厚生労働省「精神・神経疾患研究委託費」

筋ジストロフィーに関連する疾患の病態解明と治療法の開発に関する研究清水班
平成14〜16年度研究報告書

平成17年3月（2005年）

研究報告書の作成にあたって

本報告書は，平成14〜16年度に行われた「筋ジストロフィーに関連する疾患の病態解明と治療法の開発に関する研究（14公一4）」の最終報告である．
当研究は，基礎医学・臨床医学関係の38名の分担研究者（公募）とともに行われ筋ジストロフィー関連疾患の克服のためfunctionalgenomicsを重視した以下の3側面から推進した・①診断研究；未解明筋疾患責任遺伝子／蛋白の機能解明と遺伝子／蛋白診断法，②病態研究；疾患に関連する遺伝子／
message／蛋白の病態と表現型との関連，疾患責任遺伝子異常に併発する他分子の発現／機能の変化と臨床病態との関連，③治療の開発；薬物治療の開発と遺伝子／細胞治療への基盤研究・これらを定例班会議に加え，実務者による目標設定型smallgroupworkshopを企画し重点研究の促進を図った・
その結果，診断・病態解明分野で，DMDrBMDに関連してβ−dystroglycanの細胞内ドメインに結合す
る情報伝達系MAGI−1／β−CateninrTtfの細胞死への関与，肢帯型に関連し日本人41家系dysftrlinopathyの遺伝子異常・表現型の集計遠位型に閑達し日本人44名のDMRVの遺伝子（GNE）異常と表現型の集計，
先天性筋ジストロフィーに関連して日本人独特の福山型筋ジストロフィー，mSCle−eye−brain病，vhlker−Wafburg症候群の責任遺伝子と0・mannOSeglycan生合成障害機序の解明・筋緊張性ジストロフィーのRNA仮説（CUG／CCUG結合蛋白の発見とRNA発現機能障害）の提唱，その他collagenopathy・
selenoprotein−N（SEPN）relatedmyopathy・Schwarz−Jampel症候群などの分子病態解明が行われた・特に・
先天性筋ジストロフィーの分子病態解明に長足の進歩があった．
治療面で軋DMDに関連してgentamicinの代替えread−through薬（negamycin），小欠失エクソン部
分のスプライシング促進オリゴヌクレオチド薬（AS−01igo，ENA／RNAchimera），成熟筋からの安全で容易な幹細胞誘導薬（Msx−lcDNA）が，肢帯型に関連してsarcoglycanopathy（LGMDs2C−F）でのβ−dystroglycan分解阻止薬BPHA，CaVeOlinopathy（LGMDIA）でのmyostatin阻害薬（myostatinprodomin）・
collagenopathyでのRNAdecay阻害薬などが開発され・検討段階にきた■特に・AS−01goではexon20
を欠失した一名のDMA患者でのトライアルが始まった．慎重な検討を加え臨床応用への道を強く促進する時が来ている．
反省として，FSH型，肢帯型の約1／3，ミトコンドリア脳筋症の病態研究が進んでいない点があげられる．また，近い将来到達すべき点として，福山型の責任蛋白fukutinの機能の最終決着，筋緊敵性ジストロフィーのRNA仮説の検証，DMl）／BMDの細胞死に関する分子病態機序（β−dystroglycan関連情報伝達系）の解明があげられる．
最後に，永年にわたり研究の促進に甚大な努力をされている日本筋ジストロフィー協会理事長河端静子氏，様々なご助言をいただきました前国立精神・神経センター武蔵病院長埜中征哉先生，国立精神・神経センター名誉総長・筋ジストロフィー総合班班長杉田秀夫先生に深謝するとともに，当班の幹事として努力された栗原照幸東邦大学教授および石浦章一東京大学教授，斉藤加代子東京女子医大教授．佐橋功愛知医科大学教授，瀬原淳子京都大学教授，戸田達意大阪大学教授，西野一三国立神経研究所部長，松田良一東京大学助教授，吉田幹晴国立神経研究所室長に感謝申し上げる次第である・

平成17年3月
主任研究者 帝京大学医学部神経内科主任教授 清 水 輝 夫

目次

平成14〜16年度総括研究報告

1

分担研究報告Ⅰ．LGDM（肢帯型筋ジストロフィー）

15

Ⅱ．FCMD（福山型先天性筋ジストロフィー）

49

Ⅲ．OPMD（眼咽頭筋ジストロフィー）およびミオパチー

61

Ⅳ．遠位型筋ジストロフィー，Emery−Dreifuss症候群、DMRVなど

79

Ⅴ．DMD／BMD、およびジストロフィンその他

91

Ⅵ．先天性ミオトニー、筋強直性ジストロフィー、治療法の開発

117

Ⅶ．骨格筋形成、壊死、アポトーシス

135

Ⅷ．ミトコンドリア異常症と治療

155

Ⅸ．筋ジストロフィー骨格筋の酸化ストレス、耐性系、遺伝子治療など

169

Small Group Workshop
Summary
平成14〜16年度 班員名簿

175

195

201

平成14〜16年度

総 括 研 究 報 告

総 括 研 究 報 告主任研究者 清 水 輝 夫

筋ジストロフィー関連疾患の診断／病態研究と治療法の開発について，診断研究（筋疾患関連遺伝
子／蛋白の解明と診断法の確立），病態研究（病態関連遺伝子／産物の分子病態と表現型との関わり），治療法開発（薬物治療と遺伝子／細胞治療への基盤研究）の3側面からアプローチした．
1．DMD／BMD関連；治療面で，1）小欠矢のexon内に存在するスプライシング促進配列に相補的なantisense oligonucleotide（AS−01igo）の導入により，欠失exonをスキップしたinframe trunCateddystrophin mRNAを発現させられることが示された．3種の変異症例の培養骨格筋細胞への投与でdystrophin発現が確認でき，一例のDMD患者で臨床応用へと進んだ．Exon20の欠失例で，eXOn19のsplicing促進配列に相補的に結合するAS−01igoを，週1臥0．5mg／kg，2時間点滴静江で4回投与した結果，3週目から末梢血リンパ球にdystrophinmRNAの発現が観察され，血清CK値や筋力には変化がなかったものの，5週目の筋生検でdystrophinの発現がわずかに観察された．副作用もなく今後の検討が必要だが，有望な治療法の可能性がある．2）細胞治療への基盤研究として，胎児，肝・骨髄・臍帯血からよりも簡便，安全，容易にえられる幹細胞を探求した結果，マウス成熟筋にホメ
オボックスの一つMsx−l cDNAの導入により効率良く，骨細胞・脂肪細胞・骨格筋に再分化可能な幹細胞が得られた．コントロールマウスの前脛骨筋にMsx−lcDNAを直接注入すると，1−2週間で豊富な幹細胞がえられ，筋ジスモデル動物mdxマウス前脛骨筋に移植すると，3 ケ月にわたって
dystrophin発現移植細胞が筋線経を形成・生存していた．拒絶反応は乏しく，適切なdrug delivery
systemにのせると有用な治療法の可能性がある．3）点変異の下流にできたstopcodonの読みとばし薬として，欧米で試みられるアミノグリコシド系抗菌薬（gentamicin，amicacin）には副作用の点で難点があるため，その代替え薬物を探した．その結果，日本独自に開発された古いdipeptide系抗菌薬negamycinが培養細胞系，mdxマウスへの投与にて，副作用が少なく，約10％のdystrophin発現がえらることが判明した．Negamycinは開発の段階で中断され実際には市場にでなかった経緯から，その供給に不安定要素があり，現在その類似体を含め検討を継続している．米国ではgentamicin類
似物質からPTC124を兄いだし，その経口摂取による治験が開始される動きがある．いずれにしても，上記3者1），2），3）はいずれも臨床応用への可能性が高いと考えられる．
病態面では，DMD侶MDの重症化に筋細胞死の進行があげられ，従来，膜直下の細胞骨格成分
dystrophinの先天的欠損で膜の脆弱性がある上に，筋収縮などストレスにより膜が断裂して細胞外Caイオンが流入して細胞死が生じると考えられてきた くCa説）．この過程で何らかの機序により筋形質膜の内外（細胞骨格とラミニン）を連結する架橋構造の中心α，β−dystroglycanの崩壊が起こっていることがわかっていた．今回，膜貫通成分であるβ−dystroglycanの細胞内ドメインにMAGI−1／
β−Catenin／Tbfsignaltransduction系が結合しており，その欠損により細胞死をきたすことが判明した．
筋ジスでの筋細胞死の具体的分子機構の解明の糸口が兄いだせた点で大きな進歩と考える．
2．LGMDs関連l）dysfbrlinopathy（LGMD2B）関連；①2B型の原因蛋白dysfbrlinの機能には筋形質膜に存在するCa
結合蛋白質であるという以外に，細胞内小胞体系（LAMP＿1陽性小胞＝リソソーム，後期エンドソー
ム，ゴルジ体，小胞体）に存在して形質膜との融合や筋丁管系にも局在してECカップリングに関係する機能があることが指摘された．これに関係して，dysftrlinがsyntaxinやSNA25と結合し，Ca依存性にAAATPaseであるVCPと複合体を形成，形質膜修復やゴルジ体の膜融合・膜輸送への関与が示唆された．②遠位型と肢帯型の両型をしめすdysftrlin異常症の日本人41家系44人（遠位型）と23家系26人（肢帯型）の遺伝子解析結果と臨床的特徴の集計が出され，遠位型で28種，肢帯型で12種（うち5種は共通）が兄い出され，遠位型ではC1939G，G3370T，3746delG，4870delTが多く，特に3746delGは肢帯型にはみられなかった．他方肢帯型ではG3370T，4870delTが多く，両者
ー3−

