厚生省新薬開発研究事業

微生物の二次代謝産物に由来する

難病治療薬（E−64）の開発研究

昭和54年度研究報告書
班 長 今堀和友

昭和55年3月

研究報告書作製にあたって筋ジストロフィー症，特にドシャンヌ型のものはきわめて重篤な遺伝病であり，一旦発症すれば20才前後で死亡するし，発症率も1万に1人と比較的高いため難病の中でも重視されるべきものの1つである。
本症が遺伝病であることもあって，その根本的治療はきわめて困難な状態にある。しかしながら・本症は筋肉の崩壊を伴うものであるから，この崩壊を喰い止めることができれば本症の進行も喰い止めることができることは充分予想される。
筋肉の崩壊は筋肉細胞の細胞質に存在するプロテアーゼによるものと考えられるが，現在までのところその様なプロテアーゼとしては，カルシウムで活性化される中性プロテアーゼ（CANP），
カテプシソB・カテプシソLが候補となる0したがって，これらのプロテアーゼを特異的に阻害する薬物があれば，上記の治療薬となる可能性が生じる。
この様な観点から，治療薬となりうる見込みのあるものとして，ロイペプチソとE−64が厚生省でとりあげられ・それぞれの開発を積極的に援助するため，それぞれについて研究組織が構成されることとなったoE−64は大正製薬で開発された試薬であるが，CANPの阻害について研究していたこともあって，私がE−64開発班の班長を命ぜられることになった。
本研究班の目的は実用に適する治療薬の開発である。それ故にこそ，私は軽々しく臨床への試用をさけ・まず基礎的データを蓄積することが大切だと考え，大別して3つの方向から研究を進める
ことを考えた。その第一はE−64及びその類縁体の製造である。治療薬として実用化されるためには・前記プロテアーゼのみを特異的に阻害し，他の酵素は阻害せず，また副作用を伴わないものであることが必要条件となる。そのためには微生物の二次代謝産物であるE−64にさらに手を加え，上記条件をよりよく満足するものを開発することを目指した。その結果，E−64−a，、E−64−b，E−
64−Cの3種類が候補として残ってきたO第二はinvitroにおけるE−64及びその類縁体の効果の判定である○ここにおいては，CANPやカテプシソ掛こ対する阻害機構の解明，至適濃度の決定の他，他の代謝酵素に対する影響をも研究することとした。第三にはinvivoにおけるE−64の効果の研究である。このグループではE−64及びその額縁体の毒性試験，一般薬理試験の他に，吸収，排泄，臓器分布，体内代謝など，実用に要する基礎的データをできる限り広く集めることを試みた○これに加えてモデル疾患動物に投与し，治療効果の判定にも着手している。
幸いにも各班員諸氏の御努力のおかげで，めざましい研究成果がこの一年間で得られたのである0本研究が厚生省の行った新薬開発研究事業の最初の例の1つであることから，この研究成果の今後に及ぼす影響も大きいと考えられるので，ここに研究の詳細をまとめて刊行することとした。
この成果がわれわれの次年度の研究の大きな礎石となることは別としても，近縁の研究を行っておられる方々の御参考にもなると信じている。
最後に，本研究の推進に援助を惜しまれなかった厚生省薬務局の方々，本研究に協力され，かつ多忙の中にも報告書を執筆して頂いた班員の方々，さらに本報告書の作製を含め，本研究の事務を担当して頂いた大正製薬の方々に深く感謝するものである。
今

相

和

友

目

次

今堀 和友

3

1. E‑64及びその類縁体の製造法に関する研究

沢田 二郎

9

2. L‑トランスエポキシコハク酸製造法に関する研究

沢田

二郎

15

大関

正弘

25

大関

正弘

37

5. E‑64及びその類縁体の生体膜に対する作用に関する研究

大関

正弘

41

6. E‑64及びその類縁体の局所刺激作用に関する研究

大関

正弘

45

7. E‑64及びその類延体の細胞毒性に関する研究

大関

正弘

47

8. E‑64の筋ジスチキンに対する効果(臨床観察)

杉田

秀夫

51

9. E‑64及びその類縁体の薬効に関する研究

大関

正弘

55

福原

武彦

63

研究報告書の作成に当って
Ⅰ

Ⅱ

製

安

造

方

全

法

性

3. E‑64及びその類縁体の急性及び亜急性毒性に関する研究
4. E‑64及びその類縁体のサルモネラ菌に対する突然変異原性に関する研究ⅢIn vivo の効果(効力試険)(一般薬理)

10. E‑64の一般薬理作用〜特に呼吸・循環機能及び中枢神経系に及ぼす影響〜

Ⅳ In vitroの効果
11.微生物が産生するプロテアーゼ阻害物質の成熟ネズミ肝初代培養細胞に対する影響

12.培養筋組胞に対するE‑64の作用

市原

明

83

小沢鍈二郎

91

大槻

磐男

95

宮武

正

99

12追補. E‑64処理を施したニワトリ骨格筋培養細胞の電子顕微鏡観察13．筋ジストロフィー症における筋膜脂質に関する研究〜筋ジストロフィーチキンの筋ガングリオシドに及ぼすE‑64の効果について〜

14．筋蛋白質代謝回転

江橋 節郎 103

15. E‑64及びE‑64誘導体によるラット肝カテプシンB及びLの阻害について(in vitro, in vivo)

勝沼

信彦

109

16．カルシウムプロテアーゼと蛋白質燐酸化反応による生理機能の調節に関する研究

西塚 泰美 117

17. Ca依存性中性プロテアーゼ(CANP)に対するE‑64の効

今堀 和友 131

果

18. Ca依存性プロチアーゼの活性測定法の問題点

杉田 秀夫 139

Ⅴ 吸収．分布．代謝，排泄19. E‑64及びその類縁体の生体内動態に関する研究

大関 正弘 145

20. E‑64のラット肝薬物代謝酵素に対する影響

北川 晴雄 155

21. E‑64及びその類縁体の生物薬剤学的研究

沢田 二郎 159

Ⅰ

製

造

方

法

1．E一朗及びその類縁体の製造法に関する研究

沢田 二郎

2．L−トランスエポキシコハク酸製造法に関する研究沢田 二郎

1．E−64及びその類縁体の製造法に関する研究

＊

晴司

＊

＊

貞

表1E−64及びその顆縁体の構造

的H＼E−64はAsp．japonicusの固体培養物中より発見されたチオールプロテアーゼ特異阻害物
質であるl）。今掘2）及びSugitaら3）は本化合物
及びその類縁体が動物筋肉中のチオールプロテ
アーゼである

正清

＊

井熊

玉小

紀孝文

＊

二

和

β
良

田

田達村

＊

沢

目

花安大

研究協力者

Ca＋＋activated neutral pro・tease（以下CANPと略）活性を強く抑制する／CO−NH−？H−CO−R【
CH量

H∞C／＼0／＼Hi

cH3／＼cHI

E−64

ーNH−（CH2）一一NH−C−NIi211

ことを明らかにし，更に筋ジストロフィー症鶏への投与実験によりin vivoにおいても本酵

NfⅠ

E−64−aE−64−b素に有効に作用することを認めた。我々は既にE−64及びその類縁化合物の願酵法並びに合成法による製造法を報告して来た11・3）〜6）。

−Nに−（CH2）一一NH2−NH−CH−CH2−CH−CH．
l

COOH
E−64−CCHI−NH−CH2−CH2−CH−CH3lCH】

本研究の目的は人の進行性筋ジストロフィー症に対する本薬剤の臨床的な適用を意図し，その開発研究に携わる「E−64開発研究班員」への試料の供給並びに医薬品開発に必要な製造法に関する基礎的な検討にある。
方l法

1．E−64及びその類縁体E−64−a，−b，−Cの製造法の検討並びに製造
E−64及びその類縁体の構造を表1に示した。

類縁体a，b，Cについては基本的にはE−64の合成法に従い，ペプチド合成の常法により合成した。額縁体の合成の各段階の反応は大別して5つの型に分類出来るのでその代表例を以下に述べる。又，表1のRにあたるアミン部分の原料合成は全て既報の方法一）によった。
1）トButoxycarbonyl−Ll川eyl−LlellCime
ethyl ester
t−Butoxycarbonyl−L−leucine monohyd−

これらの合成法並びに得られたDL−E−64及びrate（17・4g），L−leucineethylesterhydro−

その混合物から各L及びD体の分別結晶についChloride（13．7g），N一methylmorpholineては大筋において既報6）の方法に従った。又，一部アグマチソを出発原料としてHanadaの方法山 も再検討した。

ら（15．5g）及び1−hydroxybenztriazole（10．4g）をtetrahydrofurane300ml及びdime−
thylformamidelOmlの混液に懸濁し，水冷故押下，1−ethy1−3−（3−dimethylaminopropyl）＊大正製薬株式会社総合研究所

Carbodiimidehydrochloride（14．8g）を徐
9

Ⅰ

製

造

方

法

た。そのAcOEt層を取り，10％Citricacid，
飽和NaHCO3，飽和NaCl水で順次洗浄，乾燥後100mlになる迄濃縮し，n−hexaneを加えて結晶化した。収量19g（73％），mp139〜

ethanol溶液60mlを水冷授押下滴下した0
氷冷下1時間，更に，室温で1時間位拝後，反応液に氷水700mlを加えAcOEtにて抽出した。水層を水冷しながら，HClでpH2以下に調整し，AcOEtで抽出した。AcOEt層を飽和
NaCl水で洗浄し，乾燥後濃縮L ethylether
を加えて結晶化した。収量16．3g（90・6％）mp

1400，〔a〕fF−49．80（C＝1，EtOH），Anal・Calcd・

158〜1590，〔α〕if＋51．70（C＝1，EtOH）Anal・Cl，H36N205：C，61．26；H，9．74；N，7・52・

Calcd．Cl，H26N205：C，57．31；H，8・34；N，Found：C，61．36；H，9．98；N，7・35・

8．91．Found：C，57．29；H，8．13；N，8・78・々に加え，氷冷授拝下2時間，更に室温で5時間授拝した。反応液を減圧下濃縮し，残法を300mlのAcOEt及び200mlの水に溶解し2）LlellCylisoamylamime
t−Butoxycarbonyl−L−leucyl−isoamylamine（18g）を99％HCOOH200ml中に溶解し，室温に3時間放置後，減圧濃縮した。残汝を水100−mlに溶解し，水冷下10％NaOH水溶液
にてアルカリ性にした後，Chloroformにて抽出した。Chloroform層を飽和NaCl水にて洗浄，乾燥後溶媒を留去し，そのまま次の反応に利用した。
3）N一〔Ⅳ−（L−3−tramS−ethoxycarbonyloxirane−25）Ⅳ−〔N−（し3−tranS・Carboxyoxirame−2−Carbo一myl）−L−leucyl〕−1，4−diamimobutane（E−64−a）
N−〔N−（L−3−tranS−Carboxyoxirane−2−Ca・rbonyl）−L−leucyl〕−Nl−benzyloxycarbony1−
1，4−diaminobutane（3．8g）をMeOH：Ac
OH：H20（8：2：1）混液 EOmlに溶解し，5％Pd−C（1．2g）を加え弱い水素気流下室温で6時間激しく授拝した。触媒を軒別後，炉液を濃縮し，aCetOne及びethyletherを加え生じた沈でんを炉取し，H20−aCetOneより結晶−earbonyl）−Lleucyl〕−しleucine ethylester

化した。収量2．16g（81％）mp203〜2050

L−Monoethylepoxysuccinate（8．54g），L−（decomp．），〔α〕㌘＋30．60（C＝1，H20），Anal・

leucyl−L−leucineethylester（14・28g）及びCalcd．Cl．H25N305：C，53．32；H，7．99；N，

1−hydroxybenztriazole（7・43g）をtetra−

13．33．Found：C，53・02；H，7・89；N，13・04・hydrofurane200miに懸濁し，水冷授押下，
dicyclohexylcarbodiimide（15・9g）のtetra−hydrofurane溶液100mlを滴下した。水冷
下2時間，更に室温で5時間置拝した後，生じた沈でんを炉別し，炉液を50mlになる迄濃縮
し，AcOEt200mlで稀釈した。これを1N
HCl，飽和NaHCO3，飽和NaCl水で洗浄，乾燥後，溶媒を留去した。残透を ethyl etherに溶解し，petrOleumetherを加えて結晶化した。収量14．5g（67％），mp94〜950，〔α〕訂2．E−64及びその類縁体のユH一ラベル体の製造
1の方法で得られたDL−E−64及びその煩縁体をWiltzbach法により3H置換した

0

結果及び考察E−64の合成ルート及び収率は図1に示した0
この方法で得られたL−E−64及びD−E−64〔L及びDは各々構成々分であるトランスーエポキ
シコハク酸の光学活性を示し，それぞれ（2S，＋18．70（C＝1，EtOH），Anal．Calcd．C20H34

3S）及び（2R，3R）の配位を有している0〕N202：C，57．94；H，8．27；N，6．76．Found：の物性を表2に示す。合成的に得たL体のE−
64は天然のE−64とよく一致した。K・Hanada

C，57．77；H，8．23；N，6．81．
4）Ⅳ−〔N−（L−3−earboxyoxirame−2−Carbonyl）一L−leucyl〕−isoamylamime（E−64−C）の方法4）と比べると行程数も短縮出来，収率も大幅に上昇したが，なお煩雑で0Verallの収Carbonyl）−L−leucyl〕一isoamylamine（19．6g）率が低い。E−64の構成々分の一つであるアグ
マチソを出発原料として利用し，K・Hanada

をethanol150mlに溶解L KOH（4．8g）のの方法4）を一部改良した方法も検討した0行程

N−〔N−（L−37ethoxycarbonyloxirane−2−101・E−64及びその類縁体の製造法に関する研究
ES

L −L e ul ，4 −D Zia m in Obutane Yield（％）

H・1／2H2CO3

60

9＝NH

74

NH−NO2C l

C l′B o cOH

H B r・
H

9＝NH

98

NH−NO2
izO

OB z

B

C＝NH

OC

95

NH−NO2
iz O

0

H

H

C＝NH

90

NH−NO2
■
zO
l

CH＝NH

63

NH−NO2
CH＝NH

HO

88

0ver−
CO−NH−CH−CO−NH−（CH2）・−NH−C＝NH〉r；il：21
IH。2：〉C▽C、H

l

NH2

CH2
【

CH

／＼
H3c cH3
図1 E−64の合成法
表2

合成L及びD−E−64の物性

Natural

l

L

I

D

mp

231−2340〔α〕葺（C＝1，0・lNHCl）＋24．40＋24．00−77．90Elementalanalysis

Found．Calcd．

Found．Calcd．

Found．Calcd．

C

49．47

49．17

49．01

49．17

45．69

H

7．56

7．70

7．65

7．70

7．85

7．94

N

19．15

19．11

19．06

19．11

17．97

17．80

C15H

N505・1／2H20

C15H

N505・1／2H王0

C15H

N505・2H20

Molecular formulaHPLC

196−2000

233−2370

k′

5．64

5．64

45．79

6．18

（HPLC：Nucleosi15cm，4Ⅹ150mm，550，0・5％HIP0．−10％CH30HTH20）

数は短くなる利点はあるが，アグマチソが高価あれる。

であること，又，エポキシコハク酸モノエステ

頸縁体a，b，Cの合成ルート及び収率を図2〜4に括めた。又，それらの物性を表3に示し

ルよりの収率が図1の方法では約55％であるのに比して約30％と低いことが欠点である。アグ
マチソ及び光学活性エポキシコハク酸モノエス
テルが容易に又安価に入手出来れば，この方法を利用したE−64の合成は更に容易になると思た。本年度中に得られたE−64及びその煩緑体の総計を表4に示す。いずれの類縁体もE−64に比較し，その合成行程も短く，しかも高収率で得られることが解った。又，実験室レベルで
11

Ⅰ製 造 方 法
ES L−Le。1，4−Diaminobutane Yield（％）
Boc

OH

H

Boc
H

EtO

Z

85

Z

1
7

OH

60

7
9

EtO

Z・1／2H2CO3

Z

HO

H

H＼〈

〈

5
8

Z

9
9

HO

l

／CO−NH−CH−CO−NH一（CH2）4−NH20verall：30

CH2CH

H。2：＞▽C＼Ht

H3c cH3
図2

E−64−aの合成法

L−Leu L．Leu

Boc

OH

H

Boc
OH

H

Yield（％）

OEt・HC1

85

0Et

88

0Et

95

0Et

67

0H

86

CH2 I1 CH2 1
HH。2。〉式N
蔓CO￣NH．？H￣CO2 Overall‥41
CH

／＼

／＼

H3c cH。H，C CH。

図3E−64−bの合成法

L−Leu Isoamylamine

B oc

H

H

Boc
0

OH

Yield（％）

96
98

H

70

0
95

H．

CO−NH−CH−CO−NH−CH2

H。2。）C▽C＼H
／

？H2

9H2

ノCミ

／Cミ

H3c cH3HbC CH3
図4 E−64−Cの合成法
120verall：63

1・E−64及びその類縁体の製造法に関する研究
表3 E−64類縁体の物性
CompoundE−64−aL

220−225（decomp．）

D
E−64−bLD

E−64−C〔α〕DMolecular formula（MlV）＋62．10（C＝1，H20，280）

Cl．H，5N，05

mp（0）195−199（decomp・）−70・00（C＝1，H20，250）

105−107＋20．00（C＝1，EtOH，260）

205−207（decomp・）L

158−159D

83−85＋51．70（C＝＝1，EtOH，290）

C15H26N205−88．00（C＝1，EtOH，300）（314）

表5 3H−ラベル化合物の製造
Total Speci丘cradioactivity activity（mCi）（〝Ci／mg）

21．62

92

E−64−a

2．04

22．9

0

E−64−C

18．25

365

1

E−64

1

2

（by Wiltzbach method）
4

1
0

論

5

7
一

3

4
2

D

結

5

D
DL
L

H26N20，
（348）

5

DL
L

E−64−CCl−96・30（C＝1，EtOH，260）

表4 昭和54年度に製造したE−64及びその類縁体の総量

E−64−b（315）

0．1

はスケールアップも可能である。C，b，aの順に合成が容易であり，それぞれの0Verallの収率にそれが反映されている。aについては光学的に純粋なモノペソジルエポキシコハク酸が得られれば1段階行程が短縮出来，より収率が上昇すると思われる。bについては，D体は結晶性が良いのに反し，L体は悪い。この点が大きな欠点となっている。一方，Cは中でも一番行
程数が短く，各段階の収率も総じて高く，又，結晶性も良く合成に関してはほとんど問題がない。Cに関するかぎり大量合成の最大の問題点
は光学的に純粋なモノエチルエポキシコハク酸
製造法にあり，この問題が解決すれば医薬品として開発して行く上での製造上の大きな問題はなくなると思われる。
3H一体の製造結果は表5に示す様にE−64，−a，−Cについては3H置換，単に精製し使用出来る標晶が得られたが，E−64−bは生成物が不安定なため，Wiltzbach法により3H−ラベル
体を得ることは出来なかった。

1．E−64及びその額縁体の合成的製造法を確立し，必要なサンプルを各班員に供給した。
2．E−64及びその類縁体の3H−ラベル体を製造し，各班員に研究材料として提供した。
文

献1）Hanada，K．，Tamai，M．，Yamagisbi，M．，Oh−mura，S．，Sawada，J．，Tanakn，Ⅰ．：Isolation

andCharacterizationofE−64，a neW thiolpro・
teaseinhibitor，Agric．Biol．Chem．，42，523，
1978．

2）今掘和友：細胞内蛋白分解酵素の新しい役割，
第20回医学会総会々誌Ⅰ，60，1979．
3）Sugita，H．，Ishiura，S．，Su2；uki，K．，Imahori，
K．：Inhibition of epoxide derivative on
Chicken calcium−aCtivated neutral protease（CANP）in vitro andin vivo，J．Biochem．，
87，339，1980．

4）Hanada，K．，Tamai，M．，Ohmura，S．，Sawada，J・，Seki，T．，Tanaka，Ⅰ．：StruCture and syn・

thesisof E−64，a neWthiolproteaseinhibitor，Agric．Biol．cbem．，42，529，1978．
5）Hanada，K．，Tamai，M．，Morimoto，S．，Ada・Chi，T．，Ohmura，S．，Sawada，J．，Tanaka，Ⅰ．：

13

Ⅰ製 造 方 法Ⅰnhibitory activity of E−64

derivatives on its derivatives，Peptide chemistry，1979，31・

papain，Agrie．Biol．Cbem・，42，537，1978・
6）Hanada，K．，Tamai，M．∴Morimoto，S．，Ada・

1979・
7）Wiltzbach，l（・E・：Tritium−labellingby ex−

chi，T．，Ogurna，K．，Ohmura，S．，Ohzeki，M・：

pOSure Of organiccompoundstotritiumgas・

Aspeci丘c thiolproteaseinhibitor，E−64and J・Am・Chem・Soc・，79，1013，1957・

14

2．L−トランスエポキシコハク酸製造法に関する研究

ロテアーゼ阻害に必須の活性基である7）。
E，64及びその類縁体a，b，Cの光学異性体のCANPに対する阻害作用について今堀ら＄）はt−ESが（2S，3S）配位を有するL体の方が，＊＊＊と略す）はE−64及びその類縁体のチオールプ＊

しトランスエポキシコハク酸（以後，L−t−ES＊

ズアップされて来た61。

暗司廣がCANP阻害剤として効正清

Asp．japonicus TPR−61の培養エキスから＊＊療法の1つとしてCANP阻害剤の開発が望ま
れている。

井熊塚

＊

する有力な推論がある2）・3）。従って，可能な治

玉小飯

紀孝一

祐

筋ジストロフィー症発症の一つの要因であると過程から有力な類縁体E−64−a，−b，−Cがクロー

＊
けい

二

和

ける中性チオールプロテアーゼ（CANP）が存在するl）。このプロテアーゼの異常な活性化が果的であること5），更には，E−64類縁体研究の

良

田

田達岡

的

筋肉中にはCaHにより選択的に活性化を受単離されたE−64

＊

沢

日

花安金

研究協力者

本研究の目的は光学活性L−t−ESを選択的に製造する方法を開発し，E−64及びその頸縁体の製造原料として供することにある。
1．合成法による

L−トランスエポキシ

コハク酸製造法の検討
方法及び結果K．Moriら（1979）は8−mutistriatin合成の中間体として，L−diethyl−tranS−ePOXy・
SuCCinateを得ている。我々はこの方法を一部改良し，D一酒石酸から，簡単な操作で，高収率にL−diethyl−tramS−ePOXySuCCinateを得，次いで水酸化カリウムで部分加水分解してモノ
エチルエステルK塩の白色結晶を得た。更にこれを水に溶かし，塩酸処理によりモノエチルエ
ステルを結晶として得た。この経路の概要を図1に示す。以下各操作を詳述し，得られた化合物の物理恒数を示す。
L−Diethyl−tramS−epOXySqeeinate（2R，3R）配位を有するD体に比して極めて高Diethy1−2−hydroxy−37bromosuccinate70

い活性を示すことを述べている。従って，E−64

gをacetone420mlにとかし，水冷摂押下，及びその類縁体をヒト筋ジストロフィー症治療

triethylamine52．6g

薬として開発していく上で，工業的規模で応用聞損拝した。析出した白色塩を炉別し，炉液を可能なし−トES製造法を確立することが極めて

減圧下濃縮し，ethylether500mlを加え，水，重要である。

lNHCl，飽和NaHCO3水，飽和NaCl水で順を滴下し，室温で6時＊ 大正製薬株式会社総合研究所

次洗浄し，無水MgSOlで乾燥した。エーテルを留去したのち，シリカゲルカラムクロマトグ＊＊ 北海道大学薬学部薬品合成化学講座

ラフィー（benzene：aCetOne＝100：3）で精製＊＊＊東京理科大学理工学部応用生物科学科

し，油状物を得た。収量，32g（収率65．4％）。
15

Ⅰ製 造 方 法
COOH

COOEt

菩一計……まHBr−AcOH

COOEt

COOH

HBr−AcOH

㌔士：

EtOH

COOEt

D−Tartaric acid

EtOOC＼。′H
N（Et）3
Me2CO

1）KOH
2）HCl

＞

H／＼。。。H

H／C＼cooEt（2S，3S）

図1光学活性トランスエポキシコハク酸モノエチルエステルの製造法

LEtIlyl，hydrogen−traTIS−epOXySuCCimatehydroxy−3−bromosuccinateをエポキシ化す

L−Diethyl−tranS−ePOXySuCCinate SO．12g

る際に，エタノール中，ナトリウムエトキシド

をethylalcho1300mlにとかし，ethylalcho1を使用しているが，この方法は金属ナトリウム200ml

potassium hydroxideを使用するため，大量にプロモヒドリンを処理

29．57gを氷冷授押下滴下し，そのまま1時間にとかした

するには必ずしも適当ではない。我々は，安全氏拝した。さらに，室温で2時間投拝したのにしかも効率よくこの行程をスケールアップすち，ethylether400mlを加え，生じた白色結る目的で，有機塩基を種々検討したところ，ト晶を炉取し，L−ethyl，pOtaSSium−tranS−epO−

リエチルアミンが最適であることがわかった。

ⅩySuCCinate67．72gを得た。これをdil．HCl

この際，溶媒系はアセトンあるいはジクロルメにとかし，ethylacetateで抽出し．水で1回タン等を用いると反応速度も大きく実用性が高洗浄後，無水MgSOlで乾燥した。減圧で濃縮後，ethylether−petrOleumetherから結晶化

いことが明らかになった。アセトン中，トリエ
チルアミンによる反応は，後処理が簡単で，大した。収量，52．0g（68％），mp61．5−62．50，

量処理が容易であり，しかも光学的に高純度のb〕if＋114．40（C＝1，EtOH），Anal．Calcd．

目的物を得ることができる。

C6H805：C，45．00；H，5．04．Found：C，45．04；

然しながら，この方法は原料として非天然型
D一酒石酸を用いわばならず，実験室レベルでH，5．18．

の合成法としてはすく・れているが，将来，E−64
考察

或いはその類縁体の原料の大量供給法としては

DL−トランスエポキシコハク酸は合成的に，コストの面で問題が残り，今後更に検討し，D一

G．B．Payneら（1959）によりフマール酸か

酒石酸に代りうる安価な原料を確保する必要がら得る方法が確立しているが，天然E−64の構ある。

成々分であるL体に関しては，K．Moriらにより僅かに，I）一酒石酸からL−diethyl−tramS−
epoxysuccinateの合成法が報告されているだけである。我々はこの方法を一部改良し，図1に示したルートにより最終的に高純度のL−ト
ランスエポキシコハク酸モノエチルエステルを得ることに成功した。Mori
16

らはdiethy1−2−

2．光学分割法による

L−トランスエポ

キシコハク酸製造法の検討
日的L−トランスエポキシコハク酸製造法研究の一環として合成的に得られるDLトランスエポ

2．レトランスエポキシコハク酸製造法に関する研究

キシコハク酸を出発原料としてこれを化学的に市販特級試薬を使用した。

分割するに必要な分割剤を開発する。
方

結

法

果

（1）アミノアルコール矧こよる分割

分割剤として安価に，しかも容易に製造可能分割剤として，先ずアミノアルコールについなアミンを用い，酸とアミンとのジアステレオて検討した。L一チロシノール，L一バリノー

マ一塩形成によるトランスエポキシコハク酸分

ル，L−プロリノールはいずれも塩の結晶化が割法を検討した。

困難であり，D−α−フェニルダリシノール，L−I）L−トランスエポキシコハク酸は，Payne

トリブトファノールは低光学収率であったが，ら（1959）の方法によりフマール酸より合成し，
これを出発原料とした。合成法の概要を図2に

L−フェニルアラニノールにより高純度の右旋性のL−トラツスエポキシコハク酸を得ること示す。

ができ，塩形成の母液より本報で使用した分割剤の一覧を表1に示す。

ノールを用いて左旋性のものを得ることができ

これらのうちアミノアルコール及び，アミノ酸
アミドの製造法は文献に従った。その概要及び文献を表2にまとめて示した。その他のものはH＼た。
佗）7ミノ酸アミドま削こよる分割
次いで，より塩の結晶性のよいことが期待さ
H／COOH H202

H。。C／C＝C＼H
図2

D−7ェニルアラニ

HOOC

COOH

b

DLトランスエポキシコハク酸の合成法

表1L−Phe−01

被験化合物
DehydroabiethylamineLTyr−01
L−Try−01
L−Va1−01
L−Pr0−01

exo−Bornylamine

D−α−PhGly−OI
L−Phe−NH2
L−Tyr−NH2
L−Try−NH2
L−Pro−NH2
D−α−PhGly−NH2
D−N，N−Dimethyl−α−PhGly−NH2

Fenchylamine

二番∴H2
Nicotine

L−N，N−Dimethyl−Phe−01
Lr−Phenylethylamine
α−b−Nitrophenyl）ethylamine

但⊥琶
17

l

製

造

方

法

R
H2N−CH−CH2−OH

芝H−COOH斗H2N−…H−COOEtく芸二

H2N−CH−COOH一一一HCl＞H2N−CH−COOEt

R

H2N−CH−CO−NH2

レPhenylalaninoI
S．Yamada et al．，Chem．Pharm．Bul1．，13，995，1965・レPbenylalanine amide
F．BergelandM．A．Pentherer，J・Chem・Soc・，3973，1964・
K．Blau and S．G．Waley，Biochem．J．，57，538，1954・
D−α−Phenylglycine amide

D，G．Neilson and D．E．Ewing，J．Chem．Soc．（C），393，1966・
表3トランスエポキシコハク酸の分割例＊＋117．8。〔J．OhhashiandK．Harada，Bull・Chem・Soc・Japan，40，2977，1967・〕

れるアミノ酸アミド掛こついて検討した。L−プ

以上，3つのグループの分割剤のうち，成功

ロリソアミドの塩は吸湿性であり，L−チロシソ

したものを比較すると，L−フェニルアラニソ

アミド，L−トリブトファソアミドは低光学収率

アミドは塩が高純度で得られ，通算収率がJ．

であったが，レフェニ々アラニソアミドとD一

OhllaSIliら（1967）によるエフェドリンの場

α一フェニルグリシンアミドでは満足すべき光学

合よりも高いので，今回検討したもののうちで収率であった。分割剤のアミノ基のエポキシ基への付加反応をさけるために，D−α−フェニル

最もすぐれた分割剤といえる。次いで，L−7ェ
ニルアラニノール，D−α−7ェニルグリシンア

グリシンアミドのアミノ基をジメチル化したもミドがすぐれている。デハイドロアビェチルアのを分割に用いたが塩の結晶化が困難であっミンは収率は多少低いが，安く市販されているた。

のでアミノ酸誘導体よりコストの点ですく一れて（3）7ミン矧こよる分割
さらに，アミノ酸以外のアミン1こついて検討いる。これらの結果を表3にまとめて示す。
考察した。ニコチンの塩は吸湿性であり，しα−フェニルエチルアミン，しα一（p−ニトロフェニル）−有揆酸の光学分割法には塩の形成による方チルアミンでは低光学収率であったが，デハイ

法，誘導体による方法，酵素を利用する方法，
クロマトグラフィーを利用する方法等がある

ドロアビェチルアミンでは純粋な右旋性のしが，本研究では酸と分割剤アミンとのジアステェチルアミン，ユキソポルニルアミン，フェソ

トランスエポキシコハク酸を得ることができ

レオマ一塩形成によるDLトランスエポキシコ

た。

ハク酸の光学分割法を検討した。トランスエポ

18

2．L−トラソスエポキシコハク酸製造法に関する研究

キシコハク酸の光学分割に関しては若干の報告があり，よく用いられるアルカロイド頬のシソ
コニソ，ストリキニーネ，ブルシソ等では成功

方法（1）L−トランスエポキシコハク酸を培地中しなかったが，モルヒネ，エフェドリンを用いて分割できるという報告がある（Ohbasbiら

へ直接生成する糸状菌の検索。

1967）。しかし，モルヒネは麻薬であり，エフ

ハク酸を生成する糸状菌の検索。

ェドリンは覚せい剤原料であるので，これを工業レベルで使用することは不可能である。本報
では，手軽で安価に使える分割剤アミンとして，アミノ酸誘導体を中心に検討した。分割剤として市販されているα−アミノ酸の誘導体を用いているので，必要ならアンチボードのアミ（2）フマール酸からL−トランスエポキシコ（3）DL−トランスエポキシコハク酸を資化し，D体だけを分解する微生物の検索。
以上3つの条件を設定し広く有用微生物をス
クリーニングする。
結

果ノ酸を用いることによりフェニルアラニソの例
で示した様に任意の旋光性のトランスエポキシ（1）L−トランスエポキシコハク酸を堵地中へ直接生成する糸状菌の検索

コハク酸を得ることができるのがこの分割法の利点である。

いてスクリーニングを行ったが，陽性の結果が保存株45株，新たに分離した株計124株につ蓑3に示したように実験室レベルではある得られなかったので，更に土壌サンプル131点

が，安価に製造可能なDLトラソスエポキシコから糸状菌200株を分離した。その内訳は，ハク酸を効率よく分割しうる2，3の分割剤をAspergillus属29株，Penicillium属44株，開発することができた。しかも，これらはいず

Fusarium属4株，Mucor属26珠，Rhizopus

れも安価に，かつ，容易に製造しうる。今後

属5株，担子菌2株，その他90株であった。現は，このスケールアップの検討，更には，トラ

在これらの菌株についてトランスエポキシコハ

ンスエポキシコハク酸エステルの分割等，そのク酸生成能を検索中である。

実用化，即ち量産に対する検討が必要である。

佗）フマール酸からL−トランスエポキシコハク殿を生成する糸状菌の検索

結論

分離細菌123株について，フマール酸を唯一

DL−トランスエポキシコハク酸を分割し，L−の炭素源として資化の有無，程度を調べた。そトランスエポキシコハク酸を製造する目的で，の結果，生育の良好（フマール酸を殆ど資化）

安価に，しかも容易に入手しうる分割剤の開発

なもの88株，生育中程度（残存7マール酸が認められるもの）のもの24株，生育の認められな研究を行い，少くとも実験室レベルの規模で分割可能なしフェニルアラニソアミド等2，3の有用な分割剤を兄い出すことができた。
3．徴生物学的方法による

L−トランス

エポキシコハク酸製造法の検討
日的かったもの11株であった。生育中程度の株及び最終pHの低かった株など22株の培養炉液について，イオン交換樹脂処理により脱塩後，薄層クロマトグラフィーを行った。供試株中E−24−1，E−20−1，E−31，E−14−1及びb−21−1の5株において，■トランスエポキシコハク酸とRfの一致するスポットが認められた。現在これらの

L−トランスエポキシコハク酸製造法研究のサンプルについてその生成物を確認中である。

一環として徴生物学的方法による製造法を検討する。

又，生育の認められなかった株については，グルコース或いはコハク酸を添加して菌を生育させ，フマール酸からのトランスエポキシコハク酸への転換の有無を検索中である。
19

Ⅰ製 造 方 法（3）Dl一一トランスエポキシコハク酸からD体のみを資化する微生物の検索

総括（2）で用いた分離細菌123株についてDLトラ

E−64及びE−64頼縁体の合成原料として将ンスエポキシコハク酸の有無及びその程度を調来実用可能なしトランスエポキシコハク酸のべた。その結果，資化能即ち分解能のすぐれた製造法の研究を開始した。

（残存トランスエポキシコハク酸の認められな

即ち，1）合成法による方法，2）DL体の光学いもの）株は22株，資化能はあるが残存トラン
スエポキシコハク酸の認められるものは4株で分割法による方法，3）徽生物学的方法の3つ？
方向からアプローチした。

あった。その他の株は分解能が認められなかっ

合成的にフマール酸を原料としてDL体を製た。現在，完全分解菌に関しては変異株の造造することは極めて容易であり原料面での問題

成，又，中程度分解菌に関しては質的分解能はないが，D一酒石酸から光学活性なし一トラン（例えはD体のみ分解）について検討中であスエポキシコハク酸エステルを製造するには技る。

術上の問題は解決されたが原料の入手が困難で考察

醗酵法により直接製造する，或いは7マール

かつ高価なため量産法としては必ずしも実用的ではない。従って，合成的にはD一酒石酸にかわりうる原料の開発が今後の課題である。

酸からの変換，更にはDL体を炭素源としてD

一方，醗酵法によるしトランスエポキシコ

体だけを選択的に資化する徴生物のスクリーニ

ハク酸の直接製造能を有する徴生物の検索を行

ング等種々の角度から微生物を利用してL−トったが現段階では応用可能な有用菌は見出されランスエポキシコハク酸製造法の検討を行っていない。
更に，安価に供給しうるDL体を化学的，或た。
現在フマール酸を変換し培地中にトランスエ

いは徴生物学的手法で分割しL体を製造する方

ポキシコハク酸と同スポットを与える糸状菌，法を検討した。化学的方法としては容易に製造

或いは，DL体を資化するバクテリアを分離してその生成物の確認を行っている段階である。

しうる分割剤を開発するという前提でアミンとアミノ酸誘導体を中心に検討し，L一フェニルア

今後変異株の作成等によりこれらの微生物がト
ランスエポキシコハク酸製造の一手段となりう

ラニソアミド，デハイドロアビェチルアミン等が極めて有用であることを明らかにした。徴生

るか否かその質的な検討を行う計画である。
更には，将来の実用化を考える時，これらの物学的にはその可能性を示唆するデータが得られつつあるが更に今後の検討を要する。

基礎データをもとに今後はDLトランスエポキ

今後更に，これらの基礎データをもとに，エシコハク酸エステルの緻生物学的（酵素学的手

ポキシコハク酸のエステル体の化学的，或いは段を含めて）分割法が重要であろう。

酵素的手段による分割等も有望と期待されるの結論

醗酵法によるL−トランスエポキシコハク酸

で，L一トランスエポキシコハク酸の工業的規模での実用化の見通しは極めて明るいと考えられる。

製造に有用な微生物のスクリーニングを行い，参考文献

フマール酸からの変換能を有する糸状菌，或いはDL体を部分的に資化するバクテリア等数珠を分離した。現在その醗酵生成物について精査中である。

1）今堀和友：筋肉のCa＋十依存性プロテアーゼ，代謝，16，139，1979．
2）石浦章一，今掘和夫：肪カルシウム依存性蛋白分解酵素とその抑制物質について，日本臨鼠35，
3910，1977．

3）杉田秀夫：Z線構成蛋白とカルシウム依存性蛋
20

2．L−トラソスエポキシコハク酸製造法に関する研究

自分解酵素，日本臨床，35，3915，1977．
4）Hanada，E．，Tamai，M．，Yamagisbi，M．，
Ohmura，S．，Sawada，J．，Tanaka，Ⅰ．：Isolati■on339，1980．

6）沢田二郎：第1回E−64研究Ⅱ会議発表要旨，
1979．

and Characterization of E−64，a．neW thiol

7）Hanada，K．，Tamai，M．，Morimoto，S．，Ada・proteaseinhibitor，AgriC．Biol．Chem．，42，

Cbi，T．，Ogllma，K．，Ohmura，S．，ObZeki，M．：

523，1978．

A speciBc thiolproteaseinhibitor，E−64and

5）Sugita，H．，Ishiura，S．，SllZuki，K．，Imahori，
K．，：Inhibition of epoxide derivatives on
Chicken calcium・aCtivated neutral proteaseits derivatives，Peptide chemistry，1979，31，
1979．

8）今掘和友：私信．

（CANP）in vitro andin vivo，J．Biochem．，87，

21

Ⅰ

安

全

性

3．E−64及びその類縁体の急性及び亜急性毒性に関する研究………………………‥大関正弘

4・E−64及びその類縁体のサルモネラ菌に対する突然変異原性に関する研究・，……・大関 正弘
5．E−64及びその類縁体の生体膜に対する作用に関する研究………………………‥大関正弘

6．E−64及びその類縁体の局所刺激作用に関する研究

大関 正弘

7．E一朗及びその類縁体の細胞毒性に関する研究

大関 正弘

3・E−64及びその類縁体の急性及び亜急性毒性に関する研究

章＊
早百合＊

的

E−64及びその類縁体a，b，Cの安全性研究の一環として，これらをマウス及びラットに皮下及び腹腔内投与し，その急性毒性を検討する。
方法

動物は4週齢のdd系雄マウス（静動協：体重20g前後）及び6週齢のWistar系堆ラット（静動協：体重200g前後）を5〜10日の予備飼育の後，実験に使用した。被験物質はE−64をアラビアゴム懸濁液，E−64−aを生食水溶液
E−64−b及び−Cは重曹水で中和溶解後生食水溶液とし，一投与段階あて10匹の動物に各々皮
下及び腰艦内投与した。各被験物質投与後7日間は一般症状を観察するとともに生死を確認
し，死亡例は発見後できるだけすみやかに，また投与7日後生存例は屠殺剖検し諸臓器の異常の有無を観察した。
結果（1）一般症状
マウスではE−64及びa，b5000mg／kgの皮下あるいは腹腔内投与により，投与24時間後

＊

西
上

＊

河
尾

1．急性毒性
目

男＊

＊

保

雄明子

本

貞正恭

樽

板村

研究協力者 笹 島 道 忠＊

中木岸

大 関 正 弘＊日以降はこれら症状も消失し，他に新たな症状変化の発現もなかった。E−64−Cの5000mg／kg
投与では皮下，腹腔内投与とも鎮静症状が継続した状態でうずくまったまま投与24時間以内に死亡した。しかしE−64−Cの2500mg／kg投与
では，これらの変化はまったく観察されなかった。
ラットでの皮下あるいは腹腔内投与においてもその症状はマウスとほとんど同様であったがE−64の皮下投与及びE−64−Cの腹腔内投与で出現した死亡例はマウスの場合より死亡までの日数がやや延長し，いずれも投与3日目に死亡した。この間鎮静症状とともに採食活動もまっ
たく無くなり，また被毛の粗毛化が観察された。
佗）剖検所見
E−64−C投与群で死亡したマウスでは皮下，腹腔内投与例とも著変は認められず，ラットでは腹腔内投与例に腹腔内脂肪の変性が観察された。投与7日後生存例ではマウスの場合，皮下，腹腔内投与とも，いずれの被験物質においても胸腺萎縮，腎表面の槌色性変化，肝の限局性壊死を示す例が観察された。しかしラットではこれらの変化は明らかでなかった。なおいずれの被験物質も皮下もしくは腹腔内に検液の貯留は認められなかった。

