Low Temperature Science

低温科学
第 67 巻 ● ISSN 1880―7593 ● 2008 vol.67

光合成研究法北海道大学低温科学研究所・日本光合成研究会 共編
Edited by Institute of Low Temperature Science, Hokkaido University and
The Japanese Association for Photosynthesis Research

目次
はじめに

１章

「光合成研究法」編集委員会

植物・藻類・細菌の材料の入手と栽培・培養

１−１ 光合成細菌
１−２ シアノバクテリア
１−３ クラミドモナス
１−４ ゼニゴケの培養法
１−５ ヒメツリガネゴケ
１−６ シロイヌナズナを用いた光合成研究
１−７ タバコ
１−８ イネ１−９ 藻類１−10 紅藻の培養，入手
１−11 珪藻の培養，入手

２章

広 瀬

侑，佐
福
大 和 勝 幸，石
青
山
村

嶋 田
子，池 内
哉，久 保
庸，河 内
之，杉 田
鹿 内
本 義 治，小保方稲 垣
上 明 男，小檜山
榎 並
榎 並
藤
澤
崎
木

敬
昌
雄
孝

3
9
17
23
31
35
39
43
53
61
63

坂 幸 毅
場 祐 子
口
航
口
航

67
73
83
89

響，村 岡 裕 由

95

利
潤
言
篤

個体・環境の測定

２−１ 個葉から葉緑体スケールのガス交換
２−１−ａ 個葉の光合成速度が決まるしくみと測定原理
２−１−ｂ 光合成研究のための安定同位体測定法
２−１−ｃ 呼吸速度（CO 発生速度）測定
２−１−ｄ 酸素発生測定
２−２ 個体から群落スケールの CO ガス交換
野 田
２−２−ａ 同化箱法による器官や個体レベルのガス交換
２−２−ｂ 群落の物質生産
２−２−ｂ−１ 草本群落の生産構造と群落光合成モデル
２−２−ｂ−２ 植物のサイズと成長 ⎜ 成長解析 ⎜２−２−ｂ−３ 森林生態系の純一次生産量の測定手法
２−２−ｂ−４ 微気象学的な測定（渦相関法による測定)
２−３ ガスチャンバー法（同化箱法）および重量法による個葉の蒸散特性の評価
松 尾 奈緒子，三

彦
半
野
野

及
長
大
斎

川 真 平
嶋 寿 江
塚 俊 之
藤
琢

137

鈴 木 祥 弘143大西 紀 和，福 澤 秀 哉
真 野 純 一

149
159

原

田 和 生，福 崎 英一郎

163久，原 田 和 生，三宅 親 弘，福 崎 英一郎

169

坂 一 馬，小 俣 達 男
子 克 己

175
179

尾 光 恵
岡 宏 造

197
205

岡

成

209

谷
島
倍
田
岡
堀
上

俊 治
賢 治
昭 洋
勝
宏 造
徹
明 男

215
223
227
233
245
249
259

橋 拓 子
並
勲
川
純
岡 宏 造

265
275
285
289

２−５ 葉緑体の光合成活性測定 ⎜ 単離葉緑体を用いた炭酸固定測定 ⎜木 直 子，廣 部

103
113
119
129

宗

２−４ 藻類の光合成関連測定
２−４−ａ 海洋と湖沼における光合成・環境要因の測定法
２−４−ｂ ガスクロマトグラフィーと酸素電極を用いた無機炭素親和性の測定

３章

三
彦
昭
之
護
治
一
要
志
勲
勲

桃
秀
公
摂

単離・精製・活性測定

３−１ 代謝産物量の定量
３−１−ａ CE/M S を用いた陰イオン性代謝産物の定量
３−１−ｂ 安定同位体標識を利用した動的代謝プロファイリング
蓮 沼

誠

３−１−ｃ 硝酸還元酵素及び亜硝酸還元酵素の活性測定
前 田 真 一，上真 野 純 一，Sergey Khorobrykh，尼３−１−ｄ 活性酸素種，抗酸化物
３−２ 光合成膜などの単離宮
３−２−ａ 高等植物の葉緑体と葉緑体膜の単離
原 田 二 朗，浅 井 智 広，大３−２−ｂ 光合成細菌の光合成膜
３−３ 酵素・電子伝達成分の精製・活性測定・定量
田茂井 政 宏，重３−３−ａ カルビン回路の酵素
３−３−ｂ フェレドキシンとフェレドキシン：NADP 還元酵素の調製と生化学的解析
榊

３−３−ｃ シトクロム
３−３−ｄ プラストシアニン
３−３−ｅ プラストキノン
３−３−ｆ 光化学系 反応中心の鉄‑硫黄クラスター
３−３−ｇ CF CF ，光リン酸化
３−３−ｈ 光化学系反応中心の分光学的定量
３−４ タンパク質複合体の単離
３−４−ａ 系 複合体の精製法
３−４−ｂ 系 複合体の精製法
３−４−ｃ 集光装置（LHC)
３−４−ｄ 光合成細菌の反応中心・アンテナ複合体

日比野

隆，田

紺

原 由紀子，長永
中 義 人，高柴大野 宏 記，久村

高 橋 裕一郎，兒 玉 なつ美，高沈建 仁，榎得 津 隆太郎，Wesley Swingley，皆大 友 征 宇，小 林 正 幸，大３−４−ｅ フィコビリソーム
近 藤久益子，佐 藤

桃

子，広 瀬

侑，渡

邊 麻 衣，池 内 昌 彦
昌 彦
勇

295
303
309

亮 一
建
正
真 一
昌 彦

315
327
339
347
355

康 浩
康 浩
康 浩
純
純
裕一郎
裕一郎
裕一郎
裕一郎
次 郎

359
373
377
381
385
387
397
409
415
423

小 池
４−１ 分光測定の基礎
４−２ 分光測定法
秋 本
４−２−ａ 蛍光小 野
４−２−ｂ 熱発光・遅延発光
伊 藤４−２−ｃ 閃光分光法と差スペクトル三 野
４−２−ｄ EPR 法
野 口
４−２−ｅ 光誘起フーリエ変換赤外差スペクトル法
野 口
４−２−ｆ 共鳴ラマン分光法
中 路
４−２−ｇ 葉群の分光反射と分光植生指数
４−３ パルス変調蛍光園 池
４−３−ａ クロロフィル蛍光と吸収による光合成測定
４−３−ｂ PAM およびガス交換測定器を用いた，蛍光および二酸化炭素同時測定による植物の光エネルギー利用の評価 ⎜ ガス交換解析とクロロフィル蛍光の同時測定 ⎜

裕 幸

431

誠 志
高 明
繁
広 幸
巧
巧
達 郎

449
453
465
473
483
491
497

公 毅

507

牧 野

周

525
529

岩 井 雅 子，池 内
３−４−ｆ 小型サブユニット
池 上
３−４−ｇ 光化学系 コアクロロフィル a の分別抽出法
３−５ 色素の分析
田 中
３−５−ａ クロロフィルおよびクロロフィル代謝経路中間体の抽出・定量法
高 橋 重 一，増 田
３−５−ｂ ヘムの分析
民 秋
均，溝 口
３−５−ｃ バクテリオクロロフィルの分析
高 市
３−５−ｄ カロテノイドの分析
石 塚 量 見，池 内
３−５−ｅ フィコビリンの単離と分析
３−６ タンパク質
井上（菓子野）名津子，菓子野
３−６−ａ SDS-PAGE
菓子野
３−６−ｂ Blue-Native PAGE
菓子野
３−６−ｃ Native-Green PAGE
岩 井 優 和，皆 川
３−６−ｄ−１ 二次元電気泳動
岩 井 優 和，皆 川
３−６−ｄ−２ ショ糖密度勾配超遠心法
小 澤 真一郎，井上（菓子野）名津子，高 橋
３−６−ｅ タンパク質の質量分析
小 澤 真一郎，岡 室彰，高 橋
３−６−ｆ カラムクロマトグラフィー
小 澤 真一郎，高 橋
３−６−ｇ 界面活性剤
大 西 岳 人，高 橋
３−６−ｈ ウェスタン分析
藤 田 祐 一，野 亦
３−６−ｉ 嫌気条件下でのタンパク質精製

４章

分光測定

宗 景 ゆ り４−３−ｃ 光化学系 サイクリック電子伝達の活性測定
４−３−ｄ 高等植物葉緑体チラコイド膜光化学系 および 電子伝達活性の生葉での同時測定

４−３−ｅ 二次元解析
４−４ 酸化還元滴定
４−５ 電子伝達活性４−６ 水素発生
４−７ 膜電位の測定

５章

高

三
見 常 明，遠
永
沈
増
伊

533
539
545
551
561
567

侑，池 内 昌 彦
佐 藤 直 樹575
583

秀 哉，久 保 雄 昭
皆 川
純

587
591

公 庸，河 内 孝
将 大，河 内 孝瑛 示，香 村 吉
鹿 内 利

之
之
洋
治

597
601
607
615

義 治，小保方黒 田
千 都，宮 尾祐 一，野 亦

一
詩
恵
郎

617
623
641
649

藤 直 樹
林 厚 史
中
歩
本
忍

657
663
669
673

形質転換

５−１ シアノバクテリア
岩 井 雅 子，広 瀬
５−１−ａ シアノバクテリアの形質転換法
５−１−ｂ PCR を使った Synechocystis の高速簡便遺伝子破壊法
５−２ クラミドモナス
福 澤
５−２−ａ 核ゲノム
５−２−ｂ 葉緑体ゲノムの形質転換
５−３ ゼニゴケ
石 崎
５−３−ａ アグロバクテリウムによるゼニゴケ核ゲノム形質転換法
千代田５−３−ｂ ゼニゴケの培養細胞と植物体のプラスチド形質転換法
杉 田
護，田 崎
５−４ ヒメツリガネゴケ
５−５ シロイヌナズナの形質転換
５−６ タバコ長 尾 一 生，山 本
５−６−ａ 核ゲノム
５−６−ｂ 葉緑体ゲノム
増 本
５−７ アグロバクテリウム法によるイネの形質転換
藤 田
５−８ 光合成細菌 Rhodobacter capsulatus における大量発現系と形質転換

６章

宅 親 弘
藤
剛
島 賢 治
建 仁
川
一
藤
繁

潤
洋
光
次

バイオインフォマティクス

６−１
６−２
６−３
６−４

比較ゲノムによる光合成関連遺伝子の推定
発現プロファイルの利用
光合成遺伝子の同定
光合成生物のオミックスデータベース利用法

遠横 野 牧 生，田
成

佐
藤
剛，高
中 亮 一，田
川
礼，岡

はじめに

植物は，太陽光を吸収して成長します．なぜ植物が成長できるのかは近代までは大きな謎でした．植物の口は地中にあり，根から取り込んだ材料で成長するとも考えられました．
しかし，ポットで植物を育てると，ポット全体の重さ（植物と土壌の重さの和）が増えるという実験は，この考えを否定し，「植物は新たに物を作り出す」という考えを生みました．
様々な実験や，酸素の発見を通して，植物は，光エネルギーを利用して光合成を行うことが百年ほど前にわかりだしました．
その後の研究の発展は著しく，光合成という生物学の研究に，物理や化学の最先端の実験手法が積極的に用いられました．1960‑70年代には光反応，２つの光化学系，酸素発生，
Ｚスキーム型の電子伝達系，電荷分離，そして電子と水素イオンの動きに共役した ATP 合成など，反応の原理があきらかになりました．日本光合成研究会が設立され（1979年），会員を中心に 1981年には「光合成研究法」（加藤栄，宮地重遠，村田吉男編，共立出版）が出版されました．
光合成研究には，レーザ分光や，計算科学，電子移動やエネルギー移動理論，遺伝学，
Ｘ線結晶学など，先端的な研究手法が，絶えず積極的に使われてきました．色素系による光の吸収，励起エネルギーの移動，電荷分離などの超高速現象の研究には先端物理手法が使われました．絶対嫌気性の光合成細菌から，酸素を出すシアノバクテリア，植物，瑚

などの共生生物にいたる光合成の多様性や進化の道筋の研究では，細菌学，生化学，遺伝子工学が活躍しました．さらに農業，農薬，生態，地球規模での環境問題までを対象に，広範な光合成研究が，実験を主体に進められています．
最近の遺伝子工学やゲノム科学の進歩，グローバルな環境やエネルギー問題，CO 削減
計画は全く新しい光合成の理解と研究の展開をもたらしつつあります．より広汎な人々が光合成に興味を持ち，理解したい，知識を利用したいと考えるようになりました．しかし，光合成の理解には分野を超えた，深く，多様な知識が必要であり，一個人や一学科だけでの教育や，実習では不十分であり，新たな参入には困難が伴います．このような状況のもとで，専門家，非専門家，初学者，ベテランを問わず，個別の専門の枠を超えた「現時点での光合成研究の知識と成果」を，たやすく，正しく，効率よく利用できる環境を作りた
いと，我々「日本光合成研究会」の研究者は考えました．

この環境を最も速く実現するために，我々は低温科学研究所が発行する「低温科学」シ
リーズの一つとしてこの新「光合成研究法」を出版します．このシリーズは，一般販売しないので，本書の配布には限界があります．しかし，ほぼこのままウェブ上に公開いたしますので，研究者や学生，産業人，など必要な人々はだれでも容易に利用できます．ダウンロードいただければ，検索や利用もしやすく，ウェブ上でもさらに使いやすいものになっていくと考えます．研究や教育基盤を構築する一つの新しい手法となってほしいと期待しています．
「光合成辞典」（日本光合成研究会編集委員会・委員長

高宮建一郎 2003年

学会出版センター）との併用も便利かと思います．

「光合成研究法」は，日本光合成研究会の幹事を中心とした編集委員会が議論を重ね，編集，出版作業を進めました．項目は編集委員会と著者の提案をもとに決定し，最終的に 97
項目となりました．各項目の短期間無償での執筆を，快く引き受けてくださった著者の方々，編集作業をお世話いただいた北海道大学低温科学研究所の中條将喜氏，岸本純子氏，㈱アイワードの松木新氏，すてきな表紙を描いていただいた岩城雅代氏に心より感謝いた
します．

この皆の思いが雪のように結晶した「光合成研究法」が，これからの光合成研究と科学の発展に寄与することを願っています．

2008年３月「光合成研究法」編集委員会
池内昌彦

伊藤

繁

鹿内利治

園池公毅

田中

歩

村岡裕由

三宅親弘

日本光合成研究会（http://wwwsoc.nii.ac.jp/photosyn/index.html)

1章
植物・藻類・細菌の材料の入手と栽培・培養1章

植物・藻類・細菌の材料の入手と栽培・培養

１．光合成細菌
嶋田 敬三
酸素非発生型光合成機能を持つ細菌は絶対好気性のものを含め 200種ほどが記載され，主に菌株保存
機関から入手できる．培地，培養法は種や目的によりさまざまであるが，よく用いられる条件について注意点を記した．

Photosynthetic Bacteria:Culture and maintenanceKeizo Shimada
M any species of anoxygenic photosynthetic bacteria belonging to four phyla have been isolated and deposited
to culture collections. Various culture media and cultural methods have been developed. In this section,
notable points for preparation of culture media and cultural skills for frequently used species are described witha few examples.

シアノバクテリアを除く原核光合成生物を慣習的に〝光合成細菌"と呼ぶ．大別すると紅色細菌，緑色イオウ
細菌，緑色糸状（繊維状）細菌，ヘリオバクテリアのそれぞれ別の門（Phylum）に属する４つのグループに分け

DSMZ：http://www.dsmz.de/microorganisms/main.
php?contentleft id＝6
ATCC： http://www.atcc.org /AT CCAdvanced
CatalogSearch/tabid/112/Default.aspx

られる．いずれも酸素を発生しない〝酸素非発生型光合NBRC：http://www.nbrc.nite.go.jp/gene.html

成"を行う能力を持つ．1970年代まではすべて絶対嫌気

理 研 BRC：http://www.jcm.riken.go.jp/JCM /JCM

性あるいは通性嫌気性で，通性嫌気性のものでも光合成

Home J.shtml

装置は嫌気条件下のみで合成されるとされてきたが，このほか場合によっては国内の大学のラボなどから分

1978年に芝，佐藤らにより好気条件下で酸素呼吸に主に与を受けることが可能な株もある．

依存しながら少量の光合成装置を合成するいわゆる〝好気性光合成細菌" が見出され，近年海洋を中心に多くの種が単離されるようになった．ここではすでに単離されている光合成細菌を培養・維持する方法についてその概略を述べる．

1.2 培地光合成細菌は上記のように４つのグループに大別されるが，培地，培養法はひとつのグループの中でもさまざまであり，場合によっては同じ種でも株（strain）によって異なる場合がある．上記の各菌株保存施設のカタログ

1.1 入手法にもそれぞれの種独自の培地が記されているものもある

好気性を含め多くの光合成細菌が DSM Z（Deutscheが，目的と異なる培地のみが示されている場合や，必ずSammlung von M ikroorganismen und Zellkulturen

しもそれぞれの種や株に最適とは言えない一般性のあるGmbH）や ATCC（American Type Culture Collection）

培地のみが示されている場合もある．たとえば DSMZなどから購入できる．国内では IFO を引き継いだ製品評のカタログでは紅色非イオウ細菌の多くの種に対して共価技術基盤機構生物遺伝資源部門（NBRC）あるいは理通な培地（Rhodospirillaceae Medium）が示され，嫌気

研バイオリソースセンターに光合成細菌株が保存されて条件にするため窒素ガスの通気などやや面倒な方法が記おり分与を行っている．詳細は以下のオンラインカタロされているが，特定の種にとっては不要と考えられる成グのサイトを参照されたい．

分（例えばいくつかのビタミン）や操作（厳密な嫌気状態の形成など）も含まれている場合が多い．実際，実験によく用いられている紅色非イオウ細菌の多くは通性嫌１) 首都大学東京理工学研究科生命科学専攻

2009 低 温 科 学

vol.67

気性で酸素に強く，培地が最初から厳密な嫌気状態であ3

る必要はない場合が多い．したがって，実験の目的にも除くため培地に少量のアスコルビン酸やシステインある

よるが，はじめて扱う株の培養にあたっては，可能な限いは微量の硫化水素（Na S として）を加えることがしばり実際にその株を使った論文あるいは経験者にあたって

しば行われる．

みることが望ましい．

培地あるいはそれを使った光合成細菌の単離法，培培地には光独立栄養条件用の無機培地と（光）従属栄

養・維持については可能なら文献も参照されるとよ

養培養のための有機培地がある．通常，完全無機培地をい．また，いくつかのよく使われる光合成細菌種につい用いるのは紅色および緑色イオウ細菌の一部だけで，多て筆者らが使っている培地・培養の例も最後（1.5）に挙くの場合多少なりとも有機物を加えた培地を用いる．いげる．

わゆる紅色非イオウ細菌も H などを電子供与体とする
独立栄養生長は可能であるが，菌体を得る目的の場合は乳酸，コハク酸などの有機物を炭素源かつ電子供与体として光従属栄養的に生長させる場合がほとんどである．

1.3 培養法
1.3.1 嫌気光合成培養

有機培地でも無機塩類を加える必要のあるものも多好気性光合成細菌以外の光合成細菌の液体培養は，多い．同じ無機塩類をよく使う場合は終濃度の 50〜100倍

くの場合嫌気条件で密閉可能なガラス容器中で光照射す程度の無機塩類のみの Basal Salt Solution を作り置きることにより行われる．特に緑色イオウ細菌など絶対嫌する場合が多いが，作成の際には水酸化鉄（）を生じ気性光合成細菌の場合は嫌気光合成培養以外の培養法はない（アルカリにしない）ようにする，リン酸塩の沈殿

ない．Rhodobacter や Chloroflexus のような通性嫌気性を生じないためにリ ン 酸 カ リ ウ ム な ど は 別 の Stock

細菌の場合は容器内に多少空気層を残して，菌体が沈殿

Solution にする，などの注意が必要である．微量元素しがちな場合に時々容器を振って菌体を攪拌分散させて（Trace elements）も通常別に濃い Stock Solution をやると良い．なお，容器を密閉するため温度変化やガス作っておいて少量を Basal Salt Solution に加えて用い発生に伴う内圧変化で容器破損が起こることがあるのる．

で，場合によっては注意・対策が必要である．

培地に加える成分でしばしば欠かせないものとしてビ

絶対嫌気性細菌の場合でも，ヘリオバクテリアのようタミン類がある．紅色あるいは緑色イオウ細菌はビタミ

な極端に酸素に弱いもの以外，特に生化学的な研究に良ン B のみ加えれば良い場合が多いが，紅色非イオウ細く用いられるような種には，植継ぎの際などに培地に多菌のビタミン要求性は種によってさまざまであるため

少の酸素が混入しても実質的な影響はないものが多い．

などで確認する必要がある．可能性

しかし，光を与えるにあたっては通性嫌気性の種でも，のあるビタミン類をすべて含んだ Vitamin mixture を

緑色糸状細菌以外は，植継ぎ後しばらく暗所に置いて培作っておいて用いても良いが，オートクレーブ滅菌が出

地中の酸素を消費させてからにするなど，酸素存在下で来ないもの（パントテン酸）もあるので注意を要する．

強い光に当てることは避けた方が良い．

Bergeyʼs Manual

これに限らず，熱耐性，揮発性などの理由でオートク

絶対嫌気性の種の場合，単離などのため寒天プレート

レーブ滅菌に適さない物質（炭酸水素ナトリウムなど）での培養が必要な場合にプレートを嫌気条件下に置いてはろ過滅菌して培地に加える必要がある．他の物質との光照射を行う必要がある．このためには嫌気チャンバー

反応性のためオートクレーブ滅菌を分けて行わねばならが使えれば理想的ではあるが，多少とも酸素耐性のあるないもの（硫化ナトリウム，グルコースなど）もあるが，ものなら Gas Pack（BD BBL），アネロパック（三菱ガ

少量の場合はろ過滅菌を行う方が手間はかからない．

ス化学）などの嫌気ジャーを用いたシステムを利用する

過去現在を通じて多く用いられている光合成細菌はか，食品用の脱気密封システムを使ってプレートをエー

Proteobacteria 門 αないしは βクラスに属するいわゆジレスなどの脱酸素剤と共にディスポーザブルの袋に密る紅色非イオウ細菌で，Rhodobacter (Rba.) sphaeroides,

封して（しばらく暗中に置いて）明条件に置くことで，

Rhodopseudomonas (Rps.) palustris, Rhodospirillum

光合成細菌コロニーを得る方法がある．この他，試料を(Rsp.) rubrum, Rubrivivax (Rvi.) gelatinosus などの通寒天培地中に薄く分散して細いガラスチューブに入れ両性嫌気性の種が多い．これらは酸素に強いため特に培地端を密封して光嫌気培養を行ってコロニーを得る方法もから酸素を除く操作は必要としない．しかし，紅色非イあるオウ細菌であっても Rsp. photometricum,Pheospirillum

養も保存のためなどには良く用いられる．

．また，通常の嫌気性細菌でも用いられる穿刺培(Phs.) molischianum などの酸素に弱い種では，酸素を4光合成細菌の培養・保存

1.3.2 好気培養，半好気（S emi-aero bic）培養，微好気培養

る必要がある．特に夏場は冷却可能なサーキュレーター
を備えた水槽に培養容器を浸して光照射をするのが安全

上記のように紅色非イオウ細菌には多くの通性嫌気性細菌がおり，酸素呼吸でも生育する．酸素濃度が高いとであろう．熱発生の少ない近赤外 LED を光源として用いれば発熱の問題は回避できると考えられる．

色素や光合成タンパクの合成は抑制されるが，生育は光培養に用いる光強度は目的によって異なる．液体の大合成培養より早い場合が多い．酸素濃度を抑制したいわ

量培養では光が全細胞に行き渡るように強い方が良い

ゆる半好気（semi-aerobic）培養では生育速度は遅くなる

が，チューブなどによる少量の培養の場合は強光では色が，色素や光合成タンパクの合成は行われる．したがっ

素・光合成タンパクの合成抑制があり得るし，酸素が残て，半好気培養は光合成機能欠損株の培養などによく用存していると生育阻害が起こることがある．特に緑色イいられる．なお，上記のように酸素存在下での光照射はオウ細菌など本来あまり明るくない環境にいるものは弱生長阻害を起こすため，紅色非イオウ細菌の好気培養あい光の方が良い場合が多い．

るいは半好気培養はあまり強い光のない場所で行う必要

1.3.5 温度がある．

培養温度は好熱菌でない限り 30℃がよく用いられる．

酸素に弱い紅色非イオウ細菌でも微好気生育が可能と

しかし，これは同時に他の種も培養する場合の妥協点で，されている種がある．しかし，これは非常に微妙な条件

至適温度は種により多少異なる．したがって単独で培養

でのみわずかな生育が見られるという意味で，ある程度する場合は Bergeyʼs M anualの菌体量を得る培養として用いることは難しい．

の至適温度に合わせたほうが良い．なお，DSMZ のカタなどを参照してその種

紅色非イオウ細菌のほか Chloroflexus の類にも好気ログでは 25℃が指示されている種が多いが，実際の至適培養が可能な種・株が多くあるが，高温による水分の蒸温度はこれより高いものが多い．一方，上記のようにタ発が激しいため好気培養はやや注意が必要である．

ングステンランプを光源に用いる場合は温度が上がり過通性嫌気性光合成細菌では寒天プレート培養も好気暗

ぎないような環境が必要である．

条件下でよく行なわれる．コロニーの小さいうちは無色

Chloroflexus, Chlorobaculum tepidum などの（中度）でも，生長につれコロニー内部の酸素濃度が下って色素好熱菌の場合は恒温水槽で培養すると水蒸気の発生が著合成が起こるため，嫌気ジャーなどを用いなくても他のしいため水槽に蓋をする必要が生じる．蓋に水滴が多量菌との判別が容易であるためである．

につくなどの問題があるため，外から光照射が可能な乾Roseobacter などのいわゆる好気性光合成細菌は嫌気式の恒温インキュベータがあれば便利である．

光合成条件では生育しないため，暗中での振盪培養や通気による好気培養で生育させる．色素や光合成タンパク
も好気条件でのみ合成されるが，必ずしも酸素濃度は高1.4 保存いほど良いとは限らない場合もある ．好気性光合成細光合成細菌の長期保存法としては通常の細菌と同じく菌でも色素や光合成タンパクの合成は光によって抑制さ15％グリセロールあるいは５％ジメチルスルホキシドれる種が多いので，通常培養は暗黒下で行う．

（DM SO）中などでの凍結保存（−70℃以下）が多くの場

1.3.3 その他の培養法合有効であるが，穿刺培養あるいは液体培養のままでも通性あるいは好気性の種では系統にもよるが，脱窒数ヶ月あるいは１年以上生存可能な種も少なくない．歴（ denitrification）や DM SO（ dimethylsulfoxide），

史的にしばしば生理・生化学実験に用いられている種・

TMAO（trimethylamine N-oxide）を電子受容体とする系統は多くがこのような丈夫なものなので，このような嫌気呼吸が可能なものもあり，必要に応じてこのようなものを時々実験に用いる場合は必ずしも超低温槽は必要

嫌気呼吸による培養も行われる ．

なく，３ヶ月から半年ごとくらいに植え継いでおけばよ1.3.4 光源い．なお，前記の Rsp. photometricum や Rhodocyclus

光合成細菌はいずれの種もバクテリオクロロフィルに

purpureus のような酸素に弱い種についてはもう少し頻よる主吸収帯が近赤外領域にあるため，嫌気光合成培養

繁に（毎月一回程度）植え継ぐことが薦められている ．

に用いられる光源としては通常タングステンランプが用

液体培養のまま保存すると菌体は沈殿するが，色調がいられる．蛍光灯でも原理的には生育可能であるが，生変わらない限り新しい培地に多めに植え継げば生育を再長速度はかなり遅い．一方，タングステンランプは熱線開する場合が多い．なお，液体培養の状態での保存は暗も強いので培養は光源から離すか水層を隔てて光照射す

所よりは多少とも光がある場所で培養温度より低い温度

2009 低 温 科 学

vol.675あるいは冷蔵庫中が良い と言われる．

1.5 培地および培養例
よく使用される種では菌株保存施設のカタログに記されている培地より作製が簡便な培地を用いる場合も多い．その例を示す．

Na MoO ・2H O

1.21g

H BO

1.55g

EDTA-3Na

20.6g【Allochromatium (Alc.) vinosum （旧 称 Chromatium
strain D）用培地】
紅色イオウ細菌には酸素を嫌う種が多く，培地作製や【PYL medium】

培養も手間のかかるものが多いが，Alc. vinosum は例外

この培地は天然培地のため組成が単純で作製に手間が的に酸素にも強く扱いやすい種である．さらに硫化水素かからない点が長所である．Rps. palustris など種によっ耐性も強いため，滅菌操作を省いても硫酸還元菌以外はては水道水など多少の無機イオンの含まれる水を用いれ混入しにくく滅菌設備のない施設でも利用できるというば Basal Salt Solution を省いても十分な生育が得られ長所がある．ただし，純粋培養では硫化水素が枯渇しやる培地である ．炭素源は乳酸ばかりでなくコハク酸

すいため，実際は硫酸還元菌を共存させたままの状態で（2Na-Succinate）などを用いても良い場合が多い．

維持・培養することが多い．

Rps. palustris, Rsp. rubrum, Rvi. gelatinosus およびRba. sphaeroides のいくつかの株が良好な生育を示す．

培地組成（1l あたり）

なお，アンモニウム塩が含まれていないため Rps. palus-

1. NaCl

10g

tris などではニトロゲナーゼからの水素ガス発生があ2. KH PO

0.5g

り，容器を密閉していると破裂することがあるので栓を

3. K HPO

0.5g

緩めるなどしてガス抜きをする必要がある．

4. NH Cl

1g

なお，下記のような Basal Salt Solution にコハク酸な5. MgCl ・6H O

0.5g

どの炭素源，硫酸アンモニウムなどの窒素源およびリン

6. CaCl ・2H O

0.06g

酸 塩，ビ タ ミ ン 類 を 加 え た 合 成 培 地（さ ら に Yeast

7. FeCl ・6H O

5mg

Extract を加える場合も多い）も多く利用される．

8. NaHCO

3g

9. Na S O

2g

10. Na S・9H O

1g

培地組成（1L あたり）
1. Yeast Extract

1g

2. Polypeptone

5g

3. Na-Lactate

2〜5g

4. Basal Salt Solution

10ml

１〜７は２倍液を Stock Solution としておくとよい．
８〜10は使う直前に加える．
この培地に（通常より）かなり多めに（たとえば 1/4〜
1/3）植継ぐと生長開始が速い．

pH 7.0にあわせる．
【緑色イオウ細菌用培地】
Basal Salt solution（1l あたり）
4.12g

れから成る光捕集装置〝クロロソーム" を持ち微弱光下

FeSO ・7H O

1.11g

での生育が可能な特徴を持つ．一般にはやはり培養が容M gSO ・7H O

24.65g

易でない種が多いが，Chlorobium limicola f. sp thiosul-

CaCl ・2H O

2.94g

fatophilum, Chlorobaculum tepidum などチオ硫酸塩も

NaCl

23.4g

電子供与体として利用できる種・株は比較的容易に培養

Trace element solution

10ml

できる．

EDTA-3Na

Trace element solution（500ml あたり）6

緑色イオウ細菌は独特のバクテリオクロロフィルとそ培地組成（1l あたり）M nSO ・4H O

5.58g

1. KH PO

2.2g

ZnSO ・7H O

1.44g

2. K HPO

0.5g

Co(NO ) ・6H O

1.46g

3. EDTA-3Na

0.05g

CuSO ・5H O

1.26g

4. (NH ) SO

0.4g
光合成細菌の培養・保存

5. M gSO ・7H O

0.4g

6. NaCl

0.4g

7. CaCl ・2H O

0.1g

8. Fe-EDTA

5mg

9. Trace Elements
10. CH COO NH

Bacteria, eds. C.N.Hunter, F.Daldal, M .C.Thurnauer
and J.T.Beatty, Springer Netherlands, 2008, p.31
４) Bergeyʼs M anual of Systematic Bacteriology (2ndedition) vol. 1, eds D. R. Boone and R. W. Castenholz,
Springer-Verlag, 2001
５) Bergeyʼs M anual of Systematic Bacteriology (2nd0.5g

edition) vol. 2, eds D.J.Brenner, N.R.Krieg and J.T.

11. Na S O ・5H O

2.0g

12. VB (0.004％)

0.5ml

Staley, Springer, 2005
６) H.Biebl & N.Pfennig, The Prokaryotes, eds. M.P.

10〜12を加えオートクレーブ滅菌し，最後に 13，14をろStarr, H.Stolp, H.G.Truper, A.Balows, and H.G.
Schlegel, Springer-Verlag, 1981, vol. I, p.267
７) N.Pfennig & H.G.Truper, The Prokaryotes, eds. M .
P.Starr, H.Stolp, H.G.Truper, A.Balows, H.G.
Schlegel, Springer-Verlag, 1981, vol. I, p.278
８) R.W.Castenholz, & B.K Pierson, The Prokaryotes,

過滅菌で加える．植菌した後空気をほとんど残さないよ

eds.M.P.Starr,H.Stolp,H.G.Truper,A.Balows,H.G.

うに容器に密栓をし，暗所に数時間置いてから（酸素をSchlegel, Springer-Verlag, 1981, vol. I, p.290
９) 星野八洲雄，「光合成細菌」
北村博，森田茂廣，山下仁平

13. NaHCO

2g

14. Na S・9H O

0.6g

１〜９は Stock Solution としておくとよい．これに吸収させた後）弱めの光で培養する．なお，好熱菌の場
合は容器に温度変化に伴う圧力がかからないような工夫が必要となる．

11) T.Satoh, Arch. Microbiol. 115 (1977)p.293.
12) A.Fukushima, K.M atsuura, K.Shimada, & T.Satoh,
Biochim. Biophys. Acta 933 (1988)p.399.
13) S.K.Bose, Bacterial photosynthesis, eds. H.Gest, A.

参考文献
１) T.Shiba, U.Shimidu, & N.Taga, Bull. Jpn. Soc. Sci.
Fish. 45 (1979)p.801.
２) K. Sato, FEBS Lett., 85 (1978)p.207.
３) V.Yurkov & J.T.Csotonyi,The Purple Phototrophic

2009 低 温 科 学編，学会出版センター，1985，p.18
10) T.Shiba, Plant Cell Physiol. 28 (1987)p.1313.

vol.67

San Pietro,L.P.Vernon,Yellow Springs,Antioch Press,
1963, p.501
14) T.M .Wahlund, C.Woese, R.W.Castenholz, & M .T.
Madigan, Arch. M icrobiol. 156 (1991)p.81.

71章

植物・藻類・細菌の材料の入手と栽培・培養

２．シアノバクテリア
広瀬

侑 ，佐藤

桃子 ，池内昌彦

シアノバクテリアは真正細菌の中で独自の分類群を構成するが，非常に多様で生態学的にも重要である．またモデル生物として研究が非常に進んでいる．研究材料として代表的な種を選んでその特徴を概説する．

Cyanobacteria
Yuu Hirose, Momoko Sato, Masahiko Ikeuchi
Cyanobacteria are the onlygroup ofprokaryotes that perform oxygenic photosynthesis. Theyconsist ofdiverse
varieties of species, such as unicellular or filamentous, nitrogen-fixing, motile or non-motile, obligate or
facultative phototrophic ones. We summarized features of these various cyanobacterial species and a primitive
eukaryote Cyanophora. Culture protocols and some tips were also included.

2.1 背景シアノバクテリア（ラン色細菌，ともいう）は酸素発

2.2 代表的なシアノバクテリアの特徴と入手法

生型光合成を行う唯一の真正細菌として独自の分類群をシアノバクテリアのゲノム情報は多くの種で決定され形成しており，光合成をしない種は知られていない．多ており，研究の標準株は，特定の古典的な培養株からゲくの系統樹によれば，シアノバクテリアの群の内部からノム決定種に大きく移行しつつある．以下に，代表的な植物の葉緑体が派生したようにみえるが，葉緑体の直系ゲノム決定種もしくは進行中の株の特徴と入手法を記の祖先種は確定していない．シアノバクテリアは古くはす．

「ラン藻（藍藻）blue-green algae」ともいわれたが，真2.2.1 S yne cho c ys tis s p. P C C 6803

正細菌に属する原核生物であるため，分子生物学や光合1968年に淡水から単離され，1996年に全ゲノムの塩基成の分野ではあまり使われなくなった（藻類学や植物学

配列が決定された ．3573471bp の環状 ゲ ノ ム で，約では今でも使われている．
）．シアノバクテリアの分類・3100個の遺伝子，ORF が推定されている．７種のプラス

学名は非常に混乱しており，現在通用している属名や種ミドも決定されている．Synechocystis は単細胞性球菌

名のいくつかはリボソーム RNA などの塩基配列による（約 2μm）で，直交する３平面で細胞分裂する．非窒素

分子系統を反映していない．そのため，種名の同定を延固定型だが，グルコースを利用して光従属栄養増殖や光期して，世界的に通用している株保存センター（PCC：

活性化による完全従属栄養増殖ができる．光合成色素と

仏 Pasteur Culture Collection など）の「株番号」で代しては，クロロフィル a，カロテノイドとフィコシアノビ

用しているものも多い．また，Synechococcus や Oscil-

リンをもち，フィコエリスロビリンをもたない．起源はlatoria などは異なるグループに分かれるので，近い将来同じであるが，実際の表現型は異なる多数の培養株が，にはその属名も改訂されると思われる．なお，多くのシ同じ〝PCC 6803"で記載されることが多いので注意が必アノバクテリアのゲノム情報は CyanoBase（http://bac

要である ．代表的な株は，フランスのパスツール研究所

から得られる．また，遺teria.kazusa.or.jp/cyanobase/）の PCC（http://www.pasteur.fr/recherche/banques/

伝子機能などから得られる．
詳細は 6.4を参照されたい．

に頼めば有償で送付してもらえる．しかし，このPCC/）
株は均一でなく運動性があり，グルコース感受性なので，光合成の研究にはあまり使われていな い（し ば し ば〝PCC 株"といわれる）．光合成の必須遺伝子をノックア

１) 東京大学大学院総合文化研究科広域科学専攻生命環境

必要がある．こ のような実験 には DuPont の Williams

科学系

2009 低 温 科 学

ウトするためには，ヘテロ増殖に必要な糖などを与える

vol.67

9

が開発したグルコース耐性株がよく利用されている ．

2.2.4 S yn ec h o co ccu s e lo n g atu s P C C

日本でもこの〝グルコース耐性株"は広く使われており，

6301および P C C 7942

株名を詳しく指定しない場合は通常この株のことであ

単細胞性で，絶対光独立栄養増殖する．両者のゲノム

る．この株は公には配布されていないが，国内の関連研は非常によく似ており，ほぼ同一種といえる．しかし，究者に頼めば，無償で入手できる．自然形質転換の方法

PCC 6301 は自然形質転換ができないが，接合による形が確立されている（５章 1‑a 参照）が，ゲノム情報が決

質転換が可能であり，一方 PCC 7942 は自然形質転換で定された，いわゆる〝かずさ株"は自然形質転換能を失っきる．どちらも細胞破砕が容易で，生化学研究によく使ている．また近縁種の Synechocystis sp. PCC 6714 は形われている．PCC から入手できるが，国内の関連研究者

質転換もグルコースによる培養も同様にできるが，遺伝からも入手できる．

情報にはかなりの違いがあり，6803の形質転換用 DNA

2.2.5 好熱性シアノバクテリア

コンストラクトで相同組換はできないと思われる．

T h e rmo s yn e c h o co c c u s e lo n g a tus

2.2.2 A na b a e n a s p. P C C 7120

B P -1および T. vu lc an us R KN

糸状性で，窒素飢餓状態でヘテロシストを形成し，窒増殖の至適は 57℃．BP-1 は別府温泉由来，RKN は湯素固定をおこなう．絶対光独立栄養で非運動性．接合にの峯温泉由来である．BP-1 のゲノムは決定されており，よる形質転換法が確立されており，窒素固定を中心によRKN の遺伝子はこれに酷似している．単細胞性桿菌でく研究されている．光合成色素としては，クロロフィル

絶対光独立栄養増殖．
BP-1 はエレクトロポレーションやa，カロテノイドとフィコシアノビリン，フィコビオロビ

自然形質転換による形質転換法が確立しており，RKN

リンをもつ．培養の光強度に応じた色素組成の調節を行

でも自然形質転換が可能（５章 1‑a 参照）．ともに耐熱性うが，いわゆる補色適応を示すかどうかは不明．この株

タンパク質をもち，とくに光化学系２や光化学系１複合を 使って い る 研 究 者 は P.Wolk を 含 め て ほ と ん ど体の結晶解析に適している．光合成色素としては，クロAnabaena sp.としているにもかかわらず，PCC はしばら

ロフィル a，カロテノイドとフィコシアノビリンをもつ．

く前からその属名を Nostoc と変更している．NCBI な

NIES（国立環境研の藻類保存施設）や関連研究者から入ど主要なゲノムデータベースは PCC の命名法を尊重し手できる．

ているため，田畑グループが Anabaena としてゲノム

2.2.6 To lypo th rix s p. P C C 7601

データを登録しても ，〝Nostoc sp. PCC 7120" としてCalothrix sp.PCC 7601,Fremyella diplosiphon ともい

公開しているという異常事態が続いている．ともかく，う．本来窒素飢餓条件でヘテロシストを形成し窒素固定

この株は PCC から入手できるし，国内の関連研究者かを行うはずだが，PCC によれば，PCC 7601 はヘテロシ

らも入手できる．また，近縁種に Anabaena variabilis

スト形成できない変異体であり，その復帰変異体 PCC

ATCC 29413 がある．その特徴は A.7120 とほぼ同じで7601/1 はヘテロシスト形成と窒素固定できるという（やあるが，フルクトースを利用して非光合成的に生育できやこしいが，PCC の Tandeau de Marsac らが PCCるなどいくつか重要なちがいがある．

．ま7601 として論文に引用するものは窒素固定できる）

2.2.3 N o s to c p u n c tifo rme ATC C 29133

た，一般に Calothrix 属の糸状体は円錐状の形態をとる

糸状性で，窒素飢餓状態でヘテロシストを形成して窒のに対し，本株はむしろ Nostoc や Anabaena などと似素固定をおこなうが，Anabaena とちがって，アキネート

た一様な糸状体を形成するので，Tolypothrix の方が妥当（休眠胞子）や運動性のホルモゴニア（連鎖体）も形成す

な属名といえる．どちらにしても，本株は赤色光でフィる．シダや裸子植物と共生関係を樹立する ．光合成色素

コシアニンを蓄積し，緑色光でフィコエリスリンを蓄積としては，クロロフィル a，カロテノイドとフィコシアノ

する典型的な補色順化を示すことで有 名 で あ る．D.

ビリン，フィコエリスロビリンをもつ．緑色光でフィコ

Kehoe（米・インディアナ大）グループは，この株由来でエリスリンを蓄積するいわゆる補色適応（正確には，〝順

糸状体を形成する細胞数が数個にまで減少した突然変異化" 現象なので，以下，補色順化に統一する）を示す．

体（SF33 という）を用いて補色順化の研究を 進めて おグルコースによるヘテロ増殖も可能であり，非常に幅広り，ゲノ ム研究も進行中であるが，歴史的な経緯からい機能をもっている．接合により形質転換する方法が確

Fremyella diplosiphon と呼んでいる．どちらも形質転換立されている（５章 1‑a 参照）．ATCC（American Typeできる．T .PCC 7601 は PCC から，F.diplosiphon は D.

Culture Collection）から入手できるが，国内の関連研究

Kehoe（米・インディアナ大）などの研究者から入手でき者からも入手できる．

る．

10

シアノバクテリア

2.2.7 M ic ro c ys tis a e ru g in o s a．これらの株は同一起源というが，配列
umontreal.ca/）

淡水性で湖沼で大量発生してアオコを生成する．強力に明らかなちがいがあるので別の株である．形質転換のな肝毒性をもつミクロシスチンを合成する．ゲノムが決報告はまだない．

定されており，自然形質転換も報告されているが効率は2.2.11 その他のシアノバクテリア

低い．

このほかにも，海洋性で窒素固定を行うがヘテロシス

2.2.8 G lo e o ba c te r v io la c eus P C C 7421

トを形成しない Trichodesmium や Cyanothece, Crocos-

チラコイド膜をもたず，細胞膜にフィコビリソームや

phaera，また，食用として注目されている Arthrospira

光化学系が存在し，光合成を行う．そのため，培養液のplatensis（いわゆる〝スピルリナ"）などもゲノムとポス

pH が光合成に大きな影響を与えるというが，生理学的トゲノム研究が進んでいる．Trichodesmium は特有の赤な研究は少ない．系統的にもっとも古く分岐した原始的潮を発生させることでも有名である．これらは Arth-な種である．絶対光独立栄養増殖性．光合成色素として

rospira を除いては，まだ形質転換は報告されていない．

は，クロロフィル a，カロテノイドとフィコシアノビリ

A.platensis IAM-135 は NIES から入手できるが，他のン，フィコエリスロビリンをもつ．PCC から入手できる

株は海外の研究者から入手する必要がある．

が，国内の関連研究者からも入手できる．形質転換の報

これらの代表的な株のほかにも，多数のシアノバクテ

告はない．

リアが株保存施設に保存されている．日本では，国立環

2.2.9 P ro ch lo ro c o c cu s 類

境研（NIES）がほぼ一手に収集，保存，配布している．

海洋性で，クロロフィル a をもたず，ジビニルクロロ

また，野外からシアノバクテリアを新たに単離・無菌化

フィル a とジビニルクロロフィル b，カロテノイドをもすることも容易である．後述する BG11 培地などは汎用

ち，フィコビリンをほとんどもたない．世界中の海洋に培地として多くのシアノバクテリアが増殖でき，しかも広く分布し，生態学的に重要な種である．多数の培養株

無機培地のため雑菌はあまりよく増殖できないためであが樹立されており，その多くのゲノムも決定されている

る．自然界から単離されたばかりの株は多様な表現型（糸が，どれも形質転換法は確立されていない．
国内では扱っ状菌体 trichome の分岐，内生胞子 baeocyte の形成なている研究者が少ないので，多数の培養株を保有していど）や環境応答（補色順化や光屈性，多様な共生など）

る M assachusetts

T echnologyを示すことが知られており，興味深いものが多い．しかCyanobacteria Culture Collection (Sallie W.Chisholm)

し，これらの株を研究材料にするときには，上記の扱いから入手するのがよい．

やすい株と比べてさまざまな問題に遭遇する可能性があ

2.2.10 海洋性 S ynecho co ccus s p.

る．たとえば，制限系が発達しているなどの理由で形質InstituteofProchlorococcus 類と近縁で，様に世界中の海洋に広く転換ができないことも多い（５章 1‑a 参照）．また，陸生分布している．生態学的には沿岸性から大洋性まで多様の種は多糖類を分泌し凝集塊を形成し液体培養がむずかな種が記載・単離されている．光合成色素として，クロ

しいもの，オリゴトロフで増殖速度が極端に遅いもの，

ロフィル a，カロテノイド，フィコシアノビリン，フィコ

細胞 の外に厚い鞘をもち無菌化が難しいものなども多エリスロビリンのほかに，フィコウロビリンをもつことい．しかし，シアノバクテリアが生態学的に重要であるもある．青色光でフィコウロビリンの蓄積が誘導されるため，実に多様な種が研究の対象となっており，他の細新規の補色順化を示すものもいる．WH 8102 株などでは菌類と比べても特異な状況といえる．

形質転換法が報告されているが，例数が少ない．国内で

2.2.12 株名の規則は扱っている研究者が少ないので，多数の培養株を保有

最後に，光合成研究者にはあまり知られていない株のし て い る Woods Hole Oceanographic Institution

名前の規則について述べる．株の命名法では一般に PCC(WHOI) Cyanobacteria Culture Collection (John B.

や NIES などの保存施設の名前と番号がつけられるが，Waterbury)から入手するのがよい．

その株名はその施設から直接譲渡された場合のみ使用で

2.2.11 C yano pho ra pa rado xa

きるが，これを第３者に配布してはいけない．もしくは灰色藻．プラスチドにペプチドグリカンをもち，系統配布されたものには新たな株名 をつけ なければなら な的にもっとも原始的な真核生物である．NIES 547 株はい．例を挙げると，世の中で研究発表さ れ てい る Syne-

NIES（国立環境研）から入手できる．また，CCM P329

chocystis sp. PCC 6803 の大半は，本来はそのように名株のゲノムプロジェクトが進行しており，EST データ

乗ることは許されないものである．この規則は，株の培

ベース も ア ク セ ス で き る（ http://tbestdb.bcm.

養，維持の間に突然変異や培養時の形質の選択などが起2009 低 温 科 学

vol.6711

こることによる混乱を避けるためであるが，研究者のコ

液

NaNO

30g

ミュニティが発達しているシアノバクテリアの分野で

K HPO

0.78g

は，この規則に基づいて別の名前をつけるとむしろわかMgSO 無水

0.73g

りにくくなる．さらに皮肉なことに，世界中でもっとも

ddH O

1L

液

CaCl 無水

1.43g/100mL

液

Na CO

2g/100mL

広く使われているグルコース耐性株は PCC 株から直接に由来したものではなく，おそらく同じ起源の ATCC
27184 由来と考えられる．このような事態にもかかわらず，PCC 6803 の名前で広く流通していることを PCC が放置しているのは，その宣伝効果を考えてのことかもしれない．

A 6液（微量元素液）

2.3 株保存施設，シアノバク
PCC：Pasteur Culture Collection（仏）

H BO

2.86g

MnCl ･4H O

1.81g

ZnSO ･7H O

0.22g

CuSO ･5H O

0.08g

テリアの株保存の老舗．属名，type strain などを保持しNa MoO ･2H O

0.021g

更新している，多様な種，確かな株の品質維持では定評

濃硫酸

1dropletがあり，GenBank の生物名の根拠となっている．

Co(NO ) ･6H O

0.0494g

ddH O

1000mL

NIES：国立環境研究所，シアノバクテリアや藻類を広く収集しており，日本の株保存の中核組織である．水の華を引き起こす淡水性の Microcystis などをとくに多緩衝液 1M TES-KOH(pH 7.0‑8.2）

く収集している．
ATCC：American Type Culture Collection（米国），
UTEX，CCAP など多数の施設がある．ホームページな［培地の作製］
プレートの場合：

液：2mL/ 液：50mL/ 液：2

どで株を請求すると，スラントなどで送られてくるが，

mL/ 液：1mL/A6 液：1mL/1M TES-KOH：5mL/

通常は有償である．新たな株の培養は意外と難しいもの

チオ硫酸ナトリウム 3g/バクトアガー15g/純水：939

で，送られてきた細胞が増殖しないこともあるが，すぐmL＝計 1000mLにクレームをつければ再送付してくれるはずである．

＊アガーのみ別途オートクレーブする．アガーは，バ
クトアガー（Difco 社）を使用する．他社のものでは生育

2.4 シアノバクテリアの培地と培養
シアノバクテリアの培地は多数報告されているが，おが遅くなる．プレートでは，チオ硫酸ナトリウムに増殖の促進効果があるが，液体では多くの場合効果がない．
液体培地の場合：

液：2mL/ 液：50mL/ 液：2

おまかには栄養塩がリッチな BG11，これから窒素を除mL/ 液：1mL/A6 液：1mL/1M

いた BG11 ，やや貧栄養な AA 培地，海洋性の種を培養

mL/純水：924mL＝計 1000mL

TES-KOH：20する培地などがある．

液体培地はオートクレーブ後，室温保存できるが，沈2.4.1 B G 11培地

澱物を生じる．後で小分けにする場合は，よく混ぜて行下 記 の BG11 培 地 は Synechocystis だ け で な く，う．沈澱は不溶性の鉄の生成によるもので，マイクロア

Anabaena や Synechococcus, Thermosynechococcus な

レイ解析で鉄飢餓応答遺伝子が発現誘導されていること

どの多くのシアノバクテリアがよく増殖する．

がよくある． 液を別途オートクレーブすれば避けられる．

［ストック液］
液 Ferric ammonium citrate

0.3g［培養の一般的注意］

Na EDTA･2H O

0.05g

液体培地に通気する気体の無菌化には，青梅綿（脱脂

ddH O

100mL

していないもの）を約 5cm くらいかたく詰めた綿濾管（乾熱滅菌），または滅菌用フィルタ（ガス用，孔径 0.2

ddH O:deionized and distilled water12μm）を使用する．
シアノバクテリア

［Th ermos ynec h o c oc cu s elon g a tu s B P -1

プレート培養では生育が遅いので，空気循環しているおよび T. vulcanus R KN の培養］

インキュベータ内に放置すると，雑菌が混入することがある．一方，パラフィルムを巻けば雑菌の混入は防げる

培養温度の至適は 57℃であるが，形質転換のスクリーが，増殖は極端に遅くなり，高密度の増殖は期待できなニングや変異体の培養は 45℃で行うのがよい．生育の温い．私たちは空気の循環から遮断する透明なプラスチッ

度範囲は約 30℃〜59℃で，室温以下の温度では，低温障

クの箱に入れて培養している．この方法では，増殖は正害によって死滅しやすいので注意が必要である．また，常でしかもコンタミしない．また，箱内に炭酸ナトリウ

30℃以上の温度でも，低めの温度では光阻害が起こりやム溶液を一緒に入れておいて，プレートの乾燥と CO のすい．なお，ある程度培養させたプレートを室温に保存欠乏に対処している．

することは可能であり，DM SO を添加して凍結保存することもできる．

［凍結保存］

2.4.2 B G 11 および AA 培地

ジメチルスルホキシド（DM SO，最終５％）を含む

窒素源を含まない培地での培養は，窒素固定するシア

BG11 培 地 に 細 胞 を 懸 濁 し，ス ク リューキャップ のノバクテリアの維持には必須である．PCC の株リストに

チューブに入れて，−85℃のフリーザーで保存する．なは，「窒素固定をするはずだができない」などと記載されお，液体窒素中で保存する方がよいともいうが，液体窒た株が多いが，これらは通常の BG11 培地などで維持さ素はチューブ内に入るため，雑菌が混入する可能性があれる間に生じた変異体である．

る．
［培地の作製］［ S yn ec h o c ys tis s p. P C C 6803の培養］

BG11 培地は，窒素源を含まない BG11 培地である．

至適温度約 34℃．白色蛍光灯などによる連続光照射す

上 記 の BG11 培 地 か ら NaNO を 除 い て 作 製 す る．

る．光強度は，約 50‑100μE・m ･s ．液体培地の場合

Anabaena や Nostoc など窒素固定するシアノバクテリ

は，炭酸ガス（1‑3％）を通気すると増殖は速くなり，最アの培地としてよく使われている．一方，Allen and

終到達濃度も高くなる．倍加時間は約８時間だが，単なArnon（AA）培地は，窒素源を含まないやや貧栄養の培る振盪培養では．約 24時間以上．プレートでは，数日で地である．これを ddH O によって４倍に希釈したもの

濃い青緑色に増殖する．プレートでの増殖には数日以上

が AA/4 培地である．

要するので，寒天培地が乾燥したり．蓋に水滴がつかな

まず，以下の＋Pi 溶液と−Pi 溶液を作製する．

いように注意する．なお，保存にはパラフィルムでシー①＋Pi 溶液

ルするとよいが，パラフィルムは増殖を阻害するので，

K HPO ･3H O 28.0g/500mL H O（無 水 K HPO

培養中はシールしない．グルコースを添加すると生育を21.4g/500mL でもよい）改善できることが多いが，培養が古くなると死滅しやす

オートクレーブし，４℃で保存．

くなるという欠点もあるので，株の維持にはあまり薦められない．培養に使用する薬剤については，表１に示す．

②−Pi 溶液
以下の（a）〜（d）の溶液を 1：1：1：1で混合し，４℃で保存．

表 1：Synechocystis 培養におけるグルコースと薬剤のストック液
ストック液

最終濃度

特徴

グルコース

2M

5mM

呼吸基質

DCM U

20mM /EtOH

10μM

光合成系２の阻害剤

カナマイシン

20‑50mg mL

20μg mLTn5 由来スペクチノマイシン

40mg ml

20μg mL

aadA，ストレプトマイシン耐性もあり

クロラムフェニコール

50mg mL EtOH

25μg mLpACYC184 由来

エリスロマイシン

100mg mL EtOH

20μg mL

黄色ブドウ球菌由来

0.2μm フィルターで濾過滅菌する

2009 低 温 科 学

vol.6713

（a) M gSO ･7H O 20g/500mL H O（オート ク レー
ブ，４℃で保存）（b) CaCl ･2H O

6g/500mL H O（オートクレーブ，

４℃で保存）（c) NaCl

20g/500mL H O（オート ク レー

ブ，４℃で保存）（d) M icroelement stock （オート ク レーブ し な い，
４℃で保存）Na β-glycerophosphate･5H O

5mg

MgSO

2mg

Vitamin B

0.01μg

Biotin0.01μgThiamine HCl

1μg

PIV metals

0.3mL

Tris(hydroxymethyl)aminomethane 50mg
99.7mL

Distilled water
pH 7.5液体培地を作る場合，970mL の H O に，＋Pi 溶液を【PIV metals】

25mL，−Pi 溶液を 6.25mL を加え，オートクレーブす

FeCl ･6H O

19.6mgる．
＋Pi 溶液と−Pi 溶液は沈殿を形成するので，先に混

MnCl ･4H O

3.6mg

ぜないこと．また，プレートを作製する場合は，10g のZnSO ･7H O

2.2mg

バクトアガーを 1L の AA 培地に加えてオートクレー

CoCl ･6H O

0.4mg

ブする．プレートはパラフィルムで封をし，４℃で保存

Na MoO ･2H O

0.25mgする．

Na EDTA･2H O

100mg

Distilled water

100mL［ No s to c punc tifo rme ATC C 29133の培養］
24〜31℃の範囲で培養する．通気培養・振盪培養いず

Cyanophora paradoxa NIES 547 は液体のＣ培地を用れも可能だが，細胞が増殖すると凝集して沈殿を形成しいて 25℃で１％ CO を含む空気を通し，白色光を照射やすい．AA 培地や窒素源を除いた BG11 培地，AA プ

して培養する．光強度は 20〜30μE m sec 程度．増殖

レートで増殖する．BG11 培地や，窒素を加えた AA 培地

速度が遅いので，雑菌の混入がないように留意する．混では増殖が速くなるが，長期間培養を続けると窒素固定

入すると，さらに増殖は遅くなり，最終の細胞密度も低能が低下する可能性がある．Jack Meeks らは Nostoc の下する．なお，寒天培地では増殖しない．また，凍結保液体培養には AA 培地を４倍に希釈して用い て い る

存もできないと思われる．

（AA/4 培地）．
2.4.3 C yano pho ra の培養方法［細胞の回収とシアネル（プラスチド）の単離］【Ｃ培地】

以下の方法で穏和に細胞を破砕する ．

Ca(NO ) ･5H O

15mg

KNO

10mg

１．培養液を 2,000×g で 10分間遠心し，細胞を回収す
る．
２．回収した細胞を等張の HEMS buffer を用いて２回以下の試薬を溶解して混ぜて調製する．
１) Double distilled water
545mL２) H BO (boric acid）
286mg
３) M nCl ･4H O
180mg
４) M oO （純度 85％)18.0mg(又は Na M o4･2H O 純度 99％，30.5mg)５) ZnSO ･7H O
22.0mg６) CuSO ･5H O
7.9mg
７) CoCl ･6H O
4.0mg
８) NH VO (NH metavanadate)
2.3mg９) Fe-EDTA 溶液
80mL
Fe-EDTA 溶液の作製法
2.6g の KOH を 93mL の H O に 溶 か し，さ ら に 10.2g のNa EDTA･2H O を加えて溶かす．そして，6.9g の FeSO ･（または Fe (SO )・nH O）を 182mL の H O に溶かす．
7H O
二つの溶液を混ぜ合わせると濁りが除かれる．フィルター（Millipore，孔径 0.45μm）を通した空気を約４時間通気する．
溶液が褐色から，赤ワイン色に変化する．その後，４℃で保存
する．

14

洗浄．
３．細胞を HEMS buffer で再懸濁したものを，低張のHEM buffer で 10倍希釈する．これによって浸透圧により細胞膜が壊れる．
４．2,500g で 10分間遠心し，シアネルを回収する．
※この方法では遠心によって，壊れた細胞膜も一緒に回収されてしまう．タンパク質の輸送実験などに用いる
高純度のシアネルを単離するには，この標品をさらにパーコールなどの密度勾配遠心分離法によって精製す
る．
【HEM S buffer】
50mM HEPES-NaOH（pH 7.5）2mM EGTA
シアノバクテリア

10mM NaCl
1mM MgCl
0.5M sucrose【HEM buffer】
50mM HEPES-NaOH（pH 7.5）2mM EGTA
10mM NaCl
1mM MgCl

文献１) T.Kaneko, S.Sato, H.Kotani, A.Tanaka, E.Asamizu, Y.Nakamura, N.Miyajima, M.Hirosawa, M .
Sugiura, S.Sasamoto, T.Kimura, T.Hosouchi, A.Mat-

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suno, A.M uraki, N.Nakazaki, K.Naruo, S.Okumura,2009 低 温 科 学

vol.6715

1章

植物・藻類・細菌の材料の入手と栽培・培養

３．クラミドモナス
福澤 秀哉 ，久保雄昭

緑藻クラミドモナス（和名，コナミドリムシ）は最も単純な細胞構造を持つ真核光合成生物であることから，古くから光合成研究に用いられてきた ．2007年秋，日米欧の研究者の協力によって JGI（http://genome.jgi-psf.org/）から雌株ゲノムのドラフト配列が公開された ．細胞の形質転換法の確立やレポーター遺伝子の整備も進み，高等植物（シロイヌナズナ）と原核光合成微生物（シアノバクテリア）との間の橋渡しをするモデル生物として利用されている．光合成を行ない鞭毛によって泳ぎ回るこのユニークな単細胞性の緑藻（鞭毛虫）には，太古の原始細胞が植物細胞や動物細胞に分岐した進化のヒントが秘められている．ここでは，クラミドモナスの特徴について概説するとともに，ク
ラミドモナス実験室株の入手法や培養法について述べる ．

Resources and culture of the green algae
Hideya Fukuzawa, Takeaki Kubo
Chlamydomonas reinhardtii is a biflagellate green alga, which has the simplest system in photosynthetic eukaryote. M oreover, the draft genome sequence of Chlamydomonas that has features similar to both plants andanimals has been released in 2007. In this chapter,we introduce the characteristics of this unicellular organismand how to obtain and maintain the laboratory strains.

3.1 クラミドモナスの特徴
クラミドモナス Chlamydomonas reinhardtii は分子

ム地図が整備されている．
⑥ 核，葉緑体でそれぞれ機能するレポーター遺伝子（ARS ，Luciferase ，GFPなど）や形質転換体の遺伝学的手法を取りうる唯一の緑藻で，学術雑誌 Cell に選抜に使用可能な薬剤耐性マーカー遺伝子（ゼオシン，〝Green Yeast" と紹介され ，動植物の特徴を兼ね備え

パロモマイシン，ハイグロマイシンなど）が使える．

ている
（図 1）
．クラミドモナスは雌雄異株で mt と mt

⑦ 多細胞体制をとるボルボックスやゴニウムやプレオという２つの性（接合型）に分かれており，どちらも有ドリナなどの群体性藻類と進化上近縁であり，クラミ

性生殖と無性生殖の両方の生活環を持つ（図 2）．葉緑体

ドモナスの比較研究から多細胞生物の起源を示唆する

ゲノム（203kb）が最初に発見され ，その形質転換が最初に成功した生物種である ．現在では核（約 120M b，n＝17）とミトコンドリアを含めた３つのゲノムすべてについて遺伝子導入が可能となっており，次のような特徴を持つ ．
① 光合成，呼吸，生殖，（母性）
遺伝，鞭毛運動などの生命現象に関わる変異株の単離が容易である．
② 葉緑体，チラコイド膜などの細胞構成成分の単離が比較的容易である．
③ 培養が容易で，世代時間が約５時間と短い．
④ 雄雌株を掛け合わせ，四分子を使った遺伝解析ができる．
⑤ ドラフトゲノム配列と EST 配列が公開され，ゲノ
１) 京都大学大学院生命科学研究科遺伝子特性学分野

2009 低 温 科 学

vol.67

図 1：クラミドモナスの光学顕微鏡写真
クラミドモナスは等長の二本の鞭毛で遊泳し，一つの大きな葉緑体で光合成を行う真核性緑藻である．葉緑体の中に見える構造体は「ピレノイド」と呼ばれる構造体で，炭酸固定の場になっている（矢印）．スケールバーは 5μm を示す．

17

研究も進められている．また，炭酸固定を制御する因機関から入所可能であるが，米国のクラミドモナスセン子

ターが最も規模として大き い．ウェブ サ イ ト（www.

や，ピノレン酸（松の実に多く含まれる脂質）の生合成に関わる脂肪酸不飽和化酵素など多様な研chlamy.org）で情報を検索することができ，有償で分譲

究に利用されている．

を受けることができる．EST 解析に用いられた野生型雄

現在，実験室で利用されている株の多くは，1945年に

株 C-9（mt−）は，文部科学省ナショナルバイオリソー

G.M.Smith 博士が米国マサチューセッツ州の Amher-

スプロジェクトで支援を受けて国立環境研究所の微生物

st のジャガイモ畑で採取された雌雄一対の株に由来す

系統保存施設（http://mcc.nies.go.jp/）で NIES-2235 株

る ．

として保存されており入手できる．EST クローンは，かず さ DNA 研 究 所（http://est.kazusa.or.jp/en/plant/chlamy/EST/）から入手できる．また，C-9 株のゲノム

3.2 ゲノムプロジェクト

クローンと完全長 cDNA クローンについては，京都大学

クラミドモナスのゲノムサイズは約 120M bp で，その13倍をカバーするショットガン配列データから 1,557（http://chlamy.pmb.lif.kyoto-u.ac.jp/）から公開される予定である．

スキャフォルドの配列が米 国 DOE-JGI か ら 公 開 さ れた ．配列はウェブサイト上で閲覧や BLAST 検索も可能 で あ る（http://genome.jgi-psf.org/Chlre3/）．こ の

3.4 培地と培養法

ショット ガ ン ゲ ノ ム 解 析 に は，雌 株 CC-503（cw92，

クラミドモナスは，液体培地，寒天培地のいずれでもmt＋）が用いられた．このゲノムについては，遺伝マー培養が可能である．標準的な培地としては酢酸を炭素源

カーの連鎖解析から染色体数は 17本と推定されていたとして含む TAP 培地と，独立栄養培養に適した最小栄が，74本のスキャフォルドが 17本の染色体を形成し，ゲ

養 HSM 培地がある ．長期で保存するときには，斜面

ノムの 78％に相当する 95M bp の領域をカバーしてい

TAP 培地を作製し 18℃で保存が可能である（通常２−

る．EST 情報と遺伝子予測プログラムを用いて，15256

３ヶ月程度）．
また液体窒素中での凍結保存技術も確立さ

種 の 蛋 白 質 コード 領 域 が 推 定 さ れ，そ の う ち 56％のれつつある（www.chlamy.org/methods/）．ここでは，

8,631種の発現が EST 情報より確認されている．雄株に標準的な培地である TAP ならびに HSM 培地（液体・プ

ついては，日本で C-9 株を標準株として，ゲノムライブ

レート）の作製法と培養法，クラミドモナス保存用のスラリーならびに EST 解析が進められている

ラント培地について述べる．

．これまでに，低 CO ストレス ，強光ストレス ，配偶子誘
導 ，概日リズム ，接合子形成に関する遺伝子が，cDNA アレイを用いて同定されている．特にこの cDNA

［準備］
・TAP 培地

アレイ作製には，多くの国内クラミドモナス研究者と「かTAP 塩ストック液

10ml

ずさ DNA 研究所」が協力した．現在も「クラミドモナス

リン酸ストック液

1ml

研究会」で活発な情報交換が行われている．

Hutner トレースエレメント10ml

染色体上の遺伝子地図と物理地図，さらにゲノム配列

(寒天末

15g )

のデータベースの充実によって，目的の遺伝子を単離す

＋蒸留水

1L

るポジショナルクローニングが可能になりつつある．ゲ

任意の容量に分注後，オートクレーブする．

ノムライブラリー，EST ライブラリーの標準化が進められており，簡便な形質転換法が確立されている（第５章‑

・TAP 塩ストック液

2参照）
ので，他の生物を扱っている研究者も容易に利用

NH Cl

40g

できる環境が整ってきた．

MgSO ・７ H O

10g

CaCl ・２ H O

5g

3.3 株ならびにプラスミド D NA 等の
入手方法

Tris

242g

酢酸

100ml

＋蒸留水

1L

クラミドモナスの実験室株（野生株ならびに突然変異
株），ならびに各種有用プラスミド DNA は，複数の保存18

緑藻クラミドモナスの入手と培養

・リン酸ストック液
10.8g

K HPO
KH PO

5.6g

＋蒸留水

100ml

・Hutner トレースエレメント
Na -EDTA

5.0g

ZnSO ・7H O

2.2g

H BO

1.14g

MnCl ・4H O

0.51g

CoCl ・6H O

0.16g

CuSO ・5H O

0.16g(NH ) M o O ・4H ０

0.11g

FeSO ・7H O

0.50g

KOH

1.6g

＋蒸留水

1L

オートクレーブして室温に２日ほど保存すると，緑色から赤紫色に変色する．
・HSM 培地
No.１ストック溶液

10ml

No.２ストック溶液

10ml

Hutner トレースエレメント

10ml

(寒天末

15g )

＋蒸留水

1L

2M KOH で pH 7.0に調整する．ただし，培地の pH 変

図 2：クラミドモナスの生活環
クラミドモナスは雌雄の性（接合型）をもつ栄養細胞がそれぞれ独立して無性分裂を繰り返す無性生殖サイクルと，窒素源枯渇によって誘導される配偶子分化，両配偶子による鞭毛凝集，接合子形成を経て２セットの雌雄娘細胞を形成する有性生殖サイクルを持つ．スケールバーは 5μm を示す
（文献２を
改変）
．

化を抑えたい場合は，終濃度 20mM M OPS バッファー（pH 7.2）を添加する．任意の容量に分注した後，オートブ），または 20〜30ml の TAP 培地を分注した 100ml

クレーブ処理する．

容の三角フラスコに無菌的に接種する（図 2‑A）．
２) 100〜150μmol m・No.１ストック溶液

sec の光照射下で静置培養す

る．細胞は３〜４日ほどで対数増殖期に達する．

NH Cl

50g

MgSO ・7H O

2.0g

CaCl ・2H O

1.0g

＋蒸留水

1L

３) 常に実験に使用できる前培養溶液として７日〜10
日毎に新しい TAP 培地に植え換える．
Ｂ．TAP プレートでの培養
１) スラントまたは TAP 寒天培地上に生えているクラ・No.２ストック溶液

ミドモナスのコロニーを，滅菌した白金耳，ニクロム

K HPO

144g

KH PO

72g

＋蒸留水

1L

線または爪楊枝で画線培養する．
２) プレートを逆さまにして 100〜150μmol m

secの光照射下で培養する．３〜４日ほどで寒天プレート
上にシングルコロニーを形成する（図 2B）．

Ａ．TAP 培地での前培養
１) スラントまたは TAP 寒天培地上に生えているクラ

３) サージ カ ル テープ を 巻 い て 乾 燥 を 防 ぎ，５〜20μmol msec の比較的暗い場所で保存する．

ミドモナスのコロニーを，5ml の TAP 培地を分注した試験管（例えば，14ml 容のポリプロピレンチュー2009 低 温 科 学

vol.6719

Ｃ．TAP （液体）での培養

ラント培地上に細胞が生えてきたら，弱光下（５〜20

１) 乾熱滅菌処理した 100ml 三角フラスコに TAP 培

μmol m

地を 50ml 分注する．

sec ），18℃で培養する．

５) スラント培地上の細胞の様子を観察しながら，２２) TAP 液体培地で前培養していたクラミドモナス培〜３ヶ月に一度植え換えを行う．

養液を 1/100〜1/50希釈で接種する．
３) 約 80rpm で 攪 拌 し な が ら，100〜150μmol m
sec の光照射下で培養する．３〜４日で対数増殖期に達する（図 3C）．

Ｅ．HS M（液体・寒天）培地での培養
１) 通気用シリコンチューブと培養栓〔例えばシリコセ
ン（信越ポリマー株）〕付の大試験管を乾熱滅菌処理し，これに HSM 培地を 50ml 分注する．

Ｄ．スラント培地でのクラミドモナス細胞の長期保存
１) TAP(＋1.5％の寒天末）に終濃度 0.4％(W /V）の割
合で Yeast Extract（DIFCO 社）を加え，湯浴させて

２) TAP 培地で前培養していたクラミドモナス培養液
を 1/100〜1/50希釈で接種する．
３) お だ や か に 通 気 し な が ら，100〜150μmol m

溶解させた後，スクリューキャップ付きガラス試験管

sec の光照射下で培養する．３〜４日で対数増殖期に 5ml 分注し，オートクレーブ処理する．

に達する（図 3C）．

２) オート ク レーブ 後，固 ま る 前 に ガ ラ ス 試 験 管 を
チューブラックに立て，傾斜をつけてスラント培地を注意>照度を下げて前培養時した細胞を植え替えて，急固化させる．

に照度を上げると細胞が白化する場合があるので，照３) 寒天プレート上のクラミドモナスのコロニー，ある度は測定して管理する必要がある．

いは前培養の TAP 培地から白金耳を用いて，スラン
ト培地に画線培養の要領で接種する（図 3A）．
４) 100〜150μmol m

sec の光照射下で培養し，ス

謝辞>貴重なコメントを頂いた京都大学大学院理学研究科の西村芳樹先生に感謝します．

図 3：クラミドモナスの培養の様子．
A．クラミドモナス細胞を TAP 培地（5ml；14ml 容ラウンドチューブ）に静置培養したものと，長期保存用のスラント培地（スクリューキャップ付きガラスチューブ）で培養したもの．B．クラミドモナス細胞を画線培養した TAP プレート．シングルコロ
ニーを形成する．C．TAP 培地（100ml 三角フラスコに 20ml の培養液）での静置培養，ならびに大試験管での通気培養．右は，50ml の HSM 培地に，滅菌フィルター（直径 25mm，ポアサイズ 0.2μm のシリンジフィルター）を通して通気している．

20

緑藻クラミドモナスの入手と培養

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Fukuzawa,& Y.M atsuda,Curr.Genetics 46(2004)P.304.
17) K.Kucho, K.Okamoto, S.Tabata, H.Fukuzawa, &M.Ishiura, Plant Mol. Biol. 57 (2005)P.889.
18）T.Kubo, J.Abe, T.Oyamada, M .Ohnishi, H.Fukuzawa,Y.M atsuda,& T.Saito,Plant Cell Physiol.49 (2008)
P.981.
19）T.Kohinata, H.Nishino & H.Fukuzawa, Plant Cell
Physiol. 49 (2008)P.273.
20）M .Kajikawa, K.T. Yamato, Y.Kohzu, S.Shoji, Y.
Sakai & H.Fukuzawa, Plant Cell Physiol. 47: 64‑73(2006).

(1999)P.353.

2009 低 温 科 学

vol.6721

1章

植物・藻類・細菌の材料の入手と栽培・培養

４．ゼニゴケの培養法
大和 勝幸 ，石崎

公庸 ，河内孝之

ゼニゴケは，陸上植物の進化を考える上では基部陸上植物の１つとして鍵となる存在である．近年，
形質転換法やゲノム情報などの分子生物学的ツールが整備され，実験生物として注目されはじめている．新たなモデル植物としてのゼニゴケの特性を紹介しつつ，その基本的な扱いについて紹介する．

The basics of cultivating the liverwort

L.

Katsuyuki T.Yamato, Kimitsune Ishizaki, Takayuki Kohchi
The liverwort Marchantia polymorpha L. is one of the basal land plants that occupies a key position in theevolutionary tree of land plants. This inconspicuous plant is easyto grow,cross,and transform,and its genomic
resource is being accumulated, which has made it an emerging model plant. Here we describe basic protocols
to culture, cross, and store M. polymorpha plants and cultured cells.

4.1 ゼニゴケとは4.1.1 進化的位置付け（図 2）．ゼニゴケにおける生殖生長への移行機構は不明
であるが，長日条件および遠赤色光照射により促進されることが報告されている ．ゼニゴケは雌雄異株であり，世界中に広く分布し，日本でも建物の日陰などで比較

性染色体をもつ（雌，n＝８＋X；雄，n＝８＋Y）．生殖

的容易に見つけることができる．一般には「嫌われ者」

生長相に移行すると雄株は造精器をもつ雄器托を，雌株のゼニゴケだが，進化的には興味深い生物である．植物は造卵器をもつ雌器托を形成する．雄器托に雨などの水は水中で出現した光独立単細胞生物に起源を有し，約４がかかると造精器より運動能のある精子が放出される．

億 5000万年前に陸上化を果たしたと考えられている．
そ

精子は２本の鞭毛を用いて水中を泳ぎ，周辺の雌株上のの後，コケ植物が陸上植物としては最も初期に分岐し，造卵器に到達して受精が成立する．受精卵（2n）は体細植物の系統において「基部陸上植物」と位置付けられている（図 1）．一般には一つの植物群として扱われがちなコケ植物であるが，実際には「タイ類」
「セン類」
「ツノ
ゴケ類」という，それぞれが４億年を超える進化の歴史をもつ３つの群で構成されている．そして，コケ植物の中でもさらに基部に位置すると考えられているのがタイ類であり，タイ類の代表とも言える の が ゼ ニ ゴ ケ（ Marchantia polymorpha）である．遺伝子ターゲティン
グが容易なことで知られるヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）もコケ植物ではあるが，セン類に属する．ゼニゴケは陸上植物の進化を考える上で極めて重要な位置にあり，現在の多様化した陸上植物に見られる様々な現象の理解に大きく貢献すると期待されている．
4.1.2 生活環
ゼニゴケの生活環は種子植物のものとは大きく異なり，配偶体，すなわち半数体（n）の状態が大半を占める
１) 京都大学大学院生命科学研究科遺伝子特性学分野

2009 低 温 科 学

vol.67

図 1：植物の進化系統樹と陸上化
ゼニゴケは約 4.5億年前に最初に陸上化を果たした植物の現生種であると考えられている（文献 より改変）．

23

図 2：ゼニゴケの生活環
ゼニゴケは，通常は配偶体（n）として存在し，胞子体（2n）である期間は受精後胞子を形成するまでの限られた期間のみである．
また，無性生殖でも有性生殖でも増殖することができる．

胞分裂を続けた後，減数分裂を経て半数体の胞子（n）を形成する．胞子は発芽して葉状体へと生長する．葉状体には杯状体と呼ばれる器官が形成され，その中に多数の無性芽が生じる．個々の無性芽は杯状体底部の始原細胞１個に由来し，成長して葉状体となる．無性芽はそれを生じた個体のクローンなので，遺伝的に均一な植物体を容易にかつ大量に得ることが可能である．
4.1.3 形態
ゼニゴケの形態は単純であり，栄養生長相では葉状体が主たる器官である（図 2）．生長点は葉状体の先端部に位置し，周期的に二分して特徴的な二叉構造を形成する．
ヒメツリガネゴケの茎葉体の葉は１層の細胞層からなるが，ゼニゴケの葉状体には分化した細胞からなる複数の組織層が見られる．葉状体の表面は気室と呼ばれる構造で構成される（図 3）．気室上部は１層の細胞層からなり，中央にガス交換のための気室孔がある．気室孔は気孔と類似しているが，気孔のように開閉することはない．気24

図 3：葉状体の断面
葉状体は異なる組織に分化した細胞層で形成されている．表層は気室が占めており，内部には葉緑体に富む細胞が多数存在する．気室には気室孔（矢頭）が存在し，ガス交換を行う．
白線は 100μm を示す．
ゼニゴケの培養法

室内には葉緑体に富む細胞が多数存在し，同化組織を形でき，当代で表現型を観察することができる ．また，葉成している．気室層の下には葉緑体に乏しい大型の細胞

緑体 DNA の形質転換はシロイヌナズナでは困難である層があり，葉状体の裏面には鱗片や仮根が形成されていが，ゼニゴケでは培養細胞・植物体を問わず可能である

る．生殖器官としては，有性生殖に雌器托および雄器托，（5.3b 千代田らの項参照) ．

無性生殖に杯状体および無性芽を形成する．
4.1.4 ゼニゴケを用いた研究

昨今のモデル生物に欠かせないリソースとして，ゲノム情報がある．これまでゼニゴケのゲノム情報は，オル

ゼニゴケは世界各地に分布する身近な植物であったこ

ガネラ，性染色体および EST に限られていたが，米国エとから，古くから研究され，19世紀前半からゼニゴケに

ネルギー省 Joint Genome Institute の Community Se-

関する学術論文が発表されている．興味の対象は分類のquencing Program によりゼニゴケ全ゲノム・ショット

他，進化，形態形成，光応答，遺伝，二次代謝など多岐

ガン・シーケンシングが実施されることが 2007年に決定にわたる．ゼニゴケを用いた研究のうち植物科学にインされている（http://www.jgi.doe.gov/sequencing/why/

パクトを与えたものとして，1986年の大山らによる葉緑．本稿執筆時点ではパイロット段階である
99191.html）

体 DNA 完全解読を挙げることができる ．葉緑体ゲノが，近く本格的に解読作業が開始される予定である．

ムの全容が明らかになったことで，光合成装置を構成す
る数多くの因子の存在が示された．また，植物としては初めてミトコンドリア DNA および性染色体 DNA が解読され，陸上植物の進化を考察する上でも鍵となる情4.2 標準系統
著者らが実験に用いているゼニゴケには培養細胞およ報を提供している．

び植物体があり，いずれの系統も筆者らの研究室より分

4.1.5 モデル光合成生物としてのゼニゴケ与している．

基部陸上植物であるタイ類は植物の陸上化後最も早く

4.2.1 培養細胞

分岐したことから，現生陸上植物の共通祖先がもつ「単熊本大学の小野らにより確立されたもので ，ゼニゴ

純さ」を保持していると考えられる．実際，著者らの研ケ葉緑体およびミトコンドリア DNA の全塩基配列解読

究で，タイ類ゼニゴケにおいて制御系の遺伝子構成が比にはこの系統が用いられた較的単純であることが示唆されている．例えば，植物の胞を大量に得ることができる．また，他の多くの培養細主要な光受容体フィトクロムの遺伝子はシロイヌナズナ

胞系統と異なり葉緑体が発達しているため，光合成・葉で５個存在するのに対し，ゼニゴケでは１個である．シ

緑体の実験に適している．

ロイヌナズナなどの被子植物では，組織や環境に応じた

4.2.2 植物体

．増殖能に優れ，均一な細精巧な制御を行うことができるが，これは制御系遺伝子

著者らは京都に自生するゼニゴケを採取し，単一の無群の重複によるところが大きい．しかし同時に，遺伝子性芽に由来する標準系統を確立した（表 1) ．いずれのの重複はその制御系を理解する上で大きな妨げとなる場

系統も無性芽の無菌培養により継代されている．前述の合が多い．この点で，単純な制御系を備えたゼニゴケは通り，ゼニゴケ葉状体は半数体であるため，いずれの系

植物における様々な制御系を理解するための優れたモデ

統も基本的に「純系」である．しかし，同一群落から採ルとなりうる．

取した雄株と雌株であっても遺伝的多型が見られるのでゼニゴケは実験生物としても適している．まず，生活注意が必要である．現在までに Tak-1 株を Tak-2 株に環のほとんどが半数体の配偶体であるため，変異処理後４回戻し交配した植物体が得られている．なお，Ｙ染色

直ちに表現型を観察することができ，変異体の作出に有体塩基配列の解読には Tak-1 株が用いられ，全ゲノム配利である．また，雌雄異株であるため，除雄などの操作

列解読にはこの戻し交配株が用いられる．

が不要で交配が容易である．有性生殖および無性生殖のいずれでも増殖し，交配による子孫の作成およびクローンの作成・維持が可能である．さらに，遺伝子の機能解4.3 培養法

析に必要不可欠である形質転換法も確立されている．胞

ここでは培養細胞および植物体の培養方法について解子を発芽させて約１週間の組織を用いることで，パー説する．いずれの培養法も，光および温度条件は以下のティクルガン法でもアグロバクテリウム法でも核ゲノム通りである．

への遺伝子導入が可能である（5.3a 石崎らの項参照) ．

光量：連続光 50〜60μmol photons m s （約 20〜

特に後者は１度の処理で多数の形質転換体を得ることが30cm 離して並行に設置した２〜３本の 40W 白色蛍光2009 低 温 科 学

vol.6725

表 1：ゼニゴケ Marchantia polymorpha L.標準系統
系統名

略記

性

採取場所

文献

Takaragaike-1 Tak-1 ♂
Takaragaike-2 Tak-2 ♀

宝ヶ池周辺（京都市左京区） ８）

Kitashirakawa-1 Kit-1 ♂
Kitashirakawa-2 Kit-2 ♀

京都大学理学部附属植物園 友金ら（未発表)

かつては雄株雌株共に「Ｅ系統」と呼ばれていたが，常染色体に多型が存在するため，
現在では別系統として扱っている．

表 2：培地および各種ストック溶液の組成灯から約 30〜40cm 下の光量）
温度：22℃（30℃前後で生育が阻害される）
4.3.1 培養細胞
ゼニゴケ培養細胞の維持には光照射が必須なので注意すること．
4.3.1.1 液体培養
綿栓もしくはシリコ栓で栓をした三角フラスコに，その表示容量の 1/4程度の 1M 51C 液体培地（表 2）を加える（例：300ml フラスコなら 70ml 程度）．約 10ml の培
養細胞懸濁液を加え，130rpm で培養する．１週間毎に培養細胞懸濁液 10ml 程度を新しい培地に加えて継代する．
4.3.1.2 固体培養
1M51C 寒天培地（表 2）を用いる．約１ヶ月に１回継

0M 51C/1M 51C 培地（1l 用）
10×0M 51C ストック溶液
100ml
2％ スクロース
20g
0.03％ Ｌ‑グルタミン
0.3g
0.1％ カサミノ酸
1.0g・1M51C 培 地 の 場 合 は 2，
4‑D ス トック 溶 液 2ml を加える
・1N KOH で pH 5.5に調整する・固体培地とする場合には寒天 14g を加える
・15〜20分間オートクレーブ滅菌
・室温または４℃で保存
2，
4‑D ストック溶液（50ml 用）
2，4‑ジクロロフェノキシ酢酸 25mg
・1N KOH 水溶液を適宜加えて溶解させた後にメス
アップ
・−30℃で保存

代する．
4.3.2 植物体
ゼニゴケ植物体は開放的にも無菌的にも培養できるので，実験に適した培養法を選択する．
4.3.2.1 無菌培養
植物体の無菌培養には 0M 51C 寒天培地（表 2）を用いる．著 者 ら は 直 径 9cm，深 さ 2cm の プ ラ ス チック
シャーレに厚さ 1cm 弱の寒天培地を調製している．植物体を植えた後，シャーレの外周を通気性のある粘着テープ（例：3Ｍ社製マイクロポア

サージカルテープ）でシールする．継代は，まず新しい培地に滅菌水を数滴たらし（図 4A）
，無性芽を杯状体ごと採取（図 4B），新
しい寒天培地に移し（図 4C），滅菌水を数滴垂らして無性芽を培地表面に拡げる（図 4D）．この際，先曲がりピンセットを利用するとよい．約１ヶ月で次世代の無性芽を回収できる．
無性芽の代わりに葉状体断片を新しい培地に移植してもよい．生長点を含む断片はその生長点が生長を続け，生長点を含まない断片は切断面から新しい葉状体を再生する．但し，無性芽を用いた場合の方がより良好に増殖する．
4.3.2.2 開放培養
タッパーやカップなどの適当な容器にバーミキュライ
26

10×0M 51C ストック溶液（4L 用）
80g
KNO
16g
NH NO
14.8g
M gSO ・7H O
12g
CaCl ・2H O
11g
KH PO
1.6g
EDTA-NaFe (III)40ml
B 5‑微量成分溶液40ml
B 5‑ビタミン溶液
0.75％ KI 溶液
4ml
・−30℃で保存
・100ml ずつチャック付ポリ袋に分注して保存すると便利
B 5‑微量成分溶液（100ml 用）
NaM oO ・2H O
CuSO ・5H O
CoCl ・6H O
ZnSO ・7H O
M nSO ・7H O
H BO
・−30℃で保存

25mg
2.5mg
2.5mg
200mg
1g
300mg

B 5‑ビタミン溶液（100ml 用）
イノシトール
ニコチン酸
ピリドキシン塩酸塩
チアミン塩酸塩
・−30℃で保存

10g
100mg
100mg
1g

ゼニゴケの培養法

る．現在，遠赤色光 LED は複数のメーカーから入手可能
で，著者らは三洋電機株式会社製の LED 光源システム（近赤外線 LED 基板：MIL-IF18(A），発光極大波長 734
nm，半値巾 13nm 光源フレーム MIL-U200，光源コン
トローラ MIL-C1000T）を利用している．白色蛍光灯の間に LED パネルを設置し，その直下に植物体を置く．２
週間程度で生殖器の形成が始まるが，雄の場合精子を生じるまでにさらに２〜３週間を要する．遠赤色光 LEDはゼニゴケの安定した生殖器誘導に極めて有効である
が，初期投資が大きいのが難点である．
4.4.1.2 遠赤色蛍光灯
遠赤色光 LED の代わりに遠赤色蛍光灯を白色蛍光灯に加えて使用してもよい．この場合，40W 白色蛍光灯１本に対し，20W 遠赤色蛍光灯２本の割合で設置する．遠赤色蛍光灯は東芝（FL20S-FR-74）から入手可能である．
遠赤色光を加えた植物育成用蛍光灯も市販されている
図 4：無性芽の無菌的継代Ａ，シャーレに滅菌水をたらす．Ｂ，杯状体ごと無性芽を採取する．Ｃ，シャーレに移す．Ｄ，ピンセットで拡げる．

が，期待される効果は得られていない．
4.4.1.3 白熱電球
80〜100W の白熱電球で連続照射する．植物体との距
離は 40〜50cm が適当であるが，多量に発生する熱線を

ト を 3〜4cm 厚 に な る よ う 敷 き，Hyponex の 500〜

カットするために熱カットフィルターが不可欠である．

1000倍希釈溶液を注ぐ．この際，Hyponex 希釈溶液の著者らは市販の角形シャーレ（例：Corning 社製 431110

液面がバーミキュライトの表面を超えない程度にする．

番）に約 50mM EDTA 水溶液を封入したものを白熱電

無性芽，葉状体あるいは胞子を植え，バーミキュライト

球の直下に吊り下げて使用している．白熱電球は多量のが乾燥しないよう留意する．霧吹きなどで植物体に直接熱を発生するため，十分な冷却能力を備えた培養環境で水分を供給すると良好な生育が期待できる．数週間に１使用すること．

度 Hyponex の 500〜1000倍希釈溶液を与える．

4.4.1.4 自然光【注意】葉状体は乾燥に弱いので，培養装置・培養室など

自然光（太陽光）は可視光に加えて遠赤色光も含むので風が直接当たらないようにする．逆に，密閉容器内でで，長日条件で生殖生長相へ移行する．しかし，30℃程

育てると湿度が過剰となり，形態異常，不稔，微生物の度の気温が継続する環境では生殖器の形成が抑制される繁殖といった悪影響を及ぼすことがある．

ようである．日長が不足する季節であれば，遠赤色光を含む光源で補光する必要がある．
4.4.2 交配

4.4 交配法

ゼニゴケは運動能のある精子で受精する．この際水を4.4.1 生殖器誘導
上述の通り，ゼニゴケを生殖生長相に誘導して交配す
るには遠赤色光（730nm 付近）が必要である．しかし，必要とする点が，花粉を用いる被子植物とは大きく異なる点である．
4.4.2.1 精子の採取

一般的な白色蛍光灯には遠赤色光が含まれていないた

雄器托（目安として直径 5mm 以上）にパスツールピ

め，以下に挙げる方法で遠赤色光を補う必要がある．正

ペットで水をおき，数分間放置する（図 5A）．精子が放常な生殖器形成には遠赤色光が継続的に必要であり，途出されると，水が白濁するのが肉眼で確認できる．見に中で遠赤色光照射を中止すると生殖器形成が中断されてくい場合には，雄器托上の水をパスツールピペットなど

稔性を失うので注意する．

透明度の高い器具で吸い上げるとよい．位相差顕微鏡

4.4.1.1 LED（400倍程度）があれば精子の運動能を確認しておく．

LED は単色光光源として優れ，消費電力が少なく寿命も長いので植物育成用の光源としての利用が広まってい2009 低 温 科 学

vol.674.4.2.2 交配
採取した精子をパスツールピペットを用いて直径およ27

図 5：ゼニゴケの交配法
雄器托上に水をのせると精子が放出される（左）．精子を含む水（白濁している）をパスツールピペットで雌器托にかける（右）．白線は 1cm を示す．

図 6：胞子の回収と保存
Ａ，滅菌処理が必要な時は，胞子嚢を傷つけないよう根本の部分をつまんで採取する．背景の目盛りは 1mm である．
Ｂ，胞子嚢（黄色）をシリカゲル（青色のビーズ）と共にサン
プルチューブに入れる．

び柄の長さが 2〜3mm 程度の雌器托にかける（図 5B）．

この時，胞子嚢の付け根をつまむようにすると破裂

受精後約１ヶ月で胞子嚢が成熟し，胞子を回収することができる．
※注意：乾燥すると胞子嚢が裂けて胞子が飛散し，収率や滅菌効率が低下する．受精後３週間程度で，高湿度を防ぐことができる（図 6A）．
２．胞 子 嚢 を 500μl の 水 が 入った 1.5ml サ ン プ ル
チューブに入れる（水に浸けることで胞子嚢が破けるのを防ぐ）．

が保たれる環境（ラップによる保湿，より大きな透明

以下の作業はクリーンベンチ内で無菌的に実施する．

密閉容器など）に移すと，胞子嚢の裂開が遅れて無傷

３．胞子嚢が入ったサンプルチューブに２×滅菌液をの胞子嚢を採取しやすくなる．

500μl ずつ加えて穏やかに転倒混和後，
1.5〜２分間放置．

4.5 系統保存方法

４．滅菌液をピペッティングで取り除き，滅菌水を 1ml
加えて穏やかに転倒混和して洗浄する．

ゼニゴケ植物体の系統保存には胞子を用いるのが最も５．胞子嚢を潰さないようにゆっくりと液をピペッティ

確実であるが，交配しなければならない点が短所である．

ングで取り除き，再び滅菌水を 1ml 加えて穏やかに確実性という点で改善の余地が残されているものの，葉転倒混和して洗浄する．
（この時，破れる胞子嚢もあ状体および無性芽も長期保存が可能である．培養細胞にるが，少なければ問題はない）

ついては通常の継代以外の保存法は試されていない．

６．５．を繰り返す（計３回の洗浄を行うことになる）．

4.5.1 胞子７．胞子嚢を潰さないようにゆっくりと液を除く．

無菌培養が必要なければ，胞子嚢を自然乾燥させた後，

８．乾熱滅菌した大粒のシリカゲルを２〜３個入れて，シリカゲルとともに冷蔵または冷凍保存するだけでよ

サンプルチューブのキャップを密閉する（図 6B）．

い．
以下に無菌培養を必要とする場合の操作を解説する．

室温もしくは冷蔵庫で保存する．著者らの経験では
最低半年は発芽率の低下は見られなかった．

［試薬と機器］

4.5.2 葉状体

２×滅菌液（0.4％ 次亜塩素酸ナトリウム（購入した0M51C 寒天培地に生育しているものを暗所，４℃で保ものを 100％原液として），0.2％ TritonX-100，滅菌水，存することができる．この時，乾燥を防ぐためにシャー

先の細いピンセット２本，シャーレ，実体顕微鏡，照明

レのシールをパラフィルムに交換する．無性芽を新しい器具，クリーンベンチ

0M51C 寒天培地に移植してすぐに冷蔵保存を開始した
ものの方が生存率がよく，５年以上保存できた例もある．

［実験方法］

長期保存には微生物のコンタミネーションに特に注意が胞子嚢の滅菌必要である．

１．実体顕微鏡下，胞子嚢を傷つけないよう採取する．
28

ゼニゴケの培養法

２) J.L.Bowman, S.K.Floyd, & K.Sakakibara, Cell 129

4.5.3 無性芽
適切に乾燥処理された無性芽は長期保存に耐える．著
者らの経験では，無性芽の乾燥は 0M51C 寒天培地上の葉状体を培地ごと自然乾燥させるだけでよく，例えば継代後の古い葉状体をこの目的に流用できる．乾燥が進む
につれ葉状体は枯死して変色するが，杯状体内の無性芽は濃緑色を保っている．これをサンプルチューブなどに回収して冷蔵または冷凍保存する．なお，杯状体からこぼれ出て水分を吸収した無性芽は乾燥保存に適していな
いようである．著者らは４℃で２年間の保存に成功している．但し，生存率が著しく低下する場合があるため，重要な系統を保存する場合には補助的にのみ用いるべきである．無性芽の確実な保存法については，無性芽が乾燥耐性を獲得する機構とともに今後の研究に期待される．
＊遠赤色光を含む光環境やスクロースを除いた 0M51C
培地上では，杯状体の形成が抑制されるので注意する
こと．

(2007)P.229.
３) S.Chiyoda, K.Ishizaki, H.Kataoka,K.T.Yamato,&
T.Kohchi, Plant Cell Rep. 27 (2008)P.1467.
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Sakaida, K.Kono, M.Takenaka, S.Yamaoka, C.Kuriyama,Y.Kohzu,H.Nishida,A.Brennicke,T.Shin-I,Y.
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10) S.Okada, M.Fujisawa, T.Sone, S.Nakayama, R.

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Acad. Sci. USA 103 (2006)P.15511.

2009 低 温 科 学

vol.67

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29

1章

植物・藻類・細菌の材料の入手と栽培・培養５．ヒメツリガネゴケ
青木 摂之 ，杉田護

ヒメツリガネゴケは高効率な遺伝子ターゲティングの適用が可能なので，逆遺伝学のモデル植物として活用されている．このコケの入手と培養法について簡単にまとめる．

Setsuyuki Aoki, Mamoru Sugita
The moss Physcomitrella patens is an excellent model plant in the reverse genetics because high efficiency-genetargeting is applicable to this moss. Here we describe briefly how to obtain,grow and maintain the wild type
and transformed strains of this moss.

5.1 ヒメツリガネゴケの由来と入手先について

5.2 ヒメツリガネゴケの培養について
ヒメツリガネゴケの培養については，その他の実験方

国内外の多くのラボで実験植物として用いられている法とともに，長谷部教授のグループにより整備された綿ヒメツリガネゴケ Physcomitrella patens の野生型株は，密なプロトコルが WEB 上で公開されている ．国内のもともと Whitehouse 博士によりイギリスの Hunting-

おそらくほとんどのラボで，このプロトコルを各々のラ

donshire, Gransden Wood で採取された株の子孫であボの諸事情に合わせて改変し，培養を行っていると思わり，１個の胞子に由来するものである ．そのうちの１系

れる．ここではそのうちの一例として，青木研の例を簡統が Andrew Cuming 博士（Leeds 大学）から基礎生物

単に紹介する．培地の名称などは長谷部研のプロトコル学研究所の長谷部光泰教授に贈られ，それが国内各地のに準じた．

研究者に広まった．その後，ゲノム解析にあたり，David

ヒメツリガネゴケの生活環は研究室の条件で２〜３ヵCove 博士が維持していた同由来の株から１個の胞子由月で完結する．まず胞子が発芽し，先端成長と時折の分

来の株が再単離され，Gransden2004 と名付けられ，The岐により平面的な原糸体（プロトネマ）組織が生じる．

U.S.Department of Energy Joint Genome Institute

この原糸体に芽が生じ，葉と茎そして仮根を持つ立体的（JGI）での配列解析に用いられた．基礎生物学研究所なな茎葉体に分化する．次に茎葉体の先端に造精器と造卵

ど JGI 以外の研究室で作出された EST などは Grans-器ができ，受精が起こり，胞子嚢を持つ胞子体が茎葉体

den2004 以外のラインを用いているので，SNPs を含んの上に発達する．各発生段階が実験・観察に用いられるでいる可能性がある．また，フランス由来の Villersexel

が，細胞を多く得るためには，再生・分裂能力の高い原K3 ライン（エコタイプではない）が遺伝的地図作成に用

糸体がよく用いられる．

いられている ．Gransden2004 ラインは造卵器造精器誘コケ細胞は通常 25℃・連続明条件で培養する．照明の導の同調率が従来の系統に比べて悪く，胞子体形成率が

光強度は，白色蛍光灯（TOSHIBA，FL20SS・W /18な低い
（長谷部光泰教授；私信による）．現在では，基礎生

ど）にアルミホイルを巻くなどして約 40μmol m s

物学研究所，熊本大学，埼玉大学，東京大学，東京農業に調整している．

大学，名古屋大学，北海道大学など多くの機関のラボで5.2.1 各種の培地

ヒメツリガネゴケを用いた研究が行われている．これか

いったん安定な形質転換体を確立した後は，抗生物質

ら新たにヒメツリガネゴケを用いて研究を始めようといなしで形質転換株を培養し続けても特に問題はない．たう方は，該当する最寄りのラボに連絡してみるとよい．

だし抗生物質入りの培地の上で培養すれば，耐性のない
菌類や野生株の混入を防げるというメリットはある．培

１) 名古屋大学大学院情報科学研究科

地は培養する細胞／組織の種類により異なり，原糸体は２) 名古屋大学遺伝子実験施設

BCDAT 寒天培地あるいは BCDATG 寒天培地，茎葉体

2009 低 温 科 学

vol.6731

は BCD 寒天培地，胞子は胞子発芽用寒天培地を用い培

４．胞子発芽用寒天培地：10ml ずつのストック B，ス養する．それぞれの培地は主に濃縮したストック液を適トック C，ストック D と 1ml の Alternative TES，量ずつ混ぜてつくる．ストック液は４℃で保存する．表

10ml の Ammonium Tartrate ストック液（最終濃１にストック液の組成を示す．

度：5mM ）
，1.5g の粉末 CaCl ･2H O，8g の寒天に総量 1000ml になるよう純水を加え，オートク［各培地の調整方法］

レーブする（121℃，20分間）．この後は BCDAT 寒１．BCDAT 寒 天 培 地：10ml ず つ の ス トック B，ストック C，ストック D，1ml の Alternative TES，天培地と同様である．
5.2.2 原糸体・茎葉体の植え継ぎ

10ml の Ammonium Tartrate ストック液（最終濃

原糸体は再生・分裂能力に優れるため，これを植え継度：5mM ）
，20ml の CaCl ストック液（1mM ），ぎコケ細胞を大量に増やすことができる．以下の操作は

8g の寒天（0.8％［w/v］；SIGM A の A 9799を用いクリーンベンチ内で無菌的に行い，器具等はあらかじめている）に総量 1000ml になるよう純水を加え，オー

オートクレーブ滅菌しておく．BCDAT 寒天培地あるいトクレーブする（121℃，20分間）．溶けた寒天培地

は BCDATG 寒天培地にシャーレのサイズに丸く切っをクリーンベンチ内でプラスチックシャーレに分注

た透明セロハン（松屋，MO-430）をピンセットを用いてし，培地が固まったらシャーレの蓋を半分ほど開け敷く．試験管に 20ml ほど滅菌水を入れ，そこにシャーレて，クリーンベンチ内で送風しながら 20分間ほど乾２，３枚分の原糸体をピンセットで集めて入れる．この燥させる．室温で大きめのプラスチックのタッパ内

原糸体をホモジナイザー（NS-310E，マイクロテック・

で気密保存する．

ニチオン）
で約 10秒間破砕する．破砕用シャフトは NS-

２．BCDATG 寒天培地：BCDAT 培地と同じ量の各ス

4 あるいは NS-7 を用い，シャフト回転速度は４〜５にトック液と寒天に 5g のグルコース（最終濃度：5設定する．セロハンを敷いた６〜10枚の寒天培地に，破g/l）を加える．これに総量 1000ml になるよう純水

砕した細胞を 3ml ずつ駒込ピペットで分注して，シャーを加える．この後は BCDAT 寒天培地と同様であレの蓋を閉めた後に菌の混入を防ぐためにサージカル

る．

テープを巻き，インキュベーターに移して培養する．通３．BCD 寒天培地：10ml ずつのストック B，ストック常の維持培養や形質転換用に細胞を増やすための培養にC，ストック D と，1ml の Alternative TES，20ml

おいては，シャーレを数枚積み重ねても問題はない．この CaCl ス トック 液（1mM ）．8g の 寒 天 に 総 量

れを４日から１週間に一度行う．なおグルコースの入っ

1000ml になるよう純水を加え，オートクレーブすた BCDATG 培地の方がコケの生育は良いが，枯れるのる（121℃，20分間）．この後は BCDAT 寒天培地とも早い．原糸体を培養してしばらく経つと芽ができ，そ同様である．

こから茎葉体が生じる．適当な大きさに育ったらピン

表 1：ストック溶液の調製法
ストック液

調製方法

ストックＢ液（×100）

25g の M gSO ･7H O（最終濃度：0.1mM ）を総量 1000ml になるよう純水に溶
かす．

ストックＣ液（×100）

25g の KH PO （最終濃度：1.84mM ）を KOH 水溶液（4M ）で pH 6.5になるよう調整し，総量 1000ml になるよう純水に溶かす．

ストックＤ液（×100）

101g の KNO（最終濃度：1M ）と 1.25g の FeSO ･7H O（4.5mM ）を総量 1000ml になるよう純水に溶かす．酸化して液が茶色く着色したら新しいものを調製して用いる．

Alternative TES ストック液（×1000)

55mg の CuSO・5H O（最終濃度：0.22mM ），614mg の H BO （10mM ），55（0.23mM ），25mg の Na MoO ･2H O（0.1mM ），55mg の
mg の CoCl ･6H O，389mg の M nCl ･4H O（2mM ），28mg の KI（0.17
ZnSO ･7H O（0.19mM ）mM ）を総量 1000ml になるよう純水に溶かす．

Ammonium Tartrate ストック液（×100)

92.05g の Ammonium Tartrate（最終濃度：500mM ）を総量 1000ml になるよ
う純水に溶かす．

CaCl ストック液（×50）

7.35g の CaCl ･2H O（最終濃度：50mM ）を総量 1000ml になるよう純水に溶かし，オートクレーブで滅菌する（121℃，20分間）．

32

ヒメツリガネゴケの入手と栽培・培養セットで BCD 寒天培地に移し，培養する．適量に増えたが沈殿した後に滅菌水を捨てる．この滅菌水による洗浄

らピンセットで数本分ずつ採取し，新たな BCD 寒天培

を３，４回繰り返す．最後に 1000μl の滅菌水を加え，地に植え継ぐ．

ペッスル（Treff，ペレットミキサー）や滅菌した爪楊枝

5.2.3 胞子の採取

ですりつぶして胞子嚢を壊し，胞子が拡散した液をピ

上記の方法で原糸体を連続して 10回以上植え継いでペットマンで 200μl ずつ胞子発芽用寒天培地に滴下すも生育などに問題は見られないが，長期にわたり栄養生

る．寒天培地にピペットマンでさらに 1000μl の滅菌水

殖を続けると突然変異が次第に蓄積する恐れがある．そを加え，培地上に胞子を広げた後，25℃，連続明条件でこで時折胞子を発芽させ，「フレッシュ」な原糸体から新培養する．２〜３週間で最初の植え継ぎができる量の原

たに植え継ぎを開始させる．例えば形質転換には５，６

糸体が得られる．

回以上植え継いだものは使用しないようにする．

5.2.5 株の保存胞子を採取するためには，有性生殖を誘導し，胞子体

胞子（胞子嚢）の状態で長期保存できるので，株の保を生じさせる必要がある．ヒメツリガネゴケの造精器と存は胞子の状態で行うのが良い．ただし原糸体の状態で造卵器の発達は温度と日長に影響されることが知られも，寒天培地が乾燥しないようにシャーレをパラフィル

る ．よく葉の茂った茎葉体を 15℃，短日条件（８時間明ムで二重に巻き，４℃，微弱光下で少なくとも数カ月は16時間暗）で３週間ほど培養すると造精器と造卵器が茎保存できる．時間が経ち，一見寒天培地とともに干から

葉体の先端に形成される．滅菌水を茎葉体全体が浸かる

びてしまったように見えても，ペラペラになった寒天培

ようシャーレに入れ，すぐに捨てる．これにより，精子

地ごと新しい寒天培地の上に置くと，再び生育を開始す

がコケ組織の表面に残った水を介して造精器から造卵器る場合がある．

まで泳ぎつき，受精が起こる．その後，約一カ月で直径2mm ほどの胞子嚢を持つ胞子体が生じる．茎葉体を水に浸す必要があるので，深型のシャーレが扱いやすい．
また BCD 寒天培地の代わりに，ジフィーセブン（ピートモスからなる園芸用の培養土ポット；サカタのタネ）を

5.3 謝辞株の由来などについて情報を頂いた長谷部光泰教授（基礎生物学研究所）に感謝します．

培地として用いると，多数の胞子体をより安定に得ることができるようである．この場合は，ジフィーセブンを
適 当 な 容 器（例 え ば IWAKI の プ ラ ン ト ボック ス

参考文献［41‑012‑002］）内に置き，水を適量加えてオートクレー

１) N.W.Ashton, & D.J.Cove, Mol. Gen. Genet. 154

ブ滅菌し，茎葉体をジフィーセブン上に植えつけ培養を(1977)P.87.
２) Y.Kamisugi, M .von Stackelberg, D.Lang, M .Care,
R.Reski, S.A.Rensing, & A.C.Cuming, Plant J. 56(2008)P.855.
３) Y.Hiwatashi, T.Fujita, Y.Sato, T.Tanahashi, T.

行う．こうしてできた胞子嚢をピンセットで採取し，数個ずつマイクロチューブに小分けして入れる．数時間マ
イクロチューブの蓋を開け放して乾燥させたのち，蓋を閉じ，４℃で保存する．少なくとも１年間は保存できることを確認している．
5.2.4 胞子蒔き
胞子嚢を保存していたマイクロチューブに 900μl の滅菌水と 100μl の次亜塩素酸を入れてよく混ぜ，５分間ほど放置する．この後，ピペットマンで上清を取り除き，1000μl の滅菌水を入れよく混ぜて胞子嚢を洗浄し，胞子2009 低 温 科 学

vol.67

Nishiyama,K.Sakakibara,R.Kofuji,N.Aono,N.Sumikawa,T.M urata,& M .Hasebe,(2008)http://www.nibb.
ac.jp/evodevo/PHYSCOmanual/00Eindex.htm４) 日渡祐二，西山智明，長谷部光泰，蘚苔類研究７（2000）
P.276．
５) D.J.Cove, & C.D.Knight, Plant Cell 5 (1993)P.1483.
６) A.Hohe, S.A.Rensing, M.Mildner, D.Lang, & R.
Reski, Plant Biol. 4 (2002)P.595.

33

1章

植物・藻類・細菌の材料の入手と栽培・培養

６．シロイヌナズナを用いた光合成研究鹿内 利治
シロイヌナズナは個体のサイズが小さく，遺伝学では有利に働くこの特徴は，光合成の生理学，生化学においては問題になる場合がある．しかしながら，多くの突然変異株が単離，解析されていること
や，ノックアウトラインなどリソースの充実は光合成研究においても魅力的である．植物の基本的な扱いはプロトコル集 が手に入るので，ここでは特にノックアウトラインの入手法，解析法を解説した
い．

Photosynthesis research using Arabidopsis
Toshiharu Shikanai
Recent advance in plant science depended on the genetics using a model plant Arabidopsis thaliana. Although
its small size is not ideal for physiology and biochemistry, the Arabidopsis genetics is providing many breakthroughs also in photosynthesis research. This protocol focuses on one of the powerful resources, the T-DNA
knock out lines, and describes how to use them in photosynthesis research.

6.1 ノックアウトラインの検索のしかた
１．ノックアウトラインを解析したい遺伝子があれば，

ラな PCR 産物を読んでいると思われる）．この可能性を下げる為に，読まれている配列の長さが短いものは避けた方が無難である．

まずその遺伝子番号（例えば At2g05620）をメモし，５．候補が決まれば〔order from ABRC〕をクリックす

Salk Institute Genomic Analysis Laboratoryのサる．ABRC（Arabidopsis Biological Resource Cen-

イ ト で あ る SIGnAL を 開 く（http://signal.salk.

ter）は，種子などを配布してくれるストックセンedu/）．そこから，T-DNA Express のページを選ぶ．

ターである．実際に分与を依頼するには TAIR（The

２．Search の Queryにメモした遺伝子番号を入力し検Arabidopsis Information Resource）user としての索する．

登録が必要である．Register 画面に進んで情報を入

３．遺伝子の下にたくさんの矢印が出てくる．ノックア

力する．登録はまず，研究室の PI に行ってもらう必

ウトラインはいくつかの機関で独立に整備されてお要がある．種を送ってもらった場合，送料などを負り，その情報がまとまっている．やや複雑であるが，担しなければならない．研究室の構成メンバーが独

短い矢印で SALK，SAIL，GABI などのラベルがつ自に種を依頼した場合でも，登録の際 PI とリンクいているのがそれである．よくわからないものがあさせておけば，PI から一括して支払い可能である．

れば，クリックすると詳しい情報が得られる．目的

種子送付の際，express mail を使うか選べるが，の遺伝子について複数のノックアウトライン候補が2008年 11月現在，フェデックスが日本への植物種得られることが望ましい（後述参考）．

子の送付を受け付けておらず，選ばない方が無難で

４．良さそうな候補があればクリックする．まず〔seq〕

ある．それでも ABRC の場合には，１か月ほどで種を確認する．これは T-DNA のレフトボーダーから

子 が 届 く．ラ イ ン に よって は ABRC で は な く

境界配列を読んだもので，T-DNA がどこにささっ

NASC（The European Arabidopsis Stock Center）ているのかを知ることができる．この情報は，大量を経由したり GABI-Kat に直接依頼する場合もあの T-DNA ラインの挿入サイトを PCR によって決るが，時間と手間がかかり，ABRC から手に入るラめたものに由来し，やや高い確率（２〜３割？）でインがある場合は，それを優先させた方が良いであ

実際の挿入サイトではない配列を含んでいる（キメろう．

１) 京都大学理学研究科

2009 低 温 科 学

vol.6735

6.2 ホモラインの選抜方法
１．種子が届いたら，多くの場合それは，T-DNA をホモに持つものとヘテロに持つもの，さらには持たない
ものの混合である（ラインによってはホモ化されたものも入手可能．T-DNA がささっているのが確認済みなので重宝．）．そこで，T-DNA をホモに持つものを選ぶ必要がある．20粒ぐらいの種子を播種す
る．T-DNA は多くの場合複数箇所に入っているので，薬剤耐性を T-DNA 挿入のマーカーに用いることは危険である．
２．T-DNA をホモに持つラインの選抜は PCR で行う．
そのため植物から DNA を抽出する．我々は，子葉一枚から簡便に DNA を抽出する方法を用いているが，最近はキットや抽出装置が普及しており，ここでは詳細な解説を避ける．
３．ホモライン選抜のための PCR プライマーを設計する．SALK ラインの場合，T-DNA 挿入株の配列情

図 1：ホモライン選抜方法
Ａ．Target gene が T-DNA の挿入により破壊されている．
Pr-LB はレフトボーダー上に設定されたプライマー．Pr-F と
Pr-R はこの位置に設計する．
Ｂ．PCR による遺伝子型の判定．

報は T-DNA のレフトボーダーから読まれているので，レフトボーダー上の配列に設計されたプライ物が得られない場合と区別できないので，Pr-F とマー（Pr-LB）と読まれているゲノム配列上に逆向き

Pr-R の組み合わせの PCR では，同様に抽出した野に設計したプライマー（Pr-F とする）では，T-DNA

生株 DNA を用いて安定に PCR 産物が得られるこを含む植物で必ず産物が得られるはずである（図 1とが条件になる．

．期待される PCR 産物は 300‑500塩基程度が望A）

５．目的の T-DNA をホモに持つ植物は，プライマーPr-

ましい．ここで産物が得られなければ，実際にここLB と Pr-F で PCR 産物が得られ，Pr-F と Pr-R のに T-DNA が挿入していない可能性がある．レフト

組み合わせで PCR 産物が得られないものである

ボーダー上のプライマーの配列は SIGnAL のペー（図 1B）．このような植物が得られない場合は，遺伝ジ か ら 得 ら れ る（http://signal.salk.edu/tdna

子のノックアウトが致死になる可能性がある．その．ラインの出所が違えば使われている
FAQs.html）

場合は，T-DNA をヘテロに持つ個体を育てて採種

ベクターが違うので，プライマーについては，それし，次世代を解析する．

にあわせて確認する必要がある．一般に用いられて６．３．で得られた PCR 産物をシークエンスする．デー

いるプライマーは必要以上に長く，我々の研究室でタベースと同じ配列が得られるはずで，レフトボー

は 21塩基までプライマーを短くして用いている．

ダー側の挿入位置が確認できる．T-DNA のライト

４．上述のプライマーセットで T-DNA 挿入染色体に由ボーダーに対応するプライマー（SIGnAL に情報が来する PCR 産物を増幅可能である．さらに T-DNAある．）とゲノムのプライマーPr-R を用いて PCRをホモに持つ植物とヘテロに持つ植物を区別する必を行い，産物が得られればシークエンスを行う．ラ

要がある．その目的で，レフトボーダーから読まれイトボーダー側の境界配列が得られる．しばしば複た配列の上流に，シークエンス同じ向きにもう一つ

数 の T-DNA が つ な がって ゲ ノ ム に 挿 入 し，T-

プライマー（Pr-R）を設計する（図 1A）．先ほど設

DNA の構造によっては両側がレフトボーダーにな

計した Pr-F と Pr-R の組み合わせで，T-DNA を含る場合がある．ライトボーダーの境界配列が得られまない染色体 DNA から 300‑500塩基程度の産物がない場合には，Pr-LB とゲノムの Pr-R プライマー期待できる位置が望ましい．一般に T-DNA のサイとの PCR も試みる．

ズはこの PCR でのびないくらいに大きいので，TDNA をホモに持つ植物では PCR 産物が得られな
い．このことは，DNA の抽出の問題などで PCR 産
36

シロイヌナズナを用いた研究悪くない限り，ABRC から届いた種子を播種する際に同時に野生株も蒔いておく．本来戻し交配は，得られた F 植物からその都度 F を得るが，バックク
ロスを急ぐ際には，F 植物にさらに野生株を交配する（図 2）．次世代では，T-DNA ヘテロと野生株に分離するので，PCR でヘテロ株を選抜し，その植物にさらにもう一度野生株を交配する．我々は三度の戻し交配を基本としており，次世代からヘテロ株を選抜し，F 世代を得る．F から PCR で T-DNA 挿入ホモ株を選抜し，大量に採種する．ここで（必要があればさらに早い世代で），T-DNA と表現型の連鎖を確認する．
２．３回の戻し交配により目的遺伝子に連鎖していない
異常の影響の多くを排除できる．しかし，目的遺伝
子に強く連鎖した異常は残る．独立のノックアウト
図 2：戻し交配作業の流れ

ラインを持ち，同一の表現型が見られた場合，この問題が起きる確率は大きく下がる．この問題を排除するための最も直接的な方法は，ノックアウト株に6.3 戻し交配と連鎖解析

野生型遺伝子を導入し，変異株の表現型が見られなくなることを確認することである．この場合は，形

目的のノックアウト株（T-DNA 挿入ホモライン）が得

質 転 換 に も と の T-DNA が 持って い る 薬 剤 耐 性

られれば，採種と同時に戻し交配を行う．クロロフィル

マーカー以外を用いる必要がある．場合によって，蛍光解析のような非破壊の解析はこの植物を用いて予備

この相補実験は不要である．例えば，EMS 処理で得的に行うことができる．しかしながら，この植物は，目られた変異株できっちりと遺伝学解析を行ってい的の遺伝子への T-DNA 挿入以外に多くの変異を含んて，表現型がノックアウト株と同一であれば，必要でいる．目的遺伝子ノックアウト以外の異常が表現型をは感じない．

引き起こしている可能性が高く，これに気づかず結論を誤った例がいくつもある．また，他の研究室からノック
アウトラインの分与を受けた場合，分与先にこの認識が注意
一連の作業は遺伝子組換え実験であり，機関による承認を受けていなければ行うことはできない．

なければ，問題を含むラインを解析することになる．充分な注意が必要である．
１．ノックアウト株が開花すれば，対応する野生株により戻し交配を行う．ノックアウト株の生育が著しく2009 低 温 科 学

vol.67

参考文献
１) 島本功，岡田清孝，田畑哲之「モデル植物の実験プロト
コール」（改訂３版）秀潤社，（2005）

37

1章

植物・藻類・細菌の材料の入手と栽培・培養

７．タバコ
山本 義治 ，小保方潤一
タバコは核・葉緑体の形質転換が可能であり，生化学実験にも適した研究材料である．本章ではタバ
コやタバコ近縁種の入手・栽培方法について紹介する．

TobaccoYoshiharu Y Yamamoto, and Junichi Obokata
Tobacco can be used for nuclear and chloroplast transformation. It is also suitable for biochemical studies. In
this chapter, we introduced methods for handling and growing tobacco plants.

7.1 はじめに7.2 培養細胞株

タバコ（Nicotiana tabacum）は核と葉緑体 の両方

N.tabacum と N.glutinosa の細胞融合より得た光独を形質転換できる数少ない高等植物である．また，パー

立栄養株 NTG-P が確立されている

ティクルガンを用いた一過的な遺伝子発現の効率が高Jack M .Widholm (College of Agricultural,Consumer,

く，よく利用される．さらに，ウイルスベクターも開発

and Environmental Sciences, University of Illinois at

されており

Urbana-Champaign,1201 W Gregory Ave,Urbana,IL，遺伝子機能の大規模解析やタンパク質の大量発現を行うことが出来る．研究に用いられる品種と．入 手 先 は Dr.

61801, USA, email:widholm＠illinois.edu).

しては Bright Yellow 4 (BY4), Samsun NN, Xanti 等がある．名古屋大学遺伝子実験施設・杉浦グループによる葉緑体ゲノム配列決定 には BY4 が 用 い ら れ た．
Petit Havana SR1 は省スペース（矮性）なので形質転換によく用いられている．

7.3 種子入手先
研究活動支援のためのタバコ種子ストックセンターのようなものは国内には見あたらないので，種子の入手に（2n＝24，SSTT）
N.tabacum のゲノムは異質複二倍体

関しては研究者に直接コンタクトするのが一般的であるであり，N.sylvestris(2n＝12，SS）と N.tomentosiformisと思われる．珍しい野性種などは下記の JT の研究所か(2n＝12，TT）を祖先としている．N.sylvestris が母系のら入手可能である．また，海外の種苗会社等がインター親であり，N.tabacum の葉緑体はこちらから来ている．

ネットで種子を販売している（Lehle Seeds http://

ゲノム構成の単純さから N.sylvestris もよく研究に用い

www.arabidopsis.com/など）．

られる．ちなみに，N.tomentosiformis は短日植物，N.
sylvestris は長日植物，N.tabacum は概ね短日である．N.

日本たばこ産業㈱ 葉たばこ研究所

sylevestris は N.tabacum と同じ条件で形質転換を行え〒 323‑0808 栃木県小山市大字出井 1900

る．無傷葉緑体の単離を行うには N.tabacum が適して

tel：0285‑23‑3142（代表）いる．N.sylvestris からは調製可能ではあるが困難であり，また N.tomentosiformis から調製するのは非常に困難であり，著者らは成功したことはない．

上記の研究所には，様々な品種，野生種のストックがある．譲渡して頂ける種子量の目安としては栽培種で0.1g，野生種で 0.01g．譲渡条件に同意し申込書に記入の上譲渡依頼を行う．譲渡条件として「第三者への譲渡禁止」，「種子の増殖禁止」等の項目がある．申込書に記

１) 名古屋大学遺伝子実験施設

載されている譲渡条件が目的にそぐわない場合は JT と２) 京都府立大学大学院生命環境科学研究科

相談する．

2009 低 温 科 学

vol.6739

タバコ種子の輸入は可能であり輸入時の検査は比較的いので神経質にならずに水やりをして大丈夫である．

簡便である．郵便封筒の外装に「tobacco seeds」と明記してあれば防疫所へ回され検査される．米国・欧州から［栽培メモ］の場合栽培検査は省略され，目視による検査（開封され・種子の大きさは鞘によって異なる．一つの花序のなかる）のみである場合が多いので，検査期間としては１−で最初の頃の花には大きな鞘が付き，中の種子も丸々２日かかる程度である．一般的には輸出国と植物種の組としているが，徐々に鞘も種子も小さくなっていく．

合せで日本への輸入の可否や検査項目が決まる．詳細は小さい鉢で育てるとこの差は顕著である．

植物防疫所の DB（http://www.pps.go.jp/eximlist/）を・葉緑体を単離するには肥料を与えすぎないように育て参照のこと．輸出国側の検査（国ごとに検査項目や栽培る方が澱粉が貯まらず収率がよい．また，収穫前に３検査免除に必要な書類が異なる）もあるがここでは省略

日程暗処理し澱粉を消化させるやり方もある．

する．詳細は農林水産省植物防疫所（http://www.maff.

・栽培温度は 25〜30℃．

go.jp/pps/）にて確認して頂きたい．

・大麻とは異なりタバコの栽培自体は野外でも（もちろん温室でも）自由に行えるが，葉を乾燥して実用に供

7.4 播種と幼植物の育成するのは違法とのこと（JT 葉たばこ研究所からの情報による）．

乾燥種子は半日程度明るい所で脱イオン水に吸水させ・巻きたばこや葉巻などから栽培中の植物へウイルスが発芽時期を揃える．種子を懸濁しパスツールピペットを感染する場合があるので気をつける．喫煙者は石鹼で用いてバーミキュライトに播種する．目安は 1000cm 当

手を洗ってから温室に入ること．

たり 20〜30mg（300粒程度）．バットの底か ら バーミ

・タバコの病害にはアブラムシやコナジラミなどがあキュライトが水を吸い上げるようにする．播種後じょうり，オルトラン（住友化学）やブルースカイ（バイエ

ろで上から水をやると種子がバーミキュライトの中にル）等の農薬で対応出来る．虫取りシート（三共消毒

潜ってしまうので具合が悪い．ガラス板もしくはプラス

商事株式会社）を温室にぶら下げておくと害虫が発生

チックラップを上蓋にし，芽生えが乾燥しないようにすした際に発見しやすい．病害と防除法については栽培

る．発芽後１週間程度で上蓋を外す．週に１−２度ハイマニュアルに詳しい記載がある．

ポネックス（500〜1000倍希釈）を与える．大きく育てる
場合はメトロミックスとバーミキュライト（土でもよい）の入った鉢に植え替える．タバコは水のやり過ぎには強7.5 種子の表面滅菌と培地への播種
１．50ml の使い捨てチューブなどを用いて，乾燥種子を 70％エタノールに浸す．一分程度おいてエタノー
ルを捨てる．
２．２％次亜塩素酸ナトリウム（５％溶液なら脱イオン
水で 2.5倍に希釈する）
を注いで 15分置く．時々撹拌する．
（以下クリーンベンチでの作業）
３．滅菌水で５回以上すすぐ．
４．寒天培地（1/2x MS，0.8％寒天，あるいは 1x MS，３％ sucrose，0.8％寒天など）に播種する．
［操作メモ］
・バーナーで焙ったハサミを用いて無菌的に鞘から取り出された種子は，表面滅菌処理を行わずにそのまま培
地上に播種しても雑菌は生えない．
・種子を「お茶パック」（トキワ工業）に入れてポリシー

図 1：タバコ（N. tabacum, cv. BY4）
人の背丈くらいまで大きくなる．SR1 なら膝〜腰丈程度で収まる．

40

ラーでシールすると扱いがラクになる．
・枝の付け根のところに茎頂点があるので，そこを含むようにメスで切り取り，寒天培地（1x MS，3％ suタバコ

に裏側
x MS，3％ sucrose，0.8％ Bactoagar など）
を上にして置く．寒天はピンセットなどで少し崩しておくと組織との接触面積を増やすことが出来る．

参考文献
１) A.Caplan, L.Herrera-Estrella, D.Inze,E.Van Haute,
M.Van Montagu,J.Schell,& P.Zambryski.Science 222

図 2：無菌培養のタバコ
マジェンタ容器にて培養．

crose，0.8％寒天など．M agenta 容器（GA-7，Sigma）
を用いると便利）に茎を挿しておけば，根や葉が発達してくる．

(1983)P.815.
２) G.An,B.D.Watson,& C.C.Chiang,Plant Physiol.81(1986)P.301.
３) Z.Svab, P.Hajdukiewicz, & P.M aliga, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 87 (1990)P.8526.
４) F.Ratcliff, A.M .Martin-Hernandez, & D.C.Baulcombe, Plant J. 25 (2001)P.237.
５) H.Hamamoto, Y.Sugiyama, N.Nakagawa, E.Hashida, Y.M atsunaga, S.Takemoto, Y.Watanabe, & Y.
Okada, Biotechnology (N Y)11 (1993)P.930.
６) J.A.Lindbo, Plant Physiol. 145 (2007)P.1232.
７) K.Shinozaki, M .Ohme, M .Tanaka, T.Wakasugi, N.
Hayashida, T.Matsubayashi, N.Zaita, J.Chunwongse,

7.6 葉の表面滅菌
温室で育てた植物の葉を表面滅菌し組織培養することもある．パーティクルガンなどに用いる．
１．葉を切り取りビーカーなどに入れる．
２．70％エタノールを加え１分程度撹拌する．
３．エタノールを捨て，１％次亜塩素酸ナトリウムを加える
４．15分間置く．時々撹拌する．
５．滅菌水で５回以上すすぐ．

J.Obokata,K.Yamaguchi-Shinozaki,C.Ohto,K.Torazawa, B.Y.M eng, M .Sugita, H.Deno, T.Kamogashira,
K.Yamada, J.Kusuda, F.Takaiwa, A.Kato, N.Tohdoh, H.Shimada, & M .Sugiura, EM BO J. 5 (1986) P.
2043.
８) C.Xu, L.C.Blair, S.M .Rogers, Govindjee, & J.M .
Widholm, Plant Physiol. 88 (1988)P.1297.
９) C.S.Goldstein, & J.M .Widholm, Plant Physiol. 94(1990)P.1641.
10) 大堀和信，黒田昭太郎 ＆ 宇野良男，「タバコ栽培の新技術」，農文協，1978．

６．寒天培地（1/2x M S，0.8％ Bactoagar あるいは 1

2009 低 温 科 学

vol.6741

1章

植物・藻類・細菌の材料の入手と栽培・培養

８．イネ
稲垣 言要
本章では，ポストゲノム時代に向けて整備されたイネの突然変異系統や遺伝解析用の種子系統について，その概要と入手法を中心に紹介する．後半は，筆者の研究室で行っているイネ栽培法を実例として示す．

Bio-resources in Rice Research Area and Tips for Cultivation of Rice
Noritoshi Inagaki
In 2004, International Rice Genome Sequencing Consortium finished to determine whole rice genome sequence,
which means the beginning of a new era for rice functional genomics. In this issue,Iʼd like to introduce several
bio-resources that will certainly contribute to the post genome era, namely core collections, introgression lines
and mutant lines of rice.

（ジーン バ ン ク http://www.gene.affrc.go.jp/index j.

8.1 はじめにphp）とイネゲノムリソースセンター（リソースセンター

イネ属（Oryza 属）は 22種（種として独立して記載す，ナショナルバイ
http://www.rgrc.dna.affrc.go.jp/jp/）

べきか議論のある種も含む）から構成され，その中で栽

オリソースプロジェクト（NBRP）のイネ部門をあげる

培種は，アジア原産で世界的に栽培されている O.sativa

ことが出来る．

と西アフリカ原産でその地域でのみ栽培されている O.

農業生物資源研究所のジーンバンクは，植物・動物・

glaberrima の２種だけで，それ以外は野生イネにあた

微生物資源の探索収集を行い，特性を評価し，さらにはる ．本章では，O.sativa，特にジャポニカ，水稲の話が増殖して配布までを行う組織として 1985年に設立され中心となるが，可能な限り野生イネなど多様なイネのリ

た．現在，イネ類に関しては４万４千件を越える遺伝資

ソースについても紹介したいと思っている．

源を登録，保管しており，このような大量の種子を確実

2004年に国際コンソーシアムによってイネ（日本晴）に管理するために，機械化された種子管理システムを導の全ゲノム配列が決定され ，これによりイネは，３大穀

入している
（図 1）
．リソースセンターは，Tos17 突然変物（イネ，コムギ，トウモロコシ）としての地位に加え，異系統，イネ遺伝解析材料（BILs，DHLs，CSSLs 系統，

モデル植物としての地位を確立する地歩をつかんだと言詳細については後述），イネ完全長 cDNA クローンの管える．この流れに呼応するように，ゲノム配列を活用す

理と配布を行っている．ともに農業研究を行う独立行政るための解析ツールが次々と構築され，それを活用した

法人内に設置された拠点であることから，栽培イネを成果が徐々に生み出されている．本章の前半では，これベースにしたコレクションが充実しており，農業研究に

らの解析ツールの内，特に種子の形で配布されているリ

資するリソースが供給できる体制となっている．

ソースについてその概要と入手法について述べる．

一方 NBRP は，これまで国立遺伝学研究所や理化学研究所，あるいは各大学の研究室において個々に収集保存されていたバイオリソースをデータベース化し，各研

8.2 種子の保管・分譲機関

究者に提供できる体制を確立することを目的に 2002年

研究用のイネ種子の保管と管理，分譲を業務としてから始まったプロジェクトで，その全体像については，行っている日本の主要な公共機関としては，農業生物資

ホームページ（http://www.nbrp.jp/）から見ることがで源研究所に設置されている農業生物資源ジーンバンク

きる．
イネ部門は，
遺伝学研究所

系統生物研究センター

を 中 核 に 運 営 さ れ て お り，イ ネ の 統 合 データ ベース
１) 独立行政法人

農業生物資源研究所

域 光環境応答研究ユニット

2009 低 温 科 学

vol.67

植物科学研究領

Oryzabase（ http://www.shigen.nig.ac.jp/rice/oryzabase/top/top.jsp）が，系統検索や分譲依頼ページ
43

般の研究者では判断が難しい問題に直面する．そこで，バイオリソースの保管機関では，このようなニーズに応えるべく，全コレクションから多様性を失わないように注意しながら品種の絞り込みを行って「核となる品種のセット」を作り上げた．これがコアコレクションで，様々な機関で構築され，配布されているものもある ．
まずは NBRP イネ部門で作られている，野生イネのコアコレクションについて紹介する．このコレクション
は，野生イネ 18種と，ゲノム構成 AA，BB，CC，BBCC，
CCDD，EE，FF，GG，HHJJ の９型の全てを含み，典型的で生息域が広い品種で構成するというコンセプトで
図 1：農業生物資源ジーンバンクの種子管理システム．Ａ：
全自動リフトが設置された種子庫内の様子．庫内は氷点下
１℃，湿度 30％に保たれている．Ｂ：リフトが種子ケースを引き出しているところ．Ｃ：種子の出庫作業．全ての操作は管理端末から行える．ケースには５×17個の種子ボトルが収納されており，その全てがバーコードで管理されている．
（写真
提供：農業生物資源研究所 ジーンバンク 知花高志氏）作られた．このコレクションには，研究の目的やスケー
ルに合わせて３つのランクが用意されている．ランク１
は 44の代表的アクセッションからなり，ランク２は 64の代表的なアクセッションを含んでいる．加えて，さらに多くのアクセッションを調査する必要がある研究者のために，169のアクセッションからなるランク３も整えられた．これらの中から，自らの研究目的や規模に合わへの入口となっている．参画している研究機関がこれませて取り寄せを行えば良い．Oryzabase（http://www.

でに収集してきた遺伝資源がコレクションの核となってshigen.nig.ac.jp/rice/oryzabase/top/top.jsp）から分譲いるので，保管機関ごとに特色のある多様な遺伝資源の依頼が行える．

供給が可能となっている．

一方，農業生物資源研究所は，栽培イネに特化したコ
アコレクションを構築している．このコレクションは，

8.3 イネ研究の解析ツールとして整備された
種子系統

代表的な品種や系統のセットであればよいというコアコ
レクションの考えをさらに拡張し，DNA マーカーを用いた多型解析によって，客観的に多様性を評価しながら

この節では，コアコレクションや遺伝解析用の種子系

選抜したもので，その結果，ジーンバンクが保有するコ統，イネ突然変異系統など，新しい研究ツールとして注

レクション全体の遺伝的多様性と同じレベルの多様性を目されている研究材料について紹介し，その入手方法に維持したコアコレクションが構築された ．現在，農業生

ついて述べる．

物資源研究所からは，69品種で構成される世界のイネ品

8.3.1 コアコレクション

種 と 50品種で構成される日本在来イネ品種 の２つ

イネと一言で言っても，その栽培（生息）地域は熱帯のコアコレクションが配布されている．分譲依頼の手続から温帯にまで拡がっており，耐乾性の強い陸稲もあれ

きは農業生物資源研究所のジーンバンクのホームページ

ば，洪水になっても生き残る浮きイネもある．栽培イネで確認して欲しい．

を全滅させるような病原菌に対して抵抗性を示すイネも8.3.2 遺伝解析用材料存在する．この驚異的とも言える能力は遺伝子に書き込

イネを栽培化し，育種している過程は強い選択圧にさまれているのだが，このような遺伝子の多くは，近代育らされており，その結果，脱粒性が失われ，生産性が向種の過程で失われていったものが多いと推定され，現在上し，洗練された草型や食味を獲得することができた．

栽培されている品種の中に見出すのは難しい．逆の言いその一方で，数多くの有用な遺伝子が失われていったこ方をすると，野生イネや在来栽培種（古い時代に栽培さとは前節でも述べた．これらの失われた重要遺伝子を座れていた品種）には，近代品種が失った農業形質を向上

乗位置まで含めて再発見するために，野生種と栽培種，させる遺伝子が数多く埋もれていることを示している．

あるいは，古い栽培品種と新しい栽培品種，インディカ

さて，これを探索することを考えた場合，一体どの品種とジャポニカを交配して得られたイントログレッションから解析を始めれば良いのか？ また，どの程度の品種

系統（introgression lines）と呼ばれる研究材料が最近注数を解析した段階で結論を得ればよいのか？

目されている．さらに，これらの系統は，
ゲノム育種
（テー

44

など，一

イネ種子の入手法と栽培法

ラーメイド育種）の遺伝資源としても大きく期待されている．

農 業 生 物 資 源 研 究 所 の リ ソース セ ン ター（http://
www.rgrc.dna.affrc.go.jp/jp/）では，栽培品種間の交配

まずは，図 2A を用いて，この節で用いる専門用語ので作られた置換系統群（表 1）を分譲している．

解説から試みたい．イネを交配すると，F 1個体は両親か

また，NBRP イネ部門では，九州大学が中心となって，ら遺伝子を半分ずつ引き継ぐ．その自殖後代である F 2

日印の栽培品種間で RILs を４系統，CSSLs を２系統構

は，確率的には両親から 50％ずつ遺伝情報を引き継ぐ築している．加えて，オリザ属内の異種交配（O.sativa×が，遺伝子座一つ一つを見てみると，花粉親由来の座もO.glumaepatula, O.sativa×O.glaberrima, O.sativa×あれば，ヘテロの座，母親由来の座もある．その F 2種子

O.meridionalis）で構築された CSSLs や RILs も作り上について単粒系統法で自殖を繰り返させると，花粉親由

げており，分譲を受けられる．
野生イネのコアコレクショ

来の染色体部分と母親由来の染色体部分がモザイク状にン同様，Oryzabase から分譲依頼が行える．

なった系統群ができあがる．これを RILs
（RecombinantInbred Lines：組換え自殖固定系統群）と呼ぶ．一方，
F 1を戻し交雑すると，戻し交雑に使った親（反復親）に由来する遺伝子座が増える．こうしてできた BC1F1 やBC2F1 について単粒系統法で自殖させると，RILs に比べて反復親由来の染色体部分が多い系統ができあがる．
これを BILs（Backcross Inbred Lines：戻し交雑自殖系
統群）と呼ぶ．次に DHLs（Doubled-Haploid Lines：半数体倍加系統群）のメリットを紹介しよう．単粒系統法
による自殖で RILs も BILs も大部分がホモの領域 となっているが，それでもヘテロの領域を完全には除去しきれない．時に，その残ったヘテロ領域が解析に支障を与えることもある．DHLs は，F 1個体の花から葯を取り出して培養するとともに染色体を倍加させて作りあげるので，初期の世代からヘテロ領域がないため，ヘテロに由来する問題が生じない．しかし，葯培養から再分化にかけて技術的に難しいステップがあるので，作られる事例は少ない．最 後 に，染 色 体 断 片 置 換 系 統 群 CSSLs（Chromosome Segment Substitution Lines）を説明す
る．この系統群は，遺伝子マーカーを用いてどの染色体部分が供与親（P 2）のゲノム由来かをモニターしながら戻し交雑を続け，染色体の一領域だけが供与親（P 2）由来で，残り全ての遺伝背景が反復親（P 1）に戻ったものを集積し，それで全ゲノム領域をカバーするように組み合わせたものである（図 2B）．その構築には膨大な時間とエネルギーが必要であるが，染色体の入れ替え構造が単純なために，遺伝子探査には非常に有効な研究資源となっている．実際，イネで作られたイントログレッショ
ン系統は，出穂期を決める遺伝子や脱粒性遺伝子の同定に大きく貢献した．さらに，コシヒカリ／Kasalath（反復親：コシヒカリ）の CSSLs からは，出穂期を調節したコシヒカリ系品種が迅速に育成されている ．このように，イントログレッション系統は，基礎研究から育種研究までの広い範囲で活用できる重要な素材となっている．
2009 低 温 科 学

vol.67

図 2：イントログレッションラインの概念．論文 の図４を改
変．Ａ：DHLs（半数体倍加系統群），RILs（組換え自殖固定系統群），BILs（戻し交雑自殖系統群），CSSLs（染色体断片
置換系統群）構築の概念を模式的に示す．Ｂ：CSSLs（染色体
断片置換系統群）の概念を模式的に示す．左の図の縦軸は染色体が１番（Chr1）から 12番（Chr12）までを模式的に表し，
横軸は CSSLs の各系統を示す．DNA マーカーによる解析を行い，各系統の染色体の構成を調査し，各系統における染色体の由来をプロットした．白は反復親由来の領域を，赤は供与親由来の領域を示し，青はヘテロ領域を示す．右は，各 CSSL 系
統の染色体構成のイメージ．緑色は反復親由来の領域，赤色は供与親由来の領域を示す．

45

表 1：農業生物資源研究所のリソースセンターから配布される置換系統群
交配組み合わせ

集団

繰り返し親

系統数

日本晴／Kasalath

BILs

日本晴

98系統

日本晴／Kasalath

CSSLs

日本晴

54系統

コシヒカリ／Kasalath

BILs

コシヒカリ

182系統

コシヒカリ／Kasalath

CSSLs

コシヒカリ

39系統

コシヒカリ／NonaBokra

CSSLs

コシヒカリ

44系統

ササニシキ／ハバタキ

BILs

ササニシキ

85系統

ササニシキ／ハバタキ

CSSLs

ササニシキ

アキヒカリ／コシヒカリ

DHLs

日本晴／コシヒカリ//コシヒカリ

BILs

コシヒカリ

127系統

日本晴／コシヒカリ//日本晴

BILs

日本晴

79系統

8.3.3 イネ突然変異系統
8.3.3.1 変異イネ

39系統
212系統

Database:RAP-DB（http://rapdb.dna.affrc.go.jp/）やRice Functional Genomics Express Database:RiceGE

NBRP イネ部門には，分譲可能な 突 然 変 異 系 統 が（http://signal.salk.edu/cgi-bin/RiceGE）な ど の 統 合

8192ライン登録されている．これらのラインは，アルキ

データベースにおいて，ゲノム配列に対応付けられておル化剤の一つ，メチルニトロソウレア（N-methyl-N-

り，ゲノム上のどこにタグの挿入されたラインが存在す

nitrosourea：M NU）を受精直後の花に処理することにるかを簡単に検索できるようになっている．まずは，こよって誘導された突然変異体で，水稲の品種「金南風」

れらのデータベースを入り口として，研究対象の遺伝子及び「台中 65号」を用いて作られた ．これらは，九州が破壊されたラインの有無を調査すると良い．

大学遺伝子資源開発研究センターにおいて作出されたもここでは，イネ本来が持つレ ト ロ ト ラ ン ス ポ ゾ ン

ので，各系統の形質は調査されており，表現型から検索

Tos17 による挿入変異系統である農業生物資源研究所

して絞り込むことが出来る．アルキル化剤による変異誘のミュータントパネルを紹介する．この系統群はイネ内

発 の た め，変 異 の 中 心 は 1塩 基 置 換 で ，loss-of-在性の転移因子を活用しているために遺伝子組換えに関function だけでなく gain-of-function 変異が得られるこする制約を一切受けないメリットがある．遺伝子組換えとも期待される．近年，1塩基多型を検出できる TIL-

生物の取り扱い設備が限られている研究機関にとってはLING（Targeting Induced Local Lesion IN Genomes）

有効な研究資源になるだろう．後半には，韓国の POS-法が開発されているので，これを活用することによっ

TECH（Pohang University of Science and Technol-て，map-based cloning などの遺伝学的解析を踏まずにogy）から分譲されている T-DNA の挿入変異系統の取変異遺伝子を同定できる可能性も出てきた．分譲依頼は，

り寄せについて述べる．

http://www.shigen.nig.ac.jp/rice/oryzabase/

8.3.3.2.1 レトロトランスポゾン To s 17 ミュータン

nbrpStrains/kyushuGrc.jsp からオンラインで行える．

トパネル

分譲依頼後，九州大学と申請者が所属する 機 関 と でイネの内在性レトロトランスポゾン Tos17 の転移を

M TA（M aterial Transfer Agreement 分譲同意書）を培養によって活性化させ ，ゲノムあたり平均８コピー

交わすことになり，その後，種子を受領することになる．

まで増幅させた後に再分化して作成された「日本晴」遺8.3.3.2 ノックアウトライン

伝子破壊系統を総称してミュータントパネルと呼ぶ．こ

数多くの研究者が，T-DNA や Ac/Ds などのトランス

れまでにおよそ５万系統の変異株が作出され，これにポゾンやレトロトランスポゾン Tos17 をゲノム上に転よってイネ遺伝子の 50％が破壊された変異系統のプー

移させることで挿入変異を導入した系統群を整え，それルができたと推定さている．Tos17 挿入隣接配列は，らは分譲されており，有効な研究資源となっている．特24000件読まれてデータベース化されているので，目的に，個々の系統におけるトランスポゾンなどの挿入位置

遺伝子近傍への Tos17 の挿入の有無が即座に解析できは inverse PCR 法や tail PCR 法などに よって 決 め らるようになった ．また，例え目的遺伝子近傍に Tos17

れ，そ れ が 挿 入 部 位 の 隣 接 配 列（FST＝flanking

挿入配列が見いだされなくとも，変異株から単離した

sequence tag）としてデータベース登録されるように

DNA を三次元的に混合したスクリーニング用 DNA のなった．その配列情報は，既に Rice Annotation Project

分与を受け，それを鋳型として目的遺伝子 primer と46

イネ種子の入手法と栽培法

Tos17 primer の組み合わせで PCR 増幅すれば挿入変

Insertion Sequence Database, http://www.postech.ac.

異株が見つかる可能性も残されている．
変異系統の検索，

kr/life/pfg/risd/index.html）に記載されている．具体的各系統の表現型確認，種子分譲依頼が，Tos17 ミュータ
˜
ントパネルデータベース（http://tos.nias.affrc.go.jp/に は，POSTECH に 分 与 依 頼 の 電 子 メール（sookan

miyao/pub/tos17/）から可能となっている．なお，各ラジからダウンロードして２部作成し，両方を An 教授にインの種子がどの研究者に分譲されたかについてはホー送付する．この２部のうち１部については，An 教授がサムページ上で公開されるシステムになっている．

インしたものが，種子と一緒に返送されてくるので請求

＠postech.ac.kr）を出し，MTA フォームをホームペー

リソースセンターから送られてくる種子は 20粒程度

者側の資料として保管しておく．

なので，世代促進して採種する必要がある．これらの種

MTA フォームの送付先：

子は再分化当代なので，変異がホモ，ヘテロ，なしのもGynheung Anのが 1：2：1の比で分離する．それぞれの個体の一部か

Department of Life Science

ら DNA を抽出し，サザン解析等で目的の変異がホモか

Pohang University of Science and Technology

ヘテロかを確認しながら世代促進する．致死性や不稔をPohang, 790‑784, Republic of Korea.

与える変異の場合，変異をヘテロの状態で維持しなけれ

通常は，検疫手続きが完了したイネが国際郵便で届く．

ばならないので，ヘテロラインも処分せずに温存してお（郵便開封前に検疫手続きがなされているかを確認しよ

くことをお薦めする．

う．検疫手続きがなされていない場合，絶対に開封せず

このラインを用いる上での注意点は，目的の遺伝子にに，所属機関の遺伝子組換え実験安全担当者に連絡して

Tos17 が挿入されている以外にも複数カ所に Tos17 が指示を受ける．その後，最寄りの植物防疫所に持参して，挿入されていることを認識しておくことであり，その影

検疫手続きを完了させることになる．各自の研究機関と響を注意深く除去しなければならない．このためには，

植物防疫所の間の往復も，遺伝子組換え生物の搬出と搬別の挿入変異株を探して共通の表現型を示すことを確認入に当たることに注意してほしい．
これを防ぐためにも，するか，戻し交雑して Tos17 挿入部位を目的遺伝子のも種子を送る封筒には「Rice Seeds」など，植物種子が在のに減らしてから確認するなどの努力が必要である．

中されていることを明記してもらうようにリクエストし8.3.3.2.2 T-D NA タギングライン

ておこう．
）

韓国の POSTECH（浦項工科大学，Pohang Univer-

送られてきた種子は 20粒程度であり，実験に入る前にsity of Science and Technology）の Gynheung An 教

一世代増殖ステップを取り，実験によってはホモライン

授は，ジャポニカ品種，Dongjin と Hwayoung を用いてを確立する必要がある．なお，Dongjin と Hwayoung は，

T-DNA の挿入ライブラリーを作り上げた

日本でも問題なく育ち採種できている．

．T-DNAの挿入部位の隣接塩基配列が網羅的に読まれており，

2007年４月に分譲を受けた時のやり取りでは，POS-

FST としてデータベース登録されている．このライブラ

TECH RISD で管理されているイネ種子のうち 20％程

リー作成に用いられたベクターは４種類で，その特徴を度に，データベース登録された位置に T-DNA が挿入さ

表 2に 示 す．エ ン ハ ン サー配 列 を 持 つ ベ ク ター

れていない系統が混在していることが書かれていた．こ（pGA2715 and pGA2772）で作出されたライン

では，のため，世代促進中にイネ個体より DNA を単離し，T-

T-DNA の挿入によって遺伝子破壊が引き起こされるだ

DNA がデータベース通りに挿入されているかを検証しけでなく，T-DNA 挿入部位近傍の遺伝子に activationておく必要もある．なお，POSTECH においても再配列

tagging の効果が現れる可能性もあるので注意が必要で解析が進められているので，このような T-DNA の非挿ある．

入ラインの数は，今後減っていくと思われる．

これらの系統は遺伝子組換えイネであることから，受け入れを考えるならば，まずは遺伝子組換え実験計画書を作成し，所属機関から実験の許可を得るなど周到な準表 2：POSTECH の T-DNA 挿入系統に使われているベクター

備が必要である．また，これらの種子の輸入は，遺伝子

VECTOR

用途・特徴

組換え生物の搬入に当たるので，そのための手続きも完

pGA2707

promoter trapping

了させなければならない．

pGA2715

activation tagging/ promoter trapping

遺伝子組換え実験が許可されたならば，具体的な入手

pGA2717bidirectional gene trapping

手続きに進む．手順は，POSTECH RISD
（Rice T-DAN

pGA2772

activation tagging vector

2009 低 温 科 学

vol.6747

8.3.3.2.3 それ以外のタギングライン

れば輸入が認められる．
このように条件は厳しいものの，

POSTECH 以外にも数多くの研究機関がタギングラ

しっかりと条件を満たせば輸入できるので，どうしてもインを作成している．今回は，それらのホームページを取り寄せることが必要な場合は，最寄りの植物防疫所に紹介するにとどめる．

ご相談のうえ，挑戦してみてはいかがだろうか．

（T-DNA,http://urgi.versailles.inra.
Oryza Tag Line
fr/OryzaTagLine/）
Rice Mutant Database（T-DNA, http://rmd.ncpgr.
cn/）

ここで紹介したリソースは，長い年月をかけて世界中から収集されてきた品種群であったり，膨大な時間と労力を払って構築されてきた系統群である．分譲を受けた

Shanghai T-DNA Insertion Population（T-DNA,
http://ship.plantsignal.cn/index.do）
Zhejiang

8.3.4 イネ種子の入手法のまとめ

University（ T-DNA, http://www.

genomics.zju.edu.cn/ricetdna.html）

後は，取り交わした MTA や規則を遵守することはもちろんであるが，敬意を持って研究ツールとして有効活用
したい．分譲システムの活用によって大きな成果が生み出されれば，リソースコミュニティーの健全な発達にもUniversity of California Davis, Sundaresan Lab.

資するので，分譲を受けるだけでなく，その恩返しとし（En/Spm, Ac-Ds, http://www-plb.ucdavis.edu/Labs/て，上手に使って大きな成果を上げていただければと思

sundar/Rice Genomics.htm）

う．

Taiwan Rice Insertional Mutants Database（TDNA, http://trim.sinica.edu.tw/）
CSIRO Plant Industry Internet（T-DNA, http://pi.
csiro.au/fgrttpub/）

これら以外にも，イネの特殊な系統を保有する研究室は数多く，共同研究をベースにすれば，それらのリソー
スの分譲を受けることも可能になるだろう．これらについては，個別に問い合わせをしていただきたい．

これらに加えて，FOX Hunting System（Full-length
cDNA Over-eXpression gene hunting system イネ完全
長 cDNA を網羅的にイネ内で過剰発現させるシステム）などのプロジェクトも進行中で，これらの遺伝子組換え

8.4 イネ栽培法
8.4.1 概論

イネ系統も共同研究をベースにすれば分譲を受けられ研究機関・研究者ごとにイネの栽培方法には流儀がある．また，近い将来には，このような開発中リソースもり，各研究者が自らの研究目的や研究環境に合わせて，公開される時代が来ると予想され，ますますイネリソー

いろいろと工夫しながら栽培を行っているのが実情であスが充実してくることが期待される．

る．ここではまず，筆者の研究室で日本晴や農林８号に

8.3.3.2.4 その他の国からの輸入適用している栽培法を紹介する．これ以外にも栽培法を

植物防疫所のホームページ（http://www.maff.go.jp/

記したプロトコールブック

もあるし，いろいろなホー

pps/index.html）によると，イネ属（Oryza 属）種子の輸

ムページに栽培のヒントは埋め込まれている．これらの入は制限が多いことがわかる． 殻が付いた状態で輸入資料も参考に取り組んでいただければと思う．あと，健できるのは，韓国，北朝鮮，台湾からだけである．

全なイネを育成するためには，栽培の実務や原理を知っ

それ以外の国からの輸入は不可能なのだろうか．ホーていたほうが良い．このための参考書として，農業高校

ムページなどによると，以下の条件を満たすならば，上向けの栽培の教科書が向いているので，こちらも一読記３地域以外からでも輸入する道が残されていることがしておくことをお勧めする．野生イネは，栽培イネに比示されていた．①輸出国政府機関が発行した植物検疫証

べて，その栽培には数多くの注意点がある．野生イネに明書を取っていること，②その国から輸入しなければな

挑戦する方は，遺伝学研究所の野生イネ栽培プロトコー

らない理由があること，③ 殻やわらの部分（輸入禁止

ル（ http://www.shigen.nig.ac.jp/rice/oryzabase/品），土が完全に除去された玄米であること，④健全な外nbrpStrains/nigProtocol.jsp）も参考にしていただきた

見で，病気の痕跡や昆虫などの混入が見られないことでい．

ある．この条件を満たした種子を国際郵便（小包郵便物，

イネは亜熱帯原産の作物であり，育種によって生み出

小形包装物）で送付してもらう．その際，外装には「植された新品種を活用することで栽培地域が段階的に北上

物在中」と明記してもらうことと，輸出国で所得した植

し，現在は，その北限が北海道の北東端にまで達してい物検疫証明書を外に貼付してもらうことが重要だ．これる ．しかしながらこのことは，地域ごとに栽培に適したにより輸入時には植物検疫が行われ，この検査に合格す

品種が異なることも意味している．全ゲノム配列が決定

48

イネ種子の入手法と栽培法

された日本晴は，北海道の屋外で採種まで栽培することは困難で，ガラス温室やグロースチャンバーなどの設備が必要となるだろう．研究場所や研究環境によっては，品種選定にも注意が必要である．
グロースチャンバーで栽培する際には，栄養生長を促進するために長日条件を与えることが多いが，限界日長（これ以上明期が長くなると，もはや出穂しなくなる明期の長さ）には注意したい．日本晴の場合，限界日長は 15
時間付近と思われ ，たとえば 16時間明期を与え続けると出穂しなくなるので，採種を考える場合には明期の長さについても考慮が必要である．筆者は，14時間 30分の
明期（28℃）と９時間 30分暗期（23℃）のサイクルを与えることが多く，この場合，日本晴で播種後 90日目周辺に出穂する．一方，開花促進は，短日処理するのが最も容易で効果的である．８〜10時間明期の処理を２週間与図 3：枠付き育苗箱への播種 A：育苗箱に８割がた土を詰める方法．その後に播種し（B，C）覆土して（D）完成（E）．

えれば，そのおよそ１ヶ月後には出穂がもたらされる．
8.4.2 育苗ていることが多いため，
この滅菌処理は確実に行いたい．

［準備］

種を水道水で洗ってから水中に沈め，28℃に設定したイ① 枠付きの育苗箱（図３ プラグトレー，
ピットトレー

ンキュベーター内で２日間吸水させる．この水は毎日取などで代用可能）② 育苗土（住友化学 合成粒状培土ボンソル２号など）り替えた方が良い．48時間後には，種子は鳩胸状態を示すようになる．

③ イネ種子④ 次亜塩素酸溶液［播種と栽培］［休眠打破］

植えられるように，枠付きの育苗箱を使っている（図 3）．

私たちの研究室では，数多くの系統を一つの育苗箱に１年以上乾燥状態で保存されていたイネ種子の休眠はプラグトレー，ピットトレーという名で売られている農打破されている．しかし，採種直後の新鮮な種子や野生

業資材の中には代用できるものがある．育苗箱に８割程イネの種子の場合は休眠が深く，打破する処理が必要と度となるよう育苗土を詰めたものを用意する．育苗箱になる．この場合，種子を 40℃で数日間，通風乾燥すれば８割がた育苗土を詰めるには，箱を傾けてブラシをかけよい．野生イネの場合は，低めの温度（35℃以下）で通ると良い（図 3A）．種子を１枠に１個ずつ投入し，作業

風乾燥しないと発芽率が低下すると指摘している文献

後に覆土する．育苗箱をバットに置き，箱が半分程度沈もある．

むくらいまで水を満たす（図 3E）．発芽してくるまでは，育苗箱を完全に水没させないように注意したい．28℃に［種子の選抜］

保ったグロースチャンバー，あるいは温室にて，２〜３

種子は，比重が大きく充実しているものほど発芽率が週間程度栽培する．茨城県つくば市において屋外でイネ良く，その後の生育も良好である．生化学実験に用いる栽培をさせる場合，この育苗作業は，遅くとも５月中旬

材料などを均一に育成したい時などは，塩水選と呼ばれまでにスタートさせないと採種するのが厳しくなる．

る比重を基準にした選抜法で登熟不良の種子をあらかじ

8.4.3 プール栽培

め除去しておくと良い．具体的には，水 0.9l に塩化ナト

ここでは，水田圃場を持たない研究者にも比較的容易

リウム（食塩）240g を溶かして比重 1.13g/ml の塩水をにイネを栽培して採種することができる，屋外でのプー作り，この溶液に沈む種子だけを用いる．

ル栽培法を紹介する．

［発芽処理］［準備］

２倍希釈した次亜塩素酸溶液に 15分間浸し，弱く振盪① 木枠（図 4A 幅 21cm 厚さ 2.5cm のラワン材をしながら滅菌する． 殻などには病原菌や害虫が混在しカットして枠としたもの．筆者の研究室では，1252009 低 温 科 学

vol.6749

cm×230cm の 木 枠 を 使って い て，こ れ に 50個場合，移植直後は含有された肥料を使って育つ．移植後（５×10個）のポットを沈めて 50個体のイネを育て30日程度経過すると葉色が薄くなってくる．これは肥料る．この時の株間は 25cm 程度である．これ以上不足の兆候なので，追肥を行う．私たちの研究室では，ポットの個数を増やすと，株間が近くなりすぎて分「888」とラベルされた粒状の化成肥料（肥料重量の８％

げつ（枝分かれ）の発生が抑えられるなど生育にはが窒素，８％がリン，８％がカリウムであるように調製

マイナスの効果が出る（図 4E）．なお，このサイズされている）をポット１個あたり 6ml 与えている（ファのプールに水を満たすとおよそ 600l で，その重量

ルコンチューブを下から 6ml のところでカットし，そのは 600kg となるので，設置場所には注意する．また，チューブですり切り１杯で 6ml としており，5g に相当

枠の４隅はしっかりと固定しておかないと，水の重する）．過剰な施肥は，病害虫の蔓延の原因となるので，さで壊れることがある．
）

葉色をよく確認してから施肥するかを決めている．葉色② ビ ニール シート（厚 さ 0.4mm く ら い の ビ ニール

が濃緑色を保っている場合は追肥せず，しばらく様子をシート．サイズは木枠の大きさによる．木枠にかぶ見た方が良い．移植 70〜80日目あたりに再度，同様の追せて，ビニールの端を木枠の下にしっかりと押し込肥を行う．

むこと．図 4B）
③ ポット（1/5000アール

ワグネルポット，あるいは，［病気と害虫，防鳥など］

ポリエチレン製でバケツ型の 3.5l ポリポット）

種子膨潤時に次亜塩素酸により滅菌処理を確実に行④ 育苗土（住友化学 合成粒状培土ボンソル２号など）

い，また，育苗土も市販の滅菌された物を使えば，初期生育における病害虫の発生は確実に防ぐことが出来る．

［移植と栽培］

しかしながら，長い栽培期間には病気や害虫が発生する

前節の育苗法で２〜３週間育てたイネを移植する．移こともある．これを初期に発見し，確実に防除するため

植は，どうしても根を傷つけてしまうので，根が張り，には専門的な知識が必要なので，近隣の農業研究者や農吸水能力が回復するまでのイネは弱々しく，栽培には注業従事者の方に支援を依頼できる体制があると心強い．

意が必要である．通常の栽培イネでは，根が伸びて活着

あと，出穂するまでには防鳥網を張るなど，スズメの食するためには日平均気温が 12℃を越えている必要があ

害に対する対応が必要である．

る．そこで，屋外で栽培する場合，移植は日平均気温が12℃を越えてから行うこと．茨城県つくば市で栽培する［採種と保管］

場合は，４月中旬頃から移植が可能となる．また移植直一般的な栽培品種を６月に移植すると，８月には出穂

後は，根の傷みからイネの吸水能力が低下しているので，が始まる．収穫は，出穂後 40日から 50日の間に行うの数日間，プールの水位を高めにした方が良い．イネは活が良い．その頃には の色は黄色になり，種子は固く締着すると葉や分げつを規則的に増やし，旺盛に育つ．

まっている．それ以前では，未登熟で緑色の種子（青米）

イネは生育ステージによって水の必要量が大きく異なが多く，遅くなると，胚乳が割れたり茶褐色の種子が増る．イネの品種が一定で，生育が揃っていれば，栄養生加する．私たちの研究室では，刈り取った穂を１個体ご

長後期にはプールの水位を下げ，いわゆる中干しを行っとに束ねて，ガラス温室（28〜30℃）内に設置した金属ても良い ．これにより土壌に酸素が供給され，土壌中の網の上で１週間から 10日かけて乾燥してから脱穀して硫化水素や有機酸などの有害物質の含量が低下し，根が保存している．100粒の重さ（百粒重）と得られた全種子健全に保たれる．ただし，生殖生長期に入ると必要水量の重さを測定することによって種子の概数が計算できが増すので，その時期までにはプールの水位を上げ，渇る．種子は個体ごとに封筒に入れ，それをシリカゲルの水させないような注意が必要だ．生育ステージの揃って入った密閉容器に収めて保存している．１年未満の短期

いないイネや，出穂期の異なるイネを同一プールで栽培保存の場合は室温でもよいが，長期保存を考えるならばする場合は，常時満水で栽培した方が問題は少ない．屋

10℃以下に設定された低温室で保管することが望まし外で栽培すると，どうしても雑草が生えて来るので，大い．乾燥状態を保つために，毎年，保存容器のシリカゲ

きくならない内に引き抜いて処分しよう．

ルは交換すること．低湿度でかつ低温で保管することが出来れば，10年以上にわたって高い発芽率を保つことが［施肥］
ボンソル２号など，肥料を含んでいる育苗土を用いた50

示されている ．
最後に，野生イネの場合の注意点を述べる．野生イネ
イネ種子の入手法と栽培法

図 4：プール育苗の手順 A：木枠を設置したところ．木枠にビニールを敷いて（B），完成後に水を張って植物を設置する（C）．D：７月末に撮影したプールの様子．E：プールで育てたイネ（日本晴）の草姿．左が株間 25cm（標準）で，右が株間 18cm（密殖状態）で育てたもの．分げつ（枝）の数は，標準が 21本，密植が 15本．標準個体からは 1355粒採種できたが，密植個体からは 1085粒しか取れなかった．株間 25cm の方が，草姿が良く，多数の種子をつけることが明らかになった．

図 5：無菌育苗の手順 Ａ：１穂用 すり機のいろいろ．右は， すり機を開いたところ．中に 100粒程度の種子を入れて蓋をし，蓋を上から押さえつけながら回す．Ｂ：１株用 すり機．1000〜2000粒の すりのための装置．上の皿に種子を投入しながら，ハンドルを回して すりを行う．Ｃ，Ｄ：無菌育苗の実例．Ｄは，プラントボックスに播種後 28℃白色光下で７日間栽培した時の状態．

は他殖性が強く脱粒するものも多いので，穂が出てきた
ら袋掛けをすることが必要となる．この際，の表面にカビが生えやすくなるので，なるべく通気性の良い袋を［発芽処理］
すり機でイネ種子から を除去する．種子を 70％エ

選んだ方が良い．

タノールに１分間浸した後，２倍希釈した次亜塩素酸溶

8.4.4 無菌育苗

液に 15分間２回浸漬して雑菌類を完全に死滅させる．
滅

ここでは，イネを無菌的に発芽させ，幼苗を得る手法

菌処理が行き渡るように弱く撹拌しながら行った方がよを説明する．種子の滅菌手順はカルスを誘導する時にもい．クリーンベンチ内で滅菌水を用いて種子を洗浄し，使うことができる．

種子の余分な水分を滅菌済み濾紙で吸い取った後に，プ
ラントボックス内の水寒天培地上に置く（図 5C）．0.4％［準備］

agar は極めて柔らかいため，種子を埋め込まなくとも根①は自然に培地中に入り込む（これよりも高濃度の水寒天すり機（図 5AB 実験規模に合わせて用意する．
ごく少数の種子を扱う場合は，手やピンセットで培地や，ゲランガムなど固い培地を使う場合，種子を培を剥がすこともできる．
）

地内にしっかりと埋め込まないと根は培地内に入り込ま② プラントボックス（図 5C マヨネーズ瓶などでもないので注意が必要である．
）
．

代用可能）
．中に水寒天（0.4％ agar 50ml）を入れ，オートクレーブ滅菌しておく．
③ イネ種子28℃白色光下など適当な条件で栽培する．筆者は，γ線④ 70％エタノール，次亜塩素酸溶液，滅菌水，ピンセッ
ト，滅菌済み濾紙
2009 低 温 科 学［栽培］vol.67で変異誘導した日本晴の M 2種子を上記の方法で発芽処理し，赤色光下 28℃で７日間栽培し，その時の幼葉鞘51

（coleoptile）の長さの違いから phyB 変異株を単離することに成功した ．幼苗で表現型解析する場合，特に無菌的に解析をおこないたい時には良い実験系と考えている．なお，このように育てた個体も移植することができる．

8.5 おわりに筆者は，11年前にイネとは無縁の研究室から農業生物資源研究所に移り，イネの研究を始めることになった．
以後，自らの研究テーマの流れに従い，イネ幼苗を育て，そこからタンパク質を単離したり遺伝子を単離したり．
時には変異株を単離し，その系統を維持し，その系統の解析のために圃場に出たり，
ついには交配を行ったりと，少しずつイネの解析技術を体得して今日に至っている．
これらの全ては，数多くの方々から手取り足取り教えていただいた技術であり，お名前が書ききれないのが残念だが，先ずは，その方々に感謝の気持ちを伝えたい．
この章は，これまでに得た知識を，私に教えてくれた
先輩同様に上手く伝えたいと思う気持ちから書き始めた．しかしながら，書き進むにつれ，根っからのイネ研究者でなく，経験も豊富とは言えない立場であることを痛感し，不安を覚える毎日であった．もしこれをきっかけにイネ栽培に取り組まれる方がいるとするならば，私としてもコミュニケーションを取りながら，より良い栽
培法を模索して行けたらと思っている．このためには，ご経験者のコメント，アドバイスも大切と感じていて，これらをいただくことができるならば，さらにうれしいと思っているしだいである．

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3311.

イネ種子の入手法と栽培法

1章

植物・藻類・細菌の材料の入手と栽培・培養

９．藻類
村上 明男 ，小檜山篤志
藻類は，多様な光合成色素，単純な体制，均質な細胞が取得可能，などの特徴が活かされ，酸素発生型光合成の研究に大きく貢献している．本章では，光合成研究における藻類の活用法を紹介する．

Algae
Akio M urakami, Atsushi Kobiyama
Algae, which are an important primary producer in aquatic habitat, consist of phylogenetically-various groupsof oxygenic photoautotroph. In this chapter, we introduce the techniques to utilize algae in photosynthetic
study; maintenance of algal strains, preparation of culture media, usage of culture instruments/devices, andconditions to control algal growth.

調培養法も開発されている．一方，多細胞体制の大型藻

9.1 藻類を活かした光合成研究

類（アオサ藻 Bryopsis/Codium/Ulva/Acetabularia，褐

藻類は，分類群ごとに光合成色素の組成が異なる他，藻 Sarugassum/Ecklonia/Scytosiphon，紅 藻 Porphyra/細胞の体制（単細胞，糸状体・葉状体などの多細胞，茎（色
Aglaothamnion/Anthithamnion）も，それぞれの特色

状部や葉状部等の器官分化）やサイズ（1μm 程度のピコ

素系，葉状体，多核体など）が活かされ利用されてきた．

プランクトンから体長 50m 以上の大型褐藻類）などの多くのシアノバクテリア（ラン藻）でゲノムが公開さ

多様性に富み，生育環境（淡水，汽水，海水，土壌，岩れているが，単細胞の緑藻 Chlamydomonas reinhardtii，上，無脊椎動物や菌類との共生，強酸性・高温・高塩・Ostreococcus tauri，紅藻 Cyanidioshyzon merolae，珪藻温泉などの特殊環境）も広範囲に及ぶ．約 10の門からThallassiorsira pseudonata，Phaeodactylum tricornutam構成される藻類の分類は，光合成色素の組成を基準としにおいても全ゲノムが解明されている．また，葉緑体（プている．光合成色素（クロロフィル・カロテノイド／キラスチド）ゲノムについては，他の分類群の藻類（ユーサントフィル・フィコビリン）の宝庫でもある藻類は，

グレナ藻，クロララクニオン藻，クリプト藻など）でもアンテナ色素系をはじめ，光化学反応中心，電子伝達系，

報 告 さ れ て い る．一 方，大 型 藻 の 褐 藻 Ectocarpuas

酸素発生系，さらに炭素固定反応の研究に幅広く活用さ

siliculasus や紅藻 Porphyra yezoensis においてもようや

れ，酸素発生型光合成の解明に大きく貢献してきた ．まくゲノム解析が開始され，形質転換系などの開発も並行た，光や栄養物などの水環境特有の環境要因に対する適して進められている．これらのゲノム情報を光合成研究

応・応答の解明は藻類ならではの研究テーマでもある．

に活用するためにも藻類の培養に関する技術の習熟は不

単細胞の微細藻類（緑藻 Chlorella/Chlamydomonas/

可欠である．

Senedesmus/Dunalliella，ユーグレナ藻 Euglena，紅藻Porphyridium/Rhodella/Cyanidiumm/Galdieria，黄金色藻 Ochromonas，珪藻 Chaetocerus/Nitschia）
は，微生

9.2 藻株の入手

物学的培養法の適用により増殖ステージが揃った均質な藻株は国内外のカルチャーコレクションから購入する細胞を得ることができ，光合成の生理学，生化学，遺伝方法が一般的であるが，株を分離した研究者へ分譲依頼

学などの研究に用いられてきたすることも可能である．また，大型藻の場合はフィール．また，突然変異株や従属栄養培養の可能な藻株も活用され，大量培養法や同ドで採集した藻体を用いることも有用である．
国内外には微細藻を中心とした藻類のカルチャーコレ

１) 神戸大学・自然科学系先端融合研究環・内海域環境教
育研究センター２) 北里大学・海洋生命科学部

2009 低 温 科 学

vol.67

クションが設置されている（表 1）．広範囲の分類群の藻株を収集している分譲機関や特定の分類群の藻株だけを収集している分譲機関など，それぞれ特徴がある．各カ53

表 1：国内外の藻類カルチャーコレクションのリスト
コレクション名
国立環境研究所（NIES）

微生物系統保存施設

2008年 11月現在
特徴

URL

微細藻約 1000株．1958年創設の IAM 株（旧東大応微研）を 2007年に移管

http://mcc.nies.go.jp/top.jsp

製品評価技術基盤機構（NITE)⎜ 生物遺伝資源部門（NBRC）㈱海洋バイオテクノロジー研究所（M BIC）収集の海産微細藻 270株を移管

http://www.nbrc.nite.go.jp/070328.html

神戸大学 海藻類系統株コレクション（KU-M ACC）

海産の大型藻（褐藻，紅藻，緑藻，他）約 500 http://www.research.kobe-u.ac.jp/rcis-ku株
macc/

Provasoli-Guillard National Center for 海産のシアノバクテリアと微細藻約 2500株
Culture of M arine Phytoplankton（CCM P）

https://ccmp.bigelow.org/

Culture Collection of Algae and Protozoa EG Pringsheim の藻株をもとに創設．藻類と（CCAP）
原生生物約 2500株．UTEX や SAG の基礎

http://www.ccap.ac.uk/

CSIRO Collection of Living M icroalgae

海産と淡水産の微細藻約 800株

http://www.marine.csiro.au/algaedb/
default.htm

Pasteur Culture Collection of Cyanobacter- シアノバクテリア
ia（PCC）

http://www.pasteur.fr/recherche/banques/PCC/

Sammlung von Algenkulturen der Univer- シアノバクテリアと微細藻約 2200株
sitat Gottingen（SAG）

http://www.epsag.uni-goettingen.de/
html/sag.html

The Culture Collection of Algae at The RC Starr が創設．Indiana 大から移管．微細藻を中心に約 3000株．1L 培養の細胞も供給
University of Texas（UTEX）

http://www.utex.org/

微藻類．微生物や培養細胞等のバイオリソー
スを扱う研究機関

http://www.atcc.org/

ATCC The Global Bioresource Center

Canadian Center for the Culture of Micro- 海産微細藻が中心（淡水産約 60株含む）
organisms（CCCM ）http://www3.botany.ubc.ca/cccm/

Canadian Phycological Culture Centre（CPCC）

Tronto 大から移管した微細藻とシアノバク
テリア約 500株

http://www.phycol.ca/

Roscoff Culture Collection（RCC）

Roscoff 臨海実験所．海産の微細藻とシアノバクテリア約 1300株

http://www.sb-roscoff.fr/Phyto/RCC/

Culture Collection of M icroorganisms 極限環境（砂漠，温泉，高塩，酸性など）の微生物（微細藻とシアノバクテリアを含む）
from Extreme Environments（CCM EE）

http://cultures.uoregon.edu/default.htm

Culture Collection of Algae of Charles シアノバクテリアと微細藻約 200株
University of Prague（CAUP）

http://botany.natur.cuni.cz/algo/caup.
html

Culture Collection of Algal Laboratory（CCALA）

チェコ科学アカデミー．微細藻とシアノバク
テリア約 500株

Microalgal Culture Collection of the Uni- 海産，汽水産，淡水産の微細藻約 380株
versity of Caen

http://www.butbn.cas.cz/ccala/index.php
http://www.unicaen.fr/ufr/ibfa/
algobank/

Culture Collection of Algae at the Univer- 微 細 藻 約 1800株．Algenkultur-Sammlung http://www.ccac.uni-koeln.de/sity of Cologne（CCAC）
Wien（ASW ）株も移管
Culture collection of Algae

Marburg 大，微細藻とシアノバクテリア

Scandinavian Culture Centre for Algae Copenhagen 大，微細藻約 600株
and Protozoa（SCCAP）
ACOI Coimbra Collection of Algae

Coimbra 大，微細藻約 1500株

http://staff-www.uni-marburg.de/cellbio/welcomeframe.html
http://www.sccap.bot.ku.dk/
http://www1.ci.uc.pt/botanica/ACOI.htm

The Chlamydomonas Center culture col- 緑藻 Chlamydomonas 株専門
lectionhttp://www.chlamy.org/strains.html

Dunaliella Culture Collection at Brooklyn 緑藻 Dunaliella 属約 40株
College

http://www.dunaliella.org/dccbc/

Antarctic Protist Culture Collection at 南極 Ross Sea 産の微細藻（分譲の可否は不明）
Woods Hole

http://www.whoi.edu/science/B/protists/

Loras College Freshwater Diatom Culture 淡水産珪藻（分譲の可否は不明）
Collection

http://www.bgsu.edu/departments/biology/
facilities/algae/html/DiatomCulture.html

54

藻類

ルチャーコレクションは，保存株のリストをホームペー

水産資源は漁業権の対象にもなっているので，採集に際ジ上で公開している．ホームページには，各藻株についし漁業協同組合などへの許可申請なども必要である．養

ての学名・株番号のほか，産地，特徴，培地，培養条件

殖のワカメやノリなどは加工前の生の藻体を栽培業者かなどの情報，さらに分譲・購入の手続き，価格，契約事ら購入することも可能である．なお，繁殖に季節性があ項などが掲載されている．コレクションによっては藻株る大型藻を通年入手することは困難なので，計画的な実ば か り で な く，大 量 培 養 し た 細 胞 ぺ レット や DNA/

験が必要となる．

RNA などの注文を受け付ける．文部科学省のナショナ

野外採集ではラボとは次元の異なる危険が伴うので，ルバイオリソースプロジェクトに参画した国内機関が収周到な準備が必要である．日本生態学会のホームページ

集している藻株の情報は，〝Algae Resource Database"

掲載の「野外調査の安全マニュアル（案）」や東京大学がとして公開されている（http://www.shigen.nig.ac.jp/

公開している「野外活動における安全衛生管理・事故防．
algae/top.jsp）

止指針」などを参考に安全対策を講ずる．

購入した株の取扱いについては，契約事項を遵守しなければならない（第三者への再分譲・販売を禁止している機関もある）．
分譲価格は藻株の維持管理の手間などか

9.3 培養の基本

ら判断すると適正な設定である．ほとんどの分譲機関は

カルチャーコレクションから藻株を購入する際には，少人数の研究者・キュレーターのボランティア的活動で各コレクションで使用している培地名（組成や作成法）

維持され，運用資金や人材の確保に苦労していることがや培養条件（光強度や温度）なども提供される．しかし，多い．コレクションの閉鎖や機器の故障により，長年維

培地の種類は，各分譲機関や研究者が経験的に選択して持してきた株が散逸・喪失した事例もある．最近は，凍いるため，同じ藻株でも異なる培地が使用されているこ結保存法の開発も行なわれ一部の藻株では成功しているともある．また，実験の目的に応じて培地や組成の一部が，まだ藻類全般に通用する保存法にはなっていない．

を変更する必要もある．培養に用いる機器や光源などにそのため，分譲機関間で藻株を交換することで藻株の喪ついては文献などを参照するとともに，最新の培養器具失リスクを低減させているケースもある．特に，培養がなどを取り入れていくと良い．なお，藻株の分離や培養

不安定な藻株の維持においては重要な対応と思われる．

法などの藻類についての多岐にわたる実験手法について

微細藻の場合は，見た目はもちろんのこと顕微鏡レベ

は多くの成書が刊行されている．各成書にはそれぞ

ルでも判別不能なことが多い．このような藻株を維持す

れ特色があるので，研究の目的に応じて参照することをる上での注意としては，株間のコンタミや株の取り違い

薦める．

のミスを避けるための工夫である．また，不要になった

9.3.1 培地藻株の廃棄にあたって，自然界に放出・漏洩させないよ培地の作成にあたっては，成分毎の保存液の作成や培う処理する．
毒性物質を生成する種ではもちろんのこと，地の作成順序などに注意する．細菌やカビの混入を防ぐ

生態系保護の観点からも重要な点である．現に，地中海ため，培地や培養器具は原則的に滅菌処理する．培地のの水族館から漏出した熱帯起源の海藻が周辺海域の在来滅菌はオートクレーブが基本であるが，沈殿物の生成や種を駆逐していることが報告されている．なお，分譲株

有機物の変質を防ぐためには，培地成分をいくつかに分を用いた研究での成果（論文）を分譲機関へ報告するこけて滅菌した後，クリーンベンチや無菌箱で混合することも大切である．各コレクションでは藻株毎の文献情報ともある．海産藻類の培地は，天然海水あるいは人工海を収集・公開している場合もあり，研究成果の宣伝やコ水をベースに各栄養塩を添加して作成する．海水を採水

レクションの支援にもつながる．

する際には，河川水や降雨の混入に注意し海水の塩濃度

海藻などの大型藻類も，特有の光合成色素や色素タンは必ず確認する．また，市販の人工海水を利用する場合

パク質の精製や多核体（緑藻カサノリ Acetabularia やハは，品質や継続した供給に留意する．
海水をオートクレー

ネモ Bryopsis）の特徴を活かした未損傷葉緑体の単離にブすると少量の沈殿物が生成する．藻株の生育に問題が活用されてきた．しかし，大型藻の実験室での培養は時生じた場合には，面倒でも濾過滅菌（0.22μm ポアサイ

間と手間を要することが多く大量培養は困難である．そズのメンブレンフィルターを使用）を行なう．多くの培のため，大型藻などの場合は野外に生育する自然藻体を養実験は光独立栄養で行うため無機培地を用いるが，従用いることも多い．野外採集にあたっては，資源や生態

属栄養培養あるいは光従属栄養培養ではグルコースなど系の保護に留意する必要がある．特に，食用海藻などのの有機物を培地に添加する．また，藻株によってビタミ

2009 低 温 科 学

vol.6755

ン類の添加も必要である．添加する有機物やビタミンのの濃縮などにも注意する．

種類や濃度は文献を参照する．

9.3.4 増殖・収穫・破砕

9.3.2 器具

微細藻の増殖速度の測定は，細胞数（血球計算盤，コー培養に使用する容器は，シャーレ，試験管，培養フラルターカウンターで計測），濁度（分光光度計で測定），

スコ，特殊形状の培養瓶，など市販品から特注品まで研クロロフィル量（色素抽出液を分光光度計で定量）など

究者の好み，培養の規模，実験目的に応じて使いわける．

の指標を使いわける．大型藻では葉面積や生重量などのオートクレーブ滅菌（例：120℃，20分）
や乾熱滅菌
（例：

指標も用いる．

150℃，３時間）
を行うため，培養容器は耐熱ガラス製が微細藻の収穫では遠心沈澱とフィルター濾過を細胞サ好ましい．特殊な培地の使用や大容量の培養では，オーイズに応じて使い分ける．いずれの方法でも迅速に回収

トクレーブ可能な透明ポリカーボネート製の容器を用いすることで細胞へのダメージを最小限にする．遠心回収る．また，培養細胞用の滅菌済プラスチック器具（多穴した細胞は新鮮培地や緩衝液での再懸濁により洗う．

プレートや扁平培養フラスコなど）は培養経過の顕微鏡

微細藻類の細胞からチラコイド膜を分取するために観察など藻類の培養にも活用できる．植え継ぎ用のガラ

は，超音波，フレンチプレス，パープレスなどを用いてスピペットなどは乾熱滅菌する．ポリカーボネート製以細胞を破砕する．小規模の細胞破砕ではガラスビーズ法

外のプラスチック製品はオートクレーブ滅菌できないこを用いることが多いが，他の方法に較べ破砕効率が低い．

とが多い．

大型藻の場合でも，予め藻体を小さく切り刻むことでこ

9.3.3 光・温度・攪拌

れらの方法が適用できる．

培養用の光源として，蛍光灯（白色，昼光色など）が用いられることが多いが，白熱電球が有効な場合もある．
大量培養などの際の広面積照射では，高圧ナトリウムラ

9.4 微細藻の培養

ンプやメタルハライドランプを用いることもある．蛍光購入した藻株は，少量の液体培地あるいは寒天上の小灯は様々な発光特性（波長分布）をもつ種類が市販されコロニーとして送付されてくることが多い．輸送中のスているので，カタログ等で確認する．発光ダイオード

トレスで弱っているので，直ちに新鮮な培地に植え継ぐ．

（LED）や冷陰極管なども培養に使用されているが，既製野外採集した藻から得たクローン培養株は二度と入手で品は高価で融通性が低い．培養光の色（波長組成）を変きないことが多いので，絶やさないように維持する．こえる場合は，光学フィルター（色ガラス製，プラスチッ

こでは，珪藻や渦鞭毛藻を例にあげ，微細藻類培養株のク製）を各種の光源と組み合わせて用いる．長寿命のラ維持と各種の培養法について紹介する．

ンプが開発されているが，時間とともに劣化するので光

9.4.1 保存培養

強度は定期的に確認する．

藻株を絶やさないように，実験培養とは別に保存培養

培養温度の設定は文献や分譲機関からの情報を参考に（元種培養）として維持する．微細藻は通常は無性的に二する．光源による熱の影響を避けるためには，培養瓶を分裂で増殖するため，新鮮培地への植え継ぎを繰り返す

恒温水槽に入れて培養すると温度を安定に保つことが出ことで藻株を維持する．珪藻は細胞分裂の度に被殻が小来る．最近は，温度安定性が向上した培養庫（インキュ型化し細胞内小器官を維持できなくなるため，有性生殖ベータ）を使うことが多いが，光源の種類や設置場所をにより増大胞子を形成させ細胞サイズを回復させる．ま変更する際には注意が必要である．保存培養では，至適た，凍結保存法も開発されているが一部の藻株を除いて温度より５℃程度低めに設定することが多い．

未確立であり，一般的には適用できない．

培養液中の藻を均一に懸濁し，藻の沈殿を防ぐため培

微細藻の継代培養では固形寒天培地や液体培地を用い養液を撹拌する．スターラーでの培地撹拌，培養容器のるが，寒天培地では生育しない藻株もいる．寒天培地で振とう，培地のエアレーションなど，藻株の特性に応じ培養できる微細藻（例：渦鞭毛藻 Symbiodinium）では，て選択する．エアレーションでは，エアポンプ（コンプクローン株の確立や無菌化が容易である ．しかし，多く

レッサー）からの配管にエアフィルターを挿入し細菌のの微細藻（例：渦鞭毛藻 Alexandrium）は寒天培地では混入を防止する．二酸化炭素濃度を変える実験では，ガ増殖できない．

スボンベからの二酸化炭素を空気と混合して供給する．

海産微細藻用として，SWII 培地 ，T 培地 ，f/2培

二酸化炭素濃度は流量計で調節し，必要に応じて実測す

地 ，ダイゴ IMK 培地（日本製薬）等の天然海水をベーる．なお，培養途中での培地の pH 変動や蒸発による培地

スにした培地の他，ASP 培地

56

や Aquil 培地

等の人
藻類

工海水培地も開発されている．各培地は生物種や研究目

培養を維持するためには，培養光源（蛍光ランプの増加，的に合わせて選択する．培地の種類により増殖速度は速高圧ナトリウムやメタルハライドなどの高輝度ランプへ

いが細胞密度が濃くならない，反対に増殖は遅いが高密の変更）や照明方式（外照射から内照射への変更）など

度になるものがある．長期間保存の場合など，光量や温の工夫も必要となる．これに伴い，培養液の過熱対策（冷度を至適条件から下げて増殖速度を遅くさせ，継代間隔

却ファンの使用）や省エネ対策（細胞密度に合わせた照を長くすることも可能である．例えば，生存の温度範囲

度の調節）なども講ずる．

が広い広温性株では，20℃では１〜２週間毎の継代が必

培養容器内の細胞や培地を均一に維持するため，エア要であるが，４℃では１〜２ヶ月間隔で十分な場合もあレーションやスターラーなどにより撹拌する．

る．藻株によって光・温度の許容範囲が異なるため，培9.4.3 連続培養養の状態が安定した後に条件検討する．

上記のバッチ培養法では，増殖に伴い個々の細胞が受休眠細胞を形成する藻株の場合，休眠細胞での長期保ける光条件や栄養状態が変わる．細胞の生理状態を安定存が可能である．渦鞭毛藻や珪藻の休眠細胞は，５℃，に保つためには連続培養法（ケモスタット法，タービド

暗所で 20ヵ月以上の生存が確認されている．また，珪藻スタット法）
を採用する ．ケモスタット法では培養タンの栄養細胞でも２〜３ヵ月は生存する ．休眠細胞の発ク内に培地を一定流量で供給することで，培地中の栄養芽は，増殖培地へ移し光や温度を至適条件にすることで条件を一定に保つ．この際，培地の窒素などの栄養分が行う．休眠細胞は有性生殖の結果生じるので，異なる交増殖の制限要因になるように濃度を調節することで，細配型の栄養細胞をもつ種ではクローン株での維持はでき

胞密度を一定に維持する．

ない．休眠細胞から発芽した後，交配型の異なる栄養細タービドスタット法は，培養タンクへの培地の供給速胞へと分化する株もあることから，クローン株の維持お度（培養液の希釈速度）を細胞の増殖速度に合わせるこ

よび異なる交配型の細胞を得るには休眠細胞から発芽とで，細胞密度を一定に保つ方法である．細胞密度を濁（分裂）後の細胞をキャピラリーで一個ずつ拾い再培養す

度で連続モニターし培地の供給速度をフィードバック制

る．このように，微細藻の保存培養を行う上でも生活環御して，細胞密度を調節する場合もある．連続培養装置の理解が必要である．海藻（大型藻）の生活環では配偶の模式図を図 1に示す．連続培養には，培養タンク，エ

体と胞子体の世代を交互に繰り返すが，微細藻の生活環

アポンプ，シリコンチューブ，添加培地用のタンク，流には栄養細胞が二分裂する無性生殖と配偶子接合による速可変のポンプ，オーバーフローした培養液を回収する

有性生殖の過程が含まれる．有性生殖の形式も種によりタンクなどが必要である．タンク類はオートクレーブ滅異なり，単一クローン細胞から生じた細胞間で有性生殖菌可能な材質の容器を使用する．また，各タンクのエアするホモタリックな種と異なる交配型のクローン間で有の出入口には細菌の混入防止用にエアフィルターを接続性生殖するヘテロタリックな種が存在する．

する．エアレーションの流量調節にも注意する．本法で継代培養による藻株の保存では日常的な観察が必須である．培養株への細菌の混入による藻株の衰弱・死滅なは，長期間にわたり細胞の状態を一定にした培養が可能
で，阻害剤の添加実験などにも活用できる．

どの異常を早く察知し，培地の作り直しや植え継ぎなどの対応を速やかに行う．天然海水を用いる場合，水質（塩濃度や溶存成分など）の微妙な違いが藻株の増殖に悪影響を与えることもある．
9.4.2 大量培養
藻体を実験に供する場合，保存培養規模の量（数 mL）
で十分な場合もあるが，タンパク質精製などの生化学実
験では 10L 単位の大量培養（高密度培養）が必要となる．
通常のラボの設備ではこの規模の培養が限界である．培養容器として，ガラス製の 3L 平底丸フラスコや 5L 三角フラスコ，あるいはポリカーボネート製の 10L 広口瓶を用いる．浮遊性の海産微細藻の大容量培養では，培養開始時の細胞密度の低さや光量不足のため小規模培養より増殖が悪くなることが多い．大量培養において高密度
2009 低 温 科 学

vol.67

図 1：連続培養装置の模式図

57

9.4.4 同調培養
細胞の生理状態をさらに均一に保つためには細胞周期の同調が必要である．藻類の同調培養においても，動物
培養細胞で用いられている栄養成分の除去，あるいは成長調節物質や細胞分裂阻害剤（DNA 合成阻害剤等）の添
加などの方法が適用できる．また，藻類では光が細胞周期の制御要因であるため，光周期を制御した同調法も利用されている．緑藻 Chlamydomonas では，12時間明期−12時間暗期の光条件による細胞周期の同調が報告されている ．珪藻 Thalassiosira pseudonana では，
ASW 培地（ASWT）

中のケイ素の欠乏−再添加による細胞周期の同調法が報告されている ．また，珪藻Seminavis robusta では，対数増殖期の細胞を 24時間暗所に置き，細胞周期を G 期で停止させる同調法も報告されている ．
渦鞭毛藻では，細胞分裂の様態（染色体が常に凝集し核膜が消失しない）が他の藻類とは異なることもあり細胞周期に関する研究が遅れている．また，明期にだけ細胞の遊泳運動が見られる Symbiodinium sp.や明期−暗期を通して遊泳運動を継続する Alexandrium tamarense のような種が存在するため，渦鞭毛藻の細胞周期制御については個別の対応が必要である．A. fundyense では
82時間の連続暗処理後に，通常の明暗周期に戻すことで同調させている ．また，Crypthecodinium cohnii では，寒天培地培養した細胞を液体培地で洗浄し遊離した細胞をメンブレンフィルター（10μm ポアサイズ）でろ過することで，G 期の遊泳細胞を得ている ．さらに，薬剤（ヒドロキシ尿素や 2，6‑ジクロロベンゾニトリル）処理による G 期での細胞周期停止も報告されている ．

9.5 大型藻の課題
大型藻は微細藻よりも培養が難しく実験室での成長速度も遅いため，光合成研究で使われることは少ない．大型藻を生化学や生理学実験などに用いるためには，組織や細胞に含まれる粘性多糖類の対策や複雑な形態や生活史の理解も必要である．海洋の環境や生態系を理解する
上からも，石灰藻（紅藻，アオサ藻の一部）も含めた大型藻の光合成研究を進める必要が高くなっている．

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2009 低 温 科 学

vol.6759

1章

植物・藻類・細菌の材料の入手と栽培・培養

10．紅藻の培養，入手
榎並

勲

ここでは，紅藻の中で，私たちが光合成の研究材料として用いてきた紅藻 Cyanidium caldarium（シアニジウム）とその近縁種である Cyanidioschyzon merolae（略してシゾンと呼ぶ）の培養法と入手法について紹介する．これらの紅藻は，世界各地の酸性温泉に生息し，pH 1〜3の酸性領域で増殖し，中性 pH では増殖できない好酸性，好熱性の単細胞藻である．光合成色素としては，クロロフィル a，カロチノイドと青色のフィコシアニン，アロフィコシアニンをもつが，紅色のフィコエリスリンはもたないため，ラン色細菌に似た青緑色をしているが，細胞内に１個の葉緑体とミトコンドリア，核をもつ真核生物で，原始的な紅藻と考えられている．

Culture and acquisition of red algae
Isao Enami
In this chapter, culture and acquisition of red algae, Cyanidium caldarium and Cyanidioschyzon merolae, were
described.

10.1 C yanidium caldariu m(シアニジウム)

するのを防ぐためにスターラー攪拌しながら培養すると良い．最近，シゾンの培養に用いる表 2に示す大量の無機栄養源を含む培養液を用いて，同様の培養条件で培養

私たちが培養しているシアニジウムは草津温泉から採集した株である．シアニジウム細胞は，強固な厚い細胞

表 1：Cyanidium caldarium の培養液組成（5L）

壁をもち，４個の内生胞子を作り増殖する．後で述べる

0.9g
CaCl
0.9g
MgCl
0.9g
KH PO
(NH4) SO
1.8g
5ml
Microelement
5L の DW に上の無機塩から順に溶解した後，H SO に
より pH を 2.5〜3.0に合わせる．

シゾン細胞に比べ，温度などの環境変化に対して強い．
外液 pH が強酸性であるにもかかわらず，細胞内 pH は
強力なプロトンポンプの働きにより中性に保持されていることが分っている．しかし，好酸機構（なぜ中性 pHでは増殖できないか）については不明のままである．すでに，高い酸素発生能をもつ系 が精製されており ，その結晶構造解析が進行中である (４．タンパク質複合体の単離 ｂ．系 参照）．
［培養方法と入手法］
表１に示す培養液 を調製し，オートクレイブで滅菌する．少し濃い目に植え継いだ方が培養しやすい．薄く
植え継ぐと，最初は弱い光強度で培養する必要がある．
通常は，30〜50μmol photon m s の蛍光灯照射下で培養している．約 40℃で，５％ CO を含む空気をフィルター（Millex M ILLIPORE）を通して強めにバブリングしながら７〜10日間培養してから，3,000x g，５分の遠心により細胞を回収する．なお，細胞が培養中に沈殿
１) 東京理科大学理学部

2009 低 温 科 学

vol.67Microelement の組成
それぞれ 2.6g の Co（NO ） ，CuSO ，FeCl ，M nCl ，Na M oO を 1L の DW に溶解する．

表 2：Cyanidioschyzon merolae の培養液組成 (5L)
(2x Allenʼ
s medium）
0.74g
CaCl
2.46g
MgCl
2.72g
KH PO
(NH4) SO
13.2g
20mL
P4 metal
5L の DW に上の無機塩から順に溶解した後，H SO に
より pH を 2.2〜2.5に合わせる．
P4 metal の組成（1L）
CoCl 4mg，FeCl 196mg，M nCl 36mg，Na MoO
2.5mg，ZnSO 22.2mg，Na EDTA 1000mg を 1L のDW に溶解する．

61

すると，より早く増殖する結果を得ているので，表２のる．７日間培養した後，3,000x g，５分の遠心により細培養液を使用した方がよいかもしれない．なお，岡山大

胞を回収する．低温で遠心すると細胞が壊れるので，細学の沈研究室では，系胞を壊さないように回収したい場合には，25℃以上の温の結晶化標品調製のため，大きな水槽を用いて大量培養をしている．

度で遠心する必要がある．

シアニジウム株は国内外の藻類保存施設からも入手可

なお，黒岩グループでは，12時間毎の明暗周期により能であるが，国内では岡山大学の沈研究室で大量培養しシゾン細胞の同調培養にも成功している ．濃い目に植ているので，生きの良い株が入手できる．

え継いだ後，12時間明期，12時間暗期の繰り返しで，最初の細胞分裂が起こるのは 18時間前後（１回目の暗期６10.2 C yanid io s ch yzo n mero lae(略してシゾンと呼ぶ）
シゾンは，立教大学の黒岩先生がイタリアの酸性温泉から採集された株である．シゾン細胞は，シアニジウム細胞と異なり，強固な細胞壁を持たず，２分裂で増殖す時間目）で，２度目の分裂期が 36〜37時間目（２回目の暗期直後から１時間程度）である．２回目の分裂で最も同調された細胞が得られるが，それ以降は，高い割合で同調することは難しい．
シゾン細胞は，立教大学の黒岩先生にお願いすれば，分与していただける．

る．25℃以下にすると細胞が破壊されるので，温度変化には注意が必要である．すでに，黒岩グループによりシゾンの全ゲノムが完全に解明されている ので，プロテオーム解析などが可能である．また，シゾン細胞の同調
培養系を用いて，葉緑体やミトコンドリアの分裂機構が解明された ．最近，シゾン細胞は凍結融解により簡単に細胞破壊でき，活性の高い系 ，系 が精製できることを我々は見出した．従って，シゾンは光合成の生化学的研究にも有用な材料と言える．
［培養方法と入手法］
表２に示す培養液を調製し，オートクレイブで滅菌する．シゾンは温度変化に弱いので，植え継ぐ時に培養液を予め 42℃付近に温めておく必要がある．濃い目に植え継いだ後，42℃で５％ CO を含む空気をフィルター（Millex M ILLIPORE）を通して強めにバブリングしな
がら，約 100μmol photon m s の蛍光灯照射で培養す

62

参考文献
１) I.Enami, H.Akitsu, & Y.Kyogoku, Plant Cell
Physiol. 27 (1986)P.1351.
２) H.Ohta, H.Shirakawa, K.Uchida, M .Yoshida, Y.
Matuo, & I.Enami, Biochim. Biophys. Acta 1319 (1997)
P.9.
３) I.Enami, H.Murayama, H.Ohta, M.Kamo, K.Nakazato,& J-R.Shen,Biochim.Biophy.Acta 1232(1995)P.
208.
４) H.Adachi,Y.Umena,I.Enami,T.Henmi,N.Kamiya,& J-R.Shen, Biochim. Biophy. Acta in press.
５) I.Enami, & I.Fukuda, Plant Cell Physiol.16 (1975)P.
211.
６) M .Matsuzaki,O.M isumi,T.Shin-i,S.M aruyama,M .
Takahara,S.M iyagishima et al.Nature 428(2004)P.653.
７) S.M iyagishima, R.Itoh, S.Aita, H.kuroiwa, & T.
Kuroiwa, Planta 209 (1999) P.371.

紅藻の培養，入手

1章

植物・藻類・細菌の材料の入手と栽培・培養11．珪藻の培養，入手
榎並

勲

珪藻は，海洋，淡水の水域圏で最も豊富に存在する単細胞藻で，世界中の熱帯雨林に匹敵する光合成を行い，水域圏の生態系，炭素循環において最も重要な位置を占める植物プランクトンである．集光性色素タンパク質としてフコキサンチン・クロロフィル a/c 結合タンパク質（FCP）をもつため，黄色〜褐色をしている．細胞の外に珪酸質の固い被殻をもつ．中心目と羽状目に分類される．すでに，中心目珪藻 Thalassiosira pseudonana（http://genome.jgi-psf.org/Thaps3/Thaps3.home.html）と羽状目珪藻 Phaeodactylum tricornutum（http://genome.jgi-psf.org/Phatr2/Phatr2.home.html）で全ゲノムが解明されている．
しかしながら，上述したように珪藻は水域圏の生態系，炭素循環において重要な位置を占めるにもか
かわらず，珪藻の光合成の生化学的研究はこれまで皆無の状態であった．その大きな要因は，珪藻は固い珪酸質の殻をもつため，細胞破壊が困難であると考えられてきたことにある．しかし，最近，中心目珪藻は凍結融解により簡単に細胞破壊できることが見出され，活性のある系

や系

の精製

にも成功しているので，今後，珪藻の光合成の生化学的研究も発展するものと期待している．そこで，我々が用いている中心目珪藻 Chaetoceros gracilis の培養法と入手法について紹介する．

Culture and acquisition of diatoms
Isao Enami
In this chapter, culture and acquisition of a diatom, Chaetoceros gracilis, were described.

11.1 C ha eto ce ro s g racilis

30〜35μmol photon m s の蛍光灯照射下，細胞が沈殿しないように空気をフィルター（Millex,MILLIPOR-UTEX（http://www.utex.org/）から購入した中心目E）を通して強めにバブリングしながら，約 10日間培養

珪藻で，25℃の室温で，弱い光強度の下で簡単に培養でしている．強光で培養すると酸素発生活性の低い系 標

きる．遠心すると細胞同士が衝突することにより細胞破品しか精製できないので，弱い光強度で培養することが壊することがあるので，注意が必要である．私たちは，重要である．上述したように，細胞を遠心により回収すフィルターを介して細胞回収する RELLICON（MIL-

ると細胞が破壊されるので，RELLICON（MILLIPOR-

LIPORE）を使用している．

E）を用いて細胞回収するようにしている．
この株は，UTEX（http://www.utex.org/）から購入［培養方法と入手法］
表１に培養液組成を示す．通常は 8L のポリタンクをできるが，兵庫県立大学の菓子野博士が培養されているので，お願いすれば分与していただける．

用いて培養しているので，その組成を示している．8L の
DW に人工海水（マリンテック社製）280g とメタケイ酸

なお，全ゲノムが解明された中心目珪藻 Thalassiosira

ナトリウム 0.4g を溶解し，オートクレーブで滅菌する．
その培養液に 8ml の藻類培養液 KW21（第一製鋼社製）

表 1：中心目珪藻 Chaetoceros gracilis の培養液組成（8L）（複合アミノ酸と複合ビタミンを含む）をフィルター

人工海水（マリンテック社）（Millex, M ILLIPORE）をセットした ピペットで入れ

0.4g
Na SiO
8L の DW に溶解してから，オートクレーブで滅菌した後，る．通常は，濃い目に植え 継いだ後，25℃，片面から280g

藻類培養液 KW21（第一製鋼社）をフィルターを付けたピ
１) 東京理科大学理学部

2009 低 温 科 学

vol.67

ペットで 8ml 入れる．

63

pseudonana と羽状目珪藻 Phaeodactylum tricornutum
ともに UTEX（http://www.utex.org/）から購入でき

参考文献

る．これらの珪藻も Chaetoceros gracilis で述べた方法に

１) Y.Ikeda, M .Komura, M.Watanabe, C.M inami, H.

より容易に培養できる．

Koike, S.Itoh, Y.Kashino, & K.Satoh, Biochim. Biophys. Acta 1777 (2008)P.351.
２) R.Nagao,A.Ishii,O.Tada,T.Suzuki,N.Dohmae,A.
Okumura, M.Iwai, T.Takahashi, Y.Kashino, & I.
Enami, Biochim. Biophys. Acta 1767 (2007)P.1353.

64

珪藻の培養，入手

2章
個体・環境の測定

２章 個体・環境の測定

１．個葉から葉緑体スケールのガス交換
a. 個葉の光合成速度が決まるしくみと測定原理
彦坂 幸毅
光合成は光エネルギーを利用して CO を糖にする代謝経路である．光合成速度（CO 吸収速度）
は様々な環境の影響を受ける．C 3光合成では，気孔コンダクタンスや葉肉コンダクタンスによって葉緑体への CO 供給能力が決まり，ルビスコのキネティクスによって光合成速度の CO 濃度依存性が決まる．
このような複雑な過程は物理・生化学に基づいて数理モデル化することができ，光合成速度の環境依存性を定量的に理解することが可能になっている．

M odelling of photosynthetic rates in C3 plants
Kouki Hikosaka
Photosynthesis is a metabolism that converts CO to sugars using light energy. Photosynthetic rate (COassimilation rate) is sensitive to various environmental factors. Stomatal and mesophyll conductance affects
CO supply to chloroplasts and Rubisco kinetics determines CO response of CO assimilation rates. Here we
present the biochemical model of photosynthesis to understand environmental dependence of CO assimilation
rates.

1.a.1 はじめに伝達系における水の分解産物で あ る（2H O→4H ＋．
O ＋4e ）

光合成速度は葉の環境，植物の生育環境，葉齢，種な

電子伝達系の構成要素の一つであるプラストキノン

ど様々な要因の影響を受ける．ここでは C 3植物の一枚は，電子伝達の際にプロトン（H ）をチラコイド膜の外の葉の光合成速度が環境の変化に対してどのように影響側から内側に運搬する．これと水分解によるプロトンのを受けるのか，物理的・生化学的なしくみを，数式を用生成により，チラコイド膜内外にプロトン濃度の勾配がいて説明する．また，重要なパラメータをどのように測できる．この濃度勾配をエネルギー源とし，プロトンが定あるいは推定するのかを説明する．

チラコイド膜の ATP 合成酵素を通過する際に ATP が合成される．

1.a.2 C 3光合成の概略

チラコイド膜で生産された ATP と NADPH は，それぞれ CO 吸収のためのエネルギー源・還元力として，ス

光合成は細胞内小器官の一種葉緑体で行われる．葉緑

トロマのカルビンサイクルで利用される．カルビンサイ

体の内部にはチラコイド膜とよばれる膜構造がある．チ

クルは，11の酵素によって触媒される循環経路である

ラコイド膜と包膜の間は液相の空間で，ストロマとよば（図 1）．CO 吸収はリブロース二リン酸カルボキシラー

れる．

ゼ/オキシゲナーゼ（Rubisco）という酵素が触媒するカ

チラコイド膜では，光エネルギーを駆動力として，電ルボキシル化反応（carboxylation）によって行われる．

子伝達と ATP 合成が行われる．電子伝達系は水を分解

CO はリブロース二リン酸（RuBP）という５つの炭素をして電子を取り出し，NADP を還元して NADPH を生もつ糖リン酸に化合し，２分子のホスホグリセリン酸

産する経路である．クロロフィルは光エネルギーを吸収（PGA）が生産される．

して励起され，エネルギーを光化学系の反応中心に伝える．反応中心はエネルギーを受け取ると励起され，強い

RuBP＋CO →2PGA(1)

還元力を持つ．この還元力を利用し，NADP が還元されPGA は３つの炭素をもつ有機酸リン酸である．PGAる（図 1）．なお，光合成において発生する酸素は，電子から，ATP と NADPH を消費してトリオースリン酸が生産される．このトリオースリン酸の一部が葉緑体の外１) 東北大生命科学研究科

2009 低 温 科 学

vol.67（細胞質）に輸送され，ショ糖などの合成に利用される．
67

複合体に CO が結合し，カルボキシル化反応が起こりやすい．逆に，O 濃度が高ければ酸素化反応が起こりやすい．これらのキネティクスは後述する Farquhar らのモデルによって定量的に記述される．

1.a.3 Farquhar らの光合成生化学モデル
CO 吸収速度 A は以下の式で表される．
A＝V −0.5V −R(3)

V と V はそれぞれカルボキシル化反応と酸素化反応の速度である．V の係数 0.5は，一度の酸素化反応あ
図 1：光合成・光呼吸の模式図 チラコイド反応において，実線は電子の，点線はエネルギー（光エネルギーまたは励起エネ
ルギー），破線はプロトン（H＋）の移動を示す．
チラコイド膜には４つの巨大なタンパク質複合体が存在す
る．光化学系 複合体のクロロフィル（chl）が光を吸収すると励起エネルギーが反応中心（P 680）に伝達される．P 680で励起された電子は反応中心を離れ，プラストキノン（PQ）に伝達される（光化学反応）．P 680が電子を失うと，光化学系
で水が分解され，電子が供給される．PQ は光化学系 から電子を受け取ると同時に，チラコイド膜外側の H と結合し，膜中を移動する．PQ はチトクロム b/f複合体に電子を渡し，H を膜内側に放出する．さらに電子はチトクロム b/f複合体
からはプラストシアニン（PC）を経て光化学系 複合体の反応中心（P 700）に伝達される．光化学系 では光化学系 同様に光化学反応が起こり，電子がフェレドキシン（Fd）に伝達 さ れ る．Fd は フェレ ド キ シ ン‑NADP 酸 化 還 元 酵 素（FNR）の触媒で NADP＋に電子を渡す．RuBP：リブロース
二リン酸，Rubisco：RuBP カルボキシラーゼ/オキシゲナー
ゼ，PGA：ホスホグリセリン酸，TP：トリオースリン酸，
PGlA：ホスホグリコール酸

残 り の ト リ オース リ ン 酸 か ら は，ATP を 消 費 し て
RuBP が再生され，再び炭酸同化反応が起こる．

トコンドリア呼吸（日呼吸）の速度である．CO 吸収速度と CO 濃度の関係は，一本の式で示すと非常に複雑になる．便宜的に，RuBP が飽和している場合（ W ）とRuBP 供給が光合成を律速している場合（ W ）の二つに分けて表される．
・R uB P が飽和している場合
Rubisco が触媒する反応では，CO と O はそれぞれ酸素化反応とカルボキシル化反応を競合的に阻害する．
RuBP が飽和している場合，この関係は生化学的に以下のような式で表すことができる．

ここで V

V＝

V
C
C ＋K 1＋O/K

(4)

V＝

V
O
O＋K 1＋C /K

(5)

とV

はそれぞれカルボキシル化反

応と酸素化反応の最大速度，C と O はそれぞれ CO と

Rubisco はカルボキシル化反応だけでなく，RuBP の酸素化反応（oxygenation）も触媒する．
RuBP＋O →PGA＋ホスホグリコール酸

たり 0.5の CO が放出されることを意味する．R はミ

O の濃度，K と K はそれぞれ CO と O に対するミ
カエリス定数である．式４において，酸素が競合的にカ(2)この反応の生成物の一つであるホスホグリコール酸から PGA を再生する過程が光呼吸（グリコール酸回路）である（図 1）．光呼吸では還元力や ATP を消費し，一度の酸素化反応あたり 0.5分子の CO が放出される．
光が当たっているときは，葉では光合成も光呼吸も同

ルボキシル化反応を阻害するさまは，分母の O に表されている．酸素濃度が高くなると，分母が大きくなり，カルボキシル化速度が低くなる．式４，５を式３に代入す
ると以下の解を得る．
W＝
ここで，Γ＊＝ V

V
C −Γ
−R
C ＋K 1＋O/K
K O / 2V

(6)

K である．また，

時に起こっている．通常大気条件では，カルボキシル化

Γ＊＝ C V / 2V でもあり，これは，ミトコンドリア

反 応 に よって 吸 収 さ れ た 炭 素 の 30〜50％が 光 呼 吸 に呼吸を無視したときの CO 補償点と等しい．

よって放出されている．光呼吸がどれだけ起こるかは，

直観的に光合成の CO 応答を説明すると，CO 濃度上

葉緑体中の CO と O の濃度に依存する．Rubisco が触

昇は，分子の C の増加によって光合成速度を増加させ媒する反応では，まず Rubisco に RuBP が結合する．葉る．光呼吸による CO 放出の影響は分子の−Γ＊の項に緑体中の CO 濃度が相対的に高ければ，Rubisco-RuBP

含まれている．V

68

は葉によって異なり，Rubisco 量
光合成速度のモデリング

（活性）が高いほど高い．
・R uB P が不足している場合
Farquhar らのモデルでは，RuBP 再生速度は電子伝達速度に律速されていると仮定している．カルビンサイ
クルで１モルの RuBP を再生するためには２モル のNADPH が必要であり，このためには４モルの電子が伝達される必要がある．さらに，酸素化反応が１度起こると，光呼吸では４つの電子を消費する．電子伝達速度をJ とすると，J ＝4V ＋4V である．これに Γ＊を導入して式３に代入すると，電子伝達速度と光合成速度 W の関係は以下のようになる．
J C −Γ
W ＝ 4 ＋8 −R
C
Γ

(7)

電子伝達速度 J は，光強度 I に対し飽和曲線を示す．
様々な曲線が利用されているが，ここでは非直角双曲線を紹介する．
J＝

φ I ＋J−

φ I ＋J2θ

ここで φ は曲線の初期勾配，J−4φ IθJ(8)は光飽和時の最大

電子伝達速度，θ は曲線の凸度を示す．Jは葉によって異なり，電子伝達系タンパク質の量が多いほど高い．
つまり，高 CO 濃度域における光合成速度を高くするためには，
電子伝達系タンパク質などの量を増やせばよい．
光合成速度 A は W と W のうち低いほうとして求められる．
A＝min W , W(9)

この式９を CO ‑光合成曲線にフィットさせたのが図2a である．

図 2：CO ‑光合成曲線 ．葉内細胞間𨻶 CO 濃度（C ）に対し光合成速度をプロットしている．上）
ミズナラの例を示す．測定条件は光強度 1000μmol m s ，葉温 20℃．矢印は大気
CO 濃度（370μmol mol ）のときの測定値．近似曲線については本文を参照．下) Rucisco 量と気孔コンダクタンス（g ）が光合成速度に与える影響．実線は光合成速度の CO 濃
度依存性を示す．Rubisco 量が多い葉は同じ C で比べると高い光合成速度を持つ．点線は，大気 CO 濃度（C ）と同じ値のときに光合成がゼロになる点から，傾き＝−気孔コンダク
タンスの直線を引いたもの（本文参照）．点線と実線が交わる
点が葉の光合成速度となる．低い光合成速度を持つ葉（A）が光合成速度を上げようとする場合，rubisco 量を増やすだけでも（B）気孔コンダクタンスを上げるだけでも（C）光合成
速度が上がる．Rubisco 量・気孔コンダクタンスの両方を高くするとより高い光合成速度が得られる（D）．

1.a.4 パラメータの温度依存性
K やVなど酵素反応にかかわるパラメータの多くは温度によって値が変わる．その変化は多くの場合指数関数的で，よく用いられるのはいわゆるアレニウス式

g 25 exp
gT ＝である．
f T ＝f 25 exp

E T −298
298RT

(10)

298ΔS−H
H T −298
1＋exp
298R
298R T ＋25
ΔST −H
1＋exp
TR

(11)

H は活性化エネルギー，H は不活性化エネルギー，
ΔS はエントロピーを示す．光合成速度の温度依存性は

ここで f は任意のパラメータ，f（25）は 25℃のときの一般に上に凸の放物線の形になるが，様々なパラメータf の値，T は絶対温度，R は気体定数（8.314J molの温度依存性の影響を受けるため非常に複雑なものとな

K ）である．E は活性化エネルギーで，曲線の傾きをる．詳しくは von Caemmerer や Hikosaka et al. を意味する．高温でパラメータの値が低下する場合には参照．

ピークモデルが使われる．三次式など様々な式が利用されているが，以下はその一種である．
2009 低 温 科 学

vol.6769

μmol mol ）で，そこから傾き−g で上昇する直線であ

1.a.5 C O の拡散る．実線と点線が交わった点が光合成速度となる．つま光合成において，CO は葉の外部からの拡散によってり，光合成速度は Farquhar モデルと式 14の連立方程式

供給される．拡散における二点間の物質の移動速度はの解として求められる．Farquhar と Sharkey は，実線

Fick の第一法則にしたがう．光合成にあてはめると，を要求関数（demand function），点線を供給関数（supply

A＝g C −C(12)

function）と呼んだ．Rubisco など光合成系タンパク質によって CO をどれだけ要求するかが決まり，気孔コンダ

ここで A は光合成速度（＝CO の移動速度），g はコンクタンスによってどれだけ CO を供給できるかが決ま

ダクタンス（抵抗の逆数），C と C は二点それぞれのるということである．この図から，葉が光合成速度を高CO 濃度に相当する．

めるためには二つの方法があることがわかる．一つは，葉の光合成においては，CO は葉の外から，葉の周囲

光合成系タンパク質の量（活性）を増やす（＝要求関数に生じる境界層，気孔，葉内細胞間𨻶を経て葉肉細胞のの傾きを大きくする）ことである．もう一つは，気孔コ細胞壁に含まれる水に溶け込む．そして細胞壁から細胞ンダクタンスを高くする（＝供給関数の傾きを大きくす

膜，細胞質，葉緑体包膜を通過してストロマに達し，カる）ことである．

ルビンサイクルで同化される．拡散に対する影響は境界層，気孔，そして細胞壁からストロマまでの過程が大きいと考えられている．式で表すと以下のようになる．
A＝g C −C ＝g C −C ＝g C −C

(13)

1.a.6 各パラメータの推定原理
・光合成速度と気孔コンダクタンス
同化箱法によって光合成速度を測定する場合，同化箱

ここで g ，g ，g はそれぞれ境界層コンダクタンス，

内部の CO 濃度が C にあたり，同化箱に入る空気と同

気孔コンダクタンス，葉肉コンダクタンスであり，C ，化箱から出て行く空気の CO 濃度の差から光合成速度

C ，C ，C は葉の外，気孔入り口，葉内細胞間𨻶，葉緑（詳しくは同化箱法参照）．しA を計算することができる

体内の CO 濃度である（C は気体中の濃度に換算）．

かし g と C を知ることはできない．情報を補うために境界層における抵抗は，風が吹くなど葉の周囲で空気が動いていればほとんど無視できる．逆に，風が全く止蒸散の測定を同時に行う．蒸散速度 E は以下のように表される．

まってしまった場合では無視できない可能性がある．同E ＝g H −H

化箱法で光合成速度を測定する際には，ファンで同化箱(15)内の空気をかき回すことによって境界層コンダクタンス

ここで g は水蒸気に対する気孔コンダクタンス，Hを上げる必要がある．境界層抵抗が無視できる場合は，と H は葉の内部と外部の水蒸気濃度である．H と E

式 13は以下のように書くことができる．

は同化箱に出入りする空気の水蒸気濃度を測定すること

A＝g C −C(14)によって得られる．さらに，葉内細胞間𨻶の水蒸気濃度
はほぼ飽和しているため，葉温を測定することにより H

気孔コンダクタンス g は気孔の開閉により大きく変を推定できる．ここから g を計算する．g は g と比例化する．気孔が完全に閉じるとコンダクタンスも０に近し，g を 1.6で割れば g が求められる．そして C が計

くなる．

算できる．

気孔コンダクタンスがどのように光合成速度に影響を与えるかを図 2b を使って考えてみよう．式 14は，A が・葉肉コンダクタンス

左辺に出ているため，光合成速度を規定している式と勘

気孔コンダクタンスで説明したように，CO 濃度を調違いされることもあるが，実際は葉緑体への CO の供給

べるだけではコンダクタンスまで計算することはできな能力を表している（直観的には C ＝C −A/g と変形しい．また，気孔コンダクタンスは蒸散を測定することにたほうがわかりやすい）．図 2b では横軸に C を，縦軸により推定が可能であったが，葉肉細胞内は水で満たされ光合成速度を示している．図中実線は上述した光合成のているため蒸散に関する情報は葉肉コンダクタンスの推

生化学的モデルであり，光合成速度は C に依存すると定には利用できない．葉肉コンダクタンスが測定できる仮定する．図中点線は A＝g C −C ＝−g C −C でようになったのは 1990年代に入ってからである ．

ある．つまり，横軸の切片が C と同じ値（ここでは 370
70

現在葉肉コンダクタンスの推定法として５種類の方法
光合成速度のモデリング

が知られている ．主として安定同位体を用いる方法とクロロフィル蛍光を用いる方法がよく使われ，前者は光合成研究のための安定同位体測定法の章で紹介する．ここではクロロフィル蛍光を用いる方法の原理を説明す
る．
クロロフィル蛍光を測定することにより，電子伝達速度を推定することができる（詳細はクロロフィル蛍光の項参照）．電子伝達速度 J を推定する方法はいくつかあるが，仮定をおくことにより簡便に計算することができ
る．
×I ×0.5
J ＝0.84×ΔF /F ʼ

(16)

ここで 0.84は葉の光吸収率（実際はクロロフィル含量

図 3：CO 補償点 Γ＊の測定例．異なる光強度で，低 CO 濃度における CO ‑光合成曲線を描く．
それぞれの光強度のデー
タを回帰し，回帰直線が交わったところが Γ＊となる．

や葉の反射率など光学的な要因によって変化する），
は光化学系
ΔF /F ʼの光化学反応の量子収率，I は照factor τは τ＝ K V / K V ＝ K V/K V

射光強度，0.5は総クロロフィル量に対する光化学系と定義され，τ＝0.5O/Γ＊という関係にある．測定法はクロロフィルの割合である（これも常に 0.5とは限らな

酵素・電子伝達成分の精製・活性測定・定量を参照．

い）．J と光合成速度 A の関係は式７によって規定されるため，以下の式によって C を計算することができる．
C＝

8 A＋R Γ −JΓ
4 A＋R −J

(17)

・光呼吸
通常大気条件で光呼吸速度を直接測定する方法はな
い．CO 濃度を０にしたときの CO 放出速度は光呼吸速

原理的にはガス交換とクロロフィル蛍光を一度同時に度＋暗呼吸速度であるが，このときの光呼吸速度は通常測定すれば C を計算することができることになるが，大気条件での光呼吸速度とは異なる．また，
酸素濃度２％

実際には J の推定に様々な仮定を含んでいること，計算のときの CO 吸収速度から酸素濃度 20％のときの COが複雑であるため誤差の影響が大きくなる可能性がある

吸収速度を差し引くことにより光呼吸速度を推定されたことなどから，一度の測定で得られる値から計算した Cことがあるが，これも大気条件での光呼吸速度とは異なの確からしさは低いと考えられている．より確かな値をる．現在のところ光呼吸速度を推定するには Farquhar

求めるために様々な工夫がなされている．詳しくは Har-

モデルを用いて V を計算するしかない．

ley et al. を参照のこと．

参考文献

・C O 補償点
見かけ上の CO 補償点，つまり CO 吸収速度が０に１) G.D.Farquhar, S.von Caemmerer & J.A.Berry,

なる CO 濃度は単純に CO −光合成曲線を見ることにPlanta 149 (1980)P78.
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３) K.Hikosaka, K.Ishikawa, A.Borjigidai, O.M uller &よって求まる．重要なのは Γ＊，つまりミトコンドリア呼吸を無視したときの CO 補償点である．これを求める方
法は二つある．
一つはガス交換法を用いるもので，100μmol mol
以下の低 CO 濃度において，異なる光強度で CO −光合成曲線を描くことにより得られる ．低 CO 濃度では光合成速度と CO 濃度の関係はほとんど直線であるが，その傾きは光強度によって異なる（Rubisco が弱光下で不活性化するため）．その直線の交点が Γ＊に相当する（図3）．
もう一つは抽出あるいは単離したルビスコのspecificity factor を測定する方法である．specificity
2009 低 温 科 学

vol.67

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71

２章 個体・環境の測定

１．個葉から葉緑体スケールのガス交換
b. 光合成研究のための安定同位体測定法
半場 祐子
安定同位体は，光合成の環境応答を調べる上で細胞レベルから生態系レベルまで広範囲に利用できるツールである．安定同位体とは何かを解説し，その測定方法と光合成研究への利用法を解説する．

M easurement of the plant stable isotopes.
Yuko T. Hanba
Stable isotopes have been widely used in biochemistry, physiology and ecology as an useful index for plant
environmental responses. Principles of the isotope fractionation and its application to photosynthesis research
will be discussed.

1.b.1 安定同位体とは

δ
X ＝ Rサンプル／R標準物質−1 ×1000 ‰1.b.1.1 安定同位体について（1)

植物に関係する主な軽元素について，安定同位体比の植物の光合成研究を研究対象の空間的なスケールで分類すると，大きな方から生態系，群落，個体，組織，細表記法と測定精度を表３に示す．
1.b.1.2 安定同位体比の測定法：質量分析計

胞，オルガネラとなるであろう（表 1）．研究手法は分子・安定同位体比は，安定同位体専用の質量分析計（iso-生化学的手法，生理的手法，微気象的方法やリモートセ

tope mass spectrometer；略 し て MASS と 称 す）をンシングなどが用いられているが，安定同位体は他の方使って測定する．
国内でよく使われている測定装置には，法と比べると，細胞レベルから生態系レベルまで広範囲

サーモフィッシャー社が扱っているシリーズ（Finniganに利用できること，また積算的な情報が得られ比較的分

MAT252，Delta Plus など）がある．

析コストが安価であるという特色がある．

質量分析計の大まかな原理を解説する．質量分析計は同位体とは，ある特定の元素に属し，核の中性子数が通常，分子量 64以下の軽元素の安定同位体比を測定す異なるため質量が異なっている原子のことをいう．同位る．サンプル中に含まれる元素の安定同位体比を質量分

体は，時間の経過とともにエネルギーを放射して別の元析計で測定するためには，あらかじめそれぞれの元素が素に壊変する放射性同位体と，時間が経過しても不変で気体になっている必要がある（表 3）．測定にあたっては，ある安定同位体 stable isotope とに分けられる(表

サンプルと標準物質の安定同位体比測定を交互に行う

2）．放射性同位体の安定性は半減期（half-life）であらわ（図 1）．サンプルの単独測定を行わない理由は，測定に長される．一方，安定同位体の量は存在比 abundance であ

時間かかるためその間に装置のドリフトが生じ，測定精らわされる．ある特定の元素の中では１つの安定同位体度を悪化させるためである．短時間の交互測定を４回〜の 存 在 比 が き わ め て 高 く，例 え ば C は 全 て の C の10回繰り返し，標準物質からの偏差の平均値を算出す

98.9％を占める．

る．サンプルと標準物質はそれぞれ別々の導入口（イン

安定同位体比は標準物質に対する偏差であらわされ

レット inlet）から導入され，チェンジオーバーバルブにる．この偏差は非常に小さいので 1000分偏差（パーミより交互に分析管に送られる．気体分子の平均自由行程

ル：‰）
であらわされる．ある物質 X について，２種のを長くするために，質量分析計の内部は 10 Pa 以下の安定同位体の比率を R とすると，安定同位体比は次の式

高真空に保たれている．導入された気体はイオンソース

で計算される．

を通ってイオン化され，加速電圧をかけられて高速で磁場に進入する．磁場ではイオン化された気体は進路が曲がるが，質量に応じて曲率が異なるため，ここで分子量１) 京都工芸繊維大学の異なる分子を分離することができる．ファラデーカッ
プと呼ばれる装置でイオン化された分子を受け取る．

センター

2009 低 温 科 学

生物資源フィールド科学教育研究

vol.6773

表 1：植物の光合成研究に使われる手法とその特色
方法

測定スケール

利点

欠点

安定同位体

細胞から生態系まで

積算的な情報が得られる，分析が容易でランニングコスト
が安い

影響因子の特定が難しい場合がある
測定装置は高価

生化学的方法細胞，葉の切片，植物抽出物 詳細な分析が可能で反応機構（タンパク質など）の研究に適している

生体外測定のため生体内での再現性が不明確生理学的方法（ガス交換法）

葉，シュート

生きた植物で測定できる，測定が比較的簡便

測定時の環境条件に大きく影響される，瞬間的な情報しか得られない

生態学・微気象的方法，
リモー
トセンシング群落，生態系

大規模スケールで推定可能時間とコストがかかる，植物反応との関連づけが難しい

表 2：植物の研究に利用される主な同位体の種類と存在比および半減期

1.b.1.3 標準物質
安定同位体の測定にあたっては，国際標準物質 inter-

元素

安定同位体

存在比(％) 放射性同位体 半減期

水素

H
H
C
C

99.9850.015

H12.32y

98.89
1.11

C
C
C
C
O
O

19.3s
20.3m
5715y
2.45s
70.6s
122.2s質に対する安定同位体比が既知であるワーキングスタン

N
N
S

0.1s
10m
87.51d

1.b.1.4.1 植物の有機物に含まれる窒素・炭素

炭素

酸素

窒素
硫黄

Ｏ
Ｏ
Ｏ

99.76
0.04
0.20

N
N
S
S
S
S

99.63
0.37
95.0
0.76
4.22
0.014

（表 4）
．国際標準物
national standard が定められている質は希少であることが多く，実際の測定には国際標準物
ダードをそれぞれの研究機関で定め，これをスタンダー
ドとして用いる．例えば窒素や炭素のワーキングスタン
ダードとしてはガスボンベの N や CO が用いられる．
1.b.1.4 サンプルの前処理
植物の有機物に含まれる窒素や炭素の安定同位体比分
析には，サンプルのガス化と安定同位体比測定を同時に行うことができる，燃焼システムと質量分析計が接続された自動分析装置が広く用いられている（図 2）．
測定の前処理は，サンプルを穏やかに熱乾燥させて

表 3：安定同位体比とその表記法（60〜80℃），
有機物が混入しないようにしながら 40メッ

元素 安定同位体の比率 R

表記

測定気体 測 定 精 度(‰)

H

H/ H(D/H)

δD

H

0.2

C

C/ C

δC

CO

0.01

O

O/ O

δO

CO

0.01

N

N/ N

δN

N

0.02

S

S/ S

δS

SO

0.5

200μL， 100μL， 50μg，サーモエレクトロンサイエンティ
フィック㈱の技術資料より引用

図 1：安定同位体比測定用の質量分析計における基本的な構造と測定原理．導入口から導入された測定気体は質量によって分離され最終的にファラデーカップで検出される．

74

シュ程度に細かく粉砕する．有機物質の同位体組成は
いったん乾燥させればほとんど変化しないため，分解が起こらない状態で保存されているサンプルの炭素同位体
組成は長期間一定であり，標本等で分析を行なうことが可能である．１回の分析に必要なサンプルの量は測定装置や条件によって異なるが，図 2のシステムで植物の炭素を分析する場合は 2mg 程度，植物の窒素を分析する

図 2：有機物の炭素および窒素の安定同位体比を自動的に分析するための測定装置．燃焼部分（元素分析計）がインターフェースを介して質量分析計に接続されている．

光合成研究のための安定同位体測定法

表 4：それぞれの安定同位体に対する国際標準物質一覧
安定同位体

標準物質

略称

安定同位体比

H/ H(D/H)

ウイーン標準海洋水Standard Light Antarctic Precipitation
Pee Dee ベレムナイト

VSMOW,
SLAP

0.00015576
0.000089089

PDB

0.0112372

C/ C
O/ O

N/ N
S/ S

ウイーン標準海洋水
Pee Dee ベレムナイト
Standard Light Antarctic Precipitation
大気
Diablo 峡谷隕石

0.0020052
0.0020672
0.0018939
0.003676
CD

0.045005

アメリカ・ノースキャロライナ州の Pee Dee 層に産出する矢石（イカの仲間の化石）の炭酸カル
シウム
アメリカ・アリゾナ州の Diablo 峡谷にあるクレーターで産出する隕石の成分（トリオライト)

場合は 10mg 程度である．計量してスズ箔に包み，オー

大気ガスから窒素や水蒸気を取り除き，CO を精製してトサンプラーにセットする（図 2）．１日に 100サンプル

ガラス管に収集・封入する．大気ガスには，CO と質量以上分析が可能である．

数が同等である N O が含まれており，精製の過程で取測定装置の精度はさまざまな理由により変動すること

り除くことができない．0.1g 程度の還元銅をガラス管がある．測定を行うたびに精度を確認し，適宜測定値のの中に入れておき，封入が終わったら 400℃のマッフル補正を行う必要がある．例えばワーキングスタンダード炉で３時間焼く．この過程で N O が N に還元される．

として使用しているアラニンやチロシンを 10サンプル

真空ラインと質量分析計を直結し，精製過程を省いてあたり１回程度分析することにより，チェックを行う．

CO の炭素安定同位体比分析が行えるようなシステム

1.b.1.4.2 真空ラインを利用した大気中 C O の分取も稼動している．

大気中の CO の炭素安定同位体比を測定するために

1.b.1.4.3 植物の酸素・水素の安定同位体比

は CO を精製する必要がある．このためにはパイレック

化学変化が生じないように保存されたサンプルのセル

スガラス製，あるいはステンレス製の真空ラインを使用

ロースを抽出し，ニトロ化してニトロセルロースとする．

する（図 3）．真空ラインは高性能のポンプを使って強力

このニトロセルロースを燃焼させ，酸素の安定同位体をに空気を引きながら，低温寒剤を使ってガスを精製する

分析する場合は二酸化炭素を，水素の安定同位体を分析装置である．通常は特注品となる（光信理化学製作所・する場合は水を収集して安定同位体比を測定する ．

東京など）．液体窒素（−170℃）とドライアイスエタノー

2000年ごろに開発された熱分解元素分析計（TCEA-

ル（−70℃）のトラップを作る（デュワー瓶などの保冷を質IRM S，サーモフィッシャーサイエンティフィック）

容器に低温寒剤を入れる）．
これらのトラップを使用して量分析計に接続して使用することにより，有機物の酸素と水素の同位体比を自動で同時測定することが可能となった．
1.b.1.4.4 植物の水の酸素・水素の安定同位体比
植物は採取後，すぐにガラス管に密閉する．真空蒸留によって水を抽出し，酸素の安定同位体を分析する場合
は二酸化炭素と交換平衡させて二酸化炭素を収集しその安定同位体比を分析する．水素の安定同位体を分析する
場合は亜鉛を触媒として水を水素に還元し，収集してその安定同位体比を分析する ．

1.b.2 炭素安定同位体比
図 3：大気ガスから CO を精製するための真空ラインの概略
図．真空ポンプを使ってラインの中を引き，真空計で真空度を確認しながら精製作業を行なう．気体はライン右側から送り込む．

2009 低 温 科 学

vol.67

1.b.2.1 炭素安定同位体比 δ C と光合成
炭素の安定同位体 C と C は，大気中や水中を拡散する速度や化学反応の反応性が異なる．軽い同位体 C
75

の方が拡散する速度は速く，一般的には化学反応に対すはたらく C 植物は，C 植物や CAM 植物と比べて Cる反応性も高い．植物の光合成は様々な物理化学反応プが少ない．イネ科の植物については，C 植物の炭素のロセスを経ているため，光合成の基質である大気 CO と

δ C は平均値で−28‰であるが，C 植物では−14‰で比較すると植物の炭素化合物の炭素は C が相対的に少ある ．CAM 植物の値は−10〜−20‰であり，昼間と夜ない．このように C がどの程度分別されたかを同位体間に固定される CO の比率などによって同一植物にお分別（discrimination）という．光合成の初期過程での同いても変動がみられることがある (図 4）．

位体分別は特に記号 Δ（ギリシャ文字の大文字のデルタ）で表し，次の式で表される．
Δ＝δ/δ−１

C 植物では，同位体分別 Δは細胞間𨻶の CO 分圧と強い相関がある．葉内で CO 分圧の低下がないと仮定し(2)た場合，Δは次のようにあらわされる ．
Δ＝a C −C /C ＋bC /Cδ，δはそれぞれ標準物質 PDB に対する，大気中のCO および植物の δ C である．
1.b.2.2.1 大気中の C O の炭素安定同位体比(3)（細胞間𨻶）の CO 分
C と C は，それぞれ大気と葉内圧をあらわしている．a は，CO が気孔から取り込まれる

光 合 成 の 基 質 で あ る 大 気 中 CO の δ C は 植 物 の際に， CO と CO の拡散速度の違いによって生じる（式２）．自動車の排気ガ
δ C の決定要因のひとつとなる分別（4.4‰）である．b は，CO 固定酵素によって COスのように化石燃料起源の CO は，上空の大気に比べるが同化されるときの分別で，27‰−30‰と考えられていと C が少なくなることが知られている ．つまり，都市る．この式から，C 植物の同位体分別は，酵素反応によっ部や工業地帯の大気中の CO は，山間部や砂漠のようなてほとんど決まることが分かる．

人間の活動の影響が少ないところとは δ C が異なる
（表 5）．

CO 分圧と同位体分別との関係は，次のように説明することができる．Rubisco は CO の方とよく反応する

また，森林の大気の CO には土壌呼吸や植物の呼吸にため，Rubisco の近くの空気（細胞間𨻶）では CO より

よって放出される CO が混合している．呼吸によって放も CO が多く消費され，その結果相対的に CO が増出される CO には C が少なくなっている．そのため，える．気孔が閉じてくると細胞間𨻶での CO の濃度が呼吸 CO が滞留しやすい条件，例えば地表付近，樹木の高くなっていくため，Rubisco は CO とも反応するよ密度が高い森林（熱帯林など），夜間は，森林の大気のうになってくる．一方，気孔が十分に開いていれば，細．
CO にはさらに C が少なくなる (表 5）

胞間𨻶と大気の CO は十分に混合されるので，細胞間𨻶1.b.2.2.2 光合成による同位体分別

での CO 濃度は大気よりもそれほど高くならない．こ光合成は植物の δ C に最も大きな影響を与える要因のときには Rubisco が CO と反応する割合は相対的である．光合成によって CO が固定されるときにはたらに低くなる．このようなことから，大気中の CO 分圧 C

く酵素は植物が利用している光合成経路によって異なが一定である場合には，C 植物の同位体分別は C が小り，C 植物では主に Rubisco，C 植物と CAM 植物では

さいほど小さくなる（相対的に軽い同位体が少なくなる）

主に PEP カルボキシラーゼと Rubisco である．Rubisco

ことになる ．

と PEP カルボキシラーゼとは同位体分別が大きく異な

なお，C 植物では，CO はまず PEP カルボキシラーゼ

る（表 6）．大きな同位体分別を示す酵素 Rubisco が主にによって葉肉細 胞 で 固 定 さ れ た 後，維 管 束 鞘 細 胞 で

表 5：さまざまな測定場所における大気 CO の炭素安定同位体比

表 6：光合成に関連する炭素安定同位体分別
過程

分別(‰)

測定場所

炭素安定同位体比(‰)

CO の水への溶解

1.1

上層大気

−8

CO の水和−9.0

都市部の大気−11.6

大気中での CO 拡散

4.4

山間部の大気−10 京都市美山町国道−12 タイ・ナラチワ熱帯林−9 夏の北海道落葉広葉樹林

水中での CO 拡散

0.7

カーボニックアンヒドラーゼ触 媒 に よ る CO
の水和

1.1

PEP カルボキシラーゼによるカルボキシル化

2.0

Rubisco29.0

CO ボンベ−24〜 −38

京都市五条通での計測（未発表）
Hanba et al.（1997）76

光合成研究のための安定同位体測定法

Rubisco によって再固定される．C 植物については同位

Panicum 属の中には C −C 中間型の性質をもつ種があ

体分別のモデルはいまだに不完全な部分があるが，葉内

るため，δ C からでのみ光合成型を決めることはできなで CO の低下がないと仮定した場合，次のように表されい ．また，CAM 植物と C あるいは C 植物も，炭素の

ている ．

．
δ C によって区別することはできない（図 4）
Δ＝a＋ b ＋φ b −s −a C /C(4)

1.b.2.3.2 水利用
炭素の δ C は，植物の水利用に関する指標として，欧a は，CO が気孔から 取 り 込 ま れ る 際 に， CO と米の研究者を中心に現在もグローバルスケールの研究な

CO の拡散速度の違いによって生じる分別（4.4‰）でどに広く利用されているある．b は，CO 固定酵素 PEP カルボキシラーゼによっδ C には葉内における CO 分圧低下の影響が大きいこてガス体の CO が同化されるときの分別で，−5.7‰ととが明らかになってきており ，δ C と水利用効率の関考えられている．b は，CO 固定酵素 Pubisco の分別で係は再考が必要であるともいわれている ．ここではま

ある
（30‰）
．φ は維管束鞘細胞からの漏れであり，s はず，従来使われて来た簡単なモデルについて説明する．

漏れに伴う分別である．C 植物でも細胞間𨻶の CO 分

水利用効率（water use efficiency, WUE）は気孔コン圧の変化に対して同位体比が変化することは分かっていダクタンス（g ）あるいは蒸散（E ）と光合成速度（A）

る．ただしその変動幅は C 植物よりもずっと小さい ．

の比で表される値で，葉から失われた水に対してどの程また，維管束鞘細胞で固定される CO の比率が高いほど度炭素を固定できたかを表している．水利用効率は，植

同位体比は低くなる（より C 植物に近い値になる）が ，物に乾燥ストレスがかかっているほど高くなる．水利用

維管束鞘からの漏れは光や生育温度などの環境要因によ

効率 WUE は，植物葉内の CO 分圧（C ）と植物体周辺

り変動し，C 植物の Δに影響を与えるの CO 分圧（C ）及び葉−大気間の水蒸気圧差（VPD）．

1.b.2.3 炭素安定同位体比 δ C の光合成研究への利用
1.b.2.3.1 光合成回路の推定．ただし，後述するようにと次のような関係にある ．
WUE＝A/E ＝C 1−C /C / 1.6VPD

(5)

．このこと
C 植物と C 植物は，δ C が異なる（図 4）δ C も，水利用効率と同じように C /C と直線的な相を利用すると，植物の δ C から光合成回路を推定する

関があるため，炭素の δ C から水利用効率を推定することができる ．現在のところ C 植物が含まれることが明らかになっている科を表 7 に示す．C 植物を含む最大の科であるイネ科の Alleteropsis 属，Neurachne 属，

表 7：C 型光合成をもつ科
科

C 種数

双子葉植物
Cappararidaceae
アカザ＞2

オシロイバナ

＞5

キク

150

キツネノマゴ80

ゴマノハグサ

14

ザクロソウ

＞4

スベリヒユ

70

タデ

80

トウダイグサ

250

ナデシコ

50

ハマビシ

〜50

ハマミズキ

〜30

ヒユ

〜250

ムラサキ

＞6

550

単子葉植物

図 4：陸上高等植物における炭素安定同位体比の分布 ．

2009 低 温 科 学

vol.67

トチカガミ＞1

カヤツリグサ

1330

イネ

4600

77

ことができる．δ C がよりプラスの値であるほど水利用
効率は大きい．水利用効率が大きいことは，より乾燥ス
トレスがかかっていると解釈されることが多い．

説明する．
葉の内部 CO コンダクタンスを測定するための測定装置を図 5に示す．装置の右側部分は光合成ガス交換測δ C を水利用効率の指標として使うメリットとして定装置であり，ポットに植えたままの葉をチャンバにはは，生育期間の積算的な水利用効率を反映していること，さんで CO 吸収量と H O 蒸散量などを測定する．装置

乾燥した植物標本でも測定できること，多数のサンプルの左側部分はパイレックスガラス製の真空ラインであを短時間で測定できること等が挙げられる．森林の管理

り，ポンプを利用してチャンバの空気を送り，液体窒素が林の水利用に与える影響などを調べることもできやドライアイスを用いて水蒸気や窒素ガスを取り除き大変応用範囲が広いが，植物体全体の δ C にはさまざ

CO ガスの精製を行う．精製した CO ガスについて，安まな環境要因が影響を与えるため，特に野外の植物で解

定同位体用の質量分析計を用いて炭素安定同位体比の測析を行なった場合には δ C の解釈には十分な注意が必定を行う（1.4.2章参照）．

要である（表 1参照）
．植物の δ C は，土壌水分や気象

植物の光合成によってチャンバの空気中に含まれる因子，植物の生長計測や生理的な計測などと組み合わせ

CO の炭素安定同位体比は変化するが，その変化の度合て解析を行なうべきである．また，常緑樹と落葉樹など，いは，内部 CO コンダクタンスがまったくないと仮定し明らかに葉の内部形態が異なる種は，葉内における CO

た場合と比較するとわずかにずれが生じる．そのずれの分圧低下の δ C への影響が異なるため，δ C によって大きさと光合成速度の測定値から，内部 CO コンダクタ

水利用効率を比較するのは避けた方がよい ．

ンスを計算することができる．以下に，内部コンダクタ

1.b.2.3.3 葉内 C O 拡散コンダクタンスの推定

ンスの計算方法を説明する ．用いられる略号を表８にC 植物で CO 固定が行われる場所は，葉肉細胞中にある葉緑体内のストロマである．葉の CO 分圧は，COが気孔から葉内の細胞間𨻶さらに葉肉細胞の葉緑体スト
ロマへと拡散するにつれて低下していく．光合成に伴う示す．
C 植物における，同位体分別（discrimination：Δ）は以下の式で表される．

定と光合成の測定とを組み合わせることにより，葉緑体

P −P
P −P
P −P
P
＋a
＋a
＋b
P
P
P
P
eR
＋fΓ
＋ k
P

のストロマの CO 分圧を推定できる，すなわち葉内でのすなわち以下の５つのステップで光合成に伴う CO

炭素安定同位体比の変化は，厳密にいえば葉緑体のスト
ロマの CO 分圧を反映している．炭素安定同位体比の測CO 拡散コンダクタンス（内部コンダクタンス）を推定することができる．

Δ＝a

(6)

の安定同位体の分別が起こる．
１）大気から葉の表層まで（境界層）での CO 拡散

これまでの研究により，気孔コンダクタンス，すなわ

２）葉の表層から細胞間𨻶までの CO 拡散

ち気孔の開閉が光合成の重要な制限要因であることは明

３）細胞間𨻶から葉緑体までの CO 拡散

らかになっていた．1990年代以降の研究により，内部コ４) 葉緑 体 内 で の Rubisco お よ び PEP カ ル ボ キ シンダクタンスも気孔コンダクタンスと同程度，あるいはラーゼによる CO 固定

それ以上に光合成速度の重要な制限要因になっているこ

５）暗呼吸および光呼吸とが分かってきた ．気孔コンダクタンスに対する内部

３) が，CO の内部拡散コンダクタンスに関係する項

コンダクタンスの比率は地中海の草本あるいは木本種にである．細胞間𨻶から葉緑体までの CO 分圧の低下がおいて 1.4であるが ，果樹については 0.6‑0.9であ

まったくない（つまり，CO の内部コンダクタンスが無り，温帯の樹木ではわずか 0.5‑0.6である ．内部コ限大である）と仮定する（P ＝P ）．さらに暗呼吸速度にンダクタンスによる光合成の制限比率は 20−35％であ伴う同位体分別と光呼吸による同位体分別が無視できるり，落葉樹であるカエデの方が草本であるヒマワリよりと仮定する．その場合の仮想的な同位体分別はも大きくなっていた．

葉の内部 CO コンダクタンスを測定する方法は，３種類に大別される；(1)炭素 安 定 同 位 体 法
フィル蛍光法(2)ク ロ ロ(3)A/C 曲線法 ．このうち，炭素安定

Δ ＝a

P −P
P −P
P
＋a
＋bʼ
P
P
P

(7)

実際に生じる同位体分別と，仮想的な同位体分別との差は，次の式で表される．

同位体法は経済コストと時間はかかるものの最も精度が高いとされている．ここでは炭素安定同位体法について
78

光合成研究のための安定同位体測定法

図 5：葉内 CO コンダクタンスを測定するための装置の概略．右側がガス交換測定装置，左側が真空ライン．
表 8：葉内 CO コンダクタンスの計算に使われるパラメータ一覧
記号

説明

単位

Δ

炭素安定同位体分別

‰

A

光合成速度
外気の二酸化炭素分圧μmol m s

P
P
P
P
P
P
g
a
a
a
b
bʼ
a
f
Γ
e
R
k
δ
δ

2009 低 温 科 学

vol.67葉の表面の CO 分圧
チャンバに入る空気の CO 分圧
チャンバから出る空気の CO 分圧
葉内の細胞間𨻶の CO 分圧
葉緑体での CO 分圧
葉内での CO の拡散コンダクタンス
境界層での CO の拡散に伴う同位体分別
気孔での CO の拡散に伴う同位体分別
水中での CO の水和・拡散に伴う同位体分別

mol mol
mol mol
mol mol
mol mol
mol mol
mol mol
mol m s‰‰‰Rubisco と PEP-carboxylase による同位体分別
Rubisco と PEP-carboxylase による同位体分別の仮定値
気孔での二酸化炭素の拡散に伴う同位体分別
光呼吸に伴う同位体分別
暗呼吸がないときの CO 補償点
暗呼吸に伴う同位体分別

‰
‰

暗呼吸速度
Rubisco のカルボキシル化効率
チャンバに入る CO の安定同位体比
チャンバから出る CO の安定同位体比μmol m s
mol m s‰‰‰‰mol mol
‰

79

P −P
P
＋ bʼ
−b
−
Δ −Δ＝ b−a
P
P

eR
＋fΓ
k
(8)
P

気孔から葉緑体までの CO の内部コンダクタンス（g ）は，次のように定義される：
P −P ＝A/g

1.b.3.1 窒素安定同位体比とは植物の安定同位体でよく測定されているのは炭素についで窒素である．窒素の安定同位体比は光合成のプロセ(9)(4）式を（3）式に代入し，bʼ＝b と仮定すると
eR
＋fΓ
b−a A
− k
Δ −Δ＝
g P
P

1.b.3 窒素安定同位体比

スとは直接関係しないが，ここで簡単に変動原理と利用方法を紹介する．窒素には２つの安定同位体 N と Nがある． N は存在比が高く大気中の窒素の 99.633％を占める．大気の窒素の同位体組成は一定であるため ，大(10)

Δ ，Δ，A，P は，炭素安定同位体比と光合成測定によって計算できる．また，b，a は定数であると考えてよい．従って，Δ −Δに対して，A/P をプロットして，傾気中の窒素は窒素安定同位体の標準物質として使われている（表 4）．すなわち，大気中窒素の安定同位体比は０‰である．窒素安定同位体比は δ N と標記され（表 3），
自然界にある植物の δ N は−10〜＋10‰である ．
植物体の窒素安定同位体比の測定方法は 1.4章を参照

き（slope）を求めれば，その傾きから内部コンダクタン

されたい．

スが計算できる．

1.b.3.2 窒素安定同位体比の決定要因と利用方法
g ＝ b−a /slope(11)

炭素の安定同位体と同じように，植物の δ N は窒素
供給源の δ N，窒素代謝過程での同位体分別，窒素化合傾きからではなく，測定データから直接拡散コンダク物の組成や転流などに影響を受ける（表 9）．植物への窒タンスを計算することもできる．暗呼吸速度に伴う同位素供給源は，窒素固定をしない植物では土壌窒素，窒素

体分別 e は非常に小さく，無視できる ．また，光呼吸に固定する植物では土壌と大気中の窒素である．土壌表面よる同位体分別 f の影響も無視できると考える．このとの窒素は大気と比較すると N が多く，δ N の平均値

き内部コンダクタンスははおよそ 9.2‰である ．一般的には，土壌が深くなるほ

g＝

b−a A
Δ −Δ P(12)

ここでは b と a は，それぞれ b＝30‰，a ＝1.8‰．
b＝28‰とする場合もある．

ど N が増加し，δ N の値はよりプラスになる ．
炭素の場合と同様，窒素についてもほとんどの反応では重い同位体 N が分別される．ただし，窒素固定反応
では軽い同位体 N が分別される場合がある（表 9）．そ仮想的な同位体分別 Δ は，次のようにして求める．
（6）のため，炭素の場合とは異なり，植物の δ N はプラスの式で，境界層の拡散抵抗が無視できる（P ＝P ）と仮定

値もマイナスの値もとりうる．植物の部位別の δ N をして，a＝4.4‰，bʼ＝30‰とおき，次式で計算する．P ，

表 10に示す ．

P は，ガス交換測定によって求められる．
Δ ＝4.4 P −P /P ＋30P /P

植物によって利用される土壌窒素は，硝酸態（NO ）(13)

実際に生じる同位体分別 Δは次のようにして計算する．

表 9：さまざまなプロセスにおける窒素安定同位体分別
過程

同位体分別係数

非生物的過程Δ＝

ξ δ−δ
1＋δ−ξ δ−δ

(14)

P
P −P

(15)

ξ＝

水中での NO ，NH ，NH

の拡散

1.000

大気中での NO ，NH ，NHの拡散 1.018

土壌中の生物的過程
N O 還元1.034〜1.039

脱窒

1.028〜1.033

ス交換測定によって測定される．δ，δは，チャンバの入窒素固定

0.991〜1.004

り口と出口の CO の安定同位体比で，真空ラインを使っ硝化

1.015〜1.035

P ，P は，チャンバの入り口と出口の CO 分圧で，ガて集めたガスの炭素安定同位体比測定により求められ
る．

80

植物
アンモニア同化1.009〜1.020

硝酸同化

1.003〜1.030

光合成研究のための安定同位体測定法

表 10：カリフォルニア砂漠の根粒をもつマメ科植物 Dalea
schottii における部位別の窒素安定同位体比
組織δ N（‰)

葉−1.5（0.2)

果実・花−1.1（0.7)

茎−3.1（0.1)

根−3.0（0.6)

根粒＋6.3（1.4)

植物全体−2.0（0.2)

図 6：窒素固定を行なう植物と行なわない植物における窒素
安定同位体比 ．

かアンモニア態（NH ）となっている．硝酸態で窒素が吸収される場合，最大 20‰の分別が生じる ．また，窒と降雨の安定同位体比との間には正の相関関係が成立

素固定を行う植物の場合，植物組織の中では根粒に Nし，気温が高いほど降水の δ O はプラスになる ．

が濃縮されて他の組織よりも δ N が高くなる（表 10）．

葉の水の δＤおよび δ O は，供給源の水の δD およ

炭素と比べると窒素の同位体分別は小さく，また同位体

び δ O と，蒸散の影響を受ける．このことから，炭素安分別がよく分かっていない反応過程も多いため，窒素の定同位体比 δ Ｃと同様に，植物の基質である水の起源

δ N と植物の生理的な過程とを関連づけるのは難しいを δD および δ O から推定することが可能である ．ま場合が多い．

た，植物の水利用と関連させることも可能であると考えδ N は植物による窒素固定の研究に広く利用されている．窒素の同位体分別は小さいため，植物の δ N

は窒素供給源の安定同位体比を反映すると考えてよい．

られるが，蒸散と同位体分別との関係モデル（CraigGordon モデル ）は実測値とのずれが大きく未だに不完全であり，現在も修正が試みられている ．

窒素固定をする植物の窒素供給源は土壌と大気の２つである．
土壌表面の窒素は平均 9.2‰であり，大気中窒素の
δ N は０‰である．したがって，窒素固定を行って大気から窒素の供給を受けているマメ科の植物は，窒素固定をしない植物よりも δ N が低くなる傾向を示す（図 6）．

1.b.4 酸素・水素安定同位体比
1.b.4.1 酸素・水素安定同位体比とは植物の水素安定同位体比 δD および酸素安定同位体比
δ O は，植物による水利用と深い関係がある．安定同位体比の標準物質としては，水素も酸素も共に標準海水（standard mean ocean water: SMOW ）が用いられる（表４）．水素安定同位体比は非常に変動が大きく，降水では 400‰にもなる ．また降水の δD と δ O との間には正の直線的な関係が成立することが知られており，天水線 M eteoric Waterline といわれている ．
1.b.4.2 水素・酸素安定同位体比の決定要因と利用方
法
水が蒸発するときには重い安定同位体が分別されるため，水蒸気には軽い安定同位体（ O，H）が多く，残った水には重い安定同位体（ O，D）が多くなる．逆に水蒸気が凝固して水滴になるときには，軽い安定同位体が分別される．蒸発と凝固による同位体分別の結果，気温2009 低 温 科 学

vol.67

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光合成研究のための安定同位体測定法

２章 個体・環境の測定

１．個葉から葉緑体スケールのガス交換
c. 呼吸速度（C O 発生速度）測定
野口

航

動物，植物を問わず，酸化的呼吸は糖などの基質を，O を消費して CO と H O に分解し，その過程
で ATP を生成する反応である．植物の葉では光照射下において，同時に O を消費して CO を発生す
る光呼吸反応が行われる．そのため，ミトコンドリアの TCA 回路を経由した呼吸を暗呼吸（darkrespiration）と呼ぶ．本章では植物組織の CO 発生速度としての暗呼吸速度の測定法について紹介する．

M easurement of CO efflux rate
Ko Noguchi
M itochondrial respiration consumes O in the respiratory chain and produces CO from the TCA cycle. In
illuminated leaves, photorespiration also consumes O and produces CO . In this chapter, I introduce methodsof CO efflux rate from the TCA cycle in darkened or illuminated leaves.

1.c.1 呼吸系における C O 発生反応
植物の呼吸系における CO 発生は，ミトコンドリアの

1.c.2 C O 発生速度としての暗呼吸速度の測定

TCA 回路（クエン酸回路）のピルビン酸脱水素酵素複合

暗呼吸速度は暗黒下で通常，光合成測定装置を用いて体（pyruvate dehydrogenase complex, PDC），イソク

測定する．栽培時の温度・湿度条件で測定すると良い．

エン酸脱水素酵素（NAD-dependent isodehydrogenase,

以前は，自作のガス交換用同化箱（チャンバー）に葉を，2‑オ キ ソ グ ル タ ル 酸 脱 水 素 酵 素 複 合 体
NAD-IDH）（2-oxoglutarate dehydrogenase complex, OGDC），リンゴ酸酵素（malic enzyme,ME）の４反応でおこる（図1）．また，酸化的ペントースリン酸回路の 6‑ホスホグル
コ ン 酸 脱 水 素 酵 素（ 6-phosphogluconate dehyの反応においても，１分子の 6‑ホスホグルコ
drogenase）
ン酸から１分子の CO が発生する（図 2) ．
ピルビン酸が唯一のミトコンドリア基質として使わ
れ，TCA 回路で完全に分解される場合には，１分子のピルビン酸から PDC，NAD-IDH，OGDC の反応により３分子の CO が発生する．しかし，硝酸同化に TCA 回路
からクエン酸やイソクエン酸が炭素骨格として供給される場合には，TCA 回路が完全に回転できない．そのときには，補充反応としてオキサロ酢酸やリンゴ酸が TCA回路の基質として使われ，ピルビン酸の供給のためにリンゴ酸酵素 が 働 く 場 合 が あ る．ま た，生 合 成 反 応 にNADPH が供給される場合には，酸化的ペントースリン酸回路から供給されうる．

１) 東京大学

2009 低 温 科 学

大学院理学系研究科 生物科学専攻

vol.67

図 1：植物ミトコンドリアの TCA 回路．(1)ピルビン酸脱水
素酵素複合体（PDC），(2)クエン酸合成酵素，(3)アコニター
ゼ，(4)イソクエン酸脱水素酵素（NAD-IDH），(5)2‑オキソ
グルタル酸脱水素酵素複合体（OGDC），(6)スクニシル CoA
リガーゼ，(7)コハク酸脱水素酵素，(8)フマラーゼ，(9)リンゴ酸脱水素酵素，(10)リンゴ酸酵素（ME）．

83

図 2：酸化的ペントースリン酸回路．(1)ヘキソキナーゼ，(2)グルコース‑6‑リン酸脱水素酵素，(3)ラクトナーゼ，(4)6‑ホスホグ
ルコン酸脱水素酵素，(5)リブロースリン酸エピメラーゼ，(6)リボースリン酸イソメラーゼ，(7)トランスケトラーゼ，(8)トラン
スアルドラーゼ．

挟み，同化箱の入口と出口の CO 濃度差を差分式 IRGA定）には，チャンバーのガスケットを通じて CO がリー（例えば LiCor 社製 ガス交換測定装置 LI-6262 など）

クしうる ．特にチャンバーの入口と出口の CO 濃度差で測定していたが，近年は Li-Cor 社製 携帯型ガス交換を上げるために，流量を下げたときに起こりやすい．
リー

測定装置 LI-6400 を用いて測定した例がよく報告されクを最小限にするためには，パージ装置をチャンバーのている ．

ガスケット周りにつけるとかなり有効である ．

LI-6400 では，ある程度葉温や湿度を調節でき，測定さ葉の暗呼吸速度は光照射後に減少することが多れた CO 濃度や H O 濃度から自動で暗呼吸速度を計算

い．光照射後には葉の光合成産物すなわち呼吸基質がしてくれるため，非常に簡便である．しかし，葉の暗呼減少するので，暗呼吸速度が減少すると考えられてい吸速度は光合成速度に比べて，速度の絶対値が小さいのる ．また，暗呼吸速度は，夜間の半ばもしくは終わり頃

で，測定の際には注意が必要である．LI-6400 を用いる場に再び増加する例も報告されている

合 に は，6cm の チャン バーも し く は 2cm の ク ロ ロ

respiration もしくは morning rise of respiration と呼フィル蛍光を同時に測定できるユニットのチャンバー

ばれる現象である．この現象の理由として，内在性リズ

で，葉のガス交換速度を測定することが多い．暗呼吸速ムもしくは呼吸 ATP の需要量の一時的な増加と考えら

度の低い葉の場合には，チャンバーサイズが小さいとれているが不明である．いずれにしろ，夜間の暗呼吸速チャンバーの入口と出口の CO 濃度差が十分に得られ度は一定ではなく変化するため，葉の積算炭素獲得量なず，安定した値が得られない場合もある．また，LI-6400

どの計算には注意が必要である．

．Midnight rise ofではチャンバーのガスケットに葉を挟んで測定する．測定時のチャンバー内の CO 濃度が周囲の CO 濃度と差がある場合（例えば，高 CO 条件下での暗呼吸速度の測84

C O 発生速度の測定

Case に よ る CO 固 定，光 呼 吸 経 路 の glycine dehy-

1.c.3 呼吸商

drogenase complex（GDC）からの CO 発生（R ）と組織の CO 発生速度の測定からでは，どのような反応

TCA 回路からの CO 発生（R）が同時に起こり（図由来の CO を測定しているかは分からない．しかし，酸3），ガス交換測定装置ではその正味の速度を測定してい素電極などで O 消費速度を同時に測定し，呼吸商（res-る．Rubisco kinetics のパラメータを求めるためや総光

piratoryquotient,RQ，CO 発生速度／O 消費速度）を

合成速度を求めるためにも，光照射下における R

求めることにより，呼吸基質や呼吸系から の 還 元 力定する方法がいくつか報告されている．

（NADPH や NADH）の利用程度を推定できる．

1.c.4.1 Lais k 法

タンパク質や脂肪のように，分子中酸素の割合が炭水Rを推を求めるために良く用いられている方法であ化物よりも少ない物質が呼吸基質になる場合には，呼吸る

商は１よりも小さくなり，それぞれ約 0.8，0.7となる．

速度（v ）と oxygenation 速度（v ），R．CO 交換速度（A）は，Rubisco の carboxylation

トウゴマやナタネなど脂肪を多く含む種子では，発芽時

ようにまとめられる．

の呼吸商は１よりも小さくなり，デンプンを多く含む種

により次式の

A＝v −0.5v −R

子では，呼吸商は１に近い．一方，リンゴ酸などの有機酸が基質になる場合には，呼吸商は１よりも大きくな

細胞間𨻶 CO 濃度（c ）が減少していくと，v と 0.5v

る ．また，生理的な反応が呼吸商に影響する場合があが等しい値になる濃度がある．そのときの c を Γ と呼る．硝酸イオンをアンモニウムイオンに変換する硝酸同び，Γ のときに CO 交換速度（A）は R

化反応では CO が放出されるため，硝酸態を与えた植物

る．実際には図４のように，葉に当てる光強度を変えての根の呼吸商は，アンモニア態を与えた根の呼吸商より

A-c カーブを測定し，複数の A-c カーブの交点として，も高くなることが知られている．成長速度の速い植物の

Γ とR

根では，硝酸同化がさかんなために成長速度の遅い植物の根に比べて，呼吸商が高い ．

と等しくな

を求める．

Laisk 法は c によって Rが変化しないということが前提となる．また c が低いときにはしだいに光合成産物が減少していくので R

1.c.4 光照射下の呼吸速度の測定
光照射下の C 植物の葉では，Rubisco もしくは PEP-が変化しうる．
すばやい測定が必要となる ．
1.c.4.2 Ko k 法
光合成速度の光依存性（光―光合成曲線）を求めると，

図 3：光照射下の葉における CO と O の出入り．
R とも略される．

2009 低 温 科 学

vol.6785図 4：イネ科ナガハグサ属コイナゴツナギ（カナダブルーグラス）の葉の CO 固定速度と葉内 CO 濃度との関係（A-C 曲線） ．図内の数字は光合成測定時の葉に照射した光強度（光量子束密度 μmol photon m s ）．直線は各光強度のデータの回帰直線を示す．v と 0.5v が等しくなる c を Γ ，そのときの CO 放出速度が R となる．

図 5：Kok 効果を示している光‑光合成曲線．文献値 をもとにした典型的な CO 固定速度のデータが黒丸で示しており，弱光下で曲線が折れ曲がっている．直線近似できるデータの回帰直線を点線で示し，外挿点の白四角のシンボルが，光照
射下の TCA 回路の CO 放出速度（R ）を示す．

（R ）よりも R
1.c.4.3の方が低い．

C ラベル

図５のように曲線の折れ曲がりがしばしば測定される．

Laisk 法も Kok 法でも，TCA 回路から放出された

これは Kok 効果と呼ばれる ．折れ曲がり点よりも光強CO が葉内で Rubisco により再固定されるフラックス

度が強いデータに対する回帰直線を外挿して，R（R ）を考慮することができない（図 6）．どちらの方法

をy

切片として求める．Kok 法の問題点は，光強度が下げるでも実際に測っているフラックス（R ）は，Rと c が増加するために，Rの差である． CO でラベルしてパルスチェイスする方を過少評価しがちであることである．しかし，c を一定にしても Kok 法から求めたRとR

法では，R を考慮した方法が考案されている ．

は Laisk 法より も 低 い と い う 報 告 も あ る ．

彼らは CO であらかじめ葉の光合成産物をラベル

Laisk 法 と Kok 法 の ど ち ら の 方 法 で も，暗 呼 吸 速 度しておき，その後， CO・光照射下で CO として出て

図 6：光照射下の葉において，ミトコンドリアの TCA 回路から放出された CO （R
り再固定され，葉外に出ていくフラックス（R ）は R の一部である．

86）の一部（R ）は，葉内で Rubisco によC O 発生速度の測定

くるフラックスを測定している．そのときに，２つの O

同位体質量分析計を用いて， CO と CO を同時に濃度条件，21％ O 条件と光呼吸が抑制される 1.5％

測定することにより R や Rを推定することも報告

O 条件，で CO フラックスを測定し，光呼吸経路からされている ．彼らの方法でも，高 CO 濃度条件では光の CO 発生と TCA 回路からの CO 発生とを分けてい呼吸が抑えられ，TCA 回路からの CO 発生は変化しなる．さらに３％ CO 条件下でも測定している．３％

いという前提が，Rを推定するために必要である．

CO 下では細胞間𨻶 CO の C/ C 比が非常に低く抑えられ，TCA 回路から発生した CO が Rubisco で再固定される可能性が低い．

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が前提となっている．この方法でもとめた R
速度 R よりも低い

も暗呼吸

．

1.c.4.4 安定同位体を利用する方法
Gas-hound と呼ばれる Li-Cor 社製の LI-800 を用いる
方法と，同位体質量分析計を用いる方法が報告されている．
LI-800 は CO に比べて CO の感度が非常に低い（1.7％程度）．その感度の差を利用して Rを求める ．

C 植物において，通常の CO 濃度下では光呼吸はほとんど働かない．そのため光照射下の CO 発生は，TCA 回路からの CO 発生と維管束鞘細胞からの CO リークである．葉を挟んだ光照射下のチャンバーに，あらかじめ
CO のみを含む空気を流しておき， CO のみを含む
空気に切り替えた後に，葉から放出される CO を LI800 で測定する．維管束鞘細胞からの CO リークはすば
や く CO に 置 き 換 わ る た め に，葉 か ら 放 出 さ れ る
CO は，Rから Rubisco に再固定されるフラックス（R ）を引いた R になる．また同時に CO 条件下のCO 固定速度（P ）や気孔コンダクタンス（g ）を COにも高い感度を示すガス交換測定装置（例えば LI-6262）
で測定しておく．それらのデータと下記の式から R

R ＝ c

g
c

は

R とほぼ同じ値を示すことを報告している ．また C
植物でも同様の方法を用いて Rを推定していたが，PEPCase の CO 固定や光呼吸による CO 発生を抑えることが難しく，
正確な R
た ．

2009 低 温 科 学

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87

２章 個体・環境の測定

１．個葉から葉緑体スケールのガス交換
d. 酸素発生測定
野口

航

酸素発生は光合成に特徴的な反応である．酸素は光化学系の水の酸化的分解の副産物として発生する．通常，光合成速度としての O 発生速度は，密閉容器内の O 濃度の一定時間の変化を，気相型もしくは液相型のポーラログラフ方式の Clark 型の酸素電極 を用いて測定することが多い．本章では植物の葉や単離葉緑体の O 発生速度の測定法について紹介する．

M easurement of O evolution rate
Ko Noguchi
Oxygen evolution is one of characteristic reactions in photosynthesis. Oxygen evolution rate has been measured
as changes in O concentration in a closed chamber,using gas-or liquid-phase Clark-type oxygen electrode. In
this chapter, I introduce methods of oxygen evolution rate of leaves or isolated chloroplasts.