ともG3370T変異で発症年齢が遅い傾向があった．しかし，変異型と臨床的重症度の間で強い相関はなかった．Dysfbrlin異常症（遠位型，肢帯型）の臨床像についてまとめ，診断指針を作成する方針である．③dysfbrlinopathy筋変性機序としてSRstress仮説（dysfbrlin欠損→SRstress→JNK／Caspase12の活性化→筋細胞死）が提唱された．④炎症性筋疾患モデルSJL／Jmouseがdysftrlin欠損症であることが示され，tyPeIfiberatrophy，中心核，細胞浸潤，筋内運動神経の脱髄（神経原性変化），が経時的に出現すること，浸潤細胞はmacrophageが60−70％，CD4陽性T細胞が15−25％，CD8陽性T細胞が10％であり，ヒトのdysfbrlinopathyとの形態的相違が明かされた．
2）sarcoglycanopathy（LGMD2C〜2F）関連；特異的病態としてβ−dystroglycan43kDaが膜外ドメイン
で膜型matrixmetalloproteinaseの分解をうけ，膜貫通ドメイン・膜内ドメイン30kDaと断端13kDaに分解をうけることが判明し，invivoでは，その阻害薬BPHAによってこの分解過程が抑えられることから治療の可能性が提唱された．この筋崩壊機序はDuchenne／Becker型でも存在するが，sarcoglycancomplexが二次的に崩壊されてから生じると考えられる・それ以外の筋疾患には福山型を含め存在しない．従って，SarCOglycanopathyの進行予防薬として有用である可能性がある．
3）caveolinopathy（LGMDIC）関連；myostatin（45kDa）活性抑制薬が筋増大をきたすため治療薬として
米国では抗myostatin抗体の点滴静江による筋ジストロフィー群の治験が開始される動きがある・しかし，抗体を打ち続けるには難点があるため，別のmyostatininhibitorの検索をしてきた．その結果，fbllistatinおよびfbllistatin−relatedgene（FLRG）の2種の蛋白質およびmyostatinprodomain（30kDa）がmyostatinreceptorと結合して強力な機能抑制効果があることが判明した・今回，LGMDICの原因蛋
白質caveolin−3の変異型（PlO4L）のtransgenicmouseにmyostatinprodomain過剰発現マウスを交配して得られたdoubletgmouseで検討してみたところ，変異caveolinmRNAとprodomainmRNAの発現が強くみられたが変異caveolin−3の筋内発現はなかった（dominantnegative）．それにも関わらず，ミオ
パテー変化の改善，骨格筋線維数の増大，軽度肥大化がえられ，トレッドミル試験でコントロール
マウス同様の走力改善がみられ，LCMDIC型の有力な治療法の可能性がえられた．
4）collagenVI異常症；collagenVIは筋基底膜の外周，COllagenIVのさらに外側に存在する成分であるが，このαsubunitの遺伝子異常により2つの病型；Bethlemmyopathy（常優，遠位関節の拘縮を伴う緩徐進行性）とUllrichmyopathy（常劣，近位関節の拘綿と遠位関節の過伸展を伴う緩徐進行性）をきたすことが判明した．その遺伝子異常と発現型との関係は未解明である．26塩基のホモの欠矢があり，フレームシフトが起こって下流にpremature termination codonが出現しているUllrich
myopathy患者の線維芽細胞を用いて，カフェイン，WOrtmannin，SiRNAによりnonsense−mediatedmRNA
decayを抑制したところ，変異collagenαを含むcollagen3量体が細胞外へ分泌され細胞外マトリックスへ取り込まれ 一部の機能回復（fibronectinreceptorの増加や細胞遊離性の冗進）がみられた．
従って，StOpCOdonを有する遺伝疾患一般の治療法として有望と考えられた．
3．先天性最重症型筋ジストロフィー関連l）Muscle−eye−brain病（MEB）の原因遺伝子／蛋白質POMGnTl（Ser／Thr−mannOSeにGIcNAc添加する酵素）が解明され，Finlandのみでなく日本を含む全世界に分布する13種の点突然変異が報告された．いずれも酵素活性は完全消失（lossoffunction）・していた．
2）最も重症な先天性筋ジスであるⅥblker−Warburgsyndrome（WWS）の原因遺伝子が下等動物で見つかっていたpmt（Serrrhrにmannoseを添加する酵素）の相同遺伝子POMT（protein0−mannOSyltransftrase）であることがオランダで報告されたが，ヒトを含む高等動物での研究がなく実態が不明であった．ヒトを始めとする哺乳類での検討を行った結果，POMTlとPOMT2の2成分の存在が必要で，臨床的WWSの約10％がPOMTlの遺伝子異常（点変異）によることを確認した．その糖添加酵素活性のアッセイ系を確立し完全消失（lossoffunction）であった．MEBとWWSについて遺伝子診断，生化
学的酵素測定での診断が可能となった．なお，約9割の臨床的WWSについては未解明である．
3）遺伝子異常が解明されたMEBとWWSについては，いずれもα−dystroglycanDGの糖鎖異常が存在しラミンニンとの結合不全が明らかとなり，両者は a DG の 0−mannOSyl
glycan（Sia−Ga1−GIcNAc−Mann−Ser／thr）の合成障害→1aminin−αDG結合不全→筋細胞死が支持された．福山型についても同一のαDG糖鎖異常・．laminin−αDG結合不全が確認されているので，これら3疾患
はα−dystroglycanopathyである．
−4−4）日本に独特の福山型先天性筋ジストロフィーFCMDの責任蛋白質fukutinの生理機能について，
餌kutinはそのN未でゴルジ体膜に存在する成分で，糖添加活性はなく，MEBの責任蛋白質である
POMGnTlに結合する成分であることが判明した．N未を欠失するとゴルジ体ではなく小胞体に移行する．Fukutin機能の最終決着が必要である．
5）FCMD，MEB，WWSの類縁3疾患は確実な遺伝子診断が可能となったので，確実症例の集計を行い臨床診断指針を作成する必要がある．
6）FKRp遺伝子異常を有し，精神発達正常な先天性筋ジストロフィーの日本人女児一名がイギリス，
チュニジア，トルコ以外の日本で始めて発見された．大脳異常はないが小脳に多発小嚢胞をみとめ，福山型に準ずる臨床症状で，αDG糖鎖異常を伴っていた．
7）古くから知られるdystrophychickenのα−dystroglycanの糖鎖が検討され0−glycanのシアール酸付加に障害が確認され，福山型，MEBと類似の病態を有すると判断され，福山型関連疾患の自然発
症動物モデルがみつかった．欧米で検討されているWWS，FKRP異常症，LARGE異常症とともに当班で行われた福山型，MEB，WWS，dystrophychickenは，いずれもα−dystroglycanの0−mannOSeglycanの合成障害→lamininとαDGの結合不全を共通の病態としてもち，α−dystroglycanopthyを呈する疾患群ができつつある．
4．Distalmyopathywithrimmedvacuoles（DMRV）
諸外国の遺伝性封入体ミオパチーHIBMの原因遺伝子GNE（UDP−GIcNAc2epimerase／ManNAc
kinase；シァル酸合成関連酵素）の異常であることが判明し，その日本人66名（4施設）の臨床病型が集計された．その結果，25種の変異（missense変異23，nOnSenSe変異2）が，分子全領域に生じ，特別のhotspotは存在しない，V572L変異が最も多く，31名はこのホモ接合体であり，次いでD176V
変異が多かった．発症の平均年齢は25．4歳，ほとんど下肢遠位部前脛骨筋からの発症で，近位部もかなり早期からおかされるが大腿四頭筋は保たれる．平均歩行可能期間は9．4年，重篤な心機能障害例が4例存在した．血清CK値は91％で上昇し，20％は1，000IU几以上の高値であった．本疾患の診断指針を作成予定である．筋糖蛋白質のシアール酸異常など分子病態について一部でシアール酸低下が報告されるも今後の課題である．
5．ミオトニア症候群関連
1）筋緊張性ジストロフィーDM（DMl＝DMPKのCTGリピート病，DM2＝ZFF9のCCTGリピート病）の骨格筋では，インスリン受容体，NMDA受容体，Clチャネル，Six5，リアノジン受容体，
筋小胞体 Ca−ATPase（Sercal），タウ蛋白，amyloid precursor protein，心筋トロボニンT，
myotubularin−relatedproteinlなど多数の蛋白質が幼弱型であり，これらの発現レベルでスプライシン
グ異常をきたし様々な臨床症状に関与することが判明した．その機序として，DMl，DM2の遺伝子にみられる非翻訳領域でのCTG，CCTGリピートの異常伸長の結果できるmRNAの異常伸長部に強固に結合する蛋白CUG−BP，MBNLl，2，3が同定され，これらが本来もっているRNAsplicing機能が異常伸長部にトラップされるため多数のRNAsplicingに影響を及ぼす結果，多くのmRNAが幼弱型を発現させる機序が解明された（RNA機能障害仮説）．異常伸長リピートがどの遺伝子に存在するかは疾患発症とは無関係であると推測された．
2）Schwartz−Jampel症候群が，筋基底層蛋白perlecanの遺伝子異常による部分欠損症であることが判明し，神経筋接合部でのαDG−Perlecan−AchE機能が低下することが示された．
6．ミトコンドリア脳筋症
ミトコンドリア異常症；MELAS，MERRFの主要mtDNA変異である3243変異，3271変異，8377
変異から複写される変異tRNAにはtaurineが結合していないことから，高濃度taurine療法の開発をすすめており，変異tRNAをもつサイブリッド細胞培養を数mM taurine存在下で膜電位，ミトコ
ンドリア形態，呼吸機能のみでなく蛋白合成能にも明白な改善がみられ，MELAS，MERRFの治療薬として有用である．

ー5−

7．その他
1）筋接着因子1aminin−integrinに結合する細胞内シグナル伝達系としてILK−リン酸化afrin−Racl／Cdc
42が同定され，筋原線経のactinfilamentの形成，fibroblast接着，血小板病集に関与することが解明された．
2）PTDFNK；筋細胞死の一つの有力機序としてapoptosisが考えられ，その抑制薬候補としてBc12の改造蛋白PTDFNKが開発され，スタウロスボリン，グルタミン酸，虚血による細胞死をいずれも効率良く低濃度（pM）で抑制できた．各種細胞死予防薬として有力である・
3）筋発生のnegativeregulatorであるmyostatinの抑制薬として抗myostatin抗体が米国で開発されつつあるが，本研究班では高分子蛋白質であるfo11istatinやfbllistatin−relatedgene（FLRG）．ペプチドであるmyostatinprodomainが開発され，種々の筋疾患への効果判定を動物実験できる段階に来ている・
4）先天性ミオパチ一に属するSEPN（Selenoprotein N）−related myopathy，すなわちrigid spine
syndrome，multiminicoredisease，desmin−relatedmyopathyが筋小胞体蛋白質selenoproteinlの遺伝子異常で発症すること，悪性高熱／centralcorediseaseが筋小胞体蛋白質ryanodinereceptorの遺伝子異常で発症すること，X−linkedmyotubularmyopathyが脱リン酸化活性をもつmyotubularin（MTMl）の遺伝子異常で発症することなど新たな筋疾患責任遺伝子が日本人家系で報告された．
8．問題点と今後の研究
1）FSH型について遺伝子診断まではできるがその分子病態解明・治療開発は滞っている．先天性筋ジストロフィーについては，MEB，約10％のWWS，FCMDの遺伝子異常，分子病態解明に大きな進歩がえられ，fukutinがゴルジ体膜でGIcNAc添加酵素POMGnTlに結合して作用する非酵素であることまでは解明したがその最終的生理機能の解明には至っていない．また，αDG糖鎖合成の第3，4段階の酵素Gal−T，Sia−TやLarge，FKRp，ジストロフィー鶏の実態解明と筋ジストロフィー発症との関連，先天性筋ジストロフィーでの脳奇形，眼奇形発症機序の解明が必要である．
2）DMDIBMD，LGMDsの2／3，筋緊張性ジストロフィーの原因遺伝子の解明がなされ遺伝子診
断・蛋白質診断が正確に可能となったが，治療薬開発の観点から筋障害の分子病態の解明に一層の努力が必要である．
3）negamycin，AS−01igo，myOStatininhibitors（抗体，follistatin，fo11istatin−relatedgene，myOStatinprodomain），
Msx−1誘導幹細胞，taurineなど有望な治療薬候補が出されており，今後その臨床治験への具体的方策を探る．
4）ミトコンドリア脳筋症の分野にみるべき成果がなく，特に核由来遺伝子異常症の解明に遅れが出ている．
5）遺伝子診断で確定できるいくつかの筋ジス病型（dysfbrlinopathy，distalmyopathywithrirmmed
vacuoles，FCMD／MEBIWWS）の診断指針を作成，社会に公表する必要がある．
9．倫理面の運用「ヒトゲノム・遺伝子解析研究に関する倫理指針（平成13年3月29日文部科学省・厚生労働省・経済省告示第1号）」，国立精神・神経センター倫理規定を遵守し，各研究施設の定める倫理規定にもとづいた倫理委員会の承認を得るものとしている．

