方，鶏胸筋示唆している．同時に除神経にみられる変化は筋の場合，遅筋型C蛋白質は新生児期を特徴づける

再生にみられる変化と異なることを示唆する．こ

蛋白質である．前年度，除神経筋では遅筋型C蛋の点，ジストロフィー筋の場合と異なっている．

白質の発現が持続的に起ることを報告したが，今図1〜3で示したようにジストロフィー筋の場合，回，除神経筋において心筋型C蛋白質の発現が引心筋型C蛋白質の出現がみられた．また，除神経き起されるかどうか検討し，ジストロフィー筋の筋では，ほぼすべての細胞で遅筋型C蛋白質が発場合と比較した．

現されているのに，ジストロフィー筋では遅筋C

ふ化直後または2月齢の時点で胸筋を除神経し，蛋白質をもつ細胞は50％以下にとどまっていた．

3〜6週間後に筋の連続凍結切片を作成し，抗C

このような事実は除神経筋に比してジストロフィ
Control

Denervated︵双岩﹂＜︶

0き旦S 苫再
C〉

で蒜
日 石
．⊥ くつ
⊂
d

図5 2カ月齢鶏胸筋を除神経した場合にみられるC蛋白質の変化，除神経後．6遇の筋の連続凍結切片を図中に示す3種の抗C蛋白質抗体で処理し，間接蛍光抗体法で調べた．
−

83

−

k
T〇一×∈dO

3￣2

3」3￣6

1

3▼2

Ag d山tion

1

3￣2

3￣4

3■6

Ag djlution
一一一−MFl

エ

ー

ALD66

軋

313￣6

Ag dik相0∩

1

3￣2

3￣4

3￣6

Ag diuion Ag d心血∩図6 除神経胸筋にみられる遅筋型C蛋白質の出現ラジオイムノアッセイによる解析．ふ化直後ヒヨコ筋の場合（A），新生児筋を除神経し，3退後の筋（C）とそれに対する対照筋（B），2カ月齢鶏胸筋を除神経し，3週後の筋（E）とそれに対する対照筋（D）の場合を示す．それぞれの場合について，C蛋白質を含む粗ミオシン画分を抗原とし，抗原量10〟g〜10×3￣7JJgの範囲で変えた（桟軸）．縦軸は抗速筋C蛋白質抗体（MFl）または抗遅筋C蛋白質抗体（ALD66）を用いた場
合の抗体反応量．

一筋ではより複雑な要田が関係する変化の過程をの変化がどのように神経支配に依存しているかを経ていることを示唆する．

知るために，ふ化直後または2月齢の鶏胸筋を除神経し，発現されるC蛋白質とミオシンH鎖に対（2）除神経筋におけるC蛋白質とミオシンH鎖の発現の変化する各種抗体を用いて調べた．除神経および対照筋より，C蛋白質を含む粗ミオシン画分を得，C筋発生過程で，C蛋白質のアイソフォームに変化が起ることをすでに述べた．それに加えて，鶏蛋白質とミオシンH鎖をラジオイムノアッセイ法
により調べた結果を，図6，7に示す．

胸筋の発生，成長過程でミオシンH鎖アイソフォ

C蛋白質に関してはすでにのべたように，ふ化ームの発現が変化していくことがモノクローン抗直後の胸筋にはモノクローン抗体，MFlにより体を用いた研究により明らかにされている5）．ミ

認識される速筋型C蛋白質に加えて，ALD66に

オシンH鎖に対する3種のモノクローンMF20，より認識される遅筋型C蛋白質が共存する（図6，

MF30，MF14は，胚，新生児，親胸筋ミオシン

A）が，成長過程で遅筋C蛋白質が減少し，速筋との反応性が異なる．すなわち，3種の抗体のうC蛋白質が増加する（図6，B）．しかし，ふ化直後

ち，MF20は胚から親に至るすべてのミオシンとに除神経された場合，遅筋C蛋白質は減少するこ反応するのに対し，MF30は新生児以降のミオシとなく存在し続けることが明瞭に認められた（図ンと，MF14は親のミオシンとのみ反応性を示す．

6，C）・一方，速筋C蛋白質しかもたない2月

筋の発生，成長に伴うC蛋白質とミオシンの発現

齢の鶏胸筋（図6，D）を除神経した場合，2〜−81−

鶏ジストロフィー筋における新生児塑構造蛋白質の出現

−0−

MF30

−▲一一

MF20

Ag dilution？≡×∈dOMF14

72×∈dO−●−二二二

Ag d仙tion

も一×∈dO

3￣23」3−6？〇一×∈dO■
二山

72×∈dO▼1

虹 享㍉
妄㍉

図7 除神経胸抑こおけるミオシンH鎖の発現ラジオイムノアッセイによる解析．ふ化直後のヒヨコ筋（A），新生児筋を除神経し，3遇の筋（C）と対照筋（B）および2カ月齢鶏筋を除神経し3遇の筋（E）と対照筋（D）の場合を示す．図6の場合と同様の実駅を3種の抗ミオ

シソH鎖抗体（MF14，MF30， MF20）を用いて行った．

3週後には再び遅筋C蛋白質の出現が明瞭にみら

ノアッセイで得られた結果が再確認された（図れた（図6，E）．このようにC蛋白質の発現は，8）．2月齢の成鶏を除神経した後，6週の胸筋の神経支配の有無により大きく影響されるが，ミオ

すべての細胞がMFlとALD66で強シンの場合には，除神経された場合でも，あまりれ，速筋および遅筋C蛋白質の共存が証明される

顕著な変化はみられなかった（図7）・ラジオイのに対し，ミオシンH董削こついては，除神経筋，

ムノアッセイによる測定結果では，ふ化直後の筋

対照筋のいずれもが3種のミオシンH鎖モノクロに存在するミオシンはMF20に比べてMF14とーン抗体で同程度に染色され，差がみられなかっMF30との反応性はかなり低い（図7，A）．ふた．このように，除神経によって引き起される変化後の成長期に，MF14，MF30の反応性は，除化をC蛋白質とミオシンの発現について比較して神経筋および対照筋いずれも除々に上昇し，両者

みると，両者で大きな違いがあることが明らかにであまり差はみられなかった（図7，B，C）．一なった．C蛋白質の発現がミオシンに比して，よ

万，2月齢の鶏胸筋を除神経した場合，上記のより可変性があるといえる．筋ジストロフィーの場

うにC蛋白質に大きな変化がみられた除神経後3合にもミオシソアイソフォームの変化はあまり顕遇の筋のミオシンのMF20，14，30との反応性

著ではない．C蛋白質は筋ジストロフィーにおけは対照筋と比べて大きな差はみられなかった（図る変化を蛋白質レベルでみる場合の指標として適

7，D，E）．このことは除神経後6週を経ても同切であると思われる．

様であった．更に，除神経によって起るC蛋白質とミオシンの変化を，個々の細胞レベルで免疫組
織化学的手法によって調べてみると，ラジオイム
−85

−

く染色さ

Denervatedu壇2d←0

図8除神経筋におけるC蛋白質とミオシンの比較2カ月齢鶏胸筋を除神経し，6遇後に筋凍結切片を作成し，間接蛍光抗体法により調べた・図中に用いた抗体を示す・

でに杉田らにより報告されたジストロフィー発症についての雌雄間の差10−は，蛋白質の面からも顕まとめと考察著であった．なお，ジストロフィー筋における蛋

鶏筋ジストロフィー症に対してべスタチンの効

白質の変化については，個体差もあり解析を複雑にした．マウス筋ジストロフィー症に対してべス

果を筋構造蛋白質の発現の面から検討した結果，
べスタチソがややジストロフィー症の進行を遅らタチソが有効であることが報告されている11）・本せる傾向がみられたものの・発症を抑制すること

研究との違いは，トリと哺乳額という違いの可能はできなかった．運動能（フリップテスト）の面性が考えられる．今回われわれが用いた抗体は哺からみても，基本的には同様の結果であった・す

乳額とは反応しないため，・マウス筋ジストロフィー86−

鶏ジストロフィー筋における新生児型構造蛋白質の出現

ー症について，蛋白質の面から検討することはで

6）Reinach，F．C．，Masaki，T．，Sha丘q，S．，Obinata，T，andFisehman，D．A．IsoformsofC−prOtein
in adult chieken skeletal muscle：Detection

きなかった．
除神経筋においてC蛋白質は麒著に変化するが，with monoclonal antibodies．J．CelL BioL．，
95，78−84（1982）．

ミオシンの変化は少なかった．ジストロフィー筋

7）丸山工作．筋ジストロフィー筋における新生児塾
構造蛋白質の出現：べスタチソの投与と除神経の影響．厚生省新薬開発研究（梅沢班）昭和58年
度研究報告書．
8）Obinata，T．，Kawashima，M．，Kitani，S．．Saitoh，でみられるC蛋白質の変化と合わせ考えると，病変，除神経などに伴う筋の変質を蛋白質の面で解析する上で，C蛋白質はとりわけ良い指標である

0．，Masaki，Tりと考えられる．

Bader，D．M．andFischman，

D．A．ExpressionofC−PrOteinisoformsduring
Chicken striated muscle developmet andits

文

dependense

献

Biologyqf

oninnervation．Zn
MuscleDevelqpmeni

Molecutar（Emerson，

C．，Fischman，D．A．，Nadal−Ginard，R Siddiqui，
M．A．Q．eds），Alan R．Liss，New York．In

1）大日方昂．筋肉の分化一筋蛋白質の多塑性と可変性一科学Vol．53，pp．689−696（1983）．
2）Takeda，S．andNonomura，Y．PresenceofthePress．

tropomyosinin dystrophic ehicken breast
muscle．βわmgd．Reg．，1，176−179（1980）．

9）Nonaka，Ⅰ．，Fujita，T．and Sugita，H．Regener−3）Obinata，T．，Takan0−Ohmuro，H and Matsuda，

muscular dystrophy．Muscle and Nerve．，7，

R．Changesin troponin T and myosinisozy−mes during development of normal and dys−
trophic chicken musele．FEBSLetE．，120，195

10）Sugita，H，，Kimura，M．，Tarumoto，Y．，Tamai，

ative capability of skeeltalmuscleinchicken

400−407（1984）．
M．．Hanada，K．，Ishiura，S．，Nonaka，Ⅰ．，Ohzeki，M．andImahori，K．In vivo administration
Of a thiol proteaseinhibitor，E−64−C，tO
hereditary dystrophic chicken．Muscle and−198（1980）．
4）Obinata，T．，Saitoh，0．and Takan0−Ohmuro，H．Effect of denervation on tropomyosin，
troponin T and myosinisozymesin chicken
breast muscle．J．Biochcm．， 95，585−588（1984）．

5）Bader，D・，Masaki，T．and Fischman，D．A．
ImmunochemiCal analysis of myosin heavy〃grpgり5，738−744（1982）．

11）松下 宏，辻 繁勝：筋ジストロフィーマウスにみられる種々な酵素の活性変動に対するロイべプ
チソおよびべスタチソ投与の影響．厚生省新薬開発研究（梅沢三旺）昭和55年度研究報告書．pp．55

Chain during avian myogenesisin vivo andin vitro．J．CelL Biol．，95，763−770（1982）．

−87−

−61．

筋ジストロフィー症マウスに対する高濃度べスタテン
およびアルファメニンB投与の効果

松
研究協力者

辻

下

宏＊

繁勝＊・楠本茂夫＊・土井芳夫の疾病個体（dy／dy）および同齢の正常対照個体
研究目（＋／−）を使用した．

的べスタチソ投与実験には疾病マウス各10匹ず
筋ジストロフィー症（dy）マウスを用いて発症つを1実験区として，1日投与量2mgのグルー直後から1日量0．4mgのべスタチソを連続投与

プ，および4mgのグループをそれぞれ4週間連することによって疾病から回復する個体が得られ続投与実験と6週間投与実験に分けて，合計4実ることが分かっている．また，症状が進行したdy

験区とし，さらに各実験区に対照として10匹ず

マウスに同量のべスタチソを授与してももはや疾

つの食塩水投与群をおいた．一方，アルファメニ

病から回復することはないが大幅な延命効果が見

ソBの投与実験には1日投与量0．4mg，0・8mgられることもすでに報告した1）．そこで今年度はおよび1．2mgの各グループをそれぞれ6週間連

1カ月齢ですでに症状の比較的進行した状態の続投与実験と12週間投与実験に分け計6実験区

dyマウスに対して，従来の投与量の5倍・（2mg／とし，さらに各実験区に対照として10匹ずつのday）ないし10倍（4mg／day）量を連続投与した食塩水投与群をおいた．

場合に症状の改善効果がどの程度に認められるか

アルファメニソB投与による延命効果を検討す

あるいは副作用が出現するか否かなどについて検るために，1日投与量0．4mg，0．8mgおよび討を行った．

1．2mgについて平均15匹ずつの実験区を作り，1カ月齢から死亡するまで投与を続け寿命を記録

また，同時に昨年度，1日量0．4mgで連続投した．

与する実験を行い，症状進行に対する抑制効果が認められたアルファメニソBについても，従来のべスタチソ粉末は，使用直前に食塩水に4mg／2倍（0．8mg／day）ないし3倍（1．2mg／day）量mJ濃度に溶解し，1回0．5mgと0．25mgずつをを長期間にわたって投与した場合の症状進行に対

1日2回ずつ，それぞれの実験区のマウス背部皮する抑制効果ならびに延命効果の有無を検討した．

下に注射した．アルファメニソB粉末も使用直前に必要量を食塩水に溶解し，1日2回ずつ，0．4
mg／day，0．8mg／day，および1．2mg／day量に材料 と 方法

なるように皮下注射した．対照マウスは食塩水を同量ずつ，その都度皮下注射した．

実験には自家繁殖または実験動物中央研究所よ投与期間を終了したマウスは，直ちに断頭採血り購入した1カ月齢のC57BL／6J−dy系マウス

し，血清中および骨格筋中のマーカー酵素群の活＊和歌山県立医科大学第二生理学教室
−

89

−

性ならびに尿中のクレアチンおよびクレアチニン

表l Effects of high dose Bestatin on serum
enzyme activitiesin dystrophic mice

含量の測定を行った．

2mg

酵素活性測定には新鮮血清はそのまま，また屠

4mg

Enzyme4weeks

殺後直ちに採取した後肢筋は20倍容の0．32M
庶糖液に入れ，テフロンホモジナイザーでホモジ

PK lO3．0
CPK

6weeks
65．7＊

64．2＊

4weeks
66．6＊

53．1＊

6weeks
78．2＊

71．8＊

32．4■

ナイズした後通常のSchneider法に従って可溶画
Unit：Bestatin／SalinexlOO

分とミトコンドリア画分に分離し，前者はそのま＊♪＜0．01

ま，後者はさらに低張処理によって膜の破砕を行

表2 Effects of high dose Bestatin on muscle

ったのちに，それぞれを酵素原品として使用した．

enzyme activitiesin dystrophic mice

酵素活性の測定法は，アルカリプロテアーゼ活

2mg

ロテアーゼ活性はDayton

4mg

Enzyme性はEdmund＆Penningtonの方法2），中性プ

4weeksら3）のCANP活性測

PK

定法に準じて，tOtalneutralprotease活性をは

134．7＊

CPK

かる方法，また，クレアチンキナーゼ活性（CPK）

140．4＊

GOT

l12．1

GPT

lO5．3

はHessらのUV法4），乳酸脱水素酵素活性（LDH）

LDH

はWroblewskiらの方法5），GOTおよびGPT

Alk．protease

6weeks130．2＊
188．1＊

4weeks
121．2

123．2

149．5＊

151．5＊

133．3＊
147．8＊
75．0

81．9

6weeks57．6＊

活性はKarmen法6），ピルビン酸キナーゼ活性

Unit：Bestatin／SalinxlOO（PK）はTanakaらの方法7）にそれぞれ準じて行＊♪＜0．01

72．4＊
75．2

57．2＊

った．また酵素標品中の蛋白含量測定は，Lowry

期間が長い程大きな活性低下を示しており，血清法で行った．さらに，尿中のクレアチンおよびク

遊出酵素の活性変動に関しては明らかな改善効果

レアチニソ含量はJa圧e反応によるTaussky法8）が認められた．一方，骨格筋中の各種マーカー酵によって測定された．

素の活性変化は表2のように，アルカリ・プロテ
アーゼ活性はベスタチソ投与によって明らかな低結下傾向を示し，6週間投与ではいずれの投与量で果も対照と比較して有意な差異を示していた．また，
1．高濃度ベスタチン投与の効果

CPK酵素はあらゆる場合に有意な活性上昇を示

筋ジストロフィー症発症後やや時間が経過し，しているのに対して，PK酵素は2mg投与の場

症状の進行が見られる1カ月齢の疾病マウスを用合だけ有意な活性上昇を示した．しかし有意差はいて，ベスタナンを従来の投与量の5倍量およびなかったが4mg投与の場合でも，活性増加の傾10倍量で4週間と6週間に分けて短期連続投与向は認められた．一方，GOT，GPT両酵素の活実験を行った．血清中に造出している疾病のマー性は2mg投与では有意な増加を示さないが4カー酵素であるPKおよびCPKの活性変動に与mgに投与量を増加すると有意差を示すようになえる影響をしらべた結果は表1のようであるが，った．LDH活性は有意な変化を示さなかった．

PK活性が2mg投与で4週間のマウスでのみ，

以上のように，高濃度のべスタチソの投与によ対照と相違を示さなかった以外は，全ての投与マってマーカー酵素の活性変化に明らかな症状改善

ウスの血清中でPKおよびCPKの活性値が有意の傾向が示されたので，次に体重変化に対する投に低下していることが認められた．特にCPK活与の影響をしらべて見た．図1は1カ月齢で投与性の変化については，投与量が多い程，また投与を開始したマウスの30 日間の体重変化を示した

−

90

−

筋ジストロフィー症マウスに対する高濃度べスタチソおよびアルファメニソB投与の効果

つq＝：＝：三ここさ二葦︵如 毒むき合○皿

】2

云
〇一一一〇

、ムー、ユニエー一也一ノA、仏
4mg Bestatin、一一●一一●、−●一一一●一一小￣●●一、■、、、●一一一●＿一−●一丁●一一小一−●

ヽ▲一一一▲ヽ

ヽ、▲一一1、

1−・「■・・一一一1一・一・・一▲・十・一・一．ノ▲一・一
0．5mJ Saline

0

4

8

12

16

20

24

28

32

Administration period（day）

図11カ月齢の筋ジストロフィー症マウスにべスタチソを連続授与したとき
の体重変化
表3

ものであるが，対照マウスに比較してべスタチソ

enzyme activitiesin dystrophic mice

投与群はいずれの投与量でも明らかに体重増加の傾向が有ることが認められる．特に投与開始後1

Effects of Arphamenine B on serum
6weeks12weeks

Enzyme0．4mg

週間位は急速な体重増加を示すが，その後は対照
PK

群と同様ゆっくり減少するという共通のパターンが見られる．また，4mg投与の方が初期効果がより早く現われているが，その後の経過は2mg

0．8mg1．2mg

0．4mg O・8mg

45．0

65．8

59．1

64．4

82．4

CPK lOO．8

80．1

68．3

110．6

102．0

LDH

92．0

108．5

115．2

94．3

140．4

Unit：Arphamenine B／SalinexlOOとほぼ同じであった．

CPK酵素は6週間投与で投与量が多い程，大幅

2．種々の濃度のアルファメ二ンB投与による効果な活性低下を示していたが，12週間投与では対照との間に変化は見られなかった．さらにLDHの昨年度の実験結果から1日投与量0・4mgのア場合は0．8mg投与量の場合にわずかに減少傾向

ルファメニソBを1カ月齢の筋ジストロフィー症を示したがほとんど変化がなく，むしろ0．4mg，マウスに連続投与することによって明らかな改善

6週間投与では活性が対照に比較して増加してい効果が見られることが分かったので，投与量を2た．一方骨格筋中での酵素活性は表4で見られる倍および3倍に増加した場合にどのような効果がように，アルカリおよび中性プロテアーゼがいず見られるかを検討した．

れも全実験区で減少傾向を示しているが，特にまずそれぞれの投与マウス血清中でのマーカー

0．4mg投与のマウスではいずれの投与期間にお酵素活性の変化は表3のようであった．PK酵素

いても著しい活性低下を示していた．また，PKは全実験区において著しい活性低下を示していた．

活性は0．4mgで12週間投与のマウス以外は全て

ー91−

表4

Effects of Arphamenine B on muscle enzyme activities
in dystrophic mice

6weeks12weeks

Enzyme
0．4mg

0．8mg

1．2mg

0．4mg

0．8mg

78．2

89．3

85．4

114．3

88．8

70．9

133．1

102．5

100．2

111．3

145．8

121．7

116．8

133．7

109．9

Alk．protease

61．5

87．3

83．8

45．4

95．4

Neut，prOteaSe

83．9

90．1

99．8

60．9

68．7

Unit：Arphamenine B／SalincxlO
表50．8mgで6週間投与のマウスでは増加の傾向を

Effects of Arphamenine Bonurinary
Creatine secretionindystrophic mice

示し，その他の場合は対照との間に差異は無かっ

Period Daily dose Creatine Creatinine Ratio
1

2
7

1

6
0

0

0
9

の変化は表5のようにいずれの投与量でも改善の

4

1
7

1

2
2

5．75

7

7．05

1．2mg

さらに，尿中クレアチンおよびクレアチこソ量

3
8

0．8mg

5

6．34

8
9

0．4mg

た．

3
6

16．53

9

6weeks Saline

傾向を示したが，特に0．8mg投与量で最も著明

14．61

9．18

1．60

な効果を現わしていることが認められた．また体0．4mg ll．38

10．19

1．12

重変化に対する影響は図2のように，0．8mg投

0，8mg

7．74

13．37

0．58

1．2mg

9．79

11．35

0．86

12weeks Saline

与で最も効果が大きく，1．2mg投与では投与開始初期での効果が大きく認められるが，その後はUnit：mg／dL urine

対照マウスと同様な減少傾向を示し，30日後では減少の傾向を示していた．CPK活性は0．4mgで0．8mg投与マウスよりもむしろ低い体重になっ6週間投与の場合にわずかに減少を示していたがた．

13

0．8mg Arphamenine B′′−「ト・、．
ノほ＿〇一・一一〇

＼1ヽ．

●一●＿

l剖

l・2mg Arphamenirl．2mg
Arphamenine B、一一…一一一、、一…一一■一一一、−一一一一一一一一…一一疇

Sa】lnea︵餌 長山至言○皿〆ぺ二二三池㌫ニご二・一

2

6

10

14

柑

22

26

30

Administration period（day）

図2

1カ月齢の筋ジストロフィー症マウスにアルファメニンBを連続授与したときの体重変化−92−

筋ジストロフィー症マウスに対する高濃度ベスタチソおよびアルファメニソB投与の効果

きな効果が得られる可能性が考えられる．さらに
体重変化に与える効果も著しく，特に投与開始の初期（1週間）における急速な体重増加は，両投与量で共に明らかに認められた．このことは長期連続投与のみでなく一定の間隔で断続的に投与を行う方法を今後試みる必要があることを示唆しているものと思われる．以上の結果を総合すると，
50