1.d.1 気相型酸素電極を用いた葉の酸素発生の測定
密閉容器内に葉を閉じ込め，容器内の気相の O 濃度の変化を Clark 型酸素電極で測定する方法は，IRGA を

Clark 型酸素電極２つの電極（Pt 電極と Ag 電極）間に，専用の制御器

で電圧を加えると電解反応が起こ

り，溶存物質が各電極で酸化あるいは還元され，電解電流を生じる．ある一定の電圧（0.4−0.8V）の時には各電極で以下の反応がおこる．

用いた CO 固定速度の測定システム（例えば Li-Cor 社

陰極（Pt)：O ＋4H ＋4e →2H O

製 LI-6400）に比べると，葉の光合成速度測定法として

陽極（Ag)：Ag＋4Cl →4AgCl＋4e

は，比較的安価で簡易な方法である．また微量のサンプ

電流は周囲の酸素濃度に比例するので，電流変化の測ルでも測定が可能である．現在，Hansatech 社によって定から酸素濃度の変化を知ることができる．電流変化は製造・販売されているこの気相型酸素電極システム

電圧に変換・増幅され，記録計で読みとれる．可変抵抗

は，1981年に Delieu & Walker によって考案された ．

を組み合わせて制御器を自作することも可能である．酸David Walker 自身によってこのシステムの使用法につ素電極の原理は（4)5a の章に詳しく記載されている ．

いての丁寧な解説書が出版され ，日本語訳も出版され

酸素電極は温度にきわめて敏感に反応するので，気相型ている ．ここでは使用法のごく簡単な紹介と注意事項の酸素電極システムに水を循環するための恒温槽は，精をまとめる．

度の高いものが良い．

1.d.1.1 システムの構成とセットアップ
・気相型酸素電極システムの構成

・酸素電極の組立

Hansatech 社の気相型の酸素電極システムは図１の酸素電極は測定ごとに組み立てた方が良い．測定後にような構造をしている．現在販売されているのはポリプ

は銀電極は酸化されるので，研磨用の酸化アルミニウム

ロピレン製の LD2/3 である．葉片を入れる部分（リーフと綿棒等で銀電極を磨く．洗浄後，白金電極の上に電解ディスクウェル）の下部に Clark 型酸素電極ディスク（S 1）がはめ込まれ，その上下部分に温度調節のための水が循環できる．循環水の上部の窓を通して，専用の赤色
LED 光源（LH36/2R）やタングステンランプ光源（LS2）などを照射できる．またクロロフィル蛍光測定用のグラ
スファイバーを差し込めるポートもある．
１) 東京大学

2009 低 温 科 学

大学院理学系研究科 生物科学専攻

vol.67

日本では Hansatech 社（http://www.hansatech-instruments.
com/index.htm）の製品は旭光通商株式会社（http://www.
kyokko.com/index.html）が取り扱っている．
Hansatech CB1-D3，Oxygraph，Oxytherm，Oxylab がある．
CB1-D3 は記録計でしかデータを読みとれないが，他は AD コ
ンバータが付いているので，パソコンで読みとれる．
園池公毅博士の HP（http://sunlight.k.u-tokyo.ac.jp/proto/
O2evolve.html）にも詳しく記載されている．

89

図 1：Hansatech 社製の気相型の酸素電極システム（LD2/3）の模式図．光は上部の窓を通して照射し，左右の気体の出入り口に
三方コックを取り付ける．上下のブロックに恒温槽からの水を循環して，温度を一定にする．

液をたらし，ペーパースペーサーと薄いテフロン・制御器と記録計の取付け

膜を載せ，Ｏリングで固定する．固定する際には専用酸素電極と制御器をつなぎ，電圧をかける．Hansatechのメンブレンアプリケーター（A 2）があると，Ｏリング

社のアナログ制御器（CB1-D3）では出力電圧が増幅されの取り付けが簡単である．取り付け後に，テフロン膜がるので，記録計への出力が 1.5V 程度になるように出力

きちんと張れているかを確認する．
白金電極だけでなく，制御ツマミで調節すると良い．恒温槽の水を酸素電極シ

銀電極のおさまっている凹みも電極液で満たすと良い．

ステムに循環し，温度を一定にする．酸素電極は 10分く

Ｏリングの位置を確認し，組み立てた酸素電極を気相型

らいでほぼ安定になるが，銀電極が酸化してくるので，システムに取り付ける．取り付け時に閉め過ぎると出力

出力電圧はしだいにゆっくりと減少していく．

電圧が不安定になる．
・測定前の注意事項
気相型酸素電極システムは閉鎖系の酸素濃度変化を測定するので，システムからのリークは大きな測定誤差に
気相型酸素電極の電解液は，飽和 KCl 溶液，0.4M ホウ酸緩衝液（pH9 ），1M 重炭酸ナトリウム（1M 炭酸ナトリウムで pHを 9に合わせておく）を 1：1：2で混ぜ合わせたものを用いる ．
タバコ紙が良い．直径 2cm くらいの円に切り取る．真ん中に白金電極が見えるくらいの穴を開けると，応答が速くなる．
テフロン膜はタバコ紙よりもすこし大きめの円に切り取ると良い．Hansatech 付属のテフロン膜（S 4）は幅が 25mm であり，ちょうどよい大きさとなっている．テフロン膜は薄い方が応答が良い．Hansatech から厚さ 0.0125mm のテフロン膜（S 4）を購入できる

90

つながる．リークの有無は次のように調べる．窒素やヘリウムなどのガスをシステムの横の三方コックから導入
し，減少した出力電圧が増加しないかを確認するか，もしくはシリンジを用いて 0.5mL 程度の空気を横の三方コックから導入し，増加した出力電圧が減少しないかを確認する．リークがあればＯリングにゴミが付着しているか，三方コックがきちんと接続されているかを確認す
る．
酸素発生測定窒素やヘリウムなどのガスを導入することにより，電を消費しきってしまう．多くの例では５％ CO 濃度

極の残留電流（ゼロ補正）と感度を確認できる．電極のと い う 高 い CO 濃 度 条 件 で 測 定 し て い る．５％

残留電流はジチオナイト（Na S O ，ヒドロサルファイト

CO 濃度になるようにボンベから三方コックに気ナトリウム）でも確認できるが，気相型だと使用しにく体を導入しても良いし，簡易な方法として呼気を導い．測定前にリーフディスクウェルに当たる光強度を測入しても良い．呼気を導入する場合には，記録計の定しておくと良い．水の層を通って葉に当たるので，光

出力電圧を見ながら約５％ CO（＝16％ O ）の電圧

強度が弱くなる．

まで導入後，両端の三方コックを閉じ，リーフディ

1.d.1.2 酸素発生速度の測定

スクウェルを閉鎖系にする．

ここではアナログ制御器 CB1-D3 と記録計を用いたと

５) まず，暗黒下での呼吸速度を測定し，出力電圧が安きの測定例をまとめる．デジタル制御器（Oxygraph な

定しているかを調べる．記録計の電圧変化が一定にど）を用いた時の操作法はソフトウェアの説明書も確認なるまで待つ．出力電圧の変化が小さい場合には，してほしい．

記録計のレンジを変更するか，制御器 CB1-D3 の

１) リーフディスクウェルに葉片を入れる前に，大気条

Back-off ツマミと出力制御ツマミでレンジを拡大

件下（21％ O , 380ppm CO ）での記録計の出力電圧すると良い．

を確認する．電極の酸化で出力電圧が徐々に減少し

６) 光を照射する．光強度を変える場合には，変化後にていくので，測定前と測定後に確認した方がよい．

葉はすぐに応答できないので５から 10分程度光をゼロ補正を行ったときの出力電圧と大気条件下での照射した後に，記録計の電圧変化を読みとる．

出力電圧の差が，「21％ O と平衡にあるときの電７) 葉が光合成を行うとチェンバー内の CO 濃度が減圧」とする．

少する．４％ CO 以下（＝17％ O 以上）になった

２) 葉 面 積 を 10cm に 切 り 取 れ る 付 属 カッター
（941002）を用いて葉を切り取り，しばらく水に浮から，再度両端の三方コックを開けて呼気を導入する．
1.d.1.3 酸素発生速度の計算法

べておいたあと，リーフディスクウェルにセットす光合成速度（P ）は，通常 μmol O m s の単位とし

る．葉面積が小さい葉の場合には，別に葉面積を測て表す．以下のパラメータ A から E を測定値として求定する必要がある．葉片の下に，機器セットに付属

め，光合成速度を計算する．

のステンレスディスク，毛細管マット，スポンジを大気（21％ O ）と平衡状態にあるときの電圧

敷く ．毛細管マットは測定中に葉が乾燥しないよ

ある一定時間あたりの電圧の変化

うに水で適度に湿らせておく（濡らすのではない）．

測定温度における 21％ O のモル濃度

３) 酸素電極システムの上部を固定し，両端の三方コックを閉じた後に，リーフディスクウェル内の体積を求める．リーフディスクウェルに横の三方コックから 0.5mL の大気をシリンジで導入し，出力電圧の変化からリーフディスクウェル内の有効体積を求め

AV

B Vs
C mol L

リーフディスクウェル内の有効体積

D L

葉面積

E m
P＝

B C D 10A E

1.d.1.4 測定時の注意事項

られる ．また同時にリークも確認できる．リーフ

最も起こる測定誤差の原因がリーフディスクウェルのディスクウェル内の有効体積は葉の厚さなどによっリークである．Ｏリングや三方コックの摩耗を測定前にて変化するが，4−6mL 程度になる．

確認した方が良い．またリーフディスクウェル内の湿度

４) リーフディスクウェル内の有効体積は小さいので，が高い場合には，上のガラスが曇る時がある．葉に当た大気条件（380ppm CO ）で測定するとすぐに CO

る光強度が下がるので，上部をはずして拭く必要がある．
気相型酸素電極システムはクロロフィル蛍光測定用のリーフディスクの下に敷くステンレスディスク，毛細管マッ
ト，スポンジの順は付属のマニュアル，もしくは文献を参考にしてほしい．厚い葉を用いるときにはスポンジを外しても良い．
リーフディスクウェル内の有効体積は，次の式で求められる．
R
v＝ − ・s
R R
v はリーフディスクウェルの有効体積（mL），R ，R は s(mL）の大気を入れる前と入れた後の電圧（V）．

2009 低 温 科 学

vol.67

ポートが上部に付属している．クロロフィル蛍光シグナ
ルが小さい場合には，上部の水槽のプラスティックの蓋を改造し，光照射と蛍光測定用のグラスファイバーを葉に近づけられるようにしても良い．

91

1.d.2 液相型酸素電極を用いた酸素発生の測定
液相型酸素電極システムは，溶液中の酸素濃度を測定することによって，試料の光合成速度を求められる．光
合成速度の測定用試料としてよく用いられるのは，
藻類，
葉肉細胞プロトプラスト，単離葉緑体，単離チラコイド膜である．酸素電極として通常は，気相型と同様に Clark型酸素電極を用いるので，測定原理は同じである．

反応容器としてはプラスティック製とガラス製がある．プラスティック製の方が壊れにくく扱いやすいが，光合成測定では光を照射し，阻害剤を加える場合もある
ので，透明度が高く，阻害剤が吸着しにくいガラス製の方が良い．液相型酸素電極システムは Hansatech 社のシステムと Rank Brothers 社のシステムがある．Han-

satech 社のシステムでは，酸素電極ディスク，制御器は気相型と同じものを使用できるが，Rank Brothers 社のシステムの方が比較的安価である．

図 2：Rank Brothers 社製のガラス製液相型の酸素電極システムの模式図．

1.d.2.1 液相型システムの構成
Rank Brothers 社製の液相型の酸素電極システムは
図２のようである．マグネチックスターラーの上に酸素の液相型酸素電極システム（DW2/2）がファイバーを反電極を固定し，水を循環できる反応容器を上に固定する．

応容器に近づけられ，光が散乱しにくい構造なので良い．

Rank Brothers 社製のガラス製反応容器は，2.5mL

1.d.2.2 酸素電極の組立てと測定前の注意事項（OXY051A），6mL（OXY050A），50mL（OXY052A）

気相型と異なり，液相型の酸素電極の組立ては測定前の３種類の容量のタイプがある．上下可動のふたがあり，日にしておくと測定が安定する．厚いテフロン膜

液量が 0.5−2mL までなら 2.5mL（OXY051A），３−

いると，１週間以上は使用できる．銀電極を磨いた後，5mL までなら 6mL（OXY050A），容量を大きくしたい

タバコ紙（真ん中に穴をあけると良い）とテフロン膜を場合には 50mL（OXY052A）を用いると良い．酸素電極

円形に切り，飽和 KCl 溶液を Pt 電極部に垂らし，Ｏリンにつなげる制御器は，Rank Brothers 社製ではシグナルグで固定する．Ag 電極の凹み部分にも飽和 KCl 溶液をを増幅できる制御器

入れると良い．反応容器と酸素電極の台とが密着する部と増幅できない制御器があるが，自作の制御器でも良い．

を用分に真空グリースを塗り，反応容器と酸素電極の台とを

酸素電極は温度にきわめて敏感に反応するので，反応固定する．テフロン膜を取り付けた後に酸素電極を使用

容器に水を循環するための恒温槽は，精度の高いものがしないときには，反応容器を蒸留水で満たし，テフロン良い．溶液中の酸素の拡散が律速しないように，溶液を膜が乾燥しないようにしておく．

スターラーで撹拌する．撹拌したときに電気的ノイズが小さいスターラーバーを選ぶ．

恒温槽から反応容器に水を循環させ，温度を一定にしておく．酸素電極の反応容器に蒸留水を半分程度入れ，光源は横から照射して光合成反応を進める．光源の照スターラーを撹拌することで大気を取り込みながら，酸射により反応容器内が暖まってしまう場合には，水フィ素電極の出力電圧が一定になるまで待つ（通常 10分程

ルターなどを光源と反応容器との間に入れる．クロロ度）．出力電圧がかなり不安定ならテフロン膜を貼り直フィル蛍光も同時に測定する場合には，Hansatech 社製

す．出力電圧が安定したら大気中の酸素と平衡にある水の酸素濃度の出力電圧を読みとる．

日本では Rank Brothers 社（http://www.rankbrothers.co.
uk）製の酸素電極は，株式会社三啓（http://www.sankei-coltd.
co.jp）が取り扱っている．
マグネティックスターラー台とも一体型なのでサイズが大きい（Digital M odel 10）．

92

筆 者 は ワ イ エ ス ア イ・ナ ノ テック 株 式 会 社（http://www.
nanotech.co.jp/index.html）製の Membrane kit Standard（5775）のテフロン膜を使用している．

酸素発生測定表 1：１気圧の空気と平衡になった蒸留水中の酸素濃度の温度依存性
温度（℃)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

酸素濃度 (μM )

442

386

341

305

276

253

235

220

206

192

176

次に，反応容器にジチオナイトを少量入れ，電極の残L に程度になるように入れる．

留電流（ゼロ補正）と反応速度（感度）を確認する．感暗幕などを用いて暗条件にしておき，酸素電極の出力度が悪い場合にはテフロン膜を貼り直した方が良い．ジ

電圧が安定するのを待つ．安定後に反応容器に光を照射

チオナイトを加えた後，ふたを挿入し，ふたの中央の穴する．２分ほど測定した後に光を消す．記録計の用紙にに水面が少し上がるように調節する．出力電圧が一定には光を on/off したところを記入し，暗条件の傾きと照射なったときの電圧値を，酸素濃度が 0μM の時の出力電条件の傾きを求める．この２つの直線の傾きの差から酸圧とする．ジチオナイトを添加する前と後の出力電圧の素濃度の変化として，酸素発生速度を求める．

差が，水の飽和溶存酸素濃度（25℃なら 253μM 表１参照）に相当する．

葉片の酸素発生測定をするときには，Rank Brothers
社製の反応容器をそのまま使用することはできない．自反応容器の液を取り替えるときにはアスピレータ（洗作の反応容器が必要となる．図３はソラマメ葉の裏表皮

ビンの中のチューブを短くしたものでも良い）を用いてを剥離して，反応容器のふたの裏に接着し，酸素発生速液を捨て，蒸留水ですすぐ．エタノールなどに溶かした

度とクロロフィル蛍光を同時に測定できる液相型システ阻害剤などを加えた場合にはエタノールでもすすいだ方ムの模式図である ．酸素電極は Rank Brothers 社製のが良い．アスピレータですすぐ際にテフロン膜を傷つけものをそのまま用いた．葉片への光照射とクロロフィル

ないように注意する．

蛍光の検出には，Walz 社製の PAM101/102/103 に付属

1.d.2.3 酸素発生速度の測定

したファイバーを用いた．反応容器には，10mL の緩衝

本章では，葉片，葉肉細胞プロトプラストと単離葉緑液（50mM HEPES-KOH［pH 7.2］
，0.5mM CaSO ，体を用いて，酸素発生速度を測定する方法について紹介

20mM NaHCO ）を入れた．あらかじめ葉に緩衝液を減する．藻類の酸素発生測定については２章４を，単離チ
ラコイド膜の電子伝達活性については４章５を参照してもらいたい．
葉肉細胞プロトプラストや単離葉緑体の酸素発生速度は，2.5mL もしくは 6mL の反応容器を用いる．
6mL の反応容器の場合には，反応液全量で 3−4mL 程度にすると良い．測定に用いる緩衝液はあらかじめ恒温槽に入れて，測定温度に保っておくと良い．酸素は低温ほどより多く溶解する．低温のままの緩衝液を用いると，反応容
器内で暖められ気泡が生じてしまう．
適切な緩衝液，測定試料，阻害剤などを反応容器に入れた後，試料室のふたを挿入し，ふたの中央の穴に水面が少し上がるように調節したのち，スターラーを回転させる．ふたをする前にスターラーを回すと，気泡が入りやすい．
測定に用いる緩衝液の例として，葉肉細胞プロトプラ
ストの測定には，0.4M sorbitol，1mM CaCl ，1mM
M gCl ，1mM NaHCO ，10mM Hepes-KOH （ pH7.5) ，単離葉緑体の測定には，0.33M sorbitol，2mM
EDTA-2K，1mM MgCl ，1mM MnCl ，0.5mM KH
PO ，5mM Na pyrophosphate，10mM NaHCO ，50mM HEPES-KOH（pH 7.6) が用いられている．プロ
トプラストや葉緑体の懸濁液は，終濃度が 20mg Chl2009 低 温 科 学

vol.67図 3：葉片の酸素発生速度とクロロフィル蛍光を同時に測定で き る 液 相 型 シ ス テ ム の 模 式 図 ．酸 素 電 極 は Rank
Brothers 社製の電極を利用している．ソラマメ葉の裏表皮を剥離して，反応容器のふたの裏に接着している．

93

圧により湿潤させておくと，高い活性が得られる．

参考文献
１) L.C.Clark Jr.,Trans.Amer.Soc.Artif.Inter.Organ 2

1.d.3 C lark 型酸素電極以外の酸素濃度センサーを用いた測定
酸素濃度の測定には Clark 型酸素電極以外に，同じ
ポーラ ロ グ ラ フ 方 式 の Joliot 型 酸 素 電 極 や，磁 気 方(1956)P.41.
２) T.Delieu & D.A.Walker,New Phytol.89 (1981)P.165.
３) D.A.Walker, The Use of the Oxygen Electrode andFluorescence Probes in Simple Measurements of Photo-といった酸素濃度センサーが用いられてsynthesis, Sheffield, Robert Hill Institute, 1987.
４) D.A.Walker，「光合成測定」平知明，和田野晃（監修）旭光通商，1995．

いる．光合成測定には，試料を電極に直接接触させる

５) K.Padmasree & A.S.Raghavendra, Physiol. Plant.

Joliot 型酸素電極が，フラッシュによる酸素発生の周期

105 (1999)P.546.
６) K.Yoshida, I.Terashima & K.Noguchi, Plant Cell

式

，ジルコニア方式

光光学方式，隔膜ガルバニ電池方式，蛍振動の測定に使われる．その他のセンサーを光合成研究に用いた例は少ないが，２つの隔膜ガルバニ電池方式のセンサーの差分電圧を測定できる酸素計を，開放系ガス交換システムで用いた研究が報告されている．

Physiol. 47 (1996)P.22.
７) Y.-P.Cen,D.H.Turpin & D.B.Layzell,Plant Physiol.
126 (2001)P.1555.
８) P.A.Davey, S.Hunt, G.J.Hymus, E.H.DeLucia, B.
G.Drake, D.F.Karnosky & S.P.Long, Plant Physiol.
134 (2004)P.520.
９) G.A.Truesdale& A.L.Downing,Nature 173(1954)P.
1236.

酸素の常磁性を利用して酸素濃度を測定する．
固体電解質ジルコニア素子が高温で酸素イオンに対して伝導性を示す．ジルコニア素子の両側に Pt 電極をつけて加熱し Pt
電極間に酸素分圧差が生じると，両電極間で酸素イオンが移動
し起電力が生じる．この性質を利用して酸素濃度を測定する．
電解液を入れた容器内に陽極側を貴金属（Au など），陰極側に卑金属（Pb など）で電極を構成する．陽極側にとりつけたガス
透過性の膜（隔膜）を拡散透過してきた酸素量に比例した電流が流れる．電流測定により酸素濃度が測定できる．
蛍光染色フィルムからの蛍光エネルギーが周囲の酸素により減少するという性質を利用し，蛍光エネルギーを光学的に測定する．Clark 型酸素電極と比較して高価だが，非常に細いタイプ な ど 様々な セ ン サーヘッド を 利 用 で き る．Presens 社（http://www.presens.de）や オーシャン オ プ ティック ス 社（http://www.optosirius.co.jp/OceanOptics/index.html）が製造している．
AEI Technologies 社（http://www.aeitechnologies.com）製の S-3A/DOX や Qubit System 社（http://www.qubitsystems.com）製の S104 Differential Oxygen Analyzer がある．

94

酸素発生測定２章 個体・環境の測定

２．個体から群落スケールの C O ガス交換
a. 同化箱法による器官や個体レベルのガス交換
野田

響 ，村岡

裕由

本稿では，同化箱（チャンバー）を用いた植物体の器官（葉，茎，根）や個体レベルの CO ガス交換速度の測定方法について概説する．これらのデータを植物の生育環境での気象条件と合わせて解析することにより，生育環境での物質生産を推定できる．

CO gas exchange measurements of a whole-plant
Hibiki Noda and Hiroyuki Muraoka
M easurements of photosynthetic and respiratory CO exchange responses ofleaf,stem and root to environmental
regimes such as light and temperature by using a cuvette (chamber)provide us with mechanistic estimation ofin situ photosynthesis and respiration at whole plant scale,which are crucial to deepen our understanding on thematter economy of plants in their natural habitats.

2.a.1 はじめにとによって，生育環境での個体の物質生産の推定が可能となる．また，１年を通じて同化器官と非同化器官の同化箱法とは，アクリルやガラス，金属製のケースに植物体を入れて空気を流し，ケースに流入する空気と排出される空気の CO 濃度の差から，植物体の CO ガス
交換（光合成，呼吸）を求める方法である．植物サンプ
ルを覆うケースを同化箱（チャンバー）と呼ぶ．空気のCO 濃度は赤外線ガス分析計（Infra Red Gas Analyzer：IRGA）で測る．植物体が光合成をすればチャンバーから排出される空気の CO 濃度は低下し，逆に呼吸をすれば CO 濃度は上昇する．同化箱法には，閉鎖系シ
ステムと開放系システムがある（図 1）．多くの場合には，
開放系システムが用いられる．開放系システムでは，一定濃度の CO を含む空気（リファレンスガス）を送り，
チャンバーから排出される空気（サンプルガス）の CO
濃度を測定することによって CO 濃度の差を検出し，チャンバー内の植物体の光合成速度あるいは呼吸速度を算出する．
同化箱法は，葉や茎，根などの器官や個体レベルの光合成や呼吸速度の環境応答の測定に用いられる．また時には草本群落のガス交換の測定にも適用できる．測定対
象は研究目的に応じるが，同化箱法は，特に植物の物質
生産や成長の環境応答を定量的に理解する研究において基本的な手法である．同化箱法によって測定した光合成や呼吸速度を，様々な光や温度，水分条件のもとで測定し，さらに生育環境での微気象観測データと照合するこ
１) 岐阜大学

2009 低 温 科 学

流域圏科学研究センター

vol.67

図 1：植物の CO ガス交換を測るためのシステムの概要．閉鎖系システム（左）では，空気をシステム内で繰り返し循環させながら CO 濃度の変化を測定することによって，植物体の呼吸速度（あるいは光合成速度）を求める．開放系システム（右）では，一定濃度の CO を含む空気をチャンバーに通気し続け，チャンバーから放出される空気の CO 濃度との差から呼吸速度（あるいは光合成速度）を求める．

95

光合成および呼吸活性を測定することによって，光合成場合がある．その場合には測定システムの自作が薦めらや呼吸のフェノロジーと個体の物質経済について実験的れる．図２に一般的な個葉ガス交換測定システムの概略に推定することもできる ．

を示す．このシステムは，一般的な開放系システムと同近年，個葉の光合成や呼吸速度は，開放系システムで様に，①チャンバーに空気を送り込む送風系，②チャンある携帯型の光合成測定装置（Li-Cor 社の LI-6400，

バーとその内部環境を制御する装置を含む同化箱系，③Heinz-Watz 社の GFS-3000，CID 社の CI-340 など）を用

試料（サンプル）空気の CO 濃度を測定する分析系，かいて測定されることが多くなっている．これらの機器はら成る．以下，それぞれについて概説する．

光強度や温度，湿度，CO 濃度の制御が可能であり，個2.a.2.1 送風系

葉の CO ガス交換反応を実験室内でも野外でも比較的光合成速度の測定は，一定の CO 濃度と湿度（水蒸気

簡便に測定できる ．一方で，これらの携帯型測定機器が濃度），
温度条件を備えた空気を葉に供給することによっ備えるチャンバーは小さく，測定対象の葉の一部しか測て実現する．したがって送風系では，CO 濃度，湿度，れないため，気孔開度の不均一性や，葉内の CO 拡散の温度の制御がシステムの要である．測定に用いる空気の不均一性を考慮した測定を行うためには，一枚の葉を十CO 濃度は，CO を含まない標準ガス（窒素と酸素の混分に覆うことのできるチャンバーを備えた開放系システ合）と高濃度 CO ガスを混合することによって調整すムの構築と適用が有効である．本章では，まず個葉のる．混合された空気はコックなどを用いて２系統に分け，

CO ガス交換（光合成，呼吸）の測定方法について概説

一方はリファレンスガスとして IRGA（図２の IRGA-1）

し，次に葉以外の器官や個体全体の呼吸速度の測定方法に送り，他方はサンプルガスとしてチャンバーに送られについて述べる．

る．
同化箱に送られる空気は水を入れたガラス瓶を通して

2.a.2 個葉の光合成および呼吸測定システム

予め加湿する．この加湿用ガラス瓶での空気のリークが生じないように密閉性に留意する．加湿用ガラス瓶に空個葉の光合成速度を測定するためには，光合成速度の気を導入するチューブは瓶内の水に漬け，加湿後の空気制限要因である光（光合成有効放射）や温度，湿度，COを瓶から出すチューブは水に漬けないように十分注意す

濃度（光合成速度の決まる仕組みについては 1a 章を参る．チャンバーに送られる空気の温度制御のために，加照）を制御できるシステムを構築する．現在市販されて湿用ガラス瓶は恒温水循環装置（タイテック株式会社のいる携帯型光合成蒸散測定装置のほとんどはこれらの機

クールニットなど）を着けた恒温水槽に浸すとよい．

能を備えている．しかしこれらの機器では測定が個葉の加湿された空気の温度と湿度を温湿度計（例えば，
ヴァ一部分に限られたり，あるいは測定温度範囲が限定的なイサラ社の HM P35A）で測定し，再び流量計で流量を確

図 2：個葉の光合成および暗呼吸速度，蒸散速度を測定する開放系システムの概略図．

96

器官や個体レベルのガス交換測定

認しチャンバーに送る．チャンバーへの流量は，チャンチャンバーと葉の𨻶間からの空気のリークと葉の損傷をバーの容量に合わせて決めるが，概ね 0.5〜1.0l/min 程防ぐために，密封性が高く，かつ柔らかい素材で枕をつ度である．チャンバーで空気のリークが生じることと，ける．ウェットスーツの生地が最も適している．

測定に用いる IRGA が適切なガス分析に要する最小流

チャンバー内には，葉温と気温を測定するための熱電量（0.5l/min 程度）を考慮する．また流量が小さいと葉対を１本ずつ挿入する．これらの熱電対はデータロガーの境界層が発達して十分なガス交換が得られないため，に接続する．

チャンバーにファンを入れない場合には，流量が多い方

チャンバーの温度は，サーモモジュールによって行う．

が良い．一方で流量が多すぎると速度の低いガス交換を

チャンバーの下部を金属製とし，サーモモジュールに直検知しにくくなるという問題も生じる．

接取り付けることによって，効率よく温度制御をするこ

2.a.2.2 チャンバーとその環境制御とができる．ただし過度な冷却はチャンバー内での結露

チャンバーは，アクリルやガラス製の無色透明な窓のを生じるため，低温での測定を行う場合にはチャンバー

付いた上蓋（チャンバー上部）と，金属製の底面を持つに送る空気の温度を事前に下げることや，実験室温の制

箱状の部品（チャンバー下部）から成る（図 3）．チャン

御を同時に行うことが有効である．

バーの容量を大きくする場合には，葉面の境界層を薄く光合成速度の測定に供する光は，陽光ランプ（メタル

するためにチャンバー内にファンをつける．チャンバー

ハライドランプ）から得る．陽光ランプの光は熱を持つの上部と下部の間に測定対象とする葉を挟む．
このとき，ため，熱線カット用ガラスフィルタを用いて熱を遮断する．または，ハロゲンランプを用いた冷却装置付きの光源装置を用いる．
チャンバーに照射する光強度の調節は，光質を変化させない寒冷紗（黒色あるいは白色）によって行う．葉の暗呼吸速度の測定を行う場合には，チャンバー全体を黒色の布などで完全に覆う．
2.a.2.3 分析系
チャンバーから出る空気（サンプルガス）は流量計を通して流量の確認を行い，IRGA に導入する（図２の．チャンバーの前後で流量に大きな差がある場
IRGA-2）合には，チャンバーの密封性を上げる工夫を施す．
2.a.2.4 光合成速度の計算
光合成速度や暗呼吸速度の計算は，チャンバーに送られる空気の流量（F），２つの IRGA で測定する CO 濃度
（CO

と CO

）
，チャンバー内の葉面積（L），光合成速度と同時に測定される蒸散速度（E ）の値を用いて行う．
開放系システムにおけるマスバランスは次式によって表される．
L×A＝F ×CO −F

×CO

(1)

ここで L はチャンバー内の葉面積，A は求める光合成
速度，F はチャンバーに入るときの空気の流量（mol
，F
s ）
CO

はチャンバーから出る空気の流量である．またと CO

は そ れ ぞ れ チャン バーに 入 る 空 気 の

CO 濃度（μmol mol ）とチャンバーから出る空気のCO 濃 度 で あ り，前 者 は CO
図 3：個葉のガス交換測定に用いるチャンバーの写真．容積が大きいためにファンを備えたもの（a）と，チャンバー内積を薄くしてファンを不要にしたもの（b)．
（写真：a，彦坂幸
毅氏，b，筆者）．
2009 低 温 科 学

vol.67COと 等 し く，後 者 はと等しい．流量計で測られる流量の単位は多くの場合は［l/min］であるため，理想気体の状態方程式を用いてモル量に変換する ．
97

チャンバーにリークが全く無ければ，チャンバーから出る空気の流量 Fは，Fに，数 m のビニル製のバルーンか大型のポリタンクにエアポンプで外気を導入し，そこから小型のポンプでガ＝F ＋L×E(2)となる．式（2）を式（1）に代入して整理すると次式を得る．

ス交換システムに送風する．送風される空気の CO 濃度は常に測定される必要がある．
チャンバーへの送風量は流量計やマスフローコント
ローラーで調節する．流量は，チャンバーのサイズや植

A＝F

CO −COL−E ×CO(3)

蒸散速度（E ）の計算方法については，３章を参照されたい．

物試料の呼吸活性にもよるが，概ね 0.5〜1.0l/min 程度である．呼吸活性が低い試料に対して流量を大きくすると，CO 濃度の差を検出しにくくなるため，測定条件や試料の状態に応じた調節を必要とする．
チャンバーに送る空気の温度と湿度も，温湿度計を用

2.a.3 植物体の呼吸測定システム
筆者らは草本や小型の稚樹の器官（葉，茎，根）や個体の呼吸速度の温度依存性を測定することを目的としいて測定する．温湿度計はデータロガーに接続し，チャンバー内の温度とともに記録する．
2.a.3.2 植物試料（サンプル），チャンバーとその環境制御て，開放系のガス交換測定システムを使用している（図筆者らが呼吸を測定する際には，適当な長さ（30cm 程4）．呼吸速度は温度の影響を最も強く受けるため，測定度）に切断した金属パイプの両端をゴム栓でふさいだも時のチャンバー内の温度環境の制御が必要である．こののをチャンバーとして用いた．金属は温度の伝わりが良システムでは，チャンバーを水槽に沈め，水槽内の水温

く，水に沈むので水槽に沈めるための工夫（重りをつけを恒温水循環装置を用いて調整することによってチャンるなど）の必要がない．金属パイプの両端にはめるゴム

バー内の温度を制御する．呼吸測定システムでも，上記

栓にはコルクボーラーで穴を開け，チャンバーへの空気の個葉ガス交換測定システムと同様に，①送風系，②同の供給（入口）と排出（出口）のそれぞれのためのチュー化箱系，③分析系，から成る．

ブと，チャンバー内の温度を測定するための銅―コンス

2.a.3.1 送風系

タンタンの熱電対を通した．

筆者らは測定に供する空気は，一定濃度の CO を含む

チャンバーの温度制御には，大型のプラスティック製

エアバランス（窒素，酸素，CO の混合）ガスボンベか

コンテナと恒温水循環装置を用いている．コンテナに水ら得ることが多い．ガスボンベではなく外気を用いる場

を入れて水槽とし，チャンバーを水槽に沈め，水温を恒合には，空気の CO 濃度を可能な限り安定させるため

温水循環装置によって制御することにより，チャンバー

図 4：植物体の呼吸速度を測定する開放系システムの概略図．

98

器官や個体レベルのガス交換測定

内の植物試料の温度を調節する．呼吸速度の温度依存性

水分やチューブ内の結露は CO を吸収してしまう．植物の測定には，概ね，５〜40℃での制御ができることが望

体サンプルが小さかったり，呼吸活性が低いサンプルのましい．水槽の水温を変える際には，恒温水循環装置だ

場合には，この吸収量は無視できない．そこで，測定のけに頼らずに，水槽に湯や氷を入れると時間の節約にな

際にはサンプルをチャンバーに入れずに測定時と同じ条る．

件（室温，水温，ガスの流量）で標準ガスを流した際のチャンバー内には熱電対を導入して，その先端を医療用の紙絆創膏などを用いて植物体に軽く止め，植物体の温度をモニタリングする．熱電対はデータロガーに接続
し，記録する．

CO 濃度の変化も測定しておき，サンプルの呼吸以外の要因による CO 濃度の変化量を把握しておく．
チャンバー内の植物体の呼吸活性以外の要因が CO
濃度の変化にもたらす影響を検出しやすくするために植物試料をチャンバーに入れる際には，測定中の乾燥は，チャンバーを複数（２〜４個）用意し，このとき少を防ぐために濡れたキッチンペーパーで包む．さらにこなくとも一つのチャンバーには植物試料を入れず，他とれを目の粗く柔らかい金属製の網で軽く覆うことによ同様に湿らせたキッチンペーパーを入れて，並行して測り，植物体サンプルやキッチンペーパーがチャンバーの定する方法がある．測定中にはこれらのチャンバーすべ

内壁に密着することを防ぐ．これによりチャンバー内のての同量の空気を流す．
チャンバーから出るチューブは，空気の循環がスムーズになるため，測定誤差を小さくす

それぞれ「三方コック」に接続する．各チャンバーの CO

ることができる．

濃度を測定する際には，このコックを操作して IRGA に

2.a.3.3 分析系

空気が送られるようにする．

チャンバーから排出される空気の CO 濃度は，赤外線室温とチャンバー内の設定温度によっては，チューブ

ガス分析計（IRGA）で分析する．このシステムでは，

内の結露は避けられないが，チューブ内に結露で水分がLI-7000（Li-Cor 社）を使用している．LI-7000 は二つの貯まってしまわないようにしなければいけない．そこで，IRGA のセルを持つ．最も安定した測定を行うためには，結露したチューブは，ひとつの条件での測定を終える度

一方のセルにはサンプルガス（チャンバーから排出されに取り外し，エアポンプで外気を流して乾燥させるなどる空気）
を，他方のセルには CO および H O の濃度が一の工夫が必要である．

定のガスを流し，二つのセルに流れる空気の CO 濃度差

2.a.3.5 呼吸速度の計算からサンプルガスの CO 濃度を測定する方法を採ると植物体の呼吸速度（R ）は，以下の式で求められる．

良い．
筆者らのシステムでは，ポンプで引いた外気をソー

R ＝F ×ΔCO ÷ M

ダライム，および過塩素酸マグネシウムの入った容器を通して CO ，H O を取り除き，その空気を分析時の基準濃度とした．

(4)

ここで，F はチャンバーへ送る空気の流量（mol s ），ΔCO はチャンバーに送る空気とチャンバーから出る空IRGA に水が入ると故障の原因になる．もし，測定の際気の CO 濃度の差（μmol mol ）， M は植物体量（葉面にチャンバーから IRGA の間のチューブ内部に水滴が積，乾燥重量）である．流量計で測られる流量の単位は多量に着く場合には，チャンバーと IRGA の間に過塩素

多くの場合は［l/min］であるため，理想気体の状態方程

酸マグネシウムを入れた容器，あるいは冷却式エアード

式を用いてモル量に変換する ．

ライヤーを着けてガスを通し，水分を取り除いた後に，植物体の器官の呼吸速度を測定する際には，個体からIRGA にサンプルガスを送る．IRGA に送られる空気の切り離すことになる．しかし植物は傷害を受けると呼吸

流量は，流量計を用いてモニタリングする．

速度が上昇する．そのため，筆者らは小型の多年生草

多くの IRGA には，測定値をデータロガーに出力する本（サクラソウ Primula sieboldii）を材料として，以下ための外部接続端子が備えられているので，測定値はの手順によって，測定された呼吸速度から傷害よる呼吸

データロガーに記録する．

が占める割合を求めて，呼吸速度の測定値を補正した ．

2.a.3.4 測定中のその他の注意
呼吸による CO 濃度の変化は光合成による変化に比べて非常に低いことから，測定値のわずかな誤差が測定結果に大きく影響する．そのため，１〜２時間ごとにIRGA の較正を行う．また，チャンバーにサンプルが入っ
ていなくても，サンプルを包むキッチンペーパーが含む
2009 低 温 科 学

vol.67

R ＝OR − OR ＋OR −R

×

OR
OR ＋OR(5)

R ＝OR − OR ＋OR −R

×

OR
OR ＋OR(6)１) Intact な状態で植物個体全体の呼吸速度（＝R ）を
測定する．
99

２) サンプル個体を地上部（葉と葉柄）
および地下部（根）響を消すために，よく洗浄し，陽に乾した）に植えた状に切り分ける．カミソリで切り分け，乾燥を防ぐた

態で測定を行った．ただしこのチャンバーでは，チャン

めに切り口にワセリンを塗る．植物体の切り分け方

バー上部と下部の間で CO の行き来がないように，パテは，材料とする植物の形態に応じる．

で茎の周辺を密閉するなどの注意深い準備が必要であ

３) それぞれ，見かけ上の地上部の呼吸速度（＝OR ）とる．さらに筆者らはこのチャンバー全体の密閉度を完全

地下部の呼吸速度（＝OR ）を測定する．この値にはなものとして，先の要領で水槽に沈めて植物体全体の温傷害による呼吸速度も含まれるため，サクラソウの度を制御することにより，光合成速度と呼吸速度の温度

場合には OR と OR の合計は R よ り 40％程 度

依存性を測定することができた．このようなチャンバー

高くなっていた．

を使うことにより，植物体の地上部と地下部の光合成・

４) 見かけ上の呼吸速度は，それぞれ同じ割合で傷害に呼吸活性の相互関係を調べることが可能になるだろう．

よる呼吸速度を含んでいると仮定し，実際の呼吸速

なお葉の光合成速度を開放系システムで測定する際に度（＝OR ，OR ）を推定した．

は，気孔閉鎖を防ぐために，チャンバーに流す空気の湿大型の植物体の一部を切り出して測定を行う場合に度を適切に管理する必要がある．チャンバーに流入するは，試料を乾燥させないように保存状態に留意しながら，空気と排出される空気の相対湿度を温湿度計で常にモニ呼吸速度の時間経過を事前に把握しておくとよい ．

タリングする．気孔コンダクタンスや蒸散速度は，これ
らの測定値とチャンバー内の葉温，空気の流量から計算

2.a.4 その他の測定例
開放系のガス交換測定システムを自作することの最大のメリットは，チャンバーのサイズや計上の自由度の高する ．また光合成測定時には，人工光源（メタルハライドランプなど）を用意する．光源はチャンバーの上方に固定し，熱線を除去するガラスフィルタを間に設置する．
葉に照射する光量の調節は寒冷紗などを用いる．

さにある．すなわち，研究対象とする植物体の構造やサ

植物個体の CO ガス交換の測定だけでなく，開放系シイズに応じてチャンバーを工夫することにより，比較的ステムを利用して，植物群落の CO ガス交換を測定する

自由に研究を実行できる．例えば筆者らは，やはり小型ことも可能である．ただしこのようなシステムでは，流の多年生草本（カワラノギク Aster kantoensis）の個体量を大きくすること，チャンバー内の空気の撹拌を十分を納めることのできるチャンバーを開発し（図 5），地上に行うことが，信頼性の高い測定に必要である．筆者ら

部（葉，茎）と地下部（根）のそれぞれの光合成と呼吸は携帯型光合成測定装置（LI-6400）に自ら設計したアク速度を別々に，そして同時に測定した ．植物の地下部はリル製チャンバーを接続することにより，高緯度北極ツ

プラスティック製のポットに入れた砂（微生物呼吸の影

ンドラ生態系において，小面積の群落の光合成と呼吸速度，すなわち生態系純生産量と生態系呼吸量の測定を試みている ．
本稿で紹介した機器のメーカーおよび日本代理店の情報は以下の通りである．
タイテック株式会社
http://www.taitec.ne.jp/index.html
Li-Cor 社 http://www.licor.com/（日本総代理店 メイワフォーシス株式会社
http://www.meiwafosis.com/index-1.htm)
CID

http://www.cid-inc.com/index.html（日本代理店

ナモト貿易株式会社

http://www.namoto.com/)
図 5：開放系システムを用いて，植物個体の地上部（葉）と地下部（根）のそれぞれの CO ガス交換速度を同時に測定する
場合のチャンバー．このチャンバーを図２で示した水槽に沈めることによって，測定試料の温度制御を行う．

100

Heinz Walz GmbH http://www.walz.com/（日本代理店

ナモト貿易株式会社

http://www.namoto.com/）
器官や個体レベルのガス交換測定

ヴァイサラ http://www.vaisala.co.jp/

５) C.B.Field, J.T.Ball & J.A.Berry, Plant Physiological Ecology -field methods and instruction-, ed. R.W.
Pearcy, J.Ehleringer, H.A.Mooney & P.W.Rundel,

文献
１) D.Sims, R.W.Pearcy, Plant, Cell and Environ. 17(1994), p.881
２) J.Matsumoto, H.Muraoka & I.Washitani, Annals of
Botany 86 (2000)p.787
３) H.Noda, H.M uraoka, Y.Tang & I.Washitani, Journal of Plant Research 120 (2007)p.375
４) 村岡裕由，「光と水と植物のかたち 植物生理生態学入門」，文一総合出版，2003，p.229

2009 低 温 科 学

vol.67

Chapman & Hall, p.209
６) T.B.Kinraide,L.F.M arek,Plant Physiol.65(1980),p.
409
７) L.Wadso, F.Gomez, I.Sjoholm, P.Roccuki, Thermochim Acta 422 (2004), p.89
８) T.Nakatsubo, Y.Bekku, A.Kume & H.Koizumi,
Polar Research 17 (1998), p.53
９) H.M uraoka,M .Uchida,M .Mishio,T.Nakatsubo,H.
Kanda & H.Koizumi, Canadian Journal of Botany 80(2002)p.1193

101

２章 個体・環境の測定

２．個体から群落スケールの C O ガス交換
b．群落の物質生産
b‑1．草本群落の生産構造と群落光合成モデル
及川 真平
群落の構造（器官のサイズや位置）は群落内の環境（特に光強度）に強い影響を及ぼし，よって群落の生産を規定している．一方で，群落の構造は生産の影響を受ける．本稿では，こうした植物群落の構造と群落内部の光環境の関係を解析する手法を概説する．

Structure of herbaceous plant stands and canopy photosynthesis models
Shimpei Oikawa
Canopy photosynthesis models are useful to analyze photosynthetic processes in a plant stand on physical andphysiological bases. Development of those models are reviewed with particular emphasis on light and nitrogenuse.

れているように，水平に置かれた１枚の葉の光合成速度2.b‑1.1 はじめには，光強度とともに増加しやがて飽和する．すなわち，草本群落の生産の中心は，葉が行う光合成である．葉

葉は受ける光の量が極度に多い場合，その全てを使い切の光合成速度は，葉をとりまく環境によって規定される．

ることができない．一方，群落内には複数の葉が存在しなかでも光は群落内で最も大きく変動する環境要因であており，適度な強さの光が全ての葉にまんべんなく行きる．
群落に降り注いだ光は群落の内部で大きく減衰する．

渡る場合，光合成速度は光強度の増加とともに飽和せず，群落内の光強度の分布は，その群落の構造，例えば葉や直線的に増加する（図 1）．少数の葉にのみ強い光が当た枝の位置，大きさや形，それらが向いている方向などのるよりも，多数の葉に適度な強さの光がいきわたるほう

影響を受ける．さらに太陽は季節変化，日変化し，それが，群落の光合成速度は高くなるのである．このように，に伴い群落内の光の分布は時々刻々と変化する．それゆ

群落の光合成速度の決定においては，群落内の光の分布

え，群落内の光分布を知ることは容易ではない．この節が重要な役割を果たしている ．

では，群落の構造と群落内の光分布の関係，そして群落

群落の構造と群落内の光の分布，そして光合成の関係

光合成速度を推定する数学モデルについて概説する．

2.b‑1.2 草本群落の構造と光合成生産
2.b‑1.2.1 草本群落の生産構造
群落内部の光の分布は，群落がもつ葉の量と配置の仕方によって決まる．葉の傾斜角が水平（地面と平行）のとき，群落の最上部に着いている葉は強い光を受け取ることができるが，群落内部の葉はわずかな光しか受け取れない．一方，葉が傾斜していると，光は群落の内部まで射し込むことができ，多くの葉にまんべんなく光が行
きわたる．そのため，水平な葉をもつよりも，傾斜した葉をもつほうが，群落全体の生産は大きい．先に述べら
１) 日本学術振興会

2009 低 温 科 学

特別研究員

vol.67

図 1：シロガラシの個葉の光―光合成関係と，群落の光―光
合成関係（×）．○は M .Monsi と T.Saeki の群落光合成モ
デルによる推定値を示す．P. Boysen Jensen を改変．

103

を解析する強力なツールが，M .M onsi と T.Saeki に

2.b‑1.2.2 群落内部の光分布

よって考案された「層別刈り取り法」である．彼らは，

M.M onsi と T.Saeki は，群落内部の光の減衰と葉植物群落を垂直方向に一定の厚さで層状に刈り取り，光の量の測定結果に基づき，両者の関係が，均質な溶液中合成器官（葉）と非光合成系器官（茎や葉柄，繁殖器官を透過する光の減衰とよく似ており，Lambert-Beer のなど）の生重，乾重および葉面積の垂直分布を測定した

法則で近似できることを示した．

（図 2）．併せて，器官の生重（あるいは乾重，葉面積）と群落内の相対光強度（群落上の光強度を１としたときのI ＝I exp −KF

式(1)相対値）の対応を示し，この図を「生産構造図」と呼ん

I は群落内のある層ｉにおける水平面の光強度（単位時だ．広葉型草本の群落では，群落上層に葉が多く，この間あたり単位葉面積あたりの光量子束密度），I は群落層で相対光強度が急激に低下する．イネ科型草本の群落上における水平面の光強度，K は吸光係数，F は群落上

では，群落下層に葉が多い．イネ科型草本の葉は広葉型から層ｉまでの葉面積指数（単位土地面積あたりの葉面

草本の葉に比べてより垂直に近い傾斜角を持ち，光が群

積，LAI）の合計（積算 LAI と呼ぶ）である．F は，群落の下層まで行き渡るためであろう．このように，生産

落上で０，最下層部で最大となり群落の LAI と同じ値と構造図を使うことによって，群落内の光の垂直分布が，なる．層ｉにおける相対光強度（I /I ）の対数と F は直葉の量やその分布によって決定されていることが分か

線関係となり，その勾配が K である（図 3）．

る．層別刈り取り法の重要なポイントは，植物を葉とそ

K は，その値が大きいほど群落内部の光減衰が急であれ以外の器官に分けたことである．それらを分けずに重ることを意味する．太陽光が群落の真上から降り注ぐ場

量を測定すると，後者（とくに茎）の重量が大きいため，合，水平に展開する葉は垂直方向に傾いた葉に比べて多しばしば光と葉の分布の関係は明瞭でなくなる．

くの光を受け取るため，葉の傾斜角が低い（＝水平に近図 2：広葉型群落（a；アカザ群落）と禾本型群落（b；チカラシバ群落）の生産構造図．Ｆは，50cm×50cm 区画内の同化器官（葉）の生重，Ｃは非同化器官の生重を示す．太い破線は群落内の相対照度（I /I ×100），細い破線は 50cm×50cm 区画内の茎の数（SN）を示す．斜線部は優占種，白色部は亜優占種，黒色はその他の植物を示す．M .Monsi と T.Saeki を改変．相対照度と相対光強度は互いによく似た値を示すが，厳密には同じではない．詳細は村岡 を参照．

104

草本群落の生産構造と光合成い）ほど群落の K は高くなる．例えば，広葉型草本の群落では K ＝0.7〜1.0，イネ科型草本の群落では K ＝0.3
〜0.5程度である ．
2.b‑1.2.3 群落光合成速度の推定
層ｉの葉が吸収する光の強さ（I ）は，I を F について微分することで得られる．
IK
I ＝ 1− exp −KFt式(2)t は葉の光透過率である ．
M.M onsi と T.Saeki は，葉の単位葉面積あたりの光合成速度（p ）を，葉が受ける光の強さ（I ）の関数として求めた．
bI
p ＝ 1＋
aI

−r

式(3)

a と b は定数，r は暗呼吸速度である．b/a は光飽和光合成速度，b は光―光合成曲線の初期勾配を意味する．式（2）を式（3）に代入して得られた p を F について積分することで，群落の光合成速度が得られる．P.Boysen
Jensen がシロガラシ群落とオートムギ群落で実測した群落光合成速度は，このモデルで推定したそれとよく一致しており（図 1），モデルによる推定が妥当であることが示された．
2.b‑1.2.4 M o ns i & S aekiモデルの問題点
M.M onsi と T.Saeki の群落光合成モデルは非常に単純化された推定法であり，著者自身も指摘しているよ
うに重要な単純化が２つある．ひとつは，群落内の全ての葉が同じ生理的特性（a，b，r ）をもつという仮定である．実際には，群落下層にある葉ほど光合成能力（飽和光下における光合成速度）は低く，同じ量の光が当たった場合でも達成される光合成速度は異なる．もうひとつの単純化は，群落に降り注ぐ光は全て散乱光である
図 3：(a)霧ヶ峰山地草原の群落における，相対照度（I /I ×100）と積算葉面積指数（F ）の関係．回帰直線の傾きが吸光係数（K ）を示す．直線に付記された数字は，種を示している，
１：ミヤコザサ―ワラビ群落（1949年９月 15日）
，２：ミヤ
コザサ群（1951年８月 29日）
，３：ミヤコザサ群落（1949年
９月 14日），４：ミヤコザサ群落（1949年８月７日），５：ス
スキ群落（1949年９月 15日）
，６：ススキ群落（1949年７月６日）．(b)１：キカラスウリ群落（1949年９月 30日）
，２：
フキ群落（1950年４月 28日）
，３：アカザ群落（1949年６月28日），４：ノウルシ群落（1951年５月５日），５：キクイモ
群落（1949年５月 26日），６：キャラボク群落（1949年６月13日），７：オギ−ノウルシ群落（1950年４月 30日）
，８：ヨ
シ−ナガボノシロワレモコウ群落（1949年６月３日），９：オ
ギ群落（1949年６月 15日），10：ヨシ−ノカラマツ群落（1949
年７月 27日）．M. M onsi と T. Saeki を改変．

と仮定していることである．晴天日には，太陽の方向か
らほぼ完全な平行光線（直達光）が群落や地表に到達する．以下に，これらの仮定が群落光合成の推定にどのような影響を及ぼすのか，そしてそれらはどのように克服されてきたのかを述べる．

2.b‑1.3 窒素分布と群落光合成
2.b‑1.3.1 群落内部の窒素の分布
群落内の葉は同じ生理的特性をもつわけではなく，強い光が当たる場所に着いている葉の光合成能力は高い．
全ての葉の光合成能力が同じではない理由について，H.
A.Mooneyと S.L.Gulmon は以下のように説明している．葉の光合成能力と窒素含量の間には強い正の相関2009 低 温 科 学

vol.67105

がある ．これは，葉がもつ窒素の半分以上が光合成系のSaeki では直角双曲線が用いられていたが，非直角双曲

酵素タンパク質に含まれるためである

線による近似のほうが光合成速度の実測値をより正確に．それゆえ，葉の酵素タンパク質含量を高くすれば，光合成能力を高くすることができる．しかし，同時に，酵素タンパク質を合成，維持するにはコストがかかる．光が十分に当たっ

反映する
p ＝

．

ϕI ＋p − ϕI ＋p2θ

−4θϕI ＋p−r

式(5)ている葉では，コストに見合った利益すなわち高い光合

ϕ は光―光合成曲線の初期勾配，p

成速度を実現できるが，群落下層など，光が光合成の律

る単位葉面積あたりの光合成速度，θは曲度，そして r

速要因になる場所では，たとえ葉が多量の窒素をもっては暗呼吸速度である．次に，彼らは光―光合成曲線を測いても高い光合成速度を実現できない．そのため，明る定した葉の窒素含量を測定し，これらのパラメーターをい場所に着いている葉ほど高い窒素含量と高い光合成能

単位葉面積あたりの窒素含量（n ）の関数として表した．

力をもつというように，群落内には葉窒素含量と光合成

ϕ＝a ＋b n
p ＝a ＋b n
θ＝a ＋bnr ＝a ＋b n

能力の勾配ができる．C.B.Field

はこのアイデアに基づいて，ある量の窒素をもつ群落の炭素獲得が最大となるときの，葉間の窒素勾配を以下の式で表した．
δ
p
＝λ
δ
n

式(4)

は個葉の日炭素獲得量，n は葉面積あたりの窒素含p量，λは定数である．この式は，n の変化に伴う pのは飽和光下におけ式(6)a と b は回帰係数である．セイタカアワダチソウにおける測定の結果を図４に示す．n と p，n と r の間には強い正の相関がある．同様の結果が多くの種で報告されているが，n の増加に対して pが飽和することも変化が群落内の全ての葉で同じになるときに，群落の光ある

合成速度が最大となることを意味している．

の場合相関は低い

2.b‑1.3.2 窒素分布を考慮した群落光合成モデルが見られる．他の種でも，相関は低い

T.Hirose と M.J.A.Werger は，群落内の窒素含量
そして光合成速度の勾配を群落光合成モデルに組み込んだ．彼らはまず，葉が受け取る光の強さと光合成速度の関 係 を，非 直 角い．ϕ と n の間にも正の相関が見られるが，多く．θと n の間には，弱い負の相関
か見られな．また，これらの関係は，同じ種であっても季節によって変わる．

彼らは，２つの個体密度の異なるセイタカアワダチソ
し，そのうち約 40枚

図 4：セイタカアワダチソウ群落における，単位葉面積あたりの窒素含量（n ）と飽和光下光合成速度（p ），光―光合成曲線の初期勾配（ϕ），曲度（θ），暗呼吸速度（r ）の関係．●は高密度，○は低密度群落の，様々な層から採取した葉を示す．T.Hiroseと M.J.A.Werger を改変．

106

草本群落の生産構造と光合成

の葉について光―光合成曲線を測定した．それらの葉の窒素含量（n ）を測定し，係数 a と b を得た．次に，層層ｉにおいて，直達光が当たっている葉の吸収光強度（I ）は以下のようになる．

別刈り取りを行い，式（2）を用いて各層の葉の吸収光強

I ＝I度（I ）を求めた．層毎に窒素含量（n ）を測定し，式（6）を用いて nから p，ϕ，θ，r を計算した．これ

らの葉の光合成を決定するパラメーターと I

を式（5）

I

＋

OI
sin β

式(7)

は層ｉの葉が受け取る散乱光，O は太陽光の入射方向から見たときの葉の投影面積，Iは群落上に代入することで各層の単位葉面積あたりの光合成速度において水平面が受け取る直達光，β は太陽高度で（p ）を求めた．そして，p に当該層の LAI を乗じて，ある．
上式の右辺第一項は葉が受け取る散乱光成分，

全層にわたって積算することで，群落の光合成速度を得

右辺第二項は直達光成分を表している．

た．このようにして，群落内における光と光合成能力のO は葉の傾斜角と太陽高度によって変化する（図

勾配を反映した群落光合成速度の推定が可能となった．

5）が，全ての組み合わせについて O を求めるのは労全ての葉が同じ量の窒素を持つと仮定した場合に比べ力的に困難である．J.Gourdriaanて，実際の群落は 21％高い群落光合成を実現しているこを３クラス（30°刻み）あるいは９クラス（10°刻み）とがシミュレーションによって示された ．

に分けて群落光合成速度の推定を行い，この単純化

は，葉の傾斜角が光合成の推定に及ぼす影響を比較検討した．群落

2.b‑1.4 直達光を考慮した群落光合成モデル
2.b‑1.4.1 散乱光だけを考慮したモデルの問題点
M.M onsi と T.Saeki の群落光合成モデルでは，群光合成速度の推定精度は，10°刻み，30°刻みのいずれにおいても高く，葉の傾斜角は３クラスに分ければ十分であることが示された．O は以下の式から求められる．

落に降り注ぐ光はすべて大気中の粒子や水蒸気などに

O＝f O ＋f O ＋f O

よって散乱した光（散乱光）であり，群落内の同じ高さ

式(8)

（同じ層）
にある葉の吸収光強度は同じである，と仮定さ，30−60°，O O ，O は，それぞれ，傾斜角が０−30°

れていた．この仮定は，晴天日には必ずしも正しくない．

60−90
（1
° 5，45，75はそれぞれの平均値を表してい

晴天日には，直達光が群落内に射し込み，同じ高さにある）の葉の O である．f ，f ，f は，各傾斜角クラる層のなかに吸収光強度が大きい葉と小さい葉が混在す

スに属する葉の割合である（図 6）．O は，以下の式る．直達光がどのように群落内に射し込み群落内の葉にから得られる．

照射されるのかは，太陽光の入射角，葉の傾斜角や方位O ＝sin βcos 15

角，サイズなどによって変わる．また，太陽光の入射角
は日や時間とともに変化する．同じ層内の中の光環境が不均一であるにもかかわらず，全ての葉が同じ強さの散乱光を受け取ると仮定してしまうと，群落光合成速度は

O ＝

2
tan β
sin βcos 15 arcsin
πtan 15

式(9a)

式(9b)

＋ sin β＋sin 15

過大評価となる．なぜならば，光に対する光合成速度の式（9a）と式（9b）は，それぞれ葉の表側と裏側か応答は飽和型の曲線であり，極度に強い光があたった場

ら直達光が当たる場合を考慮している．β が葉の傾合，光合成速度はさほど高くならないからである．
2.b‑1.4.2 直達光を考慮した群落光合成モデル
直達光を群落光合成モデルに組み込む試みは，黒岩と門司に始まり，その後同様のモデルが次々と発表された．ここでは N.P.R.Antenのモデルに基づいてその概要を紹介する．
１）群落を垂直方向に複数の層に分ける．
２）各層の葉が受けとる光の強さを計算する．直達光が当たっている葉は直達光と散乱光の両方を受け取り，直達光が当たっていない（すなわち他の葉の陰になっている）葉は散乱光のみを受け取る．
2009 低 温 科 学

vol.67

図 5：太陽の入射方向から見た葉の投影面積（O）と，太陽高度（入射角；β），葉の傾斜角（β），吸光係数（K ）の関係の模式図．例として，β が 75°（a）と 45°（b）の場合を示す．

107

斜角より大きい時には式（9a）を，β が葉の傾斜角

れる．

より小さい時には式（9b）を用いる．O と O も同

p ＝f p ＋ 1−f様に求める．
他の葉の陰になっている葉の吸収光強度（I）は以下のようになる．
I

＝

p

とp

p

式(16)

は，それぞれ太陽光が直接当たっている

葉と，他の葉の陰になっている葉の単位葉面積あた

K
1−σ

I ＋I

式(10)

K は散乱光の吸光係数，σは葉の散乱係数，Iりの光合成速度である．f は，層ｉにおける，太陽
光が直接当たる葉（葉面積）の割合である．

は

f ＝exp −K F

層ｉにおいて水平面が受け取る散乱光の光強度，式(17)は層ｉにおいて水平面が受け取る，直達光から

他の葉の陰になっている葉の割合は，1−f とな

派生した散乱光の光強度である．K は，式（1）のる．このように，f は太陽高度，葉の傾斜角，そしK と同じである．Iて LAI の関数として求められる．葉の方位角も f

I

は次式を使って求められる．

I ＝I exp −K F
I

式(11)

は群落上において水平面が受け取る散乱光の光に影響するが，計算を簡単にするために，ここでは葉の方位角は spherical（全ての方位角が同じ確率）であると仮定している．

強度である．
直達光が大気を通過するときや葉に当たったとき

４) p に当該層の LAI を乗じ，それを全層にわたってにその一部は透過や反射によって散乱する．直達光

積算すれば，単位土地面積あたりの群落の光合成速由来の散乱光の光強度は，「葉に当たった光の一部は度が求められる．

反射・透過される」と仮定して推定した直達光の光強度から，「群落内の葉は黒色で全く反射・透過をしC.J.T.Spitters はシミュレーションによって，直達ない」と仮定して推定した直達光の光強度を差し引

光と散乱光の両方を考慮して推定した群落光合成速度にくことで推定できる．層ｉにおける，直達光から比べて，散乱光のみを考慮した群落光合成速度は最大で派生した散乱光（I）は次のように表される．

４％過大評価となることを示した．ただし，Spitters を含

I
I

＝I

−I

式(12)

は層ｉにおいて水平面が受け取る直達光の光強度，Iは，層ｉにおける，散乱しない直達光の光強度である．IとIは，それぞれ次式で求められる．

めほとんどのモデルでは，光合成の推定においていくつかの問題点がある．まず，群落内の位置による葉の生理的特性の違いが適切に組み込まれていないか，あるいは全く考慮されていない．そして多くの場合，光―光合成曲線の近似に直角双曲線が用いられている．また，葉の傾斜角は spherical であると仮定されている．N.P.R.

I＝I exp −K 1−σ F

式(13)

I

＝I exp −K F

式(14)

Anten

は，J.Goudriaanの方法に従って実測した葉の傾斜角を計算に組み込み，葉間の光合成特性の勾配を考慮して，両モデルを比較検討した．
イネとパールミレッ

K は直達光の吸光係数で，以下の式によって求めト群落において，直達光を考慮した場合に比べて，散乱られる．

光のみを考慮した場合，群落光合成速度は最大で 30％過K ＝O/sin β式(15)以上のように，このモデルでは群落内の散乱光の減大評価されることが示された ．この過大評価は，先に述べたように，葉が受け取る光の強さと光合成速度の関係が飽和型の曲線であるがゆえに生じたものである．

衰 は M .Monsi と T.Saeki が 示 し た の と 同 様 にLambert-Beer の法則に従い，直達光は，光の強さは変わらず下層ほど直達光が当たる葉（葉面積）の割合が減る，としている．

2.b‑1.5 マニュアル：群落光合成速度の推定
ここでは，直達光を考慮した群落光合成速度の推定方法を紹介する．わかりやすさのために，同じサイズの個

３) 各層の葉の光合成速度を計算する．層ｉの葉の単位体からなる，単一種群落を対象として説明する．

葉面積あたりの光合成速度（p ）は，次式で求めら108

草本群落の生産構造と光合成

［調査地での測定］

う．複数の光量子センサーが配列された棒状の測定器

１) 調査区（枠）の設置（Decagon Devices 社（Pullman, USA）の「AccuPAR

まず，調査区を設置する．調査区内の物理的環境が広LP-80」や Li-Cor 社（Lincoln,USA）の「ロング光量子

範囲にわたって均一な場所を選ぶ．対象とする材料や場センサー」など）は，広範囲の光強度の平均値が得られ所にもよるが，調査区（枠）の大きさは一辺が 0.5〜1.0

るので，この測定に向いている．それが終わったら，セm 程度の正方形をすすめる．このサイズならば，群落をンサーの高さを 10〜20cm 上げて同様の測定を繰り返

破壊することなく，内部まで手や測定機材を入れること

す．測定は曇天日に行う．全ての光が散乱光であるだけが可能である．調査枠の四隅に，目盛りを書いたポール

でなく，光強度の変動が小さく２つのセンサーの値を同を垂直に立てる．

時に読み取るのが容易であり，誤差が小さくなる．

２) 葉の傾斜角４）層別刈り取り

分度器やクリノメーターを用いて，調査区内にある葉剪定ばさみを用いて，調査枠内の植物体を，上から一の傾斜角を測定する．葉の傾斜角とは，地面と平行な水定の厚さで層状に切り取っていく．ポールの間にロープ

平面と葉の間の角度である．それほど細かく読み取る必やタコ糸を張って，切り取る位置（高さ）を明確にする

要はなく，30°間隔（図 6）で良い ．30〜50枚程度の葉とよい．層の厚さは，群落の高さや目的にもよって異なについて測定する．イネのように葉身が長くたわんでいる．群落の高さが 1m 以上あるなら，層の厚さは 20cm，る場合，葉を２，３の部位に区切って測定する．群落内

群落の高さが 1m 以内ならば，層の厚さは 10cm を目安に手を差し込む際に，葉の位置が大きく変わらないようにする．群落全体の光合成速度を知りたいのであればお注意する．

おまかな分け方で良いが，背丈の異なる種や個体間の比較を行いたい場合には細かく分ける必要がある．群落の

３) 群落内の光の分布

高さを 10あるいは 20の倍数に設定すると，ちょうど地

群落内の散乱光の分布を測定する．光量子センサーを面が 0cm となり区切りがいい．ある葉や枝を切り取っ２つ用意し，片方のセンサーに対してもう片方のセンたときに，他の葉の角度や位置が変わってしまわないよ

サーを校正しておく．ひとつは，全天下の光強度（I ）をうに注意する．一番上の層を刈り取ったら，その後，同測定するため，群落よりも高い場所に水平に設置する．

様の手順で地面まで刈り取りを続ける．切り取った植物

もうひとつは群落内の光強度（I ）の測定に用いる．まず，体は，乾燥して葉が縮むのを避けるため，ポリエチレン

地表面の I を測定する．細長い棒などの先端に固定した袋などに入れて実験室に持ち帰る．

光量子センサーを，群落内部に差し込み，地際に保持す種毎，個体毎に光合成を推定したい場合，細かく切りる．このとき，センサーを水平に保つよう注意する．I と刻まれたサンプルから種や個体を区別するのは難しいこ

I の値を同時に読み取る．１人だと同時に読み取るのはとがある．この場合には，野外では層別刈り取りを行わ難しいので，２人で行うと良い．センサーの高さを維持ず，地際で全植物を刈り取り，実験室に持ち帰ってからしたまま，群落内で位置をずらし，同様の測定を数回行種や個体に選別し，層別に切り分けても良い．ただし，
葉の高さや角度などについて，なるべく現地の状態を再現するよう注意を払う必要がある．
５）葉の光合成特性
層別刈り取りを行った群落と隣接した場所で，なるべく物理的環境が似ている個体を選び，葉の光合成速度を測定する．携帯型光合成測定装置を用いて，光―光合成曲線が得られるように，葉に照射する光の強さを変えて測定を行う．
様々な高さにある葉 10〜30枚程度を対象に同様の測定を行う．測定方法についての詳細は，多くの良書

図 6：葉の傾斜角の模式図．傾斜角を３つのクラス（０°
−30°
，
30°
−60°
，60°
−90°
）に分けた場合の例．
2009 低 温 科 学

vol.67が出版されているので，そちらを参照されたい．

光合成速度の測定が終了したら，測定に用いた葉を切り取り，乾燥しないようにポリエチレン袋などに入れ，実109

験室に持ち帰る．据え置き型の光合成測定装置を用いる
場合は，植物を切り取り，水差しにして実験室に持ち帰曇天日の場合，群落にふりそそぐ散乱光（I ）の日変化は次式で近似できる ．

り，上と同様の測定を行う．

I ＝500sin β［実験室での測定］式(21)

ここでは，空の明るさは一様であると仮定している．

実験室に着いたらすぐに，層別刈り取りをしたサンプ群落に降り注ぐ太陽光のうち散乱光と直達光の比率

ルを袋から出し，生きている部分と枯死した部分に分けは，Delta-T Devices 社（Cambridge,UK）の「sunshine

る．層毎に，生きている部分の葉の葉面積を測定する．

sensor」や，Climatec 社（Tokyo,Japan）の「シャドウ

ベルト式の葉面積計を使うと，大量のサンプルを短時間バンド」といった装置を用いて測定することができる．

で測定できる．また，スキャナーで葉の画像をパソコン

また，大気透過度やエアマスの関数として推定する方法に読み込み，画像解析ソフトで計測する方法もある．こもある．

の方法は，測定精度は高いが若干時間と手間がかかる．
サンプルを十分に乾燥させた後，乾燥重量と窒素濃度を

２）直達光と散乱光の群落内垂直分布測定する．種毎に光合成速度を推定したい場合，乾燥さ群落内の直達光と散乱光の分布を推定する．まず，図せる前に種毎に分けて別の袋に入れる．乾燥したサンプ

３のように，実測した各層の相対光強度（I /I ）の対数とルから種を同定するのは難しい．光合成測定に用いた葉LAI の関係を図式化し，回帰式の傾き（すなわち散乱光についても，同様に葉面積を測定し，十分に乾燥させたの吸光係数；K ）を得る．次に，各層における，群落上

あと窒素濃度を測定する．

からその層までの積算 LAI（F ）を計算する．F ，K とを式（11）に代入し，層ｉにおいて水平面が受ける散I［群落光合成速度の計算］

乱光の光強度（I ）を層毎に計算する．

１）群落に降り注ぐ直達光と散乱光

葉の傾斜角について，３つのクラス（０−30°，30−60°，

まず，雲のない完全な晴天下において，群落にふりそ

60−90°）に属する葉の割合（それぞれ f ，f ，f とする）

そぐ直達光（I ）と散乱光（I ）の日変化を求める．はを計算する．これらの値を式（8）に代入し，太陽光の入じめに，群落光合成速度を推定したい日の，太陽高度（β）

射方向から見たときの葉の投影面積（O）を計算する．O

の日変化を次式を使って求める ．

と β を式（15）に代入し，直達光の吸光係数（K ）を求める．

sin β＝sin β sin β ＋
cosβ cosβ cos 2π

t −12
24

式(18)

K ，I

と F を式（13）に代入し，層ｉにおいて水平面が受ける直達光の強さ（I）を層毎に計算する．式

β は調査地の緯度，β は当該日の赤緯（β と β の（13）内の σは葉の散乱係数で，0.2程度を仮定すればよ

単位はラジアン），t は太陽時である．t を変えることにい ．K ，I

よって，β の日変化が得られる．

直達光のうち散乱しない光の強さ（I次に，次式を使ってエアマス（m）を計算する．
m＝ 1229＋ 614 sin β−614sin β

式(19)

とI

I
（I

と F を式（14）に代入し，各層におけるの 差 か ら，直 達 光 か ら 派 生 す る 散 乱 光）を求める（式（12））．

K と I ，Iを式（10）に代入し，層ｉの葉が散乱

エアマスは相対大気路程ともいい，ある太陽高度におい光のみを受け取る場合の吸収光強度（Iて太陽光が大気を通過する距離を示す尺度である．太陽する．

が天頂にあるときに太陽光が大気中を垂直方向に横切る

I

距離を１としたときの，相対値で表す．

）を計算する．

）を層毎に計算，O，I ，β を式（7）に代入し，層ｉの葉が直達光と散乱光の両方を受け取る場合の吸収光強度（I ）を式（18）と式（19）を次式に代入し，群落にふりそそ

層毎に計算する．

ぐ直達光（I ）と散乱光（I ）の日変化を求める．
I ＝S τ sin β式(20a)

I ＝S 0.271−0.294τ sin β式(20b)

３）各層の光合成速度
作図ソフトなどを用いて，光―光合成曲線の測定デー
タを非直角双曲線（式（5））で近似する．回帰式から，，τは大気透S は太陽定数（2510μmol photons m s ）光飽和光合成速度（p過率で，0.7程度を仮定すればよい ．

呼吸速度（r ）を得る．測定した全ての葉についてこれら

110），初期勾配（ϕ），曲度（θ），暗草本群落の生産構造と光合成の値が得られたら，図４のように，各々の葉の単位葉面積あたりの窒素含量との関係式を得る（式（6））．層別刈り取りを行ったサンプルの，各層の単位葉面積あたりの窒素含量をこれらの関係式に代入し，各層の pr を求める．層毎に，p，ϕ，θ，r と I，ϕ，θ，きの単位葉面積あたりの光合成速度（p ）を求める．同，ϕ，θ，r と I

本稿の執筆に当たって多くの助言を下さった廣瀬忠樹
氏と Niels Anten 氏に深く感謝する．

を式（式
（5））

に代入し，層内の全ての葉が散乱光のみを受け取ったと
様に，p

謝辞

引用文献

を式（式（5））に代入し，

１) P.Boysen Jensen, Die Stoffproduktion der Pflanzen,層内の全ての葉が直達光と散乱光の両方を受け取ったと

Jena:Gustav Fischer (1932)
２) M .Monsi & T.Saeki, Japanese Journal of Botany 14

きの単位葉面積あたりの光合成速度（p ）を求める．
K と F を式（17）に代入し，層ｉにおける直達光を受け取る葉の割合（f ）を計算する．
f ，p ，pを式（16）に代入し，層ｉの平均光合成速度（p ）を計算する．p に層ｉの LAI を乗じ，全ての層にわたって積算すれば，単位土地面積あたりの群落
光合成速度が得られる．
完全な曇天下における各層の葉の受光量は，式（10）によって求めることができる．ここで Iはゼロとして扱えばよい．

2.b‑1.6 おわりに
本節で紹介したモデルの主目的は，植物と環境の間の相互作用を理解することである．これらのモデルは，群落全体の光合成速度だけではなく，群落を構成する個体や個葉の光合成速度を推定することができる．それゆえ，個体の炭素獲得量を最大にする植物の適応的な特性を知りたい場合や，複数の種がどのような機構で共存しているかを知りたい場合には，ここで紹介したモデルが活躍する．また，光以外の環境要因（気温，VPD，CO 濃度など）の群落内の変異が群落光合成に及ぼす影響や，環境変化に対する植物群落の応答を解析するモデルもある．これらは，進行しつつある地球

環境変化に対する植物群落の応答を予測するうえで有効な手段になろう．
ここで紹介した群落光合成モデルはいずれも，半影，
雲や風の非規則的，偶然的な変動，それによる直達光と散乱光の群落内分布の変動は考慮していない．群落光合成に影響を及ぼす要因の全てをモデル化するのは難し
く，現実的ではない．あくまでも，植物が置かれた環境のなかで，それらが互いにどのように関わり合うのかという因果律を解析するための手法であることに留意した
い．

(1953)P.22
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文一総合出版（2003）P.215

草本群落の生産構造と光合成

２章 個体・環境の測定

２．個体から群落スケールの C O ガス交換
b．群落の物質生産
b‑2．植物のサイズと成長 ⎜ 成長解析 ⎜長嶋 寿江
植物の成長は，光合成生産速度だけでなく，葉への分配など成長のしかたにも大きく影響される．本章では，成長を解析する方法と，それを行うための実験デザイン，測定方法について述べる．

Plant Growth Analysis
Hisae Nagashima
Because photosynthetic products are used to produce new assimilating organs, plant growth is influenced bybiomass allocation as well as photosynthetic rate of individual leaves. A traditional method for analysisingplant growth, including the experimental design and measurement methods, is outlined.

でないため，通常は区別しない．しかし死んだ組織（材）

2.b‑2.1 成長解析

が大きな部分を占める樹木などの場合は，生産が行われ植物は，光合成で得た産物をもとに根・茎・葉などのる組織や一年間の成長量を W とすることがある（森

器官を新たに成長させ，それらがまた光や水・栄養の獲林の成長や純一次生産量の評価については，2a‑3章を参得を行い生産を行う，という拡大再生産的な成長を行う．

照）． W の変化量は，期間中の純同化量（＝総同化量−

そのため，最終的な成長量は，葉面積当たりの光合成生

呼吸量）からその期間に死亡した植物体部分を差し引い産速度だけでなく，得た産物をどのように各器官に分配た値となる．
純同化量に日内変動があることを考えると，するかなどの植物の成長のしかたによっても大きく左右１日が最小の測定間隔となる．

される（図１）．植物の最終的なサイズは，農学的にも生もし全個体重に対する葉面積の割合が一定で，葉面積態学的にも重大な関心事であるため，植物の成長を解析

当たりの物質生産速度も一定であれば，RGR は一定の値

する様々な方法が開発されてきた．それらのうち標準的で最も広く使われる方法が，1900年代初期に作物学者
らによって考え出された「成長解析（growth analy-」と呼ばれる手法である
sis）．

成長解析では，成長が複利的で個体サイズに依存するという植物の特徴をふまえ，成長を相対成長速度（relative growth rate, RGR）で表す．
RGR ＝

1 dW d lnW
＝
W dt
dt

d または week

(1)

W は個体全体の乾燥重量（g），t は時間（day，weekなど）である．RGR は SGR（specific growth rate）と呼ばれることもある．農学的・生態学的に非常に有用な成長の指標である．理論上，W は生きている部分の乾燥重量であるが，道管など生きていなくても機能している組織もあり，死んだ組織を区別して測定するのは実際的

１) 東北大学大学院生命科学研究科生態システム生命科学
専攻機能生態分野

2009 低 温 科 学

vol.67

図 1：個体重に対する葉面積の割合（LAR）が２倍異なる仮想上の植物の成長．葉面積当たりの物質生産量（NAR）が一定の場合，LAR が２倍になると相対成長速度（RGR）も２倍になる．図の植物は，初期重量を 1g，RGR を 0.1day （上の個体），0.05day （下の個体）として計算．30日後には個体
重量が 4.5倍異なった．

113

となり，植物の個体重は時間とともに指数関数的に増大する．一方，同化産物の葉への分配率や光合成速度が変2.b‑2.2 各パラメーターの算出

化すれば RGR も変化する．RGR は以下のように「純同成長解析を行うにあたり上記のパラメーターを得るに化速度（net assimilation rate,NAR）」と「葉面積比（leafは，ある時間間隔をおいて植物を刈り取り，個体全体や」に分解される．
area ratio, LAR）

器官の乾燥重量，葉面積を測定する（破壊測定）．あるい

RGR ＝NAR ×LAR
NAR ＝

(2)

1 dW
g m d または g m week
A dt

(3)

A
mg
W

(4)

LAR ＝

A は同化が行われる部分の面積であり，通常は葉面積は，同一個体について繰り返し非破壊的な測定を行い，別に刈り取った植物のデータから乾燥重量などを推定す
る（非破壊測定あるいは間接測定）．これらの測定は比較的容易で，成長解析の利点の一つである．一方，これら測定値から上記パラメーターを算出したり，パラメー
ターの違いを統計学的に評価するのは少し複雑である．
パラメーターの算出方法には主に classical approach と（m ）が用いられる．光合成を行う茎の表面積を含めた

functional approach がある

り，針葉など表面積を求めるのが困難な場合には葉の乾成長解析が開発された当初から用いられている方法であ燥重量を代用することもある．
また，植物体のクロロフィ

るが，後に述べるようにいくつか問題を含んでいるため，ル量や葉窒素量，葉タンパク質量，カルボキシル化酵素

1960年代に functional approach が開発された量を代わりに用いることもできる．NAR は ULR（unitかし，これにも別の問題があることがわかり，統計学的leaf rate）と呼ばれることもあり，葉の光環境や光合成手法の改善もあって，近年 classical approach も見直さ

能力に影響される．

れている ．

LAR はさらに「比葉面積（specific leaf area,SLA）」と「葉重量比（leaf weight ratio,LWR）」に分解される．
LAR ＝SLA×LWR

(5)

A
SLA＝
m g

(6)

LWR ＝

(7)

は葉など同化が行われる部分の乾燥重量（g）であ．classical approach は．し

2.b‑2.2.1 C las s ical (interval) appro ach
２つの測定時点の間の期間の平均的な値を求める．瞬間式（式 1，3‑4，6‑7）を積分し，それを測定間隔の時間で割った値となる（表 1）．RGR の場合は，
RGR ＝lnW −lnWt −t(8)となる．破壊測定を行った場合は，各測定時のいくつかの個体の平均値を式（8）に代入することになるが，そのときに， W の平均値（）
ではなくln

の平均値
（ ln

）

る．SLA は葉の厚さや機械的支持組織の量に影響されるを代入する．そうでないと，母集団の真の平均 RGR 値かので葉の構造の指標とされる．種間や種内でも環境にらの偏り（bias）が生じるおそれがある ．

よって大きく異なる ．種間の比較では葉の寿命と相関

RGR の計算には問題はないが，その他のパラメーターがある ．SLA の逆数もよく使われ，SLW（specific leaf

では少々問題が生じる．例えば，NAR の計算では，積分

weight）あるいは LMA（leaf mass area）と呼ばれてするにあたり W と A の関係，あるいは，W と t の関係いる（ʻはʻを意味するため，SLW
specificʼ
per unit massʼ

と A と t の関係が必要となる．W と A の間に直線関係

は名称として不適切であると指摘されている ）．LWRを仮定する場合が多いが，実際には二次式や指数関数のは LWF（leaf weight fraction）と呼ばれることもある．

方がその関係をよく記述している場合もあるかもしれな

上記の分解により，植物の成長において，光合成など

い．どの関数を選ぶかによって，算出される NAR の値はの生理学的性質の影響（NAR）と植物の形態の影響

異なる
（表 2）
．LAR においても，A/W と t の関係，あ（LAR，SLA，LWR）を分けて評価することが可能とな

るいは，A と t の関係と W と t の関係がわからないとる．これらパラメーターを他の生育条件下や他種と比較計算できない．多くの場合，LAR は時間と共に直線的にすることで，それら植物との成長の違いの原因を探るこ

変化すると仮定されているが，この場合，NAR の計算でとができる．このような成長解析は，個体単位だけでな仮定した W と A の関係と矛盾してしまう ．また t とく，群落単位（土地面積当たり）でも行える．

t における値の平均値を直接，瞬間の式（4）に代入するのも誤りである．したがって，classical approach を用いるときは，これら算出に問題のあるパラメーターは，各114

植物のサイズと成長 ⎜ 成長解析 ⎜表 1：成長解析のパラメーター（Chiariello and Mooney 1989 より）
パラメーター
相対成長速度(RGR，SGR，R )純同化速度(NAR，ULR，E )

単位

瞬間的

Classical

d
w

1 dW
W dt

lnW −lnW
t −t

gm d
gm w

1 dW
A dt

1
t −t

Functional
df t
dt
ただし
f t ＝lnW

1 dW
dt
A dt

e

df t
dt

ただし
g t ＝lnA

1 df tdt
ft
ただし
f t ＝W
1 df tdt
g t
ただし
g t ＝A

葉面積比(LAR，F )

m g

A
W

1
t −t

A
dt
W

e

g t
ft

比葉面積
(SLA)

m g

A

1
t −t

A

e
ただし
h t ＝ln

g t
ht
ただし
ht＝

e

ht
ft

葉重量比
（LWR）

W

1
t −t

W

dt

dt

；t，時間；A，葉面積（m ）； ，乾燥葉重量（g）．
W ，乾燥重量（g）＊ ，A，の間に特定の関係を仮定しない一般的な表現．

表 2：classical approach における W と A の関係を仮定した NAR の計算式（Radford 1967 ，Chiariello andM ooney 1989 より）
W と A の関係

NAR の式

W ＝c＋bA

W−W
A −A

W ＝c＋bA

2 W−W
A ＋A t −t

W ＝c＋bA
W ＝c＋bA＋dA

lnA −lnAt −t的手法が使えない．この問題に対して古くからとられている対策は pairing という方法で，ある測定時点の個体を別の測定時点の個体と組にして同じ個体とみなして計算する手法である．ランダムに選んだり，W の順位が同じ個体を選んだりする．実験開始前に似たようなサイズの個体をあらかじめグルーピングしておく 方 法 も ある ．個体サイズが比較的均一であれば有効かもしれな

A −A
A −A

いが，いずれの方法でも反復個体間のばらつきを実際と2d A −Ab lnA −lnA
＋
t −t
t −t

だ場合は過大評価，同順位で組んだ場合は過小評価して

α
α−1

W−W
t −t

異なって評価してしまう可能性がある．ランダムに組んしまうかもしれない．２つめの方法は，統計学的定理を用いて各測定時の W のばらつきから RGR の分散を計測定時の瞬間値として提示するほうがよいかもしれな

算して推定する方法である

い．あるいは，W ，W ，A の測定値からこれらの値の間は不要である．この分散値をもとに，t 検定を行ったり，の関係式を導く必要がある．

パラメーターの標準誤差や 95％信頼限界を求めること

このような問題の他にも，測定時点間での RGR の変（後述）．この場合 paringができる ．しかしながら，この方法でも分散を過大評価

動（fluctuation）が大きく，生育期間を通した傾向がつしてしまうおそれがある

かみにくいといった問題がある ．変動の原因は，例えことを仮定しているので，ランダムに個体を組にするこ． W と W が独立である

ば，時点 t に大きな値のはずれ値があった場合，t ‑t 間とと実質上変わらないからである．なお，上記の方法で，の RGR は大きめに出る一方で，t ‑t 間の RGR は小さ

パラメーターの標準誤差，95％信頼限界を算出するプロ

めに出てしまう，といったことである．これは，各測定グラム（Excel ファイル）が Annals of Botanyの Web

時点で最大値と最小値を取り除くというデータのトリミ

ページからダウンロードできる（Hunt et al. (2002) ,ングを行うことである程度避けられる．

．３つめの方法は，RGR に関して
supplementalydata）

さらに，パラメーターの値の違いを統計学的に評価すのみ使える方法だが，分散分析を用いる方法である ．

るのが難しいという問題がある．破壊測定の場合，成長

lnW を従属変数とし，処理（あるいは種など）と時間の量の反復個体間のばらつきがわからないため，RGR や２つを独立変数として解析を行い，処理と時間の相互作

NAR の分散を直接求めることができず，通常の統計学

用が有意かどうかを調べる．
有意であれば処理間で RGR2009 低 温 科 学

vol.67115

に違いがあるといえる．この方法の場合，測定間隔が一＝定であることが必要である．一定でない場合は共分散分析（時間を共変量とする）が使えるだろう．
2.b‑2.2.2 Functio nal (po lyno minal,
dynamic) appro ach

W のばらつき（σ2×σt −t × n(9)）が大きかったり，測定間隔（t ‑t ）や反復数（n）が小さいと RGR の標準誤差が大きくなる．W のばらつきを抑える工夫としては，実験開始前

各測定で得た W ，A， W の測定値を時間 t の多項式に平均的でない個体をあらかじめ取り除いたり，同じくなどの関数で回帰し，そこから成長解析の各パラメー

開始前に小さい個体と大きい個体のサブグループに分けターを算出する方法である．例えば，Y＝b ＋b X＋たりすることが行われている ．測定データを得た後に．
．
＋b X にて Y＝lnW ，X＝t として回帰を行
b X ＋．

各測定時の最大と最小のデータを除く方法もあるが，統い，回帰式を X(＝t）で微分すると RGR の式が得られ計テストを行うときにその手順を調整しなくてはならな

る．その他のパラメーターについても容易に求まる（表い ．測定間隔が短いと誤差が大きくなる理由は，ばらつ1）．回帰式ではステップワイズ法を用いて有意になる項

きのあるデータで２点間のスロープを推定するときに間を選択する ．また回帰式の統計値をもとに各パラメー

隔が短いほど不正確になることから理解できる．したターの 95％信頼限界を求めることができる．関数としてがってこれらのことから，例えば，ある限られたサンプ

は多項式がよく使われ，その他にも様々な関数が使われル個体数で，ある期間の RGR（期間平均）を知りたいとたが，リチャーズ関数やスプライン曲線が当てはまりがきは，測定時点を増やすよりも，減らして（期間の最初よいことが示されている．

と最後の２回），一回の反復数を増やした方がよい．測定

functional approach の 利 点 は，上 記 の classical

間隔を短くとる場合は， W のばらつきを小さくするか，

approach の問題が回避できることである．また，期間平反復個体数を多くとることに気をつける必要がある．１

均を求める classical approach と異なり，ある時点のパ週間以下の測定間隔で反復個体数が６というのは明らか

ラメーター値を知ることができるという利点もある．一に不十分である ．一方，測定間隔を長くとる場合は，方で問題もある．一つは，多項式を用いる場合であるが．

NAR などの他のパラメーターの推定に問題が生じる場

なかなか測定期間全てにわたって満足に回帰できないと合がある． W と A などの間に仮定した関係式が実際という点である．次数の選択が難しく，次数が低いとデー違ってくるかもしれないからである．経験的には，葉面タの傾向に比べて単純すぎ（underfitting），高いと特に積が２倍になる期間よりも短い測定間隔であれば，異な曲線の両端付近で大きくはずれ（overfitting），その結果る関係式で計算しても NAR の違いは小さい（＜５％) ．

RGR や NAR が深刻にずれる ．しかしこのような問題それ以上に測定間隔を長くする場合は， W と A やはリチャーズ関数やスプライン曲線を使うことで解決すとの関係を把握するために，期間の途中でいくつか個体るかもしれない．もう一つの問題は，回帰式による Y のを刈り取ることが勧められている ．

予測値の 95％信頼限界は，X(＝t）の平均値付近では狭functional approach では，逆に，一回の反復数は小さ

いが両端に近づくにしたがって広がることである ．こくてもよいから，測定間隔を短くし測定回数を増やすののため測定期間の初めや終わり付近では，95％信頼限界

がよい ．一定の測定間隔で一定の反復個体数が望ましの範囲が広くなってしまい，統計学的な違いが検出されい．一般的には，週に２−３回の頻度で，一回の測定ににくくなる．

つき５−10個体ずつが適当である．
各測定時点で W のばらつきが小さいことが望ましい
ことから，成長解析を行うには，コントロールされた均

2.b‑2.3 実験デザイン

一な生育条件で植物が育つのが望ましい．人工気象室，

classical approach と functional approach のどちら

温室，実験圃場，野外の自然条件，となるにしたがってを用いるかによって，適切な実験デザインは異なる．

その条件から離れる．特に野外の自然条件に生育する植classical approach で，破壊測定を行う場合は，測定時の物個体の破壊測定による成長解析は難しい ．発芽時期

個体サイズのばらつきを抑え，長い測定間隔で，反復個の違いや微環境，生物間相互作用によって，個体サイズ

体数を多くとることが重要である．ln W ，ln W が標や成長速度は個体間で大きく異なる．各測定時にランダの正規分布に従いサンプル数も同じである

ムに個体を選ぶとサイズのばらつきは非常に大きいものと仮 定 し た 場 合，統 計 学 的 定 理 か ら 求 め た classicalになるだろう．相互被陰などの結果生育期間中に死亡す

approach の RGR の標準誤差は以下となる ．

る個体は破壊測定では把握できないので，RGR を過大評

準偏差 σ

116

植物のサイズと成長 ⎜ 成長解析 ⎜価するおそれもある．また根などの地下部を回収するのが難しい．
集団の代表値でなく，個々の個体の成長のバリエー

参考文献
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ションに興味がある場合は，非破壊的な間接測定を行う．

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４) D.R.Causton & J.C.Venus, The Biometry of Plant（1971) に詳しい．

2.b‑2.4 植物体サイズの測定
乾燥重量は，送風乾燥機で重さが変わらなくなるまで乾燥させてから求める．デンプンなどの非構造炭水化物（TNC）
が呼吸で失われるのを防ぐためには，凍結乾燥が最もよいが，あまり実際的ではない．酵素を変性させる
ために乾燥機で最初 60−90分間 100℃にした後に 70℃にすると，呼吸による損失が凍結乾燥と同 程 度 に なる．TNC は，最初から 70℃で乾燥させた場合は25％，室温（27℃）で乾燥させた場合は 40％減少し得
る ．乾燥重量の TNC 濃度は，葉では日内変動して最大10％前後，根や茎，小枝では 30−50％までである．

乾燥機から取り出した後は，結露を防ぐためすぐデシケーターに移し，そこで冷却する．
葉面積は，自動葉面積計（LI-COR 社，林電工など）
や，
パーソナルコンピューターと市販のスキャナー，画像解析ソフトのシステムを用いて測定できる．後者では，スキャナーで葉の画像を取り込み，画像解析ソフトでその面積を測る．100dpi 以上の解像度で画像を取り込めば，
自動面積計と同程度の精度で測定できる．画像解析ソフ
ト に は，フ リーウェア と し て，NIH

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rsbweb.nih.gov/nih-image/）や ImagJ（http://rsbweb.
nih.gov/ij/），LIA32（http://www.agr.nagoya-u.ac.
jp/%7Eshinkan/LIA32/index.html）などが公開されて成長解析は考案されてすでに 100年が過ぎるが，植物の成長の環境応答や種間比較など，研究の最初のステップとして現在もなお頻繁に使われる手法である．比較的
近年でも，成長が速い植物（fast-grwoing species）と遅い植物（slow-growing species）の違いをもたらす最も大きな原因が SLA であることや，上昇した大気 CO

濃度下では，SLA の低下のために成長はわずかしか促進
されないことなど ，重要な知見を我々にもたらしている．その簡便さと重要性から，これからも使用され続けるであろう．
2009 低 温 科 学

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植物のサイズと成長 ⎜ 成長解析 ⎜２章 個体・環境の測定

２．個体から群落スケールの C O ガス交換
b．群落の物質生産b‑3．森林生態系の純一次生産量の測定手法
大塚 俊之
森林生態系において，植物の成長と枯死を野外でどのように定量的に測定するのか，また渦相関法によるタワーフラックス観測との連携を視野に入れて，生態学的な方法にどのような問題点があるのかについて整理した．

M easuring Net Primary Production in Forest Ecosystems
Toshiyuki Ohtsuka
Net primary production (NPP)is defined as the total new organic matter produced during a specified interval.
I examine how forest NPP can be estimated based on field measurements,and how field NPP measurements canbe used to complement eddy covariance based studies of whole-forest CO flux.
目次

陸上生態系の炭素吸収は生産者の光合成の結果であ

2.b‑3.1 はじめに
2.b‑3.2 野外での純一次生産量の推定
2.b‑3.2.1 地上部の NPP
2.b‑3.2.1.1 地上部の林分増加量
2.b‑3.2.1.2 地上部の損失量

り，葉や植物体の正味の光合成量を土地面積あたりで表

2.b‑3.2.1.2.1 リターフォール
2.b‑3.2.1.2.2 その他の損失量
2.b‑3.2.2 地下部の NPP
2.b‑3.2.2.1 太根の純生産量
2.b‑3.2.2.2 細根の純生産量

様々な場所で NPP の測定に対して強い関心が持たれ，

2.b‑3.2.2.3 地下部でのその他の損失量
2.b‑3.2.3 非構造的炭水化物の蓄積
2.b‑3.3 NPP と森林全体のフラックス測定とのリンク
引用文献

す場合には，これを純一次生産（Net primary production：NPP）と呼ぶ．1960年代から 70年代の初めにかけて，陸上生態系だけでなく，海洋・湖沼などの地球上のその定量化が行われた ．これは「人類の福祉と生産力の生物学的基礎」をその総括的な研究課題とする国際生物学事業計画（略称 IBP）の実施と密接に関係していた．
日本でもこの時代に，様々な陸上生態系の物質生産に関する膨大なデータの蓄積がある ．その後やや下火になった物質生産の研究は，1990年に IPCC 第一次報告書 が提出されてから，再びその重要性を増してきた．この報告書では化石燃料の使用によって大気中に放出され2.b‑3.1 はじめにる CO の約 30％が行方不明とされた．このミッシング・
シンクの探索のために，
微気象学的な渦相関法に基づく，

IPCC の第三次報告書によると ，地球全体の陸上生態

陸 上 生 態 系 と 大 気 の CO 交 換 量（Net ecosystem

系の炭素シンクとしての機能は，1980年代（0.2PgC

exchange：NEE）ついての研究（2.b‑4.参照）が 1990

yr の吸収）に比べて 1990年代（1.4PgC yr の吸収）年代に入ってから爆発的に発展したに入って大幅に増大した．これは主に気候変動にその要でも草原生態系は，一般的に一年以内にすべての地上部

因があると考えられており ，気候変動に伴って陸上生が枯死する，放牧を含む消費者による被食量が大きいな

態系の生態系純生産量（Net ecosystem production：

ど，森林生態系とは大きく異なった特徴を持つ ．そのた

NEP）がどのように変化するかを理解することは，地球め，本稿では森林生態系の NPP の測定手法について取規模での炭素循環に対する陸上生態系の役割を知る上でり扱う．特に森林生態系において，植物の成長と枯死を非常に重要である．

野外でどのように定量的に測定するのか，また渦相関法．陸上生態系の中によるタワーフラックス観測との連携を視野に入れて，
１) 岐阜大学流域圏科学研究センター

2009 低 温 科 学

vol.67

生態学的な手法にどのような問題点があるかについて整
119

理する．

1b）
．NPP はある期間内における，図 1b に含まれるすべての構成要素の合計であり，基本的には以下の二つか

2.b‑3.2 野外での純一次生産量の推定
純一次生産（NPP）とは，単位面積当たりの真の光合成速度の総量（総生産，Gross primary production：
GPP）から呼吸速度を差し引いたものである．しかしならなる．
１) 生きた植物によって，ある期間の終わりに保持されている新しい有機物の総量
２) 同じ期間にその植物によって生産されて失われた有機物の総量

がら，森林生態系において野外で両者を測定し，この差

NPP の精度（どこまで NPP に近づけるか）は，どれ

異から NPP を求めることは現段階では不可能である．

だけの構成要素をどれだけの精度で測定できるかにか

野外で森林の GPP を直接的に求めることは難しく，まかっているが，森林生態系ですべての構成要素を野外でた生産者の呼吸量の生態系レベルでの総量を求めること

測定することは，現状ではほぼ不可能である．図 1b の構にもいまだに相当の不確実性がある．このため野外で測成要素の中で，地上部のバイオマス純増加量とリター定する場合には，「ある特定の期間内に新たに生産された

フォールの二つの要素を測定することが一般的には一番

有機物の総量」と NPP を定義する．この NPP の構成要

多く，両者の和が地上部 NPP（ANPP）とみなされる．

素を概念的に整理することは比較的簡 単 で あ る（図地下部の NPP は無視されるか，地上部との理論的な比1a) ．しかしながら，実際には測定期間内にそれぞれの率から計算される場合が多いが，実際には非常に大きなプールからの移動（被植，分解，死亡，転流など）があ値であり，その推定は NPP の精度に大きく影響する．

るため，ある期間内に生産された有機物量をすべての構

NPP のすべての構成要素（特に地下部の要素）に対し成要素において直接的に測定することは不可能である．

て，正確な推定のための実際的あるいは理論的な挑戦がこのため NPP の野外での実際の推定は，様々な仮定を現在でも続いており，今現在行われている方法についておいた上で，構成要素のうちのいくつかの測定に基づい具体的な調査例を紹介しながら解説する．

たものとなる．Clark et al. は，NPP（期間内に生産さ2.b‑3.2.1 地上部の NP P

れたすべての有機物）の真値に対して，野外での測定に

2.b‑3.2.1.1 地上部の林分増加量

基づく操作上の 推 定 値 を NPP と し て 定 義 し た（図地上部の林分増加量は，永久方形区を用いてある間隔

図 1：Clark et al. によって定義された，森林生態系における NPP（a，期間内に生産されたすべての有機物）と，野外での測定に基づく操作上の推定値である NPP （b）の構成要素．NPP はある期間内におけるすべての構成要素の合計であり，生きた植物によって，ある期間の終わりに保持されている新しい有機物の総量と，同じ期間にその植物によって生産されて失われた有機物の総量の二つの部分からなる．Clark et al から改訂．

120

森林生態系の純一次生産量

（通常は１年以上）をおいて森林のバイオマスを２回以上推定することによって評価することになる．年輪が形成される温帯や亜寒帯の森林生態系では，樹幹解析や年輪解析などによって複数のサンプル木の過去の成長を推定出来る．
log W ＝2.334logD−0.946 r ＝0.98，n＝24(1)

log W ＝1.977logD−1.074 r ＝0.92，n＝7(2)

して，１回の毎木調査から林分全体の地上部バイオマス（kg 葉を除く），W ：太根の乾燥重W ：地上部乾燥重量の増加量を推定する方法も従来用いられてきた（木村に

量（kg），D：胸高直径（cm）

詳しい) ．Ohtsuka et al. は，岐阜大学・流域圏科学

最大直径に相当するような大径木をサンプリングする

研究センターのカンバとミズナラを中心とする冷温帯落ことはバイオマス推定において非常に重要であるが，現

葉広葉樹林（高山サイト）において，地上部の林分増加

実的にはこのようなサンプルの処理は極端に労力がかか量を評価する方法を比較検討した．高山サイトでは複数る．なお図２の地上部バイオマスには葉の重さは含まれの種が優占しており，少数のサンプル木では種特異的なていないことに注意する必要がある．落葉樹林では，必成長パターンを評価できないこと，１回の調査では過去ず葉の量を除いた相対成長関係式を用いてバイオマスをの枯死木を評価できないことなどの理由から樹幹解析や推定する．なぜなら，後述するようにリタートラップに

年輪解析の方法は，自然の二次林では適さないことを報よる枯死・脱落量と地上部バイオマスの増加量とで，葉告している．後述するように生態系の NEP を評価するの生産量を２回加えてしまう可能性があるからである．

ための森林全体のフラックス測定との連携を考えた場合

永久方形区内のすべての樹木の直径を，ある期間をおには，温帯の森林でも永久方形区を用いて生残と成長のいて２回以上測定すれば，林分増加量の推定が可能とな調査を継続的に行なうことが不可欠である．

る．ただし，稚樹等を含めてすべての個体を調査するこ森林内に永久方形区を設置して全個体（幹）についてとは労力がかかるので，直径成長を測定する最小サイズの毎木調査を行なった場合，森林全体の地上部バイオマを設定することが多い．最小の直径サイズは，そのサイスは，胸高直径（DBH）と樹木の乾燥重量との相対成長

トの樹木の密度やサイズクラスなどの群落構造に依存す関係式から推定することになる．サイト特異的な相対成るが，高山サイトでは DBH≧5cm の成長を測定してい長式をつくることはバイオマスの推定において最も重要る．この森林では，樹高が 1.3m 以上で直径が 5cm 以下

なプロセスの一つである．高山サイトでは，方形区周辺の幹数密度は方形区全体の 25％以上を占めるが，年間のから 24本のサンプル木を伐採して相対成長関係式を作

地上部の林分増加量とし て の 寄 与 は ５％以 下 で あっ

成した
（図 2）
．この調査では 24本のうち，７本についてた ．また，実際の樹木の成長は年に数 mm 程度でありは地下部の主要な太根も掘り出して乾燥重量を求め，（図 3) ，直径の測定には最新の注意が必要である．野外

DBH と太根のバイオマスの相対成長関係式も求めていの測定では枯死していない個体でも直径成長がマイナスる．これは後述する太根の NPP の推定に用いることがになる場合がある．樹勢の弱った個体では，実際に直径が減少する場合もあるが，測定位置や測定者の癖などにも注意する必要があるだろう．少なくとも，測定場所の幹周囲をペンキ等で丁寧にマーキングした上で，適切な測定時期を選定すること，また測定誤差を少なくするた
めに金属製でなるべく幅の狭いメジャーを使うほうが良い．
永久方形区を用いた毎木調査と，相対成長関係式を用いた地上部の林分増加量の推定には二つのアプローチがある（図 4) ．樹木の枯死と新規加入（期間内に成長して最小直径に到達する個体）についての扱いが異なっているが，二つのアプローチは基本的に同じものである．ア

図 2：高山サイトによる，サンプル木の胸高直径（DBH，cm）と乾燥重量（kg）との間の相対成長関係．この調査では毎木調査のための永久方形区周辺から 24本のサンプル木を伐採
して，胸高直径と地上部幹枝バイオマス（葉のバイオマスは含
まれていない）との相対成長関係を求めた（a）．また 24本のうち，７本については地下部の主要な太根も掘り出して，．
DBH と太根のバイオマスの相対成長関係式も求めた（b）
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プローチ１ではすべての個体の生残と成長を追っており，それぞれの個体の測定期間の最初（t ）と最後（t ）のバイオマス推定値の差によって各個体の成長を計算す
る．これは期間内に生存していた，すべての個体の成長量の合計である．期間内に死亡する個体がある場合，そ121

図 3：高山サイトでの永久方形区内における DBH 5cm 以上のすべての幹の成長調査の例．2001年から 2003年までの３年間の調査を，前年の DBH（cm）と一年間の直径成長量（cm yr ）の相関として示している．

図 4：永久方形区を用いた２回以上の調査による，地上部の林分増加量を計算するための二つの方法．アプローチ１は生きている
すべての個体の追跡に基づいている．アプローチ２はそれぞれの調査期間でのバイオマス測定に基づいているが，期間内に死亡した個体と，最小サイズに加入してきた個体の調査が必要である．Clark et al から改訂．

の個体は期間内の増分は０とみなし増加量の計算には入アプローチ２は 10年以上たって方形区を再調査するよ

れていない．また新規加入の評価も必要である．新規加うな，調査間隔が長い場合に良く用いられる．しかし，入個体の調査期間前のバイオマスは最小サイズ（例えば調査期間が長いと期間内の枯死個体の評価が難しく，特DBH＝5cm）の樹木バイオマスと等しいとみなし，それに大径木個体が死んだ場合には期間内の成長量が考慮でと期間後のバイオマスとの差異を成長量とみなして，全きないのでバイオマス増分は過小評価となる．

個体の成長量の合計に加える．

2.b‑3.2.1.2 地上部の損失量アプローチ２では，各個体の成長を追うのではなく，植物に新しいバイオマスが蓄積するのに加えて，期間

期間の最後（t ）のバイオマスから期間の最初（t ）のバ

内に生産された有機物の一部は枯れたり食べられたりしイオマスを差し引き，樹木の枯死と新規加入による補正て失われていく．このような損失には葉や花，実，生物を行う．枯死の補正は，期間中に死んだ個体のネクロマ

起源の揮発性有機物，根から浸出する有機物など様々なスを期間の最初のバイオマスと等しいと仮定し，バイオものがある．地上部の NPP の推定にはこれらの損失分

マスの純変化に足してやる．さらに新規加入の補正のたの評価が必要である．

めに，新規加入の個体数と最小直径の個体バイオマスを

2.b‑3.2.1.2.1 リターフォール

かけて，これをバイオマス増分から減じることになる．
122

植物器官の一部（葉や花，小枝など）は寿命が短いの
森林生態系の純一次生産量

で，調査期間内に生産されたものが，調査終了までの間に枯死したり脱落したりすることがある．このような枯死・脱落した植物器官はリターフォールと呼ばれ，一般
的にリタートラップ法を用いて野外で測定される．リ
タートラップとは，面積が 1m 程度のネット状のカゴを方形区内に複数個設置し，主に林冠から落ちてくる細かなリターフォールをサンプリングするものである．リ
タートラップ内に溜まったリターは，通常月に１度回収して器官ごとに分けた後，乾燥重量を測定する．
リタートラップを使って推定すべきものは，測定期間内に作られた有機物の枯死・脱落量であるが，実際にはその推定は難しい．完全な落葉樹林の場合には，調査期間を一年間とすれば，期間内に新しく生産された葉は測定期間中に必ず枯れ落ちるので，リタートラップにより得られた葉の損失量は年間の葉の生産量と等しい．一方
で常緑樹の場合には，リタートラップによる年間の葉の枯死・脱落量は測定期間とそれ以前の生産を含んでいるが，両者を区別することは現実的には難しい．測定期間
前と測定期間後の生きている樹木の葉量の差異は，測定

図 5：リタートラップ法による細かなリター（a）と，林床に設置した枝トラップ法による木質リター（b）の１年間の枯死・脱落量を示す．両者共に基本的に月に一度回収しているが，積雪の影響によりリタートラップでは 12月〜３月までの４ヶ月分を，枝トラップでは 12月〜４月までの５ヶ月分をまとめて回収している．

期間中における新しい葉の生産と，新しい葉と古い葉の損失の結果である．従って，葉の量が定常状態であるとター量も無視できない．また，枯死・脱落量の推定精度仮定したマスバランスによって，年間の枯死・脱落量をはリタートラップ間の分散が大きい場合には，リタート

そのまま NPP に含める場合が多い．

ラップの数にも大きく影響を受ける．リタートラップの一方で，枝などの木質リターの扱いも難しい．一般的数の問題を評価した研究は少ないが，理想的には分散のには，木質リターは測定期間以前の生産物である場合が定量的評価のための予備調査を基にして，そのサイトで多いので，リタートラップからは除くべきである．しか必要なトラップ数を決定する必要があるだろう．ただしし，かなりの木質リターが測定期間内に脱落し，相対成閉鎖した林分内では６−７個以上あれば十分という意見

長関係式がそのような脱落を含んだ代表的なサンプル木もある ．また枝トラップの小区画の合計面積は，少なくで作成されているとすれば，このような脱落量を測定期

とも調査林分の面積の 10％を超えることが望ましいと間後のバイオマスに加えないと成長量が過小評価になされる ．

る．この場合，比較的大きな枝の脱落量は空間的に非常

2.b‑3.2.1.2.2 その他の損失に不均一である場合が多いので，リタートラップ法だけ

地上部の生産量は消費者によってかなりの損失を被る

では精度良い推定は難しい．そこで，方形区内に数 m 四場合があるが，森林生態系の NPP の推定において，消方程度の面積をいくつか区切り，いったんきれいに枝を費者による被食量を考慮したものは比較的少ない．これ取り払った後に，そこに新しく落ちてきた枝をきれいには，健全な森林では消費者による捕食は比較的小さいと回収する方法（枝トラップ法）が併用される．このよう考えられているからである

な枝の枯死・脱落は，空間的な不均質性だけでなく年変なると昆虫の大発生などが起こる場合があり，今後検討動も大きいので，野外では５−10年程度の平均値を補正していかなければならない課題である．生物起源の揮発値として用いるべきである．

性有機物や地上部の植物体からの溶脱を NPP に組み．しかし，調査が長期的に図５はアカマツ林でのリタートラップによる細かなリ込んでいる研究はさらに少ない．これらについては，野ターフォール量（a）と，枝トラップによる木質リター量外での定量的な測定手法についてはほとんど検討されて（b）を示したものである．アカマツは常緑樹であるが，いない．

落葉期は秋にあって，ほとんどの葉が 10月に落葉する．

2.b‑3.2.2 地下部の NP P

また雪の影響などで冬の間に小枝や樹皮などの多くの木

森林における地下部の NPP は手法的な難しさのた質リターが落ちることがわかっており，冬季の間のリめに，いまだに残された課題が非常に多く，その理解が2009 低 温 科 学

vol.67123

進んでいない．図 1b にあるように，地下部の NPP はい

知られている ．しかしながら，細根の量と分布の時間

くつかの構成要素からなるが，現状では便宜的に樹木の的・空間的な変動性のために，これらの方法を用いた細根を太根と細根に区別する必要がある．両者は生物学的

根 NPP の推定には不確実性が非常に高い．そのため近な活性が異なり，特に根の成長と枯死によって起こる

年では，土壌中の細根の動態をカメラを用いて直接的に

ターンオーバータイムも大きく異なるからである．ただ観察するミニライゾトロン法によるデータが森林生態系

し，細根の定義は直径 2mm 以下，5mm 以下など，対象においても増加してきた ．例えば，高山サイトでは，細とする林分の組成や研究手法などによって異なる ．

根のバイオマスは 1.6tC ha で，樹木バイオマス全体

2.b‑3.2.2.1 太根の純生産量のわずか２％に過ぎない．しかしミニライゾトロン法で仕事量としては非常に大変だが，サンプル木の太根を調 べ た 細 根 NPP は 1.8tC ha y に も の ぼ り，樹 木

掘り出すことによって，樹木の胸高直径と太根の乾燥重（5.4tC ha y ）の 30％以上の寄与となった．このNPP

量は相対成長関係式で示せる場合が多い（図 2b）．この相ことからも細根 NPP は森林の NPP を推定する上で対成長関係式を用いれば，永久方形区を用いた２回以上不可欠であり，その推定方法が NPP の精度に大きく影の毎木調査による成長と生残の調査によって，地上部バ響することになる．ミニライゾトロン法を中心とした細イオマスのアプローチと同様に太根の NPP（枯死量と根 NPP の野外での研究手法については，里村ら

純増加量）を推定することが出来る．

常に詳しくまとめられており，
本稿では詳細は触れない．

に非Clark et al. は，この方法の問題点として，一般的にミニライゾトロン法は細根 NPP の測定手法として標太根に分類される根の中でも比較的細い根（２−10mm

準的な手法となりつつあるが，機材が高価であること，

程度の根）の生産量が，相対成長関係式では評価されな

画像データの解析に長い時間がかかることなど，いまだい点を述べている．相対成長式を作るための根のサンプに問題点もある．また最近の報告では，ミニライゾトロ

リングは重機などを用いて行う場合も多く，不完全なサン法の観測開始直後は，土壌撹乱のために細根のターン

ンプリングや物理的な破壊によって２−10mm 程度のオーバタイムを短く評価してしまう傾向があることが報根は失われて，太根の乾燥重量には含まれないからであ

告されている ．これは，今までの研究結果のほとんどる．

が，細根 NPP を過大評価している可能性を意味する．ま2.b‑3.2.2.2 細根の純生産量

た，ミニライゾトロン法と比べて， C や C などの炭素

細根 NPP の測定のためには，NPP の他の構成要素

同位体を用いた非破壊的な細根動態の研究ではターンと同様に，測定期間内の細根の純増加量と，期間内の枯オーバータイムの推定値が長い傾向があることも知られ死量を評価する必要がある．生態系レベル で の 細 根ている

NPP は，野外での森林 NPP の推定において，現在残さては，その測定手法の標準化を含めて，現在まさに活発れている課題のうちで最重要なものの一つであろう ．

な議論が行われている状況にある．

生態系レベルでの森林の細根純生産量の測定手法は

2.b‑3.2.2.3 地下部でのその他の損失量．このように森林生態系の細根 NPP につい

Vogt et al. にまとめられており，間接的な手法と野外

生きた根から土壌中への浸出物（根圏リゾデポジショ

で直接的に根を測定する手法がある．間接的な手法としン) や，菌根菌への有機物の移動，消費者による根の捕ては，生態系の土壌呼吸量を測定することによって，炭食など根の枯死以外の地下部での損失量は，森林生態系

素のマスバランス（従属栄養生物による土 壌 圏 炭 素の NPP ではほとんど考慮されてこなかった．しかし，（SOM ）の分解呼吸量と SOM への植物からの炭素の供

近年の研究では全 NPP のかなり大きな部分を占めると給量とが等しいと仮定する）から地下部の NPP を推定の指摘もある．Norton et al. は，マツの実生においてする方法が良く用いられている ．しかし，土壌呼吸にお新しく固定した炭素の菌根菌への再分配量は 30％以上ける根の呼吸量の割合の推定が難しく，また SOM が定もあることを指摘した．また Bekku et al. は，雑草群常状態であるという仮定に問題がある場合も多い ．

落ではあるが根からの浸出量は NPP の３−13％を占め

直接的な方法としては，コアを用いて野外で細根をサると述べている．炭素同位体ラベリングを用いた根茎かンプリングする方法が従来から用いられてきた．これにらの炭素の損失量の研究は増えてきているが ，生態系

は，月に一度など定期的に土壌中からコアをサンプリン

レベルでの研究のためには，まだ今後の発展が必要であグして細根量の変化を推定する連続コアサンプリング法

る．

と，ネット状のコアを土壌に空けた穴に埋めて，その中

2.b‑3.2.3 非構造的炭水化物の蓄積に伸張してくる細根を定量化するイングロウスコア法が124

NPP の一部は，非構造的炭水化物の形で樹木の地上
森林生態系の純一次生産量

部や地下部に蓄えられる．この蓄積量の変動は NPP のつの変化（例えば細根の枯死量）でも biometric NEP の推定に大きな影響を与えると考えられているが，森林生推定に大きな誤差をもたらす．また土壌呼吸による Rh

態系において野外でこの問題を扱った研究はまだ見られの推定は，１) 根の呼吸量の推定が難しい，２) 森林にない．しかし，微気象学的なフラックス測定が行われて多く見られる倒木などの大型木質リター（CWD）の呼吸いるサイトでは，炭素のマスバランスから，この蓄積量量を含んでいない，３) 地形的なスケールアップの問題が注目されている場合がある．例えば，Shibistova etなどにより，これも十分な精度が得られているとは言い

al. は，マツ林において地上部の樹木生産量は森林全体がたい．しかし，渦相関法による推定にもいまだに多くの NPP のわずかに 25％に過ぎず，渦相関法により推定の問題があり（2.b‑4.参照），これらの二つの手法の比較した GPP の年変動が樹木の成長量と全く相関が無いこはクロスチェックのために非常に重要である．近年にとを見出した．彼らは，翌年以降の新しい植物体の生産なって，渦相関法と biometric 法による NEP の比較にに必要な炭水化物の需要によって非構造的炭水化物の蓄ついて先駆的な研究がいくつかある．

積が増加し，このために当年の樹木成長量と GPP の相Ohtsuka et al. は，５年間（1999−2003）の平均値

関が無い可能性を指摘している．また Gough et al. は，として高山サイトでの biometric NEP を推定した（図ミシガン州の落葉混交林において，ある年の NPP は，渦6）．地下部の太根の NPP と地上部幹枝の NPP は，図 4相関法によるその前年の NEE と相関があることを見出のアプローチから計算し，細根 NPP を含めた樹木 NPP

した．これは，その年に固定した炭素の一部がその年のは 5.4tC ha y と推定された．また高山サイトでは林

成長よりも，むしろ翌年の成長のために蓄積されるから床が密なササ群落に覆われており，その林床ササ NPP

ではないかと述べている．このようにタワーフラックス

が 1.1tC ha y と推定された ．高山サイトでは，土壌観測と野外での NPP の測定をリンクさせたデータ解

呼吸の連続測定も行われており ，地形補正を行った年

析によって，非構造的な炭水化物の動態についての知見

間土壌呼吸量が 7.1tC ha y ，CWD 分解を含めた Rh

が今後増えてくる可能性がある．

は 4.4tC ha y と 推 定 さ れ た．こ れ ら の 結 果 か ら

2.b‑3.3 NP P と森林全体のフラックス測定とのリンク
1990年代以降，微気象学的な渦相関法を用いた，生態
系と大気の炭素交換（NEE）に関する研究は爆発的に増加している．近年では NEE の年々変動に関する研究も増加しており，温帯地域の森林生態系の炭素シンクとしての機能や，NEP の変動に対する GPP と生態系呼吸（RE）の寄与などが評価されるようになった．
一方で，NEP は生態系内の二つの生物学的プロセスのバランス―独立栄養生物の光合成生産（NPP）と従属栄
養生物の呼吸量（Rh)⎜ によって決定されている．森林
生態系では従属栄養生物の分解呼吸（Rh）は主に土壌圏で起こり，チャンバーシステムを利用した土壌呼吸の測定が行われてきた
莫・関川．土壌呼吸の測定手法については，や木部・鞠子を参照のこと．野外での NPPの推定と合わせて，土壌呼吸の測定によって Rh を推定
し NEP を評価する方法は，微気象学的な渦相関法に対して Biometric 法と呼ばれる ．
Biometric NEP＝NPP−Rh(3)

上述したように，森林 NPP の推定には必ずしも十分な精度が補償されていない．多くのフラックスの中の一2009 低 温 科 学

vol.67

図 6：高山サイトでの炭素循環のコンパートメントモデル．
□は生態系内の炭素プールを示し，１年間の収支を数値で示している（1999年から 2003年までの５年間の平均値）．矢印
は各プール間の炭素フラックスを示し，1ha 当たりでの１年間の移動量を示している．

125

biometric NEP は 2.1tC ha y （5.4＋1.1−4.4）と連続的な測定を行うことによって，森林生態系の炭素循なった．Saigusa et al. は，高山サイトで渦相関法によ環プロセスの年々変動とそれに対する独立栄養生物と従る NEP の年変動を報告しているが，同じ５年間の渦相

属栄養生物の寄与を評価し，炭素循環プロセスが気候変関法による平均値は 2.77tC ha y と biometric 法と動にどのように応答するかについての理解を可能にす

おおよそ近い値になった．NPP の構成要素を，すべてる．地球規模での炭素循環の問題がクローズアップされのサイトで同じように精度良く推定することは，現状でる中で，様々な生態系で渦相関法による生態系の炭素交は非常に難しい．従って単年の推定値で Biometric 法と換量に関する研究が発展してきた．このような中で，精渦相関法の NEP の絶対値を比較することはあまり意味度の高い NPP を推定することの重要性がますます増が無い．しかしながら，複数年の平均値の Biometric 法

してきている．

と渦相関法の比較は，両方の方法の信頼性を高める結果となり，生態系の NEP の推定精度を上げるために重要なテーマである．

引用文献

一方で NPP の中でも，現状では複数年の平均値とし１) IPCC (2001)Climate Change 2001:IPCC Third Assess-てしか評価できない要素と，比較的精度良く年変動をと

ment Synthesis Report. Cambridge University Press.
２) D.S.Schimel,J.I.House,K.A.Hibbard et al.,Nature
414 (2001)P.169.
３) H.Lieth & R.H.Whittaker (1975)Primary productiv-

らえられる要素があることをきちんと理解することは重要である．Ohtsuka et al. は biometric NEP の年変動を推定するために，NPP の構成要素のうち，年々変動を比較的精度よく推定できる要素（リタートラップによる葉 NPP と毎木調査による木部 NPP）とそれ以外の主要な要素（細根 NPP やササ NPP など）を区別した．その結果，木部 NPP は 0.88tC ha y から 1.96tC ha，葉 NPP とy まで大きな年々変動を示したが（表 1）
Rh の変動はこれに比べると小さかった．年間の木部
NPP は渦相関法による NEP と有意な正の相関を示し
たが，葉 NPP と Rh は NEP と相関が見られなかった．
このことから，この生態系の NEP の年変動は，独立栄養生物の NPP の変動（特に木部 NPP）に直接的に関連していることを見出した．
このように野外での NPP の測定のクオリティーコン

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４) T.Shidei & T.Kira (1977) Primary productivity ofJapanese forests- Productivity of terrestrial
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８)「草地科学実験・調査法」日本草地学会編．草地・施設におけるエネルギー・物質動態のモニタリングと評価に接的に比較することも可能となる．タワーフラックス観

関する調査法（1）23．草地におけるエネルギー・物質動態のモニタリングと評価に関する調査法（板野志郎）
９) D.A.Clark, S.Brown, D.W.Kicklighter, J.Q.Cham-

測サイトでは，土壌呼吸の連続的測定と同時に NPP の

bers, J.R.Thomlinson,& J.Ni,Ecological Applications

トロールに注意すれば，NPP と渦相関法の年変動を直

表 1：高山サイトにおける８年間の森林動態と樹木 NPP の年々変動．1999年と 2000年及び，2004
年と 2005年はそれぞれ２年間の平均値として示している．木部 NPP は，地上部の幹枝（葉を除く）生産量と，地下部の太根の生産量を，図４に示した方法で推定した．また葉の NPP
はリタートラップ法により推定した．
樹木 NPP は木部 NPP と葉 NPP を足したものである．
1999‑2000

2001

2002

2003

2004‑2005

2006

30
5

54
4

14
4

45
5

18
2

22
1

0.73
0.15

1.15
0.23

1.64
0.33

1.02
0.20

1.10
0.22

1.23
0.25

0.88

1.38

1.96

1.22

1.32

1.47

葉 NPP（ton C ha y )

1.66

1.94

1.92

1.92

2.03

1.69

樹木 NPP（ton C ha y )

2.54

3.31

3.88

3.14

3.35

3.16

幹数（5cm DBH)
枯死幹数（ha y )新規加入幹数（ha y )木部 NPP（ton C ha y )
地上部幹枝
太根
小計

126

森林生態系の純一次生産量

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2009 低 温 科 学

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127

２章 個体・環境の測定

２．個体から群落スケールの C O ガス交換
b．群落の物質生産
b‑4．微気象学的な測定（渦相関法による測定）斎藤琢

群落スケールの CO 交換量の計測手法の一つとして微気象学的な測定が挙げられる．本章では，微気象学的手法の一つである渦相関法を用いた CO 交換量計測を中心に紹介する．

CO flux measurement using eddy-covariance method
Taku M . Saitoh
To assess budgets of CO exchange between the biosphere and atmosphere,long-term measurements have been
carried out using eddy-covariance method over various ecosystems worldwide. In this chapter, we introduce
eddy-covariance method.Especially,principle ofmeasurements,calculation process offluxes,and qualitycontrol
of flux data has been described.

ることを示し，純生態系生産量（NEP:Net Ecosystem

2.b‑4.1 概要とは逆符号となる．RE は森林生態系を例
Productivity）

群落スケールの大気と生態系間の CO 交換量を研究に挙げれば，

対象とする場合，微気象学的な手法によって CO フラッ
クス

RE＝R ＋Rを計測することが有効である．微気象学的な手法＋R＋R

は，短い時間インターバルで連続的に物質の交換量を把であり，微生物分解による呼吸量
（R ）
，根呼吸量
（R

握できる利点を持ち，Biometric 法（2b．3参照）では困

幹呼吸量（R

難な「日」から「季節」スケールでの生態系の環境応答とができる（図 1）．

），葉呼吸量（R(2)），）の総和として表すこを議論できる．微気象学的な手法には，傾度法，バルク法，乱流変動法などがある ．近年は，乱流変動法の一つとして確立された計測手法である渦相関法が多用されている．乱流変動法には，他に，簡易渦集積法，バンドパ
スコバリアンス法などがある ．
裸地，草本類群落などの水平一様な理想的な観測条件において渦相関法によって計測される CO フラックス
は，純生態系交換量（NEE:Net Ecosystem Exchange）と呼ばれ，土壌圏を含む生態系が正味として放出する．
CO である．NEE は以下の式で表せられる（図 1）
NEE＝RE−GPP＝−NEP(1)

ここで，RE は生態系呼吸量（Ecosystem Respiration）
であり，生態系の呼吸によって放出された CO 総量を表し，GPP は総一次生産量（Gross PrimaryProductivity）
であり，生態系の光合成によって吸収された CO 総量を表す．NEE が負の値のとき生態系が炭素を吸収してい１) 岐阜大学流域圏科学研究センター

2009 低 温 科 学

vol.67

図 1：森林生態系の CO 収支．
一般的には，単位面積，単位時間当たりにある面を通過する物
質・エネルギーなどの量．狭義には，大気―地表面間の交換量
を表す．

129

2.b‑4.2 渦相関法の概念

2.b‑4.3 渦相関法による計測

渦相関法は，渦（乱流）によって輸送される物質量を2.b‑4.3.1 計測場所の選定

直接的に計測する手法である．計測場所における鉛直風

通常，計測器は，裸地，草本群落，背の低い森林群落

速と物質量の変動は，時々刻々と変化する乱流による上では簡易ポール上に設置し，森林群落では観測タワーを下方向の物質の輸送をとらえている．上向きの風は下方建設してタワー上に設置する．ポールやタワーの設置場の物質を上方へ輸送し，下向きの風は上方の物質を下方所（計測地点）としては，研究対象とする生態系が「水に輸送する．このとき，上向き（下向き）に輸送される平一様」に広がる場所に観測サイトを設定することが理

物質量が多ければ収支として物質は上向き（下向き）に想である．その第１の理由として，渦相関法は，移流輸送されたことになる．

よる物質輸送を無視でき，物質の鉛直輸送量は乱流によにCO を例にすれば，裸地，草本群落，樹高が低い森林

る輸送量のみで説明できるという仮定に基づいている点

群落上などで計測される CO フラックス（NEE）は本質が挙げられる．「水平一様」
でない観測場所ではこの前提

的には以下のように表すことができる（各記号についてが崩れ，移流による物質輸送が無視できないほど大きく

は表 1参照）．

なることもある．第２の理由として，タワーで計測されNEE＝ w′c′h(3)

た CO フラックス値は風上の群落上の各地点で乱流によって輸送された CO 量の加重平均である点が挙げら

このとき，鉛直風の変動成分（w′）は乱流変動を示してれる．図２はタワーで計測されたフラックス値に風上側

おり，CO モル密度の変動（c′）は乱流によって上下方向のどの地点が最も寄与するかを示した図である．計測さへ輸送される CO 量を示す．w′と c′に正（負）の相関がれたフラックス値に影響を与える地表面の領域はフット

あれば，フラックスは上向き（下向き）となり，NEE はプリントと呼ばれ，風や乱流の強さに依存して常に変化

正（負）となる．このように，フラックス値が w′と c′のする．通常，大気が安定な成層になるほど鉛直方向の混相関と関係深いことから渦ʻ相関ʼ法と呼ばれる．

合が弱くなるので，観測地点から遠方な場所の寄与率が大きくなる．フットプリント領域に研究対象外の地表面が含まれる場合，計測されたフラックス値に研究対象外

表 1：使用記号一覧
記号

説明

NEE
NEP
RE
GPP
Ｒ
Ｒ
Ｒ
Ｒ
Ｒ
ｄ
L
u
v
w
c
q
T
h
T
c
R
プライム（ ′)バー（ )純生態系交換量
純生態系生産量
生態系呼吸量
総一次生産量
微生物分解による呼吸量
根呼吸量
幹呼吸量
葉呼吸量
土壌呼吸量
地面修正量（m）
モニンオブコフの長さ（m）
x 座標方向の風速の水平成分（m s )y座標方向の風速の水平成分（m s )風速の鉛直成分（m s ）CO モル密度（mol m ）Ｈ Ｏモル密度（mol m ）音仮温度（K）
渦相関法計測高度（m）
大気温度（K）
CO 濃度（ppm）
気体定数（8.3143 J mol K )変数の変動成分
平均成分130

図 2：(a）乱流による物質の鉛直輸送の模式図と（b）タワー
で計測された CO フラックス値への風上の各地点の寄与率（マレーシア熱帯雨林における計測例）．

乱流ではなく平均流によって物質が運ばれる現象

渦相関法による C O フラックス計測

の地表面の情報も紛れ込むことになる．このような現象

u，v，w，T ，c，q の時系列から CO フラックス値をを回避するためにも，フットプリント内は，研究対象と算出するためには，平均化時間を設定する必要がある．

する群落が「水平一様」に広がっていることが望ましい．

これまでの研究から，輸送に寄与する乱流変動の統計値

必要十分な生態系の水平一様性の範囲は，生態系の構造を求めるため，平均化時間を 30分から 60分と設定すると観測高度（樹冠の平均高度からの鉛直距離），風速などことが多い．この平均化時間毎の u，v，w，T ，c，q のに依存し，フットプリント解析

時系列データを１ランを行うことによって事と呼び，CO フラックスはこの前調査が可能である ．しかし，実際には，研究対象とす

１ラン毎に c と w の共分散によって算出される（式（3）る生態系が複雑地形上や急傾斜地上にあるという理由か参照）．実際に計算を行う際には，座標変換 や計測されら，必ずしも理想的な観測条件が確保できるとは限らなた各変数や式（3）で算出されたフラックス値に対するい．このような場合には，計測されたデータに対して行

様々な補正を行う．代表的な補正を表２に示す．これら

う品質管理によって不適切なデータの除外を行う．

の補正や品質管理の際には，顕熱フラックス，潜熱フラッ2.b‑4.3.2 計測測器

クス，Ｈ Ｏフラックス，運動量フラックスが必要であり，

渦相関法を用いて CO フラックスを算出するために

CO フラックス値を算出する際に同時に計算を行う．

は，時間応答性の高い測器を用いて風速の三次元成分（u，v，w），温度（T ），CO モル密度（c），H O モル

表 2：各種補正

密度（q）を計測することが必要である．これらの観測に補正

説明

は超音波風速温度計と赤外線 CO /H O ガス分析計を用

横風補正（Crosswind
correction）

水平風の影響で音波の到達時間が長くなることにより音速が過小評
価され，結果として T も過小評
価することになる．横風補正はこの T に対する補正である．

水蒸気補正（Humidity
correction）

超音波風速温度計によって計測される T が水蒸気の変動成分を含んでいるため，T が過大評価される．水蒸気補正はこの T に対する補正であり，横風補正とは逆センスに働く．

プローブによる
流れの減衰(Shadow
effect)超音波風速温度計のプローブ部の影響で風速の測定値を過小評価する現象に対する補正であり，風速を補正する．自然風条件下における平均風速に対しては，それほど影響がないとの指摘もある ．

いる場合が多い．超音波風速温度計は，10Hz を超える応
答速度で風速の三次元成分と温度（音仮温度 T ）を計測することが可能な測器である．赤外線 CO /H O ガス分
析計は，CO /H O モル密度（または濃度）の計測が可能
であり，オープンパス式とクローズドパス式がある．オー
プンパス式は赤外線光路が外部に露出しており，大気中の CO /H O モル密度を直接計測可能である．一方，ク
ローズドパス式は，赤外線光路が測定器内部にあり，ポンプを用いてサンプル空気を計測セル内に導入し濃度分析を行う．現在では，超音波風速温度計，オープンパス
式赤外線 CO /H O ガス分析計，クローズドパス式赤外
線 CO /H O ガス分析計のいずれも一年を超える長期観測に耐えうる耐候性と安定性を持った測器が存在する．
また，後述する補正のために，温度，湿度の計測も必要であり，超音波風速温度計と赤外線 CO /H O ガス分
析計と同高度で通風式の温湿度計を用いて計測を行うことが推奨される．
2.b‑4.3.3 C O フラックスの計算方法
５〜25Hz 程度のサンプリング周期で計測された

Agricultural and Forest M eteorologyの 127巻 3‑4号が「Flux and Concentration Footprints」の特集号となっており，フットプリント解析について詳細に記述されている．
温度計には，熱電対型，サーミスタ型，白金抵抗型，乾湿球型などがあり，湿度計には，静電容量型，乾湿球型などがある．
温度計，湿度計がセットになった計測測器（例えば，HMP45A，
Vaisala）を用いる場合も多い．通風の方式は，その設置方法
によって，横型および縦型がある．また，通風方法によって，自然風のみによる自然通風式と FAN を用いた強制通風式があり，後者の方が高精度を期待できる．
サンプリング周期は，乱流輸送に寄与する乱流渦のスケールを2009 低 温 科 学

vol.67

文献

吹き上げ角エラ 超音波風速温度計に風が吹き上げーの補正る（吹き下げる）ことよって起こ（Correction of る鉛直風速の過小評価，水平風速
attack depen- の過大評価に対する補正であり，鉛直風速，水平風速を補正する．
dent error)
WPL 補正（WPL
correction)

大気の鉛直方向の密度差で生じる
鉛直平均流によって輸 送 さ れ る
CO 量に関する補 正 で あ り CO
フラックスを補正する．

加熱補正（Heating
correction)

オープンパス赤外線ガス分析計のパス部分が熱せられることによっておこる気温変動の影響についての補正であり，CO フラックスを補正する．

考慮して設定する必要がある．近年は多くの観測サイトでサンプリング周期として 10Hz が採用されている．
10Hz のサンプリング周期で平均化時間が 30分の場合，１ランの各変数のデータ数は 18000個となる．

131

2.b‑4.3.4 データの品質管理
実際に渦相関法によって得られた CO フラックス値
は，降雨時のデータ，測器のトラブルや校正時のデータ，

2.b‑4.4 渦相関法に関連した計測
2.b‑4.4.1 様々な観測条件における NEE の推定

乱流輸送が十分検出できていないと考えられるデータな

実際の観測では，必ずしも理想的な観測条件が揃うわ

ど，データ利用目的に適さない様々なデータが含まれてけではない．このため，渦相関法による計測に加えて，いる．利用可能な CO フラックスの時系列データセット

非圧縮性流体における物質輸送で定義される複数の項目を作成するためには，利用目的に合わせてデータの品質について計測することで NEE を算出する場合もある．

管理を行う必要がある．
代表的な品質管理を表３に示す．

非圧縮性流体において水平方向の乱流輸送

表３に示す品質管理以外に，風向によるデータの除外がると，単位地表面上の直方体における NEE は式（4）である．風向によるデータの除外は，ある風向に対して十与えられる．

分なフェッチが得られない場合に行う．各品質管理についてはいくつかの文献で詳細に記述されているのでそれらを参照されたい

NEE＝ w′
c′h ＋

cz
dz
t

＋

uz

cz
＋v z
x

＋

wz

cz
z

．

表 3：品質管理手法
品質管理手法説明

文献

スペクトル解析
(Spectrum
analysis)

各変数の１ランの時系列に対してスペ ク ト ル 解 析 を 行 い，パワースペクトルが理想的な形状にならないランを検出する．
ドロップアウト
各変数の１ラン内の時系列にお(Dropouts)
ける極端な凸凹を検出する．
分解能 (Resolution) 低分解能データを検出する．
スパイク値
各変数の１ラン内に一定以上の(Spike)率でスパイクが存在するデータを検出する．
絶対値
各変数の１ラン内に閾値（最大(Abusolute limit) 値，最小値）外のデータが一定値以上の率で出現するデータを検出する．
尖度（Skewness) 各変数の１ラン毎または，１ランを数個に分割した時系列毎に得られる尖度（３次モーメント）の閾値外データを検出する．
歪度（Kurtosis) 各変数の１ラン毎または１ランを数個に分割した時系列毎に得られる歪度（４次モーメント）の閾値外データを検出する．
ハル平均値
各変数の１ラン内における平均(Haar mean)
値の不 連 続 性 データ を 検 出 する．
ハル分散値
各変数の１ラン内における分散(Haar variance) の不連続性データを検出する．
乱流強度
モニン・オ ブ コ フ の 相 似 則 に(Integral
よって想定される安定度と分散量の関係に対する適応度合を検turbulence
characteristics) 出する．
定常性
各共分散の１ラン内における定(Instationarity or 常性の保持度合を検出する．
nonstationarity)

風上側に広がる均一な地表面の観測点からの水平距離のこと
で吹走距離ともいう．

132

を無視す

第

cz
y

dz

(4)

dz

項は渦相関法によって取得された鉛直方向の CO

交換量であり，第 項は貯留 CO フラックスと呼ばれる地表面と渦相関法計測高度間の CO 濃度の時間変化，第項は水平方向の CO 移流，第項は鉛直方向の CO移流である（図 3）．式（4）の各記号については表１を参照されたい．
第 項に加えてどの項を追加で計測するかは観測サイ
トの植生や地形によって異なる．裸地，草本類群落，背の低い森林群落の水平一様な理想的な観測条件では，通常，第 〜 項は無視し，第 項の算出に必要な計測を行って NEE を求める

．比較的背の高い森林群落では，樹冠内部に CO の貯留がおこるため
加えて第

，第 項に

項の算出に必要な CO 濃度プロファイル計

測も行うことが多い．しかし，AC 電源供給のない観図 3：非圧縮性流体における乱流と移流による CO 輸送．水平方向の乱流輸送成分は無視．

一般的に水平方向の乱流変動による物質輸送は式（4）の各項に比べ小さいため無視される．

渦相関法による C O フラックス計測

測サイトでは，CO 濃度プロファイル連続計測の維持がい計測することも可能ではあるが，測定時の器差の影響

困難な場合が多いため，比較的背の高い森林群落であっを受ける，測器が高価であるという理由により推奨され

ても第

ない．

項の計測のみから NEE を算出する場合もある ．第 項は，夜間の地表面付近の CO 蓄積を放出す

計測高度は等間隔ではなく，濃度勾配が生じやすい地

る明け方と CO 蓄積を開始する夕方の時間帯でとくに表面付近では間隔を密にし，樹冠上では間隔を粗に設定

NEE の値に寄与する傾向がある ．第項，第 項は特する．例えば，AsiaFlux の TKC サイト（樹高約 20m のに複雑地形や傾斜地における観測サイト

で NEE への常緑針葉樹林）では，地上から 30.2，22.8，18.4，14.7，．しかし，AsiaFlux，

10.6，6.5，3.6，1.3m の計８高度で計測を行っている．

寄与が注目されている項である

AmeriFlux，CarboEurope-IP などのデータベースで公開されている NEE データは，第 項，第 項を無視して計算したものが一般的である

2.b‑4.4.3 環境計測
実際に研究を行う際には，
フラックス計測だけでなく，．その理由として，第日射，気温，湿度，降水量，地温，土壌水分といった様々項の算出については，(1)通常２地点以上の CO 濃度

な微気象，
土壌環境を同時に計測する必要がある．
タワー

プロファイルの高精度な計測が必要であり ，大がかりにおけるフラックス観測とその周辺の環境計測例を図４

な観測システムとなるため研究コストがかかる，(2)連続に示す．環境計測については，多くの優良な教科書で，した観測システムの維持に多大な仕事量を要する，と測定原理，計測手法，データ処理法，計測例について言いった理由が挙げられる．また，第 項の算出について及されている．ぜひ，これらを一読されたい．

は，渦相関法による計測と一地点の CO 濃度プロファイ
ル計測から算出可能ではあるが，(1)第項の NEE

への寄与率がどの程度かといった議論が依然不十分である，(2)鉛直平均風と CO 濃度計測の高精度計測が要求

2.b‑4.5 渦相関法の問題点
渦相関法は，現在も計測手法そのものについて議論がされる，といった理由が挙げられる．

行われている手法である．とくに，熱収支のインバラン

2.b‑4.4.2 C O 濃度プロファイル計測

ス問題，夜間呼吸量の過小評価については現在でも日々式（4）の第 〜 項を算出するためには，渦相関法計

多くの論文で議論されている．

測高度下の CO モル密度（mol m ）の鉛直分布が必要

熱収支のインバランス問題とは，有効エネルギー（純である．とくに，貯留 CO フラックス（式（4）第 項）

放射量と地中熱流量の差）と乱流フラックス（渦相関法

は背の高い森林群落で NEE への寄与が大きいことが指によって計測された顕熱と潜熱の和）は理論的には等し摘されており，多くの森林サイトで CO 濃度プロ

くなるが，実際の観測結果では両者が等しくならないとファイルが連続的に計測されてきた．貯留 CO フラック

いう現象を指す．複数の観測サイトを研究対象とした論ス（μmol m s ）は，計測された CO 濃度（ppm）と文

気温（K）の鉛直分布から次式で表すことができる．

の比は平均で 0.8程度となり，この値がデータの品質のによれば，有効エネルギーに対する乱流フラックス

一つの目安となっている．
cz
dz＝
t
t
ここで，c

c zP
dz
RT z

(5)

夜間呼吸量（夜間 NEE）の過小評価は，乱流が十分発達していない安定成層条件下で式（4）の 項が小さくなは ppm（μmol mol ）単位系の CO 濃度でることで起こる．夜間 NEE の過小評価はとくに年積算あり，T が気温（K），P は大気圧（Pa），R は気体定数の RE，GPP，NEP を推定する際に誤差を生む．年積算（8.3143 J mol K ）である．渦相関法計測高度下の CO

RE，GPP，NEP を推定するためには，計測トラブルや

濃度プロファイルの計測方法として，電磁弁制御システ

品質管理によって欠損となったデータを補完する必要がム，ポンプなどを用いて，各高度からチューブを通してある．この補完方法には，(1)NEE と環境要因（例えば，

大気サンプリングし，単一のクローズドパス赤外線ガス

光合成有効放射量，気温，地温，土壌水分量）の関係か

分析計を用いて複数の高度の CO 濃度を自動計測する

ら非線形回帰曲線を用いてデータギャップを埋める手方法が一般的である

法，(2)計測データから各期間毎（例えば，数日，10日程．複数の赤外線ガス分析計を用

度，一か月）の平均日変化パターンのデータセットを用
Ecological Applications の 18巻６号が「Eddy Flux M easurements in Difficult Conditions」の特集号となっており，
理想的ではない観測条件におけるフラックス計測について詳細に記述されている．

2009 低 温 科 学

vol.67意しデータギャップを埋める手法，(3)環境要因をある一定の幅で階級分けし，その階級ごとに NEE の平均値を算出した表を作成し，欠側日時の環境要因が当てはまる133

図 4：フラックス観測タワーにおける計測例．

階級の NEE 値によってデータギャップを埋める手法，

RE の年積算値など定量値を議論する際には，積み上げなどがある ．何れの方法でも，過小評価された夜間

法 に よ る 推 定 値 や チャン バー法 に よって 計 測 さ れ た

NEE を含むデータセットを用いて年積算 NEP を推定Ｒした場合，年積算 RE が過小評価され，年積算 NEP は過微気象学的な手法は，相対値の議論に十分な観測精度を大評価される結果となる．

持っており，日変化や季節変化レベルの生態系の環境応とクロスチェックすることが重要となる．一方で，この過小評価を回避するために摩擦速度（u ）が小さ答に関する研究に大いに活用されるべきである．ただし，い（乱流の発達が十分ではない）ときの夜間 NEE データ

本稿で示した計測手法，補正方法，データの補完方法にを除去する方法を用いることが一般的である

ついては，推奨される手法が更新されることもあるので，．u の閾値を増加させると夜間 NEE の値も増加するが，この夜最新の論文で確認することが望ましい．

間 NEE の増加が飽和したと判断される値を u の閾値とする．u の閾値は観測サイト毎に異なるが，多くのサ
イトでは 0.5m s 以下の値となる．最近では，u の閾値を用いた手法の他に，夜間 NEE の各日の最大値の参考文献

みを用いて温度―夜間 NEE 曲線を作成し RE を推定す

１) 塚本修，文字信貴編，「気象研究ノート 第 199号 地表
面フラックス測定法」，日本気象学会，2001，p.242.

る手法

２) P.H.Schuepp, M .Y.Leclerc, J.I.M acPherson, & R.

や，チャンバー法によって計測された土壌呼吸などが提案

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３) X.Lee, W.M assman, & B.Law, Handbook of M i-

微気象学的な手法は，短い時間分解能で連続的に物質

crometeorology:A guide for surface Flux Measurement
and Analysis, Kluwer Academic Pub, 2004, p.250.
４) J.C.Kaimal, & J.E.Gaynor, Boundary-Layer Meteorol. 56 (1991)p.401.
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６) T.Hanafusa, T.Fujitani, Y.Kobori, & Y.Mitsuta,
Papers Metepr. Geophys. 33 (1982)p.1.
７) T.Shimizu,M .Suzuki,& A.Shimizu,Boundary-Layer

量の値を基準として RE を推定する手法
されている．

2.b‑4.6 おわりにの交換量を把握できる利点がある一方，その計測や得られたフラックス値の計算手法，データの補完方法に様々問題を持っており発展途上の手法であるといえる．このため，微気象学的な手法によって得られた NEP，GPP，
134

Meteorol. 93 (1999)p.227.
渦相関法による C O フラックス計測

８) J.C.Kaimal, J.E.Gaynor, H.A.Zimmerman, & G.A.
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10) T.Nakai, M.K.van der M oren, J.H.C.Gash, & Y.

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13) G.G.Burba, D.J.Anderson, L.Xu, & D.K.McDermitt,27th Conference on Agricultural and Forest Meteorology, (2006)p4.4.
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Aubinet,C.Bernhofer,G.Burba,R.Ceulemans,R.Clement, H.Dolman, A.Granier, P.Gross, T.Grunwald, D.
Hollinger,N.-O.Jensen,G.Katul,P.Keronen,A.Kowalski, C.T.Lai, B.E.Law, T.Meyers, J.Moncrieff, E.
M oors, J.W.M unger, K.Pilegaard, ̈
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2009 低 温 科 学

vol.67Layer Meteorol. 113 (2004)p.201.
31) C.Feigenwinter, C.Bernhofer, U.Eichelmann, B.
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Montagnani, R.Queck, C.Rebmann, P.Vestin, M.Yernaux, M .Zeri, W.Ziegler, & M.Aubinet, Agric. For.
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Kowalski, T.M eyers, J.M oncrieff, R.M onson, W.Oe-

135

chel,J.Tenhunen,R.Valentini,& S.Verma,Agric. For.
Meteorol. 113 (2002)p.223.
48) N.Saigusa, S.Yamamoto, R.Hirata, Y.Ohtani, R.

136

Ide, J.Asanuma, M.Gamo, T.Hirano, H.Kondo, Y.
Kosugi, S.-G.Lie, Y.Nakai, K.Takagi, M .Tani & H.
Wang, Agric. For. Meteorol. 148 (2008)p.700.

渦相関法による C O フラックス計測

２章 個体・環境の測定

３．ガスチャンバー法(同化箱法)および重量法による個葉の蒸散特性の評価
松尾奈緒子 ，三木

直子 ，廣部

宗光合成活動に影響を与える要因の一つである葉の蒸散特性の評価法として，ガスチャンバー（同化箱）
法による解析と重量法による解析がある．これらの解析は蒸散に関する種特性を評価する上で有効である．

Evaluation of transpiration properties by gas chamber and gravimetric methods
Naoko M ATSUO (section 3.2), Naoko M IKI, M uneto HIROBE (section 3.3)
Gas chamber methods and gravimetric methods of dehydration from leaves can provide evaluation of transpiration properties, which are the factors affecting photosynthesis. These analyses would be suitable to evaluate
inter-specific differences in transpiration properties in plant species.

ここで，g は水蒸気拡散に対する全コンダクタンス

3.1 はじめに（mol m s ）， W は細胞間𨻶の水蒸気モル分率（mol

光合成活動に必要な CO の取り込みと蒸散活動にお， W は大気中の水蒸気モル分率（mol mol ）でmol ）

ける H O の放出は，主に同一経路である葉の気孔を介ある．水蒸気拡散に対する全コンダクタンス（g ）は気して行われる．この気孔の開閉は主に，光，CO 濃度，

孔コンダクタンス（g ）および葉面境界層コンダクタン

葉の細胞の水分状態（水ポテンシャル）に制御されるこス（g ）とからなる．片面気孔の葉の場合，この水蒸気とから，葉における蒸散（失水）は気孔の開閉を通じて拡散に関する全コンダクタンス（g ）は次式で表せる．

光合成速度に少なからず影響を与える．ここでは蒸散特

1
1
1
＝
＋
g
g
g

性についての測定方法のうち，ガスチャンバー
（同化箱）
とg

(2)

法（gas chamber methods）と重量法（gravimetric

ここで，gはそれぞれ水蒸気拡散に対する気孔

methods）について概説する．ガスチャンバー法は，近年，コンダクタンス（mol m s ）と葉面境界層コンダクタ

測定機器の発展に伴い最も広く用いられており，また，ンス（mol m s ）である．葉面境界層とは葉の表面に重量法は複雑で高額な測器が特に不要で歴史的に古くかおいて摩擦により風速が減衰している空気層のことを言ら用いられている方法の一つである．

う．葉面境界層コンダクタンスは葉面境界層における水蒸気の拡散のしやすさを表し，その大きさは葉の形状や3.2 ガスチャンバー法による蒸散速度と気孔コンダクタンスの測定

粗度，葉のつく角度と風速によって決まる．なお，光合成の際の二酸化炭素拡散に対するコンダクタンスは，上述の水蒸気拡散に対するコンダクタンスと次のような関

松尾 奈緒子

係にあることを注意しなくてはならない．静流条件での3.2.1 蒸散速度と気孔コンダクタンス

水蒸気分子の拡散係数は二酸化炭素分子の 1.6倍となる葉が光合成のため気孔を開くと，気孔内外の水蒸気濃ので，水蒸気に対する気孔コンダクタンス（g ）と二酸度勾配にしたがって細胞間𨻶から大気へと水蒸気が拡散化炭素に対する気孔コンダクタンス（g ）との間には次していく．これが蒸散であり，蒸散速度 E（mol m s ）式の関係が成り立つ．

は Fick の法則により次式のように表される．
E ＝g

W− W

(1)

g
g ＝ 1.6(3)

ここで，g は二酸化炭素拡散に対する気孔コンダクタン
ス（mol m s ）である．一方，葉面境界層は強制対流

１) 三重大学大学院生物資源学研究科

条件であるため，水蒸気分子の拡散係数は二酸化炭素分２) 岡山大学大学院環境学研究科

子の 1.37倍となる．したがって，水蒸気に対する葉面境

2009 低 温 科 学

vol.67137

界層コンダクタンス（g ）と二酸化炭素に対する葉面境にも影響を与える．飽差が増加するにつれて気孔コンダ

界層コンダクタンス（g ）との間には次式の関係が成り

クタンス（g ）は低下し，飽差に対する応答は樹種や個立つ．

体によって異なることが知られている ．
g
g ＝ 1.37(4)

3.2.2 ガスチャンバー法
蒸散速度の主な測定方法にはガスチャンバー（同化箱）

ここで，g は二酸化炭素拡散に対する葉面境界層コン法と重量法がある．ガスチャンバー法の測定原理やシスダクタンス（mol m s ）である．

テムについては「2.2個葉の光合成および呼吸測定シス

細胞間𨻶の水蒸気濃度（ W ）を算出するには，細胞間テム」に詳細な解説があるので参照されたい．ここでは，

𨻶が葉温において水蒸気飽和していると仮定する．ある

ガスチャンバー（同化箱）内に空気が一定の流量で流入・温度における飽和水蒸気圧（e T ）の算出法としては，流出する開放系システムである携帯型光合成蒸散測定装

Smithsonian Meteorological Table（1984）による対応

置（Li-Cor 社の LI-6400 など）を用いた測定について簡表や数種類の経験式が提案されている ．そのうちのひ

単に説明する．このシステムにおいて，空気の流れは葉とつ Lowe（1971）の飽和水蒸気圧式によると，ある温度が入ったチャンバーを通過する経路（サンプル）とチャ

における飽和水蒸気圧（e T ）は次式で与えられる ．

ンバーを通過しない経路（リファレンス）とに分岐する．
チャンバー内の水蒸気のマスバランスは次式のように表

e T ＝6.1078＋4.4365×10 T ＋1.4289×10 T＋2.6505×10 T ＋3.0312×10 T

(5)

せる．

＋2.0341×10 T ＋6.1368×10 T

LE ＝F

ここで，e T は温度が摂氏 T ℃のときの飽和水蒸気圧

W −F W(10)

ここで，L はチャンバー内の葉面積（m ），E は蒸散速（hPa）である．したがって，細胞間𨻶の水蒸気圧は葉温度（mol m s ），F と F

が T ℃のときの飽和水蒸気圧 e T となる．この e T

入する空気とチャンバーから流出する空気の流量， Wを大気圧（P ）で除した値が細胞間𨻶の水蒸気モル分率と W（ W ）となる．

バーから流出する空気の水蒸気濃度（mol mol ）であ
W＝

e T
P

(6)

また，大気水蒸気圧（e ）は次式により得られる．
Rh
e ＝ 100e T

はそれぞれチャンバーに流はそれぞれチャンバーに流入する空気とチャンる．流入した空気に蒸散による水蒸気が加わってチャンバーから出て行くので，チャンバーから流出する空気の
流量（F

）は，

(7)

＝F ＋LEF(11)

ここで，e は大気水蒸気圧（hPa），Rh は相対湿度（％），となる．式（11）を式（10）に代入すると，蒸散速度（E ）e T は気温 T ℃における飽和水蒸気圧（hPa）である．

は次式で得られる．

大気水蒸気圧（e ）を大気圧（P ）で除した値が大気中のE＝水蒸気モル分率（ W ）となる．
W＝

e
P

(8)

細胞間𨻶水蒸気圧（e T ）と大気水蒸気圧（e ）の差を葉面における飽差（Vapor pressure deficit,VPD）と
いう．

F

W −W
L 1− W(12)

携帯式光合成蒸散測定装置（Li-Cor 社の LI-6400）では，赤外線ガスアナライザー（Infra Red Gas Analyzer：
IRGA）で測定したサンプルとリファレンスの水蒸気モ
ル分率を Wと W としている．

蒸散速度（E ）と水蒸気拡散に対する全コンダクタンス
VPD ＝es T −e(9)（g ）の関係を示した（1）式は空気中に水蒸気だけが存在する場合の式である．実際の空気中には二酸化炭素分

ここで，VPD は飽差（hPa）である．この飽差（VPD ）子と水蒸気分子とが存在することを考慮すると，蒸散速を大気圧（P ）で除した値が気孔内外の水蒸気モル分率度（E ）は次式のように表される ．

差（ W − W ）であり，（1）式を見てもわかるように蒸散速度を決定する要因のひとつである．
飽差が大きいとき，
つまり大気が乾燥しているときは蒸散速度が大きくなる．しかし，飽差は気孔コンダクタンス（g ）の大きさ
138

E ＝g

W −W ＋

W ＋W
E
2

(13)

したがって，水蒸気拡散に対する全コンダクタンス（g ）は次式で得られる．
個葉の蒸散特性の評価

W ＋W
2
W −W

引用文献

E 1−
g ＝

(14)

水蒸気拡散に対する気孔コンダクタンス（g ）は（2）
式より，
1
g ＝ 1
1
−
g
g

１) R.List, Smithsonian M eteorological Tables, Smithsonian Inst. Press., Washington DC, USA, 1984.
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３) E.-D.Schulze & A.E.Hall, Physiological Plant Ecol-(15)

ogy II. Encyclopedia of Plant Physiology Vol 12B., eds.

となる．
（15）式において，気孔コンダクタンス（g ）を

O.L.Lange,P.S.Nobel,C.B.Osmond,H.Ziegler,Springer, Berlin Heidelberg New York, 1982, P.181‑230.
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求めるには葉面境界層コンダクタンス（g ）の値が必要となる．携帯式光合成蒸散測定装置ではチャンバー内の風速を一定に保っているため，葉面境界層コンダクタン
スは一定であると仮定して装置ごとに設定された値をそのまま用いることが多い．このとき，両面気孔の葉では3.3 重量法による蒸散特性の評価

両面に葉面境界層ができるので，葉面境界層コンダクタ

三木 直子・廣部宗ンスは片面気孔の葉の２倍となることに注意する．ただ3.3.1 重量法

し，3.2.1で述べたように葉面境界層コンダクタンスは⑴ rapid-weighting method

葉の形状・粗度・角度によっても異なることにも注意し重量法にもいくつかの手法があるが，大きくは２種類

なくてはならない．そこで，紙などを使って実際の葉にに分けることができる．一つは植物体の採取後に直ちに似せたモデルを作り，それを水に濡らして一定時間にど

重量を短時間計測し，採取直後の重量の減少速度から，れだけの水が蒸発するかによって葉面境界層コンダクタ

その植物体のおかれた自然条件下における採取時の蒸散ンスを求めることがある．

速度を算出するものである．重量法において最もシンプ

g ＝

E
W−W

(16)

ルな手法であり，rapid-weighting methodと呼ばれる．この測定法は，採取後の数分間の蒸散速度は採取前

ここで，E は紙からの蒸発速度（mol m s ），W と Wの蒸散速度と有意な差は無いという仮定の基に成り立っ

は そ れ ぞ れ 紙 の 表 面 と 大 気 の 水 蒸 気 モ ル 分 率（molている．しかし，供試植物によって傾向が異なる可能性mol ）である．

があるため採取前と採取後の値についてガスチャンバー

開放系のガスチャンバー法には上述のシステムの他に法等を用いて確認をした方がよい．また，葉に近い部分

も，乾燥空気を流してチャンバー内の湿度を一定に保つ

で植物体を採取した場合，採取直後の蒸散速度が一時的タイプがある（Li-Cor 社の LI-1600 など）．これは，チャに増加する「IVANOV effect」 と呼ばれる現象も時折

ンバー内の湿度を湿度計でモニタリングし，蒸散により確認されていることから，採取にあたってはシュート単水蒸気濃度が上昇すると乾燥空気を送り込み，チャン

位などの方が好ましい．蒸散速度は採取個体の重量の減

バー内の湿度を一定に保つよう調節するという仕組みで少速度から求められ，目的に応じて単位乾重，単位生重，ある．このときの湿度と乾燥空気の流量から蒸散量を算あるいは単位葉面積あたりでの解析も可能である．

出する．
また，閉鎖系のガスチャンバー法（Decagon Device の［測定手順と解析］もある．閉鎖型のチャンバーに葉を挟み，チャ
SC-1 など）

植物体は採取後，吸水させずに直ちに切り口にワセリ

ンバー内の水蒸気濃度の上昇速度から蒸散速度を算出しンを塗り，空の広口バイアル瓶に入れて重量を測定する．

ている．このシステムではチャンバー内の湿度が上昇す

植物体採取後から測定開始までの間隔および測定間隔はるにつれて蒸散速度が低下してしまったり，チャンバー

できるだけ短くし（30秒から１分程度），10分から 20分

内の湿度が大気よりも高い状態で葉を挟むと蒸散速度がほど測定する．対象となる植物体の自然条件下におけるうまく測定できないなど問題点があり，注意が必要であ採取時の蒸散速度を求めることが目的であることから，る．

測定は植物体がおかれていた自然条件下において行う必要がある．供試する植物体のサイズによって異なるが，
シュート単位ほどのサイズの測定では最小目盛り 0.1

2009 低 温 科 学

vol.67139

mg で風防付きの電子天 が好ましい．
得られた生重量の変化データから，積算失水量の採取直後の変化曲線を得ることができる．積算失水量は時間経過に伴い測定後数分は直線的に増加するが，その後は曲線的な増加を示す．そのため，直線的な増加が認められる部分における直線回帰の傾きから蒸散速度を求めることができる．
一般的には直線的な増加は５分から 10分
程度認められるが，供試植物によって異なる可能性があることから 10分から 20分程度測定を継続してその範囲を見極めた方がよい．

図 1：含水率の対数値の経時変化（Betula platyphylla var.
japonica で作図）

⑵ 失水曲線法
重量法におけるもう一つの手法として，乾燥に伴う失水曲線（water loss curve，あるいは leaf drying curve）

え ば，気 温＝25℃，湿 度＝50％，PFD＝500μmol mを用いた解析がある．失水曲線は採取した植物体を一度．
s ）十分に飽和させた後，制御した一定の環境条件下におい得られた生重量の変化データ（w）を，試料の測定開始て，失水による重量変化を比較的長時間（５時間から 10時（initial）の生重を 1000mg としたときの値（ W ；含時間程度）連続的に測定することで得ることができる．

水率（千分率））に変換し，log W ＝f t の片対数グラフを

これは前者とは異なり，各供試材料における specific な

作 成 す る（図 1）．こ の 片 対 数 グ ラ フ か ら 視 覚 的 に

潜在的蒸散能の評価を行うものである．

stomatal phase，closing phase，cuticular phase を区

Fukuda および Hygenは失水曲線を基に気孔蒸別し，stomatal phase，cuticular phase それぞれにおけ

散速度とクチクラ蒸散速度を分けることを試みた．採取

る蒸散速度を算出し，気孔蒸散速度およびクチクラ蒸散した植物体を人工光の下で強制的に蒸散させることによ速度を求める．

り，失水による重量変化曲線を作成することができる．

気孔の開閉は植物の乾燥に対する応答特性として非常

重量は一定の環境条件下において時間経過に伴い指数関に重要であることから，この手法はこれまで蒸散速度と数的な減少を示す．そのため，時間経過に対する植物体しか扱っていなかったものを，気孔応答を考慮し気孔蒸の含水率の対数変化をプロットすると，測定開始時の飽散とクチクラ蒸散に分けて評価する試みとして価値が高和条件下では含水率は直線的に低下し，やがて曲線的ない．しかしながら，この手法は各 phase の境界を視覚的低下に変わり，その後，再度直線的な低下を示す．彼らに区別することから主観的であると指摘せざるを得ず，はこの傾きの変化に失水に伴う気孔閉鎖が関わっている

また算出方法が複雑であることも無視できない．

と考え，最初の直線段階を気孔開度が最大で開度に変化

3.3.2 失水曲線を用いた新たな評価法の可能性が見られない stomatal phase，次の曲線的な変化の段階

ここで，水の損失に対して，完全に気孔を閉鎖するこを気孔の閉鎖が起こっている closing phase，そして最後とのできる植物を想定した場合，以下のような評価が考の直線的な段階を気孔が閉じ終わった cuticular phase

えられる．

であるとした．

乾燥に伴う植物体の重量減少は葉における蒸散量を表している．したがって，植物体の蒸散量（TT ）は気孔蒸［測定手順と解析］
植物体は採取後，直ちに水中において水切りし，切り散量（TS）とクチクラ蒸散量（TC ）の和として表される．

口を水で満たした容器に入れ一晩十分に吸水させ飽和さ

TT ＝TS＋TC

せておく．切り口にワセリンを塗り，空の広口バイアル(1)

瓶に入れ強光条件下に置き，一定間隔（例えば１分から気孔コンダクタンスは乾燥に対して指数関数的に低下

２分間隔）で重量変化が安定するまで（５時間から 10時することが報告されている ．したがって，気孔は時間経間程度）
重量を測定する．供試する植物体のサイズによっ過とともに同じ割合で閉じると仮定すると，ある時刻 tて異なるが，葉やシュートを用いる場合には最小目盛りにおいて開いている気孔数（X ）は以下のように表され0.1mg の電子天る．

を使うとよい．室内の環境条件は気孔を十分に開く上で適した条件に制御する必要がある（例
140

個葉の蒸散特性の評価

X ＝X ×e(2)

ここで，X は全気孔数，k は気孔閉鎖に関する定数である．
ある時刻 t における気孔蒸散速度（Ts ）は以下のように表される．
Ts ＝S×X ,(3)

ここで S は気孔一つあたりの蒸散速度である．
式（2）と式（3）より，
Ts ＝S×X ×e
ここで，Ts

＝Ts

×e

,

(4)

は最大気孔蒸散速度である．

また，TS は Ts (4）の積分値であるので，
TS＝＝Ts

Ts dt＝

Ts

×e

×−

1
×e
k

＋C ,

dt
(5)

C は積分定数．
時刻 t＝0のとき，TS は 0であることから，
1
1× − ×e ＋C ＝0,C ＝
k
k

Ts

(6)

式（5）と式（6）より以下の式が得られる．
TS＝Ts

1
× − ×e
k

＋

1 Ts
＝
k
k

1−e

(7)

クチクラ蒸散速度（Tc）は一定で時間変化がないと仮定すれば，クチクラ蒸散量（TC ）は次のように表すことができる．
TC ＝Tc×t(8)

式（1），式（7），および式（8）より，採取した植物体の蒸散量（TT ）の時間変化は以下のように表すことがで

図 2：Artemisia sphaerocephala（a)，Betula platyphylla var.
japonica（b)および Castanopsis cuspidata（c)の単位葉面積あたりの積算失水量の経時変化（フィッティングには Kaleidagraph 4.0; Synergy Software
Technologies,Inc.,Reading,PA を使用した．また，図中にお け る 各 パ ラ メータ の 単 位 は Ts お よ び Tc は mmol）
m s ，k は s である．

きる．
TT ＝TS＋TC ＝

Ts
k

1−e

測定手順は Fukuda および Hygen

＋Tc×t

(9)

いて一般的な種］，Betula platyphylla var. japonica；落葉 広 葉 樹［冷 温 帯 の 代 表 的 樹 種］， Castanopsisとほぼ同様で）にこの式
cuspidata；常緑広葉樹［暖温帯の代表的樹種］

あるが，彼らは解析において，採取した植物体の生重の（9）を適用してみると，曲線全体において非常によく当変化曲線を用いたのに対し，我々が提案するこの評価法てはまっているように思われる（図 2）．ただし，この評では積算失水量の変化曲線（図 2）を用いる．図 2では単価は，完全に気孔を閉鎖することのできる植物を想定し位葉面積あたりの積算失水量の変化を示しているが，目ている点に気をつけなければならない．実際には Tc の的により単位乾重，あるいは単位生重あたりでの解析も中に残余の気孔蒸散速度，つまり気孔を最大限閉じても可能である．各積算失水量の変化曲線に対し式（9）を当

閉じきれなかったために生じる気孔蒸散速度がわずかなてはめると Ts，Tc，k の３つのパラメータを客観的にがら含まれている場合があるため，気孔が閉じきってい

得 る こ と が で き る．実 際 に，数 種 の 植 物（Artemisia

るかどうかを実体顕微鏡，あるいはスンプ法等により確

sphaerocephala；落葉半潅木［中国の温帯ステップにお認した方がより正確な評価が可能である．スンプ法とは2009 低 温 科 学

vol.67141

検鏡材料（ここでは植物体の葉面）にスンプ液（酢酸ア曲線から，個葉レベルあるいはシュートレベルといった

ミルエステル）を塗布したスンプ板（セルロイド板）を各レベルにおいて，蒸散に関する種特性を評価すること貼り付けて乾燥させ作成したレプリカを用いて，検鏡材が可能であると同時に，供試植物体のサイズを様々に変料の表面構造を顕微鏡で観察する方法のことである．k

化させることにより，気孔応答といった蒸散特性に対しについてはいずれの場合も乾燥に対する気孔の反応速度て貯水量が与える影響についても評価が可能だろう．まを表しているが，確認の結果，わずかながら気孔が閉じた，失水に伴う水ポテンシャルの変化とも関連づけた解

きっていなかった場合は，Ts

析を行うことにより，蒸散特性および貯水評価の上で更は「気孔の開閉により調節可能な範囲内での最大気孔蒸散速度」，Tc は「クチクに発展的な解析も可能となるだろう．

ラ蒸散速度と気孔を最大限閉鎖しても生じてしまう気孔
蒸散速度の和」を表していることになる．この場合，気孔蒸散速度とクチクラ蒸散速度の完全な分離とはならな
い．しかしながら，いずれの場合においても，これら３つのパラメータは植物生理に関する分野において非常に有意義な生理特性を表現しており，高い利用価値があるだろう．
3.3.3 失水曲線を用いた評価の意義
失水曲線はある一定の制御条件下における水分供給の無い状態での脱水過程を表現している．そのため，この曲線の形は乾燥に対する気孔応答だけでなく，供試植物
体の貯水量によっても影響を受ける．したがって，この

142

引用文献
１) B. Huber, Ber. dtsch. bot. Ges. 45 (1927)p.611.
２) L.A. Ivanov, Lesn. Zh. 48 (1918)p.1.
３) L.A. Ivanov, Ber. deut. bot. 46 (1928)p.306.
４) Y. Fukuda, Pflanzenforsch. 10 (1935)p.1.
５) G. Hygen, Physiologia Plantarum 4 (1951)p.57.
６) G. Hygen, Physiologia Plantarum 6 (1953)p.106.
７) B. Slavik, M ethods of studying plant water relations,ed. B.Slavik, Springer-Verlag, New York, (1974)p.236.
８) A.R. Nejad, and U.Meeteren, Physiologia Plantarum
125 (2005)p.324.

個葉の蒸散特性の評価

２章 個体・環境の測定

４．藻類の光合成関連測定
a．海洋と湖沼における光合成・環境要因の測定法
鈴木 祥弘
海洋での国際共同研究では中心となる測定項目について，共通の観測・測定手法が採用され，データの質と互換性が保障されている．本節では，共通手法のうち，本章の１，２節で陸上生態系について述べられたものに相当する部分を紹介し，さらに，溶存酸素による測定法について補足する．

An introduction to universal protocols for estimation of primary productions
and environmet factors in lakes and ocean.
Yoshihiro Suzuki
In international projects to study primary productions and ocean carbon flux in the ocean, universal protocols
for the core measurements were adopted for quality-guaranteed and comparable data sets in each experiment.
One of these universal protocols in JGOFS will be introduced, here. Some additional protocols for estimating
dissolved O will be explained.

ments（全球海洋フラックス合同研究（JGOFS）におけ

4.a.1 概説

る観測・測定手法，以降 JGOFS-Protocols）がある．改国際共同研究での共通手法
海洋では陸上に匹敵する光合成が行われている訂 版 が http://ijgofs.whoi.edu/Publications/Report．まSeries/reports.html ♯No.19 に公開されており，また，た，海洋で行われる光合成は，「生物ポンプ」と呼ばれる

日本語翻訳版は 1995年に日本海用データセンターから機構の主要素であり，大気 CO の海洋の中・深層への移刊行されている．JGOFS-Protocols には本書の（2）の１，動を促進する働きを担っている ．このため，海洋で行わ２で述べられた陸上生態系での測定を海洋で行うためのれる光合成とそれを支える微細藻類の生物量（バイオマ

手法が記されており，湖沼や河川などの陸水を含む水界

ス）や光合成に影響を与える環境要因について，多くのでの測定において標準的な手法として参考にすべきもの

測定と研究が精力的に行われていることは，全球海洋フである．本節では，JGOFS-Protocols 日本語版を利用す

ラックス合同研究計画（Joint Global Ocean Flux Study,

るのに必要な簡単な説明を行い，さらに，溶存酸素の測JGOFS;http://ijgofs.whoi.edu/）や世界海洋循環実験計

定に関して説明を付け加えるものとする．

画（World Ocean Circulation Experiment, WOCE;

海洋での環境要因とバイオマスの測定

http://www.noc.soton.ac.uk/OTHERS/woceipo/ipo.

海洋での光合成や環境要因の測定は，基質である水のhtml），これに付随する様々なプロジェクトとその成果特性により，陸上での測定と異なる点がある．海洋ではからも明らかである．既に終了しているこれらの研究は水深とともに様々な環境要因が変化する ．たとえば，水さらに発展継承され，2008年 11月現在，全球海洋観測シの光吸収により，水深とともに光強度が低下し，水の吸ステム計画（Global Ocean Observing system, GOOS;

光特性により光質が鉛直方向に変化する．海域により溶

http://www.ioc-goos.org/）などのプロジェクトが推進

存成分や懸濁粒子が異なるため，光強度や光質の変化はされている．

海域により異なる ．また，吸収した光で暖められた表面

これら全地球規模の共同研究では，相互比較のためのの海水と深部の海水には温度と密度に差が生じる．さら

データの互換性と質の保障が重要である．このため，プに，風や波浪，結氷などによって海水が撹拌されて鉛直

ロジェクトでは共通の観測・測定手法が採用される．こ方向の環境勾配は複雑に変化する

うした手法をまとめたものに Protocols for the Joint

細藻類が増殖することで，光，栄養塩類，無機炭素や有Global Ocean Flux Study（JGOFS）Core M easure-

機炭素，酸素濃度などの環境要因の勾配はさらに複雑に．これに対応して微変化することになる．このような鉛直方向の環境勾配を
１) 神奈川大学理学部

2009 低 温 科 学

vol.67測定するために海洋では CTD センサー（Conductivity143

（電気伝導度），Temperature（温度），Depth（圧力，水伴って O が発生することになる．C:N 比が約７のバイ

深））に加えて様々なセンサーを装備し，複数の採水器（目オマスが形成される場合でも，的によりニスキン採水器や GO-FLO 採水器が使われる）をロゼット型に配置した機器をウインチで海中に降下さ0.71CO ＋0.59H O＋0.101HNO →0.71バイオマス＋O

せて測定を行う．装備された溶存酸素計（D.O.メーター）となる．すなわち 1.00mol の炭素を同化するために，やクロロフィル蛍光測定装置のデータは，採水された試1.41mol の O が発生することになる（PQ＝1.41) ．微

水で測定された D. O.や試水中のプランクトンのクロロ

細藻類で光合成により固定されたエネルギーを考える場

フィルａ濃度と比較・校正されて利用される．採水され合には，CO の取り込みよりも O の発生により求めらた試水を用いて，塩分，ウィンクラー方による溶存酸素れた速度の方が適切であることが分かる．

の測定，電量滴定法による全無機炭素濃度の測定，硝酸

光合成速度・一次生産速度は C に基づいて CO 濃度

塩・亜硝酸・リン酸・反応性ケイ酸塩の定量などの環境変化や炭素同位体の C， C の取り込み速度として測定

要因や，分光法や蛍光分析法によるクロロフィルａとされたり，O に基づいて溶存 O の変化として測定されフェオ色素，粒状有機炭素と粒状窒素，溶存有機炭素なたりするが，目的に応じても使い分ける必要がある．さどのバイオマスの測定が行われる（JGOFS-Protocols 参らに，粒状有機炭素やクロロフィル濃度などのバイオマ照）．

スの変化（JGOFS-Protocols 参照）や人工衛星からの海

海洋での光合成・一次生産の測定

色データに基づく表層のクロロフィル濃度の変化からも一般に光合成反応は水と CO から炭水化物を生成す

一次生産速度が見積もられる ．

る以下のような反応で表される．
6CO ＋12H O→ CH O ＋6H O＋6O
この式から明らかなように，光合成は CO の吸収や

4.a.2 溶存酸素濃度の変化に基づく光合成
速度の測定

O の発生により測定が可能である．実際には，光合成と溶存酸素濃度の変化を測定する方法として ，1．O

平行して行われる呼吸により発生する CO の放出や O

電極法による電気的測定 2．蛍光錯体を用いた分光学の吸収の速度（R）によって，見かけ上の CO の吸収や的測定 3．ウィンクラー法による化学的測定が挙げら

O の発生の速度（純光合成速度；Pn）は，光合成で生じれる．
ここではこれらの方法の簡単な特徴を挙げる．
ウィる CO の吸収や O の発生の速度（総光合成速度；Pg）

ンクラー法については次節で実際の測定法を述べる．

より低い値を示す．この関係は，

O 電極法による電気的測定

Pg＝Pn＋RO 電極法は．溶存酸素をクラークタイプの電極で検出する方法 で，上述の海中に降下する D.O.メーターにの式で表すことができる．無機炭酸イオンが比較的高濃も利用されている．培養細胞などの光合成速度の測定に度で存在する海洋では，通常，光合成が CO の不足で制用いられる電極は，薄いテフロン膜を用いることなどに限されることは無く，光依存性の呼吸や O の消費は比より，感度や応答性が高く，校正を頻繁に行うことで僅較的小さいと考えられている ．このため，光照射下の呼かな酸素濃度の変化を正確に測定することが可能である

吸速度と遮光条件下での光合成速度が等しいものと仮定（2.c 参照）．植物の単離葉緑体を用い Hill 反応などの実して，
R と Pn に加算することで Pg が求められることが験に用いられるのもこのタイプの測定装置である．O 電

多い．一方，陸上植物以上に考慮しなければならない問

極では測定に伴い陽極の Ag が酸化され，同時に試水中

題に，光合成による O 発生と CO 吸収の比である光合の O が消費される．測定条件でバッックグランドとし成商（PQ）がある．陸上植物は光合成産物の多くを澱粉て電極の O 消費速度を求めておくことや電極の内部抵などの炭水化物として蓄積し，セルロースなどの炭水化

抗が変化しシグナルがドリフトすることに注意する必要

物を主成分とする幹や枝などの膨大な支持組織を形成すがある．

る．これに対し，海中の微細藻類はその多くを光合成を

蛍光錯体を用いた分光学的測定

行う細胞の形成に使う．このため微細藻類は蛋白質としO 電極とほぼ同じ利用法が可能なものに，酸素濃度にて大量の窒素原子を含み，C:N は７以下（通常 C:N:P＝より蛍光強度の変化する蛍光錯体を塗布した光ファイ

106：16：1Redfield ratio）に抑えられている．多くの場

バーセ ン サー（Pst3 oxygen sensor，ド イ ツ PreSens

合，この窒素原子は硝酸塩から同化されるため，これに社；http://www.presens.de/）が あ る．蛍 光 錯 体 セ ン

144

海洋と湖沼での光合成の測定

サーは０−500％大気飽和（すなわち０−100％濃度）の平衡状態で遊離されたヨウ素により，ヨウ素・澱粉反応

酸素濃度が気相でも液相でも測定可能であり，酸素濃度による青紫色の呈色が見られる．チオ硫酸イオンを加えの時間変化を PC ソフト上で詳細に追跡することが可能

ると，この錯体は再び還元されてヨウ素イオンとなる．

である．頑丈センサーは，土壌中に差し込むことも可能

青紫色を消すのに必要なチオ硫酸イオンの量により，生であり，センサー自身が O を消費することがないため，じた MnO(OH) の量を求めることができる．分光器にO 電極よりも簡便に測定ができる．近年，呼吸などの測よりヨウ素錯体の紫外部の吸収を測定して，チオ硫酸イ定に利用される例が増えている

オンにより生じたヨウ素錯体の消失検出し，自動的に酸．

ウィンクラー法

素量を求める方法もある．上記の反応に対する化学等量

Winkler の化学的な溶存酸素濃度測定法を，光合成速式は以下のとおりである．

度の測定に応用するものである．通常は 4.a.3で述べる
明暗瓶法での溶存 O の測定に用いられるが，現在最もMn ＋ 2OH

良く利用されるのは，水質の代表的指標である化学的酸

Mn OH

素要求量（Chemical Oxygen Demand,COD）や生物化

MnO OH

学的酸素要求量（Biochemical oxygen demand,BOD）

I ＋Iの測定に対してである．培養前後のある時点での酸素濃

1/2O→ M nO OH

2I ＋ 4H→ Mn ＋ I ＋ 3H O

→ I

＋ 2S OI→ Mn OH→ 3I ＋ S O

度を求めるものであり，培養中の酸素濃度変化やそれにより求められる光合成速度の時間変化を見ることはでき滴定に用いるチオ硫酸塩は大気中で酸化されて，そのない．しかしながら，１．BOD や COD の測定と機材を組成が変わるので，１次標準物質（ヨウ素酸カリウム）

共有でき，機材が比較的安価であること，２．環境中とで滴定直前に標定する必要がある．ヨウ素酸カリ KIO

ほぼ同じ条件で長時間培養が可能であり，生物に負荷をを正確に秤量してメスフラスコで溶解し，正確な濃度のかけること無く長時間の測定が可能である明暗瓶法に適溶液を得る．この溶液一定体積をビーカーにとり，KI の用されること，３．酸素濃度の測定であり，硝酸同化や結晶を添加すると，KIO 一分子につき三分子の I

呼吸も考慮できることなど，有用な点も多い．

じて，溶液が赤褐色に染まる．これに適量蒸留水を加えが生て濃度を調整し，チオ硫酸ナトリウム水溶液で滴定する

4.a.3 ウィンクラー法と明暗瓶法による光合成測定の実際
4.a.3.1 ウィンクラー法と，滴定に要した量から，チオ硫酸イオンの濃度が算出される．上記の反応に対する化学等量式は以下のとおりである．
KIO ＋ 8KI ＋ 6H
＋ 2S O→ 3I＋ 3H O ＋ 9K

以下に述べる溶存酸素濃度の化学的測定法は，Wink-→ 3I ＋ S O

I

ler の方法を実際の光合成の測定に適用した Lobban ら

試薬（1988) や渡辺（1981) の方法に基づいている．

塩化マンガン水溶液：

分析の原理

MnCl・4H O 150g を蒸留水（D.W.）に溶かし，最終的強いアルカリ性の下で Mn( ) は，Mn(OH) の白に 250ml とする（塩化マンガンの代わりに硫酸マンガン

色沈殿を形成する．この際，M n(OH) は，溶存酸素と化を用いても良い）．褐色のプラスチック瓶中で保存する．

学的に結合して，第二水酸化マンガン（M nO(OH) ）のヨウ化カリ・苛性ソーダ溶液：

茶褐色の沈殿物を形成する．現場で試水に塩化マンガン

NaI 150g を 150ml の D.W.に溶かす．もし，溶液の色とヨウ化カリ・苛性ソーダ溶液（後述）を加えて十分にが黄褐色に着色したら，改めて作り直す．水で冷やしな反応を進めると，全ての溶存酸素はこの沈殿に取り込ま

がら NaOH 80g を加え，最終的に D.W.で 250ml とす

れ固定される．これらの沈殿は比較的安定であり，空気る．褐色のプラスチック瓶中で保存する．

から遮断した瓶中，冷暗所で一定期間保持できる．

これら二溶液は試料に添加する際の作業で，試水などに実験室へ移動後，試水を硫酸（塩酸）で pH 1.0〜2.5のより汚染され易い．使用前に，小瓶（50ml ファルコン

酸性にすると，沈殿した水酸化物が溶解して，M n( ）チューブなど）に分注して用いると良い．

イオンが遊離し，予め加えてあったヨウ素イオンをヨウ濃硫酸（濃塩酸）：

素に酸化する．このヨウ素は，周囲の過剰なヨウ素イオ

100ml の D.W.に 100ml の濃硫酸（濃塩酸）（特級）をンとともに錯体を形成する．この錯体が存在する間は，

ゆっくりと加えて希釈する．明暗瓶法への利用では塩酸

2009 低 温 科 学

vol.67145

で代用できる場合が多いが，酸化還元反応をともなう入れ，滴定を開始する．ビーカー中の撹拌子を回転さ

BOD や COD の測定には適さない．

せながら，予想される終点付近の容量までチオ硫酸ナ

呈色用澱粉溶液：

トリウムを加えると赤褐色が薄くなる．ここで呈色用

可溶性澱粉 0.25g に D.W.25ml を徐々に加え，ガラス

澱粉を加えると青紫に呈色する．濃い赤褐色のままで棒などで撹拌し糊状にする．
これに沸騰した D.W.25ml

で澱粉を加えると，色が消えるまでにタイムラグが生を加えてさらに撹拌して調整する．

ずる場合があるので注意する．この場合，終点付近でチオ硫酸ナトリウム：

慎重に滴定を行う必要がある．青紫色が消えるまで，酸素濃度や培養瓶の容量に合わせて，滴定の精度が維持

さらに少量ずつチオ硫酸ナトリウムを加える．

できるよう適切な濃度に調整する．Na S O ・5H O 2.5
g を D.W.1000ml に溶解すると約 10mM の溶液が調整できるが，小容量の試料に用いる際は，より希薄な溶・終点までに必要とした液量から濃度の決定が決定できる．
・撹拌子を外側から磁石などで固定し，廃液を廃液入れ液を用いると充分な容量を滴下できる．

に集める．ビーカーを D. W.で２度リンスし，次の実

ヨウ素酸カリウム標準液：

験に用いる．リンスした廃液は廃液入れに捨てる．

デシケーターで充分乾燥させた KIO を正確に量し，メスフラスコ中で D.W.を加え正確に 1000ml とする．
（356.7mg を酸素の固定･試水を細口瓶にとる（4.a.3.2参照）．細口瓶の蓋を取量すると 10.mM の溶液が得られるが，り，塩化マンガン 1000μl とヨウ化カリ・苛性ソーダ溶

この前後の重量で正確な濃度が求めれば，計算の際に補液 1000μl を加える（50−60ml 細口瓶の場合，瓶の容正できる）．

量に応じて加える試薬の量は調整する）．この際，マイ装置

クロピペッターのチップの先端を水中に十分に浸し，試料固定用マイクロピペッター：1000μl を正確に測定

気泡が水中に混入しないように留意する．

できるもの．チップを交換して使っても良いが，できれ・気泡が入らないように思い切って蓋をする．躊躇しなば塩化マンガン水溶液とヨウ化カリ・苛性ソーダ溶液用がら蓋をすると気泡が入る．気泡が入った場合にはふに２本用意する．

たを開け，再び２種類の試薬を加えてから，蓋をする．

マグネチックスターラーと撹拌子

加えた試薬の量は記録しておく．加えた試薬の容積分

デ ジ タ ル ビュレット：先 端 に 適 切 な 口 径 の シ リ コ ン

だけ試水の体積が減少したと考えて計算する．

チューブを取り付けて，試料の底に直接，チオ硫酸ナト
リウム溶液を入れられるようにする．

・気泡が入らないように注意し，強く栓を抑えながら瓶を激しく振る．
十分に撹拌して全ての酸素を固定する．

滴定箱：終点を見易くするため，白色の板などでスター

・細口瓶は冷暗所で，（培地に合わせて）水または海水にラーを囲えるようにしておく．照明も終点の見やすいも浸けて，瓶を立てたままで静置しておく．沈殿が沈んのを工夫する．

だ時点でもう一度激しく振って，溶存酸素を完全に固廃液入れ：ポリタンクにプラスチックの漏斗などをつけ定する．

ておく．廃液は強酸性なので注意が必要である．

・細口瓶を冷暗所で，（培地に合わせて）水または海水に操作

浸けて，瓶を立てたままで静置し，６時間以上放置す

チオ硫酸ナトリウム溶液の濃度

る．

・チオ硫酸ナトリウム溶液の入った瓶にデジタルビュ
レットを設置し，ビュレットの先端に硬質のシリコンチューブを接続しておく．チューブの先までチオ硫酸ナトリウム溶液を満たし，ビュレットの操作とともに先端から溶液が流れ出るようにする．
・マイクロピペッターまたはホールピペットを用いて，ヨウ素酸カリウム標準液 10ml を滴定用ビーカに正確にはかりとり，ヨウ化カリの結晶を少量加える．側壁

ヨウ素イオンの酸化・沈殿を底に沈めたまま，静かに細口瓶を取り出し，口周辺の水を拭き取る．
・栓を開け，
沈殿が上層に拡散しないよう注意しながら，静かに濃硫酸（濃塩酸）1ml を加え，気泡が入らないように栓をする．
・瓶を良く振り，全ての沈殿が溶解して溶液が褐色透明になったことを確認する．

についた標準液を洗い落とすように，約 2ml の濃硫酸

ヨウ素イオンの滴定（濃塩酸）溶液を加えると，
ヨウ素が生じ赤褐色になる．

・細口瓶から滴定用のビーカーに試水を完全に移す．硫・ビーカーにビュレットに取り付けたチューブの先端を146

酸で共洗いしても良い．
海洋と湖沼での光合成の測定

・チオ硫酸ナトリウム溶液の入った瓶にデジタルビュ

除き，十分に洗浄したもの．乾燥重量と D. W.を満たしレットを設置し，ビュレットの先端に硬質のシリコンた状態の重量の差から，容積を正確に求めておく．測定

チューブを接続しておく．チューブの先までチオ硫酸した際の共栓と瓶の対応付けをしておく．12本

ナトリウム溶液を満たし，ビュレットの操作とともに温度制御可能な水槽：培養中に空気が入らないように，

チューブの先端から溶液が流れ出る様にする．

培地の基質（水や海水）を入れておき，培養温度と同じ

・ビーカーにビュレットに取り付けたチューブの先端を入れ，滴定を開始する．

温度にしておく．
照明：培養に用いている照明を使う．光強度は適切に調・ビーカー中の撹拌子を回転させながら，予想される終整する

点付近の容量までチオ硫酸ナトリウムを加える．ここ方法

で呈色用澱粉を加え，青紫色が消えるまでさらに少量

・培養中の微細藻類をスターラーで静かに撹拌し，均一

ずつチオ硫酸ナトリウムを加える．終点までに必要とした液量から濃度の決定が決定できる．
・撹拌子を外側から磁石などで固定したまま，廃液を廃液入れに集める．強い酸性であることに注意する．集に混ぜる．
・シリコンチューブを用いて，サイフォンで細口瓶に微細藻類を移す．チューブの先端を瓶の底付近まで差し込んで，培地を流入させる．

めた廃液は炭酸水素ナトリウム（工業用の安価なもの

・細口瓶はバットの上に置く．瓶に培地が充たされてもでかまわない）を過剰に加えて，弱アルカリ性にしてそのまま移動を続け，瓶の上部より培地をあふれさせから廃棄する．

る．瓶の容積の２倍程度あふれたところで，チューブ

4.a.3.2 明暗瓶法
原理

を取り出しながら送液を停止する．
・細口瓶 12本に順次培地とそれに含まれる微細藻類を明暗瓶法は二本の瓶に光合成生物を含む試料を封入し，一本に光を当てて光合成を行わせ
（明瓶）
，もう一本
の瓶を遮光して光合成を行わせずに（暗瓶），適切な時間充たす．
・気泡が入らないように注意しながら，すべての瓶に栓をする．

培養する方法である．その間に二本の瓶に生じた差から・12本から無作為に４本ずつ選び，３組に分ける．

光合成速度が求められる．通常は明瓶，暗瓶ともに各三・１組に黒色ビニール（アルミホイル）を巻き遮光する．

本以上用いる．培養開始時の状態を測定するために，明もう一組とともに水槽に立てたまま沈め，照明を当て

瓶暗瓶以外にもう一組の瓶を用意することもある．光合て培養を開始する．

成により生じる変化として，溶存酸素濃度，溶存無機炭

・残った一組（イニシャル瓶）のうち三本にウィンクラー

素濃度， C や C の生物（懸濁粒子）への取り込み，生法の試薬を添加して，溶存酸素を固定する．残りの一物量（クロロフィル濃度）の変化などが測定される．こ本はバイオマスの測定に用いる．
（濾過後，有機溶媒での変化は単位容積あたり，単位生物量あたりの変化に換抽出し，蛍光法や分光法でクロロフィル濃度を決定す

算され，単位時間あたり（時，日，年）の速度として求る．細胞あたりの速度を算出する場合には，細胞密度められる．瓶中の環境変化が光合成や呼吸に影響を与えないよう，試料の濃度や培養時間は十分に考慮する必要がある．海洋や湖沼の単位面積あたりの生産速度に換算

を顕微鏡観察で求める．）
・培養後，明瓶と暗瓶，各三本で溶存酸素を固定し，残った各一本でバイオマスを測定する．

されることもある．海洋や湖沼の現場培養に関しては・培養中に生じた明瓶とイニシャル瓶の差，暗瓶とイニ

JGOFS protocols を参照していただきたい．ここでは実シャル瓶の差から純光合成量と呼吸量を求める．

験室において液体培地中で培養中の微細藻類の１日の光・培養後のバイオマスの変化を考慮し，培養期間中に対合成速度を求める方法を例示する．
材料

数増殖していることを仮定して，培養期間中の平均バイオマスを求める．

培養中の微細藻類：培地 2000ml 中で対数増殖期にある・光合成量と呼吸量を培養時間と平均バイオマスで換算細胞を用いる．

して，単位生物量，単位時間あたりの純光合成速度

低速スターラーと撹拌子：（Pn）と呼吸速度（R）とし，両者から総光合成速度（Pg）

シリコンチューブ（直径 5mm 程度）50cmを算出する．

プラスチックバット：
共栓付き細口試薬瓶：希塩酸に１日以上つけて重金属を2009 低 温 科 学

vol.67・明暗周期をつけて培養している場合には，この周期にあわせて実験を行う．暗期の呼吸を同様に求めると，
147

１日あたりの Pn，R，Pg を求めることが出来る．

参考文献
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Wigley, D.S.Schimel, Cambridge Univ Pr (Sd), 2000, p.
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1997.
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B.Sadkowiak, F.Wachholz, M arine Chemistry 103(2007)163‑171
10) Experimental phycology,［edited by］Christopher S.
Lobban,David J.Chapman,Bruno P.Kremer;sponsoredby the Phycological Society of America, Cambridge;
Cambridge University Press, 1988. p.64‑82.
11) 水圏における光合成および一次生産の測定法，
渡辺泰徳，
光合成研究法（加藤栄，宮地重遠，村田吉男編），共立出版
株式会社，1981，p.110‑138.

海洋と湖沼での光合成の測定

２章 個体・環境の測定

４．藻類の光合成関連測定
b．ガスクロマトグラフィーと酸素電極を用いた無機炭素親和性の測定
大西 紀和

，福澤

秀哉

炭酸固定を研究する上で，溶存無機炭素に対する親和性を評価することは，生物がどのように COを利用しているのかを知る上で重要である．微細藻類の CO （無機炭素）濃縮機構を研究する上で重要なガスクロマトグラフィーを利用した無機炭素親和性の測定法を紹介する．

A M ethod for photosynthetic affinity against inorganic carbon using gas
chromatography and oxygen electrode.
Norikazu Ohnishi, Hideya Fukuzawa
In order to understand how the photosynthetic organisms utilize carbon dioxide,it is important to evaluate thephotosynthetic affinities against inorganic carbon. Especially microalgae efficiently utilize carbon dioxide by
inducing carbon-concentrating mechanisms. We described a refined method to measure the photosynthetic
affinity using gas chromatography and oxygen electrode.

ナスを使った場合について述べるが，本方法は，その他

4.b.1 はじめにの藻類（ラン藻 ，灰色藻 など）にも利用されている．

炭 酸 固 定 酵 素 ribulose-1,5-bisphosphate carbox-

ただし，測定結果を解析する際に利用する細胞濃度や酸

ylase/oxygenase（RubisCO）は，１ 分 子 の リ ブ ロー

素電極の温度等のパラメーターは，生物種ごとに設定す

ス‑1,5‑ジリン酸と３分子の CO と３分子の水分子かる注意が必要である．

ら，
２分子の３‑ホスホグリセリン酸を生成するカルボキ

光合成における細胞の無機炭素（Ci）に対する親和性

シラーゼ反応に加えて，２分子のリブロース‑1,5‑ジリンとは，細胞を酵素に例えて，どのレベルの光合成基質が酸と２分子の酸素から２‑ホスホグリコール酸と３‑ホス最大光合成活性を与えるのかを測定して，K

ホグリセリン酸を生成するオキシゲナーゼ反応も触媒す

half"と読む．Kる．光合成生物にとって，本酵素の CO に対する親和性

る．例えば，この Kと O に対する親和性の違いは炭酸固定能を規定する大り細胞全体として，Ci に対して親和性が高い状態を示す

値（〝K-と表記することもある）として表記す
値が低ければ，CCM が作動しておきな要因である．また，RubisCO の CO に対する Km 値
は，陸上植物に比べて水生光合成生物は，高い値を示すことから，CO を有効に利用するために無機炭素（Ci；CO と HCO ）濃縮機構（carbon-concentrating mechanism：以下 CCM と略す）をもつことが知られている（図１）．この CCM は Ci 欠乏環境において誘導され，細胞膜や葉緑体胞膜における輸送体と細胞の各コンパート
メントに局在する炭酸脱水酵素によって構成されており，Rubisco 周辺に CO を濃縮することで光合成の効率を維持する役割を担っている．ここでは，CCM の総合的活性の指標として用いられる，ガスクロマトグラ
フィーと酸素電極を用いた細胞の無機炭素に対する親和性の評価方法を述べる．実験材料として緑藻クラミドモ

１) 京都大学大学院生命科学研究科（＊現

岡山大学大学院自然科学研究科）

2009 低 温 科 学

vol.67

図 1：微細藻類の無機炭素濃縮機構を示した概略図．細胞外から取り込まれた無機炭素（Ci；CO と HCO ）は，Ci poolを経て Rubisco の局在するコンパートメント（カルボキシ
ゾーム や ピ レ ノ イ ド）に 輸 送 さ れ，最 終 的 に CO と し て
Rubisco に供給される．CO と HCO の交換反応には，炭酸脱水酵素が関与する（文献８参照）．

149

と判断できる．
本解析法は Ci 輸送も含めた細胞の光合成

一部は前日までに行っても良い．
）⑷細胞の調製（ガスク

特性を知る方法である．

ロの準備中に行う．）
を行い，測定する．器具等を片付け

具体的には，培地中および細胞中の Ci を一旦枯渇さて得られたデータを解析する．ただし，測定当日は，ませ，その細胞懸濁液に NaHCO 溶液を徐々に加えていずガスクロの準備から始める．途中２時間程度の待ち時

き，各濃度における酸素発生活性（Dissolved inorganic

間があるので，酸素電極等の準備をする．

carbon (DIC)-dependent photosynthesis activity）を測定する．最大の酸素発生活性（Vmax）の 50％の活性を与える NaHCO 濃度を算出し，これを K値とする．ただ，培地中および細胞中の Ci を，完全に除去する（枯渇させる）ことは難しい．定性的には，酸素発生速度をモ

4.b.2 器具・装置･酸素電極（英国 Hansatech Inst.製，国内では旭光通商
株が「クロロラボ１」として販売）

ニターして，新たな酸素発生が無くなった時点で「Ci は測定チャンバーに飽和 KCl 溶液を入れて保管して枯渇した」と仮定する場合もあるが，Ci に対する親和性おく事が多い．その場合は，コントロールボックスやの低い細胞の場合は，酸素発生が停止するまでに時間をレコーダーのスイッチを入れてみて，反応するようで要するので，その間に細胞の生理状態が変化してしまう

あれば新たに電極を組み直す必要は無い．酸素電極の可能性がある．そこで，酸素発生速度の測定を開始する

セットアップについては，前項を参照する．

時点での，細胞懸濁液における溶存 Ci 量を推定する必要･循環型恒温槽（EYELA 製，CCA-1111，28℃に設定）がある．そのためには，細胞懸濁液に含まれる Ci を水素･励起光源（M egalight100, SCHOTT AG, Mainz,

ガスと Ni 触媒（メタナイザー）を用いてメタンに還元

Germany；測定中に光強度を変えることができる装し，これをガスクロマトグラフ（ガスクロ）（図２）で定置が良い）量する．この値を用いることで，初期 Ci 濃度を知ることができるので，
低 Ci 濃度での光合成速度を正確に評価することが可能となる．

･ガスタイトシリンジ（先端が針状の物．ガイド付 10μL
用２本と，100μL 用，200μL 用各１本）･酸素発生活性測定用レコーダー（YOKOGAWA 製，

実験では，酸素電極とガスクロを短時間のうちに並行

LR-4220；測定しながら NaHCO 溶液を加えた点をして操作することになるので，正確な測定を行うには準マークしていくので，記録面が水平なタイプが良い．

備と慣れが必要である．また，測定当日に対数増殖期のまた，わずかな酸素発生量を正確に測定するために測細胞を使用する必要があるので，あらかじめ計画を立て

定レンジを低めに設定する必要があり，かつ１回の測て，細胞を培養しておく．測定前日には，測定用各種溶

定に 10分程度要するので，チャートの幅は 25〜30cm

液（細胞懸濁用バッファーのストック溶液等）を調製す程度が必要）

る．測定当日には，⑴ガスクロの準備，⑵細胞懸濁用バッ･ガスクロクロマトグラフ（島津製メタナイザーMTN-

ファーの調製（ガスクロの準備中に行う．前日までに行っ

1，レコーダー［クロマトパック C-R6A］を接続したても良い．）⑶酸素電極の準備（ガスクロの準備中に行う．

GC-8A に特注のインジェクションセットを接続して使用．脚注 参照）･窒素ガス
（ガスクロに接続するボンベとは別に準備し，
HEPES バッファーの脱気と，Ci の枯渇に使用する．
レギュレーターの後には二分岐コックを連結し，シリコンチューブを接続し，さらにその先端には，ピペッ
トチップを付ける）･電動アスピレーター（ガスクロのカラムの洗浄に使用）

図 2：ガスクロマトグラフの全体像．ａ．本体，ｂ．メタナイ
ザー，ｃ．ガラスセル，ｄ．レコーダー．

150

メタナイザー前のガラスセルとインジェクションバルブの加工は，関西学院大学理工学部生命科学科の松田祐介先生による．

無機炭素親和性の測定法

4.b.3 試薬類･100mM Na CO 溶液（ガスクロマトグラフィーCalibration standard 用．メスフラスコで調製し，ゴム栓で密閉しておく）：
N （PRIMARY）

500kPaN （CARRIER GAS 1）：

280kPa：H （HYDROGEN 2）

70kPa

Air：

5kPa

６) 本体上部の左側の通気孔から点火する（図４）．スパ･活性測定用 NaHCO 溶液（20mL 容量の三角フラステルを使って蒸気が出ているのを見ることで，点火をコ（３本）に超純水をガラスピペットで正確に 20mL確認する．スパテルが全く曇らないようであれば点火を測り取り，NaHCO を 1.26g（750mM ），0.252g

できていないので，点火し直す．

（150mM ），0.025g（15mM ）ずつ加えてスターラー

７) メタナイザー内の Ni 触媒を還元させるために，Hで攪拌する．溶解したらゴム栓をして密閉しておく）

ガスを１時間半程度通気する(この間にバッファーの（図３）．

調製，酸素電極の準備等を行う）．

･細胞懸濁用 1M HEPES-NaOH（pH 7.8）（500mL 程度．オートクレーブ処理する）．
･25％（v/v）H PO 溶液（ガスクロ用）

８) カタリシスを 400℃に，Air の圧力を 50kPa にそれぞれ設定し直す．
９) ガラスセルのツマミを INJECT に合わせ，100μLの 25％ H PO 溶液をマイクロシリンジでガラスセルの中で均一に広がるようにアプライする．均一に広4.b.4 実験

がれば，全体が泡立つようになる（図５）．アプライす4.b.4.1 ガスクロマトグラフ（ガスクロ）の準備る時にガラスセルからの圧力でシリンジのピストンが１) 本体とメタナイザーの電源を入れる（部屋の換気を押し上げられるので，ピストンから手を離さないよう

忘れないこと）．
２) メタナイザーの調節つまみを回して，触媒温度（カタリシス）を 450℃に設定する．
３) ガラスセル下のコックを閉じ，ガラスセルの横にあるツマミを CHARGE に合わせる．
４) ガスクロに接続した窒素，圧縮空気のガスボンベを開栓し，水素ガス発生装置（島津，OPGU-2100S）を始
動する．

にする．
10）そのまま１時間以上放置しておき，この後にレコー
ダーの準備（次項）を行う．
4.b.4.2 ガスクロ用レコーダー（クロマトパック）の準備
１) 電源を入れる．READY のランプが始めは点滅しているので，点灯するまで待つ．
２)〝SHIFT DOWN" を押しながら〝I"，〝N"，〝I" と

５) ガスクロ本体のツマミで各ガスの分圧を以下のように合わせる．圧力を間違えると７）で点火できないの

入力し，〝ENTER"を押して初期化を行う（〝INITIAL．
IZED" と印字される）で注意．

図 3：ゴム栓をした NaHCO 溶液．密閉できていることが重要である．

2009 低 温 科 学

vol.67

図 4：ガスクロマトグラフへの点火の様子．点火口付近に火炎の先端を近づけて点火する．点火できると「ポン」と音がする．

151

図 5：ガスクロマトグラフに設置されたガラスセル．Ａ．ガラ
スセルを上から見たところで矢印はマイクロシリンジの先端を挿入する場所を示す．Ｂ．ガラスセルに 25％リン酸溶液をアプライしたときの様子．ガラスセルに均一に広がるとこのように泡立つ．

図 6：ガスクロマトグラフのチャートレコーダーの様子．Ａ．
運転準備ができ安定したときの様子．レコーダーのペンは左に寄った状態で止まる．Ｂ．200μM Na CO 溶液を３回ガラ
スセルにアプライした後のチャートの記録結果．ピークの高さはほぼ同じ高さになる．

３)〝PRINT" を押した後に，〝CTRL" を押しながら〝LEVEL"→〝ENTER"の順でキーを押し，ゼロ点の値を印字する．

１) 三角フラスコ（10mL 容量）に，超純水をピペット
で 10mL 量りとっておく．

４) 3200〜3800μV の範囲になるようにガスクロ本体の

２) レコーダーの〝START"を押し，測定を開始する．

の手順で印字COARSE のツマミを回して合わせ，３）

３) １）のフラスコから超純水を 10μL とり，マイクロして確認する．

シリンジでガラスセルにアプライする（NaHCO 用の

５) 各パラメーターを以下のように設定する．
MIN AREA：

10SLOPE：

200

SPEED：

10

ATTEN：

2

６)〝ZERO" →〝ENTER" と押して，レコーダーペンを原点に合わせる．
７)〝SHIFT DOWN" を押しつつ〝S.TEST" を押し，
〝ENTER" と入力し，ノイズテストを行う（50秒）．

10μL マイクロシリンジを使って，10秒間隔くらいで３回以上アプライする）．
４) レコーダーの〝STOP"を押してチャートを止め，各ピークの面積（AREA）を算出させる．
５) １）のフラスコに 100mM Na CO 溶液をマイクロシリンジ（Na CO 用の 50μL タイプ）で 20μL 加え，
よく攪拌する（200μM 溶液が調製できる）．
６) 再びレコーダーの〝START"を押して測定を開始する．

８)〝SHIFT DOWN" を押しつつ〝PLOT" を押し，

７) ４）で調製した 200μM Na CO 溶液を，10μL アプ〝ENTER"を押す．チャートが進み始めるので，ベーライする（NaHCO 用の 10μL マイクロシリンジをスラインが安定するまで待つ．正しく設定できていれ使って３回以上アプライする）．

ば，この時点でレコーダーペンは少しずつ左に移動す

８) レコーダーの〝STOP"を押して，チャートを止める．

る．リン酸をアプライしてから十分時間が経っていれ

９) それぞれのピークの面積（AREA）が算出されるのば，安定しているのでむしろレコーダーペンは左右にで，アプライ１回あたりのピーク面積の平均値を算出は動かない（図６）．

し，さらに以下の式により１ μM の Na CO ，10μL あ９) ベースが安定したら，〝SHIFT DOWN"を押しつつたりの面積を算出する．

〝PLOT"を押し，〝ENTER"でチャートを止める．レ（［Na CO 溶液の面積］−［超純水の面積］）/200

コーダーペンが大きく左に移動する場合は，20分程度得られた値を１ μM DIC とし，以降の解析に用いる．

してから３）以降を再度行う．
4.b.4.3 C alibratio n s tandard の測定

10）７）で使用したマイクロシリンジ内に Na CO 溶液が残らないように，洗浄用の超純水で 10回以上洗う．

溶存 Ci 量（DIC:dissolved inorganic carbon）を決定

11) ガスクロのレコーダーの〝START"を押してチャーするために，Calibration standard として超純水と 200

トをスタートさせ，10）で洗ったマイクロシリンジで

μM Na CO 溶液について Ci 量の測定を行う．

０ μM DIC 用超純水（細胞懸濁用バッファーの調製．

152

無機炭素親和性の測定法

手順５）を参照）を 10μL 取って測定する．Calibration

１) １ M HEPES（pH 7.8）を 200倍希釈して 50mM

standard 測定時のものと比べて，ほぼ同じ大きさの，更HEPES（pH 7.8）を用意し（100〜200mL 程度）

ピークが検出されれば良い．明らかに大きなピークがにこれと同量の超純水も用意する．

検出された場合は，シリンジ内に Na CO が残ってい

２) 両液をホットスターラーで沸騰しない程度に熱したので，更に超純水で数回洗浄し，再度測定する．

（フラスコの内壁に泡が付着する程度），攪拌しながら参考>ガスクロで少量の液体をアプライする際の注意点．この時，水分が蒸発し過N ガスを通気する(図８Ａ）･10μL のマイクロシリンジは，先端が細く曲がり易い．

ぎないように，かつ蒸気がある程度逃げるようにフラ

これに対し，ガスクロのガラスセルのサンプル注入口

スコにラップをかけておく．水分が蒸発して体積が減は，抵抗があり径も小さいので，シリンジの針の挿入るので，50mM HEPES(pH 7.8）を入れたフラスコにが難しい．10μL のシリンジでアプライする場合は必は，あらかじめペンで水位のところに線を引いておく．

ず針部分に手を添え，ゆっくりと挿入すること．挿入３) 脱気を１時間以上行った後（最初の半分近くまで体する方向によっては，途中で金属部品に突き当たって積が減っているはず），氷上で冷やしながら N ガスを

しまい，ガラスセル内まで針を挿入できないことがあ通気する．

るが，その場合は一旦引き抜き，再度方向を少し変えて挿入すること．
･10μL をアプライする場合に，サンプルがガラスセル
内で四方に散ってしまいうと正確な測定ができない．

４) 室温程度まで冷めたら，氷から出して N ガスを止める．50mM HEPES の体積が減るので，N ガスの通気を止めてすぐに脱気を行った超純水を１）の水位まで加えて体積を合わせる．

正確な測定には，シリンジの中の液体の量が残り４５) 50mM HEPES（pH 7.8）は，ゴム栓をして（図８μL 程度までは丁寧に（ゆっくりと）ピストンを下げてＢ）室温に置く．残った超純水については，測定当日

シリンジの先端に水滴を作り（図７），次に一気にまとに調製した場合も０μM DIC 用としてゴム栓で密閉めて液滴を真下のリン酸溶液に落とすようにする．液しておく．

がカラムの壁面に飛散したら再度アプライする必要が4.b.4.5 溶存酸素濃度の測定ある．

注意＊) 酸素電極はセットアップ毎に感度が異なるの

4.b.4.4 細胞懸濁用バッファーの調製で，レコーダーのチャートの目盛りがどの程度の調製後のバッファーを放置しておくと大気中の CO

酸素濃度に相当するかを実験毎に見積もる必要がが溶解してしまい，測定誤差が生じる．そこで，溶存 Ci

ある．酸素電極の掃除や組み直しは前日に行って濃度を減らすため，バッファーの窒素置換（脱気）を行も良いが，この溶存酸素濃度の測定は必ず測定当う（ガスクロ本体の準備中）．
容器にゴム栓をしていても，測定前日には脱気しておく．

日に行う．
注意＊) 測定に使う ジ チ オ ナ イ ト（Sodiumhydrosulは酸化されやすい物質なので，密fite，Na S O ）栓して乾燥状態で保存する．

図 7：ガスクロマトグラフのガラスセルに 10μL の Na CO
溶液をアプライする様子．シリンジのピストンを少しずつ下ろして先端に液滴を作り，それから一気に全部落とすと少量でも正確に測定が可能となる．

2009 低 温 科 学

vol.67

図 8：バッファーの脱気と保存の様子．Ａ．ホットスターラーに載せたフラスコに，窒素ガスをピペットチップを先端に付けたシリコンチューブで通気している．Ｂ．脱気後のバッ
ファーはゴム栓の薄い部分を折り返して密栓する．

153１) あらかじめ循環型恒温槽の電源を入れておき，28℃の水を測定チャンバーに循環させておく．
２) 測定チャンバーから KCl 溶液を除き，数回超純水で洗う．
３) 調製直後の超純水（０μM DIC 用超純水）を 1.5mL
入れる．

チオナイトを加えたところで Air-line に対して直角にペンが移動して２〜３分以内にほぼ平衡に達するようであれば良い．チャートスピードを遅くする
ことは解決にはならない．
９) Air-line（O 濃度は下表参照）から N -line（０ μM
Ｏ ）までの電位差をチャート上で定規を使って測り，

４) スターラーを回して，コントロールボックスに表示

１mm あたりの酸素量を推定する．Air-line におけるされる値，またはレコーダーのペンの動きが安定する

酸素量を，表１に示す．通常は 25℃で計算して問題無のを待つ（30分程度．少しづつ上昇するはず）．

い．

５) レコーダーのレンジを５V または 10V に，チャー
トスピードを 1200mm/h に設定する．

10) 測定までに少し間がある場合は，飽和 KCl を１mL入れておき，メンブレンの乾燥を防ぐ．

６) チャートをスタートさせ，Air-line を 30秒程度記録
する．
７) 測定チャンバーに，マイクロスパテルにすり切り一杯程度のジチオナイトを加え，すぐにフタをする（こ表 1：15−30℃における溶存酸素濃度
温度（℃）

15

20

25

30

溶存酸素量（μM ）

313

286

254

228

の場合は液面にフタの下部が接触しないようにする）．
電極が正しくセットできていれば，すぐにレコーダーのペンは左に動く（図９）．

4.b.4.6 細胞の調製
ガスクロの準備からレコーダーの準備までが完了して

８) １分以内に電位が安定するので，この値を N -lineから（レコーダーに表示される数値が安定していることとする．安定したら記録を停止し，直ちに測定チャンを確認しておく），脱気済の 50mM HEPES バッファー

バーを超純水で 10回以上洗う．
ジチオナイトはテフロを用いて，測定用の細胞を調製する．カラムにリン酸溶

ンメンブレンを傷める上に，洗浄が不十分だと測定は液をアプライしてからの時間によっては，初期値が十分失敗する．

安定しないことがある．

＊電極の応答が遅いと，電位は１分以内に安定しない

１) 50mL 培地で OD 730＝0.2〜0.4まで培養した細胞ので，電極を組み直す．組み直しても１分以内に電を，700×g で５分，28℃で遠心して集める．

位が安定しない場合は，ジチオナイトが酸化されて２) 培地を残さないように，上清を捨てる．

いる可能性もあるので，別のロットに交換する．ジ

３) 脱気した 50mM HEPES（pH 7.8−KOH）で懸濁する（下記の注意を参照）．この時，OD 730＝１の細胞は約 10μg Chl mL であるので，理論上最終濃度が20μg Chl mL よりも少なめの量に懸濁する．
注意> 脱気した HEPES バッファーはゴム栓をしたま
まの状態で，以下の手順で 18Ｇの針を付けたシリンジ（15mL 容量）をゴム栓中央付近に突き刺して取る．
手順>−ａ．シリンジで N ガスを，細胞を懸濁するバッファーの量分だけ吸う．
−ｂ．そのままの状態で，バッファーの入ったフラスコのゴム栓に突き刺す．
−ｃ．シリンジ中の N ガスをフラスコ内に押し出す．
−ｄ．フラスコを逆さにしてシリンジの針の先端がバッファーに浸るようにして，必要量のバッファーを吸い取る．

図 9：レコーダーの測定レンジを５ V に設定した際の AirN line．矢印はジチオナイトを加えた時を示す．

154−ｅ．シリンジの針をゴム栓から抜く．
４) クロロフィル濃度を定量する．15〜20μg Chl mL
無機炭素親和性の測定法

であればそのまま実験に使う．濃い場合は 20μg Chl

コーダーペンはレコーダーやコントロール ボック ス

mL に希釈し，再度定量する．15μg Chl mL 未満（Back-ff の coarse, fine）で調節して，測定値の低いの場合は遠心からやり直す．
4.b.4.7 溶存無機炭素に依存した光合成活性の推定と測定

側（チャート用紙の端の方）に寄せておく．
４) ガスクロのレコーダーの〝START"を押し，チャートをスタートさせる．

細胞の状態に結果は左右されるので，細胞懸濁液を調５) 測定チャンバーからマイクロシリンジを使って細胞製したら素早く測定を開始する．１サンプルにつき，測を 10μL 取り出し＊，ガスクロのガラスセルにアプラ

定は２回行う．３回目の測定の頃には細胞の状態が悪くイする＊＊．細胞を採取したタイミングを，酸素電極なっていることがある（最大光合成速度 Vmax が低下すのチャートに印をつけておく．

る）ので，手際よく測定を進めることが重要である．ガ＊EZA（Ethoxyzolamide）等の阻害剤を加える場合

スクロと酸素電極の両方を使うので，混乱しないよう準は，細胞を採った後にマイクロシリンジを使って添備する．

加する．阻害剤を含んだ細胞懸濁液をガスクロにア

4.b.4.7.1 マイクロシリンジ洗浄用として，100mL ま

プライすると，正確な測定ができないので注意する．

たは 200mL のフラスコに，適当量の超純水を入ておく．

＊＊細胞懸濁液がガラスセルの中で垂直に落ちたこと

また，10μL のマイクロシリンジは一方を細胞採取用，他を確認すること．横に飛び散った場合は，正確に測方を NaHCO 溶液用と決めておく．

定できていないのでやり直す．

4.b.4.7.2 初期 D IC の測定

６) ガスクロのチャートにピークが確認できたらレコー

１) 酸素電極の測定チャンバーに調製した細胞懸濁液を

ダーペ ン が ベース ラ イ ン に 戻 る ま で 待って か ら

1.5mL 入れ，350μmol photons m- s の光を照射〝STOP"を押してチャートを止め，AREA の面積を算し，N ガスを５分〜15分程度通気する（図 10Ａ）．

出させる．これを初期 DIC とする．

＊通気が短すぎると溶存 Ci が十分に消費されない一方で，長すぎると細胞の状態が悪化するので注意．

4.b.4.7.3 光合成活性の測定
酸素電極のレコーダーのチャートは止めずに，前項の比較するサンプル間では，通気時間の長さを同じに

DIC 濃度の測定から続けて行う．

する．

１) 励起光を 750μmol photons m- s にする．

２) N ガスのチューブを測定チャンバーから抜き，素早く蓋をする．

２) 表２に従って，NaHCO 溶液をマイクロシリンジで低濃度のものから順に 30秒間毎に加えていく（図 10３) 酸素電極のレコーダーの測定レンジを２V に設定

Ｂ）．NaHCO 溶液を加えたタイミングをマークして，し，レコーダーペンを下ろしてチャートをスタートさ．
NaHCO の終濃度も書き込んでおく（図 10Ｃ）

せる．チャートスピードは 1,200mm/hr のままで，レ＊ 30秒のタイミングを逃してしまった場合でも，
溶液

図 10：無機炭素（Ci）の枯渇と酸素発生速度の測定．Ａ．細胞にＮ２ガスを通気し，Ci を枯渇させている様子．ガス圧が高すぎると細胞懸濁液が飛散し液量が減るが，低すぎると細胞が Ci を消費し切るまで時間を要するので，程良いガス圧に調節する．Ｂ．測定チャンバーの蓋上部の穴から，マイクロシリンジで NaHCO 溶液を加える様子．Ｃ．活性測定時のチャートの様子．
NaHCO 溶液を加えた時点にマークを付けておく．NaHCO 溶液を加える
毎に，徐々に酸素濃度が上昇する．

2009 低 温 科 学

vol.67155

表 2：活性測定時に加える各 NaHCO 溶液の量と終濃度
Stock 液15mM

量（終濃度)
1μl（10μM )2μl（20μM )3μl（30μM )4μl（40μM )5μl（50μM )stock 液150mMを加えたポイントをマークしておけば良い．要は，
チャート上で何 mm 進んで何 mm 上昇したか（＝単位時間あたりどれだけ O が発生したか）がわかれば良い．
３) 最高濃度まで測定を終えたらレコーダーのチャートを止め，励起光を切る．
４) 測定チャンバーから細胞を除き，NaHCO が残らな量（終濃度)
1μl（100μM )1μl（100μM )2μl（200μM )3μl（300μM )4μl（400μM )stock 液750mM

量（終濃度)
1μl（ 500μM )2μl（1,000μM )4μl（2,000μM )10μl（5,000μM )６) 窒素ガスは，PRIM ARY を 100に合わせて一晩放置する．
７) 翌日も測定を行う場合は，この状態から 4.b.4.1ガスクロ本体の準備の手順⑵以降の準備を行うことができる．測定を行わない場合は，翌日には窒素ガスの元栓を閉じて，メタナイザー，ガスクロ本体の電源を切る．

いように超純水で 10回以上洗う．また，NaHCO に4.b.4.8.3 マイクロシリンジ使ったマイクロシリンジも，洗浄用の超純水で 20回以

１) 使用したマイクロシリンジは，全て超純水を十数回上洗う．NaHCO が残っていると，次の測定が正確に通す．特に NaHCO 用のシリンジは十分洗浄してお行えないので注意する．

くこと．

５) ガスクロのレコーダーの〝START"を押してチャートをスタートさせ，マイクロシリンジで０ μM DIC 用２) ピストンを外して，タオルペーパー等の上で一日乾燥させる．

の（調製直後の）超純水を 10μL 計り取り，ガスクロ

３) 乾いたらピストンをシリンジに戻し，それぞれの箱にアプライして DIC 量を測定する．アプライした液体に戻す．濡れた状態でピストンを戻さないこと（内側は超純水なので，シリンジが十分洗ってあれば Cali-に張り付いて抜けなくなる）．

bration standard 測定時のものと同程度の高さのピー

4.b.4.9 データ解析

クが検出される．明らかに大きなピークが検出された

測定結果の解析は，１）各測定点における酸素発生活場合は，シリンジ内に NaHCO が残っているという性の計算，２）各測定点における実際の DIC 濃度の計算，ことなので，更に数回超純水で洗って再度測定する．

３）グラフ化の３ステップから成る．１），２）では，Excel

4.b.4.8 あと片付けに計算式を入力しておくと作業の効率が上がる．この時4.b.4.8.1 酸素電極

必要な情報は，以下の通り．

１) レコーダー，Back-Off 装置，循環型恒温槽の電源を

１) 光合成活性を測定した細胞のクロロフィル濃度

それぞれ切る（特に順番はない）．
２) 測定チャンバーは数回超純水で洗い，最後に飽和
KCl を１mL 程度入れてフタをする．液面がフタの下側に付かないようにする．
4.b.4.8.2 ガスクロマトグラフ
１) ガラスセル横のツマミを CHARGE に合わせ，下のバルブを開く．
２) ガラスセル上部のフタを外してチューブをつなぎ，
アスピレーターをつないで吸引する．
３) ガラスセル下部から超純水を吸引させて，カラム内を洗う．
４) ガラスセル下部にアスピレーターをつないで，上部から超純水を吸引してカラム内を洗う．
５) 洗 浄 が 終 わった ら メ タ ナ イ ザーの カ タ リ シ ス を300℃に合わせて，
水素，
空気ボンベの元栓のみ閉じる．
156

２) Air-N の高さ（単位は mm）→ 4.b.4.5を参照
３) ガスクロで測った初期 DIC 濃度（μM ）→ 4.b.4.7.2
を参照
4.b.4.9.1 各 D IC 濃度における酸素発生活性の計算
まず，NaHCO 溶液を加えたある点から次の点まで
で，チャートがどのくらい進んだ時に酸素発生量がどの程度上昇したのかを計算する．
１) 測定した全ての点について，次の a，b（図 11の a，b に相当）をチャート紙に直接定規を当てて測る（１．
mm の 10分の１まで読み取る）
ａ）２点間のチャートの進み具合
ｂ）２点間での酸素発生量の上昇
ガスクロ測定用の細胞を採取した点から一番最初の
NaHCO 溶液を加えた点（すなわち終濃度 10μM の点）についても同様に，上記 a，b を測る．
無機炭素親和性の測定法

を初期 DIC 濃度から引き，この数値に 10μM を加える．これを 10μM 点での〝実際の DIC 濃度"とする．
３) 10μM 点−20μM 点 間 で の DIC 消 費 量 を 10μM
点での実際の DIC 濃度から引き，この数値に 20μMを加えて 20μM 点での〝実際の DIC 濃度" とする．
４) 同様の操作を 5mM 点まで行う．
＊ Excel を使ってテンプレートを作成しておくと，解析が簡略化できる．著者らはクロロフィル濃度，
Air-line から N -line までの高さ，初期 DIC 濃度，
チャートの a,b の数値をそれぞれ入力すれば，各点での酸素発生活性，および実際の DIC 濃度が算出で
図 11：酸素発生測定後の解析．チャートの進んだ距離（ａ）と測定点における酸素発生量（ｂ）を，それぞれ定規で測る．
図の a.b の場合は，30μM の測定点での酸素発生活性を算出することになる．

きるようなテンプレートを作成している（図 12）．
4.b.4.9.3 グラフ化による K

値の決定

上記の作業が完了した時点で，ある程度 K

は見当がつくが（活性が Vmax の 50％になる実際の DIC 付近），
その濃度付近の測定が正確に行えていない場合がある．

２) 各点における酸素発生活性（μmol O mgChl h ）Kは，グラフ化して測定全体を見た上で決定した方が，を 算 出 す る．５mM 点 の 活 性 を 最 大 光 合 成 活 性

妥当な値が得られる．

（Vmax）とし，野生株であれば通常 110−190μmol O

１) 横軸の〝実際の DIC（μM ）"，縦軸に酸素発生活性のmgChl

h 程度の活性が得られる．

4.b.4.9.2 各測定点における実際の D IC 濃度の計算
測定実験では細胞懸濁液に NaHCO 溶液を順次加えているが，実際の DIC 濃度は純粋な積算になるのではな

絶 対 値（μmol O mgChl

hr ）ま た は Vmax を100％とした時の相対値をとって，Excel または適当なグラフソフトを使ってグラフを描く．
２) 近似曲線を描き，最大活性(Vmax）の 50％を与える

く，各点で光合成によって低下しているはずである．4.
b.4.7.3で得られた酸素発生活性を基にして，各点における実際の DIC 濃度を求める．これを無視すると，最も重要な K

値を数十 μM 高く見積もってしまうことになる．
１) 光合成の一般式（6CO ＋6H O → C H O ＋6O ）に基づくと，消費される DIC 量と発生する O 量は理論上１対１の関係にある．
各測定点での酸素発生量（図11，ｂ）から，それぞれの測定点間において消費された DIC 量を算出する（単位は μM で）．
２) 初期 DIC 濃度測定点−10μM 点間での DIC 消費量

図 13：縦軸に酸素発生活性の絶対値をプロットした場合の例．

図 12：測定結果を計算する際に用いる Excel の template の例．
2009 低 温 科 学

vol.67157

図 14：Michaelis-Menten 式と理論曲線を利用した，測定結果の評価の例．Ａ．Michaelis-M enten 式に従って描いた酵素反応曲線．Ｂ．理論曲線と実際の測定点を重ねた例．測定が正確であれば，ほとんどの点は理論曲線に載る．Ｃ．初期 DIC 濃度を実際よりも高濃度に推定し間違えた場合の理論曲線と実測値の関係．

DIC 濃度を Kとしてグラフから読み取る(図 13）．

期 DIC の測定ミスが原因である可能性が高い．

4.b.4.9.4 測定精度の評価
DIC 濃度と光合成活性はおおよそ一次酵素反応的な関係にあるので，M ichaelis-Menten の式を利用すれば，実験の精度が評価できる．

謝辞
本法の確立には，関西学院大学理工学部・松田祐介先

１) M ichaelis-M enten の 式（ v/Vmax＝［ S］/ Km＋

生に多大なご協力を得た．ここに記して感謝申し上げる．

［S］）に従って，任意の数値を入力して酵素反応の理論曲線を描く．この時，縦軸の v/Vmax は０−１の範囲に linear で，横軸の基質濃度［S］は１−10000の範囲に log でそれぞれプロットする（図 14Ａ）．
２) 4.b.4.9.3で縦軸に相対値をとって描いたグラフについて，横軸を１−10000の範囲に log でプロットし直し，１）の理論曲線と同じサイズのグラフ枠で描く．

参考文献
１) T. Yamano & H. Fukuzawa, J. Basic M icrobiol. 49(2009)p.42
２) M .R.Badger & M .H.Spalding,Photosynthesis:Physiology and M etabolism,ed.R.C.Leegood,T.D.Sharkey

点が大方載ってくれば測定は成功と判断できる（図 14& S.von Caemmerer, The Netherlands, Kluwer Academic Publisher, 2000, p.369
３) J.A.Raven, Eur.J.Phycol 32 (1997)p.319
４) T.Omata, G.D.Price, M.R.Badger, M.Okamura, S.

Ｂ）．大きくずれる場合は，何か実験操作に問題があっGohta & T.Ogawa,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(1999)

たか（例えば，初期 DIC 濃度の測定を失敗した）か，

p.13571５) S.C.Burey, V.Poroyko, Z.N.Ergen, S.Fathi-Nejad,
C.Schuller, N.Ohnishi, H.Fukuzawa, H.J.Bohnert &W.Lofelhardt, Plant Cell Environ. 30 (2007)p.1422
６) B.C. Birmingham & B.Colman, Plant Physiol. 64３) １）の理論曲線を２）の実測データによる曲線と重ね合わせて，左右いずれかに移動させた時，２）の各

新しい発見である．いずれにしても，測定を複数回行
い，再現性を確認する．
＊ある点だけ理論曲線からずれる場合は，理論曲線に載ってくる他の点を主に考慮して Kを求める．シグモイド型にはなっても傾きが理論曲線とは一致しない場合は，プロットした点を測定した際に，本来の濃度よりも全体的に高濃度（図 14Ｃ）または低濃度側にシフトしている場合がある．この場合は，初158(1979)p.892
７) Y.M atsuda & B.Colman, Plant Physiol 110 (1996) p.
1283

８) 福澤秀哉，「タン パ ク 質 化 学 第 ４ 巻：酵 素 4.4リ
アーゼ（ ）」，廣川書店，2003，p.177

無機炭素親和性の測定法

２章 個体・環境の測定

５．葉緑体の光合成活性測定⎜ 単離葉緑体を用いた炭酸固定測定 ⎜真野 純一
単離葉緑体での炭酸固定測定によって，カルビン回路成分の機能的統合性に関する生化学的解析ができる．酸素電極を用いた炭酸固定測定法と，光合成部分活性測定法を紹介する．

CO -fixation in isolated chloroplastsJunʼ
ichi M ano
Intact chloroplasts that have high activity of CO fixation are useful for investigating the integrity of the Calvincycle components and the electron transport chain. Although obtaining highly active chloroplasts is sometimes
difficult,the supplementation with glyceraldehyde-3-phosphate will result in a satisfying level of activity,which
represents the whole pathway from H O to CO .

発に O 発生を行う葉緑体を得るのは難しい．これは，カ5.1 はじめにルビン回路中間体の糖リン酸が葉緑体から失われてしま

炭酸固定活性の高い葉緑体が単離できる高等植物はホうことが主な原因と考えられる．筆者らはカルビン回路

ウレンソウ，エンドウマメなどに限られており，分子生の全過程を含む光合成活性を測定するために糖リン酸中物学の対象となるシロイヌナズナやタバコ，イネではま間体を補っている．

だ難しい．カルビン回路の integrityに関する生化学的解
析には，単離葉緑体での炭酸固定測定が必要である．ここでは酸素電極を用いた炭酸固定測定法と，光合成部分
活性測定法を紹介する．

5.3 グリセルアルデヒド‑3‑リン酸（G AP ）補塡による C O 固定測定
カルビン回路の中間体となる糖リン酸は葉緑体包膜の5.2 炭酸固定活性の高い葉緑体の調製

トランスポーターを介してストロマに入るため，外部から補塡することができる ．外部から葉緑体に供給され葉緑体として炭酸固定研究に使える活性レベルは，

た GAP は，光照射下で ATP を消費し RuBP に変換さ

CO を電子受容体としたときの O 発生が 50μmol mg

れ，Rubisco 反応が進行すると PGA となる．PGA から

Chl h 程度以上であり，100μmol mg Chl h が得ら

GAP への還元に，ATP と電子伝達系から供給される

れれば，かなりよい．葉緑体の単離法の詳細は⑶２ａをNADPH が消費され，これに伴い O が発生する（図 1

参照していただきたいが，筆者の経験では活性の高い葉①）．CO の代わりに PGA のみを電子受容体として葉緑緑体を得るコツは次の通りである．(1）
植物材料の鮮度．

体に与え，PGA 依存性の O 発生を観測することもでき

ホウレンソウも研究室（圃場）で栽培し，調製日の早朝に収穫する（天気のよい日は，日照にともない葉緑体にデンプン粒が蓄積し，インタクト率の高い葉緑体調製が難しくなる）．(2）葉を破砕する際，できるだけ低い温度で行う．筆者の研究室では調製開始の１時間くらい前に破砕用メディウムを冷凍庫で冷却し（フレーク状の氷が少しできる程度），使用している．(3）葉の破砕からパー
コール密度勾配遠心分離までをできるだけすばやく行
う．このような注意を払っても，CO を与えるだけで活
１) 山口大学総合科学実験センターアイソトープ分析施設

2009 低 温 科 学

vol.67

図 1：GAP 補塡による炭酸固定活性（①）と PGA 還元活性（②）
．GAP 依存 O 発生（電子伝達）にはカルビン回路の全過程が関与する．

159

る（②）．①の GAP 依存的 O 発生活性は電子伝達系とカ⑷ PGA 溶液 200mM

ルビン回路の全過程を含んでおり，反応に関わる成分が⑸ ホウレンソウ葉緑体多いため，葉緑体調製後も活性は失われやすい．②は部

単離後，パーコール密度勾配遠心分離により精製し，分反応であり，PGA を GAP に変換する酵素（ホスホグ

葉緑体懸濁メディウム（X1）に懸濁した（〜2mgChl

リセリン酸キナーゼとグリセルアルデヒド‑3‑リン酸デml ）標品．インタクト率 90％以上が望ましい．

ヒドロゲナーゼ），電子伝達系からの NADPH 供給，光リン酸化による ATP 供給が揃えば観測される．包膜が破れストロマ成分が拡散してしまうと②の活性も失われ

２．GAP 依存性 O 発生活性測定⑴ 酸素電極のセルに下の溶液を加え，蒸留水で全量を 990μl とする．

てしまうので，部分反応といえども葉緑体の機能的統合

葉緑体メディウム（X2）500μl

性のひとつの指標となる．
たとえば学生実験レベルでは，

NaHCO 200mM

50μl

PGA 還元活性が脱共役剤により完全に阻害されること

GAP 50mM

10μlから電子伝達系とストロマ酵素系との共役について考察させることができる．

⑵ 葉緑体を 15μgChl ml となるよう加え，ふたをして暗所で撹拌しながら酸素濃度変化を２〜３分間記録する．

［実験方法］⑶ 光照射し，酸素発生を記録する．光照射時の最大１．用意する試薬など

O 発生速度と光照射前の O 濃度変化速度の差を⑴ 葉緑体懸濁メディウム（Ｘ２）ソルビトール

0.6M

MgCl

2mM

NaCl

20mM

DTPA（※）

1mM

アスコルビン酸（用時添加） 2mM
ピロリン酸ナトリウムHepes-NaOH

1mM⑵ GAP 溶液 50mM
⑶ NaHCO 溶液 200mM

160⑴ 酸素電極のセルに下の溶液を加え，蒸留水で全量を 990μl とする．
葉緑体メディウム（X2）

500μl

PGA 200mM

10μl⑵，⑶は上記２．と同じ．

100mM ，pH 7.6※ diethylenetriamine N,N,N ′
′
′
,N ′
,N ′
pentaacetic acid

活性とする．
３．PGA 光還元活性

参考文献
１) D.Walker, Use of the Oxygen Electrode, Sheffield,
Oxygraphics Ltd., 1987.

単離葉緑体の炭酸固定測定

3章
単離・精製 ･
活性測定

３章 単離・精製・活性測定

１. 代謝産物量の定量
ａ. C E/M S を用いた陰イオン性代謝産物の定量
原田 和生 ，福崎英一郎
光合成によって固定化された炭素フラックスを議論する上で，糖リン酸，有機酸，糖ヌクレオチドな
どの陰イオン性代謝産物を定量する方法は非常に重要である．当該陰イオン性代謝産物を分離，同定，定量する方法としてイオンクロマトグラフィーやイオンペアークロマトグラフィーなどの方法が提唱されてきたが，これらの手法にはいくつか問題があった．本章ではキャピラリー電気泳動／質量分析
法（CE/M S）法を用いた陰イオン性代謝産物測定法について紹介する．

Metabolic profiling of anionic compounds bycapillaryelectrophoresis /mass spectrometry
Kazuo Harada, Eiichiro Fukusaki
M etabolic profiling of anionic compounds,such as sugar phosphates,organic acids and nucleotides,provides us
the knowledge ofphotosynthetic carbon-fixing metabolism. Capillaryelectrophoresis /mass spectrometry(CE/M S)is very useful method for metabolic profiling of anionic compounds.

1.a.1 はじめに
光合成によって固定化された炭素のフラックスを議論

LC/MS 法の一種であるアニオンイオン交換クロマトグ
ラフィー/質量分析（anion exchange ion chromatography/mass spectrometry, AEC/MS)

やイオンペアーする上で，カルビン・ベンソン回路，光呼吸，解糖系，

液 体 ク ロ マ ト グ ラ フィー/質 量 分 析（ion-pair liquid

トリカルボン酸回路（TCA 回路）等の代謝情報は必要不

chromatography/mass spectrometry, IP-LC/MS) が可欠である．当該代謝経路の中間体は全て糖リン酸，糖挙げられる．AEC は溶離液に高濃度の不揮発性塩を使用

ヌクレオチド，有機酸，コエンザイムＡ誘導体（CoA 体）

するが，これがエレクトロスプレーイオン化（electros-のいずれかの化合物である．さらに ATP，GTP，NAD，

prayionization,ESI）室に流入すると，塩が析出し，イNADP，FMN などのヌクレオチド類が補酵素として数オン化が阻害される．したがって，質量分析計に導入さ多くの代謝反応に関わっている．したがって，光合成暗れる前に溶離液中の塩を取り除くためにクロマトグラフ

反応の代謝変動を議論するためには糖リン酸，有機酸，装置と質量分析計の間にイオンサプレッサーを設置する

ヌクレオチド，CoA 体を測定する代謝産物プロファイリ

ことが必須であるが，塩を完全に取り除くことは極めてング手法が必須である．糖リン酸，有機酸，ヌクレオチ困難である．IP-LC/M S は揮発性の塩をイオンペアー試

ド，CoA 体を含む化合物群は酸性極性基であるカルボキ

薬として用いるが，MS でのイオン化の際にイオンペ

シル基，あるいはリン酸基を有する．そこで，本稿におアー試薬が陰イオン性化合物とイオンペアーを形成し，いては当該化合物群を陰イオン性代謝産物と標記する．

結果，分析対象化合物のイオン化効率が変動し，再現性

近年，ガスクロマトグラフィー/質量分析（GC/M S) ，に劣ることが問題となる．

液体クロマトグラフィー/質量分析（LC/MS) などの代
謝産物プロファイリング手法が発達し，一度に数十〜数百もの低分子代謝産物を一斉に検出，定量することが可

1.a.2 C E/MS の原理

能となってきた．しかし，GC/MS や汎用されているオク

前項で述べた方法の他にイオン性化合物を分析する強タデシルシリル（ODS）カラムを用いた LC/MS では陰力な手法としてキャピラリー電気泳動/質量分析（capil-

イオン性代謝産物を分離，検出することが極めて困難でlary electrophoresis/mass spectrometry, CE/ある．
陰イオン性代謝産物に特化した分析手法としては，

MS)が挙げられる．図１に CE/M S システムの模式図を示した．
１) 大阪大学大学院薬学研究科

CE は内径 50〜100μm 程度のキャピラリーの中を電

２) 大阪大学大学院工学研究科

解質で満たし両端に数十 kV の電圧を印加することによ2009 低 温 科 学

vol.67163

図 1：CE/M S システムの模式図

り，対象化合物を電荷と分子の大きさの違いにより分離

なる．

する．異性体も電荷分布と分子の大きさが異なるので
CE により分離が可能である．また，内径が非常に小さい
キャピラリーを使用するため，分析対象化合物の熱拡散

1.a.3 C E/MS 測定手法を抑制でき，高い分離能を達成することが可能となる．

CE/M S の大まかな測定条件について以下に記述す

キャピラリー出口は質量分析計に接続されており，る．具体的な操作手法はどのメーカーの機種においてもESI 法により対象化合物の気相イオンが形成される．通ほぼ同様であるが，細かい部分で若干異なる点が多数存

常，メタノール等の極性有機溶媒と酢酸アンモニウム等在する．実際に運用する際は各メーカーの説明を参照しのイオン化補助剤を含むシース液（sheath liquid）をイて頂きたい．

オン化室内で電解質と混合する手法が用いられる．これ

1.a.3.1 C E 条件

は，ESI イオン化室に流入する液体が電解質のみの場合

CE 分析条件を決定するためには，まず電気浸透流

では気相イオンが形成される際に必要な脱溶媒の効率が（electroosmotic flow,EOF）が質量分析計側に向かうよ

非常に低く，脱溶媒および気相イオン化を促進する必要

うに，用いるキャピラリーの種類と CE の極性（キャピラがあるためである．気相試料イオンは質量分析装置内のリー入口側を陽極とするか，陰極とするか）を決定する

質量分離部に導入され，質量電荷比（m/z）の値に従っことが必要である．EOF の発生原理は次の通りである．

て分離，検出される．ESI 法ではプロトン化分子や脱プロ

キャピラリー内壁表面が帯電していると電解質中に存在

トン化分子などのような分子内結合が開裂していない分するカウンターイオンがキャピラリー内壁との界面に集子量関連イオンが検出されるので，化合物の同定に有用

まり電気二重層が形成される．この状態でキャピラリー

である．

両端に電圧が印加されると，電解質の流れが発生する．

このように CE はイオン性化合物に対して高い分離能

これが EOF である．EOF の方向はキャピラリー内壁のを，MS は高い選択性と感度を有するので，CE/M S 法は電荷によって決まり，正電荷の場合は陰極から陽極，負イオン性化合物を誘導体化することなく精度良く測定す電荷の場合は陽極から陰極となる．また EOF の大きさることが可能である．したがって，当該手法は陰イオン

はキャピラリー内壁表面の電荷密度が高ければ大きくな

性代謝産物をプロファイリングする非常に強力な手法とり，低いと小さくなる．電荷が無ければ０となる．この164

C E/MS による陰イオン化合物測定

EOF が質量分析計の方向に向かなければ，質量分析計側

は化合物の分離と EOF の大きさに影響を及ぼす．pH がのキャピラリー内部に空気の層が生じ，電気泳動が成立８以上でないとリボース 5‑リン酸やリブロース 5‑リンしない．

酸のような構造異性体の分離は難しい．しかし，pH を上

陰イオン性代謝産物プロファイリングに用いられる

げ過ぎると，キャピラリー内壁の修飾基あるいはシリカ

キャピラリーは（i）未修飾フューズドシリカキャピラに含まれるシロキサン結合が開裂しやすくなり，キャピリー (内壁にシラノール基が露出），（ii）化学修飾によりラリーの寿命が短くなる．通常は pH 8〜9程度に調整す

スルホン基が内壁表面に提示されたキャピラリー（例，る．また，電解質は質量分析計においてイオン化を阻害

GL sciences 社製 FunCap Type S)，（iii）カチオン

しないよう揮発性のものを使用しなければならない．

性ポリマーで物理的にコーティングされたキャピラリー

従って CE/MS において利用できる電解質は非常に制（例，Nacalai Tesque 社製 SM ILE(＋))，（iv）ポリ

限され，酸として蟻酸，酢酸，塩基としてアンモニウム，

ジメチルシロキサンによりコーティングされたキャピラ

トリメチルアミン，トリエチルアミンが用いられる．濃リー（例，Agilent Technologies 社製 DB-1) の４種で度は 50mM 程度が適している．これ以上高くするとある．上述の EOF の発生原理に基づくと（i），（ii）を用

キャピラリーに過電流が流れ，安定しにくくなる．これいる場合，CE の極性はキャピラリー入口を陽極，出口をらの電解質の種類は EOF や分離にも影響を与える．著

陰極とし，（iii）を用いる場合は入口を陰極，出口を陽極者らの経験では，酢酸やトリエチルアミンを用いるととする．また，（iv）の場合は通常（iii）と同じ極性を用

EOF は小さくなり，分析時間が長くなるが異性体の分離いるが，ほぼ完全に EOF が抑制されるため，CE 付属のが向上しやすくなり，蟻酸やアンモニウムを用いるとエアーポンプを用いて電解質バイアルを加圧することにEOF が大きくなり，分析時間が短縮されるが，異性体のより，電解質の流れを発生させる必要がある．尚，（i），

分離がやや劣るという傾向が見られた．

（ii）を用いた場合は陰イオン性化合物が静電引力により次に重要なのは試料注入量である．注入量が大きいと陽極である入口側に引き寄せられるため，それ以上の大当然感度が上昇するが，エレクトロフェログラムのピー

きさの電解質の流れを発生させる必要がある．EOF の大ク幅が広くなり，分離が難しくなる．通常は 10nl 程度にきさがそれに達しない場合は（iv）と同様にエアーポンプ

するのがよいと思われる．試料注入はエアーポンプを用による送液を用いる必要がある．また，同じく（i），（ii）

いて試料バイアルに非常に低い圧力で加圧することによを用いた場合，分離の途中からエアーポンプで送液を行り行う．

い，キャピラリー中に残った化合物を質量分析計側に送1.a.3.2 MS 条件り込む手法も非常に有用である ．ただし，電解質の流れ

第２項で述べたように CE キャピラリーの出口側はの速度分布が，EOF は均一な栓流に近いのに対し，エMS の ESI イオン化室に接続される．CE/MS の成否のアーポンプによる送液は放物面を持つ層流となるため，カギを握るのはこの接続部分といっても過言ではない．

分離度が低くなるというデメリットもある．

通常，スプレーニードルの構造は図１に示すように，二キャピラリーの使い分けに明確な指針はないが，（iii)

重構造となっている．すなわち内側の SUS ニードル中は ATP や GTP などの多価イオンが内壁に吸着されやを CE キャピラリーが通り，キャピラリーとニードルの

すい ，
（iv）
は電解質の pH を７以上にすることができな

間をシース液，内側と外側の SUS ニードルの間をネブい，といった問題点がある．また，（ii)〜(iv）は（i）にライザーガスが通過し，先端部で電解質，シース液，ネ

比べ約 10倍もの価格になることも考慮しなければならブライザーガスが混合され，イオン化室内部に噴霧されない．なぜなら，キャピラリーは GC や LC のカラムに比る仕組みになっている．M S の機種によって CE キャピ

べ圧倒的に寿命が短く，ランニングコストを無視するこ

ラリーが内側の SUS ニードルの先端から突出する場合とができない．CE におけるキャピラリーの寿命とは両と，内側の SUS ニードルの先端がテーパー状になり，CE端に電圧を印加しても電流が流れなくなり，電気泳動がキャピラリー先端はニードルの中に収まっている場合の成立しなくなる状態の事を指している．この点を鑑みる

二種類が存在する．前者の場合，二つの SUS ニードルとと（i）は他の３者に比べ，移動時間の再現性や寿命の点

CE キャピラリーの先端の位置のバランスがスプレーのでやや劣るが，ランニングコストが抑えられることから，安定性，感度に大きく影響を与える．後者の場合も二つファーストチョイスとして適していると著者らは考えの SUS ニードルの先端の位置バランスが重要である

る．

が，CE キャピラリー先端は内側のニードルの先端直前

続いて電解質の pH と組成について言及する．これら
2009 低 温 科 学

vol.67まで押し込めばよく，この点に関して後者のほうが，操165

作がやや簡便であるかもしれない．

考えている．

さらに ESI の構造の違いとして，スプレーニードルに

現在，質量分離部の構造が異なる様々な質量分析計が電圧が印加される構造か，接地されているか，という点

市販されているが，カルビン・ベンソン回路，解糖系，が挙げられる．前者の場合は，分析開始時 CE の電圧を印

TCA 回路の既知の中間体を感度良く定量するために加する最中にスプレーニードルに電圧を印加せず，CEは，タンデム四重極型質量分析計が有用である ．当該装の電流値が安定した後にニードルに電圧を印加し，イオ

置は multiple reaction monitoring（MRM ）法と呼ばれンの検出を行うという工夫が必要である．

る手法によりバックグラウンドを除去し，高感度分析をネブライザーガス圧もスプレー形状を安定化させるの達成することができる．ただし，MRM 法は標準物質溶に非常に重要である．特に，ガス圧を高く上げ過ぎると液を用いて collision energyなど質量分析に必要な各種

アスピレーション作用が働き，イオンの移動度が大きくパラメータを最適化する必要があり従って，標準物質がなり，十分に分離される前に質量分析計に到達すること入手可能な化合物でなければ分析対象にすることが難しになるので注意が必要である．

い．また，未知化合物のスクリーニングにはあまり適しシース液の組成，流量は感度に直接影響を及ぼす．シーていない．

ス液の組成は前述のように極性有機溶媒にイオン化補助

飛行時間型質量分析計（TOF-MS）は精密質量情報が剤を添加する．有機溶媒にはメタノール，2‑プロパノー得られる為，未知化合物のスクリーニングに有用であル，アセトニトリルが良く用いられる．陰イオン性化合る ．また，従来はダイナミックレンジが狭く定量には不物の場合は非プロトン性のアセトニトリルを 50％程度向きとされていたが，近年では計算処理により，四重極の割合で用いるのが適していると思われる．イオン化補型質量分析計と同等のダイナミックレンジが達成できる助剤には 5mM 程度の蟻酸アンモニウム，酢酸アンモニ

ようになってきた．さらにスキャン速度が四重極型に比ウムが用いられる．流速は低いほうが分析対象化合物のべ圧倒的に早く，同時に多くの化合物を定量する場合は，希釈も抑えられ，検出感度が高まるが，CE の電流値が安TOF 型のほうが適している．

定しない，ピーク面積がばらつきやすい等，システムが参考までに，著者らが植物の葉に含まれるカルビン・

安定化しにくい場合がある．
シース液の流速を上げると，ベンソン回路，中間体を測定する際に用いている分析条

感度は落ちるが，安定化しやすい．機種によって最適な件の例を表１に記す．

値を探索すべきであるが，著者らは 10μl/min が目安と
表 1：CE/MS 陰イオン性代謝産物測定条件の例

試料注入

CE
P/ACE M DQ (Beckman Coulter)
FunCap-CE type S (GL sciences)
50mm i.d.×80cm
20℃
4℃
50mM 酢酸アンモニウム pH 9.0
0‑12分：30kV，12‑16分：0kV
0.30分
0‑12分：０ psi，12‑16分：3.5psi
陽極：入口（vial 側），陰極：出口（MS 側)
初めて使用するキャピラリーの場合：30psi（2.1bar），60分間
分析間：30psi，5分間
2.0psi（0.14bar），5秒間，（約 6nl)

装置
イオン化室
イオン化法
極性
イオンスプレー電圧
ネブライザーガス圧
モニタリング法
Dwell time
シース液
シース液流量MS
4000QTRAP (Applied Biosystems)
Turbo V ion source (Applied Biosystems)
ESI
ネガティブ
0‑1分：0kV，1‑16分：−4.5kV
20psi
MRM
100msec/1MRM
10.0mM 蟻酸アンモニウム/アセトニトリル（50/50)
10μl/min装置
キャピラリー
キャピラリーサイズ
キャピラリー温度
試料室温度
電解質
印加電圧
ランプ時間
エアーポンプ圧
極性
リンス条件

166

C E/MS による陰イオン化合物測定

分，1,200rpm の条件で振盪し，抽出．

1.a.4 サンプル調製法

３．500μl のクロロホルム，180μl の蒸留水を添加し，本稿で分析対象とした糖リン酸，ヌクレオチド類は

振盪後，遠心分離．

ターンオーバーが非常に速く，サンプリング時に瞬時に

４．上相（水相）を回収し，新しい 1.5ml サンプルチュー

クエンチングを行わなければ，代謝が進んでしまい本来

ブに移し，さらに 200μl の蒸留水を添加し，遠心分の代謝プロファイルを得ることができない．特に液体培

離．

地で培養した光合成微生物や培養細胞は，培地と細胞の５．上相を Ultrafree MC（分画分子量 5kDa，Millipore

分離，細胞の洗浄に時間がかかり正確な代謝プロファイ社）に移し，10,000×g，60分間遠心し，限外ろ過．

リングを困難にする．細胞懸濁液を−20℃程度に冷却し６．得られたろ液を遠心濃縮に供し，溶媒を除去．

たメタノール水溶液に直接入れて，クエンチングと洗浄

７．蒸留水で再溶解し，CE/MS 分析に供す．

を同時に行う方法も提唱されているが，菌体からのアミノ酸や有機酸の漏れが大きいことが報告されている ．
また，サンプル抽出にはメタノールなどの極性溶媒が用

1.a.5 おわりにいられるが，水分を大量に含むサンプルであると酵素が現 状 で は CE/MS は GC/MS や LC/MS ほ ど 普 及 し十分失活せず代謝が進んでしまう．そのような場合は凍ていない．その要因として，移動時間再現性の低さ，イ結乾燥などで代謝をクエンチしながら乾燥させる等の工オン化サプレッションの影響などの課題が挙げられる．

夫も必要である．

しかし，現在のところ，カルビン・ベンソン回路，解糖

サンプル前処理としては，タンパク質，脂質の除去が系，TCA 回路など光合成の炭素固定に直接関与する代重要である．当該化合物群は CE における分離を著しく謝経路の中間体を網羅できるのは CE/MS のみである．

阻害する．特に，光合成が盛んな植物の葉の組織におい

今後，技術的課題の克服が進み，バイオサイエンスに大てはクロロフィルや光合成関連タンパク質が大量に含まきく貢献していくものと考えられる．

れており，これらを徹底的に除去しなければならない．
これらの除去には下記に示す通り，液々分配および限外濾過が有効である．
固相抽出による精製も考えられるが，回収率の低下が回避できず，加えて汎用されているシリカベースの固相担体ではリン酸エステル結合が開裂しやすいなどの問題も生じる．
植物の葉の組織において，糖リン酸は比較的低濃度であり，場合によっては濃縮が必要である．しかしながら，必要以上に濃縮すると CE の電流値が安定しない，ピー
ク形状が悪くなる，分離が不十分でイオンサプレッショ
ンによりイオンがより検出し難くなるなどの不具合が生じるので注意が必要である．また，CE の分離能を十分引き出すためには，試料溶液は伝導度の低い超純水で溶解させておく必要がある．
以下に，植物組織を用いた場合のサンプル調製法を記
す．

参考文献
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10) K.Harada, Y.Ohyama, T.Tabushi, A.Kobayashi, &E.Fukusaki, J. Biosci. Bioeng., 105 (2008)P.249.
11) S.Kodama, A.Yamamoto, H.Terashima, Y.Honda,）を添加し，37℃，５ethanesulfonic acid（PIPES）

A.Taga, & S.Honda, Electrophoresis, 26 (2005)P.4070.

［実験方法］
１．植物組織（湿重量，約 100mg）を 2.0ml サンプル
チューブに移し，液体窒素で凍結させ，ボールミル
で 20/秒の速度で破砕．
２．破砕した細胞に 500μl のメタノールと 20μl の内部
標 準 物 質 溶 液（100μM

2009 低 温 科 学

vol.67167

12) H.Katayama, Y.Ishihama, & N.Asakawa, Anal.
Chem., 70 (1998)P.5272.
13) T.Soga,R.Baran,M.Suematsu,Y.Ueno,S.Ikeda,T.

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14) C.J.Bolten, P.Kiefer, F.Letisse, J.C.Portais, & C.
Wittmann, Anal. Chem., 79 (2007)P.3843.

Sakurakawa, Y.Kakazu, T.Ishikawa, M .Robert., T.
Nishioka, & M .Tomita, J. Biol. Chem., 281 (2006) P.

168

C E/MS による陰イオン化合物測定

３章 単離・精製・活性測定

１. 代謝産物量の定量
ｂ. 安定同位体標識を利用した動的代謝プロファイリング
蓮沼 誠久 ，原田

和生 ，三宅親弘 ，福崎英一郎

生体試料に含まれる代謝産物の量的情報を M S や NM R を利用して網羅的に解析する代謝プロファ
イリング技術は，微量な中間代謝物質を含む多様な化合物の一斉分析を可能にしたが，ここで得られる情報は代謝物質を抽出した時点での蓄積量のスナップショットであった．生体内で代謝物質が動的定常状態にある時，総量は変わらずに一定の同じ速度で分解と合成が行われて入れ替わっており，新規合成される物質の存在比率を知るためには安定同位体を用いた in vivo 標識が必須である．代謝プ
ロファイリングと安定同位体標識法の組合せを利用した「動的代謝プロファイリング」は，代謝産物の量的変動を網羅的に観測することを可能にする．植物の環境変化やストレスに対する応答はシステ
マティックな代謝変動に基づくことが予想され，「動的代謝プロファイリング」はこうした複雑な応答機構の解明に寄与することが期待できる．

Dynamic metabolic profiling using

stable isotope labeling

Tomohisa Hasunuma, Kazuo Harada, Chikahiro M iyake, Eiichiro Fukusaki
M etabolic profiling technique has enabled to analyze the level of various metabolites including minor intermediates by using MS or NMR simultaneously,but the information available from the technique was snapshot in vivo
at the time of sampling metabolites. In the dynamic steady state, metabolites are replaced with newlysynthesized compounds at a constant rate and the total amount of metabolites remains unchanged. Therefore,in vivo labeling with stable isotopes is necessary for the determination of turnover rates of metabolites.
Dynamic metabolic profiling formed by the combination of metabolic profiling and stable isotope labelingtechnique enables to determine changes in metabolic flux exhaustively. In plants, responses to stress orenvironmental changes would be based on systematic variations in metabolism. The dynamic metabolic
profiling would contribute to elucidate the complicated response mechanism.