−6−

分 担 研 究 報 告目次

Ⅰ. LGMD(肢帯型筋ジストロフィー)
1) 血清抗giantin抗体陽性の肢帯型ミオパチー

17

愛知医科大学医学部神経内科

佐

橋

功

2）筋特異的カルパイン・コネクチンを中心とするネットワークと肢帯型筋ジストロフィー症の病態機序
東京都臨床医学総合研究所酵素機能制御研究部門

19

反

町

洋

之

3）筋ジストロフィーモデルマウスにおけるマトリックスメタロプロテアーゼ遺伝子発現の検討
23
川崎医科大学神経内科

砂

田

芳

秀

芳

秀

4) 変異caveolin‑3トランスジェニックマウスにおける肥大型心筋症の発現
川崎医科大学神経内科

砂

田

25

5) Myostatin prodomainによる変異caveolin‑3トランスジェニックマウス表現型の改善
川崎医科大学神経内科 砂 田 芳 秀

276) 筋ジストロフィーの分子発病機序としてのmatrix metalloproteinaseによるdystroglycan複合体の崩壊に関する研究29

帝京大学医学部神経内科

清

水

輝

夫

7）遺伝子二重変異筋ジストロフィーマウスの作成と解析による病態の解明

31

国立精神・神経センター神経研究所モデル動物開発部 荻 原 康 子

8) Calpain3の筋線維内局在33

国立精神・神経センター神経研究所疾病研究第一部 西 野 一 三9）新しいサルコグリカン分子の組織発現と機能に関する研究

34

国立精神・神経センター神経研究所遺伝子疾患治療研究部 今 村 道 博

10）サルコグリカン異常症：日本人における原因サブユニット，遺伝子変異，及び免疫組織化学染色パターンの再検討
国立精神・神経センター武蔵病院 南

36

成 祐

11) 日本人dysferlinopathyにおける遺伝子変異と臨床型の特徴

38

東北大学医学部神経内科 青 木 正 志12) SJLマウス骨格筋における遺伝子発現解析

40

東北大学医学部神経内科 青 木 正 志913）筋ジストロフィー発症機構の理解をめざす関連タンパク質の分子論的研究

42

国立精神・神経センター神経研究所 吉 田 幹 晴14) 三好型筋ジストロフィー(LGMD2B)責任遺伝子産物ジスフェルリンと(ER)ストレス発生の機構

44

国立精神・神経センター神経研究所疾病研究第五部 桃 井隆15) SJL/Jマウス骨格筋における炎症性細胞とNF kappa B発現の経時的検討
東邦大学大橋病院神経内科

栗

原

46

照

幸

Ⅱ. FCMD(福山型先天性筋ジストロフィー)
16) 福山型先天性筋ジストロフィーにみられるてんかんと遺伝子異常との関連
神戸市総合療育センター小児神経科

吉

51

岡

三惠子

田

達

17）福山型筋ジストロフィーおよび類縁疾患の遺伝子異常と蛋白質／細胞病態および治療に関する研究
大阪大学院医ゲノム機能分野

戸

53

史

18）筋ジストロフィーにおける糖鎖異常と病態機序の解明
東京都老人総合研究所

55

遠

藤

玉

夫

19）筋形質膜蛋白質に起因しない筋ジストロフィーの病態解明についての研究
国立精神・神経センター神経研究所 林

57

由起子

20) 新たなモデル動物を用いたα‑dystroglycanopathyの発症機序に関する研究

帝京大学医学部神経内科

清水21) Agrin/MuSK系障害における限局性骨格筋障害の臨床と病因的考察
愛知医科大学神経内科 佐

橋

輝

59

夫

Ⅲ. OPMD (眼咽頭筋ジストロフィー)およびミオパチー
63功22）筋型糖原病の生化学・遺伝子診断法の確立および病態に即した治療法の開発

65

浜松市発達医療総合センター小児神経科 杉 江 秀 夫
23) コラーゲンⅥ異常による筋疾患(Ullrich病, Bethlem myopathy)の臨床的,病理学的および遺伝子学的研究

67

鹿児島大学神経内科・老年病学 樋 口 逸 郎24）眼咽頭筋ジストロフィーモデルマウスの作製
熊本大学大学院医学薬学研究部先端生命医療科学部門
脳・神経科学講座・神経内科学分野

69

内 野

誠

25) 極長鎖アシルCoA脱水素酵素(VLCAD)欠損症の免疫組織化学染色によるスクリーニング
国立精神・神経センター武蔵病院DNA診断・治療室 南

10

71

成 祐

26)悪性高熱症およびセントラルコア病:リアノジン受容体RYR1の遺伝子変異検索
国立精神・神経センター武蔵病院DNA診断・治療室 南

72

成 祐

27) X‑linkedミオチュブラーミオパチー :日本人患者の遺伝子変異スペクトラム及び臨床・筋病理学的検討

74

国立精神・神経センター武蔵病院DNA診断・治療室

南

成

祐

28）デスミンミオパチー組胞傷害機構の検討

76

秋田大学医学部神経内科

豊

島

至

29) 家族性還元小体ミオパチー ─ ERストレス関連疾患? ─
国立精神・神経センター神経研究所疾病研究第一部

78

西

野

一

三

Ⅳ. 遠位型筋ジストロフィー, Emery‑Dreifuss症候群, DMRVなど

30) DMRVにおける分子生物学的検討および遺伝子変異型と臨床症状の関連についての検討
東京医科歯科大学大学院脳神経病態学

81

水

澤

英

洋
83

31) Rimmed vacuole型遠位型ミオパチーの筋変性機序に関する研究
新潟大学脳研究所神経内科

田

中

惠

子

32) Rimmed vacuoleを伴うミオパチーにおける免疫染色─レクチンを中心に─

愛知医科大学神経内科

佐

橋

85

功

33) アセチルコリン受容体αサブユニット遺伝子の機能を有さないエクソンP3A上のミスセンス変異はmRNAスプライシング異常を誘発する
愛知医科大学神経内科

佐

橋

功

34) Rimmed vacuoleを伴う遠位型ミオパチーの骨格筋における糖蛋白のシアル酸負荷に関する研究
帝京大学医学部神経内科

87

88

清

水

輝

夫

35) 縁取り空砲を伴う遠位型ミオパチー(DMRV)におけるシアリル化異常90

国立精神・神経センター神経研究所 西 野 一 三

Ⅴ. DMD/BMD,およびジストロフィンその他
9336) 新しい中間径フィラメントであるβ‑syneminの分化に関する研究
群馬大学大学院脳神経内科学

水

野

裕

司

37) ジストロフィン欠損骨格筋におけるMAPKおよびmatrix metalloproteinase‑2,‑9の検討

信州大学医学部第三内科

池

田

修

一

38）筋原線維から筋形質膜への分子連関構築と筋ジストロフィー発症機序の相関解析
武蔵野大学薬学部機能形態学

土 方 貴 雄群馬大学大学院医学系研究科器官機能構築学 依 藤

11

95

宏

98

39) Duchenne型筋ジストロフィー筋における浸潤細胞の解析
新潟大学脳研究所神経内科

100

田

中

惠

子

40) mdxマウスに対する同系筋前駆細胞移植によるジストロフィン導入
熊本大学医学部発達小児科

102

三

池

輝

久
104

41) Syntrophin, aquaporinの骨格筋における発現と局在の研究

昭和大学藤が丘病院神経内科

若

山

吉

弘
106

42) Aquaporin4過剰発現トランスジェ二ックマウスの作製とmdxマウスの治療

昭和大学藤が丘病院神経内科

若

山

吉

弘

43）ジストロフィン遺伝子のスプライシング制御機序の解明とその治療への応用
神戸大学大学院医学系研究科小児科

松

尾

雅

108

文

44）ヘルパーウイルス依存型アデノウイルスベクターによる骨格筋へのジストロフィン遺伝子導入効率と治療効果
熊本大学大学院医学薬学研究部神経内科学分野

内

110

野

誠

45) Read‑Through活性物質を検索するためのダブル･レポーター遺伝子を導入したトランスジェニックマウスの開発

112

東京大学大学院総合文化研究科生命環境科学系（生物学）松 田 良 一46）筋ジストロフィー治療法の開発
─培養骨格筋細胞におけるステロイドおよびゲンタマイシンの影響─

114

東京女子医科大学遺伝子医療センター 斎 藤 加代子

Ⅵ. 先天性ミオト二ー,筋強直製ジストロフィー,治療法の開発
47) 筋強直性ジストロフィー骨格筋におけるmRNAスプライシングの異常

119

大阪大学大学院医学系研究科神経機能医学（神経内科）佐古田 三 郎48) クラスIc抗不整脈薬の骨格筋型ナトリウムチャネルに対する作用
─ミオトニー治療薬としての検討─

121

大阪大学大学院医学系研究科神経機能医学（神経内科）佐古田 三 郎49）ミオトニーの筋活動電位反復発火の減衰に関する研究
東邦大学大橋病院神経内科

123

栗

原

照

幸

50）筋強直性ジストロフィーの分子病態と治療

125

東京大学大学院総合文化研究科

石

浦

章

一

51) RNA結合因子としてのSIX5と筋強直性ジストロフィーの関わり
自治医科大学分子病態治療研究センター細胞生物研究部

12

127

川

上

潔

52) Nonsense‑mediated mRNA decay(NMD)抑制による神経筋疾患の病態と治療に関する研究

128

国立水俣病総合研究センター 臼 杵 扶佐子

53) PC12細胞を用いた筋強直性ジストロフィーモデル細胞の作成:
薬剤スクリーニングシステムの確立を目指して
九州大学大学院医学研究院脳神経病研究施設神経内科

130

吉

良

潤

一
132

54) Schwartz‑Jampel症候群におけるミオトニア発症機序の解明
順天堂大学脳神経内科

平

澤

恵

理

Ⅶ. 骨格筋形成，壊死，アポトーシス
55）骨格筋の脱分化と再生：筋ジストロフィーの再生治療にむけて
千葉大学理学部生物学教室

137

遠

藤

剛

56）ミオフィラメント動態制御因子の変異に起因する筋異常に関する研究─コフィリンおよびc−蛋白質に焦点をおいて140

千葉大学理学部生物学科 大日方昂57）筋肉形成におけるマイオスタチンの役割

143

徳島大学工学部生物工学科

野

地

澄

晴

58) 筋細胞特異的に必須な役割を果たしているインテグリン‑ILK‑affixin系

シグナル伝達の研究

145

横浜市立大学大学院医学研究科分子細胞生物学教室

鈴

木

厚
147

59）筋分化・筋形成とSix遺伝子とのかかわり
自治医科大学分子病態治療研究センター細胞生物研究部 川 上潔60) SIX5の標的分子と筋緊張性ジストロフィーの関わり

148

自治医科大学分子病態治療研究センター細胞生物研究部 川 上

潔61) Dystroglycan結合蛋白質MAGI‑1の生理機能の研究
鳥取大学医学部神経生物学

150

二

宮

治

明

62）細胞死抑制の蛋白質細胞内導入治療法の開発
日本医科大学大学院医学研究科加齢科学系専攻細胞生物学分野

152

太

田

成

男

Ⅷ．ミトコンドリア異常症と治療
63）ミトコンドリア脳筋症のタウリン療法─培養細胞を用いての効果検定

157

日本医科大学大学院医学研究科加齢科学系専攻細胞生物学分野 太 田 成 男64) ミトコンドリアALDH2欠損によるミトコンドリア病病態モデルマウスの作製とその病態改善法─ビタミンEの効果

160

日本医科大学大学院医学研究科加齢科学系専攻細胞生物学分野 太 田 成 男

1365) MELAS筋芽細胞における細胞死とその抑制

自治医科大学小児科学

162

桃

井

真里子

66）ミトコンドリアゲノム多型データベースを用いた病的変異と多型の鑑別

164

東京老人総合研究所健康長寿ゲノム探索 田 中 雅 嗣

67）筋形成に関わる細胞間相互作用の解明

166

京都大学再生医科学研究所再生増殖制御学分野 瀬 原 淳 子

Ⅸ．筋ジストロフィー骨格筋の酸化ストレス，耐性系，遺伝子治療など
68）筋ジストロフィーに対するゲンタマシン治療対象患者のスクリーニング及びハイブリット型リボソームを用いた治療法の開発
熊本大学医学薬学研究部発達小児科