まで自発運動あ重度な抑制とともに一カ所に静（3）LDso

止状態を床づ儲静症状が観察されたが，投与2

LD50値を一括して表1に示す。E−64のラットにおける皮下投与，E−64−Cのマウスにおけ＊大正製薬株式会社総合研究所

る皮下及び腹睦内投与ならびにラットでの腹腔
25

Ⅰ

安

全

性

表1E−64及びその類縁体のマウス及びラットにおける急性毒性

LDS。（95％C．L．）mg／kg
Animals

Route Sex

E−64

S．C．

8

E−64−a l E−64−b l E−64−C

＞5000

＞5000

＞5000

2500−5000＞5000

2500−5000

Ⅰ．P．

8

＞5000

＞5000

S．C．

8

1000−2500

＞5000

＞5000

＞5000

Ⅰ．P．

8

＞5000

＞5000

＞5000

1000−2500

内投与を除いて，いずれの場合も物理的に投与限界量である5000mg／kgにおいても死亡例が認められず，これらのLD50倍は5000mg／kg
以上と判断された。なお上記のE−64及び−C
は供試サンプル量の都合上，LD50倍の範囲を示すにとどめたが，いずれも1000mg／kg以上のLD50と推察された。
考察

E−64及びその類縁体はマウス，ラットの皮下及び腹陸内投与においてそのLD50倍がいずれも1000mg／kgを越え，総じて急性毒性の弱い物質群と推察された。被験物質相互間の比較では死亡例のあったE−64及びE−64−CがE−
64−a，−bに比較して若干強いようであるが，一方一般症状，剖検所見では4者の相似性が高い
ことから，質的にはいずれも同様な作用を右す
るものと考えられる。また各被験物質とも投与経路の相違による毒性の差が少ない事から，いずれの投与経路においてもほは同程度でかつ良好な吸収性を示す事が推察される。なお，今後更に種差，性差およびE−64−Cにおける詳細な検討が必要と考えられる。
結論

E−64及びその類縁体のマウス，ラットにおける皮下及び腹腔内投与による急性毒性を検討し，以下の結論を得た。
1）E−64及びその煩縁体a，b，CのLD50億
は皮下，腹艦内投与とも1000mg／kg以上であった。
2）いずれの被験物質も大量投与により，肝，腎への影響が示唆された。
2613）投与経路及びマウス，ラット間での種差による毒性差は認められなかった。

2．亜急性毒性−1）目

的E−64及びその顆縁体a，b，Cの安全性研究の一環として，これらをラットに2週間皮下連続投与し，その亜急性毒性を検討する。
方法（1）動物：生後5週齢のWistar系雄ラット（静動協）を1週間の予備飼育ののち，1群8匹あて群別し，実験に使用した。これらの動物の投与開始時体重は104〜133gであった。動物は温度23土20，湿度55土5％のバリヤーシステムの動物室で飼育し，飼料（オリエンタル酵母社
製MF）と水は自由に摂取させた。
（2）投与量，投与方法：検液はE−64をアラビアゴ
ム懸濁液，E−64−aを生食水溶液，E−64−b及
び−Cは重曹水にて中和後生食水溶液とし，各々5，10％（W／v）液に調製した。投与量はいずれの被験物質も200及び400mg／kg とし，投与容量は体重100gあたり0．4mlとして1
日1回14日間，毎日定時にラットの背部に皮下投与した。対照群には5％アラビアゴム液を同様に投与した。
（3）検査項目：
1）一般症状；毎日一般症状の観察及び体重測定を行うとともに1週間に2度摂食量の測定を行った。
2）血液学的検査；14日間の投与終了後，エーテルによる軽麻酔下に限苗静脈叢より採取した3．E−64及びその類縁体の急性及び亜急性毒性に関する研究︿uこも芯き合〇四ノr一一p一一小−−サーーて一一一：Control′一一A一一サ′′〇・・一一：E−64≠ニ＿一心−＿＿・

−−−4°
丁

：

−−−一−

△

A

E−64−a 200m9侮
400m9Ag
E−64−b 200喝ル9

A・一一d

X−X
X一一一一方05

10200m9几9400喝几9400mg／k9

E−64−C 200m9ノ旬
400m9Ag
15（Days）

図1E−64及びその類縁体のラットへの2週間連続投与における体重変動

新鮮血を用い，赤血球数，白血球数，血小板数（ミクロセルカウンター：東亜社），ヘモグロビ
ン量（Cyanmethemoglobin法），ヘマトクリ

ット値（毛細管遠心分離法）を測定した。
3）血液生化学的検査；投与終了後，エーテルによる軽麻酔下に股動脈より採取した新鮮血を遠心分離して得た血清についてオートアナライ
ザー（日立500型自動分析装置）を用い，総蛋
白量（Biuret法），A／G比（アルブミン／総蛋
白−アルブミン），グルコース量（ブドウ糖酸
化酵素法），尿素窒素量（Urease−Indophenol法），クレアチニソ量（Jaだe法），総ビリルビ
ソ量（Jendrassik−Cleghorn法），総コレステ
P−ル量（Lieberman−Burchard法），トリグ
リセライド（ヤトロンTGTEキット法），GOT・GPT活性（Reitman−Frankel変法），ALP活性（Kind−King変法），LI）H活性（ピルピソ酸

間尿を採取し，尿量，クレアチニソ量（Jaだe法）を測定した。
5）病理解剖学的検査；投与終了後，エーテルの軽麻酔下に放血致死させ，開胸腹して胸部，
腹部諸臓器を観察し，摘出した脳，心，肺，肝，腎，脾，胸腺，下垂体，甲状腺，副腎，精巣については各々重量を測定した。これら諸臓器のうちの肝，腎ならびに大腿筋については10％ホ
ルマリン液で固定後，常法のごとく切片を作製
L H−E及びPAS染色を施し，病理組織学的検索を行った。
結果

投与期間中，いずれの被験物質投与群においても死亡及び一般症状の変化は観察されなかった。

ックスー日本エームス社）の半定量的検査を行

体重変動を図1に示す。E−64の200，400
mg／kg群，E−64−a，−Cの400mg／kg群に比較的投与初期から有意な体重増加の抑制が認められ，この変化はE−64の400mg／kg群においてもっとも顕著であった。また体重の変化に伴って摂食量にも各々の投与群に抑制憤向が見られ，E−64の400mg／kg群に，より明らかであった。

い，また各群3匹については代謝ケージで24時

血液学的検査所見を表2に示す。いくつかのヒドラジン発色法），無機燐量（Fiske−Subba−
row法）を測定し，さらにCPK活性（ヤトロンCPK−Sキット法），Na，K（炎光法一島津原
子吸光AA−650）量についても測定した。
4）尿検査；投与終了時の強制排泄尿について
蛋白，糖，pH，ケトン体，潜血（ラブスティ

27

Ⅰ

安

全

性

表2 E−64及びその類縁体のラットへの2週間連続投与における血液学的検査所見
E 一朗

lO ソ m ml

W BC

l O ℡／m m ｝

H b

400

4 00

200

40

7 5 1 ±3 7

74 8± 43

20 0

400

76 1± 24731 ± 69730 ± 24

7 3 0 ±2 0

7 19 ± 3 0

734 ± 25

7 3 8 士4 41 0 1 ±9112士 12g ／d l14 ．
2 ±0 ．
4

14 ．
0 ±0 ．2％

47．
0 ± 1 ．1

45．
8 士 1 ．0 ＊ 4 5 ．9 ± 1 ．
4

H t
P la．

E 一朗 −b

20

2 ∝）
R B C

10ソ mm l

696 ± 74

100 ± 12

1 0 3 ±8100 ± 5105 ± 15

13 ．
8 土0 ．4

13 ．
7 ±0 ．
4 ＊14 ．
0 ±0 ．
4

13 ．
8 ±0 ．
5

9 土0 ．
7 ＊ 45 ．
3 ±1 ．5 ＊ 4 5 ．
9 ±1 ．
0
45 ．
5 土0 ．
9 ＊ 45 ．
3 ± 1 ．2 ＊ 4 5 ．

45．
9 ±1 ．
2

1 2 7 ± 1 6 ＊＊1 4 ．1 ± 0 ．
2

96 ± 1399 ± 10 ◆1 4 ．1 ± 0 ．
2

83 7± 11 1＊

7 6 6 ±9 4（
m g ／k g ）E 一朗 一C （m g ／k g ）E 一朗 −8 （m g ／k g ）（m g ／kg ）C o n trolT e s t it e m s

14 ．
0 ±0 ．
4

6 2 3 ± 14 2

5 4 5 ±7 9 ＊＊644 ± 89

7 8 0 ±6 9 ＊65 1± 1（
旧606 士 94

RBC＝Red Blood Cell，WBC＝White Blood Cell，Hb＝Hemoglobin・Ht＝Hematocrit・PZa・＝Platelet＊P＜0．05．＊＊P＜0．01

表3 E−64及びその類縁体のラットへの2週間連続投与における血液生化学的所見

T e s t item s
T od

p r o lein

C on tro lgノⅦE 一朗 （m gA g）

E一
弘 −a （m g ／kg ）E 一朗 −b （m g 几 g）

20

2（
泊

20

2（
氾

40

7．
4 ±0 ．
2 ＊l 7 ．
6 ±0 ．
1 ＊＊ 7 ．
3 ±0 ．
2＊

7．
3 ±0 ．
2 ■＊ 6 ．
9 ±0 ．
3

6，
8 土0 ．
3

7 ．1 ±0 ．
26．
7 ±0 ．
3

40

4（
氾E 一朗−C （m g ／k g ）6．
9 ±0 ．
2

4（氾

2．
4 ±0 ．
2

3．
1 ±0 ，
2 ヰ＊ 3 ，0 ±0 ．
1 ＊＊ 2 ．
3 ±0 ．1

2．
3 ±0 ．1

2．
4 ±0 ．
2

2．
5 ±0 ．
1

2．
3 ±0 ．
1

2．
5± 0．
1

G lu co s e

m gノⅦ

1 5 9 ±12

1 5 2 ±1 1

15 2 ±15

1 9 1 ±2 6 ＊＊18 4 ±26 ＊♯1 8 3 ±1 9 ＊16 9 ± 1 2

2 0 2 ±2 8 ＊

2 2 4 ±4 2＊＊

BUN

m g ／d2 1．
4 士1 ．
4

21 ．
6 ±1 ．
922 ．
9 ±1 ．
1■25 ．
0 ±2 ．
1 ＊＊ 2 1 ．
1 ±2 ．
7

C r ea tin in e

m g川

2．
5 土0 ．
3

1．
9 ±0 ．
1蠣
ヰ

1．
9 ±0 ．1＊＊ 2 ．
4 ±0 ．
4

2．
0 ±0 ．2 ＊■ 2 ．
1 ±0 ．
2 ＊＊ 2 ．
1 ±0 ．1 桝

2．
2 ±0 ．
2＊

2．
4 士0 ．
5

T o ta l b ili ru b in

m g川

0．
8 ±0 ．10．
7 ±0 ．
10．
8 ±0 ．10．
8 ±0 ．
10．
8 ±0 ．10．
7 ±0 ．
10．
7 ±0 ．10．
8 ±0 ．
10．
8 ±0 ．1

T o tal c h o le S te r O 1

m g ／d

6 5 土38 3 ±6 ＊＊9 3 ±1 0 ＊＊77 士7 ＊＊

7 2 ±4 ＊＊5 9 ±5 ＊＊6 0 ±3 ＊＊8 1 ±76 6 ±3T r igly c e r id em gノ
Ⅶ

2 10 ±2 6

14 5 ± 14 ＊＊1 75 ±1 8 ＊＊1 8 1 ±3 0

14 3 ±1 9 ＊＊14 7 ±4 1 ＊

15 6 ±1 8 ＊＊1 4 1 土2 5 ＊＊1 13 ±2 5 ＊＊A ／G

4 ±1 ．
3 ＊＊ 1 8 ．
7 ±1 ．
4 ＊＊18 ．
2 ±1 ．
8 ■＊ 18 ．
3士 1．
7 ＊＊ 1 7 ．

G OT

K −U

12 2 土1 4

13 3 土 10

2 02 ±38 ＊＊1 4 2 ± 14 ＊1 24 士1 2

1 12 ± 10

1 11 ±8

1 1 6 ±8

1 2 1 ±2 0

GPT

K −U

4 8 土76 6 ± 1 1＊＊

1 3 2 ±4 2 ＊＊5 5 ±84 9 ±1 0

4 3 ±83 8 ±5 ＊＊4 3 ±6

説）
±1 4

A l−P

K A −U68 ．
0 ±1 ．
7

7 1．
2 ±3 ．
8＊ 72．
8 ±3 ．
9 ＊＊ 6 5 ．
9 ±4 ．
8

57 ．
4 土5 ．
5 ＊＊ 5 6 ．
8 ±5 ．
6＊

4 ±6 ．
6 ＊＊ 4 5 ．
1 ±6 ．
4
到．
9 ±7 ．6 ＊■ 5 2 ．

LDH

トU

3 52 ±5 2

3 6 5 ±3 3

3 9 2 ±3 8

3 別）
土5 3

3 18 士4 5

訣）
3 ±69

3 18 ±2 4

2 6 9 ±2 6 ＊＊2 4 7 ±4 7 ＊＊CP K

I U ／12 3 7 ±2 4

2 4 1 ±1 7

2 4 5 ±2 2

2 5 5 ± 10

2 5 1 ±1 0

24 5 ±1 7

2 4 7 ±1 4

2 4 6 ±2 2

2 3 3 士1 9

IP

m g佃

9．
9 土0 ．
7

1 0 ．5 ±0 ．
91 ±0 ．
9 ＊＊ 1 2 ．
3 ±0 ．
9 ＊＊ 12 ．
5± 1．
3 ＊＊ 1 2 ．
7 士1 ．
8 ＊＊11 ．
3 士0 ．
8 ＊＊ 1 1 ．
2 ±0 ．
9 ■＊ 12 ，
1 ±0 ．
7 ＊＊ 1 2 ．

Na

m E qハ

1 4 0 土0 ．
8

13 8 ±1 ．
5嶋＊ 139土 1．
0＊

Km E q ／l5．
2 土0 ．
2

5 ．2 ±0 ．
35．
8 ±0 ．
4 ＊＊ 4 ．
9± 0．
6

Ca

m g畑

10 ．
4 ±0 ，
410 ．
4 ±0 ．
7

10 ．
6 土0 ．
4

2＊
13 8 ± 1 ．
2 ＊＊ 1 38 ± 1 ．
1 ■＊ 1 37 ±1 ．1 ＊＊ 1 3 8 ±0 ．

10 ．
6 ±0 ．
4

13 9 ± 1 ．
8

137士 1．
6 ＊＊4．
8 土0 ．
3 ＊＊ 4 ．
9 ±0 ．5

5．
0 土0 ．
5

4．
9 ±0 ．
4

5．
0 ±0 ．
510 ．
7 ±0 ．
2

10 ．
8 士0 ．
4

10 ．
9 ±0 ．
7

11 ．
0士 1．
4

11 ．
0 ±1 ．
0＊P＜0．05，綿P＜0．01

表4 E−64及びその頬縁体のラットへの2週間連続投与における臓器重量E 一朗
O r ga n S（m g ／k ）E 一朗 一旦 （m g ／k ）E 一朗 −b（m g ／k

E 一朗 −Cト（m g ／k ）C o n tr o l
孤）

4（
追

刀 ）

400

200

4（氾

H X）

B rah

g％

0 ．81 ±0 ．0 50 ．
9 1 ±0 ．
0 5 疇ヰ

0 ．％ ± 0 ．07 嶋ヰ

0 ．紀 ±0 ．0 5

0 ．電 ±0 ．0 5♯

0 ．81 ± 0 ．06

0 ．紀 ±0 ．0 5

0 ．幻 ± 0 ．
060 ．訂 ±0 ．
鋸 ＊

H ean

m g％

3 19 ±10

卸 3 ± 10 ⇒ヰ

誕B ± 2 1300±1 6 ■

3 03 ±1 6■

3 侶 ± 16

3 18 ±1 4

3 27 ± 20

33 7 土 13♯

L u ng S

m g％

4 12 ±24

4 19 ± 14

4 28 ± 23

35

±1 8

3 89 ±3 6

3 繋 ±48

4 18 ±2 0

4 02 ± 19

4 11 士3 0

L iv e rg ％4 ．17 ±0 ．1 0

5 ．31 士 0 ．14 1ヰ

6 ．訂 ± 0 ．42 わl

4 ．亜 ±0 ．
2 0 ＊l5 ．0±0 ．2 6嶋ヰ

4 ．防 ±0 ．16

4 ．tB ±0 ．25

4 ．10 ±0 ．23

4 ．11 土0 ．12

K i血 叩 Sg ％0 ．瑠 ±0 ．0 2

0 ．81 士 0 ．ひl

0 ．渕 ±0 ．餌 ヰヰ

0 ．記 ±0 ．
鋸 ♯1 ．礪 土0 ．鋸 ＊♯0 ．乃 ±0 ．0 2

0 ．紀 ±0 ．
0 2⇒ヰ

0 ．乃 ±0 ．03

0 ．
隠 士0．
0 4 ＊＊

S p lee nm g ％2 ヱ ±1 8

2 45 ±142盟 ± 15＊

2 19 ± 16

2 記 ±1 5

2 18 ±1422 〕土922±18

2 19 ± 18

T hym usm g ％15 4 ±1 3

1 35 ±20 ＊刀 ± 10Iヰ

14 1 ± 19

花 ±2 5♯15 5 ±25

14 8 ± 13

159 ±24

1 51 士 かH y p op h y S iS

m g ％

3 ．
4 ±0 ．5

3 ．3 ±0 ．63．
7 ±0 ．9

3 ．6 ±0 ．
7

3 ．
8 ±1．
4

3 ．
6 ±0 ．9

4 ．0 ±0 ．
63 ．
7 ±1 ．8

3 ．9 土 0 ．
8

T h y ro id ea

m g％

7 ．
0 ±0 ．6

6 ．9 ±1 ．1

7 ．7 士 1 ．
4

7 ．3 ±0 ．
8

8 ．
5 ±1．
8 ■

8．
2 ±2 ．3

7 ．4 ± 1 ．
3

7 ．
4 ±1 ．6

8 ．0 ± 1 ．
3

A d r e na ls

m g％

17．
3 土 1．4

15 ．7 ±1 ．7 ■17 ．3 ± 1 ．
7

16 ．6 ± 1 ．4

15 ．8 ±2 ．
0

1 7 ．2 ±2 ．1

17 ．3 土 1 ．
8

17 ．
6 ±1 ．3

17 ．7 ± 1 ．7

1．
4 7 ±0 ．12 141．
封 ± 0 ．05

T e s tis
B ody w e嗣lg％

1 ．24 士0 ．
08

1 ．亜 ±0 ．1 3嶋ヰg

1g 3 ．
0 ±7 ．
7

1朗 ．
5 ±8 ．8 日■P＜0．鴨，＊P＜0．01

28

14 6 ．5 ± 10 ．7 1ヰ 1 81 ．0 ± 8 ．8

1．2 6 ±0 ．15
1臥2 土9 ．
4 ＊40）± 0 ．07

1．
5 ±0．
礪

1 ．㌘ ±0 ．0 7

1 ．31 ± 0 ．06

1釦 ．3 ± 1 3 ．6

1お ．9 ± 1 1．5

17 7 ．
0 ±8 ．2

1 74 ，2 ±9 ．4

1 ．B

●

3・E−64及びその類縁体の急性及び亜急性毒性に関する研究
表5 E−64及びその類縁体のラットへの2週間連続投与における病理組織所見
E−64（mg／kg）

Findings

200

1400

E−64−a（mg／kg）
200

1

400

E−64−b（mg／kg）
200

1

E−64−C（mg／kg）

400

200

1

400

8

8

8

8

7

8

8

8

3

7

7

5

5

1

1

3

［Liver］
8

Irregular arrangement
Ofliver cell cords

53

Various size

1

8

Ofliver cells

Multinulcatedliver
161

Cells

8

53

44

Mitosis888

Eosinopbilicinclusionin the cytoplasm ofliver cells

8

26

62

Swelling of cell nuclei

8

152

116

Swelling ofkuppercells

53I）esquamation ofliver
Cells（COunCilmanbody
formation）［Kidney］
Hyalinelike substancein proximal renal
tubular epithelia

＋＋
＋＋＋
4

±
＋

22

Hyaline droplet degene−rationofrenaltubularepithelia

±
＋

＋＋

8

8

8

Atrophyandvacuolation
Of collecting tubularepithelia±［Skeletalmuscle］

No abnormalcbange

ー：Normal・±：Slightchange，＋：Moderatechange，＋＋：Severechange，＋＋＋：Highsevere change

測定値に統計的有意差を認めたが，いずれも散発的で用量反応を示さず，意味のある変化とは考えられない。
血液生化学的検査所見を表3に示す。いずれの被験物質投与群においてもいくつかの測定値に統計的有意差を認めたが，E−64400mg／kg
群のGOT，GPT活性の増加以外は用量反応，他の検査結果との関連性に乏しく，また生理的変動範囲からの逸脱の小さいものであった。

尿検査ではいずれの投与群の定性・定量値にも著明な変化は認められなかった。
剖検所見ではE−64及び−a投与群で肝の腫大及び槌色，腎の槌色，胸腺の萎縮等が観察され，E−64−b，−Cではこれらの変化は認められなかった。またいずれの投与群にも投与部皮下に膿瘍形成のみられる例があったが，検液の貯留は認められなかった。各摘出臓器の相対重量を表4に示す。絶対重量，相対重量の両者におい
29

Ⅰ

安

全

性

2
・■
・

tl．・t
†ナ

ヤギ∵・登録上略

・●㌧

耳虹

一▲

滋∴

鎮鮭

郡

音

■■ト

唇や打い

⁚
一
︸
．
・

ふや
一

祷攣

八八∵†い

ごヽl

r
︑
．
︵

−

撃軒．㌃

僻離せ翫絹穣
吋・＿

、華子Jj

F

肝
写真1：異常なし（ControIH．E．×250）
写真2：肝細胞の大小不同，肝細胞索の乱れ，肝細胞核の分裂像（」1），膨化，多核性変化（一2）及び胞体内のエオジン好性封入体（一3）（E−64400mg／kg H．E．×250）

写真3：E−64群と同質で，軽度な肝細胞の変化（E−64−a400mg／kg H．E．×250）
写真4：二核性肝細胞の軽度な増加（E−64−b400mg／kg H・E．×250）30

3・E−64及びその類縁体の急性及び亜急性毒性に関する研究6

肝写真5：二核性肝細胞の軽度な増加（E−64−C400mg／kgH．E．×250）
腎写真6：異常なし（ControIH．E．×400）
写真7：近位尿細管上皮内の硝子様物の中等度な沈着（E−64400mg／kgIJ．E．×400）
写真8‥近位尿細管上皮内の硝子様物の高度な沈着（E−64−a400mg／kgH．E．×400）
31

Ⅱ

安

全

性

腎

写真9：近位尿細管上皮内の結晶物の沈着（PAS染色 陰性）（→）（E−64−a400mg／kg PASx400）
写真10：異常なし（E−64−b400mg／kg H．E．×400）
写真11：近位尿細管上皮内の硝子様物の中等度な沈着（E−64−C400mg／kgH．E．×400）32

3・E−64及びその類縁体の急性及び亜急性毒性に関する研究
12

13

骨格筋
写真12：異常なL（ControIH．E．×250）
写真13：異常なし（E−64−C400mg／kgH．E．×250）て，E−64の200mg／kg群，E−64−aの200，400
mg／kg群に心の減少，E−64の200，400mg／
kg群，E−64−aの400mg／kg群に肝の増加，
E−64−aの200，400mg／kg群に腎の増加，E−64の200，400mg／kg群，E−64−aの400mg／kg
群に胸腺の減少，E−64の200mg／kg群に副腎の減少が各々有意に認められた。その他絶対重量あるいは相対重量のみに変化のみられる臓器が種々認められた。
病理組織学的検索所見を蓑5に示す。
肝では（写真1〜5）肝細胞の多核化，核の膨化・分裂，肝細胞の大小不軌肝細胞索の乱れ，胞体内エオジン好性封入体の形成，肝細胞変性脱落，クッ／く−星細胞の腫大が観察され，E−64の400mg／kg群ではこれらの変化が全例に軽〜高度に，200mg／kg群ではいずれも軽減されてみられた。さらに両群ではダリソソ
柳こエオジン淡染性の小型細胞の小葉族もみられた。E−64−aでは400mg／kg群で肝細胞索の乱れを除くすべての変化が軽度にみられたが，200mg／kg群では胞体内エオジソ好性封入体が軽度に認められたのみであった。E−64−bでは400mg／kg群の1／8例に多核細胞及び核分裂像が軽度にみられた他は著変を認めなかった。E一朗−Cでは多核肝細胞の軽度な増加が400
mg／kg群の3／8例，200mg／kg群の1／8例に認められたのみであった。
腎では（写真6〜11）E−64−bを除く投与群
で近位尿細管上皮に硝子様物質が認められ，E−
64−aで高度に，E−64及び−Cでは400mg／kg
群で中等度，200mg／kg群で軽〜中等度に観察された。また尿細管上皮の硝子滴変性がE−64−aの400mg／kg群で中〜高度，E−64の400
mg／kg群で中等度，E−64の200mg／kg群及びE−64−Cの400mg／kg群で軽〜中等度に観察された。さらにE−64−a群では硝子様物質中あるいは尿細管上皮内に針状〜ナビクラ型の結晶様物質が認められた。
筋肉では（写真12〜13）いずれの投与群にも著変は観察されなかった。

33

Ⅰ

考

安

察

E−64及びその類縁体の急性毒性試験ではいずれの物質も1000mg／kg以上の高いLDs。値が得られたが，それらの中でE−64−Cは若干低
いLD50倍を示した。しかし2週間の連続投与による亜急性毒性試験では逆にE−64及びE−
64−aに肝，腎の変化を主散とする影響が認められ，E−64−C，E−64−bではその影響が微弱であった。各被験物質相互間のこのような投与回数による量的な相違は今後の課題として残されるが，質的な相違は4着間に明瞭なものでな
く，いわゆる特異的毒性を示す物質群とは考え難い。肝の変化については投与量に応じた出現
頻度及び程度の増強からみて薬物の作用に基づいたものである事が考えられる。これらの変化のうち肝細胞の増数現象は単細胞壊死や好エオ
ジン性小体の出現などから，薬物の直接的刺激
ではなく，比較的投与初期に受けた変化の再生像あるいは再生経過像と推察される。一方このような形態的変化は一般的に薬物処置外の原因，たとえはウイルス性肝炎時にも観察されることから，二次的な外的要因も否定できない。
また腎にみられた退行性変性像は炎症の関与がまったくなかった事からネフローゼと考えられる0なお，尿細管上皮に含まれたエオジン好性
硝子様物質及び針状〜ナビクラ型結晶性物質の本態あるいは形成メカニズムについては現在のところ不明である。
今後更に各々被験物質の薬理，生体内動態等
多面的な見地から詳細な検討を加えつつ毒性を評価しなければならないが，今回の結果から結論を急ぐならはヒト進行性筋ジストロフィーへの長期連投を考える時，E−64−b，E−64−Cが薬物としてより望ましいと考えられる。
結論

E−64及びその類縁体の200，400mg／kgをラットに2週間皮下連続投与して亜急性毒性を検討し，以下の結論を得た。
1）肝，腎の変化を主散とする影響がE−64＞
E−64−a＞E−64−C＞E−64−bの順に強く認められ
34

全

性

た。

2）4物質中，E−64−b及びE−64−Cが安全性の見地からは薬物としてより望ましいと考えられた。

3．亜急性毒性−2）日的E−64類縁体の毒性研究の一環として，E−64−a，−b，−Cのエステル体を幼雛に2週間皮下連続
授与し，その亜急性毒性を検討する。
方法（1）動物：醇化1週令の雄白色レグホン（日本動物）を1群10羽あて群別し，実験に用いた。動物の投与開始時体重は58〜76gであった。動物は温度370の育雛器内で飼育し，飼料（日清
製粉社製幼雛用）と飲水は自由に摂取させた。
但）投与量，投与方法：検液はE−64−a−ethylester（以下E−647aeSterと略す），E−64−b−ethyl
ester（以下E−64−b esterと略す）を生食水
溶液，E−64−C−ethylester（以下ET64−CeSterと略す）をコーンオイル懸濁液とし，各々5，10％（W／v）液に調製した。投与量はいずれの被験物質も100及び200mg／kgとし，体重100gあたり0．2mlの液量を1日1回14日間，毎日定時に雛の腹側部皮下に投与した。対照群にはコーンオイルを同様に投与した。
（3）検査項目：投与期間中は毎日一般症状を観察するとともに体重を測定し，投与終了後には断頭により採取した血液の赤血球数（ミクロセル
カウンター；東亜社），ヘマトクリット値（毛細管遠心分離法）を測定した。また同時に採取した血液を遠心分離して得た血清についてオー
トアナライザー（日立500型自動分析装置）により総蛋白量（Biuret法），グルコース量（ブドウ糖酸化酵素法），総コレステロール量（Li・eberman，Burchard法），クレアチニソ量（Ja・ぽe法），トリグリセライド量（ヤトロンTG−E

キット法），GOT活性（Reitman−Frankel変法），ALP活性（Kind−King変法），LDH活性（ピルビン酸ヒドラジン発色法）を測定し3．E−64及びその類縁体の急性及び亜急性毒性に関する研究

亡コ〇一一一一・・〇

二

二■■一■一一−−X−X
X一一一JX

Control（corn oil）
E−64−a−eSter lOOm9／k9
200m9Ag
E−64−b−eSter lOOm9∧9200m9ルg
E−64−C−eSter lOOm9Ag
200m9ル915（Days）

図2 E−64類縁体の鶏への2週間連続投与における体重変動

た0採血後には剖検して胸部，腹部の諸臓器を観察の後，心，肺，肝，脾を摘出して重量を測
定した。
結

果

投与期間中いずれの投与群にも死亡例は認められなかった。一般症状ではE−64−CeSter群に投与3日日頃から，投与部局所皮下組織の壊死性変化に基づく政行が観察された他に著変は認められなかった。
体重変動を図2に示す。E−647CeSterの100，200mg／kg群に政行のみられたと同時期から有意な体重増加抑制がみられ，この変化は投与終了時まで継続した。
血液学的検査所見を表6，血液生化学的検査
所見を表7に示す。E−64−b ester投与群に赤
血球数の増加が統計的有意差として認められたが，著変を示すものでなかった。また血清分析
値にも統計的有意差がいくつかの検査項目で，いずれの被験物質にも認められたが，いずれも用量反応に乏しく，また変動幅の小さいものであった。
臓器の相対重量を表8に示す。E−64−aeSter
lOO，200mg／kg群の脾，200mg／kg群の心，E−64−bester200mg／kg群の脾に絶対，相対両重量の有意な減少が認められた。その他，
E−64−CeSterでは体重増加抑制に伴う肝相対重量の増加が観察された。また剖検所見ではいずれも著変を認めなかった。
考察

E−64類縁体のエステル体100，200mg／kg
を幼雛に連続皮下投与した結果，いずれの物質にも特異的あるいは強い毒性症状の誘発は認められなかった。E−64−CeSterによる体重増加の抑制は，この物質のみがオイル懸濁剤で，投与24時間後にも投与部皮下局所に残留し，局所的壊死を誘発するとともに歩行障害を招いていた事から，栄養障害等の二次的影響による変化と思われる。血液，臓器重量の変化については，
35

Ⅰ
表6

安

全

E−64類縁体の鶏への2週間連続投与における血液学的検査所見
E−64−b−eSter（mg／kg）

E−64−a−eSter（mg／kg）

Testitems性E−64−C−eSter（mg／kg）

Control
100

RBClOソmml 251土12
33．4土2．0
Ht
％

1

100

200

245±55

256士3031．9土6．3

34．0土3．5

RBC＝Red Blood Cell，Ht＝Hematocrit

1

100

200
271士14＊＊279±16＊＊34．3土1．9

33．4土2．1

1

200

253土19251士2632．5±2．0

33．0土2．8＊＊P＜0・01

表7 E−64類縁体の鶏への2週間連続投与における血液生化学的検査所見
E−64−a−eSter（mg／kg）IE−64−b−eSter（mg／kg）

Testitems

E−64−C−eSter（mg／kg）

Control
100

1

200

1100

1

100

200

1

200

Totalprotein g／dl

3．2±0．2

3．2±0．3

3．3土0．3

3．3土0．7＊ 3．5土0．4＊ 3．7土0．3＊＊

3．6土0．4＊

Glucose mg／dl

269土14259土12206±83＊

265土15252±10＊229土18＊＊321土33＊＊200士17

194士30201±31222±34212土22202±28199士25Creatinine mg／dl

2．3土0．2

2．2土0．1

2．2土0．1

2．4土0．3

2．4土0．2

2．2土0．2

2．1土0．1＊

Triglyceride mg／dl

152±20161士27151±18143土15145士17176土20＊171±27

GOT

201士10188土22206±14190±12＊

193土12205土9

197土10Total cholestero1
mg／dl

I（−U

AトP

KA−U

LDH

IUl337士3959．3±16．3 57．5士22．

．5．4±25．1＊

0．6土17．7＊ 33．7土17．9＊＊275±39＊＊332土49305土51＊P＜0．05，＊＊P＜0．01

表8 E−64類縁体の鶏への2週間連続投与における臓器重量E−64−a−eSter（mg／kg）
OrgansE−64−b−eSter（mg／kg）

E−64−C−eSter（mg／kg）

Control
100

1

200

100

1

100

200

Heart g％Lungs g％Liver g％Spleen g％

0．79士0．07

0．76土0．07

0．71±0．05＊＊

0．72±0．10

0．70士0．12

0．66±0．07＊＊

Body
Weight g

172．1土15．3 169．5士16．51167．2±7．9

2．53土0．21…；…………罰…………：；…＊＊t
0．14土0．02 0．11±0．02＊ 0．11±0．

1200

2．47土0．13 2．45±0．20
0．13±0．02 0．11±0．03＊
161．7士18．6 178．6士17．0

土18．3＊＊＊P＜0．05，＊＊P＜0・01

統計的には有意なものの，著変を示すものではなく，いわゆる生理的変動範囲に属するものと思われるが，幼雛におけるこれらの資料，経験も少い事から今後更に詳細な検討が必要と思われる。しかし総体的にはいずれのエステル体も麒著な毒性を示すものではなく，したがって
E−64類縁体はPrOdrugであるエステル体としてもその有用性が期待できると考えられる。

36

結

論

E−64−a，−b，−Cのエステル体100，200mg／kg

を幼雛に2週間皮下連続投与して，毒性面の有用性を検討した結果，いずれの被験物質にも顕著な毒性は観察されず，E−64煩縁体がpro−drugであるェステル体としても有用であると考えられた。

4．E−64及びその類縁体のサルモネラ菌に対する突然変異原性に関する研究

大
研究協力者

安
後

関

井
藤

宏

正

弘＊

一＊

小佐野

宏

美＊

三＊

大

貞

文＊

村

3．陽性対照日

的化学物質が実験哺乳動物に対して発癌性を持つ場合，その物質は同時にある種の緻生物群に対し高い確率で突然変異を誘発する（変異原性）
ことが知られており，この検出の為の実験系がB∴N．Amesら1㌧ その他により提出されてい今回の測定に用いた陽性対照化合物（既知変
異原性物質）の種類と，検定平板1枚当りのそれらの供試量を記す。

試験菌株巨91化
TA15352−aminoanthracene

TAlOO

Styrene OXide
2−naphthylamineを用いた方法により測定したので報告する。
TA1537方

9−aminoacridine法

3，4−benzpyrene
2−nitrofluorene

方法の細部に関しては文献日に譲り，ここでは簡略に記す。
1．非代謝処理測定法（S9H test）

3，4−benzpyrene

注1）被検化合物の構造式を下に示す。
基本骨格：
H

混液を基礎寒天平板注4）の上に一様に拡げる。

H＼−／
HO2C／＼0／＼H

N
O
C
H 鴫
C −C
H
N

2mlをこの順に注ぎ入れ，軽く振盟の後，このOC

0・5ml，試験菌液注2）0・lml，及び軟寒天液注3）／＼

R試験管に被検液注 0．1ml，M／10燐酸緩衝液

物

2・3−ePOXy−1−prOpanO1

る。今回，E−64とその類縁の化合物3種の突然変異原性の有無をAmesら1）のサルモネラ菌

合J

放置国化後，370Cで2日間培養し，生じたヒ
cHl／＼cII】

スチジン非要求復帰変異株（bis＋）による集落数を算定する。被検液の代わりに水0．1mlを用いたものを盲検対照とする。
2．In Yitro 代謝処理測定法（S9日）teSt）
前項の測定方法において，燐酸緩衝液に替えて肝磨砕物遠沈上清ぐS9 ）注5−を主体とする酵素系（ S9−mix ）江6〉0．5mlを用いる。
＊大正製薬株式会社総合研究所

E−64−（CHZ）一NHCく：：2．1′2H2。
E−64−a−（CH2）一NH2

E−64−b−CHCH2CH〈芸F

E−64−C−CH2CH2CH〈芸
37

Ⅰ

安

全

性

表1E−64及びその類縁体に対するAmes試験成続l〉−変異株（bis＋）集落形成数を表示−。．111。晶11。
E−64−a E−64−b

Positive

E−64−C
O．1

1

10

19

15

17

16

18

17

18

20

20

15

22

19

18

20

20

14

10

13

14

16

20

11

15

11

129

137

142

120

139

117

142

122

120

136

129

115

168

157

140

141

155

145

158

154

133

149

169

149

5

8

6

4

7

5

6

5

6

5

6

4

4

6

4

6

4

4

Control

89AT

S9（＋）：In vitro activation assay usingratliver homogenate

E−64は1／30M濃度の水溶液を，誘導体3種は何注6）検定平板60枚分のS9−mixとして次の組成のものを用意した。

液とした。なお，溶解度を上げる目的でE−64は加温
溶解し，またE−64−b，及び−Cの溶解には重曹水をS9：添加してこれを援けた。各原液を更に水で10倍，及M／5燐酸緩衝液pH7・4：
ブドウ糖6燐酸（lNa塩）：NADP（Sigma社製）：

び100倍に稀釈した。検定平板1枚当りの被検体供試量は下記の如くになる。

ml血m l卿卿
105155020
11

れも1／10M濃度の水溶液を，それぞれ調製し被検原

M／20MgC12−M／5KCl：

E−64

単位：〃g（〝M）
12（0．03）122（0・3） 1220（3）

結果及び考察E−64−a32（0．1） 315（1．0） 3150（10）各検定とも試験管内反応の時点から2重役でE−64−b35（0．1） 348（1・0） 3480（10）E−64−C31（0．1） 314（1．0） 3140（10）注2）試験菌株として

Salmonella typhimurium

TA1535，TAlOO，TA1537，及びTA98（何れもhis￣株）を用いた。普通ブイヨン5mlを分注した試
験管にそれぞれの菌株を接種し，370Cで17時間静匿した後，同温で4時間振造培表した。
注3）0．7％の寒天液に0．6％の食塩．1mg％のヒス測定した。検定平板毎のヒスチジン非要求復帰
変異株集落の形成数の平均値を表示する（表1）。
表示の如く，盲検値と比較する場合，試験菌株の種煩の如何に拘わらず，またinvitro代
謝処理の有無に拘わらず，被枚の4化合物の何れにもその変異形成数に実験誤差範囲を越える
有意の増加は認められない。

チジンの塩酸塩，及び1．2mg％のどオチソをそれぞ

結

れ含む。

論

注4）7線で滅菌した内径86mmのプラスチック製

E−64，E−64−a，E−64−b，ならびにE−64−Cはペトリ皿に0．2％のブドウ糖を含むVogeトBonner
最少培地Eを25ml注ぎ，放置固化した。

サルモネラ菌を用いるAmesらの方法17による

注5）PCB（カネクロール500）0．1gと落花生油0．4
gを良く混じ，SD系ラット雄7遇令の腹腔に注入して5日後，屠殺して肝を得た。保冷下，3倍重量の0．15MKCl水溶液中で肝を十分に磨砕した後，9〜
11×103Gで10分間冷却遠心分戯して上清（S9）を得た。
38

突然変異原性試験において何れも陰性と判定さ
れる。
文

献

1）Ames，B．N．，McCann，J．and Yamasaki，
E．：Methods for detecting carcinogens and4・E−64及びその顆縁体のサルモネラ菌に対する突然変異原性に関する研究
mutagenSwith the Salmonella／mammalian−
microsome mutagenicity test，Mutation Re・

SearCh，31，347−364，1975．

39

5．E−64及びその類縁体の生体膜に対する作用に関する研究

大 関 正 弘＊
研究協力者

目

小

友

的

勝沼ら日によって認められたラットにおけるE−64によるlysosome酵素の漏出が，lyso・SOme膜に対する直接作用によるものか否かをラット肝lysosomeならびにラット赤血球を用いたin vitroの実験系で検討した。
方法

1．Lyso50me画分の調製
おおむねTanakaら2）の方法に準拠した。
前日より絶食したWistar系雄性ラットを断頭放血し，ただちに肝を摘出した。これを細切した後，テフロこ／ホモジナイザーで5倍容の0．25
Msucrose−0・04M triS−aCetate緩衝液pH
7．4（以後緩衝液と略す）中にてホモジナイズ

進＊

樋

口

昭

平＊

pTnitro−Phenolを410nmの吸光度で測定した。
2）β−グルタロニダーゼ活性β−ダルクPニダーゼ活性はSOdiump−nitro−
phenylglucuronideを基質として測定した。

酵素液0．7ml，基質1．25mM，80mM ace・tate緩衝液（pH5．2）からなる反応混液2miを370，15min インキュベーションした後，
lNNaOHlmlを加えて反応を停止し，遊出したp−nitro−phenolを410nmの吸光度で測定した。
3．インキュベーション系
インキュベーション混液は緩衝液，lysosome
画分（肝0．34g／ml）及び検液からなり総量15mlとする。これらを水冷下に調製し，室温にて10分間放置した後，370でインキュベーショ