1.b.1 はじめに

敏に検出できるため，Calvin らが CO を用いて還元的
ペントースリン酸経路の構成化合物を決定した よう

同位体を利用して代謝経路の特定の原子や分子をラベに，代謝経路や生体内物質の分布などの研究に幅広く使ル（標識）し，その変化を追跡するトレーサー実験は，用されてきた．ただし，放射性核種を使用する放射性ト代謝研究に必須の技法の一つである．基本的に元素の化

レーサー実験は放射線防護に注意する必要があり，標識学的性質は電子配置，つまり原子番号で決まり，原子量率を定量化できない，分子内の標識部位を識別することにはよらないため，
代謝物質中の特定原子のたどる道は，ができないという欠点を有している．

その原子を同位体でラベルして代謝経路（図 1）での行動

安定同位体は質量分析（MS）計や核磁気共鳴（NMR）

を調べれば分かる（同位体の質量差による反応速度の差装置で検出することによりトレーサー実験に適用されを同位体効果というが，一般には無視できる）．同位体にる．天然存在比が 100％に近い H， P， C， N といっは，不安定で放射能を持ち崩壊する放射性同位体と，安た原子に対し，例えば C は 1.1％， N は 0.4％しか存定で崩壊しない安定同位体とがある．放射性同位体を用在しないため，これらの安定同位体を細胞内に取り込まいたトレーサー実験はトレーサーが放出する放射線を鋭せることにより，標識化された代謝反応を選択的に観測することが可能である．M S はイオン化した代謝産物を

１) 神戸大学大学院工学研究科
２) 大阪大学大学院薬学研究科
３) 神戸大学大学院農学研究科
４) 大阪大学大学院工学研究科

2009 低 温 科 学

vol.67

質量電荷比（m/z）にしたがって分離して検出するため，安定同位体標識された化合物は m/z が分子内に含まれる安定同位体の数だけ増加した値を示す（図 2）．したがって，安定同位体が含まれない主分子イオンと安定同169

図 1：炭素代謝の概略図
ADP-Glu;adenosine 5ʼ-diphosphate glucose;DHAP, dihydroxyacetonephosphate;E4P, erythrose 4-phosphate;FBP,fructose 1,
6-bisphosphate; F6P, fructose 6-phosphate; GAP, glyceraldehyde 3-phosphate; G1P, glucose 1-phosphate; G6P, glucose 6phosphate;αKG, α-ketoglutarate;OAA, oxaloacetate;PGA, phosphoglycerate;PEP, phosphoenolpyruvate;Pi, phosphoric acid;
R5P, ribose 5-phosphate; RuBP, ribulose 1, 5-bisphosphate; Ru5P, ribulose 5-phosphate; S6P, sucrose 6-phosphate; S7P,
sedoheptulose 7-phosphate;SBP, sedoheptulose 1, 7-bisphosphate;UDP-Glu, uridine 5ʼ-diphosphate glucose;Xu5P, xylulose
5-phosphate

図 2： C により標識化を受けた化合物（炭素数６，分子量 M ）の同位体濃縮を表す模式図．M ＋n は n 個の C が取り込まれた化合物を表し，図は各アイソトポマーのアバンダンスを意味する．

位体を含む同位体イオンの強度比を観測することによりとにより幅広い化合物の分析に適用することが可能であ

安定同位体標識率を算出することができる．また観測しり，分子量情報も得られるために分子種の同定においてたい化合物が開裂して生じるフラグメントイオンは，試も有用である．NMR は，スペクトル情報から得られる化料分子の部分構造を反映するため，その構造が帰属でき学シフトやスピン−スピン結合定数などの構造パラメー

れば分子内の標識部位を識別することが可能になる ．

ターを基に，標識化合物の同定や標識部位の特定を可能

M S は通常，ガスクロマトグラフィ（GC）や液体クロマにする．混合物からでも複数種類の化合物の同定が可能

トグラフィ（LC），キャピラリー電気泳動（CE）などのな C-H COSY（correlation spectroscopy）や HMQC

分離装置と連結して用いるため，分離モードを変えるこ（hetero nuclear multiple quantum correlation）等の二170

動的代謝プロファイリング

図 3：安定同位体を利用した in vivo 標識のコンセプト
定常状態から in vivo 標識を開始すると，生体内物質の炭素原子は C に置換される（左）．同位体による標識率の経時変化（右グ
ラフの初期勾配）がターンオーバー速度を表す．

次元 NMR が汎用され，化合物内での安定同位体標識

収支や酵素反応速度のパラメーターを与えることによの分布を定量的な情報として得ることができるのがり，代謝ネットワークのモデル化が可能になった ．一

NMR の強みである．一方 NMR には，感度がさほど高方，植物の場合には，微生物と違って様々な制約があり，くないため微量な代謝中間体を検出できない，絶対量のネットワークレベルでのフラックス解析は難しいのが現測定には向かないといった弱点も有している．

状である．例えば，貯蔵組織の存在や転流，細胞内コン

安定同位体を利用した in vivo 標識後に，同位体標識

パートメント間の物質移動は代謝フラックスの数値モデの濃縮度分率を経時観測すれば，代謝のターンオーバー

ル化を複雑化させる．さらに，物質代謝の定常状態を作に関する情報を得ることができる（図 3）．近年，生体試

り出すことが不可能であるため，外部から付与する摂動料に含まれる代謝産物の量的情報を M S や NM R を利の影響を直接的に解析することができず，定常状態法に用して網羅的に解析する「代謝プロファイリング技術」

よる代謝フラックス解析 を適用することが原理的に不の開発が進み，微量な中間体生成物を含む多様な化合物可能である．そこで，代謝フラックスの観測対象を植物の一斉分析が可能になってきた．こうしたメタボロミ

材料に求める場合，培養細胞や胚，組織切片等が利用さ

クス的手法のトレーサー実験への適用は，代謝物質の合れている ． C 標識したグルコースやスクロースを炭素成・分解といったターンオーバーに関する動的代謝プロ源として培地中に添加し，アミノ酸，有機酸，脂肪酸，

ファイリングを実現する．本稿では，トレーサー実験に

スクロース，デンプン等の標識率と標識パターンを GC/

広く用いられる安定同位体である C や N を用いた動MS や NM R で観測することにより解糖系や酸化的ペ的代謝プロファイリングについて記述する．

ントースリン酸回路，TCA 回路に関する代謝フラック
スが調べられてきた1.b.2 in vivo C 標識による動的代謝
プロファイリング．

光合成産物の生合成系を解析するためには，安定同位体標識した CO を炭素源として植物に与え，代謝産物の C 標識率を求める実験が必要になる． CO を利用し

C 標識した炭素源基質を細胞外から取り込ませ，代た植物体の標識実験は 30年以上前から行われている

謝経路の中間代謝物の同位体分布を検出することができが ，多くの場合，分析対象となる化合物は糖類や二次代れば，含炭素化合物の代謝フラックスの観測が可能にな

謝物質といった細胞内蓄積量の多い物質に限られてい

る．代謝フラックスとは代謝ネットワーク中の物質の流た．しかしながら近年，分析装置の検出機能の高感度化，れであり，代謝フラックスの観測は物質代謝の調節機構

スペクトル情報の高解像度化，データ取得速度の高速化の理解に必須の手段である．代謝フラックスの観測手法等により網羅的な代謝プロファイリングが可能になり，は，はじめ，微生物（大腸菌や枯草菌，コリネ型細菌，

代謝ネットワーク上の分岐点に位置する微量な中間代謝

酵母など）を対象に確立され， C 標識グルコースなどを物質の分析が可能になってきた ．代表例として，Huege

炭素源として培養液中に加え，一定時間後の代謝産物のら はまず，水耕栽培したシロイヌナズナ幼植物体を光同位体分配率を調べることで，解糖系，ペントースリン

強度，CO 濃度，温度および湿度の制御が可能なバイオ

酸経路，TCA 回路などの代謝フラックスが観測された．

チャンバーに移し，800ppm CO 雰囲気内で育種する

さらに個々の代謝経路のフラックス情報を統合し，物質ことにより，植物個体を丸ごと C 標識した
（地上部では2009 低 温 科 学

vol.67171

91.5±10.5％，根では 90.2±9.7％の C 標識率であっ

４．フリーズクランプシステム（筆者らが用いているのた）．次に，標識個体に与える炭素源を CO に切換えては光信理化学製作所製光合成同化箱フリーズクラン

安定同位体希釈を行い，一定時間後に採取した組織からパー）を用いて φ 30mm の葉切片をカットすると代謝成分の抽出液を調製した．これを GC/M S 分析に供

同時に液体窒素でこれを凍結させる．

して，有機酸やアミノ酸，スクロースの経時的な標識化率の減少を観測することで代謝物質のターンオーバーを

５．凍結切片をピンセットで取り出して液体窒素につけた後，−80℃で保管しておく．

評価した．一般に水溶性の一次代謝産物には不揮発性の化合物が多く，GC/M S 分析の場合，揮発性を付与するた糖リン酸や糖ヌクレオチドは，生体内含量が微量であめの誘導体化（メトキシアミノ化およびトリメチルシリ

り，高い極性を有する点で分析方法についても工夫が必

ル化）
処理が前処理として必要である．化合物の同定は，要である．筆者らは CE/M S による分離・検出を行って電子イオン化（electron ionization；EI）法により生じる

いるが，以下に分析上の注意点を挙げる．まず，高極性フラグメントパターン（マススペクトル）とキャピラリ

化合物は汎用的な逆相の HPLC での分離が困難である

カラムにおける保持時間の情報をもとに行った後，個々ため，陰イオン交換クロマトグラフィやイオンペア液体の化合物について C 標識率を算出した．また，GC/EI-

クロマトグラフィ，キャピラリー電気泳動（CE）などに

M S による標準化合物の分析結果はデータベース化されよる分離が必要になる．一般に，陰イオン交換クロマトており，web サイト（http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/グラフィでは M S 導入前に中和用のサプレッサーを導からの照合が可能である．
csbdb/gmd/gmd.html）
Huege

入する必要がある，イオンペア液体クロマトグラフィでらの実験では，約 100のマスフラグメントの同定に成功

はイオンペア試薬によるイオン化抑制効果が避けられなし，経時的な同位体標識率の減少を観測することができ

い，といった難点があり，MS と連動して使用する場合にた．

は条件設定に注意を要する．一方で CE は汎用性が高い

カルビン回路の中間代謝物である糖リン酸や糖ヌクレとはいえず，安定した分離と保持時間を得るためには分オチドを対象とした動的代謝プロファイリングを行う場

析対象組織に合わせた分離条件の最適化が必要である．

合には， CO による標識と標識化組織のサンプリング

CE の分離条件については「１) CE/M S による陰イオン

および化合物分析の方法に工夫が必要である．カルビン

性代謝物の定量点」に詳細な記述がある．次に，微量成回路をはじめ，糖代謝の主要経路のターンオーバー速度分の検出については，より高感度な検出が可能な質量分は非常に速く ，in vivo のターンオーバーを正確に観測

析装置を用いることが望ましく，分析試料は前処理操作するためには，標識化組織の採集から代謝反応のクエンにより夾雑物をできるだけ排除しておくことが重要であ

チングに要する時間をできるだけ短くすることが重要とる．以下に分析試料の調製方法を記す．

なる．また，短時間で標識を行う場合には CO 固定速度を厳密に管理する必要があり，光合成速度に影響を与え［実験方法］

るファクター（光強度，CO 濃度など）の制御も必須と

１．100mg 湿重量の植物組織を水／メタノール／クロなる．以下に標識化試料の調製手法を記す．

ロホルム（2：5：5）の混合溶液中で攪拌・破砕する．
２．上記混合液の 1/6容量の水を添加・混合・遠心した［実験方法］
１．光強度，CO 濃度，相対湿度およびチャンバー温度の外部制御が可能な光合成チャンバーを作製し，この中で生葉の光合成を開始させる（この時点で用いる CO は CO とする．20,000ppm CO と 20％O

後，水溶性画分を回収する
３．回収液を分子量カット 5,000の限外濾過膜を通過させて得られた濾液を減圧乾固する．
４．得られた残渣を蒸留水で溶解したものを分析試料として CE/M S に供する．

air を混合して調製したガスをチャンバー内に供給する．）．生葉の光合成速度は LI-COR 社製 LI-7000

筆者らは検出に三連四重極リニアトラップ型の質量分

CO /H O ガスアナラザー等を用いてガス交換法に析装置を用いて multiple reaction monitoring（MRM ）より計測する．

方式による観測を行っている．図４にはホスホグリセリ

２．30−60分後に光合成速度が定常化したら，フィードン酸，リブロース 1,5‑ビスリン酸および UDP‑グルコー

する CO ガスを CO に切り替える．

スの代謝ターンオーバーの観測結果を示す．対象とする

３．一定の時間， CO で光合成させる．

化合物毎に MRM のパラメーターを最適化することに172

動的代謝プロファイリング

より，カルビン回路内の主要代謝産物とグルコース 6‑リ化炭素，水，無機塩だけで生育することが可能である．

ン酸，ADP−グルコース，UDP‑グルコースといったス

植物体内に多く存在する炭素，酸素，水素は大気と水か

クロース・デンプン生合成経路の代謝中間体や，アミノ

ら得ることが可能である．次いで最も多く存在する窒素酸，有機酸，アセチル CoA 等を検出することが可能であはそのほとんどが土壌中から吸収されるが，自然環境下る（表 1) ．

では当該元素が最も欠乏しやすい．従って，カリウム，
リンと並んで窒素は植物の成長速度を決定する栄養源と

1.b.3 in viv o N 標識による動的代謝
プロファイリング
植物は光合成に由来する化学エネルギーを用いて二酸なる場合が多い．また，光合成によって獲得した炭素は，植物体の窒素栄養状態によって分配先が制御され，その結果として植物の生長，形態形成にも影響を与える ．つまり，植物の生育にとって重要な窒素代謝は光合成とも密接に関係しており，C/N バランスによる代謝ネット
ワークの変動，それに伴う分化，形態形成の制御機構の解明は非常に重要な研究課題である．
植物に含まれる代謝産物にはアミノ酸，ポリアミン，
核酸，アルカロイドなど窒素を含む有機化合物が非常に多い．このことは安定同位体である N で標識した硝酸カリウムや硝酸アンモニウムなどの無機塩のみを窒素源とすることで，多くの化合物を同位体標識することが可能となり，ネットワークレベルでの動的代謝プロファイ
リ ン グ が 実 行 で き る こ と を 示 し て い る．従って，in

図 4：糖リン酸，糖ヌクレオチド類の C 濃縮度分率の経時
変化
光強度 1,000μmol m s ，CO 濃度 1,000ppm，相対湿度60％，チャンバー温度 25℃で光合成を行ったタバコ葉から抽出した成分を CE/M S 分析に供して各標識時間における C
標識率を調べた（蓮沼ら，論文準備中）．

vivo N 標識による動的代謝プロファイリングは窒素代謝の代謝変動，そして窒素代謝と光合成の関係を解明する上で非常に有用であると考えられる．
in vivo N 標識による動的代謝プロファイリングの特徴として次のような点が挙げられる．i)多くの含窒素
化合物はアミノ酸から派生して合成されるので，前駆体

表 1：CE/M S により C 標識率が測定可能なアニオン性代
謝産物
リンゴ酸
ホスホエノールピルビン酸
グリセルアルデヒド 3‑リン酸ジヒドロキシアセトンリン酸
3‑ホスホグリセリン酸
クエン酸
イソクエン酸
リボース 5‑リン酸
リブロース 5‑リン酸
グルコース 6‑リン酸
フルクトース 6‑リン酸
グルコース 1‑リン酸
セドヘプツロース 7‑リン酸
リブロース 1,5‑ビスリン酸
フルクトース 1,6‑ビスリン酸
フルクトース 2,6‑ビスリン酸
セドヘプツロース 1,7‑ビスリン酸
UDP‑グルコース
ADP‑グルコース
アセチルコエンザイムＡ

2009 低 温 科 学

vol.67であるアミノ酸から測定対象となる含窒素化合物までの中間体の N 標識率を経時的に測定することにより，当該経路の詳細な代謝フラックスを解析することが可能である．ii)無機態窒素の N 標識体は C， O 標識化合物に比べ非常に安価であり，取り込みも簡便に行うことができる．iii)炭素とは異なる，細胞内での窒素の分配，フラックスに関する知見を得ることができる．
in vivo N 標識による動的代謝プロファイリングではアミノ酸，ポリアミン，核酸などのような含窒素化合物が分析対象化合物となる．これらは前項で述べた糖リ
ン酸，糖ヌクレオチドと同様に極性が非常に高く，汎用の HPLC では分離が困難である．従って，含窒素化合物を網羅的にプロファイリングする分析手法にも工夫が必要である．この場合においても前項で述べた CE/MS は非常に有用である．あらゆるアミノ酸，ポリアミン，核酸は pH が２以下の溶液中で正に帯電する．従って，pHが２以下の電解質を用いれば，これらの化合物群を誘導体化せずに CE によって分離することが可能である．また，通常 CE で用いられるフューズ ド シ リ カ キャピラ173

リーは酸性溶液に対し非常に安定であるため，低 pH の

代謝変動の全体像を定量化することができる．植物の環電解質を用いた CE は HPLC に匹敵する再現性を達成

境変化やストレスに対する応答は遺伝子レベルや代謝レすることが可能である ．さらに，解糖系やカルビンベン

ベルでのシステマティックな変動に基づくことが予想さソン回路の中間体に比べ，アミノ酸やポリアミンは植物

れ，「動的代謝プロファイリング」はこうした複雑な応答

細胞内に高濃度で蓄積しているため，試料調製の際，濃機構の理解に寄与することが期待できる．また応用面か縮の必要がない．また，M S 測定時に M RM ではなく，らは，炭素や窒素の分配の速度論的な理解を可能にし，広範囲の m/z 領域をスキャンすることでも十分検出可

植物の物質生産性の向上につながる律速酵素反応を明ら能であるため，同時に測定可能な化合物の数も増え，ノ

かにすることが期待できる．例えば遺伝子工学的手法にンターゲットの代謝プロファイリングも可能である．含よる律速酵素の過剰発現は当該代謝フラックスを強化

窒素化合物を対象とした CE/MS プロファイリングにし，最終産物の生産量を増大させる可能性が高い．一方はこのような分析技術の面でも優位性が存在する．

で，in vivo での代謝変動をより正確に把握できるか否か

著者らはモデル植物であるシロイヌナズナの培養細胞

は同位体標識を施す試料の調製方法と標識方法の成否がT 87を明，暗条件，各々において in vivo N 標識によ

鍵を握っており，今後も研究目的に応じた標識システム

る動的代謝プロファイリングを行った ．代謝プロファの構築に取り組んでいく必要がある．

イリングには CE/MS を用いた．その結果，無機窒素体の受容体であるグルタミンやグルタミン酸の N 標識率は大きく変化しないにも関わらず，プロリンや芳香族

参考文献

アミノ酸の N 標識率が暗黒下で大きく低下している

１) M .Calvin. J. Chem. Soc. (London) (1956)p.1895

ことを明らかにした．

２) J.Huege et al., Phytochemistry 68 (2007)p.2258
３) G.Sriram et al., Plant Physiol. 136 (2004)p.3043
４) G.Sriram et al., Phytochemistry 68 (2007)p.2243

N 標識無機窒素塩による in vivo 標識はタンパク質のような高分子のターンオーバー解析にも用いることが可能である． CO を取り込ませ，タンパク質あるいはその消化物であるペプチドを MS により解析した場合，ス
ペクトルは非常に複雑になり，解析が困難であるが， Nで標識する場合，分子内に存在する窒素原子の数が炭素に比べ，圧倒的に少なく，解析が容易である． N 標識した硝酸カリウムで培養し，体内の窒素がほぼ 100％となった植物体を作成し，タンパク質の構造を NMR により解析した例も報告されている ．ルビスコや光化学系複合体を構成するタンパク質は，他のタンパク質に比べ圧倒的に量が多く，光合成活性に直接関与する．様々な環境下においてこれら光合成に直接関与するタンパク質のターンオーバーを解析することにより，光合成の制御
機構解明につながることが期待される．

1.b.4 おわりにin vivo 安定同位体標識法と代謝プロファイリング技
術の組み合わせは，代謝物質の合成・分解に関するダイ
ナミックな量的変動の網羅的な観測を可能にするため，

174５) O.Fiehn et al., Nat Biotechnol. 18 (2000)p.1157
６) J.Kikuchi et al., Plant Cell Physiol. 45 (2004)p.1099
７) S.Sato et al., Plant J. 40 (2004)p.151
８) G.Stephanopoulos et al.,M etabolic Engineering,Principles and M ethodologies, Academic Press, San Diego(1998)
９) J.Schwender. Curr. Opin Biotechnol. 19 (2008)p.131
10) M .Dieuaide-Noubhani et al., J. Biol. Chem. 270 (1995)
p.13147
11) V.Iyer et al., Plant Cell Environ. 31 (2008)p.506
12) D.Rontein et al., J. Biol Chem. 277 (2002)p.43948
13) J.Schwender et al., J. Biol. Chem. 278 (2003)p.29442
14) J.Schaefer et al., Plant Physiol. 55 (1975)p.1048
15) W.Romisch-Margl et al., Phytochemistry 68 (2007) p.
2273
16) T.C.Sharkey et al., Plant Physiol. 81 (1986)p.788
17) K.Harada et al., J. Biosci. Bioeng. 105 (2008)p.249
18) A.Ikeda et al., Protein, Nucleic Acid and Enzyme 48(2003)p.2103
19) T.Soga et al., Electrophoresis 25 (2004)p.1964
20) K.Harada et al., Biotechnol. Prog. 22 (2006)p.1003
21) J.H.Ippel et al. Proteomics 4 (2004)p.226

動的代謝プロファイリング

３章 単離・精製・活性測定

１. 代謝産物量の定量
ｃ. 硝酸還元酵素及び亜硝酸還元酵素の活性測定
前田 真一 ，上坂

一馬 ，小俣

達男

光合成生物の多くは，硝酸イオンをアンモニアに還元し有機窒素化合物を合成する硝酸同化機構を持っているため，硝酸イオンを窒素源として利用できる．本章では植物及びラン藻の硝酸還元酵素及び亜硝酸還元酵素の活性測定方法について紹介する．

Assay of the Activities of Nitrate Reductase and Nitrite Reductase
in Photosynthetic Organisms
Shin-ichi M aeda, Kazuma Uesaka, Tatsuo Omata
Nitrate, which is a major source of nitrogen for photosynthetic organisms, is reduced to ammonium by thesequential action of nitrate reductase and nitrite reductase. In this chapter,we describe the methods to measure
the activities of nitrate reductase and nitrite reductase in photosynthetic organisms.

1.c.1 硝酸還元酵素及び亜硝酸還元酵素の種類
硝酸還元酵素は，硝酸イオンを亜硝酸イオンに還元すpH 7.5，1mM DTT，2mM KNO ）150μl を加え，30℃で１分間インキュベートする．
３．0.6mM NADH（または NADPH）溶液 50μl を加えて反応を開始させる．

る反応を触媒する酵素である．光合成生物には，電子供４．経時的（５分おき）に 50μl サンプリングし，直ちに与体としてフェレドキシンを用いる酵素と NAD(P)H

450μl の氷冷した水と混合し，激しく撹拌することを用いる酵素があり，いずれもモリブデン酵素である．

で反応を停止させる．NADH（または NADPH）を亜硝酸還元酵素は，亜硝酸イオンをアンモニアに還元

空気中の酸素と反応させることで酸化し，反応を停する反応を触媒する酵素である．光合成生物の亜硝酸還元酵素は，シロヘムを持ち，フェレドキシンを電子供与体として用いる．

止させる．
５．反応液中の亜硝酸イオンの濃度を測定し，その増加速度から硝酸還元酵素活性を算出する．

1.c.2 実験方法
1.c.2.1 NAD (P )H 依存型硝酸還元酵素の活性測定（植物組織)
１．植物組織（約 100mg）を液体窒素で凍結させ，乳鉢と 乳 棒 を 用 い て 粉 砕 し，酵 素 抽 出 液（50mM

高等植物の硝酸還元酵素は，翻訳後修飾により活性調節を受けている．
リン酸化された硝酸還元酵素は，
14‑3‑3タンパク質と結合し不活性化される．この翻訳後修

飾には２価のカチオンが必要であるため ，酵素抽出液
中の EDTA の代わりに MgCl を加えると，活性化状態の硝酸還元酵素の活性のみ測定することができる．

HEPES-KOH pH 7.5，5mM EDTA，10mM 2‑メ
ルカプトエタノール，1mM DTT，0.5mM PMSF，5mg ポリビニルピロリドン）300μl に懸濁し，遠心（15,000×g，３分）後，その上清を酵素溶液として回収する．

1.c.2.2 フェレドキシン依存型硝酸還元酵素の活性測定（ラン藻)
フェレドキシンを電子供与体とする硝酸還元酵素（および亜硝酸還元酵素）の活性測定には，Na S O により

２．酵素溶液 100μl に反応溶液（50mM HEPES-KOH

還元したメチルビオローゲンを電子供与体として用いるのが一般的である．

１) 名古屋大学大学院生命農学研究科 生物機構・機能科
学専攻 分子細胞機構学講座（植物分子生理学研究分

10分）により回収し，無窒素培地

野）

2009 低 温 科 学

１．ラン藻細胞（0.2〜0.5mgChl）を遠心（2,000×g，

vol.67で洗浄後，無窒
175

素培地 1ml に懸濁する．細胞質膜の透過性を高める
ために，細胞懸濁液にトルエン 25μl を加え，２分間

反応液中の亜硝酸イオンの濃度を測定し，その減少速度から亜硝酸還元酵素活性を算出する．

激しく撹拌する．
２．6mM KNO を含む炭酸緩衝液(120mM NaHCO /1.c.2.4 フェレドキシン依存型亜硝酸還元酵素の活性

Na CO ，pH 10.5）2.43ml を試験管に入れ，30℃に保温しておく．

測定（ラン藻)１．2‑2の１と同じ

３．これに 100mM メチルビオローゲンを 0.12ml，ト

２．1.5mg/ml 臭化セチルトリメチルアンモニウム

ルエン処理した細胞懸濁液を 0.15ml 加え，30℃で0.15ml と M OPS 緩衝液（40mM M OPS-NaOH，

５分間インキュベートする．

pH 7.2）1.98ml を試験管に入れ，30℃に保温してお４．次に 100mM Na S O （0.3M NaHCO に溶解する）を 0.3ml 加え反応を開始する（メチルビオロー
ゲンが Na S O により還元されることで反応液が青色に変わる）．

く．
３．これにトルエン処理した細胞懸濁液を 0.3ml 加え，30℃で５分間インキュベートする．
４．次 に 100mM メ チ ル ビ オ ローゲ ン を 0.12ml，10

５．経時的（３〜５分ごと）に 0.5ml サンプリングし，（反応液の色が Na S O を加える前の色に戻るまで）激しく撹拌する．Na S O を空気中の酸素と反応させることで酸化し，反応を停止させる．
６．反応液を遠心（15,000×g，１分）
し，上清を回収し，反応産物である亜硝酸イオンの濃度を測定する．亜硝酸イオン濃度の増加速度から硝酸還元酵素活性を算出する．

mM NaNO を 0.15ml 加 え，30℃で ５ 分 間 イ ン
キュベートする．
５．さらに 200mM Na S O （0.3M NaHCO に溶解する）を 0.3ml 加え反応を開始する（メチルビオ
ローゲンが Na S O により還元されることで反応液が青色に変わる）．
６．経時的（３〜５分ごと）に 0.5ml サンプリングし，（反応液の色が Na S O を加える前の色に戻るまで）激しく撹拌する．Na S O を空気中の酸素と反無窒素培地

応させることで酸化し，反応を停止させる．

ラン藻培養用培地 BG11 のクエン酸鉄（ ）アンモニ

７．反応液を遠心（15,000×g，１分）し，上清を回収し，ウム，硝酸ナトリウム，硝酸コバルトをそれぞれ同濃度基質である亜硝酸イオンの濃度を測定する．亜硝酸のクエン酸鉄（ ）水和物，塩化ナトリウム，塩化コバ

イオン濃度の減少速度から亜硝酸還元酵素活性を算ル ト で 置 換 し て 作 製 す る．培 地 の pH は，20mM

出する．

HEPES-KOH で 8.2に合わせる．
1.c.2.5 亜硝酸イオン濃度の測定
1.c.2.3 フェレドキシン依存型亜硝酸還元酵素の活性測定（植物組織)ジ ア ミ ン 二 塩 酸 塩 0.01g，塩 酸 6.25ml，蒸 留 水

１．2‑1の１と同じ

141.25ml を混合し，発色試薬を作る．

２．酵素溶液 50μl に反応溶液（50mM HEPES-KOH
pH 7.5，1mM DTT，2mM

１．スルファニルアミド 0.5g，N‑1‑ナフチルエチレン

２．サンプル 0.05ml を発色試薬 2.95ml と混合し，15メチルビオローゲン，

分反応後，540nm の吸光度を測定する．検量線作成

1.5mM NaNO ）200μl を加え，30℃で１分間インには，０〜0.5mM の亜硝酸イオン溶液を用いる．

キュベートする．
３．60mM Na S O （0.3M NaHCO に溶解する）を50μl 加え反応を開始する（メチルビオローゲンが
Na S O により還元されることで反応液が青色に

１) Wray,J.L., and Fido,R.J. (1990)in Methods in Plant

変わる）．

Biochemistry (Dey,P.M., and Harborne,J.B., eds) Vol.
3, pp.241‑256, Academic Press, London
２) Huber,S.C., Bachmann,M ., and Huber,J. (1996)
Trends Plant Sci. 12, 433‑438
３) M oorhead,G., Douglas,P., Morrice,N., Scarabel,M .,４．経時的（５分おき）に 50μl サンプリングし，直ちに450μl の氷冷した水と混合し，（反応液の色が Na
S O を加える前の色に戻るまで）激しく撹拌することで反応を停止させる．Na S O を空気中の酸素と反応させることで酸化し，反応を停止させる．
176

参考文献

Aitken,A., and M acKintosh,C. (1996) Curr. Biol. 6,1104‑1113
硝酸同化系酵素の活性測定

４) Su,W.,Huber,S.C.,and Crawford,N.M.(1996)Plant
Cell 8, 519 ‑527
５) Athwal,G.S., Huber,J.L., and Huber,S.C. (1998)
Plant Cell Physiol. 39, 1065‑1072
６) Herrero,A., Flores,E., and Guerrero,M .G. (1981) J.
Bacteriol. 145, 175‑180
７) Stanier,R.Y., Kunisawa,R., Mandel,M., and Cohen-

2009 低 温 科 学

vol.67

Bazire,G. (1971)Bacteriol. Rev. 35, 171‑205
８) Herrero,A., and Guerrero,M .G. (1986) J. Gen. Microbiol. 132, 2463‑2468
９) Snell,F.D., and Snell,C.T. (1949) in Colorimetric
Methods of Analysis Vol.2, pp.802‑807, Van Nostrand,
New York177

３章 単離・精製・活性測定

１. 代謝産物量の定量
ｄ. 活性酸素種，抗酸化物
真野 純一 ，S erg ey Kho ro brykh

，尼子

克己

光合成に伴い生成する活性酸素種は，細胞のレドックスシグナルとして作用すると同時に環境ストレス障害の要因ともなる．活性酸素には化学的特性の異なるいくつかの分子種があり，それぞれ特異的な検出法がある．活性酸素種およびそれを消去するアスコルビン酸やグルタチオンなどの還元剤は，寿命が短い，相互の酸化還元反応が容易に進行する，といった特性をもつため，定量的な抽出・測定に注意を要する．この節では，チラコイド膜を用いる活性酸素生成機構解析，組織抽出液の過酸化物，
酸化タンパク質，抗酸化物の定量法を中心に解説する．

Reactive Oxygen Species and Antioxidants Associated with PhotosynthesisJunʼ
ichi M ano, Sergey Khorobrykh, Katsumi Amako
Photosynthesis reactions are intrinsically accompanied by the production of reactive oxygen species (ROS)suchas superoxide anion radical (O ), hydrogen peroxide, singlet oxygen ( O ) and hydroxyl radical (HO ), which
influence the productivity and stress responses of plants. Selected methods for determining individual ROS invitro and in vivo and for evaluating the redox status of ascorbate and glutathione in plant tissue extracts aredescribed, with specific precautions.

り，検出法はそれぞれに特異的である．また，研究目的

1.d.1 はじめにと材料に応じて最適な測定手法は異なる．例えば活性酸

C 3光合成を行う葉での典型的な活性酸素生成フラッ素生成機構解明にはチラコイド膜などを材料とした inクス（H O 換算）は，試算によると葉緑体で 4,000nmol

vitro 測定，酸化的損傷・ストレス耐性の評価には過酸化m s ，ペルオキシソームで 10,000nmol m s ，ミト

物やアルデヒドなどの組織からの抽出・定量，活性酸素

コンドリアで 200nmol m s 程度である ．ペルオキシのシグナル作用解明には蛍光プローブなどを用いた組織

ソームの H O 生成はほとんどグリコール酸オキシダーの in situ 観察が行われる．各手法の原理と限界を理解す

ゼ反応によるが，葉緑体では主要な活性酸素反応は２つることが，結果の正しい解釈には不可欠である．本節で

ある
（図 1)

．ひとつはいわゆる M ehler 反応で，光化はまず活性酸素測定法を研究目的と検出法の特徴によっ

学系 I（PSI）で O が一電子還元されスーパーオキシドて分類し，研究目的に応じた測定手段選択のガイドライ（O ）が生成し，O の不均化反応 で H O が 生 成 す

ンを提供する．その後 in vitro 測定，in situ 測定の具体る例をいくつか紹介する．

．もう一つは光化学系 II（PSII）での一重項酸素（ O ）生成である ．この他にも PSII 還元側での O 生

なお，NO ，ペルオキシ亜硝酸（ONOO ）など活性窒

成 ，そ れ に 由 来 す る H O ，ヒ ド ロ キ シ ル ラ ジ カ ル

素種の植物試料での測定については最近の文献（HO ）の生成 ，H O 酸化酵素が機能しないときの PSIIを参照されたい．
より広範な活性酸素，
酸化ストレスマー

酸化側での酸化力による活性種の生成 ，プラストセミカーの測定法の成書もある

キノンによる O 生成 ，亜硝酸，アスパラギンからの一ファクトの原因は活性酸素種の化学的性質と密接に関連

酸化窒素（NO ）生成している．基礎的理解のため総説，成書などの可能性が指摘されている．

．測定の限界やアーテを一読され活性酸素には化学的特性の異なる複数の分子種があることをお薦めする．

１) 山口大学総合科学実験センターアイソトープ分析施設
２) Institute of Basic Biological Problems, Russian

1.d.2 活性酸素種の特性と検出法の選択

Academy of Sciences
３) 神戸学院大学栄養学部

2009 低 温 科 学

vol.67

活性酸素とは酸素分子（O ）に由来する反応性の高い分子種の総称で，「活性酸素種」という表現がより正確で
179

図 1：葉緑体電子伝達に伴う活性酸素生成．点線は電子伝達経路を表す．
① PSI ストロマ側での O 還元による O 生成．触媒としてグルタチオンレダクターゼ，モノデヒドロアスコルビン酸レダク
ターゼ（MDAR）などストロマのフラビンタンパク（SF) ，フェレドキシン（Fd）が考えられる．
② PSI 還元側の鉄硫黄センターF ，F ，F の自動酸化による O 生成．
③ PSII 反応中心での O 生成．
段階１：プラストキノンプールが過還元状態となり，Q /Q の還元レベルが上昇すると，P680 と Q の電荷再結合の確率が高まり P680の励起三重項状態 P680 が形成される．
P680 ＋Q → P680 ＋Q
段階２： P680 から基底状態酸素分子（ O ）へのエネルギー移動で O （励起一重項状態）が生成．
P680 ＋ O → P680＋ O④ アンテナクロロフィルでの O 生成（ Chl ， O の消去剤であるカロテノイドが欠損すると起こりうる）．
⑤ PSII 還元側での O 還元による O 生成 ．
⑥ PSII 酸化側での P680 ，Chl ，Y などによる周辺分子の酸化により生成する有機ラジカル（R ）が O と反応し，ペルオキ
シルラジカル，有機ペルオキシド，さらにアルコキシルラジカルを生成する ．
⑦ プラストセミキノンラジカル（PQH ）の O 還元による O 生成 ．
PQH ＋O → PQ＋O ＋H
いったん O が生成すると，プラストキノール PQH を酸化し PQH を再生する．
O ＋PQH → PQH ＋H O

ある．本節の活性酸素種の表記は IUPAC Recommendations 2000 およびその簡略版

表２に活性酸素測定法を目的および分子種ごとに整理に従う（表 1）．ここにした．葉緑体やチラコイド膜を用いると，光照射時の活含まれる分子種の性質は，それぞれの酸化力（酸化還元性酸素種生成をリアルタイムで検出できる．これは活性電位）および，ターゲットとの反応性（二次反応速度定

酸素の生成速度または定常濃度測定である．組織からの数）により異なる ．

過酸化物，酸化生成物抽出では，含量が得られる．これ

表 1：活性酸素種の種類と性質
活性酸素種

表記

スーパーオキシド（アニオン）ラジカル
過酸化水素

O

ヒドロキシルラジカル

HO

一重項酸素

O

過酸化脂質（有機ペルオキシド）
脂質（有機）ペルオキ
シルラジカル
アルコキシルラジカル

LOOH(ROOH)
LOO(ROO )LO(RO )ラジカル連鎖反応の中間体で定常濃度は低い．

一酸化窒素
ペルオキシ亜硝酸NO
ONOO

酸化力は中程度で，還元剤としても働く．中性分子で生体膜を通過する．
NO と O の結合で生成する．きわめて反応性が高い．ラジカルではない．

180

HO

酸化力は中程度で，還元剤としても働く．プロトン化（pK a＝5.5）したスーパーオキシド
ラジカル HO は，アニオン型より酸化力が強く，中性分子なので膜にも溶け込む．
酸化力は中程度で，還元剤としても働く．中性分子で生体膜を通過する．金属触媒が存在しなければきわめて安定．ラジカルではない．
酸化力，反応性ともに極めて大きく，ほとんどの有機，無機分子と拡散律速で反応し酸化す
る．
酸化力，反応性ともに大きい．励起電子のエネルギー準位により Σ 状態と Δ 状態に区別される．本稿で O の表記は後者の意． Σ は寿命が極めて短く生化学的に重要でない． Δの寿命は H O 中で 3.8μs，D O 中で 62μs．
酸化力，安定性は H O と似ている．ラジカルではない．

HO と似た性質を持つ．酸化力が強く，寿命が短い．

活性酸素，抗酸化物の測定法

表 2：試料の種類と活性酸素種に応じた分析法
O

O

HO

HO

LOOH

その他

生組織，細胞 DanePy
蛍光減少
SOSG 蛍光NBT 染色蛍光プローブDCF 蛍光DAB 染色DCF 蛍光

DCF 蛍光
※化学発光
DCF 蛍光

組織抽出液

LOOH 分析（LC/MS/MS)※※FOX 吸光
ルミノール
発光

※※

酸化タンパク質
Spy-LHP 蛍光TBARS（MDA) ASA/DHA
GSH/GSSG

葉緑体

DanePy蛍光減少

チラコイド膜 DanePy
蛍光減少
His/RNO 法

O 測定（カタラーゼ法)

Spy-LHP 蛍光
TBARSCyt c 還元
O 測定
スピントラップ （カタラーゼ法)
ESR

ス ピ ン ト ラップ Spy-LHP 蛍光
ESR
TBARS

特異的消去剤 N イ オ ン (水 SOD系)
β‑カ ロ テ ン (膜
系)
その他

カタラーゼ

重水（D O）中では寿命が 20倍長
いため，検出レベルが上がる．

ESR（Asc)
DCF 蛍光スピントラップ
ESR(マンニトール，
Hepes など）※※※
Fenton 反応による 生 成 は キ レー
ト 剤（DTPA など）で 抑 え ら れる．

ジクロロジヒドロフルオレセイン（DCFH ；非蛍光）は HO などによって非酵素的に酸化され蛍光性のジクロロフルオレセイン（DCF）となる．過酸化物（H O ，ROOH）による DCFH 酸化はペルオキシダーゼに依存する．すなわち細胞での DCF 蛍光増大は非特異的な活性酸素種増大の指標である．DCFH は光でも酸化されるため，光照射する試料には適さない．光酸化を受けにくい hydroxyphenyl fluoresein, aminophenyl fluoresein（Alexis Biochemicals）が販売されているが，植物試料への適用例はまだない．
※ 細胞内 HO の特異的検出法は確立されていない．
※※ 組織抽出液では ASA 等の還元剤が遊離金属イオンの触媒により自動酸化され，O が生じる．O は不均化して H O を生じ，HaberWeiss 反応（金属イオン触媒による H O の還元的分解）で HO が生成する．すなわち，抽出液で検出される O ，HO は，遊離金属イオンと還元剤の存在を示しているにすぎない．
※※※ HO はほとんどの化合物と非選択的に反応するため，どんな物質も濃度に応じて HO を「消去」する効果をもつ．すなわち HO に「特異的な」消去剤があるわけではなく，ターゲットの濃度より過剰に（100mM 程度）添加しても測定系，反応系に影響を与えない化合物（Hepes など）が消去剤として利用されるのである．

らの測定ではすぐれた定量性が得られる．一方，蛍光プ

つ不対電子のスピンエネルギー準位（磁場のない状態でロープなどを用いる in situ 測定では生成の積算量を見は縮退している）を分裂させ，マイクロ波（数 cm 波長の積もるが，定量性は高くない．このように測定法によっ電磁波）を照射し，共鳴により電子スピンが遷移するとて得られるパラメータが異なることに注意が必要であきの吸収を測定する．この共鳴エネルギーの大きさは不る．また検出法（試薬）の活性酸素種に対する特異性に対電子の微環境（分子内の隣接原子など）によって決まも注意を払う必要がある．表２にはさらに，個々の活性るため，ラジカル分子種ごとに特徴的なスペクトルが得酸素種の特異的消去剤を記載した．検出されたシグナルられる．紫外・可視領域の分光法とは異なり，マイクロが特異的消去剤によって低下すれば，その活性酸素種が波の波長は固定したまま，磁場強度を変え（「掃引する」

検出された証拠のひとつとなる．

という）ラジカル分子の共鳴エネルギーレベルを変化させることでスペクトルを得る．マイクロ波吸収は微弱で1.d.3 葉緑体，チラコイド膜を用いた
in vitro 活性酸素測定
1.d.3.1 電子スピン共鳴
電子スピン共鳴（ESR，同じものを電子常磁性共鳴

あり，S/N 比改善のために磁場変調という一種の微分測定（これを高周波数で行い平均化してノイズをキャンセ
ルする）を行う．通常 ESR スペクトルとして示されるのはこの一次微分シグナルである．測定原理の詳細は成書を参照されたい．

EPR ともいう）測定は分光法であり，不対電子をもつ分生物試料のラジカル測定に最もよく用いられるＸバン子すなわちラジカルを直接検出する唯一の方法である．

ド ESR のマイクロ波領域は H O の分子振動と共鳴す

ESR では試料を強い磁場の中におき，ラジカル分子がもる．この不都合な水の影響を抑えるため，水系・常温で2009 低 温 科 学

vol.67181

の測定には，扁平な石英セルを用いる（注：凍結状態での測定には通常の石英管を使用する）．扁平セルは厚さ0.4mm であり光照射を行う場合の光路長が短いため，試料のクロロフィル濃度を高くできる．
O や HO などは寿命が短く常温での定常濃度がきわめて低い．これらの測定には，ラジカル種と付加反応して寿命の長い有機ラジカルをつくる化合物（スピントラップ剤）を加え，生成したラジカル付加物（spin adduct）を検出する．スピントラップ剤なしで直接測定できるアスコルビン酸ラジカル（Asc ）は，スピントラッ
プ剤の使用が難しい細胞や組織でのラジカル生成の指標として有用である（1d.4.1に記載）．
（Asc ラジカルはモ
ノデヒドロアスコルビン酸，セミデヒドロアスコルビン酸，アスコルビン酸フリーラジカルとも標記される）しかし，アスコルビン酸（AsA）酸化による Asc 生成は活性酸素に対する特異性がなく，in vitro での特異的活性
酸素検出には不適当である．
1.d.3.1.1 P S II膜への光照射で生じる O ，HOのスピントラップ検出
スピントラップ剤自体は ESR サイレントであり，ラジカル付加物となって ESR シグナルを生じる．付加するラジカルの種類により，ラジカル付加物の超微細結合定数が異なり特異的なスペクトルがあらわれる．水溶性
スピントラップ剤で O ，HO 検出に比較的よく使われる の は N -tert-butyl-α-phenylnitrone (PBN）， α-(4pyridyl 1-oxide)-N-tert-butylnitrone (POBN）， 5,5dimethyl-1-pyrroline N -oxide (DMPO）である．PBNや POBN の場合は，O 付加物と HO 付加物はいずれ

図 2：DM PO スピントラップ法による O ，HO の検出．Ａ)
DM PO の 構 造 と DM PO-OOH，DM PO-OH の 生 成 反 応．
DM PO-OH はこの他にも DM PO の直接酸化反応によっても生じる．Ｂ) PSII 膜標品への光照射による O 生成の検出．
光照射により，DMPO-OOH に特有の２，４，４，２本に分裂したシグナル（◆）が観測される．光照射停止後約１分で，DM PO-OOH シグナルは消失し，DMPO-OH（○）が生成す
る．

も６本線のよく似たシグナルを生じ，両者を一目で判別することは難しい．これに対し DM PO の O 付加物

ある．最近，DMPO-OOH より寿命の長い O 付加物を（DMPO-OOH）と HO 付加物（DM PO-OH）のスペクト

つ く る 5-(diethyloxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline

ルは明確に区別できる（図 2）．DMPO-OOH シグナルのN -oxide（DEPMPO）およびその類縁体の使用例が増え検出は O 生成の証拠となる．これに対し，DM PO-OHてきている ．

シグナルの検出から HO 生成を立証する際は注意を要

光合成反応系での使用に際してはスピントラップ剤がする．DMPO-OH シグナルはさまざまな酸化系で容易に還元剤的性格をもち電子供与体または阻害剤となりうる検出されるが，DM PO-OH は DM PO の直接酸化反応でことに注意しなければならない．とくに O の検出にはも生じる．また DM PO-OOH も１分程度で DM PO-OH

比較的高濃度（50‑100mM ）のスピントラップ剤が必要に変化する（図２の実験例でも，DM PO-OOH からのであり，その影響を別の実験で評価する必要がある．

．HO 生成の検証には，
DMPO-OH 生成が観測された）

また，複数のラジカル種が同時に生成すると，それぞHO によらない DM PO-OH 生成の可能性を排除する実れの付加物シグナルが重なり複雑なスペクトルが得られ

験，すなわち（i）Fenton 反応を抑制するカタラーゼやキることがある．この場合は，予測される個別のスペクトレート剤により DM PO-OH シグナルが低下する，（ii）

ルを，主要なラジカル付加物の超微細結合定数（文献値）（iii）ジメチル
SOD で DMPO-OH 生成が抑制されない，からシミュレーションし，それらを線形結合させ，観測ス ル ホ キ シ ド 添 加 に よ り DM PO-OH シ グ ナ ル がしたスペクトルを近似する．これにより，もとのスペク

DMPO-CH シグナルに変化する，などの確認が必要でトルを構成する成分とそれらの存在比率（※）を推定す

182

活性酸素，抗酸化物の測定法

る．この機能は ESR 装置のデータ解析システムに備えようにする），下端をキャップで閉じる．

られている．
（※スピン濃度の比であり，ラジカル付加物

３．フラットセルの平たい面が照射光に対し正面となるの定常濃度比を示す．ただしラジカル付加物ごとに寿命

よう ESR キャビティ内に固定し，チューニングをが違うので，付加物の濃度比がもとのラジカルの濃度比

行う．

を示すわけではない）

４．以下の測定条件で磁場の掃引を行う．暗所ではラジカル付加物は検出されない（図 2）．

［実験方法］

マイクロ波出力5mW

１．用意するもの

磁場変調周波数

100kHz

磁場変調幅0.079mT

時定数0.3s⑴ キレックス処理水．重金属イオンはラジカル反応を触媒するため，ラジカル測定に用いる水は，重金属の混入を最小限にする必要がある．キレックス

５．試料はそのままで，再度低磁場側から磁場掃引し，100樹脂（バイオ・ラッド，142‑2832）はキレート剤

白色光（1,500W m ，熱カットフィルター使用）をを表面に結合した樹脂である．樹脂 30g を適当なカ

キャビティの窓から照射する．DMPO-OOH のシグ

ラムに充塡し，ここに蒸留水（ミリ Q 水など，できナルが観測される．

るだけ精製した水）１リットルを通し，集める．使６．光照射を止め，再度スペクトルを記録する．DM PO-

用するガラス器具もキレックス水でゆすいでおく．

OOH が DMPO-OH に変化するため，異なるスペク⑵ DM PO 500mM ．DMPO は自動酸化によりラジトルが得られる．

カルとなることがある．試料を加えず DM PO だけ

７．新たに SOD（10units ml ）を添加した試料を調製で ESR 測定を行い，ラジカルが検出されないこと

し，上の４〜６と同様の測定を行う．光照射時のシを確認する．ラジカル種が混入している場合は以下グナルが観測されなくなることから，O 付加物での要領で精製する．
① 器具・容器はなるべくガラスを避け，プラスチッ
ク製のものを用いる．
② DMPO 1g を 9ml のキレックス水に溶解し，約1.8g の活性炭を加え，よく撹拌する．

あったことが確認できる．
８．Fenton 反応による HO 生成を阻害するカタラーゼ（60,000units ml ），キレート剤（0.5mM DTPA）
を添加しても，光照射による DMPO-OOH シグナル
生成および光照射後の DMPO-OH シグナル生成は③ ガラスフィルターろ過により活性炭を除く．
（ガ

影 響 を 受 け な い．こ の こ と か ら DMPO-OH はラスフィルターがない場合，遠心し，上清を 0.45

DM PO-OOH から変化して生じたもので，HO と

μm メンブレンフィルターでろ過する）

DM PO の付加反応によるものではないと考えられ④ 濃度測定のため，10μl 程度を 95％エタノール
で 10,000倍希釈し，232nm の吸光度（ε＝7,700
M cm ）から希釈前の濃度を計算する．

る．すなわちこの系では検出可能なレベルの HO は
生成しなかったといえる．
1.d.3.1.2 アスコルビン酸ラジカル（As c ）の測定

⑤ キレックス水で 500mM に希釈し，プラスチッ

in vitro でのAsc ラジカル測定は，活性酸素生成の指ク製マイクロチューブ中，−80℃冷凍保存する．
こ

標より，むしろチラコイド膜や葉緑体での AsA や Ascの状態で数ヶ月間は安定である．

ラジカルそのものの代謝を解析するために行う．Asc ラ⑶ ホウレンソウチラコイド膜から調製し た PSII
膜 ．

ジカルが PSI の電子受容体であること ，また，AsA がチラコイド内腔で PSII，PSI の電子供与体となり Asc⑷ スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）例えば
Bacillus sp.由来 Mn-SOD（和光純薬 195‑10291）⑸ 光照射用の窓を備えた ESR キャビティ．
⑹ 熱カットフィルターを備えた光源．

ラジカルに変換されることの証明に用いられた．

1.d.3.2 チラコイド膜への光照射による O生成の測定（C yt c 還元法)
酸化型シトクロム c (Cyt c III ）が O により還元さ

２．PSII 膜（0.5mg Chl ml ）を 20mM M ES-NaOH，

れると 550nm に強い吸収をもつ還元型（Cyt c II ）にな

pH 6.5，10mM CaCl ，100mM DM PO に懸濁し，る（（還 元 型)−(酸 化 型）の 分 子 吸 光 係 数 差：ε ＝

石英フラットセル（４×45mm，厚さ 0.4mm）に入

19,600M cm ）．

れ（セルの上端にプラスチックの注射器（1ml）を接続し，下端からゆっくり吸引する．気泡を残さない
2009 低 温 科 学

vol.67

Cyt c III ＋O → Cyt c II ＋O

(1)

183

チラコイド膜に酸化型 Cyt c を加え，光照射しながらまた，［HisO ］は p-nitrosodimethylaniline（RNO）

550nm の吸光度増大により O を検出する．
吸光度増大

を酸化し，脱色する（λ ：440nm）．これを分光学的にが SOD 添加により阻害されれば O 生成の証拠とな追跡することができる．

る．O に よ る Cyt c 還 元 反 応 の ２ 次 反 応 速 度 定 数［HisO ］＋RNO → RNO ＋生成物

1.4×10 M s （pH＜7.4）に基づき，Cyt c 還元速度(8)から O の定常濃度が求められる．なお O が Cyt c で測定にはクロスイルミネーションのできる分光光度計

100％捕捉されるなら，（Cyt c 還元速度）＝（O 生成速を用い，検出器には干渉フィルターで 440nm の光のみ度）となるが，実際の捕捉率は 100％ではなく，この方法

を透過させ，試料の照射には 440nm より長波長側の光での O 生成速度見積もりは過小になる．測定にはクロを用いる．

スイルミネーションのできる分光光度計が必要で，検出O の寿命はアジ化物イオン（N ）で短くなり，重水器には干渉フィルターで 550nm の光のみを透過させ，（D O）中で長くなる（つまり O の定常濃度が高くなる）

試料の照射には 550nm より長波長側の光（650nm 以下

ことを利用し，コントロール実験として，上の２つの反をカットする赤色フィルターなど使用）を用いる．

応が，（i）アジ化物イオンにより抑制され，（ii）D O 溶

1.d.3.3 チラコイド膜，葉緑体での H O 生成速度

媒中で促進されることを確認する．この検出法により，(O 測定/カタラーゼ法）

Telfer らは，エンドウマメ PSII 反応中心に光照射した

光化学系 （PSI）での O の光還元で生成する O は
H O と O に不均化する．この反応は酸素電極で酸素消費として測定できる．

とき O が生成することを示した ．
1.d.3.5 P S II膜標品での過酸化脂質生成
感度の高い過酸化脂質検出試薬として，ペリレン環に2O ＋2e →2O(2)

2O ＋2H →H O ＋O(3)

O ＋2e ＋2H →H O

(4)トリフェニルホスフィンを結合させたジフェニル‑1‑ピ
レニルホスフィン（DPPP）が用いられてきた．ホスフィンが過酸化物と反応して生成するホスフィンオキシドが強い蛍光をもつ．最近開発された Spy-LHP は，DPPP にカタラーゼを充分量加えると，H O が O と H O に不長鎖アルキルを結合させ親油性を高めており，H O お

均化される．

よび他の活性酸素種との反応性が極めて低く，過酸化脂
H O →H O＋1/2O(5)

質にほぼ特異的である ．励起・発光波長域が 500〜550
nm であること，nM レベルの検出感度をもち少量の試料

カタラーゼを加えたときと加えないときの O 消費速度で測定できることからクロロフィルによる消光を低く抑の差 ΔO (μM min ）を求め，これを２倍することで，えることができ，植物試料に適している．検量線作成の

H O 生成速度 v

標準過酸化物には m-chloroperbenzoic acid を用いる．

(μM min ）を求める．
v

＝2×ΔO

(6)

このカタラーゼ有無の差をとる方法は，光合成の電子供与体が H O で O が発生する場合でも，それ以外の場

水溶性の過酸化脂質標準物としてよく用いられる tertbutyl hydroperoxide や cumene hydroperoxide は SpyLHP との反応性が低く，本法の標準物としては不適である．

合でも同じように適用できる．インタクト葉緑体では，酸化的ストレスによってアスコルビン酸ペルオキシダー［実験方法］

ゼが失活したとき，葉緑体外に H O が放出される速度

１．用意するものを測定することができる ．

⑴ Spy-LHP ストック溶液．Spy-LHP（同仁化学，

1.d.3.4 P S II反応中心標品での O 生成

S 343）をアセトンに溶解し，1mM 溶液とする．ガ(His /R NO 法）

ラス容器中，窒素雰囲気下，−20℃で保存できる．酸

O が生成し，His（またはイミダゾール）が存在する

素存在下では次第に酸化される ．

と，両者はペルオキシド中間体［HisO ］を形成し，最終⑵ Spy-LHP 測定溶液（用時調製）．上記ストック溶

的に安定な酸素付加物 HisO となる．すなわち His 依存

液をエタノールで希釈し，2.7μM とする．一測定あO 消費は O 生成の指標となる．

たり 2.7ml 使用する．

O ＋His →［HisO ］→ HisO

184

(7)

⑶ 標準 LOOH．m-chloroperbenzoic acid のエタ
ノール溶液（25nM 〜250nM ）を調製する．
活性酸素，抗酸化物の測定法

２．PSII 膜標品を 50mM M es-NaOH，pH 6.0，35mM

元剤が鉄イオン等で容易に酸化され減少すると同時

NaCl に懸濁し（50μg Chl/ml），光照射する．経時に，還元された鉄イオンが O を還元し O を生成

的に 0.3ml を取り，Spy-LHP 測定溶液 2.7ml と混することで H O ，HO ，有機ラジカル生成の原因と合する．
（Chl 終濃度 5μg/ml となる．25μg/ml までなる．キレート剤の添加が不可欠である．アルデヒ

上げてもよい）ド抽出の際は，過酸化脂質の生成を防ぐため還元剤

３．暗所で 30分間静置した後，膜画分を遠心（18,000×により除き，上清を得る．上清中の蛍光体
g ，５分）を加える．
⑶ 検量線の作成．試料からの分析物の回収率を見積

は暗所で数時間安定である．

もるため，量の異なる標準化合物を試料に加え，検４．励 起 光 524nm で の 535〜537nm の 蛍 光 を 測 定 する．

量線を作成する．
1.d.4.2 過酸化水素，有機ペルオキシドの測定

５．検量線およ び 消 光 補 正 は 次 の よ う に 得 る．標 準

H O と二価鉄イオンにより生成した HO とキシレ

LOOH（各濃度）に，PSII 膜標品を加えたもの（＋

ノールオレンジによる発色を定量する FOX アッセイ，

PSII）と加えないもの（−PSII）を調製する．光照

ペルオキシダーゼ反応による酸化生成物の蛍光（ホモバ

射せず，Spy-LHP 測定溶液と混合，静置，遠心し，ニリン酸）や発光（ルミノール）を測定する方法がある．

上 清 を 得 る．＋PSII，−PSII 試 料 そ れ ぞ れ の 標 準

いずれの測定でも H O だけでなく有機ペルオキシド

LOOH 濃度ゼロでの蛍光強度を a ，a ，それぞれの（LOOH，ROOH）も検出される．有機ペルオキシド由来

検量線の傾きを b ，b とする．クエンチング係数はのシグナルを見積もるために，カタラーゼを加え H O

b /b であり，光照射後の試料の蛍光強度 x が得らのみを消去した試料で同じ測定を行う．Queval らはれ た な ら，そ れ に 対 応 す る 過 酸 化 脂 質 濃 度 は

H O の抽出・検出条件を詳細に検討し，次のような注意

x−a ×b /b となる．また光照射前の PSII 膜に事項を挙げている ．

含まれる LOOH 濃度は， a −a ×b /b となる．

⑴ 抽出：酸で抽出，中和し塩を除く．低温ですばやく行う．試料量と抽出液量の比を一定にする．

1.d.4 組織抽出液の過酸化物・酸化生成物
測定⑵ 抽出後の処理：AsA をアスコルビン酸酸化酵素（AOX）で酸化し除去する（AsA 除去は Cheesemanの推奨する脱気処理

1.d.4.1 組織からの抽出に関する諸注意に代わるもので，より優れている）．イオン交換樹脂でフェノール類を除く．カタ

組織から抽出して測定できるのは，比較的安定な物質

ラーゼ処理したネガティブコントロールを作る．

であり，活性酸素としては H O や LOOH などの過酸化⑶ アッセイ法と定量：蛍光またはルミネセンス測定

物に限られる．また，細胞内活性酸素生成の間接的な指が高感度である．内部標準を加えたコントロール試標として，過酸化脂質が分解して生じるアルデヒドや，料を作成する．

酸化タンパク質など，活性酸素による酸化生成物の増大，⑷ その他コントロール実験：抽出液の体積と測定値

および抗酸化物である AsA や GSH の酸化，減少も測定の直線的相関性を確認．抽出および試料調製時のできる．これらの物質も充分安定ではなく，また酸化還H O 収率を確認．

元を受けやすいため，組織からの抽出に際してはつぎのような注意が必要である．
⑴ 分析物の安定性．過酸化物は−80℃で保存していてもしだいに分解する．試料調製後はなるべく早く

ここでは，シロイヌナズナ葉からの H O 抽出と測定例を紹介する．ルミノール化学発光法の方が FOX法より感度が高いが，分光光度計で測定する後者の方が汎用性が高いため，FOX 法を例示した．

抽出し測定する必要がある．アルデヒドは比較的安定だが，過酸化脂質の分解で次第に生成するため，［実験方法］

植物材料を長期間凍結保存することは望ましくな

１．用意する試薬

い．AsA，グルタチオン測定の試料は凍結保存せず，⑴ 0.2M 塩酸．

フレッシュな植物材料から測定試料を当日抽出し，⑵ 0.2M NaOH．

測定する．

⑶ AOX．

⑵ 抽出操作に伴うアーテファクト．組織の磨砕により鉄イオン等が結合タンパク質から遊離すると，還2009 低 温 科 学

vol.67⑷ カタラーゼ．
⑸ FOX 指示薬（X 2）．0.5mM 硫酸アンモニウム第185

一鉄，0.2mM キシレノールオレンジ，0.2mM ソル
ビトール，２％ (v/v）エタノール，50mM 硫酸

ル酸を 0.65％ (w/v）溶解する．
２．試料 0.5g を乳鉢に入れ，抽出溶液 10ml と海砂を

⑹ H O 標準液（1.0，2.0，5.0μM ）．240nm での分子吸光係数 ε＝43.6M s を用いる．

加えよく磨砕する．
３．室温で 20分静置した後，遠心分離（3,000×g ，10分）

２．葉 100mg を液体窒素凍結下で磨砕し，さらに 0.2
M 塩酸 20ml を加え磨砕する．

する．
４．ふた付遠心管２本を用意し，一方には上清 1ml と３．遠心上清 5ml をとり，50mM Na HPO 水溶液 40

TBA − 液 1ml を混合する．もう一方には上清 1

ml を加え，0.2M NaOH で pH 5に調整し，体積をml と TBA ＋ 液 1ml を混合する．どちらも激しく

50ml にする．

振とうし，沸騰湯浴中で 25分間加熱する．

４．0.5ml をとり，AOX を 2U ml となるよう加え，
５分間インキュベートする．

５．試料を冷まし（室温で５分，氷中で５分），遠心分離（3,000×g ，10分）し，上清を得る．

５．AOX 処理後の試料を２つに分け，一方にカタラー

440nm，532nm，600nm の吸光度を測定し（TBA(−)

ゼを 25U ml となるよう加え，５分間インキュは 440mm の測定不要），以下の計算式から M DA 当量

ベートする．

を求める．

６．試料液（(＋）カタラーゼまたは（−）カタラーゼ）
100μl，FOX 指示薬（X 2）
0.5ml，蒸留水 0.4ml を混合する．
７．５分以上おいてから，A −Aを測定する．

８．検量線は，各濃度の H O 標準液 100μl に FOX 指示薬（X 2）
0.5ml，蒸留水 0.4ml を加え，作成する．
９．検量線から試料の過酸化物濃度を求める．カタラー

TBA ＋ −AA

A
A

TBA ＋ −TBA − −A
TBA ＋ −A

M DA 当量 nmol ml

TBA −
TBA ＋

＝X

(9)

×0.0571＝Y (10)＝ X−Y /157,000 ×10 (11)

1.d.4.4 酸化タンパク質（カルボニル化タンパク質）
測定

ゼ添加試料で得られる値は LOOH に由来すると見タンパク質のアミノ酸残基のうち，Cys，Met，His，

なせるので，試料の H O 含量は（カタラーゼ不添

Trp，Tyr，Lys，Arg，Pro は活性酸素によって酸化さ加）−（カタラーゼ添加）の値から求める．

れやすい．このうち Lys，Arg，Pro の酸化でカルボニル

1.d.4.3 過酸化脂質分解物（チオバルビツール酸反応基が生じる ．また，Lys への MDA 付加や Cys，His へ

物 TB AR S ）測定
過酸化脂質の非酵素的分解産物であるマロンジアルデのアクロレイン（脂質由来アルデヒドのひとつ）付加によって も カ ル ボ ニ ル 基 が 生 じ る．こ れ に 2,4-

ヒド HOCCH CHO（M DA）などのアルデヒドとチオバ（DNPH）
を反応させ（DNP 化），
dinitrophenylhydrazine

ルビツール酸（TBA）を酸性条件で反応させ，生成する発色させて定量する．一測定に試料 1g 程度が必要で，試

赤色の色素（チオバルビツール酸反応物；TBARS）を分料調製から１日以内で終了する．
実験例を下に紹介する．

光学的に定量する．過酸化脂質生成の指標として広く用この DNP 化タンパク試料の電気泳動を行い，抗 DNP

いられている．アルデヒドは比較的安定であり，抽出前

モノクローナル抗体を一次抗体としたイムノブロッティの植物試料は−80℃で数日間保存できる．一測定に試料

ングによって修飾タンパクのバンドを特定すれば，ペプ

0.5g 程度を用いる．試料に含まれるアントシアニンな

チドシークエンシングからカルボニル化タンパク質が同ど色素の影響を除くために，TBA を含まない溶液で同定できる．また，MDA などアルデヒド修飾タンパク質にじ処理を行った試料との差をとる．TBARS には M DA

対する抗体がいくつか市販されている（日油㈱，東京）．

以外のアルデヒド反応物も含まれるため，MDA を用い

Yamauchi らた検量線から計算した値を「MDA 当量」と表わす．

高温ストレス処理を行ったシロイヌナズナ，ホウレンソ

は，抗 MDA 修飾タンパク抗体を用い，

ウ で は，そ れ ぞ れ OEC33 お よ び LHCII が 優 先 的 に［実験方法］

MDA 修飾を受けることを明らかにしている．

１．用意するもの⑴ 抽出溶液．エタノール：水，80：20(v/v）［実験方法］⑵ TBA − 液．20％ トリクロロ酢酸，0.01％ ブ

１．用意する試薬

チルヒドロキシトルエン（BHT）⑶ TBA ＋ 液．上の TBA − 液にチオバルビツー
186⑴ 抽出メディウム．10mM リン酸ナトリウムバッ
ファー，pH 7.4，1mM EDTA，2mM DTT，0.2％
活性酸素，抗酸化物の測定法

（v/v）Triton X-100，1mM phenylmethane sulfonyl

を受け，過酸化脂質となる．不飽和脂肪酸のペンタジエ

fluoride（PMSF）

ニル構造（−CH＝CH−CH −CH＝CH−）に対し， O⑵ 10mM DNPH 溶液（2M 塩酸中）は不飽和結合をつくる２つのＣ原子にエンドペルオキシ

２．洗った葉 1g を乳鉢に入れ，4ml の抽出メディウム

ドの形で付加し，結果として４種のヒドロペルオキシドと少量の海砂を加え，磨砕し，ミラクロス（Calbio-（R-OOH）が生じる．一方，HO などラジカルによる酸chem）一層でろ過後，遠心分離し（27,000×g ，20化では，中央の C 原子の水素引き抜きが優先的に起こ分），上清を得る．これを試料とする．

り，ペンタジエニル構造の両端の C 原子にしか O は付

３．タンパク濃度を測定しておく．一測定あたり少なく
とも 0.5mg タンパク質を用いる．

加しないため，２種類のヒドロペルオキシドしか生成しない．中央のＣ原子の隣のＣ原子に-OOH をもつ過酸化４．核酸を除くため，試料に１％（w/v）硫酸ストレプト

脂質は O 付加反応でのみ生成するので O マーカーとマ イ シ ン を 加 え，20分 間 静 置 し，遠 心 分 離 す る

な る（図 3) ．リ ノ レ ン 酸 の 過 酸 化 物 で は， 10-（2,000×g ，5分）．

hydroperoxy-8, 12, 15 (E,Z,Z) octadecatrienoic acid,５．上清（200μL）に 10mM DNPH 溶液 300μL を加15-hydroperoxy-9, 12, 16 (Z,Z,E) octadecatrienoic

え，混合する．ブランク試料には 2M 塩酸を同量加acid の２つである．組織から脂質画分を抽出し，過酸化える．室温で１時間静置する．

物をアルコールに還元し安定化させてから，LC/MS/

６．トリクロロ酢酸を 10％となるよう加え，遠心し，沈MS で分離・定量する．このとき，ラジカル反応で生成す殿したタンパク質を 500μL エタノール／酢酸エチ

る他の LOOH アイソマーも定量し， O 付加反応とラジル（1：1）で３回洗浄する．

カル酸化反応の比を求める．Triantaphylides ら

７．沈殿を 6M グアニジン塩酸，20mM リン酸カリウ
ムバッファー，pH 2.3に溶解する．
８．A

はこの方法で，さまざまな酸化的ストレスを与えたとき葉で O が生成することを示した．

から カ ル ボ ニ ル 含 量 を 求 め（ε＝22.0mM

1.d.4.6 アスコルビン酸(As A)，グルタチオンの含cm ），mg タンパク質あたりのカルボニル含量を計

量および酸化還元レベルの測定

算する．
1.d.4.5

AsA とグルタチオンは植物における主要な抗酸化物

O により特異的に生成する過酸化脂質のであり，組織中に mM レベルで含まれる．生細胞ではほ検出

ぼ９割が還元型，１割が酸化型であり，これらの中間のリノール酸やリノレン酸など多価不飽和脂肪酸は酸化酸化状態にあるラジカル分子（微量）との三者間で化学

図 3：多価不飽和脂肪酸と活性酸素の反応で生成する過酸化脂質．左の経路はHO ，HO などラジカルによる酸化，右の経路は Oの直接付加反応．枠で囲んだ分子種が O 付加反応のマーカーとなる．
2009 低 温 科 学

vol.67187

平衡が成立している．還元型・酸化型の比率，および両オサゾンに変換し HPLC で分析する方法が行われてき者の合計量は，植物が受ける酸化ストレスの種類・程度

た．この方法は感度および特異性に優れており，食品成によってダイナミックに変化するだけでなく，抗酸化物

分表に記載のビタミン C 含量は基本的にこの方法にの生合成・分解速度にも影響される．組織中の抗酸化物依っているが，操作が煩雑で時間がかかる．ここでは最の酸化還元比率を変化させず，かつ高効率で抽出し，測近適用例が増えてきた，α，α′‑ジピリジルを用いる方

定するには，いくつか注意が必要である．(1）抗酸化物

法

は，溶存酸素による酸化（自動酸化）を受ける．例えば測定あたり 1g 程度の試料が必要である．AsA は凍結試

AsA は Fe /Fe など遷移金属イオンの共存下で容易

料中でも酸化されるため，試料を採取したその日のうちにデヒドロアスコルビン酸（DHA）に酸化される．DHAに抽出・定量する必要がある．

は不安定で分解しやすい．(2）共存する抗酸化物どうし

1.d.4.6.1.1 ジピリジル法と，DHA を直接測定する酵素法を紹介する．一の酸化還元反応が起こる．たとえば DHA は還元型グル‑ジピリジルは Fe と反応して 525nm 付近に
α，
α′

タチオン
（GSH）
と酵素的または非酵素的に反応し，AsA

ピークを持つ赤色の化合物を生成する．AsA は酸性条件と酸化型グルタチオン（GSSG）を生じる．これらの反応

下でも Fe をよく還元することから，この性質を用いは特に pH が高い領域で速いため，動・植物・微生物材料て AsA が測定できる．本法は他の抗酸化物の影響を若を問わず，抗酸化物の抽出には通常氷冷した強酸性溶液

干受けるものの，比較的短時間に測定を完了できる．

（トリクロロ酢酸，メタリン酸，過塩素酸，スルホサリチル酸等）を用いる．試料等の制約で中性付近の pH での抽［実験方法］

出が必要なときは，自動酸化を防ぐため 1〜5mM 程度

１．用意する試薬の EDTA を添加する．また，試料は抽出したその日のう⑴ ６％トリクロロ酢酸（抽出用）．冷蔵保存可

ちに全て測定する．

⑵ 10％トリクロロ酢酸．冷蔵保存可

一般に抗酸化物の測定では酸化型・還元型のいずれか一方を検出する．抽出液中の酸化型と還元型の総量を求⑶ 0.2M リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.4）
．常温保存可

めるには，全てを酸化または還元した後に測定を行って⑷ 10mM DTT（⑵に溶解させる）．用時調製総量を求め，別に同じ試料を用いて酸化型・還元型の片⑸ 0.5％ NEM ．用時調製方を化学的にマスクし，残った一方のみを測定する．両⑹ 42％ (w/w）リン酸．常温保存可者の差から酸化型と還元型の量を求める．これらの前処⑺ 4％ α，‑ジピリジル（和光純薬）．70％エタノーα′理に用いるジチオスレイトール（DTT）や N −エチルマ

ルに溶解させる．冷蔵保存可

レイミド（NEM ）は，測定前に除去する必要があり，操⑻ ３％ FeCl ．冷蔵保存可

作の煩雑さ，工程の多さから微量定量ではしばしば誤差⑼ AsA 標準液
（検量線用，0〜1.0mM ）．６％トリクの要因となる．近年，測定に影響しない新規試薬の使用（例えば DHA の還元剤としてのトリス［2‑カルボキシエ

ロロ酢酸に溶解させる．用時調製
２．植物組織からの抽出

チル］フォスフィン) ，総量からではなく還元体・酸化⑴ 切り取った組織 0.4〜1.2g（洗った場合は表面の体をそれぞれ直接測定する方法などが開発され，これら水をペーパータオルなどでよく拭き取る）を計量（gの問題は徐々に解消されつつある．

新鮮重あたりで AsA 量を求める場合）し，液体窒素

1.d.4.6.1 アスコルビン酸（As A）とデヒドロアス
コルビン酸（D HA）

で予め冷却した乳鉢に入れる．
⑵ 液体窒素を加え，乳棒で粉末になるまですり潰す．

活性酸素により AsA が Asc ラジカルに酸化され，不液 体 窒 素 が 完 全 に 気 化 す る 前 に，氷 冷 し た ６％均化反応で DHA が生じる
（後述 1.d.5.1）．DHA は酵素

TCA 0.8ml を加え，溶解と同時に TCA が試料にに よ り AsA へ 還 元 再 生 さ れ る が，AsA 酸 化 速 度 が浸潤するように，乳棒で擦ってこれを溶かす（液体DHA 還元速度を上回れば AsA/DHA 比が低下する．ま窒素が蒸発してしまうと，粉砕した試料の AsA がた，DHA は分解しやすいため，DHA の蓄積は［AsA＋

空気に触れ，低温でも酸化されてしまう．その前に

DHA］プール全体の量の低下につながる．

酸性にしてしまうことが重要である．TCA を加え

従来，AsA の測定は，ジクロロインドフェノールや活たとき，凍るくらいの方がよい）．乳鉢・乳棒の表面性炭で AsA を酸化させ，生成した DHA をスズ・メタリ

を６％ TCA で洗いながら抽出液を集め，全容を 2ン酸存在下でジニトロフェニルヒドラジンと反応させてml に調整する．多検体の抽出を行うときは，一検体

188

活性酸素，抗酸化物の測定法

の抽出が終わってから次の試料の採取を行う．フェ

［実験方法］

オフィチンあたりのアスコルビン酸量を求める場合

１．用意する試薬は，この抽出液から一部を取ってフェオフィチン定⑴ ６％ トリクロロ酢酸（TCA）（抽出用）．

量に用いる．

⑵ 0.2M リン酸カリウム緩衝液（pH 7.4），1mM⑶ 抽出液を 10,000×g ，4℃，10分間遠心し，上清をEDTA．

新たな試験管に移す．これを測定試料とする．

⑶ 0.1M リン酸カリウム緩衝液（pH 6.0）
，1mM

３．表３に従い，新たな試験管に，試料，試薬を１）〜10）の順に混合していく．
４．すべてを加えた後，42℃恒温漕で 40分間加温する．
５．A

EDTA．
⑷ 200mM GSH．

を測定し，（本試験)−(盲検）の値から検量線に⑸ AOX（東洋紡，0.1U/μl）．
0.5mM AsA，0.5mM EDTA，5mM リン酸ナトリ

より AsA 濃度を求める．

ウム（pH 5.6）混 合 液 中 で A

1.d.4.6.1.2 アスコルビン酸オキシダーゼ（AO X）･の 減 少（ε＝14.0

mM cm ）から求め，１分間に 1μmol の AsA を

デヒドロアスコルビン酸レダクターゼ法

酸化する酵素量を 1U とする．

AsA の紫外吸収は，DHA に酸化されると消失する．

⑹ DHA レダクターゼ（組換え体，イネ由来，0.2U/

AsA の O による酸化を触媒するアスコルビン酸オキシμl) ．

ダーゼ（AOX）を加え AsA を DHA に酸化し，吸光度減0.1mM DHA，2mM GSH，50mM リン酸カリウム

少から AsA 濃度を測定することができる．

（pH 7.8）混合液中で A

2AsA＋O → 2DHA＋2H O A ↓(12)

DHA は，GSH による DHA から AsA への還元を触の増大から求め，１分間に 1μmol の AsA を生成する酵素量を 1U とする．
この酵素量検定に用いる DHA は AsA から以下のように用時調製する（ドラフト内で行う）．ミリ Q 水

媒する DHA レダクターゼを用い，AsA 生成として定量に溶解させた 100mM AsA 水溶液に等容の臭素水する方法を筆者らが最近開発した ．

（３％w/v）を加えて混合した後，窒素ガスを２分程

DHA＋2GSH → AsA＋GSSG A ↑(13)

AsA と DHA の測定値から，酸化型と還元型の比を求

度 吹 き 込 み 過 剰 な 臭 素 を 追 い 出 す．こ れ を ６％
TCA で希釈し 10mM とする．市販の DHA 標品は純度が低く，正確な濃度が決められない．

める．この方法は酵素を用いるため特異性が高い．また，

AOX および DHA レダクターゼは，1mg/ml 以上

DHA レダクターゼ法は，従来の DHA 定量法（DTT での濃度で 0.1M リン酸カリウム緩衝液（pH 6.0），

（総ア
DHA を AsA に還元，総アスコルビン酸量を求め，1mM EDTA に溶解させたものを 100μl 程度ずつマ

スコルビン酸)−(AsA）を DHA 量とする）に比べ，精イクロチューブに入れ，−20℃で保存する．AsA 測定

度が改善されている．

時に活性を検定する．数回の凍結融解は実用上問題な
表 3：ジピリジル法の測定液調製法．
「−」
は，加えないことを示す．単位は ml．
AsA（還元型）量本試験
盲検

2009 低 温 科 学

vol.67

総アスコルビン酸量
本試験

盲検１）測定試料／標準液
0.2
−
0.2
２）10mM DTT−−
0.2３）６％ TCA−
0.2−
４）0.2M リン酸緩衝液
0.6
0.6
0.4
混合後，42℃恒温漕で 15分加温する．
５）0.5％ NEM−−
0.2
混合後，１分間室温におく．
６）ミリ Q 水
0.20.2−７）10％ TCA
1.0
1.0
1.0
８）42％ リン酸
0.8
0.8
0.8
９) ４％ α，‑ジピリジル
0.8
0.8
0.8
α′
10) ３％ FeCl
0.4
0.4
0.4
FeCl を加えたら速やかにボルテックスミキサーで混合する．

−
0.2
0.2
0.4

合計

4.0

4.0

4.0

4.0

0.2
−
1.0
0.8
0.8
0.4

189

い．

を実質的に抑えることができる．DHA レダクター

２．組織からの抽出．1d.4.6.1.1の 2. と同じ．
３．AsA の測定．

ゼは，至適 pH で校正した酵素量から計算される必要量の２倍を用いている．

⑴ 10〜100μl の粗抽出液をキュベットに入れ，３倍
体積の 0.2M リン酸カリウム緩衝液（pH 7.4），１
mM EDTA を加え，中和する．

1.d.4.6.2 グルタチオン還元型（G S H）
，酸化型
(G S S G ）GSH は AsA とほぼ同じ安定性，測定感度であり，同⑵ ここに，
全容が 999μl になるよう 0.1M リン酸カ様の制約がある．グルタチオンレダクターゼ（GR）とジ

リウム緩衝液（pH 6.0），1mM EDTA を加え，A

チオビスニトロ安息香酸（DTNB）を用いた酵素リサイを測定する．

クリング法が第一選択であり，この方法を紹介する．試⑶ 1μl の AOX を加えて，５分放置後，A

を測定

する．

料調製から測定終了まで半日以内である．
本法では，GSSG が GR によって GSH に還元される⑷ AOX 添加による吸光度減少から，測定溶液中のAsA 濃度を求める（ε ＝14.0mM cm ）．
４．DHA の測定（※）．

反応と，GSH による DTNB の還元反応をカップルさせ，DTNB の還元生成物である 5‑メルカプト‑2‑安息香酸の吸収増大（λ ＝412nm）を計測する（図 4）．充分⑴ 上の 3.⑴と同様の操作によりキュベット内で粗抽出液を中和する．

量の NADPH と DTNB が存在し，かつ，反応液中のGSSG 濃度が GR の GSSG に対する Km 値に対して低⑵ ここに，
全容が 989μl になるように 0.1M リン酸

い条件では，GR の GSSG 還元反応が全過程の律速段階

カリウム緩衝液（pH 6.0）
，1mM EDTA を加え，となり，吸光度は添加したグルタチオン濃度，および反Aを測定する．

応時間に比例して増加する．

⑶ 1μl の DHA レダ ク ターゼ，次 い で 10μl の 200
mM GSH を加え，５分後，Aを測定する．

⑷ DHA レダクターゼ反応により増大した吸光度にGSH と GSSG を分別するには，チオール基と不可逆的に結合する試薬を試料に加え GSH をマスクし，過剰量のマスキング剤を除去してから，試料中に残る GSSG

対応する AsA 濃度が，測定溶液中に存在していたを上の測定で求める．紹介する方法

は，抽出にスルホ

DHA の濃度である．

サリチル酸，チオールのマスキングに 2‑ビニルピジリン※ DHA は試料中の GSH によって非酵素的に還元さを用いるもので，従来法（トリクロロ酢酸抽出，NEM にれ減少する可能性がある．非酵素的反応の速度定数よるマスキングの後，エーテル抽出を繰返す）に比べ簡は pH が低いほど小さいので，本法では DHA レダ

略で，回収率のばらつきとスループットが改善されていク ターゼ の 至 適 pH で あ る pH 7.8〜8で は な くる．なお，本法は試料中の他のチオールの影響を受ける

pH 6の緩衝液を用いる．pH 8と pH 6では，GSH

が，組織内の代謝物濃度や酵素の基質特異性を考慮すると DHA の非酵素的反応の速度定数は２桁以上小さと，おおよそ問題のないレベルで測定が可能であり，筆くなるのに対し，DHA レダクターゼ活性は約半分

者らはこの方法で植物・酵母の抽出液中のグルタチオンの低下にとどまる．これにより非酵素的 DHA 還元

量を良好に測定している．GSH をそれ以外のチオール

図 4：グルタチオンの酵素リサイクリング反応の原理．

190

活性酸素，抗酸化物の測定法

化合物と分別して精密定量する HPLC 分析法も確立されている ．

クロプレートリーダーで A
９．10〜30分後にもう一度 Aを測定する．
を測定する．インターバル時間は試料の呈色程度に応じて任意に決定して［実験方法］

よい．

１．用意する試薬

10．9.と 8.の吸光度の差を，GSSG 標準液の濃度に対し⑴ ４％ スルホサリチル酸（抽出用）．

てプロットし，比例関係が保持されている濃度範囲⑵ 0.1M リン酸カリウム緩衝液（pH 7.5），1mMを用いて検量線を作成する．複数時間で測定するこEDTA．

とにより，試料測定に適した濃度の検量線が得られ⑶ 50mM GSSG．４％ ス ル ホ サ リ チ ル 酸，0.1M

る．

リン酸カリウム緩衝液（pH 7.5），1mM EDTA に

1/2×GSSG 濃度の決定>

溶解させる．

11．2.で調製した抽出液，および 3.で調製した GSSG

⑷ 50mM NADPH．４％ スルホサリチル酸，0.1M

標準液を 260μl ずつ別々のマイクロチューブにとリン酸カリウム緩衝液（pH 7.5），1mM EDTA に溶る．それぞれに 2‑ビニルピリジン 10μl を加え，30解させる．用時調製．

秒間ボルテックスミキサーの最高速で撹拌する．次⑸ 1mM DTNB
（10mM 溶液は−20℃で少なくとも１ヶ月は安定に保存できる．実験当日に 10倍希釈し使用する）

いで 20％トリエタノールアミンを 80μl 加え，同様に撹拌する．
12．室温で 10,000rpm，1 分間遠心分離する．

⑹ 97％ 2‑ビニルピリジン．

13．下層を 50μl×３連とって，マイクロタイタープレー⑺ 20％ トリエタノールアミン．

トのウェルに分注する．このとき 2‑ビニルピリジン⑻ グルタチオンレダクターゼ（GR：オリエンタル酵の油滴を取らないように注意する．

母，1U/μl の液状品）．
２．組織から抽出液を調製する．操作は 1f.3.4.1.1の2.〜4.に準じる．ただし抽出液には４％スルホサリ
チル酸を用いる．

14． 総グルタチオン濃度（GSH＋1/2×GSSG）の決定>の 7.〜10.と同様，グルタチオン濃度を求める．
15．(総グルタチオン濃度）−(1/2×GSSG 濃度）から，もとの試料の GSH 濃度を求める．

３．50mM GSSG 6μl を４％スルホサリチル酸 994μlと混合する（終濃度 300μM ）．さらにこれを４％ス
ルホサリチル酸で段階的に希釈し，150，75，37.5，
18.8，9.38，4.68μM および０の GSSG 標準液を調製する．

1.d.5 活性酸素の in s itu（in vivo ）測定
生きた組織や植物体では恒常的に活性酸素種が生成しているが，そのほとんどは，細胞の抗酸化成分によって総グルタチオン濃度（GSH＋1/2×GSSG）の測定>

消去されており，細胞での活性酸素種の定常濃度は数４．2.で調製した抽出液または 3.で調製した GSSG 標

μM 以下（分子種による）である．in situ 測定では抗酸

準液 4μl をマイクロタイタープレートのウェルに化物やプローブ試薬が活性酸素種と反応して生じる酸化入れる．

生成物を検出する．

５．196μl の 0.1M

リン酸カリウム緩衝液（pH 7.5），

1.d.5.1 葉切片のアスコルビン酸ラジカル測定

1mM EDTA を 4.のウェルに加えて混合する．

AsA は植物細胞に数十 mM 含まれ，アスコルビン酸

６．5.の混合液を 50μl×３連とって，別のウェルに移

ペルオキシダーゼの電子供与体として H O を還元し，す．

自身は Asc に酸化される．

７．別 の 容 器 で 2.8ml の 1mM DTNB，3.75ml の 1

H O ＋2AsA → 2H O＋2Asc

mM NADPH，5.85ml の 0.1M リン酸カリウム緩

(14)

衝液
（pH 7.5），1mM EDTA，および 4U の GR を

また AsA は非酵素的に水溶性のラジカル種（R ）を一

混合し，リザーバーに移す．これをマルチチャンネ

電子還元・消去し，この反応でも Asc ラジカルが生成す

ルピペッターで 100μl ずつ，6.のウェルに加える．

る．

記載した量で 96穴プレート１枚分のウェルに試料を添加できる．
８．プレートミキサーでウェル内の溶液を混合し，マイ2009 低 温 科 学

vol.67

R ＋AsA → RH＋Asc(15)

すなわち Asc は活性酸素種の包括的マーカーと見な191

すことができる．

件例を示す．

細胞には Asc ラジカルを特異的に還元する酵素系が⑴ マイクロ波周波数 9.40GHz

ある．ストロマでは Asc ラジカルは還元型フェレドキ⑵ マイクロ波出力

3mW

シン
（Fd ）
によって速やかに還元される ．NAD (P)H⑶ 磁場変調幅 0.1mT，周波数 100kHz

を電子供与体とするモノデヒドロアスコルビン酸レダク⑷ 応答時間

0.3s

ターゼ（MDAR）もストロマ，ミトコンドリア，ペルオ⑸ 磁場（中央）

337.5mT⑹ 磁場掃引速度

1.25mT/min

キシソームに存在する．
Asc ＋e ＋H → AsA(16)

これらによって還元されない場合，Asc ラジカルは，
自己不均化で AsA と DHA になる．
(17)

活性酸素種が生成する条件で細胞内コンパートメント
は，上記の反応のバ

ランスによって決まる．AsA 酸化による Asc ラジカル
生成速度を v ，Asc ラジカルの還元速度と不均化速度をそれぞれ v ，v とすると，定常状態ではv ＝v ＋vとなり，v ＝k Asc

で 30分置いた後，ESR キャビティ内で光照射する．
レットシグナルとして観測できる．
４．一次微分シグナルの一方のピークの山と谷との差をシグナル強度として評価する．これは Asc ラジカ
ルの定常濃度に対応する（絶対値は求められない）．
1.d.5.2 プローブ試薬を用いた活性酸素の in s itu
検出
生組織に蛍光プローブや発色試薬を与え，活性酸素を(18)

検出する方法は，活性酸素生成部位の空間的な分布を知ることができ，シグナル作用研究などに最近よく用いら（反応速度定数れている ．プローブ試薬は活性酸素種と反応して比較

濃度，MDAR 濃度，NADPH 濃度に依存．k

的安定な化学形に変化し，この蓄積量を評価する．すなは pH に依存）である．すなわち，活性酸素種による AsA

わちこれらの方法では，活性酸素生成量の積算値に相当

酸化が増大すると（k ，k が一定として）Asc ラジカル

するパラメータが得られる．細胞内の反応であり，検量の定常濃度が増大する．また酵素の失活などによりAsc

線を得ることは困難で，測定試料に対する適切なコント

ラジカル還元速度が低下しても Asc

ロール試料と比較しシグナル強度の大小を判定する．

k は Fd，v ＝k Asc

メチルビオローゲンを減圧吸引によって与え，暗所
Asc ラジカルが超微細結合定数 0.23mT のダブ

Asc ＋Asc ＋2H → AsA＋DHAの Asc ラジカルの定常濃度 Asc

３．ポジティブコントロールとして，葉切片に 0.1mMは増大する．葉の切片を ESR キャビティ内にセットし，Asc ラジカル

in situ 測定では２つの注意点がある．(1）プローブ試を測定することで，細胞内のこうした状況を観測するこ薬の活性酸素種に対する特異性．ほとんどの場合，活性とができる．Asc ラジカルの細胞内での寿命はミリ秒レ

酸素種の検出はプローブ試薬との酸化還元反応を利用しベル以下であり，ESR で検出するシグナル強度は Ascている．例えばニトロブルーテトラゾリウム（NBT）にラジカルの定常濃度に対応する．ただし，肉厚の葉，毛よる O 検出は NBT の還元で生成するホルマザンの発状突起のある葉，平らにできない葉（シロイヌナズナ，

色を O の指標とするが，この還元反応は AsA によっ

タバコ，セントポーリアなど）
は本法には不向きである．

ても進行する．検出されたシグナルが AsA によらない

これは水によってマイクロ波が吸収されたり，不規則なことを確認するコントロール実験が必要である．また，形状によって ESR キャビティ内のマイクロ波共鳴が乱プローブ試薬の細胞内代謝や葉緑体チラコイド電子伝達されるためである．

系での直接酸化還元の可能性を検証する実験が必要である．(2）プローブ試薬の組織内，細胞内分布の均一性．

［実験方法］

例えば葉の組織にプローブ試薬を与える場合，葉脈から１．用意するもの

蒸散流によって吸引させると維管束に沿って試薬が分布⑴ 石英製ティシュセル

する．
より均一に分布させるには気孔からの減圧吸引や，⑵ メチルビオローゲン 0.1mM

葉面にピンホールを作り，針のないシリンジで加圧注入

２．植物の生葉を 4mm×2.5cm 大に切り取り，ティするといった方法がある ．ただし組織に強制的に溶液

シュセルにシリコングリースで貼り付ける．これをを注入した直後は細胞間𨻶が水で満たされておりガス交

ESR のキャビティに差し込み，ラジカル測定を行換が制限されるため，暗所では酸素不足，光照射下では

う．Ｘバンド ESR（JES-RE2X,JEOL）での測定条

CO 不足となることに留意する必要がある．

192

活性酸素，抗酸化物の測定法

なお，動物細胞での活性酸素プローブ使用に関する総説も参照されたい．

nm に極大をもつ．葉には減圧吸引あるいはピンホール

1.d.5.2.1 ニトロブルーテトラゾリウム（NB T）に
よる O

nm での発光は溶液中で 550nm，葉の組織中では 532からの加圧によって与える．葉に与えた DanePyは代謝の in s itu 検出され次第に蛍光を失うため，光照射と同じ時間だけ暗所

NBT は O により還元され，青色で不溶性のホルマにおいたときの蛍光低下を測定し，これを差し引くことザンとなり，組織に沈着する．NBT 水溶液 6mM を減圧で光照射による O を評価する ．もう一つの蛍光物質吸引によりシロイヌナズナ葉に浸透させ，葉の半分を遮（励起 330nm，発光 540nm）
は O ，O ど
HO-1889NH

光し，強光（600μmol m s ）を 60分間照射する．クロ

ちらでも酸化され，蛍光を失う ．これらのプローブを与

ロフィルを脱色するため，乳酸：グリセロール：エタ

えたインゲンマメ葉に UV-B 照射すると，HO-1889NH

ノール（1：1：4（v/v））混液中で５分間煮沸した後，ホの蛍光が消光し DanePyの蛍光が消光しなかった．これ

ルマザンの青色を観察する．光照射部と遮光部を比較す

は UV-B 照 射 に よって 葉 で O が 生 成 す る こ と を 示ることで，光照射による O 生成を見積もることができす ．

る．
上述のように NBT は AsA による非酵素的還元を受Singlet Oxygen Sensor Green（SOSG；モレキュラー

ける．また，アルコールデヒドロゲナーゼの存在下でプローブ社）は非蛍光性であり， O と反応して蛍光性NAD(P)H により還元される．上記の実験で観測した（励起 480nm，発光 532nm）となる

NBT 還元が O によるという結論は，光照射では AsA

光化学系

活性を 10％程度阻害することを考慮する必や NAD(P)H は増大しないとの仮定に基づいている．

要がある

．

．使用に際しては

1.d.5.2.2 3,3′‑ジアミノベンジディン（D AB ）による H O の in s itu 検出
細胞外から与えた DAB は細胞内にも浸透し，ペルオ

1.d.6 おわりにキシダーゼの存在下で H O により酸化されポリマーを冒頭で述べたように細胞内での活性酸素種の生成フ形成し，細胞に沈着する ．植物細胞内外の各コンパート

ラックスはかなり大きい．しかし，細胞には大量の抗酸

メントにはペルオキシダーゼが存在するため，DAB の化物・抗酸化酵素が存在するため，活性酸素種の定常濃

酸 化 は H O の 生 成 に 対 応 す る．DAB は 酸 性 条 件

度はきわめて低いレベルに保たれている．おおまかに（pH 3.8）で水溶性となるので，DAB 塩酸塩（たとえば言って，活性酸素消去能が一定であれば，活性酸素定常

同仁化学，D 006）
を用いればよい．5mM 溶液を調製し，濃度は生成フラックスに比例して増大する．一方，生成減圧吸引によりシロイヌナズナ葉に浸透させる．あるいフラックスが一定でも消去能が低下すれば定常濃度は容は DAB 溶液に 0.1％ TritonX-100 を加え，この液に８易に一桁以上上昇する．生体内の活性酸素の動態をでき

時間浸しておく．この葉を 1d.5.2.1と同様に一部遮光るだけ正確に把握するには，生成速度の変動だけでなくし，強光照射後，クロロフィルの脱色を行う．光照射を消去活性の変化も常に意識しなければならない．実際，受けた部位は赤褐色の色素が形成されており，H O の活性酸素消去酵素の中には活性酸素によって失活しやす生成を示す ．DAB は直接光を吸収し着色する．生成しいものがあり，また環境ストレス条件下で特定の酵素だ

た H O が光合成電子伝達反応に由来することを検証す

けが失活する例もある

るコントロール実験として，30μM DCMU など光合成性酸素消去酵素の活性評価も細胞の酸化的ストレス状態

電子伝達阻害剤を与え光照射する．また，カタラーゼをを知る上で重要であることを指摘しておきたい．

組織に与えて DAB の酸化が抑制されれば，細胞外でH O が生成したことが確認できる．
1.d.5.2.3 蛍光プローブを用いた O と O．本節では述べなかったが，活活性酸素種の「分かりにくさ」は，その寿命の短さに負うところが大きいが，時間と空間のスケールを日常感のin s itu 検出

覚の 1000〜100万倍ほど拡大して考えてみれば，これらの分子がそれほど特別な性質をもつわけではないことがdansyl-2,2,5,5-tetramethyl-2,5-dehydro-1H-pyrrole

理解できるとおもう．化学，とくに反応速度論的理解に（DanePy）は蛍光物質であり O と反応し酸化されると基づき，活性酸素と抗酸化物質，標的分子の細胞内での蛍光を失う． O に選択性が高いが，O ，H O によってふるまいを正しくイメージできるようになれば，実験結も酸化される ．DanePyを葉に与え，強光照射などで果の解釈において大きな間違いは防げるはずである．

O を生成させたときに消失する蛍光を蛍光顕微鏡や蛍光イメージアナライザーで評価する．励起波長 330‑345
2009 低 温 科 学

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2009 低 温 科 学

vol.67195

３章 単離・精製・活性測定

２．光合成膜などの単離
a．高等植物の葉緑体と葉緑体膜の単離
宮尾 光恵
高等植物の緑葉から無傷葉緑体を単離する方法，葉緑体膜（包膜とチラコイド膜）の単離法，および，チラコイド膜から光化学系

膜を調製する方法を紹介する．

Isolation of intact chloroplasts,thylakoids and photosystem II membranes fromhigher plants
M itsue M iyao
Intact chloroplasts and subchloroplast membranes can be purified from a variety of plant species by applying
standard procedures with slight modification. This article summarizes procedures for isolation of intact
chloroplast and subchloroplast membranes including envelope, thylakoid and photosystem II membranes.

① すべての操作を 0‑4℃で行う．また，すばやく作業す

2.a.1 概論

る．使用する溶液，器具類を予冷し，氷中あるいは氷高等植物の緑葉から無傷葉緑体，包膜，チラコイド膜を単離・精製する方法は，1980年代にはほぼ確立された．

上で作業を行う．遠心分離機の側で作業するのが望ましい．

その多くは，ホウレンソウ，コムギ，エンドウ，レタス② 弱光下で作業する．
作業場所は暗い方が望ましいが，等，光合成研究材料として「使いやすい」植物，すなわ

日光が差し込まない部屋（光強度 5μmol m s 程度）

ち，材料が大量にかつ容易に入手でき，葉が柔らかく，であれば，作業場所の天井照明を消す程度（光強度 1

ポリフェノール，粘稠な貯蔵物質（例えば，フラクタン）で充分である．試料を氷中で保存すμmol m s 以下）

等，精製を妨害する物質が少ない植物を対象としたもの

るときは，必ず遮光する（光を通さないアイスバケッ

がほとんどであった．一方，近年の植物科学の進展にとトに入れるかアルミホイルで覆う）．

もない，アラビドプシスやイネ等のモデル植物，野生植③ 懸濁液が薄い（葉緑体や葉緑体膜の濃度が低い）と，物等，広汎な植物種が研究材料として用いられるように

光傷害や物理的損傷を受けやすくなる．組織破砕液，

なってきている．材料が異なっても，先人の確立した「古試料懸濁液ともに，不透明の濃い緑色になるようにす

典的な」単離精製法は適用可能であり，多くの場合破砕る．最終的な精製標品は，できるだけ濃く懸濁する．

方法と破砕液の組成を若干改変するだけで純度の高い標④ 試料の遠心沈殿は，水彩絵筆を使って穏やかに懸濁品を得ることができる．本章では，ホウレンソウまたはする．この時，沈殿に直接かからないように懸濁溶液

エンドウを材料とした古典的な方法を紹介するとともを添加する（溶液がかかると沈殿がダマになって遠心に，他の植物種への適用法を概説する．なお本章では，管壁からはがれ，均一に懸濁できない）．溶液で濡らし葉肉細胞から葉緑体と葉緑体膜（チラコイド膜，包膜，

た絵筆で沈殿の表面をなでるようにして，少しずつ沈光化学系 膜）を単離する方法を扱う．C 植物維管束鞘

殿を懸濁する．

細胞および藻類の葉緑体単離法は文献１）を，クラミド⑤ 無傷葉緑体は 0‑4℃で保存しても徐々に包膜が破壊

モナスからの葉緑体，チラコイド膜単離法，シアノバクされる．また，凍結融解で包膜が破壊される．他の葉テリアのチラコイド膜単離法は第３章を参照されたい．

緑体膜標品は，0.4‑0.8M ショ糖（高濃度の方が望ま

葉緑体および葉緑体膜の単離は，組織の破砕，遠心分しい）を含む溶液に濃く懸濁すれば活性を保持したま

離法による分画，密度勾配遠心分離法による精製の３段

ま凍結保存できる．液体窒素中で保存するか，液体窒階に大別できる．
全般的な注意事項は以下の通りである．

素で急速凍結したのち−80℃で保存する．使用時は水浴で速やかに融解し，融解したら氷中に移す．ショ糖

１) 独立行政法人農業生物資源研究所 光環境応答研究ユする時間を短くする効果もある．無傷葉緑体の凍結保ニット2009 低 温 科 学

は生体膜とタンパク質の安定作用をもつが，融解に要

vol.67197

存にも高濃度のショ糖を加える．

やく行えば，ホウレンソウと同じように取り扱うことができる（組織破砕液の遠心上清は褐変するが，葉緑体は2.a.2 材料の前処理と葉の破砕
2.a.2.1 材料の前処理

褐変しない）．それでも試料が褐変する場合は，破砕液に5‑20mM の還元剤
（DTT，アスコルビン酸）を添加する．
ポリフェノールとアルカロイドの吸着剤である水溶性ポ

葉のデンプン含量が高いと，分画遠心法で単離した葉リビニルピロリドン（polyvinylpyrrolidone,PVP；例え

緑体や葉緑体膜にデンプンが混入し完全には除去できな

ば，PVP-400,Sigma）を 1‑2％（w/v）添加してもよい．

い．またデンプン粒は葉緑体より密度が高いため，無傷

多くの場合還元剤だけで褐変は抑えられる．

葉緑体を遠心分離する際，葉緑体内のデンプンが包膜を2.a.2.3 葉の破砕と濾過突き破ってしまう．ホウレンソウ，タバコ，ジャガイモ，大概の葉は市販の家庭用ミキサー（容量 0.5‑1.5リッアラビドプシス等，デンプンを葉内に蓄積する植物では，

トル）で破砕できる．材料が少ないときは，ワーリング

破砕に先立ってデンプン含量を低下させる処理を行う．

ブレンダー（Waring 社；ステンレス製カップに上から市販のホウレンソウは，植物体を水道水で充分に洗った刃を入れて破砕するタイプ）で小さいカップに入れて破のち，3‑4cm の深さに水を張ったバケツに入れサラン

砕する．材料が極少量のときはガラスホモジナイザーを

ラップをかけて低温室に一晩置くか，湿らせた新聞紙に使う．硬い葉や茎の破砕にはワーリングブレンダーある包んでビニール袋に入れて冷蔵庫で保存する．どちらのいはポリトロン（Kinematica 社）を使用する．

場合も 2‑3日は保存できる．タバコ，ジャガイモ，アラ

破砕液をまず２層のガーゼ，引き続き 16層のガーゼでビドプシスはいわゆる「デンプン葉」で，葉のデンプン

濾過し，葉の破砕断片を除く．濾過が遅くなったらガー含量が高い．タバコ成熟葉の場合，植物体を 2‑3日弱光

ゼを交換する．特に最初のガーゼ２層は詰まりやすいの下（実験室内；光強度 5μmol m s 程度）に置くとデンで，複数セット用意して頻繁に交換する．組織破砕液にプンをかなり減らすことができる．イネ，コムギ等，単は液胞由来のプロテアーゼが含まれるため，組織の破砕

子葉植物の多くは「糖葉」で，デンプンは葉身ではなくから破砕液の遠心分離作業は特にすばやく行う．

葉鞘に蓄積される．葉身のみを使用すればデンプンの混入は比較的少ない．また，破砕前日に植物体を暗所に移［実験方法：家庭用ミキサー（容量１リットル）による葉動すればデンプンをかなり減らすことができる．

の破砕］

2.a.2.2 破砕溶液の組成

１．使用する溶液類と器具類は予め氷中で冷やしてお基本的組成は，浸透圧調節剤，pH 緩衝剤，塩類である．

く．ミキサーは氷を入れて予冷する．

浸透圧調節には，無傷葉緑体の場合 0.33M ソルビトー

２．双子葉植物の葉は 5cm 程度の大きさにちぎり，氷ル，チラコイド膜の場合 0.3‑0.4M ショ糖を用いる．植に入れたビーカーに入れて冷やす．単子葉植物の葉物材料の性質，単離標品の使用目的に応じて保護物質をはハサミで長さ 3‑5mm 程度に裁断する．

添加する．例えば，EDTA は重金属の除去，牛血清アル３．ミキサーの氷を捨て予冷した破砕液ですすぐ（水がブミン（BSA）は膜の安定化と遊離脂肪酸の除去，フィ混じって浸透圧が低下するのを避けるため）．

コール（Ficoll），ポリエチレングリコール（PEG），デキ

４．ミキサーの刃の 3‑4倍の高さまで葉片を軽く入れ，

ストランは膜の安定化と粘度の調節のために用いられそこに刃の高さ程度の破砕液（30‑40mL）を注ぎ，る．酸化防止剤としてジチオスレイトール（dithioth-

フラッシュ（一瞬破砕してすぐに停止する操作）を

reitol, DTT），2‑メルカプトエタノール，アスコルビン

3‑4回繰り返す．双子葉植物の葉であればこの操作

酸，イソアスコルビン酸等の還元剤が用いられる．ホウで葉片は 1‑3cm 程度に破砕される．単子葉植物のレンソウ等の一般的な光合成研究材料であれば，特別な場合は，葉片が破砕液になじんでかさばらなくなる．

保護物質は必要ない．

さらに葉片を加えて 2‑3回フラッシュする．これを留意が必要なのは植物組織のポリフェノール含量で，3‑4回繰り返す．フラッシュしても破砕液がかき混

ポリフェノールが酸化されると試料が褐変し，葉緑体やぜられなくなったら，破砕溶液を少しずつ追加する．

葉緑体膜の凝集（アグリゲート）を引き起こす（水溶性

カップに入れた葉片がほぼ均一になったら，２秒かタンパク質もアグリゲートを形成し，SDS で可溶化できら数秒間破砕する．無傷葉緑体を単離する場合は３なくなる）．タバコはポリフェノール含量が高いが，葉の秒程度，チラコイド膜を単離する場合は３秒の破砕

破砕から遠心分離による葉緑体の沈殿までの操作をすばを 2‑3回繰り返す．

198

無傷葉緑体と葉緑体膜の単離

５．破砕液を速やかに濾過し，遠心分離する．三角フラ破砕溶液，葉緑体懸濁溶液の一般的な組成は，0.33M

スコにガーゼをセットした漏斗を立てておくと，すソルビトール，1‑5mM MgCl ，10‑20mM NaCl，pH

ばやく濾過できる．

緩衝剤（MES, HEPES, Tricine；pH 6‑8）である．炭

この方法で単子葉植物（イネ，コムギ）の葉も完全に酸固定活性 を 保 持 し た 無 傷 葉 緑 体 の 単 離 に は 1mM破砕できる．用いる破砕溶液の量は，葉片 20‑30g に対し

MnCl ，1mM EDTA，2mM イソアスコルビン酸が必要て双子葉植物（ホウレンソウ，タバコ）で約 100mL，単とされている．

子葉植物（イネ，コムギ）で約 200mL である．
［実験方法：Nakatani & B arber の方法 ］

2.a.3 無傷葉緑体の単離と精製

Mg

は生体膜の安定化（チラコイド膜ではグラナ構造の維持）に必要であるが，Mgがあると壊れた葉緑体

緑葉破砕液からまず分画遠心法で葉緑体を粗精製し，やチラコイド膜がアグリゲートしやすくなる（おそらく引き続き Percoll（GE Healthcare）密度勾配遠心分離法

DNA もアグリゲート形成に関与）．本法では，アグリで精製する．かつてはショ糖密度勾配遠心法が精製に使ゲート形成を抑えるため定法よりかなり低いイオン強度

用されていたが，ショ糖は包膜を透過し葉緑体の浸透圧と Mgが高くなるため，浸透圧を変えずに密度勾配を形成でき

１．葉片 30‑40g を 100mL のＡ液（0.33M ソルビトー

る Percoll が用いられている．また，Percoll 密度勾配法

ル，0.2mM MgCl ，20mM MES，Tris 溶液で pH

では密度以外に試料表面の電荷も分離に影響する．このを 6.5に調整；最終 Tris 濃度は約 0.5mM ）で破砕効果により，壊れた葉緑体と無傷葉緑体とを効率よく分し，破砕液を濾過したのち，2,200× g で 30秒間遠離することができる ．

心する．ハンドブレーキ

得られた葉緑体標品の無傷度（intactness）は光学顕微

濃度で葉緑体を単離する．

でロータを減速させ遠心に要する時間を 90秒以内とする．

鏡で簡単に観察できる．無傷葉緑体はきらきら光る緑の２．アスピレーターにつないだパスツールピペットで上顆粒のように見える．脱イオン水で低張にして包膜を破

清を速やかに取り除く．沈殿表面のどろどろした緑

壊すると，光らない暗緑色の粒になる．

色のスラリーと緩い沈殿（破壊された葉緑体やチラ

無傷葉緑体は不安定で，氷中暗所で保存しても徐々にコイド膜を含む）も除く．遠心管をキムタオルの上包膜が破壊される．包膜が壊れると小さなダマ状のアグに数秒倒立させて，残った上清とスラリーを切る．

リゲートができる．葉緑体懸濁液にダマができたら葉緑３．筆で沈殿をＢ液（0.33M ソルビトール，Tris 溶液で体の一部が壊れたと考えられる．

pH を 7.5に調整；最終 Tris 濃度は約 0.5mM ）約

2.a.3.1 分画遠心による無傷葉緑体の粗精製

40mL に懸濁する．激しく懸濁すると包膜が破壊さ定法とされている無傷葉緑体単離法のほとんどは，収率は低くとも大量の出発材料から純度の高い標品を得る

れるので，筆で沈殿の表面を軽くなでるように丁寧に少しづつ懸濁する．

ことを目的に開発された．ホウ レ ン ソ ウ で は 2,000‑

４．懸濁液を 2,200× g で 20秒間遠心する．ハンドブ

2,500× g で 30‑60秒間遠心し，葉緑体を沈殿させる．こレーキでロータを減速させ遠心に要する時間を 60の遠心をもう一度繰り返したのち，500‑600× g で 10秒秒以内とする．

程度遠心し夾雑物（未破壊の細胞，デンプン等）を沈殿

５．沈殿をＢ液 1‑2mL に懸濁する．

させて除く「下切り」を行う．葉緑体を沈殿させる遠心ホウレンソウの場合，無傷葉緑体の割合（intactness）

条件をきつくする，あるいは，下切り条件を緩くすれば，は最初の沈殿が 75％以上，２回目の沈殿がほぼ 100％で，純度は低下するが収率を上げることができる．ただし，Percoll 密度勾配法で精製した標品とほぼ同等のポリペ

葉緑体の沈殿条件をきつくしすぎると壊れた葉緑体も沈プチド組成の標品が得られる．この無傷葉緑体標品には殿するため，無傷葉緑体がアグリゲートを形成しやすくデンプンが混入するが，短時間の下切り遠心（500‑600×

なる．

g に達したらハンドブレーキで減速）で除くことができ緑葉を破砕すると，無傷葉緑体や壊れた葉緑体が DNA にからまるように吸着してアグリゲートを形成する．このアグリゲー
トの密度は無傷葉緑体とほぼ同じなため，ショ糖密度勾配遠心法では分離できない．Percoll 密度勾配遠心法の場合アグリゲートは無傷葉緑体より低密度の位置にバンドを形成する．

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vol.67

遠心停止ボタンを押し，遠心機の蓋を開けて手でロータを減速させる．この時，雑巾あるいは小さいタオルを両手に持ち，左右対称になるように両手でロータを軽く押さえる．最初は軽く振れ，アンバランスが無ければ徐々に強く押さえる．ロータが止まる直前には手を離す．

199

る．Percoll 密度勾配遠心法で葉緑体を精製するときは２回目の遠心を省略できる．

５．形成される２本の緑色バンドのうち，上（低密度側）
がチラコイド膜と壊れた葉緑体を含むバンド，
下（高

本法はほとんどの双子葉植物と単子葉植物に適用可能密度側）が無傷葉緑体のバンドである．注射器で無であるが，ケイ酸含量の高いイネでは無傷葉緑体の収率

傷葉緑体のバンドを吸い取り３倍容の G‑R 溶液では必ずしも高くない．これは，葉の破砕液中のケイ酸の希釈する．

結晶が包膜を物理的に破壊するためで，葉の柔らかい幼６．2,500× g ，70秒の遠心で無傷葉緑体を沈殿させる．

苗を用いた場合でも操作ステップ数を増やすと収量が激Percoll が残っているため，沈殿はゆるく，また遠心減するので注意が必要である．

管の底を滑りやすい．駒込ピペットかアスピレー

2.a.3.2 P erco ll密度勾配遠心分離法による無傷葉

ターで沈殿を吸い込まないように注意しながら上清

緑体の精製

を除く．

1979年に報告された高倍らの方法 が，高純度で生理７．Percoll 密度勾配中の BSA 濃度が高いため，無傷葉活性（炭酸固定活性）の高い葉緑体を精製するもっとも緑体に大量の BSA が付着している．BSA を除くに優 れ た 方 法 で あ る．100mL の Percoll に PEG 6000

は，沈殿の再懸濁と遠心操作を 2‑3回繰り返す．

（Sigma）
を 5g，BSA を 1g，Ficoll 400 を 1g 添加した溶液（PPBF）で密度勾配をつくる．炭酸固定活性を問題［実験方法２：不連続（段階的）密度勾配を用いる方法 ］にしないのであれば，Percoll のみ（ソルビトールと pH

密度勾配の作製が容易な簡便法である．２種類の Per-

緩衝剤のみ，あるいは保護物質として 0.1％程度の BSA

coll 層の界面に無傷葉緑体が集積するため高濃度の葉緑を含む）の密度勾配で充分である．無傷葉緑体の密度と体を回収できる．

大きさは均一でないため，連続密度勾配を使うと無傷葉・葉 緑 体 懸 濁 溶 液（Ａ 液）：0.33M sorbitol，30mM

緑体は幅の広いバンドを形成する．葉緑体がバンドを形成する Percoll 濃度を予め決めておけば，不連続（段階的）密度勾配で精製できる．

HEPES-NaOH（pH 7.8）
・Percoll 密 度 勾 配：50％お よ び 80％ Percoll，0.1％
BSA，0.33M sorbitol，30mM HEPES-NaOH（pH 7.8）．50mL 遠心管に 80％ Percoll を 10mL 入［実験方法１：高倍らの方法 ］

れ，その上に 50％ Percoll を 20mL 重層する．

・破砕溶液：0.33M sorbitol，2mM Na -EDTA，1mM

１．Nakatani & Barber の方法 で調製したホウレン

MnCl ，1mM M gCl ，20mM NaCl，2mM isoascor-

ソウ無傷葉緑体粗画分（２回目の遠心沈殿）を 0.1％

bic acid，50mM M ES-NaOH，pH 6.1．

BSA を含むＡ液に懸濁し，Percoll 密度勾配に重層

・グラジエント・再懸濁（G‑R）溶液：0.33M sorbitol，する．

2mM Na -EDTA，1mM MnCl ，1mM MgCl ，1

２．スイングロータを用い，8,500× g で 15分間遠心す

mM pyrophosphate，5mM isoascorbic acid，5mMる．ロータをゆっくり加速・減速させれば，アング

gluthathione，50mM HEPES-NaOH，pH 6.8．

ルロータも使用できる．

・Percoll 密度交配：11−90％（v/v）PPBF．他の組成

３．チラコイド膜と壊れた葉緑体は Percoll 層上部にとは G‑R 溶液と同じ．40mL 遠心管（日立スイングロー

どまり，無傷葉緑体は 50％と 80％ Percoll の界面

タ SW-27 用）に 35mL の連続密度勾配を作製．

にシャープなバンドを形成する．パスツールピペッ

炭酸固定活性の保持を目的としないのであれば，破砕

トで無傷葉緑体バンドを回収し，Ａ液で 3‑5倍に希溶液と G‑R 溶液の M nCl ，EDTA，ピロリン酸，イソア
スコルビン酸，グルタチオンは除いても構わない．
１．連結管を用いて Percoll 連続密度勾配を作製し，氷中あるいは冷蔵庫で０‑４℃に冷却する．

釈する．
４．2,500× g で 60秒間遠心し，沈殿をＡ液に懸濁す
る．
５．再遠心し，沈殿をＡ液に再懸濁する．

２．ホウレンソウ葉片 35g を 120mL の破砕溶液で破砕，濾過し，2,500× g で 70秒間遠心する．
３．沈殿を破砕溶液 5mL に懸濁し，Percoll 密度勾配に2mL ずつ重層する．
４．スイングロータを用い，7,000rpm（8,820× g ）で15分間遠心する．
200［実験方法３：一段階簡易精製法 ］
粗葉緑体標品を Percoll 液に重層し，遠心により無傷
葉緑体のみ Percoll 層を通過させ沈殿させる方法である．壊 れ た 葉 緑 体 は Percoll 層 上 部 に と ど ま る．Nakatani & Barber の方法 で粗精製した無傷葉緑体を用
無傷葉緑体と葉緑体膜の単離いれば，充分に純度の高い葉緑体が得られる．収率が高［実験方法：包膜の単離法］

いので，少量の材料からの無傷葉緑体の精製に適用でき

チラコイド膜に比べて包膜は非常に少ない．ショ糖密る．また，様々な処理を施した葉緑体標品から無傷葉緑度勾配上に試料を重層し遠心する沈降法（沈降速度法，

体のみを回収する際に用いられる（例えば，プロテアー

沈降平衡法）では，包膜より重くかつ大量に存在するチゼであるサーモリシン（thermolysin）処理 ；包膜表面

ラコイド膜が包膜を「追い越して」沈降する．このため，に露出したタンパク質の同定や包膜表面に付着したタン

包膜バンドへのチラコイド膜の混入は避けられない．一

パク質の除去に用いられる）．

方，高濃度のショ糖を加えた試料の上に密度勾配を重層・葉緑体懸濁溶液（Ａ液）：0.33Msorbitol，30mM

HEPES-NaOH（pH 7.8）
・Percoll 密度勾配：40％ Percoll，0.1％ BSA，0.33M．
sorbitol，30mM HEPES-NaOH（pH 7.8）

し遠心すると（浮遊遠心法），密度勾配中を包膜が先行して浮上するため，チラコイド膜の混入の少ない包膜を得ることができる．
１．エンドウの無傷葉緑体を 0.6M ショ糖を含む緩衝

１．遠心管に 40％ Percoll を入れ，その上に粗精製した

液 TE（10mM Tricine，pH 7.5，2mM EDTA）

無傷葉緑体画分（クロロフィル濃度 1‑2mg/mL）をにクロロフィル濃度が 1‑3mg/mL になるように懸

重層する．

濁する．

２．スイングロータで 3,000× g ，５分間遠心する．ロー
タをゆっくり加速・減速させればアングルロータも使用できる．

２．懸濁液を０℃で 10分間静置したのち−20℃で凍結させる．
３．1.5時間後室温に移し融解させる．エンドウではこ３．得られた無傷葉緑体の沈殿をＡ液に懸濁する．

の操作で約 70％の葉緑体が破壊される．ホウレンソ

４．2,500× g で 60秒間遠心し，沈殿をＡ液に懸濁す

ウでは凍結融解を２回繰り返す．顕微鏡で葉緑体のる．

破壊率を調べ，50‑75％が破壊されるまで凍結融解を

５．再遠心し，沈殿をＡ液に懸濁する．

繰り返す．

Percoll 層の厚さと遠心条件は，使用するロータ，出発

４．破壊された葉緑体懸濁液にショ糖を加え最終的に材料の量と精製度に応じて適宜調節する．スケールダウ

1.3M とし，15mL ずつ遠心管に分注する．これにンも可能で，1.5mL のディスポーザブルチューブの場

1.2M ショ糖 を 含 む TE を 9mL，さ ら に 0.3M

合，40％ Percoll 1mL に粗精製葉緑体 0.4mL を重層

ショ糖を含む TE を 6mL 重層する．

し，5,000× g で２分間遠心する（ホウレンソウ，タバ

５．スイングロータで 113,000× g ，14時間遠心する．

コ）．無傷葉緑体の沈殿の量，無傷葉緑体と Percoll 層上包膜は密度勾配中を浮上し，0.3M と 1.2M ショ糖部の壊れた葉緑体との分離を目で確認しながら，最適条の界面に黄色の層を形成する．破壊されなかった葉件を決める．

緑体，チラコイド膜，ストロマ成分は 1.3M ショ糖
中にとどまる．無傷葉緑体 1mg クロロフィルあた

2.a.4 葉緑体包膜の単離
葉緑体包膜の密度はミクロゾームやミトコンドリア外りタンパク質量で 40‑70μg の包膜が得られる．
［実験方法：内包膜と外包膜の分離精製法］

膜の密度とほぼ同じなので，精製した無傷葉緑体を出発

上記の方法で調製した包膜標品を，ショ糖密度勾配中材料として用いる．まず葉緑体を高張処理し包膜を剥離の沈降平衡遠心法で内包膜と外包膜に分離する．また以させる．葉緑体を 0.6M ショ糖あるいは 0.8M マンニ

下に示すように，高張液中で破壊した葉緑体から分画遠

トールを含む溶液に懸濁すると，透過性の差から内包膜

心法で包膜を粗精製し，これから内包膜と外包膜を分離のみが収縮して内包膜と外包膜の間隔が広がる．この状すると精製時間を短縮できる．

態で機械的な力を加えたり凍結融解を繰り返すと内包膜

１．凍結融解法で破壊した葉緑体の懸濁液に２倍容のと外包膜は別々の小胞となる．剥離した包膜をショ糖密

TE を 加 え ショ糖 密 度 を 0.2M に 下 げ，こ れ を度勾配遠心分離法でチラコイド膜とストロマから分離す

4,500× g で 15分間遠心しチラコイド膜を沈殿さる．引き続きをショ糖密度勾配遠心分離法で内包膜と外包膜に分離する．

せる．
２．上清を 40,000× g で 30分間遠心し，得られた沈殿（粗包膜画分）を 0.2M ショ糖を含む TE に懸濁す
る．

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vol.67201

３．懸濁液を 0.6‑1.2M ショ糖連続密度勾配に重層し，スイングロータで 113,000× g ，14時間遠心する．
密度勾配中にできる２本の黄色のバンドのうち，上が外包膜のバンド，下が内包膜のバンドである．

２．10,000× g で 10分間遠心し，チラコイド膜を沈殿させる．
３．沈殿を 0.4M ショ糖，5mM MgCl ，10mM NaCl，50mM HEPES-NaOH（pH 7.8）に懸濁し，再遠心する．
４．懸濁，遠心を 1‑2回繰り返しチラコイド膜を洗浄す

2.a.5 チラコイド膜の単離

る．

チラコイド膜は組織破砕液から分画遠心法で単離す
る．純度の高いチラコイド膜が必要であれば，精製した
無傷葉緑体標品から分画遠心法あるいはショ糖密度勾配
遠心法でチラコイド膜を精製する．破砕溶液とチラコイ

2.a.6 チラコイド膜の分画：光化学系
単離

膜のド膜懸濁溶液の基本組成は，0.3‑0.4M ショ糖，50mM

様々な方法でチラコイド膜からグラナチラコイドとス，5
pH 緩 衝 剤（HEPES ま た は Tricine；pH 7.5‑7.8）

トロマチラコイドを単離するすることができる ．ストmM M gCl ，10mM NaCl である．5mM M g

はグラ

ロマチラコイドは Yeda プレス処理，超音波処理でグラナの積み重なり構造の維持に，10mM Cl は酸素発生活

ナから切り離され小胞となる．また低濃度の界面活性剤

性の維持に必要である．

処理で小胞または膜断片となる．チラコイド膜にこれらの処理を施し遠心分離すれば，純度の高いストロマチラ［実験方法：チラコイド膜の単離］

コイドが単離できる．一方グラナは機械的処理に強く，

１．濾過した組織破砕液を 3,000× g で 8‑10分間遠心プレス処理を施すとグラナのマージン（margin；膜の接し，チラコイド膜を沈殿させる．
２．沈殿を懸濁溶液に懸濁し，300× g で 30‑60秒間遠心する．
３．遠心上清を 3,000× g で 8‑10分間遠心し，チラコ
イド膜を沈殿させる．
４．沈殿を懸濁溶液に懸濁し，300× g で 30‑60秒間遠心する．
遠心条件は，使用するロータ，出発材料の量，必要とするチラコイド膜の純度に応じて適宜調節する．大きい

着部分の周縁）で膜が分断されるが，グラナの積み重なり構造はほとんど破壊されない．このグラナの膜の接着を剥がすと margin の切断部位で膜が閉じて，膜の表裏が逆転した裏返り膜（inside out 膜）となる．裏返り膜は水性二層分配法で精製できる．また，チラコイド膜を高濃度の界面活性剤 Triton X-100 で処理し分画遠心すると，グラナチラコイドを単離できる．この標品は光化学系 に富むことから，慣用的に光化学系 膜と呼ばれている．

ロータを使ってチラコイド膜を大量に調製するときは，２種類の光化学系 膜単離法がほぼ同時期に開発されロータの減速が遅いため，ステップ２と４の「下切り」

た．相違点は Triton 処理の際共存させる陽イオンが２遠心条件を緩くする（設定回転数に達したら遠心停止ス

価（Mg ) か１価（Na ＋K ) かという点のみであイッチを押す）．なお，チラコイド膜の沈殿の上に形成さる．開発者の名前から，単離した標品はそれぞれ BBY 粒

れる濃緑色のスラリーと「下切り」遠心のどろっとした

子，Ｋ＆Ｍ（桑原・村田）粒子と呼ばれた．光化学系

濃緑色の沈殿は，核 DNA によって形成される様々な膜複合体の単離を目指して開発された方法だったため「粒を含むアグリゲートである．

子」という名称が付けられたが，その後グラナ部分に相当する膜標品であることがわかり（文献 10）参照），光化［実験方法：無傷葉緑体からのチラコイド膜の単離］学系 膜という名称に改められている．使用する陽イオ

低張処理あるいは凍結融解処理で葉緑体を破壊する．

ンの種類によらず，得られる光化学系 膜の性質と組成

破壊した葉緑体懸濁液を 3,000‑10,000× g で 10分間

はほぼ同じである．２価イオンを用いるとグラナ構造の遠心し，チラコイド膜を沈殿させる．遠心上清はストロ

膜の接着が強まるため光化学系

マ画分として回収する．ストロマ画分を 10,000× g でが，光化学系 が存在する margin 部分が混入しやすく，

10分間遠心すればチラコイド膜の破片を，100,000× g

また膜どうしも凝集しやすい．一方，１価カチオンを用で１時間遠心すれば包膜を沈殿として除去できる．

いるとグラナの接着が弱く光化学系

１．無傷葉緑体の沈殿を 5mM MgCl ，50mM HEPES-

が，光化学系 膜の収率が若干低い．筆者は，材料が大（pH 7.8）に懸濁し，氷上で 10分間静置する．
NaOH

量に入手できるホウレンソウではＫ＆Ｍ法を，コムギと202膜の収率が高くなるの混入も少ない

無傷葉緑体と葉緑体膜の単離イネでは BBY 法を使っている．

11．上清を 35,000× g で 10分間遠心し，沈殿を C 液に懸濁する．ステップ９同様，沈殿が完全に分散され［実験方法：桑原・村田の方法 ］
・破砕溶液：50mM Na/K phosphate buffer（pH 7.4），200mM NaCl，0.1M sucrose．

るまで懸濁する．
12．遠心と C 液への懸濁を３回繰り返す．
光化学系 膜の回収率は，チラコイド膜のクロロフィ

・チラコイド膜懸濁溶液（Ａ液)：50mM Na/K phos-

ル量の 20‑40％である．回収率が低いときは Triton とク，50mM NaCl，0.3M sucrose．
phate buffe（r pH 6.9）

ロロフィルの比を 20：1（w/w）に下げる．原報ではス・20％（w/v）Triton X-100．

テップ 11の沈殿が光化学系 膜標品とされているが，
こ

・光化学系

の沈殿には高濃度の Triton が残っている．遠心と懸濁膜洗 浄 液（Ｂ 液)：40mM Na/K phos-．
phate buffer（pH 6.9）
・光 化 学 系

膜 懸 濁 液（Ｃ 液)：25mM MES-NaOH

を最低３回繰り返して（ステップ 12）Triton を除去す
る．Triton を除去した光化学系

膜は安定で，クロロ（pH 6.5），10mM NaCl，0.3M sucrose．

フィル濃度 2‑4mg/mL，０℃で遮光保存すれば少なく

１．ホウレンソウ葉を破砕溶液で破砕，濾過し，3,000×

とも１日間酸素発生活性はまったく低下しない．

g で 10分間遠心する．
２．沈殿を破砕溶液に懸濁し遠心する．500× g に達したら遠心を停止する．
３．遠心上清を 3,000× g で 10分間遠心し，チラコイ
ド膜を沈殿させる．
４．沈殿をＡ液に懸濁し遠心する．500× g に達したら遠心を停止する．
５．上清（チラコイド膜）を回収し，クロロフィル濃度を決定する．
６．Ａ液で希釈してチラコイド膜懸濁液のクロロフィル
濃度を 2mg/mL とする．
７．チラコイド膜懸濁液をビーカーに入れスターラーでゆっくり撹拌しながら，Triton とクロロフィルの比が 25：1（w/w）になるように 20％（w/v）Triton
溶液を滴下する．Triton 溶液を滴下し終えたら約１分間撹拌を続ける．この処理は４℃以下の低温室内あるいはビーカーを氷に入れて行う．
８．1,000× g で２分間遠心し，上清を回収する．
９．上清を 35,000× g で 10分間遠心し，沈殿をＢ液に懸濁する．沈殿はねばねばしていて懸濁しにくい．
Ｂ液を少しずつ加えながら沈殿が完全に分散されるまで懸濁する（塊がほぼ無くなってから筆で 100回
懸濁液をかき混ぜると完全に分散できる）．
10．1,000× g で２分間遠心し，上清を回収する．

2009 低 温 科 学

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参考文献
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Keegstra, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78 (1981)3595.
10) 宮尾光恵，蛋白質 核酸 酵素 別冊 30号（1987）157．
11) D.A.Berthold, G.T.Babcock, & C.F.Yocum, FEBS
Lett. 134 (1981)231.
12) T.Kuwabara & N.M urata, Plant Cell Physiol. 23(1982)533.

203

３章 単離・精製・活性測定

２．光合成膜などの単離
b．光合成細菌の光合成膜
原田 二朗 ，浅井智広 ，大岡宏造

紅色細菌から単離されるクロマトフォアは安定性が高く，光合成研究の歴史の中ではごく初期の頃か
ら，光化学反応，電子伝達反応，リン酸化反応の機構を調べるために用いられてきた．一方，緑色硫黄細菌やヘリオバクテリは光化学反応系が非常に不安定であるため，比較的容易で迅速に調製できる
膜標品を研究に用いる場合が多い．光合成膜は，アンテナ複合体や反応中心複合体をはじめ，膜タンパク質複合体を精製する際には必ず調製しなければならない．ここでは紅色細菌，緑色細菌，およびヘリオバクテリアの光合成膜標品の調製法について説明する．

Preparations of membranes from anoxygenic photosynthetic bacteria.
Jiro Harada, Chihiro Azai, Hirozo Oh-oka
Photosynthetic membranes contain integrated protein complexes essential for energy conversion system.
Reaction centers and their related electron transfer components reside in invaginated membranes in purple
bacteria, while they do in cell membranes in green bacteria and heliobacteria. Procedures to isolate thesemembranes are described briefly in order to investigate photosynthetic activities and/or purify membraneassociated complexes followed by further studying their structures and functions in details.

を変化させる紅色細菌も存在する

2.b.1 紅色細菌

．Rps. palustris とその近縁種は強光のときは LH2 を，弱光のときは LH4

紅色細菌を光合成条件（嫌気光照射条件）にて培養をを合成し，同時に BChl a やカロテノイドの組成も変化

行 う と，細 胞 内 に 様々な 形 状 の 膜 を 発 達 さ せ る．

することが報告されている

Rhodobacter(Rba.)sphaeroides ，Rhodospirillum(Rsp.)

養時の光強度を変化させることにより，目的に応じたク

rubrum ，Allochromatium vinosum には袋状の，Rsp.

ロマトフォアの調製が可能である．

molischianum や Rhodopseudomonas(Rps.) palustris

2.b.1.2 クロマトフォアの調製

ではラメラ状の構造体が観察される．細胞破砕後に袋状（図 2参照）．それゆえ培クロマトフォアは，新しく培養した菌体から調製するの小胞膜 vesicle が得られるが，これを一般的にクロマ
トフォアと呼んでいる．ここで得られたクロマトフォア
は，細胞膜に存在していたときと異なり，膜の内外が反転していることに注意すべきである（細胞質側を向いていた面が外側に来る) ．クロマトフォアの大きさは，約600Åであり，膜の厚さは約 55Åである ．
2.b.1.1 培養条件における光合成系の変化
紅色細菌の反応中心複合体は培養条件によって影響を受け，特に光強度によって大きく変化する．図 1は異なる光強度にて培養したとき，Rba. sphaeroides の細胞の可視吸収スペクトルの変化を示す．光強度が弱くなる
につれて，LH2 の極大吸収波長（Ｂ 850とＢ 800）での吸収が増大する．またアンテナ複合体の種類や色素組成

１) 立命館大学理工学研究科
２) 大阪大学大学院理学研究科生物科学専攻

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図 1：Rba. sphaeroides の菌体の吸収スペクトル異なる光強度にて培養した時の吸収 ス ペ ク ト ル を 示 す．
OD を 0.5に合わせて規格化した．実線：3μE/sec/m ，破線：30μE/sec/m ，点線：200μE/sec/m ．

205

ことが最も好ましい（菌体を凍結保存する場合には，緩回収するだけで十分であり，次の可溶化過程に用い衝液Ａ（50mM Tris-HCl (pH 7.8），150mM NaCl）でる．

２回，洗浄しておくことを勧める）．調製時に用いる緩衝

図２には，Rps. palustris から調製したクロマトフォア

液はおもに Tris-HCl 緩衝液やリン酸緩衝液であるが，の可視吸収スペクトルを示している．200μE/sec/m に紅色細菌の種類や実験目的に応じて変える必要があり，よる培養では周辺アンテナ系のほとんどが LH2 を形成

過去の文献を参考にすべきである．クロマトフォアは内しているが，光強度が下がるにつれて LH4 の比率が多側に可溶性チトクロームを含む場合が多く，実験目的にくなる．得られたクロマトフォア標品のバクテリオクロ

よっては不都合となる．菌体を 10mM EDTA を加えた

ロフィル a の濃度は，アセトン/メタノール混合液（7/2，

緩衝液に懸濁して氷冷放置（１〜２時間）し，EDTA をv/v）にて抽出後，吸収スペクトルにて定量する（ε ＝含まない緩衝液で洗浄することによりクロマトフォアか75mM

らほぼ完全に除くことができる．

融解後にクロマトフォアが凝集するのを避けるためにcm ）．クロマトフォアを凍結保存する時は，菌体を破砕する方法には，フレンチプレスと超音波処10％のショ糖を緩衝液に加えておく．また遮光して氷中理がある．フレンチプレスによる破砕はクロマトフォア

保存した場合，Rsp. rubrum の光リン酸化活性を例としの収量が高く，おもにタンパク質精製に用いられる．超たとき，１ヶ月以上安定であることが報告されている．

音波処理は少量の菌体からクロマトフォアを調製することができ，光化学反応や酵素活性を測定する場合に便利である．ここでは Rps. palustris からクロマトフォアを調製する方法を説明する．標品調製は４℃（あるいは氷中）で行う．

2.b.2 緑色細菌
緑色細菌は緑色イオウ細菌と緑色糸状性細菌（非イオウ細菌）からなり，両者は系統的には大きく離れた二つのグループである．紅色細菌に見られるような発達した［手順］

膜系をもたず，光合成反応中心は細胞膜に存在する．反［1］培養後，8,000×g，15分間の遠心で集菌する．1L の応中心の種類や電子伝達系など，生化学的，生理学的に培養液から湿重量で 10g 程度の菌体が得られる．

両者は大きく異なるが，クロロゾームという巨大な膜外Rps. palustris は培養時に水素ガスを発生するため，

アンテナ系をもつ点で共通している ．

培養瓶を完全に培地で満たすと破損する危険があ

緑色細菌から純度の高い光合成膜標品を調製するためる．
培養瓶の上層部に 1/10程度の気層を空けておくには，クロロゾームを除く必要がある．細胞破砕後の膜必要がある．

画分から，ショ糖密度勾配超遠心法によりクロロゾーム［2］ａ．フレンチプレスによる破砕：菌体を約３倍量の緩衝液Ａに懸濁する（懸濁液の粘性が高くて扱いが脱離した光合成膜の調製が可能である ．本項では，好熱 性 の 緑 色 硫 黄 細 菌 Chlorobaculum

tepidum（syn.

にくい場合には，緩衝液に DNase（10μg/ml）を添加する）．20000psi での処理を２回行う．
ｂ．超音波処理による破砕：菌体を適当量の緩衝液
Ａに懸濁する．懸濁液を氷水で冷却しながら，超音波発生装置の最大出力（250W ，10kHz）にて
70〜120秒間処理する（熱発生を極力抑えるために不連続な超音波処理を行うこと）．
［3］破砕溶液を 8,000×g，15分間遠心することにより未破砕細胞を除いた後，85,500×g，60分の超遠心により沈殿画分を回収する．沈殿画分を緩衝液Ａで懸濁し，再度，85,500×g，60分の超遠心を行い，上清を除く．この作業を２回繰り返す．最後に沈殿画分を少量の緩衝液Ａで懸濁し，クロマトフォア標品とする．この際，絵筆等を用いて塊を残さないように
少しずつ沈殿を懸濁するとよい．膜タンパク質精製を目的とする場合には最初の超遠心後の沈殿画分を206

図 2：Rps. palustris のクロマトフォアの吸収スペクトル異なる光強度にて培養後，調製したクロマトフォアのスペク
トルを示す．クロマトフォアのタンパク質濃度を 30μg/mlに合わせている．実線：3μE/sec/m ，破線：30μE/sec/m ，
点線：200μE/sec/m ．
光合成細菌の膜標品調製

Chlorobium tepidum）からの光反応活性を保持した光合体 10g（湿重量）あたり 20‑30ml の緩衝液Ａに懸濁後，成膜標品の調製を具体例として紹介する ．同様の方法

フレンチプレス（20,000psi）に３回通すことにより細胞で，Chlorobaculum thiosulfatiphilium（syn.Chlorobiumを破砕する．23,500×g ，20分間の遠心により未破砕細胞

limicola f.thiosulfatophilum），Chlorobaculum parvum

や元素イオウを除き，40,000×g，60分間の遠心により大（syn. Chlorobium vibrioforme NCIB 8327）の膜標品のきな膜断片を除く．２回目の遠心後に回収された上清中調製が報告されている．また，弱光で培養した緑色糸には，クロロゾームと光合成膜，および可溶性タンパク状性細菌 Chloroflexus aurantiacus でも同様の方法を用質が含まれている．上清をショ糖密度勾配（40，42.5，

いた調製例がある ．しかし，より強光で Chloroflexus

45，47.5，50％（w/v）の段階勾配．嫌気グローブボック

aurantiacus を培養した場合にはクロロゾームが脱離しス内において緩衝液Ａと 50％ショ糖緩衝液を用いて準にくくなるため，ヨウ化ナトリムのようなカオトロピッ

備する）にロードし，200,000×g で 17‑19時間の超遠心クイオンを少量加えて調製する方法が報告されてい後，45％ショ糖付近にある淡緑色の層を光合成膜画分とるして回収する（図 3）．すぐ上層にある濃緑色の層は，お．

2.b.2.1 光合成膜の調製もに脱離したクロロゾームである．回収した光合成膜画

緑色硫黄細菌は絶対嫌気性の細菌で，反応中心をはじ

分はバイアル瓶に移して脱気・窒素ガス交換後，嫌気グめとする光合成装置は極度に酸素に不安定なため，調製

ローブボックス内に持ち込む．緩衝液Ｂで約４倍に希釈には嫌気的手法を用いる．下記手順において，ショ糖密した後，室温で 15分間穏やかに撹拌する（緩衝液Ｂに含度勾配遠心後は嫌気グローブボックス内で操作しなけれまれる Glucose oxidase/Catalase により溶存酸素は除ばならない．緑色硫黄細菌のクロロゾームは酸素存在下

去される）．最後に 160,000×g ，60分間の遠心により沈では吸収した光を消光する

殿画分を回収し，少量の緩衝液Ｃに懸濁して光合成膜標．それゆえクロロゾームを除去するまでは発生した酸素ラジカルは容易に除去さ品とする．約 10L の培養液から，OD

れ，光合成膜の光反応活性は安定に保持されている．使が 100‑200μl 得られる．

＝50‑100の標品

用する緩衝液類は脱気・窒素ガス交換後，嫌気グローブ

図 4は Chl. tepidum から調製した光合成膜標品の吸ボックス内で一晩以上放置して溶存酸素を十分に除き，収スペクトルである．比較のために細胞懸濁液，粗精製

調製当日に適当な還元剤を加えて使用する．遠心中は直膜標品の吸収スペクトルも示している．緑色硫黄細菌の接酸素に触れないようにキャップ付遠心管を用いるか，

光合成膜は，反応中心複合体のアンテナ色 素 で あ る

超遠心機用ローターを直接嫌気グローブボックス内に持BChl a に由来する 810nm の吸収ピークをもつ．標品のち込むなどの工夫が必要である．緑色糸状性細菌の光合

純度は，ショ糖密度勾配遠心後，いかにクロロゾームの成活性は酸素に対して寛容であり ，嫌気操作を行う必

層を採らずに膜画分を回収できるかで決まる．クロロ

要はない．また操作は可能限り冷暗所で行うように努め

ゾームが混入した場合，図 2の粗精製膜標品の吸収スペ

る．

クトルで見られるような，750nm 付近に比較的大きな吸収ピークが現れる．しかしほとんどのクロロゾームは，［準備する緩衝液］

既に光合成反応中心複合体から脱離しているため光反応・緩衝液Ａ：50mM Tris-HCl（pH 8.0），1mM EDTA，10mM L-cysteine
・緩衝液Ｂ：50mM Tris-HCl（pH 8.0），1mM EDTA，2mM DTT，20mM β-D-glucose，glucose oxidase（2U/ml），catalase（20U/ml）
・緩衝液Ｃ：50mM Tris-HCl（pH 8.0），1mM EDTA，2mM DTT
・50％ショ糖緩衝液：50mM Tris-HCl（pH 8.0），1mM
EDTA，10mM L-cysteine，50％ショ糖（w/v）［手順］
培養後，12,000×g ，10分の遠心により集菌する．約 10
L の培養液から，湿重量で 10‑15g の菌体が得られる．菌2009 低 温 科 学

vol.67

図 3：Chl. tepidum の光合成膜調製時のショ糖密度勾配遠心

207

文献
１) G.Cohen-Bazire, Bacterial Photosynthesis, ed. H.
Gest, A.S.PietroL & P.Vernon, Yellow Springs,
Artioch Press, 1963
２) T.Oda & T.Horio, Exp Cell Res 34 (1964)P.414.
３) J.A.Bergeron, Brookhaven Symp. Biol. 11 (1958) P.
118.
４) G.Drews, Arch. Mikrobiol. 36 (1960)P.99.
５) G.Cohen-Bazire & W.R.Sistrom, The Chlorophylls,
ed. L.P.VernonG & R.Seely, New York, Academic
Press, 1963
６) R.C.Prince, A.Baccarini-Melandri, G.A.Hauska, B.
図 4：Chl. tepidum の光合成膜標品の吸収スペクトル．
緑線：細胞懸濁液（Cell suspension），青線：粗精製膜標品（Crude membrane），赤線：光合成膜標品（Purified mem．各標品は長波長側の吸収ピークで規格化して示し
brane）
た．粗精製膜標品は，細胞破砕後，110,000×g，1時間の超遠心により得られた沈殿画分を緩衝液 C に懸濁したものである．

には寄与せず，クロロゾームの蛍光や夾雑物などが目的

A.M elandri & A.R.Crofts Biochim. Biophys. Acta 387(1975)P.212.
７) A.Hochman, I.Fridberg & C.Carmeli, Eur. J.Biochem. 58 (1975)P.65.
８) W.R.Sistrom, Control of Antenna Pigment Components:The Photosynthetic Bacteria,ed.R.K.Clayton &W.R.Sistrom, New York, Plenum, 1978, p.841.
９) M .Itoh, K.Matsuura, K.Shimada & T.Satoh, Bio-の実験に影響しない程度の混入であれば問題ない．

chem. Biophys. Acta 936 (1988)P.332.
10) A.Hiraishi, Int. J.Syst. Bacteriol. 47 (1997)P.217.
11) M .B.Evans, A.M.Hawthornthwaite & R.J.Cogdell,

2.b.3 ヘリオバクテリアからの光合成膜の調製

Biochim. Biophys. Acta 1016 (1990)P.71.
12) J.Harada, T.M izoguchi, S.Yoshida, M.Isaji, H.Oh-

ヘリオバクテリアも絶対嫌気性の光合成細菌であり，酸素に対して非常に不安定な光合成膜調製のためには嫌気的手法が必要である ．しかし紅色細菌がもつようなアンテナ複合体 LH1/LH2 や緑色細菌のクロロゾーム

oka & H.Tamiaki, Photosynth. Res. 95 (2008)P.213
13) T.M izoguchi, M .Isaji, J.Harada & H.Tamiaki,
Photochem. Photobiol. Sci. 7 (2008)P.492.
14) N.U.Frigaard & D.A.Bryant, Arch. M icrobiol. 182のような巨大アンテナ系を持たない．複雑に発達した内(2004)P.265.
15) K.Schmidt, Arch. M icrobiol. 124 (1980)P.21.

膜系をもたず，
光合成反応中心は細胞膜のみに存在する．

16) H.Oh-oka,M .Iwaki & S.Itoh,Biochemistry 37 (1998)

それゆえ細胞膜標品の調製は簡便であり，培養液 1L かP.12293.
17) U.Feiler, W.Nitschke & H.M ichel, Biochemistry 31

ら得られた湿重量 1‑2g 程度の菌体から，光化学反応の活性測定に必要な量を調製することができる．

(1992)P.2608.
18) B.Kjaer, N.U.Frigaard, F.Yang, B.Zybailov, M .

［手順］

Miller, J.H.Golbeck & H.V.Scheller, Biochemistry 37(1998)P.3237.
19) P.van Vliet,D.Zannoni,W.Nitschke& A.W.Ruther-

湿重量 1‑2g の菌体に対し 5‑6ml の緩衝液（50mM，2mM DTT，1mM EDTA）に懸
Tris-HCl（pH 8.0）
濁後，菌体をフレンチプレス（20,000psi，3回）で破砕する．12,000×g，10min の遠心で未破砕細胞を除き，180,000×g，60min の超遠心により細胞膜画分を得る．
使用する緩衝液は嫌気的に調製する必要があり，菌体破砕や遠心操作以外は嫌気グローブボックス内で行う．

ford, Eur. J.Biochem. 199 (1991)P.317.
20) R.G.Feick, M .Fitzpatrick & R.C.Fuller, J.Bacteriol. 150 (1982)P.905.
21) R.G.Feick & R.C.Fuller, Biochemistry 23 (1984) P.
3693.
22) N.U.Frigaard & K.Matsuura, Biochim. Biophys.
Acta. 1412 (1999)P.108.
23) M .F.Hohmann-Marriott & R.E.Blankenship, Biochim. Biophys. Acta. 1767 (2007)P.106.
24) H.Oh-oka, Photochem. Photobiol. 83 (2007)P.177

208

光合成細菌の膜標品調製

３章 単離・精製・活性測定

３．酵素・電子伝達成分の精製・活性測定・定量
a．カルビン回路の酵素
田茂井政宏 ，重岡成

カルビン回路は光合成炭素固定の初期経路であり，チラコイド膜上で生成された ATP と NADPH を用いて，CO を固定し，糖に還元する．高等植物のカルビン回路で機能する酵素群はフェレドキシン／
チオレドキシン（Fd/Trx）系をはじめとする複雑な制御系により厳密な活性調節を受けているが，ラン藻および一部の藻類では植物と異なることも明らかになっている ．本章では，カルビン回路の主な
酵素活性測定方法について紹介する．

Enzymes for Calvin Cycle
M asahiro Tamoi, Shigeru Shigeoka

3.a.1 カルビン回路

リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH），ホスホリブロキ
ナーゼ（PRK），セドヘプツロース‑1,7‑ビスホスファ

カルビン回路は光合成炭素固定の初期経路であり，葉ターゼ（SBPase）の分子内に存在する２つのシステイン

緑体に含まれる 11種類の酵素による 13の反応で構成さ残基が，光照射下では Fd/Trx 系を介した光還元力を利れており，大きく以下の３つの段階に分けられる（図 1）．

用して還元されて活性型となり，暗黒下では酸化されて第１段階はカルボキシル化過程で，リブロース‑1,5‑ビス

ジスルフィド結合を形成し不活性型となる．さらにカル

リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（Rubisco）にビン回路は，他の酵素群の特性に基づいて厳密な制御を

より３分子の CO が３分子のリブロース‑1,5‑ビスリン

受けており，それぞれの酵素学的特性からの調節機構に酸（RuBP）に固定され，６分子の 3‑ホスホグリセリン

ついては詳細に検討されている．

酸（PGA）が生じる．第２段階は PGA の還元過程で，生成した PGA は光化学系に由来する ATP と NADPH
でリン酸化・還元され，６分子のトリオースリン酸（ジヒドロキシアセトンリン酸：DHAP およびグリセルア
ルデヒド３リン酸：GAP）に変換される．第３段階は3.a.2 リブロース‑1,5‑ビスリン酸カルボキ
シラーゼ／オキシゲナーゼ(R ubis co ）活性測定法

RuBP の再生過程で，一連の反応で RuBP が再生され（EC 4.1.1.39）は RuBP に CO を固定し２分
Rubiscoる．この回路において，トリオースリン酸は鍵となる中子の 3‑ホスホグリセリン酸を生成する反応を触媒する．

間体であり，５分子のトリオースリン酸から３分子のリ

Rubisco 本来の生理学的な役割は RuBP へのカルボキ

ブロース‑5‑リン酸（Ru5P）が再生され，１分子は葉緑シル化（カルボキシラーゼ反応）であるため，リブロー

体内でのデンプン合成もしくは細胞質でのショ糖合成へ

ス‑1,5‑ビスリン酸カルボキシラーゼが正しい呼称であと分配される．したがって，カルビン回路での RuBP 再

るが，CO の代わりに O を固定する反応（オキシゲナー生に利用するためのトリオースリン酸が枯渇しないようゼ反応）も行うことから，リブロース 1,5‑ビスリン酸カに，デンプン・ショ糖合成系への転出とのバランスを維

ルボキシラーゼ／オキシゲナーゼと呼称される．Rubis-

持することが葉緑体内での炭素代謝では特に重要であ

co の反応において，カルボキシラーゼ反応は O によっる．このバランスを維持するために，カルビン回路のいて，オキシゲナーゼ反応は CO によって拮抗的に阻害さくつかの酵素群は厳密な制御を受けている．主な調節機

れる．したがって，触媒部位近傍の溶存基質濃度をそれ構として，光還元力を利用したフェレドキシン／チオレ

ぞれ［CO ］，
［O ］
，カルボキシラーゼ反応とオキシゲナー

ドキシン（Fd/Trx）系がある．フルクトース‑1,6‑ビスゼ反応の最大速度をそれぞれ V

ホスファターゼ（FBPase），グリセルアルデヒド−３−

対するミカエリス定数をそれぞれ K ，K とすると，カル，V，溶存基質にボキシラーゼ反応の速度（V ）とオキシゲナーゼ反応の１) 近畿大学農学部バイオサイエンス学科

2009 低 温 科 学

vol.67速度（V ）は次式で表すことが出来る ．
209

図 1：カルビン回路⑴リブロース‑1,5‑ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（Rubisco），⑵ホスホグリセリン酸キナーゼ，⑶グリセルアル
デヒド‑3‑リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH），⑷トリオースリン酸イソメラーゼ，⑸アルドラーゼ，⑹フルクトース‑1,6‑ビスホ
スファターゼ（FBPase），⑺トランスケトラーゼ，⑻セドヘプツロース‑1,7‑ビスホスファターゼ（SBPase），⑼リブロース‑5‑リン酸エピメラーゼ，⑽リボース‑5‑リン酸イソメラーゼ， ホスホリブロキナーゼ（PRK）

V /V ＝ V/K / V/K

キナーゼおよび NAD-GAPDH とのカップリング反応

CO / Oによる NADH の減少量として，チャートスピード 15/K はカルボキシラーゼ反応の反応特異性，V/（20mV），27℃における 340nm のmm/min，レンジ 0.4

K はオキシゲナーゼ反応の反応特異性を示す．この式か

吸光度変化により測定する ．NADH の 340nm におけら Rubisco の両 反 応 の 特 異 性 の 比 Vる分子吸光係数 εは 6220M cm とする．

V

/K / V/K ，すなわち反応特異性（relative specificity：Sまたは τ）を示す次式が導かれる．
S ＝V

O /V

CO ＝V

［実験方法］K /V

K

１．植 物 組 織（1 2g wt）に 5ml の 100mM Tris-HCl（pH 7.8），1mM

EDTA，5mM

DTT，5mMが高いほどカルボキシラーゼ反応を好むことを意味

MgCl ，１％ Triton X-100 を加え，海砂，PVP をする．高等植物の Rubisco では 60〜130，緑藻の Rubisco

スパチュラに１杯ずつ加えた後に乳鉢，乳棒で破砕

では 60〜65，ラン藻の Rubisco では 40前後である ．空する．

S

気と平衡にある水中の溶存 CO と O 濃度はそれぞれ11μM ，256μM である．この条件では 95の Sをもつ

２．破砕液を遠沈管に移して 12,000× g ，４℃で 10分
間遠心分離後，上清を新しい試験管に移す．

高等植物の Rubisco では，カルボキシラーゼ反応がオキ

３．1ml セ ル ２ つ に 反 応 系 50mM HEPES-KOH

シゲナーゼ反応の 4.1倍の速度で進行することになる．

（pH 8.0），15mM M gCl ，1mM EDTA，20mM

一方，40の S

NaCl，10mM DTT ，0.5mM ATP，0.2mMをもつラン藻の Rubisco では，その値は1.7倍となる．
活性測定は，
反応生成物である PGA の増加量を，PGA
210，
NADH，5mM ホスホエノールピルビン酸（PEP）
5mM リン酸クレアチン，10mM NaHCO ，20 unit
カルビン回路の酵素

ピルビン酸キナーゼ（PK），2 unit クレアチンホス

合は GSH，DTT を除く）
，1％ Triton X-100 を加ホキナーゼ，18 unit NAD-GAPDH，18 unit PGA

え，海砂，PVP をスパチュラに１杯ずつ加えた後にキナーゼ をそれぞれ 1ml ずつ加え，両方に粗酵素液（10 50μl）を加えて撹拌する．
４．W ビーム の セ ル ホ ル ダーに そ れ ぞ れ セット し，
27℃，吸光度 340nm の条件で約２分間ベースライ
ンを引く．

乳鉢，乳棒で破砕する．
２．破砕液を遠沈管に移して 12,000× g ，４℃で 10分
間遠心分離後，上清を新しい試験管に移す．
（細胞内活性化率を測定する場合は，N 置換すること）
３．1 ml セ ル 2つ に 反 応 系

100 mM T ris-HCl

５．片方のセルにのみ 1mM RuBP を加えて素早く撹（pH 8.0），10mM M gCl ，5mM ATP，0.2mM

拌し，反応開始とする．340nm の吸光度変化を経時

NADPH，10mM GSH，2 unit PGA キナーゼ を的に測定する（約 10分間）．

それぞれ 1ml ずつ加え，両方に粗酵素液（10 50μl）

６．上記実験条件で得られたデータから NADH 減少速度を計算し，Rubisco 活性とする．
７．活性化状態の活性を測定する場合は，粗酵素に 20を加えて撹拌する．
（NAD −GAPDH 活性を測定する場合は，NADPH の代わりに NADH を加える．）

mM MgCl ，10mM NaHCO を加えて氷上で 10分

４．W ビーム の セ ル ホ ル ダーに そ れ ぞ れ セット し，間 イ ン キュベート し た 後 に，上 記 3 6の 方 法 で27℃，吸光度 340nm の条件で約２分間ベースライ

Rubisco 活性の測定を行う．

ンを引く．
５．片方のセルにのみ 3mM PGA を加えて素早く撹拌3.a.3 グリセルアルデヒド‑3‑リン酸デヒド
ロゲナーゼ（G AP D H）活性測定法
GAPDH（EC 1.2.1.9）は 1,3‑ビスホスホグリセリン

し，反応開始とする．340nm の吸光度変化を経時的に測定する（約 10分間）．
６．上記実験条件で得られたデータから NADPH 減少
速度を計算し，GAPDH 活性とする．

酸（DPGA）←→ GAP の反応を可逆的に触媒する酵素で７．活性化状態の活性を測定する場合は，粗酵素液に 20あり，高等植物には葉緑体と細胞質に局在している．葉mM DTT を加えて氷上で 30分間インキュベート

緑体型 GAPDH は NADP (H)および NAD (H)のいずれした後に，上記 3 6の方法で GAPDH 活性の測定をも利用し，NADP −GAPDH と表される．一方，細胞質行う．

型 GAPDH は NAD (H)の み を 利 用 す る こ と か ら，
NAD −GAPDH と表される．葉緑体型 GAPDH はカルビン回路で機能しており，Fd/Trx 系を介した酸化還元
により活性調節を受ける．細胞質型 GAPDH はショ糖合

3.a.4 フルクトース‑1,6‑ビスリン 酸アルドラーゼ（FB A）活性測定法

成系（解糖系）で機能しており，酸化還元による活性調

FBA（EC 4.1.2.13）は DHAP＋GAP ←→フルクトー

節を受けない．活性測定の際に NADPH を用いること

ス‑1,6‑ビスリン酸（FBP）FBP の反応を可逆的に触媒により，葉緑体型 GAPDH のみを測定することが可能でする酵素であり，高等植物には葉緑体と細胞質に局在しあ る．活 性 の 測 定 に は Ｗ ビーム 分 光 光 度 計 を 用 い，ている．FBA はその酵素学的性質から，反応に金属イオ

NADPH の減少量を，チャートスピード 15mm/min，レンを必要としないクラス I-FBA（CI-FBA）と，反応に金ンジ 0.4(20mV），27℃における 340nm の吸光度変化に属イオンを必要とするクラス II-FBA（CII-FBA）とに分より測定する ．また，基質である DPGA が非常に高価類される．真核光合成生物の葉緑体には CI-FBA のみがである（入手しにくい）ため，PGA を PGA キナーゼに存在するのに対し，細胞質には CI-FBA と CII-FBA の

よって DPGA に変換する反応をカップルさせて測定す両方が存在する．ラン藻（Synechocystis PCC6803）にはる．NADPH の 340nm における分子吸光係数 εは 6220

CI-FBA と CII-FBA の両方が存在することが報告され

M cm とする．

ている ．FBA 活性の測定は，FBP → DHAP＋GAP の反応生成物である GAP 生成量を，トリオースリン酸イ［実験方法］

ソメ ラーゼ（TP イ ソ メ ラーゼ）お よ び グ リ セ ロール

１．植 物 組 織（1 2g wt）に 5ml の 100mM Tris-HCl‑3‑リン酸デヒドロゲナーゼとのカップリング反応によ（pH 8.0），10mM MgCl ，1mM EDTA，1mM

る NADH の減少量として，チャートスピード 15mm/

GSH，2.5mM DTT（細胞内活性化率を測定する場（20mV），27℃における 340nm の吸光
min，レンジ 0.4

2009 低 温 科 学

vol.67211

度変化により測定する ．NADH の 340nm における分ラーゼ）とのカップリング反応による NADPH の増加

子吸光係数 εは 6220M cm とする．

量 を，チャート ス ピード 15mm/min，レ ン ジ 0.4（20mV），27℃における 340nm の吸光度変化により測定す［実験方法］る ．NADPH の 340nm に お け る 分 子 吸 光 係 数 εは

１．植 物 組 織（1 2g wt）に 5ml の 100mM Tris-HCl

6220M cm とする．

（pH 8.0），5mM M gCl ，1mM EDTA，50mM
KCl，3mM DTT，１％ Triton X-100 を加え，海［実験方法］

砂，PVP をスパチュラに１杯ずつ加えた後に乳鉢，

１．植 物 組 織（1 2g wt）に 5ml の 100mM Tris-HCl

乳棒で破砕する．
２．破砕液を遠沈管に移して 12,000× g ，４℃で 10分
間遠心分離後，上清を新しい試験管に移す
３．1ml セル 2つに反応系 50mM Tris-HCl（pH 8.5)，5mM M gCl ，0.15mM NADH，5 unit TP イソメ（pH 8.0），10mM M gCl ，1mM EDTA，1mM
GSH，2.5mM DTT（細胞内活性化率を測定する場
合は GSH，DTT を除く）
，１％ Triton X-100 を加え，海砂，PVP をスパチュラに１杯ずつ加えた後に乳鉢，乳棒で破砕する．

ラーゼ，2 unit グリセロール‑3‑リン酸デヒドロゲ

２．破砕液を遠沈管に移して 12,000× g ，４℃で 10分

ナーゼ をそれぞれ 1ml ずつ加え，両方に粗酵素液

間遠心分離後，上清を新しい試験管に移す．
（細胞内（10 50μl）を加えて撹拌する．

活性化率を測定する場合は，N 置換すること．）

４．W ビーム の セ ル ホ ル ダーに そ れ ぞ れ セット し，

３．1ml セ ル ２ つ に 反 応 系

100mM Tris-HCl

27℃，吸光度 340nm の条件で約２分間ベースライ（pH 8.0），10mM MgCl ，1mM EDTA，0.4mMンを引く．

NADP ，0.5 unit G6PDH，1.5 unit GP イソメラー

５．片方のセルにのみ 2mM F6P を加えて素早く撹拌
し，反応開始とする．340nm の吸光度変化を経時的に測定する（約５分間）．
６．上記実験条件で得られたデータから NADH 減少速度を計算し，アルドラーゼ活性とする．

ゼ をそれぞれ 1ml ずつ加え，両方に粗酵素液（1050μl）を加えて撹拌する．
４．W ビーム の セ ル ホ ル ダーに そ れ ぞ れ セット し，
27℃，吸光度 340nm の条件で約２分間ベースライ
ンを引く．

７．CI-FBA は上記方法で測定できるが，CII-FBA を測

５．片方のセルにのみ 200μM FBP を加えて素早く撹

定 す る 場 合 は 5mM M gCl の 代 わ り に 0.2mM

拌し，反応開始とする．340nm の吸光度変化を経時

CoCl を加え，反応系の pH を 7.5にして同様に測的に測定する（約 10分間）．

定する．

６．上記実験条件で得られたデータから NADPH 増加
速度を計算し，FBPase 活性とする．

3.a.5 フルクトース 1,6‑ビスホスファターゼ（FB P as e）活性測定法（EC 3.1.3.11）
は，FBP をフルクトース‑6‑リ
FBPase７．活性化状態の活性を測定する場合は，粗酵素に 20mM になるように DTT を加えて氷上で 30分間インキュベートした後に，上記 3 6の方法で FBPase
活性の測定を行う．

ン酸（F6P）と無機リン酸に加水分解する反応を触媒する酵素であり，高等植物には葉緑体型と細胞質型の２種類のアイソザイムとして存在している．葉緑体型 FBPase

3.a.6 トランスケトラーゼ活性測定法

はカルビン回路で機能しており，Fd/Trx 系を介した酸

トランスケトラーゼ（EC 2.2.1.1）は F6P＋GAP ←→化還元により活性調節を受ける．細胞質型 FBPase はキシルロース‑5‑リン酸(X5P)＋エリスロース‑4‑リン酸

ショ糖合成系で機能しており，酸化還元による活性調節（E4P）（もしくはセドヘプツロース‑7‑リン酸（S7P）＋を受けず，AM P およびフルクトース‑2,6‑ビスリン酸）の反応を可GAP ←→ X5P＋リボース‑5‑リン酸（R5P）（F2,6-P ）による阻害を受ける．これらの性質を利用す

逆 的 に 触 媒 す る 酵 素 で，活 性 の 測 定 は X7P＋E4P →ることにより，葉緑体型と細胞質型の FBPase を分別測

F6P＋GAP の反応生成物である GAP 生成量を，TP イ

定することも可能である．活性の測定にはＷビーム分光

ソメラーゼおよびグリセロール‑3‑リン酸デヒドロゲ

光度計を用い，グルコース‑6‑リン酸デヒドロゲナーゼ

ナーゼとのカップリング反応による NADH の減少量と（G6PDH），ホスホグルコースイソメラーゼ（GP イソメ

し て，チャート ス ピード 15mm/min，レ ン ジ 0.4（20212

カルビン回路の酵素mV），27℃における 340nm の吸光度変化により測定すえ，海砂，PVP をスパチュラに１杯ずつ加えた後にる ．NADH の 340nm における分子吸光係数 εは 6220

乳鉢，乳棒で破砕する．

M cm とする．

２．破砕液を遠沈管に移して 12,000× g ，４℃で 10分
間遠心分離後，上清を新しい試験管に移す．
（細胞内［実験方法］

活性化率を測定する場合は，N 置換すること）

１．植 物 組 織（1 2g wt）に 5ml の 100mM Tris-HCl

３．1ml セ ル ２ つ に 反 応 系

100mM

Tris-HCl（pH 8.0），5mM M gCl ，1mM EDTA，50mM（pH 8.0），10mM M gCl ，20mM KCl，0.1mM

KCl，3mM DTT，１％ Triton X-100 を加え，海ATP，1mM PEP，0.15mM NADH，20mM DTT，砂，PVP をスパチュラに１杯ずつ加えた後に乳鉢，

2 unit PK，2 unit LDH，0.5 unit PFK をそれぞ

乳棒で破砕する．

れ 1ml ずつ加え，両方に粗酵素液（10 50μl）を加２．破砕液を遠沈管に移して 12,000× g ，４℃で 10分
間遠心分離後，上清を新しい試験管に移す．
３．1ml セ ル ２ つ に 反 応 系 100mM

えて撹拌する．（initial activityを測定する場合は）DTT を除く．

HEPES-KOH

４．W ビーム の セ ル ホ ル ダーに そ れ ぞ れ セット し，（pH 7.5），12mM MgC ，0.15mM NADH，0.2

27℃，吸光度 340nm の条件で約２分間ベースライmM

チアミンピロリン酸，0.8mM X5P，0.8mM

ンを引く．

E4P，5 unit TP イソメラーゼ，2 unit グリセロー

５．片方のセルにのみ 400μM SBP を加えて素早く撹

ル‑3‑リン酸デヒドロゲナーゼ をそれぞれ 1ml ず

拌し，反応開始とする．340nm の吸光度変化を経時つ加え，両方に粗酵素液（10 50μl）を加えて撹拌す

的に測定する（約 20分間）．

る．

６．上記実験条件で得られたデータから NADH 減少速

４．W ビーム の セ ル ホ ル ダーに そ れ ぞ れ セット し，
27℃，吸光度 340nm の条件で約２分間ベースラインを引く．

度を計算し，SBPase 活性とする．
７．活性化状態の活性を測定する場合は，粗酵素液に 20mM DTT を加えて氷上で 30分間インキュベート

５．片方のセルにのみ 0.8mM X5P を加えて素早く撹拌し，反応開始とする．340nm の吸光度変化を経時した後に，上記 3 6の方法で GAPDH 活性の測定を行う．

的に測定する（約 10分間）．
［実験方法（リン酸定量による活性測定法）］

3.a.7 セドヘプツロース‑1,7‑ビスホスファ
ターゼ（S B P as e）活性測定法（EC 3.1.3.37）はセドヘプツロース‑1,7‑ビス
SBPaseリン酸（SBP）を S7P と無機リン酸に加水分解する反応

１．A 溶液（50mM Tris-HCl，pH 8.2，15mM MgCl ，
1.5mM MgCl ）およびＢ溶液（50mM Tris-HCl，
pH 8.2，15mM M gCl ，1.5mM M gCl ，10mM］および粗酵素液を以下のよう
DTT，1mM SBP）に混合し，27℃で５分間インキュベートする．

を触媒する酵素であり，Fd/Trx 系を介した酸化還元に

コントロール：Ａ溶液（80μl‑粗酵素液量），Ｂ溶液

より活性調節を受ける．活性測定はホスホフルクトキ（66μl）

ナーゼ（PFK），PK，乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）とリファレンス：Ａ溶液（80μl‑粗酵素液量），Ｂ溶液のカップリング反応による NADH の減少量を，チャー（66μl），粗酵素液（10 20μl）

トスピード 30cm/hr，レンジ 0.4（20mV），27℃におけ

２．反応終了後急冷し，完全に反応を止めるため，６％る 340nm の 吸 光 度 変 化 に よ り 測 定 す る 方 法 と ，（v/v）過塩素酸をすべてのチューブに 50μl 加える．

SBPase 反応により生じるリン酸を定量する方法

がある．

３．コントロールには粗酵素液をリファレンスと同量加
える．
４．沈殿が多い場合には 12,000× g ，４℃で 10分間遠［実験方法（カップリング反応による活性測定法）］

心分離後，上清を新しい試験管に移す．

１．植物組織（1 2g wt）に 5ml の 100mM Tris-HCl５．リン酸定量の検量線作製に用いるリン酸標準液とし（pH 8.0），10mM MgCl ，1mM EDTA，1mMて，リン酸二水素ナトリウムを 0.4，0.25，0.2，0.15，

GSH，2.5mM DTT（細胞内活性化率を測定する場

0.1，
0.05，0.025mM の濃度になるように６％（v/v）

合は GSH，DTT を除く），１％ Triton X-100 を加過塩素酸に溶解する．

2009 低 温 科 学

vol.67213

６．0.5N H SO に 0.3％モリブデン酸アンモニウムを加えた溶液（Ｃ溶液）を作製する．

27℃，吸光度 340nm の条件で約２分間ベースライ
ンを引く．

７．リン酸標準液，SBPase 反応液をそれぞれ 40μl ず

５．片方のセルにのみ 2mM R5P を加えて素早く撹拌

つ試験管に入れ，C 溶液を 850μl 加え，混ぜた後 10

し，反応開始とする．340nm の吸光度変化を経時的

分間室温で静置する．

に測定する（約 10分間）．

８．0.035％マラカイトグリーン，
0.35％ポリビニルアル
コール（Ｄ溶液）を 150μl 加え混ぜた後，45分間室温で静置し，分光光度計を用いて 620nm での吸光度を測定する．

６．上記実験条件で得られたデータから NADH 減少速度を計算し，PRK 活性とする．
７．活性化状態の活性を測定する場合は，粗酵素液に 20mM DTT を加えて氷上で 30分間インキュベート
した後に，上記 3 6の方法で PRK 活性の測定を行

3.a.8 ホスホリブロキナーゼ（P R K）活性測
定法
PRK（EC 2.7.1.19）は Ru5P と ATP から Rubico のう．

3.a.9 その他の酵素基質となる RuBP と ADP を生成する．Fd/Trx 系を介

PGA キナーゼ，TP イソメラーゼ，リブロース‑5‑リンした酸化還元により活性調節を受ける．活性測定は，酸エピメラーゼ ，R5P イソメラーゼ があるが，これら

PRK 反応生成物である ADP の増加量を，LDH，PK とのほとんどが上記酵素活性測定法を改変することによりのカップリング反応による NADH の減少量として，測定可能である．
詳細はそれぞれの報告を参照されたい．

チャートスピード 15mm/min，レンジ 0.4（20mV），
27℃における 340nm の吸光度変化により測定する．また，基質である Ru5P が非常に高価である（手に入りに参考文献く い）た め，R5P を リ ボース‑5‑リ ン 酸 イ ソ メ ラーゼ

１) E-M Aro, B.Anderson Eds., Regulation of Photosyn-（R5P イソメラーゼ）によって Ru5P に変換する反応を

thesis, p.297‑373, Kluwer Academic Press (2001)
２) R.C.Leegood, T.D.Sharkey, S.von Cammerer eds.,
Photosynthesis: Physiology and M etabolism, pp.9 ‑51,

カップルさせて測定する ．NADH の 340nm における分子吸光係数 εは 6220M cm とする．
［実験方法］
１．植物組織（1 2g wt）に 5ml の 100mM Tris-HCl（pH 8.0），10mM MgCl ，1mM EDTA，1mM
GSH，2.5mM DTT（細胞内活性化率を測定する場
合は GSH，DTT を除く），１％ Triton X-100 を加え，海砂，PVP をスパチュラに１杯ずつ加えた後に乳鉢，乳棒で破砕する．
２．破砕液を遠沈管に移して 12,000× g ，４℃で 10分
間遠心分離後，上清を新しい試験管に移す．
（細胞内活性化率を測定する場合は，N 置換すること）
３．1 ml セ ル 2つ に 反 応 系

100 mM T ris-HCl(pH 8.0)，10mM MgCl ，5mM GSH，1mM ATP，0.2mM NADH，50mM KCl，0.5mM PEP，5 unit
LDH，2 unit PK，2 unit R5P イソメラーゼ をそれぞれ 1ml ずつ加え，両方に粗酵素液（10 50μl）
を加えて撹拌する．

Kluwer Academic Press (2000)
３) R.C.Leegood, T.D.Sharkey, S.von Cammerer eds.,
Photosynthesis:Physiology and M etabolism, pp.85‑113,
Kluwer Academic Press (2000)
４) R.M .Lilley and D.A.Walker, Biochim. Biophys.
Acta 358 (1974)p.119
５) E.Lazko and R.V.Gibbs, Plant Physiol. 44 (1969) p.
295
６) V.Haake, R.Zrenner, U.Sonnewalt, M .Sttit, Plant J.
14 (1998)p.147
７) K.Nakahara, H.Yamamoto, C.Miyake, Yokota,A.,
Plant Cell Physiol. 44 (2003)p.326
８) G.Zimmermann, G.J.Kelly, E.Lazko,Eur. J.Biochem. 70 (1976)p.361
９) D.J.Murphy and D.A.Walker,Planta 155(1982)p.316
10) I.E.Woodrow and D.A.Walker,Arch.Biochem.Biophys. 216 (1982)p.416
11) E.P.Harrison, N.M.Willingham, J.C.Lloyd, C.A.
Raines, Planta 149 (1998)p.78
12) E.Racker, Arch. Biochem. Biophys. 69 (1957)p.300

４．W ビーム の セ ル ホ ル ダーに そ れ ぞ れ セット し，214

カルビン回路の酵素

３章 単離・精製・活性測定

３．酵素・電子伝達成分の精製・活性測定・定量
b．フェレドキシンとフェレドキシン：NAD P 還元酵素の調製と生化学的解析
榊原由紀子 ，長谷俊治

フェレドキシンは鉄硫黄クラスターを含む電子キャリアータンパク質で，光合成電子伝達反応では光
化学系

か ら 受 け 取った 電 子 を フェレ ド キ シ ン：NADP 酸 化 還 元 酵 素 に 供 与 し，NADP を

NADPH へ還元する反応を駆動している．本章では，植物組織の抽出物からや組換え体としてのこれ
らの酵素タンパク質を調製する方法とそれらを用いて活性を測定する方法を紹介する．

Purification and biochemical analysis of ferredoxin and ferredoxin:
NADP reductase
Yukiko Sakakibara, Toshiharu Hase
Ferredoxin is an electron carrier protein with FeS cluster and transfers electron from photosystem I to ferredoxin:NADP reductase, which catalyzes reduction of NADP to NADPH in the photosynthetic electron transfer
system. In this chapter, we describe purification methods of these two proteins from plant tissues and recombinant E. coli cells,and a typical assay method for the activity of ferredoxin:NADP reductase by using Fd as
an electron carrier.

3.b.1 フェレドキシン (Fd)とフェレドキシン：
NAD P 還元酵素 (FNR )の種類

は強い還元剤となる．FNR は分子サイズが 35kDa 程度の弱い酸性から中性付近の等電点をもつタンパク質であり，FAD を含むフラビン酵素である．この FAD の酸化

光合成において水の光分解により取り出された電子の還元電位は‑350mV と Fd のそれと同程度か若干高く，励起により生じる強い還元力は，電子伝達系を介して化

エネルギー論的には Fd からの電子を受け取るのに適し学還元力に変換される．この還元力は最終的には炭素，た電位関係にある．Fd から１電子ずつの２回の電子授受

窒素，硫黄等の無機物の還元同化や，糖，アミノ酸，脂により FAD が２電子還元され，還元型 FNR は NADP肪酸，核酸等の生体物質の合成に必要な素材を供給する

を NADPH に変換する．FNR の立体構造や酵素反応機

代謝系の駆動力として用いられる．この植物の独立栄養構については多くの知見が集積しており，フラビン酵素

機能を支える様々な光合成の生体反応は，電子キャリの典型として扱われている ．Fd と FNR との分子間電アー蛋白質である Fd を電子供与体とするレドックスカ

子伝達反応の際には電子伝達複合体を形成するが，そのスケードとして，葉緑体内でエネルギー・代謝のネット

複合体の構造が解かれており，両者のタンパク質・タン

ワークを形成している ．Fd が関与するレドックスカス

パク質間相互作用の詳細が明らかになっている．

ケードの中で最も主要な経路は FNR への電子供与過程

高等植物では Fd と FNR はそれぞれ数種類の分子種であり，FNR は NADP を還元し NADPH に変換すとして存在している．これらのイソ酵素タンパク質は大る．この光合成電子伝達系による NADPH の生成過程

きく光合成型と非光合成型に大別され，光合成型の分子を NADP の光還元反応と呼ばれる．

種はこれまで述べたように葉緑体内での NADP の光

Fd は分子サイズが 12kDa の酸性タンパク質で，酸化還元反応が主要な生理的役割である．一方，非光合成型

還元中心として［2Fe-2S］クラスターを持つ．生理的条Fd や FNR は根のプラスチドと葉緑体の両方に存在し，件下では，２原子の鉄イオンのうち一方のみが２価と３

生理的な反応は NADPH を還元力とした FNR による価の間を変換するので１電子キャリアーとしてはたら

Fd の還元であり，NADP の光還元とは逆方向であると

く．その酸化還元電位は‑400mV 前後と低く，還元型 Fd

信じられている ．光合成型，非光合成型のグループの中でも，さらにイソ酵素タンパク質として存在する場合が１) 大阪大学蛋白質研究所

2009 低 温 科 学

vol.67あることが報告されているが，その生理的役割にどの
215

表 1：高等植物の Fd と FNR のイソ酵素タンパク質
Fd，FNR の分子種

発現部位，特徴

酸化還元電位 (mV)

トウモロコシ
FdI
FdII
FdIII
L-FNR1L-FNR2L-FNR3R-FNR

葉（葉肉細胞），光誘導
葉（維管束鞘細胞），光誘導
根と葉，非光誘導
葉，チラコイド膜に局在
葉，チラコイド膜とストロマに分布
葉，ストロマに局在
根と葉，可溶性

−421
−412
−321
−340

イロイヌナズナ
Fd1
Fd2
Fd3
LFNR1
LFNR2
R-FNR1R-FNR2葉葉
根と葉葉，チラコイド膜に多い葉，ストロマに多い
根と葉，根と葉，根での主要成分

−425
−435
−337

−350

ような分業があるのか，まだ明確にはなっていない．こか低温室で行うが，すばやいカラム操作等であれば室れらの Fd と FNR の分子種のリストと特徴を表 1に示

温でも可能である．

した．一般に非光合成型 Fd の酸化還元電子は‑350mV

３．破砕緩衝 液 で 平 衡 化 し た DEAE セ ル ロース 樹 脂前後であり光合成型 Fd より 50mV から 80mV 程度高（DE-52 など）200g（湿重量）をバッチ法で上清に加えく，NADPH/FNR により還元される反応には光合成型て撹拌し，適当なサイズのブフナーロートに２重層にFd より熱力学的には有利になっている．

したミラクロスを敷いて樹脂をろ過により集める．
４．Fd が吸着した樹脂を取り出して破砕緩衝液に懸濁3.b.2 植物からの調製
3.b.2.1 Fd
Fd は比較的安定な可溶性タンパク質である．植物の緑葉を適当な緩衝液中で破砕力の強いブレンダーでホモゲ

し，適当な大きさのカラムに詰める．同じ緩衝液で樹脂を洗浄した後，Fd を溶出液（50mM Tris-HCl，
pH 7.5，500mM NaCl）で溶出する．Fd は褐色のバンドとして植物由来の色素類と共に溶出されるので，着色した画分を集める．

ナイズすれば容易に抽出・可溶化され，pH を中性付近に５．70％飽和硫安で塩析を行い，10000x g，15分間の遠保つことに留意すればほとんど変性は起こらない．残渣

心で上清を得る．相当量の沈殿が出る．上清に回収さや沈殿物を遠心で除いた後，上清に陰イオン交換樹脂をれた Fd は 50mM Tris-HCl，pH 7.5，70％飽和硫安

加えると Fd は強く結合する．一方，多くの共雑タンパクで平衡化した DE-52（50g 湿重量の樹脂をカラムに詰質は結合しないので，このバッチ法による大まかな処理

めたもの）に重層する．この条件で Fd は樹脂に結合すはその後の精製ステップに好都合である．著者らの精製る．

方法を以下に示す．これは２日―３日で完了する．

６．結合した Fd は 50mM Tris-HCl，pH 7.5，500mM
NaCl で溶出し，赤褐色画分を得る．この画分を 50［実験方法］

mM Tris-HCl，pH 7.5，150mM NaCl に透析（外液１．ホウレンソウ緑葉 2kg を氷冷した 2L の破砕緩衝は 50倍以上）する．ここまでが１日目の工程．

液（50mM Tris-HCl，pH 7.5，150mM NaCl）を用

７．DEAE を結合官能基としてもつイオン交換樹脂でいてワーリングブレンダー（一般のミキサーでも良い

中 圧 に 耐 え う る も の（DEAE トーヨーパール やが，一度に処理できないので，数度に分ける）で完全

Resource Q）を用いてカラムクロマトグラフィー（200に破砕する．ガーゼやミラクロス等でろ過し，大きな

ml 程度のカラム容 量）を 行 う．50mM Tris-HCl，

残渣は除く．

pH 7.5緩衝液中で NaCl の 150mM から 500mM の２．容量が 500mL から 1L の遠心管に移し，5000x g
で 10分間冷却遠心し，上清を得る．以下の操作は氷上
216

濃度勾配（総体積 500mL）で溶出する．Fd は明瞭な赤褐色バンドとして回収できる．
フェレドキンと FNR の調製法

８．Fd 画分を疎水カラムクロマトグラフィー（Phenylてよく混ぜる．アセトンの終濃度は 80％(v/v）程度とトーヨーパールや Phenyl Sepharose，50mL カラム

する．タンパク質はほとんど沈殿するが，クロロフィ

体積）で精製を進める．Fd 画分に同体積の 100％飽和

ルは可溶性画分に移る．

硫安液を加えて 50％とし，50mM Tris-HCl，pH 7.5，

４．アセトン溶液を 10000x g，15分間冷却遠心する．緑

50％飽和硫安で平衡化したカラムに掛け，硫安濃度

色の上清を完全に取り除き遠心管の底に集まった沈殿

50％から０％への逆濃度勾配 200ml で溶出する．Fdを得る．

は純度が十分高い状態で得られ，大抵の生化学的実験

５．50mM Tris-HCL，50mM NaCl を 100mL を加えはこの精製段階のものを用いることができる．ここまて沈殿を溶解する．大部分は解けるが，一部は残る．

でが２日目の工程．通常 20‑30mg の精製標品が得ら

残渣は４．と同じ遠心操作で取り除く．

れる．

６．上清を Fd のときのステップ７と同様のイオン交換

９．もし，精製度が不十分であれば（後述の純度検定に

カラムクロマトグラフィーを行う．ただし，NaCl の濃より），共雑物の大部分は核酸である．ゲルろ過カラム

度勾配は 50mM から 500mM とする．フラビンの黄クロマトグラフィーを行う．Superdex 75 あるいは同色を呈する FNR 画分が目視で確認できる．もし，色調等品を 用 い て，50mM Tris-HCl，pH 7.5，150mMがあいまいであれば後述の活性測定で溶出液をモニ

NaCl を展開緩衝液としてクロマトグラフィーを行ターする．NaCl 濃度が 150mM 前後で溶出されるは

う．

ずである．

トウモロコシのような硬い葉の場合は，組織重量に対して加える破砕緩衝液の量を増やして，ブレンダーの回７．FNR 画分を 50mM Tris-HCl，pH 7.5に透析する．
ここまで１日目の工程．

転を容易にする．ホリフェノール類が多量に含まれてい８．Fd セファロース樹脂を用いたアフィニティーカラる組織では，吸着剤であるポリビニルピロリドンを組織

ムクロマトグラフィーを行う（50mL カラム体積）．Fd

重量の 10％程度まで加えると除去効果が顕著である．まセファロース樹脂を 50mM Tris-HCl，pH 7.5で平衡

た，必要な場合には，タンパク質分解酵素阻害剤（カク化し，透析済みの FNR 画分を掛ける．NaCl の 0mM

テルとして市販されている）を加えて分解を抑える配慮

から 500mM の濃度勾配 200mL で溶出する．FNRをする．適宜判断したらよい．

の精製標品を得る．ここまで２日目の工程．20mg 程度

3.b.2.2 FNRの標品が得られる．

ホウレンソウ緑葉出発材料とする場合，FNR の大部

3.b.2.3 Fd-セファロース樹脂の調製分はチラコイド膜に結合した状態を保ちながら植物葉をFNR の 精 製 に は Fd 固 定 化 樹 脂 を 用 い た ア フィニ

破砕して，得られる膜断片から精製する方法を述べる．

ティークロマトグラフィーが有効である．Fd を固定化し最初に FNR を可溶化する方法もあるが，大量の共雑タ

た樹脂は一般には市販されていないが，簡単に自作でき

ンパク質から FNR を分画する操作をいくつも重ねる必る．

要があるのでやや面倒である．チラコイド膜からの調製
法は収量は落ちるが，精製操作は簡単であり失敗はほと［実験方法］

んど無い．

１．Fd の精製標品 30mg 程度を 100mM NaHCO ，300
（pH は８程度になる）に十分透析する．Tris
mM NaCl［実験方法］

緩衝液等，アミノ基類を含む物質は完全に除く．

１．ホウレンソウ 5kg に対して氷 冷 し た 破 砕 液（50２．BrCN で活性化したセファロース樹脂（市販品）10

mM Tris-HCl，300mM Sorbitol）5L の割合で加え，g を 200mL の 1mM HCl に懸濁し，樹脂に混在してブレンダーを用いて弱く破砕する（緑葉の細かい断片いる安定剤等を完全に溶解する．

がつぶ状に残っている位が目安）．２重層のミラクロス

３．シンターガラス付のロートで懸濁した樹脂を弱く吸でろ過して大きい残渣は取り除き，緑色のホモジェ

引ろ過し，樹脂の乾燥を避けながら，1L 以上の 1mMネートを得る．

HCl でよく洗浄する．

２．Fd のときのステップ２と同様の遠心を行うが，今度は緑色の沈殿画分を回収する．
３．沈 殿 を 60mL の 50mM Tris-HCl，100mM NaClに懸濁し，−20℃に冷却したアセトン 240mL を加え2009 低 温 科 学

vol.67

４．透析済みの Fd をキャップの付いた広口ボトル（100に入れ，透析外液と同じ 100mM NaHCO ，
mL 程度）
300mM NaCl を加えて 50mL 前後にする．
５．この Fd 溶液に洗浄した樹脂をスパチュラで少量ず
217

つ懸濁しながら加える．すべての樹脂が Fd 溶液と混側から 10残基くらいまでを目安に３番目に GC が多合し，キャップをして低温を保ちながらシェーカーでければ，アミノ酸変異を伴わないように３番目の塩基

ボトルごと緩く撹拌する．数時間から終夜撹拌でほとが AT であるコドンに改変する．これだけで発現量がんどの Fd は樹脂に共有結合する．

大幅に増加する場合がある ．もう一つは大量に発現

６．ボトルを静置すると樹脂が沈む．上澄みの色（Fd のしている大腸菌タンパク質の遺伝子のコドン頻度を考赤褐色）がほとんど無色になれば固定化完了である．

慮して，組換えタンパク質の遺伝子を完全に化学合成膨潤した樹脂の体積 1mL あたり 1‑2mg の Fd が固する方法である ．Fd 遺伝子の場合は 300塩基程度で定化し，樹脂は赤褐色を呈する．1M Tris-HCl，pH 7.5あるので化学合成はそれほど手間を必要としない．

を終濃度 100mM になるよう加えて，樹脂の未反応の官能基をブロックする．

3.b.3.2 ホロ型の酵素タンパク質の発現条件
大腸菌の細胞中では大量に発現するが，補欠分子族の７．Fd が固定化した樹脂をカラム（50mL 体積）に詰め持たないアポ型となり，封入体に取り込まれる場合もあて，50mM Tris-HCl，pH 7.5，1M NaCl でよく洗浄る．人工的にホロ型に再構成することも報告されている

して，遊離の Fd は完全に除く．Fd 樹脂はこの状態でが ，手間がかかるので，できればホロ型で発現させる方少なくとも数ヶ月は安定に低温保存できる．

が好都合である．大腸菌の生育温度や遺伝子の転写誘導剤の濃度などの，一般的な発現条件を検討することで改3.b.3 大腸菌組換え酵素タンパク質として調製善する場合も多い．20℃から 37℃の温度範囲で，誘導剤である IPTG の濃度が 0mM ，0.01mM ，0.05mM ，0.1
mM ，0.5mM と変化させて，いくつかの組み合わせを試

近年では，植物の Fd や FNR の遺伝子を大腸菌を宿せばよい．組換えタンパク質の発現速度が遅くなる低温

主とする組換え DNA の方法で発現させて，生化学や物での培養が，タンパク質のフォールディングが効率よく理化学実験に十分な数十から数百 mg を調製している場

行われる可能性が高いと思われるが，われわれの経験か合も多い．ここでは［2Fe-2S］クラスターや FAD をもっらは Fd や FNR のホロ型変換の効率には必ずしもこのたホロ型の Fd や FNR の組換え体の発現と精製方法にような傾向があるわけではない．温度は高温側で誘導剤ついて述べる．

の濃度が低い方が良い場合や，反対に低温側で高濃度の3.b.3.1 遺伝子のコンストラクト

誘導剤の方が良い場合もある．大量にホロ型が発現すれ以下の３点に留意する．

ば Fd の場合は菌体の色調が赤色に，FNR の場合は緑黄

１) cDNA クローニングや RT-PCR で得られた遺伝子

色を呈するので，目視でホロ型としての発現量を簡便には，葉緑体への移行シグナルをもった前駆体をコード見積もることができる．ホロ型の発現量の条件検討にはする場合が多い．この延長ペプチド部分はあらかじめそれほど手間はかからない．

取り除く必要がある．成熟体のＮ末端構造が未知であ3.b.3.3 精製方法

れば他の構造が判明している Fd や FNR から推定する．

基本的には植物組織抽出物を出発材料とする場合と類似している．菌体の色が Fd や FNR の補欠分子族の色

２) 発現ベクターには特に制限はないが，古くは pTrc

調として見えるくらい高発現しているのであれば，植物

ベクター，近年では pET 系ベクターや pQE ベクター

組織での発現量に比べ組換え体の場合の方が，総タンパが使われている．精製に便利なようにタグを付けると

ク質量あたりの含量が相当多いので，精製は容易である．

の考え方もあるが，FNR のＣ末端の Tyr は酵素活性

大腸菌体の破砕と抽出物に含まれる大量の核酸類の除去に必須あり ，また FNR のＮ末端領域 や Fd のＣ末に留意すれば，あとは特に問題点はない．

端領域 は両者の相互作用に何らかの役割を果たして

菌体重量の３倍量
Fd を発現している大腸菌の場合は，いる可能性があるので，安易にタグをつけることは避程度の 50mM Tris-HCl，pH 7.5，150mM NaCl，1mMけた方が良い．

MgCl ，1mM EDTA，0.5％メルカプトエタノール，1３) 組換え体の発現量が低く，大腸菌発現系の大量調製

mM PMSF で菌体を懸濁し，超音波破砕で細胞を処理すの利点が生かせない場合がある．これまでの経験からる．超音波により菌体から出てくる核酸が断片化される

２つの解決方法が工夫されている．翻訳開始 M et からので，破砕液の粘度が十分に低下すれば，良好に破砕で直後の下流のコドンの第３番目の塩基がＧあるいはＣ

きたことの目安となる．10000x g で 15分間の冷却遠心が多い場合は発現量が少なくなる傾向がある．Ｎ末端で上清をとり，バッチ法の DE-52 処理を行う．Fd は樹脂

218

フェレドキンと FNR の調製法

に吸着した画分から回収される．これ以降の操作は植物組織の場合と同じであるが，精製初期のステップでは Fd
画分には核酸が相当量混入してくるので，両者を分けることができるクロマトグラフィーの溶出条件等を工夫す
る．
FNR を発現している大腸菌の場合は，菌体重量の３
倍量の 50mM Tris-HCl，pH 7.5，200mM NaCl，1mM
M gCl ，1mM EDTA，0.5％(v/v）メルカプトエタノー
ル，1mM PM SF で菌体を懸濁し，超音波破砕で細胞を処理する．10000x g で 15分間の冷却遠心で上清をとり，バッチ法の DE-52 処理を行う．FNR は未吸着の画分に回収される．核酸の大部分は吸着するのでこのバッチ操
作 で 効 果 的 に 核 酸 除 去 が 可 能 と な る．FNR 画 分 は30％−60％飽和硫安による塩析処理をし，60％沈殿物を50mM Tris-HCl，pH 7.5に透析して，それ以降のイオン交換クロマトグラフィーや Fd アフィニティークロマ
トグラフィーは植物組織由来の場合と同様に行う．
もし，
FNR の発現量が非常に多い場合は，一回の Fd アフィニ
ティークロマトグラフィーでは Fd 樹脂の吸着容量を越えることもあるので，数回に分けて行う．FNR の量が多ければ，Fd アフィニティークロマトグラフィーをさけて，疎水クロマトグラフィーやゲルろ過クロマトグラ
フィーでも精製は可能である．

3.b.4 吸収スペクトルと純度評価

図 1：Fd と FNR の吸収スペクトル
トウモロコシ由来の Fd と FNR を大腸菌組換え体として精製した標品の可視紫外の吸収スペクトルを用す．Fd（上図）
は 461nm，423nm，328nm，276nm に吸収極大を，FNR（下図）は 457nm，391nm，274nm に吸収極大を示している．

と 275nm 付近の極大波長での吸光度の比は 0.11から0.12の範囲にある．

可視部に吸収極大のある補欠分子属を含む酵素タンパ

純度を評価するために一般的な SDS ゲル電気泳動を

ク質の純度は，補欠分子属由来の極大波長とタンパク質用いることももちろん可能であるが，Fd の移動度は標準の吸収極大波長である 280nm 付近における吸光度の比的なタンパク質のそれからは相当外れ，実際の分子サイを指標として評価する場合が多い．Fd と FNR もこのよズが 11‑12kDa であっても，ゲル上では 17‑20kDa 位のうな純度評価が一般的で適用されている．

場所に移動する．また，精製標品であっても複数のバン両方の酵素タンパク質とも精製した状態では酸化型でドに分かれる場合もある．これは，Fd の異常な振る舞いあり，
図 1にこれらの典型的な吸収スペクトルを示した．

は，強酸性のタンパク質である Fd に結合する SDS の量

Fd は 460nm，420nm，330nm 付近に［2Fe-2S］クラス

が標準的なタンパク質より大幅に少ないためであると考ター由来の吸収極大が認められ，420nm 付近の吸収極大えられる．FNR の場合はこの様なことはなく，分子サイのミリモル分子吸光係数は 9.6mM cm であり，このズに応じた移動度を示す．

値を用いて定量できる．精製標品の 420nm と 275nm 付
近の極大波長での吸光度比は 0.45‑0.55の範囲にくる．
この値にかなりの幅があるのは，ポリぺプチド鎖に含ま3.b.5 活性測定れる芳香族アミノ酸（主にトリプトファンとチロシン）

FNR と Fd の活性は，NADPH を電子供与源，Cyt cの残基数によりタンパク質由来の吸収の大きさが変動すを電子受容体として，Cyt c の還元を分光学的にモニるからである．個々の Fd の分子種で精製標品の値をターする方法が一般的である．FNR の NADPH と Fd

知っておくと便利である．FNR は FAD 由来の吸収極大に対する Km 値は数 μM から数十 μM 程度，FNR の分が 455nm，385nm 付近にある．455nm のミリモル分子子活性は１秒間あたり数十から数百程度であるので，測吸光係数は 10.7mM cm である．精製標品の 455nm

定の条件決定の際にこれらの数値を考慮すればよい．こ2009 低 温 科 学

vol.67219

こでは Fd に対する Km 値を求めるための活性測定を実例として説明する．
［実験方法］
１．Fd と FNR を除いた反応液の組成（終濃度）は以下のようにする．
50mM Tris-HCl，pH 7.5
100mM NaCl
100μM NADPH
5mM Glucose-6-リン酸（G6P）
1unit G6P デヒドロゲナーゼ（市販品）
200μM Cyt c
２．これに 0‑50μM にまたがる所定の濃度の Fd と数十nM の FNR が加わり活性測定のための全成分がそろう．FNR は生物種により分子活性が異なるので，活性測定に適した濃度を予備実験で求めておく．最大の活性を測定する場合に１分間で Cyt c の還元が完了する
位を目安とする．

図 2：NADPH/FNR/Fd による Cyt c の還元測定の一例
実験方法に記したアッセイ条件で，Fd 濃度を 0μM ，1μM ，
5μM ，10μM ，20μM ，40μM と変化させて，Cyt c の還元を 550nm の吸光度の時間変化でモニターしている．測定に当たっては，反応スタート時の吸光度をゼロになるよう記録している．

３．Cyt c の還元は 550nm の吸光度の増加で追跡する．
還元型 Cyt c の分子吸光係数は 29mM cm である

高濃度の Fd による測定は難しくなる．また，マイクロので，1cm の光路長のセルでは濃度が濃すぎて測光がタイタープレートを用いても工夫をすれば簡便に測定困難である．光路長が 2mm のセルを用いると全還元出来る．

されて吸光度が 1.2程度になる．
４．実際の測定にあたっては，反応の開始は NADPHの添加により反応をスタートさせ，550nm の吸光度変参考文献

化を連続的に記録する．反応液には NADPH の再生

１) T.Hase, P.Schurman, & D.B.Knaff, Photosystem I,

系が含まれているので，時間に比例して反応が直線的

ed. J.H.Golbeck, Dortrecht, Springer, 2006, p.477
２) P.A.Karplus, M .J.Daniels & J.R.Herriott, Science,
250 (1991)p.60
３) R.M orales, M-H.Charon, G.Kachalova, L.Serre, M .
Medina,C.Gomez-Moreno & M .Frey,EM BO Reports,1に進行する．
５．Fd の各濃度で同様の測定を行い，直線の勾配から還元速度を算出する．Cyt c の酸化型と還元型との差ス
ペクトルにおいて，550nm の分子吸光係数は 19.5
mM cm である．
６．Cyt c はウシやウマの心筋由来の市販品を用いる．
この標品には相当量の共雑物が含まれているらしく，50mM Tris-HCl，pH 7.5に溶解すると Cyt c は還元型となる割合が多い．フェリシアンカリウムを少量加えて完全酸化型に戻し，カルボキシ（CM ）セルロースなどの陽イオン交換樹脂に吸着し，50mM Tris-HCl，(2000)p.271
４) G.Kurisu, M.Kusunoki, E.Katoh, T.Yamazaki, K.
Teshima, Y.Onda, Y.Kimata-Ariga & T.Hase, Nat.
Struct. Biol. 8 (2001)p.117
５) Y.Onda, T.M atsumura, Y.Kimata-Ariga, H.Sakakibara, T.Sugiyama and T.Hase, Plant Physiol. 123(2000)p.1037
６) G.T.Hanke, Y.Kimata-Ariga, I.Taniguchi & T.

７．光路長が 1cm の標準セルを用いる場合は Cyt c のHase, Plant Physiol. 134 (2004)p.255
７) G.T.Hanke, S.Okutani, Y.Satomi, T.Takao, A.
Suzuki & T.Hase, Plant Cell Environ. 28 (2005)p.1146
８) Z.Deng, A.Aliverti, G.Zanetti, A.K.Arakaki, J.
Ottado, E.G.Orellano, N.B.Calcaterra, E.A.Ceccarelli,N.Carrillo & P.A.Karplus,Nat.Struc.Biol.6(1999),
p.847
９) M .Maeda, Y.H.Lee, T.Ikegami, K.Tamura, M .Ho-

濃度を 40μM に下げる．ただし，この濃度と同程度のshino,M.Yamazaki,M .Nakayama,T.Hase& Y.Goto,

pH 7.5で 十 分 洗 浄 し た の ち，50mM Tris-HCl，
pH 7.5，500mM NaCl で溶出する．吸着・溶出した
Cyt c は 50mM Tris-HCl，pH 7.5に透析する．この操作でほとんどの Cyt c が酸化型となった標品が得られる．
−20℃で凍結保存できる．

220

フェレドキンと FNR の調製法

Biochemistry, 44 (2005)p.10644
10) T.M atsumura, Y.Kimata-Ariga, H.Sakakibara, T.
Sugiyama, H.M urata, T.Takao, Y.Shimonishi & T.

11) K.Teshima, S.Fujita, S.Hirose, D.Nishiyama, G.
Kurisu, M.Kusunoki, Y.Kimata-Ariga & T.Hase,
FEBS Lett. 546 (2003)p.189

Hase, Plant Physiol, 199 (1999)p.491

2009 低 温 科 学

vol.67221

３章 単離・精製・活性測定

３．酵素・電子伝達成分の精製・活性測定・定量
c．シトクロム
永島 賢治
紅色光合成細菌の反応中心への電子供与体として働く水溶性シトクロム c を中心に，その基本的性質
や精製法および定量法などを解説する．

Soluble cytochromesand HiPIP in purple photosynthetic bacteria

Kenji V.P.Nagashima
Biochemical natures and methods for isolation and quantification of soluble electron donor proteins working for
reduction of photo-oxidized reaction centers in purple photosynthetic bacteria are described.

3.c.1 紅色細菌における水溶性電子供与体の種類と性質

クトルはシトクロム c とよく似ている．ただしシトクロ
ム c が反応中心への主要な電子供与体となっていることを示す報告は無く，これらの細菌では高電位鉄イオウ

ヘムを結合したタンパク質のうち，そのヘムの中心にある鉄原子がイオン価を変える（Fe ←→Fe ）ことで可タンパク質（HiPIP）が生理的な電子供与体となっている

逆的に電子の授受を行うものを一般的にシトクロムと呼ヘムを二つ含むシトクロム c も反応中心への電子供与

ぶ ．結合するヘム構造の違いにより a，b，c，d 型に大体として働くことが示唆されている ．また，αグループ

別され，生理機能の違いやアミノ酸配列の違いによっての一部の細菌（Rhodobacter 属および Rhodovulum 属のさらに細分化される大きなタンパク質ファミリーを形成一部）ではシトクロム c またはシトクロム c と呼ばれしている．このうち，本項では反応中心への電子供与体

る膜結合型のシトクロムが合成され，シトクロム c と同として働く水溶性の c 型シトクロムを対象に記述する様の働きをしていることが知られていることとする．

合型シトクロムはシトクロム c と高いアミノ酸配列相ようである ．他に分子量 20‑30キロダルトン（kDa）で．これら膜結葉緑体・シアノバクテリアの光化学系 や非酸素発生同性を示すが，Ｎ末端側に膜を一回横切る疎水性領域が型光合成細菌では低分子量の電子伝達タンパク質が反応付加している点が特徴で，分子量は 20から 50kDa と幅

中心への電子供与体として働く．このような電子供与体がある．

として古くからよく知られ研究に用いられてきたものに
紅色光合成細菌のシトクロム c がある ．シトクロム cは紅色細菌の αグループの種に共通して見られる電子

3.c.2 精製法

伝達タンパク質で，呼吸鎖においてもシトクロム酸化酵

シトクロム c および類似の機能を持つ各種電子伝達

素への電子供与体として働く．SDS-PAGE で見た分子タンパク質はいずれもペリプラズム空間に含まれる水溶量は１万ダルトン前後でヘムを一つ結合しており，酸化性の低分子量タンパク質である．可視光領域に特有の吸還元中点電位は 300mV をやや上回る．還元型の吸収ス収帯を持ち実験操作中も容易に視認できるため単離・精ペクトルでは α吸収帯のピークが 549‑551nm に現れ製は比較的簡単である．一般的な精製の流れを図１に示る．βグループおよび γグループの紅色光合成細菌ではす．精製に用いる菌体は光合成条件下で指数増殖後期まシトクロム c は見られず，替わりにシトクロム c が合たは定常期まで培養したものを用いる．電子伝達タンパ成される．シトクロム c は分子量が８千前後でシトクロク質は定常期に達しても直ちに分解されることはない

ム c に比べやや小さいが，酸化還元中点電位と吸収スペが，定常期を過ぎて数日放置した菌体を用いると収率が落ちるようである．集菌から細胞破砕・分画までの流れ

１) 首都大学東京

大学院

細胞エネルギー研究室

2009 低 温 科 学

vol.67

理工学研究科生命科学専攻は光合成膜標品（クロマトフォア）を調製する操作と共通である．細胞破砕の方法として図ではフレンチ・プレ
223

使った場合 DEAE 等の陰イオン交換カラムには吸着しないことがある．下にいくつかの紅色細菌でのイオン交
換カラムクロマトグラフィーの選択について例示する
が，まずはサンプルの一部をカラムに乗せてみて吸着するかどうか確認してから全量をアプライすると良い．
・Rubrivivax gelatinosus
反応中心への電子供与体として複数の水溶性電子伝
達タンパク質の存在が知られている．これらのタンパ
ク質はいずれも陽イオン交換樹脂（CM Sepharose）に吸着する．吸着したタンパク質のうちまず HiPIP が30mM の塩強度で緑がかった茶色いバンドとして回収される．55mM の塩強度で赤いシトクロム c のバンドが動き出すが，移動の速いバンドと遅いバンドの二つに分かれる．移動の速いほうがシトクロム c で，遅いほうがシトクロム cʼ
である．
・Rhodobacter sphaeroides
DEAE Sepharose などの陰イオン交換樹脂を用いて精製する．この場合カラムに乗せる前に予め少量のアスコルビン酸で還元型にしておくと樹脂への吸着が安定し，70‑80mM の塩強度でシトクロム c が溶出する．光合成培養した場合，他のシトクロムは極めて微量である．
・Blastochloris virids
CM Sepharose などの陽イオン交換樹脂を用い，10‑20mM の塩強度でシトクロム c を溶出させる．カ
図 1：紅色光合成細菌からの水溶性電子伝達タンパク質の単離手順

ラムに乗せる前に予め少量のフェリシアナイドで酸化型にしておくと樹脂への吸着が安定する．他のシトク
ロムはほとんど見られない．

スを用いているが超音波破砕などでもかまわない．いずこれらのタンパク質には目で見える色が付いているのれにせよ超遠心分離により膜標品を沈殿させた上清を粗で，カラムへの吸着や移動を確認することは容易である．

抽出液として精製を進める．また，細胞をリゾチームでまた，カラム操作の過程で緩衝液中に終濃度 1mM 程度処理してスフェロプラスト化し，その結果得られるペリのアスコルビン酸またはフェリシアナイドを加えておく

プラズム画分を粗抽出液としても良い．この場合リゾと酸化還元状態が安定しバンドがシャープになるようでチームが良く効いているかどうか時々確認することが望ある．溶出させたサンプルは，必要に応じて限外濾過やましい．
確認は処理溶液１量に対し蒸留水を 10倍量程度

ポリエチレングリコール等で濃縮し，ゲル濾過カラム

加え光学顕微鏡で観察して行う．この時，細胞がスフェ（Sepharose S-100 など）にかけ分子量の異なるタンパク

ロプラスト化していれば細胞が丸く膨潤している様子が質を除去する．この操作は脱塩も兼ねる．以上の操作で観察できるはずである．

得られる電子伝達タンパク質の収量は，B.viridis のシト

粗抽出液はまず硫安沈殿法により大まかに画分する．

クロム c の場合で 1l の培養から 40μmol 位である．こ電子伝達タンパク質の大部分は 40％‑100％硫安分画とれらのタンパク質は比較的安定であり，常温での測定でして得られる．100％硫安による沈殿物を緩衝液に懸濁半日程度，氷上での保存で１週間程度（ただし暗中）なし，透析により硫安を除去する．透析後のサンプルはイら吸収スペクトルに変化は見られない．長期に渡って保オン交換カラムクロマトグラフィーにかける．シトクロ

存する場合は−80℃で冷凍保存，あるいは凍結乾燥する

ム c および類似の水溶性電子伝達タンパク質の等電点ことが望ましい．

は塩基性側にあることが多く，中性域のバッファーを
224

なお，電子伝達タンパク質には水溶性のものだけでな
シトクロム c ，c ，HiP IP

く膜に緩く結合しているものや吸着しているものも少な
くない．こうしたタンパク質を精製するためには膜標品との分離の際に高イオン強度の緩衝液または低濃度の界面活性剤を含む緩衝液を使用する．タンパク質が静電的相互作用で膜に吸着している場合は前者が，疎水性相互作用の場合は後者の緩衝液が必要である．例として Rvi.
gelatinosus の場合では 0.1％オクチルグルコシドを添加することで２ヘム型のシトクロムであるシトクロム cが得られる．このシトクロムは陽イオン交換カラムでは40mM の塩強度で溶出する．

3.c.3 精製したシトクロムの定量と検定
紅色細菌に見られる各種電子伝達タンパク質の酸化型
および還元型での吸収スペクトルを図 2に示す．濃度を求 め る 際 は HiPIP の 場 合 430nm で の 吸 光 係 数 を 4mMとし，シトクロム c では酸化還元差スペクトルでの α帯（550nm 付近）の吸収変化に対し 19mMとするのが一般的である．シトクロム cʼ
では γ帯（430nm 付近）での酸化還元差に対し 30mMの吸光係数を適用する．ただしこれらの吸光係数はあくまでも目安であり，種によって吸収帯の形は微妙に異なるのが普通である．

図 2：各種電子伝達タンパク質の吸収スペクトル
実線は還元型，点線は酸化型でのスペクトルを表す．

シトクロムの場合，より正確なヘム濃度を求める方法としてはピリジン‑ヘモクロム法がよく利用される．1mlのサンプル溶液に 200mM NaOH と 40％のピリジンを

参考文献

含む混液 1ml を加え攪拌した後，酸化（フェリシアナイ

１) G.Palmer,& J.Reedijk,Eur.J.Biochem.200 (1991)p.

ド添加）還元（ジチオナイト添加）差スペクトルを測定

599.
２) T. E. M eyer, &する．c 型ヘムの場合，α帯の吸収ピークは 550nm に現れ，吸光係数は 24mMとされている ．

シトクロムは電気泳動後のゲル上で特別な処理をせずとも特異的に染色できる．特に c 型シトクロムの場合はヘムがジスルフィド結合を介してペプチドと強固に繫がっているため SDS-PAGE 後でも特異的な検出が可能である．3,3ʼ
（TM BZ）
をメタ,5,5ʼ-Tetramethylbenzidine
ノールに 6.3mM となるように溶かした溶液をＡ液，
0.25M 酢酸ナトリウムを氷酢酸で pH 5.0に調整した溶液をＢ液とし，これらを A：B＝3：7に混合する．泳動後のゲルをこの混合液に浸し，緩やかに振とうしながら１時間以上暗中に置いた後 30mM となるように過酸

T. J. Donohue, Anoxygenic

Photosynthetic bacteria, eds. R.E.Blankenship, M .T.
Madigan,& C.E.Bauer,Dordrecht,Kluwer,1995,p.725.
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４) F.E.Jenney, & F.Daldal, EMBO J. 12 (1993)p.1283.
５) H.M yllykallio, D.Zannoni, & F.Daldal, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 96 (1999)p.4348.
６) Y.Kimura,J.Alric,A.Vermeglio,S.Masuda,Y.Hagiwara, K.M atsuura, K.Shimada & K.V.P.Nagashima,
J.Biol. Chem. 282 (2007)p.6463.
７) E.A.Berry, & B.L.Trumpower, Anal. Biochem. 161(1987)p.1.
８) P.E.Thomas,D.Ryan,& W.Levin,Anal.Biochem.75(1976)p.168.

化水素を加えるとシトクロム c のみが青緑色のバンドとして検出できる ．洗いにはイソプロパノールとＢ液を 3：7の量比で混合した溶液を使用する．
この処理の後で CBB による通常のタンパク質染色も可能であるので，精製したシトクロム c の精製度の評価も容易であろう．
2009 低 温 科 学

vol.67225

３章 単離・精製・活性測定

３．酵素・電子伝達成分の精製・活性測定・定量
d．プラストシアニン
日比野 隆 ，田中

義人 ，高倍昭洋

プラストシアニンは光合成電子伝達反応において，シトクロム f から電子を受容し，光化学系

へと電子を供与する銅タンパク質である．本章では，植物およびラン藻のプラストシアニンの抽出・精製法，定量および活性測定法について紹介する．

Purification and Analysis of Plastocyanin in Photosynthetic Organisms
Takashi Hibino, Yoshito Tanaka, Teruhiro Takabe
Plastcyanin is a blue-copper protein, which accepts electron from cytochrome f and donates to photosystem I
reaction center. In this chapter, we introduce protocols for purification of plastocyanin from photosyntheticorganisms and methods for kinetic analysis of redox reaction. Structural and functional properties of plastocyanin have been described.

3.d.1 P C の分子的性質
プラストシアニン（以下 PC と略す）は，分子量約 10のパッチではむしろ正電荷が多く分布する．このため，植物では pI が酸性なのに対して一部のラン藻では中性や塩基性になる ．

kDa の銅タンパク質である．植物では葉緑体に存在しており，酸化型 PC は鮮やかな青色を呈する．葉緑体中の存在量はクロロフィルの 1/200〜1/300で，光合成単位あた

3.d.2 P C の電子伝達反応

り１分子の割合に相当する ．PC は，種子植物からラン

植物の PC は疎水結合と静電気的結合の両方でシトク藻にいたるまで多くの光合成生物種で存在が報告されてロム f と一時的に複合体を形成し，電子伝達反応が起こいる．植物の PC は等電点（pI ）が酸性だが，一部のラる．溶液の反応系では，反応の tは 200マイクロ秒程

ン藻の PC には pI が中性や塩基性のものがあり，イオ度である ．PC による光化学系

反応中心の還元反応

ン交換カラムを用いて精製を行う場合には注意が必要では，衝突によるもの（タイプ ），複合体の形成を経るもある．いくつかの生物種について報告されている pI のの（タイプ ），複合体形成の際に相互作用表面の構造変値を表 1に示す．

化を伴うもの（タイプ ）に分けられる ．タイプ およ

PC のＸ線結晶構造解析によって，PC の表面には２つびタイプ はラン藻の PC にみられ，タイプは主に植の重要な部位が存在することが明らかにされている（図物にみられる．タイプ の反応は二相性を示し，最初の1）．一つの部位は電子移動反応に関与する疎水的な部分

速い反応は数マイクロ秒で進行するが，遅い反応は，そ（サイト１）
であり，もう一つは反応相手であるシトクロの 100倍程度の時間で進行する．

ム f や光化学系と静電気的に相互作用して複合体を形成する部分（サイト２）である ．サイト１は，疎水性アミノ酸の中にヒスチジンが存在する．サイト２は，多くの PC で保存されているチロシンの周りをいくつかの

表 1：様々な生物種の PC の等電点および酸化還元電位

電荷をもつアミノ酸が取り囲む構造をとっている．サイト２は生物種によって多様であり，植物ではアスパラギ
ン酸やグルタミン酸残基からなる二ヶ所のパッチから構成されているが，ラン藻では負電荷の数が少なく，一方

１) 名城大学大学院総合学術研究科
２) 名城大学総合研究所

2009 低 温 科 学

vol.67

等電点 酸化還元電位(mV)
種子植物
ホウレンソウ
緑藻
Monoraphidium braunii
ラン藻
Synechocystis sp.PCC6803
Anabaena sp.PCC7119

4.2

370

3.7

350

5.5
8.8

358
355

227

図 1：X 線構造解析から得られた高等植物（Silene）PC の立体構造
Ａ．リボンモデル（Molscript および Raster3D によって作画した）．Ｂ．銅原子と結合するアミノ酸残基の配置（M IDAS により作画した）．

3.d.3 チラコイド内腔への P C の輸送の比（Ａ/ ）で見積もる．精製した高等植物の PC ではＡ

は 1.0に近い値になるが，藻類やラン藻では/植物の PC 遺伝子は核ゲノムにコードされており，PC

それより高いこともあり，2.0を超える例も報告されてアポタンパク質は細胞質で合成されて葉緑体チラコイド

いる．PC は比較的安定なタンパク質で抽出・精製の操作

内腔まで輸送される．PC アポタンパク質はＮ末端部分を室温で行っても収率はあまり低下しないが，精製が進に 65−70個程度のアミノ酸残基からなる通過ペプチド

んだ段階での操作は低温で行うことが望ましい．精製し（transit peptide）を持っており，Toc，Tic 輸送システ

た PC は，40％（v/v）グリセロールを含む 10mM リンムによって葉緑体包膜を通過した後，Ｎ末端部分が切断

酸緩衝液（pH 7.0）中で−20℃以下で凍結保存すれば，されて中間サイズの PC となる．中間サイズとなった

数年間は安定である．

PC は，バクテリア内膜の輸送体と相同性のある secA，

3.d.4.1 葉緑体からの P C の抽出

secYE 輸送体によってチラコイド膜を通過後，２回めのPC は葉緑体チラコイド内腔でラメラ膜に比較的弱く切断をうけて成熟型 PC となると考えられている ．図

結合しており，種々の処理で容易に可溶化することがで２に PC の通過ペプチドのアミノ酸配列を示す．通過ペきる．したがって，多量の PC を必要としない場合，葉緑

プチドのＣ末端側には疎水性アミノ酸のクラスターがみ体を調製してから抽出することにより，不純物の少ないられる．この構造は大腸菌の外膜タンパク質の通過ペプ

粗抽出液から精製を始めることができる．

チドとよく似ており，PC を大腸菌のペリプラズマに蓄⑴ 根と葉を除いたホウレンソウの葉 1kg に対して積させて抽出・精製するのに利用できる ．精製した成熟

冷やした緩衝液（0.4M ショ糖，0.05M リン酸緩衝型 PC アポタンパク質は in vitro で銅が組み込まれるこ

液 pH 7.0）2L の割合で加え，ミキサーで破砕すとが知られている ．

る．
⑵ ４層のガーゼでろ過した後，ろ液を 3,000xg で3.d.4 植物からの P C の抽出法
PC は，硫安分画や種々のクロマトグラフィーなど，タンパク質の精製に一般的に用いられる方法を組み合わせ

15分間遠心し，得られた沈殿を葉緑体画分とする．
⑶ 葉緑体画分を 1L の冷やした脱イオン水に懸濁した後，9L のアセトン（−20℃）を少量ずつよく撹拌
しながら加える．

て精製できる．PC を含む画分は，1mM 程度のフェリシ⑷ しばらく静置してから容器を傾けて上清を捨てた

アン化カリウムを加えることにより青色を呈するので，

後，3,000×g で５分間遠心して得られた沈殿を風乾

濃度が高ければ目視で確認できる．PC の純度は，278nm

する．

の吸収と酸化型 PC の吸収極大である 597nm の吸光度
228⑸

乾 い た 沈 殿 を 1L の 10mM リ ン 酸 緩 衝 液
光合成生物のプラストシアニンの精製法・活性測定法

図 2：PC の通過ペプチド（transit peptide）のアミノ酸配列，Synechocystis sp.PCC 6803（GenBank Accession No.X54105）の翻訳産
Silene pratensis（GenBank Accession No.X02965）
物のアミノ酸配列を元に作成した．矢印の部分でプロセシングが起こる．疎水性ドメインと考えられる部分を下線で示した．

（pH 7.0）に懸濁し１時間放置する．3,000×g で 10
分間遠心して得られる上清を粗抽出液とする．
3.d.4.2 ホウレンソウの葉からの P C の抽出⑴ ホウレンソウの葉 6kg に 18L のア セ ト ン（−
30℃）を加え，ワーリングブレンダーで破砕した後，15分間静置する．
⑵ 破砕物を 5,000×g で 10分間遠心し，沈殿を室温で乾燥させ，アセトンパウダを得る．
⑶ 得られたアセトンパウダを 12L の蒸留水に懸濁した後，5,000×g で 10分間遠心し，不溶物を除去す⑷ 10‑200mM リン酸緩衝液（pH 7.0）で濃度勾配をかけて PC を溶出する．
⑸ Ａ/を測定し，PC を多く含む画分を集め，10mM リン酸緩衝液で透析する．
⑹ DEAE-Sephacel カラムによる分画をもう一度行
い，Ａ/が１に近い画分を集め，10mM リン酸

緩衝液で透析する．
⑺ 十分な純度の PC が得られない場合は，10mM リン酸緩衝液で平衡化した Sephadex G‑100 column（2.5×120cm）を用いてさらに精製するとよい．

る．得られた上清を粗抽出液とする．
3.d.4.3 P C の精製⑴ PC 粗抽出液を 55％−90％飽和濃度で硫安分画す
る．

3.d.5 ラン藻からの P C の抽出・精製
藻類やラン藻のなかには PC をもたず，シトクロム c⑵ 得られた沈殿をできるだけ少量の 10mM リン酸

がシトクロム f と光化学系との間の電子伝達を行う

緩衝液（pH 7.0）に溶かし，同じリン酸緩衝液で 24ものがある

時間透析する．

つラン藻の場合には，培地の Cu 濃度が低下すると PC．PC とシトクロム c の両方の遺伝子をも⑶ 透析した PC 溶液に少量のフェリシアン化カリウの蓄積量が低下するので，培地の Cu 濃度を高くしてムを溶かして PC を完全に酸化させ，10mM リン酸（4μM CuSO 程度）培養すると PC の収量が増加するこ緩衝液で平衡化した DEAE-Sephacel カラム（4.5×とがある ．

20cm）に吸着させた後，カラムに結合しない画分が3.d.5.1 ラン藻からの P C の抽出

溶出されるまで 10mM リン酸緩衝液で洗う．
2009 低 温 科 学

vol.67⑴ 定常期（Ａ＝1.6−1.8）の培養液を 14,000×g
229

で遠心する（1L の培養液から約 1‑2g の菌体が得ら

mM Tris-HCl 緩衝液（pH 7.5）に懸濁し，10分間れる）．得られた沈殿 250g に対して 1L の冷やした置いた後，8,000×g で 10分間遠心し，菌体を回収す

抽出緩衝液（1mM PM SF（フェニルメタンスルホ

る．

ニルフルオリド），1mM ベンズアミジン，1mM ε⑷ 菌体を低張液（0.5mM MgCl ，1mM CuSO を‑アミノカプロン酸，20mM リン酸緩衝液，pH 7.0）

含む 1mM Tris-HCl，pH 7.5）に穏やかに懸濁し，を加えて懸濁し，暗所４℃で１時間よく撹拌する．

ペリプラズマに蓄積している PC を細胞から遊離さ⑵ 懸濁液を M anton-Gaulin high pressure continu-

せる．8,000×g で 10分間遠心し，菌体残渣を除き，

ous system（7000 psi）あるいは French pressurecell（Aminco,Silver Spring,MD,140 MPa）に３回通して細胞を破壊し，3,000×g で２分間遠心して未破壊の菌体を除去する．

得られた上清を粗抽出液とする．
3.d.6.2 P C の精製⑴ 得られた上清を 60％−100％飽和濃度で硫安分画し，沈殿を少量の 20mM Tris 緩衝液（pH 7.5）に⑶ 得られた上清に終濃度 50mM になるように固体の NaCl を 溶 か し，１ 分 間 超 音 波 処 理 し た 後，
12,000×g で 20分間遠心する．

溶かす．その溶液を Sephadex G-25 カラムに通して脱塩する．
⑵ 脱塩した溶液を 20mM Tris 緩衝液（pH 7.5）で⑷ 得られた上清をよく撹拌しながら，1/10容の 0.1

平衡化した DEAE-Sephacel カラム（5×10cm）にM 硫酸ストレプトマイシン水溶液（pH 7.0）を加え，吸着させた後，０−0.5M NaCl の濃度勾配で PC

１ 時 間 穏 や か に 撹 拌 し た 後，２ 時 間 静 置 す る．
12,000×g で 20分間遠心して不溶物を除去し，得られた上清を粗抽出液とする．

を溶出する．
⑶ PC を含む画分を濃縮し，50mM NaCl を含む 20mM Tris 緩衝液（pH 7.5）で平衡化した Sephadex⑸ 粗抽出液を 50％−98％飽和濃度で硫安分画する（pH を 7.0付近に保つ）．

G-100 カラム（2.5×120cm）にのせ，同じ緩衝液でPC を溶出する．

⑹ SynechocystisPC のように酸性タンパク質の場合⑷ PC を含む画分を集め，Tris 緩衝液で平衡化したは，植物のときと同様に，DEAE-cellulose カラムをTSK-gel DEAE-5PW カラムに吸着させ，20‑300

用いて精製する．また，NostocPC のように塩基性タ

mM NaCl の濃度勾配をかけた 20mM Tris 緩衝液

ンパク質の場合は carboxymethyl-cellulose カラム（pH 7.5）で PC を溶出する．Ａを用いて精製する．

画分を集めて濃縮し，凍結保存する．

3.d.6 大腸菌で発現させた P C の抽出・精製/

が 1.2に近い

3.d.7 定量法
3.d.7.1 分光測定法

PC の遺伝子を pET3d などの発現ベクターに組み込

酸化型 PC は青色を呈し，597nm に主吸収帯をもちみ，大腸菌で発現させる．PC 遺伝子のチラコイド通過ペ（図 3），還元型 PC は可視部に全く吸収を持たない．高等プチドに対応する塩基配列を残したコンストラクトを作

植物 PC に含まれる銅原子の 597nm におけるモル吸光

成し，大腸菌のペリプラズマに PC を蓄積させる．

係数は 4.5×10 M cm である ．純化した PC 水溶液

3.d.6.1 大腸菌のペリプラズマに蓄積させた高等植物にフェリシアン化カリウムを加えて酸化型にしたとき

P C の抽出と，アスコルビン酸ナトリウムを加えて還元型にしたと⑴ 組み換え体の大腸菌は適当な抗生物質を含む LB
液体培地で 30℃で培養し，OD＝0.6となったと

こ ろ で 終 濃 度 0.5mM と な る よ う に IPTG（iso-きの 597nm の吸光度の差から PC の濃度を計算する．
3.d.7.2 電子伝達反応を利用した定量法
葉緑体から光化学系 複合体を調製し，光照射によっを加え，16時
propyl 1-thio-β-D-galactopyranoside）てアスコルビン酸から PC と光化学系を経て NADP

間培養する．培養中，４時間おきに終濃度が 25μMが還元される反応，または還元されたメチルビオローゲになるように培地に CuSO を加えると PC の収量

ンが酸素を消費する反応を測定する ．既知量の精製しが増加する．

た PC による反応と比較することにより，試料中の PC⑵ 菌体を 8,000×g で 10分間遠心して回収する．

量を定量することができる．また，シトクロム c の光酸⑶ 菌 体 を 20％ sucrose，2mM EDTA を 含 む 20化反応が PC に依存することを利用して PC を定量する

230

光合成生物のプラストシアニンの精製法・活性測定法

図 3：高等植物（Silene）の酸化型 PC の吸収スペクトル597nm に主吸収帯をもち，他に 770nm と 460nm に吸収を示す．

こともできる ．これらの方法は，不純物による影響が少ないので粗抽出液中の PC の定量に適している．

図 4：高等植物 PC（Silene）の EPR スペクトルa：スペクトル全体．b：g シグナルの近傍を縦軸のスケールを３倍にして示した．

3.d.7.3 EP R 測定
酸化型 PC の，150K における EPR スペクトルを図４

し，吸光度変化をモニタする．タングステンランプなどに示す．g の４本に分かれたシグナルは葉緑体の EPRの光源から 550nm 以上の光および赤外線をカットしてを測定しても得られるので ，このシグナルの大きさを反応光とし，フォトマルの手前で測定光以下の波長の光既知量の精製した PC のものと比較することにより，葉をカットする．0.25μM P700 に相当する光化学系

緑体内の PC の量を知ることができる．g シグナルは，合体，3μM PC の溶液（2.5mM アスコルビン酸を含むと，これに結合する Cys 残基との間の非局在化に
Cu( ）10mM Tris-HCl，pH 8.0）を用い，P700 の還元反応を由来すると考えられており ，銅原子周辺の構造を分析解析する．光化学系 複合体の調製によって持ち込まれするのにも用いられる．

る界面活性剤（Triton X-100 など）の溶液中の濃度は

複0.001％以下となるようにする．光源として Nd：YAG

3.d.8 活性測定法
3.d.8.1 シトクロム f と P C との間の電子伝達反応

レーザーからの 532nm の閃光を用い，ダイオードレー
ザーで 830nm の吸光度変化を測定する方法も報告され
ている ．

の測定
測定は，ストップドフロー分光光度計を用いて行う．
シトクロム f は使用直前にフェリシアン化カリウムで参考文献

酸化させるか，あるいはジチオスレイトールで還元させた後，Sephadex G-25（2×30cm）を通して過剰な酸化剤および還元剤を除去する．0.3μM シトクロム f 溶液
（0.19M NaCl，10mM リン酸緩衝液，pH 7.0）に対して８倍から 100倍濃度の PC を用い，シトクロム f の422nm の吸光度変化を室温（20℃）でモニタする．反応

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用いて，750nm をレファレンス光，697nm を測定光と８) M .Hervas, J.A.Navarro, & M .A.De la Rosa, Acc.

速度はシトクロム f の偽一次反応として解析する．
3.d.8.2 P C と光化学系 との間の電子伝達反応の測
定
光化学系

反応中心 P700 の光酸化とそれに続く暗所2009 低 温 科 学

vol.67231

Chem. Res. 36 (2003)P.798.
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光合成生物のプラストシアニンの精製法・活性測定法

３章 単離・精製・活性測定

３．酵素・電子伝達成分の精製・活性測定・定量
e．プラストキノン
柴田勝

プラストキノンは，光合成電子伝達系の光化学系とシトクロム b /f 複合体を仲介する電子伝達体として機能しており，その酸化還元状態により反応中心などのタンパク質の転写が調節されている．

本章では，緑葉，葉緑体からの酸化型・還元型プラストキノン類の一般的な抽出・分析方法に加え，微量試料での定量法について紹介する．

Analysis of Plastoquinones in Green Leaves
M asaru Shibata
Plastoquinone is a major plant quinone in chloroplasts, and its function in photosynthesis is to act as electron
redox-mediator between PSII and cytochromb /f complexes and hydrogen pump across the thylakoid membranes. M any cellular responses to variable environments are carried out via the redox state of theplastoquinone-pool as function of a redox sensor in chloroplasts. In this chapter, I introduce plant quinone
analytical methods with high performance liquid chromatography which has high sensitive and selective
methods. Biosynthesis,principle of analysis and quinone determination of plastoquinones have been described.

3.e.1 プラストキノンの種類渡っている．電子伝達に関与するキノン蓄積（プール）は，電子プールとして知られており，主成分はチラコイ

プ ラ ス ト キ ノ ン（2,3-dimethyl-6-multiprenyl-1,4-ド膜の PQA である ．これらのことから特に言及されbenzoquinone）は，酸化還元反応を行うベンゾキノン環ていない限り，論文等のプラストキノン類は PQA-9 をの６位に側鎖としてイソプレニル誘導体が結合した構造示している．本章では以後，PQA-9 を主な分析対象としを持つ．イソプレニル基（C ）を単位として，その数がて紹介する．

９，４，３のプラストキノンが知られており，それぞれプラストキノンは，側鎖の構造の違いにより３種類に

（図 1）
．従
PQA-9，PQA-4，PQA-3 として記されている

大別することができ，最も一般的なＡ型のプラストキノ

来，論文等では側鎖の炭素数を明示すために側鎖炭素数

ン（PQA）に加えてＢ型（PQB），Ｃ型（PQC）がある

が 45個の PQA-9 を PQA-45 や PQA として表記され

（図 1)

てきたが

が PQC であり，OH の結合位置により６つの異 性 体，近年はイソプレン単位を基本として示すのが一般的である ．

．イソプレン側鎖の１つに OH が付加したもの（PQC 〜PQC ）に分類されている．また，PQC の OH 基

全ての緑色植物の葉にはプラストキノンが存在しておに脂肪酸（C 〜C ）がエステル結合したものが PQB でり，
葉令や生育条件によりその含量は大きく変動するが，あり，それぞれが PQB 〜PQB に対応している ．PQA

その中で PQA-9 が量的に最も多く，重量比でクロロ

以外のマイナーPQ 成分として，側鎖長の短い PQA-4 がフィル の 10〜50％程 度 相 当 す る 量 が 含 ま れ て い

セイヨウトチノキの緑葉る

ウレンソウにも PQC．葉内のプラストキノンは，葉緑体のチラコイドに見出されており，また，ホ

，PQC ，PQB が全キノン類の膜，包膜およびプラストグロビュール顆粒に蓄積してい１％程度，存在している ．これらのプラストキノン類のることが知られている．主な機能として光合成電子伝

うちで，比較的機能が明確になっているのが PQA であとシトクロム b /f 複合体の電子伝達

り，その他のものについてはあまり研究が行われていな

達系の光化学系の仲介を行い，その酸化還元レベルは転写制御のシグナ

い．

ル として働いている．また，光化学系 の Q 成分や直接的な活性酸素のクエンチングなど，その機能は多岐に
１) 長岡工業高等専門学校物質工学科

2009 低 温 科 学

vol.67

3.e.2 プラストキノンの生合成
プラストキノンは葉緑体において，ベンゾキノン環に233

図 1：プラストキノン A，B，C の構造と酸化還元反応

側 鎖 の イ ソ プ レ ニ ル 基 が 転 移 し，合 成 さ れ る（図ロン酸経路とは異なり，葉緑体・色素体でのピルビン酸・

2)

グリセルアルデヒド‑3‑リン酸を出発物質とする非メバ．葉緑体の植物キノン類は，光化学系 の A のフィロキノン，抗酸化物質のトコフェロール，電子伝達

ロン酸経路により合成されている（図 2)．

体のプラストキノンがあり，その合成経路の多くが共通している．ベンゾキノン環は，シキミ酸からコリスミ酸
を経てホモゲンチジン酸から合成される．包膜でホモゲ
ンチジン酸にイソプレン（C ）が９個縮合した C のソ

3.e.3 プラストキノン分析
プラストキノンは，酸化型，還元型でその吸収スペ

ラネシルピロリン酸（solanesyl pyrophosphate）が脱炭

クトルが異なることから，キノン同定は主に紫外域の酸

酸と共に転移し，2‑メチル‑6‑ソラネシルキノール（2-化還元差ス ペ ク ト ル，高 速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フィー

methyl-6-solanesylquinol）となる．次いでベンゾキノン（HPLC），薄層クロマトグラフィー（TLC）により行わ

環のメチル化れている．小型の葉や変異体などでは，得られる試料量が行われ，プラストキノンの還元型であるプラストキノールが合成される．生合成は，酸化型ではなく全て還元型を基質として行われており，酸化型では各反応は起こらない ．
プラストキノン側鎖のイソプレノイドは，細胞質・ミ
トコンドリアでのアセチル‑CoA を出発物質とするメバ
234

PQA-9 は市販されているが，マイナープラストキノンの標準物質の入手は困難であることから，TLC などにより精製する必要がある．PQA-9 を含め，主なプラストキノン類ならば，キノンを研究している研究室から分譲してもらうのが純度や濃度の信頼性の点から確実である．

プラストキノンの抽出と分析

図 2：葉緑体のプラストキノンの合成経路が限られていることから，極微量試料（10mg 以下）によ

表 1：プラストキノンの吸収とモル吸光係数（エタノール中）るプラストキノン測定についても紹介する．

プラストキノン3.e.3.1 酸化還元差スペクトルの測定操作
プラストキノンは，酸化型が 255nm，還元型が 290nmに吸収極大を示す．微量の不純物を含むプラストキノン
や分画フラクションのキノンの定性定量を行うには吸収

吸収極大波長 モル吸光係数(nm)(mM cm )

酸化型

255

還元型
酸化還元差

文献

17.9

3),30)

290

3.43),30)

255

15.03),22)

法ではなく，酸化還元差スペクトルにより行う（表 1，図3）．酸化型プラストキノンは 255〜260nm に吸収帯があと類似しているが，その酸化型の吸収帯が大きく異なる

り，還元型ではその吸収が消失する（図 3）．緑葉には，

ことから，酸化還元差吸収スペクトルにより定性を行う．

キノン類としてトコフェロール，フィロキノン，ユビキ

プラストキノンの吸収スペクトルは側鎖の種類や長さにノンがあり，トコフェロール，ユビキノンの還元型の吸より影響を受けないことから ，全てのプラストキノン

収スペクトル（極大 290nm）はプラストキノンの還元型種に対して同様な手順により定量を行うことができる．

2009 低 温 科 学

vol.67235

元する．ゆっくり攪拌し，20秒後に再度，吸収スペ
クトルを測定する．キノン還元は比較的速く行われるが，条件により時間がかかる場合があるので，数回，スペクトル測定を行い，変化がなくなるまで繰
り返し測定する．スペクトル変化がなくなれば，全てのキノンが還元されたとみなす（図 3)．
３．255nm の還元前の吸光度（ΔAox）と還元後の吸光度（ΔAred）の 差 を 酸 化 還 元 差 モ ル 吸 光 係 数
15.0（mM cm ) を用いてプラストキノン濃度を求める（表 1)．

−
プラストキノン mM ＝ ΔAox ΔAred15
４．試料中に還元型プラストキノン（プラストキノール，
プラストヒドロキノン）が混在する場合は，試料のエタノール溶液に最終濃度が 1mM となるように
FeCl を加えて，攪拌し，１分間放置してキノールの酸化を行う．
５．次いで，等量の石油エーテル（またはヘキサン）と適量の蒸留水を加えて混合し，キノンを含む石油
エーテル層を分離する．エーテル層を他のチューブに移し，エタノール水層を等量の石油エーテルで再抽出する．２つの石油エーテル抽出液を合わせて，数回，蒸留水で Fe を取り除いた後，減圧乾固する（水分が多ければ抽出エーテル層を無水硫酸ナトリ
ウムにより脱水する）．
これをエタノールに再溶解さ
図 3：プラストキノンのスペクトル
酸化型，還元型および酸化還元差スペクトル（エタノール中)
還元型プラストキノンの蛍光スペクトル（290nm 励起）せることで，ほとんど全てのプラストキノンは酸化型となる．本操作後にプラストキノンの酸化還元差
スペクトルから溶液中の酸化型プラストキノン定量を行い，全プラストキノン量（酸化型＋還元型）を溶液中の酸化型プラストキノンの定量を以下の１〜３
操作により行い，還元型を含む全プラストキノン量に対しては４，５操作により測定する．

求める．
3.e.3.2 緑葉・葉緑体からのプラストキノンの抽出
プラストキノンは，疎水的であることから緩衝溶液ではなく有機溶媒による効率的な抽出を行う．一般的な抽［実験操作］

出溶媒として，エタノール，エーテル，ヘキサン，アセ

１．プラストキノンを含むエタノール溶液の吸収スペク

トン，クロロホルム/メタノールなどがある．葉片の抽出

トルを 220〜340nm の範囲で測定する ．

溶液をプラストキノンのみではなく，他の色素類の測定

２．次にエタノール溶液 1.0ml に対して水素化ホウ素の分析にも使用する場合は，極性有機溶媒のアセトンやナトリウム（NaBH ）を数粒（極微量，数 μg 程度）

複数の混合有機溶媒で抽出されることが多い．また，抽添加し ，プラストキノンをプラストキノールに還出操作中の酸化分解など防ぐために，抽出溶媒の冷却や脱 気，窒 素 パージ に よ る 溶 存 酸 素 の 除 去，そ し て t-

試料・標準物質が微量である場合，全ての操作を分光光度計のセル内で行う．
プラストキノンは比較的安定であるが，過剰な水素化ホウ素ナ
トリウムの添加により分解する．また，分光光度計のセル内で水素が発生し，気泡の付着によりスペクトルが乱れることがあるので注意すること．

236

buthyl-p-hydroxytoluene（BHT），グルタチオン，アス

酸化還元差スペクトルはエタノール中で 233，276，308nm の３箇所で ΔΔA が 0（isobenstic point）になるため，これらの波長は差スペクトルの確認に用いる．

プラストキノンの抽出と分析

コルビン酸などの抗酸化物質の添加により抽出時の酸化２．マイクロチューブに移し，5,000xg で５分間遠心抑制を行う場合もある．一方，高濃度の抗酸化物質（還後，上清を他のマイクロチューブに移し，残渣に 250元剤）
によるキノンの還元も知られており ，キノンの酸

μl アセトンを加えてボルテックス後，再遠心により化還元状態を調べたい場合は，抽出時の酸化還元反応，

上清と残渣に分離する．上清を先程の上清に加え，試料の保存性が問題となる．これらのことから，抽出溶

再度，残渣に 250μl アセトンを加え，キノン抽出を媒と安定化剤の種類・濃度を選択しなければならない．

行う．全てのアセトン抽出液を混合し，抽出溶液の抽出効率や溶媒の扱いやすさから，葉片のプラストキ

重量測定（空のマイクロチューブ重量を差し引く）

ノンの定性・定量分析を行うには，緑葉からアセトンま後，アセトンの比重 0.79g/ml から抽出溶液量を計

たは酢酸エチルにより抽出を行う．抽出溶媒としてのア算する．全量で約 1.0ml 程度になる．本抽出によりセトンはプラストキノン抽出の効率が良く，材料中のプ

葉内の 98％以上のプラストキノンの抽出が可能でラストキノンをほとんど完全に抽出できるが，クロロある．

フィルやその他の極性脂質も同時に多量に抽出されるた

３．キノンの酸化，分解を抑えるために，マイクロチュー

めに，その後の操作として適切な分離・分析条件の設定

ブをアルミホイルで遮光する．すぐに，測定を行わが必要であり，得られるキノンの純度や定量性が問題とない場合は−20℃以下で冷凍保存する．

なる場合がある．
石油エーテルやヘキサンによる抽出は，
クロロフィルなどの雑物質の共抽出を抑制することができることから，その後の精製操作が簡便になり，また，
水溶性抗酸化物による酸化型キノンの還元を抑えることができる．しかし，条件によりキノン抽出が不安定となるために幾分，定量性に欠ける．

［抽出法２］葉緑体・チラコイド膜からの抽出・濃縮(色素類を含む全抽出）１．200g のホウレンソウの葉から調整した葉緑体を 15
ml の脱イオン水に懸濁する．
２．攪拌しながら 200ml のアセトンに加える．５分間攪

葉緑体からキノン抽出を行う場合，葉緑体を脱イオン

拌後，濾過して緑色のアセトン抽出液を分離する．

水に懸濁してアセトンやメタノールで抽出するか，凍結

さ ら に 100ml の ア セ ト ン で ２ 回，200ml の 石 油

乾燥後石油エーテルやヘキサンなどで抽出を行う．

エーテルで１回抽出を行う．本操作で残渣にはほとんど緑色がない状態となる．

［抽出法１］少量の葉片からの抽出

３．全ての抽出液を合わせ，200ml の脱イオン水を徐々

本節では，抗酸化物質を加えない冷却したアセトンにに加えて石油エーテル層を分離させる．石油エーテ

よる抽出を基本として説明する．必要な場合，アセトン

ルを除き，アセトン ⎜ 水相に再度，石油エーテルにグルタチオンまたは BHT を加える．

１．乳鉢を用いて植物組織（50〜100mg）を液体窒素内で破砕し，アセトンを加え，抽出する．

を 100ml 加え攪拌後，石油エーテル層を分離する．
４．エーテル層を先程の抽出エーテルに合わせ，無水硫酸ナトリウムで脱水後，ロータリーエバポレーターなどで減圧乾燥（40℃以下に設定）する．

酸化型プラストキノンは 30mM アスコルビン酸を含む 90％
アセトン水溶液中で，常温，５分間の攪拌により，一部ではあるが還元型になることが知られている ．グルタチオンでは還元されない．酢酸エチル中でのプラストキノンの安定性は高く，高濃度のアスコルビン酸を含む場合でも酸化型を還元させず，また，無添加の状態においても常温で還元型の酸化があまりみられない．また，抽出効率も非常に高く，アセトンと同程度である．
葉片からのアセトン抽出では，ワックス状物質が抽出液中に混在して精製の操作が困難になる時があるために，葉緑体から抽出したほうがその後の操作しやすくなる．葉緑体はホウレンソ
ウの葉から常法に従って調整すればよいが，粗標品で十分である．
シロイヌナズナなどの薄い葉の場合，ビーズ破砕で定量的な抽出が可能である．
90％アセトン水溶液に高濃度アスコルビン酸を添加すると酸化型の一部が還元されてしまうが，グルタチオンではその心配はない．

2009 低 温 科 学

vol.67［抽出法３］葉緑体・チラコイド膜からの抽出・濃縮(共雑物質を抑えた抽出）１．葉緑体を凍結乾燥し，クロロフィル 1mg 当たり 10
ml の石油エーテルを加える．
２．大型のガラスホモゲナイザーか乳鉢中で固まりがな
いように分散させた後，ビーカーに移し 10分間攪拌
する．遠心または濾過して黄色の石油エーテル抽出
液を分離する．
３．この抽出操作を２回くり返し，得られた抽出液をいっしょにして，ロータリーエバポレーターなどで減圧乾燥（40℃以下に設定）する．

237

［抽出法４］チラコイド膜からの簡易抽出（20×20cm）に線状に塗布する．次いで，クロロホ

１．0.1μmol 程度のク ロ ロ フィル を 含 む 葉 緑 体 溶 液

ルム−イソオクタン（80：20）で展開する．プラス

100μl に等量の蒸留水を加え攪拌後，冷えた 300μl

トキノン類の R 値はそれぞれ PQA＝0.9，PQB＝のアセトンを加え，攪拌後遠心する．

0.8，PQC＝0.4，PQC ＝0.3である．各キノン

２．上清を別のマイクロチューブに移し，残渣に 300μlの位置はロイコメチレンブルーで検出する．検出はアセトンを加え，攪拌後遠心し，再度，残渣に 300μl

プレートの片端で行ない，その他の部分は濾紙かガアセトンを加えて，再抽出する．残渣に緑色が残っラス板で覆うことでメチレンブルーが噴霧されないていたら，再度，アセトン抽出を行う．

ようにする．

３．全てのアセトン抽出溶液を合わせ 80％アセトン比５．還元型のメチレンブルー（ロイコメチレンブルー）

重（0.82g/ml）から抽出溶液量を計算する．全量でにより発色させる．ロイコメチレンブルーの調整と1.0ml 程度になる．本抽出により葉内の 98％以上のして，50ml 0.1％メチレンブルーアルコール溶液，

プラストキノンの抽出が可能である．

1.0g 亜鉛末，1.0ml 濃硫酸を加えて軽く攪拌して

3.e.3.3 TLC によるプラストキノンの分画から 10分以上静置する．
亜鉛粉末が沈殿しているた

プラストキノン分画は，粗抽出液を酸性アルミナ（８％

めに，ガラスウールなどを用いて亜鉛粉末を除いて不活性化）のカラムクロマトグラフィーとシリカゲルのから用いる．

薄層クロマトグラフィー（TLC）により行う．ただし，６．TLC で分離後，ロイコメチレンブルーをスプレーしアルミナカラムによる分画操作では，還元型キノン（キ発色させる．本発色剤は，キノンの反応性により還ノール）が全て酸化型になるために，精製を通じての酸元型メチレンブルーを酸化し青色変化することを利化還元比を求めることはできない．PQB，PQC 異性体の用している．ロイコメチレンブルーは空気中の酸素分離に関しては Barr & Crane（1971）に詳しく記述さによっても酸化されるために，スプレー後，バックれているので，参照されたい．本項では，TLC によるグラウンドの青色が徐々に強くなるために手際良

PQA，PQB，PQC までを紹介する．

く，スポットを可視化する．
７．発色溶液がかかっていない TLC 部分をき出し，

１．アルミナ（アルミニウムオキシド活性型，酸性，カエタノールにより溶出させる．PQC と PQB はそれ

ラムクロマトグラフィー用，M erk）100g に脱イオ

ぞれ異性体の混合物である．
異性体を分離するには，

ン水 8ml を加えて攪拌する．この際，発熱するが常さらに別の展開溶媒で TLC を行う必要がある．

温にもどってから石油エーテルに懸濁して湿式でク

PQA は 5〜10ml の熱エチルアルコールに溶かし，ロマト管に充塡する（3×15cm）．
（石油エーテルは揮発しやすいのでドラフトチャンバー内で操作）

冷凍庫中に放置すると結晶になる．
3.e.3.4 HP LC によるプラストキノンの測定

２．乾燥抽出物を石油エーテル（5〜10ml）に溶解させ抽出溶液のキノン定量には，紫外（UV）検出器によるる．クロロフィルを含む場合は，少量のジエチルエ

高速液体クロマトグラフィー（HPLC）が用いられてきチルエーテル（1〜2ml）に溶解してから 10倍量の石た．しかし，プラストキノンなどの植物キノン類の測定

油エーテルで薄める．

には，紫外部に大きな吸収を示すクロロフィルやカロチ

３．これをカラムに添加吸着後，それぞれ 50ml ずつの
石油エーテルとエチルエーテルの混液で展開す

ノイドなどの色素類が抽出溶液に混入することから，キ
ノン種やその濃度によっては定量的な分析 が で き なる．両者の割合は⑴ 100：0，⑵ 100：2，⑶ 100：5，

い．このために植物葉片のキノン分析では前処理や⑷ 100：10，⑸ 100：20で，この順に添加する．⑵と分析法の工夫が行われてきた．前処理として①アルミナ⑶で溶出される画分に PQA と PQB が，⑸で PQC

カラムによる色素除去，② FeCl などの酸化剤を用いてが溶出される．各画分の PQ の有無は紫外部の酸化

キノン還元体を色素類と分離しやすい酸化体へ変換させ還元差スペクトルにより行う．

てから全量測定すること，などがある．また，分析法の４．PQA と PQB を含む画分と PQC を含む画分はそれ改良として③ HPLC によりキノンを分離後，NaBH な

ぞれ別々に濃縮して，別々のシリカゲルプレート

どの還元剤により蛍光性を有する還元型キノン（キノール）に反応させ，蛍光検出器

夏季，空調のない実験室では石油エーテルがカラム内で気化し，内部のアルミナ層が乱れるので注意すること．

238

により検出する分析法がある．これらの方法は前処理の煩雑さや反応試薬によるキノン分解，急激な分離カラムの劣化などが起こりやす
プラストキノンの抽出と分析

い．これらの問題点を解決する方法として④キノン類のカラム：Luna 5μC18 (2)酸化還元電位を選択的に検出可能な電気化学検出器（ECD）を用いた分析が行われてきた．しかし，ECD(φ 4.6x 150mm，Phenomenex, Inc.)
溶離液：メタノール/エタノール＝1/1(v/v)

は，特殊な検出器であることから PQ 類定量を迅速・簡単

カラム温度：40℃に行うための障壁となっている．これらのことから，一流速 ：1.0ml/min

般的な紫外―可視吸光度検出器による検出に加えて，キリテンションタイム：

ノンに対して特異性が高く，高感度な on-line 法の一種

還元型 7.4min，酸化型 10.9min

であるポストカラム還元法について紹介する．
ポストカラムキノン還元法は，フィロキノンの分析を［検出］中心に進歩してきたが，基本的な操作はプラストキノン検出法により，プラストキノンの定量限界，検出限界分析に応用することができる．まず，ポストカラム還元が異なるので，実験に適した検出器を選択する（表 2）．

法はその還元方法により３つに大別される．(A)白金黒【吸光度検出】

カラムを用いたカラム還元法 ，(B)電気化学的還元

ホトダイオードアレイ型（PDA）のような多波長で同法 ，(C)NaBH などの還元剤を用いた 化 学 的 還 元

時に検出可能なマルチ波長検出器を用いた場合，プラス

法．その中で白金黒カラムを用いたカラム還元法

トキノンの酸化型 255nm，還元型 290nm の各吸収極大と NaBH を用いた化学的還元法について具体的な条件での検出波長により，同時に測定が可能である．しかし，を記す．

還元型は酸化型に比べて吸光係数が小さい（酸化型のまた，より簡単な系による HPLC 分析として検出器に20％程度 ）ために，還元型が低濃度のときは，UV 吸収

吸光検出器と蛍光検出器を組み合わせた方法についても

では定量性のある測定ができない．また，還元型は，比記述する．

較的，早くに溶出することから色素類のピークの端に掛かりやすく，
酸化型に比べて定量限界が比較的高くなる．

［キノン類の分離条件］

一方，酸化型は比較的遅くに溶出され，他の物質と分離

プラストキノンはその側鎖の性質から，キノン分離にしやすく，明確なピークとして検出できることから，低対して逆相カラムを用いた HPLC により行う（表 2）．分

濃度の還元型測定のために還元型を酸化型に変換後，離カラムとして逆相カラム ODS，溶離液にメタノールやHPLC 測 定 を 行 う．ま ず，255nm の UV 検 出 に よ るエタノールを用いてキノン類を分離する．エタノール

HPLC 分析により酸化型を定量し，その後，抽出溶液にの比率を高くすると，プラストキノンの溶出が早くなり，最終濃度が 0.5mM になるように FeCl を添加し，全て分析時間が短縮されるが，比較的早くに溶出する還元型の還元型プラストキノンを酸化型に反応させた後に再が他の物質のピークと重なり，キノンの定量の妨げとな度，HPLC により全 PQ（PQ＋PQH）量の測定を行い，る場合がある．

全 PQ から先程の PQ 量を差し引くことで PQH を求め植物葉片のキノン類の側鎖の炭素数はトコフェロールる．しかし，HPLC カラムに高濃度の Fe を含む溶液を直が C ，フィロキノンが C と短く，還元型プラストキノ

接インジェクションしても分析可能であるが，分析カランより早くに溶出する．しかし，ユビキノン‑9,10の側鎖ムの寿命を低下させてしまう可能性が高い．
液‑液分配操は C ，C であることから PQ と溶出位置が近く，特に作などにより Fe を取り除いた後（3e.3.1）に分析を行う

C 側鎖の還元型ユビキノンとプラストキノン還元型のことでこれらの問題を解決できるが，多数の試料を同時分離は，一般的な ODS カラムでは分離が十分に行えなに前処理には時間がかかり煩雑となる．このために，検い．しかし，適切な検出器・検出条件を設定することで出器の種類を適切なものを選択する．

還元型ユビキノンを検出せずに定量誤差を抑えることが【蛍光検出】

できる．プラストキノン定量は，標品の酸化型，還元型

還元型は励起波長 290nm において 330nm の蛍光をのピークエリアとの比較により行う．
(例）キノン分離の条件

逆相カラム（ODS など）に溶離液としてメタノールを中心にエタノールまたはヘキサンを混合することで酸化型，還元型を分離可能である．

2009 低 温 科 学

vol.67ODS であれば，メーカにはこだわらない．また，本章では 150mm 長のカラムを用いているが 250mm 長でも，全く問題はな
い．
定性限界とは目的物質が含まれていることを示すピークを認識できる限界値で S/N＝3程度である．定量限界とは目的物質の定量性が得られる下限値でありおよそ S/N＝10である．
本条件では還元型ユビキノン‑9と還元型 PQA-9 の分離が不239

表 2：プラストキノンの分離・検出条件
カラム

溶離液

流速
(ml/分)

Teknokroma C18(4.0x 250mm)

MeOH/Hex＝17/1(v/v)

1.5

検出条件
【種類】
(波長，電圧)

キノン【蛍光，吸収】
ex.290nm，em.330nm PQA(red)abs 255nm
PQA(ox)

リテンション
文献
タイム
(分)
8.8
26.2

22)

6.9
8.0
10.9
15.2

12)

3.4
8.2

25)

【ECD(ref. Ag/AgCl)】
Radial-PAK
Cartrige C-18

MeOH/EtOH＝3/1(v/v)
containing 50mM NaClO ，
2mM HClO

Radial-PAK
Cartrige C-18

MeOH/EtOH＝1/4(v/v)
containing 50mM NaClO

2.0

2.0

−250mV(ox)PQC (ox)
PQC (ox)
PQB(ox)PQA(ox)【ECD(ref. Ag/AgCl)】−500mV(ox)PQA(red)−800mV(red)PQA(ox)【蛍光(NaBH 還元)】

Shimpack ODS(4.6x 250mm)

MeOH/EtOH＝1/1(v/v)

1.5

ex.290nm，em.330 nm

PQA(red)
PQA(ox)

7.8
21.5

PQA(red)
PQA(ox)7.410.9【蛍光(白金黒還元)】
Luna C18 (2)(4.6x 150mm)

MeOH/EtOH＝1/1(v/v)

1.0

ex.290nm，em.330 nm：M eOH；メタノール，EtOH；エタノール，Hex；ヘキサン：酸化型プラストキノン PQ(ox)，還元プラストキノン PQ(red)示すことから，カラムによるキノン分離後に蛍光検出器

ムとして上記条件でキノンを分離後，カラム出口に接続

により還元型プラストキノンの高感度測定が可能となした 40℃に保った反応コイル（φ 0.5mm x 150cm）のる．しかし，酸化型プラストキノンは蛍光性を示さない

一端から還元試薬として 0.045％(w/v)NaBH を含む

ことから，そのままでは還元型のみしか検出できない（図エタノール溶液を流速 0.5ml/min で流し，分離したキ

5A，B）．このことから，HPLC によりキノン類を分離

ノン類の還元した後，酸化型を還元型に反応させる post-reduction の元型プラストキノンを励起波長 290nm，蛍光波長 330

操作を行うことで，蛍光検出器によるプラストキノン類

nm の条件により検出する．全てのキノン類の定量を濃の高感度検出が可能となる．定量限界は 2.0pmol 以下

度既知のプラストキノンのピークエリアとの比較によりであり，抽出溶液量に依存するが葉片として 1〜5mg あ行う．

れば十分測定可能である．キノン測定に関する post-【蛍光検出（白金黒カラムによる触媒還元法）】

を行う．検出には蛍光検出器を用い，還reduction 法は，化学的還元，電気化的還元，触媒還元の

ODS カラムによりキノン類を分離した後に無蛍光性３種類あるが，電気化学的な還元には特殊な装置が必要の酸化型キノンを白金黒カラムで還元し，蛍光検出器をとなることから，化学的還元，触媒還元の２種類を紹介

用いて測定を行う（図 3B）．分離カラムの後ろに白金黒する（図 4A，B）．
【蛍光検出（NaBH による化学的還元法）】
ODS カラムによりキノン類を分離した後に無蛍光性の酸化型キノンを反応コイル中で NaBH と反応させる
ことにより，蛍光性の還元型キノン（キノール）に還元
し，蛍光検出器を用いて測定を行う（図 4A）．分離カラ

完全であるが，エタノール溶液中では還元型プラストキノンの蛍光量子収率（0.117）は，還元型ユビキノン（0.004）に比べて大きく ，また，蛍光波長はそれぞれ 327nm，371nm と大きく異なっていることから，蛍光検出において還元型ユビキノンによる還元型プラストキノンの定量性に与える影響はほと
んどない．

240

反応コイル（φ 0.5mm x 150cm）を用いたキノンからキノー
ル へ の 反 応 時 間 は 同 条 件 下 で 約 10sec.で あ り，還 元 溶 液
0.01％ NaBH で 1.0nmol PQ が 全 還 元 さ れ る．高 濃 度 の
NaBH はキノン類の分解を促進することが知られていることから，0.06％ NaBH でキノン類の分解を調べたが，各キノンの分解は確認されず，各測定間の誤差は 0.44％であった．還元試薬の 0.045％(w/v)NaBH で 5.0〜2000pmol/injectionの広い濃度範囲においてピークエリアとキノン量とに相関関係が得られている．
還元カラムは資生堂より4.0x15mm，4.0x30mmの２種類が販売されている．しかし，乾燥状態でステンレスの空カラムに詰めて十分に使用できる品質のカラムを簡単に自作することができる．1.0g の白金黒（platinum black）
で 4.0x 15mmのカラムを詰めることができる．

プラストキノンの抽出と分析

図 4：ポストカラム還元法によるプラストキノンの高感度 HPLC 測定装置

カラムを接続するのみであることから，化学的還元法に出に良く用いられている．キノン類などの酸化還元反応

比べて装置的にも簡略することができ，還元溶液の調整を行う物質に対して検出の特異性が高い．原理として，などの必要もない．

カラムから分離したキノン類が検出器のセル内で電気的先程と同様な条件において分離・還元反応を行い，290に還元（Q＋2e ＋2H → QH ）または酸化（QH → Q＋

nm により励起した 330nm のキノン類の蛍光を測定す

2e ＋2H ）し，その時の電流の大きさとキノン濃度が比ることにより検出する（図 5A，B）．全てのキノン類の例する．このとから，キノンの検出に用いることができ定量を標準サンプルのピークエリアとの比較から行う．

る．

白金黒カラムの還元力は徐々に低下していくことから，

ECD 検出器を用いた HPLC は他の測定と異なり，溶カラムの長期保存，多数の検体を扱う場合は標品の PQ

離液に NaClO ，HClO など分子の大きな酸（過塩素酸）などを用いてチェックを行うべきである．

を添加する．実際の測定では，酸化型プラストキノン検【酸化還元・電気化学検出】

出にポテンシャル‑800mV

または ‑250mVにセッ（電気化学検出器，electrochemical detector）
は，
ECD

トする（表 2）．酸化還元物質に対して高感度で特異的に

電気化学的な反応を用いた検出器であり，アミン類の検応答することや各物質の酸化還元ポテンシャルが異なることから，ECD により高感度キノン分析を行うことがで

ポテンシャル 0.25V の条件では，トコフェロールキノン，ユビキノンフィロキノンも同時に検出される．

2009 低 温 科 学

vol.67

きる．

241

図 5：酸化型，還元型プラストキノンの HPLC チャート

【より簡単な良感度な検出】
比較的低濃度の還元型を正確に定量するには，感度的大幅に短縮でき，１試料の HPLC 分析は１〜５分以内にすることも可能である．

に吸光度検出器では難しい．このことから，分離カラム

参考のために表２にプラストキノンの具体的な分析条

以降に吸光度検出器（255nm 設定）を接続することで酸件を示す．また，微量試料や高感度測定では，検出器の化型を検出し，その後ろに蛍 光 検 出 器（ex 290nm，選択が重要となることから酸化型，還元型に対する感度

em 330nm に設定）を接続して還元型を検出することでの一覧を表３に記す．

酸化型・還元型を同時に比較的高感度で測定を行うことができる ．

測定以外に注意する点．プラストキノンはチラコイド
膜以外に，包膜やプラストグロビュールに光合成電子伝達に関与しないプラストキノンが大量に存在している．

3.e.4 おわりにこのために，葉片のプラストキノンは電子伝達に関与するキノンと関与しないキノンが混在しており，葉片のキHPLC 測定に慣れていない場合や初めてプラストキ

ノン量（酸化還元状態) ，分析定量値のままでは光合成

ノン測定を行う場合は，PDA 検出器のみ，または，PDA（電子伝達鎖）のプラストキノンプール（またはその酸化と蛍光検出器を備えた HPLC による測定を行うことで，還元比）とはならないので注意が必要である ．実際，暗比較的定量性のある結果が得られる（3e.3.4の【より簡処理した葉のプラストキノンの 30％が還元型で，飽和光単な良感度な検出】を参照）．また，試料数が多い場合や下でも全プラストキノンの 65％までしか還元されておシロイヌナズナなどの薄い葉の場合，ビーズ破砕によりらず，光強度に依存しないプラストキノンが存在してい抽出を行っても良い．さらに，HPLC 分析に HTP 型

ることが知られている（図 5C，D）．

（high-through put）のカラムを用いることで分析時間を文献
カラム出口以降の検出器の接続は，セルの耐圧性等の問題からの吸光度検出器の後ろに蛍光検出器を接続する．

242１) J.F.Allen & T.Pfannschmidt,Phyilos.Trans.R.Soc.,

プラストキノンの抽出と分析

表 3：プラストキノン類の検出感度の比較
検出の種類

吸収

蛍光

酸化還元電位

検出器

検出感度

(条件)

酸化型

還元型

紫外吸収検出器
255nm
290nm

中
低

−
低

蛍光検出器(ex.290nm，em.330 nm)
ノーマル
白金黒カラム還元
NaBH 還元

−
高
中高

高
高
中高

電気化学検出器−800mV
500mV

高
−

−
高

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243

３章 単離・精製・活性測定

３．酵素・電子伝達成分の精製・活性測定・定量
f．光化学系Ⅰ反応中心の鉄‑硫黄クラスター
大岡 宏造
鉄‑硫黄クラスターとは鉄原子および酸不安定な硫黄原子から構成される酸化還元中心のことである．
通常，タンパク質質内のシステイン残基の側鎖である SH 基に鉄原子が配位する構造をもち，［2Fe2S］型，［3Fe-3S］型，［4Fe-4S］型が存在する．光合成反応系においてはさまざまな電子伝達体として機能している．ここでは光化学系 反応中心に存在する鉄‑硫黄クラスターについて述べる．

Iron-Sulfur Centers in Photosystem I.
Hirozo Oh-oka
Iron-sulfur clusters are redox centers which consist of iron and acid-labile sulfur atoms. They are held withinproteins by chelating iron atoms with SH groups of cysteine residues, forming ［2Fe-2S］-,［3Fe-3S］-, and［4Fe-4S］-type ones. In photosynthesis, iron-sulfur clusters function as various electron transfer components.
Three electron acceptors, centers X and A/B, in the photosystem I are described here.

3.f.1 センターX とセンターA/B

光化学系

反応中心のセンターX はヘテロダイマーを構成する PsaA/PsaB コアタンパク質質間に配位し，葉緑体チラコイド膜の光合成電子伝達系を構成する

酸化還元電位は約‑700mV で，ESR スペクトルの g 因

鉄‑硫黄クラスターには，シトクロム b f 複合体の Ries-

子は 2.04，1.88，1.78を示す．センターA/B は分子量約ke センター，光化学系

反応中心のセンターX とセン

9000の PsaC タンパク質に配位し，クラスターを配位す

ターA/B，最終的に光化学系 反応中心から電子を受けるアミノ酸配列はバクテリア型（2［4Fe-4S］
型）フェレド

取るフェレドキシンが存在する．Rieske センター，フェキシンのクラスター配位に特徴的なモチーフ（Cys-X-X-

レドキシンは［2Fe-2S］型，センターX とセンターA/B

Cys-X-X-Cys-X-X-X-Cys-Pro）と同一である．センター

は［4Fe-4S］型のクラスターを持つ．

A（g ＝2.05，1.94，1.86）の酸化還元電位は‑530mV，

鉄‑硫黄クラスターは可視部の 350‑500nm にあまり

センターB（g ＝2.07，1.92，1.89）は‑580mV であり，特徴のない，なだらかな吸収をもつので，個々のクラス

両クラスターが同時に還元されるとスピン間相互作用を

ター型を可視部の吸収極大波長のみから特定することは示す．このスピン共役は 2［4Fe-4S］
型フェレドキシンに困難である．ヘムやフラビンなど，他のクロモホアに由おいて観測される現象であり，センターA/B は同一タン来する吸収が重なると，標品中に存在するクラスターそ

パク質内に存在する，互いに近接したクラスターであるのものを見落としてしまうことがあるので注意が必要でことを意味している．

ある．クラスター型を同定するための分光学的手法として ESR（電子スピン共鳴 electron spin resonance）がある ．Fe や Cu などの遷移金属イオンや有機ラジ
カルは，電子軌道に不対電子をもつ常磁性物質としての3.f.2 P s aC （F /F ）タンパク質質の調製
PsaC タンパク質質は光化学系

反応中心複合体のサ性質を示す．ESR では常磁性物質をある磁場の中に置く

ブユニットであるが，一旦，複合体から解離すると水溶ことにより，不対電子の共鳴現象に由来する信号を検出

性タンパク質質として存在する．複合体の立体構造からすることが可能である．鉄‑硫黄クラスターの ESR スペも明らかなように，PsaC タンパク質は膜表在性である．

クトルは極低温下（5‑20K）で観測するため，液体ヘリ3.f.2.1 n‑ ブタノール処理による解離

ウムを用いて冷却するための低温装置が必要となる．詳しくは第４章を参照されたい．

Triton X-100 等で可溶化，調製してきた反応中心標品
溶液に等量の氷冷した n‑ブタノールを重層し，ヴォル
テックスミキサーで激しく撹拌する．18000×g，５分間

１) 大阪大学大学院理学研究科生物科学専攻

2009 低 温 科 学

vol.67の遠心後，薄い褐色を呈した下部の水層部分には PsaC
245

タンパク質および PsaD，PsaE タンパク質が含まれる．

やかに撹拌する．22000×g，10分間の遠心により薄い黄これらのタンパク質は反応中心複合体に結合した表在性

褐色の上清を回収し，100％ 飽和硫安緩衝液を最終的にタンパク質であり，解離後は水溶性タンパク質として扱

20％となるように徐々に加えていく．20％ 飽和硫安緩衝

える．しかしながら解離した PsaC タンパク質は酸素に液（100％溶液に脱気・窒素ガス交換を行った水を加えて対しては極端に不安定になり，
鉄‑硫黄クラスターはすぐ濃度を調整する）で平衡化しておいた Phenyl-Sepharoseに破壊される．その後の分光学的解析には不向きである

CL-4B カラム（2.2x 10cm）に吸着させ，３カラム容量

が，再構成実験 に用いるためのアポタンパク質調製法の同溶液でカラムを洗浄する．緩衝液Ｂを用いて溶出しとしては簡便である．

た褐色画分を限外濾過（Amicon，YM-5）により濃縮し，

3.f.2.2 メタノール／アセトン処理による精製

緩衝液Ｃで平衡化して お い た Sephadex G-50 カ ラ ム［準備する溶液・緩衝液］（1.8x 56cm）にのせてゲル濾過を行うことにより最終・緩衝液Ａ：25mM Tris-HCl（pH 8.0）
，10mM NaCl

精製標品を得る．メタノール／アセトン処理後の可溶性・緩衝液Ｂ：50mM Tris-HCl（pH 8.0），2mM dith-

タンパク質の抽出，カラムクロマトグラフィー操作等は，300mM NaCl
iothreitol（DTT）
・緩衝液Ｃ：50mM

すべて嫌気グローブボックス（米国・Coy社製）内で行

cyclohexyl-aminopropane sul-う．使用する溶液・緩衝液は脱気・窒素ガス交換を行っ，2
fonic acid（CAPS）‑NaOH（pH 9.8）てから嫌気グローブボックス内に持ち込み，一昼夜放置

mM DTT，300mM NaCl

後，残存酸素を完全に除くために還元剤である dithioth-

・100％ 飽和硫安緩衝液：50mM Tris-HCl（pH 8.0），

reitol（DTT）を加える．1M DTT 溶液は，嫌気グロー

2mM DTT，100％

飽和硫安

・4M 臭化ナトリウム溶液：50mM Tris-HCl（pH 8.0），
4M NaBr
・1M MgCl 溶液［手順］
ホウレンソウの葉（3kg）から調製してきた葉緑体を低ブボックス内に作り置きしておくと便利である．また遠心は直接酸素に触れないようにキャップ付チューブを用いるとよい．その他，嫌気操作の詳細については本書別項を参照されたい．

3.f.3 鉄（Fe）の定量

張液（緩衝液Ａ）で処理した後，22000×g，15分間の遠一般にタンパク質に含まれる鉄‑硫黄クラスターの型

心によりチラコイド膜を回収する．2mg Chl/ml となるやその損傷程度を知りたい場合には，標品中の鉄あるいようにチラコイド膜を緩衝液Ａで懸濁する．等量の 4M

は硫黄含量から推定することが可能である．硫黄（S）定

臭化ナトリウム溶液を加えて 30分間ゆるやかに撹拌し量にはメチレンブルー法 があるが，クラスターの硫黄た後，さらに等量の純水を加えて臭化ナトリウムの最終原子は酸不安定で定量性に欠ける．ここでは鉄（Fe）の濃度を 1M にする（臭化ナトリウム処理はチラコイド膜定量法としてキレート試薬であるフェレン（ferene）を使

表面にゆるく結合したタンパク質を除去するのに有効な用する方法について述べる ．従来の o‑フェナントロリ方法である）．12000×g，10分間の遠心により膜画分を回ン法については他の文献 を参照されたい．

収し，再度 2mg Chl/ml となるように純水を加えて懸濁まず３種類の希釈系列の反応中心標品を準備する．各する．10秒間隔で２分間，超音波処理を行い，純水を加標品の溶液 300μl に，試薬Ａ（4.5％ ドデシル硫酸ナト

えて４倍に薄める．その後 1M MgCl 溶液を 5mM な

リウム，1.5％ 飽和酢酸ナトリウム）と試薬Ｂ（273mM

るように加え，12000×g，10分間の遠心により膜画分をアスコルビン酸，8.45mM 二亜硫酸ナトリウム，6.6％

回収する（膜断片は MgCl の添加により凝集し，通常の飽和酢酸ナトリウム）をそれぞれ 300μl 加えて混合し，遠心操作により沈殿物として回収することができる）．
回

37℃で 15分間，静置する．最後に試薬Ｃ（36mM フェレ

収した膜画分は適量の純水に懸濁した後，凍結乾燥を行ン）または純水を 15μl 加えて 593nm の吸光度を測定

う．

し，両者の吸光度差から標品中の Fe 濃度を見積もる．こ

凍結乾燥標品を−20℃に冷却したメタノール／アセトの際，あらかじめ標準試料（Fe(NH )(SO )・6H O）液ン溶液（1：10，V/V；0.1％ β‑メルカプトエタノールをを用いて検量線を作製しておく．反応中心あたりの Fe含む）で処理し，窒素ガスを吹き付けることにより残渣原子の数は，標品のアンテナサイズ（スペシャルペアあを乾燥する．回収した残渣は乳鉢ですりつぶすことによたりのクロロフィル色素数）から算出することができる．

り粉末状態にし，400ml の緩衝液Ｂを加えて１時間ゆる
246

光化学系Ⅰの鉄‑硫黄クラスター

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247

３章 単離・精製・活性測定

３．酵素・電子伝達成分の精製・活性測定・定量
g ．C F C F ，光リン酸化
紺野 宏記 ，久堀徹

葉緑体 ATP 合成酵素（CF CF ）は，光合成に必要な ATP を合成する酵素で，ミトコンドリアや細菌の ATP 合成酵素と同じく，プロトンの電気化学的勾配を利用している．その特徴は，他の ATP 合成酵素とは異なり，酸化還元調節を受ける点にある．本章では CF CF の取り扱い，酸化還元調節の生化学的研究法，チラコイド膜や大腸菌反転膜を利用した ATP 合成活性の測定法等を紹介する．

Chloroplast ATP synthase (CF CF ) and its activity
Hiroki Konno, Toru Hisabori
F F -ATP synthase catalyzes ATP synthesis driven by the electrochemical potential of proton gradient acrossthe energy transducing membranes formed by photosynthetic or respiratory electron transfer reaction. The
chloroplast ATP synthase, CF CF is unique due to its thiol modulation property. In this chapter, the basic
method for the preparation of CF CF from spinach leaves,the methods for the measurement of ATP hydrolysis
activity, proton transfer activity and photophosphorylation activity are described.

