2023. 8. 25 日化協LRI研究報告会

化学物質の皮膚感作性評価について～再構築皮膚モデルを用いた代替法EpiSensAの開発と活用～

花王株式会社
水町秀之
宮澤正明

皮膚感作性2 /24

アレルギー性接触皮膚炎

 感作性物質により生じる皮膚疾患
精神的影響大、社会的関心が高い

 生涯にわたる懸念
QOLの低下

ヘアカラーによる症例
https://www.caa.go.jp/

皮膚感作性は重要な安全性評価項目の一つ
動物実験廃止に対する世界的関心の高まり
信頼度の高い代替法が複数開発

動物実験における陽性/陰性を正しく予測できた割合

例）h-CLAT ・・・  花王と資生堂の共同開発

85%

 樹状細胞に着目した世界初のOECD TG試験法

既存代替法の共通課題

難水溶性物質の評価が困難(N=142)

被験物質の析出液体培地

TG: Test guideline

課題解決に向けたアプローチ

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再構築ヒト表皮モデル（3Dモデル）
3Dモデル
培養カップ培地 ヒト正常角化細胞から構成
 親油性溶媒で直接曝露が可能
 ヒト表皮に高い類似性（構造、代謝酵素 など）

LabCyte EPI-MODEL 24 (J-TEC)

F. Oesch, et al., 2014

http://www.jpte.co.jp/business/LabCyte/EPI_MODEL.html

動物実験同様の広い適用性を有するツールとして期待感作の成立においてキーとなる 「ケラチノサイトの応答」 を評価する試験として、

EpiSensA（Epidermal Sensitization Assay）を開発

Contents
I. EpiSensAの開発と評価
 感作マーカー遺伝子の選定、プロトコル
 感作性予測性能の検証
 OECDテストガイドライン化に向けたvalidation研究
II. EpiSensAを活用した応用検討 感作強度予測モデルの検討、組み合わせ評価系の構築
 感作性リスク評価への応用

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マーカー遺伝子の選定

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皮膚感作における毒性発現経路（AOP） key event 2;
ケラチノサイトにおける抗酸化応答遺伝子の発現、 およびdanger signalの伝達 (e.g. 炎症性サイトカインやATPの放出)
マーカー遺伝子選定

感作性物質もしくは非感作性物質

マイクロアレイ (n=3)

Real-time PCR(n=3)

ATF3, GCLM, DNAJB4,IL-8, HSPA6, HSPH1

ECVAM reference
16 物質
ATF3, GCLM,DNAJB4, IL-8

＜選定基準＞ • 感作性物質曝露時に有意に亢進し、非感作性物質で亢進しないこと• 皮膚感作時におけるケラチノサイトの応答との関連性• マイクロアレイとReal-time PCRでの再現性
ATF3, GCLM, DNAJB4, IL-8遺伝子は、バイオマーカーとして感作性物質と非感作性物質を仕分け可能
Saito et al., Toxicol in Vitro., 2013; 2017

EpiSensAプロトコル

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被験物質の溶解性確認
曝露に使用する溶媒をAOO, 蒸留水, 50% EtOHから選択（最も高い濃度で溶解できた溶媒ひとつを選択）

Dose finding studyAOO・・・Acetone：Olive oil=4：1

曝露時間：6h

被験物質の希釈系列を作成 (公比4)viabilityを指標に、Main studyの曝露濃度域を決定

Main study

曝露時間：6h

被験物質の希釈系列を作成 (公比2)リアルタイムPCRにより マーカー遺伝子発現を測定
陽性判定基準4つのうち少なくとも1つのマーカー遺伝子で陽性判定基準*を超える相対発現 （cell viability≧80%）*: ATF3>15-fold,

GCLM>2-fold,

DNAJB4>2-fold,IL-8>4-foldContents
I. EpiSensAの開発と評価
 感作マーカー遺伝子の選定、プロトコル
 感作性予測性能の検証
 OECDテストガイドライン化に向けたvalidation研究
II. EpiSensAを活用した応用検討 感作強度予測モデルの検討、組み合わせ評価系の構築
 感作性リスク評価への応用

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難水溶性物質における予測性（vs. マウス動物試験 LLNA）