三

池

輝

171

久

69）筋疾患と小胞体ストレスの関連173

九州大学大学院医学研究院脳神経病研究施設神経内科

14

吉

良

潤

一

Ⅰ．LGMD（肢・帯型筋ジストロフィー）

血清抗giantin抗体陽性の肢帯型ミオパチー
佐 橋
研究協力者

衣

斐

達●

近

功●
藤

はじめに

久

雄●●

大

野

欽

司…

伴う筋萎縮．生検筋より抽出したDNA変異検索，
LGMD2A，2B，2Ⅰ遺伝子異常はなかった．

福山型先天性筋ジストロフイP（F−CMD），Walker−Whrburg症候群（WWS），muSCle−eye−braindisease（MEB病），肢帯型筋ジストロフィーG．GMD）2Ⅰ等は，a−dystrogycan（α一DG）

病理学的検討の欠陥によりグリコシル化とlaminina2，neuregulin，agrin
連関への二次的異常も来す遺伝性α−dystrogycanopathy（α一DGpathy）である12）．しかし，現在まで後天性・二次性α−DGpathyに伴う筋疾患の報告はない．
Giantinは，372kDaのゴルジ体膜タンパク質であり，

上腕二頭筋生検筋の光顕所見は，1）酸化還元酵素
PADH−TR，CytOChTOme COXidase等）異常を示す散在性・集族性の小径壊死線経，2）問質結合組織の中等度増加，3）cytoplasmicbodyと空胞変性，4）結合組織中の散輸送小胞（transportvesicle）とゴルジ膜間の架橋をなす3・4）．
我々は血清抗ゴルジ（giantin）抗体を有する成人発症
でα−DG染色が特異的に滅弱した進行性LGMD様ミオ
パチーの世界初報告をする．

在性AcPaSe陽性小円形細胞浸潤，5）甘匹2線維萎縮，6）dystrophin，utrOPhin，emerin，CaVeOlin3，SarCOglycan複合体，Calpain3，dysfbrlin，telethonin，merOSinの免疫染色正常，7）α−DG免疫染色（VIA4−1抗体使用）の減弱．
電子顕微鏡所見は，筋原線経の走行障害，細胞内の細胞小器官の変性，核近辺の小水癌変化，運動終板は正常．

症例報告
患者；59歳，女性，既往歴・家族歴；2人弟に不整脈，
虚血性心疾患，子供3名は健康．
44歳時に，立ち上がり困難を自覚し，進行性．47歳の免疫学的検討筋生検で慢性炎症性筋疾患の診断．48歳に愛知医大初診．
第2回目の筋生検→パルス療法，48歳以降はプレゾニゾ
ロン（PSL）経口療法を受けたが，進行性．当時の身体・

抗ゴルジ抗体陽性患者血清は，〟甲一2細胞の核周囲構造と免疫反応し，Hela細胞抽出物で300kDa以上の分子と同定された（図1A，1B）．Giantinがゴルジ体において300kDaの分子量を上回る唯一の既知の分子であり，患者血清とgiantinとの反応の検索をしたところ，giantinと抗giantin抗体は良く反応した（図1C）．そして患者血清と免疫沈降した蛋白は，抗giantin抗体で染色された（図1D）．

神経所見；意識・知能正常，150．5cm，51．0kg，134／70
mmHg，36．3℃，球結膜は浮腫様，紅斑性皮膚変化，リンパ節症，レイノー現象，関節症はない．流涙正常，シルマー試験陰性．顔面・球筋は正常，頚部屈筋／伸筋・体幹筋・骨盤周囲筋・大腿筋は高度障害．歩行は高度動揺

考性，ガワーズ徴候陽性，運動不耐性．四肢遠位筋は良く保持（握力正常）．筋痛，筋緊張，筋浮腰，仮性肥大，線維束性筋れん縮なし．深部腱反射は減弱，Babinski徴
候陰性．

察

本症例はLGMD2A，2B等の劣性疾患に似ていたが除外された．Giantinは，句ogren症候群6），強皮症6）とRA5・7）
患者より分離されこれら症例では高力価の抗giantin自己抗体を有したが筋疾患はなかった．血清抗giantin抗体のスクリーニングで自己免疫疾患や筋疾患はなかったが，主要検査64人の健康対照者は陰性であったが，HIV陽性患者の血清CK値は常に正常．蛍光Hepana試験（MBL，名古屋，日本）を使用した血清中の抗核抗体（×160）のス
クリーニングで，細胞質内のまだら蛍光が観察され，抗164人中の18人に低力価で抗giantin抗体が検出されたという6）．

ゴルジ抗体を示唆．自己抗体とSSA（Ro）陽性（ELISA
X31．4）．15年間以上にわたる悪性腫瘍に関する可能な限りの検討は陰性．心電図STT異常，針EMG筋原性，骨格筋CTは近位筋優位の高度の四肢筋肉の脂肪置換を

giantin抗体は筋ゴルジ体において蛋白輸送に潜在的な影響を与えると思われる3・5）

Giantinは輸送小胞とゴルジ膜間の架橋をなし，抗●愛知医科大学神経内科●●ケンブリッジ大学…名古屋大学神経疾患腫瘍センター神経遺伝情報学

F−CMD，WWS，MEB，LGMD2Ⅰ等は，α−DG欠陥とさらに二次性laminin−2，neureXin，agrin2）のグリコシル化欠陥を伴う遺伝性疾患である．α−DG染色性の減弱は，）ami血−2の免疫染色は正常であったが，遺伝性α−DGpathy
類似の病態への関与が想定された．また患者血清CK値−17−

の正常は，筋線経の極緩徐変性による可能性が高いが，ゴルジ体での不完全なCK合成による可能性もある．
本患者と遺伝性a−DGpathyとの類似性は，自己抗体が進行性ミオパチーを引き起こすことを示唆している．しかしPSL反応性と細胞浸潤の乏しさ，細胞内分子である抗体の標的は，この炎症性の可能性を否定している．
結語

血清中の抗ゴルジ抗体（giantin）を有し，四肢筋生検でα−DGへの免疫染色性の低下を示す女性例を報告し，遺伝性α−DGpa仙yとの病因的類似性につき考察した．

図1
Patient

引用文献

sscrumdilutedtol：20isappHedtoculturedHep・2cclls

1）MuntoniF；BrockingtonM，BlakeDJ，etal．：Defective

derived録omhumanlartngealcancer．ApplicationofFITC−labeledanti−human serum antibody（1：100）detects aggregated granules

glycosylationinmusculardystrophy．Lancet，360：1419−（mw）．

1421，2002．
2）GrewalPK，HewittJE．Glycosylation defects：a neW

A kDa鸞艶照

mechanismformusculardystrophy？：Hum MoIGenet

BkDa

12：Supp12：R259−264，2003．
3）LesaGM，SeemannJ，ShorterJ，etal．Theamino−terminal
domainofthegolgiproteingiantininteractsdirectlywith
the vesicle−tethering protein pl15．J BioI Chem2000，
275：2831−2836

4）SohdaM，MisumiYi1bmamotoA，Ctal．：Ident抗cation
andcharacterizationofanovelGolgiprotein，GCP60，thatinteractswith theintegralmembrane proteingiantin．J
BioIChem276：4529845306，2001．
5）SohdaM，MisumiYiFLtjiwaraT，etal．：Molecularcloning
andsequenceanalysisofahuman372−kDAproteinlocalーCizedintheGolgicomplex．BiochemBiophysResCom−

Hela￠eIlmembranes＋

mun205：1399−140S，1994．

＋

6）SeeligHP；SchranZESchroterH，etal．：Macrogolgin−−aPatjent■sserum

−

＋

＋

new376kDGolgiComplexoutermembraneproteinas
target ofantibodiesinpatients withrheumatic diseases

Giantin−

andHIVinfbctions．JAutoimmun7：67−91，1994．
7）TbkiC，FttiiwaraT；SohdaM，etal．：Identはcationand

図2（A）Patient

Characterizationofrat364−kDaGoIgi−aSSOCiatedprotein
recognized by autoantibodies舟om a patientwithrheu−

sserumdilutedtol：20isappliedtoculturedHep−2

Cells derived fiom humanlaryngeal caJICer．Application of
FITC−labeledanti−humanSerumantibody（日00）detectsaggregatedgranules（arrow）．（B）ImmunostainingofHelacellextractsprobed
withthepatient．sserumreVealsa＞300kDaband（arrowhead）．（C）A
moleculeinthe Golgimembraneproteinsimmunostainedbythe
patient

matoidarthritis．CellStruCtFunct22：565−577，1997．

sserumhasasimilarmolecularweightasgiantindetectedbyarabbitpolyclonalanti−humangiantinantibody（arrowhead）．The
弧tibodywasagi食fromDr・YoshioMisumi，FukuokaUniversity，Japan．（D）Denaturedimmunoprecipitationrevealsthatamolecule
immunOpreCipitatedwiththepatient

sserumisimmunostainedwith

ananti−giantinamibody．

−18−

筋特異的カルパイン・コネクチンを中心とするネットワークと肢帯型筋ジストロフィー症の病態機序
反 町 洋 之＊・＊＊＊…

居葉川

弥勝福智博

野

小秦鳥千米

研究協力者

子●

尾 嶋 孝 一●・●…● 土 井 菜穂子●・…●●

志●小 山
傑●，† 川 畑 順 子††
柿 沼 良 美…… 川 原 裕 之†††田 中 啓 二…
多 屋 長 治…●
反 町 典 子…† christianWitt†††††

代†
樹●●
通●●●●

StephanieWitt††M

AbigailS・McElhinny※

中 尾 晴 美※※鈴 木 紘 一※※※ 阿 部 啓 子†
Sieg鮎edLabeit††＝

日的

本研究は，骨格筋特異的に発現するカルパインホモロ
グp94（カルパイン3）及びコネクチンの骨格筋における機能を解析し，特に両者が中心となる情報伝達系の作用機序を明らかとして，p94遺伝子（以捌周欠損で発症する
肢帯型筋ジストロフィー2A型（LGⅦ）2A）1）の分子メカニズ
ムの解明とその臨床的応用を目的とする．昨年までに我々は，LGMD2Aがp94のプロテアーゼ活性の機能不全に

caroIC・Gregori0※

饗

場

篤※※

Cys129をSerに変異させたターゲテイングベクターを作成し，これによって相同組換えを起こした遺伝子改変マ
ウスのホモ体を得た（図1参照）．これをCreリコンビ
ナーゼを発現するトランスジェニックマウスと交配し，バッククロスを行うことにより，選択マーカーが切除されたほぼintactに近いノックインマウスを作出した．このマウスを解析した結果，中心核などのミオパチー症状は見られたが，ノックアウトの表現型に比べると非常に軽いものであった5）．

より生じることを，様々な解析2ト4）から明らかにした．
本研究期間では，次の3つの方向から研究を進めた．即ち，（D不活性型p94：C129Sノックインマウス（以下，p94CSマウス）の作成と解析，②p94活性測定系の開発と診断（2）カルパスタテン及び蛍光タンパク質を用いたp94の活性測定系の改良：一昨年開発した，カルパスタチンの両端にシアン及び黄色蛍光蛋白質を融合させたp94特異的蛍光基質タンパク質について，カルパスタチン部分をへの応用，③p94の分子生物学・生化学的解析，である．
p94CSマウスは，活性中心のCysがSerに変異したプロ
テアーゼ不活性型p94を野生型の代わりに発現する遺伝