3.g .1 葉緑体 ATP 合成酵素の特徴

ΔμH による調節（ΔμH activation）である．CF CF
は暗所下で不活性な状態にあり，光照射により一定量の葉緑体 ATP 合成酵素（CF CF ）は，光合成の電子伝ΔμH が形成されると活性化する．この ΔμH activa-

達系によって水が分解され還元力である NADPH が生tion に伴って，γと εサブユニットが構造変化すること成される過程でチラコイド膜の内外に形成されるプロトが知られているンの電気化学的勾配（ΔμH ）を駆動力として ATP 合成

相互作用により暗所では溶液中に露出していないそれぞを行っている．すなわち，この酵素は光エネルギーを化れのサブユニット上の Lys 残基が，ΔμH によって誘導

学エネルギーに変換する鍵酵素である．同様の酵素は，される構造変化により溶液中に露出して，Lys の修飾試

ミトコンドリア内膜や細菌細胞膜に存在する呼吸鎖でも薬であるピリドキサールリン酸によって修飾されるとい働いており，これらは呼吸基質（多くの場合，糖）の分う実験結果がある．しかし，この実験ではタンパク質分解によって生成する NADH から酸素までの電子伝達反子において具体的にどのような構造変化が誘導されるか応によってエネルギー産生膜系で形成される ΔμH をが明らかになっていないので，ΔμH activation の分子利用して ATP を合成する（酸化的リン酸化）．触媒活性機構そのものは現在でも不明のままである．CF CF にを担う F F の基本構造は，すべての生物種由来のもの

ΔμH activation による構造変化を誘導しなければ，葉において維持されており，ATP 合成および加水分解の緑 体 か ら 調 製 し た チ ラ コ イ ド 膜 に ATP を 加 え て も

分子機構も基本的に同じである．しかし，CF CF だけ

ATP 加水分解活性や H 輸送活性はまったくみられなは，光合成反応によって形成される ΔμH を駆動力としいのでているため（光リン酸化），駆動力を供給できない夜間にえることが出来る．もうひとつの調節機構は，チオール

は ATP 合成の逆反応である ATP 加水分解反応が起こ調節とよばれている．葉緑体 ATP 合成酵素の γサブユ

り，エネルギー的に不利な状況に陥る危険がある．このニットには他の生物種由来の ATP 合成酵素にはみられような環境条件に対応するため，CF CF には光合成のない 37アミノ酸長の挿入配列があり，
この挿入配列上の電子伝達系が駆動しない暗条件下で酵素活性を抑制する

ふたつの Cys 残基間によるジスルフィド結合の形成・解ための様々な活性調節機構が存在し，これが上記のよう

離により酵素活性が調節されているな逆反応を抑えていると考えられている．
そのひとつは，

この挿入配列を，調節領域とよぶ．γサブユニットの分子．すなわち，γと εサブユニット間の，この現象が酵素活性の調節機構のひとつと考

（図 1）
．そこで，

内に形成されるこのジスルフィド結合の還元は，光照射
１) 東京工業大学資源化学研究所

2009 低 温 科 学

vol.67により光合成電子伝達系が働きフェレドキシンが還元さ249

図 1：葉緑体 ATP 合成酵素 γサブユニット上にみられる調節領域
青：調節領域 赤：チオール調節を行うシステイン残基れた際，その一部の電子を用いて還元されるチオレドキ

ATP 合成酵素の研究に比べて立ち後れている．筆者ら

シ ン（Trx）に よって 行 わ れ る．CF CF の 酵 素 活 性

は，次善の策として好熱菌 Bacillus PS3 (TF TF ）由来

（ATP 加水分解活性）は，この還元によって２〜３倍上の α，βサブユニットと葉緑体由来の γサブユニットを昇する ．チオール調節および ΔμH activation はそれ再構成させたキメラ αβγ複合体を用いた研究をおこぞれ単独で働くものではなく，互いに関わりあいを持ちなったながら活性を調節する機構と考えられる．すなわち，上(αβγδ
，αβγ，αβ の調製法や ATP 加水分解活性ε）

述のピリドキサールリン酸による Lys 残基の標識実験の測定法などを紹介する．また，ホウレンソウより調製の結果に従えば，ΔμH の形成によって γと εサブユ

した葉緑体由来の αβ と組み換え体 γを再構成させ，γニットが構造変化することで γサブユニット上の調節

サブユニットへの変異導入がチオール調節に与える影響

領域が表面に露出する．次に，フェレドキシンにより還を調べた一連の研究において用いた方法およびそれに元されたチオレドキシンが，γサブユニット上に露出しよって得られた結果を紹介する．葉緑体 ATP 合成酵素

た調節領域のジスルフィド結合を還元する．このように，のような酸化・還元応答する酵素では，タンパク質の酸

ΔμH activation は Trx によるジスルフィド結合の還化還元状態と酵素活性の変化の対応付けが重要である．

元を起こすために必要と考えられている．また，調節領

そ こ で，SH 基 の 修 飾 試 薬 で あ る 4-acetamido-4ʼ
-域のジスルフィド結合が還元されると，より低い ΔμH

maleimidyl-stilbene-2,2ʼ
-disulfonate（AM S）を用いて，でも ATP 合成が可能となることも知られている ．

γサブユニットの還元状態を SDS‑ゲル電気泳動の移動．本章の前半では，ホウレンソウからの CF

もうひとつの調節機構は，内在性の阻害サブユニット

度の変化によって確認する方法もあわせて紹介する．後として知られている εサブユニットが担っている．εサ

半では，葉緑体チラコイド膜を用いた ATP 合成活性のブユニットの ATP 加水分解活性に対する阻害効果は細測定および大腸菌反転膜小胞を用いた ATP 合成酵素の菌由来の ATP 合成酵素においてもみられるが，CF 由

プロトンポンプ活性の測定法について述べる．

来の εサブユニットはその阻害効果が顕著で，これも暗所下で ATP の加水分解を効率よく抑制する機構のひとつと考えられている．しかし，このような CF CF の活性調節機構の詳細は，CF CF の取り扱いの制約および3.g .2 C F の調製と ATP 加水分解活性の測定

結晶構造がまだ完全に明らかにされていないことなどのATP 合成酵素は光リン酸化反応や酸化的リン酸化反理由から，いまだに不明な点が多い．特に，CF CF もそ応を行う酵素として 1950年代に発見され，当初からアメの可溶性画分である CF も，シロイヌナズナの全ゲノム

リカの E.Racker の研究室を中心に活発に研究が行わが解読され遺伝子構成が全て明らかになった現在でも，れた

いまだに活性をもった組み換え体タンパク質を得ること

おり，現在でも基本的には同じ方法が用いられている．

が出来ないため，分子レベルでの研究が細 菌 由 来 のCF は分子を構成する基本サブユニットが，α，β，γ，

250．従って，その精製方法は早くから確立されて葉緑体 ATP 合成酵素と光リン酸化

δ，εの５種類からなる複雑な分子複合体であり，可溶性

で，2.5〜3mg chlorophyll/ml になるように懸濁する．

画分として膜から抽出した場合，ATP 合成活性を失っ

７．この溶液に 1/2容量のクロロホルムを加え 15秒間ているが，様々な条件下で ATP 加水分解活性を測定す激しく撹拌する．攪拌後，4,000×g で５分間遠心して，ることが出来る．ここでは，もっとも簡便に CF を得る

手早く黄緑色の上清をクロロホルム層から分離して回ことの出来るふたつの方法を紹介する．

収する．この上清を 70,000×g で 30分間（20℃）遠心

3.g .2.1 C F の調製法（クロロホルム抽出法）

する．得られた上清に 70％飽和となるように硫安を加ATP 合成酵素の F 部分の抽出方法として一般的にえて４℃で保存する．

用いられるのが，クロロホルム抽出法である ．これは，以上の操作によって，SDS-PAGE の結果（図 2‑A，疎水的な膜タンパク質成分を脂質膜とともにクロロホル

レーン１）に示すように，ほぼ夾雑物のない CF (αβム層に集めて親水性タンパク質成分のみを回収する方法

を得ることが出来る．必要に応じて，ゲル濾過法
γδε）

である．含ハロゲン有機溶媒の取り扱いと処理が若干面などによりさらに精製する．

倒であるが，高純度の CF を大量・簡便に抽出することが可能である．

3.g .2.2 ショ糖を用いた精製法（スモールスケール）
CF は，葉緑体チラコイド膜の表在性タンパク質としてかなりの部分を占めているが，CF との結合は分子間［実験方法］

相互作用によるもので，それほど強固ではない．このた

１．葉緑体破砕液（300mM sucrose，20mM Tris-Cl

め，溶液の組成を適当に変化させるだけでも簡単にチラ（pH 8.0），10mM NaCl）をあらかじめ調製し，氷冷

コイド膜から遊離させ，回収することができる ．

しておく．
２．市販されているホウレンソウの葉（中ろくを除いた［実験方法］

もの）100g に対して 200ml の葉緑体破砕液を加え，１．ホウレンソウの緑葉 10g に，チラコイド膜抽出液

調理用ミキサーを用いて破砕する（ブレンダーミキ（0.3M Sucrose，1mM MgCl ，50mM NaCl，20mMサーを用いても構わないが，いずれの場合も葉の断片）を 20ml 加え，ミキサーで軽Tricine-NaOH(pH 8.0）がいくらか見える程度で破砕操作をやめる）．筆者ら

く破砕する．残渣をガーゼで除き，濾液を 3000rpm では，通常，一回の抽出操作について 1〜1.5kg のホウレ
ンソウ緑葉を使用している．

10分間遠心して沈殿を得る．
２．沈殿にチラコイド膜抽出液 10ml を加えてパスツー

３．破砕した葉を４層のガーゼでろ過し，ろ液を遠心

ルピペットを用いてよく懸濁し，10,000×g で２分間

（5,000×g，10分間）する．遠心操作は，４℃で行う．

遠心する．

４．遠心後の沈殿を 2mM Tricine-KOH(pH 8.0），10

３．上 清 を 除 き，沈 殿 に 10mM Na-pyrophosphatemM NaCl に懸濁して，４℃で 60分間スターラーを用(pH 7.5）を 10ml 加えてパスツールピペットで懸濁いて撹拌する．沈殿の懸濁には，絵の具用の絵筆を用した後，10,000×g で２分間遠心する．この操作を３回いるとよい．この低張操作によって葉緑体の包膜を破繰り返す．

壊し，チラコイド膜標品を得る．
５．この懸濁液を，15,000×g で 10分間遠心し，得られる沈殿を 10mM Na-pyrophosophate(pH 7.4）に懸濁

４．得 ら れ た 沈 殿 に 0.3M sucrose，10mM TricineNaOH(pH 8.0）を 2.5ml 加え，十分に懸濁してから
室温で 30分間放置する．

し，４℃で 10分ほどインキュベートしてから遠心処理

５．この溶液を 20,000×g で 30分間遠心して上清を回して沈殿を得る．この操作を二度繰り返して，チラコ収するだけで，ほぼ夾雑物を含まない CF 標品が得ら

イド膜表面に結合している Rubisco を除去する．

れる．

６．2度目の遠心後の沈殿を，あらかじめ室温に保温し3.g .2.3 αβγの精製て お い た 500mM sucrose，40mM Tricine-KOH

3.g.2.1で紹介した方法で抽出した CF は，基本的に（pH 8.0），2mM EDTA ，4mM ATP，10mM DTT

は αβγδεのサブユニット構成であるが，δサブユニッ
トは部分的に外れていることや，εサブユニットが ATP

CF と CF の結合には M g イオンが重要な役割を果たしている．このため，EDTA のようなキレート剤を加えると，両者は解離しやすくなる．クロロホルムで膜を変性させなくても，
EDTA の添加によって CF は CF から外すことが出来るので，この方法だけで温和に精製する方法もあるが，収率が低くなる．

2009 低 温 科 学

vol.67

加水分解活性を強力に阻害していることなど，酵素の均一性にはやや難点がある ．そこで，触媒活性を維持した得られる標品の電気泳動の染色バンドの濃度から判断する限251

最小単位である αβγの調製方法が確立されている．
［実験方法］
１．ホウレンソウより調製した CF（10〜30mg，硫安沈殿として保存した場合には脱塩操作をあらかじめ行
い，25mM Tris-Cl(pH 8.0）溶液とする）を，25mM，2mM ATP，5mM DTT であらかTris-Cl(pH 8.0）
じめ平衡化した DEAE-Sephacel（GE ヘルスケア）カラム（1×10cm）にロードし，CF をカラムに吸着させる．
２．20ml の上記の緩衝液で吸着しないタンパク質を完
全 に 溶 出 さ せ た 後，50〜100ml の 25mM

Tris-Cl(pH 8.0），2mM ATP，5mM DTT，30％(v/v)glycerol，20％(v/v)ethanol，0.1M NaCl を付加し，εサブユニットを αβγより解離させる．この操作で一部のδも解離する．

図 2：葉緑体 ATP 合成酵素の部分複合体の調製
Ａレーン１，ホウレンソウからクロロホルム抽出法により調製した CF (αβγδ．
ε複合体）
レーン２，CF から εを除去する処理をした後の αβγδ複合体．
Ｂレーン１，αβγδ
レーン２，αβγδ複合体から調製した αβ 複合体．
レーン３，大腸菌内で不溶性画分として発現した CF γを調製したもの．

３．20ml の 25mM Tris-Cl(pH 8.0），2mM ATP でカラムを洗 浄 し，glycerol や ethanol を 除 去 し た 後，

２．氷上で１時間，ゆっくりと攪拌を続ける．

20〜50ml の 25mM Tris-Cl(pH 8.0），2mM ATP，

３．酵素溶液を細孔径 0.2μm のフィルターに通して微0.4M NaCl でカラム内に吸着している αβγを溶出

粒子を除去し，十分に冷却した 30mMさせる．αβγを含む分画を 12％ SDS-PAGE で確認

phosphate(pH 7.0），1mM MgATP，0.3M LiCl でし，その分画に 70％となるように硫安を加えて，使用平衡化した Hydroxyapatite（BioRad 130-0420）カラ時まで４℃で保存する．この方法で調製した αβγδム（1.5×15cm）にロードする（サンプルの容量はカ複合体の SDS-PAGE の実験例を図 2A，レーン２に示す．この標品では，δサブユニットがまだ完全に除去

potassium

ラム体積の半分程度まで）．
４．30mM

potassium phosphate(pH 7.0），1mM

できていない．

MgATP，0.3M LiCl 溶液 150ml でカラムからタン

3.g .2.4 αβの精製

パク質を溶出し，αサブユニットと βサブユニットの葉緑体由来の ATP 合成酵素では，αおよび βサブユ

両方を含む分画を 12％ SDS-PAGE で確認した後，こニットは，再構成可能な組み換え体タンパク質を得るこの 分 画 を 20mM

HEPES-NaOH(pH 7.0），10％とが出来ないが，γサブユニットだけは既に発現系が構

glycerol，1mM M gATP，2mM DTT に対して，４℃

築されており，変異導入実験も行われている．そこで，

で 15時間透析する．

アメリカの Richter らは，葉緑体 ATP 合成酵素から α

５．この段階で得られる標品には，γサブユニットを含β 部分だけを調製する方法を確立し，これに組み換え体

む αβγが共存している．そこで，20mM HEPES-

γを再構成している

NaOH(pH 6.5），1mM M gATP，1mM EDTA で平．

衡 化 し た DEAE-cellulose (Sigma D 3764）カ ラ ム［実験方法］（2〜3ml）に数 mg のタンパク質を含む上記画分（αβ１．15〜20mg の αβγに ATP/M gCl を 終 濃 度 でおよび αβγが含まれている）をロードし，カラム体

5.5mM /5mM となるように加える．この溶液をス

積の３〜５倍量の 120mM NaCl，20mM HEPES-

ターラーで ゆっく り と 攪 拌 し な が ら，室 温 で 10M

NaOH(pH 6.5），1mM M gATP，1mM EDTA を流

LiCl をゆっくりと加え，LiCl の終濃度を 2M となるして，解離している βサブユニットを溶出させる．次ようにする（タンパク量は 1mg/ml となるようにすに，３〜５倍量の 170mM NaCl，20mM HEPES-る）．

NaOH(pH 6.5），1mM M gATP，1mM EDTA で αβ を溶出させる．さらに，400mMり，3.g.2.2の方法で調製した標品のサブユニット数量比の方が，CF 本来のそれに近いと思われる．

252

HEPES-NaOH(pH 6.5），1mM

NaCl，20mM

M gATP，1mM

EDTA で αβγを溶出する．
葉緑体 ATP 合成酵素と光リン酸化

６．得 ら れ た α β 及 び α βγは そ れ ぞ れ 20mM

タンパク質の酸化還元状態をそろえておくためにあらか

HEPES-NaOH (pH 7.0），20％ glycerol，1mM

じめ DTT 及びチオレドキシン（Trx-f）（還元型にする

MgATP に対して４℃で 15時間透析する．透析後のため）または CuCl（酸化型にするため）で，30℃，30分

サンプルを濃縮し使用時まで−80℃で保存する．上記

間インキュベートしておく．

の 方 法 で 調 製 し た αβγ及 び αβ 複 合 体 の SDSPAGE の結果を図 2B，レーン１およびレーン２に示［実験方法］

す．これらの標品では，δサブユニットがまだ完全に除

１．37℃で 保 温 し た 930〜950μl の 反 応 溶 液（50mM

去できていない．

，2mM ATP，2mM MgCl ，Tricine-KOH(pH 8.0）

3.g .2.5 葉緑体 αβ とリコンビナント γの再構成

50mM Na SO ，50mM KCl，5mM phosphoenolpyr-

CF γは大腸菌を用いた組み換え体タンパク質の大量，50μg/
uvate(PEP），50μg/ml pyruvate kinase(PK）発現系が既に構築されているので，アミノ酸変異を行っ，0.2mM NADH）
ml lactate dehydrogenase(LDH）

た γサブユニットの作成は容易である．筆者らの CF γに，酸化・還元処理した酵素液（50〜70μl）を加え反変異体は，ドイツ Heinrich-Heine 大学の Strotmann 教

応を開始させる．

授の研究グループから供与されたホウレンソウ CF γサ

２．この反応系では，ATP 加水分解 に よって 生 じ た

ブユニット単独発現系をもとに作成した．変異 γのプラ

ADP は PK によって速やかに ATP に戻り，その時にスミドの作成及び大腸菌内での発現条件の詳細は文献を生じるピルビン酸が LDH によって乳酸に還元される

参照されたいときに１分子の NADH が消費される．従って，ATP．

加水分解活性は NADH の 340nm における吸光度の［実験方法］

減少から直接算出することが可能である．反応溶液 1

１．組み換え体 γ（図 2B，レーン３）は大腸菌体内で封ml の場合次の計算式によって，比活性を算出する．

入体として発現してしまうので，50mM NaHCO ，1mM EDTA，5mM DTT，20％
NaOH(pH 9.5）
glycerol，4M urea に溶解させる．この溶液を 50mM
NaHCO -NaOH (pH 9.5），0.3M

比活性 U/mg ＝ΔA /min×10 /6220×protein μg
3.g .2.7 AM S による γの還元状態の確認

LiCl，1mM

CF を初めとするチオール酵素は，酸化条件下では分EDTA，5mM DTT，20％ glycerol に対して４℃で 24

子内ジスルフィド結合を形成し，それによって起こる構時間透析する．透析後の試料をタンパク質濃度 1mg/

造変化が酵素活性を低くあるいは完全に抑えている．こml となるように濃縮し使用時まで−80℃で保存する．

のタンパク質分子内でのジスルフィド結合を可視化する

２．精製した αβ を 50mM HEPES-NaOH（pH 7.0），

方 法 と し て，4-acetamido-4ʼ
-maleimidyl-stilbene-2,2ʼ
-

20％ glycerol，2mM M gCl ，2mM ATP，2mM DTT

disulfonate（AMS）のような SH 修飾試薬を用いてタンで 100μg/ml となるように希釈し，氷上で γを含む上パク質を標識し，標識に起因する分子量およびタンパク

記の溶液をモル比で 3γ：1αβ となるように αβ質の荷電状態の差を利用して，電気泳動的に酸化状態と溶液に滴下する．αβ 及び γを混合させた溶液を穏や還元状態のタンパク質を識別する方法がある．この方法かに撹拌し 20℃で２時間インキュベートする．

を用いると，系の中に混在する酸化型と還元型の割合を

３．再構成した αβγはゲルろ過 HPLC(Tosoh, SWG3000 カラム）によって分取する．
3.g .2.6 ATP as e 活性の測定
CF の ATP 加水分解活性は，リンモリブデン酸比色決定することや，修飾可能な SH 基の数を推定することが可能である．ここでは，CF γの調節領域を含む TFの αβγ(αβγ ）複合体を用いて γの還元状態を確認した結果を紹介する ．

定量法やマラカイトグリーンを用いた比色定量法によって遊離した Pi を定量することで高感度に測定すること［実験方法］

ができる．本項では，ATP 再生系を用いた ATP 加水分

１．前項と同様に，CF γの調節領域上のジスルフィド

解活性の測定法を紹介する．ATP 再生系を用いた測定

結合を還元するため，CF あるいは αβγ法では，系の中の ATP 濃度を一定に保ち，酵素の ATP

100μM DTT，5μM Trx-f，50mM HEPES/KOH

加水分解活性を実時間で追うことができるので，速度論(pH 7.5），5mM MgCl で 30℃，10分間インキュベー

的な解析を行う際に非常に有用である．CF などの場合トする．酸化処理する場合には，DTT と Trx-f の代わには，酸化状態と還元状態で活性が大きく異なるので，りに，50μM CuCl を用いる．

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複合体を253

２．酸化・還元処理した αβγ複合体に同量の 10％

TCA を加え，氷上で 10分間インキュベートする．この溶液を 15,000×g で 10分間遠心して沈殿を得る．
沈殿に 200μl の氷冷したアセトンを加えて懸濁した
後，15,000×g で５分間遠心する．この操作を二度繰り返す．
３．遠心後の沈殿からアセトンを乾燥によって除去した
後，10μl の１％ SDS，50mM Tris-Cl(pH 7.5），15mM AM Sを加え室温で 30分間強く撹拌して沈殿を完全に溶解する．この溶液に 10μl の SDS-PAGE（2‑メルカプトエタノールを含まない溶
sample buffer液）を加え，9.0％ SDS-PAGE で酸化・還元処理による γの移動度の違いを調べる．
この方法は，分子量が４万までの比較的小さなタン
パク質の酸化還元状態を見るのに簡便で有効な方法である．図 3には，γ上のジスルフィド結合の還元の程度に比例して ATP 加水分解活性が上昇する様子を調べた結果を示す．

3.g .3 C F C F を用いた光リン酸化活性の測定と大腸菌反転膜によるプロトンポ
ンプ活性の測定
ホウレンソウ緑葉から単離した葉緑体を用いた光リン

図 3：AMS による γの還元と酵素の活性化
Ａ 調節領域を含む αβγ複合体（αβγ ）の γサブユニッ
ト部分の酸化還元レベルを DTT および Trx-f によって変化させ，AM S 修飾によって可視化した．
Ｂ Ａの標品の ATPase 活性を測定し，γサブユニットの還元レベルに対してプロットしたもの
実験の詳細は，文献 25を参照．

［実験方法］
１．市販のホウレンソウの緑葉 30g に対して，あらかじ
め氷冷した 60ml の破砕用緩衝液（20mM

Tricine-

酸化活性の測定は，50年以上前に Arnon によって報告

NaOH(pH 8.0），50mM NaCl，5mM MgCl ，400

されている．非循環的な電子伝達による光リン酸化活性mM sucrose）を加え，ミキサーで 15〜20秒間破砕すを測定するためにはパーコール法などで無傷葉緑体を調る．

製する必要があるが，循環的電子伝達による活性は，包２．破 砕 液 を ４ 層 の ガーゼ で 濾 過 し て 残 渣 を 除 き，膜を欠いたチラコイド膜標品でも容易に測定することが3,800×g（5,000rpm）で５分間遠心して沈殿を得る．

出来る．一方，CF CF が ATP を加水分解すると同時に３．以降の操作は，出来るだけ氷上あるいは低温室で行ATP 合成の時とは逆にチラコイド膜ルーメン側にプロう．この沈殿に破砕用緩衝液 60ml を加え絵筆を用いトンを輸送するプロトンポンプ活性を測定するためには，適当な蛍光色素を用いる必要があり，クロロフィルて丁寧に懸濁し，同様に遠心して沈殿を得る．
４．氷 冷 し た 低 張 緩 衝 液（20mM

Tricine-NaOH

を大量に含む葉緑体チラコイド膜では実測が難しい．本(pH 8.0），50mM NaCl，5mM MgCl ）60ml を沈

項では，ホウレンソウ葉緑体による光リン酸化活性の測殿に加え，氷上でスターラーで 60分間攪拌し，葉緑体

定法，大腸菌反転膜小胞を用いたプロトンポンプ活性のを破壊する．

測定法を紹介する．
3.g .3.1 ホウレンソウ葉緑体チラコイド膜の調製

５．葉緑体溶液を 10,000×g で５分間遠心し，沈殿を回収した後，低張緩衝液で２回懸濁と遠心を繰り返して基本的には，CF を調製するときと同じ方法でいわゆ洗浄する．最終的に得られたチラコイド膜標品の沈殿るチラコイド膜標品を得るが，光リン酸化活性を測定すを 4ml の低張緩衝液に懸濁し，定法に従ってクロロ

る場合には，使用する緩衝液条件をより穏和なものにす

フィル定量を行い，終濃度 0.5mg Chlorophyll/ml にる．理由はよく分からないが，緩衝液には，Tris よりもなるように低張緩衝液で希釈して，チラコイド膜標品

Tricine を用いた方が高い比活性が得られる．

とする．
3.g .3.2 光リン酸化活性の測定

AM S は使用時に調製する．

254

上記のようにして調製したチラコイド膜は，表在性タ
葉緑体 ATP 合成酵素と光リン酸化

ン パ ク 質 で あ る フェレ ド キ シ ン や フェレ ド キ シ ン−NADP 還元酵素（FNR）を失っており，通常は光照射してもチラコイド膜内外にプロトン勾配を形成しない．そ６．中和処理した試料に含まれる ATP 量を，後述のLuciferin-Luciferase 法によって定量する．
７．バックグラウンド測定

こで，光化学系 周辺だけで循環的な電子伝達を可能に

ここで紹介した ATP 合成の測定法では，先に述べする脂溶性化合物である Phenazine methosulphate をたように系内に adenylate kinase が含まれていた場用いて擬似的に電子伝達反応を行わせ，チラコイド合に，その働きによって生じた ATP を ATP 合成酵

膜内外のプロトン勾配を形成させることで，CF CF の素 が 合 成 し た ATP と 識 別 す る こ と が 出 来 な い．

ATP 合成活性を測定する．従来は，ATP 合成活性の基

Adenylate kinase は diadenisine penta phosphate に質に用いるリン酸に P 標識のものを用いることで，合よって特異的に阻害することが出来るが，試薬が高価成された

P ‑ATP を定量していたが，取り扱いの煩雑であることや高濃度に添加しないとその活性を必ずしさから敬遠されることが多く代替法として Luciferin-

も完全には抑えることが出来ないことなどの理由か

Luciferase 法を用いることが多い ．ただし，後者の場

ら，バックグラウンド測定にはあまり適していない．

合には，系の中に含まれる adenylate kinase 活性（2ADP

CF CF による ATP 合成は，チラコイド膜内外に形→ ATP＋AMP）により生じる ATP と光リン酸化で合成される ΔμH を利用するので，これを脱共役剤で解成された ATP を区別できないので，阻害剤の使用など

消する，もしくは，CF に特異的な阻害剤であるテンに特別な注意が必要である．

トキシンを使用した方が確実に阻害することが可能であり，これによって試料中の ATP 量の変動における［実験方法］

ATP 合成の寄与を簡単に評価することが可能であ

１．あらかじめ，光リン酸化反応液（57.5mM Tricine-

る．通常は，上記の２の操作の際に，50〜100μM の，50mM NaCl，5mM MgCl ，62.5
NaOH(pH 8.0）

FCCP（脱共役剤）をあらかじめ加えておくことで，

mM Phenazine methosulphate）を調製し，光を遮断

ATP 合成を完全に阻害することが可能である．テンして氷冷しておく．Phenazine methosulphate は光トキシンの場合には，チラコイド膜標品に対して 5

感受性なので，可能な限り遮光して保存する．

μM になるように添加し 30分ほど室温で放置するこ

２．容量 4ml の透明なガラスバイアル瓶に，光リン酸化
反応液 2.4ml，3.g.3.1で調製したチラコイド膜標品とで CF の活性を完全に阻害することが出来る．
3.g .3.3 ATP の微量定量法

0.6ml を入れ，両者を混合する．このバイアル瓶をス

光リン酸化反応によって生じる ATP の定量法としてターラーの上にセットし，厚さ 5cm の水フィルター

は，以前は P 標識のリン酸を用いることで，合成された（透明なガラス瓶に水道水を入れたもの）
を介して，
150

P ‑ATP をイソブタノール‑ベンゼンで抽出し定量しW のコールドランプで光照射することで室温で反応ていた．放射性同位体を利用すれば，反応系の夾雑化合を行う．最終的な試料溶液中のクロロフィル濃度は，物の影響をほとんど考慮せずに注目する反応を追跡する

0.1mg/ml とする．

ことが可能である．しかし，最近では，放射性同位体が，３．光照射開始後，一定時間（通常は５分くらい）経過

その取り扱いの煩雑さから敬遠されることが多くなり，した後に，バイアル瓶に ADP とリン酸を添加し，いくつかの代替法が使用されるようになってきた．例えATP 合成反応を開始する．用いる ADP とリン酸の濃ば，HPLC の紫外可視検出器が非常に高性能になり，度はそれぞれ１ないし 2mM である．

ATP や ADP の微量定量法としてこれを用いることが４．反応開始から一定時間経過後にバイアル瓶から 50可能である．実際，ATP と ADP は C カラムによる逆μl の試料を採取し，手早く氷冷した 2μl の 10％ PCA

相クロマトグラフィーや，酸化チタンカラムによるクロ溶液と混合して反応を停止する．

マトグラフィーで高速に分離可能であるが，両者の量比５．一連の反応停止処理が終了するまで停止した試料はに大きな差がある場合にはピークがかぶることがあり定氷上に放置し，その後，20,000×g で 10分間遠心して，量が難しい場合がある．測定対象とする ATP 量が十分

上 清 を 回 収 す る．上 清 20μl に 対 し て 50μl の 2Mである場合には，Hexokinase と Glucose 6-phosphate

Tris-acetate(pH 7.7）を混合し中和する．

dehydrogenase を用いたカップリングアッセイを行うことにより，NADPH の生成量に変換することが可能であ

現在は光安定性の高い 1-Methoxy phenazine methosulphate
も Sigma 社から市販されており，これを用いることもできる．

2009 低 温 科 学

vol.67

り，分光光度計でリアルタイムに測定することが出来る．
ATP の高感度定量法としてよく用いられる方法とし255

て，Luciferin-Luciferase 法がある．これは，ホタルの発

3.g .3.4 大腸菌反転膜によるプロトンポンプ活性の測光現象を触媒している Luciferase を利用して ATP の
存在量を発光量に変換して測定する方法である．
Luciferase
ATP＋D-luciferin＋O→

oxyluciferin＋PPi＋
AMP＋CO ＋photon

定チラコイド膜に結合した F F に ATP 加水分解を行わせた場合には，その H 輸送活性によりチラコイド膜の外側から内側に向かって H が輸送され，膜内外にH の濃度差（ΔpH）および膜電位差（Δ ）が生じる．
一 般 に ， 膜 小 胞 内 に 形 成 さ れ る ΔpH は ， 9 -この反応は，系の中の ATP を fmol オーダーで測定すaminoacridine，ACMA などの蛍光性 pH 指示薬を使用ることの出来る高感度な測定系であるが，混合後速やかし，また，Δ は dis-C (5）や Oxonol-V などを使用するに反応が進行してしまうため，発光現象を測定することことによって，測定することが出来る ．CF CF の Hが難しい．このため，ヒ酸ナトリウムによって Lucifer-

輸送活性を測定する場合には，いったん光駆動により膜ase をある程度阻害した条件下で出来るだけ発光現象が内外に H の電気化学的勾配（ΔμH ）を形成させ，CF

持続するようにして測定を行う．実際には，測定に必要

CF を活性化（ΔμH activation）させる必要がある．本な Luciferin や Luciferase はヒ酸ナトリウムを含む緩項では，CF γの調節領域および CF εを含む TF TF

衝 液 と 混 合 キット と し て Sigma 社 ま た は Roche-（キメラ F F ）を大腸菌内に発現させ，その反転膜小胞をDiagnostics 社から販売されている．

用いたキメラ F F の H 輸送活性の測定法を紹介する．

［実験方法］
１．3.g.3.2で中和済みの測定試料（通常 20〜40μl 程［実験方法］度）
に対して，等量の Luciferase 反応溶液
（上記のキッ

１．CF γの調節領域および CF εを 含 む TF TF (キトを使用法に従って溶解し，氷上に保温したもの）をメラ F F ）の発現プラスミド DNA を大腸菌 DK8 株

加え，混合 10秒後から１分間に放出される Photon のにトランスフォームし，コロニーを少量の液体培地

量を測定する．

２×YT（1.6％ Bacto-tryptone，１％ Bacto-yeast

２．Photon の測定は，市販のルミノメーターを使用す
れば，混合後の測定時間を簡単に設定することが出来で培養し，その培養液を 2〜3L
extract，0.5％ NaCl）の２×YT 培地に加えて，20時間培養する．

るので容易である．但し，Chemiluminescence 測定用

２．回収した菌体を 10mM HEPES/KOH(pH 7.5），5のマイクロプレートに対応した機種では，試料に反応

mM MgCl ，10％ glycerol で 0.4mg protein/ml にな液を投入してから一定時間後に測定することが出来なるように懸濁し，フレンチプレス（1,500kg/cm ）でいので，ATP の定量に用いるには不向きである．

破菌する．破菌後の溶液を 17,000×g で 20分間遠心

３．ルミノメーターが使用できない場合には，蛍光光度し，回収した上清を 240,000×g で 60分間遠心する．

計を代用することも出来る．この場合には，蛍光光度

得 ら れ た 沈 殿 を 10mM HEPES/KOH(pH 7.5），5計のセル室の励起光源側のシャッターを閉じ，さらにmM MgCl ，10％ glycerol で懸濁し，再度 240,000×

黒い板などで試料室への入射光を完全に塞ぎ，蛍光測g で 60分間遠心する．遠心後の沈殿を 10〜20mg pro-

定波長を 560nm にセットする．また，蛍光側のスリッ

tein/ml と な る よ う に 10 mM H EPES /KOH

ト幅を最大，フォトマル電圧を最大感度になるように(pH 7.5），5mM MgCl ，10％ glycerol で懸濁し，使設定する．混合と同時に試料をセルホルダーにセット用時まで−80℃で保存する．

し，蛍光の時間測定を行えば，発光量をモニターするこ

３．H 輸 送 活 性 を 測 定 す る た め 反 応 溶 液（10mMとが可能である．
高感度化の工夫として，
セルホルダー，5mM MgCl ，100mM KCl，
HEPES-KOH(pH 7.5）の蛍光入射窓と反対側に反射鏡をセットするとよい．

0.3μg/ml ACMA）に約 500μg protein の酸化・還元

４．既知濃度の ATP を 3.g.3.2で行った酸処理，中和

処理した大腸菌反転膜小胞を加え，蛍光光度計のセル処理したものを用いて検 量 線 を 描 け ば，発 光 量 をATP の絶対量に換算することが出来る ．
Luciferase 反応は，夾雑物に敏感なので，検量線の測定に用いる ATP もあらかじめ試料と同様に酸変性・中和処理をしておかないと，正しい測定が出来ない．

256

葉緑体チラコイド膜には，クロロフィルやカロチノイドなど可視領域に強い吸収をもつ色素分子が多く存在するため，これらの蛍光試薬を用いて ΔμH を測定することが難しい．これを回避する方法として，チラコイド膜に内在のカロチノイドの吸収変化を指標として測定する方法がある．

葉緑体 ATP 合成酵素と光リン酸化

室にセットし，ベースラインが安定するまで 42℃でイ

ブユニットの全遺伝子配列が完了しているし，1994

ンキュベートする（励起波長 410nm，蛍光波長 480

年には呼吸鎖を構成する５つの複合体の中で最初に結晶．なお，反転膜小胞の酸化・還元処理は AM S によnm）

構造が明らかにされている ．一方で，その分子機構の研る γサブユニットの還元状態の確認に記載した方法究に関しては，Penefskyや Boyer らが速度論的な解析と同様の条件で行う．

を熱心に行い，1997年には吉田・木下らの研究グ

４．スターラーで 攪 拌 し て い る セ ル に 直 接，0.5mM

ループの手で，触媒反応中に分子の軸部分を構成するサ

ATP を投入することにより，反応を開始させる．反応

ブユニットが回転していることが顕微鏡下で実際に映像を開始し，蛍光変化がプラトーに達したら，1μg/ml

としてとらえられ ，分子モーターとして一躍注目され

FCCP を加えて反応を停止させる．実際の測定例としるようになった ．一方で，本章でも触れたように，このて，葉緑体 CF CF の γサブユニットの酸化還元調節

酵素はエネルギー供給という重要な役割を担っているこ

領域を好熱菌 ATP 合成酵素に組み込んだキメラ Fとから，生理的に高度に調節されているようである．こF の H 輸送活性と，そのチオール調節を図４に示しの調節機構については，細胞の状態に合わせてどのようた．

に調節が行われるのか，その実体がまだ明らかにされておらず，これから大きく研究が進展する分野であろう．
分子モーターとしての性質が明らかになって以来，

3.g .4 おわりに

ATP 合成酵素は一分子レベルの研究の材料となり，研CF CF は，光合成の炭酸同化に必要な化学エネル

究技術の観点からも非常に高度な物理化学的な測定の対ギーを，光化学反応で形成される膜ポテンシャルを利用

象となっている．しかし，一方で，本章で紹介したようして合成し供給しているという意味で，光エネルギーをに，CF CF は葉緑体から容易に大量に調製することが化学エネルギーに変換するプロセスの重要な酵素であ可能であり，その ATP 加水分解活性やプロトン輸送活る．50年以上前に Arnon によって発見された光リン酸

性も分光光度計や蛍光光度計だけで測定出来るなど，大化反応学の学生実習レベルでも容易に取り扱える便利な材料では，その後，Racker の研究室を中心に活発に研究が行われ，ATP 合成酵素の研究として発展した．

研究の過程では，同種の酵素であるミトコンドリア由来ある．今回，本章で紹介した方法が今後の植物生理学研究の一助になれば幸いである．

の ATP 合成酵素と細菌細胞膜由来の ATP 合成酵素
が，その理解に大きく貢献しており，1983年には構成サ

図 4：F F による ATP 依存的 H 輸送活性に対するチオール調節の影響
Ａ，大腸菌反転膜小胞を用いた H 輸送活性測定の概略図．F F の H 輸送活性による小胞内の pH の低下は蛍光性 pH 指示薬である ACMA の蛍光強度の減少により測定した．反転膜小胞は DTT，2-M E，Trx-f（還元条件，実線）または CuCl（酸化条件，点線）で 30℃，10分間インキュベートした．F F による H 輸送反応（B；TF TF ，C；キメラ F F ）は ATP を加えることにより開始し，脱共役剤である FCCP を加えることで停止させた．
2009 低 温 科 学

vol.67257

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DTT
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258

ATP

9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine
4-acetamido-4ʼ
-maleimidylstilbene-2,2ʼ
disulfonic acidadenosine 5ʼ
-triphosphate

PCA

trifluoromethoxyphenylhydrazone
N -(2-hydroxyethyl)piperazine-N -2ethanesulfonic acidperchloric acidTCA

trichloroacetic acid

HEPES

葉緑体 ATP 合成酵素と光リン酸化

３章 単離・精製・活性測定

３．酵素・電子伝達成分の精製・活性測定・定量
h．光化学系反応中心の分光学的定量村上 明男
酸素発生型光合成生物がもつ２種の光化学系（光化学系Ⅰと光化学系Ⅱ）の量比は，光などの環境条
件により適応的に制御される．本章では光化学反応中心の定量法について紹介する．

Quantification of Photosystem Reaction Centers
Akio M urakami
Stoichiometric relationships of photosystem II, cytochrome b -f and photosystem I complexes are regulated by
growth conditions such as light intensity and light quality. In this chapter,I introduce(i)estimation ofphotosystem I/photosystem II ratio by 77K fluorescence emission spectra and (ii)quantification of thylakoid components
by oxidation-reduction difference absorption spectra.

温度（77K）で測定すると，光化学系 と光化学系 由

3.h.1 はじめに
光化学系

来の蛍光帯が明瞭に区別できる蛍光スペクトルの解析かと光化学系 の量比は光量や光質などの生ら光化学系反応中心/ の量比の見積もりが可能であ

育環境により適応的に調節され，両光化学系の励起バラ

る．植物，緑藻，紅藻，一般的なラン藻（シアノバクテ

ンスや光の利用効率が維持されるリア）では，685nm 付近，695nm 付近，710‑740nm に．光合成の環境応答などの研究において光化学系反応中心の定量は重要項目極大を示す３つの蛍光帯が普遍的に存在する（図 1)であり，これまでに様々な定量法が考案されている．

光化学系複合体の精製標品の解析などから，685nm と光化学系

反応中心複合体には１分子のクロロフィル(dʼ)，光化学系aʼ

反応中心複合体には２分子のフェオ．

695nm の２つの蛍光帯は光化学系 に，710‑740nm（見かけの極大波長は生物種により異る）の蛍光帯は光化学

フィチン a が存在する．これらの特殊な微量色素を液体系 に帰属することが明らかになっている

クロマトグラフィーにより精密分析する方法が開発されドリムシ藻や褐藻などの葉緑体二次共生生物や特殊なクている ．また，両光化学系複合体にはそれぞれ P 700や

ロロフィルをもつラン藻などの 77K 蛍光スペクトル

シトクトム bは，これらのパターンにあてはまらないことが多い．

などの酸化還元成分が存在する．これら．一方，ミの成分の酸化還元差スペクトルによる光化学系反応中心

低温蛍光スペクトルの測定では，液体窒素用のデュの定量が行われている ．この他，電子スピン共鳴などに

ワー瓶やセルが必要である．蛍光分光光度計の特別付属よる反応中心の定量法も報告されている．一方，生細品，あるいは特注扱いで製作したものを用いる．測定試

胞や葉緑体の液体窒素温度でのクロロフィル蛍光スペク料（生細胞，単離葉緑体，生葉，藻体）を 15％ ポリエチ

トルの解析により，光化学系

レングリコール溶液に懸濁あるいは浸漬し，
専用セル
（ア

る

/ の量比が推定でき．

クリル製など）に入れ液体窒素中で迅速に凍結する．蛍本章では，蛍光スペクトル法と酸化還元差スペクトル法による光化学系反応中心の定量について紹介する．

光分光光度計の試料室に液体窒素を満たしたデュワー瓶を設置し，試料を入れたセルをセットする．
液体窒素中での試料の状態が安定した後に蛍光スペク

3.h.2 低温蛍光スペクトルによる光化学系
反応中心Ⅰ/Ⅱ量比の測定
生細胞などのクロロフィル蛍光スペクトルを液体窒素

トル（600nm〜850nm，励起波長 435nm 付近）を測定する．なお，蛍光スペクトル測定には多くの注意点があるので成書を参照する ．
光化学系（F１) 神戸大学・自然科学系先端融合研究環・内海域環境教
育研究センター2009 低 温 科 学

vol.67帯（F由来の 685nm と 695nm の２つの蛍光帯と F ）と光化学系

由来の 710〜740nm の蛍光）の間の蛍光強度（蛍光帯面積）の比〝F/（F ＋F )"は，反応中心 / 量比の指標となる ．少量の試259

図 1：Synechocystis sp.PCC6714 生細胞の室温吸収スペクトル（左）と 77K 蛍光スペクトル（右）．Ａ：橙色光で培養し，反応中
心 / 量比が高くなった細胞（PS /PS ≒ 3），Ｂ：赤色光で培養し，反応中心 / 量比が低くなった細胞（PS /PS ≒ 1）．

料で解析できるため，光化学系量比の変化を追跡する培

精製段階のチラコイド膜を測定に用いるが，ショ糖密度養実験などにおいて有用な手法である．ラン藻 Syne-

勾配遠心により細胞壁などの夾雑物を除くこともあ

chocystis

sp. PCC6714（3培 養 光 条 件），緑 藻，および緑Chlamydomonas reinhardtii（２培養光条件）
色植物 Spinacia orelacea について調べたところ，上記の蛍光強度比と反応中心/ 量比の間に高い相関性が示されている ．

る ．単離したチラコイド膜は凍結保存する．
3.h.3.2 光化学系Ⅰ反応中心の定量
光化学系 反応中心は，光化学系 に１当量存在する
反応中心分子 P 700の酸化還元差スペクトルにより定量
する ．
チ ラ コ イ ド 膜 を 緩 衝 液（50mM

3.h.3 酸化還元差スペクトルによる光化学系
反応中心の定量

Tricine-NaOH，

pH 7.5）に懸濁する．テフロンホモジナイザー等で均一化することで，分光測定中にチラコイド膜が凝集・沈降
しないようにする．短時間の超音波処理も有効である．

チラコイド膜を用いる酸化還元差スペクトルから，各なお，界面活性剤を用いたチラコイド膜の可溶化は有効

光化学系固有の反応中心色素やヘムなどの構成成分を定と思われるが，酸化剤／還元剤の添加に伴うクロロフィ量することができる ．光合成色素よる高バックグラウ

ルなどのバックグラウンド吸収の変化が拡大する問題も

ンド吸収もつ試料の微小吸収変化を測定するため，セルあり，個別の条件検討が必要である．チラコイド膜懸濁の汚れや試料液中の気泡などに対する様々な注意が必要

液（20〜60μg Chl a/ml，A ≒1.5〜4.5）をセル（光である ．

路長：10mm）に入れ，酸化剤（フェリシアン化カリウ

3.h.3.1 チラコイド膜の調製

ム）を終濃度 1mM で加え撹拌する．二波長分光光度計

細 胞 や 葉 緑 体 を 緩 衝 液（50mM

Tricine-NaOH，で測定する場合は，λ を 730nm に設定し 690〜730nm

pH 7.5）に懸濁し，フレンチプレスや超音波処理により(λ）の波長範囲で測定する．まず酸化剤を加えた試料の破砕し断片化したチラコイド膜を得る ．強固な細胞壁

ベースラインを測定する．次に，還元剤（アスコルビンをもつ微細藻などでは破砕処理を数回繰り返す．処理中酸ナトリウム）を終濃度 1〜4mM（100倍液または粉末）の温度上昇や泡立ちを防ぐため，予冷や間欠処理にも留で加え，ゆっくり撹拌した後差スペクトルを測定する（図

意し，必要に応じてプロテアーゼ阻害剤を添加する．

2A）．P 700の還元反応の飽和を確認するため，再度還元

低速遠心（1,600g ，15min）により未破砕の細胞など剤を少量加え同様に測定する．酸化剤や還元剤の至適濃の 残 査 を 除 き，遠 心 上 清 の チ ラ コ イ ド 膜 を 超 遠 心

度は予備実験により検討する．なお，酸化還元剤の過剰（140,000g ，1hr）
で回収する．沈殿を緩衝液で再懸濁し，な添加は光合成色素の退色や膜断片の凝集・沈澱を引き

超遠心を繰り返すことで膜に吸着したタンパク質（フィ起こし，バックグラウンド吸収が大きく変動することでコビリンタンパク質など）などを洗い除く．通常はこの測定が困難になる．通常のダブルビーム型分光光度計を260

反応中心定量法

用いた測定では，サンプル側とリファレンス側の両方の高いので，酸化剤・還元剤を用いた差スペクトル測定はセルにチラコイド膜懸濁液を入れ，ベースラインを補正困難である．このため，光化学系 反応中心の定量法とする．次に，サンプル側に還元剤，リファレンス側に酸して，酸素発生の閃光収率の測定 ，二次電子受容体 Q化剤を加え，差スペクトルを測定する．

の分光測定 ，放射標識した除草剤の結合，電子スピン共

光酸化‑暗還元の差スペクトルで P 700を定量するこ鳴によるチロシンラジカルの測定などの様々な方法

とも可能である（図 2B）．還元剤を添加したチラコイドが開発されている．いずれ方法も特殊な装置を必要とす

膜懸濁液に光照射の ON-OFF を繰り返して P 700の酸る．ここではラン藻で開発され 広く適用されている ，化‑還元を誘起する．四面透明セルを用い，分光光度計のシトクロム b

測定光束に対して直角方向の面から青色光を照射した状系 反応中心の定量法を紹介する．なお，同一試料でシ態でスペクトルを測定する．そのため，光電子増倍管（ホトクロム b -f 複合体も定量可能である．

トマル）に照射光が入らないよう光学フィルターで保護の酸化還元差スペクトルによる光化学

チラコイド膜懸濁液（50〜100μg Chl a/ml，A≒

する．光照射の ON-OFF を繰り返して測定することに4〜8）をセル（光路長：10mm）に入れ，酸化剤（フェより，スペクトルの精度を向上させることができる．

リシアン化カリウム）を終濃度 1mM になるように加える．二波長分光光度計の λ を 570nm に設定し，540〜

P 700濃度の算出方法：差スペクトルの極大波長（700580nm(λ）の波長範囲で測定する．酸化剤を加えた試料

nm 付近）とベースライン（730nm 付近）の吸光度差をに，還元剤（ヒドロキノン）を粉末で加える．ヒドロキ

読みとる（図 2参照）
．報告されている差分子吸光係数

ノンの添加では高酸化還元電位のシトクロム f（Em ≒（Δε340mV）が還元される．この段階でベースライン測定を＝64mM cm ) を用いて P 700量（クロロ

フィル当たりのモル濃度）を算出する．

行う．次に還元剤（アスコルビン酸ナトリウム）を粉末

3.h.3.3 光化学系Ⅱ反応中心とシトクロム b -f

で加え，静かに撹拌し１分間ほど静置した後にシトクロ複合体の定量光化学系

反応中心の P 680は酸化還元電位が非常にムbの差スペクトルを記録する（図 3B）．シトクロムb (Em ≒80mV）還元の飽和を確認するため，差スペク
トル測定を２，３回繰り返す．
同じ試料を用いて３種の還元剤を逐次加え差スペクト
ルを連続測定することで，シトクロム b -f 複合体も定量出来る ．フェリシアン化カリウムとヒドロキノンの間の酸化還元差スペクトルではシトクロム f(Em ≒340mV），アスコルビン酸ナトリウムと亜ジチオン酸ナトリ
ウム（ハイドロサルファイトナトリウム）の間の酸化還元差スペクトルではシトクロム b (Em ≒−50mV）の各成分が選択的に現れる（図 3A，C）．
特定の１成分だけを測定する場合は還元剤を溶液として加える場合もあるが，同一試料で３種のシトクロムを連続測定する際には，粉末（固形物）で加えることで試料の濃度変化を抑えることができる．粉末を加える際には，薬さじ（小）を用い少量（数粒）づつ分けて加え，その都度よく攪拌して溶解させる．なお，還元剤は湿気などにより変質することが多いので，デシケータ中で保管する．
シ トク ロ ム bとシトクロム b -f 濃度の算出方法：

差スペクトルの極大波長 559nm とベースラインとの図 2：Synechocystis sp. PCC6714 単離チラコイド膜で測定した P 700の酸化還元差スペクトル．A： Na ascorbate − Kferricyanide の差スペクトル，B： 暗還元 − 光酸化 の差ス
ペクトル．

2009 低 温 科 学

vol.67

吸光度差を読み取る．ベースラインが斜めになった場合
は，540nm と 570nm 付近の差スペクトルの谷を直線で結びベースラインとする．シトクロム bの濃度は，精261

3.h.4 おわりに本章ではラン藻での測定例を中心に光化学系反応中心などの定量法について紹介したが，緑色植物オオムギ ，クロマツ ，緑藻 Chlamydomonas ，紅藻 Porphyra
でも同様な測定が可能である．

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図 3：Synechocystis sp. PCC6714 単離チラコイド膜で測定したシトクロム f，シトクロム b ，シトクロム b の酸化還元
差スペクトル．A： Hydroquinone − K ferricyanide の差
スペクトル（シトクロム f），B： Na ascorbate − Hydroquinoe の差スペクトル（シトクロム b ），C： Na dith．
ionite − Na ascorbate の差スペクトル（シトクロム b ）製標品の還元型スペクトルのモル吸光係数
計 算 し た 559nm で の 差 吸 光 係 数 Δε

をもとに
＝15mM

cm を用いて計算する ．なお，光化学系 反応中心複合体当たりのシトクロム bの数（１あるいは２個）については，光化学系 反応中心の精製標品では１個との報告があるが，まだ決着していない．我々はラン藻（編集）蓮沼・木村・徳永，シュプリンガー・フェアラーク
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ロム b

ヘムが含まれると判断している ．しかし吸光係数の扱いの問題などもあり今後も検討が必要である．
シトクロム f とシトクロム b の差吸光係数としては，
そ れ ぞ れ Δε
Δε

＝21mM

cm （554/557nm）と＝14mM cm （563nm）を用いる．シトク

ロム b -f 複合体当たり１分子のシトクロム f と２分子のシトクロム b が含まる．

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2009 低 温 科 学

vol.67263

３章 単離・精製・活性測定

４．タンパク質複合体の単離
a．系１複合体の精製法
高橋裕一郎 ，兒玉なつ美 ，高橋拓子

系１複合体は，チラコイド膜に存在し，多数のサブユニットとコファクターから構成される超分子複合体である．光エネルギーを利用して，プラストシアニンもしくはシトクロム c からフェレドキシン
への電子伝達反応を駆動する．本章では，系１複合体を可溶化したチラコイド膜から精製する方法を紹介する．

Purification and characterization of photosystem I complex
Yuichiro Takahashi, Natsumi Kodama, Hiroko Takahashi
Photosystem I catalyzes a light-induced electron transfer from plastocyanin or cytochrome c to ferredoxin andforms chlorophyll-protein complex consisting of more than ten subunits and one hundred cofactors. In thischapter,biochemical purification of photosystem I complex by sucrose density gradient ultracentrifugation and
DEAE column chromatography is described.

4.a.1 チラコイド膜上のタンパク質複合体
酸素発生型光合成の電子伝達系の成分は，シアノバク
テリアや葉緑体のチラコイド膜に存在する．これらの成分として，チラコイド膜のストロマ側の表面に結合する

フトキノンであるフィロキノンもしくはメナキノン），，F と F (4Fe-4S の鉄硫黄
F (4Fe-4S の鉄硫黄中心）中心）である（図 1) ．その他に，アンテナとして機能する Chl a と β‑カロテンおよび脂質が存在する．
系１複合体は 10以上のサブユニットと 100以上のコフェレドキシン（Fd）とフェレドキシン NADP 還元酵素
（FNR），ルーメン側の表面に結合するプラストシアニン（Pc）やシトクロム c (Cyt.c ）などの可溶性タンパク質，チラコイド膜の脂質二重層中に存在するプラストキ
ノン，および系 1（PSI），系 2（PSII），シトクロム b f（Cyt.b f）などのチラコイド膜内に埋め込まれた多数のポリペプチドから構成される複合体がある．これらの複合体を精製するには，チラコイド膜を界面活性剤で可溶
化し（３章６．g），カラムクロマトグラフィーなどの生化
学的な精製操作が必要である．チラコイド膜上には，光合成電子伝達系の成分の他に，ATP 合成酵素も多量に存在し，電子伝達系の複合体を精製する時に混入してくる．

4.a.2 系１複合体の機能と構造
系１は光を利用して Pc もしくは Cyt. c を酸化し Fdを還元する反応を触媒する．系１に含まれる電子伝達成
分は，初期電子供与体 P 700(Chl a と Chl aʼ
のヘテロ二
量体）
，初期電子受容体 A (Chl a），電子受容体 A (ナ１) 岡山大学大学院自然科学研究科

2009 低 温 科 学

vol.67

図 1：系１電子伝達成分の配置
６分子の Chl a，２分子のフィロキノン
（ビタミン K ），３つの 4Fe-4S 中心の空間配置を示す．Chl a とフィロキノンは対称的に配置される．効率は異なるが，P 700から F までのいずれの電子伝達成分も反応に関与すると考えられている．

265

ファクターから構成されている．シアノバクテリアと植LHCI から LHCI を取り除くには，比較的強い界面活性物の複合体の機能と構造はよく保存されている．表 1剤を使用する必要がある．LHCI の PSI への結合は，生にシアノバクテリアと植物の系１サブユニットの組成を物種によっては弱いものもあり，精製の過程で遊離するまとめた．両者は 10種のサブユニット PsaA-F，I-L を共ことがある．

通にもつ．主な相違は，シアノバクテリアには PsaM と系１サブユニットのうち，PsaA と PsaB は相同性をPsaX があり，植物には PsaG，PsaH，PsaN，PsaO がもつサブユニットで，ヘテロ二量体の反応中心を構成す

ある．シアノバクテリアの系１複合体と高等植物の PSI-

る．電子伝達成分のうち P 700，A ，A ，F および多く

LHCI 複合体の結晶構造がそれぞれ 2.5と 3.4Åの分解のアンテナ Chl a と β‑カロテンを結合する．この反応中能で決定された（図 2) ．

心複合体は構造が安定で，SDS のような強いイオン性のシアノバクテリアの系１複合体は三量体を形成する

界面活性剤で低温処理しても解体されにくい．このことが，高等植物や藻類の系１複合体は集光性クロロフィル

から，
グリーンゲル（Green Polyacrylamide Gel Electro-

タンパク複合体（LHCI）を結合する単量体である．温和

phoresis）と呼ばれる低温で行う SDS‑ポリアクリルア

な界面活性剤でチラコイド膜を可溶化すると，シアノバ

ミドゲル電気泳動では，PSI は CPI と呼ばれるクロロ

クテリアからは三量体の複合体が，高等植物や藻類からフィルタンパクとして分離される．最終電子受容体であは PSI-LHCI 複合体が単離される．一般的には，PSI-

る F と F は PsaC に結合している．PsaC は反応中心の ス ト ロ マ 側 に 結 合 し，そ れ を 覆 う よ う に PsaD とPsaE が存在し，Fd 結合部位を形成する．PsaF は膜を貫通するヘリックスを１つもち，残りの親水領域は反応中
心のルーメン側に存在し，Pc 結合部位を形成する．このサブユニットの近傍に膜貫通へリックスをもつ PsaJ とルーメン側に存在する表在性の PsaN が存在する．結晶構造によると PsaN は反応中心より LHCI に接近した場所に存在する．
反応中心のストロマ側およびルーメン側に存在する表在性サブユニットの他に，反応中心の疎水領域の外辺部に膜貫通へリックスをもつサブユニットが存在する．
PsaH，PsaI，PsaL は LHCI の結合部位の反対側に存在する．PsaI と PsaL は反応中心に直接結合し，PsaH はその外側に結合している．PsaH は三量体を形成するシアノバクテリアの系１複合体には存在しない．結晶構造には存在しないが，高等植物にはこの近傍に PsaO とPsaP が存在すると考えられている．PsaH，PsaL とPsaO はステート遷移に関与すると考えられている．その他に，PsaK と PsaG が高等植物には存在し，４量体
LHCI の両端に位置し，その構造の安定化に関与すると考えられている．LHCI が存在しないシアノバクテリア
では PsaK のみが存在する．

4.a.3 系１複合体の精製
図 2：系１複合体の構造（上）シアノバクテリアの PSI 複合体の構造 ，（下）植物のPSI-LHCI 複合体 ．膜貫通ヘリックスをもつサブユニットはリボンで，表在性サブユニットはボールで示した．シアノバク
テリアには PsaM と PsaX が存在するが，植物には PsaG，PsaH と PsaN の他に４つの LHCI（Lhca1-4）が存在する．

266

系１複合体はチラコイド膜上に存在するため，精製のためにはシアノバクテリアや高等植物および藻類の葉緑体からチラコイド膜を単離する．チラコイド膜標品から
細胞壁，核酸およびデンプンなどの夾雑物をあらかじめ除いておくと，チラコイド膜の可溶化効率を高め，最終
系１の精製

表 1：系１複合体のサブユニット組成
サブユニット遺伝子の場所

膜貫通へリックス 機能保持する生物種

psaA

葉緑体

11

反応中心

共通サブユニット

psaB

葉緑体

11

反応中心

共通サブユニット

psaC

葉緑体

０

鉄硫黄中心

共通サブユニットpsaD

核０（ストロマ側)Fd 結合

共通サブユニットpsaE

核０（ストロマ側)Fd 結合

共通サブユニット

psaF

核

１

Pc 結合

共通サブユニット

psaG

核

２

LHCI の安定化

植物，藻類

psaH

核

１

ステート遷移

植物，藻類

psaI

葉緑体（核）

１

psaJ

葉緑体

１

psaK

核

２

LHCI の安定化

共通サブユニット

psaL

核

３

ステート遷移共通サブユニット

psaM

シアノバクテリア

１−

主にシアノバクテリア

psaN

核

０（ルーメン側)

psaO

核

２

ステート遷移

植物，藻類

psaP

核

２

リン酸化

植物

psaX

シアノバクテリア

１３量体の安定化

シアノバクテリア

Lhc1

核

３

集光

植物，藻類

Lhc2

核

３

集光

植物，藻類

Lhc3

核

３

集光

植物，藻類

Lhc4

核

３

集光

植物，藻類

共通サブユニット
共通サブユニット

植物，藻類

植物，藻類における機能

標品への夾雑物も減らす効果がある．EDTA や NaBr なで可溶化効率が低く，生物材料によっては系１複合体のどで処理すれば，チラコイド膜から表在性タンパク質や可溶化には利用できない．

ATP 合成酵素を除くことができる．ATP 合成酵素は系可溶化したチラコイド膜から系１複合体を精製する時

１標品に混入すると完全に取り除くことが難しいので，によく使われる方法は，ショ糖密度勾配超遠心法，陰イ

あらかじめチラコイド膜から除去しておくことは重要で

オン交換クロマトグラフィー，ゲルろ過クロマトグラ

ある．

フィーなどである．その他に，Isoelectric Focusing やヒチラコイド膜を界面活性剤で可溶化するときに用いる

ドロキシアパタイトクロマトグラフィーが考えられる

界面活性剤の選択は重要である（３章６．g を参照）．一般

が，あまり用いられていないので，ここでは触れない．

にイオン性界面活性剤を使うと，構成サブユニットが脱ショ糖密度勾配超遠心法は，超遠心機とスウィング

落したり，光合成色素が遊離したり，活性が低下したりローターを使用する．アングルローターでも分離は可能

することがある．逆に余分なサブユニットを取り除きたで，遠心時間は大幅に短縮されるが，分離は悪くなる．

い時には有効である．系１複合体の精製によく使われる

ショ糖密度勾配超遠心法の利点として，不溶性の夾雑物のは，非イオン性界面活性剤である．構造と活性に対しが遠心チューブの底に沈殿するので，容易に取り除くこて温和で，イオン交換クロマトグラフィーや等電点電気とができる，タンパク質がバンド状に分離されるので希泳動などの精製手法も利用できる．最もよく使われてい釈されない，操作が簡単である，などがある．欠点としる信頼性の高い界面活性剤はドデシルマルトシドであては，遠心に時間がかかる，多量のサンプルの分離に向る．系１の構造や活性に対して温和であり，チラコイド

かない，などがあげられる．

膜の可溶化効率も優れている．以前よく使われた Triton

陰 イ オ ン 交 換 ク ロ マ ト グ ラ フィーに は，DEAE と

X-100 は安価であるが，クロロフィルなどの色素の結合．溶出溶液中の塩
MonoQ がよく用いられる（３章６．
f）や吸収スペクトルを変化させることがある．ジギトニン（例えば NaCl）濃度を増加させて分離するので，塩濃度はタンパク質の構造や活性に対して温和であるが，高価を高くすると遊離するサブユニットを保持したまま複合

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体を精製したいときには注意が必要である．一般的に使合は，この操作は必要ない．以下の操作中では，サンプ

われているのは，ポリマーの支持体をもつ担体（TOSO

ルは常に氷で冷やし，溶液は十分に冷やして使用する．

の DEAE Toyopearl など）である．以前よく使われた
DEAE セルロースは分離能が高くなく，最近ではあまり［実験方法］

使われない．

１．チラコイド膜（0.8‑1.0mg Chl/ml）に冷やした 5M

カラムは自分で担体を詰めるか，すでに担体がカラム

NaBr 溶液を最終濃度が 2M になるように加える．

に詰めてあるプレパックカラムのいずれかを選択する．

２．氷上においたサンプルをゆっくりかくはんしながら筆者らの経験からは，イオン交換クロマトグラフィーに５分間放置する．

関しては，自分で担体を詰めたカラムでペリスタポンプ

３．冷やした脱イオン水で５倍以上希釈する．

を用いて分離しても，プレパックカラムで中速クロマト
グラフィー装置（FPLC や ̈Akta）を用いて分離しても，４．遠心管に移し，15000× g で５分間遠心分離後，上澄得られる結果はあまり変わらないことがある．ただし，５．沈殿したチラコイド膜を冷やした脱イオン水に懸濁

後者の方は溶出速度が高いので，時間短縮と省労力になる．

みを取り除く．
する．
６．再び 15000× g で５分間遠心分離後，上澄みを取りゲルろ過クロマトグラフィーはタンパク質の大きさの除く．

差を利用して分離する方法であり，ショ糖密度勾配超遠７．後の操作のことを考慮して，適切な溶液に懸濁する．

心法での分離とよく似ている．したがって，ショ糖密度

4.a.4.2 チラコイド膜の可溶化

勾配超遠心法で分離できなかった夾雑物は，この方法で用いる材料によって，最適可溶化条件は異なる．チラはうまく除去できない場合がある．しかし，サイズが近コイド膜の濃度，界面活性剤の種類と濃度，可溶化時間接しているサンプル同士の分離は，フラクションコレク

と温度，などを検討する必要がある．

ターにより細かく分画できるので，ゲルろ過クロマトグ

図 3に，クラミドモナスのチラコイド膜（0.8mg Chl/

ラフィーが優れている．しかし，時間がかかること，少ml）を異なる濃度のドデシルマルトシドで可溶化し，量のサンプルしか処理できない，などの欠点がある．ま

ショ糖密度勾配超遠心でクロロフィルタンパク質を分離た，自分で担体を詰めたカラムを利用する場合，１メー

したときのパターンを示す．
0.4％ドデシルマルトシドでトルほどの長いカラムが必要である．ゲルろ過カラムク

可溶化すると，密度の高い（チューブの底に近い）画分

ロマトグラフィーに関しては，プレパックカラムを用いに分離されるクロロフィルタンパク質の量が増加する．

た中速クロマトグフィー装置を利用すると，時間的にもまた，LHCII の分離位置がショ糖密度のより高い画分に分離においても優れた結果が得られる．

分離される．特に LHCII は PSII と同じ画分に分離されている．PSII-LHCII が分離されたというより，両者が同

4.a.4 緑藻クラミドモナスから系１複合体の精製
系１複合体の精製は数多く報告されている．しかし，標準的な方法はなく，用いる生物材料や目的とする標品

じ位置に分離されたのである．PSII-LHCII 複合体は，さらにショ糖密度の高い画分に分離される．可溶化時のドデシルマルトシド濃度を高くすると，LHCII のバンドがショ糖密度勾配の上部に移動し，PSI や PSII の分離も明瞭になる．

の活性や組成により精製法は最適化しなければならな

遠心チューブの底に注目すると，いずれの可溶化条件

い．ここでは，緑藻クラミドモナスのチラコイド膜からでも不溶性の沈殿物の量が少ないことが分かる．これは，

PSI-LHCI を精製する方法について述べる．他の材料

細胞膜，デンプン，核酸などの混入の少ないチラコイドから精製する場合は，この方法を改良して最適化すれば膜は，低濃度のドデシルマルトシドでもよく可溶化されよい．

るからである．チラコイド膜に不純物が多く含まれてい4.a.4.1 チラコイド膜から表在性タンパク質の除去

るときは，沈殿が多くなる．この時は，可溶化条件を強用いる生物材料によるが，ATP 合成酵素が系１標品に混入すると除去するのが難しい．そこで，可溶化前にくするより，チラコイド膜から不純物を除去する方がよい．

チラコイド膜から ATP 合成酵素を除去する．このとき，

図３に示した結果から，１) 活性やサブユニットをよ弱く結合するサブユニットが系１複合体から脱離しないく保持した標品を単離したい時は，0.8％もしくはそれ以ように注意する．ATP 合成酵素の混入が問題でない場

下の濃度で可溶化する，２) 混入物の少ない標品を得る

268

系１の精製

図 3：チラコイド膜の可溶化条件のクロロフィルタンパク質の分離パターンへの影響
同じ濃度のチラコイド膜を異なる濃度のドデシルマルトシド（0.4から 1.6％）で可溶化し，ショ糖密度勾配超遠心法で分離した．
生物材料によりクロロフィルタンパク質の可溶性が異なるので，界面活性剤の種類や濃度の最適化するとよい．

ときは，1.0‑1.6％ドデシルマルトシドで可溶化する，と判断される．

図４にショ糖密度勾配を変えたときのクロロフィルタ
ンパク質の分離パターのの様子を示した．0.1〜1.0M のシアノバクテリアのチラコイド膜を同様に可溶化する

勾配のときは，１番上のバンドの LHCII と２番目のと，主に二量体 PSII と三量体 PSI に相当する２本のバ

PSII の分離がよい．0.4〜1.0M の勾配のときは，LHCII

ンドが密度勾配の上部と下部に分離される．

を結合した PSI-LHCI-LHCII のような PSI-LHCI より

4.a.4.3 ショ糖密度勾配超遠心法による P S Iの分離

大きな複合体を分離するときに最適である ．

用意する溶液，5mM Tricine-NaOH，pH 8.0および

4.a.4.4 陰イオン交換クロマトグラフィーによる分離

0.05％ドデシルマルトシドを含むショ糖溶液（0.2，0.4，

ショ糖密度勾配超遠心法により，緑のバンドが明瞭に

0.6，0.8，1.0M ）．50mM NaCl を加えるとバンドの分分離されたなら，系１はかなり純化されているはずであ離がシャープになることがあるので，用いる生物材料にる．しかし，少量の LHCII や PSII 複合体の混入が残る．

応じて検討するとよい．

そこで，精製の第２段階として，陰イオン交換クロマト
グラフィーを行う．この２段階の精製により，ほとんど［実験方法］

夾雑物のない PSI 標品が得られる．

１．スウィングローター用の遠心チューブに 0.2〜1.0
M のショ糖の直線的濃度勾配を作成する．
２．チラコイド膜（1.0mg Chl/ml）に 10％(w/v）ドデシルマルトシド溶液を最終濃度 0.8から 1.2％になるように加える．
３．可溶化は氷上で 5‑10分間行う．
４．可溶化したチラコイド膜をショ糖密度勾配の上に加える．
５．13ml 程度のチューブ（Beckman SW41 Ti）を使用する場合，可溶化物を 0.5ml（最大 1ml）加え，288000× g で 14時間，４℃で遠心する．38ml 程度のチューブ（Beckman SW28）を使用する場合は，
2.0‑2.5ml 加え，141000× g で 24時間，４℃で遠心する．
６．上から，LHCII，PSII，PSI-LHCI の順番でクロロ
フィルタンパク質が分離される（図 3‑5）．
７．上から３番目のバンドを分画する．
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図 4：異なるショ糖密度勾配でのクロロフィルタンパク質の分離(1) 0.4〜1.0M ，(2) 0.25〜1.0M ，(3) 0.1〜1.0M のショ糖密度勾配．生物種によりクロロフィルタンパク質の分離パターンが変わるので，異なるショ糖密度勾配を作成し最適な分離条件を見出すことが大切である．

269

図 5：ショ糖密度勾配超遠心法による系１複合体の分離（上）ショ糖密度勾配をチューブの底から分画した．右から LHCII，PSII，PSI-LHCI のピークが分離した．
（下）各画分のポリペ
プチド組成を SDS-PAGE で分析すると，画分 21‑25には LHCII の 25‑30kDa ポリペプチドが，画分 15‑16には，PSII の 32kDaと 45kDa ポリペプチドが，そして画分 9‑12には PSI-LHCI のポリペプチドが検出される．

１．DEAE カラム（DEAE Toyopearl 650S，直径 2.5

られる．

cm，高さ 8cm）を作製する．
２．ショ糖密度勾配超遠心法で分離した PSI-LHCI（0.1

プレパックカラムとして MonoQ（HR 5‑5）
（0.5cmmg Chl/ml，70‑80ml）をカラムに吸着させる（吸x 5 cm， カ ラ ム 体 積 0.982 ml） や D EA E 8 cm

着された緑のバンドは高さ 2cm 程度）．カラムを 50

TOYOPEARL TSKGEL（0.5cm×7.5cm）が利用でき

mM Tris-HCl，pH 7.5，0.05％ DM 溶液で１カラる．

ム体積分洗う．溶液の流速は 0.4ml/min．

4.a.4.5 系１標品の濃縮

３．0‑150mM 直線的濃度勾配の NaCl を含む溶出 液（300ml）で溶出する（図 7）．
４．最後に 150mM NaCl を含む溶液（100ml）で溶出する．
５．溶出液の 280nm での吸光度を測定し，溶出曲線を求める．
６．溶出曲線の形が左右対称であれば，単一の成分が含まれている．そうでない場合は，PSI 標品に夾雑物が含まれる，もしくは PSI 標品が不均一であると考え
270［ポリエチレングリコール（P EG ）沈殿］
ポリエチレングリコール（PEG6000）存在下で遠心す
れば，クロロフィルタンパク質は効率よく沈殿するので，濃縮や界面活性剤や溶液の交換に利用できる．この方法
は，体積の大きいサンプルにも適応できる．また，高濃度に濃縮するのにも適している．
１．サンプル溶液の塩濃度が低い時は，50mM NaCl もしくは 1mM MgCl を加える．
２．50％ PEG6000 溶液を少しずつ混ぜながら，最終濃系１の精製

度 10‑12％になるように加える．溶液が濁ってくる．

ラミドモナスの PSI-LHCI のスペクトルのピークの波

３．160000× g で 30分遠心する．

長は，シアノバクテリアの PSI 複合体や植物や他の藻類

４．遠心後，上澄みを捨て，沈殿を適当な溶液に懸濁すの PSI 複合体のピーク波長（730nm 付近）と比べかなりる．

短波長側にシフトしている．
4.a.4.6.2 ポリペプチド組成［スピンカラムによる濃縮］

PSI 標品のサブユニット組成は，SDS‑ポリアクリルア

少量のサンプルを 10倍程度濃縮するのに適している．

ミドゲル電気泳動法で分析する（３章６．
a）．また，抗体

１．サンプル用が 0.5ml 以下の場合，フィルター付マイが手に入れば，ウェスタンブロッティング法により分析

クロ チューブ（UFC30GV00，MILLIPORE，Dur-する（３章６．
．3‑5μg Chl に相当する標品を２％ SDS
h）apore PVDF 0.22μm）にサンプルを入れる．

と５％メルカプトエタノールもしくは 0.1M ジチオス

２．微量冷却遠心機で，12000× g で 1‑4分遠心する．

レイトール（DTT）で処理し，ポリペプチドを変性させ３．濃縮されたサンプルを回収する．

てから，電気泳動にかける．系１複合体は安定なので，室温では反応中心が完全に変性せず，クロロフィルを結［小さな陰イオン交換カラムによる濃縮］
この方法は，量の多い低塩濃度の溶液中のサンプルの合した CPI として分離されることがある．このため，サンプルを 100℃，１分で熱処理する．しかし，疎水性の高濃縮に適している．

い反応中心ポリペプチド（PsaA と PsaB）はこの処理に

１．DEAE カラム（直径 1cm，高さ 3‑5cm）を準備する．

より不可逆的に会合することがある．この場合，60℃程

ただし，カラムのサイズは濃縮するサンプルの量により異なるが，小さくすれば，より高く濃縮できる．
２．サンプルを吸着させる．
３．サンプルが溶出される塩濃度より高い濃度の塩を含む溶液で一気に溶出させる．
4.a.4.6 系１複合体標品の性質
4.a.4.6.1 室温での吸収スペクトルと低温での蛍光ス
ペクトル
緑藻クラミドモナスのチラコイド膜をドデシルマルト
シドで可溶化後に分離した LHCII，PSII，PSI-LHCI の
室温の吸収スペクトルを図 6に示した．LHCII の Chl aと Chl b の赤色部の吸収極大の波長はそれぞれ 672nmと 651nm である．青色部には顕著なカロテノイドの吸収ピークが 473nm にある．PSII の Chl a の赤色部の吸収極大の波長は 674nm である．Chl b を含まないので，
650nm 付近の吸収が低くなっている．シアノバクテリアの PSII も同様の吸収スペクトルを示す．PSI-LHCI は
赤色部の吸収極大の波長は 679nm で，Chl b の吸収は650nm 付近に小さなふくらみとして存在する．シアノバ
クテリアの PSI は LHCI を結合しないので，Chl b に相当する吸収はないが，赤色部の Chl a の吸収極大の波長は同様に長波長側にシフトしている．以上の結果から，
クロロフィルタンパク質を分離したとき，それらの吸収スペクトルを測定すれば，おおよその同定は可能である．
しかし，Triton X-100 はクロロフィルフォームに影響を与えるので，吸収スペクトルの形は影響を受ける．
低温の蛍光発光スペクト ル も 図 7に 示 し た よ う に（もしくは PSI）で異なる．ク
LHCII，PSII，PSI-LHCI
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図 6：クラミドモナスのクロロフィルタンパク質の室温における吸収スペクトル
LHCII にはクロロフィル b の吸収に相当する 651nm のピー
クがあり，カロテノイドの吸収が大きい 473nm のピークが高くなっている．PSII にはクロロフィル b が含まれないので，650nm 付近の吸収が他と比べて低くなっている．PSILHCI は少量のクロロフィル b を結合するので，651nm 周辺の吸収はピークではなくわずかなふくらみとして観察される．それぞれの複合体のクロロフィル a の赤色部の吸収極大の波長の違いに注目すると，精製中の各画分の同定に役立つ．

271

度で 5‑10分熱処理して変性させる．
系１サブユニットの分子質量は，大きいものがおよそ 80kDa で小さいもの
でおよそ 4kDa と広い範囲にまたがっている．系１の全ポリペプチドを一度に分析するには，電気泳動にはアクリルアミド濃度に勾配をつけたグラディエントゲルを用いる．
PSI サブユニットの SDS-PAGE における相対的な泳動度は，種や SDS-PAGE システムにより異なる．図 9にクラミドモナスの PSI-LHCI 標品のサブユニットの分離パターンを示す．ショ糖密度勾配超遠心法で，PSILHCI はきれいに分離されているが，図 9の矢頭で示したように，PSI 以外のポリペプチドの混入が認められる．
DEAE クロマトグラフィーでの精製後には，混入していたサブユニットはほとんど除かれている．
反応中心サブユニットの PsaA と PsaB は 66kDa 付
近に幅広い１本のバンドとして検出される．クラミドモ
ナスには Lhca が９種存在し，そのうち７種の量が多い
ので CBB 染色で検出できる ．ここでは Lhca-1 の a〜g
図 7：クラミドモナスのクロロフィルタンパク質の液体窒素
温度の蛍光発光スペクトル
感度が高いので，少量のサンプルでも測定でき，便利である．
クラミドモナスの PSI-LHCI のピークはシアノバクテリア
や高等植物のものに比べ，20nm 以上短波長にシフトしているので注意が必要である．

として示してあるが，相対的泳動度が近いので，完全に分離されたバンドとしては検出されない．その他に，小型のサブユニットのバンドが数多く認められる．PsaD

図 8：ショ糖密度勾配超遠心法で分離した系１複合体の DEAE カラムクロマトグラフィーによる分離
サンプルを DEAE Toyopearl 650S に吸着させた後，溶出バッファーの塩濃度を０から 150mM NaCl に直線的に増加させた．
100mM NaCl の溶液付近に PSI-LHCI が溶出された．混入していた 60kDa 付近のポリペプチドが画分 44および画分 54−60に分離され，最終標品から取り除かれた．

272

系１の精製

近して分離されるので１本のバンドに見える．さらに 5
KDa 程度の PsaI と PsaJ が遊離した色素の少し上側に分離されるが，染色されにくいため，ここでは検出されていない．しかし，ウェスタン分析ではこれらの小型のサブユニットの存在は確認できる．
クラミドモナスでは，
PsaN と PsaO は遊離しやすく，精製の過程で失われるため，PSI 標品には検出されない．

文献
１) A.Amunts, O.Drory, & N.Nelson, Nature 447 (2007)
P.58.
２) P.Jordan,P.Fromme,H.T.Witt,O.Klukas,W.Saenger, & N.Krauss, Nature 411 (2001)P.909.
３) P.E.Jensen, R.Bassi, E.J.Boekema, J.P.Dekker, S.
Jansson, D.Leister, C.Robinson, & H.V.Scheller, Biochim Biophys Acta 1767 (2007)P.335.
４) N.Nelson & C.F.Yocum, Annu Rev Plant Biol 57(2006)P.521.
５) J.Knoetzel, A.M ant, A.Haldrup, P.E.Jensen, & H.
図 9：PSI-LHCI 標品のサブユニット組成
１；ショ糖密度勾配超遠心法で精製した標品，２；１を更にDEAE クロマトグラフィーで精製した標品．これらの標品には小型のサブユニット PsaI と PsaJ が存在するが，染色度が低いため検出できない．しかし，ウェスタン分析によると，これらのサブユニットは遊離することなく存在する．

と PsaF は接近した２本のバンドとして分離し，さらに相対泳動度が大きい順番に PsaL，PsaH，PsaE，PsaG，V.Scheller, FEBS Lett 510 (2002)P.145.
６) A.Khrouchtchova, M .Hansson, V.Paakkarinen, J.P.
Vainonen, S.Zhang, P.E.Jensen, H.V.Scheller, A.V.
Vener,E.M.Aro,& A.Haldrup,FEBS Lett 579 (2005)P.
4808.
７) I.Sugimoto & Y.Takahashi,J Biol Chem 278(2003)P.
45004.
８) Y.Takahashi, T.A.Yasui, E.J.Stauber, & M.Hippler, Biochemistry 43 (2004)P.7816.
９) H.Takahashi, M .Iwai, Y.Takahashi, & J.M inagawa, Proc Natl Acad Sci U S A 103 (2006)P.477.

PsaC，PsaK が検出される．ここでは PsaG と PsaC は接2009 低 温 科 学

vol.67273

３章 単離・精製・活性測定

４．タンパク質複合体の単離
b．系Ⅱ複合体の精製法
沈建仁 ，榎並勲

チラコイド膜から各種界面活性剤を用いて，タンパク組成や酸素発生活性の異なる光化学系

複合体（以下系 とする）を単離精製することができる．以下，これまでに精製されたいろいろな植物種からの系 の単離方法を紹介する．

Isolation of photosystem II
Jian-Ren Shen, Isao Enami
Photosystem II complexes with a variety of protein composition and oxygen-evolving activities can be isolated
from various organisms by detergent solubilization of thylakoid membranes. In this chapter, procedures for
isolation of various PSII from different organisms were described.

4.b.1 系Ⅱ標品の種類と生物種間での違い
系 の反応中心複合体はシアノバクテリアから高等植

さらに Psb31 (23.5kDa）を加えた５種の表在性タンパ
ク質の存在が知られている ．また，高等植物と緑藻やユーグレナの表在性タンパク質の種類は同じでも，結合物まで保存されているが，酸素発生反応に関与する表在様式は異なることが報告されている．このような違い性タンパク質や集光性アンテナ複合体の組成は生物種にから，異なる生物については異なる系 の精製方法が必より異なる．これまでに，高等植物 ，緑藻 ，ユーグレ

要になる．以下，これまでに精製された各種系 の精製

ナ ，珪藻 ，紅藻 ，シアノバクテリア から系 標品が法について述べる．

精製されている（図 1）．生物種の違いによって，系 の精製方法も異なる．それは，異なる生物種において，系の存在環境や集光性アンテナタンパク質が異なるからである．たとえば，高等植物ではチラコイド膜がスタッ

4.b.2 高等植物の系Ⅱの精製
4.b.2.1 系Ⅱ膜断片

キングしてグラナチラコイドを形成し，系 は主にこの高等植物では，系 がグラナチラコイドに集中して存グラナに，系 はストロマチラコイドに存在するのに対在し，系 がストロマチラコイドに存在するので，このして，シアノバクテリアではチラコイド膜がスタッキン

性質を利用し，チラコイド膜を Triton X-100 で可溶化グしておらず，系 と系 の存在場所ははっきり分離しし，遠心によって系 を除去することで系ていない．また，高等植物では膜貫通型の集光性アンテ取する．最もよく使われる方法は Berthold ら が発表しナタンパク質（LHCII）が系 の周りを囲んでいるが，たもので，BBY 粒子あるいは BBY 標品と呼ばれる．精シアノバクテリアでは LHCII の代わりに，水溶性で膜製の手順は本章の 2a に述べられているので省略するの表面に結合しているフィコビリゾームが系

膜断片を分

のアンテ

が，得られた BBY 標品には LHCII が結合しており，反ナとして働いている．さらに酸素発生反応に関与してい応中心あたり約 250chl が結合し，chl a/b 比は 2.0程度

る表在性タンパク質として，図１に示すように，高等植である．chl a/b 比がこれより大きい場合は系

物では PsbO (33kDa），PsbP (23kDa），PsbQ (17kDa）が考えられるので，Triton X-100 可溶化の条件を再検討が働いているが，シアノバクテリアでは主に PsbO，する必要がある．系が機能していPsbU (12kDa），PsbV (チトクロム c-550）

O /mg chl/hr 以上の酸素発生活性を持つ BBY 標品がる．紅藻では，シアノバクテリア型の３種の表在性タ望ましい．これよりも活性が低い場合は，Triton X-100

ンパク質に加えて PsbQʼ
(20kDa）
が結合し ，珪藻では，の濃度を低くする，処理の時間を短くする，あるいは新の混入の各種機能研究には，500μmole

鮮な材料（ホウレンソウなど）を使うなどの工夫が必要
１) 岡山大学大学院自然科学研究科

である．

２) 東京理科大学理学部

2009 低 温 科 学

vol.67275

図 1：各種生物から単離された系 標品（レーン１）とその表在性タンパク質（レーン２）．表在性タンパク質は系 標品を 1.0M
；C．ユー
Tris（pH 8.0）で処理し遊離させたもの．A．ホウレンソウ；B．緑藻クラミドモナス（Chlamydomonas reinhardtii）
グレナ（Euglena gracilis）；D．珪藻（Chaetoceros gracilis）；E．紅藻（Cyanidium caldarium）；F．シアノバクテリア（Thermosyne．（文献 19より改変）．
chococcus vulcanus）

4.b.2.2 系Ⅱコア標品

するので廃棄し，上清を回収する．

BBY 標 品 を ヘ プ チ ル チ オ グ ル コ シ ド（HTG, n-

５．回収した上清に，最終濃度 15％(w/v）になるよう

heptyl-β-thioglucoside）によって可溶化し，LHCII の一50％(w/v）の PEG 1,450ストック溶液を添加し，十部を除去して，３つの表在性タンパク質（PsbO，PsbP，分攪拌した後，４℃，35,000xg ，20min 遠心する．

PsbQ）を保持した系 標品を精製することができる ．

６．沈殿は HTG‑系 標品になるので，0.4M sucrose，

酸素発生能を保持し，表在性の PsbO のみを保持した系

30mM M es(pH 6.5）
，3mM CaCl ，10mM NaCl

コア標品は，オクチルグルコシド（OG, n-octyl-β-D（OTG,n-octyl-βglucoside) ，オクチルチオグルコシドに濃く懸濁し，分析に用いるか液体窒素に保存する．
こ の よ う に 得 ら れ た HTG‑系

標 品 に は major

D-thioglucoside) ，あるいはドデシルマルトシド（DDM,

LHCII はなくなるが，CP29 などのマイナーLCHII は

n-dodecyl-β-D-maltoside) を用いて BBY 標品を可溶

残って お り，chl a/b 比 が 7‑10，ア ン テ ナ サ イ ズ は化し，ショ糖密度勾配遠心法により精製する．以下HTG‑

70‑100chl 程 度 で，酸 素 発 生 活 性 は 800‑1,000μmole

系 標品と，DDM を用いた系

O /mg chl/hr になる．chl a/b 比が低かったり活性が低コア標品の精製について紹介する．

い場合は処理時の HTG 濃度を再検討する．

ホウレンソウの HTG ‑系Ⅱ標品の精製

ホウレンソウの系Ⅱコア標品の精製［実験方法］［実験方法］

１．ホウレンソウの BBY 標品を４℃，35,000x g ，20

１．BBY 標 品 を 遠 心 し，Buffer A (30mM

M es

min 遠心し，Buffer A (1M sucrose，30mM M es

(pH 6.5），10mM NaCl，3mM CaCl ）に懸濁し，(pH 6.5），10mM NaCl，40mM MgCl ）に濃く懸

1mg chl/ml で，0.8％ DDM ，０℃，暗所，ゆっく

濁する．

り攪拌しながら 30分間処理する．

２．Buffer A に 溶 か し て お い た 10％(w/v）HTG ス

２．処理した BBY 標品を，0.03％ DDM を含む Buffer

トック溶液を，最終濃度が 2.1‑2.3％ HTG，2mg

A で作成した 0.3M ‑0.7M sucrose の密度勾配に

chl/ml になるよう添加し，０℃，暗所，ゆっくり攪

のせ，４℃，160,000xg ，16hr 遠心する．

拌しながら 10分間処理する（処理中の HTG 濃度は３．遠心の結果，図 2のように LHCII monomer，LHCII

major LHCII が除去されるが，表在性の PsbP，

trimer，PSII monomer，PSII dimer の各バンドがPsbQ は除去されず，酸素発生活性を十分保つよう分離するので，PSII monomer，PSII dimer の画分

予め少量のサンプルを用いてテストして決める）．

を回収する．

３．２倍量の Buffer B (0.5M sucrose，30mM M es

４．回収された画分をそれぞれ２倍量の Buffer A で希(pH 6.5），10mM NaCl）を添加し，０℃，暗所，釈してから，PEG 1,450を終濃度 13％になるよう添

５分間インキュベートする．

加 し，４℃，100,000xg ，20min 遠 心 し，沈 殿 を４．４℃，35,000xg ，10min 遠心する．LHCII は沈殿
276

Buffer A に懸濁し，分析に用いるか液体窒素に保存
系Ⅱの単離法これにより，約 95mM NaCl での大きなピークと，
約 130mM NaCl での小さいピークが溶出される．
最初の大きなピークが D1，D2，チトクロム b-559α,βサブユニット，PsbI を含む反応中心であり，次の小さいピークは PsbO を含まないが，CP47，CP43 を含むコア複合体である．なお，カラム操作は可能な限り４℃，暗所で行う．
このように得られた反応中心標品は，4‑6分子の chl aと２分子のフェオフィチン a を持ち，光励起による初期電荷分離の活性を持つが，酸素発生活性はなく，Q ，Qも結合していない．

4.b.3 緑藻の系Ⅱの精製
緑藻のチラコイド膜は，集光性アンテナタンパク質として LHCII をもつが，高等植物のようなグラナ・スタッ
図 2：ホウレンソウ BBY 標品を DDM で可溶化し，0.3‑0.7
M ショ糖密度勾配にかけたときのパターン．

キングはなく，２〜多数のチラコイド膜が密着して帯を形成した構造をとる．ここでは，緑藻クラミドモナス（Chlamydomonas reinhardtii）から酸素発生活性のあるする．

系 を精製する方法について紹介する．しかし，クラミ

このように得られた系

コアには LHCII と表在性のドモナスのチラコイド膜を高等植物で用いられた

PsbP，PsbQ は結合していないが，PsbO は残っており，

Triton X-100 やもっと温和な界面活性剤により可溶化

3‑10mM CaCl の存在下で酸素発生活性が 700‑1,200

した後，カラムクロマトグラフィーまたはショ糖密度勾

μmole O /mg chl/hr になり，chl a/b 比が 10以上，ア配遠心により精製しても活性のある系 は調製できない

ンテナサイズは 35‑50である．

ことが多い．長時間を要する精製過程で表在性タンパク

4.b.2.3 系Ⅱ反応中心複合体質が遊離するなどの影響により失活すると考えられる．

酸素発生能を持たないが，光による初期電荷分離活性

そこで，系 のサブユニットの１つに His-tag をつけ，を持つ系 反応中心複合体は，D1，D2 サブユニット，チNi‑カラムによるアフィニテイークロマトグラフィーにトクロム b-559α,βサブユニット，PsbI によって構成さよる迅速な精製法について紹介する．

れ，BBY 膜断片を Triton X-100 によって可溶化し，DEAE 650S を用いたイオン交換クロマトグラフィーで［実験方法］

精製する．

チラコイド膜１．遺伝子工学的手法により系のサブユニットの１つ［実験方法］である CP47 のＣ末端に６つの His をつけたクラ１．BBY 膜 断 片 を 50mM Tris-HCl(pH 7.2）バッ

ミドモナスを培養し，遠心により細胞を回収した後，ファー中，1mg chl/ml，４％(w/v）Triton X-100，，0.4M sucrose，
Buffer A（40mM Mes (pH 6.5）

０℃，１時間処理する．

5mM MgCl ，10mM NaCl）に濃く懸濁し，−80℃

２．処 理 液 を ４℃，100,000xg ，1hr 遠 心 し，上 清 をBuffer A（50mMで凍結保存する．

Tris-HCl（pH 7.2），0.05％

２．凍結した細胞を解凍し，冷やしておいたビーズビー

Triton X-100，30mM NaCl）で平衡化しておいた

ダー（Bead-Beater,Bio-spec Co.）の容器に入れ，DEAE 650S カラムにロードする．

直径 100μm のガラスビーズと 1：1の割合で混ぜ

３．Buffer A で溶出液が無色になるまで洗浄する．これにより，すべての LHCII や表在性タンパク質，ほとんどの CP47，CP43 が溶出される．
４．30‑200mM NaCl の濃度勾配でカラムを溶出する．
2009 低 温 科 学

vol.67る．
３．氷で冷やしながら，15sec ON，2min OFF のサイ
クルを４回繰り返し，細胞を破壊する．
４．破壊液を４℃，1,000xg，5min 遠心してガラスビー277

ズと未破壊の細胞を除き，その遠心上清を４℃，

いて紹介する．ユーグレナからは，クラミドモナスのよ

35,000xg ，10min 遠心し，沈殿したチラコイド膜をうに遺伝子工学的な手法を用いないで，野生株から系回収し，Buffer B (20mM M es (pH 6.5）
，100mMを精製することができる．

に懸濁する．同 buffer で２NaCl，12.5％ glycerol）
回遠心洗浄した後，同 buffer に懸濁し，−80℃で凍［実験方法］

結保存する．

チラコイド膜１．遠心により回収した細胞を，Buffer A（50mM Mes

系Ⅱ標品

（pH 6.0），25％ glycerol，5mM CaCl ）に濃く懸

１．チラコイド膜を 1.5mg chl/ml，1.2％

シューク

濁する．

ロースモノラウレイト（SM L, sucrose monolaur-

２．濃く懸濁した細胞を，冷やしておいたビーズビーate）で可溶化し，暗所，氷中，穏やかに攪拌しながダー（Bead-Beater,Bio-spec Co.）の容器に入れ，ら 10分間処理する．

直径 100μm のガラスビーズと 1：1の割合で混ぜ

２．処理液を４℃，35,000xg ，10min 遠心し，上清を0.03％ SM L，15mM イミダゾールを含む Buffer B
で平衡化しておいた Ni カラム（ProBond

Resincolumn）にロードする．

３．氷で冷やしながら，15sec ON，2min OFF のサイ
クルを５回繰り返し，細胞を破壊する．
４．破壊液を４℃，1,000xg，3min 遠心してガラスビー

３．カラムを同じ濃度の SM L とイミダゾールを含む
Buffer で十分洗浄した後，250mM
0.03％

る．

SM L を含む Buffer B で系

ズと未破壊の細胞を除いた遠心上清を４℃，10,000

イミダゾール，

xg ，10min 遠心し，沈殿したチラコイド膜を回収を溶出する．

し，Buffer B（50mM Mes (pH 6.5）
，25％ glycerol）

なお，カラム操作は可能な限り４℃，暗所で行う．

に懸濁する．

４．溶出した系 に，10％になるよう PEG 6,000を添加
し，４℃，410,000xg ，30min 遠心して沈殿させる．

LHC IIを結合した系Ⅱ標品

５．得られた系 を Buffer C (20mM M es (pH 6.5），

１．チラコイド膜を 1mg chl/ml，2％ DDM ，0.5％ デ

0.4M sucrose，20mM NaCl）に懸濁し，液体窒素

オキシコール酸（DOC）で可溶化し，暗所，４℃，に保存する．

穏やかに攪拌しながら 10分間処理する．（系 と系

このように精製した系 は，PsbO，PsbP，PsbQ の全の分離には，0.5％ DOC の存在が必要である．
）

表 在 性 タ ン パ ク 質 を 結 合 し，CaCl 存 在 下 で fer-

２．処理液を４℃，8,000xg ，10min 遠心した後，そのricyanide を 電 子 受 容 体 に 用 い た と き 2,300‑2,500

上清を４℃，37,000xg，10min 遠心する．この遠心μmole O /mg chl/hr の酸素発生活性を示す．一方，電により，上清に系 が除かれ，沈殿に LHCII を結合子受容体として DCBQ（2,6-dichloro-p-benzoquinone）

した系 が得られる．この沈殿を Buffer B (20mMを用いた場合には，CaCl 存在の有無には関係なく，，10mM NaCl）に懸濁する．
Mes(pH 6）

710‑820μmole O /mg chl/hr の酸素発生活性を示す．なお，この系

３．この懸濁液を，70％ sucrose を含む Buffer B の上は Q から Q への電子伝達が阻害された標にのせ，４℃，270,000xg，30min 遠心する．その品である．表在性タンパク質の結合様式は高等植物のも

上清に２倍量の Buffer B を加え，４℃，
100,000xg，のとは異なり，PsbO のみならず PsbP と PsbQ も直接

10min 遠心し，その沈殿として LHCII を結合した系 膜タンパク質と結合する．

系 を得る．

4.b.4 ユーグレナの系Ⅱの精製

LHC IIを除いた系Ⅱ標品
１．LHCII を 結 合 し た 系

を 2.6％ HTG を 含 む

ユーグレナは，原始緑藻の２次共生により誕生したとBuffer C (40mM Mes (pH 6.5），1M sucrose，400

考えられており，３層の葉緑体包膜をもつ．チラコイド

mM NaCl，5mM CaCl ）に終濃度で 5mg chl/ml

膜は，LHCII をもつがグラナ・スタッキングはなく，葉になるように懸濁し，暗所，０℃，10分間，可溶化

緑体の長軸に沿って２〜３層が重なり合って存在する．

処理した後，４℃，35,000x g，15min 遠心する．

ここでは，これまで生理学，生化学的研究によく用いら

２．その遠心上清に，２倍量の Buffer D（40mM Mes

れてきた Euglena gracilis から系278を精製する方法につ（pH 6.5），0.5M sucrose，400mM NaCl，5mM系Ⅱの単離法を加え，暗所，０℃，５分間インキュベート
CaCl ）の中心目珪藻 Chaetoceros gracilis から系

した後，４℃，35,000xg，15min 遠心し，沈殿とし方法について紹介する．

を精製するて会合した LHCII を除き，上清を回収する．
３．回収した上清を 10倍量の Buffer E (40mM M es

［実験方法］(pH 6.5），0.4M sucrose）に対して透析する（１時

チラコイド膜間後に透析外液を交換し，さらに２時間透析）．

１．培 養 し た 珪 藻 Chaetoceros gracilis 細 胞 を PEL-

４．透析後，４℃，35,000xg，15min 遠心し，回収した

LICON（MILLIPORE）を用いて回収した後，４℃，

上清に 10％ PEG 6000を加え，35,000xg，15min 遠3,000xg，3min 遠心し，沈殿を少量の DNase I と心した沈殿を Buffer F (20mM Mes (pH 6.5），0.4

1mM PM SF を加えた Buffer A（1M betaine，50に懸濁し，液体窒素に保M sucrose，20mM NaCl），5mM M gCl ）に約 1.8mg chl/mM Me（s pH 6.5）

存する．

ml になるように懸濁する．

こうして得られた LHCII を除いた系標品には，まだ若干の LHCII が結合しており，ホウレンソウHTG‑系
標品に類似した標品である．PsbO，PsbP，PsbQ の全
表在性タンパク質が結合し，phenyl-p-benzoquinone を
電子受容体に用いたとき，約 700μmole O /mg chl/hrの酸素発生活性を示す．活性に Ca や Cl イオンの要求性はみられず，酸化側，還元側ともに正常であると考えられる．ユーグレナ系 の特徴は，PsbO のみを再結合した

２．その細胞懸濁液を含むサンプル管を液体窒素に入れ，凍結する．
３．10分後に液体窒素から取り出し，室温で 10分以内に融解させる．
４．凍結融解したサンプルを，０℃，暗所で 30分間イン
キュベートし，DNA を分解する．
５．４℃，3,000xg，3min 遠心した上清を，40,000xg，
10min 遠心する．

系 で Ca イオンによる酸素発生活性の促進がみられな

６．その遠心沈殿を Buffer B（1M betaine，50mM Mes

い点である．なお，表在性タンパク質の結合様式は，高(pH 6.5），1mM EDTA）に懸濁し，チラコイド膜

等植物型ではなく緑藻型である．

とする．
こうして調製したチラコイド膜は，200‑300μmole

4.b.5 珪藻の系Ⅱの精製
珪藻は，紅藻が二次共生して誕生した不等毛植物門にO /mg chl/hr の酸素発生活性を示す．なお，珪藻には強力な金属プロテアーゼが存在するので，DNase 処理後のbuffer には 1mM EDTA を入れておいた方がよい．

属する単細胞藻で，葉緑体包膜は４層からなる．細胞は珪酸質の被殻に包まれているのが特徴で，その殻の形態

系Ⅱ標品

から中心目珪藻（殻にある胞紋（条線）が中央部から外

１．チラコイド膜を 1mg chl/ml，１％ Triton X-100 でに向かって放射配列するもの）と羽状目珪藻（殻の条線

可溶化し，暗所，０℃，穏やかに攪拌しながら５分

が中央部の軸に対して左右対称に配列するもの）に分類

間処理する．

されている．３重のチラコイドラメラからなり，集光性

２．可溶化処理したチラコイド膜を４℃，40,000xg，10

アンテナタンパク質として膜貫通型のフコキサンチン・min 遠心し，上清をさらに 50,000xg，20min 遠心すクロロフィル a/c 結合タンパク質（FCP）が存在する．

る．

光合成色素として，
クロロフィルの他にフコキサンチン，
デイアデイノキサンチン，デイアトキサンチンが大量に３．その遠心上清をさらに４℃，146,000xg，20min 遠心する．

含まれるため，細胞が黄色〜褐色に見える．珪藻は，熱４．そ の 遠 心 上 清 に 10％ PEG 6000を 加 え，４℃，

帯雨林の光合成量に匹敵する炭素同化を行い，水域圏に40,000xg，10min 遠心し，沈殿（系 ）を Buffer B

おける生態系，炭素循環において最も重要な藻類であるにもかかわらず，これまで光合成の生化学的研究は皆無に懸濁し，液体窒素に保存する．
こうして精製された系

は，大量の FCP が結合しての状態であった．その大きな要因は，細胞が珪酸質の固いる粗系 で，ホウレンソウの BBY 標品に相当する標い殻に覆われているため細胞破壊が難しいと考えられて品であり，500‑900μmole O /mg chl/hr の酸素発生活性きたことにある．しかし，最近，中心目珪藻については，を示す．なお，珪藻系 には，紅藻タイプの PsbO，PsbQʼ
，

凍結融解により活性を保持した状態で，容易に細胞破壊

PsbV，PsbU の４種の表在性タンパク質に加え，新規のできることが見出された

Psb31 の表在性タンパク質が結合している ．

2009 低 温 科 学

vol.67．そこで，ここでは，海産性279

６．４℃，40,000x g，20min 遠心して系

4.b.6 紅藻の系Ⅱの精製を回収し，Buffer A に懸濁する．

紅藻は，光合成色素としてクロロフィルの他にフィコ
エリスリン，
フィコシアニン，アロフィコシアニンのフィ系Ⅱ単量体と二量体

コビリン色素をもち，集光性アンテナタンパク質として１．系 （1.5mg chl/ml）に 0.5％ DDM と 0.7％ SML

フィコビリゾームが存在する．約 4,000種が知られていを加え，０℃，暗所，20分間，可溶化処理を行う．

るが，ほとんどは海産で淡水産は少数である．葉緑体は

２．こ の 可 溶 化 し た 系

を，Buffer B で 平 衡 化 し た

２枚の包膜に包まれ，一重チラコイド膜からなる．ここDEAE TOYOPEARL 650S にかけ，0.05‑0.15M

で は，酸 性 温 泉 産 の 単 細 胞 紅 藻 シ ア ニ ジ ウ ム

NaCl 勾配を用いて，系（Cyanidium caldarium）から系 を精製する方法について紹介する．シアニジウムは pH 1‑3の強酸域に生育す

core monomer と dimerを溶離する．
３．系

core monomer と dimer は２倍量の Buffer

るにもかかわらず，その細胞内 pH は強力なプロトンポ

A で希釈後，PEG を加えて遠心し，沈殿を Buffer A

ンプの働きにより中性 pH に保持されている ．

に懸濁する．なお，カラム操作は可能な限り４℃，
暗所で行う．

［実験方法］

こうして精製した PSII は，PsbO，PsbQʼ
，PsbV，PsbU

チラコイド膜の ４ 種 の 表 在 性 タ ン パ ク 質 を 結 合 し，3,000‑4,000

１．シアニジウム細胞を 1mM

benzamidine，1mM

μmole O /mg chl/hr の高い酸素発生活性を示す．このPMSF，少 量 の DNase I と 5mM M gCl を 含 む

PSII core dimer を用いて，結晶化にも成功している ．

，
Buffer A (25％ glycerol，40mM M es (pH 6.1）
10mM CaCl ）に濃く懸濁する．
２．懸濁した細胞を，冷やしておいたビーズビーダー

4.b.7 シアノバクテリアの系Ⅱの精製（Bead-Beater, Bio-spec Co.）の容器に入れ，直径

シアノバクテリアではチラコイド膜がスタッキングし100μm のガラスビーズと 1：1の割合で混ぜる．

ておらず，高等植物のように系 と系 を簡単に分離し，３．氷で冷やしながら，10sec ON，4min OFF のサイ系 の膜断片標品を単離することはできない．
そのため，クルを 18回繰り返し，細胞を破壊する．
４．破壊液を４℃，1,000xg，3min 遠心してガラスビー

主に酸素発生能を持った系 コア標品として精製・使用される．中でも好熱性シアノバクテリア Thermosyne-

ズと未破壊の細胞を除いた遠心上清を４℃，
104,200

chococcus elongatus, T.vulcanus 由来の系

コアは安

xg ，30min 遠心 し，沈 殿 の 上 層 の ゆ る い 部 分 を定で扱いやすく，精製しやすい．一方，常温性の Syne-

Buffer A に懸濁し，チラコイド膜とする．

chocystis sp. PCC 6803 は変異体の作製が簡単にでき，
光合成能を失っても従属栄養成長ができるので，光合成系Ⅱ標品の機能研究に多く使われている．以下 T.vulcanus と

１．チ ラ コ イ ド 膜（1.2mg chl/ml）に 終 濃 度 1.2％

Synechocystis sp. PCC 6803 由来系 コアの単離・精製

DDM を加え，０℃，暗所，40分間，穏やかにスター

方法について述べる．

ラーで攪拌しながら可溶化処理する．

4.b.7.1 T.vulcanus の系Ⅱコア標品の調製

２．可溶化したチラコイド膜を４℃，104,200xg ，30

T.vulcanus 細胞は 52‑55℃で培養し，30‑50L 培養液（25％ glycerol，40mM
min 遠心し，上清を Buffer B

を遠心で集めた後，チラコイド膜，粗系 ，系 コアの，3mM CaCl ，0.03％ DDM ）で平衡
M es (pH 6.1）

順に精製する．

化した DEAE TOYOPEARL 650M の陰イオン交換カラムにかける．
３．カラムを 0.09M NaCl を含む Buffer B で，280nmの吸収がほとんど無くなるまで充分洗浄する．

［実験方法］
チラコイド膜１．細胞を１ L の Buffer A（0.4M mannitol，40mM

４．0.23M NaCl を含む Buffer B で系 を溶離する．

に懸濁し，EDTA（final 1mM ），KH PO（pH 6.8））

なお，カラム操作は可能な限り４℃，暗所で行う．

lysozyme（1.2mg/ml）を添加し，35℃で振とうし

５．系に ２ 倍 量 の Buffer A を 加 え て か ら，15％

PEG 1,450を加える．
280

ながら２時間処理する．
２．10,000xg ，5min 遠心し，沈殿を 1L の Buffer A に系Ⅱの単離法懸濁し，再度遠心する．

系Ⅱコア標品

３．沈殿を少量の Buffer A に懸濁し，35℃に温めておい た 1L の 20mM

Hepes-NaOH(pH 7.0）バッ

粗系 標品（LDAO-PSII）を DDM で可溶化し，陰イ
オン交換カラムを用いて系 単量体，二量体を分離し精ファーを一気に入れ，浸透圧ショックを与えること製する．

によって細胞を破砕する．

１．LDAO‑系

４．1M

を Buffer A（25％ glycerol，30mM

M gCl を終濃度 5mM になるよう添加し，，10mM MgCl ）中で，1
Hepes-NaOH（pH 7.0）

DNase I（1mg/ml）を 200μl 添加する．以降氷上

mg chl/ml，１％ DDM を添加し，暗所，氷中，穏に移して作業を行う．

やかに攪拌しながら 30min 処理する．

５．４℃，15,000xg ，10min 遠 心 し，沈 殿 を 1L の２．30mM Mes（pH 6.0），3mM CaCl ，0.03％ DDM

Buffer B (30mM Hepes-NaOH (pH 7.0），10mMで平衡化しておいた Q Sepharose High Perfor-

M gCl ）に懸濁する．

mance カラムにロードし，吸着させる．

６．４℃，1,000xg ，20sec 遠心し，上清を回収し，４℃，
15,000xg ，10min 遠心する．

３．吸光度が十分下がるまでカラムを 170mM NaCl で洗浄する．これによって，ほとんどのフィコビリタ

７．沈殿を 25％ glycerol を含む Buffer B に懸濁し，チ
ラコイド膜として−80℃に保存する．

ンパク質と残存の系 三量体が溶出される．
４．170‑300mM NaCl の濃度勾配でカラムを溶出 する．この時の溶出パターンを図３に示し，NaCl 濃度

粗系Ⅱ標品（LDAO-PSII）の低い方から系 単量体，系 二量体，系 単量体１．220mg chl のチラコイド膜を 1L の 30mM Hepes-の順に溶出される．系 単量体の量は通常系 二量NaOH（pH 7.0），10mM MgCl に希釈し，遠心し体の1/4〜1/3程度で，これよりも単量体が著しく多た後，沈殿を総量 110g になるよう５％ glycerol，30

い時は，LDAO-PSII の調製において系（pH 7.0），10mM MgCl のバッ
mM Hepes-NaOH

一部が単量体化した，あるいは細胞培養の段階で単ファーに懸濁する．

量体が増えていたなどが考えられるので，LDAO の

２．上 記 懸 濁 液 の 重 さ を 計 り な が ら 0.86g
lauryldimethylamine-N-oxide (LDAO,Fluka，〜30％）を添加し，暗所，氷上，穏やかに攪拌しな
がら５分間処理する．

二量体の処理条件や細胞の培養条件を検討する必要がある．
なお，カラム操作は可能な限り４℃，暗所で行う．
５．系 単量体，系

二量体の画分を，２倍量の Buffer

B（30mM Mes（pH 6.0），3mM CaCl ，10mM

３．４℃，35,000xg ，1hr 遠心し，沈殿を総量 140g になるよう Buffer A（25％ glycerol，30mM HepesNaOH (pH 7.0），10mM MgCl ）に懸濁する．
４．1.45g LDAO を添加し，暗所，氷上，穏やかに攪拌しながら５分間処理する．
５．４℃，100,000xg ，1hr 遠 心 し，上 清 を 回 収 し，Buffer A で２倍希釈してから再度 100,000xg ，1hr
遠心する．
６．上清を回収し，PEG 1,450を終濃度 15％になるよう添加し，４℃，100,000xg ，30min 遠心する．
７．沈殿が粗系 標品（LDAO-PSII）であり，Buffer Aに懸濁した後，−80℃に保存する．
以上の方法で調製した LDAO‑系

標品は，チラコイドの chl 量を基とした収率が 10‑20％，酸素発生活性が1,000‑2,000μmole O /mg chl/hr になる．収率が 10％よりも著しく低い場合は，系 が十分可溶化されなかったので，２回目の LDAO 処理時の LDAO 濃度を 5‑15％程度上げてみる．逆に収率が著しく高い場合は２回目処
理時の LDAO 濃度を下げる．
2009 低 温 科 学

vol.67

図 3：T. vulcanus 由来粗系 （LDAO-PSII）を DDM によって可溶化し，Q Sepharose High Performance カラムにかけた時の溶出パターン．

281

で希釈し，13％ PEG 1,450を加えた後，４℃，
NaCl）

系Ⅱコア標品

100,000xg ，30min 遠心する．沈殿した系 単量体，１．チラコイド膜を 1mg chl/ml，0.8％ DDM で可溶化

二量体をそれぞれ Buffer B に懸濁し，液体窒素にし，暗所，氷中，穏やかに攪拌しながら 20分間処理保存する．保存時に 25％ glycerol を加えると活性する．

の低下を抑制することができる．

２．処理液を４℃，35,000xg ，10min 遠心し，上清を以上の手順で精製される系 二量体は３つの表在性タ0.03％ DDM を 含 む Buffer A（40mM

M es

ンパク質 PsbO，PsbU，PsbV を結合しており，酸素発生（pH 6.0），25％ glycerol，10mM

活性は 2,500‑3,500μmole O /mg chl/hr になり，chl を

CaCl ）で平衡化しておいた Ni カラムにロードす

MgCl ，5mM基とした収率はチラコイド膜の 3‑5％である．収率が著る．

しく低い，あるいは活性が低い場合は精製手順の改良が３．カラムを同 Buffer で十分洗浄した後（必要であれ必要である．こうして精製された系 二量体は結晶化にば 5‑10mM イミダゾールを含む buffer A で洗浄成功し構造解析されている ．

する），50mM イミダゾール，0.03％ DDM を含む

4.b.7.2 S ynecho cys tis s p. P C C 6803のBuffer A で系 を溶出する．

系Ⅱコア標品の調製

４．溶出した PSII を Buffer A で１倍希釈し，15％にな

常 温 性 シ ア ノ バ ク テ リ ア で あ る Synechocystis sp.
PCC 6803 の系 は表在性タンパク質の結合が弱く，特るよう PEG 1,450を添加し，４℃，100,000xg ，30
min 遠心して沈殿させる．

に PsbU，PsbV が解離しやすい．従来のように界面活性５．得られた系剤による可溶化，カラムクロマトグラフィーまたはショ存する．

糖密度勾配遠心による系 コア標品の精製も報告されてを Buffer A に懸濁し，液体窒素に保このように精製した系

コアは酸素発生活性がいるが，３つの表在性タンパク質を持った，高い酸素発

2,000‑3,000μmole O /mg chl/hr になり，３つの表在性生能を持つコアの精製は難しく，再現性が低い．そのた

タンパク質以外に PsbQ-like タンパク質が結合している

め，遺伝子工学により系 サブユニットのうちの１つに場合がある．このコアには単量体と二量体が混在していHis-tag をつけ，Ni‑カラムによるアフィニティークロマ

るので，必要であればショ糖密度勾配遠心などを用いてトグラフィーを利用した精製がよく用いられる．以下分離する．

CP47 のＣ末端に６つの His をつけた系

コアのアフィ

ニティ精製について紹介する ．

参考文献［実験方法］
チラコイド膜１．常温性シアノバクテリアの細胞は好熱性のものと同じように高温でリゾチーム処理して，破壊することができないので，ガラスビーズで機械的に破壊する．
細胞を集め，Buffer A（40mM Mes (pH 6.0），25％
glycerol，10mM M gCl ，5mM CaCl ）に懸濁し，−80℃で凍結する（凍結 ⎜ 解凍により細胞が壊れやすくなる）．
２．凍結した細胞を解凍し，冷やしておいたビーズビー
ダー（Bead-Beater,Bio-spec Co.）の容器に入れ，直径 100‑170μm のガラスビーズと 1：2の割合で混ぜる．
３．氷で冷やしながら，10sec ON，2min OFF のサイ
クルを 24回繰り返し，細胞を破壊する．
４．破壊液を４℃，100,000xg ，30min 遠心し，沈殿したチラコイド膜を回収し，Buffer A に懸濁する．

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283

３章 単離・精製・活性測定

４．タンパク質複合体の単離
c．集光装置（LHC ）得津隆太郎 ，Wes ley S wing ley ，皆川
緑色植物における光化学系

純の集光装置は LHCI，光化学系の集光装置は LHCII と呼ばれる膜内在性のクロロフィル／カロテノイド結合タンパク質群である．これらはチラコイド膜上ではそれぞれの反応中心を取り巻くように存在し，太陽光を集め反応中心へ供給している．また，過剰な光を与えた
際にその過剰なエネルギーを安全に熱として消去できる機構も兼ね備えている．LHCI，LHCII それぞれを精製する手法について述べる．

Light-harvesting proteins
Ryutaro Tokutsu, Wesley Swingley, Jun Minagawa
In green plants,light-harvesting complexes I (LHCI)and II (LHCII)proteins serve as light-harvesting apparatus
for photosystem I and II,respectively. These are chlorophyll-carotenoid binding integral membrane proteins in
the thylakoid membranes. We describe a protocol for isolation of LHCI and that for LHCII proteins bydetergent-solubilization of the membranes followed by sucrose density gradient ultra centrifugation.

［実験方法］

4.c.1 LHC Iタンパク質

１．精 製 し た チ ラ コ イ ド 膜 を 25mM MES/NaOH，

高等植物では，光化学系 コア複合体の片側（PsaG/
F/J/K サブユニット側）に４分子の LHCI タンパク質（以下 LHCI）が結合し，PS1-LHCI 超複合体を構成している (PS1-LHCI 超複合体は，3.4a を参照）．緑藻では４分子以上の LHCI が光化学系

pH6.5 で２度洗浄したのち，終濃度 0.8mg Chl/mLになるよう希釈する
２．β-DM（終濃度 0.8％）を 1.のチラコイド膜に加え，４℃で 10分間撹拌しながら可溶化を行う．

に結合することが確

３．可溶化したチラコイド膜（0.3〜0.5mL）を0.1〜1.3

認されているが，まだその構造情報は得られていない．

（100,000g ，24
M ショ糖密度勾配に重層し，超遠心

LHCI は，LHCII とは異なりコア粒子に強固に結合しているため，n-dodecyl-β-D-maltoside(β-DM ）による可溶時間）を行う．
４．クロロフィル結合タンパク質による緑色のバンドの化ではコア粒子から分離されない．LHCI を光化学系

うち，上から３番目の A 3バンド
（PSI-LHCI 超複合のコア粒子から分離するためには，イオン強度が上がる体画分）を分取する．

Zwittergent による可溶化が有効であると報告されてい５．メンブランフィルター（分子量 100,000以下排除）る ．以下のプロトコルは，現在知られている LHCI 精製により 4.を濃縮した後，界面活性剤を含まないバッ

方法のうち，もっとも穏やかなものである．

ファー（25mM MES/HEPES，pH 6.5‑7.5）にてクロロフィル濃度 3mg/mL になるよう希釈する．

LHC I精製プロトコル(C ro ce et al. 1998 を改変)
ホウレンソウチラコイド膜から LHCI を精製する手６．１％ β-DM /0.5％ Zwittergent 3‑16（終濃度）を加え，４℃で 1‑3時間撹拌する．

順を紹介するが，他の材料からもほぼ同様の手順 ⎜ １)

７．液体窒素を用いて急速凍結した後ゆっくりと融解さβ-DM によるチラコイド膜の可溶化，２) ショ糖密度勾せる．これを３度繰り返し PS1 コア粒子から LHCI

配 超 遠 心 法 に よ る PSI-LHCI 超 複 合 体 の 分 画，３)を解離させる．

Zwittergent 存在下で凍結融解を繰り返すことによる

８．200mg クロロフィル相当の 7.の懸濁液を 0.1〜1.3

LHCI の 解 離，４) ショ糖 密 度 勾 配 超 遠 心 法 に よ る

M ショ糖密度勾配（13PA チューブ，日立）に上層

LHCI の精製 ⎜ で LHCI を得ることができる．

し，超遠心（100,000g ，24時間）
にて脱離した LHCIを分離する．

１) 北海道大学低温科学研究所

2009 低 温 科 学

vol.67

超遠心後，通常４本のバンドが得られるが，LHCI モノ
285

マーは上から一番目，LHCI ダイマーは上から２番目のLHC II精製プロトコル

バンドに見られる（図 1）．界面活性剤の作用が強すぎる（Minag awa et al. 2001 を改変）

場合は，１番目の LHCI モノマーバンドのさらに上に脱離した色素によるバンドが現れる場合がある．

本稿では，緑藻 Chlamydomonas reinhardtii から精製する手順を紹介するが，他の材料からもほぼ同様の手順⎜ １) β-DM によるチラコイド膜の可溶化，２) ショ糖

4.c.2 LHC IIタンパク質

密度勾配超遠心法による LHCII 画分の分離 ⎜ で精製することができる．β-DM は 0.8％ 〜1.0％ で用いる．

LHCII タンパク質（以下 LHCII）は，PSII の周辺集光得られた LHCII 画分は，シリンジまたはパスツールピ

装置として集光および過剰エネルギー消去の機能を持

ペットを用いて回収する．ゲルろ過及びその他の生化学

つ．大きく分けて２種類の LHCII が知られており，コア的解析に用いるためには，ショ糖密度勾配超遠心後，透粒子に隣接して単量体として存在するものをマイナー

析によるショ糖の除去が必要となる場合がある．

LHCII，その外側に位置し三量体を構成するものをメジャーLHCII と呼ぶ ．メジャーLHCII の三量体構造の１．精 製 し た チ ラ コ イ ド 膜 を 25mM MES/NaOH，結晶構造は解明されている ．メジャーLHCII は緑藻でpH 6.5で２度洗浄し，終濃度 0.4‑0.8mg Chl/mL

は４種類のポリペプチド（LHCII type I〜IV），高等植となるように濃度調整した後，β-DM を Chl：deter-

物では３種類のポリペプチド（Lhcb1〜3）で構成され，

gent 比が 1：8になるように加え，氷上で 10分間緩

それぞれのポリペプチドはさらに数個の重複遺伝子にやかに攪拌しながら可溶化する．

よってコードされる ．緑藻にはマイナーLHCII として

２．0.2‑0.4mg Chl 相当（500μL）の可溶化チラコイド

CP29 ，CP26 の２種類が，高等植物にはそれにさらに膜を，あらかじめ作製しておいたショ糖密度勾配

CP24 を加えた３種類が存在する ．チラコイド膜を β-（0.1‑1.3M sucrose gradient/25mM Mes/NaOH，

DM やオクチルグルコシドなどで可溶化すると，通常全pH 6.5/0.03％ β-DM /11.5mL）に重層し，超遠心ての LHCII はコア粒子から脱離するが，高等植物では分離（４℃，100,000g ，24時間）を行う．

マイナーLHCII が脱離しない場合もある．

３．クロロフィル結合タンパク質によって形成された緑
色のバンドのうち一番上の A 1バンド（LHCII 画分）を分取する．条件によっては A 1バンド内にさらに２つのサブバンドが確認できるが，その場合上のバンドが LHCII の単量体，下のバンドが LHCIIの三量体に相当する（図 2）．
高等植物のグラナ領域（BBY particle）から LHCII を精製する場合，この領域には比較的多くの PSII-LHCII
超複合体が含まれているため，多くの３量体 LHCII を得ることが出来る ．３量体 LHCII は，調製前に光処理
または phospholipase 処理を行うことで単量体化することが知られている ．ショ糖密度勾配超遠心法では，単量体化した３量体 LHCII ともともと単量体 LHCII である CP26，CP29 及び CP24 を分離・精製することは困難
だが，フラットベッド等電点電気泳動法を用いれば，色素を結合させたままこれらを分離することも可能である．

参考文献
図 1：ホウレンソウより単離したチラコイド膜から光化学系
超複合体（PSI-SC）を調製し，Zwittergent 法で LHCI を解離させ，ショ糖密度勾配超遠心によって LHCI を分画した．

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P.Horton, J.Biol. Chem. 274 (1999)P.10458.
図 2：クラミドモナスより単離したチラコイド膜を可溶化
し，ショ糖密度勾配超遠心によって LHCII（A 1）を分画した．

2009 低 温 科 学

vol.67287

３章 単離・精製・活性測定

４．タンパク質複合体の単離
d．光合成細菌の反応中心・アンテナ複合体
大友 征宇 ，小林正幸 ，大岡宏造

光合成細菌は原始的で多様なエネルギー獲得変換系を有していることから光合成における最も本質的な課題の１つであるエネルギー獲得と変換機構を物理化学的に研究する絶好なモデル系を提供している．本項では，光合成細菌のエネルギー獲得変換器官である光捕集アンテナ複合体と反応中心の単離精製について述べる．

Isolations of Reaction Center and Antenna Complexes from Photosynthetic
Bacteria
Zheng-Yu Wang, Masayuki Kobayashi, Hirozo Oh-oka
Bacterial photosynthesis provides a simplified model system ideally for studying the light energy conversion andpigment-membrane protein interaction. In photosynthetic bacteria, the light energy is absorbed by lightharvesting complexes and then is transferred rapidly and efficiently to the reaction center where the primarycharge separation takes place across the membrane and a cyclic electron transport chain is formed. In thischapter, we describe the isolation procedures of these pigment-membrane protein complexes.

光合成細菌の反応中心複合体は膜タンパク質の中で一Thermochromatium tepidum を例に取り，反応中心の単番最初に高分解能の立体構造が決定されたもので，その離法について述べる ．クロマトフォアのペレットにま単離精製法も比較的早くから確立されている．しかし，ず 少 量 の 20mM Tris-HCl (pH 8.5），0.05％(v/v)

以下に示すように反応中心とアンテナ複合体の単離法はLDAO（Buffer A）溶液を加えて毛筆で懸濁する．その光合成細菌の種類によって大きく異なり，扱う菌体に対後 850nm の吸光度 A ＝50になるように濃度を調整して個別に条件を検討する必要がある．膜タンパク質のする．こ の ク ロ マ ト フォア 懸 濁 液 に LDAO を 0.25％

単離全般において，特に可溶化の際光合成膜と界面活性(v/v）になるように加え，40℃で 40分間程度振とうす剤との量比が重要なポイントである．

る．この溶液を 150000×g で 90分間超遠心分離し，上清溶液に可溶化した膜タンパク質が入っている．沈殿物を

4.d.1 紅色光合成細菌由来の反応中心・アンテナ複合体

Buffer A で懸濁して，再度上記の可溶化処理を 25〜35分程度行う．超遠心で得られた上清溶液を Buffer A で一晩透析（MWCO＝6000〜8000）を行い，過剰の LDAO

これらの複合体が古くから精力的に研究され，単離精を取り除く．次に，DEAE 陰イオン交換カラム（TOSOH,

製法はほぼ確立されている．材料として光合成膜（クロTSK Gel DEAE-TOYOPEARL 650S）による精製を行

マトフォア）を使用するので，クロマトフォアの調製にう．Buffer A をカラム体積の５〜10倍流すことによっ

ついては本書 3.2b または文献 を参照されたい．

てカラムの平衡化を行う．透析後の試料溶液を平衡化し4.d.1.1 紅色細菌の反応中心複合体の調製たカラム剤に吸着させる．その後，次に示す NaCl 濃度勾

これまで３種類の紅色細菌から反応中心の高分解能立配法によって反応中心を溶出させる．0mM ：90分，0→体構造が報告されている．これらの複合体の可溶化には150mM (linear）：300分，150mM ：90分，150→ 500

両性イオン界面活性剤 Lauryldimethylamine-N-oxide：30分，500mM ：90分．反応中心は約 125mM（linear）（LDAO）が使われる場合が多い．ここで好熱性細菌

mM から徐々に溶出し始める．純度評価 に 280nm と800nm の吸光度の比（A /A ）を用いることが多い

１) 茨城大学理学部
２) 有明工業高等専門学校

が，この段階で A /A ＝２〜４になる．さらに純度を物質工学科

３) 大阪大学大学院理学研究科生物科学専攻

2009 低 温 科 学

vol.67上げるた め に は，HPLC に よ る 精 製 が 必 要 で あ る．
DEAE 精製後の試料溶液を数 mM NaCl，A ＝10にな
289

るようにフィルター（MWCO＝30000）で脱塩濃縮する．

加える．LDAO を終濃度で 0.35％になるように加えて，

得 ら れ た 試 料 を 0.22μm の フィル ターで 濾 過 し て，

室温（約 23℃）で 60分間撹拌する．Buffer B により希HPLC カ ラ ム（TOSOH, TSK

Gel PW タ イ プ

釈し，LDAO 濃度を 0.1％程度にす る．20％の Triton

G3000PW 7.8mm I.D.×30cm）に 100μl ロードする．

X-100 溶 液 を 終 濃 度 0.1％に な る よ う に 加 え て，

カラム流速が 0.5ml/min の場合，反応中心が約 15分で150000×g，60min，４℃で 超 遠 心 を 行 う．沈 殿 物 を

溶 出 す る．HPLC 精 製 後 の 反 応 中 心 の 純 度 は A /Buffer B で懸濁し，A ＝25になるように調整する．終A ＝1.7〜1.9となり，典型的な吸収スペクトルを図 1

濃度が 0.35％となるように LDAO 溶液を加えて，４℃に示す．

で 60分間撹拌する．150000×g，60min，４℃で超遠心

4.d.1.2 紅色細菌のコアアンテナ複合体 LH 1の調製を行った後，上清溶液を透析チューブに入れて，50mM

現在のところ，全ての紅色細菌から反応中心を含まな

Tris-HCl(pH 8.0），0.05(v/v）LDAO で透析を４℃で

い LH1 の単離ができるわけではなく，LH1 と反応中心

12〜24時間で行う．透析後の試料を４℃で陰イオン交換との相互作用が強いため単独に LH1 の単離と精製がでカラム（TOSOH,TSK Gel DEAE-TOYOPEARL 650S

きない場合が多い．ここでは，比較的容易に LH1 を単離で精製を行う．50mM Tris-HCl(pH 8.0），
25×250mm）

することができる Rhodospirillum

rubrum の例を示

0.09(v/v）％LDAO（Buffer C）を用いて，流速 1.5ml/．Rhodospirillum rubrum は従属栄養光合成細菌

min でカラム体積の約 2.5倍量程度で平衡化する．LH1

で，種々の培地により生育させることが可能である．大を溶出するための NaCl 濃度条件は 120分間で 60mM量の試料が必要な場合，リンゴ酸もしくはフマル酸を用から 250mM まで直線勾配をかける．LH1 は 100mMいる方がよい．リンゴ酸を含んだ培地では生育速度が格〜130mM の間に溶出する．この段階で A /A ＝2.5

段に速く，1.2ℓで約 10g 程度の湿菌体が得られる．

以上，A /A ＝7.5以上のフラクションが高純度のYeast extract がなくても生育するが，得られる菌体量

LH1 を含む．LH1 の典型的な吸収スペクトルを図 1には５ g 程度である．LH1 を高い収率と純度で得るために示す．精製された LH1 溶液を蒸留水で１〜２日間４℃以下の点に注意する．

で透析することにより，LH1 の沈殿が得られる．

す(1) 反応中心を除去するために，ある程度強めの界面活性剤の濃度で可溶化する．
(2) 抽出の間の酸化を抑えるため，LH1 の単離は一日

4.d.1.3 紅色細菌のアンテナ・反応中心複合体
LH 1-R C の調製
多くの菌体に適用できる一般的な簡便法としてショ糖で行い，迅速かつ冷暗所で行う．

密度勾配法が用いられる．クロマトフォアのペレットを(3) 対数増殖期を過ぎた菌体は使わない．

20mM Tris-HCl(pH 8.0）溶液で懸濁し，A ＝50程度

クロマトフォアを 50mM リン酸（pH 7.0）（Buffer B）になるように濃度を調整する．この懸濁液に OG（オクチ

で懸濁し，880nm の吸光度が A ＝40になるように調

ルグルコシド）を終濃度 1.0％(w/v）になるように加え，整する．アスコルビン酸ナトリウムを終濃度 10mM で室温で１時間程度振とうする．この溶液を 150000×g で90分間超遠心分離 し，上 清 溶 液 を 20mM

Tris-HCl(pH 8.0）と 0.8％(w/v）OG を含む 10〜40％(w/v）のショ糖密度勾配で 150000×g 約 12時間分離する．通常，
密度の高いフラクションに LH1-RC が含まれる．この方法は少し不純物を含んだ少量の試料の場合に適しているが，大量（mg オーダー）かつ高純度の試料を調製する場
合，次に述べる精製法が必要になる．ここでは Thermochromatium tepidum の例を示す．クロマトフォアのペレットに 20mM Tris-HCl(pH 8.5）溶液を加えて懸濁
し，A ＝50になるように濃度を調整する．この懸濁液にアスコルビン酸ナトリウムを終濃度 10mM ，LDAO
を終濃度 0.35％となるように加え，室温で 60分間穏やかに攪拌する．この溶液を 150000×g で 90分間超遠心図 1： Thermochromatium tepidum 由 来 RC（赤）とRhodospirillum rubrum 由来 LH1（黒）の吸収スペクトル290

分離し，上清溶液に可溶化した LH2 が回収される．沈殿物を 20mM Tris-HCl(pH 8.5）で再懸濁して，LH1 の光合成細菌反応中心とアンテナの単離Qyピーク（約 915nm）が A ＝25になるように濃度を度振とうする．この溶液を 150000×g で 90分間超遠心調整する．アスコルビン酸ナトリウムを終濃度 10mM ，分離し，上清溶液を 20mM Tris-HCl(pH 8.0）と 0.8％

OG を終濃度 1.0％となるように加え，室温で 60分間穏(w/v）OG を含む 10〜40％(w/v）のショ糖密度勾配でやかに攪拌する．この溶液を 150000×g で 90分間超遠150000×g 約 12時間分離する．通常，密度の低いフラク

心分離し，上清を回収する．次に，陰イオン交換カラム

ションに LH2 が含まれる．カラムによる精製の場合，前による精製を行う．カラムは TOSOH,TSK Gel DEAE-

述の LH1-RC を溶出する過程で LH2 を回収することも

TOYOPEARL 650S（25×250mm）を用いる．20mM可能である．LH2 の典型的な吸収スペクトルを図２に示，0.7％ OG を用いて，流速 1.5ml/
Tris-HCl(pH 8.5）

す．

min でカラム体積の約 2.5倍量程度で平衡化した後，試料をロードする．LH1-RC を溶出するための NaCl 濃度
勾配は 50mM 〜150mM まで 20分毎に 25mM ずつ濃度を上げていく．この精製法で高濃度（A ＞20）
，高純度（A /A ＞2.1）の LH1-RC が得られる．典型的な

4.d.2 緑色光合成細菌由来の反応中心とアンテナ複合体
緑色細菌にはイオウ細菌と非イオウ細菌が存在する．

吸収スペクトルを図 2に示す．

緑色非イオウ細菌の反応中心の性質・構成サブユニット

4.d.1.4 紅色細菌の周辺アンテナ複合体 LH 2の調製は基本的には上記紅色細菌の反応中心と同じでタイプ２

簡便法として界面活性剤 LDAO を用いると LH2 が（キノン型）反応中心に分類される．またアンテナ複合体

選択的に抽出される．クロマトフォアのペレットに 20

クロロゾームを構成する BChl c 会合体の構造はイオウ

mM Tris-HCl(pH 8.0）溶液を加えて懸濁し，A ＝50

細菌と非イオウ細菌ではほぼ同じである．ここでは緑色程度になるように濃度を調整する．この懸濁液に LDAO

イオウ細菌由来の反応中心（タイプ１（Fe-S 型）反応中を終濃度 0.35％(w/v）になるように加え，室温で１時間

心）とアンテナ複合体を調製する方法について述べる．

程度振とうする．この溶液を 150000×g で 90分間超遠4.d.2.1 緑色イオウ細菌の反応中心の調製

心分離し，上清溶液に LH2 が抽出される．クロマトフォ

緑色イオウ細菌由来の反応中心は非常に酸素に不安定

アに含まれる LH2 の割合が菌体によって異なるが，クであり，厳密な嫌気条件下での調製が必要である．以下

ロマトフォアの濃度と LDAO 濃度を微調整すれば比較の操作方法の中で，膜標品の可溶化，硫安分画，カラム

的高純度の LH2 が得られる．他の界面活性剤を使う場

クロマト等はすべて嫌気グローブボックス（米国・Coy

合，ショ糖密度法やカラムによる精製が必要である．OG社製）内で行わねばならない．また使用する溶液・緩衝を使う場合の例を示す．クロマトフォアのペレットに 20

液は脱気・窒素ガス交換を行ってから嫌気グローブボッ

mM Tris-HCl(pH 8.0）溶液を加えて懸濁し，A ＝50

クス内に持ち込み，一昼夜放置後，残存酸素を完全に除程度になるように濃度を調整する．この懸濁液に OG をくために還元剤である dithiothreitol（DTT）を加える．

終濃度 1.0％(w/v）になるように加え，室温で１時間程

遠心中は直接酸素に触れないようにキャップ付チューブを用いるか，超遠心機用ローターを直接嫌気グローブ
ボックス内に持ち込むなどの工夫が必要である．嫌気操作の詳細については本書別項を参照されたい．
【準備する溶液・緩衝液】
・緩衝液Ａ：50mM Tris-HCl(pH 8.0），2mM DTT，20mM glucose，glucose oxidase(2U/ml），catalase(20U/ml）
・緩衝液Ｂ：50mM Tris-HCl(pH 8.0），2mM DTT，2mM sucrose monolaurate(SM -1200）
・可 溶 化 溶 液 １：50mM，2mM
Tris-HCl(pH 8.0）

DTT，60mM β-D-octylglucoside，１％ Na-cholate，20％ 飽和硫安
図 2：Thermochromatium tepidum 由 来 LH1-RC（赤）とLH2（黒）の吸収スペクトル2009 低 温 科 学

vol.67・可 溶 化 溶 液 ２：50mM，2mM
Tris-HCl(pH 8.0），40％
DTT，2mM sucrose monolaurate(SM-1200）
291

飽和硫安

い硫安濃度下では疎水クロマトとして使用できる）．
30％

・100％ 飽和硫安緩衝液：50mM Tris-HCl(pH 8.0），2

飽和硫安緩衝液（緩衝液Ｂと可溶化溶液２を 1：3の割合

mM DTT，100％ 飽和硫安で混合して作る）で濃緑色画分が溶出してくるので，こ上記の緩衝液には以下の各種プロテアーゼ阻害剤を含の画分を緩衝液Ｂで平衡化した Sephadex G25 カラム

む．
・プ ロ テ アーゼ 阻 害 剤：1mM（11×260mm）を用いて脱塩する．最後に緩衝液Ｂで平EDTA，1mMp-

衡化した DEAE Bio-Gel A カラム（15×40mm）に通し，

aminobenzamidine，1mM 6 amino-n-caproic acid，

素通りで溶出してくる鮮緑色の反応中心画分を回収す

0.2mM PM SF，2μM E-64，1μM pepstatine

る．典型的な吸収スペクトルを図３に示す．

また１ M DTT 溶液と 100mM SM-1200 溶液は，作り置きしておくと便利である．それぞれ粉末を上記の方法では湿重量 30g の菌体から A ＝11−15量してバ程度の反応中心標品を約 10ml 得ることができる．反応

イアル瓶に入れ，嫌気グローブボックス内に持ち込んだ

中心可溶化の界面活性剤として Triton X-100 を使う方

後，脱気・窒素ガス交換を行った水を加えて溶かす．

法 も 報 告 さ れ て い る が ，β-D-octylglucoside/Nacholate の混合界面活性剤による可溶化に比べ，その効【手順】
材料としては好熱性 Chlorobium tepidum を用いる．
嫌気グローブボックス内での操作は常温で行うため，一率はきわめて低い（筆者らの経験では約 1/10である）．
4.d.2.2 緑色細菌のアンテナ複合体クロロゾームの調製

般に熱安定性が期待できる好熱性細菌由来のタンパク質

ここで，良く研究に用いられてきた好熱性緑色硫黄細が望ましい．湿重量 30g の菌体に対し 10mM cysteine

菌 Chlorobium tepidum 由来のクロロゾームの単離精製を加えた緩衝液Ａ，100ml で懸濁後，菌体をフレンチプ法について述べる ．菌体を湿重量で約 15g とり，10mM

レスで破砕する（glucose oxidase/catalase は処理中に

リ ン 酸（pH 7.0）−2M チ オ シ ア ン 酸 ナ ト リ ウ ム

混入してくる酸素をできるだけ除去するために加えてい（SCN 緩衝液）
で懸濁し，体積を 200mL に
NaSCN 溶液

る．また cysteine は抗酸化剤として加える）．10000×g，する．この操作を含め，以下の一連の操作はできるだけ15min の遠心で未破砕細胞を除き，110000×g，60min

氷水中でサンプルを低温に保ったまま行う．細胞を超音の超遠心で膜画分を回収する．ここで回収する膜画分は波（70〜100W ，３分間×４回）で破砕する．超音波によっ

クロロゾームを含む細胞膜画分であり，反応中心の可溶て熱が発生するので，変性を防ぐためにこの操作は特に化においては膜画分を用いる方が操作的には簡便で，収温度が上昇しないように気を付ける．超音波処理した菌量も高く大量調製に適している．フレンチプレスでの菌体の懸濁液を 25000×g で 20分間遠心分離し，破砕され体破砕方法および精製細胞膜標品の調製については本書なかった細胞や巨大な細胞膜はペレットとなって，遠心別項を参照されたい．

チューブのそこに溜まる．ペレットの重さは最初の菌体

膜画分を緩衝液Ａで懸濁し，5mg BChl（BChl a との湿重量の約 60％になる．遠心後の上清中にクロロゾー

BChl c の合計）/ml の濃度に調整する．この懸濁液に等ム が 含 ま れ て い る の で，さ ら に 上 清 溶 液 を ４℃で量の可溶化溶液１を加え，60分間緩やかに撹拌する．
110000×g，60min の超遠心で得られた緑色の上清に1/2
容量の 100％ 飽和硫安緩衝液を加え，20分間緩やかに撹拌する．26000×g，30min の遠心後の上清に 1/3容量の100％ 飽和硫安緩衝液を加え，再度，20分間の緩やかな撹拌，26000×g，30min の遠心を行い，緑色の沈殿画分を回収する．つぎに可溶化溶液２を加え，60分間緩やかに撹拌することにより，界面活性剤の置き換えとともに再可溶化を行う．110000×g，60min の超遠心後，反応中
心に富む緑色の上清画分が得られる．
可 溶 化 溶 液 ２ で 平 衡 化 し て お い た TOYOPEARL
HW-65（TOSOH）のカラム（15x 30mm）に上清を吸着させ，１カラム容量の同溶液でカラムを 洗 浄 す る（TOYOPEARL HW-65 はゲル濾過用樹脂であるが，高292

図 3：Chlorobium tepidum 由来 RC の吸収スペクトル
光合成細菌反応中心とアンテナの単離150000×g 約２時間超遠心分離する．ここでクロロゾー

り，湿重量 1‑2g 程度の菌体から各種分光測定に必要なムを含む光合成膜がペレットして得られる．次に，ペレッ量を容易に調製することが可能である．

トを SCN 緩衝液で体積が 15mL 以下になるように懸濁 す る．懸 濁 液 を SCN 緩 衝 液 で 調 製 し た 15〜40％【準備する溶液・緩衝液】(w/v)のショ糖密度勾配で 150000×g 約 12時間超遠心・緩衝液Ａ：50mM Tris-HCl（pH 8.0），2mM DTT，分離する．ショ糖密度分離終了後，およそ 35％と 20％の部分に２つの緑色バンドが出現する．これらのバンドはそれぞれクロロゾームの大部分が外れた細胞膜と，クロロゾームが濃縮されたフラクションである．クロロゾー
ムを上層から簡易ポンプを用いて分収する．この段階でクロロゾームの吸収スペクトルに，細胞膜中のバクテリ
オクロロフィル a 由来の 807nm の成分がないことが確認できる．回収したクロロゾームからショ糖や SCN イ
オンを取り除くため，透析チューブを用いて４℃，20

1mM EDTA
・緩衝液Ｂ：50mM Tris-HCl（pH 8.0），2mM DTT，1mM EDTA，2mM SM-1200
・緩衝液Ｃ：50mM Tris-HCl（pH 8.0），2mM DTT，1mM EDTA，2mM SM-1200，40％ 飽和硫安
・100％ 飽和硫安緩衝液：50mM Tris-HCl（pH 8.0），
2mM DTT，1mM EDTA，100％ 飽和硫安
・ショ糖 溶 液：緩 衝 液 Ｂ に 30％お よ び 35％(w/v）のショ糖を加えて作る．

mM リン酸（pH 7.0）緩衝液で透析を２，３回緩衝液を交換しながら１昼夜行う．これらの操作によって純粋な【手順】

クロロゾーム標品が得られる．その吸収スペクトルを図材料としては好熱性 Heliobacterium modesticaldum４に示す．さらに必要に応じて，クロロゾームを超遠心を用いる．湿重量 1‑2g の菌体に対し緩衝液Ａ，6ml に分離でペレットにし，これを凍結乾燥して，固体のクロ懸濁後，菌体をフレンチプレス（20000psi，3 回）で破砕

ロゾーム標品を得ることも可能である．菌体湿重量 15g

する．12000×g，10min の遠心で未破砕細胞を除き，から，乾燥クロロゾームが約 200mg 以上得られる．

180000×g，60min の超遠心で細胞膜画分を回収する．緩衝液Ａで A ＝30となるよ う に 懸 濁 し，界 面 活 性 剤

4.d.3 ヘリオバクテリア由来の反応中心の調製

SM-1200 を終濃度 20mM となるように加え，60分間緩やかに撹拌する．180000×g，60min の超遠心で得られた褐色の上清を，ショ糖密度勾配遠心（30％，35％(w/v）

ヘリオバクテリア由来の反応中心もタイプ１（Fe-Sの段階勾配）にかける．450000×g，120min の超遠心後，型）反応中心に分類され，酸素に対して非常に不安定で反応中心に富む濃褐色のバンドが 30％と 35％ ショ糖溶

ある ．それゆえ可溶化・精製においては上記 4.d.2.1で液の界面に形成される．この反応中心画分を回収し，説明したような嫌気的手法が必要である．しかしアンテ

100％ 飽和硫安緩衝液を加えて硫安濃度が 40％飽和にナ複合体を持たないために細胞膜標品の調製は簡便であなるように調整する．その後，緩衝液Ｃで平衡化しておいた TOYOPEARL HW-65（TOSOH）のカラム（15×40mm）に吸着させ，１カラム容量の同溶液でカラムを洗浄する．30％ 飽和硫安緩衝液（緩衝液Ｂと 100％ 飽和
硫安緩衝液を 7：3の割合で混合して作る）
で濃褐色の反
応中心画分が溶出してくる．典型的な吸収スペクトルを
図５に示す．

参考文献
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294

光合成細菌反応中心とアンテナの単離

３章 単離・精製・活性測定

４．タンパク質複合体の単離
e．フィコビリソーム
近藤久益子 ，佐藤桃子 ，広瀬侑 ，渡邊

麻衣 ，池内 昌彦

フィコビリソームはシアノバクテリア，灰色藻，紅藻に広く存在するフィコビリタンパク質の集光超分子複合体で，光エネルギーの捕集と光環境への順化，分配や貯蔵タンパク質として重要な役割を果たしているが，まだ不明な点が多い．

Phycobilisome
Kumiko Kondo, Momoko Sato, Yuu Hirose, Mai Watanabe, Masahiko Ikeuchi
Phycobilisome is a light harvesting-supercomplex in rhodophytes, glaucocystophytes and cyanobacteria. It is
located on the thylakoid membrane and transfers light energy to photosystems. In this chapter, we introduce
methods of its isolation and analysis in cyanobacteria and glaucocystophytes. The protocol of the complementary chromatic adaptation (acclimation)was also described.

4.e.1 フィコビリソームの基本コンセプトと問題
フィコビリソームはコアとロッドからなる超複合体である質の詳細は省くが，通常は色素を結合せず，ドーナツ状の 3/6量体ディスクの内側に入り込んでディスク同士を連結する役割をもつ（図 1）．これらの成分はシアノバク
テリア，灰色藻，紅藻に広く分布しており，よく似たフィ．そのコアやロッドは，互いによく似たフィコビ

コビリソームを形成し，光化学系の集光装置として機能

リタンパク質のドーナツ状のディスクとこれをつなぐリしている．このようなフィコビリソームの分子質量は 1

ンカータンパク質から構成されており，さらにコアとMDa を越えるまさに超複合体である．また，ここでは述

ロッドの間も別のリンカータンパク質によって連結されべないが，束状のフィコビリソームなど多様な構造が知ている（図 1）．フィコビリタンパク質とは開環テトラピられている

ロールであるフィコビリン色素がタンパク質に共有結合＊注：フィコビリタンパク質の分野では，遺伝子は cpcAしたものである（３章５参照）ディスクとは，各フィコなどと表記するが，タンパク質は α ・β （フィコシ

ビリタンパク質の α/βサブユニット複合体を単位（モノ

アニンモノマーの場合）などと表記する．これでは初マーと呼ぶ）として，ドーナツ状の３量体もしくは３＋

心者には対応関係がわか り に く い の で，本 項 で は３＝６量体を形成したものである．ロッドの遠位部分は

α ・β を CpcA・CpcB などと統一的に表記する．

フィコエリスリン６量体（これをもたない種もある），近位部分はフィコシアニン６量体，コアの主成分はアロ

上述のように，フィコビリソームのロッドの遠位にフィコシアニン３量体が中核を形成している．フィコエ

フィコエリスリン，近位にフィコシアニン，コアにアロ

リスリン αサブユニット（CpeA）は，フィコシアニン α

フィコシアニンが配置されており，それぞれが〜560

サブユニット（CpcA），アロフィコシアニン αサブユ

nm，〜620nm，〜650nm の吸収ピークを示す．光エネ

ニット（ApcA）と相同で，フィコエリスリン βサブユ

ルギーが波長に反比例するので，この配置は遠位の高いニット（CpeB）は，フィコ シ ア ニ ン βサ ブ ユ ニット

光エネルギーを吸収してコアの低いエネルギー準位への（CpcB），アロフィコシアニン βサブユニット（ApcB）

励起エネルギーの効率的な伝達を実現している．しかし，と相同で，しかも αサブユニットと βサブユニットも相

ここで述べた基本成分以外の微量成分のフィコビリタン

同性はやや低いが起源をともにする．つまり，フィコビ

パク質や種ごとに異なる多様なリンカータンパク質の存

リソームの主要な構成成分は単一の色素タンパク質の遺在は，フィコビリソームの物質的理解がまだ十分でない

伝子の重複によって生じたといえる．リンカータンパク

ことを示している．また，各フィコビリタンパク質が特定波長の光を吸収するしくみ，フィコビリソームの自己

１) 東京大学大学院総合文化研究科広域科学専攻

2009 低 温 科 学

vol.67

会合のしくみ，フィコビリソームから光化学系複合体へ
295

図 1：Synechocystis sp. PCC 6803 のフィコビリソームのモデル図．

の効率のよい光エネルギー転移のしくみ，さらに栄養飢［実験方法］フィコビリソームの単離

餓や光環境の変化に応じた発現や分解の誘導など，解明

以下，全ての作業は 20℃付近で行う ．

されていない問題が山積している．

１．シアノバクテ リ ア の 細 胞 を 0.8M リ ン 酸 緩 衝 液

フィコビリソームは 1970年代から活発に研究されて（pH 7.0）に懸濁し，細胞を破砕する．破砕にはフレ

きたが，フィコビリソームやそのフィコビリタンパク質

ンチプレスやビードビーターを用いる．フレンチプの構造解析やゲノム解読の進展から予測されるフィコビ

レスの場合，1500kg cm で２回もしくは３回通

リソーム遺伝子の機能や構造の多様性が次々に明らかにす．冷却式のビードビーター（BioSpec 社）の場合，なってきており，フィコビリソーム像を見直す時期に来氷水のジャケットで包み，30秒で４回程度破砕すているといえる．

る．
(1ʼ
)灰色藻の場合，低張ショックで単離したシアネル（色

4.e.2 フィコビリソームの単離素体）を，0.8M リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）に懸濁し，リゾチーム（終濃度 1mg mL ）を加え

フィコビリソームの構造を維持するにはリン酸やクエる．ペプチドグリカン層は薄いので，すぐにシアネン酸などの多価アニオンの高濃度の緩衝液が必要であ

ルは破裂するが，通常 25℃で 15分間静置する．これる．このような溶液を用いたフィコビリソームの古を遠心回収して，
再度リン酸溶液に 濁し，
最終２％

典的な単離法は現在でももっとも有効である．これらのの Triton X-100 を加え，15,000xg，５分間遠心し，溶液にはアンチカオトロピック効果があるが，シアノバ
クテリアの細胞内のイオン組成と関係があるかどうか明
らかではない．この条件で細胞を破砕すると，フィコビ
リソームの一部はチラコイド膜に結合している．Triton
X-100 処理はこの膜結合フィコビリソームを抽出するのにある程度有効であるが，完全には抽出しきれない．
296

フィコビリソームは熱変性しやすく，不溶性の凝集物をつくる．したがって，内部から熱を発生するビードビーターを使用するときは，過熱に注意する．容器は冷たくても，内部は過熱していて不溶化することがある．細胞は破砕できているのに，
フィコビリタンパク質が沈澱するときは，破砕時間もしくは回転数を下げることを検討する．

フィコビリソーム

図 2：ショ糖密度ステップ勾配 と Synechocystis sp.PCC 6803 における分離例（A），および分光学的解析例（B）．13PET チュー
ブ（Hitachi），スイングロータ P65ST（Hitachi）を使用．

上清を回収する．これを上記のショ糖密度勾配遠心

コビリタンパク質のサブユニットが上部に回収さ法で分画する．なお，フレンチプレスや超音波処理

れ，Triton X-100 で可溶化されたクロロフィル類はをしているプロトコルもあるが，リゾチームで十分

通常は最上部に留まる（図 2A および図 3）．図 3は，である．

各種の生物のフィコビリソームの 分 画 は，intact

２．終濃度が２％になるように Triton X-100 を添加す

フィコビリソームの多様性を示す．

る（20％(w/v）ストックを使用）．
３．遮光して 30分間振盪する．

［実験方法］単離フィコビリソームの解析

４．遠心（20,000xg，20分間）によって層分離させる．

青色層をシリンジ等によって分画後，構成タンパク質

上にクロロフィルを含む Triton X-100 層，下にフィとその会合状態を SDS-PAGE や吸収・蛍光スペクトル

コビリソームを含む水層の２層に分離する．

測定によって推定することができる．

５．下側の青い水層を回収し，0.8M リン酸（pH 7.0）

・SDS-PAGEを含む 10‑50％(w/v）ショ糖密度勾配（連続密度勾

基本的にフィコビリソームの構成タンパク質は 7‑9

配またはステップ勾配，図 2A）に重層する．なお，

kDa のコアリンカーおよびロッドエンドキャッピング

上のステップ４で，二層に分かれなかった場合はそリンカー，約 15‑20kDa のフィコビリタンパク質，30‑40のまま重層する．

kDa の ロッド コ ア リ ン カーお よ び ロッド リ ン カー，

６．超遠心（130,000xg，15時間）によってフィコビリ
タンパク質複合体を分画する．
結果：一般に，intact フィコビリソームが最も下に，フィ70‑120kDa のコアメンブレンリンカー（アンカーともいう）に分けられる．このうち，コアメンブレンリンカー
は限定分解を受けやすく，複数のバンドに分かれることが多い．またシアノバクテリアにおいては，フィコビリ

0.8M リン酸緩衝液と 2％ Triton X-100 溶液は２層に分離し，上層にはクロロフィル，下層にはフィコビリソームが回収されるが，試料が多すぎると層分離しなくなったり，下層にクロロフィルが混入しやすくなるが，その場合でも次の密度勾配
遠心で分画できることが多い．
われわれは，密度勾配の作製にグラジエントマスター（トーワ2009 低 温 科 学

vol.67

ソームと相互作用している FNR も確認することができラボ）を使用している．これは２種の液を重層して一定時間
チューブを傾けて回転させて連続勾配をつくる簡単な装置であるが，複数のチューブを作製するとき簡便で再現性にすぐれ
ている．

297

図 3：数種のシアノバクテリアおよび灰色藻のフィコビリ
ソームの分画例（10‑50％ ショ糖）
．左から順に Thermosynechococcus elongatus BP-1, Anabaena sp. PCC 7120, Cyanophora paradoxa NIES-547, Synechocystis sp. PCC 6803,
Nostoc punctiforme ATCC 29133, Fremyella diplosiphon.
最上部の緑色層は手順５におけるクロロフィルタンパク質の混入によるもの．

図 4：Synechocystis の 泳 動 例（15％ acryl amide，Tris．左は銀染色．右は FM BIO による蛍光画像．
（他
Glycine 系）の泳動条件例として低分子量リンカーに適しているのは 7.5）
M urea，16‑20％ アクリルアミドゲルなどがある．

光波長 623nm．
＊筆者らは FMBIO II（Takara）を用いている．この場
合，励起光（532nm）は固定であるが，蛍光はチャ

る．
尿素を含まない通常の SDS-PAGE では主要なフィコ
シアニン，アロフィコシアニンのタンパク質がよく分離
し，代表的な種では移動度の大きい方から CpcB，ApcA，

ンネル 2（605nm 固定）で感度よく検出できる．蛍光像を図４に示す．感度は落ちるが DNA 検出用のUV 照射装置でも検出可能である．
・吸収・蛍光スペクトル測定

CpcA，ApcB の順に分離する（図 4) ．一方，尿素を含

前述のようにフィコビリタンパク質の同定や部分複合

む SDS-PAGE（３章 4e を参照）では，これらのタンパ

体の会合状態の推測には分光学的な解析が有効である．

ク質の分離は少し悪くなるが，コアリンカーなど低分子

特に液体窒素温度下における低温蛍光スペクトルでは色タンパク質や高分子のコアメンブレンリンカータンパク

素タンパク質の蛍光ピークがシャープに得られ，近接し質すべてを分離できる．

た蛍光ピークを持つフィコビリタンパク質の同定に適し・Zn 蛍光検出ている．エネルギー伝達が正常な無傷のフィコビリソー

フィコビリタンパク質は，SDS-PAGE 後に共有結合

ムからは約 680nm のピークが得られる（図 2B）．一般

している開環テトラピロール由来の蛍光によって確認すに，光化学系複合体の低温蛍光は 685‑695nm 付近の系

ることができる．この原理は，本来ばらばらになった４２と 720nm 付近の系

個のピロール環に Zn を配位させることでテトラピ

コビリソームの蛍光ピークは近接しているので注意が必

ロールの平面性を保ち，吸収や蛍光効率，つまり検出感要である．

由来のものに分かれるが，フィ度を上げることにある ．
１．SDS-PAGE ゲルを約 10分間，ddH O で洗浄する．
２．10mM の酢酸亜鉛溶液に浸し，30分間遮光して振盪する．ストック（1M 水溶液，pH 調整不要）を使用する．
３．２次元蛍光検出器で検出する．励起波長 577nm，蛍
298

4.e.3 低塩緩衝液によるフィコビリソームの部分解体
ロッドに結合しているリンカータンパク質は多種多様であり，これらの複合体内での局在を調べることは，
フィ
フィコビリソーム

コビリソーム全体の構造を理解するうえで重要である．
フィコビリソームは高塩濃度の緩衝液中では安定だが，低塩濃度の緩衝液中ではその構造が不安定となり，ロッドとコアなど部分的に解体されることが知られている．

4.e.3.1 ショ糖密度勾配遠心法による解体・分画
細胞破砕時から低塩濃度の緩衝液を用いても，フィコ
ビリソームのサブ複合体を得ることは可能だが，フィコ
ビリソーム構成タンパク質以外の混入をさけられない．
そのため，3.4.e.2で単離した intact フィコビリソーム

画する．

図 5：Cyanophora paradoxa の 部 分 解 体 さ れ た フィコ ビ リ
ソームのショ糖密度勾配遠心法による分画例．色のついた画
分は，分光学的解析や SDS-PAGE をおこなうことでロッドやコアであることを特定できる．
（PC, phycocyanin; APC,
allophycocyanin）［実験方法］

表 1：の超複合体を解体した方が解析しやすい．回収したフィ
コビリソーム画分を希釈してリン酸濃度を 0.3M 以下として，超複合体を解体させショ糖密度勾配遠心法で分１．0.8M リン酸緩衝液（pH 7.0）をもちいて単離した

6‑12％分離ゲル
6％

フィコビリソーム画分（目安としてフィコシアニンの吸光度Ａ＝3.35くらいのものを×mL くらい

用意するとよい）を，同じリン酸緩衝液を用いてショ糖濃度が 10％以下になるように希釈する．
２．限外濾過法により，元の体積まで濃縮する．
３．30mM リン酸緩衝液（pH 7.0）で３倍に希釈．緩衝
液の濃度が約 0.3M になるように調整する．
４．限外濾過法を用いて再濃縮．
５．再濃縮したフィコビリソーム溶液を 10‑25％ショ糖

12％60％(w/v）アクリルアミド
1.6％ ビス

0.4mL 0.8mL

3M Tris/HCl pH 8.6
1.26M Tris/HCl pH 6.8

0.5mL 0.5mL−−

3.1mL 2.3mL
DW
60％(w/v）ショ糖−
0.4mL
10％(w/v）過硫酸アンモニウム 12μL
12μL
2μL
2μL
TEM ED
合 計

4mL

4mL

濃縮ゲル
3％
0.1mL
−
0.2mL
1.7mL
−
16μL
3μL
2mL

密度勾配（0.3M リン酸緩衝液中）に重層する．
６．遠心（130,000xg，15時間）．

アクリルアミドゲル溶液（表 1）は筆者らの処方である

７．色のついた画分をシリンジ等で分取する（図 5）．

が，通常の 30％アクリルアミド，0.8％ビス溶液を２倍量

4.e.3.2 native P AG E による解体・分画用いてもよい．

フィコビリソームのサブ複合体は native PAGE を用いることでも分離することができる

分離パターンを図６に示す．

．以下に現在当研究室で行っている例をしめす．このときに得られるのは
主にフィコビリタンパク質の三量体，もしくはそれに低分子量のリンカータンパク質がついた複合体である．電4.e.4 フィコビリソーム／光化学系Ⅱ超複合体の調製

気泳動条件は低塩条件であるため，フィコビリソームはフィコビリソームがどのように光化学系複合体と結合

解体し，ロッド由来のディスク，コア由来のディスク，

し，光エネルギーを伝達しているかを知るためには，
フィコアメンブレンリンカーを含むコア複合体のバンドなど

コビリソームと光化学系複合体の超複合体を調製する必が分離される．

要がある．1980年代にこれを目指した論文がいくつか報告されているが，もっとも有望な方法を以下に述べる．

【材料】

材料はやはり安定性が高い好熱性 Thermosynechococ-

泳動用緩衝液：Tris-glycine buffer

cus elongatus BP-1 で，高イオン強度溶液と穏和な界面

Tris hydroxymethylaminomethane 1.515g
Glycine7.205gddH O

1L2009 低 温 科 学

vol.67活性剤ジギトニンを使用する ．

299

（0.4mg Chl mL ，1mM phenylmethylsulfonyl
fluoride，5mM MgCl ，0.1％(w/v)DNase，0.5％
digitonin を含む SPC buffer，このとき界面活性剤とクロロフィルの濃度比(w/w）が 12.5になる）
２．インキュベート（25℃で 30〜60分間）
３．遠心（25,000g，10分間）して，膜断片を除く．
４．上清を段階的なショ糖密度勾配（0.5，0.75，1.0，
1.5M ショ糖，SPC buffer）に重層する．
５．超遠心（300,000g，70分間，スイングロータ使用）．
結果：1.0M と 1.5M ショ糖層の間の暗緑色のバンド
がフィコビリソーム―光化学系 超複合体である．

4.e.5 窒素飢餓におけるフィコビリソームの分離
フィコビリタンパク質は全細胞 タ ン パ ク 質 の 10−
図 6：Thermosynechococcus elongatus の フィコ ビ リ ソームの native PAGE による分離例．

20％を占めるといわれ，いわば有機窒素の貯蔵体という側面もある．したがった，培地から窒素を除くと窒素固定ができないシアノバクテリアや藻類はフィコビリタン［実験］ Thermo s ynecho co ccus のチラコイド
膜の調製

パク質を分解する ．このしくみは，次に述べる補色順化とは異なり積極的な現象である．

１．細胞を 0.15％(w/v）リゾチーム，0.5M ショ糖，0.1
M リン酸カリウム（pH 7.2）に懸濁する．
２．40℃で２時間緩やかに撹拌．この処理により細胞壁が壊れ，スフェロプラストになる．
３．スフェロプラストを遠心により回収する．
４．SPC buffe（
r 0.5M ショ糖，0.5M リン酸カリウム，［実験方法］
・BG11 培地から硝酸塩を除いた BG11 培地を使用す
る．
・窒素飢餓の早い応答をみるためには，細胞をフィルター濾過して培地を交換する．

0.3M クエン酸ナトリウム，0.2mM CaCl ，1.5％

結果：フィコビリソームのサイズの減少は 3.4e.2の単(w/v)牛血清アルブミン，pH 6.9）に懸濁する．

離分画法によって追跡することができる（図 7）．

５．フレンチプレス（12,000kg/cm ）にかけ，細胞を破砕する．
６．遠心（10,000g，10分間）して，非破砕の細胞を除
く．上清を回収する．
７．上清に 0.1％(w/v）の DNase を加え 40分間，20℃で処理する．

4.e.6 補色順化
ある種のシアノバクテリアのフィコビリソームには620nm 付近の赤色光を吸収するフィコシアニンの他に，570nm 付近の光を吸収するフィコエリスロシアニンや

８．遠心（22,000g，20分間）
して，上清を段階的なショ

フィコエリスリンといった短波長の光を吸収する集光タ

糖 密 度 勾 配（0.7，0.8，1.0，1.2M ショ糖，SPC

ンパク質が含まれる．これらの種の中には，緑色光下でbuffer）に重層する．

フィコエリスリンを蓄積し，赤色光下でフィコシアニン

結果：遠心（200,000g，70分間）．0.8M と 1.0M ショを蓄積するものが古くから知られてお り，補 色 適 応

糖層の間にフィコビリソームを結合したチラコイド（Complementarychromatic adaptation）と呼ばれてい膜の層が得られる．

る．この現象は慣例的に適応（adaptation）と呼ばれているが，遺伝子の変化を伴わない環境応答現象である［実験方法］フィコビリソーム―光化学系Ⅱ超複合体の単離
１．フィコビリソームを結合したチラコイド膜を懸濁300

ので，以下，順化（acclimation）と呼ぶ．補色順化は，
フィコシアニンとフィコエリスリンを持つシアノバクテ
リアの性質としてよく知られており，パスツールのカル
フィコビリソーム

①緑色光に 530〜540nm，赤色光には 630〜640nm 付近の波長の光を用いる．
②約 10μE m sec の弱光で細胞を培養する．
③濃度の薄い細胞を２週間程度かけて培養する．
重要なポイントは，それぞれの光条件を弱光にすることである．フィコシアニン励起の赤色光であっても，その光強度が 30‑40μE m sec より強いと，むしろフィコシアニン含量が低下する強光応答が起こる．また，一度合成されたフィコシアニンやフィコエリスリンはあまり分解しないので，弱光でできるだけ長期間培養し，培養開始時の細胞の持ち込みをできるだけ少なくすることが重要である．光源は白色光とカットフィルターやセロ
図 7：窒素飢餓におけるフィコビリソームの分解過程における分離プロフィール．

ハン等を組み合わせてもよい．
また色付きの蛍光灯や LED 光源を利用してもよい．
また，680nm 付近の赤色光によってクロロフィルを励起

チャーコレクションの株も補色順化によって分類されてすると，系 ／系 比の調節が起こる可能性もあるので，いる．補色順化の主な種類として，次の３つに分けられ

注意する．

ている ．
Group

：緑色光や赤色光の下でフィコエリスリンとフィコシアニンの組成を変化しない（補色順
化しない）
．

Group

：緑色光の下でフィコエリスリンを増やすが，赤色光の下ではフィコシアニンを増やさな
い．

Group

：緑色光の下でフィコエリスリンを増やし，
赤
色光の下でフィコシアニンを増やす．

これらは赤色光，緑色光を照射して培養し，その細胞の吸収スペクトルを測定することで分類が可能である．
代表的な種は，Group II では Nostoc punctiforme ATCC
29133，Group III では Fremyella diplosiphon UTEX 481
であるが，PCC のリストでは株ごとに記載されている．
Group II と III は，発現誘導を受ける第２のフィコシア
ニン遺伝子があるかどうかで区別されるといわれているが，近年の遺伝子の研究によれば第２のフィコシアニン
遺伝子がなくてもリンカータンパク質の発現制御によってフィコシアニンの蓄積制御が起こる可能性があり，この分類はそれほど絶対的ではないかもしれない．
［実験方法］
培養の際には以下の点に注意する必要がある．

2009 低 温 科 学

vol.67

文献
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301

３章 単離・精製・活性測定

４．タンパク質複合体の単離
f．小型サブユニット
岩井 雅子 ，池内昌彦

チラコイド膜に存在する光合成装置には多数の疎水性小型サブユニットが結合している．これらのタ
ンパク質の分析法は一般のタンパク質実験法と異なるので，その分析法と問題点を概説する．

Low-molecular-mass subunits of photosynthetic apparatus
M asako Iwai, Masahiko Ikeuchi
Low-molecular-mass subunits are unique components of photosynthetic apparatus harboring photosystems andcytochrome b6/f complex in the thylakoid membranes. We summarized technical points for handling of theselow-molecular-mass subunits including detailed protocol of SDS-urea-PAGE.

型サブユニットを分離するには，それだけでは不十分で

4.f.1 背景
光化学系ある．そのおもな理由は，低分子の疎水性タンパク質がや光化学系 複合体，シトクロム b /f 複合

SDS と脂質の混合ミセルの泳動と競合すること，また脂体には多数の小型サブユニットが結合している．これら

質を除いてもそもそもシャープなバンドを形成できないのほとんどはチラコイド膜を貫通する αヘリックスをことにある．この問題点を解決したのは筆者らの SDS-

もち，それぞれの反応中心を周辺から取り囲むように存

urea-PAGE 法 と Shagger ら の Tris-Tricine 法 な ど

在している．これらには進化的にシアノバクテリアから特殊な電気泳動法である．これらは，3章 6f で詳しく述

高等植物まで広く保存されているものが多い．その中にべられているが，ここでは，筆者らの方法を，コツなど

は，複合体の会合や安定化，ステート遷移や電子伝達なを交えて紹介する．

ど特定の役割が提唱されているものもあるが，近年の結晶構造解析の結果と合致しないものもある．これらの小型サブユニットの構造や機能，生理的役割についてはさらに詳しく調べる必要があるが，疎水性の低分子タンパ
ク質に固有の技術的問題も多い．本項では，これらの小型サブユニットの分離・同定に使われる SDS-PAGE 法
や抗体，アミノ酸配列の決定，質量分析法などさまざまな手法とその問題点について解説する．

4.f.2 S D S -urea-P AG E 法
SDS ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル 電 気 泳 動 法（SDSPAGE）はタンパク質の分離法としては非常に有効であり，なかでも濃縮ゲルをとり入れた Laemmli の方法 は広く利用されている．一般に，低分子のタンパク質を分離するには，高濃度のアクリルアミドが適しているが，光合成系に存在する疎水性の分子質量 10kDa 以下の小

１) 東京理科大学理工学部応用生物科学科
２) 東京大学大学院総合文化研究科広域科学専攻生命環境科学系

2009 低 温 科 学

vol.67

図 1：SDS-urea-PAGE による光化学系 複合体の分離例．
泳動先端部のクロロフィルを含む部分は SDS と脂質の混合
ミセルに相当する．lane 1：Thermosynechococcus elongatus
野生株の系 ，lane 2：同 psbY 破壊株の系 ．赤い矢印は，破壊によって消失した PsbY のバンド位置．

303

SDS-urea-PAGE 法のポイントは，高濃度の尿素を用グネットを軽い側の管にも入れてもよい．

いることで，SDS と脂質の混合ミセルの移動度を大きく＊混合する２つの溶液の比重が大きくちがうので，等すること，またタンパク質に弱く結合した SDS を解離

量の溶液を連通管に入れ，両管をつなぐチューブをしてくっきりとしたバンドとして分離することにある．

開くと，重い側の液が軽い側へ逆に流れ込んでしま

また，この方法は Tris-Tricine 法と比べて，幅広い分子

う．また，マグネットを重い側にだけ入れると，さ量のタンパク質を分離できることや安価な試薬だけででらに逆流が促進される．この逆流を避けるコツは，きる点ですぐれている．一方，室温が 20℃以下では尿素２つの溶液を入れた後，ペリスタポンプで約 1mLが析出するため泳動できないことは欠点である．

ほど流した後で，両管をつなぐとよい．実際には，両管をつなぐ細いチューブをスクリューコックなど［実験方法］

で閉じておき，液を少し流してから，コックを開き，準備

チューブ内の気泡を押し出すのが簡便である．軽い・通常サイズのスラブ泳動用ガラス板（16cm×16cm，側の管の上部を手のひらで軽く押せば，チューブ内

スペーサー 1mm）を用意する．
・連通管型グラジエント作製器の両筒をつなぐチューブ
をスクリューコックで閉じておく．
・ペリスタポンプ：流速を 1〜1.5mL min に設定しておく．
・重合の予備実験が必要である．流速 1.5mL sec の場の気泡を押し出し，軽い側の液を重い側の管に流し込むことができ，その後の混合がスムーズに進む．
３．ペリスタポンプによってグラジエントを作製．流速
約 1〜1.5mL min ．
４．適当な位置で送液を止める（ガラス板の上端から約2.6cm くらいが目安）．

合でも，18mL を流し込むには，10分以上要する．こ５．水もしくはブタノールを重層して，空気を遮断する．

の間にアクリルアミドが重合しないように，しかも，６．室温で１時間以上放置して十分に重合させる．

30分後には重合するように過硫酸アンモニウム溶液

７．重層した水またはブタノールを除き，洗浄後，濃縮（重合開始剤）と TEM ED（重合促進剤）の量を調節す

ゲル混合液を流し込み，手早くコウムを挿入する．

る必要がある．これらを多めに入れるときは，重合開８．30min 以上放置して重合を完了．

始剤などを加える前に，アクリルアミド混合液を氷上で１分ほど冷却して重合しにくくするとよい．

保存溶液作製の注意
・分離ゲルの pH が重要である．分離ゲル用緩衝液の調ゲル作製

製では，3M Tris 溶液に濃塩酸を加えて，pH を調整

１．16‑22％濃度勾配用の溶液を，
表 1に基づいて調製すするが，このとき発熱する．Tris は緩衝液の中でもとる．なお，過硫酸アンモニウムと TEMED 以外を混合

くに pH の温度依存性が高い．したがって，濃塩酸を加して，少し暖めるなどして尿素を完全に溶解する．その後，すべての準備ができてから，過硫酸アンモニウ

表 1：
分離ゲル

ムと TEMED を加え，よく混合する．

16％

22％

60％アクリルアミド溶液Ａ
60％アクリルアミド溶液Ｂ
分離ゲル用緩衝液
濃縮ゲル用緩衝液
尿素
HO
60％(w/v)ショ糖
10％(w/v)SDS

2.4mL
−
1.8mL
−
4.05g
1.8mL
−
90μL

3.3mL
−
1.8mL
−
4.05g
−
0.9mL
90μL

−
0.4mL
−
0.4mL
1.8g
1.85mL−
40μL

10％過硫酸アンモニウム
TEMED

30μL
4.3μL

20μL
4.3μL

28.5μL
4.5μL＊筆者らは，50mL 容量の大きいガラス試験管で混合液を調製している．尿素は周りから溶解熱を奪うた
め，高濃度の溶液をつくりにくい．必要に応じて，湯浴もしくは湯沸かし器のぬるま湯で少し暖める．
しかし，溶液の温度が高くなると，グラジエント作
製中にアクリルアミドが重合してしまうおそれがある．尿素の溶解後は，水道水に浸すなどして室温付
近まで冷ます．これらの作業には試験管が便利であり，またボルテックスもできる．
２．グラジエント作製用連通管にこれらの溶液を入れる．重い 22％溶液を入れる側の管（ペリスタポンプにつながれている側）には小さなマグネット（体積は約0.5〜1mL）
を入れ，スターラーで混合する．同様のマ
304

濃縮ゲル

Ａ：60％(w/v）アクリルアミドモノマー，0.8％(w/v）ビスアクリ
ルアミド
Ａ：60％(w/v）アクリルアミドモノマー，1.6％(w/v）ビスアクリ
ルアミド
分離ゲル用緩衝液：3M Tris-HCl(pH 8.6）
濃縮ゲル用緩衝液：1.26M Tris-HCl(pH 6.8）

小型サブユニット

えて，見かけの pH が 8.6になっても，しばらく放置しし，水などと混合後は長く放置すると CBB が凝集して冷ますと，pH は 8.7〜8.8に上昇する．そのため，て不溶物をつくりゲル表面を汚す．なお，この汚れはもう一度濃塩酸を加えて pH を調整する必要がある．

メタノールで洗い落とすこともできる．一度使用した

なお，分離ゲル用緩衝液の pH が 8.8以上では，低分子染色液にはゲル中の SDS が溶けだしており，CBB の

量域は拡がるが，バンドはぼけて役に立たない．pH が染色性を抑制するので，再利用はしない．CBB ストッ8.4以下ではバンドはシャープになるが，低分子量域

ク液は安定であるが，メタノールと酢酸を混合すると，は圧縮されてしまうので，いい分離は期待できない．

エステル生成が起こるので，エステル臭が強くなった

したがって，不満足な結果の場合は，分離ゲル用緩衝

染色液は未使用でも使用しない．

液の pH を再度確認した方がよい．

脱色：短時間の脱色は，25％メタノール，10％酢酸の水

・アクリルアミド溶液：室温で遮光して保存する．濃度溶液で行う．また，overnight や長期間の脱色もしくはが高いので，４℃では沈澱を生じる．アクリルアミド

放置するときは，10％酢酸に浸し，キムワイプやクリ溶液Ａはビスの量が半分になっている．これは溶液Ｂ

ネックスなどのセルロースパルプを折りたたんで同じでも代用できるが，分離は溶液Ａの方が少しよい．

容器に入れておく．これらのセルロースパルプは溶液

・過 硫 酸 ア ン モ ニ ウ ム 溶 液：溶 液 を １ヶ月 く ら い は

中の CBB の凝集物をトラップしてゲル表面の汚染を−20℃で保存できる．重合条件が微妙なので，同じ溶軽減してくれる（メタノール濃度は 15％以下のときに液を用いて，最適条件を固定することがもっとも重要

限る）．

である．
電気泳動における注意

4.f.3 Wes tern blo tting 法

・泳動するサンプルは約 3μg Chl になるよう調整する．

筆者らは合成ペプチドや大腸菌で発現させた融合タン

サンプル量が多すぎると，持ち込みの脂質が過剰にな

パク質に対する特異抗体の作製を試みた．いくつかの小り，SDS と脂質の混合ミセルの泳動位置が先端から遅型サブユニット（PsbI，PsbTc，PsbK など）に対するウ

れて，低分子タンパク質の泳動を妨害する．

サギの抗体は抗体価は高くないが Western blotting に・濃縮ゲルにも 7.5M 尿素が含まれており，上部電極液使用できた ．一方，PsbM に対する抗体は免疫用の抗原を入れた後，サンプルをロードするまでに，周りのゲとは反応したが，チラコイド膜中の PsbM タンパク質をルから尿素が溶けだし，ウェルの底には高濃度の尿素

実用レベルで検出できなかった ．小型サブユニットのが蓄積する．そのため，サンプル溶液に十分な重さが膜表在性領域は限定されており，エピトープとして十分ないと，ロードしたサンプルが浮き上がってくる．対でなかったと考えられ，さらに検討が必要である．

策としては，60％(w/v）ショ糖溶液をサンプル溶液に少量添加するとともに，ロードの直前にウェルの底の尿素を含む液をシリンジで除去する．

4.f.4 エドマン分解法
N 末端アミノ酸配列の決定はタンパク質同定の鍵で

染色液：0.04％クーマ ジーブ リ リ ア ン ト ブ ルーR-250

ある．SDS-urea-PAGE で展開したバンドを PVDF 膜（CBB），50％メタノール，10％酢酸で，室温で１時間（polyvinylidene difluoride）にブロットし，プロテイン

以上，ゆっくり振盪しながら行う．筆者らは CBB ス

シーケンサーでＮ末端アミノ酸配列を決定する．この方トック液（最終 0.08％ CBB，100％メタノール）を用法は，アミノ酸配列として確実にタンパク質を同定でき意して，使用直前に CBB ストック液 100mL，酢酸 20

るが，プロテインシーケンサーの検出感度が低いことがmL（最終 10％），H O 80mL（合計 200mL）を混合

欠点である．小型サブユニットのうちでも PsbJ タンパ

し，すぐに使用している．CBB の浸透性は悪いので，

ク質は，ほとんど検出できない．その理由は明らかでは染色時間が短いとゲル内部のタンパク質は十分には染ないが，SDS-urea-PAGE でも分離されるバンドが幅広色されない．これはゲルを切ってみるとよく分かる．

くなって，検出感度に到達していないためかもしれない．

なお，CBB は製品によって純度や不純物にちがいがあPVDF 膜（0.2μm 孔径，ミリ ポ ア 社 の イ モ ビ ロ ンり，染色性が異なることがある．筆者らは Bio-Rad 社

PSQ グレードなどがある）に電気的にブロットし，アミのものを使用しているが，この色素は不純物はそれほドブラック 10B で染色し，目的のバンドを切り出す．ブ

ど多くなく，不溶物を濾過除去する必要はない．しかロット装置はセミドライ型が効率がよい．染色液の組成

2009 低 温 科 学

vol.67305

は，0.1％ アミドブラック 10B，50％メタノール，10％

でなく，細胞や光化学系複合体などをそのまま網羅的に

酢 酸 で，染 色 時 間 は 1‑2分 間 で 十 分 で あ る．脱 色 は分析できることも大きな利点である．しかし，疎水性ペ

ddH O のみでよい．CBB も染色剤として使用できるが，プチドや低分子タンパク質の分析は不得手であり，膜貫バックグランドが強く染色されるので，脱色作業をてい

通性の小型サブユニットの検出はほとんど報告されていねいに行う必要がある．プロテインシーケンサーには，ない．筆者らは，シアノバクテリア Synechocystis 全タン

感度に定評がある Procise システム（アプライドバイオ

パク質の網羅的な解析を行い，全遺伝子の約 45％の産物

システムズ）があるが，メンテナンスが面倒である．一を質量分析で検出した ．しかし，系方，島 津 の シーケ ン サー（モ デ ル PPSQ-20 な ど）は

きたのは PsbA PsbB PsbC PsbD PsbE psbO PsbU

HPLC システムの溶離液としてアセトニトリル溶液をPsbV PsbZ だけで，ほとんどの小型サブユニットは検出再利用することができ，運転費用が安く，個人でもある

されていない．しかし，近年の分析法の進歩により，光程度メンテナンスが可能であるが，感度はやや落ちる．

化学系 複合体を出発標品とすれば，ほとんどの小型サ

いくつかの小型タンパク質のＮ末端はホルミル化されブユニットも検出できるようになってきた ．このため，ており，エドマン分解を受けないが，0.6N HCl 処理に

SDS-PAGE で予想外の位置に泳動されるタンパク質でよって除去することができる．切り出した PVDF 膜のバも同定できるメリットもある．筆者らの具体例としては，ンドをエッペンチューブに入れ，0.6N HCl 溶液に浸PsbTc のＣ末領域にカセットを導入して本来のバンド

し，12〜24時間ほどインキュベートする．なお，PVDFが消滅したので遺伝子破壊できたつもりであったが，質膜の表面は非常に疎水的で，一度乾燥すると水溶液（希量分析によってＣ末の truncation であることが判明し塩酸も同様）はほとんどはじかれる．しかし，塩酸は揮たことがある ．質量分析の欠点としては，シグナル強度

発性なので，PVDF 膜を入れたチューブをボルテックス

がペプチド鎖の配列や特性に大きく依存するため，異ななどでよく混合しつづければ，十分な結果が得られる．

るタンパク質の量比を議論することはほとんどできなに絞ると，検出でSDS-urea-PAGE の分離能はかなり高いが，切り出しい．この欠点も，異なる同位体でラベルした標品を同時た１本のバンドをシーケンサーで分析しても，複数のアに質量分析することで，標品間のタンパク質の変動を追ミノ酸シグナルが得られることも多い．異なる小型サブ

跡することが可能になったが，まだ小型サブユニットのユニットが微妙にオーバーラップして泳動されるためで分析に適用された報告はない．

ある．既知の配列に相当するシグナルを差し引くか，近接したバンドも分析して，それらのシグナル強度を比較することで，特定のタンパク質の配列を知ることができ

4.f.6 遺伝子操作法る．また，各アミノ酸のシグナル強度から，その存在量

これまでに多数のタンパク質が光化学系複合体などにをおおまかに推定することもできる．しかし，タンパク結合していることが報告されている．上述したエドマン

質によってブロット効率は異なり，エドマン分解での切分解法でも質量分析法でも，検出できたタンパク質がす

出効率や HPLC でのピークの形状などはアミノ酸残基

べてその複合体に特異的に結合しているのかそれとも非の種類によって異なるので，単純にアミノ酸ピークの高特異的なものか，判断できないものも多い．そのためにさだけで存在量を推定するのは危険である．異なるタンは，これらのタンパク質の遺伝子を操作してその影響を

パク質の同じアミノ酸残基のピーク高を比較したり，異調べることや，タグを導入してマイルドな条件でタンパなる標品での同じタンパク質の同じアミノ酸残基のピー

ク質（複合体）を単離すること ，抗体の代わりにタグをク高を相互に比較することで，それらの存在量の変化も検出するなどさまざまな遺伝子工学的アプローチを組み議論できる．

合わせることが重要になってきている．
通常の遺伝子破壊の手法を小型サブユニットに応用す

4.f.5 質量分析法

る場合は，標的 ORF のサイズが小さいため，制限酵素の認識部位が限定される．小型サブユニットの遺伝子破壊

質量分析法は感度が非常に高く，脱ホルミル化のようでは，わずかな残基の有無でも本来の破壊株の表現型にな前処理を必要としないなど便利な点が多いが，アミノ影響が出るので，とくに注意が必要であることは，4.f.5

酸配列を直接決定するのではなく，分子質量と合致するの PsbTc でも述べた ．多くの小型サブユニットは膜貫配列を推定しているだけであり，ゲノム情報が必須であ通性という意味では「膜内在性」といえるが，光化学系

る．また，SDS-PAGE のバンドを抽出して分析するだけ

複合体において周辺部に結合するという意味では「外在306

小型サブユニット

性 peripheral」といえる．外在性のサブユニットは複合体に強く結合していないことが多い．このような小型サブ文献

ユニットの性質を調べるには，4.f.1〜5の生化学的解析

１) U.K.Laemmli, Nature 227 (1970)P.680.

と本項の遺伝子操作の組合せが必要で，そのような材料

２) H.Schagger & G.von Jagow, Anal. Biochem. 166

としては好熱性シアノバクテリアが適していると考えら(1987)P.368.
３) M .Ikeuchi,& Y.Inoue,Plant Cell Physiol.29 (1988)P.
1233.
４) M .Ikeuchi, & Y.Inoue, FEBS Lett. 241 (1988)P.99.

れる．
好熱性シアノバクテリアの形質転換法については，
5.1a を参照されたい．
最近の系

複合体の結晶構造を決定した論文（Guskov

et al.Nature Struct.Mol.Biol.16 (2009)P.334）では，
PsbJ のＮ末端はアセチル化されていると推定している．
アセチル化されたポリペプチドの配列はエドマン分解では決定できない．したがって，アセチル化が PsbJ タンパ
ク質がこれまで検出されなかった理由かもしれない．な
お，その根拠としては，MALDI-TOF 型の質量分析によって 求 め た 分 子 質 量 4017Da が ア セ チ ル 化 さ れ た
PsbJ と一致する．しかし，エドマン分解でシグナルが得

５) 青山智佳，修士論文，（2003）．
６) Y.Ishino, H.Okada, M.Ikeuchi, & H.Taniguchi,
Proteomics 7 (2007)P.4053.
７) M .M.Nowaczyk, 私信．
８) T.Henmi, M.Iwai, M .Ikeuchi, K.Kawakami, J.R.
Shen, & N.Kamiya, J. Synchrotron Radiat. 15 (2008) P.
304.
９) H.Fey, D.Piano, R.Horn, D.Fischer, M.Schmidt, S.
Ruf, W.P.Schroder, R.Bock, & C.Buchel, Biochim.
Biophys. Acta 1777 (2008)P.1501.

られる PsbF もアセチル化を仮定するなど，質量分析法にもまだ問題があるようである．

2009 低 温 科 学

vol.67307

３章 単離・精製・活性測定

４．タンパク質複合体の単離
g ．光化学系Ⅰコアクロロフィル a の分別抽出法
池上勇

本稿では光化学系

反応中心複合体に結合している約 150分子のクロロフィル a の有機溶媒による分別抽出法について述べている．水飽和度が 70％〜80％のジエチルエーテルで処理することにより，
Chl a/P700 比が約 10の標品を得ることができる．

Selective Extraction of antennain the core complex ofI

Isamu Ikegami
This section describes the ether-extraction of PSI-RC complexes with diethyl ether containing water at appropriate saturation level, which leads to the preparation of P700-enriched complexes with the Chl a/P700 ratio of
about 10.

媒を用いることによって，クロロフィルなどの脂溶性成

4.g .1 始めに光化学系分を抽出することはできるが，多くの場合は，同時に反反応中心複合体は 82‑83kDa の大きさを応中心部に存在するクロロフィル（P700 など）も抽出・

もつ PsaA/PsaB ヘテロダイマーコアポリペプチドとそ破壊される上，抽出後のタンパク質も変性させるので，の周りを取り囲む 9‑11個の小サブユニットからなり，
こ

分光学的解析に適した標品を得ることは難しい．

こに好熱性シアノバクテリア（Thermosynechococcus

本項で述べるジエチルエーテル抽出法 は，光化学系（１分子の Chl a epimer
elongatus）では 96分子の Chl a

コアポリペプチドの外縁部は疎水的環境にあり，
一方，

を含む）
，22分子の β‑カロテン，２分子のフィロキノン，
３分子の Fe-S cluster，および４分子の脂質を結合している（図 1) ．高等植物エンドウマメ（Pisum sativum
var.alaska）では Lhca1〜4 と呼ばれる４つの光化学系
アンテナ色素タンパク質をさらに結合した複合体として得られるが，Lhca を除いた複合体の構造はシアノバ
クテリアとほとんど同じであり，ここに結合している約100分子の Chl a 分子の結合位置や配向性も好熱性シア
ノバクテリア Thermosynechococcus elongatus で明らかになった配置とよく一致している ．エンドウマメで位置が同定された２分子のフィロキノン，３分子の Fe-Scluster，および５分子の β‑カロテンの位置もシアノバ
クテリアと変わっていない．
これら複合体に結合して い る ク ロ ロ フィル な ど の
cofactors の 大 部 分 は 複 合 体 の 主 成 分 で あ る PsaA/
（図 1）
，タンパク
PsaB ポリペプチドに結合しているため質的な分離精製法ではクロロフィルなど脂溶性の分子数を減少させることはできず，そのため，反応中心部に存在する P700 などの特殊なクロロフィルの分光学的挙動を解析することは困難である．一方，極性の高い有機溶
１) 帝京大学薬学部

2009 低 温 科 学

vol.67

図 1：(II Fig1.jpg）
好熱性シアノバクテリア Thermosynechococcus elongatus の光化学系 反応中心複合体の結晶構造図 ．光化学系 複合体
は 12個のポリペプチド，95分子のクロロフィル a（周辺部のアンテナクロロフィル a を白色，中心部のコアクロロフィル，１分子のクロロフィル a エピマー，22分子
a を赤色で示す）の β‑カロテン（黄色），３組の 4Fe-4S クラスター，２分子のフィロキノン（ビタミン K1）（赤橙色），４分子の脂質（３分子のホスファチジルグリセロール，１分子のモノガラクトシ
ルジアシルグリセロール）（茶色）が有機的に組み合わさって構成されている．図はその複合体をチラコイド膜面に対して上（ストロマ側）から見たときのクロロフィル配向構造を強調して示している．Protein Data Bank ID(1JB0）より作図．

309

電荷分離を起こすポリペプチド中心部は親水的環境にあることを利用したクロロフィル分別抽出法である．極性の低い複合体外縁部に結合したクロロフィルから優先的に抽出除去していくことにより，極性の高い反応中心部に結合している P700 などのクロロフィルを色素的に精製できる．この方法で得られた標品を用いて，反応中心部のクロロフィルの詳細な分光学的解析が可能になった．また，この方法により，クロロフィルのほかに，極性の低い β‑カロテン，フィロキノン，脂質を容易に抽出できるが，抽出後のポリペプチドの構造は変性せずに保たれるため，クロロフィルを始め，フィロキノンなど脂溶性成分の再構成実験も可能になった．

4.g .2 調製法
4.g .2.1 ホウレンソウ光化学系Ⅰ複合体の単離エーテル抽出を行うために，適切な標品を選ぶ必要がある．ここでは，抽出に適したホウレンソウ光化学系
複合体調製法を示す（図 2）．
【光化学系Ⅰ複合体調製に関する注意点】
１) 材料は高等植物であればホウレンソウ以外を用いてもよい．高等植物以外（藻類，シアノバクテリア，光化学系 型光合成細菌）では，エーテル処理に対する反応中心クロロフィルの抵抗性が低いため，分別抽出ができない場合がある．

図 2：ホウレンソウ葉からジギトニン処理による光化学系
複合体の調製法

２) 調 製 に 用 い る Buffer solution の 組 成：50mM，50mM NaCl，0.4M suphosphate buffer(pH 8）
crose．

げて再度，遠心し，5.5以上のときの上清を用いる．
６) 得られた光化学系 複合体は光化学系

反応中心複３) 葉緑体可溶化時のジギトニン濃度は 3‑5％(w/w)

合体に光化学系 アンテナ色素複合体（Lhca）が一部（液量は 100mL〜200mL）．この条件ではジギトニン

結合している．Chl a/P700 比は約 150である．Lhca

は完全には可溶化せず，粉末との平衡状態（飽和濃度）

は次のエーテル処理後の可溶化操作で不溶性沈殿としを保ちながら攪拌する．可溶化溶液に M gCl を加えるて除去できる．

のは，葉緑体膜の stacking（ストロマラメラとグラナ

７) 凍結乾燥する前に緩衝液成分やジギトニンをできる

ラメラの構造がはっきり区別できるようにすること）

だけ除くために，蒸留水で２回洗う（沈殿をよくほぐを起こし，光化学系

して同じ遠心操作を繰りかえす）．
調製に用いた試薬類と の分離を容易にするためである．

が残っていると，凍結乾燥後のサンプルがふわふわし４) 光化学系 複合体の調製にはジギトニン以外の表面

た粉末状にならず，次のエーテル処理ができない．

活性剤（Triton X-100，Dodecyl maltoside など）を使

８) 凍結乾燥した光化学系 複合体は薬包紙に分包，さうことも可能であるが，その場合は，次のエーテル処

らに，アルミホイルで包んで遮光し，真空容器に入れ理においてクロロフィルの分別抽出の効率が悪くなて空気を除き，窒素ガスと置換して−80℃で保存する．

る．
５) 126,000g，20min の遠心で光化学系数年間保存できる．
複合体が沈殿，除去される．この沈殿の上部を取って Chl a/P700

4.g .2.2 エーテル抽出法
エーテル抽出法を図３に示す．

比を測定する．この比が 5.5以下の場合は回転数を上310

P S I C hl a の分別抽出法

になる），期待された結果が得られないことがある．また，夏は外気温度が高いので，操作中，室温に晒すと，エーテルの温度やエーテル水飽和度が変化するので，遠心操作はできるだけ手早く外気に晒さないよう行うことが重要である．
５) 標品は一回あたり約 40mL のジエチルエーテルで抽出処理する．遠心管にエーテルを少量加え，固まりが無いようブラシ（有機溶媒抵抗性のもの）でよくほぐしてから，残りのエーテルを加える．この操作をもう一回繰り返す．色素のほとんどは一回目の操作で抽出される．
二回目の遠心による上清は薄い緑色である．
上清（エーテル抽出液）は捨てる．
６) 抽出後の標品に残ったエーテルは完全に飛ばす（数分で自然乾燥する）．
７) エーテル臭が無くなったら，1mL のリン酸緩衝液（20‑50mM Phosphate buffer，50mM NaCl，pH 8）に懸濁させる．このとき，緩衝液の pH を酸性にすると，細かく分散しない（標品が凝集しやすい）．アルカ
リ性にするほどより可溶化する．
図 3：光化学系 複合体のエーテル処理法

８) 0.1〜0.3％ Triton X-100 により可溶化しないもの
が薄緑色〜灰白色の沈殿として除かれる．ここに色素【エーテル処理に関する注意点】

が完全に抽出された（Triton X-100 で可溶化されな

１) 一回の処理で 10mg〜50mg の凍結乾燥した光化学い）Lhca-アポタンパク質が含まれる．

系

複合体を用いる．乾燥重量当り約 1/10が Chl a９) 遠心の上清は−80℃で保存する．

量となる．
秤量の際，
空気中の湿気を吸って重量が徐々10) ジエチルエーテル以外の有機溶媒ではアセトンが類に増加するので，標品を室温に戻した後，湿度の低い似の性質を示すがジエチルエーテルほど有効ではな

環境下（湿度 50％以下が望ましい）で金属製遠心管に

い．アルコール類はクロロフィルを非特異的に抽出す

量り取る．

るので P700 の分別濃縮はできない．ジエチルエーテ

２）遠心管をパラフィルムなどで密封し，低温室（5℃）に入れる．

ルに数％のアセトアルデヒドを加えることによって，クロロフィルの分別抽出の効率をやや高めることがで

３) 水飽和度の異なるエーテル約 80mL（抽出２回分）
を以下のように調製し，5℃に保っておく．
(100％水 飽 和 エーテ ル xmL＋０％(dry) エーテ ル

きるが，Triton X-100 による可溶化の効率が低下す
る．
11) アンテナ色素タンパク質および光化学系 複合体にymL）結合しているクロロフィル類はこのエーテル処理によ① 水飽和エーテルの調製：500mL のジエチルエー

りほぼ完全に抽出される（すなわち，P680 の分別濃縮

テルに 10mL 以上の水を加え，よく攪拌して一昼夜はできない）．そのため，凍結乾燥した葉緑体を用いて放 置 す る．100％水 飽 和 エーテ ル は 5℃で 約 １％

エーテル処理することにより，ほぼ同様な P700 が分(v/v）の水を含んでいる．5℃保存．

別濃縮された標品を得ることができる．

② 乾燥エーテルの調製：500mL のジエチルエーテ

12) 好熱性 シ ア ノ バ ク テ リ ア（Thermosynechococcus

ルに 10g 以上の無水硫酸ナトリウムを加え，よく攪

elongatus）でも同様な P700 の分別濃縮標品を得るこ拌して一昼夜放置する（これを dry-または０％水飽とができる ．しかし，光化学系 タイプの光化学系を

和エーテルと呼ぶ）．5℃保存．

持つヘリオバクテリア（Heliobacterium chlorum）で４) エーテル抽出操作は温度（5℃）と低温室内の湿度にはエーテル処理はそれほど有効ではない ．また，クロ注意する．湿度が高いと，操作中に水分がエーテル中

ロフィル d を持つアカリオクロリス（Acaryochlorisに入り，エーテルの水飽和度が増し（時には水過飽和

marina）では，クロロフィルの分別抽出はできない

2009 低 温 科 学

vol.67311

表 1：光化学系 反応中心複合体の構成成分に対するエーテ
ル処理効果（Unpublished data）．

4.g .3 エーテル抽出標品の性質
4.g .3.1 クロロフィルの抽出
図 4はジエチルエーテルの水飽和度を変えたときのChl a,b および P700 の抽出％を示している．dry(0％water-satureted）ether では Chl a の約 60％が抽出されるが，P700 は全く抽出されない．エーテルの水飽和度を高めるにしたがって Chl a はさらに抽出され，70％水飽
和エーテルで約 90％の Chl a が，また，100％水飽和エー
テル（water-saturated ether）で 95％以上の Chl a が抽PS I Components

Effects of ether treatment

Constituents
Chl a, b
Carotenoids
LipidsPolypeptides

Selectively extracted
Fully extracted
Almost fully extracted
Not extracted

Electron carriers
P700 (Chl a dimer)(Accessory Chl a)A(Chl a monomer)A(Quinone)
A(FeS cluster)F
F /F (FeS clusters)

Not extracted
Not extracted
Not extracted
Fully extracted
Not extracted
Not extracted

出される．一方，P700 は 70％水飽和エーテルまではほとんど抽出されず，それ以上の水飽和度で徐々に抽出される．その結果，P700 当りに存在する Chl a の分子数は抽出前の 150から 10程度にまで低下する．

4.g .3.2 クロロフィル以外の成分の抽出
表１は光化学系 複合体を構成している成分に対する

4.g .4 応用例
本法によって得られた標品を用いた研究応用例は総説を参照されたい．この標品を用いることによって，① 光化学系

反応中心に位置する P700 や A および

エーテル処理の効果をまとめている．
この処理によって，その周りに位置するコアアンテナクロロフィルの解析がβ‑カロテン，脂質（ホスファティジルグリセロールとモ可能になったノガラクトシルジアシルグリセロール）およびキノン電位へのフィロキノンおよびその誘導体を用いた再構成実

子受容体（フィロキノン）は完全に抽出されるが，それ験により，フィロキノン結合部位の解析が可能になっ以外の電子伝達に関与するクロロフィル成分（P700, A,たA ）および FeS クラスター（Fx,F /F ）は抽出されな反応中心近辺のエネルギー伝達・電子伝達の解析が可能

い．ポリペプチド成分は抽出前と変わらず，脂溶性成分になったが除かれたタンパク質部分も非可逆的な変性は受けていナ機能の再構成実験を行うことにより，PsaA/B ポリペ

ない（脂溶性成分の再結合により機能が回復する) ．

プチドにおけるクロロフィル結合部位の解析が可能に．② 抽出されたフィロキノン結合部．③ フェムト秒/ピコ秒分光による光化学系なった．④ クロロフィル誘導体を用いてアンテ．

参考文献
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P.58.
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図 4：(II Fig4.jpg）
ジエチルエーテルの水飽和度を変えたときの Chl a，Chl b
および P700 の量変化．赤丸，左目盛りは，処理前の量を 100％と し た と き の 各 処 理 後 の 標 品 に 残って い る Chl a お よ び
P700 の％量．ひし形，右目盛りは各標品の Chl a/P700，Chl
b/P700 のモル比（mol/mol）．

312(2000)P.1085.
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P S I C hl a の分別抽出法

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2009 低 温 科 学

vol.67313

３章 単離・精製・活性測定

５．色素の分析
a．クロロフィルおよびクロロフィル代謝経路中間体の抽出･定量法
田中 亮一
植物および藻類からのクロロフィルとその代謝中間体の抽出・定量法について解説する．特に，有機溶媒による色素の抽出方法と吸光光度計および HPLC を用いてこれらの色素を定量する方法について，具体的な手順と注意点を詳述する．

Analysis of chlorophyll and its metabolic intermediates
Ryouichi Tanaka
M ethods for the analysis of chlorophyll and its metabolic intermediates are presented. In particular,the HPLC
method developed by Zapata et al. ［Marine Ecology-Progress Series 195 (2000)p.29 ］and its application to theanalysis of various intermediate molecules of chlorophyll metabolism are described in detail.

5.a.1 はじめに
クロロフィルは，図１に示したクロリン環をもつテト
ラピロール化合物である．chlorophyll a, b, c, d などの従って，本稿では，まず，chlorophyll a および chloro．初めて光合成
phyll b の抽出・定量法を解説する（2章）
色素を扱う読者を想定して，できるかぎり，詳細な手順を記述した．

種類が知られている（図１参照：例外的に chlorophyll

３章では，さまざまな代謝中間体の定量法について述

c1, c2, c3 はクロリン環の代わりにポルフィリン環を持べた．４章では，HPLC を用いて，chlorophyll a, b だつ）．陸上植物は，このうち，chlorophyll a および chloro-

けでなく，その他のクロロフィルとその代謝中間体を定

phyll b を合成する．我々にとって最もなじみ深く，研究量する方法について述べている．４章でも，２章と同様対象となる頻度が高いのがこの２つの色素であろう．

に，色素の抽出についての注意事項を記載しているが，

図 1：クロロフィル類の構造
Chlorophyll a の構造式上に，IUPAC の命名法に基づいた炭素原子の位置番号とピロール環の名前を示した．
１) 北海道大学・低温科学研究所

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４章では，HPLC での色素の分離を想定した色素の抽出方法を述べており，いくつか記載の異なる箇所があるので注意していただきたい．基本的に，ほとんどのクロロ
フィルとその代謝中間体の定量の際には，まず，HPLC
による色素の分離が必要になる．続いて，クロロフィル
類は吸光光度計で，主要な代謝中間体は蛍光光度計を用いて定量する．筆者らの研究室では，Zapata ら の開発
した方法を一部改変して用いている．本稿では，主に被子植物のクロロフィルと代謝中間体の分離と定量を例にとって解説するが，基本的に，これ以外の生物のクロロ

図 2：ガラス製ホモジナイザーと多検体用破砕機
１．ガラス製ホモジナイザー，２．多検体用破砕機 ShakeMas（破砕中にチューブ
ter，3.ShakeMaster 付属のアルミ製容器のふたが開かないように，筆者は固めのスポンジをふたの裏に貼付けている．
）

フィルも同様の方法で分離，定量することが可能である．
上記の方法で，組織が十分につぶし，撹拌した後，懸5.a.2 chlo ro phylla およびchlo ro phyllb の抽出と定量
5.a.2.1 chlo ro phylla および chlo ro phyllbの抽出

濁液を植物組織ごと遠心チューブに移す．約 10,000x g
で５分程度遠心し，上清を別なチューブに移す．再度，
acetone を組織に加え，組織から完全に緑色が抜けるまで，撹拌と遠心を繰り返す．上清を一本のチューブに集め，上清の量を量っておく．なお，クロロフィル類は光，陸 上 植 物 か ら の chlorophyll a お よ び chlorophyll b

高温，酸素に弱い．極力，光を避けるにこしたことはなの 抽 出 に は，acetone を 用 い る．M ethanol, Nʼ,N”-

い．しかし，よほど正確な定量が必要な場合，また，微dimethylformamide などを用いることも可能 である．

量な試料を扱っている場合を除いて，通常の実験室の照methanol は，クロロフィル類を化学修飾しやすい，ま明下で抽出操作を行っても構わない．ほとんどの場合，た，抽出液中での光合成色素の消失を招きやすいとされ急激にクロロフィルが分解することはない．

ているが ，methanol を用いた抽出方法もいくつか報告

5.a.2.2 吸光光度計による chlo ro phylla およびされている．Porra らは，20％(v/v）の 2.5mM リン酸バッファー（pH 7.8）を加えた 80％ acetone で色素を抽出する方法も紹介している．

chlo ro phyllb の定量
上述の抽出液に，最終的にアセトン濃度が 80％になる
ように水または 2.5mM リン酸バッファー（pH 7.8）を

被 子 植 物 の 葉 の 場 合，ま ず，乳 鉢 に 葉 と 適 量 の加える．植物の生葉は，およそ 90％程度の水分を含んで

acetone を加えて，すりつぶす．葉がやわらかく，量がいるので，大量の試料を用いた場合は，試料からの持ち少ない場合は，乳鉢の代わりにガラス製のホモジナイ

込みの水分も計算に入れるとより正確である．

ザーなども便利である（図 2A）．また，試料の数が多い

吸光光度計で測定する際には，スクリューキャップ付場合は，ShakeM aster（バイオメディカルサイエンス）

きの石英またはガラスのキュベットを使うとよい．測定などの多検体用破砕機を使うことができる（図 2B）．

中の有機溶媒の蒸発を防ぐことができる．

ShakeMaster を使用する場合，試料をステンレスビー

chlorophyll a および chlorophyll b のモル吸光係数

ズ，acetone とともに 2ml の丸底のマイクロチューブには，いくつかの研究室から報告されているが，この中入れ，さらに付属のアルミ製容器（図 2C）に入れて，１で，原子吸光法により，クロロフィルの定量をおこない，分ほど震盪する．

モル吸光係数を求めた Porra らの係数 が最も信頼性が高いと言われている．663.6nm（chlorophyll a の吸収極

Chlorophyll a の 80％ acetone 中 に お け る モ ル 吸 光 係 数（663.6nm: L mmol cm ）は 76.8である 2) R.Porra, W.
Thompson and P.Kriedemann. Biochim Biophys Acta 975(1989) p.384.．ある生物の 1g あたりのクロロフィル量を大雑把 に １ μmol と 見 積 も れ ば，試 料 10mg か ら 1ml の 80％
acetone で chlorophyll a を抽出すると，663.6nm の吸光度は，0.01μmol x 76.8＝0.768となる計算である．つまり，大体 1mg から 10mg 程 度 の 試 料 か ら 1ml の 80％ acetone で
クロロフィルを抽出すれば，吸光度は 0.08〜0.80程度におさまる，ということになる．文献等から，試料中のクロロフィル
量が予測し，抽出に用いる溶媒の量を決めるとよい．

316大波長）および 646.6nm（chlorophyll b の吸収極大波長）を測定し，以下の式によって，80％アセトン中における chlorophyll a（式 1），および chlorophyll b（式 2）の濃度を求める．このとき，750nm における吸光度をバックグラウンドとして，663.6nm および 646.6nm から差し引いておく．

クロロフィルと代謝中間体

Chlorophyll a μg/ml ＝12.25×A−2.85×A
Chlorophyll b μg/ml ＝20.31×A−4.91×A

(式 1)
(式 2)

比例している範囲で，ALA 合成活性を測定する必要がある．
Chlorella おいては，レブリン酸処理によって ALA が細胞外に排出されるとの報告がある ．藻類において，chlorophyll a と chlorophyll b の分子量はそれぞれ

ALA 合成活性を測定する際には注意が必要であろう．

893.48と 907.46であるので，モル濃度が必要な場合は，

ALA の 前 駆 体 で あ る glutamate-1-semialdehyde はこの数値を用いて換算する．

不安定な中間体であり，生物試料から抽出して，定量した と い う 報 告 は な い．ま た，glutamyl-tRNA か ら

5.a.3 クロロフィル代謝中間体の種類と性質

glutamate-1-semialdehyde を合成する glutamyl-tRNA
reductase と glutamate-1-semialdehyde か ら ALA を

クロロフィル代謝は，厳密に考えると，代謝経路がヘ合成する glutamate-1-semialdehyde aminomutase は複ムと分岐する Mg-protoporphyrin IX から始まると言え合体を作っていると考えられており，中間体である，るが（図 3），実際の研究でクロロフィル代謝を扱う際は，

glutamate-1-semialdehyde が細胞内に蓄積しているとグルタミン酸から始まるテトラピロール化合物に共通のは考えにくい．

代謝経路まで含めて調べることが多い．そこで，本稿での定量は northern blotting によって行う ．

tRNA

は，クロロフィルとヘムの共通の代謝経路（図 3参照：

tRNA

グルタミン酸から protoporphyrin IX まで）も含めて解増減はテトラピロール合成だけでなく，葉緑体内のタン説する．

パク質合成にも影響を与えると予想される．従って，生

この章では，まず，クロロフィル（ヘム）代謝経路を

はタンパク質合成の基質でもあり，tRNA

物が tRNAのの増減でテトラピロールの量を調節して概観し，代謝中間体の特徴について解説する．また，本いるとは考えにくい．
（ヘムとクロロフィルを含めた）
テ

稿では詳しく紹介していない代謝中間体の定量法につい

ト ラ ピ ロール 合 成 の 調 節 は glutamyl-tRNA か らて，随時，引用文献を挙げた．

glutamate-1-semialdehyde を 経 て ALA を 合 成 す る 段

グルタミン酸から 5‑アミノレブリン酸(ALA) テトラ

階で調節されていると考えられる．

ピロール合成経路の出発物質はグルタミン酸またはグルPorphobilinogen ALA ２分子が縮合するとピ ロール

タミル-tRNA である．
（一部の光合成生物には例外もあ環をもつ porphobilinogen（PBG）が生成される．PBG

る ．）
図３を見れば明らかなように，ALA までの中間体の定量は，原理的に ALA の定量法と同様に Ehrich 試薬

は，ピロール構造を持たないので，これ以降の物質とはを用いればよい．Mock らは，PBG を 95℃で熱すること

検 出 方 法 が 異 な る．ALA を 検 出 す る た め に は，eth-

によって，uroporphyrin I に変換し，HPLC によって定

ylacetoacetate と ALA を反応させてピロール環を形成

量する方法を紹介している ．
（注：uroporphyrin I はさせた後，Ehrlich 試薬を用いて検出する．Ehrlichuroporphyrinogen I が酸化されたもので，uroporphyr-

試薬にはもともと水銀が含まれているが，水銀を除いて

inogen I は uroporphyrinogen III の D ring が逆向きにも使用可能である ．

付加されたテトラピロール分子である．
）PBG のモル吸

通常は，多くの生物の細胞内においては，ALA の蓄積

光係数は，Mauzeall と Granick によると 2N の perch-

量はごくわずかである．これは，ALA がすぐに代謝されloric acid を含む Ehrlich 試薬中で，61mM cm （555て，テトラピロール化合物に変換してしまうからだと思nm）である ．

われる．細胞にレブリン酸を与えると，ALA の代謝が阻

Hydroxymethylbillane この分子も不安定であり，自動害され，ALA が蓄積する．多くの研究では，レブリン酸

的に閉環して uroporphrinogen I を生成する．uropor-を処理した後に蓄積する ALA の量を ALA の合成活性

phyrinogen III synthase が存在するとＤ環が反転して，と見なしている．植物の葉においては，このように測定

テトラピロールを形成し，uroporphyrinogen III となる．

された ALA の合成活性は，クロロフィルの合成活性とhydroxymethylbillane は細胞内ではほとんど蓄積してよく相関している．シロイヌナズナの場合，レブリン酸

いないと考えられる．

を処理する時間が 90分を超えると，ALA の分解が起こ

Uroporphyrinogen IIIから Protoporphyrin IX これらる可能性があるので，レブリン酸の処理は 90分以内にとの化合物は全てテトラピロール化合物である．uropor-

どめておいた方がよい．30分，60分，90分というように，

phyrinogen III，coproporphyrinogen III，protoporphyr-

いくつかの処理時間を試し，処理時間と ALA 蓄積量がinogen IX の３つの化合物では，４つの methene bridge

2009 低 温 科 学

vol.67317

図 3：被子植物のクロロフィル代謝経路

318

クロロフィルと代謝中間体

が還元されているが，protoporphyrin IX は酸化されて０％からＡ溶媒０％，Ｂ溶媒 100％のグラジエントをかいる．前者の３つの化合物は，テトラピロール環が共役

け，続く 13分間は，Ｂ溶媒 100％ですべての色素を溶出していないので無色であるが，後者はテトラピロール環する．蛍光検出器が必須で，励起波長は 405nm，蛍光波が共役しており，赤色で，蛍光を発する．
（後述する

長は 615nm にあわせる．標準物質を入手し（例えば，

Zapata らの HPLC の分離システムのＡ溶媒中においFrontier Scientific Inc.などから入手できる．http://て，励起極大波長が 400nm，蛍光極大波長が 634nm でwww.frontiersci.com/），検量線を作成した上で定量すある．
）uroporphyrinogen III，coproporphyrinogen III，

る必要がある．

protoporphyrinogen IX の３つは，抽出中に自動的に酸

Mg-Proto IX，Mg-Proto IX monomethylester これら

化してしまって，uroporphyrin III，coproporphyrin III，の化合物は，Mg2＋が配位しており，強い蛍光を発する．

protoporphyrin IX になる．HPLC を用いて定量する場

クロロフィルとは異なって，phytol などの側鎖がついて合は，酸化した化合物を蛍光検出器を用いて定量する．

い な い の で，比 較 的 親 水 性 で，20％程 度 の 水 を 含 む

uroporphyrin III，coproporphyrin III の場合は，細胞内acetone や diethylether などによく溶ける．筆者の研究では uroporphyrinogen III，coproporphyrinogen III で

室では Zapata らの系を用いて分離，定量している（４章あったと仮定してよいが，protoporphyrin IX の場合は，参照）．

それが，生体内で protoporphyrinogen IX であったのProtochlorophyllide 被 子 植 物 の 場 合，Protochloro-

か，protoporphyrin IX であったのか，判別することは難phyllide は暗所におけるクロロフィル合成経路の最終産

しい．抽出液中の uroporphyrinogen III，coproporphyr-物である．Protochlorophyllide には，3,8-divinyl-(DV)-inogen III，protoporphyrinogen IX を完全に酸化させる

protochlorophyllide，3-vinyl-(MV)-protochlorophyllide

ために，2-butanone peroxide などの酸化剤を抽出液にの２つの化合物が存在する．前者は８位に vinyl 基が付加えることもある ．

加しているが，後者ではこれが還元されて ethyl 基にProtoporphyrin IX は，後述する Zapata らの方法 でな っ て い る ． DV-protochlorophyllide と M V-

定量が可能であり，また，uroporphyrin III，coporopor-

protochlorophyllide は吸収極大波長が若干異なっておphyrin III の定量も可能であると思われるが，uropor-

り，diethylether 中での Soret 帯の吸収極大波長はそれ

phyrin III，coproporhyrin III の定量に関しては，筆者

ぞ れ ， 432 n m と 437 n m で あ るらの研究室では，まだ確認していない．そこで，本稿でprotochlorophyllide か ら M V-protochlorophyllide へは，この２つの化合物の定量に関して，Bernhard Grimmの 還 元 反 応 を 触 媒 す る の は，8-vinyl chlorophyllide（ドイツ，Humboldt 大学）の研究室で行われている方

reductase である法

lide に対する活性が低いので，8-vinyl 基の還元に時間がを紹介する．
色素の抽出：100mg の葉を 200μl の 50mM のリン． DV-が，この酵素は，protochlorophyl-

か か る．そ の 結 果，双 子 葉 植 物 で は，主 に DV-酸カリウムバッファー（pH 7.8）中で破砕し，遠心し，protochlorophyllide が蓄積するが，暗所で生育させ上清を別なチューブに移す．続いて，沈殿を 200μl のる期間が長いほど，M V-protochlorophyllide の割合が高methanol/0.1M ammonium hydroxide（9：1v/v）にくなる

懸濁し，遠心し，上清をチューブに集める．再び，沈殿

は，MV-protochlorophyllide の 蓄 積 が 主 に 観 察 さ れを 200μl の acetone/methanol/0.1M

ammonium

る ．単 子 葉 植 物 の 8-vinyl chlorophyllide reductase（10：9：1，v/v/v）懸濁し，遠心を繰り返す．
hydroxideは，比較的 DV-protochlorophyllide に対する活性が高い

最終的に上清を一本のチューブに集める．抽出液に，ace-と考えられる．

という現象が観察される．単子葉植物の子葉で

tic acid と 2-butanone peroxide を最終濃度がそれぞれProtochlorophyllide の抽出において，最も大切な点

25mM と 2.5％になるように加え，ポルフィリン化合物

は，組織が完全に破砕され，acetone に懸濁されるまで，を酸化させる．

可視光にあてない，という点である．protochlorophyl-

HPLC による分離：Novapak C18，4μm particle

lide が光を吸収すると，そのエネルギーを使って，暗所でsize，3.9x 150mm（Waters）を用いる．Ａ溶媒（meth-

protochlorophyllide に 結 合 し て い る protochlorophyl-anol/0.1M ammonium acetate pH 5.2/水＝1：1：8，

lide oxidoreductase（POR）が瞬時に protochlorophyl-

v/v/v）とＢ溶媒（methanol/0.1M ammonium acetatelide を還元して，chlorophyllide を生成してしまう．このpH 5.2＝9：1，v/v/v）のグラジエントで分離する．流速

反応は 77K でも起こりうる．したがって，完全な暗所では 1ml/min で，最初の 12分間にＡ溶媒 100％，Ｂ溶媒

組織の破砕を行うべきであるが，難しければ，緑色の蛍2009 低 温 科 学

vol.67319

光灯に緑色のセロファンをまいた「安全灯」のもとで暗ウリや大麦など被子植物の黄化芽生えが緑化する際に見室内で色素の抽出を行う．このとき，光の強度は，目がつかることがある．これらの化合物は，基本的にクロロ

慣れてやっとものが見える程度の明るさまで落とす必要

フィルとよく似た性質を持っており，大半は４章に記載がある．あるいは，赤外光の照射下で赤外線カメラを使した方法で分離することができる．

用して抽出を行う，という方法もある．protochlorophyl-

また，chlorophyll a から Mg イオンが抜けた pheo-lide の 定 量 に は い く つ か の 方 法 が 報 告 さ れ て い ると呼ぶ）
phytin a や 13(2）位の epimer（chlorophyll aʼ

がも光化学系に存在する．pheophytin a は４章の方法で分，本稿では，４章で HPLC を用いる方法を述べる．

離することができる．chlorophyll aʼの分離については，

Chlorophyllide 上述の通り，protochlorophyllide が還中村らの方法

元されると chlorophyllide になる．chlorophyllide は，Hydroxymethyl-chlorophyll a こ の 化 合 物 は chloro-

phytol が結合していないので，比較的親水性である．inphyll b が chlorophyll a に変換されるときの中間体であvivo では，DV 型の chlorophyllide は生成されるとすぐる．chlorophyll b から a への変換は，植物が環境に適応に MV 型 に 還 元 さ れ て し ま う の で，通 常 は DV 型 のして，chlorophyll a と b の比率を調整するときや，chlo-

chlorophyllide が観察されることはない．また，MV-

rophyll b が chlorophyll a を経て分解されるときにおこchlorophyllide もすぐに phytol と結合して，chlorophyll

ると考えられている．シロイヌナズナの葉には，常にになるようである．したがって，少なくとも被子植物のchlorophyll a の 0.1％程 度 存 在 す る よ う で あ る．

場合，観察される chlorophyllide は，多くの場合，chloro-

Scheumann ら は，オ オ ム ギ の 葉 の 老 化 初 期 に

phyll の合成経路の中間体というよりは，むしろ，chloro-hydroxymethyl-chlorophyll a の蓄積が増加すると報告

phyll が chlorophyllase のはたらきによって分解されたしている ．この化合物も４章の記載した方法で分離す産物であると思われる．また，シロイヌナズナの葉を材ることができる．

料とした場合，微量の chlorophyllide a は頻繁に検出さクロロフィルの分解産物 クロロフィルの分解経路の研れるが，chlorophyllide b はまれにしか検出されない．筆究は主に高等植物を材料として行われている ．現在の者の経験では，chlorophyllide b が検出されるのは，抽出ところ，chlorophyll b を直接分解する経路は知られてお液に含まれている chlorophyllase によって，抽出の際にらず，大半の chlorophyll b は一度 chlorophyll a に変換生成された artifact であることが多い．このような場合されてから分解されると考えられている ．chlorophyllには，クロロフィルを抽出するときに acetone の量を増

a は chlorophyllase の活性によって，chlorophyllide a

やすことによって，chlorophyllase の活性を抑えることになり，Mgができる場合がある．

うのが，通説であるが ，chlorophyllase の役割について

Chlorophyll chlorophyll a または b のみを測定する場は異論もある ．pheophorbide a は red chlorophyll

合には，第２章に記載の方法を用いるのが最も簡便であcatabolite (RCC), fluorescent chlorophyll catabolite

る．これ以外のクロロフィルを測定する場合には，第４(FCC),non-fluorescent chlorophyll catabolite と変換さを参照されたい．

が抜けて，pheophorbide a になる，とい章で述べるように，HPLC を用いる必要がある．Zapata

れるのが，主要な分解経路と考えられている．ダイコン

らの原報 には，彼らの HPLC における chlorophyll c1,（Raphanus sativus）など一部の植物には，pheophorbide

c2, c3 の溶出位置が報告されているので参照していたa の 13位 の methoxycarbonyl 基 が 外 れ た pyropheo-

だきたい．

phorbide a が生成される経路も存在する ．

クロロフィルの誘導体

ほとんどの酸素発生型光合成生

クロロフィルの分解産物のうち，pheophorbide a まで

物のもつクロロフィルの 17位は ethyl 基となっているは４章に記載した方法で，分離することができる．クロが，例外的に 17位に vinyl 基を持つ DV-chlorophyll a

ロフィルは分解が進むと次第 に 親 水 性 が 増 す の で，および DV-chlorophyll b を合成するラン藻の一群が存

RCCR 以降の分解産物を４章に記載した Zapata らの方在する ．また，これも例外的であるが，phytol 鎖の代法 で分離することはできない．これらの分解産物を分わりに geranyl-gerany（l GG）鎖，あるいは，GG 基の２離するには，Hortensteiner らの方法

重 結 合 が 一ヶ所，ま た は ２ ヶ 所 還 元 さ れ た ，

ただきたい．

を参照していd i h yd r o g e r a n yl-g e r a n yl （ D H G G ） 基 ，
tetrahydrogeranyl-geranyl（THGG）基を側鎖にもつクロロフィルも存在する．これらのクロロフィルは，キュ320

クロロフィルと代謝中間体

5.a.4 Z apata らの方法によるクロロフィ
ルと代謝中間体の分離と定量

は溶出時間が同一であるので，定量
protoporphyrin IX）には注意が必要である．これらの注意点に関しては，適宜，項目を設けて記載した．また，この方法では，カロ

この章では，Zapata らの方法 によるクロロフィルとチノイド類も同時に検出することができる．カロチノイ

代謝中間体の分離と定量について述べる．この方法で分ド類の定量は，本稿の範囲ではないが，クロロフィルと離，同定できる化合物を表１に示した．クロロフィル類

同時にカロチノイド類の定量を行う読者のために，有用の他に protoporphyrin IX 以降，pheophorbide a までのと思われる情報を付記した．カロチノイド類の定量の詳

ほとんどの代謝中間体を分離することができる．いくつ細に関しては，高市の稿を参照していただきたい．また，か の 物 質 は，（例 え ば chlorophyllide a と M g-

この章に記載した方法で測定した，一部の代謝中間体の

表 1：本稿の４章で紹介した HPLC システムにおける色素の溶出時間とそれぞれの色素の吸収極大，モル吸光係数およびモル吸光係数の出典の文献
色 素 名

溶出時間
(分)(a)

吸収極大(b)

モル吸光係数溶

媒7-hydroxymethyl
chlorophyllide

3.3

n. d.

chlorophyllide bchlorophyllide a
M g-proto IX
DV-Pchlide

4.7
9.2
9.2
9.9

n. d.
430，664416
439，629

pheophorbide b
M V-Pchlide

10.1
10.4

n.d.
436，626

M g-protoIX
monomethylester
proto IX

11.7

416

13.7
14.2

402
409，664

15.9
17.0
19.8
20.1
21.0

413，437，466
418，440，470
446，474
461，647
461，647

Chl b(THGG）
Chl a(GG）

21.9
22.0

461，647
431，664

Chl b と同じ
Chl b と同じ
Chl b と同じ
Chl a と同じ

hydroxymethyl Chl
Chl a(DHGG）

434，657
431，664
461，647

61100（655.5）
Chl a と同じ
47040（646.6）

diethylether

Chl b

22.4
22.7
22.9

DV-Chl b

22.9

466，650

43910（643）50530（651）

diethylether
80％ acetone

Chl a(THGG）
DV-Chl a

23.4
24.1

431，664
441，664

Chl apheophytin aβ-carotene

24.3

431，664

Chl a と同じ
78340（660）69290（664）76790（663.6）

diethylether
80％ acetone
80％ acetone

26.2
26.8

409，665451

50530（665）

diethylether

pheophorbide a
neoxanthin
violaxanthin
luteinChl b(GG）
Chl b(DHGG）

文献

7-hydroxymethyl
Chl と同じ
Chl b と同じ
Chl a と同じ
165900（417）205000（437）22100（622）n.d.
241000（432）31100（623）
M g-proto IX と同じと思われる
150000（404）44500（667）

80％ acetone
diethylether

80％ acetone

diethylether
ethanol

80％ acetone（a) 溶出時間については，筆者の研究室における複数のクロマトグラムをもとに，実験間での溶出時間の誤差を計算によって補正して，一覧に示した．用いる HPLC システムによって，溶出時間は変わりうるので，各々の研究室ごとに標準物質を用いて，溶出時間を確認する必要がある．
（b) この欄に示した吸収極大は，HPLC のフォトダイオードアレイ検出器のデータをもとにした．
±2nm の誤差がありえる．よく似た色素であっても，溶出時間によって，溶媒組成が異なるので，吸収極大はシフトすることがある．テトラピ
ロール化合物に関しては，Soret 帯と Qy帯の吸収極大を示した．カロチノイド類については，S2 吸収帯の極大波長を示した．

2009 低 温 科 学

vol.67321

えた 80％ acetone などを用いることも出来るが，上述のように，抽出液中の水分含量が５％を超えると chlorophyllase に よって chlorophyll a と chlorophyll b がphytol 鎖と chlorophyllide に分解されてしまい，正確な測定が困難になることがある．特に，ストレスを受けた葉からクロロフィルを抽出するときは注意が必要である．（２章に記述した方法で，HPLC を使わずにクロロ
フィルを定量する場合には，chlorophyllase の作用を気にする必要はない．chlorophyllide と chlorophyll の吸
光スペクトルは同一である．
）
一方，ラン藻，プラシノ藻，珪藻などの場合は，80％
acetone や acetone/methanol（50：50，v/v）などの溶媒で色素を抽出することが多い．これらの生物では，
chlorophyllase の活性が見られることはなく，また，
pure acetone を用いるよりも，これらの溶媒を用いる方が抽出効率が高いことがある．固い殻を持つ藻類の場合，
ガラスビーズ等による破砕が必要になる場合もある．筆者の研究室では，Mini-Beadbeater（Biospec Products
Inc. OK, USA）を用いる場合もある．
5.a.4.2 HP LC のシステム
筆者は，以下の HPLC システムを使用している ．
システム１（Hitachi 製）
図 4：Zapata らの系による光合成色素の分離
Ａ．シロイヌナズナの葉の抽出液の分離．横軸は溶出時間（分），縦軸は 410nm における吸収．：1.chlorophyllide a，2.
pheophorbide a，3.neoxanthin，4.violaxanthin，5.lutein，6.chlorophyll b，7.chlorophyll a，8.pheophytin a，9.βcarotene Ｂ．クロロフィル代謝中間体（標準物質）の分離．
蛍光検出器（Shimadzu,RF550）を用いて，励起波長 417nm，蛍光波長 600nm で測定した．
：10.Mg-protoporphyrin IX，11.M g-protoporphyrin IX monomethylester，12.protoporphyrin IX

ポンプ：L-7100（低圧グラジエントシステム）
検出器１：フォトダイオードアレイ検出器 L-2450
検出器２：蛍光検出器 L-2485
オートサンプラー：L-7200
カラムオーブン：L-7200
デガッサー：L-7610
システム２（Shimadzu 製）
ポンプ：LC-10ATvp
ミキサー：FCV-1-ALvp

吸収スペクトルが，光合成事典に記載されているので，参照していただきたい．
また，光合成色素の分離に関しては，van Haukelem
らが，数十種類の色素を HPLC で分離する方法を報告し検出器１：フォトダイオードアレイ検出器
SPD-M10Avp
検出器２：蛍光検出器 RF-550
オートインジェクター：SIL-10ADvpている ．彼らの方法は，藻類の光合成色素の分離に特に有用だと思われる．
5.a.4.1 HP LC のためのクロロフィルと代謝中間体の抽出方法
筆者は，植物の葉からクロロフィルや代謝中間体を抽出するために，acetone を用いている ．
水や buffer を加
クロロフィルの代謝中間体を植物から抽出するために，リン酸
バッファーや 90％ methanol など３種類の溶媒を順番に用いる方法が報告されているが 34）A.Strand,T.Asami,J.Alonso,J.R.Ecker and J.Chory.Nature 421(2003)p.79.，この方

322

法は単に煩雑なだけでなく，
chlorophyllase の作用が見られる
ことがあり，あまり薦められない 35）
N.M ochizuki,R.Tanaka, A.Tanaka, T.M asuda and A.Nagatani. Proc Natl
Acad Sci U S A 105 (2008)p.15184.．M g-Proto IX などのク
ロロフィル代謝の中間体の acetone への溶解度はあまり高くないので，標準品などを高濃度で扱う場合には水分含量の低い
acetone は適さないが，植物試料中のクロロフィル代謝中間体の濃度は非常に低いので，acetone で十分に抽出可能である．
原報１）M .Zapata, F.Rodriguez and J.L.Garrido.Marine
Ecology-Progress Series 195 (2000) p.29.では，３種類のHPLC システムを比較している．システムによっては，溶媒のグラジエントのかけ方を多少変更する必要があるようだ．

クロロフィルと代謝中間体

カラムオーブン：CTO-10Avp

Ｂ溶媒：Methanol:acetonitrile:acetone＝20：60：

デガッサー：DGU-14A

20（v:v:v）

コントローラー：SCL-10Avp

Ａ溶媒のピリジンは酢酸で pH を 5.0にあわせる．わ
れわれの研究室では，pH メーターを使って，ピリジン溶

検出器

液の pH をあわせ，必要な酢酸の量を測っておき，２回目

筆者はフォトダイオードアレイ検出器を用いて，400の溶媒調整からは pH メーターを使わずに一定量の酢酸

nm‑700nm の範囲で吸光度を記録している．通常の一波をピリジン水溶液に足すようにしている．酢酸の量は色

長型の吸光検出器でも構わないが，２種類以上の色素が素の保持時間に大きな影響を与えるので，常に一定量のほぼ同じ時間に溶出されることがあり，一波長型の吸光酢酸を加えるようにすると，毎回 pH メーターを使って検出器では見落としてしまうことがある．一波長型の検溶液を調製するよりも簡便に再現性を保つことができ出器を用いる場合は，研究対象としている色素以外の色

る．

素の溶出位置を確認しておいた方がよい．
また，protoporphyrin IX 以降のクロロフィル代謝のサンプルのインジェクションついて中間体の検出をする場合は，蛍光検出器が必須であると

サンプル容量が 20μl 以下の場合は，抽出液（100％に考えた方がよい．吸光光度計とは違って，蛍光検出器の近い濃度の acetone）をそのままインジェクションして場合は，ランプの劣化によって，シグナルが低くなっても構わない．しかし，サンプル容量が 20μl を超える場合くるので，定量を目的としている場合は，頻繁に標準物

は，サンプル抽出液とＡ溶媒のミスマッチによって，ピー

質を流す必要がある．protoporphyrin IX を検出する場

クのテイリングがおこる．サンプルに 20％程度の水を加合は，蛍光検出器の励起波長を 400nm，蛍光波長を 635

えるとテイリングを抑えることができる．しかし，サン

nm に あ わ せ る． M g-protoporphyrin

IX， M g-

プルに水を加えると，時間とともに β-carotene の沈殿がprotoporphyrin IX monomethylester を検出する場合おこるので，β-carotene の検出をする場合は，水を加えは，蛍光検出器の励起波長を 417nm，蛍光波長を 600nm

たらすぐにサンプルをインジェクションする必要があにあわせる．同時に検出する場合は，蛍光検出器のタイる．また，水の存在下では，クロロフィル類の修飾がおム プ ロ グ ラ ム を 利 用 し て，Mg-protoporphyrin IX

こりやすいと思われるので，微量のクロロフィルの検出，

monomethylester の溶出のあとで，蛍光波長を切り替え定量をするばあいは，できるだけ水は加えない方がよいる．

と思われる．

Zapata の系に特有の問題として，ピリジン（または，オートサンプラーを使う場合，もう一つ注意しないとピリジンに混入している物質）の 595nm 付近の蛍光がいけないのは，サンプルバイアルからの蛍光物質の溶出ある．
一波長型の吸光光度計の場合は問題にならないが，である．ポリプロピレン製のバイアルを使うと蛍光物質

蛍光光度計の場合や，特にフォトダイオードアレイ検出が溶出されることがあるので，クロロフィル代謝中間体

器の場合は，奇妙なスペクトルが見られる原因となるのを分離する際には，ガラス製のバイアルを使用するか，で，注意してほしい．

事前に蛍光物質の溶出がないことを確認してポリプロピ
レンバイアルを使用する（京都大学・望月伸悦博士・私

カラム

信）．

カラムは，SymmetryC8,150×4.6mm,3.5 m particle size

(Waters）で，ガード カ ラ ム と し て，

タイムプログラム

Phenomenex(AJO-4290)C8 4.0(L)mm ×3.0(ID)mm

Ａ溶媒 100％，Ｂ溶媒０％から開始して，直線的なグラを使用している．カラム温度は 40℃に設定している．

ジエントをかける．phytol 鎖をもたない物質は主にＡ溶媒で溶出され，phytol 鎖をもつ物質は主にＢ溶媒で溶出

溶媒される．筆者の研究室では流速をあげて，原報 よりも若Ａ溶媒：M ethanol:Acetonitrile: 0.25M

aqueouspyridine＝ 50：25：25（v:v:v）

干解析時間を短縮している．
流速 1.2ml/min
０ min Ｂ溶媒 ０％

同じ Waters 製の Sunfire という C8 カラムも試してみたが，β-carotene と pheophytin a が同じ位置に溶出してしまった．

2009 低 温 科 学

vol.67

12min

40％

17min

95％
323

22.5min

95％

25min

０％

30min

０％（５分間平衡化してから，次の１) M .Zapata, F.Rodriguez and J.L.Garrido. M arine

サンプルをインジェクション）

Ecology-Progress Series 195 (2000)p.29.
２) R.Porra, W.Thompson and P.Kriedemann. Biochim
Biophys Acta 975 (1989)p.384.
３) M .Latasa, K.van Lenning, J.L.Garrido, R.Scharek,

検量線について原理的には，HPLC の吸光検出器のピーク面積から，
モル吸光係数を使って色素の濃度を見積もることは可能であると思われるが，筆者の研究室では，基本的に標準物質を購入するか，または生物試料から調製して，検量線 を 作 成 し て い る．M g-protoporphyrin IX，M gprotoporphyrin IX monomethylester は Frontier Scientific Inc.で購入できるが，特注になる．protoporphyrin
IX，pheophorbide a は和光純薬やフナコシ，コスモバイ
オなどで購入できる．protochlorophyllide はキュウリや大麦の暗所芽生えから精製する ．クロロフィルも各社から購入できる．標準物質の濃度を見積もるために，モル吸光係数が必要となるので，モル吸光係数を表１に示した．

5.a.5 おわりにクロロフィルおよびその代謝中間体の検出には，さまざまな方法が開発されている ．本稿では，筆者の研究室で実際に使っている，比較的簡便で応用のきく分析方法を紹介したが，これらの方法ですべてのクロロフィルとその代謝中間体が測定できるわけではないので，目的にあった分析系を選んで使い分ける必要があると思われ

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18) N.Nagata,R.Tanaka,S.Satoh and A.Tanaka.Plant

Abbreviations

Cell 17 (2005)p.233.
19) N.Nagata, R.Tanaka and A.Tanaka. Plant Cell

GG: geranylgeranyl, DV: divinyl, M V: monovinyl,
Chl: chlorophyll, Chlide: chlorophyllide, DHGG:
dihydrogeranylgeranyl, THGG: tetrahydrogeranylgeranyl
謝辞
本稿の執筆にあたって，さまざまな情報を提供していただいた北海道大学・低温科学研究所の田中歩教授，伊藤寿博士，WesleySwingley博士，得津隆太郎氏，長根智洋氏，岸本純子氏，田中佐知子氏，に感謝いたします．
また，作図に関して，同研究所の岸本純子氏に感謝いた
します．

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324

クロロフィルと代謝中間体

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2009 低 温 科 学

vol.67(1992)p.261.

325

3章

単離・精製・活性測定

５．色素の分析
b．ヘムの分析高橋 重一 ，増田建

光合成においてヘムは，光化学系のシトクロムや活性酸素消去系のカタラーゼなどのヘムタンパク質の補欠分子族として，酸化還元や電子伝達に機能している．本章では植物組織からのヘムの抽出・分析方法について紹介する．

Analysis of Heme in Photosynthetic Organisms
Shigekazu Takahashi, Tatsuru Masuda
Heme is prosthetic group of hemoproteins, which are responsible for various biological processes including
reduction and oxygenation,oxygen metabolism,oxygen transfer,electron transfer and secondary metabolism.In
this chapter,we introduce analytical methods of heme in photosynthetic organisms.Variety of hemes,biosynthesis, principle of heme analysis, and several heme assays have been described.

の結合様式によって多種類のヘムタンパク質が存在する

5.b.1 ヘムおよびヘムタンパク質の種類

が，機能的には１）カタラーゼやオキシダーゼなどの酸ヘムはポルフィリンの鉄錯体の慣用名である（表１）．

化還元酵素，２）シトクロム

やなどの電子伝達体，ヘムには多くの種類が存在するが，細菌から真核生物に

３）ヘモグロビンやミオグロビンなどの酸素運搬体の３まで広く存在するヘムは，ヘム ，ヘム ，ヘム

種類に分類できるである．また近年，ヘムセンサータンパク（図１）．その他にヘム ，クロロクルオロヘム，またポル質とよばれる一群のタンパク質が同定されている ．こ

フィリンのＤ環が還元されたクロリン骨格を持つ，ヘム

れらのタンパク質は，ヘム鉄に酸素や一酸化炭素，一酸，ヘム，シロヘムが存在する（表２）．特に断りがな

化窒素などのガス性シグナルが結合したり ，あるいはい場合，一般に〝ヘム" とよぶと，生体内に存在する最ヘム分子そのものがタンパク質に結合・解離したりするも代表的なヘムのことを意味する．

ことがシグナルとなって ，細胞内のさまざまな生理作

ヘムは，ヘムタンパク質の補欠分子族として機能する．

用に機能している．酸化還元酵素と酸素運搬体のヘムは，アポタンパク質の構造，ヘムの種類，ヘムとタンパク質

主にヘムであり，シトクロムにはヘムの違いにより多くの種類がある（表２）．結合しているヘムが Fe II と
表 1：ポルフィリン鉄錯体の慣用名

Fe III の酸化還元を繰り返すことで，電子伝達体としてへム（heme）
フェロへム（ferroheme)
フェリヘム（ferriheme)
ヘモクロム（hemochrome)
フェロヘモクロム（ferrohemochrome)
フェリヘモクロム（ferrihemochrome)
ヘミン（hemin）

ポルフィリンの鉄錯体
ポルフィリンの２価鉄錯体機能する．還元型 Fe II シトクロムの吸収スペクトルにポルフィリンの３価鉄錯体

最も長波長側の α帯のピークは還元型シトクロムにのヘマチン（hematin）

含窒素化合物などが１あるいは２個配位したポルフィリンの鉄錯体
２価鉄のヘモクロム
３価鉄のヘモクロム，ヘミクロムともいう
Cl が１個配位したポルフィリンの３価鉄錯体OH が１個配位したポルフィリ
ンの３価鉄錯体は特徴的な３つのピーク，α，β，γ（Soret）帯がある．
み認められ，吸収波長はシトクロムの種類によって異なる．またシロヘムは植物および細菌の，亜硝酸還元酵素
および亜硫酸還元酵素の補欠分子族として機能する．
図１に主要なヘムである，ヘム ，ヘム ，ヘム
造を示す．ヘム

位に 1‑ヒドロキシ‑2‑trans,trans‑ファルネシルエチル基を持ち，８位にホルミル基を持つ．ヘム
チル基である以外はヘム

は８位がメと同じ構造をもつ．また古細菌には３位に異なるプレニル骨格を持つヘム
１）東京大学大学院総合文化研究科広域科学専攻

2009 低 温 科 学

vol.67の構はプロトポルフィリン IX の側鎖の３が存在する ．ヘムやヘムはプロトポルフィリン IX 骨格を持327

5.b.2 ヘムの生合成
植物のヘムの生合成（図２)の第１段階は 5‑アミノレブリン酸（5‑aminolevulinic acid：ALA）の合成である．ALA 合成は，全てのテトラピロールの合成量を調節する律速段階となっている．動物，酵母やある種の細菌
では，ALA は ALA シンターゼが触媒するスクシニル
CoA とグリシンの縮合反応により１段階で合成される．
これに対して，植物の色素体，シアノバクテリアや多くの細菌では，ALA はグルタミン酸を出発物質とする３段階の酵素反応により合成される．グルタミン酸は最初に色素体ゲノムにコードされたグルタミン酸 tRNA と
ATP 依存的にアミノアシル化される．このアミノアシ
ル tRNAは，テトラピロール合成だけでなく，色素体

タンパク質合成にも使われる．このように代謝系においてアミノアシル tRNA を利用する反応は非常に珍しい．
次に，グルタミル tRNA 還元酵素により NADPH 依存
的に還元され，アミノ基転移反応によって ALA が生成する．次の一連の反応では，２分子の ALA が縮合しピロール環を形成した後，さらにそれが４分子縮合し，開環テトラピロールを形成する．そして，閉環したテトラピロール環であるウロポルフィリノーゲン III が生成される．ウロポルフィリノーゲン III はシロヘム生合成の基質でもあり，メチル化，酸化，そして鉄配位反応によりシロヘムが合成される．また，ウロポルフィリノーゲ
ン III が２段階の酸化的な脱カルボキシル化反応および酸化反応を受けることによりプロトポルフィリン IX が合成される．このプロトポルフィリン IX はクロロフィ
ルとヘム生合成の共通の基質であり，Mg‑キラターゼにより Mgが配位するとクロロフィル合成系に，フェロ

キラターゼにより Fe が配位するとヘム （プロトヘム）が合成される．ヘム

は ALA 合成系のグルタミル

tRNA 還元酵素のフィードバック阻害剤として働き，テ
トラピロール代謝系の合成量を調節する重要な役割を担っている
図 1：へム ，ヘム ，ヘムの構造．

プロトポルフィリン IX 合成の最後の段階を触媒する
プロトポルフィリノーゲン酸化酵素より，前の段階を触ち，プロトヘムあるいは鉄‑プロトポルフィリン IX とも媒する全ての酵素は可溶性のタンパク質であり，葉緑体よばれる．ヘム

は４つのメチル基，２つのプロピオンのストロマに局在している ．一方，プロトポルフィリ

酸基，そして２つのビニルチオエーテル基を持つ．ヘム

ノーゲン酸化酵素とフェロキラターゼは膜タンパク質でとヘムはタンパク質とは非共有結合によりタンパク質と結合しているが，へム

は２つのビニルチオエーテ

あり，葉緑体の包膜とチラコイド膜の両方に存在すると考えられている．これらの酵素は，動物細胞ではミト

ル基がヘムタンパク質のシステイン残基とそれぞれ共有

コンドリアに局在しており，植物細胞においてもミトコ結合している．

ンドリアに活性やアイソフォームが存在すると報告され
ている

328

．しかし，植物では色素体におけるヘムの生合
光合成生物のヘムの分析法

表 2：ヘムの種類と吸収特性，機能および存在する生物種
ヘムの種類

α吸収ピー
ク（nm）

ヘム
ヘム

584
557

ヘム
ヘム
クロロクル
オロヘム

551
553

ヘム
ヘム
シロヘム

613
620
550〜560

補欠分子族（機能）生物種

シトクロム オキシダーゼ（シトクロム）（電子伝達）
ヘモグロビン（酸素運搬）
ミオグロビン（酸素運搬）
カタラーゼ（酸化還元）
ペルオキシダーゼ（酸化還元）
シトクロム P−450（酸化還元・電子伝達）型シトクロム（電子伝達）型シトクロム（電子伝達）
シトクロム （シトクロム ，シトクロム ）（電子伝達）
クロロクルオリン（細胞外ヘモグロビン）（酸素運搬）

細菌から真核生物
細菌から真核生物

シトクロム （シトクロム）（電子伝達）
亜硝酸塩還元酵素（シトクロム）（酸化還元）
亜硫酸還元酵素および亜硝酸還元酵素（酸化還元）

細菌から真核生物
細菌のみ
環形動物多毛綱
カンザシゴカイ科
ケヤリ科
細菌のみ
細菌のみ
細菌から真核生物

ピリジンフェロヘムクロムの α吸収ピーク

図 2：ヘム生合成系．ヘム生合成の第１段階は ALA の合成で，高等植物などではグルタミン酸 tRNA に依存した珍しい代謝系である．２分子の ALA がピロール環を形成し，これが４分子縮合して開環テトラピロールを生じた後，閉環して中間体である
プロトポルフィリン IX が作られる．Fe が配位することでヘムが合成され，M g が配位するとクロロフィル合成系に進む．

2009 低 温 科 学

vol.67329

成量が殆どを占めることから，ミトコンドリアにおける化型（フェリヘモクロム）と Na S O で還元した Fe II

ヘム合成の生理的意義は未だ明らかではない ．

還元型（フェロヘモクロム）の差スペクトルを測定し，合成されたプロトヘムは，ヘムオキシゲナーゼによるα帯の吸光度と等吸収点（isosbestic point）の吸光度の酸化的開裂を受けビリベルジン IXαに変換される．高等差を求める方法（酸化還元差スペクトルの測定）も一般

植物ではさらにフィトクロモビリンに変換され，光受容的なヘムの定量・分析方法である ．また非共有結合によ体であるフィトクロムの発色団として機能する．またビ

りタンパク質に結合しているヘム

リベルジン IXαは，シアノバクテリアや紅藻などのアン性アセトンで抽出することができる．一方，ヘム

テナ系であるフィコビリソーム色素（フィコビリン）のンパク質とチオエーテル結合しているため，塩酸酸性ア

前駆体であり，フィコシアノビリンやフィコエリスロビ

セトン処理では遊離してこない．従って，ヘムタンパク

リンに変換され，アンテナ色素として機能する．

質に結合しているヘムの種類を調べるには，塩酸酸性ア

ヘムの合成に関与する酵素は，未だ同定されていな

い．ヘムの合成に関しては，シトクロム

は，塩酸酸
はタ

セトンによるヘムの抽出の可，不可とフェロヘモクロムの成熟化過の α吸収帯のピークの位置により分析することができ程として研究が行われている．生物種によって異なる３つのシトクロムとヘム

る．

成熟システムが存在すると考えられタンパク質と結合した状態のヘムを調べる場合には，ている．いずれも，アポシトクロム ，ヘム，アポシトク

そのタンパク質を精製して，分光学的な解析を行う必要

ロムのシステイン残基とヘムを還元するタンパク質，がある．また本章では詳しく述べないが，タンパク質にこれらの輸送に関わるタンパク質，そしてヘムを共有結結合しているヘムの配位状態やスピン状態は，共鳴ラマ合させる酵素（リアーゼ）などにより構成される，複雑ンスペクトルなシステムである ．

EPR あるいは ESR)や電磁常磁気共鳴（電子スピン共鳴：
により調べることができる．

また，非共有結合性のヘムは，塩酸酸性アセトンで抽出後，定量することが可能である．共有結合性のヘム は，

5.b.3 ヘム分析の原理

チオエーテル結合を Ag SO もしくは Hg SO 処理でヘムの種類を知るには，ヘムの第５，第６配位座にピ

切断後，酢酸‑エーテル混合液で抽出することが可能であリジンなどのＮ塩基が配位結合したフェロヘモクロムをるが，この場合最終的に得られる物質は，３，８位の側形成させる．フェロヘモクロムの可視光領域での強い吸鎖がヒドロキシエチル基に変化したヘマトヘムとよばれ収帯はポルフィリン側鎖の電子吸引性の増加とともに長る化合物であり，本来の状態とは異なるので注意が必要

波長側にシフトする性質をもつことから，α帯の極大吸である．

収波長と吸光係数からヘムの種類の同定と定量を行うことが出来る（表３)

ヘムはアルカリ性の溶液や生理的な pH では界面活性．また，ヘモクロムの Fe III 酸剤を含む溶液に可溶である ．本章では塩酸酸性アセト

表 3：ピリジンヘモクロムの吸収と吸光係数
Soret 帯（nm)へムへム
（プロトヘム）

λmax
εmM

418.5
191.4

ヘム

λmax

427

へム

λmax
εmM
λmax
εmM
λmax
εmM

シロヘム
メソへム

デューテロヘム

330

λmax
εmM

β
（nm)

α
（nm)

526 (525)
17.5(16.0)

557 (557)
34.4(32.0)εmM
20.7585 (584)(30.8)
551
29.1
557
15.7
547 (547)
33.2(35.8)εmM
21.7545 (544)
24.0(26.4)
εmM
15.3

522
18.6
401
407 (407)
140.4(139.5)

518 (518)(20.9)

406 (405.5)
97.3(134.6)

514 (514)（18.3)

文献

光合成生物のヘムの分析法

ンで抽出可能な非共有結合性のヘム，主にヘムの分析法について述べる．

の脱イオン水の順に分液漏斗に加え，混合する．
７．ヘム

はエーテル層に抽出される．エーテルによる抽出は１回で十分である．
８．エーテル層を濃縮フラスコに移し，ロータリーエバ

5.b.4 植物からのヘムの抽出法

ポレーターを用いて，22℃暗所で減圧濃縮を行い，ヘムは赤血球の血色素として古くから研究されて来て１〜２ml まで濃縮する．高温や光照射下ではエーテ

おり，動物細胞におけるヘム代謝の研究報告は多く，ヘル中にペルオキシドが生成されるため注意が必要でムの抽出・定量法も確立している

ある．

．一方，植物からのヘムの抽出・定量法について述べた論文の数は限られている．ここでは，1978年の Stillman と Gassmanにラスコを 2.5ml のピリジン，そして１〜２ml の脱の抽出法を紹介する．

イオン水で順に洗浄し，目盛り付き試験管に加える．

の定量系で測定する場合に（総量が９ml を越えないように加える洗浄水の量を基づいた，植物組織からのヘム
後で述べる，高感度なヘム

は，実験のスケールを 100分の１に下げ，５．までの抽出操作を行うことでヘム

９．濃縮液を 10ml の目盛り付き試験管に移す．濃縮フを定量することが可能であ調整する．）
10．すぐに定量しない場合には５℃暗所で保存する．

る．
［実験方法］
原論文では，ペルオキシド生成によるヘムの分解を防ぐため，全ての操作は照明を暗くした条件（1 fc(カンデ5.b.5 アルカリ‑ピリジンヘモクロムの酸化
還元差スペクトル測定によるヘムの定量ラ）以下）で行うとしているが，エーテル抽出までの過［実験方法］

程は通常の実験室光下でも問題ないと考えられる．

１．ピリジン−ヘムを含む溶液に１ml の 1N NaOH を

１．植物組織（１〜２g）に 30ml の 90％アセトン/10％
0.1N アンモニアを加え，ワーリングブレンダーな
どのホモジナイザーで完全に破砕する．
２．50ml 遠心管に移し，10,000xg で 10分間遠心分離
後，上清を取り除く．この上清画分にはクロロフィ

加え，脱イオン水で 10ml に定容する．ピリジンの終濃度は 25％，NaOH の終濃度は 0.1N となる．
２．暗所に放置後（１時間以内），溶液を２本のキュベッ
トに等量ずつ（〜1.5ml）加え，分光光度計（デュアルビーム型が望ましい）にセットする．

ルおよびその中間体，カロテノイド，脂質などが含３．５mg 程度の K Fe CN の結晶を，リファレンス側

まれているため，別途分析に供することが可能であのキュベットに加え，良く混合して完全に溶解させる．

る．

３．沈殿を 30ml の 80％アセトンで洗浄し，再度遠心分

４．10mg 程度の Na S Oの結晶を，サンプ ル 側 の離後，上清を取り除く．上清にクロロフィルなどのキュベットに加え，転倒撹拌などにより穏やかに混色素が完全に含まれなくなるまで，操作を繰り返す．

合し溶解する．還元後，測定までに数分から数十分

４．沈殿に 25ml の２％塩酸を含むアセトンを加え，ヘ間放置する場合は，流動パラフィンなどを重層してムを抽出する．遠心分離後，上清は別の容器に移し，酸素の浸透を防ぐ．スペクトル測定後，念のために沈殿を再度 25ml の塩酸アセトンで抽出する．

再度 Na S O を加え，再還元による吸収の増加がな

５．遠心分離後，２回分の上清を合わせヘム粗抽出液といことを確認すれば確実である．

する．ヘムは塩酸アセトン中では比較的安定であり，５．535nm〜560nm の吸収スペクトルを測定する．通少なくとも−20℃暗所で数日間保存することができ常の条件では，吸光度のスケールは０〜0.1の範囲

る．
６．ヘム粗抽出液を 500ml の分液漏斗に移し，30ml のペルオキド・フリーのジエチルエーテル ，100ml
試薬メーカーからはペルオキシド・フリーのジエチルエーテルが販売されているが，本論文では，エーテル中のペルオキシドを完全に取り除くため，ジエチルエーテルを 1/2〜1/3容の５％硫酸中５％ FeSO w/v で３回洗浄し，終濃度0.1％の2009 低 温 科 学

vol.67

フェノールをペルオキシドのスカベンジャーとして加えている．このエーテルを０℃暗所で保管後，ヨウ化カリウム溶液を用いて完全にエーテル中のペルオキシドが除かれていることを確認してから，実験に供されている．論文中では以上の操作を行わないとヘムは完全に分解し，全く検出されていない．
Na S O は大変分解しやすいため，新品の封を切った後は密閉できる容器に小分けにしておく．１回蓋を開けたものは数日で使い終わるようにする．

331

に収まる．

出液を最終容量が１ml となるよう加える．

６．557nm と 541nm における吸光度の差を求め，吸光係数 20.7mMを用いて，ヘムの濃度を定量する ．
７．ヘム

２．側管内に 100μM Fe ‑クエン酸塩を含む同緩衝液を１ml 入れる．
３．ツンベルグ管を，窒素置換を数回行いながら，真空の濃度を求める場合は，ピリジンの終濃度をポンプで２〜３分間減圧下におく．

90％とし，584nm における Na S O 還元による吸４．側管内の溶液を反応管内に移し，反応を開始する．

光度を求め，吸光係数 30.8mM

５．反応は 30℃で暗所下，30分間浸とうする．

るを用いて定量す．

６．0.5ml の 0.1M ヨードアセトアミドを加えて反応を 停 止 さ せ，0.5ml ピ リ ジ ン と 0.5ml の 0.1N

5.b.6 フェロキラターゼの活性測定法
ヘムの生合成（２．
）でも述べたように，フェロキラター
ゼはプロトポルフィリン IX に Fe を配位させヘムを合成する酵素である．高等植物では，フェロキラ

ターゼ活性は葉緑体に検出されている．本酵素の活NaOH を加える．
７．反応液を二分し，５．の実験操作２からに従って，酸化還元差スペクトルを測定する．
８．543nm と 531nm における吸光度の差を求め，吸光係数 15.3mMを用いて，デューテロヘムの濃度を計算する．

性測定にはプロトポルフィリン IX をはじめ，人工基質であるメソポルフィリン IX やデューテロポルフィリン
IX が用いられ，精製したヘムのピリジンヘモクロムの酸化還元差スペクトルを測定することで 行 わ れ る（表5.b.7 高速液体クロマトグラフィーによる
ヘムの定量

３) ．基質である Fe の酸化を防ぐため，酵素反応はツ非共有結合性のヘムは，高速液体クロマトグラフィー

ンベルグ管を用いて行われる．図３にキュウリのフェロにより分離し，400nm 近辺の吸光度を分光検出器で検出

キラターゼ組換えタンパク質におけるデューテロヘム生することで，定量することが可能である．逆相の C カラ成の経時変化を示す ．

ムを用い，展開溶媒に 0.5％トリフルオロ酢酸を含むア
セトニトリルと 0.5％トリフルオロ酢酸を含む水の段階［実験方法］

的な濃度グラジエント（30〜100％）で分離することによ

１．ツンベルグ管の反応管内に，50μM デューテロポル

り，ヘム ，ヘム ，およびヘム

フィリン IX 0.5％ Triton X−100，２mM ジチオト
レイトール，100mM Tris−HCl，pH 8.0，酵素抽を検出している．

植物のヘム分析については Weinstein と Beale により報告されている ．この方法では，ヘムとヘムの両方を同時に測定している．この論文では，DEAE 樹脂を用いてヘムの精製を行った後，高速液体クロマトグラ
フィーにサンプルをアプライしているが，この操作の必要性はそれぞれの実験条件によって判断されたい．分離は逆相カラムを用い，ヘムの検出には 402nm の吸光度を測定している．
［実験方法］
１．先に述べた植物からのヘムの抽出操作の８．まで行
う．エーテル層は 0.2ml 以下になるまで濃縮する．
２．ヘムを 0.1ml のピリジンと２ml の酢酸に溶解後，0.5ml の ベッド 容 量 の DEAE Sepharose CL-6B（酢酸型）カラムにアプライする．
３．DEAE カラムを５ml の酢酸，４ml の 80％アセトン
図３：ピリジンヘモクロム法によるフェロキラターゼ活性の測定．キュウリフェロキラターゼ組換えタンパク質によるデューテロへムの経時的生成．Ａ：反応時間ごとの酸化還元
差スペクトル．Ｂ：定量結果．

332で洗浄することで，陽イオン性や中性の脂質を取り除く．
４．ヘムを４ml の２％ v/v 氷酢酸を含む 80％アセト
光合成生物のヘムの分析法

ンで溶出し，ロータリーエバポレーターで真空減圧

数が 165という，
アルカリ‑ピリジンヘモクロム法より８濃縮し，乾固させる．

倍程度高い感度を示している．この方法は，0.1N NaOH

５．ヘ ム を 66.5％エ タ ノール／17％酢 酸／16.5％ 0.1に溶解したヘム 20μl と 2.5％ Triton X−100を含むメ

N アンモニア v/v/v に溶解する．まず，アンモニ

タノール 180μl を混合し，405nm の吸光度を測定する

アに溶解してから，酢酸を加え，ヘムを溶解する．

もので，96ウェルのマイクロタイタープレート上で反応

６．Altex Ultrasphere ODS カラム（25cm×4.6mm，させ，マイクロプレートリーダーによる測定も可能であ５μm particle）を装着した高速液体クロマトグラム

る．示されている検量線によれば，10 〜10 モル濃度程を用いる．展開溶媒は 66.5％エタノール／17％酢

度のヘムが直線性をもって定量できている．実際，ヘモ酸／16.5％水 v/v/v を用い，１ml/min の流速で，グロビンを直接 0.1N NaOH に溶解し，希釈すること

カラム温度を 30℃で分離し，装着した分光検出器

で，直接ヘモグロビン中のヘムの定量に成功している．

（402nm）
を用いて測定する．インジェクション容量

しかし，本方法はポルフィリンの Soret 帯の吸収を測定

は 100μl．

しているため，他のポルフィリンが混入している場合に７．上記の実験条件で，ヘム

およびヘム

の保持時間

は，これらの影響を大きく受けると考えられる．実際，は，それぞれ 10.6min および 30.6min である．そ著者らが本法に従い測定すると，ヘム以外のプロトポル

れぞれのヘムの定量には双方の分画を回収し，ヘム

フィリン IX や Zn‑プロトポルフィリン IX も高い吸収は 398nm の吸光度を測定し，吸光係数 144mMを示すことが認められた．従って，本方法でヘムを測定を用いて，またヘム

は 406nm の吸光度を測定し，する場合には，調製するサンプルに注意が必要である．

吸光係数 123mMを用いて計算する．あるいはヘ本方法に基づいたと思われるヘムの定量キット Quanti-

ム ，ヘムの標準物質のピークから検量線を作成

し，濃度を求めても良い．

Chrom

Heme AssayKit（DIHM −250）が BioAssay

Systems より販売されており，日本ではフナコシより購入することができる ．
また，ヘムのもつ偽ペルオキシダーゼ活性を利用して，

5.b.8 発色法などによるヘムの定量

ペルオキシダーゼ基質の発色を測定する方法が報告され先に述べたアルカリ‑ピリジンヘモクロム法によるヘている ．本方法では，市販のペルオキシダーゼ基質であムの定量は，歴史的にも古くから行われており，操作にるテトラメチルベンジジン（TM B）を基質としてヘムの熟練すれば，ある程度高い再現性が得られている．しか定量を行い，トリトン‑メタノール発色法よりも 13.5倍

し，操作が煩雑で，有機化学に縁のない生化学や分子生

高い感度を得ている．しかし本方法は，ヘモグロビンや物学の実験室では，新たにガラス器具や実験装置を準備

鉄などの偽ペルオキシダーゼ活性を持つ夾雑物の影響をする必要がある．さらに，ペルオキシド・フリーのジエ受けやすいと考えられるため，測定するサンプルの調製

チルエーテルの調製に注意を要すること，有毒な溶媒でには注意を要する．

あるピリジンをスペクトル測定時に使用すること，アルカリ‑ピリジンヘモクロムのモル吸光係数が低いために，
比較的多くの実験材料から抽出を開始する必要があることなど，微量サンプルを多検体測定したい場合には問題点が多い．

最後に著者らが最近開発した，酵素学的アッセイによ

そこで，いくつかの発色法による定量法が報告されている

5.b.9 酵素学的アッセイによるヘムの高感
度定量法

（表４）
．その中で，Pandyらるヘムの定量法について紹介する．著者らは高等植物のによるトリトン‑

ヘム代謝に関する研究を行ってきており，モデル植物でメタノール発色法は簡便で，397nm におけるモル吸光係あるシロイヌナズナなど，小さな実験材料からヘムを定量する必要に迫られていた．そこで著者らは迅速，簡便

表 4：分光学的手法によるヘム定量法の比較
吸収極大波長 ヘムの吸光係数（nm)（mM cm )

測定方法
SDS 法
トリトン‑メタノール法
ピリジンヘモクロム法
Direct NaOH 法

2009 低 温 科 学で高感度なヘム定量系の開発を行った ．この方法は，vol.67

400
397
557
385

91
165
20.7
58

1990年の Thomas と Weinsteinが行った，ヘムの抽出液と西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）のアポタン
パク質を混合することで，HRP 活性を自発的かつ定量的に再構成させ，発色法により検出するという手法を応用したもので，HRP 活性をルミノールの化学発光検出333

により，さらに高感度かつ簡便に測定するものである．

性は十分検出可能であり，数 mg の植物体からでもヘム

本方法に従って，ルミノメーター（Turner design 社の含量を測定することが可能であった．以上のことか

製，TD−20/20）を用いてヘムの標準溶液を測定すると，ら，本方法はアセトン以外の有害な有機溶媒を用いず，検出限界は 20pM 程度であり，１nM 程度まで直線性をしかも従来の測定法に比べて 100倍以上の高感度で，夾もって定量することが可能であった．さらにこの反応は雑物の影響を受けない，簡便かつ特異的なヘム定量法でヘムに特異的であり，他のポルフィリンや金属ポルフィあることが明らかとなった．

リンは全く HRP 活性を示さなかった．また，Fe III や

その後，市販の化学発光によるウェスタンブロット検

ヘムはそれ自身が偽ペルオキシダーゼ活性を持ち，ルミ

出試薬を用いて，検出感度の向上と試薬調製の手間の軽

ノール酸化活性を示すことから，ルミノール反応による減を試みた．さらに，96ウェルのマイクロタイタープ

血液の検出など警察の科学捜査などにも利用されていレート上で反応させたサンプルの化学発光を，CCD カメ

る．そこで，Fe III やヘムのみが示す化学発光活性と比ラを内蔵したゲルドック内で測定することにより，多検

べたところ，同濃度のヘムで再構成した HRP 活性より体を同時測定することを可能にした ．現在，冷却 CCD

も 100倍以上低いことが明らかとなり，これらの物質がを備えない旧式のゲルドックを用いて多検体を同時に測共存しても，HRP 由来の化学発光には殆ど影響を与え定しても，高い再現性と測定可能濃度の広いダイナミッ

ないことが分かった．

クレンジを実現している．実際，本測定法のへムの検出

一般に植物細胞には種や組織によっても異なるが，１感度は数 pM 以下にまで達し，さらに１nM 程度まで高〜20nmol/g 新鮮重程度のヘムが存在することが報告さ

い直線性を示している（図４）．以下に最新の実験方法をれている ．従って，先に述べた塩酸酸性アセトンによる紹介する．

抽出法に従い，１g の植物体からヘムを抽出した場合，塩酸アセトンに含まれるヘムの濃度は，１〜20nmol/50［実験方法］

ml＝20〜400nM と計算できる．アセトンは HRP 活性１．用意するべき試薬を阻害するが，１％以下では殆ど活性を阻害しないことから，塩酸アセトン抽出液をバッファーで数百倍程度に(①)HRP アポザイム（APOHRP：Biozyme 社製，
日本ではフナコシより購入可能）

希釈するだけで，HRP 活性に影響を与えない適度なヘ(②)Hemin（どの試薬メーカーのものを用いても特ム濃度の溶液を調製できることが分かった．実際，このに問題は無い．DMSO に溶解後，10mM KOH

方法で調製したヘム希釈液を用いて再構成した HRP 活

で希釈して標準溶液を調製する ．
）

図 4：高感度定量法におけるヘムの検量線．Ａ：０〜80pM およびＢ：100〜800pM のヘム濃度における検量線を示す．
図表内の写真はゲルドックで撮影し，定量に供した化学発光を示す．それぞれの濃度範囲で高い直線性を示すことが分かる．

334

光合成生物のヘムの分析法

(③)Immobilon

Western Chemiluminescent

HRP Substrate（ミリポア社製 ）(④)500mM Tris−HCl，pH 8.4
２．96ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルに，終 濃 度 2.5nM

5.b.10 おわりにこれまでヘムは，ヘムタンパク質の補欠分子族として，
酸化還元，電子伝達，そして酸素運搬として機能するこ

HRP ア ポ ザ イ ム，100mMとが知られて来た．しかし近年ヘムが，動物，植物，微（１〜100pM あ
Tris−HCl，pH 8.4，ヘム標準溶液

生物を問わず，多様な生理作用を調節する細胞内シグナ

るいは 100〜1000pM の濃度段階）を，最終容量 100

ルとしての機能することが明らかとなって来た．実際ヘ

μl となるように混合する．

ムは，転写

，翻訳

，翻訳後のタンパク質輸送 ，

３．HRP の再構成のため，30分間室温で放置する．

そしてイオンチャネルの制御

４．Immobilon のキットに含まれる２液を等量混合す

調節することが報告されている．さらに細胞内オルガネ

る．

など，幅広い生理現象をラ間のヘム輸送が，赤血球形成に重要な役割を持つこと

５．各ウェルに 100μl の混合した溶液を添加し，混合する．

が報告された．植物細胞においても，ヘムはテトラピ

ロール生合成系の負のフィードバック制御を担い，また６．化学発光は反応開始後２分程度で最大に達し，15分

緑藻クラミドモナスの転写制御シグナルとして機能する

間は最大発光が維持される．化学発光検出用のゲルことが報告されている ．へムの高次な役割の解明には，ドックあるいはマイクロプレート対応のルミノメー

細胞内の各オルガネラにおける微量なヘム濃度を正確にターで化学発光を検出する ．

測定する必要がある．実際，葉緑体においてヘム合成の７．各ウェルの化学発光を定量し，検量線を作成する．

フィードバック制御に関わる遊離ヘムのプールが存在す

８．植物組織のヘム濃度を測定する場合は，先に述べたるのか，またその濃度は？などについての知見は殆ど得

酸性アセトンによる抽出法を，実験のスケールをられていない．特にシロイヌナズナなどの微小な生物材

100分の１に下げ，実験操作５．まで行う．得られた料におけるヘムの定量は難しく，植物体に 2,2ʼ
‑dipyr-

塩酸アセトン抽出液を数百倍程度，100mM Tris−

idyl などの鉄キレーターを処理することでフェロキラ

HCl，pH 8.4で希釈し，実験に用いる ．最近の我々

ターゼ活性を阻害し，ヘムによるフィードバック制御をの研究結果によると，不特定のヘムタンパク質が実解除した材料におけるポルフィリン蓄積や ALA 合成活験操作１．のアンモニア性アセトンに溶解すること性を測定することで，ヘムの含量を間接的に見積もる方が明らかとなった（未発表）．従って，植物組織中の法がとられている

総ヘム量を正確に定量するためには，アンモニア性度と相関するかどうかはいまだ明らかではなく，本方法

アセトンによる抽出操作を省き，破砕を 80％アセトのような直接的な定量が望ましいことは明らかである．

ンで行うべきである．この条件ではヘムは抽出されまた簡便かつ高感度なヘム定量系は，マラリアの感染ない．

．しかしこの方法が遊離へムの濃診断にも有用であることが示されている．ヒトに感染したマラリア原虫は，肝臓から赤血球に侵入した後，ヘモグロビンを分解しヘムを放出させる．この放出された遊離ヘムはマラリア感染による致死率と相関することか

ヘムの濃度はアルカリ−ピリジン−ヘモクロム法で求めるか，
66.5％エタノール／17％酢酸／16.5％水中でのヘムの 398nmの吸光度を測定し，吸光係数 144mM を用いて計算する．
GE Healthcare Bioscience 社の ECL Plus Western Blotting
Detection System も同等の性能を有すると考えられる．
測定感度は機器に応じて異なるため，それぞれの装置で調整す
る．浜松ホトニクス社製の ARGUS−50を用いて測定を行った場合，integration frame の値を 100，bit range の値を７〜14にセットすることで，安定して測定することが可能であった．
本測定系は非常に感度が高いため，希釈率を誤るとヘム濃度は容易に検量線の範囲を越える．いくつかの希釈条件で測定を行い，濃度を確認する．またあまり高濃度のヘムを測定しようとすると，基質の枯渇による化学発光の kinetics の変化や，高発光による CCD 検出器の焼き付けなどを引き起こす場合があり得るので，注意する．

2009 低 温 科 学

vol.67

ら，血中のヘム濃度を調べることがマラリア感染診断の重要な指標と成り得ることが報告されている ．またマ
ラリア原虫は遊離へムを多量体化してヘモゾイン（マラリア色素）とよばれる物質に変換することで，ヘムを無毒化している．現在マラリア治療に用いられているキ
ニーネやアルテミシニンといった治療薬は，マラリア原
虫細胞内でのこのヘム多量体化による無毒化のステップを阻害することで，作用することが知られている．従って，抗マラリア治療薬を開発する上でも，ヘムは良い指標になると考えられ，今後，微量のヘムを簡便かつ迅速に定量する技術は，ますます重要になっていくと考えられる．
335

ヘムは比較的不安定な物質であり，植物における微量分析などはこれまで殆ど成されて来なかった．今後，高感度なヘム測定の需要はますます増加していくことが予想され，著者らが開発した酵素学的アッセイによるヘムの高感度定量法がその一助になれば幸いである．

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337

３章 単離・精製・活性測定

５．色素の分析c．バクテリオクロロフィルの分析
民秋

均 ，溝口

正

バクテリオクロロフィルは，光合成アンテナや反応中心において，光収穫・エネルギー伝達や電子移動を行う光応答性の色素分子である．本章では酸素非発生型光合成細菌からのバクテリオクロロフィ
ルの抽出・分析方法について紹介する．

Analysis of Bacteriochlorophylls
Hitoshi Tamiaki, Tadashi Mizoguchi
Bacteriochlorophylls are photoactive pigments in photosynthetic antennas and reaction centers where lightharvesting, energy-transferring and electron-transferring processes occur. In this chapter,we describe analytical methods of bacteriochlorophylls in anoxygenic photosynthetic bacteria. variety of bacteriochlorophylls,
their biosynthesis and principle of their analysis are also described.