川0

150

200

Age（day）

マウスの筋ジストロフィー症の場合，すでに症状の進行した段階からでも大量のベスダチンを連続

図3 筋ジストロフィー症マウスに種々の量のアル
ファメニソBを授与したときの延命効果

授与する治療を行うことによってかなりの程度に症状の改善が得られる可能性を強く示唆している

次に各投与量におけるマウスの寿命の変化につものと考えられる．また，べスタチンの投与量にいて実験を行った結果は図3のようにいずれの投ついても，今回の投与是では多い程，効果が大き与量についても，対照マウスと比較して明らかない傾向を示しており，また，全く副作用と思われ寿命の延長傾向が認められたが，0．4mgと0．8mgで最も効果が大きく，1．2mg投与では平均寿る現象が認められなかったことから，さらに高濃度に投与する試みも可能と思われる．
次に，種々の投与量におけるアルファメニソB

命の延長は見られるが投与マウスが短期間のうちの疾病に対する改善効果の比較であるが昨年度にに一斉に死亡するという幌向が見られた．

実験を行い効果が認められた1日投与量0．4mg
考の場合を含めて，2倍量（0．8mg），3倍量（1．2察mg）で共に明らかな症状抑制効果が認められた．
発症初期から投与を開始することによって筋ジ

しかし，そのうち2倍量投与が全般的に最も大きストロフィー症マウスに対して疾病回復効果が有な効果を示しているものと考えられる．特に延命ることが認められているべスタチソを従来の投与効果における3倍量投与マウスにおける一斉死亡

量の5倍および10倍に増量して1カ月齢ですでなどの傾向はこの物質の効果の限界量を示すものにかなりの程度に症状の進行している筋ジストロとも考えられるが，この点については末だ実験例

フィー症マウスに投与した場合に症状進行に対しがあまり多くないので，さらに繰り返し，実験をてどのような抑制効果があるかを検討する実験を椚み重ねる必要がある．今回データは示さなかっ行った．その結果血清遊出酵素のPKおよびCPK

たが同様投与量におけるアルファメニンAの効果

活性はいずれも著しく減少して明らかに症状改善を見る実験も同時に行った．しかし，結果は1日の傾向を示していた．一方骨格筋中のマーカー酵

投与量0．8mg以上では逆に毒性効果が強く出て素も分解系酵素であるアルカリ・プロテアーゼは症状を悪化させる傾向が認められたので，実験を有意に活性減少を示し，同化系酵素であるPK，中止した．しかし昨年度に報告したように，低濃CPK，GOTあるいはGPTなどの活性は有意に度の投与ではアルファメニソAの方がむしろアル増加していることが分かった．また，この症状改ファメニソBより強く症状抑制効果が現われるこ

善傾向はべスタチソ投与量が多い程著しく，また，とが示されているので両物質についての適当濃度

投与期間が長い程強く現われていることから，1による投与効果の実験はさらに続行する必要があ

日投与量をもう少し増加することによってより大るものと考えられる．

−

93−

文

献

1）松下 宏，辻 繁勝，筋ジストロフィーマウスにみられる種々な酵素の活性変動に対するロイべプ
チソおよびベスタチン投与の影響．厚生省新薬開発研究室㌢微生物の二次代謝産物に由来する難病治
療薬（ロイペプチン）の開発研究，昭和55年度
研究報告書．p．55−61（1980）．
2）Edmund，T．and Pennington，R．J．T．Mast
Cell orlgln Of myofibrillar protease of rat
Skeletalandheart muscle．Biochcm．Biophys．
Ack，661，28−31（1981）．
3）Dayton，W．R．Reville，W．J．，Goll，D．E．，and
Storomer，M．H．A Ca＋十−aCtivated proteasepossiblyinvoIvedin myofibrillar protein
turnover，Partial eharacteri2，ation of thepurified enzyme．Biochemistry．，15，2159−2167（1976）．

4）Hess，J．W・，Murdock，K．J．，andNatho，G．J．W．

ー94一

Creatinephosphokinase．Aspectrophotometrie
method withimproved sensitivity．Am．J．
CJi仇 劫J加7．，50，89（1968）．
5）Wroblewski，F．，and LaDue，J．S．Lactic dehy−
drogenase activityin blood．Proc．Soc．Exp．
βわJ．〟gd．，90，210−213（1955）．
6）Karmen，A．，Wroblewski，F．，and LaDue，J．S．，
TranSaminase activityin human blood．J．
CJf刀．九がg5g．，別，126（1955）．
7）Tanaka，T．，Harano，Y．，Sue，F．andMorimura，
H． Crystallization， Characterization andmetabolic regulation oftwotypesofpyruvatekinasesisolatedfromrattissues．J．Biochem．，
62，71−91（1967）．
8）Taussky，H．H．A microcolorimetric determi−
ation of creatineinurinebytheJaffereaction
J・月わJ．C反別．，208，853−861（1954）．

体外受精法によって作出されたC57BL／6−dyホモマウス
に対するべスタテンおよびロイ■ペプチン投与の影響

野 村 達 次＊研究協力者

横山峯介＊・日置恭司＊・江崎孝三郎＊・谷本義文＊′

従来，筋ジストロフィーdyマウスを得るため

間に穀処分して卵管膨大部から採取した．一方，には，dy遺伝子をヘテロにもつ保田マウスのメ

精子はオスの精巣上体尾部から採取して，体外受ス・オスを交配する方法がとられている．しかし，精用のメディウム1）に懸濁し，受精能投得を誘起

この交配では，その仔の4分の1にdyホモマウ

するために炭酸ガス培養装置内で1〜1．5時間イスが現われるのみであり，また，生後2〜3週齢

ンキュベーションしてから使用した．媒精は，卵にならないと正常と筋ジストロフィーを区別するを含むメディウム内に少量の精子懸濁液を加えてことができないために，胎生期や生後の早い時期行った．精子の侵入が起こり，受精が成立した卵にdyホモのマウスを実験に使用することができは，温度が37cc，気相が5％炭酸ガス・5％酸

なかった．そこで，体外受精の技術を用いてdy

素・90％窒素の閉鎖形の条件下で培養し2），2細ホモマウスを作出することを試みた．さらに，得胞期へと発生させた．

られた発症前のdyホモマウスを用いて，べスタ

2細胞期へと発生させた胚は，あらかじめ精管

チソならびにロイべプチソ投与の影響を調べた．

結禁オスとの不妊交配で偽妊娠を誘起しておいた
Dayl（膣栓観察日を第1日として）のレシピェ

材料および方法

ソトマウスの卵管内へ常法により移植した．片側の卵管あたりの移植胚は5〜7個とし，両側合わ

体外受精用としては，当研究所で生産された

せて10〜14個とした．以上の操作により得られ

C57BL／6−dyマウスのメスとオスを使用した．

たdyホモマウスは，ベスタチソおよびロイペプ

これらは，筋ジストロフィーの発症が確認された

チソ投与の実験に供した．

生後2〜4カ月齢で実験に供した．体外受精によ今回の投与実験に用いたべスタチソおよびロイって得られた受精卵（胚）を移植するためのレシペプチソは，微生物化学研究所の青柳高明博士よピェソト（借腹メス）には，Jcl：ICRの3〜5カ

りご提供いただいたものである．これらは生理食

月齢メスを用いた．

塩液に2mg／mlの濃度で溶かし，dyホモマウス

体外受精に使用する未受精卵は，dyホモマウの頸背部皮下に，1日2回ずつ連日投与した．投スのメスに5IUのPMSG（妊馬血清性性腺刺政

与量は，生後1〜2週齢の間は0．05mgとし，そホルモン）と5IUのhCG（秩毛性性腺刺激ホルの後10遇齢までほ0．1mgとした．また．一部のモン）を48時間間隔で腹腔内注射して排卵を誘

dyホモマウスには，同量の生理食塩液のみを同起した．卵は処理マウスをhCG注射後16〜17時

様に授与して，対照群とした．
投与を行った個体は，定期的に体重を測定し，＊（財）実験動物中央研究所−95−筋ジストロフィーの発症時期等を調べた．また，管内に移植したところ，11匹（84．6％）で妊娠が10適齢で，500Cのホットプレート上に置かれた成立し，59匹（34．5％）の仔が得られた．

金アミケージを用いて，筋の耐久力試験を行った．
さらに，殺処分ののち，血液生化学的検査として，

2）ベスタチンの投与

GPT（glutamate−pyruVate tranSaminase），GOT

体外受精の手法によって作出された発症前の（glutamate−0Ⅹaloacetate tranSaminase），LDH

dyホモマウスに，ベスタチンを1週齢から連日（1actate dehydrogenase），CK（creatine phos−

投与したさいの体重曲線を図1に示した．べスタ

phokinase），Aldolase，ALP（alkaline phos−

チソ投与群および生理食塩液投与群とも5週齢まPhatase）の各酵素活性を測定した．

では良好な体重増加を示したが，その後プラトーに達し，増加はみられなかった．さらに，べスダ

結果

チソ投与群および生理食塩液投与群の個体とも，
生後2〜3週齢で筋ジストロフィーの症状が現わ

1）体外受精および移植成績

れはじめ，4週齢では全例で発症が確認された．

筋ジストロフィーの発症が確認された43匹のこのようなことから今回の実験からは，ベスタチ

dyホモマウスのメスにホルモン処理を施したとン投与によるdyホモマウスの体重増加ならびに

ころ，その内の32匹（74．4％）に排卵が認められ

筋ジストロフィーの症状改善の効果は認められな正常な未受精卵が回収された．これらの大多数はかった．

体外受精により，前核期の受精卵とすることができ，総数222個（一匹あたり6．9個）であった．

3）ロイぺプテンの投与

さらに培養により，209個（94・1％）の卯が形態

dyホモマウスにロイペプチン′を1週齢から連的に正常な2細胞期胚へと発生した．これらのう日投与したさいの体重曲線を図2に示した．ロイ

ちの171個の胚を13匹のレシピェソトメスの卵

ペプチン投与群および生理食塩液投与群とも，5′一一●一一一一一●一一一一●一一一一●＿＿一●一′︵u︶三官主こすぷ
2

4

6

8

10

（Weeks）

図1べスタテン投与dyホモマウスの体重曲線
−

96

−

体外受精法によって作出されたC57BL／6−dyホモマウスに対するベスタチソおよびロイペプチソ投与の影響︵u︶一遍葺合○皿
2

6

4

8

10

（Weeks）

図2

ロイべプチン投与dyホモマウスの体重曲線

週齢までは良好な体重増加を示したが，その後プペプチソを投与したdyホモマウスは，全例ともラトーに達し，大きな変動はみられなかった．ま金網によじ登ることができず，ホットプレート上

た，ロイペプチソ投与群，生理食塩液投与群の個にとどまった．また，生理食塩液を投与したそれ

体とも生後2〜3週齢で筋ジストロフィーの症状

ぞれの対照群の個体でも，まったく同じ結果であが現われはじめ，4週齢では全例で発症が確認さった．

れた．このようなことから今回の実験においては，

5）血液生化学的検査

ロイペプチソ投与によるdyホモマウスの体重増

各実験群のマウスを10適齢で殺処分後実施し加ならびに筋ジストロフィーの症状改善の効果はた血液生化学検査の結果を表1に示した．GPT，認められなかった．

GOT，ALPについては，べスタチソおよびロイ
4）筋の耐久力試験

ペプチソ投与群とも，生理食塩液を投与した対照

べスタチソおよびロイべプチソを連日投与した群と有意差は認められなかった．また，正常無処

個体は，10遇齢で筋の耐久力試験を行った．方法

置群と比べ有意差があってもその差は小さいもの

としては，500Cのホットプレート上に置かれたであった．

金網ケージ内にマウスを一定時間（10分間）入れ，今回のベスタチソおよびロイペプチン投与効果

金網によじ登っている時間を測定した．ただし，の判定マーカー酵素として特に重要視したLDH，

ホットプレートにマウスが連続して1分間以上とCKならびにAldolaseとも，投与群とそれぞれ

どまった場合は，その時点で実験を中止した．正の生理食塩液のみを投与した対照群との間に有意

常無処置のマウス（C57BL／6）では，10分間の実差は認められなかったが，正常無処置の値と比較

験実施中にホットプレート上に数秒以上とどまっすると有意に高いものであった．したがって，dy

たり，登りついた金網から落下するものはまったホモマウスに対するベスタチソおよびロイペプチ

くみられなかった．一方，べスタチソおよびロイソ投与の効果は，血液生化学的な面からみても認

−

97−−

表1血液生化学的検査の成績
GPT GOT LDH CK Aldolase ALP（IU／ml）（IU／mL）（IU／ml） （IU／ml） （IU／mL） （IU／ml）
べスタチン投与

生食液投与
ロイべプチン投与

生食液投与
正常無処置

8

8

44±118）94±30

529±161567±227201±109

124：±45

9

7

29± 3

67：±12408±

69

295±128125±43145±26

3
9

6
4

32±6
31± 3

93±30
65± 7

383±

91

479±255147±

49

117±24

58

130±

24

138：±1565140±452±101

336：±

8

3

26±5

85±5

197±

23

380±105

343±

年

5

34＝ヒ1457＝ヒ25250二と56

401±182323±104

6
9
8

3
2
3

28±8
31士 4
28±7

369±

4

786±254440±

43132±10

90±14
38±6

321±

64

435±148322± 85

105：± 4

90＝ヒ

21

48±

70±

174±168233

122±29a）Mean±SD

められなかった．

およびロイペプチソとも，dy筋ジストロフィー
マウスの症状改善に対しては，はっきりとした効
考

果は認められなかった．効果に差の出た原因につ察

いては，現段階では不明であるので，今後さらにマウス卯の体外受精に関しては，1968年に最初

詳細な検討が必要と考えている．

の成功例3）が得られて以来，数多くの報告がなさ文れている．この体外受精の技術は，繁殖障害を伴うような疾患モデル系統の維持・生産の手法のひとつとして，有用であると考えられてきたが，実際的な報告はみられなかった．今回われわれは，

Culture of preimplantation embryoin vitro．
Aかα粥．βわ5Cf．，6，129（1971）．
3）Whittingham，D．G．：Fertilization of mouse

筋ジストロフィーを発症したdyホモマウスのメスとオスを使用し，産仔を得ることができた．こeggs h pか0．〃αJ〟rg．，220，592（1968）．
4）Tsuji，S．and Matsushita，H．：Effects of pro−の手法で作出される個体は，新生期や胎生期からteaseinhibitors on the activity changes of
SeVeral enzymesin murine muscular dystro−
phy．J．タカノ∫わJ．50C．′（ゆ桝，43，374（1981）．
5）松下 宏，述 繁勝：筋ジストロフィーマウスに見られる種々な酵素の活性変動に対するロイベプ
チンおよびベスタ≠ン投与の影響．厚生省新薬開発研究（梅沢班），昭和55年度研究報告書．pp．

遺伝子型が明確なので，いままで困難であった実験も可能になり，dy筋ジストロフィーマウスの利用の幅も広がったと考えられる．
dy筋ジストロフィーマウスに対して，各種のプロテアーゼインヒビターの投与が，症状改善に

55（1981）．

効果があるという報告日）がなされている．しかし，今回われわれが行った実験では，ベスタチソ−

献1）豊田 裕，横山峯介，星 冬四郎：マウス卵子の体外受精に関する研究Ⅰ．精巣上体精子による受精成績，家畜繁殖誌，16，147（1971）．
2）Whitten，W．K．：Nutrient requirements forthe

98−

筋疾患に対するべスタチンの長期投与を中心に村 上 慶 郎＊研究協力者

岡崎

隆＊・石川和彦＊・林英人＊

日常生活動作のテストとしては，数多くのものはじめがあるが，国際的に統一されたものがなく，我がに国では最近日本リハビリテーション医学会の試案
今年度は，前年度に引き続きべスタチソを2，3がだされているが，いまだに広く用いられるに至の筋疾患に長期間投与した成績およびDuchenneっていない．そこで私共は，近年米国で，神経疾型筋ジストロフィー症に長期間大量に投与した成患の治療薬，リハビリテーションの効果の評価に績について報告する．

用いられているBarthelIndexを用いた．このテストはこまかい点での評価は十分ではないが，簡単に日常生活動作が数量化されるので便利である．

対象および方法

血清酵素としてはCPK，LDH，GOT，GPT

対象は国立療養所箱根病院に入院または外来通
院中の筋疾患患者で，肢体型筋ジストロフィー症

を用い，その他副作用のチェックのため，末梢血，
肝・腎機能検査および尿検査を行った．

3例，顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー症2例，
筋強直性ジストロフィー症4例，多発性筋炎2例，

成績

Duchenne塾筋ジストロフィー症10例，計21例

前年度に報告したように，肢体型筋ジストロフであった．このうち女性は4例，男性は17例であった．年齢は2歳から55歳までであった．

ィー症，顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー症，筋使用量は30〜90mgより漸増し，副作用，検査

強直性ジストロフィー症では特に効果は認められず，悪化の傾向を示している．

成績などを参考にして，2週〜4遇で増量した．
最高は1500mgに及んだものもある．これは体重多発性筋炎ではステロイドの節約効果がみられ

11【gにつき2mgから10mgに相当する．使用たが，長期間の使用では，症状の進行がみられた

期間は2カ月から42カ月に及んでいる．

（表2）．

臨床症状の評価は，定期的な握力，床からの立10例のDuchenne型筋ジスト。フィー症では，ち上がり時間の測定，一部に筋力測定，10m歩行5例に症状の悪化がみられた．残りの5例は，1時間の測定を行った．また，日常生活動作の評

例を除いて，比較的短期間の使用であったので効価にはBarthelIndex（パーテル指数）を用いた果の判定は困難であった．
多発性筋炎およびDuchenne型筋ジストロフィ（表1）．
＊国立療養所箱根病院

ー症では，べスタチソの使用開始後CPKの一時−99−

表1生活動作のパーテル指数

項

目

評

1

食

2

ベ ットか ら立上 が る

事

3 臣

洗

顔， 結

l

髪

価

点数

で

き

る

ト

10 点

で

き

る

■

15 点

で

き

る

5 点

4

大

便

で

き

る

10 点

5
6 t

入
浴
平 な 所 を 歩 く

で

き

る

5 点

で

き

る

7；

階

段

の

昇

降

81

着

物

の

着

脱

l

91

大

便

を

も

ら

す

10】

中

根

を

も

ら

す

任， 小

1

評

一

価

点数

助 けて もら う

0 点

助けてもらう0 点

助けてもらうlio 点

助けてもらう

】

0 点

15 点

1

助けてもらう0 点

1

助けてもらう

0点
0点

で

き

る

l lO点

で

き

る

l lO点

助けてもらう

l

もらさない

l lO点

も

ら

す

l

もらさない

も

ら

す

的な低下がみられ，その後徐々に増加の傾向がみられた・べスタチソを増益することによりCPK

10点

l o点
】

0点

副作用としての消化器症状が従来からあげられているが，今回の私共の症例ではみられなかった．

の低下のみられるものとそうでないものがみられた・LDH，GOT，GPTもほぼ同様の憤向を示
した．

】

0 点

助けてもらうその他，尿，血液検査上異常値を示したものは

なかった．

−100−

筋疾患に対するべスタチソの長期投与を中心に
表2

名

年齢 性 最大投与量 投与期間臨床症状副作用

21

男

600mg

2カ月

顔面扇甲上腕型

50

男

270mg

42カ月

270mg

42カ月

1400mg42カ月

Duchenne筋ジス トロフィ

2

男

240mg

2カ月

Duchenne筋ジス トロフィ

12

男

600mg

42カ月

Duehenne筋ジス トロ7イ

16

男

500mg

12カ月

Duchenne筋ジス トロフィ

12

男

1000mg

12カ月

Duchenne筋ジス トロフィ

15

男

1000mg

8カ月

Duchenne筋ジス トロフィ

8

男

1000mg

4カ月

Duchenne筋ジス トロフィ

7

男

400mg

4カ月

Duchenne筋ジス トロフィ

11

600mg

2カ月
24カ月

し

900mg

L

1500mg

L

男

L

男

L

2
8

L

Duchenne筋ジス トロフイ
Duchenne筋ジス トロフイ

行行行行
進進進進

男

38カ月
15カ月

12カ月

ベスクチソ投与時の立上がり時間，／；−テル指数の変化Duchenne PMD

投与前

8

2

●

0
8

いて

0

Duchemne型筋ジストロフィー症の症例につ

0

90

4．7
80

6

90

5．3
80

00
36
0・8
4

5．0
80

6歳男子

8遇後10週後12週後15週後18遇後4020840・

90

3．5
80

6週後

090
404・8

立上がり時間，秒
バーテル指数

4週後

020
95・8

べスタテン，mg O

2遇後

L

42カ月

男

男

90mg
90mg

L

1400mg

32

42カ月

L

51

多発筋炎

男
男

42カ月

270mg

L

多発筋炎

男

270mg

L

40
38

女

L

筋緊張性ジストロフィー
筋緊張性ジストロフィー

41

男

L

37

L

21

L

顔面肩甲上腕型
筋緊張性ジストロフィー
筋緊張性ジストロフィー

L

肢体型筋ジストロフィー

進行

L

5カ月

L

42カ月

600mg

L

270mg

女

L

女

32

L

55

肢体型筋ジストロフィーな な な な な た な な な な な な な な た な な た な な な

肢体型筋ジストロフィー

行行行行行行行行
進進進進進進進進KMFSMSROIISSMTMKKYOTS
AHHLNL㌻KNTMKTMMK㌻KmKT

1234567891011121314151 6171819．2021

表3

病

べスタチン投与患者一覧

3〜4秒から少しずつ増加して，10週日には4．2秒となった．しかし，14週目の終りには感冒に確り，自宅で床につき，数日べスタチソを服用しな

1．6歳のDuchenne型筋ジストロフィー症のい日があった．その後15週目には床よりの起立

男子．3歳頃，異常歩行のため某大学小児科で時間は6．3秒と悪化し，その後は感冒は治癒した

Duchenne型筋ジストロフィー症と診断．昭和59にもかかわらず，床よりの起立時間は増加してい年6月当院外来を受診，外来受診時には登はん性

る．日常生活動作を示すBarthelIndexは変化を起立を示し，階段昇降に際し手摺りを使用するよ

示していない．

うな状態であった．また，床よりの起立時間は3〜4秒位であった．べスタチソは90mg
始し，10週目より

血清CPKは第9週目（90mg／day）で低下を示より開し，400mgに増量してやや低下しているが，15400mgに増量し，21週目に週の感冒隈患中は立ち上がり時間と同様に増加を600mgに増量した（図1，表3）．