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EpiSensAEpiSensA

DPRA

KeratinoSens

h-CLAT

陽性・陰性を判定できた物質数

69/69

68/69

64/69

37/69

67

感度 (%)

83 (43/52)

50 (26/52)

60 (29/48)

100 (27/27)

94 (46/49)

特異度 (%)

65 (11/17)

63 (10/16)

13 ( 2/16)

0( 0/ 10)67 (12/18)

一致率 (%)

78 (54/69)

53 (36/68)

48 (31/64)

73 (27/37)

87 (58/67)*(水溶性物質)*：LogKow ≧ 3.5の被験物質は「陰性」と結論できない (OECD TG 442E)

 既存代替法に適用できない難水溶性物質でもすべて判定可能
 水溶性物質と同様に高い予測性

被験物質の溶解性に関わらず広い適用範囲と高い予測性
OECD GL 497; Urbisch et al., 2015; Jaworska et al., 2015; NICEATM LLNA database, 2013

Contents
I. EpiSensAの開発と評価
 感作マーカー遺伝子の選定、プロトコル
 感作性予測性能の検証
 OECDテストガイドライン化に向けたvalidation研究
II. EpiSensAを活用した応用検討 感作強度予測モデルの検討、組み合わせ評価系の構築
 感作性リスク評価への応用

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OECD TGに向けた国際Validation研究（2018.7~）

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・ 主導：JaCVAM (日本動物実験代替法評価センター)、 委員長 : 小島 肇 先生
・ 参加施設 ： (一財)食品薬品安全センター、 (株)コーセー、 ライオン(株)目的開発機関だけでなく、複数施設のデータに基づいたプロトコルの最適化、頑強性の証明⇒ 検証の手段として、施設内/施設間の再現性を確認

12物質を使用
物質名を伏せて1回

施設A
2回目

3回目

コード 結果コード 結果コード 結果

m15

E
RaPN
PPiii
xiv

QP
P: 陽性N 〇P 〇
P ×…
…

uN
PN

G…

d…

12
3

1回目…

 施設間再現性：
80% (27物質)

被験物質

xii

P 〇

N: 陰性

被験物質

施設A

施設B

施設C

12NNN
PN
P〇
×…

15物質を使用
物質名を伏せて 3回 繰り返し…

 施設内再現性：
85% (15物質)…

施設間再現性 (Phase II)…

施設内再現性 (Phase I)…

目標値の設定

1112P
PP
PPP〇
〇

Phase Iと合わせて27物質で評価

Phase I の結果まとめ

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P: 陽性

Lab.A
Lab.B
ChemicalNo.
Set 1 Set 2 Set 3 Set 1 Set 2 Set 3

N: 陰性

Lab.C
Set 1 Set 2 Set 31PPPPPPPPP2NNNNN

NNPN

3PN

NPPPPPP4PPPPPPPPP

5PPPPPPPPP6NNNNNNNNN

7NNNNNNNNN

8NNNNNNNNN

9PPPPPPPPP

10PPPPPPPPP11N

N

NN

NPNN

P

12PPPPPPPPP

13PPPPPPPPP

14PPPPPPPPP15PPPPPPPPP Phase I における施設内再現性
Lab.A: 93% Lab.B: 93%

Lab.C: 87%

目標値(85%)を全施設で達成

 追加試験の実施基準などを明確化するようにプロトコル微改訂

Phase II

Phase I

Phase II 試験結果 および 施設間再現性
Chemical No.
123456789101112131415161718192021222324252627Lab.AP
N
NPPN
N
N
PPN
PPPPN
PN
PP
PP
PPPPPLab.B
PN
PPPN
N
N
PP
N
P
PPPP
N
N
PPPPP
P
PPP

Lab.C
PN
PPPN
NNPPN
PPPPPPN
PPPPPPPPP 施設間再現性 89% (24/27) となり、目標値（80%）を達成
 再現性が取れなかった3物質はいずれも陽性基準値近傍の応答であり、再現性を取るのが難しかったと考察

 曝露操作手順を明確化するようにプロトコル
微改訂

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Validation report

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 約100ページの本文＋12のAppendix からなる試験評価報告書としてまとめ- Validation試験および運営委員会の全体像- 試験法の定義、科学的妥当性と根拠- プロトコルの移譲性- 施設内/施設間再現性- 予測性- 適用範囲、適用限界
etc.

