令和2年7月21日

タイトジャンクション形成を誘導する新規生体由来ペプチドの発見

京都大学 ウイルス・再生医科学研究所
生命システム研究部門
助教 小田 裕香子
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発明の背景上皮バリアであるタイトジャンクション(Tight junction: TJ)
病原体

上皮＝バリアタイトジャンクション（TJ）
Claudin2

発明の背景claudin欠損マウスと炎症
claudin-1 KO

脱水（皮膚）、致死

claudin-1 KD

アトピー性皮膚炎

claudin-3 KO

肝炎、脳炎

claudin-5 KO

BBB（脳血液関門バリア）破綻、致死

claudin-7 KO

炎症性腸炎

claudin-18 KO

化生性胃炎、肺炎

TJ破綻は炎症の原因・憎悪因子である
炎症時には速やかにTJを形成することが重要
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従来技術とその問題点
TJの形成促進剤
文献

概要

問題点

Host Defense (Antimicrobial) Peptide,
Human β-defensin-3, Improves theFunction of the Epithelial TightJunction Barrier in Human
Keratinocytes.
J. Invest. Dermatol. 2014, 134 (8),2163-2173

既知の抗菌ペプチドを高濃度・長活性が低い。
期間細胞に処理し、TJ形成がやや動物試験の結果が無い。
促進されることを報告しているが、 作用点が不明。
生理的ではない。

CaMKII Regulates the Strength of theEpithelial Barrier.
Sci. Rep. 2015, 18;5:13262

TJ形成を促進する低分子化合物を同定。CaMKIIという広範な阻害剤である。

細胞毒性・副作用が見込まれるが検討されていない。

特開2020-007255(日本メナード化粧品株式会社）

エビスグサ種子を含有することを特徴とする、腸管バリア機能向上剤。

作用機序不明。
食品としての腸管バリア機能の向上剤と、内服用の肌荒れ改善剤であり、用途は限定的。

実用的な化合物はまだ報告されていない
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発明の着想TJはどのようにして形成されるのか？
−形成を直接誘導する生体因子は存在するのか？
ヒト表皮癌細胞A431

・TJ構成因子（皮膚；claudin-1, -4,ZO-1, occludin）を発現

マウス組織を共培養

・TJは形成していない

A431

TJ因子；細胞側面に拡散して存在生体由来のTJ誘導因子は存在するか？

TJの形成
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発明の内容6

TJ形成を誘導する生体由来因子の存在 ①マウス上皮/中皮組織

共培養

A431 cell/HBSS

HBSS

成体マウス
腹膜

claudin-1

claudin-1/α-catenin
/DAPI

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TJ形成を誘導する生体由来因子の存在 ②
培養上清claudin-1/α-catenin

*HBSS

2

腹膜培養上清3

claudin-1

1

keratin50

腹膜培養上清claudin-1

腹膜培養上清
TJ形成率(相対値）

HBSS

A431cell

HBSS

腹膜8TJ形成を誘導する生体由来因子の存在 ③
マウス組織（腹膜等)

マウス組織がTJ形成誘導する液性因子を分泌している
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TJ形成誘導因子の同定 ①

腹膜→→→

HBSS→

煮沸10minQ sepharose(陰イオン交換カラム)
溶出 (pHグラジエント)→→

conA sepharoseclaudin-1

nanoLC/MS/MS

Protein X fragments

溶出→A431cell10

CH3CN (%)

TJ形成誘導因子の同定 ②
Protein X 由来peptide m35の同定（質量分析）

UV214

特許; タイトジャンクション形成誘導剤 小田裕香子、豊島文子、石濱泰4321e6e5e4e3e2e1

FT0HBSS

TJ形成率(相対比）

(min)

11

TJ形成率(相対値）

マウスProtein X 由来ペプチド(m35)はTJ形成を誘導する ①

12

マウスProtein X 由来ペプチド(m35)はTJ形成を誘導する ②

Paracellular Flux Assay (FITC-dextran 4kDa)
バリア×/透過性↑

バリア◯/透過性↓13TJ形成率(相対値）

ヒトProtein X 由来ペプチドによってもTJが誘導される ①14

ヒトProtein X 由来ペプチドによってもTJが誘導される ②
Paracellular Flux Assay (FITC-dextran 4kDa)
バリア×/透過性↑

