P C R 法による羊毛とカシミヤの鑑別
福田ゆか * 1

橋村靖彦 * 2

坂川登 * 1

Identification of Wool and Cashmere fibers using PCR method
Yuka FUKUDA

Yasuhiko HASHIMURA

Noboru SAKAGAWA

Owari Textile Research Center,AITEC ＊ １ ,Planning and Coordination Division,AITEC ＊ ２
現在、実用化されている獣毛の鑑別方法としては、熟 練者の光学顕微鏡を用いた外観観察により行われて い る 。 そ こ で 、 本 研 究 で は 遺 伝 子 技 術 の 一 つ で あ る PCR 法 を 用 い 、 そ れ ぞ れ の DNA の 特 異 的 な 部 分 を 分析 す る こ と に よ り 、 羊 毛 と カ シ ミ ヤ を 鑑 別 す る 手 法 を 研 究 し た 。 そ の 結 果 、PCR 法 を 用 い て 羊 毛 と カ シ ミ
ヤ に そ れ ぞ れ 特 異 的 な 部 分 の DNA を 増 幅 す る こ と に よ り 、 羊 毛 と カ シ ミ ヤ の 鑑 別 が 可 能 で あ る こ と が 分 かった。また、製品でも鑑別が可能であることから、この方法が実用的なものであることが示唆された。

食品の分野では加工食品中に使用される食肉の種類の鑑

1. は じ め に別１）２）や、遺伝子組み替え大豆やトウモロコシ等の鑑別

家庭用品品質表示法の改正が行われ、繊維製品品質表および定量に既に実用化され、広い分野で一般的に用い示規程の中で、従来は、毛の表示しかできなかったものられている。また、獣毛の鑑別についても一部報告があが獣毛の種類を表示することができるようになり、獣毛る。３）４）５）の鑑別および混用率の測定は増加している。また、羊毛

そこで、本研究では遺伝子技術の一つである PCR 法をの延伸加工や脱スケール加工などの開発や獣毛の多様化用い、それぞれの DNA の違いを分析することにより、羊により、よりいっそう高度な鑑別技術が求められてきて毛とカシミヤを鑑別する手法を研究した。

いる。
しかし現在、実用化されている獣毛の鑑別方法として

2. 実 験 方 法

は、熟練者の光学顕微鏡を用いた外観観察により行われている。電子顕微鏡を用いた画像処理による方法、アミ2 . 1 試料ノ酸分析による方法などの研究も行われている。しかし、試料としては、平均繊維直径約 29μm のメリノ種の羊電子顕微鏡による画像解析は、羊毛と種々の獣毛の形状の原毛（以下羊毛）と約 19μm のカシミヤヤギの原毛（以の違いを判別するための精度を上げることと判定の自動下カシミヤ）を、ジエチルエーテルでソックスレー抽出化が難しい。また、アミノ酸分析等による方法は、獣毛して脱脂し、洗浄・乾燥した試料を用いた。の化学的性質が、それらが全てタンパク質から合成され2.2 DNA の 抽 出ていることから極めて近く、鑑別は困難である。そのた

試料約 250mg にバッファー(50mM Tris‑HCl(pH8.0)・め、どちらも実用化には至っていない。よって、特殊な25mM EDTA(pH8.0)・0.5% SDS・150mM NaCl)5ml と 2‑メル技能を持っているもの以外は測定が不可能であり、これカプトエタノールを 25μl 加え、試料の煮沸処理（10 分を一般的な測定技術で解決することができれば、熟練者間）を行った。その後、proteinaseK(20mg/ml)を 25μlでなくとも獣毛の鑑別および混用率の測定が可能となる。

加え、55℃で 3 時間インキュベートし、RnaseA(4mg/ml)

近年の分子生物学の進歩はめざましく、DNA の解析はを 25μl 加えてさらに 37℃で 1 時間インキュベートし、医学・農学の分野での研究に用いられているだけでなく、遠心分離後、約 3.5ml の上清を新しいチューブに移した。

*1 尾張繊維技術センター応用技術室*2 企画連携部

イソプロパノール 7ml とグリコーゲン溶液(20mg/ml)25属の反応液 19.9μl に Taq DNA polymerase(Ampli Taqμl を加えて混合し、遠心分離した。上清を廃棄し 70%Gold)を 0.1μl、抽出した DNA 1 μl、水 4μl を加えて全エタノール溶液で洗浄した後、 市販のDNA 精製用のフィル量を 25μl とした。