 2022年にvalidation report の第三者評価であるPeer review を実施
 2023年4月にvalidation report およびpeer review report が OECD にて採択
 現在、専門家会議にてDraft TGを審議中（TGとしての承認は2024年以降）

Contents
I. EpiSensAの開発と評価
 感作マーカー遺伝子の選定、プロトコル
 感作性予測性能の検証
 OECDテストガイドライン化に向けたvalidation研究
II. EpiSensAを活用した応用検討 感作強度予測モデルの検討、組み合わせ評価系の構築
 感作性リスク評価への応用

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EpiSensAによる感作強度予測の検討- 低濃度での曝露であっても陽性（感作成立）⇒ 強感作性

強度の考え方GHS Cat.1A

EpiSensA Min EC (%)

Cat.1B
Weak

101

 UN GHS分類においては、
動物実験LLNAにおけるEC値を基準に強度を分類

LLNA 測定値- 高濃度での曝露のみで陽性（感作成立）⇒ 弱感作性

EpiSensA陽性 89物質
10015 /24

陽性
基準
EC値

濃度0.1

 EpiSensAにおけるEC値：4つのマーカー遺伝子におけるEC値のうち最小のもの (Min EC)

0.01

過大評価、過小評価が小さくなる閾値を探索
Strong

0.001
0.001

0.01

0.1

12%

LLNA EC3 (%)

10100

EpiSensAによる感作強度予測の検討- 低濃度での曝露であっても陽性（感作成立）⇒ 強感作性

強度の考え方

EpiSensA Min EC (%)

GHS Cat.1A

Cat.1BWeak

過小評価

9%10(9/89)

1

 UN GHS分類においては、
動物実験LLNAにおけるEC値を基準に強度を分類

LLNA 測定値- 高濃度での曝露のみで陽性（感作成立）⇒ 弱感作性

EpiSensA陽性 89物質
10016 /24

陽性
基準
EC値

濃度

 EpiSensAにおけるEC値：4つのマーカー遺伝子におけるEC値のうち最小のもの (Min EC)

0.1
0.01

過大評価、過小評価が小さくなる閾値を探索

過大評価

7%

Strong

0.001
0.001

0.01(6/89)

0.1

12%

LLNA EC3 (%)

10

100

0.1%近傍で仕分けをすることで高い強度予測性を達成可能

EpiSensAを用いたDefined approach17 /24

感作メカニズムは複雑、ひとつの試験だけでは適切な予測は困難⇒ ・ in vitroもしくはin silicoを用いて明確に定義された組み合わせ法 (DASS)が必要
・ いずれかのKey event(KE)をカバーすべき (最低でも一つ)Supporting document for evaluation and review of draft Guideline (GL) for Defined Approaches (DAs) for Skin Sensitisation, OECD, 2019

 KE1 : タンパク質との結合 ・・・ DPRAなど
 KE2 : ケラチノサイトの応答 ・・・ EpiSensA
 KE3 : 樹状細胞の応答 ・・・ h-CLATなど

難水溶性物質への適用に課題
被験物質の溶解性に依存しない方法が必要⇒ in silico modelに着目

KE2をベースとし、in silico modelと組み合わせたDASS ⇒ RTS (RhE-based Testing Strategy)
・ RTS v1: EpiSensA + TIMES-SS(有償モデル)

・ RTS v2: EpiSensA + OECD QSAR Toolbox(無償モデル)＜共通の特徴＞
 化学構造（SMILES など）から予測
 皮膚透過時の酵素代謝などを考慮
 皮膚中タンパク質との結合を判定

RTSの予測モデル

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EpiSensA と in silicoモデルによる Simple score-based system
Score

EpiSensA

in silico*

3Strong-2-

Strong1

Weak

Weak0

NS

NS*: QSAR toolboxではLLNA予測結果を基に分類

RTSにおける強度予測
GHS Cat.1A : 5~4
GHS Cat.1B : 3~2
GHS NC: 1~0

Contents
I. EpiSensAの開発と評価
 感作マーカー遺伝子の選定、プロトコル
 感作性予測性能の検証
 OECDテストガイドライン化に向けたvalidation研究
II. EpiSensAを活用した応用検討 感作強度予測モデルの検討、組み合わせ評価系の構築
 感作性リスク評価への応用