短くすることで，基質の安定化を図った．また，測定条
件にセリンプロテアーゼを含有することで，バックグラ
ウンドの活性をほぼゼロにすることに成功した．この系

子改変マウスであり，立体構造を保持したままプロテアーゼ活性のみを欠失するため，活性に焦点を当てた，
極めて興味深い解析と応用が可能となり，（診，③のプロ
ジェクトにももちろん適用した．

を用いて，野生型全長p94，不活性型p94，〟−カルパイン，などを発現させたCOS細胞のエキストラクトを用いて，直接その活性を測定した．その結果，実際にp94の活性がクルードな状態で測定可能であることが判明した．

方法と結果

計算では，10〝m切片数枚で十分測定可能であると考えられ，正確かつ簡便な診断法の確立に一歩近づくことができた6）．

（1）p94：C129Sノックインマウスの作成：マウス129Sv
ゲノミックライブラリーより得たp94遺伝子（C甲〃j）
DNAを用いて，エキソン3にコードされる活性中心の（3）新規p94バリアントの発見とその解析：新規p94バ
リアントは，マウスerythroleukemia細胞（MEL）及びヒト牌臓のcDNAを用いてクローニングし，配列を決定し●東京都臨床医学総合研究所酵素機能制御研究部門■●東京都臨床医学総合研究所独立研究部門■●●東京都臨床医学総合研究所分子腫瘍研究部門
HH東京都臨床医学総合研究所実験動物研究部門

た．その発現解析は半定量的RTPCRを用いて行った．
得られた新規p94バリアントは，興味深いことに従来の骨格筋特異的プロモーターの約10kb上流に存在する新＋■＋＋■CREST，JST†東京大学大学院農学生命科学研究科††福山大学生命工学部†††北海道大学大学院薬学研究科††††国立国際医療センター研究所消化器疾患研究部門†††††マンハイム大学医学部※アリゾナ大学医学部※※神戸大学大学院医学研究科※※※東レ・先端融合研究所

規のプロモーターから転写されており，新規のエキソンを有していた（図2参照）．その5，一端は上流に存在するグルコシダーゼ遺伝子とオーバーラップしていることが判明した．さらに，この新規p94バリアントは組織普遍的に発現しており，血球系細胞の維持，分化に機能して−19−

図1p94：C129Sノックインマウス作出のストラテジー
最終的に得られた迫伝子改変マウスのゲノムには変異C129S及びloxP配列のみが存在する

図2 様々な組織に発現するp94のバリアント
組織普遍的に発現するhUp84などは、組織普遍的プロモーターを用いる．

いることが示唆された刀．

考察
LGMD2Aの分子メカニズムを考える上で極めて重要（4）p94のNa十一依存性の発見：p94の活性中心を形成する
Asn386をAspに変異した蛋白質は，活性が1／100程度になっており，野生型では不可能であった加vi加での生化

なp94CSのマウスを得ることに成功した．これらは，治療・診断をはじめ様々な解析に応用可能となる．その表学的解析が可能となった．そこで，p94：N386D蛋白質をバキュロウイルス系で発現・精製し，その生化学的性質

現型から，正常な骨格筋機能にp94のプロテアーゼ活性が必須である事が証明されたと同時に，症状が極めて軽を解析した結果，興味深いことにp94はCa2十とNa＋の両方に感受性を示すことが見出された．さらに，免疫組織いことから，p94には構造タンパク質としての機能も存在することが示された．また，p94の細浦柑活性測定系

染色の結果，p94がSRにも存在していることが示された．

の開発に成功したが，その実用性は今後p94CSマウスを用いて評価が可能と考えられる．

ー20−

王棚ne N2．1ine

N2．1ine ZJine

M．暮ine

≡≡⊆芸∃
Ⅰ

．‥．＿

㌔、Y 埠

図3 筋原諒誰の構造と「シグナル複合体」
Z，N2，及びM線は，それぞれ，コネクチンのN末端，N末端から1／3の部分，C末端に相当する．
それぞれの部位にp94，TIcap，CARRJuKRD2，MURFlなどの興味深い分子が複合体を形成している・
p94を含めて，その多くは核に移行し，核に情報を伝える．

一方，p94の分子生物学・生化学的解析から，p94の新しい性質，即ち，組織普遍的バリアントの存在とN㌔依存

Functional deftcts ofa muscle−SpeCifk calpaln，p94，

性，が見出された．前者は，P94がサイクリンAやC佗BPβなどのプロセシングに関与するという結果さ）を支持する

musculardystrophytype2A（LGMD2A）．J Biol．Chem．

もので，今後の発展が期待される．また，後者は，p943）1bgawa，K．，Taya，C．，Hayashi，Y K．，Nakagawa，M．，

がSRにも存在することを考え合わせると，p94の全く新しい骨格筋での機能が示唆された（図3参照）．

Ono，Y，Fukuda，R．，Karasuyama，H．，Tbyama−Sorimachi，

CauSed by mutations associatedwithlimb−girdle

273：17073t78．1998．

N．，Katsui，Y．，Hata，S．，Ishlura，S．，Nonaka，1．，Seyama，Y，Arallata，K．，ヽbnekawa，H．，Sorimachi，H．，andSuzuki，

研究の意義

K．：MyopathyphenotypeoftranSgenicmiceexpressing

p94CSマウスは，我々の研究のみならず，LGMD2Aの治療・診断・予防の有効性の検討に重要なモデルマウス

activesite−mutated，inactivep94，Skeletalmuscle−SPeCincとなりうる．p94活性測定系も同マウスを用いて検証可

muscular dystrophy type 2A．Hum．肋）．Gene1．，9：能である．p94結合タンパク質であるコネクチンの変異で筋ジストロフィーを生じる桝加マウスの解析結果9）4）Spencer，M．J．，Guyon，J．R．，Sorimachi，IL，Potts，A．，と合わせることで，さらに筋ジストロフィーへの理解は

Richard，Ⅰ．，Herasse，M．，Chamberlain，J．，Dalkilic，I．，

深まるであろう．一方で，p94：C129Sが軽度の筋ジスト

Kunkel，L．M．，andBeckmann，J．S．：Stableexpressionof

ロフィー症状しか呈しなかった事から，野生型p94（こCalpain3舟om a muscle tranSgeneinvivo：Immature

れはプロテアーゼ活性が強く危険）ではなく，p94：C129S
タンパク質を重度LGMI）2Aの遺伝子治療に用いること

muscleintranSgenicmicesuggestsaroleforcalpain3in

Calpaln，the gene product responsibleforlimb−girdle

1393−1402．，2000．

muscle maturation．伽C．肋tl．Acad Sci．USA．99：

は極めて有望であろう．Na＋依存性などの新しく見出さ

8874−79．2002．

れたp94の生理的意義を明らかにしていくことで，さらに有効性の高い治療法への道を拓くことであろう．さらに，

5）Richard，Ⅰ．，Roudaut，C．，Marchand，S．，Baghdiguian，S．，

他の筋ジストロフィーの発症機序への関与の可能性もあ

Sorimachi，H．，LefranC，G，Fardeau，M．，S6bille，A．，and

る．今後さらに詳細な解析を行っていくつもりである．

Beckmann，J．S．：Lossofcalpain3proteolyticactivity

Herasse，M．，Stockholm，D．，Ono，Y，Suel，L．，Bourg，N．，

leadstomusculardystrophyandtoapoptosis−aSSOCiated文

献

IkBα／NuclearFactorKBpathwaypertllrbationinmince．J

1）Suzuki，K．，Hata，S．，Kawabata，Y，andSorimachi，H．：〔kJJβわエ151：1583−90，2000．

StruCture，aCtivation，andbiology ofcalpaimDiabetes，

6）Ono，Y，Kakinuma，K．，Tbrii，F．，Ⅰrie，A．，Nakagawa，K・，

53：S12−18．2004．

Labeit，S．，Abe，K．，Suzuki，K．，and Sorimachi，H．：

2）Ono，Y．，Shimada，HりSorimachi，H．，Richard，Ⅰ．，Saido，TI

PossibleregulationoftheconvemionalcalpalnSyStemby

C．，Beckmann，J．S．，Ishiura，S．，and Suzuki，K．：

Skeletalmuscle−SpeCinccalpaln，P94／calpain3．J Biol．

−21−

Cゐem．279：276ト71，2004．

CleavageofcyclinAbycalpain3inmyeloidprecursor

7）Kawabata，Y，Hata，S．，Ono，Y，Ito，Y，Suzukj，K．，Abe，CellsJβわJ．C e〝玖277：33848−56，2002．

K・，andSorimachi，H・：Newlyidentinedexonsencoding9）Ono，Y，Witt，C・C・，Puschmann，E．，McNabb，M．，Wu，Y，novelvariantSOfp94／Calpain3areexpressedubiquitously

Gotthardt，M・・Witt，S・H・，Haak，M・，Labeit，D・，Gregori0，

andoverlapthecL−glucosidaseCgene．且EBSLett．555：

C・C・，Sorimachi，H・，Granzier；H・，and Labeit，S．：

623−30，2003．

Induction and myonbrillar targeting of CARn and8）Welm，A・L・，Timchenko，N．A．，Ono，Y，Sorimachi，H．，

SuPPreSSionoftheNkx2．5pathwayintheMDMmouse

Radomska，H・S・，Tbnen，D・G，Lekstrom−Himes，J．，and

withimpairedtitin−basedsignaling・J肋L BioL336：

Darlington・GJ・：C／EBPcLisrequiredfbrproteolytic

145−54，2004．

−22−

筋ジストロフィーモデルマウスにおけるマトリックス
メタロプロテアーゼ遺伝子発現の検討
砂 田 芳 秀●研究協力者

市 川 弥生で 大 澤
裕■ 萩 原 宏 毅● 村 上
笹 岡 俊 好● 新 石 健 二… 今 村 道 博…◆

日

龍

文●

上記4種類の筋ジストロフィーモデルマウスおよび野的Dystroglycan複合体（DG）はα−DGとβ−DGから構成
され，基底膜と細胞内骨格を結び付け，強固な架橋構造を形成している．近年，細胞外マトリックス分解酵素であるマトリックスメタロプロテアーゼ（matrix metaJl。．
proteinase：MMP）がβ−DGの細胞外ドメイン部分を分解し，その結果，この架橋構造が崩れ，筋変性が生じる可能性が示唆されている．しかし，20数種類あるMMPの生型マウスの骨格筋から抽出した蛋白について，β−DGのC末端を認識する抗体を用いてウエスタンプロット
解析を行いβDG30の発現を検討した．また見出した
MMP遺伝子をDG複合体が発現しているCOS7細胞に導入し，その遺伝子の存在下でβDG30が増加するかど
うかをウエスタンプロット解析にて検討した．その結果

うち，どのMMPが特異的にβ−DGのプロセッシングに関与しているかは明らかにされていない．我々は，筋ジストロフィーのモデルマウスにおいて発現量が多い
MMP遺伝子を見出し，そのMMP遺伝子がβ＿DGのプロ
セッシングに関与している可能性について検討した．

感鳩酢1MMP二衝撃車券潔や裔 4 kb

方法と結果

M

DNAamyによる遺伝子発現プロファイル解析：我々が作製したヒトcaveolin−3遺伝子変異を導入したトランス

繁華牽廃車碗4・2

ト2MMP

ゝ サ

MMP2

ジェニックマウス（Tg），m血マウス，野生型マウスについてDNA岬を用いた遺伝子発現プロファイル解析を行い，これらの筋ジストロフィーモデルマウスにおい溶
MMP9て遺伝子発現が上昇しているMMP遺伝子を検索した．