TMターキット(GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit,

次に、キットを用いない条件として、10×PCR buffer 10

amarsham pharmacia biotech 製)を用いてDNA の精製を行い、μl、dNTP 10μl、それぞれのプライマー0.5μl、Taq DNA50μl の TE (pH8.0)バッファーに溶解した。抽出した DNA はpolymerase(Ampli Taq Gold) 0.5μl、水 77.5μl に抽出10μl の抽出 DNA 溶液を 2%アガロースゲルにより、電気した DNA 1μl 加えて全量を 100μl とした。

泳動を行い、ゲルをエチジウムブロマイドで染色した。

この反応液を、核酸増幅装置（Gene Amp PCR System

その後、UV 照射装置上で画像解析装置を使用して、ゲル9700、Applied Biosystems 製）により、94℃に 10 分保の写真撮影を行い、抽出した DNA の検出を行った。

った後、94℃30 秒間・58℃30 秒間・72℃1 分間を 1 サイ

2.3 PCR 反応の条件クルとして、50 サイクルの増幅反応を行った。

まず、食肉検定用キット(DNAnimal Consensus
Standard Gene Scan)を用いた PCR 反応液は、キットに付使用したプライマーの配列、増幅領域、増幅サイズは
表 1 に示す。

表 1. 使 用 し た プ ラ イ マ ー の 配 列 、 増 幅 領 域 、 増 幅 サ イ ズ
食肉検定用ｷｯﾄ

羊毛ｶｼﾐﾔｶｼﾐﾔ

ﾌﾟﾗｲﾏｰCyt‑b1
Cyt‑b2
Sheep1
Sheep2
Goat 1Goat 2
Goat 1Goat 3配列5'‑CCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA‑3'5'‑GCCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA‑3'5'‑GCACTATACTCCGTTCTCTCTA‑3'5'‑AAGTGAAGCTTCAGAATTGGCAA‑3'5'‑CCAGCACTATACTCCGTTCTA‑3'5'‑AAGTGAAGCTTCGAAATTGGAAG‑3'5'‑CCAGCACTATACTCCGTTCTA‑3'5'‑TAGTGGAGTAAGGCCCATTTTC‑3'

増幅領域
cytochrome b 14816‑14841
cytochrome b 15149‑15174
alpha‑lactalbumin 1325 ‑1346
alpha‑lactalbumin 1408 ‑1430
alpha‑lactalbumin 2028 ‑2048
alpha‑lactalbumin 2110 ‑2132
alpha‑lactalbumin 2028 ‑2048
alpha‑lactalbumin 2296 ‑2317(図 1 ‑羊毛 1,カシミヤ 1)。

用して、ゲルの写真撮影を行い、増幅された DNA 断片のそこで、前処理として 2‑検出を行った。

メルカプトエタノールを2.5 制 限 酵 素 処 理加え煮沸処理することに食肉検定キットにより増幅した PCR 反応液 1 0μl に、より獣毛は充分分解され制限酵素（HaeⅢ）を 1μl 加え、37℃で 1 時間インキュた。電気泳動の結果、約ベートを行った。

500bp〜1000bp の長さの制限酵素による切断断片の確認のために、5μl の制限DNA が抽出できたことが酵素処理後のサンプルを 2%アガロースゲルにより、電気わかった（ 図 1 ‑羊毛 2,泳動を行い、ゲルをエチジウムブロマイドで染色した。

カシミヤ 2）。

その後、UV 照射装置上で画像解析装置を使用して、ゲル3.2 食 肉 検 定 用 キ ッ トの写真撮影を行い、制限酵素により切断された DNA 断片の検出を行った。

ｶｼﾐﾔ 2では検出できなかったで染色した。その後、UV 照射装置上で画像解析装置を使

ｶｼﾐﾔ 1により、電気泳動を行い、ゲルをエチジウムブロマイド

2902

充分分解されず電気泳動

105

羊毛

5μl または 10μl の PCR 反応液を 2%アガロースゲル

1071

白質分解酵素のみでは、

359

羊毛

ﾏｰｶｰ

2.4 DNA 増幅断片の検出

増幅ｻｲｽﾞ

図 1. 抽 出 DNA の 電 気 泳 動

PCR 反応後、電気泳動で確認した結果、羊毛から抽出した DNA およびカシミヤから抽出した DNA を鋳型として、ともに約 359bp の DNA 断片が増幅されたことがわかった