5.c.1 バクテリオクロロフィルの種類
バクテリオクロロフィルは，酸素非発生型光合成細菌から見出されたクロロフィルに名付けられている．その名称が与えられているのであって，バクテリオクロリン
骨格を有する化合物にバクテリオクロロフィルという名称が与えられている訳ではないことを，再確認しましょう．

ような光合成細菌にあるクロロフィル類は，主としてバ

まず 17位上の長鎖エステル基の多様性を無視して，
バ

クテリオクロロフィルであるが，一部マイナーなクロロ

クテリオクロロフィルの分子構造について簡単に説明しフィル（緑色硫黄細菌やヘリオバクテリアの反応中心にましょう．バクテリオクロロフィル a は多くの紅色細菌

おける一次電子受容体）には，酸素発生型光合成生物にに見られるが（表 1），その８位と 8 位から各１個の水素見出されるクロロフィル a の誘導体として名付けられ原子を除いて（E ）‑8‑エチリデン基になったものが，バているものも有るので注意しましょう．

クテリオクロロフィル b である（図 1）．バクテリオクロ

バクテリオクロロフィルには，a から g までの７種類

ロフィル b も一部の紅色細菌から見出されているが，そが有り，これまで f を除く６種類が確認されている（バの天然界における分布はさほど多くない．バクテリオク

クテリオクロロフィル f は名前が予約されているだけ

ロロフィル b の 3‑アセチル基をビニル基にしたものが，で，天然界からは発見されていない）．17位上のプロピオ

ヘリオバクテリアで見出されたバクテリオクロロフィル

ネート残基における長鎖炭化水素基の多様性を除けば，

g である．好酸性紅色細菌の中にはバクテリオクロロ

バクテリオクロロフィル a，バクテリオクロロフィル b，

フィル a の中心金属がマグネシウムから亜鉛に置き変バクテリオクロロフィル g は，Ｂ・Ｄ両環の β位の炭わったものも有り，亜鉛バクテリオクロロフィル a と呼素―炭素二重結合が単結合に還元されたバクテリオクロ

ばれている．

リン骨格を有する単一の分子構造を示し，バクテリオク

バクテリオクロロフィル c は多くの緑色細菌に見ら

ロロフィル c〜f は，Ｄ環のみが還元されたクロリン骨

れるが，その 20位のメチル基を水素原子に置き換えたも格を有する同族体分子の総称である（図 1) ．
名称と π骨のがバクテリオクロロフィル d に，その７位のメチル基格とが一致しない（クロリン骨格を有するバクテリオク

をホルミル基に置き換えたものがバクテリオクロロフィ

ロロフィルが存在する）ので，混乱しないように心掛け

ル e になる．なお，バクテリオクロロフィル e の 20位脱るべきである．酸素非発生型光合成細菌から単離されたメチル体がバクテリオクロロフィル f という名前で予

クロロフィル型分子に，バクテリオクロロフィルという約されている．バクテリオクロロフィル c〜e は，8 や12 位上でのメチル化度が異なる同族体の総称であり，

１) 立命館大学総合理工学院薬学部薬学科

これまで８位にエチル・プロピル・イソブチル・ネオペ

２）立命館大学総合理工学院生命科学部応用化学科

ンチル基が，12位にメチル・エチル基が見出されている．

2009 低 温 科 学

vol.67339

図 1：バクテリオクロロフィル a〜g の分子構造

さらに，それぞれの同族体において，3 位の不斉炭素原る（図 1) ．バクテリオクロロフィル g ではファルネシル

子に関して立体構造の異なるもの（R 体と S 体）が存在

基しかこれまで見つかっていない．緑色硫黄細菌のバクすることも多い．

テリオクロロフィル c〜e では，主としてファルネシル

17位上の長鎖エステル基は，バクテリオクロロフィル

基であるが，それ以外の多様な炭化水素基も見出されて

a やバクテリオクロロフィル b では通常フィチル基（P）

いる．緑色非硫黄細菌のバクテリオクロロフィル c でである．種によってはその生合成途上のゲラニルゲラニ

は，上記の分枝炭化水素基以外に，ステアリルやオレイ

ル（GG）
・ジヒドロゲラニルゲラニル（DHGG）・テトラル基のような直鎖状のものまでが見られる．

ヒドロゲラニルゲラニル（THGG）もみられることがあ340

バクテリオクロロフィルの中 心 金 属 を 除 い た も のバクテリオクロロフィルの分析法

表 1：バクテリオクロロフィルの種類および存在する器官と生物種
バクテリオクロロフィル類
バクテリオクロロフィル a

バクテリオクロロフィル b
バクテリオクロロフィル c
バクテリオクロロフィル d
バクテリオクロロフィル e
バクテリオクロロフィル f
バクテリオクロロフィル g
亜鉛バクテリオクロロフィル a
バクテリオクロロフィル aʼ
バクテリオクロロフィル gʼ
バクテリオフェオフィチン a
バクテリオフェオフィチン b

光合成器官

生物種

LH1，LH2，LH3，LH4，RC（紅色細菌）
ベースプレート，FM O，RC 複合体（緑色硫黄細菌）
ベースプレート，膜内アンテナ，RC（緑色非硫黄細菌）
LH1，RC
クロロゾームクロロゾームクロロゾーム未発見
RC 複合体
LH1，LH2，RC
RC の一次電子供与体（緑色硫黄細菌）
RC の一次電子供与体（ヘリオバクテリア）
RC の一次電子受容体（紅色細菌）
RC の一次電子受容体とアクセサリー部（緑色非硫黄細菌)
RC の一次電子受容体（紅色細菌）

紅色細菌
緑色細菌
紅色細菌
緑色細菌
緑色硫黄細菌緑色硫黄細菌
ヘリオバクテリア
好酸性紅色細菌
緑色硫黄細菌
ヘリオバクテリア
紅色細菌
緑色非硫黄細菌
紅色細菌（フェオフィチン化）を，バクテリオフェオフィチンと呼ウムを中心に挿入し，13位上でのプロピオネート残基のび，紅色細菌や緑色非硫黄細菌の PS 2型の反応中心にメチルエステル化とそれに続く嫌気下でのオキソ化とエおける一次電子受容体として機能している
（表 1）
．また，

キソ五員環形成によって，（3,8‑）ジビニルプロトクロロ

バクテリオクロロフィルの 17位上のプロピオネート残フィリド a が合成される．ここまでは，酸素発生型光合基のエステルを加水分解して得られるカルボン酸体を，成で見られるクロロフィル a・b と同じである．この後，バクテリオクロロフィリドと呼び，このようなカルボン

どのような経路でバクテリオクロロフィルを合成される酸が生合成途上で見られる．さらに，13 位の不斉炭素原のかは，いくつかの経路が提唱されており，まだ確定し子における立体異性体（エピマー体）をプライム体と呼

ていない

び，
「ʼ
」を名称の後に付ける．バクテリオクロロフィル

からバクテリオクロロフィリドに至る酵素による官能基とバクテリオクロロフィル gʼ
が，緑色硫黄細菌とヘリaʼ

変換を列挙する（図 2）．

オバクテリアの PS 1型の反応中心における一次電子供

１) 3‑ビニル基は，マルコフニコフ型で水分子の付加を与体にあるとされている（表 1) ．
バクテリオクロロフィル a・b・g は，オリゴペプチド．以下に，ジビニルプロトクロロフィリド a

受け 1‑ヒドロキシエチル基になり，さらに酸化されることでアセチル基に変換される．

と非共有結合して，バクテリオクロロフィル−タンパク２) 7位のメチル基が酸化されて，ホルミル基になる．

複合体を形成しており，その中心マグネシウムはアキ

３) 7‑8位の二重結合がトランス型で「水素分子」の付加

シャル位から配位を受けて，必ず五配位錯体となってい（還元）を受ける．

る．この第五配位子は，オリゴペプチド中のヒスチジン

４) 8‑ビニル基は還元を受けてエチル基になり，その末残基のイミダゾール基であることが多いが，それ以外の端のメチル基の水素原子が順次メチル化されること

残基や水分子などの場合も有る ．バクテリオクロロ

で，プロピル・イソブチル・ネオペンチル基へと変換

フィル c〜f は，自己集積して巨大なＪ会合体を形成しされる．また，7‑8位の二重結合と共役した 8‑ビニルており，その中心マグネシウムは隣接分子の 3 位の水酸基は，1,4‑水素付加（還元）を受けて 8‑エチリデン基基の酸素原子のアキシャル位配位を受けている ．いずに変換されうる．8‑エチリデン基は，7‑8位の二重結合

れのバクテリオクロロフィルでも天然界では，中心マグの還元後の 8‑ビニル基の異性化によって合成されるネシウムは五配位型であり，四配位や六配位錯体では存可能性と，7‑8位の二重結合と 8‑ビニル基の両方の還在していないことに注意しましょう ．

元後に８位と 8 位の水素脱離（脱水素・酸化）によって合成される可能性が有る．

5.c.2 バクテリオクロロフィルの生合成

５) 12位のメチル基の水素原子がメチル化されて，エチル基になる．

ヘムやクロロフィルと共通して，プロトポルフィリン

６) 13 位のメトキシカルボニル基が加水分解を受けてが生合成経路における前駆体となる（図 2）．マグネシカルボキシ基となり，さらに脱炭酸して水素原子にな2009 低 温 科 学

vol.67341

図 2：バクテリオクロロフィルの生合成経路（官能基変換)

る．13 位のメトキシカルボニル基の立体配置が反転

レー（Soret）帯と呼ぶことも多い．バクテリオクロリン

して，立体異性体（エピマー体・プライム体）になる．

骨格を有するバクテリオクロロフィル a・b・g は，近赤７) 17‑18位の二重結合がトランス型で水素付加（還元）外領域に大きな Q 帯と可視領域に少し小さいがはっきを受ける．

りとした Q 帯と近紫外領域に大きくて分裂したソー

８) 20位の水素原子がメチル化される．

レー帯を有している．クロリン骨格を有するバクテリオ

９) 中心金属のマグネシウムが亜鉛に置き変わったり，

クロロフィル c〜e は，可視領域に大きな Q ・ソーレー

２個の水素原子に置き変わったりする．

帯ときわめて小さい Q 帯を有している．

以上のようにして生合成されたバクテリオクロロフィ

バクテリオクロロフィルの吸収帯は，環状テトラピ

リドは，エステル化されてバクテリオクロロフィルとなロールの π共役系に基づいているために，π系に直結しる．なお，エステル化後にエステル上の炭素―炭素二重た置換基の影響を大きく受ける．このために，各バクテ結合が還元されるのか，予め還元されたエステル化剤でリオクロロフィルは固有の吸収スペクトルを与える．つエステル化されるのかもはっきりしていない．どちらか

まり，単離したバクテリオクロロフィルの適当な有機溶

一方が起こるのではなく，そのどちらもが起こる可能性

媒中での吸収スペクトルを測定すれば，その同定が可能も否定されていない．

である．一方，π系から離れた 8 や 12 位上でのメチル基の数や 17位上のエステル基の違いや 3 位の立体構造

5.c.3 バクテリオクロロフィル分析の原理

は，ほとんどその吸収スペクトルに変化を与えない．そこで各バクテリオクロロフィルにおけるこのような差異

各バクテリオクロロフィルは，中心マグネシウムへのは，吸収スペクトルからでは区別できない．質量分析や配位が可能な有機溶媒中（例えばアセトンやエーテル）

核磁気共鳴法などを利用して，その分子構造を決定する

では，単量体として存在し，その固有の性質を与える（表ことになる．

2）．特に近赤外・可視・紫外領域での電子吸収スペクト

バクテリオクロロフィルは，生体系では比較的安定でルがその同定には大きな威力を発揮する．一方，低極性あるが，有機溶媒中の単量体では化学的に比較的不安定

有機溶媒や水中では容易に自己集積して，その吸収スペである．従って，その分離・分析には注意を要するが，クトルが大きく変化する．

近年では高速液体クロマトグラフィー（HPLC）法を用いバクテリオクロロフィルの吸収スペクトルは，長波長

れば，初学者でも比較的容易に分離・同定が行える．検側から，Q ・Q ・B ・B の４つの吸収帯があり，それぞ出に吸収スペクトル測定が可能なフォトダイオードアレ

れに振動構造を有している．B ・B 帯をまとめてソー

イ型の検出器を用いれば，分離同定が一度に出来て便利

342

バクテリオクロロフィルの分析法

表 2：バクテリオクロロフィルのジエチルエーテル中での吸収極大 λ (nm）と吸 光 係 数 ε(mM cm )バクテリオクロロフィル類
バクテリオクロロフィル a

バクテリオクロロフィル b

バクテリオクロロフィル c

バクテリオクロロフィル d

バクテリオクロロフィル e
バクテリオクロロフィル g
亜鉛バクテリオクロロフィル a
バクテリオフェオフィチン a
バクテリオフェオフィチン b

λ
ε
λ
ε
λ
ε
λ
ε
λ
ε
λ
ε
λ
ε
λ
ε
λ
ε
λ
λ
λ
λ
ε
λ
ε

ソーレー帯

Q 帯

Q 帯

358

577

773
90.0
771
97.0
794
106
791
106
659
112.5
660
73
651
113.5
651
88.3
647
34
767
767（1.00)
763（1.00)
749
67.5
776
100

357
75.3
368

578

372
77.2
429
429
112
423
423
117
458
100
364，404
364（0.94)353（0.80)
358
114
398
237

565

文献
11
12
11
12
11
12
11
12
11，12
11
12
12
12
12

アセトン中， 相対吸光強度．

である．さらに，蛍光発光による検出法を用いれば，高光合成細菌からのバクテリオクロロフィルの抽出法

感度な分析が可能であり，質量分析を検出に用いる LC-

は，利用可能な溶媒・器具等により様々であるが，本稿

M S 法を用いれば，高感度分析の上に，エステル鎖や同族では一般的な化学系実験室で可能な方法について記述す体の決定にも威力を発揮する．なお，3 位の立体構造は，る．なお，バクテリオクロロフィルを変性させる外部因

誘導体の結晶構造解析によって決定できるが，これまで子として，光・熱・酸素があげられる．必要に応じこれの多くの分析結果に基づき，HPLC の溶離順によってほらの因子の低減を心がけるべきである．

ぼ確定できる（5.c.6参照）．
(1) 少量の抽出（吸収スペクトル測定，HPLC 分析）

5.c.4 光合成細菌からのバクテリオクロロ
フィルの抽出法
酸素非発生型光合成細菌は，自然から単離精製するか器具＝卓上型遠心分離器（あると便利），キャップ付き
試験管
試薬・溶媒＝アセトン，メタノール，ジエチルエーテ
ル，飽和食塩水，窒素ガス

研究室のストックや各種団体からの分与によって入手す

操作①：培養液 5mL 程度を遠心沈降し，ウエットセル

ることになる．この種菌をゲルや液体培地で培養して増を得る（1000g 程度を発生させる卓上型遠心器で十分殖してから，バクテリオクロロフィルを抽出することにに沈降できる）．卓上型遠心器が無い場合は，培養液（1なる．
いずれの場合でも，コロニー形成による精製を行っ

mL 程度）そのものを用いて以下の操作を行うこともておいた方が，微量バクテリオクロロフィルの分析には可能である．バクテリオクロロフィルは脂溶性である安心である．

ため，水の割合（培養液量）が増えると抽出効率が悪

通常は，液体培地で培養後に，菌体を遠心沈降によっくなる．必要に応じて，溶媒量を調節すること．

て分離し，そのウエットセルから抽出することになる．

操作②：ウエットセルに，アセトン／メタノール混合溶

以下に菌体からのバクテリオクロロフィルの抽出法を述

液（≒1：1(v/v））（2mL）を加え，よく撹拌する（超べる．

音波照射等の激しい破砕を行わなくても十分抽出され2009 低 温 科 学

vol.67343

る）．
操作③：再度遠心分離し，上清画分を回収する（ろ過により残渣を除去してもよい）．
操作④：回収した上清画分（アセトン／メタノール混合(3) 単離・精製法
上記の抽出操作では，目的のバクテリオクロロフィル
以外にカロテノイド色素も抽出されるので，カラムクロ
マトグラフィーや再結晶等による精製が必要となる．そ溶液＋微量の水）に同量のエーテルを加え（2mL），更の精製時における注意点を下記に示す．

に（蒸留）水を加えて色素をエーテル層に抽出する．

・一般的に市販されているシリカゲルによるバクテリオ

操作⑤：エーテル層は，飽和食塩水を用いて脱水・洗浄

クロロフィルの単離は，試料の変性を誘起しやすいた

する．
操作⑥：エーテル層を回収し，窒素ガス気流などで溶媒を留去後，目的の溶媒に再溶解し，種々の測定・分析

め困難である（固定相であるシリカゲルが酸性である
ため）．
・バクテリオクロロフィルの単離に適した固定相としてに用いる．

は，Sepharose（アガロース）やセルロースがあげられ以上の操作は数分間で十分行えるので，通常の白色蛍る．Sepharose は，幾分高価であるが分離能は極めて光灯下で作業しても大抵のバクテリオクロロフィルは安高い．一方，セルロースは，安価であるが分離能の点定に抽出できる．

で Sepharose に劣る．
・緑色細菌に含まれるバクテリオクロロフィル c〜e に(2) 大量の抽出
原理的には上記(1)の少量での抽出と同じである．作業
時間が幾分長くなるので，各操作中，容器をこまめに遮光することを心がけること．
器具＝磁気撹拌器，三角フラスコ，分液ろうと，ロー

関しては，ヘキサン等の無極性溶媒への溶解度が低い
ので，再結晶により単離が容易に行える．
なお，十分に純度の高いバクテリオクロロフィルを得るためには，5.c.6で述べる HPLC を利用する必要が有
る．

タリーエバポレータ
試薬・溶媒＝アセトン，メタノール，ジエチルエーテ
ル，飽和食塩水，無水硫酸ナトリウム，窒素ガス
操作①：ウエットセルにアセトン／メタノール混合溶液
を加え，磁気撹拌器を用いてよく撹拌する．必要に応じて（特にバクテリオクロロフィル b や g などの空気

5.c.5 吸収スペクトル測定によるバクテリオ
クロロフィルの同定
一般的なダブルビーム型分光光度計を用いた同定法を以下に記述する．

酸化が起こりやすい試料の場合），窒素ガスを通気した光合成細菌に含まれるバクテリオクロロフィルは，そ窒素雰囲気下で行うことで試料の変性が低減される．

れらに固有の吸収帯を有しているので，吸収スペクトル操作②：デカンテーションにて溶液を回収し，残渣に対から容易に同定が行える（表 2）．特に最長波長吸収帯でして①と同様の操作を色素が抽出されなくなるまで行

ある Q 帯は，バクテリオクロロフィルの種類により大う．

きな差があるので，識別に適している．測定に用いる溶操作③：アセトン／メタノールの抽出液を混合し，エーテルと（蒸留）水で分液・洗浄する．
操作④：エーテル層は飽和食塩水で脱水・洗浄し，無水
硫酸ナトリウムを加え 15分以上脱水する．
操作⑤：ロータリーエバポレータを用いて溶媒を留去す

媒は，ジエチルエーテルやアセトン等が一般的で，これらの溶媒中でのモル吸光係数も決定されているので便利である．溶媒の吸収にも配慮し，使用する溶媒を選定す
る（アセトンは紫外部に吸収を有すため，350nm よりも短波長領域での測定は出来ない）．バクテリオクロロフィ

る．

ル a・b・g では，Q 帯の吸光度も大きいので，色素の同試料の保存は，乾燥状態の場合，窒素ガスを封入し（空定に有効である．特に，脱マグネシウム化したか否かの気による酸化に注意），
冷凍保存する．
溶液保存の場合は，確認（あるいはバクテリオフェオフィチンの生成）の際ジエチルエーテルやアセトン等を溶媒として用い冷凍保に威力を発揮する．緑色細菌のバクテリオクロロフィル

存する．いずれの保存法でも容器は遮光しておく．バクc〜e では，Q 帯の強度が低いので，ソーレー帯によるテリオクロロフィルの変性を誘起する因子（光・熱・酸

フェオフィチン化の識別が有効である（Q 帯に比べ波長素）を低減させれば，長時間，安定に保存できる（年単の変化が大きく識別が容易）．バクテリオクロロフィル

位での保存も可能）．

は，大きなモル吸光係数を有すため，目視にて着色が確認できる程度の濃度（μM オーダー）で十分測定可能であ344

バクテリオクロロフィルの分析法

図 3：紅色光合成細菌のバクテリオクロロフィル a の逆相
HPLC 分析例．
１：ゲラニルゲラニルエステル
２：ジヒドロゲラニルゲラニルエステル
３：テトラヒドロゲラニルゲラニルエステル
４：フィチルエステル，7.5％(v/v）水−メタ
Cosmosil 5C18-AR-II(4.6x 150mm）
ノール，1.0mL/min ．

図 4：緑色光合成細菌のバクテリオクロロフィル c の逆相
HPLC 分析例．
Ｒ Ｅ，
Ｍ ：(3 R )‑8‑エチル‑12‑メチル体
Ｒ Ｅ，
Ｅ ：(3 R )‑8‑エチル‑12‑エチル体
Ｒ Ｐ，
Ｅ ：(3 R )‑8‑プロピル‑12‑エチル体
Ｓ Ｐ，
Ｅ ：(3 S)‑8‑プロピル‑12‑エチル体
Ｓ Ｉ，
Ｅ ：(3 S)‑8‑イソブチル‑12‑エチル体，10％(v/v）水−メタ
Cosmosil 5C18-AR-II(4.6x 150mm）
ノール，0.5mL/min ．

る．バクテリオクロロフィル a・b・g の場合，可視部のおける光学異性体（R または S 型）も分離ができ，R吸収が弱いので注意を要する（容易に吸収が飽和する）．

型配置の方が溶出は早い（図 4）．
バクテリオクロロフィルの順相系 HPLC 分析では，用

5.c.6 HP LC によるバクテリオクロロフィ
ルの同定

いるカラム（＝シリカゲル）の酸性度に注意が必要である．バクテリオクロロフィル b・g では，分析中に容易にＢ環の異性化が生じクロロフィル誘導体へと変性する．

HPLC のための注入試料の調製は次の通りである．ままた，ヘキサン等の無極性溶媒がベースとなるため，緑ず，抽出・単離したバクテリオクロロフィルを，HPLC で色細菌のバクテリオクロロフィル c〜e に対しては，溶使用する移動相溶媒に置換する．0.45μm の細孔径を有解度が低いため，不向きと言える．

すフィルターでろ過後，HPLC に注入する．ろ過フィル
ター以外にも多種の前処理カートリッジが市販されているので，カロテノイド色素の除去に便利である．
大部分のバクテリオクロロフィルは，メタノール／水（10％程度）の混合溶媒を用いた逆相系 HPLC により容易に分離・同定が行える．オクタデシルシリル（ODS）
カラムを固定相とした逆相 HPLC による分離・同定について以下に記述する．
・バクテリオクロロフィル a・b では，17位の長鎖エステ
ルの微細な構造の違いも分離可能である（図 3) ．ま

参考文献
１) H.Tamiaki, R.Shibata & T.M izoguchi, Photochem.
Photobiol. 83 (2007)P.152.
２) T.M izoguchi, J.Harada & H.Tamiaki, FEBS Lett.
580 (2006)P.6644.
３) 小林正美，大橋俊介，光合成微生物の機能と応用（上原赫監修），第１章の３，シーエムシー出版，2006．
４) T.Oba & H.Tamiaki, Photosynth. Res. 74 (2002)P.1.

光学異性体のバクテリオクロロフィル aʼ
の分離も簡

５) H.Tamiaki, Coord. Chem. Rev. 148 (1996)P.183.
６) 民秋 均，金属錯体の光化学 （佐々木陽一・石谷 治編
著），13章，三共出版，2007．

単に行える．

７) T.M asuda & Y.Fujita, Photochem. Photobiol. Sci. 7

た，バクテリオクロロフィル a とその 13 位における・緑色細菌に含まれるバクテリオクロロフィル c〜e では，８位および 12位のアルキル基におけるメチル化度の異なる一連の同族体の分離も可能である ．メチル
化度が高い化合物ほど，その脂溶性が高くなるので逆相系 HPLC では溶出が遅くなる（図 4）．また，3 位に2009 低 温 科 学

vol.67(2008)P.1131.
８) R.D.Willows & A.M .Kriegel, The Purple Phototrophic Bacteria (C.N.Hunter, F.Daldal, M .C.Thurnauer& J.T.Beatty, ed.) Adv. Photosynth. Respiration 28 ,Chapter 4, Springer, 2009 .
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345

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Grimm, R.J.Porra, W.Rudiger & H.Scheer, ed.) Adv.
Photosynth. Respiration 25 , Chapter 15, Springer, 2006.
10) T.M izoguchi, H.Oh-oka & H.Tamiaki, Photochem.
Photobiol. 81 (2005)P.666.

346

11) Chlorophylls (H.Scheer, ed.), P.731, CRC Press, 1991.
12) 光合成事典 （日本光合成研究会編），P.392，学会出版センター，2003．
13) T.M izoguchi,T.Y.Kim,S.Sawamura & H.Tamiaki,
J. Phys. Chem. B 112 (2008)P.16759.

バクテリオクロロフィルの分析法

３章 単離・精製・活性測定

５．色素の分析
d．カロテノイドの分析
高市 真一
光合成生物にとってカロテノイドの存在は必須であり，多種多様なカロテノイドがある．光合成生物の分類群ごとに特有なカロテノイドもある．本章ではカロテノイドの抽出，精製，同定などの方法を解説する．

Analysis of Carotenoids in Phototrophic Organisms
Shinichi Takaichi
Presence of carotenoids in phototrophic organisms is essential for light-harvesting and photoprotection, andaround 150 kinds of carotenoids are found in these. Some specific carotenoids are only found in specific groups.
In this chapter, the methods for extraction, analysis, purification and identification are explained.

.d.1 はじめにンを主成分とする ．代表的なカロテノイドの構造式を
図 1に示した．

光合成生物にとってカロテノイドの存在は必須であ

本章ではカロテノイドの抽出，分析，精製，機器分析

り，光合成における機能が解明されつつあるが，まだ不による同定の方法などの一般的な解説をする．詳しくは明な点も多い．クロロフィルに比べて多種多様なカロテ〝カロテノイド：その多様性と生理活性"高市編，裳華房

ノイドが存在する．即ち，自然界には 750種類以上のカ（2006) を参照して欲しい．また生物材料ごとの事例にロテノイドが知られているが ，光合成に関与するカロ

関しては〝Methods in Enzymology, vol. 213" ，〝Ca-

テノイドは生合成中間体を含めて 150種類くらいと思わ

rotenoids,vol.1A" などを参照して欲しい．個々のカロれる ．主要なカロテノイドとして，陸上植物の葉緑体にテノイドの構造式や性質などは上記〝カロテノイド" あはほぼ共通して β‑カロテン，ルテイン，ビオラキサンチ

るいは〝光合成事典" ，〝Carotenoids,Handbook" ，生ン，9ʼ‑シス・ネオキサンチンと微量成分として α‑カロテ

理活性脂質データベース のカロテノイド部門などを参ン，ゼアキサンチン，アンテラキサンチンがある．藻類

照して欲しい．

は多種多彩で，微細藻類を中心に系統性の再検討がなされていて，一部の藻類では分析が充分でない．β‑カロテ
ンとゼアキサンチンがほぼ共通して主成分である．クリ5.d.2 抽出

プト藻の α‑カロテンとアロキサンチン，黄緑藻のジア

新鮮な生物材料を使うことが望ましいが，材料を保存

ジノキサンチンとジアトキサンチン，珪藻や褐藻やハプする場合はできるだけ低温に保存した方がよい．また抽ト藻のフコキサンチン，渦鞭毛藻のペリジニン，真正眼

出後は異性化や分解を受け易くなるので，生物材料のま点藻のビオラキサンチン，ユーグレナ藻のジアジノキサ

ま保存する方がよい．カロテノイドは光あるいは温度にンチンと 9ʼ‑シス・ネオキサンチンなど分類群に特有なカよる異性化，酸素による酸化，重合，分解などを受けやロテノイドの存在も知られている．以上のカロテノイド

すく，また酸あるいはアルカリにより化学構造の変化がは両側の末端基が βあるいは ε末端基である．原核光合起こることもある．できるだけ弱光の所で実験をおこな

成生物はさらに多様なカロテノイドを持つ．シアノバク

う，試料は低温で保存する，また窒素置換後，密栓をしテリアは β‑カロテンとその水酸化あるいはケト化したて酸素にふれないようにする，などの注意が必要である．

誘導体とミクソール配糖体，紅色細菌はメトキシ化した

さらに有機溶媒は人の健康に害を及ぼすのでドラフトな

非環状カロテノイド，緑色硫黄細菌と緑色糸状細菌は γ‑

どの換気施設の中で操作しなければならない．特にクロカロテン誘導体，
ヘリオバクテリアは炭素数 30のカロテ

ロホルムなどハロゲン化物は他の有機溶媒よりも人体に対する毒性が高いので，できれば他の有機溶媒に置き換

１) 日本医科大学生物学教室（日本医大・生物）2009 低 温 科 学

vol.67

えた方がよい．
347

くなりその後の処理がしにくくなる．生物材料によっては有機酸などの酸性物質，あるいは塩基性物質を多量に含み，また抽出用クロロホルムは塩酸を含むことがある
ので，濃い緩衝液を少量入れて pH 変化を防ぐと良い．
抽出液に多量の水分が含まれる場合は，抽出液にヘキ
サン，次いで水を加えて，ヘキサン層と含水有機溶媒層に分離させると，カロテンおよび低極性キサントフィル
はヘキサン層に含まれ，体積の減少，水分と夾雑物の除去をすることができる．酢酸エチル層と水層に分配する方法もある．水分が少ないときは直接ロータリーエバポ
レーターで有機溶媒を除去する．エタノールを加えて，水とエタノールの共沸を利用すると水分を除去しやすい．
有機溶媒での抽出により，カロテノイドばかりでなく，
中性脂質，リン脂質，糖脂質，キノン，膜タンパク質，
クロロフィルなど脂溶性物質も抽出されてくる．ただし光合成生物では脂質類に対してカロテノイド含量が多い
ので，多くの場合，そのまま分析できる．脂質類の妨害が問題となるときは，ケン化（アルカリ分解）により除くことができる．抽出物をエタノールあるいはジエチル
エーテルに溶かし，60％（w/v）水酸化カリウム水溶液を1/10容入れ，気相を窒素置換し，暗所，室温で 4‑6時間
あるいは 60℃で 20分放置する．その後，等量のジエチル
エーテルあるいはヘキサン，次いで塩化ナトリウム溶液を入れると二層に分離する．カロテノイドは有機溶媒層に残るが，脂質はグリセリンと脂肪酸塩に，クロロフィ
ルはクロロフィリドとフィトールに加水分解して水層に移動する．ただし花弁やある種の藻類などにはカロテノ
イド脂肪酸エステル，ある種の光合成細菌にはカロテノ
図 1：代表的なカロテノイドの構造式．

イド配糖体脂肪酸エステルがあり，これらのカロテノイ
ド誘導体はケン化により脂肪酸を失うので注意が必要である．またフコキサンチンやペリジニンなどのアセチル

生物材料ごとに抽出方法は千差万別である．生物材料

基も外れてしまう．

は水分を含んでいるので，前もって水分を減少させ，抽出には水と混ざる有機溶媒を用いる．一般にはメタノー
ル，アセトン，アセトン／メタノール
（7：2）
，クロロホ

5.d.3 分析方法

ルム／メタノール（1：2）などがよく用いられ，色がな

陸上植物の葉緑体，既にカロテノイドが同定されていくなるまで抽出を数回繰り返す．凍結乾燥した生物材料

る生物，近縁種のカロテノイドが同定されている生物，の場合は，材料の保存性がよく抽出しやすいこともあるなどは，フォトダイオードアレイ検出器（PDA）を接続

が，時に有機溶媒により細胞壁成分が固化して有機溶媒し，逆送系カラムを装着した高速液体クロ マ ト グ ラが浸透しにくくなることもあり，このときは湿った状態

フィー（HPLC）を使用すると，溶出時間と吸収スペクトに戻すと抽出しやすくなることがある．有機溶媒中で超ルからカロテノイドをほぼ同定できることがある．ただ音波あるいは乳鉢などによる破砕をすると抽出の効率がし分光光度計に較べて PDA は，波長分解能が低くまた上がる．抽出溶媒の体積を増やし，抽出回数を多くする

1‑2nm の波長のズレはおこる可能性はある．

と抽出の効率は上がるが，その反面，抽出液の体積が多348

逆送系カラムはシリカゲルにオクタデシルシラン基
カロテノイドの分析

（ODS，C ）を結合させたものであり，多用されている．
最近は C ，C ，C などの製品もあり，C はシス体の分5.d.4 吸収スペクトル離に便利である．各メーカーから多種類の製品が出ていカロテノイドの吸収スペクトルの形および吸収極大波て，製品毎に C の結合割合，残存水酸基の処理方法，残長は，共役二重結合の数，β末端基の数，溶媒に依存する．

存シリカの割合などが異なるため，性質に差異がある．

従って吸収スペクトルよりこれらの数を推定できる．共少量の中極性から高極性溶媒に溶かしたカロテノイド

役二重結合の数が多いほど吸収極大波長は長波長になは，カロテノイドの炭化水素部分と吸着剤の炭化水素部

り，共役二重結合系が同じカロテノイドでは水酸基やエ分との疎水結合により吸着し，初めに高極性成分が，最ポキシ基などの有無，例えば β‑カロテンとゼアキサンチ

後にカロテンが溶出してくる．共役や非共役二重結合のン，は吸収スペクトルに影響を与えない．
表１にメタノー

数が多いほど早く溶出する．カラムの種類あるいは溶出ル（HPLC 溶媒，PDA 測定）中の代表的なカロテノイド

溶媒を変えると，溶出時間が大きく変わることがある．

の吸収極大波長をまとめた．また環状構造をもたない鎖

先ずは文献と同じカラムと同じ溶出条件を用い，必要に状カロテノイド，共役二重結合の数が３のフィトエンか応じて条件を変更するとよい．溶出時間は，カラムの汚ら 13のスピリロキサンチン，の吸収スペクトルを図２にれ具合や温度などにも大きく影響を受け，多少の変動が示した．鎖状カロテノイドは３つの吸収極大波長が明瞭みられることがある．粗抽出液では脂質などの影響で精であるが，β末端基の数が１，２個と増えると極大ピーク

製物と溶出時間が異なることがある．そのため文献値とがブロードになる（図 3）．一般に溶媒の分極率が低い n‑の比較ではなく，既知のカロテノイドと比較対照した方

ヘキサンより高い二硫化炭素の方が吸収スペクトルが長がよい．

波長シフトするので（図 4），カロテノイドの吸収スペク

緑葉，シアノバクテリア，紅色細菌の HPLC 分析例を最後に示した．

トルを示すときは，必ず溶媒の種類を明記しなければい
けない．また共役したカルボニル基（ケト基，アルデヒド基）を持つカロテノイドは，吸収スペクトルが一つの幅広い形であるが，カルボニル基を NaBH で還元すると吸収スペクトルはピークをもつ形に変化する．また色

表 1：種々のカロテノイドのメタノール中での吸収極大波長 ．
N

N

N

3
5
7

3 ０
5 ０
7 ０

8
9

8 ０
9 ０

10
11
12
13

10
11
12
13

9
10

8 １
9 １

０
０
０
０

11 10 １
12 11 １13 12 １119 ２

吸収極大波長（nm)％III/II％D /D284 (294)
346 365
398 422395 419419 446436 465436 466
452 482
468 499
480 513492 524

85.0
95.0
89.9
97.7
90.2
89.9
78.5
68.7
65.2
63.8

10.1
5.2
11.1
5.8
6.8
5.0
10.6
9.2
10.7
14.1

フィトエン
フィトフルエンζ‑カロテン
非対称 ζ‑カロテン
シフォナキサンチン還元型
ニューロスポレン
ビオラキサンチン
スフェロイデンリコペン
アンヒドロロドビブリン
スピリロキサンチン

426
442
443
457
459
468
484

451
471
470
485
488
499
516

52.4
61.2
61.7
30.4
45.5
46.2
40.7

6.0
5.6
5.3
13.5
7.4
17.4
13.0

β‑ゼアカロテン
α‑カロテンルテイン
γ‑カロテンクロロバクテン
バクテリオルビキサンチン
トルレン

341 (429) 449
341 (427) 448
341 (425) 448

475
475
475

24.6
27.4
30.9

5.4
5.7
9.9

β‑カロテン
ゼアキサンチン
ノストキサンチン

254
295
295
309
328
326
344
360
372
385

(276)
329
377
374
397
413
415
427
442
454
464

324 (405)
335 (422)
335 (422)
346 (436)
350 (437)
361 (446)
379 (463)

カロテノイドN ，共役二重結合の数；N ，ポリエン鎖中の N; N ，共役 β端末基の数；N ＝N ＋N，室温で測定した．PDA の波長分解能（波長間隔HPLC に接続したフォトダイオードアレイ検出器（PDA）
1.3nm）のため 1‑2nm の差異がでることがある．吸収極大波長は吸収スペクトルの微分から求め，カッコ内
は吸収の肩を示す．

2009 低 温 科 学

vol.67349

図 2：非環状カロテノイドのメタノール中での吸収スペクト
ル．括弧内に共役二重結合の数を示した．1：フィトエン（3)，
2：フィトフルエン（5)，3：ζ‑カロテン（7)，4：ニューロス
ポレン（9)，5：スフェロイデン（10)，6：リコペン（11)，7：
ロドビブリン（12)，8：スピリロキサンチン（13)．
図 4：種々の有機溶媒中での β‑カロテンの吸収スペクトル．
濃度は同一：n‑ヘキサン（緑），クロロホルム（赤）
，二硫化
炭素（青）
．

ようなカロテノイド混合物あるいは未知カロテノイドを定量するときは，吸収極大波長において E ％＝2500あ
るいは ε＝140mM

cm を使用する．試料の吸光度が１であると，約 4μg/ml あるいは約 7μM に相当する．
また HPLC を用いて簡便的に各カロテノイドを定量するときは，HPLC 各ピークの吸収極大波長における分子
吸光係数が同一と仮定し，そこから求めた量を比較することもできる．

5.d.5 分離精製
分離精製はいくつかの方法を組み合わせて行う．抽出
図 3：吸収スペクトルに対する β末端基の数の影響．メタ
ノール中の β‑カロテン（緑），γ‑カロテン（赤），リコペン（青）の吸収スペクトル．

物を有機溶媒と水へ分配することや，乾固後，有機溶媒で再抽出することにより一部の夾雑物を除去できる．次に各種クロマトグラフィーの組合せで分離精製をする．
このとき順相系（シリカゲルなど）と逆相系（C など）

素タンパク複合体に結合すると，カロテノイドの吸収スの吸着剤の両方を用いた方がよい．HPLC あるいは薄層

ペクトルは長波長にシフトすることが多い．

クロマトグラフィー（TLC）からの分取，カラムクロマ

同じ共役二重結合系をもつカロテノイドは同一溶媒中

ト グ ラ フィーに よ る 分 離 を 行 う．DEAE-Toyopearl

ではほぼ同じ分子吸光係数である．一方，同一カロテノ

650M カラムクロマトグラフィーを使用すると，カロテ

イドでも溶媒により吸収極大波長ばかりでなく分子吸光

ノイドはヘキサン／アセトン混液で溶出し，カロテノイ

係数も異なることが知られている．これらは Davies &ド配糖体はアセトン濃度を上げると溶出し，（バクテリKost ，Britton にまとめられているが，多数の論文のオ）クロロフィルはアセトン／メタノール混液で溶出す

データをまとめたため，測定精度の違いなどのため一部

る．（バクテリオ）
クロロフィルや極性脂質の除去に有効の値に差異が見られる．その中から代表的なカロテノイである ．粗抽出液中のカロテノイドは脂質など夾雑物

ドの分子吸光係数を表 2にまとめた．一般に粗抽出液のの影響で，精製されたカロテノイドとクロ マ ト グ ラ

350

カロテノイドの分析

表 2：種々のカロテノイドの種々の有機溶媒中での分子吸光係数の例 ．
カロテノイド

溶媒

λ

ε

フィトエン
ζ‑カロテンニューロスポレン
ビオラキサンチン
スフェロイデンリコペン
アンヒドロロドビブリン
スピリロキサンチン
γ‑カロテン
α‑カロテンルテイン
β‑カロテン
ゼアキサンチン
フコキサンチン
ペリジニン

Ｈ
Ｈ
Ｐ
Et

286
400
438
441

50
138
147
150

Ｐ
Ｐ
Ｈ
Ｈ
Ｈ
Et
Ｈ
Et
Ｈ
Et

472
482
493
462
446
445
451
450
449
472

185
153
152
148
146
145
135
145
105
84

溶媒

λ

ε

Ｂ
Ｂ
Ｂ

454
465
487

134
157
181

Ｂ

510

147

Ｃ
Ｂ
Ｃ

456
458
465

130
127
129

Ｃ

470

81

溶媒

λ

ε

CS
CS
CS

477
475
484

117
123
108

CS

478

134

（nm），ε：分子吸光係数（mM cm ），Ｂ：ベンゼン，Ｃ：クロロホルム，CS ：二硫化炭素，Et：
λ：吸収極大波長
エタノール，Ｈ：ヘキサン，Ｐ：石油エーテル．

フィーでの挙動が異なることがある．また一般にカロテ装置を用いて高分解能質量を測定すると，カロテノイド

ノイドは精製が進むほど不安定になり，異性化や分解なの正確な分子式（分子を構成する炭素，水素，酸素の各々どがおこりやすくなるので注意を要する．

の数）を決定できるので，新規化合物の同定には高分解能質量分析は欠かせない．
5.d.6.2 核磁気共鳴

5.d.6 同定

核磁気共鳴（NM R）は H と C の化学シフトを測定

一般的にカロテノイドを同定するには，①既知カロテすることにより，有機物の化学構造について最も多くのノイドとの HPLC 溶出時間あるいは TLC 移動度の一構造情報を与える測定法であり，カロテノイドの化学構

致，②吸収スペクトルの一致，③質量数の決定，の３点

造決定には必須の測定である．最近は測定のソフトなどが最低限必要である．カロテノイドによってはこれだけの改良により， H-NMR や C-NMR 一次元測定のみなで同定できる場合と，不可能な場合がある．ただし近縁らず各種の二次元 NMR スペクトルも容易に測定でき生物の持つカロテノイドとの比較，生合成経路なども考るようになった．また天然存在比 1.1％の C も濃縮せ

慮すると可能性が絞られてくることもある．

ずに測定できる．通常は重クロロホルムに溶かす．試料

新規カロテノイドあるいは既知カロテノイドの化学構が微量な時は残存溶媒や水分に由来するシグナルの影響

造を正確に決定するには次のデータを必要とする．①吸を受けやすいので，前もって十分に乾燥させる必要があ

収スペクトルから共役二重結合系の構造を決定する．②

る．脂質は紫外吸収を持たないので，精製したときに夾

クロマトグラフィーでの挙動から極性基を推定する．③

雑物として残りやすいので脂肪酸のシグナルには注意が

質量分析で分子イオンから質量数を決定する．④質量分必要である．

析のフラグメンテーションパターン，極性基の化学的なカロテノイドは中央の共役二重結合が長いので，左右検 出 な ど か ら 極 性 基 の 種 類 と 数 を 決 定 す る．⑤ H-

非対称構造のカロテノイドの場合，例えばルテイン（図NMR， C-NMR を測定する．⑥必要ならば CD スペク

１参照），左半分の構造に由来する NMR スペクトルとトルから立体構造を決定する．

右半分に由来する NMR スペクトルは，お互いに影響せ5.d.6.1 質量分析

ずに両者を足しあわせたスペクトルになる．Englert は質量分析では分子イオンから質量数を決定でき，さら多数の半分の構造の NM R データをまとめた ．このにフラグメントイオンの解析により分子構造を推定できデータと測定データを比較して同定することができる．

る．近年発達した FAB 法，FD 法などソフトなイオン化

5.d.6.3 円偏光二色性法を用いると分子イオンを得やすい．さらに HPLC とオ

不斉炭素をもち立体異性の存在する有機物は左右の円ンラインで接続した LC/M S として用いられるイオン

偏光に対するモル吸収係数が異なり，これを円偏光二色化法もある．主に質量数決定に用いられる．また磁場型性（CD）という．カロテノイドは不斉炭素を末端原子団

2009 低 温 科 学

vol.67351

にもつと紫外領域（200‑400nm）の CD は相当な強度を示すので，不斉炭素の立体構造を決めることができる．
一方，可視領域（350‑550nm）では一部のカロテノイドを除いて CD は強度が非常に弱い．一般に溶媒としてジエチルエーテル／イソペンタン／エタノール（5：5：2）
を用いる．

5.d.7 分析例
緑葉，シアノバクテリア，紅色細菌の色素を C -HPLCで分析した例を示す ．
緑葉から色素を抽出するときは，液胞にある有機酸などによるカロテノイドのエポキシ基の構造変化を防ぐため，1M Tris-HCl（pH 8.0）1/10容を加えて酸性化を防ぐと良い．乳鉢にアセトンあるいはアセトン／メタノー
ル（7：2）を加えて葉を破砕し，色素を 2‑3回抽出する．
葉緑体の場合は有機溶媒を加えただけでも抽出できる．
ロータリーエバポレーターを用いて有機溶媒を除く．

図 6：シアノバクテリアの色素の C -HPLC 分析例．ノス
トック・コミュニー M ‑13 の粗抽出色素．カラム：μボンダ
パック C （RCM タイプ，ウオーターズ），溶出溶媒：0‑20
分；90％ メタノール：20‑40分；100％ メタノール（2.0ml/分）．1：2‑ヒドロキシ・ミクソール 2ʼ
‑フコシド，2：ノストキ
サンチン，3：ミクソール 2ʼ
‑フコシド，4：カロキサンチン，
5：ゼアキサンチン，6：カンタキサンチン，7：クロロフィル
a，8：エキネノン，9：β‑カロテン．

残った水分はエタノールを加えると蒸発させやすい．ホ
ウレンソウ粗抽出色素の C -HPLC 溶出を図５に示した．一般にルテインとゼアキサンチンは構造式が似ていオラキサンチンに戻ってから抽出した方がよい．葉緑体

るために分離しにくい．キサントフィルサイクルのカロの色素は既に知られているので，溶出順と吸収スペクト

テノイドを研究するのでないときは，１時間くらい暗所

ルから同定できる．

に放置して，ゼアキサンチンとアンセラキサンチンがビ

シアノバクテリアや紅色光合成細菌の沈澱菌体にアセトン／メタノール（7：2）を約５倍容加え，超音波
破砕し，遠心分離して色素抽出液を得る．沈澱からもう
1‑2回同様に抽出する．ロータリーエバポレーターを用
いて有機溶媒及び水分を除く．粗抽出色素の C -HPLC
溶出パターンを図 6，7に示した．

図 5：緑色植物の色素の C -HPLC 分析例．ホウレンソウ葉の粗抽出色素；光照射によりキサントフィルサイクルのアン
テラキサンチン，ゼアキサンチンが増加する条件に置き，抽出した．カラム：ノバパック C （RCM タイプ，ウオーターズ），
溶出溶媒：0‑8分；1.75％ メタノール，1.75％ ジクロロメタ
ン，1.75％ 水，94.75％ アセトニトリル：8‑20分；50％ アセ
トニトリル，50％ 酢酸エチル（2.0ml/分）．

352

図 7：光合成細菌の色素の C -HPLC 分析例．紅色光合成細菌ロドバクター・スフェロイデスの粗抽出色素．カラム：μボ
ンダパック C （RCM タイプ，ウオーターズ），溶出溶媒：メタノール（1.8ml/分）．
カロテノイドの分析カロテノイドの蛍光，ラマン，カロテノイドシフトなど物理化学的性質は各章を参照して欲しい．カロテノイ
ド生合成経路の解析には二つの方法がある．生合成経路の後の方の遺伝子・酵素，例えば β‑カロテン・ケトラー
ゼ（CrtO，CrtW ），の性質は遺伝子破壊株を作成して蓄積するカロテノイドと合成できないカロテノイドを分析する ．生合成経路の始めの方の遺伝子・酵素，例えばβ‑カロテン・ヒドロキシラーゼ（CrtR），は大腸菌（カロテノイドを合成できない）に基質を合成する遺伝子を導入し，さらに調べたい遺伝子を導入して，遺伝子発現により生産されたカロテノイドを分析する ．

５) 日本光合成研究会編，「光合成事典」，学会出版センター，
2003．
６) 生理活性脂質データベース http://lipidbank.jp/
７) S.Takaichi, Photosynth. Res. 65 (2000)p.93.
８) B.H.Cavies, H.-P.Kost, CRC HandbookofChromatography: Plant Pigments, vol.I, Fat-Soluble
Pigments, ed. H.-P.Kost, CRC Press, Boca Raton, 1988.
９) G.Britton, Carotenoids, vol.1B:Spectroscopy, ed. G.
Britton, S.Liaaen-Jensen, H.Pfander, Birkuhauser,
Basel, 1995, p.13.
10) S.Takaichi, M .Mochimaru, T.M aoka, Plant Cell
Physiol. 47 (2006)p.211.
11) C.R.Enzell, S.Back, Carotenoids, vol.1B: Spectroscopy, ed. G.Britton, S.Liaaen-Jensen, H.Pfander, Birkuhauser, Basel, 1995, p.261.
12) G.Englert, Carotenoids, vol.1B:Spectroscopy, ed. G.

参考文献
１) G.Britton, S.Liaaen-Jensen, H.Pfander, (ed.), Carotenoids, Handbook, Birkuhauser, Basel, 2004.
２) 高市真一編，「カロテノイド：その多様性と生理活性」，
裳華房，2006．
３) L.Packer, (ed.), Methods in Enzymology, vol.213:
Carotenoids, Part A: Chemistry, Separation, Quantitation, and Antioxidation, Academic Press, San Diego,
1992.
４) G.Britton, S.Liaaen-Jensen, H.Pfander, (ed.), Carotenoids, vol. 1A:Isolation and Analysis, Birkuhauser,
Basel, 1995.

2009 低 温 科 学

vol.67

Britton, S.Liaaen-Jensen, H.Pfander, Birkuhauser,
Basel, 1995, p.147.
13) R.Buchecker, K.Noack, Carotenoids, vol.1B:
Spectroscopy, ed. G.Britton, S.Liaaen-Jensen, H.Pfander, Birkuhauser, Basel, 1995, p.63.
14) M .Mochimaru, H.Masukawa, S.Takaichi, FEBS
Lett. 579 (2005)p.6111.
15) T.M akino, H.Harada, H.Ikenaga, S.Matsuda, S.
Takaichi, K.Shindo, G.Sandmann, N.M isawa, Plant
Cell Physiol. 49 (2008)p.1867.
注) Carotenoids,Vol.1A，1B は絶版であるが，Caro Natureから入手できる．

353

３章 単離・精製・活性測定

５．色素の分析
e．フィコビリンの単離と分析
石塚 量見 ，池内昌彦

フィコビリンはシアノバクテリアや灰色藻，紅藻，クリプト藻などの真核藻類における主要な光合成の集光色素であり，タンパク質と共有結合している．本項では光合成色素としてのフィコビリンの性
質，分析・単離法およびフィコビリタンパク質について述べる．

Phycobilins
Takami Ishizuka, M asahiko Ikeuchi
We summarized technical protocols for preparation,separation and identification of phycobilins extracted fromcyanobacterial cells.

5.e.1 概論：フィコビリン色素の構造と吸収補う吸光特性をもつため，光の波長特性が大きく変化する水環境に生息する藻類に広く分布する．なお，フィコ

フィコビリン phycobilin は藻を表す phyco と胆汁をビリン以外のビリン色素としては，フィトクロムに結合表す bile の合成語である．フィコビリンはシアノバクテするフィトクロモビリンやビリベルジンもあるが，ここ

リアや灰色藻，紅藻，クリプト藻などの真核藻類に広くでは触れない．

分布する開環テトラピロールで，タンパク質と結合してフィコビリン色素はすべてアポタンパク質に共有結合

フィコビリタンパク質を形成し，主要な光合成色素とししており，これをフィコビリタンパク質という．これらて重要な役割を果たしている．フィコビリタンパク質はは大きく，フィコシアニン，アロフィコシアニン，フィ

通常，フィコビリソーム（３章４e 項参照）という超複合

コエリスリン，フィコエリスロシアニンに分けられるが，体を構成するが，フィコビリソームをもたないクリプト

互いに相同で，グロビンスーパーファミリーに属する．

藻や Prochlorococcus 類においても光合成の集光色素とまた，フィコビリソームのコアメンブレンリンカーの色してはたらいている．

素結合ドメインも同様の構造をとっている．

これまでに知られている光合成の集光色素としては，

用語解説：色素タンパク質の部分を表す用語は一部混

４種のフィコビリン（フィコシアノビリン，フィコエリ

乱しているので，ここで整理する．一般に，複合タンパ

スロビリン，フィコビオロビリン，フィコウロビリン）

ク質はアポタンパク質と補欠分子族 prosthetic groupがある（図１）．これらは互いによく似た開環テトラピから成り，色素タンパク質の場合は，この補欠分子族がロールで，すべてプロトヘムを開裂して生成するビルベ色素である．しかし，フィコビリタンパク質のように色ルジン を出発物質として合成される
（図２）
．それぞれ

素分子がアポタンパク質に共有結合している場合は，ホの吸収スペクトルはテトラピロール分子内の共役二重結

ロタンパク質を色素（広義）と呼び，補欠分子族の部分合の長さに依存する．Ａ環の二重結合とＤ環の二重結合を発色団（広義）と呼ぶことも多い．発色団は元来は分がともに還元されたものはフィコシアノビリンで，出発子内の光吸収にかかわる部分を表す用語で，共役二重結のビリベルジンよりも数十 nm ほど短波長の吸収ピーク

合など色素分子内の特定の領域を指すこともある（狭を示す．フィコシアノビリン以外の色素はピロール環の義）．

間の二重結合が還元されることで，共役二重結合が短くなっており，より短波長の光を吸収することができる．
これらの色素はクロロフィル a の２つのピークの間を

5.e.2 フィコシアニンの共有結合の検出例(図１）で示したように，開環テトラピロールはシステ

１) 東京大学大学院総合文化研究科広域科学専攻生命環境

変性させるだけでは切断されない．したがって，開環テ科学系

2009 低 温 科 学

イン残基と共有結合している．この結合はタンパク質をvol.67355

図1
ビリ
ン．それぞれ，タンパク質の Cys 残基に共有結合している分子構造を示す．なお，フィコエリスロビリンは紅藻のフィロエリスリ
ンではＤ環でもタンパク質に共有結合している．また，フィコウロビリンも紅藻では，Ｄ環でもタンパク質に共有結合している．

トラピロールを結合したタンパク質は SDS-PAGE で着色したバンドとして検出が可能である．フィコシアニン
を SDS-PAGE したゲルの例を示す（図２）．フィコシア
ノビリンを結合する，フィコシアニン α（CpcA），フィ
コシアニン β（CpcB），アロフィコシアニン α（ApcA），
アロフィコシアニン β（ApcB）のバンドがそれぞれ青いバンドとして認識される．
［実験方法］S D S -P AG E 後の蛍光検出
フィコビリン色素は開環テトラピロールで共役二重結合系は溶液中ではそれほど安定ではなくモル吸光係数はホロタンパク質と比べて数分の１以下となる．したがって，SDS-PAGE 後の変性タンパク質の検出にはしばしば Zn 誘導性の蛍光を利用する．Zn は安定な金属イオンとして開環テトラピロールの各ピロール環の窒素原子に配位することで，ピロール環をつなぐ共役二重結合系の平面性をよくするため，モル吸光係数や蛍光収率を大きく改善する．

図 2：SDS-PAGE で分離したフィコビリタンパク質の青いバンド．上から順に，フィコシアニン β，アロフィコシアニン
α，フィコシアニン α，アロフィコシアニン βのバンドに対応
する．

１．ポスト染色法：簡便な方法である．SDS-PAGE 泳
動後，ゲルを１mM 酢酸亜鉛溶液に 30分間浸して振液で洗浄して，白沈を除く必要がある．また，後述す盪する．もし，白沈を生じる場合は酢酸などの酸性溶

る FMBIO などの高精度検出器を使用するときは，酢

356

フィコビリン色素

酸蒸気でミラーが劣化するので，さらに水洗して酢酸を除く必要がある．最近の論文では，ブロッティング
したメンブレンで酢酸亜鉛処理をしていることも多い．
２．ゲル中に添加する方法：濃縮ゲル，分離ゲル，泳動溶液各々に１mM 酢酸亜鉛を加えて SDS-PAGE を行う．この場合は，通常は沈澱は生じないので，そのま
ま蛍光検出できる．この場合は PVDF 膜などにブロットする必要もない．この方法は結果の再現性も高くおすすめである．
３．蛍光検出法：２次元ゲル蛍光検出装置を使用する．
筆者らが使用している FMBIO II（日立製，現在はFMBIO II は生産終了で FMBIO III が販売されている）は，検出感度が非常に高い．励起光は 532nm レー
ザー光，検出は 605nm を使用する．なお，フィコシア
ノビリンの SDS 溶液中の励起波長は 577nm，蛍光波
長 は 623nm で あ る が，固 定 さ れ た FMBIO の レー

図 3：タンパク質に結合したフィコシアノビリンの酸性変性
後の吸収スペクトル．

ザーと検出の波長設定で十分検出できる．なお，DNA
検出用 UV イルミネーターでも検出は可能であるが，基にチオエーテル結合によって強固に結合している．し感度は高くない．

たがって，発色団を単離してその構造を決定することは重要であるが，容易ではない．これまでにいくつかの抽

5.e.3 フィコシアニンの発色団の同定（酸性変性）

出例が報告されているが ，ここでは Cornejo らの方法を参考にした Synechocystis のフィコシアニンからフィコシアノビリンを単離する例を記述する．この方法は，

開環テトラピロールは各々の共役二重結合系の違いにメタノールを用いてフィコビリンとシステイン残基の間より異なった吸収ピークを持つ．例えば，フィコシアノ

の共有結合を解離させるものでメタノリシスと呼ばれる．

ビリンは赤色域，フィコエリスロビリン，フィコビオロ
ビリンは緑色域，フィコウロビリンは青色域に吸収ピー［実験方法］メタノリシス

クを持つ．また，開環テトラピロールはプロトン化する

1． Synechocystis の 細 胞 を 100mM NaCl， 20mMと各開環テトラピロール間で吸収ピークの違いが明確になることが知られている．このため，開環テトラピロー
ルは酸性溶媒に溶かして吸収スペクトルを測定し，そのHepes-NaOH，pH7.5 に懸濁し，破砕する．
２．細胞破砕液（約 50mL）を 100000x g，30min 超遠心する．フィコシアニンは上清に回収される．

吸収ピークと形から種類を判断することが多い．図３は３．上清に終濃度１％TCA（トリクロル酢酸）を加え，フィコシアノビリンを結合したタンパク質を酸性尿素で１h，４℃，暗所で，スターラーバーで穏やかに撹拌す変性させた吸収スペクトルである．吸収ピークは 661nm
で，このスペクトルのピーク位置と形はＡ環とシステイン残基が結合したフィコシアノビリンを反映している．

る．
４．30000x g，20min 遠心してフィコシアニンを回収す
る．

しかし，酸性変性は開環テトラピロールのおおまかな構

５．メタノール洗浄：沈殿にメタノールを加え，超音波

造しか反映しないので，詳細な構造を知るには結晶解析

処理し，30000x g，20min 遠心し，不純物を含む上清や，質量分析，NMR などを用いる必要がある．

を除く．この洗浄を２回行う．
６．沈殿を約 1/10容のメタノールに懸濁し，HgCl（１5.e.4 メタノリシス：フィコシアノビリンの単離開環テトラピロールはアポタンパク質のシステイン残2009 低 温 科 学

vol.67を加え，20h，42℃，暗所で保温する．HgCl
mg mL ）
は開環テトラピロールがシステイン残基から外す反応を促進する．
７．保温した標品を 10000x g，10min 遠心して上清を357

図 4：メタノリシスで抽出したビリン色素の薄層クロマトグ
ラフィーによる分離例．矢印はフィコシアノビリンを示す．

図 5：フィコシアノビリンの吸収スペクトル

ビリンがシステイン残基から遊離していることを示す．
回収する．タンパク質から遊離したフィコシアノビリ

この長波長シフトはシステイン残基から遊離した部分がンが上清に抽出される．青い色で抽出を確認できる．

二重結合を再生し，共役二重結合系が長くなったことに

８．上清にメルカプトエタノール（１ μL/mL）を加え

よる．ちなみに，フィコシアノビリンを結合したタンパて，30000x g，10min 遠心し上清を回収する．この操

ク質を中性メタノール溶媒で変性させ吸収スペクトルを作で Hgを還元し沈殿物として除くことができる．

測定すると，その吸収ピークは 580〜590nm になる．薄遠心チューブの底に白色の沈殿を確認できる．なお，

層クロマトグラフィーの結果（図４）は，本来のフィコ

メタノリシスで，HgCl を使用しない場合この操作はシアノビリンだけでなく数種類の副産物を生じているこ

必要ない．筆者らの経験では，HgCl を入れなくてもとも示している．一般的にメタノリシスは多くの開環テ

メタノリシスは十分行われる．この上清をフィコシア

トラピロール副産物を生み出すことが知られている．色

ノビリン粗標品とする．

調が異なるものは異なる物質と判断できるが，例えば，
開環テトラピロールのプロピオニル基がモノメチル化，［実験方法］薄層クロマトグラフィーによる精製

ジメチル化されてしまっても，吸収スペクトルは変化し

１．シ リ カ ゲ ル 薄 層（シ リ カ ゲ ル 60，TLC プ レート

ないことが知られている．したがって，精製品の評価に

5553，メルク）を用意する．前処理は不要である．

は細心の注意が必要である．なお，開環テトラピロール

２．展開溶媒：飽和酢酸エチル．
（酢酸エチル：ddHは二重結合が多く酸化されやすく不安定なので操作は迅

O＝10：１の混合液から酢酸エチル層を使用する）

速に行う必要がある．

３．フィコシアノビリン粗標品を微量スポットして，密封容器で先端まで展開する．
図４の矢印で示したバンドがフィコシアニンから単離した遊離のフィコシアノビリンである．この部分の薄層を掻き取りメタノールで抽出する．フィコシアノビリン
は中性メタノール溶媒中で 600nm 付近に吸収ピークを持ち，これに塩酸を添加すると，一部のピロール環の窒素原子をプロトン化して吸収ピークは 685nm 付近にシ
フトする
（図５）
．同じ酸性条件である図３のピークより
約 20nm 長波長シフトしているが，これはフィコシアノ
358

参考文献
１) A.Auche, C.R. Soc. Biol. 64 (1908)P.297.
２) T.R.Berkelman,& J.C.Lagarias,Anal.Biochem.156(1986)P.194.
３) D.J. Chapman, W.J. Cole, & H.W. Siegelman, Biochim. Biophys. Acta. 153 (1968)P.692.
４) J.Cornejo,S.I.Beale,M.J.Terry,& J.C.Lagarias,J.
Biol. Chem. 267 (1992)P.14790.
５) H.Falk, The chemistry of linear oligopyrroles andbile pigments, ed. Springer-Verlag 1989.

フィコビリン色素

３章 単離・精製・活性測定

６．タンパク質
a．S D S -P AG E
井上（菓子野）名津子 ，菓子野康浩
調製した生体試料のタンパク質組成を解析する際などに，最初に行われる最も基礎的な実験のひとつが SDS-PAGE であろう．近年のプロテオミクス解析に於いて広く用いられる等電点二次元電気泳動
でも，二次元目には SDS-PAGE が行われるのが一般的である．比較的容易に行うことができる SDSPAGE であるが，手元の生体試料に含まれているタンパク質群の中にある重要なタンパク質を見落とさないために留意しておくと良いことがある．本稿では，４種類の SDS-PAGE 系を比較しながら，それぞれの実験方法を簡単に記述する．

SDS-PAGE
Natsuko Inoue-Kashino, Yasuhiro Kashino
SDS-PAGE is one of the very basic techniques for the protein analysis. One has to keep in mind the availability
and the limit of this technique. In this section,we will describe the characteristics of four SDS-PAGE systems
and present the outline of the procedure.

6.a.1 各種の S D S -P AG E 系

色性がかなり低い ．PsbJ も染色性が低く，検出することが困難な場合が多い ．また，Synechocystis sp. PCC

SDS-PAGE は，精製した標品などのタンパク質組成

6803 の Psb30 も染色性が低く，また，抗体を使っても検を解析するために頻繁に用いられる基本的な分析法の一出が困難な場合もある ．pI が泳動バッファの pH よりつである．SDS-PAGE でタンパク質を分離し，その後も大きいと，泳動されないことにもなる．

ウェスタンブロットによるタンパク質の同定，また，N

本稿では，我々の研究室で日常的に用いている４つの末端配列解析や MS 分析を行うことも日常的に行われ系の手順を紹介する．第一は，Mes/Tris の系である ．

る．しかし，SDS-PAGE とひとくちに言っても，いろい

我々は，日常的には 18‑24％アクリルアミド，6M 尿素のろな系が開発されてきており，それぞれに特徴がある．

スラブゲルを作成し，用いている．この条件で，3kDa 程それぞれの特徴をつかんで，自分の研究対象のタンパク度から 100kDa 超まで，膜タンパク質の多くを明瞭に分質を分離できる系を選ぶことが重要である．また，解析離することが可能である．場合により，均一アクリルア

対象の標品に含まれているタンパク質を捉えるためにミド濃度のゲルや，ミニゲルも作成し，用いているは，ひとつの系にこだわらず，別の系で，あるいはゲル

この系は，次に述べる 3M Tris の系の不自由な点を解

条件を変えて泳動してみることも必要であろう．そのた消するために，3M Tris の系を元に開発したものであ

めに見たくないものも見えてきてしまうこともあるかもる．3M Tris の系に比べると尿素濃度が低いためか低分しれないが，誤った結論に行き着かないためには，いま子量域で若 干 シャープ さ に 欠 け る バ ン ド も あ る が，使っている系ではもしかしたら見えていないだけのタン

20〜50kDa 域ではより明瞭なバンドが得られることがパク質が含まれている可能性もあることも心しておくべ多い．また，Synechocystis sp.PCC 6803 の D1/D2 タンきである．またごく少数の例外と言えるかも知れないが，パク質は明瞭に別個のバンドとして分離されるが電気泳動後の染色で染色されづらいために，実際には存M 尿素のゲルでは Thermosynechococcus elongatus の在するのに検出が困難な Ninja タンパク質 ともいえる

D1/D2 タンパク質は分離されず単一のバンドとなる．こタンパク質がある．たとえば，リジン，ヒスチジン，シの M es/Tris の系では，通常６ M 尿素のゲルで充分な分

ステインを全く含まない PsbW は Coomassie による染離が得られるため，冬季室温がかなり下がってしまう研．

，6

究室でも問題なく使用することができる．また，分離ゲ
１) 岡山大学大学院自然科学研究科

ル緩衝液は Tris，Mes，SDS を溶解させるだけで pH 調２) 兵庫県立大学大学院生命理学研究科

整の必要がないため，緩衝液調製が容易であり，また，

2009 低 温 科 学

vol.67359

緩衝液調製ごとの再現性も充分である．冬季に室温がか

は多価電解質であり，電場中に置かれると電荷に依存しなり下がってしまう研究室に於いても，ストック溶液がた速度で陽または陰極に移動するので電荷の異なるタン

析出することはない．

パク質を分離することができる．この際，支持体として第二の系は，池内により開発された 3M Tris の系でア ク リ ル ア ミ ド 重 合 体 の ゲ ル を 用 い る の が PAGE

ある ．通常使われる 16‑24％アクリルアミド，7.5M 尿（polyacrylamide gel electrophoresis）である．ポリア

素のゲルにより，3kDa 程度から 100kDa 超まで，膜タ

クリルアミドゲルは電気泳動の際の良い支持体であり，ンパク質の多くを非常に明瞭に分離することが可能であ

大きさにより分子を分離する分子篩効果を持つ．界面活る．このゲル条件では，Thermosynechococcus elongatus

性剤 SDS（Sodium Dodecyl（または Lauryl）Sulfate）の D1/D2 タンパク質も明瞭な別個のバンドとして分離が結合してタンパク質を変性させると，SDS の硫酸基にされる．ゲルに含まれる尿素濃度が高いため，冬季に温よってタンパク質は負に荷電する．この時結合する SDS

度が低い研究室に於いては，泳動中に尿素が析出するこ

量はタンパク質の種類に依らず単位重量当りほぼ一定でともあり，また，そのような環境では，分離ゲル緩衝液

ある．このため，SDS が結合したタンパク質は電場中でやアクリルアミドのストック溶液も析出することもある

陽極に移動し，ポリアクリルアミドゲル中では分子篩効ので，注意が必要である．

果のために大きな分子ほど移動度が小さく，小さい分子

第 三 の 系 は，Schagger ら に よ り 開 発 さ れ た Tris/

ほど移動度が大きくなる．これにより，ポリペプチドのTricine の系である ．1kDa から 100kDa 程度までを分鎖長（分子量）で移動度が決まる．SDS-PAGE では，こ離できる系である．低分子量域の分離にとくに優れていのようにしてタンパク質が分離され，ポリペプチドの移る．ただし，膜画分や膜タンパク質複合体の解析の際は，動距離（移動度）から分子量を推定することが可能であ

やはり脂質除去処理（6.a.3.1）を行わないと充分な分離る．分子量標準試料の移動距離を横軸に，分子量の対数が得られないのは，上記の系と同様である．一方，40kDa

を縦軸にしてプロットして分子量標準曲線 を 作 成 す程度以上になるとバンドの間隔が非常に狭くなり，高分

る ．目的のタンパク質バンドの移動距離を測り，分子量

子量域の解析には困難が伴うことが多いようである．こ

標準曲線から「見かけの」分子量を得ることができる．

の系での電気泳動は，上記ふたつの系や Laemmli の系

この「見かけの」分子量は，厳密な意味での分子量ではに比べてコスト高になり，また同じゲルサイズでも長いない．個々のタンパク質の性質も反映され，移動距離は泳動時間が必要であるが，アクリルアミドの濃度勾配を標準曲線から若干ずれることもある．いっぱんに，同じ作成する必要がなく，また，ゲルに尿素を含まないので，分子量のタンパク質であっても，膜タンパク質の移動距

ゲル作成が容易である．ただし，6M 尿素を含むゲルも離は水溶性タンパク質の移動距離よりも大きくなる．

用いられることもある ．

本稿の読者は光合成に関わるタンパク質を研究対象に第四の系は，Laemmli により報告された系で，最も一していて，そして多くの場合，チラコイド膜など，膜画

般的に使われている．ゲルに尿素が含まれていれば膜タ分のタンパク質の分離が往々にして重要になると考えら

ンパク質の分離も申し分ない．また，アクリルアミドのれる．膜タンパク質を SDS-PAGE で分離する場合，尿素

濃度勾配ゲルを作成することにより，分離可能な分子量を含むゲルを使用した方がいっぱんにバンドが明瞭であ域も広げることができる．必要な泳動時間も上記３種類

る．水溶性タンパク質の場合，尿素が含まれていなくての系に比べて短い．ただし，アクリルアミド濃度を上げも明瞭なバンドとなることが期待できるが，膜タンパクても，低分子量のタンパク質を明瞭なバンドとして分離質の場合は，
4〜7M 程度の尿素が含まれている方が分離することは困難である．10kDa 程度以上のタンパク質をおよびバンドの明瞭度がよい．もちろん，水溶性タンパ

対象とする場合には，この系が便利であろう．

ク質もより明瞭なバンドとして得られる．ただし，本稿

上記のように，それぞれ特徴があるが，系によりタンで取り上げる Tris/Tricine の系では尿素を含まなくてパク質の移動度が異なり，また，移動度の逆転が起こる

も，膜タンパク質が明瞭なバンドとして得られる．尿素

場合もある．これを利用して，一次元目と二次元目のゲがタンパク質の分離に与える影響は，文献 で取り上げ

ルの系を変えて二次元電気泳動を行い，分子量が似ていてある．また，アクリルアミド密度勾配のゲルの方が，るために分離しにくいタンパク質相互を分離することも均一アクリルアミドゲルよりも，しばしばバンドが明瞭可能な場合がある．

になる（図 1）．

このように，SDS-PAGE にもいろいろな系があるが，これらのことは，レディメィドゲルではなく，実験ご

系は違っても，基本的な原理は共通である．タンパク質とにゲルを自分で作らないといけないことを意味する．

360

S D S -P AG E

図 1：サンプル処理の効果．
Synechocystis sp.PCC 6803 HT3 株から精製した光化学系 複合体を使い，変性液を加えただけの場合（Lane 4），変性液を加えた後 95℃で５分間の熱処理を行った場合（Lane 5），脂質除去処理を行った場合（Lane 6）を比較した．いずれも 5μg Chl 相当
量の光化学系 複合体を泳動した．ゲルは，M es/Tris 系の 18−24％アクリルアミド濃度勾配ゲルで 6M 尿素を含む．
Lane 1〜3 は，分子量マーカである．
Lane 1, Bio-Rad 161‑0317;Lane 2, Bio-Rad 161‑0304;Lane 3, Bio-Rad 161‑0326
Lane 3 の 161‑0326 には，以下のタンパク質が含まれている．
26,625 Triosephosphate isomerase
16,950 Myoglobin
14,437 α-Lactalbumin
6,512 Aprotinin
3,496 Insulin b chain, oxidized
1,423 Bacitracin

尿素を含むゲルは日持ちしないので（尿素の変性と析出

タポンプとは離れた側（図 2では右側）の底面にコインのため），せいぜい２，３日程度の保存であろう．もし保を１枚敷くと，二つの管に液を入れたときに液面がほぼ存する場合は，ゲル板上部をラップで丁寧に包み，水分同じ高さになる．ペリスタポンプのプレッシャーノブをが蒸発しないようにしておく．尿素濃度が 7.5M のゲル

回し，適度な強度で送液チューブを締め付ける．ミキシ

では，低温では尿素が析出するので，冷蔵庫での保存は禁物である．
【実験方法】

6.a.2 アクリルアミド濃度勾配ゲルの作成
図 2に示すようにガラス板，ペリスタポンプ，ミキシ
ング管をセットする．ミキシング管の下にスターラを置き，ミキシング管のペリスタポンプに近い側に回転子を入れる．我々は，10mm 長の三角柱状回転子を使ってい
る．回転子の体積を考慮すると，ミキシング管のペリス
2009 低 温 科 学

vol.67

図 2：アクリルアミド濃度勾配ゲルの作製．

361

ング管の二つの間を繫ぐチューブを目玉クリップで閉じが完了すると，重層した純水の下部が再び明瞭になる．

る．目玉クリップの方が，スクリューコックよりも使いまた，ゲル底部とスペーサとの間にも明瞭な線が見ら

勝手が良いようである．

れる．

１．まず低濃度アクリルアミド溶液に過硫酸アンモニウ

７．分離ゲルができたら，濃縮ゲルを作成する．濃縮ゲ

ム液を加えて攪拌し，次いで TEMED を加えて攪拌す

ルアクリルアミド溶液に過硫酸アンモニウム液を加える．この溶液を，ミキシング管のペリスタポンプとはて攪拌し，次いで TEMED を加えて攪拌する．分離ゲ

離れた側（図 2では右側）に入れる．

ルの上部の液体をアクリルアミド廃液入れに回収し，

２．ミキシング管の二つの管を繫ぐチューブを閉じた目

少量の上記濃縮ゲル液で共洗いする．共洗いを行わな

玉クリップを少し開き，このチューブ内の空気を押しいと，分離ゲルと濃縮ゲルの境界に波状のシュリーレ

出し，また目玉クリップを閉じる．

ンが見えるゲルができる．共洗い後，濃縮ゲル液を適３．高濃度アクリルアミド溶液に，1と同様にして過硫量注ぎ，サンプルコームを差し込む．この際，気泡が酸アンモニウム液と TEM ED を加え，ミキシング管の残らないように注意する．サンプルコームを水平に差ペリスタポンプに近い側（図 2では左側）に入れる．

し込むよりも，サンプルコームを傾けて片方を先に差このとき，プレッシャーノブを閉め忘れていると液がし込み，その後徐々に水平になるように差し込んでい送液チューブに流れ込んでしまう．その場合は，慌て

くと，気泡が押し出されていき，気泡が残りにくい．

ずにプレッシャーノブを締め，ミキシング管の方に液ミキシング管は，スラブゲルを作る際は，内径 24mm，を送り戻す．
４．用意ができたら，スターラを適度な速さで回転させ，ペリスタポンプのスイッチを入れ，ミキシング管につ

高さ 55mm の管のものを使っている．どこの電気泳動メーカでも作成してくれるであろうが，我々は日本エイドーに依頼している．

けた目玉クリップをはずす．この際，低濃度アクリル

サンプルコームは，必要に応じ，ウェルの数を変えたアミド溶液が高濃度アクリルアミド溶液の中に流れ込ものを作成している．Ｎ末端配列解析の際や，抗原調製

んでくるか，確認する．流れ込んでくると，シュリーのためにタンパク質バンドを大量に回収したい場合，二レンが観察される．流れ込んでくるのに若干のラグが次元電気泳動のための幅広のウェルが必要な場合など，あることもあるが，それはとくに問題ではないことが12連などのウェルがついたサンプルコームよりも，カー多い．スターラによっては，目玉クリップを外さない

テン状の泳動を行った方がいいことがある．このようなと回転子がうまく回転しないことがある．また，残液場合にも，サンプルコームを自作している．
サンプルコー

量が少なくなるに連れて，スターラの速度を徐々に落ム用のテフロン板も，どこの電気泳動メーカからも可能としていくと良い．送液速度は，スラブゲルの場合（10であろうが，我々は日本エイドーから調達している．

，10分近くの時間をかけるのが良いよう
mL＋10mL）
である．
５．ゲル液がすべてゲル板に注がれたら，あるいは所定

6.a.3 サンプル処理の高さまで注がれたら，ペリスタポンプを止め，送液

膜タンパク質を多く含む標品の場合，また，膜タンパ

チューブをゲル板から外す．ゲル板の中のゲル液上面

ク質をターゲットとした解析の場合，サンプル処理が重に，パスツールピペットを使って静かに純水を重層す要である．多くの電気泳動の教科書には，熱処理を行う

る．これは，ゲル液を空気（酸素）から遮断するためように記載されている．しかし，図 1に示したように，である．この際，ガラス板にゲル液が辿った痕がつい

変成処理液を加えた光化学系ているので，そこから注ぎ込むとゲル液の上面を乱さ熱処理すると，D1/D2 タンパク質，CP43/CP47 タンパクずに純水を重層することができる．一カ所から注ぐだ質の多くは凝集してしまって分離されなくなってしま

けで，純水は左右に広がっていく．純水を注ぐのが苦う．多くの水溶性タンパク質は熱処理をしなくても充分手であれば，
水を飽和させたイソブタノールを使うと，に変性されるため，熱処理は必要ない．したがって，通容易になる．しかし，この場合，余計な有機廃液が発常は，熱処理は行うべきではない．ただし，超好熱菌の生することになる．

LHC のように，熱処理などを行わないと変性されず，ク複合体を 90度で５分間

６．過硫酸アンモニウム液と TEMED は，1時間ほどで

ロロフィル複合体のまま泳動された例もある．
もっとも，ゲル化が完了する程度が良いようである．重層した純

我々の経験では，脂質除去処理によりその LHC も充分

水とゲル液との境界が次第に不明瞭になるが，ゲル化に変性させることができた．

362

S D S -P AG E

6.a.3.1 脂質除去

脂質がある程度除去されるようで，改めて脂質除去処理

低分子量タンパク質を解析する場合は，脂質除去処理を行う必要性は低い場合が多い．TCA が皮膚などに触を行う必要がある．これは，図 1に示したように，多量れるとやけどを負うので，取り扱いには充分な注意が必に含まれる脂質とクロロフィルが低分子量タンパク質の要である．

分離を妨げるからである．脂質除去処理を行うことによ6.a.3.3 サンプル量

り，低分子量域の分離が劇的に改善される．ただし，D1/

標品の必要量を計算し，通常は，変性液と標品を等量

比較的分子量の大きな膜タンパク質
D2 タンパク質など，ずつ混合し，泳動サンプルとする．目的，サンプルの状が凝集し，分離ゲルに展開される量が減ってしまうもの

況によっては，上記のように TCA による濃縮や脂質除がある．

去のステップが必要になる．泳動サンプルは，スラブゲ

我々は，通常ジエチルエーテルを使って脂質除去を

ルの 12連のコームの場合１ウエルあたり 10μL が適量行っている．クロロフィル定量，あるいはタンパク質定である．そして，光化学系 ， 標品やチラコイド膜で量を行い，標品の泳動に必要な量を決める．処理量が 30は１ウエルあたり 5μg Chl が良いようである．その他の

μL を超える場合は，複数に分け，脂質除去処理終了後ひ標品の場合，経験あるいは文献に当たるのが良いが，例

とつに合わせるようにする．これは，30μL 以上の水溶液

えば，BSA をスラブゲルで泳動した場合，10μg 程度がではジエチルエーテルと混和しないためである．30μL

Coomassie Blue で染色される充分なバンドになること

以下の標品に 100μL のメタノールを加え，ボルテック

がサンプル量を考慮する参考になるであろう．また，１スにより攪拌する．そして，1mL のジエチルエーテルをウェル分だけを処理するのはいろいろなステップでの作

加え，攪拌し，10,000rpm で 10分間，遠心する．ドラフ

業がやりづらいので，標品に余裕があれば２〜３ウェル

ト中で，パスツールピペットを使って上清を静かに取り

分程度を調製するとよい．例えば，1,400μg Chl/mL の除く．上清を除いたら，なるべく速やかに変性液を加え，標品の場合，10.7μL（5μg chl x 3ウェル分，15μg Chl）

バスタイプの超音波破砕器・ボルテックスを使って沈殿をサンプルチューブに分注し，標品懸濁液を 15μL になを溶解させる．乾燥してしまうと，変性液に溶解しづらる よ う に 加 え，変 性 液 を 15μL 加 え て（最 終 体 積 30

くなることがままある．バスタイプの超音波破砕器で沈，10μL を泳動する．TCA 処理や脂質除去処理を
μL）

殿を溶解させる際は，キャビテーションポイントにサン行った場合，30μL の変性液を加え，10μL をロードす

プルチューブを配置するように注意する．どうしても沈る．

殿が残る場合，サンプルチューブのふたを開けて氷上に

6.a.3.4 変性液の組成

静置し，少量残存しているジエチルエーテルを蒸発させ我々の用いている変性液（ローディング液）は，40mMると改善されることがある．この脂質除去処理は，エッDTT，5.2％ LDS，172mM Tris，0.5M sucrose，0.01％

ペンドルフタイプのサンプルチューブで問題なく行うこ

pyronin Y，である．変性液を加えた泳動サンプルは，とができる．

ローディングの時まで氷上に置いておく．高濃度の SDS

6.a.3.2 タンパク質濃度が低い場合のサンプル処理

は低温で析出しやすく，LDS（Lithium Dodecyl Sulfate）

ゲル濾過後の標品を泳動する場合など，タンパク質濃の方が低温での溶解度が高いので，LDS を用いている．

度が低く，そのまま泳動サンプルとして調製することがpyronin Y は赤色の色素で，泳動の状況を確認するため困難な場合がある．泳動に必要な標品量が 1mL 以下ののものである．Pyronin Y は現在では Sigma から手に入場合，エッペンドルフタイプのサンプルチューブに標品れることが可能であるが，BPB（bromophenolblue）でを入れ，最終体積を 1mL になるように純水を加える．83

も良い．sucrose は，泳動サンプルの密度を上げるために

μL の 98％ TCA を加え，充分に攪拌し，10,000rpm で加えてある．尿素入りのゲルでは，サンプルをロードし15分間，遠心する．上清を捨て，変性液を加える．必要ている間にも尿素がウェル内の泳動バッファに溶け出し

標品量が 1mL 以上の場合，ファルコンチューブを使ってウェル内の密度が上がり，サンプルのローディングがて同様に処理すると良い．必要があれば，脂質除去処理

うまく行かないことがある．このような場合，sucrose にを行う．この際，変性液を加える前に上記のようにメタよりサンプルの密度を上げておくと良い．グリセロール

ノールとジエチルエーテルを加えて，処理を行う．このでも良い．このような変性液を適量調製し，サンプル

脂質除去のために溶媒に沈殿を溶解させる際，バスタイ

チューブに 500μL 程度ずつ分注して冷凍しておくと便プの超音波破砕器を使うと良いが，破裂する恐れがある

利である．解凍・凍結を複数回繰り返しても，分離にはので充分な注意が必要である．ただし，TCA 処理だけで問題ないようである．ただし，ヘム染色を行う場合，新2009 低 温 科 学

vol.67363

鮮な DTT が必要で，解凍を繰り返した変性液は不適である．また，そのような変性液では，ヘム蛋白質（PsbV

ストック溶液（いずれも室温保存）
分離ゲル用アクリルアミド溶液（0.5％ ビス）など）のバンドも不明瞭化しがちである．

49.5％(w/v）アクリルアミド，

6.a.3.5 サンプルのローディング

0.5％(w/v）メチレンビスアクリルアミド

両端のウェルを使ったレーンでは，バンドが歪みがち

濃縮ゲル用アクリルアミド溶液

である．両端のウェルを使わない場合，サンプル量の２29.2％(w/v）アクリルアミド，

割増し程度（サンプル量が 10μL であれば 12μL）の変性液をこれらのウェルに入れてから泳動すると良い．こ

0.8％(w/v）メチレンビスアクリルアミド
分離ゲル用緩衝液；pH の調製は行わないのことにより，スカート状に裾が広がるのを抑えることができる．また同様に，全部のウェルを使わない場合，0.65M Mes，3M Tris，0.5％(w/v）SDS
濃縮用緩衝液サンプルをロードしたウェル達の両側にサンプル量の２0.625M Tris-HCl(pH 6.8）
，１％(w/v）SDS

割増し程度の変性液を入れてから泳動すると，泳動結果電極液（Laemmli の系と同じ．ワーキング溶液）

がスカート状に裾広がりになるのを抑えることができ25mM Tris，0.192M Glycine，0.1％(w/v)SDS

る．
サンプルのローディングは，先端の細いチップをつけ10％過硫酸アンモニウム液は，小分けして冷凍しておたマイクロピペッタあるはマイクロシリンジを使って行

くと便利である．凍結・融解を繰り返しても，通常は差う．この際，チップの先端あるいはマイクロシリンジのし支えない．ただし，融解後は氷上に静置する．アクリ

針の先端をなるべくウェルの底近くに挿入し，静かにサ

ルアミド濃度勾配ゲルを作成するには，表 1にしたがっンプルを吐出するようにすると良い．
このようにすると，てアクリルアミドゲル溶液を調製し，先述の 6.a.2「アサンプルはウェルの底部でしっかりとした層になり，クリルアミド濃度勾配ゲルの作成」にしたがって，ゲルシャープなバンドを得やすい．溶け出してきた尿素のたを作成する．アクリルアミドゲル溶液を脱気する必要はめにロードしづらくなった場合は，シリンジなどを使っない．10％ 過硫酸アンモニウムの量は，外気温により調てウェル内の溶液を吸い出すと良い．

節が必要な場合もある．アクリルアミド均一濃度のゲルを作成するには，表 2を参考にゲル溶液を調製する．いずれの場合も，アクリルアミド濃度を変更するときは，

6.a.4 各種の S D S -P AG E 系

分離ゲル用緩衝液および尿素の量をそのままにして，

6.a.4.1 Mes /Tris の系

50％アクリルアミド溶液と純水の量を調節する．尿素の以下のように，ストック溶液を調製する．いずれも室温で保存する．未重合のアクリルアミドは高い神経毒性濃度を変更するときは，表 3の尿素濃度と液体の関係を参考にして，調節する．

があるので，取り扱いには充分な注意が必要である．まアクリルアミド均一濃度のミニゲルを作成するには，た，アクリルアミドを含む廃液は回収し，ゲル化させて

表 2を参考にして，分離ゲル液の最終体積が 10mL になから廃棄する．

るようにする．

表 1：M es/Tris の系での 6M Urea，18−24％アクリルアミ
ドゲル溶液（スラブゲル）

表 2：Mes/Tris の系での 6M Urea，24％均一アクリルアミ
ドゲル溶液（スラブゲル）

アクリルアミド溶液
50％ アクリルアミド

アクリルアミド溶液

18％

24％

Stacking

3.6mL

4.8mL

−

50％ アクリルアミド

24％Stacking

9.6mL−

30％ アクリルアミド

−

−

1.6mL

30％ アクリルアミド

−

1.6mL

分離用ゲル緩衝液

2mL
−

2mL
−

−

分離用ゲル緩衝液

1.6mL

濃縮用ゲル緩衝液

4mL
−

1.6mL

3.6g
1.9mL

3.6g
0.7mL

2.9g
2.8mL

尿素

純水

純水

7.2g
1.4mL

2.9g
2.8mL

(体積)

(10mL) (10mL)

(8mL)

(体積)

(20mL)(8mL)

10％過硫酸アンモニウム

12μL
4.5μL

40μL
9.0μL

10％過硫酸アンモニウム

20μL
9.0μL

40μL
9.0μL

濃縮用ゲル緩衝液
尿素

TEM ED

364

8μL
4.5μL

TEM ED−S D S -P AG E

表 3：一定体積の尿素含有溶液を調製する際の尿素量および
液体量
尿素

液体

最終体積

2M 尿素

12.01g90.93mL

100mL

4M 尿素

24.02g82.02mL

100mL

6M 尿素
8M 尿素

36.04g74.86mL

100mL

48.05g63.97mL

100mL

アクリルアミドゲル溶液を調製する際は，アクリルアミドストック
溶液，ゲル緩衝液，純水の合計量を上記の液体量として考える．

泳動は，電源にも拠るが，6M 尿素を含むスラブゲルで，180mA h 程度である（12mA 定電流で約 15時間）．
最近の電子回路型の電源装置では，低めの仕事量になる

表 4：3M Tris の系での 7.5M Urea，16−24％アクリルアミ
ドゲル溶液（スラブゲル）
アクリルアミド溶液
16％22％50％ アクリルアミド

2.67mL

3.67mL−

30％ アクリルアミド

−

−

0.8mL

分離用ゲル緩衝液

2mL−−

濃縮用ゲル緩衝液

2mL
−

尿素

4.5g

4.5g

純水

2.1mL

1.1mL

3.6g
2.1mL

(体積)

(10mL) (10mL)(8mL)

10％過硫酸アンモニウム

20μL

15μL

TEM ED

4.5μL

4.5μL

40μL
9.0μL

Stacking

0.8mL

ようである（約 160mA h）．泳動度の再現性を得るためには，いつも同じくらいの電流値で泳動するのが良い．

て，ゲルを作成する．アクリルアミドゲル溶液を脱気す

6.a.4.2 3M Tris の系

る必要はない．10％ 過硫酸アンモニウムの量は，外気温

以下のように，ストック溶液を調製する．いずれも室により調節が必要な場合もある．

温で保存する．未重合のアクリルアミドは高い神経毒性

泳動は，電源にも拠るが，スラブゲルで，180mA h 程があるので，取り扱いには充分な注意が必要である．ま度である（12mA 定電流で約 15時間）．最近の電子回路

た，アクリルアミドを含む廃液は回収し，ゲル化させて型の電源装置では，低めの仕事量になるようである（約から廃棄する．これらのストック溶液は，低温で保存す

160mA h）．泳動度の再現性を得るためには，いつも同ると析出する可能性が高い．冬季気温の低い部屋では注じくらいの電流値で泳動するのが良い．

意を要する．

6.a.4.3 Tris /Tricine の系

ストック溶液（いずれも室温保存）

文献 にプロトコルが改めて紹介されている．

分離ゲル用アクリルアミド溶液

以下のように，ストック溶液を調製する．いずれも室60％(w/v）アクリルアミド，

温で保存可能である．未重合のアクリルアミドは高い神

0.8％(w/v）メチレンビスアクリルアミド

経毒性があるので，取り扱いには充分な注意が必要であ

濃縮ゲル用アクリルアミド溶液
30％(w/v）アクリルアミド，
1.6％(w/v）メチレンビスアクリルアミド
分離ゲル用緩衝液
3M Tris-HCl(pH 8.8）
，0.5％(w/v）SDS
濃縮用緩衝液る．また，アクリルアミドを含む廃液は回収し，ゲル化させてから廃棄する．
ストック溶液（いずれも室温保存）
AB-3 Mix
49.5％ T, 3％ C
48％(w/v）アクリルアミド，

1.25M Tris-HCl(pH 6.8）
，１％(w/v）SDS
電極液（Laemmli の系と同じ．ワーキング溶液）
25mM Tris，0.192M Glycine，0.1％(w/v)SDS

1.5％(w/v）メチレンビスアクリルアミド
AB-6 Mix
49.5％ T, 6％ C
46.5％（w/v）アクリルアミド，

分離ゲル用緩衝液を調製する際には，充分に時間をかけて pH を調整する必要がある．塩酸を加えることにより，温度が上昇し，その状態で目的の pH に合わせても，

3.0％ メチレンビスアクリルアミド
ゲル緩衝液（3x）3M Tris-HCl(pH 8.45），0.3％(w/v）SDS

実際に使用するときには pH がずれている可能性があ

陽極液（Anode buffer, 10）

る．そうすると，低分子量域に於いては期待通りの分離

0.2M Tris-HCl(pH 8.9）を得ることができない．実際に泳動を行ってみて分離状
況が不充分であれば，pH の再調整を行う．

陰極液（Cathode buffer）
0.1M Tris，0.1M Tricine，0.1％(w/v）SDS

表 4にしたがってアクリルアミドゲル溶液を調製し，先述の「アクリルアミド濃度勾配ゲルの作成」にしたがっ2009 低 温 科 学

vol.67

表５にしたがってアクリルアミドゲル溶液を調製す
365

表 5：Tris/Tricine の系でのアクリルアミドゲル溶液の調製（スラブゲル）
分離ゲル(16.5％T，6％C)

スペーサゲル(10％T，3％C)

濃縮ゲル(4％T，3％C)

AB-3 Mix
AB-6 Mix
ゲル緩衝液
グリセロール
純水−
6.68mL
6.68mL
2.68g
4.5mL

1.22mL−
2.0mL−
2.78mL0.40mL−1.24mL−
3.36mL(総量)(20mL)(6.0mL)(5.0mL)

10％過硫酸アンモニウム

66.8μL
7.5μL

24μL
4.8μL

40μL
4μL

TEMED

る．アクリルアミドゲル溶液を脱気する必要はない．分
離ゲル液をゲル板に注ぎ（スラブゲルの場合，スペーサ

0.8％(w/v）メチレンビスアクリルアミド
40％ アクリルアミド溶液

ゲルと濃縮ゲル，サンプルウェルのために，3〜5cm 程度

38.9％(w/v）アクリルアミド，の空間を上に残す），
すぐにスペーサゲル液をその上に静1.1％(w/v）メチレンビスアクリルアミド

かに重層する（1〜2cm の高さ）
．そして，そのスペーサ
ゲル液の上に純水を静かに重層し，ゲル化が完了するのを待つ．ゲル化したら，濃縮ゲル（コーム先端からスペー
サゲルとの境界までが 1〜2cm の高さ）を作る．
ゲルをセットし，サンプルをロードする．サンプル量は，10μL 程度までに抑えた方がよいようである．サンプ

分離用ゲル緩衝液
1.5M Tris-HCl(pH 8.8），0.4％(w/v）SDS
濃縮用ゲル緩衝液
0.5M Tris-HCl(pH 6.8），0.4％(w/v）SDS
電極液（ワーキング溶液）
25mM Tris，0.192M Glycine，0.1％(w/v)SDS

ルが濃縮ゲルに入りきるまで，30V を印加し，その後は90V で最後まで泳動する．表 5に示したスラブゲルの条

表 6に「5M 尿素，13.5％均一アクリルアミドゲル溶

件で，約 24時間を要する．分離ゲルにタンパク質が到着

液（ミニゲル）」のゲル液組成を示した．スラブゲルであしたときには 90mA 程度の電流が流れるが，次第に電流れば，分離ゲル液を 20mL 調製すればよい．また，表 7

量は減少し，泳動終了時には 10mA 程度になる．ゲルのに「6M Urea，12‑18％アクリルアミドゲル溶液（スラブ

温度が 40℃以上にならないようにする．そのために４℃

ゲル）」の例を示した．先述の「アクリルアミド濃度勾配で泳動を行ってもよいであろう．ゲルの厚みによってはゲルの作成」にしたがって，ゲルを作成する．アクリル

より高い電圧を印加することもでき，より短時間で終了

アミドゲル溶液を脱気する必要はない．アクリルアミドする ．

濃度を変更するときは，分離用ゲル緩衝液および尿素のミニゲルでもスペーサゲルを通過するまで 90V で泳量をそのままにして，アクリルアミド溶液と純水の量を動し，分離ゲル中で 105V 電圧をかけた場合，約６時間調節する．尿素の濃度を変更するときは，表 3の尿素濃を要する．分離ゲルにタンパク質が到着して 105V の電度と液体の関係表を参考にして，調節する．

圧をかけたときに約 40mA 程度の電流が流れるが，泳動終了時には 10mA 程度にまで徐々に減少する．
6.a.4.4 Laemmliの系

表 6：Laemmli の系での 5Ｍ尿素，13.5％均一アクリルアミ
ドゲル溶液（ミニゲル）
アクリルアミド溶液

Laemmli により報告され，最も広く利用されている系

13.5％

Stacking

30％アクリルアミド
分離用ゲル緩衝液
濃縮用ゲル緩衝液
尿素
純水

4.5mL
2.5mL
−
3.0g
0.80mL

1.6mL
−
2.0mL
2.4g
2.6mL

（体積）

(10mL)(8mL)

10％過硫酸アンモニウム

28μL
5.0μL

40μL
9.0μL

である．以下のように，ストック溶液を調製する．いずれも室温で保存可能である．未重合のアクリルアミドは高い神経毒性があるので，取り扱いには充分な注意が必要である．また，アクリルアミドを含む廃液は回収し，ゲル化させてから廃棄する．
ストック溶液（いずれも室温保存）
30％ アクリルアミド溶液
29.2％(w/v）アクリルアミド，
366

TEM EDS D S -P AG E

表 7：Laemmli の系での 6M Urea，12‑18％アクリルアミド
ゲル溶液（スラブゲル）
アクリルアミド溶液
12％18％40％アクリルアミド

3.0mL

4.5mL

−

30％アクリルアミド
分離用ゲル緩衝液

−
2.5mL

−
2.5mL

1.6mL
−

濃縮用ゲル緩衝液
尿素
純水

−
3.6g
2.0mL

−
3.6g
0.5mL

1.6mL
2.9g
2.8mL

（体積）

(10mL) (10mL)(8mL)

10％過硫酸アンモニウム

20μL
5.0μL

40μL
9.0μL

TEM ED

15μL
5.0μL

Stacking［均一アクリルアミド濃度ゲルの作製］
分離ゲルの作成
１．分離用ゲル液に過硫酸アンモニウムを加えてあまり泡を立てないように混ぜた後，TEMED をさらに加え，注意しながら混ぜる．
２．組み立てたゲル板のなかに(1)の液を静かにそそぎ込む．ガラス板の上端から約 3cm のところまで入れる（残ったゲル溶液は必ずゲル廃液入れに入れる）．

図 3：Laemmli の系での分離パターン．
5M 尿素，13.5％均一アクリルアミドゲル溶液（ミニゲル）のゲルを使い，35mA 定電流で約１時間泳動した．Lane 1，分
子量マーカ；Lane 2，ホウレンソウの光化学系 コア複合体；Lane 3，ホウレンソウ BBY 標品；Lane 4，ホウレンソ
ウ葉緑体．

３．純水をパスツールピペットを用いて静かに重層する（約 5mm の高さ）
．純水を重層するのが難しい場合

低めの仕事量になるようである（約 160mA h）．泳動度

は，水を飽和させたイソブタノールを用いる．

の再現性を得るためには，いつも同じくらいの電流値で４．1時間ほど静置する．アクリルアミドが重合すると泳動するのが良い．

ゲルの界面が水（イソブタノール）層の下に鮮明に見えるようになる．
濃縮用ゲルの作製
１．分離ゲルの重合が完了したらゲル上面の水（イソブ
タノール）を流し出す．

6.a.5 検出法
6.a.5.1 C o o mas s ie B lue（C B B ）染色
SDS-PAGE 後のタンパク質の検出に広く使われてい２．過硫酸アンモニウムを濃縮用ゲル液に加えて手早くる染色法である．いっぱんには Coomassie Blue R-250

混ぜた後，TEMED をさらに加え，あまり泡を立てなが用いられる．検出限界はタンパク質にも拠るが 8‑16

いように注意しながら混ぜる．分離ゲルと違って急速ng である．ダイナミックレンジは，125‑1000ngにゲル化するので素早く行う必要がある．

る．使い捨てが一般的であるが，廃液を減らすために数３．作製した分離用ゲルの表面を少量の濃縮用ゲル液で共洗いする．

であ回の再使用も可能である．染色液の組成は，0.15％(w/v)
Coomassie Blue R-250，50％(v/v)メ タ ノール，10％

４．濃縮用ゲル液を切れ込みのところまで注ぎ込む．

(v/v)酢酸である．泳動後のゲルを染色液に浸し，約１時

５．コームの下に気泡が残らないように注意しながら，間振とうする．染色時間が長くなっても，一般的には問ゲル板の間にコームを差し込む．重合が完了すると題はない．温めた純水を使って染色液を調製すると，染コームの歯の周辺に境界線が見えてくる．

色時間を短くすることができる．脱色液の組成は，25％

図 3に示した電気泳動像は，5M 尿素，13.5％均一ア(v/v）メタノール，7％(v/v）酢酸である．キムワイプ

クリルアミドゲル溶液（ミニゲル）のゲルを使い，35mA（ティシュペーパ）
を紙縒状にし，ゲルに重ならないよう

定電流で約１時間泳動したものである．表 7に示したよに入れておくと，キムワイプが Coomassie Blue を吸着

うなスラブゲルの場合，180mA h 程度である（12mA 定する．キムワイプを取り替えながら脱色を進めていく．

電流で約 15時間）．最近の電子回路型の電源装置では，脱色液も，温めた純水を使って調製すると，脱色の時間

2009 低 温 科 学

vol.67367

を短縮することができる．

後のゲルであれば，この DTT 溶液での平衡化を行わ

6.a.5.2 ゲルの乾燥ないと，発色されない．

Coomassie 染色や後述の銀染色後，ゲルを乾燥して保存することができる．乾燥中にゲルが割れるのを防ぐた

４．0.2％ AgNO 溶液（0.2g/100mL）で 30分の平衡化．

めに，グリセロール液に浸してから乾燥を行うことが勧５．純水でゲルを数回洗う．このステップは必ずしも必められている場合がある．しかし，我々の経験では，充要でないが，このステップを入れた方が仕上がりが綺分に脱イオン水に置換した後，比較的低温（50度程度）

麗である．

で乾燥すれば，割れることなく無事に乾燥が終了する．

６．発色液（15g Na CO ，0.25mL HCHO/500mL）を

乾燥は，濾紙の上にゲルを載せ，セロファンやラップ

加える．この際，染色ムラを防ぐため，ゲルの上面・をかぶせた上で行う．乾燥後，ラップははがされるが，下面に速やかに，なるべく均等に行き渡るようにする．

セロファンはゲルに密着するので，セロファンを使う際

７．染色具合を確認しつつ，静かに振とうし，適度な発には気泡を除いておく必要がある．

色が得られたら反応停止液（10％(v/v）酢酸）と交換

また，ゲルの両面をセロファンで乾燥すると，後々MSする．

分析をしたいと思ったときに便利である．目的のバン

８．反応停止液にしばらく平衡化させる．

ド・スポットを切り出しやすく，また，純水でゲル状に９．発色が強すぎてバックグランドが濃くなりすぎた

戻しやすい．目的のバンド・スポットを切り出した後，ら，Farmerʼs reducer（0.19g FeCN，2.4g Na -エッペンドルフチューブなどに純水を入れ，その中に切に浸し，振とうする．適度なバッ
thiosulfate/250mL）

り出したゲル片を入れると，ゲルが膨潤し，セロファン

クグランドになったら，速やかに純水と交換し，数回も自然に剥がれる．この膨潤したゲル片で通常のゲル内洗う．Farmerʼs reducer に長時間浸すと，すべてが脱消化を行い，MS 分析サンプルにすることができる ．濾

色されてしまう．

紙を台紙にして乾燥した場合も同様に MS 分析に用い10．純水に平衡化した後，スキャナで画像化する，MS 分ることができるが，膨潤したゲル片から濾紙の繊維を取析のサンプル処理を行う，乾燥する，等の処理を行う．

り除くのに手間取ることが多い．

6.a.5.4 S YP R O R uby や Flaming o による

6.a.5.3 銀染色検出

Coomassie Blue では染色できないほどの微量のタン

蛍光検出装置の普及により，SYPRO Rubyや Fla-

パク質でも染色することが可能である．検出限界は，タmingo 等による検出が容易に行われるようになってきンパク質にも拠るが，0.5ng 程度

た．これらの手法による検出限界は銀染色と同程度であである．ダイナミッ

クレンジはそれほど広くなく，4‑60ng 程度の間で染色り ，また，ダイナミックレンジは 1‑1000ng と度の線形性が得られる ．染色キットが市販されている

染色と Coomassie Blue 染色の両方をカバーする．操作，銀が，我々は以下の手順で染色している．大きめのバット

は Coomassie Blue と同様，いたって簡便である．泳動で操作すると，染色ムラを少なくすることができる．な

後のゲルを染色液に３時間程度平衡化させ，蛍光イメー

お，この方法で染色したタンパク質バンド・スポットは，ジング装置で画像化する．特定のバンド・スポットを切M S 分析に用いることができる．また，Coomassie Blue

り出すためには，専用の装置が必要となる．これらの手で染色・脱色した後のゲルでも，引き続き銀染色を行う

法で染色したゲルも，改めて Coomassie Blue で染色すことができる．廃液は，研究機関の規則に従って処理をることができるので，必要があれば Coomassie Blue 等

行う．

で染色し直してバンド・スポットを切り出すということも可能である．

［染色方法］

6.a.5.5 フィコビリンタンパク質の検出

１．ゲルを 40％(v/v）エタノール，10％(v/v）酢酸を含

ラン色細菌や紅藻など，フィコビリゾームを含む材料

む溶液で，少なくとも 30分間，平衡化させる．Coomas-を取り扱う場合，フィコビリンタンパク質を感度良く検

sie Blue 染色後に充分に純水に平衡化させたゲルであ出できると便利である．電気泳動後のゲルを，トランス

れば，このステップは省略する．

イルミネータに載せ，紫外線を照射することで，フィコ

２．純水で，数回洗う（10分，３回程度）

ビリンタンパク質を発色させることができる．また，硫３．320μM DTT 溶液（32μL 1M DTT/100mL）に約酸亜鉛（ZnSO ）溶液を使うことで検出感度を高くする方

30分間，平衡化させる．Coomassie Blue で染色した368法も報告されている．この方法では，色のついていS D S -P AG E

ないリンカータンパク質も検出することが可能である．

［D AB Z 法］

6.a.5.6 ヘム染色

１．SDS-PAGE の終了したゲルを純水で約 20分，振と光合成電子伝達系の構成成分として知られている cう．途中，純水を数回，交換する．

型シトクロムがある．多くの酸素発生型非緑色光合成生２．純水で平衡化している間に，
水 50ml に対して 0.2g

物の光化学系 複合体に結合している PsbV（cyt c550）の 3,3ʼ
-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride

や，シトクロム b 6/f 複合体のシトクロム f 等である．

(DABZ-4HCl）を溶かし，それにメタノール 25ml とこれらのタンパク質バンドを電気泳動後に定量的に検出

Citric Buffer（1M citrate-NaOH/pH 4.7）25ml をする場合，ヘム染色が有効である．ただし，ヘムタンパ

加えたものを調製しておく．

ク質ごとに染色度が異なるので ，異なるヘムタンパク
質間の量的な比較は困難である．また，とくに注意すべき点は，タンパク質の変性液に含まれる DTT（dithiothreitol）は新鮮でないといけないということである．通常

３．純水を捨て，上記 DABZ 液に置換し，１時間程度の振とうを行う．
４．終濃度２％となるように過酸化水素水を加え，発色させる．

の SDS-PAGE では，変性液の凍結・融解を繰り返してい５．充分に発色させた後，純水で数回の洗浄を行う．

ても大きな問題はないようであるが，ことヘム染色に関

6.a.5.7 ウェスタンブロット

しては DTT の鮮度は大きな問題である．新鮮な DTT

SDS-PAGE や Native-PAGE で分離したタンパク質

でないと，ヘム染色されないばかりか，Coomassie Blueを特異的な抗体を用いて検出・同定する方法である．ス

で染色したヘム蛋白質のバンドも不鮮明になることもあ

ウェーデンの AgriSera（http://www.agrisera.se/）が光る．ここでは，蛍光イメージング装置を使った検出法

合成関連の抗体を各種取り揃えている．

（ECL 法 ）と，Diaminobenzidine（DABZ）を使った方

電気泳動後，PVDF 膜やニトロセルロース膜にタンパ法とを紹介する．ECL 法では，引き続いてウェスタンブ

ク質を転写し，BSA やスキムミルク等でブロッキングを

ロットを行うことができる．ウェスタンブロットのつい行った後，特異的な抗体（一次抗体），二次抗体と反応さでにヘム染色を行うことができるわけである．また，せ，二次抗体に結合させた HPR などの活性を利用してECL 法では，DABZ 廃液も生じない．

検出を行う．一次抗体は通常，数百倍に希釈して使用し，再使用することが多い．この場合，防腐剤が必要である．

［EC L 法］

一般的には，HRP 結合の二次抗体を使用する場合，アジECL 反応液を用意する．我々は，Pierce 社の West-化ナトリウムはその活性を阻害するために一次抗体の保Femto を使っている ．同じ会社の WestPico では感度存にもアジ化ナトリウムは使ってはならないことになっが不充分なことが多い．

ている．しかし，一次抗体を反応させた後，PVDF 膜（ニ

１．SDS-PAGE 後，あるいは Native PAGE 後，West-

トロセルロース膜）を充分に洗浄するため，防腐剤とし

ern blotting の方法により，PVDF 膜にブロットする．

てアジ化ナトリウムが入っていたとしても二次抗体を作

２．ブロット終了後，PVDF 膜を軽く純水で洗う．そし用させる前に洗い流されるようで，実際問題としてはアて OHP フィルム上に WestFemto（Pierce 社）を適

ジ化ナトリウムの使用は問題ない．アルカリフォスファ

量，混合し，PVDF 膜の両面を反応液になじませる．

ターゼ結合の二次抗体の場合も，同様であろう．

そして，気泡を挟まないように，OHP フィルムを被せ

ブロッティング終了後，前述のヘム染色操作（ECL 法）る（OHP フィルムで PVDF 膜を挟む）．ラップでも可で c 型 シ ト ク ロ ム の 検 出 を 行って か ら ウェス タ ン ブ

能であるが，反応液のムラを除くためには OHP フィ

ロットを進めることが可能である．

ルムが良い．
３．蛍光イメージング装置で画像を取り込む．または，
Ｘ線フィルムに感光させ，現像する．
４．PVDF 膜 を ア ミ ド ブ ラック（0.1％(w/v）Amido［実験方法］
予め用意しておく溶液．
TBSX solution

black-10B，10％(v/v）メタノール，2％(v/v）酢酸）

20mM Tris-HCl（pH 7.5）
，0.5M NaCl，0.1％で染色し，スキャナで画像化する．脱色は，純水のみ

Triton X-100

で行う．

(バックグランドの低減のためには，ナカライの５．必要であれば，ウェスタンブロットに進む．

Triton X-100 が良いようである）
Blocking solution

2009 低 温 科 学

vol.67369

1％ BSA in TBSX
Antibody buffer
1％ BSA/TBSX
Blotting buffer（Transfer buffer）
0.1M Tris，0.192M Glycine，5％ Methanol，
0.02％ SDS
BSA の代わりにスキムミルクを使うこともできる．

印をつけておくとよい．
11．さらに，Blotting buffer をゲルの上に小量注ぎ，Blotting buffer に浸しておいた濾紙を先ほどと同様に１枚ずつ４枚重ねる．
12．さらに Blotting buffer を少量注ぎ，次いで上部電極と濾紙との間に気泡が入らないように，注意深く上部
電極を載せる．上部電極をやや傾けて載せると，気泡が押し出される．このような手順で行うと，濾紙の間［操作］などに気泡ができにくいので，上部電極を載せる前に

１．電気泳動を行う．

ローラーなどで気泡を押し出す操作をしなくて済み，・試料タンパク質量は Coomassie Blue 染色の場合の1/5から 1/10でよい．
２．電気泳動終了後，ゲルを切り出し，Blotting bufferに浸して振とうする．
３．ゲルを振とう・平衡化し始めて 15分ほど経ったら，ゲルを採寸する．

また，Blotting buffer も濾紙などに充分保持される．
13．極性を確認して電源に繫ぎ，通電を始める．
・通電は，ゲル面積 1cm 当り 2.0mA 定電流に設定
し，約 45分通電する．通電直後は 10V 程度で，時間が経つにつれて電圧が高くなっていく．
・通電時間等はゲル，試料によって異なるので，条件平衡化中にゲルが伸張する場合は，しばらく浸漬し設定をした方がいい場合もある．

てから採寸するとよい．アクリルアミド濃度勾配ゲル14．終了後，必要に応じ，ヘム染色を行う．

の場合は，ゲルの下端側が若干伸張しやすいようであ15．アミドブラック，ポンソーなどで染色し，その後，る．
４．この大きさに合わせて PVDF 膜（ニトロセルロース

脱色する．
16．スキャナで画像を記録する．

膜）（１枚）と厚手の濾紙（８枚）を切り出す．PVDF

17．PVDF 膜（ニトロセルロース膜）を Blocking Solu-膜（ニトロセルロース膜）や濾紙は，ゲルよりも 5mmtion に浸し，膜上のタンパク質がない部分をコーティ

以上は大きくないように切り出す．

ングする．振盪しながら約 30分．

５．切り出した PVDF 膜を 100％メタノールに浸す．短18．一次抗体を反応させる．振盪しながら 30分〜一晩．

時間でよいが，ムラなく浸す．ニトロセルロース膜の19．反応後の PVDF 膜を TBSX で洗う．5分間 x 4回場合，必要ない．

程度．

６．メタノールを Blotting buffer に置換し，振とうしな

20．二 次 抗 体（Horseradish Peroxidase-conjugated

がら浸漬する．置換後すぐは注意深く攪拌し，Blottingを反応させる．振盪しながら 30分〜１時間．１％
IgG）

buffer に馴染ませるようにする．なるべく空気に触れ

BSA/TBSX で希釈して使う．

ないようにしないと，転写後の膜への保持効率が悪く

21．PVDF 膜を TBSX で洗う．5分間 x ４回程度．

なるようである．

22．OHP フィル ム に ECL 液（Pierce 社 の WestPico

７．セミドライタイプの転写装置の下部電極板に Blotting buffer をむらなく広げる．
８．この電極板の上に，Blotting buffer に浸しておいた濾紙を１枚ずつ４枚重ねる．このとき気泡が濾紙と電極板の間，および濾紙と濾紙の間にできないように，
濾紙の下の空気を押し出すように濾紙を載せていく．

等）を載せ，PVDF 膜（ニトロセルロース膜）の両面を反応液になじませる．そして，気泡を挟まないように，OHP フィルムを被せる（OHP フィルムで PVDF
膜を挟む）．
23．蛍光イメージング装置で画像を取り込む．または，
Ｘ線フィルムに感光させ，現像する．

９．４枚重ね濾紙の上に PVDF 膜を気泡ができないよ

24．必要に応じ，別の一次抗体を反応させる．この場合，

うに素早く重ね，また素早くその膜の上に Blotting

前の一次抗体をはがすための処理もあるが，完全に取

buffer を注ぐ．

り除くことは難しい．

10．気泡が入らないようにゲルを載せる．このとき，で6.a.5.8 N 末端アミノ酸配列の解析

きるだけゲルの裏表を確認して載せる．転写後 PVDF

ウェスタンブロットと同様にして，ブロッティングを膜をレーンに合わせて切り出す必要がある場合，後で行い，アミドブラックなどで染色する．電気泳動の際，切りわけ易いように，膜の上にレーンの境目を鉛筆でTris/Glycine 系の泳動バッファを使わないようにとの370

S D S -P AG E

指示がある場合もあるが，問題ないようである（装置に６) Y.Kashino, T.Harayama, H.B.Pakrasi, & K.Satoh,

よるのかもしれない）．

J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 849(2007)P.282.
７) M .Ikeuchi & Y.Inoue,Plant Cell Physiol.29 (1988)P.

Blotting buffer の組成は，50mM Tris，30mM Boricacid，0.02％(w/v）SDS，5％(v/v）methanol である．
pH を調製していない 1M Tris 溶液と，0.5M Boricacid 溶液を用意しておくと，Blotting buffer の調製が容易である．
ゲル面積 1cm 当り 2.0mA 定電流に設定し，約 45分
通電する．通電直後は 20V 程度で，時間が経つにつれて電圧が高くなっていく．ブロッティング終了後はアミド
ブラック等で染色し，バンドを確認する．フォルミル化
によるブロッキングを除くために，0.6N HCl で一晩，インキュベーションを行っても良い．その場合は，純水で充分に洗浄を行う．

1233.
８) H.Schagger & G.von Jagow, Anal. Biochem. 166(1987)P.368.
９) H.Schagger, Nat. Protoc. 1 (2006)P.16.
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371

３章 単離・精製・活性測定

６．タンパク質
b．B lue-Native P AG E
菓子野康浩
光合成電子伝達系には，複数の膜タンパク質複合体が関与している．これらのタンパク質複合体を複合体のままで電気泳動するいわゆる Native-PAGE のひとつとして，近年，Blue-Native PAGE が頻繁に用いられるようになった．膜タンパク質複合体の構成を調べたり，単量体なのか二量体なのかを検証することなどが行われている．本稿では，Blue-Native PAGE を概観し，実験方法を簡単に紹介する．

Blue-Native PAGE
Yasuhiro Kashino
Photosynthetic electron transport system contains several membrane protein complexes such as photosystems I
and II. Blue-Native PAGE is useful to assess the oligomeric form of membrane protein complexes and theircomposition in their native form. In this section, outline of this electrophoresis system and the experimental
procedure will be presented.

分の可溶化は必要であるが，可溶化後の膜タンパク質複6.b.1 B lue-Native P AG E
光化学系

複合体，光化学系

合体に Coomassie Blue G-250 を結合させ，Coomassie

複合体，シトクロム

Blue G-250 の持つ負電荷により膜タンパク質複合体のb 6/f 複合体，等，光合成電子伝達系では複数の膜タンパ泳動を行うものである．泳動により，タンパク質複合体

ク質複合体が協調的に機能している．そのような膜タンおよびゲルが青色を呈するため，Blue-Native PAGE とパク質複合体のサブユニット組成を解明するためには，呼ばれる．Coomassie Blue G-250 は水への溶解性が大き膜タンパク質複合体を精製し，精密な SDS-PAGE 等にく，一方，疎水的性質も備えているため膜タンパク質に

よる解析

が行わ

結合することも可能である．そのため，Coomassie Blue

れてきた．しかし，そのような方法では，多量に精製す

G-250 を結合させた膜タンパク質は，界面活性剤によりることが必要であり，また特定のサブユニットが精製の可溶化されたときと同じように可溶化状態にある．多量過程で遊離してしまう可能性も捨てきれない．さらに，の Coomassie Blue G-250 が膜タンパク質複合体本来の膜タンパク質複合体は，常に離合集散しているダイナ

電荷を覆ってしまうため，泳動バッファの pH は 7.5でミックな存在であり ，生理的な条件下での構築・修復過あるが，塩基性タンパク質も正極に向かって泳動される程を解明するためには，精製によるサブユニット組成のことになる．電気泳動のための担体としては，アクリル

解析では非常な困難がある．このような問題を解決する

アミド濃度勾配ゲルが用いられる．つまり正極に近いほ

ひとつの方法として，近年汎用されるようになってきた

ど，ポアサイズが減少する．ポアサイズの減少に伴い，手法が Blue-Native PAGE である

泳動中の膜タンパク質複合体の移動速度は減少していや結晶化による構造解析．

上記のような目的や精製のために，従来，6c 節で取りく．そして，タンパク質複合体の大きさに応じたポアサ

上げる Green-Native PAGE と呼ばれるような Native

イズのところまで移動すると，そのタンパク質複合体のPAGE が行われてきた．そのような Native PAGE で移動は停止する．このようにして，タンパク質・タンパ

は，界面活性剤により膜タンパク質を可溶化して電気泳ク質複合体の大きさ（分子量）によって分離されること動を行う．穏和な非イオン性界面活性剤が用いられるこになる．

とが多く，主に膜タンパク質複合体の持つ電荷に依存し通常用いられる Coomassie Blue G-250 の濃度では，て複合体が泳動される．Blue-Native PAGE では，膜画

膜タンパク質複合体が解体される可能性は低いようで，複合体が複合体として泳動されることになる．
そのため，

１) 兵庫県立大学大学院生命理学研究科

2009 低 温 科 学

vol.67

Blue-Native PAGE 後に SDS-PAGE を組み合わせた二373

次元電気泳動を行うことにより，比較的存在量の少ない

り，ある条件では重なってしまうタンパク質複合体を分膜タンパク質複合体のタンパク質組成を調べることがで離することができることもある．Blue-Native PAGE にきるようになった．これは，近年ゲノム情報が蓄積されより分離されたバンドから予想外のタンパク質組成が得てきたことと，微量でもタンパク質の同定を可能にしたられた場合，泳動条件を変えて解析してみることも必要

M S 分析，Ｎ末端アミノ酸配列解析などの分析技術の進であろう．また我々は，ショ糖密度勾配遠心により得ら歩に負うところも大きい．Blue-Native PAGE と SDS-れたタンパク質複合体のように，ショ糖が高濃度含まれPAGE を組み合わせた二次元電気泳動を行うことによた標品では，Blue-Native PAGE での解析が困難になっり，ラン色細菌 Synehcocystis sp. PCC 6803 等を材料にたことも経験している．さらなる条件の検討が必要であ

して，チラコイド膜上に存在する膜タンパク質複合体のろう．

サブユニット組成が詳細に解析された例が頻繁に報告されている．タンパク質複合体は健全（native）な状［実験方法］態で泳動されるため，ゲル内での活性測定を行うこともBlue-Native PAGE は，Coomassie Blue G-250 の性

でき，ブロッティングすることにより抗体を使って特定質を利用して泳動するものであるが，チラコイド膜などのタンパク質を検出することも可能である（ウェスタンの膜画分での分析を行う場合，予め適切な濃度の適切なブロット）．また，ゲルから抽出して色素分析などを行っ

界面活性剤で可溶化する必要がある．可溶化のための界たりすることが可能である．

面活性剤としては，Digitonin，n-dodecyl-β-D-maltoside

また，この方法では，タンパク質複合体を分子量によ（DDM ），Triton X-100 等が用いられる．我々は次のようり明瞭に分離することができ，適切な分子量マーカを使にして泳動のための可溶化条件を決定している．

うことにより，分子量を推定することも可能である．こ１．1mg Chl/mL のチラコイド膜に 0.5〜1.2％程度ののことを利用して，精製した光化学系 ，光化学系 や濃度範囲で DDM を加える．

シトクロム b 6/f 複合体のオリゴマー状態を決定するこ

２．暗所・氷上で 20分間の処理を行う．

とができる．Huang ら

３．遠心により不溶物を除去する．

は，シトクロム b 6/f 複合体が二 量 体 で あ る こ と を 示 す の に Blue-Native PAGE を４．5μg Chl 相当量を Blue-Native PAGE で泳動し，適行った．その後，結晶構造でも二量体構造であることが切な濃度条件を決定する．

示された

光化学系 複合体や光化学系．我々は，珪藻の光化学系 複合体が単量体複合体であれば，界面であることを Blue-Native PAGE により 示 し た ．

活性剤濃度の上昇にともない，バンドが鮮明になるととBlue-Native PAGE による分離は，ゲル濾過によるもの

もに，泳動度が徐々に大きくなる．そのような変化がな

よりもいっぱんに良好であるようだ．また，二次元目のくなる最低濃度に設定している．通常，1％ DDM であSDS-PAGE への展開が容易であるので，濃縮などの操る．Herranen ら

作をせずに，分離された複合体のタンパク質組成を容易

ラ コ イ ド 膜 を 材 料 に，0.5mg Chl/mL，2％ DDM でに検証することができるという利点もある．

０℃，60分の処理を行っている．Zhang ら

このように非常に有用な手法であるが，注意すべき点もいくつかある．我々の経験では，光化学系

は，Synechocystis sp.PCC 6803 のチ
は，Syne-chocystis sp.PCC 6803 のチラコイド膜を材料に，10μg

複合体のprotein/μL，1.5％ DDM で氷上 10分の処理に引き続きPsbO，PsbU，PsbV などの表在性タンパク質が遊離して室温で 20分の処理を行っている．すでに報告されている

しまっている．したがって，例えば光化学系

条件を参考にして，材料や界面活性剤の種類に応じた適複合体の修復・構築過程を解析する場合など，チラコイド膜上に切な条件を検討すべきである．

小数存在する修復・構築過程にある複合体にそのような精製した光化学系複合体などは，改めて界面活性剤に

表在性タンパク質が実際に結合しているかどうかを容易

よる処理を行わず，下記のように 5％ Coomassie Blueには決定できないことになる．そのような表在性タンパ

G-250 溶液を添加し，泳動サンプルとする．泳動の際，ス

ク質を保持することができる条件を検討しなくてならな

ラブゲルであれば，チラコイド膜や光化学系 複合体はいであろう．さらに，これは Blue-Native PAGE に限っ

5μg Chl 相当量，光化学系 複合体は 2μg Chl 相当量がたことではないが，異なるタンパク質複合体であっても，適量であるが，サンプルに応じて調節する．分子量マー

分子量が非常に似ていると，泳動度がほとんど同じにな

カ は， Invitrogen の NativeM ark（ http://www.

ることがある．そのような場合でも，ゲルのアクリルア

invitrogen.co.jp/electro/lc0725.shtml）を使用している．

ミド濃度勾配等の泳動条件を変えて泳動することによ

サンプルのローディングを容易にするために，5％(w/v）

374

B lue-Native P AG E

表 1：Blue-Native PAGE のためのストック溶液
Stock Solution

Composition

Deep Blue Cathode Buffer(pH 7.0）
Slightly Blue Cathode Buffer(pH 7.0）
Anode Buffer (pH 7.0）
AB mix

50mM Tricine，7.5mM Imidazole
0.02％ Coomassie Blue G-250
50mM Tricine，7.5mM Imidazole
0.002％ Coomassie Blue G-250
25mM Imidazole-HCl
49.5％T，3％C（48％(w/v)Acrylamide，1.5％(w/v)methylenebisacrylamide)
75mM Imidazole-HCl
1.5M 6-Aminocaproic acid5％(w/v)Coomassie Blue G-250，
500mM 6-Aminocaproic acidGel Buffer (pH 7.0）
5％ CBB G-250

未重合のアクリルアミドおよびメチレンビスアクリルアミドは高い神経毒性を有する
ので，取り扱いに注意する．

グリセロールなどでサンプルの比重を高くしておくとよ

ペットを使って純水を静かに重層し，ゲル化するのをい．チラコイド膜や光化学系複合体の調製には通常ショ待つ．

糖やグリセロールが含まれた溶液が用いられるので，そのような場合は，改めて加える必要はない．
Blue-Native PAGE のためのストック溶液の組成を
表 1に示した．表 2に示したゲル条件は，光化学系 複３．分離ゲルがゲル化したら，濃縮ゲルを作りサンプル
ウェル用コームを気泡が残らないように差し込む．
４．サンプルにその 1/10量の 5％ CBB 溶液を加えて，よく混合する．

合体や光化学系 複合体複合体を対象にして解析するた

５．泳動槽の陽極側に Anode Buffer を入れ，ゲルを泳めに我々が用いているものである．Schagger によるプ

動槽にセットし，陰極側に Deep Blue Cathode Buffer

ロトコル

を Stacking gel と Separation gel の境界付近まで入に，タンパク質複合体の大きさに応じた適切なアクリルアミド濃度勾配の例が挙げてあるので，それる．

れも参考に適切なアクリルアミド濃度勾配を決定すると(ここで Deep Blue Cathode Buffer を途中までしか良いであろう．6a 節（SDS-PAGE）にアクリルアミド濃入れないのは，サンプルをロードしやすくするためで度勾配を作成する手順を記載してあるので，必要であれある．最初からいっぱい入れてしまうと，Deep Blueばそれを参考にしてゲルを作成する．アクリルアミド均Cathode Buffer の色が濃いため，サンプルウェルを確

一濃度のゲルでも泳動は可能ではあるが，バンドが曖昧認しづらくなる．）となり，正確さに欠けるようである．また，分子量の大６．サンプルをロードする．5〜10μL が適量である．分

きなタンパク質複合体を対象にする場合，表 2に示した

子量マーカ NativeMark は，スラブゲルの場合，5μL

2.5％T のような低アクリルアミド濃度の濃縮ゲルを使が適量である．
サンプルのローディングが終了したら，うと良い．アクリルアミド濃度が高いと，分子量の大き

陰極側に Deep Blue Cathode Buffer を追加する．

なタンパク質複合体が濃縮ゲルにも入らない場合がある．2.5％T の濃縮ゲルは非常に柔らかいので，泳動終了
後にゲル板を剥がす際は注意を要する．この濃度の濃縮

表 2：5‑10％T アクリルアミド濃度勾配ゲルを作成するためのゲル液
Separation Gel
5％ T
10％ T

ゲルは板状になっておらず，ゲル板を剥がす際に分離ゲルから剥がれてしまう．
未重合のアクリルアミドは高い神経毒性があるので，取り扱いには充分な注意が必要である．また，アクリル
アミドを含む廃液は回収し，ゲル化させてから廃棄する．
１．ゲル溶液を調製し（表２），アクリルアミド濃度勾配
ゲルを作る．
２．ゲル液をゲル板に入れ終わったら，パスツールピ
2009 低 温 科 学

vol.67

Stacking Gel
2.5％ T

AB mix1mL

2mL

0.15mLGel Buffer

3.25mL

3.25mL

1mL

Glycerol

―

2g

―

Water

5.75mL2.75mL1.85mL

Total

10mL

10mL

3mL

10％ APS

40‑55μL

30‑50μL

25μL

TEM ED

4.0‑5.5μL

4.0‑5.0μL

2.5μL

APS，過硫酸アンモニウム375

７．クロマトチャンバー，あるいは低温室（4℃）に泳動

入するのも一つの方法である．

槽を水平に置き，電源と接続する．
８．Stacking gel を過ぎるまでは 60V で泳動し，Separation gel に入ったら 300V に電圧を上げる．この場

参考文献

合，泳動先端がゲル下端に達するのに，４〜６時間程

１) M .Ikeuchi & Y.Inoue,Plant Cell Physiol.29 (1988)P.

度を要する．電圧を 60V で維持した場合，20時間程度

1233.
２) Y.Kashino, W.M .Lauber, J.A.Carroll, Q.Wang, J.
Whitmarsh, K.Satoh, & H.B.Pakrasi, Biochemistry 41

である．
９．泳動の先端が Separation gel の 1/3まで進んだら，いったん泳動を止め，陰極側の電極液を SlightlyBlue
Cathode Buffer に置き換える．
10．再び 300V にして，泳動先端の CBB がゲルから流れ出るまで泳動する．
(あるいは，適切な泳動距離まで．）
11．泳 動 槽 か ら ゲ ル を 取 り 出 し，ス キャナーで コ ン
ピュータに取り込む．
ゲルが破れやすいので，注意して取り扱う．
12．Coomassie Blue による染色・脱色後，スキャナーでコンピュータに取り込む．
13．必要に応じ，二次元目の泳動を行う．Coomassie
Blue による染色を行わずに二次元目の SDS-PAGEを行っても良い．
泳動後のバンドからタンパク質複合体を抽出する場合など，泳動先端の Coomassie Blue G-250 がゲルの下端に到着する前に，目的のタンパク質複合体が充分に分離された段階で泳動を終了する．その方が，タンパク質複合体の抽出が容易である．
二次元目の泳動のためにレーンを切り出す際は，カッターナイフの刃を垂直に当て，押し切るようにすると切り や す い．そ し て，そ の ゲ ル ス ト リップ を 変 成 液 に
10〜20分程度，浸してから二次元目のゲルに載せる．
Blue-Native PAGE の解析対象は膜タンパク質なので，二次元目の SDS-PAGE は，前節（6a）に記載したように膜タンパク質の分離に適した系を選択すべきである．
Blue-Native PAGE をスラブゲルで行い，二次元目のSDS-PAGE も同じサイズのゲル板を使った場合，濃縮ゲルは最上部まで作製し，その上に Blue-Native PAGEのゲルストリップを載せるようにすると良い．
その上で，0.5％アガロースで封入する．厚みの同じゲルストリップ
をゲル板の間に押し込むのは困難である．分子量マーカ
等を同時に泳動する場合，分子量マーカを 0.5％アガ
ロースで固化させ，適切な大きさに切り分けておく．このゲル片を濃縮ゲルの適切な場所に載せ，Blue-Native(2002)P.8004.
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PAGE のゲルストリップと同時に 0.5％アガロースで封376

B lue-Native P AG E

３章 単離・精製・活性測定

６．タンパク質
c．Native-G reen P AG E
菓子野康浩
光化学系

複合体や光化学系

複合体などのクロロフィル結合タンパク質をクロロフィルを結合した状態で分離し，その生化学的性質を解析するための方法のひとつとして，電気泳動的に分離することが行われてきた．いわゆる Native-PAGE であるが，得られるバンドが緑色をしているため，NativeGreen PAGE とも呼ばれる．本節では，いくつかの Native-Green PAGE について，実験方法を簡単に紹介する．

Native-Green PAGE
Yasuhiro Kashino
For the biochemical analysis of chlorophyll-binding proteins such as photosystem I and II complexes, native
PAGE is one of the tool to separate those proteins. The chlorophyll-binding proteins are colored in green on thegel. In this section, outline of this electrophoresis system and the experimental procedure will be presented.

組成を詳細に分析することも可能であろう．また一方，

6.c.1 Native-G reen P AG E

複合体を部分的に解体するほどの界面活性剤処理を行っポリアクリルアミドゲルなどを担体にした電気泳動て Native-Green PAGE を行うことで，サブユニット間は，タンパク質やタンパク質複合体を電荷や大きさにの相互位置関係を解析する手段として用いることも可能

よって分離する．その分離能は非常に高い．そのようなであろう．タンパク質複合体 の 精 製 の 場 合 と 同 様，

電気泳動の中でも，タンパク質を変性させずに泳動し，Native-Green PAGE の際の可溶化およびゲルに用いる

タンパク質やタンパク質複合体を分離する電気泳動が界面活性剤の種類や濃度，組み合わせにより，多様なア

Native PAGE（非変性電気泳動）である．Native PAGE

プリケーションが可能である．しかしこれは，界面活性によりタンパク質やタンパク質複合体を分離し，得られ剤の条件を適切に設定する必要があることも意味する．

たタンパク質バンドの活性をゲル内で測定することや本稿では，近年用いられ始めた Clear-Native PAGE や，（活性染色），ゲルからタンパク質複合体などを抽出し，古典的な Davis の系など，少数の例であるが実験方法を

そのタンパク質組成，補因子の分析など生化学的な分析紹介する．また活性染色の例も最後の項で紹介する．

に用いられる．厚みのあるゲル等により，活性を保持したタンパク質やタンパク質複合体の精製に用いることも可能である．
光合成研究の分野でも，Native PAGE は盛んに行われてきた．葉緑体やチラコイド膜を材料にしてこのよ

6.c.2 C lear-Native P AG E
これは，前節で概説した Blue-Native PAGE の変方である．Blue-Native PAGE

では，陰極液（Cathodeうな Native PAGE を行うと，光化学系 複合体，光化が濃い群青色をしており，泳動にともない陰極液
buffer）

学系

複合 体，光 捕 集 ク ロ ロ フィル 結 合 タ ン パ ク 質

中の Coomassie Blue G-250 がゲル中に拡散していく．

（LHC），などのクロロフィル結合タンパク質がバンドとこのために泳動中はバンドの認識が困難である場合が多して分離される．そしてそのバンドが緑色を呈している

い．ただし，泳動終了後にゲルを取り出すと，多量にあことから，Native-Green PAGE とも呼ばれる．穏和な界るクロロフィルタンパク質（複合体）は緑色のバンドと面活性剤によりチラコイド膜を可溶化し，Native-Green

して認識できるので，Blue-Native PAGE も Native-

PAGE を行って生理学的に完全な構成の光化学系

Green PAGE の一種ではある．Clear-Native PAGE

複合体，光化学系 複合体などを分離し，そのタンパク質

は，基本的には Blue-Native PAGE における陰極液中のCoomassie Blue G-250 を界面活性剤に置き換えたもの

１) 兵庫県立大学大学院生命理学研究科

2009 低 温 科 学

vol.67である．これにより，泳動中もゲルは着色されず（clear），
377

クロロフィルタンパク質は緑色のバンドとして分離される．
バックグランドの濃い群青色がないため，
クロロフィ

6.c.3 Allen の系

ルタンパク質以外のタンパク質（複合体）の活性染色をNative PAGE とはいいながら，泳動時に一部のクロ行うことなども容易である．個人的な見解ではあるが，ロフィルがタンパク質から遊離し，フリーのクロロフィ

この系と界面活性剤との組み合わせを工夫することによルとして泳動先端に現れてしまう場合があった．しかし，り，多様なクロロフィル複合体および膜タンパク質複合

穏和な非イオン性の界面活性剤が導入されるようにな体に応用でき，後に紹介する他の方法に取って代わるこり，このような問題点が解決されていった．その例の一とができるのではないかと考えられる．

つがここで紹介する Allen & Staehelin による系である ．この系では，従来の方法に比べて遊離色素を減らし［実験方法］てクロロフィル結合タンパク質（複合体）を分離するこ

表１に Clear-Native PAGE のためのストック溶液をとが可能となった．しかし，電極液に 0.1％(w/v)SDS を示した．これは，6b．Blue-Native PAGE に記した表１

用いているためか，光合成色素が若干遊離することは避の陰極液に含まれる Coomassie Blue G-250 を 0.02％

けられないようである．複数の界面活性剤を組み合わせ(w/v)n-dedecyl-β-D-maltoside(DDM ），0.05％(w/v)てチラコイド膜を可溶化した後，低温で電気泳動を行う．

sodium deoxycholate(DOC）の組み合わせに置き換えたものである．泳動は，低温で Blue-Native PAGE と同様［実験方法］に行う．ただし，可溶化処理後の標品をそのままロード

表２のようにストック溶液を調製し，表３にしたがっし，Blue-Native PAGE の際に必要であった陰極液の交てゲルを作製する．分離するクロロフィル結合タンパク

換作業は必要ない．可溶化標品の比重が低い場合は，グ質により，アクリルアミド濃度の調整が必要である．

リセロール等で比重を高くすると良い．Wittig ら は，Allen と Steahelin によるオリジナルの報告 では，クラ上記の界面活性剤の組み合わせ以外に，0.05％(w/v)

ミドモナスを材料にして８％(w/v)アクリルアミドのゲ

Triton X-100，0.05％(w/v)DOC の組み合わせ，0.01％

ルが使われている．予備実験により，濃縮ゲルが必要か(w/v)DDM ，0.05％(w/v)DOC の組み合わせも紹介している．いずれの条件に於いても，陰イオン性界面活性表 2：Allen の系のためのストック溶液

剤 DOC が含まれている．Wittig ら の報告等を参考に

ストック溶液して，手元の標品を分離するのに適切な界面活性剤の組X10分離ゲル緩衝液

250mM Tris, 500mM Glycine(pH 8.3)

X10濃縮ゲル緩衝液

250mM Tris, 500mM Glycine(pH 6.3)
49.5％(w/v)Acrylamide,
0.5％(w/v)
methylenebisacrylamide

み合わせを検討すると良い．
必要に応じ，二次元目の SDS-PAGE を行う．一次元目のゲルからゲルストリップを切り出す際は，カッターナ

50％アクリルアミド溶液

イフの刃を垂直に当て，押し切るようにすると切りやす
い．

電極液

組成

25mM Tris, 192mM Glycine,
0.1％(w/v)SDS

電極液は，Laemmli の系のものと同じ組成である．

表 1：Clear-Native PAGE のためのストック溶液
ストック溶液組成50mM Tricine, 7.5mM Imidazole
Cathode Buffer(pH 7.0)
0.02％(w/v)DDM, 0.05％(w/v)DOC
25mM Imidazole-HCl
Anode Buffer(pH 7.0)
49.5％T, 3％C
AB mix(48％(w/v)Acrylamide,1.5％(w/v)
methylenebisacrylamide)
75mM Imidazole-HCl
Gel Buffer(pH 7.0)
1.5M 6‑Aminocaproic acid
DDM ，n-dodecyl-β-D-maltoside
DOC，sodium deoxycholate
未重合のアクリルアミドは高い神経毒性があるので，取り扱いには充分な注意が必要である．また，アクリルアミドを含む廃液は回収し，ゲル化させてから廃棄する．

378

表 3：Allen の系におけるゲル液の調製（7％(w/v)アクリル
アミド，ミニゲル）
分離ゲル

濃縮ゲル

X10分離ゲル緩衝液
X10濃縮ゲル緩衝液
50％アクリルアミド溶液
純水

1mL
−
1.4mL
7.6mL

−
1mL
0.6mL
8.3mL

(体積)

(10mL)(10mL)

10％ APS

50μL
5μL

100μL
10μL

TEM ED

未重合のアクリルアミドは高い神経毒性があるので，取り扱いには充分な注意が必要である．また，アクリルアミドを含む廃液は回収し，ゲル化させてから廃棄する．

Native-G reen P AG E

表 4：Davis の系のためのストック溶液
ストック溶液組成

Ａ(分離ゲル緩衝液)
Ｂ(濃縮ゲル緩衝液)
Ｃ(28％ アクリルアミド溶液)

1.5M Tris-HCl(pH 8.9), 0.12％ TEMED
494mM Tris(pH 6.7), 0.46％ TEMED
28％(w/v)Acrylamide,
0.735％(w/v)methylenebisacrylamide
10％(w/v)Acrylamide,
2.5％(w/v)methylenebisacrylamide
0.004％(w/v)リボフラビン
40％(w/v)スクロース
10％(w/v)過硫酸アンモニウム
50mM Tris, 384mM Glycine

D/2Ｅ(リボフラビン)
Ｆ(40％ スクロース)
Ｇ(10％ APS)
電極液(pH 8.3)(x 10)(pH を合わせる必要はない)

否かを検討する．また，予備実験により，チラコイド膜

消えて白くなると，ゲル化が完了している．

の可溶化のための界面活性剤の種類，濃度を比較検討すチラコイド膜を界面活性剤により可溶化し，遠心してる．0.5mg Chl/mL(0.05％ w/v)の濃度のチラコイド膜

可溶化上清を得，低温で電気泳動を行う．必要に応じ，に対して，界面活性剤の影響を検討するものである．

二次元目の SDS-PAGE を行う．

Allen と Steahelin に よ る 報 告 で は，0.45％(w/v)n-Thermosynechococcus elongatus チラコイド膜（1mgoctyl-β-D-glucoside(OG)，0.45％(w/v)DDM ，0.1％

を 0.8％
Chl/mL，50mM Tris(pH 7.5），10mM NaCl）(w/v)LDS(Chl:OG:DDM:LDS＝1：9：9：2)の条件で（室温，30分），遠心後の上清を上記のジギ
OG で処理し氷上で 30分間の処理が行われている．Chl:OG:DDM:

トニンを含む Davis の系で泳動を行うことにより，光化

LDS＝1：18：18：1や Chl:OG:DDM :LDS＝1：20：

学系 コア複合体を得ることができる．このゲル条件で20：4，などの条件で可溶化を行い，実際に泳動を行っては，10mA，30分程度の泳動により，ゲル上部から光化

濃度条件や界面活性剤の種類を検討する．我々は，Syne-

学系 複合体（濃い緑色），光化学系 コア複合体（ややchocystis sp.PCC 6803 の チ ラ コ イ ド 膜 を Chl:OG:

薄い緑色），カロチノイド（黄色），フィコビリゾーム（青

DDM:LDS＝1：10：10：1，キュウリのチラコイド膜を色）の順でバンドが得られる．

Chl:OG:DDM :LDS＝1：20：20：2，で処理し，2mA
で約２時間の泳動（ミニゲル）を行うことにより，クロロフィル結合タンパク質を分離することができた．
必要に応じ，二次元目の SDS-PAGE を行う．

6.c.5 デオキシコール酸を含む系
我々の研究室では，ラン色細菌のチラコイド膜を泳動し，ジアフォラーゼ活性による活性染色にも用いてい

6.c.4 D avis の系
古くから用いられてきた系である．現在でも，より穏

表 5：Davis の系におけるゲル液の調製（スラブゲル）（5％(w/v)アクリルアミド，0.2％ジギトニン）
分離ゲル

濃縮ゲル

ウム（APS）を加え，静かに撹拌してからゲル板に注ぎＡ(分離ゲル緩衝液)
Ｂ(濃縮ゲル緩衝液)
Ｃ(28％アクリルアミド溶液)
D/2Ｅ(リボフラビン)
Ｆ(40％ スクロース)
純水
ジギトニン

5.25mL−
3.75mL
−
−
−
12mL
42mg

−
0.6mL
−
1.2mL
0.6
2.4
8.3mL
9.6mg

込む．純水を静かに重層し，ゲル化するまで静置する．

(体積)(21mL)(4.8mL)

分離ゲルがゲル化したら，重層した純水を排出し，濃縮

10％ APS

150μL−

ゲル液にＥ（リボフラビン溶液）を加える．濃縮ゲルのＥ(リボフラビン）は，濃縮ゲルを作製する直前に加える．
未重合のアクリルアミドは高い神経毒性があるので，取り扱いには充分な注意が必要である．また，アクリルアミドを含む廃液は回収し，ゲル化させてから廃棄する．

和な界面活性剤で可溶化処理を行い，クロロフィル結合
タンパク質を分離する目的に用いられている．表４のストック溶液を調製し，表５にしたがってゲルを作製する．界面活性剤の種類や濃度は，用途に応じて検討を行う．Yamazaki ら ，Chen らは，DDM を用いて泳動を行っている．分離ゲル液を脱気し，過硫酸アンモニ

上面を共洗いし，濃縮ゲル液を加えてコームを差し，蛍光灯の光により光重合を行う．濃縮ゲル液の黄色い色が2009 低 温 科 学

vol.67379

表 6：デオキシコール酸を含む系のためのストック溶液
ストック溶液組成

AB Mix

49.5%T, 3%C(48% (w/v)Acrylamide,
1.5% (w/v)methylenebisacrylamide)

x10ゲル緩衝液
60％Sucrose
５％DOC

0.25 M Tris, 1.9 M Glycine
60% (w/v)Sucrose
5% (w/v)NaDOC

陰極液（Cathode buffer）

25 mM Tris, 0.192 M Glycine, 0.1% (w/v)NaDOC

陽極液（Anode buffer）

25 mM Tris, 0.192 M Glycine

表 7：デオキシコール酸を含む系におけるゲル液の調製（スラブゲル）（5‑18％（w/v）アクリルアミド，0.1％デオキシコール酸）
アクリルアミド溶液
５％Ｔ

18％T

Stacking(4%T)

AB M ix
x10 ゲル緩衝液
60％Sucrose
５％DOC
純水

1.0mL
1.0mL
−
0.2mL
7.75mL

3.67mL
1.0mL
3.0mL
0.2mL
2.1mL

0.5mL
0.6mL
−
0.12mL
4.73mL（体積）(10mL) (10mL)(６mL)

10％過硫酸アンモニウム

50μL
5.0μL

50μL
5.0μL

TEMED

30μL
3.0μL

る ．表６のストック溶液を調製し，表７にしたがってゲルを作製する．Synechocystis sp. PCC 6803 のチラコイ
ド膜（25％ glycerol，10mM CaCl ，10mM M gCl ，50）を 0.5mg Chl/mL，1％ DDM で
mM MES(pH 6.5）
30分間，氷上にて可溶化処理する．遠心後，可溶化上清（１レーン当たり 10μg Chl 相当量）を上記ゲルにロード
し，４℃にて泳動を行う．電圧は，当初 100V を印加し，段階的に 400V まで上げていく．必要に応じ，二次元目の SDS-PAGE を行う．
ジアフォラーゼ活性による活性染色を行う場合，泳動終了後のゲルを染色緩衝液（50mM Tris-HCl(pH 7.5)，
0.25mM EDTA，and 0.1mg/mL nitroblue tetr（NBT））中で 30分程度振とうし，0.2
azolium chloride

色が充分に発色するまで振とうし，その後純水に置き換
える．

参考文献
１) J.M.Anderson, Biochim Biophys Acta 591 (1980) P.
113.
２) A.Yamagishi & S.Katoh,Arch Biochem Biophys 225(1983)P.836.
３) K.D.Allen & L.A.Staehelin,Anal Biochem 194(1991)
P.214.
４) H.Schagger & G.von Jagow,Anal Biochem 199 (1991)
P.223.
５) H.Schagger, in M embrane Protein Purification and
Crystallization:A Practical Guide, ed C.Hunte, G.von
Jagow, & H.Schagger (Academic Press, Amsterdam,
2002), P.105.
６) I.Wittig, H.P.Braun, & H.Schagger, Nat Protoc 1(2006)P.418.
７) I.Wittig, M .Karas, & H.Schagger, M ol Cell
Proteomics 6 (2007)P.1215.
８) I.Wittig, R.Carrozzo, F.M.Santorelli, & H.Schagger, Electrophoresis 28 (2007)P.3811.
９) B.J.Davis, Ann N Y Acad Sci 121 (1964)P.404.
10) J.Y.Yamazaki,A.Kozu,& Y.Fukunaga,Photosynth
Res 89 (2006)P.19.
11) G.Chen, X.Niu, X.Chen, L.Li, T.Kuang, & S.Li,
Photosynth Res 96 (2008)P.75.
12) J.Ooyabu, M.Ohtsuka, Y.Kashino, H.Koike, & K.
Satoh, Biosci Biotech Biochem 72 (2008)P.3180.

mM NADH または 0.2mM NADPH を添加する．青い380

Native-G reen P AG E

３章 単離・精製・活性測定

６．タンパク質
d‑1．二次元電気泳動
岩井 優和 ，皆川純

光合成反応は多数のタンパク質によって支えられている．それらを網羅的に解析する際，一次元 SDSPAGE では全てのタンパク質を分離することは困難であるため二次元電気泳動が行われる．本項では，一次元目に等電点電気泳動，二次元目に SDS-PAGE を用いた二次元電気泳動のプロトコルを紹介する．

Two-dimensional electrophoresis
M asakazu Iwai, Jun M inagawa
Two-dimensional electrophoresis (2DE)based on two different principles has been employed to separate many
proteins. In this chapter, we describe a protocol for 2DE with isoelectric focusing (IEF) and SDS-PAGE ofsolubilized thylakoid membranes of C. reinhardtii.

shino et al.（2007) を参照されたい．

6.d‑1.1 背景
通常の一次元 SDS-PAGE ではバンドが重なり分離されないタンパク質も，二次元電気泳動（2DE）を行うことで分離できる可能性が高まる．一次元目の電気泳動に等電点電気泳動（IEF），二次元目の電気泳動に SDS-PAGE

6.d‑1.2 プロトコル (Hippler et al.,2001 を改変）
6.d‑1.2.1 試薬が使われることが多い．光合成研究では BN-PAGE を一可溶化バッファー次元目に行う方法も見られる．注意する点は，異なる機

2M thiourea

1.5g/10mL会に得られた二枚の 2DE ゲルのタンパク質の量を比べ

8M urea

4.8g/10mLることが難しい点である．また，一次元目にのせるタン

4％(w/v)CHAPS 0.4g/10mL

パク質の量には限界があり，分離されたとしても少量の20mM Tris-base 24.2mg/10mL

タンパク質であると CBB 染色では染まらないことが多30mM DTT

い．そのためしばしば銀染色が行われるが，銀染色は定0.5％(v/v)IPG buffer(GE Healthcare）

量性に乏しく，同一ゲル上であってもタンパク質の量を46.2mg/10mL
50μL/10mL（pH の幅に注意)

比べることはできない（この点を改善した染色法として0.05％ β-DM

25μL of 20％ DM /10mL

Flamingo 染色が知られる．）このため，2DE は定性的なOrange G 微量/10mL

解析手段として用いられることが多い．最近，異なるタ
ンパク質サンプル（例えば，ストレス前と後）を異なる

平衡化溶液Ａ

蛍光染色でラベルし，それを混合し一枚の 2-DE ゲルで（※ Immobiline DryStrip 1本につき 5mL 必要）

展開する方法も行われるようになった（2D-DIGE）．本稿

50mM Tris(pH 6.8/HCl）

では，緑藻クラミドモナスのチラコイド膜を 2DE で展開

6M urea

し，質量分析で LHC タンパク質の同定を行った例を示

30％(v/v)glycerol

す．一次元目は等電点電気泳動，二次元目は SDS-PAGE

2％(w/v)SDS

を 行 う．疎 水 性 の 高 い PS2 の コ ア タ ン パ ク 質 は Im-

2％(w/v)DTT

mobiline DryStrip に浸透しないなど，必ずしも目的タ
ンパク質が展開されるとは限らない点に注意が必要であ

平衡化溶液Ｂ

る．PS2 コアタンパク質を IEF で分離する方法は Ka-（※ Immobiline DryStrip 1本につき 5mL 必要）
50mM Tris(pH 6.8/HCl)

１) 北海道大学低温科学研究所

2009 低 温 科 学

vol.67

6M urea381

30％(v/v)glycerol
2％(w/v)SDS
2.5％(w/v)iodoacetamide
bromphenol blue 微量
6.d‑1.2.2 装置など
M ultiphor II（GE Healthcare）

６．Immobiline DryStrip のゲル面を下にして，サンプ
ル溶液が入ったトレーの溝にゆっくりと置く．Stripのゲルが溶液に完全に浸たるように注意する．
７．サンプル溶液の蒸発と urea の結晶化を防ぐため
Strip の上を 2〜3mL のシリコンオイルで覆う．
８．トレーの蓋をし，12時間室温で放置する．

Immobiline DryStrip（適した pH range を選択)
IPG Buffer（適した pH range を選択）

２日目（一次元目の電気泳動：等電点電気泳動）

Immobiline DryStrip 膨潤トレー

１．Multiphor II の冷却プレートを 15℃に設定．

Immobiline DryStrip アライナー

２．冷却プレートの上に 2〜3mL のシリコンオイルを等電点泳動トレー

のせ，等電点泳動トレーをその上に置く．プレートと等電点電極（陰極・陽極）

トレーの間に空気が入らないように注意する．

等電点用電極ろ紙（5x 20mm）

３．12〜15mL のシリコンオイルをトレーの上にのせ，

シリコンオイル

Immobiline DryStrip ア ラ イ ナーを ト レーの 上 に 置

SDS-PAGE 用スラブ

く．トレーとアライナーの間に空気が入らないように

2DE 用コーム（下図）注意する．
４．膨潤済みの Strip をアライナーの溝に置く．ゲル面

１日目（Immobiline DryStrip の膨潤）
１．タンパク質サンプル中のポリペプチドをクロロフォ
ルム・メタノール法 により沈殿させる．これにより色素を除き，その電荷が等電点電気泳動に影響するのを防ぐことができる．
２．Immobiline DryStrip（11mm）
一本につき，０〜100
μg protein のポリペプチドサンプルを 230μL の可溶化バッファーで可溶化するため，室温で１時間イン
キュベートする．
３．可溶化サンプルを 9,000g ５分間遠心する．
４．200μL の上清を分取し，IPG buffer を 1μL 加え
る．※加えるバッファーの pH 幅に注意．
５．上記サンプル溶液 200μL を膨潤トレーの溝に添加する．

は上．Strip の＋側と−側に注意する．
５．等電点用電極ろ紙を水で適度に湿らせる．
６．湿らせたろ紙を Immobiline DryStrip の両端の上に置く（ゲルの両端から 3mm 幅分を重ねれば充分）
７．陽極線と陰極線を湿らせたろ紙の上にセットする．
８．120〜150mL のシリコンオイルをトレーに静かに注ぐ．
９．トレーの電極を M ultiphor II の泳動槽に接続し，Multiphor II のフタを閉める．
10．300V/1mA/5W で 一 時 間 泳 動 後，1400V/1mA/
5W で 19時間泳動を行う（合計 20600Vh）．等電点電気泳動の場合，泳動時間の超過はさほど問題にならない．最初の一時間泳動後，Orange G が流れているのを確認する．
３日目（二次元目の電気泳動：SDS-PAGE）
１．一次元目終了後，Immobiline DryStrip を取り出し，フィルム側についているシリコンオイルを拭っておく．
２．取り出した Immobiline DryStrip は試験管などに入れる．
二次元目を当日にやらない場合は，−80℃で保存する．
３．試験管に平衡化溶液Ａを加え，15分間インキュベー
トする．
４．Strip を取り出し，ゲルに触れないようにフィルム

図 1：クラミドモナス葉緑体タンパク質の２次元電気泳動（IEF を一次元目（横方向，SDS-PAGE を二次元目（縦方向）
に行った．

382

側の平衡溶液Ａをキムワイプなどで吸い取る．
５．平衡化溶液Ｂが入った試験管に Strip を入れ，10分
間インキュベートする．
二次元電気泳動

６．2DE 用コームを使って，ゲルを作っておく
７．スタッキングゲルの上に Strip を挟み込む．

参考文献

８．通常通りに電気泳動を行う．この時，マーカーや一

１) Y.Kashino,Y.,T.Harayama,H.B.Pakrasi,K.Satoh,次元目の等電点電気泳動で使用したサンプルを横に同

J.Chromatogr. B 849 (2007)P.282.
２) M .Hippler, J.Klein, A.Fink, T.Allinger, P.Hoerth,

時に流しておくと良い指標となる．

Plant J.28 (2001)P.595.
３) D.Wessel, U.I.Flugge, Anal. Biochem. 138 (1984) P.
141.

2009 低 温 科 学

vol.67383

３章 単離・精製・活性測定

６．タンパク質
d‑2．ショ糖密度勾配超遠心法
岩井 優和 ，皆川光合成反応は，光化学系

純
，光化学系

を始め，いくつものタンパク質複合体，あるいはタンパク質

超複合体によって行われる．
「ショ糖密度勾配超遠心法」は，これらの複合体を大きさによって分画す
る場合に広く用いられている．本項では，緑藻クラミドモナスの葉緑体上の光化学系複合体を例に取り，ショ糖密度勾配超遠心法のプロトコルを紹介する．

Sucrose density gradient ultracentrifugation
M asakazu Iwai, Jun M inagawa
Sucrose density grandient ultracentrifugation has been widely used to separate pigment-binding protein (super)complexes on the photosynthetic membranes. In this chapter, we describe a standard protocol for sucrose
density gradient ultracentrifugation of the C. reinhardtii thylakoid membrane proteins.

カーを使うのが一般的だが，以下に示すステップグラジ

6.d‑2.1 背景

エントを用いる方法は，より簡便で多くの場合良好な結密度勾配を形成したショ糖溶液上に混合物からなるサ果が得られる．扱うサンプルによってバッファー組成はンプルを重層し超遠心を行うことで，様々なタンパク

異なるが，ここではチラコイド膜から LHCII，光化学系

質・タンパク質複合体粒子，さらにはさまざまなオルガ

１超複合体，光化学系２複合体を分離する方法を示す．

ネラを分画することができる．粒子の沈降速度は沈降係数（粒子の比重，形，質量などによって決定される）に

１．1.3M ，1.0M ，0.7M ，0.4M ，0.1M のショ糖を依存するのに対し，平衡に達した地点での沈降距離は粒含むバッファー（25mM M ES，pH 6.5/NaOH）を各子の比重に依存する．そのため，光化学系タンパク質複2.2mL ずつ，遠沈管の数だけ用意する．

合体や LHC タンパク質など比較的近い比重を持つ粒子
を分子量の違いによって分離するには，平衡に達するま２．界面活性剤（β-DM ）を終濃度 0.05％になるように各バッファーに添加する．

での間の沈降速度の違いを利用してバンドを形成させる

３．まず，2.1mL の 1.3M バッファーを遠沈管に入れ（rate zonal centrifugation）．一方，オルガネラを分画す

る．この時，ピペッティングで，空気の泡を水面につる場合は，平衡に達するまで遠心し，密度の違いを利用くる．その泡がクッションの役目となり，次の 1.0M

してバンドを形成させる（isopycnic centrifugation）．こバッファーの重層が容易になる．

の方法で得られたタンパク質複合体試料は比較的無傷に

４．同様に，1.0M ，0.7M ，0.4M ，0.1M の順にバッ保たれるため，ゲルろ過などの各種クロマトグラフィー

ファーをゆっくりと重層する．
（このようにして作成しや結晶化に用いるのに適している．ショ糖以外にはグリたステップグラディエントは，超遠心後はリニアグラ

セロールの密度勾配を用いる場合があり，例えば PSII

ディエントとなる．
) 完成したショ糖密度勾配溶液はコアの dimer と monomer を分離することができる ．

４℃で保存する．
５．精 製 し た チ ラ コ イ ド 膜 を 25mM M ES，pH 6.5/

6.d‑2.2 プロトコル
ここでは日立超遠心スイングローターP40ST と専用
遠沈管 13PA チューブ（13mL）を使用した場合を例に取り解説する．グラジエントは市販のグラジエントメー

NaOH で２度洗浄したのち，終濃度 0.8mg Chl/mLになるよう希釈する．
６．チラコイド膜懸濁液に β-DM （終濃度 0.8％）を加え，撹拌しながら４℃で 10分間可溶化する．
７．可溶化したチラコイド膜（0.3〜0.5mL）を 4.で作成したショ糖密度勾配に重層し，超遠心（100,000g ，

１) 北海道大学低温科学研究所

2009 低 温 科 学

vol.6724時間）を行う．
385

８．超遠心後，遠沈管の底にシリンジで穴を開け，溶液をチューブや 96穴プレートに分画する．
少数のバンドのみを回収する場合は，上からシリンジなどで吸い出してもよい．通常，上から LHCII（A 1バンド），PSII
コア粒子（A 2バンド），PSI-LHCI 超複合体（A 3バンド）の緑色の３本のバンドが得られる（図 1）．

参考文献
１) I.Sakurai, J.-R.Shen, J.Leng, S.Ohashi, M.Kobaya-

図 1：クラミドモナスより単離したチラコイド膜を可溶化
し，ショ糖密度勾配超遠心により３つの複合体に分離した（Ref. 2 を改変）．

shi, H.Wada, J.Biochem. 140 (2006)P.201.
２) H.Takahashi, M .Iwai, Y.Takahashi, & J.M inagawa, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006)P.477.

386

ショ糖密度勾配超遠心３章 単離・精製・活性測定

６．タンパク質
e．タンパク質の質量分析
小澤真一郎 ，井上(菓子野)名津子 ，高橋裕一郎
光合成生物のゲノム解析の進展と質量分析計の進歩により，微量の光合成タンパク質の解析が容易になった．本章では，二次元電気泳動法で分離したタンパク質を質量分析計で同定する方法について紹介する．

Characterization of photosynthetic proteins by mass spectrometryShin-ichiro Ozawa, Natsuko Inoue-Kashino, Yuichiro Takahashi,
Combination of genomic information of photosynthetic organisms and mass spectrometric analyses enables one
to identify a large number of proteins and polypeptides separated by one-or two-dimentional SDS-PAGE. In
this chapter, we introduce principles and methods of mass spectrometric analyses of proteins.

6.e.1 質量分析の原理
質量分析計は，ポリペプチドをイオン化し，質量対電体 ク ロ マ ト グ ラ フィー（nano LC, nano Liquid
chromatography）と組み合わせ，LC-MS として使用することが多い．

荷比（mass-to-charge ratio,m/z）を実測する．イオン

イオントラップ型質量分析計では，質量分析装置内で化手法として，MALDI（M atrix-assisted laser desorp-ペプチドを開裂させ，アミノ酸配列の情報を得ることがtion/ionization）と ESI（Electrosprayionization）が一できる．ペプチドイオンをイオントラップ部に導き，ヘ

般的に用いられる．ESI の中でも，感度を上げるためにスリウムなどの化学的に安定なガス中で振動エネルギーをプレーを微少にしたものを NSI（Nano-spray ioniza-

加え互いに衝突させペプチドイオンを開裂させる（CID,tion）という．正電荷のイオン化を促進するため，ギ酸や．ポリペプチド結合を開Collision Induced Dissociation）

TFA（トリフルオロ酢酸）を溶液に加える．MALDI で裂するようにエネルギーを調節して，N 末端側の b イオ

はまずマトリックスとサンプルとで結晶を作る．そこにンと C 末端側の yイオンを得る（図 1）．開裂前のイオン

パルスレーザーを照射することで，マトリックスが速やを前駆体イオン（Precursor ion），開裂の結果生じたイ

かに昇華しペプチドにエネルギーが伝達され，イオン化

オンをプロダクトイオン（Product ion）という．図 1をする．ESI（NSI）ではペプチドを含んだ溶液を霧状に放例にとると，一度の開裂，すなわち M S/MS，により b イ

出させ，高電場下で溶液を蒸発させ，正電荷にイオン化

オンと yイオンがそれぞれ３種類（ペプチド結合の数とされたペプチドを得る．

一致する），合計６種類のプロダクトイオンが生じる．こイオン化した物質の分析法には，加速器内の一定距離の一連の測定によって得られた前駆体イオンとプロダクを飛行する時間を測定する TOF（Time of flight，飛行

トイオンの質量のデータ一揃いと，データベースに登録時間）法や，磁場中における荷電粒子の挙動を利用するされているタンパク質をトリプシンで消化したペプチド

イオントラップ（Ion trap）法，四重極（Quadropole）（前駆体イオンに相当する）とそこから生じると予測され法が利用される．一般に，イオントラップや四重極法はるプロダクトイオンの質量のデータ一揃い，を比較する

精度で TOF 法に劣るが，データの S/N が高い．市販さことによってポリペプチドを同定する．M S/MS では前れている製品は M ALDI でイオン化し TOF で分析する

駆体イオンとプロダクトイオンの情報を組み合わせてア

M ALDI-TOF/MS や，NSI でイオン化しイオントラッ

ミノ酸配列情報を得るので，少ないタンパク質の消化断

プと四重極で分析するハイブリッド型 NSI-M S などが片からでも高い信頼性でタンパク質を同定できる．
また，ある．MALDI-TOF/MS は単独で使用する例が多いが，タンパク質の同定だけではなく化学架橋剤を利用した架NSI-M S は数十nl/min で送液することができるナノ液

橋部位の特定 にも用いられる．
特別に高性能な質量分析計は別として，タンパク質の

１) 岡山大学大学院自然科学研究科

2009 低 温 科 学

vol.67

同定には既存のデータベースを参照するので，正確で信387

図 1：M S/MS によるアミノ酸配列の同定．
質量分析装置内でポリペプチド結合を開裂させ，前駆体イオンからプロダクトイオン（b イオンと yイオン）を得る．ここに示す
ように，４残基を含むポリペプチド（R R R R ）からは６種類のプロダクトイオン（b ,b ,b ,y ,y ,y ）が生成される．

頼性の高いタンパク質データベースが必要不可欠であいタンパク同士を分離するには pH 範囲の狭いものを，る．

それぞれ選択する．
二次元目の SDS-PAGE の後，分離されたタンパク質

6.e.2 二次元電気泳動で分離したタンパク質の質量分析を染色し，スポットを切りだしてトリプシンなどのタンパク質分解酵素によりゲル内消化を行う．得られたペプ
チドの質量を質量分析計で求め，ゲノム情報と照合しタ質量分析計は感度が高いので，タンパク質を精度よくンパク質を同定する．表 1にまとめたタンパク質検出法

同定するには，可能な限り精製して混合物を除いておくのうち，感度の高さ，脱色のしやすさ，そして肉眼でスと良い．特に網羅的な解析には，多種類のタンパク質を

ポットを確認できる簡便さから銀染色がよく用いられ高分解能で分離することができる二次元電気泳動法が良る．

く用いられる．ここでは等電点電気泳動後に二次元目の SDS-PAGE を行いスポットとして分離したタンパク質を質量分析で同定する手法を紹介する．
等電点電気泳動法とは，両性担体（キャリアアンフォ

6.e.3 脂質除去処理
チラコイド膜など脂質を多く含むサンプルを等電点電ライト）を含む泳動ゲルに高電圧をかけて pH 勾配を形

気泳動にかける場合は，脂質除去

成し，タンパク質の等電点（pI）によって分離する手法でロフォルムは，クロロフォルムと水をマイクロチューブ

ある ．等電点電気泳動による膜タンパク質の分離は一に取り，ボルテックスした後静置して，下層に分離して般に難しいとされているが ，変性剤濃度や緩衝液系の使う．

最適化やゲルの支持体にアガロースを使用するなど様々

１．サ ン プ ル 100μl に メ タ ノール を 400μl 加 え ボ ル

な工夫がされている．等電点電気泳動は，現在ではプレキャストのゲルストリップ（Immobilized pH gradi-を行う．水飽和クロ

テックス後，21,500g で 10秒間遠心し上清を回収する．

ent gel strip；IPG，GE Healthcare や Bio-Rad）を使

２．１で回収した上清に水飽和クロロフォルムを 100μl

うのが一般的である．さまざまな pI 値のタンパク質を分加えボルテックスし，21,500g で 10秒間遠心後，上清

離するには pH 範囲の広い（pH 3‑11）ものを，pI 値の近を回収する．

388

光合成タンパク質の質量分析

表 1：質量分析で使われるタンパク質検出法
検出法

感度

定量性

検出までに要する時間

検出装置

CBB 染色
銀染色

△

○

２時間程度

必要なし

◎

×

２時間程度

必要なし

蛍光色素染色

○

◎

５時間程度

蛍光スキャナー

CyDye

○

◎

泳動直後

蛍光スキャナーCBB 染色は感度が劣るが手軽に検出できる．しかし，質量分析前の脱色に時間がかかる欠点がある．蛍光色素染色は感度と定量性に優れ，質量分析サンプル調整前の脱色が不要だ
が，検出に蛍光スキャナーが必要である．CyDye は泳動前にタンパク質を蛍光色素でラベルするので泳動終了後直ちに検出できるが，まだ一般的ではない．銀染色は定量性に劣るものの，比較的短時間に十分な感度でタンパク質を検出できる．蛍光色素染色後の二重染色も可能であり，分析前の脱色も容易なので質量分析では最もよく使われる．

３．水を 200μl 加えボルテックスし，21,500g で１分間遠心する．
４．この遠心により二層に分配された液層の中間に分離

6.e.5 アガロースゲルを用いた等電点電気泳動

されるタンパク質を吸わないように上の相（水相）を泳動ゲルにポリアクリルアミドを使う IPG ゲルスト除去する．そして下の相（有機相）にメタノールを 300

リップでは，疎水性タンパク質の分離は芳しくない．しμl 加えボルテックスし，21,500g で２分間遠心する．

かし，ポリアクリルアミドよりも大きな分子櫛を持つア

５．上清を除去し，沈殿に 95％(v/v）メタノールを 500

ガロースを使うことで，疎水性タンパク質をきれいに分

μl 加えボルテックスし，21,500g で２分間遠心する．

離できる等電点電気泳動法が最近開発された ．ディス６．ステップ５をもう一度行い，沈殿を遠心濃縮機で乾ク泳動用のキャピラリー管にゲルを作成し，ディスク泳

燥させる．

動装置で泳動する．アガロースは等電点電気泳動用を使７．11cm 長 IPG ゲルストリップを使う場合は 120μlの水で懸濁し，次に示す膨潤液を調製する．

い，ゲル化と泳動は４℃で行う．
１．ディスク泳動用のキャピラリー管からアガロースゲ
ルを取り出しやすくするため，1ml サイズのピペット

6.e.4 Immo bilized pH g radient g els trip(IP G )を用いた等電点電気泳動
ここでは 11cm 長 IPG ゲルストリップの場合を紹介

バルブをキャピラリー管の一端に取り付け，シグマ
コート（Sigma）の吸引・吐出を数回繰り返し，その後立てかけて乾燥させ，内壁をコーティングする．
２．2cm 角の透析膜（dialysis membrane,size 27(cut-する．

off size〜14,000），和光）を水で数回洗い，キャピラ

１．膨潤液｛サンプル 120μl に，以下の試薬を加え，水リー管の一端に透析膜を密着させ，短いゴム管で固定で 200μl に合わせる．尿素 0.096g(8M ），チオ尿素

しパラフィルムを巻く．キャピラリー管先端に取り付

0.031g(2M )，10％(w/v)DDM 20μl(1％(w/v)，イ

けた透析膜は，泳動中も外さない．

ソプロパノール 30μl(15％(v/v）），1M DTT 5μl(25３．サンプルとゲル溶液を混ぜてゲルを作成する．サン

mM ）， IPG buffer 4μl(2％(v/v）），0.1％(w/v)

プルを後からロードする場合は，キャピラリー管上部｝をゲルストリップに
Orange G 4μl(0.002％(w/v））に 5mm ほど残してゲルを作成し，手順６で管をセッかぶせ，専用のミネラルオイルで封入する．

トしてからサンプルをロードする．2.5mm x 7mm

２．20℃，50μA/ストリップ，10時間で膨潤させる．

x 130mm（内径 x 外径 x 長さ）のキャピラリー管４本

３．等電点電気泳動を行う．15分間 300V，30分間 500分の場合，20ml の三角フラスコに，ソルビトール 0.48

V，60分間 1000V，７時間 3000V，７時間 8000V，のg，等電点電気泳動用アガロース 0.04g，純水 2ml を順に，段階的に電圧を上げ，泳動終了後は 300V を維

入れ電子レンジでアガロースを完全に溶解させる．手持する．

早く尿素 1.2g とチオ尿素 0.6g を加え，撹拌する．室
温まで温度が下がったら撹拌しながら，20％(w/v)
DDM を 200μl，Pharmalyte（キャリアアンフォライト）を 400μl，1M DTT を 8μl，サンプルを 20μl，の順に加える．
｛0.66M ソルビトール，1％ DDM ，5M

2009 低 温 科 学

vol.67389

尿素，2M チオ尿素，2mM DTT，10％ Pharmalyte，1％ アガロース｝．
４．1mL シリンジの先端にキャピラリー管よりも細い
テフロンチューブを取り付け，チューブ先端をキャピ
ラリー管の一番奥まで差し込んで，液面の上昇に合わせてチューブ先端を引き上げながら気泡ができないよ
うにゲル液を注ぎ込む．
５．４℃で 15時間以上かけてゲル化させる．
６．下部泳動槽に陽極液｛680μl リン酸（85％）/1000ml｝
を入れ，キャピラリー管をセットする．
７．泳動槽上部に陰極液｛0.2M NaOH｝を入れる．
８．50V で 30分間，100V で 30分間，300V で約 24時
間，４℃で泳動する．
９．ゲルの温度を十分に下げるため，泳動終了 30分前に電圧を 50V に下げる．

6.e.6 S D S -P AG E

図 2：二次元電気泳動ゲルのコーム
二次元電気泳動では，一次元目の IPG ゲルを載せるために特殊形状のコームを利用すると便利である．一次元目のゲルを載せたときに二次元目のゲルとの間に𨻶間が生じないように，ウェルの深さをゲルの幅に合わせるように濃縮ゲルを作成する．

0.00044％(w/v）BPB（1％ ストックより調製））にゲ

二次元目の SDS-PAGE は，6a 章に述べられた方法を

ルストリップを 15分間漬け，平衡化する．平衡化中に用いる．分析するタンパク質の性質（サイズ，膜タンパ

0.5％(w/v）アガロースゲル溶液（核酸泳動用．溶媒はク質であるか水溶性タンパク質であるかなど）により電

水．
）を準備する．

気泳動システムを選択する．一次元目の電気泳動で分離４．ゲルストリップを二次元目の濃縮ゲルとの間に空間したタンパク質に SDS と SH 基還元剤を加えて変性さが空かないように SDS-PAGE 上に載せ，0.5％（w/v）

せる．この時，メルカプトエタノールを還元剤として用いると，システイン残基が不可逆的な架橋産物（分子質量が 75.998Da 増加する）を形成するので，SDS-PAGEの還元剤には DTT を使う．

アガロースゲル溶液で封入する．
５．二次元目の電気泳動を行う．
等電点電気泳動にアガロースゲルを用いた場合の二次元目の電気泳動．

等電点電気泳動を一次元目に行った場合，二次元目の等電点電気泳動にアガロースゲルを用いた場合では，

SDS-PAGE の濃縮ゲルは特殊形状のコームを使って作IPG ゲルストリップのようにプラスチック板が付いて成すると良い（図 2）．端のウェルに分子量マーカータン

いないので壊れやすい．このため一次元目のゲルを二次

パク質を泳動すれば，分離されたタンパク質スポットの元目の濃縮ゲル上にキャピラリー管から直接押し出す．

分子質量を求めることができる．

アガロースゲルと濃縮ゲルの間に𨻶間を作らないため

等電点電気泳動に IPG ゲルストリップを用いた場合の二次元目の電気泳動．

る．

１．ゲルストリップを取り出す．
２．2.5ml の平衡化液 A｛50mMに，二次元目のゲルは濃縮ゲルをゲル板の上端までつく
１．封入用アガロースゲル｛0.8％(w/v)低融点アガロー

Tris-HCl pH 8.8

ス（核酸用），10％(v/v)SDS-PAGE 用変性液｛40mM(25℃)（1M ストックより調製），6M 尿素，30％(w/v)

DTT，5.2％(w/v)LDS，172mM Tris-HCl pH 6.8，
glycerol，1％(w/v）SDS（20％ ストックより調製）(25℃），0.5M sucrose，0.01％ BPB｝，電子レンジで16μM DTT（1M ス トック よ り 調 製），0.00044％(w/v)BPB（1％ ストックより調製）｝にゲルストリッ
プを 15分間漬け平衡化する．

作成｝を準備する．
２．キャピラリー管を泳動装置から取り出し，透析膜を外す．

３．2.5ml の 平 衡 化 液 Ｂ｛50mM Tris-HCl pH 8.8

３．キャピラリー管の一端に 1ml サイズのピペットバ(25℃)（1M ストックより調製），6M 尿素，30％(w/v)

ルブをつけ，アガロースゲルを二次元目の濃縮ゲル上，
glycerol，1％(w/v）SDS（20％ ストックより調製）に押し出す．

4.5％(w/v）Iodoacetamid（使用直前に調製する），
390

４．封入用アガロース液を注ぐ．溶液の温度が高すぎる
光合成タンパク質の質量分析

と等電点アガロースゲルが溶けるので注意する．
５．二次元目の電気泳動を行う．

6.e.7 銀染色
SDS-PAGE が終了したら，タンパク質を銀染色で検出する．
通常の銀染色法で用いるグルタルアルデヒドは，
タンパク質を化学架橋するので，質量分析が目的の場合は使用しない．高感度な染色法なので，必ず手袋を装着して行う．使用する水は蒸留水または超純水を用い，固定液以外の溶液は必ず使用直前に調製する．ここに示す
液量は 15cm x 15cm の容器を基準としている．
１．100ml の固定液｛40％(v/v）メタノール，10％(v/v)
酢酸｝
で 30分間振盪しゲルを固定する．この状態で中断することができる．

図 3：二次元電気泳動による膜タンパク質の分離
クラミドモナスの膜タンパク質を多く含むサンプルを分離した後，スポットを銀染色した．左のレーンはタンパク質分子量マーカーである．

２．固定液を捨て，水で 10分間振盪しゲルを洗浄する．
３回繰り返す．
３．100ml の 0.02％(w/v)Na S O で 1分間振盪する．
４．水で 10分間振盪しゲルを洗浄する．３回繰り返す．
この洗浄操作が不十分な場合，硝酸銀溶液を加えたときにバックグラウンドが茶色に着色する．

6.e.8 タンパク質のゲル内消化(In-g el dig es tio n）
ゲル内消化では一般的にトリプシンを使うが，Arg 残基で化学架橋した産物を同定するための質量分析には，

５．100ml の 0.2％(w/v)AgNO でゲルを 30分間振盪

Lys-C や V8 protease を使うこともある ．還元されたする．使用済みの硝酸銀溶液は別個に廃液入れを用意

システイン残基が再酸化されないようにヨードアセトア

し，塩酸を加えて塩化銀の粗大沈殿を生じさせる．後ミド処理をする（カルボキシアミドメチルシステインと日，廃液の上清をろ過し，低 pH 廃液として処分する．

なり質量が 57.022Da 増加する）こともある ．しかし，６．５の間に発色液｛３％(w/v)Na CO ，0.05％(v/v)

この操作を省略しても質量分析に問題はほとんど生じな

HCHO｝を 250ml 調製し冷やしておく．

い．水は超純水を使い，使用する溶液のうち，ストッ７．発色操作のとき，容器の下に白い紙を敷くと，発色

ク溶液以外は必ず使用直前に調製する．作業には手袋をしてくるタンパクを視認しやすい．廃液入れを二つ着用し，使用するチップ・チューブはオートクレーブし（Ａ，Ｂ）用意する．硝酸銀溶液を廃液入れＡに捨てる．

ない．1.5ml のチューブを使用する例を示すが，非常に水を 100ml 注ぎ，ゲルが容器の底面につかないように

小 さ い ゲ ル 片 を 取 り 扱 う 場 合 は 0.2ml や 0.5ml の容器を振盪させてゲルを軽くすすぎ，廃液入れＡに捨チューブを使うこともある．ステップ 1，5，は−80℃で，てる．この操作をもう一度繰り返す（洗いすぎると発７は乾燥した状態で，それぞれ操作を中断することがで色しなくなるので注意する）．発色液を入れ，ゲルを底きる．

面につけることなく容器を振盪させ，常に発色液をか

１．100％エタノールで刃を洗浄したのち，ゲルからバン

くはんさせる．目的とするタンパクが検出されたら使ド・スポットを切りだし，ゲル片が大きいときは一辺用済みの発色液を廃液入れＢに捨て，速やかに次のス

1〜2mm 程度の立方体２，３個にする（図 4A）．

テップに移る２．水 500μl を加えボルテックスし，水を捨てる．４回

８．150ml の固定液を加え５分間振盪して発色反応を
停止する．

繰り返す
３．銀染色液脱色液 30mM K Fe(CN) と 100mM

９．酢酸臭がなくなるまでゲルを水洗する．４℃でゲルを水中に保存可能だが，時間経過に伴いコントラストが失われていくので注意する（図 3）．

Na S O を等量混合させる． を 100μl 加え，８分間静置する．
４．脱色液を捨て，水 500μl を加えてボルテックスし水を捨てる．
５．４を４回繰り返す．４回で不十分な場合はゲルが無2009 低 温 科 学

vol.67391

える．調製後は冷蔵保存し２週間程度で使い切る． をゲル片に各 10μl 加え，氷上に 20分間静置する．
12．余分なトリプシン溶液を除き，30μl の 50mM NH
HCO を加える．
13．30℃で 15分間イン キュベート 後 37℃で 16時 間 イ
ンキュベートする．
14．50mM NH HCO を新しいチューブに移し，ACN
溶液（ACN：水＝3：2，(v/v)）を 20μl 加えて 21,500
g，25℃で 20分間遠心する．微少なゲル片を吸わないように上清を回収後，さらに ACN 溶液 ACN：水＝3：2，(v/v） と ACN を各 10μl ずつ加え，21,500g，25℃で 25分間遠心し，上清を回収する．
15．14で回収した上清が完全に乾固するまで遠心濃縮機で乾燥させる（１時間程度）．
16．分析まで−80℃で保存する．
固相カラムによる精製
LC-MS/M S の場合，トラップカートリッジが装着されている機器では精製は必要ない．
１．乾固させたサンプルに溶液 2 アセトニトリル２％(v/v)，TFA 0.1％(v/v) を 30μl 加え，ボルテックス
図 4：ゲル内消化前後のゲル片の様子
Ａ；切り出したゲル片．一辺 1mm 程度の立方体２，３個に切りそろえておくと作業しやすい．Ｂ；遠心濃縮機によって乾燥したゲル片．白く小さいゲル片になっている．この状態は静電気によって飛びやすいので注意する．

する．
２．微量遠心機で５分間最高回転数で遠心して，沈殿した微少なゲル片を吸わないようにして上清を 25μl 回
収し，バイアルに入れ，オートサンプラーにセットする．

色になるまで繰り返す．

しかしながら，LC-MS/M S のラインやカラムは非常

６．アセトニトリル（ACN）溶液（ACN：水＝3：2，に細いので，微少なゲル片の混入は機器の不具合を起こ(v/v)）を 500μl 加えボルテックス後 20分間静置す

すこともある．遠心分離による微粒子除去が技術的に難る．

しい場合はスピンカラムを使うこともある（ペプチド低７．溶液を除去して遠心濃縮機で乾燥させる（20分間程

吸着タイプのメンブレンで，孔径は 0.2μm）
が，ここで

度）
．白く小さくなって，ゲル片が十分に乾燥しているは固相カラム C-TIP（AMR,Japan）による精製例を紹かを確認する．乾燥したゲル片は静電気により飛びや介する．M ALDI-TOF/MS では塩類の混入が分析に影すいので注意する（図 4B）．

響するので，固相カラムによる精製は必要である．

８．50μl の 50mM NH HCO （1M ス トック よ り 調製）を加え 10分間静置する．

１．C-TIP (規格 10μl）を 1.5ml チューブに入れる．
２．洗浄のために，C-TIP の上側から溶液 1 アセトニ

９．50mM NH HCO 溶液を除去する．除去した体積

トリル 90％(v/v)，TFA 0.1％(v/v) を 10μl 注ぐ．

を記録し，減少した体積から必要なトリプシン溶液の

３．C-TIP を 2,000g で 15秒間遠心する．溶液１がチッ

体積をあらかじめ把握する．
10．６から９をもう一度繰り返したあと，６から７を行
う．
11．トリプシン溶液 60ng trypsin/μl 溶液．sequencing

プ先端から流れ出ることを確認する．
４．溶 液 2 ア セ ト ニ ト リ ル ２％(v/v)，TFA 0.1％(v/v) でステップ２と３を行い，C-TIP 先端のカラ
ムを湿潤状態にする．

grade, modified trypsin, Promega(cat. V5111)20

５．C-TIP を入れているチューブを新しいものに替え

μg/vial に，40μl の trypsin resuspension buffer（トて，2,000g で 10秒間遠心してカラムの上に液が残らリプシンに付属）と 293μl の 50mM NH HCO を加ないようにする．

392

光合成タンパク質の質量分析

６．溶液２で懸濁したサンプル溶液を２の方法で注ぐ．

出する．ペプチドの種類が少なく検出限界近くの濃度でカラムの上から液がなくなるまで 500g で遠心してサある場合はアセトニトリルの濃度溶液の勾配をきつくしンプルをカラムに吸着させる．

て 短 時 間 で 溶 出 す る．溶 液 A ア セ ト ニ ト リ ル 2％

７．洗浄のために溶液２をステップ２の要領で C-TIPの上側に注入し，2,000g で 15秒間遠心する．

(v/v)，ギ酸 0.1％(v/v） と溶液 B アセトニトリル 90％(v/v)，ギ酸 0.1％(v/v） を使う場合をここに紹介する．

８．７をもう一度行い，C-TIP を入れているチューブを比較的短時間な 35分間の溶出では，B 溶液の濃度を新しいものに替えて，2,000g で 10秒間遠心してカラ5％から 75％まで 20分間かけて上げ，その後一気に 95％

ムの上に液が残らないようにする．

まで上げて５分間維持し，5％に戻す．比較的長時間な 60

９．ステップ２の要領で，溶出のために 10μl の溶液１を C-TIP に注入する．
10．500g で約 10秒間遠心して溶出させる．

分間の溶出では，
B 溶液の濃度を 5％から 95％まで 50分
間かけて上げ，その濃度で５分間維持し，5％に戻す．
MALDI-TOF/MS の場合は，サンプルとマトリック

11．濃縮遠心機で乾固させる．

スを混和させて作った結晶をパルスレーザーで撃つ．分

12．NSI-M S/MS では溶液２に懸濁しバイアルにセッ析時間は１スポットあたり数分以内だが，LC-MS/MS

トする．M ALDI-TOF/MS では，0.1％(v/v）
TFA 溶と異なり，多数のタンパク質が様々な濃度で混在してい液に懸濁しマトリックス溶液 様々なマトリックスがる場合や低分子質量の夾雑物が多い場合，ペプチドが一あるが，ここでは一例を挙げる．2mg（α-cyano-4-

本しか存在しない場合は，タンパク質の同定が難しい．

hydroxy-cinnamicacid）を，超音波などを使って 100に完全に溶解μl の 50％(v/v)ACN，0.1％ TFA(v/v）

データ解析（図５）

させる．飽和溶液なので沈殿が少し残る． と混和させ市販の解析ソフトを使うのが一般的である．購入が難ターゲットプレート（金属製）の所定スポット上に結しい 場 合 は，データ を 抽 出 し て Web サ イ ト（http://

晶を作る．

www.matrixscience.com/や http://prospector.ucsf.
edu/）で解析するか，自作サーバー上で解析する．

分析例

解析ア ル ゴ リ ズ ム は M ASCOTと SEQUEST

LC-MS/MS の場合，カラムから分離されるペプチドがよく使われる．MASCOT を使った解析では得られたを連続的にイオン化し分析する．ペプチドの種類が多く

質量の情報を網羅的に検索し，結果は P(Probability）と検出に十分な濃度である場合やリン酸化部位を同定するいう確率で表される．SEQUEST を使った解析ではシグ

場合は，取得する情報を増やすために LC の溶出溶液のナル強度の情報も加味して，X-corr(cross correlation)

アセトニトリル濃度の勾配をゆるくして長時間かけて溶という相関係数の値で結果が表される．いずれの解析ア

図 5：解析の結果
A；異なる分子質量のタンパク質が同一サンプルに同定された例．見かけ上 66kDa 付近に分離された PsaA と PsaB に相当する
バンドを分析した結果，見かけ上 32kDa の D 1(PsbA）と D 2(PsbD），45kDa 付近の CP43（PsbC）と CP47（PsbB）由来のポリペプチドのシグナルも検出された．本来は PsaA と PsaB のみが検出されるはずであるが，D 1と D 2は凝集し PsaA と PsaBの位置に泳動されたことにより検出されたと考えられる．また，ゲルを切り出すときに刃の洗浄が不十分であったために，直前に切り出した CP43 と CP47 は混入したと考えられる．B；同一サンプルに，ほぼ同じ分子質量のタンパク質が同じ程度の確からしさで同定された例．SDS-PAGE によるタンパク質分離が不十分で，D 1と D 2が重なって泳動されたことが原因と考えられる．
2009 低 温 科 学

vol.67393

ルゴリズムも得られた値が大きいほど信頼性が高い．
M ALDI-TOF/MS などペプチドを開裂させない MS 解
析では，得られた前駆体イオンの質量とデータベースを照合する解析（前駆体イオンにおける PMF（Peptide
M ass Fingerprinting）解析）を行うことが多いので
M ASCOT がよく使われ，タンパク質単位で結果を解釈する．これに対してペプチドを開裂させアミノ酸配列情
報 を 得 る LC-MS/M S 解 析 は MASCOT と SEQUESTのいずれかが使われ，ペプチド単位で結果を解釈する．
SEQUEST を使った解析結果の実例を図５に示す．明らかに異なる分子質量のタンパク質が同定された場合，凝集産物や分解産物が重なって泳動している，切り出し時に混入した可能性がある（図 5A）．また，LC‑M S/MSの場合は先に分析したサンプルが経路に残って次の分析に持ち越された（キャリーオーバー）可能性も考えられる．このような場合，LC にインジェクションする量を減らすか，サンプルを含まない溶液（ブランク）をサンプ
ルの直後にインジェクションし，どれほどのペプチドが次の分析に持ち越されているか様子を見る．似た分子質
量のタンパク質が同定された場合，一方が圧倒的に高い値を持っているならば，値の高い方が真のタンパク質，

図 6：ニュートラルロスを利用したリン酸化残基の同定
桃色で示した残基（図では R ）がリン酸化したペプチドを
MS/M S にかけると脱リン酸化し R の側鎖が脱水する．脱リン酸化したペプチドを前駆体イオンとしてさらに M S/
MS/M S を行う．水色で示した部位では脱水化により質量が18kDa 減少しているとする．

あるいは量の多いタンパク質であるとする．同程度の値の場合（図 5B）
，電気泳動による分離が不十分であるた化による脱水反応が起きていると言える．したがって，

めに，同じバンド・スポットにタンパクが重なっている

R がリン酸化部位であると特定できる．

と解釈する．

この手法でリン酸化部位を特定するには比較的大量のリン酸化ペプチドを必要とするので，金属カラム（鉄やリン酸化部位の同定（図 6）ガリウム，チタンなどの金属を使った IM AC（Immobil-

質量分析計はタンパク質を同定すると同時に翻訳後修

ized metal affinitycolumn）を使う）でリン酸化ペプチ

飾に関する情報も得られる．例えば，ESI（NSI）-MS でドを濃縮したサンプルを分析する．ゲル内消化の過程では，二度イオンを開裂させる MS/MS/M S によってリン脱リン酸化しやすいので，リン酸化タンパク質は電気泳

酸化部位を特定できる．

動で分離せず，溶液のままトリプシンでタンパク質を消リン酸化されたペプチドは，一度目の開裂ではペプチ化し（In-solution digestion）分析することもある．

ド結合よりリン酸基の開裂が主に起こる．したがって，
リン酸化ペプチドは，一度目の開裂で脱リン酸化に相当
する質量が減少するペプチドとして同定される（価数が変わらず質量が減少するため，ニュートラルロス（Neutral loss）という）．もしリン酸化されたペプチド内にリン酸化修飾を受ける可能性のある残基（Ser，Thr，Tyr）
が複数存在すると，リン酸化部位は同定できない．しかし，脱リン酸化には脱水反応が伴うので，18Da の質量減少が生じる．これを利用して，脱リン酸化した前駆体イオンをさらにもう一度開裂させて脱水により質量減少したプロダクトイオンの情報を利用してリン酸化部位を特定する．図 6では y , y , b において質量が減少していることから，これらに共通して存在する R で脱リン酸
394

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395

３章 単離・精製・活性測定

６．タンパク質
f．カラムクロマトグラフィー
小澤真一郎 ，岡室彰 ，高橋裕一郎

可溶性および膜タンパク質の精製においてカラムクロマトグラフィーは最も有効な手法の一つである．本章では，一般的によく使われるカラムクロマトグラフィーの方法について紹介する．

Column chromatography
Shin-ichiro Ozawa, Akira Okamuro, Yuichiro Takahashi
Column chromatography is one of the most useful methods for purification of solubile and membrane proteins.
In this chapter, principle and application of variable column choromatographies is presented.

6.f.1 カラムクロマトグラフィーに必要な装置

慣れている人にとっては，初めはとまどいを感じるかもしれない．しかし，半自動式クロマトグラフィー装置

タンパク質精製のクロマトグラフィーに必要な機器（BioLogic LP,BioRad）などが利用できれば操作の負担は，用いる担体の種類やカラムサイズにより異なる．一は軽くなる（図 2）．この装置ではペリスタポンプを使用

般的に必要な基本構成は，カラム，（ペリスタ）ポンプ，
モニターとレコーダー，フラクションコレクターとそれらをつなぐチューブ・コネクター類などである．図 1にイオン交換クロマトグラフィーの基本構成を示す．試料
溶液と溶出溶液の塩濃度の勾配を作成するグラディエン
トメーカーをそれぞれ三方コックを介してカラムにつな
ぐ．静水圧を利用して溶液をカラムに送ることは可能であるが，ここではペリスタポンプでカラムへ送液する．
アフィニティークロマトグラフィーなどで用いる小さな
カラムのときは，ポンプやフラクションコレクターは必ずしも必要ない．イオン交換，ヒドロキシアパタイト，
および疎水性相互作用クロマトグラフィーには，溶出溶
液の塩濃度の勾配を作成するためグラディエントメー
カーが必要である．また，精製中のタンパク質の変成を防ぐため，クロマトグラフィーは低温室もしくはクロマ
トチェンバー内（4℃）で行う．自分でカラムを作成する
ときは，担体を均一に充塡することが，高い分離の必要条件である．ゲルろ過用の 1m もの長いカラムを作成す
るときは特に重要で，リザーバーを利用するとよい．担体によっては様々な種類のプレパックカラムが利用でき
る．低圧用のプレパックカラムはペリスタポンプでも使用できる．しかし，a 圧用のプレパックカラムは，a 圧用のポンプで送液しなければならない．
カラムクロマトグラフィーの操作には経験と独自の工夫が必要である．そのため，マニュアル化された操作に
１) 岡山大学大学院自然科学研究科

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vol.67

図 1：カラムクロマトグラフィー装置のセッティング
イオン交換クロマトグラフィーに用いる溶出溶液の塩濃度に勾配をかけてサンプルを分離する方法の例を示す．グラディ
エントメーカー，三方バルブ，カラム，ペリスタポンプ，モニター，フラクションコレクターがチューブにより連結されている．ポンプがない場合は，静水圧を利用して溶出する．三方バルブがあると試料添加に便利である．カラムに詰めた担体の上端に𨻶間が空くので伸縮式のアダプターを取り付けるとよい．モニターがない場合は，分画した各画分の 280nm もし
くは適当な波長での吸光度を測定しグラフにする．

397

図 2：低圧クロマトグラフィー装置
ポンプ，モニター，カラムスタンド，フラクションコレクターの他に，送液時間，送液速度，グラディエント作成，モニターによる溶出の記録，などがコントロールできるようになっている．

するため，自分で作成したカラムも使用できる．中圧ク
ロマトグラフィー装置（̈AKTA, GE Healthcare）は自動化が進み，速い送液で短時間の分離が可能である（図3）．

図 3：中圧クロマトグラフィー装置
コンピューターで制御して試料添加，溶出を自動で行う中圧
カラムクロマトグラフィー装置で，プレパックのカラムを用いる．溶出の送液速度を速くできるため，高い分離を保ちながら分離時間を大幅に短縮できる利点がある．特に，ゲルろ過カ
ラムクロマトグラフィーの分離が優れている．

6.f.2 イオン交換クロマトグラフィー
イ オ ン 交 換 ク ロ マ ト グ ラ フィー（ion exchange
は，合成樹脂などの担体に共有結合さ
chromatography）
せた解離基とタンパク質の表面電荷との相互作用を利用してタンパク質を分離する（図 4）．水溶性や膜タンパク質の精製に利用でき，再現性よく高い分離が得られる．

図 4：陰イオン交換カラムの原理
陰イオン交換体による異なるタンパク質の分離の様子を模式的に示した．試料を添加すると負電荷をもつタンパク質は開始バッ
ファーの対イオン（Cl ）と置き換わり担体に結合する．溶出バッファーのイオン強度を増加させると，担体に結合したタンパク
質は溶出バッファーの対イオン（Cl ）と置き換わり溶出される．タンパク質の担体への結合強度により，溶出されるときのイオ
ン強度が異なり，タンパク質は分離される．

398

カラムクロマトグラフィー表 1：イオン交換カラムクロマトグラフィーの担体
陰イオン Functional group name
弱塩基
弱塩基
強塩基
強塩基
強塩基
強塩基

解離基／官能基

Diethylaminoethyl(DEAE)
Aminoethyl(AE)−CH CH N H(CH H )−CH CH NH
Diethyl-2-hydroxypropylaminoethyl(Quaternary aminoethyl)(QAE) −CH CH N (CH CH ) CH CH(OH)CH−CH N (CH )Trimethylaminomethyl(SuperQ，MonoQ)()−CH CH N (CH CH )Triethylaminoethyl TEAE
−CH N (CH ) CH CH OH
Dimethyl-2-hydroxyethylaminomethyl

陽イオン
弱酸
弱酸
強酸
強酸
強酸
強酸

Carboxymethyl(CM )Carboxy(C)Sulphopropyl(SP)Sulphoethyl(SE)Sulphomethyl(SM )(Mono S)−CH COO−COO−CH CH CH SO−CH CH SO−CH SO−SO

Sulpho

解離基が正電荷をもつ場合は，タンパク質表面の負電荷質の吸着を抑えることができる．そうすると，多数のタと結合するため，陰イオン交換体と呼ばれる．それに対ンパク質が含まれる試料では，目的のタンパク質をカラして解離基が負電荷をもつ場合は，陽イオン交換体と呼ムにより多く吸着させることができる．

ばれる
（表 1）
．いずれも弱および強イオン交換体がある．

6.f.2.1 D EAE カラムクロマトグラフィーによる水

弱イオン交換体は結合容量が小さく，イオン化が pH 依存性を示す．一方，強イオン交換体は幅広い pH 領域でイオン化し，タンパク質の結合容量が大きい．

溶性タンパク質の分離
図 5に緑藻クラミドモナスの水溶性タンパク質の分離例を示す．凍結融解を繰り返して細胞を破壊し，得られ中性付近の pH では正の電荷をもつタンパク質が多い

た水溶性タンパク質を DEAE カラムに吸着させ，展開溶

ため，陰イオン交換体がタンパク質の精製に多用されて液中の KCl 濃度を０から 500mM まで増加したときにいる．弱陰イオン交換体として一般的に利用される官能

溶出されるタンパク質を示した．ここでは，プラストシ

基は，Diethylaminoethyl（DEAE）である．一方，強陰アニン（Pc），フェレドキシン（Fd），フェレドキシン

イオン交換体として第４級アミノエチルが利用される．

，リブロースビスリン酸カルボNADP 還元酵素（FNR）

Trimethylaminoethyl 基は，Mono Q（GE Healthcare）

キシラーゼオキシゲナーゼの大サブユニット（Ls）と小や Super Q（東ソー）に使用され，プレパックカラムとサブユニット（Ss）の分離に注目する．

して市販されている．弱陽イオン交換体として最も一般的に利用される官能基はカルボキシル基を含む Carbox-［実験方法］

ymethyl（CM ）である．強い結合性の官能基はスルホ基

１．直径 2.5cm のエコノカラム（Bio-Rad）に DEAE

を含む．M ono S（GE Healthcare）は Sulphomethyl 基

Toyopearl 650S（東ソー）を高さ 7cm 充塡する（カを含み，SP シリーズ（東ソー）は Sulphopropyl 基を含ラム体積は 34ml）．

む．

２．20mM Tricine-NaOH pH 7.8でカラムを平衡化す

図 4に陰イオン交換カラムでタンパク質を分離する様子を模式的に示した．陰イオ ン 交 換 体 に は 開 始 バッ
ファーの対イオンである Cl が結合する．試料を添加す

る．
３．1ml/min で試料を吸着させる．この時，必要であれ
ば非吸着画分も回収する．

ると，交換体はタンパク質を結合し，対イオンは遊離さ４．20mM Tricine-NaOH pH 7.8に 0‑500mM KClのれ る．次 に 溶 出 バッファーの 塩 濃 度（NaCl も し く は

濃度勾配をかけながら，流速 0.4ml/min で溶出する．

KCl）を増加させると，交換体への結合の強さに応じてタ

5ml ずつ 80フラクションに分画する．

ンパク質が順次溶出される．高塩濃度の溶出液でタンパ
ク質をすべて溶出した後，開始バッファーで置き換える細胞から抽出した水溶性タンパク質の試料（レーン１）とカラムを再生することができる．試料をカラムに吸着と溶出された画分のうち 18画分（レーン 2‑19）のタンパさせるとき，目的のタンパク質が溶出しない程度の塩をク質を SDS-PAGE で分離し，CBB で染色した（図 5）．

試料溶液に加えておくと，低塩濃度で溶出するタンパク

試料には細胞質と葉緑体などのオルガネラのすべての水2009 低 温 科 学

vol.67399

図 5：DEAE クロマトグラフィーによる水溶性タンパク質の分離
緑藻クラミドモナスの細胞から水溶性タンパク質を抽出し，DEAE クロマトグラフィーで 0‑500mM KCl の濃度勾配を含む溶出溶液で分離した．得られた画分のタンパク質組成を SDS-PAGE で分析した．FNR；フェッレドキシン NADP 還元酵素，Fd；
フェレドキシン，Pc；プラストシアニン，Ls；リブロースビスリン酸カルボキシラーゼオキシゲナーゼ大サブユニット，Ss；リブ
ロースビスリン酸カルボキシラーゼオキシゲナーゼ小サブユニット．

溶性タンパク質が含まれているため，多数のバンドが検出される．レーン 2‑19のタンパク質組成を観察すると，異なるタンパク質が分離される様子が分かる．低塩濃度のレーン 3‑4に約 40kDa の FNR が，100‑150mM KCl
付近のレーン 5‑7に Pc が，350mM KCl 付近のレーン
14に Fd が分 離 さ れ た．レーン 10に 分 離 さ れ た 約 50

DEAE Toyopearl 650S（東ソー）を高さ 7cm 充塡する（カラム体積は 34ml）．
２．50mM Tris-HCl，pH 8.0，0.05％ドデシルマルト
シド（DM ）の溶液でカラムを平衡化する．
３．0.5ml/min で試料（ショ糖密度勾配超遠心法で分離した A2画分）を吸着させる．

kDa と 15kDa のバンドは，それぞれ Rubisco の大およ４．吸着された緑色の試料は 1‑2cm 位の高さになる．

び小サブユニットである．最初の試料には多数のタンパ

５．50mM Tris-HCl，pH 8.0，0.05％ DM 溶液に 0‑150

ク質が含まれているので，分離後の各画分にはまだ複数

mM NaCl の濃度勾配をかけながら，流速 0.5ml/minのタンパク質が含まれている．精製を改善するには，カで溶出する．溶出容量は 300ml である．

ラムに充塡する担体を増やし，別の精製法も組み合わせ
る．

分離に用いた試料は，チラコイド膜を DM で可溶化

6.f.2.2 D EAE カラムクロマトグラフィーによる膜タンパク質の分離

し，ショ糖密度勾配超遠心法で分離した A2画分である．
この画分には複数の複合体と光化学系 コア複合体の解膜タンパク質も水溶性タンパク質と同様に分離するこ体産物が混ざっているが，それぞれは溶出曲線のピークとができるが，タンパク質を凝集させないようにするたもしくは肩として分離されている．ただし，LHCI 複合体

め，溶液に CM C 以上の濃度の非イオン性界面活性剤をだけは広範囲の NaCl 濃度で溶出されている．これは，加える．緑藻クラミドモナスから単離したチラコイド膜

LHCI は光化学系 複合体から解体した後も多量体を維を非イオン性界面活性剤で可溶化して得られるクロロ

持しているが，部分的に解体しヘテロな状態であるから

フィルタンパク質の分離例を図 6に示す．

だと考えられる．多数のサブユニットから構成される複合体を精製する場合，ここでの LHCI や光化学系 複合［実験方法］体の様に，本来は均質な複合体でも精製の過程で部分解

１．直 径 2.5cm の エ コ ノ カ ラ ム（Bio-Rad 社 製）に体することがある．したがって，部分解体を最小限にす400

カラムクロマトグラフィーるには，分離時間，温度，界面活性剤，緩衝液および塩濃度の設定を最適化しなければならない．

図 7は，DEAE クロマトグラフィーで分離した Pc に富む画分（図 5，レーン 4‑6）をヒドロキシアパタイトク
ロマトグラフィーでさらに精製した結果である．

6.f.3 ヒドロキシアパタイトクロマトグラ
フィー［実験方法］
１．直径 1cm のエコノカラム（Bio-Rad）にヒドロキシタンパク質とヒドロキシアパタイトの相互作用は，主アパタイト（Macro-Prep Ceramic Hydroxyapatite

としてタンパク質表面の負電荷とヒドロキシアパタイト（Bio-Rad）を高さ 5cm 充塡する．カ
TYPE I 20μm）の Ca との静電的な結合により引き起こされる．した

ラム体積は 4ml である．

がって，タンパク質の分離は陰イオン交換カラムクロマ
トグラフィーと似ているが，タンパク質表面の正電荷とヒドロキシアパタイトのリン酸基との相互作用も生じているため，分離パターンが異なってくる場合もある．
カラムに吸着したタンパク質を溶出するには，Ca と強い親和性をもつリン酸などの陰イオンの濃度を上げていく．例えば，リン酸ナトリウムもしくはリン酸カリウ

２．20mM potassium phosphate，pH 7.8を 1ml/min，
15分間流し，カラムを平衡化する．
３．試料を 20mM potassium phosphate，pH 7.8で５倍に希釈する．
４．試料を 1ml/min でカラムに吸着させる．
５．20mM potassium phosphate，pH 7.8で 1ml/min，
15分間カラムを洗う．

ムの濃度をそれぞれ 10‑150mM もしくは 10‑200mM

６．potassium phosphate，pH 7.8の濃度勾配を 20‑500の範囲で使用する．溶出溶液中のイオン強度を高くする

mM にして溶出させる．流速 0.4ml/min，1ml ずつと（例えば 250‑500mM NaCl），タンパク質の溶出に必

40フラクションに回収する．

要なリン酸緩衝液濃度が低下することがある．溶出時のリン酸緩衝液の濃度を低くしたいときは試してみるとよい．

７．500mM potassium phosphate pH 7.8で 1.0ml/
min，15分間カラムを洗う．
８．20‑200mM Potassium phoshate の濃度で溶出され

図 6：DEAE クロマトグラフィーによる膜タンパク質の分離
緑藻クラミドモナスのチラコイド膜をドデシルマルトシドで可溶化し，ショ糖密度勾配超遠心法で分離して得られた A2画分を
DEAE クロマトグラフィーで分離した．A2は主に光化学系 コア複合体を含み，その他に光化学系 コア複合体，LHCI 複合体，
シトクロム b f複合体なども含む．溶出曲線は 280nm での吸光度を測定して求めた．ここでは a から fで記したピークおよび肩が観察される．a；アンテナ複合体 LHCII，b；光化学系 のコアアンテナ複合体 CP43，c；光化学系 のコアアンテナ複合体
CP47，d；光化学系 コア複合体，e；光化学系 複合体，f；CP43 を欠く光化学系 複合体．LHCI 複合体は不均一な性質をもつ
らしく，a を除く各画分に溶出されている．
2009 低 温 科 学

vol.67401図 7：ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによる分離
図５で分離した Pc に富む画分（レーン 5‑7）をヒドロキシアパタイト
カラムに吸着させた．20‑500mM の濃度勾配をもつリン酸カリウム溶液で溶出された各画分を SDS-PAGE で分析した．約 10
kDa の Pc のバンドを矢印で示した．低濃度のリン酸カリウム溶液で 60kDa タンパク質と共に Pc が溶出され，Pc の純度が大きく上がった．

る画分に Pc が分離される．

ることができる．担体がタンパク質と弱い相互作用をもつときは，展開溶媒中のイオン強度により溶出体積が変

DEAE クロマトグラフィーで精製した Pc 画分には化することがある．

40〜90kDa のサイズのタンパク質がかなり混入していゲルろ過（Gel filtration）クロマトグラフィーに用いた（図 5，レーン 6）．ヒドロキシアパタイトクロマトグ

る担体は，大きさの異なる網目構造をもつ粒子である．

ラフィーにより，Pc は低濃度の Potassium phoshate に

図 8A に，カラムの体積に相当するベッド体積（Vt），ゲ

よ り 溶 出 さ れ，混 入 タ ン パ ク 質 の 大 部 分 は 200mM

ルの体積，排除体積（Vo）の関係を示す．ゲルの体積は，Potassium phoshate の画分に溶出された．したがって，溶液が入り込めるゲル粒子の網目構造の体積（Vi）と溶

Pc の精製には有効である．しかし，約 60kDa のタンパ

液が入り込めないゲル粒子そのものの体積（Vp）の合計

ク質は，低濃度の Potassium phoshate で溶出してくるである．したがって，Vt＝Vo＋Vi＋Vp となる．溶出溶

ため完全に除去することはできない．このタンパク質と液のように十分に小さい分子はゲル粒子の網目の内部に

Pc の分子質量の差は大きいので，さらに精製を進めるに浸透するので，カラムを通過するには Vo＋Vi の溶液量はゲルろ過クロマトグラフィーが有効であろう．

が必要となる（図 8B）．大きな分子はゲル粒子の網目から排除されるため，ゲル粒子を素通りして溶出される．

6.f.4 ゲルろ過クロマトグラフィー

このような大きな分子の溶出体積 Vo を排除体積（voidvolume）と呼び，ベッド体積（Vt）のおよそ 20％程度に上記のイオン交換やヒロドキシアパタイトクロマトグ

相 当 す る．分 子 質 量 2MDa の Blue Dextran 溶 液

ラフィーと異なり，ゲルろ過クロマトグラフィーではタ（0.2％）をベッド体積の１％程度を添加し，溶出するま

ンパク質は担体へ結合せず，サイズに基づいて分離されでの溶液量から Vo を求める．一方，中間の大きさの分子

る．分子のサイズの対数と溶出体積は直線関係になる．

は網目構造に部分的に浸透するので，溶出体積（Ve）は，

したがって，分子量マーカータンパク質を用いて検量線

Vo＜Ve＜Vt＋Vi となる．このようにして，タンパク質を求めると，目的のタンパク質の見かけの分子量を求めが球状の場合，ゲルろ過クロマトグラフィーでは大きな402

カラムクロマトグラフィー

図 8：ゲルろ過クロマトグラフィーによるタンパク質分離の原理(A）カラムのベッド，ゲル粒子，および排除体積の関係．(B）異なるサイズのタンパク質の分離．

タンパク質が先に溶出される．タンパク質が非対称な形

安としている．膜タンパク質は界面活性剤を結合してい状である場合，溶出体積が影響を受けることがある．ゲるので，分離サイズの範囲は狭くなる．一般的には，表ルろ過カラムを自分で作成する場合，タンパク質の分離示されている分画サイズより小さい膜タンパク質の分離を十分にするためには長さ 1m 以上が必要となる．しかに用いられる．また，分離サイズの小さいゲル粒子（Se-し，プレパックカラムは分離能が高いため長さ 30‑60cm

phadex G-25 および G-50）は脱塩などに用いる．この場でも十分である．

合，タンパク質は排除体積に溶出されるが，低分子の塩

ゲルろ過クロマトグラフィーで分離できるタンパク質は遅れて溶出される．タンパク質の分離には試料をベッ

分子のサイズの範囲（分画範囲）は，ゲル粒子の網目構

ド体積の 0.5‑4％添加するが，脱塩の場合は 30％まで添造の大きさに依存する．様々な網目サイズのゲルろ過用加できる．ゲルろ過担体の選択と溶出条件の設定は，製の担体が入手できるので，目的のタンパク質のサイズに造会社のマニュアルを参考にする．膜タンパク質の分離

最適な担体を選ぶことは重要である（表 2）．一般的にゲ

例は少ないので，以下にクロロフィルタンパク質の分離

ルろ過担体の分画範囲は，水溶性タンパク質の分離を目の例を示す（図 9）．

2009 低 温 科 学

vol.67403

表 2：ゲルろ過クロマトグラフィー用担体
充塡用担体

製品名

分画範囲（kDa）

Sephadex G-25
Sephadex G-50
Sephadex G-75
Sephadex G-100
Polyacrylamide
Bio-Gel P-2
Bio-Gel P-6
Bio-Gel P-30
Bio-Gel P-60
Bio-Gel P-100
Dextran, corss-linked agarose Sephacryl S-100HR
Sephacryl S-200HR
Sephacryl S-300HR
Sephacryl S-400HR
AgaroseSepharose 6B
Sepharose 4B
Sepharose 2B
Polyvinylchloride
TOYOPEARL HW-40
TOYOPEARL HW-50
TOYOPEARL HW-55
TOYOPEARL HW-65
TOYOPEARL HW-75
プレパックカラム＜1.5
1.5‑303‑70
4‑150
0.1‑1.8
1‑6
1.5‑20
3‑60
5‑100
1‑500
5‑250
10‑1,500
20‑8,000
10‑4,000
60‑20,000
70‑40,000
0.1‑100.5‑801‑700
400‑5,000
500‑50,000

GE Healthcare
GE Healthcare
GE Healthcare
GE Healthcare
Bio-rad
Bio-rad
Bio-rad
Bio-rad
Bio-radGE Healthcare
GE Healthcare
GE Healthcare
GE Healthcare
GE Healthcare
GE Healthcare
GE Healthcare
東ソー
東ソー
東ソー
東ソー
東ソー

Dextran linked tocross-linked agarose

10‑60010‑600
1‑300
5‑5,000

GE Healthcare
GE Healthcare
GE Healthcare
GE Healthcare

DextranSuperdex 75 pg
Superdex 200 pg
Superose 12 pg
Superose 6 pg

チラコイド膜を DM で可溶化し，ショ糖密度勾配超遠
心で LHCII，PSII，PSI-LHCI 複合体に相当する A1，
A2，A3画分を分離した．次にそれぞれの画分をゲルろ過
クロマトグラフィーに添加し，その分離の様子を比較した．
［実験方法］
溶出溶液；0.05％DM ，50mM Tris-HCl，pH 8.0，
（ただし水溶性マーカータンパク質を分
100mM NaCl，
離 す る と き は DM を 加 え な く て も よ い）．カ ラ ム；Superose 6 HR 10/20（GE Healthcare），クロマトグラ
フィーシステム；FPLC もしくは ̈
AKTA（GE Health，分子量マーカータンパク質；Thyroglobulin
（669
care）
，β-amylase（200kDa），kDa），Apoferritin（443kDa）（150kDa），Bovine Serum AlbuAlcoholdehydrogenase，Carbonicanhydrase（29kDa）．
min（66kDa）
図 9：ゲルろ過クロマトグラフィーによるクロロフィルタン
パク質の分離ドデシルマルトシドで緑藻クラミドモナスのチラコイド膜を可溶化しショ糖密度勾配超遠心により分画した３種のクロロ
フィルタンパク質をゲルろ過クロマトグラフィー（Superose
6HR 10/30）でさらに分離した．

１．試料を 0.2μm のフィルターに通し，不溶物やゴミなどを除去する．
２．試料 200μl をカラムに添加する．
３．流速 0.2ml/min で分離し，280nm の吸収で溶出液をモニターする．
４．0.4ml ずつフラクションをとる．

404

カラムクロマトグラフィー表 3：疎水性相互作用クロマトグラフィーの担体
担体

リガンド

製造会社

RESOURCE ETHRESOURCE ISORESOURCE PHE
Toyopearl Ether
Toyopearl PPG
Toyopearl Phenyl
Toyopearl Butyl
Toyopearl Hexyl
Methyl HIC
t-Butyl HIC

Matrix-OCH CHOHCH -OH
Matrix-OCH CHOHCH OCH CHOHCH OCH (CH )Matrix-OCH -CHOHCH OCH CHOHCH OC H
Matrix-(OCH CH ) OH
Matrix- OCH (CH )CH - OH
Matrix-OC H
Matrix-OCH CH CH CH
Matrix-OCH CH CH CH CH CH
Matrix-OCH
Matrix-OC (CH )GE Healthcare
GE Healthcare
GE Healthcare
東ソー
東ソー
東ソー
東ソー
東ソー
Bio-Rad
Bio-Rad

膜タンパク質を分離するときは，溶出溶液中に界面活溶出液の塩濃度を低下させることによりタンパク質を溶性剤を添加する．マーカータンパク質の溶出体積を溶出出させる．異なる疎水性のリガンドを結合した担体が購

曲線の上部に示した．マーカータンパク質は水溶性であ入できるので，目的のタンパク質の精製に最も適した担るので，溶出溶液中に界面活性剤を加える必要はないが，体を選択する（表 3）．

界面活性剤の有無により溶出体積に差は生じない．ゲルろ過クロマトグラフィーではタンパク質と単体の間に相互作用は基本的にはないはずである．しかし，Superose

6.f.6 アフィニティークロマトグラフィーの担体とタンパク質の間には疎水性相互作用があり，溶タンパク質は特定の物質と相互作用することによりそ

出溶液のイオン強度を上げるとタンパク質の溶出が遅くの機能を発揮する．例えば，酵素は基質，生成物，補酵なる．

素，競争阻害剤およびアロステリック活性化剤などと，各クロロフィルタンパク質複合体の見かけのサイズ

抗体は抗原とアフィニティー（親和力）により結合する．

は，A1（LHCII）は約 200kDa，A2（PSII 複合体）は約

タンパク質のこの様な特性を精製に応用したのがアフィ

400kDa，A3（PSI-LHCI 複合体）は約 700kDa である．

ニティークロマトグラフィーである．アフィニティーク

ショ糖密度勾配超遠心法では，クロロフィルタンパク質

ロマトグラフィーでは，目的のタンパク質とアフィニはその密度の差により分離されるはずであるが，密度にティーをもつ物質をリガンドとして担体に結合させる

あまり差がない場合はサイズによって分離されるようで（図 10）．リガンドを担体に化学的に結合させるために反ある．確かにゲルろ過クロマトグラフィーとショ糖密度

応性官能基をもつスペーサーを導入した活性化型アフィ

勾配超遠心の分離パターンはよく似ている．

ニティー担体が市販されている．精製するタンパク質に6.f.5 疎水性相互作用クロマトグラフィー
用いるゲル担体に疎水性リガンドを導入し，タンパク質の表面の疎水性の差に基づいて分離する．逆相クロマ
トグラフィーと異なり，導入された疎水性リガンドの密度は低い．したがって，タンパク質の疎水領域との相互作用は弱く，吸着されたタンパク質を温和な条件で溶出できる．
一般的に水溶性タンパク質の精製に用いられる．
担体は界面活性剤を強く結合するため，膜タンパク質の精製にはあまり用いられない．高塩濃度下ではタンパク質の電荷が中和され，溶解度が低下し疎水性が増加する
ため，担体の疎水性リガンドに結合する．そのため，タンパク質を塩析する濃度以下の高塩濃度条件下でカラムへ吸着させる．したがって，硫安沈殿やイオン交換クロマトグラフィーの後に利用するのに適している．また，2009 低 温 科 学

vol.67

図 10：アフィニティークロマトグラフィーによるタンパク
質分離の原理担体にリガンドを結合させる．このとき 6‑10炭素原子を含む
スペーサーを介在させて結合させることがある．吸着時の溶液は目的のタンパク質とリガンドの結合が最適になるように選択すると，タンパク質はカラムに吸着され，リガンドと親和性のないタンパク質はそのまま溶出される．溶出時には溶液の塩濃度を高くしたり，pH を変化させたりして，タンパクとリガンドの結合を解離させる．

405

よりリガンドや担体を適切に選択しなければならない．
リガンドとして抗体を使用すると，抗原タンパク質を精製することができる．アガロース担体を CNBr で活性化
して抗体を結合させる．カラムにタンパク質を吸着させるときは，温和な塩，中性 pH 条件下で行う．溶出には高塩や低 pH，界面活性剤などの変性剤の添加，などの条件下で行う．
関連した機能や構造をもつタンパク質に共通した親和性を示すリガンドを利用して精製する方法もある．この様なリガンドを結合させたアフィニティークロマトグラ
フィー用担体が市販されている．Staphylocuccus aureus
より抽出したプロテインＡは，ほ乳類の IgG の Fc 部分に結合する．このプロテインＡを結合させた担体（BioRad）は IgG を高純度に精製するために利用される．
IM AC（Immobilized M etal ion AffinityChromatography）は固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（Metal Chelate Chromatograpy）とも呼ばれる．主に二価の金属イオン（Cu ，Zn ，Hg ，Cd ，Co ，Ni ，
M n ）を固定化する．リン酸化タンパク質やペプチドの精製には Fe も使われるが，二酸化チタン（TiO ）から作製された Titansphere（GL サイエンス）が有効である．また，Ni-NTA（nickel-nitrilotriacetic acid）
アフィ
ニティークロマトグラフィーはリコンビナント His-tag
タ ン パ ク 質 の 精 製 に 利 用 さ れ る．リ ガ ン ド は IDA（Iminodiacetic acid）で，ネイティブな条件でも変性条件でも精製できる．また，核酸関連物質を基質とする酵
素などの精製に利用される色素結合型アフィニティーク

図 11：色素結合型アフィニティークロマトグラフィーによる FNR の精製
緑藻クラミドモナスの水溶性タンパク質のうち，DEAE カラ
ムの FNR を含む画分（レーン 2〜5）を試料にした．カラムに試料を吸着させ，0.1M KCl を含む溶液で溶出させ４つに分画し（レーン 2‑5）
，さらに 0.5M KCl を含む溶液で２つに分画した（レーン 6‑7）．FNR 抗体を用いたウェスタン分析は，
レーン 3に FNR が溶出することを示す．

ロマトグラフィー用担体が市販されている．その一つである Toyopearl AF-Red-650（東ソー）は担体に Procion
Red HE-3B 色素（Reactive Red 120）を共有結合させたゲルで，ヌクレオチドに依存した酵素，リポタンパク質などの精製に用いられる．
クラミドモナスの水溶性タンパク質の DEAE クロマ
トグラフィーによる分離により，低塩濃度の溶出液に
FNR に富む画分が分離された（図 5，レーン 2〜5）．こする．
３．カラムに試料を添加し，キャップをし，液漏れしな
いようにパラフィルムを巻く．
４．カラムを４℃でゆっくり回転させながら一晩放置
し，FNR を吸着させる．
５．試料の吸着後，カラムをしばらく放置し担体を沈殿させる．

の画分には多くの水溶性タンパク質が含まれている．こ６．非吸着試料を溶出させる．

の 画 分 を Toyopearl AF-Red-650 を 用 い た ア フィニ

７．4ml の 20mM Tricine-NaOH pH 7.8でカラムをティークロマトグラフィーでさらにする例を示す（図
11）
．

洗う．
８．4ml の 20mM Tricine-NaOH pH 7.8，0.1M KCl
で溶出し，1ml ずつ分画する．

［実験方法］
１．1ml の AF-Red 650M L（東ソー）をキャップのできる小型のカラム（例えば Bio-Rad 社製のポリプレップ
エンプティーカラム）に充塡する．
２．カラムを 20mM Tricine-NaOH pH 7.8で平衡化
406９．4ml の 20mM Tricine-NaOH pH 7.8，0.5M KCl
で溶出し，1ml ずつ分画する．
10．20mM Tricine-NaOH pH 7.8，1M KCl でカラムを洗浄し，再生する．
11．20mM Tricine-NaOH pH 7.8，1M KCl，20％エ
カラムクロマトグラフィータノールに置き換え，４℃でカラムを保存する．

て精製する様々なカラムクロマトグラフィーが開発されてきた．タンパク質には共通の特性があるので，１回の図 11に 分 離 し た 画 分 の タ ン パ ク 質 組 成 を SDS-

クロマトグラフィーにより目的のタンパク質を完全に純PAGE で，FNR の分離をウェスタン分析で解析した．本化することは難しい．
したがって，各クロマトグラフィー

吸着条件では FNR は効率よくカラムに吸着した．0.1の原理と特性を理解して，複数の精製操作を効率的に組M KCl 存在下では FNR は担体から遊離し，１カラム容み合わせていかなければならない．目的のタンパク質の積の溶出後に検出される．0.5M KCl 存在下では新たに精製にアフィニティークロマトグラフィーが利用できる

多数のタンパク質が溶出されるが FNR は検出されな場合は，精製の最終段階に利用すると有効である．最近

い．この方法により FNR は純化されたと言えるが，このでは，様々な種類のタグを融合したタンパク質を発現さ

アフィニティー担体と親和性をもつタンパク質は少なかせる手法が開発され，極めて微量に発現するタンパク質

らず存在するため，FNR に富む画分にもまだ多くのタの精製も可能になった．タンパク質の質量分析技術の進

ンパク質が存在する．

歩に伴い，カラムクロマトグラフィーによるタンパク質
精製手法はこの後もますます重要になると考えられる．

6.f.7 おわりにタンパク質の化学的および物理的性質の違いを利用し2009 低 温 科 学

vol.67407

３章 単離・精製・活性測定

６．タンパク質
g ．界面活性剤
小澤真一郎 ，高橋裕一郎
界面活性剤は光合成タンパク質の生化学的解析によく用いられる．電気泳動法による分析では，タンパク質の可溶化，変性，電荷の付与などに，膜タンパク質の精製・分析では，疎水性タンパク質の可溶化に使われる．本章では，一般的に使われる界面活性剤について紹介する．

DetergentsShin-ichiro Ozawa, Yuichiro Takahashi
Detergents are frequently used for biochemical analyses of photosynthetic proteins. For polyacrylamide gelelectrophoresis, detergents are used to solubilize and/or denature proteins. For purification of membraneproteins, detergents are also required for solubilization of water-insoluble proteins. In this chapter,detergentsthat are frequently used in protein biochemistry are introduced.

6.g .1 界面活性剤の種類
界面活性剤（detergent）は，親水基と疎水基をもつ両の界面活性剤を加える．光合成タンパク質の解析によく使われる界面活性剤のリスト（表 1）と分子構造（図 1）をまとめた．

親媒性分子（amphiphilic molecule）で，ミセルを形成することにより，疎水性分子を可溶化する作用をもつ．
親水基に正もしくは負の電荷をもつイオン性界面活性剤（ionic detergent），正と負電荷の両方をもつ両性界面活

6.g .2 タンパク質の分析に使われる界面活性剤

性剤（zwitterionic detergent）と電荷をもたない非イオ

SDS は，ポリペプチドの分析によく使われる SDS-

ン性界面活性剤（nonionic detergent）がある．イオン性PAGE（6a 章参照）において，分析するタンパク質を変界面活性剤はタンパク質の変性作用が強く，非イオン性性させるために使用される．親水基として負電荷の硫酸

界面活性剤は変性作用が弱いと一般的に考えられている基をもち，変性したポリペプチドに負電荷を与える．しが，例外もある．イオン性界面活性剤を加えるとそのミたがって，SDS-PAGE では，ポリペプチドはそのサイズセルを結合したタンパク質の電荷が増加し，電気泳動でに依存した距離を泳動する．SDS はカリウムイオン存在タンパク質を分析するときの分離がよくなる．しかし，下では不溶性の塩を形成するので，サンプル溶液にカリ

Isoelectric Focusing や，疎水性，ヒドロキシアパタイト

ウムイオンが含まれないように注意する．

およびイオン交換クロマトグラフィーにはイオン性界面活性剤は適しない．

ウェスタン分析で疎水性タンパク質をゲルからフィルターへ電気泳動的にブロットするとき，ブロット溶液に水溶液中での界面活性剤の濃度が，臨界ミセル濃度．また，ウェスタ
SDS を加えることがある（6h 章参照）

（CM C,critical micelle concentration）より高いと，界ン検出のときの非特異的な交差反応によるシグナルを減面活性剤は親水基を外側に，疎水基を内側にしたミセル少させるとき，ハイブリダイズや洗浄する溶液に非イオを形成する．界面活性剤のミセルサイズが大きい，もしン性界面活性剤の Tween20（polyoxyethylen (20)sor-

くは CMC が低いと，界面活性剤を透析により除去する．
bitan monolaurate）を加える（6.h 章参照）のは難しくなる．可溶化した膜タンパク質の精製に用い膜タンパク質や多数のタンパク質から構成される複合る溶液には，可溶化状態を維持するために界面活性剤を

体を非変性の状態で微量分析する手法として使われる加える必要がある．CMC は溶液の温度，イオン強度およNative Polyacrylamide Gel Electrophoresis（Native

び pH により変化するので，溶液中には CM C より高め

PAGE）に は，様々な 変 法 が 報 告 さ れ て い る．Green
Polyacrylamide Gel Electrophoresis は，1964年 に１) 岡山大学大学院自然科学研究科

2009 低 温 科 学

vol.67

Ogawa らにより報告された SDS-PAGE によるクロロ409

表 1：光合成研究に使われる界面活性剤
界面活性剤
n-Decyl-β-D-maltoside
n-Undecyl-β-D-maltoside
n-Tridecyl-β-D-maltoside
n-Tetradecyl-β-D-maltoside(DM , DDM )n-Dodecyl-β-D-thiomaltoside
n-Octyl-β-D-glucoside
Deoxycholate, sodium salt
Lauryldimethylamine-oxide(LDAO）
Sodium dodecyl sulfate(SDS）
Litium dodecyl sulfate(LDS）TRITON X-100
TWEEN 20
Digitonin
M ethyyl-6-O-(N-heptylcarbamoyl)-α-D-glucopyranoside(HECAMEG)

フィルタンパク質の分離法である ．チラコイド膜のSDS による可溶化条件を温和にし（チラコイド膜濃度を高く，SDS 濃度を低く，処理温度を低温に），電気泳動を低温で行うと，系

アルキル基
の炭素数
10
11
13
14
12
8

12
12

7

タイプ

分子量

非イオン性
482.6
非イオン性
512.7
非イオン性
524.6
非イオン性
538.6
非イオン性
526.6
非イオン性
292.4
負イオン性
414.6
両性(pH＞7)，
正229.41
イオン性(低 pH)
負イオン性288.38
負イオン性
非イオン性
非イオン性
1228(平均)
非イオン性
1229.3非イオン性
335.4

CMC(mM ) 構造
1.8
0.21
0.033
0.01
0.05
18‑20
2〜6
0.14

10
10
10
10
9
8
2
6

2.6

1

0.23
0.059
0.5
19.5

3
4
5
7

6.g .3 膜タンパク質の可溶化に使われる界面活性剤

や LHCII などのクロロフィルタン

水溶性タンパク質と異なり，膜タンパク質の精製に可パク質がポリアクリルアミドゲル上に CPI や CPII とし溶化は必須である．タンパク質の変性を最小限に抑え，て分離される．
低温でチラコイド膜の可溶化を行うとき，かつ高い効率で可溶化しなければならない．イオン交換

SDS が析出する場合は，ナトリウム塩の代わりに低温でクロマトグラフィーでの精製には，イオン性界面活性剤の溶解度が高いリチウム塩の LDS（litium dodecyl sul-は使用できない．したがって，膜タンパク質の精製には，

fate）を使用することもある．Colorless Native Polya-

非イオン性界面活性剤が一般的に使用される．

crylamide Gel Electrophoresis（CN-PAGE）は，非イ

光合成に関与する膜タンパク質は数多く知られている

オン性界面活性剤で可溶化した膜タンパク質複合体を分が，最もよく研究されてきたのは，クロロフィルタンパ

離する方法である ．タンパク質は変性されずに，タンパク複合体やシトクロム b f 複合体などである．用いる光ク質のもつ電荷（負電荷）で電気泳動される．しかし，合成生物や膜タンパク質の種類により，効果的な界面活

大きな複合体は泳動度が小さいため，分離がよくない．

性剤は異なることが多い．これまでに可溶化効率が高く，Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis

かつタンパク質の変性作用の少ない非イオン性界面活性（BN-PAGE）は，CN-PAGE の欠点を補うため，負電荷剤が数多く開発されてきた．

をもつ Coomasie Blue R-250 色素をタンパク質に結合

ジギトニン（digitonin）は温和な非イオン性界面活性させて電気泳動を行う（6.b 章参照) ．その結果，タンパ

剤で，葉緑体の膜断片やクロロフィルタンパク複合体のク質の分離が大幅に改善される．しかし，分離された膜単離に使われる．光化学系 とタンパク質に青い色素が結合しているため，吸収スペクることを示した実験に使われた ．低濃度のジギトニン

トルや活性などの分析には不適切なことがある．この方でチラコイド膜を処理すると，チラコイド膜のスタック

法は，SDS-PAGE と組み合わせた二次元電気泳動によした領域（グラナチラコイド）とスタックしていない領り，分離された複合体のサブユニット組成の分析に優れ域（ストロマチラコイド）の境界で膜が切断される ．そを生化学的に分離できている．High Resolution Clear Native Electrophoresisの結果，重い画分である，光化学系 に富むグラナチラ（HR-CNE）は，非イオン性界面活性剤の代わりに，負のコイドと，軽い画分である光化学系 に富むストロマチ

電荷をもつがタンパク質の変成作用が強くないデオキシ

ラコイドが，分画遠心により分離された．より高濃度のコール酸塩（deoxy cholate）を用いる ．

ジギトニンでチラコイド膜を処理すると，クロロフィル
タンパク質が可溶化される ．しかし，チラコイド膜を完
全に可溶化する効率は高くなく，最近ではクロロフィル
タンパク質の可溶化にはあまり使われない．

410

界面活性剤

図 1：界面活性剤の分子構造

非イオン性界面活性剤は高価なものが多いが，安価でイドの膜断片やクロロフィルタンパク複合体の単離に使ある．TRITON X-100(α-4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)

われる．チラコイド膜を低濃度で処理すると，酸素発生

phenyl -ω-hydroxy-poly(oxy-1,2-ethanediyl)）は ポ リ

活性をもつチラコイド膜のスタックした領域（光化学系

オキシエチレン基（-O-CH -CH -) -OH を含み，チラコ
2009 低 温 科 学

vol.67

酸素発生標品）が分画遠心により単離される

．より
411

高濃度でチラコイド膜を可溶化すると，クロロフィルタ
ンパク質が可溶化される．
この界面活性剤を使用すると，
クロロフィルタンパク質に結合するクロロフィルの吸収スペクトルが変化することがある．
LDAO（lauryldimethylamine-oxide）とオクチルグル
コシド（n-octyl-β-D-glucoside）は，光合成細菌の反応中
心や酸素発生活性を保持した光化学系 の単離に有効である（4b 章）．可溶化度を最適化すると，シアノバクテ
リアのチラコイド膜から，光化学系 を特異的に可溶化できる．溶液の pH が 7以上では LDAO は両性界面活性剤であるが，酸性 pH では正の電荷をもつイオン性界面活性剤となる（図 1）．一方，HECAM EG は，濃度を最適化するとシトクロム b f 複合体を特異的に可溶化できる ．活性の高いシトクロム b f 複合体を高純度に精製するのに使われる．
親水基に糖鎖（グルコースおよびマルトース）と疎水
基にアルキル鎖をもつ界面活性剤は，膜タンパク質の可溶化に有効である．糖鎖がグルコースでアルキル基の炭素数が６〜12の界面活性剤が 入 手 で き る（Anatrace
社；http://www.anatrace.com/）．炭素数が少ないもの（７以下）は CMC が高く，炭素数が多いもの（10以上）
は水に溶けにくいため，膜タンパク質の可溶化には不向きである．この系列の界面活性剤の中で最もよく利用されるのは，炭素数８のアルキル基をもつオクチルグルコ
シドである．また，糖鎖がマルトースでアルキル基の炭素数が６と８〜16の界面活性剤が入手できる．グルコー
スに比べマルトースをもつ界面活性剤は，アルキル基の炭素数が多くても水への溶解度が高く，さらにタンパク質の構造や機能に対して温和であるため，膜タンパク質の解析には適している．図 2に，アルキル基の炭素数11〜14の界面活性剤での可溶化とクロロフィルタンパ
ク質のショ糖密度勾配超遠心法による分離パターンを示
す．炭素数が 11と 12の undecyl-maltoside と dodecylmaltoside の可溶化効率と分離パターンはよく似てい
る．炭素数 13の tridecyl-maltoside は，クロロフィルタ
ンパク質の解離において少し温和である．炭素数 14のtetradecyl-maltoside の可溶化効率は悪く，クロロフィ
ル タ ン パ ク 質 の 分 離 も や や 不 明 瞭 で あ る．dodecyl-

図 2：親水基にマルトースを含む界面活性剤で可溶化したチ
ラコイド膜の分離
炭素数が異なるアルキル基をもつ界面活性剤（C＝11，12，13，
14は Undecyl-maltoside，Dodecyl-maltoside，Tridecylmaltoside，Tetradecyl-maltoside に相当する）で可溶化した
時のクロロフィルタンパク質の分離パターンへの影響．チラ
コイド膜を異なる濃度の界面活性剤で可溶化し，ショ糖密度
勾配超遠心法でクロロフィルタンパク質を分離した．

maltoside は，チラコイド膜の可溶化の効率と再現性が高く，光化学系 複合体や光化学系 コア複合体の可溶体の結晶化では，dodecyl-maltoside を用いて精製した化に最もよく使われる（4a 章参照)

後に界面活性剤を dodecyl-thiomaltoside に置き換えて．この界面活性剤を使って単離された標品の電子伝達活性も高く保た成功した例がある ．

れ，クロロフィルの吸収スペクトルの保存もよいという利点がある．結晶化のための光化学系複合体標品の精製でも優れた成果が得られている．植物の光化学系 複合
412

界面活性剤

6.g .4 おわりに文献

界面活性剤はタンパク質の分析や膜タンパク質の可溶

１) T.Ogawa, F.Obata, & K.Shibata, Biochim Biophys

化に必須であるが，用いる光合成生物や対象とするタンActa 112 (1966)P.223.
２) H.Schagger, W.A.Cramer, & G.von Jagow, Anal

パク質により，最適な界面活性剤が異なることが，これまでの研究で明らかにされている．しかし，すべての種類の界面活性剤が，あらゆる光合成生物や膜タンパク質に系統的に試されてきた訳ではない．したがって，より高い純度と活性をもつ膜タンパク質を単離・精製するには，界面活性剤の選択や可溶化条件の最適化が重要である．また，構造解析のための膜タンパク質の結晶化が盛んに行われるようになってきた．この場合，精製された膜タンパク質の純度や均一性が重要である．さらに用いた界面活性剤の結晶化に与える影響も無視できないため，界面活性剤は慎重に選択する必要がある．最後に，界面活性剤でタンパク質を可溶化すると，プロテアーゼ
による分解を受けやすくなる．この場合，プロテアーゼ
阻害剤を溶液に添加する必要がある．金属プロテアーゼに 対 し て は，0.5〜5mM ethylenediaminetetraaceticacid(EDTA），セ リ ン プ ロ テ アーゼ に は 1〜2mM
phenylmethanesulfonyl fluoride(PM SF）や 2〜5mM
6-aminocaproic aid が安価でよく使われる．

Biochem 217 (1994)P.220.
３) H.Schagger & G.von Jagow,Anal Biochem 199 (1991)
P.223.
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2009 低 温 科 学

vol.67413

３章 単離・精製・活性測定

６．タンパク質h．ウェスタン分析
大西 岳人 ，高橋裕一郎
タンパク質を特異的に検出するウェスタン分析は，化学発光を用いる検出法により微量のタンパク質
でも強いシグナルが得られるため，強力な実験手法である．本章では，ウェスタン分析の実験手法と抗体の作製法について紹介する．

Western blotting
Takahito Onishi and Yuichiro Takahashi
Western blotting is a powerful tool for detecting with high sensitivity a specific protein resolved by SDSpolyacrylamide gel electrophoresis. In this chapter, procedures for western blotting using enhanced
chemiluminescence and for generation of antibodies in rabbits are described.

6.h.1 ウェスタン分析とはがって一次抗体を入手することがウェスタン分析には必須である．可能であれば他の研究者から譲り受けたりす

組織，細胞および葉緑体などのタンパク質を可溶化し，る．最近では，商業的に購入可能な光合成タンパク質にSDS-PAGE で分析すると，多数のポリペプチドが分離

対する抗体の種類も増えている（Agrisera 社，http://

される．目的のタンパク質が多量であれば，その存在を．新規のタンパク質に対する抗体がwww.agrisera.se/）

確認することは難しくないが，少量であると検出は容易

必要な場合，費用がかかるが業者に抗体作製を委託するでない．また，細胞もしくは葉緑体のタンパク質の蓄積ことも可能である．費用を節約したい場合，ウサギなど

量の変化を分析する場合，特定のタンパク質を特異的かを飼育して自分で作製する．この場合，動物を飼育する

つ定量的に検出することが必要となる．目的のタンパク施設が必要で，動物の世話も行わなければならず，労力質に対する抗体があれば，ウェスタン分析は特異的で，がかかることを覚悟しなければならない．また，目的の高感度で，信頼性の高い分析法である．

タンパク質にタグ（HA や FLAG など）を融合して発現ウェスタン分析法では，SDS-PAGE で分離したポリペプチドを，ニトロセルロース（NC）や polyvinylidene

させた遺伝子組み換え植物を作製し，タグに対する抗体を購入して使用する方法もある．

difluoride（PVDF）膜に電気泳動的に転写するブロッティングを行う．次に，膜上に結合した目的のポリペプ
チドとそれに対する抗体（一次抗体）を抗原抗体反応で結合させる．次に一次抗体を結合したポリペプチドを検出するため，一次抗体に対する抗体（二次抗体）を結合させる．化学発光法（ECL,enhanced chemiluminescenでは，二次抗体に結合した HRP（horseradish peroxce）
idase）活性を利用し，目的のポリペプチドのバンドを高い感度で検出する (図 1）．化学発光はＸ線フィルムもしくは CCD カメラに露光させて検出・記録する．
ウェスタン分析には，SDS-PAGE，ブロッティング，
および化学発光を検出する装置が必要である．二次抗体は市販されている（GE ヘルスケアバイオサンエンス，．したAnti Rabbit IgG, HRP-linked whole Antibody）
１) 岡山大学大学院自然科学研究科

2009 低 温 科 学

vol.67

図 1：ウェスタン分析におけるシグナルの検出415

［実験方法］

価格の安い 0.44μm の膜を用いる．10kDa 以下の低分用意する試薬子タンパクを検出するときには，0.2μm の膜を使用す

ブロッティングバッファー（1L)；3.03g Tris base，

るとシグナル強度が強くなることがある．PVDF 膜は，20％(v/v）メタノール．

特に低分子タンパクの保持力が若干高いようである．特5.25g ε‑アミノカプロン酸を加えることもある．

にシグナルが弱いときに使用を検討したらよい．NC 膜

10倍ポンソ溶液（100mL)；2g Ponceau S，20g trich-と異なり，メタノールに浸透させる前処理が必要となる．

loro acetic acid，20g sulfosalycilic acid，水で 10倍に希釈して使用．

１．SDS-PAGE 後，ゲルをゲル板からはがし，ブロッ

10倍 TBS-T（1L）；24.3g Tris-base，80g NaCl，20％

ティングバッファー中で 10−30分間振とうし，バッ(w/v)Tween20，HCl で pH 7.6にあわせる (Tween

ファーの置き換えを行う．この操作は省略して，直接20 は必ずしも必要ないが，検出時のバックグランドをブロッティンを行ってもよい．しかし，ゲルが Tricine

低くする効果がある）．10倍に希釈して使用．

バッファーまたは高濃度の尿素を含むと，ブロッティ

化学発光用検出試薬；化学発光の持続時間が長い，感度ング時により多くの熱が発生する．温度が上昇するとが高いなどの市販の検出試薬を使用する．一次抗体のゲルが伸びるので，特に低分子量のポリペプチドのブ

力価が高い場合は，自分で調製した検出試薬でも検出

ロットの歪みが無視できなくなる．

はうまくいく．
Ａ液 14mg p-coumaric acid/ml DMSO 400μl に分注し，−20度で保存Ｂ液 44mg Luminol/ml DMSO 900μl に分注し，−20２．厚さ 1mm のろ紙６枚（アドバンテック，クロマト
グラフィー用ろ紙 No.590，厚さ 0.93mm），NC 膜１枚をブロッティングバッファーに浸す．ブロッティン
グ装置の下側の電極が正の場合，バッファーに浸した度で保存

ろ紙を３枚重ね，次に NC 膜，ゲルの順番で重ねる（下

液 90ml Tris-HCl，pH 8.5に 30％H O 溶液 50μl側の電極が負の場合は，NC 膜とゲルの順番は逆にすとＡ液 400μl を混ぜる．

る）．
さらにゲルの上にバッファーに浸したろ紙を３枚

液 90ml Tris-HCl，pH 8.5にＢ液 900μl を混ぜる．

重ねる．メスピペットや長めの試験管を転がして，メ検出直前に 液と 液を 1：1に混合し使用する．

ンブレンとゲルの間の気泡を取り除く．（図 2）液と 液は１週間くらい冷蔵保存できる．Luminol

３．1mm のゲル（15cm x 15cm）なら 300mA 定電流は不安定なので，鮮やかな黄色の粉末が，長期間保存すで１時間（300mAh），電気泳動的にブロットする．高ることにより褐色になると，シグナルの検出感度が低下

分子のポリペプチド（80kDa 以上）はブロットされにすることがある．

くいので，電気泳動時のゲル濃度を低くするか，
ブロッ
ト時間を長くする．ブロット後のゲルを染色すれば，電気泳動的ブロッティング

どれくらいポリペプチドがブロットされたかを確かめ

ポリペプチドを分離する SDS-PAGE は３章 6.a を参照する．泳動が終了した後，ゲルから分離したポリペプ
チドを NC 膜や PVDF 膜に電気泳動的にブロッティン
グする装置には，ウェット式とセミドライ式がある．
ウェット式では，ブロット槽中のブロッティングバッ
ファーにゲルと膜を完全に浸けた状態でブロットを行う．高電流を発生するブロット用電源や大量のブロッ
ティングバッファーが必要である．熱がかなり発生する
ため，ブロット中はバッファーを冷却する．ここでは主流になりつつあるセミドライ式でブロットする法を述べる．セミドライ式はブロッティングバッファーが少量ですみ，電源も電気泳動用のものが使用できる．熱の発生も少ないので，冷却する必要はなく室温でできる．ここでは，NC 膜を使用した方法を述べる．0.44μm と 0.2
μm のポアサイズの NC 膜が販売されているが，通常は416

図 2：セミドライタイプのウェスタンブロッティング

ウェスタン分析ることができる．電流を 300mA 以上にすると熱の発タノールを用いると効率よくブロットされる．また，

生が無視できなくなる．2mm のゲルの場合は２倍のブロットは，目的のポリペプチドの分子量と分離に用

時間ブロットするが，ゲルシステムにより熱の発生がいるゲルのかたさにより，最適化する必要がある．こ多い場合は，電流を下げて長い時間ブロットする（例

こで述べた標準条件では，90kDa 以上のポリペプチド

えば 150mA で４時間）．

のブロット効率は低い．また，SDS を加えたり，ブロッ

４．ブロット後，濃縮ゲルのウェルの位置を基にして各レーンの位置をマークする．NC 膜を純水で洗い，ポンソ溶液に浸して２分間染色する．
５．NC 膜を水で洗い脱色する．染色された分子量マー
カーの位置をマークする．

トを長くしたりすると，小型のポリペプチドが膜を通り抜けることがあるので注意しなければならない．
３．シグナルの弱い時；目的のポリペプチドの量が少な
い時は，ブロッキングと一次抗体溶液のスキムミルク
濃度を下げる（0.5％程度）．スキムミルク濃度が高す
ぎると，目的のポリペプチドが覆われてしまうことがシグナルの検出ある．

１．5％(w/v）スキムミルクを溶かした TBS-T 中で NC

４．定量的なシグナル検出；一次と二次抗体の濃度設定

膜を 30‑60分振とうして，ブロッキングする．染色さが重要である（図 3）．抗体濃度が高すぎるとバックグれたバンドはこの操作中に脱色する．

ランドが高くなり，非特異的な交差反応によるシグナ

２．ブロッキング後，TBS-T で５分間２回洗う．

ルが強くなることがある．また，一次抗体や二次抗体

３．5％(w/v）スキムミルクを溶かした TBS-T で希釈を結合させた後の膜の洗い条件を強くすると（溶液体

した一次抗体溶液に NC 膜を浸し，60分振とうする．

積を多くしたり，振とう時間を長くしたりする），バッ

４．NC 膜を TBS-T で５分間 2‑3回洗う．
５．二次抗体を TBS-T で希釈した溶液に NC 膜を浸し，20‑40分振とうする．

クグランドや非特異的なシグナルが弱くなる．
５．抗体濃度の設定法；一般的には，一次抗体の力価は大きく異なるので，それぞれの抗体について，最適な６．NC 膜を TBS-T 溶液で５分間３回洗う．

希釈度を決める．最適化することにより，力価の低い，７．NC 膜を検出試薬に１分間浸す．

もしくは非特異的な交差反応がある一次抗体を用いて８．NC 膜をビニル袋に入れ，ポリシーラーでシールし，も，きれいなシグナルが得られることがある．標準的

液体が外にもれないようにする．

な力価の抗体の場合，二次抗体の希釈度は標準に設定

９．NC 膜をＸ線フィルムにコンタクトさせ，シグナルし（例えば 10000倍），一次抗体を 500，1000，2000倍を検出する．一般的に検出時間は 30秒‑5分間である．

に希釈して検出する．最適と判断された一次抗体の希もしくは，CCD カメラ撮影装置でシグナルを検出す

釈条件で，次に二次抗体の希釈を変化させて検出する

る．

（この場合 5000，10000，20000倍）（図 3）．市販の二次抗体もロットにより力価が変わるので注意する．

6.h.2 ウェスタン分析の実験条件の検討項目
検出するタンパク質により，シグナルの検出が難しい場合があるので，実験条件の検討を行う必要がある．
１．SDS-PAGE の最適化；疎水性タンパク質を分離する場合，タンパク質の可溶化，分離ゲルの組成などを最適化しないと，バンドが不均一に広がり，シグナルがうまく検出できないことがある．例えば，6M 程度の尿素を分離ゲルに加えると改善することがある．また，10kDa 以下の小型のサブユニットを分離するときには，低分子ポリペプチド用の泳動システムを選択する（３章 6.a 参照）．
２．ブロッティング条件；疎水性タンパクをブロットする 時 は，ブ ロッティン グ バッファー (1L）
；3.03gTris base，14.4g glycine，0.5g SDS，20％(v/v)メ2009 低 温 科 学

vol.67

図 3：左；一次抗体の濃度のシグナルへの影響．二次抗体の濃度は一定である．一次抗体 500倍希釈では少しバックグラ
ンドが高い．2000倍希釈ではシグナルが弱くなる．
右；二次抗体濃度のシグナルへの影響．一次抗体の濃度は一定にし，二次抗体の濃度を変えた．二次抗体 5000倍希釈では，
バックグランドが高い．20000倍希釈でも強いシグナルが得
られる．

417

6.h.3 抗体の作製応する可能性があるので，注意が必要である．
サンプルを調整用電気泳動で分離し CBB で染色し，抗体はウェスタン分析の他にも免疫沈降，免疫染色な目的のタンパクのバンドを切り出す．切り出したゲルをどの実験に使われる．ここでは，最もよく使用されるウ

破砕してそのままウサギに免疫すると，力価の高い抗体

ザギのポリクローナル抗体を自分で作製する方法についができやすいと言われている．しかし，破砕したゲルはて紹介する．

粘性が高く，注射しにくい欠点がある．切り出したゲル

２週間ごとに４回ウサギを免疫すると，抗体ができるからポリペプチドを電気泳動的に抽出して抗原に使用しまで少なくとも２ヶ月かかる．抗体価をチェックするたてもよい．

め，３回目以降の免疫の１週後に試採血し，ウェスタン

6.h.3.2 ウサギ

分析でシグナルの様子を調べる．抗体価の上昇が頭打ち

抗体のできやすさは，ウサギの個体差が大きいので，になれば全採血する．場合によっては，さらに免疫を繰

2kg 程度の日本白色種ウサギ（Japanese White）オスをり返さなければならないが，10回程度行っても効果がな

２匹使用する．ウサギは購入後，環境に慣れさせるためいときは，必要な抗原の量にも限りがあるので，あきらに初回の免疫の１週間程前からケージで飼育する．3‑4

めることが多い．

ヶ月の飼育期間にほぼ２倍の体重に生長する．飼育には

6.h.3.1 抗原の作製

ウサギ用のケージを使い（図 4），汚物の掃除が便利なよ

一般に用いられる方法を述べるが，それぞれに利点と

うにケージの底に新聞紙を６枚くらい敷く．
１日に１度，

欠点があるので，研究目的に応じて選択する．

ウサギ用飼料を１合と水の補給を行い，新聞紙を交換す

a）大量発現る．冬場ならエサ以外は２日に１度でもよい．なお動物目的のタンパク質の全長もしくは部分配列を大腸菌に大量発現させる．大量発現したタンパク質が不溶性であ

実験は所属機関の動物実験規則・指針に従って実施する．
6.h.3.3 採血と血清の調整

ると，精製は容易でない．封入体（inclusion body）を単

免疫前チェック採血および３回目以降の免疫１週間後離してから精製することもある ．不溶性であってもにウサギの耳の静脈から採血する．慣れるまでは，２人

SDS-PAGE で分離し，ゲルを切り出して抗原として使で作業するとよい．

用できる．タグを融合したタンパク質を発現すれば，ア１．ウサギが舌を嚙まないように固定器に入れる（図フィニティーカラムクロマトグラフィーで精製できる．
b）合成オリゴペプチド

5）．
２．ウサギの耳を軽く叩いたり，マッサージしたりして業者に委託してオリゴペプチドを合成してもらう．特血行を良くし，採血しやすくする．血管が拡張すると異性が高い抗体を得ることができるが，抗体の力価は上

耳が赤くなるのでよく分かる．冬場は使い捨てカイロ

がりにくいことがある．合成オリゴペプチドは，目的のでウサギの耳を暖めたり，事前にウサギを運動させたタンパクの配列の中から，10‑15アミノ酸配列を選ぶ．こりするとよい．

の と き，キャリ ア タ ン パ ク の Keyhole Limpet

３．70％エタノールを含んだ脱脂綿で血管の周囲を消毒

Hemocyanin(KLH) をマレイミドベンゾイルオキシ
コハク酸イミド（MBS）で化学架橋させるため ，Ｎ末端にシステインを加える．オリゴペプチド溶液（100‑200
μg/ml）は 1ml ずつクライオチューブに分注し，冷凍保存する．1回の免疫注射に必要なタンパクは 100‑200μg
である．
c）生体から精製
SDS-PAGE で分離した後，CBB で染色可能な濃度のタンパク質が十分量あれば，精製して抗原として使用できる．タンパク質の全長配列に対する抗体であるので高い抗体力価が得られる可能性が高い．しかし，同サイズの他のタンパクの混入を許すので，ウェスタン分析による検出の際には交差反応によるシグナルが生じることもある．また，ホモロジーの高い他のタンパクとも交差反418

図 4：ウサギのケージ．ウサギの前にエサ箱，白い入れ物は給水器．

ウェスタン分析図 5：固定器に入れたウサギ

する．
４．2ml シリンジと 26G x 1/2（0.45x 13mm）の針を用意する．耳の静脈に血流と逆向きに針を刺して少な
くとも 1ml 採血する（図 6）．
５．採血後，乾いた脱脂綿で押さえながら針を抜き，出血を抑える．
６．注射器から針を外し，マイクロチューブに血液を入れる．
７．血液を室温で１時間，その後４℃で一晩静置し，血餅を形成させる．
８．ピペットで血清を新しいマイクロチューブへ移す．
９．マイクロ遠心機で 15,000rpm で５分間遠心し血餅を完全に除く．
10．血清に 1mM になるよう NaN を加え，４℃で保存

図 6：採血の様子．血流に向かって針を刺す．

する．
6.h.3.4 抗原注射液の調製
抗原とアジュバントを 1mL ずつ混合しエマルション（乳濁液）を形成させ，抗原注射液とする ．初回の免疫には加熱滅菌した結核菌体を含み，強力な免疫反応を引き起こす Freundʼs Complete Adjuvant を使用する．その後の免疫には Freundʼs Incomplete Adjuvant を使用
する．シリンジ中に残るなどして 0.2‑0.5ml ほどロスが出てくるので，少し多めに調製してもよい．

３．針を外し，他方のシリンジの連結管と接続する．
４．一方のシリンジの抗原溶液を他方のシリンジへピス
トンを押して移動する．
５．いったん連結管を外し，抗原溶液の入ったシリンジから空気を除く．
６．再度連結管に接続し，２つのシリンジのピストンを
左右交互に押し，エマルションを形成させる．
７．エマルションが十分に形成され，ピストンが固くなるまで数分間混合を続ける．

［抗原溶液の調整方法］

８．注射器に 19Ｇの針をつけ，免疫注射する．

抗原が溶液の場合
１．連結部があるガラス製の 2ml シリンジを２つ用意する．一方のシリンジには 19Ｇの針を，他方には連結管をつける．

抗原を含んだゲルを使用する場合
抗原を含むポリアクリルアミドゲルをアジュバントと混合して抗原注射液を調製する．

２．針の付いたシリンジでアジュバントを 1‑1.2ml 吸

１ 2mm 厚のゲルから切り出したタンパク質を含むゲ

い取り，空気を抜いてから続けて抗原溶液を 1‑1.2ml

ル片（2mm x 2mm x 150mm）２つを乳鉢に入れる．

吸い取る．
2009 低 温 科 学

２ 液体窒素を加えゲルを凍結し，乳棒で粉末になるま

vol.67419

で砕く．
３ 粉末が溶けるとペースト状になるので，マイクロス
パーテルでシリンジに移す．
４ シリンジにピストンを入れ，連結管をつける．
５ もう一方のシリンジに 19Ｇの針をつけ，
アジュバン
ドを 1‑1.2ml 加え，シリンジを押して空気を抜く．
６ ２つのシリンジを連結管に接続し，ピストンを左右交互に押し，エマルションを形成する．
７ エマルションが十分に形成され，ピストンが固くなるまで混合を続ける．
８ 注射器に 19Ｇの針をつけ，免疫注射する．
6.h.3.5 免疫
ウサギの皮下に抗原溶液を注射する．初回の注射にはFreundʼs Complete Adjuvant を使用しているため，自分の手を刺さないよう注意する．背中に注射する方法もあるが，ここではリンパ節の近い四肢の付け根，脇腹部に注射する方法を紹介する．
１．ウサギは足が滑ると暴れるので，作業台にタオルを敷くとよい．
２．ウサギを作業台に乗せ，目隠しをして落ち着かせる．
目隠しの上から頭を押さえ，もう一方の手でウサギの腰を押さえて動かないようにする．
３．ウサギの脇腹の皮膚を引っぱり，70％エタノールを含む脱脂綿で消毒する．
４．毛を湿らすと，皮膚が見えてくるので，針をウサギの身体に平行に刺す（図 7）．針の先が体腔で止まるよ
うにし，0.3‑0.4ml 注射する．これを左右の脇腹でそれぞれ３カ所注射する．出血したら，脱脂綿で押さえて止血する．
6.h.3.6 抗体価のチェック
抗体価は免疫回数を重ねるにつれて高くなるが，ピークに達したのちに低下することもある．最も抗体価が高い時期に全採血を行うために，３回目の免疫からは，免図 7：注射中の様子

疫１週間後に毎回試採血し，抗体価の変化をチェックする．主にウェスタン分析に抗体を使用するなら，ウェス

頚動脈を引き出し採血する．煩雑な作業なので少なくとタン分析で抗体価をチェックするのがよい（図 8）．オリも２名で行うことが望ましい．

ゴペプチドを抗原とした場合，オリゴペプチド溶液の希１ 全採血の前日には，ウサギに水は与えるが，エサは釈溶液を NC 膜上に 10μl 滴下しスポットをつくる．こやらない．

の膜を使って，1000倍希釈した血清と反応させ，ウェス

２ ハサミ，カンシ，ピンセット２本，10cm に切った裁タン分析と同じ方法でシグナルを検出すると抗体価の上

縫糸２本，解剖ハサミ，メスの柄はエタノールに浸け昇の様子がわかる．

て消毒する．また，21G の針の先端をＵ字に曲げたも

6.h.3.7 全採血
十分に抗体価が上がった段階で全採血を行う．50‑150のを用意する．
３ ウサギを固定器に入れる．

ml 採血できる．耳からの採血でも，10‑20ml の採血は可

４ ウサギの耳の静脈から注射で麻酔薬ネンブタールを能である．全採血ではウサギに麻酔をかけ，喉を開いて

1.5‑2ml 投与する．始めは 1.5ml 投与し，麻酔の効き

420

ウェスタン分析糸で３重に縛る（図 11）．そこから数 mm 距離をおいてもう一カ所糸で同様に縛る．
11 心臓に近い方で縛った糸をカンシではさんで頸動脈を少しもち上げる（図 12）．
12 縛った２カ所の間で，頸動脈をハサミで切る（図図 8：抗体力価のチェック
上；ウェスタン分析による試採血の血清の力価の検定．免疫前は何もシグナルが出ないが（pre），免疫回数が増加するに従って抗体力価が上昇するが，交差反応によるシグナル強度は低下している．下；別の抗体のチェック．５回目の免疫まで抗体価が上昇した．

図 9：表皮を左右からつまみ上げ，メスで切るが悪いようであれば残りの 0.5ml を追加する．麻酔薬
は血流に乗せるため，針を血管の流れと同じ方向に刺す．麻酔の濃度が急に上がってウサギがショック死しないように，静脈が麻酔薬で透明にならない程の速さ
でゆっくりと投与する．
５ 麻酔が効いてウサギがグッタリしたら固定器から出し，解剖台に仰向け乗せ，四肢と頭を固定する．
６ 70％エタノールを喉の周りの毛にスプレーして濡らしてからハサミで刈る．
７ 喉の皮を左右からピンセットでつまみ上げ，その真図 10：筋肉を切り開くと，食道の脇に頸動脈が走っているのがみえる．

ん中をメスで切る．さらに正中線に沿って顎から胸の鎖骨の根元まで皮を切り開く（図 9）．
８ 皮の内側にある腹膜を同様にピンセットで摘み上げてメスで切る．腹膜の下には血管が多く走っている．
細い血管は切っても構わないが，太い血管は切らないように注意する．
９ 腹膜の下の筋肉を，中心より少し左右どちらかよりに切り開いていくと（図 10では右側より），食道の大きな管が見えてくる．すると，食道の横やや背面よりに，沿うように直径約 1mm の頚動脈と白い神経が薄い膜に覆われて並んでいる（図 10）．メスで傷つけないように注意する．
10 頚動脈は丈夫なので，ピンセットで摘んで持ち上げ，2009 低 温 科 学

vol.67

図 11：頸動脈を頭に近い部分二カ所で三重に縛る421

図 14：頸動脈を鉗子で遠沈管に誘導する
図 12：鉗子で心臓側の縛った糸をつかんで持ち上げる

図 15：針で頸動脈に穴を開け，採血する
図 13：二カ所で縛った動脈の間を切る

16 採集した血液は室温に１時間，４℃で一晩静置し，
13）．

翌日に血清を回収する．

13 カンシで頸動脈（心臓側の切り口）を 50ml 遠沈管の口に近づける（図 14）．
14 Ｕ字に曲げた針で頸動脈に穴を開ける．このとき，血液が遠沈管の方向に飛び出るように穴を開ける（図15）．
15 血液が勢いよく出すぎると，血圧が急激に下がり心臓が止まることがある．
ピンセットで動脈をつまめば，血流を調整できる．血が抜けるにつれウサギの唇が紫に変わっていく．動脈に開けた穴が塞がって血液の出が悪くなったら，もう一度針で穴を開けてみる．また，心臓を手で押してマッサージすると，血液が出ることがある．さらに，ウサギの脚の固定を外して下半身を持ち上げりと，より多くの血液が回収できることがあ
る．

422

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ウェスタン分析

３章 単離・精製・活性測定

６．タンパク質
i．嫌気条件下でのタンパク質精製
藤田 祐一 ，野亦次郎

ニトロゲナーゼに代表されるように酸素と触れることで速やかに活性が失われるタンパク質が多数存在する．このようなタンパク質を活性型として精製するために必要とされる嫌気的条件での操作を紹介する．

Protein purification under anaerobic conditions
Yuichi Fujita, Jiro Nomata
Some proteins with oxygen-sensitive metallocenters such as nitrogenase are immediately inactivated upon
exposure to oxygen. Here we describe technical procedures for purification of oxygen-sensitive proteins underanaerobic conditions.