した0ホモジネートを700×タ，15min遠心分ンした。インキュベーション開始後一定時間に離し，さらに，その上活を3，500×タ，15min

それぞれ2mlを採取し，ただちに10，000×タ，

遠心分離して得られたPelletを同条件にて洗15min遠心分離し，上清中の酸ホスファクー

浄した後，緩衝液に懸濁し，実験に供した。
2．酵素活性の測定

ゼならびにβ−ダルクロニダーゼ活性を測定した。

1）酸ホスファターゼ活性4．Lysosome酵素に対する直接作用

酸ホスファクーゼ活性はSOdium p−nitro−

Lysosome画分を緩衝液に懸濁（肝0．17g／

Phenylphosphateを基質として測定した。酵
素液0．5ml，基質5．8mM，67mM acetateml）し，370，90minインキュベーションした緩衝液（pH4．8）からなる反応混液3mlを後，10，000×タ，15ふin遠心分離した上清を酵素液として使用した。酵素液と検液とを混合

370，15minイシキュべ−ショソした後，lN

し，370でインキュベーションした。インキュ

NaOHlmlを加えて反応を停止し，遊出したベーション開始後一定時間にそれぞれ2mlを採取し，酸ホスファクーゼとβ−グルクロニダ＊大正製薬株式会社総合研究所

ーゼの活性を測定した。検体の影響は，検体添
41

Ⅰ

安

加時の酵素活性を無添加の対照の酵素活性に対

全

性
表2

ライソゾーム酵素活性に対する直接作用

する百分率であらわした。

Acidβ−Glucuronidase

Sample Phospatase5．赤血球の調製（10￣3M）

60min

Wistar系雄性ラットより，へ′くリン処理下に採取した血液を3，000rpm，5min遠心分離して得た赤血球を冷生理食塩液で十分に洗浄して使用した。

120min60min

120min102・lE−64（DL）100．3

99・1

98・8

E−64−a lOO．0

99．1

95．6

E＿64＿b

lOl．7

99．1

99．7

106．4

6．溶血の測定

E＿64−C

検体を所定の濃度に溶かした1／15Mリン酸
緩衝液pH7．4（NaClで等張化）に上記赤血Enzymeactivitywasexpressedaspercentage

球を1％となるように加えて混和し，370にて

lOO．0

102．1

100．2

95．6

ofcontrol．（meanoftwo）

表3 赤血球膜に対する作用

インキュべ−ショソした。以後，経時的に一定量を採取し，3，000rpm，5min遠心分離した

94．0

Hemolysis
Sample（10￣lM）

60min

120min上清中のヘモグロビンを540mmの吸光度で測
定した。
結

果

7．5

8．3

E−64（DL）

6・4

8・l

E−64（D）

6．6

6・2

The valueisexpressed aspercentageof

1．Lysosome膜に対する作用
370，120minのIysosome

Contro1とのインキュベ

ーションによって，DLE−64，E−64−a，−b，−Cのいずれの検体においても10￣3Mで酸ホスフ
ァクーゼ，β−ダルクロニダーゼの造出に対する

total hemolysis．

た（表3）。
考察

E−64の腹隆内投与によりラット肝にカテプ作用は認められなかった（表1）。
表1ライソゾームからの酵素退出に対する作用

シソDなどのIysosome酵素が漏出することが勝沼ら1）によって指摘された。しかし，その作

samplePhosphatase（10￣きM）

60min

β一Glucuronidase

120min60min

120min用が膜の破壊を伴うものか，あるいはまた，院の透過性克進によるものか，その詳細は不明である。我々はE−64及びその頼縁体a，b，CのE−64（DL）100．4
E＿64＿a

99．0

100．0
100．0

E＿64＿b

lOO．0

97．2

E＿64−C

lOO．4

99．7

100・9
100．0

99．0

100．9

99・5

生体膜に対する直接作用の有無を調べる目的

100．O

103t8

で，ラット肝lysosome及びラット赤血球を用

100・0いinvitroで検討した。その結果，いずれのEnzymeactivitywasexpressedaspercentage
ofcontrol．（meanoftwo）

化合物にも10￣3Mの高濃度において，lysosome
及び赤血球からの酵素あるいはヘモグロビンの遊出促進作用は認められず，直接作用による膜

2．Lysosome酵素活性に対する直接作用
1．と同様の条件下で，E−64−Cによるβ−ダルの破壊や透過性の克進はないものと思われた。
従って，勝沼らl）によって認められたinvivo

クロニダーゼ活性のわずかな阻害がみられた以でのE−64の作用はlysosome

外は，他の化合物に何らの作用も認められなかった（表2）。

作用ではないものと推察された。

3．赤血球険に対する作用
1．と同条件でヘモグロビンの遊出に対しD一及びDLE−64に何ら作用は認められなかっ42

結に対する直接論

DL−E−64及びその煩縁体a，b，Cいずれもin vitroにおいてlysosome膜の不安定化作

5．E−64及びその類縁体の生体膜に対する作用に関する研究
用は認められなかった。従って，E−64のinvivoにおけるラット肝lysosome酵素の漏出文
献は，lysosomeに対する直接作用によるもので 1）勝沼信彦：私信，1979．
はないと思われた。

2）Kiichiro Tanaka and Yosbio Iizuka：
Suppression of enzyme releaseiromisolated
ratliverlysosomes by non steroidal anti・

inぬmmatory drugs，Biochem．Pharmaco1．，
17，2023，1968．

43

6・E−64及びその類縁体の局所刺激作用に関する研究

大

関

正

弘＊

研究協力者 花 田 和 紀＊ 天 本 十四郎＊
岡

崎

忠

研究日的

大

村

貞

文＊

表1E−64及びその類縁体のモルモットの血管透過性に対する作用
Acceleration（％to bistamine）

漏出した色素斑面積より検体のモルモット皮膚に対する刺激性を陽性対照薬であるヒスタミ
ソの作用に対する百分率で表わした。
表1に示すようにE−64の作用は，ヒスタミ
ンの約1／400と弱いながらも毛細血管からの色素の漏出があり局所刺激性が再確認された。しかしながら，その類縁体ではこの様な作用は殆んど認められなかった。
考

察

6
0

果

3
0

結

5
2

被験生食水溶液を投与し，直ちに，2％ェグァ
ソスブルー生食溶液（0．4mi／head）を静脈投与した。15分後，皮膚の漏出色素斑の面積をHaradaらの方法1）で測定した。

E−64−e001

クリーム（新アレオス，大正製薬）を用いて脱毛し，3時間放置後，背部皮内に0．05mlの0

モルモット（Hartley，male，350g）を脱毛

0E−64−b

材料及び実験方法

0

E−64
E−64−a0E−64は，弱い局所刺激性を有することが既に知られている。類縁体a，b，Cにおいても同様な作用がみられるか否か，ヒスタミンを対照薬としてその作用を検討する。

靖＊

Histamineが認められる。しかし，a，b，Cでは，いずれもその様な作用は認められなかった。E−64の
agmatineをarginineに置換した化合物にも同程度の作用がみられること（未発表データ）
及びE−64とE−64−aとの比較からこの刺激作用は，グアニジル基に起因するものと考えら
れる。
結

論

E−64は，ヒスタミンの約0．25％の弱い局所刺激作用を有するが，その頸縁体a，b，Cには，殆んどその様な作用は認められなかった。
文

献1）Harada，M・，Takeuchi，M．and Fukano，T．：
A simple methodofthequantitative extrac・
tion of dye extravasatedinto the skin，J．
Pbarm．Pharmac．，23，218，1971．

E−64には弱いながらも明らかな局所刺激性＊大正製薬株式会社総合研究所
45

7・E−64及びその類縁体の細胞毒性に関する研究

研究協力者

大

関

正

花

田

和

紀＊

天

本

十四郎＊

山

田

正

雄＊

岡

崎

忠

研究目的

弘＊

表1E−64及びその類縁体のマウス脾細胞の生存率と回収率に対する作用

E−64及びその類縁体の安全性検討の一環とRecovery（％）l Viability（％）

して動物細胞に対するinvitroにおける毒性を検討する。

10￣510￣一10￣き（M）】10￣510￣一10￣，（M）′
7

E一朗及びその類縁体の10￣5，10−4，10−3M
濃度での回収率及び生存率を表1に示した。いずれも対照より生存率では約5〜10％細胞回収
率では約15〜20％と減少し，僅かながらその影響がみられたが明確な濃度依存性は認められな
かった。

5

8

果

6

結

7

一

ー炉過後添加した。培養後，回収細胞数及びト
リパンブルー染色法3）による生存細胞数を測定した。

9

インキュベーター中で48時間培養した。検体
は，生理食塩水に溶解させ，ミリポアフィルタ

︐

7

87

7

0

400／Jlとなるようにして，3705％炭酸ガス

7

8

HEPES及び5％FCS添加を用い106cells／

8

7

9

mML−Glu，1mMsodiumpyruvate，10mM

︻

7

7

Shellら2）の培養系即ち，RPMI1640培地（1

9

一

3

製したい。得られたリンパ系細胞をR．Ⅰ．Mi−

7

7

8

control

一

臓より無菌的に細胞浮遊液を斎藤らの方法で調

7

6

7

63

2

E−64−c8

7

マウス，C57BL／6，（雌），6〜10週令の脾

5
6

73

7− 5 566
6

6

E−64−b

4

7

64

5

70

E−64−a30E−64

材料及び実験方法

靖＊

Mouse：C57BL／6
Medium：RPMI＋L一glutamine，pyruVate，

HEPES，FCS．
Incubation：370，48hrin COZincubator．
考察

細胞生存率，細胞回収率共に弱いながら薬物による影響がみられたが，濃度依存性は認められず，更に，検討を要する。その後の実験により，E−64及びその類縁体の免疫校能に対する影響が観察され，リンパ系細胞を細胞毒性試験に用いたこと自体（その妥当性の）問題が生じてきた。現在，ラット線維芽細胞を用い，比較検討中である。
結論

E−61及びその額縁体は，マウス脾臓細胞に対しinvitro培養系において，僅かながら細胞生存率，細胞回収率共に影響が認められた。

＊大正製薬株式会社総合研究所
47

Ⅰ

安

全

性
zation of Dissociated Spleen Cell Cultures

文

献fromNormalMice，J．exp．Med．，126，423，1967．

1）斎藤和久，多田限卓史：CunninghamandSz−
enbergのプラーク法，免疫実験操作法A，日本免疫学会編集，485．1975．

3）H・J・Phillips：DyeExclusionTestforCell
Viability，Tissue Culture，editedby PaulF・
KruSeetal・，Academicpress，NewYork，406，

2）Mishell，R．Ⅰ．and R．W．Dutton：Immuni−

1973．

48

ⅢIn vivoの効果（効力試験）
8・E−64の筋ジスチキンに対する効果（臨床観察）杉田 秀夫

9・E−64及びその類縁体の薬効に関する研究

大関 正弘（一般薬理）

10．E−64の一般薬理作用〜特に呼吸・循環機能及び中枢神経系に及ぼす影響〜

福原 武彦

8．E−64の筋ジスチキンに対する効果（臨床観察）

杉 田 秀 夫＊・＊＊
研究協力者

目

高

木

昭

夫＊

埜

中

征

哉＊

石

浦

章

一＊

村

上

博

彦＊

的

0

8．4 6・4

4

0

0

1
1

8
6
8
8
1
6
5
5
3
3
3
2
± 土 ± 士1

E−64treated2
8
1

Dystrophyline413

2．4 7 6
6
6
8
2
0
9
2
2
1

E−64treated

0

与法，慢性毒性などに関する基礎的データを得ることを目的とした1）〜3）。

Normalline412

5

チキンに対してE−64投与の効果を観察し，投N Bodyweight（g）％
01

ミオパチーモデル動物であるジストロフィー

表1100日齢チキンの体重

100
91．2
100
91．9

実 験 法
LE一朗はガラス蒸留水に10mg／mJとなるように溶解し，冷蔵庫に保存した。卵酎ヒ後1週

結果

表1に辟化後100日のニワトリの平均体重を日より週3回，体重1kg当り20mgのE−64示した。正常鶏（line412）の方が約2262g，を後背部皮下に注射し，その経過を観察した。

筋ジストロフィー鶏（line413）が約1987gと実験は正常群（ ＝10），E一朗投与正常群（帝＝正常群の方が14％ほど高値を示した。一方，

5），筋ジストロフィー群（ ＝16）及びE−64投

E一朗投与群の方は，正常鶏約2064g，筋ジス

与筋ジストロフィー群（乃＝11，そのうち1羽は直接筋注）で開始した。

（約9％）を示した。この値は，ジフェニルヒダ

体重は，フリップテストとは無関係におよそ15日おきに測定した。
フリップテストは，発症確認が可能な最低日数である4週目から行った。方法は，両羽を広げた状態で静かに仰臥させ，そこからの起立能力を判定した。評価は，起立したものを1息10秒経過して起立不能のものを0点とし，この操作を5回くり返して起立回数（FlipNumber，
FN）を記録した。
月別ヒ後3ヶ月までに病死した個体はなく，成長は一見順調であると考えられた。

トロフィー鶏約1825gと明らかに軽度の低下
ソトイン投与時の体重低下一）（30日で約25％），
ペニシラミソ投与時の減少5）（100日で約15％），
及びセロトニンアンタゴニスト投与時の減少6）（60日で約20％）に比べて緩徐であり，急性の毒性はないと考えられた。しかしながら，同様のタンパク分解酵素阻害剤であるロイぺプチソ投
与においては体重変化が全くないこと7）を考えあわせると，長期投与の影響はなお慎重に検討すべきものであると思われた。
また，E−64投与において体重変化に性差があることが判明した。表2にその結果をまとめた。これでまず明らかなことは，一般的に雄の＊国立武蔵療養所神経セソクー，疾病研究第一部＊＊東京大学医学部脳研・神経内科

方の体重増加が顕著であり，標準偏差を考慮して全く重なりあわないことがわかる。この雌雄
51

ⅢIn vivoの効果
表2 E−64投与チキンの体重変化
Normalline412
Untreated

Male2452．9土97．8

Female1816．7±60．3

I）ystrophyline413
Treated

Untreated

2313．3土187．2（れ＝7）2111・3土277・6

（乃＝3）

（

1790．0土169・7（乃＝3）

2002・9土89・4

＝8）

（弟＝7）

1500・0±14・1（乃＝2）Female o．74

Treated0．77

1517・5土81・4

（れ＝2）

（ル＝4）

0・71

0・76

表3 チキンの体重に対するE−64の影響
Normalline412

Dystropbyline413

M．

0．94＊

0．95＊

F．

0．99＊

1・01＊

＊The values are theratioof E−64treated chickens tollntreatedchickens・

表4（a）Dystrophyline413（Untreated）
Sex

70

75

85

90

95

102days
0
0

0

0

0

0

1

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0 0 0 0 0

0

0

0

0

0

1

2

1

1

1

0

0

一

5
9

0
0
0
0
0
0
0
5

0

1

0

0

2

3

0

〇

1 0 2 0 0 0 5 0 0 0

0
9

4

一

0

1

1

0

0
0

0

0

1

2

4

1

0

0

0

0

0．50

0．50

0．50

0．43

0

1

0

0

1

2

0

0

0

1

1

3

0

0

3

3

0

0

0

3

1

0

2

2

0

0

0

0

0

0

0

0

0

1

0

0

0

0

1

0

0

0

5
8

3

0

1

1

2

0．50

0

〇

〇

0

0

0．50

一

一

一

0

1

5

0 3 0 0 0 0 0 5 4−0 3

0

2

2

0

5

1

0

0

0

4

0

1

2

3

0

0

0

1．36

0

0

0

1．00

0

0

0

0．45

1

0

0

3

0．64

l

0

0

0

102days75

0 0 0 0 0 1 0．4 0 0 0

0

0

0

70

0 0 0 0 0 0 1．4 0 1 1

0

5

1
3

1

8
2

52

2

35

Mean FN（FN／例数）

2

26

0

23

60

0

30

55

1

29

0．40

0

27

0

0

25

0

1

24

60

表4（b）E−64treateddystrophym m m m m m m L fh・L＋f

22

0

3

0．67

Mean FN（FN／例数）

21

55
0

2

L

f．

0

f．

0

m．

0

m．

4

m．

0

m．

0

m．

0

m．

0

m．

0

m．

0

m．

0

m．

L

252
62729
83
20313334353732363840

m．

35

8．E−64の筋ジスチキンに対する効果の差は，栄養状態が同一であるにもかかわらず

考

生後60日日頃からあらわれ，また同時にFNにも関係してくる重要な田子の1つである。また，表2より雌雄の体重比を計算したところ表中に示すようにその比が0．71〜0．77となった察

E−64皮下投与において体重と起立能力の変化を見た。体重は未処理群に比べてE−64投与
群では若干の減少を見たが，それはすべて雄のが，正常鶏，筋ジストロフィー鶏いずれもE−64

体重低下によるものであった。今後，例数を増投与群の方がその割合が高かった。これは，してこの事実を確認する必要がある。

E−64投与によって雌の方がほとんど体重変化

一方，同齢のニワトリにおいては，体重の少がないのに反して，雄の方はかなり減少する，ない方が起立能力も高いという報告がある。これは今回の実験において雌雄間でこの関係が成という事実を反映しているものである。その差をわかりやすく表3にまとめた。この事実は他の薬物投与実験では見られない新しい知見であり，E−64が両性において異なる薬理作用を持つ可能性もあることを指摘したい。
次に両群の起立能力について調べた（表4）。

立することはわかったが，雄同志，また雌同志では必ずしも成り立たないことがわかった。
今回の実験で明らかになったことは，個体差が想像以上に大きく，例数が少ないとFNに誤表4（a）は未処理，（b）はE−64投与の筋ジストロ

差を生ずる危険が大きいことが判明した。このことは，筋肉内酵素活性や血清酵素活性でも同フィー群である。正常鶏の結果はここでは記さ様で，生後100日における筋ジストロフィー

なかったが，もちろん未処理及びE一朗投与群

line413群でのばらつきは大きく，例えば血清ともに毎回完全に起立した。表4では，個々のCPKは1・2〜3．6U／mJと約3倍もばらつく個体についてのFNを示した。表4（a），（b）共に（正常は0・019〜0・028U／mJとかなりせまい範

明らかな雌雄の差が読みとれる。つまり生後約囲に落ちつく）ことがわかった例もある。少な30日の時点でほとんどの雄が起立不可能になる

くとも10羽以上で検討しなければ正確な値は出ないとの感触を得た。

のに反して，雌は生後70日でもかなり起立できることがわかる。表4（b）のE一朗投与群では（a）の未処理群との差がほとんど見出せなかった。
少々の希望は，E−64投与群の雌で90日日以降

参考文献
1）埜中征乱春原経象石浦章一，杉田秀夫，高田FNの上昇がわずかに見られる。しかし雄の方

邦安：筋ジストロフィーチキンに対するproteaseには全く変化がなく，学習効果によるという仮定も否定できない。また，生後35日目においてinhibitor（E−64）の効果−形態学的側面−，

E−64投与群の起立成績が未処理群に比して良特徴，厚生省神経疾患研究委託費，「筋ジストロフ

いが，E−64が若干の発症の遅延をもたらしたものかどうかの判定はむずかしい。35日目からィー症の病因に関する臨床的研究」（三好斑）昭和53年度報告書，pp．40−44．

102日目までのすべての成績の平均をとりE−642）杉田秀夫，石浦章一：筋ジストロフィーチキン

の効果を蓑したのが表5である。これよりE一朗

に対するproteaseinhibitor（E・64）の効果−

は雌に対して起立能力を少々改善するように働いたと考えられる。

3）Sugita，H．，Ishiura，S．，Suzuki，K．＆Ima−

及び筋ジストロフィーチキン骨格筋の組織化学的

生化学的側面−，同上pp．45−48．
hori，K．：Inhibition of epoxidederivativeson

表5 ジストロフィーチキンの平均起立回数（35〜102日齢）
Untreated E−64treated

Male O．28

0．25

Female l．14

1．86

Chicken calcium・aCtivated neutral protease（CANP）invitroandin vivo，J．Biochem．87，
339−341，1980．

4）Chou，T．，Hill，E．J．，Bartle，E．，Woolley，K．，
Lequire，V．，OIson，W．，Roelofs，R．＆Park，J．
H．：Beneficialeffects of penicillamine treat−
53

ⅢIn viYOの効果
mentonhereditaryavianmusculardystrophy，Skeletal

J．Clin．Invest．，56，842−849，1975．

treated dystrophicchickens，Exp．Neuro1．．61，

5）Bhargava，A．K．，Barnard，E．A．＆Hudecki，muscle properties of phenytoin−

650−663，1978．

M．S．：Effects of serotoninantagonistsonthe7）埜中征歳，高木昭夫，石浦章一，村上博象杉田developmentofinheritedmuscularydystrophy

秀夫：ロイべプチソのジストロフィー鷲に対する

inthechicken，Exp．Neuro1．，55，583−602，1977・

作用，厚生省新薬開発班会議（梅沢班）昭和舅年度6）Entrikin，R．KりPatterson，G・T・，WeidofE，P．M．＆Wilson，B．W．：Righting ability and

54

発表．

9．E−64及びその類縁体の薬効に関する研究

＊

男子晴雄
＊
＊
＊

井地

＊

保恭正道

本

＊

櫓岸玉倉

＊
＊

松

＊

岩

雄幸紀司和

孝＊

和活弘

早首合＊

達

貞

上

安

＊

尾

裕

明＊

弘

正

根西田熊原

村

正

日

木

中河花小相

研究協力者 笹 島 遣 忠＊

関

大

子＊

的

1

筋ジストロフィー鶏におけるE−84摂縁体の薬効評価

E一朗及びその類縁体a，b，CはいずれもinVitroにおいて強いCANP（Ca≠activated日

neutralprotease）阻害活性を有し17，ヒトの的進行性筋ジストロフィーに対して期待される。

われわれはinvitroにおけるCANP阻害

これらの薬物の臨床的評価の前段階として，モデル疾患動物における有効性を検討することが活性，安全性，生体内動態等の多角的評価から有力な手段である。

る化合物であることを報告した6）。

E−64類縁体の中でE−64−CがE−64凌駕しう

進行性筋ジストロフィーの疾患モデルとして本研究はE−64−Cのin vivoにおける薬効

ほ，マウス21，鶏3㌧ ハムスター11等の遺伝性発をジスロフィーチキンを用いて検討することに症モデルが開発されているが，とりわけヒトのある。

疾患モデルとしては鶏のそれがより類似性が高方いといわれている。一方，最近Parkerら5）に法

より，セロトニンミオバチーのI）uchenne塑
ジストロフィー症との類似性が報告されてい（1）動物
ジストロフィーチキン（Line413）及びコソる。

トロールチキン（Line412）を使用した。

われわれは遺伝性及び薬物発症の両タイプの疾患モデルを用い，E一朗及びその類縁体の薬効を評価する目的で筋ジストロフィー鶏に対する投与実験及びセロトニンミオパチーモデルの確立を行った。

（2）藁物
E一朗−Cの生食水溶液￠）投与法
膵化1週間後より上記薬物40mg／kg及び100mg／kg・体重を皮下注。
極）投与スケジュール
毎日1回投与で3ヶ月間連投。
結果

投与群，コントロール群共に一群5羽でスタ＊大正製薬株式会社総合研究所

ートし，i）CPK及びLDHの測定，ii）フリ55

ⅢIn vivoの効果

ップテストを10日間隔で実施し，5月現在実験ための基礎的研究を目的とし，今回，セロトニ

継続中である。経過観察し，投与終了後，筋肉ンミオパチ一における筋肉重量，血中酵素活性及び病理組織学的変化の特徴を明らかにするとの酵素活性及び病理観察等の評価を行い総合的に薬効評価を行う予定である。
考察

E−64のジストロフィーチキソに対する薬効評価は杉田ら7）により実施された。われわれはE−64及びその類縁体に関する安全性，Bio−availability，さらにはその製造の容易さなど
総合的な評価から額縁体E−64−CがE−64グループの中では将来医薬品として開発するに最適

ともに，発症のための薬物投与スケジュールを検討し，さらにヒトの筋ジストロフィー症との類似点について考察した。
方法

6適齢のWistar系雄性ラットを用い，表1に示すスケジュールでイミプラミソ（Im）及びセロトニン（Se）を投与した。すなわち1日1であるとの判断を下した。しかしながら，その回Imを投与し，4日目のIm投与の6時間後に（スケジュールⅠ及びⅠ），あるいは毎日乃

最終的な評価はinvivoにおける薬効試験の結至3及び4日日のIm投与の2時間後に（スケ

果をまたねばならないことはいうまでもない。
ジストロフィーチキン，一群5羽，40mg／kg，

ジュ「ルⅢ）Seを投与した。この4日間を1
CyCleとし，それぞれ表1に示したCyCle数を100mg／kgの2ドースでパイロットテストを開繰り返した後，大腿四頭筋及び麟腹筋を分離始した。3ヶ月の投与スケジュールで症状観察
及び病理所見等総合的に評価し，さらに必要なし，重量を測定した。次に，これらの筋肉を10％中性緩衝ホルマリンで固定し，常法に従いパらば実験規模をスケールアップし，統計的に信ラフィン切片とした後，H・E，PAS及びトリク

板しうる評価を行う計画である。

ローム染色を施し，病理組織学的検査を行った。
また，スケジュールⅠ−Aについて，l cycle2

セロトニンミオパチ一に対する薬効試験

におけるSe投与後の血菜中CPK活性を測定した。なお，トフラニール（藤沢薬品）は原液
を，硫酸セロトニンクレアチニン（東京化成）は

日

的

筋ジストロフィー症治療薬の効果を検討する
場合，自然発症モデルを用いることは勿論であるが，薬物発症モデルも有用な手段となりうるであろう。しかし，そのためにはモデル動物，

0．4％CMCに懸濁し，腹腔内投与した。また，
CPK活性の測定にはイアトロセット CPK−S（三光純薬）を用いた。
結果

すなわち実験的ミオパチー動物がヒト筋ジスト（1）行動観察イミプラミソの1回あるいは連続投与によっロフィー症と頸似の異常，あるいは病理組織像ても，著明な変化は観察されなかった。しかを呈するか否かを明確にする必要がある。イミ

し，セロトニンの投与によって著明な行動上のプラミンとセロトニンによるミオパチー（セロ

変化が観察された。すなわち，セロトニンの投

トニンミオパチー）ではDucbenne型筋ジス

与後数分で，動物は転倒し，呼吸は緩徐かつ不トロフィー症に特徴的なlesionが出現LS），血中CPK及びLDH活性の上昇が認められ8）・9），

規則となり，瞳孔の散大，チアノーゼ及び後肢の筋力低下が認められた。これらの変化は1〜

さらに，月莫異常10）も報告されていることからヒ2時間持続したが，その程度は個体間で，かな

ト・ジストロフィーのモデルとして再考する価
値があろう。本研究はE一朗及びその誘導体のりの差が認められた。また，薬物投与のCyCle
数を重ねるにつれて，セロトニンに対する軽度

セロトニンミオパチ一に対する作用を検討するのtaChyphylaxisが観察された。

56

9．E−64及びその額縁体の薬効に関する研究
表1セロトニンミオバチー発症のための薬物投与スケジュール
S ch edu les

弓

Ⅱ

Ⅲ

Ⅰ
妄

Ⅰ
革

Ⅰト

Ⅰ夏

Se H

C y cleM or ta lity（mg几 9 ）（
n um b er）（％ ）C On t．

00

5 0 r lO

0

e

芸

10

25

5

0

（day）

C

10

50

5 0r lO

27 ．8

20

50

5 0 r lO

25 ．0

睾

等

Im ＊
（
m g／k9 ）

Ⅰ
葺
（
d ay）
きe

Im

≡ n t●
B

c，
O nt・

0

0

3

0

10

75

3

0

10

100

3

47 ．
8

0

0

3

0

Im

Im

Im

圭↓S e ll↓S e lJ ↓S el・2 1 ↓S el・
2 A

10

25 （
S e l）

3

0

2

3

10

50 （
S e2）

3

14 ．
3

（
4
day ）

B

・；Ⅰmipramine HCl佗）体重及び筋重畳Im（100r20mg／kg）の投与により，体重の自然増加は抑制され，さらにSe（50mg／kg）の投与によって体重は著明に減少した。しかし，投与を続けることによって体重減少はみられなくなった。大腿四頭筋及び俳腹筋の湿重量
はIm及びSe投与群において有意に減少した（図2）が体重100g当たりの筋重量に換算した場合には有意差は認められなかった。
（3）病理粗描学的所見…；Serotonin−Creatinine sulfate

薬物投与群の大腿四頭筋において，筋線経の変性及び萎縮，貪食反応を伴った壊死線経，筋核の増加，中心化及び鎖状配列，問質細胞の増加及び問質線維成分の増生が認められた。しかし，その病変形態及び程度は多彩であるので，筋症所見及び病変の分布状態により5種類に分析（図3）した。すなわち，分類①では軽度の細胞浸潤の認められるもの，分類②〜④では，
筋線経の萎縮及び壊死，核の中心化及び鎖状配列等の認められるもので，その分布及び程度に

（g）

1

2

3

4

5

6

7

8

9

101112131415（day）

図1イミプラミソ及びセロトニン投与による体重変化
57

J
〔q
E I l

−

図2

U

．J
亡

−

〔q

巨∃

J

くく
⊂

［q
l l

日

日

イミプラミソ及びセロトニンを投与したラットの体重及び筋湿重量＊；P＜0．05，＊＊；P＜0．01より3種類に分煩した（写真1〜3）。分穎⑤では問質の著明な拡大，白血球の浸潤が認められ，分類（む〜④とは変化が異質のものである（写真4）。以上の分顆に属する例数をスケジュール毎に示した（表2）。一方，餅腹筋についても同様の変化が観察されたが，その程度は撞
く軽度のものであった。
極）セロトニン投与後の血中CPR活性の変化
58

■く
I l

ヒヨ

平均土S．D．
Ⅱ−AのスケジュールにおいてCyCle数を1とした場合の最終セロトニン投与後の血集中
CPK活性を経時的に測定した（図4）。CPK活
性は，セロトニン投与後1．5時間にピーク値を示し，6時間では，ほは回復した。
考察

セロトニンミオパチ〜はDuchenne型筋ジ9．E−64及びその類縁体の薬効に関する研究

Distributioh

Changes①Interstitialcellinfiltration＊（参Scatteredlesions
OMuscle fibers
atrophynecrosis（phagocytosis）＊③Small focallesions
OMuscle fibers
atrophydegeneration
necrosis（phagocytosis）＊④Large focallesions
OMuscle fibers
atrophy
SeVere degeneration
SeVere neCrOSis（phagocytosis）
OConnective tissueinfiltration⇒i∃⑤Leucocyte（Neutrophil）infiltration★；ONuclei
central nuclei
rowing of centralized nuclei（nuclear chain formation）

図3

セロトニンミオパチ一における病理組織学的所見の分類
及び分布形態一大腿四頭筋−

ストロフィーPMD）析似の病変を形成すると及びⅢ−Bであるが，これらのうちⅠ−Aを除く

報告11）されて以来，DMD類似の組織学的損傷，血中酵素活性の上昇，膜異常等，モデル動物とすべてにおいて死亡例が認められた。そこでスしての妥当性を示唆する報告がある5）・8｝〜10）が，他方，それに疑問を投げかける報告12）も提出されている。

ケジュールⅠ−AについてDMDの特徴の1つである血中CPK活性の上昇が認められるか否かを検討したところ，すでにlcycleでのセロ

今回，われわれはラットにセロトニンミオパ

トニン投与後1時間より有意な上昇が認められ，6時間後には回復していた。これは血中セチーを作成し，その変化の特徴を観察した。イ

ロトニンの消失が早いためと推定される。まミプラミソ及びセロトニンの投与により，大腿た，膵腹筋の病変は大腿四頭筋のそれに比べて四頭筋及び麟腹筋の湿重量は対照群に比し有意かなり弱いものであった。これら2種類の筋肉に減少した。これらの筋肉について病理組織学における病変の違いは何によるものか，現在の的検討を行ったところ，大腿四頭筋に多彩な組

ところ不明である。

織変化が認められたので，その病変形態及び分布により5種類に分類した。このうち，②③及の変化を現わすことを示したが，さらに詳細な

以上，セロトニンミオパチーがDMDと類似

び④の分類にみられた筋線維及び筋核の変化と検討，すなわち，病変の進行及び治癒過程での問質結合織の増生等の所見はParkerら5）の報

組織化学を含む病理所見及び各種酵素活性の測告と一致している。彼らは，これらの変化をDMDにみられる所見と共通のものとしてい定，生理的変化の究明等が必要と思われる。

る。従って，これらの諸変化が観察される実験

結論

的ミオパチーはDMDの病態モデルとしての可E−64及びその類縁体のヒト筋ジストロフィ能性を有する。すなわち，卜B，Ⅱ−A，Ⅰ一B

ー治療薬としての開発に当って，その病態モデ
59

Ⅲb vivoの効果・・√∴．〟﹁．J．：こリ七

t．
・■

、l

■＿■′

一

リ了一﹁∴工．﹂∴、吋．，′■■小￣′−で・￣・ヽ二■＿了．′十
．＿

′

−■ヽ・＿

r
・

ハ￣「￣入‥、 ￣1，、−
′

一

￣′．∴
◆

ヽ

ナ一︑．ノ▲ヽ

t

ヽ

▲一丁

▼

◆．■

（∴鼻∴∴二

′二卜∵サ

了工も
√
一

︑

︑

■

t

●．

●

■一・

く

．

一

▲ r

−
ヽ

†

写真1大腿四頭筋，Ⅰ−A group（H．E．染色，100倍）

写真2 大腿四頭筋，Ⅰ・Bgroup（H・E．染色，100倍）

Scatteredlesions

Small focallesions

誓一言毒、 妄牽き塾、■、州も一軍一箪壱鎚．

i■■

、ノ

写真3 大腿四頭筋，Ⅰ−Bgroup（H・鼠染色，100倍）

写真4 大腿四頭筋，ⅠⅠ−A group（H・E・染色，100倍）

Large focallesions

Leucocyte（Neutrophil）
in丘ltration

表2セロトニンミオパチ一における病理組織学的変化
一大腿四頭筋一G roupsIⅡ

打

D ose s （m 9／短） N o．
of
Im −S eR a ts

①

②

③

④

3

4

A
B

10 − 25

2／6

2

10 − 5 0

5C

20 − 5 0

5／18
2／12

…

10 − 7 5

5／21

1

5

3

10 − 10 0

5／23

1

5

4

10 − 2 5

5／21
5／
21

2

3

2

5

…

10 − 5 060

C ha rlgeS⑤

M or tality （
％）

0
27 ．
8

2

25 ．
0
2
3

0
47 ．
8
0

2

14 ．
3

0

1

図4

2

3

4

5

6（hr）

セロトニン投与後の血祭中CPK活性の変化（Schedule mA， One CyCle）＊；P＜0．05，＊＊；P＜0．01

ルとして，薬物発症ミオパチーであるセロトニ
ソミオパチ一について，その当否につき若干の一，松下宏鼠p．419，筋ジストロフィーマウス

（dy，dyり），1979．

検討を行った。

3）石浦章一，杉田秀夫：同上，p．414（1）イミプラミソ及びセロトニンの投与により，呼吸の異常，チアノーゼ，後肢の筋力低
下等が観察された。
（2）薬物投与群において，大腿四頭筋及び俳腹筋の湿重量は有意に減少したが，体重100g
当たりの筋重量に換算した場合には有意差は認められなかった。
（3）薬物投与群の大腿四頭筋において，筋ジス
トロフィー症で観察される筋線経の変性及び4）L Proschek and G．Jasmin：Progression of

萎縮，筋核の増れ 中心化及び鎖状配列，問質細胞の増加及び問質線維成分の増生が認められた。
（4）セロトニン投与後，CPK活性は著明に上昇した。

Hereditary Cardiomyopathy in Hamsters
UM・Ⅹ7．1Line，J．Mol．andCellularCardiology
VOl．11，Suppl．1，50，1979．
5）Parker，J．M．and Mendell，J．R．：Proximal
myopathy induced by

5・HT−imipramine

Simulates duchenne dystrophy，Nature，247，
103−104，1974．

6）大関正弘：本誌
7）杉田ら：本誌
8）Silverman，L M．and Gruemer，H．D．：
Sarcolemmal membrane changes related toenzyme releasein theimipramine／SerOtOnin
experimental animal model．Clin．Chem．，22，
1710−1714，1976．

9）Mendell，J．R．，Engel，W．K．and Derrer．E．

参考文献

C．：Increased plasma enzyme concentrations

1）今掘ら：本誌
2）辻繋勝：疾患モデル動物ハンドブック，川俣順

provideapossiblemodelofduchennemuscularin rats with funCtionalischemia of muscle

dystropby，Nature，239，522−524，1972．

61

ⅢIn vivoの効果
10）Verril，H．L．，Pickard，N・A・and Gruemer，

E．C．：Duchenne muscular dystrophy：Func・

H．D．：Mechanisms of cellular enzyme

tionalischemia reproducesits characteristic

release．Ⅰ．Alterrationin membrane fluidity

andpermeability，Clin・Chem・，23J2219−2225，

M．A．：Experimental

1977．
11）Mendell，J．Rリ

62

lesions，Science，172，1143−1145，1971．

12）Munsat，T．L．，Hodsson，P．andJolmson，Engel，W・K・and

Derrer，

serotonin myopathy，

Neurology，27，772−782，1977．

10．E−64の一般薬理作用〜特に呼吸・循環機能及び中枢神経系に及ぼす影響〜

彦

和書

押野

＊

武

ガ研

一政

野川

高宮

反

赤丸

後八

＊
＊

研究目的
E−64，DL体及びL体の一般薬理作用の追究を目的とする。本年度は薬理作用のうち，急性
実験条件下のイヌ，ネコ，ウサギにおいて，とくに循環楼能，呼吸桟能及び中枢神経系の活動に及ぼす影響について検討を行った。
研究方法（1）実験動物：成熟した両性のイヌ，ネコ及びウサギを用いた。
佗）実験条件：麻酔下及び非動化，局麻，人工呼吸下の急性実験条件に化合体の薬理作用を検討した。麻酔にはpentobarbital（10mg／kg〜30
mg／kg静脈内適用）を用いた。非動化動物の人工換気レベルは呼気ガス02及びCO2濃度ならびに動物血酸素分圧（Pao2）の連続測定を行いつつ，適正レベルに維持された。
Q）被酎ヒ合体：E−64，L体1）・2）及びDL体2）を生理食塩液に20〜おmg／mJの濃度に溶解し，静脈内に適用した。三種の実験動物においてL
体の1回適用量，1〜100mg／kg，累積適用総量
15〜350mg／kg，DL体の1回適用量5〜100
mg／kg，累積適用総量10〜110mg／kgを適用した。
極）循環機能i）動脈血圧：大腿動脈血圧を圧トランスデ＊東京慈恵会医科大学 第二薬理学教室

原

福
＊

合

子伸三

首嘉淳

口 川井

木西亀

研究協力者

ユーサーを用いて観血的に測定，他の諸現象記録と共にペソ書記録器を用い記録した。
ii）心電図（ECG）：標準肢第一導出によった。
iii）大腿動脈脈波：脈波の波型変化を平均加算解析法によって検討した。
iv）交感神経（大内臓神経）自発発射活動電位を導出記録した。
（5）呼吸機能i）呼吸運動：胸開法により胸郭周径変化を，サミスターを用いて呼吸流速を測定記録した。

ii）横隔神経自発発射活動電位：頸部で横隔神経を分離，切断中枢端から遠心性活動電位を導出した。導出された電位はデータレコーダー
を用い磁気テープに収録，要に応じて再生して，医用電算枚を用いてデータ解析を行った。
（6）Pao2：ポーラログラフ法により腸骨動脈におけるPa02を連続的に測定，記録した。
（7）呼気ガス酸素濃度（FEO2）及び炭酸ガス濃度（FECO2）：呼気ガス瞬時分析装置（三栄測器，
lHO2及び2HOl）を用いて連続的に測定記録した。
（8）脳波（EEG）：頭皮上脳波又は皮質脳波を双球銀電極を用いて導出，記録した。導出された脳波を磁気テープに収録し，医用電算横を用いてパワースペクトル分析を行った。
（9）諸現象の記録：上述の諸パラメーターはそれ
ぞれ増幅され，同時にポリグラフ的にべン書オ
63

ⅢIn．Yivoの効果

シログラフに記録した。他方，これらの諸現象をデータレコーダを用いて磁気テープに収録
し，医用電算校を用いて詳細なデータ解析を行った。
帥医用電算枚によるデータ解析
上述の諸現象を医用コンピューターの種々のプログラムを用いて解析，評価した。
i）心拍数：心電図のR波の時間間隔ヒスト
グラムを演算し，平均値，標準偏差を得，心拍数変化を分析した。
ii）脈波波形：大腿動脈脈波の平均加算（100回）を行い波形変化の有無を検討した。
iii）杭隔神経活動電位：活動電位放電群を構成するスパイク電位の数と振幅のヒストグラム
を演算，平均値と標準偏差を算出した。
iv）EEG：脳波のパワースペクトル分析を行った。

ウサギにL体を，静脈内適用し，その影響を検討した（蓑1）。
表1ET64のDL体（DL）及びL体（L）の作用を検討した動物種と実験条件
DL

I

L

Paral．l Anesth．l Paral．l Anesth．

Paral．：非動化し，呼気から02およびCO2濃度の連続監視のもとに適正な人工換気で維持した条件．
Anesth．：pentObarbital麻酔下の実験条件．
記号○：実験を実施済の条件．
（1）一回適用且及び適用総量i）L体：麻酔ウサギにおける一回適用量は10〜100mg／kg，総量は120mg／kg，非動化ウ