毒静≡芋茎‡≒￣二

GAPDH 轡準崇繁藤幣恕0・7

その結果・Tgマウス・mdxマウスにおいてmembrane−typematrixmetalloproteinase−1（MTl−MMP）遺伝子の発現が上昇していた．

図1caveoun−3Tgマウス，βおよびγサルコグリカンノック
アウトマウス（βSGK／0，TSGK／0），野生型マウス．
mdxマウスの骨格筋におけるMMPのノザンプロット解
析・各レーン10膵tOtalRNAをアプライした．

MMP遺伝子発現の解析：モデルマウスにおいて発現が上昇していたMTl−MMP遺伝子についてTgマウス，mdx
マウス，βおよびγサルコグリカンノックアウトマウス（βSGKノ0，TSGKノ0），野生型マウスの骨格筋における発現量をノザンプロット解析にて確認した．その結果，
上記すべての筋ジストロフィーモデルマウスの骨格筋においてMTl−MMp遺伝子の発現量が野生型マウスに比べて増加していた（図1）．

威酔盛

kDa

β−DGプロセッシング産物（βDG30）の発現の解析：
β−DGはMWによるプロセッシングを受けると，細胞外ドメインとC未側30kDの大きさのプロセッシング
産物（βDG30）に分解されることが報告されている．

43

−叫■■●

ユ8

−

￣T∵ごご■L臓＝穣蟻酸や画一βDG如11

遠範紆−βDG30

図2 caveoliか3Tgマウス，βおよびγサルコグリカンノック
アウトマウス（βsGK／0，γSGK／0），野生型マウス，
mdxマウスの骨格筋におけるβ−DGプロセッシング産物（βDG30）のウエスタンプロット解析．上のバンドは分解されないβ−DG，下のバンドはβDG30を示す．

■川崎医科大学神経内科■■岡崎国立共同研究機構基礎生物学研究所■＊書神戸大学大学院医学系研究科
叫＊＊国立精神・神経センター神経研究所

一23−

βDG30の発現量はサルコグリカンノックアウトマウス（βSGK／0，TSGKノ0）においてのみ野生型に比べ増加していた（図2）．さらにヒトMTl−MMP遺伝子をCOS7細胞に導入すると，発現ベクターのみを導入した時と比ストロフィーモデルマウスすべてにおいてその発現がべて，βDG30の発現量は増加していた．

βDGのプロセッシングが先進していることを明らかに上昇していることを示した．次にこれを培養細胞に導入するとβDGのプロセッシングが増加することを兄いだ
した．さらに生体内ではサルコグリカン欠損筋でのみ，した．このことから正常なサルコグリカン複合体の存在

考察はこのプロセッシングを阻止する可能性が示唆され，筋LGMDICのモデルマウスである変異caveolin−3Tgマウス骨格筋において発現が先進していたMTl●MMP遺伝
子は，検討した筋ジストロフィーモデルマウスすべてで同様に発現が上昇していた．MTl．MMPをCOS細胞にジストロフィーの発症のメカニズムを知る上で重要な発現させると，βDG30の生成が有意に増加したことから，MTl＿MMP遺伝子がβDGのプロセッシングに関与することが示唆された．MTl−MMP遺伝子はサルコグリ
カノバチーだけでなく，他のタイプの筋ジストロフィー

1）ohsawaY，TbkoH，KatsuraM，MorimotoK，Y如madaモデルマウス骨格筋においても，発現が上昇していたが，
βDG30の生成はサルコグリカンノックアウトマウス（βSGK／0，TSGK／0）のみで増加していた．このこと

hanCed contractility associationwith endothelial oxide

意義をもつと考える．
文

献H，IchikawaY，MurakamiT，OhkumaS，KomuroI，
SunadaY・OverexpressionofPlO4Lmutantcaveolin−3inmice develops hypertrophic cardiomyopathywith en−
synthaseactivity．HumMoIGenet13（2）：151−7，2004．
2）ohsawaY，TbkoH，KatsuraM，MorimotoK，1ねmadaからMMPによるβDGのプロセッシングはサルコグリ
カン欠損状態で促進されることが示唆され，正常筋ではサルコグリカンの存在がMMpによるβDGのプロセッ
シングを阻止している可能性が考えられた．

H，IchikawaY，MurakamiT，OhkumaS，KomuroI，
SunadaY・Non−tranSCriptionalactivationofnitricoxide
Synthaseinduces hypertrOPhiccardiomyopathywithen−hanCed contractilityin the PlO4L mutant Caveolin−3

tranSgenicmice．NeuromuscDisord13（7−8）622−3，

研究の意義

2003（8thIntemationalCongressoftheWorldMuscle

筋ジストロフィー発症機構において，α−dystroglycanの糖鎖異常によるラミニン結合能の喪失と細胞外マト

Society）

3）砂田芳秀，市川弥生子，大澤裕，萩原宏毅，村上能文，
笹岡俊邦，新石健二，今村道博．筋ジストロフィーモデ
ルマウスにおけるマトリックスメタロプロテアーゼ
遺伝子発現の検討．平成15年度厚生労働省精神・神経疾患研究委託費「筋ジストロフィーに関連する疾患の病態解明と治療法の開発に関する研究」清水班班会議

リックスと細胞骨格の架橋構造の脆弱性が問題になっている．サルコグリカノバチ一においてはマトリックス
メタロプロテアーゼによるβ−dystroglycan（βDG）の切断が，この架橋構造の破綻をもたらすことが提唱されている．我々は20種以上存在するMMPのうち，MTl−MMP
がβDGのプロセッシングに関与し，今回検討した筋ジ

東京12月5日，2003．

ー24−

変異Caveoliか3トランスジェニックマウスにおける肥大型心筋症の発現
砂 田 芳 秀●研究協力者 大 澤村 上 龍 文● 大ェニック（Tg）マウスを作成したl）．このマウスの骨格筋
では，著明な筋萎縮を特徴とするミオパチーを呈し，
caYeOlin＿3の著明な減少と．骨格筋nNOS活性の克進が認められた．一方，心筋の肥大シグナル2）及び心筋収縮の

4

12

・﹇パ離職

染色体優性肢帯型筋ジストロフィーlC（LGMDIC）のモデ
ルとして，我々は，muSClecreatinekinasepromotor調節下にPlO4Lミスセンス変異Caveolin−3過剰発現トランスジ

司…

十一声諏

．70創部■0∬00000︵邑男空lもち手合○ヰ014も■璧至芸名宝8caveolae構成蛋白質caveolinのisofbmで，骨格筋では
nNOS，心筋では，eNOSと結合しその活性を強力に阻害することが知られている．caveolin●3遺伝子変異による常

昌

専﹇顔yⅥ

的

caveolin＿3 は骨格筋と心筋に特真的に発現している

占丁適齢Uy冊目

裕● 東 口 治 弘… 桂
熊 誠太郎… 小 室 一 成●●

24

36A蓼（W帥叫図1野生型Wt（○），およびTg（●）の心重量・体重比■♪＜0．05（恥ね柚トtest）

メカニズム3）において，各NOSアイソフォーム（eNOS，
nNOS，iNOS）が極めて重要な役割を果たしていることが，最近次々と明らかとなってきた．我々はcaYeOlil1−3遺伝A

子変異が，心筋においてもNOSアイソフォームの活性に変化をおこし，その形態および機能に影響を与えると考え，変異caveolin−3Tgマウスの心筋に関して病理形態解析，生理機能解析，NOS活性をふくめた生化学的解析を行った．

B
言r；雀t各点

方法と結果
病理形態解析：野生型マウスと比較すると，変異caveolin−3
Tgマウスでは，4週，12週，24週，36週齢における心重量の増加を認め，心臓重量ノ体重比は，有意に増加していた（図1）．心臓横断面では左室壁と心室中隔の肥厚が著明で，左室内腔は狭小化し（図2A），心筋線維径は有意に増大していた（図2B），心肥大マーカー遺伝子ANR
BNPの叩regulationが認められた．

芯蒜㌫㌫蒜乱写蒜；蒜；㌫㌫誌蒜

図2 6週齢Wt，Tgマウスの心横断面仏），心筋線維径ヒスト
グラム由）

表124適齢マウスの経胸壁心エコー検査
Interventri cular

L eftventri cular

L eftventri cular

L eR ventricular

L e食ventricular

G roup

Septal血icb ess（mm）

posted or w all
thicb ess（mm）

end d iaStOlicdjam eter（mm）

end 野StOlicdiam eter（mm）

丘actional
Shortening
（
mm）

W t

0．
83 ＋0．
110．
78 ＋0 ．
083．
94 ＋0．
2g

2．
14 ＋0．
23

45．
60 ＋4 ．
00Tg

1．
0 4 ＋0．
12書

1．
07 ＋0．
11＊

3．
0 0 ＋0．
30＊

1．
15 ＋0．
18 ■6 1．
20 ＋4．
70■

1咋0．01．Wt（〝＝7）；Tg（乃＝7）■川崎医科大学神経内科学＊■千葉大学大学院循環病態医科学＝＊川崎医科大学薬理学
ー25−

生理機能解析：経胸壁心エコーによる心機能解析では，
心筋壁の肥厚，心筋拡張不全が認められ 心筋収縮力冗進を伴う肥大型心筋症と考えられた（表1）．

肥大型心筋症が発症し，心筋では，CaVeOlin＿3蛋白の著明

生化学的解析：心筋組織のcaveolin−3mRNAは著増してな減少と，CaVeOIin−3結合蛋白質であるeNOSの中等度活いたが（図3A），蛋白は著減し（図3B），一部，細胞質にmislocalizationしていたく図3C）．Northem blot解析，
Immunoblot解析では心筋組織の各NOSアイソフォームの発現に差違はなく，eNOSの組織染色でも蛋白発現に著変は認められなかった．新鮮心筋組織のnNOSおよび性克進が認められた．骨格筋ではcaveolin＿3欠損により考

変異caveolin−3Tgマウスでは，心筋収縮力冗進を伴う

nNOS活性が克進し，顕著な萎縮を認めるが，これとは対照的に心筋においてはeNOS活性克進が，心筋肥大
シグナルに関与している可能性が示唆された．我々の報告とほぼ同時に，CaVeOlint3遺伝子変異によるヒトの肥iNOS活性も野生型と差違は認められなかったが，eNOS
活性は中等度先進していた（図4）．

大型心筋症が報告されており4），肥大型心筋症は，
caveolinopa仇yの新たな表現型として注目される．
文

耽

察

献

1）SunadaY，OhiH，HaseA，OhiH，HosonoT；ArataS，Tg

ShigesadaH，MatsumuraK，ShimizuTTranSgenicmice
OVereXpreSSlngmutantCaVeOlin−3showseveremyopathy

CaY8議拳］ゴ仏。雛・。

associatedwithincreasednNOSactivity．HumMoIGenet
GAPDH

−■■1■

lO（3）：173−178，2001

2）Barouch LA，Harrison RW SkafM et al．Nitric oxideBregulatestheheartbyspatialconfinementofnitricoxide
Wt Tg

Synthaseisoforms．Nature416：337−341，2002

C−Yj

叫一

トDG

亡こ三村

3）Ⅵ1a−PetroifMqKimSH，PepeSetal．Endogenousnitric

正血

OXidemechanismsmediatethestretchdependenceofCa
releaseincardiomyocytes．NatCellBio13：867−873，2001
4）OhsawaY；TbkoH，KatsuraM，MorimotoK，1ねmadaH，lchikawa Y；MurakamiT，Ohkuma S，Komuro T，and