示している．血清LDH，GOT，GPTも同様の結果は臨床的には歩行，筋力，日常生活動作に傾向を示している．この症例では体重1kg 当り

は著明な変化はなく，床よりの立ち上がり時間は30mg／dayに増加すると急激にCPK，LDHが低−101−

単位：unit，mg

授

与 前

単位：U鴫mg

2 過

4 娼

6 i昌

9 週

川 i司

12 周

13遥

15 週

け i昌

19 週

2 1 i堅

投

与 前

l 月

2 月

3 月

4 月

月

6 月

7 月

8 月

月

IO 月

【

ヘ

0

90

9 0

90

90

40 0

4 00

40 0

4 00

40 0

4 00

6 00

−

ベ ス タ テ ン

0

9 0

3 00

4 00

5 00

60 0

6 00

90 0

6 00

600

60 8

90 0

−

C P K

40 30

4 3 706 日 0

5 8 104 530

4 89 547 64

4 75 865 43

5 3 10

67 05

36 42

ー

C P K

44 90

4 59 5

26 30

14 08

27 95

2 43 0376 5

3 】4 5

368 3

2 856

2 69 42 83 3

一一 L D H

24 90

2 5 383 48 6

24 69

26 78

2 79 2

2 5 ：け3 12 623 96

2 10 7

26 59

20 44

一一 L D H

17 8 0172 6

19 4 8

18 92

15 引

柑 2 8

16 12

16 0 8164 6

14 5 0160 2

14 0 6

一一 G O T

140

18 0

22 9

I52

164

28 3

2 44

2 8 1

2 32

20 3

22 7

柑 3

一一 G O T

12 1

8 2

‖川

llS

99

79

9 6

99

l 18

109

10 8

96

ス タ チ ン

投与期間

9

ほ 月

投与期間

図1べスタチン投与例1（DuehennePMD6歳男子）
表4

5

図2

べスタチlJ投与例2（DuchennePMD9歳男子）

べスタチン投与時の捉力，立上がり時間，／1−テル指数の変化DuchennePMD

9歳男子

投与前1月後2月後3月後4月後5月後6月後7月後8月後9月後10月後11月後12月後
0
0
9

0
1

8

0
．
6
1
5
5

0
5
． 5
5
1

0
6

0
0
6

3
．
5
1

0
6

5
5

5
1

9
．
2
1

5

一

0
．
6
1

0
0
6

0
2

3

3
1

5
1

0
0
6

3

0

0
0
6

0

9

0

5
6

0
7

0
．
9

9
．
9

0
7

0
3

5
3

0
．
0
1

5
7

0
0
6

0
0
5

5
3

0
．
9

5
7

0
7

0
0
4

5
3

9
．
9

9
．
7

0
0
3

0
1

0
5
． 7
0
1

0
2

0
9

0
3

mg

0
0
6

0

ベスタチン

6

握力（右）kg
立上がり時間（秒）バーテル指数下しているがその後は漸増の傾向にあった．

量して12カ月間使用した（体重1kg当り3mg

2．9歳のDuchenne型筋ジストロフィー症のから30mg）．

男子．3歳頃に歩行異常に気付き，近医を受診す

血清CPKは4500単位からべスタチソ300mg／

るも診断不明，6歳頃某大学病院にてDuchenneday使用で2500単位に下駄型筋ジストロフィー症と診断．昭和59年1月にに椛患しベスタチソを中止すると再びCPKは上当院を受診，以後外来通院中である（図2，表4）．

昇した．その後べスタチソを増量（500〜600mg／

外来受診時は臨床的には登はん性起立を示し，day）によって再びCPKは低下した．べスタテ

階段を昇ることは非常に困難で，手摺りを使用しン使用開始後6カ月目に転倒し，右踵骨骨折のたてやって可能であった．

め自宅安静．その際1週間べスタチソ服用を中止

本患者にべスタチソ90mgから，3〜4週毎にその後患者が感冒した．この際CPKの上昇がみられ900mg／dayと増に増量L CPKは低下の傾向を示している．この量し，次いで600mgに減量，再び900mgに増CPKの低下は600mg／dayにしても著明な変化

300mg，400mg，500mg，600mg，900mg−102−

筋疾患に対するべスタチソの長期投与を中心にはみられない．LDH，GOT，GPTもほは同様の単位：uniLmg

変化を示している．
臨床的には，握力は最初30kg前後から12カ月
後には10kg前後に低下しており，床からの立ち
上がり時間も10秒前後から15秒前後に増加して
おり，BarthelIndexも75から55と低下しておりかなりの悪化が認められた．
3．3歳のDuchenne型筋ジストロフィー症．
本症例は昭和58年度に報告したpre−Clinicalな症例で，その後引続きべスタチソの投与を続け，現在までに24カ月を経過している．
べスタチソの使用量は最高1日量1500mg（100mg／kg）であったが現在は，1日量900mg（60mg／kg）を使用中である．
血清CPKはべスタテン使用前は10000単位以上であったが，べスタチン使用開始と共に低下の
12 月

14 月

一

ベ ス タ テ ン

0

90

3 00

6 00

9 00

12 0 0

9 00

15 00

150 0

60 0

3 00

9 00

ー

C P K

138 80

77 20

56 20

8 120

5 引 0

52 30

44 90

47 二
！
0

4 93 07 8引

13 1754 7 88

一

L D H

37 17

2 0 t）
8

2 112

3 15 1

2 904

2 174

22 94

16 50

2 60 22 74 425 92】9 9 8

一一 G O T

3 25

2 48

12 1

2 03

238

l l2

199

105

20 4

17 6

2 50

92

棺 与 前

傾向を示していた．この傾向はべスタチン投与量の減量または発熱などで再び増加し，その後再度増量でCPKは低下の傾向を示した．

図3

2 月

4 月

6 月

8 月

10 月

16 月

18 月

2 2 月

2 4 月

投与期間
べスタチソ投与例3（DuehennePMD2歳男子）

CPKは最初300mg（20mg／kg）で急激に下向ある（図3，表5）．

しその後1500mg（100mg／kg）までの増量ではBarthelIndexも65から現在は90と改善を示

非常に緩やかな下降を示し，1500mgから300mg

している．

にベスタテンを急に減量するとCPKは再び10000
単位以上となった．そこで900mg／day（60mg／

臨床的には，母親によると以前より活動が激しkg）に増量するとまたCPKは減少した．LDH，

くなり，おそいけれども走れるようになったと述GOT，GPTもほぼ同じ幌向であった．

べている．

床からの立ち上がり時間は，使用開始時には5秒前後から，現在は3秒前後と短縮している．い考案

わゆるGowers s Signは使用前陽性であったが，現在は時に手を膝にあてる位で余り Gowers s

今回の報告では臨床部会が行っているシングル

Signはみられない．母親の言葉でも手を使用せブラインドテストの症例については部会長の報告ずに立ち上がることがほとんどであるとのことでがあるので省略した．

表5

べスタチン投与時の立上がり時間，／；−テル指数の変化DuchennePMD

2歳男子

投与前2月後4月後6月後8月後10月後12月後14月後16月後18月後20月後22月後24月後
0
0
5
1

0
0
6

0
0
3

0
0
3

0
0
9

2
．
4

6
．
3

9
．
2

0
9

1
0
． 9
3

1
．
3

0
9

0
9

0
9

5
8

103

0 4 13
0
． 8
5
3
1

1
．
5

5
7

0
0
9

0
7

0
8

0
7

4
．
5

nV 8
0
．
6
4

0
0
9

6
．
4

︼5
6

0
0
2
1

0
0
3

O
．
5

4
．
5

へU
9

立上がり時間，秒
バーテル指数

4
5
5・6

mg

0

べスタテン

従来から行っている投与方法で長期間投与した改善がみられ，血清CPKなどの酵素の低下がみ症例については，前年度の報告と同様に肢体型筋られるが，これが薬剤の効果なのか，自然経過でジストロフィー症，顔面肩甲上腕型筋ジストロフ

あるのか，さらに長期間の使用とこのようなpre−

ィー症，筋強直性ジストロフィー症には効果は明Clinicalな症例の数を増やして統計学的な方法でらかではなかった．

効果を検定する必要がある．

多発性筋炎ではステロイドとの併用で，症状の多少の軽減が認められたが病気の進行はくいとめ

ま

と

め

られないようである．
Duchenne型進行性筋ジストロフィー症ではべスタチソ投与後，大多数の症例で，血清CPKの1・21例の筋疾患患者にべスタテンを2カ月から42カ月間投与しその結果について検討した．

下降がみられたが経過と共に上昇し，また減量または中止によりCPKの増加がみられた．この

CPKの経過と共に増加するのは薬剤の 慣れ の2・肢体型筋ジストロフィー症，顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー症，筋強直性ジストロフィー症には効果は認められなかった．

ためかも知れない．また歩行可能なDuchenne型

3．多発性筋炎では，臨床的にはステロイドの筋ジストロフィー症のうち5〜10歳の患者にベス節約作用が認められたが，進行は阻止し得なかっ

タチソを授与した場合CPKなどの酵素は低下のた．

傾向にあるが，臨床症状は長期間の使用では進行4・Duchenne型筋ジストPフィー症では，歩し，特に呼吸器感染症，骨折などで短期間の安静行可能者でも症状の進んでいるものは，ベスタチを取った場合には急速に悪化がみられるが，これソの投与でCPKは低下の傾向にあるにもかかわはDuchenne型進行性筋ジストロフィー症の自然らず，症状は進行してくるものが多かった．

経過によくみられる現象であり，この点からも従幼児およびpre−ClinicalなDuchenne型筋ジス

来のべスタチンの使用法では効果はみられないもトロフィー症は長期間使用でも，臨床的な悪化はのと思われる．

みられず，CPKも低下し，一見効果のあるよう

幼児やPre−ClinicalのDuchenne型進行性筋ジである．

ストロフィー症に使用した場合，一応臨床的にも−104−

5．特別な副作用はなかった．

DMD患者に対するべスタテン服用の臨床的検討について
三吉野
研究協力者

産治＊

陳

正貴＊・松金郁郎＊・板井義男＊・折口美弘＊

金子

薫＊・吉田祐三＊・守田和正＊・小国美昭＊

GOT，GPT，LDH，CPK，クレアチン，クレア
目

チニソを4週間ごとに，血清総蛋白，電解質，一

的

般検血，一般検尿を4週間おきに行った．血中濃度は4週，6週，8週目の朝服薬1時間後に採血

われわれは，10歳以下の入院中のDuchenne

した血清を用いて測定した．

型筋ジストロフィー症（DMD）患者6例に，べス
タチソを授与し，血中濃度，血液生化学所見，運運動機能評価として4週ごとに日常生活動作

動機能，ADLなどについて臨床的効果を検討し（ADL：整形外科的筋ジストロフィー症ADLテたので報告する．

スト，厚生省基準），10m往復走行時間，階段昇降時間，立ち上がり時間（立ち上がり動作をビデ
方オ記録し，再生画像で動作時間を3回測定し平均法

時間を求めた），握力，筋力を測定し指標とした・
対象はDMD患者6例，年齢は5歳から9歳

蓑2Stage（上田の分類）は1から4である（表1）．
べスタチソの投与量は20mg／kg／日（1000mg／日／
8W成人）を，7時，13時，21時の3回に分け服用

Bestatin PIacebo Bestatinする．投与法はSingle blind cross over法で，20mg／kg

交叉期間を8週間とする．つまり8週間べスタチ（Week）04

6820mg／kg12

ソを授与し，その後8週間はプラセポに変更し，再びべスタチソを8週間投与する（表2）．検査は
表1

No Name Sex

舞 StageDiagnosis 誓言‡tl F∴K．

M

9

2

S．U．

M

7

1

3

E．T．

M

7

2

4

M．M．

M

8

4

5

Y．K．

M

9

2

DMD

23．0〜24．5

6

MLH．

M

5

2

DMD

16．5′、18．5＊国立療養所西別府病院

2

DMD
DMD
DMD
DMD

19．5〜21．5
22．5〜23．O
18．0〜19．O
18．0〜20．O

16

20

24

副作用は皮膚症状，消化器症状などの一般状態をした．

チェックした．

血中濃度は，症例6の8週日の17．5ug／mJを除き，4．95±0．56から5．14±0．39ug／mJまでに結安定な状態を保っていた．CPKでは，1例はほと果んど変化しなかった．他の1例は4週目より低下

すべてのデータは平均値の標準偏差として表示したままであった．低下後再上昇ないし上昇後再

○−0

0PK

●−●

Serum bestatinlevel

CPK
（∪）

800
700
600
500
0
0
4

壬＼ト壬／ト壬／壬

0
0
3
0
0
2
0
0
1

．′／トトi
0

4

6

8

12

16

20

Week

20

Week

図1血清CPKと血中濃度の推移（Mean±S．E．）
LDH

0−O LDH

（∪／り

●−●

0

GOT

4

8

12

16

図2 血清酵素の推移（Mean±S．E．）−106−

DMD患者に対するベスタチソ服用の臨床的検討について

20

15

トトー／」＼圭

0

4

8

12

16

20

Week

図310m往復走行時問の推移（Mean±S．E．）

0

4

も

ほ

16

図4 階段昇降時間の推移（Mean±S．E．）
−107−

20

Week

低下は各2例であった．平均として，ベスタチソ

達遅延があり，ときに協力が得られにくく，症例投与前の675．83±103．92単位から8過日の4は途中で走行困難がすすんできて，測定値のば462．00±51．86単位と低下した．プラセボに変更

らつきが大きかったので，評価対象からはぷいた．

してから，12週目に一旦上昇し，16週目に再び10m往復走行時間は4週目を除き，投与前より低下したが，べスタチソ再投与後，20週馴子
620．00±110．68単位までの上昇が見られた（図増加した（図3）．階段昇降時間では，昇りは投

1）．血清GOT，GPT，LDHなどでは，有意的し，その後次第に増加した（図4）．握力では，8な変動はなかった（図2）．

週目より，左右ともにはは平行に変動し，全般と運動機能評価については，症例3ほ軽度知能発

与前より延長した．降りは4週目に明らかに低下

して軽度増強があった（図5）．立ち上がり時間

0−O Right
kg

●−・

Left

0

4

8

12

16

20

図5 握力の推移（Mean±S．E．）
0−O ADL．−●Supineto stand

図6 ADLと立ち上がり時間の推移（Mean±S．E．）
−108−

Week

DMD息名に対するベスタチソ服用の臨床的検討について

は4週目に若干短縮したが，以後延長する傾向に

昇憤向を示し，いわゆる反動現象が認められた．

あった．ビデオ器械故障のため16週目の1回は統計学的にCPKは有意差がなかったが，血中濃測定しなかった．ADLは，ほぼ不変が1例，そ度の上昇にしたがって，下降してきた．臨床効果のほか全例悪化であった．全体として，8週目まについては，10m往復走行，階段からの降り，握でやや改善があり，その後変動しながら低下して力，立ち上がり，ADLなどは一過性に運動機能いた（図6）．

の改善が見られる例があったが，全体として運動

その他の血液生化学，一般検血，一般検尿では，機能が悪化する傾向にあった．またADLに対し投与前に比べて異常変化はなかった．経過中，発て，CPK，投与期間，投与量を用いて重回帰分析

疹，嘔気などの副作用は認めなかった．

をした結果，CPKはADLに最も相関する変数であったが，5％の有意差は認められなかった．

まと今度の調査計画の終了は，3月中旬までの予定

めであり，今回は中間報告として発表する．
今回のべスタチソの使用では，血中濃度は3回しか測定しなかったが，前回，われわれの報告し最後に，血中濃度を測定していただきました大

たように，1日3回投与法でほぼ安定した血中濃度が得られた．ベスタチソ投与により，CPKが倉洋甫教授に深謝致します．

一時低下し，プラセボとべスタチソの再投与で上−109−

Dudlenne塑筋ジストロフィー症（DMP）に対する
べスタテンの使用経験−臨床的立場から−
福 山 幸 夫＊
研究協力者 大沢真木子＊・川井末加子＊・中田恵久子＊
鈴木陽子＊・平山義人＊・宍倉啓子＊

2）検
目

査

服用前と投与開始後4週間ごとに採血および1

的日採尿を行い，クレアチン・フォスフォカイネー

進行性筋ジストロフィー症に対するべスタチソス（CPK）などの血清酵素，血中・尿中のクレア
チン・クレアチニソ，尿中3−メチルヒスチジンのの治療効果を検討する．

測定を行った．
対象3）臨床評価東京女子医科大学小児科外来通院中のDuchen−

各運動機能所要時間（20m走行・階段昇降・起ne型進行性筋ジストロフィー症（以下DMP）12

立・起坐・寝返り）の測定および運動機能・筋力例（年齢2〜8歳）および非典型的な良性DMPの変化について問診および診察により評価した．

l名（12歳）である（表1）．2歳の新鮮例1例
を除き全例投薬開始時には歩行可能であった．
方結

果

今回は紙面の都合もあり，べスタチソ投与によ法

る運動機能と血清酵素の変動についてのみ記述す

1）投与方法る．また全期間の観察を終了しておらず中間報告

べスタチソ20mg／kg／日を8週間，次に偽薬をである．

8週間，その後再びべスタチソを8週間にわたり
1日3回に分けて投与するという single blind1）血清CPK値（図1）cross over法に従った．すでにベスタテンの投与

DMP新鮮例5例中4例では，投与開始後4週歴のある例では2週間以上休薬後に投与開始した．

の時点で著明に低下していた．1例では投与前値

本論文中の各症例の年齢はすべて今回のプロトコが比較検討に不十分な値しか得られておらず判断ールによる痩与開始時の年齢である．また偽薬投不能であった．使用経験を有する例では昨年報告

与後に家族が悪化を訴えてきた場合には，2〜4したように初回投与開始初期には低下を示したが，週間で真薬に戻して検討した．

今回の投与ではこの傾向は明確ではなく休薬・偽＊東京女子医科大学小児科学教室

薬投与・真薬投与によりそれぞれ不定の反応を示−111−

薬前と今回？投与開始前とで比較すると各運動所
要時間はほとんど無変化であった．運動機能につmU／mJ

いては，今回の投与開始後階段下降時の姿勢に改善（片手で手すりにつかまる⇒手の介助不要）がみられ，偽薬変更4週後には悪化した．また起立時間その他についても投与後軽度短縮したが，偽薬変更4週後には悪化し，特に起立所要時間が3秒延長した．偽薬は4遇のみにとどめ真薬に戻したところ，その4週後に起立・起坐時間の短縮が，8遇後に階段下降時の姿勢の改善がみられた．
C）症例DN

6歳4カ月

DMP（図3）

5歳2カ月より使用開始していた．本例では，休薬により運動枚能が悪化し，今回の投与開始後もさらに各運動の所要時間の延長および階段昇り
時の姿勢の悪化がみられていた．しかしながら偽薬変更後の各運動所要時間の延長は真薬投与中よ
休業前

投与前

4W

8W l2W

16W

20W

投与後期間

りも著明であり，また自力起立可能の状態から何か物につかまらなければ起立不能の状態へと悪化した．其薬に戻しても4遇後では依然として悪化

図1血清CPK値の変動

し続け，連続歩行可能距離が短縮したという訴えもあった．8週後には階段昇り時間・起立時間・した．

起坐時間の短縮をみ，また連続歩行可能距離も延長するというように改善を示した．

2）各症例における投与前後の臨床的変化
A．ベスタチン使用経験を有する例

d）症例SoS

休薬前・開始前・開始後・偽薬後の変化につき

症例2の兄．5歳5カ月より使用開始．本例で2歳3カ月

DMP（図4）は，休薬による運動機能悪化はなかった．運動機検討した．数例につき記述する．
a）症例SS

6歳7カ月

能では，偽薬後階段昇りの姿勢の悪化・起立時間

DMP

本例はPreClinicalstageである1歳2カ月よりの延長がみられ，真薬変更4週後に階段昇り時間

べスタテンの投与を開始，以後運動機能の生得がはさらに延長したが，8遇後にはいずれの運動所漸次得られ1歳11カ月より歩行開始した症例で要時間も短縮し，階段昇り時の姿勢の改善（片手ある．休薬により下肢が細くなったという訴えがてすり＋片手膝の状態⇒手の介助なし）を示した．

あったが，運動機能については偽薬に変更後も特e）症例NYに変化はなかった．

本例では，真薬投与中も階段昇りの姿勢が悪化b）症例SeS

4歳0カ月

7歳9カ月

DMP（図5）

してきた．偽薬変更2週間後に 急な悪化 を訴

DMP（図2）

歩行開始1歳6カ月．2歳10カ月より3歳3えて診察予定日より早く来院した．偽薬に変更後，カ月までベスタチソを投与したが，その後36週

それまで「かろうじて一人で下校していたのが下間休薬していた．休薬直後に運動機能は軽度低下

校途中で下肢痛のため歩行不能となり，他の人にしたl）が，休薬のままでもその後再び改善し，休背負われて帰宅した」というものであった．その−112−

Duchenne型筋ジストロフィー症（DMP）に対するべスタチソの使用経験

牽きN一

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Duchenne型6歳7か月ぺスタテン使用経験有

血清酵素

暇蚕
休業前

運動時所要時間5432−090076543210

投与前

4W後

Ib

lb

lb

8W後

12W後

】6W後

4b

4b

Jb

階段昇り

休薬前

投与前

4W後

bestatin Duchenne型7歳9か月

8W後

はW俊一′16W後

図4SoS，6歳7カ月
DMP偽薬後階段
昇り姿勢の悪化，真薬4週後では悪化し続けるも8遇
後には改善慣向を
示した．

20W後

ベスタテン使用経験有

28000
26000
24000

血 22000

芸20000

要言…gg…
値
12000
10000
8000
6000
4000
2800
0

休葉前

投与前

4W後

8W後

任用期間
−114−

IQW後

J6W後

20W後

★Withsupport

図5

NY，7歳
9カ月
DMP

I）uchenne型筋ジストロフィー症（DMP）に対するベスタチソの使用経験

使用 期間
図6

★with support

TA，8歳11カ月，DMP

後は母が自転車で送迎している．運動機能でみる

偽薬後の変化については未だ観察していないが，と，偽薬変更前には自力で起立可能であったのがべスタチソ投与開始後立位保持可嘩（支持要）状

偽薬変更後には物につかまらなければ起立できな態から起立（支持要）および歩行可能状態となり

くなり，所要時間も著明に延長していた．2遇で全経過を通じ運動機能の獲得・改善を示した．

真薬に変更した．真薬に変更4週後8週後と起b）症例YK

立・起坐時間は短縮傾向を示し改善を思わせたが，投与後改善，偽薬後悪化，・真薬再投与後改善を

階段昇り時間は4週後で延長8週後で短縮，走行示した．投与開始前の各運動按能所要時間の値が時問は4週後無変化8遇後延長した．

得られていないが，投与開始後にそれまで不能でf）症例TA

8歳11カ月DMP（図6）

5歳3カ月

DMP（図7）

あった縦8〜12cmの箱を飛び越えることが可能

休薬により運動横能の悪化がみられたが，今回となった．また母も日常動作に活発さが出てきたの投与開始後もさらに悪化し続け，階段昇り・起と喜んでいた．偽薬後4週では膝を屈曲してかろ

立時間はむしろ偽薬変更により短縮，真薬変更後

うじて8cmの箱を飛び越えることは可能であっ起立不能となった．階段下り・起座時間は偽薬変たが，12cmの方は不能であり，母も日常動作に更により延長，真薬変更4週後に軽度改善幌向を活発さがなくなったと訴えた．真薬再投与後4週示している．全体としては進行している．

で再び箱を飛び越えることが可能となった．各運

B．新 鮮 例

動機能所要時間にはほとんど無変化であった．

2例のみ偽薬投与まで観察し得た．

C）症例TNa）症例NA

投与開始後も軽度悪化していたが，偽薬後明ら

2歳4カ月

DMP
−115−

7歳11カ月DMP（図8）

bestatin Duchenne型5歳3か月ぺスタテン使用経験無CPK GOT Alb

lumP8cm−
12cm TMo伽r＋shpress10∩

＋

±

＋
†

†

1

＋
＋

＋
＋

†

†

図7 YK，5歳3カ月，DMP，箱を飛び越えることが可能となった症例．

かな悪化を示した．家人からの訴えがなかったのは真薬に変更4週間後改善を示したが8週間後にで偽薬を8週間継続したが，4週後・8遇後共には悪化を示した）．

悪化傾向を示していた．

C．起立所要時間
休薬による悪化が2例，改善が3例，無変化1

3）各運動所要時間の検討（図9〜12）

例．

A．起坐所要時間

偽薬投与4週間後に延長を示したのが5例（其休薬による悪化が2例，改善が1例，無変化2
例．

薬に変更後改善4例，1例は未観察），短縮したのが1例（真薬に変更後不能となる．本例は所要

偽薬投与4週間後に延長を示したのが5例（この中英薬に変更後改善を示した例が4例，1例は時間が長すぎるため図11には記入されていない），
無変化2例，判定不能1例であった．