研究成果

サギでは，一回適用量は1〜100mg／kgの範囲（Ⅰ）実験動物の種類及び実験条件，ならびに化合体適用量にあり，2〜3時間内における適用総量は15〜

急性実験条件下の麻酔イヌ，非動化ネコ，非350mg／kgであった（表2）。
ii）DL体：麻酔イヌで一回適用量5〜40

動化ウサギにDL体を，非動化ウサギ及び麻酔

mg／kg，適用総量65〜75mg／kg，非動化ネコ

表2 E−64（L体）の静脈内一回適用量と適用回数（N）及び適用総量
Dose

l

N

TotalDose
15

mg／kg

Dose
20

mg／kg

lOO

25．56
90
100
150
206
350

左表：非動化ウサギ，中央：2〜3時間内における適用総量，右表：麻酔ウサギ．
表3 E−64（DL体）の静脈内一回適用量と適用回数（N）
Dose

t

N

Dose

l

N

左表：非勧化ウサギ，中央：非動化ネコ，右表；麻酔イヌ．
64

l

N

L．10MG／K61V

ナL・10H6化6Ⅳ，岨｝｝川嶋嶋hJL 攣誓二声こ｝■｛｝｛｝
引r

9㌢

も〇一一

釘■一

5′

．上巳

2減擁編編編編編繊細蕪醤硝藍禦慧慧慧蕪覿蕪轟袈

贈細則榊

川輌欄画仰紳坤州中細明細如
い中州梢榊柵帰納

R．ANESTH．T E
図1E−64（L体）の影響￣
1：動脈血圧（記録右端の校正・mmHg），2‥心電図，3：脳波，4：横隔神経活動電位・L：E−64，L体・PENT：pentObarbital・図の左側半部に人工呼吸下に非動化したウサギ，・右側半部に人工呼吸下に麻酔したウサギにおけるL体10mg／kg静脈内適用前後の記録を示した（記録1上部の横線は適用期間を示す）．

BL．10日師Gl．V．

票忘虻等

▲

3十十1群構碍精粋叫岬州冊岬州脚醐糎碍碍親

′▼

篭

．︺

．ノ

■

．

＼

∪

． −

汀i軋

一 ・

1

T

岬∴

︵蓼

﹁

ハ日

︹

︹
I
．

∫J

﹁ミ︼ltV

正一

一一

は一

一一一

一−一一一一1−1

図2 E−64（L体）の影響
非動化ウサギ・1：動脈血圧・2‥心電図・2′：脳波，3：横隔神経活動電位，4：呼気
ガス酸素濃度・5：呼気ガス炭酸ガス渡凰6：動脈血酸素分圧（記鐘右端甲電流校正値＝0・1×10￣■A）．

65

ⅢIn vivoの効果

図3 E−64（L体）の動脈血圧に及ぼす影響
血圧上昇を示した非動化ウサギ（7例，適用前の平均血圧121士9mmHg）における血圧変化の時間経過．S：収縮期圧，D：拡張期圧・M：平均血圧・縦軸：適用前の値に対する百分率，横軸：時間・各記号はそれぞれ一実験例を示し，曲線右端の数字
は適用量（mg／kg）を現わす．
では，それぞれ6．2〜10mg／kg，10〜18・5mg／

後3〜4時間の観察時間内に，いずれの動物にkg，非動化ウサギでは5〜100mg／kg，95〜110

おいても致死効果は認められなかった。

mg／kgであった（表3）。
但）毒性‥上述の適用総量を2〜3時間にわた
る実験時間内に数回に分けて間欧的に静脈内適用した。
化合体適用によって，前述の各実験条件下の実験動物において，循環扱能の変化をはじめとして種々の影響が発現した。しかし，総量適用
66（Ⅱ）循環機能に及はす影響
イヌ・ネコ・ウサギにおいて動脈血匠，脈波，心電図，ネコにおいては，これらの諸パラメーターに加えて血管収縮神経遠心性活動電位に及ぼす影響を検討した。
（1）L体の作用
i）麻酔ウサギにおける作用10．E−64の一般薬理作用

BP（→）

R．WAL．
L

1000％

ll

1000
11

図4 E−64（L体）の動脈血圧に及ぼす影響
有意の変化を示さなかった6例（適用前の平均血圧103土lmmHg）．非動化ウサギ．
S・D・M・縦軌横軌記号，曲線右端の数字の説明については図3参照．

Ether麻酔下で，両側迷走神経切断，神経筋
接合部遮断薬を用いて非動化した人工呼吸下のウサギをpentobarbitallOmg／kg静注によって麻酔した。E−64，L体10mg／kg，100mg／kg
適用により数分間にわたって，ごく軽度の動脈kg）を適用し影響を検討した。
1）動脈血圧：L体の1〜100mg／kg静脈内
適用直後から10〜15分後にわたって上昇（7例）（図2，図3），変化が認められない場合（5例）（図4）及び下降（7例）（図5）の三様の変化が認められた（図6）。上昇（図7）または下降がおこる場合，収縮期圧，拡張期匠及圧下降が認められたが，ECG，脈波には有意の変化が認められなかった。図1に10mg／kg適用時の変化を示した。
ii）非動化ウサギ（両側迷走神経切断）における作用

び平均血圧は，ほぼ並行して変化した。血圧上昇は緩徐に発現し，上昇例における平均血圧の変化率は，適用前のレベルの10〜20％（図3，

L体1〜100mg／kg（累積適用15〜350mg／

M），下降例のそれは10〜30％の範囲にあり（図67ⅢIn vivoの効果

図5 E−64（L体）の動脈血圧に及ぼす影響
血圧下降を示した5例（適用前平均血圧70土19mmHg）・非動化ウサギ・S，D，M，縦軌横臥記号，曲線右端の数字の説明は図3参照・

5），変化のピーク時の平均値と適用前の平均
値の差は統計的に有意であった（表4）。これ
ら血圧反応の三型の変化方向と適用前の動脈圧レベルとの問には相関関係が認められた。すな
わち，血圧上昇，不変，下降例のL体適用前の平均血圧の平均値（土SD）はそれぞれ121

強度を比較すると，10mg／kgのそれが最大であり，100mg／kg，ついで1mg／kgの順であった（図8）。10mg／kgを30〜60分の時間間隔で繰り返し，適用した場合の血圧変化にタキフィラキシーは認められなかった。
2）脈波：電算校による100回の平均加算演（土9），103（土11），70（土19）mmHgであってこれらの平均値相互間の差はいずれも有意であった（表5）。
三段階の適用量，1，10，100mg／kgの作用算の成績を検討した。化合体適用前後の波型に差は認められなかった（図9，A〜D）。
3）ECG：

68a）波型には著変が認められないが，一部の

10．E−64の一般薬理作用

図6 E−64（L体）の平均血圧に及ぼす影響
非動化ウサギにおける平均血圧変化の時間経過を平均値で示した．縦軸：適用前の平均血圧値に対する百分率，横軸：時間．矢印：適用時点上段：血圧上昇例（適用前の平均血圧の平均値＝121士9mmHg），中段：血圧下降例（103土lmmHg），下段：
血圧の変化を示さなかった例（70士19mmHg）．上段及び中段のグラフの適用後2分の値と適用前の値の差は統計学的に有意．
蓑4 E−64（L体）の平均血圧に及ぼす影響

非動化ウサギにおける平均血圧変化の時間経過を示した．
A：血圧上昇例（適用前の平均血圧の平均値＝121土9mmIIg）
B：血圧不変例（103土lmmHg）
C：血圧下降例（70±19mmHg）
69

ⅢIn vivoの効果

図7 E一朗（L体）の動脈血圧に及ぼす影響
血圧上昇を示した一例を示す．非動化ウサギ．縦軸：動脈圧．S，M，D，横軸の説明は
図3に同じ．矢印：L体適用時点．
A
L・lM01▼！灯

B
5・

C

R．恥町

こいOH／■●け；∝r mrげ

こし・1∝lHO／KOけ：

山一仙r u・ごニ−■■ 二二二二二二二二′■｛｝｛｝

⁝川

酬岬
酬榊

日日

州紺榊

棚

拙州

椚裾

加醐肌用刷貼附伽冊ⅧW醐皿
図8 E−64（L体）の作用比較
非動化ウサギ．1：動脈血已 2‥EEG，3：横隔神経活動電位，4：呼気ガス02濃度（連続記録の一部を示す），5：呼気ガスCO2濃度．
A：L体1mg／kg静脈内適用，B：10mg／kg適用，C：100mgノkg適用．
70

10．E−64の一般薬理作用
表5 E−64（L体）による動脈血圧の変化方向と化合体適用前の平均血圧との関係
Ⅹ±SD
（To汀）

A

1

7

1121±9B l

71103±11

C l

5

1

70土19

非動化ウサギ．A：血圧上昇群，B：血圧変化を示さない群，C：血圧下降群．N：実験例数．
左表：三群の平均値の差はいずれも有意である．右蓑：各群の平均血圧の平均値と標準偏差（富士SD）．

ECG
J

′

I

j

一

山

J

J

j

J1

C

j

−

1

叫刃ン｛√叫ハイ√叫冊√
H

ノ九叫

こ￣∵

軋、八

∴

l j l

二∴＿−∴

C

予

ペ叫・／Ⅵ▲／可否パパー√r＝∴∴∴ユー一一∴∴∴∴図9 E−64（L体）の脳波（A〜D），心拍数，心電図（G〜J）に及ぼす影響
A〜F，Jは非動化ウサギ，G〜Ⅰは非動化ネコにおける記録，時漂（G及びJの右下部）：1秒．A：L体適用前，B：10mg／kg静脈内適用後1分33秒，C：10分後，D：18
分後．E：L体適用前のR−R間隔ヒストグラム（平均値士標準偏差＝219土7msec），F：
10mg／kg静脈内適用後10分（242土15msec）．G：L体適用前のECG，H〜J：適用後のECG．

例で適用後30〜90秒後から一過性に不整脈が発現し（図9，J），ある例では心室性期外収縮が現われた。
b）電算撥によるヒストグラム解析によって心拍数に及ぼす影響を検討した（図9，E，F）。
13例中3実験例において，適用前の値の5〜20％の減少が認められ，このL体適用による徐脈は100％02の吸入下においても発現した。
佗）DI」体の作用i）麻酔イヌにおける作用
DL体5mg／kg適用により動脈圧に有意の変化は認められなかった（図11，B）。一部の実71

ⅢIn vivoの効果

図柑 E−64（L体）の心拍数に及ぼす影響
非動化ウサギ．縦軸：適用前の心拍数に対する百分率，横軸：時間．上段：L体1または5mg／kg静脈内適用後の変化の経過，中段‥10（9例），20（4例），40mg／kg（1例）適用後，下段：100mg／kg適用後（5例）．

72

10．E−64の一般薬理作用

5MG爪G．Lv．gL

8

20MG／KG．i．V肌

トー●

T￣

C RmmGニrlm∵∴Ⅵ胴淵皿冊5。ノ／／√
図11E−64（DL体）の影響
麻酔イヌ・1‥動脈血凪2：心電図，3：呼気ガス酸素濃度，4：呼気ガス炭酸ガス濃度・5：呼吸流速曲線（上方のふれが吸息）・B；DL体5mg／kg静脈内適用（1上部の横線は静江持続を示す）．C；20mg／kg適用．

験例で20mg／kg適用により軽度の平均血圧の上昇（10mmHg程度），収縮期及び拡張期圧の上昇及び脈圧の拡大が認められ，これらの変化
は十数分間持続した（図11，C）。このとき，適用直後に短時間不整脈が発現する少数例を例外
として，心電図及び脈波波型に有意の変化は認められなかった。
ii）非動化ネコにおける作用て適用直後，心室性期外収縮がおこった（図9，
H，Ⅰ）が，いずれも一過性でありその後ECG
波形，心拍数，脈波波形に有意の変化は認められなかった。交感性血管収縮神経線経を含む大内膿神経及び腎交感神経遠心性発射活動のいずれにも有意の変化は認められなかった。
iii）非動化ウサギ（両側迷走神経切断）における作用

Ether麻酔下に，神経筋接合部遮断薬で非動化人工呼吸で維持したネコにおいて，両側迷走神経及び頸動脈洞神経を切断し，末梢受容器からの反射性影響を除いた条件下に，DL体の影響を検討した。

DL体5〜100mg／kg（総量95〜110mg／kg）
適用により数分間にわたり，軽度の動脈圧下降が認められたが，この時の平均血圧は110mmHg前後であった。また同時に，7例中1例において対照値の15％程度の徐脈がおこったが，他の6例では有意の心拍数の変化は認められなかった（図13）。

DL体6・2〜iomg／kg静脈内適用により，動脈血圧示収縮期及び拡張期圧の軽度の上昇（10〜15mmHg）が約10分間にわたって発現した（図12，B）。この時，一部の例のECGにおい

73

ⅢIn vivoの効果

DL．85目釘KGi・Y．
l●●

f
l
一

呪

．
1
1

伽

．
■

2・＼t、＼ヾ、、＼・、ヾ∴・、＼＼＼＼・、・∴・、＼

■

幻

︻

3潮岬潮岬蒜．L
叫刷叫両叫
C．PARAL．Y．S
E

図12 E−64（DL体）の影響
非動化ネコ（両側迷走交感神経幹，頸動脈洞神経切断）．1：時標，2：動脈血圧，3：心電図，4：脳波．B：DL体8・5mg／kg静脈内適用．

図13 E−64（DL体）の心拍数に及ぼす影響
非動化ウサギ．縦軸：適用前の心拍数に対する百分率，横軸‥時間．記号はそれぞれ一実
験例を示し，各曲線右端の数字は静脈内適用量を示す．5〜100mg／kg（N＝7）．

74

10．E−64の一般薬理作用

図14 E−64（L体）の横隔神経活動電位に及ぼす影響
非動化ウサギ．各グラフは電算依演算によって得られた振幅ヒストグラム，縦軸：活動電位に含まれるスパイク数，横軸：電圧で表わされたスパイクの振幅，
上段：適用前（スノミイク数N＝1920，平均値M＝53），中段：100mg／kg静脈内適用後3分（N＝1974，M＝53），下段：適用後15分（N＝2032，M＝53）．適用
前後における NXMの値の差は有意ではない．

（Ⅲ）呼吸機能に及はす影響（1）L体の作用

表6 E−64（L体）の横隔神経活動電位の呼吸性
放電群の周期に及ぼす影響

i）Pentobarbital麻酔下のウサギにおける作用
横隔神経遠心性発射活動電位に現われる呼吸性放電群の周期，及び放電群に含まれるスパイ
クの数と振幅の積に及ぼす影響を検討した。後者は，横隔神経の呼吸性活動総体増減の量的指標と考えられ，電算機による演算によって算定され総活動量（スパイク総数×振幅の平均値）
として表わされる。
L体10〜100mg／kg適用により，横隔神経放電群周期及び活動総量に有意の変化は認められ

非動化ウサギ．N：実験例数．Before：適用前の周期の平均値と標準偏差，After：L体静脈内適用後10〜15分後における周期．N．S．：nOt SigniBcant．

なかった（図1，右側，4）。
ii）非動化ウサギにおける作用
L体1mg／kg適用例では，放電群周期，総75

ⅢIn vivoの効果

50▲8

31︻

1 0鋸Kγ
4LM

2
L ⁚ M

EEG・POWER SPECTRUM
R

PARAL．

図15 E−64（L体） のEEGに及ぼす影響
非勧化ウサギ．電算扱演算により得たEEGのノミワースベクトル．縦軸；パワー値，

横軸：周波数．1，3：L体適用前，2： 1mg／kg静脈内適用後1分，4：10mg／kg
適用後1分．5‥10mg／kg適用後5分． lと2及び3と4または3と5の総パワー
値の差はいずれも有意ではない．
活動量に変化が認められない。10〜100mg／kg
適用により静江直後から5〜6分間にわたって多くの例で，適用直後に神経発射活動の増加と放電群周期の短縮が起った（図2，B，3；図8，B，C，3）が，以後，有意の変化は認められなかった（図14）。表6にL体適用前後の放電群周期を比較して示した。
佗）DL体の影響
i）麻酔イヌにおける作用
呼吸流速に及ぼす影響を検討した。5〜40
mg／kg適用により有意の変化は認められなかった（図11，B，C，5）。
ii）非動化ネコにおける作用
両側で迷走神経及び頸動脈洞神経を切断した
76

表7 E−64（L体）の呼気ガス02濃度（FEO2），
CO2濃度（FECO2）及び動脈血02分J王（Pao2）に及ぼす影響
Before l After

非動化ウサギ．N：実験例数．Before：適用前の平均値と標準偏差，After：L体1〜100mg／kg静脈内適用後10分．N．S．：nOt Signi丘cant．
非動化ネコの杭隔神経活動はDL体6．2〜10
mg／kg（総適用量10〜18．5mg／kg）によって有意の変化を示さなかった。

10．E−64の一般薬理作用iii）非動化ウサギにおける作用
両側迷走神経切断後において，5〜100mg／kg（適用総量95〜110mg／kg）適用前後の横隔神経活動の放電群周期及び総活動量に有意の差は認められなかった。
（Ⅳ）呼吸，循環の化学的調節因子に及ほす影響
i）L体の作用
頸部で両側の迷走，減圧及び交感神経を切断したPentobarbital麻酔ウサギ，及び非動化
ウサギにおけるFEO2，FECO2，Pa02は，それぞれ20〜100mg／kg（適用総量120mg／kg）
及び1〜100mg／kg（適用総量15〜350mg／kg）
適用によって有意の変化を示さなかった（表7；図2，B，4，5；図8，A，B，C，4，5）。
ii）DL体の作用
Pentobarbital麻酔下のイヌ（図11，B，C，
3，4），非動化ネコ（迷走，頚動脈洞神経切断）のFEO2及びFEC02はそれぞれDL体5〜40mg／kg（適用総量65〜75mg／kg），6．2〜10
mg／kg），6．2〜10mg／kg（適用総量10〜18．5
mg／kg）によって有意の変化を示さなかった。
また，両側迷走，減圧，交感神経を切断した非動化ウサギのFEO2，FECO2（図2，B，4，5；
図8，4，5），Pao2（図2，6）にもDL体5〜100mg／kg（適用総量75〜200mg／kg）適用により有意の変化が認められなかった。
（Ⅴ）脳波（EEG）に及はす影響
i）L体の作用
Pentobarbital麻酔ウサギ及び非動化ウサギ（両側迷走神経切断）の頭皮上EEGに及ぼす影響を電算機を用いるパワースペクトル分析によって検討した。麻酔ウサギのEEGはL体20〜100mg／kg適用により著明な変化を示さなかった（図1，右側，3）。L体1〜100mg／kgを適用した24例の中，4例（10mg／kg，100mg／kg
適用例それぞれ2例）において適用直後から2〜6分間にわたって速波化し，総パワー値の著減（対照値の40％減少）（図8，A，B，2），
2例では同期化′くターン（図8，C，2）が一過性に出現したがそれ以後，有意の変化は認められなかった。適用直後の変化は1mg／kgあるいは100mg／kg適用時に比べて10mg／kg

適用時に最も著しく，かつ持続も長かった。図15にL体1及び10mg／kg適用前後における非動化ウサギEEGのノミワースベクいレを示した。
ii）DL体の作用
DL体5〜100mg／kg適用によって非動化ウ
サギ（両側迷走神経切断）の頭皮上EEGに有意の変化は認められなかった。また，非動化ネ
コ（両側の迷走，頸動脈洞神経切断）の体性運動野及び体性感覚野の皮質脳波はDL体6．2〜10mg／kg（適用総量10〜18．5mg／kg）適用によって認めるべき変化を示さなかった。図12に8・5mg／kg適用時のEEGパターン（同図，4）
を示した。
考

察

今年度は，イヌ・ネコ・ウサギの三種動物を用いて，急性実験条件においてE−64のL体及びDL体の一般薬理作用のうち，とくに呼吸枚能，循環機能，呼吸，循環調節の化学的因子及び中枢神経の電気的活動に及ぼす影響について検討した。
急性実験は麻酔下で行われることが多い。
この場合，麻酔薬の種類と麻酔の深さは呼吸系，循環系，中枢神経系の枚能を著しく変化させる3）・4）。本研究では，この問題を考慮してpentobarbital麻酔及び非動化の両条件下にある動物において化合体の作用を検討した。また，一般に動物種によって上記の三校能系の物に対する反応が異なる場合も予想される。この見地から，研究ではイヌ・ネコ・ウサギの三種について比較検討を行った。
ウサギでのL体の2〜3時間内における累積適用総量の最大値は350mg／kg（静脈内），DL
体のそれは，ウサギで110mg／kg，イヌで75mg／kg，ネコで18．5mg／kgであったが，いずれの場合も致死効果は発現しなかった。マウス，ラットにおける50％致死量の推定値は1g（腹腔内）以上といわれている5）。
麻酔下及び非動化条件の三種動物のいずれにおいても，呼吸，循環機能の化学的調節因子，
呼気ガス02，CO2濃度及び動脈血02分圧には，
77

ⅢIn vivoの効果

L体，DL体の適用後，有意の変化が認められなかった。
麻酔及び非動化条件下三種動物のいずれにおいても，頭皮上及び新皮質EEGにも適用直後の一過性の変化以外に変化が認められないこと，また呼吸中枢の活動状態の直接的指標である横隔神経活動電位，血管運動の中枢神経機構の活動を示す交感神経活動に対しても適用直後に発現する軽度の変化以外には認むべき変化が共通していたが，下降の程度はL体の方が大で発現しなかった。これらの生体諸電気活動への
E−64L体，DL体の影響の有無は通常の視察法による評価のみならず，電子計算按を用いるデータ解析に基づいて判定された。
麻酔及び非動化条件下のウサギ，ネコ，イヌ
において，化合体適用後10〜15分以内に以下に述べる循環校能のパラメーターの種々の変化が発現したが，それ以後有意の変化は認められなかった。
ウサギ・イヌ・ネコにおいて，L体適用による動脈血圧の上昇及び下降は，直後から発現度について見ると，L体の1mg／kgと10mg／

し，圧受容器から中枢への反射性入力が著しい
影響を及はさなくなると考えられる時期（適用後10〜15分後）迄持続した。血圧下降相に不整脈または徐脈の発現を伴わない例があった。こ

響を検討した。

の事実及び動脈血PO2，呼気ガス02，CO2濃度に殆ど変化が認められていないという成績
は，今後L体適用による血圧変化の捺序を解析していく場合の重要な基礎的知見となる。この
少数の例においてのみではあるが，脈波波型の変化を伴うことなく徐脈が発現することが確められた。また，迷走及び頸動脈洞神経切断後のネコにおいてDL体適用により血圧上昇が認められたが，非動化のウサギでは血圧の軽度の下降が認められた。これには麻酔による適用前の血圧レベルの低下が関係していると考えられる。
DL体とL体の作用を非動化ウサギにおける作用について比較すると，DL体適用による血圧上昇例がなかったこと及び徐脈の発現が認められなかった点でL体の場合と異なっていた。
麻酔下及び血圧の対照値の低い実験例では，両化合体によって軽度の血圧下降がおこる点では40mg／kgであった。
1）両化合体適用により呼吸，循環機能の化
学的調節田子，呼気ガス02濃度，CO2濃度及び動脈血酸素分圧には変化が認められなかった。
2）ウサギ・ネコの横隔神経遠心性活動電位
は化合体適用直後一過性の活動増加を示した

78

あった。
L体による血圧上昇，L及びDL体による血圧下降の薬理学的性格は，今後の検討に得たねばならない。現在，予備実験においてL体による昇圧がアドレナリン作動性効果遮断薬（α型）
前処置により降圧に反転することが観察され，さらに詳細な検討を加えつつある。
ウサギでの血圧上昇または下降及び徐脈の程kgの効果との間には用量依存性が認められるが，100mg／kgの効果は10mg／kgのそれより軽度であった。この理由を明らかにするためには，L体の生体内運命，薬動力学的知見との関連を考慮しつつ今後の検討が必要である。
要

約

ウサギ・ネコ・イヌを用い，麻酔下及び非動化の急性実験条件のもとにE−64L体及びDL
体の呼吸，循環機能及び中枢神経系に及ぼす影
L体の静脈内適用量はウサギにおいて，1〜100mg／kg，DL体のそれはウサギで5〜100
mg／kg，ネコでは6．2〜10mg／kg，イヌで5〜が，以後，有意の変化を示さず，イヌの呼吸流速にも変化が認められなかった。
3）両化合体は，ウサギ・ネコの脳波に影響を及ぼさなかった。
4）L体適用によりウサギの動脈圧は実験例
により軽度の上昇，無変化，軽度の下降の三様の変化を示し，それぞれの群の対照時の平均血圧は，121土9，103土11，70土19mmHgであった。両側迷走交感神経幹，頸動脈神経を切断したネコの動脈匠はDL体適用により軽度の上昇を示した。

10．E−64の一般薬理作用

5）少数例のウサギにおいてL体，DL体適用後10〜20分間にわたって，徐脈が発現した

Synthesis of E−64，a neW thiolproteaseinhi・が，この時，脈波波形，心電図波形に変化は認
められなかった。また，一部の側で不整脈が発現した。

3）Hukuhara，T．，Jr．，Saji，Y．，Kumadaki，N．，

bitor，Agric．Biol．Chem．，42，529−536，1978．

Kojima，H．，Tamaki，H．，Takeda．R．and Sa・kai，F．：Die Lokalisation von atemsynchron
entladenden Neuronen in der retikuはren

文献1）Hanada，K．，Tamai，M．，Yamagishi，M．，
Ohmura，S．，Sawada，J．and Tanaka，Ⅰ．：Iso・Formation des Hirmstammes derKatzeunter
VerSChiedenen experimentellen Bedingungen，
Naunyn−Schmiedebergs Arch・Pharmak．exp．
Path．，263，462−484，1969．

lation and characterization of E−64，a neW4）Uvn畠S，B．：Central cardiovascular control，thiol proteaseinhibitor，Agric．Biol．Chem．，

Hdb・Physiol．Sect．1，Neurophygiol．，Vol．ⅠⅠ．，

42，523−528，1978．

Amer．Physiol．Soc．，Wash D．C．，1131−1162，

2）Hanada，ⅩりTamaiM．，Ohmura，S．，Sawada，J．，Seki，T．and Tanaka，Ⅰ．：Structure and1960．

5）沢田，大関：私信．

79

ⅣIn vitroの効果

11・微生物が産生するプロテアーゼ阻害物質の成熟ネズミ肝初代培養細胞に対
する影響

市原

12．培養筋細胞に対するE−64の作用小沢鉄二郎

13・E−64処理を施したニワトリ骨格筋培養細胞の電子顕微鏡観察…………………‥大槻

14・筋ジストロフィー症における筋膜脂質に関する研究

宮武

明

磐男

正

〜筋ジストロフィーチキンの筋ガングリオシドに及ぼすE−64の効果について〜

15．筋蛋白質代謝回転

江橋 節郎

16・E−64及びE−64誘導体によるラット肝カテプシソB及びLの阻止について（invitro，invivo）

勝沼 信彦

17・カルシウムプロテアーゼと蛋白質燐酸化反応による生理機能の調節に閑す西塚 春美
18・Ca依存性中性プロテアーゼ（CANP）に対するE−64の効果……・・……………・今掘

19・Ca依存性プロテアーゼの活性測定法の問題点

和友

杉田 秀夫

11．微生物が産生するプロテアーゼ阻害物質の成熟ネズミ肝初代培養細胞に対する影響

研究協力者

田

市

原

中

啓

はじめに
細胞内蛋白質量はその合成速度と分解速度の釣り合いによって変動するが，そのメカニズ
ム，掛こ分解機構については不明な点が多い。
しかしながらライソゾームが発見されて以来，
この細胞内顆粒の蛋白質分解に対する役割が注

明＊
二＊

生

垣

尚

彦＊

酵素活性の測定

酵素標品は凍結融解後の細胞上清画分を用い，ヘモグロビン（Hb）及びα−N−ベンゾイルー
DL一アルギニソーβ−ナフチルアミド（BANA）

水解活性はそれぞれAnson．｝及びBarret5）の方法で測定した。

目されいる。そこで著者らは微生物が産生する

結 果

プロテアーゼ阻害剤を利用して肝臓のライソゾ
ーム，プロテアーゼの役割について初代培養肝細胞内蛋白質分解に対する麒性及びチオールプロテ
アーゼの役割細胞を用い検討したところ，カテプシソの生理的意義の他，種々の特異的現象を兄い出したので報告する。

ゼ，即ち酸性（カルポキシル）プロテアーゼと尚，成熟ネズミ肝初代培養系は種々の肝機能を維持しており，その具体的な方法及び蛋白質
代謝を中心とした細胞枚能についてはすでに発ライソゾーム中には二種のエンドべプチダー
チオールプロテアーゼが存在していることが知られている。前者はカテプシソDと呼ばれているが，後者はカテプシソB，H，Lの3種の異表しl）・2，，また総説3）でも述べたので省略する。

ったプロテアーゼに細分されること6）が最近明らかになってきた。一方梅沢ら7）は酸性プロテ

材料及び方法

アーゼの特異的阻害剤としてペブスタチソを，肝実質細胞の分離と初代培養法
肝細胞はコラゲナーゼ漂流法により分離し，
ファルコン組織培養用プレートを用い静置単層培養した。培養液としてウィリアムスE培地に10％牛血清，抗生物質，インスリン（10−7M）
及びデキサメサゾソ（10−5M）を添加したものを用いた。これらの詳細については既報1）・3）の通りである。

またチオールプロテアーゼの特異的阻害剤としてロイペプチソを微生物より分離・精製した。
そこでこれらの阻害剤の両酵素活性に対する影響について検討した。酸性プロテアーゼはHb−
水解活性として，またチオールプロテアーゼは
BANA一水解活性として測定した。図1−Aに示すように，培養2日後の肝細胞にべブスタチ
ソを添加するとBANA−水解活性に何ら影響することなく，Hh水解活性を強く抑制した。べ
ブスタチソはジメチルスルホキシド（DMSO）＊徳島大学 医学部 附属酵素研究施設 酵素病理部門に溶解し，DMSOの終濃度は1％にしたが，この濃度のDMSOは両酵素活性には全く影響
83

ⅣIn vitroの効果︵彗到垂琴号室 ▲▼阻害剤添加後の時間
図I BANA一及びHb−水解活性に対するべブスタチソ及びロイべプチソの影響
2日間培養した肝細胞にA：べブスタチソ（50〃g／mJ）及びB‥ロイべプチソ（50〃g／mわを添加した後，経時的にプロテアーゼ活性を測定した・活性は阻害剤未処理のものを対照とし，それに対する％で表示した．結果は平均値土標準偏差（3実験）である・しなかった。同様に図1−Bはロイべプチソの影響について調べたものであるが，BANA一水
解活性は添加後急速に阻害された。しかしながら予想に反して，Hb一水解活性は添加4〜5時
間経過後から急速にその活性が上昇し，24時間
後では対照値の5〜6倍の値を示した8）。この
Hb一水解活性の増加については後述する。
次に両阻害剤の蛋白質代謝回転に対する影響について検討した9）。両阻害剤は細胞内蛋白質の合成活性にもまた細胞外蛋白質の分泌活性にも全く影響しなかった。更に位相差麒徴鏡による細胞形態にも特別の変化は認められず，細胞に対する毒性効果はほとんどないと考えられた。そこで蛋白質分解活性に対する結果について図2に示した。
蛋白質分解活性はハンクス液中へのニソヒド
リン陽性アミノ酸の放出速度で測定した。この
84

方法は比較的全体蛋白質の分解活性を観察していると思われるが，細胞内含量の少い蛋白質及び代謝回転速度の遅い蛋白質などほ含まれていないかも知れない。さて，べブスタチソは徐々に作用し，添加1日後で約15％の蛋白質分解の抑制が観察されたにすぎなかった。他方ロイべ
プチソは急激に作用し，添加15時間後最大に達し約60％の強い抑制が観察されたが，更に長期間作用させると，蛋白質分解抑制の部分的な回復が観察された。この結果は図1−Bで示した
Hb一水解活性の誘導との関連性が示唆される0
またべブスタチソ及びロイべプチソを同時添加すると，常に相加的な蛋白質分解の抑制が観察され，更にベブスタチソが存在してもロイべプ
チソの長期間処理による蛋白質分解抑制の回復は認められた。これはロイベプチソによって誘導されるHb−水解活性がべブスタチソによる

11．微生物が生産すプロテアーゼ阻害物質の成熟ネズミ肝初代培養細胞に対する影響

0︵堅塁善吉品義盛ヽ〃卜︶埜悪法表裏西南

0

図2

10

20

30

40

50

阻害剤添加後の時間
蛋白質分解活性に対するペブスタチソ及びロイべプチソの影響○；べブスタチソ（100J瑠／mり，□：ロイペプチン（50J噌／mJ），
1：べブスクチソ＋ロイぺプチソ
蛋白質分解活性はハンクス液中へのニソヒドリン陽性アミノ酸の放出速度を測定し対照値の％で表示した．

阻害を受けないこと（後述）と一致すると思わ

図3−Aのように，ロイペプチソの他にもアンれる。

チパインはBANA一水解活性を抑制し，逆相関以上の結果をまとめると，細胞内の蛋白質分解に対しては特にチオールプロテアーゼの役割

的にHb−水解活性を誘導させた。

が重要であることが示唆されたが，同時に酸性

またキモスタチソはBANA−水解活性に影響せずにHb一水解活性を誘導させた。尚キモ

プロテアーゼもチオールプロテアーゼとは異っスクチソの場合は図3−Bのように添加24時間た役割を演じている可能性が示唆された。

後では誘導効果が弱いが，更に10時間位経過す

酵素阻害物質によるHト水解活性誘導の特性
ロイべプチソによる Hb一水解活性の上昇は度の効果を示した。他方図3−Cに示すように

シクロへキシミド及びビューロマイシン等蛋白

エラスチナール及びE−64はBANA−水解活性質合成阻害剤で完全に抑制されることから，こを強く阻害したが，Hb−水解活性には全く影響の活性増加は新しい蛋白質合成を介した酵素誘導と考えられる。またこの現象はHb−水解活に対してBANA一水解活性の抑制が必須な要因

性に特異的であり，酸性ホス7ァクーゼ，チト

ではないことを示唆している。しかしながらこ

クローム酸化酵素及びNADPH−チトクロームの酵素誘導を発現させる阻害剤の構造上の類似

C還元酵素等他の顆粒画分の活性にはほとんど

性については明確でなく，現在その揆横について解析中である。

影響しなかった。更にこの誘導は樹立株細胞であるマウスL細胞では見出せなかった。現在，他の細胞株について検討中である。

ると5〜6倍の値に達し，ロイベプチソと同程しなかった。この結果はHb一水解活性の誘導

ロイぺプテンによって誘導されたHb−水解酵素の性
質

次にロイべプチソ以外の他の阻害剤について

ロイべプチソによって誘導されたHb一水解

検索すると，3種の異った影響を示した。即ち酵素は量的に乏しい為，精製が困難であるが現85

︵■□︶苫一国．︵●○︶ミームhKm⁚⁚Uヽ≠粗く卑朴⁚頂︵︸口︶ゝ†て小ヽ卜．︵●○︶ゝ小トでtn⁚可．吏J摂罵如由由百1卜トln≠Q麗積弊臣皆芯りー固．J点燈㌣蛍整eヤせ細尾駈ヨ
翠琴芝慧芸者⁝卜hnト将小戻りー蟄婁堅実・qHb再・≦貞道＝∽区

8611．徴生物が生産すプロテアーゼ阻書物質の成熟ネズミ肝初代培養細胞に対する影響︵課e撃︽嗜︶埜周蒜便宜上H

図4

Hb−水解酵素のpH活性曲線
A：対照細胞標晶，
B：ロイベプチソ処理細胞標晶
一〇一 全酵素活性，−ロー ベブスタチソ（10〝g／mり 存在下での活性
pH2．0〜3．0ではダリ
シソ塩酸緩衝液を，pH
3．5〜5．5では酢酸ナトリ

ウム拶衝液を，pH6・0〜
8．0ではリン酸カリウム
緩衝液を用いた。いずれも終濃度 0．125M である．■

87

ⅣIn vitroの効果

0︵婆霊芳遠︶彗悪粘忠言璧

20

30

50

40

60

試験管番号（ml）
図5

Hb一水解酵素のセファデックスG−75によるゲルタロ17トグラフィ一
一〇一 BANA一水解活性，−ロー Hb一水解活性カラム（1．6×20cm），50InM酢酸ナトリウム緩衝液pH5．0，100mM NaCl，試料はロイべプチソによるHb一水解酵素の誘導比が6．2のものについて分析した．

在までに得られた結果を整理すると，まず，至られるように，本酵素活性はBANA一水解活性

適pHは図4−Bに示すように3〜5の酸性に少し遅れて溶出され，分子量は約25，000と推定された。また等電点分画法によってこの酵素の等電点を調べると5．6であった。次にこの酵素のpH安定性（図6）を調べると，中性及び弱アルカリ性領域でもかなり安定であり，酸性領域でのみ安定なBANA一水解活性とは明らかな相違が認められた。更にペブスタチソ以外のプロテアーゼ阻害剤の影響を調べると，本酵素領域にありカテプシソDと類似している。しかしながら，ロイペプチソ未処理細胞のHb−水解活性はそのほとんどがべブスタチソによって阻害されるカテプシソDである（図4−A）のに反して，誘導酵素はペブスタチソによる阻害を全く受けなかった。尚図4−Aのペブスタチ
ソ存在下で見られるHb一水解活性はカテプシ
ソLを中心としたチオールプロテアーゼの作用と思われる。次にセ7ァデックスG−75による
ゲル・タロ「十トグラフィーを行うと，図5に見88

はPMSF，TPCKでは阻害されず，高濃度のIAA，TLCK，PCMBで阻害された。また本
酵素は驚くべきことに誘導物質であるロイべプ

11・徴生物が生産すプロテアーゼ阻害物質の成熟ネズミ肝初代培養細胞に対する影響

図6 BANA−及びHb一水解酵素のpH安定性曲線
一〇一 BANA一水解活性，−⊂ト Hb一水解活性
pIi3・76〜6・35までは酢酸ナトリウム緩衝液を，pH6．46〜7．72まではリン酸
カリウム援衝液を，pH7・74−8・68までほトリス塩酸緩衝液を用いた．いずれ
も各pH・370で1時間保温した後，酵素活性を測定してその残存活性を％で表示した．
Hb一水解酵素はロイペプチン処理後の試料を，またBANA一水解酵素は未処理の試料を使用した．

チソ，アンチパイン及びキモスクチソにより著

考 察

明な阻害を受けると共にE−64によらても阻害されるが，エラスチナールでは阻害されない。
これらの結果は本酵素がチオールプロテア＿ゼ

ライソゾーム・プロテ7−ゼの機能についてに属する可能性を示唆するものと考えられる

ソを処理すると肝蛋白質の分解が抑制されるこが，チオール基が活性発現に必須か否かは不明
である。札 本酵素はコソカナバリソA一七フとから細胞内の蛋白質分解にライソゾームが直接関与している可能性を示唆したが，その後アローズに吸着するので糖鎖を有した糖蛋白質であると推定された。

Seglenら11）及びNeffら12）は分離肝細胞系及びその初代培養系においてロイべプチソにより以上の結果は，細胞の粗抽出画分で検討した

DeanlO）は肝潅流実験において，ベブスタチ

蛋白質の分解が抑制されることを報告した。

不十分な成績であるので，現在このHも一氷解

またWardら13）は肝漂流実験においてべブス

酵素の精製を進めておりまたその詳しい性質についても解析中である。

タチソとロイべプチソが相加的に蛋白質分解を抑制することを見出したが，この結果は我々の成績別と一致した。また木南ら川はラットにロ89

ⅣIn Yitroの効果

イベプチソあるいはE−64を処置すると肝のア

B，L，Hとは異なる酵素であるとも思われ

ルドラーゼの分解が停止することを示した。しかしこれらの阻害剤の成績から蛋白質分解秩序することから本酵素がカテプシソB及びHではる。等電点が5．6であることやHbをよく分解

におけるライソゾームの関与を直接的に結論すなく，カテプシソLが何らかの修飾を受けた可るのは困難である。と言うのは細胞内にはライソゾーム以外にも種々のプロテアーゼが存在し能性も否定出来ないが，その場合，特に安定性の増大，ロイベプチソへの感受性の低下，あるているからである。たとえば細胞質にはCa十十

いは蛋白質合成の必要性などを合理的に説明す依存性のプロテアーゼ15）やATPによって活性ることは難しい。

化される高分子量プロテアーゼ16）などが存在しこれらはチオールプロテアーゼであるのでロイ何れにしてもこのHb一水解酵素とライソゾーム●プロテアーゼとの異同については明確に

べプチソなどを処置した場合，これらも阻害さする必要があると思われる。またこのような現れている可能性も考えられる。しかしながら細象の生理的意義及びその普偏性についても今後胞質にはチオールプロテアーゼの天然阻害剤がの問題であるように思われる。

存在することlr）やロイべプチソは細胞質を経由しないで直接ライソゾームにエンドサイトーア
スされる可能性もありまた酸性プロテアーゼはその至適pHからライソゾームに局在して作用していると考えられることなどから，現在，このような阻害剤の影響は主にライソゾームを介した結果と結論されている。
Eb−水解酵素の誘導について
ロイべプチソによって誘導されるHb一水解酵素の細胞内局在性については細胞分画が困難である為，正確には解からないが，至適pHが酸性であることや糖蛋白質らしいことからライソゾームの可能性が強いと思われる。しかしながら，ロイべプチソ処理によってBANA一水解

文 献1）Tanaka，K．，Sato，M・，Tomita，Y・＆Ichihara．
A．：J．BiocIlem．，84，937，1978．
2）Tanaka，K．，Kishi，K・＆Ichihara，A・：J・
Biocbemリ86，863，1979・

3）田中啓二，市原 明‥蛋白質 核酸 酵素，23，
1259，1978．

4）Anson，M．L．：J・Gen・Pbysiol・，22，79，1938・
5）Barret，A．L．：AnaLBiochem・，47，280，1972・
6）Kirschke，H．，Langer，J・，Wiederanders，B・，
Ansorge，S．，Bohley，P．＆Broghammer，U・：
Acta．Biol．Med．Germ．，35，285，1976・
7）青柳高明：酵素阻害物質，共立出版，1978・
8）Tanaka，K．，Ikegaki，N・＆Ichihara，A・：
Biochem．Biophys・Res・Commun・，91，102，1979・

