学 位 論 文 内 容 の要 旨

博士の専攻分野の名称

博士（医 学）氏 名

檀 崎 敬 子学 位 論 文 題 名
Effects of interleukin-17A on atherosclerosis formation and plaque characteristics(インターロイキン-17A が動脈硬化巣形成およびその性状に及ぼす影響の検討)【背景と目的】近年、食生活の欧米化や人口の高齢化に伴い、高血圧、高脂血症、糖尿病などの生活習慣病の患者数が増加している。生活習慣病が原因と考えられる脳梗塞や心筋梗塞などの動脈硬化性疾患による死亡率は年々増加しており、日本では癌に次ぐ死因となっている。従って、動脈硬化の発症機序を明らかにし、より効果的な治療法を開発することは重要な研究課題の一つである。
動脈硬化は主に血管壁への変性したコレステロールの蓄積により形成される。その病態には泡沫化マクロファージや活性化 T 細胞などの細胞浸潤や、それらにより産生されたサイトカインなどによる炎症の存在が深く関与していることが明らかにされてきている。まさに動脈硬化症は、慢性炎症性疾患の１つであると言える。
Interleukin-17A (IL-17A) は、主に Th17 細胞から産生される炎症性サイトカインである。多発性硬化症や関節リウマチなどの自己免疫疾患は、従来 Th1 細胞がその疾患の進展に重要であると考えられていたが、近年、 IL-17A 欠損マウスでコラーゲン誘導性関節リウマチ (CIA) や、実験的アレルギー性脳脊髄炎 (EAE) が抑制されることや、Interferon- (IFN- ) 欠損マウスで EAE や CIA の病態が悪化することなどから、Th17 細胞が多くの自己免疫疾患の発症に主要な役割を果たしていることがわかってきた。
動脈硬化の病態においても炎症が重要な働きを持つことと、冠動脈アテローム性動脈硬化患者の病変部に浸潤した T 細胞が、IL-17A と IFN- を共に産生することが報告されていることから、本研究では広範に用いられている動脈硬化自然発症モデルである apolipoprotein E 欠損 (ApoE KO) マウスと IL-17欠損マウスのダブルノックアウトマウス (ApoE/ IL-17A dKO) を作成し、動脈硬化の進展における IL-17Aの役割について検討を行った。
【材料と方法】IL-17A KO マウスを ApoE KO マウス (共に C57BL/6 バックグラウンド) と交配し、ApoE/IL-17A dKO マウスを作成した。動脈硬化を発症させるために、angiotensin II (AII) を持続投与することで血圧を上昇させ、全身性の炎症を誘導し、動脈硬化および動脈瘤を発症させる AII 持続投与モデルと、マウスに高脂肪食 (high fat diet, HFD) を給餌し、血中のコレステロール値を上昇させることで顕著なアテローム形成を示す動脈硬化を発症させる HFD モデルを用いた。AII 持続投与モデルでは 16～18 週齢、体重 27～33g の ApoE KO マウスの背部皮下に浸透圧ポンプを植え込み、AII (1.6 g/kg/min) を 4 週間持続投与した。HFD モデルでは、6～8 週齢の雄の ApoE/ IL-17A dKO マウスおよびコントロールであるApoE KO マウスに高脂肪食を 8 または 16 週間与えた。摘出した大動脈は、脂肪染色である Oil red O 染色を用いて動脈硬化病変部を染色した。HFD モデルにおいて、大動脈基部は Oil red O 染色およびマクロファージのマーカーである MOMA2 と血管平滑筋細胞のマーカーである -smooth muscle actin

( -SMA) の免疫組織化学染色により、病変部の性状を解析した。また、血清を採取し、血中コレステロール値を測定した。更に、脾臓から CD4+ T 細胞を magnetic-activated cell sorting (MACS) 法で分離し、phorbol 12-myristate 13-acetate/ ionomycin を添加した 10%FCS/ RPMI 培地で 72 時間培養した後、ELISA 法により培養上清中のサイトカイン濃度を測定した。さらに、6～8 週齢の雄の ApoE KO マウスに12 週間 HFD を給餌し、その間、週 2 回リコンビナント IL-17A を投与し (2 g/mouse) 、病変の形成にどのような影響が見られるか検討した。
【結果】AII 持続投与モデルにおいて、ApoE KO マウスと比較して ApoE/ IL-17A dKO マウスにおける腹部大動脈瘤の形成が亢進する傾向が見られた。HFD モデルでは、HFD を 8 または 16 週間与えた ApoE/IL-17A dKO マウスにおいて、大動脈病変部面積が ApoE KO マウスに比べていずれも有意に増加していた (8 週；16.1% vs. 6.8%, p<0.005, n=23,22 16 週；21.2% vs. 33.7%, p<0.001, n=24,34) 。また、高脂肪食を 8 週間与えた ApoE/ IL-17A dKO マウスにおいて、大動脈基部における病変部面積が ApoE KO マウスに比べて有意に増加し (14001.6 m2 vs. 8809.7 m2, p<0.05, n=14,7) 、さらに病変部面積に対するMOMA2 陽性の面積の割合は増加し、 -SMA の割合は減少していた。一方、HFD を与えたマウスの血中コレステロール値は各群間で差は認められなかった。また、HFD を給餌した ApoE KO マウスにおいて、CD4+ T 細胞培養上清中の IL-17A 濃度が普通食の ApoE KO マウスに比べ増加していた。更に、8 週間
HFD を与えた ApoE/ IL-17A dKO マウスにおいて、ApoE KO マウスと比較して脾臓 CD4+ T 細胞の培養
上清中の IFN- 濃度が増加し、IL-5 の濃度は低下していた。最後に、IL-17A を投与した ApoE KO および ApoE/ IL-17A dKO マウスにおいて、IL-17A 非投与群に比べて大動脈病変部面積の割合が減少していた。
【考察】HFD モデルにおいて IL-17A の欠損で動脈硬化の病変形成が促進し、病変部の性状はマクロファージが多く、平滑筋細胞が少ない脆弱なものになっていたことから、IL-17A は動脈硬化に対し保護的に作用すると考えられた。IL-17A の欠損による血中コレステロールへの影響がなかったことから、動脈硬化の増悪化は脂質代謝異常の促進によるものではないと考えられた。ApoE/ IL-17A dKO マウスの脾臓CD4+ T 細胞において、動脈硬化の進展、増悪化を促進させる IFN- (Th1 サイトカイン の産生が増加していたことから、IL-17A の欠損による動脈硬化の悪化には主に IFN- が関与しているものと考えられる。
また、ApoE/ IL-17A dKO マウスの脾臓 CD4+ T 細胞において、抗動脈硬化作用があると報告されている
Th2 サイトカインの IL-5 が減少したことも、動脈硬化を促進させた一因であると考えられる。更に、ApoE
KO および ApoE/ IL-17A dKO マウスに IL-17A を投与することにより病変部の形成が抑制されたことから、
IL-17A は活性化 T 細胞からの IFN- の産生を抑制する一方、IL-5 の産生を促進することで、動脈硬化の発症・進展に抑制的に作用すると考えられる。