一本鎖抗体の産業価値を高める、その特異的な検出・修飾・精製を可能とする技術
大学院工学研究院
生命機能科学部門教授 浅野 竜太郎
2023年 9月 7日
1

本技術の概要➢一本鎖抗体 (scFv) に特異的に結合する核酸アプタマーを開発。
➢scFvは、医薬品やセンシング素子として幅広く利用されているが、scFvを特異的に検出する汎用技術がないことが実用化の妨げ。
➢核酸アプタマーは修飾が容易であるため、scFvを特異的に修飾、あるいは検出できるツールを提供。
➢汎用されているペプチドリンカーである (GGGGS) ｘ 3を有するscFvの特異的な化学修飾や検出が可能。

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2

発明の背景と問題点
ペプチドリンカーで安定化

一本鎖抗体 (scFv)

Fv

抗体〇微生物で容易に調製可能〇汎用的な次世代抗体モダリティ〇低分子ならではの薬効に期待〇センサ素子としても利用〇人工抗体の構成要素として利用
scFv

scFv

scFv

Brolucizumab

Blinatumomab×均一な修飾法が未確立
×短い血中半減期×薬物動態解析等が困難
×精製用人工タグの免疫原性
×巻き戻しによる調製が低効率

scFv
TCR
Tebentafusp

Toxin
scFv
免疫毒素

scFvは、様々な利点を有し、既に医薬品としても認可されているが特異的な修飾や検出が容易でないことが問題

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3

抗scFv核酸アプタマーの応用例〇化学合成と化学修飾が容易〇内在性の抗体と区別が可能
抗scFv核酸アプタマー 〇広範囲のscFvに対して適用
蛍光物質

PEG

薬剤

イメージング能の付与

治療効果の付与

電子伝達体

Theranostics分子

薬物動態の制御

磁気ビーズ

e電気化学センサ (モニタリング) 素子

精製リガンドリンカーの抗原性を低減

巻き戻し添加剤

抗scFv核酸アプタマーは、scFvの医療応用を大いに促進し得る。

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4

scFvの検出に際しての従来技術に対する優位性➢抗体のFc領域に結合する核酸アプタマーは生体内に存在する、内在性の抗体にも結合してしまう。

➢抗イディオタイプ抗体は特定の抗体医薬しか検出できない。
➢抗scFv抗体は、均一な化学修飾等がscFvと同様に困難。
➢scFvは生体内に存在しないため、その特異的な化学修飾や検出を可能とする抗scFv核酸アプタマーは、scFvの医薬化を促進し得る。

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5本技術と従来技術との比較表
本技術

競合技術１

競合技術２構成

抗scFv
核酸アプタマー

抗Fc核酸アプタマー

抗イディオタイプ核酸アプタマー

特徴・適用

広範囲のscFvの検出、および化学修飾等による機能付与が可能。内在性の抗体と区別可能。scFvの結合と競合しない。

IgG等のFcを有する抗体の検出、および化学修飾等による機能付与が可能。内在性の抗体と区別不可。

特定の抗体の検出、 広範囲のscFvのおよび化学修飾等 検出が可能。化学による機能付与が 修飾等による機能可能。抗体の結合 付与は困難。と競合する。

報告は多数
センサ応用も多数

数件報告例

その他

競合技術３

抗ｓｃFv抗体数件報告例

Int J Mol Sci. 2020;21(16):5748 (Review)

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6競合選択による抗scFv核酸アプタマーの取得
SELEX (Systematic Evolution of Ligand by EXponential enrichment)MW
35 k -DNA library

Next
DNA library

25 k -

scFv

15 k -Fv

Selection
Purification

Repeatmultiple times
Targetprotein

Amplification byPCR
BiotinCompetitive selection
研究グループ独自技術(特許第4706019号)

scFv

Elution

抗上皮増殖因子受容体 (EGFR)
scFvとFvを大腸菌を用いて組換え調製

Fv
Blocking(BSA or human serum)

scFv-binders

Tokyo University of Agriculture and Technology7ELONAによるスクリーニング
Enzyme-linked oligonucleotide assay(ELONA)
Chemiluminescence
Avidin-ALP
ALP:

Anti-EGFR
scFv or Fv

BiotinALP
substrate

Aptamer
96-well plate

Apt A Apt B

2種のアプタマー (Apt A, Apt B) にscFv特異的な結合を確認

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8ドットプロットによる結合評価
抗EGFR scFv
抗EGFR Fv
20

105(pmol)

Chemiluminescence
Avidin-HRP
HRP

Apt A

BiotinAptamer

HRP
substrate

scFv or Fv

Nitrocellulose
membrane

抗EGFR 抗Hb 抗EGFR
Fv
scFv scFv-ST

Apt B
抗EGFR 抗CD137 抗EGFR
scFv
Fv
scFv

Apt A
Apt B
10 pmol/each

20 pmol/each

scFv特異的な結合と種々のscFvへの結合を確認

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9BLIによる解離定数の算出
Sensor tip

Reflected
lightWhitelight

Streptavidin
Biotinylated aptamer

Biolayer Interferometry (BLI)

Apt A, KD= 26 µM

2

scFv concentrations
10 µM
5 µM
3 µM
1 µM

1.8

1.7

Binding [nm]Binding [nm]

1.9

1.6
1.5
1.4

Dissociation

Association

1.3
1.2
180

240

300

Time [sec]

360

420

Apt B, KD= 17 µM

2
1.9
1.8
1.7
1.6
1.5
1.4
1.3
1.2
1.1
1

scFv concentrations
10 µM
5 µM3 µM
1 µM

Dissociation

Association180240300360420

Time [sec]Tokyo University of Agriculture and Technology 10

Anti-c-Myc-HRP

Chemiluminescence ×(10⁴ A. U.)