未観察），短縮したのが3例（この中英薬に変更

D．階段昇り時間

後もさらに短縮したのが2例，悪化したのが1例），

休薬による悪化が1例，改善が3例．

無変化1例であった．

偽薬投与4週間後に延長を示したのが3例（真B．20m走行に要する時間

薬に変更後改善2例，1例は未観察），無変化4

休薬による悪化が4例，改善が1例．

例（真薬に変更後改善1例，無変化2例，悪化1

偽薬投与4週間後に延長を示したのが1例（真例）．

薬に変更後改善），ほとんど無変化7例（中1例
一二116−

以上まとめてみると起坐所要時間については起

Duchenne型筋ジストPフィー症（DMP）に対するベスタチソの使用経験
Duchenne型7歳ILか月ベスタテン任用経験無；O T A IU・；P T （K U ）
0
O
O
6

180

0
nU O
nU
nU
O
O
︷U
O
4
つ ⊥

血清酵素値

▲
士
′
日

168

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20

k
mg

g
…
当
や0 丁
G PT

14g
120
100

0

80
60

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‥●
●
←
←
●
●‥●
●
一
●
●●
■
一●
●

40
20
0
少

投与前

4W 後

20 †

5b

5b

投与前

4W後

8W 後

ZW 後

6b

6 b＝
＿
−
＿

8W後

6W 後
卓b

12W

投与後期間

図8

TN，7歳11カ月，DMP

単位：秒て再び悪化した例が1例（8歳），全経過ほとん

10

ど無変化の例が1例（良性DMP12歳），投与期

9

所
要

8

間が短く判定不能が3例，幼君のため運動揆能判7

定不能が1例であった．

6

時・与
間

4）使用経験を有する例の休薬前と新鮮例の投4

与前の運動機能の比較（表1）3

IK例は良性DMPなので比較は不適当としても，年齢を合致させてみて使用経験の有る例の方
休薬前儲が良好という傾向は無かった．
4

8

12

16

20

ぺスタテン投与後期間（週）考図9 ベスタチソ20mg／kg／日使用例における起座
所要時間の変化．
坐動作が容易と思われる例では真薬・偽薬に関係なく改善した．

案

べスタチソは，アミノペプチダーゼBおよびロ
イシンアミノペプチダーゼの活性を括抗阻害する

その他の機能を全体的にみると，偽薬投与後に作用をもつと同時に，細胞表面に結合する．この悪化し真薬に変更後改善を示した例が4名，真薬結果に基づいて免疫増強剤として開発されている．

投与中から悪化し偽薬投与にて改善，真薬に戻し筋ジストロフィーマウスおよびニワトリの筋肉内

−117−

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Duchenne型筋ジストロフィー症（DMP）に対するベスタチソの使用経験表1対象症例一覧，およびべスタチソ使用経験を有する例の休薬前と新鮮例の投与前の各運動機能所要時間（秒）比較

TN

7YllM†l】l

15b

24．914blO．8】

NY

7Y8Ml

＋

】

2

1

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1
8．7】

8．2【

12．71

3．1

12．11

17．31

2．4

9．31

14．2】

3．3

†fresh case 階段昇降姿勢1．手の介助なし 2．手の膝おさえ 3．片手手すり
4．片手手すり＋手の膝おさえ 5． 両手手すり 6．四つんばい

a一段ずつ片足交互
b一段ずつ両足揃えのアミノべプチダーゼ活性が正常群に比して異常例が真薬により改善を示すあるいはほとんど悪化に上昇していることが明らかになったことから，しないとすれば，偽薬4遇後の悪化は単なるリバ本剤が筋ジストロフィー症の治療薬として使用さウンドではないと言えると思われる．

れるようになった2）．また，ジストロフィーマウ

今回の治験中ベスタチン投与に関係なく悪化し，スの実験では，血清酵素の減少，体重増加，およ

むしろ時には偽薬中の方が良い状態を示すこともび金網よじ登り実験により筋力回復が報告されてあった症例TAは，過去の投与時には，各運動機いる．この場合，発症初期に投与開始することが能所要時間の改善を示したことや，学校の担任教歪要であるという3）．

師から改善の印象を報告されたこともあった症例

今回のわれわれの経験では偽薬投与後に悪化・である1）．また今回新鮮例のYKはべスタチン投其薬による改善を示したのは，偽薬投与後に悪化

与後よりを示しても実業後の改善を示さない症例よりも機とが可能となっており，それが偽薬の時には不能

能が良好な症例であった．このことからも，よりとなり再び真薬で改善している．また一方，血清進行した症例に投与するよりも軽症例に授与する

CPK値も初回投与の初期には低下がみられる．

方が効果が出る可能性があると思われた．また，動物実験では初期効果ということが言われている

この場合真薬変更後4週ではさらに悪化しても8が，我々の経験でも初回投与時の反応の方が良い

週で改善する症例があった．このことから，一時ように思われ，べスタチソを長期に投与すると生的なリバウンドがありその後は自然に改善する可体の反応が変化する可能性も存在すると考えられる．

能性も考えられるが，症例NTでは偽薬後4週，
8遇ともに悪化が著明となっており，今後この症ー119−

高さ8cm，12cmの箱を飛び越えるこ偽薬4週後明らかな悪化を示し8週でもさらに悪まと化し続けた．

め

4．使用経験の有る例の休薬前と新鮮例の投与

1．ベスタチソをDMP12例（新鮮例5例，使前の運動枚能を比較したが，年齢を合致させてみ

用経験有7名），良性DMPl例にSingle blindて使用経験の有る例の方が良好という傾向は無か

CrOSS OVer methodにて授与した．

った．

2．血清CPK値はDMP新鮮例5例中4例で以上ベスタチソ投与により一時的な改善を示す

は，投与開始後4過の時点で全例低下していた．

例はみられたが，著明な臨床効果の認められた例

使用経験を有する例ではこの傾向は明確ではなはなかった．機能低下の急速に進む6〜7歳例では，

かった．

休薬および偽薬に変更後の悪化が服薬中よりも目

3．運動横能の変化は以下のごとくであった．

立つ印象を受けた．またやや軽症の例では偽薬て

1）preclinicalstageと思われる2歳の2例で悪化しても真薬投与後4週または8週で軽度改善

は，使用経験を有する例も新鮮例も共に投与開始傾向がみられた．しかしながら，使用経験の有る後の運動枚能は上昇していた．

例の休薬前と新鮮例の投与前の運動機能を比較し，

2） 4歳以上の使用経験有の例では，休薬前・

年齢を合致させてみた場合使用経験の有る例の方

開始前・開始後・偽薬後の変化につき検討した．

が良好という傾向は無く，現在のところ本剤の治a） 3例では休薬後悪化し，投与開始後もさら療効果については結論できない．

に悪化，偽薬後著明な悪化があったが，1例（DN：
6歳4カ月）では真薬再投与後軽度改善，1例（YN：7歳8カ月）では其薬再投与後4遇で改善
8週で再び悪化，他の1例（TA：8歳11カ月）
では4遇も8週もさらに悪化した．
b）

3例（SeS：4歳0カ月，SoS：6歳5カ

月，TK：7歳4カ月）では休薬の変化は明確でなかったが，偽薬後悪化があり，真薬再投与後軽度改善していた．
いずれの症例も全体の機能はa）の3例よりも良好であった．
3）新鮮例では，2例のみ偽薬投与まで観察し得た．
a） 5歳の1例は投与後改善，偽薬後悪化，真薬再投与後改善を示した．
b） 7歳の1例は投与後も軽度悪化していたが，

−120−

文

献

1）福山幸夫，大沢真木子，宍倉啓子，鈴木鳴子，陶山亜理子，森本武彦．進行性筋ジストロフィー症に対するベスタチンの任用経駅．厚生省新薬開発
研究費．微生物の二次代謝産物に由来する難病治
療薬（ロイペプチン）の開発研究（梅沢班）．昭
和58年度研究報告書，pp．101−114．
2）梅沢浜夫，微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイべプチン）の開発研究．厚生省新薬開発研究費．微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプチソ）の開発研究（梅沢班）．
昭和55年度研究報告書，昭和56年3日．pp．3−
14．

3）松下 宏，辻 繁勝．筋ジストロフィーマウスにみられる種々な酵素活性変動に対するロイべプチ
ソおよびべスタチン投与の影響，同上，pp．55−61．
4）松下 宏，辻 繁膠．ハムスター筋ジストロフィー症に対するロイペプチンおよびべスタチン投与の影響．厚生省新薬開発研究費，徴生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイべプチン）の開発研究（梅沢班）・昭和56年度研究報告書，pp．
51−56．

血清CPKの変動に対するべスタテンの効果

木 下 英 男＊
研究協力者

山田信興＊・李延植＊

馬場繁二＊・川 村 力＊

経

これまでのわれわれの経験および諸家の報告か

過表

らみて，べスタチソ投与が筋ジストロフィー症患

38歳者の血清CPKに影響を及ぼしている可能性が考1）Becker型筋ジストロフィー症

2）入院時えられる1・2）．しかし，血活CPKは種々の要素で変動することもたしかであり，べスタチソの影響を一概に疾患そのものに対する効果と断定するこ（握力右11kg
左 9kg
lOm歩行11．8秒
階段昇り14．2秒

べスタチソ投与により，自他覚的に有意な変化はなかった．
3）12／14〜1／8までnasalpolypの手術後ベット上とも不可能である．
われわれは今回，同一症例について長期間頻回安静となった．
ベット上安静の問リハビリテーションは禁止し，
トイレ歩行のみ可とした．
4）べスタチソ投与により 360mg／日で若干血清
CPKの低下を示したが，600mg／日では変化な
く，その後の360mg／日投与でも，有意な変化は認めなかった．

に血清CPKを測定し，治療の効果を検討することによりこの問題に何らかの示唆を得ようと試みた．また，運動負荷が血清CPKに大きな影響を及ぼすことも知られており3〜7），これとべスタチソ投与との関係についても検討し，べスタチソ効果の枝序を解明する手がかりを得ようと考えた．
以下がその成績とあらましであり，これに若干の量にし，40

考察を加えた．

日間にそれぞれ32回，27回の血清CPKを測定し，投与によ卑効果を検討した・この間，運動はリハビリテーションのための運動療方法を含め日常の入院生活を行った．以下，安静時

法

以外同様である．
1．同一症例での長期検討

2）360mg／日，600mg／日と漸増法による血清

38歳，Becker型筋ジストロフィー症患者におCPKの変化について検討を行った．

いて，長期にわたって頻回に血清CPKを測定し，

3）トイレ歩行以外は運動療法を中止し，ベッ

べスタチソ投与による効果を統計的に検討を行っ

ト上安静にて 600mg／日投与とplaceboとの比た．また，投与方法の違いおよびベット上安静の較をし，さらに，同様の方法で通常の入院生活で有無により血清CPKがどのように変動するかをの血清CPKの変化を比較検討した．
4）600mg／日，360mg／日と漸減法によって血種々の方法で検討した．
1）べスタチソ投与前および180mg／日を維持

清CPKがどのように変動するかを検討した．

＊東邦大学医学部第4内科−121−

2．運動の影響

d）安静時ベスタチソ600mg／日を1週間服用

1）健康成人2名に，トレッドミルを使用して後の血清CPKを比較検討した．

Bruce法換算6〜8Mets相当の運動負荷を行った．
a）血清CPKおよびその分画を各々，運動前，成績

運動後1，12，24，48，72時間に測定した．
b）べスタチソ600mg／日を1週間服用後に同1・1）ベスタチソ投与前と180mg／日投与後の程度の運動負荷をかけ，a）と同様に血清CPK

血清CPKはそれぞれ595．9±130．1（SD）mU／を測定した．

mJ（以下省略）641．0±154．2（SD）と有意差

2）健康成人5名に，野球一試合前後におけるは認めなかった（図1）．

血清CPKの変動を観察した．一試合中ポジショ2）漸増法による血清CPKの変動は，360

ンは変えず，ピッチャー，キャッチャー，セカン

mg／日投与で523．0±67．9（SD）と若干の低下

ド，ショート，サードの5名に各々，試合前，試を示したが，その後600mg／日投与では上昇を合後6，24時間後に血清CPKを測定した．

示した（図1）．

3）運動選手（ラグビー部員）7名に6〜8Mets

3）安静による効果では，600mg／日投与お相当の運動負荷をかけた．原則として運動負荷前よびplacebo投与での血清CPKは，おのおに最低5日間はラグビーを禁止した．

の226．3±26．0（SD），349．2±96．2（SD）とa）運動負荷前と運動負荷後24時間の血清
CPKを測定した．

低下を示した．しかし，その後，安静解除により血清CPKは上昇した（図1）．

b）べスタチソ600mg／日を1週間服用後にa）と同様の検討を行った．

4）安静解除後，placebo，600mg／日，360
mg／日の順に投与を行ったが，血清CPKは，

C）運動負荷後の血清CPK上昇値がべスタチ
ン服用の有無での影響を比較検討した．

placebo投与で455．7±63．8（SD）に比べ，600mg／日 投与では546．5±88．9（SD），360

図1Becker型筋ジストロフィー症患者における血清CPKの変化−122−

血清CPKの変動に対するべスタチンの効果

表l Becker塑筋ジストロフィー症患者における血清CPK

安 静（−）

非投与

投 与570，8＋138．8

623．0＋181．9（乃＝39）

安 静（＋）

349．2±

96．2＊

ぺスタテン服用前〇一一一一〇

べスタテン600mg／日／週日艮用後ここ（舛＝51）
226．3二と

（乃＝5）

26．0＊

（乃＝4）

＊♪＜0．05ぺスタテン月昆用前

0−…一〇

ベスタテン600mg／日／週服用後

こ．＝

CPKlU

0
5
2
0
nU
2

前 I t2

24

48

72

96時間

0
5
・−

図3 健康成人（2）：トレッドミル負荷後の血清
CPKの変動表2

野球試合による血清CPKの変動

試合前

9
4
3
1
5
4
5
8
0
3

1
0
2

0
2
2

3
7

3
0
2

96時間

9
9

72

2
4
4

48

8
1
3

24

5 3 La
5
6
3

ほ

1
2
1

l

24時間後

6
6

前

（∋投 手
④三塁手
㊥遊撃手
④捕
手
（9二塁手

6時間後

図2 健康成人（1）：トレッドミル負荷後の血清
CPKの変動Normal：10−80IU

mg／日投与では666・7±143・6（SD）と上昇をCPKを各ポジションごとに測定した結果，血示した（図1）．

清CPKは全員上昇し，試合後24時間には試2．1）−a）健康成人声名に運動負荷をかけ，運合前の3．5倍〜20．4倍と上昇を認めた（表2，

動前，運動後1，12，24，48，72，96時間に測図4）．

定した血清CPKの変化は，運動後24時間に

3）a）b）べスタチソ月昆用，非服用時ともに，ピークを示した（図2，図3）．

運動負荷後血清CPKは有意に上昇を示した

b）a）の2名にべスタチソ600mg／日，1週（図5）．

間投与後にも運動負荷後24時間に血清CPKはC）べスタチソ非服用時血清CPK上昇値のピークを示したが，2名ともべスタチソ服用前

平均は，51．0±5．68（SE）であり，べスタチと比べて血清CPKは低い傾向にあった（図2，

ソ服用時では，28．6±4．20（SE）であった．

図3）．

べスタチソ服用時には非服用時に比べ，♪＜

2）健康成人5名に野球一試合前後の血清−123−

0．025で運動負荷後の血清CPKの上昇を抑制

PKル403020−
00090807
06050403020川C

試合後24時間

ぺスタテン非服用時

ベスタテン月艮用時

運動前

運動前

運動後

運動後

K

D

0

0

0

0

図5 ラグビー部員における運動前後の血清CPKの変動およびベスタチン投与による影響
ることが知られており，今回われわれも健康成人においてトレッドミル負荷，野球試合，ラグビー

図4 野球試合による血清CPKの変動のトレーニングにより血清CPKが上昇することした（衰3）．

を確認し，そのピークは筋肉痛を認める時期とはd）安静時血清CPKは，べスタチソ月艮用にぼ相関して運動負荷後24時間であった．

よる影響ほうけなかった（表4）．

また，筋疾患患者において，ベスタチソが血清CPKを低下させる報告もあり，今回われわれは，

考

接39歳のBecker型筋ジストロフィー症患者に種々のベスタチン投与法および安静の有無による血

従来より血活CPKは，運動負荷により上昇す

清CPKの変動をみたが，前述のごとくべスタチ

表3 ラグビー部員における運動前後の血清CPKの変動およびべスタチソ投与による影響
べスタチソ非服用時のCPK

8
2

9
6

9
1

8
4

2
2

5
7

2
5

1

0
5
1

べスタチソ服用時 運動前77．0±13．8（S．E．）

ベスタチン非服用時 運動後
265．0±36．1（S．E．）

ベスタチン月艮用時 運動後
106．0土17．4（S．E．）
−124−

1
3

ベスタチン非服用時 運動前
213．0±65．2（S．E．）

2
2

0
6
0
7
1− 1

Normal：10−80IU

6
2

2
2

5
4

2
4

8
7

0
5

4
7
1

6
9

9
4

5
9
1

1

0
6
5 ・4

4
9
1

3
2

8
3
6

CPK上昇値

6
2

7
4

4
5
1

運動後

0
5

3
8

9
7
1

運動前
2
2
1

1
2
3

2
3
1

7

5
4
1

6

5
4
1

5

2
9
5

4

4
0
1

3

CPK上昇値

2
3
1

2

運動後

8
3
2

1

運動前

べスタチソ月艮用時のCPK

血清CPKの変動に対するべスタチソの効果

表4 安静時におけるペスタチソの影響：ラグビー部員

作用には，疾患そのものに対する効果の他に，非特異的な膜安定作用も関与している可能性が示唆

べスタチソ服用前 600mg／日／遇服用後
9
5

2
2
1

2

1
0
1

0
5

1

1
7

4

1
9

5

8
2
1
9
6

6

6
3
6
8
2
2
9
7
1

3

結

語

1．べスタチソの筋ジストロフィー症患者の血

5
4

3
4

7

清CPKに与える影響について検討し，運動負荷による影響と比較した．

Normal：10−80IU
服用前80．0±11．0（S．E．）

される．

2．べスタチソは，運動負荷後上昇する血清

服用後77．0±15．0（S．E・）

CPKに対して抑制的な作用を有する．

ソ600mg／日投与時ばかりでなくplacebo投与時参においてもベット上安静で血清CPKが有意に低下し（表1），安静解除後べスタチソ600mg／日を授与しているにもかかわらず，血清CPKは上昇を示した．このことからも，血清CPKの変動には安静の有無が大きな要素を有していることがわかった．
今後，べスタチソ投与による影響を判定するに

次に，運動による血清CPKの上昇にべスタチ
ソがどのような影響を及ぼすかという点に関して
は，ラグビー部員のトレーニングの結果からも明らかなとうり，べスタチソにより運動後の血清文

献1）村上慶郎他．2，3の筋萎縮症患者に対するベス
タチソの効果．厚生省，微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬の開発研究（梅沢班）稚告各
昭和59年3月．p．89．
2）里吉栄二郎．筋ジストロフィーを中心とする各種筋疾患に対するべスタチソ投与後の経過報告．厚生省，梅沢班報告書，昭和59年3月．p．131．
3）Remmers，A．R．＆Roljot，M．Ⅴ．Serum tran−
saminaselevels effect of strenuous and pr0−
10nged physical exercise on healthy young

あたって，血清CPKを指標とする場合には，運動量も検討しなければならないと思われる・

考

subjects．J．A．MA．，21，968（1963）．
4）Schlang，H．A．＆Rirkpatrick，C．A，Theeffectof physicalexercise on serum tranSaminase．
A椚gr．J．〃gd．gcf．，242，338（1961）．

5）山崎芳徳他．長距離走老における血清CPK値の検討．月内会誌，64，1303（1975）．
6）大村一郎，小泊好事他，運動選手と血清CPK値，医療．31，37（1977）．

CPK上昇は抑制される傾向にあった．この機序に関しては末だ明確な解答は得られていないが，可能性の1つとしては，筋線維膜の安定化が考えられる．すなわち，べスタチソの血清CPK低下−125−7）Siegel，A．J．＆Silverman，LM・，et al．ElevatedskeletalmusclecreatinekinaseMBisocnzymc
levelsin marathon runners．J．A．MA．，250，
2385（1983）．

Dudlenne塑筋ジストロフィー患者に対する
べスタテンの影響−新しV＞筋障害のmarkerを用いて−
祖父江

逸郎＊

研究協力者 陸 重雄＊＊・杢野謙次＊＊＊・印東利勝＊＊＊・加藤兼房＊＊＊＊等またはそれ以上の優れたマーカーとなり得る酵はじ

め

素の存在が報じられている1〜3）．当教室でもこれにらの酵素を測定し血清CK活性値と比較検討した

進行性筋ジストロフィー（以下PMD と略す）

結果，極めて有用性の高いことがわかってきたの患者に対する蛋白分解酵素阻害剤の効果に関してで，薬効判定に利用することを考え，muSCle

は多大な注目を集めながらも明確な結論が得られspecific enolase（以下MSE）について昨年本班ないまま今日にいたっている．これまでの経験を

班会議で発表した．本年はさらにCarbonic anhy−

通じ，薬効を検討するうえで重要な問題がいくつ

draseIII（以下CA−ⅠⅠⅠと略す）も加え，これらか存在することを指摘したい．第1にPMD患者

酵素に対するべスタチソの影響をみた．

に薬剤の投与を開始する時期，投与量・方法など

ここではまずCA−ⅠⅠⅠのPMD患者における特もっぱら治療方法に関する問題，第2として評価徴を紹介し，ついでべスタチソ投与によって血清方法をどうするかという問題である．前者につい

CK活性値，MSE，CA−IIIなどの値がどのよう￣ては，発症早期に大量投与するという方向が本班な影響を受けるか報告する．

で示されており，当面大きな障害はないようであ対象 と 方法

る．後者に関しては血清CK活性値などの検査所
見と実際の運動機能との二者があげられるが，血清CK活性値などの酵素は変動が大きく，運動機

1．PMD患者における血清CA−ⅠⅠI

能は発達の影響があり，また鋭敏でないなどいず

PMD患者143例（Duchenne型104例，肢帯れも問題をかかえている．われわれはこのような

型19例，顔面肩甲上腕型11例，先天型9例），

短所を了解したうえで，より鋭敏であると思われ

年齢4〜61歳（平均20．1±11・7歳），男129例，

る血活酵素の評価を中心にして薬剤の影響をみて

女14例を対象として，EIA法によって血清CA−

きた．

IIIを測定した．同じ検体を用いCK活性値，MSE

最近，骨格筋障害の指標として，従来最も信煩を測定し，CA−ⅠⅠⅠと比較検討した・対照として性が高いとされてきた血清CK活性値のほかに同性と年齢をマッチさせた54名の正常人または非＊国立療養所中部病院＊＊名古屋大学医学部神経内科．現在藤田学園保健衛生大学医学部神経内科＊＊＊名古屋大学医学部神経内科＊＊＊＊愛知県心身障害者コロニー生化学部門