6.i.1 なぜ嫌気条件が必要なのかえられる．実際，ラジカル SAM とよばれるユニークな［4Fe-4S］クラスターをもつ O 感受性の酵素群が最近見

大気中には 21％の酸素（O ）が含まれており，これといだされ，光合成生物を含む多くの生物に広く分布する

平衡化した水溶液には 0.3mM（25℃）の O が溶存してことがわかってきた ．O に感受性を示すタンパク質のいる．たいていのタンパク質の酵素活性は，このような多くは，酸化還元反応に関わっており，光合成に関連す

好気的な条件によって失われることはないが，O と触れる酵素でも，生化学的な解析を進めるうちに，このようることで速やかに活性が失われるタンパク質も多数存在

な O 感受性酵素に出会う（出くわす），あるいは，既知

する．もっとも有名な例は，窒素固定反応を触媒するニの O 感受性酵素を取り扱う必要性が生じることもあり

トロゲナーゼである ．ニトロゲナーゼは，Fe-タンパク

うる．筆者らは，（バクテリオ）
クロロフィル生合成系で質と MoFe-タンパク質とよばれる２つのコンポーネン

機能する O 感受性の酵素として，ニトロゲナーゼと構トからなるが，これらいずれのコンポーネントも酸素に造的な類似性をもつプロトクロロフィリド還元酵素を研

触れると数秒から数分というオーダーで不活性化され究してきたので，ここに嫌気的環境のセッティングと嫌る

気条件下でのタンパク質の精製などについて紹介する．

．こういった O 感受性タンパク質の多くは，鉄と硫黄などから成る金属クラスターをもつ酸化還元酵素である．O は，これらの金属クラスターを破壊することで酵素を速やかに失活させてしまう．ニトロゲナーゼに限らず，酸素に触れることによってその金属中心が破壊され，

6.i.2 嫌気環境のセッティング
6.i.2.1 嫌気チャンバー

不活性化してしまう酵素やタンパク質がこれまでに多く

嫌気的環境は，市販の嫌気チャンバーを利用すること報告されている．光合成に関連するタンパク質では，光で確立することができる．筆者らの研究室では，アメリ

化学系の鉄硫黄中心 F /F を保持する表在性タンパ

カの COY 社（COY Laboratory Products Inc., Grass

ク質 PsaC が高い O 感受性を示し ，Fx を保持するコ

Lake,Michigan，日本の輸入代理店は東洋紡エンジニア

アタンパク質 PsaA/PsaB と再構成するためには嫌気条リング）の Anaerobic chamber（嫌気チャンバー）を愛件が必要とされる ．今後，新たな酵素やタンパク質につ

用している
（図 1）
．この嫌気チャンバーは，透明なビニー

いて生化学的な研究が進むにつれて，このような O 感ル（PVC vinyl）製で，水素ガスを少量（1〜5％程度）含受性を示すタンパク質の例がますます蓄積していくと考む窒素ガスで内部を満たして使用する．このため，エアロック（前室）（図 1a）に窒素ガスボンベ（高純度窒素；

１) 名古屋大学大学院生命農学研究科；さきがけ・JST
２) 名古屋大学大学院生命農学研究科：日本学術振興会特H ‑5％ CO ‑N バ ラ ン ス の 標 準 ガ ス；図 1c；CO はチャンバー内で光合成生物を培養することを想定して添別研究員

2009 低 温 科 学

純度 99.9999％以上；図 1d）と混合ガスボンベ（10％vol.67423

図 1：嫌気チャンバー（A）嫌気チャンバーの構成図．
（B）嫌気チャンバーで操作している著者．（C）前室付近．a〜e の記号は，
A と共通している．

加しているが，そうでなければ除外する．
）
それに，排気などによりわずかずつ混入してくる O を，効率よく除用の真空ポンプを接続して使用する．これらのガスボン

去し，チャンバー内の嫌気性を保っている．O 除去で生ベは市販されているが，混合ガスは基本的に受注生産な

じた水は，表面のアルミナに吸着保持されるため，１，ので，１ヶ月程度の納期を要する．

２週間おきにパラジウム触媒を乾熱処理（125℃，２時間）

6.i.2.2 嫌気性が確保される理由によって再生して使用する ．

嫌気チャンバー内部の O レベルがほぼ 1ppm 以下と6.i.2.3 嫌気状態のモニターいう嫌気的環境を保持することができるのは，嫌気チャ

内部の嫌気状態をモニターするために，酸素水素検出

ンバー内に設置しているパラジウム触媒（アルミナが器（ガスアナライザー，モデル 10，COY 社；図 1e）をコートされた塩化パラジウム）によって混入する O が設置している．この酸素水素検出器は，酸素レベルと水水素と反応して水に変換されて除去されているためであ素レベルを同時に計測できるので，嫌気チャンバー内のる．チャンバー内に少量の水素を導入しているのはこの

酸素レベル（ppm）と水素レベル（％）を確認するためためである．また，パラジウム触媒が置かれている触媒に設置している．

ボックス（図 1b）のファンにより内部の空気を一定の割

6.i.2.4 嫌気チャンバーへの器具などの取入れ

合でパラジウム触媒にふれるように常に循環させてい嫌気チャンバーへの器具などの出し入れは，ボンベとる．こうすることで，試料の出し入れや外部からの拡散真空ポンプが接続されているエアロックを経由して行

424

嫌気条件下でのタンパク質精製

う．チャンバーに入れたい器具などは，最初エアロック

また，チャンバー外にサーキュレータを設置し，チャンに入れ，エアロック内を嫌気状態にした後に，エアロッバー内部に電線を導入しているブチルキャップを通して

クとチャンバーとの間のエントリーポートを開けて本体

冷却水の循環系（循環する水はチャンバーの空気に接触へ入れる．このため，まず真空ポンプによるエアロック

しない）を作って冷却することも有効である．

内の空気の排出とガスボンベからの窒素ガスによるガス

6.i.2.6 溶液の調製

置換というサイクルを３回繰り返す（３回目のガスの流

大気と平衡化した溶液には，大量の O が溶存してい入は水素を含む混合ガスで行う）．
この一連のガス置換をる．したがって，嫌気操作で使用するためには溶液の溶行うことによりエアロック内の酸素レベルは 7,600ppm

存 O を除去しておく必要がある．前もって，窒素ガスを程度まで低下する（ガス置換操作で酸素レベルを０にす

パージすることで積極的に O を追い出すこともできる

ることはできない）．
こうして初めてチャンバー側のエアが，筆者らは，使用する溶液を１週間以上前にチャンバー

ロックを開き，エアロックに搬入した器具などをチャンに入れ，フタをゆるめて放置しておく．こうすることでバー本体側に移動する．同時に，この操作で，エアロッ嫌気チャンバーのガスと平衡化することで徐々に O を

ク内 に 残 存 し た O が チャン バー内 に 流 入 し，チャン除く．しかし，この方法では短期間には完全に溶存 O が

バー本体の酸素レベルは 260ppm 程度（チャンバー本体除去できない．このため，ほぼ全ての溶液に対し使用直の体積によって決まるが，この値はＡタイプのチャン

前にジチオナイト（亜ジチオン酸ナトリウム sodium

バーの場合）となる ．こうして不可避的に流入した O

hydrosulfite）を終濃度 1.7mM になるように加えるこは，上述のパラジウム触媒の作用で除かれて O レベルとで，完全に O を除去する．ジチオナイト溶液は，粉末

は 1ppm 未満（酸素水素検出器の読みでは 0ppm）が保を 0.1M NaHCO に溶解して調製するが，O と反応し持される．

て酸化していくため使用当日に調製する．また，ジチオ

タンパク質の精製や活性測定の操作では，多くのプラナイト粉末は，乾燥状態であれば空気中でも安定というスチック製の遠沈管やサンプルチューブを使用する．こことにはなっているが，保存には注意を要する．ジチオ

れらプラスチック製のチューブ類の取り入れには注意を

ナイトは強力な還元剤のため人工的な電子供与体として要する．まず，チューブ内には空気が入っているので，さまざまな酵素活性測定に利用されるが，活性が認めら

エアロックに入れる前にチューブ類のフタを開いておいれない時の原因がジチオナイトの変質によることが多て，エアロックでのガス交換でチューブの中の空気が置い．筆者らの研究室では，ジチオナイト粉末は嫌気チャ

換しやすいようにする．本体とフタを別々にしておくとンバー内で保存し，使用するときにはチャンバー内に設よい．また，プラスチック自体に O が溶け込んでいる．

置した小型電子天秤で秤量し，チャンバー内に保存してこれはチャンバー内で平衡によって徐々に除去するほか

いる 0.1M NaHCO 溶液に溶かして使用している．

ないので，使用する一週間以上前にチャンバーに入れておく．
6.i.2.5 チャンバー内での冷却

6.i.3 嫌気条件でのタンパク質の精製

タンパク質の精製では，タンパク質を低温に保つこと

精製しようとするタンパク質がどの程度の O 感受性が重要である．通常の精製操作では試料や溶液を冷却すを示すかによって，精製の過程でどの程度嫌気的環境のるために氷を利用するが，氷自体が大量の O を溶存し保持に注意を払うべきかが異なってくるが，ここでは，ているので，チャンバーに氷を持ち込んで使用すること

精製した状態で空気にさらすと１分以内に活性が消失すは，嫌気度維持という点で問題である．したがって，チャるという非常に高い O 感受性を示す酵素プロトクロロ

ンバー内でどのように低温を確保するための工夫を要す

フィリド還元酵素の還元コンポーネント L‑タンパク質る．筆者らは，氷に代わりにミラクルビーズをミニ恒温

を活性型として精製した例で記す ．L‑タンパク質は，ニ槽（e-Bucket EIB（３℃固定タイプ），TAITEC）で冷

トロゲナーゼの Fe‑タンパク質と構造的に類似してお却して利用している．これに加え，精製や活性測定に必り，Fe‑タンパク質と同様にホモ二量体当たり１個の

要なさまざまなストック溶液などを冷蔵するために，小［4Fe-4S］クラスターをもつ ．この鉄硫黄クラスターが型の冷蔵庫をチャンバー内に設置している．ただ，冷蔵O による不活性化のターゲットとなる．L‑タンパク質庫の排熱のためにチャンバー内部の温度が 30℃以上には，細胞破砕から精製，活性測定という一連の操作すべなってしまうので，チャンバーを設置している実験室をてにおいて嫌気条件を保持しておく必要があり，結果と適宜冷房し，チャンバー内部の温度上昇を抑えている．

して嫌気チャンバー内でほぼすべての操作を行う必要が2009 低 温 科 学

vol.67425

ある．また，チャンバーでの操作をできる限り簡便にする ．

るために，特異性の高いアフィニティタグを付加し，E.

6.i.3.3 酵素活性の測定

coli などでの大量発現系を確立しておくことが重要であ

酵素活性測定についても嫌気条件が必要であるため，る．筆者らは，Strep タグ（ストレプトアビジンとビオチ

酵素活性溶液の混合，分注をチャンバー内で行う．チャンとの相互作用を模した 8アミノ酸残基(WSHPQFEK)

ンバー内に適当な恒温槽が設置されていれば，全ての操から成るアフィニティタグ）をＮ末端に付加した融合タ作をチャンバー内部で完結させることができる．もし，ンパク質として E.coli や光合成細菌などで大量発現さチャンバーの外の恒温槽でインキュベートしなければな

せて精製を行っているらない場合は，小さなガラスバイアルにアッセイ溶液を．

6.i.3.1 集菌分注し，ブチルゴムキャップでしっかり密閉してからエ集菌の段階での嫌気状態への配慮も目的とするタンパ

アロックを経由して，チャンバーの外に出しインキュク質の感受性の程度によるので一概には言えない．しかベートを開始する．この場合，ブチルゴムキャップを装し，筆者らの経験では，E.coli は好気的に培養されても，着したり，エアロックを経由したりするため，溶液を混

細胞内部は比較的嫌気状態が保たれており，集菌操作自合してから恒温槽にセットするまでに数分のデッドタイ

体には嫌気条件を必要とせず，L‑タンパク質のような高ムがどうしても生じてしまい，短時間でのアッセイにはい O 感受性を示すタンパク質の場合でも，集菌は通常不向きである．反応を分光学的に追跡可能な酵素反応ののタンパク質の精製と同じようにチャンバー外で行うこ場合，蓋付きのブラックセルがあると便利である．嫌気とができる ．もし，集菌操作自体も嫌気条件を必要とす

チャンバー内で，ATP 溶液などの反応を開始させるた

る場合，嫌気チャンバー内で超遠心機用の遠沈管に分注めの溶液だけを除いて反応溶液を調製しブラックセルにし，超遠心機によって集菌を行う．超遠心機は，稼働中分注する．ATP 溶液（数 μl）を反応溶液に触れないようは真空ポンプによって高い真空度が得られる上，超遠心にセルの上部に付着させて，しっかりふたを閉めて，チャ用の遠沈管は気密性が高いため，超遠心操作でも嫌気的ンバーの外に出す．セルをたたいて ATP 溶液を反応溶条件が確保される．

液に混合して反応をスタートさせ，所定の波長の吸収変6.i.3.2 細胞の破砕と粗抽出液の調製化を経時的にモニターすることで容易に反応の初速度を

多くの酵素がもっとも失活しやすいのは，細胞の破砕

測定することができる．

の段階である．そこで，集菌した L‑タンパク質を発現す

6.i.3.4 嫌気条件での培養

る E.coli 細胞のペレットの段階で嫌気チャンバーに持

最後に，ラン藻や緑藻などの通常は好気的な条件で培ち込む．チャンバー内に前もって破砕用バッファー（要養する光合成生物を嫌気条件下で培養する方法を紹介す

冷却；100mM HEPES-KOH；pH 7.4，10mM M gCl ，る．液体培養では，通常のラン藻などの培養では CO レ

1M グリセロール，5mM EDTA，1mM DTT，10mM

ベルを１％から２％に高めた空気を通気して培養していβ‑メルカプトエタノール）を用意しておく．上述のようるが，この通気ラインの空気供給のライン（通常エアーに使用直前にジチオナイトを添加した破砕用バッファー

ポンプで送り出している）を窒素ガスボンベにつなぎ替

で細胞を懸濁し，嫌気チャンバー内に設置したソニケー

える．
通常の窒素ガスボンベは 47リットルに 150気圧程

ター（Sonifier 250,Branson）を 30秒間バースト（50％度で圧縮してあるので，1l/min で流し続けると５日弱

間欠出力）を３回（バースト間１分間恒温槽で冷却）繰

は連続して使用できる．ただし，窒素ガスを供給するのり返し，細胞を破砕する．得られた細胞破砕溶液を超遠で，培養室の換気には注意を要する．また，寒天培地の心用遠沈管に回収し，超遠心（37,000g，１時間；日立

場合は，GasPak（BBL GasPak 100 anaerobic systems,

によって上清画分を調製
RP50‑2 ロータ，30PC 遠沈管）

Becton Dickinson and Company,Sparks,M D；シャーする．この上清画分をチャンバー内に用意したアフィニ

レが 12枚まで収納可能）という嫌気性細菌培養用の専用

ティーカラム（Strep タグとの融合タンパク質では，容器を利用する．専用のパウチ（BBL GasPak Plus

Strep-Tactin カラム）にロードする．アフィニティーカ

Anaerobic System Envelopes with Palladium Cata-

ラムの操作は，O を含まない溶液を使うという点以外はlyst）に 10ml の水を添加し，GasPak に入れて密閉する

基本的にチャンバー外で行うのと同じである．タンパクと，容器内の空気から O が除去されて嫌気条件となる．

質をゲルろ過やイオン交換などによりさらに精製するために，小型のクロマトシステム（例えば ̈AKTAprime；

これは，水の添加により水素化ホウ素ナトリウムのタブ

GE）を嫌気チャンバーに持ち込んで使用する場合もあ

ウム触媒により嫌気チャンバーと同様の原理で O を水426

レットから水素が発生し，パウチに添付してあるパラジ

嫌気条件下でのタンパク質精製

に変換されて除かれるためである．このパウチでは，同時に CO も生成し水添加後１時間で４〜10％の CO レ
ベルとなり，光合成生物の成育を促進する．嫌気条件をモニターするため，メチレンブルーを発色指示薬とした試験紙（BBL Dry Anaerobic Indicator Strips）を容器内に入れておく．嫌気的になるとメチレンブルーが青から無色へと色が変化するので確認に便利である．パウチに水を加えて容器を密閉し，数時間で試験紙が無色になる．光合成生物の培養装置などの光条件下に容器ごとおくことで，嫌気的条件での光合成的培養が可能である．
この条件で，Rhodobacter capsulatus などの光合成細菌
を光合成的に生育させることができる．ヘテロシストをもたない窒素固定性のラン藻（Leptolyngbya boryana など）を窒素固定的に生育させることも可能である ．また，このような嫌気条件で培養することにより初めて単離可能となったラン藻の変異株の例もある ．

467.
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vol.67

Y.Fujita, J.Biol. Chem. 283 (2008)2684.

427

4章
分光測定

４章 分光測定

１．分光測定の基礎
小池 裕幸
分光測定は，今や生化学，分子生物学では欠かすことのできない基本測定法である．さらに，光合成の分野では光誘起の微少スペクトル変化の測定も，分光光度計を使ってなされる．本項ではこの分光測定の基礎と，その装置の仕組みを解説する．

Principles of spectrophotometry and measurement of action spectra andquantum yield
Hiroyuki Koike
Principles of spectrophotometry are described. Spectrophotometer is basically composed of three parts;lightsource, a monochrometer and a detector. Properties of the three parts are described in detail. Techniques tomeasure spectra of turbid samples and the samples at 77K are also described. Principles and techniques todetermine action spectra and quantum yields are described.

1.aと表すことができる．これを変形すると，装置と基本原理

光合成にはたらく物質は紫外・可視から近赤外に吸収− dI ＝kʼdl
Iを持つものがほとんどで，この領域の吸収スペクトルをとなり，両辺をそれぞれ I から I ，０からℓまで積分す測定できる市販の分光光度計が，標準の測定装置になる．

ると，

一方，光照射に伴う反応中心やシトクロム等の吸光度変

(4.2)

dI ＝
kʼ dl
I

(4.3)

装置を自作したりすることが多い（4.2 分光測定法で詳− lnI −lnI ＝kʼ
l

(4.4)

述）
．なお，測定試料はクロロフィルやカロチノイド等，−ln I ＝kʼ
l
I

(4.5)

−

化を測定する場合は，市販の分光光度計を改造したり，可視部に吸収を持つものがほとんどであるが，光合成細菌の場合は 1,000nm 付近まで吸収を持つ試料もある．

これを常用対数に直すと，また，透明なものばかりではなく，混濁試料の場合も多−log I ＝k lIい．本項ではこれらの測定法も含めて，装置の原理およ(4.6)

び試料の測定法について解説する．

という式が得られる（底の変換の結果出現する定数を kʼ

1.a.1 Lambert-B eer の法則に掛けたものを新たに k とした）．すなわち，透過光の強吸光度測定の原理は，単色光が試料を透過する間に吸収された光量を測定するものである．濃度 c（c mM ）の試料を吸収セルに入れ，これに強度 I の単色光が光路長さは被測定試料の長さが増加すると指数関数的に減少する．
ここで，透過した単色光の中にある溶質分子 n は，試ℓを透過したときに強度が I になったとする．単色光が試料中を dl 分だけ通過したときに吸収されて減少する
光量を−dI とすると，この量は微少区間 dl への入射光
量 I に比例し，また通過距離 dl にも比例する．したがって，−dI ＝kʼIdl１) 中央大学理工学部生命科学科

2009 低 温 科 学

vol.67(4.1)

図 4.1.1：光の吸収431

料の長さℓに比例するので，−log I ＝k n
Iダイオードを使い，検出部をコンパクトにしたものもみ(4.7)

られる．光電子増倍管は 900nm より長波長では感度がほとんどなくなるので，光合成細菌のように 1,000nmとすることができる．この分子数 n は濃度 c に比例する付近まで測定する必要がある場合には PbS セルと併用ので，している測定機を使う．検出された信号は増幅され，記−log I ＝k c
I

(4.8)

録される．以前はレコーダー上に直接記録するものが主流であったが，最近は測定値はデジタル化されて分光光と書き換えることができる．したがって，透過光の強さ度計付属のディスプレイに表示されたり，コンピュータ

は，溶液濃度が上がるに従い，やはり指数関数的に減少に転送されてグラフソフトで表示でき，データ処理が容する．

易になった．

以上のことから−log I /I は光の通過距離にも，溶液光源の濃度にも比例することが分かる．したがって，−log I /
I は両者の積にも比例するため，−log I ＝εcl
I

(4.9)

分光器

試料

試料

分光器

検出器

増幅器

記録計

分光光度計の構成は上のようになっているが，分光器と試料の順序を入れ替えて，試料に白色光を照射し，分と書くことができる．ここで，εは c をモル濃度で表した

光器で分光した後，フォトダイオードアレイで検出してときの比例定数で，吸光係数（extinction coefficient）

短時間の内にスペクトルを測定できる装置（ポリクロと呼ばれる．特に，c を mM で表したときの εは mM 吸メーター）も売り出されている．HPLC 用には，単一波光係数（milimolar extinction coefficient）と呼ばれ，長をモニターする検出器のほかに，このタイプのものも

実際はこちらの方が多用される．また，I /I を透過度よく使われる．

（transmittance）といい，T で表す．これを％で表した
ときには透過率（percent transmittance）と呼び，T ％と表現する．また，−log I /I を吸光度（absorbance）と

1.b

光源

いい，A で表す．したがって吸光度は，上にも述べたように，測定波長域をカバーする連続光I
A＝−logT ＝−log ＝εclI源が必要である．
〝連続"とは波長も，時間も切れ目のな(4.10)い（例えば輝線が非常に大きいとか，パルス的に光がでと表すことができる．この法則は Lambert-Beer の法則

るようなものではない）光源という意味である．光照射と呼ばれ，分光測定の基本となる．この法則が成立するで誘起される吸収変化を時間を変えて追跡するような場には，ａ）測定光は単色光で，ｂ）溶液は透明，ｃ）溶

合に，光源からの単色光をシャッターを用いてミリ秒や質の状態は濃度に依存しない（高濃度での分子同士の会

秒単位で切り，その強度を測定する場合もあるが，ここ

合や，逆に低濃度での解離が起きたりして吸光係数が変では割愛する．

化しない）という条件が必要である．

1.b.1 重水素放電管

1.a.2 機器の構成

放電管中に数 Torr 程度の重水素を封入し，この中で分光光度計には光源，分光器，検出器の３つが必須で放電を行うと 170〜400nm にわたって連続した発光ス

ある．これは可視・紫外吸収スペクトル測定用の分光光ペクトルが得られる．発光部は放電電極を取り囲むよう度計だけでなく，蛍光光度計（蛍光を出す試料が光源にに遮蔽ケースが置かれ，電極部に穴（ピンホール）が開相当する）や，赤外分光光度計，放射光施設を用いたいている．放電による発光はこの穴で起こる．このよう

XENES 測定でも基本的に同じである．通常の紫外・可視な重水素放電管を紫外部の吸収スペクトル測定用光源と分光光度計の場合は，光源として測定波長領域で発光がして用いる．生物試料用の紫外可視分光光 度 計 で はあるもの，すなわち重水素放電管，タングステン・ハロ

190〜370nm の波長領域で用いられる．なお，可視部のゲンランプ，キセノンランプを用いる．光源からの光は486.5nm にも輝線があり，これは波長駆動部の波長校正分光器（モノクロメーター）で単色光にして試料に当てなどに使われる．

る．分光器は現在ほとんどの場合，回折格子が用いられ

1.b.2 タングステンランプ(タングステンヨウ素ランプ)ているが，プリズムを組み合わせる場合もある．検出器

可視光領域の吸収スペクトル測定に用いられる光源でとしては光電子増倍管が普通用いられる．最近はフォトある．通常の測定波長領域は 370〜900nm だが，検出器

432

分光測定の原理と作用スペクトル・量子収率の測定

図 4.1.2：重水素ランプの発光スペクトル

図 4.1.4：キセノンランプの発光スペクトルを交換してさらに近赤外部までこの光源で測定出来る．

使う例はあまりない．しかし，発光スペクトル（図 4.1.4）

タングステンランプは，平たく言うと普通の白熱電球で，に示すように，近赤外部に輝線があるものの，400〜750

以下のような特徴を持つ．①連続スペクトルを示す②赤

nm にかけてほぼフラットな発光強度が得られるので，〜赤外部で強度が最大になる③輝度が高い④長時間安定

酸素発生型光合成生物から調製された試料の測定に有利に点灯できる．放射スペクトルは，ほぼ黒体放射の式にである．ただ，一般的に発光強度が強く，長時間の照射従う．すなわち，放射エネルギーの波長特性は発光体温

は試料を損傷したり，測定光が励起光になって試料中の度に依存する（図 4.1.3）．

電子伝達成分が酸化や還元される．そのため，測定光用

ハロゲンランプ（ヨウ素ランプ）は，タングステンラには，ニュートラルデンシティフィルター（減光フィル

ンプのフィラメントの寿命を延ばし，発光温度を高くでター）で減光したり，シャッターを用いて試料励起の前きるようにしたものである．フィラメントに電流を通し後のみにあてるといった工夫がいる．キセノンランプはて発光させるとタングステンが気化する．気化したタン

発光管内部に 10気圧程度のキセノンを封入し，電極間のグステンが，ランプの低温部でハロゲン（ヨウ素）と結放電で発光するので（図 4.1.5），発光面の揺らぎで光強合し，ハロゲン化タングステンが出来る．これがフィラ

度が微妙に揺らぎ，微少な吸光度変化の測定にはあまりメント付近の温度で分解して元に戻る．このため，フィ適さない．数ミリ秒から数十ミリ秒程度の短時間なら発ラメントから気化したタングステンが絶えずフィラメン

光面の変化は小さいので，フラッシュ励起後の短時間内トに供給されることでフィラメントの消耗が抑えられ，の測定で，強い測定光を必要とする測定には用いられる．

フィラメント温度を高くして発光ピークを短波長にすることができる．
1.b.3 キセノンランプ
キセノンランプを吸収スペクトル測定用の光源として

1.c.1 分光器
連続スペクトルを示す光源から分光光度計に必要な単色光を取り出すための装置が分光器である．現在使われている主な分光器は反射型回折格子とプリズムである．
それぞれ一長一短があるが，回折格子の方が分光光度計の波長駆動装置を単純化できるので，現在はこれが主流である．

図 4.1.3：タングステンランプの発光スペクトル2009 低 温 科 学

vol.67

図 4.1.5：キセノンランプの構造433

図 4.1.6：回折格子と回折光の反射

1.c.1 回折格子
回折格子は，図 4.1.6に示すように，反射面に階段状の溝が一定幅で精密に刻まれた鏡である．回折格子に入射した白色光はそれぞれの溝で回折され，色々な方向に出ていく．回折光はそれぞれ互いに干渉し合い，位相が合わない大部分の波長光は弱めあい，特定波長の光が特定角度で回折された場合のみ強めあい，その波長の光が出る．この強め合う干渉波長は角度により連続的に変わるので，白色光がいわゆる虹色に分光される．
いま，回折格子に入射角 αで白色の平行光線が入ってきたとする．この時格子面で回折された光が回折角 βで反射して出ていくとする．この時互いに強め合う干渉が起こるためには，光の位相がＰ点とＢ点で揃っていなけ
ればならない．そのためには，線分 AO＋線分 OB が波長

図 4.1.7：回折格子を使った光学系．文献⑴を改変

λの整数倍にならなければならない．
AO＝dsin α， OB ＝dsin β(4.11)

であるから，光が強め合う回折条件は，
d sin α＋sin β ＝nλ

実際の回折格子を使った分光器では，図 4.1.7に示す
ように５つの代表的な光学系が使われている ．上の２つは出射側にもスリットがつけられているので，単色光(4.12)が取り出せ，モノクロメーターとして使われる．また，下の３つはモノクロメーターとしても使えるし，虹色にと表せる．ここで，λは波長，n は整数で，干渉次数と呼広がった複数波長の光を取り出すポリクロメーターとしばれる．

ても使うことができる．

いま回折角 βが β＝−α，すなわち普通の鏡と同じよ上の式で示した回折条件は，n＝1の時だけではなく，

うに反射する場合，左辺が０なので，右辺は n＝0とな

n＝2，3，……の場合も成立し，これらの波長の光を高次る．この条件下では，波長 λの値に依存せず上の式が成光と呼ぶ．高次光の回折効率は非常に低いが，試料が λ立する．これは０次光と呼ばれ，白色光が反射して出ての波長域の光を強く吸収するような場合には，吸収を受行くことになる．次に n≠0の時は，波長 λが変わると回けない高次光が測定され誤った測定結果が得られる場合

折条件（干渉を強める条件）を満たす回折角 βが変化すがある．この点については 4.2.2.b で解説する．

る．このため，回折格子の角度を変えることで白色光を1.c.2 プリズム

波長ごとに分離できる．
434

小学校の理科の授業でも出てくるプリズムである．ガ
分光測定の原理と作用スペクトル・量子収率の測定

ラスの三角柱（石英でも透明アクリルでもよい）に光を高抵抗の半導体に，入射する光の強度が増加すると電気通すと，屈折率が波長によって異なるのを利用して光を抵抗が下がるという性質を利用している．フォトダイ

分離できる．

オード，CCD といった光起電力効果を利用する検出器も

図 4.1.8(b）にプリズムを通る光線の光路を示す．いま最近増加している．

プリズム面の法線に対して角度 αで白色光が入射し，屈1.d.1 光電子増倍管

折されて角 βでプリズム内を進み，反対側の面に角 βʼで光電子増倍管は，真空中で金属に負電圧をかけておき，

到達し，再び屈折されて角 αʼで分光された光が出るとこれに光を当てると電子が放出される光電効果を利用しする．また，入射光と出射光のなす角を θ，プリズムの頂たものである（図 4.1.9）．光電効果で光の粒子性を証明

角を A とする．この時，したことでアインシュタインはノーベル賞を受賞した．

sin α＝nsin β(4.13)＝nsin βʼsin αʼ

(4.14)＝A＋θ
α＋αʼ

(4.15)＝A
β＋βʼ

(4.16)

光電子増倍管のガラス容器（バルブ）内の真空中に，
光電面と２次電子放出電極とが納められている．光電面に入射した光は，光電効果で運動エネルギーを持つ電子を光電面から放出させる．これが光電子増倍管への印加
電圧で光電面に対して正極になっている増倍電極（ダイが成立する．ここで，n はプリズムの屈折率である．このノード）に衝突し，２次電子を放出させる．光電面から式において，α＝αʼ，β＝βʼのとき θは最小になり，これ１光子当たり１電子放出された電子は，さらに増倍電極を最小偏角という．普通プリズムは最小偏角か，それにから数倍の２次電子を出す．何段もの増倍電極で，衝突近い条件で使用される．

のたび毎に電子が増幅され最後に陽極（アノード）に達

プリズム分光器は回折格子と違って，原理的に高次光する(図 4.1.10)．ダイノード１段当たりの電子放出比がが混入しないのできれいな単色光を取り出せるという利４で 10段のダイノードで増倍すれば，4 ≒10 倍の電子点がある．ただし，光の分解能は波数（波長 λの逆数）増幅率となる．

に比例するので，紫外部の分解能は高く赤外域の分解能

光電子増倍管には，真空ガラス容器（バルブ）の側面は下がる．しかし，通常の紫外・可視分光光度計ではスから光が入るサイドオン型と頭端部から入るヘッドオン

ペクトルは等間隔に目盛った波長に対してプロットされ型がある(図 4.1.11)．サイドオン型では光が当たると内るので，これを機械的に補正しようとすると，プリズム部金属電極上の光電面から光電子放出が起こる．一方の駆動系は回折格子の場合より複雑になる．

ヘッドオン型では入射ガラス窓内面の光電面から光電子が放出される．大部分の市販分光光度計はサイドオン型

1.dを採用している．ヘッドオン型は，本体を試料に近づけ検出器散乱された測定光も有効に捕捉できるので，混濁試料も紫外・可視分光測定に用いられる検出器の主流は光電子増倍管である．これは光の光電効果を利用したもので測定できる分光光度計や，微弱光測定用の検出器として使われている．

あり，光電子を増幅して検出するものである．もう一つ

光電子増倍管の感度は，使用する光電面により異なは近赤外光領域で用いられるフォトセルである．
これは，る ．紫外部にのみ感度があるものや，逆に近赤外の方が

図 4.1.8：プリズムの形状（a）と光路の説明（b）

図 4.1.9：光電効果

2009 低 温 科 学

vol.67435

図 4.1.10：光電子増倍管の原理

各電極間の適当な電位操作により，蓄積電荷を転送して読み出して，各チャンネルの電気量（入射光量）を測定する．CCD を使うと，回折格子（ポリクロメーター）で分離され虹色に広がった回折光全部を一挙に測定できる
ので，短時間でスペクトルを測定できる．この利点を生かして，時間ごとに次々と変化する試料の吸収スペクト
ルをほとんどオンタイムで測定でき，HPLC のモニターとしてよく使われている．また，回折格子を回転させないので，分光光度計の駆動部分が不要で，故障が減る．
広い波長範囲をカバーするために，通常のイメージセン
サより波長領域の広い 200〜700nm に感度を持つものが使われる．

1.e
図 4.1.11：サイドオン型とヘッドオン型光電子増倍管の構
造

分光光度計

これまで分光光度計で心臓部をなす各部品について解説してきた．分光光度計の構成は，基本的にこれら３つ感度が高いものがあり，用途に応じて（蛍光測定等）使の装置に，増幅器と記録計を繫げたものである．
したがっい分ける(図 4.1.12)．

て，原理を理解すればこれらを組み合わせて分光光度計

1.d.2 P bS セル

を自作する（組み立てる）ことも可能である．本節ではPbS セルは半導体光検出器の一種で，900nm 以上の波長範囲のスペクトル測定に用いられる．高純度の半導分光光度計での測光法と光学系について例を示して解説する．

体または不純物をドープした半導体が，光を吸収したと原理のところで述べたたように，ある溶液の吸光度をきに電気伝導度が変化することを利用して光の検出を行測定するためには，試料入射前の光強度（I ）と，試料透うものである．光電子増倍管の感度は 900nm 以上では

過後の光強度（I ）を測定する必要がある．通常の吸収ス

急速に落ちるため（図 4.1.12），近赤外部のスペクトル測

ペクトルの測定では，試料を透過した光（I ）と，対照を定にはこの PbS セルが使われる．PbS セルは常温では透過した光（I ）の強度比を取り，吸光度を計算する．こ2,500nm まで感度があるので，光合成細菌の吸収スペク

れには二つの方法がある．①まず測定光に対照試料をおトル測定には十分な感度を持つ．

いて I を測定する．次に試料をおいて I を測定する．こ1.d.3 C C D 検出器の比の対数を取り，吸光度とする．これはいわゆるシン

CCD とは Charge Coupled Device の略で，電荷結合

グルビームによる測定である．②もう一つは，測定光を素子と訳される．CCD は半導体の基板表面にシリコン酸

二つに分け，一つは対照試料の入ったセルを通った光の化膜のような絶縁膜を薄く貼り付け，その上にさらに多強度を測定し（I に当たる），もう一つは測定試料の入っ数の電極を配した構造をしている．フォトダイオードをたセルを通った光の強度を測定して（I に当たる），これ

小さくして（必然的に受光面積は小さくなる）多数配列

を一つあるいは二つの検知器で検出して吸光度を求めるさせたというイメージである．各チャンネル（素子）にものである ．これはダブルビーム方式と呼ばれ，自記分入力した光は電気量に変換されて蓄積される．この後，

光光度計はこの方式が採用されている．検出器は一つの436

分光測定の原理と作用スペクトル・量子収率の測定

図 4.1.12：光電子増倍管の感度曲線

出典：浜松ホトニクス株式会社(文献（2）)

ものが主流である．検出器が一つの場合，試料を透過した光強度に対する信号と，対照を透過した光強度に対する信号を別々に検出しなければならない．これには，モノクロメーターから取り出した単色光のビームを二つに分け，試料と対照とを交互に（時間的に分割して）入射させ，検出器からの信号を試料側と対照側の信号とに分離増幅し，吸光度に変換する方式がとられる．光束の分割は，回転する半円鏡（セクター）とその後ろの固定鏡によって行う（図 4.1.13a，b，c，d）
か，振動鏡（図 4.1.13
2009 低 温 科 学

vol.67

図 4.1.13：ダブルビームの作り方

文献（3）を改変

437

図 4.1.14：島津 MPS-2000 の光学系

文献 (4) を改変

g）によって行う．測定光を分割する装置をビームスプ

ローセルを通った後に分光するので，フローセルを通過

リッターと呼ぶ．試料透過後の光はミラーあるいはハーする成分の吸収スペクトルを逐次測定していくことがでフミラーで光束を揃え，検出器の同じ位置に入射させる．

きる．そのため，単一波長のモニターでは見逃すような，

1.e.1 分光光度計の光学系

予想外の波長にピークを持つ成分の検出も可能になっ光電子増倍管を検出器として用いた分光光度計の光学た．モニターしたスペクトルを時間に対してプロットし系の一例として島津 M PS-2000 の光学系を図 4.1.14にていって，三次元表示を行うことも広く行われている．

示す ．測定光源である，重水素ランプ（D ）またはタン

これはコンピュータの性能が飛躍的に向上したためで，グステンヨウ素ランプ（WI）からの光は，測定波長範囲

フォトダイオードアレイ型検出器が広く使われるようににあわせて，ミラーの挿入によって選択される．その後なった要因の一つである．

分光器の入射スリットを通って凹面鏡（コンケイブミ
ラー）で平行光にされた後，グレーティング（G）で分光される．この光がもう一つの凹面鏡で出射スリットに集光され，単色光として取り出される．この光はセクター
ミラーで分割されて試料または対照光として別のキュベットを透過し，一つのヘッドオン型光電子増倍管で測定される．
フォトダイオードアレイ検出器を用いた分光光度計の光学系の原理を図 4.1.15に示す．これは HPLC や，カラムクロマトグラフィーのモニター用として使われる分光
光度計の例である．
従来は，分光器で単色光にしてフローセルに通していたため，単一波長での溶出曲線しか取れず，分離された全ての成分を感度よく捉えるための波長を選択するのはほとんど不可能だった．しかしフォトダ
イオードアレイ検出器を使ったものでは，白色光がフ438

図 4.1.15：クロマトグラフィーモニターに使われる光学系

分光測定の原理と作用スペクトル・量子収率の測定

図 4.1.16：フォトダイオードアレイ型モニターの光学系 文献（5）を改変

フォトダイオードアレイ型検出器を使った，実際のモニターの光学系の例を図 4.1.16に示す ．測定光源であるタングステンランプからの光と重水素ランプからの光
は，フィルターを兼ねたハーフミラーによって完全に同一の光軸上に載せられ，紫外から可視までの光を含む白図 4.1.17：透過率と吸光度の関係

色光としてフローセルを通過する．この後，グレーティ
ングにより分光され，512素子のフォトダイオードアレ

あり，吸光度の値を読み取るのは非常に簡単になっていイに結像させて吸収スペクトルを測定する．

る．分光光度計の検出器からの直接出力は対照および試料を透過した光の強度に比例した電流値である．この時，

1.f 吸収スペクトルの測定

通常は対照からの透過光の出力（電流値）を 100％T にしておくので，試料からの透過光の出力は透過率に相当

吸収スペクトルを測定する場合，まず試料側，対照側

する値になる(図 4.1.17参照)．
もし試料を透過率（T ％）ともに同一試料（通常は水あるいは緩衝液）を入れて，で測定するのなら，測定誤差は測定値全範囲で一定にな

吸光度を波長に対して記録させる．これをベースライン

る．しかし，吸光度の計算法（A＝−logT ＝−log I /I ）と呼び，原理的には吸光度ゼロの直線が引かれるが，使から，吸光度の値は濃度 c に比例するので，T の誤差は用しているセルのマッチングが悪かったり，セルの微少

一定でも，−logT の誤差は一定にはならないので，吸光な汚れやキズ，ビームが完全に対照になっていないため

度値は全ての範囲で測定誤差は同じにはならない．

の微妙な光強度，光の純度の違い，検知器への測定光のいま濃度の相対誤差 Δc/c と ΔT との関係は，入射のしかたが同じでない，等で凹凸を示す．大半の市販自記分光光度計はこのベースラインをまず測定器本体

ΔT ＝
A＝−lnT ＝εʼ
cl −
εʼ
Δcl
T

のコンピュータに記憶させて，吸光度０の値として補正となる．ここで，εʼは，常用対数ではなく，自然対数で表する．次に試料側に測定したい試料を入れて波長をスしたことによる係数を含んでいる．上式の両辺を εʼ
cl でキャンし，対照試料に対する吸収曲線（ベースライン）

割ると，から引いて，試料の吸収スペクトルとする．
1.f.1 測定誤差
最近の分光光度計は，吸光度表示は全てデジタル表示になっている．表示範囲も０〜２または４というものも2009 低 温 科 学

vol.67(4.17)

Δc ＝− ΔT ＝ ΔTc
T εʼcl T lnT(4.18)

1
Δc/c
＝
≡F
ΔT
T lnT

(4.19)

439

.1.19：吸収スペクトルに対する迷光の影響

文献（6）をが強い波長でも迷光の影響が出やすい．
外部の場合，正しくは図 4.1.19の曲線 A のようなスペクトルを示すものが，長波長の迷光で曲線 B や
図 4.1.18：測定値の相対誤差

C のように，あたかも吸収ピークを持つようなスペクト
ルを示すことがある．また，本来吸収がない 750nm 付近となる．この F を誤差関数といい，透過率の誤差（ΔT ）（曲線 D）
で，長波長になるに従って吸収があがるスペクを１％としたときの F と T の関係は，図 4.1.18のようトルになることがある．これは，混入している短波長のになる．この時の極小値は，迷光を試料が吸収するためである．

d T lnT＝lnT ＋ T ＝lnT ＋1＝0
dT
T

（4.20)−lnT ＝1，lnT ＝−1，T ＝e ，T ＝0.368 (4.21)

また，検量線を作成する場合，ある吸光度以上で検量線が直線から下にずれることがある．これも迷光の影響であることが多い．

つまり，36.8％T（A＝0.434）のところで誤差が最小と迷光の影響を減らすには，迷光の少ないモノクロメーなる．このグラフから，吸光度測定を行うときは，誤差ターを使う，測定波長範囲で十分な感度を持つ光電子増の小さい 10〜80％T （A＝0.1〜1.0）の範囲に試料濃度倍管を使う，モノクロメーターの入射側に適切なフィルを調整した方がよいことになる．

ターを入れて高次光を除く，等が対策となる．

ただ，最近の分光光度計は透過率の測定誤差がもっと低く抑えられているので，より高濃度部分での測定値もかなり信用できる．
しかし，常に心がけておかねばならないのは，表示さ1.f.3 混濁試料の測定
光合成生物由来の試料には不透明なものが多い．光合成細菌や藻類などの生細胞や単離したチラコイド膜はそのよい例である．通常の分光光度計は透明試料を測定す

れる吸光度の値はゼロ付近と高い吸光度の所では測定誤差が大きいことである．デジタルで表示された値をそのまま信用してはならない．
1.f.2 迷光の影響
単色光には，モノクロメーターの構造と，入射および出射スリットの幅に依存した，ある波長幅を持った光が含まれている．また，モノクロメーター内部で乱反射した光が単色光と同じ光軸で出てくることもある．
さらに，
グレーティングを使って単色光を作る場合，除去しきれない高次光が混ざっている．これら単色光に含まれる，
目的としない光を迷光と呼んでいる．測定したスペクト
ルに迷光の影響が現れやすいのは，紫外部と近赤外部である．それは，グレーティングの回折効率がこれらの領域で悪くなり目的とする単色光の強度が落ちることと，
光電子増倍管の感度が下がることによる．また，試料の440

図 4.1.20：混濁試料を透過する測定光

分光測定の原理と作用スペクトル・量子収率の測定

るために作られている．そのため，試料と検出器（光電こととほぼ同じになる．したがって，検出器では対照側，子増倍管）間の距離が比較的遠い．また，使われている

試料側ともに入射光の一部のみが測定され，その結果試

光電子増倍管はサイドオン型なので，受光面積が狭く受料の吸収スペクトルにほぼ忠実な測定光の信号が得ら

光範囲が散乱に影響される．

れ，懸濁試料の吸収スペクトルが測定できる．図 4.1.22

混濁試料は，母液中に微小な粒子が浮遊している状態の曲線Ａは，通常の測定法でクロレラの懸濁液を測定しと考えることができる．いま，混濁試料に平行な測定光

た場合で，特徴的な吸収スペクトルが得られない．
オパーが入射された場合を考える．この時測定光 I について，

ルグラスを対照，試料両側に挿入して測定すると曲線Ｂ①試料中の粒子に一度も当たらずに素通りする（I ），②のスペクトルが得られる．これはクロレラ懸濁液から有粒子に当たって吸収が起こり，吸収され残った光が前方

機溶媒で色素を抽出した，透明な溶液の吸収スペクトルに散乱される（I ），③吸収され残った光が後方に散乱さ（曲線Ｃ）とよく似ている．普通の分光光度計を使って混れる（I ）の３つの場合が考えられる．実際には，I は無濁試料の吸収スペクトルを測定する際には，オパールグ

視できるので，試料からの透過光の強さは I と I の和ラスを使うのが有効であることが分かる．

と考えて差し支えない．ここで，I はそのまま透過して問題点としては，オパールグラスによって対照光も散きた光なので，平行光として検出器に入射される．一方

乱されるため，光電子増倍管に入射する光量がかなり低I は散乱光なので，円錐状に後方に散乱されていくこと下する点である．対照光が絞られると，感度を上げるたになる．通常の分光光度計は，試料と検出器の間が離れめに光電子増倍管への印加電圧が高まり，それに伴うノているので，I は全量を検出できる（そのように設計さイズが多くなる．特に光電子増倍管の感度が低下する短れている）が，I はその一部分のみが検出されるだけである．散乱光強度 I にかかる係数 f は，分光光度計の検出器（光電子増倍管）が捉える散乱光の割合で，試料と検出器間の距離が長くなると f は距離の自乗に反比例して急激に小さくなる．普通の分光光度計の場合，この値は数百分の１のオーダーになるため実質的に fI はゼロで，吸光度 A は試料に吸収されたかどうかということとは無関係に，I /I で決定されることになる．さらに，
I /I は波長にほとんど依存しないので，波長による変化がほとんど見られないスペクトルとなってしまう．
懸濁試料の吸収スペクトルが正しく測定できないのは，試料によって測定光図 4.1.21：オパールグラス法の原理

I
I
I
A＝−log ＝log ＝log ＋I
I
I fI
ここで，I ＝I ＋fI ，0 f

(4.22)

1である．

が散乱されるためである．その解決策としては，①対照試料の測定光も同じように散乱させる（I も同じような散乱効果を与える）か，②検知器を試料に密着させる（fの値を１に近づける）．①には，積分球を使う方法と，オパールグラスを使う方法がある．②には，このために設計された特殊な分光光度計が必要となる．
① オパールグラス法
オパールグラス法は，通常の分光光度計を使って比較
的 簡 便 に 吸 収 ス ペ ク ト ル を 測 定 す る 方 法 で あ る(図4.1.21)．オパールグラスは不透明に近い散乱板で，平行光（対照試料からの測定光）も，散乱光（混濁試料からの測定光）も区別なく一様に散乱させるので，試料，対照とも同じ程度に混濁した試料が入った状態で測定する
2009 低 温 科 学

vol.67

図 4.1.22：オパールグラス法による測定例 文献（7）を改変

441

波長側でその傾向が目立つようになる．

底状態または第１励起状態に落ちる．光の吸収による電② 検出器密着法子状態の遷移も，室温では様々な振動準位から遷移する

もう一つの解決法として，散乱光も捉えて吸収スペク

ため，吸収スペクトルの半値幅は広く，吸収ピークは低トルを測定する方法である．このために光電子増倍管をくなる（図 4.1.24左）．一方低温では，低い振動準位に試料セルに密着させて，散乱光をほとんど全て捉える方

多くの電子が存在している状態から，光の吸収で励起状法が工夫されている．これには，受光面が広く，かつ平態に遷移するので，半値幅が狭く，ピークは高くなる．

面になっているヘッドオン型光電子増倍管が使われる．

また，低い振動準位から励起状態に上げるために，室温

この場合，対照は通常透明な溶液を使うので，対照光はより多少高いエネルギーが必要になり，吸収ピークは室

光電面の一部だけに強く入射するので，その場所だけが

温より短波長側にシフトする（図 4.1.24右）．したがっ

激しく劣化する危険性がある．また，なるべく広く光電て，低温で吸収スペクトルを測定すると吸収型（吸収面を使う方が場所による感度差が少なくなるので，石英フォーム）の違いが室温より明瞭になる．

板をスリにして（磨りガラスと同じだがガラスは紫外線

実際に葉緑体の吸収スペクトルの測定例を図 4.1.25を透過しないので石英ガラスを使う），
セルの後ろまたはに示す ．室温では 680nm 付近に一つのなだらかなピー

光電子増倍管の前に置いて測定光を散乱させて測定する

クを示すだけだが，液体窒素温度 77K ではピークが鋭のが普通であるが，これでも問題は完全には解決されな

くなり，いくつかの肩が見られるようになり，同じクロい．これらの問題をある程度解決する方法として，光散

ロフィル a でもタンパク質に結合した状態ではその吸乱させる磨り石英板と光電子増倍管の間をある程度離し収ピークがいくつかの型（クロロフィルフォーム）に分て測定するという工夫がなされている（図 4.1.23）．このかれるのが見て取れる．

ような光学系の例を，図 4.1.14に示した．
1.f.4 低温吸収スペクトル

低温といっても，数 K から 273K（0℃）まで広いが，液体窒素温度（77K）またはドライアイス ⎜ メタノー

紫外・可視領域における吸収スペクトルは，測定分子の，基底状態から励起状態への電子状態の遷移を測定するもので，電子スペクトルに相当する．
ところで，分子が持つ内部エネルギーには，回転，振動，電子の三種類がある．紫外―可視吸収スペクトルの測定はそのうちの電子エネルギーの遷移を測定するものだが，それぞれの電子状態はその準位内に振動と回転準位を含む．振動準位間の遷移は室温程度の熱エネルギーで容易に励起されるので，基底状態にある分子の電子状態中にも，広い振動準位の分布がある．これを低温（たとえば 77K）に冷却すると，電子の多くは振動準位の基
図 4.1.24：室温と低温における分子のエネルギー準位と遷移および吸収スペクトル

図 4.1.23：検出器密着法442

文献（8）を改変

図 4.1.25：葉緑体の室温と液体窒素温度での吸収スペクト
ル 文献（9）を改変

分光測定の原理と作用スペクトル・量子収率の測定

図 4.1.26：低温スペクトル用サンプルホルダー（1)ル温度（−79℃）での測定が簡便なためよく用いられる．
本項では，液体窒素温度での吸収スペクトル測定に必要な付属装置について述べる．液体ヘリウム温度または寒剤のみでは到達できない温度での測定には通常クライオ
スタットが用いられる．この装置はやや高価で，複雑である．生体試料の低温スペクトル測定の詳しい解説は他の成書を参照していただきたい．

液体窒素温度での測定には専用のデュワー瓶（魔法瓶）を使用する．普通のデュワー瓶は保温性を上げるためにメッキが施されているが，吸収スペクトル測定用では測定光の通路部だけ窓状，または帯状にメッキしていない

図 4.1.27：低温スペクトル用サンプルホルダー（2）文献（11）を改変ものが用いられる．
サンプルホルダーは，
図 4.1.26に示したようなものが飛んだり，吸収スペクトルが異常になったりする．これ一般的である．
図 4.1.27はサンプルホルダー全体を横かを避けるために，試料を−50℃ぐらいまでいったん暖めら見た図である ．これは，アルミ板に四角く窓を開けた

る．すると突然白濁し，氷の微結晶ができて試料がオパー

ものに，サンプル保持用のアルミ枠をアクリル板で挟ん

ルグラス状になり，安定した状態になる．この状態からだ構造になっている．サンプルはこのアクリル板の間の再び冷却して測定する．また，この微結晶のために測定

𨻶間に注入して凍らせる．試料を凍らせるには，液体窒

光の多重吸収が起こり，吸光度が増加する利点もある．

素を入れた別のデュワー瓶にサンプルホルダーを静かに（クライオスタット中や熱伝導などで，55％以上のグリセ

入れるだけでよい．最初は液体窒素が沸騰するが，全体ロール存在下でゆっくり凍らせると透明な氷ができる）．

が低温になるとおさまるので，測定用のデュワー瓶に移スペクトル測定後はサンプルホルダーを水道水の中に入して測定を開始する．低温スペクトル測定装置の光学系

れて融かす．その後洗瓶でよく洗い，細く切った濾紙での一例を図 4.1.28に示す ．

セルに残った水を除き，次の測定に用いる．

測定用のデュワー瓶にも液体窒素を入れておき，サン

窓剤として使うアクリル板は液体窒素に浸しても割れ

プルホルダーのアルミ板がそれに浸るようにする．通常たりしないので都合がよい．しかし，紫外線を透過しな

は窓の下あたりまで液体窒素を入れる．試料を全部液体いので紫外部の吸収スペクトルは測定できないことに注

窒素に漬けると，気化した窒素の泡が上がり吸光度が安意する．分解可能なサンプルホルダーは，その日の測定

定しない．

が終了したら分解して乾燥させておく．

試料はグリセロールやショ糖を含む場合がある．このような試料を急速に凍らせると透明なまま凍るが，大きなひび割れができる．これをそのまま測定に用いると，測定中にさらにひび割れができてベースラインが途中で2009 低 温 科 学

vol.67443

図 4.1.28：低温スペクトル測定装置の例

1.g

文献（11）を改変た単色光の光強度（光量子）と反応量から作用スペクト

作用スペクトルと量子収率

ルを測定する方法もある）．波長 λの光を照射したとき，

1.g .1 原理

その反応量 P と吸収された全光量子

光合成に限らず，
光照射で何らかの反応が起こる場合，t は比例関係にある．このときの比例定数を φ とすると，一定の光量（光量子またはエネルギー）で起こる反応量P ＝φまたは反応速度を，照射光の波長に対してプロットした(4.24)

t

ものが作用スペクトルである．
フィトクロームのように，と表すことができる．この比例定数 φ を量子収率（quan-

生体中での光受容物質の量が極端に少なく，吸収スペク

tum yield）と呼ぶ．すると，作用スペクトル測定におけ

トルでは検出できない場合でも，作用スペクトルの測定

る波長 λの反応は，で，その光受容物質の吸収スペクトルを推定することがP/可能である．また，光合成系のように，多数の色素（吸

t ＝φ

t/

t ＝φ

/

(4.25)

収フォーム）によって吸収された光が光化学反応を起こと表せる．したがって，作用スペクトルは量子収率 φ とす場合，色素間のエネルギー移動や光化学系

吸収率

， の関

与を解析する手段としても有効な手法である．

/の積についての波長依存性と考えることができる．

ある反応系に，単色光の波長 λの光量子を単位時間あここで，量子収率 φ は光受容物質に吸収された光量子

たり N 個照射し，測定対象が N 個の光量子を吸収した

当たりの反応（分子）数であったので，一種類の光受容とする．この照射を時間 t だけ行い，反応量 P が得られ物質のみが反応する場合には φ の値はその光受容物質たとする．このとき，波長 λにおける反応はの吸収波長全域に渡って一定の値をとるということに注P /N t(4.23)

意する．つまり，ある一種類の色素が光を吸収して反応を起こす場合，標的色素が光を吸収して反応するのなら，で表され，作用スペクトル（action spectrum）はこれの，どの波長の光であってもその効率は同じであるというこ

波長 λを変えたときの関数として定義される．

とである．したがって，試料濃度が高く， /が１に近作用スペクトルの測定は，光受容物質による光の吸収

いようなところでは，量子収率が見かけ上波長に依存すが反応全体を律速する条件で行わなければならない．つるような測定結果が得られてしまう（もちろん光合成系

まり，反応は，与えた光強度と照射時間に比例する条件のように複数の色素が反応に関与していたり，色素間のが必要である．したがって，試料はそのような条件を満エネルギー転移の効率が最終的な反応量に反映されるよ

たすような希釈されたものを用いる必要がある（ただし，うな場合は，量子収率は実際に照射波長に依存する）．

逆に光が全て吸収されるように濃い試料を用い，照射し通常作用スペクトルは吸収スペクトルに関連させてプ444

分光測定の原理と作用スペクトル・量子収率の測定

ロットされる．式 4.25は，物質の吸収率

/

の関数と

なっていた．通常使う吸光度は透過率 T の常用対数をとったものである．透過率は，(4.26)

で表されるので，光受容物質の吸光度を A としたとき，
A＝−logT ＝−log 1− /(4.27)−A＝log 1− /(4.28)/ln 10(4.29)

exp −A ln 10 ＝1− /(4.30)/ ＝1−exp −2.303A(4.31)となる．いま，N /N と A が十分に小さければ，/ ＝2.303A(4.32)と表せる．したがって，
P/水の層を通して除去する．
そのほかに，最近では発光ダイオードで，安価，容易

T ＝1− /

−A＝ln 1− /外から赤外）に出現するので，熱線カットフィルターやt ＝φ / ＝2.303φ Aに単色光光源を作ることが可能になった．青色発光ダイ
オードも実用化され，青から赤まで，ほぼは全波長範囲に渡ってそろえることができる．青色部はまだ高輝度のものは得られていないが，２〜３個合わせて使えば問題はない．赤色部では超高輝度のものまで入手できる．680
nm 以上の波長範囲の発光ダイオードはあまり多くな
い．
LED 光源には，直流安定化電源が一つあれば十分である．これに抵抗を入れ，定格電圧で発光させればよい．
平行光や収束光を作るにはそれなりのランプハウスとレンズがいるが，円錐形にした厚紙の内側にアルミホイルを貼ったものでも十分使用できる．
発光ダイオードは定格電圧以下でも発光が始まり，電(4.33)

圧を上げる輝度が上がり，発光ピークが 1〜2nm，場合によっては 5nm ほどシフトすることがあるので注意が必となり，作用スペクトルを光受容物質の吸収スペクトル要である．
蛍光光度計の試料室に発光ダイオードを置き，と対比できる．この関係式を満たす測定には，試料濃度

励起光を遮断してスペクトル測定すれば発光スペクトルを低く抑える必要がある．試料濃度が高いと作用スペクが得られるので，正確な発光波長を求めておくことを勧トルは吸光度ではなく，吸収率で表されるスペクトルにめる．

近づき，波長依存性は不明瞭になる．
1.g .2 作用スペクトルの測定
作用スペクトルの測定には，反応を測定するための装さらに，分光器を使うにせよ，干渉フィルターを使うにせよ，装置の隅をまわって迷光が入り込むことがあるので，これを除くように注意しなければならない．

置に加え，光を照射するための光源，そこから単色光を光量測定には，専用の熱電対が用いられてきた．これ取り出す器具，光量子または光のエネルギーを測定する

は，熱電対を何段にも重ね，受光部内部を黒くして光を装置が必要になる．

全て熱に変換して測定するもので，専用の道具（サーモ

光源は，連続スペクトルを持つタングステンランプや，
白熱球，またはキセノンランプがよい．

パイル）として購入できた．波長感度特性が波長によって変わらず，入射光が全て熱に変わるという前提で，温単色光を取り出す器具としては分光器が考えられる度上昇に比例した起電力が生ずるのでこれを記録すればが，これは波長精度はよいものの，どうしても光強度がよい．たいていは感度の校正値が付いてくるので，エネ低くなる．また，適当なフィルターの組み合わせで高次ルギーに換算する．赤外線を十分に除き，照射波長の光

光を除かなければならないという欠点がある．
そのため，だけをサーモパイルに導入する．得られる値はエネル

波長精度は落ちるが，干渉フィルターを用いて測定する

ギーなので，測定した波長ごとに光量子数に換算する必ことが多い．干渉フィルターは 10nm 程度の半値幅を持要がある．

つものが一般的である．従来の干渉フィルターは，得ら

最近は，照射光強度を直接光量子数として計測換算でれる強度は強いが，透過する波長の幅が広いという欠点

きる光量子センサーが市販されている．今のところ可視があった．しかし最近は金属薄膜を多重蒸着させた，透光領域でのみ測定できるが，センサーとしては，感度に過率が高く，かつ切れのよい干渉フィルターがあり，高あまり波長依存性のないフォトダイオードを使用していい波長精度で単色光を取り出すことができる．

る．

干渉フィルターはその性質上，照射光をフィルターに実際の測定に際しては，測定条件で反応が飽和しない

対して垂直に当てる必要がある．斜めに入射すると透過ことに注意する．特定波長（通常は反応が一番大きく出

波長が変わるので，注意が必要である．また，干渉フィると予想される波長）を選び，時間当たりの光強度 N の

ルターといっても高次光を通す「窓」が長波長側（近赤光を一定時間照射して反応量（P ）を測定する．このとき，2009 低 温 科 学

vol.67445

図 4.1.29：異なるバックグラウンド光を照射したときの，酸素発生または吸収に対する作用スペクトル 文献（12）を改変

反応量が照射時間 t に比例していることを確認する．同時にいくつかの異なる光量を選んで測定し，反応が十分大きく，かつ比例関係にある光量を選んでおく．この条
件が見つかれば，N を一定にして t を変化させても，逆に t を一定にして N を変化させても同じ結果が得られるはずである．
このような比例関係が満たされていれば，

図 4.1.30：ラン藻細胞における酸素発生と重炭酸イオンの取り込み量に対する作用スペクトルと，それらの量子収率
文献（13）を改変

波長 λを変えて試料を一定時間照射し，得られた反応量
P をプロットすれば作用スペクトルが得られる．厳密にり短波長側の 677nm にピークが見られ，700nm では活

作用スペクトルを求めるのなら，P ＝α N t の比例関

性はほとんど見られない．また，650nm に光化学系 の係から αを波長に対してプロットする．

集光性クロロフィルタンパク質の寄与による明瞭な肩が作用スペクトルの例を，図 4.1.29に示す ．これは，見られる．

ホウレンソウの葉緑体にバックグラウンド光を照射して両者の作用スペクトルの形は，分離された光化学系 ，おき，波長の異なる，90Hz で変調した作用光を照射したのそれぞれの吸収スペクトルとよく一致している．

ときの活性の変化量を，波長に対してプロットしたものである．

作用スペクトルの測定は十分な光強度を持つ単色光を作り出すことが困難なため，あまり行われてこなかった．

曲線１は，系 光（650nm）をバックグラウンド光としかし，自然科学研究機構基礎生物学研究所にある共同して照射しながら，波長の異なる変調光を照射したとき利用機器，大型スペクトログラフは強力で照射面積の広に観測される，メチルビオローゲンの還元活性（光化学

い単色光を照射できる．作用スペクトルの測定設備を整

系 の活性）
を，波長に対してプロットしたものである．

える費用や手間がなければ，これを利用するのも一つの活性のピークは 681nm にあり，700nm でも高い活性を手である．

示すことが分かる．一方曲線２は，720nm のバックグラ

1.g .3 量子収率の測定

ウンド光を照射しながら，波長の異なる変調光を照射し量子収率 φ は，反応量（速度）P を，吸収された光量たときに見られる酸素発生量（光化学系 の活性）を，

子数 N で割ることで求められる．N の測定は，反応系に波長に対してプロットしたものである．この場合は，よ照射した光の光量子数 N と，反応液に吸収されずに透446

分光測定の原理と作用スペクトル・量子収率の測定

過してきた光の光量子数（N −N ）を測定すれば，求め量子収率が急激に低下している．他方，無機炭素の蓄積られる．しかし単色光を照射して測定する場合は，N だに対する量子収率は，650nm より短波長側では低い一定けを測定し，N /N は，分光光度計でスペクトル測定しの値を示すが，それより長波長側では急激に上昇し，700て求めても同じである．

nm 以上で最大値を示す．これは，上で述べたように無機作用スペクトルの場合は相対値として測定して問題は炭素の蓄積は専ら光化学系 によって進行し，光化学系ない．しかし，量子収率は絶対値の測定になるので，光は主にクロロフィルが（フィコシアニンではなく）そ

強度の測定は精確に行う必要がある．

の集光色素系を構成しているためである．フィコシアニ

一例として，ラン藻を用いた量子収率の測定結果を示

ン類の吸収の寄与が全くない 700nm 以上の波長領域です．ラン藻は主な光合成色素としてクロロフィル a と，はクロロフィルのみが光を吸収するため，高い量子収率

620nm 付近にピークを持つ青色の可溶性タンパク質でを示す．

あるフィコシアニン類，および黄色〜橙色の複数種のカ

ここで注意しなければならないのは，量子収率が高い

ロチノイドを持つ．このうち，クロロフィルは主に光化からといって反応量が大きいとは限らないことである．

学系 に属し，フィコシアニンは光化学系 に属す．

中段の吸収・吸収率スペクトルが示すように，長波長側

ラン藻は炭酸固定のための無機炭素（CO ，HCO ）を，では試料に光を照射してもほとんど吸収されない．反応

光のエネルギーを使って細胞内に取り込む．この反応の量は吸収された光量に比例するので，吸収率が低ければ作用スペクトルとそれらの量子収率を測定したのが，図

当然反応量も小さい．したがって，長波長光を照射した

4.1.30である ．なお，照射光は干渉フィルター（半値場合，量子収率は高いが，実際の反応量は少ない．

幅 10〜15nm）を用いて単色光化している．
上段の図は酸素発生で測定した炭酸固定反応と，光照
射で細胞内に蓄積される無機炭素の量についての作用ス
ペクトルである．酸素発生反応の作用スペ ク ト ル は600〜700nm に広いピークを持ち，フィコシアニンの吸収スペクトルとよく一致している．これは，炭酸固定反応までを含む全体の光合成反応が光化学系 （フィコシ
アニンが主要な集光色素）の反応で律速されていることを示している．一方無機炭素の取り込みは酸素発生のそれとは全く異なり，684nm にピークを持つクロロフィルの吸収スペクトルの形とよく一致しており，この反応は専ら光化学系 によって進行することを示す．
中段の図は使用したラン藻細胞の吸収スペクトル（B）と吸収率（N /N ）スペクトル（A）である．原理のところで述べたように，測定試料が希薄な場合は吸収スペク
トルに係数を掛けた値で反応量を割れば量子収率が得られるが，図に示した試料は吸収率が１に近いため，吸光度ではなく，吸収率（中段曲線 A）で割って量子収率を求めている．
こうして得られた量子収率が下段の図である．酸素発
生の量子収率は 630〜670nm でほぼ一定の最大値をとり，短波長側では緩やかに低下していく．この低下は作用スペクトルの低下よりも緩やかである．もし短波長側の吸収もフィコシアニンによる寄与が非常に大きければ高い値のままであるはずであるが，これらの波長域ではクロロフィルによる吸収の寄与が大きくなるので，その分だけ量子収率が低下することになる．また，長波長側

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はクロロフィルによる吸収が圧倒的に大きくなることで2009 低 温 科 学

vol.67447

４章 分光測定

２．分光測定法a．蛍光
秋本 誠志
吸収とは異なり蛍光は電子励起状態にある物質のみから得られるため，蛍光分光法は光合成系における励起エネルギー移動など電子励起状態が関与する現象の観測に適している．本章では，蛍光分光法についての概略を述べる．

Fluorescence spectroscopy
Seiji Akimoto
Fluorescence spectroscopy is one of the most important techniques to detect excitation relaxations within apigment molecule and excitation energy transfer among pigment molecules. In this chapter, fluorescenceemission and excitation spectra, fluorescence anisotropy, and time-resolved fluorescence are described.

2.a.1 蛍光発光スペクトルれる．一方，液体窒素温度（−196℃，絶対温度 77K）まで冷却すると，光化学系 のクロロフィル a からの蛍光

発光は，電子励起された物質が光を発しながら電子基

バンドが 685nm 近辺と 695nm 近辺に，光化学系 のク

底状態に緩和する過程である（図 1）．比較的寿命が短く

ロロフィル a からの蛍光バンドが 715‑735nm に観測さ一重項間の遷移で発せられるものを蛍光と呼び，比較的れる ．685nm と 695nm の２つのバンドは，光化学系

寿命が長く三重項 ⎜ 一重項間の遷移で発せられる燐光

コアアンテナ CP43，CP47 サブユニットに存在する低エとは区別される．ある固定された波長で物質を励起し，ネルギーのクロロフィル a からの蛍光，また，715‑735

そこから発せられる蛍光の強度を観測波長の関数として

nm のバンドは，光化学系表したものを蛍光発光スペクトルと呼ぶ．単に蛍光スペ
クトルと略される場合が多い．

複合体や隣接する光化学系

アンテナ色素タンパク質複合体（LHC I）に存在する相互作用の強いクロロフィル a からの蛍光に帰属され蛍光は，振動緩和，内部転換，項間交差などの緩和過ている（これらのクロロフィル a は吸収帯についても長程と競合して起こる．最低電子励起状態の寿命が振動エ

波長にシフトする）．
光化学系 蛍光は光合成生物ごとにネルギーの緩和時間よりも十分に長い色素分子（クロロ
フィルやフィコビリンなど）では，蛍光は最低電子励起状態の振動基底状態から発せられるもの（図 1，赤矢印）が主成分となり，定常蛍光スペクトルの形状は励起波長依存性を示さない．カロテノイド系分子 やポルフィリ
ン系分子 などでは，高電子励起状態からの蛍光スペク
トルも観測される．
液体窒素や極低温クライオスタットなどを用いて低温にすると蛍光スペクトルのバンド幅は鋭くなり，色素分子の電子遷移エネルギーや分子間相互作用に関する詳細な検討が可能となる．例えば，室温で植物やシアノバク
テリア中のクロロフィル a 蛍光を観測すると（図 2），光
化学系 の蛍光は弱く，680nm 近辺に極大を持つ光化学系の集光性クロロフィル a からの蛍光が主に観測さ
１) 神戸大学自然科学系先端融合研究環分子フォトサイエ
ンス研究センター

2009 低 温 科 学

vol.67

図 1：光励起後の緩和過程の概略
分子が光を吸収した後，分子内振動エネルギー再分配（IVR），
振動緩和，内部転換，励起エネルギー移動過程などが起こる（この他にも，三重項状態が関与する項間交差などがある）．こ
こでは，第２電子励起状態（S ）への励起を例にしている．実際には，最低電子励起状態（S ）においても，IVR，振動緩和，
電子基底状態（S ）への内部転換が起こる．

449

クトルを反映したものとなる．また，光合成色素タンパ
ク質複合体など複数の色素分子が近接して存在する場合には，色素分子間の励起エネルギー移動効率に依存したスペクトルが得られる．エネルギーアクセプターの蛍光を観測しながら蛍光励起スペクトルを測定すると，エネ
ルギー移動効率が高い場合にはエネルギードナーとエネ
ルギーアクセプターの吸収スペクトルを足し合わせたスペクトルが得られ，エネルギー移動効率が低い場合にはエネルギードナーの寄与の小さいスペクトルが得られる．
実際の測定では，励起光源や分光器の特性を反映して
図 2：シロイヌナズナチラコイド膜の蛍光スペクトル
赤は室温，青は 77K でのスペクトルを示す．77K では室温と比較してスペクトルが鋭くなっており，光化学系 クロロ
フィル a からの蛍光バンドが 684nm と 695nm 近辺に，光化学系 クロロフィル a からの蛍光バンドが 733nm に観測されている．

励起光強度が波長に依存し変動するため，あらかじめ励
起光の分光特性を調べ装置の較正を行う必要がある ．
特に，励起光源の経年変化に注意を要する．

2.a.3 時間分解蛍光分光法
サンプルを十分に短いパルス幅を持った光源で励起少しずつ異なり，明確なピークを示さない生物や，もっし，その後の蛍光強度の変化，蛍光スペクトルの形状のと長波長の 760nm 付近にバンドが確認されるシアノバ

変化，蛍光異方性の変化などを時間の関数として観測す

クテリア（スピルリナ) なども報告されている．LHC I

る方法である．従来は，サブピコ秒から数 10ピコ秒を持たないシアノバクテリアでは光化学系 複合体は３（10 〜10 s）のパルス幅を持った色素レーザーが光源

量体を形成するが，３量体形成に伴い，長波長蛍光を発として用いられていたが，最近では，フェムト秒領域（

するクロロフィル数が変化したり，単量体にはみられな

10 s）のパルス幅を持ったチタンサファイアレーザー

い波長領域にバンドが観測されたりする ．光化学系が用いられることが多い．

複合体，光化学系 コアアンテナ，および，アンテナ色

数ピコ秒から数 100ナノ秒領域（10 〜10 s）で起こ

素タンパク質複合体に存在する集光性クロロフィル a

る現象の観測には，時間相関単一光子計数法

やストや b は，長波長領域に蛍光を出すクロロフィル a に励起

リークカメラ法 が用いられる．前者は，感度が高くダイエネルギーを効率よく移動させるので，大量に存在する

ナミックレンジが広いため遅延蛍光などの微弱蛍光成分にもかかわらず 77K での定常光測定では弱い蛍光しかの検出に適しているが，基本的に観測は単一波長につい観測されない．光化学系 ， 蛍光バンドの強度比をはて行われる．それに対して後者は，時間―波長の２次元かることで，光化学系， の量比や，相互間でのエネ測光が可能であるため光照射により劣化がみられる試料

ルギー移動が推定できる．蛍光強度や収率の変化を測定の測定に適しているが，ダイナミックレンジが狭い．しすることで光化学系間のエネルギー移動の変化（ステー

たがって，観測する現象や試料に応じて測定法を選ぶか，ト遷移）や，光化学反応も研究されている（4.3a，b 項

併用することが望ましい．ピコ秒より短い時間領域の測参照）．

定には，蛍光アップコンバージョン法
ト法

2.a.2 蛍光励起スペクトルや光カーゲーなどが用いられる．

時間分解測定では，高電子励起状態，振動励起状態からの蛍光が得られ，内部転換や振動緩和などを詳細に検蛍光を観測する波長を固定し，蛍光強度を励起波長の討することができる．また，光合成色素タンパク質複合関数として表したものを蛍光励起スペクトルと呼ぶ．一体ではエネルギードナーとなる色素分子からの蛍光を捉

種類の色素分子を含む希薄溶液では，蛍光励起スペクト

えることができ，構成色素分子が発する蛍光スペクトル

ルは吸収スペクトルと同じものとなる．一方，複数種のの時間変化を観測することにより，色素分子間での励起色素分子が存在する時は，蛍光励起スペクトルは吸収ス

エネルギー移動を実時間で追跡することができる ．異ペクトルとは一致しないが，特定の色素分子の吸収スペ

なる波長領域に蛍光を発する色素分子間での励起エネル

450

蛍光分光法

図 3：偏光が解消される過程（a）内部転換，（b）回転ブラウン運動，（c）励起エネルギー
移動．赤い楕円は色素分子を，その中にある黒矢印は遷移双極子モーメントの向きを示す．

図 4：直線偏光を用いた蛍光偏光の測定
励起光（図ではレーザー光）の電場の振動方向と遷移双極子
モーメントの方向が平行に近い分子が選択的に励起される（赤色の濃い分子）．励起光源の偏光方向と平行な蛍光偏光成
分 I および垂直な蛍光偏光成分 I の観測を行う．

ギー移動の観測に適している．
変化（それぞれ，I t ，I t ）の測定を行えば，r の時間
変化 r t が2.a.4 蛍光異方性

r t＝

レーザー光など電場の振動方向が一定方向に揃った光I t −I t
I t ＋2I t(2)

源（直線偏光）を用いて物質を励起すると，電場の振動と求められる．等方的な蛍光強度の時間変化，すなわち，方向と遷移双極子モーメントの方向が平行に近い分子が蛍光減衰曲線は I t ＋2I t として得られる．偏光解消

選択的に励起される（平行の時で最大，直交する時は０）．

過程を反映して時間と共に r t が変化し，例えば，同じしたがって，タンパク質中で光合成色素がランダムな向波長領域に蛍光を発する色素分子間での励起エネルギー

きに分散している場合でも，直線偏光を用いて励起を行

移動を実時間で観測することができる．

うと，励起直後は色素分子から発せられる蛍光もまた偏実際の測定では，検出系（回折格子，光電子増倍管，光性を示す．蛍光の偏光性は，（a）内部転換，（b）色素など）の感度が偏光の方向に対して一様でない場合があ分子の向きの変化，（c）励起エネルギー移動，などにより，その補正を考慮する必要がある．鉛直方向および水り失われる（偏光解消，図 3）．
（a）は，励起された電子

平方向に偏光した光に対する検出系の感度の比（G 因

状態と蛍光を発する電子状態の遷移双極子モーメントの子）を観測波長の関数として求める方法や，簡単には，

向きが異なる場合である．
（b）は，励起状態にある間に偏光解消板を蛍光観測用の分光器の前に設置する方法が色素分子の向きが変わることによって，励起時点での遷ある．

移双極子モーメントの向きと発光時点での遷移双極子
モーメントの向きが異なる場合である．溶液中における回転ブラウン運動がその例である．
（c）は分子間過程であり，遷移双極子モーメントの向きが異なる色素分子へと励起エネルギー移動が起こり，励起された色素分子と

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となる．時間分解蛍光分光法により，I および I の時間

６) 山崎巌，藤田昌久，内田勝雄，進藤善雄，馬場宏明，応

発光する色素分子が異なる場合である．
励起光源の偏光方向と平行な蛍光偏光成分を I ，垂直な蛍光偏光成分を I とする（図 4）と，蛍光異方性 r は，
r＝

I −I
I ＋2I

(1)

と定義される．この時，等方的な蛍光強度は I ＋2I で与えられる．励起子相互作用などがある場合を除き，等方
的なサンプルから観測される r の値は，0.4 r

2009 低 温 科 学

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９) J.Shah, IEEE J.Quantum Electric., 24 (1988)P.276.
10) 秋本誠志，木場隆之，横野牧生，三室守，山崎巌，分光研究，54（2005）P.18．
11) M.A.Duguay & J.W.Hansen, Appl. Phys. Lett. 15452(1696)P.192.
12) 永原哲彦，兼松泰男，木下修一，岡田正，分光研究，49（2000）P.186．
13) I.Yamazaki, M.M imuro, T.M urao, T.Yamazaki, K.
Yoshihara, & Y.Fujita, Photochem. Photobiolo., 39(1984)P.233.
14) S.Akimoto & M .M imuro,Photochem.Photobiolo.,83(2007)P.163.

蛍光分光法

４章 分光測定

２．分光測定法
b．熱発光・遅延発光小野 高明
電荷分離反応の結果生じた光化学系

反応中心の還元側と酸化側の電子伝達成分上の正電荷と負電荷の再結合により発光が起こる．この発光（遅延発光・熱発光）は光化学系の電子伝達成分（特に酸素発生系）に関する有用な情報を数多く含む．

Thermoluminescence and delayed light emission
Takaaki Ono
Thermoluminescence and delayed light emission arise from an excited state of photosystem II reaction center(P680),which is formed by charge recombinations between positive and negative charges stabilized in photosystem II. They provide useful information on the function of PSII,especially on photosynthetic oxygen evolving
system. In this chapter, we describe application of these techniques for probing PSII.

ない．また，系 ではその強度は弱く，特殊な場合以外

2.b.1 はじめにほとんど観測されない．熱発光と遅延発光（特に熱発光）

熱発光（TL:thermoluminescence）と遅延発光（DLE:

は酸素発生系を中心とした系 自身の研究や，研究環境

delayed light emission，遅延蛍光／DLF:delayed fluo-

ストレス等が光化学系に与える影響の評価に広く使われrescence とも呼ばれる）は，主として，光吸収に伴う光ている．応用例についてはレビュー等

合成光化学系 （系 ）反応中心における電荷分離反応

い．

の結果，系

を参照されたの酸化側に生じた正電荷（正孔）と還元側に生じた負電荷（電子）に由来するこれらの再結合により系 反応中心クロロフィル P 680の再励起され発光が起こる．電荷再結合過程では最終的に生成する P 680

2.b.2 遅延発光と熱発光に関与する光化学系
Ⅱ反応

Phe 上の正負電荷の再結合に伴い，ある確率で P 680の遅延発光と熱発光の理解に必要な，系 における電荷

一重項励起状態（P 680 ）が生成する． 従って，これら分離反応と引き続いて起こる分離電荷の安定化に関与すの発光は光照射により系 が励起された場合の蛍光と基る電子伝達成分について，その概要を述べる．

本的に同じスペクトルを示す．熱発光と遅延発光はとも

図 1に示されるように，系 反応中心における電荷分に，系 の酸化側，還元側で生じた分離電荷の性質に関離の結果生じた P 680 は Y （D 1タンパク質 Tyr161）

する情報を与えるため，光化学系

自身を対象とした研により還元される．酸化された Y （Y ）は M n クラス

究や，系 を通じた光合成反応の全体的な評価に用いらターからの電子供与により再還元される．Mn クラス

れている．

ターは４つの M n と１つの Ca からなる複核錯体であ

熱発光と遅延発光は同じ現象を異なった手法により観り，水の酸化反応で中心的な役割をはたしている．Mn ク

測するものであり，得られる情報も原理的には同等であ

ラスターを中心とする水酸化触媒は，Yへの電子供与る．また，測定に使用する装置も基本部分は共通な場合

により１電子当量ずつ酸化され，最も還元された S かが多く，本章では熱発光・遅延発光について，測定方法

ら最も酸化された S までの状態をとる．S は不安定でを中心に紹介する．

暗所で２分子の水を酸化して S にもどり，１分子の酸

熱発光と遅延発光には，その由来が系 光化学反応と素が生成される．暗所に置いた系 では，クラスターのは直接関係ないものや，一重項励起状態（P 680 ）が関与

大部分は安定状態である S にあるため３閃光の照射後しないものもあるが，それらについては一部を除き触れに酸素が発生する．S と S は正電荷を持つ．D 2タンパ
ク質の Tyr160（Y ）も P 680 により酸化されるが，酸

１) 茨城大学工学部生体分子機能工学科

2009 低 温 科 学

vol.67素発生反応には関与していない．酸化された Y は暗所453

図 1：光化学系 における酸化還元成分の配置と電子移動の模式図(左)；酸素発生系における S 状態遷移と Q キノン部
位における２電子ゲート(右)熱発光と遅延発光に関与する電子伝達成分を緑で，熱発光と遅延発光に関与する S 状態を赤で，Q キノンを青で示す．

図 2：光化学系 における電荷再結合による発光スキーム
励起状態の P 680（P 680 ）のエネルギーは電子移動反応により自由エネルギー（ G安定化）を失い D A 電荷分離状態として安定化される．電荷分離過程は可逆過程であり，電荷再結合
過程の活性化エネルギー（ G活性化≒ G安定化）に相当するエネ
ルギーを得ると P 680が再励起され発光が起こる．一定の温度条件化では，確率的に P 680が再励起され発光（遅延発光）がおこる．一方，加熱状態では，活性化エネルギーに対応する
温度で電荷再結合が高い確率で起こり発光（熱発光）する．

を起こす正負電荷の安定性（再結合に必要な自由エネル
で比較的安定に存在する．このほか，シトクロム b ，カギーの変化の大きさ）に依存し，それらがどの電子伝達

ロチノイド，クロロフィルも P 680 により酸化される

成分上にあるかで決まる．すなわち，光照射直後の発光が，これらの酸化型は電荷再結合による P 680 形成には

は光化学系 の反応中心に近い酸化還元成分間での電荷寄与しない．

再結合に由来し，時間経過とともに反応中心からより離

一方，還元されたフェオフィチン（Phe ）は D 2タン

れた酸化還元成分上の電荷同士の再結合に由来する発光

パク質に結合する Q キノン受容体により再酸化されが主成分となる．光化学系 で生成した分離電荷の再結

る．還元された Q キノン受容体（Q ）は D 1タンパク質合に由来する遅延発光も報告されているに結合する Q キノン受容体を還元する．生成したセミ

2.b.3.2 熱発光．

キノン Q は比較的安定で，次の閃光での電荷分離反応

光照射後に試料を急速冷却すると，液体窒素温度（77により生成した Phe から２個目の電子を受け取る．２などのように温度が十分に低ければ，冷却過程で電荷K）

電子還元体 Q はチラコイド膜内プールの酸化型プラ

再結合を起こさなかった正負電荷は，低温下で安定にトストキノンにより置き換えられるため，Q キノン受容体

ラップされる．この後，試料温度を徐々に上げ，電荷再は閃光照射ごとに交互に Q と Q となる．

結合の活性化エネルギーに相当する熱エネルギーを供給
すると，トラップされた正負電荷間で再結合がおこり，

2.b.3 遅延発光と熱発光

ある確率で P 680が再励起され発光が観測される．
（図2）2.b.3.1 遅延発光
葉緑体などの試料を光照射すると，遅延発光または遅延発光と及ばれる微弱な発光が，光照射直後から分の時

2.b.4 熱発光測定と遅延発光測定

間域でおこる．発光強度は光照射直後が強く，時間とと光照射に続いて観測される遅延発光の場合は，一定温もに指数関数的に減衰する（強度変化の様子は減衰曲線

度環境から供給される熱エネルギーに依存して電荷再結と呼ばれる）．この発光は，光照射の結果生じた系 の酸合が起こる．そのため，光照射後の発光強度の時間経過

化側と還元側の様々な電子伝達成分上に分布した正負電は，各正負電荷対の再結合の確率の違いを反映して，異荷が再結合する時に P 680を再励起することに由来すなった時定数を持つ指数関数的減衰成分の足し合わせとる．光照射後どの時間領域で発光するかは，電荷再結合

して表される．一般に，各々の減衰成分を正確に分離す

454

熱発光と遅延発光るにはかなり煩雑な操作が要求される．
実際の実験では，遅延発光に含まれる成分の数，強度，時定数が不明の場
合も多い．各成分の正確な分離ができないと，観測された遅延発光の起源となる正負電荷対の正確な同定や定量が困難となる．

2.b.5 測定装置と測定の実際
2.b.5.1 装置の構成
熱発光測定はほとんどの場合，それぞれの研究者が自作した装置でおこなわれており，その装置構成も研究者

一方，熱発光では，活性化エネルギーが外部加熱で与ごとにかなり異なる．また，装置の詳細は論文等には記えられる為，特定成分間での電荷再結合が特定温度領域

述されていない．しかしながら，基本的には以下の四つで起こる．試料温度に対して熱発光強度をプロットしたの部分から構成されている．微弱光の測定部と試料の光曲線（熱発光グローカーブ又は熱発光バンド）は山型

照射部の利用で遅延発光測定に対応できる．

（ピークを与える）となり，遅延発光の各減衰成分は異なったピーク温度をもつバンドとして分離される．正負

試料ホルダー部

電荷の酸化還元電位と関連する再結合の自由エネルギー

試料温度の制御部

変化の大きさの違いが熱発光バンドのピーク温度の違い

微弱光の測定部として現れる．このピーク温度から，関与する正負電荷

試料の光照射部

対の酸化還元電位を推定できる．また，バンドの強度か
ら各正負電荷対の相対量をある程度見積もる事ができ

これらの構成の主要な部分について以下に述べる．

る．さらに，各正負電荷対の酸化還元電位の変化がピー

2.b.5.2 試料ホルダー

ク温度の変化として現われるため，僅かな変化も容易に

熱発光測定では試料を光照射後，急速に冷却し，その検出出来る．遅延発光では，酸化還元電位の変化は主に後，一定の速度で試料温度を上げる．
様々な試料ホルダー

発光強度の減衰キネティックスの変化として現われるが用いられるが，可動タイプと固定タイプの２つに分け為，解析は容易ではない．

られる．

以上のような理由から，近年では系 で起こる光化学

図 3は筆者が用いている可動タイプの試料ホルダーの反応過程に関する研究手法としては熱発光がもっぱら用概略である．非常にシンプルな作りだが十分に実用に耐いられ，遅延発光が用いられる事は少ない．従って，本える．試料は適当な大きさのアルミ板とアクリル板の間

稿でも熱発光を中心に話を進める．しかしながら，熱発に挟み込み固定する．アルミ板には試料加熱用のヒー

光測定だけからでは，発光に伴う自由エネルギー変化なターが装着されている．ヒーター装着に際しては，試料

どの熱力学的パラメーターを正確に求める事は困難であ

全面が均一に加熱されるよう注意を払う．この例では，る．遅延発光の測定により熱発光測定で求めたパラメー
ターの評価が行える．また，遅延発光測定では，試料の冷却や加熱装置が不要で，より簡便な装置で測定可能である．また，装置によって異なるが，熱発光測定では試料交換も含み，１試料あたり 20−30分程度の測定時間が必要だが，遅延発光測定では数分で測定を終えることが出来，原理的には，多検体測定や連続測定，イメージングも可能である．また，ミリ秒領域に現われる遅延発光の強度はチラコイド膜を介した膜電位形成と関連する事が知られている ．さらに，藻類細胞などでは，光照射後数秒から１分程度の発光は，電子伝達系全体の状態を反映すると思われる特徴的な時間変化を示す．これらの特色を生かし，藻類の遅延発光を環境中の藻類の量や種類の評価に用いたり ，環境モニタリングプローブとして用いたりする研究も行われている．
図 3：可動タイプの試料ホルダーの例
正面（左）と側面（右）．右図は測定用ジュワーに装着した状
態．測定用ジュワーの透明窓が平面状になっており，光ファイバーを試料に接近して設置できるようになっている．

2009 低 温 科 学

vol.67455

シリコンラバーヒーターを厚さ 1mm のアルミ板の裏

ルミ板を温度制御可能な熱交換ステージ（顕微鏡用熱交面に直接接着してある．
素早い温度変化が可能なように，

換ステージなどが利用できる）に固定してある．試料をアルミ板の厚さと装着するヒーターの W 数を最適化す

ホルダーに乗せ，上からアクリル板で蓋をする．試料温る必要がある．

度は熱交換ブロックに埋め込まれたヒーターと冷却窒素

液体の試料は 1cm 四方のロ紙に浸み込ませ，アルミ

ガスで制御する．試料に接して置かれたた熱電対で温度板とアクリル板の間に挟み，クリップでしっかり固定すを検出する．適当な光源からの光をライトガイドで試料る．葉などはコルクボーラーなどで打ち抜き，直接試料ホルダーまで導入し，試料を光照射する．照射後，冷却ホルダーに挟み込む．温度測定用の熱電対（Cu／コンス

窒素ガスの流量を最大まで上げ試料を急冷する．25秒以タン）を試料上に直接置き試料と共にホルダーに挟み込

内に 100K に達する．可動タイプと比べると冷却速度はむ．この状態でホルダーを透明窓を持つジュワー瓶に移比較的遅いが，熱発光測定の主な適応例である酸素発生

す．ジュワーを液体窒素で予冷し，ヒーターの印加電圧系の場合，S Q 電荷分離状態の寿命が５℃で約 30秒なを調節する事で，試料温度を制御する．光照射後，ホルので，電荷分離状態のトラップには十分な冷却能力であダーを液体窒素中に投入し，急速冷却する．５秒以内にる．冷却後，適当な温度制御装置によりヒーター出力を100K に達する．冷却した試料ホルダーを測定用ジュ

フィードバック制御することにより昇温速度を制御すワーに移し，ヒーター電源を投入して測定を開始する．

る．この装置では，６〜108℃/min の範囲で昇温速度を

試料温度はヒーターからの熱の供給量と試料ホルダー自正確に制御できる．上に述べた例では，加熱にヒーター

身の熱容量に応じて上昇するので，ヒーターへの印加電を用いているが，この代わりにペルチェ素子も利用でき

圧を変化させることで昇温速度を調整できる．この方法る．

では，試料温度が全温度範囲で直線的に昇温するわけで

2.b.5.3 発光の検出はないが，−50℃から＋50℃までほぼ一定速度で昇温で熱発光・遅延発光の強度はかなり低いため，その検出

き，熱力学的パラメーターを求めるなど正確な昇温速度には光電子倍増管（PMT:photo multiplier tube）が用の制御が必要な場合を除き，実用上問題ない．昇温速度いられる．クロロフィル蛍光に対応する長波長領域で十を正確に制御したい場合は，測定用ジュワー内に冷却し分な感度を持つものを選択する．マルチアルカリの光電

た窒素ガス（液体窒素中に投入した蛇管に窒素ガスを通面を持つ PM T はバイアルカリ光電面を持つ PMT よりすことにより容易に得られる）を一定流量で流して冷却

長波長感度が高いが，バイアルカリの方が暗電流は低い．

し つ つ，適 当 な 温 度 制 御 装 置 に よ り ヒーター出 力 をエンドオンタイプの受光面を持つ PMT 使用が望まし

フィードバック制御する．

い．PMT を冷却することにより暗電流を減らし，信号／

図 4は固定タイプの試料ホルダーの例である．この場

ノイズを高めることができる．またシングルフォトンカ

合，試料用の凹（直径 15mm，深さ 0.5mm）を持つア

ウンティング計測により微弱光を感度よく測定できる．
PMT 冷却機能付のフォトンカウンティング装置が市販されている．
微弱光測定では試料からの発光を効率よく PMT の光電面に集めることが重要である．立体角を稼ぐためには試料と PMT の距離を可能な限り短くする．PMT を試料に接近して配置する事が困難なら，試料からの発光をレンズで PMT の光電面に集光したり，試料近傍に光ファイバーを置いて発光を PMT に誘導したりする．微弱光測定用に PM T，電源等を一体化したコンパクトな
シングルフォトンカウンティング装置（浜松ホトニクス）も市販されている．遅延発光測定では ICCD
（intensified

図 4：固定タイプの試料ホルダーの例
熱交換ブロックに埋め込まれたヒーターと冷却窒素ガスで試料温度を制御する．リング型ライトガイドで励起光を試料面まで誘導し，リング型ライトガイドの中空部分を通り，試料に近接して設置された光ファイバーで試料からの発光を集める．

456

CCD）も用いられている ．
2.b.5.4 試料の照射
電荷分離状態を実現する為には試料を励起光照射する必要がある．実験目的により最適な光照射方法（光源，
照射方法，照射条件）を選択する．固定タイプの試料ホ
熱発光と遅延発光表 1：熱発光バンド・遅延発光成分と発光に関与する分離電荷対発光
熱発光バンド電荷分離対・起源
遅延発光成分

バンド名

ピーク温度(℃）

Low temperature bands
Z-band

−250，
−220，
−200
〜−160

Zv-bandA-bandA -band
Q-bandB -bandB -bandAG-band−80to −30
〜−15
〜−15
〜＋５
〜＋20
〜＋30
〜＋40

〜150μs
〜4ms
〜4ms？
〜2s
〜30s
〜60s

P 680 (Chl ？)Q
SQ
His(Yz )Q
SQ
SQ
SQ
SQX

C-bandHigh temperature bands
High temperature bands〜＋50＋50to ＋70〜＋130

〜10minY Q
酸化的化学発光
脂質の過酸化

Chl の凝集体
Chl Chl

ピーク温度は光照射温度に依存して変化する．
四角内は，光化学系 に由来する発光．緑文字は酸素発生系に関係する発光．

ルダーでは光ファイバーで効率的に試料を照射できる．
以下に，いくつかの例と留意点を述べる．

や精度の評価が可能である．
低温にピークを持つ熱発光バンド（表 1参照）の測定

酸素発生反応の研究では，酸素発生系の S 状態（S とでは，通常，発光温度付近で光照射した後，試料を急冷

S 状態）と系 還元側の Q （場合によっては Q ）間でする．通常，電荷分離状態形成の量子収率が低いため励起こる電荷再結合に由来する発光を観測する（図 1参起光として連続光を用いる場合が多い．また，試料を室照）．通常は試料の閃光照射でこれらを生成する．この光

温からゆっくりと冷却しながら連続光照射すると，様々源としてキセノン（Xe）フラッシュが用いられる．試料な電荷分離状態が実現し，昇温に伴いそれらに由来する

中の全ての系 が１回だけ全部励起されるように，短い

熱発光バンドが重なって観測される．

閃光寿命（〜3μ秒以下）と強い閃光強度が必要であ

遅延発光測定では，試料を秒オーダーの連続光で照射る ．試料の照射温度は，装置の冷却能力・電荷再結合のし，その後の発光減衰曲線の様子を調べることもある．

寿命・電荷分離対生成の温度依存性を考慮して決める．
熱発光測定の場合，閃光照射後の試料冷却に秒オーダーの時間が必要なので，特別な場合を除き，酸素発生系と2.b.6 装置のセットアップ

Q （Q ）上で安定化された正負電荷のみが発光に寄与す

図 5は固定タイプの試料ホルダーを持つ熱発光測定装

る．遅延発光では，これらの電荷分離状態からの発光は

置のブロックダイアグラムを示す．リング型ライトガイ（測定温度にも依存するが）閃光照射後，数百ミリ秒以降

ド（外側）で励起光を試料近くまで誘導し，その中空部に現われる発光の大部分を占める．酸素発生活性を保持

分を通して試料近くまでいく別の光ファイバーで試料かした試料を暗順応後１閃光照射すると S Q が，Q かららの発光を集める（図 4）．光ファイバーの反対の出口側

Q への電子移動を止める系 特異的阻害剤（DCM U）をのレンズで発光を PMT 受光面に集める．Xe 閃光光源

加えて１閃光照射すると S Q が安定電荷対として生成と PMT の前に電動シャッターが置かれている．閃光照するので（図 8参照），これらに由来する熱発光や遅延発

射 時 に は Xe 閃 光 側 の シャッターを 開 け，PM T 側 の光を測定する事で，自作の熱発光・遅延発光装置の能力

シャッターを閉じる．閃光照射後，Xe 閃光側のシャッターを閉じ，PMT 側のシャッターを開けることで，熱発実際には，試料全体を完全に励起できない（飽和していない）
強度の照射閃光でも，強い照射を受ける試料表面からの発光がより強く検出されるので，S 状態遷移に伴う熱発光強度の閃光
照射依存４周期振動を検出できる場合が多い．また，〜10μ秒程度の閃光寿命であれば，詳細な解析が必要な場合を除いて使用できる．

2009 低 温 科 学

vol.67

光測定と同じ光学系で遅延発光の測定ができる．
可動タイプの試料ホルダーを使用する熱発光測定でも基本的には同じブロックダイアグラムでよい．ただし，試料照射は測定とは別に行われるので，緑色で囲まれた部分のみ使う．試料からの発光を効率よく検出するため，
457

図 5：熱発光測定のブロックダイアグラム
固定タイプの試料ホルダーを使用する場合を示してある．可動タイプの試料ホルダーを使用する場合，試料の照射は測定系とは切り離されて行われるので，緑色で囲まれた部分のみが必要となる．

可動タイプの試料ホルダー測定用ジュワーの透明窓部分

料ホルダーを備え，PMT を試料ホルダーの直ぐ上に近の一部を平面状（図 3）とし，試料ホルダー（ジュワー内）

接して設置してある．励起閃光光源は LED を用い，閃光と光ファイバー（ジュワー外）を近接して設置できるよ

照射後，100ms からの遅延発光測定もできる．

う工夫してある．

浜松ホトニクス社では微弱発光計測システム（PMX-

遅延発光測定のみを目的とする場合は，通常，試料温を供給しており，この装置を用いて遅6100，PMX-2100）

度の厳密な制御は必要ないので，試料周りの自由度は高延発光測定が可能である．光源と試料間，試料と PMT 間

く，目的に応じたセットアップが可能である．液体試料にシャッターがあり，励起光照射後に前者を閉じた後，の場合は通常の光学キュベットを用いてもよい．励起光

後者を開け遅延発光の測定を行う（図 6）．両装置とも非源のアフターグローが問題とならない時間領域のみで測

常にコ ン パ ク ト（PMX-2100 は 78mm×163mm×125定を行う場合は光源と試料間のシャッターは必ずしも必mm）に作られている．３つの LED ユニットを備えてお要ではない．シャッターを用いた場合，励起光照射直後

り，LED の波長を選択することにより目的に応じた様々のミリ秒以下の時間領域の遅延発光の測定は困難だが，なシークエンスによる試料励起が可能である．PMX-

現在，この領域の遅延発光測定が必要となる場合はあま6100 では様々な形態の試料に対する試料ユニットが用りないと思われる．遅延発光の測定方としては，ベクレ

意され，専用計測ソフトウエアーにより本体と PC を

ルタイプの燐光計を用いる方法があるが，現在ではほとUSB ケーブルで接続するだけで測定ができる．バッテ

んど使われていない．

リー（5V）ユニットを準備すればフィールドでの測定も可能である．

2.b.7 市販の熱発光・遅延発光測定装置
熱発光・遅延発光測定は，その大部分が研究者により自作された装置を用いておこなわれているが，市販品もある．

2.b.8 熱発光バンド（遅延発光減衰曲線）と関与する系Ⅱの酸化還元成分
試料を光照射すると，光照射条件等に依存して様々な

熱発光装置は Photon System Instruments 社で市販

熱発光バンドが現われる（図 7）．表 1は観測される熱発されている（TL-200/PM T）．この装置は固定タイプの試

光バンドとそのピーク温度，起源となる分離電荷対，お458

熱発光と遅延発光図 6：遅延発光測定装置（PMX-6100）（左）装置の全体写真（右上）試料室：ガラス製の試料ビンによる測定（右下）測定系のセットアップ（写真は浜松ホトニクスの好意による）

図 7：主要な熱発光バンド
各バンドの概要を示すための模式図で実測結果ではない．

よび対応する遅延発光減衰成分の緩和時間をまとめたも

図 8：熱発光 B ‑バンド（S Q ）と Q‑バンド（S Q ）のである．系 の光化学反応と密接に関連した重要な熱発光バンドは−50〜＋50℃の間に現われる．

光回数に対して４周期振動を示す（図 8）．十分に暗順応

2.b.8.1 熱発光バンド

した酸素発生系は S ：S ＝25：75となる状態にあり，

2.b.8.1.1 B ‑バンド

還元側は Q ：Q ＝25：75の状態にあるので，閃光照射〜＋20℃にピークを示す S Q 再結合由来の B ‑バン

回数に応じて S Q と S Q 状態にある系の数は表２

ドと〜＋30℃にピークを示す S Q 再結合由来の B ‑バのように４周期で変化する．ミスヒット（閃光によってンドがある．十分に暗順応した試料を１閃光照射するとも電荷分離が起こらない場合）やダブルヒット（閃光に．S Q 再結合による相対
B ‑バンドのみが現れる（図 8）よって電荷分離が２回起こる場合）の確率や，S Q と S

発光強度は S Q 再結合によるものより強い（1.7〜2.0

Q の発光強度比を考慮すると観測される４周期振動を倍）．B ‑バンドと B ‑バンドのピーク温度は pH に依存再現できる．酸素発生活性に必須の Ca イオンや Cl イオ

して変化し，〜pH 7.5以上では同じピーク温度を示す．

ンなどを除去し，
酸素発生活性を失った試料の B‑バンド

B‑バンドのピーク温度は S や S の酸化還元電位の僅強度の振動を解析して，これらがどの S 状態遷移段階にかな変化を反映して変化するので，酸素発生機能に影響

必要かを調べる事ができる．

を与える様々な処理が Mn クラスターに与える変化を

2.b.8.1.2 Q ‑バンド

鋭敏に検出できる．B‑バンド（B ＋B ）の強度は照射閃2009 低 温 科 学

vol.67と A‑バンド〜＋10℃にピークを示す Q‑バンドは S Q 再結合に459

表 2：閃光照射による熱発光 B‑バンドに寄与する分離電荷数の変化と熱発
光強度の変化
閃光回数

0

1

2

3

4

5

6

系 の数
1S Q
5S Q
1S Q
熱発光
系 の数
強度

1S Q
1S Q
5S Q
1S Q

1S Q
1S Q
5S Q
1S Q

1S Q
1S Q
5S Q
1S Q

1S Q
1S Q
5S Q
1S Q

1S Q
1S Q
5S Q
1S Q

1S Q
1S Q
5S Q
1S Q

1S Q

0
0

5
5

2
2.7

1
1.7

0
0

5
5

2
2.7

十分に暗順応した光化学系 （S ：S ＝Q ：Q ＝25：75）を閃光照射し，ミスヒッ
ト，ダブルヒットがないと仮定する．
熱発光に寄与する光化学系 の数
熱発光強度＝1×S Q ＋1.7×S Q

試料を〜20℃で光照射すると現われる．閃光照射でも現われるが，フルチャージには連続光照射が必要である．
Q と光酸化されたヒスチジン残基（又は Y ）の再結合に由来するとされている．A‑バンドと同じ温度に現われるがその起源は異なることに注意が必要である．
2.b.8.1.4 AG ‑バンド〜＋40℃にピークを示す AG‑バンドは，電子伝達の逆行反応により S Q 状態にある PS

へ電子が供給されて生成する S Q に由来すると考えられている．電子供
給には光化学系 循環的電子伝達反応が関与している．
図 9：熱発光 B‑バンド（B ＋B ）強度の４周期振動
十分に暗順応した葉緑体を閃光照射し熱発光測定を行い B‑
バンド（B ＋B ）強度を閃光回数に対してプロットした．

2.b.8.1.4 C ‑バンド〜＋50℃にピークを示す C‑バンドは Y Q 再結合に由来すると考えられている．C‑バンドは系

阻害剤である DCMU を加えた試料を液体窒素温度で連続光照射由来する．系 阻害剤である DCMU により Q から Q（〜2min）
すると現われる．S と S は正電荷を持たないへの電子移動を阻害した試料を光照射（閃光又は連続光）

ため，77K 照射で生成した Q が Y と電荷再結合を起すると現われる（図 8）．Q を失った精製された系 コア

こす．C‑バンドは他の様々な条件においても観測され標品では，光照射によりこのバンドがあらわれる．B‑バ

る．界面活性剤ミセルに取り込まれたクロロフィルからンドと同様に，ピーク温度は S や S の酸化還元電位のも〜＋50℃にピークを示すバンドが現れるので注意が必

僅かな変化を反映して変化する．また，Q‑バンドのピー

要である．

ク温度は系

2.b.8.1.5 Z ‑バンド

阻害剤の種類に応じそのピーク温度が様々に変化することが知られている．

−40℃〜−100℃で試料を連続光照射すると，照射温度〜−10℃にピークを示す A‑バンドは S Q 再結合に

より 10〜20℃高い温度にピークを示す Z ‑バンドが現由来する．通常の光照射条件ではこのバンドが現れるこれる．反応中心標品など，Mn クラスターを持たない試料とはない．S Q 状態にある試料を２発の閃光で照射しでも現われる．P 680 Q 再結合に由来すると考えられて

S Q を作った後急冷し，液体窒素温度 77K で連続光照いる．

射（〜1min）する．77K 照射では電荷分離の結果 Q が

2.b.8.1.6 その他の熱発光バンド

生成し，P 680 はシトクロム b ，カロチノイド，クロ

これまで述べた熱発光バンドは光化学反応の結果，系

ロフィルにより酸化される．昇温に伴い，Q は S と再に生成する正負電荷の再結合に由来したが，系 と直結合して A−バンドが現れる．

接関係ない熱発光バンドも存在する．試料を液体窒素温

2.b.8.1.3 A ‑バンド度で連続光照射すると〜−160℃にピークを示すブロー〜−10℃にピークを示す A ‑バンドは，Tris 処理やヒ
ドロヒシルアミン処理等で Mn クラスターが失われた460

ドなバンドが現れる（Z‑バンド）．また，試料を液体

ヘ リ ウ ム 温 度 で 連 続 光 照 射 す る と〜−200，−220，−
熱発光と遅延発光

250℃に ピーク を 示 す ブ ロード な バ ン ド が あ ら わ れな る．図 11は 好 熱 性 シ ア ノ バ ク テ リ ア Thermosyne-

る ．これらのバンドは光照射によりクロロフィルの凝

chococcus. elongatus 細胞を，様々な条件で光照射した後集体においてクロロフィル分子間の電子移動がおこり，の遅延発光の減衰曲線を示したものである．それぞれのその結果生成した Chl Chl 間の電荷再結合反応に由来

ピークの由来は不明な部分も多いが，細胞の生理状態のすると考えられている．また，50℃以上の高温では様々指標となる．

な酸化プロセスや脂質の過酸化に由来するバンドがあらわれる．これらの過程で生成する一重項酸素などの活性種からクロロフィルへのエネルギー移動により化学

2.b.9 熱力学的パラメーターの算出

発光がおこる．これらのバンドは試料を光照射しなくて様々なモデルに基いた理論式を用い，熱発光と遅延発も現われるが，光照射によりその強度が高くなる場合が光をフィッティングし，発光に関与する分離電荷対再結

多い．

合の熱力学的パラメーターを求める事ができる．詳細に

2.b.8.2 遅延発光減衰曲線

ついてはそれぞれの文献を参照されたい．

遅延発光の減衰曲線は様々な寿命を持つ分離電荷対間の再結合に由来する，異なった時定数で指数関数的に減衰する曲線の足し合わせと理解される．表 1に見られる

2.b.10 試料

ように，各減衰成分の緩和時間より関与する正負電荷対

葉緑体標品や光化学系 膜標品，シアノバクテリアやの種類が推定できる．暗順応した葉緑体標品を１閃光照

藻類細胞など溶液中に分散している試料は，固定タイプ

射した後の遅延発光減衰曲線を図 10に示す．主成分は，の試料ホルダーの試料用のくぼみに直接のせる．筆者がDCMU の存在下では〜８秒，非存在下では〜70秒で緩用いている可動タイプの試料ホルダーでは，試料（〜200

和し，それぞれ，S Q ，S Q の再結合に由来している．

，〜70μl を ピ ペット で ろ 紙（15mm×15
μg Chl/ml）

藻類やシアノバクテリアの細胞や葉では，様々な部分に浸み込ませ，アルミ板とアクリル板の間にはさみmm）で安定化された電荷が関与し，それらの再結合も細胞の込む．〜20μg Chl/ml 程度の試料でも十分に測定可能で生理状態を反映するため減衰曲線はより複雑となり，指ある．生葉などは葉脈などが少ない部分を選び，リーフ

数関数的に減衰する曲線の足し合わせでは記述できなくパンチ（または，コルクボーラー）で打ち抜いたものを直接ホルダーにのせる．試料葉がホルダーに密着するよ
うに注意する．生葉を DCMU などの薬剤で処理したい
場合は，薬剤が入った溶液中で真空浸透（vacume infiltration）する．軽く減圧後，急に常圧に戻すことを数回

図 10：S Q と S Q 再結合に由来する遅延発光減衰曲線
十分に暗順応した葉緑体を DCMU 存在下（上）又は，DCMU
非存在下（下）で１閃光照射した．15℃で測定．

2009 低 温 科 学

vol.67

図 11：シアノバクテリア細胞における遅延発光減衰曲線
好熱性シアノバクテリア（Thermosynechococcus elongatus）細胞（5μgChl/ml）を赤色光（700nm）で照射（緑），白色光
で 30秒間照射→赤色光（700nm）で照射（赤），白色光で 30秒間照射→５秒暗→赤色光（700nm）で照射（青）した後，遅延発光測定装置（浜松ホトニクス：PM X-6100）で遅延発光
減衰曲線を測定．
（勝又，小野 未発表）461

行う．葉の表皮を剥いて薬剤が入りの溶液中に浸してもよい．

2.b.11 熱発光測定に際しての留意点
１) 熱発光バンドのピーク温度は，装置によってばらつく．実際の試料温度と温度測定用熱電対が示す温度は
必ずしも一致しない．また，試料が均一に加熱されず，試料中に温度のばらつきや勾配ができるとバンドの形などに影響を与える．しかし，理論式に従ってバンドのフィッティングを行い，熱力学的パラメーターなどを求める場合などを除いては，通常の使用ではあまり問題とならない．
２) 熱発光バンドのピーク温度は pH により変化する．
生葉で熱発光を測定する場合，凍結，加熱により細胞組織が破壊される為，単離葉緑体で測定した場合と異なる温度にバンドが現われる場合がある．
３) 熱発光バンドのピーク温度は昇温速度によって変化する．高い昇温速度ではより高い温度にピークが現わ
れる．
４) 凍った試料の融解に伴い昇温速度が変化するため，０℃近傍に現われる熱発光ピークが歪んだり，偽のピークが現われることがある．溶液に凍結防止剤として〜25％(v/v）程度の glycerol を添加することにより改善することができる．
５) 光照射する前に試料を十分暗順応させる．暗順応に必要な時間（と温度）は，測定しようとする熱発光バ
ンドにより異なる．
６) ある処理や条件下で熱発光バンドのピーク温度や形が変化した場合，変化が系 の酸化側の正電荷キャリ
アーと還元側の負電荷キャリアーのどちら側（又は両側）に由来するかは原理的にわからない．すなわち，
S Q 再結合由来の B ‑バンドのピーク温度が変化した場合，これが S の性質の変化に由来するものか，Qの性質の変化に由来するものかを区別する事は出来な

Plants and Bacteria, eds. J.Amesz & D.C.Fork, Academic Press, Orlando, 1986, P.329.
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い．しかし，Q の性質が変わった場合は S Q 再結合

Friedrich, M .Pohlmann, Archiv. Fur. Hydrobiologie.

に由来する Q‑バンドには変化が現われず，S の性質

Special Issues Adv. Limnol. 55 (2000)P.87.
21) M .Katsumata,T.Koike,M.Nishikawa,H.Tsuchiya,が変わった場合は Q‑バンドにも同じような変化が現われる可能性が高い．
７) 熱発光測定に使用した試料は，通常，凍結と加熱により生理学的な活性を失っている．

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P.125.

463

４章 分光測定

２．分光測定法
c．閃光分光法と差スペクトル伊藤繁

光合成に使われる閃光分光法による差スペクトル測定の原理，実験装置の説明をした．実験例として植物，アカリオクロリス（シアノバクテリア），ヘリオバクテリア，クロロビウムの型反応中心質複合体と光センサー蛋白質 AnPixJ の吸収時間変化と時間分解差スペクトル測定を紹介した．

Flash photlysis of photosynthetic systems
Shigeru ItohPrincipals and apparata of flash-photolysis measurement sytems are reviewed. M eareuments of flash-induced
absorption changes of chlorophylls in type-I reaction centers of plant, Acaryochloris marina, Heliobacterium,
Chlorobium and of a color sensor protein in cyanobacteria are interpreted.

2.c

はじめに

ΔA＝ΔεΔCL

アンテナ色素に吸収された光は．反応中心タンパク質の関係となり，閃光照射前後での（明−暗）吸光度変化

中のクロロフィルに渡され，電荷分離がおこる．ほとん

ΔA

どの電子伝達成分は非アミノ酸で，酸化還元反応に伴い照射前後の透過光量 I と Iʼを測定すれば良い．

特徴的な吸収スペクトルの変化を示す．閃光分光法は，
光反応をキセノンフラッシュランプあるいはレーザ閃光(2)を測定すれば濃度変化がわかる．これには，閃光ΔA＝log I /Iʼ−log I /I ＝ΔεΔCL(3)照射で開始し，各成分特有の吸収スペクトル変化（差ス

従って混在する他の物質やその濃度を測定しなくともペクトル）を検出するので光合成研究に最適の方法であ（知らなくとも），光応答する対象分子の反応量や反応速

る．試料を透過した測定光量の変化を高感度，高速に測度を実測できる．Δε未知物質についても差スペクトル定することで，反応や速度を直接決定できる．

や時間経過は測定できるので，反応過程を容易に非破壊的に追う事が出来る．他手段で分子数を推定できれば，Δεも決定できる．閃光光源，レーザ，計算機，検出器で2.c.1 測定原理と差スペクトルある光電子増倍管などの発達がもたらした閃光分光法の分光法では，試料に測定光 I を照射し，透過光強度 Iを測り試料中の物質量を計測する．試料が吸収する光量発展により光合成研究は大きく進んだ．
測定上の注意点は，特定波長の光について I，Iʼを正確は Lambert-Beer の法則に従い試料中の光吸収分子の対象波長での分子吸光係数 εと光路長（L），分子濃度 Cに比例する．吸光度 A は常用対数を使うとA＝log I /I ＝εCL

(1)（εは分子吸収係数で分子固有の値，C はモル濃度，Lは光路長）であり，ε既知の物質の濃度を簡単に決定できる．図 1は，閃光分光法の原理を示す．ある分子種が酸化（あるいは還元）され吸光係数が変化する時，その差
分子吸光係数（Δε）が既知ならば，濃度変化 ΔC は吸光
度変化 ΔA と
１) 名古屋大学大学院理学研究科物質理学専攻物理2009 低 温 科 学

vol.67

図 1：閃光分光法の原理と吸光度変化の計算．
F 2，F 3は光学フィルター465

に測定することにつきる．例えば，励起用の閃光が受光部にもれたり，試料の光散乱が変わったり（濁ったり）

2.c.2 多様な電子伝達成分

すると，I と Iʼの比を正しく測定できない．これを避ける

表 1に植物型光合成に働く主な電子伝達成分の名称，

ために，測定領域の光は通すが，閃光は通さないような分光特性と酸化還元電位，反応速度（反応全般は文献 参

光学フィルターや，分光器を受光器の前におく．

照）を示す．電子伝達成分近傍のクロロフィルや，カロ

吸光度変化量は，受光器の出力電圧変化から計算する．

テノイドなども局所的な電場変化や，膜内外液相間でのた と え ば 700nm で，L＝1cm，I と Iʼが 1V と 1.01V

膜電位に応じてスペクトル変化を示す．これらの詳細に（透過率１％増）の出力変化を生んだと測定されればついては光合成関連の教科書などを参照されたい．

ΔA＝−log Iʼ
/I ＝−log 1.11/1 ＝−log 1.11 ＝−0.00432の 吸 光 度 減 少 と な り，700nm で の Δεが 64
mM cm の分子（例えば P 700）の反応なら式（3）より ΔC＝−0.00432/64mM

2.c.3 測定装置

cm /1cm＝0.000068

mM ＝0.068μM の変化となる．波長ごとの測定から，差実際に使われているいくつかの閃光分光装置を図 2に示し，その特性を以下に示す．

スペクトルを得て反応分子を同定したり，その量，変化，加えた試料の量や反応条件との関係を調べる．
表 1：植物光合成初期反応に関わる成分の分光的特徴
吸収帯の red ox は還元と酸化型での吸収ピークを示す．
（ ）内は差分子吸光係数
反応部位

分子名

吸収波長 nm(吸光係数 mM cm )酸化還元電位
(V)

反応速度

参考になる
文献

PSI 電子供与体 Chl a

P700

700red(64)430red(44)810ox(8)0.43‑0.46

光酸化 3‑10ps
暗還元 0.1，1，30ms

1，7

PSI 電子受容体 Chl a

A0686red〜−1.0

光還元 3‑10ps
暗酸化 30ps

13

PSI 電子受容体キノン

A1：フィロキノン
QK

390red〜−0.8

光還元 30ps，Fx によ 3，13る酸化 ns，P700と 0，
2ms

PSI 電子受容体鉄硫黄
センター

A2＝Fx

430red (11）〜−0.7

光還元 25‑200ns
P700による酸化 1ms

PSI 電子受容体鉄硫黄センター

P430（＝FB，FA)

430red (11）460ox〜−0.48

光 還 元〜200ns P700 1，6‑8による酸化 30ms

P700への電子供与体

プラストシアニン

460，597ox (4.9)，
770ox

＋0.37

光酸化 0.01〜0.2ms

9，10

PSII 電子供与体 Chl a P680

680red410，825ox(7）〜＋1.0

光酸化〜 ps
暗還元 1‑200μs

4，10PSII 電子受容体

フェオフィチン a

410，680546red〜−0.4

光還元〜 ps
暗酸化 200ns

PSII 電子受容体

Q (プラストキノン) 270ox，320red(13)〜0

光還元 200ns

5，6，12

PSII 電子受容体

Q (プラスとキノン)〜0.1

光還元 200μs

5，6，12PSII

シトクロム b 559

429，539，559red
415ox

0.35

〜20‑30ms

1，6

b 6/f複合体中

シトクロム b 6

434，536，563red(A 563−600＝21)
413，ox−0.08

b 6/f複合体中

シトクロム f421，522，553，6(28） ＋0,365(pH 7.8)
red，410ox

1，5，6

b 6/f複合体中

Rieske-FeS

ESR で測定5，6

膜電位感受性515nm カロテノイド
変化518＋，480−でチラコ
イド膜内側正の膜電位
変化

466

1，3

1，5，6

0.29
光での立ち上がり
＜20ns

11

閃光分光法

図 2：各種閃光分光装置の概略（F 1，F 2，F 3は光学フィルター）Ａ．閃光分光装置標準型（濁った試料も測れるが，蛍光が強い試料は困難）

きないので，測定光より２−３桁強い励起光が 0.1％もれても測定に大きく影響する．これを改善するために長

概略：直流点灯の光源ランプ（可視 ⎜ 近赤外光領域

波長や短波長光カット用の色ガラスフィルターや干渉ではハロゲンランプ，紫外部では Xe 放電管など）からでフィルター，レーザ波長だけを通さないノッチフィル

た光を光学フィルター F 1と分光器１で必要な波長光のターなどを使用する．２枚以上を組み合わせてもよい．

み取り出し，試料にあて，パルスレーザ（または Xe フ

励起光で生じるクロロフィル蛍光なども測定を阻害す

ラッシュランプ）からの励起光で引き起こされる吸光度る．ただし，励起光や蛍光の影響は，励起時間だけのも

変化を光電子増倍管で検出される光電流の増減として測ので，長時間の測定ではあまり問題にならない．また，定する．電流はプリアンプで増幅し，デジタルオシロス

増幅系の時定数を遅くして測定すると，その時定数に合コープで記録する．測定光はＤに示すようなタイミング

わせて励起光によるノイズが観測される．反応を引き起（コンピュータあるいは専用パルスジェネレータで制御）

こさない範囲で測定光強度をあげ，繰り返し測定を行い，でレーザ照射に同期させて電磁シャッターを開閉するこ信号を積算することで，S/N 比を上げる．フィルターがとで，閃光照射前に試料にあて，測定終了後は消す．こ

強い蛍光を発する場合もあるので注意する．
（色ガラス，

れにより，試料に不必要な光反応が起こるのを防ぐ（電干渉フィルターともメーカー多数あり，価格は数千円−

磁シャッターの振動が測定系に余分なノイズを与えない

20万円/１枚）

ように注意する）．（このような測定系は東京インスツル

検出器：光電子増倍管は多種あり，それぞれ紫外，青，メンツ，堀場製作所，などで得られるが，注文生産）．

赤，近赤外などの感度に特徴がある．測定波長で感度が光学フィルター：F 1は分光器の２次光 カット 用 で高い事を確認する．励起波長域で感度が低く，測定波長

F 3があればなくともよい．F 2は励起光を必要な波長の域で高い検出器が良い．たとえば，シトクロムなどを測みに限定するガラス光学フィルターで，波長精度が良い

定する時は赤感度のない管を使用し，赤色部のククロロ

レーザ励起時には無くても可（しかし，レーザ励起用のフィル吸収帯を励起する事で，蛍光や励起光によるノイフラッシュ光などが漏れる事もあるので注意）．F 3は励ズの少ない測定ができる．一方，P 700のようなクロロ

起光が光電子増倍管にはいるのを防ぐためで，重要．光フィルの吸収変化を測定する時には赤感度の高い管が必

合成では，通常１％以下の吸光度変化（存在する被測定要となる．化学物質の光反応では赤や近赤外には感度が分子の濃度と分子吸収係数から計算できる）しか期待で低い検出器を使用することが多い．電圧を印可したまま2009 低 温 科 学

vol.67467

光電子増倍管に強光を照射すると損傷するので注意す

閃光光源；キセノン閃光光源（発光時間 1‑50ミクロ秒

る．300‑1000V の安定化電源が必要．
（浜松ホトニクスの程度），やパルスレーザ（発光時間 10‑20ナノ秒）を使用

カタログなど参照）．

する．前者は簡便で幅広い発光スペクトルで，ガラス分

プリアンプ：光電子増倍管の出力は直接オシロスコー

光フィルターや干渉フィルターと組み合わせ，様々な波プにつなぐ事も可能だが，電流が少ないので，簡単な電長での励起が可能である．発光時間が長く，発光スペク

流増幅用のプリアンプで増幅したあとさらにもう一段オ

トルが広いことが便利だが同時に迷光をうみ，検出を妨

フセット電圧を加える増幅器を使用する（市販の 100

げる．例えば波長範囲 400‑700nm でのクロロフィル吸

M Hz 程度の高速汎用安価なオペアンプによる自作も容収変化の測定では，600nm 以上の測定にはフィルターを易．電源ノイズや発振などに注意する．スイッチング電

閃光光源につけ 500nm 以下の Soret 帯のみを励起す

源は GHz 程度の早いノイズがあるので，100μs 以下のる，600nm 以下の測定には 650nm 以上のみを励起する

測定では使用しない）．ごく小さな変化量（１％以下）をような工夫が必要で，しかも（光強度と吸収帯とできま

拡大して増幅記録するためにオフセット電圧を引加し，る）励起効率も異なる．最も普及している Nd-YAG レー

信号変化範囲を 0V 付近に限定することでデジタル分

ザの２倍波（20ns，532nm）で励起するなら，検出器側解能を最大限利用して S/N よく記録できる．たとえばに 532nm＋−20nm 程度を通さないノッチフィルター

10ビット分解能のデジタルオシロ に 入 力 す る と，1/をいれると，これ以外のほぼ全波長で測定可能となる．

1024＝0.1％以下の信号差は全く記録できないはずであ

しかも，短い閃光時間により高速過程の測定が出来る．

るが，実際にはオフセット電圧の利用や多数回の信号積

さらに，色素レーザ（色素により，500‑700nm），チタン

算により分解能があがり，必要精度を得られる．
（岩通，

サファイヤレーザ（700‑900nm 可変）などを加え，異なっテクトロ，など色々 数十万円）

た波長域を励起できれば更に便利だが，費用がかかる．

光源と分光器と回折格子；目的の波長精度にあわせて選定する．通常 1nm 程度の精度がえられれば十分で15‑50cm の分光器が一般的．既存のスペクトロメータか

Ｂ．ダブル分光器型閃光分光装置（透明試料や，蛍光を出す試料に適している）．

ら取り出してもよいが，一番重要なのは明るさ．波長精上記Ａ装置とは逆に試料の後に主分光器（2）をとりつ

度と光量がいる．分光器はニコン，島津，日本分光，なければ試料の蛍光を取り除ける．クロロフィル蛍光と重ど多数あり，使用波長範囲で明るいものを選ぶ．閃光分

なる波長域の測定（例えば P 700）の測定にはこの配置が光での最重要点は明るさであり，ランプとの組み合わせ

よい．試料にあてる測定光量をへらし，波長精度をあげが重要．光源は高安定化直流電源で点灯し，分光器の細るために，副分光器（1）も使うが，これは明るく小さないスリットに焦点を合わせるので，100W 程度の小さくもので良い．この代わりに特定波長光を透過するバンド

高輝度（青部分で重要）のフィラメントのハロゲンラン

パスフィルターや干渉フィルターなどを使用してもよプが良い．やや低い電圧で新しいものを使用して変動をい．試料に当たる測定光が強すぎないようにする（光応減らす．
ランプの冷却ファンはノイズをだすので止める．

答信号量を測定光量を変えてはかり，減らない事を確認

Xe ランプは高輝度だが，直流点灯でも発光量，発光部位する）．光が試料を透過後に主分光器２に入れるので，試の変動が大きく紫外部（レンズ系を石英にする必要あり）

料が透明でないと，光電子増陪管に到達する光量が減少

以外ではメリット少ない．

してしまい，ノイズが増え測定困難となる．濁った試料

試料室；試料は通常の 1x 1x 4cm のガラスセル中に（例えば植物葉緑体チラコイド膜，細菌細胞，葉，など）いれるのが便利．試料ホルダーは水循環などで温度制御には散乱に強いＡ型が，表面活性剤処理で分離精製したしたりマグネットスターラーなどで撹拌できると便利で透明な光化学系

ある．試料室中，あるいは外にガラスフィルターを取り

ア反応中心などや，蛍光の強い試料にはＢ型が適してい付ける．我々はやや大きめの 25cm 角の試料室を使用しる．

， 標品やアンテナ蛋白質，バクテリているが，手をいれることが出来るので，低温測定用のクライオスタット（Oxford など）もいれられ，使い勝手

Ｃ．光ファイバー型分光装置．

はよい．既成の分光器の一部を取り外しても良い．我々

A，B，型での分光器の役割を干渉フィルターで置き換

は，鉄板上に，マグネットで，分光器，試料室，検出器

え，光路を光ファイバーに置き換え，検出器をダイオーを固定してＡ，Ｂ兼用型として使用している．装置 A‑D

ドにすることで，簡便で安定，必要なら移動可能な装置

では防振台などは特に必要ない．

を作る事ができる．F 1を小型分光器にしても良い．差ス

468

閃光分光法

ペクトルが明らかな特定の成分（例えば P 700やカロテ

測定して時間分解スペクトルを直接得られるのが特徴でノイドシフト）の時間変化だけを測りたい場合に良い．

あるが，その分検出器が小さいので光量がへり，S/N は

市販品もある．
（例えば PAM 蛍光測定装置の付属品）．

落ちる．Ｂと同様に濁った試料の測定には向かない．同

励起光も光ファイバーを通して与える事が可能である．

じ装置で測定光をつけなければ蛍光スペクトルもとれる

試料に検出器側の光ファイバーを近づけることで，濁っ利点があり，透明である程度大きな信号が期待される精た試料（たとえば葉など）でも測定ができる．この際に製反応中心試料などの測定に向いている．一方信号の小は，励起光や散乱光の影響を除くために，フィルターやさい（差吸光係数の小さな）分子の反応などにはあまり測定時間などに注意する．

向かない．ランプの時間による揺れなどでベースラインのずれも起こりやすい．

Ｄ．A‑C 装置の測定時系列例．

この測定では励起レーザ光と，測定用閃光，ゲート制

励起閃光照射の直前に光路中の電磁シャッターをあ御信号のタイミングがきわめて重要となる．Ｇに示すよけ，信号を測定する．測定後はシャッターを閉じておく

うにレーザ光と，測定閃光間の時間を設定し，積算を行ことで，試料の暗回復をはかり，より強い測定光でも問い，時間分解スペクトルを得る。時間を変えて行くこと

題なく測定できるようにする．デジタルオシロスコープ

で反応を追う．

での記録はシャッター解放と閃光照射時からシャッター
閉鎖直前までにおこなう．タイミングの調製には，専用

Ｆ．ピコ秒時間分解スペクトル測定装置の パ ル ス 発 生 機（我々は 50ps で 設 定 可 能 な ス タ ン

ナノ秒以下の分光測定では，電気的な方法での時間制

フォードリサーチ社製 DG535 を使用）
を用いて，シャッ

御は困難であり，光速と距離の関数として時間を決める

ターの解放，測定の開始，レーザの照射，シャッター閉

方法をとる．光源として，数ピコ秒〜数十フェムト秒の鎖のシークエンスを制御する．
これを 1‑1000回程度繰りレーザ閃光を用いる．この閃光を偏光ビームスプリッ

返し，信号積算することで，S/N 比の高い測定ができる．

ターで２つに分け，一方は励起光として試料にあて，も測定時間や，繰り返し時間は目的信号の特性と試料の暗う一方は，CS 溶液や D O などに当てて白色光を作り出所回復時間などの条件毎に検討して，信号強度が最大にし，これを測定光として使う．測定光の光路長を移動スなるように設定する．

テージ上のミラー対により変化させて，試料への到達時間を励起光とはずらしていく．光検出器としてはＤと同

Ｅ．マルチチャンネル時間分解スペクトル測定装置

様に分光器とダイオードアレイや CCD の組み合わせを

A‑C では，特定波長での透過光強度を測定し，その変用い，励起光と測定光の時間差を変えつつ時間分解スペ

化量を波長を変えて測定することで，変化成分の差吸収

クトルを得る．レーザ閃光の幅で時間分解能がきまる．

スペクトルを得る．これと反対に，レーザ閃光後の特定

時間分解能が高い（測定光照射時間が短い）と得られる

時間での吸収スペクトル（時間分解スペクトル）を直接光量が減るので，多数回の積算が必要となる．このため得る．タイミングを変化させて沢山の時間分解スペクト

励起レーザの繰り返しも早くなるので，試料損傷も起こ

ルを得た後，時間変化を判定する．本装置では，閃光照

りやすくなる．これを防ぐために，フローセルによる試射後の特定時間に，測定光を白色閃光として与え，透過料の循環，冷却などを行う．数ナノ秒以下の時間範囲で光を分光器にいれ，分光後の光量をダイオードアレイ検はアンテナクロロフィルの励起状態生成による吸収変化

出機や CCD 検出器で波長全域での時間分解スペクトルや，レーザ光照射による蛍光誘導放出などが起こるのでとして一度に検出する．
このタイミングを変えることで，これらの影響も考慮して時間分解スペクトルを解釈する

励起レーザ閃光照射前後の広範囲の時間での時間分解ス必要がある．測定試料溶液の酸化還元電位の制御などもペクトルを得る．暗所でも出る熱ノイズを減らすため，行い，電子移動に伴う吸収変化と励起状態による吸収変−20から−80℃程度の冷却器付きのダイオードアレイや化（こちらは酸化還元状態に依存しない）を分けること

CCD を用いる．パルスレーザで励起し，測定光は Xe 閃

も行い，目的対象のスペクトル変化を得る．F に示す時間

光から得る．後者の発光時間（1ミクロ秒程度）に応じた系列と同様だが，受光器のゲート信号による感度制御は時間分解を行う場合と，さらに CCD やダイオードアレ

不要となる．

イの前に取り付けたイメージインテンシファイヤーを
ゲート電気信号で制御して 10ナノ秒程度の分解能での時間分解スペクトルを取る方法がある．多波長を同時に2009 低 温 科 学

vol.67469

2.c.4 測定例 1：閃光で誘起される吸光度変
化の時間変化と差スペクトル装置Ｂによる，クロロフィル d を主要色素として持つ
シアノバクテリア，アカリオクロリスより単離したチラ
コイド膜上の光化学系

反応中心クロロフィル P 740の

光酸化と暗回復の測定（図 3）
．文献

参照．

試料，アカリオクロリスをビーズビーターで破砕し，超遠心分離機により分画したチラコイド膜．反応液：50mM Tris 緩衝液 pH 7.5，20mM NaCl，さらにアスコルビン酸 10mM ，DCIP 0.1mM を添加して P 740を前もって還元しておく．室温．励起光は NdYAG レーザ
２倍波 532nm，10ns パルス幅，0.25Hz 繰り返し，吸収変化が 90％飽和するレーザ強度に設定．32‑256回積算．

図 4：ホウレンソウとアカリオクロリスの光化学系 ，ヘリオバクテリア，クロロビウムの反応中心質複合体の吸収スペ
クトル（上）とレーザ誘起された各電子供与体の差スペクトル（下）．P 740差スペクトルは図 3の結果から作成

閃光照射で引き起こされる各波長での吸収の時間変化を測定した（図 3）．P 740の時間変化は遅いので ms 領域

図 4に，
絶対嫌気性細菌と植物，アカリオクロリス各々

のみを表示．1ms 以内では 725nm に一部見られるようから精製された 型反応中心複合体の吸収スペクトルとに PSII の反応中心クロロフィル（2009年時点ではクロ反応中心クロロフィルの光誘起差スペクトルを示した．

ロフィル d か a か論争中）の半減期 200μs の変化が重クロロフィル a をもつホウレン ソ ウ の 光 化 学 系

なる．波長ごとに変化の大きさ，方向が変化する．このP 700，クロロフィル d をもつアカリオクロリスの光化

うち遅い部分（2ms での変化量）の大きさを波長に対し学系 は P 740，バクテリオクロロフィル g をもつヘリて示すと図 4下の P 740（還元−光酸化）の差スペクトル

オバクテリアの反応中心は P 800，バクテリオクロロが得られる．この差スペクトルは 460nm と 740nm に吸フィル a をもつフロロビウムの反応中心は P 840とよ

収減少の極大を示し，430nm と 700nm に正の極大を示

ばれ，それぞれ異なったクロロフィルの 2量体が電子供す P 700（ホウレンソウなどのようにクロロフィル a を与体として働く．
各反応中心複合体は 100‑50分子のアンもつ通常の植物やシアノバクテリアの光化学の反応中

テナクロフィルと１分子の電子供与体（クロロフィル 2

心クロロフィル a 2量体）とはことなっていた．この差ス

量体）を持ち，特徴的なスペクトルを与える．反応中心

ペクトルからアカリオクロリスの光化学系

は

でクロロ

クロロフィルはアンテナクロロフィルの長波長側に吸収

フィル d の２量体が反応していることがわかり，酸素発

帯を持ち励起エネルギーを集め光反応を行う．多数のア

生型の光合成でもクロロフィル a 以外のクロロフィル

ンテナクロロフィル中でも，光酸化をする各電子供与体が電子供与体として働くことが初めて示された．反応時の異なる差スペクトルだけが閃光分光法では測定でき間の違い，試料の酸化還元状態の制御で吸収変化を与える．また差スペクトルは近傍クロロフィルのシフトによる成分の特定や反応が検討できる．

る吸収変化もふくみ，時間範囲を変えると違う成分の反応も見えてくる．

2.c.5 測定例 2：時間分解差スペクトルの実
測ゲート CCD 分光システム（図 2E）によるシアノバク
テリア光センサータンパク質 AnPixJ の時間分解スペク
トルの測定（図 5）．
試料 大腸菌で発現精製した，シアノバクテリア光センサータンパク質 AnPixJ．図 5上に示すように，この蛋
図 3：アカリオクロリスチラコイド膜閃光照射時の吸収変化

470

白質は赤と緑に吸収帯を持つ Pr と Pg の２状態を示す．
光照射で状態間の遷移が起こり，シアノバクテリアの走
閃光分光法

変化，同時にその超波長側に吸収増大が起こる．これは650nm の Pr 型の基底状態の吸収帯が消失し，660‑70
nm(a）に新吸収帯が出現（長波長シフト）した事を示す．
次に 1μs の時点では逆に短波長側 570nm(b）に吸収帯が移る（短波長シフト），更に 10ms 後にには最終状態である Pg が 540nm に新吸収帯をもたらす．この間 650
nm の Pr 型の基底状態の吸収帯は消えたままで，最終的に Pr が光照射で a，b に極大を示すような中間状態を経て Pg 型に遷移したことがわかる．更に多くの時間分解スペクトルを測定し，各中間体個々のスペクトルをガウ
ス曲線を使ったシミュレーションと時間変化を計算した．

文献
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図 5：シアノバクテリア光センサー蛋白質 AnPixJ の光反応に伴う差スペクトルの変化

光性を制御する光センサーとして機能する．
測定装置，Pr から Pg への遷移を，反応開始用レーザ
閃光として，固体体色素レーザ（Solar），10ナノ秒閃光，
650nm を使用
（Nd-YAG レーザ２倍波 532nm，10ns を変換）．測定光はキセノン閃光 1ミクロ秒白色光．受光器
はオリエール社製ゲートイメージインテンシファイヤー付き冷却 CCD，分光器はオリエール 30cm 分光器．
励起用レーザ閃光照射に同期して，図 G に示すように一定時間ずらしたキセノン閃光（測定光）1ミクロ秒を照射し，そのピーク時間でイメージインテンシファイヤー
を 10‑50ナノ秒ゲート信号で作動させ，I，Iʼ
を測定し，差スペクトルを計算した．繰り返し間隔５秒，測定をしない４秒間は緑色 LED 照射で，試料を Pr 状態に保持した．ゲート信号の時間を変えて得た時間分解スペクトルを示す．
レーザ閃光照射後 100ns 以内に，650nm に負の吸収

2009 低 温 科 学

vol.67

Physiology. Photosynthesis I ,Springer-Verlag, Berlin.
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471

４章 分光測定

２．分光測定法
d．EP R 法
三野 広幸
本稿では，はじめに EPR 法の原理を紹介し，次に，X-band 汎用 EPR 機による測定法の使用を想定し，光合成研究への応用例を紹介している．また，最近のより進んだ EPR 測定法についても簡単に紹介している．

EPR spectroscopy for photosynthesis research
Hiroyuki M ino
EPR (Electron paramagnetic resonance)is a powerful method for photosynthetic research. In this chapter,weintroduce the principle of the EPR technique and some methods for spin quantization in photosynthetic organisms. Some examples of EPR signals in photosynthetic organisms and recent techniques are introduced.

EPR 法は光合成研究で定量から分子構造の解明まで

エネルギー差は磁場の大きさに比例し，その比例定数

広く使用される．近年ではパルス法，多周波 EPR 法など

を g 因子と呼ぶ．g 因子は有機ラジカルの場合にはほの新手法も発展している．EPR 装置といえば一般的には

ぼ２の値である．g 因子は分子の形や方向によって異X-band（9GHz）帯の連続波（CW )‑EPR 機で，共通機なるため，これを利用して分子構造を知ることができ器として広く大学や研究所に装備されている．いくつかる（図 1）．

の点に注意すれば汎用の分光測定器と同様に簡便に用い

２．核スピンのゼーマンエネルギー：磁場中で核スピンることができて，研究の幅をより一層広げられる．本章がどちらの方向を向くかによって生じるエネルギー差

では，汎用機を使用した測定例を中心に EPR 法を紹介である．
（核スピンを小さな磁石と考えれば理解しやす

する．

い．
）
電子のゼーマンエネルギー同様，エネルギー差は磁場の大きさに比例し，その比例定数を核の g 因子

2.d.1 EP R 法の原理

（g ）と呼ぶ．核の g 因子は核の種類により異なる．このエネルギー遷移を NM R 遷移と呼ぶ．

EPR（電子常磁性共鳴）は電子スピンを対象とした磁３．超微細相互作用：電子スピンと核スピンの相互作用気共鳴法である．ESR（電子スピン共鳴）とはほぼ同義である．これは電子磁石と核磁石の磁石間の相互作用に用いられる．主な検出対象はラジカル，遷移金属であと考えればよい．

る．核スピンを対象とする NMR（核磁気共鳴）に比べる

以上の１から３によって磁場中で電子スピンのエネルと感度は格段に高いが，光学的分光法に比べるとかなりギー準位がわかれ，分裂したエネルギー幅に等しいエネの高濃度試料が必要で，ラジカル濃度にして 20μM 以上の濃度が必要である．測定は非破壊的に行うことができ，
測定そのものによる損傷はない．精製純度の低いタンパ
ク質などでも目的信号のみを検出できる利点はあるが，それは検出対象が限られるということでもある．
EPR の原理を理解するには基本的に以下の３種類のエネルギー分類を知っておけばよい．
１．電子スピンのゼーマンエネルギー：磁場中で電子スピンの向く方向によって生じるエネルギー差である．
（電子スピンを小さな磁石と考えれば理解しやすい．
）
１) 名古屋大学理学研究科（物質理学）

2009 低 温 科 学

vol.67

図 1：磁場中におかれた電子スピンはスピンの向きによってエネルギーに差を生じる．これをゼーマン分裂と呼ぶ．エネル
ギー差は磁場の強さと g 因子で決まる．エネルギー差に対応したマイクロ波をあてると共鳴吸収がおこる．

473

図 2：１つの電子スピンと１つの核スピンが磁場中におかれた場合のエネルギー準位の模式図．ESR 遷移と NM R 遷移は
同時にはおきない．①電子のゼーマン分裂，②核のゼーマン分裂，③超微細相互作用．

図 3：EPR 測定装置のブロックダイアグラムが少ないため溶液系の測定に有利である．どのような空洞共振器を用いているのかは測定前に確認しておいルギーのマイクロ波を加えることにより共鳴吸収がおきたほうがよい（図 4）．通常の EPR 測定では変調磁場をる（図 2）．EPR 遷移と NMR 遷移は同時にはおきないた

用いるが多くの場合，変調コイルは空洞共振器内に装め，図 2の場合には４準位のうちで２種類の EPR 遷移

着されている．

が観測される．信号強度はエネルギー準位間のスピン数の差によって決まる．準位を占める状態の数の差が大き４．信号検波装置と出力装置（コンピューター，レコー
ダーなど）

ければそれだけ大きな信号が得られる．各準位にいるス

信号の検波は通常ロックインアンプを用いて変調磁

ピン数はボルツマン分布により決まるため温度が下がれ場に同調させて行う．このため EPR スペクトルは微ば下の順位にいる数が増え，それだけ大きな信号が得ら分形で測定される．

れる（キューリーの法則）．原理的には０℃（273K）と液体窒素温度（77K）では信号強度は 3.5倍に，液体ヘ
リウム温度（4.2K）では 65倍になる．このため，定量的な議論をする場合には信号強度への温度の影響を考慮
しなければならない．

2.d.3 測定法の一般的注意
測定は以下の手順に従う，
１．マイクロ波の強度を決定する．
２．変調磁場の大きさを決定する

2.d.2 装置の概要

３．外部磁場の掃引範囲を決める．

一般的な 9GHz 帯の EPR 装置の場合次のような構成をしている．
（図 3）１．外部磁場印加用のマグネット
２．マイクロ波の発振器および信号検出器（マイクロ波
ブリッジ）
３．空洞共振器
EPR の測定では試料を空洞共振器に挿入し測定を行う．空洞共振器は信号感度を決める最も重要な部分といってもよい．空洞共振器には内部の形状により矩形型，円筒型などの違いがあり，感度，測定条件など
がそれぞれ異なる．また，内部のマイクロ波の定在波のモードによって TM 型，TE 型などがある．汎用には矩形型または円筒型の TE 型空洞共振器が使用されることが多い．TM 型空洞共振器は水による誘電損失474

図 4：Bruker 社製空洞共振器 矩形型 TE ．正面のカバーをずらしたところ
試料管は共振器上部から挿入する．共振器の正面から光を照射できる．両側には測定用の補助コイルが組み込まれており，変調磁場を加えることができる．

光合成研究のための EP R 測定法

図 5：マイクロ波強度と EPR 信号の強度の関係
飽和していない条件では EPR 信号強度はマイクロ波パワーの平方根に比例する．正しい線形のスペクトルを測定するには比例関係のなりたつ範囲で測定を行う．飽和の条件は試料や空洞共振器の種類によって異なる．

４．外部磁場の掃引時間と信号検出時の時定数を決める．
（詳細は各装置の取り扱い説明書を参照されたい．）

図 6：変調磁場の効果
変調磁場を変えて測定した DPPH の EPR 信号．変調磁場を大きくすると信号強度は強くなるが，大きすぎると信号線形がひずみ本来の線形が崩れる．

以下にそれぞれの注意すべき点を挙げる．
１．マイクロ波の強度
適正な条件では EPR 信号強度はマイクロ波のパ３．外部磁場の掃引

ワーの 1/2乗に比例して大きくなる．よって強いマイ

有機ラジカルの場合外部磁場の掃引幅は 50〜200G

クロ波の方が観測には有利である．しかし，マイクロでよい．通常 g ＝2周辺に観測される．中心磁場の位置

波が強すぎるとこの比例関係がなりたたずスペクトルは以下の式が目安になる．

のひずみを招く．
このため初めて観測する信号の場合，マイクロ波パワーを変えて信号強度をグラフにプロッ

中心磁場 G ＝ マイクロ波周波数 GHz ×357
４．掃引速度と時定数トしておく必要がある（図 5）．得られたグラフから比EPR 測定では外部磁場を掃引することにより信号

例関係の成り立つ範囲を読み取り適正なマイクロ波強を得る．掃引速度が速いとスペクトルがひずむことが度で観測する．マイクロ波のパワーが強くなると信号ある．初めて信号を観測する対象の場合，掃引速度を

強度は飽和し，比例関係が成り立たなくなる．飽和特変えて測定し，スペクトルが掃引速度によって変わら

性は温度にも依存するので注意が必要である．低温ほないことを確認しておく必要がある．

ど飽和しやすい．なお，特別な使い方としてグラフの飽和特性からラジカル間の距離などを読み取ることもできる．
２．変調の大きさ

2.d.4 測定温度による測定法の違い
室温測定

標準的な EPR の測定の場合信号検出用に外部から
100kHz 程度の変調磁場を与える．

通常 EPR 測定では外径 4mm 内径 3mm，あるいは外径 5mm 内径 4mm の専用の石英試料管を用いる．しか信号強度は変調磁場に比例して大きくなる．しかしし，室温での測定の場合には誘電損失のため多量に水分

変調磁場が大きくなるとスペクトルのひずみを招くを含む試料は測定できない．このため測定には平型試料（図 6）．このため初めて観測する信号の場合．変調磁場

管を用いる
（図 7）
．平型試料管中の試料体積は数 μl であの大きさを変えてスペクトルの形が変わらないことをる．測定を簡便に行うなら，ガラス製毛細管を用いても確認しておく必要がある．適正な変調磁場の大きさはよい．ガラス製毛細管の場合廉価で手軽に測定ができる

観測したい EPR スペクトル中のピーク分離幅の 1/が，ガラスに不純物が含まれるためバックグランド信号

3〜1/4が目安である．

がでることに注意が必要である．ガラス製毛細管の場合

2009 低 温 科 学

vol.67475

図 7：EPR 試料管の形状．（A）通常のもの．（B）溶液測定用の平型試料管の形状．

50μl（外径 1.5mm 程度）のものが使いやすい．100μlの毛細管でも測定は可能であるが，水分量が増えること
により信号の感度が落ちる場合がある．また空洞共振器の中の感度の実効長は 1cm 程度であるが，スピン定量

図 8：液体窒素温度での EPR 測定専用デュアー．空洞共振器に挿入して使用する．

を行う場合には余裕をみて 2cm 長程度いれておき共振器の中心位置に据える．
凍結状態での測定
試料は外径 4mm 内径 3mm，あるいは外径 5mm 内
径 4mm の専用の石英試料管にいれる．
試料体積は 150μl 程度，濃度は 20μM 以上が目安で法であるが，測定前に試料管中の空気を窒素やアルゴン
ガスによって置換して封じてもよい．あるいはゴムのキャップを用いて封じてもよい．バーナーで試料管を封じた場合には，ひび割れなどで試料管中に液体窒素がたある．

まりこみ，室温にあげた際に爆発することがあるので注

液体窒素温度（77K）での測定：意が必要である．

液体窒素測定には専用のデュワーが市販されている（図 8）．液体窒素を継ぎ足すことなく１時間程度の観測ができるが，使用頻度により３か月から１年で真空度が2.d.5 EP R 法を用いた分子数の定量法低下するので定期的に真空を引きなおす必要がある．液

スピン S＝1/2をもつ分子の EPR 信号は同じスピン体窒素の沸騰による試料管の振動を避けるため，デュ数なら信号の線形によらず積分強度は一定となる．通常

ワーの底にグリセロールを１滴たらしておくと沸石がわの有機ラジカルはスピン S＝1/2である．これを利用しりになる．あるいは，液体窒素をいれた状態でデュワーてタンパク量を定量できる．
（EPR で観測される信号は内を減圧することにより沸騰はおさまる．

スピン S＝1/2だけではない点に注意が必要である．た

極低温から室温での測定：

とえば三重項の場合スピン S＝1，Mn の場合スピン低温での測定のために Oxford 社などから，専用の測）S＝5/2である．

定ユニットが市販されている．1.5‑300K での測定が可

光化学系 のスピン定量能である．77K から室温までの制御ユニットは各 EPR［実験方法］

メーカーで市販されている．77K 以下の極低温の場合に光化学系のチロシン D は安定なラジカル状態で存は専用ユニットを使う必要がある．
それより高温は，ヒー在する．このためチロシン D を定量することによってターなどで液体窒素容器から発生させた低温の窒素ガス

光化学系

を石英製二重管中の試料に吹き付ける簡便な方法で得ら

9）
．

れる．
酸素分子の影響：の反応中心数を定量することができる（図定量にはチラコイド膜または，精製した光化学系 粒子を用いる．細胞のままでも不純物からのラジカル信号

酸素分子は常磁性種であるためバックグランド信号とがなければ計測は可能である．ここでは精製した BBY

なる．特に極低温の場合，固体酸素となり試料管下部に粒子からの場合を例に示す．測定は凍結状態下で行う．

蓄積するため，より影響が大きい．真空ポンプで試料管１．標準試料を 用 意 す る．ス ピ ン ラ ベ ル 試 薬 で あ るを引いた状態でバーナーによって封じるのが最もよい方

TEM PO を水に溶かし適当な濃度に調整しておく．ス

476

光合成研究のための EP R 測定法

し，積分強度を得る．
10．チロシン D と TEM PO ラジカルで得られた積分値を比較しその比からチロシン D のスピン量を求める．
（図 9）
この方法によりクロロフィル定量から求められたクロ
ロフィルの分子量とチロシン D との比は 210‑230になる．
注意：EPR の測定条件が異なる信号の積分値を比較す
るには変調，マイクロ波強度，横軸のデーターポ
イント数，温度，磁場掃引幅を考慮する必要があ
る．特にデーターポイントが異なる場合二重積分
後の値はデーターポイント比の二乗に比例することに注意が必要である．煩雑な計算を避けるため，
図 9：(A‑1）光化学系 由来のチロシン D ラジカルの EPR
信号（B‑1）TEM PO 水溶液の EPR 信号．測定は凍結状態で行った．定量のためには比較試料も同じ測定条件で測定するのが望ましい．（A‑2，B‑2）チロシン D ラジカル，TEM PO
ラジカルの EPR 信号をそれぞれ二重積分したもの．二重積分の強度比からスピン量を定量する．

標準試料はすべて同じ条件で測定するのが望まし
い．
光化学系Ⅰの定量
光化学系の量は反応中心クロロフィル P 700 を定量することによって得られる．
測定法は光化学系 のチロシン D に準ずる．

ピンラベル試薬は劣化する場合があるので注意して保存しておく．

P 700 は光化学系

カリウムを加えることにより得るか，低温下で光照射す

２．BBY 粒子を 4‑6mgChl/ml の濃度に調整し，
クロロ
フィル濃度を定量しておく．

ることにより得る．反応中心すべてに十分光照射されていることに注意が必要である．光合成バクテリアの反応

３．試料を EPR 試料管に移す．試料長は 1cm 以下（100
μl 程度）にしておく

中心の定量もこれに準ずる．
P S I/P S II比の算出

４．０℃で試料に 10秒〜１分間光照射を行う．

チロシン D と P 700 のラジカル量比から PSI/PSII

この操作により還元されていたチロシンＤも酸化され，すべてのチロシンＤが酸化型になる．

比を求めることができる．PSI/PSII 比のみの算出の場
合，TEMPO などの標準試料は必要としない．（図 10）５．光照射後数秒程度おいてから暗状態で液体窒素中に移し凍結する．

１．チロシン D 信号を測定する．
（光化学系 の測定法
参照）

６．77‑100K 程度の温度でチロシン D の信号を測定す
る．

２．同じ試料を低温下で（200K 以上で）十分光照射しP 700 をつくる．

測定条件の目安は，マイクロ波強度：0.05mW

変調磁場 4G 磁場掃引幅 200G 掃引時間 30秒

フェリシアナイドを 10mM になるように加えてもよい．

７．得られたスペクトルを二重積分し，積分強度を得る．
積分操作のためにはベースラインをあらかじめ引いておく必要がある．
ベースラインはチロシン D 信号の存在していない
両端の位置から１次，あるいは２，３次程度でのフィッティングを行う．１回目の積分後にもベースラインはひずむため，再度ベースラインを引き算してから積分する．

200K 以 下 で 光 照 射 す る と，光 化 学 系

で測定する．

由来のChlz が同時に酸化蓄積されるので，注意する．
３．P 700 とチロシン D の重なった信号から予め測定しておいたチロシン D の信号を引き算し P 700 のみの信号を得る．
４．チロシン D ，P 700 それぞれの信号を二重積分し得られた値から PSI/PSII 比を得る．
Mn

８．TEM PO ラジカルを標準試料として全く同じ条件

イオンの含有量の定量

植物の葉を直接 EPR で測定した場合 M n の信号が観測されることがある．これは液胞に含ま れ て い る

９．TEM P ラジカルで得られたスペクトルを二重積分
2009 低 温 科 学

粒子に 10mM のフェリシアン化

vol.67

Mn と考えられる．酸素発生系マンガンクラスター由477

図 11：(A)：クロロプラストから抽出した M n イオンのEPR 信号（B)：M nCl 水溶液中の Mn イオ ン の EPR 信
号．強度比から M n を定量する．

図 10：クロロプラスト標品での測定例．A：光化学系 由来のチロシン D の信号．B：200K 光照射下での信号．B‑A：
引き算により得られた P 700 の信号．測定は凍結状態で行った．

Mn の信号強度を比較する．
８．信号強度比から Mn のスピン量を求める．
活性な酸素発生系を光化学系

あたり４個の Mn が析出する．
(注：必ずしも遠心分離の必要はないが，これを行わな
来のマンガンの EPR 信号は室温では観測されない．しい場合測定中に固体成分が毛細管の下部へ沈降し，感かし酸素発生系を酸により破壊すると酸素発生系のマン度や周波数などの測定条件が変わる場合がある）

ガンは Mn イオンとして溶出する．これを利用して

in vivo での葉の EP R 測定

M n 量（光化学系 の量）を求めることができる．以下

植物の葉を直接測定する場合，葉を適当な大きさに切はチラコイドまたは BBY タイプ PSII 標品での測定例

断して石英 EPR 試料管に挿入すればよい．多くの場合である．
（図 11）

Mn や由来不明のフリーラジカルが観測されるが，若１．試料を 1ml のチューブに移し体積の 1/10量の硝酸

い葉や植物種によっては M n が観測されずチロシンDを加える．この操作により光化学系 に含有されるマのみ信号が観測できる場合がある．また，空洞共振器内ンガンクラスターが壊れ Mn となり溶液中に溶出すへの光照射によって P 700 を観測することもできる．シる．

アノバクテリアの場合，細胞のままでは不純物由来の

２．18,000×g ５分程度で遠心分離する．

EPR 信号が大きく大抵の場合観測は困難であるが，条件

３．上澄みを 25μl の毛細管中に吸引し，真空グリース

や種によっては不純物ラジカル由来の EPR 信号が全くなどで毛細管の両端をふさぐ．

でない試料もある．

サンプル量は十分長くとる（2〜3cm）．
４．EPR 測定用試料管中（内径 3mm 外径 4mm，ある
いは内径 4mm 外径 5mm のもの）この毛細管をいれ，空洞共振器の中央におき測定を行う．

2.d.6 EP R 法による光合成反応中心の信号
マンガンクラスターの EP R 信号

EPR の測定条件例：室温，変調 20G，マイクロ波パ

酸素発生系由来の EPR 信号は極低温でのみ測定でき

ワー 1mW ，磁場掃引幅 1000G．Mn 由来の６本のる．これまでに S ，S ，S ，S 状態の EPR 信号が観測

EPR 信号線が観測できる．

されているが，通常観測できるのは S ，S 状態のみであ５．濃度既知の MnCl 水溶液を同じ 25μl 毛細管に同量とる．

る（図 12）．特に S 状態に由来する S マルチライン信号
は，その発見以来 EPR 法における酸素発生系の構造研

６．試料と同じ条件で M nCl 水溶液を測定する．

究や，S 状態のモニターに使われてきた．S 状態は 200K

７．試 料 中 の M n の 信 号 強 度 と MnCl 水 溶 液 中 のでの光照射で生成される．通常 g ＝2を中心に 80‑90G

478

光合成研究のための EP R 測定法

相互作用により幅の広い信号として観測される．また，
この信号は鉄との相互作用のために有機ラジカルに比べて飽和しにくい（図 5）．そのため強いマイクロ波パワー（100mW 程度）にして他の磁性種の EPR 信号を飽和させる条件下で測定すると観測しやすい．Fe を Zn などに置換すると Q のみの一般的な有機ラジカル信号を観測できる．紅色バクテリアでも同様である．
クロロフィル信号
クロロフィル由来の信号としては，光化学系 の反応
中心 P 680 ，Chl 光化学系 の反応中心 P 700 ，バクテ
リアの反応中心 P 840 などがある．P 680 以外は 10mM 程度のフェリシアナイド添加，あるいは凍結状態で
図 12：酸素発生系マンガンクラスターの信号
S 信号が最も広く研究には用いられている．S ，S 信号は
bimodal 空洞共振器によって測定．

の光照射により安定なラジカルとして観測できる．正しい信号線形を得るためには小さな変調磁場（2‑3G）での測定を行う．P 680 はすぐに還元されてしまうので時間
分解 EPR 法によってのみ観測できる．

間隔で 18‑20本からなる EPR 信号が観測される．このトリプレット信号の測定

S マルチライン信号と同時に g ＝4付近にも S 状態由電子受容体が還元された状態の光合成反応中心を光照来の信号が観測される．アルコール類の添加で g ＝4信射すると，反応中心クロロフィルのトリプレットが形成

号は消失する．140K での光照射で大きな g ＝4信号が観され，EPR で観測できる． 型反応中心では電子受容体

測されるが，200K に温度を上げてアニールすると S マ

キノンの二重還元，あるいは除去によって観測できる．

ルチライン信号と強度を交換して g ＝4信号は小さくな

光化学系

る．S マルチライン信号は Ca 除去や NH イオンのして出来た P 680の EPR 信号を図 13(A）に示す．

反応中心タンパク質を 4.2K で連続光照射添加により線の本数が増える．Cl イオンを除去すると
S マルチラインは観測されず g ＝4信号のみが観測される．
BBY タイプの光化学系

2.d.7 時間分解 EP R

での観測では，試料濃度は磁場を固定して EPR 信号強度の時間変化を測定すれ10mgChl/ml（タンパク質濃度で 50μM 程度），変調はばラジカル信号の生成消滅をモニターできる．レーザー

20G，マイクロ波強度は 0.2mW が目安となる．10K 以

光照射と同期して測定をはじめればよい．ただし，時間

上では観測できない．

分解能は変調磁場の周波数で制限される．
（100kHz 変

FeQ 信号

調では 10μs 程度より早い時間変化は測れない）．より高光化学系の電子受容体 Q は，近傍の非ヘム鉄との速での時間分解測定では，変調磁場をかけずデジタルオ

図 13： P 680の EPR スペクトル（左）4.2K 定常光照射下での磁場掃引スペクトル（右）130K でのレーザー同期による P 680の時間分解 EPR スペクトル．右の場合変調磁場は用いていない．
2009 低 温 科 学

vol.67479

図 14：(A，B）ENDOR の信号パターン（A）核ゼーマン ω が超微細相互作用 A の 1/2より大きい場合（B）核ゼーマン ω が超微細相互作用Ａの 1/2より小さい場合（C）光化学系 反応中心クロロフィル P 700 の ENDOR 信号．信号パターン（A）に対応して，左右対称な信号となる．

シロスコープなどに直接信号を出す．この場合，信号はENDOR 法は観測条件が厳しく，信号を観測できるかど

微分形ではなく積分形（吸収形）
で検出される．図 13(B）うかは実際に測定してみないと予想できないという難点に P 680の時間分解 EPR を示す．

が普及を妨げてきた．しかし，最新のパルス ENDOR 法を使えばスピンエコー信号が検出されれば原理的には観2.d.8 パルス EP R 法による光合成反応中心の信号測定測可能で，状況は大きく改善されている．
ESEEM（電子スピンエコー変調）法はパルス ESR 法の手法の一つである．図 15(A）に２パルスでの ESEEM

パルス EPR 法や多周波 EPR 法が光合成反応中心タの例を示す．時間間隔 τでマイクロ波パルスを磁場中でンパク質の研究では盛んにすすめられている．これらのかけると τ時間後にスピンエコー信号が観測される．時手法は分子構造の解析や，ラジカル間の距離測定に威力

間間隔 τを変化させると超微細相互作用によってスピを発揮する．ここでは ENDOR，ESEEM ，多周波数 EPR

ンエコー信号の強度が変調を受ける．図 15(B）に光化学について簡単に紹介しておく．

系

反応中心 P 700 の２パルス ESEEM 信号を示す．

END OR 法と ES EEM 法
ENDOR（電子核二重共鳴）法はマイクロ波による
EPR 遷移とラジオ波による NMR 遷移を同時におこすことによって超微細相互作用（図２）を検出する方法である．EPR の強度で NM R の分解能を実現することができ，分子上の電子スピン密度，プロトン位置などについての情報が得られる．ENDOR の信号パターンには次の２通りがある．
(A）核ゼーマン相互作用が超微細相互作用の 1/2より小さな場合（図 14(A））．有機ラジカルにおいてプロトンの信号を ENDOR で観測する場合（A）のパターンになる．図 14(C）は光化学 系の 反 応 中 心 ク ロ ロ フィル

P 700 のプロトン ENDOR 信号である．プロトンの共鳴周波数（14‑15M Hz）を中心に左右対称な１対の信号となる．分離幅の大きさが超微細相互作用の大きさになる．これに対して（B）核ゼーマン相互作用が超微細相互作用の 1/2よりより大きな場合には図 14(B）のようなパターンになる．超微細相互作用の 1/2の周波数を中心に
核ゼーマン相互作用の大きさで一対の信号が観測でき
る．マンガン核のように核のゼーマン相互作用が小さな
核 に 対 す る ENDOR 信 号 は こ の パ ターン に な る．
480

図 15：(A)２パルス ESEEM の測定法．２つのマイクロ波マ
ルスを時間間隔 τでかけると，τ時間後にスピンエコー信号が観測される．τを変えると，超微細相互作用に由来する変調効果がスピンエコー強度に現れる．(B)2パルス法により測定した P 700 の ESEEM スペクトル．図中の振動パターンは
クロロフィルの Mg に配位している窒素核の NMR に由来する．解析の際には時間変化スペクトルをフーリエ変換する．

光合成研究のための EP R 測定法

変調は主にクロロフィルのマグネシウムに配位している
窒素核に由来している．時間変化のスペクトルはフーリ

2.d.9 おわりにエ 変 換 に よって 周 波 数 軸 に な お し て 解 析 を 行 う．

本稿では主に汎用の共通機器として測定可能と思われENDOR がプロトンなど g 因子が比較的大きな核の測る方法を中心に例をあげた．本稿ではふれなかったが，定に有利なのに対して，ESEEM は窒素核，重水素など

他にもスピンラベル法，スピントラップ法なども盛んに

g 因子が比較的小さな核に対して有効である．

使用されている．これらの測定に関しての注意点は本稿

多周波数 EP Rで紹介したものに準じて頂きたい．本稿の最後にはより一般に EPR の測定には 9GHz 帯が使われる．しか進んだ測定法の例をいくつかあげた．特に，パルス EPRし，周波数を変えて EPR を測定することにより多くの法，時間分解 EPR は幅広く研究がおこなわれており，光情報を得ることができる．ゼーマンエネルギーは磁場の合成系は最も成功している EPR の応用対象のひとつと大きさに比例して大きくなるため（図 1，2）高周波のして数えられている．興味をもたれた方は参考文献

ESR では g 因子の異方性，つまり分子構造の方向によるを一読されたい．

違いにより信号を分解することができる．逆に，低周波の ESR では g 因子の異方性が小さくなるが，相対的に超微細相互作用（図 2）が大きくなるため電子と核との相互作用をみるのに適している．図 16に多周波数 ESR 法によるチロシン D の信号を示す．周波数の低い S-band
では g 因子の異方性の影響が小さくなり中心から左右対称なスペクトルが得られている．一方周波数の高い
W-band では g 因子の異方性によりスペクトルが分裂している．これらの手法により分子構造の詳細を知ること

参考文献
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図 16：2009 低 温 科 学

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vol.67481

４章 分光測定

２．分光測定法
e．光誘起フーリエ変換赤外差スペクトル法野口

巧

光誘起フーリエ変換赤外（FTIR）差スペクトル法を用いることにより，光合成蛋白質における電子伝
達成分などのコファクター及びその結合部位の構造や反応を原子・分子レベルで調べることができる．
本手法の原理，及び測定・解析法について解説する．

Fourier transform infrared difference spectroscopy
Takumi Noguchi
Light-induced Fourier transform infrared difference spectroscopy provides information on the structures andreactions of cofactors such as redox components in photosynthetic proteins at the atomic and molecular level.
In this article, the principle of this spectroscopy and the methods of measurements and spectral analysis are
explained.

によって分子構造を表すのに相対する手法であるといえ2.e.1 はじめにる．後者が分解能（一般的には 1‑3Å）以下の構造の違い

近年，光化学系 や光化学系 を含め，多くの光合成に鈍感であるのに対し，基準振動の振動数は，分子の極

蛋白質の三次元構造がＸ線結晶解析により解明され，蛋めて微小な構造変化や相互作用変化を鋭敏に反映する．

白質中における色素やアミノ酸残基の構造や位置関係がまた，振動分光法は，化学結合や水素結合の生成や切断，明らかとなってきた．しかし，各コファクターの電子・強度変化を直接的に表すため，反応プロセスの解析に適プロトン移動反応や励起移動反応のメカニズムを分子レしている．

ベルで理解するためには，活性部位における水素結合構

赤外分光法では，一般的に，振動基底状態から第一振造やプロトン化構造など，通常のＸ線結晶解析の分解能

動励起状態への赤外線吸収による遷移を検出する．生体を越える，より詳細な構造情報が必要となる．また，実系への応用としては，蛋白質のポリペプチド骨格のアミ際の光合成反応を解析するためには，生理条件下におけドＩバンド（C＝O 伸縮振動：1700‑1600cm ）を用いたる反応を直接観測することのできる分光学的手法が必要

二次構造解析が広く行われてきた ．一方，分散型赤外分

不可欠である．光誘起フーリエ変換赤外（FTIR）差スペ

光計からフーリエ変換赤外（FTIR）分光計への移行に伴クトル法は，こうした要求に答え，光合成蛋白質におけい，蛋白質の全体構造だけではなく，蛋白質中の活性部

るコファクター及びその結合部位の構造・相互作用，及位のより詳細な構造や反応の解析が可能になった．

び反応を原子・分子レベルで調べることのできる手法である．

FTIR 法では，干渉計によって生じる干渉光を，駆動鏡の位置の関数（インターフェログラム）として測定し，それをフーリエ変換することにより，波数を横軸とした

2.e.2 光誘起フーリエ変換赤外差スペクトル法：原理

赤外光分布を計算する．従って，分散型分光計のように赤外光の波数スキャンは行わない．駆動鏡の位置は
FTIR 分 光 計 に 内 蔵 さ れ た He-Ne レーザーの 633nm

赤外分光法やラマン分光法などの振動分光法は，分子の発振線により正確に決められるため，得られた赤外スの基準振動を検出することにより，化学結合や相互作用

ペクトルの波数精度は極めて高いという特徴がある．その存在及び強度としての分子構造情報を与える手法であのため，ある反応の前後で測定した２つのスペクトルのる差スペクトルから，強い吸収バンド下の極めて微小なス．これは，Ｘ線結晶解析が原子（電子密度）の位置

ペクトル変化を検出することが可能である．通常の測定
１) 筑波大学

大学院数理物質科学研究科

条件下（数分間のデータ積算）において，ΔA で 10 オー
ダーのシグナルを検出することができ，光化学系 や光学専攻

2009 低 温 科 学

物性・分子工vol.67483

化学系 のような分子量の大きな蛋白質複合体においても，各アミノ酸及びコファクター中の化学結合や相互作用の変化を調べることができる．このように，反応による蛋白質等の構造変化を FTIR を用いて検出し，その構造及び反応の情報を得る手法が反応誘起 FTIR 差スペ
クトル法である．

反応を誘起するためのトリガとして光を用いた場合には，光誘起 FTIR 差スペクトル法と呼ばれ，光によって反応を進めることができる光合成試料では主にこの手法が用いられる．また，電位を変化させることによって，電子伝達成分の酸化還元反応由来の FTIR 差スペク
トルを測定することも可能である．本稿では，光合成

分野においてより一般的な光誘起 FTIR 差スペクトルの測定法について述べる．
電気化学反応誘起の場合でも，試料部以外の測定・解析法はほぼ同じである．
生体物質は基本的にすべて赤外活性であると考えてよい（酸素分子も金属に結合して対称性が崩れれば赤外活

図 1：光誘起 FTIR 差スペクトル測定システム．ここでは，
Nd：YAG レーザーのパルス光を用いて水和試料を励起し，FTIR 差スペクトルを測定する場合を示している．

性となる）．よって，反応によってある分子または構造部分に何らかの変化が起これば，それらは必ず FTIR 差ス

ある．4000‑650cm の領域を透過する Ge 基板の多層膜ペクトルに現れる．つまり，蛋白質骨格，各アミノ酸側

干渉フィルターを用いれば，通常の赤外領域をカバーで

鎖，基質，そして水分子など，系に含まれるあらゆる分

きる．様々な透過領域の赤外フィルターが市販されてい子の構造変化を FTIR によって検出することができる．

るので，目的に応じて選択する．フィルターは赤外ビー

これは，励起光に共鳴する特定の色素の振動だけが検出

ムに沿って試料の前に置く．また，光照射に尖頭値の高される共鳴ラマン法と対照的である．コファクターの構いパルス光を用いる際には，その反射光が検出器の素子造変化だけではなく，それに共役した蛋白質や水分子のを傷めるので，試料と検出器の間にもフィルターを置く

反応を捉えることができるのは FTIR 差スペクトル法

必要がある．

の大きな長所である．

試料への光照射には，目的に応じて，定常光やパルスレーザーからの閃光を用いる．図 1の例では，試料を赤

2.e.3 測定法
2.e.3.1 測定系
図１に，光誘起 FTIR 差スペクトルの測定システムの外ビームに対して 45°
傾け，パルスレーザー光を直角方向から入射している．試料室の光照射用の窓には電磁シャッターを設置する．
光照射及びシャッターの開閉は，
FTIR 分光計からの TTL トリガを用いてコントロール

一例を示す．通常の中赤外領域（4000‑600cm ）の測定

し，スペクトル測定と同期させる．

には，高感度 MCT（HgCdTe）検出器を用いる．FTIR

2.e.3.2 試料部

分光計に標準的に装着されている TGS（triglycine sul-

試料を挟む赤外透過板には，通常，水に不溶・難溶性fate）検出器では，十分な S/N 比のスペクトルは得られの CaF や BaF を用いる．BaF の方が低波数側の透過ない．MCT 検出器は，感度が高いものほど，低波数側の域が広いが（BaF ：＞700cm ；CaF ：＞1100cm ），測定範囲が狭くなる．いわゆる狭帯域 M CT では〜800

わずかに水に溶けるので，長時間常温で水溶液試料に接cm までの測定が可能であり，中帯域で〜600cm ，広するような使用法は避けた方がよい．より低波数の測定

帯域では〜420cm 以上となる．600cm 以下の低波には ZnSe（＞450cm ）や AgBr（＞300cm ）などを数振動を測定したい場合には，Si ボロメータを用いるの使うことができる．

が一般的である ．

試料は，なるべく濃い状態で，これらの赤外透過板に

光合成試料のような光応答性試料の測定で特に注意が挟 む．水 の 赤 外 吸 収 バ ン ド（OH 伸 縮 振 動：〜3400

必要なのは，干渉計から試料室に漏れ出てくる He-Ne

cm ；HOH 変角振動：〜1640cm ）が蛋白質のバンドレーザーの赤色光を，光学フィルターで除去することでに重なるためである．1650cm 付近のバンド（水の484

光誘起 FTIR 差スペクトル法

HOH 変角振動＋蛋白質のアミドＩ振動）の吸光度を１調べることができる．

以下に抑えるようにする．
膜試料の場合には，
遠心によっ

溶液試料またはペレット試料をそのまま，常温に近いて得たペレットを細いガラス棒などで掻き取り，赤外透温度で測定するためには，溝付き窓板を用いるとよい（図

過板の上に載せて，もう一枚の窓板に挟んで押し込むと2b)

よい．押し込む力の程度で試料の厚さをコントロールで試料を置いて挟む．ホルダーで押さえつける力の加減にきる．溶液試料の場合には，濃縮した試料を窓板上で窒よって，試料の厚さをある程度コントロールできるが，素ガスなどを用いて軽く乾燥させ，他の窓板に 1μL 程

必要ならば，外側のグリース部にアルミホイルの小片を度の水を載せて挟む．

置いて試料の厚み（数 μm）を確保する ．凍結試料や水．溝の外側にシリコーングリースを塗り，内側にFTIR 差スペクトル測定用の試料作成において特に重和試料に比べてベースラインは変動しやすいので，ス

要な点は，試料の変動を極力抑えることである．試料のキャン時間を短くしたり，ベースラインの変動を暗中で変動はベースラインの歪みとなって現れ，正しいスペク

別に測定しておいて光誘起差スペクトルから差し引くな

トルを測定する妨げとなる．そこで，クライオスタット

どの工夫をする．

を用いて試料を凍結するのがよい．低温測定は，中間状

2.e.3.3 全反射吸収法の利用態の寿命を延ばし，差スペクトルの S/N 比を向上させ上で述べた透過法に対し，全反射吸収法（ATR 法）をるのにも有効である．また，低温において電子伝達鎖の利用して測定することも可能である．ATR 法は，一部の反応が阻害されることから，特定の電子伝達成分

ATR 結晶と試料の界面において赤外光が全反射する際のスペクトルを選択的に測定するための条件ともなる．

の，試料側へのわずかな潜り込みを利用して赤外吸収を

FTIR 差スペクトル測定に有効なもう一つの試料形態測定する手法である．ATR 結晶上に試料を吸着させる

は，蛋白質あるいは膜標品の水和試料である（図 2a) ．

ことにより，緩衝液を自由に交換することができ，同一溶液試料を窓板上で適度な大きさに広げ，窒素ガスで軽試料を用いて様々な条件下での測定が可能になる ．

く乾燥させる．この試料を，シリコーングリースを塗っ

塩や界面活性剤を極力除いた試料を ATR 結晶上で適たスペーサーともう一枚の窓板で密閉する．この密閉し度に乾燥させてそれに吸着させ，ホルダーを取りつけたた赤外セル中には，試料に触れないようにグリセリン水

後，緩衝液を流して安定させる．ATR 結晶に Si や Ge な溶液を数 μL 入れておき，セル中の相対湿度をコント

ど，可視光を透過しないものを用いれば，He-Ne レー

ロールする．
グリセリンと水の割合を変えることにより，ザー光を除去するための赤外フィルターは不要である．

試 料 の 水 和 量 を 変 化 さ せ る こ と が で き る．20‑40％

光照射によって光誘起差スペクトルを測定するだけでは(V/V）グリセリン水溶液を用いれば，活性を保ったまなく，
酸化還元剤によって電位を変えた緩衝液を交換し，ま適度に水和した試料が得られる．このような水和試料

その際の酸化還元差スペクトルを測定することも可能でを用いることにより，常温に近い温度において，試料のある ．ATR 法は将来性のある有力な手法であるが，光変動を抑えて測定を行うことが可能となる．冷水を循環

合成試料への応用例は多くはなく，方法論の確立にはまさせた銅製ホルダーなどに試料を取り付け，温度をコンだ時間が必要である．

トロールする．この水和試料の最大の利点は，バルクの2.e.3.4 差スペクトルの計算法

水の吸収バンドを最小限に抑えることによって，そこにFTIR 差スペクトル法では光照射前後（または光照射

重なる蛋白質や蛋白質内水分子のバンドの測定が可能に

前と光照射中）で赤外スペクトルを測定し，その差スペなることである．例えば，この試料を用いて，光化学系

クトルを計算する．入射赤外光強度を I ，光反応前後でにおける水分解（酸素発生）系の基質水分子の反応をの透過赤外光強度をそれぞれ I ，I とすると，光反応前後での吸光度 A ，A の差 ΔA は，
ΔA＝A −A ＝−log I /I ＋log I /I＝−log I /I(1)で表される．よって，実際には光照射の前後でシングル
ビームスペクトル（I ，I ）を測定し，それらを使って吸光度計算をすれば差スペクトルを計算したのと同じこと
図 2：FTIR 差スペクトル測定用試料セルの例．(a）水和試料；(b）液体またはペレット試料．
2009 低 温 科 学

vol.67になり，試料の赤外吸収スペクトルそのもの（A ，A ）を測定する必要はない．しかし，測定したい領域の吸収
485が飽和していないかどうか，試料が均一な状態かどうか

は，あらかじめ試料のない状態で測定しておいた水蒸気（不均一の場合，部分的に飽和するため，バンドがつぶれのスペクトルを差し引くことによって，それらを除くこた形になる）などを確認するため，試料のない状態でレとができる．水蒸気のバンドが非常に大きい場合には，ファレンススペクトル（I ）を測定しておき，A のスペ

このような補正操作をしても，異なる条件下で測定したクトルを確認しておくべきである．

水蒸気のスペクトルの微小な違いによって，水蒸気の2.e.3.5 FTIR 差スペクトル測定における注意

ピークを完全にはキャンセルできない場合がある．そのFTIR 差スペクトル測定の際には，いくつか注意すべ

ような場合には，光誘起差スペクトル測定の直前に暗状

きことがある．紫外・可視分光では問題にならない事柄

態での差スペクトルを測定し，そこに現れる水蒸気のがほとんどであるので，同じ感覚で FTIR スペクトルを

ピークを用いて差し引く．二重差スペクトルを取ること測定すると，誤ったスペクトルを測定してしまうことにによってスペクトルの S/N 比は下がるが，正しいスペなる．また，ΔA で 10 −10 オーダーのバンドを観測

クトルを得ることを優先しなければならない．

するため，測定系と試料系を安定させ，慎重に測定を行装置の安定性は，FTIR 差スペクトルを測定する上でう必要がある．FTIR 差スペクトルは，正しく測定すれ重要な要素である．通常の FTIR 差スペクトル測定に要ば，極めて再現性が良く，別の測定系を用いても基本的する数十秒から分オーダーでの分光計の安定性は，装置に全く同じスペクトルが得られる．しかし，誤った測定

仕様上の S/N 比などでは表すことができない．安定性法のために，〝artifact" バンドを正しいものとして報告が悪い場合には，試料の大きな赤外バンド（例えば蛋白している例がかなりあるので注意が必要である．

質のアミドＩバンド）の領域に変化が生じ，ベースライ

まず，赤外スペクトルは温度変化に極めて敏感である

ンの歪みの原因となる．乾燥ガスの圧力変動や，電圧変ため，温度コントロールを精密に行う必要がある．クラ化，室内温度の変化などを極力抑える必要がある．安定

イオスタットで温度を設定した場合には，目的の温度でした試料に対し，暗状態で差スペクトルを測定すること安定するまで根気よく待たねばならない．暗状態で差ス

により，測定系の安定性を確認しておく必要がある．

ペクトルを測定し，蛋白質の赤外吸収の変化が無くなるのを確認する．最も気を付ける必要があるのは，試料の光吸収による局所的な温度上昇によって現れる，いわゆ

2.e.4 スペクトル解析法

る「熱バンド」である．水の温度上昇はコールドフィル得られた FTIR 差スペクトルには，構造変化を起こしターによって近赤外光を除くことで防ぐことができる

た複数の分子・置換基の赤外吸収が現れるので，バンドが，クロロフィルなどのアンテナ色素の光吸収による温の帰属を慎重に行う必要がある．およその帰属は，経験度上昇は，ある程度避けられない．なるべく強度を抑え的なグループ振動によって行うことができる ．しかし，た飽和光を用い，また，長波長側の吸収帯（クロロフィ

複数の振動モードが現れる波数領域については，より正ルの Qy帯など）で励起するようにするなど，余分な熱を確な帰属を行うために，様々な安定同位体置換が必要と発生させない工夫が重要である．また，定常光励起の場なる．蛋白質全体の N， C 置換 ，や各アミノ酸側鎖合には，照射時間をなるべく短時間（典型的には 10秒以の選択的同位体置換（例えば， 4‑ C Tyr や下）に抑えるようにする．強光または長時間照射を行っ

ど)て，熱バンドの位置や形を把握して，実際の光照射条件

が一般に行われる．重水中での測定により，解離性プロによって，熱バンドが現れないかどうかを確認しておくトンを含む振動を同定することができる．また，HO及ことは有効である ．

びD．部

N His な

，同位体ラベルしたコファクターの再構成

O 置換は，水分子のバンドの帰属を与えるなど

FTIR 分光計では乾燥ガスのパージや真空引きなどに位特異的変異導入によるアミノ酸改変も有効な手段であ

よって水蒸気を除く工夫がなされているものの，その振る ．但し，変異による二次効果がスペクトル上に現れる

動回転遷移による複数のピーク（4000‑3400及び 2000‑

可能性が高いので，スペクトルの解釈の際には十分に注

1300cm ）を完全に除くのは困難である．赤外光路中の意する必要がある．

水蒸気量の微妙な変化によって，水蒸気のピークが差ス

最近は，密度汎関数法などによる量子化学計算を，研ペクトルに重なる場合が多い．蛋白質やコファクターの究室のコンピュータを用いて手軽に行えるようになっバンドが現れない 2000‑1800cm の領域にも鋭い複数た．モデル化合物の量子化学計算による振動解析によっのピークが現れるので，判別は容易である．目的とするて，各アミノ酸側鎖やコファクターの振動数と赤外強度バンドに対して水蒸気のピークが比較的小さい場合にを求め，バンドの帰属に役立てることができる

486．

光誘起 FTIR 差スペクトル法

赤外スペクトルやラマンスペクトルのような振動スペ

度 10mM ）及 び ジ ク ロ ロ フェニ ル ジ メ チ ル 尿 素

クトルには，様々な構造や相互作用の情報が含まれる．

（DCMU）（最終濃度 0.1mM ）を加える．NH OH 処理

しかし，振動モードにはそれぞれ個性があり，振動数やによりマンガンクラスターは除去され，また同時に，強度から構造情報を導くための解析基準は，対象とする

NH OH は測定の際の外来電子供与体としても働く．

置換基ごとに異なる．多くの置換基について，そのよう

DCMU によって Q から Q への電子伝達は阻害されな解析基準が経験的に得られている．例えば，カルボキ

る．マンガンクラスター除去にはトリス処理（0.8M

シル基（COO ）の配位構造（単座配位，架橋配位，キレーを行ってもよい．また，Q アニオン
Tris-HCl，pH 8.5）

ト配位）に関しては，対称及び逆対称伸縮振動の振動数の再酸化を速めて繰り返し測定を行うために，phen-

差との相関が知られている．また，クロロフィル類のazine methosulfate（PM S）などの酸化還元メディエー

ケト C＝O 基の伸縮振動と水素結合構造や極性環境とのタを加えることもあるが ，PMS の変化がキノンのスペ関係も調べられている

クトルに重なることがあるので注意が必要である．

．このような解析基準が確立されていない場合には，モデル化合物の実測と，様々なこの試料を 150,000G で 30分遠心し，膜標品のペレッ相互作用構造を仮定したモデル系の量子化学計算から，

トを得る．ペレットをガラス棒ですくって CaF 窓板（直

振動数や強度と構造との相関を求める

径 13mm）上へ置き，別の CaF 板で挟んで押し込む．

．

試料が窓板全体に均一に広がるように押し込むのが，ベースラインの変動が少ないきれいなスペクトルを測定

2.e.5 測定例
光化学系

す る こ つ で あ る．試 料 を ク ラ イ オ ス タット（Oxford， 及び光合成細菌の反応中心における各DN1704）へ挿入し，250K に設定する．暗状態で差スペ

反応性コファクターの FTIR 差スペクトルの測定に関

クトル測定を行い，試料の温度が一定となりベースライ

しては，それぞれの試料系について既にほぼ確立した手ンが安定するのを待つ．赤色光（〜30mW /cm ）で 10秒法がある．総説と引用されている原著論文を参間試料を照射し，その前後でそれぞれシングルビームス

照していただきたい．重要なことは，目的とするコファペクトル（150s スキャン）を測定し，差スペクトルを計

クターのみを反応させるような条件下で測定を行うこと算する．

である．そのためには，試料形態（膜標品，光化学系 ，得られたスペクトルを図 3に示す．負のバンドは中性

コア複合体，反応中心蛋白質など），特定のコファク

Q ，正のバンドは Q アニオン状態のときのプラストキ

ターの除去（マンガンクラスター除去，Q 除去など），温

ノン及び蛋白質のバンドであり，この反応によって変化度（低温における電子伝達反応の阻害），緩衝液の酸化還した構造部分が現れている．最も顕著なバンドは 1479

元電位，励起光（定常光，閃光）などの条件を様々に変える必要がある．
反応中心における電荷分離反応により，必ず酸化側と還元側の変化が同時に起こる．単一のコファクターの反応によるスペクトルのみを測定したいときには，適当な電子受容体または電子供与体を添加し，電子または正孔を蛋白質の外に逃がすようにする．その際，フェリシア
ン化物イオンのような無機物を使うと，そのバンドが蛋白質のバンドを重ならず，都合がよい．酸化側，或いは還元側のどちらかが測定できれば，電荷分離による差ス
ペクトルとの二重差スペクトル計算し，もう片方のスペクトルを求めることもできる．以下に，光化学系 の第一電子受容体 Q と酸素発生系についての測定例を示
す．
2.e.5.1 光化学系Ⅱの第一電子受容体 Q
ホウレンソウより調製した光化学系 膜標品を緩衝液（40mM Mes-NaOH，400mM sucrose，20mM NaCl；，NH OH（最終濃pH 6.5）に懸濁し（0.5mg Chl/ml）
2009 低 温 科 学

vol.67

図 3：光化学系 における第一キノン電子受容体 Q の一電子還元による光誘起 FTIR 差スペクトル．試料はホウレンソ
ウより調製した光化学系 膜標品．電子供与体として NH
OH，電子伝達阻害剤として DCM U を含む．温度は 250K．

487

cm のセミキノンアニオンの CO 伸縮振動と CC 伸縮
振動がカップルしたバンドである．このバンドの振動数は２つの CO 基の水素結合強度やその対称性によって変化するため，水素結合構造を調べる指標となる．例えば，
シアン処理により鉄中心に CN が結合すると，水素結合状態が変わり，4cm の低波数シフトを示す ．また，
Q 部位に様々な除草剤を結合させると，フェノール系除草剤が結合したときのみ，このピークは小さな（〜1
cm ）低波数シフトを示す．この水素結合構造の変化とQ の酸化還元電位とは相関が見られ，Q 部位に結合した除草剤が Q の相互作用に影響を及ぼしていることがわかる ．
2.e.5.2 酸素発生系の S 状態サイクル
パルスレーザーを用いて酸素発生反応における S 状
態サイクルを１ステップずつ動かすことにより，各 S 状態遷移の際の FTIR 差スペクトルを測定することができる．
好熱性シアノバクテリア Thermosynechococcus elongatus の光化学系

コア蛋白質を緩衝液（10mM Mes-

M aOH，5mM NaCl，5mM CaCl ，0.06％ n-dodecyl（4.5mg Chl/ml），4μL を取っ
β-D-maltoside）に懸濁して 100mM フェリシアン化カリウム水溶液 1μL と混合する．それを CaF 板（直径 25mm）上で楕円状（6×9mm）に引き伸ばし，窒素ガスを用いて軽く乾燥させる．
20％(V/V）グリセリン水溶液 2μL を試料に触れないよ

図 4：光化学系 における酸素発生 S 状態サイクルの閃光誘
起 FTIR 差スペクトル．1（a），2（b），3（c），4（d）閃光目のスペクトルは，それぞれ S 状態サイクルの S → S ，S →S ，S → S ，S → S 遷移の際の構造変化を示す．試料は好熱性シアノバクテリア T. elongatus より調製した光化学系
コア蛋白質複合体の水和試料．電子受容体としてフェリシア
ン化物イオンを含む．温度は 10℃．

うに周りに置き，シリコーングリースを塗ったテフロン
スペーサ（厚さ 0.5mm）と別の CaF 板で密閉する（図の際の構造変化を表している．実際には 12％程のいわゆ

2a）．試料は銅製ホルダーで押さえ，冷水を流して 10℃

るミスファクターがあるので，後のスペクトルほど，他に保つ．試料を１時間程その状態で放置し，試料が十分の遷移の混入が増えてくる．しかし，ミスファクターをに水和し，安定するまで待つ．FTIR スペクトルを測定す考慮して補正をしてもスペクトルの形自体は大きくは変ることによって水和の過程を追うことができる．

化しないので定性的な議論をするには問題がない．

Q スイッチ Nd:YAG レーザーからの 532nm のナ ノ

どのスペクトルにも，カルボキシル基の逆対称伸縮振秒パルス光（〜7ns：〜10mJ pulse cm ）を用いて試動（1600‑1500cm ），及 び 対 称 伸 縮 振 動（1450‑1350

料に光照射を行う．まず，酸素発生系を S 状態に揃えるの領域に複数の顕著なバンドが現れている．特に，cm ）ため，２発の閃光（1Hz）を照射し，１時間暗順応させ後者の領域のバンドは N 置換で全く変化せず， C 置る．その後，10秒間隔で４発の閃光を照射し，その閃光換によってすべて低波数シフトを示したことから，これ照射の前，閃光間，閃光後の FTIR スペクトルを測定す

らは基本的にすべてカルボキシル基の振動であると帰属る．サンプルを１時間暗順応させ，このサイクルを繰りされている ．1760‑1700cm の COOH 基の C＝O 伸

返すことによってスペクトルの S/N 比を向上させる．

縮振動の領域には顕著なバンドが観測されないことか

このようにして得られた各閃光照射における FTIRら，これらのバンドはカルボキシル基のプロトン化反応

差スペクトルを図 4に示す．フェリシアン化物イオンにによって現れているのではなく，脱プロトン化した状態

よって，キノン電子受容体から電子を蛋白質の外に引きで，配位子として，または水素結合を通してマンガンク

抜くことにより，基本的に酸素発生系のみに由来するスラスターと相互作用し，反応に関与していると考えられペクトルが得られている．1，2，3，4閃光目のスペクト

る．また，アミドＩ領域（1700‑1600cm ）にも多数のバルは，それぞれ S → S ，S → S ，S → S ，S → S 遷移

ンドが観測され，蛋白質の二次構造が酸素発生反応の過488

光誘起 FTIR 差スペクトル法

程で大きく変化することが分かる．
それぞれのバンドに対応して，別の遷移において，ほ(2008)p.11024.
19) R.Hienerwadel, D.Thibodeau, F.Lenz, E.Nabedryk,

ぼ同じ振動数のバンドが逆の符号で現れており，マンガ

J.Breton, W.Kreutz & W.Mantele, Biochemistry 31

ンクラスターの配位子及びその近傍の構造が S 状態サ
イクルの中で周期的変化をすることが明瞭に表されている．図４のスペクトルは，酸素発生反応の際の蛋白質骨格や個々のアミノ酸側鎖の動きを，中間状態ごとに原子・分子レベルで追跡できることを表している．

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489

４章 分光測定

２．分光測定法
f．共鳴ラマン分光法
野口巧

共鳴ラマン分光法は，光合成試料中におけるクロロフィルやカロテノイドなどの色素の構造や相互作用を調べるのに極めて有効な手法である．本稿では共鳴ラマンスペクトルの測定法と解析法について解説する．

Resonance Raman spectroscopy
Takumi Noguchi
Resonance Raman spectroscopy is a very useful method to study the structures and interactions of pigments suchas chlorophylls and carotenoids in photosynthetic proteins. In this article, the methods of measurements andanalysis of resonance Raman spectra are explained.

される双極子モーメントの強制振動に，分子振動が重な

2.f.1 はじめにることによる「うなり」の現象として理解することがで分子の振動スペクトルを測定する主な手法としては，

きる．入射光よりも小さい振動数の散乱光をストークス

赤外分光法の他に，ラマン分光法がある．共鳴ラマン法

散乱，逆に大きい振動数の散乱光をアンチストークス散を用いることにより，多成分からなる光合成試料におい乱と呼ぶ．常温では，分子はほとんど振動基底状態にあて，クロロフィルやカロテノイドなど，特定の色素のラるため，振動準位が一つ上に遷移するストークス散乱のマンスペクトルを選択的に測定することができる．した方が，アンチストークス散乱に比べて遥かに強い強度をがって，蛋白質中の色素の構造や相互作用を，蛋白質や持つ．そのため，通常は入射レーザー光よりも長波長側

水のバンドに妨害されることなく調べることが可能となでラマン散乱を観測し，入射光の振動数からのシフト値

る．赤外分光法と同様に，共鳴ラマン法が与える構造情（ラマンシフト）を横軸にとってスペクトルを表示する．

報は，水素結合構造など，Ｘ線結晶解析によって得られある分子の電子吸収帯と一致する波長の光を入射する

る情報と相補的なものを含んでおり，また微小な構造のと，共鳴効果により，その電子遷移に共役する振動のラ違いに敏感である．ラマン散乱の原理，及び測定法につマン散乱光が著しく増大する．これを共鳴ラマン散乱といては成書に詳しく述べられている ．ここでは，光合成呼ぶ（図 1）．共鳴ラマン法を用いると，蛋白質，脂質，試料の共鳴ラマンスペクトルの一般的な測定法について

水など複合的な成分を持つ試料中において，特定の分子述べる．共鳴ラマン法の光合成系への応用については，の振動スペクトルを，励起波長を変えることにより，選

過去に多くの総説が出されているので，それらも参照さ

択的に測定することができる．光合成試料におけるラマ

れたい

ンスペクトル測定の対象は，ほとんどの場合，カロテノ．

イドとクロロフィル・フェオフィチン類である．これらの π電子共役系を持つ色素では，共役系に含まれる構造

2.f.2 共鳴ラマン散乱部分の振動モードだけがスペクトル上に現れる．

ラマン分光法では，物質に単色レーザー光を入射した

電子吸収帯に一致した励起光による真正共鳴ラマン散

ときの散乱光を観測する．
その散乱光の中には，レーザー

乱に対し，それよりもやや長波長側の励起光によるラマ光と同じ振動数を持つレイリー散乱の他に，分子振動のン散乱を前期共鳴ラマン散乱と呼ぶ（図 1）．この前期共振動数分だけシフトしたラマン散乱光が存在している．

鳴条件でもある程度の共鳴効果が得られ，ラマン散乱光

ラマン散乱の原理は，定性的には，入射光によって誘起の強度増大が見られる．よってスペクトルは，非共鳴ラマン散乱とは異なり，やはり近くの電子遷移の性質を反

１) 筑波大学

大学院数理物質科学研究科

物性・分子工映したものとなる．

学専攻

2009 低 温 科 学

vol.67491

図 2：光合成試料に適したラマン散乱測定の試料部．(a）液体
試料用回転セル．(b）クライオスタットによる試料凍結；(i）傾斜石英ガラスセル，(ii）直接マウント試料．
図 1：真正共鳴ラマン散乱と前期共鳴ラマン散乱．

色レーザー光ではカロテノイドも同時に励起してしまう
が，クロロフィルやフェオフィチンの構造情報を示す

2.f.3 測定法

マーカーバンド（4.参照）はカロテノイドのバンドとほとんど重ならないため特に問題にはならない（図 2）．バ

ラマンスペクトルの測定系は，レーザー光源，試料部，

ク テ リ オ ク ロ ロ フィル a の 場 合 に は，紫 外 域 に あ る

分光器，検出器よりなる．光合成試料の共鳴ラマンスペ

Soret バンドを励起するため，Ar レーザーの 363.8nm

クトルの測定は，紫外から近赤外にわたる広い波長領域の発振線を用いる．

で行われる．
通常は分散型分光器を用いて測定を行うが，クロロフィル類の Qy帯への真正共鳴ラマン散乱は，

近赤外領域の測定においては，フーリエ変換（FT）赤外

強い蛍光によって妨害されるため，一般的には観測が困

分光計を用いた FT ラマン法を用いることができる．こ難である．しかし，光合成細菌の反応中心蛋白質などでれは異なる原理の測定法であるため，他とは区別して述は，励起波長の選択とスペシャルペアの酸化状態により，べることとする．

各コファクターの共鳴ラマンスペクトルを選択的に測定

2.f.3.1 レーザー光源

することが可能である．ま た，SERDS（Shifted-

励起光として，Ar レーザー，Kr レーザー，He-Cd

excitation Raman difference spectroscopy）法によっ

レーザーなどの各発振線，及び波長可変の Ti:sapphireて，数 cm だけ異なる励起光を用いてラマン散乱を測レーザーや色素レーザーからの光を用いることができ定し，その差を計算して蛍光によるバックグラウンドをる．目的とする色素の吸収帯に合わせて励起光を選択す

除去するという手法もしばしば用いられる

る．

の測定には，750‑900nm に存在するバクテリオフェオ．これら

カロテノイドの共鳴ラマンスペクトルの測定には，フィチン及びバクテリオクロロフィルの Qy帯に合わせAr レーザーの 514.5または 488.0nm の発振線が最もて，連続波長可変の Ti：sapphire レーザーや色素レー

よく用いられる．これらの波長領域にはクロロフィルのザーが用いられる．

吸収帯が存在しないため，その共鳴ラマン散乱の混入を

2.f.3.2 分光器防ぐことができる．

ラマン散乱を測定する際に最も注意を要することは，

一方，クロロフィル・フェオフィチン類の測定には，強いレイリー散乱光を除去して迷光を除くことである．

通常，Soret 帯を励起するレーザー光を用いる．クロロ

そのために，以前は，ダブルモノクロメータやトリプル

フィルの種類によって Soret 帯の位置はそれぞれ異な

モノクロメータを用いるのが一般的であったが，スルーるので，用いる励起光もそれに合うものを用いる．クロプットが低くなるという欠点があった．現在では，ノッロフィル a の場合には，He-Cd レーザーの 441.6nm のチフィルターなどによってレイリー光を選択的に除去

発振線，フェオフィチン a には Kr レーザーの 406.7まし，シングルモノクロメータで測定するという手法がよたは 413.1nm の発振線などが用いられる．これらの青く使われる．それぞれの励起光に対して基本的に別の

492

共鳴ラマン分光法

フィルターを用意しなければならないが，フィルターをは，クロロフィル類に対しては前期共鳴条件となり，蛍傾けることにより，若干カットオフ波長をシフトさせる

光による妨害を回避してラマン散乱を測定することがでことができる．

きる

2.f.3.3 検出器

ように，1000nm 付近に吸収帯をもつ分子種に対しては．一方，カロテノイドのラジカルカチオンなどの検出器として光電子増倍管を用いる場合には，モノク

真正共鳴ラマン散乱の測定となる ．FT ラマン法は，光ロメータをスキャンしてラマンスペクトルを測定する．

合成細菌の第一電子供与体バクテリオクロロフィルの水

近年では，分光器をポリクロメータとして用いて，高感

素結合状態の解析に有効に利用されている ．

度 CCD 検出器（charge coupled device）によって広い波数領域を一度に測定するのが一般的である．
2.f.3.4 試料部

2.f.4 スペクトル解析

光合成試料などで共鳴ラマンスペクトルを測定する際

共鳴ラマンスペクトルでは，共鳴条件にある特定の色の注意は，レーザー光照射による色素および蛋白質試料

素の振動のうち，励起電子遷移に共役するもののみが観の破壊，不活性化をなるべく防ぐことである．液体試料測されるため，バンドの帰属は比較的容易である．励起で測定する際には，回転セル（図 2a）を用いて試料を回波長を変えて測定すれば各色素への帰属も容易に判断で転させることにより，同じ試料に励起光が当たるのを避き，同位体置換が必要になることもあまりない．ただし，

けるようにする．光吸収による試料温度の上昇を防ぐた

試料中に同じ吸収帯をもつ同種の色素が多数含まれていめには，冷 N ガスなどを回転セルに吹き付けて，試料をる場合には，それらのラマンバンドが重なって現れる．

冷やすとよい．

よって，各コファクターを識別するためには，酸化還元

また，クライオスタットを用いて試料を凍結させることにより，試料を動かさなくとも，励起光による温度上

電位を変えて活性種の割合を変化させ，その差スペクト
ルを測定するなどの工夫が必要となる．

昇と試料の破壊を抑えることができる（図 2b）．図 2b各色素のラマンスペクトルは，抽出精製物として様々(ii）の様に，金属ホルダーに直接試料溶液を載せて凍結な溶媒中で測定されており，構造情報を導き出すためのすれば，10μL くらいの少量の試料で測定が可能である．

マーカーバンドもほぼ確定している

また，レーザー光を直接試料に照射できるので，ガラスフィル a とカロテノイドについて，マーカーバンドとそセルからのラマン散乱の混入を避けることができる．

れから得られる情報について簡単に述べる．

2.f.3.5 波数較正2.f.4.1 クロロフィル a．以下に，クロロ

ラマンスペクトルの横軸は励起光からのラマンシフト

1620‑1510cm の領域には，クロリン環の C＝C 伸縮

で表わされるため，波数較正が必要となる．特に，CCD振動が現れる．これらの振動の振動数は中心 M g への配検出器を用いる際には，生データの横軸は素子のチャン

位数の違いによって変化するため，配位数を決めるマー

ネル数であるため，標準物質のラマン散乱を用いてスペカーとなる ．６配位構造においては，中心 Mg は環平面

クトルの較正を行う．標準物質としては，一般的なラマ上に位置するが，5配位構造では第５配位子によって中ン測定ではインデンが用いられる場合が多いが，クロロ

心 M g が環平面から引き出された構造を取る．よって，

フィル類のマーカーバンドが現れる 1600‑1750cm の５配位構造において環はより縮んだ状態となり，C＝C

領域にバンドを持たないため，光合成試料に対する標準

伸縮振動の振動数は６配位の場合よりも高く現れる．３

としてはあまり有用とは言えない．アセトンや酢酸エチ

つの C＝C バンドが，それぞれ 1620‑1590，1560‑1540，

ルなど，この波数領域に C＝O 伸縮振動バンドを持つ溶

1530‑1510cm の領域に現れ，そのうち，1600cm 付近媒が有用である．標準溶媒のラマンスペクトルは成書のバンドが最も明確に配位数依存性を示す．5配位ではの付録に纏められているので利用するとよい．

1620‑1600cm ，6配位では 1600‑1590cm にバンドが2.f.3.6 フーリエ変換ラマン法

現れる．

近赤外励起のラマン散乱測定法として，FT ラマン法

13 ケト C＝O はクロリン環の共役系に含まれているが普及している．励起光としては Nd：YAG レーザーのため，その伸縮振動は比較的強い強度を示す．1710‑1640

1064nm の発振線が主に用いられ，試料からの散乱光をcm の範囲にバンドが現れる

フーリエ変換赤外分光計に導入し，そのスペクトルを観ない場合には，1710‑1680cm に振動数を示す．その際，測する．検出器としては，近赤外領域に感度を持つ，In-

C＝O 基が存在する環境の誘電率が高いほど，低い振動

GaAs 検出器や Ge 検出器などを用いる．この励起波長数となる．水素結合を形成することにより，より低波数2009 低 温 科 学

vol.67．水素結合相互作用が493

他のクロロフィル類に関しても，多少の振動数の違いはあるものの，同様のマーカーバンドを用いてスペクト
ルを解釈することができる．
2.f.4.2 カロテノイド
カロテノイドの共鳴ラマンスペクトルにおける顕著なバンドは，1600‑1500cm の C＝C 伸縮振動，1300‑1100
cm に現れる CC（C＝C または C‑C）伸縮/CH 面内変角振動，1000cm 付近の Me 横揺れ振動，960cm 付近に現れる C‑H 面外変角振動のバンドである ．
共役二重結合の長さが長いカロテノイド程，C＝C 結
合は低い振動数を持つ ．これにより，ラマンスペクトルからカロテノイドのポリエン鎖長をある程度推定することができる．しかし，溶媒や蛋白質環境の違いによっても C＝C 振動数が変化するので注意が必要である ．一
般に，電子吸収バンドの波長と C＝C 伸縮振動数とは負の相関があることが知られている．
1200‑1100cm の CC 伸縮/CH 変角領域には複数のバンドが見られ，
そのバンドパターンからシス/トランス
異性体を区別することが可能である．紅色光合成細菌の反応中心蛋白質に結合するカロテノイドが 15シス型を持つことは，この CC/CH マーカーによって明らかと
なり ，後にＸ線結晶解析により確認された ．
960cm 付近の対称 C-H 面外変角振動バンドの相対強度により，ポリエン鎖の捻じれ構造を知ることができる（図 4)．ポリエン鎖が平面構造を取っている際には，この振動モードはほとんど強度を示さないが，二重結合に対して捻じれて対称性が崩れることにより，強い
図 3：光化学系 反応中心蛋白質の電子吸収スペクトル（A)と共鳴ラマンスペクトル（B）．共鳴ラマンスペクトル（B）は，441.6nm（a）及び 406.7nm（b）励起によるもの．ラマン散乱測定の試料温度は 85K．

ラマン強度を示すようになる．蛋白質に結合したときのカロテノイドの捻じれ構造は，光合成細菌の光捕集系におけるカロテノイドからバクテリオクロロフィルへの一重項励起エネルギー移動効率
光化学消光

や，植物の LHCII の非と関連付けて議論されている．

側にシフトし，通常は，1680‑1660cm にバンドを示す．
クロロフィル会合体において，ケト C＝O が別のクロロ
フィルの中心 Mg に直接配位すると，その伸縮振動は，
1660‑1650cm に現れる．また，水との会合体において，2.f.5 測定例：光化学系Ⅱ反応中心蛋白質の共鳴ラマンスペクトル

C＝O‑‑HO(H)‑‑M g のような架橋構造によって著しく光化学系 の反応中心蛋白質には，コファクターとし強い水素結合が形成されると，1650‑1640cm まで振動て６分子のクロロフィル a と２分子のフェオフィチン

数がシフトする．

a，２分子の β‑カロテン，１分子のチトクロム b 559が含

13 エステル C＝O は，共役環の近傍に存在している

まれている．406.7nm と 441.6nm の励起光を用いて，ため，弱いラマンバンドを示すことがある．ケト C＝O よクロロフィル及びフェオフィチンの Soret 帯を励起し，りも高い 1750‑1710cm の振動数領域にバンドを示す

それらの共鳴ラマンスペクトルを測定する．

ため，ケト C＝O との区別は容易である．水素結合の形成

励起光として，He-Cd レーザー
（Kimmon IK5651R-G）

により，また，極性環境下おいて，より低波数側に振動の 441.6nm，及び Kr レーザー（Innova 90-K）の 406.7数を持つことはケト C＝O と同じである．

nm の発振線を用いる．

494

共鳴ラマン分光法

３) B.Robert, Biochim. Biophys. Acta 1017 (1990)p.99.
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図 4：紅色光合成細菌のクロマトフォアにおけるカロテノイ
ドの共鳴ラマンスペクトル（CH 面外変角振動領域）．
（a)
Rhodobacter sphaeroides（b）Chromatium vinosum．CH 面
外変角振動バンドを矢印で示す．Rb. sphaeroides の弱い CH
面外変角振動バンド，及び Ch. vinosum の強い CH 面外変角振動バンドは，それぞれ，ポリエン鎖の平面，及び捩れ構造を表す．

Hepes 緩衝液（50mM Hepes-NaOH，0.1％ dodecyl
maltoside pH 7.5）に懸濁した反応中心蛋白質（0.2mg
Chl/mL）を石英ガラスセル（図 2b(i））に入れ，クライ
オスタット（Oxford DN1704）中で温度を 85K にする．
試料部において 15mW の強度のレーザー光をやや焦点をぼかして照射し（局所的な温度上昇を防ぐため），レー
ザー光に対して直角方向の散乱光を集光する．ノッチ
フィルター（Kaiser Optical Systems,Inc.）でレイリー散乱を除去した後，シングル分光器に入射し，分光されたラマン散乱光を CCD 検出器（Princeton Instruments,
Inc., LN/CCD-1100PBUVAR）を用いて検出する．
図３のスペクトルが得られる ．クロロフィル a のSoret 帯と一致する 441.6nm による励起では，クロロ
フィルと β‑カロテンのバンドが，またフェオフィチン aの Soret 帯に近い 406.7nm の励起では，これらに加えて，フェオフィチンのバンドが観測される．

参考文献
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496

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29) T.Noguchi, T.Tomo & Y.Inoue, Biochemistry 37(1998)p.13614.

共鳴ラマン分光法

４章 分光測定

２．分光測定法
g ．葉群の分光反射と分光植生指数
中路 達郎
本節では，植物葉を対象とした分光特性研究の基礎的な知見と，野外における基本的な計測手法について解説し，葉内色素や光合成活性と関連した研究で用いられる評価指標（分光植生指標）について紹介する．

Foliar spectral reflectance and spectral vegetation index
Tatsuro NakajiThis section explains the fundamental knowledge ofthe spectrum characteristic research for an ecophysiologicalstudy of plant leaf, and introduces the basic measurement technique in the field and general indices (spectral
vegetation index)related to the foliar pigment and photosynthesis.

している（図 1）．

2.g .1 はじめに葉のスケールにまで拡大して，この分光特性を考えてすべての物質は，電磁波を反射，透過，吸収する性質

みると，葉内にクロロフィルを多く含む緑葉で例えるとを持ち，その性質は対象の物質に固有の波長特性を示す

理解しやすい．一般に緑葉では可視光のうち青（440nm

ことから，分光特性と呼ばれる(図 1）．電磁波は波長周辺）や赤（680nm 周辺）の波長はクロロフィルで吸収の短いものから，γ線，Ｘ線，紫外線，可視光線，赤外線，

されて光化学系で励起エネルギーとして利用される．こ電波と分類される．植物の分光計測研究では，おもに可のため，太陽によって葉に照射される光のうち，これら視（400〜700nm），近赤外（700〜1100nm），短波長赤外の青と赤の波長の光はほとんど反射あるいは透過しな（1100〜2500nm）の波長帯が扱われ ，原子レベルでみい．その一方で，緑色の波長（550nm 周辺）の光はほとると，これらの波長帯における分光特性は，原子の外殻

んどクロロフィルに吸収されないため，この波長の光の電子の励起や分子振動，格子振動などの内部状態を反映

大部分は反射や透過によって外部に出ていく．私たちが図 1：分光特性の概念図．原子レベルでは，（a）電磁波が物質中の原子に当たると，一部の特定波長 λの電磁波は吸収され内部状態の変化を起こす．他の波長の電磁波は作用せず，外部に出ていく．内部状態の変化は物質や波長に固有であり，可視〜赤外波長帯では，励起や分子振動，格子振動などが起きる．励起の場合，E −E ＝hc/λ（h プランク定数，c 光速）で決定されるエネルギーが吸収されて，外郭電子軌道があがる．（b）励起とは逆に電子軌道が下がる場合は電磁波が放射される．
（c）観測対象（葉）の境界面でみた場合，吸収されない電磁波は外部に散乱する．表面で起きる反射のうち，電磁波の射出方向に散乱する成分を後方散乱（backward scattering），入射光の進行方面に散乱するものを前方散乱（forward scattering）という．個葉の場合，葉内で吸収・散乱を繰り返してして裏側から抜けた電磁波が透過成分として観測される．

１) 独立行政法人国立環境研究所(現職：国立大学法人北海道大学）

2009 低 温 科 学

vol.67波長の呼称は研究領域によっても若干異なることがある．分析
化学の分野では，近赤外と短波長赤外の双方を含めて近赤外と呼ぶ場合もある．

497

葉の表面を眺めた時や森の樹冠を見上げた時にそれらを緑色と認識できるのは，緑色の波長が多くを占めている
可視域の反射光・透過光を知覚しているためである．
植物の葉を対象とした場合，色素をはじめとする葉内物質の吸収による反射光や透過光の減衰過程はLambert-Beer の法則に従っており，多くの事象は物理的に解釈することが可能である．例えば，私たちは〝緑が濃い葉"＝〝クロロフィル濃度が濃い" と経験的に知っているが，その濃さの客観的な評価までは肉眼では行うことは不可能である．この点，分光特性，ここでおもに扱う分光反射の計測では，葉における波長ごとの反射強度を正確な数値情報として取得し，波長ごとの強度や波長間のバランスを解析することで，色素をはじめとする葉の生理情報を非破壊かつ客観的に評価している．
このような非破壊計測の手法は，分析化学や植物生理学における比較的細かいスケールの対象から，航空機や人工衛星のセンサーを活用した地表面のリモートセンシ
ングに至るまで，非常に多くの分野，さまざまな空間ス
ケールで活用されている．本節では，植物の生理研究に関連した分光特性の研究事例を紹介し，次に，分光反射

図 2：(a）緑葉の反射・透過・吸収のスペクトルと（b）微分
分光反射率．ポプラの個葉の表側に人工光（ハロゲン光）を照射し，センサーを近接させて分光特性を計測した．

を中心に，地上における計測手法について概説する．そして最後に，分光反射情報をもとに算出される評価指標

nm 近辺を境に 780nm 近辺まで急勾配で増大し，その後（分光植生指標）についていくつか実例を交えて紹介す1100nm あたりまでおよそ 50％で安定する（図 2a）．短る．

波長赤外においても反射率は比較的高い値を維持する
が，水の吸収によって 1450nm，1940nm 近辺で反射率は大きく低下する．なお，図２ａではあまり顕著ではない

2.g .2 葉の分光特性が，970nm 近辺にも水の吸収帯が存在する．リモートセ

図 2a にポプラの緑葉（個葉）の可視〜短波長赤外におンシングの分野では，これらの吸収帯近辺の反射率を用ける分光特性を示す．波長ごとの反射や吸収，透過はそいて地表面や植生の水分量の評価手法が提案されていれぞれ分光反射率，分光吸収率および分光透過率と呼ばるれるが，グラフに示したような波長に対する反射や吸収，やリグニンなどの構造性炭水化物やデンプンや糖，タン透過の応答パターンは，それぞれ，反射スペクトル，吸パク質といった同化産物・生体物質の吸収帯も存在して収スペクトル，透過スペクトルとも呼ばれる．このよういる．食品や土壌などを扱った分析化学分野では，対象なスペクトルの計測や，それに対する植物種や環境要因

物の短波長赤外の反射スペクトルを極めて詳細な波長分の影響を調査した歴史は古く，玖村・石井 は 1800年代

解能（＜10 nm）で計測し，微分処理や多変量解析手法

後半からの数多くの報告を取りまとめている ．それらを活用することで，動植物の組織や土壌などに含まれるを参考に従来の報告を見渡すと，多くの緑葉では，図 2a

炭素や窒素化合物などの化学成分の推 定 を 行って いに示したようなスペクトルを示すことが知られている．

る

すなわち，反射率を例にとると，可視域では 500nm あた

外の分光反射計測機材の多くは，室内分析で利用されるりまではカロテノイドやクロロフィルによる吸収のため

フーリエ変換赤外分光光度計などよりもその分解能は格に５％程度の低い反射率でほぼ安定し，550nm 近辺を中段に粗い．しかし，航空機搭載のマルチバンドセンサー

心に 15％程度の反射のピークを示す（グリーンピークと（波長分解能〜数十 nm）を使ったリモートセンシングにも呼ばれる）．このピークは葉内色素の波長選択性に依存おいても，2000〜2200nm における反射率のひずみの程しているため，白斑を持つ植物やアルビノ種の葉，紅葉度から地表面の植物残さに関連したセルロース量の分布が進んだ葉では観察されないを推定する手法が提案されている ．現在も分光観測装

498．反射率は，その後，670．一方，1600〜2300nm の波長帯には，セルロース．野外において植物の計測に利用される短波長赤葉の分光反射と植生指標

置の波長分解能が進歩し続けていることもあり，今後，られている．たとえば，葉の老化に伴うクロロ

野外の植物葉の観測研究においても，葉内成分の定量なフィルの分解はグリーンピークの右側の反射率を増大さどに短波長赤外の反射情報が注目される日が来るかもし

せ，カロテノイドの分解は左側の反射率を 増 大 さ せ

れない．

る

(図 3）
．また，老化によって組織が崩壊すると，表ここで，波長に対する分光反射率の変動を解析する際

面の租度や内部組織の空𨻶率，水分の状態が大きく変わの一技法である微分処理についても少し触れておく．図り，近赤外における反射・散乱も強く影響を受ける．ま2b に，ポプラ緑葉の一次微分反射スペクトルを示す．こた，毛茸やワックスは葉の表面の反射率を全体的に高めれは，波長方向に連続して計測された分光反射率をもとることは古くから知られており，表面を実験的に洗浄しに，ある中心波長の前後の波長の反射率の値を用いてそたり毛を剃ると反射率は低下するの増減を算出したものである．このような微分スペクトでは葉の処理を行うわけにはいかないので，色素評価の

ルは可視〜近赤外を中心に研究されており，反射率の変ための指標の開発研究では，このような表面反射の影響

動が明確な色素吸収帯を中心にした報告は非常に多い．

を軽減するために青（445nm）や赤の波長帯の反射率を

可視〜近赤外に着目すると，グリーンピークと赤色〜近基準にした反射率の補正を行っている ．また，多くの広赤外にかけたクロロフィル吸収帯に比較的大きなピーク

葉では，表側と裏側で柵状組織や海面状組織の配置が異を得ることができる．特に 710nm 近辺のピークはレッ

なるため，光の内部散乱過程が異なり，一般に裏面の反ドエッジと呼ばれ，そのピーク高さはクロロフィル濃度

射率のほうが表側よりも高いことも良く知られておと高い相関にあり，ピーク波長は色素のフェノロジーとり関連して変動することも知られているも貴重な知見を与えている．

．気温などの．多くの観測研究，群落内部における光の吸収，散乱を解釈する上で環境要因を変化させながら，人工光チャンバー内でカエ

このように，葉の分光特性には葉の生理生態的な特徴

デの葉群の分光反射計測を行った Zalco-Tejada et al.

が反映するため，逆に，分光情報を用いることで，植物は，レッドエッジ周辺 690‑710nm の間にクロロフィルの状態を非破壊かつ迅速に計測，評価することが期待さ

蛍光に関連する２つの微分ピークが検出されることに着れている．個葉だけでなく，葉群（群落表面）において目し，二つのピークの明瞭さが定常状態のクロロフィル

も葉自体がもつ反射や吸収の特徴は大きく変わらないの

蛍光特性の温度ストレス応答と関連があることを報告しで，観測手法は応用が可能と思われる．ただし，野外のている．また，野外でも，航空機搭載型の分光画像情報

群落表面の分光情報を扱うときには，植物側の生物要因から得られる微分反射スペクトルをもとにした指標でクだけでなく，周囲の光条件や枝や幹，土壌からの反射とロロフィル蛍光の強度（Ft）や蛍光ベースの量子収率（ΔF /Fmʼ
）の評価が行われており ，個体スケールから群落スケールにおいても，微分反射スペクトル情報の解析が光合成研究にとって有効な情報となりつつある．
次に，葉のタイプや季節ごとの分光特性の応答についても簡単に紹介する．約 80種類の植物で可視〜近赤外の植物の分光反射，吸収，透過といった分光特性を調査した例では，植物種間の差は約 10％程度と報告されている．他方，熱帯の 25種 ，温帯 26種の植物の葉について陽葉と陰葉の分光特性を比較した研究では，植物種による多少の相違は認められるものの，陰葉と陽葉では明瞭な特性の違いが認められないことが報告されている．Knapp & Carter は，考察の中で，この一因として，葉の成長パターン，形態や寿命などの違いが複雑に分光特性に影響し，明確な傾向を示さなかった可能性があると述べている．
葉齢や葉色，葉組織の発達，毛茸やワックスの有無，
水分状態，葉の表裏など，非常に多くの生物的な要因が可視〜近赤外の反射スペクトルに影響することはよく知2009 低 温 科 学

vol.67

図 3：(a）葉内色素の吸光特性と，(b）季節の異なるモミジバ
フウの個葉の反射スペクトル ．

499

2.g .3 分光反射の計測
分光反射率は入射光の放射に対する対象物からの反射の比として算出される（図 5）．このうち，入射光の計測に関しては，直接太陽光やランプなどの光源を見て計測する手法と，拡散板を使用して一度反射させた入射光の輝度を計測する場合の２種類がある．センサーの受光部に透過拡散板を装着している全天分光放射計などでは前者の手法で計測し，受光部に透過拡散板を用いない分光放射計や，分光輝度を画像で記録する分光カメラでは，拡散板を使用する後者の手法で計測する．
（a）分光放射計
最近の分光放射計の多くは分光系に回折格子を用いており，数 nm の高い波長分解能で数十〜数百バンドの連続した波長の情報（ハイパースペクトル）を計測できる．
受光部の仕様によって，全方位型のものと測定視野が狭いファイバー型に大別される（図 6）．いずれも，内部で平行光にした導入光を回折格子に照射し，分光された光を内部のセンサーで検出し放射量として計算し出力す
図 4：イネ科草本群落の（a）波長ごとの分光反射率および（b）の影響 ．地上 2m のNDVI に対するセンサー角度（天頂角）
位置から計測したデータを示している．上の図は，太陽天頂角が 35°のときにセンサーの俯角を変えながら分光反射率を計測し，天頂から垂直に群落を観測したときの値を１とした相対値を波長ごとに示している．下の図では，センサーの天頂角を変動させた際の NDVI の変化をセンサーの方位角ごとに示している．上の図において横軸（センサー角度）が 35°のと
きと，下の図において横軸が 35°，方位角が０°のときは太陽を背に計測している状況になる．ホットスポットとは，太陽を背にした際にできる自身の影の周囲部分で反射率が高い．

る．分光放射計は視野角内の反射情報を平均化して計測する点が後述の分光カメラと大きく異なる点である．全方位型のものは，受光部に装着した透過拡散板を通した光を計測するため，視野角はほぼ 180度であり，太陽位
置による角度効果も補正されている．風雨に耐えられる機構のものが多く，野外の植物群落上の分光放射収支の長期計測に適している．市販品では，英光精機製 MS シ
リーズや PREDE 社の分光アルベドメーターなどがある．一方，受光部に光ファイバーを使った分光放射計（ASD 社 FieldSpec，ス ペ ク ト ラ コープ 社 Handy-

いった物理的要因も影響することを念頭に置く必要もあは，視野角は狭いが，逆に，ある一定のLambda2 など）

る．例えば，植物群落に分光放射計などを一方向から向

対象範囲を特定して計測することができる．また，ファけて反射を計測する際，センサーの角度や日射の角度がイバープローブを使った分光放射計では，波長分解能や変化すると反射率も変動し，また，その変動パターンも価格帯などの選択の幅が広く，積分球やリーフクリップ

波長によって異なることが知られている
（図 4）
．これは，

などのアクセサリー類も充実しているため，分光反射率

光の入射角度や観測位置によって検出する反射成分（後だけでなく，葉の分光透過や分光吸収も計測できる利点

方散乱，前方散乱）が異なること，波長ごとの光学厚さがある．

が波長によって異なることなどによる．この詳細な原理や対策については観測視野内の構成物の割合や，群落内（b）分光カメラの光の散乱・吸収プロセスを紐解く必要があり，今回は分光カメラには，任意の数波長の分光反射を計測する

触れないが，少なくとも，野外の葉群や植物群落においマルチバンドカメラと，多波長の反射画像を撮影できる

る分光反射を扱う際は，植物の生理生態条件を考慮する

ハイパースペクトルカメラがある（図７）．カメラによる

だけでなく，例えば観測角度や太陽角度を一定にするな

分光反射観測では画像の中の任意の地点の解析をするこど，非生物的要因の影響がなるべく小さくなるように観とができるため，近接撮影による個葉の解析や，群落内測条件にも考慮する必要がある．

の個体ごとの評価，土壌など構成物ごとの評価が可能に

500

葉の分光反射と植生指標

図 5：分光反射の計測手法．
（a）対象の直上の入射と対象の反射の両成分を直接計測して両者の比率（/ ）を求める手法と，（b）既知の反射率を持つ拡散板をリファレンスにして入射光の強度を計測し，対象の反射輝度との比から反射係数（/ ）を計算して後で反射率に変換する手法がある．

図 6：分光放射計を使った観測風景．
（a）全天放射計では上向きと下向きの同時計測によってその日射と反射の比率を計算する．
（b）ファイバータイプのものでは，任意の場所で計測したり，人工光源を内蔵したリーフクリップを使用した個葉の観測が可能である．

2009 低 温 科 学

vol.67501

図 7：分光カメラを使った観測風景．
（a）マルチバンドカメラによる個葉の分光撮影実験．拡散板と対象の葉をひとつの画面に映しこみ，両者のピクセル比から反射率を計算する．後ろの黒い板には，低反射率の布が貼ってあり，対象の背面からの反射の影響を軽減している．
（b）ハイパースペクトルカメラシステムの一例．カメラ本体に電動の回転ステージや雲台を装着してスキャンを
行う．

なる．

を通して入射した線上の画像を分光して撮影する．このマルチバンドカメラの分光方式は，任意の波長を透過ため，コピー機のラインスキャンのように，センサー部

するバンドパスフィルターを装着して透過した分光画像

位を動かしながら高速で連続スキャンし，後でそれらのを撮影するものが主流であり，４バンドの市販分光カメ

画像を結合させることで二次元情報として分光画像を解ラ で は Photron 社 M SI-4，Optical Insights 社 Agro-析する．

Imager などがこれにあたる．また，私たちが通常使っているカラーデジタルカメラも青，緑，赤の３色の画像をファイバープローブを使った分光放射計や分光カメラ

撮影しており，ある意味では３バンドの分光カメラともによる観測では，反射標準となる拡散板を用いる．拡散

言える．カラーデジタルカメラ内部の CCD や CMOS は

板には，一般に BaSO を圧縮して固めたものや，テフロ

可視〜近赤外において広く感度を持つが，素子表面に近ン 樹 脂 製 の プ レート（Labsphere 社 Spectralon や

赤外をカットするフィルターを貼り付けることで可視の（エ
SphereOptics 社 Zenith など）が利用される．EVA

３色の画像を撮影している．このため，近年では，そのチレンビニルアセテート）樹脂や発泡スチロールの板な

近赤外カットフィルターの代わりに青色波長のカット

どの安価な素材を二次標準として使用することも可能だ

フィルターを装着することで緑，赤，近赤外域に感度をが，表面が鏡面になっていたり，粗すぎたりすると反射持たせた３バンドのマルチスペクトルカメラを作り研究

率に方向性が強く出たりてしてしまうので，あらかじめする例もあり，Tetracam 社の ADC3 のような製品も市

分光反射値の検証が必要である．

販されている．ハイパースペクトルカメラでは，分光方式に回折格子，液晶チューナブルフィルター，音響チュー
ナブルフィルターなどが用いられているが，回折格子を2.g .4 分光植生指標

用いるものが多い（Specim 社 ImSpector シリーズ，

前述のように，分光反射率や微分反射率は，特定の波

Headwall Photonics 社 Hyperspec シリーズなど）．回長領域に葉の光合成機能に関する色素や水分，構造など

折格子を用いたカメラでは，レンズと分光系の間には幅の生理生態情報を反映している．そのため，これらを活が数〜数十ミクロンのスリットが入っており，スリット用した多くの指標，いわゆる分光植生指標（Spectral

502

葉の分光反射と植生指標

表 1：植生群落や個葉において利用される分光植生指標．R ，D はそれぞれ分光反射率，一次微分反射率を示し，その後ろの英字
および数値は使用される波長帯，波長を示す（NIR：任意の近赤外波長，VIS：任意の可視波長，RED：680nm 近辺の赤色
波長帯）．波長は使用するセンサーの性能や対象植物などで変わる場合もある．
指標

計算式

SR

R

/R

NDVI

R

−R

GEMI

SAVI

評価対象

特徴

文献

群落の greenness，色素など

２波長の反射率の比率を計算したもので，組み合わせは非常に
多 い．800nm と 680nm を 組 み 合 わ せ た SR や 750nm と705nm を使った SR はクロロフィル濃度の評価にも利用されている．計算式の特性から，高輝度の情報や陰影の強い場合などに値の振れ幅が大きくなる特徴をもつ．

25ほか

＋R

群落の greenness，
FAPAR

26，27ほか

η 1−0.25×η − R −0.125 / 1−R ，
η＝ 2× R −R
−1.5×R ＋0.5×R / R ＋R ＋0.5
/ R ＋R ＋L × 1＋L
R −R

群落の greenness

最も古くから利用される．２波長の反射率の差分を正規化した指標の総称で PRI や CI などもこの類に入るが，NDVI と呼ばれる指標の多くは，赤色域と近赤外を利用している．緑色域を使った Green NDVI などもある．一般にこの NDVI は，LAI が２を超えると飽和し，LAI との関係が非線形になる．
NDVI に対する土壌表面の高輝度反射の影響を抑え，大気成分の影響を軽減させるために開発された指標．

群落の greenness，
FAPAR

土壌表面の高輝度反射の影響を補正した指標．係数 L は０〜１の値をとり，0.5で利用される．土壌や植生タイプが異なる時の安定性に課題がある．他にも MSAVI2，TSAVI，OPVI など多くの補正指標がある．

29，30

群落の greenness，
FAPAR，光合成量

青の反射情報を加えてエアロゾルによる影響を軽減し，非線形補正係数（L）も加えることで植生情報に対して飽和しにくい利点を持つ．C ，C はエアロゾル抵抗係数，G は出力係数．一般に L＝1，C ＝6，C ＝7.5，G＝2.5で計算される．最近では，
NDVI に代わって光合成ポテンシャルの評価に使われるよう
になった．

31，32

，R

/R

/R

など

＋C ×R

EVI

R
R

−R
/R
＋L ×G

PVI

R

−aR

＋b / a ＋1

群落の greenness

可視と近赤外を２軸に取った散布図における土壌反射率の分布を直線で定義し，解析対象の分光情報がその直線からどれだけ離れているかユークリッド距離を算出，指標化したもの．衛星などの画像解析でよく利用される．a，b は土壌の基準線を定義
する変数．

33

PRI

R

−R

/R

＋R

葉内キサントフィル 光強度に応じたキサントフィルサイクルの色素組成を検出する
サイクル，光化学系 指標．光化学系 の励起状態や，光合成速度における光利用効
活性，光利用効率， 率（単位光あたりの CO 固定効率）の日内変化を間接的に評価
カロテノイド／クロ する．また，グリーンピークのスロープの反射率を使うためカ
ロフィル比
ロテノイド，クロロフィルのバランスも反映する．

34

SIPI

R

−R

/R

＋R

カロテノイド／クロ カロテノイドとクロロフィルの吸収波長の違いを考慮して半経ロフィル比
験的に開発された指標．葉表面組織や葉肉細胞の影響が軽減さ
れている．

35

PSRI

R

−R

/R

カロテノイド／クロ カロテノイドとクロロフィルの吸収波長の違いを考慮して半経ロフィル比
験的に開発された指標．両色素の比率が葉の老化や果実の熟成に関連することからこの指標名になっている．

22

CI

R

−R

/R

＋R

クロロフィル濃度

750nm と 705nm を使った NDVI．

36

mSR

R

−R

/R

−R

クロロフィル濃度

750nm と 705nm を使った SR に，445nm をベースにした補正を施した指標．

5

mND

R

−R

/R

＋R

クロロフィル濃度

750nm と 705nm を使った CI に，445nm をベースにした補正 5を施した指標．Datt（1999）は 680nm を補正に使ったが，Sims&
Gamon によって改良された．

CCI

D

/D

クロロフィル濃度

クロロフィル濃度と関連が強いレッドエッジ周辺の 720nm と700nm の微分反射率の傾きを指標化したもの．微分を扱うため，高い SN，波長分解能が要求される．

37

WI

R

/R

水分

近赤外における水の吸収帯の深さを指標化したもの．ある程度の乾燥ストレスがかかった植物葉において効果が認められる．

6

NDWI

R

−R

＋R

水分

短波長赤外における水吸収帯の深さを近赤外のプラトー領域で 7，38，39
評価した指標 ．SPOT-VGT を使った例では，植生の春先のフェノロジーの評価に有効であると報告されている ．また，この指標と NDVI を２軸にして広域の地点の散布図を作成し，対象とする地点と同じ NDVI で取りえる最小 NDWI と対象地点の NDWI のユークリッド距離を乾 燥の指標（VDI：Vegetation Dryness Index）と定義して森林火災ポテンシャルを評価した研究もある ．

CAI

0.5× R−R

セルロース

セルロースの吸収帯（2100nm 近辺）における反射率のひずみを両側の反射率を基準に指標化したもの．植物残さの検出などで有効性が示されている．

/R

＋R

−C ×

28

−2×R

11

ａ 略称 SR:Simple Ratio,NDVI:Normalized Difference Vegetation Index,GEMI:Global Environment Monitoring Index,SAVI:Soil Adjusted
Vegetation Index, EVI: Enhanced Vegetation Index, PVI: Perpendicular Vegetation Index, PRI: Photochemical Reflectance Index, SIPI:
Structure Insensitive Pigment Index, PSRI:Plant Senescing Reflectance Index, CI: Chlorophyll Index, mSR:Modified Simple Ratio, mND:
M odified Normalized Diffrence,CCI:Canopy Chlorophyll Index,WI:Water Index,NDWI:Normalized Difference Water Index,CAI:Cellulose
Absorption Index.
ｂ FAPAR (Fraction of Absorbed Photosynthetically Active Radiation）は光合成有効放射量が群落内で吸収される比率を示す．Greenness の示すものとしては，土地被服分類を行う際の緑被率や，緑葉の葉面積指数（LAI, Leaf Area Index）などが指標をもとに評価される．

2009 低 温 科 学

vol.67503

Vegetation Index）が開発されている．表 1に代表的な究も進んでおり ，PRI も広域の植生観測の観測指標と分光植生指標を示す．反射率の値をそのまま用いるケー

しての実用化が検討されている．しかし，これまでの個

スや，反射と透過の比率を利用する例などもあるが，こ葉や群落スケールでの観測研究では，植生タイプごとのこで紹介した指標の多くは，植物の情報に感度を持つ波

感度の違い

長の分光反射率の変動を対象波長と基準波長の正規化差されており，そのメカニズムの解明とそれに即した実用

分や比率から検出している．

化に研究の余地が残っている．これまでの指標の多くがや土壌の影響による感度低下

も指摘

NDVI（Normalized Difference Vegetation Index)

そうであるように，PRI も CO の吸収などの光合成機能

は，
最も古くから利用されてきた指標であり，クロロフィを直接計測しているものではなく，光学的に検出可能な

ルの反射領域と構造に関連した近赤外の反射率の正規化

光合成関連物質（色素など）の組成の変化から光合成機差分として算出される．人工衛星による広い分光幅の反能を間接的に評価している．このため，今後は，光合成

射データから計算できることもあり，広域の群落スケーの各種モデルにおけるパラメータの外挿として利用や，

ルにおける光合成有効放射（FAPAR, Fraction of

植物のストレス応答やフェノロジーの検出といった定性

Absorbed Photosynthetically Active Radiation）や葉的な観点からの利用性を探るのも，分光観測の活用手法

面積指数（LAI,Leaf Area Index）の推定に広く利用さとして重要になると思われる．

れてきたが，LAI がおよそ２を超えると飽和するなどの欠点もあるため，最近では EVI（Enhanced Vegetation
Index)のほうが良く利用される．EVI は群落における日積算の GPP（総一次生産）の間に正の関係を示すため，衛星データを用いた全球の炭素吸収量マッピングなどに広く利用されており，地域ごとの安定性の検証や気象条件が変動したときの対応などが今後の課題となっている．
一方，生理情報との関連があり，個葉においても研究利用が期待される指標としては，クロロフィル濃度を可視―近赤外の反射率から推定する mND（M odified

Normalized Deference) や微分スペクトルを利用した（CanopyChlorophyll Index) といった色素系の指CCI標，キサントフィルサイクルの光応答を反映し光化学系の 活 性 と も 関 連 の あ る PRI（Photochemical Reflectance Index) などであろう．PRI は，グリーンピー
クの両側の反射率の正規化差分を使っているので，長期的な変動にはクロロフィルとカロテノイドの比率が影響するが，キサントフィルサイクルの色素であるビオラ

キサンチンが強光時にアンテラキサンチンやゼアキサン
チンに移行する際に生じる 531nm 近辺の反射率低下も検出するため，キサントフィルサイクルのエポキシ化や，間接的な光化学系
るの指標として提案されてい．また，光合成において単位光あたりの炭素固定効率（LUE,Light Use Efficiency，光 ⎜ 光合成曲線の初期勾配 φ とは異なる）と PRI の間の正の相関関係も
個葉から群落まで報告されている．日本のカラマツの針葉における観測研究でも，光化学系 活性やエポキシ化率，LUE の日変動や季節変動，群落スケールの LUE のと PRI の間には正の相関が得られている（図8）．群落においては，衛星データを用いた LUE の推定研
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葉の分光反射と植生指標

図 8：分光カメラを使った PRI の観測結果．（a）マルチバンドカメラによるカラマツ針葉の撮影画像．便宜的に NDVI を閾値にしてバックグラウンドのデータを削除して表示させてある．
（b）画像を撮影した針葉における純光合成速度の光利用効率（LUE＝純光合成速度/PAR），エポキシ化率（EPS＝ V ＋0.5A / V ＋A＋ Z ，V ：ビオラキサンチン濃度，A：アンテラキサンチン濃度，Z ：ゼアキサンチン濃度）および PRI の季節ごとの経時変化．快晴日におけるデータを示してある．LUE や EPS は日中に低下し，PRI は緑葉時期（6/3〜9/23）は日中に同様に低下する．緑葉時期は，PRI は他のパラメータと正の相関を示すが，10月の黄葉では正の相関を示さなかった（Nakaji et al. の一部を抜粋）．
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506

葉の分光反射と植生指標

４章

分光測定

３．パルス変調蛍光a．クロロフィル蛍光と吸収による光合成測定
園池

公毅

クロロフィル蛍光はその起源となる光化学系の種類や量，そしてエネルギー移動を反映するため，光化学系の量比やステート遷移に関する情報をそこから得ることができる．また，室温での蛍光測定に
パルス変調測定法を適用することにより，植物の光合成の状態を非破壊的に測定することができる．
この場合，クロロフィル蛍光自体は光化学系 から発光するが，電子伝達の相互作用を通して，系以外の光合成の状態に関する情報を蛍光から得ることもできる．本稿では，クロロフィル蛍光測定の原理と，測定結果を定量化する方法，そして結果として得られたパラメーターの解釈の方法について解説し，さらにパルス変調法の吸収測定への応用についても触れる．

Basics of the Measurements of Photosynthesis by Pulse Amplitude Modulation
Kintake Sonoike
Recentlydeveloped technique ofpulse amplitude modulation (PAM)fluorescence measurement is a veryeffective
method to characterize the various aspects of photosynthesis. Principles of the measurements and basic
application to the photosynthesis research is summarized.