3. 結 果 及 び 考 察
3.1 D N A の 抽 出
獣毛はスケールで覆われているため、バッファーと蛋(図 2 )。
増幅した DNA 断片サンプルを制限酵素で処理した結果、羊毛とカシミヤはそれぞれ異なる長さの断片に切断されていることがわかった(図 3 )。よって、羊毛とカシミヤの鑑別が可能であることが示唆された。

幅サイズである約 100bp の断片を確認できた(表 2 /図

食肉用検定キットでの羊毛とカシミヤの鑑別は可能

4‑ 5 )。さらに、羊毛・カシミヤともに非特異的なプライであると考えられるが、羊毛とカシミヤの２種類が混ざマーの組み合わせ〔 羊毛の DNA を鋳型とした場合り合った試料の場合、電気泳動のバンドが複雑になる。

Goat1,Goat2 の組み合わせ、カシミヤの DNA を鋳型としその他の獣毛も含めて考えると数種類が混ざり合った状

た場合 Sheep1,Sheep2 の組み合わせ〕では、増幅しない態では判定しにくいことも考えられる。

ことも確認できた(表 2 /図 4 ‑2 , 4 )。
ｶｼﾐﾔ
羊毛ﾏｰｶｰ

ﾏｰｶｰ

ｶｼﾐﾔ
羊毛

Sheep1,Sheep2 の組み合わせと Goat1,Goat2 の組み合わせで増幅した断片はほぼ同じサイズであるため、羊毛とカシミヤが混ざっている場合、２種類ともに存在することを１反応液中で示すことができない。そこで、予測される増幅サイズの異なる、ヤギに特異的なプライマー〔Goat1,Goat3 の組み合わせ〕を試みた。Goat1,Goat3の組み合わせのプライマーでカシミヤから抽出した DNA500bpを鋳型とした PCR 反応を行った結果、予測する増幅ｻｲｽﾞ500bpである約 300bp の断片を確認できた(表 2/図 5‑6)。この100bp

プライマーの組み合わせでは、羊毛から抽出した DNA を100bp鋳型とした PCR 反応で、増幅しないことも確認した(表2 /図 5 ‑ 3 )。
さらに、羊に特異的なプライマーとヤギに特異的なプ

図 2. 食肉検定用キットのPCR 生成物の電気泳動

図 3. 食肉検定用キットの制限酵素処理後の電気泳動

ライマーをどちらも一つの反応液に加えた、4 種類のプライマーの組み合わせ〔Sheep1,Sheep2,Goat1,Goat3 の組み合わせ 〕で PCR 反応を行った。羊毛から抽出した DNAのみを鋳型とした PCR 反応では、予測する増幅サイズで3.3 特 異 的 プ ラ イ マ ーある約 100bp の断片のみを、カシミヤから抽出した DNA

PCR 反応後、PCR 生成物を電気泳動で確認した結果、羊のみを鋳型とした PCR 反応では、予測する増幅サイズで毛から抽出した DNA を鋳型とした PCR 反応では、羊に特ある約 300bp の断片のみをそれぞれ確認できた(表 3 /図異的なプライマー〔 Sheep1,Sheep2 の組み合わせ〕の反6‑ 7,8 )。羊毛およびカシミヤから抽出した 2 種類の DNA応液で、予測する増幅サイズである約 100bp の断片を確を鋳型とした PCR 反応では、予測する増幅サイズである認できた(表 2 /図 4 ‑ 1 )。カシミヤから抽出した DNA を鋳