神経筋疾患々者（年齢5〜55歳，平均20・4±12・3
歳，男49例，女5例）について同様にCA一ⅠⅠⅠを
測定した．

−127−

2．Duchemme型PMD患者に対するベスタチ

表1進行性筋ジストロフィー（PMD）患者の血清
CA一ⅠⅠⅠ値

ン投与の影響対象は10例のDuchenne型PMD患者で年齢

CA−ⅠⅠⅠ（ng／mJ）

Diagnosis No．
Range Mean±SD

5〜14歳，全例歩行可能であり，このうち6例は階段昇降も可能．べスタチソは，カプセルまたは
ドライシロップ剤を用い体重1kgあたり20mg

ControIs

54

2．1〜24．8

Duchenne type lO4

13．0〜1250

LG

19

を1日3回毎食後に分服させた．8週間連続投与

FSH l1

し，その後さらに8週間placeboを同量single

Congenita1

blind法で授与し，合計16週間観察した．

9．2〜333

13．5〜58．899．9±5．3243±228＊

83．1±80．0＊
26．1±14．2＊

43．5〜310

171±105・＊P＜0．001

評価項目として，血清CK，MSE，CA」IIの均±SD，以下同様），肢帯型9．2〜333（83．1±

ほか，当班臨床分科会で決められた一般血液生化80・0）ng／mJ，顔面肩甲上腕型13．5〜58．8（26．1

学・末梢血・尿，運動機能に関する諸種目を採用，±14・2）ng／mJ，先天型43．5〜310（171±105）

血清CK，MSE，CA−ⅠⅠⅠについては二週間に一

ng／mJ，であるのに対し，対照群では2．1〜24．8

度，その他の項目については4週間に一度評価し（9・9±5・3）ng／mJであった（表1）．

た．血液の採取は，筋運動による各酵素の変動をさけるために早朝覚醒時とした．

2）PMD患者の血清CA−IIIとCK，MSEとの相関を調べた．CA−ⅠIIとCKの相関係数は
r＝0・8471（P＜0．001），同様にCA−ⅠIIとMSE

結果ではr＝0・7818（♪＜0・001）といずれも高い相関を示した（図1，2）．

1．P鳳ID患者における血清CA−ⅠⅠI

3）PMD患者の病型別に血清CK，MSE，l）PMD患者の血清CAJIIの値は，Duche−

CA−IIIの異常値の出現率をみた（表2）．CA−ⅠⅠⅠ

nne型13・0〜1250ng／ml（243±228ng／ml，平

はCK，MSEに比べ異常値の出現率が同等また三重 ≡く0

川0

柑00

5000

回l PMD患者の血清CK活性値とCA−III値の相関．
−128−

cKlU／L7000

Duchenne型筋ジストロフィー患者に対するベスタチソの影響

盲＼ぎ ≡40300

200

MSE ngノmJ

図2
表2

PMD患者の血清MSE値とCA−ⅠⅠⅠ値の相関．

終了時の第8週に比べ有意に高かった（♪＜0．01）．

PMD患者の病型別にみた血清CK，MSE，
CA−ⅠⅠⅠの異常値出現頻度．

しかしその後は再び下降した（図3）．

No．（％）with elevated serum
CA−ⅠII

CK

下降傾向を示さず，ほぼ横ばい状態であったが，

MSE
︶
︑ − ．

8
5

︶

9

0
0
1

︶

9

0
0
1

placeboに変更してから上昇し，4週目（通算第12週）で最高値（189±116ng／mJ）に達し，べス
クチソ投与第8週目の債（122±84ng／mわに比べ

︶

︵

︶

． ′ ＼

． ′ l ＼

2

8
1

︵

3

7
2

ヽ 一 ノ

′ ■ ＼

1
1

︵

︵

︶

9

0
0
1

％％％％

︵

2
9

ヽ ■ ′

4
7

6
9

4
1

︶

′ ■ ＼

％％％％

7
9

︶

／ ■ ＼

1
0
1

7

4
6

︵

︶

9
7

9

Congenital

％％％％

7
9

5
1

FSH

︵

1
0
1

1
1

9
1

LG

4
0
1

Duchenneb）血清MSE値：べスタチソ投与により特にlevels ofType No．

有意に高かった（ク＜0．01）．その後はCK活性値は高頻度であったが，有意に高率というわけでは同様下降した（図3）．
C）血清CA−ⅠⅠⅠ値：MSE同様，べスタチソ

なかった．

投与による有意な下降はみられなかった．しかし
2．DllCIlemne型PMD患者に対するベスタテ

placeboに変更後は前2者同様上昇し，第4週目（通算第12遇）の値（509±207ng／mわはベスタ

ン投与の影響1）血清CK活性値，nISE値，CA−ⅠⅠⅠ値のチソ終了時の第8遇の値（295±119ng／mJ）よりも有意に高かった（♪＜0．05）・その後は前2老同変化a）血清CK活性値：ベスタチソ投与により次様下降した（図4）．

第に下降傾向をとり，第6遇（3278±1856IU／L）

以上の血清酵素の変化に対応させ，各例の運動では投与前（4004±1863IU／L）に比べ有意に低値機能をみると，べスタチソ投与により明らかな改を示した（♪＜0．01）が，最終の第8週（3291±

善が得られた例はなかった．全体的に悪化したも1845IU／L）では有意な低下を示さなかった．

の3例，部分的悪化2例，ほぼ不変5例であった．

Placeboにしてから4週間目（通算第12週）でd）機能障害の特に軽い6例の検討：臨床症状

CK活性値は上昇（4430±1893IU／L），べスタチソが軽い患者の方がべスタチソの効果が得られやす

ー129−

B

2

4

6

8

10

12

川

16（W）
●♪＜0．01

図3

ベスタチソおよびplacebo投与による血清CK活性値とMSE倍の推移．

B

2

4

6

8

10

12

14

柑（W）

●♪＜0．Ol・・♪＜0．05

図4 ベスタチンおよびplacebo投与による血清CK活性値とCA−III値の推移
いであろうとの仮定に立って，10例の中から階段は全例で検討した時同様いずれの酵素も有意に高昇降の可能な6例を選び出し，同様の検討を行っい値を示した．すなわち血清CK活性値は，第8た．べスタチソを投与した8週間では，3種類の週4058±1930IU／L，第12週5518±1474IU／Lといずれの酵素とも有意な変化を示さなかった．し後者で高値（ク＜0．05），同様にMSE値は，各々かし，Placeboに変更後4週目（通算12週）で143±96ng／ml，−130−

243±115ng／ml（P＜0．01），

Duchenne型筋ジストロフィー患者に対するべスタチソの影響

8

2

4

6

8

10

12

14

Ⅰ6（W）

・♪＜0．05：‥せく0．Ol

図5（a）

8

2

4

6

8

川

12

川

■♪＜0．05

柑（W）●●♪＜0．02

図5（b）
図5 階段昇降の可能な6例の患者でみられた各酵素の推移．
a‥CKとMSE，b：CKとCA−ⅠⅠⅠ．

ー131−

〇一・一MSE●一一」■CK
X一一一X CAIll

Bestatin

pJaceb。

図6 5歳，男児でみられた各酵素の推移．

CA−III値は312±143ng／ml，500±154ng／ml

特記すべき副作用は認められなかった．

（ク＜0．02）であった（図5a，b）．
最後に今回の対象中点も症状の軽かった5歳の考

察

患者の経過を示す．血清CK活性値はベスタテン
投与開始後2週間でいったん著しい高値を示し，近年，Carbonic anhydraseにはⅠ，Il，Ⅲ型の以後は投与前値よりやや高いまま横ばい，placebo

アイソザイムが存在し，そのひとつであるⅢ型

変更後いったん下降しその後上昇をつづけ第16（CA−ⅠⅠⅠ）は骨格筋に多く存在することが明らか

週で下降するという経過をとった．血清MSE値にされた4・5）．このCA−ⅠⅠⅠの大きな特徴として，は上昇下降を示しながらもほぼ拭はいの状態であCKやMSEと異なり心筋には微量しか存在しなった．血清CA−ⅠⅠⅠ値は，投薬後4週目まで上昇，

いこと，MSEが主に骨格筋のtypeII線経に存その後第10週目まで下降傾向を示したが，べス

在するのに対し，CA−ⅠⅠⅠは主にtypeI線経に局

タチソ終了時の第8週目でも投与前値とほぼ同様

在する，という2つの点があげられる巨6）．最近であった（図6）．この間患者の運動践能は明ら

各種神経筋疾患患者の血清CA一ⅠⅠⅠが測定され，かな改善も悪化も示さず，ほぼ不変と判定された．

本酵素が血清CK活性値に相当するまたはそれ以上の鋭敏さをもつ筋障害の指標となり得るとの報

2）副 作 用告がある2，3）．今回，われわれがPMD患者を対べスタチンの剤形はカプセル，ドライシ′Pップ

象としてCK，MSEと比較した結果では，CA−IIIの2種煩を用いたが，いずれでも食欲不振・胃部は異常値の出現率ではCK，MSEと大体同程度

不快感などの胃腸障害をはじめ，特記すべき副作であり，これら酵素との相関も高く，骨格筋障害

用は自覚的にも他覚的にも認められなかった．

の指標として極めて有用性が高いと考えられた．

また一般血液生化学，末梢血，尿の諸検査でも，−132−次に，べスタチソ投与による各酵素の動きをみDuchennC型筋ジストPフィー患者に対するベスタチソの影響

ると，血清CK活性値は次第に下降傾向をとり，第6週のみであるが有意な低下を示し，さらに，

ま

と

め

placeboに変更後再上昇するという一見リバウンドが生じたとも解釈される経過をとった．このよ1．血清carbonic anhydraseIII（CA−III）の

うなCKの変化が何によってもたらされたか説明

値をPMD患者で測定し，血清CK活性値，muSCle

することは必ずしも容易ではないが，ひとつの考

specific enolase（MSE）値と比較した結果，CA−

え方として筋崩壊が抑制された結果と推測するこⅠⅠⅠはCK，MSEと同等の筋障害の指標となることも可能であろう．ただその際，Placeboの投与継とが示された．

続でCKが投薬前よりもさらに低値を示すにいた

2．10例の歩行可能なDuchenne型PMD患った点は大きな疑問として残る．また運動機能の者にベスタチソを大量投与（20mg／kg／日）して，改善がこれと平行してあるいは遅れて得られなか

本剤の影響を種々の項目で評価した．

った点も問題であるが，血清CK活性値の低下し

1）血清CK活性値はベスタチソ投与によってた程度が大きくない点からして，8週間という短下降傾向を示し，placeboに変更後4週間で有意期間では当然の結果かもしれない．

に高い値をとった．

血活MSE，CA−IIIとも比較的CKに近い動

2）血清MSE，CA−ⅠⅠⅠの値はべスタチソによきを示したのみで，べスタチソ投与によって何らって有意な変化を示さなかったが，CK同様pla−

特別な変化をとることはなかった．両酵素ともベceboに変更して4週日で高値を示した．

スタチソ投与期間中の8週間では有意な低下を示

3）血清MSE，CA−IIIはべスクテンによってさなかったが，CK同様，placeboにして4週目

CKと頬似の変化を示し，これらがCK以上の価に有意に高い値をとりその後下降するという態度

値を薬効判定上もつとは考えられなかった．
4）血活酵素の変化に伴う運動機能の明らかなをとった．今回の結果を通じ，べスタチソ投与に対する効果判定の有用性という観点からCKと改善または悪化は認められなかった．

MSE，CA−IIIとを比較してみると，べスタチソ

5）特記すべき副作用はみられなかった．

によってこれら新しい筋障害のマーカーがCKと異なった影響を受けたとは思われず，全体の動きなどをみてもCK以上の価値をもっとは考え難い．
したがって，今後べスタチソの効果判定にこれらの酵素を用いていくことには杭極的な意味がないと思われる．
最後に，本研究ではべスタチソを1日20mg／
kg と大量に投与したが8週間では自他覚的ならびに諸検査のうえで特に問題とすべき副作用は認
められず，安全性の高いことがあらためて確認された．ここに発表したのはべスタチソ8週間，placebo 8週間の結果であるが，ひきつづきべス

文献1）Mokuno K，Riku S el al：Serum muscle−Spe−cificenolaseinprogressivemusculardystrophy

and other neuroznusculardiseases，J．Neurol．
Scf．63，345（1984）．
2）CarterND，HeathReEaL：Carbonicanhydrase
IIIin Duchenne muscular dystrophy，Clin．
C加減．AcJ仇133，201（1983）．
3）Heath R，Schwartz MS et al：Carbonic an−
hydraseIIIin neuromuscular disorders，J．
Ⅳg〃rOJ．5cf．59，383（1983）．
4）Tipler TD，Edwars YH ei al．：Developmental
changesin the protein profiles of human

Cardiac and skeletal muscle，Ann．Hum．
Gg乃eJ，41，409（1978）．

5）Kato K and Mokuno K：Distribution of

タチソの再投与を実施しており，今後いかなる結

immunoreactive carbonic anhydraseIIIin

果が得られるか，その展開に期待したい．

various human tissues determined by a
SenSitiveenzymeimmunoassaymethod，Ctin．
C鋸血．AcJα．141，169（1984）．
−133−6）Shima K，Tashiro K eE al：Carbonic anhy−
drase III immunohistochemical locali2，ation

−134−

in

human

skeletalmuscle，Acta．NeuYO一郎助叫 59，237（1983）．

筋ジストロフィー症に対するNK421（Bestatin）

長期投与後の経過報告
里舌

栄二郎＊

研究協力者 富 英明＊

昭和56年より各種筋ジストロフィー症に対しNK421（Bestatin）を経口授与し臨床経過を観方法察してきた．今回，約4年にわたる投与中の臨床症状，血液化学的変化につき報告する．

NK421投与は，少量より漸増し，消化器症状などの副作用を監視しながら，症例に応じ，1カ対

月単位で漸増した．途中，副作用と思われる症状

象が出現した場合は，減量あるいは，一時中止し様対象は，昭和60年3月現在まで経過観察を続子観察後，再開，増量した．昭和60年3月現在

けている筋ジストロフィー症の9例である．内訳

での最高投与量は，1000mg／日1例，900mg／日

は，肢帯型筋ジストロフィー症（LG−PMD）5例，3例，800mg／日1例，500mg／日2例，240mg／（男3，女2），年齢37〜54歳，羅病期間17〜27

日1例，200mg／日1例である．（表2）

年，NK421投与期間27〜45カ月．顔面扁甲上これら9例のNK421投与開始からの全投与期間は，7〜45カ月で平均32．7カ月である．

腕型筋ジストロフィー症（FSH−PMD）2例，（男1，女1），年齢29，50歳，罷病期間17，33

臨床効果判定には，原則的に1カ月間隔で10m

年，NK421投与期間20，43カ月．Duchenne

歩行，階段11段昇降時間，全身18筋の5段階方型筋ジストロフィー症（DuchenneTPMD）2例，式による筋力評価を施行し，これらより総合的臨（男2）年齢1，10歳，躍病期6年，他の1例は，

床評価を行った．同時に，午前中一定時刻での安CPK値のみ高値のSubclinicalな例である．NK

静時血清CPK値を測定しNK421投与開始時

421投与期間は，7，20カ月（表1）．

点での連続3カ月の平均値と最近の連続3カ月の

表1対

象

M′F

譜

擢病期間
（年）

最大投与量 投与期間開（mg／日） 始よりの月数

1．肢帯型筋ジストロフィー症（LG PMD）

3／2

37J4

17〜27

500〜1000

27〜45

2．顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー症（FSH PMD）

1／1

29，50

17，33

200，800

20，43

3．Duchenne塑筋ジストロフィー症（Duchenne PMD）

2／0

1，10

6，

240，900

7，20

1例は，Subclinical＊国立武蔵療養所神経センター−135−

表2 最大投与量

血沈，CPK，Aldolase，総蛋白，総ビリルビン，
GOT，GPT，LDH，AITp，BUN，CRNNを，

最大投与量（mg／日）
0001

尿より尿蛋白を測定した．

0
0
9
0
0
8
0
0
5

結

果

0
4
2
0
0
2

9例のNK421長期投与後の経過を表4にまとめた．臨床的改善を示した例は1例もなく，計9例

SubclinicalなDuchenne PMD（No．9），FSH

表3 測定項目

PMD（No．6）をのぞき，全例，症状の進行をみ1．10m歩行時間
2．階段11段昇降時間
3・5段階方式従事筋力テスト
僧帽筋，三角筋，大胸筋，兢上筋，棟下筋，前銘筋，広背筋，上腕二頭，三頭筋，腕債骨筋，手関節筋，握力，腸腰筋，大腿内転，外転筋，大腿四頭筋，大腿屈筋，前脛骨筋，下
腿三頚筋
4．体 重
5．自覚症状6．副作用
7．血 液
RBC，WBC，Hb，Plt．，CPK，Aldolase，
ESR，T．P．，T．Bil．，GOT，GPT，LDH，
Al−p，BUN，CRNN
8．尿蛋白

た．CPK値は，N0．1のLG PMDをのぞき低下がみられた．この傾向は，Duchenne PMDなどCPK値が特に高値を示す例で顕著に認められた．
NK421投与中，No．2，N0．3のL．G−PMD，
N0．8のDuchenne PMDで消化器症状を一時的に訴えた．これらに対しては，一時的に投与中止
あるいは減量を行い，症状消失後，再びNK421
投与を継続することが出来た．血液生化学データ
では，貧血，肝機能障害など特に重篤な障害は認
められなかった．
図1は，No・1，LG−PMDの経過表である．臨床的には症状が進行し，CPK値でも改善がみら

平均値との比をとった．（表3）

れなかったが，昭和59年暮，1カ月NK421をこの比が，1より小さくなれば，CPK値が低中止したところ自覚的に脱力感の増強を訴えた．

下したことになる．

その後，900mg／日まで増量し現在も経過観察中

NK421投与中の副作用監視のため，血液よりである．

赤血球数，ヘモグロビン，白血球数，血小板数，

表4 KN−421長期投与患者経過表

症例

病 名

4．K．0．

1／

5．N∴K．

付

6．Y．M．FSH−PMD
7．M．S．

〝

8．R．K．Duchenne PMD

009

9．T∴K．
1／（Subclinical）

0
0
0
0
0
nU 0 0 0 4
5
5
8
2
2

1／

44

450→598（1．33）
1253→757（0・60）／′

食欲低下（1000mg）

72035→1293（0．64）

／′

悪

45

668→428（0．64）／′

441054→564（0．53）

009

3．Y．A．

900

繋蒜謂璧払臨床症状 副作用
進

行

0
0
0
1

／／

161713272133176一

2．M．Y．

MFFMMMFMM
572890901
53534521

1．S．A．LG PMD

繹病最大投与
年齢 期間量（年）（mg／日）l′20

161→111（0．69）

不

変

43

122→85（0．70）

進

行

20

4636→1814（0・39）／′

75610→4150（0．74） 無症状−136−

心（450mg）

悪心・下痢（120mg）

筋ジストロフィー症に対するNK421（Bestatin）長期投与後の経過報告
No．l S，A．55，M LG−PMD

564

681012 572

468

川125824

681012592

4

6

81012

図1

No．2

564

6

810

は572

4

6

M．Y．37，F LGAPMD

81012582

4

図2
−137−

6

81012592

4

681012602

No．3

564

6

81012572

4

6

Y．A．52，F LG−PMD

8】012582

4

図4
−138−

6

810

は592

4

6

8

川12

筋ジストロフィー症に対するNK421（Bestatinl長期投与後の経過報告
No．5

N．K．49，M LGLPMD

は582

4

図5

No．6Y．M．50，M FSH−PMD

300

2

810

0

6

00

4

6

は572

4

810

2
9
5

6

2

4

0

2

8

6

56

No．7

564

6

81012572

4

6

M．S．29．F FSHAPMD

81012582

4

6

810

は592

6

81812602

図7

No．8

582

N K

421

4

6

8

R．K．JO，M Duchenne

川

は592

図8

ー140−

4

4

6

810

は602

二ノ

筋ジストロフィー症に対するNK421（Bestatin）長期投与後の経過鞭告No，9T．K．（，M Duchenne
900

S59

7

8

9

10

（9mon．）（10） （lり （12）（二三）（：；）●602

図9

図2は，No．2LGTPMD例である．NK421

421投与後，CPK値は動揺を示しながらも低下

漸増中，CPK値の低下を認めたが，症状は進行傾向がみられた．240mg／日投与後より消化器症性であった．NK421，1000mg／日投与後に一過性状が出現し，服薬が不規則となっているが，現在の食欲低下を認めたため，一時断薬したところ脱もCPK値は，低下している．しかしながら，臨力感増強を自覚した．

床的には明らかに進行している・

図3は，No．3LG−PMD例である．NK421

図9は，No．9Duchenne−PMD．（Subclinical）

450mg／日で悪心が出現．その後，CPK値の低下である．出生後9カ月時点でのCPK値は，5600

傾向を認めたが，症状は進行性である．

U／Lと高値を示しているが，その後の運動発達は

図4は，No．4LG−PMD例である．CPK値は，軽度減少傾向にあるが，臨床的には進行性である．

正常である．NK421，900mg／日まで増量しているが，CPK値の低下は認められない・

図5は，No．5LG−PMD例である．昭和58年
以後，CPK値は低下傾向にあるが，臨床的には

ま

と

め

進行性である．
図6は，No．6FSHLPMD例である．臨床的に各種筋ジストロフィー症例に対して約4年にわもCPK値も大きな変化がみられない．現在800たるNK421の長期投与を行い経過を観察してmg／日に増量し経過観察中である．

きたが，この間，臨床的に改善を示した例はなか

図7は，No．7FSH−PMD例である．臨床的にった．血清CPK値は，NK421の投与後，低下を示す例が多く，特に従来よりCPK値が高値を軽度進行．CPK値は変化ない．
図8は，No．8Duchenne−PMD例である．NK

示すDuchenne型PMDにこの傾向が強くみられ−141−

た・しかしこれらの例でも明らかに臨床症状は進ることを考慮すると，NK421が疾患の進行を遅行しておりNK421投与により臨床症状を改善らせている可能性も否定できず，今後，二重盲検することは出来なかった．このように，NK421

法などにより検討を加える必要性が残された．

投与により疾患の進行を止めることは出来なかっ
たが，LG−PMDの2例で休薬後，自覚的に脱力

副作用としては，軽度消化器症状以外には，血液，尿所見とも異常を認めなかった．

感を訴えたり，CPK値が多くの例で低下してい−142−

ホルへこシノールの体内動態研究

松 本 郁 男＊

HPLC法は図1に示した前処理を行い，図2に
rま

じ

め

示した測定条件で行った．血中，糞中代謝物につにいては内部標準としてメタヒドロキシ安息香酸を昨年度はホルへこシノール（BF−121）および代用いた内部標準法で行ったが，尿中代謝物の測定

謝物（M−3）の測定法（RIA法），さらに［3H］−ホは内部標準物質のピークが尿中妨害ピークと重なルへこシノールをラットに経口あるいは静脈内授るため絶対検量線法により行った．またM−2の与した時の血中濃度，尿糞中排泄について研究を