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皮膚感作性リスク評価（QRA: quantitative risk assessment）

Gilmour et al., 2020
IDEA project, 2016
Api et al., 2008, 2020

 感作性：閾値・強度がある毒性 → 定量的リスク評価可
LLNA EC値 (%)
RTSによる強度予測

PoD (μg/cm2)(EC3 % × 250)
LLNA 被験物質曝露量25 μL/ 1 cm2

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AEL (μg/cm2)

AEL / CEL ≧1→ リスク低(感作評価係数を適用)

 Point of departure (PoD: 容量反応から得られるアセスメント基準値) 決定はリスク評価において重要
 PoDは許容曝露量（AEL）に換算、AELは消費者曝露量（CEL）と比較(Acceptable Exposure Level)(Consumer exposure level)

 PoDはLLNA EC値(%)から推算可能動物を用いないリスク評価において、RTSによるEC値の予測（強度予測）は有用

RTS による皮膚感作性リスク評価
Score3210

EpiSensA
StrongWeak
NSin silico
StrongWeak
NS21 /24

RTSにおける強度予測
GHS Cat.1A : 5~4GHS Cat.1B : 3~2GHS NC: 1~0<UN GHS分類の定義>
GHS Cat.1A: LLNA EC ≦ 2%
GHS Cat.1B: LLNA EC > 2%
GHS NC: LLNA 陰性 (EC>100%)

RTSの強度予測結果から、保守的に見積もったEC値を設定可能
RTS予測

保守的EC値 (%)

PoD (μg/cm2)

AEL* (μg/cm2)

GHS Cat.1A

設定不可--GHS Cat.1B

2500

5GHS NC100

25,000250*: 感作評価係数 = 100の場合e.g.) RTS v1により GHS Cat.1B と予測された香料 Farnesol をフェイスクリームに0.1%配合する場合、製品の消費者曝露量**：2.73 mg/cm2/day ⇒ 香料のCEL=2.73 μg/cm2
AEL / CEL = 1.83

≧1となり、懸念は小さいと考えられる(RTS v2でも同様の結論)**: 12th SCCS Notes of Guidance、2023

Conclusion
 難水溶性物質を含む広い適用範囲と高い予測性を確認
 OECDテストガイドラインを目指したvalidationは終了し、reportがOECDに採択
 感作強度予測に対する有用性を確認
 RTSによる強度予測は感作性リスク評価に有用

EpiSensAは既存代替法の共通課題に対して有用な試験法
強度予測が可能なRTSの構築により感作性リスク評価への応用も期待

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謝辞＜Validation運営委員会＞
国立医薬品食品衛生研究所, JaCVAM•

小島 肇 (JaCVAM representative, Chair, QC manager)•足利 太可雄

東京理科大学•寒水 孝司（一財）化学物質評価研究機構•武吉 正博

海外メンバー※敬称略

23 /24＜Validation参加施設＞（株）コーセー•水野 誠 (Study director, 2020年4月～）•

今井 教安 (Study director, ～2020年3月）•

佐久間 めぐみ•

芝田 桃子（一財）食品薬品安全センター秦野研究所•

渡辺 美香 (Study director)•

生悦住 茉友 (~2020年3月)•

梶原 三智香 (2020年4月～)•

安田 美智代 (2020年4月～)•

David Basketter (DABMEB Consultancy Ltd.)•

Chantra Eskes (SeCAM)•

Sebastian Hoffmann (seh consulting + services)•

渡辺 真一 (Study director)•

David M. Lehmann (U.S. EPA)

•

上野 順子

ライオン（株）謝辞※敬称略

日化協LRI 事務局•

稲若 邦文 (住友化学株式会社)•平井 祐一 (日産化学株式会社)•

長井 大地 (日本化薬株式会社)•須方 督夫 (住友化学株式会社)•事務局の皆様

４期（第6期～第9期）に渡り多大なるご支援を頂きました。
厚く御礼申し上げます。

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