3.a.1 光合成測定としてのクロロフィル蛍光が，Iが一定であるとの前提の下では F と ΦF の挙動は一致するため，解釈においては通常大きな問題とはな
らない．

3.a.1.1 蛍光の一般論
蛍光とは，光を吸収して励起状態となった色素が元の3.a.1.2 光合成色素の蛍光

基底状態に戻る際に，基底状態と励起状態の差に相当す

有機溶媒中におけるクロロフィルの蛍光収率は室温でるエネルギーの一部を光の形で放出する現象である ．

通常 0.3程度である．しかし，植物の葉におけるクロロ

照射した光の光子数（またはエネルギー）に対してどれフィルの蛍光収率は 0.01‑0.003と極めて低い．この差だけの蛍光が放出されるかの比率を蛍光の量子（またはは，クロロフィルが吸収したエネルギーが光合成に使わエネルギー）収率という．ある物質が一定の光量子束密れる場合には蛍光として放散されるエネルギーの割合が度I低下するとして解釈できる．クロロフィル蛍光の強さはの光を吸収した時の蛍光の強さ F はその物質の蛍光の量子収率を ΦF とした時にF＝I

ΦF

温度依存性を示し，低温になると蛍光強度は増大する．
室温では，光化学系の蛍光収率は光化学系

として表される．ΦF が一定とみなしうる時には F を測検出している場合は，光化学系

定することによって Iを占める．

を求めることが可能なので，蛍光色素 Cy3，Cy5 や蛍光タンパク質 GFP などを利用した蛍光測定においては，Iが蛍光物質の量に比例すると仮定して，例えば mRNA の量やその他の物質の指標に比べて非常に小さくなり，特に蛍光のうち 690nm 付近を主にの蛍光がそのほとんど

3.a.1.3 低温蛍光スペクトル測定による光化学系量比の測定
室温では光化学系の蛍光は弱く，また二つの光化学とする．一方，クロロフィル蛍光の測定においては，I系の蛍光の波長が近いため，両者を区別することは通常を一定とみなし，F を測定することによってクロロフィできない．一方，液体窒素温度（−196℃，絶対温度 77K）

ルの ΦF の変化を見積もることにより，光合成系に関すまで冷却すると，光化学系のクロロフィルは 715‑735

る情報を得ることになる．なお，文献の中において F（蛍

nm に蛍光発光を示すのに対して，光化学系

光強度）と ΦF（蛍光収率）を区別していない場合もあると 695nm に蛍光発光を示し，これはコアアンテナに由来する（蛍光測定の章を参照）．光化学系

１) 東京大学・新領域創成科学研究科・先端生命科学専攻

2009 低 温 科 学

vol.67は 685nmの場合は，コ

アアンテナ単独では 720nm に蛍光極大を示すが，LHCI
507

を結合した光化学系

では 735nm に極大が見られる．

LHCII 自体の蛍光極大は 680nm 付近であるが，光化学系のコアアンテナへの励起エネルギー移動は極めて効る必要がある．
一般的な蛍光光度計でも，液体窒素温度での測定を可能にするユニットを増設することにより測定が可能になと複るが，機種によっては特注による改造が必要となる．試合体を形成している時には LHCII の蛍光はほとんど検料を冷やす方法としては，試料セル自体を液体窒素に浸出されない．一方，紅藻やシアノバクテリアにおいては，す場合と，試料セルの金属部分を一部液体窒素に浸してクロロフィルの蛍光の他にフィコビリンの蛍光が観察さ熱伝導によって温度を下げる場合の二通りがある．前者

れる．LHCII とは異なり，in vivo でもある程度の蛍光がの場合は，測定光の光路が液体窒素の中を通るため，特見られ，特にクロロフィルへのエネルギー移動が阻害さに熱の絶縁が不完全な場合，液体窒素の中の泡が測定をれるような条件では強い蛍光が観察される．液体窒素温

妨害する場合があることに注意する．また，後者の場合

度では，アロフィコシアニンの蛍光が 685nm に，フィコは，冷えた試料セルが空中にでているため，場合によっ

シアニンの蛍光が 660nm 付近に観察されることが多ては霜が付いて測定を妨害する場合があるので注意すい．

る．蛍光光度計では，測定光の光路と検出する蛍光の光率的であるため，葉や細胞などにおいて光化学系

蛍光の収率は各複合体で異なるので蛍光の強さから光路が直角になっている場合が多い．液体窒素温度による

化学系量自体を見積もることはできないが，蛍光スペク

測定では試料が凍結するため試料の散乱が大きいので，トルの測定により２つの光化学系の相対的な比率を見積

試料セルは 1mm 程度の薄いものを用いる．その際，試もることは可能となる．また，各光化学系からの蛍光発料セルの向きがちょうど測定光と 45度の角度に配置さ光の強さは，その光化学系にエネルギーを渡すアンテナ

れると測定光の反射光が検出器に入ってしまうので，どのサイズに比例する．従って，ステート遷移のように，

ちらかに少しずらしておくことが望ましい．

条件によってアンテナサイズが変化するような場合に光化学系の量比を測定する場合，試料は，５分程度のは，クロロフィル蛍光の強さに反映されることになる．

暗順応をしてから暗所で凍結するとステート遷移の影響

これを利用して，例えばステート１からステート２へのが避けられ，再現性のある結果が得られる．測定波長は遷移が起こっているかどうかを推定することも可能であ

650nm から 770nm 程度まででよい．励起光は 430nm

る（次節参照）．

付近の青い光を用い，その場合スリット幅は最大で構わ

この際，試料のクロロフィル濃度が蛍光スペクトルにない．蛍光を検出する側のスリット幅は 2nm 程度とす

影響を与える場合があることに注意する必要がある．試ることが多い．陸上植物の場合は 650nm においては蛍料のクロロフィル濃度が高いと，クロロフィルから発光

光は通常発光しないので，この波長における信号の強さ

した蛍光が試料から外へ出る前に別のクロロフィルにを蛍光のゼロ点としてよいが，紅藻やシアノバクテリア

よって吸収される．これを自己吸収という．クロロフィといったフィコビリンを含む生物では，きちんとバック

ルの赤色部の吸収バンドの波長は 670‑680nm 付近なのグラウンドを測定する必要がある．水やバッファーによで，その影響は，光化学系

るバックグラウンドの測定により，励起光の反射などにの 685nm の蛍光の場合に一の蛍光起因する迷光などのアーティファクトの存在も確認する

に対する影響は一番小さくなる．従って，クロロフィル

ことができる．ただし，試料が存在する条件では試料の濃度が高い試料では光化学系の蛍光が選択的に吸収さ吸収によって迷光の大きさは減少するので，バックグラが少なくなっているように見ウンドを単に引き算することによってアーティファクト

番大きく，次が 695nm の蛍光になり，光化学系

れ，見かけ上，光化学系

える．クロロフィル濃度が異なる試料間でスペクトルをを補正することが困難な場合もある．

厳密に比較することはできないと考えた方がよい．液体

光化学系の量比の指標としては 685nm の蛍光強度

試料の場合は，5μg/ml 以下のクロロフィル濃度にする

F 685もしくは 695nm の蛍光強度 F 695と 735nm（実とほぼクロロフィルの自己吸収の影響を避けることがで際には極大波長を取るのでシアノバクテリアなどではきる．クロロフィル蛍光スペクトルは，植物の葉でもそ725nm）の蛍光強度 F 735（F 725）の比，つまり F 735/のまま測定できる点が利点であるが，葉の場合は局所的

F 685もしくは F 735/F 695を用いる．高等植物の場合，なクロロフィル濃度が極めて高いので，スペクトルを見F 695に比べて F 685の方が条件による変動が少ないた

ると必ず光化学系

め，F 735/F 685を光化学系のピークが相対的に非常に大きく

／光化学系

の比の指標

なっている．従って，クロロフィル濃度が異なる葉の間として用いる場合が多い．シアノバクテリアの場合，685

でスペクトルを比較しても意味がないという点に注意す

nm の蛍光は，系

508のクロロフィル蛍光の他にフィコビ
パルス変調による光合成測定

リンの蛍光の寄与もあるので，F 725/F 695を指標とす

ように変化するかは，さまざまな反応の競争の結果決まる例が多い．いずれにせよ，これらの値は指標に過ぎず，ると考えられる．それぞれの反応の収率を足し合わせた

光化学系

ものは１になると考えられるので，ある反応の変化は他／光化学系のモル比を示すわけではないことに注意する必要がある．

の反応の相補的な変化を伴う．光化学反応に伴って蛍光

3.a.1.4 低温蛍光スペクトルによるステート遷移のの収率が減少することを光化学消光（photochemical
quenching），熱放散の増大に伴って蛍光の収率が減少す

測定
藻類とシアノバクテリアにおいては，ステート遷移がることを非光化学消光（nonphotochemical quenching）

光合成に与える影響が大きいため，液体窒素温度でクロという．実際に，クロロフィル蛍光の誘導期現象においロフィル蛍光スペクトルを測定することによって容易にて，蛍光収率と光合成の速度の間に負の相関があること

ステート遷移の大きさを見積もることができる．シアノ

は古くから指摘されていた．蛍光の収率自体は，当然のバクテリアは原核生物であるため，細胞内の光合成電子

ことながら熱になる反応の速度によっても左右されるこ伝達系が呼吸鎖と一部の電子伝達成分を共有している．

とから，蛍光の誘導期現象が，そのまま光合成速度の変また，藻類でも，大きな葉緑体呼吸が見られる．従って，化を示すわけではない．しかしながら，暗所においた葉これらでは，高等植物とは異なり，暗順応した細胞におに光合成が飽和するような光をあてて，１秒程度までのいてプラストキノンプールは還元されてステート２の状

短い時間のクロロフィル蛍光強度の変化を見る場合に態になっている．一方で，光化学系

は，その変化は主に光化学消光によると考えられる．その阻害剤である

光化学系
DCM U を加えて光を照射すれば，の働きでプして，この蛍光挙動は暗所で酸化されていた光化学系

ラストキノンプールは酸化されてステート１の状態になの電子受容体である Q が光照射によって還元される過る．このようにして，細胞を簡単にステート１もしくは

程によってほぼ説明できる．すなわち，最初に Q が完全

ステート２の状態にすることができるので，5−15分暗酸化されている状態 O（全ての反応中心が open である

順応した細胞での蛍光スペクトルと DCM U を終濃度 10状態）では蛍光強度は最低（F ）であり，Q が還元されμM 加え，光を１分ほど照射してそのまま液体窒素で凍ていくに連れて（close した反応中心が増えるに連れて）らせて測定した蛍光スペクトルを比較すれば，ステート

蛍光強度は増加しやがて P で極大値（F ）に達する．こ

遷移を観察することができる．ステート２では光化学系の P で，Q が完全還元されている場合（全ての反応中心のアンテナサイズが小さくなっているので，相対的にが close である場合）は，この F は蛍光の最大値 Fm にの蛍光は弱くなり，逆にステート１では光化等しくなる．蛍光の値は F 以後も，さらに電子伝達や炭の蛍光が弱くなるはずである．２つの状態でクロ酸固定の活性状態の変化により S‑M ‑M ‑T と複雑なロフィル蛍光スペクトルに差があればステート遷移が起変化を示す場合が多い（図 1）．この変化がどの程度の時こっている，差がなければステート遷移に異常がある，間で引き起こされるかは，照射した光の明るさに依存すと結論できる．陸上植物でも理論的には同様な実験が可

ることもあり，一定ではない．また，研究グループによっ

能であるが，ステート遷移の蛍光に対する寄与が小さいて，O，P，S，M ，T といった名前の付け方も様々であので，２つのステートごとに別々の測定が必要な本方法

る．

光化学系
学系

では試料間の誤差が生じやすく，正確な測定が難しい．

比較的強い励起光を用い，サブミリ秒からの短い時間

従って陸上植物の場合は，後述するパルス変調などによる蛍光の連続測定中に励起光を変えることにより蛍光強度の変化を検出することによってステート遷移に関する情報を得る場合が多い．
3.a.1.5 クロロフィル蛍光の誘導期現象
暗所においた光合成細胞に一定の連続光を照射すると，その蛍光強度が図 1のように複雑に変化することは19世紀から知られていた ．このような蛍光強度変化を
クロロフィル蛍光の誘導期現象という．実際には，吸収された光のエネルギーは，光合成に使われ，また蛍光として際放出されるだけでなく，さまざまな反応を経て熱になる分も存在する．吸収された光のエネルギーがどの
2009 低 温 科 学

vol.67

図 1：暗所に順応させた葉に連続光を照射した時の蛍光強度
変化の例

509

図 2：暗所に順応させた葉に飽和光を照射した時のサブミリ秒からの蛍光強度変化を対数目盛で示した例

図 3：DCMU で処理したチラコイド膜に連続光を照射した
時の蛍光強度変化の例

スケールにおいて測定したクロロフィル蛍光を時間を対数にプロットした場合，F から F への変化は Q への
電子伝達速度と Q から Q 以降への電子伝達速度の釣3.a.1.6 ポンプ＆プローブ法

り合いを反映するため，複数の変曲点を持つ複雑な挙動

蛍光の測定においては，色素を励起するための測定光を示す（図 2）．２つの変曲点（J と I，場合によって I とを試料に当てる必要があるが，従来の方法では，測定光I と記述する）を含めた誘導期現象（O‑J‑I‑P）による光に弱い連続光を使用し，この連続光が光合成を駆動する

合成状態の解析は，Hansatech Instrument 社の Plant

励起光の役割も果たす．これに対してポンプ＆プローブ

Efficiency Analyzer によって簡便に行なうことができ，

法では，この測定光に短く強いパルス光を用い，光合成

その方法論は JIP テストとして Strasser らによって定の励起には別の光源（閃光またはパルス光のことが多い）

式化されている ．Strasser らによって考案されたさまを用いる．ポンプ＆プローブの「ポンプ」とは，光合成

ざまなパラメーターは，植物の光合成状態の変化を簡便の励起に用いる最初の閃光照射のことで，「プローブ」はにスクリーニングする方法として有用であるが，その変その後のパルス光による測定のことを指す．通常の連続化の原因を特定することは通常難しい．

光による蛍光測定の場合は，測定光による励起効果が無Q から Q への電子伝達を DCM U の添加により阻害視できないが，このようなパルス光を用いた場合は，パした場合には，Q の還元速度だけによって蛍光挙動が決

ルスの持続時間を短くすれば，パルス強度を強くしても，

まるため，誘導期現象の立ち上がりは極めて速くなり，

時間平均したときの光の強さは連続光に比べてきわめて

またより単純になる（図 3，赤の線で示した変化）．実際小さくなる．従って，ポンプ＆プローブ法では，(1)事実には，単一の反応速度でこの蛍光の立ち上がりを記述す

上励起効果を持たない（見かけ上暗所での）蛍光測定がることはできないが，それは，アンテナサイズの異なる可能になる，(2)測定パルス光の強度を上げることができ２種類の光化学系（αセンター，βセンター）が存在する

るため感度のよい蛍光測定が可能になる，という２つのことにより，Q の還元速度が均一ではないことによる．

利点がある．このような利点を持つポンプ＆プローブ法

Q が時間と共に還元される量は図 3の光照射開始からは，(1)測定光が励起作用を持つと測定が困難となる，閃ある時間までの水色の部分の面積として計算しうるた

光照射後の蛍光時間変化の追跡，(2)きわめて希薄な溶液

め，この面積の時間変化を解析することにより，アンテ（例えば海水そのもの）の蛍光測定などの感度を要求されナサイズの解析などを行なうことができる．

る測定，といった場合に用いられる．

このように，Q の酸化還元を反映する光化学消光だけ

通常，ポンプ＆プローブ法では，まず，光化学系

でもさまざまな因子の影響を受けるのに加え，キサント

還元する閃光を照射する（図 4）．この閃光により Q はま

フィルサイクルなどのエネルギーを熱として放散する反ず還元され，次いで再酸化されるという時間変化を示し，応を反映する非光化学消光もクロロフィル蛍光に影響を

それによって蛍光の収率変化が引き起こされる．この際，与えるため，クロロフィル蛍光挙動の解釈には常に困難

最初の閃光照射（t0）からある一定時間後（t0＋Δt）に測がつきまとう．これを解決するためには，3.a.2.2節で述

定パルス光を照射して蛍光を測定する．この Δt を変化

べるように飽和パルス光の導入などにより，要因の切りさせて繰り返し測定を行うことにより，蛍光の時間変化，分けを行なう必要がある．

つまり Q の酸化還元状態の時間変化を知ることができ

510をパルス変調による光合成測定

期させてシャッターを切ることにより，上記のパルス＆プローブ的な効果を得ることができる．この場合，測定パルスとは別に，光合成を励起させるための定常光を当てることにより，蛍光の誘導期現象を２次元画像で捉えることが可能となる（蛍光イメージングの節 3.d を参照）．

3.a.2 パルス変調蛍光測定
3.a.2.1 パルス変調蛍光測定
図 4：ポンプ＆プローブ法による蛍光収率の測定

PAM という言葉は Pulse Amplitude Modulation（パルス変調）に由来し，この後半の Amplitude Modulation

る．閃光照射後の蛍光の立ち上がり（Q の還元）
速度は，はラジオで使う AM と同じである．AM ラジオでは，放光化学系のアンテナサイズに依存するので，この立ち送局によって決まった周波数のラジオ波を信号に用い，上がり速度からアンテナサイズに関する情報を得ること

音の強弱を波の振幅の大小に変換して送る．ラジオを聞ができる．また，Q の再酸化は，Q への電子伝達によっ

く人が自分の聞きたい放送局の放送だけを聞くことがでて起こるので，図 5のように光化学系を１回だけ励起す

きるのは，さまざまな周波数のラジオ波のうち特定の（自るシングルターンオーバーフラッシュ後の蛍光の減衰の分の聞きたい放送局の）周波数の信号だけを増幅してい初期速度を見ることによって Q から Q への電子伝達るためである．ある周波数成分に信号を載せて送れば，速度を見積もることができる．
特に後者のような情報は，それ以外に他の信号が飛び交っていても，それらの信号

原理的に定常光による蛍光測定では難しく，ポンプ＆プ

が別の周波数成分である限り無視することができる．パローブ法の利点がもっとも良く生かされる測定例であルス変調蛍光測定（PAM ）においては，この変調の技術

る．Waltz 社のキセノン PAM 蛍光測定装置においてを利用してノイズを減らすと共に，以下に述べるようなは，このような測定原理により高感度の測定が可能とさまざまな光源を用いた測定が可能となっている．

なっている．測定パルスの励起効果を最低限に抑えるた

従来の弱い連続光を使う蛍光測定では，測定光が励起めに，通常は１回の励起閃光後の測定で測定パルスは１光の役割も兼ねていた．この場合，連続光の強さが弱い

回しか用いないが，測定パルスの励起効果が無視できると（図 6，赤の線で示した変化）蛍光の最大値 Fm を求めときは，閃光照射後に測定パルスを複数回当てることにることができない一方，光が強くなると（図 6，青い線でより，１回の測定のみで時間変化を求めることもできる．

示した変化）蛍光の立ち上がりが速くなり，F を正確にPhoton System Instruments 社の二重変調蛍光測定装

求めることが困難となる．蛍光測定におけるパルス変調

置においては，この方法がとられている．

とは，この測定光を，短い繰り返しパルス光で行い（図特殊な応用例として，蛍光カメラによる２次元蛍光画7A），試料からの発光のうち，測定パルス光の繰り返し

像時間分解解析が上げられる．蛍光を CCD カメラに周期と同じ蛍光成分だけを増幅して測定値とする（図よって捉えて画像として解析する際に，測定パルスと同

7B）．この方法は，測定にパルス光を用いる点では上述

図 5：蛍光による Q から Q への電子伝達速度の測定例

図 6：連 続 光 照 射 に よ る ク ロ ロ フィル 蛍 光 測 定 の 問 題 点（赤：励起光が弱い場合，青：励起光が強い場合）

2009 低 温 科 学

vol.67511

図 8：パルス変調による F の測定

図 7：パルス変調法による蛍光測定の原理（A：光検知部位での蛍光強度，B：取り出された変調シグナルの大きさ）

消光）と熱放散系の変化（非光化学消光）という２つの要因が共に蛍光を変化させる点にある．しかし，20ns 程度で起こる Q の還元に対して，熱放散系の変化はずっのポンプ＆プローブ測定と似ているが，一定の周波数（実と遅い．従って，光合成を飽和させるような短いパルス

際には 1kHz〜100kHz）の信号だけを増幅する点が大光を与えることにより，熱放散の状態は変化させずに Q

きく異なる．このような測定方法は，２つの大きな利点だけを還元することができる．飽和パルス光照射前の蛍をもたらす．１つ目は，ポンプ＆プローブ法と同様，測光収率と照射中の蛍光収率の差は，Q の還元を反映する

定パルス光の強度をある程度強くしても，パルスの幅をはずである．一方，この飽和パルス光照射中の蛍光収率非常に短くすれば，時間平均したときの光の強さを連続は熱放散による影響を主に反映する．このようにして，光を使用したときに比べて，非常に小さく抑えることが飽和光を導入することにより，蛍光挙動に影響を与えるできる点である．つまり，適切なパルス強度と周波数を２つの要因を分離することができる．このようにパルス

選べば，測定光による光合成系の励起は無視できるくら変調に飽和パルス光を組み合わせることにより光化学消いに小さくなり，暗所での蛍光 F を正確に測ることが光と非光化学消光を区別して見積もる測定方法をクエンできる（図 8）．さらに，変調という方法の特性上，繰りチング測定という．前項で説明したように，パルス変調

返し周期を持たない光による蛍光は増幅されないので，

法によって始めて，飽和パルス光によって引き起こされ他の光が当たっている状態でも測定が可能になる．図 7

る蛍光収率の変化を飽和パルス光が励起光となって生じに示すように，ベースラインのドリフトや迷光があってる蛍光の変化から分離できる．飽和パルス光を導入したも，それらは繰り返し周期を持たないので，（測定光の周クエンチング解析はパルス変調法の利点を最大限生かし

波数と同じ周波数を持つノイズでない限り）信号としてた手法であると言える．

は現れないので，非常に安定した感度での測定が可能で3.a.2.3 一般的なクエンチング測定あり，生葉などでも充分な測定結果を得ることが可能で暗順応させた植物の葉をパルス変調蛍光測定装置によある．同様に外部から連続的な励起光や単発のパルス光る測定する例を以下に紹介する（図 9）．測定パルスの照を与えた場合も，励起光自体による蛍光は増幅されない射を開始すると蛍光は F レベルまで上がる．前述した（図 7B）．検出されるのは，励起光による蛍光収率の変化のみとなる．つまり，必要であれば，野外で自然光が当たっている条件での蛍光の収率をも測定することができる．ただし，ポンプ＆プローブ法に比べると測定パルスの照射回数が非常に多くなるため，励起効果を避けるた
めには１回のパルス強度は小さくせざるを得ず，一般的に，絶対的な感度はポンプ＆プローブ法よりも低くなる．
3.a.2.2 飽和パルス光の導入
前節で述べた測定パルス光に加えて，パルス変調蛍光測定においては，もう一種類，飽和パルス光と呼ばれる光源が測定に用いられる．クロロフィル蛍光挙動の解釈を困難にしている１つの原因は，Q の酸化還元（光化学512

図 9：パルス変調法への飽和パルスの導入

パルス変調による光合成測定

ように，測定パルス光の時間平均した強さは非常に弱い

結局処理の効果を見ることができない．逆にその植物のので，そのままでは蛍光は F レベルのまま変化しない．

葉の最大の能力を知りたいときには，非光化学消光など

そこへ，飽和パルス光をあてると Q が一時的に還元さがほぼ解消すると思われる 30分以上の暗順応をするこ

れて蛍光は最大レベルの Fm にまで上昇する．パルス変とが望ましい．ただ，冬季の樹木の葉などでは，日中の調の場合，この蛍光レベルの上昇は，飽和パルスが励起

低温光ストレスによる光合成効率の低下が，夜の間に完した色素からの蛍光が加わるためではなく，飽和パルス

全には回復せず朝まで残る例なども報告されており，30

によって Q が還元されて蛍光の収率が上がったことに分おけば最大能力が求まるとは断言できない．

よる間接的な影響が現れるためである．一般的にパルスb）励起光照射の時間変調測定方法においては，蛍光の収率の変化を測定して励起光の照射を開始したあとには，一時的な蛍光収率いると考えてよい．
飽和パルス光は通常 10−20秒間隔での変動があり，通常は数分でその変動が Fs に落ち着く

あて続けることが多い．次に光合成を駆動する励起光の（定常状態になる）ので，そこで励起光を停止して F ʼを照射を開始する．これは連続光なので，やはり励起光に測定する．しかし，場合によっては，だらだらと蛍光収よる直接の蛍光は観察されず，励起光により蛍光の収率

率が（たいていは低い方へ）変化し続けるような場合もが変化した間接的な結果として蛍光収率の変化が見られある．特に，光阻害に弱い変異体を生育光と異なる光環

る．蛍光レベルは光化学消光と非光化学消光の２つの要境においた場合など，なかなか定常状態にならない場合

因により変化しながら最終的に一定の値 Fs（F という場がある．光阻害が時間によって進行するような場合は数合もある）に落ち着く．一方，この間，飽和パルス光が時間蛍光強度が変化し続ける場合もあるので，基本的にあたっている時には Q は完全に還元されるので，そのは大きな変動が落ち着いた状態を準定常状態と考えて励

時の蛍光強度 Fmʼ
は非光化学消光の影響だけを受ける

起光を打ち切ることになる．また，一定値になるのを待っことになる．つまり，Fmʼの値をつないだ線の変化は，ていると F より蛍光が小さくなってしまう場合もあ

非光化学消光の変化を示すことになる．励起光を停止す

る．これは，シロイヌナズナの変異体などにおいてはし

ると，Q の酸化により蛍光は減少するが，その時の蛍光

ばしば見られ，非光化学消光が非常に強く誘導されるこの最小レベル F ʼは最初の F レベルより小さくなる場とが原因であると考えられる．この場合には，Fs が一定

合がある．これは，励起光停止後，Q の再酸化は速やかの値に落ち着くのであれば，F よりも値が小さくなるこに起こるのに対し，非光化学消光の解消は遅いため，非と自体は問題ない．いずれの場合においても，励起光を光化学消光により蛍光強度が F レベルよりもさらに減止めた後に，再び元の F のレベルに戻るかどうかが一少することによる．

つの判断の目安となる．F レベルに戻らない場合は，不この測定によって得られるそれぞれの時点における蛍可逆的な阻害が進行していると考えられ，より励起光を光の強度（F ，Fm，Fmʼ
，Fs，F ʼ）から蛍光パラメー

弱くするなどの対策が必要となる．

ターを計算することにより光合成の状態を知ることがで

c）F ʼ
の測定

きる．パラメーターの意味及び計算方法は次節に譲り，

上述のように，強い励起光照射下では F 自体も非光

ここでは，実際の測定にあたっての注意点について述べ

化学消光にによって F ʼまで低下する．この F ʼのレベる．

ルを求めるためには，非光化学消光が減衰しないうちに

a）暗順応の時間

Q の再酸化が完了する（光化学消光が０になる）必要が測定前の暗順応の時間は，測定が何を目的としている

ある．光化学系の下流に何らかの阻害が見られる場合

かによって異なる．もし，電子伝達の量子収率 Φ のみをなどは，励起光を消すと同時に光化学系

知りたいのなら，パラメーターの算出には Fm や F は収される 700nm 以上の光を照射して Q の速い再酸化必要ないので，そもそも暗順応をする必要はない．場合を保証する必要がある．ただし，藻類やシアノバクテリ

によっては，励起光すら必要でなく，栽培・培養していアにおいては，第５章で述べるように暗順応した状態で，る所へ，単にパルス変調測定装置のグラスファイバーを

既に蛍光の消光が見られるため，F ʼのレベルが F レベ

近づけて測定すれば生育光強度での Φ は求まる．次に，ルよりも高くなる場合が多い．陸上植物においても，F ʼ

短時間のストレス処理などをした後の光合成効率の変化

レベルの測定をきちんと行なうことはそれほど容易ではなどを知りたいときには，暗順応は５分程度で測定するなく，励起光が弱い場合などにおいては F ʼ
レベルが Fことになる．当然ながらストレスの影響は処理終了後，レベルより大きくなる場合もあり，パラメーターの計算

徐々に小さくなるので，あまり長く暗順応を行なうと，において，F で代用する場合もある．また，F ʼを実測

2009 低 温 科 学

vol.67に選択的に吸513

テリアの場合は 3.a.5を参照）．一方，消光が最大限にせず，＝F / Fv/Fm ＋ F /FmʼFʼ

(1)

なって Fmʼ＝F ʼ(Fvʼ＝0）となる時，qN は１になる．つまり，qN は非光化学消光の大きさに依存して，０から１という式を用いて，計算で求める方法も提案されていの値を取る．単に消光を定量化するだけなら 1−Fmʼ
/る ．

/F でもよいが，その場合，Fmʼ
や F ʼは
Fm でも 1−F ʼ

この他の測定機器の設定項目の調整については 3.a.4
で述べる．

０にはならないので，定量化した値は１までは大きくならない．Fv を使うと（実際に実現するかどうかは別として）理論的には qN＝1−Fvʼ
/Fv は１になりうる．

3.a.3 クエンチング測定結果の定量化と解釈
3.a.3.1 qN と NP Q
上述のように，蛍光の誘導期現象を引き起こす原因は，

非光化学消光の主な原因は，１) チラコイド膜のプロトン濃度勾配ができたときのキサントフィルサイクルなどによる過剰エネルギー消去，２) アンテナ複合体の反応中心間の移動（ステート遷移）による蛍光収率の減少，

光化学消光と非光化学消光にわけて考えることができる

３) 光化学系の光阻害による蛍光収率の減少が主なもので，それぞれを分離して定量化することが必要となる．

ので，高等植物においては，プロトン濃度勾配によって蛍光の強度自体は励起光の強さ，試料中のクロロフィル

誘導されるキサントフィルサイクルの寄与が大きい（図濃度などによって変化してしまうので，他の試料・条件

10）．この３つの成分を区別して測定する方法が，Quickと比較することはできない．そこで，相対値の形をとる

and Stitt によって提案されている ．励起光を切ったあことになる．

との非光化学消光の解消を考えた場合，プロトンの濃度暗順応した葉の蛍光の収率は，Q の酸化還元に依存し勾配は，ATPase を通したプロトンの流出により数十秒て，値が F から Fm まで変化する．ここにある一定の励の時間スケールで解消する一方，ステート遷移は 10分程

起光があたると，非光化学消光が増大することにより，度で起こり，光阻害の修復には通常数十分の時間を必要

蛍光の値は，Q が完全に還元しているときは Fm からとする．従って，これらの３つの要因は，励起光を消しへ低下
Fmʼへ，完全に酸化しているときは，F から F ʼ

た後の qN の低下（Fmʼの上昇）の時間経過を観察すれする．また，Fm と F の差である Fv は Fvʼへと低下すば区別することができることになる．励起光を消したある．そこで，ある励起光照射によって，どれだけ蛍光収とも飽和パルス光を当て続け，その飽和パルス光による率が低下するかを qN という以下のようなパラメーター

蛍光の変化を観察していき，それぞれの時点の Fmʼ
の大を使って表す．

きさから図 11のように a，b，c などを求めると，Quick−F ʼ/ Fm−F ＝1−Fvʼ
/Fv (2)qN＝1− Fmʼ
この qN は非光化学消光の指標となる．消光（quenching）とは蛍光収率が減少することで，この計算式では，

and Stitt の計算式では，
q ＝1−a/cq ＝1−c/dq ＝1−d/e

(3)
(4)
(5)

熱になる反応が大きいときに消光のパラメーターが大きとして，蛍光消光のうち早く減衰する成分 f，中間の成分

くなるように，１から引き算をしている．
暗所では，
＝
Fvʼ

m，遅い成分 s を分けることができる．これらの数値は，Fv なので qN は０になる（高等植物の場合，シアノバク

図 10：非光化学消光の概念図514

図 11：非光化学消光の解析例

パルス変調による光合成測定

qN＝1−a/e

(6)

1−q )

の方がよいだろう．また，NPQ は，F から Fʼ
への蛍光の消光に関する Stern-Volmer の関係

であることを考えると，全体の非光化学消光 qN と
1−qN＝ 1−q 1−q

光領域も含めた広い領域の変化を捉えたいときは NPQ＝1−kτQ
F/Fʼ

(7)

(9)

という関係で結びつけられる．つまり各成分の積で全体が Fm において成り立つとした時の kτQ に相当するが表されることになる．そしてこれらの成分は，阻害剤

ので，消光物質の濃度 Q と比例関係にあると考えられを使った実験などに基づき，それぞれプロトン濃度勾配る（k は消光の速度定数，τは蛍光寿命）．そのため，非による項 qE，ステート遷移による項 qT，光阻害による

光化学消光の原因となるキサントフィルの脱エポキシ化

項 qI に相当すると解釈される．

の程度や，非光化学消光を起こす物質の濃度，非光化学

さて，これだけだと簡単そうで，実際にあまり考慮を

消光の反応速度などとの相関は NPQ の方が高いとされ払うことなくこの方法を適用している論文も見られる

る．キサントフィルサイクルや非光化学消光との定量的が，実際には，３つの成分がきちんと分かれる条件は，な関連づけを行いたいときは NPQ の方が適切である．

植物によっても異なることが報告されている．考えるべ

3.a.3.2 qP と qL，qき条件としては，飽和パルス光の間隔と強さがある．飽

次に，光化学消光の定量化を考える．光化学消光にお和パルス光の間隔については，オオムギの葉では 100秒

いては，Q の還元に伴って蛍光収率が増大すると考える

以上の間隔をあければ，非光化学消光の緩和が妨害され（図 12）．ある一定の励起光があたっているときは，非光ないと報告されている．
飽和パルス光の強さについては，

化学消光によって蛍光の収率は変化し，Q が完全に酸化

非光化学消光が強く誘導されている条件では，光捕集効もしくは完全に還元されている時の蛍光強度は，それぞ率が当然低下しているので，より強い光が飽和に必要とれF ʼおよび Fmʼになる．励起光のもとでの定常状態になる．オオムギの葉の場合は，励起光を切って５秒後のなったときの蛍光 Fs を考えた場合，その時の Q の酸化時点では，3,400μmol/m /s の光でもまだ飽和しないと還元状態に応じて Fs は F ʼと Fmʼの間の値を取るはずいう報告がある．励起光を切って 30秒以上すれば 2,100である．そこで，F ʼと Fmʼの差を１として Fs を標準化

μmol/m /s の光で飽和するとのことなので，30秒以後した値を qP とするとのデータだけを用いれば問題ないと思われる．

−Fs / Fmʼ−F ʼ
qP＝ FmʼqN のかわりに NPQ というパラメーターを非光化学消光の指標として用いる場合もある．qN は，その計算式(10)となる．Q が完全に還元されたときは Fs＝Fmʼとなるの中に，F ʼを含むために，きちんと計算しようとするとので qP は０に，完全に酸化されたときは Fs＝F ʼとな

励起光を一旦消して測定を行なう必要があり，連続的なるので qP は１となる．つまり，qP は，Q の酸化還元状測定ができない．そこで，態に応じて０から１の値を取ることになる．

NPQ＝ Fm−Fmʼ/Fmʼ(8)

このパラメータは，当初，蛍光強度が Q の酸化還元状態を反映するという経験的な事実に基づいて考案されたというパラメーターが考案された．これならば，最初にが，光化学系

が複合体間でエネルギー移動を行なわな

暗所で Fm を測っておけば，あとは，連続的に Fmʼを測いというモデル（puddle model）を前提にした場合には，定していくだけで，パラメーターを計算できる．また，
このパラメーターは，どれだけ Fm が励起光によって消光されて Fmʼ
になったかを，相対的に示すものなので，直感的にも理解しやすい．このパラメーターは，分母がになっているので，１以上の値を取る
Fm ではなく Fmʼ
こともある．qN も NPQ も厳密な理論的バックグラウ
ンドがあるものではなく，経験的なものである．従って，実用的に使いやすい方を使えばよいと考えて構わない．
一般に，弱光領域では qN の方が大きく変化するので，弱光領域での非光化学消光の変化を敏感に捉えたいときは
qN がよい．一方，qN は強光領域では飽和するので，強2009 低 温 科 学

vol.67

図 12：光化学消光の概念図515理論的に上式を導き出せることが示されている．しかしながら，実際の光化学系においては，複合体間のエネ

ルギー移動が認められる．光化学系がアンテナを全て

今度は光合成の収率 Φ の最大値 Φを考えると

Φ ＝k / k ＋k ＋k ＋k(14)

共有しているとするモデル（lake model）をもとに考案となる．さて，Fm，F あるいは Fv はある時点での蛍光されたパラメーターqL はの強さを示すが，比のかたちであれば蛍光の収率に置き/Fs Fmʼ−Fs / Fmʼ−F ʼ
qL＝ F ʼ＝Fʼ/Fs qP(11)となり ，qP と qL の間には直線関係はない．lake モデ

換えることもできるので，
Fv/Fm＝ Fm−F /Fm＝ Φ −Φ

/Φ

(15)

ルと puddle モデルの中間の状態をモデル化した con-

ここに，先ほどの式を k の値（０または k ）を考えな

nected unit モデルでは，光化学系

がら代入するとの複合体間にある一定の確率でエネルギー移動が起こると仮定する．そこから導き出されるパラメーターq

は，エネルギー移動の−Fs / Fs−F ʼ p/ 1−p
q ＝ Fmʼ
＋Fmʼ
−F ʼ
はq

(16)

分子と分母に k ＋k ＋k /k をかけ算すると確率を p とした時にとして表すことができる

Fv/Fm＝ k / k ＋k ＋k −k / k ＋k
＋k ＋k / k / k ＋k ＋k(12)．当然のことながら，p＝0では qP に一致する．陸上植物では p＝0.6程度であるとの報告があり，その場合，qは qP よりは qL に近Fv/Fm＝1− k ＋k ＋k / k ＋k ＋k ＋k(17)

これを変形すると
Fv/Fm＝k / k ＋k ＋k ＋k(18)となるが，これは結局先ほどの式の右辺が同じなので

い値を示す．
従って，一般的にもっともよく使用される光化学消光のパラメーターである qP は，Q の酸化還元状態との直Fv/Fm＝Φ

(19)

線性という観点からすると，必ずしも適切ではないと考が導け，Fv/Fm が光合成の最大収率を示すことになる．

えることができる．ただし，多くのクロロフィル蛍光測

この式の前提では 2.2で説明した lake モデルが使われ定においては，Q の酸化還元状態との直線性よりも過去ているが，この場合は puddle モデルを用いても全く同の文献の値との比較の方が重要である場合が多く，そのじ結果になる．
この Fv/Fm は暗順応した葉に飽和パルス光をあてる

意味では過去の蓄積の多い qP の有用性は高い．

だけで求まる（図 13）ので測定が極めて簡便であり，広3.a.3.3 Fv/Fm と Fvʼ/Fmʼ
次にもっとも有名なパラメータといってもよい Fv/

く使われている．高等植物では，最適条件で 0.8‑0.83のFm を考える．このパラメーターは，Kitajima and But-

値が得られ，測定の再現性も高い．酸素発生の量子収率

ler によって最初に提出されたもので ，極めて簡単な前（１光子あたり何分子の酸素が発生するか）は最適条件

提から導出することができる．
吸収した光エネルギーが，で，0.106という報告がある．８光子で１分子の酸素が発１）蛍光になる，２）光合成に使われる，３）熱になる，生し得ることを考えると理論上の収率は 0.125になるは

４）それ以外の方法で消光される，という４つの運命のずであり，ここから予想される光合成の量 子 収 率 はどれかをたどると考え，それらの反応が k ，k ，k ，kという反応速度定数を持って競争しているとする．その場合，蛍光の収率は
Φ ＝k / k ＋k ＋k ＋k(13)となる．つまり，どれだけが蛍光になるかは全体の反応速度の中で，蛍光の反応速度がどれだけ速いかによって決まると考える．ここで，蛍光の収率と光合成の収率の関係を他の条件（k ，k ）が変化しないとして考えた場
合，光合成が働かない時（k ＝0）に蛍光の収率 Φ は最大値 Φを取るはずである．一方，光合成速度が最大の時（k ＝k ），蛍光の収率は最小値 Φ を取る．ここで，516

図 13：Fv/Fm の測定例
パルス変調による光合成測定

0.106/0.125＝0.85となって Fv/Fm の実測値とほぼ一と変形できるので，ある時点における蛍光 Fs とその時致する．

点で飽和パルス光をあてた時の蛍光 Fmʼの２つの値が3.a.1.5で述べたように，クロロフィル蛍光の収率変あれば求まる．このように，極めて簡便に測定できるパにおいて起こり，F から Fm への変化がラメーターでありながら，この値は実際に別の方法で求Q の還元に伴って誘導されることを考えると，この Fv/

めた電子伝達の量子収率と非常によい相関があることがFm というパラメータは光化学系確かめられている ．

化は光化学系

における P 680とQ の間の電荷分離の量子収率を反映する．従って，Q か

ここで，１つ注意しなくてはならないのは，この Φ はら Q への電子伝達が何らかの要因（例えば DCM U の添

光化学系

を通る電子伝達の量子収率ではあるとはい加など）で阻害された場合でも，理想的な条件下では Fv/

え，その値が光化学系以外の要因によっても左右され

Fm は変化しないはずである．しかし，実際には，Q かることである．Φ のうち Fvʼ/Fmʼ
の部分は光化学系

ら Q への電子伝達が阻害された条件では，微弱な光にの状態によって決定するが，qP は，シトクロム b /f 複合

よっても Q の還元型の蓄積が起こるため，測定光パル体であれ，光化学系

スによる F の上昇が見られ，結果的に見かけ上の Fv/

学系

Fm の低下が見られる．同様に，マンガンクラスターから場合は小さくなり，結果として Φ も小さくなる．従っZ までの酸素発生系が阻害された場合にも，飽和パルスて，何らかの条件または処理で，電子伝達の量子収率 Φ

光をあてている間の電子伝達が不十分になることからが減少していた場合，その原因が qP にあるのか，Fvʼ
/Q の還元が不十分になって Fm が低下し，結果として

Fmʼにあるのかを分けて考えてみれば，原因が光化学系

見かけ上 Fv/Fm が低下する．従って，Fv/Fm は光化学系のさまざまな収率低下を反映することになり，ストレス応答研究などにおいて光化学系の機能低下の指標であれ，炭酸固定系であれ，光化の下流に存在するコンポーネントが機能を失ったの下流にあるのか，光化学系自体にあるのかを見極めることができる．Fvʼ
/Fmʼが低下していた場合に Fv/
Fm が低下していれば，光化学系の最大量子収率自体が低下していることになり，そうでなければ，励起光をとして広く使われている．
Fv/Fm は暗所において Q が完全に酸化している条つけたときに光化学系の量子収率を低下させる何らか

件での量子収率であるが，光が当たっている状態では，のメカニズムが働いていることになる．後者であれば，

Q が部分的に還元され，同時に非光化学消光も誘導され熱になる反応の量子収率が高くなる場合が多いので，通る．そのような条件での Q が酸化されている（open な）

常，qN（NPQ）の上昇が観察される．このようにして，

光化学系

光合成の低下の原因を切り分けることが可能である．

の量子収率を Fvʼ
/Fmʼとして考えることができる．Fv/Fm が理論的に導出しうるものであるのになお，この Φ に関しては，光化学系のエネルギー移対して，Fvʼ
/Fmʼは半ば経験的なパラメーターであると動モデルから導出可能であり，しかも，lake モデルでも考えた方がよい．それでも，Fvʼ
/Fmʼの振る舞いは qP と

puddle モデルでも同じ結果を与える．このことは，qP が組み合わせることにより，次に述べるように極めて効果/
puddle モデルからのみ示されることを考えると，Fvʼ

的に光合成の電子伝達の量子収率を記述することができが qP と同様モデル依存的であることを示す．従っFmʼ

る．

て，Q の酸化還元状態（光化学消光）の指標として qL を

3.a.3.4 Φ と ETR用いる場合は，Fvʼ/Fmʼ
の代わりに Fs/F ʼ Fvʼ
/Fmʼを

前述のように，ある一定の光が当たっている状態での，考える必要がある．

の量子収率がさて，Φ は電子伝達の量子収率なので，これに吸収さ/Fmʼであるが，同じ条件で，Q が還元された（closeFvʼ

れた光量子数をかければ，電子伝達の速度（ETR と略称）な）系

においては光化学反応は進行しないので，そのが求まるはずである．あたっている光量子数はすぐに測

量子収率は０として考えることができる．この場合，Q定でるが，吸収された光量子数の実測は簡単でないため，が酸化された光化学系

Q が酸化された状態の（open な）系

を

蛍光測定機器についているプログラムでは，照射光量子

通る電子伝達の実効量子収率は，qP と Fvʼ
/Fmʼ
の積と

数に葉の吸収係数として 0.84をかけて吸収された光量なるはずである．このパラメーターを Φ（Φもしくは子数としている場合が多い．実際の葉の吸収係数は植物と呼ぶ．この Φ は，
Yield と表記されている場合もある）

種によっても葉によっても異なるので，このようにして/Fmʼ
Φ ＝qP Fvʼ＝ Fmʼ−Fs / Fmʼ
−Foʼ Fvʼ
/Fmʼ
＝ Fmʼ
−Fs /Fmʼ

求められる ETR は便宜的なものであることに注意しな2009 低 温 科 学

vol.67の割合を qP とすれば，系(20)

ければならない．さらに，光化学系は光化学系
学系と光化が直列に電子伝達を行なうので，吸収された光の517

に分配されるかによって電子ルサイクルなどによって安全に消去されることもなかっ

伝達速度の見積は異なることになる．一般的に，反応中た「過剰な」エネルギーとして Excess と呼ぶ ．実際に心あたりのアンテナクロロフィルの数は，高等植物におD の大きさは光阻害の速度とよい相関を持つことがいては光化学系，系

Kato らによって報告されている ．

系

はほぼ 1：1に光を吸収すると考え，うちどれだけが光化学系と光化学系

ともに 200程度なので，光化学

ETR＝Φ PAR 0.84 0.5(21)

一方，光阻害は光化学反応の結果生じるものであり，「過剰な」エネルギーによって説明されるべきではないとする考え方もある．その場合，吸収されたエネルギーは，として計算している例が多い．ここで PAR というのは

1) 光化学反応に使われる割合 Φ ，2) 光によって誘導光合成有効放射 Photosynthetically active radiation のされる熱放散系によって熱になる割合 Φ，3) 熱また

略で，クロロフィルが吸収できる範囲の波長の面積時間は蛍光になる定常的な割合 Φ ，のどこかへ使われるこあたりの光量子数である（単位は mol m s ）．

とになる．これを lake モデルから導くと，

このようにして計算した ETR は，必ずしも炭酸固定
速度の実測値と一致しない．これは，上記の前提（葉の吸収係数や光化学系間のエネルギー分配比）が正確では

Φ＝Fs/Fmʼ−Fs/FmΦ ＝Fs/Fm

(23)
(24)

ないことにも由来するが，電子伝達によって作られた還となり，これらに Φ ＝1−Fs/Fmʼ
を足した合計は１と元力のうちに炭酸固定に使われない部分があることも大なる ．ほぼ同じ意味を持つパラメーター Φ

きな要因となる．この点については，本書の光合成とクがもう少し複雑な形式で定義されている ．

とΦ

ロロフィル蛍光の同時測定の項で述べられている．
なお，ETR の推定は，照射光量子密度が高い領域では収率 Φ が小さくなるため誤差を多く含むようになる．
一方で，照射光量子密度の測定自体は比較的小さい値でも誤差が少ないので，一般的に ETR の相対的な誤差は3.a.4 パルス変調クロロフィル蛍光の測定条
件
3.a.4.1 測定光の設定

照射光量子密度が低い領域でも比較的小さい．これは，パルス変調における測定光は，通常１マイクロ秒程度

ガス交換による光合成速度の見積などの場合と逆であるの長さのパルス光である．Waltz の PAM システムでので注意が必要である．

は，650nm 付近に発光極大がある LED が測定光に使わ3.a.3.5 その他のパラメーター

れ，周波数，強度を最大に設定したときの平均光量子密上記の一般的なパラメーターの他に，吸収した光エネ

度は 10μmol m s 程度である．パルス変調による蛍光

ルギーの行方という観点からいくつかのパラメーターが測定の眼目の１つは，測定光による光合成の励起がほと提案されている．そのうちの一つ，Excess というパラ

んどなくすことができる点であるが，設定がいい加減なメーターの考え方においては，吸収したエネルギーを，場合，これが実現しない場合がある．光合成系が励起さ反応中心に伝えられる前に LHCII 内でキサントフィル

れているかどうかは，測定パルス光を on にしたのちに，サイクルなどで消去される部分と，反応中心に伝えられ蛍光強度が変化していないかどうかでチェックできる．

る部分に分け，この割合は，反応中心が close であるか

測定パルス光はきわめて短い時間（Walz の PAM シス

open であるかによらないとする．つまり，open な反応中テムの場合 100μ秒以下）で安定するので，もし，スイッ

心では反応中心にエネルギーが伝わる収率が Fvʼ
/Fmʼ

チを入れたあとに蛍光強度の増加が見られたら，測定パであるが，これが close な反応中心でも成り立つとする．

ルス光による励起効果と考えられる．測定パルス光の強逆に言うと，1−Fvʼ
/Fmʼが LHCII 内で安全に消去され度を高く設定せざるをない場合は，測定の直前まで測定たエネルギーとなる．残った Fvʼ/Fmʼ
が反応中心へと伝パルスを off にしておくとよい．

えられ，このうち反応中心が open なものでは，電子伝達

測定パルス光の強さは，1) パルスの持続時間，2) パにエネルギーが使われるので，電子伝達の収率は前項でルスの強さ，3) パルスの周波数，という３つのパラメー述べたように qP Fvʼ
/Fmʼになる．一方，残りの close

ターのかけ算で決まる．このうち，パルスの持続時間はな反応中心にいったエネルギーを通常変えられない．また，パルスの周波数も，通常固定

D＝ 1−qP

/Fmʼ
Fvʼ

(22)

と定義し，光化学反応にも使われず，かつキサントフィ
518

か，２種類の切り替えであり，連続的には変えられない．
従って，実質上は，測定パルスの強さを変化させて，励起効果のない最大限の強さで測定すればよいことにな
パルス変調による光合成測定

することができる．ちなみに，Waltz の PAM システム

る．
測定パルスの周波数が切り替えられる場合は，測定パ

では，測定光の平均光量子密度の 100万倍までの非変調

ルスの周波数が高いと励起効果も高くなるので，通常，光は，変調作用によりシステムに影響を与えないとされ低い周波数で測定を開始し，連続励起光の照射開始時，ている．

もしくは，励起用フラッシュ光の照射の直前に，高い周連続光源を使う代わりに，閃光を飽和パルス光として波数に上げることになる．Waltz の PAM ではこの切り使う場合もある．閃光の場合，持続時間は 50ms 程度必

替えを Auto 100kHz モードという方法で行なう．この要となる．この場合，持続時間が短いので，充分光が飽場合，トリガーによって飽和パルス光照射の 3ms 前に和しているかどうかを確認する必要がある．また 50ms

周波数を自動的に切り替えることができる．周波数が高という短い持続時間では，記録計のペンの速度が追いつければより大きなシグナルが得られ，従って信号ノイズ

かない場合がほとんどなので，Waltz のマルチプルター

比（S/N 比）を減らすことができる．また，1kHz の周ンオーバーフラッシュについているようなデータ保持機

波数で測定すれば，測定間隔は１秒に 1000回なので 1

能を通して記録計に出力するか，オシロスコープやパソ

ms より速い変化は検出できないが，100kHz の周波数

コンへデータを取り込んで処理する必要がある．なお，で測定すれば 10μs の変化まで捉えることができる．Q

高等植物とは異なって，シアノバクテリアや藻類では，の酸化還元のような速い時間スケールの測定を行う場合

非光化学消光による蛍光強度の減少が非常に速い時間ス

は，高い周波数での測定が必須となる．ただし，Q の再ケールで起こる（3.a.5参照）．この場合も，正確な Fm

酸化速度の測定の時のように単発の飽和パルス光の直前の測定のためには，データ保持機能やオシロスコープ，に高い周波数に切り替える場合は，パルスのあと，励起

パソコンの使用が必要となる．また，Waltz のマルチプ

光がない状態で高い周波数での測定を続けると，蛍光強ルターンオーバーフラッシュには初期設定で青色フィル

度変化の遅い成分が強調された形になる可能性があるこ

ターが入っており，これは陸上植物においては問題ないとを頭に置いておく必要がある．このような場合は，タが，紅藻やシアノバクテリアにおいてはフィコビリンをイマーを使って 10ms 程度でもとの周波数に戻すのが励起しないために飽和光として十分に働かない場合があ

よい．

る．その場合は，フィルターを取り外す必要があるが，3.a.4.2 飽和パルス光の設定

その状態で陸上植物の葉の測定を行なうと強すぎる励起

飽和パルス光は Q を完全還元するのに充分なだけ強くなくてはならない一方，光合成系への一般的な影響を

光による副作用が出る場合があるので注意を要する．
3.a.4.3 励起光の設定

最小限にするため必要以上に強くてはならない．飽和パ

励起光をどれだけの強さにするのかは，実験の目的に

ルス光の影響の大きさも，パルスの持続時間と強度のかよって異なる．一番よいのは，励起光の強さをふって，け算で決まる．一般的に，高等植物の葉では，連続光源

励起光強度依存性をきちんと測定することである．シアからの 800ms 程度の持続時間に設定したパルスが使わ

ノバクテリアにおける qN の励起光強度依存性のようれる．Waltz の PAM システムで使われる連続励起光光に，それによって新しい情報が得られる場合もある（3.

源 FL103 は Schott の KL1500 という光源を改造したも

a.5.3参照）．もし，１つの励起光強度に決める必要があので，スイッチをオンにした直後の過電流を避けるため，る場合には，測定する植物または細胞を栽培・培養して最初の 300ms は光が照射されず，さらに最大の光強度

いた光強度で行うのがもっとも一般的である．いずれにに達するまでに 200ms かかる．従って，持続時間を 800

せよ，Fv/Fm 以外の全ての蛍光のパラメーターは励起

ms に設定した場合，実際に所定の光強度があたってい光の強度に依存して変化するので，実験条件としてきちる時間は，800−300−200＝300で 300ms ということにんと論文に明記することが必要である．

なる．パルス強度は，実際に何段階か変えてみて，一番

3.a.4.4 その他の設定項目

感度，応答速度高い Fm を与える強度を選ぶのがよい．変調がうまく働

感度（ゲイン）は，信号の増幅度であり，これが高けいているときは，原理的には飽和パルス光自体は測定装

ればシグナルは大きくなるが，ノイズも大きくなる．従っ

置に影響を与えないが，飽和パルス光があまりにも強いて，きちんとシグナルが見えている範囲内では低い方がと飽和パルスの反射光などが測定フォトダイオードに入よいと言える．シグナルの大きさは，前述のように測定ることによる影響を充分に除けなくなる．その場合は，パルスの強度にも依存するので，もしノイズが非常に大光源に 700nm 以 下 の 光 だ け を 通 す short-pass フィル

きく，かつ，F の正確な決定が目的でない場合（例えばターを入れることにより，測定フォトダイオードを保護Φ の情報だけ必要な場合など）は，感度を上げる代わり

2009 低 温 科 学

vol.67519

に測定パルスの強度を上げるという方法もある．いずれ

よって隔てられていない．特に，電子伝達系においてはにせよ，感度と測定パルスの強度の組み合わせで考える

プラストキノンプールからシトクロム b /f 複合体を経必要がある．

てシトクロム c までを光合成と呼吸系で共有している応答速度（レスポンス，ダンピング）は，測定回路が，ため，光合成系の電子伝達鎖の酸化還元状態は呼吸系のどれだけ速い変動にまで追随するかを決める．応答速度影響を直接受ける．暗所で呼吸系が動いているシアノバ

が速ければ（ダンピングが小さければ），速い変化もきち

クテリアでは，定常状態においてはプラストキノンプーんと捉えることができるが，信号の平均化効果が期待でルはかなり還元された状態にあり，これは，NDH 複合体

きないのでノイズは大きくなる．Q の酸化還元のようなの活性が末端酸化酵素の活性よりも高いとして解釈でき

速い反応を測定する場合は，応答速度（レスポンス）をる．真核藻類においては，光合成系は葉緑体に存在し，最大にする（ダンピングを最小にする）必要がある．連ミトコンドリアの呼吸系とは局在が異なるが，おそらく

続励起光による速い蛍光誘導期現象の測定では 1ms 程は葉緑体呼吸の存在により，シアノバクテリアの場合と度の応答速度，秒単位の変化だけを測るのだったら，同様，暗所ではプラストキノンプールが還元状態に保た

0.1s 程度の応答速度で充分である．ただし，DCM U 添加

れる．筆者の経験では，少なくとも緑藻，紅藻，そして時の蛍光の立ち上がりの測定などには 10μs 程度の応答

サンゴの共生藻である渦鞭毛藻などで，陸上植物とは異速度が必要となる．基本的に，測定したい変化のうち，なり，シアノバクテリアと同様の，呼吸系の光合成系へ

最も速い変化の速度定数より，少し速い応答速度を選ぶの影響を考慮に入れた解析が必要である．

ことになる．F の測定だけであれば，基本的に測定値が3.a.5.2 ステート遷移と qN変化しないので，一番遅い応答速度にしても構わない．

藻類またはシアノバクテリアの細胞でクロロフィル蛍

DCM U の存在下で Q から Q への電子伝達が阻害され光測定を行うと，暗所で飽和パルスを当てても，そもそている場合や，低温での測定では，Q の再酸化速度が遅も蛍光の最大値が得られない（図 14）．その後に励起光をくなるので，測定光の励起効果を最低限にしないと正確当てたときの方がむしろ蛍光強度が高くなる．従って，に F が測定できない．そこで測定光強度を下げるとどこのまま強引に qN などを計算しようとすると，負の値うしてもノイズが大きくなるが，そのような場合，応答になるなど意味をなさない．これは，上述のように暗所

速度を一番遅くすることにより，ノイズを抑えることがでも藻類やシアノバクテリアではプラストキノンプール

できる．

が還元されているために qN が大きい（蛍光が小さい）ここのほか，測定系にファイバーオプティクスを使ったとによる ．この点が，暗所ではプラストキノンプールが系では，光源や測定フォトダイオードと，ファイバーオ

酸化されて qN が０になる陸上植物とは全く異なる．しプティクスの先端の距離を変えることにより，測定光・かも藻類やシアノバクテリアの qN は，陸上植物のよう

励起光の強度やシグナルの出力を微調整することができにプロトン濃度勾配による部分の寄与が大きくない．プる．これは，出力を微調整できないタイプの光源を使っロトン濃度勾配を反映する ATP/ADP 比は，シアノバているときに便利なテクニックである．また，分岐型のクテリアの場合はまったく qN と相関を示さない．紅藻

ファイバーオプティクスを使って測定光と励起光を照射やシアノバクテリアの場合は，フィコビリソームから光している場合，一本一本のファイバーは別々の光源につながっていることを認識する必要がある．ファイバーオ
プティクスを測定対象の葉に密着させた場合は，励起光があたる葉の部分と蛍光を観察する部分は厳密には一致しない．測定面積が小さい場合は，この影響を無視できないので，葉とファイバーオプティクスの先端の間に最低 5mm 程度の𨻶間を空ける必要がある．

3.a.5 藻類とシアノバクテリアにおける測定
3.a.5.1 藻類とシアノバクテリアの呼吸と光合成
シアノバクテリアは原核生物であり，陸上植物のように細胞内小器官を持たず，呼吸系と光合成系は膜系に520

図 14：シアノバクテリアにおけるパルス変調蛍光測定例

パルス変調による光合成測定

化学系

へのエネルギー分配（ステート遷移）にともな

う蛍光の消光が，qN のかなりの部分を占めるとされている．
3.a.1.3でも述べたように，フィコビリソームから光化学系へのエネルギー分配は DCM U を添加したときには完全に抑えられ（ステート１），系からの蛍光が相対的に一番大きくなり，qN は０となる．従って，DCMUを添加した後にはじめて蛍光の最大値 Fm が得られることになる．通常の条件ではフィコビリソームから光化
学系へのエネルギー移動が大きいため，光化学系の蛍光は消光され，その結果，qN は大きい値をとる．一方の光化学系がもう一方の光化学系より励起される条件下においても，プラストキノンプールは，酸化状態，もしくは還元状態に片寄る．光化学系が選択的に励起されるような光が照射された場合はプラストキノンプールは酸化され（ステート１），逆に光化学系

が選択的に酸化図 15：シアノバクテリアにおける非光化学消光の測定光強度依存性

されるような光が照射された場合はプラストキノンプー
ルは還元される（ステート２）．ステートの状態は，主にプラストキノンプールがどの程度還元されているかに

トキノンの酸化が電子伝達の律速段階となるため，プラよって調節されると考えられる．ただし，プラストキノ

ストキノンの還元が起こり，qN は再び上昇する．このよンの酸化還元を表すはずの qP とステート遷移の指標と

うに，qN は測定時の励起光強度に対して下に凸の曲線

なる qN の間には必ずしも相関がなく，この理由はまだを取るが，qN が最小値となる光強度を，そのシアノバク

解明されていない．フィコビリソームを持たない緑藻なテリアの生育光強度に対してプロットすると，非常によどにおいても，陸上植物に比較してステート遷移がクロい相関が見られる ．つまり，シアノバクテリアでは，生ロフィル蛍光に非常に大きな影響を与えるという点では育環境の光強度においてもっとも qN を小さくしてお紅藻やシアノバクテリアと同様である．

り，言い換えるとエネルギーを無駄に熱に変える割合を藻類やシアノバクテリアの場合，もう一点，測定上のもっとも小さくしていることになる．したがって，逆に，問題となるのは，非光化学消光の誘導が極めて速いことあるシアノバクテリアの qN の励起光強度依存性を測定である．陸上植物の場合，前に述べたように 0.8s 程度のし，その最小値を与える光強度を求めれば，そのシアノ飽和パルス光の照射によって Fm ないしは Fmʼ
を得る

バクテリアが順化している光強度が求まることになる．

ことができるが，藻類やシアノバクテリアの場合は，こ野外において，あるシアノバクテリアがどのような光環の 0.8s の間にも非光化学消光がおこり，蛍光が減少し境の中で生育しているかを推定することは通常困難が伴てしまう ．従って，レコーダーなどのレスポンスの遅いうが，このような方法を使えば，それを見積もることが記録機器で測定をしていると，蛍光を過小評価すること可能になる．この方法はシアノバクテリア以外の藻類にになる．このため，電気信号としてそのままパソコンへも適用できると考えられる．

取り込む，データ保持回路を使用する，オシロスコープ

3.a.5.4 オレンジカロテノイドタンパク質
従来，シアノバクテリアの非光化学消光は，ステートを使う，などの対策が必須となる．

遷移で全てが説明されるとされていたが，近年，多くの3.a.5.3 光環境測定への応用
シアノバクテリアにおいては qN の励起光強度依存性

シアノバクテリアにおいてオレンジカロテノイドタンパ

は，興味深い性質を持つ．qN は，暗所では呼吸によるプク質が蛍光の消光に寄与することが明らかとなった．オ

ラストキノンプールの還元のため，高い値となるが，励

レンジカロテノイドタンパク質はカロテノイドを結合し起光を徐々に強くしていくと光合成の光化学系

た水溶性のタンパク質で，フィコビリゾームを持つ生物と系が動き始め，そのバランスがとれる光強度までプラストに広く保存されている．シアノバクテリアの細胞の Fmʼ

キノンが酸化され，qN は低下する（図 15）．さらに励起を連続的に測定している場合，暗所から弱光励起条件に光を強くしていくと，シトクロム b /f 複合体でのプラス細胞を移すと，ステート２からステート１への移行に2009 低 温 科 学

vol.67521

伴って，Fmʼの増大が見られる．ここで，励起光を弱光

光した光強度を反映する．ところが，分光セルに入れたから，クロロフィルのみを励起する（フィコビリソーム

試料と違って，葉では，光がどこを通ったかについてはを励起しない）青緑色光の強い光に切り替えた場合，シ

全くわからない．例えば，上記の反射型では葉をいった

アノバクテリアではクロロフィルの９割近くは光化学系

ん通り抜けた光が受光部に戻るので光路はかなり長くなに結合しているため，細胞はステート１に保たれるはるが，内部反射型では，主に葉の細胞間𨻶で反射されたずである．にもかかわらず，青緑色の強い光への励起光光が戻るため光路は比較的短くなる．従って，吸収の絶の切り替えに伴い，Fmʼの減少が観察され，しかもこの対測定は不可能である．情報が得られるのは，吸収の変減少はオレンジカロテノイドタンパク質の変異体では消化についてのみである．また光路長に影響を与える組織失する ．従って，シアノバクテリアにおいては，ステー構造の変化が無視できる場合にのみ測定結果は意味を持ト遷移の他に，オレンジカロテノイドタンパク質によるつことに注意する必要がある．

エネルギー放散系が働いていると考えられる．このオレ

3.a.6.2 P 700の測定

ンジカロテノイドタンパク質による熱放散系は，過剰なP 700は光化学系の反応中心クロロフィルで，酸化光による光阻害からの保護などに働いていると考えられされると，700nm 付近に吸収減少を，750‑850nm 付近にるが，その詳細な機構についてはまだわかっていない．

クロロフィルカチオンの生成に伴うブロードな吸収増加を示す．800nm 付近ではクロロフィルの吸収はほとんど

3.a.6 パルス変調の吸収測定への応用
3.a.6.1 吸収測定の原理

ないこと，酸化還元による吸収変化が知りたい情報であること，の２点から，P 700の測定は，パルス変調による測定に非常に適している ．実際の測定は，700nm 付近

上記のパルス変調による蛍光測定では，当てる光の波の近赤外光を照射したことによる 820nm の吸収変化を長とシグナルとして受け取る光の波長をずらすことに測定して P 700の相対量を見積もる．クロロフィルの吸よって蛍光を測定しているが，当てる光の波長と受け取収はこの測定光の波長領域では小さいため，蛍光測定のる光の波長を同じにすれば，その波長での吸収・反射・場合と異なり，測定パルスの強度や周波数は低く抑える

散乱などを測定することができる．通常の吸収測定とは必要はない．

違って，パルス変調によりノイズが軽減されるので，葉

光化学系が吸収する近赤外光の照射によって P 700

による吸収の少ない赤外領域の光を使えば，生葉での吸が酸化されると 820nm 付近の吸収は増加するので，受収変化の測定が可能となる．一般の吸収測定でのように光部に入る光量は減少する．この光量の変化を吸収変化

発光部と受光部の間に試料を入れて吸収を測定することに換算するには以下のようにする．

も可能であるが（透過型，図 16a），葉の場合は，海綿状

まず，試料に入る前の光量を Io，試料を通過したあと組織などで光が散乱されるので，その散乱光をグラスの光量を I，試料が吸収変化を起こしたあとの光量を I＋ファイバーを経て受光することにより，発光部と受光部

ΔI とする．ある関数 y＝f x において，yの小さな変化

を葉の同じ側においた状態でも，吸収を測定することがΔyは，x の小さな変化 Δx と f x の微分値（つまり，関できる（内部反射型，図 16b）
．また，葉の内部での光の数の傾き）である fʼx を用いて，散乱が少ない場合には，葉の反対側に光の反射板をおいΔy＝Δx fʼxて測定することもできる（反射型，図 16c）．

(25)通常の分光器とは違って，パルス変調を利用した吸収と表すことができる．ただし，この式が成り立つのは，

測定では，受光部で受け取った光の量がそのまま信号と

Δx もしくは Δyが充分小さいときである．次に，吸収 A

して取り出される．つまりシグナルは吸収ではなく，受は透過率 T を用いて
A＝−log T(26)

なので，小さな吸収変化 ΔA は，log x の導関数がlog(e)/xであることと上の式を考え合わせるとΔA = ー0.434ΔT/(1/T)(27)となる．吸光度 T は I/Io なので，これを上の式に代入す
図 16：パルス変調による吸収測定の方法

522

ると
パルス変調による光合成測定

ΔA=ー0.434(ΔI/Io)/(I/Io)=ー0.434ΔI/I (28)

元型で残る．
この解釈として，系の電子受容体が励起光によってとなる．つまり P-700の酸化に伴う光量の変化量を，吸一部還元されているためにその一部では電荷分離が起こ

収変化を起こす前の光量で割れば，吸収変化量になるこらず（もしくは電荷分離が起こっても電荷再結合（逆反とがわかる．ΔI そのままでは吸収変化（ΔA）ではないこ

応）が速く）P 700を完全に酸化することができない，とと，ΔI から ΔA への換算は ΔI が Io に比べて充分小さの考え方がある ．このような考え方にたてば，図の a といときにのみ成り立つことに注意する必要がある．

b の差の部分は，
P 700は還元型であっても電荷分離は起3.a.6.3 系Ⅰの実効量子収率

こらないので，open な光化学系

光化学系のある光強度における実効量子収率（Φ )は，その光強度における反応中心が open である割合 qPの割合は b−c /a になり，これを Φ と定義する．
ただし，a と b の差の部分に関しては別の解釈も可能の量子収率 Fvʼ
/Fmʼを掛け合わせである．一般に，飽和パルス光源の光強度の立ち上がりることで求めることができる（3.a.3.4参照）．同様な実には時間がかかるため，飽和パルス光が本当の意味で飽

効量子収率は光化学系和光になるまでには一定の時間がかかる．飽和パルス光と open な光化学系についても定義できるはずである．反 応 中 心 が open な 割 合 は，P 700に 関 し て は，源は当然光化学系

P 700 / P 700 ＋ P 700 で表すことができる．open

学系

な光化学系

を完全に酸化することは難しくなる．このことは飽和連の量子収率を直接測定することはできないも励起するので，この時間内に光化からの電子が P 700まで到達してしまうと，P 700の量子収率は条件によって変化

続白色光を当てた場合には P 700が一部還元されることしないとされているので，もしそれが正しければ，実効からもわかる．赤外光を当てているときには，ほとんど量子収率は open な反応中心の割合に比例するはずであの P 700があらかじめ酸化されているので飽和パルス光る．このような考え方で，光化学系

源により P 700が完全酸化されるが，励起光照射時には，が，一般に，光化学系についてもその量

子収率 Φ を定義する場合がある．
実際に P 700による吸収変化を測定すると，図 17のよ

還 元 さ れ て い る P 700が 多 い た め，飽 和 パ ル ス 光 がP 700を完全に酸化する前に光化学系からの電子がうになる．暗所では P 700は還元状態と考えられる．ここP 700を還元してしまい，図の a と b の差の部分についに赤外光を当てると P 700のほとんどが酸化され，残っては P 700を酸化しきれない，という解釈も成り立つ．こたわずかな還元型の P 700も飽和パルス光（SP）を当ての場合は，単に技術的な問題のために図の a の部分を酸ることにより酸化される．従って，図の a が P 700の全化できないだけなので，open な光化学系

量を示すと考えることができる．完全酸化の直後に，一a−c /a となる．

過的な P 700の還元が見られるが，これは飽和パルス光の割合は実際には実験の条件によってもどちらの考え方が正しからの電子が P 700を還いかは異なるようである．特に飽和パルス光の特性が大元することによる．一方，一定強度の励起光（白色光）

きく影響を与える．もともと Φ を定義した論文では飽を当てた場合，P 700は酸化型と還元型がある値で平衡

和パルス光にメカニカルシャッターを組み合わせること状態になる（図の c）．ここで，飽和光を当てるとほとん

により光強度の立ち上がりを速くしているのでおそらくどの P 700が酸化される（図の b の部分）が，一部は還問題はないが，その後この方法を使った論文ではそのよ

によって駆動される光化学系

うな配慮をしていないケースも多く，技術的な問題が大きく効いている可能性がある．図の a と b の差の部分の解釈として，上記の２つのケースのうちどちらが正しいかを見分けるには，暗所で飽和パルス光を当てたときにP 700が全量酸化されるかどうかを見ればよいだろう．
電子受容体の還元が図の a の部分の原因であれば，暗所
では電子受容体は酸化されているはずなので P 700は全量酸化されるはずであるし，光化学系

からの電子が原因であれば，暗所ではもともと P 700がほとんど還元されているので，P 700は完全酸化されないはずである．いずれにせよ，このように定義された Φ は，実効量子収率
図 17：パルス変調による P 700の酸化還元の測定例
2009 低 温 科 学

vol.67そのものではなく，open な系の割合を示したものであ523

ることに注意する必要がある．

Plant. Mol. Biol. 42 (1991)P.313.
２) Govindjee, Aust. J.Plant Physiol. 22 (1995)P.131.
３) B.J.Strasser & R.J.Strasser, Photosynthesis: from

3.a.7 参考となる総説など

Light to Biosphere, vol.V, ed. P.Mathis, Dordrecht,
Kluwer, 1995, p.977.
４) K.Oxborough & N.R.Baker, Photosynth. Res. 54

最後に，クロロフィル蛍光の測定にあたって参考となる総説などを若干紹介しておく．
単行本としては，Papageorgiou と Govindjee の編集による〝Chlorophyll a Fluorescence: A Signature of（2004）
が詳しい ．また，Yunus,PathPhotosynthesis"re, M ohantyによる編集の〝Probing Photosynthesis"（2000）にも蛍光関係の総説が載っている ．その他，
Austrarian Jouranl of Plant Physiologyの 22号（1995）
は蛍光の特集号になっており，数多くの総説が掲載されていて参考になる．特に，この号の最初に載っている
Govindjee の総説 は，古い歴史から手際よくクロロ
フィル蛍光の紹介がされていて楽しい．この他，蛍光測定の素人向けの実際の測定方法の解説としては Ecological Studies というシリーズの中の〝Ecophysiology of
Photosynthesis" の中の第３章〝Chlorophyll Fluorescence as a Nonintrusive Indicator for Rapid Assesment of In Vitro Photosynthesis" が極めてわかりやすい ．
クロロフィル蛍光の初歩全般を扱った総説としては，
Annu. Rev. Plant Physiol. Plant M ol. Biol.に Krauseと Weis が 1991年に書いた〝Chlorophyll Fluorescenceand Photosynthesis:The Basics" が平易でわかりやすい ．日本語のものとしては，データの解釈方法について
筆者が光合成研究会報に書いたもの（パルス変調クロロ
フィル蛍光測定におけるデータの解釈，2005年）がある ．
この他，数多くの総説が出されているが，最近の総説としては Baker による〝Chlorophyll Fluorescence: A
Probe of Photosynthesis In Vivo" が 2008年に Annu.
Rev.Plant Biol.に出ているので，そこに紹介される文献と共に参考にして欲しい．

参考文献(1997)P.135.
５) W.P.Quick & M.Stitt, Biochim. Biophys. Acta 977(1989)P.287.
６) D.M.Kramer,G.Johnson,O.Kiirats& G.E.Edwards,
Photosynth. Res. 79 (2004)P.209.
７) J.Lavergne & H.W.Trissl, Biophys. J. 68 (1995) P.
2474.
８) M.Kitajima & W.L.Butler, Biochim. Biophys. Acta
376 (1975)P.105.
９) B.Genty, J.-M.Briantais & N.R.Baker, Biochim.
Biophys. Acta 990 (1989)P.87.
10) B.Demmig-Adams,W.W.Adams III,D.H.Barker,B.
A.Logan,D.R.Bowling & A.S.Verhoeven,Physiologia
Plantarum, 98 (1996)P.253.
11) M.C.Kato,K.Hikosaka,N.HIrotsu,A.Makino & T.
Hirose, Plant Cell Physiol., 44 (2003)P.318.
12) L.Hendrickson, R.T.Furbank & W .S.Chow,
Photosynth. Res. 82 (2004)P.73.
̈quist,Plant Physiology,111 (1996)
13) D.Campbell & G.O
P.1293.
14) U.Schreiber, T.Endo, H.Mi & K.Asada, Plant Cell
Physiol., 36 (1995)P.873.
15) D.Kirilovsky, Photosynth. Res. 93 (2007)P.7.
16) U.Schreiber, C.Klughammer & C.Neubauer, Z.
Naturforsch. C 43 (1988)P.686.
17) C.Klughammer & U.Schreiber, Planta 192 (1994) P.
261.
18) G.C.Papageorgiou & Govindjee (ed.), Chlorophyll a
Fluorescence:A Signature of Photosynthesis, Springer,
2004.
19) M.Yunus, U.Pathre & P.Mohanty (ed.), Probing
Photosynthesis: Mechanisms, Regulation, and Adaptation, Taylor & Francis, 2000.
20) U.Schreiber, W .Bilger & C.Neubauer, Ecophysiology of Photosynthesis,ed.C.D.Schulze& M .M .
Caldwell, Springer-Verlag, 1994, p.45.
21) 園池公毅，日本光合成研究会会報 42（2005）p.7.
22) N.R.Baker, Annu. Rev. Plant Biol. 59 (2008)P.89.

１) G.H.Krause & E.Weis, Annu. Rev. Plant. Physiol.

524

パルス変調による光合成測定

４章 分光測定

３．パルス変調蛍光b．P AM およびガス交換測定器を用いた，蛍光および二酸
化炭素同時測定による植物の光エネルギー利用の評価⎜ ガス交換解析とクロロフィル蛍光の同時測定 ⎜牧野周

光合成ガス交換解析とクロロフィル蛍光解析による測定技術は，植物の葉の光合成能力を非破壊的に評価できる技術としてそれぞれ別々に開発されてきたものであり，現在，植物の光合成を評価するもっとも有力な測定技術の一つである．ここでは，両手法の同時測定解析得られるパラメータを紹介しその理論と問題点および測定上の注意事項について解説する．

Simultaneous measurements of gas exchange and chlorophyll fluorescence
Amane Makino
Simultaneous measurements of gas exchange and chlorophyll fluorescence have made it possible to evaluate
photosynthetic capacity from the electron flux in PS II to carbon assimilation and photorespiration at the levelof an intact leaf. I introduce theory and principal of this technique and describe the technical problems on themeasurements.

光合成ガス交換とクロロフィル蛍光の同時解析は，研蛍光解析の技術は(4)2a および(4)3a．にて紹介される

究者独自の考案により 1990年代頃より報告されている．

ので，それらの詳細な原理や測定法については割愛する．

代表的なものとしては，Gentyら の PSII の量子収率からの電子伝達速度算出の正当性の確認，Di Marco ら やHarleyら の葉肉細胞における CO 拡散伝導度の評価

3.b.1 同時測定の原理と理論

法，M iyake& Yokota の water-water cycle などのオ光合成ガス交換法により測定される光合成速度（CO

ルターナティブ電子伝達活性の評価等に用いられてき交換速度）から，Farquhar らの光合成モデル理論［詳細た．いずれも，それらのパラメータを評価するのに重要は(2)1a］に基づくと，その測定された光合成速度を説明な情報を与えたが，精度高く定量的に評価すると言う意

するリニア電子伝達速度が算出可能となる（Jg，単位は味では限界がある手法でもある．

通常葉面積当たりで μmol e m s ）．

しかし，ガス交換とクロロフィル蛍光を同時測定することにより，原理的には PSII からの電子伝達活性への光の利用効率から Rubisco サイトでの CO 固定活性ま

Jg＝ A＋Rd 4Cc＋8Γ / Cc−Γ(1)

A はガス交換で測定される光合成速度（光呼吸速度をでの反応が生葉レベルで定量的に，しかも非破壊的に比含めた光合成速度を意 味 す る，単 位 は μmol CO m

較考察できる解析手法であるので，光合成全体の反応の，Rd は測定条件の光強度下における呼吸速度（単位s ）調節機構やポテンシャルとしての総合能力を評価するには μmol CO m s ），Cc は葉緑体内での CO 分圧（単はもっとも有力な手法であることは間違いない．

位は通常 Pa），Γ は光合成速度と光呼吸速度間の CO

ここでは，Miyake& Yokata および Makino ら の報告に従い，ガス交換とクロロフィル蛍光の同時解析によって評価可能なパラメータを紹介し，理論と問題点および測定上の注意事項について解説する．なお，本書では，カス交換解析の技術は，(2)1．にて，クロロフィル

補償点で，Rubisco の酵素的キネティックパーラメータ
であらわされる．
Γ ＝0.5Vo Kc/Vc Ko(2)

Vc と Vo は Rubisco のカルボキシラーゼ活性とオキシゲナーゼ活性それぞれの Vmax（単位はともに mol

１) 東北大学大学院農学研究科応用生命科学専攻

2009 低 温 科 学

vol.67mol s ）で Kc と Ko はそれぞれ Rubisco のカルボキ
525

シラーゼ活性の CO に対する Km（単位は通常 Pa）とオとを強調している［式(2)より算出］．しかし，Jordan &キシゲナーゼ活性に対する Km（単位は通常 Pa）である．

Ogren の報告でも Ko の測定に大きな問題点がある．ま一方，同時測定したクロロフィル蛍光解析から測定さた，Rubisco のキネティクス値自身文献により値が大きれた PSII の量子収率より Gentyら の式を用いて PSII

く異なる（例えば von Caemmerer & Quick を参照）

での電子伝達速度が算出される（Jf，単位は μmol e m

ので，正しい値の採用が難しい．

．
s ）また，式(1)のもっとも大きな問題点は，測定される
Jf＝αIΔF/Fmʼ

(3)

CO 交換速度がすべてリニアな電子伝達活性によって説明される光合成であることが前提となっており，サイ

は PSII の量子収率，I は光合成ガス交換クロ
ΔF/Fmʼ

クリック電子伝達活性の関与が考慮されていない点であロフィル蛍光の同時測定を行っている時の葉の表面でのる．近年，いろいろな環境条件でサイクリック電子伝達

光強度（単位は μmol quanta m s ），αはその光測定条

活性が光合成全体の反応に貢献していることが明らかに件で PSII が吸収する光強度の分配割合を意味し，Genty

なってきており，解釈には十分な注意が必要となる．上らの報告 に基づき，弱光（100μmol quanta m s 程

でも述べたように，サイクリック電子伝達の関与は Ja度），低 O 分圧（1kPa 程度），高 CO 分圧（100Pa 程をマイナス側に振る要因となる．

度）の測定条件では Jg は Jf に等しいと仮定して算出する．通常は 0.4から 0.45くらいの値が得られる．

クロロフィル蛍光解析による PSII の量子収率より電子伝達活性を算出する式(3)においては，
測定条件の光条

このようにしてクロロフィル蛍光解析により求めた件で PSII が吸収する光強度割合 αの算出方法に問題点

PSII の電子伝達速度はガス交換解析で求めた電子伝達がある．αは Gentyらの報告 に基づき，弱光条件で光速度 Jg を上回ることが多く，その差がオルターナティ

呼吸を抑えた低 O 分圧/高 CO 分圧下ではオルターナ

ブな電子伝達速度 Ja とみなされる．

ティブの電子伝達は生じない前提で算出している．しかJa＝Jf−Jg(4)

ここで算出される Ja は water-water cycle の電子伝し，低 O 分圧下では，サイクリック電子伝達活性が促進されるとの報告もある．また，光強度の上昇等に伴いこの α値が変化する可能性も否定できない．

達活性が高い場合にはプラス側の値に，PSI サイクリッ

以上のように，ガス交換とクロロフィル蛍光を同時測

ク電子伝達活性が高い場合にはマイナス側の値に振れ定は，光合成全体の反応の調節機構やポテンシャルとしる．

ての総合能力を評価する非常に有力な手法ではあるが，いくつかの問題点を含む解析法であることを認識しなけ

3.b.2 同時測定の理論上の問題点
ガス交換速度より電子伝達活性を算出する式(1)において，いくつかの問題点がある．まず，呼吸速度 Rd の算ればならない．

3.b.3 同時測定の注意事項

出である．呼吸速度は明暗の条件で異なることが知られ光合成測定を行う場合，葉面での光強度，温度，CO 分ている（明所呼吸の方が暗所呼吸より小さい）ので，暗圧，O 分圧および湿度が厳密に制御可能な装置が備わっ所で測定された呼吸速度をここに代入することは正しくていることと，その測定に耐え得る厳密な同化箱装置をない．Brooks & Farquhar は光強度を変えて測定される

作製されていることが必要不可欠であることは言うまで見かけ上の CO 補償点に違いから Rd を算出する方法もない．また，同化箱装置内では葉面における CO の拡を報告している ．理論的には正しい算出法であるとさ

散境界面抵抗が測定値に影響を及ぼさないように十分なれているが，実験誤差を伴いやすい．Cc の算出も簡単で風速が与えられること，同化箱内外のガスの巻き込みやはない．これについては(2)1b.c において詳しく解説さ

漏れが生じない工夫も必要である．一般には，ファンがれるのでそちらを参照されたい．また，Γ の算出も無視内蔵された同化箱装置が用いられ，同化箱内の空気圧ができ得ない誤差を伴う．Γ の算出も Brooks & Farqu-

外気に対して多少陽圧になるような設計がされる場合がhar の報告 に従い可能であるが，上でも述べたように多い．例えば，Sharkeyら考案した装置

誤差を生じやすい．
彼らはホンレン草を用い 25℃で 4.27

は記載されていないが，同化箱にはマノメーターがセッ

Pa という値を見出し，別に Rubisco の酵素キネティッ

トされており，外気に対して１％ほど陽圧が保たれるこクより求めた Jordan & Ogren の値と一致していることが確認できるようになっている．また，彼らは Farqu-526

では，論文にガス交換と C hl蛍光同時測定解析

har の式を用いて，光合成速度を計算する時も大気圧プない誤差を生じさせる．また，例えば，上述の α値の正ラス１％の補正を行っている．

確な算出も困難となる．最近，Walz 社から測定面積が 8

近年では，米国の Li-Cor 社製のポータブル光合成装置

cm 確 保 さ れ た ク ロ ロ フィル 蛍 光 同 時 測 定 ユ ニット

LI-6400 が広く普及している．この装置では上記の条件

3055-FL が販売されたが，残念ながら，筆者はその使用実をおおよそ満足するものである．しかし，同化箱内がど績の情報を得ていない．

のくらい陽圧にされているかは公表されていない．
また，自作する場合は，さらに同化箱内でクロロフィル蛍光

低 CO 分圧条件での外気 CO の巻き込みや高 CO 条件

測定のためのファイバーが光源からの影を落とさないよ

での CO の漏れも確認されており，装置そのものを包みうな工夫も必要となる．リングライトのように同化箱の込むエアバッグを併用して，外気との CO 分圧差を可能

周囲から均一に光照射ができ，ライト穴の中央から蛍光

な限り小さくして測定することを推奨する報告もあ

測定用のファイバーが組み込めるような装置が良いである．いずれにせよ，これらの CO の巻き込みや漏れがな

ろう．筆者らは日本ピー・アイ社の COLD SPOT スクエ

いことの確認は，熱処理した葉を同化箱にはさみ，COアリングライトを使い，ファイバーからの影が同化箱にフリー条件や 100Pa 以上の高 CO 分圧ガスを同化箱に落ちないように作製した装置で解析を進めている ．

流し込み，同化箱流入前後の空気の CO 分圧に差が生じないことでチェックできる．
ガス交換とクロロフィル蛍光の同時測定でも同化箱の参考文献

工夫を凝らす必要がある．なぜならば，ガス交換はなる

１) B.Genty, J.Briantais & N.Baker, Biochim. Biophys.

べく同化箱前後での CO 分圧差を大きくすることが望Acta 990 (1989)p.87
２) G.Di Marco,F.Manes,D.Tricoli& E.Vitale,J.Plant

まれるため，ある程度測定面積を確保した同化箱が必要となる．例えば，Li-Cor 社の LI-6400 では標準タイプとして 6cm の同化箱が設定されている．Walz 社から販売されているポータブル装置 GFS-3000 でも同等の測定面積が確保されている．しかしながら，クロロフィル蛍光測定では測定光が葉面に均一に照射されることをが厳密に要求されるので，比較的小さなスポット測定で行われる（通常は 1cm 程度）．すなわち，同時測定を行う場
合は，大きな面積に厳密に均一な光強度の照射が求められる．Li-Cor 社から販売された最初の同時測定装置 LI6400R は販売直後に一旦製造中止となり，現行のモデル
では同化箱面積が 2cm まで小型化された．おそらく，初期型のものでは，測定光の均一性に問題があり，改良が加えられたものと想像している．しかし，同化箱の小型化はやはり，同化箱前後の CO 分圧差を小さくするため
カス交換測定の精度を下げるものであった．例えば，この装置を用いての弱光条件や各種ストレス条件での光合成速度解析は測定される絶対速度が低いため無視でき得2009 低 温 科 学

vol.67

Physiol. 136 (1990)p.538
３) P.C.Harley,F.Loreto,G.Di Marco & T.D.Sharkey,
Plant Physiol. 98 (1992)p.1429
４) C.Miyake & A.Yokota, Plant Cell Physiol. 41 (2000)
p.335
５) A.M akino, C.M iyake & A.Yokota, Plant Cell
Physiol. 43 (2002)p.1017
６) A.Brooks & G.D.Farquhar, Planta 165 (1985)p.397
７) D.B.Jordan & W.L.Ogren, Planta 161 (1984)p.308
８) S.von Caemmerer & W.P.Quick, Photosynthesis:
Physiology and Metabolism, ed. R.C.Leegood, T.D.
Sharkey & S.von Caemmerer Kluwer, Dordrecht, The
Netherlands, 2000, p.85
９) T.Joet, L.Cournac, G.Peltier & M.Havaux, Plant
Physiol. 128 (2002)p.760
10) T.D.Sharkey, Plant Physiol. 78 (1985)p.71
11) M .Rodegbiero,U.Niinemets & A.Cescatti,Plant Cell
Environ. 30 (2007)p.1006
12) N.Hirotsu, A.Makino, S.Yokota & T.Mae, Plant
Cell Physiol. 46 (2005)p.1377

527

４章 分光測定

３．パルス変調蛍光c．光化学系Ⅰサイクリック電子伝達の活性測定
宗景 ゆり
光化学系

サイクリック電子伝達では，光化学系を通過した電子は，プラストキノンへ戻され，直鎖電子伝達経路を経由して再び光化学系 へ渡される．本章ではクロロフィル蛍光測定や P 700の酸化キネティックス測定から光化学系

サイクリック活性を検出する方法を紹介する．

M easurement of PSI cyclic electron transport activity
Yuri Munekage
In cyclic electron transport around photosystem I, electrons are donated to plastoquinone from acceptor ofphotosystem I. In this chapter, I introduce methods for evaluating cyclic electron transport activity fromchlorophyll fluorescence measurement or oxidation kinetics of P700 measurement.

の逆反応によりフェレドキシンにわたり，サイクリック

3.c.1 はじめに
光化学系活性によってプラストキノンが還元される様子がみられサイクリック電子伝達は，光化学系 を通る．

過した電子がプラストキノンへ戻される電子伝達で，測定バッファー（7mM M gCl ，1mM M nCl ，2mM

戻ってきた電子はシトクロム b f 複合体，プラストシア

EDTA，30mM KCl，0.25mM KH PO ，50mM

ニンを経由して再び光化学系 へ渡される．この経路に

HEPES pH 7.6）に低張液で破砕させた単離葉緑体または，葉緑体 NAD (P)H dehydrogenase（NDH）複合体

は単離チラコイド膜（10μg Chl ml ）を入れスターラーを介する経路と，アンチマイシン A によって阻害されるで攪拌する．測定光（1.0μmol photonsm s ）を照射

Ferredoxin-plastoquinone reductase（FQR）経路の二し 0.25mM NADPH 続いて，5μM フェレドキシンをつの経路があることが知られている．これらの経路の詳加える．図 1 のようにシロイヌナズナ野生株（WT）か細や生理的意義の解明は長い間手つかずのままであったら単離した破砕葉緑体ではフェレドキシンを添加したとが，近年これらの電子伝達に関わる分子の解析が飛躍的

きにクロロフィル蛍光の上昇がみられる．アンチマイシに進んでいる．定量的なサイクリック電子伝達活性測定

ン A（2μM ）を加えた破砕葉緑体ではクロロフィル蛍光法は未だ確立されていないが，ここではクロロフィル蛍の上昇速度が著しく遅くなる．また pgr5 変異株 ，NDH

光測定や P 700の酸化キネティックス測定から間接的に複合体を欠く crr2-2 変異株 から単離した破砕葉緑体

サイクリック活性を検出する方法を紹介する．

ではクロロフィル蛍光上昇速度が野生株より遅い．pgr5
変異株の破砕葉緑体にアンチマイシン A を加えたとき

3.c.2 in vitro プラストキノン還元測定
常温でのクロロフィル蛍光は光化学系には変化が見られないが，crr2-2 変異株の破砕葉緑体にから発せられ，光化学系 のキノン型電子受容体である Q やプラ
ストキノンプールの還元状態を反映する．このため測定
光下で光化学系 を励起し，サイクリック活性によるプ
ラストキノンの還元を，クロロフィル蛍光の上昇として検出することができる．in vitro の系では，単離チラコイ
ド膜に過剰量の NADPH およびフェレドキシンを加えることで，NADPH から電子がチラコイド膜上の FNR
１) 奈良先端科学技術大学院大学バイオサイエンス研究科

2009 低 温 科 学

vol.67

図 1：in vitro プラストキノン還元529

アンチマイシンＡを加えたときにはクロロフィル蛍光のチングが起き，クロロフィル蛍光の一過的上昇がみられ上昇がほとんどみられなくなる．また pgr5 crr2-2 二重なくなるため，光合成誘導光は生育光強度またはそれよ

変異株から単離した破砕葉緑体でもクロロフィル蛍光のり弱い光を用いる．

上昇がほとんどみられない．このように in vitro プラス
トキノン還元測定では NDH に依存する経路，FQR に依存する経路の両方の活性を検出できる．

3.c.4 P 700酸化還元測定
光化学系 サイクリック電子伝達によってプラストキ

3.c.3 ND H 活性に依存した一過的クロロ
フィル蛍光の上昇測定

ノンに戻された電子は，再びシトクロム b f 複合体，プラストシアニンを経由して光化学系 に渡される．光化学系の反応中心 P 700の酸化還元に伴う 820nm 付近の光合成誘導光を消したときに測定光照射下でクロロ

吸光度変化をモニターすることで，サイクリック活性に

フィル蛍光が一過的に少し上昇し山を描いて下がる様子

よって光化学系 に渡される電子の量を評価することがが見られる．これは，光合成中に蓄えられた還元力によできる．

り，暗黒下でプラストキノンが還元されたことを反映しSchreiber らは，光合成誘導光照射後に赤外光照射下ている．NDH に依存するこのクロロフィル蛍光の上昇

で P 700酸化速度を測定し，ストロマに蓄えられた電子

はがサイクリック活性によって P 700に渡される量を見積

ndhB 葉緑体形質転換タバコの解析より見出された ．

もっている ．図 3は夾竹桃の生葉での P 700酸化速度

図 2はシロイヌナズナの生葉の NDH 活性を測定しを調べたものである．まず，電子伝達系内の電子のプーたものである ．暗順化させた葉に測定光（M L）を照射

ルサイズを測定する（図 3A）．葉に赤外光（＞700nm，

しクロロフィル蛍光の Fo レベルを確認する．飽和光パ

6.8W m ；FR）を 20秒間照射して P 700酸化させ，電ルス（800ms；SF）を照射後，光合成誘導光（50μmol

子伝達系内の電子を除去する．次に FR 照射下でキセノ

photons m s ；AL）を５分間照射する．光合成誘導光

ンランプ（1,500W m ）を使って，一励起エネルギーをを消した時，野生株（WT）では，クロロフィル蛍光が一与える single-turnover light（a half peak width 14μs；

旦 Fo レベルまで下がり，次に一過的に上昇した後再びST）を照射する．P 700は光化学系 からの電子によりFo レベルまで下がる．NDH 複合体を欠損した crr2-2還元されるが，すぐに FR によって酸化される．続いて電変異株ではクロロフィル蛍光の一過的上昇がみられない

子伝達系内をすべで還元させるためにキセノンランプ

が，pgr5 変異株では野生株と変わらずクロロフィル蛍光（1,500W m ）を 使って multiple-turnover light（50の一過的上昇がみられる．このようにクロロフィル蛍光

ms；MT）を照射する．P 700はほとんど完全に還元されの一過的上昇は NDH 経路のみに依存していることがた後，再び酸化されるが，ST 照射後よりもゆっくりと酸わかる．光合成誘導光（AL）が強すぎると Fo のクエン化される．図の水色で示した部分［ST］を青色の部分［MT］で割ると P 700あたりの電子伝達系内の電子のプールサイズが得られる．
今度はサイクリック活性を見積もるため，FR 照射下

図 2：NDH 活性に依存した一過的クロロフィル蛍光の上昇

530

図 3：Schreiber らによる P 700酸化速度を利用したサイクリック電子伝達活性の見積もり

光化学系Ⅰサイクリック電子伝達

で光合成誘導光（AL）を照射する（図 3B）．AL を消し学系

たあと P 700は一旦，光化学系 から来る電子によってに伴って低下し，直線的電子伝達に置き換わることを報還元されるが，その後 FR によりゆっくりと酸化される．

告 し て い る ．図 5は FR 照 射 下 で の P 700酸 化 キ ネ

続いて MT を照射する．AL 照射後の P 700酸化速度はティックスを示している．curve 1 は緑色光を 10分間以M T 照射後の酸化速度よりも非常に遅くなっており，電上照射して光順化させ２分間暗処理した葉，curve 2 は子伝達系内の電子より多くの電子が P 700に渡されてい暗順化させた葉の P 700酸化キネティックスである．暗ること，つまりストロマに蓄えられた電子がサイクリッ

順化させた葉では光順化させた葉よりも P 700酸化速度

ク活性によって電子伝達系に入ってきて P 700に渡されは 遅 く なって い る．P 700の 酸 化 が 遅 く な る 条 件 下ていることを示している．
オレンジ色で示した部分［AL］（curve 2）でもチラコイド膜内外に電場が形成されるこが AL 照射下でストロマに蓄積された電子がサイクリッとから，電子伝達が継続して起こっていると考えられ，

ク活性によって P 700に渡された量を示している．従っ

光化学系 サイクリック電子伝達によって P 700に電子て，P 700あたりのストロマから戻ってくる電子のプーが渡されるため酸化速度が遅くなると解釈される．またルサイズはcurve 2 は二相性のキネティックスを描く．速い phase

M T-area/ST-area × AL-area/M T-area −1と見積もられる．

サイクリック電子伝達が CO 固定反応の活性化

はストロマの電子受容体（おそらく NADP ）へ電子が送られていることを示している．curve 3 は暗順化させた
葉に緑色飽和光を 200ミリ秒間照射し５秒間暗処理した

Shikanai らは比較的強い測定光下で FR を照射した

葉の P 700酸化キネティックスである．この短時間の飽と き の P 700酸 化 速 度 か ら PGR5 に 依 存 す る サ イ ク

和光照射は，CO 固定反応を活性化しないが電子供与体

リック活性を評価している ．図 4は測定光（1.3μmol

プールを完全に還元するため，curve 2 でみられた速い

photons m s ）照射下で FR（＞700nm，36Wm ）phase は消え，P 700の酸化速度はもっとも遅くなってを照射したときの P 700の酸化速度を，シロイヌナズナ

いる．P 700酸化速度は緑色飽和光の照射時間が長くな

野生株，pgr5 変異株，カリフラワーモザイクウイルスると次第にはやくなり，完全に光順化させた curve 1 と（35S::
35S プロモータでドライブした PGR5 過剰発現体

同様のキネティックスを示すようになる．この curve 1

PGR5 ）間で比較したものである．pgr5 変異株では FR

は methyl viologen 存在下での P 700キネティックスと照射下での酸化速度が野生株よりも速くなっており，光変わらないことから，直線的電子伝達による P 700酸化

化学系 に渡される電子の数が少ないことがわかる．逆速度であることが示されている．このように，暗順化さに PGR5 が約５倍発現している 35S::PGR5 では野生株せた葉では光化学系 サイクリック電子伝達が最大活性よりも酸化速度が遅くなっており光化学系 に渡されるをもち，それが光照射により直線的電子伝達に置き換わ

電子の数が多くなっていることがわかる．

る様子がわかる．この測定方法で pgr5 や crr4-2 pgr5

Joliot ら は 暗 順 化 し た 植 物 を 光 順 化 さ せ る 過 程 で（crr4-2；NDH 複合体量が 12.5‑25％に減少している変P 700の酸化速度が変化していく様子をとらえ，CO 固定反応が抑制される環境下で最大活性をもっていた光化

図 4：Shikanai らによる P 700酸化速度を利用したサイクリック電子伝達活性の評価

2009 低 温 科 学

vol.67

図 5：Joliot らによる P 700酸化速度の測定を利用した暗順化および光順化した葉におけるサイクリック電子伝達活性の
見積もり

531

野生株の値とほとんど変わらない ．従って，C 植物においてこの方法で光化学系 サイクリック活性を評価することは難しいと考えられる．

参考文献
図 6：赤外光照射後の暗黒下での P 700再還元速度

１) J.D.Mills, D.Crowther, R.E.Slovacek, G.Hind & R.

異株 の P 700酸化キネティックスを調べると，暗順化
した葉，また緑色飽和光を 200ミリ秒間照射した葉のP 700の酸化速度は野生株よりも速くなっているが，光順化させた葉と比較すると非常に遅く，pgr5 や crr4-2
pgr5 においても光化学系

サイクリック電子伝達活性が残存すると報告されている ．
P 700再還元速度もまた光化学系

サイクリック電子伝達活性を反映することが報告されている．図 6は赤外光を照射し P 700を酸化させた後，赤外光を消し暗黒 下 で P 700再 還 元 速 度 を 測 定 し た も の で あ る ．
Synecocystis や C 植 物 で あ る Maize で は P 700再 還元速度は速く，half-time（t ）はそれぞれ 178ms，196
ms である．これは暗黒下でサイクリック電子伝達経路
を介して入ってくる還元力が P 700を還元するためであると考えられる．Synechocystis では，NDH 欠損株において P 700の再還元速度が著しく遅くなる報告されている ．一方 C 植物である tobacco では P 700再還元速度の half-time は 1,157ms と非常に遅い．この結果は
C 植物では光化学系 サイクリック活性が藍藻や C 植
物と比べて低いことと一致する ．しかし

ndhB 葉緑体形質転換タバコや Antimycin A で処理したタバコのMcCarty Biochim. Biophys. Acta 767 (1979)P.127
２) T.Endo, T.Shikanai, F.Sato & K.Asada Plant Cell
Physiol. 39 (1998)P.1226
３) Y.M unekage, M.Hashimoto, C.M iyake, K.Tomizawa, T.Endo, M .Tasaka & T.Shikanai Nature 429(2004)P.579
４) Y.M unekage, M .Hojo, J.Meurer, T.Endo, M .Tasaka & T.Shikanai Cell 110 (2002)P.361
５) M .Hashimoto, T.Endo, G.Peltier, M .Tasaka & T.
Shikanai Plant J.36 (2003)P.541
６) T.Shikanai, T.Endo, T.Hashimoto, Y.Yamada, K.
Asada and A.Yokota Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(1998)P.9705
７) K.Asada,U.Heber & U.Schreiber Plant Cell Physiol.
33 (1992)P.927
８) Y.Okegawa, T.A.Long, M .Iwano, S.Takayama, Y.
Kobayashi, S.F.Covert & T.Shikanai Plant Cell
Physiol. 48 (2007)P.1462
９) P.Joliot & A.Joliot Biochim. Biophys. Acta 1757
(2006)P.362
10) B.Nandha,G.Finazzi,P.Joliot,S.Hald & G.N.Johnson Biochim. Biophys. Acta 1767 (2007)P. 1252
11) T.Joet, L.Cournac, G.Peltier and M .Havaux Plant
Physiol. 128 (2002)P.760
12) H.M i,T.Endo,U.Schreiber,T.Ogawa and K.Asada
Plant Cell Physiol. 33 (1992)P.1233

葉における P 700再還元速度の half-time は，未処理の532

光化学系Ⅰサイクリック電子伝達

４章 分光測定

３．パルス変調蛍光d．高等植物葉緑体チラコイド膜光化学系ⅡおよびⅠ電子伝達活性の生葉での同時測定
三宅 親弘
測定光をパルス変調したロックイン増幅検出系を，生葉での蛍光測定法および分光測定法に用いて以来，クロロフィル蛍光測定における PSII の量子収率解析あるいは光化学系

反応中心 P 700の量子収率解析が盛んに行われてきた（Genty et al.1989,Klughammer and Schreiber 1994）．これは，パルス変調による測定光シグナルの交流化によりノイズ低減そして分光法における測定光の透過あるいは反射シグナルの増幅，また測定光に対する蛍光シグナルの増幅効率の飛躍的増大の恩恵による．パルス変調系のシステムおよび原理の詳細，さらに PSII および PSI それぞれの量子収率を見積もるモ
デルは，4章 3.a を参考にしていただきたい．ここでは，生葉を用いて，光合成電子伝達系の光化学系
および光化学系の電子伝達活性を同時に測定解析する方法を紹介する．

M easurements of Photosynthetic Electron Flow In Vivo
Chikahiro M iyake
M ethods for the simultaneous determination of photosynthetic electron flows in both PSI and PSII with thetechnique of pulse amplitude modulation (PAM )were introduced.

て，PSII が吸収する光の量（αx PFD）と LEF の活性3.d.1 原理

（PSII の電子伝達活性（Je(PSII)）との間には以下の関係

3.d.1.1 葉緑体チラコイド膜光化学系Ⅱ電子伝達活性式が成立する．

3.d.1.1.1 活性評価の考え方

LEF＝Je PSII

生葉における非循環的光合成電子伝達（リニアーエレ＝αx Φ PSII x PFD

クトロンフロー：linear electron flow（LEF））活性は，(1)

光化学系 の水の光酸化の結果生じる電子が，プラスト

LEF：非循環的光合成電子伝達（リニアーエレクトロ

キノン，シトクロム b/f‑複合体，プラストシアニンを経

ンフロー：linear electron flow(LEF））活性であ由し，光励起された光化学系 を介して，Fd-FNR により，PSII の電子伝達活性（Je(PSII））として示されり NADP の還元に利用される速度として評価される．

る．単位は，μmol e m s である．

つまり LEF で流れる電子の由来は，PSII で生成するもα：チラコイド膜における PSII への光の分配率であのであり，その電子生成速度は PSII 反応中心 P 680のる．したがって，PSI への光の分配率 βの値と合わ

光によるターンオーバーによる．したがって，4章 3.a でせると，1＝α＋βの関係をもつ．

記載されているパルス変調システムを用いたクロロフィ

Φ(PSII)：PSII の量子収率

ル 蛍 光 強 度 の 測 定 で 得 ら れ る PSII の 量 子 収 率（ΦPFD(photon flux density)：生葉へ照射される光の(PSII))が LEF の電子伝達活性を反映し，LEF は，PSII

光量子密度であり，単位は μmol photons m s での電子伝達活性として示される（式 1）．

ある．

3.d.1.1.2 Φ(P S II）の意味するもの
PSII の量子収率 Φ(PSII）は，その定義より，PSII に吸収された光の量子密度に対する PSII 反応中心クロロ
フィル P 680のターンオーバーの割合を示す．したがっ

実際の，多くの生葉が示す Je（PSII）と光強度の関係
は図１の様式が一般的である（ここでは，モデル的に示す）．
この図から明らかなように，弱光の領域では，光強度の増大とともに，LEF は増加する．これは，LEF 速度の

１) 神戸大学大学院

農学研究科

物栄養学研究室2009 低 温 科 学

vol.67

生命機能科学専攻 植

律速が光供給にあることを反映しており，Φ(PSII）が高い値で一定に維持されていることを示している（図 2）．
533図 2：PSII 量子収率（Φ（PSII））の光強度依存性

図 1：PSII 電子伝達活性（Je(PSII））の光強度依存性

一方，光強度の増大とともに，LEF はその増加が頭打の評価の原理は，4章 3.a を参照されたい．なΦ(PSI）

ちになり，最終的には飽和してしまう．これは，LEF 速

お，光の分配率を考慮しない Φ(PSI)x PFD の値は，PSI度の律速が，暗反応での CO 固定速度によることを反映の相対電子伝達活性を示す．これは，また，PSII の相対している．このような状況下では，Φ(PSII）は光強度の電子伝達活性にも適用され，それは Φ(PSII)x PFD とし増大とともに，減少しており，このことが LEF の低下をて示される．

説明する．

3.d.1.2.3 光励起 P 700 の減衰速度測定解析

3.d.1.2 葉緑体チラコイド膜光化学系 電子伝達活性3.d.1.2.1 活性評価の考え方

こ の 解 析 で は，以 下 の モ デ ル が 前 提 に なって い る（Clarke and Johnson 2001）．

生葉での PSI の電子伝達活性評価には，現在，主に，２つの方法が活用されている．以下にその考え方を紹介

P 700

する．
3.d.1.2.2 P S Iの量子収率測定解析

k1
k2

P 700

(3)

P 700が光励起される P 700 生成過程：速度定数を

基 本 的 に，PSII の 量 子 収 率 と 同 じ 考 え 方 で あ る

k1 とする（Klughammer and Schreiber 1994）．つまり，その定義

P 700 がプラスシアニンにより還元される P 700再より，PSI に吸収された光の量子密度に対する PSI 反応

生過程（ここでは，還元されたプラストキノンから中心クロロフィル P 700のターンオーバーの割合を示の電子がシトクロム b/f‑複合体を経てプラストシ

す．したがって，PSI が吸収する光の量と PSI の電子伝アンに受け取られている）：速度定数を k2 とする

達活性（Je（PSI））との間には以下の関係式が成立する．
Je PSI ＝βx Φ PSI x PFD(2)

Je(PSI)：PSI の電子伝達活性である．
β：チラコイド膜における PSI への光の分配率であ定常状態では，反応式（3）は，P 700が励起され，そして P 700 が還元される反応が平衡状態にある．このとき，P 700 の還元の速度 v(P 700 ）は，
v P 700 ＝k x P 700

る．したがって，PSII への光の分配率 a の値と合わとして示される．k は，P 700 の見かけの速度定数であせると，1＝α＋βの関係をもつ．

り，k2 に等しい．このモデルに従えば，k の大きさとΦ(PSI)：PSI の量子収率

P 700 の大きさに依存して，P 700 の還元速度が見積もPFD(photon flux density)：生葉へ照射される光のられ，その値は，シトクロム b/f‑複合体，そしてプラス

光量子密度であり，単位は μmol photons m s でトシアニンを介した還元型プラストキノンからの電子流ある．

入速度を反映することになる．

534

生葉での光合成電子伝達活性測定

3.d.2 方法
3.d.2.1 機器の設置
PSII および PSI の電子伝達活性を，１つの生葉において同時に測定する場合，Walz 社の PAM を２台用いる．
下記に，測定システムの構図を示す．
PSII 量子収率評価のためのクロロフィル蛍光のシグ
ナルは，チャート式レコーダーを用いて記録する
PSI 量子収率評価のための P 700 のシグナルは，パルス照射に伴う短時間の時間遷移（ミリ秒〜500ミリ秒）でモニターが可能なオシロスコープを用いた記録計を活用する．
解析する生葉は，Li-Cor 社 LI-6400 に付属するアラビ
チャンバーにセットする．このチャンバーでは，葉温はモニターされないので，別途，熱伝対を用意し，生葉の温度をモニターする必要がある．
PSII および PSI の量子収率評価での電子伝達活性測定のためには，Walz 社 PAM のグラス・ファイーバーを
LI-6400（LiCor 社）付属のアラビチャンバーの上部に固定しなければならない．そのためには，チャンバー上部

図 3：光化学系 および光化学系 電子伝達活性同時測定シ
ステム．PAM -1，Φ(PSI）測定用 PAM（ドイツ Walz 社）；；E およびPAM -2，Φ(PSII）測定用 PAM（ドイツ Walz 社）（Φ(PSI）測定の場合）PAM 付属の測定光のエミッターおD，
よび反射光の検出部，（Φ(PSII）測定の場合）PAM 付属の測定光のエミッターおよびクロロフィル蛍光の検出部；M T，
PAM 付 属 の M ultiple Turnover Flash ユ ニット；AL，（Actinic light）
照射ユニット；SP，PAM
PAM 付属の作用光
付属の飽和パルス光照射ユニット（クロロフィル蛍光解析による Φ(PSII）の見積もりに用いる)；IRGA，赤外線ガス交換測定器（この図では，測定器に付属したアラビチャンバー（商品名）が使用可能な米国 Li-Cor 社製 LI-6400 を想定している）．

と一体化する筒状の固定ユニットを自作する必要がある（図 4）．ただし，これは測定時，Walz 社 PAM のグラス・

3.d.2.2 P S IIおよび P S Iの電子伝達活性の同時測定

ファイーバーがセットされたアラビチャンバーからずれ

本方法では，PSII のクロロフィル蛍光強度を常時モニることなく一定に固定できる状況であれば，必ずしも必ターしつつ，PAM クロロフィル蛍光測定用のパルス測要ではない．

定光照射のためのエミッター（E）およびパルス変調蛍光

図 4：アラビチャンバー（商品名）（米国 Li-Cor 社製 LI-6400 付属）へ，PAM 用グラスファイバー（ドイツ Walz 社）を接続する
筒の外観図

2009 低 温 科 学

vol.67535

検出のための検出部（D）それぞれに連結されている率（Φ(PSI））を以下のモデルから見積もることが可能と

PAM のグラス・ファイーバーを，PSI 量子収率評価を目なる（詳細は，4章 3.a 参照）．

的に P 700 測定のための測定光エミッター（E）および検出部（D）に連結しなおす必要がある．
PSII 量子収率測定のためのクロロフィル蛍光測定お
よび PSI 量子収率測定のための一般的方法および注意

Φ(PSI)＝(光照射時あるいは暗黒下，飽和パルスで生成する P 700 シグナル強度)/(暗黒下，遠赤外光で生成する P 700
シグナル強度）(4)

点は，他の章（4章 3.a）もまた参照されたい．ここでは，実際の解析においては，作用光を照射後，LI-6400 でモ

とくに P 700 のシグナル検出において，PAM の設定にニターする CO 固定速度が定常値に達するのを観測す言及する．

る．この間，クロロフィル蛍光解析による PSII の量子収

P 700 シグナル測定での測定光による生葉からの反率評価も同時に行っておく．

射光を感度よく測定するためには，測定光強度を可能なある条件の下，たとえば一定の光強度の下，CO 固定

限り最大にする必要がある．そのためには，PAM -101 ユ

速度が定常値に達した後，PAM のグラス・ファイーバー

ニットにおいて，検出されるシグナルが過負荷（OVER-を P 700測定に切り替える．この折，検出される P 700

LOAD）にならない程度に測定光強度（Measuring Lightのシグナルは，オフセットし，ゼロ合わせをしておく．

Intensity）を増大あるいは測定光の検出感度（GAIN）を

その後，50ms の飽和パルス光照射を行い，生成する増大させる．さらに，PSI の量子収率測定のために照射す

P 700 シグナルの強度を評価し，PSI の量子収率を見積る飽和パルスの照射開始そして終了後の P 700 の時間

もる．測定後，再度，PAM のグラス・ファイーバーをク

変化（ミリ秒〜500ミリ秒）をモニターするために，測定

ロロフィル蛍光測定に切り替える．このようにして得ら光の変調周波数を 100kHz に設定する．

れた Φ(PSI）と Φ(PSII）の値を用いて，PSI および PSII

生葉において，光合成を駆動させるための光（作用光；の電子伝達活性の光強度依存性を調べた結果を下記に示）の照射を行っている際あるいは暗黒Actinic light（AL）

す（図 5，6）（三宅：未発表）．

下，最大の P 700 の量を見積もるために照射する飽和パ

3.d.2.3 光励起 P 700 の減衰速度測定解析

ル ス 光 と し て，Walz 社 PAM オ プ ション M ultiple

本方法では，作用光の照射後の P 700 の減衰を評価す

Turnover Flash ユニット（MT）が与える 50ms のパル
ス光を利用することができる．これにより，PSI の量子収

図 5：PSI お よ び PSII 電 子 伝 達 活 性（Je(PSI）お よ び Je
(PSII））の光強度依存性：○，Je(PSI）；●，Je(PSII）．光強度の増大とともに，Je(PSII）は増大するがやがて飽和する．
一方，Je(PSII）は，Je(PSII）が光強度に対して飽和した後もその活性は増大し，強光下での活性は，Je(PSII）を上回っ
ている．

536

図 6：PSI 電 子 伝 達 活 性 の PSII 電 子 伝 達 活 性 に 対 す る プ
ロット．図５で得られた Je(PSI）の値を Je(PSII）に対してプロットした．Je(PSI）の値が Je(PSII）と同じ値をとる場合の点線が示されている．Je(PSII）の光飽和に伴い，Je(PSI）
は Je(PSII）の値とのずれを示し，そのずれは光強度の増大とともに大きくなる．これは，PSI 循環的電子伝達活性の発現と，光強度による活性増大を反映している．

生葉での光合成電子伝達活性測定

る必要があるために，定常状態に達した後，光が消える

積もることができる．幸いなことに，クロロフィル蛍光時間が発生する．筆者の経験では，約１〜３秒の暗黒時

解析による PSII 量子収率測定とガス交換解析による

間は，定常状態にある光合成の CO 固定速度に影響を与CO 固定速度測定を同時に行うことにより，PSII への見えない．

かけの光分配率（α）を見積もることができる（4章 3.b）．

この測定では，光照射後の P 700 の減衰を記録できるその値から，βを見積もり，PSII および PSI の電子伝達

ように，減衰時間である数百マイクロ秒〜ミリ秒に対応

活性を評価する．

できるオシロスコープが必要とされる．この測定でもや

3.d.3.2 P S I量子収率測定における暗黒下でのはり，P 700 シグナル検出条件は，上記と同様に設定する．

P 700 の見積もり
一般に，長時間暗黒下に置かれた植物の光合成は不活モニターすべき内容は，光照射中の P 700 のレベルお化しているために，光照射直後は光合成電子伝達系が機よび光照射後の P 700 の減衰曲線である．この測定で能しない，またカルビンサイクル酵素が機能しない状況

は，P 700 の減衰曲線から P 700 が低下する速度定数になっている．そのため，暗黒下での飽和パルス光照射（k）の値を見積もる必要がある．そのためには，オシロによる P 700 の見積もり値が，遠赤外光により見積もら

スコープへ取り込んだデータを用いて，減衰曲線を１次れる値を下回る場合が多く見受けられる．この問題を克

減衰カーブ（次式）として近似させるカーブフィッティ

服 す る た め に は，中 程 度 の 光 強 度（200〜300μmol

ング処理を行い，k の値を見積もる．フィッティングされphotons m s ）で光合成を行わせ，定常状態に達したたデータの処理は，市販の数式処理ソフトウェアの活用

後に遷移的に暗黒下，その後の作用光の光強度を増大さが可能である．

せる測定手順をとることにより，弱光下での PSI 量子収
P 700 ＝A x exp −k(5)

A：光照射停止前の P 700 のレベル

3.d.3.3 光励起 P 700 の減衰速度測定解析の問題点
この方法の問題点は大きく２つに分けられる．第１に，得られた k および A の値を用いて，P 700 へ電子が流入する速度の初速を次式から評価する．
v P 700 ＝k x P 700 ＝k x A

率を評価できる．

P 700 が生成し，その量は検出できるレベルでなければならない．このような状況は，光合成を駆動するための(6)

光の強度がある程度大きくなければならず，弱光下でのPSI 電子伝達活性の評価を困難なものにしている．第２また，この方法による PSI 電子伝達活性の評価も，に，式６から明らかなように，PSI 電子伝達活性の絶対値

PSII クロロフィル蛍光解析と同時に行う場合は，PAMを見積もることはできない．したがって，任意の生葉でのグラス・ファイーバーの交換を行う必要がある．

の相対値評価のみが可能であるということである．この点，さまざまな処理を施した植物間，あるいは他の品種
間，また野生型と組換え体との間での活性比較が困難と

3.d.3 問題点

なっている．

3.d.3.1 光の分配の見積もり
生葉において，PSII および PSI の電子伝達活性を見積もる場合，それぞれの活性の値を示す式に見られるよ

参考文献

うに，光の分配率（αおよび β）が含まれる．αおよび β

１) Genty,B., Briantais,J.M . and Baker,N.R. Biochim.

は，Biophys. Acta 990 (1989)P.87.
２) Klughammer,C.and Schreiber,U.Planta 192(1994)P.
261.
３) Clarke,J.E. and Johnson,G.N. Planta 212 (2001) P.
808.

1＝α＋β

(7)

の関係をもつ．そこで，αあるいは βのいずれかの値が明らかになれば，PSII および PSI の電子伝達活性を見2009 低 温 科 学

vol.67537

４章 分光測定

３．パルス変調蛍光e．二次元解析髙見 常明 ，遠藤剛

現在，海外の数社からクロロフィル蛍光測定装置と CCD カメラを組み合わせた２次元測定を目的とした装置が市販されている．ここでは，二次元測定の実際とそれを利用した光合成突然変異株の選抜について述べる．

2-D analysis of chlorophyll fluorescence
Tsuneaki Takami, Tsuyoshi Endo
Practical application ofcommerciallyavailable equipments for 2-D analysis ofchlorophyll fluorescence is shown.
Screening of photosynthetic mutants using 2-D fluorescence analysis is also presented.

3.e.1 二次元測定装置
これまでに市販されている二次元クロロフィル蛍光装

飽和閃光照射時のパラメータを記録
ROI（region of interest，装置により表現が異なるので注意）を設定している部分のクロロフィル蛍光キ

置には Imaging PAM（Walz 社），FluorCam（PSI 社），

ネティクスを表示

CF imager（Technologica 社）などがある．また自作す装置ラインナップが豊富ることも可能である．これらの装置はそれぞれパルス変調法（Imaging PAM と CF imager）ポンプ＆プローブ

・Fluo rC am：

法（FluorCam）を用いている．また解析プログラムの特蛍光誘導期，クエンチング解析ができる

徴として飽和閃光照射時の画像（パラメータ）取得を行

解析プログラムを実験者の任意で作成可能

う装置（Imaging PAM ），任意ヵ所の画像取得を行える

クロロフィル蛍光のサンプリングレート（画像取得）装置（FluorCam, CF imager）と大別できる．
二次元クロロフィル蛍光装置は，その名の通りクロロ
フィル蛍光を画像として取得し解析できる装置である．

を設定できる
ピクセルごとのクロロフィル蛍光キネティクス表示が可能

市販されている装置はあらかじめ測定に必要なプログラ

装置ラインナップが豊富でカスタマイズ可能

ムテンプレートが付属されている．ある程度測定者の任

アクセサリーが豊富意で測定系を構築でき，誰でも簡単に測定できる．注意
する点は装置によって測定に用いる光強度が％表示で・C F imag er：

あったり，デフォルト値で設定されているため実際の光蛍光誘導期，クエンチング解析ができる

強度とは異なった値であったりするため，測定前に光強解析プログラムを実験者の任意で作成可能度を確認・調整することである．各装置の特徴を以下に解析項目が充実示す．

光源に 16枚の LED パネルを使用（光源の自由度が高い）

・Imag ing P AM：

他の２機種ではできない長時間の測定ができる

クエンチング，光合成電子伝達量（光―光合成曲線）解析ができる

これらの装置は測定が自動であり難しい操作を必要と解析プログラム数は少ない

しないため，強光ストレスなどのストレス処理の評価などに有用な装置である．また Walz 社，Hansatech 社，

１) 九州大学生物資源環境科学府

PSI 社などから発売 さ れ て い る PAM ，FMS，Fluor-２) 京都大学生命科学研究科

meters などのクロロフィル蛍光測定装置とほぼ同等の2009 低 温 科 学

vol.67539

図 1：Imaging PAM による二次元クロロフィル蛍光パラメーター画像
それぞれ光化学系 最大量子収率（Fv/Fm），光強度 600μmol m s における光化学系 量子収率（φPSII），熱放散の指標である NPQ の二次元画像である．pgr5-1 はサイクリック電子伝達を欠き，チラコイド膜を介した pH 勾配が形成されにくい突然変異株である．そのため強光条件下では CO 固定に必要な ATP が不足し，その結果 φPSII が低下すると考えられている．同様に熱放散の誘導には pH 勾配の形成（チラコイドルーメンの酸性化）が必要であるため，pgr5-1 では NPQ の値が強光条件下において野生株よりも低くなる．

解析が行え，光化学系 最大量子収率（Fv/Fm），光化学

う際，crr2-2 の像を浮かび上がらせることも可能であ系 量子収率（φPSII），Non-Photochemical Quenching

り，NDH 活性欠損変異株のスクリーニングやポジショ(NPQ）などのクロロフィル蛍光から算出されるパラ

ナルクローニングを行う際に効果的である．このようなメータを二次元画像として取得できる（図 1）．また ROI

機能は市販の装置にはプログラムテンプレートの都合を設定することで画像からパラメータを算出することも上，基本的には装備されていない．任意で画像取得がで可能である．

きる FluorCam では減算することは可能であるが，カメ

最近では二次元クロロフィル蛍光装置を使った研究がラ性能が劣るため鮮明な像を得ることは難しい．

多く報告されており，強光ストレス応答や凍結・低温ス
トレス応答の評価，病原菌感染の経時応答 ，dg1 のよ

うな葉緑体形成に異常を表す変異株の評価 などに使われている．

3.e.3 二次元クロロフィル蛍光装置での測定
手順１) 暗馴化した植物にピントを合わせる ．市販の装置

3.e.2 装置の自作について
パルス変調法を必要としない二次元クロロフィル蛍光
測定装置は，光源とフィルターと CCD カメラを組み合では構造上の理由からカメラの焦点距離と光源からの照射距離が制限されてしまう．鮮明な画像を取得する
ためには一番初めにピントを合わせることが重要である．

わせることで比較的容易に自作可能である．市販されて２) 測定光を設定する．測定方式にポンプ＆プローブ法

いる二次元クロロフィル蛍光装置では画像解析結果を自を 用 い て い る FluorCam で は カ メ ラ シャッタース

動で算出するのに対し，自作した二次元クロロフィル蛍

ピードと感度を測定光と合わせて設定を行わないとク

光装置では画像取得・演算用のソフトウエアを自作する

ロロフィル蛍光が飽和してしまい正しい測定が行えな

か，画像解析ソフトを使用して画像演算を行う必要があい．

る．手間のかかる自作装置の利点はあるか？という疑問

３) 作用光・飽和閃光の設定する．多くの測定の場合，が生じるが，市販の装置と比べて検出器となるカメラを

飽和閃光は最大にしておいて問題ない．光源の角度や高性能なものを使うことが可能であるため，非常にきれ被写体との距離を自由に設定できるタイプの装置でいな画像の取得が行え，後述する光合成突然変異株の単は，視野の中心と周辺で受光量が大きく異なることが離の強力なツールとなる ．

あるので，光量を測りながら光源の角度等を微調節す

光化学系の循環的電子伝達系のひとつである NDH

る必要がある．距離が離れすぎると中央では飽和して経路の活性を欠く突然変異株で具体例を示すと，自作しいる閃光が，周辺では飽和閃光になっていないというた装置では，図 2に示すように任意ヵ所での画像取得が可能で image2 から image1 を減算することにより野生株は像が浮かび上がり，NDH 活性を欠く crr2-2 では像が消失するという画像処理が行える．また画像演算を行540

測定上の注意として市販の装置，自作の装置ともに画像演算を行い，クロロフィル蛍光パラメータを算出するため，測定中に風などで植物が動かないようにする．

二次元蛍光測定図 2：自作二次元クロロフィル蛍光装置による NDH 活性の評価
NDH 活性を欠く変異株 crr2-2 では作用光消灯後のクロロフィル蛍光の一過的上昇が起こらないため image2 から image1 を差し引くと野生株のクロロフィル蛍光のみが現れる．

状況もあり得るわけで，当然計算される蛍光パラメー

株の選抜についての紹介をする．なお当然のことながらタに信頼はおけなくなる．

光化学系や電子伝達の状態は光照射後数秒間の蛍光の初４) 解析開始．

期誘導波形にも影響を与えるため，これに着目した選抜

５) 解析終了．市販の装置であればクロロフィル蛍光か法も開発されており ，クエンチング解析に比べ測定がら算出されるパラメータが画像として自動的に算出さ短時間で済む等のメリットがあり有力な選抜法として期

れる．

待される．
3.e.4.1 材料と選抜法

3.e.4 二次元クエンチング解析による光合成
突然変異体の選抜

ここでは植物分子遺伝学のモデルとなっているシロイ
ヌナズナの幼植物を用いた実験を想定して論を進める．
選抜の母集団には，T-DNA をランダムに挿入した形質

クロロフィル蛍光を指標とした光合成突然変異株の選転換体のライブラリまたは，エチルメタンスルフォン酸

抜は古くから行われており，一般に hcf（high chloro-（EM S）等の突然変異誘発剤により変異を導入した植物

phyll fluorescence）と称され，その幾つかは原因遺伝子のライブラリを用いる．もちろん劣勢ホモの形質が現れが同定され生化学的な解析も行われている．二次元クロる世代の種子を用いる．シロイヌナズナの場合，ホルモ

ロフィル蛍光装置では様々な蛍光パラメータに着目したンを含まない組織培養用寒天培地

選抜が容易に行える．多くのパラメータのうち，最も端に滅菌種子を 50ないし 100個蒔き，発芽後２週間目程度

的に光合成活性に直結し，市販の二次元クロロフィル蛍の幼植物を対象として二次元クロロフィル蛍光装置にてを張ったシャーレ

光装置にデフォルトで計算式が組み込まれているもの
は，Fv/Fm，NPQ，qP などであり，光合成機能の欠損はこれらのパラメータを正しく測定することで，かなり詳細な情報を得ることができる．ここではこれらの蛍光クエンチング解析法のパラメータに異常を示す突然変異
2009 低 温 科 学

vol.67

M S や Gamborg の B5 等の一般的な培地レシピーの塩濃度を２倍希釈または希釈なしで使用する．培地にショ糖を1‑3％添加すると，光合成のみでは生育不可能な重篤な変異をもつ株も選抜できるが，これらは種子の採取が困難であり，その後の遺伝学的解析には不向き．

541

選抜を行う．
3.e.4.2 クロロフィル蛍光に異常のある変異株の分類
Meurer ら はクロロフィル蛍光のクエンチング解析
により，表現型を示す変異株を PSI の異常，PSII の異常，および光合成電子伝達系の異常に分類している．Shikanai ら は，蛍光パラメータに基づいた実際的な分類

HCF173(short-chain dehydrogenase/reductase)(psbA の転写後制御に関与するタンパク質）・P Q タイプ：
PAA1 (葉 緑 体 へ の 銅 イ オ ン 輸 送 に か か わ る
ATPase）
PGR3(PPR タンパク質) (葉緑体遺伝子の転写後制として，(1)high Fo，(2)NPQ 形成異常，および(3)PQ

御因子）異常に分けており，ここではその分類に従う．一般に hcf

・NP Q タイプ：の表現型を示す変異株は，実際の蛍光測定では，測定光照射下での蛍光（Fo）が高いものと，作用光照射下で蛍光レベルが時間とともにクエンチングされないものに大別される．前者は本来 Fv/Fm 値が低い変異株が，低い
Fv/Fm による PSII 機能の低下を補う適応として，葉面

PsbS(キサントフィルサイクルにかかわる PSII ア

ンテナ）
・NP Q と P Q の複合タイプ：
PGR5 (循環的電子伝達に必須なチラコイド膜タン
パク質）

積当たりの PSII の数を増やし Fo レベルが上昇したも

3.e.4.4 選抜の実際のと推定できる（high Fo タイプ）
．すなわち high Fo と

１) 15分程度以上暗適応したシャーレ内の幼植物に測は low Fv/Fm の裏返しの表現である．Fv/Fm 値は定光を照射し，Fo レベルのデータ（もしくは画像）を

P 680の近傍または酸化側の異常により低下する．また，得る．High Fo タイプはこの時点で高い蛍光を示すた

光阻害の誘発および回復過程の異常も低下の原因となめ，選抜可能．

る．さらに，光合成電子伝達系や炭酸固定等に異常があ

２) 飽和閃光を照射し Fm 値を得る．この作業は後にる場合に，酸化的ストレス条件下では光阻害が起こるた

Fv/Fm，NPQ，PQ 値を計算するために必要である．

め，Fv/Fm 値が低下する．

二次元画像で hcf 株を選抜する場合には必要ではな

作用光下で蛍光クエンチングがうまくできない突然変い．

異株は，飽和閃光を照射することにより NPQ タイプと

３) ５分間程度，作用光を照射した後，蛍光データを得（NPQ
PQ タイプに選別することができる．NPQ タイプ

る．この時点では NPQ タイプ，PQ タイプが高い蛍光が低下する突然変異株）はキサントフィルサイクルに依を示す．弱めの作用光を照射すると PQ タイプが選抜存した PSII での過剰エネルギーの熱放散機構の異常やしやすく，逆に強めの作用光を使うと NPQ タイプが光化学系 の循環的電子伝達の異常等に起因する．
一方，

選抜しやすい．両者を同時に選抜するためには，400

PQ タイプ（PQ が低下する突然変異株）は Q の還元側

μmol m s 程度の白色光が適当．NPQ タイプと PQの電子伝達または光化学系 の異常等により引き起こさタイプを区別するには，作用光照射下飽和閃光を照射れる．

し，クエンチング全体に対する NPQ と PQ の比を測

3.e.4.3 変異株の解析例

定すればよい．

以上のようなスクリーニングで得られた変異株には，

４) 以上，二次元測定により選抜された hcf 株は，表現型

光化学系や光合成電子伝達系の構成タンパク質遺伝子そを確かめるため通常の PAM 蛍光測定装置で再度クエのもの，またはそれらの発現制御にかかわる遺伝子に変

ンチング解析を行う必要がある．二次元測定では high

異を持つと考えられる．以下に最近報告された各タイプ

Fo タイプと PQ タイプの区別は難しいことが多い．この突然変異株の原因遺伝子がコードしているタンパク質

れは測定光による反応中心の励起と蛍光放出が無視でについて解説する．

きないためで，両者を区別するためには，通常の PAM
測定の際に赤外光のバックグランドのもとで Fo を・Hig h Fo タイプ：HCF60(RPS 17) (トウモロコシ葉緑体リボゾーム
サブユニット）PsbO2 (アブラナ科特有の２つ目の PsbO イソタン
パク質）
RnaR1 (葉緑体リボゾームの発現制御に機能する
RNase）
542（正しく）測定する必要がある．また，PQ の低下は，
NPQ の 低 下 を 招 く こ と が 多 い た め，PQ タ イ プ と
NPQ タイプの分別も典型的なものを除くと難しい場
合が多い ．PQ タイプの変異の場合，P 700の酸化還元測定を併用することにより，光合成電子伝達系の変異（または異常）の位置を推定することができる．
５) T-DNA の挿入位置の決定やポジショナルクローニ
二次元蛍光測定ングで原因遺伝子を同定するとともに生化学的，遺伝

７) T.M urashige, & F.Skoog,Physiol.Plant.15 (1962)p.

学的解析を行う．遺伝子の同定が済めば，光合成電子473.
８) O.L.Gamborg, R.A.Miller, & K.Ojima, Exp. Cell

伝達系や炭酸固定の構成成分の遺伝子が原因遺伝子の場合は，比較的簡単に決着がつく場合が多いが，葉緑体の遺伝子発現に関わる核支配の制御遺伝子であった
場合には，遺伝子同定から先の研究が正念場になる．

(1996)p.385.
10) N.P.Schultes,R.J.H.Sawers,T.P.Brutnell,& R.W.
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543

４章 分光測定

４．酸化還元滴定
永島 賢治
電子伝達反応の向きと速度は，供与体と受容体それぞれの電子親和性の違い，すなわち酸化還元中点電位（E ）の差に大きく依存する．この酸化還元中点電位を実験により求める方法として酸化還元滴定がある．本章では化学的方法による酸化還元滴定を中心に紹介する．

Redox titration for electron transfer proteins
Kenji V.P.Nagashima
Redox midpoint potential is an important factor as a determinant of the direction and the rate of electrontransfer. Here,methods of titration to determine the redox midpoint potentials of electron transfer proteins aredescribed.

化剤・還元剤を加えながら酸化還元状態を少しずつ変え

4.1 はじめにていく方法で，電極を使って酸化還元電位を測定しなが細胞内での電子伝達反応機構を調べるにあたって，電ら分光測定を行い，サンプルの状態をモニターして E

子供与体と受容体の電子の「渡し易さ」「受け取り易さ」を求める．本章では主にこの化学的方法による酸化還元を知ることは極めて重要なことである．この電子の授受

滴定の実際について解説する．また，近年では電極で直の起こり易さを表す尺度として酸化還元電位がある．単接的に酸化還元状態を制御する方法（電気化学的方法）

位はボルト（V）で，定義としては標準水素電極におけるも用いられるようになってきているので，この事にも簡H ＋e

単に触れたい．

1/2H の反応に伴う電極電位を 0V とした時，対象となる電子の受け渡し反応（酸化還元反応）が示す電極電位のことで，これを標準酸化還元電位（E ）と呼ぶ．酸化還元反応は周囲の pH の影響を強く受ける

4.2 電極が，実際の生体反応を考える上では pH 7の時の E を考

酸化還元電位の測定に用いる電極は ORP 電極と銘えることがほとんどであり，この時の標準酸化還元電位

打って市販されているもので，これは基準電極と作用電

はEʼ
または E

あるいはさらに省略して E などと表極をひとつにまとめた複合電極である．定義に従えば基現される．ちなみに pH 7の条件下では上述の水素の酸

準電極は水素電極とするのが自然であるが，ほとんどの化還元反応は−0.42V となる．

製品では基準電極（比較電極）として銀―塩化銀（Ag/

大まかな理解としてはある電子伝達成分が pH 7の緩AgCl）電極を使用している．作用電極は白金である．

衝液中で半量が酸化型，半量が還元型となっているとき

ORP 電極は pH メーターに接続して使用する．たいての電極電位（E ）がその成分の酸化還元能を表している

いの pH メーターは電極電位をそのまま mV 表示すると考えて差し支えない．光合成研究の論文ではこの値を

モードを備えているのでそれを利用する．注意すべきこ

酸化還元中点電位（redox midpoint potential）と表記し，とはこのとき表示される電位は使っている基準電極に対

記号では E を使うことが多い．一般には単に酸化還元する電位差であることで，この値を水素電極に対する電電位とだけ表記することもある．

位差に換算してやる必要がある．基準電極が銀―塩化銀

酸化還元滴定は E を実験により求める手法であり，電極であって，かつ電極内部液として飽和 KCl を使用しDutton によって確立された化学的方法が広く用いられ

室温（25℃）で測定する場合，水素電極に対して＋197mVてきた ．これは目的とするサンプルを含む緩衝液に酸の差が生じる．水銀―塩化水銀を使ったカロメル電極（甘コウ電極）
を基準電極とした場合，この差は＋241mV と

１) 首都大学東京

大学院

理工学研究科生命科学専攻なる．

細胞エネルギー研究室

2009 低 温 科 学

vol.67545

4.3 測定容器

溶液の酸化還元平衡を安定に保つため容器内の酸素を除去する必要がある．これはニードルを通して窒素ガスや図１に執筆者らが酸化還元滴定に使用している測定容

アルゴンガスを常に通気することで達成する．容器内が器を示す．1cm 角のガラスキュベット上部に湾曲した液

完全に密閉されている場合はガスを排出するためのニー溜め部を持ち，そこに内径 18mm の開口部がキュベッ

ドルをもう一本追加する必要があるが，図１の装置の場

トの直上に，内径 15mm の開口部がやや角度を付けか合ではモーター部分の𨻶間から抜けるのでその必要は無

つキュベット直上に向けて二つ備えられている．15mm

い．ガス置換で気を付けたいのは，これらのガスがたいの開口部の片方にはゴム栓を介して電極を取り付け，もてい乾燥していることで，長時間の測定では試料溶液がう片方の口にはガス置換用のニードルをやはりゴム栓を濃縮される可能性が有る．そのため執筆者らは図にある介して装着している．この口は試薬を加えるときにも使ようなトラップを設け，窒素ガス等を蒸留水に通気して用する．直上の開口部には攪拌用のモーターを取り付けから測定容器へ導入している．このトラップは気泡の出てある．モーターは乾電池で作動する模型用のもので，方を見ることでガス流量モニターとしても利用できる．

直径 9mm ほどの穴を空けたゴム栓を貼り付けて容器

ここで紹介した測定容器は酸化還元滴定法の草分けでに装着している．モーター軸は切ったスパチュラ等（直ある Dutton らが使用したものに基づいた一例である．

径 2mm）で延長し，ゴム栓の穴を通じて溶液部まで伸び

市販はされていないのでガラス器機業者に特注することている．その先端は平たく，さらにヒネリを加えることになる．重要なのは(1)試料溶液を嫌気条件下に保つこと

で攪拌効率を上げているが，作動時に電極を叩かないよが出来る(2)試料溶液を随意に攪拌できる(3)使用する分

う微調整が必要である．攪拌が強すぎると溶液が泡だっ

光測定機器への装着に支障が無い，の３つの条件を満たて測定に悪影響を与えるので，モーターと電池の間に 10

すことである．

オーム程度の可変抵抗を入れ，回転数を調節できるようにしておくと良い．電極は試料溶液に対しやや斜めに浸かることになるので液絡部が水面上に出ないよう深さや向きに注意しなければならない．酸化還元滴定では試料4.4 溶液組成測定するサンプルは精製した電子伝達タンパクまたは

図 1：酸化還元滴定における測定用キュベットのセットアップ例

546

酸化還元滴定によるE の決定クロマトフォア等の膜標品となるが，これらの物質と電ファーもしくは 10mM M OPS バッファーである．また，極の間に速やかでかつ安定した酸化還元平衡を成立させ場合によっては違う pH で測定することが効果的なことるために電子のやり取りを仲介する低分子化合物を加えがある．対象となる物質の E が低すぎたり高すぎたりておく必要がある．これら電子伝達を仲介する化合物をして測定が困難なときは pH 1ユニットあたり 60mV

メディエーターと呼び，主なものを表 1にまとめた．各

変化することを逆に利用して，測定しやすいレンジにメディエーターはそれ自体が酸化還元反応を行う物質で持ってくることが出来る．ただし覚えておきたいのは測あり特有の E を持っている．一つのメディエーターが

定対象物質が溶液に露出しているかペプチド等に囲まれ平衡の安定化に寄与する E の範囲は限られており，おて溶液から隔離されているかで pH による影響が変わっおよその目安としてその E の前後 100mV 程度だと考てくることである．もちろん隔離されていれば pH 変化

えるとよい．従って酸化還元滴定を行う際には，自分のをほとんど受けないことになる．逆にこのことを上手く測ろうとする E レンジをいくつかのメディエーターを利用すると pH7での E が近接した２成分をバッファー

組み合わせてカバーするように考えなければならない．

の pH を変えることで見分けられるかもしれない．

また，メディエーターの中には特有の波長に吸収帯を持

溶液の酸化還元電位を変えるための酸化剤としては

ち，それが酸化還元状態に応じて変化する場合があるの

フェリシアナイド（フェリシアン化カリウム），還元剤とで，分光学的に滴定を行う場合はメディエーターの吸収してはジチオナイト（ハイドロサルファイトナトリウム）変化が測りたい物質の吸収帯と重ならないように考慮すがよく使われる．還元剤としては他にもジチオスレイる必要がある．執筆者が光合成細菌のクロマトフォアをトールや，100mV 程度以上の範囲を測定する場合には使ってチトクロムの酸化還元滴定を行う場合を例に取る

アスコルビン酸なども使われる．滴定を行う際にはこれと， DAD 20μM ， Fe-EDTA 50μM ， PM S 5μM ，らの酸化還元剤を電極電位をモニターしながら適量ずつ

Pyocianin 5μM ， Hydroxy-1,4-naphthoquinone 10

加えていくことになるが，1，10，100mM 程度に濃度を

μM ，Vitamin K3 20μM の組み 合 わ せ で，お お よ そ

分けて溶液を作っておくと使い勝手がよい．ジチオナイ−200mV から 450mV の範囲で測定を行っている．

ト溶液は空気との接触による自動酸化が速いので，測定

酸化還元反応は先にも述べたとおり pH の影響を大きの度に作り直す．ジチオナイトの場合は小試験管に粉末く受ける．後の章で説明するネルンストの式に従えば，を少量（10mg 程度）入れ，洗瓶で蒸留水を静かに注いで溶液の pH が１ユニット上昇すると E は−60mV 変化

やれば溶液上方に向かって薄くなる濃度勾配が出来るのすることになる．従って測定溶液は十分な緩衝能を備えで，適当な層から溶液を吸い取りながら使うと便利であていなければならない．基本的には pH 7で測定する事る．

が多い．執筆者がよく利用するのは 50mM リン酸バッ
表 1：酸化還元滴定でよく使われるメディエーター

2009 低 温 科 学

メディエーター名（カッコ内は通称または略称)

E

Ferrocene carboxylic acid
Potassium ferricyanide
1, 1ʼ-Dimethylferrocene
N, N, Nʼ
, Nʼ
-Tetramethylphenylene diamine（TM PD）
2, 3, 5, 6-Tetramethylphenylene diamine（diaminodurol or DAD)
2, 6-Dichlorophenol indophenol（DPIP）
1, 2-Naphtoquinone
Trimethylhydroquinone
Fe-EDTAN-M ethylphenazonium methosulfate（PMS）
N-Ethylphenazonium ethosulfate（PES）
2-M ethyl-1, 4-naphtoquinone（Vitamin K or Menadione）
N-M ethyl-1-Hydroxyphenazonium methosulfate（Pyocanine）
2-Hydroxy-1, 4-naphtoquinone
Anthraquinone-2-sulfonic acid
Benzyl viologen dichloride
Methyl viologen dichloride hydrate＋530mV＋430mV＋340mV＋260mV＋260mV＋217mV＋145mV＋100mV
＋96mV
＋80mV
＋55mV
0mV
−34mV
−145mV−225mV−350mV−440mV

vol.67547

4.5 測定
１．測定容器にまずバッファーのみ（10ml 位）を入れ，

ディエーターの種類と濃度は過去の文献を参照し，その条件下の各 Eh レンジで酸化還元平衡がどんな挙動を示すか体得しておくことが重要である．

電極，攪拌子，ガス置換用ニードルをセットする．窒酸化還元滴定は，ある程度慣れていても時間の掛かる

素ガスまたはアルゴンガスを通気しながら 20分程度作業である（フェリシアナイド／ジチオナイトを使った

バッファーを攪拌し，嫌気状態を確立する．

広い E レンジの測定だと約半日から全日）．その間，サ２．サンプルとメディエーターを入れる．サンプルは濃ンプルが変性していないか，アグリゲーションを起こし度の高いものを少量入れるようにし，メディエーター

ていないか，時々測定容器を取り出してチェックする必も終濃度の 1000倍程度に調整したものをストックと要がある．また，面倒であっても酸化→還元（reductive

して使うようにする．なおメディエーターの中には水

titration）と還元→酸化（oxidative titration）の両方向に溶けにくいものも多く，その場合ストック液はエタとも滴定すべきで，論文の投稿の際などでもしばしばこノールで作る．

の事が求められる．両者の一致性が低い場合，電極とサ３．酸化剤または還元剤を加え，容器内の酸化還元電位を高低いずれかに振っておく．

ンプルの間で充分な酸化還元平衡が得られぬうちに測定していることが疑われる．

４．測定容器を分光光度計にセットし測定を開始する．
滴定中も常にガスを通気しておくが，液面が揺れるほど過度に吹き付けないこと．攪拌も続けるが，スペク
トル測定時には一時的に止める．

4.6 データ処理
測定作業の次に，得られたデータをグラフ上にプロッ５．酸化剤または還元剤を極少量加えて酸化還元電位をトし E を求める．横軸は水素電極を基準とした電極電変える．10μl 容量のガラスシリンジで加えるのが望ま

位（E ），縦軸に吸光度変化量をとるのが一般的である．

しいが，キャピラリーチップを装着した小容量のピ

図 2に例として紅色光合成細菌 Rhodovulum

ペットマンでも可．いずれにせよ測定容器に差し込む

philum から単離・精製したチトクロム c を用いた滴定

前にキムワイプ等で外側に付着した余分な溶液をふき結果を示す．ここでは α帯のすそ野（540nm および 570

取っておくこと．

を結んだ線をベースラインとし，551nm のピークまnm）

sulfido-

６．目安として 10mV ほど電位が変化し，容器内の酸化での吸光度差を縦軸にプロットしている．図 2から読み還元平衡が安定したところで分光測定する．この「安とれるようにグラフはシグモイド曲線を描く．この曲線定した」という判断をいつ下すかが難しいところで，の上端（還元型）と下端（酸化型）の漸近線のちょうど

例えば１分間待っても電位の変動が±1mV 以内であ中間に線を引き，曲線と交わる点が E 値ということにるなど具体的な判断基準を作っておくと良い．

なるが，普通はコンピューターを使ってネルンストの式

７．手順５と６を繰り返し，目的とする範囲まで測定を続ける．
酸化還元滴定は根気のいる作業である．酸化剤・還元剤を加える時，どれだけの量を加えれば望むだけの電位と呼ばれる理論式に当てはめ，線形回帰させたうえで求める．
ox
ネルンストの式：E ＝E ＋ RT ln
nF
red

(1)

変化が起こるか予想するのは困難で，メーターの表示を

ここで R は気体定数，T は絶対温度，n は反応にあず

見ながら慎重に作業しなければならない．ある E レン

かる電子数
（チトクロム c の場合は１），F はファラデー

ジではシリンジの針先が溶液に触れただけで電位が大き定数である． ox / red は酸化型と還元型のモル比を示

く変わったり，またあるレンジでは大きく変化してもすしており，E は電極電位，E は標準酸化還元電位つまりぐに元の電位まで戻ってきたりする．こうした経験に基今求めようとする E にあたる．この式を図 2のデータ

づいて，使用するメディエーターの組み合わせや濃度がに合わせて横軸（x）を E (mV），縦軸（y）を差吸光度決まってくる．単純にその種類を増やしたり濃度を高くとし，さらに各定数（温度は 25℃とする）も代入して表すれば良いというものでもない．信頼性のあるデータを現すると得るにはある程度「慣れ」が必要である．初めて酸化還元滴定に挑む場合，いきなり大事なサンプルを使うので

y＝a1＋exp 0.039 x−E

＋b

(2)

はなく，まずは入手し易く性質のよく分かっている馬心と表すことが出来る．ここで a はシグモイド曲線の上端

臓チトクロム c 等を使って練習すると良い．加えるメと下端の差，つまり吸光度の変化量を，b はシグモイド曲

548

酸化還元滴定によるE の決定図 3：紅色光合成細菌 Blastochloris viridis の反応中心結合型４ヘムのチトクロム c の酸化還元滴定
測定サンプルはバクテリオクロロフィル濃度が 40μm となるように調製した光合成膜標品（クロマトフォア）である．
Nagashima らの報告 から一部改変して転載．

で表される．図３にこのような例として４つの c 型ヘムを含む紅色光合成細菌 Blastochloris viridis 反応中心結合型チトクロムサブユニットの滴定データを示す．ここでは n＝5として計算を行っているが，そのうち最も E
図 2：紅色光合成細菌 Rhodovulum sulfidophilum から精製
した膜結合型モノヘムチトクロム c の酸化還元滴定
Ａ．E を変えていった時の α吸収帯のスペクトル変化．Ｂ．
α吸収帯の吸収変化量を E に対してプロットした結果．
Kimura らの報告 から一部改変して転載．

の高い成分（400mV 付近）はスペシャルペアによるものである．
本章で例示したのは与えられた酸化還元平衡状態における電子伝達成分の吸収スペクトルを記録していくいわ
ゆる dark titration であるが，閃光照射に伴う吸収変化

線下端が示す吸光度（ベースライン）を示す．執筆者らを測定して滴定を行う場合もある．吸収スペクトルが測は自作のプログラムによって線形回帰を行っているが，りにくい反応中心のキノン・アクセプターを，電子供与

市販のデータ解析ソフトウェア（Origin Lab 社 Origin体となるスペシャルペアや結合チトクロムの光酸化量になど）を利用しても同様の計算が出来るものと思われる．

よって滴定する場合などがそれにあたる．また，滴定を

図 2で示したチトクロム c は電子の授受を行う成分

目的とせずとも特定の酸化還元平衡状態での電子伝達反としてヘムを一つだけ含む単純な例であるが，電子伝達応を測定するメリットは大きい．こうした閃光照射／時

タンパクの多くは複数の電子伝達成分を持つ．n 個の成間分解分光測定を行う際に気を付けたいのは，メディ分を含み，かつそれらの E が同じである場合，（2）式のエーターによってはサンプルへの電子伝達が非常に速指数部分にある 0.039に n を乗じる．例えば電子伝達成

く，閃光照射後の酸化・還元速度を測りたい時などメディ分を一つ持つタンパクのホモダイマーであれば 0.039

エーターによる反応が無視できなくなることである．こx 2＝0.078を適用することとなり，描く曲線の傾き部分のことは特に PMS や DAD などを 使った 場 合 に 顕 著は急になる．複数の電子伝達成分それぞれの E に違いで，紅色細菌の膜を使った閃光照射実験では測定する Eがある場合は（2）式を加算することになる．この場合 nにもよるが数 10ミリ秒のオーダーで反応中心結合チト個の成分があるとするとクロムへの電子伝達が見られる．一方で電子の授受が遅

a1
1＋exp 0.039 x−E 1
a2＋
1＋exp 0.039 x−E 2
an＋1＋exp 0.039 x−E nいメディエーターの場合，測定間隔に注意を払う必要がy＝2009 低 温 科 学

vol.67ある．測定データを積算する際などは特に，平衡が元に＋…

(3)戻るまで充分な間隔を取ることが大切である．

＋b

549

図 4：電気化学的方法による酸化還元滴定で用いられる測定セルの例
フランス IBPC-CNRS の Alric 博士から執筆者への提供資料より，許可を得て転載．

4.7 電気化学的酸化還元滴定
実際の測定を行う上での酸化還元電位は，基準電極とム等はこれで充分測定できる．しかし酸化還元物質が２つ以上となるとそれぞれを見分けることが出来ず，近年
はポテンショスタットに光学系を組み合わせた測定が行作用電極の間に生じる電位差によって表されるというこわれるようになってきた．図 4にそのような測定で使とはすでに述べた．このことを逆にとらえれば，電極間われる特殊なセルの一例を示す．このセルは光を通す材の電位を制御することができれば測定溶液中の酸化還元質で出来ており，作用電極は極めて薄い金メッシュであ状態を任意に調節できることになる．ポテンショスタッ

る．サンプルはその表面に 0.1mm ほどの厚みを持ってトというのがそのための装置であり，電極間の電位を任配置され，電極との間の平衡が素早く均一に成立するよ

意の値に調節し，その時の電極間に流れる電流値を測る

う考慮されている．測定光は作用電極を通過して検出さように作られている．つまり電位を変化させていったとれることとなる．

きに，溶液中の電子伝達物質が電極との間で電子のやり取りをすれば電流値が変化するので，それをモニターすることで E を推定することが出来る．ここでは詳しい
説明はしないが，その原理や特性について加藤らの解説が分かりやすいので参照されたい ．
酸化還元剤を用いる化学的な方法に比べ電気化学的方法が優れているのは測定レンジの広さである．化学的方法でよく酸化剤として使われるフェリシアナイドは 450
mV，あるいはせいぜい 500mV 程度までしか電位を上げることが出来ないが，電気化学的方法ではそのような限界は無く，これは反応中心のスペシャルペアのようにE が高い色素団の測定に極めて有利である．電位の制御も化学的方法のような手技的な〝熟練" は必要無いので，その点も有利である．
電気化学的な酸化還元滴定で最も単純なやり方はポテ

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ンショスタットのみを使う方法で，モノヘムのチトクロ

550

酸化還元滴定によるE の決定

４章 分光測定

５．電子伝達活性沈

建仁

光合成の電子伝達反応は，光化学系

において光照射により水を分解し，得られた電子をチトクロム

b /f 複合体を経由して光化学系 に伝達し，最終的に NADP（NAD）を還元することで終結する．
この電子伝達系全体の活性は，電子供与体である水の分解によって放出される酸素量を酸素電極で測定するか，電子受容体である NADP
（NAD）の還元を分光学的に追跡することにより行われる．一方，
電子伝達系の反応機構や外部因子による影響を調べるためには，水や NADP
（NAD）以外の，人工的な電子供与体及び受容体を加えることによって起こる部分反応を解析することが必要である．また，
チラコイド膜を可溶化し，系
たは系

及び系

粒子を調製することが簡単にできるので，単離された系

ま粒子の活性は，やはり外部から電子供与体／受容体を供給して測定する必要がある．これらの解析方法の多くは酸素電極，分光・蛍光測定を用いて行われるが，分光・蛍光測定は第２，第３節で述べられているので，ここでは酸素電極の原理と測定の実際にについて述べるとともに，部分反応の解析に用いられる主な電子供与体・受容体を紹介し，さらに阻害剤や光化学系 の各種処理法について概説する．

Electron transfer mediators and inhibitors
Jian-Ren Shen
The principles and practical applications of oxygen electrode in photosynthetic research were described.
Subsequently, various artificial electron transfer donors and acceptors useful for measuring photosynthetic
electron transfer activities were described. Finally, various inhibitors of the electron transfer chain, together
with the treatments leading specifically to the deactivation of oxygen evolution were mentioned.

5.1.1 酸素電極の原理

5.1 酸素電極

酸素電極の陽極（銀）はあらかじめ飽和 KCl 溶液に浸光合成活性を調べるための各種測定法の中でも，酸素しておき，陰極（白金）との間に薄い電解質（通常 KCl）

電極による酸素発生活性測定は比較的安価な装置で行うでつないでおく．電圧印加により，陽極と陰極でそれぞことができ，しかも酸素発生反応は光合成の最も特徴的

れ次の反応が起き，電流が流れる．

な反応であるので，この反応の活性を測定することは光

一定電圧をかけたときに流れる電流は，陰極での電解合成研究に不可欠である．酸素電極は，光合成による酸素発生の量のみでなく，電子受容体との組み合わせによって起きる酸素吸収量も測定することができ，電子伝
達鎖全体，あるいは系，系 の活性を個別に調べることができる．現在，光合成研究に使われる酸素電極はほ
とんどポーラログラフ方式のものであり，中でもクラーク型と呼ばれる酸素電極が最もよく使用されている．以下クラーク型酸素電極の原理と液相中での使用法について述べる．気相での酸素電極の使用については第２章を参照すること．

１) 岡山大学大学院自然科学研究科

2009 低 温 科 学

vol.67551

光による酸素濃度変化に対応する電圧変化を記録する．
これによって記録計のレンジを拡大して測定できるようになる．逆電圧をかける装置はオフセットまたはバッキ
ング装置と呼び，その回路を図 5.2B に示した．バッキ
ング回路が付いた記録計も利用可能である．また，記録計の代わりに信号をコンピュターに取り入れ，それをデジタルデータとして記録・保存する A/D コンバーター，
ソフトウェアも発売されている．
酸素電極の陰極は他の陰イオンとも反応し電流を流してしまうので，クラーク型電極ではその表面をテフロン
膜など，酸素は通過するが他のイオンは通過しない膜で覆うことで，電極液（反応液）と測定液を分離している．
図 5.1：酸素電極の印加電圧と流れる電流（電圧に変換）の関係

実際には測定液の酸素濃度と平衡状態にある反応液の酸素濃度を測定することになるので，測定時には十分な攪拌が必要である．クラーク型の酸素電極は市販のものと質反応の速度，すなわち，酸素濃度に比例するので，こして，ランクブラザーズ，ハンザテック社などのものがの原理を利用して，光照射による試料中の酸素濃度の変あり，筆者の研究室ではハンザテックのものを使用して化を測定する．このためには，印加電圧が変化しても流いる．その電極と測定セルを図 5.3に示す．

れる電流が一定であることが望ましい．
印加する電圧（電クラーク型電極は連続光照射による光合成試料の酸素極電圧）と流れる電流（電圧に変換）の関係を図 5.1に発生を測定するのに十分な感度を有しているが，閃光照示す．電極電圧が 0.4‑0.9V の間で流れる電流がほぼ一射による微量の酸素を検出するには感度が不十分であ定であるので，この間で流れる電流が溶存酸素量と比例る．このため，陰極の電極面を大きくし，感度を向上さすることになる．従って電極電圧は，通常多少の変動がせた Joliot タイプ電極が作られているあっても流れる 電 流 が 変 動 し な い 領 域 の 中 央 値，約ことで閃光照射による酸素発生量の振動パターンや，

0.60〜0.65V を使用する．

Mn クラスターの S ，S 状態の寿命を測定することがで酸素電極にかける電圧と信号取り出しのための電気回路を図 5.2A に示す．可変抵抗Ｒ１は電極にかける電圧．これを用いるきる．
5.1.2 酸素電極使用の実際の調整用，R 2は酸素濃度に比例して流れる電流を電圧

電極反応は温度に非常に敏感であり，また，水の溶存に変換し検出するのに用いる（ゲーン調整用，電極電圧

酸素量と試料の光合成速度も温度に依存するので，測定の調整にも使われる）．
得られた信号は増幅器で増幅して液の温度を一定に保つよう，恒温水で反応容器の周りをモニターするが，通常は飽和酸素濃度に対して光合成反循環させる必要がある．市販の反応容器は恒温水が循環

応による酸素量の変化が小さいので，酸素電極から取りできるようになっているが，恒温水循環装置を別途用意出した電圧に対して，溶存酸素量に匹敵する一定の逆電する必要がある，恒温循環器とセットした反応容器もハ

圧をかけることによってこの分の電圧をキャンセルし，

ンザテック社から発売されている．光照射による電極の図 5.2：酸素電極（A）とバッキング装置の回路図（B）

552

電子伝達担体と阻害剤

図 5.3：ハンザテック社の酸素電極．A．酸素電極本体；B．電極を装着した測定セル．

温度上昇を防ぐ必要もある．そのため，光源からの光をい．磨いた後は液体洗剤または水でよく洗ってすすい

5‑10cm の水槽または熱線カットオフフィルター，及びでおく．

赤外線フィルターを通して使用する．

２．乾いた陽極（Ag）の回りに O リングをセットし，陽回転子の速度も電流値に影響を与える．回転子の速度

極と陰極の上に飽和 KCl を数滴ずつたらす．円形にが小さいと，電流値が小さく，回転子の速度を増加させ切ったタバコ紙をのせ，陰極（Pt）の上に１滴の飽和ると，電流値も増加し，やがて一定になるので，この一KCl をたらし，タバコ紙より若干小さく切ったテフロ

定になる回転速度を使用する．回転速度をさらに大きくン膜を重ね，O リングをのせ，その上からアプリケー

すると，過度の攪拌によるノイズが生ずる恐れがある．

ターを用いて O リングがフィットするようにセット

一定温度での水の飽和酸素濃度を表 5.1に示す．流れする．

る電流は基本的に溶存酸素量に比例するが，電極の汚れ

３．セットした電極をサンプルホルダーにフィットさ

その他の原因により，溶存酸素量が O でも一定の電流がせ，水漏れがないようしっかり固定する．電極のリー

流れる．測定の前には酸素が O と飽和濃度に対応する電ド線をつなぎ，反応容器に水を入れ，攪拌しながら電流値（電圧に変換）をチェック（キャリブレーション）

流値（電圧）が安定するまで待つ．通常は 30分−１時

しておく必要がある．以下酸素電極の用意とそのキャリ間で電極が安定するが，場合によっては１日待つこと

ブレーションについて述べる．

もある．この場合はテフロン膜のセットは測定の１日前から行っておく必要がある．

酸素電極のセット

４．テフロン膜のセットがうまくできているかどうか

以下ハンザテック社のものを例に説明する．ランクブ

は，以下に示すキャリブレーション時に，信号のノイラザーズ社のものについても基本的に同じである．

ズは十分小さいか，異常なドリフトはないか，ジチオ

１．長時間使用した電極の表面は汚れが溜まっている可ナイトを添加したときの酸素濃度の減少速度は適当か能性があるので，よく洗ってから乾かしておく．電極（通常は数秒で最小値まで減少する）などで判断する．

を傷つけないよう洗剤で洗うのもよいが，汚れがひど

一旦セットしたテフロン膜は乾かさないよう常に水溶い場合は，専用の粉末洗剤で電極表面を軽く磨くか，液に浸しておく．きちんとセットしたテフロン膜は１

粉末洗剤の代わりに，やわらかい歯磨き粉で磨くとよ

週間程度そのまま使用できる．長時間使用しない電極

表 5.1：１気圧の空気と平衡になった蒸留水中の酸素濃度（飽和酸素濃度)2009 低 温 科 学

温度（℃）

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

酸素濃度 (μM )

442

386

341

305

276

253

235

220

206

192

176

vol.67553

は，よく洗ってから乾燥状態で保存する．
キャリブレーション
１．恒温水槽を測定温度に設定する．測定用バッファー
も恒温槽に入れ，測定温度に保っておく．

5.2 電子受容体と供与体
細胞や〝intact"葉緑体の場合は，CO （NaHCO ）を
電子受容体として電子伝達鎖全体の活性を酸素電極で測定することができる．一方，単離したチラコイド膜，系

２．測定セルに適当量の水を入れ，攪拌しながら空気を，あるいは系 標品を用いた場合，あるいは電子伝達

取り込み，出力電圧が一定になるまで待つ（通常５分の部分反応の活性を知りたい場合，外部から各種電子受から 10分）．この電圧値が設定した温度における，空容体及び供与体を加えて測定する必要がある．外部から気と平衡した水の飽和酸素濃度に対応するものであ与えられた電子担体は主に(1)酸化還元電位，(2)反応部

る．

位への接近の容易さによって電子伝達鎖のさまざまな成

３．ジチオナイト（Na S O ）をミクロスパーテルで少量分と反応する．電子供与体と受容体を同時に加えて測定

加え，ふたを水面との間に空気層がなくなるまで挿入する時には，供与体と受容体同士で起こりうる化学反応

し，電圧が下がるのを待つ（数秒〜１分程度）．電圧がに注意する必要がある．全電子伝達鎖，及び光化学系 ，十分下がり，安定したらその値を酸素濃度 O の時の出系 に使われる主な供与体，受容体の作用部位を図 5.4

力電圧とする．この電圧値と飽和酸素濃度の電圧値とに示し，その使用例を表 5.2に示した．

の差が，設定温度の飽和酸素濃度（例えば，25℃の場
合は 253μM ）に相当する．

どの供与体，受容体を使用するかは，使用する試料の種類，測定したい部分反応によって決まる．一般に，細４．ジチオナイトを十分洗い落とす．ハンザテック社の胞，〝intact"葉緑体には細胞膜，葉緑体包膜があるため，専用ソフトウェアを使用する場合は，再度水を充塡し脂溶性のキノン類は反応部位に到達することが可能で使てから飽和酸素濃度の電圧値を測定し，その値は自動用できるが，水溶性の電子担体は使用できない．これら

で酸素濃度に変換される．

の試料では光リン酸化と共役しており，M g，ADP，Pi を添加しないと電子伝達速度が低いが，1‑2mM NH Cl の

実際の測定

ような脱共役剤の添加により活性が著しく増加する．チ

１．キャリブレーション終了後，測定セルの水をアスピ

ラコイド膜は系 と系 の受容体側がストロマ側に露出

レーターあるいは先端を柔らかいシリコンチューブでしているので，それらの部位で電子を受け取ることがで保護したパスツールピペットで吸い取り，全量 2ml にきる受容体は使用できるが，ルーメン側に存在する系

なるように，測定セルにバッファー，電子受容体，試と系 の電子供給側で電子を供給するには，膜を通過す

料の順に加え，空気層がなくなるまでふたを挿入する．

ることが可能な脂溶性の供与体は機能を果たすことがで

２．スターラーを回転し，記録計をスタートさせ，出力きるが，水溶性の供与体は使用できない場合がある．

信号（電圧）が安定になるまで待つ（1−2分程度，こ反応液の組成や pH も試料に応じて選択する必要があ

れより長くなると，試料の失活を考慮する必要があ

る．一般に葉緑体やチラコイド膜における電子伝達鎖全る）．

体の活性や単離した系 の活性は至適 pH が７〜８であ３．測定セルに飽和光を照射し，1−2分ほど測定したるが，系 にとっての至適 pH は 6.0‑6.5である．電子伝後，光照射を止め，暗黒のまましばらく記録計を動か

達鎖全体の活性は特にイオンを必要としないが，通常

し続け，光照射を止めた後の電圧が安定かどうかを確

5‑10mM MgCl ，10‑20mM NaCl の存在下で測定する

認する．

ことが多い．一方，系 の酸素発生複合体には Ca ，Cl

４．光照射を ON した直後の電圧信号の傾きから，酸素イオンが結合しており，これらのイオンは遊離しやすい発生の活性（μmoles O /mg chl/ml として表す）を計ので系 の酸素発生活性を測定する時は Ca ，Cl イオ

算する．光照射前と照射後の電圧信号（ベースライン）ンを添加して行う．特にシアノバクテリアではチラコイが一定でなければ，それらの傾きも計算に入れる．

ド膜でも Ca ，Cl イオンの存在下で測定した方がよ

５．測定セルの試料を捨て，蒸留水で数回，テフロン膜

い．

を傷つけないようセル内を洗浄し，蒸留水で満たして光照射は，光強度に対する光合成活性の依存性を解析保管する．長期間（１週間以上）使用しない時は電極する以外は飽和光を用いなければならず，市販のハロゲを解体し，乾燥状態で保管する．

ンランプを光源とした「コールドライト」などが利用できる．
「コールドライト」と言っても強い光強度下ではか554

電子伝達担体と阻害剤

図 5.4：光合成電子伝達系と主な電子受容体，供与体の作用部位．矢印は電子の流れを示し，破線は電子受容体または供与体への電子の受け渡しを示す．矢印のない破線は電子の流れが必ずしも確定されていないこと，あるいは電子伝達の速度が必ずしも最適でないことを示す．略語：DPC,dephenylcarbazide;DCIP,2,6-dichlorophenolindophenol;Fecy,potassium ferricyanide;M V,
methyl viologen (paraquat);PMS, phenazine methosulfate;TM PD, N, N, Nʼ, Nʼ
-tetramethyl-p-phenylenediamine.
表 5.2：代表的な電子受容体と供与体の使用例
略称

名称

作用部位と機能

溶媒

使用濃度

ストック濃度

炭酸水素ナトリウム

sodium bicarbonate（NaHCO )全電子伝達鎖受容体

水

5mM

2M

NADP

nicotinamide adenine
dinucleotide phosphate

全電子伝達鎖受容体

水

0.2mM

20mM

DCBQ

2, 6-dichlorobenzoquinone（2, 5-dichlorobenzoquinone)

PSII 受容体

エタノール 0.4‑1.0mM

40mM

DMBQ

2, 6-dimethylbenzoquinone（2, 5-dimethylbenzoquinone)

PSII 受容体

エタノール 0.4‑1.0mM

40mM

PPBQ

phenyl-p-benzoquinone

PSII 受容体

エタノール 0.4‑1.0mM

40mM

DCIP

2, 6-dichloroindophenol

PSII（PSI）受容体

水0.1‑0.2mM

20mM

Fecy

potassium ferricyanide

PSII（PSI）受容体

水

1‑2mM

200mM

MV

methyl viologen

PSI 受容体

水

1‑2mM

200mM

ナフトキノン

1, 4-naphthoquinone

PSI 受容体

エタノール 0.05mM

10mM

DPC

diphenylcarbazide

PSII 供与体

エタノール 0.5‑1mM

200mM

ヒドロキシアミンhydroxyl amine（NH2OH)

PSII 供与体

水

1‑2mM

200mM

還元型 DCIP

Ascorbate＋DCIP

PSI 供与体水Asc.10mM ＋
DCIP 0.1mM

Asc.1M ，
DCIP 20mM

NADP を電子受容体とする場合，必要に応じて Fd，Fd-NADP 酸化還元酵素（FNR）を添加する必要がある．

なりの熱が発生するので，熱線カットフィルターや 10時は，通常葉緑体やチラコイド膜は 10‑20μg chl/ml，精cm 程度の水槽を通すことで熱をカットする．さらに製した系 や系 粒子は 5‑10μg chl/ml の濃度で行う．

イェローフィルターなどを通してクロロフィルやフィコ

より高濃度で測定する場合，chl による自己吸収や攪拌ビリンなどに吸収される長波長側の光を使うと安全であが不十分による酸素濃度のムラや吸光度の変動に由来す

る．光が飽和しているかどうかを簡単に確認するには，るノイズに注意する必要がある．より低い濃度で測定すニュートラルフィルターを用いて光強度を 80‑90％に下る場合は，活性が低いために測定の誤差が相対的に大きげた時に活性が減少しないか確認すればよい．

くなる可能性がある．以下全電子伝達鎖，光化学系 ，酸素電極や分光学的手法で電子伝達の活性を測定する
2009 低 温 科 学

vol.67

光化学系 の順にそれぞれの活性測定について述べる．
555

3.2.1 全電子伝達鎖酸素を還元し過酸化水素を生成する．KCN は過酸化水細胞，〝intact"葉緑体，チラコイド膜における全電子素の分解を触媒するカタラーゼを阻害するためのもので伝達鎖の活性は，電子供与体として水，電子受容体としある（KCN は 10倍の濃度ではプラストシアニンからて CO (NaHCO ），NADP ，ベンゾキノン，アントラキ．１分子
PSI への電子供給を阻害するので注意すること）

ノンを用いて，酸素電極で測 定 す る こ と が で き る．

の M V は１分子の酸素を還元し，酸素が４分子還元されNADP を受容体として用いる場合は，その光による還れば２分子の過酸化水素と２分子の酸素になる．従って，元で生成される NADPH 量を 340nm の吸収増大で測光化学系 で２分子の水が分解され，１分子の酸素が発定することができる（NADPH の 340nm でのモル吸光

生すると，電子伝達系に４電子が流れ，MV によって２

係数は 6.2x 10 M cm である）
．さらにメチルビオロ

分子の酸素が吸収され，全体としては４電子あたり１分

ゲン（MV）を電子受容体として用い，酸素電極で酸素吸子の酸素が吸収されることになる．即ち，電子当量とし収量を測ることで測定できる．キノン類や Fecy（potas-ては酸素発生と同じ値でマイナスのものになる．

，DCIP
（2,
sium ferricyanide，フェリシアン化カリウム）

上記の測定で高等植物のチラコイド膜を用いた場合

6-dichloroindophenol）を電子受容体として用いる場合

は，脱共役剤として 2mM NH Cl または 10mM メチル

は，系 からも電子を受け取る可能性があるので，系

アミンを添加することで活性が増加する．シアノバクテ由来の活性を考慮する必要があり，実質的に全電子伝達

リアから単離されたチラコイド膜は多くの場合〝脱共役"系の活性を測定するのは難しい．以上の電子受容体のうの状態にあるので，
特に脱共役剤を添加しなくてもよい．

ち，CO (NaHCO ）以外は全電子伝達系の活性は膜電位

しかし，シアノバクテリアから単離されたチラコイド膜の形成によって律速されるので，電子伝達系の活性のみはしばしば系を調べる場合は，2mM NH Cl や 10mM メチルアミンが脱離するので，全電子伝達鎖の活性が高くないかもしなどを脱共役剤として添加して測定を行う．

れない．M V は細胞膜を透過するので，シアノバクテリの電子供与体であるシトクロム c (c )アの生細胞の全電子伝達鎖，あるいは適当な電子供与体［実験例１］との組み合わせで光化学系 の活性をこの方法で測定すシアノバクテリア細胞の全電子伝達鎖活性の測定ることも可能である．

酸素電極を用意し，測定セルに 2ml の BG11 培地を入れ，10μg chl/ml になるよう細胞を加え，2M のストッ5.2.2 光化学系Ⅱ
光化学系の電子受容体として最もよく使われるのク溶液から 5mM NaHCO になるよう加え，光照射には，PPBQ (phenyl-p-benzoquinone)，2,6-DCBQ (2,6-よる酸素濃度の増加を測定する．得られた値を μmoles

dichlorobenzoquinone)，2,5-DCBQ（2,5-dichloroben-

O /mg chl/hr に換算して，炭酸固定と共役した全電子伝，2,5-DMBQ（2,5-dimethylbenzoquinone），
zoquinone）

達鎖の活性を決定する．活性が低く，誤差が相対的に大BQ（benzoquinone）などの各種キノン類で，主に Q か

きいような場合は，測定液の試料濃度を 15‑20μg chl/

ら電子を受け取る．Q 部位が損傷を受けた場合は Fecy

ml 程度に増やす（20μg chl/ml 以上の濃度はできるだ

がよい受容体になる．DCIP も Q ，Q 両方からの電子受け避けた方がよい）．この方法は炭酸固定能を保持した容体として用いられる．特に酸素電極が利用できない，〝intact" 葉緑体についても使用可能である．

あるいは酸素発生活性が失われた場合，DPC（diphenylcarbazide）を電子供与体とし，DCIP の光還元を 600nm［実験例２］

で測定することで光化学系 の活性を評価することが有シアノバクテリア及び高等植物のチラコイド膜の全電子効である．一方，系 の酸化側では，通常水が電子供与

伝達鎖活性の測定体となるが，酸素発生複合体が損傷を受けた場合，DPC，

2ml の測定用バッファー（たとえば，0.4M sucrose，

NH OH，M n などが電子供与体として使用することが40mM Hepes（pH 7.0）
，10mM NaCl，5mM M gCl ）できるが，このうち，NH OH，M n は DCIP をゆっくに 10μg chl/ml になるようシアノバクテリアまたは高り還元させるので，実質的には DPC が最も有効な電子等植物のチラコイド膜を加え，さらにそれぞれのストッ供給体である．

ク溶液から最終濃度が 1mM KCN，1mM MV になるよ
う加え，光照射による酸素吸収量を測定する．この方法［実験例１］

では，水の分解によって生じた電子が，光化学系 ，系

光化学系 膜断片（BBY 標品）酸素発生活性の測定を経由して MV に渡され，還元された MV はさらに
556

酸素電極を用 意 し，2ml の 測 定 バッファー（0.4M
電子伝達担体と阻害剤

，10mM NaCl，5mM
sucrose，40mM Mes(pH 6.0）

1-dimethylurea)で阻害しておく必要がある．

に 0.4mM PPBQ を入れ，ホウレンソウ BBY 標
CaCl ）
品を 10μg chl/ml になるよう加え，光照射による酸素濃［実験例］

度の変化量を測定する．測定バッファーの Ca イオン

チラコイド膜の系 活性の測定

は酸素発生系が損傷を受けているかどうかの指標であ

酸素電極のセルに 2ml の測定バッファー（0.4M su-

り，損傷を受けていない高等植物の BBY 標品の活性測，10mM NaCl，5mM
crose，40mM Hepes（pH 7.0）

定には Ca イオンが必要ないが，コア標品やシアノバ

MgCl ）を入れ，最終濃度 2mM アスコルビン酸ナトリ

クテリアの系

標品は Ca イオンがないと活性が低く

ウム，0.1mM DCIP，0.2mM M V，1mM KCN，10

なる．電子受容体として，PPBQ 以外に，2, 6-DCBQ，

μM DCMU を加え，光照射による酸素濃度の減少を測定

2,5-DMBQ がほぼ同じ活性を与える．チラコイド膜や葉する．必要であれば脱共役剤として 2mM NH Cl，また緑体でも，プラストキノンから系への電子供給を阻害

は 10mM メチルアミンなどを加える．M V は４分子還す る DBM IB（2,5-dibromo-3-methyl-6-isopropyl-p-

元されれば４分子の酸素を還元し，それらが酸素ラジカ

benzoquinone）の添加により，この方法で系の活性をル O を経由して２分子の過酸化水素と２分子の酸素に測定することができる．コア標品やシアノバクテリアのなるので，ネットとしては２分子の酸素が吸収されるこ系 標品には，1mM Fecyを同時に入れた方がより高いとになる．従って，これによって測定される酸素吸収の活性が得られる．

活性は，系 における酸素発生活性の２倍に相当する．
しかし，アスコルビン酸の存在下では，酸素ラジカル O［実験例２］

は過酸化水素まで還元されるが酸素を作らないので，見酸素発生活性を失った光化学系 の活性測定

かけの酸素吸収量は４電子あたり２分子よりも著しく大光化学系の酸素発生活性は，トリスなどの各種処理，きくなる．これを避けるため，過剰量の SOD（superoxide

各種ストレスによって簡単に失われる．このように酸素

dismutase）を添加して酸素ラジカル O からの過酸化水発生能を失った光化学系 の電子伝達活性は，DPC を電素と酸素への分解を促進する必要がある ．なお，KCN

子供与体，DCIP を電子受容体として測定することがではカタラーゼを阻害することで生成された過酸化水素のきる．還元された DCIP の定量は，600nm での吸光度変分解を防ぐためのものである．

化により行われる（600nm での DCIP のモル吸光係数は1.9x 10 M cm ）．通常の分光光度計を用いて，試料セ
ルの側面，測定光と直角の方向から光照射を行い，600
nm での吸光度変化を追跡する．

5.3 阻害剤
阻害剤は電子伝達系の特定のステップを阻害する薬剤

3ml の測定バッファー（0.4M sucrose，10mM NaCl，であり，その作用様式は主に２種類に分けられる．すな

5mM M gCl ）に，1mM DPC，0.2mM DCIP を加え，

わち，(1)電子伝達体と競合して，その結合する部位に結20μg chl/ml になるよう試料を入れ，攪拌しながら光照合することで電子伝達を阻害する；(2)電子伝達体の結射による 600nm での吸光度変化を測定し，DCIP のモル合部位あるいはその周辺の構造を破壊することで電子伝吸光係数から活性を求める．DCIP の還元は２電子反応

達を阻害する．光合成電子伝達系の主な阻害剤の作用部なので，測定された活性は酸素発生活性の２倍に相当す

位を図 5.5に示し，典型的な阻害剤の使用例を表 5.3にる．チラコイド膜や葉緑体標品も，光化学系

示した．

の活性を

阻害すればこの方法で系 の活性が測定できる．
5.2.3 光化学系Ⅰタイプ(1)の阻害剤として，
光化学系 では還元側にある Q 結合部位に特異的に結合する DCMU，アトラジ系 の電子受容体としては，メチルビオロゲン（MV），
各種キノン，DCIP，Fecyがある．一方，系ン，ト リ ア ジ ン，シ マ ジ ン，o‑フェナ ン ス ロ リ ン，の供与体

HOQNO（2-heptyl-4-hydroxyquinoline oxide）などがあとして，還元型の DCIP，PM S（phenazine methosul-

り，例えば，チラコイドや生細胞で光化学系 の活性のfate）， TM PD（ N, N, Nʼ Nʼ -tetramethyl-p-みを測定する場合，10μM DCMU を添加して系の活

phenylenediamine）を用いるが，それらの還元型を作る性を阻害しておく手法はよく用いられる．光化学系 型には，高濃度のアスコルビン酸と合わせて使用する．さ（Q Q 型）反応中心を持つ光合成細菌の場合は o‑フェらにチラコイド膜などで系のみの活性を測定する場

ナンスロリンが阻害剤として用いられる．アトラジンは合，系 由来の電子を DCM U (3-3,4-dichlorophenyl)-1,

その Q 部位への結合の特異性と C 同位体標識による2009 低 温 科 学

vol.67557

図 5.5：光合成電子伝達系に対する各種阻害剤の作用部位（矢印の付いた破線で表してある）．略語：CCCP, carbonylcyanide
m-chlorophenyl-hydrazone;DCMU, 3-(3, 4-dichlorophenyl)-1, 1-dimethylurea;HOQNO, 2-heptyl-4-hydroxyquinoline oxide;pCM B, p-chloromercuribenzoate; PMA, phenyl-mercuribenzoate; NEM, N -ethylmaleimide;スルフォDSPD, disulfodisalicylidenepropanediamine.
表 5.3：光合成電子伝達系の阻害剤の使用例

定量分析が可能であることから，シアノバクテリアの生

キノン結合部位に結合して，還元型プラストキノンの酸

細胞中での系 を定量することにも利用される．系 の化を防ぐことで電子伝達を阻害する．DBM IB は 10μM

電子供給側では，DBMIB とスチグマテリンが阻害剤と以上の濃度では光化学系 に直接電子を供給するので注してよく用いられ，それらはシトクロム b f のプラスト意が必要である．アンチマイシンＡは光合成細菌の電子558

電子伝達担体と阻害剤

伝達系で働くシトクロム bc 複合体を特異的に阻害する

ンＡ，アラメシチン，NH ，NH Cl，などがある．

が，シトクロム b f では有効な阻害剤ではない．
タイプ(2)の阻害剤としては，
光化学系 の酸素発生複合体中の Mn 原子を遊離させるヒドロキシアミン，トリ
ス処理，熱処理（これらの作用については次節を参照），
P 680への電子供給を阻害する CCCP（carbonylcyanide
m-chlorophenyl-hydrazone），系

5.4 トリス処理などによる光化学系
と再活性化

の失活

光化学系 の酸素発生反応は電子伝達系の中でも最もの電子供給側を阻害

失活しやすい部位であり，各種処理によって活性が失わする HgCl ，KCN（炭酸固定を阻害する濃度の数十倍のれることが知られている．系 の酸素発生反応を失活さ

濃度）
，及び系

せる処理とそれらの作用機構を表 5.4にまとめた．これの還元側を 阻 害 す る ス ル フォDSPD（sulfo-disalicylidenepropanediamine），PMA（phenyl-

らの処理の作用機構は４つに分けられる：(1)系，NEM（N -ethylmaleimide），pCMB
mercuribenzoate）

性タンパク質の全部または一部を遊離させる；(2)M n（p-chloromerrcuribenzoate），などがあげられる．このを遊離させる；(3)表在性タンパク質と Mn を同時に遊うち，CCCP は脱共役剤であるが，10‑100倍高い濃度で離させる；(4)Mn と表在性タンパク質には影響しない

用いると阻害剤になる．HgCl と KCN はプラストシア

が，Mn クラスターの Ca のみを遊離させる．(1)に属す

ニン中の銅を遊離させることで系

るのは高塩濃度による処理で，例えば，1M の一価カチへの電子供給を阻害

表在するが，HgCl は系 の酸素発生反応も阻害するので注オンである NaCl は高等植物系の 23kDa，17kDa タ

意が必要である．pCM B はフェレドキシンの阻害剤としンパク質を遊離させるが，33kDa タンパク質は遊離しなて，PMA，NEM はフェレドキシン―NADP オキシド

く，M n も結合したままである．このように処理した高等レダクターゼ（FNR）の阻害剤として用いられるが，植物の系 は数 mM の Ca ，Cl 存在下で未処理系 とPMA や NEM はフェレドキシンを阻害する場合もある

ほぼ同じ酸素発生活性を示す．1M の二価カチオンであので注意が必要である．

る CaCl や MgCl で処理すると，33kDa を含む３つの電子伝達反応と光リン酸化反応（ATP 合成反応）を切

表在性タンパク質が遊離し，酸素発生活性が著しく低下

り離すための薬剤は脱共役剤として知られている．これする．(2)の処理に属するのはヒドロキシアミンである

らの薬剤はチラコイド膜を介したプロトンの電気化学的が，場合によっては表在性タンパク質の一部または大部

ポテンシャルを解消することによって，ATP 合成に必分を脱離させるので注意が必要である．
(3)は熱処理やト

要な駆動力をなくし，ATP 合成反応を阻害する．通常，

リス処理があげられ，特にトリス処理は Mn と表在性タ生細胞や葉緑体では光合成電子伝達系は光リン酸化反応

ンパク質の両方を遊離させる処理として，高等植物のチと共役しているので，全電子伝達鎖の速度は ATP 合成

ラコイド膜，系 標品，あるいはシアノバクテリアの系

反応によって律速されているが，脱共役剤の使用によっ標品に広く使われている．
(4)は単離した高等植物の系て全電子伝達鎖の速度を著しく促進することができ，電標品に特異的に働く方法で，pH 3.0のバッファーで５子伝達系の活性のみを分析する時には脱共役剤の使用が分程度処理することによって Mn クラスターに結合し不可欠である．
よく用いられる脱共役剤として，ナイジェている Ca 原子のみが脱離する．

リシン，バリノマイシン，FCCP（カルボニルシアニドp‑
トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン），
グラミシジ

表在性タンパク質のみが脱離した場合は，脱離した表在性タンパク質を系と混合することで再結合させ，

表 5.4：光化学系 酸素発生反応を阻害する各種処理
処理

作用機構

文献

1M Tris，pH 8.0

Mn と表在性タンパク質を脱離

10，111M CaCl （MgCl ）３つの表在性タンパク質を脱離させるが，Mn は遊離しない

12，13

1M NaCl

高等植物の系 の表在性 23kDa，17kDa タンパク質のみを脱離，シアノバクテリア系 には効果なし．Mn は遊離しない．

14，15

2‑10mM NH OH

Mn を還元して遊離させる．表在性タンパク質も部分的に脱離

16100 citric acid，pH 3.0 高等植物の系 Mn クラスターの Ca を脱離，シアノバクテリア系 には効果なし．M n と表在性タンパク質は遊離しない．

17

熱処理

18

2009 低 温 科 学

表在性タンパク質を優先的に脱離させるが，場合によっては M n も脱離．

vol.67559

PSII を再構成し，酸素発生を回復させることができ

８) I.Enami, S.Yoshihara, A.Tohri, A.Okumura, H.

る

Ohta, & J.-R.Shen, Plant Cell Physiol. 41 (2000)1354.
９) G.M .Cheniae & I.F.M artin, Biochim. Biophys.Acta．一方，トリス処理やヒドロキシアミン処理のような，M n を脱離させた場合，電子受容体である DCIP や
Fecyの存在下で弱い光照射によって M n を酸化してから再結合させることが必要であり，これは光再活性化と253 (1971)167.
10) Y.Yamamoto, M.Doi, N.Tamura, & M.Nishimura,

呼ばれる手法である ．

FEBS Lett. 133 (1981)265.
11) T.Kuwabara, & N.Murata, Plant Cell Physiol. 24

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12) T.Ono, & Y.Inoue, FEBS Lett. 164 (1983)255.
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17) T.Ono, & Y.Inoue, FEBS Lett. 227 (1988)147.
18) I.Enami, M .Kitamura, T.Tomo, Y.Isokawa, H.
Ohta,& S.Katoh,Biochim.Biophys.Acta 1186(1994)52.

電子伝達担体と阻害剤

４章 分光測定

６．水素発生増川一

光合成生物による水素発生は，酵素ニトロゲナーゼまたはヒドロゲナーゼにより触媒される．本稿ではガスクロマトグラフィーを使用した水素発生の分析方法について述べる．

M easurement of photobiological hydrogen production
Hajime Masukawa
M any microorganisms, eukaryotic as well as prokaryotic, can evolve H . The enzymes of H production are
either hydrogenase or nitrogenase,both of which are generally sensitive to O . Here,method for measurementof H production by photosynthetic microorganisms using gas chromatography has been described.

6.1 水素を発生する生物とその酵素

き，シアノバクテリア，光合成細菌などのさまざまな原核生物に分布するが，緑藻などの真核生物には見られな水素を発生する光合成生物には，水を電子供与体としい．窒素化合物（硝酸，アンモニア，尿素など）を含むて酸素発生型光合成をするシアノバクテリアや緑藻，硫培地（＋N 培地）からそれらを取り除いた培地（−N 培

化水素などの硫黄化合物や有機物を電子供与体とする各地）に細胞を移し培養すると，細胞内が窒素飢餓状態に種光合成細菌がある ．光合成生物以外にも，有機物や糖なり，ニトロゲナーゼの遺伝子発現が誘導される．

類を電子供与体として暗所嫌気性発酵過程により水素を発生する発酵細菌などがあるが本稿ではふれない．
水 素 発 生 を 触 媒 す る 酵 素 は，ニ ト ロ ゲ ナーゼ（nitrogenase）またはヒドロゲナーゼ（hydrogenase）であり，どちらも一般的に酸素感受性が高く，酸素共存

下では失活しやすい．一般的に，光合成細菌による水素生産は，嫌気的条件を必要とする．酸素発生型光合成生物である緑藻やシアノバクテリアのヒドロゲナーゼを利用した生産系では，水素生産系に嫌気的（微好気的）条ニトロゲナーゼ反応の必然的副産物として水素が発生
し，反応式は，窒素ガス存在下では次式のように表される：
N ＋8e ＋8H ＋16ATP→H ＋2NH ＋16 ADP＋Pi (1)窒素ガスが存在しない条件下（例：Ar 気相）では，全ての電子が水素発生に向かう：
2e ＋2H ＋4ATP→H ＋4 ADP＋Pi(2)

件を必要とする．シアノバクテリアのニトロゲナーゼを

この反応は不可逆的に水素発生に向かうので，ヒドロ利用した生産系では，好気的条件下でも水素発生を持続

ゲナーゼと異なり（後述），酸素共存下でも逆反応の水素できる．発生または吸収された水素は，ガスクロマトグ

吸収が起こらない．しかし，多くの窒素固定生物は，水ラフィー，水素電極，ガス質量分析法などにより定量さ素の吸 収 に 働 く 取 り 込 み 型 ヒ ド ロ ゲ ナーゼ（uptake

れる．ガスクロマトグラフィーは，多数のガスサンプル

hydrogenase，通称 Hup）を持ち，酸素共存下では，ニを短時間で簡便に分析するのに適しているので，この方トロゲナーゼ反応により発生した水素は Hup により再法について紹介する．

吸収され，エネルギー源として再利用される．このため，取り込み型 Hup 活性を持つ株では，実際に測定される正6.2 ニトロゲナーゼによる水素発生
6.2.1 ニトロゲナーゼ反応と水素代謝
ニトロゲナーゼは，生理的には窒素固定酵素として働

味の水素発生速度は低くなる．なお，単細胞性の窒素固定シアノバクテリア野生株のごく一部には，取り込み型
Hup の遺伝子または活性が見られず，ニトロゲナーゼによる比較的高い水素発生速度を示すものもいる．取り込み型 Hup を持つものでも，その遺伝子破壊によって水
１) ミシガン州立大学

素再吸収が抑えられるので，野生株と比べて高い水素発２) 神奈川大学光合成水素生産研究所

生速度を示すことが，これまでに光合成細菌やヘテロシ

2009 低 温 科 学

vol.67561

スト形成するシアノバクテリアで示されている．

6.2.2 各種光合成生物のニトロゲナーゼによる水素発
生

れは細胞の一部が異型細胞を形成することなく酸素発生型光合成活性を一時的に失い，ヘテロシスト内と同様な代謝経路により窒素固定を行うと考えられる．

光合成細菌のニトロゲナーゼによる水素発生では，ニトロゲナーゼばかりでなく細菌の生育自体も酸素感受性

6.2.3 ニトロゲナーゼによる水素発生の分析法
6.2.3.1 ニトロゲナーゼ活性の誘導であるため，嫌気条件でなければ持続しない．一方，シニトロゲナーゼは，細胞を＋N 培地から−N 培地に移アノバクテリアの中には，酸素発生型光合成とニトロゲして培養を続けると誘導される．誘導にかかる時間は生ナーゼ反応とを空間的，または時間的に分離することに物種や株で異なる．時間的分離により窒素固定するシア

よって，酸素感受性ニトロゲナーゼが失活することを防

ノバクテリアでは，−N 培地で暗期に入って数時間後にぎ，これらの反応を両立させているものがいる．この

誘導されてくるが，ヘテロシスト形成するシアノバクテ

ようなシアノバクテリア株では，ニトロゲナーゼ誘導のリアでは，ヘテロシスト形成以降（−N 培地移行後，約ための培養を好気的条件下（空気中）で行うことができ

１日目以降）に誘導されてくる．ニトロゲナーゼの活性る．特に，ヘテロシスト形成する株（後述）は培養などと Ar 気相下で測定した水素発生速度は，ほぼ比例し，その取り扱いが容易なため，水素発生の研究材料としてよれらの活性は−N 培地移行後，対数増殖期に最大になく用いられている．

り，それ以降急激に低下していく傾向がある．活性が最空 間 的 分 離 は，糸 状 性 シ ア ノ バ ク テ リ ア の 中 の大となるタイミングも株や培養条件により数時間から数Anabaena，Nostoc 属等で見られ，窒素栄養欠乏下で通常日異なる．このため，カルチャーの時期によって，水素の酸素発生型光合成を行う栄養細胞の一部が約 10‑20細

生産速度は大きく異なることがある．

胞間隔でヘテロシストと呼ばれる異型細胞へ分化し，そ6.2.3.2 水素発生時の気相条件

こでニトロゲナーゼ反応を行う．ヘテロシストは窒素固

酸素共存下では，取り込み型 Hup による水素吸収が原定に特化しており，自身は光化学系 のみを持ち，酸素因となり，正味の水素発生速度は低くなり，場合によっ発生に係わる光化学系を持たないので酸素発生型光合ては，ニトロゲナーゼの活性はあるが水素発生は検出さ成を行わず，さらに呼吸活性を上昇させるなどにより内れないこともある．気相を Ar（アルゴン）ガスに置換す

部の細胞内酸素濃度を低く保つことにより，ニトロゲ

ることにより，ニトロゲナーゼを経由する電子はすべてナーゼを酸素失活から保護している．ニトロゲナーゼ反が水素生産に振り向けられ（反応式２），酸素濃度が低い

応には，多量の電子と ATP が必要であるが，前者は栄養ので取り込み型 Hup による水素吸収活性が抑えられる．

細胞から供給される有機化合物（通常の酸素発生型光合Ar 気相下（数％程度の CO を含む）での水素発生は，シ成により合成）に依存し，後者は異型細胞内の光化学系

アノバクテリア Anabaena，Nostoc 属の Hup 遺伝子破周辺の電子伝達に共役した光リン酸化および呼吸に壊株を用いた実験では，光合成により発生する酸素の共よって供給される．ヘテロシストは，一般的に，＋N 培地

存下で約１週間程度は持続させることができるが，窒素から−N 培地へ移行して約１日後に形態学的分化が完

栄養が不足して細胞が弱っていくためか，水素発生速度

了し，ニトロゲナーゼの発現は，ヘテロシスト形成以降は次第に低下していく傾向がみられる ．

（−N 培地移行後，約１日目以降）に誘導されてくる．

6.2.3.3 ガスクロマトグラフィー

時間的分離は，窒素固定を行う単細胞性（Cyanothece，

検出器に TCD（thermal conductivitydetector）を備

Gloeothece 属 等）や 一 部 の 糸 状 性 シ ア ノ バ ク テ リ ア

えたガスクロマトグラフィー（ガスクロ）を用いる．ガ（Oscillatoria（新 名：Plantothrix），Trichodesmium 属

スクロには，キャピラリカラム用とパックドカラム用が等）で見られ，ニトロゲナーゼによる水素発生は一般にあり，前者の分離能力は非常に優れているが，後者でも細胞の概日周期により制御されていると考えられる．こ水素の分析を十分に行える．ガスクロに装着するガス分の場合，同一細胞が日中（明期）は酸素発生型光合成に

離 カ ラ ム は，molecular sieve 5 A ま た は molecular

より CO から有機化合物を合成し，夜間（暗期）は，日

sieve 13 X を使用する（水素の分離に必要な時間は，中（明期）に合成した有機化合物を利用して呼吸活性を．水素のみの検出を目
molecular sieve 13 X の方が短い）

上昇させることにより細胞内酸素濃度を低下させると同的とする場合，キャリアーガスに窒素（N ）ガスを用い時に ATP を生成し，ニトロゲナーゼ反応を行う．ニトロ

る．また，水素，酸素，窒素ガスを分離する場合，分離ゲナーゼは，暗期に入って数時間後に誘導されてくる．

カラムに molecular sieve 5 A，キャリアーガスに Ar ガ

一部のものは，日中もニトロゲナーゼ活性を示すが，こスを用いる．より純度の高いガスをキャリアーガスとし562

水素発生分析法

て用いることで，検出感度を向上させることができる．

用バイアル（容量約 7‑10ml 前後）に 1‑2ml 入れ，ゴ

キャピラリカラム用のガスクロ装置で，molecular sieve

ム栓（ブチルゴムまたは PTFE/Silicone 栓）をし，上5 A カラム，キャリアーガスに Ar ガスを用いて，水素，部に穴のあいたスクリューキャップを閉める．ガスク

酸素，窒素ガスを分離した分析例を図 1に示す．

ロバイアルは，日電理化硝子や Sigma-Aldrich/Supel-

6.2.3.4 実験方法

co などから購入できる．ブチルゴムまたは PTFE/Sil-

ここでは，嫌気操作の必要がなく，取り扱いが容易なヘテロシスト形成するシアノバクテリアを用いた水素発
生の分析手順を紹介する

icone のゴム栓は，耐久性，機密性に優れ，何回か針を刺してもガスが漏れることなく使用できる．

．

４. ガスクロバイアルのゴム栓に２本針を刺し，一方の１. ニトロゲナーゼを誘導するため，＋N 培地（BG11 ま

針から Ar ガスを入れ，もう一方を出口として，バイア

たは AA/8(＋N））で培養したカルチャーから細胞をル内の気相に Ar ガスを通し（Ar ガスの流速にもよる

遠心で集め，−N 培地（BG11 または AA/8）で 1‑2回

が 5‑10分程度），気相を Ar に置換する（図 2）．

洗った後，細胞を新しい−N 培地に移す．その際，−N

５. 光照射下で，バイアル内の細胞懸濁液が十分懸濁さ培地中の細胞密度が高くなりすぎないようにする（細れるように振とうさせながら，１時間前後プレイン

胞密度が高い光制限下では，ニトロゲナーゼが十分に誘導されないことがある）．

キュベーションする．
６. 再度，Ar ガスを通して（操作４），光照射下に置き，

２. −N 培地中でのニトロゲナーゼ誘導に必要な時間

1‑2時間インキュベーションする．
1‑2時間程度のインは，株や培養条件により異なる．十分に誘導されていキュベーションであれば，CO は必ずしも必要ない

ないカルチャーでは，水素発生が検出されないこともが，数時間〜数日間にわたる場合，水素発生を持続さあるので，−N 培地に移して１日目，または必要に応せるために，ガスタイトシリンジを用いて CO を加えじて２日目以降のカルチャーの一部を遠心で濃縮し，る必要がある．暗所で水素発生する生物の場合は，操適当な濃度に調整する（Anabaena，Nostoc 株では，濃度 5μg Chl/ml 前後）．
３. 濃縮した細胞懸濁液を透明なガスクロサンプリング

作５，６を暗所で行う．
７. バイアル内の気相からガスタイトシリンジで 0.5‑1ml（パックドカラム使用の場合）のガスサンプルを取図 1：キャピラリカラム用ガスクロマトグラフィーによる水素，酸素，窒素ガスの分離
水素のピークは 9.4nmol，ガスサンプル中の水素濃度は約 0.12％(v/v）に相当する．インキュベーション前に Ar ガスを約 10分
間通した場合でも，微量の酸素，窒素ガス（濃度１％(v/v）以下）が検出される．これは，(1)光合成により酸素が発生する，(2)微量の空気が Ar 置換時やガスタイトシリンジを用いたサンプリング時に残留・混入するためと考えられる．
ガスクロ装置本体：Trace GC Ultra (Thermo Scientific),Column:molecular sieve 5 A (Restec,30m,0.53mm ID),Sample size:
0.2 mL, Column temp.:70℃, Carrier gas:Argon 10 ml/min, Detector:TCD.
2009 低 温 科 学

vol.67563

シアノバクテリアのヒドロゲナーゼ（双方向性 Hox お
よび取り込み型 Hup）は，活性中心部位に鉄（Fe）とニッ
ケル（Ni）を結合した NiFe 型に属し，双方向性 Hox の電子供与／受容体は NAD(P)H/NAD(P) である．緑藻の Fe 型ヒドロゲナーゼの活性中心は Fe を含むが Ni
を含まない Fe 型で，電子供与体はフェレドキシンである．Fe 型ヒドロゲナーゼは，嫌気性細菌や古細菌にも分布するが，シアノバクテリアには見られない．Fe 型ヒドロゲナーゼは，双方向性 Hox と比べて，代謝回転の速度が高く，電子供与体となるフェレドキシンは NADPH
よりも酸化還元電位が低いので，水素生産にとって好都合だと考えられる．
ヒドロゲナーゼ反応（反応式３）は可逆的であるため，
光照射，酸素共存下で細胞内が酸化的になると，逆反応により水素を吸収する，または，ヒドロゲナーゼ活性が酸素により失活してしまうため，水素発生が短時間しか

図 2：気相の Ar 置換

起こらない．一つの方法として，通常の光合成により有機物を十分蓄積させた後，暗所嫌気条件下に移し，ヒド

り，TCD を装備したガスクロに注入する（キャピラリロゲナーゼによる水素発生を発酵過程により起こすこと

カラム使用の場合，注入量はこれよりも少量でよい（図ができる ．また，緑藻 Chlamydomonas では，通常の光

1参照）
）．

合成による有機物の蓄積後，生育培地を硫黄欠乏培地に

８. ガスサンプル分析の前後に，濃度調整された標準水変えることにより，光照射，嫌気下で水素発生が起こ

素ガスを用いて校正し，検出した水素量を計算する（自る ．このメカニズムは，硫黄欠乏下で光化学系 活性が動的に計算されるように機器設定する）．
純水素ガスか

次第に低下していき，蓄積している有機物が主な電子供ら適当な濃度の標準水素ガスを作成する場合，O を含与体となって光化学系 ，フェレドキシン，
ヒドロゲナー

んだガスと混ぜると，一部が O と反応して水になる

ゼによる水素発生が起こり，光化学系 より発生するわ

おそれがあるので，必ず Ar または N ガスを満たし

ずかな酸素は有機物を消費する呼吸により消去されるとた容器内に純水素ガスを加えて希釈する．しかし，低考えられる．

濃度の正確な標準ガスが必要な場合には，ボンベ入り

上記のようなヒドロゲナーゼによる水素発生には，嫌の標準ガスをメーカー（GL Sciences など）から購入

気的条件が必要である．発生した水素は，ニトロゲナー

し使用する．

ゼの場合と同様に，一定時間蓄積させた後，ガスサンプ
ルをガスタイトシリンジでとり，ガスクロで分析する．
また，N や Ar などのガスを低速で流し（lifting gas），

6.3 ヒドロゲナーゼによる水素発生

ガス中の水素を分取または連続的に測定するという方法

一部の酸素発生型光合成生物（シアノバクテリア，緑もある．

藻）は，光照射下でヒドロゲナーゼによる水素発生を行

生理的条件下で水素発生が見られない場合でも，細胞うことがあるが，これは生理学的には，過剰な電子を水懸濁液または細胞抽出物に嫌気下（Ar または N ガス気

素として排出することにより細胞内が過度に還元的にな

相下）で sodium dithionite（Na S O ）（最終濃度 20るのを防ぐという意義があると考えられる．

，methyl viologen（最終濃度 2mM ）を加えた還元mM ）2e ＋2HH(3)

この反応は，シアノバクテリアでは双方向性ヒドロゲ

的条件で，ヒドロゲナーゼによる水素発生が起こる．この方法で，双方向性または Fe 型（可逆性）ヒドロゲナー
ゼ活性を簡便に測定することができる ．

ナーゼ（bidirectional hydrogenase，通称 Hox）が，緑藻では Fe 型ヒドロゲナーゼ（可逆性ヒドロゲナーゼ（reversible hydrogenase）とも呼ばれる）が触媒する．
564

水素発生分析法

参考文献
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565

4章

分光測定

７．膜電位の測定伊藤繁

光合成光反応は電子の動き（酸化還元反応に伴う電流）を膜内に作りだし，光合成膜系で仕切られた
内外溶液相間に電位差（膜電位，Δϕ）を生じる．これとは別に，酸化還元反応に伴う水素イオン（H ）の膜内外での消失と出現，膜を横切る動きが，内外溶液相間に H 濃度差（ΔpH）を作り出す．Δϕ とΔpH で変わる H を動かす力（エネルギー差）は，H についての液相間での電気化学ポテンシャル差（Δμ ＝Δϕ− RT/F ΔpH）
で表される．ATP 合成酵素は Δμ を消費して H を動かし，分子を回転させ ATP 合成をする．ここでは１．膜電位と Δμ の発生と測定の原理，２，Δμ の解消と脱共役，３．実際の測定例を解説する．

M easurement of membrane potential
Principles of formation of membrane potential in photosynthesis are reviewed. Photosynthetic electron transfer
reaction forms the electrochemical potential difference of electrons, protons and ions across the membranes.
Simple equations to understand the ion and electron movements in relation to membrane potential and membranesurface potential are shown. Methods for the measurements of membrane potential by using the carotenoid
electrochemical bandshift and the ion distributions are interpreted with examples.

て電位が正にある膜内側に向かって，エネルギーに逆7.1 膜電位らって（能動輸送と呼ぶ），H が運ばれる．

7.1.1 膜電位と Δμ の発生と測定の原理(1) なぜ細胞や葉緑体膜は閉じた袋状なのか？「化学浸どうしてこのような方向で電子が移動するのだろうか？ まだ膜タンパク質の位置や構造が不明な時代に，透圧説の誕生」（1966 ，1968 ）は，「生体膜上の蛋白質は一P.Mitchell

光合成では光により電子やイオンが動く．電子の動き

定向きに配列され，光合成や呼吸電子伝達系は膜を横切

は，水を酸化したり，キノンや NADP の還元をおこす

り一方向のみに電子を動かし Δϕ を増大させ，さらにが，これと同時に電流として電位差（電圧差）を作り出

H を動かす．同じ膜上に並んだ ATP 合成酵素は，これす．この溶液相間の電位差を膜電位 Δϕ と呼ぶ．図１は，と反対向きに水素イオンを動かし ATP を合成する」と

植物葉緑体やシアノバクテリア膜系内部での光合成電子

いう「化学浸透圧説（chemiosmotic theory）」を提案し移動経路を模式的に示す．光化学系 と 反応中心複合た．この時期に急発展した生化学は，タンパク質一つ一体内では，電子は内側から外側に向かって膜内を移動し，つを精製し，
分子レベルで調べることを目標としていた．

シトクロム b /f 複合体内でも電子は外側に向かって動

蛋白質複合体を精製し，溶液中で混じり物のない状態でく．
全体としてみると電子の流れは絶えず外側に向かい，の研究が可能になりつつあった．このような状況で「閉内 側 が 正，外 側 が 負 の 電 位 差 Δϕ を 生 じ る．こ れ をじた袋状の膜構造そのものに意味が有る」というこの提（電位差発生的）な電子の動きと呼ぶ．一方
electrogenic

案は，大物生化学者たちとの間に，大論争を巻き起こし

膜内での，プラストキノン酸化型（PQ）と，水素イオン

た．私自身も英国での postdoc 時代に「Mitchell は気が（H ）を結合した還元型の（PQH ）の動きは電荷移動を狂っている」という反対意見をよくきいた．シンポジウ

伴わないので，Δϕ を変えない．光化学系 での PQ の光

ムや学会ごとに会場挙げての熱い論争が 10年以上つづ

還元反応，シトクロム b 6/f 複合体内での酸化還元反応，き，これが光合成や呼吸などのエネルギー共役機構，膜光化学系 での NADP の還元反応では膜内側への H構造，イオンや代謝産物の輸送，細胞膜の役割などにつ放出，膜外側での H 結合により，酸化還元反応全体としいて，大きな研究発展をもたらした．この論争は，その後の生化学研究，特に光合成反応中心膜タンパク質の構

１) 名古屋大学 大学院理学研究科物質理学専攻物理 光
生体エネルギー研究室

2009 低 温 科 学

vol.67

造解析により，決着をつけられ，「化学浸透圧説」
は生命現象の基礎概念の一つとして受け入れられた．
567

(2) 膜電位の発生と測定の原理：

エネルギーは ΔpH，Δϕ に依存して変わることがわか

化学浸透圧説は，閉じた袋状のエネルギー変換膜の内る．室温 300K では 2.3RT /F ＝60mV なので，１ ΔpH

外溶液相間での H の動きがエネルギーを伝達する実体は約 60mV の Δϕ に相当する．Δϕ の変化は水素イオン

であると提案し，実証された．溶液中のイオンは，濃度以外の全イオンの動きにも同時に影響する．今，イオンの低い方向への拡散力（濃度差に依存）と，その電荷にX の平衡を考えると，働く電気的な力（電位差とイオン電荷に依存するクーロン相互作用）を受けて動く．従って，あるイオン種のモル自由エネルギー（電気化学ポテンシャル， μ）を，そΔμ ＝ μ − μ＝2.3RT log C /C＋z FΔϕ(3)の活量（a ，ほぼ濃度に等しい）と価数（z ）とその場所

C はイオン濃度．電気泳動でよく見られるように，Δϕ にの電位（ϕ）で表すことができる．

従ってイオンは動く．逆にイオンの分布と Δμ がわかれ

μ＝ μ ＋RT log a ＋z Fϕ(1)

ば Δϕ を算出できる．もう一つ大事な事は，膜透過性のないイオンにはこれは関係ない（膜透過性に依存する）．

μ は一定の標準状態（ϕ＝0，a ＝1）での μ の値，R は従って，チャンネルタンパク質や後述のイオノホアなど

ガス定数，F はファラデー定数，T は絶対温度，log はで特定イオンの膜透過性を変えると，電子移動や他イオ

自然対数である．イオンは μ の差（エネルギー差）があンの動きできまる Δϕ に応じてそのイオンが動き，これると Δμ のより小さい方へ移動させようとする力を受がまた Δϕ や Δμ を変える．生体膜は Δμ の積極的なけ，その動きで Δμ 分の仕事がなされる．たとえば，葉形成（電子移動やイオンの能動輸送）と，イオン種ごと

緑体チラコイド膜の外液（o）と内液（i）間での pH 差がの透過性の違い，イオン間の共役関係をうまく制御してΔpH，電位差が Δϕの場合，H にかかわる電気化学ポテンシャル差は，の移動をうまく制御している．Δμ に従うイオンの動き
を受動輸送，逆らう輸送を能動輸送という．

Δμ ＝ μ − μ＝−2.3RT ΔpH

ATP 合成やイオン輸送を行い，細胞内環境や代謝産物

＋FΔϕ

(2)

逆に膜を横切る物質の動きはエネルギーの変化をともなう．この関係を利用してエネルギー共役（たとえば，

で表される．H の動きで Δμ に応じたエネルギーが得

電子伝達反応と ATP 合成反応間でのエネルギーの交られる，あるい H を動かすには Δμ 分のエネルギー換）が行われる．電子伝達系は電子を膜中で動かし，Δϕを要する．この式から，同量の H が動いても，得られるをつくり，同時に膜外と中での H 量をかえる．Δμ を

図 1：葉緑体チラコイド膜上の電子伝達系と ATP 合成酵素の働きによる Δμ ，Δϕ，ΔpH の生成と解消．光化学系 と 反応中
心複合体内とシトクロム b f 複合体中での膜外向きの電子の動き（白矢印）が内側が正の向きに Δϕ を形成する．電子伝達反応に伴い H は膜外側で吸着され，内側で放出される．こうして作られた Δμ が ATP 合成酵素で H を膜外側へ動かし，ATP 合成を駆動する．H の電荷は電子と違い正なので，外向きに動くと Δϕ は減少し（ATP 合成酵素内部の細い白矢印），同時に ΔpH も
減少する．

568

M embrane po tential利用した ATP 合成酵素による ATP 合成では以下の式

合成しなくても Δϕ は減少する．たとえば，表面活性が実現されると期待される．

剤トリトン X-100 を膜構造を大きくこわさないよう

nΔμ ＝ΔG ＋2.3RT log ATP / ADP Pi(4)

n は 1ATP 合成に必要な H の個数，ΔG は ATP 合成

な低濃度（0.01％）加えるだけでも，膜のイオン透過性は高まり，Δϕ と ΔpH は消失する．ATP 合成も阻害される．

に伴う標準 Gibbs 自由エネルギー変化で約 32kJ/mol

３) イオノホア：イオンの膜透過性を選択的に変えるである（pH に依存する）．右辺の値は通常の pH や実験

様々な分子が知られている（図 2）．これらの組み合わ条件下で 200‑600mV に相当する．たとえば Δϕ＝0，

せで，ATP 合成と Δμ の関係が確認された．

ΔpH＝2−3なら 1/F Δμ は 180mV となり n＝2か 3

細菌を殺す抗生物質として発見されたバリノマイシ

で（4）式が成立する．最適実験条件下では 2H で ATP

ンは K と膜透過性の高い包摂化合物をつくる．K −が合成される．

バリノマイシンの高い膜透過性により K の動きが促

化学浸透圧説は電子伝達系と葉緑体やミトコンドリア

進され，（K 濃度差が大きくなければ）Δϕ のみが消失の ATP 合成のエネルギー共役機構を示しただけでなする．従って，バリノマイシン添加のみでは ATP 合成

く，細胞膜を始め様々な生体膜系でのイオンや分子の輸は阻害されない．逆に膜内外液相間に K 濃度差を送現象についての理解を進めた．最近では，分子構造の作っておき，バリノマイシンを加えると濃度差に応じ解明や１分子観察法により，ATP 合成酵素の膜外側部

た Δϕ（拡散電位：式３で Δμ ＝0に相当）が一時的に位（F 部位）の回転にともなう ATP 合成が示されてい形成される．K 移動により濃度差が解消するとともる．たった２名の Glynn Research Laboratory（ロンドにこの Δϕ は消える．

ン大学に今でも記念研究室がある）の小さな研究室で P.

グラミシジンは膜に穴を開け，H ，Na ，K ，Rb

M itchell が主張し，戦った新しい考え方が生命理解の基などの透過性を増大し，Δϕ を消失させる．この場合に本概念の一つとなった．

は ΔpH も消失するので ATP 合成が阻害される．
ナイジェリシンは H との結合型と K との結合型(3) 電子伝達系による Δϕ と Δμ の形成が共に電荷なしに膜を透過するので H と K の交換

葉緑体チラコイド膜では，図１に示すように膜の内側を早める．この交換は Δϕ の変化をもたらさない．

から外側に電子が動き，膜胞内側が正の電位差（膜電位従って K 存 在 下 で Δϕ は 消 さ ず に ΔpH だ け を 消Δϕ）が生じる．内側正の Δϕ に逆らってより Δμ を高す．ATP 合成は阻害しない．

める方向に H が運ばれる．膜を横切る電子やイオンの

農 薬 で も あ る CCCP（ carbonylcyanide m-

移動は Δϕ を変える．一方，膜表面での H の放出や吸着

chloromethoxyphenylhydrazone）は H 結 合 型（中などは Δφ を変えず，ΔpH のみに影響する．ΔpH と Δϕ性）
，非結合型（負イオン）ともに高い膜透過性をもちに応じて Δμ が変わる．膜横方向での電子や H の移H 透過性を高める．負イオン型の動きは Δϕ を H

動は同じ溶液相内での別のイオンの動きでうち消される

結合型の動きは ΔpH を消し，Δμ を消失させる．

ので Δϕ，ΔpH を変えない．膜で隔てられた溶液相間では，膜を横切る電子やイオンの動き（電流）がない限り従って ATP 合成を強く阻害する．
４) 膜透過性のアミン類：中性では膜透過性が高く，HΔϕ は変化しない．

を結合し荷電型になると膜を透過できないようなアミ7.1.2 Δμ の解消と脱共役

ン類（アンモニアやアルキルアミン）は，ΔpH が形成(1) 様々な Δμ の解消過程

され膜内側の H 濃度が高くなると膜内側溶液中に蓄Δμ は ATP 合成や（図 1）やイオン透過性を変える

積し，結果として ΔpH だけを消す．低濃度のアミンは試薬の添加で変化する（図 2）．それぞれの過程を以下に

ATP 合成をとめないが，高濃度加えると ΔpH の寄与説明する．

が大きい葉緑体などでは ATP 合成をかなり抑制す

１) ATP 合成：Δϕ や ΔpH は，膜を通してイ オ ン やる．また，ΔpH にあまり影響しない低濃度（数 μM 程H が動けば変わる．光で駆動される電子伝達反応と度）で分布を測定できる蛍光性や放射性アミンの膜内逆向きに ATP 合成で H が動けば，エネルギーが得外での分布差から，ΔpH を測定できる（9‑アミノアクられ，その分 Δμ は減少する（図 1）．

リジンや，同位体置換したメチルアミンなど：表 1）．

２) 表面活性剤：膜に孔をあけたり，壊したりして Hや他のイオンが自由に動けるようにすると，ATP を2009 低 温 科 学

vol.67569

出される自由エネルギー変化と釣り合えば，そこで電子伝達速度も遅くなり，後は Δμ の減少分だけしか電子伝達が進まなくなる．ここで ATP 合成を促進して Δμ を減少させれば電子伝達速度は再び早まる．
同様に，イオノホアや表面活性剤添加などで Δμ を下げると電子伝達は速くなり，ATP 合成もとまる．これを脱共役とよぶ．
２) 膜表面電位：膜表面はタンパク質などの固定電荷により，溶液中に比べて通常 10‑50mV 負に帯電している．すなわち，式３を同じ溶液中とそれとつながる膜
表面に当てはめると Δμ ＝ゼロでも，表面での局所的な固定電荷の密度は違うので，電位，イオン濃度，
H 濃度は異なり，反応速度に影響を与える．この固定電荷による外液相と膜表面との電位差を「膜表面電図 2：イオノホアとアミン類による膜透過性と，ΔpH，Δϕ の変化の模式図位：Δψ とよぶ．固定電荷の影響は他のイオンがあれば遮蔽されるので，溶液の塩濃度の−1/2乗に依存して変化する．低塩濃度では大きく（チラコイド膜では(2) 脱共役と電子伝達速度10mM NaCl 存在下で Δψ＝−60mV 程度），高塩濃１) 脱共役：電子伝達反応は Δϕ や ΔpH を作り出す．

度ではより小さくなる．膜表面電位は膜電位と違い膜では Δϕ や ΔpH が変わると，電子伝達速度はどうなを隔てての（溶液相間の）Δμ に影響せず，エネルギー

るだろうか？

共役に直接影響を与えない．しかし，膜表面での電子Δϕ に応じて，膜内成分の酸化還元電位は実質的に変化する．たとえば，酸化還元滴定では，外部溶液中に加えたメデエーターの酸化還元状態を溶液中の電極伝達速度には大きく影響する ．例えば，式（3）から，
Δμ(表面−外液中)＝ 0＝2.3RT log C(表面)/C(外液中)＋z FΔψ(表面−外液中)等により電位としてモニターし，それと平衡な膜内電(5)子伝達成分の酸化還元状態をみる．しかし電極面と違となり，‑3価のフェリシアナイドを pH 7の反応液に

う電位 Δϕ にある膜内側の成分に電子を渡すために

1mM 加えると，10mMは，−Δϕ の寄与分だけ余分に仕事が必要なので，見かmV の膜表面では，けの酸化還元電位の値も Δϕ だけずれる．これは，膜NaCl 存在下で Δψ＝−60

C(表面)/C(外液中)＝10

内側に正の Δϕ がかかっていれば，負電荷をもつ電子＝10はより多く存在できる（平衡下では，式３で Δμ ＝0となり，表面濃度は加えた濃度の 1/1000，すなわちであるから，Δϕ 分だけ log(e ）が変わるはずである）

1μM と計算される．NaCl 濃度を 100mM に上げる

として定性的にも理解できる．ある成分についての電か，1mM の MgCl の添加により全体で負に荷電した子の濃度（＝酸化還元状態）が変われば反応速度も変

膜表面の固定電荷の影響を遮蔽してやると，Δψ＝−わる．従って，Δϕ に応じて，電子伝達速度は変化する．

20mV に下がる．すると C(表面) は 10倍あがる．当然，また膜内 pH の変化も H 濃度を変えて反応速度を制膜表面での反応速度も促進される．一方，電荷を持た御する．定常光照射下でできる Δμ が光反応で生みない中性試薬の表面濃度は変わらず，正電荷を持つメ

表 1：定常光下での，紅色細菌クロマトホア膜小胞での Δμ 測定例，Δμ は mV 単位で表示．括弧内は
測定方法

570

試料

ΔpH

Rb. sphaeroides
クロマトホア−３〜−3.3
200‑240mV
350‑440mV（9‑アミノアクリジン蛍光法) (カロテノイド吸収帯シフト)Δϕ（mV）

７

Rs. rubrum
クロマトホア−1.8（C ‑メチルアミン分布)

８89mV(C −SCN 分布)

Δμ (mV)

200mV

文献

M embrane po tentialチルビオローゲンなどの膜表面濃度は外液中より高く

体（30μg c˜
hl/ml）を懸濁する．新鮮なホウレンソウ葉なっている．従って，生体膜上にある分子の見かけのを用い，１−２分くらいで手早く葉緑体を低温で単離

酸化還元電位や，外部から加えたイオン性の分子とのし ，測定する．時間とともに，膜系のイオン透過性が上

反応速度は膜表面電位に大きく影響される．酸化還元

がるので試料を調整し直す．発光時間 10μs の Xe 放電

電位の決定や反応速度を測定するときには，塩濃度や管（Sugawara M F-1500-U3）付きの閃光分光装置で 518

pH の効果を確かめておくことが必要である．

nm でのカロテノイド吸光度変化を測定した．試料は 17.1.3 膜電位の実測：カロテノイドシフトとイオンの分配

x 1x 5cm の４面透明ガラスセルに 2ml いれた．閃光分
光装置は散乱が多くても測定できるように，検出器と試大きさが数十ミクロンある動植物細胞などでは膜内外料間が近いタイプがよい（2e 参照）．励起閃光は色ガラ溶液相に電極をいれ，膜電位を直接電位差として測定でスフィルター（650nm 以上の光を通すカットオフフィル

きる．しかし，チラコイド膜小胞や，光合成細菌の内膜

ターを２枚）を通して試料にあて，強度を変えて吸収変（クロマトホア膜）などは数ミクロン以下であり，電極を化量がほぼ飽和していることを確かめておく．試料と検いれるには小さすぎる．このため膜内部に結合している

出器間には，閃光の漏出を防ぐため，518nm に透過ピー

カロテノイド色素や外部からいれた電位感受性試薬などクをもつ干渉フィルターか青色ガラスフィルター（Corn-の吸収変化や蛍光などを分光的に測定する．Δϕ に応答をいれ，信号／ノイズ比を高めるために，信号ing 4-96）

する事が知られている，チラコイド膜内タンパク質に結を加算平均した．

合したカロテノイド色素の吸収帯のシフトを利用した測定法を図 3にしめす．タンパク質の膜内特定位置に結合

解説：閃光照射により，電子が光化学系， 反応中したカロテノイドは極性の違いで有機溶媒溶液中と異な心内で膜内から外側にながれ，Δϕ が生じる．この Δϕ 値

るスペクトルを示すだけでなく，各々の周囲アミノ酸残は，膜という平板コンデンサーに電荷を与えた際の電圧基が作る局所的外部電場強度の２乗に応じて吸収波長を変化と同様に考えることが出来，電荷密度（光に応答す変えている．さらに膜電位変化に伴う小さな電場変化

る反応中心量）と電気容量（膜の厚さと膜の誘電率に依Δϕ がこれに加わると，ほぼ Δϕ に比例した吸収変化量存）がわかれば電圧変化が計算できる． ， 反応中心を示す．同様な現象は紅色細菌膜のアンテナ色素タンパの膜上での存在密度と膜の電気容量（約 1μF）から，約

ク質 LH に結合したカロテノイドでも知られている．表

60mV の膜内側正の Δϕ が１閃光照射後数ナノ秒で作

１にはこれと，イオン分布測定法による Δϕ 測定結果をられると計算できる ．図 1はキセノン放電管の閃光を示す．

繰り返し８発与えたときの吸光度変化をしめす．１閃光あたり 60mV とすると，定常レベルではこの３倍の 200(1) 膜結合カロテノイドの吸光度変化（カロテノイドシ

mV 程度の Δϕ が生じる．ADP を加えて ATP 合成を促フト）による Δϕ 測定

進すると新たな速い Δϕ の減衰（半減期 15ミリ秒）が見

試料：反応液：3mM リン酸カリウム緩衝液 pH 8.0，

られた．Δϕ が ATP 合成で消費されることがわかる．

50mM KCl，5mM MgCl にホウレンソウクラス 葉緑

チラコイド膜では Δϕ 消失速度は比較的速く定常光照射下での Δϕ はあまり大きくならない一方，水の分解反応などで ΔpH＝3以上（室温で 180‑240mV の Δμに相当する）が形成される．光照射下の定常状態での
Δμ は 300‑400mV と推定される．Δϕ の測定にはこの
他に，電位感受性色素（メロシアニンなど）の吸収変化もよく使われる ．
(2) 紅色光合成細菌の単離クロマトホア膜での，Δϕ，Δμ の測定例

図 3：518nm でのカロテノイド吸収変化を利用した膜電位の測定．飽和光強度の 10μs の閃光を逐次８発当てた際の変化．下向き矢印は閃光照射の時間を示す．左右図はそれぞれATP の合成が抑制されている時と促進されている時を示す．
１閃光で約 60mV の膜の内側が正の Δφ が形成される．
2009 低 温 科 学

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カロテノイド吸収変化を示す紅色光合成細菌での実測例を示す（表 1）．細胞膜とつながる光合成細菌のクロマ
トホア膜小胞系では ΔpH が小さく，Δϕ のほうが Δμへの寄与が大きい．
571

イオン透過性の低いクロマトホア膜では，外部溶液内の K 濃度を変え内外溶液相間にあらかじめ K 濃度差

ン濃度が高いと ΔpH や Δϕ そのものが減るので，濃度を変えて測定するなどの注意が必要である．

をつくり，バリノマイシンを添加すると一時的に拡散電位による Δϕ を数分間安定に形成できる．この時の吸収変化量と比較することでカロテノイド吸収変化量と Δϕ

引用文献間の関係を得て，光照射時の Δϕ を算定する ．しかし，

１) P.Mitchell(1966)Chemiosmotic coupling on oxidative

カロテノイドシフトを示さない紅色光合成細菌種も多い

and photosynthetic phosphorylation, Glynn Research,
Bodmin.
２) P.Mitchell (1966) Chemiosmotic coupling and energy
transduction, Glynn Research, Bodmin.
３) 伊藤繁 光合成細菌（北村博，森田茂広，山下仁平編）
膜電位，P.251学会出版センター（1984）
４) W.Junge and H.T.Witt (1968) Z.Naturforsh. 23b P.

（例えば Chromatium vinosum, Thermochromatium te．膜透過性のイオン（たとえば表 1中のC ‑pidum など）
SCN ）の膜内外での分配から Δϕ を算定することも行われている．
表１上段の実験では ΔpH は 9‑アミノアクリジンの蛍
光強度の減少として測定している ．このアミン色素は
膜小胞内部に入ると H を結合し正に荷電して，膜透過できず内部にたまる．内部の高濃度状態では蛍光強度が弱まる．この変化量から ΔpH に換算するには，同じような条件下で内外 pH を人為的に変えて作った状態でのΔpH に対する応答と比較するか膜小胞内部体積をみつもって計算する ．表１下段には放射性のアミン分子の分配から計算した ΔpH を示す ．使用する膜透過性イオ

572

244.
５) S.Itoh and S.Morita (1982) Biochim. Biophys. Acta
682 P.413.
６) K.M asamoto,K.M atsuura,S.Itoh and M.Nishimura(1981)Biochim. Biophys. Acta 638 P.108.
７) A.Baccarini-M elandri, R.Casadio, B.A.M elandri(1977)Eur. J.Biochem. 78, P.389.
８) S.Schuldiner, E.Padan, H.Rottenberg, Z.GrometElhanan, M.Avron (1974)FEBS Lett. 49, P.174.

M embrane po tential

5章
形質転換

５章 形質転換

１．シアノバクテリア
a．シアノバクテリアの形質転換法
岩井 雅子 ，広瀬

侑 ，池内

昌彦

シアノバクテリアは真正細菌の一種として，相同組換による遺伝子操作がよく整備されているものが多いが，重要な種でも形質転換できないものもある．代表的な形質転換のプロトコルとともに今後の展望を述べる．

Transformation of Cyanobacteria
We summarized principles and technical protocols for transformation of several representative species of
cyanobacteria.

1.a.1 シアノバクテリアの形質転換の概要
1.a.1.1 多コピーゲノム

cus elongatus BP-1，Synechococcus elongatus PCC
7942，Synechococcus sp.PCC 7002）．この取込には細胞表面の線毛やいくつかの遺伝子が必要である ．一方，シ大腸菌などと異なるシアノバクテリアの大きな特徴

アノバクテリアの多くは制限酵素をもっており，これがは，細胞内に複数のゲノムコピーが存在する点であり，外来 DNA による形質転換を阻んでいる．接合による形

例えば Synechocystis sp. PCC 6803 では一細胞当たり約質転換では，その制限酵素に対抗する DNA メチラーゼ

12コピーのゲノム DNA が存在する ．このため必須遺を組み込んだ大腸菌が使われている ．今後は，ゲノム情伝子を破壊するコンストラクトで形質転換しても，変異報から推定した DNA メチラーゼ遺伝子を組み込むこと

体は薬剤スクリーニングで容易に得られる．このとき野で，これまで形質転換できなかった種の形質転換を可能

生型 DNA と変異体 DNA が細胞内に共存している．しにできるかもしれない．野外に生息するシアノバクテリ

たがって，形質転換後にさらに１〜数ヶ月間培養を続け

アの多くは細胞外多糖類などを多量に分泌して細胞を保て，変異体 DNA が野生型から完全に分離する（segrega-

護している．このため，DNA を添加しても細胞に到達でtion）を確認する必要がある．segregation の確認には感きないことも多い．細胞の生存率を保持したまま，この度が高い PCR 法がよく使われるが，その増幅効率はような細胞外物質を除去することはこれまで成功しておDNA の長さに逆の依存性があるので注意が必要であらず，今後の課題である．

る．一方，サザン法は DNA の長さにそれほど依存せず

1.a.1.3 光合成遺伝子の操作

segregation の割合を推定することに適しているが，微いくつかのシアノバクテリアは炭素源として有機物を量の DNA の有無を確認できるほどの感度はない．なお，取込み，従属栄養で増殖できる．たとえば，Synechocystis

segregation 途中であっても，必須遺伝子の変異体も含6803 や Plectonema boryanum dg5 はグルコースを利用

めて表現型が確認できることもある．

でき，Anabaena variabilis ATCC 29413 はフルクトー

1.a.1.2 形質転換法

スを，Synechococcus 7002 はグリセロールを利用できる．

シアノバクテリアの形質転換法としては，自然形質転このような株では，光合成の必須遺伝子のノックアウト

換法，エレクトロポレーション法，接合法などが一般的や部位特異変異導入などができる．一方，われわれは絶である．自然形質転換は，単に DNA を細胞と混合するだ

対独立栄養型の Thermosynechococcus にグルコース輸

けで細胞内に取り込まれて，相同組換でゲノムに組み換送体の遺伝子を組み込んで，光合成の必須遺伝子の操作えられる現象であり，多くのシアノバクテリアで見られを目指したが，これまでのところ従属栄養増殖を実現でる（例：Synechocystis sp.PCC 6803，Thermosynechococ-

きていない．

１) 東京理科大学応用生物学科２) 東京大学大学院総合文化研究科広域科学専攻生命環境科学系

2009 低 温 科 学

vol.67575

・このほかに，アンピシリンやハイグロマイシン，ゲン

1.a.2 形質転換各論

タマイシンなども使用例がある．

1.a.2.1 S ynecho cys tis s p. P C C 6803
自然形質転換の報告は古くからあり，効率が非常に高・DCMU：光化学系阻害剤．10mM エタノール溶液

を作製，最終濃度 10μM ．

い ．Synechocystis の特質はグルコース輸送体の遺伝子・グルコース：2M 溶液を作製，フィルター滅菌，最終をもち，グルコースを供給することで光合成の必須遺伝濃度 5mM で使用する．ただし，Synechocystis は完全子を完全にノックアウトできることにある．このとき，

暗所ではグルコースによる従属栄養でも生育できな

DuPont の Williams が開発したグルコース耐性株の使

い．１日に１回，15分程度光を照射する必要があり，用が重要である ．グルコースは通常，培地に最終 5mM

light-activated heterotrophic growth という ．

ほど添加する．

・ニトロセルロースメンブレンフィルター：ミリポア社の HATF，孔径 0.2μm．Advantec 社のものも代用［実験方法］代表的な自然形質転換法

可．
〝detergent-free" の方がコロニー出現率は高い．

１．形質転換用 DNA を用意．プラスミド DNA の場合，環状を切断する必要なし，特別な精製も不要．
２．OD 730＝0.5−1.0の 細 胞 1mL に 1‑5μg の DNAを混合する．

［実験方法］表現型相補による新規遺伝子の同定
２回交叉型の自然形質転換能を利用して，変異株の変異部位を容易に同定できる．変異株だけが増殖できない

３．薬剤の入っていない BG11 プレートにニトロセル

培養条件で，その変異株に野生株または抑圧株由来のゲ

ロース膜（ミリポア，界面活性剤フリー，孔径 0.2μm）

ノム DNA またはそのライブラリーDNA を添加す るをのせ，細胞/DNA を塗布する．

と，形質転換した細胞だけが生育できるというのがその

４．24時間，光照射（50μE ms ）する．

原理である（図 1）．変異株が増殖できる場合でも，増殖

５．薬剤入りのプレートにニトロセルロース膜を移す．

速度が大きくちがっていれば，表現型の相補を検出でき

６．1‑2週間，光照射（50μE m

る．このような方法で，これまでに実に多くの遺伝子がs ）する．

＊簡便法として，ニトロセルロース膜に細胞を塗布し単離されている．

てから，DNA を 1‑2μL 滴下してもよい．この場合

１．増殖できる株からゲノム DNA を単離し，いくつかは，形質転換効率は低下するが，１枚のプレートでの制限酵素で消化したものでまず相補を確認する．

多数の形質転換を行える．

２．相補できる DNA を低融点アガロース電気泳動など
でサイズ分画し，相補できるサイズを求める．

［その他の参考事項］
・カナマイシン耐性カセット：Tn5 由来（pRL161）やTn903 由来（pUC4K）などがある．いずれも readthrough 型で，挿入部位の下流の遺伝子の発現を許すので，オペロン中の遺伝子の破壊などに適している．カ
ナマイシン濃度は 20〜100μg mL ．
・クロラムフェニコール耐性カセット：pACYC184 由
来．readthrough 型と思われるが，確かな証拠はない．
クロラムフェニコールはエタノールに溶解し，最終濃３．サイズ分画した DNA を大腸菌にクローニングし，相補できるクローンを単離する．
４．相補できる DNA インサートの両端をシーケンス
し，CyanoBase をサーチして領域を決定する．
５．相補できる DNA インサートの塩基配列に基づいて，約 1kbp の断片に分割し，相補する領域を同定す
る．
６．こうして絞り込んだ相補できる領域を野生株と変異株でシーケンスし，変異部位を決定する．

度は 20μg mL ．
・スペクチノマイシン耐性カセット：pRL453 由来．両側にオメガ因子のターミネータ配列がある ．スペク
チノマイシン濃度は 20μg mL ．
・エリスロマイシン耐性カセット：20mg mL エタ［具体例］
図１は，メチルビオロゲン耐性株の DNA を野生株に添加して耐性を付与した結果を示す．培地は 10μM メチ
ルビオロゲンを含んでおり，100μE m

s の光条件下

ノール溶液を作製し，最終濃度は 20μg mL ．コンスで培養すると，発生する活性酸素によって野生株は死滅

トラクト作製時には大腸菌がエリスロマイシン耐性なする．しかし，形質転換して耐性となった細胞だけが生ので，100μg mL 以上の高い濃度で選別する必要が育して，緑色のコロニーを形成する．この図では，大腸ある．

菌にクローニングした EcoRI 断片 4‑6kbp の各クロー

576

シアノバクテリアの形質転換つまり表現型相補などの形質転換において，PCR 産物とプラスミド DNA で効率に大差ない．
1.a.2.2 Thermos ynechococcus elong atus
B P -1および T.vulcanus R KN
好熱性シアノバクテリアはその遺伝子産物であるタン
パク質の高い熱耐性と，光化学系複合体のようなタンパ
ク質複合体の高い安定性を特徴としており，これを生かすためにはその遺伝子操作が必須である．Thermosynechococcus elongatus BP-1 に適用できる形質転換法には
自然形質転換，エレクトロポレーション，接合法などがある．一方，T.vulcanus RKN では自然形質転換は確認されているが，エレクトロポレーションはこれまで成功していない．T.vulcanus RKN は電気パルスでの生存率が低いことがその理由かもしれない．本項では，当研究室の経験に基づいて，エレクトロポレーションと自然形
質転換について述べる ．
［実験方法］

T.elo ng atus B P -1のエレクトロポレーション
図 1：Synechocystis 6803 の表現型相補の例．ここではメチル
ビオローゲンを含むプレートに野生株の細胞を塗布し，耐性株の DNA を分画したものをスポットした．特定の画分でのみ耐性コロニーが多数出現している．

１．対数増殖期の T. elongatus BP-1 の細胞を用意す
る．定常期の細胞では効率は低い．ddH O で細胞を洗浄し塩を除く．このときの遠心は室温で行う．細胞密度 OD＝20になるように ddH O に懸濁し，40μLになるようにエッペンチューブに分注（約 1×10 cells
ンによる相補の結果を示している．DNA 溶液を滴下し．
mL ）たところ以外に生じたコロニーは，本来生育できない細２．コンストラクト DNA（3μg μL ）を 4μL 加えて混胞から生じた自然抑圧変異体であり，これから DNA を合し，エレクトロポレーション用セル（幅 2mm）に移単離してさらに抑圧のしくみを解析することも可能であ

し，１分間氷上におく．

る．数十個から数百個のクローンをスクリーニングすれ

３．電気パルスをかける．10kV/cm，time constant 5m

ばたいてい相補できる DNA を同定できる．そこで筆者

秒，10μF コンデンサー，島津エレクトロポレーション

らは，10個ずつまとめた DNA を用いてスクリーニング

装置 GTE10 を使用．

し，相補できるものから個別クローンを同定する２段階

４．すぐに BG11 培地 1mL を加える．

のスクリーニングを行っている．また，大腸菌にクロー

５．45℃で 24時間，dim light（10‑20μE m

ニングできない場合，複数の制限酵素による相補できるs ），120rpm で振盪する．

断片のサイズを求め，CyanoBase をサーチするだけで領

６．溶 解 し た トップ ア ガー（0.75％ バ ク ト ア ガー／

域を決定できることがある．なお，Synechocystis の形質

BG11）を 3mL 加えて，薬剤入りのプレートにプレー

転換は２回交叉型なので，プラスミドライブラリーDNA

ティング．

で相補してもプラスミド部分は挿入されておらず，プラ

７．トップアガーが固化後，インキュベータへ．培養条

スミドレスキューはできない．

件：45℃，弱光（約 20μE m［注］ゲノムライブラリーを作成するとき，
制限マイナス＊トップアガーがある方が出現するコロニーが多いの大腸菌を使用する．Synechocystis の修飾系はわかっ．
s ）が，コロニーサイズは小さい（図２）．

ていないが，通常の大腸菌でのクローニング効率は非８．約１週間でコロニーが出現し，２週間で２枚めのプ

常に低い．筆者らは，エレクトロポレーション用のレートへ移す．移す時はコロニーを P 20のピペットマ（StrataGene）を使用している．なお，
XL1Blue MRFʼンで吸い取り，5‑10μL の BG11 培地で懸濁して，２枚

Synechocystis は，大腸菌の制限修飾系を拒否しない，めのプレートにスポットして培養．

2009 低 温 科 学

vol.67577

図 2：Thermosynechococcus elongatus BP-1 のエレクトロポレーションによる形質転換の例．左のトップアガーを用いた場合は，コロニーサイズは小さいが，出現したコロニー数は非常に多い．

＊通常，１週間で３枚めに移せ，さらに１週間で４枚＊ T.vulcanus RKN はエレクトロポレーションによめに移せる．３，４枚めのプレートで生育している

る形質転換はできない．また，自然形質転換効率も細胞を白金耳でかき集め，ゲノム DNA を単離して低い．もし，形質転換が難しいときは，筆者らは，

segregation チェックを行う．多くの変異体はこの

T.elongatus BP-1 と非常に近縁関係にあることを段階で segregation が完了している．

利用して，まず T.elongatus BP-1 にエレクトロポ＊プラスミド DNA は ddH O に対して透析し，塩をレーションで変異を導入する．さらに，そこから変除く．

異体ゲノム DNA を単離して，ゲノム DNA による＊エレクトロポレーション法は T.vulcanus RKN に

自然形質転換によって T.vulcanus RKN の変異体は適用できない．

を得ている ．

［実験方法］自然形質転換法［参考事項］

どちらの株にも同じように適用できる．
プロトコルは，・制 限 系：こ れ ま で に T.elongatus BP-1 に は CGCG

パルスをかけないことを除けば，エレクトロポレーショを認識する 型制限酵素 SelI の存在や，ゲノム DNA

ン法に近い．

の RGATCY 配列が特異的にメチル化を受けている

１．対数増殖の細胞を濃縮し，OD＝20で 40μL にな

ことなどが知られているが，これらが形質転換の障害

るようにエッペンチューブに分注．

となっているかどうかは不明である．一方，ゲノム配２．コンストラクト DNA（〜3μg μL ）を 4μL 加え

列から 型制限系の遺伝子（tll2228-tll2230 ）が発見て，室温で 5‑10分インキュベートする．

された．このうちの制限系の tll2230 を破壊した株は＊この時間や光条件を最適化することで形質転換効率

有意に形質転換効率が高く，必要に応じて形質転換のが高くなる可能性がある．

親株として使用されている ．

３．BG11 培地を 1mL を加える．あとはエレクトロポ

・薬剤耐性：これまで Synechocystis で長年使われてきレーション法と同じである．

たカナマイシン耐性カセット，クロラムフェニコール

＊自然形質転換の効率はエレクトロポレーションより耐性カセット，スペクチノマイシン／ストレプトマイも低く，Synechocystis の自然形質転換効率より非常

シン耐性カセットなどが使われてきた（表 1）．注意をに低いので，高い濃度のプラスミド DNA を用意す

要するのは，培養温度が高いと抗生物質の効力の低下

る必要がある．

がみられることで，２週間以上培養したものは耐性カ

表 1：Thermosynechococcus の選択に使用する薬剤耐性カセットと抗生物質濃度．
薬剤耐性カセット
クロラムフェニコール耐性カセット
Sp/Sm 耐性カセット
カナマイシン耐性カセット

由来
pACYC184
pRL453
pRL161(Tn5 由来)

薬剤濃度（μg mL )
液体培地
プレート
Cm 5〜7Cm 3.4
Sp 5＋Sm 10 Sp 5＋Sm 10
Km 40〜80
Km 40〜80

Cm：クロラムフェニコール，Sp：スペクチノマイシン，Sm：ストレプトマイシン，Km：カナマイシン

578

シアノバクテリアの形質転換

セットを持たない細胞でも増殖できるようになるのでいるが，日本ではまだ研究者が少ない．筆者らは，Jack

注意が必要である．また，耐熱性生物のカナマイシン

Meeks 教授（米・カリフォルニア大学）の指導を受けて耐性遺伝子を利用したカセットも作製されている ．

Nostoc 29133 の形質転換に成功した．この方法は煩雑で擬陽性のコロニーがカナマイシン耐性，スペクチノマ

あるが，Nostoc 29133 はこれから注目される生物なの

イシン／ストレプトマイシン耐性では生じるので注意

で，ここで詳しく紹介する．Nostoc 29133 の形質転換法が必要であるが，クロラムフェニコール耐性の擬陽性は Jack Meeks 教授のホームページ

は生じたことがない．
そのため，共通のプラットフォー

いるが，筆者らは一部を改変している．全般的には大腸ム作製のためのカセットには前者を用い，個々の遺伝菌の接合を用いた Anabaena 属の形質転換法に準じて子破壊などでは後者のカセットを使用している．

いる ．Nostoc 29133 の形質転換は，①接合に用いる大にも記載されて・温度：われわれは通常 45℃でスクリーニングや seg-

腸菌体量が少ない，②擬陽性コロニーの数が多い，③適

regation のための培養を行っている．この温度は本来切な薬剤カセットの使用が必要，という点において，の最適増殖温度より 10℃以上低いが，使用しているカ

Anabaena 7120 の形質転換と異なっている．

セットが中温性生物由来であること，また上述したよ
うに抗生物質自身の安定性も考慮したためである．ま

［実験方法］

た，
実際の形質転換効率も 45℃の方が 50℃よりも有意

１．使用菌株とプラスミドの準備に高かった．

①モビライザープラスミド（pRK2013：クロラムフェ

・組換様式：これまでに相同２回交叉と相同１回交叉がニコール耐性）とヘルパープラスミド（pRL528：カ

報告されているが，前者が普通である．後者は psbTc

ナマイシン耐性）を形質転換した大腸菌 HB101．

付近の DNA を使用したとき非常に高かったが，ほかJack Meeks 教授より取り寄せが可能．

の部位の DNA では成功していないので，まだ適用は限定的である．

②カーゴプラスミド（pRL271：クロラムフェニコール
およびエリスロマイシン耐性）のマルチクローニン・接合法：ブロードホストベクターRSF1010 をベースとしたシャトルベクターも開発されている ．
・プロモータ：われわれはこれまで多数の内在プロモー
タや外来プロモータを試みたが，まだ十分なコンセン

グサイトにコンストラクトをクローニングし，大腸菌 HB101 へ形質転換．相同組み換えには薬剤 カ
セットの上流・下流には 1kbp 以上の配列が必要．
③Nostoc 29133 細胞

サスはない．内在のプロモータはコンストラクト作製

AA 培地（１章２参照）に 5mM M OPS，2.5mM時に大腸菌で発現するものとしないものがある．T.

（最終）を加え，ddH O を加えて
NH Cl，pH＝7.8

elongatus BP-1 の psbAI プロモータは大腸菌で強く４倍に希釈する（以下，AA/4＋N 培地という）．約発現し，毒性のある遺伝子の多コピーベクターへのク

100mL の AA/4培 地 で Nostoc 29133 を OD

ローニングができなかったことがある．

1‑2程度まで液体培養する（BG11 でも代用できるか・コンストラクト設計：組換え効率は Synechocystis よりもかなり低いので，カセットの両側の相同領域は上流，下流とも各 1kbp 以上必要である．われわれは約
1.5kbp くらい用意している．
1.a.2.3 No s to c punctifo rme ATC C 29133
Nostoc punctiforme ATCC 29133（以後 Nostoc 29133＝

もしれない）．
２．Nostoc 29133 細胞の準備①約 100mL の AA/4＋N 液体培地 で 育 て た Nostoc
29133 を，フィラメントあたり 4‑6個の細胞になる
ように超音波処理し，その後，数時間回復培養させる．

と略）は，ホルモゴニア（連鎖体）を形成して滑走運動②クロロフィル a 濃度を測定する．細胞を遠心して沈する，緑／赤色光に応答して光合成の集光装置の合成を殿させ，上清を除き，メタノールを加えてボルテッ

調節する（補色適応）など，興味深い現象を示す．これクスする．その後，遠心した上清を波長 665nm の吸まで窒素固定遺伝子やヘテロシスト形成の研究には，

光度（A ）
で測定する．クロロフィル a 濃度は次のAnabaena 7120 がおもに使われてきたが，Anabaena式を用いて算出する．

7120 には窒素固定以外の現象がほとんど見られない（Nostoc 29133 で同定される遺伝子の多くは Anabaena

クロロフィル a 濃度 μg mL＝12.7×A(式 1)）．
7120 にも存在するので，一種の変異体かもしれない．

③大腸菌の回収を行なう直前に，Nostoc 29133 の細胞

そのため，Nostoc 29133 のゲノム決定後は注目を浴びてを室温で遠心する．ク ロ ロ フィル 濃 度 75‑100μg

2009 低 温 科 学

vol.67579

mL (約 0.75−1.0x 10 cells mL ）になるように
AA/4＋N 培地を加え，細胞培養液とする．
３．大腸菌の準備④育ったコロニーをエッペンチューブにかきとり，300
μL の AA/4＋N 培地を加えて懸濁する．そして，穏①大 腸 菌 HB101（pRL271）と HB101（pRK2013，
pRL528）をそれぞれ 100mL の抗生物質入りの LB
で培養し，OD

レートに塗り広げて培養を続ける．

＝約 0.6まで培養する．培養液を混合し，計 200mL とする．
②室温で遠心して細胞を回収し，抗生物質を含まない（細胞の洗LB 培地を加えて懸濁し，再び室温で遠心浄），③同じ作業をもう一度繰り返す．ペレットの状態で長時間放置しないこと．10mL の抗生物質を含まない
LB 培地に懸濁し，大腸菌混合液とする．
４．接合①AA＋N＋LB 培地のプレート（5mM MOPS，pH＝7.8，2.5mM NH Cl，0.5％ LB，１％ バ ク ト ア

やかに超音波処理する．
⑤５％のショ糖および抗生物質を加えた AA プレー
トに細胞を撒き，通常光の下で１週間程度培養するとコロニーが現れる．筆者の経験では，ショ糖選択における擬陽性はかなり少ない．
６．薬剤耐性カセットの挿入の確認①５％のショ糖および抗生物質を加えた AA プレー
トで生育してきたコロニーを，別の抗生物質のみを加えた AA プレートに塗り広げて培養する．
②育ってきた細胞の少量をかきとり，エッペンチュー
ブ に 入 れ る．200μL の TE pH 8.0と １％(v/v)
Triton X-100 を加え，よくピペッティングする．少量の寒天は混入しても問題ない．

ガー）を 10枚作製し，ニトロセルロースメンブレン③ 95℃，3.5min 処理する．溶液が濁る．

フィルター（HATF，孔径 0.45μm，M illipore）を④ 200μL のクロロホルムを加え，ボルテックスをし，密着させる．
②エッペンチューブに 0.5mL の大腸菌混合液と 0.5

５分間遠心する．その後水層を回収する．
⑤上記の操作をもう一度繰りかえす．

mL の Nostoc 培養液を加えて混合し，室温で 30秒⑥得られた水層を DNA の鋳型として PCR を行い，間遠心する，上清 600‑700μL を捨て，ペレットを穏

ゲノム上の DNA が完全に薬剤カセットと置き換

やかに懸濁する．そして，懸濁液全量をできるだけわったことを確認する．もし置き換わっていなけれ

均一にフィルターに塗り広げる．細胞数が多い部分

ば，
ショ糖選択を行なう前の細胞を何回か植え継ぎ，は抗生物質が効かないので注意．

置き換わるのを待つ．

⑤プレートをパラフィルムで封し，１％ CO ，弱光（2‑3W m ）の元で一晩培養．

注意事項⑥フィルターを LB を除いた AA＋N 培地のプレート＊大腸菌は ４℃で 保 存 し て お く と 徐々に 死 滅 す る のに移し，弱光で２日間培養．

で，−80℃のフリーズストックを作製しておく．

⑦通常光（4‑6W m ）へプレートを移し，２日間培養．

＊sacB の遺伝子は変異が入りやすいので，形質転換前に⑧フィルターを適切な抗生物質入りのプレートに移pRL271 を持った大腸菌をショ糖入り LB プレートにし，通常光で２週間程度培養するとコロニーが出現

塗り広げ，コロニーが現れないことを確認すること．

する．コロニーの出る個数はプレート間でのばらつ＊Anabaena 7120 よりも大腸菌の量が少ない．

きが大きい．以後，全ての培養は通常光のもとで行＊sacB ；レバンスクラーゼ遺伝子．異常な糖転移産物をなう．
５．sacB による選別① 1×1cm で区画わけをした抗生物質入りの AA プ
レートを用意する．

蓄積させて致死させる条件致死遺伝子．
＊１回目の組換（integration）によって Cm（Em＋Nm）
耐性のコロニーが生じる．この組換えは挿入カセットのどちらか片側の相同領域で起こる．こうして，プラ②出現したコロニーを１つずつ滅菌した爪楊枝でつつ

スミド全体がゲノムに組み込まれる．一方，２回目のき，それぞれを区画に植えついでいく．破壊する遺組換（resolution）が挿入カセットの反対側で起きる

伝子にもよるが，8‑9割以上のコロニーは植えついと，sacB を含むプラスミドのベクター部分が脱落し，だ後に死んでしまうので，なるべく多くのコロニー

５％ショ糖に耐性のコロニーを生じる．また，このとを拾うこと．

き１回目に組換えた側で再び組換えが起こると，挿入③通常光の下で１週間程度培養すると，薬剤耐性をもされたプラスミド全体が脱落しショ糖耐性は回復する

つコロニーが現れてくる．このコロニーを別のプが，挿入カセットのネオマイシン耐性も失う．この原580

シアノバクテリアの形質転換

理は，Anabaena の形質転換でも同じである．

を供与体として使用するのは現実的に難しい．

＊大腸菌の pRL271 のコンストラクトが完成後，大腸菌・海洋性 Synechococcus の場合，接合によってブロードをショ糖プレートに塗り広げ，コロニーが出ないこと

ホストベクターと自殺ベクターを導入することによっを確認すること．

て目的の遺伝子の破壊に成功した例もある ．この手

＊Nostoc 29133 の形質転換に使用する抗生物質の濃度
Neomycin 25μg mL ， Ampicillin 10μg mL ，法は，WH 8102株，WH 8103株，WH 7803株で適応できるという．

Erythromycin 10μg mL ，Chloramphenicol 60μg

・最後に，原始的な Gloeobacter violaceus，クロロフィ

mL ，Streptomycin 1μg mL ．なお，Kanamycin

ル d をもつ Acaryochloris marina，海洋性窒素固定型には本来耐性なので使用できない．

Cyanothece，海洋性で主要な生態的地位を占める Pro-

＊Nostoc 29133 はカナマイシン耐性を持つため，スク

chlorococcus marinus なども，形質転換は成功していリーニングにはネオマイシンを用いる必要がある．まない．DNA の取込や制限系など問題点が洗い出された，Anabaena 7120 でよく使われるストレプトマイシてきており，ゲノム情報を利用して，今後は新しい展

ン／スペクチノマイシン耐性の Ωカセットは，十分な開が期待できるだろう．

耐性を付与しないので，Amaranthus hybridius のpsbA プロモーターとネオマイシンホスホ ト ラ ン ス
フェラーゼ（npt）を融合させたカセットが開発されている（プラスミド pSCR9 ) ．
1.a.2.4 その他のシアノバクテリアの形質転換
・Synechocystis 6803 と並んで，古典的な自然形質転換法が確立されいる株は Synechococcus elongatus PCC
7942 と Synechococcus sp. PCC 7002 である．前者は絶対独立栄養だが，形質転換能が非常に高い．後者はグリセロールを炭素源として従属栄養増殖ができるので，光合成関連の遺伝子をノックアウトが可能．
・アオコを形成する単細胞性の Microcystis aeruginosa
PCC 7806 は自然形質転換による遺伝子破壊の報告がある ．しかし，Synechocystis 6803 と比べるとかなり効率は低い．
・乾燥耐性でもっとも有名でよく研究されている Nostoc commune は形質転換の報告はない．しかし，単細胞性で乾燥耐性が非常に強い Chroococcidiopsis thermalis PCC 7203 はエレクトロポレーションと接合によって形質転換できる ．
・Plectonema boryanum IAM-M101 strain dg は糸状性で窒素固定するとともに完全暗所でグルコースで生育する．この株ではエレクトロポレーションによる形質転換が報告されており，プラスミドレスキューも可能である ．
・商業的に重要な種であるいわゆるスピルリナ（Arthrospira sp. PCC 9438）の形質転換法は非常に複雑な手法で報告されている．具体的には，トランスポゾン，
トランスポザーゼをリポソームに組み込んでエレクト
ロポレーションによって細胞内へ導入している ．
Arthrospira は６種もしくはそれ以上の制限酵素を持っており，大腸菌などで増幅したプラスミド DNA
2009 低 温 科 学

vol.67

参考文献
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581

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582

シアノバクテリアの形質転換

５章 形質転換

１．シアノバクテリア
b．P C R を使った S ynecho cys tis の高速簡便遺伝子破壊法
佐藤 直樹
外来 DNA を取り込む性質のある Synechocystis sp.PCC6803 では，遺伝子破壊のために必要な遺伝子破壊コンストラクトを PCR によって簡便に作ることができ，多数の遺伝子破壊を平行して行うことができる．

A rapid method for gene disruption in
Naoki SATO
A rapid and convenient method for making DNA constructs to be used in gene disruption in Synechocystis sp.
PCC6803 is presented.

1.b.1 はじめに
1996年にシアノバクテリアとして最初にゲノム塩基1.b.2 P C R を用いた遺伝子破壊コンストラ
クトの作製

配列が決められた Synechocystis sp. PCC6803 は，外来

図 1に方法の概略を示す．全部で４個の DNA を PCR

DNA を容易に取り込み，相同組換えによって，遺伝子によって増幅し，これを順次つないでいく．すべてを一

ターゲティングが容易にできる．これまで，薬剤耐性カ度につなぐということもよく行われるが，失敗した場合セットによって分断した遺伝子を含むプラスミドによるにどこが悪いのか全くわからず，また，多くの場合，複遺伝子破壊や，変異株のゲノム DNA・プラスミドクロー

数のバンドが出るため，あまり適切ではない．少し手間ンによる相補を利用したクローニング などが行われてがかかるが，３回にわけて PCR を進めることにする．ないる．これまで多くの研究では，遺伝子破壊コンストラ

ぜ薬剤耐性カセットを分断するのかという疑問があるかクトとしてプラスミドが用いられてきたが，これには目もしれない．このようにすれば，最後にできる正しいコ

的の遺伝子を含む DNA 断片のプラスミドへのクローニ

ンストラクト以外の DNA が細胞に入っても薬剤耐性を

ング，遺伝子内部の制限部位における切断，薬剤耐性カ

与えることはないからである．PCR 自体は，各研究室でセットの挿入，という３つの段階を踏む必要がある．適行われている方法を利用すればよい．

当な遺伝子内部の制限サイトがない場合も多く，また，本法で用いるプライマーは表 1にまとめた．プライ

遺伝子によっては，プラスミドへのクローニングがうま

マーの長さは研究室ごとに好みがある．プライマーの設

くできないこともある．筆者の研究室でも以前は，遺伝計は経験に頼らず，適当なプライマー設計プログラムを

子破壊コンストラクトを１個作るために１ヶ月程度要す

利用するのがよい．私の場合，長いにこしたことはない

ることも稀ではなかった．近年，PCR を利用した遺伝子と思ってだいたい 25塩基くらいで設計しており，AT に改変技術が進歩し，これを活用することによって，
クロー富む場合は，さらに長くしている．また，参考までに，ニングを経ることなく容易に融合遺伝子を作ることがで研究室で使っている PCR のプロトコルを表 2，3に示しきるようになった．本稿ではその一例として，相同組換た．実際に研究室で使っている装置は，BioRad 社の iCy-

えに使う薬剤耐性カセットを含んだ直鎖 DNA の作製と酵素としてはごく一般的なタカラの ExTaq
cler である．

それによる形質転換を用いているが，特に変異率を低く抑えたい場合には他について述べる．このような遺伝子破壊法の基本は前項 1.a に述べられているので，ここでは，本法に特有の事柄を中心として解説する．

の適当な酵素を利用することをお薦めする．
まず，カナマイシン耐性カセットを２つに分けて増やす．私たちは pUC4K というプラスミドに入っているカ
ナマイシン耐性カセットを使った．どこで分割しても構

１) 東京大学大学院総合文化研究科

2009 低 温 科 学

vol.67

わないが，分割した２つの断片は互いに重なり合うよう583

図 1：PCR を用いた遺伝子破壊コンストラクトの作製にする．ここでは，上流半分 4K-L(707bp）と下流半分ある（表 1）．他の耐性カセットを使う場合には適宜考え

4K-R(457bp）としている．重なりは 50bp となる．このればよい．次に，目的遺伝子の上流約 1kbp の領域を増

カナマイシン耐性遺伝子は昔の GC テール法でクローニ

やすようにプライマーup-f と up-r を設計する（図 1）．

ングされているので，上流側はＧが並んでいるつなぎの側に，カナマイシン耐性カセッ
up-r については，その 5ʼ

部分のすぐ隣から使うことでプロモータを確保し，下流

トの 5ʼ
末端を増やすプライマーLf と相補的な配列であ側は終始コドンの 150塩基ほど後ろまで含むようにしてる Lf-rev をつけた形で合成する．同様に，下流側につい

表 1：本方法で用いる PCR プライマー
名称
4K-Lf
4K-Lr
4K-Rf
4K-Rr
Lf-rev ‑up-r
Rr-rev ‑dn-f

584

配列（5ʼ
‑＜3ʼ
）
AGCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCC
AAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCAGTTGGTG
ACATCAGAGATTTTGAGACACAACGTGGCT− (遺伝子ごとに設計)

up-f

CACCAACTGGTCCACCTACAACAAAGCTCT− (遺伝子ごとに設計)
遺伝子ごとに設計

dn-r

遺伝子ごとに設計

高速簡便遺伝子破壊法

表 2：PCR 反応の組成
滅菌蒸留水
10x PCR 緩衝液
2.5mM dNTP 混合液
5mM プライマー１
5mM プライマー２
変性 DNA テンプレート

表 3：PCR 反応のプログラム

ExTaq

76.5μl
10
8
2
2
1
0.5

全量

100

サイクル

ステップ

温度（℃)

時間

１(x 1）

１

96

2分

２(x 4）

１
２
３

95
55
72

30秒
1分 30秒
2分

３(x 25）

１
２
３

95
57
72

30秒
1分 30秒
2分

４(x 1）

１

72

10分

５(x 1）

１

10

0（無限)

ゲノム DNA やプラスミド DNA は，アルカリ変性したものを用いると増幅効率が高い．すなわち，1μg/μl 程度の DNA を 1μl とり，
9μl の 2N KOH，2mM EDTA を加えて，37℃で 10分間処理した後，1μl の 2N 酢酸を加えて中和する．さらに 90μl の滅菌蒸留水を加える．通常さらに５倍程度希釈して PCR に用いる．−20℃で保存する．

この条件はかなりゆるめの条件なので，もう少しアニーリング温度（ステップ２）を高くしてもよい．また，短い DNA を増やす時は，
ステップ２と３の時間も短くしてよい．

ても一方は複合したプライマーとしておく．通常，遺伝の DNA を使って反応する．結合する２つの DNA の濃子を完全に欠損した変異株を作ることを考えるので，度があまり大きく異ならないように留意する．反応後，コード領域はほとんど含まない形で，上流側と下流側をDNA の一部をとり，純水で 50‑200倍に希釈する．この別々に増やしている．但し，隣の遺伝子が近接している

とき，いくつかの希釈率を試すのがよい．濃すぎると次場合には，その発現に影響しないように配慮する必要がの PCR 産物が複数バンドになり，薄すぎると何も増えある．また，図１では，遺伝子の向きは指定していない．

ない．

しかし，目的遺伝子Ｘの下流側にも遺伝子が並んでいる

この希釈液をテンプレートとして，２回目の PCR を場合，共転写されているかどうかはわからないにしても，行う．条件は表 2，3の通り．プライマーはそれぞれ，up-f

極性効果により下流側の転写ができなくなるのを避けると Lr，および Rf と dn-r である．産物を電気泳動で確認ため，カナマイシン耐性カセットの転写方向と目的遺伝

し，DNA を精製する．

子Ｘの転写方向をそろえておくのが無難である．

こうして得られた２つの DNA を上記と同様にして結こうして１回目の PCR で，４個の DNA を作る．でき合し，PCR で増幅する．この３回目の PCR が曲者で，た DNA はミニゲル電気泳動で確認し，DNA 精製キッ

多数のバンドが出ることが多い．その場合，目的のバント（GE ヘルスケア社 GFX など）
により精製する．100μl

ドをピペットで吸い出して，再度 PCR で増幅すると，１の反応液から得られた DNA を 50μl の純水に溶かして本のバンドになることが多い．但し再び多数のバンドにおく．

なることもある．この際，ゲルを切り出して GeneClean

次に DNA を２個ずつ結合する．これは，目的遺伝子の上流部と下流部を増幅する際に用いた複合プライマーになどのキットで精製するというような必要はなく，先の細い微量ピペットで 1μl 程度吸い出せばよい．

含まれるカナマイシン耐性遺伝子の末端配列を利用する．up と 4K-L，dn と 4K-R をそれぞれアニーリングして，１回の伸長反応を行う（表 4，5）．このときはプライ
マーを使わず，アニーリング効率を高めるため，高濃度

1.b.3 相同組換えによる遺伝子破壊株の取得
ひとたび DNA コンストラクトが完成すれば，あとは難しくない．基本的な形質転換の方法については前項 1.

表 4：接続反応の組成a を参照していただくとして，ここでは Synechocystis の滅菌蒸留水

68.5μl

10x PCR 緩衝液10

表 5：接続反応のプログラム

2.5mM dNTP 混合液

1

ステップ

温度（℃）

時間

DNA 1
DNA 2

10

ExTaq

0.5

全量

100

１
２
３
４

95
55
72
10

5分
1分
10分
0（無限）

10

なお，DNA の量は適宜変更してもよく，その場合，水の量を加減する．

2009 低 温 科 学

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ステップ２に進む段階のアニーリングを，時間をかけてゆっくりと温度を下げるようにすればもっとよいかもしれない．

585

形質転換について述べる．100ml の三角フラスコに 25に DNA が増えないことが多い．通常，まず，up-f と dn-r

ml 程度の BG11 培地をいれ，Synechocystis のシングル

で増やし，その産物の一部（0.5μl）を使って，２回目のコロニーを植え込む．なお，私たちは 1mM の NaHCOPCR を行う．その場合，up-f と Rr または Lf と dn-r の（炭酸水素ナトリウム）を添加している．30℃で数日間，組み合わせを用いてカナマイシン耐性カセットを含む形

30μE m s 程度の白色蛍光灯（15‑20W のランプを使

質転換体を確認する．Synechocystis のゲノムはマルチコ

い，20cm 程度離す）で培養する．750nm の吸光度（濁ピーなので，完全に野生型コピーがなくなっていること度）が 0.5程度の対数期の細胞を用いる．100μl の培養を確認するため，目的遺伝子Ｘの内部配列を一方のプラ液をマイクロチューブに取り，できあがった PCR 産物

イマーとし，他方は up-f または dn-r を用いて PCR を行（精製品）を 20μl 加える．量は適宜変更してもよい．

う（論文 参照）．候補株が見つかったら，液体培養で殖1.3％寒天を含む新鮮な BG11 培地の上にセルロースア

やし，更に詳細な確認をする．

セテートフィルター（0.45μm 口径のもの，アドバン
テック製など，パッケージのものをそのまま用い，オー
トクレーブする必要はない）を滅菌したピンセットで載1.b.4 おわりにせ，この上に上記の細胞液をスプレッダーで広げる．軽この方法は非常に簡単で，同時に多数の遺伝子を扱う

く広げる程度で，刷り込まないこと．クリーンベンチでこともできる．月曜日にプライマーがあれば，PCR のや

表面を乾かし，シャーレをテープ（パラフィルムを切っり直しを含めても，金曜日には形質転換までいくことがて用いている）で巻いて，光を弱くして１日間培養を行できる．一人でも，１週間で８個程度の遺伝子破壊が余う．なお，寒天培地の場合，BG11 培地には 0.05％ Na

裕をもってできる（選抜の段階は別）．元気のある研究者

S O（チオ硫酸ナトリウム）と 1mM NaHCO を添加しならばその２倍でも可能であろう．Synechocystis の遺伝ておくことで，プレート効率が高まるとされている．

子は約 3,000個なので，準備が順調にできれば，フルに１日または２日経って，フィルター表面がうす緑色に働けば一人でも１年間で終わる計算である．筆者らは，なったら，フィルターを滅菌ピンセットではがし，30μg/

このようにして 40個の遺伝子破壊を行い，変異株の光合ml のカナマイシンを含 み 1.3％寒 天 で 固 め た 新 鮮 な成特性などを調べた．

BG11 培地に載せる．パラフィルムでシールし，今度は20‑30μE m s 程度の光を当てて培養する．特に明暗周期をつける必要はなく，多くの研究室は連続明期で培参考文献

養している．数日で細胞は白くなるが，１週間を過ぎる

１) H.Wada, Z.Gombos, & N.M urata,Nature 347 (1990)と小さなコロニーが見えてくる．これが形質転換体であp.200.
２) N.Sato, M ,Ishikawa, M .Fujiwara, & K.Sonoike,
Genome Informatics 16 (2005)p.56.
３) I.Sakurai, N.Mizusawa, H.Wada, & N.Sato, Plant

る．十分にコロニーが大きくなったら，白金耳で 30μg/
ml のカナマイシンを含 み 1.3％寒 天 で 固 め た 新 鮮 な
BG11 培地に移す．あとは，シングルコロニーを広げて植える作業を数回繰りかえす．
コロニーが遺伝子破壊株であることを確認するには，コロニーPCR を行う．ただし，大腸菌のプラスミドのス

Physiol. 145 (2007)p.1361.
４) M . Ishikawa, M . Fujiwara, K. Sonoike & N. Sato,
Plant Cell Physiol. (オンライン版) doi :10.1093/pcp/
pcp027

クリーニングの場合とは異なり，１回の PCR では十分

586

高速簡便遺伝子破壊法

5章

形質転換

２．クラミドモナス
a．核ゲノム
福澤 秀哉 ，久保雄昭

緑藻クラミドモナス Chlamydomonas reinhardtii は，核，葉緑体，ミトコンドリアの３つのゲノムす
べてについて遺伝子導入が可能となっており，外来遺伝子の導入や遺伝子タギング法による突然変異株の作製も容易になっている．本稿では，クラミドモナスの核ゲノムの２種類の形質転換法（エレクトロポレーション法・ガラスビーズ法）を紹介する．

Nuclear transformation methods for a green algae,
Hideya Fukuzawa, Takeaki Kubo
The nuclear transformation techniques are powerful tools for isolation of new mutants, and also for complementation of mutant phenotypes by introducing exogenous DNA segments into the nuclear genome. We
described two methods for nuclear genome transformation in a green algae, Chlamydomonas reinhardtii.
Linealized DNA fragments encoding selectable markers can be introduced into the nuclear genome by using
electroporation and glass beads. Especially dominant selectable markers are useful for the selection oftransformants for gene tagging.

るので，細胞壁の不完全な変異株を使うことが多い．細2.a.1 クラミドモナスの形質転換

胞壁が正常な株を形質転換に使いたい場合は，クラミド

クラミドモナスの核ゲノムの形質転換は，1990年にモナス由来の細胞壁溶解酵素ガミートライシン（マトリKindle によって初めてガラスビーズ法による形質転換

クス･メタロプロテアーゼ）を使って細胞壁を除去して使法が報告されて以来，広く行われるようになった

．ま

用する ．
ただし，
完全に細胞壁を失った細胞は物理的に弱た 1998年にはエレクトロポレーション法による高効率

いので，使用する株毎に処理条件を検討する必要がある．

の形質転換法も開発され ，ガラスビーズ法と共に一般的な形質転換法として利用されている．また栄養要求性［試料］

変異株を宿主にしたマーカー遺伝子や，選抜マーカーと・pSP124S

しての薬剤耐性遺伝子も報告されており，実験の目的にておく．

応じたマーカーの選択を行うことが可能になっている（表 1）．栄養要求性マーカー（硝酸還元酵素）や薬剤耐性

制限酵素 EcoRI で切断し，線状 DNA にし・ク ラ ミ ド モ ナ ス 宿 主 株 CC-2627（5D：nit1-305 ，cw15 ，mt )マーカーを使った遺伝子タギング法は新しい遺伝子の発見につながる有用な方法である．宿主として用いるク［試薬］

ラミドモナスの栄養要求性変異株や野生株，ならびに・TAP 培地

マーカー遺 伝 子 は 開 発 者 も し く は 米 国 の・TAP‑50mM Sucrose

Chlamydomonas Center（http://www.chlamy.org/）から入手可能である（第１章‑3参照）．
2.a.1.1 エレクトロポレーションによる核ゲノムの形
質転換細胞の DNA による形質転換には，細胞壁が障害とな
１) 京都大学大学院生命科学研究科遺伝子特性学分野

2009 低 温 科 学

vol.67

RbcS2 プ ロ モーターに コ ド ン 適 合 型 ゼ オ シ ン 耐 性 遺 伝 子（Ble）を連結させたコンストラクト．http://www.chlamy.
org/plasmids.html から入手可能．表 1参照．
硝酸還元酵素遺伝子 NIT1 と細胞壁欠損（cw）の変異株．エレ
クトロポレーション法及び後に述べるガラスビーズ法では，細胞壁合成酵素の変異株を用いることが多いが，この株は，完全に細胞壁を失っているわけではなく，形態は卵形である．
TAP 培地の作製法については，第 1章‑3参照．
浸透圧調整用．

587

表 1：クラミドモナ核ゲノムの形質転換に利用できるマーカー遺伝子や薬剤耐性遺伝子
マーカー遺伝子

酵素名

宿主株

選択培地・抗生物質

文献

NIT1（NIA1)
THI10
ARG7
BLE
APHVII

Nitrate reductase
Hydroxyethylthiazole kinase
Argininosuccinate lyase
Zeocin 結合タンパク質

nit1 株thi10 株arg7 株
野生株
野生株

TAP(NO )培地
Thiamin 添加培地
TAP‑アルギニン添加培地
Zeocin 添加培地
パロモマイシン添加培地

5，10
11
12
13，14
15

野生株

ハイグロマイシン添加培地 16

APHVIII

Aminoglycoside 3′-phosphotransferase VII
Aminoglycoside 3′-phosphotransferase VIII

・1.2％ 選択培地

９) シャーレを裏返して 100〜150μmol m

sec の

光照射下，26℃で培養し，約一週間すると，形質転換［器具・装置］

体のコロニーが得られる（図 1) ．

・培養用エアインキュベーター

10) コロニーを滅菌爪楊枝で拾い，TAP 寒天培地に画・Gene PulserII（BioRad）

線し，１日培養した後に，0.2ml の TAP 培地を分注・滅菌済み爪楊枝

したタイタープレートに移して細胞が生え揃うまで培・滅菌済み平底 96穴タイタープレート

養する．

・エレクトロポレーション用キュベット（電極間距離 4mm）

2.a.1.2 ガラスビーズ法を用いた核ゲノムの形質転
換

［方法］

［試料］

１) 宿 主 株 5D を，TAP 培 地 1l で 26℃，100〜150

・ク ラ ミ ド モ ナ ス 宿 主 株 CC-2627（5D；nit1-305 ，μmol msec 光照射下で 1〜2×10 cells/ml（対数増殖期）まで培養する．

cw15 ，mt ）・プラスミド DNA pMN24E

２) 培養液を一部採取し，10％ glutaraldehyde を 1/10
量添加して細胞を固定し，血球計算板で細胞数を測定する．
３) 700×g で 10分間遠心 し て 集 藻 し，細 胞 を 1×10
cells/ml になるように TAP＋50mM Sucrose で再懸濁する．
４) 形質転換に用いる pSP124S 溶液を 20μg 加える．
５) 4mm キュベットに細胞懸濁液 250μl を移し，15℃
で 5‑15分冷却する．
６) 電気パルスを一回加える ．
７) ポ レーション 処 理 後 の 細 胞 を 15ml FALCONTUBE に 分 注 し た TAP 培 地 12ml に 懸 濁 し，ローテーターで回転させながら 100〜150μmol m

secの光照射下で 16時間培養する．

図 1：エレクトロポレーション法によってゼオシン含有培地上に生育した形質転換体

８) 抗 生 物 質 Zeocin を 10μg/ml 含 む 1.2％ TAP プ
レートにスプレッダーで均一に広げ，５分間静かに置いて，細胞を寒天培地になじませる．
ジーンパルサー を用いた場合の設定は，キャパシタンス 25
μF，負荷電圧 2,000V/cm（＝800V/4mm）バイパス抵抗としてセメント抵抗（330Ω）を電極間に配線する．この条件で時定数は 5.0程度（4.5〜5.5）を示す．

588

約一週間でコロニーが見え始め，２週間目までの間に 1〜2
mm の大きさになる．シャーレの蓋に水滴が付いたままだと，雑菌が混入する可能性があるので，定期的にクリーンベンチ内で除く．
硝 酸 還 元 酵 素 遺 伝 子 NIT1 全 長 を 含 む プ ラ ス ミ ド DNA（pM N24）を EcoRI で切断後，フェノール処理・エタノール沈殿して使用する．表 1参照．

緑藻クラミドモナスの核ゲノム形質転換法

［試薬］

よう，遠沈管を立てたまま 10秒程度静置する．

・TAP 培地９) 上清を新しい 50ml 遠沈管に移す．

・TAP

10) 700×g，20℃，10分間遠心して集藻し上清を捨てる．

培地

・20％ PEG（6000）溶液（シグマ)11) 1ml の TAP（NO ）培地を加えてボルテックスにより細胞を再懸濁する．

［器具・装置］

12) 一枚の TAP（NO ）プレートあたり 0.1‑0.5ml の・ボルテックスミキサー VORTEX-GENIE 2（Scientific industries）

細胞懸濁液をスプレッダーで均一に広げ，細胞が流れなくなるまで静置する．

・培養用インキュベーター
・滅菌済み平底 96穴タイタープレート
・直径 0.35〜0.5mm のガラスビーズ（イウチ)13) シャーレを逆さにして 26℃，100〜150μmol m
sec の光照射下，約 10‑14日間静置培養する．
14）コロニーを爪楊枝で拾い，0.2ml の TAP（NO ）培
地を分注したタイタープレートに移して細胞が生え揃［方法］

うまで培養する．

１) 宿主株 CC-2627 を，1L の TAP 培地中で，26℃，
100〜150μmol m

sec 光 照 射 下 で 1〜2×10

cells/ml（対数増殖期）まで培養する．

［トラブルシューティング］
１．形質転換効率が低い．

２) 培養液を一部採取し，10％ グルタルアルデヒドを主な原因として宿主株の細胞壁が再生している可能性

1/10量添加して細胞を固定し，血球計算板で細胞数をがある．細胞壁の有無の検定を次のように行う．
250μl の測定する．

培養液に 0.075％ Triton-X，5mM EDTA を加え，5‑10３) 700×g，20℃，10分間遠心して集藻し，上清を十分
に取り除く

．

秒間ボルテックスミキサーで攪拌する．攪拌後の細胞を顕微鏡で観察すると，細胞壁欠損の細胞は破壊されるが，

３ʼ) 細胞壁をもつ株を用いる場合には，ここで集めた細細胞壁が残っていると生細胞が観察される．もし細胞壁胞をオートライシンを含む酵素液に懸濁して 15〜30が再生していれば株のストックからシングルコロニーを分，光照射しながらゆっくりと振盪して細胞壁を除とり，細胞壁の薄いものを選び出す．もしくは，細胞壁く

溶解酵素を使って細胞壁を除く操作を加える．

．

４) 沈殿した細胞を TAP（NO ）培地で 2×10 cells/mlになるよう再懸濁する．
５) 5ml のガラスビーズを入れた 50ml 遠沈管に細胞懸濁液を 5ml 加える．
６) 20μg の pMN24E プラスミド DNA（濃度 1μg/μl）と，1.66ml の 20％PEG（6000）溶液を加える．
７) ボルテックスを最高速度にして，30秒撹拌する．

２．バクテリアの混入がみられる．
50μg/ml のアンピシリンを含む TAP プレートに画線培養し，シングルコロニーを単離し直すとよい．また形質転換の前に少量の LB 培地に細胞懸濁液を加えて一晩 37℃で振とう培養し，バクテリアの混入がないことを確認しておく．

８) 遠沈管の 50ml の目盛りまで TAP（NO ）培地を加えて細胞をよく懸濁し，ガラスビーズがよく底に沈む

謝辞> 貴重なコメントを頂いた京都大学大学院理学研
究科の西村芳樹先生に感謝します．

TAP 培地の塩ストック液の NH Cl を KNO で置き換えたもの．
脱イオン水に溶解し，120℃で 15分間オートクレーブ後，遮光して室温で保存する．
濃硫酸に 30分ほど沈め，その後十分な流水で硫酸を除く．さらに 180℃で３時間乾熱滅菌処理してから，滅菌済み 50ml 遠沈
管に 5ml づつ分注しておく．
培地中に含まれるアンモニア塩が残ると，形質転換株の選抜時
宿主株も生育してしまうので，滅菌済マイクロピペットを用いて可能な限り除去する．
野生株の雌雄配偶子を高効率で接合させ，30分後の細胞液を遠心した上清液をガミトライシンの粗酵素液として利用する．
−80℃で３ヶ月程度は保存が可能である．

2009 低 温 科 学

vol.67

参考文献
１) 福澤秀哉・九町健一・三浦謙治：植物のゲノム研究プロ

筆者らの研究室では，透明アクリル製のデシケータに，三角フ
ラスコに入った水をくぐらせた１％CO ガスを含む空気を通気して培養している．ガスを水中に通すことでチャンバー内の湿度を高く保つことができ，培地の乾燥を防ぐことができる．
また光合成に必要な CO ガスを供給することにより増殖速度が上昇する．

589

トコール（佐々木卓治・田畑哲之・島本 功監修）
，pp.169‑
178，秀潤社（2001）．
２) 福澤秀哉，久保雄昭，山野隆志，蛋白質核酸酵素（共立Shimogawara, M .Ishiura, Genes Dev. 22 (2008)P.918.
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緑藻クラミドモナスの核ゲノム形質転換法

５章 形質転換

２．クラミドモナス
b．葉緑体ゲノムの形質転換皆川純

1989年に行われた最初の葉緑体形質転換では単細胞緑藻のクラミドモナスが使われた．その後，形質転換の手法には工夫が重ねられ，またいくつもの選択マーカー，発現マーカーが開発された．クラミ
ドモナス葉緑体形質転換の歴史的背景と現状を解説する．また，最新のツールとプロトコルを紹介する．

Transformation of chloroplast genomeJun Minagawa
Stable chloroplast transformation was first accomplished by Chlamydomonas reinhardtii bombardment withhigh-velocity microprojectiles in 1989. Transformation techniques have been refined, and several selectable
markers and reporter genes have been developed. This chapter overviews the history and current situation ofchloroplast transformation of C. reinhardtii, including the molecular tools and the standard protocols.

れているため，葉緑体のストロマに目的の DNA を導入

2.b.1 背景することは容易ではなかった．

多くの高等植物の細胞では細胞あたり 100から 1000

葉緑体形質転換系の開発における最も重要な突破口

個の葉緑体があるとされるが，クラミドモナスには細胞は，Boynton らと Sanford のグループによって 1988年

あたり１個しか存在せず，しかも細胞容量の 40‑60％をに報告されたクラミドモナスの研究である ．彼らは，占めるほど細胞内にひろがっている．大きな葉緑体が１atpB 遺伝子を欠損し光合成的に生育できない変異株を個しかないという特長が，クラミドモナスが葉緑体形質

ホストに用い，野生型の atpB 遺伝子をパーティクルガ

転換生物の一番手となる決め手となった．クラミドモナ

ンで葉緑体に導入し，形質転換体が光独立栄養条件で生スの葉緑体ゲノムは環状分子で配列は決定されており，育することを証明してみせたのだ．これに先立つ 1984

そのサイズは 203kbp である ．葉緑体タンパク質の多年，植物体の形質転換のために花粉へ遺伝子を導入しよ

くは核ゲノ ム に コード さ れ て い る が，光 化 学 系のうとしていた Sanford は，既存の導入法を試みたがどれの D1/D2 タンパク質もうまくいかず，高エネルギーイオンビームを打ち込んなど，光合成系の主要なタンパク質は葉緑体ゲノムにで細胞に穴を開けてみようと，極微細加工 の 専 門 家

コードされている．これらのタンパク質の構造や機能をWolf のもとを訪れた．この試みもうまくはいかなかっ

解析するうえで，葉緑体形質転換系は重要な研究手段とたが，逆に DNA の方を打ち込んではどうかとすすめらなっている ．また，最近では葉緑体工場の名のもと，ヒれ，以後３年をかけて DNA を細胞に打ち込む技術を確ト抗体ほか有用なタンパク質の発現が次々と試みられて立したことになる．彼らによって，硬い細胞壁を通過さいる ．

せるためには，1) 柔らかい DNA を硬い粒子に付着しPsaA/B タンパク質や光化学系

たさせればよいこと，2) 貫通した硬い粒子は必ずしも

2.b.2 バイオリスティック形質転換

細胞に死をもたらすわけではないこと，3) 小さな細胞には小さな粒子が有効であること，4) 粒子を減速させ葉緑体遺伝子の発現系は原核生物型であり，導入されないためには真空中で打ち込みを行うと良いことなどがた DNA は核ゲノムの場合と異なり相同組換えにより葉明らかにされた．更に，5) 細胞内に粒子を打ち込むに緑体ゲノムに組み込まれる．
したがって，ジーンターゲッ

は，〝銃"と同様の原理で行うと最も効果があることもわ

ティングが可能である．しかし，葉緑体は堅い細胞壁をかり，装置をパーティクルガン（粒子銃）と名付け，そもつ植物細胞の中にあるだけでなく，二重の包膜に包まれによる形質転換をバイオリスティック形質転換と呼ぶことにした ．
１) 北海道大学低温科学研究所

2009 低 温 科 学

vol.67591

導入した部位特異的変異や 483bp 配列はゲノムの挿入

2.b.3 分子生物学的ツール部に残るが，
スペクチノマイシンには再び感受性となる．

初 期 の 研 究 で は，抗 生 物 質 耐 性 を 示 す リ ボ ソーム

こうして，部位特異的変異の導入や遺伝子破壊をさらにRNA 遺 伝 子 上 の 点 変 異 を 選 択 マーカーと し て 用 い加えられるようになった．この方法により，葉緑体ゲノ

た ．この場合，別のプラスミド上にコードされた目的のム上の遺伝子操作は何度でも行うことができる．

導入遺伝子はリボソーム RNA マーカー遺伝子と同時に2.b.3.3 薬剤選択マーカー aphA-6

葉緑体に導入される（co-transformation）．しかしこの方

aadA 以後報告されたいくつもの薬剤選択マーカーの法はマーカーのみが導入される確率が高いため，現在でうち，Bateman and Purton によって開発された院内感はその後に開発された以下のマーカーが広く使われるよ染 菌 Acinetobacter

うになった．

phosphotransferase 遺伝子（aphA-6 ）は，安定したカナ

2.b.3.1 薬剤選択マーカー aadA カセット

マイシン（もしくはアミカシン）耐性遺伝子として広くGoldschmidt-Clermont によって開発された細菌由来のスペクチノマイシン／ストレプトマイシン不活化酵

baumannii の aminoglycoside

使われている．
2.b.3.4 レポーター遺伝子素（aminoglycoside adenine transferase）遺 伝 子

葉緑体ゲノム遺伝子の発現レポーター遺伝子として（aadA）．5ʼ
側にクラミドモナス葉緑体由来の atpA 遺伝

は，複数の GFP やルシフェラーゼなどが報告されてい子の 5ʼ
側に rbcL 遺伝子の 3ʼ
UTR を，3ʼ
UTR をそれぞる（表 1）．高い発現を得るため，ほとんどの場合クラミれ連結したものが配布されている．aadA カセットは葉

ドモナス葉緑体ゲノム用にコドンバイアスが最適化され緑体ゲノム上どこに挿入させることも可能であるが，ている．詳細は原報を参照されたい．

aadA カセット挿入サイトの上流または下流に存在する遺伝子の発現に影響を与える可能性に留意しなければならない．
2.b.3.2 再利用可能な薬剤選択マーカー
483-AAD -483カセット

2.b.4 葉緑体形質転換の手順
2.b.4.1 ベクターの作成
ゲノムに挿入する遺伝子の両端に，十分長い葉緑体ゲ

aadA 遺伝子をマーカーとして同一株に複数回の遺伝ノム配列を配置した形質転換ベクターを作成する．相同

子導入を行うために開発された ．aadA カセットの前後

組換え（double crossover event）を効率良く起こすたに全く同じ配列を持つ 483bp の DNA を連結させたためである．長さは少なくとも 500bp 程度は必要で，通常め，その部分で起こる相同組み替えを利用してマーカーは 1kb 以上を用いる．

をゲノムから排除する（マーカーを失った株を選択する）

2.b.4.2 パーティクルガンによる遺伝子導入ことが可能となった．工程としては，一旦選択培地上でベクターDNA をマイクロキャリアと呼ばれる微小なスペクチノマイシン耐性をマーカーとしてカセットをゲ

タングステンもしくは金粒子（直径約 1μm）に付着さノム上に組み込ませたのち，スペクチノマイシンを加えせ，これを音速程度に加速させプレート上の細胞に撃ちない培地に移し薬剤による選択圧を取り除く．前後の込む．初めて市販されたパーティクルガンは火薬を使っ483bp 配列同士の間で組換えが起き，中心の aadA 部位たものであったが（PDS-1000，デュポン），その後ガス式が抜け落ちたスペクチノマイシン感受性株を選抜する．

の銃が考案された ．この方式では，DNA を付着させた

表 1：クラミドモナスで利用されるレポーター遺伝子
レポーター遺伝子発現されるレポーター

文献

uidA
gfp
GFPct
rluc
luxCt
lucCP

大腸菌（E.coli）GUS（β-glucoronidase）
クラゲ（Aequora victoria）GFP
クラゲ（Aequora victoria）GFP
ウミシイタケ（Renilla reniformis）ルシフェラーゼ
発光細菌（Vibrio harveyi）ルシフェラーゼ
ホタル（Photinus pyralis）ルシフェラーゼ

10)
11)
12)
13)
14)
15)

〝バイオリスティック（biolistic）"は，生物学的弾道学（biological ballistics）を意味する造語．

592

クラミドモナスの葉緑体形質転換

マイクロキャリアの懸濁液をさらにマクロキャリア（銃培地のプレートで１週間程度生育させシングルコロニー

で例えれば銃弾に相当する）に付着させる．真空室の天を単離する．これを３回程度繰り返すことによって，葉井にマクロキャリアを〝装塡" した後，ヘリウムガスを緑体ゲノムのすべてのコピーは完全に形質転換型に変換

ラプチャーディスクが破れるまで圧縮し，破れた瞬間のされる．

圧力でマクロキャリアをストッピングスクリーンに打ち付ける．マイクロキャリアは慣性の法則で細胞に打ち込まれる．マイクロキャリアの大きさはクラミドモナスの2.b.5 葉緑体形質転換プロトコル

十分の一程度なので，ʻ
爆撃ʼ
を受けた大半の細胞は，絶命ʼʻ

2.b.5.1 用意するもの

する運命となるが，中には１個程度のʻ
貫通銃創ʼ
を負って

［パーティクルガン］

も，生命には別状のないものもある．このような細胞で

現在日本で入手可能な２機種と自作の方法について紹は，マイクロキャリアが貫通した際にその表面に付着し介する．

ていた遺伝子が細胞内に残されていることがある．残さ１．PDS-1000/He（Bio-Rad 165-2431，定価 540万円）

れた遺伝子と葉緑体ゲノム上の遺伝子との間で相同的組

初期の火薬式の PDS-1000 に替え，ヘリウムガス用換えが行われると，組換え遺伝子が葉緑体ゲノム上に保に改良されたもの．ラプチャーディスクやマクロキャ

持される．

リアを必要とするなど PDS-1000 時代からのシステム

2.b.4.3 形質転換体の選択をそのまま引き継いでいる．文献に良く登場するのが爆撃ʼ
後，選択培地上の細胞はゆっくりと死に，緑の色
ʻ
が薄くなりわずかに褐色を帯びてくる．選択マーカーに
aadA カセットを用いた場合，暗所よりわずかに光が当利点であるが，装置自体が高価であり，またランニン
グコストも安価ではない．
２．PIG（自作）たる場所に放置したほうが選択マーカーがよく発現す

PDS-1000/He で必要となるラプチャーディスクやる．1−3週間程度で，死んだ細胞の層上に緑の濃いコロマクロキャリアは使わず，ヘリウムガスボンベを電磁ニーが現れる（図 1）．葉緑体には 80コピーのゲノムが含弁で制御することでマイクロキャリアを発射する．こまれるので，最初に生育してきたコロニーでは葉緑体ゲのためパーティクル〝インフロー"ガン（PIG）と呼ばノムが形質転換型になっているわけではなく，野生型のれる ．リレーを用いた簡単な回路によって制御する

コピーも残る．そこで，得られたコロニーを新しい選択

電磁弁，天井部にフィルターホルダーを取り付けられるようにデザインした真空室，ヘリウムボンベ，真空ポンプとそれに配管部品等を組み合わせて比較的安価に自作することができる（図 2，3）
．ランニングコスト
もほとんどかからず，また PDS-1000/He よりも 10倍

図 1：爆撃後２週間たった選択培地上にはこのようにコロニーが現れる．

2009 低 温 科 学

vol.67

図 2：パーティクル・インフロー・ガンの構成

593

遠心して集める．
２．細胞を 0.5ml 程度の TAP 培地に懸濁し，あらかじ
めよく乾かした TAP 培地の中央に直径 5cm 程度の水溜りʼを作る．クリーンベンチで 2‑3時間乾かす．
ʻ
３．タ ン グ ス テ ン 粒 子 約 50mg を エッペ ン ド ル フ
チューブに量りとる．
４．エタノールを 1ml 加え，30秒間ボルテックスして滅菌する．
５．微量遠心機で遠心してタングステンを沈殿させ，上清のエタノールを捨てる．
６．タングステン粒子を滅菌水 0.5ml に再懸濁し，30
秒間ボルテックスののち，再度遠心し，上清を捨てる．
図 3：自作したパーティクル・インフロー・ガン

７．6．をもう一度繰り返す．
８．100mg/ml に な る よ う タ ン グ ス テ ン 粒 子 を 25％
glycerol 溶液に懸濁する．

から 100倍効率が良いとの報告もある．電磁弁制御の９．以下の順で必要な試薬をマイクロチューブに加え方がヘリウムガスを正確にコントロールでき，特に低る．
一つ加えるごとにピペッティングでよく混合する．

圧で発射することが可能であるために，サンプルに優

滅菌水

7.5μl

しい爆撃ができるためであると考えられている．

100mg/ml タングステン懸濁液

7.5μl

0.3mg/ml DNA 溶液

5μl

2.5M CaCl

12μl

0.48M Spermidine

1μl

３．IDERA GIE-III（株式会社タナカ，定価 228万円）
PIG の原理を用いて商品化した国産品．
［マイクロキャリア］
バイオリスティック形質転換では，タングステン粒子

DNA は Mini-prep 程度の純度の環状プラスミド
で良い．

あるいは金粒子がマイクロキャリアとして使われる．タ

10．室温で 10分間静置する．

ングステンは安価でさまざまな粒子径のものが手に入

11．微量遠心機で 30秒間遠心し，上清のうち 25μl を捨り，DNA もよく結合するが，粒子径の分布が荒い，生物てる．

学的に有害であるなどの欠点を持つ．金粒子は均一な粒12．エッペンドルフチューブの底に沈殿したタングステ

子径のものが手に入る反面，DNA を結合させにくく，まンの粒子を残りの 8μl の溶液にピペッティングでよた凝集したりプラスチックの表面に付着するなど取り扱

く懸濁したのち，シリンジホルダー内の金属メッシュ

いが難しい．クラミドモナスの葉緑体形質転換においての中央に注意深くのせる．

は，ほとんどの研究者がタングステンを使用している．
Sanfordによるとマイクロキャリアの粒子径は細胞の大きさの十分の一程度が目安となるため，長径が 5〜10
μm であるクラミドモナスに対しては，通常は 1μm 径程度のものが選択される．国内で容易に入手できる２種

13．真空チェンバーの空気流入弁を閉じ，真空ポンプへの弁を開け，真空ポンプを起動する．
14．真空ゲージが 25inch Hg を指した時点で真空ポンプへの弁を閉じる．
15．ヘリウムガス（6kg/cm ）の電磁弁を 50ミリ秒間開を紹介する．

放することによってタングステン粒子をプレート上の１．タ ン グ ス テ ン M 17（ψ1.1μm)(Bio-Rad，♯165‑

細胞層に打ち込む．

2267）
２．B10（ψ1‑1.3μm）（東京タングステン株式会社）

16．室温，弱光のもとで３時間程度静置したのち約 5mlの TAP 培地で細胞層を剥ぎ取り，懸濁した上で，選択培地（通常は 100μg/ml スペクチノマイシンを添加し2.b.5.2 プロトコル
以下のプロトコルは，Boynton et al.（1988）を改変したものである．
１．2x 10 cells/ml 程度に生育したホスト株 40ml を
594

た TAP 培地）上にスプレッドする．
17．10日前後で現れるコロニーを，白金耳で８個程度単離する．
18．更に約 10日後，成長した単離コロニーから葉緑体
クラミドモナスの葉緑体形質転換

DNA を M ini-prep（後述のプロトコル参照）する．
19．適当なプライマーを用いて PCR を行ったのち，該当領域の塩基配列を決定する．
※必要ならばホモプラスミック状態が得られるまで，
スプレッド→単離→塩基配列解析を繰り返す．

2.b.6 クラミドモナス葉緑体 D NA の
M ini-prep プロトコル
大腸菌からプラスミド DNA を抽出する手法をほぼそのまま踏襲する．キアゲン社の QIAquick plasmid miniprep kit を用いて行う例を紹介するが，陰イオン交換カ
ラムがなければフェノール処理等でも実用上問題はな
い．
１．２週間程度培養した TAP 培地上から，白金耳の先のループに載る程度のコロニーをすくい取る．
２．エッペンドルフチューブにあらかじめ 0.25ml のP1 溶液（50mM Tris. HCl，10mM EDTA，1mg/
ml RNaseA，pH 8.0）を入れておき，1ですくったコ
ロニーをそこに懸濁する．よく懸濁しにくい場合は適宜超音波処理等を行う．
３．P2 溶液（0.2M NaOH，１％SDS）
を 0.25ml 加え，細胞を可溶化する．
４．N3 溶液（主成分酢酸）を 0.35ml 加え，数秒ボルテックスによって攪拌する．
５．12000rpm，5分間遠心する．
６．上清を付属の陰イオン交換カラムにロードし，12000
rpm，1 分間遠心する．
７．リザーバーに受けたフロースルーを捨て，以下，0.5
ml PB 溶液，0.75ml の PE 溶液の順でカラムを洗浄する．
８．３分間 12000rpm で遠心し，カラム上のメンブレンを乾かしたのち，
30μl の精製水で１分間インキュベー
ションすることにより DNA を抽出する．これらのDNA は制限酵素処理，PCR 等にそのまま使える．

参考文献

Miller, E.H.Harris, & D.Stern, Plant Cell 14 (2002) P.
2659.
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イオリスティック形質転換発明のいきさつが書かれている．
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Plant Cell Rep. 11 (1992)P.323.
18) J.C.Sanford, F.D.Smith, & J.A.Russell, M ethods in
Enzymolgy 217 (1993)P.483. ※バイオリスティック形質転換の応用についてまとめるとともに，最適化へのヒントを数多く含む．

１) J.E.M aul, J.W.Lilly, L.Cui, C.W.dePamphilis, W.