イソゾーム外に存在するとすれば説明可能であ9）Tanaka．K．，Ikegaki，N・＆Ichihara・A・：投稿中．
10）Dean，R．T．：Nature，芸7，414，1975・
11）Seglen，P．0．，Grinde，B・＆Solheim，A・E・：
Eur．J．Biochem．，95，215，1979．

るが，まだ推量の域を出ていない。しかし，も12）NeH，N．T．，DeMartino，G・M・＆Goldberg，酵素が阻害されているにも拘らず，本酵素活性は抑制されていないので，ロイべプチソが直接ライソゾーム内に蓄積し，誘導される酵素がラしライソゾーム内酵素であったにしても酸性ホ
スファターゼ活性に変化がないので，ライソゾ
ームそのものの量的増加とは考えられない。
他方，誘導されたHb一水解酵素は至適pH
が酸性領域にあることから，最初はカテプシソ
Dと思われたが，ベブスタチソによる阻害を受けないことや分子量が25，000位であることから
寧ろチオールプロテアーゼに近似していると考えられた。しかしながら中性及び弱アルカリ性においてもかなり安定なことからカテプシソ
90

A．L∴J．Cell．Pbysio1．，101，439，1979・

13）Ward，W．F．，Chua，B・L，Li，J・B・，Morgan，
H．E．＆Mortimore．G．E．：Biochem．Biophys．
Res．Communり87，92，1979．

14）Kominami，E．，Hashida，S・＆Katunuma，N・：
Biochem．Biophys・Res・Commun・，93，713，1980・

15）今掘和夫：代謝，16，139，1979・
16）DeMartino，G．N・＆Goldberg，A・L・：J・BioI
Chemり芸4，3712，1979・
17）Lenney，J．F．，Tolan，J・R・，Sugai，W・J・＆
Lee，A．G．：Eur．J．Biocbem・，101，153，1979・

12．培養筋細胞に対するE−64の作用

小 沢 銭二郎＊
研究協力者

木

村

三

浦

一

表題のような研究のために，培養筋細胞すな
わちinvitroで発生分化を行っている細胞に対して適当な時期にE−64を作用させそれが数日後に細胞に及ぼしている影響を調べた。マーカーとして用いたものは光学顕微鏡及び電子顕微鏡による形態変化像と，培養細胞中に含まれるクレアチンキナーゼ活性の蓄積とである。このうち電子顕微鏡による観察は，九州大学医学部薬理学教室大槻磐男に委託して行ったのでこの報文の追補として大槻による報文を附ける。
この報文では主としてクレアチンキナーゼ活性の蓄掛こよる結果について述べるが，E−64を筋管細胞が形成されてから与えるとクレアチン
キナーゼ活性の蓄積を促進する効果があるが，結果にはバラツキがあり更に今後の検討を要する。
材料と方法
正常ニワトリ受精卵を膵卵し，10日から12日
胚の胸筋を切り出し，コラゲナーゼで処理して単細胞を集めて使用した。EagleのMinimum
EssentialMedium85％，馬血清15％の混合
液中に，2％以下のニワトリ血清を加えた液中で一晩培養した後，細胞を0．05％トリプシン溶液にて培養皿から剥離して集めた。この細胞を20分自至40分培養し，その時点でもまだ培養液中に浮薄している細胞を集めて実験に用いた。
実験用の培養皿（Falcon35mmプラスチッ
クべトリ皿）に3〜5×105cells／dish播き上記＊国立武蔵療義所神経センター横能研究部

郎＊

萩

原

康

子＊

力＊

培養液2．5mg中で培養した。

と共にCO2インキュベーター

ラセミ体又はL体のE−64を生理的食塩水に溶かし，培養の始めからあるいは途中から培養
液中に加えた。適当時間培養後細胞を光学顧徴鏡あるいは電子顕微鏡で観察した。また培養皿に附著した細胞を155mMNaCl・lmMCaC12溶液で洗った後に，蒸留水中で剥離して集めた。細胞内に含まれるクレアチンキナーゼの活性をNodaらの方法の変法で測定した。なお
E−64はクレアチンキナーゼの測定に影響を与えなかった。
結

果

単一細胞を上記培養液中で培養すると，初めは培養皿に定着し，筋芽細胞や線維芽細胞などに分化して特有の形をとってくる。すなわち肪
芽細胞は紡鐘形であり，線椎芽細胞は平に展び
た多角形をとる。2〜3日培養すると融合して筋管細胞となる。この時期以降，クレアチンキ
ナーゼ活性の蓄積が起ることが知られている。
さらに成長すると坊紋がみられるようになる。
以上ゐような成長の時期に，E−64を与えてクレアチンキナーゼ活性の蓄積に及ぼす影響を観察した。図1の横軸は細胞がE−64と接触していた日数を示している。すなわち細胞を播いた翌日にE−64を与えたものは横軸で7日になっている。0日は全期間中E−64を与えなかったものを示す。細胞を集めた日は（すなわち培養の全日数は）すべての細胞で同じである。0日をコントロールとして比較すると，融合が起
91

ⅣIn vitroの効果

荒さ叫出雲コd巴U uOきちっ0くってからの時期にE−64を与え長い時間培養したものでは，活性値は高かった。しかしその後
E−64の作用時間の短いものでは高さの程度は下ってくる。問題なのは培養の初期にE−64を加えた場合で，図1ではコントロール値よりも高いが，他の実験ではコソ1トロール値よりもずっと低い値を示した。
培養の初期に起ることは，細胞が培養皿へ定着すること，分裂すること及び融合することなどである。E−64が細胞の定着に対して及ぼす影響について調べた（表1）。定着はE−6410〃g／mJを与えても与えなくても殆んど変りはなくt検定でも両者に差はなかった。
細胞を播いてから1〜2日は分裂期である。
一方，図1でみるように細胞が定着した後にE−64を与えたものでは活性は下るので分裂に

表l 肪原細胞定着に及ぼすE−64の影響
ControI E−64（10J唱／mJ）
3936

3983

4153

3264

4024

3393

3788

3966

2877

3486

3580

3482

3726

3596
t＝0．58

Platingの効果は細胞を播いてから15時間後に
測定した．
われる。
図2は，図1でE−64の効果のみられた日，
すなわち筋管細胞が形成されてからの時期に
E−64を与え，それ以後日を追って培養細胞を集め，クレアチンキナーゼ活性の増加を観察し対して抑制的に働いている可能性は否定できない。光学顕徴鏡的には筋芽細胞が典型的な紡鐘型をとらず，変形がはなはだしいので定量的な検討は行わなかった。しかし電子顕散鏡の観察では単核細胞に空胞がみられるという大槻の観たものである。破線はE−64を入れないコント

察はこの点と開通して考えると重要であると思字曲線を示した。E−64を入れると定性的には

92

ロールで，活性の自然の増加である。細胞融合が起ってしばらくの間は活性の増加はあまり多くないが，その後筋管細胞の発達とともに活性特増加し，活性の蓄積は，培養日数に対してS

12．培養筋細胞に対するE−64の作用

5

6

7

8

9

10

Days ofIncubation

図2

茨言明出告叫一男hUち合川＞叫︺U＜

0．5

2

10

50（〟〟ml）

Concentration ofE−64（racemic body）in culture medium

図393

ⅣIn vitroの効果

コントロールと変らない経過をたどるが，活性に報告しているが，形態識別は常に容易である

蓄積の速度が促進されただけではなく，プラトーの水準も高くなった。

とはいえず，さらに今回のようにE−64で細胞の形自体が変化してしまっている場合には殆ん

これまで述べてきた実験は，E−64を4〜10ど用いられない。筋管細胞を取扱うにはその特〃g／mJというかなり高い濃度を用いたものであった。次の実験では，一度筋管細胞が形成され散であるミオシンなどのいわゆるぜいたくな蛋てから後に種々の濃度のE−64を加えて一定時操作は必ずしも容易でない。

白の合成をマーカーにすることは可能であるが細胞が大きくなるから細胞の大きさ，あるい間培養した後に細胞を集めクレアチンキナーゼ
活性の蓄積の状態をみたものである。図3に示は細胞が占める面掛まマーカーとしてはあまりすように0．5／Jg／mJでもかなりの効果がみら信較できない。それは細胞の厚さが細胞によっれた。図には示していないが，0．3Jjg／mJでも有効であるという結果も得られている。逆に濃て均一ではないからである。クレアチンキナー
ゼもぜいたくな蛋白であ■るので筋管細胞が形成

度を上げてゆくと活性は下るが，光学顕微鏡でされた後に増加して来る。この際にクレアチン

は，50〜70J瑠／mJ以上で筋管細胞が破壊されキナーゼ活性の殆んどのものが，単核細胞に由る像が観察された。

来するのではなく筋管細胞に由来することが示

考察

この研究は，E−64のbathapplicationを行って，筋原細胞への作用を主としてクレアチ

されている。また培養液からCaイオンを除くと，筋管細胞が選択的に破壊されると共にクレ
アチンキナーゼ活性が低下することが示されている。これらの事実からはクレアチンキナーゼ

ンキナーゼ活性の蓄積をマーカーとして観察することによって行われたものである。従って初活性が筋管細胞の 量 を示すマーカーとしてめにマーカーとしてのクレアチンキナーゼ活性ことも利点である。

蓄積の意味について述べたい。培養筋細胞を定量的に取扱う際に，いくつかの方法が考えられる。まず単核筋細胞の特性である分裂は，核の考えることは自然であろう。その手技の容易なさて上に述べた実験結果からはE−64は少くともクレアチンキナーゼ活性の蓄積を促進する
ようにみえる。初めにも述べたようにこれらのる。しかしprimarycultureでは線維芽細胞

結果には実験によりノミラツキがみられるし，特にL体を用いた際には全く作用がでないこともが必ず混入するために算える際に両者を形態的経験しているので結論を下すためには慎重を要に識別しながら筋芽細胞のみを算えてゆくことする。

数を算えることによって推定することができになる。この方法の詳細については，我々は既94

12迫補．E−64処理を施したニワトリ骨格筋培養細胞の電子顕微鏡観察小沢

瑛二郎＊

研究協力者 大 槻 磐 男＊＊

方 法
ニワトリ胚胸筋からコラゲナーゼ処理によって単細胞化した標本を径3．5cmのプラスチッ
クシャーレに4×105個の密度で播き4日間培養したのち，E−6トを加えて更に2日間培養した。この標本をグルタールアルデヒド及び四酸
化オスミウム固定し，1％酢酸ウランでブロッ
ク染色，エタノール脱水を施してからェポキシ
樹脂に包埋，加熱固化した。固化した標晶の中央部分を切り出しジュラルミン台に固着し，丁度シャーレ底面に平行になるように超ミクロトームを用いて培養細胞の超薄切片を作製した。
切片はカーボン蒸着したコロジオン膜上にすくい取り，Reynolds法鉛染色を施して電子頗徴
鏡（日立−HS8型）下で観察した。
結果と考察
培養4日日の標本では，筋管細胞（myotube）
は比較的径が細く内部に筋原緑経が殆んど認められない未成熟なものが大部分を占めていた。
単核細胞の空胞形成は殆んどみとめられなかった。
E−64を添加しさらに2日間培養をつづけた標本で以下の様な所見が得られた。用いたE−64の濃度は，1〝g／mJ，3摺／mJ，10膵／mJであり，無添加標本（OJ瑠／mりと計4種煩である。無添加標本では筋管細胞の径が増加し，内＊国立武蔵療養所神経セソタ一機能研究部＊＊九州大学医学部臨床薬理学教室

部には筋原緑経が明瞭に認めることができるよ
うになり一部では明らかなZ帯とM線をもった
筋原線経の成熟型が規則的に配列している例も観察することができた。単核細胞の空胞化は散見されるもののそれ程著明ではなかった。
E−64を加えた例では，10〝g／mJの場合でも筋管細胞の発達は良好であり内部の筋原線経の分布，膜等の発達などの点で無処理標本（0／唱／mりと有意の差を見出すことは出来なかった。
ただOJ唱／ml，10〃g／mJの両例で最も発達がよい細胞について比較を行なうと，10／唱／mJの方がむしろわずかに発達が遅れている印象をうけたが，この点に関しては今後詳細な形態学的な検討を行って裏付ける必要があるものと考えられる。E−641〝g／mJ，3〝g／mト処理例では0〃g／mJと筋管細胞については全く差がみとめられなかった。単核細胞についてみると，E−64の濃度が高い程空胞形成が著明になる傾向がみられた。
この他，筋管細胞内に，E−640／唱／mJ例でも少数ではあるが高密度の膜構造に覆われている封入体が観察された。E−641膵／mJ処理例
ではこの頻度は殆んど変化しなかった。E−643〝g／mト処理によってわずかに頻度が増し内部に膜状物をとり込んだものもみとめられた。形状も大型なものが見出された。さらにE−6410〝g／m仁処理を施した筋管細胞においてはこの
高密度構造の数が著しく増加し，とくに細胞膜
周辺の細胞表層部には大型の管状に全体としてみえる構造を形成していることが見られた。ミ
トコンドリア膜をとり込んだ例も観察された。
95

ⅣIn vitroの効果

写真説明 E−64処理培養筋管細胞の電子顕徴鏡写真
1．無勉理例
2．E−643〝g／mJ 3．E−6410JJg／mJ
国中の横線は1J の長さを示す．
96

12追掃．E−64処理を施したニワトリ骨格筋培養細胞の電子頗徴鏡観察

単核細胞においてもE−64の濃度が増すに従って，このライソゾーム様構造の数と大きさが増すことが観察された。これらの所見はE−64
によって細胞内代謝が何らかの変化をうけることを示唆するものである。培養条件をさらに吟味することによってこの結論は明確になるものと思われる。なお上述のライソゾーム様構造が観察された筋管細胞において，他の一般的な特徴は正常例と何ら差異がみとめられなかった。

97

13．筋ジストロフィー症における筋膜脂質に関する研究〜筋ジストロフィーチキソの筋ガングリオシドに及ぼすE−84の効果について〜

宮 武
研究協力者

渥

美

暫

至＊

有

はじめに

正＊・＊＊
賀

敏

夫＊＊

中

村

京

子＊＊

トグラフィーで個々のガングリオシドに分離
し，ガスクロマトグラフィーにより，おのおの筋ジストロフィー症における筋線維崩壊の原田として膜異常の存在を示唆する数多くの研究がなされている1）。ガングリオシドは膜の脂質二重層の外表面に存在する糖脂質であり，免疫学的抗原，コレラ，テクヌストキシソなどの受の糖組成を同定した。
2．筋ジスチキン筋組織のガングリオシド分析：
材料は対照，筋ジスチキン及びE−64治療5）を行った筋ジスチキン，各々7，8，8羽の前胸容体として機能し，又最近副腎髄質のクロマフ筋を用いた。筋をホモゲナイズLAndoらの方
法6）に従って粗ガングリオシドを得，薄層クロィン顆粒の膜にガングリオシドが高濃度に存在

マトグラフィーを行い，個々のガングリオシド

することが明らかにされその生理作用との関連が問題となっている。

を分離し，島津二波長クロマトスキャナーを用いて定量した。

著者らは，筋ジストロフィー症における膜異常研究2）〜4）の一つとして筋ジストロフィーチ
キン筋と対照の差およびCANPインヒビター
であるE−64投与の影響について検討を行っ
た。
方

法

結

果

1・チキン筋組織粗ガングリオシドのDE・
AE Sephadexによる

elution patternはfractionI，Ⅰ及びⅢに分けられ，Iの薄層ク
ロマトグラフィーを行ったところ3個のスポットが検出された。この分画のPreparative蒋

1・チキン筋組織ガングリオシドの構造解析：チキン前胸筋を用い，クロ∵Pホルムーメタノール

層クロマトグラフィーを行った。3つの主分画（1：1，容比）及び（1：2，容比）により総脂質マトグラフ上GM3及びGD3ガングリオシド

A，B及びCのうちAとBはおのおの薄層クロを抽出し，DEAE Sephadex column chro一のRfと一致し，Cは既知のガングリオシドとmatographyを行いneutrallipidとacidicは一致していなかった。AとBのガスクロマト

lipidに分け，aCidiclipid分画をアルカリ水解

グラフィーによる糖組成は，グルコース，ガラによりガングリオシドを得た。さらにDEAE

クトース，Nアセチルーノイラミソ酸よりな

Sephadexcolumnchromatographyを行っ

り，それぞれのモル比は，Aが1：1：1，Bがて精製ガングリオシドを得たのち，薄層クロマ

1：1：2であった。Clostridium perfringensのNeuraminidase処理によりAとBはいず＊ 自治医科大学神経内科

れもCeramide−dihexosideとなった。しかし＊＊都立臨床医学総合研究所中間代謝部門

Cは2つのbandよりなり，単一物質でない可99

ⅣIn Yitroの効果
表1チキン筋肉中のガソグリオシド
control

total sialic acid
FLgNANA／g protein

FEgNANA／g wet weightdystrophy

treateddystrophy

n＝12

n＝7

n＝9

26．0土3．4

75．0土22．5＊

50．0土9．7＊ム

6．1土0．7

14．2土3．9＊

10．5土1．7＊ム△

n＝7

n＝7

n＝3

GM3：FLgNANA／g protein

6．3±2．6

24．9土13．4＊

20．3土5．2＊（31．7土8．1％）（35．9土7・9％）

GD3：FLgNANA／g protein（25．2土8・2％）
9．5土2．0

22．9土6．0＊

27．2土6．7＊（31．1土3．6％）＊＊（37．2土7．2％）

X：FLgNANA／g protein（39．0土6．1％）
8．6土1．7

27．2土6．7＊

17．0土3．3＊AA（35．8±9・8％）（37．2土7．2％）（31・5土1・7％）

ganglioside fractions＊：t＜0．01，＊＊：t＜0．05

foreachsampletocontrol・

ム；t＜0・01，ムム：t＜0・05

foreachsampletodystrophy・

これらの結果よりAは，GM3ガソグリオシド性の低下も報告されている9）。一方分離筋膜を用いた測定では，Na＋K＋ATPase，Mg≠ATPであり，BはGDきガングリオシドであること

ase活性いずれも正常と差がなく，膜脂質にもが明らかとなった。Cは6糖よりなると考えら正常と差がないと報告されている10）。

能性がでてきたため，更に検討を行っている0

れるが，その構造はさらに解析中である。

筋ジスマウスの筋膜酵素については，分離筋

2．筋ジスチキン筋組織ガングリオシド分析

膜のNa＋K＋ATPase活性の低下，ウア／：イン

結果を表1に示した。筋ジスチキン筋組織ガン

感受性の低下が報告されている12）。しかし正常

グリオシドの蛋白あたり，及び湿重量あたりのと差がない11）か，又はウアパイン感受性の克進

含量は，いずれも対照に比し明らかに増加し，E−64治療筋ジスチキンでは，対照に比し増しがあるとする報告もある12）。筋膜の adenylているが，筋ジスチキンに比べると減少しておCyClase活性についても冗進が報告されているが，エビネフリンやNaFによる活性化には差り，いずれも有意な差を認めた。

がないか又は冗進していると分れている肌14）。

筋ジスチキンのガングリオシド分画，GM3，

Guanylatecyclase活性についても克進が報GD3及びunknownXのいずれもが増してい告されているほ）。筋膜脂質につL、ては総脂質含るが，最も増しているのはGM3ガングリオシ

量が増し，特に中性脂質の増加と遊離コレステ
ロールの相対的減少，リン脂質の軽度増量が報ドであった。E−64治療群では，筋ジスチキンに比べⅩガングリオシドの減少が明らかであった。
考案

告されている16）。
筋ジスチキンについては，Na＋K十ATPase
活性の低下，ウア／ミイン反応性の低下，adenyl

ジストロフィー症患者及び動物モデルのジス

CyClase活性の克進が報告され，いずれもアン
ホテリシンB処理により差がみられており，膜トロフィーマウス，チキン各々について以下にコレステロールを介しての膜受容体・環境変化

述べる如く筋組織の膜酵素，膜脂質，小胞体などに異常の存在を示す報告が蓄積されている。
患者筋の膜酵素に関しては，筋ホモジネートを用いた測定によりadenyleyclase活性のエ
ビネフリンやNaFに対する感受性の低下が指摘されている7）・8）。又guanylatecyclase活100の誘起に差のあることが示されている17）。又，
べリレンの脂溶螢光ラベルを用いた膜の微細粘度の測定により，粘度の増加が示され，膜の脂質流動性の減少が報告された18）。
筋小胞体（SR）に関しては，患者筋のSR分
画のCa摂取能の低下，ATPase活性の低下

13．筋ジストロフィー症における筋膜脂質に関する研究が報告され肌加），SR蛋白及び主要脂質含量は正常と差がなく，フォスファチジルコリソの減少が認められている20）。

が2倍に増加していると報告されているが）。今回のジストロフィーチキン筋では，ガングリオ
シドが明らかに増加し，特にGM3ガングリオ

筋ジスマウスのSRについても微細粘度の低シドが増加していた。またE−64治療を行った

下があり，脂質流動性の低下が示され，SR膜筋ジストロフィーチキンでは，ガングリオシド

脂質の分析でコレステロールの増加が報告されている21）。

が対照に比し増していたが，未治療のジストロ
フィーチキンに比べると減少し，特にⅩガ㌧／グ筋ジスチキンのSRについては，Ca摂取能

リオシドの減少が認められた。これらガングリの低下はあるが，膜蛋白，Ca≠ATPase活性オシドの変化は，ジストロフィー筋の膜成分のは正常でフリーズフラクチャ一法で蛋白顆粒の変化を示すと考えられるが，筋組織における筋
緑維以外の組織成分の変化の影響を検討する必減少があるとする報告22）とCa甘ATPase活性の低下を認めるも精製ATPaseの蛋白には正常と差がなく，脂質環境の影響を想定する報告23）がある。
以上のごとく，患者筋，動物モデル筋の膜酵素活性や小胸体に異常が報告され，又その要因
として膜脂質の異常を想定する報告も出されている。しかし未だ膜脂質に関しては充分なデータが得られていない。
私達は膜脂質研究の一つとして筋ガングリオ
シドの分析を行っている。今回私達の行ったチキン筋ガングリオシド含量は，ヒト24），ブタ25），
ウサギ25）・26），ネコ訂），ラット25）・㌘）の筋ガングリ
オシド含量とはぼ一致する。
チキン筋ガングリオシド分画はGM3，GD，，
Ⅹガングリオシドの3主分画よりなっていた。
ヒト筋ではGM3，GM2，GDl，GM．ガングリ
オシドが主であり24），ウサギ筋ではGM3，その他2種の構造未決定のガングリオシドからな
る26）0 また，ネコ，ウサギ，ラットではGM3
ガングリオシドが主分画であるか）と報告されており，現在までの報告では，いずれの種につい要があり，E−64投与による変化についても更に追究する必要がある。
文

献1）Rowland，LP．：PathogenesiS Of muscular
dystrophies，Arch・Neurol・，33，315−321，1976．
2）渥美暫至・官武正・大林民典他‥Ducbenne型
ジストロフィー症の赤血球の形態及び生化学的研
究・筋ジストPフィー症の病因の究明に関する研究，沖中温昭和51年度報告書，173瓦3）吉田充乳 渥美哲至，官武正他：筋ジスチキン
赤血球膜に関する研究，筋ジストロフィー症の病因の究明に関する研究，沖中温 昭和52年度報告書，141貢．
4）官武正，渥美暫至，前沢政次他：筋ジストロフ
ィー症における筋膜脂質に関する研究，三好乱
昭和封年度報告書．
5）杉田秀夫他‥筋ジストロフィーチキンに対するproteaseinhibitor（E−64）の効見 三好班，昭和舅年度報告書．
6）Ando・SりChang，N・C・and

Yu，R：Highperformancethin・layer chromatography and

ることは共通するが，その他は，種によってガ

densitometricdeterminationofbrainganglio・Side compositions of several species，Anal．

ングリオシドを異にするという興味深い結果が出ている。

7）Mawatari，S・，Takagi，A．，et al．：AdenylてもGM3ガングリオシドが主分画の一つであ病的状態の筋組織ガングリオシドについて
は，ウサギ脱神経筋においてGM3を主とする
ガングリオシドの増加㌘）及び筋ジストロフィー
ラット筋では逆にガングリオシドの減少が報告
され28），一方ビタミンE欠乏によるウサギの実
験的ジストロフィー症の筋ではガングリオシド

Biochem．，89，437−450，1978．

CyClasein normal and pathologic humanmuscle・Arch・Neurol・，30，96−102，1974．
8）Susheela，A・K，l（aul，R．D．，etal．：Adenyl
CyClaseactivityinI）uchennedystrophicmus・
Cle，J・Neurol．Sci．，24，361−363，1975．
9）Cerri．C・，Canal．N・andFrattola，L．：Guany−
latecyclase activityinnormaland diseasedlOl

ⅣIn vitroの効果
human muscle，J．Neurol．Neurosurg．Psychi−
atry，41，805−808，1978・
10）Peter，J．B．：A（Na十＋K＋）ATPase of
sarcolemma from skeletal muscle，Biochem．

184−188，1969．

20）Takagi，A．，Schotland，D・L・，et al・：Sar−
coplasmiCreticulumin Duchenne muscular
dystrophy，Arch・Neurol・，28，380−384，1973・

Biophys・Res・Commun・，40，1362−1367，1970・

21）Rubsamen，且，Barald，P・andPodleski，T・：

11）Boegman，R．J．：Theisolation and partial

Aspeci丘cdecreaseof thefluorescence depo・

characteri2；ation of membranes from dystro−larizationof perylenein muscle membranes

phic and normal muscle，Comp・：Biochem・

frommicewithmusculardystroplly，Biochim．

Pbysiol・，48A，237−244，1974・
12）Bray，G．M．：Acomparisonoftheouabain−

Biophys・Acta，455，767−779，1976・
22）Scales，DりSabbadini，R・andInesi，G・：Thesensitive（Na＋＋K＋）−ATPaseof normal andinvoIvement of sarcotubular membranesin

dystrophicskeletalmuscle，Biochim・Biophys・

geneticmusculardystrophy，Biochim・Biophys・Acta，298，239−245，1973・

Acta，465，535−549，1977・

13）Strickland，K．P．，Hudson，A・J・andThakar，23）Hanna，S．D．andBaskin，R・J・：Comparison

J．H．：Biochemicalstudiesindystropllic mou−of the（Ca2＋＋Mg2＋）−ATPase proteins fromse muscle，Ann．N．Y．Acad．Sci・，317，187−

normaland dystrophic chicken sarcoplasmiC

205，1979．

reticulum，Biochim．Biophys．Acta，540，144−

14）Canal，N．andFrattola，L・：InRecentAd−vancesjnMyology，W．G．Bradley，D・Gardner−
Medwin andJ．N．Walton，Eds．，Excerpta
Medica．Amsterdam，TheNetherlands，p・273−276，1975．

150，1978．

24）Svennerholm，L・，Brace，A・，Mansson，J・・etal．：Sphingolipidsofhumanskeletalmuscle，Biochim．Biophys．Acta，280，626−636，1972・
25）Puro，K．，Maury，P・and Huttunen，J・K・：

15）Blosser，J．C．and Appel，S・H・：Properties

Qualitative and quantitative patterns ofand distribution of mammalianskeletalmus−

gangliosidesinextraneuraltissues，Biochirn・

cleguanylatecyclase，J・Biol・Chem・，253，3088−3093，1978．
16）DeKretser，T．A・andLivett，B・G・：Skeleta1−
muscle sarcolemma from normal anddystro・

Biophys・Acta，187，230−235，1969・
26）Lassaga，F．E．，I．AlbarracindeLassagaand
Caputto，R・：Rabbit muscle gangliosides・J・
Lipid Res・，13，810−815，1972・

phic mice・Isolation，Characterization and27）Max，S．R．，Nelson，P・G・andBrady，R・0・：

lipid composition，Biochem・J・，168，229−237，

The e任ect of denervation onthecomposition

1977．

of muscle gangliosides，J．Neurochem・，17，

17）Rodan，S．B．，Hintz，R・L・，etal・：Theacti−

1517−1520，1970．

vityofmembraneboundenzymesinmuscular28）Max，S．R．andBrady，R・0・：Alterationof

dystrophic chicks，Nature，252，589−591・1974・

thegangliosidecompositionofskeletalmuscle18）Shaa丘，R．Ⅰ・，Rodan，S・B・，etal・：Abnorma−in murine muscular dystrophy，Nature，233，

litiesin membrane microviscosity andion
transportin genetic muscular dystrophy・
Nature，254，525−526，1975・
19）Samaha，F．J．andGergely，J・：Biochemical

55−56，1971．
29）Albarracin，Ⅰ．，Lassaga，F・E・and Caputto，R．：Changesofgangliosides and otherlipids
in skeletal muscle from rabbitswith experi−

abnormalities of the sarcoplasmic reticulum

mentalin muscular dystrophy，N．Engl．J．Med．，280，

1974．

102

dystrophy，J．Lipid

Resり15，89−93，

14．筋蛋白質代謝回転

江

橋

節

郎＊

研究協力者 小 浜 一 弘＊

E−64の筋蛋白質代謝回転に与える影響を検討するにあたり，本報告書においては正常及び

く14）〜17），事実多様性を検出できなかった報告もある18）・19）。

及びジストロフィー症ニワトリにおける各種構

速筋は代謝回転が最も遅く，遅筋，心筋及び平滑筋の兢程度である9）・11）・20）。構造蛋白質よりも可溶性蛋白質の方に筋種による差が大き

造蛋白質のアミノ酸取り込み量測定のデーター

い11）0

を示す。

発育途上にある筋総蛋白質は，幼君な時代に代謝回転が速く，成熟に伴って低くなる21）・2）。
筋を生体より取り出して栄養液中に数時間生
体内と同じ総蛋白質代謝回転を保たせることが異常筋における筋蛋白質代謝回転に関する文献的考察を行うとともに，予備的実験として正常

生体内外における筋総蛋白質代謝回転筋は最も蛋白質含量が多く総蛋白質の分解と合成速度（代謝回転）の遅い器官のひとつである。各器官のうちやや高い総蛋白質代謝回転を示すグループに属する肝の韻〜祐程度にしかす
ぎない1）〜5）。
最もよく利用されているラットでは合成された筋総蛋白質の量が半減するのに要する時間は約10日（6〜19日の範囲）3）・4）である。ニワトリ6）及びマウス5）もほぼ同程度である。しかし
ウサギ7）及びブタ1）はもっと多くの日数を要すると考えられる。
筋総蛋白質は構造蛋白質と酵素類を含む可溶性蛋白質に大別される。構造蛋白質の方が代謝回転がより遅く3）・5）・8）〜12），外因による影響もうけにくい（次節参照）。肝における可溶性蛋
白質に含まれる酵素は代謝回転上多様性があり，代謝回転の最も速いものは最も遅いものの750倍になる13）。一方，構造蛋白質の間では代謝回転上の多様性があるものの，最も速いものと最も遅いものの問で10倍程度の開きしかな＊東京大学医学部薬理学教室可能である23）・24）。細胞培養された筋の構造蛋
白質の代謝回転19）・25）は生体内におけるとの同範囲にある6）。
筋総蛋白質量の増減と総蛋白質代謝回転
種々の田子によって筋の肥大または萎縮がもたらされる9）・13）・26）・38）。筋総蛋白質の合成速度と分解速度の差が正なら肥大を，負なら萎縮がもたらされる。
筋総蛋白質量の増減を種々の方法で引き起し，蛋白質合成速度と分解速度を比較した
Goldberg らの仕事によれば，これらは比較的独立に制御されていてそれぞれの原因に特異的であると考えられる9）・13）・38）。
ほとんどの筋萎縮には蛋白質分解の促進が起るが，蛋白質合成は必ずしも抑制されない9）・13）・53）。事実，ジストロフィー症筋では蛋白質合成が促進されている5）・軋21）・36）。除神経された筋では手術直後には蛋白質合成は抑制されるが，やがて蛋白質合成の促進がみられる43）〜46）。
肥大には蛋白質の合成の促進と分解の抑制が103

ⅣⅠn vitroの効果共にみられが）・13）。物理的方法（運動，伸張，

表1刺激）によって起った肥大では，Goldbergら
は蛋白質分解の抑制が主な原因だと主張している9）・13）・26）が，Goldspinkらは蛋白質合成の促進が主な原因とみなしている訂）〜盟）。
小沢らによって血清より分離された筋成長促
進因子は細胞培養された筋細胞に対し有効であった30）。血中の田子活性はオスの方がメスよりも高く，アンドPジェソ注射が因子活性を促進
Act：アクチン，Myo：ミオシン，TM：トロポ

することを示した31）〜35）。アンドロジェソ注射によって生じた肥大筋と筋成長因子存在下で培養した筋細胞における代謝回転の変化を比較したデーターはない。
細胞内Ca2◆濃度上昇と筋総蛋白質代謝回転

ミオシン，TN：トロポニソ，α：α−7クチニソ，

M：M一蛋白質，a：分子量比，b：細胞内蛋白量
存在比（47），C：細胞内分子数比（b／a），d：蛋
白質量あたりのアミノ酸取り込み比，e：細胞内で合成される分子数比（CXd），R：ウサギ（16），
C：ニワトリ（図1）＊純粋なM蛋白質でない

Ionasescuらはジストロフィー筋を培養し，栄養液にA23187を加え筋細胞内のCa2＋濃度を上昇させるとロイシソの筋蛋白質へのとり込

Myo

み量が増加することを示した36）。
亀山とEtlinger37）は筋細胞内のCa2＋濃度を同様の方法で増加させ筋総蛋白質代謝回転をTM検討した。蛋白質合成のみならず分解も促進を受けた。蛋白質分解速度は栄養液にロイペプシ
ソを加えることによって抑制された。

TN

短時間の筋細胞内Ca2＋濃度上昇は筋収縮時にもたらされる39）。慢性的刺激を受けている筋

AcIまたは筋小胞体のCa2＋結合能の低下している
ジストロフィー筋においてはCa2十濃度は長時10S間の問上昇しているであろう。これらは細胞内Ca2・の新しい撥能すなわち筋蛋白質の合成または分解に対する作用を示唆する実験結果であαる。
各種構造蛋白質の代謝回転
構造蛋白質の代謝回転が一致していないということは3つのグループによって独立に発表された14）〜17）・40）。小泉16）はウサギ骨格筋において各種構造蛋白質の蛋白量当りのアミノ酸取り込
み量を調べた（表1）。この結果は小浜40）によってもニワトリ骨格筋において確認された。取り込み量の多い順から，M蛋白質≧トロポニソ＞可溶性総蛋白質＞トロポミオシン≒α−アク
104

0

0．50

l．00

1．50

2．00

2．50

図1 ジストロフィー筋におけるアミノ酸取り
込み量
Normal（412系統）及び Dystrophic（413系統）のニワトリ（生後450日経過）に
IHラベルのロイシンを注射し，22時間後
胸筋をとり出し各種タンパク質を抽出し，タソバク質量当りの放射能を求めた。ミオシγの比放射能に対する同系の各種タンパ
ク質の比放射能の比率で，相対的アミノ酸
取り込み量を示す。（10SlOS−アクチニ
ソ，他は表1参照）

14．筋蛋白質代謝回転
チニソ≧ミオシン＞10S一アクチニソ＞アクチンである（表1，図1）。平滑筋でも ミオシン

リの未熟な筋のアクチンはミオシンの取り込み量のそれぞれ0．71及び0．51倍であることを示しはアクチンより代謝回転が速い41）。

た。成熟筋では0．43倍（表1）なので未熟な筋

肝における酵素のうち肝槙能上重要な撥能をもつものは非常に代謝回転が速い13）。筋の可溶

ではアクチンのアミノ酸取り込み量が大きい。
Rubinsteinら19）は細胞培養された骨格筋のア性蛋白質のうち分子量の大きいものほど代謝回

クチンとミオシンの蛋白質量当りのアミノ酸取転が速い42）。構造蛋白質もこの原則にはば従う

り込み量が等しいことを示し，上述の構造蛋白（表1）。ミオシンは分子量の大きさに比較して質の代謝回転上の不均一性に疑問を投げかけ

取り込み量が少い。トロポニソは分子量に比較た。しかし，彼らのデークーは細胞培養された

して取り込み量が大きい。収縮機能上重要な作骨格筋が幼君型であることを示しているにすぎない。

用を担っている39）・47）ことを意味するであろう。
各々の構造蛋白質の分子量と細胞内存在量47）より，表1に示される様に細胞内で合成される

近年になって非筋組織にもアクチンとミオシンが存在し細胞性運動に関与していることが明

分子数総量が計算される。アクチンとミオシン

らかになってきた50）。アクチン及びミオシンのは最も多くかつ同程度に合成され脚注），トロポ

代謝回転は筋組織より非筋組織の方が速い19）。

ニソとトロポミオシンはこれに次いでいる。
DevilinとEmerson48）は培養筋細胞のアクチンの合成分子総量はミオシンと同じであることを報告した。
10S−アクチニソとアク≠ソの異同について

除神経萎拍筋とジストロフィー症筋における構造蚤白質の代謝回転清水46）は除神経により蛋白質合成が促進しているウサギ萎縮筋において各種構造蛋白質のアは議論の余地がある47）。表1及び図1に示され

ミノ酸取り込み量を測定した。これらのうち特る様に，10S−アクチニソはアクチンの1．7倍まにα−アクチエソと10S−アクチニソのアミノ

たは1・2倍のアミノ酸取り込み量を示す16）・40）。
これは抗10S一アクチニン抗体がアクチンと反応しない49）ことと共に10S−アクチニソがアクチンと異なる分子であることを示唆する。
成熟骨格筋のアクチンは等電点が最も酸性であるα−アクチンのみから成立していると考えられる50）。小浜51）は成熟骨格筋よりアクチンを抽出する際，抽出時間が長く温度の高い方が40

10dqys

7weeks％程度アミノ酸取り込み量の大きいアクチン標晶が得られることを報告した。このことは新しく合成されたアクチンは筋原線維上アクチン標

60weeks

晶として抽出されにくい部位に組み込まれていることを示唆する。また，10S−アクチニソを抽出する条件では新しく合成されたアクチン＿が容易に抽出され10S−アクチニン標晶となる可能性も示唆される。
小浜40）はニワトリ胚またはふ化直後のニワト

0

0．50

I．00

図2

アクチンのアミノ酸取り込み量

生後10日，7週そして60遇のニワトリ胸筋のミオシソとアクチンへのタンパク質量当りのロ
イシンの取り込み量を求めた。各々の筋肉のミ脚注）後述のアクチンのアミノ酸取り込みの不均一性を考えても，このことは成り立つと考えられる

オシンに対するアクチンのロイシンの取り込み量の比率で示した。Normal（412系統），Dys・
tropbic（413系統）。
105

ⅣIn vitroの効果

酸取り込みが促進していた。

P．：Biochem．Jり166，315−321，1977．

前述の様にジストロフィー症でも筋蛋白質合9）Goldberg，A．L．，Gri伍n，G．E．＆I）ice，J・F・成は促進している。小浜30）は遺伝性ジストロフ

Jr．：in Pathogenesis of Human Muscular

ィー症ニワトリとコントロールニワトリ51）の問で各種構造蛋白質へのアミノ酸取り込み量を比較した（図1，図2）。成長期においてほアクチ
ンのアミノ酸取り込み量がジストロフィー症のDystrophies，Pp376−385（Rowland，L P．ed・），
1977．
10）Leurent，G．JリSparrow，M・P・＆Millward，
D．J．：BiocbeImJ．，176，407−417，1978．
11）Leurent，G．J．，Sparrow，M．P．，Bates，P．C・

方で著しく促進されていた。これはジストロフ＆Millward，P．J．：Biocbem．J．，176，393−405，

ィー筋の分化が遅れているという各種データ一

1978．

に良く一致する52）。

13）Goldberg，A．L．＆

一年以上加令し十分に発症したジストロフィー症ニワトリにおいては，アクチン及びトロポ
ニソのアミノ酸取り込み量の増加は著しくな
く，α一アクチニソと10S−アクチニンのアミノ酸取り込み量の増加が著しかった（図1）。
ニワトリジストロフィー症ではα−アクチニ

ソのあるZ帯の異常6）及びトロポニン存在部位の異常53）が報告されている。α−アクチニソのア
ミノ酸取り込み量の促進はZ帯の破壊に伴うものであろう。トロポニソに関しては，その各々のサブユニットについての合成の促進を検討す

14）Funabiki，R．＆Cassens，R．G．：NatureNew
Bio1．，236，249，1972．
15）Funabiki，R．＆Cassens，R・G．：J・Nutr・Sci・
Vitamino1．，19，361−368，1973．
16）Koizumi，T．：J．Biochem．，76，431−439，1974．
17）Low，R．B．＆Goldberg，A．L．：J．Cell．Bio1．，
56，590−595，1973．

18）Zak，R．，Rakitzis，E．＆Rabinowitz，M．：Fed．
Procり30，1147A，1971．

19）Rubinstein，N．，Chi，J．＆Holtzer．H．：Expl．
Cell

る必要があろう。
ジストロフィー症筋で合成の促進を受けている蛋白質が除神経萎縮筋で合成の促進を受けている蛋白質と同じである40）・46）。このことはジストロフィー症発症に神経性の要田のあることを示唆している。

St．John，A．C．：Ann．

Rev．Biochem．，45，474−803，1976．

Resリ387−393，1976．

20）Goldberg，A．L，Jablecki，C．＆Li，J．B．：
Annal．N．Y．Acad．Sci．，288，190−202，1974．
21）Srivastava，U．：Can．J．Biochem．，46，35−41，
1968．

22）Millward，D．J．，Garlick，P．J．，Stewart，R．
J．C．，Nnancyelugo，D．0．＆Waterlow，J．C．：
Biocbem．Jり150，235−243，1975．

文献1）Garlick，J．P．，Burk，T．L．＆Swick，R．W．：
Am．J．Physio1．，230，1108−1112，1976・
2）Garlick，J．P．，Willward，D．J・，James．W・P・T．＆Waterlow，J．C．：Biochem．Biophys．Acta，
414，71−84，1975．
3）Millward，D．J．：Clin．Sci．，39，577−590，1970．