抗scFv核酸アプタマーの結合によるscFvへの影響
HRP

Aptamer
Anti-EGFR
scFv

c-myc

20

Apt A

1816141210864200

EGFR

1101001000

0No protein

scFv-aptamer complex
scFv: 100 nM
Aptamer: 0 nM ~ 1000 nM(Shaking at 600 rpm, 1 h, r.t.)

Chemiluminescence ×(10⁴ A. U.)

Aptamer conc. (nM)
1816

Apt B

1412108642

抗scFv核酸アプタマーの結合は01101001000 No protein
scFvの結合を妨げない (他のscFvに対しても確認済) Aptamer conc. (nM)0Tokyo University of Agriculture and Technology 11

Avidine-HRP

Aptamer

BiotinAnti-EGFR
scFv

EGFR

Chemiluminescence ×(10⁴ A. U.)

抗scFv核酸アプタマーの結合によるscFvへの影響
700
600

500
400
300
200
10001000 µM
nM
1000

nM
1 µM

Aptamer conc. (nM)

アプタマー濃度に依存したscFvの検出を確認

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抗scFv核酸アプタマーの二次構造評価
CDスペクトル測定 (pH 7.4)1616

θ×10⁻⁵ (deg・cm²/dmol)

θ×10⁻⁵ (deg・cm²/dmol)

100 mM

1210 mM
0 mM

840220-4-8Apt B

カリウム濃度

Apt A

240260280wavelength (nm)

カリウム濃度

12100 mM
10 mM

80 mM

40220300240-4260280300

wavelength (nm)-8パラレル型G4構造を示唆

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measurements is plotted versus the base staircase potential. The resulting peak-shaped voltammogram is symmetrical around the half-wave potential and the peak current is proportional
to the concentration. Excellent sensitivity accrues from the fact that the net current is larger
than either the forward or the reverse components (since the net current is the difference between the forward and the reverse currents).

scFvの電気化学計測

Square wave
voltammetry (SWV)

Cleaned gold disc electrode

AptamerFig. 52: SWV waveform.

1 µM
Thiol-modified aptamer

Assay solution
100 mM PPB+NaCl(pH7.4)10 mM Ferricyanide

SAu

Aptamer-modified
gold disc electrodeScan-2.5 to 2.5 V vs Ag/AgCl
PH :150 mV
PW :200 ms (= 20 Hz)
SH :10 mV

Fig. 51: SWV detailed diagram.

•Initial potential

AptamerSet Ewe to Ei = … V vs. Ref/Eoc/Ectrl/Emeas for ti = … h … mn … s

10 mM
6-mercapto hexanol

sets Ewe to the initial potential Ei. This potential value can be set vs. reference electrode potential or according to the previous open circuit potential (Eoc) or controlled potential (Ectrl) ormeasured potential (Emeas).
Notice that only the last point of this period is recorded at the time 0.
•

Blocked aptamer-modified
gold disc electrodeElectrodes
WE: Gold disc
RE: Ag/AgCl
CE: Pt wire

S S

S S S

Au

Pulse waveform

Scan Ewe from Ei to Ev = … V vs. Ref/Eoc/Eidefines the vertex potential as Ev, either vs. reference electrode potential or vs.
Eoc or Ei.
Ferricyanide
withpulses height PH = ... mV
pulses width PW = ... ms
step height SH = ... mV(メディエーター)

scFvへの結合がもたらすメディエーターの電極へのアクセスの影響を評価
64

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scFvの電気化学計測
scFv
ΔI = I0 - I
f.c.1000 nM

f.c.50 nM

f.c.10 nMBlank

….

50

50

403020Apt A

10403020

Apt B

100000.1

0.2

E step (V)

0.3

0.4

30

00.1

0.2

E step (V)

0.3

0.4

R² = 0.9858

25

R² = 0.991

20Δ I (µA)

60

Apt B (N=4)

25Δ I (µA)

60Apt A (N=3)

30Stirring (30min)

70Current (µA)

Current (µA)

Stirring (30min)

I0 : Peak current at blank
I : Peak current at each scFv conc.

15102015
105

500
1100log scFv conc. (nM)1101001000log scFv conc. (nM)

scFv濃度依存的なピーク電流変化を観測

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培地中でのscFvの測定
250

Current (µA)

Current (µA)

Apt B

200

100

200
150
100
50
0000.1

0.2

0.3

00.4

0.20.4E step (V)E step (V)
60

10080
R² = 0.9284

40

ΔI (µA)ΔI (µA)

LB培地を10倍希釈しscFvを添加

Apt A

300

20R² = 0.9799
60402000110100log scFv conc. (nM)

10001101001000

log scFv conc. (nM)

培地を10倍希釈することで測定可能

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実用化に向けた技術的課題と今後の展開
医薬品応用に向けた高親和性化② in silicoでの配列の組換え① 結合能を指標とした配列の順位付け

配列複製点変異③ 次世代の配列群の合成

薬剤
ペアリング

交差

④ in vitroにおける結合能評価

タンパク質―核酸間を共有結合させるリガンド
再び①へ戻り操作を繰り返す

in silico maturation法
による親和性の向上

scFvと核酸アプタマー間の化学架橋剤の利用検討

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本技術に関する知的財産権• 発明の名称：一本鎖抗体結合アプタマー• 出願番号 ：出願済み、未公開• 出願人：東京農工大学• 発明者：浅野 竜太郎、池袋 一典

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お問い合わせ先

東京農工大学先端産学連携研究推進センター
Tel042-388-7550
Fax042-388-7553
e-mail suishin@ml.tuat.ac.jp

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