定量はM−2が不安定であるためメトキシイミノ行ったが，今年度はさらに代謝物M−2，M−4，
Plasma Urine Feces（homogenate）

M−5，M−6のHPLCによる一斉分析測定法を確」A−C

立し，ラット，ウサギ，イヌ，ヒトにおける血中3000rpmX10min．

⊥「

濃度，尿・糞中排泄，代謝物を測定して，動物種
問の体内動態の相違について検討を行った・また

Cm Elut（CE川030rCE1005）

ラットにおける組織分布についても研究を行った・

AcOEトiPrOH−0．1N HCl（柑：4：l）

方

6mJX20r5mJX4法

l−dl血lPL︒

extractl dry−uPe

ラットにおける血中濃度，尿・糞中排泄，代謝S

物，組織分布の実験は，前回報告した方法1）よりS調製した［3H］−ホルへこシノールを用いて行った・O

代謝物の定量はシリカゲルTLC（展開溶媒；ブクノール：酢酸プチル：酢酸：水＝4：2：1：1）

0．025M H3PO4−CH3CN（95：5）
0￣．5mJorlmJ（¶ttrate）

H

法で行った．
非標識化合物を用いた場合の血中，尿中，糞中
代謝物の測定は，ヒトの場合GC−MS法，ウサギ，イヌの場合はRIA法（M−1，M−3），およびHPLC法（M−2，M−4，M−5，M−6）にて行った．RIA法の詳細については前回報告したl）．

A．0．2MCitrate Buffer（pH3．0）
B．H2NOMe・HCl

C・H野

CO2H（LS．）

図1Clean−up Procedure of M−2，4，5，6＊萬有製薬（株）目黒研究部
ー143−Gradjent systerTL︵訳︶dE00
13

17

22
0

Time（min．）

1

2

4

T・me

図2

Conditions of HPLC

図3

after

6

Admin■Stiation（hr）

Plasma Concentration of BF−121after
Oral Administration of BF−121in Rats

Column：Fine SIL C18T−5，4．6×300mm（45mg／kg）（pre：50mm）
Flow rate：lmL／min
Injeetion volume：20FLE

Wavelength：245nm（M−2：263，M−6：230nm）
SoIvent system：A，0．025M HSPOrCH3CN（95：5）

8，0．01M H8PO4−CH3CN（60：40）体に誘導して測定した．
また動物への投与はすべて絶食下にて経口授与
した．

結

果

1．血中濃度
図3にラットにホルへこシノール45mg／kg経口授与した場合の血中濃度の経時変化を示したが，消化管から速やかに吸収され，投与約30分後に最高血中濃度に達し，以後急速に減衰して24時

l

15

45
Dose（mgノkg）

一間後には血中にはほとんど認められない．血中代

図4I）ose Dependence of AUCin Rats

謝物は末変化体（M−1）が大部分であるが，わず
かに尿中の主代謝物であるALアセチルホルへこットの場合45mg／kgまでほ吸収に飽和のないこ

シノール（M−6）が認められる．この傾向は1mg／とを示した．

kg，15mg／kgを経口投与した場合でも同様であ

図5はウサギに45mg／kg経口投与した時の血り，また台形方式で求めた［AUC］。→Oと投与量中濃度の経時変化を示したものである．ラットにとの間にはよい相関（r＝0．9997）が認められ，ラ比べると吸収がやや遅く，最高血中濃度に達する−144−

ホルへこシノールの体内動態研究

0︵盲＼琶︶uO焉﹂盲2︒02の丘d0∧U︵盲＼琶︶uO焉L一日02002S歴

O
1

2

4

6

8

Time after Administration（hr）

1

2

4

6

8

¶me afterAdministration（hr）

図5 Plasma Concentration of BF−121after Oral
Administration of BF−121in Rabbits（45図6mg／kg）

Plasma Concentration of BF−121afterOral
Administration of BF−121in Men（240mg／
man）のは投与約1時間後である．しかし最高血中濃度

速に減少する．

はラットと比べて大きな相違は認められず，またイヌの血中濃度については現在測定中である．

血中からの消失もラットと同様に早い．血中代謝2．尿・糞中排泄物はほとんど末変化体（M−1）である．
図6はPhaseI studyにおいて健常成人に240

図7にラットおよびウサギに45mg／kg経口授

mg／man経口授与した時の血中濃度の経時変化を与した時の尿・糞中への累積排泄率を示した．ラ

示したものである．吸収はやはり早く，投与約30

ットでは投与48時間後までに投与量の90％が排分後に最高血中濃度約9／g／mJに達し，その後急泄され，その大部分は尿中への排泄であって，糞Rat（45mg／kg P．0．）

Rabbit（45mg／kg P．0．）

0︵訳︶〇一遥UO葛﹂0×山0＞毒⊃∈⊃0

0

4

8

24

48

0

4

8

24

Time after Administration（hr）

図7

Cumulative Excretionin Urine and Feces after Administration of BF−121
−145−

48

Man（240mg／man P．0．）

Dog（450mg／dog P．0．）0︵訳︶￠一度uO竜LOXu雪盲⊃∈⊃0

0

4

8

48

24

0

4

8

48

24

Jnme after Administration（hr）

図8 Cumulative Excretionin Urine after Administration of BF−121

中への排泄はわずか1〜2％程度である．ウサギ

Rat

RabbitDog

Man⁚仙．一い・1．山においても糞中への排泄はほとんど認められず，
投与量の75％が48時間までに尿中へ排泄される．
図8にイヌに450mg／kg，ヒトに240mg／man
経口授与した時の尿中への累積排泄率を示した．
投与24時間までに，イヌでは投与量の88％，ヒトでは80％が尿中に排泄された．
これらの結果からホルへこシノールは，いずれの動物種においても消化管からの吸収が良く，また尿中へ速やかに排泄される薬剤であることが明らかとなった．

3．尿中代謝物
いずれの動物種においても尿中への排泄が主たる排泄経路であることが明らかとなったので次に尿中代謝物の検討を行った．図9にラット，ウサギ，イヌ，ヒトにおける尿中総排泄量に対する各

図9 Metabolitesirl Urine

代謝物の割合を示した．各代謝物の構造は図10に示した．

M−2が15％を占めているが，ウサギにおいては

血中濃度，尿・糞中排泄は動物種差はあまり認ラットの主代謝物M−6は認められず，ラットでめられず，良く似た動態を示したが，代謝に関しは5％を占めるにすぎないM−4が60％を占め，ては種差は大きく，冬動物の主代謝物はすべて異M−3が25％，M−2が8％であった．イヌではなることが明らかとなった．すなわちラットにおM−1が80％以上を占め，ほとんど代謝をうけず

いてはM−6が55％を占め，ついでM−3が20％，に尿中へ排泄されることを示している．またヒト−146−

ホルへこシノールの体内動態研究

HO

HO
CO2H

HO2C

二≡・−

CO2H

HOH2C

M−5

図10 Metabolites of Forphenicinol

においてほM−3が80％以上を占め，その他に

表1組織中放射能濃度の半減期（peak〜4hr）

M−1とM−4が少量認められる．
組

4．組織分布ラットに［8H］−ホルへこシノールを1mg／kg経口投与し，各組織内濃度の経時変化について検討を行い，その結果を図11に示した．濃度は組織
1gあるいは1mgあたりのホルへこシノール換
算量で表わした．また組織中放射能濃度の半減期（ピーク′〉4時間）を表1にまとめた．
大部分の組織では，投与30分〜1時間後に最高濃度に達し，血中からの消失とほぼ同様な経過で速やかに消失し，24時間後には組織内にほとんど検出されないようになり，蓄積性のないことを示した．またほとんどの組織において，組織内濃度
が血中濃度を上まわり組織移行性の良いことが明らかにされた．特に脳下垂体には高濃度に分布し，投与1時間ではプラズマ中濃皮の12倍に達する
が，他の組織と同様急速に減少し，24時間後にはわずか0．19〟g／g認められるにすぎない．次いで
腎臓，膵臓に高濃度に分布し，投与1時間後の値はそれぞれプラズマ中濃度の5．4倍，4．4倍の値を示した．しかし一般に高濃度に分布することの多い肝臓にはあまり分布せず，プラズマ中濃皮とほぼ同程度の値しか示さなかった．またホルへこ
シノールは免疫調節作用を有することが知られているが2・3），免疫担当組織であるリンパ節，胸腺，
−147−

織

Tl′2（peak〜4hr）

血液1．71hr
血
渠
1．42
皮
膚
2．07
皮 下 脂 肪2．21
腋窟リンパ節1．61
腸間際リソパ節
1．81
副
腎
3．26
膵
臓
1．85
膵
臓
2．03
肪
胱
1．65
前
立
腺
1．48
精
の
う
2．64
精 巣 上 体
3．31
精
巣
3．73
胃
0．691），2．452）
小腸1．031），1．712）
大腸1．341），3．892）
腹脛内脂肪
1．23
腎
臓
1．53
肝
臓
1．94
腺
2．45
肺
1．80
心
臓
3．98
大
動
脈
1．91
顎
下
腹
1．62
甲
状
腺
1．66
気
管
1．75
限
球
2．58
脳 下 垂 体
1．65
筋
肉
16．27
骨
髄
1．48
1）0．5〜2hr2）2〜8hr（〟gノ／g）

皮

膚

′J．tl

二il′

皮下脂肪

牌

臨

腋苗リンパ節臆胱

腸間膜リンパ節

0．512

4

0．引2 48

図1ト1各組織内濃度の経時変化

−148−

8

M1−

▲

ホルへこシノールの体内動態研究（〝g／g）（〟g／9）

精のう

小 腸

精巣上体

脂月空内脂肪

0．512

4

8

24

0．引2

4

（hr．）

図11−2 各組織内濃度の経時変化

−149−

8

（〟g／g）

0．512

胸

4

腺

顎下限

8

0．512

4

図11−3 各組織内濃度の経時変化

−150−

8

ホルへこシノールの体内動態研究（〝g／g）（〟g／g）

大 脳

0．512

0．512

4

8

血

4

24
（hr．）

図11−4 各組織内濃度の経時変化

−151−

8

液

脳下垂体

0．512

4

8

0．512

4

図1ト5 各組織内濃度の経時変化

−152−

8

ホルへこシノールの休内動態研究

骨髄，脾臓に比較的高濃度に分布し，薬理効果を過と共にM−6の割合が増加し，投与4時間後に体内動態の面から裏付けた．また大脳，小脳へのは80％を占めた．肝臓ではM−1の割合が多いが分布は最も低いが，筋肉への分布も低い値となっその割合は時間の経過と共に減少し，逆にM−6ている．しかし，筋肉中からの減衰は他の組織にの割合が増加してくる．M−3も次第に減少し，4比べると遅く，表1に示したようにその半減期は，時間後にはもはや認められないが，M−4の割合は他の組織では1〜4時間であるのに対し16時間とあまり変化せず対照的である．これらの結果から極端に長く，投与4時間以後は血中よりも筋肉中

腎臓ではM−6，M−3への代謝，膵臓ではM−6濃度の方が高い値となっている．

への代謝，肝臓ではM−4，M−6への代謝が行わ

次に薬物の代謝に関与する臓器である肝臓，腎れていると推定される．また免疫担当組織である臓，膵臓における代謝物の割合の経時変化についリンパ節，脾臓，胸腺における投与1時間後の代て検討し，その結果を図12に示した．腎臓にお謝物の割合は，胸腺で4％程度のM−6が検出さ

いてはM−1とM−6の割合が多く，またM−3もれる他はM−1以外は認められない．

認められるが，この割合は時間が経過してもあまり変化しない．これに対し膵臓では腎臓と同様や

ま

と

め

はり M−1とM−6の割合が多く，投与初期ではM−1とM−6の割合が1：1であるが，時間の経

1．ホルへこシノールはラット，ウサギ，イヌ，i

ヒトのいずれの動物種においても消化管から速や0．5hr lhr

2hr

4hr

かに吸収され，その大部分が尿中へ速やかに排泄され，蓄積性は認められない．
2．代謝は種特異性が高く，主代謝物はラット
ではM−6，ウサギではM−4，イヌではM−1，ヒ
トではM−3である．
3．組織への移行性は良く，多くの組織ではプ
ラズマ中よりも高濃度に分布する．筋肉中濃度は低いが半減期は長い．
文献1）松本郁男．ホルへこシノールの体内動態に関する研究．厚生省新薬開発研究（梅沢班）・昭和58年
度研究報告書．pp．143−148（1984）・
2）Umezawa，H．Smallrnolecular weightimmu−
nomodifiers produced by microorganisms：
Their screening and discoveries，and thegenetics ofmicrobial secondary metabolites．
In Small Molecular Immunomodifires ofMicrobia10rigin．ed．byIl．Umezawa，pp．
1−16Japan Scientific Societies Press．Tokyo・（1981）．

3）Ishizuka，M．，Ishizeki，S．，Masuda，T・，Momose，A．，Aoyagi，T．，Takeuchi，T．，andUmezawa，H・Studies on effectsofforphenicinolonimmune−
responses．J．AntibtoE．35，1042−1048（1982）．＿

図12 各臓器における代謝物の経時変化−153−ロイペプチンおよびべスタテンの難病治療薬としての開発研究田中

亘＊1・滝田智久＊2・石井靖男＊1

I．Bioavailability
l． ロイペプチソのBioavailability
研究協力者 山下幸和＊2，渡辺恵子＊2，高山秀樹＊2，石橋正冗＊2
2．筋ジストロフィー発症マウスにおけるべスタチソのBioavailability
研究協力者 諏訪正人＊2，亀谷俊一＊2，渡辺紀子＊2，浅川紀子＊2，小山通則＊2，石橋正光＊2
3．べスタチソの幼君ラットにおける血中動態研究協力者 笹原富弥＊2，坪崎正寿＊2，高橋 奉書2
4．Duchenne型進行性筋ジストロフィー小児患者におけるベスタチンの代謝研究協力者 浅川紀子＊2，諏訪正人＊2，小山通則＊2，石橋正冗＊2，福山幸夫＊‡，大沢真木子＊3

Ⅰ．製剤研究1．硫酸ロイべプチンの安定性に関する研究
研究協力者 石間戸秀之＊2，青木 稔＊2，寺田 隆＊22．硫酸ロイぺプチソ製剤の研究
研究協力者 石間戸秀之＊2，青木 稔＊2，寺田 隆＊2
3．べスタチソドライシロップ剤の安定性に関する研究
研究協力者 石問戸秀之＊2，青木 稔＊2，寺田 隆＊2

Ⅲ．毒性試験
1．べスタチソの幼君ラットにおける毒性−急性毒性試験および亜急性毒性試験（経口投与）
研究協力者 萩原隆夫＊2，大塚登紀男＊2，伊藤公一＊2，林 幹人＊2，坪崎正寿＊2，高橋 泰＊2，和田 浩＊4
仲川憲一＊4＊1日本化薬（株）医薬事業本部＊2 日本化薬（株）総合研究所＊8東京女子医科大学小児科学教室＊4（株）日本バイオリサーチセンター羽島研究所−155−

ロイべステンおよびべスタチンの難病治療薬としての開発研究した．
d）血奨中濃度の測定

Ⅰ．Bioavailability

血莱100／上Zを用いて昭和56年度研究報告書に1．ロイベプチンのBioavailability

記載したRIA法により測定した3）・

2）結果および考察

昨年度までマウス1），ラット2），イヌ1），ニワト
リl）を用いてロイペプチソ（Leup）のBioavaila−

各製剤をイヌに経口授与したときの血菓中濃皮bilityを検討してきたが，経口投与におけるを図1に示した．対照カプセルに比べて，腸溶製

Bioavailabilityはいずれも低い結果を示した．そこで，今回昨年度に引き続き，腸溶製剤の可能性を検討するため，イヌにおける腸溶顆粒製剤のbioavailabilityについて検討した．

1）実験方法a）製剤および投与方法
Leupカプセル（対照カプセル），Leup腸溶顆
粒カプセル（本研究報告書Ⅱ．2節）の2カプセル（50mg／cap）を経口授与し，直ちに水50ml投与
した．なお，同一個体に対して，10日間間隔で対照カプセル，腸溶顆粒カプセルを経口授与した．
b）動物

ピーグル犬雄性，体重約10kg，乃＝4）．投与前
24時間絶食した．
C）採

血

O

投与後，1，2，3，4，5，6，8，24時間に前肢

1

2

3 4
5
6
8
Theafter administration（hr）

24

静脈より採血した．ただし，対照カプセルについFig．l Plasma concentration ofleupeptlnin maleては，投与後5時間は採血しなかった．血液は常beagle dogs after oral administration ofleupeptin（50mgx2／head）：CapSules（〇・・・・・・

法により血菜とし，■測定まで−200Cで凍結保存〇）andentericcoated一granules（●−●）．

ー157−

剤は投与4時間以降若干の持続性を示したものの，（一群3匹）に対しては［＄Hl］−べスタチソを12．47

その血奨中濃度は大きく改善されなかった．一方，

mg・2．23mCi／kgの割合で1日1回，7日間連続［AUC］。＿2．加は対照カプセル1．057±0．491，腸経口授与した．

溶顆粒カプセル0．881±0．465（〃g・hr・m7−1）であC）血液および筋肉中濃度の測定

り，腸溶顆粒カプセルは，対照カプセルに近い

i）単回投与群

AUCを示したが，腸溶顆粒のAUCは低い結果

血液中濃度測定：［3Hl］−べスタチソ投与後，0．5，1，2，4，8，24時間に尾静脈より Hepari−となった．
腸溶製剤のなかでは，昨年度報告した腸溶錠4）

nized capillary tube（国産遠心機（株），東京）でを含めて，腸溶顆粒カプセルが最も高いAUCを経時的に採血し，COMBUSTCONEおよびPAD示したが，腸溶製剤化によってAUCを高めるこ（Packard社，Illinois，USA）にとり乾燥後サンとはできなかった．

プルオキシダイザー（B−306型，Packard社）で燃焼し，生じたトリチウム水を冷却して捕集し，

2．筋ジストロフィー発症マウスにおけるベス

Mono PHASE−40（Packnrd社）をシソチレー
ターとして用いて液体シンチレーションカウンタ

タチンのbioavailabilityー（LSC−753型，アロカ社，東京）でその放射能
昭和58年度において，われわれはC57BL／6マを測定した．
筋肉中濃度測定：［3Hl］−ベスタチソ投与後1時

ウスにおける単回および連続投与時のべスタテン
血中動態および筋肉中におけるべスタチソとその間にエーテル麻酔下，上腕動脈より放血死させ，代謝物の動態を明らかにし，さらに尿中代謝物に血液および筋肉（後肢大腿部）を採取し，血液中ついて検討した結果を報告した．今回さらに筋ジ放射能測定の場合と同様にその放射能を測定した．

ストロフィー発症マウスと同腹非発症マウスを用

ii）連続投与群

いて単回および連続投与時のベスタチソ血中動態

最終回投与後，i）と同様の方法で血液，筋肉中

および筋肉中におけるべスタチソとその代謝物の放射能を測定した．

動態を明らかにし，両者の比較検討を行うこととd）尿，糞中排泄率の測定した．また，べスタチソ投与時の筋ジストロフィ

単回投与群について前報に記載した方法により測定した．

ー発症マウスにおける尿中代謝物を検索した．

e）高速液体クロマトグラフィー（HPLC）に
1）実験方革よる尿，血柴，筋肉中代謝物の同定および

a）試

定量

薬

べスタチソおよび［3Hl］−ベスタチソは前掛こ
記載したものを使用した．

HPLC条件，HPLC分析のための試料調製は前報に記載した方法により行った．

b）実験動物および投与方法

2）結果および考察

筋ジストロフィー発症雄性マウスC57BL／6J

筋ジストロフィー発症マウスと非発症マウスにdy（−）および同腹非発症雄性マウスC57BL／
6J dy（＋）は日本クレアより購入した．

［3Hl］−ベスタチソを5・04mg・0．90mCi／kgの割

単回投与群（一群3匹）に対して，［3Hl］−ベス合で単回経口投与した時の血液中濃度（放射活性タチソを5．04mg・0．90mCi／kg、および12．47mg・

値のべスタチソ換算値）の推移を図2に，また2．23mCi／kgの割合で経口投与した．連続投与群

12・47mg・2・23mCi／kgの割合で単回経口投与しー158−

ロイペプチソおよびべスタチソの難病治療薬としての開発研究︵盲＼ぎ︶ uO葛LlU8U00
10

012

4

12

8

Fig．2

4

8

24

Time after administratl0n（hr）

Theafter administration（hr）

afterasingle oraladministrationtonormal

Blood concentrations of the radioactivity
after a repeated oral administration to（−〇一）and dystrophic

Blood concentrations of the radioactivlty

Fig．4

mice（−●一）in a

normal（一〇一）anddystrophicmice（−●−）in

dose of5．04mg／kg of［SH］bestatin．The

daily dose of12．47mg／kg of［3H］bestatin

radioaetlVlty WaS Calculatedin theamOuntof bestatin．

for 7days．The radioactlVlty WaS Calcu−
1atedin the amount ofLbestatin．

1に示した．単回経口投与時の血液中濃度曲線より，TmaXは筋ジストロフィー発症マウス群，非発症マウス群ともに0．5時間であった，またcm．x︵盲＼ぎ︶UO召一UO200

は両マウス群の間に差はなく，ほは同様の値を示すとともに，投与量の増加にともなってその値も増加した．両マウス群の血液中濃度曲線はいずれも2相性を示し，α相の半減期はいずれの投与量に軍いても0・4〜0・5時間（投与後0・5〜2時間値で算出）を示した．β相の半減期（投与後4〜24
時間値で算出）は非発症マウスの6〜7時間に対■
10

012

4

8

24

ぷ∵し；▲筋ジストロフィー発症マウスでは8〜11時間

The afteradministration（hr）

Fig．3

Blood concentrations of the radioactiYityとその延長が認められた・両マウス群の［AUC］計

afterasingle oraladministrationtonormal

は環与量の増加にともなって増加し，筋ジストロ（，ロー）and dystrophicmice（−−）in ad6去eof12．47mg／kgof［3H］bestatin．Theradio−
activity was calculatedin the amount of

フィー発症マウスのそれは非発症マウスに比較して約1・芦〜1・4倍高い値を示した・この差は発症

bestatin．

マウスぎこおいて投与後8・24時間の血液中濃度値た時のそれを図3に示した．さらに，筋ジストロが有意Iこ（それぞれ禽SO・05，ク＜0・01）高いこフィー発症マウスと非発症マウスに［8Hl］−ベスとと，・β相の半減期の延長によるものと思われる∴

タチソを12・47mg・2・23mCi／kgの割合で1日．1

蓮続落b投与群の血液申渡度曲線も単回投与群

回，7日間連続投与した時の最終回投与後の血液の場合と同様に二相睦を示した．両マウス群の中濃度の推移を図4に示した．これら血液中濃度

TmaⅩlは単回投与群と同様に0・5時間であった・

より算出したPharmacokinetic parametersを表

またcm．xも両群ともほぼ同様の値を示すものの∴−159−

T8blel Phrmacokinetic parameters of mean blood concentration afterasingle and arepeatedOraladministration of［3H］bestatin to malemice on several doses．
′
α

5

0

of12・47mg／kg

5

dose

0

daily

′1′2β

ge．

ガ。β

0．065

0．48

10．65

1．452

0．43

6．68

1．629

0．104

8．47

1．682

0．082

0．47

5．73

−1．484

0．121

0．50

13．23

1．390

0．052

0．38

14．18

0．41

5

：repeatedin［AUC］3406554．75

5normal09766．00

59717．50

dystrophic

0

normal511910．00

0

dystrophic

Ⅹa＊4361．50m

12．47＊

5918．00

normalr

12．47

dystrophic

116103520418
225544

5．04

X
■
m

︵し

（n誌）animal ［AUC］34

1．804

0．049

for7days：AredunderbloodconcentrationVS time curve（ng・h／ml）

cm＆Ⅹ：Maximumblood concentration（ng／ml）

TmaⅩ：Time to maximum bood concentration（h）

K。a Or K。β：Elimination rate constant（h−1）
ll／2a Or tl′2P：Blood halトlife（h）

T8ble2Concentrationandrelativepercentage of bestatin and（2S，3R）AHPAin plasma

atlhrafterasingleand arepeatedoraladministrationtomalemice（n＝3），The
radioactlVlty WaS Calculatedin terms of bestatin equivalent．