23）Fulks，R．M．，Li，J．B．，＆Goldberg，A．L：
J．Biol．Chemリ250，290−298，1975．

24）Li，J．B．＆Goldberg，A．L．：Am・J．Physiol・，
231，441−448，1976．

25）Walker，C．＆Strohman，R．：Expl．CellRes．
116，341−348，1978．

26）Goldberg，A．L．，Stlinger，J．D．，Goldspink，

4）Millward，D．J．：Clin．Sci．，39，591−603，1970・

I）．F．＆Jablecki，C．：Med．Sci．Sport．，7，248−

5）Simon，R．J．，Gross，C．S．＆Lessell，Ⅰ・M・：

261，1975．

Arch．Biochem．Biophys．，96，41−46，1962・
6）Rouke，A．W．：J．CellPhysio1．，86，343−352，
1975．
7）McManus，Ⅰ．R．＆Mueller，H．：J．Biol．Chem．，
241，5967−5975，1966．

8）Everett，A．W．，Taylor，R．R．＆Sparrow，M・
10627）Goldspink，D．F．：J．Physiol・，264，283−296，
1977．

28）Goldspink，D．F．：J．Physiol・，264，267−282，
1977．

29）Goldspink，D．F．：Biochem・J・，174，595−602，
1978．

14．筋蛋白質代謝回転30）Ozawa，E．＆Kohama，K．：Proc．Jap．Acad．，
49，852−856，1973．
31）Ⅹohama，K．＆Ozawa，E．：Proc．Jap．Acad．，
49，857−860，1973．

32）Ozawa，E．＆Kohama，K．：Muscle＆Nerve，
1，230−235，1978．

33）Kohama，K．＆Ozawa，E．：Muscle＆Nerve，
1，236−241，1978．

34）Ozawa，E．＆Kohama，K．：Muscle＆Nerve，
1，314−319，1978．

35）Kohama，K．＆Ozawa，E．：Muscle＆Nerve，
1，320−321，1978．
36）Ionasescu，V．，Zellweger，H．，Ionasescu，R．
＆Lara−Braud，C．：in PathogenesisofHuman
Muscular Dystrophies，（Rowland，L．P．ed．）
pp376−385，1977．
37）Kameyama，T．＆Etlinger，J．D．：Nature，
279，344−346，1979．

38）Goldberg，A．L．＆Odessey，R．：in Explara・41）Kohama，K．：（unpublished observation）．
42）Dice，J．F．，Dehlinger，P．J．＆Schmke，R．T．：
J．Biol．Cbem．，248，4220−4228，1973．
43）Goldspink，D．F．：Biochem．J．，156，71−80，
1976．

44）Pater，J．L＆Kohn，R．R．：Proc．Soc．Expl．
Biol∴Medり125，476−481，1967．

45）Turner，L．V．＆

Garlick，P．J．：Biochem．

Biophys．Acta，349，109−113，1974．
46）Simizu，T．：（in preparation），1980．
47）Ebashi，S．＆Nonomura，Y．：intheStructure
and Function of Muscle（2nd ed，Bourne，G．
H．ed．）Vol．3，pp285−262，1973．
48）Devlin，R．B．＆Emerson，C．P．Jr．：Cell，
13，599−611，1978．

49）Sugita，H．，Masaki，T．＆

Ebashi，S．：J．

Biochem．，75，671−673，1974．
50）Clark，M．＆Spudich，J．A．：Ann．Rev．

Biocbem．，46，797−822，1977．

toryConceptsinMuscularDystrophy（Milho−51）Kobama，K．：J．Biocbem．，87，997−999，1980．

rat，A．J．ed．）pp187−199，1974．

52）Wilson，W．，Randall，R．，Patterson，G．T．＆

39）Ebashi，S．＆Endo，M．：Prog．Biophys．Mol．
Biolり18，123−183，1968．

40）Kohama，K．：Jap．J．Pharmaco1．，29，（Suppl．）（in press），1979．

Entrikin，R．X．：Annal．N．Y．Acad．Sci．，307，
224−246，1979．

53）Irish，J．M．，Hirabayashi，T．＆Wilson，F．J．：
Tissue＆Cell，9，499−505，1977．

107

15．E−64及びE−64誘導体によるラット肝カテブシン
B及びLの阻害について（invivo，invitro）

＊

彦

＊

校

章

渡

唐

誠英

﹂紆

沼

田南

信

勝

楠木

研究協力者

はじめに

ソゾーム中のカテプシソBとLの阻害態度と比較検討した。

E−64は花田ら1）によって，Aspergillusja−
ponicusTPR−64から発見精製されたチオール

材料及び実験方法

プロテアーゼの新しい阻害剤である。E−64は，
バパイン，ブロメライン，フシソl）やカルシウ

ム依存性中性プロテアーゼ（CANP）2）を特異的に阻害する。しかし，同じチオール酵素であるクレアチンキナーゼや乳酸脱水酵素2）は阻害しない。私達は既にinvitro3）・4）及びin
Vivo5）でラット肝リソゾームのカテプシソBとLが，E−64及びロイべプチンによって強力に阻害されることを報告した。現在，リソゾー
ム中に存在するカテプシソ群が細胞内のタンノミ
ク質の分解に関与していると考えられているが，その機構については明らかでない。一方では各種プロテアーゼ阻害剤によって，特定なタ材料
正常食100〜120gウィスク一系堆ラット，ア
ゾカゼイン，BAPA，BAA（シグマ社），イー
スト・グルコースー6−リソ酸脱水素酵素（べ−リンガ一社）を使用した。E−64とその誘導体，〔3H〕−E−64（DL）は大正製薬花田氏から供与された。
方法
1．カテプシソBとLの精製と活性カテプシソBとLは，唐津ら3）・4）の方法により精製した。
カテプシソB活性は，BAPAを用いて，Otto
ら9）の方法によった。

ンパク質の分解が減少することは知られていカテプシソL活性は次の三種の方法で測定しる。また，ロイペプチソやペブスタチソなどのた。1）阻害機掛こおいてほ，BAAを用いて10）プロテアーゼ阻害剤は，タンパク質の分解に関

2）E−64とその誘導体のinvitroでの活性与しているプロテアーゼの性格の判定に役立っは，唐津ら4）のグルコースー6−リン酸脱水粟酵ている6）〜8）。E−64はその特異性，強力性な素の失活によって測定した。3）E−64とそのらびに毒性の無さから考えてこれらの阻害剤以誘導体のin vivo

上に細胞内での特定なタンノミク質の分解機構のインを用いて10）E−64存在下と非存在下で活性解明に有効であると期待できる。

を測定することによって，E−64依存性アゾカ

今回，ラット肝から単一迄精製化したカテプ
シソBとLに対するE−64及びロイベプチソのゼイン水解活性をカテプシソLの活性として測定した。

阻害キネチックスを詳細に，invivoでの肝リ2・カテプシソBの活性チオール基の測定
カテプシソBは，2，2′−ジチオジピリジンと＊徳島大学医学部酵素研究施設酵素化学

で（の活性）は，アゾカゼ

0．1Mリン酸緩衝液中pH6．0，250Cで反応し
109

ⅣIn vitroの効果
チオール基を算出した。また，反応液中よりの直線の傾きは同じで，（直線）は横軸を交差

20J▲ヱくみ出して，活性を測定した。2，2′−ジ7．060M￣1する。このことより，E−64はカテプシソB及びLに不可逆的に結合するものと考えられる。

3．カテプシソBと〔3H〕−E−64（DL）の結合

2．E−64（L）とカテプシンBの結合
E−64とカテプシソBの結合量を知るために，

4．8nmolのカテプシソと〔3H〕一E一朗JpL）〔3H〕−E−64（DL）を使って，検討した。図3にを0．1Mリン酸緩衝液pH6．0中で反応し，活示すように，カテプシソBは1モルのE−64と性を測定した。被放射能は10mJのトライト

結合することによって活性の完全な消失がみら

ソートルエソ系で測定した。
4．ET64とその誘導体のinvitroでの阻害揆

れた。カテプシソBと2，2′−ジチオジピリジン

チオジピリジンの分子吸光係数はcm￣111）を用いた。

を変性剤のない状態で反応させると，1個のSH構が滴定され，1個のSHの修飾により，活性はE−64とその誘導体は，生理食塩水または，完全に消化し，活性には約1ケのチオール基の飽和重曹水に溶かし，中和後，生理食塩水で等みが関与していることがわかった。（図4）こ量とした。カテプシソBとLの活性は，E−64

れらのことより，E−64はカテプシソBの活性またはその誘導体と反応液中370Cで5分間，基である特定の1ケのチオール基と結合すると予備反応後，それぞれの基質添加によって反応完全に活性を消失することが明らかとなった0を開始した。ID50はカテプシソBとLを50％阻

3．カテプシンB及びLに対するE−64とその誘導体の阻害能の比較
E−64の誘導体は，E−64のアグマチソ部分の害する阻害剤の濃度とした。
5．Er64とその誘導体のinvivoでの阻害態度
1mg／100gラットのE−64とその誘導体を，

変換物を使った。（表1）この誘導体のカテプ
シソBとLに対する阻害活性をin vitroとin

腹睦内注射，1時間後，肝臓を摘出しホモジネ

vivoで検討した。Ⅰnvitroでは，精製したカート遠心して，リソゾーム分画をとり5），カテ

テプシソBとLを用いて阻害活性を比較した。

プシソBとLの活性を測定した。E一朗とその活性測定には，カテプシソBはBAPAを，カ誘導体の阻害活性の比較は，それぞれの阻害％

テプシソLには，グルコースー6−リン酸脱水素酵をE−64の阻害％で割り，E−64の阻害活性を素を用いた。ほとんどの誘導体はカテプシソBとLに対して，E−64とほぼ同程度の阻害活性100とした。
6． タンパク量は，Lowryら12）の方法によっ分の阻害活性を示した。Invivoでは，E−64

た。
結

果

1．E−64（L）による精製カテプシンB及びLの阻
書機構
BAPA とBAAを使って．カテプシソBとLに対する，E−64の阻害機構を検討した。
Lineweaver−Burkプロット（図1a，1b）に示すように，E−64はカテプシソB及びLに対し，非括抗阻害形式をとった。この阻害が，可
逆的か不可逆的か判断するため，速度を縦軸にとって，横軸に酵素量をとった時の各種濃度のE−64存在下での酵素反応を検討した。（図lb，2b）に示すように，それぞれのE−64濃度で110を示したが，E−64（D）はE−64（L）の約半
及びその誘導体を1mg／100g ラットで腹腔内に注射した。1時間後，肝臓のカテプシソBとLの活性を測定した。（表2）E−64（L）とE−64−C（SS）が，一番強い阻害活性を示し，他の誘導体はE−64（L）に比し，若干弱い阻
害活性を示した。しかし，E一朗−b（RR）は全
くin vivoでは阻害活性がなかった。
4．E−64（L），E−64−a（SS），E−64−e（SS）の細胞内での阻書活性の時間変化
E−64（L），E−64−a（SS），E−64−C（SS）
を前項と同量ラットに投与し，それぞれの時間ごとに肝臓のカテプシソBとLとの活性を測定した。E−64（L）とET64−C（SS）は1時間以15・E−64及びE−64誘導体によるラット肝カテプシソB及びLの阻害について
（b）

（a）

1．0

0

2．0

1／S（mM）￣10−阻害剤なし

上

土1×10￣TM

4．0︵ぷコくu叫モtOEu︶ A

5

7︵tE＼u苫＼一〇E u︶ ＞＼l

0．5

6．O

Enzyme（×10￣TM）

こ

こ2×10￣7M＝＝3×10−7M

図1カテプシソ1日こ対するE二64（L）の阻害機構

0．1

0．2

0．3

1／S（mM）￣10−−−−一一阻害剤なしユ

図2

ニ0．83×10￣7Mこ

0

1．0

2．0

3．O

Enzyme（×10−7M）

こ1．50×10−7M＝＝1．66×10−TM

カテプシソLに対するE−64（L）の阻害横構111︵3mくu召＼t昌已︶ト5︵u篭＼lE＼tO∈エ A＼t
0

ⅣIn vitroの効果

5

4

日u芯dj一日一〇E u＼一OE u HS

0
5

3

的一美Sdj一日hO合三一U可読

2

0

1

0
0
1

1

10

5

Time（h）

E−64（10￣6M）

ここカテプシンB活性△一一「△E−64の取り込み

図3 カテプシソBへの〔】H〕−E−64（DL）の
取り込み

図4

0・一一・・・・つSH基滴定

カテプシソBのSI王基の2，2′−ジチオジ
ピリジンによる滴定0︵辞︶埜悪壮麗＝＝E−64（L）▲一一「▲E−64−a（SS）一一日＝一一E−64−C（SS）

1mg／100gラットでE−64（L），E−64−a（SS）とE−64−C（SS）をラット腹盤内注射後それぞれの時間で肝リソゾーム中カテプシソの活性を測定した0
図5 E−64（L），E−64−a（SS）．E−64−C（SS）投与後のカテプシソBとLの阻害活性の時間変化
112

15・E−64及びE−64誘導体によるラット肝カテプシソB及びLの阻害について
表1InvitroにおけるE−64とその誘導体のカテプシソBとLに対する阻害活性HO急▽∠弘一NH−CHく：：こく芸
0化合物

カテプシソ活性E−64（L）に対す
る阻害活性

カテプ
シソB

カテプ
シソL

カテプ

カテプ

シソB

う′ソL

（％） （％）（M）（M）

2．4×10￣7

1．1×10￣7

5．4×10−7

1．7×10￣7

2．4×10￣I

1．0×1014・E−64−a−Z（RR）

3．0×101

1．3×10−†5・E−64−a2．4×10￣−

1．4×10￣7

2．8×10￣I

1．4×10−−

3．5×10−−

1．4×10￣7

2．4×101
2．4×10−I

1・E−64（L）

2・E−64（D）−NH−（CH2）一一NH−Cく：：：芸

3・E−64−a−Z（SS）

100

100

44．4

64．7

100

110

80．0

84．6

100

78．6

85．7

78．6

68．6

78．6

1．3×101100

84．6

0．9×10−†100122−NH−（CH2）rNH−COOCHrC．H事（SS）−NH−（CH，）．−NH，

6・E−64−b
7．E−64−b（SS）−NH−CH−COOH

（RR）

CH2
／CIT＼

8・E−64−C（SS）

9・E−64−C（RR）−NH−CH2−CH2−CHく芸

表2InvivoにおけるE−64とその誘導体のカテプシソBとLに対する阻害活性
カテプシソ活性＊化合物

カテプシソBE−64（L）に対する阻害活性

カテプシソL（SS）

4．88土0．91

7・E−64−b（RR）

33．1土7．82

08・E−64−C（SS）

12．4土0．92
1．12士0．25

7．6土6．45

110

9．E−64−e（RR）

6．56±0．68

25．7土3．29

56．6

73．1

0
2

54．5

6．E−64−b12．7土4．32
19．9土4．37

32

6．76士0．77

3

58．8

（SS）

6
8

17．7±2．19

5

61．3

6．34土0．26

82．9

3
4

8．9土3．76

6

5．E−64−a100

86

4．E−64−a一之（RR）

3．6土3．23
8．4士1．65

1

3．E−64−a−Z（SS）

3．89土0．49
6．08±1．53

152．15±0．52

（D）

6

（L）

2・E−6418

l・E−64（％Inhibition／E−641nhibition）

3（mU／gliver）
12．3±1．30
32．4土4．12

カテプシソL

3
8

WitboutInbibitor

カテプシ㌧／B＊1mg／100gラットでそれぞれの阻害剤をラット腹腔内注射，1時間後，ラット肝リソブーム中カテプシソの活性を測定した。

内に最高の阻害活性を示し，以後徐々に阻害活性が弱まっている。しかし，6時間までは十分に阻害活性が認められた。E−64−a（SS）も同
じような態度を示したが，相対的に（他の2つより）阻害活性が低かった。

考察

E−64は，非括抗的不可逆的にカテプシソB
及びLを阻害する。（図1，2）カテプシソBは約10ケのチオール基を持っているが3），E一朗
が特定の1ケの活性チオール基に結合すること
113

ⅣIn vitroの効果考えられる。（図3，4）これは花田ら1）によるパパインや杉田ら2）によるCANPの報告と一できることが解った。この2種の阻害剤は，細胞内タンパク質の分解枚樺の解明や，それに関与するプロテアーゼの分煩の研究に有効であろ致する。その上プロテアーゼに特異的であり他う。

によってカテプシソBの活性を阻害するものとのチオール酵素の活性には影響を与えない2）0
この阻害校横は，ロイペプチソによるチオール
プロテアーゼの阻害枚構13）とは異なるようである。InvitroでのEr64の誘導体のカテプ
シソBとLに対する阻害活性では，E−64（D）
がやや低いほかは，ほぼ同程度の阻害活性が認められた（表1）。このことは，E−64のアクマ

文献1）Hanada，K．，Tamai，M・，Yamagishi，M・・
Ohmura，S．，Sawada，J．＆Tanaka，Ⅰ・：Isolationand characterization of E−64，a neW thiol
proteaseinhibitor，Agric・Biol・Chem・・42・
523−528，1978．

2）Sugita，H．，Ishiura，S・，Suzuki，K・＆Imahori，

チソ部分が，カテプシソBやLの阻害には必須でないことが考えられる。杉田ら2）によって，K．：Inhibition of epoxide derivatives on

E−64−bはE−64に比べてCANPに対する阻h Vifroandi和め0，J．Biocbemり87，339−341，

害活性が低く，D体も阻害活性が低いことが認められている。このことは，カテプシソBやLとCANPに対するE一朗の阻害作用は各種の3）Towatari，T．，Tanaka，K・，Yoshikawa，D・＆

chicken calcium−aCtivated neutral

protease

1980．

Katunuma，N．：Puri丘Cationandproperties of

誘導体間で異なるのではないかと考えられる0
InvivoE−64の誘導体の阻害活性では，E−64

a new cathepsinfromratliver，J・Biochem・，−b（RR）はinvitroで強い阻害活性を有す

4）Towatari，T・，Kawabata，Y・＆Katunuma，

るにもかかわらず，invivoではほとんど阻害
活性がなかった。しかし，E−64（L），E一朗（D），
E−64−C（SS）が特に強い阻害活性を示したOこのことは，E−64誘導体によって細胞への取り込

84．659−671，1978．

N．：Crystallizationandpropertiesofcathepsin
B fromratliver，Eur．J．Biochem．，102，279−
289，1979．
5）Ⅹ0minami，E・，Hashida，S・＆Katunuma，N・：
Inhibitionsofdegradationofratliveraldolase

み活性が異なることが示されている。Invivo

andlacticdehydrogenasebyE−640rleupeptinの実験において，誘導体の選択が重要であるこ

in vivo，Biochem．Biophys．Res．Commun・，93，とを示唆している。大関ら14）は，E−64，E−64−a，
E−64−Cの3H体を使ってinvivoではそれ6）Dean，R．T．：Directevidenceofimportance

ぞれ阻害剤が素速く肝臓に集まることを報告しoflysosomesin degradation ofintracellularている。しかし，E−64（L）とE−64−b（SS）

713−719，1980．

proteiJIS，Nature，257・414−416，1975・

は阻害活性が特に強いが，全体的にみると，

7）Hopgood，M．F．，Clark，M・G・＆Ballard・F・

E−64（L），E−64−b（SS），E−64−C（SS）のJ．：Inhibition of protein degradationinis0−

invivoでの阻害活性の消失の時間変化に態度の差異はこの3種で差はみられなかった。私達は以前，ロイペプチソについての時間変化を発表した5）が，これよりは少し阻害活性の消失時間が遅いようである。しかし，少なくとも，6
時間は十分に肝臓中で阻害活性を維持できることが確かめられた。

1ated rat hepatocytes，Biochem・J・，164，399−
407，1977．

8）Seglen，P．P．，Grind，B・＆S91heim，A・E・：
Inhibitionofthelysosomalpathwayofprotein
degradationinisolated rat hepatocytes byammonia，methyl amine，Chloroquine andleupeptin，Eur・J・Biochem・，95・215−225，1979・
9）Otto，K．＆Bhakdi，S・：Zur kenntnis des以上のことより，E−64（L），E−64−C（SS）

kathepsinsB，Spezititat und Eigenschaften・は細胞内でカテプシソBとLを特異的に最も強Hoppe−Seyler・s Z・Physiol・Chem・・350・1577−

く阻害し，動物実験で阻害剤として有効に使用

1588，1969．

114

15・E−64及びE−64誘導体によるラット肝カテブシソB及びLの阻害について
10）Kirshke，H・，Langeer，J．，Wiederanders，B．，

265−275，1951．

Ansorge，S・＆Bohley，P・：CathepsinL，aneW13）Knight，C・G・：Principleofthe design andthioIproteinasefromratliverlysosomes，Ellr．

use of synthetic substratesandinhibitorsfor

J．8iocllem．，74，293−301，1977．
11）Glassetti．D．R．＆Murray，Jr．J．R．：I）eter．
minationofsulfhydryl

groupswith2，2′−Or

4・4′−dithiodipyridine，Arch・Biochem．Biophys．，

119，41−49，1967．

12）Lowry，0・H．，Rosebrough，N．J．，Farr，A．L．
＆Randall，R．J．：Protein mesurement withthefolinphenolreagent，J．Biol．Chemり193，

tissueproteinase，Barrett，A′J・，editor，−．pro−teinasesin

mammalian

cells

and

tissues

North−Holland Pub．，583−636，1977．

14）大関正弘，野津隆司，諏訪俊男，河野事郎：E−64
及びその類縁体の生体内動態に関する研究，第3回E−64研究班会議．
15）今掘和友：Ca依存性プロテアーゼと生体制御，蛋白質，核酸，酵素，芸，483−491，1980．

115

16．カルシウムプロテアーゼと蛋白質燐酸化反応による生理機能の調節に関する研究
Ⅰ．E−づ4の生理作用の解析法について

＊
＊

洋潮三

康

＊
＊

弘

＊

原川関

＊

川書見

＊

明次彦雄

＊

龍公憲

図1に示すように蛋白質の燐酸化反応，脱燐
酸化反応による校能の調節は，その迅速性，可逆性においてあきらかにすぐれた枚構である
が，実際にそれは糖代謝や多くの代謝調節において重要な役割を果しており，CyClicAMPは蛋白質燐酸化反応を介して，その生理活性をあらわしていることが確立されている。しかし一方，数多くのホルモンや生理活性物質の作用横序が仔細に解析されるにつれて，生体の受容・美＊る。ことにホルモソや神経伝達物質など，外界シグナルに対する標的組織の受容と応答の機序
は最近飛躍的な進展をみせ始めている。このような生体反応の枚横は，1958年Sutherlandl）
によりCyClicAMPが発見され いわゆるセ
カンドメッセンジャーの概念が導入されて以来，多くの知見がもたらされた。そして今では外界シグナルに対する標的組織の多岐にわたる
校能の応答，ないし代謝の応答には，蛋白質燐
酸化酵素が重要な役目をになうことがあきらかにされつつある。

口野川＊

多彩な生体の現象を適応・応答の枚序に焦点をあててその化学的基盤を解明することは，今日医学・生物学の重要な研究課題となってい

本

岸水佐梶

＊

はじめに

春

壕

＊

美寿治光

渕

西

義光粟

井

高森千田

研究協力者

応答の機構にはCyClicAMP のみではなく，カルシウムもまたきわめて重要な役割を果すことが示唆されるようになった2）。
今日，カルシウムと代謝調節との具体的なかかわりあいの機序としては次の3つの機構が知られている。その第1はいわゆるモジュレータ
ー蛋白質（カルモジュリン）と呼ばれる蛋白質を介して多彩な揆能を発揮する様式であり3），
その第2は本稿で問題とするカルシウム要求性のプロテアーゼを介する様式4）・5），そして第3は蛋白質燐酸化酵素の活性化を通して多岐にわたる揆能を発揮する様式である6）・7）。ことに第3の蛋白質燐酸化酵素を介するカルシウムの働
きは，CyClicAMP と対立するホルモンや生
理活性物質の受容・応答と直接関連する可能性が強い。この種の蛋白質燐酸化酵素は生体にきわめて広く分布しており，脳やリンパ球，血小板等，組織によってはCyClicAMPに対応す
る蛋白質燐酸化酵素よりも数十倍の活性が認められる。その活性化には2つの過程があり，カルシウムと燐脂質の代謝が共役する可逆的活性化の過程の他に，上述のカルシウムプロテアー
ゼによる限定分解が関与する不可逆的活性化の過程がこれであって，いずれの場合にもカルシ
ウムイオンを必須不可欠としている。この2つの活性化の過程はそれぞれその模作が異なって＊神戸大学医学部第2生化学教室

いるが，最終的な蛋白質燐酸化反応による生体117

Ⅳ

h vitroの効果

セカンドメッセンジャー

l
ATP

朝糾皿蹴肋
蛋白質燐酸化酵素

ADP

不活性型
酵素蛋白質

■

図1蛋白質の燐酸化反応
制御の効果は同一であり，多岐多彩におよぶ生材料及び方法体の受容と応答，生理現象に果す役割はきわめて大きく，CyClic AMPと並ぶ重要性をになうものと予想される。
筋萎縮症の進行とカルシウムプロテアーゼとの関連を中心課題とする本研究班に参加する機会にめく・まれたのを契機として，今回，我々は（1）材料
本研究には主としてラットの脳を材料とし，その他必要に応じて羊トの血小板を用いたo C
キナーゼ及びCa2＋プロテアーゼはラット脳より前報にしたがい調整した8）。
各種の併脂質は赤血球より抽出分画した他，

上述のような生体の受容と応答の撥序においてカルシウムプロテアーゼがどの程度の意義をもオレイン酸，ジオレイン，その他の中性脂質はち，生体反応の調節に役割を果しているのかに市販品を用いている9）。本実験に使用したシナ

ついて，解析を実施しようとした。ことにそのプス睦はラット脳よりKruegerら10）の方法に

解析には，種々の外界シグナルのトランスメソ

したがい調整した。蛋白質燐酸化反応の基質とブレンコントロールに働く上記の蛋白質燐酸化
酵素の可逆的・不可逆的活性化というきわめてして用いたヒストンは仔牛胸腺から前報にしたがい調整した11）。A23187はェーラィリリー社，

好都合のパラメーターが存在し，それぞれの活E−64は大正製薬より寄贈をうけた他，ジプカ

性化の過程を選択的に抑制することによって，逆にその重要性を推定することが可能であるとイン等の種々の薬剤は各社より寄贈されたものを用いた。
佗）酵素活性の測定考えたからである。
実際にはいくつかの問題点があることが判明

CキナーゼはHlヒストンを基質として，燐

し，なお解決しなければならない点が見出され

脂質，ジオレイン，カルシウムの存在下に〔γ一たが，以下では昭和54年度に得られた成果の概32P〕ATPよりの放射能のとり込みを測定した。
またCa2＋プロテアーゼの活性測定はCキナー

略について中間的に報告する。簡単のためこの種の蛋白質燐酸化酵素をCキナーゼ，これに対してCyClic AMPの生理活性の発揮に中心的役割を果す蛋白質燐酸化酵素をAキナーゼと呼ぶこととする。両者はいずれも多岐にわたる触媒活性を有しており，生体内ではPleiotropic

ゼを基質として用い，その限定分解の結果あらわれるキナーゼ活性をHlヒストンを基質として測定した8）。
（3）その他の方法
血小板の凝集はアグリゴメーターを用いて測な役割を果すものであるがこの点については次回に譲り，ここでは主としてCキナーゼの活性定した。放射能の測定はNuclear−Chicago社

化反応とカルシウムプロテアーゼに焦点をあて

なお，各試薬はCa2＋を除去するためChelex

たい。なおカルシウムプロテアー‥ピは以下Ca2＋

lOOのカラムを通し，蒸留水はいずれも石英ガ

プロテアーゼと記載する。

ラスによる二重蒸留を実施して調整した。

118

製ガスフローカウンターを主として使用した。

16．カルシウムプロテアーゼと蛋白質燐酸化反応による生理揆能の調節に関する研究

可逆的活性化反応

K a ：1 × 1 0 ￣6 M

不可逆的活性化反応

K a ：4 × 10 ￣5ht
by C a2＋−prO tea Se Ⅱ

b y P I tu r n o v e r
K a ：5 × 10 ￣4ht

K a ：5 × 1 0 ￣S M

by C a2＋−p rOtea Se I

b y C a 2＋in f lu x

図2 蛋白質燐酸化反応の活性化様式とCa2＋の漬度︵S一竃n︶とてこ04むSdヱOJdFraction Number
図3

脳における2種のCa打プロテアーゼ（DEAE−Cellulose column chromatography）

119

ⅣIn vitroの効果︵S一芸n︶・言卜苫くど叫ヨ遥結果（1）生白質燐殿化酵素の概要とCキナーゼ
外界情報の細胞内伝達物質，すなわちセカン

A及びCキナーゼは上述の酵素であり，Gキナ
ーゼはCyClicGMP

によって選択的に活性を頗わす酵素である12）。この3着はその枚能が多彩である点で多くの類似性，共通性が認められドメッセンジャーとして今日ではCyClicAMP，る6）。これに対してbキナーゼ，MLCキナー

CyClicGMP及びCa2十の3着が注目を集めてゼとはそれぞれホスホリラーゼbキナーゼ，ミいるが，表1はこれらの伝達物質に対応する種

オシンL鎖キナーゼであり，いずれもCa2十一モ々の蛋白質燐酸化酵素の一覧表である。表中のジュレーター蛋白質によって活性化されるが，120

16・カルシウムプロテアーゼと蛋白質燐酸化反応による生理機能の調節に関する研究︵至言︐ 0く麗眉︒hdJもU
E−64（FLg／ml）
図5

Leupeptin（FLg／ml）

脳Ca汁プロテアーゼに対する阻害効果

／受容体
∵∵了ニ

ヤギさ長。示轟a；詭

図6

生体膜

Cキナーゼの可逆的活性化校構

121

ⅣIn vitroの効果

1

1

1

1

）
︵u苫OJd叫E＼亡叫∈己一︒U︒︶言U︒tざ︒︒ U宕∝Dplus D iolein l0．
8／〟m l＼O
plus D iolein

0

0
・

0．
抽 g／m l認 芸崇 fデid alone

レー
′
′
′′′

0
0

0

−6． 七 二二ざ
−5 ま 一五
−4

0

D 謡競

憲 当

一一一
△
−3

CaC12（Log M）
図7

Cキナーゼのジグリセリドによる活性化現象
ll

活性化様式も異なっている。この中でその活性質とCa三十が必要であり，イノシトール燐脂質の代謝回転と共役している場合には10￣6M以及び機能の点から，外界情報の伝送・増幅にも下のCa2＋により，またCa2十の流入によってっとも重要と考えられるものはAキナーゼとC活性化される場合には10−5M程度のCa2十が関キナーゼである。Gキナー‥亡は節足動物では重与する。これに対してCa2＋プロテアーゼによ要と思われるが量的には哺乳動物においては著

る限定分解によって活性化される場合には，このプロテアーゼのCa2＋要求性が問題となるが，その機能は両者ともやや限定されていて，そのしく少なく，その意義は今日もなお不明である。これらの蛋白質燐酸化酵素はいずれもトリ
プシンによって限定分解をうけて活性を保持す

従来はこの種のCa2＋プロテアーゼは10￣一M程るフラグメソトが得られるが，Ca2＋プロテアー

義がもたれていた。しかし，最近になり10￣5M

ゼによって活性化現象が確認されているのはC
キナーゼとbキナーゼのみである。

程度のCa2十によって充分に活性をあらわす
Ca2・プロテアーゼが見出され，限定分解による以下に焦点をあてるCキナーゼではこのよう

Cキナーゼの活性化の様式も生理的に存在しうな限定分解による不可逆的な活性化様式と，生る可能性を考慮する必要が生じてきた。そこで

体膜の燐脂質が関与する可逆的な活性化様式とまずこれらのCa2＋プロテアーゼとともに，不が認められ，その様子を図2に模式的に示した。可逆的な活性化様式については後に詳しく

可逆的なCキナーゼの活性化様式について概要

のべるが，この場合には生体膜を構成する燐脂122

度のCa2十を要求する点でその生理捺能には疑をのべたい。

16．カルシウムプロテアーゼと蛋白質燐酸化反応による生理校能の調節に関する研究︵箪二号三きよSg叫滅亡曇︒Jd
0．5

1．0

1．5

2．0

Dibucaine（mM）
図8

ジブカインによるCキナーゼの選択的阻害（2）Cat＋プロテアーゼによるCキナーゼの不可逆的活性化反応とその選択的抑制離される。試験管番号45〜50付近のCa2十プロ
テアーゼⅠは従来見出されていた酵素である

Cキナーゼは分子量約77，000と推定され，が8），低濃度の食塩によって溶出されるCa2十プ

通常は不活性型として可溶性分画に存在する

ロテアーゼⅠは分子量8万前後であり，きわめ

が，Ca2＋プロテアーゼによって限定分解をうけて不安定な酵素であって容易に活性が消失す

ると分子量は約51，000のフラグメソトが生成る。しかし，図4に示すようにCa2＋濃度は約する。これはCa2＋，燐脂質と無関係にそれ自10分の1，すなわち10￣5Mで充分の酵素活性

身で活性を煩わすので，見かけの上では図2のを示すことができる。この両Ca2＋プロテアーゼ

ように，活性を抑制していた部分が除去されたの相互の関係は不明である。なお，Ca2＋プロテように見える。Ca2＋プロテアーゼについては最

アーゼⅠはCa2＋濃度に対してややS字状をな

近Mellgren13）は犬の心筋中にCa2＋が低濃度

すがこの理由も今の処不明である。
さて，E−64によるこれらCa2＋プロテアーゼ

において活性を示す酵素の存在を報告しているが，同様にラットの脳などにもこの種のCa2÷

の活性抑制であるが，両プロテアーゼともに

プロテアーゼを見出すことができる。通常の温E−64，ロイべプチソによってきわめて強く抑制され，その模様を図5に示した。しかし，非常度に対しては著しく不安定のため，やや低温（150C）において活性を測定すると図3に示す
ように2種のCa2＋プロテアーゼがDEAEセル
ロースのカラムクロマトグラフィーによって分に特長的なことにこれらの阻害程度，すなわちプロテアーゼ阻害剤の効力は酵素の純度と密接に関係しており，図5のようにある程度純化し
123

ⅣⅠn vitroの効果︵70tXudU︶阜三もく宗望遠u曇OJd

図9Cキナーゼの阻害様式

たCa2十プロテアーゼに対してはきわめて強力において充分あり得るものと推定されるが，しな抑制を示し，Kf値は非常に低い。しかし，かしこの過程をE−64やロイべプチソによって比較的爽雑物の多い粗抽出液においてはほとん
ど阻害効果が認められず，1mg／mJの高濃度に選択的に抑制することは純粋な酵素系ではおいてようやく数十パーセントの抑制が認めら考えられない。この点については後に論議するれるにすぎない。この事は非常に重要な点であこととしたい。

り，後述のようにCa2＋プロテアーゼの生理的機能を判定する上において問題になるように思われる。

100％可能であるが，生体内で可能であるとは（3）燐脂質によるCキナーゼの可逆的活性化反応とその選択的抑制
次にCキナーゼの可逆的活性化反応について

これらの結果からCキナーゼのCa2＋プロテはその概要を図6に示しているが，この過程

アーゼによる活性化現象は生理的なCa2十濃度は，従来より観察されているイノシトール燐脂124

16．カルシウムプロテアーゼと蛋白質燐酸化反応による生理機能の調節に関する研究

Dibucaine
Ki：2×10￣4M

Ki：4×10￣6M

図10 蛋白質燐酸化酵素活性化反応の選択的阻害

C−Kinase activation

Platelet aggregation

by Ca2＋＆membraneby thrombin

O Tetracaine0＼＼ヽO Tetracaineヽヽヽヽ△Imipramine●Chlorproma2：ine△Imipramine●Chlorpromazine

ヽ

ヽ

60

ロVerapamil▲Dibucaineヽ

合叫A叫一042コdtq銘

ロVerapamil▲Dibucaine

合、 ヽ

ヽ

、

0ヽ

、一一一一〇

＼
＼
＼
ヽ．

ヽ、

、、0

、一一一一、▲

0
0

■■−−−

1．0

2．0

0

1．0

2．0

Cdmpoundindicated（mM）

図11Cキナーゼの可逆的活性化反応と血小板溌集反応

125

ⅣIn vitroの効果

Ca2＋−PrOteaSe

Membrane boundactive form

Solubleactive form

M em brane boundactive form

S oluble
active form

i nus C a2十m一
prOteaSe

78 ％

22 ％

plus C a2＋−
prOteaSe

13 ％

87 ％

図12 生体膜結合性Cキナーゼの限定分解による細胞質への移行

C−Kinase activation
by Ca2＋−prOteaSeヽ80︵求︶き⁝人相lUくどコdtむ銘60ー￣￣一一一一◆一一一一一一一→

ヽ

ト、、、、

Activation of
membrane bound C−kinase

Platelet aggregation
by A23187

ヽ■●Activation ofied soluble C−kinase

0．5

1．0

0
E−64（mg／ml）

図13 Cキナーゼの不可逆的活性化反応と血小板凝集反応126

16・カルシウムプロテアーゼと蛋白質燐酸化反応による生理機能の調節に関する研究

質の代謝回転と密接な関係があり，細胞膜にお量のジグリセリド，この実験においてはジオレ

ける燐脂質の代謝が重要な意義をもっている。
イノシトール燐脂質の代謝回転は約25年前，インが共存すると著明に活性が上昇し，同時に必要なCa2＋の濃度が著しく低下することを示

Hokinによってアセチルコリン感受性の組織においてはじめて観察された14）。この現象は外している。すなわち10￣6M程度の生理的な濃度のCa2十が存在する条件では，Cキナーゼの界のシグナルによってイノシトール燐脂質が特活性は事実上ジグリセリドの存在に依存してお異的に分解され，イノシトール燐酸とジグリセ

り，したがってジグリセリドがい景っはセカンドリドが産生される反応であるが，観察される現

メッセソジャーとして作用してCキナーゼを活象としては再合成の過程で放射性のイノシトー

性化しているといえよう。このことは外界シグ

ルや燐酸がこの燐脂質へ再びとり込まれてゆくナルによりアデニル酸シクラーゼが活性化さ事実を指している。この現象はその生理的意義

れ，ATPからCyClicAMPが産生され，これがセカンドメッセンジャーとしてAキナーゼをが不明のまま生体受容枚樺との関係が重視され，今日まで莫大な研究が行われ，当初のアセを介さ選択的に活性化することと対比することができる。

ない今一群のホルモンや生理活性物質の作用に

この種のジグリセリドとしては不飽和脂肪酸

チルコリンのみでなく，CyClic AMP

際して認められている15）。今日の処，これら多を含有することが必須条件であり，オレイン

数の外界シグナルがどのような揆序によって標酸，リノール酸，リノレン酸，アラキドン酸な的細胞膜のイノシトール燐脂質を選択的に加水どが少くとも2位に1個存在すればよい9）・16）。

分解するかはあきらかではないが，今回の我々

実際，高等動物組織に存在するイノシトール燐

の解析によって，ここに生成するジグリセリド

脂質はほとんど100％2位にアラキドン酸を含がCキナーゼの活性化の引き金をひいているこ

有していることが特長的であるので，外界シグとが見出された9）・16）。すなわち図6のように，

ナルによりイノシトール燐脂質から産生するジ

ジグリセリドがcyclic AMP

グリセリドはCキナーゼの活性化の引き金を引と同様にセカンドメッセンジャーとして作用しており，細胞膜

くことができる。一方，燐脂質の特異性としての脂質2重層をなす燐脂質，中でもセリソ憐脂

はセリソ燐脂質がもっとも有効であり，ついで質と共同してCキナーゼを生体膜に結合させ，エタノールアミン燐脂質が僅かの活性を示すの

その活性を発揮させるというきわめてユニークみでコリン燐脂質は全く無効である。したがっな秩序が働いている。この過程は可逆的であて生体膜を構成する憐脂質にはそれぞれ独自のり，Ca2十が必要であって，Ca2＋を除去する

機能分担があり，このCキナーゼの活性化に関か，ジグリセリドが消失すればCキナーゼは再するかぎり，イノシトール燐脂質とセリソ燐脂

びもとの不活性型となる。換言すると，生体膜質とが共同して働き，外界シグナルの受容機構の脂質2重層の中で，外界シグナルの作用に際して何らかの機序でホスホリパーゼCが作用において重要な役割を果している16）。
次にCa2＋の特異性はきわめて高く，Sr2十がし，イノシトール憐脂質の極性基が除去される

わずかに有効である以外は，他の金属は全く無と，これが引き金となってCキナーゼが生体膜に結合して活性化するという仕組みである。こ効である。ところで上述の機構によれば，Cが十の濃度変化は必ずしも必要ではなく，イノシトの作用の結果としてジグリセリドは再び燐脂質ール憐脂質の加水分解がCキナーゼの活性化のに再合成されるが，これが久しく多くの研究者

引き金となっている。しかし，図6の結果からみればジグリセリドの生成を伴わずともCa2十によって観察されていたイノシトール燐脂質の代謝回転である。
図7はこの代表的な実験成績である。Cキナの濃度の上昇のみによってもCキナーゼが活性化しうることがあきらかである。したがってCーゼの活性の発現には燐脂質のみではなく，徴キナーゼの可逆的な活性化反応においてもCa2＋
127