2009 低 温 科 学

vol.67595

５章 形質転換

３．ゼニゴケ
a．アグロバクテリウムによるゼニゴケ核ゲノム形質転換法
石崎 公庸 ，河内孝之

苔類ゼニゴケは，アグロバクテリウムを介する形質転換が容易である．胞子から培養した分化初期の葉状体を使うことによって，１胞子嚢あたり数百の独立した形質転換体が短期間で作成できる．世代の大半が半数体であることや無性芽による純系化といった特徴を生かしたユニークな実験が可能となった．

-mediated transformation of the liverwort
L.
Kimitsune Ishizaki, Takayuki Kohchi
Here we describe a rapid Agrobacterium-mediated transformation protocol for the liverwort, Marchantia
polymorpha L.using immature thalli developed from spores. This protocol should provide molecular techniques
to facilitate comparative genomics, taking advantage of this unique model plant that retains many features of
the common ancestor of land plants.

げられる ．この方法で得られた形質転換体には，核ゲノ

3.a.1 概論

ムへのランダムな T-DNA 挿入が検出され，その挿入コ

苔類ゼニゴケは，他の多くの植物同様に，パーティク

ピー数は１〜数コピーであった ．共培養の期間を長くルガンによる DNA の直接導入法により形質転換が可能

することで得られる形質転換体が増える傾向が認められである．しかし，挿入コピー数が多く染色体の再編成

たが，単一コピーのものを多く得るには，24〜48時間のを伴う傾向があることや，導入した DNA が断片化する共培養が推奨される．T-DNA は，その内部で断片化すること等の問題があった．アグロバクテリウムによる形質

ことなくゲノム中に挿入されており，高等植物と同様に，転換は，一般的に，パーティクルガンやポリエチレング

境界配列（ライトボーダー，レフトボーダー）に依存しリコール（PEG）などを用いた DNA 直接導入法と比べ，て DNA の組換えが起こっていた ．このことから，苔類操作が簡便であること，形質転換効率が高いこと，挿入

ゼニゴケにおけるアグロバクテリウムを介する T-DNA

コピー数が比較的低いことなど多くの利点がある ．ゼ

挿入メカニズムは，高等植物の場合と同じであると考え

ニゴケにおいても，アグロバクテリウムによる形質転換られる ．アグロバクテリウムによるゼニゴケ形質転換法が幾度か試されたが，無性芽および無性芽から生育さは，胞子培養開始から４週間程度で形質転換体の分離がせた葉状体を用いた場合，形質転換効率は低く実用的で可能である．１細胞に由来する無性芽はなかった．近年，蛍光灯に加え遠赤色光を照射するこすることにより，純系が容易に分離できる．また，形質とにより，成熟した葉状体を生殖成長へと移行させるこ転換に供する幼葉状体は，半数体であるため，導入遺伝とに成功し，実験室条件下で胞子を大量に採取できるよ

子の分離（ホモ接合体やヘテロ接合体）を考慮する必要うになった（1.4. 大和らの項参照）．この胞子より短期がない．そのため，形質転換直後より，T-DNA 挿入によ間培養した分裂の盛んな分化初期の葉状体（以降，幼葉る遺伝子破壊の表現型が観察される．このように，ゼニ状体と呼ぶ）をアグロバクテリウムと共培養することにゴケのアグロバクテリウムを介する核 DNA の形質転換より，１胞子嚢あたり数百ラインという高い形質転換効

は，個々の遺伝子機能の解析に加えて，遺伝子タギング率が得られた ．この際，胞子発芽後５〜７日目の幼葉状による T-DNA 挿入変異株の作製など，様々な展開が期体を用いることが重要である．また，もう一つのポイン待される．

を単離して培養トとして共培養時にアセトシリンゴンを加えることが挙
１) 京都大学大学院

2009 低 温 科 学

生命科学研究科 遺伝子特性学分野

vol.67597

3.a.2 形質転換方法

・ピンセット（歯科用：先が折れているタイプ）

3.a.2.1 準備［バイナリーベクターおよびアグロバクテリウム宿主株］［試薬・培地］

・ハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝・ゼニゴケ胞子嚢（表面滅菌済み，1.4．大和らの項参照）

子（hpt）をマーカーに持つバイナリーベクター．カリ・２×胞子滅菌液：0.4％ アンチホルミン溶液（ナカラフ ラ ワ ー モ ザ イ ク ウ ィ ル ス 35 S プ ロ モ ー タ

イテスク，次亜塩素酸ナトリウム溶液を 100％として（CaM V35S）制御であることが望ましい．ノパリンシ

計算する）0.2％ Triton X-100（ナカライ）

ンターゼ遺伝子のプロモータ（nosP）制御では，ゼニ・ハイグロマイシン‑B（和光純薬）

ゴケでの発現が弱く，得られる形質転換体の数が，顕・セ フォタ キ シ ム（商 品 名 ク ラ フォラ ン：Sanofi-

著に減少する．使用実績のあるバイナリーベクター例

Aventis K.K.）

として，pUC 由来のマルチクーニングサイトを持つ・LB 培地（アグロバクテリウム培養用）

pCAM BIA1300（ http://www.cambia.org/daisy/

・リファンピシン（ナカライテスク）

や，Invitrogen 社の GATEWAY
cambia/585.html）

・ア セ ト シ リ ン ゴ ン：3ʼ,5ʼ
-Dimethoxy-4ʼ
-hydroxy-cloning 技術が使用可能な pGWB シリーズが挙げら

acetophenone，100mM ス トック＝19.2mg/ml in・アグロバクテリウム宿主株：菌株の検討はしていな

DM SO
・液体培地

れる ．

0M51C 培地（1.4. 大和らの項参照）

い．著者らは，通常，シロイヌナズナで用いている

・選抜寒天培地 0M 51C 固体培地（1.4. 大和らの項参C58C1 GV2260（pGV2260) を使用している．他のア

照）にハイグロマイシン（終濃度 10μg/ml），セフォタ

グロバクテリウム宿主株，例えば EHA101 なども実績

キシム（終濃度 100μg/ml）を加える．

がある．
3.a.2.2 ゼニゴケ胞子からの植物体培養［器具・装置］［実験方法］・幼葉状体を回収・洗浄するための器具：6cm×6cm

１．胞子嚢が入った 1.5ml マイクロチューブに，滅菌水の 大 き さ に 切 断 し た 50μm 格 子 ナ イ ロ ン メッシュ

（１胞子嚢：約 10 個の胞子あたり 100μl）を加える．

（NBC Inc. N-No. 305T），50ml プラスチックコニカ

チップの先で 1.5ml マイクロチューブの壁に押し当

ルチューブを切断し，蓋にドリルで穴をあけたものをてるなどして胞子嚢を破り，胞子を懸濁する．

組み立てる（図 1参照）．
・培養容器：100ml 三角フラスコにシリコ栓をする

２．懸濁後，胞子嚢の空袋などのゴミを吸わないように注意して，胞子懸濁液を別の 1.5ml マイクロチューブ
へ移す（図 2A）．
３．(オプション）コンタミネーションが心配な場合は，等量の２×胞子滅菌液で２分間処理し，8,000× g １
分間の遠心後，滅菌水へ懸濁し，再滅菌する．
４．胞子懸濁液 100μl（１胞子嚢分）を 25ml の 0M51C培地（100ml 三角フラスコ）へ加える（図 2B）．
５．130rpm，22℃，50〜60μmol photons m s の白
色光連続照射下で７日間振盪培養する（図 2C）．
3.a.2.3 アグロバクテリウムの準備［実験方法］
１．バイナリーベクターを形質転換したアグロバクテリ
ウムの培養プレートからシングルコロニーを突き，5ml の液体 LB 培地へと植菌し，28℃，２日間培養する．
アグロバクテリウムは，２日間でほぼ飽和培養となる．

図 1：ゼニゴケ幼葉状体の回収洗浄用器具
切断した 50ml プラスチックコニカルチューブ，穴を開けた
蓋と 6×6cm に切った 50μm 格子ナイロンメンブレンを，右にあるように組み立てる．

598

LB 培地には使用するベクターに適切な抗生物質とア
グロバクテリウム選抜に 100μg/ml リファンピシン
を加えておく．
ゼニゴケ核ゲノム形質転換法

図 2：アグロバクテリウムによるゼニゴケ核ゲノム形質転換の手順
Ａ) 懸濁した胞子．Ｂ) 0M 51C 液体培地への胞子植え付け．Ｃ) 胞子振盪培養．Ｄ) アグロバクテリウムの投入．Ｅ) 共培養前（左）と共培養終了後（右）．Ｆ) 共培養液からの幼葉状体の回収．Ｇ) 0M 51C 培地による洗浄．Ｈ) ナイロンメッシュからの幼葉状体の回収．Ｉ) 選抜寒天培地上での幼葉状体の分配．Ｊ) 選抜寒天培地上に播かれた幼葉状体．Ｋ) クリーンベンチ上で余分な水分を飛ばしている様子．Ｌ) 選抜寒天培地移行後２週間目の様子．右下は拡大図．

２．ア グ ロ バ ク テ リ ウ ム 培 養 液 1ml を 15ml プ ラ ス

ロンメッシュ上に回収する（図 2F）．

チックコニカルチューブへ移し，2,000× g，15分間遠

２．約 20ml の 0M51C 液体培地で３回洗う（図 2G）．

心し，集菌する．

３．ピンセットでゼニゴケ植物体を回収し，約 100μl の３．培地を捨て，5ml の液体 0M51C 液体培地（100μM

滅菌水を滴下した選抜寒天培地へ移す（図 2H）．

アセトシリンゴン含有）を加え，菌体を懸濁する．こ４．ゼニゴケ幼葉状体を目分量で３〜５等分し，それぞの時の濁度は OD＝1〜2である．

４．28℃，６時間，振盪培養する．
3.a.2.4 アグロバクテリウムとゼニゴケ幼葉状体の共培養

れ選抜寒天培地へ移す（図 2I）．
５．ゼニゴケ幼葉状体に 1mg/ml のセフォタキシム溶液を 1ml 滴下し，ピンセットで選抜寒天培地上に広げる（図 2J）．

［実験方法］

６．クリーンベンチ上で十分に余計な水分を蒸発させる

１．上記 2.1で調製した７日目のゼニゴケ幼葉状体の培
養液 25ml に対し，2.2で調製したアグロバクテリウ
ム懸濁液を 1ml 加える（図 2D）．
２．終濃度 100μM となるように，25μl のアセトシリン
ゴンを加える．

（図 2K）．
７．22℃，50〜60μmol photons m s の白色光連続照射下で静置培養する．１〜２週間ほどで，仮根の生えた形質転換体が確認できる（図 2L）．
８．さらに約２週間培養すると，杯状体上に無性芽を生

３．130rpm，22℃，50〜60μmol photons m s の白ずる個体が出現し始める．無性芽もしくは葉状体の１色光連続照射下で 24〜48時間，共培養する（図 2E）．

部を新たな選抜寒天培地に植え継ぐ．ゼニゴケの無性

3.a.2.5 形質転換体の選抜

芽は１細胞由来である［実験方法］

分離すれば，純系が確立できる．

ので，１無性芽由来の個体を

１．アグロバクテリウムと共培養したゼニゴケ幼葉状体を，図１にあるような道具を用いて，50μm 格子ナイ
2009 低 温 科 学

vol.67599

参考文献
１) M .Takenaka, S.Yamaoka, T.Hanajiri, Y.ShimizuUeda,K.T.Yamato,H.Fukuzawa,& K.Ohyama,Transgenic Res. 9 (2000)P.179.
２) S.Chiyoda, K.Ishizaki, H.Kataoka,K.T.Yamato,&
T.Kohchi, Plant Cell Rep. 27 (2008)P.1467.
３) A.Kohli, R.M .Twyman, R.Abranches, E.Wegel, E.
Stoger, & P.Christou, Plant Mol. Biol. 52 (2003)P.247.
４) K.Ishizaki, S.Chiyoda, K.T.Yamato, & T.Kohchi,

600

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５) C.R.Barnes, & W.J.G.Land, Bot. Gaz. 46 (1908) P.
404.
６) S.J.Hughes, Can. J.Bot. 49 (1971)P.1319.
７) T.Nakagawa, T.Kurose, T.Hino, K.Tanaka, M .
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Jinbo, & T.Kimura, J.Biosci. Bioeng. 104 (2007)P.34.
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Schell, M .Van M ontagu, & J.Leemans, Nucleic Acids
Res. 13 (1985)P.4777.

ゼニゴケ核ゲノム形質転換法

５章 形質転換

３．ゼニゴケb．ゼニゴケの培養細胞と植物体のプラスチド形質転換法
千代田将大 ，河内孝之

苔類ゼニゴケは，増殖の盛んな培養細胞や分化初期の葉状体を材料として，容易にプラスチド DNA への遺伝子導入が可能である．スクロースを除いた選抜培地や直線状化したコンストラクト DNA を用いることによって，プラスチド形質転換体獲得の効率が上昇し，ホモプラストーミックな状態にする
ことも容易となる．

Plastid transformation system for suspension-culture cells and intact plants ofliverwort
L.
Shota Chiyoda, Takayuki Kohchi
We describe a simple and efficient plastid transformation method for suspension-culture cells and plants of theliverwort, Marchantia polymorpha L. Selection on a sucrose-free medium improved the recovery rates of plastidtransformants. Homoplastomic transformants were established without the processes of dedifferentiation andregeneration.

増殖が盛んであるために，特別な操作は必要としない（図

3.b.1 序論

1）
．ゼニゴケは，その生活環のユニークさと進化上の位

苔類ゼニゴケのプラスチド DNA（ptDNA）は，緑色

置付けの重要性から，モデル植物として注目されている

培養細胞系を材料として全塩基配列が解読された ．全（1.4. 大和らの頁を参照）．葉緑体遺伝子発現，DNA 複

長が 121,025bp の環状分子であり，高等植物との間で高製や母性遺伝の研究にも，有望な材料である．ここでは度に保存された遺伝子構成を持つ．プラスチドゲノムにパーティクルガンを用いたゼニゴケ培養細胞および植物

は，主に ptDNA 上の遺伝子の転写・翻訳に関わるタンパ

体のプラスチド形質転換法について解説する．

ク質遺伝子や光合成機能に関わるタンパク質遺伝子がコードされている．これらの遺伝子やプロモーターなどの機能配列の解析，さらには，ptDNA の複製や遺伝様式を調べるための直接的な手段として，プラスチド形質転換系は非常に有効である．

3.b.2 実験の準備
ここでの実験は，パーティクルガン 10ショット分で記載している．通常，プラスチド形質転換体は 10株以上得

プラスチド形質転換の成否を左右する因子としては，られる．

形質転換ベクターの設計と導入条件，植物材料の状態，
形質転換体の選抜条件，および脱分化・再分化の効率な［植物とプラスミド］

どが考えられる．タバコが葉緑体形質転換でよく利用さ・ゼニゴケ培養細胞

れるが，これは培養系が確立しており，植物の扱いが容1.4.大和らの頁を参照．
継代培養後 7‑10日目の培養

易であることが背景にある．ゼニゴケの場合，DNA 導入

液を 70ml（300ml フラスコ１本分）．我々が使用するの材料として，葉緑体に富み独立栄養培養が可能である

培養細胞系統は，長期間の培養のため，再分化能はな

培養細胞，および，旺盛に生育する分化初期の幼植物体（幼葉状体）を用いることで，高効率なプラスチド形質転換系の構築が可能となった

い．培養細胞の利点を生かした研究に使用している．
・ゼニゴケ滅菌胞子嚢．高等植物では DNA 導入

1.4.大和らの頁を参照．プラスチド形質転換には滅や選抜とホモプラズム化に脱分化と再分化の培養系が利菌胞子嚢を約 10個用いる．
機能解析に植物個体を扱う用されているが，ゼニゴケは，本来，分化全能性が高く，必要がある時に使用している．
・プラスチド形質転換ベクター

１) 京都大学大学院生命科学研究科遺伝子特性学分野

2009 低 温 科 学

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こ こ で は pCS31 ベ ク ターを 使 用．pCS31 は pBS601

図 1：プラスチド形質転換系の概略図．
プラスチド形質転換系は大きく分けて，形質転換ベクターの導入，プラスチド形質転換体の選抜，ホモプラストーミックな形質転換体の獲得の３段階から成る．外来遺伝子は相同組換えによって ptDNA に組込まれる．
ここではタバコ rrn プロモーターと psbA
遺伝子 3ʼ
UTR の制御下にある aadA 遺伝子の発現カセットの両脇に約 1kb の trnI 及び trnA 遺伝子を持たせた形質転換ベクターである pCS31 を示す．図中の pCS31 及び野生型 ptDNA 上の矢印はプラスチド形質転換体の選抜及び，ホモプラストーミッ
クな形質転換体の確認に用いるプライマーを表す．P1,5ʼ
-ACCCATTAAATTATCCTTAGCATG-3ʼ
,P2,5ʼ-TGGATCCCTCCC．形質転換後初期のプラスチド形質転換体では一部の ptDNA が組換
TACAACTG-3ʼ
,P3,5ʼ
-TGCCTAGGTATCCACCGTAA-3ʼ
え型である（ヘテロプラストーミック）．選抜圧下で ptDNA が複製・分配されるにつれて，野生型 ptDNA が全て形質転換型．
ptDNA に置換される（ホモプラストーミック）

SK＋の SmaI 制 限 酵 素 部 位 に 約 2kb の ゼ ニ ゴ ケ
trnI 〜 trnA 遺伝子領域をサブクローニングし，trnIと trnA の遺伝子間領域にタバコ rrn プロモーターと・パーティクルガン（Bio-Rad：PDS-1000/He Particle
delivery system）
・0.6μm 金粒子（Bio-Rad：♯165‑2262）

psbA 遺伝子 3ʼ
UTR の制御下にあるスペクチノマイ

20μg/μl の懸濁液を 110μl ずつ 1.5ml チューブに入シン耐性遺伝子 aadA の発現カセットを組込んだもの

れたもの．
−30℃保存可能．

（図 1）．QIAGEN Plasmid M idi Kit で抽出して 1μg/

・900psi Rupture Disk 10枚（Bio-Rad：♯165‑2328）

μl に 調 整 す る．線 状 DNA 断 片 を 利 用 す る 場 合 は・Macrocarrier（Bio-Rad，♯165‑2335）10枚

aadA カセットと相同配列を含む制限酵素断片をゲル・Stopping Screen（Bio-Rad，♯165‑2336）10枚

抽出によって調製する．

Ruptur Disk，Macrocarrier，Stopping Screen は使用分だけエタノールにくぐらせて滅菌したあと，ク［機器・器具］

リーンベンチ内で乾燥させて，プラスチックシャーレ・吸 引 濾 過 器（Nalgene：134mm x 230mm，♯300‑

に入れる．

4050）
オートクレーブで滅菌しておく．

［試薬・培地］

・水流アスピレーター

・滅菌超純水・円形濾紙

・10μg/ml RNase A 入り Tris-HCl（pH 8.0）

10枚（Whatman：No.1φ 55mm）

培養細胞の場合のみ使用．ガラスシャーレに入れて・70％ エタノール

オートクレーブしておく．

・99％ エタノール

・円形セロファン 10枚
植物体の場合のみ使用．プラスチックシャーレの大き・中性フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール溶液（25：24：１）

さよりも少し小さめに切って，洗浄・オートクレーブ

・2.5M 塩化カルシウム（分注して−30℃保存）

したもの．

・0.1M スペルミジン（分注して−80℃保存）・細胞破砕用ペッスル
オートクレーブで滅菌しておく602

・スペクチノマイシン二塩酸塩五水和物（SIGMA，♯
S9007-5G）
ゼニゴケのプラスチド形質転換法

超 純 水 で 50mg/ml に 調 整 し て フィル ター滅 菌，−に流し込んで 50枚程度の選抜培地を作製する．

30℃保存．
・尿素フェノール液
5M 尿素，0.3M 塩化ナトリウム，50mM Tris-HCl

3.b.3 実験方法

pH 8.0，20mM EDTA pH 8.0，5％(v/v）フェノー

3.b.3.1 植物の準備

ル pH 7.0，0.5％ SDS．４℃で約１ヶ月は保存可能．

［ゼニゴケ培養細胞］

・0-M51C または 1M 51C 寒天培地 10枚・培養細胞の選抜培地

2l

スクロースを含まない 1M51C 寒天培地 を オート ク

１．形質転換ベクター導入の前日に，継代培養７日目のゼニゴケ培養細胞を吸引濾過器で濾紙上に 1mm ほどの厚みで円形に集める（図 2A）．

レーブする．培地が 65℃程度まで冷えてから，上記の２．集めた細胞を濾紙ごと 1-M51C 寒天培地の中央に置

フィルター滅菌したスペクチノマイシン溶液を終濃度

き，翌日まで 22℃，連続光下（50‑60μmol photons m

500μg/ml になるように加える．40ml ずつプレートs ）に静置する．

に流し込んで 50枚程度の選抜培地を作製する．
・植物体の選抜培地 2l［ゼニゴケ植物体］

スクロースを含まない 0M51C 寒天培地 を オート ク

１．１ショット当たり１つの滅菌胞子嚢を 100μl 滅菌レーブする．培地が 65℃程度まで冷えてから上記の水に懸濁し，セロファンを敷いた 0M 51C 寒天培地のフィルター滅菌したスペクチノマイシン溶液を終濃度

中央に 100μl 滴下して１週間培養する（図 2B，C）．

300μg/ml になるように加えて，40ml ずつプレート

２．形質転換ベクター導入の前日に幼植物体まで育った

図 2：パーティクルガンのターゲットとなる植物の準備．
（A）ゼニゴケ培養細胞の準備．継代培養後７日目の細胞（矢印）を吸引濾過器（黒色矢頭）によって濾紙上に円形に集めた様子（白色矢頭）．
（B，C）ゼニゴケ幼植物体の準備．（B）胞子懸濁液．
（C）胞子から１週間育てたゼニゴケ幼植物体．選抜培地へ移す際に剥がし易くするために培地上にセロハンを敷いている．

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vol.67603

ゼニゴケの集団を直径 25〜30mm の円形になるようにピンセットなどで整える．
3.b.3.2 形質転換ベクターの金粒子へのコーティングと導入懸濁する．ピペ sッティングによる懸濁はしないこと．
８．調製した金粒子を懸濁して，フォルダにセットした
Macrocarrier に 5.4μl ずつ塗布して乾燥させる（以降は無菌操作）．

１．保存している金粒子懸濁液を遠心分離（6,000× g，

９．パーティクルガンを操作して，準備した金粒子を1min）
し，上清のエタノールを捨て，1ml 滅菌水を加ターゲット に 打 ち 込 む（ターゲット と の 距 離 は 120

えてボルテックスでよく懸濁する．

．
mm，28inHg，900psi）

２．遠心分離（2,000× g，3min）を行い，上清を捨てる．

3.b.3.3 スペクチノマイシン耐性株の選抜

３．滅菌水を 230μl 加えて，金粒子をボルテックスで完１．形質転換ベクター導入後の細胞を翌日まで 22℃，連全に懸濁させる．

続光下（50‑60μmol photons m s ）に静置する．

４．2.5M CaCl 250μl，プラスチド形質転換ベクター

２．形質転換ベクター導入後のプレート上の細胞を４等（1μg/μl）25μl，1M スペルミジン 50μl を順番に手分して，滅菌水を数滴垂らした選抜培地上にピンセッ

早く加えて，ボルテックスで懸濁する．

トで均一に広げる（図 3A，B）．

５．氷上に静置し，１分ごとに 10秒間のボルテックスによる懸濁を 10回繰り返す．

３．選抜培地上に広げた細胞を３〜４週間培養する（図3C，D）．

６．遠心分離（2,000× g，3min）を行い，上清を捨てる．

４．緑色のスペクチノマイシン耐性株を 20株以上新し

500μl エタノールを加えて，ボルテックスで洗浄する．

い選抜培地に移し，番号をつける．株が混ざらないよ

チューブの壁に金粒子が付着する場合は，チップの先うに注意して１枚の選抜培地に 10株程度移してもよでこそぎ取る．これを計２回繰り返す．

い．
使用する形質転換ベクターによって異なるが，
我々

７．遠心分離（2,000× g，3min）を行い，上清を捨てる．

の実験では無作為に選んだスペクチノマイシン耐性株

60μl のエタノールを加えてボルテックスで金粒子をのうち５〜70％程度がプラスチド形質転換体であっ

図 3：スペクチノマイシン耐性株の選抜．
（A，B）スペクチノマイシン耐性ゼニゴケ培養細胞の選抜．形質転換ベクター導入後の培養細胞（A）または幼植物体（B）を選抜培地上に滅菌水を用いて密集しないように均一に広げた様子．
（C，D）スペクチノマイシン耐性株の獲得．選抜開始３〜４週間
後に緑色のスペクチノマイシン耐性の培養細胞（C）または植物体（B）が得られる．

604

ゼニゴケのプラスチド形質転換法

た．そのため，20株以上は新しい選抜培地に移す必要がある．
3.b.3.4 プラスチド形質転換体の選択とホモプラズム化
１．成長したスペクチノマイシン耐性株の一部をサンプリングして 1.5ml マイクロチューブに移す．10mg 程
度で十分．培養細胞なら 2mm 程度．植物体はごく小さ い 段 階 で も 1mm 程 度 の 組 織 を メ ス な ど で 切 り
取って調べることが可能．仮根以外の緑色の組織ならば切り取る場所は問わない．
２．100μl の尿素フェノール液をチューブに加えて，プラスチックペッスルで細胞を破砕する．
３．破砕液に 400μl の尿素フェノール液を加えてよく混和してから，フェノール・クロロホルム抽出とエタ
ノール沈殿を行う．沈殿に RNase A を終濃度 10μg/
ml で含む Tris-HCl（pH 8.0）を 100〜200μl 加えて
トータ ル DNA 溶 液 と す る．QIAGEN の DNeasy
Plant M ini Kit でも PCR 用の total DNA 抽出は可能である．
４．ベクターに持たせた ptDNA の相同配列の外側に設計したプライマーと（図 1，P 1プライマー），aadA カセットの部分に設計したプライマー（図 1，P 2プライマー）のセットを用いて PCR を行う．
５．目的の領域に外来遺伝子が挿入されている株を選

図 4：PCR によるホモプラストーミックなプラスチド形質転換体獲得の確認．
（A，B）ゼニゴケ培養細胞（A）および植物体（B）におけるスペクチノマイシン耐性株の trnI 〜trnA 遺伝子間領域へのaadA カセットの組込みを図 1の矢印で示したプライマー
セット（P 1と P 3）を用いた PCR で調べた．増幅断片の長さは野生型 ptDNA 由来（WT）が 2,179bp，プラスチド形質転換型 ptDNA 由来（TP）が 3,563bp となる．（A）培養細胞ではホモプラストーミックな形質転換体を得るまでに 12〜16
週間かかる．
（B）植物体では選抜直後の段階において，すでに大半の株がホモプラストーミックである．

び，新しい選抜培地へ移植する．
６．得られたプラスチド形質転換株がホモプラストー
ミックになるまで，株の一部を２〜３週間ごとにスクターの設計において，trnI-trnA 遺伝子間に組込まれたロースを含む選抜培地へ植え継ぐ．ホモプラストー

外来遺伝子が高発現すると報告された ．ゼニゴケも含ミックであることはベクターに持たせた ptDNA の相めて，現時点の様々な植物におけるプラスチド形質転換

同配列の外側に設計したプライマーセットを用いた法でも trnI-trnA 遺伝子間領域が外来遺伝子の挿入部位．
PCR で確認する（図 1，P 1と P 3プライマー）

として広く用いられている ．他の領域を標的にして形質転換体は得られているが，遺伝子導入が困難な部位も培養細胞の場合，最初の選抜培地で細胞塊が出現して存在した（千代田，未発表）．

から，12〜16週間で野生型のプラスチド DNA が PCR

また，ゼニゴケのプラスチド形質転換において重要とで検出されない程度のホモプラストーミックな株が得らなるのは，選抜培地からスクロースを除くことである．

れる（図 4A）．植物体の場合，最初の選抜培地から単離

それに加えて，植物体ではターゲットを胞子から１週間

した時点でホモプラストーミックなプラスチド形質転換

育てた幼植物体として，直線状の形質転換ベクターを導体も得られる（図 4B）．ホモプラストーミックなライン

入することが重要である．上記の方法で得られるスペクが得られない場合は，無性芽を数回選抜培地へ継代培養

チノマイシン耐性株の数は１プレート当たり培養細胞とする．

植物体でおよそそれぞれ 100〜200株と 10株である．しかし，選抜培地にスクロースを加えた場合，出現する薬

3.b.4 まとめと考察

剤耐性株は増加するが，プラスチド形質転換体でない擬陽性の株がスペクチノマイシン耐性株全体の 90％以上

相同組み換えに依存するプラスチド形質転換においを占めてしまう．これらの擬陽性の株は一過的な耐性株て，遺伝子導入位置の設計は重要である．形質転換ベク

もしくは核形質転換体であると思われる．スクロースを2009 低 温 科 学

vol.67605

添加せずに光合成に依存して生育させることで葉緑体機能に対する選抜圧があがり，結果的にプラスチド形質転

参考文献

換体が優先的に生き残ることで選抜後にプラスチド形質

１) K.Ohyama, H.Fukuzawa, T.Kohchi, H.Shirai, T.

転換体の割合が増加すると考えられる ．著者らの実験

Sano, S.Sano, K.Umesono, Y.Shiki, M.Takeuchi, Z.
Chang, S.Aota, H.Inokuchi, & H.Ozeki, Nature 322

では最も効率の良い場合でスペクチノマイシン耐性株の70％程度が設計通りのプラスチド形質転換体であった．
一度得られたホモプラストーミックなプラスチド形質転換体は，スペクチノマイシンを含まない培地（植物体の場合はバーミキュライト）に移しても少なくとも半年は安定してホモプラストーミックな状態を維持することを確認している．

(1986)P.572.
２) S.Chiyoda, P.J.Linley, K.T.Yamato, H.Fukuzawa,
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３) S.Chiyoda, K.Ishizaki, H.Kataoka,K.T.Yamato,&
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５) D.Verma, & H.Daniell, Plant Physiol. 145 (2007) P.
1129.

606

ゼニゴケのプラスチド形質転換法

５章 形質転換

４．ヒメツリガネゴケ
杉田

護 ，田崎

瑛示 ，香村吉洋

ヒメツリガネゴケは植物の中では例外的に相同組換え能が高いため，核ゲノムと葉緑体ゲノムに遺伝子を導入することが容易である．導入法としては，ポリエチレングリコール法が一般的であるが，パーティクルボンバードメント法も適用可能である．

Transformation of
M amoru Sugita, Eiji Tasaki, Yoshihiro Komura
Homologous recombination occurs at a high frequencybetween genomic sequences in transforming DNA and thecorresponding chromosomal or chloroplast sequences, allowing precise inactivation or modification of genes.
For the transformation of Physcomitrella patens, polyethylene glycol (PEG)-mediated transformation of protoplasts is almost exclusively applied even though particle bombardment is as well applicable.

4.1 ポリエチレングリコールを用いたプロトプラストへの遺伝子導入

ゴケを参照されたい．
↓
植え継ぎ後３日目の原糸体が生育した培養プレート（直ポリエチレングリコール（PEG）法によるヒメツリガ

径 9cm プラスチックシャーレ）10〜12枚分からプロト

ネゴケの形質転換と相同組換えによる効率の高い遺伝子

プラストを調製する．クリーンベンチ内で原糸体を滅菌

ターゲティングが，スイスの Didier Schaefer らによっピンセットでかき集めて，25ml のドリセラーゼ溶液て初めて報告された．ヒメツリガネゴケの胞子体（原糸体と茎葉体など）のゲノムはハプロイドであるため，

表１．使用した試薬と培地の組成

遺伝子を破壊するとその影響がすぐに現れ，逆遺伝学に

ストック溶液●ストックＡ（×100）４℃保存
0.5M Ca(NO )4.5mM FeSO ・7H O

よる遺伝子機能の解析に適している．同法による形質転換の実験プロトコルは自然科学研究機構 基礎生物学研
究 所 生 物 進 化 研 究 部 門 長 谷 部 研 究 室 ホーム ページ（http://moss.nibb.ac.jp/）やフライブルグ大学の Reski
研究室ホームページ（http://www.plant-biotech.net/）
から入手できる．同法はコケ原糸体細胞のプロトプラス
トの調製，PEG を用いたプロトプラストへの DNA の導入，薬剤耐性形質転換体の選択の３つのステップからなる．ここでは当研究室で行っている核と葉緑体の形質転換の実験手順を紹介する．

4.1.1 原糸体細胞のプロトプラストの調製(所要時間：1.5時間）
使用する試薬および培地のうち重要なものを下線で示し，その組成と調製レシピを表 1にまとめた．
ヒメツリガネゴケ原糸体を４日毎に植え継ぐ．ヒメツリ
ガネゴケの培養と植え継ぎの方法については（1）植物・●ストックＢ（×100）４℃保存
2.5％ M gSO ・7H O●ストックＣ（×100）４℃保存
2.5％ KH PO
pH 6.5に 4M KOH で調製する．
●ストックＤ（×100）４℃保存
1M KNO
4.5mM FeSO ・7H O
酸化して茶色になったら新しいストックを調製する．
● Alternative TES 液（×1000）
0.0055％（0.22mM ）CuSO ・5H O
0.0614％（10mM ）H BO
0.0055％（0.23mM ）CoCl ・6H O
0.0025％（0.1mM ）Na M oO ・2H O
0.0055％（0.19mM ）ZnSO ・7H O
0.0389％（2mM ）M nCl ・4H O
0.0028％（0.17mM ）KI

藻類・細菌の材料の入手と栽培・培養，5．ヒメツリガネ
１) 名古屋大学遺伝子実験施設

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vol.67

ドリセラーゼ溶液（使用直前に調製する）
２％ Driserase-20（協和発酵工業株式会社）
８％ D-M annitol

607

の 入った 50ml ガ ラ ス 製 遠 心 管（ IW AKI TE-32

4.1.2 プロトプラストへの D NA の導入

PYREX）に入れる．原糸体はシャーレの周辺部 1cm を残し中央部のみをかき集める．
↓（所要時間：２日間）
使用する試薬，および培地は表１にまとめた．
30μℓの＊DNA 溶液（30μg DNA 断片）
，300μ
ℓのプロ

ガラス製遠心管をアルミホイルで覆い，25℃の培養室まトプラスト溶液，300μℓの PEG/T 溶液

たはインキュベータ内で，５分毎にガラス製遠心管を横ポリピレン丸底チューブ（ファルコン 352006）に加えて向きのままゆっくりと半回転まわす．
この操作を 30分間

混合し，45℃（恒温水槽）で５分間，20℃で 10分間イン行い，細胞壁を除去する．

キュベートする．

↓の順に，14ml＊市販のキット（QIAGEN）で調製したプラスミド DNA

口径 40μm のナイロンメッシュでプロトプラストを濾を制限酵素で完全消化し直鎖状にする．さらにフェ

過し，50ml ガラス製遠心管に集める．ナイロンメッシュ

ノール処理，エタノール沈殿してから，オートクレー

はガラス製ロートにセットし，アルミホイルで包んでブ滅菌したミリ Q 水（または TE）に溶解する．DNA

オートクレーブしたものを用いる．

濃度を 1μg/μℓに調整する．

↓↓1,000rpm，４℃で２分間遠心（TOM Y TS-7 ローター

プロトプラスト液体培地使用）し，プロトプラストを沈殿させる．

分間かけて穏やかに加える．加える手順：0.3ml を３分↓

6.5ml を 10回に分けて 30

毎に５回，次に 1ml を３分毎に５回加える．最初の３回

上清を 25ml メスピペット（または駒込ピペット）を用いまでは加える都度，チューブを指で軽くはじく（退屈でて捨てる．上清を少量残し，ゆっくりと回転しながらプ

根気を要する作業．気の短い人には向かない）．

ロトプラスト沈殿を懸濁する．
↓↓
三三九度の要領で全量をプラスチックシャーレ（直径 6

沈殿懸濁液に８％マンニトール溶液を遠心管の壁面にcm，IWAKI code 1010-060）に移し，フタをしてからパ

そってゆっくりと加え 40ml にする．

ラフィルムでシールする．さらにアルミホイルで遮光し，この遠心と洗浄の操作をあと２回繰り返す．

箱に収めて 25℃で一晩〜24時間培養する．
ここまでの所＊３回目の遠心をする前のプロトプラスト−マンニトー

要時間：1.5時間．

ル混液（40ml）の一部を取って，血球計算盤を用いて↓プロトプラストの総数と濃度を算出しておく．

翌日，P 5000ピペットマンを用いてプロトプラスト液を↓15ml ファルコンチューブ（35‑2096）に移し，1,000rpm，

３回目の遠心後，1.6×10 プロトプラスト/ml になるよ

4℃，２分間遠心分離し，プロトプラストを沈殿させて上うに MM M 溶液

清をデカントまたは P 5000ピペットマンを用いて除く．

をプロトプラスト沈殿に壁面にそってゆっくりと加えて懸濁し，これをプロトプラスト溶液↓とする．通常，7〜20ml のプロトプラスト溶液が得られる．
ここまでの作業を可能な限りクリーンベンチ内で行う．

＊50ml のファルコンチューブにドリセラーゼ粉末を 0.5g 入
れ，８％ D-mannitol を 25ml 加え溶解する．これを 4,000rpm で５分間遠心する．上清をシリンジに入れフィルター
滅菌（0.45μm）しながら，50ml のガラス製遠心管（IWAKIPYREX）に入れる．
M MM 溶液（20ml，使用当日に調製する）
0.5M D-Mannitol
15mM MgCl
0.1％ MES
フィルター滅菌（0.22μm）する．

608

PEG/T 溶液（使用当日に調製する）
40％ Polyethylene glycol 6000（PEG 6000）
0.1M Ca(NO )0.01M Tris-HCl(pH 8.0）
7.2％ D-Mannitol
2g の PEG 6000 とスターラーバーをキャップ付き硬質バイア
ル瓶（20ml 容量）に入れてオートクレーブし，これに上記のフィルター滅菌（0.22mm）した混合溶液 5ml を加え，よく溶かして調製する．
プロトプラスト液体培地（100ml，使用当日に調製する）
1×ストック A
1×ストック B
0.1×ストック C
0.005％ Diammonium（＋)‑Tartrate（(＋)‑酒石酸ジアンモニウム）和光純薬
6.6％ D-Mannitol
0.5％ Glucose

ヒメツリガネゴケの形質転換

予 め 45℃保 温 し た PRM /T 溶 液

を P 5000ピ ペット

コケを移したシャーレをサージカルテープでシールし，マンまたは 10ml メスピペットを用いてチューブの壁面

25℃連続明条件下で培養する（図 1）．このステップを１にそってゆっくりと 8ml 加える．直ぐに予め透明セロハ

次スクリーニングと呼ぶ．

ン

を 敷 い た PRM /B 培 地に 2ml ず つ 分 注 し，プ↓

レート面に均一に広げる．この操作を寒天が固まらない

３週間後にシャーレのふたを開け，生育したコロニーをにうちに手早く行う．

先細ピンセットでつまみ，抗生物質などの薬剤を含まな↓いセロハンなし汎用培地（BCDATG または BCDAT)

シャーレをサージカルテープ（またはパラフィルム）でに移す．コロニー毎にピンセットの先端をガスバーナー

シールし，25℃連続明条件下で３日間培養する．

で焼く．プレートあたり 25個〜60個のコロニーを移す

4.1.3 薬剤耐性形質転換体の選択（所要時間：４週間）

（図 1）
．

３日後，シャーレのふたを開け，２本のピンセットを用↓いて再生したコケをセロハンごと選択培地

に移す．

↓

１週間培養した後，コロニーの一部を新たな選択培地に移し，さらに２〜３週間培養する．このステップを２次スクリーニングと呼ぶ．

PRM /T 溶液（45℃で使用する）
1×ストック B
1×ストック C
1×ストック D
1×Alternative TES
5mM Diammonium（＋)‑Tartrate（（＋)‑酒石酸ジアンモニ
ウム）
10mM CaCl ・2H O
８％ D-Mannitol
0.8％ agar（Sigma A9799, Plant Cell Culture Tested）
オートクレーブした後で，45℃に保温する．残った溶液は室温で保存しておき，使用前にもう一度オートクレーブする．
透明セロハンの前処理と保存
市販のセロハンには培養に適さないものがある．例えば，セロハンの表面が撥水性を示す，あるいはオートクレーブによりセ
ロハンが白く変質するタイプは培養に適さない．当研究室では，フタムラ化学のセロハン（PL♯300）を使用している．
セロハンの洗浄方法：シャーレの大きさに切ったセロハン
300枚を 5mM EDTA(pH 8.0）液 500ml 中でオートクレー
ブする（1000ml ビーカーを用いる）．オートクレーブ後，セロハンをミリ Q 水（あるいは蒸留水）500ml 中で念入りにピンセットを用いてすすぎ，ミリ Q 水 500ml を入れてオートク
レーブ滅菌する．この操作をもう一度繰り返す．前処理済みのセロハンを室温保存する．培養のコンタミはセロハンが原因となる場合が多いので，使用直前に必ずもう一度オートクレーブ
する．
PRM /B 培地（プロトプラスト再生培地）（使用前日に調製する）
1×ストック B
1×ストック C
1×ストック D
1×Alternative TES
5mM Diammonium（＋)‑Tartrate（（＋)‑酒石酸ジアンモニ
ウム）
10mM CaCl ・2H O
6％ D-M annitol
0.8％ agar（Sigma A9799, Plant Cell Culture Tested）
オートクレーブし，シャーレにまいて固める．使用直前まで
25℃に保つ．
選択培地（汎用培地＋薬剤）汎用培地（BCDAT または BCDATG）をオートクレーブ後，50℃までさまし，クリーンベンチ内で下記の薬剤を加えよく混ぜ，プラスチックシャーレに分注する．

2009 低 温 科 学

vol.67↓選択培地で生育したコロニーを安定な形質転換体として選抜する．
通常，300個のコロニーのうち 50個の安定形質転換体が得られる．ただし目的とする遺伝子の性質によって得られる安定形質転換体の数は大きく変動する．

20mg/ml ジェネティシン（G 418，50mg/ml geneticin disulfate solution, WAKO 075-04893），マーカー遺伝子 nptII を用いる時に使用する．
ま た は，30mg /ml ハ イ グ ロ マ イ シ ン B （50 mg /ml
Hygromycin B solution, WAKO 084-07681），マーカー遺伝
子 hpt(aphIV ）を用いる時に使用する．
または，50mg/ml ゼオシン
（100mg/ml Zeocin,Invitrogen46-0509 ），マーカー遺伝子 zeocin resistant gene（ble）を用いる時に使用する．
または，500mg/ml スペクチノマイ シ ン（spectinomycin，
dihydrochloride pentahydrate，粉末，Sigma, 091K1257）
葉緑体形質転換のためのマーカー遺伝子 aadA を用いる時に使用する．
汎用培地（BCD）
1×ストック B
1×ストック C
1×ストック D
1×Alternative TES
1mM CaCl ・2H O
0.8％ agar（Sigma A9799, Plant Cell Culture Tested）
オートクレーブし，シャーレにまく．１ヶ月間室温保存．
汎用培地（BCDG）パーティクルボンバードメント法によるDNA の導入に用いる．
BCD 培地に 0.5％ glucose を加える．
オートクレーブし，シャーレにまく．１ヶ月間室温保存．
汎用培地（BCDAT）（＋)‑酒石BCD 培地に 5mM Diammonium（＋)‑Tartrate（
酸ジアンモニウム）を加える．
オートクレーブし，シャーレにまく．１ヶ月間室温保存．
汎用培地（BCDATG）
BCDAT 培地に 0.5％ glucose を加える．
オートクレーブし，シャーレにまく．１ヶ月間室温保存．

609

選択薬剤存在下でプロトプラストから再生した形質転換体には，導入 DNA が核ゲノムに組み込まれた安定形

したものを用いる．プラスミドのまま導入すると，核ゲノムへの組み込みがほとんど起こらない．

質転換体（stable transformant）の他に，核ゲノムに不⑷ PEG による形質転換法は，高価な遺伝子導入器機を安定に組み込まれたり，ゲノムに組み込まれていない形

必要とせず，簡便に行うことができる利点がある．し

質転換体（transient transformant）が存在する．これら

かし，PEG によってプロトプラスト融合が起こるたの形質転換体を排除し安定形質転換体のみを分離するため，コケ形質転換体がハプロイドではなくポリプロイ

めに，一度選択薬剤を含まない培地で１週間培養し，再ドとなってしまうことがある ．得られた形質転換体

び選択薬剤を含む培地で培養（２次スクリーニング）すを解析する前に，形質転換体の核相をプロイディーア

る．この再選択で生き残った形質転換体を安定形質転換

ナライザー（Patec 社 PA 型）により確認しておく．

体として選抜する（図 1）．

⑸ プロトプラストの再生率が形質転換効率に大きな影

4.1.4 相同組換えの確認

響を与える．確実に形質転換体を得るには，胞子から形質転換体コロニーが小さい段階でコロニーPCR 法を行い簡便に相同組換えの有無を調べる ．さらに，プ
レート５枚分のコケ原糸体からゲノム DNA を調製しゲ
ノミックサザン解析を行う．両者の結果を照らし合わせ

発芽した原糸体を３〜４回継代したものを用いるとよい．
⑹ PEG 法は簡便ではあるが，プロトプラストを調製するのに手間がかかる．

て，導入遺伝子がゲノムに組み込まれたかどうかを判定
する．
4.1.5 留意点および課題など⑴ 導入する遺伝子は，薬剤耐性マーカー遺伝子の上流

4.2 パーティクルボンバードメントによる
D NA 導入法と下流にそれぞれターゲット領域のゲノム DNA 配列

PEG 法によるヒメツリガネゴケの形質転換が報告さを連結するようにデザインする．ゲノム DNA 領域のれた後に，パーティクルボンバードメント法でも DNA

長さはそれぞれ 1kb 以上とる必要がある ．遺伝子破導入が可能であることがいくつか報告された壊株を作製しようとする場合は，ターゲット領域に薬

ティクルボンバード メ ン ト 法 は コ ケ の 原 糸 体 に 直 接剤耐性マーカー遺伝子を挿入するよりも，ターゲット

DNA を導入することができるので，PEG 法のようにプ遺伝子をそっくり欠失させ薬剤耐性マーカー遺伝子とロトプラストを調製する手間がはぶけ，形質転換に使用置換したコンストラクトを構築した方がよい．

する DNA 量も 5μg と少量ですむなどの利点がある．当．パー⑵ 導入した遺伝子がコンカテマーを形成してゲノム内研究室では，PEG 法だけでなくパーティクルボンバードに組み込まれることがある ．形質転換体の導入遺伝

メントによる DNA 導入で，GFP 蛍光の一過的発現の観子のコピー数を調べておく必要がある．

察と安定形質転換体の作製を行っている．当研究室で⑶ 形質転換用の導入 DNA は必ず断片化して直鎖状に行っている同法の実験プロトコルを紹介する．

図 1：薬剤耐性形質転換体のスクリーニング
DNA 導入後３週間，ジェネティシンを含む選択培地（BCDAT＋G 418）で培養（１次スクリーニング）し生育してきた多数の原
糸体コロニー（左），左写真の原糸体コロニーをピンセットで拾い，ジェネティシンを含まない汎用培地（BCDATG）に移して１週間生育させた原糸体コロニー（中），中写真の１週間培養した原糸体コロニーの一部を新たな選択培地（BCDAT＋G 418）に移して３週間培養（２次スクリーニング）した（右）．

610

ヒメツリガネゴケの形質転換

4.2.1 金粒子の滅菌処理（所要時間：１時間)↓

1.5ml マイクロチューブに金粒子（径 1.0μm BioRad,

70％エタノール（室温）を 200μℓ加え，P 200を用いてピ

cat. ♯1652263）60mg を入れる．

ペッティングで懸濁する．チップ内に金粒子が付着しな↓いように注意しながら軽くピペッティングする．

70％エタノール（室温）を 1ml 加え，５分間ボルテック
スする（TOMY MT-300 で最大の強さ）．
↓↓
5,000rpm，４℃で２秒間遠心し，P 200ピペットマンを用いて上清を捨てる．金粒子を吸い込まないように注意

室温で 15分間静置する．
↓

する．
↓

15,000rpm，2 秒間遠心する．
↓

100％エタノール（室温）200μℓを加え，ピペッティング
で懸濁する．

P 1000ピペットマンを用いて上清を捨て，ミリ Q 水を 1
ml 加える．

↓5,000rpm，4℃で２秒間遠心する．

↓↓

１分間ボルテックスした後，室温に１分間静置する．
↓

上清捨て，100％エタノール 30μℓを加え，ピペッティン
グで懸濁する．

15,000rpm，2秒間遠心し，上清を捨てる．ミリ Q 水を
1ml 加え，遠心と洗浄を３回繰り返す．
↓↓
氷上へ
4.2.3 コケ原糸体への D NA の導入滅菌した 50％ グリセロールを 1ml 加え，金粒子が均一になる程度にボルテックスする．
↓（所要時間：0.5時間）
パーティクルボンバードメントによる DNA 導入には，植え継ぎ後３〜５日目のコケ原糸体を用いる．コケ−80℃で保存する．

原糸体をプレート上（直径 9cm プラスチックシャーレ）

4.2.2 D NA 断片の金粒子へのコーティングに十分に広げるため，0.5％グルコースを加えた BCDG

（所要時間：0.5時間）

培地（透明セロハンは敷かない）で培養する．ここでは，50％グリセロールに保存しておいた金粒子液 25μℓを㈱タナカ社の IDERA（GAS 法遺伝子導入装置）型式

1.5ml のマイクロチューブに入れ，ボルテックスミキ

GIE-III を使用した場合の操作手順と打ち込み条件を紹サー（TOMY M T-300 など）にセットする．

介する．

↓
ボルテックスミキサーをスイッチ ON にし，ボルテック

電源スイッチ（M AIN）が OFF，ポンプ作動スイッチ

スの強さを 5.0〜5.5（中程度，こぼれない程度の強さ）（PUMP RUN）が OFF，排気切換バルブ（EXHAUSTにセットする．マイクロチューブのふたは開けた状態に

VALVE）が OFF になっていることを確認する．

する．

↓

↓

ヘリウムガス圧調整バルブ（He PRESS ADJ（ACCEL））

次の試薬を順に加える．

が反時計方向（ガス圧が低い）に位置しており，真空加

2.5M CaCl 25μℓ

圧調整バルブ（VACUUM ADJ（ACCEL）），ヘリウムℓ（5μg DNA 断片）
DNA 溶液 14μガス減圧調整バルブ（He PRESS ADJ（REDUC）），チャ

1M スペルミジン 1μℓ

ンバーリークバルブ（AIR LEAK）が時計方向に一杯に滅菌水 15μ
ℓ（80μ
ℓになる）

回っていることをそれぞれ確認する．

↓↓

マイクロチューブのふたを閉めて，３分間最大の強さでヘリウムガスボンベのバルブを開き，ヘリウムガスレ

ボルテックスする．室温で１分間静置する．

ギュレーターの一次測を 7.0kgf/cm 以上に設定した↓

後，二次測を 7.0kgf/cm 以下に設定する．

5,000rpm，４℃で２秒間遠心し，P 200ピペットマンを用いて上清を捨てる．
2009 低 温 科 学

vol.67↓
MAIN スイッチを押す．
611

↓状態に戻す．

排気遮断スイッチ（EXHAUST CUT）が OFF になって

4.2.4 薬剤耐性形質転換体の選択（所要時間：４週間）

いることを確認する．

金粒子を打ち込んだコケプレートをサージカルテープで↓シールし，暗所で（箱に入れて）25℃３日間培養する．

ヘリウムガス圧計（He PRESS GAUGE）の表示を見な
がら，希望する噴出ヘリウム圧力（4.0kgf/cm ）に到達

一過的発現を観察する場合は一晩の培養でよい．
↓

するまで，He PRESS ADJ（ACCEL）を時計方向に徐々金粒子を打ち込んだ位置のコケ原糸体をピンセットでつに回す．

まみ，6ml のミリ Q 水が入った 50ml コーニングチュー↓

ブ（430829）に入れ，コケ原糸体を粉砕する．粉砕は（1）（希望噴出圧力を超えてしまった場合は，操作マニュアル

植物・藻類・細菌の材料の入手と栽培・培養，5．ヒメツ

に従って調整する）

リガネゴケに準じて行う．

↓↓

PUMP RUN を押す．
↓

コケ原糸体粉砕液 2ml ずつを予め透明セロハンを敷いた選択培地３枚にまく．シャーレをサージカルテープでチャンバー内に試料（コケ原糸体が密生した培養プレー

シールし，25℃連続明条件下で３週間培養する．これ以ト），DNA コーティング済み金粒子液（10μℓ）を格納し降の作業は 4.1.3薬剤耐性形質転換体の選択と全く同たフィルターホルダーをセットし，扉を閉める．培養プ

じ．

レートの底面３カ所をマジックでマークしておく．試料↓とフィルターホルダー先端の間の距離を 75mm に設定

３週間後にシャーレのふたを開け，生育したコロニーをする．フィルターホルダーは使用直前に 70％エタノール

先細ピンセットでつまみ，抗生物質などの薬剤を含まな液中から取り出し，クリーンベンチ内で乾燥させてからいセロハンなし汎用培地（BCDATG または BCDAT）に金粒子液を加える．

移す．

↓
EXHAUST↓VALVE を VACUUM 表示位置に回し，

VACUUM GAUGE の表示を見ながら希望する真空圧（600mmHg）に到達したところで，EXHAUST VALVE
を OFF の表示位置に戻す．
↓
READY の点灯を確認する．
↓

１週間培養した後，新たな選択培地に移し，さらに２〜３
週間培養する．
↓
選択培地で生育したコロニーを安定な形質転換体として選抜する．
当研究室では，ある遺伝子の下流に GFP 遺伝子をノックインする形質転換を行った際，１次スクリーニン

START スイッチを押す．これにより，金粒子が噴射しグで選抜した 360個のコロニーを２次スクリーニングにコケに打ち込まれる．

回した結果，19個の安定形質転換体コロニーを得た．

↓
AIR LEAK を徐々に反時計方向に回し，チャンバー内に空気を入れる．
↓
試料（培養プレート）
を残したまま，フィルターホルダー

4.2.5 留意点と対処法
噴射されたヘリウムガス圧によって，コケ試料が吹き飛ぶことがある．これは，培地上についた水分が原因と考えられる．打ち込む金粒子液とコケ試料プレートを常に余分に用意しておく．

だけを取り出す．次に，DNA コーティング済み金粒子液（10μℓ）をフィルターホルダーにセットし，上記と同じ要領で金粒子を噴射しコケに打ち込む．これをもう１回繰
り返す．このようにして，１枚の培養プレートあたりℓを ３ 回 に 分 け て 10
DNA コーティング 金 粒 子 液 30μℓずつマジックでマークした位置に打ち込む．
μ↓
打ち込み終了後，装置の取り扱い手順に従って使用前の
612

参考文献
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2009 低 温 科 学

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10) S.H.Cho, Y.S.Chung, S.K.Cho, Y.W.Rim, & J.S.
Shin, Mol. Cells 9 (1999)P.14.

613

５章 形質転換

５．シロイヌナズナの形質転換
鹿内 利治
シロイヌナズナの形質転換は，技術的にほぼ完成されており，容易に簡便に行うことができる．以前
は vacuum infiltration 法がよく使われたが，最近は floral dip 法 が主流である．

Transformation of
Toshiharu Shikanai
Transformation technique of Arabidopsis thaliana has already been established almost completely. Althoughvacuum infiltration was routinely used previously,the transformation became even more efficient and simple by
the establishment of floral dip method.

４．培養液を遠心チューブに移し，集菌する．JLA100．

5.1 植物の準備

500ローターの場合は，4000rpm，５分，４℃の遠心を１．プラスチックポットに培養土を入れ，表面をネットで覆う．これはアグロバクテリウム懸濁液に逆さまに浸ける際，土がこぼれ落ちたいようにするためである．

行う．
５．上清を捨て，菌を 200ml の懸濁用培地に懸濁し，500ml ビーカーに移す．

流し台の水切りネットなどを適当な大きさに切って，

６．実験台にラップを敷き，その上で形質転換用の植物輪ゴムでポットに固定する．ネットと培養土に𨻶間がを逆さまにし，ロゼッタ葉までアグロバクテリウム懸入らないように，培養土は山盛りにする．

濁液に浸す．しばらく置いて引き上げ，５分後，もう２．直径 75mm の丸形ポットの場合，10〜20粒の種子

一度懸濁液に浸す．

を蒔く．約１か月後，伸びた花茎を切除（摘心）し，７．広げたラップの上に植物を寝かせて置き，地上部をさらに花茎の誘導を促す．さらに２週間ほどしたら形

ラップでくるむ．上部を折りたたんで閉じる．作業の質転換に用いる．

間，70％エタノールのスプレーを用意し，アグロバク
テリウムで実験台を汚染させないようにする．
８．ラップでくるんだ植物をそのまま１日通常条件で育5.2 形質転換の操作て，ラップを外す．さらに植物を同じように育て，種１．形質転換に用いるアグロバクテリウムを準備する．

を集める．この種が T 世代になる．

我々は Agrobacterium tumefaciens M P90（C58C1），
ASE などを用いている．形質転換の１週間ほど前，菌を新しくプレートに広げておくと（新鮮な菌を準備す

5.3 形質転換植物の選抜

る），その後の培養時間をコントロールしやすい．

１．耳かき一杯程度の種子を 1.5ml チューブに取り，２．50ml の無菌プラスチックチューブに 5ml の抗生３％次亜塩素酸 1ml を加えて 10分間滅菌する．

物質入りの LB を加え，プレートからアグロバクテリ
ウムのコロニーを少し多めに取り加える．一晩 23℃で震盪培養する．培養温度は 25℃でもかまわない．
３．翌日，抗生物質入りの LB 200ml を含む 1l フラス
コに 200μl の前培養液を加え，一晩（約 16時間）震盪
培養する．翌日 OD
やめ，氷上に移す．
１) 京都大学理学研究科

2009 低 温 科 学

vol.67が 0.8〜1.2になったら培養を

懸濁用培地
1/2×M S 塩
10％ ショ糖
0.5g/L MES
KOH で pH を 5.7に合わせる．
使用直前に，ベンジルアミノプリン（1mg/mL ストック，
DM SO 中）を 2μl と Silwet-L77 を 40μl 加える．Silwet-L77
は Lehle seeds（http://www.arabidopsis.com/main/cat/
VacInStuff/%21vis.html）から購入できるようだが，少量ならシロイヌナズナを扱っている研究室から分与してもらうと良い．

615

２．1ml の滅菌水で２回種子を洗う．
３．チューブを良くふった後，選択培地上

離），そこからホモ個体（T ですべて形質転換体）を得に流す．すて保存する．この際，薬剤耐性を指標にすると，しばぐに 2ml の 0.15％アガー（無菌）を加え，まんべんな

しば導入した目的遺伝子と連鎖していない問題が起き

く種子が行き渡るように培地を回す．

る．PCR で目的導入遺伝子の存在を確認する必要があ

４．サージカルテープで封をし，アルミホイルに包んでる．

冷蔵庫で数日置く．
５．アルミホイルから出し，23℃で培養する．場合よって非形質転換体も枯死せず緑を保つが，生育の差で形質転換体との見分けは容易である．
６．本葉が５〜６枚出たら，鉢あげする．最初は鉢をラッ

注意
すべての作業はクリーンベンチ内で行う．一連の作業は遺伝子組換え実験であり，機関による承認を受けていなければ行うことはできない．

プで包み，高湿を保ち，徐々に大気の湿度に馴らす．
７．個々の植物をライン化し，T 種子を採種する．必要があれば T-DNA が一カ所挿入されたラインを選び（薬剤耐性か可能であれば表現型が T で 3：1に分

参考文献
１) S.J.Clough & A.F.Bent, Plant J. 16 (1998)P.735.

選択培地
MS 塩
1％ ショ糖0.5g/L MES
KOH で pH を 5.7にあわせ，寒天を 0.8％になるよう加える．

616

シロイヌナズナの形質転換

５章 形質転換

６．タバコ形質転換
a．核ゲノム長尾 一生 ，山本

義治 ，小保方潤一

ここではアグロバクテリウムを用いたタバコの核ゲノムの形質転換について紹介する．タバコは葉緑体の形質転換も可能な数少ない植物であり，また大きく育つので生化学実験にも適している．無傷葉
緑体も簡単に調製出来る．

-mediated tobacco nuclear transformation
Issei Nagao, Yoshiharu Y Yamamoto, Junichi Obokata
Tobacco is a model plant that can be used for both nuclear and chloroplast transformation. In this chapter,weintroduce well established methods for Agrobacterium-mediated transformation of the tobacco nucleus. The
protocol includes introduction of a binary vector into Agrobacterium, inoculation of tobacco leaf disks with
Agrobacterium, and selection and regeneration of transformed tobacco.

6.a.1 試薬の調製
6.a.1.1 ストック
１．抗生物質など

２．植物ホルモン
BAP（benzyl aminopurine) 1.0mg/ml になるように
70％エタノールに溶解，−20℃保存．
IAA（indole acetic acids) 1.0mg/ml になるように

Chloramphenicol 25mg/ml になるようにエタノールに溶解，−20℃で保存．
Claforan 医療用の無菌粉末を 100mg/ml になるように滅菌水に溶解し，−20℃で保存．

70％エタノールに溶解，−20℃保存．
安定性がやや低いので半年ごとにストックを作り直す．
6.a.1.2 培地
１．MS（Murashige & Skoog）培地

Gentamycin 100mg/ml に な る よ う に 蒸 留 水 に 溶 解

無機塩類ミックス及び 1,000倍ビタミンミックスが和し，フィルター濾過により滅菌，−20℃で保存．

光純薬等から市販されているのでそれらを用いる．必要

Hygromycin 25mg/ml になるように蒸留水に溶解し，ならショ糖も加える（1〜5％）．溶解後 1N KOH を用いフィルター濾過により滅菌，−20℃で保存．
Kanamycin 100mg/ml になるように蒸留水に溶解し，フィルター濾過により滅菌，−20℃で保存．

て pH 5.6に合わせる．用途に応じて寒天（0.8％）を加え撹拌してからオートクレーブする．用いる寒天は INA（伊那食品工業．フナコシから入手可），
AGAR GA-10,30

Phosphinothricin（glufosinate, biaraphos, BASTA の（Difco）などがある．オートクレーブ後熱い
Bacto-Agar有効成分) 10mg/ml になるように蒸留水に溶解

うちに撹拌し寒天を完全に溶解させる．抗生物質や植物

し，フィルター濾過により滅菌，−20℃で保存．

ホルモンはオートクレーブ後 60‑70℃に冷ましてから加Rifampicin 25mg/ml になるようにメタノールに溶解

える．培養に用いる容器類はとりわけ丁寧に蒸留水です

し−20℃で保存．
Spectinomycin/streptomycin 100mg/ml に な る よ うに蒸留水に溶解し，フィルター濾過により滅菌，−20℃で保存．

すぎ，洗剤等の混入を避ける．培養専用にして洗剤では洗わないことにしておくのもよい．
２．YEB 培地
アグロバクテリウム用の液体もしくは寒天（BactoAgar 1.2％）培地．1l 当たり Bacto-Peptone（Difco）5

１) 北海道大学・大学院先端生命科学研究院・次世代ポス
トゲノム研究棟・細胞機能科学
２) 名古屋大学遺伝子実験施設・遺伝子解析分野
３) 京都府立大学・大学院生命環境科学研究科・植物ゲノ

g，Beef Extract（Difco）5g，Bacto-Yeast Extract（Difco）1g，ショ糖 5g，2mM MgSO ，1N NaOH でpH 7.2に合わせてオートクレーブ．

ム情報学2009 低 温 科 学

vol.67617

6.a.1.3 培養容器

り，異なるベクターであっても変える必要は無い．

１．深底シャーレ

バイナリー法で用いることの出来るアグロバクテリウ

高さ 2cm 程度のもの．カルス培養に用いる．ガス滅菌

ム（Agrobacterium tumofaciens）はいくつかあるが，よりは γ線滅菌されたものを選ぶとよい．テルモや Bio-

LBA 4404株 がタバコ界では一般的である．LBA 4404

bik などから入手可．

の選抜マーカーはリファンピシン（50μg/ml）である．

２．マジェンタ容器（GA-7，Sigma）

6.a.2.1 アグロバクテリウムへのベクター導入

高さ 10cm のオートクレーブ可能なプラスチック容器．シュートや幼植物の培養に用いる．

(２〜３日）
バイナリーベクターは大腸菌とアグロバクテリウムの両方で複製可能である．以下に大腸菌から調製したベク

6.a.2 アグロバクテリウムへのプラスミド
導入

ターをエレクトロポレーションを用いてアグロバクテリ
ウムに導入する方法を説明する．
6.a.2.1.1 エレクトロポレーション用コンピテントセ

アグロバクテリウムは双子葉植物に感染する土壌細菌でありバクテリアが持つ Ti プラスミドや Ri プラスミ

ルの調製（１日）
１) アグロバクテリウムのコンピテントセルを調製す

ド上の T-DNA 領域が植物の染色体 DNA に組み込まれる．300ml の YEB 培地に植菌し，ODるになるまで（５時間程度）28℃で震盪培養する．

．この性質を利用して外来遺伝子を植物体に導入する方法が考案された ．ここではまず，一般的に用いられているバイナリーベクター系 を用いた実験について解が 0.5〜0.6

２) 6000rpm，5分間，４℃で遠心して上清を除き，氷冷した 10％グリセロールで３回程度洗浄する．

説する．外来遺伝子導入，植物での過剰発現，人工的に

３) 100〜200μL の 10％グリセロールに懸濁して 50μl

作成した RNAi を用いた遺伝子発現抑制，レポーター遺ずつ分注して液体窒素中で凍結させる．
−80℃で保存

伝子導入等の目的のために多数のバイナリーベクターが作成されているが，その一部を表 1に紹介した．

する．
6.a.2.1.2 エレクトロポレーション法によるアグロバ

本章では pBI101 を例にして方法を紹介する．このベ

クテリウムの形質転換（２〜３日）

クターはバクテリア及び植物で作用するマーカー遺伝子

１．融 解 し た コ ン ピ テ ン ト セ ル 50μl に ベ ク ターをとして共にカナマイシン抵抗性遺伝子を含むので，下記

50〜100ng 入れ，エレクトロポレーション用キュベッのプロトコールではアグロバクテリウム及びタバコの選ト（電極間の幅 1.0mm）に移す．キュベットは使用時

抜はカナマイシンで行っている．他のベクターを用いるまで氷冷しておく．

場合は選抜マーカーに合わせて抗生物質を変える必要が

２．BioRad 社のエレクトロポレーター（GenePulser）
をある．アグロバクテリウムと植物の選抜マーカーは通常用いる．抵抗値 200Ω，電気容量 25μF，電圧 1.7kV

別の遺伝子が担っているので，用いる抗生物質等も異なで電気パルスをかける（放電時間は 13msec 程度になるのが普通である．リーフディスクの培養時にクラフォる）．用いるキュベットが 1.0mm 幅ではなく 2.0mm

ランを加えるのはアグロバクテリウムを除くためであ幅の場合は電圧は 2.5kV にする．放電後すぐに 1ml

表 1：主なバイナリーベクター
ベクター名

大腸菌／アグロバクテリウム選
抜マーカー

植物選抜
マーカー

大腸菌・アグロバクテリウムでのコピー数

メモ

入手先情報など

pBI

Kan

Kan

低

GUS レポーター

TAIR/ABRC，
http://www.arabidopsis.org/

pPZP ，pPZPY

Cap，Strep/
Spec

Kan，Gent

高マーカーのすべての組合せあり．pPZPY
は植物での高発現カ
セット．

pPZP: Dr. Pal Maliga, Rutgers University, maliga＠mbcl.rutgers.edu
pPZPY:http://www.gene.nagoya-u.
˜obokata-g/yyy/plasmid.html
ac.jp/

pGREEN

Kan

Kan，Hyg，
Bar，Sul高

各種レポーターとの http://www.pgreen.ac.uk/
組合せあり

選抜マーカー（耐性が付与される抗生物質）略称 Bar: biaraphos/phosphinothricin, Cap: chloramphenicol, Gent: Gentamycin, Hyg:
hygromycin, Kan:kanamycin, Spec:spectinomycin, Step:streptomycin, Sul:sulphonamide.他にも多数ベクターが開発されている ．

618

アグロバクテリウムによるタバコ核の形質転換

の YEB 培地を加えて懸濁し，試験管に移して 28℃で12．フェノールクロロホルム抽出を２回行う．

１〜２時間震盪培養する．

13．エタノール沈殿を行い，20〜50μl の 0.1x TE に溶

３．培養液の全量と 1/100量をそれぞれカナマイシン（25μg/ml），リファンピシン（LBA 4404の場合．濃度解する．
14．制限酵素で切断して目的のプラスミドが導入されたは 50μg/ml）を含む YEB 寒天培地にスプレッダーでか確認する．

広げて，28℃で２〜３日間静置培養すると，コロニー

プラスミドに問題がないことを確認したクローンを用が現れる．

いて，植物体への感染を行う．

6.a.2.2 アグロバクテリウムに導入されたベクターの確認（２〜３日）
導入したプラスミドは稀に組み換えを起こし思いがけない構造になっている場合があるため，アグロバクテリ

6.a.3 植物へのアグロバクテリウムの感染，形質転換細胞の選抜と個体再生

ウムからプラスミドを抽出し制限酵素パターンの確認をここで紹介するリーフディスク法と呼ばれるタバコの行う．コンストラクトあたり３クローン程度見ておく．

形質転換法は，簡便で導入される遺伝子のコピー数も少もし問題が起きたクローンを用いて実験を進めてしまっなく，優れた方法として行われてきた．植物体の葉を１た場合，その発見は非常に遅れることが予想されるので，cm 角に切ってアグロバクテリウムを感染させ，組み換

ここで確認しておいた方が安心である．

え体の選抜，カルス誘導を行い，その後植物ホルモンのアグロバクテリウムからは大腸菌で行われるアルカリ量を調整して植物体を再生させる．これらの操作は無菌法とほぼ同様の方法でプラスミドを精製出来るが，ゲノ的に行うため，無菌的に生育させたタバコを用意して実ムの混入や精製度を向上させるために以下の改変法を用験を行う．

いる ．シリカレジンを用いた大腸菌用プラスミド精製

6.a.3.1 感染に用いる植物体の準備（２週間程度）

キット（Wizard Minipreps DNA Purification System,

無菌的に植物を育成するため，
まず種子の滅菌を行い，Promega など）を用いてもよい．その場合はキットの説

MS 寒天培地に播種し発芽させる．その後，マジェンタ容明書に従ってプラスミドを精製する．

器に移し 10cm 程度まで育成し，葉を感染に用いる．タ

１．カナマイシン（25μg/mL）を含む 2mL の YEB 培

バコの培養は 25℃，明期 16h/暗期 8h で行う．

地で 28℃，１〜２日間培養する．一部をプラスミド精１．種子を 100〜200粒程度マイクロチューブに入れる．

製用に用い，一部をグリセロールと混合して−80℃で２．エタノールを 1ml 入れ，５分間ボルテックスし，軽保存する．

く遠心して種子を落とし，エタノールを除く．これを

２．10000rpm，3分間，４℃で遠心し，上清を除く．

２回行う．

３．リゾチーム（4mg/ml）を含む TEG（25mM Tris-

３．次亜塩素酸滅菌溶液（1.5％ 次亜塩 素 酸，0.02％

HCl pH 8.0，10mM EDTA，50mM glucose）で充

Triton-X100）を 1ml 加え，15分間ボルテックスにか分に懸濁し，室温で 10〜30分間静置する．

ける．

４．0.2ml のアルカリ液（１％ SDS，0.2N NaOH）を加えて転倒混和し，10分間室温で静置する．
５．二倍量のアルカリ液で飽和させた 30μl のフェノール溶液を加え，転倒混和して充分に混合する．
６．150μl の 3M 酢酸ナトリウム（pH 4.8）を加えて転倒混和し，15分間，−20℃で冷やす．
７．15000rpm，15分間，４℃で遠心し，上清を新しいチューブに移す．

４．遠心して種子を落とし，上清を除く．
５．滅菌水で３回程度洗浄する．
６．100μl 程度の滅菌水を加え，熱したメスで先を切ったブルーチップを用いて一粒ずつ，MS 寒天培地に播種する．
７．パラフィルム（もしくはサージカルテープ，住友 3M ）を巻いて１週間程度生育させる．
８．ある程度，芽が育ってきたら，培地の入ったマジェ

８．イソプロパノールを加えて遠心し，上清を捨てる．

ンタ容器に移植し，本葉が展開するまで生育させ感染９．100μl の TE に溶解して LiCl 沈殿を行い，高分子の実験に用いる．育ちすぎて培養コンテナが窮屈になっRNA を除く．

てきたら，茎と葉一枚を含むようにメスで切り取り，10．エタノール沈殿を行って 100μl の TE に溶解する．

茎を新しい培地に挿すと，枝の付け根のところから茎11．RNaseA（50μg/ml）を加えて 30分間室温で静置す

頂点が，培地に挿した茎からは根が発達してくる．

る．
2009 低 温 科 学

vol.67619

［培養メモ］

ナマイシン 100μg/ml（植物ホルモン無し）を含む MS

褐変した組織片があるとシャーレ全体に調子が悪くな

寒天培地に移して培養する．芽が出ていないリーフ

ることがあるので，具合の悪そうな組織片 が 現 れ た

ディスクは，クラフォラン 300μg/ml，カナマイシン

シャーレからはすみやかに元気な組織片だけを新しい培

100μg/ml，BAP 1μg/ml，IAA 0.1μg/ml を含む MS地に移すとよい．

寒天培地で培養する．また，１週間程度の培養で培地

6.a.3.2 植物体への感染と形質転換カルスの選抜，個が黄ばんで来る事があるが，その場合は新しい培地に体再生（３週間〜）

植継ぐ．
リーフディスク一枚から１個体だけを選ぶと，無菌的に生育させたタバコの葉をメスを用いて四角く

確実に独立した形質転換体が得られる．その場合リー

切りアグロバクテリウムを感染させる．感染させたリーフディスク 20枚からは最大 20の形質転換個体が得ら

フディスクは，抗生物質と植物ホルモンを含む M S 培地

れる．

で芽が出るまで培養する．芽が出てきたら，適宜植え継10．芽が大きくなり発根してきたら，MS 寒天培地
（クラぎながら植物体の再生を行う．この操作は，カビや雑菌

フォラン 100μg/ml，カナマイシン 100μg/ml）の入っが混入しやすいので十分に注意して行う．

たマジェンタ容器に移し，10cm 程度まで生育させる．

１．目的のベクターを保持したアグロバクテリウムを抗生物質を含む 3ml の YEB 培地で 28℃，24時間程度［操作メモ］

培養する．5000rpm，5分間，室温で遠心して集菌し，・カルスから再生した形質転換体は希にキメラである場

抗生物質を含まない YEB 培地に懸濁して感染に用い
る．

合がある．
・カルス化・再生の際に希に倍数化してしまう場合があ

２．無菌的に生育させた植物体を角シャーレ上でメスをる．細胞が大きいものはその可能性が高い．孔辺細胞用いて 1cm 角程度に刻み，乾燥しない様に液体のに含まれる葉緑体数を数え，野生型個体の倍程度あれ．主脈は除MS 培地に浮かべる（葉の裏側を上にする）
く様にする．感染させるアグロバクテリウムのクローンに対して 20枚程度用意する．
３．10cm シャーレに葉の裏を上にして置き，菌液を注
いで葉になじませる様にして数分静置する．
４．滅菌したティッシュの上に葉片を置いて余分な菌液ば倍数化している．
6.a.3.3 鉢上げ
10cm 程度に育った植物はプラスチックボックスから取り出し，根に付着している寒天培地を水道水で丁寧に洗浄し（根を傷つけないように），鉢上げをし，隔離温室で生育させ種子を得る．

を除き，10cm シャーレの MS 寒天培地に葉片の裏側

１．組織を採取した後の植物体は，プラスチックボック

を上にして置く．この時，寒天を崩す様にして葉が乾スから丁寧に培地ごと取り出し，主な寒天培地を軽くかない様に埋めるように置くと良い．

手で取り除いた後，水道水をかけながら根を傷つけな

５．シャーレをパラフィルムでシールし，培養する．無菌的に培養したタバコと言ってもカビの胞子等が付着していることもあるので，数枚のシャーレに分けて操作する方が無難である．

い様に優しく洗い流す．培地が多く残るとカビや雑菌が生えてしまう．
２．鉢は４号を用いる．底に割れた鉢の破片等で穴を塞ぎ，メトロミックス，バーミキュライトの順に等量入

６．36〜48時間後，リーフディスクを M S 液体培地に浸れ，たっぷりと水を注いでおく．用意した鉢に指で穴して軽く洗浄し，過剰のアグロバクテリウムを除く．

を開けておき，寒天培地を洗い流した植物体を深めにこれを２回行う．

埋める．プラスチックボックスで培養してきた植物体

７．滅菌したティッシュで余分な水分を除き，抗生物質

は乾燥に弱いので，最初はビニール袋を被せておく．

と植物ホルモン（クラフォラン 500μg/ml，BAP 1μg/

１週間程度経ったら，ビニール袋の角の部分をハサミ

ml，IAA 0.1μg/ml）を含む M S 寒天培地に移して培でカットし，さらに数日経ったら，袋の底を抜く様に養する．

して乾燥に慣らしていく．
植物が元気に育っていたら，

８．４〜５日後，クラフォラン 400μg/ml，カナマイシン
100μg/ml，BAP 1μg/ml，IAA 0.1μg/ml を含む MS
寒天培地に移して培養する．

ビニール取り外して生育させる．乾燥して萎れている
ようなら，再度ビニール袋を被せる等しておく．
３．植物が成長して蕾を付けてきたら，紙袋等を被せて

９．１〜２週間程度培養すると芽が出て来るので，芽が自家受粉させる．導入した遺伝子が１遺伝子座なら，出ている部分を切り離し，クラフォラン 300μg/ml，カ

得られた種子をカナマイシンを含む培地に播種する

620

アグロバクテリウムによるタバコ核の形質転換

と，メンデルの法則に従って白色のカナマイシン感受性の個体が４分の１現れる．
４．形質転換世代（T ）もしくは次世代（T ）の組織を用いてサザンハイブリダイゼーションや PCR により導入遺伝子の確認を行う．

6.a.4 最後に以上タバコを用いて形質転換を行う方法の概略を述べた．植物の培養は期間が長いためにカビ等の混入の影響を大きく受ける．従って操作や生育環境には十分注意して行う必要があるが，同時にある程度ダメになることを見越して材料等は余分に用意する．植物培養操作の習熟は必要になるが，形質転換に関してはそれほど難しい操
作は無いため，慣れれば必ず出来る．

参考文献
１) M .F.Thomashow, R.Nutter, A.L.M ontoya, M.P.

2009 低 温 科 学

vol.67

Gordon, & E.W.Nester, Cell 19 (1980)P.729.
２) M .F.Thomashow,R.Nutter,K.Postle,M.D.Chilton,
F.R.Blattner,A.Powell,M .P.Gordon,& E.W.Nester,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980)P.6448.
３) K.A.Barton, A.N.Binns, A.J.M atzke, & M .D.
Chilton, Cell 32 (1983)P.1033.
４) M .Bevan, Nucleic Acids Res. 12 (1984)P.8711.
５) R.A.Jefferson, T.A.Kavanagh, & M.W.Bevan,
EM BO J. 6 (1987)P.3901.
６) A.Hoekema, P.R.Hirsch, P.J.J.Hooykaas, & R.A.
Schilperoort, Nature 303 (1983)P.179.
７) C.R.Walkerpeach,& J.Velten,Plant M olecular Biology Manual, Dordrecht, Kluwer Academic Publishers,
1994, pB1:1.
８) P.Hajdukiewicz, Z.Svab, & P.M aliga, Plant M ol.
Biol. 25 (1994)P.989.
９) Y.Y.Yamamoto, M .Matsui M, L.-H.Ang, & X.-W.
Deng, Plant Cell 10 (1998)P.1083.
10) R.P.Hellens, E.A.Edwards, N.R.Leyland, S.Bean,& P.M .Mullineaux, Plant Mol. Biol. 42 (2000)P.819.
11) R.Hellens, P.M ullineaux, & H.Klee, Trends Plant
Sci. 5 (2000)P.446.

621

５章 形質転換

６．タバコ
b．葉緑体ゲノム黒田 洋詩
葉緑体形質転換は，葉緑体遺伝子発現機構や遺伝子産物の機能解析などの基礎研究から有用タンパク質の生産などの応用研究まで広く利用されている．本章では，パーティクルデリバリー法によるタバ
コ葉緑体形質転換法を紹介する．

Biolistic method of tobacco plastid transformation
Hiroshi Kuroda
Plastids of plants carry their own genomes and gene expression system. Plastid transformation is a powerfultool to study gene expression system and functions of gene products encoded in plastid genomes. This chapter
describes a biolistic method to obtain tobacco plants that carry stably transformed plastid genomes.

6.b.1 はじめに
光合成の場として知られる葉緑体は，プロプラスチド

6.b.2 葉緑体形質転換法の確立
1986年にタバコとゼニゴケで葉緑体ゲノムの全塩基から分化した色素体の一形態であり，そこでは光エネル

配列が発表された．これにより，多くの機能不明の遺ギーを化学エネルギーへと変換する反応だけでなく，色伝子や ORF が葉緑体ゲノムに含まれていることが明ら

素合成，アミノ酸生合成など様々な反応が行われていかになり，それらの機能や遺伝子発現系の解析が葉緑体

る ．単細胞緑藻などとは異なり，多細胞の植物には異な機能を探る上で重要な課題となった．一方，緑葉に存在る組織・器官があり，そこには機能的に分化した色素体

するタンパク質の 50％以上が葉緑体に局在すること，まが存在する．現在のシアノバクテリアと同じ祖先から進化したとされる色素体は，独自のゲノムとその発現系を持つ．タバコの場合，色素体ゲノムは約 156kb の環状
DNA であり，そこには約 120遺伝子がコードされている（図 1) ．このうち，約 80種類がタンパク質をコードする遺伝子であるが，いくつかの遺伝子産物の機能は長い間不明であった．クラミドモナスとタバコを材料にした葉緑体形質転換法による解析が行われるようになり，
機能不明な遺伝子は残りわずかになってきた．また，葉緑体遺伝子発現機構の解析などの基礎研究から，ワクチンなどの医学的に重要なリコンビナント・タンパク質の生産，除草剤や害虫などに抵抗性をもつ植物の作出などの応用研究まで非常に幅広くこの技術が利用されている．本章ではまず，葉緑体形質転換法を用いてこれまでに行われた研究について簡単に触れ，続いて実際のプロトコールを紹介する．

１) 名古屋市立大学大学院システム自然科学研究科

2009 低 温 科 学

vol.67

図 1：葉緑体ゲノム地図（2005年版) ．名古屋市立大学の湯川真希，杉浦昌弘両氏および愛知学院大学の續伯彦氏のご好意により提供していただいた図を改変した．

623

た，
例えばタバコでは１細胞あたり約 10,000コピーの葉の成功が報告されている．葉緑体形質転換法により行わ

緑体 DNA が存在することから，葉緑体ゲノムへ外来遺れた研究についてまとめた非常に詳しい文献があるの伝子を導入できれば，高レベルの組換えタンパク質の生で，興味がある方は参照されたし ．

産が可能になると考えられた．そのため，多くの研究者が様々な植物の葉緑体ゲノムの形質転換を目指して，研究を行った．

6.b.3 葉緑体形質転換法を利用した研究

Boynton らは単細胞の緑藻クラミドモナスを用いて，

図 2は葉緑体ゲノムの形質転換を模式的に示したもの

相同組換えによる葉緑体ゲノムへ外来遺伝子を導入するである．葉緑体ゲノム（cpDNA）と形質転換ベクター

ことに世界で初めて成功した ．クラミドモナスは細胞（vector）上のターゲット領域間で相同組換えが起こり，中に約 80コピーの DNA をもつ葉緑体を一つしかもた

選択マーカー遺伝子を含む領域が葉緑体ゲノムへ導入さないため，葉緑体形質転換の材料として適した生物でれる（tp-cpDNA）．タバコ葉緑体形質転換では，図 2A，あった．彼らは，葉緑体 ATP 合成酵素の βサブユニッ

2B に示した外来遺伝子の導入と葉緑体遺伝子のノック

トをコードする atpB 遺伝子が部分的に欠損するためにアウトが主に行われており，図 2C の葉緑体遺伝子の改

光独立栄養的に生育できない変異株をホストとして形質変はタバコではあまり行われていない．

転換を行った．その結果，相同組換えにより正常な atpB

形質転換ベクターが葉緑体中へ導入されると，葉緑体遺伝子が導入され，光独立栄養的に生育できる形質転換

DNA とベクターDNA 間で組換えが起こり，まず少数の体を得ることができた．この方法では形質転換できるゲ

葉緑体 DNA が組換わる．最初のうちは一部の葉緑体

ノム上の領域が限定されたが，1991年に，GoldschmidtClermont により，抗生物質であるスペクチノマイシンに耐性を与える aadA 遺伝子を用いたクラミドモナス葉
緑体形質転換法が発表され，葉緑体ゲノム上の任意の位置へレポーター遺伝子を導入したり，特定の遺伝子をノックアウトすることが可能となった ．
一方，多細胞の被子植物の葉緑体では，導入したレポーター遺伝子の一過的な発現は確認されていたが，安定な葉緑体形質転換体をなかなか得ることができなかった．単細胞で葉緑体を一つしかもたないクラミドモナ

スと比べ，タバコを例にとると，細胞一つだけをみても約 100コピーのゲノムをもつ葉緑体が約 100個存在す
る ．つまり，１細胞当たり葉緑体ゲノム約 10,000コ
ピーのすべてが均一に形質転換されなければならない高等植物では，葉緑体ゲノムすべてが形質転換した個体を得ることは非常に困難であることが予想されていた．そのような状況の中で，Svab らは抗生物質スペクチノマ
イシンとストレプトマイシンに耐性を与える変異を導入した rrn16 を選択マーカーとして用い，タバコの葉緑体
形質転換に高等植物で初めて成功した ．彼らはストレプトマイシン存在下で耐性株を選抜した後，ストレプト
マイシン耐性を調べることで，組織培養の際に頻繁に出現するスペクチノマイシン耐性突然変異株と形質転換体を明確に区別した．1993年には，クラミドモナス葉緑体
形質転換で用いられた aadA 遺伝子を用いたタバコ葉緑体形質転換が報告され ，これ以降，タバコだけでなく，
トマト ，ナタネ ，ニンジン ，ダイズ ，レタス ，ニンジン ，ポプラ ，コットン624などで葉緑体形質転換

図 2：相同組換えによる葉緑体ゲノムの形質転換．A．外来遺伝子の導入．B．特定の葉緑体遺伝子のノックアウト．C．葉
緑 体 遺 伝 子 の 改 変．葉 緑 体 DNA（cpDNA）と ベ ク ター
（vector）上の葉緑体 DNA 配列との間で相同組換えが起こり，ターゲット領域に挟まれた領域が置換した葉緑体 DNA（tp-cpDNA）が生ずる．LTR,Left Targeting Region;RTR,
Right Targeting Region; cpDNA, chloroplast DNA; tpcpDNA, transplastomic chloroplast DNA.
タバコ葉緑体形質転換法

非翻訳領
Staub らは，psbA 遺伝子のプロモーターと 5ʼ
域をつないだ uidA レポーター遺伝子を葉緑体ゲノムへ導入し，光に依存した D 1タンパク質の合成が翻訳開始の 段 階 で 5ʼ
非翻訳領域を介して行われると報告した．また，転写に関しては，青色光依存型の psbD プ

ロモーター ，Type II NEP の clpP1 プロモーター ，
構成的な rrn16 プロモーターの解析が行われた．このうち，rrn16 プロモーターについては唯一 in vitro 転写系でも非常に詳細な解析が行われた ．
このほか，RNA プロセシン グ（psbT-psbH ，psbH（atpI ) ，RNA エディティン
petB ) ，スプライシンググ（psbL，ndhB )，RNA の安定性（rbcL) ，翻訳（atpB ，rbcL，psbA)に関わるシス配列の研究が行われた．このうち，RNA エディティングはクラミドモナス
葉緑体では起こらないため，in vivo でシス配列の解析を行うにはタバコを用いるしかなかった ．
遺伝子発現系についての研究により得られた情報は，
葉緑体において外来遺伝子を高発現させる研究に応用されている．ワクチンなどの医学的に有用なタンパ

ク質，生分解性プラスチックのような工業的に有用なタンパク質，除草剤や害虫に耐性を与える農業的に有用なタンパク質がその対象となっており，最近では，葉緑体
図 3：形質転換した葉緑体ゲノムが徐々に増えて行く様子を模式的に示した図．選択圧のかかった状態で相同組換えと分裂を繰り返すことで，マーカー遺伝子を含む葉緑体が増えて行く．最終的に，葉緑体ゲノムがすべて置き換わったホモプラ
ストミックな葉緑体形質転換体を得ることができる．

における代謝系の改変なども行われている ．
6.b.3.2 逆遺伝学的手法による葉緑体遺伝子産物の機能解析
タバコ葉緑体ゲノムにコードされる遺伝子のうち，これまでに約 50種類のノックアウトが報告されている（表

DNA コピーだけが置き換わったヘテロプラストミック

1）．最初にノックアウトされたのは Rubisco の大サブユな状態だが，選択培地で培養を続けるうちに組換え配列

ニットをコードする rbcL 遺伝子である ．原核型 RNAを含む葉緑体 DNA が増えて行き，最終的にすべての葉ポリメラーゼのサブユニットをコードする遺伝子をノッ

緑体 DNA が置き換わったホモプラストミックな状態にクアウトした植物では，色素体に mRNA の蓄積が観察なる（図 3）．一旦ホモプラストミックな状態になれば，されたことから，核コードの別の RNA ポリメラーゼが選択圧をかけない状態にしても形質転換された葉緑体は確かに存在し，色素体遺伝子の転写を行っていることが安定に保持される．

明らかになった

6.b.3.1 遺伝子発現の解析および外来遺伝子の発現在することが知られているが ，上記のいずれのノック．葉緑体 DNA は核ゲノム内にも存先の述べたように，葉緑体には独自のゲノムと遺伝子アウト株においても，核ゲノム内に存在する葉緑体遺伝発現系がある．光化学系などの動的な分子構築や修復に子のコピーから発現するかもしれないタンパク質が葉緑は，高度に制御された遺伝子発現系が重要な役割を果た体で機能するわけではないことも確認された．その後多しており，多くの研究者が単離葉緑体や無細胞系を用いくの遺伝子がノックアウトの対象となり，ycf3 ，ycf6 ，て解析を行っていた．葉緑体形質転換法が確立されると，

ycf9 遺伝子産物の機能はタバコで初めて明らかになっレポーター遺伝子を用いて遺伝子発現制御に関わるゲノた．このうち ycf3 遺伝子は植物において逆遺伝学的手法

ム配列（シス制御配列）の解析が行われるようになっにより機能が明らかになった最初の葉緑体遺伝子であ

た ．

る ．

最初に調べられたのは，光化学系 反応中心タンパク質 D 1をコードする psbA 遺伝子の発現制御機構 で，2009 低 温 科 学

vol.67光合成の分野で特に重要だったのは，Ndh 複合体に関する研究である．ヒトのミトコンドリアの NADH625

表 1：これまでにノックアウトの対象となったタバコ葉緑体
遺伝子等

る clpP1 遺伝子 ，脂質の生合成に関与する accD 遺伝

光化学系
psaJ
ycf3

Clp プロテアーゼ
clpP1

キーピング遺伝子などがそれで，このうち clpP1 遺伝子

アセチル‑CoA カルボキシラーゼ
accD

れた ．また，ycf1 遺伝子や ycf2 遺伝子の完全なノック

光化学系
psbA
psbE
psbF
psbI
psbJ
psbL
psbM
psbTc
psbZ (ycf9 )シトクロム b f 複合体
petA
petB
petD
petG
petL
petN (ycf6 )NDH 複合体
ndhA
ndhB
ndhC
ndhF
ndhH
ndhI
ndhJ
ndhK

RubiscorbcLなどのハウスについては，別の研究によりその仮説の正しさが証明さ

RNA ポリメラーゼ
rpoA
rpoB
rpoC1
rpoC2

アウトは失敗に終わったことから，非常に重要な機能を

リボソーム
rpl20
rpl33
rps2
rps4
rps14
rps18

存在することが報告されたが ，それらの機能は依然不tRNA
trnC-GCA
trnG-GCC
trnG-UCC
trnN -GUU
trnV -UAC

ノム上の領域を，核ゲノムへ導入した葉緑体移行シグナ

持つタンパク質をコードしていると考えられた ．タバ
コ BY-2 培養細胞の色素体タンパク質のプロテオミクス
解析から，Ycf1 タンパク質と Ycf2 タンパク質が実際に明である．
相同組換えによる方法とは別に，バクテリオファージ
P1 に由来する CRE-lox 部位特異的組換えシステムを用いた葉緑体遺伝子のノックアウト法が報告 さ れ て い
る ．この方法では，２つの lox 配列で標識した葉緑体ゲルを持つ CRE リコンビナーゼで切り出すことにより，ノックアウトする方法である（図 4）．この技術には葉緑体形質転換と核形質転換が必要になるが，CRE リコンビ
ナーゼの発現を誘導型にすれば，目的の遺伝子を時期特

低分子 RNA
sprA

ATP 合成酵素
atpB operon

子 ，リボソームタンパク質遺伝子

異的または器官特異的にノックアウトし，その影響を調

ycf 遺伝子
ycf1
ycf2
ycf5 (ccsA)
ycf10 (cemA)

べることができる．これまで葉緑体以外での色素体遺伝

複製開始点
oriA
oriB

できたとしても，致死となる可能性が高いため解析が困子の機能の解析は進んでいないが，ここで紹介した方法
は有用なツールになるかもしれない．ただし，ycf1 やycf2 遺伝子などは，このシステムを用いてノックアウト
難であることが予想される．完全なノックアウトを目指すのではなく，クラミドモナス葉緑体 clpP 遺伝子の研究で行われたように発現量を下げるような工夫が必要かは必須と思われる遺伝子．

もしれない ．
脱水素酵素のサブユニットに相同なタンパク質をコードすると思われる遺伝子が葉緑体ゲノムに見つかり，シア
ノバクテリアの ndhB 変異株で光化学系

サイクリッ

6.b.3.3 葉緑体遺伝子の改変
シアノバクテリアやクラミドモナスに比べ，タバコ葉緑体遺伝子に点変異を導入したという報告は非常に少な

ク電子伝達が起こらないこと，また，シアノバクテリア

い．選択マーカーとして用いられた rrn16 遺伝子と葉緑体の NDH 複合体が類似していたことから，葉緑rps12 遺伝子体においても同様の機能を持つのではないかと考えられ子ていた．そして，葉緑体 NDH 複合体が光化学系 サイらいである．点変異ではないが，rbcL 遺伝 子

クリック電子伝達に関与することが実証されたのは，葉rpoA 遺伝子

緑体形質転換により得られた ndh 遺伝子欠損株の解析

形質転換が行われた．いずれの場合にも，タバコ本来のからである

遺伝子産物とは機能的に置き換わらないようである．

．この他，電子伝達系の複合体に含まれる低分子サブユニットの機能解析にも逆遺伝学的な手法が用いられている．

以外では，psbF 遺伝子とと rbcL 遺伝に点変異を導入し，その影響を調べた研究があるくやを別の生物種由来の遺伝子と置換する

これ以外に，葉緑体で機能する複合体を簡便かつ穏和な条件下で単離精製するために，その複合体に含まれる

コピーのすべてを完全にノックアウトできない遺伝子

サブユニットにアフィニティー精製タグを付加すること

は植物の生存に必須のものと考えられた．ATP 依存型が行われた．Suzuki らは，葉緑体 rpoA 遺伝子にコードClp プロテアーゼの触媒サブユニットの一つをコードす

さ れ る RNA ポ リ メ ラーゼ αサ ブ ユ ニット の C 末 に

626

タバコ葉緑体形質転換法

His-tag を導入し，葉緑体形質転換体から原核型 RNA
ポリメラーゼをアフィニティー精製した．そこには σ因子は含まれていなかったが，コア・サブユニットの他に，機能の不明なタンパク質がいくつか含まれていることを明らかにした．また，最近になって，葉緑体 psbE 遺伝子にコードされるシトクロム bの αサブユニットに His-tag を導入し，光化学系 をアフィニティー精製する方法が報告された．葉緑体には多くの機能性複合体が存在しているが，その構造や組成はまだ完全に分かっている訳ではない．これまでの精製法では失われていたかもしれないサブユニットが，今後見つかってくるかもしれない．この方法はそのための強力なツールになると考えられる．

6.b.4 実験方法
葉緑体形質転換法は既に様々な文献で詳しく紹介されている．葉緑体ゲノムを形質転換するためには，形

質転換ベクターを葉緑体中へ導入しなければならない．
そのための方法がいくつか報告されているが，パーティ
クルガンを用いて形質転換ベクターを細胞へ撃ち込む
図 4：CRE-lox 部位特異的組換えシステムを利用した葉緑体
遺伝子のノックアウト法．A．まず，葉緑体形質転換により，目的の遺伝子を挟み込むように２つの lox 部位を導入する．
B．その後，核へ CRE リコンビナーゼ遺伝子を導入した核形
質転換体（♂）と交配することで，葉緑体形質転換体（♀）へ
CRE 遺伝子を導入する．CRE リコンビナーゼは２つの lox
部位での組換えを引き起こし，そこに挟まれた領域を葉緑体
ゲノムから排除する（ΔcpDNA＋deleted gene）．

パーティクルデリバリー法が一般的である．この方法では，葉緑体形質転換ベクターでコーティングしたマイクロキャリア（タングステンまたは金粒子）を，ヘリウムガスを利用した空気銃の要領で，緑葉へ撃ち込み，葉緑体中へ形質転換ベクターを導入する（図 5）．
パーティクルデリバリー法以外には，ポリエチレング
リコールを用いてプロトプラスト化した細胞へ形質転換
ベクターを導入する方法

や顕微鏡下で形質転換ベク

図 5：パーティクルデリバリー法による葉緑体への形質転換ベクターの導入．ヘリウムガスを利用した遺伝子導入装置を用いて，ベクターDNA でコーティングしたマイクロキャリアを緑葉へ向けて撃ち込む．バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社のご好意により提供していただいた図を改変した．

2009 低 温 科 学

vol.67627

ターを葉緑体へ注入するマイクロインジェクションといを得る方法も報告されている ．この方法では，相同組換う方法がある．前者の場合，高価な装置を必要としなえにより正常な遺伝子を導入することで，正常な表現型

いが形質転換効率が低いという難点があるため，あまりをもつ植物体になることを形質転換成功の指標としてい用いられない ．後者の場合，この方法で導入された

る．

DNA が葉緑体ゲノムへ組み込まれた安定な葉緑体形質6.b.4.1.3 葉緑体遺伝子をノックアウトするためのベ転換体は得られていない．本プロトコールではパーティクルガンを用いた葉緑体形質転換法を紹介する．
6.b.4.1 葉緑体形質転換ベクター

クター
特定の葉緑体遺伝子をノックアウトする場合，葉緑体
ゲノム配列を基にノックアウトする領域とターゲット領

葉緑体形質転換ベクターの基本形は，大腸菌で増やす域を決める．大抵の場合，ノックアウトしたい遺伝子のための複製オリジンとアンピシリンなどに耐性を与える

代わりに選択マーカー遺伝子を挿入したベクターを構築

選択マーカー遺伝子を持ち，葉緑体 DNA 上のターゲッ

する．この場合にも，効率の良い相同組換えのためには，

ト領域と葉緑体形質転換のための選択マーカー遺伝子をターゲット領域は左右それぞれ少なくとも 1kb あるこ

持つことである．ベクター・バックボーンとして，pUCとが望ましい．また，マーカー遺伝子の挿入場所と向き

ベクターや pBluescript ベクターが用いられる．

は，周辺の遺伝子発現に影響を及ぼさないように決めな

6.b.4.1.1 遺伝子発現を研究するためのベクターければならない．

葉緑体遺伝子発現系の研究のために，これまで多くのレポーター遺伝子を用いた研究が行われている．レポー

6.b.4.1.4 葉緑体遺伝子へ変異や精製タグを導入する
ためのベクター

ター遺伝子としては，βグルクロニダーゼ
（GUS）
をコー

変異を導入したい遺伝子が決まったら，まず，葉緑体

ドする uidA 遺伝子や GFP などの 蛍 光 タ ン パ ク 質 をゲノム配列を基にターゲット領域を決める．次に，選択コードする遺伝子が用いられる ．レポーター遺伝子をマーカー遺伝子の挿入場所を決める．ベクターの設計の挿入する場所の選択は非常に重要であり，レポーター遺際の注意点は，ノックアウトのときと同様である．変異

伝子につないだ発現調節領域以外から転写が起こるようを導入する部位がマーカー遺伝子から離れている場合，な場所は避けるべきである．その目的に最も適している

マーカー遺伝子だけが導入され，目的の変異が導入されと考えられるのは，trnV -GAC 遺伝子と 3ʼ
rps12 遺伝子ないことがある．ターゲット領域内ではどの領域でも相の間の領域である

同組換えが起こる可能性があるためで．この位置に挿入しても周囲の遺伝，なるべくた子発現の影響を受けにくい．一方，rbcL 遺伝子と accD

くさんの形質転換体を得て，目的の変異が導入された個遺伝子間にレポーター遺伝子を挿入した場合，レポー

体を選ぶ必要がある．また，変異を導入する際に，そのター遺伝子は自身のプロモーターからだけではなく，周辺の塩基配列に新しい制限酵素切断部位ができるよう

rbcL プロモーターからも転写される．そのためにレポーに設計すれば，形質転換体を得た時にサザン解析で野生

ター遺伝子につないだ制御配列に依存しない発現が起こ株と区別しやすくなる ．

るため，この目的には適していない ．

目的のタンパク質にアフィニティー精製のためのタグ

6.b.4.1.2 外来遺伝子発現のためのベクターを導入する場合，
Ｃ末側に付加した方がよいと思われる．

医学的に重要な組換えタンパク質，除草剤や害虫に抵

Ｎ末側へ導入すると翻訳開始効率が低下し，結果として抗性を与えるタンパク質，代謝系を改変するようなタン

目的のタンパク質の蓄積量に影響を及ぼす可能性がある

パク質を葉緑体で合成する目的で，葉緑体ゲノムへの外ためである．また，Rubisco 大サブユニットに His-tag を来遺伝子の導入が行われている

導入した葉緑体形質転換体の亜鉛含有量が増加したとい．これまで葉緑体

ゲノム上の様々な位置への挿入が報告されており，レ

う報告がある

ビューにもまとめられている

す可能性は否定できない．したがって，目的に応じて別．
大きいものでは，約 50

kb の DNA の挿入が報告されている．多くの場合，フィールドへ出すことが前提になっているため，選択．His-tag の導入が代謝系に影響を及ぼのタグの使用も考慮に入れる必要がある．

6.b.4.1.5 選択マーカー遺伝子と阻害剤

マーカー遺伝子を除いた形質転換体を作る動きが出てい葉緑体形質転換体を得るためには，植物の再分化の際る．そのため，形質転換後にマーカー遺伝子を取り除くに何らかの手段を用いて選択圧をかける必要がある．通ための方法がいくつか報告されている．また，異常常用いられるのは，葉緑体遺伝子発現を阻害する抗生物な表現型を持つ Δycf3 ，ΔpetA，ΔrpoA 株へ形質転換す質である．植物の代謝経路に影響を及ぼす除草剤も使用ることで，マーカー遺伝子を持たない葉緑体形質転換体例がある．表 2，表 3に，これまでに報告されているタバ628

タバコ葉緑体形質転換法

表 2：選択マーカー遺伝子と阻害剤
阻害剤

シンには副作用があるらしく，nptII 遺伝子の発現量をスペクチノマイシン／ストレプトマ
イシン
スペクチノマイシン／ストレプトマ
イシン
カナマイシン
カナマイシンベタイン・アルデヒド

増やしても形質転換効率はあまり高くならない．nptII

選択マーカー遺伝子
rrn16 (点変異)
aadA
nptII
aphA-6
BADH

りも形質転換効率が良いようである．ただし，カナマイ遺伝子や aphA-6 遺伝子により不活性化できる副作用の少ない抗生物質が見つかれば，葉緑体形質転換効率が高くなるかもしれない．
抗生物質を必要としない選択マーカーとして，BADH
遺伝子が報告されている．この遺伝子産物であるベタ

イン・アルデヒド脱水素酵素は，毒性のあるベタイン・
コ葉緑体形質転換に用いられた選択マーカーと阻害剤をアルデヒドを不活性化するため，この薬剤を含む選択培示す．

地で葉緑体形質転換体が選抜される．スペクチノマイシ

タバコ葉緑体形質転換に用いられた最初の選択マーンを用いたときよりも形質転換効率が高いらしい．

カーは，スペクチノマイシン（およびストレプトマイシ

この他に，グリホサートに耐性を与える EPSPS 遺伝ン）に耐性を与える変異を導入した rrn16 遺伝子であ子，ビアラフォスに耐性を与える bar 遺伝子やピリミジ

る ．スペクチノマイシンは葉緑体の 30Ｓリボソームに

ニルカルボキシ系除草剤に耐性を与える変異型 ALS 遺

結合し，ペプチド転移反応を阻害するため，スペクチノ伝子などを導入した葉緑体形質転換体は薬剤耐性を示す

マイシン存在下では植物は生長できない．この選択マーがカーを用いた場合，形質転換が可能なゲノム上の位置が葉緑体形質転換体を得たという報告は今のところない．

限定される．Carrer らにより報告された２種類の異なる植物の再分化には長い時間がかかるため，阻害剤は室形質転換ベクターを同時に導入する方法，これらの遺伝子を選択マーカーとして使ってに利用でき

温で数ヶ月間安定でなければならない．また，スペクチ

るかもしれないが，一般的には抗生物質を不活性化する

ノマイシンのような副作用のない（または少ない）阻害

ことで耐性を与える選択マーカーを用いる．

剤を用いることが重要である．余談になるが，イネは元々

現在最もよく用いられている選択マーカーは aadA 遺

スペクチノマイシンに耐性であり，葉緑体形質転換にス

伝子である．この遺伝子産物であるアミノグリコシド‑

ペクチノマイシンによる選抜を行うことができな

3"‑アセチル転移酵素は抗生物質ストレプトマイシンといスペクチノマイシンを不活性化する．そのため，aadA 遺れば，イネ葉緑体形質転換は容易になるかもしれない．

伝子の導入された植物細胞はスペクチノマイシンを含む

6.b.4.1.6 ベクター構築の際の注意点など．スペクチノマイシン感受性のイネ変異株を得られ再分化培地で耐性を示し，葉緑体形質転換体を選抜する

ホモプラストミックな葉緑体形質転換体が得られるまことができる ．また，緑色蛍光タンパク質をコードする

で数ヶ月間を要する．
もし，ベクターの設計に問題があっgfp 遺伝子と aadA 遺伝子を融合させた Flare-S（Fluo-

たと判明した場合，それまでの労力と時間が無駄になる

rescent antiboitic resistance gene-Spectinomycin）をかもしれない．そのため，ベクターの設計には十分な時用いて得られた葉緑体形質転換体では，GFP の蛍光を追間をかけ，念入りに行うべきある．

跡することで，形質転換した細胞とそうでない細胞が分離する過程を観察することができる．

るため，基本的には葉緑体ゲノムのどの領域へも形質転カナマイシンに対する耐性を与える nptII 遺伝子を利用した葉緑体形質転換も報告されている

葉緑体形質転換では相同組換えにより遺伝子を導入す．カナマイ

シンは翻訳開始阻害剤であり，nptII 遺伝子産物である換が可能である．ただし，葉緑体遺伝子発現を阻害した
り，遺伝子をノックアウトするような部位への挿入は避けるべきである．

ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ （NPTII）が選択マーカー遺伝子の発現のために，通常は葉緑体由

カナマイシンを不活性化するため，選択培地上では形質来のプロモーター，5ʼ非翻訳領域，3ʼ
非翻訳領域を用い転換した細胞のみ増殖できる．また，nptII 遺伝子とは別る．この時，マーカー遺伝子のコード領域の 5ʼ
側と 3ʼ
側に，カナマイシンなどのアミノグリコシド系の抗生物質につなげる DNA 配列は同じ遺伝子由来にしない方が良に耐性を与える aphA-6 遺伝子の使用も報告されていい．たとえその領域短くても，予期せぬ領域で相同組換るえが起こったり，葉緑体内在性遺伝子がノックアウトさ．この遺伝子産物であるアミノグリコシド・ホスホ

トランスフェラーゼは NPTII よりも効率よくカナマイ

れてしまう可能性がある

シンを不活性化するため，nptII 遺伝子を用いたときよ

翻訳領域から発現するマーカー遺伝子を葉緑体ゲノムへ

2009 低 温 科 学

vol.67．また，葉緑体由来の 5ʼ
非629導入した時，葉緑体内在性遺伝子の発現が阻害される場
合があるので，注意が必要である

表 3：10x macro 水溶液（1,000ml）．

試薬1,000ml あたり加える量

KNO

19.0g

する過程で，大腸菌が正常に増殖しないことがある．そMgSO 7H O

3.7gの原因の一つとして考えられるのは，葉緑体と同様に原CaCl 2H O

4.4g

核型の遺伝子発現系をもつ大腸菌において組換えタンパ

KH PO

1.7g

ク質が大量発現してしまうことである．この場合，目的(NH )NO

16.5g

組換えタンパク質を発現させるためのベクターを構築のベクターが構築できなかったり，葉緑体形質転換に用いる DNA の調製が困難になるため，コピー数の少ない

表 4：100x micro 水溶液（100ml)

ベクターをバックボーンとして用いたり，大腸菌を低温

試薬

100ml あたり加える量（室温以下）で培養するなどの工夫が必要である．また，MnSO 2H O
H BO
ZnSO 7H O
KI
Na M oO 2H O(1mg/ml)
CuSO 5H O(1mg/ml)
CoCl 6H O(1mg/ml）

169.0mg
62.0mg86.0mg
8.3mg
2.5ml
0.25ml0.25ml

目的の組換えタンパク質が大腸菌にとって有害な場合があるが，葉緑体において翻訳開始が RNA エディティン
グに依存する psbL 遺伝子や ndhD 遺伝子の 5ʼ非翻訳領域を用いることで問題を回避できるかもしれない．大腸菌では RNA エディティングが起こらないか

らである．
表 5：RM 寒天培地

6.b.5 形質転換に用いるタバコの生育6.b.5.1 タバコの種類と生育条件
実験用タバコの栽培品種のうち，葉緑体形質転換には
Petit Havana や Xanthi が用いられている．葉緑体形質
転換には培養室かグロース・チャンバーで 25‑26℃で 16
時間明条件／８時間暗条件下，無菌的に生育させたタバ

ストック溶液・試薬

1,000ml あたり加える量

10x macro 水溶液

100ml

100x micro 水溶液

10ml

1％ Fe-EDTA(Sigma E6760)
ショ糖

5ml
30g

アガー（植物組織培養用)

7.5g

KOH で pH 5.6‑5.8に調整する．
1％ Fe-EDTA は水に溶解後，濾過滅菌し，冷暗所で保存する．

コを用いる．
6.b.5.2 培地

チ内で行う．エタノールや次亜塩素酸処理の時間が長す

無菌的にタバコを生育する際，RM 寒天培地が用いらぎると発芽率が大幅に低下するので注意を要する．RMれる．これは，M urashige-Skoog 培地に３％ショ糖と培地への播種後，培養室またはグロース・チャンバーへ

0.75％ア ガーを 加 え た も の で あ る．種 子 発 芽 用 に は置き，２週間ほど生育させる．

40‑50ml の寒天培地を厚めのシャーレに入れたものを

6.b.5.3.1 用意するもの

用意し，植物育成用には 40‑50ml の寒天培地の入ったマ・滅菌水：約 10ml をバイアルなどの小さな容器に入れ

ジェンタ・ボックスを用意する．アガーの種類やオートたものを５本程度用意しておくと良い．

クレーブの条件（加温・冷却にかかる時間）により，同・70％エタノール

じ濃度でも寒天培地の固さが変わる．従って，研究室ご・５％次亜塩素酸／0.1％ Tween 20 水溶液と に ア ガー濃 度 を 決 定 す る 必 要 が あ る．通 常 は・滅菌済みのマイクロチューブとピペットマン用のチッ

0.6‑0.8％内に収まるはずである．市販の M urashigeSkoog 培地用の粉末を用いても良いが，メーカーごとに品質が異なるようなので注意を要する．もしオートク

プ
・滅菌済みのパスツールピペット（脱脂綿などを詰めてオートクレーブにかける）

レーブ後に濁りを生じるならば，その使用は避けた方が・RM 寒天培地／10‑cm シャーレを数枚

良い．

・サージカルテープ．

6.b.5.3 種子の殺菌処理および R M 培地への播種

6.b.5.3.2 殺菌処理の手順

タバコの場合，シードポッド内は無菌のため，殺菌せずに播種する人もいるが，通常はカビやバクテリアの繁殖を抑えるために殺菌処理を行う．作業はクリーンベン
630

１．1.5ml のマイクロチューブへ種子を入れる（100〜200個）．
２．70％エタノールを 1ml 加え，３分間置く．
タバコ葉緑体形質転換法

３．軽く遠心したあと，上清を捨てる．

培養室で育てる．

４．次亜塩素酸／Tween 20 水溶液を 1ml 加え，１分間
置く．
５．軽く遠心したあと，上清を捨てる．
６．1ml の滅菌水 1ml で 3‑5回洗浄する．

6.b.6 葉緑体形質転換
6.b.6.1 R MOP 寒天培地および R MO P /S pec 寒７．最終的に，1ml の滅菌水に種子を懸濁する．

天培地の準備（シューティング前日）

6.b.5.3.3 播種の手順

１種類の形質転換ベクターにつき 20‑30ショット行

１．RM 寒天培地上に滅菌水を 2ml 程度注ぎ，培地全体に行き渡らせる．

う．そのために直径 10cm の薄いバクテリア用プレートに約 10ml の RMOP 寒天培地を入れたものを 20‑30枚

２．殺菌処理した種子を 100個程度含む懸濁液をパス用意する．また，シューティング後の形質転換体の選抜

ツールピペットで RM 寒天培地上に載せ，種を培地全のため，500μg/ml スペクチノマイシン（塩酸塩）を含む

体に行き渡らせる．

RM OP（RM OP/Spec）寒 天 培 地 40‑50ml を 厚 め の３．培地上の余分な滅菌水を捨てる（パスツールピペッ
トまたはピペットマンで）．

シャーレに入れたものを 100枚ほど用意する．滅菌はオートクレーブにより行う．スペクチノマイシンはオー

４．シャーレのふたを閉じ，サージカルテープを巻く．

トクレーブ後，表 6の RM OP 培地が 50℃以下に冷めて５．培養室またはグロース・チャンバーへ置き，２週間から加える．

ほど生育させる．

6.b.6.2 葉の準備（シューティング前日）

6.b.5.4 タバコの植え継ぎと育生

3‑6週間生長させた植物から緑葉を切り出す．全体が播種後，約２週間ほどで RM 寒天培地の入ったマジェ

均一に緑色で，なるべく丸い形の葉を用いる．細長い葉

ンタ・ボックスへ移植できる段階になる（マジェンタ・は花芽形成が近い状態なので，形質転換には用いない．

ボックスはシグマ社から入手可能）．作業はクリーンベン

作業はクリーンベンチ内で行う．

チ内で行う．

6.b.6.2.1 用意するもの

6.b.5.4.1 用意するもの

・滅菌済みのピンセット

・RM 寒天培地（40‑50ml)/マジェンタ・ボックス GA7

・滅菌済みのメス・滅菌済みのピンセット

・滅菌済みの濾紙（直径 10cm のシャーレに載る大きさ

・サージカルテープのもの）

6.b.5.4.2 手順

・RMOP 寒天培地（バクテリア用シャーレに約 10ml 注

１．シャーレで育てた実生をピンセットで傷つけないよぎ込む）

うに採り，マジェンタボックス中の RM 寒天培地に移6.b.6.2.2 手順

植する．

１．RM OP 寒天培地上にオートクレーブで滅菌した濾

２．シャーレのふたをした後，サージカルテープを巻き，紙を一枚のせ，その上に葉を逆さまにして置く（葉の表 6：RMOP 寒天培地（必要に応じて抗生物質を加える）
ストック溶液・試薬

1,000ml あたり加える量

10x macro 水溶液
100x micro 水溶液
1％ Fe-EDTA(Sigma E6760)
ショ糖
1mg/ml thiamine
1mg/ml NAA (0.1M NaOH に溶解)
1mg/ml BAP (0.1M HCl に溶解)
Myo-inositol
アガー（植物組織培養用）
100mg/ml スペクチノマイシン，塩酸塩
100mg/ml ストレプトマイシン，硫酸塩

100ml
10ml
5ml
30g
1ml
0.1ml
1ml
0.1g
7.5g
500μl
500μl

KOH で pH 5.6‑5.8に調整する．
NAA：1-Naphthaleneacetic acid（ナフタレン酢酸；オーキシン）
BAP：N6-Benzylamino purine（ベンジルアミノプリン；サイトカイニン）

2009 低 温 科 学

vol.67631

表側が濾紙に接するように置く）．
２．濾紙の上に葉をのせ，葉脈などに切れ目を入れ，葉用意する場合のみ）．
6.b.6.4 マイクロキャリアの D NA コーティング

全体が培地に触れるようにする．葉に切れ目を入れる(シューティング当日）のを躊躇してはならない．小さな葉を用いる場合，１

形質転換ベクターDNA でマイクロキャリアをコー

シャーレあたり 2‑3枚の葉をのせても構わない．
なお，

ティングする．１ショットあたり 5μl の DNA コートし濾紙はシューティング時に寒天培地が飛び散らないよ

たマイクロキャリア懸濁液が必要である．CaCl とスペうにするためのものである．

ルミジン存在下でマイクロキャリアをコーティングした

３．シャーレのふたを閉じる．サージカルテープを巻く必要はない．

後，無水エタノールで洗浄する．無水エタノールを用いることで，DNA コートしたマイクロキャリアがサラサ

４．必要な枚数用意できたら，シャーレの入っていた無ラな状態になり，マクロキャリアに載せたときにきれい

菌のビニール製のバッグに入れ，培養室に置いておく．

に均一に広がる．マイクロチューブ内でサラサラな状態

6.b.6.3 マイクロキャリア（タングステンまたは金粒子）の準備（シューティング前日）
形質転換ベクターを葉緑体へ導入するためのマイクロキャリアとして，タングステン粒子（直径 1.1μm）または金粒子（直径 0.6μm）が用いられている．最近では高になるまで無水エタノールでの洗浄を繰り返す．
6.b.6.4.1 用意するもの
・洗浄済みのマイクロキャリア懸濁液
・形質転換ベクターDNA（T E 緩衝液に溶解し，濃度は 1μg/μl 以上）

価ではあるが金粒子の使用が主流になっている．マイク・2.5M CaCl

ロキャリアを洗浄する作業はクリーンベンチ内で行う．

・0.1M スペルミジン（free base）

なお，この作業はシューティング当日に行っても構わな・無水エタノール

い．

・マイクロチューブ

6.b.6.3.1 用意するもの

6.b.6.4.2 手順

・マイクロキャリア

１．1.5‑ml のマイクロチューブを氷上に置き，以下のも・スクリューキャップ付きのマイクロチューブのを順に混合する（６ショット分）．

・無水エタノール

マイクロキャリア懸濁液

50μl

・滅菌水

形質転換ベクターDNA

10μg

・ソニケーター

2.5M CaCl

50μl

・超音波処理のための容器（微量超遠心用の厚手のポリ

0.1M

20μl

プロピレンチューブなど）

スペルミジン（free base）

２．低温室で 30分間ボルテックスミキサーにかける．

6.b.6.3.2 手順

３．200μl の無水エタノールを加え，よく混ぜる．

１．100ショットあたり 50mg のマイクロキャリアを用

４．軽く遠心にかける．

意する．
２．1.5‑ml のマイクロチューブへ入れ，無水エタノールを 1ml 加える．

５．上清を除き，沈殿を 200μl の無水エタノールによく懸濁する．
６．軽く遠心にかける．

３．95℃で２時間処理し，マイクロキャリアを洗浄する．

７．5‑6の操作を少なくとも３回繰り返す．

４．軽く遠心し，マイクロキャリアを沈殿させる．

８．最終的に沈殿を 30μl の無水エタノールに懸濁す

５．上清を捨て，沈殿を無水エタノールに懸濁する．
６．適当な容器へ移し，超音波処理を施す．５分間の処理を３回行う．
７．超音波処理後，マイクロキャリア懸濁液を 1.5‑mlのマイクロチューブへ移す．

る．
6.b.6.5 パーティクルデリバリー（シューティング）
遺伝子導入装置 PDS-1000/He（図 6）をクリーンベン
チ内に設置する．そのため，作業はクリーンベンチ内で行うことになる．

８．軽く遠心する．

6.b.6.5.1 装置など

９．上清を捨て，沈殿を滅菌水 1ml に懸濁する．この作

・Bio-Rad PDS-1000/He システム

業を３回繰り返す．

・真空ポンプ

10．沈殿を 1ml の滅菌水に懸濁する．

・ヘリウム・ガス・ボンベ

11．フリーザーで冷凍保存する（シューティング前日に・クリーンベンチ

632

タバコ葉緑体形質転換法

はマクロキャリア上にきれいに広がるはずである．そうならない場合には，水分を完全に除去できていないということなので，DNA コートしたマイクロキャリ
アを再度無水エタノールで洗浄する．
６．ラプチャーディスク・ホルダーにラプチャーディス
クを装着する．
７．真空チャンバー内にホルダーをしっかりと取り付け
る．
８．フライングディスク・ホルダーにストッピングスク
リーンをのせ，その上にマクロキャリアホルダーを取り付ける．ステージの位置は上から１番下または下から２番目のスロットである．
９．葉をのせたシャーレの蓋を外し，ステージにのせる．
真空チャンバーの扉を閉める．
図 6：遺伝子導入装置 PDS-1000/He．写真はバイオ・ラッド・
ラボラトリーズ社のご好意により提供していただいた．

10．真空ボタンを入れ，チャンバー内の圧力が少なくとも〝25 inches of Hg" に達するまで待つ（10数秒かかる）．
11．シューティングボタンを押し続ける．圧力が 1,100

6.b.6.5.2 １ショット当たり必要なもの

psi に達したら，ラプチャーディスクが 破 れ，DNA・ラプチャーディスク 1,100psi

１枚コートしたマイクロキャリアが発射される．この時点

・マクロキャリア

１枚でシューティングボタンを放す．圧力ボタンのセッ・ストッピングスクリーン

１枚

ティングを変え，チャンバー内を真空状態から復帰さ・マクロキャリアホルダー

１個

せる．

これらを無水エタノールで滅菌し，クリーンベンチ内で乾燥させる．滅菌済みのシャーレ上で行うとよい．ま12．真空チャンバーからシャーレを取り出し，蓋を被せる．

た，PDS-1000/He の真空チャンバー内を 70％エタノー

13．すべての葉をシューティングし終わったら，再び無ルで消毒し，乾燥させる．葉緑体形質転換においては，菌のビニール袋に入れ，培養室またはグロース・チャ

カビが大敵である．植物の再分化には３週間以上を要す

ンバーに２日間静置する．
時間が経つと，
マイクロキャ

るが，その間無菌状態が保たれていなければならない．

リアが撃ち込まれた部分はメタリック色に見えてくる

従って，非常に清潔な環境で作業を行わなう必要がある．

はずである．

機器の詳しい取り扱い方についてはその取扱説明書を参照のこと．

6.b.6.6 再分化培地への移植
シューティング後，２日間置くことで葉緑体中での6.b.6.5.3 手順

aadA マーカー遺伝子の発現を促す．シューティング後

１．遺伝子導入装置 PDS-1000/He のメインスイッチをすぐに再分化培地へ移すと，培地中のスペクチノマイシ

入れる．

ンが aadA 遺伝子の発現を阻害するため，すべての葉緑

２．付属の真空ポンプのスイッチを入れる．

体がスペクチノマイシンを不活性化できず，植物が再分

３．ヘリウム・ガス・ボンベのバルブを開く．この時，化できない．作業はクリーンベンチ内で行う．

圧力が少なくとも 1,300psi 以上でなければならな

6.b.6.6.1 用意するもの

い．

・滅菌済みのピンセット

４．マクロキャリアホルダーを５枚を用意し，それぞれ・滅菌済みのメスにマクロキャリアを装着する（滅菌済みのシャーレ上・RMOP/Spec 寒天培地

で行うとよい）．

6.b.6.6.2 手順

５．DNA コートしたマイクロキャリアをよく懸濁す

１．シューティングした葉を約 1cm くらいの大きさにる．マクロキャリア１枚当たり 5μl をアプライし，乾切り分け，RMOP/Spec 寒天培地上に葉の裏側を上に燥させる．この時，DNA コートしたマイクロキャリア

向けて載せる．寒天培地になじむように，しっかりと2009 低 温 科 学

vol.67633

押さえつける．プレート一枚当たり８片程度にする．

り，発根を促すために RM 培地に移植する．サザン解析

２．しっかりとラッピングし，培養室かグロース・チャ

や PCR 解析を行うため，少なくとも４個体を植えつぐ

ンバーに移す．スペクチノマイシン耐性のシュートが必要がある．

出てくるまで待つ．

6.b.7.3 サザン解析や P C R 解析による葉緑体形質
転換体の評価

6.b.7 植物の再分化と葉緑体形質転換体の評価
葉緑体形質転換が成功していれば，3‑4週間ほどで再分化したシュートを見ることが出来る．新しい再分化植シュートが発根し適当な大きさになったら，葉からDNA を抽出し，サザン解析や PCR 解析を行う．これにより，すべての葉緑体 DNA が置き換わっていることを確認する．これらの解析法は広く行われているので，こ
こでは簡単に触れるにとどめておく．

物の出現は再分化の開始から２ヶ月ほど続く．再分化しサザン解析の場合，CTAB 法な ど に よ り 調 製 し た

た植物体の多くは葉緑体形質転換体であるが，16 遺伝

DNA を適当な制限酵素で切断し，マーカー遺伝子およ子への突然変異によるスペクチノマイシン耐性株も出現

びターゲット領域に相補的な２種類の異なるプローブをする．また，導入した DNA が核ゲノムへ組み込まれるこ

用いて別々にハイブリダイゼーションを行う．注意しなともあるため，葉緑体形質転換体を正しく選抜する必要ければならない点は，ターゲット領域の外側で切断するがある．

制限酵素を用いることである（一方が外側で，もう一方

6.b.7.1 再分化，継代培養，種子形成のアウトライン

が内側でも良い）．
ターゲット領域の内側で切断する制限

１．最初のシュートを切り刻み，新しい RMOP/Spec 寒酵素を用いると，ベクターが葉緑体ゲノムのどこに挿入

天培地で再分化を開始する．
２．3‑4週間後，再分化したシュートを切り刻み，新しいRM OP/Spec 寒天培地へ移植する．また，突然変異体と区別するために，RMOP/Spec/Str 寒天培地にも移植する．
３．3‑4週間後，再分化したシュートを RM 寒天培地に移植し，発根させる（シャーレ）．
４．発根し，葉が大きくなったら，葉から DNA を抽出
し，サザン解析や PCR 解析を行う．
５．再分化した植物が目的のホモプラストミックな形質されても同じシグナルが得られてしまうからである．また，野生株と葉緑体形質転換体を明確に区別できるように切断する制限酵素を選択する．
ゲノム解析から，核ゲノムにも葉緑体 DNA が挿入されていることが報告されている．そのため，葉全体から抽出した DNA の解析では，ホモプラストミックな葉緑体形質転換体かどうかの判定が難しいことがある．単離葉緑体から DNA を抽出するか，パルス・フィールド・
ゲル電気泳動で葉緑体 DNA を分離してから PCR により検定することで，その問題を回避できる ．

転換体であれば，植物をマジェンタ・ボックスの RM
寒天培地に植えかえ，さらに大きく育てる．
６．土壌へ植えかえ，種子を形成させる．
6.b.7.2 抗生物質による葉緑体形質転換体の評価

6.b.8 継代培養と種子形成
RM 寒天培地の入ったマジェンタ・ボックスへ移し，

シューティング後に再分化したシュートが大きくなっ

形質転換体を生育させる．また，土へ植えかえ，種子をてきたら，細かく切り分けて，新しい RM OP/Spec 寒天形成させる．マジェンタ・ボックスで生育させた植物体培地に移植する．これと同時に，RMOP/Spec/Str 寒天を土へ植えかえるとき，根に付着した RM 寒天培地をよ培地（表 6を参照）にも移植し，培養する．もし，再分

く洗い流さなければならない．栄養分を含む培地が残る化した植物が目的の葉緑体形質転換体であれば，ストレと，カビやバクテリアが繁殖し，根の発達に悪影響を及

プトマイシンを含む培地上で緑色のカルスを形成するはぼすからである．土へ植えかえたあとは，植物をサランずである．aadA 遺伝子が導入されたタバコはストレプ

ラップなどで軽く覆い，数日から一週間くらいは出来る

トマイシンにも耐性となるからである．スペクチノマイ

だけ湿度を保つようにする．

シン耐性の 16S rRNA 変異株はストレプトマイシン耐性とはならない．そのため，葉緑体形質転換体と突然変異体を容易に区別することが出来る．
３週間ほどすると，多数の新しい再分化したシュートが出現する．今度は細かく切り分けず，茎のところで切634

6.b.9 交配とシード・アッセイによる
葉緑体形質転換体の評価
サザン解析や PCR 解析では，再分化した個体の一部
タバコ葉緑体形質転換法

分しか調べないため，個体全体としてはホモプラスト

RM OP/Spec 寒天培地上では芽生えはすべてグリーン

ミックな形質転換体となっていない可能性が残っていになるはずである．白い個体が見られるようなら，葉緑る．また，葉緑体ゲノムだけでなく，核ゲノムへも選択

体形質転換体はホモプラストミックではないということ

マーカー遺伝子が挿入している可能性もあるため

になる．

，得

られた種子を抗生物質を含む培地上で発芽させること

6.b.9.5 野生株（♀）と形質転換体（♂）の交配によりで，ホモプラストミックな葉緑体形質転換体かどうかを得られた種子の場合

判定しなければならない．そのために，自家受粉により芽生えはすべて白くなるはずである．もし RM OP/

えられる種子とは別に，野生株との交配による種子を得Spec 寒天培地上でグリーンの芽生えが多数見られるよる必要がある．

うなら，核ゲノムへも aadA 遺伝子が挿入した可能性が

6.b.9.1 交配方法ある．そのような場合には，「形質転換体（♀）と野生株

6.b.9.1.1 用意するもの（♂）の交配により得られた種子」の中から核ゲノムに・ピンセット（使用前に 70％エタノールで洗浄する）

マーカー遺伝子の挿入されていないものを選び出す必要・グラシン紙などで作った小さな袋

がある．

・付け札
6.b.9.1.2 手順
１．開花直前のつぼみを選び，花の一部にピンセットで切れ目を入れる．

6.b.10 トラブル・シューティング
再 分 化 培 地 上 で 形 質 転 換 体 が 得 ら れ な い 場 合，

２．つぼみの中の５本の雄しべをすべて取り除く．

RM OP/Spec 培地などに問題がないかを確認する．抗生３．他の個体から採取した花粉を雌しべに塗り付ける．

物質を含まない培地で野生株からの再分化が起こるかを

４．グラシン紙製の袋をかけ，開花後に受粉が起こらな

調べればよい．

いようにする．

葉緑体機能を損ねるような変異を導入することで植物

５．付け札に，どの組み合わせで交配を行ったかを記入
し，花に引っ掛けておく．
6.b.9.2 シード・アッセイ

が異常な表現型を示したり，また，組換えタンパク質の大量発現により〝弱い" 形質転換体が得られることがある．再分化した植物を良く観察し，異常な表現型の出マーカー遺伝子として aadA 遺伝子を用いた場合に現を見逃さないことが重要である（形質転換後，最初には，500μg/ml スペクチノマイシンを含む RM 培地上

出現した葉をよく見ると，緑と黄緑色の斑模様が観察でで，nptII を用いた場合には，200μg/ml カナマイシン

きることがある．
）．

（硫酸塩）を含む RM 培地上で発芽させる（表 5を参照）．

再分化培地上で長期間組織培養を続けると，予期せぬ抗生物質としてカナマイシンを用いる場合，種子の洗浄

変異が入ることで植物が異常な表現型を示すことがあに使用する滅菌水にあらかじめ 200μg/ml カナマイシ

るンを加えておく必要がある．カナマイシンを含む RM 寒よる表現型と混同する恐れがある．もし核ゲノムへの変天培地上で発芽した時，子葉がグリーンになることがあ異による異常な表現型であれば，野生株との交配を繰りるからである．ただし，カナマイシンに耐性を示さない返すことで，問題を解決できるかもしれない．

場合，本葉は形成されないため，形質転換体と野生株を．このようなことが起こると，目的の変異の導入に雄しべが短すぎて自家受粉ができない形質転換体が得区別することは可能である．

られることがある．このようになると花がぽろぽろと落6.b.9.3 自家受粉により得られた種子の場合

ち，種子が形成されない．この場合には，野生株の花粉

ホモプラストミックな形質転換体を自家受粉させた場を用いて葉緑体形質転換体と交配させることで，問題を合（タバコは基本的に自家受粉する），得られた種子から解決できることがある．また，ミトコンドリア DNA への

発芽した芽生えはすべて RM OP/Spec 寒天培地上でグ変異のために雄性不稔が起こる可能性がある

リーンになるはずである．白い個体があれば，葉緑体形などの種子植物ではミトコンドリアは葉緑体と同様に母質転換体はホモプラストミックではないということにな性遺伝するため，野生株との交配による正常化はできな

る．

い．葉緑体ゲノムへの変異による優性不稔の可能性も報

6.b.9.4 形質転換体（♀）と野生株（♂）の交配により告されており得られた種子の場合
被子植物の葉緑体は基本的に母性遺伝 す る た め，2009 低 温 科 学

vol.67．タバコ，このような変異が入った場合には，修正は不可能と思われる．このような問題が起こらないよ
うにするためには，一つの形質転換について複数の形質635

転換体を得て，それぞれを確実に評価することが重要でで紹介したプロトコールが光合成研究の発展に役立つもある．

のとなれば幸いである．
謝辞

6.b.11 おわりに

葉緑体ゲノム地図を提供していただいた名古屋市立大タバコ葉緑体形質転換法の確立から約 20年が経過し，学の湯川真希，杉浦昌弘両氏および愛知学院大学の續伯

これまでに基礎研究から応用研究まで非常に幅広く利用

彦氏に感謝いたします．また，遺伝子導入装置等の図をされてきた．しかしながら，被子植物の葉緑体形質転換

提供いただいた際にご協力いただきましたバイオ・ラッは非常に手間がかかり，また，容易に形質転換できる植ド・ラボラトリーズ社の平子俊行氏に厚く御礼申し上げ

物種が非常に限られているため，光合成研究にはまだそます．

れほど積極的に用いられていない．現状では，医学的，薬学的，工業的に有用な組換えタンパク質の生産や除草剤や害虫に抵抗性をもつ植物や代謝系を改変した植物を作出するなど応用分野で主に注目されている．
葉緑体形質転換法を用いた逆遺伝学的手法により，葉緑体遺伝子産物の機能が次々に明らかになってきたが，
ycf1，ycf2 などいまだに機能不明のものもあり，それらの解 明 は 今 後 の 課 題 で あ る．も し か す る と，非 コード
RNAなどの未知の遺伝子がまだ残っているかもしれない．また，クラミドモナスとは異なり，植物には分化した色素体が存在する．しかし，葉緑体以外の色素体でのプラスチド遺伝子の機能に関する研究はあまり進んでいない．葉緑体（色素体）形質転換法は，光合成研究を含めた葉緑体の研究だけでなく，他の色素体の研究にも利用できると思われる．これまでに作出された葉緑体遺伝子ノックアウト株やレポーター遺伝子を導入した形質転換がこの研究に用いられなかったのは非常に残念なことである．
葉緑体コードのサブユニットへ導入したタグを利用して超分子複合体をアフィニティー精製し，そこに新規のタンパク質やこれまでの方法で精製した標品には含まれていなかったサブユニットが確認された．このことは，このアプローチの有効性の高さを示すものである．
もし，複合体の単離精製の段階で失われたサブユニットがあるとすれば，その標品を用いた構造解析や活性測定に大きく影響を及ぼす可能性がある．今後，他の複合体

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て研究を進めることも必要になってくるであろう．本章

Shen, Z.H.Chen, & Z.M .Hu, Transgenic Res. 12

でも，より生体内での存在状態に近い形で精製するために同様のアプローチが用いられるかもしれない．
実のところ，葉緑体形質転換体の設計と作出は出発点に過ぎず，一定の結論を得るためには様々な手法による形質転換体の詳細な解析が行われなければならない．タ
バコ葉緑体形質転換法は決して難しい技術ではないが，高価な装置を必要とするため，実際に形質転換を行える

636

タバコ葉緑体形質転換法

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2009 低 温 科 学

vol.67639

５章 形質転換

７．アグロバクテリウム法によるイネの形質転換
増本 千都 ，宮尾光恵

イネはアグロバクテリウムの宿主でないため，イネへの遺伝子導入はエレクトロポレーションやパー
ティクルガン等の直接導入法が主流であった．近年アグロバクテリウムを介した間接導入法が適用され，未経験者でも容易にイネに遺伝子を導入できるようになった．

-mediated transformation of rice
Chisato Masumoto, Mitsue Miyao
Application of Agrobacterium-mediated gene transfer to rice transformation enabled us to produce transgenic
rice plants efficiently and easily.

ス法）で，遺伝子が導入されたカルスを薬剤（抗生物質）

7.1 原理と概要

耐性で選抜したのち，植物体を再分化させる．感染から従来イネへの遺伝子導入は，プロトプラストを用いた

約３ヶ月で形質転換イネが得られる．種子に直接アグロ

エレクトロポレーション法や PEG（ポリエチレングリ

バクテリウムを感染させカルス培養期間を短縮する方法

コール）法，カルスを用いたパーティクルガン法等，直（種子法）も報告されている ．

接導入法が中心であった．1994年にアグロバクテリウム（ Rhizobium

イネへの遺伝子導入効率が高いことから，アグロバク

radiobacter ；旧 称 Agrobacterium

テリウムの系統 EHA101 と EHA105 がもっともよく使

tumefaciens）を介したイネへの遺伝子導入法が開発されわれている．EHA105 は，カナマイシン耐性（Km ）のた ．本法では特殊な装置が不要で操作も簡単であり，かEHA101 からカナマイシン耐性遺伝子を除いた系統で，つ高効率で完全長の遺伝子をゲノムに導入できる．遺伝バイナリーベクター（Km ）が導入されたアグロバクテ子導入法と培地組成，また遺伝子導入用バイナリーベ

リウムをカナマイシン耐性で確実に選抜することができクターと選抜薬剤耐性マーカー遺伝子にも改良が重ねらる．選 抜 用 薬 剤 と し て は，ハ イ グ ロ マ イ シ ン

れ，現在では未経験者でも簡単に形質転換イネが作製で（hygromycin，Hm；原核型タンパク質合成阻害剤）
が汎

きるようになった．

用されている．しかし，ハイグロマイシンの場合は耐性

単子葉植物であるイネはアグロバクテリウムの宿主範

カルスの選抜が難しいことから，ビアラフォス（biala-

囲外である．アグロバクテリウムの宿主となる双子葉植，ALS（アセト乳酸脱phos；グルタミン合成酵素阻害剤）

物では，アグロバクテリウムが感染すると Ti プラスミ

水素酵素）阻害剤等，除草剤を選抜薬剤として用いる方

ドの Vir 領域を活性化するフェノール化合物（アセトシ

法 が 複 数 開 発 さ れ て い る．バ イ ナ リーベ ク ターは，

リンゴン，シナピン酸等）が合成され，Ti プラスミドか

pBI101 由来のベクターに薬剤耐性遺伝子（ハイグロマイ

ら T-DNA が切り出され，いくつかの過程を経て宿主のシン耐性遺伝子，hpt；ビアラフォス耐性遺伝子，bar 等）

核染色体 DNA に組み込まれる．イネはこれらのフェを 導 入 し た も の（例 え ば，pBI101Hm，pIG121Hm，

ノール化合物を合成しないためアグロバクテリウム法がが汎用されている．また，市販の pCAM BIA
pGPTVbar）

適用できなかったが，アグロバクテリウム感染時にアセシリーズも使用できる（pBI101 系ベクターに比べて大腸

トシリンゴンを添加することによって，アグロバクテリ

菌内での増幅コピー数が多い）．

ウムを介した遺伝子導入が可能になった ．現在用いられている一般的な方法は，再分化能が高い種子胚盤由来のカルスにアグロバクテリウムを感染させる方法（カル

以下にカルス法による遺伝子導入の概要を示す．
１．種子からのカルス誘導（3週間）
種子をオーキシン（2,4‑D）を含む培地で培養し，胚盤からカルスを誘導．

１) 農業生物資源研究所

光環境応答研究ユニット

２) 農業生物資源研究所

光環境応答研究ユニット

2009 低 温 科 学

vol.67

２．カルスの前培養（2,4‑D を含む培地；３日間）
アグロバクテリウム感染に先立ち，カルスの増殖能
641

を高める．
３．アグロバクテリウムの前培養（3日間）

7.2 イネへの遺伝子導入法

グリセロールストックからアグロバクテリウムを増殖．

アグロバクテリウム EHA 株，pBI 系あるいは pCAMBIA 系バイナリーベクター，選抜薬剤としてハイグロマ

４．カルスのアグロバクテリウム感染（3日間）
カルスにアグロバクテリウムを接種し，アセトシリ
ンゴン存在下で共存培養し感染させる．
５．アグロバクテリウムの除去と薬剤選抜（2週間×１または×２）

イシンとビアラフォスを用いたカルス法（文献

を若干

改変）
を紹介する．種子法に比べて時間がかかるものの，少ない種子から多数の形質転換イネが得られる．一般的な日本型イネ品種（日本晴，キタアケ，農林６号，農林８号：日本晴型）に用いられる培地組成と作製法を表

カルスをカルベニシリン（carbenicillin；グラム陰1‑3に示す．日本晴はカルス培養が容易な品種であり，性桿菌用抗生物質，アグロバクテリウム除菌用）溶液

50％以上の種子から増殖能の高いカルスが得られ，遺伝で洗浄し，アグロバクテリウムを除去．引き続き，カ子導入効率（最終的に得られる形質転換イネの個体数）

ルベニシリンと選抜薬剤を含むカルス増殖培地

はアグロバクテリウムを感染させたカルス数の 50％に

（2,4‑D を含む）でカルスを選抜．

達する．キタアケの場合は，日本晴に比べるとカルスの６．植物体の再分化（1‑2週間）

増殖が若干悪く，遺伝子導入効率は 10‑20％である．

オーキシン（ナフタレン酢酸；NAA），サイトカイ

コシヒカリ，あきたこまち，ひとめぼれはカルス培養

ニン（カイネチン），選抜薬剤，カルベニシリンを含むが困難な品種として知られている．これはカルスの亜硝培地で培養し，遺伝子が導入されたカルスから植物体

酸還元酵素活性が低いことが原因で，一般的な培養条件

を再分化．

では亜硝酸が蓄積し，カルスが褐変，壊死するためであ

７．根の伸長促進と再分化植物の育成（2‑3週間）
ホルモン（オーキシン，サイトカイニン）を含まなる ．これらの品種でも培地組成を改良することで遺伝子導入が可能になっている ．

い培地（選抜薬剤を含む）で根を伸長させ，植物体を大きくする．

アグロバクテリウムは 28℃，暗所で培養する．カルスと植物体は 28‑33℃，明所（30μmol photons m s ）８．再分化植物の土壌への移植で培養する．シャーレはガンマ線滅菌されたプラスチッ
クシャーレ（直径 9cm，深さ 20mm（アグロバクテリウ
ム用のみ深さ 15mm）)を用い，培地を入れたプレートはサージカルテープでシールする．2‑3日間室温で保存し，

表 1：抗生物質・ホルモンストック溶液の調製
試薬名・調製法

642

濃度

Carbenicillin
Hygromycin B
Bialaphos(明治製菓）
Kanamycin
すべて Milli Q 水（DW ）に溶解し，フィルター滅菌（0.22μm）．
1ml ずつ分注（Bialaphos は 200μl ずつ）．
−20℃保存．

200mg/ml
50mg/ml
25mg/ml
25mg/ml

2,4‑D(2, 4-dichlorophenoxyacetic acid)(Sigma)
0.04g を 10ml エタノール（99.5％）に溶解し，DW で 200mlにメスアップ．４℃保存．

0.2mg/ml

Acetosyringone(Aldorich）
DMSO で溶解．フィルター滅菌できないため，できるだけ無菌状態で調製．50μl ずつ分注，４℃遮光保存または−20℃保存．

100mg/ml

Kinetin
20mg を 5ml の 1N NaOH に 溶 解 し，DW で 100ml に メ ス
アップ．４℃保存．

200μg/ml

NAA(α-naphthaleneacetic acid）
10mg を 1ml の 1N NaOH に溶解．溶液 100μl を DW で 5
ml にメスアップ．４℃保存．

200μg/ml

イネの形質転換

表 2：植物用培地の調製
カルス誘導，共存培養，薬剤選抜用培地
N6D 培地（カルス誘導用，薬剤選抜用）
最終濃度

試薬名・ストック溶液名

再分化培地，発根用ホルモンフリー培地
再分化培地
1l

① 3％
30g
Sucrose② 300mg/l Casamino acids
300mg③ 25mM
2.9g
Proline④
１袋
Chu N6 basal salt mixture (Sigma)⑤
1ml
N6 Vitamin(×1000)⑥ 2mg/l10ml
2,4‑D(×100，0.2mg/ml）↓ 2N KOH で pH 5.8に調整し，１ l にメスアップ．
⑦ 0.4％
4g
Gelrite↓ オートクレーブ
選抜培地作製時は，約 60℃に冷ましたのち抗生物質を添加．
300mg/l Carbenicillin(200mg/ml）
1.5ml
50mg/l1ml
Hygromycin(50mg/ml）
または
5mg/l
200μl
Bialaphos(25mg/ml）

最終濃度

試薬名・ストック溶液名

1l

① 3％
30g
Sucrose② 3％
30g
Sorbitol③ 2g/l2g
Casamino acids④
1袋
M S Powder(Wako)⑤
1ml
M S Vitamin(×1000)⑥ 2μg/l
10μl
NAA(×10000，200μg/ml)⑦ 2mg/l
10ml
Kinetin(×100，200μg/ml)↓ 1N HCl で pH 5.8に調整し，1l にメスアップ．
⑧ 0.4％
4g
Gelrite↓ オートクレーブ
約 60℃に冷ましたのち抗生物質を添加．
100mg/l Carbenicillin(200mg/ml)
0.5ml
50mg/l1ml
Hygromycin(50mg/ml)
または
5mg/l
200μl
Bialaphos(25mg/ml)

50ml ずつ深型シャーレ (90×20mm）に分注．
50ml ずつ深型シャーレ（90×20mm）に分注．

ビアラフォス選抜の場合，カザミノ酸濃度は 200mg/l．
N6 Vitamin ス トック 溶 液（×1000）25ml，Glycine 50mg；
Nicotinic acid 12.5mg；Pyridoxine-HCl 12.5mg；Thiamine−20℃保存．
HCl 25mg；myo-Inositol 2.5g．

M S Vitamin ストック溶液（×1000）25ml，Glycine 50mg；
Nicotinic acid 12.5 mg ； Pyridoxine-HCl 12.5 mg ；−20℃保存．
Thiamine-HCl 2.5mg；myo-Inositol 2.5g．

2N6-AS 培地（共存培養用）

発根用ホルモンフリー培地

最終濃度

試薬名・ストック溶液名

1l

① 3％
30g
Sucrose② 300mg/l Casamino acids
300mg
③
1袋
Chu N6 basal salt mixture (SIGMA)④
1ml
N6 Vitamin(×1000）⑤ 2mg/l10ml
2,4‑D(×100，0.2mg/ml）↓ 2N KOH で pH 5.2に調整し，0.9l にメスアップ．
⑥ 0.4％
4g
Gelrite↓ オートクレーブ
約 60℃に冷ましたのち以下を添加．
⑦ 1％
10％(w/v)D-(＋)-Glucose
100ml(オートクレーブ滅菌)⑧ 10mg/l
100μl
Acetosyringone(100mg/ml)
50ml ずつ深型シャーレ（90×20mm）に分注．
10％(w/v）D-(＋)-Glucose 溶液：グルコースは溶けにくいので，
攪拌しながら粉末を添加し，溶解する．

最終濃度

試薬名・ストック溶液名

1l

①３％
30g
Sucrose②
1袋
M S powder（Wako）③
1ml
M S Vitamin（×1000）↓ 2N KOH で pH 5.8に調整し，1l にメスアップ．
↓ オートクレーブ
約 60℃に冷ましたのち抗生物質を添加．
50mg/l1ml
Hygromycin(50mg/ml）
または
5mg/l
200μl
Bialaphos(25mg/ml）
50ml ずつ深型シャーレ（90×20mm）に分注．

［準備］
種子（ ）約 150粒；小型 すり器（藤原製作所）；プ
ラスチックシャーレ；70％エタノール；次亜塩素酸ナト
リウム溶液（食品添加物用，有効塩素濃度約５％）；

カビ等が生えていないこと確認してから４℃で保存．

Tween 20；50ml ファルコンチューブ；滅菌水約 1l；

３ヶ月以上は保存しない．選抜に用いるハイグロマイシ

レシプロ型振盪機；オートクレーブ滅菌した濾紙（直径ン，ビアラフォス濃度はそれぞれ 50，5mg/l である（日7cm，数〜10枚）；オート ク レーブ 滅 菌 し た ピ ン セッ

本晴，キタアケの場合）．

ト；N6D プレート 10枚．サージカルテープ．

7.2.1 種子の選別，種子滅菌とカルス誘導［実験方法］

玄米を 2,4‑D を含むカルス誘導用プレート（N6D 培地）で培養し，胚盤からカルスを誘導・増殖させる．

１．よく充実した種子（ ）を選ぶ．黒ずんだり傷のある は使わない．小型 摺り器で 殻を取り除く．白色半透明の玄米 100‑150粒を選抜する．緑色あるいは黒ずんだ玄米はカビ等の混入の原因となるので除く．

2009 低 温 科 学

vol.67643

表 3：アグロバクテリウム用培地の調製
AB 培地（アグロバクテリウム培養用）
最終濃度

AAM 培地

試薬名・ストック溶液名

1l① 3g/l3g
K HPO② 1.3g/l
1.3g
NaH PO ･2H O③ 1g/l1g
NH Cl④ 0.15g/l
0.15g
KCl⑤ 10mg/l
10mg
CaCl ･2H O⑥ 2.5mg/l 25mg/ml FeSO ･7H O(用時調製) 100μl↓ 2N KOH で pH 7.2に調整し，0.9l にメスアップ．
↓ 300ml の三角フラスコに 180ml ずつ分注．
⑦ 1.5％
3g/180ml
Bacto agar
↓ オートクレーブ
約 60℃に冷ましたのち以下を添加．
⑧ 0.5％
5％(w/v)D-(＋)-Glucose
20ml(オートクレーブ滅菌)⑨ 1.2mM
1M M gSO ･7H O
240μl(オートクレーブ滅菌)⑩ 50mg/l
400μl
Kanamycin(25mg/ml）
ハイグロマイシン選抜の場合
50mg/l
200μl
Hygromycin(50mg/ml）
ビアラフォス選抜の場合，選抜薬剤は添加しない．

最終濃度

試薬名・ストック溶液名

1l① 0.3g/l
0.3g
L-Aspartic acid②
1ml
AA-1(×1000）③
1ml
AA-2(×1000）④
1ml
AA-3(×1000）⑤
1ml
Fe-EDTA(×1000）⑥
1ml
AA-5(×1000）
⑦
(
×1
0
0
0
）
1ml
AA-6 Vitamin⑧
10ml
AA-Sol(×100）⑨
20ml
AA-KCl(×50）⑩ 0.5g/l
0.5g
Casamino acids
6.85％
68.5g
Sucrose
0.9g/l
0.9g
L-Glutamine↓ 2N KOH で pH 5.2に調整し，0.9L にメスアップ．
↓オートクレーブ
室温に冷ましたのちグルコース溶液を添加．
3.6％
36％(w/v)D-(＋)-Glucose
100ml（オートクレーブ滅菌）
100ml 三角フラスコに 90ml ずつ分注し，４℃保存．
L-Aspartic acid は溶解しにくいので最初に加える．

約 20ml ずつ薄型シャーレ（90×15mm）に分注．
AAM 培地（アグロバクテリウム感染用）
ストック溶液の組成が浸かる程度に 70％エタノールを加え，30秒間手で軽く振盪したのち，70％エタノールを素早く捨てる．こ１．AA-1 ストック溶液（×1000)
100ml
次の順に溶解させる．KI 75mg；CoCl ･6H O 2.5
mg；
CuSO ･5H O 2.5mg；Na M oO ･2H O 25mg；
ZnSO･4H O 0.2g；M nSO ･6H O 1g．
２．AA-2 ストック溶液（×1000）
15g
CaCl ･2H O

100ml

３．AA-3 ストック溶液（×1000）
25g
MgSO ･7H O

100ml

４．Fe-EDTA ストック溶液（×1000）
4g
Fe-EDTA

100ml

５．AA-5 ストック溶液（×1000）
NaH PO ･2H O 15g

100ml

６．AA-Sol ストック溶液（×100）
1.77g
L-Arginine
75mg
Glycine

100ml

７．AA-KCl ストック溶液（×50）
15g
KCl

100ml

の操作で滅菌溶液を浸透しやすくする．
４．玄米を滅菌溶液に移し，150‑200rpm で 15分間振盪
する．
５．デカントで滅菌溶液を交換し，15分間振盪する．
以下はクリーンベンチ内で作業する．
６．チューブをデカントして滅菌溶液を捨て，新たに滅菌水 40ml を入れ玄米をすすぐ．この操作を 5‑6回繰
り返し，最後に洗浄水を捨てる．
７．プラスチックシャーレに滅菌濾紙を数枚入れ，その上に滅菌した玄米を広げ水を切る．
８．ピンセットで玄米を N6D プレートに置床する（プレート１枚あたり 10粒；プレート 10枚）
．この時，胚だけ培地から出るようにする．シャーレをサージカル
テープでシールする．

８．AA-6 Vitamin ストック溶液(×1000) 10ml
Nicotinic acid 10mg；Pyridoxine-HCl 10mg；
Thiamine-HCl 0.1g；myo-Inositol 1g．
AA-6 Vitamin は−20℃保存．それ以外は４℃保存．

９．30‑33℃で 21日間培養する（暗所，明所どちらでも構わない）．
培養開始後数日間は，カビや雑菌が発生していないか毎日チェックする（雑菌等が生えると種子のまわりが白濁する．プレートを光にかざすとわかりやすい）．雑菌等が生えた種子は取り除く．種子を除いて

２．滅菌溶液を作製する．50ml ファルコンチューブにも雑菌は残されたままなので，雑菌発生場所近傍の

次 亜 塩 素 酸 ナ ト リ ウ ム 溶 液 20ml，滅 菌 水 20ml，種子から増殖したカルスは使用しない．

Tween 20 を１滴入れる．チューブ２本を用時調製．

誘導されたカルスを培地に直接置き直すと，増殖が３．選抜した玄米 100‑150粒をシャーレに入れる．玄米
644

促進される．
イネの形質転換カルスの増殖が悪い場合（多くは褐色を呈する）は，培地のカザミノ酸（窒素源）濃度を上げると改善されることが多い．

7.2.4 アグロバクテリウムの接種と共存培養
カルスにアグロバクテリウムを接種したのち，３日間共存培養して感染させる．接種時のアグロバクテリウム
濃度が低い方が感染効率が高い．アグロバクテリウム懸7.2.2 カルスの前培養（感染３日前に開始）

濁液がかすかに濁るか濁らない程度で充分である．

増殖能の高いカルス選抜し，新しい N6D プレートに移植する．アグロバクテリウムを感染させるカルスの増［準備］

殖能が遺伝子導入効率に大きく影響する．胚盤上で増殖

50ml ファルコンチューブ；AAM 培地；アセトシリ

したカルスの塊より，塊からこぼれ落ちたカルスの方がンゴン溶液；2N6AS プレート１枚；滅菌した濾紙（直増殖能が高い．褐色がかったカルスは増殖能が低いので径 7cm）；ミクロスパーテル（滅菌済み）；駒込ピペット使用しない．カルスの増殖に問題がなければ，玄米１個（10ml，滅菌済み）；ステンレス製茶こし（滅菌済み）；ピから感染に使用できるカルスが 5‑20個取れる．

ンセット（滅菌済み）；プラスチックシャーレ．

［準備］［実験方法］

N6D プレート２枚；ピンセット（滅菌済み）；サージ

１．50ml ファルコンチューブに AAM 培地 40ml を入

カルテープ．

れ，アセトシリンゴン溶液（100mg/ml）を 4μl 加え［実験方法］

２．2N6AS プレート上に滅菌した濾紙をのせ，その上る（終濃度 10mg/l）．
１．直径約 2‑3mm の淡黄色で固いカルスを選び，ピンセットで新しい N6D プレートに置床する（プレート１枚あたり 200個，プレート２枚）．この時カルスをプ
レートに軽く押しつけるようにする．
２．30‑33℃，３日間培養する（暗所，明所どちらでも構わない）．

にステップ１のアセトシリンゴン入り AAM 培地を 1ml 注ぐ．
３．茶こしを空のプラスチックシャーレに置く．シャー
レの蓋に滅菌濾紙を 2‑3枚敷く．
４．前培養したアグロバクテリウムをミクロスパーテル
で き取り（ミクロスパーテルの 1/5程度，約 5μl；
図 1），ステップ１の AAM 培地（約 40ml）に懸濁す

7.2.3 アグロバクテリウムの前培養（感染３日前に開始）

る．懸濁液を駒込めピペットで 100回程度ピペッティ
ングしてアグロバクテリウムを分散させる．

バイナリーベクターを導入したアグロバクテリウムを増殖させる．ハイグロマイシン選抜の場合，カナマイシ
ンとハイグロマイシンを含む培地（AB 培地）で培養す
る．ビアラフォス選抜の場合，カナマイシンのみを含む培地を使用する．
［準備］；白金耳またAB プレート（カルス 400個あたり１枚）
は滅菌済みミクロスパーテル；サージカルテープ．
［実験方法］
１．アグロバクテリウムのグリセロールストックの表面
を白金耳またはミクロスパーテルで き取る．
２．AB プレートにアグロバクテリウムを塗布し，サージカルテープでシールする．
３．28℃，暗所で３日間培養する．30℃を越えるとアグ
ロバクテリウムからプラスミドが脱落しやすくなるので培養温度に注意する．
2009 低 温 科 学

vol.67

図 1：AB 培地で３日間培養したアグロバクテリウム．
コロニーが判別できる程度に増殖したところ（丸で囲んだ部分）の菌体をミクロスパーテルで き取り，アグロバクテリウ
ム感染用の AAM 培地 40ml に懸濁する．

645

５．プラスチックシャーレに置いた茶こし（ステップ３）に前培養したカルスを約 200個入れる（100‑200個）．

４．30‑33℃，14日間培養する（暗所，明所どちらでも構わない）．

この時，直径約 2mm の淡黄色の固いカルスを選ぶ．

除菌が不充分でアグロバクテリウムが増殖する場

６．カルスにアグロバクテリウム懸濁液（約 40ml）をか

合，カルスを滅菌水で５回，引き続きカルベニシリ

け，
茶こしを時々揺すりながら 90‑120秒間アグロバク

ン溶液で５回洗浄し直すと除菌できる．ただし，こテリウムを接種する．

の処理はアグロバクテリウムがコロニーを形成して７．シャーレの蓋に敷いたろ紙（ステップ３）の上に茶１日以内でないと効果はない．

こしを置き，アグロバクテリウム懸濁液を切る．

５．ビアラフォス選抜の場合は，選抜用 N6D プレート

８．2N6AS プレート上に敷いた濾紙（ステップ２）にカ上で増殖したカルスの一部を次の選抜培地（カルベニ

ルスを置床し（プレート１枚あたり約 200個），サージ

シリン濃度を 200mg/l に下げた選抜用 N6D プレー

カルテープでシールする．

ト）に移植し（プレート１枚あたり 16個），選抜を繰

９．28℃，暗所で３日間培養する．３日間培養するとア

り返す．

グロバクテリウムがカルスを覆うように増殖する．
7.2.6 植物体の再分化
7.2.5 アグロバクテリウムの除去（除菌）とカルスの
薬剤選抜

NAA，カイネチン，選抜薬剤を含む再分化培地（MS培地＋ビタミン類，ショ糖，ソルビトール，カザミノ酸）

アグロバクテリウムと共存培養したカルスをカルベニ

でカルスを培養し，植物体を再分化させる．再分化培地

シリン溶液（500mg/l）で洗浄したのち，カルベニシリにはカルベニシリン（200mg/l）も含まれるが，アグロン（300mg/l）と選抜薬剤を含む N6D 培地で培養し，薬バクテリウムの増殖が認められる場合，カルスを新しい剤耐性カルスを選抜する．２週間の薬剤選抜を２回繰り

プレートに移植し直す．

返すのが一般的であるが，ハイグロマイシン選抜の場合は耐性カルスと感受性カルスの区別がつきにくいため，２週間選抜培地で培養したのち，再分化を開始する．選［準備］
再分化用プレート；ピンセット（滅菌済み）．

抜培地での培養は除菌効果が高いため，最低１回は行う．
ビアラフォス選抜の場合は，２回（２週間×２）または［実験方法］

３回（２週間×２，7‑10日間×１）の培養で耐性カルス

１．再分化用プレートにカルスを移植する．プレートをが選抜できる（感受性カルスは増殖せず，褐変する）．

４区画に分け，１区画に同一カルス由来のカルス 5‑7個を置床する．

［準備］

薬剤選抜中に増殖するカルスは小さい塊を形成す

50ml ファルコンチューブ；滅菌水；カルベニシリン

る．これらの小さいカルス，あるいは薬剤選抜用プ

ストック溶液；選抜用 N6D プレート（選抜１回あたりレートに置床したカルスから形成した大きい塊の淡８枚）；ピンセット（滅菌済み）；サージカルテープ．

黄色の部分を置床する．
２．28‑30℃，明所で 7‑14日間培養する（最長１ヶ月）．

［実験方法］

早いものでは培養３日目からカルスにグリーンのス

１．滅菌水 40ml を入れた 50ml ファルコンチューブにポットが現れ，そこから植物体が再分化する．グリー

共存培養したカルス約 200個（100‑200個）を入れる．

ンスポットをもつカルスが増えたら，１区画あたり５蓋をしてチューブを数回反転させ，カルスを洗浄する．

個程度残し，残りは除去する．

この操作を５回繰り返す．

３．シュートが 1‑2cm に伸長したら，発根用ホルモン

２．同様に，500mg/l カルベニシリン溶液（滅菌水 40ml

フリー培地に移植する．再分化プレート上で根が伸長にカルベニシリンストック溶液を 100μl 添加）でカルする場合もある．その場合，シュートと根を切らない

スを３回洗浄する．ここまでの操作でカルスは直径約ように移植する．

3mm に膨潤する．

４．再分化しなかった場合，カルスを 100mg/l カルベニ

３．選抜用 N6D プレートに直径約 3mm のカルスを置

シリンを含む再分化プレートに移植し（プレート１枚床する（プレート１枚あたり 25個）
．カルスの破片はあたり 5‑10個），28‑30℃，明所で 7‑14日間培養する．

置床しない．
646

イネの形質転換

7.2.7 ホルモンフリー培地による根の伸長促進と土壌への移植

ずし水を張って，明所（10μmol photons m s 以
下；室内照明用蛍光灯程度の明るさ）に置き，植物体

シュートが 1‑2cm に伸びた再分化植物をホルモンをを３日間空気に順化させる．

含まない培地（ホルモンフリー培地；MS 培地＋ビタミ

４．流水あるいは水を張ったバットの中で培地を洗い落

ン類，ショ糖）に移植し，根を伸長させる．再分化植物としながら再分化植物を株分けし，土壌に移植する．

が充分に大きくなったら，空気（低湿度）に順化させた

この時，シュート１個を１個体とする．移植後５日間

のち，土壌に移植する（鉢上げ）．ホルモンフリー培地で程度は寒冷紗をかけ強光が当たらないようにする．

１ヶ月培養した個体も鉢上げする．

順化処理を行っても鉢上げ後枯死する場合があるので，同一カルス由来の再分化植物を 2‑3個体移植し，［準備］

新しい葉が展開したら間引きする．

発根用ホルモンフリープレート；ピンセット（滅菌済み）．

同一カルス由来であっても，株分けをせずに複数のシュートをまとめて移植するとキメラになる場合があるので，必ず株分けする．

［実験方法］
１．シュートが 1‑2cm に伸びた再分化植物をホルモン
フリープレートに移植する．通常単一のカルスから複参考文献

数の植物体が再分化するので，まず再分化プレート上

１) Y.Hiei,S.Ohta,T.Komari,& T.Kumashiro,Plant J.

で植物を株分けする（シュートと根をもつ苗に分け

6 (1994)P.271.
２) H.Rashid,S.Yokoi,K.Toriyama,& K.Hinata,Plant

る）．この時周囲のカルスをできるだけ除く．ホルモン
フリープレートに小さな穴をあけ，株分けした苗を埋め込むように移植する．培養にともなってアルビノになるケースもあるので，同一カルス由来の苗をプレー
ト１枚に 2‑3個体移植する．
２．28‑30℃，明所で 2‑3週間培養する（最長４週間）．
生育が悪い場合，新しいプレートに植え替える．
３．シャーレ一杯に植物体が成長したら（草丈７〜10，シャーレの蓋をはcm，根はプレートの底に展開する）

2009 低 温 科 学

vol.67

Cell Rep. 15 (1996)P.727.
３) S.Toki, Plant Mol. Biol. Rep. 15 (1997)P.16.
４) 駒嶺穆，野村港二，「生物化学実験法 41 植物細胞工学入門」，学会出版センター，1998，P.311．
５) 島本功，岡田清孝，「新版 モデル植物の実験プロトコー
ル ⎜ 遺伝的手法からゲノム解析まで」，秀潤社，2001，P.
93．
６) S.Toki, N.Hara, K.Ono, H.Onodera, A.Tagiri, S.
Oka, & H.Tanaka, Plant J. 47 (2006)P.969.
７) 小川泰一，化学と生物 38（2000）P.189．

647

５章 形質転換

８．光合成細菌 R hodobacter c ap s ulatus
における大量発現系と形質転換
藤田 祐一 ，野亦次郎

光合成細菌 Rhodobacter capsulatus は，遺伝子操作系が確立されており，さまざまなタンパク質の大量発現系として有望な系である．本節では，R. capsulatus の発現ベクター系と形質転換系，特定の遺伝子破壊株の単離方法について紹介する．

Transformation system of photosynthetic bacteria
Yuichi Fujita, Jiro Nomata
The purple nonsulfur bacterium Rhodobacter capsulatus provides a promising system for overexpression ofvarious proteins as an alternative system of E. coli. Here we describe transformation system of R. capsulatus
including overexpression vectors and targeted interposon mutagenesis.

8.1 光合成細菌 R hodobacter caps ula tus
における大量発現系と形質転換

遺伝子クラスターは，外界の酸素条件や光条件などにより精緻に制御されている ．特に，バクテリオクロロフィ
ル生合成系遺伝子 bch 群の同定は，その後の植物のクロ光合成細菌は，酸素を発生しない光合成を行う一群のロフィル生合成系の解明への道しるべとなった ．筆者

光合成生物である ．紅色非硫黄細菌 Rhodobacter cap-

らは，バクテリオクロロフィル生合成系のプロトクロロ

sulatus は，好気的環境では呼吸により，嫌気的環境では

フィリ ド 還 元 酵 素 の 生 化 学 的 解 析 の た め に，R.cap-

光合成により生育するなど，おかれた環境により多様な

sulatus を用いたタンパク質の大量発現系を確立してき生育モードを採って生育できる多彩な能力を備えた光合た成細菌である ．このため，1970年代から遺伝学的手法が比較的短く，高い細胞濃度まで培養できることから，光開発され，光合成，呼吸，窒素固定，水素生成など多様

合成関連タンパク質のみならず膜タンパク質を含むさまな生物現象の生化学的，分子生物学的研究に用いられてざまなタンパク質の大量発現系と して有望な系であきた．興味深いことに，光合成に関連した一群の遺伝子る ．本節では，R.capsulatus の発現ベクター系と形質転（集光性バクテリオクロロフィル結合タンパク質や反応

換系，
特定の遺伝子破壊株の単離方法について紹介する．

．R.capsulatus は，培養が容易であり，世代時間も中心タンパク質，バクテリオクロロフィルの生合成系，
カロテノイドの生合成など光合成に関わる一揃いの酵素の遺伝子）がクロモゾーム上の 46kb という限られた領域に密集し複数のオペロンを形成している．この光合成
表 1：R. capsulatus で用いられる抗生物質とその濃度
抗生物質

ストック溶液カナマイシン

10mg/ml

使用濃度(μg/ml)
10.0

スペクチノマイシン

10mg/ml

10.0

ゲンタマイシン

20mg/ml

0.5

ストレプトマイシン

50mg/ml0.5

リファンピシン

50mg/ml100

備考

SB1003 由来の株は Rif で，接合の際に含まれる E. coli の生育を阻害し，形質転換体の単離を容易にしている．

１) 名古屋大学大学院生命農学研究科；さきがけ・JST
２) 名古屋大学大学院生命農学研究科；日本学術振興会特別研究員

2009 低 温 科 学

vol.67649

8.2 R .c a p s u latus における大量発現
ベクター

は，E. coli との接合を利用する．
R.capsulatus への導入）
R.capsulatus に導入したいプラスミドを有するドナー
E.coli と接合を誘発するヘルパー E.coli および，プラ

R. capsulatus でのタンパク質大量発現のためのベク

スミドを導入したいレシピエント R.capsulatus というターと し て，筆 者 ら が 構 築 し 活 用 し て い る pJN3 と３者で行うことから triparental mating とよばれる方

pJNY を図 1に示す．これらのベクターは，多様な原核法である ．ドナー E.coli は，JM 105 などプラスミド構

生 物 に お い て 複 製 維 持 が 可 能 な 広 宿 主 域 ベ ク ター

築に使う E. coli であり，ヘルパー E.coli はヘルパープ

pBBR1-M CS2 から構築した．タンパク質の大量発現系

ラスミド pDPT51 をもつ XL1-Blue，DH5，C600 などがでは，どのようなプロモータを利用して目的タンパク質使われる．また，最終的な発現宿主となるレシピエントの発現を誘導するかが重要である．pJN3 と pJNY では

R.capsulatus は，puc プロモータが野生株よりもより強puc プロモータを利用している．puc プロモータは，光合く誘導される DB176 を使うが，当然，野生株やさまざま

成遺伝子クラスターにおいて集光性バクテリオクロロ

な変異株でも利用できる．

フィル結合タンパク質をコードする pucAB の発現を制

8.3.1 使用する菌株御しており，嫌気条件に応答して強く転写が誘導され１．遺伝子破壊用プラスミドを持つ E.coli JM105 など

る ．さらに，目的タンパク質をより簡便，迅速に精製す

２．ヘルパーE.coli XL1-Blue/pDPT51，DH5/pDPT51

るために，Ｎ末端にアフィニティタグが付加されるようなどな塩基配列が開始コドンの直後に挿入されている．pJN3

３．レシピエント R.capsulatus DB176 など

では His タグ（6xHN タグ）が，pJNY では Strep タグ

４．GTA 大量生産 株 R.capsulatus R121 など（後述；がＮ末端に付加されるように設計されている．クローニ

8.4参照）

ング部位は，pJN3 では KpnI，pJNY では BamHI-KpnI

8.3.2 R .c a ps ulatus 培養用培地と溶液である．薬剤耐性マーカーとして元のベクターが有してRCV 培地（1l）いたカナマイシン耐性に加えて，新たにスペクチノマイ

10％リンゴ酸（DL-malic acid）

40ml

シン耐性遺伝子を付加している．

10％（NH ) SO

10ml

0.64M KPO

15ml

150μg/ml D‑ビオチン

0.1ml

Super Salts solution

50ml

8.3 R .ca p s ula tu s における形質転換系
R.capsulatus の形質転換（構築した発現ベクターのPY 培地（1l）Peptone

図 1：R. capsulatus 発現用プラスミド pJN3 と pJNY
広宿主域ベクターとして開発された pBBR1-MCS2 のマルチクローニング部位に，スペクチノマイシン耐性カートリッジ，
puc プロモータ，開始コドンに続くアフィニティタグをコードする配列を挿入して構築した．pJN3 では KpnI をクローニ
ング部位，アフィニティタグとして His タグ（HN タグ）が，pJNY では BamHI と KpnI をクローニング部位，アフィニ
ティタグとして Strep タグが付加される．

650

3.0g

0.64M KPO （500ml）
20g
KH PO
30g
K HPO
Super Salts solution（500ml）
1％ EDTA
20ml
20％ MgSO ･7H O 10ml
7.5％ CaCl ･2H O 10ml
0.5％ FeSO
24ml
1g/l thiamine-HCl 1ml
10ml
Trace Elements
Trace Elements（200ml）
2.5g
Na EDTA
0.2g
M nCl ･4H O
0.1g
H BO
0.1g
Na M oO ･2H O
0.05g
ZnCl
0.05g
NiCl ･6H O
0.02g
CoCl ･6H O
0.01g
CuCl ･2H O
0.005gNa SeONaVO ･nH O(meta)0.005g

光合成細菌の形質転換系

3.0g

Yeast extract

行う．実体顕微鏡下で見ると，ソフト寒天中では E.coli

各培地ともに，寒天培地には agar 1.5％，重層用のソのコロニーが球状であるのに対し，R.capsulatus のコロ

フト寒天には 0.8％になるように BactoAgar（Difco）を

ニーは輪郭がはっきりとしたラグビーボールのような形添加してオートクレーブする．

なので容易に区別できる．後者のようなコロニーを，爪1x GTA バッファー

楊枝を用いてピックアップし，PY 寒天培地上でシング

10mM Tris-HCl；pH 7.8

ルコロニーを形成，単離する．

1mM M gCl
1mM CaCl
1mM NaCl
500μg/ml BSA

8.4 R .ca p s ulatu s における特定遺伝子破壊

8.3.3 器具装置

R.capsulatus における特定の遺伝子の破壊について

小型冷却遠心機も，前述した接合によって遺伝子破壊用のプラスミドにインキュベータ (R.capsulatus 用 34℃，E.coli 用 37℃）

よる形質転換でも原理的には可能である．しかし，遺伝

GasPak（R.capsulatus の光合成条件での培養用；BBL

子導入効率が低いため必ずしもうまくいかない場合があGasPak 100 anaerobic systems, Becton Dickinson

る．そこで，R.capsulatus では，GTA というファージ様

and Company, Sparks, MD；嫌気性細菌培養用の専粒子を利用した遺伝子破壊法が用いられる．GTA
（Gene

用容器）

Transfer Agent；GTA）とは，R.capsulatus に特有の8.3.4 実験操作

ファージ様粒子のことである ．GTA は，リファンピシ

まず，ドナーE.coli，ヘルパーE.coli および，レシピ

ン耐性をもつ株の培養液（0.45μm フィルター濾液）か

エント R.capsulatus（PY 培地）を一晩培養する．翌朝，らリファンピシン感受性株を耐性化する因子として発見

ドナー，ヘルパー両 E.coli の各培養液 500μl を SOC 液

された ．GTA は，ファージ様粒子で，ドナーとなる細体培地 5ml（抗生物質を加えないこと）に植え継ぎ，培胞のゲノム DNA からランダムに 4.5kb 断片を切出し養する．R.capsulatus の培養はそのまま継続する．２時

ビリオン粒子に取り込んで細胞外に出て，レシピエント

間後，ドナー，ヘルパー，レシピエントの三者を各 2mlとな る 細 胞 に 付 着 し て ビ リ オ ン 内 の DNA を 注 入 すずつボトルトップフィルター（0.22μm，cellulose ace-

る ．GTA は，ファージではなくレシピエント細胞を溶

tate membrane,CORNING など）上に吸引する（アス菌するような作用は示さないが，DNA 注入の結果，レシ

ピレータ使用）．
１分間吸引した後に滅菌したメスを用いピエント細胞のゲノムとの間で相同組換えが誘発されてフィルターメンブレンを切り取り，菌体が乗った面がる．ドナー細胞におけるランダムな DNA 断片の切り出上になるように PY 寒天培地（抗生物質を含まない）にしとパッケージングは，ゲノムと同様にプラスミドに対乗せ，暗所で 34℃にて保温する．５時間後，菌体が乗っしても行われることから，特定の遺伝子を薬剤耐性遺伝

たフィルターメンブレンをプレートから剥がし，50‑ml

子によって破壊した変異株を単離するための高効率な遺滅菌遠沈管（CORNING など）に移す．遠沈管に PY 液

伝子導入法として GTA が広く活用されている ．野生体培地を 2ml 入れ，ふたを閉めてよくボルテックスし

株は GTA を少量しか生産しないため，GTA の解析のたフィルターメンブレン上の菌体を培地に再懸濁する．そ

めに GTA を大量に生産する特別な変異株 Y262 が単離の後，フィルターメンブレンを取り除き，懸濁液の入っされた ．その後，この株を遺伝子操作に利用しやすくす

た遠沈管に PY ソフト寒天（リファンピシン 0.5mg/

るため，GTA 大量生産能に加えてカロテノイド生合成

ml，カナマイシン 5μg/ml，スペクチノマイシン 10μg/

系の変異 crtG121 をもつ株 R121（カロテノイド生 合 成

ml を含む）を 4ml 加え，素早く PY 寒天培地（抗生物質

系遺伝子 crtG の変異のため緑色のコロニーを形成すは必要に応じて含む）に移し，前後左右に傾けて均一にる）やリファンピシン耐性の CB1127 などが単離され，活なるように広げる．固まりやすいので素早く行う．重層用されている．

したソフト寒天が固化したら，暗所 34℃にて保温する．

8.4.1 破壊用プラスミドによるヘルパーE.c o liの通常３日後ソフト寒天中に 5000個以上のコロニーが生

形質転換

じるが，その中には目的とする形質転換体の他にドナー

ヘ ル パーE. coli（XL1-Blue/pDPT51 ま た は DH5/として用いた E. coli のコロニーも混ざっている．そこ

pDPT51 など）を遺伝子破壊用プラスミド（ターゲット

で，次は R.capsulatus のコロニーのみを選別し，単離をの遺伝子を薬 剤耐性カート リッジで 分 断 したプラ ス ミ

2009 低 温 科 学

vol.67651ド）により形質転換する．この形質転換は，塩化カルシ

ピエント細胞の懸濁液 100μl と上記の GTA 濾液 100

ウム法などの定法でも上述の接合による方法でも可能で

μl および 400μl の 1xGTA バッファーを混合（GTA はある（図 2A および Aʼ
）．ヘルパーE.coli の保持するヘガラス表面に吸着しやすいので，ガラス容器は使わずに

ルパープラスミド pDPT51 は，トリメトプリム耐性をも

プラスチック製の容器を用いる．
）し，35℃で１時間静置

つので，培養の際には 50μg/ml のトリメトプリム（ス

す る（図 2E）．こ の 混 合 液 を 2.5ml の ソ フ ト 寒 天

トック溶液 10mg/ml は DMSO に溶かす）を添加して（0.8％）PY 培地と混ぜて，PY 寒天培地上に重層し，34℃

おく．R.capsulatus の遺伝子破壊でよく用いられる薬剤で４時間培養する．その後，形質転換体を選抜するため耐性は，カナマイシン耐性，スペクチノマイシン耐性，にゲンタマイシン（6.7μg/ml）を含むソフト寒天 PY 培

ゲンタマイシン耐性などがある（表１）．ここでは，ゲン

地を重層（寒天培地全体に希釈されると 0.5μg/ml 程度

タマイシン耐性カートリッジを利用する場合を紹介すになる）し，34℃で培養する．この間に，GTA から導入る．

されたゲンタマイシン耐性遺伝子をもつ DNA 断片がレ

8.4.2 R 121株へのプラスミド導入

シピエント細胞に導入され，ゲノム上のターゲット遺伝

R.capsulatus R121 を RCV 培地にて光条件下 34℃で子の野生株コピーと相同的組み換えを起こし，破壊遺伝

ほぼ１日培養する．破壊用プラスミドをもつヘルパーE.

子コピーと入れ替わる（図 2F）．３から４日後，生じてcoli を終夜培養（LB 培地 50μg/ml トリメトプリムおよきたゲンタマイシン耐性のコロニーが目的とする遺伝子

び 10μg/ml ゲンタマイシン含有）する．ヘルパーE.coli
を集菌し，同体積の RCV 培地で洗浄し，再度同体積のRCV 培地に懸濁する．RCV 寒天培地（抗生物質は含まない）に R121 の懸濁液を 200μl ずつ何カ所かに分けてスポットする．それらのスポット上にさらにヘルパーE.
coli の懸濁液 200μl をスポットする．クリーンベンチな
どでしばらくシャーレのふたを開けてスポットを乾燥させた後，暗所 34℃にて５時間インキュベートする．この間に，R121 とヘルパーE.coli との間で接合が起こり，ヘルパーE.coli の保持する遺伝子破壊 用 プ ラ ス ミ ド が（図 2B）．次に，ゲンタマイシン
R121 細胞へと移動する
5μg/ml を含むソフト寒天（0.8％）RCV 培地 4ml を重層する．光合成条件（明所嫌気条件）にて３日程度培養する．
R121 特有の緑色のゲンタマイシン耐性コロニーが多数出現する．これが遺伝子破壊用プラスミドをもつ
R121（図 2C）であり，この株から GTA を調製する．
8.4.3 R 121から G TA 調製
ゲンタマイシン耐性 R121 を RCV 培地で一旦生育させて，1/20容の割合で PY 培地に植菌し，光条件にて34℃で培養する．細胞の増殖が静止期に達したところで（植菌後１日〜２日），2ml の培養液を 0.45μm フィルター（Sterile Ascodisc 0.45μm；Gelman Science な
ど）でろ過し，濾液を回収する（図 2D）．この濾液に GTAが大量に含まれている．濾液の 1/9容の 10xGTA バッ
ファーを添加し，数時間以内に使用する場合は氷上で保存，また長期保存する場合はこのまま−80℃で凍結する．
8.4.4 G TA による形質転換
レシピエントとなる R.capsulatus を PY 培地で培養する．この培養液 4ml を遠心により集菌し，細胞ペレッ
トを同体積の 1xGTA バッファーに懸濁する．このレシ
652

図 2：R. capsulatus における GTA を用いた特定遺伝子破壊
株の単離
破壊しようとするターゲット遺伝子を白いボックス，遺伝子破壊用の薬剤耐性カートリッジを黒いボックスで示した．E.
coli は角の丸い四角形で，R. capsulatus は楕円形で表した．
（詳細は本文参照）

光合成細菌の形質転換系

破壊株と考えられる（図 2G）ので，コロニーPCR など
により遺伝子破壊を確認する．

参考文献

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653

6章
バイオインフォマティクス

６章 バイオインフォマティクス

１．比較ゲノムによる光合成関連遺伝子の推定佐藤 直樹
真核光合成生物の光合成関連遺伝子はシアノバクテリアから細胞内共生によってもたらされたものが多く，これらは比較ゲノムによる知識発見の最適なターゲットである．ゲノムの比較を効率的に行うことにより，相同タンパク質遺伝子を的確に発見し，その機能解析を行う方法について述べる．

Comparative genomics of photosynthesis-related genes
Naoki SATO
A method of comparative genomics using all-against-all comparison is used to infer photosynthesis-related
protein-coding genes.

のもと，ゲノムをうまく比較しようという取り組みが始

1.1 はじめにまった．本項では，ゲノムを比較する情報的な手法につ酸素発生型光合成は，シアノバクテリアで成立し，細いて，簡単に紹介する．

胞内共生によって藻類・植物にもたらされた．今のところ，Paulinella など一部の例外を除いて，すべての色素体は単一の起源をもち，単一の一次共生に由来すると考え

1.2 比較ゲノムの基本的手法

られている．一方，二次共生，三次共生は複数回起こっ

コンピュータを用いた遺伝子データの解析は今ではごたと考えられている．このような大規模な遺伝子の流入

く当たり前のものになっているが，それでも「これはバは，遺伝子の水平伝達の著しい例であり，主要な光合成

イオインフォマティクスを用いてみつけました」などと関連遺伝子は基本的にこの水平伝達の産物と見ることがいう言葉が未だに横行している現実は嘆かわしい．結局できる．現在の藻類や植物の色素体には小型のゲノムがのところ，コンピュータを使おうが，いわゆるインフォ

含まれているが，そこにコードされる遺伝子は緑色系統

マティクスを使おうが，自分で何をやっているのかを把で 100足らず，紅色系統でも 200程度の数に過ぎない．

握していることが大切で，それは実験と何も変わらない．

シアノバクテリアのゲノムはもっとも小型のものでも約キットを使った実験と誰かが作ったソフトウェアを使っ

1.7M bp 程度あり，約 1700個程度の遺伝子を持っていたインフォマティクス，
どちらも本質を理解しなければ，る．従って，細胞内共生によって真核光合成生物にもた

ただ手を動かしているだけである．そこで，勘所をいくらされた遺伝子の多くは消滅したか細胞核に移行したとつか押さえておこう．(1)バイオインフォマティクスを考えられる．このように，色素体または葉緑体で働いて使っても，理にかなわないことはできない．(2)原理のないるタンパク質の総数は 2000個とも 3000個とも推定さいアルゴリズムは存在しない．(3)少しだけ「情報」を理れているが，その半数はシアノバクテリア起源で，その解しよう．

大部分が細胞核コードと考えられる．では残りの半数はいくら原理を理解するといっても「情報」とは何かと何かということだが，これらは進化の過程で真核起源のいう根本を理解しないでは無理である．
「情報は乱雑さのタンパク質が，遺伝子重複や二重ターゲティングなどに対数に比例し，符号を変えたもの」ということをおさえ

よって，色素体でも機能するようになったものと考えらていれば十分である．対数の底として２を使うと，情報れる．このように起源の異なるタンパク質が協力して色の単位は「ビット」になる．簡単にいえばエントロピー

素体を機能させているのが，真核光合成生物，特に被子と情報は符号が違うだけで同じものということができ植物の特徴である．こうした起源の異なるタンパク質をる．では遺伝情報とはなにか．よく転写因子の結合配列

見分けて手っ取り早く調べる手段はないか，という考えとして途中にたくさんＸを書いて，実質的に４塩基程度で決まるコンセンサス配列を出している発表をみること

１) 東京大学大学院総合文化研究科

2009 低 温 科 学

vol.67がある．どんなにＸを並べてもこれには情報はない．
従っ657

て，４塩基が持ちうる情報量は４の４乗の対数，つまり連続的な E 値のならびに従って表示されている．これでlog 2 ＝8ビットである．何のことはない，パソコンのは，どれが自分の捜したいホモログであるのかも容易にメモリの一番小さな単位程度でしかない．256通りの中はわからなくなってしまった．そこで，一つ便利なのが，から１つを選択する程度の情報量では，大きなゲノムの繰り返し検索をしてくれる PSI-BLAST などの新たな中から特定の遺伝子を選択するには少なすぎるというこツールである ．繰りかえすことで，曖昧な類似性の中かとになる．最近では誰でも使う BLAST 検索 ででてく

ら，確実なものを特にピックアップするようにできている E 値 というのがある．ウェブサーバーの画面ではる．それでも同じ生物や近縁生物の配列がいくつも連続

1.0e‑25などと書かれているので，自然対数の底を使っして出力されるという不便さは解消しない．

た指数かと思うかもしれないが，これはコンピュータの世界での表現法であって，中身は 1.0×10

これに対し，ゲノム配列が決められた生物のデータだのことであけを使って類似配列を見つければ，このような多数の候る．E 値というのは２つの配列が似ているときに，他人補に悩まされる問題はなくなる．調べたい生物に目的ののそら似で偶然似ている確率がこのくらいであるというホモログがあるかないかだけが明確にわかる．これがことを意味する．言い換えると，系統関係がないのに似

Gclust をはじめとする検索サーバーである．理研のている確率がこのくらい低いということである．だからSABRE（http://saber.epd.brc.riken.jp/SABRE0101.

系統関係がわかっているときにこの値で議論するのはおcgi），ペンシルベニア大の ChloroplastDB（http://chlo

かしいことになるのだが，実は E 値を計算するときにroplast.cbio.psu.edu/）なども類似の機能をもつ．これらは，類似関係の指標である p 値から極限分布の計算で求は BLAST で得られた情報を更に加工して検索配列とめるのである ．従って類似度の尺度として E 値を使っ類似の配列を予め計算しておき，ユーザーからの問い合ていても構わないことになる．いずれにしても情報量にわせに応じてデータを出力する．Gclust の特徴は，ゲノ変換するには対数をとるので，結局べき乗の値の大小でムが解読された何十種類の生物がコードすると推定され考えればよいことになる．
そのままの数として考えれば，るすべてのタンパク質配列について，全対全の BLAS-

10では，どちらもとても小さいだけである

TP 検索を行い，その結果をもとに，相同なタンパク質のが，情報量として考えれば，後者は前者の５倍の情報を

グループをまとめてあることである ．主な利用方法と持っていることになる．BLAST の理論では配列の長さして，相同タンパク質を手軽に集めて系統解析や配列比による補正が入っているので，配列の長さは関係ないは

較をすることと，特定の生物群を指定して，それらに共ずであるが，現実には，長い配列ほど E 値のべき乗の値

通に存在するタンパク質を検索することがある．日本語の絶対値が段違いに大きくなっている．まとめると，バで書かれたサーバーの詳しい使用方法は，サーバーのイオインフォマティクスといっているものは実質的にはトップページ（図 1；http://gclust.c.u-tokyo.ac.jp/）か

確率計算に尽きるということで，そこで観察されている

らダウンロードできる．類似タンパク質のクラスターと事象が偶然おきる確率がいかに低いかを客観的に記述すしては，NCBI で 作 ら れ た COG（Clusters of orth-

る手法ということができる．相同性など情報関係の基本

ologous groups of proteins：http://www.ncbi.nlm.nih.

事項は，私が担当している講義の講義録でも説明していgov/COG/）が有名であるが，14生物群のうちの３群以るので参照していただきたい（http://nsato4.c.u-tokyo.

上に保存されたタンパク質に番号をつけたもので，この．
ac.jp/old/Kougi/Tokuron.pdf）

定義から，光合成関連のタンパク質は基本的に含まれてと 10いない．未だに COG との相同性に基づいたタンパク質

1.3 G clus t を用いた系統解析の分類が行われているのをみることがあるが，本来，解析対象となる生物を含んだ生物群の総当たり解析を行わ

BLAST は便利であるし，NCBI（http://www.ncbi.

なければ正しいタンパク質の分類は難しいことに留意す

nlm.nih.gov/）などのサイトを使うと，ものの数十秒で答べきである．こうした点で，植物関連分野では，既存のえが返ってくるという信じられないような優れものであ

相同タンパク質データベースが必ずしも役に立たないこる．しかし，世界中で爆発的に増え続けている遺伝子情とも多い．

報の蓄積の結果，検索によってでてくるものもまた膨大

まず，相同タンパク質配列を検索し，それを用いて系となり，手っ取り早く自分が知りたいホモログ探しがで統樹を作成する方法を説明する．従来は，NCBI などのきなくなってしまった．そこには明らかに同一とわかる

BLAST 検索サイトで得られた相同タンパク質のリスト

配列がトップにでてくる以外，さまざまな生物の配列がの中から，好きなものを選んで配列をダウンロードして，

658

比較ゲノム

図 1：Gclust サーバーのトップ画面
現在のバージョンでは，PPDB へのリンクも表示している．
通常のサーチは Select Dataset から始める．古いバージョンのデータセットは，Old versions から選択する．データ全体
もダウンロード可能で，展開後，
PERL などを利用して処理すればよい．データセットを作るのに用いた具体的なゲノムについては，Version historyにある．日本語のマニュアルは黄
色い画面の下の方のリンクを使って取得できる．

図 2：Gclust サーバーに お け る ALL95 4 データ セット のサーチメニュー画面
大きな画面なので，スクロールして下の方を見せているため，
一番上にある Search M enu という文字は隠れている．キー
ワードによるサーチの他，生物群特異的なタンパク質遺伝子のサーチのため，生物種のリストと生物群の定義が示されている．

PCC6803 であれば同様に， slr1234 のようにする．
ClustalX (http://bips.u-strasbg.fr/fr/Documenta

上 か 下 の 端 に あ る submit ボ タ ン を 押 す と，tion/ClustalX/）などを使ってアラインメントや系統樹

Search Results が表示され，さまざまなタンパク質を作っていたのではないだろうか．Gclust では，保存性グループの一覧表が出てくる．たいていは１つだけの高いタンパク質では厳しい閾値を，保存性の低いタンが表示されるので，Cluster number をクリックする

パク質では緩い閾値を設けることによって，選んだ生物と，相同タンパク質の一覧（図 3に例を示す）が出

群のそれぞれから相同タンパク質がひととおり出てくるてくる．

ようにしている．よく似たパラログがある場合にはそれ(b) アノテーション：一 番 上 の Annotations と い うらも含まれるので，普通の意味でのオルソログだけでは欄で，左のラジオボタンをクリックした上で，右のない．Gclust サーバーを使った相同タンパク質群の検索欄に「DNA polymerase」など，タンパク質を表すについて，以下に簡単に説明する．

言葉を入れる．上か下の端にある submit ボタンを

(1) まず，Gclust のトップページ（図 1）にアクセスし，
左のメニューから Select Dataset を選ぶ．Start hereとハイライトしたボタンである．
(2) ALL95 4 の左のラジオボタンをクリックすると，（図 2）．いろいろな検Search M enu の一覧が出てくる索の仕方を選ぶことができる．
(3) 次の３通りの方法のどれかで検索の元になる配列を入力する．
(a) 配列名：シロイヌナズナまたはシアノバクテリ
アの遺伝子名（Locus tag など）がわかっている場
合，下の方の Sequence ID という項目のラジオボタンを押し（２とは異なり，押しただけでは先に進まない），
右側の記入欄に遺伝子名を記入する．
その際，シロイヌナズナなら AGI コード（半角大文字）を使い，その前後を半角（英文字）のアステリスクではさむ．例： AT1G12340 ．
シ ア ノ バ ク テ リ ア の 場 合，Synechocystis sp.
2009 低 温 科 学

vol.67

図 3：Gclust サーバーにおける相同タンパク質グループの表示
サーバーでは Cluster と表現している．配列数が多いときには，このような類似度マトリクスではなく，単なるリストとして表示される．

659

押す．Search Results が表示され，さまざまなタン

そうでない場合には０が，それぞれ表示される．対角

パク質グループの一覧表が出てくる．たくさんの相線（同じ配列同士）であっても０が書かれていること

同タンパク質を集めたものがそれぞれのグループがあるが，これは短い配列の場合に起こりうるので，

で，Cluster number が割り当てられ，それぞれ１行

エラーではない．

で表示されている．目的のものと関連すると思われ(5) 前項で表示された配列が，検索配列の類似配列である Cluster number をクリックすれば相同タンパクる．しかし，期待したものがない場合もある．これは質の一覧表が表示される．

配列をクラスター化する際に，できるだけよく似たも注意点として，Gclust サーバーで利用した元ののだけでまとめているため，少し異なるパラログや長データベースが作られたあとで決められたアノテー

さの異なる配列，ドメインが余分にある配列などが排ションや遺伝子名はキーワードとして使えない．い除されるためである．下の方に Related groups という

まはシロイヌナズナならば基本的にすべてのタンパ

ボタンが表示されていれば，こうした排除された配列

ク質配列に AGI コードがあるが，機能がわかると新があることがわかり，このボタンをクリックすると，たに遺伝子名がつけられ，中にはあえて AGI コード

それらのリストが表示される．

を書かない論文もある．こうしたタンパク質の相同(6) 相同配列を集めて系統解析をする場合，配列数が少性を調べたい場合，新たにつけられた遺伝子名や酵なければ，下の方の ClustalW というボタンを押すと，

素名ではなく，NCBI などのデータベースから別途

アラインメントが表示される．また，その画面で，上取得した配列を利用して，（c）に従って検索すれば，の 方 の コーヒーカップ の 絵 を ク リック す る と，

本来の AGI コードがわかり，相同タンパク質もすぐJalview が起動し，色つきのアラインメントと簡易系にわかる．

統樹が表示される．配列や種名を選択すると，さまざ(c) 配列名のわからないアミノ酸配列または DNA 配

まにハイライトを変えることができる．

列があるときや，Gclust データベースには含まれて(7) 配列数が多いときには，ClustalW はできない旨のいない生物の配列を使って，それと似た配列が含ま表示がでる．この場合には，先の配列リストの表示のれるクラスターを探すことができる．
そのためには，下の方にある Get All Sequences というボタンをク

Search Menu の画面で上の方にある BLAST とい

リックする．これで，クラスター内のすべての配列がうボタンをクリックする．そうすると，BLAST 検索

FASTA 形式で表示されるので，テキストファイルとの画面に変わる．ここで，手持ちの配列をペーストして保存すればよい．保存した配列をもとに，手元のし，左上の Program の選択を行う．いまペーストしマシンを使って ClustalX によりアラインメントをた配列がタンパク質配列なら blastp，DNA 配列な作成し，さらにさまざまなソフトを使って系統解析をら blastx を選ぶ．多くの場合，その他の設定は既定することができる．ただし注意すべき点がある．それのままでよい．Run BLAST のボタンを押し，しばは配列名がかなり長いため，ソフトによっては配列名

らくすると類似配列のリストがでてくる．
その中で，を途中で切り捨ててしまうことで，その場合，同じ名

上位の配列名をクリックすると，その配列を含むク

前の配列が複数できるため，その先の処理に支障がでラスター名が表示され，さらに Cluster number をることがある．たとえば，Phylip パッケージ (http://

クリックするとそのクラスターに含まれる相同タン

evolution.genetics.washington.edu/phylip.html）やパク質の一覧表が表示される．

MAFFT (http://align.bmr.kyushu-u.ac.jp/mafft/(4) 相同タンパク質の一覧表では，メンバー数が多いク

software/）などの場合，それぞれ 10文字，15文字でラスターの場合，配列名，アミノ酸残基数，元のデー

切り捨てている．私自身は，長い配列名に対応するよタベースにおけるアノテーションの３つが表示されうに，これらの解析ソフトのソースコードを書き換える．このうち，元のデータベースのアノテーションはて対処している．TreeFinder (http://www.treefin

必ずしも正しくないことがあるので，これを見ておか，MEGA (http://www.megasoftware.net/）
der.de/）

しいと思う必要はない．個々の配列は Sequence ID をなどは，配列長に関しての問題はない．しかし，Gclust

クリックすると表示される．
配列数が少ない場合には，で用いている配列名（ゲノム名と配列の番号の組み合相互の類似度を示すマトリクスが表示される（図 3）．

わせ）で，さらに既知の遺伝子名をイコール記号で付この場合，一番上に表示された E 値を基準としてそれ加している場合には，これが災いすることがある．まよりも低い場合（よりよく似ている場合）には１が，た，イネなどの場合，元のデータベースに同一配列名

660

比較ゲノム

の異なる配列が含まれていたため，Gclust に取り込む
際に，それらを区別するため，配列名の末尾に＠0，＠1などの文字を加えてある．これらイコール記号やアットマークは，ソフトによってはエラーの原因となる．
その時は，テキストエディタソフトを使って無害な文
字（アンダーバーなど）に一括変換する必要がある．
系統解析の詳細はここでのテーマではないので，この程度にとどめておく．

1.4 G clus t を用いた系統特異的遺伝子の検索
Gclust がもつ本来の特色は，系統特異的に存在する遺伝子（タンパク質）の検索である．たとえばシアノバク
テリアだけに保存されたタンパク質であるとか，シアノ
バクテリアと植物・藻類に共通なタンパク質とかを素早く発見するのである．それには 1.3(2)で表示されたメ
ニュー（図 2）のうちで，Organism Group を選択するラジオボタンを押す．ここで Plants と Cyano を yes，その他を no として submit を押せば，植物・藻類とシアノバ
クテリアに共通でその他の生物にはないタンパク質グ

図 4：CZ36 データセットに基づく光合成生物の間の相同タ
ンパク質共有関係
このデータセットには，14種のシアノバクテリア，５種の光合成細菌，７種の色素体含有真核生物のほか，４種の非光合成細菌と４種の非光合成真核生物，２種の古細菌が含まれている．シアノバクテリアの過半数にあるクラスターが真核光合成生物にどのように共有されているかを示している．ここでは，シロイヌナズナ（緑または上段）とシアニジオシゾン（赤または下段）がもつ遺伝子数をそれぞれ示している．CZ36
データ セット は Gclust サーバーの Old versions の 中 の2007‑06にある．

ループが表示される．実際にやってみると 167グループが表示される．意外と少ない．リストの中には，それぞ

中央上の部分で，シロイヌナズナで 408個の遺伝子が含れの生物群の中でそのタンパク質グループを含む生物種

まれる．中央の丸はすべての生物に共通のクラスターを数が表示されている．ここで不思議に思うかもしれない

示し，
そこに含まれるシロイヌナズナの遺伝子は 1134個のは選択していないはずの生物群でも，数が０になってである．単細胞性紅藻シアニジオシゾンではだいぶ数がいないことである．これは，検索において各生物群を構少ない．

成する生物種の過半数に当該タンパク質グループが含ま

Gclust では生物種を基準としているので，核ゲノムだれるかどうかによって判別しているためである．その理

けでなく葉緑体やミトコンドリアゲノムに含まれるタン

由は，「存在しない」ということが必ずしも絶対的ではな

パク質遺伝子も同等に扱われており，ある生物で葉緑体いからで，そもそもの原因は元のデータベースにおいてコードの遺伝子のホモログが他の生物では核コードであ

そのタンパク質が認識されているかどうかにかかっているというような事態も簡単に確認することができる．

るためである．この過半数基準をユーザーが変えること
は，このサーバー上ではできない．しかし，元のデータを使えば容易にできるので，その場合には，相談していただきたい．サーバー上の元データや，検索作業をする

1.5 G clus t と P P D B の連携によるホモログにまたがるプロモータの検索ためのソフトウェア は Gclust のウェブサイトで公開

こうしてホモログを集めると，プロモータも似ている

し て い る の で，自 前 の UNIX マ シ ン（Linux ま た はのかということが気になる．Plant Promoter Databaseがあれば容易にできる．ちなみに今の 167個
M acOS X）（PPDB) を使うと，Gclust によって作られた相同タンのグループを見てみると，光化学系に関わる遺伝子名がパク質クラスターに含まれるシロイヌナズナ，イネ，ヒ

目立つことがわかる．つまり，主だった光化学系タンパ

メツリガネゴケの３種の生物の遺伝子の 5ʼ
上流領域のク質は既に見つかっているということになる．

比較ができる．Gclust の各クラスターとの間での直接の図 4には，少し前の CZ36 データセットを使って得ら

リ ン ク は 今 の と こ ろ な い が，PPDB の トップ ページ

れた光合成生物の間での相同タンパク質クラスターの共（http://ppdb.gene.nagoya-u.ac.jp/）で Homolog Gene

有関係が示されている．
光合成生物共通のタンパク質は，

Search という項目に AGI コードなどを入れることで，2009 低 温 科 学

vol.67661

直ちにホモログのリストが表示され，その中から選択したものについて，プロモータ領域に見られるモチーフがグラフィカルに表示される（図 5）．３種のうちのどの遺伝子から検索してもそれを含む相同クラスタがでてくる．これだけ異なる植物の間なので，プロモータはあまり似ていないだろうと思われるかもしれないが，いろいろな例を試してみると，案外よく似たパターンがでてくるので，試してみるとよい．

1.6 おわりに
比較ゲノムは実際のところまだまだ開発途上にあり，どういう観点で何を比べるかということは知恵とセンスの問題であろう．ここで述べたのは，著者らが考える比
較ゲノムの一例に過ぎない．光合成研究はもともと比較
生物学的な観点があり，光化学系を解析するためには，

図 5：PPDB による比較プロモータ解析の画面の例
シロイヌナズナ，イネ，ヒメツリガネゴケの相同遺伝子の上流部に含まれるモチーフが色分けして示されている．いくつかは確かに共通したモチーフをもつように見える．

植物もシアノバクテリアもともに活用してきた．これをゲノムのレベルでもやってみるというのはごく自然なことである．私たちも新しい光合成関連遺伝子の探索を進めていて，その成果の一部を最近発表しました ．またシ

４) N. Sato, Bioinformatics（オンライン版）doi: 10.1093/
bioinformatics/btp047
５) J.D.Thompson, T.J.Gibson, F.Plewniak, F.Jean-

方々が新たなチャレンジを試みることに期待したい．

mougin,& D.G.Higgins,Nucleic Acids Res.24 (1997)p.
4876.
６) J.Felsenstein, Cladistics 5 (1989)p.164.
７) T.Katoh, Brief. Bioinform. 9 (2008)p.286.

参考文献

８) G.,Jobb, A.von Haeseler & K.Strimmer, BM C Evol.
Biol. 4 (2004) 論文番号 18.（ページではない）
９) S.Kumar, J.Dudley, M.Nei & K.Tamura Brief.

ア ノ バ ク テ リ ア を 中 心 と し た CyanoClust（http://
cyanoclust.c.u-tokyo.ac.jp/）も公開した．これを読んだ

１) S.F.Altschul, T.L.M adden, A.A.Schaffer, J.Zhang,
Z.Zhang, W.M iller, & D.J.Lipman, Nucleic Acids Res.
25 (1997)p.3389.
２) S.Karlin,& S.F.Altschul,Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87 (1990)p.2264.
３) N.Sato, M ,Ishikawa, M.Fujiwara & K.Sonoike,

Bioinform. 9 (2008)p.299.
10) Y.Y.Yamamoto & J.Obokata, Nucleic Acids Res.36(2008)p.D977.
11) M .Ishikawa, M .Fujiwara, K.Sonoike & N.Sato,
Plant Cell Physiol.（オンライン版）doi:10.1093/pcp/
pcp027.

Genome Inform. 16 (2005)p.56.

662

比較ゲノム

６章 バイオインフォマティクス

２．発現プロファイルの利用
遠藤

剛 ，高林

厚史

高等植物，とりわけシロイヌナズナにおいて，公開マイクロアレイデータの蓄積が進み，最近ではそれらデータを光合成研究に取り入れる動きも出てきている．本稿ではそれらマイクロアレイデータの光合成研究への利用について概説する．

Application of public microarray data to a photosynthesis study
Tsuyoshi Endo, Atsushi Takabayashi
Recently,a lot ofmicroarraydata is available in the public repositories recently. Here,we brieflyintroduce you
to how to use it and give you examples of how it is used in photosynthesis studies.

光合成においてモデル植物として用いられてきたのンパク質を同定したとの論文も報告されている（2.3参は，エンドウやホウレンソウなど， ) 入手や栽培が容照）．そこで本稿では，光合成研究者を対象とし，公開マ

易， ) 無傷葉緑体の単離が容易， ) サイズが大きい，

イクロアレイデータの利用法について概説する．

等の条件を充たした植物であった．これは光合成研究の手法として主に物理化学的な測定や生化学的な解析が用2.1章では，実際に公開マイクロアレイデータを用い

いられてきた事が大きな理由であると考えられる．そのて解析するために必要な３つのステップ，すなわち， )後，形質転換が容易なタバコも光合成研究の材料として公開マイクロアレイデータの取得， ) データの前処理，用いられるようになってきたが，状況が一変したのは) 遺伝子発現解析，について概説する（図 1）．

2000年に高等植物として初めてシロイヌナズナの全ゲノムが解読されてからである．それ以来，光合成研究の2.2章では，すでに解析済みの遺伝子発現データを公モデル植物としてシロイヌナズナを選択し，その充実し開しているデータベースを利用する事で，自ら解析するた変異株リソースを用いた逆遺伝学的に解析するアプ

事なしで，公開マイクロアレイデータを利用する方法にローチが盛んに行われるようになってきた．さらに，マついて紹介する．

イクロアレイの発現データなど膨大なゲノムリソースが大量に公開されていることもシロイヌナズナを用いる利点と言えよう．
とりわけ光合成研究者にとって興味深い点は，核ゲノ
ムコードの光合成遺伝子群は転写レベルで共発現（coexpressed）する傾向が見られる事である．これは他の代謝経路と比べて例外的なレベルといえ，光合成遺伝子群の発現調節を考える上でも大きな特徴であると共に，使い方しだいでは新規光合成遺伝子の同定につながる大変
有益な情報である．実際，近年になって，蓄積された公開マイクロアレイデータを利用して，新規光合成関連タ１) 京都大学大学院生命科学研究科
２) 名古屋大学遺伝子実験施設（日本学術振興会特別研究員 PD）
2009 低 温 科 学

図 1：新規 NDH 遺伝子候補の発現ネットワーク（r＞0.85)

vol.67663

2.3章では，実際に公開マイクロアレイデータを光合成研究に利用する際の参考に，筆者らの研究を含め，実（Nottingham Arabidopsis Stock Centre Transcriptomics Service) がよく用いられている．

際の研究例を紹介する．
シロイヌナズナの公開マイクロアレイデータとして広2.1 公開マイクロアレイデータを用いた遺伝子発現解析についてく用いられているのが，AtGenExpress プロジェクトによって作成・公開されたデータセットである．AtGenExpress はシロイヌナズナの遺伝子発現データを網羅的に

様々な生物種においてゲノム情報が充実してきた今日収集するための国際的なプロジェクトで日本の理化学研

では，ポストゲノム時代に向けてゲノムワイドな解析が究所も中核的な役割を担った．このプロジェクトでは広く行われるようになってきた．中でも良く用いられてAffymetrix の GeneChip である ATH1 アレイが用いらいるのが DNA マイクロアレイを用いた包括的な遺伝子れており，２万以上のシロイヌナズナ遺伝子の発現を解発現解析（トランスクリプトーム解析）である．DNA マ

析する事が可能になっている．AtGenExpress のデータ

イクロアレイは発現解析のみならず，ChIP-on-chip，は，TAIR もしくは NASC から入手可能である．また，

SNP 解析等，非常に幅広く用いられているが，ここではNASC は現在でも Affymetrix の GeneChip を用いたシ発現解析に絞って簡単に紹介したい．

ロイヌナズナの解析データを精力的に集積・提供し続けており，これら（AtGenExpress 以外の）NASCArray

DNA マイクロアレイは２種類のタイプに大別されデータもよく用いられている．なお，現段階では，Af-る．Stanford 大 学 の Pat Brown ら の 研 究 グ ループ に

fymetrix 社以外の製品を用いたデータはほとんど登録

よって 開 発 さ れ た cDNA ス ポット ア レ イ と，Af-されていない．

fymetrix 社によって開発されたオリゴヌクレオチドア
レイ である．後者は一枚のアレイで発現が検出できる登録されたマイクロアレイデータを利用するときに遺伝子数が多く，また，ターゲット配列に対して完全には，多くの場合バックグラウンド補正，および正規化等

相補的な PerfectMatch（PM ）プローブと中央の一塩基の前処理を行う必要があり，そのあとで発現解析を行うのみをミスマッチさせた MissMatch（M M ）プローブを事になる．これらデータ解析のための商用ソフトとして比較する事で非特異的なハイブリダイゼーションの影響は GeneSpring や Spotfire 等が知られているが，フリーを排除できる事から，現在では主流となっている．ただの Bioconductor（http://www.bioconductor.org/）もよ

し，一昔前に比べれば安価にマイクロアレイを利用できく用いられるようになった．最近では Bioconductor にるようになってきたとはいえ，気軽に実験できる価格とついての日本語ドキュメントも多くなってきたため，解は言えないため，筆者らの研究グループでは公開マイク

析は容易になってきたと言える．

ロアレイデータを自分の研究目的のために利用させて頂2.1.2 前処理

いている．
2.1.1 公開マイクロアレイデータの利用法

マイクロアレイデータを用いて発現解析を行う際には，バックグラウンド補正や正規化などの前処理が必要

多くのジャーナルでは，マイクロアレイを用いた大規となる．バックグランド補正はスポットのバックグラン

模発現解析のデータを投稿するにあたって，M GED (Mi-ドの蛍光強度の影響を考慮し真のシグナル強度を検出す

croarray Gene Expression Data) Societyが作成したるために必要であり，また正規化はデータの偏りを補正

M IAME（minimal information. about a microarray

する事で，複数のマイクロアレイデータを相互に比較しexperiment: http://www.mged.org/Workgroups/

定量的な検討を行うために必要な作業である．

M IAME/miame.html）ガイドラインに従い情報公開をする事が必要とされている．公開されたマイクロアレイ

前処理のためのアルゴリズムとしては，RMA(Robust

データの公的 レ ポ ジ ト リ と し て は ア メ リ カ NCBI の，M AS5(Microarray Analysis
Multi-array Analysis），欧 州 EMBL のGEO（Gene Expression Omnibus），dChip(DNA-Chip Analyzer）などの数々の手法
Suite）

ArrayExpress 等が利用さられており，それらレポジトが知られており，それらは Bioconductor 等の解析ソフ

リにアクセスする事で登録されているマイクロアレイ

トを用いる事で容易に試す事ができる．なお，どのアルデータを入手する事が可能である．シロイヌナズナの公

ゴリズムを用いるか判断に迷った場合には，解析結果を

開 ア レ イ データ に 関 し て 言 え ば， NASCArrays

比較した論文664

が有益と思われる．いずれにせよ処理す
公開マイクロアレイデータの利用法

るアレイの枚数が多くなれば，実行にはその分だけ多く知識が要求される場面が少なくない．この障壁を乗り越のメモリと時間を必要となるため，本格的な解析には相えるためには，それ相応の時間が必要であり，その時間

応のマシンパワーが必要になる．

が取れない人は少なくないと思われる．しかし，最近の2.1.3 遺伝子発現解析

データベースの充実により，公開データベースの利用にマイクロアレイの一般的な使用法としては，まず興味のある遺伝子についての時系列や組織別の発現変動，ス

より自ら解析せずとも典型的なデータ解析の多くは達成できるようになってきた．

トレス応答など，ある実験条件で発現が有意に増減する遺伝子群を選抜する事が考えられる．これらの解析に関典型的なデータベースでは，AtGenExpress 等のデー

しては，例えば Bioconductor を用いる事で比較的容易

タセットを用いて図 1のような手順を踏んで大規模なに対応できる．

データ解析を行い，解析済みの遺伝子発現データを公開

一方で，様々な実験条件で同じような発現プロファイ

している．とりわけ，シロイヌナズナに関しては個性的ルを示す遺伝子群は機能的に関連している可能性が高いなデータベースが次々と公開されているため，自分の目と考えられるため，それを利用した未知遺伝子のアノ的に応じて使い分ける事が重要と思われる．

テーションも試みられている．その試みの１つがクラスタリングであり，遺伝子群を発現プロファイルの類似性

例えば，ある特定のシロイヌナズナの遺伝子の発現プを指標にしてクラスタに分け，それらのクラスタ内の遺ロファイルを調べたいのであれば，eFP Browser (http:

伝子は機能的に関連していると考える解析手法であ//www.bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi）やる ．具体的なクラスタリングの手法としては，階層的なGenevestigator（ https://www.genevestigator.ethz.

クラスタリングや自己組織化マップ（self-organizingch/）等を利用するのが容易であり，とりわけ Geneves-

map；SOM ）等があり，実際に光合成研究にも利用され

tigator を利用した解析は論文の Figure としてもよく利ている ．

用されている印象がある．また，ある実験条件で発現強いずれの手法においてもその類似性の比較に発現強度度が変化する遺伝子群を選抜したい場合には，DART間の違いを基にした距離を利用しており，その遺伝子発（http://tabacum.agr.nagoya-u.ac.jp/dart/）が利用でき

現プロファイルの相似度の指標としては，ユークリッドる．

距離だけでなく，ピアソンの相関係数やスピアマンの順
位相関係数が用いられている．ユークリッド距離を用い

また，興味のあるシロイヌナズナの遺伝子と共発現しる場合には発現データ値の大小が反映されるが，相関係ている遺伝子群を選抜する目的であれば，ATTED-II数を用いる場合には相対的な増減・変動パターンの類似（ http://www.atted.bio.titech.ac.jp/）や CSB. DB

性が反映される．
生物学的には発現レベルの絶対値（ユー（http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/），Cress Express

クリッド距離）よりも変化の方向（相関係数）が重要で（http://www.cressexpress.org/）などのデータベースがある場合も多く，そのような場合には発現プロファイル

利用可能である．それらデータベースでは，興味のあるの相似度の指標として相関係数が用いられる．一方で，遺伝子名を入力するだけでその遺伝子と高い相関係数を転写因子のように刺激に応答して発現強度が大きく変動示す遺伝子群のリストを得る事ができる．とりわけ，光するような遺伝子に着目する際には，ユークリッド距離

合成関連遺伝子においては機能的に関連する遺伝子群がが有用と思われる．

高い相関係数を示すため，これらデータベースの利用はまた，ある遺伝子と機能的に類似する遺伝子群を探索非常に有効である．例えば，実際に光化学系 の遺伝子する目的であれば，単純にその遺伝子と相関係数が高い

名を入れると，相関係数が高い遺伝子群のなかに光化学遺伝子群を探す事で充分である事も多い．実際に，筆者系 の関連遺伝子群が含まれることが確認できるはずでらはこの手法を用いて新規 ndh 変異株を同定している

ある．

（後述）．
いずれにせよ，
データベースの進歩は日進月歩であり，

2.2 データベースの利用
実際に実験研究者が公開マイクロアレイデータを利用して大量解析を行おうとすると，数学やコンピュータの2009 低 温 科 学

vol.67

すぐに情報は古びてしまうため，筆者は Nucleic Acid
Research の Database issue などをチェックし，新しいデータベースや更新されたデータベースを自分で実際に試している．
665

2.3 光合成研究における発現プロファイルの利用法
ここでは実際に光合成研究において発現プロファイルを利用した研究について紹介する．

T-DNA が挿入されたシロイヌナズナ変異株を取り寄せ，実際に NDH 活性を測定した．その結果，NDH 活性
が 失 わ れ た 新 規 変 異 株 を 5ラ イ ン 得 る こ と が で きた．これら変異株の原因遺伝子群は相互に共発現しており（図 2），生化学的な解析からも NDH の新規サ
ブユニットの可能性が高いと考えている．

光合成研究に発現プロファイルを利用した先駆的な研究として Max-Planck 研究所の Dario Leister らの研究

これらの例は発現プロファイル，特に共発現に着目すグループによる pgrl1 変異株の単離・同定が挙げられる．

る事で，興味ある機能を有する光合成関連遺伝子の同定

まず彼らはシロイヌナズナの公開マイクロアレイデータが従来法よりも迅速・簡便に行う事ができる可能性を示を利用してクラスター解析を行い，発現プロファイルの唆している．今後は，シロイヌナズナ以外の植物種にお類似性を指標にしてシロイヌナズナの光合成遺伝子群のいても公開マイクロアレイデータの数が増える事が予想

グループ分けを行った ．その結果，光合成関連遺伝子群

され，ますますこの手法が重要になると期待される．

と葉緑体リボソーム遺伝子群は共発現している傾向が見られ，しかも他の一般的な葉緑体タンパク質をコードする遺伝子群と異なった発現制御を受けている事を見出している．さらに彼らは，新規光合成関連と予想された遺伝子について変異株を利用して逆遺伝学的な解析を行い，光化学系

循環的電子伝達経路で機能 し て い る

PGR5 遺伝子と相互作用する PGRL1 遺伝子の同定に成功している ．
PGRL1 遺 伝 子 は シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ で 2コ ピー（PGRL1A，PGRL1B ）存在し，両方の遺伝子機能を破壊する事で初めて表現型が現れるため，通常の変異株ス
クリーニングでこの遺伝子にたどり着くのは困難であると思われる．一方，Leister らの研究グループでは共発現解析であらかじめ遺伝子数を絞り込み pgl1a/pgrl1b の二重変異体を作成する事で，その変異株が pgr5 と同様の表現型を示すことを見出した．この研究は光合成研究に発現プロファイル解析を組み合わせる事で研究効率を

参考文献
１) M .Schena,D.Shalon,R.Heller,A.Chai,P.O.Brown,& R.W.Davis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (1996)P.
10614.
２) D.J.Lockhart, H.Dong, M.C.Byrne, M.T.Follettie,
M.V.Gallo, M .S.Chee, M .M ittmann, C.Wang, M .
Kobayashi, H.Horton, & E.L.Brown, Nat. Biotechnol.
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３) D.J.Craigon, N.James, J.Okyere, J.Higgins, J.Jotham, & S.May, Nucleic Acids Res. 32 (2004)P.D575.
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L.A.Voesenek, & A.J.Peeters, BM C Bioinformatics.7(2006)P.137.
５) W.K.Lim, K.Wang, C.Lefebvre, & A.Califano, Binformatics. 23 (2007)P.i282.
６) J.Gollub,& G.Sherlock,M ethods Enzymol.411(2006)
P.194.
７) A.Biehl,E.Richly,C.Noutsos,F.Salamini,& D.Leis-

上げた好例と言えるだろう．
また，我々の研究グループでは光化学系 循環的電子
伝 達 経 路 で 機 能 す る NAD (P)H Dehydrogenase（NDH）の未同定サブユニットの探索にこのアイディア
を 適 用 し，成 果 を 挙 げ て い る．具 体 的 に は，ま ず，
ATTED-II データベースを利用して既知の ndh 遺伝子（ndhL，ndhN，ndhO）と相関係数が高い遺伝子群のリストを作成した．また同時に，系統プロファイル法 を組み合わせ，シロイヌナズナ全タンパク質のうち，NDH 複合体を持っている生物種のゲノムにホモログが存在し，
NDH 複合体を持たない生物種のゲノムにホモログが存在しないタンパク質のリストを作成した．
次に，作成したリストに含まれている遺伝子について，
666

図 2：発現解析のフローチャート

公開マイクロアレイデータの利用法

ter, Gene. 344 (2005)P.33.
８) G.DalCorso, P.Pesaresi, S.Masiero, E.Aseeva, D.
Schunemann,G.Finazzi,P.Joliot,R.Barbato,& D.Leister, Cell. 132 (2008)P.273.
９) M.Pellegrini, E.M.Marcotte, M.J.Thompson, D.
Eisenberg, & T.O.Yeates, Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
96 (1999)P.4285.

2009 低 温 科 学

vol.67

10) A.Takabayashi, N.Ishikawa, T.Obayashi, S.Ishida,
J.Obokata, T.Endo, & F.Sato, Plant J.accepted (2008)
doi:10.1111/j.1365-313X.2008.03680.x
11) S.Ishihara,A.Takabayashi,K.Ido,T.Endo,K.Ifuku,& F.Sato, Plant Physiol. 145 (2007)P.668.
12) N.Ishikawa, A.Takabayashi, S.Ishida, Y.Hano, T.
Endo, & F.Sato, Plant Cell Physiol. 49 (2008)P.1066.

667

６章 バイオインフォマティクス

３．光合成遺伝子の同定
横野 牧生 ，田中亮一 ，田中歩

全ゲノム配列情報が利用できる生物種の数は急速に増加している．次世代シークエンサーの利用など
により，この数は今後ますます増加することが予想される．本章では，この情報を利用した遺伝子の同定法について紹介する．

Identification of genes by using whole genome sequence
M akio Yokono, Ryouich Tanaka, Ayumi Tanaka
Recently,the number of available whole genome sequences is rapidly increasing. In order to identify the genes
responsible for photosynthesis, we developed a bioinformatics tool, CCCT (Correlation Coefficient Calculation
Tool), which calculates the correlation coefficient between the distributions of a certain phenotype and genes
among a group of organisms. By using this method, we identified cyanobacterial DVR gene responsible forchlorophyll synthesis. This method can also be applied to the identification of non-photosynthetic genes.

を紹介する．この手法は多くの生物種の全ゲノム情報を

3.1 はじめに利用できることが前提となっているため，今後さらに精近年シーケンサーの高速化に伴い数多くの生物種の全度は向上すると予想できる．

ゲノムの配列情報が公開されている．一方でそこに含まれる遺伝子の機能についての情報（アノテーション）は不足しており，機能が不明とされているものが数多く存

3.2 解析対象にする生物群の選定

在する．遺伝子の機能を決定するために，関連する変異

まず始めに未知の遺伝子を持っていることが確実な生体を作成することやコードされているタンパク質を単離物種をクエリー種として選定する．これは例えば，あるすることが行われる．しかしこれらの作業には多くの時色素を蓄積するのにその合成に関与する遺伝子が未知で間がかかるため，どの遺伝子が目的とする表現型の発現あるような種である．次にクエリー種に近縁で，未知のに関与しているのかを予測することが必要とされる．

遺伝子を持っていると予想される種と，持っていないと機能が不明な遺伝子の機能を予測するためによく用い予想される種を解析対象に選ぶ．

られるのは相同性検索であり，BLAST や FASTA が有

この解析を行うためには準備段階として，解析対象に

名である
［1，2］
．これを使うと，機能が既知のある遺伝する生物群の持つ全遺伝子を総当たりで相同性検索を行子に類似した別の遺伝子を探すことができる．しかしなうことが必要となる．筆者らはすでに NCBI において公がら単に機能が既知の遺伝子と類似のものを検索するだ

開されている真核生物を含む約 850種の生物の全遺伝子

けでは，それらと相同性が無く機能が未知の遺伝子に対に対して総当たりで Blast 検索を完了しており，結果の応できない．

ファイルを統合データベースプロジェクトの協力を得て未知の遺伝子の機能を推定する上で，その遺伝子がど公開する予定である．しかしながら，非公開になっていのような生物種に存在しているかを知ることは大きな助る生物種を用いる場合や，Blast 以外の相同性検索の結けになる．言い換えると，ある生物群が特定の表現型を果を用いて CCCT を用いる場合のために，解析に用いる示している場合，その原因となる遺伝子（群）もそれら

相同性一覧の表のフォーマットを示す［表 1］．一行目はの生物全てに共通して存在する可能性が高い．
本章では，解析対象にする生物の名前であり，左端がクエリー種で，この考えに基づいて筆者らが開発した CCCT（Correla-

順次ターゲット種を任意の順で並べる．二行目はそれぞtion Coefficient Calculation Tool）による遺伝子の同定

れの生物が，
目的とする未知の遺伝子を持つはず（−180）
なのか，持たないはず(1)なのかを示す．ここでは検索方

１) 北海道大学低温科学研究所

2009 低 温 科 学

vol.67

法に Blast を採用し相同性の指標としては E-value の指669

表 1：相同性一覧の例
A. thaliana

A. thaliana

C. reinhardtii

E. coli E22

．
．
．

−180

1

−180 ．
．
．

NP 974945.2−180−15.04575749

0.146128036 ．
．
．

NP 974899.2−168−19.15490196

0.491361694 ．
．
．

NP 974897.2−17.52287875

0.698970004

0.146128036 ．
．
．

NP 974807.2

−172

−65

0.681241237 ．
．
．

．．
．

．．
．

．
．
．

．
．．

．
．
．

数部分を用いているので，値が小さいほど類似した遺伝

リー種と遠い種でその遺伝子を持つと予想される種があ子を持つことを表している．一列目の三行目以降はクエる場合には，候補を絞り込みやすくなる．ここでは筆者

リー種（この場合は Arabidopsis thaliana）の全遺伝子そらが特定に成功した光合成関連遺伝子を例にとり，そのれぞれのアクセッション番号を示す．二列目以降の三行

手順を示す．

目以降は，各列の生物種の全遺伝子をターゲットにして，クエリー種の各遺伝子の相同性を検索したときに最も相同性が高かった遺伝子の相同性の値である．例えば二列

3.3 クロロフィル合成に関する遺伝子目の三行目は A.thaliana の遺伝子 NP 974945.2 をクエ

クロロフィルはその合成過程においてジビニル体からリーにして A.thaliana の全遺伝子を検索したときにベモノビニル体へ変換される．高等植物においてはその反ストヒットした遺伝子の相同性の値である．これは採用応に関与する遺伝子（dvr）がすでに同定されているがした相同性検索の方法で，各遺伝子と全く同じ遺伝子が［3］，
他の多くの光合成生物にはその酵素が無くどのようヒットしたときに表示される相同性の値となる．また，に変換しているのか不明であった．筆者らは CCCT を用

三列目の三行目は A.thaliana の遺伝子 NP 974945.2 をいてシアノバクテリアの持つ dvr を特定することがでクエリーにして Chlamydomonas reinhardtii の全遺伝

きた．

子を検索したときにベストヒットした遺伝子の相同性の値である．
このように相同性の値を並べると，各行は各遺伝子の3.4 解析対象の生物種の選定

生物間の分布パターンを示すことになる．例えば三列目

ほとんどのシアノバクテリアと紅藻は高等植物の持つの NP 974945.2 は C.reinhardtii と E.coli に は 良 く 似

dvr を持たないにも関わらずモノビニル体のクロロフィているものは無く，六行目の NP 974807.2 は C.reinhar-

ルを光合成に用いている［表 2］．このことは新規の dvr

dtii には少し似ているものがあるが E.coli には似ていがあることを示している．モノビニル体のクロロフィル

るものが無いことがわかる．ここで理想とするパターンを持つ生物のうち高等植物と類 似 の dvr を 持 た な い（二行目）と各行との相関をとれば，クエリーの持つ全遺cyanobacteria および紅藻はすべて未知の dvr を持つと伝子のうちどれが理想とする分布パターンに近いかがわ

仮定した．これらの生物のうち Synechocystis sp. PCC

かる．また各行のパターンをそれぞれ各行のパターンに6803 は遺伝子操作が可能であり比較的良くアノテー

対して相関をとれば，クエリーの持つ全遺伝子をその生ションされていることから，これをクエリー種とし他の物間分布パターンに基づいて自動的に分類することがで生物はターゲット種に加えた．一方でシアノバクテリア

き る．筆 者 ら は Mathematica を 用 い て Stand-alone

でも Prochlorococcus はジビニル体のクロロフィルを持

Blast の制御，相同性一覧表の作成，および相関係数の算

ち，高等植物と類似の dvr も持たないことから，未知の出を行ったが，統合データベースのホームページ上でdvr も持たないといえる．これらも全てターゲット種にFireFox にて動作する CCCT のスクリプトを公開予定

加えた．高等植物，緑藻，珪藻は既知の dvr を持つためである．

解析対象には加えなかった．

この解析で最も重要なのは，解析対象の生物種の選定と，理想とする分布パターンの設定である．未知の遺伝子を持つクエリー種に比較的近縁な種で，その遺伝子を持たないと予想される生物種が存在する場合や，クエ
670

3.5 総当たりの相同性検索
Synechocystis sp. PCC 6803 の遺伝子は約 3600個あ遺伝子同定

表 2：解析対象の生物群と各生物の持つクロロフィルのタイプ

クロロフィルはモノビニル
高等植物の dvr は無い
未知の dvr を持つはず

Synechocystis sp. PCC 6803（クエリー種として使用）
Anabaena variabilis ATCC 29413
Crocosphaera watsonii WH 8501
Cyanothece sp. CCY0110
Gloeobacter violaceus PCC 7421
Lyngbya sp. PCC 8106
Nodularia spumigena CCY9414
Nostoc punctiforme PCC 73102
Nostoc sp. PCC 7120
Synechococcus elongatus PCC 6301
Synechococcus elongatus PCC 7942
Synechococcus sp. JA-2-3Bʼ
a (2-13)
Synechococcus sp. JA-3-3Ab
Synechococcus sp. RCC307
Synechococcus sp. RS9917
Synechococcus sp. WH 7803
Thermosynechococcus elongatus BP-1

Synechococcus sp. RS9916
Synechococcus sp. WH 5701
Synechococcus sp. WH 7805
Trichodesmium erythraeum IMS101

Cyanidioschyzon merolae

クロロフィルはジビニル
高等植物の dvr は無い
未知の dvr も無いはず

クロロフィルはモノビニル
高等植物の dvr を持つ
未知の dvr を持つかは不明

Prochlorococcus marinus str. AS9601
Prochlorococcus marinus str. MIT 9301

Prochlorococcus marinus str. M IT 9211
Prochlorococcus marinus str. M IT 9303

Prochlorococcus marinus str. MIT 9312
Prochlorococcus marinus str. MIT 9515

Prochlorococcus marinus str. M IT 9313
Prochlorococcus marinus str. NATL1A

Prochlorococcus marinus str. NATL2A
Prochlorococcus marinus CCM P1986

Prochlorococcus marinus CCM P1375

Synechococcus sp. BL107

Synechococcus sp. CC9311

Synechococcus sp. CC9605

Synechococcus sp. CC9902

Synechococcus sp. WH 8102

Arabidopsis thaliana

Osterococcus tauri

Thalassiosira pseudonana

る．
これらをひとつずつクエリー配列として，
各ターゲッ

子は slr1302 だけであった．この２つをクエリーにしてト種の全遺伝子を対象に Blast サーチを行い，最も類似

NCBI の protein database に対 し て Blast 検 索 を 行っしているターゲット種の遺伝子を抜き出して表 1のようたところ，slr1923 は Methanococcus の coenzyme F420

な類似度（期待値：E-value）の行列を作成した．ただしhydrogenase /dehydrogenase family protein と弱い相ク エ リー種 は Synechocystis sp. PCC 6803 と し，ター

同性のあることがわかった．最後に Synechocystis sp.

ゲット種は表２に赤および青で示した生物種を用いた．

PCC 6803 で slr1923 を破壊した変異体がジビニル型のクロロフィルを蓄積したことから，slr1923 がシアノバク

3.6 相関係数による並べ替え

テリアでモノビニル型のクロロフィルの合成に関与していることが確認できた．

表 2に示した条件をグラフに表した物が図 1a）である．縦軸は E-value を対数表示にしたもので小さいほど相同性が高い遺伝子を持つことを意味する．このパター

3.7 まとめ

ンとクエリー種の持つ全遺伝子それぞれの分布パターン

本解析方法は単純な原理に基づいており，始めの相同との相関をとり，相関の高い順にグラフとして表示した性検索さえ終わらせてしまえば，相関による並び替えは［図 1b〜d］．最も相関が高かったのはシアノバクテリア

数分で完了する．候補を絞り込めるかどうかは解析に用のアンテナ（フィコビリソーム）をチラコイド膜に接続いる生物種の種類と数にかかっており，十分な生物種をするリンカータンパク質であった．ほとんどのシアノバ用いることができれば候補を相当絞り込むことができクテリアと紅藻はフィコビリソームをアンテナとして用る．実際シアノバクテリアの dvr では候補が２つに絞りいるが，Prochlorococcus はフィコビリソームを持たない込まれた．

ことから，これは予期された結果である．次に相関係数

一方で課題もいくつか存在する．ひとつは，目的の遺が高かったのはアノテーションのない slr1923 であり，伝子の理想とする分布パターンを設定するには解析に用

これは未知の dvr である可能性が高いと考えられた．他いる生物種の特徴をよく知っている必要がある点であに相関が 90％以上の範囲でアノテーションがない遺伝

る．これについては生物の特徴を集めたデータベースの2009 低 温 科 学

vol.67671

ような物があればそれと連動させることである程度解決

ことがより容易かもしれない．なお，今回紹介したデーが可能である．もうひとつは，複数のタンパク質が共同

タおよびツールは非営利目的に限り希望者に提供が可能

で何かの反応に関わっている場合，それら全てが同じよである．

うな生物間分布を示すとは限らないことである．この場
合 CCCT では，異なる生物間で保存性が高いと思われる
鍵となるタンパク質を見つけることはできるが，補う形

引用文献

で働くタンパク質すべてを検出することはできない可能

１) W.R.Pearson, D.J.Lipman, Improved Tools for Bio-性がある．補うタンパク質の分布パターンを複数想定しlogical Sequence Comparison, Proceedings of the
National Academy of Sciences 85 (1988)2444‑2448.
２) S.F.Altschul, W.Gish, W.M iller, E.W.M yers, D.J.

組み合わせて解くことは可能ではあるが，計算量がかな
りのものになる．
例えば鍵となるタンパク質は共通だが，補うタンパク質は生物によって２種類の組み合わせがある場合，クエリー種を２つ組み合わせることになるため，それぞれが 3000の遺伝子を持っていた場合 3000×3000
通りの比較をすることになり，およそ丸一日計算にかかる．現時点では見つかった鍵となるタンパク質を手がかりに分子生物学的手法で相互作用するタンパク質を探す

672

Lipman, Basic local alignment search tool (BLAST), J
Mol Biol 215 (1990)403‑410.
３) N.Nagata, R.Tanaka, S.Satoh, A.Tanaka, Identification of a vinyl reductase gene for chlorophyll synthesis in Arabidopsis thaliana and implications for theevolution of Prochlorococcus species, Plant Cell 17(2005)233‑240.

遺伝子同定

６章 バイオインフォマティクス

４．光合成生物のオミックスデータベース利用法
成川

礼 ，岡本

忍

近年のゲノム解析の進展と，それにともなうゲノムレベルの様々な網羅的解析手法の開発により，膨大な量の計測データがデータベースに蓄積され続けている．生物学者は研究を進める上で，これらの情報を有効に活用する必要性に迫られている．
本章では，光合成生物に関連するオミックスデータベースの内容と所在について紹介する．

Utilization of omics databases
Rei Narikawa, Shinobu Okamoto
Over the last decade, genomic and post-genomic data are accumulating at an ever-accelerating rate. Experimental biologists are on the verge of effectively utilizing these data to design experimental procedures. In thischapter, we introduce location and context of omics databases of phototrophic organisms.

4.1 ゲノム配列データベース

配列決定のコストが下がり，膨大な数のゲノムプロ
ジェクトが精力的に行われた結果，研究者は自分に関係ゲノムの塩基配列データは，実際に配列決定を行ったのある生物種のゲノムプロジェクトの把握すら困難な状研究機関が国際塩基配列データベース（International

況にある．このような状況を受け，プロジェクト単位，

Nucleotide Sequence Databases）に登録することによ

生物種単位で配列決定プロジェクトの進捗状況やプロり，
世界中に公開され利用可能になる．
国際塩基配列デー

ジェクトの推進機関などメタデータの重要性が高まってタベースとは，日本の DDBJ（DNA Data Bank ofいる．Genome Online Database (GOLD，表 1‑8）は，，米 国 NCBI（National Center forJapan，表 1‑1）

プロジェクト毎の進捗状況に応じて，解読が完全に終了，および欧州 EBI
Biotechnology Information，表 1‑2）した生物のゲノムプロジェクト，真核生物，古細菌，真（European Bioinformatics Institute，表 1‑3）からなる

正細菌の現在進行形のゲノムプロジェクト，メタゲノム組織であり，世界中の塩基配列データ登録の窓口になっプロジェクトという視点で分類，整理され閲覧可能であている．登録された塩基配列データは，国際規約に従いる．このデータベースは，JGI の微生物ゲノムプロジェク

アクセッション番号（Accession number）が付与される．

トのチームリーダーである Nikos Kyrpides を中心としひとつの機関に登録された配列データは，公開と同時にてボランティアベースで提供されている．また，NCBI

同一のアクセッション番号で DDBJ，GenBank，EMBL

Genome Project（表 1‑9）は，NCBI の豊富なゲノム情の三者間で共有される．配列決定が完了した生物種に関報リソースをゲノムプロジェクト単位で整理し直すこと

しては，DDBJ の Gene Trek in Procaryote Spaceで，ゲノム配列情報，生物種情報やプロジェクトに関連（GTPS，表 1‑4）や GenBank の RefSeq (表 1‑5）のよする主要機関などの情報を参照可能である．

うに独自の判断基準と自動処理を用いて，均一な遺伝子構造抽出を行ったゲノム情報なども公開されている．また，Joint Genome Institute（JGI，表 1‑6）や J. Craig

4.2 個別生物種の統合データベース

Venter Institute（JCVI，表 1‑7）など，配列機関やプロ

網羅的解析時代以前は，個別の研究プロジェクトデー

ジェクトによっては，ゲノム配列決定完了前のドラフト

タベースが，それぞれの関係者により開発，維持されて状態での公開もおこなわれている．

きた．網羅解析時代になると，そのようなデータベースが乱立し，利用者が必要な情報にたどり着くことが困難になった．また，技術や資金の問題から，プロジェクト

１) 東京大学大学院総合文化研究科広域科学専攻

毎でのデータベースの維持管理も難しくなっている．こ２) かずさ DNA 研究所のような背景から，近年，データベースを統合して利便2009 低 温 科 学

vol.67673

表 1：ゲノム配列・ゲノムプロジェクトデータベース
データベース名No

URL

1 DDBJ

http://www.ddbj.nig.ac.jp/index-e.html

2 NCBI

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

3 EBI

http://www.ebi.ac.uk/

4 GTPS

http://gtps.ddbj.nig.ac.jp/

5 RefSeq

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/

6 JGI

http://www.jgi.doe.gov/

7 JCVI

http://www.jcvi.org/

8 GOLDhttp://www.genomesonline.org/

9 NCBI Genome Project

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db＝genomeprj

10 ELIXIR

http://www.elixir-europe.org/

性を上げようという試みが加速している．各研究機関やた，1998年には変異株の情報を共有したいという利用者

研究者コミュニティは，分散している大量なゲノム情報の要望にこたえて CyanoBase 内に変異株データベースを収集整理して検索機能，比較機能などをつけることに

CyanoMutants が，さらに，その機能を拡張するかたち

より利用者の便宜をはかり，情報の付加価値を高めようで研究者自身の遺伝子注釈を自然言語で記入することがと し て い る．こ の よ う な 試 み は，米 国 NCBI や 英 国

出来る CyanoGenes が提供された．2002年には京都大学

ELIXER（表 1‑10）など，ライフサイエンスの包括的なのバイオインフォマティクスセンターからコミュニティ

データベース統合だけでなく，光合成のモデル生物毎に型アノテーションの先駆けとなる CYORF（表 2‑2）が提も精力的に行われている．ここでは光合成に関連する生供され，専門家によるジャンボリー形式の遺伝子注釈が物の統合データベースの一部を紹介する．

試みられ，文献証拠に基づいた遺伝子注釈が提供されている．また，アメリカの Elhai らによって，CyanoBIKE（表 2‑4）と呼ばれるコミュニティデータベースも近年開4.3 シアノバクテリア，
光合成細菌データベース

発され，Web 上から様々なコマンドを使用したバイオイ
ンフォマティクス解析が可能となっている．2007年にシアノバクテリア Synechocystis sp. PCC 6803 は，酸は，Web ページ に 注 釈 付 け が 行 え る シ ス テ ム，

素発生型光合成生物として 1996年に世界で初めてゲノ

KazusaAnnotation（表 2‑3）を用い，S.PCC 6803 の約

ム配列が決定された ．CyanoBase (表 2‑1）は，当初1200報の原著論文全文中に記述された遺伝子・タンパク

Synechocystis のゲノムデータベースとして開発され，そ質名を抽出する試みがなされている．それ以外にも，東の後，
現在 30種以上のシアノバクテリアと光合成細菌の京大学の園池らは網羅的に遺伝子破壊株のクロロフィル

ゲノム情報が収集公開されている．

蛍光を測定し，そのプロファイルによる機能分類を行ったデータベース，Fluorome (表 2‑5）を公開している．

CyanoBase では，遺伝子構造，遺伝子産物情報，ゲノ
ムマップなどの他に，プロテオーム解析の結果 ，Yeast
two-hybrid 法によるタンパク質相互作用実験情報 や，
外部データベースへの豊富なリンクも提供している．ま4.4 シロイヌナズナデータベース
世界における主なシロイヌナズナデータベースを表 3

表 2：シアノバクテリア，光合成細菌データベース
No674

データベース名URL

1CyanoBase

http://bacteria.kazusa.or.jp/cyanobase

4

CYORF

http://cyano.genome.jp/

3

KazusaAnnotation

http://a.kazusa.or.jp/

4

CyanoBIKE

http://cyanobike-community.csbc.vcu.edu/welcome-frame.php

5Fluorome

http://sunlight.k.u-tokyo.ac.jp/fluorome/about.php

オミックスデータベース利用法表 3：シロイヌナズナ関連データベース
データベース名No
1 TAIR
2 AGNS

URL
http://www.arabidopsis.org
http://wwwmgs.bionet.nsc.ru/agns

3 AGRIS
4 AM Pdb

http://arabidopsis.med.ohio-state.edu
http://www.plantenergy.uwa.edu.au/applications/ampdb/index.html

5 M PSS
6 AtNoPDB

http://mpss.udel.edu/at/
http://bioinfo.scri.sari.ac.uk/cgi-bin/atnopdb/proteome comparison

7 ARAM EMNON
8 ARTDEdb

http://aramemnon.botanik.uni-koeln.de
http://omicspace.riken.jp/ARTADE

9 ASRP
10 AtGDB

http://cgrb.orst.edu/smallRNA/db
http://www.plantgdb.org/AtGDB

11 AthaMap
12 ATTED-II

http://www.athamap.de
http://www.atted.bio.titech.ac.jp

13 CATMA
14 DATF

http://www.catma.org
http://datf.cbi.pku.edu.cn

15 GABI-Ka
16 M AtDB

http://www.GABI-Kat.de
http://mips.gsf.de/proj/thal/db

17 NASCarrays

http://affymetrix.arabidopsis.info

18 PlantQTL-GE

http://www.scbit.org/qtl2gene/new

19 Plprot

http://www.pb.ipw.biol.ethz.ch/proteomics

20 RARGE

http://rarge.gsc.riken.jp

21 SeedGenes

http://www.seedgenes.org

22 SUBA

http://www.suba.bcs.uwa.edu.au

23 WAtDB

http://www.watdb.nl

24 GeneFarm

http://urgi.versailles.inra.fr/Genefarm

25 TIGR Arabidopsis annotation db

http://www.tigr.org/tdb/e2k1/ath1/ath1.shtmlにまとめた．なかでも圧倒的に整備されているのが，The

The TIGR Arabidopsis thaliana Genome Annota-

Arabidopsis Information Resource (TAIR，表 3‑1）

tion Database (表 3‑25）に含まれる配列は，TIGR をで あ る．TAIR は，シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ（Arabidopsis

含む全ての Arabidopsis Genome Initiative（AGI）に所の包括的なデータベースであり，30以上の研究
thaliana）

属する研究機関に由来するものである．このデータベー機関による遺伝子構造，遺伝子産物情報，代謝，遺伝子スはこれらのデータの標準化のため，解析とアノテー発現の他に，ゲノムマップ，遺伝子マーカー，文献情報

ションを行ったものである．本データベースは，TAIR，とシロイヌナズナ研究コミュニティに関する情報などを，GO，INTERPRO（表 6‑2）
，PRINTSMIPS（表 6‑1）

統合して提供している．2008年時点で，月間３万人以上（表 6‑3），PRODOM（表 6‑4）
，PROSITE（表 6‑5），Pfamの利用者がある．また，TAIR は The Gene Ontology（表 6‑6）などの情報が付加されている．また検索ツール

Consortium でも中心的な役割を果たしており，GOが３種類，解析ツールが２種類，利用できる．

term の整備や GO に基づいた遺伝子注釈が精力的に行われている．
遺伝子構造予測と遺伝子注釈は，
年に１〜２

MAtDB

(M IPS Arabidopsis thaliana Database，回の頻度で更新されており，最新の TAIR8（2008年４月

表 3‑16）は，AGI の一部として European Scientists

リ リース 版）で は，27,235の 推 定 タ ン パ ク 質 を 含 む（ESSA）計画のゲノム配列デー
Sequencing Arabidopsis

38,963の遺伝子モデルを提供している．さらに TAIR

タのリポジトリとして開始された．現在は，分散していは，その Web ページから他のシロイヌナズナ資源までるデータの統合と各種解析・可視化ツールの提供により，広範囲なリンクを提供し，ポータルサイトの役目も果た

生物学的知識の統合リソースとなっている．また，各プしている．

ロジェクトによる全長 cDNA の ID 統合データベースを持ち，AGI Locus コードを軸に TIGR，TAIR と相互2009 低 温 科 学

vol.67675

参照が可能になっている．他の植物ゲノムとの比較ゲノ

遺伝子発現プロファイルを可視化するツール，LabAT-

ム解析ツールも充実しており，シンテニーブラウザー

TED や，検索ツールなども提供している．データベース

SynBrowse により，ミヤコグサ，タルウマゴヤシ，トの更新状況や，データ数などの統計情報など，解析を支ウモロコシ，イネなどとゲノムレベルで比較することが援する周辺情報も充実している．

できる．
ATTED-II(表 3‑12）は，公開されているシロイヌナ

ズナのマイクロアレイデータ，58実験，1,388スライド

4.5 イネゲノム解析プロジェクトとイネデータベースと予測 cis-element から推測された遺伝子の共発現解析

世界的に主要なイネ関連データベースを表 4にまとめに基づいた相互制御関係のデータを提供している．
また，

た．IRGSP（The International Rice Genome Sequence

表 4：イネ科植物データベース

27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37

データベース名URL
RAP-DB
http://rapdb.lab.nig.ac.jp/
TIGR Rice Genome Annotation
http://www.tigr.org/tdb/e2k1/osa1/
INE
http://rgp.dna.affrc.go.jp/giot/INE.html
Oryzabase
http://www.shigen.nig.ac.jp/rice/oryzabase/top/top.jsp
Gramenehttp://www.gramene.org/Oryza sativa/index.html
Rice M PSS
http://mpss.udel.edu/rice/
RiceGE（Rice Functional Genomics Database）
http://signal.salk.edu/cgi-bin/RiceGE
RAD（Rice Annotation Database）
http://rad.dna.affrc.go.jp/index .html
KOME（Knowledge-based Oryza Molecular biological http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/
Encyclopedia）
RiceGAAS
http://ricegaas.dna.affrc.go.jp/（）
M OsDB MIPS Oryza sativa Database
http://mips.gsf.de/proj/plant/jsf/rice/index.jsp（）
M GOS M agnaporthe Grisea Oryza Sativa Database http://www.mgosdb.org/
OsGDB
http://www.plantgdb.org/OsGDB/index.php
RetrOryza
http://www.retroryza.org/
RED（The Rice Expression Database）
http://red.dna.affrc.go.jp/RED/
Rice Proteome Database
http://gene64.dna.affrc.go.jp/RPD/main en.html
DRTF（The Database of Rice Transcription Factor） http://drtf.cbi.pku.edu.cn/
TIGR Oryza Repeat Database
http://www.tigr.org/tdb/e2k1/osa1/blastsearch.shtml（Genomes TO Protein structures and functions） http://structure.rice.dna.affrc.go.jp/gtop/gtop.html
GTOP
RKD（Rice Kinase Database）
http://rkd.ucdavis.edu/index.htm
The Genome Cluster Database（GCD）
http://bioweb.ucr.edu/databaseWeb/index.jsp
CSRDB
http://sundarlab.ucdavis.edu/smrnas/（）
RiceTFDB Rice Transcription Factor DataBase
http://ricetfdb.bio.uni-potsdam.de/v2.1/
BarleyBase
http://www.plexdb.org/plex.php?database＝RiceASIP（Alternative Splicing In plant）
http://www.plantgdb.org/ASIP/
IRGSP（The International Rice Genome Sequencing http://rgp.dna.affrc.go.jp/J/IRGSP/index.html
Project）
RM G（Rice M itochondrial Genome Information）
http://rmg.rice.dna.affrc.go.jp/
RPSD（Rice Protein Structure Database）
http://structure.rice.dna.affrc.go.jp/
ricemarker
http://shenghuan.shnu.edu.cn/genefunction/ricemarker.htm
Rice Pipeline
http://cdna01.dna.affrc.go.jp/PIPE/index a.html
PLACE
http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/
Rice SNPs Database
http://www.pgcdna.co.jp/snps/index.html
Rice Research Database（RRDB）
http://www.pgcdna.co.jp/igs system/index.html
Wild Rice Database（WLD）
http://www.pgcdna.co.jp/cgi-bin/wrdb/content.cgi
Oryza Tag Line
http://urgi.versailles.inra.fr/OryzaTagLine/
IRIS -International Rice Information System
http://www.iris.irri.org/
POGs PlantRBP
http://plantrbp.uoregon.edu/

676

オミックスデータベース利用法

No
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Project，表 4‑26）は，日本を含む 10カ国からなる国際する包括的なゲノム情報を収集したデータベースであ

イネゲノム塩基配列解析プロジェクトで決定したイネ

る．ヒトやマウスゲノムプロジェクトデータベースに携（Oryza sativa L. ssp. Japonica）ゲノムデータを公開しわってきた Cold Spring Harbor 研究所の Lincoln Steinている．イネの 12本の染色体，合計約４億塩基対に対しが開発している．イネ科植物の基本的なゲノム情報以外て，階層型ショットガン方式により，PAC，BAC クローにも，文献情報によるタンパク質の機能構造注釈，代謝ンをシーケンスし，DNA マーカーに基づき再配置が行

マップおよび EST 配列や QTL などの情報が検索可能

われている．現在の最新版は Build 5.0（2008年 12月リである．また，比較ゲノムツール CM ap を用いて，イネ，

リース版）である．

ムギ，トウモロコシ，アワ，シロイヌナズナなどの種間でシンテニー領域を比較することできる．ゲノムブラウ(Rice Annotation Project Database，表

ザーには，多くの真核生物ゲノムプロジェクトで標準的4‑1）は，独立行政法人農業生物資源研究所（NIAS），独

な Ensembl Genome Browser を使用しており，EST 配

立行政法人産業技術総合研究所（CBRC），大学共同利用

列，発現データ，SNPs 情報などの膨大なデータがゲノム機関法人 情報・システム研究機構 国立遺伝学研究所

上にマッピングされている．また Web ベースのデータ（NIG）がイネゲノム全塩基配列上に存在する 29,550のマネジメントシステムである BioMart

予測遺伝子の位置を決定し，Gene Ontology，EST 配列，いて，共通プロモーター領域や共通の機能ドメインをもタンパク質機能ドメイン（InterPro），TIGR Annotation

つ任意のゲノム配列といったデータを一括取得すること

Pseudomolecules などの情報を付与したアノテーショが可能となっている．

RAP-DB(表 6‑7）を用

ンデータベースである．特に専門家による遺伝子のマ
ニュアルキュレーションに注力しており，ジャンボリー
形式の遺伝子アノテーションが過去４回行われ，成果がRAP4（2007年 10月）として反映されている．

4.6 その他のオミックスデータベース
EST データベース：かずさ DNA 研究所では，クラミ
ドモナス，ミヤコグサ，シロイヌナズナ，スサビノリ，

TIGR Rice Genome Annotation Resource（表 4‑2)

トマトの EST データ（表 5‑1）が公開されている．様々は，The Institute for Genomic Research（TIGR，現な真核生物の EST を集めている TBestDB（表 5‑2）とJCVI）が，予測遺伝子 42,653個の位置を決定し，機能アいうデータベースも存在する．真核藻類のデータ取得等

ノテーションの付与，発現データ，完全長 cDNA データ，に便利である．

M PSS データ，SAGE データ，Genbank EST をマッピ

トランスクリプトームデータベース：広範囲の生物のングしたプローブ，Agilent 社や Affymetrix 社の Rice

トランスクリプトームデータのポータルサイトとして

Genome Arrayプローブ情報などを統合したアノテー

は，ArrayExpress（表 5‑3）や GEO DataSets（表 5‑4）

ションデータベースである．このプロジェクトでは，コなどが存在する．シロイヌナズナの発現データはかなり

ンピューター解析と人手によるキュレーション作業によ蓄積されている．前者のデータベースにはシアノバクテ

り，高精度のゲノム注釈を行うことを目的としている．

リアのデータは少ないが，後者のデータベースには 24つ

リリース４の段階で，42,653の遺伝子（トランスポゾンのデータセットが蓄積されている．GEO DataSets には関連遺伝子を除く）を同定した．

近年プロテオームデータも蓄積している．シアノバクテ
リアに関しては，KEGG EXPRESSION（表 5‑5）にもGramene (表 4‑5）データベースは，イネ科植物に関データが蓄積されている．

表 5：その他のオミックスデータベース
データベース名

No

URL

1

Kazusa Plant cDNA project http://www.kazusa.or.jp/e/resources/database.html

2

TBestDB

http://tbestdb.bcm.umontreal.ca/searches/welcome.php

3ArrayExpress

http://www.ebi.ac.uk/microarray-as/ae/4

GEO DataSets

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db＝gds&cmd＝search&term

5

KEGG EXPRESSION

http://www.genome.jp/kegg-bin/get htext?htext＝Exp DB&hier＝1

6

NSF2010 Metabolomics

http://lab.bcb.iastate.edu/projects/plantmetabolomics/

2009 低 温 科 学

vol.67677

メタボロームデータベース：メタボローム解析に関しては近年データが蓄積し始めているので，データベースと し て 公 開 さ れ て い る 例 が 少 な い． NSF2010
M etabolomics（表 5‑6）にシロイヌナズナのメタボロー
ム解析データが集められている．

Mewes, & K.F.Mayer, Nucleic Acids Res. 32 (2004) D.
373.
12) X. Pan, L. Stein, & V. Brendel, Bioinformatics. 21(2005)P.3461.
13) T.Obayashi, K.Kinoshita, K.Nakai, M .Shibaoka, S.
Hayashi, M .Saeki, D.Shibata, K.Saito, H.Ohta, Nucleic Acids Res. 35 (2007)D.863.
14) Rice Annotation Project,T.Tanaka,B.A.Antonio,S.

参考文献

Kikuchi, T.M atsumoto, Y.Nagamura, H.Numa, H.

１) K.D.Pruitt, T.Tatusova, & D.R.M aglott, Nucleic
Acids Res. 35 (2007)D.61.
２) K.Liolios, K.Mavromatis, N.Tavernarakis, & N.C.
Kyrpides, Nucleic Acids Res. 36 (2008)D.475.
３) T.Kaneko, S.Sato, H.Kotani, A.Tanaka, E.Asamizu, Y.Nakamura, N.Miyajima, M.Hirosawa, M .
Sugiura, S.Sasamoto, T.Kimura, T.Hosouchi, A.Matsuno, A.M uraki, N.Nakazaki, K.Naruo, S.Okumura,
S.Shimpo, C.Takeuchi, T.Wada, A.Watanabe, M.
Yamada,M.Yasuda,& S.Tabata,DNA Res.3(1996)P.
109.
４) Y.Nakamura,T.Kaneko,& S.Tabata,Nucleic Acids
Res. 28 (2000)P.72.
５) T.Sazuka, M .Yamaguchi, & O.Ohara, Electrophoresis. 20 (1999)P.2160.
６) S.Sato, Y.Shimoda, A.Muraki, M.Kohara, Y.Nakamura, & S.Tabata, DNA Res. 14 (2007)P.207.
７) H.Ozaki, M.Ikeuchi, T.Ogawa, H.Fukuzawa, & K.
Sonoike, Plant Cell Physiol. 48 (2007)P.451.
８) D.Swarbreck, C.Wilks, P.Lamesch, T.Z.Berardini,
M.Garcia-Hernandez, H.Foerster, D.Li, T.Meyer, R.
Muller,L.Ploetz,A.Radenbaugh,S.Singh,V.Swing,C.
Tissier, P.Zhang, & E.Huala, Nucleic Acids Res. 36(2008)D.1009.
９) Nucleic Acids Res. 36 (2008)D.440.
10) A.P.Chan, P.D.Rabinowicz, J.Quackenbush, C.R.
Buell, & C.D.Town, Methods M ol. Biol. 406 (2007) P.
113.
11) H.Schoof, R.Ernst, V.Nazarov, L.Pfeifer, H.W.

Sakai, J.Wu, T.Itoh, T.Sasaki, R.Aono, Y.Fujii, T.
Habara, E.Harada, M .Kanno, Y.Kawahara, H.Kawashima,H.Kubooka,A.M atsuya,H.Nakaoka,N.Saichi,
R.Sanbonmatsu, Y.Sato, Y.Shinso, M .Suzuki, J.Takeda, M .Tanino, F.Todokoro, K.Yamaguchi, N.
Yamamoto, C.Yamasaki, T.Imanishi, T.Okido, M .
Tada, K.Ikeo, Y.Tateno, T.Gojobori, Y.C.Lin, F.J.
Wei, Y.I.Hsing, Q.Zhao, B.Han, M .R.Kramer, R.W.
McCombie, D.Lonsdale, C.C.Oʼ
Donovan, E.J.Whitfield, R.Apweiler, K.O.Koyanagi, J.P.Khurana, S.
Raghuvanshi, N.K.Singh, A.K.Tyagi, G.Haberer, M .
Fujisawa, S.Hosokawa, Y.Ito, H.Ikawa, M.Shibata,
M.Yamamoto, R.M .Bruskiewic, D.R.Hoen, T.E.
Bureau, N.Namiki, H.Ohyanagi, Y.Sakai, S.Nobushima, K.Sakata, R.A.Barrero, Y.Sato, A.Souvorov,
B.Smith-White, T.Tatusova, S.An, G.An, S.OOta, G.
Fuks, G.Fuks, J.Messing, K.R.Christie, D.Lieberherr,
H.Kim, A.Zuccolo, R.A.Wing, K.Nobuta, P.J.Green,
C.Lu,B.C.Meyers,C.Chaparro,B.Piegu,O.Panaud,&
M.Echeverria, Nucleic Acids Res. 36 (2008)D.1028.
15) P.Jaiswal, J.Ni, I.Yap, D, Ware, W.Spooner, K.
Youens-Clark,L.Ren,C.Liang,W.Zhao,K.Ratnapu,B.
Faga, P.Canaran, M.Fogleman, C.Hebbard, S.Avraham, S.Schmidt, T.M .Casstevens, E.S.Buckler, L.
Stein, & S.M cCouche, Nucleic Acids Res. 34 (2006) D.
717.
16) S.Durinck, Y.M oreau, A.Kasprzyk, S.Davis, B.De
Moor,A.Brazma,& W.Huber,Bioinformatics.21(2005)
P.3439.

表 6：Web アプリケーション
No678

アプリケーション名

URL

1

M IPS

http://mips.gsf.de/2

INTERPRO

http://www.ebi.ac.uk/interpro/

3

PRINTS

http://www.bioinf.manchester.ac.uk/dbbrowser/PRINTS/index.php

4

PRODOMhttp://prodom.prabi.fr/prodom/current/html/home.php

5

PROSITE

http://ca.expasy.org/prosite/

6

Pfam

http://pfam.sanger.ac.uk/

7

BioM art

http://www.biomart.org/

オミックスデータベース利用法

紀要「低温科学」の変遷
・低温科學，第１輯（1944年）−第 10輯（1953年）
・低温科學．生物篇，第 11輯（1954年）−第 35輯（1978年）
・低温科学．物理篇，第 11輯（1953年）−第 53輯（1995年）
・低温科学．物理篇．資料集，第 27輯（1970年）−第 63輯（2005年）（このうち，第１輯（1944年 12月）〜第３輯（1950年 12月）は岩波書店発行，第４輯（1948年 10月）は北方出版社発行，第５輯（1950年 12月）以降は低温科学研究所発行）
・低温科学．第 64巻（2005年）〜

著作権・本紀要に掲載された論文の著作権は，北海道大学低温科学研究所に属する．
・ただし，原著者が出典を明示して再利用することは妨げない．
・また，掲載論文の一部または全部を電子的に蓄積し，北海道大学低温科学研究所が行う情報提供
サービスにより公開することがある．

2009年３月 31日
発

行

者

北海道大学

低温科学研究所〒060‑0819 札幌市北区北 19条西８丁目
URL：http://www.lowtem.hokudai.ac.jp
印刷・製本㈱アイワードｃ 2009 Institute of Low Temperature Science, Hokkaido University◯