バリア◯/透過性↓15炎症回復期においてm35はバリア形成に必要である
DSS誘発性潰瘍性腸疾患モデルマウス
ctrl
tap water
day0

day02%DSS
recover 1d 2d×
day10

ctrl+ 中和抗体 or preimmune×
day124%DSS

day0DSS
recover 2d+中和抗体 or preimmune

m35中和抗体 or preimmune×
day102%DSS

×
day12m35中和抗体 or preimmune

TJ形成率(相対値）

大腸の上清中のTJ形成活性

tap waterday10DSS

4%DSS

ctrl

m35中和抗体により炎症回復期における腸バリア機能の回復が遅れる
16m35はDSS誘導性腸炎モデルマウスの症状を緩和させる①
DSS誘発性潰瘍性腸疾患マウス
m35/vehicle 皮下注射
水道水or
4% DSS

0日

解剖

10日

水道水 + vehicle

水道水 + m35

DSS + vehicle

DSS + m35

DSS + m35mut1
17

m35はDSS誘導性腸炎モデルマウスの症状を緩和させる②18

m35はDSS誘導性腸炎モデルマウスの症状を緩和させる③
claudin-3の局在m35の局在

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m35はDSS誘導性腸炎モデルマウスの症状を緩和させる④4日目から注射開始（出血症状あり） 解剖
水道水or
4% DSS

体重変化率

0日

m35/vehicle 注射（毎日）

22日

生存率

20

m35は細胞膜に挿さり、細胞境界部に局在しているm35抗体の細胞質への導入liposome+ m35+ m35 mutants
+ IgG

HBSS

YYYY+ m35ZO-1

m35

HBSS

rabbit IgG (m35)

YYYY

m35抗体

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summary+ m35ペプチド

TJバリア破綻
TJバリア修復

炎症惹起

生体組織の適応・修復機構の時空間的解析による生命現象の理
解と医療技術シーズの開発（PRIME）「新規生理活性ペプチドによる上皮組織修復機構の解明」
基盤研究B「上皮バリア形成メカニズムの解明」

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新技術の特徴・従来技術との比較

・生体内において、タイトジャンクションを形成誘導・機能制御することは重要な課題であるにもかかわらず、実用的な物質は開発されていなかった。
・本ペプチドは実用化可能な初めてのタイトジャンクション形成誘導物質である・本ペプチドは生体由来因子であるため、副作用が少ないことが見込まれる
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想定される用途•タイトジャンクションのバリア破綻と炎症は密接に関連していることから、炎症に対して効果があることが期待される•皮膚バリアの水分保持の観点から、化粧品にも展開可能であると思われる•老化等による消化管バリア機能低下に対する機能性食品への展開も可能であると思われる

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実用化に向けた課題• 現在、培養細胞レベルでの実験、潰瘍性大腸炎モデルマウスを用いた動物実験まで検証済み。しかし、作用点の直接的ターゲットが未解明である。
• 実用化に向けて、個体レベルでの安全性を評価する必要がある。
• 物質を腸などへの標的部位への送達技術（ドラッグデリバリー技術）を有する企業を歓迎

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企業に求めること• 炎症性疾患（潰瘍性大腸炎など）に対する創薬の開発プラットフォームを持つ企業との共同研究を希望。
• 抗炎症薬を開発中の企業、炎症性疾患分野への展開を考えている企業には、本技術の導入が有効と思われる。
• 大学側での開発協力の優先順位は医薬品＞医薬部外品＞化粧品の順で。
• 共同研究（共同開発）は研究室のキャパシティなどの観点から1社ずつしか対応できない。
• 独立に開発できる企業であれば、「医薬部外品」「化粧品」分野の企業とも契約が可能。
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本技術に関する知的財産権• 発明の名称• 出願番号• 出願人• 発明者：タイトジャンクション形成誘導剤：特願2019-115248
PCT/JP2020/024154：国立大学法人京都大学：小田裕香子、豊島文子、石濱泰27

お問い合わせ先

国立大学法人京都大学内
株式会社ＴＬＯ京都
京大事業部門 技術移転チーム
ＴＥＬ ０７５－７５３－９１５０
ＦＡＸ ０７５－７５３－９１６９e-mail event@tlo-kyoto.co.jp

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