図3 6週齢Wt，Tgマウス心筋組織のはVeOliか3のノザンプロット
解析は），ウエスタンプロット解析由），免疫組織染色（C）

SunadaY．OverexpressionofPlO4LmutantCaVeOlin−3inmice develops hypertrOphic cardiomyopathywithen−hancedcontractilityinassociationwithincreasedendo−

13（2）：151−157，2004

窯5）HayashiT，ArimuraTlUedaK et al．IdentiGcation and

5functionalanalysis ofa caveolin−3mutation associated

− J

避
4

with

蝕milial hypertrophic cardiomyopathy．BBRC

313：178−184，2004−■ ■曾盲亨雪盲−雪ぎ羞○∈色を 琶僧∽ON等菅市○▲ ○thelialnitric oxide synthase activity．Hum MoIGenet

『
W IT9

W IT gr Jl■il■
W ITg

モNO S

nIq0 ＄lN O ＄

○

靴 Tg
Tふ
ねl

〝＝8

図4 6週齢Wt，Tgマウス心筋組織のL−PH］アルギニンーL−（，H】
シトルリン変換法によるNOS活性測定●ア＜0．05（杯を克カトtest）

ー26−

Myostatinprodomainによる変異caveolin−3トランスジェニック
マウス表現型の改善
砂 田 芳 秀●
研究協力者

大 澤
武 田

裕● 萩 原 宏 毅● 土 田
伸 一●…篠 野 静 香● 森

はじめに

邦 博●● 野 地 澄 晴…
弥 生● 村 上 龍 文●

WildType Pl04LCAV−3Tg

変異caveolin−3トランスジェニック（Tg）マウスは，我々が作出した常染色体優性肢帯型筋ジストロフィー
LGMDICのモデルマウスで，骨格筋caveolin−3の著減と，著明な筋萎縮を特徴とするミオパチーを表現型としている1）．一方，myOStatinは，骨格筋特異的Transfbrminggrowthfhctor−β（TGF−β）superfamilyであり，その機能抑制により，筋線経の数とサイズの増加による骨格筋量の著増を

DoubIeTg ProMSTNTg

来たすことから，骨格筋量のnegativeregulatorと考えられている2）．最近CaveolinーlがTGF−β1の細胞膜受容体に結合しその下流のシグナルを強力に抑制することが報
告され3），CaVeOlinと，TGF−βsuperfhmilyのsignal
crosstalkが注目されている印）5）目

図1交配により誕生した4種類のマウスの下腿中央部横断
CT所見、10週齢 Bar＝5mm

的

変異caveolin−3トランスジェニック（Tg）マウスの筋萎縮に至る病態機序のひとつとして，CaVeOlin＿3欠損によ沸疋州35鱒5出10訓51
0︵8旦−色でこ曾貞って，TGF−βsuperfamilyであるmyostatinシグナルの脱抑制が引き起こされるのではないかと考えた．この仮説の検証のため，変異caveolin−3Tgマウスのミオパチpが，myostatinの生理的活性阻害蛋白質6）であるmyostatin
prodomainにより改善するか否か検討した．

M ak （
n弓 ）
．

34

方法と結果

5

6

8

12

1

3

4

5

8

12

11

Agt（▼−亡亡b）

図2 体重増加曲線

myostatinprodomainを過剰発現させたTgマウスと変異
mY001in−3Tgマウスを交配して，二重トランスジェニック（doubleTg）マウスを作出し，その表現型，生化学的及び生理学的機能を解析した．

（n＝4）は，野生型（m1685，EDL717）変異caveolin−3
Tg（1226，458），doubleTg（2286，1485），myOStatinprodomain

Tg（3340，1692）であった．m筋線維断面積（n＝4：各1000本）の検討では，変異caveolin−3Tgでは，筋線維ヒスト
グラムの左方偏侍が認められたが，doubleTgでは回復し交配により誕生した，doubleTgと，変異caveolin−3Tg，
myostatinprodomainTg，野生型の計4種類のマウスについて検討した・doubleTgでは，変異caveolin−3Tgで認められた筋萎縮が，ほぼ野生型まで改善していた（図1）．

ていた（図3）．m平均筋線維断面積は，野生型（1610l12）
変異caveolin−3Tg（1092．8p2），doubleTg（1586．3p2），
myostatinprodomainTg（1649．lp2）であった．従ってdouble

体重は，8週齢から，ほぼ野生型のレベルまで回復していた（図2）・次いで，このdoubleTgに認められた骨格
筋量回復の原因について，それぞれのマウスの下腿筋線

Tgでは，著明な筋線維数の増加（hyperplasia）が主体となり，軽度の筋線維サイズの増加（hypertrophy）を伴い，骨格筋量が回復することが明らかとなった．また変異

維数及び筋線維断面積から比較検討した．平均筋線維数●川崎医科大学神経内科学…徳島大学分子酵素研究センター■●■徳島大学工学部…●国立精神・神経センター神経研究所

caveolin−3Tgの筋萎縮には，筋線維数の減少（hypoplasia）と，筋線維サイズの減少（hypotrophy）の双方が関与することも示された．doubleTg骨格筋では，CaVeOlin−3蛋白−27−

の著明な減少とmyostatinprodomain蛋白の過剰発現が確芳井l

Do鵬IeTg

MSTNpro血mdnTg

が

￥

び

別

漬

ha

け

け

Ⅷ

l●

up

㌍HUqGやP

変異CAV3Tg

一
l一

翼

長

I

！

具

象

！

Singlemyofiberarea（microni）
図310適齢マウスの前脛骨筋（m）の単筋線維断面積ヒストグラム n＝4，各1000本
D≠

■h■Ht

［コ士人⊂▲YJT暮文E胴■▼山一T■

︸

仰

l ▲

00

ShigesadaH，MatsumuraK，ShimizuT：Transgenicmice

測

OVereXPreSSlngmutantCaVeOlin−3showseveremyopathy

● 一

▲

測

l

00

associatedwithincreasednNOSactivity・HumMoIGenet

即︵∈28 もUと︸−阜占

1）SunadaY；OhiH，HaseA，OhiH，HosonoTIArataS，lO（3）：173−178，2001．
4

8

11

1￠

4

1

11

2）McPherron AC，LowlerAM，Lee S−J：Regulationof

1

Age（Wteb）
図4

献

マウスの握力検査

Skeletalmuscle massin

mice by a new TGF−β

SuPerfhmilymember．Nature387：83−90，1997．

＊加′痺m〃ほtestaRerl−WayANOVA，

3）RaLZaniB，ZhangL，BitzerM，GerdorfrqBoettingerEn
LiSantiMP：Caveolin−l regulates transfbrming growth

認された．機能的には，doubleTgでは，生後4週齢から，握力は野生型を上回るまで著明に改善し（図4），トレッ
ドミル運動検査上，走力も完全に回復していた．

factor（TGF）−b／SMAD signalingthroughaninteraction
with the TGF−btypel receptor．JBC276：6729−6738，
2001．

考

4）NoheA，KeatingE，LohC，UnderhillMT；PetersenNO：察

Caveolin−lisoform recognization studied byimage

交配により導入したmyo血Ipmdomdnによるmyosb血活性阻害により，CaYeOlin−3欠損マウスの筋萎縮および筋力低下はほぼ正常に回復した．今回の検討で変異

COrrelationspeCtrOgraPhy．FaLradayDiscuss126：185−195，
2004．

5）DiGuglielmo GM，Roy CL，GoodftlloAFIWranaJL．：

CaYeOlin−3Tgマウスにおける筋萎縮には筋線経の萎縮

Distinct endocytic pathway regulate TGF−b receptor

だけではなく筋線維数の減少（hypoplasia）も関与することを明らかにした．さらに骨格筋発生の早期からSlgnalingandtumover．NatCellBiol：410−420，2003．
6）ThiesRS，ChenT；DaviesMVetal．：GDF−8propeptide

Myostatinを阻害すると，筋線推数が増加（kyperplasia）
するという興味深い知見も得られた．この結果から

bindsand antagonizes biologicalactivity byinl1ibiting
GDF−8receptor binding．Growth Factoes18：251−259，

myostatin阻害はcaveolin−3欠損による筋萎縮には有効な治2001．

療法であることが示された．今後，CaVeOlin−3とmyostatin
シグナル伝達系との関連をより下流のsmadリン酸化経路の解析によりに検討するとともに，myOStatinprodomain投与による筋ジス・トロフィー治療法の開発を目指したい．

−28−

筋ジストロフィーの分子発病機序としてのmatrixmetalloproteinaseによるdystroglycan複合体の崩壊に関する研究
清 水 輝 夫●
研究協力者

日

松 村 喜一郎● 鐘鏑● 新 井謙●
大 井 博 子● 西 野 一 三●● 斉 藤 史 明●

結的

dystroglycan複合体は様々な細胞の表面膜に発現し発生の初期には基底膜形成の中核となりその後は基底膜と細胞内骨格をつなぎとめる強固な架橋構造として維持される．これを別の角度から見ると生理的状態としての細胞の発生・分化，ならびに病的状態としての癌細胞の転移・侵潤などの過程にはこの架橋構造を特異的にしかも効率良く破壊するメカニズムが存在するはずである．こ（1）MMPによるPdystroglycan細胞外ドメインの分解はBI0−14．6ならびにT0−2心筋症ハムスターの骨格筋，心筋，平滑筋で特異的に克進していた．一方，脳では認めなかった．
（2）正常ハムスター，別0−14．6ならびにT0−2心筋症ハム
スターすべてにおいて，骨格筋，心筋抽出成分中のαdystroglycan，Pdystroglycan，laminina2鎖はすべてのようなメカニズムとして我々はβ卸Stroglycanの細胞外ドメインを特異的に分解するmatrixmetalloproteinase活性を報告して来た．このMMP活性は筋ジストロフィーの分子発病授序においてどのような役割を果たし七いるのだろうか？我々はSarcoglycan欠損症ではdystroglycan
複合体が崩壊しαdystroglycanとPdystroglycanが分離しているという事実に注目し，まずsarcoglycan欠損症のモデ
ル動物であるBI0−14．6ならびにTO＿2心筋症ハムスターの筋変性にこのMMP活性がこの現象に関与しているか

果

WGAcolumnに完全に吸着された．しかしBIO＿14．6
ならびに

T0−2

心筋症ハムスターで認める

PdystroglycanのMMP分解産物は全く吸着しなかった．
つまりmatrixmetalloproteinaseによるβdystroglycan細胞外ドメインの分解によって心筋症ハムスター筋ではdystroglycan複合体が一部崩壊していた．
（3）MMPによるPdystroglycan細胞外ドメインの分解はsarcoglycan欠損症とDuchenne型筋ジストロフィーで著明に冗進していたが，その他の疾患では正常と差を認めなかった．

解析した．次にsarcoglycan欠損症，DuchennC型筋ジス
トロフィー，福山型先天性筋ジストロフィー，炎症性筋疾患など各種の筋疾患の生検筋を同様に解析した．

考察

我々はこれまでにPdystroglycanの細胞外ドメインを特方法

異的に分解するmatriⅩmetalloproteinase活性について研（1）sarcogIycan欠損症のモデル動物であるBI0−14．6なら
びに T0−2 心筋症ハムスターの各種臓器を
βdystrogIycanのカルポキシル末端を認識する抗体を用いたイムノブロット法で解析した究して来た．本研究で我々は心筋症ハムスターの骨格筋（2）BI0−14．6ならびにT0−2心筋症ハムスターならびに正でも心筋症ハムスターと同様にmatrixmetalloproteinase