ⅣIn vitroの効果の濃度に対応して種々の機構が働きうるものと考えられる。
以上のようにCキナーゼは生体膜の燐脂質の代謝と共役し，Ca2十の存在下に活性を発現するが，この過程はすでにのべたように可逆的である。そしてこの過程を特異的に抑制することが可能である。ジプカイソやテトラカイン等の局所麻酔剤やクロルプロマジン等のトランキラ
イザー，その他の薬物の中には燐脂質と結合して，それ本来の作用以外に，種々の細胞の活動を抑制するものが知られており，近年多くの細胞生物学的解析にもちいられている17）。これらの薬物は，興味のあることにCキナーゼの可逆的な活性化の過程のみを選択的に抑制すること（4）血小板凝集反応におけるCat＋プロテアーゼの関与の評価
ヒトの血小板はトロンビンやADP，コラー
ゲン等に反応して凝集し，セロトニンを遊離す
る他，プロスタグランジン等によってその抑制が認められる等，多彩な応答反応を示すため，ホルモン作用の類型として古くから多くの研究がおこなわれている。実際，血小板にはCキナーゼの含量が著しく多く，Aキナーゼの20倍以上の活性が認められる。血小板をトロンビンで刺激するとイノシトール燐脂質が速やかに分解されジグリセリドが生成され，Cキナーゼが活性化される。そしてCキナーゼが血小板内での蛋白質燐酸化反応に関与していることを強く示ができる。図8はその一例であり，Cキナーゼ
がジプカイソによって阻害されることを示している。この阻害現象はCキナーゼの活性中心の抑制ではなく，燐脂質と結合することによる活性化の抑制に基づいている。したがって先にのべた限定分解によって活性をあらわしたCキナ
ーゼはジプカインによっては全く抑制されない。図9にあげる解析を含めて，種々の検討の結果この種の抑制は燐脂質と競合的であり，
Ca2＋やジグリセリドとは関係しないことがあ
きらかになっている。なお，ジプカイン等の薬剤は先にのべたCa2十プロテアーゼには作用しないため，不可逆的なCキナーゼの活性化反応は抑制しない。
以上の結果を総合すると，Cキナーゼの活性唆する成績が得られている。

化とその抑制は図10に示すように理解される。
すなわちCキナーゼには可逆的及び不可逆的な2つの活性化の様式があり，いずれも比較的幅広いCat＋濃度の変化に対応して作動するように仕組まれている。そしてそれぞれの過程はこれを選択的に抑制することが可能である。すな
わち生体膜の関与する可逆的過程はジブカイン
等の薬剤により，Ca2◆プロテアーゼによる不可逆的過程はE−64等のプロテアーゼ阻害剤によって抑制することができる。そこでこの現象を利用してCa2◆プロテアーゼの生理機能の調節に果す意義を知るべく，以下においては血小板を用いて細胞レベルの実験を企画した。

内の蛋白質の燐酸化反応を促進することもあき128

図11はこの事を示唆する実験成績の一つであるが，Cキナーゼの可逆的な活性化反応と血小板のトロンビンによる凝集反応がいずれも数多くの薬剤によって平行して抑制されることを示している。この際，実験成績は示していないが，血小板内の蛋白質燐酸化反応もまた平行して抑制されることがあきらかになっている。したがってトロソビン刺激による血小板の応答に際して，可逆的なeキナーゼの活性化反応が重要な役割を果すことが強く示唆される。
次に不可逆的活性化反応の役割を知る目的か
ら次の解析を行った。A23187はCa2＋流入を促進し，トロンビンと同様に血小板の凝集をひきおこすことがすでに確立されており，血小板らかとなっている。そこで，この際，Ca2十プロ
テアーゼによるCキナーゼの不可逆的活性化反応が作動するか否かがきわめて興味のある点である。実際，血小板には多量のCa2＋プロテアー
ゼが存在しており，試験管内の解析によると図12に示すように生体膜に結合して活性をもっているCキナーゼにもCa2＋プロテアーゼが作用し，可溶性分画へ活性型のCキナーゼを移行させる能力をもっている。しかしすでにのべたよ
うに，E−64は粗抽出液中，あるいは生体内におけるCat十プロテアーゼを抑制し得ないため，
A23187による血小板の反応における不可逆的16・カルシウムプロテアーゼと蛋白質燐酸化反応による生理按能の調節に関する研究

活性化反応，すなわちCa2＋プロテアーゼの生理文機能に関しては明瞭な結論に達することは出来なかった。図13はA23187による血小板の凝集も， 生体内に近い条件におけるCキナーゼの不可逆的活性化反応も，いずれもE−64は抑制し得ないことを示している。しかし，これらの結献1）Rall，T．W．＆Sutherland，E．W．：Formation
Of a cyclic adenine ribonucleotide by tissue
particles，J．Biol．Chem．，232，1065，1958．
2）Rasmussen，H．＆Goodman，D．B．P．：Re・

果はA23187による血小板の反応に際してはlationships between calcium and cyclic nu−

Ca2＋プロテアーゼが重要な役割を果す可能性を

Cleotidesin cell activation，Physiol．Rev．，57，
421，1977．

残すものであろう。
考3）Cheung，W．Y．：Calmodulin playsapivotal

察

今回の解析によってCa2＋プロテアーゼが果す機能が確立されたわけではないが，少なくともその意義を知りうる実験系を開拓することができたように思われる。この解析の途上，E−64
は純粋な酵素の実験系においてはCa2＋プロテ

rolein cellular regulation，Science，207，19，

4）今期和友：筋肉のCat・依存性プロテア二ゼ，代謝，16，139，1979．
5）岸本明，森光寿，高井義美：肝臓のCat＋依存性
プロテアーゼ，代謝，16，147，1979．
6）Nishizuka，Y．，Takai，Y．，Hashimoto，E．，

アーゼの強力な阻害剤として作用するが，生体内においてはほとんど無効に近いことが示唆さ

Kisbimoto，Aり

れ，そのためにCa2＋プロテアーゼの果す生理

partment of three multifunctional protein

的役割を知ることには現段階では限界があるこ

kinaseとが判明した。今後生体内でも作用しうる強力なCa2＋プロテアーゼの抑制剤を開発することによって，プロテアーゼの生体制御に果す意義とその重要性を評価することができると考えられる。
本稿は与えられた課題に対しては現段階では中間的な報告にとどまっているが，しかし少な
くとも蛋白質燐酸化反応，とくにCキナーゼの可逆的，不可逆的活性化反応をパラメータとして，1つの解析の緒口が得られたように思われる。これまで全く推定の域を出ていない限定分
解反応のもつ生物学的意義に関して，今後種々の実験系をもちいて解析を続けたいと考えている。

Kuroda，Y．，Sakai，K．＆Ya−

mamura，H．：Regulatory and functionalcom・

systems，Mol．Cell．Biochemり23，153，

1979．

7）Nishizuka，Y．：Three multifunctionalpro・
tein kinase systemsin transmembrane cont・rol，ChemicalRecognitionin Biology（Chap・
eville，F．＆Haenni，A．L．eds），Springer・
Verlag，Berlin，in press，1980．
8）Inoue，M．，Kishimoto，A．，Takai，Y．＆Nishizuka，Y．：Studiesonacyclicnucleotide・
independentproteinkinaseanditsproen2；yme
in mammalian tissues・ⅠⅠ・Proenzymeandits
activationbycalcium−dependentproteasefrom
rat brain，J．Biol．Chem．，252，7610，1977．
9）Kishimoto，A．，Takai，Y．，Mori，T．，Kikkawa，
U．＆

Nishizuka，Y．：Activation of calcium

and phospholipid−dependent proteinkinaseby
diacyJglycerol，its possible relation to phos−

昭和54年度の報告を終えるに当って，本研究の推進に当り，多大の御支援と御助言を賜わった今掘和友教授，ならびに大正製薬株式会社の各位，厚生省新薬開発研究助成に対して深い感
謝の意を捧げたい。

phatidylinositolt11rnOVer，J．Biol．Chem．，255，
2273，1980．

10）Krueger，B．K．，Forn，J．＆

Greengard，P．：

Depolarization−induced phosphorylation of
SpeCi丘c proteins，mediated by calciumionin丑ux，in rat brain synaptosomes，J．Biol．
Cbem．，芸2，2764，1977．
11）Hashimoto，E．，Takeda，M．，Nishizuka．Y．，
129

ⅣIn vitroの効果
Hamana，K．＆Iwai，K・：Studieson■the sites

unitsinindividualphospholipidsofpancreas
slices and brain cortex slices，Biochim．Bio・

inhistonesphosphorylatedby

adenosine3′；5′−mOnOphosphate−dependent

3′：5／−mOnOphosphate・dependentandguanosine

proteinkina・ses，J．Biol．Chem．，252，6287，1976・
12）Kuo，J．F．＆Greengard，P・：CyclicnllCleo−

pbys．Acta．，18，102，1955・
15）Michell，R．H．：Inositol phospholipidsin
membrane function，Trends Biochem．Sci・，4，
128，1979．

tide−dependent protein kinases・VLIsolation

16）Takai，Y．，Kishimoto，A・，Kikkawa，U・，Mori，

andpartialpuri丘Cation of a protein kinase

T．＆Nishizuka，Y．：Unsaturated diacylgly・

activatedbyguanosine3′，5′−mOnOphosphate，

J．Biol．Chem．，245，2493，1970・
13）Mellgren，R．L．：Canine cardiac calcium−
dependentproteases：reSOlutionof twoforms
withdiuerentrequirementsforcalcium，FEBS
Lett．，109，129，1980．
14）Hokin，L．E．＆Hokin，M・R・：E任ects ofacetylcholineonthe turnover of pbosphoryl

130

cerolas a possible messengerfortheactiva−
tionofcalcium−aCtivated，phospholipid・depen・
dentproteinkinasesystem，Biochem・Biophys・
Res．Commun．，91，1218，1979．
17）Seeman，P．：The membrane actions ofanesthetics

and tranquilizers，Pharmacol．

Rev．，2も583，1972．

17．Ca依存性中性プロテアーゼ（CANP）に対するE−64の効果

研究協力者

鈴

今

掘

和

友＊

木

紘

一＊

辻

崇

一＊

久保田俊一郎＊ 木 村 吉 雄＊
石浦章

Ⅰ．筋崩壕とプロテ7−ゼ
急激に壊死に陥った筋線経を電顕的に観察す

一＊には変化がないが，多くの場合その原形質膜（plasmamembrane）に損傷があることで，これは多くの研究者によって指摘されているとると筋線経が部分的に過収縮（hypercontrac−

ころである。電顕観察では，その現象が原因で

tion）している像を見ることがある。これは通あるのか，過収縮の結果生じたものであるのか

常の強い収縮ではなく，Z線をミオシンフィラは議論できないが，単純に考えると損傷が生じメントとアクチンフィラメントが突き抜けるよ

た結果筋細胞外のCa2十が細胞内に流入し，そうに収縮し，もはやもとには戻れなくなってしのために一瞬にしてA及びⅠフィラメントのすまった像である。ここではフィラメントの区別

べりが起こり，同時に筋小胞体の揆能が破壊さがつかなくなり，過剰に収縮しているため横断れて不可逆的に収縮したままになり，その後タ面を見ると膨化して正常筋線経よりも直径が大ンパク分解作用を受けてフィラメントの区別がきい。この像は，電屈切片作製上の人工産物でつかなくなるまでに部分消化を受けたものと考あるとの批判も出たが，正常人の細胞にはほとえられる。過収縮線維中のCa濃度は，Engel

んど見られず，ミオバチ一，特にDuchenne

ら1，によって組織化学的に測定されており，型筋ジストロフィー症に多く見られる事実であGBHA染色より2〜3mMとされている。もしもそうなら，このように高い濃度のCa2＋にること，また貪食細胞（phagocyte）を含むことがあること，付近に再生緑経が観察されることなどから疾患に特徴的な現象であると考えられている。このようにDucbenne型筋ジスト
ロフィー症などの進行性筋萎縮を呈する疾患でのみ過収縮現象を見るということは，この現象そのものが筋線維崩壊の異常な克進を反映してより活性化されるプロテアーゼがこの分解を行うと考えることができる。
Ⅰ．Ca依存性プロテアーゼ（CANP）の定義
Ca依存性プロテアーゼという言葉は，活性いると考えてさしつかえないであろう。以下，発現にCa2十を必要とするプロテアーゼを総称するように思われ，たとえば微生物由来のサモ

この過収縮の原田と，現在までに得られた過収

ライシソなどもこれに属するようにみえる。し縮緑経の性質をまとめてみる。

かしここで述べようとするのは，動物の臓器中電顕で観察された過収縮線経の一番の特徴
は，それを囲む基底膜O）aSementmembrane）（本稿ではとくに筋肉中）に存在するCa2十で活性化される中性プロテアーゼ（calcium ac−
tivated neutralprotease，CANPと略す）＊東京大学医学部第二生化学教室のことを意味するものであることを了解してい131

ⅣIn vitroの効果

ただきたい。

同一物か否かは判定しがたい。ただ筆者らは精この種のプロテアーゼの存在は1968年Hus−
tonとKrebs2）とにより，ウサギ筋肉中にホ製したCANPに対する抗体をもっているので，スホリラーゼキナーゼを限定加水分解することできると思う。
むしろCANPとはいっても，生物種によりにより活性化する因子として発見された。彼らはこれをkinaseactivatingfactor（KAF）と命名した。その後この種のプロテアーゼの存在は多くの人々によって確認され，種々の名称

これを用いて免疫的に同一であるか否かは判定

やや性質を異にする点に注目しなければならない。反応横棒その他は共通であっても，たとえばトリとウサギのCANPは免疫学的にはほとに，そのZ帯を分解する能力を有する因子がやんど交叉せず，またサブユニット構造も異にしている。したかって今後はむしろ，どの生物種

はりCa2十で活性化されることを発見し，これより得られたCANPであるかを明記することをCASF（Ca2＋activatedsalcomicfactor）のほうが大切と考えられる。

がつけられている。Busch3）は筋細胞の細胞質と名づけた。またReddyら一，は同様な因子にCAF（Ca2＋activatedfactor）と名づけた○

Ⅲ．CANPの精製と性質

このように，KAF，CASF，CAFなど種々

著者らは，トリ7㌧ ウサギ8㌧ ヒト9）などの筋の名がつけられたのは，それぞれの揆能に着目したことによるが，もう1つこれら田子になる

肉よりそれぞれCANPを完全精製したが，そものが精製されておらず，まったく同一の酵素

表1CANPの精製の操作を表1に示してある。表1はトリの胸筋なのか，異なるものかの判定さえつかないことにも由来している。最近までのところDayton
らがブタの筋肉から85％まで精製したというのが最高の精製であった5）・6）。
そのような情勢に基づき，筆者らは種々の生物より，Ca依存性プロテアーゼの完全精製に着手し，これに成功した7）。これは活性発現にlmM程度のCa2十を必要とすること，至適
pHが中性にあることなどの特色を有するので，これを前述のように CANP（Ca2＋activatedneutralprotease）という名を付することにした。

1kgより出発したものの例であるが，他の材料についても同じ方法で行うことができた。すなわち胸筋1kgを3倍量の炭酸ナトリウム緩衝液，lmMEDTAとともにブレンダーを用いてホモジナイズし，10，000g，15分の遠心で筋肉より抽出したものであるから，RTFや，

上清をとり，これを粗抽出液とする。次にこれをpH4．9にすることにより等電沈殿を得るわけであるが，これは精製における最も重要な点である。なぜなら，筋肉中には本酵素に対する特異的な阻害蛋白質があり，CANPはこれと複合体を形成しているものが多いと考えられる。この等電沈殿の操作は，複合体を解離させるとともに，CANPは沈殿に，阻害蛋白質は
上清にと分別するので，精製上とくに効果的なのである。
このようにして，精製度は2，700倍，収率25

C−キナーゼ活性化プロテアーゼ（脳と肝腋）と％でCANPを得た。1kgのトリ胸筋より4・6

すなわち，完全精製によってこれが単純蛋白質であり，蛋白分解酵素以外の何ものでもない
ことが明らかになったから，正体不明のものにつける因子（factor）という名前を排し，正式にプロテアーゼと認定したことになる。一方，
CANPと，KAF，CASF，CAFについては，
現在必ずしも明確なことはいえないが，筆者らのCANPが，KAF，CASFとしての性質をそなえていることは明らかであるから，同一物と考えてよいと思われる。筆者らのCANPが132

17．Ca依存性中性プロテアーゼ（CANP）に対するE−64の効果

﹃●．．

欝

製されたことを示している。ただし，図1に示すようにSDSゲル電気泳動においては，トリのCANPは分子量8万のバンド1本を示すのに対し，ウサギ，ヒトのCANPでは8万と3万のバンドが現れ，そのモル比は一・1：1であった。このことから，ウサギ，ヒトなど哺乳類のCANPはサブユニットを有する点，トリのものと異なっている。
精製された各CANPの性質を比較したのが
表2である。
サブユニット組成が異なる以外は，至適pH，活性に必要とするCa2＋の濃度（表2では最大活性の半分を発現するに必要なCが十の濃度のA

B

対数の絶対値，pKaを示す）など，ほぼ同じである。

図1精製したヒトCANPの電気泳動図

ウサギにつき，2つのサブユニットが共に活性に関与するか否かを調べるため，つぎの実験

A：ポリアクリルアミドディスクゲル電気泳動，pH8・3，矢印はマーカー色素のバソドを示すを行った。まずウサギCANPをサブユニット

B：SDS一ポリアクリルアミドゲル電気泳の解離させる条件を調べた。種々の条件で酵素

動を保温後ポリアクリルアミド電気泳動で検討しmgの酵素が得られる。他の材料よりの精製もほぼこれと同じである。

た結果，6M以上の尿素で処理すると

CANP

は80Kと30Kサブユニットに解離すること

こうして得られたCANPはいずれもディスを見出した。この条件（6M尿素，2mMED−

ク電気泳動では単一のバンドを示し，完全に精TA，5mM2−メルカプトエタノールを含むト

表2

種々のCANPの比較

巨 夕車、巧ウサギ…巨分子

ト1ゥサギ当ウシ心筋1車ット肝1

量

サブユニット

至適80，000〜
92，00080KpH

7．5−8．0

Ca2＋による活性化（pKa）＊2

1

Ca才＋
Srt＋

Mg2十
Mn2＋
Bat＋

比

活

性

（〝／mg）

等電1︒︒即押脚伊＝

金属イオンによる活性化＊】点＊1辻ら未発表＊2 50％活性を発現するときのCa2＋濃度（mM）＊3 10mMCa打存在下の活性を100％としたときの活性（金属イオン濃度10mM）＊4，＊5，＊6 金属イオソ濃度各々lmM，5mM，2mM
133

ⅣIn vitroの効果

リス緩衝液，pH7．5，40C，2時間処理）で
CANPを解離させた後，尿素を除いて酵素活性を回復させる条件を調べた。CANPを20mM Tris−HCl，2mMEDTA，5mM2−メルりはるかに大量を必要とする。ヒトの場合には測定に用いた限りではSr2十では活性化されなかった。
その他，これらのCANPがヨード酢酸，

晩透析して尿素を除いてから300Cで40分保温

pCMB，DTNBなどSH修飾試薬で失活することも共通しており，これらのCANPはCa2十すると活性の回復がみられた。活性の回復率はで活性化される，中性のチオールプロテアーゼ

約55％でまだ100％活性が回復する条件が見出という点ではすべて共通である。

カプトエタノール，pH7．5に対し40Cで一せないが，この解離会合系を用いて30Sサブ

Ⅳ．CANPとSH基ユニットの役割を調べた。ウサギCANPを上述の6M尿素で処理し尿素の存在下でSeph−adex G−75のゲル炉過を行って80Kと30K

CANPの活性発現にSH基の存在が必要でサブユニットを分離した。この2種のサブユニあることが明らかになったので，トリのCANPにつき以下くわしく検討した。

ットを単独または混合して変性を回復させ活性

図2はトリのCANPをDTNBで滴定したの戻りを調べた。表3に示した結果から明らか
ウサギCANPの再構成実験

未処理CANP

335

5
5
3
0
2
5
2

（80K＋30K）＊一5
4（80K）＋（30K）＊3．4（30K）＊201（80K）＊2

5

コントロール＊1

100
0
0
1

8
1

再構成CANP

相対活性（％）＊16M尿素で解離後そのままサブユニットを分解せずに尿素を除いたもの＊2 分離したサブユニットを各々単独で尿素を除いたもの＊3 分離したサブユニットから尿素を除いたのち300Cで保温するとき両者を混合したもの＊4 分離したサブユニットを再び混合してから尿素を除いて再構成したもの

4

比活性（〝／mg）

dNくじ一〇∈＼堰僅仇HS

蓑3

0

20

40

60

インキュベーション時間（分）図2 CAMPのSH基のDTNB満足
矢印の点で，Ca汁，尿素を添加する
ときの結果を示す。すなわち，まずCANP分子の表面に存在する3個のSH基が修飾されなように，80K及び30Kサブユニット単独る。ついで活性発現に必要なlmMのCa2十を添加するとさらに1個のSHが滴定され，では活性が出現せず，両者を混合した場合にの6Mの尿素をこれに加えると，もう2個のSH

み活性の回復がみられた。また，あらかじめ尿基が滴定される。以上の結果はCANPには，はじめから表面に存在するSH基3個（第一族素を除いて変性を回復させた80Kと30Kサも活性の回復は高くないので，尿素を除き変性

SH），Ca2＋の添加ではじめて表面に露出するSH基1個（第二族SH），尿素で変性してはじを回復させる以前に80Kと30Kサブユニッ

めて露出するSH基2個（第三族SH）がある

トが共存することが活性の回復には必須であことを示している。

ブユニットを300Cで保温するときに混合してる。Ca2＋の代用ができる金属としては，トリ，

図3は第二族のSHの滴定度をCa2＋濃度

ウサギの場合Sr2＋があるが，いずれもCa2十よに対してプロットしたものである。この曲線は

134

17．Ca依存性中性プロテアーゼ（CANP）に対するE−64の効果

棟蟄＼宙豆て∵丁小ぺふ
0

1．0

2．O

0

Ca2＋濃度（mM）
図3

表面のSH基を修飾してあるCANPのSH基の出現とCa汗濃度との関係

1

2

3

ヨード酢酸混合（mol／moICANP）
図41−C−モノヨード酢酸による滴定

これらの結果から，活性に関与するSH基CANPの活性をCa2＋濃度に対してプロット

は第一族のもののうちの一つで，Ca2十の効果したものとほぼ一致する。このことは，第二族SH基が活性に関与していることを示唆するもはむしろCANPにコソホメーショソ変化を与

のである。

定された。

しかし，次の実験事実はこの考えが誤りであえ，必要な活性中心を構成することにあると判
なお，ウサギCANPについてはこのようなることを示している。まず，CANPをDTNB

くわしい実験は行ってはいないが，活性に関与で修飾するとき，修飾の度合に比例して活性がするSH基は8万のサブユニット側に局在す減少し，3個修飾されたところで，活性は0にることはiっかっている10）。

なる。このことは表面にある第一族のSH基，Ⅴ．CANPの阻害剤

3個ともが活性に関与するか，または活性に関与するのは1個でも，修飾されやすさは3個同阻害剤，とくに競合的阻害剤は酵素の活性部等であるかのいずれかである。そこで，DTNB

位の微細構造の研究に有力な手段になりうる。
しかしながらCANPが低分子基質をもたないの代わりに，ヨード酢酸で修飾してみた。その結果が図4である。

という事実はこの種の研究にきわめて不利であ

HCで標識されたヨード酢酸はCANPに3る。それは一方では，低分子の競合的阻害剤の個とり込まれるが，1個とり込まれたところで存在の可能性が少ないことを示しているし，ま活性は消失する。このことは第一族のSHのうちの一つが活性に関与することを示すものでた他方ではたとえ存在したとしても，これを用いての動力学を行うことがほとんど不可能だか

ある。

らである。

第二族のSH基が活性に関与しないことをさらに示すために，まず第一族のSH基をす

すなわち，CANPの活性測定にはどうしてもカゼイソのような高分子基質を用いなければべてDTNBで修飾する。ついでこれにCa2＋ならないが，Kmやk。atの値は切断するペプを加えると第二族のSH基が露出するので，こチド結合の種塀に応じてまちまちの値をとるでれをヨード酢酸を用いて不可逆的に修飾する。

あろうから，たとえLineweaver−Burkプロ

この後で，DTT，またはメルカプトエタールを用いて，DTTによる修飾をはずしてやる

ットをとってみても，それから求められるKm，
Vm，KI値などはたいして意味あるものとはと，活性は回復するのである。

ならないからである。
135

ⅣIn vitroの効果
表4

ヒト，トリCANPの活性に及ぼすインヒ
ビターの効果ヒトCANP

ロイベプチソ

25＊1

トリCANP

52

55

キモスクチソ100

150

ペブスタチン

3，400

2，100
5
6

0

1

3

6

4

3

9
5

することが知られている。
大正製薬では，図5のようにコハク酸のトラ
ンスエポキシドの誘導体を種々つくっており，0

これらのあるものが，パパインのようなチオー

4
−

3

4

1

一

■

9
1
．4 2

Ep402

7
2

Ep236

1

1
6

E−64

5

一

5

2

3
0
6

0

Ep241

RlOO芝と上宝。R2
図5 ェポキシコハク酸誘導体の構造と反応機構

ェポキシコハク酸誘導体＊2

PBES

1画一SH

15

アンチパイン

M−23

R10等aこ。R2

ルプロテアーゼを不可逆的に阻害することを発＊1数字はLD5。値（酵素活性を50％阻害するときの阻害剤と酵素のモル比）＊2 図4に示したRlとR2が異なる稜々の誘導体見していた。筆者らは，図5の構造における，

そこで筆者らはもう少し一般的な阻害剤を試の条件に合格するものを探した。その結果も表してみた。その結果を表4にまとめてある。

Rl及びR2の性質により，CANPには作用す
るが，他のSH酵素には作用しないものがみつかるとの想定のもとに，多数の化合物中よりこ4に示してある。すなわちE−64と呼ばれる化

上に述べたように，阻害定数KIを求めるこ

合物（Rl＝H，R2＝ロイシルアグマチン）がとは不可能なので，カゼインを基質としたとき

CANPをきわめて能率よく失活させるが，筆CANPの活性を半分にまで抑えるのに要する者らの試した限り解糖系などのSH酵素は阻害

阻害剤とCANPの比で阻害の強さを示してあも失活もしなかった。事実HCでラベルしたエる。この比が小さいほど，阻害能力が大きいことになる。

ポキシコハク酸誘導体を用いて，そのCANP

まずダイズのトリプシンインヒビターやオポと，CANP当たり，lmolとり込まれたところ

ムコイドなど，トリプシンの強力な阻害剤となで，活性は完全に消失することから，この試薬るものは，CANPを全くといってよいほど阻は図4におけるヨード酢酸の場合と同様，第一害しない。一方，梅沢らにより発見された微生族のSHのうち活性に関与するものを修飾した物の第二次代謝産物の阻害剤を調べたところ，
表4に示すようにいずれのCANPについてもと想定される。

へのとり込みと，失活との時間経過を調べる

この試薬はCANPのはか，パパイン，カテ
プシソBのようなチオールプロテアーゼには作同じ傾向にあり，ペプシンなど酸性プロテアー
ゼに特異的なべブスタチンを除けは，いずれも用するが，そのほかのSH酵素には作用しない

ある程度の阻害を示した。中でもチオールプロという特性をもっている点でヨード酢酸など，

テアーゼにとくによく効くロイペプチソは強力

いわゆるSH試薬とは異っている。したがってな阻害効果を示すが，これはCANPがチオー

後述のように，CANPの活性の抑制が効かな

ルプロテアーゼの一種であることとよく合致す

くなったことによる病気の治療薬としては有効る。

なものと考えられる。

一方，CANPがSH酵素であることを利用

一方，ウサギのCANPに対するエポキシコして，これを不可的に失活させる阻害剤が考え

ハク酸誘導体の効果を判定するためェポキコハ

られる。一般にエポキシド誘導体は図5に示す
ように酵素のSH基と反応して，これを修飾させ，80K，30Kどちらのサブユニットと反136ク酸の誘導体（Ep241）をウサギ酵素に反応17・Ca依存性中性プロテアーゼ（CANP）に対するE−64の効果︵TOtX邑U︶トヒAHトUdO岩くだ

表5

図6

CANPの基質特異性

分解されるものl

ウサギCANPとトリチウムラベルしたェ
ポキシコハク酸誘導体（Ep241）の反応
ウサギCANPにEp241を300Cで5分間反応させて失活させ，SDSポリアクリル
アミド電気泳動でサブユニットを分離し，細片したゲルの放射活性を測定した．矢印は同時に泳動したCANPのサブユニットの位置を示す．

分解されないもの

カゼイン

アルブミソ

ヘモグロビン（変性）ホスホリラーゼ

チトクロムe（変性）調整蛋白質

インスリソB鎖
ミエリン

アクチン

A

スペクトリン

Bz−Arg−OEt，Bz・Tyr・pNA

チューブリン

Z・Glu・Tyr，Z−Leu−Tyr

筋蛋白質

Z−Gly−His−Leu，Z・Pbe−Leu

ミオシソ

Suc・（Ala），−pNA

トロポこソ

Z・Phe・Leu・NH2

トロポミオシソ

Z・Pbe・Leu・Ala

α−アクチニソ

Z・His−Pbe（NO，）・Phe−OMe

Z・Tyr・ONP

Z−Gly−Pro−Phe・Leu・Ala
Z−Gly−Pro・Leu・Gly・Pro
Z−Ala−Ala・Lys−Ala−Ala・Ala

するかといえばそうでもなく，ある種の選択性がある。宋変性のままで分解するのは，ミニリン蛋白質，チューブリン，スペクトリンのはか
アクチンを除く筋肉蛋白質である。CANPは応するかを調べた。ウサギCANPとトリチウ非常に特異的にグリコーゲンホスホリラーゼキ

ムでラベルしたEp241を保温すると酵素1ナーゼなどの解糖系調節酵素，トロポニソ，ト

分子当りEp241が1分子とりこまれて酵素活

ロポミオシンなどの収縮調節タンパク質，フィ性が消失した。このCANPをSDS電気泳動
にかけ泳動後トリチウムの放射活性を測定したo Ep241は図6に示した結果からウサギ

ラミン，デスミソ，EuアクチエソなどのZ帯タンパク質を切断することがinvitroで証明されたわけである。

CANPの80Ⅰ（サブユニット中にあるSH基と特異的に反応したので，ウサギCANPの2

次に，これら蛋白質の分解の仕方にも特色がある。CANPが，ホスホリラーゼキナーゼや個のサブユニットのうち80KサブユニットがC−キナーゼを活性化するという事実は，この直接酵素活性に関与するサブユニットであることが明らかになった。

分解がきわめて限定的なものであることを示唆している。

Ⅵ・筋タンパクの分解とE−64による阻害

トロポミオシン，及びトロポニソのCANP

による分解の経時的変化を調べたところトロポ

CANPについて特筆すべきことはその基質特異性である。種々の蛋白質，ペプチドにつミオシンの場合，CANPはその分子のほぼ中央で切断して，18，500と16，000の分子量をもつ

き，CANPで分解されるものと，分解されな2つの断片しか生じない。トロポニソTの場合

いものとに分類したのが表5である。まず注目されるのは，右下に示したように，トリプシ子化してゆくが，ここでは明らかな限定分解がン・キモトリプシン・ペプシン，エラスターゼ，みられる。このほかα一アクチニソやミオシン

コラゲナーゼなどに対する合成基質をCANPのH鎖についても，まず限定分解が先行することがみられた13）。

はいっさい分解しないという事実である。
それでは高分子基質はすべてCANPが切断には，30，000，26，000，14，000としだいに小分

この様に，筋蛋白質中の選択性や，小分子化
137

ⅣIn vitroの効果のバターンはすべて筋ジストロフィー患者の生検より得られた結果と一致する。われわれが
CANPと筋ジストロフィーとの関連性を考えたのはこのためである。
次に，筋蛋白質のCANPによる分解に対す
るE−64の効果を調べた。その結果，E−64の添加により，すべての筋蛋白質の小分子化は起らなくなった。

−1120，1975．

2）Huston，R．B．＆Krebs，E・G・：Biochemistry，
7，2116，1968．

3）Busch，W．A．，Strbmer，M．H・，Goll，D・E・＆
Suzuki，A．：J．CellBio1．，52，367，1972．
4）Reddy，M．X．，Estringer，J・I）・，Rabinowitz，
M．，Fischman，D．A．＆Zak，R・：J・Biol・Chem・，
250，4278，1975．

5）Dayton，W．R．，Goll，D・E・，Zeece，M・G・，筋ジストロフィー患者の筋肉中ではCANP
活性が上昇していることが報告されている〇一
万，モデル動物である筋ジスチキンにおいてRobson，R．M．＆Reville，W．J．：Biochemistry，
15，2150，1975．

6）Dayton，W．R．，Reville，W・J・，Goll，D・E・＆も，対照に比し，CANP活性が上昇している0Stromer，M．H．：Biochemistry，15，2159，1975・

そこでE−64を筋ジスチキンに投与することに7）Ishiura，S．，Murofushi，H・，Suzuki，Ⅹ・＆ょり，CANP活性の上昇が防止できるか否か

Imahori，K．：J．Biochem．，84，225，1978・

8）Tsuji，S．＆ImallOri，K・：未発表を検討したい）。
体重1kg当り10mgのE−64を貯化直後から，1週2回ずつ筋注した。対照の筋ジスチ
キンには溶媒のみを注射した。3ヵ月後調べてみると，筋ジスチキンのうち，無処理，E−649）Suzuki，K．＆Imahori，K・：FEBSLetters，104，
355，1979．

10）Azanza，J．−L．，Raymond，J・，Robin，J・・M・，
Cottin．P．，＆Ducastaing，A．：Biochem・J・，183，
339，1979．

処理のCANP活性は，9．92土1．84（n＝5），
7．00土2．51（n＝8）（筋wetweight当りの単11）Toyo・Oka，T．，＆Masaki，T・：J・Mol・Cell・位）で，E−64処理によりCANP活性は減少

12）岸本明，森光寿，高井義美：肝臓のCah依存性

したが，健全なチキンのCANP活性3．99土
1．59 よりはまだ大きかった。
文 献1）Mokri，B．＆Engel，A・G・：Neurology，25，1111

138

Cardio1．，11，769，1979．

プロテアーゼ，代謝，16，147，1979・
13）Ishiura，S．，Sugita，H・，Suzuki，K・＆Imahori，
K．：J．Biocbem．，86，579．1979．
14）Sugita，H．，Ishiura，S・，Suzuki，K・＆Ima−
bori，E．：J．BiocIlem．，87，339，1980・

18．Ca依存性プロテアーゼの活性測定法の問題点

杉 田 秀 夫＊・＊＊
研究協力者

石
埜

目

浦

章

一＊

村

上

博

彦＊

中

征

哉＊

高

木

昭

夫＊

的

E−64投与の直接的効果を見るため，細胞内チオールプロテアーゼの1つであるCa2＋依存

ダーゼは村上の方法1）で，その他の酵素は既知の方法で測定した。CANP活性は，後述の等電沈殿法2）で測定した。なおCANP活性の測性中性プロテアーゼ（Ca−aCtivated neutral

定は，以下の二法を比較検討した。第一は硫安沈殿法である。ニワトリ骨格筋2gを4倍量のPrOteaSe：CANPと略す）の活性変化を検討

20mMトリスー0・1MXC1−2mMEGTA，pH

するのが目的である。本酵素は，大部分が細胞

7・5溶液と共にホモゲナイズし，8000×タ，10

内可溶性分画に存在するが，生体内ではインヒ分間の遠心で上清を集めた。次に固体硫安を加ビターと結合しているため一見非常に弱い活性しか持たず，粗抽出液での活性測定には大きなえpHが下がらないように調整して00C，10分放置した後沈殿を集めた。沈殿はその後20誤差が伴うため正確な定量が困難であった。今mMトリスー0．1M KC1−1mM EGTA−20mM回は同酵素の細胞内分布と，種々の活性測定法の検討を行った。

メルカプトエタノール，pH7．5溶液に懸濁し，40C，一晩同緩衝液に透析した。この溶液を粗実験

ニワトリ骨格筋5gを10倍量の0．25M Su−
CrOSe−lmM EDTA，pH7．0溶液と共にすりつぶした。核及び筋原線経の分画は次のようにして行った。まず懸濁液をガーゼでろ過し筋CANP溶液とした。第二の方法は等電沈殴法である。前法と同様に粗抽出液を集めた後，
1N酢酸を用いてpHを4．5〜4．9に調整した。
生じた沈殿を0．1Mグルセロリソ酸ナトリウムー1mMEDTA，pH7．5溶液に懸濁し，粗CANP溶液とした。

原緑経を分けた。次に600×タ，10分間の遠心結で沈殿したものを核分画とした。当然この分画には筋原線経の断片が混在していた。上清部分
はその後，100000×タ，60分間遠心し，ミクロ

果（1）CANPの細胞内分布を示したのが表1で
表1

ゾーム，ライソゾーム及びミトコンドリア分画を得た。上清部分を可溶性分画とした。特に骨細胞内分布格筋においてはライソゾーム，ミトコンドリア（10000×g沈殿）分画はほとんどなく，まとめて100000×タの沈殿をとった。α−グルコシ核
ライ ソゾームミトコンドリア
一ミ ク ロゾーム

上＊国立武蔵療養所神経セソクー，疾病研究第一一部＊＊東京大学医学部脳研・神経内科

清言妄パ

LDH CANP等夏竺言（％） （％） （％） （％）

9．0 10．2

0．7

30．0

8．0

1．3

0．3

27．3

83．0

71．3

92．7

35．8

82．8

83．7

92．8

％回収率 100．0

139

ⅣIn vitroの効果
CANP Activity

（U／g）

o t。

20

30

40

50

60

70

80

90（NH4）2SO4（％）

□□∪∪
L．413

図1
内因性のインヒビターのせいであり，1つはある。これで明らかなようにCANP活性はそのほとんどが可溶性分画から回収される3）。こ

CANP自身が硫安の存在下で活性低下を示すの傾向は同様の可溶性酵素である乳酸脱水素酵

せいである。しかし，この実験では透析で硫安素（LDH）にも見られ，これらの酵素がライソを除いてあるので後者の可能性は否定される0ゾームやミクロゾームに存在しないことは明瞭

筋ジストロフィーニワトリでは，ほは40％飽和である。一方，ライソゾーム酵素である酸性で最大活性を示すが，これは内因性インヒビタ

α−グルコシダーゼ（酸性マルターゼ）活性は可ーが50〜80％飽和で回収される事実と，筋ジス

溶性分画のみならず広く存在している。これはトロフィーニワトリの方がインヒビター活性が同様のライソゾーム酵素であるカテプシソDに高い，という事実に合致する結果である。ゆえにこの方法ではいつも混在するインヒビター活性を考慮に入れねはならず，生体内でのCANP
活性をどこまで反映しているかという問題を考える場合十分検討を要するところである。
次に等電沈殿法でのCANP活性の回収率を図2に示す。図1と同様，正常（C）と筋ジス
トロフィー（Dy）ニワトリについて行った。正

ついても言え，ホモゲナイズでライソゾームが破壊されてこのような広い分布を示すと考えられた。少なくともこの結果よりCANPがライ
ソゾーム酵素である可能性は否定された。
（2）次にCANP活性測定法上の問題点について検討した。図1は，正常ニワトリ（line412）と筋ジストロフィーニワトリ（line413）骨格筋のCANP活性を硫安沈殿法を使って測定したものである。値はすべて硫安の％飽和で示した。正常ニワトリではCANP活性は最大50％飽和で回収された。また硫安濃度が高くなるにつれて回収率が悪くなるのほ，1つは混在する
140

常，筋ジストロフィー共pH約4．5で最大の回収をみた。正常では約1U／gであり筋ジスでは
約3U／gであった。この等電沈殿法ではCANPと内因性インヒビターは分離し，CANPの絶対量が測定可能である。図1と比較すると，正18．Ca依存性プロテアーゼの活性郡定法の問題点
CANP ActivityinAcidPrecipitatenH〇一一一・・O C●一一・・・・・●Dy

1

1

J
l

l

︵如＼n︶か三︸Uく

J＼
l

ノ

J

t

＼

′●

04

常ニワトリではほぼ同様の回収率を示すにもか
かわらず，筋ジストロフィーニワトリでは約3倍に活性が上昇する。これは明らかにインヒビターがはずれたためと理解できる（図2）。
考察

本研究により，CANP活性はその測定方法
によって異なった値をとることが判明したが，これは，CANPの絶対量を測定するか，インヒビター共に活性を測定するかの違いである。
E−64の効果を見る場合，もしE−64が不可逆的にCANPに結合するならば．CANPの絶対量を測定すればいいのであるが，もし可逆的に阻害した場合にはこの方法では不十分であると考えられる。また，実際生体内でCANPがどれだけ働いているかは，そのインヒビター結合量とも関係し，インヒビターを全く除外して測定することは生体内プロテアーゼのin vivoの作用を無視することになる。これらの点を考慮に入れると，CANPの測定法にはまだまだ問題点があると考えざるを得ない。
参考文献
1）村上博象高木昭夫，埜中征茂，石浦章一，杉田秀夫，水谷誠：日本ウズラに発見された陪原病Ⅰ型，神経内科，1980印刷中．
2）杉田秀夫，石浦章一：各種神経筋疾患羅患筋のCANP活性，厚生省筋ジス（三好斑），昭和舅年
141

ⅣIn vitroの効果
度報告．
3）Ishiura，S．，Sugita，H・．Nonaka，Ⅰ・＆Imahori，
E．：Calcium・aCtivated neutral protease．Its

142

localizationin the myo五bril，eSPeCiallyatthe
Z−band，J．Biocbem．，87，343−346，1980．

Ⅴ 吸取 分布，代謝，排泄19．E一弘及びその類縁体の生体内動態に関する研究・…・…・・・

大関 正弘

20．E一朗のラット肝薬物代謝酵素に対する影響

北川 晴雄

21．E一朗及びその類縁体の生物薬剤学的研究

沢田 二郎

19．E−64及びその類縁体の生体内動態に関する研究

研究協力者

目

大

関

正

野

津

隆

司＊

河

野

喜

郎＊

的

E−64はAspergi11us japonicusの固体培
養代謝産物でありl），CANP（Ca2＋activatedneutralprotease）阻害活性を有し2）・3），筋ジストロフィー発症鶏における予防試験において有効性が認められていることから3），ヒトの進行性筋ジストロフィー症に対する治療効果が期待されている。しかしながらE−64は固体培養での生産効率が低く，且つ精製も困難であり，また化学合成も長い行程4）を要して大量合成が難しいため，医薬品としての供給に問題が残されている。そこでE−64の各種類縁体を合成
し5），invitroでの薬効スクリーニングを行った結果，E−64−a，E−64−b及びE−64−Cの3検体にE−64に匹敵する生理活性を認めた。本研
究ではE−64及びこれらの類縁体につき，医薬品開発上の評価の一環としてラットにおける生体内動態を比較検討した。
方法（1）標識化合物
沢田5）によりWilzbach法6）で3Hガス標識
された3H−E−64，3H−E−64−a及び3H−E−64−Cを標識検体として使用した。3H−E−64，3H−E−
64−a及び3H−E−64−Cの比放射能はそれぞれ
92・0，22・9，：6．5／疋i／mgであり，放射化学的
純度は各種展開溶媒による蒋層クロマトグラフ
ィーの結果，いずれもほぼ100％であった。な＊大正製薬株式会社総合研究所