約 100bp および約 300bp の断片、２種類ともに確認でき型とした PCR 反応では、ヤギに特異的なプライマーた(表 3 /図 6 ‑ 9 )。

〔Goat1,Goat2 の組み合わせ〕の反応液で、予測する増表 2. 鋳型 DNA とプライマーの組み合わせと増幅の有無
試料番号123456

鋳型 DNA
羊毛羊毛羊毛
カシミヤ
カシミヤ
カシミヤ

プライマー1
Sheep 1Goat 1Goat 1
Sheep 1Goat 1Goat 1

プライマー2
Sheep 2
Goat 2
Goat 3
Sheep 2
Goat 2
Goat 3

予測増幅ｻｲｽﾞ107105290

増幅ｻｲｽﾞ
約 100
増幅なし
増幅なし
増幅なし
約 100
約 300

表 3. 2 組のプライマーを同時に用いたときの鋳型 DNA と増幅の有無
試料番号

鋳型 DNA

鋳型 DNA2

7羊毛−8カシミヤ−

9羊毛

カシミヤ

プライマー
Sheep 1
Sheep 2
Goat 1Goat 3

予測増幅ｻｲｽﾞ

増幅ｻｲｽﾞ

107

約 100290

約 300

107,290

約 100,300

536400bp
300bp

400bp
300bp
200bp
100bp

89400bp
300bp
200bp
100bp

200bp
100bp

図4. 特異的プライマーを用い

7製品

4ﾏｰｶｰ

2ﾏｰｶｰ

1ﾏｰｶｰ

ﾏｰｶｰ

試料番号400bp
300bp
200bp
100bp

図5. 特異的プライマーを用

図6. ２組のプライマーを同たときのPCR生成物

いたときのPCR生成物時に用いたときのPCRを鋳型としたPCRの電気泳動の電気泳動生成物の電気泳動生成物の電気泳動

図7. 製品から抽出したDNA

羊毛、カシミヤともに抽出した DNA を鋳型として、そわかった。また PCR 反応後の断片長さを変えたプライマ

れぞれに特異的なプライマーでの増幅の有無で鑑別が可ーを設計することにより、１反応液中での 3 種類以上の能であることが分かった。羊毛とカシミヤから抽出した

獣毛の DNA を鋳型とした鑑別の可能性も示唆された。

DNA を鋳型として増幅する PCR 生成物の断片を異なる長さになるようにプライマーを設計することにより、１反5. 謝 辞応液で双方一度に判定することが可能であるとわかった。
最後に、羊毛とカシミヤ混の製品から抽出した DNA を

この研究を進めるにあたって、貴重なご意見、提案な鋳型として〔 Sheep1,Sheep2,Goat1,Goat3〕の組み合わせど多大なご協力をいただきました、食品工業技術センタ

で PCR 反応を行った。その結果、羊毛を含む製品から増ーの北本則行主任研究員をはじめ、同所の方々に厚く御幅されると予測できる、約 100bp の断片と、カシミヤを礼申し上げます。

含む製品から増幅されると予測できる、約 300bp の断片

文献をともに確認することができた(図 7 )。
1.

Length Polymorphism Analysis : A simple method

4. 結 びfor species identification in food. J.of ACAC

食肉検定用キットの共通プライマーを用いて増幅させ、制限酵素で切断しその断片で判定する方法、羊毛・Meyer,R.他 : Polymerase Chain Reaction Fragment

Int. 78 (6),1542‑1551,1995.
2.

Kocher,T.D.他 : Dynamics of mitochondrial DNA

カシミヤにそれぞれ特異的なプ ライマーを用いて、増幅

evolution in animals : amplification andの有無で判定する方法、ともに鑑別の手法としては可能

sequencing with conserved primers.

であることが分かった。しかし、食肉検定用キットを用いたとき、獣毛数種類が混ざり合った試料では、より複Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6196‑6200,1989.
3.

Appley,J.M.他 : PCR amplification of the雑になる。また、特異的なプライマーを用いる方法のほ

RuBisCo small subunit genes and their novelうが制限酵素による処理が必要でないため、より簡便でapplication to plant tissue identification.

ある。よって、PCR 法を用いた羊毛とカシミヤの鑑別にHeredity,79(6),557‑563,1997.

は、種に特異的なプライマーを用いて行う方法が最も適4.

していると考えられる。また、羊毛とカシミヤそれぞれに特異的なプライマーを、PCR 生成物の断片長さが異な

Hamlyn,P.F.他: Molecular speciation of animalfibres. JSDC,144,78‑80,1998.

5.

加藤三貴: 獣毛の DNA 鑑別方法の研究調査, 財団法るよう設計することにより、２種類の DNA が混在してい人日本化学繊維検査協会研究調査報告書,ても、１反応液中で一度に２種類の鑑別ができることがNo.1002,1999.