Concentration
Dose（mg／kg）

・MouseBestatin

Normal＊＊

3527

110

2

347±966910642±5092

5

Dystrophic

69

129±4861261±16209Normal

4

142

9
8

1234

3

12．47＊

125
85±16

1
8

12．47

621
399±1839I）ystrophic＊＊（2S，3R）AHPA Bestatin
1
8

DystrophicH
Normal

5．04

Relative％ng／ml plasma（2S，3R）AHPA
18．1
18．7
10．6
9．4
3．5
3．8

＊：repeatedin daily dose of12．47mg／kg for7days．
＊＊：（ル＝2）

Table3

Concentr

ation

and

relative

percentage

ofbestatinand（2S，3R）AHPAinmuscle

atlhrafterasingleandarepeatedoraladministrationtbmalemice（n＝3）．The
radioactlVlty WaS Calculatedin terms of bestatin equivalent：Concentration

Dose（mg／kg）

Mouse

Bestatin

9

1

5
1

5

2
5

−160−

8

＊：repeatedin daily dose of12．47mg／kg for7days．
＊＊：（乃＝2）

0
5
5
5 3 4

438

4

2298

8
3

Normal筆書・

12．47＊

5

230±91482764±19979

254±13Dystrophic

09

226±45313±885423±100

4
5

Dystrophic
Normal

8

127±7

4
6

156±51132±612

244±17

9
4

Dystrophic
Normal

（2S，3R）AHPA

6

12．47

（2S，3R）AHPA Bestatin
1
6

5．04

Relative％ng／g muscle

ロイベプチソおよびべスタチソの難病治療薬としての開発研究

単回投与時のそれと比較したとき両マウス群ともTable4（2S，3R）AHPA formationin

わずかながら減少する傾向が見られた．連続投与

theincubation mixture of［3H］
bestatin and mouse skeletal

時における筋ジストロフィー発症マウス群のmuscle homogenate．

［AUC］芸4は非発症マウス群のそれに比較して約（2S，3R）AHPA

1．5倍高い値を示した．

Formed＊Normal Dystrophic

筋ジストロフィー発症マウスと非発症マウスに20．4［3Hl］−べスタチソを単回授与したとき，および連

10．2＊pmol／28．6mg protein／24hr続授与したときの投与後1時間における血奨中おスでは84．5％と前者の方が高い値を示した．

よび筋肉中代謝物の検索を行った．
血菜抽出物中に存在する放射活性をHPLC−

標的組織である筋肉中におけるべスタチソとRIDにて検索した結果，前報と同様に血菜中には（25，3月）AHPAの存在比が両マウス群ともに未変化体であるべスタチソとアミド結合の切断に血菓中のそれと異なった原因として筋肉中におけょり生成する（25，3R）AHPAの存在が確認さるべスタチソの代謝が考えられた．そこで両マウれた．これらの放射活性をべスタチン換算したとスの筋肉ホモジネートを用い［3Hl］−べスタチソきの血集中濃度を表2に示した．さらに筋肉中のと24時間f乃めroでインキュべ−トした．表4

それらを表3に示した．単回投与後1時間におけに示すように，この反応により［8Hl］−べスタチ

る血菜中ベスタチソ濃度は両マウス群とも投与量

ソから（25，3月）AHPAが生成することが確認の増加にともなって増加し，筋ジストロフィー発され，その生成量は筋ジストロフィー発症マウス

症マウスの方が非発症マウスに比較して高い傾向の筋肉ホモジネートを使用したとき，非発症マウを示した．しかしながら血策中のべスタチシとスのそれに比較して1／2にすぎなかった．このこ（25，3月）AHPAの存在比は両マウス群ともよく一致しており，高投与量の場合，べスタチソのとより筋肉中に移行したべスタチソが筋肉中に存在する加水分解酵素により（2g，3月）AHPAに存在比が高い値を示すことが認められた・連続経変換するものと考えられ，筋肉中べスタチソの存

口投与時の最終回投与後1時間における血奨中べ在比が血梁中のそれより低い値を示す原田の一つ

スタチソ濃度は両マウス群とも単回投与群に比べと考えられる．さらに筋ジストロフィー発症マウて高い値を示し，その存在比は96％であった・

スと非発症マウスの筋肉中に存在するべスタチソ

さらに筋肉中に存在するべスタチソと（2ぶ，の量的変化はべスタチソに対する水解酵素の量的3R）AHPAの存在比を検討したとき，べスタチ

変化に寄困するものなのか，それともベスタチソ

ソの存在比は血菜中のそれに比較して低い値を示

に対する酵素の77ィニティー変化すなわち質的し，（2S，3R）AHPAの存在比の高いことが確変化を伴うものであるのかは現在不明であるが極認された．また筋ジストロフィー発症マウスの筋めて興味深いところである．

肉中に存在するべスタチソの割合は非発症マウス

筋ジストロフィー発症マウスに［8Hl］−べスタのそれに比較して約1．2〜1．3倍高い値を示した・

チソを12．47mg・2．23mCi／kgの割合で単回経口連続投与時の筋肉中べスタチソ濃度は両マウスと投与したとき，投与後24時間における放射活性も単回投与群に比して約6〜7倍高い値を示し，の尿および糞中排泄率を表5に示した．授与した

さらに筋ジストロフィー発症マウスの方が高い傾［8Hl］−べスタチソは0〜24時間にその放射活性の向を示した．また筋肉中べスタチソの存在比は筋

83．4％が尿中に，2．5％が糞中に排泄された．まジストロフィー発症マウスで90．9％，非発症マウ

たこの尿をHPLC−RIDにて尿中代謝物を検索し−161−

TAble 5 Excretion rates（％of dose）of the

血菜中には末変化体であるベスタチソが80％

radioaetlVltyin24hrurine and feces
after a single oraトadministration to

以上存在し，その値は投与量の増加に伴って高い

male dystrophic mice（n＝4）in a

値を示した．また，両マウス群の投与量の増加にdoseof12．47mg／kgof［3H］bestatin．

％of Dose

Mouse No伴う血菓中ベスタチソおよび代謝物である（2ぶ，3ji）AHPAの存在比に差は見られなかった．

Urine Feces
8

7
9

4

3

4

4

9

筋肉中ベスタチソの存在比は血安中のそれに比
7
8

1

8

2

3

■

8

べて低い値を示した．特に非発症マウスにおける

4

8
8
0
7

6

2

5

2

4

6

1

7

8

ベスタチソの存在比は発症マウスのそれに比して168

低い値を示した．わりんroの実験結果より，このMean±S．D．83．4±11，12．5±0．8

85．9±11．3

原因の一つとして筋肉中に存在する加水分解酵素によりべスタチソが（25，3月）AHPAへと変換

T＆ble

6

されることが確認できた．

Excretion rates（％of dose）of bes−
tatin and（2S，3R）AHPA as meta−

さらに筋ジストロフィー発症マウスと非発症マ

bolitein24hr urine after a single
Oraladministrationtomaledystrophic
mice（n＝4）in a dose of12．47mg／

ウスの筋肉中に存在する加水分解酵素の量的ある
いは質的変化がうかがえる．

kg of［3H］bestatin．

ベスタテンの尿中排泄率は83・4％を示し，吸％of Dose

Mouse No

収後すみやかに排泄される・また，その尿中には（2S，3R）AHPA Bestatin Total
4

4
9

4

1
8

0

3
1
2
1

7

1
7

6

4
8

3

0
7
1

0

6
7

7

6
8

7

6

0
6

5

8
6

1

Mean±S．D．10．8±2．5

72．6±9．0

ベスタチンが72．6％，（2g，3月）AHPAが10・8％存在しており他の代謝物は確認できなかった．
∴すご．／183．4±11．1

3・ベスタチンの幼著ラッ・…トにおける血中動態についてた結果，前報と同様に尿中には末変化体であるベスタチソとその代謝物である（25，3R）AHPA

べスタチソは難病治療薬として小児への適用がのみが存在し，他の代謝物を確認するには至らな（筋ジストロフィー）検討されている．そこで今かった．衰6に示すように，両代謝物の尿中排泄回，幼君ラット（離乳後の3週齢ラッりにべス

率はべスタチン72．6％および（2S，3R）AHPA

タチソを単回経口投与または，3週間連続経口投lO．8％であった．こ れらの結果は前報に記載し与した後，経時的に採血を行いべスタチンおよびた結果と良く一致しており，筋ジストロフィー発

かハイドロキシベスタチソの血中濃度測定を行症マウス，および同系非発症マウスにおいて，そい，その血中動態について検討を行った．Jfの24時間における排泄率および尿中代謝物の割∴＼・．

合に差は認められなかった．

1）実験材料および方法

べスタチソは筋ジストロフィー発症マウス，非iJa）実験動物発症マウス共にすみやかに吸収されその血液中濃チャールスリバー社より購入したSprague−

度曲線は2相性を示した．べスタテン単回投与群，DawIey系雄ラットを実験に供した．動物は1ケ

連続投与群共にrm．xは0．5時間を示tン

ージにつき1匹を収容し，飼料（固型飼料，CRF−1，［AUC］孟lほ投与量の増加に伴い高い値を示した．

オリェソタル酵母）および飲料水（水道水）は自−162−

ロイベプチソおよびベスタチソの難病治療薬としての開発研究

由摂取させた．飼育条件は，室温24±20C，湿度f）抽出，誘導化および測定法

55±10％とし，照明は午前6：00から午後6：00

ベスタチソおよびクーハイドロキシべスタチソ

までの12時間とした．

の抽出，誘導化および測定はKoyama5）らの方法

経時的採血には各時間5匹を配し計40匹を使に従って行った．

用した．
b）投

与

量

2）結果および考察

べスクチソの臨床用量として，600〜1．200mg／

幼君ラットにべスタチソを117mg／kgの割合でbody／dayと高用量が用いられることがあるので，単回投与および3週連続投与したときのべスタチ

本実験の投与量は，すでに亜急性毒性試験でラッソ，クーハイドロキシべスタチソの血清中濃度のトにおける最大安全量と確認されている117mg／

推移を図5に，また，べスタチソについてこれら

kg／dayを設定した．

の血清中濃度値より算出したpharmacokineticC）投与薬剤の調製

parameterを表7に示した．

べスタチソは，ポールミルを用いて0．5％

単回および3週連続投与のいずれにおいてもCarboxymethylcellulose sodium salt溶液に約Tm8Xは0．5時間を示し，［AUC］い2 ほそれぞれ

2時間撹拝懸濁させた後，実験に供した（23．4

67502，60617mg・hr／mJであり，ほとんど変化はmg／mJ）．

認められなかった．連投によるα相の半減期は単d）採血および検体保存回投与時の約1．4倍となり，やや長くなる傾向がラットにべスタチソを117mg／kgの割合で経口見られた．β相の半減期は単回投与時の約4倍と授与し，投与0．25，0．5，1．0，2．0，4．0，8．0，

長くなったが，これは単回投与時の12時間値

12．0，24．0時間後にエーテル麻酔下，腹大動脈（650ng／ml）が6時間値（435mg／ml）より高い値

より採血し，室温下30分放置後3．000rpmで10になっている（この原因は不明）ことに起因する

分間遠心分離し上層（血清）をサンプル瓶に採取ものであり，実際にはそれ程の違いはないものとし，測定まで−200C下で保存した．

思われる．

e）試

クーハイドロキシべスタチソの血清中濃度の推薬

べスタチソは日本化薬（株）にて製造した医薬品
純度のものを使用した．通常の分析試薬は和光純

移は，今回3点（1，2，4時間）しか測定できなかったが，連投による変化は見られなかった．

薬より，無水トリフルオロ酢酸（TFAAn）およ

今回，べスタチソを幼君ラットに単回および3

びトリメチルシリルジメチルアミン（TMSDMA）

週連続経口投与したときの血清中べスタチソ，クー

は東京化成より，［2H4］メタノールはメルクジャ

ハイドロキシべスタチソ濃度を測定した結果，連バソより，アンバーライトⅩAD−ⅠⅤはオルガノ

投によって血相の半減期がやや長くなった他，変社よりそれぞれ購入した．塩酸−［2札］メタノール化は認められず，特に連投による血中への蓄積性溶液（5％）は，［2H4］メタノールに塩酸ガスを導は認められなかった．

入することによって調製した．
内部標準物質は，［2H6］Bestatin：［（2S，3R）−

4．DucIlenne型進行性筋ジストロフィー小
児患者におけるベスタテンの代謝

3−amin0−2−hydroxy−4−phenylbutanoyl（AHPA）−［2H6］S，R−［leucine］，［2H6］p−hydroxybesta−

健康成人男子におけるベスタチソの生体内動態

tin：［p−hydroxy（2S，3R）．AHPA−［2H6］S，R−［leucine］をそれぞれ用いた．

については詳細に検討されているが小児に対して
−163−

0

︵盲＼冒︶UO馬上∪8日00

6

ほ

18

24

The afterthe adrninistratin（hr）
Fig．5

Serum concentration ofbestatin（●）and P−hydroxybestatin（○）in ratsaftertheoraladministration of bestatin（117mg／
kg，乃＝5）−；Single administration，……；repeated administration for three weeks

T＆ble

7

Pharmacokinetic parameters of serurn eOnCentration after the oraladminis−
tration of bestatin．

half−life
Administration［AUC］。＿24

geα

Tm＆Ⅹ

α

Single

67502

0．5

1．14

repeated

60617

0．5

1．62

方。β

β

4．95
19．63

0．610

0．140

0．429

0．0353［AUC］。＿2．：area under blood concentration（ng・hr／ml）
Tm＆Ⅹ

：time

to

maximumblood

concentration（hr）

K的，K。P：elmination rate constant（hr−1）の報告はない．今回，Duchenne型進行性筋ジス

1）実験方法トロフィー症の小児に対し，その治療を目的としa）対象および投与方法てベスタチソが連続授与されたのを機会に，尿中

対象は東京女子医大小児科で加療中のべスタチ

代謝物のプロファイルを検討したのでその結果にン投与歴のないDMD患者2例に1ないし2カ月

ついて報告する．

間べスタチソを連続経口投与した．ただし，尿の採取日の前日は朝1回の服薬とした．
b）尿中代謝物の同定−164−

ロイべプチソおよびベスタチソの難病治療薬としての開発研究

初日および投与1カ月および2カ月後の尿の1オンをモニタリングイオソとして用いてマスクロ

カラムクt］マトグラ

マトグラムを描かせた．さらに代謝物の特徴的イフィー（18mmIDx15cm）に付した．水洗後，オソに応答したピークはそのマススペクトルを描

メタノールにて溶出しその溶出液を減圧濃縮し，かせ，べスタチソ，クーOH−べスタチソおよび残留物を塩酸−メタノールで処理し，メチルエス（25，3月）AHPA標準品のマススペクトルと比テル誘導体とした．ついで無水トリフルオロ酢酸

較し，代謝物の同定を行った．

部を，Amberlite XAD−IV（TFAAn）でトリフルオPアセチル化（TFA化）

した後，過剰のTFAAnを減圧下で留去した．

2）実験結果残留物にN−トリメチルシリルジメチルアミン

図6にベスタチソ，クーOHべスタチソ，（25，（TMSDMA）を加えてGC−MS試料とした．

3R）AHPA標準品のメチルエステルーN−TFA

GC−MS

アミド一〇一TMSェーテル誘導体のマススペクト

JMATDA5000mass data system（日本電子，

ルを示した．べスタチソ，♪一OHベスタチソ，東京）を装着したJMS−DX300mass spectr0−（25，3月）AHPA共に分子イオンは観察されな

meter（日本電子）を用いた．分析には3％のいものの分子イオンからメチル基の脱離したm／Z

0V−3をChromosorb WpHP（80〜100mesh）に

475，563，362の各イオンが観察された．さらにコーティングしたものを充唄したガラスカラム

べスタチソ，クーOHべスタチソにおいて基準イオ（3mmIDxlm）を使用した．気化室温度，セパンとしてMcLaぽerty転位によるm／Z275のイ

レーターおよびイオン源温度は2500Cで使用しオンが観察された．また，ペソジル基に由来する

た．カラム温度は1700Cで5分間保持した後，トロポニウムイオンであるm／Z91のイオンがべ

4OC／minで260ccまで昇温，同温度で10分間保スタチソ誘導体のマススペクトルに，クーOHベン

持した．イオン加速電圧およびイオン化電圧はそ

ジル基に由来するm／Z179がクーOHべスタチソ

れぞれ3．OkVおよび70eVとした．調製した試誘導体のマススペクトルにそれぞれ特徴的なイオ料をGC−MSに注入し，その1分後から1．5秒ンとして観察された．また，クーOHべスタチソ誘

ごとにスキャンを繰り返した．得られたデータか

導体のマススペクトルに観察された，m／Z293のらべスタチソおよびその代謝物のマススペクトル

イオンはこのペプチドのCH−CONH結合の切断の情報に基づいたそれぞれの化合物に特徴的なイにより生じたm／Z406のイオンからさらにCF3

275
8腔

．
∴

i7

2＿
lP

20 ．
97

293

f・LOH Bestatin

563
l
事5．
0
gI

275

22・
78
43・

228
lJl
llOf ．
9■−■114

3 18 ■5．
0

1 1．【
162

4†5

205

26・
70
362
l

3告 ．L 芋
1こ
100

Fig．6

．

11

200

（2S，3R）AHPA

372 − ●
5・
0
300

400

500

600

Mass spectra of the N−TFA−0−TMS ether methyl ester derivatives of（2S，3R）AHPA，
bestatin and9−0H bestatin．
−165−

0

5

10

（
2S，
3R ）
A H PA

15

20

25

B estatin♪−
O H B estatin
m

1
′

▲

■

200

Fig・7

275朋引

■
i

400

600

800

川00

ほ00

1400

Scan

Mass chromatogram of the N−TFA−0−TMS ether methylestsr derivativesof（2S，3R）AHPA，bestatin and9−0H bestatin．

CONH2の脱離によって生じたものと推察された．

示した．クロマト上にはm／Z91，162，205のモ（25，3R）AHPA誘導体のマススペクトルにはニタリングイオンに応答するピークが3．5分に，

べスタチソ，P−OHべスタチソと同様にMcLa・

m／Z91，205，275に応答するピークが16．5分

仔erty転位によるm／Z162のイオンが観察されに，m／Z179，275，293に応答するピークが22．3

るとともにベンジル基に由来するトロポニウムイ分に出現し，これら3本のピークはそれぞれ（25，オンであるm／291のイオンが観察された．また，3月）AHPA，べスタチソ，クーOHべスタチソでm／2205のイオンは分子イオンからCOOCH＄基あることがそれらのマススペクトルから確認されの脱雛によって生じたイオンm／Z318からさらにた．それ以外の代謝物は長期運用した際にも認め

CF3CONH2の脱鮭によって生じたイオンである．

られなかった．べスタチソを連続投与する時，第1これらベスタチソ，クーOHベスタチソ，（2ぶ，3月）日目に比べてべスタチソに対する代謝物（クーOH

AHPAに特徴的なイオンである

m／Z91，162，

べスタチソおよび（2S，3R）AHPA）の量比に

179，205，275をモニタリングイオンとして使用変化が見られ，連続投与により代謝物の増加する

したときのセレクテッドイオンレコーディング法

傾向が示唆された．

によるマスクロマトグラムを図7に示した．クロ
マト上にはこれら特徴的なイオンにそれぞれ応答〈症例2：5歳8カ月，体重15．2kg，投与量100
mg／日〉

する3本のピークが得られ，各ピークに相当する

投与第1日目と連続投与1カ月後の24時間尿マススペクトルおよびGC−MS上における保持時

抽出物のクロマトグラムを図9に示した症例1と間から3．5分に（2．S，3月）AHPA，16．5分にベ同様に代謝物としてクーOHべスタチソ，（25，スタチソ，22．3分にクーOHべスタチソが出現す

3尺）AHPAが確認され，さらに連続投与によりることが確認できた．これらの知見をもとに各患

代謝物の増加する傾向が示唆された．

者の尿から抽出した試料を分析した結果について

3）考

述べる．

察

べスタチソを人に授与したとき，投与丑の90％く症例1：7歳10カ月，体重18kg，投与量130が尿中に排泄され，しかもその大部分が末変化体

mg／日〉

投与第1日日と連続投与1カ月後および2カ月後の24時間尿抽出物のクロマトグラムを図8にであり，代謝物としてはクーOHベスタチン，（25，3月）AHPAが確認されている．

−166−

ロイペプチソおよびべスタチソの難病治療薬としての開発研究
0

5

Ip

l声

2．
0

A

2．
5

30 ・

35

′P e s柚／ （2 S 3 R ）A H P A／ P −O H B e statin

／

／

275

一
′

け9

l

91

000

】200

川00

30

35

Scan

R．1

B
／
／

／

／
／
J

275
Ⅰ79

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91

800

1000

Ⅰ200

20

25

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川00

35

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l
l

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200

400

27
17
91

l

600

800

1000

は00

川00

soan

T・N・（a boy of7years andlOmonths）18kg，dose of130mg／day（3times）
A：24hrs，urine offirst day
B：24hrs，urine afterlmonth
C：24hrs，urine after2months
Fig・8

Mass chromatogramsofthe N−TFA−0−TMS ether methylester derivativesof
urinary metabolites after continuous administration of bestatin（20mg／kg）in
the dystrophie patient．

今回，小児DMD患者2名に連続投与されたべが末変化体であるべスタチソであり，これに加えスタチソの体内動態を検討すべくその尿中代謝物て代謝物としてクーOHべスタチソ，（2ぶ，3R）を検索した・その結果，尿中に排泄された大部分