弘＊
諏

訪

俊

男＊

おE−64−bの3H標識も試みたが，精製過程で不純物を生じ，精製が困難であったため，今回の検討から除外した。
但）実験動物及び検体投与法
動物は体重180−200gのSprague−Dawley
系雄ラットを1群3〜4匹使用した。ラットは日本チャールス・リバー（株）から購入し，1週間予備飼育後に実験に供した。標識検体は担体を加えて生理食塩水溶液とし，5mg／kg（約20JJCi／匹）を背部皮下へ皮下注または経口ゾン
デを用いて胃内に経口投与した。なお3H−E−64−Cは予め少量の払N重曹水に溶解後，生理食塩水で一定量とした。また経口投与の琴合は投与前16Ilr及び投与後6br絶食した。
￠）放射能の測定
血液と糞は乾燥させたのち，一定量を自動試料燃焼装置（Aloka LSCTlll型）で処理し，血清，胆汁及び尿はその一定量にキシレンで2倍に希釈したPCSシソチレークー（Amer−Sham）3mJを添加し，また組織は20％（W／v）
水ホモジネート液を調製し，その0．25mgを減
圧乾国後に水50〆を加え，または分取した湿重量100mgあるいは小臓器をそのまま用い，可溶化剤Soluene−350（Packard）0．5mlを加え，一晩放置して可溶化後，キシレン希釈
PCSシソチレークー3m巨を添加し，いずれも液体シンチレーションカウンター（Aloka
LSC−502型）で放射能を計測した。なお試料のクエソチソクは外部線源法により補正した。
極）血中濃度の測定
3H−E−64，3H−E−64−a及び3H−E−64−C5mg／
145

Ⅴ 吸収，分布，代謝，排泄
Muscle

Serum

Urine

extracted with
MeOH

Slicedcentrifuged

Centrifugedhomogenizedin MeOH

1yophilized
extracted with
MeOH
centrifugedaporated to dryness
ssoIvedin water

Chacoal column

washed with water
eluted with acetone−Water（1：1，V／V）

evaporated to dryness

dissoIvedin MeOH
TLC
SoIvent system：（a）BuOH−AcOH−H20（3：1：1）（b）PrOH−H20（7：3）

チャート1E−64の代謝物の分離方法
Muscle（100）Serum，Urine，Bile（100）diluted with H20

iced

mogenizedin MeOH
adjusted to pH3with AcOH

ntrifuged

extracted with AcOEt

Aq．layer Bile（66）Extract

Serum（89）SupernatantMuscle（98）β−Glucuronidase

Urine（83）「．壱基出7Bile

HCI hydrolysis（34）

evaporated to dryness

dissoIvedin MeOH

ExJ。t（3。）

TLC

SoIvent system：（a）BuOH−AcOH−H20（3：1：1）（b）PrOH−H20（7：3）（）：Recovery％

of

3H

チャート2

E−64−C代謝物の分離方法

kgをラットに皮下注または経口投与したのち，経時的に尾静脈より20βを採血し，2×5cmの炉紙片に吸着させて夙乾後，放射能を測定した。
（5）尿，糞及び胆汁中排泄率の測定
ラットに標識検体5mg／kgを皮下注または146

経口投与し，代謝ケージに収めて別brごとに3日後及び5日後までの尿と糞を分別採集し，放射能を測定した。一方，胆汁中への排泄はェ
ーテル麻酔下に開腹し，胆管Cannulaを施したラッ＝こ標識検体5mg／kgを皮下注または経口授与し，ポールマンケージに収めてlbr

19．E−64及びその類縁体の生体内動態に関する研究2︻∈＼雲芯−2叫nb︒切立

∠さ＞ゝ
▲

：一：

ヽ・

J

l

図1ラットに3H−E−64，iH−E−64−a及び】H−E−64−Cを皮下または経口投与時の血中濃度及び薬動力学パラメーター （投与量；5mg／kg）
ごとに6brまで及び別，30br後までの胆汁を採集し，放射能を測定した。
（6）組織内濃度の測定
ラットに標識検体5mg／kgを皮下注または経口投与し，1／2，3及び別hr後に放血死させたのち，組織を摘出して全血，血清，肝及び筋
肉（大腿筋）の放射能を測定した。また3H−E−
64についてのみ，他に腎，心，肺，脾，副腎及び脳について同様な実験を行った。
の 代謝物の検索
3H−E−645mg／kgをラットに皮下注し，1／2
brの血清，筋肉，及び以hrまでの尿中の代謝物をチャート1に示す操作に従って抽出精製
後，シリカゲルプレート（Silica ge160pre−COrted）上で展開したのち，薄層クロマトスキ
ャンナー（AlokaJTC−202B型）で走査した。
なお各試料からのMeOHによる抽出効率はい
ずれも85％以上であった。また3H−E−64−Cについても24br胆汁を加え，チャート2に従って代謝物を抽出精製し，同様な検討を行った。
結果（1）血中濃度ラットに3H−E−64，3H−E−64−a及び3H−E−
147

Ⅴ 吸収，分布，代乱 排泄
E−64−a S．C．

100

E−64−C p．0．

E−64 p．0．
q）
【n
O
■て〕

3

50

iミ

1

2

こ

こ：Urine

5

3

1

2

3

5

1

2

3

5
days

〇一一・・・・一つ：Feces

図2 ラットに，H−E−64，】H−E−64−a及びjH−E−64−Cを皮下または経口投与後のN＝3
放射能の尿中及び糞中排泄（投与量：5mg／kg）

E＝誤OP︸0辞illl

240−−−0：p．0．

△一一一ム：S．C．

図3 ラットにIH−E−64，lH−E−64−a及び】H−E−64−Cを皮下または経口投与後の放射能の胆汁中排泄（投与量：5mg／kg） N＝3−4

148

■1

30hr

19．E−64及びその額縁体の生体内動態に関する研究
Whole blood

Serum

4

tE＼盲ヱ空叫コb心地も

1／2

3

24hr

Muscle42u＼盲ヱ空叫nbq uも1／2

匠詔E−64

3

24

3

24hr

⊂コE−64−a

図4 ラットに3H−E−64，3H−E−64−a及びJH−E−64−Cを皮下投与後の放射能の組織内分布（投与量64−Cを投与したときの血中濃度を図1に示す。
皮下注後短時間の血中放射能濃度はE−64 とE−64−aがE−64−Cに優っており，3者とも速やかに減衰するが，1／2−2brにおける半減期（Tちら）はE−64が最も早く21minであり，次いでE−64−a，E−64−Cの順であった。E−64−C
は他の2着に比べて吸収が若干遅れ，その後の消失も遅れる傾向がみられた。一方，経口投与時の血中濃度は3者ともほぼ同じレベルで推移
し，1−3hr後に0．15′唱／mJ前後の最高値を示
し．24hr後までの血中濃度曲線下面積（AUC）
はほとんど差異を認めなかった。なおE−64を筋肉内注射した場合の血中濃度は皮下往時に近5mg／kg）

N＝3

似していた。
佗）尿，糞及び胆汁中への排泄ラットに3H−E−64，3H−E−64−a及び3H−E−
64−Cを投与したときの尿，糞中への排泄を図2に，胆汁中への排泄を図3に示す。E−64は皮下注後以brまでに尿中に投与放射能の74．5％，糞中に3．5％，5日後までにそれぞれ77．9％，5．5％が回収され，主に尿中へ，一部が糞中へ排泄された。また経口投与時は別hr後までに尿中へ6．0％，糞中人55．9％，5日後までにそれぞれ10．1％，79．3％が回収され，主に糞中へ，一部が尿中へ排泄された。E−64−a はE−64に頬似した排泄バターンを示した。これ
149

Ⅴ 吸収，分布，代乱 排泄
4

4

Serum

2

lu＼︺亡む一夕エnbむ址iWhole blood

1／2

3

24

hr

4
2

餌＼盲ヱ空⁝nbむ餌もMuscle3

EZZZ］E−64

24

1／2□E−64−a3

24hr

匿ヨE−64−C

図5 ラットに】H−E−64，】H−E−64−a及び｝H−E−64−Cを経口投与後の放射能の組織内分布（投与量：5mg／kg）

N＝3

23．1

□

KidenyHeart

Spleen4u＼盲ヱ空ちbむ餌も

6
2

1／2

3

24

1／2

3

24

1／2

3

24

1／2

虹＼一uヱdヱコbU址ヒ

24

1／2

1／2

3

24

3 24
hr

l／2

3

24

3

24

Brain

3

24

1／2

3

24

1／2

3

24

hr

図6 ラッ＝こⅥ一E−64を皮下または経口投与後の放射能の組織内分布（投与量；5mg／kg）
N＝3
150

1／2

p・0．

S．C．

3

24

Adrenal

Lung

1／2

3

1／2

hr

19．E−64及びその額縁体の生体内動態に関する研究
表l】H−E−64，JH−E−64−a及び】H−E−64−Cを皮下または経口投与したラットの筋肉内濃度（投与量：5mg／kg）
Time Concentration（FEge11uivalent／g）
（br）
2
／
1
3
4
2
2
／
1
3
4
2

E−64

E−64−a0．342土0．004

0．829土0．121

0．320±0．109

0．037土0．002

0．204土0．018

0．102土0．049

0．051土0．004

0．202±0．021

0．083土0．020

0．024土0．005
0．065士0．010

0．191土0．012
0．200土0．006

0．111土0．058
0．115土0．048

0．065土0．021

0．132土0．015

0．086士0．004
N＝3，Mean士S．E．

に対し，E−64−Cは皮下往時の糞中排泄が5日後までに42．0％に達し，糞中排泄の割合が高かった。
一方，胆汁中への排泄は皮下注，経口投与時
とも30hr後までに，E−64では約4％，E−64−aは10％強，E−64−Cは約40％が回収された。
E−64−Cは胆汁中への排泄率が最も高く，これに起因して糞中への排泄率も高まったものと考えられる。
￠）組織への分布
3H標識E−64，E−64−a及びE−64−C5mg／kgをラットに皮下注及び経口投与後1／2，3，24brの全血，血清，肝及び筋肉への放射能分布を図4，図5に示す。皮下注後1／2hrの全血中濃度
はE−64−Cに比べてE−64とE−64−aが高く，3hrでは減衰が著しかった。血清の場合も同様な傾向を示した。肝への分布は胆汁中排泄の割合の高いE−64−Cが皮下注，経口投与時とも高い値を示した。疾患時の標的部位である筋肉への移行性は3者とも特異的な分布は認められなかったが，皮下注1／2brを除いてE−64は約0．05／唱／g，E−64−aは約0．2，E−64−Cは約0．1を示し，ある程度の移行性と長時間ほぼ一定濃度が保持される分布が認められた（表1）。
3H−E−64投与時のその他の組織への分布を
図6に示す。皮下往時の腎に高濃度移行がみられたほかは，いずれも極めて低濃度であった。
脳へはほとんど分布せず，また腎，心，肺で皮下往時いずれも速やかに減衰した。
（4）血清，筋肉，尿及び胆汁中代謝物

ラットに3H−E−64を皮下注後1／2llrの血
清，筋肉及び別br尿について薄層クロマトス
キャンニングした結果を図7に示す。血清及び筋肉では原品の3H−E−64に一致する単一ピー
クを待，ほとんどが未変化体のまま存在することが解った。また尿中へも主として未変化体のまま排泄されるが，他の代謝物ピークも認められた。
一万，3H−E−64−Cについても胆汁を追加して同様な処理を行った（図8）。血清及び筋肉ではほとんどが未変化体として存在し，尿中へも大部分が未変化体のまま排泄された。また酢酸
エチルによる抽出効率は血清89％，筋肉98％，
尿83％と高率であったのに対し，胆汁では34％に過ぎず，抽出残液中にグルクロン酸抱合体とアミノ酸抱合体がそれぞれ7，30％存在するものと推定されたが（チャート2），非抱合体画
分中の放射能はほとんどが末変化体であった。
考察

3H標識E−64，E−64−a及びE−64−Cをラットに皮下注したときの血中濃度はいずれも速やかに減衰した。投与後短時間ではE−64−Cが他の2着より低かった。しかし211r以降では3
着間に大差はないが，逆にE−64−Cがわずかに高い傾向がみられた。これは物性上E−64とE−64−aは水溶性であるため皮下部位から速かに拡散，吸収され，そのため初期の血中濃度が著明に上昇し，その後の消失が速かったものと考えられる。経口投与時は3老ほは同レベルで151

Ⅴ 吸収，分布，代謝．排泄

1．0
Rf

0．5

0

1．0

0

0．5

Solvent（b）

1．0

0．5
（b）

（a）

図7 ラットに】H−E−64を皮下投与後の血清，筋肉及び尿中代謝物のラジオ蒋層クロマトグラム

1．0

0．5

0

1．0

0．5

0

Rf
（）：SoIvent

図8 ラットにIH−E−64−Cを皮下投与後の血清，筋肉，尿及び胆汁中代謝物のラジオ薄層クロマトグラム

152

019・E−64及びその類縁体の生体内動態に関する研究あり，AUCも近似していたことから，生物学的利用率は同等と推定される。
一方，経口投与時の尿中排泄量は5日後までにE−64は投与放射能の10．1％，E−64−aは17．3％，E−64−Cは11．7％であった。この値に胆汁中排泄量を加算して消化管からの吸収率と仮定すると，E−64は13．7％，E−64−aは27．8％，E−64−Cは50．4％となり，消化管吸収率は
E−64−Cが最も高く，次いでE−64−a，E−64の順であると解せられる。E−64−Cは脂溶性を有するため，消化管粘膜でのリビド親和性が高
く，他の2者に比べて吸収率が高いものと考えられる。
組織への分布は別に行ったラットにおける全身オートラジオグラムの結果，3着とも皮下往時は投与部位，肝，腎，膀胱及び消化管内容にのみ明瞭な分布を認め，経口投与時はE−64−C投与の肝にわずかに移行がみられたほか，消化管内容にのみ黒化像が得られた。いずれの場合も別br後は消化管内容にのみ放射能が検出された0定量実験の結果を合わせて，3者とも肝，腎を除き，高濃度の移行は認められず，いずれの組織からも速やかに減衰し，全身からの消失及び尿，糞中への排泄が速やかだったことから，特定の組織への親和性あるいは蓄積性はないものと推定される。なおE−64の定量実験及びオートラジオグラムの結果，3着とも脳へはほとんど移行せず，血液・脳関門を通過しにくい物質と推定される。一方，作用部位である
筋肉へはある程度移行し，低レベルではあるがであり，筋肉への移行性はE−64−aが最も高く，E−64−Cがそれに次いでいた。しかしながらE−64−Cは消化管吸収率，ラットにおける亜悪性毒性が低い点で他の2者に優り7），CANP
阻害活性もE−64と同等でE−64−aの約2倍であり，さらに製造が容易な利点も有するため，3着の中では医薬品開発上E−64−Cがより勝れていると考えられる。
結論

E−64とその類縁化合物E−64−a，E−64−Cの3検体につき，3H標識体を用いてラットにおける生体内動態の比較試験を行った。経口投与
時の生物学的利用率は3着ほぼ同等であり，消化管からの吸収率はE−64−Cが最も高く，次いでE−64−a，E−64の順であった。3着とも肝，腎を除いて高濃度分布を示す組織はなく，体外へ速やかに排泄されるが，作用部位である筋肉へある程度分布し，E−64とE−64−Cは末変化
体のまま移行していることが確認された。生体
内動態による評価ではE−64−Cが他の2検体に優ると考えられた。
文1）Hanada，Kり献Tamai，M．，Yamagisbi，Mリ

Ohmura，S．，Sawada，J．and Tanaka，Ⅰ．：

IsolationandcharacterizationofE−64，aneWthiol proteaseinhibitor，Agric．Biol．Chem．，
42，523，1978．

2）今堀和友：細胞内蛋白質分解酵素の新しい役乱長時間はぼ一定濃度が保持される特徴ある分布が認められ，薬効発現の可能性を期待し得るものと考えられる。

3）Sugita，H．，Ichillra，S．，Suzuki，K．andIma・

また生体内の代謝をE−64とE−64−CについOnChichencalcium−aCtivatedneutralproteaseて調べた結果，両者とも化学構造上比較的安定
で串り，皮下注1／2hr後の血清，筋肉中ではいずれもほとんどが末変化体として存在していた。従ってこれらは作用部位である筋肉へ薬理活性を保持したまま到達することが確認された。
今回生体内動態試験を行った3検体を比較す
ると，経口投与時の生物学的利用率ははは同等

第20回医学会総会会誌，トp．60，柱トL−3，1979．
hori，K．：Inhibition of epoxide derivatives（CANP）in vitro andin vivo，J．Biochem．，87，
339，1980．

4）Hanada，K・，Tamai，M．，Ohmura，S．，Sawada，J．，Seki，T．and Tanaka，Ⅰ．：Structure andSynthesis of E−64，a neW thiol proteaseinhibitor，AgriC．Biol．Chemり42，529，1978．

5）沢田二郎：E−64及びその類縁体の製造に関する研究，本誌，1980．
6）Wilzbach．K．E．：Tritium・latelling by ex−
153Ⅴ 吸収，分布，代謝，排泄
posureoforganiccompouzldstotritiumgas・
J．Am．Chem．Soc．，79，1013，1957．

1封

7）大関正弘：E−64及びその類縁体の急性及び亜急性毒性に関する研究，本誌，1980．

20．E−64のラット肝薬物代謝酵素に対する影響

北

川

晴

雄＊

研究協力者 佐 藤 哲 男＊北 田 光 一＊＊

はじめにグ管に入れ窒素気流中に−gOOCで保存した。
In vitro実験では，未処理ラットから上記のE−64はチオールプロテアーゼの特異的阻害剤として近年注目されている物質であり，臨床面における有用性としてほ筋ジストロフィー症の治療薬として目下基礎的研究が広範に進められている。本分担研究では主としてE−64の代謝ならびに体内動態を知る目的で，本年度は肝薬物代謝酵素に対する影響について，invivo
ならびにinvitroの系を用いて検討した。
材料及び方法
体重180〜200gのJCL−SD雄性ラットを使用し，飼育期間中は230Cの恒温室にて市販のラット，マウス用固型飼料（日本クレアK．X．，
CE−2）により飼育した。飲料水としてほ水道
水を自由に摂取させた。動物はすべての場合実験に供する20時間前から絶食した。Invivo実験の場合，E−64（500mg／kg）は生理食塩水に溶解し，1日1回5日間背部皮下に投与した。
なお，この際対照群には生理食塩水を0．5m7／
100g体重の割合で同様に投与した。
動物は断頭潟血後肝をとり出し，肝重量を測定した後1・15％KClにて涯流し，肝重量の3倍容の1．15％KClを加えてホモジナイズした。得られた25％ホモジネートを常法に従い超遠心分離法によりミクロゾーム（Ms）画分を分離し，一定量の1．15％KClに懸濁しツソベル＊千葉大学薬学部薬効・安全性学講座薬物学研究室＊＊千葉大学薬学部医療薬学講座薬剤部

方法により調製した肝Msを用いた。
N一脱メチル化活性の測定は基質としてアミノピリン，エチルモルヒネ及びベンツフェタミ
ンを用い，表1のインキュベーション組成液を用いて10分間インキュベーション後，生成する
ホルムアルデヒドをNash法l）にて測定した。
又，アニリン水酸化活性は生成するパラヒドロ
キシアニリンをImaiらの方法2）で測定した。チ
表1薬物代謝酵素活性用インキュベー
ション組成液Microsomes（5mg／mJ）

0．2mJ

0・2MNa，K−phosphate（pH7．4）
0．5mM EDTA

O．4mJ

Substrate（10mM aniline or aminopyrine）

O．2mJ
O．l mJ

NADPH−generating system（3．3mM NADP，80mM glucose
6−phosphate，l unit glucose6−
phosphatedehydrogenase，60mM

0．1mJ

MgC12）

1．OmJ
トクロムP−450，チトクロムbS及びNADPH−
チトクロムCレダククーゼ活性は各々OmuraとSato3，及びPhillipsとLangdonの方法4）に準じて行った。NADH一フェリシアナイドレ
ダククーゼ活性はMiharaとSatoの方法5）

に従って行った。なおMs蛋白量はGornallの方法6）により定量した。

155

Ⅴ 吸収，分布，代謝，排泄
表2InvitroにおけるE−64のラット肝ミクPゾーム薬物代謝酵素活性に及ぼす影響
Substrate

Concentration（mM）＊

Aminopyrine＊

Benzphetamine＊

Ethylmorphine＊

Aniline＊＊None

95．33（100）120・66（100）231．67（100）15．32（100）O．05

96．04（101）117・65（98）230．49（99）15．87（104）0．10

94．12（99）

120・66（100）223．22（96）15．87（104）0．50

90．49（95）

118・25（98）230．47（99）16．00（104）1．00

90．49（95）

125・49（104）232．88（101）15．26（99）

HCHO formed nmoles／mg protein／15min・＊i nmoles／mgprotein／15min．

Figuresin parenthesesrepresentpercentofcontrol・

表3InvivoにおけるE−64のラット肝ミクロゾーム薬物代謝酵素活性に及ぼす影響

EnzymeaCtivity（n＝10）（n＝10）P

Aminopyrine
N・demethylase（nmoles／mg／15min）bmoles／gliver／15min）

107．67土7．50

92．41士3．60

n．S．

2．20±0．22

2．11士0．21

n．S．

Anilinebydroxylase（nmoles／mg／15min）（nmoles／gliver／15min）

22．49土1．23

21．79士1．04

460．07士42．05

510．20士66．13

Rats were treatedwith E−64at a dose of50mg／kg s．C．for5days・
表4InvivoにおけるE−64のラット肝ミクPゾーム電子伝達系に及ぼす影響
ControI
Component（n＝10）

Treated（n＝10）

NADPH−CytOChrome creductase（Units／mg protein）（Units／gliver）

0．130士0．010
2．68土0．27

0．130土0．010
2．99土0．38

2．40土0．1348．8±4．5

1．84土0．11NAI）lJ−ferricyanide
reductase（Units／mg protein）（Units／gliver）

43．2士6．4

Cytochrome PT450

0．65土0．06

0．63土0．03

13．32土1．50

14．16±1．52（nmoles／mg protein）

0．40土0．02

0．33士0．02（nmoles／gliver）

7．98土0．68

7．29±0．75（nmoles／mg protein）（nmoles／gliver）
Cytocbrome b5

Rats were treated with E−64at a dose of50mg／kg s．C．for5days．

156

P

20．E−64のラット肝薬物代謝酵素に対する影響

結 果（1）hl Yitro試験
水に溶解した4濃度のE−64溶液をインキュ
ベーション混液に加え，一定時間インキュべ−ト後の薬物代謝酵素活性を4種の基質を用いて測定した。その結果，表2に示す様に，0．05
mMからlmMの問では無添加群と比較して殆んど差は認められず，E−64の濃度と代謝酵
素活性との間には有意な関連性はみられなかった。
（2）In YiY0試験

NADH−7ェリシアナイドレダククーゼ及びチ
トクロムb5において若干の低下が認められた。
若しE−64が薬物代謝酵素の誘導剤となり得る
ならば，連続投与実験において薬物代謝酵素活性の有意な増加がみられる筈であり，又，阻害剤として作用するならば，in vitroで顕著な阻害が認められねばならない。従って今回の実験結果からラット肝薬物代謝酵素系に対しては特に大きな影響をもたないものと結論づけることが出来る。今後はラット以外の種を用いて検討し，薬物代謝酵素に対する種属差の有無を究明する予定である。

E−64を5日間ラットに連続投与し肝薬物代
謝酵素活性の変動の有無を検討した。その結果，表3から明らかな様にアミノピリン脱メチ
ル化活性はE−64処理群で若干の低下が認められたが有意差はなく，アニリン水酸化活性も対照群との間で差がみられなかった。さらに肝Ms電子伝達系の各因子について検討した所，
NADH−フェリシアナイドレダククーゼ及びチ

参考文献
1）Nash，T．：The colorimetric estimation offormaldehydebymeansoftheHantzsch reac−tion，Biochem．J．，55，416−421，1953．
2）Imai，Y．，Ito，A．＆Sato，R．：Evidence forbiochemiCally diLferent types of vesiclesin
the hepaticmicrosomalfraction，J．Biochem，
60，417−428，1966．

トクロムbSにおいて有意差が認められたが，

3）Omura，T．＆Sato，R．：Thecarbonmonoxide

NADH−チトクロムCレダククーゼ活性及びチ

bindingpigmentoflivermicrosomes，J．Biol．

トクロームP−450量については対照群とはば同程度であった（表4）。

4）Phillips，A．H．＆I．angdon，R．G．：Hepatic

Chem．，239，2370−2378，1964．

triphosphopyridine nucleotide−CytOChrome c

考察E−64のラット肝Ms薬物代謝酵素活性及びMs電子伝達系に対する影響をinvitroならびにinvivoで検討した。その結果，in vitroにおいては1mMまでE−64の添加量を増加
しても代謝酵素活性には殆んど影響がみられなかった。又，in vivoにおいてはE−64，50
mg／kgをラットに5日間連続皮下投与した場
合でも薬物代謝酵素活性は処理群と対象群間で有意差が認めら五ず，電子伝達系因子である

reductase：Isolation，Characterization，and
kinetic studies，J．Biol．Chem．，237，2652−2660，
1962．

5）Mihara．K．＆Sato，R．：Partialpuri丘cation
OfNADH・CytOChromeb5reductasefromrabbit
microsomeswith detergents andits proper・
ties，J．Biochem．，71，725−735，1972．
6）Gornall．A．G．，Badawill，C．S．＆David，M．
M・：Determinationofserumproteinsbymeans
Ofthebiuretreaction，J．Biol．Chem．，177，751−759，1949．

157

21．E−64及びその類縁体の生物薬剤学的研究

＊

けnH
・日八

文什

＊

己

玄小

＊

己

由和

＊

嶋 田

＊

親司晴

＊

E−64及びその類縁体のヒト進行性筋ジスト

中花

田

継清正

研究目的

二

沢

田熊井

書小玉

研究協力者

は水に，E−64−b及びE−64−Cはそれぞれの溶
離液に溶かして，1〜50〝g／mJの溶液を調製し，検量線作成のための標準溶液とした。

ロフィー症に対する臨床的評価に先だって，そiv）活性炭カラムの実験動物レベルにおける有用性の評価が極め

トグラフ用活性炭をアセトン，次いで水で各々て重要である。更に，その薬効評価に際しては数回洗浄し，クロマト用ガラス管に充塀した

薬物の標的組織内濃度が重要な意味を有する。

（0．7×3cm）。

本研究はE−64及びその額縁体の動物レベル
における吸収性及び組織への移行性を検討し，薬剤学的評価の尺度とすべく，更には，疾患モデル動物実験における薬剤の投与基準を設定することを目的に，各薬物の定量法を確立し，次いでそれに基づいて実験動物におけるbioava−
ilabilityを検討することにある。
方 法（1）E−64及びその頸得体の血中濃度定量法

1）材料i）試験化合物
E−64及びその額縁体a，b，Cはいずれも沢田らの合成した標晶を用いた。
ii）試薬・溶媒
酢酸エチル，アセトンは特級品を蒸留し，メタノール，アセトニトリル
は和光純薬（株）製クロマトグラフ用を用い，その他の試薬，溶媒は，すべて特級品を用いた。
iii）標準溶液
E−64及びその類縁体a，b，Cをそれぞれ精密に量り，E−64及びE−64−a＊大正製薬株式会社総合研究所

和光純薬（株）製クロマ

Ⅴ）シリカゲルカラム
和光純薬師製ワコ
ーゲルC−200を酢酸エチルに懸濁し，クロマ
ト用ガラス管に充填した。
2）動物及び投与法i）動物
ラット Wistar系ラット，雄，8遇令，

体重180〜200g。
日本白色ウサギ，雄，
体重約2．5kg。
鶏
白色レグホン，雄，1ケ月令，
体重約250g。
ii）剤形 コーンオイル懸濁液及び生理食塩水溶液（ただし，E−64−b及びE−64−Cは濃重曹水で中和後使用）の両剤形を用いた。
iii）投与法及び採血法 背部皮下投与及び経口投与にて比較した。いずれの動物においても，体重200g当りオイル懸濁液の場合lmJ，
家兎

生理食塩水溶液の場合0．5mgになる様，検体を調製し，投与した。尚，採血は鶏の場合，翼下静脈より，ラットの場合は鼠瑛部動脈より，
家兎の場合，耳静脈より，いずれもmJ当り10単位のヘパリンを添加した試験管に採取し，
159

Ⅴ 吸収，分布，代乱 排泄
500r．p．m．，5分間，次いで1500r．p．m．，15
分間遠心分離後の上澄を血祭溶液として供試した。
3）高速液体クロマトグラフ条件i）枚種

日立635型高速液体クロマトグ

ラフii）分離カラム
内径4．0mm，長さ150mmの日立製ステンレスカラムに，ナーゲル社製充填剤ヌクレオシルC18（平均粒子径5／′）を，粘度法により充填した。

ii）E−64−a
供試動物の血祭0．5mgに，無水エタノール
lmJを加えてよく振り混ぜ，室温で5分間放置した後，3分間遠心分離（3000r．p．m．）する。この上澄液lmJに，2，4−ジニトロフルオ
ロベンゼンの4％無水エタノール溶液0．1mg
及び炭酸水素ナトリウム飽和溶液0．5mgを加えて，500の水浴中で30分間反応する。冷後，6N塩酸0．5mg及び水10mgを加えておだやかに振り混ぜた後，酢酸エチル25mgを加えiii）分離カラム温度
550iv）検出波長E−64，E−64−b，E−64−Cはてよく振り混ぜ，3分間遠心分離（3000r．p．m．）

205nm，E−64−aは350nmに設定した。
Ⅴ）溶離液
使用する溶媒，溶液はすべて縮乾国する。残留物を少量の酢酸エチルに溶かメソブランフィルター（0．45JJ）を用いてろ過し込み，次に酢酸エチル・酢酸混液（997：3）

し，下記の容量比率で混合し，減圧下で脱気し40mlを用いてシリカゲルカラムを洗った後，た。

酢酸エチル・メタノール・酢酸混液（89：10：1）

E−64

メタノール・水（10：90）

E−64−a

リン酸・アセトニトリル・水（0．04：37：63）
E−64−bテトラーn−プチルアンモニウムヒ

し，酢酸エチル層20mgを分取し，減圧下に濃し，あらかじめ調製したシリカゲルカラムに流25mlを用いてE−64−a（DNP一誘導体）を溶出し，溶出液は減圧下で濃縮乾国する。残留物に溶離液0・5mgを加えて溶かし，この液50JJJ
を高速液体クロマトグラフの分離カラムに注入

ドロキシドの10％水溶液10mlにリン酸を加し，E−64−a（DNP一誘導体）のピーク高さを測えてpH5．0に調整し，水を加えて550mgと定する。

した液・メタノール（55：45）
E−64−C

リン酸・メタノール・水（0．5：42．5：57）4）定量法i）E−64

別にE−64−aの標準溶液を用いて全操作を同様に行って検量線を作成し，血菜中のE−64−aの濃度を求める。
iii）E−64−b

供試動物の血菜0．5mgに，メタノール1mg

供試動物の血祭0．5mgに，5％リン酸溶液に硫酸ナトリウムを飽和させた液0．5mgを加を加えてよく振り混ぜ，室温で5分間放置した

えた後，酢酸エチル7mJを加えてよく振り混後，3分間遠心分離（3000r．p．m．）する。このぜ，3分間遠心分離（三000r．p．m．）する。この上澄液1mgに，水1mgを加えて振り混ぜ，

酢酸エチル層5mgを分取し，減圧下に濃縮乾あらかじめ調製した活性炭カラムに流し込む。

固する。残留物を溶離液0．5mgに溶かし，こ

次に水・メタノール混液（2：1）15mgを用いの液100／JJを高速液体クロマトグラフの分離カて活性炭カラムを洗った後，水・アセトン混液

ラムに注入し，E−64−bのピーク高さを測定する。

（1：1）20m仁を用いてE−64を溶出する。溶出液は減圧下で濃縮乾固し（操作は500以下），
残留物を水0・5mgに溶かし，この液100J∠1を
高速液体クロマトグラフの分離カラムに注入し，E−64のピーク高さを測定する。別にE−64
標準溶液を用いて作成した検量緑より，血柴中のE−64の濃度を求める。
160

別に標準溶液を用いて作成した検量線より血菜中のE−64−bの濃度を求める。
iv）E−64−C

供試動物の血柴0．5mJに，5％リン酸溶液
0．5mgを加えた後，酢酸エチル7mgを加えてよく振り混ぜ，3分間遠心分離（3000r．p．m．）

21．E−64及びその類縁体の生物薬剤学的研究

1020Concentration（FLg／ml）

E−64−・−−E−64−b−−−E−64−a−‥−−E−64−C

図1検量線
表1E−64及びその塀縁体の家兎血菜からの回収率
Reeovery（％）

Compounds Added（FLg／ml）

Av・（n＝3）

Range

E−64−aE−64−bE−64＿C

1

99．7

10

95．8

161

Ⅴ 吸収，分布，代謝，排泄︵．白．S＋u宕EJEもエdESd一d u−uOコ空言Su︒UlTime afteriniection（hr）

図2 E−64のラットにおける皮下投与後の血祭中濃度の変動︵一∈＼加エ言Sd一d u⁝uOコ巴一uBu︒UTime after administration（hr）
図3

162

E−64及びその炉緑体のラットにおける皮下及び経口投与後の血祭中濃度の変動（n＝2）

21．E−64及びその類縁体の生物薬剤学的研究︵t∈もエ岩Sd一d u uOコ已盲むUu︒U

E−64−CE−64−b

1

3

6

1

3

6

ト音．−

Time afterinjection（hr）
〇一一一一
＝

＝

Cornoilemulsion（100mgル9，10ml）
Saline solution（50mg／k9，5ml）

図4 E−64及びその額縁体の家兎における皮下投与後の血祭中濃度の変動する。この酢酸エチル層5mgを分取し，液圧下に濃縮乾固する。残留物を溶離液0．5mgに溶かし，この液100βを高速液体クロマトグ
ラフの分離カラムに注入し，E−64−Cのピーク
高さを測定する。
別に標準溶液を用いて作成した検量緑より血祭中のE−64−Cの濃度を求める。
結果及び考察（1）E−64及びその類縁体a，b，Cの血中濃度定量法
方法の項で述べた定量法に従って作成した検量線の1例を図1に示し，家兎血菜に添加した時の回収率を表1に示した。検量線はいずれも原点を通る良好な直線となり，回収率はすべて95％以上の良好な値を得た。検出限界は，E−64
0．2FLg／ml，ET64−aO．6FLg／ml，E−64−bO．2FLg／

mJ，E−64−CO．1〝g／mJであった。
従って本法は，E−64及びその類縁体の定量法として十分信頼性があると判断した。
（2）E−64及びその類縁体の動物における血中濃度
ラットにおけるE−64の生理食塩水溶液の皮下投与量とその血莱中濃度の相関を図2に示す。明らかな投与量依存性が認められた。一方，剤形の比較及びE−64及びその類縁体a，b，C
がいずれも水溶性が高い点を考慮し，油性形にして徐放化することを合わせて検討する目的でコーンオイルエマルジョン化し，ラットに皮下及び経口投与した。この結果を図3に示す。
皮下投与では，E−64は生理食塩水溶液の方がコーンオイルエマルジョンにくらべて，吸収のピークは約2倍高いが排泄が早く，油性化による徐放化の効果も僅かに認められる。また，
163

Ⅴ 吸収，分布，代謝，排泄

1）E−64243）E−64−b2）E−64−a

6

810

2

4

6

810

2

4

6

4）E−64−C

810

2

4

6

810

Retention time（min）

図5 E一朗及びその類縁体の家兎皮下投与後1時間血菜の高速液体クロマトグラム（生理食塩水溶液）（矢印はそれぞれの化合物のピークを示す．）

経口投与では皮下投与にくらべて，いずれもその血中濃度は1／10〜l／10と低いが，明らかな吸収が認められ，今後，剤形などの製剤学的検討によりこれらの薬物を経口薬として使用しうる可能性も高いと考えられる。
次いで，同一個体による血中濃度の推移を観察する目的で，家兎皮下投与後の経時変化を調べた。この結果を図4に，また，この際のクロマトグラムの例を図5に示す。
家兎の場合，ラットに比較していずれの薬物でもその血中濃度は2乃至3倍高く，これは種差によるものと考えられる。家兎においても，ラットの場合と同様に，生理食塩水溶液の方がよる徐放化の効果も認められた。
更に，ジストロフィーチキンでの薬効評価に際して各薬物の投与基準を設定する目的で白色
レグホンにおける皮下投与後の血中濃度を測定した。この結果を図6に示す。
各薬物の血中レベルは，投与量を換算すると，家兎にくらべてE−64−aほほは同レべ′レ，
E−64−bは的域，E−64及びET64−Cは約坑のレベルであった。また哺乳動物にくらべて比較的その排泄速度が早い傾向がうかがわれ，特にその幌向はE−64−Cにおいて顕著である。
（3）EJ4のD，L異性体の分離定量
天然のE−64は，エポキシコハク酸部分はL

オイルエマルジョンよりそのピークは高く（E−体であるが，7マール酸を原料とする合成品で64−aではほぼ同等），また僅かながら油性化には，DL混合物が得られる。両者は互いにジア

164

21．E−64及びその類縁体の生物薬剤学的研究︵tEもヱ昌Sdld已州uOコ空言BuOU

クロマトグラフ法による定量法を確立した。
2．この方法により実験動物血中濃度測定法を検討した結果，E−64及びa，b，Cの各検出限界0．2J塔，0．6′唱，0．2摺，0．1JJgの各範囲内で測定しうることがわかった。
3．ラット，家兎，鶏を用い，E−64及びその類縁体a，b，Cの生理食塩水溶液，及びコー
ンオイルエマルジョンについて皮下，及び経口投与後の血中濃度を調べ，各薬剤の吸収性を比較した。皮下投与ではいずれも高い血中濃度が得られたが，その順序はE一64≒E−64−a＞E

1

2

3

Time afterinjection（hr）
C

〇E−64

〉く

〉くE−64−8ロ△

コE−64−b△E−64−C

図6 E−64及びその類縁体の鶏（白色レクホン）における皮下投与（生理食塩水溶液，100mg／kg）
後の血祭中濃度の変動
ステレオアイソマーであるため，高速液体クロマトグラフィーでの分離が可能と考え，その分離条件を検討した。その結果，E一朗用の溶離液に少量のリン酸を加えることにより，ほぼ良好に分離されることがわかった。この時のクロ
マトグラムの1例を図7に示した。そこで生体内でのDL体の挙動の差を知る目的で，合成品をラットに皮下授与して血祭中のDL体の分離定量を行ったところ，表2に示すとおり，血祭中にも投与に用いた原料と同じ比率でDL体が現われることがわかった。なお，投与に用いた
原料中のL体含量は天然のE−64を標準として定量したところ，58．9％であった。従って，生02

体内でのDL体の挙動には差はないものと考え
られる。
図7

結 論

6

8

10

D，LE−64の高速液体クロマトグラム

高速液体クロマトグラフ条件
カラム

1．E−64及びその頸縁体a，b，Cの高速液体

4

Retention time（min）

ヌクレオシルC18（5J）

溶離液リン酸：メタノール：水（0．5：10：90）
165

Ⅴ 吸収，分布，代乱 排泄
表2 D一及びレE一朗の皮下投与後のラット血菜中の分離定量（オイルエマルジョソ，50mg／kg）
Found（〝g／mJ）

Time after No．
injection（hr）

ofratsTotal Ratio（L：D）

2

58．3：41．7

3

54．7：45．3

9
1

一

7

0
1
5

0

3
1

5

5

7

5

9

2

2

4

2

8

1
1

4

0

5

3

2

6

2

4

1

60．7：39．3

57．7：42．3

DL ratio of E−64injectedis57．9：42・1−64−b＞E−64−Cであった。ラットの経口投与

れるが，油性形のオイルエマルジョンにして用では皮下投与にくらべて1／1。〜1ん。と低いがいずいることにより，血中レベルの保持時間を延長

れもその吸収は認められた。又，生理食塩水溶しうる。臥血中レベルは動物種差により若干液ではいずれも3乃至6時間で速やかに排泄さ変動がみられた0166

微生物の二次代謝産物に由来する難病治療薬（E−64）の開発研究班
班員および関係者名簿
氏

名

】

施

設

名

l

住

所

主任研究者

今掘和友（班長） 東京大学医学部第二生化学〒113東京都文京区本郷7−3−1

分担研究者

江橋節郎
杉田秀夫

東京大学医学部第一薬理学〒113東京都文京区本郷7−3−1

東京大学医学部附属脳研究施設 神経内科

〒113東京都文京区本郷7−3−1

勝沼信彦

徳島大学医学部附属〒770徳島県徳島市蔵本町3−18−15

酵素研究施設 酵素化学部門

西塚春美
神戸大学医学部第二生化学〒650兵庫県神戸市生田区楠町7−12−1
福原武彦（幹事） 東京慈恵会医科大学第二薬理学 〒105東京都港区西新橋3−25−8
小沢鉄二郎
国立武蔵療養所神経センタ一〒187東京都小平市小川東町2620
枚能研究部

野村達次
北川晴雄（監事）
大関正弘（幹事）沢田二郎

実験動物中央研究所〒213神奈川県川崎市高津区野川1430

千葉大学薬学部薬物学〒280千葉県千葉市弥生町1−33

大正製薬株式会社総合研究所〒330埼玉県大官市吉野町1−403

大正製薬株式会社総合研究所〒330埼玉県大官市吉野町1−403

国立武蔵療養所神経センター〒187東京都小平市小川東町2620

班友

豊吉栄二郎

167