AHPAが確認された．また，投与回数の増加に

−167−

0

5

10

1声

2＿
0

年

亭0

35

A
B estatin〆／（2 S・
3 R ）AH P A／ 押 H B estatin

／
」

／

ll
0

2do

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豆00

15

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35

1000

1200

1400

B
／
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／

／
／
■
▲ ・
′

200

ll
400

600

800

scan

Y．Y．（a boy of5years and8months）15．2kg，doseoflOOmg／kg（3times）
A：24hrs，urine of丘rst day
B：24hrs，urine afterlmonth
Fig．9 Mass chromatogramsoftheN−TFA−0−TMS ether methylester derivatives ofurinary metabolites after continuous administration of bestatin（20mg／kg）in
the▲dystrophic

patient．

つれて，代謝物であるクーOHベスタチソ，（2g，

1）

実験方法

3月）AHPAの比率甲増加する傾向が認められた・

a） 試

これらの結果から，べスタチソは小児，健康成人

原末，散剤（D−マンニトール10倍散）およびカ

男子のいずれにおいてもほは同様の代謝パターン

プセル剤（ロイペプチソ50mg含有）を，室温下を示すことが示唆された．

に密封状態で36カ月および42カ月間保存したの料

ちに，ロイペプチソ含量および外観変化の観察を行った．

Ⅰ．製剤研究b）測1．硫酸ロイベプテンの安定性に関する研究

定法

各試料の定量は，昭和56年度の本報告書に記載された方法により，ロイペプチソを水素化ホウ

前報に引き続き硫酸ロイペプチソの原末および治験用経口製剤（散剤とカプセル剤）の安定性を

素ナトリウムで還元してロイペプチノールとし，
下記の条件にてHPLCにより分析した．

検討した．

横 器：日立655型高速液体クロマトグラフ−168−ロイペプチソおよびベスタチソの難病治療薬としての開発研究
Table

8

Thestabilityofleupeptinbulkstored
at the room temperature．

最の低下は，ほとんどラセミ化によることがわかった．なお，外観の変化は認められなかった．

Residual amount（％）ofleupeptin
Lot No．

Storage time（month）
36
42
4

3

5

2
9

0

2

6

5

8

5
9

2
9

前年度に引き続き，bioavailabilityの向上を目的とした腸溶性製剤の研究として，今回は，ロイ

5
9
2

1

2

9

ペプチソの腸溶カプセル剤および腸溶較粒剤の検

6

4
9

4

D−form4

L−form5

D−form3

L−form8

D−form5
9

L−form2．硫幣ロイベプチン製剤の研究討を行った．

検出器：日立638−4型紫外吸光光度計

2−1．腸溶カプセル剤の研究（測定波長200nm）
カラム：Nucleosi15C18（H）4．6mmi．d．×a）腸溶カプセル剤の試製実験

150mm

ロイペプチソ1部，D−マンニトール2部を十分

カラム温度：300C

混合し，腸溶性の基材であるHPMC−AS（ヒドT］

移動相：0．05Mリン酸−アンモニウム：メタノ

キシプロビルメチルセルロースアセテートサクシ

ール：アセトニトリル＝80：12：8

ネート）から成る2号カプセル＊（信越化学工業，

流 速：1．4mg／min．

東京）に充唄（1カプセル中にロイペプチソ50
mgおよびD−マンニトール100mgを含む）し，

2） 結果および考察

腸溶カプセル剤とした．

a）硫酸ロイベプチン原未の安定性

T8blelO Test results ofleupeptin cnteric
CapSules

表8に示すように，室温42カ月保存後において試料中のロイペプチソのし体の残存率は92．0

Testitems

Results〜95．ビ％であり，また外観も白色粉末の状態を保Appearance

White powderin clear

持して変化せず，安定であった．

Leupeptin content

46．5mg／cap．

and colorless capsulesb）硫酸ロイぺプチン製剤の安定性

Disintegration time表9に示すように，室温42カ月保存後における試料中のロイペプチソのし体の残存率は，散剤で94．7％，カプセル剤で91．6％であり，L体含
TAble

9

Thelstfluid

The2nd nuid
Weight variation test

Not disintegrated
17〜20（min．）

WithinlO％（deviation）

The stability ofleupeptinin the oral preparation for the clinical trial
StOred at the room temperature．

Residual amount（％）ofleupeptin
Preparations

Storage time（month）
36
42

Powder
6

3

1
9

6

8

7

5

1

7

7

4
9

4・
9

−169−

2

D−form4

L−formCapsule（Leup．50mg）

3

D−form8
9

L−form（Leup．10％in D一mannitol）

P，Tablell Test results ofleupeptirLenteric−COated granules

Testitems

3．ベスタチンドライシロップ剤の安定性に関Results

する研究

Appearance Pale yellow granules

Leupeptln COntent

7．8％

前報に引き続きべスタチンドライシロップ剤のDisintegration time

安定性を検討した．

Thelst nuid Not disintegrated
The2nd nuid

2〜3（min．）

Particle size distribution

500〜1410（pm）

1）実験方法a）試b）結果および考察

料

べスタチソドライシロップ剤を，室温下に密栓得られた腸溶カプセル剤の製剤試験の結果を表10に示す．これらの結果から，ロイペプチソ腸溶
カプセル剤は，日局10，一般試験法記載の崩壊試状態で30カ月保存したのちに，べスタチソの含量，外観変化および薄層クロマトグラフ法による観察などの測定に供した．

験法および重量偏差試験法に適合し，脂溶性製剤b）測の特質を十分保持しうるものである．

定法

試料のベスタチン含量の測定は，昭和58年度の本報告書に記載された方法により行った．

2−2．腸溶顆粒剤の研究
2）結果および考察a）腸溶顆粒剤の試製実験

室温30カ月保存後において試料中のベスタチ

顆粒の処方は，種々検討した結果，ロイペプチ

ンの残存率は98．9％であり，外観も白色であり

ソ10部，D−マンニトール87部，PVP（ポリビニ変化は認められなかった．また，蒋層クロマトグ

ルピロリドン）3部を混合し，常法により造粒，ラフのスポットは単一であり，分解物の生成は認

乾燥後，整粒を行いロイペプチン顆粒を得た．

められず安定であった．

次に，腸溶性の基材であるHPMC−AS溶液を，
裸顆粒に対して20％重量部スプレーコーティン

Ⅲ．毒性試験
ペスタチソの幼若
ラットにおける毒性
急性毒性試験および亜急性毒性試験

グし，ロイペプチソ腸溶頼粒の試製を行い，ロイ
ペプチソ含孟約8％の製剤を得た．
b） 結果および考察得られた腸溶顆粒剤の製剤試験の結果を表11

べスタチソ（以下，NK421と略す）はStre−に示す．これらの結果から，ロイペプチソ腸溶顆

ptomyces olivoreticuliの培養濾液中からアミノ

粒剤は，日局10，一般試験法記載の崩壊試験法おペプチダーゼB阻害物質として発見されたペプチ

よび製剤総則記載の析粒剤の粒度試験に適合し，ドで，免疫応答に増強作用を示し，生体の防衛機

腸溶性製剤の特質を十分保持しうるものである．

構を賦括化し癌に抑制作用を示すことから，そのなお，製造工程での分解物の生成は，HPLCでは抗睦瘍剤としての開発が進められている．

認められなかった．

また一方，難病筋ジストロフィー治療薬としてもその適用が注目されているので，今回幼児への臨床適用を考慮し，幼若期ラットを用い，経口投与による急性毒性試験および13週間亜急性毒性ー170−

ロイべプチソおよびベスタチソの難病治療薬としての開発研究

ゾンデを使用し，前日から摂水下で約16時間絶試験を実施したのでその結果を報告する．

食している動物へ単回経口投与した．

．

1．急性毒性試験
1）諸 検 査試験方a）一般状態観察法

一般状態の観察は投与後14 日間行った．投与
1）材料および方法

日は投与後6時間まで，翌日からは1日1回全例a）使用動物について実施した．
b）体重測定動物は8週齢で購入したSD系雌雄ラット〔日本チャールス・リバー（株）〕を約4，5週間飼育後

体重測定は1日1回全例について実施した．

交配し，自然分娩させて得た3および4遇齢の雌C）病理学的検査

雄ラットを使用した．動物数は対照群を含め4投観察期間終了後，全例を剖検し肉眼的観察を行

与群を設定し，各群には雌雄各5匹を配し，計80った．

匹を使用した．

肉眼的観察終了後，さらに最高用量2．0g／kg投

飼育は温度20〜240C，湿度40〜70％，換気回

与群の雌雄各3例について，肝臓，腎臓，脾臓，数12回／時間，照明時間12時間（午前6時から午胸腺，心臓，胃および十二指腸，小腸（空回腸），後6時まで）のバリャーシステム内の飼育室で行

副腎，精巣，卵巣を摘出し，常法に従って10％い，動物は生後19 日で離乳させるまで母獣ととBu仔ered formalin水溶液で固定し，パラフィン

もにニコンケージで，離乳から投与前日まではポ

包埋，薄切の後，HE染色を施し組織学的検零を行った．

リカーボネートケージでそれぞれ群飼いし，投与後は，5連ケージで個別飼育した．

d）統計学的解析

飼料はオリェン∵タル酵母（株）製の固型飼料
CRF−1を，水は水道水をそれぞれ自由摂取させ体重は対照群と各投与群の間でStudentt検定を行い解析した．

た．
b）投与方法試験成績

NK421は日本化薬（株）で製造したロット番
号004−2Rを使用した．

1）一般状態および死亡の有無

投与用量はすでに実施したラットの急性毒性試

一般状態観察では3週齢および4週齢のラット

験8）（5遇齢で開始）を参考にして，0．5g／kg，

とも試験期間を通じ著変はみられず，また，死亡

1．0g／kgおよび2．0g／kg（投与可能最大量）を設も認められなかった．

定した．

2）体重変動（Fig．10，11）

NK421は0．5％カルポキシメチルセルロース

3週齢および4週齢のラットとも，体重変動にナトリウム（以下，CMCと略す）溶液に6．25
g／100mgの濃度で懸濁させ，投与容量を8，16

著変はみられなかった．

および32mg／kgと調整し，調製後30分以内に各投与群に所定の用量を授与した．対照群には0．5

3）剖検所見％CMC溶液を投与した．

3遇齢および4週齢のラットとも，剖検所見に投与は滅菌したガラス製注射筒および金属性胃

異常はみられなかった．

−171−

（g）
140

120

100

80

60

40

0
Fig．10

1

2

3

4

5

6

7

8

9

川

1112

13

14

（days）

Averagebodyweight ehangesin rats（3weeks ofage）tseated singlyPO with NK421

4）病理組織学的検査
病理組織学的検査では3遇齢および4週齢の

ま

と

め

2．0g／kg投与群で，肝臓に小細胞浸潤巣の散在，腎臓に尿細管上皮の再生・問質性細胞浸潤などが3週齢および4週齢の幼若ラットを用い，NK

それぞれ軽度に散見されたが，いずれも対照群に421の経口投与による急性毒性試験（投与量：も認められた．

0．5，1．0および2．0g／kg）を実施したが，投与可

その他の器官には著変はみられなかった．

能最大量（2．0g／kg）投与においても，一般状態，
体重変動，病理学的検査のいずれにも著変はみられず，NK421は幼若ラットにおいても，極めて低毒性の物質であることが認められた．
−172−

ロイペプチソおよびべスタチソの難病治療薬としての開発研究．・・一・1●一■
0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1112

13

14

（days）

Fig．11Averagebodyweight changesinrats（4weeksofage）treatedsinglyPOwithNK421

週間母獣と一緒に飼育した後3週齢で離乳させ，試験を開始した．動物数は対照群を含め5投与群

2．亜急性毒性試験を設定し，各群には雌雄各15匹を配し，計150試験

方匹を使用した．

法

飼育は温度24±20C，湿度55±10％，換気回数1）材料および方法

12回／時間，照明時間12時間（午前6時から午後a）使用動物

6時まで）のオープンシステムの飼育室で行い，動物は生後2遇齢のSD系雌雄ラット〔日本チ

動物はラット用ハソギソグ型ケージ（ステンレスャールスリバー（株）〕を母獣とともに購入し，1製）に1ケージ当り1匹を収容した．

一173−

飼料はオリエンタル酵母（株）製の固型飼料
CRF−1を，水は水道水をそれぞれ自由摂取させた．

動分析装置クリナライザーN2C4型を使用して，以下の項目について分析を行った．

b）投与方法トランスアミナーゼ（GOT，GPT：NADH2

NK421は日本化薬（株）で製造したロット番号
004−2Rおよび002を使用した．

法），アルカリフォスファクーゼ（ALP：クーNPP法），ロイシンアミノペプチダーゼ（LAP：1−L−

投与用量はすでに実施したラットの亜急性毒性

P−NA法），乳酸脱水素酵素（LDH：NADH2法），

試験7・8）（5または6週齢で開始）における，39

血糖（GLU：GOD−POD法）総コレステロール

mg／kg（最大無作用量），117mg／kg（安全量），（T−CHO：酵素法），総蛋白質（T−P：Biuret法），

350および700mg／kg（生理的投与可能最大韮）

A／G比（A／G ratio：T−P値およびALB値からを設定した．

算出），尿素窒素（BUN：UreaseGLDHTNADH

NK421は各用量毎に投与容量が5mg／kg体重法），クレアチニソ（CRNN：Jaffe変法），また，（ただし，700mg／kg投与群では10mg／kg）にな

ナトリウム（Na：炎光光度法）およびカリウム

るように，毎日投与前に滅菌した0．5％CMC溶（K：炎光光度法）は日立製炎光光度計205D型

液にボールミルを使用して2時間以上撹拝懸濁さを，クロライド（Cl：電量滴定法）は平沼製タロ

せ投与した．対照群には0．5％CMC溶液を投与

ライドカウンターCL−3型を使用して測定を行っ

した．

た．

投与は滅菌したガラス製注射筒および金属性胃C）尿ゾンデを使用し，1日1回13週間連続経口授与
した．

検

査

30，60および90回投与終了後，各群雌雄5例のラットから直接新鮮尿を採取し，尿診断用試験
紙マルチスティックス〔マイルス三共（株）〕を用

2）諸

検

査

いて，pH，蛋白質，糖，潜血，ケトン体，ビリa）一般状態観察（体重・摂餌量）

ルビンおよびウロビリノーゲンを測定した．比重

ラットの一般状態の観察は1日1回全例についは屈折法により測定した．

て投与直後に実施した．体重および摂餌量の測定d）病理学的検査

は毎週1回全例についてそれぞれ実施し，摂餌量b）で腹大動脈から採血し放血致死させた動物は1週間の累積摂取量を測定した．

について胸腹部および頭蓋部を切開し，諸器官のb）血液検査

肉眼的観察を実施した．

13週間投与終了後，各群雌雄10例について約

肉眼的観察終了後，心臓，肺，肝臓，脾臓，腎18時間絶食後，エーテル麻酔下で腹大動脈より採臓，副腎，胸腺，精巣，卵巣，前立腺，子宮，脳，血し，下記の項目について実施した．

下垂体，膀胱を摘出し，全例についてメトラー電i）血液学的検査

子天秤PK300でその湿重量を測定した．

．．血液学的検査では赤血球数，白血球数，ヘモグ

さらに，全例について，重量測定器官および脊ロビン量（以上，トーア自動血球計数装置cc−

椎骨，大腿骨，胃および十二指腸，小腸（空回108システム），ヘマトクリット値（高速遠心法），

腸），大腸（結腸），腸間膜リンパ節，膵臓，甲状腺

血小板数（トーアプレートレットカウンターPL−を摘出し，常法に従って10％Buffered formalin100）および末杓血液像（Wright染色）を測定した．

水溶液で固定し，パラフィン包埋薄切の後，HE′ii）血液生化学的検査

染色およびアザンマロリー染色を施して組織標本b）で得られた血漠を日本電子（株）製の臨床自を作製し，組織学的検索を行った．

−174−

ロイべプチソおよびベスタチソの難病治療薬としての開発研究

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ロイべプチソおよびべスタチソの難病治療薬としての開発研究

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ロイべプチソおよびべスタチソの難病治療薬としての開発研究
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ロイペプチソおよびべスタチソの難病治療薬としての開発研究e）統計学的解析

6）病理学的検査

諸測定値および検査成績は，対照群と各投与群a）剖見所見剖見所見では全投与群に署変は認められなかっとの間でStudent−t検定を行い解析した．

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b）器官重量（Table15，16）

績

700mg／kg投与群の雄で，脾臓および副腎の増1）一般状態

加が湿重量および比体重が相関して，ともに統計

一般状態の観察では試験期間を通じ全投与群に学的有意差を示して認められたが，著明なものではなかった．その他にも対照群と比べ統計学的有著変はみられず，死亡も認められなかった．

意差のみられる器官が散見されたが，いずれも用2）体重変動（Fig．12）

量依存性はみられず，対照群と比べ著変は認めら

体重変動では試験期間を通じ，雌雄とも全投与れなかった．

群で体重増加の抑制が軽微に認められたが，用量C）病理組織学的検査

依存性はみられず，対照群とほは同様の推移を示検体適用との関連性が推察される変化として，した．

腎臓では髄質外帯の尿細管上皮細胞でビマン性に
刷子緑の短縮や脱落，好塩基性化を伴う萎縮，さ3）摂餌量（Fig．13）

らに散在的核肥大が全投与群でほぼ用量依存的に摂餌量の推移では投与前半に雌雄全投与群で摂観察されたが，これらの変化は二次的な組織反応

餌量の軽微な減少が認められたが，投与期間を通または尿細管の壊死，強度の脂肪変性などの明確して対照群と比べて著変は認められなかった．

な障害像を伴わない極めて軽微な器質的変化であった．

4）尿検査（Table12）

また，胸腺では皮質リンパ球に散在性の単細胞

尿検査では，試験期間の各検査を通じ，雌雄全投与群に著変は認められなかった．

壊死が117mg／kg以上の投与群で桓軽微に観察されたが，明確な用量依存性は認められなかった．
さらに膵臓では腺房細胞の散在的単細胞壊死が5）血液検査

全投与群に用量依存性を示して極めて軽微に観察a）血液学的検査（Table13）

されたが，対照群にも認められた．

血液学的検査では雄または雌の高用量群で，ヘ

しかし，上述した器質的変化はいずれも軽微なマトクリット値，白血球数および血小板数に統計もので，血液検査においてそれに関連する機能障学的有意差のみられる減少が認められたが，いず

害性を疑う知見は全く認められなかった．

れも軽微な生理的変動範囲内の変化であり，全投

その他には，心臓で単核細胞浸潤を伴う限局性

与群とも対照群に比べて著変は認められなかった．

の心筋の変性・線維化，肺で限局性の気管支炎・b）血液生化学的検査（Table14）

泡沫様細胞，肝臓で中肉芽形成や細胞浸潤，ある

血液生化学的検査では雄または雌の高用量群で，いは限局性の出血や細胞浸潤を伴う肝細胞壊死，

GOT値・GPT値・A／G比の増加傾向およびGLU

膵臓でラ氏島細胞や腺房細胞の線維化が散見され

値・T−CHO値・CRNN値の減少傾向が認めらたが，いずれも用量依存性を示すものではなく，れたが，いずれも軽微な変化で明確な用量依存性

背景病変と考えられた．

はなく，対照群に比べて著変は認められなかった．
−181−

長期間連続経口投与試験で，最高用量700mg／kg
まと投与群においても一般状態・尿検査・血液検査・

め

病理学的検査のいずれにも著変はみられず，著明

離乳直後の3週齢SD系雌雄ラットを用い，な毒性標的器官は認められなかった．したがって，

NK421の13週間連続経口投与による亜急性毒NK421は幼若ラットにおいてもすでに報告した性試験（投与量：39，117，350および700mg／kg）

亜急性毒性試験の場合と同様に，経口的に極めてを実施し，以下の結果を得た．

低毒性の物質であることが認められた．

1．一般状態観察では全投与群に著変はみられず，死亡も認められなかった．

文

2．体重変動では試験期間を通じ全投与群に軽傲な体重増加の抑制がみられたが著明な変化ではなく，対照群と同様の推移を示した．
3．摂餌量の推移では試験期間前半に軽徴な減少がみられたが，対照群に比べて著明な変化では

献

1）田中 亘．微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプチン）の開発研究．昭和55年度
研究報告書，p．101（1981）．
2）田中 亘．同上．昭和54年度研究報告書，p，65（1980）．

3）田中 亘．同上．昭和56年度研究報告書，p．104（1982）．

4）田中 亘．同上．昭和58年度研究報告書，p．151

なかった．

（1984）．

4．尿検査では全投与群に著変は認められなかった．

5）M．Koyama，M．Hashimoto，N．Asakawa，M・Ishibashi．and H．Miyazaki，Biomedical Mass
Spectrometory，7，pp．372−376（1980）・

5．血液学的検査では全投与群に著変は認めら

6）Sakakibara，T．et al．Toxicological studieson
Bestatin．Ⅰ．Acute toxIClty teStinmice，ratSれなかった．
6．血液生化学的検査では全投与群に著変は認められなかった．
7．病理学的検査では，剖検所見，器官重量および病理組織学的検査のいずれの検査においても著変は認められなかった．
以上のように，NK421の幼君ラットにおける−182−

and dogs，Jpn．J．AntibioE．36（11），2971−
2984，November（1983）・
7）Huntington Research Centre．ToxicoIogicalStudies on Bestatin．Subacute toxIClty teStand recovery studyin rats．Unpublished8）Hagiwara，T．et aL．Toxicological studies on
Bestatin．Subacute toxIClty teSt andrecovery
Studyin rats．Pharmacometrics．27（3）（Oyo
Yakuri）March（1984）．

微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（ロイペプチン）開発研究班分担研究者一覧
氏

名

所

属

住

所

T

班 長 梅沢 浜夫 微生物化学研究所

141東京都品川区上大崎3−14−23
03−441−4173〝

980 仙台市星陵町2−10222−74−1111（内2311）
大塚 正徳 東京医科歯科大学医学部薬理学教室113 東京都文京区湯島ト5−45
03−813−6111（内3145）
野村 達次 実験動物中央研究所
213 川崎市宮前区野川1430
044−755−5441（内20）
高木 昭夫 虎の門病院神経内科
105 東京都港区虎の門2−2−2
03−588−1111（内2016）
埜中 征哉 国立武蔵療養所神経センター
187 小平市小川東町4−1−1
微細構造研究部
0423−4ト2711（内5211）
松下
宏 和歌山県立医科大学第二生理学教室 640 和歌山市9番丁90734−31−2151（内319）
村地
孝 京都大学医学部附属病院検査部
606 京都市左京区聖護院川原町
075−751−3502（直）大倉 洋甫 九州大学薬学部薬品分析化学教室
812 福岡市東区馬出3−ト1〝

三吉野産治 国立療養所西別府病院

班 員 岩崎 祐三 東北大学医学部脳疾患研究施設
脳微細構造部門

〝
〝
〝
〝
〝
〝

092−64ト1151（内6151′｝4）874 別府市大字鶴見4548
0977−24−1221〜3′′

村上 慶郎 国立療養所箱根病院

250 小田原市風祭412
0465−22−3196

幹 事 木下 真男 東邦大学医学部附属大橋病院
第四内科
班 員 祖父江逸郎 国立療養所中央病院

153 東京都目黒区大橋2−17−6
03−468−1251

474 大府市森岡町源吾36−3
0562−46−2311

監 事 里吉栄二郎 国立武蔵療養所神経センター
班 員 福山 幸夫 東京女子医科大学小児科教室′′

丸山 工作 千葉大学理学部生物学教室

187 小平市小川東町4−ト1
0423−4ト2711（内400）
0423−44−378T（直）162 東京都新宿区市谷河田町1003−353−8111（内3508）
260 千葉市弥生町ト33
0472−51−1111

幹 事 青柳 高明 微生物化学研究所酵素研究部

141東京都品川区上大崎3−14−23
03−441−4173〝

田中

亘 日本化薬株式会社医薬事業本部

班 員 滝田 智久 日本化薬株式会社医薬事業本部
総合研究所〝
石井 靖男 日本化薬株式会社医薬事業本部〝

松本 郁男 万有製薬株式会社研究本部

102 東京都千代田区富士見1−1ト2
東京富士見ビル
03−237−5131
115 東京都北区志茂3−3ト12
03−901−2878

102 東京都千代田区富士見1−11−2
東京富士見ビル
03−237−5131
153 東京都目黒区下目黒2−9−3
03−492−4106

斑 友 江橋 節郎 岡崎国立共同研究棟構生理学研究所 444 岡崎市明大寺町字西郷中380564−54−1111（内821）〝
勝沼 信彦 徳島大学医学部酵素化学研究施設 770 徳島市蔵本町3−18−15
C886−31−3111