常ハムスターの筋の抽出成分をwheatgermagglutinin（WGA）amnity column chromatography にかけ
dystrogIycan複合体の組成，安定性を解析した．なお
正常対照としてFIBハムスターを用いた．
（3）sarcoglycan欠損症，Duchenne型筋ジストロフィー，
福山型先天性筋ジストロフィー，炎症性筋疾患など各種筋疾患の生検筋をβ郎StrOglycanのカルポキシル末端を認識する抗体を用いたイムノブロット法で解析した．

と心筋ではこのmatrix metalloproteinaseによってdystrogbcan複合体が崩壊し細胞膜と基底膜の間の架橋が破綻することを明らかにした．ヒトsarcoglycan欠損症によるβdyStrOglycan細胞外ドメインの分解が克進していた．またdystrophinの一次的な欠損のために二次的にsarcoglycanを欠損するDuchenne型筋ジストロフィーでも同様の現象を認めた．これらの結果は一次的，二次的を問わずsarcoglycanを欠損する筋ではこのmatrixmet−
alloproteinase活性が冗進し，その結果として起こる
dystroglycan複合体の崩壊が筋細胞変性に関与していることを示唆した．
研究の意義
SarCOglycan欠損症とDuchenne型筋ジストロフィーでは●帝京大学医学部神経内科…国立精神神経センター神経研究所

Pdystroglycanの細胞外ドメインを分解するmatrixmetallo−

ー29−

proteinaseによって筋変性が進行する可能性を示した．これ

10）Sasaki，Tl，etal．Biochim．Biophys．Acta1425：599−606，
1998．

はこのmatrixmetalloproteinase活性を阻害する薬物がこれらの疾患の治療法として有用である可能性を示唆している．今11）Saito，F．，etal．J．Biol．Chem．1999；274：8240−8246．

後，これらの疾患の動物モデルへの投薬実験を行い，その12）Shimqji，Y，etal．Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．96：9857−

実用性を検討して行きたい．

9862，1999．

13）Matsumura，K．，etal．Cell．Molec．Biol．45：751−762，1999．

文献14）Masaki，Tl，etal．ActaNeuropath01．99：289−295，2000．

1）Matsumura，K．，etal．FEBSLett．334：281−285，1993．

15）Claudepierre，Tl，etal．J．CellSci．113：3409−3417，2000．

2）1hmada，H．，etal．FEBSLett．352：49−53，1994．

16）Masaki，T，etal．ActaNeuropathol．2001；101：174・178．

3）Ⅵunada，H．，etal．J．Neurochem．66：1518−1524，1996．

17）Yamada，H．，etal．Hum．Molec．Genet．10：1563−1569，

4）1bmada，H．，etal．J．Biol．Chem．271：23418−23423，

2001．

1996．

18）Masaki，T，etal．Exp．Neurol．174：109−117，2002．

5）Chiba，A．，etal．J．Biol．Chem．272：2156−2162，1997．

19）Matsumura，K・，etaLCurrentTbpicsinNeurochemistry6）Matsumura，K．，etal．J．Biol．Chem．272：13904−13910，

3：131−140，2002．

1997．

20）Matsumura，K．，etal．Neuromusc．Disord．213：796−803，
20017）Matsumura，K．，etal．Histol．Histopathol．12：195−203，
1997．

21）Matsumura，K・，etal．BasicandAppliedMyology13：299・304，

8）Matsumura，K．，etal．Neuromusc．Disord．7：7−12，1997．

2003．

9）Saito，Fl，etal．J．Biol．Chem．272：26708−26713，1997．

−30−

遺伝子二重変異筋ジストロフィーマウスの作成と解析による病態の解明
萩 原 康 子●
研究協力者

目

笹

岡

野

口

俊

邦

●

悟…●

今
依

的

カベオリンー3（Cav3）遺伝子異常による筋ジストロフイ
pは，Minettiらによって報告された肢帯型筋ジストロフ
ィー（LGMDIC）1）をはじめ，異なる筋疾患でも報告されてきている．われわれは，Cav3ノックアウト（CaY3KO）マ
ウスを作成し，このマウスが軽度の筋ジストロフィー
phenotypeを示すことを報告した2）．また，DNAマイクロアレイを用いた網羅的遺伝子発現解析から，Cav3KOマウ

村

藤

道

博…

藤

田

雅

子…■

宏■●■■●

が，カベオリンー1，2は両との差がなく，またNOS遺伝
子の発現もn，e，iの3種類共に雨との発現に差がみられなかった．opN遺伝子発現がノックアウトしたCav3遺伝子と同程度に減少していた．2週，1，3，6および8
ケ月齢のdoublemutant，m血，Cav3KOおよびwtマウスの前脛骨筋からRNAを単離して，OPN遺伝子発現を
SYBR Greenを用いたリアルタイムRT−PCRで測定し比較した（図2）．内部コントロールのG3PDHmRNA量でス骨格筋では野生型（融）マウス骨格筋に比べてオステオ
ポンチン（OPN）遺伝子発現が低下していることを見出した．DMDおよびmdxマウスの骨格筋では，高いOPN遺伝子発現が報告されている3・4）が，その理由はまだ充分に解析されていない．本研究では，Cav3とジストロフィンの遺伝子二重変異筋ジストロフィー（doublemutant）マウ補正したOPNmRNA量は，椚血マウスでは報告されているように両より高かった4）．しかし，Cav3遺伝子発現が（−）であることは，OpNmRNA量を低下させる効果

スを用いて解析し，OPN遺伝子発現へのCav3遺伝子発現の効果をより明瞭にすることを試みた．

ど筋変性のない2週齢でも既に両の約3倍であり，筋変性の盛んな1ケ月齢では約55倍であった．3，6，8ケ月
齢と低下するが，8ケ月齢でもwtの約30倍の高値であった．一方，doublemutantマウスでは調べた月齢間でそれ程大きな変化は見られずに，1ケ月齢でもwtと比べた方法と結果
沼放マウスとCav3KOマウスを3−4世代交配することにより，doublemutantマウスを作成した．cav3およびジストロフィンの遺伝子変異は，PCR法により同定した．
doublemutantマウス骨格筋のH＆E染色像では，2．5週齢でわずかに浸潤細胞が観察され，壊死・再生像が1ケ月齢で観察されたが，椚血マウス骨格筋での病理像と比較があった．即ち，doublemut飢tマウスでは仇血マウスの半分以下であり，Cav3KOマウスではwtマウスより減少していた．月齢を追った解析では，椚血マウスでは殆

値は約8倍で，椚血マウスの約1／7の値であった．opN
抗体を用いた免疫組織染色像では，浸潤したマクロファージの周辺が濃く染まり筋線経は殆ど染まらなかったが，マクロファージが入込んだ筋線経は弱く染色された．一方，Cav3抗体では，マクロファージは染まらなかった．

して特別な差はみられなかった．さらに，マウス腹腔内にPBSで稀釈したエバンスブルー色素（EBD）を注入して骨格筋線経へのEBDの取込みを凍結切片標本で観察した結果においても，doublemutantマウスとm血マウス間の特別な差はみられなかった．
6週齢のCav3KOマウス骨格筋から単離したmAを用いて，CodeLinkオリゴマイクロアレイで約8，000種類の遺伝子の発現プロファイル解析を行った（図1）．cav3
KOマウスでwtマウスの2倍以上に発現が上昇していた遺伝子は約200種類，1／2以下に発現が減少していた遺伝子は約60種類あった．cav3遺伝子は激減していた●国立精神・神経センター神経研究所モデル動物開発部＝ 自然科学研究機構基礎生物学研究所神経生化学研究室＊＊＊国立精神・神経センター神経研究所遺伝子疾患治療研究部■＊＊■国立精神・神経センター神経研究所疾病研究第一部
H■■攣群馬大学大学院医学系研究科器官機能構築学

図1マウス骨格筋の遺伝子発現プロファイル
Cav3遺伝子変異ホモマウスを縦軸に，野生型マウスを横軸にとり，解析した約S，000種類遺伝子についての発現プロファイルの結果をスキャッタープロットした．カベオリン＿3遺伝子変異ホ
モマウスにおいて，野生型マウスの2倍以上に発現が上昇していた遺伝子（上の線より上の部分）が約200種類，1／2以下に減少していた遺伝子（下の線より下の部分）が約60種類あった．矢印はカベ
オリンー3遺伝子，二重矢印はオステオポンチン遺伝子，ー31−

OPNmRNA発現量は，沼血マウスでは筋変性・壊死の盛んな時期と並行していて，マクロファージの浸潤によると考えられる．しかしながら，double mutantマ
ウスでは，マクロファージが多く浸潤していて変性の盛んな1ケ月齢でもOPNmRNA量が椚血マウスより低く抑えられていたので，おそらくこの時期はCav3遺伝
子発現が（−）であることの効果がより強く作用していると思われる．
21

1

3

l

図2 マウス骨格筋におけるオステオポンチン遺伝子発現
2週齢および1，3，6，8ケ月齢マウス前脛骨格のmRNAから合成したcDNAを用いて，オステオポンチン遺伝子に対するリアルタイムPCRを行った．内部コントロールG3PDH遺伝子の発現量に対するオステオポンチン遺伝子の相対発現量を縦軸にとり表記した．m血マウスおよび遺伝子二重変異マウスでは野生型よりオステオポンチン退伝子の発現量が高かった．

今後の展望
筋ジストロイ一におけるOPN遺伝子発現の上昇は明らかであるが，その意味付けはまだ解明されていない．opN
退伝子発現へのCav3の役割をさらに明らかにすることは，筋ジストロフィー病態解明および治療法開発への手掛かりになると思われる．
参考文献

考

察

1）MinettiC，SotgiaF，BrunOCetal，NatGenet18：365−368，

Cav3遺伝子発現を（−）にすることによってOPNmRNAの発現が低く保たれた．cav3は骨格筋に特異的でありマ

1998

2）HagiwaraY；SasaokaT；AraishiKetal，HumMoIGenet9：

クロファージには発現していない．一方，OPNタンパク
質はマクロファージで発現しているが筋線経には殆ど発

3047−3054，2000

3）HaslettJN，SanoudouD，KhoATetal，ProcNatlAcadSci

現していない．このことから，OPNmRNA発現に関してのマクロファージと筋線経との相互作用の存在が示唆さ

USA，99：15000−15005，2002
4）PorterJD，SangeetaK，KaminskiHJetal，HumMoIGenet

れた．これがどのような機構で行われるかは不明である．

ll：263−272，2002

ー32−

Calpain3の筋線維内局在
西

研究協力者

野

一

悟●

計 良 陽 子● 野 口

緒

言

南

成

祐●

林

由起子●

初めて組織学的に確認するものである．一方、M−line上骨格筋型カルパインCalpain3は、肢帯型筋ジストロ
フィー（LGMD）2A型の原因遺伝子産物である．反町らによるYeast2−hybridでの解析から、Calpain3がタイチン（コネクチン）に結合して筋原線維上に局在していることがにCalpain3のシグナルは観察されなかった．筋線維タイプによる発現量の違いは認められなかった．
筋細胞核への局在を確認するために、さらに、筋細胞予想されている．しかし、Calpain3が激しい自己分解活性を有するため、これまで骨格筋試料上での局在に関する直接的な証明はなされて来なかった．この間題を解決

果、確かに核画分にCalpain3が存在することを確認した．
LGMD2A患者筋を用いた解析では、ウエスタンプロッ

すべく、今回、我々は新たにCalpain3に対するポリク
ローナル抗体を作製した．この抗体を用い、正常及びLGMD2A筋におけるCalpain3の局在を検討した．
方法

Calpain3の特異的な配列であるN末100残基とGSTを融合させた組み換え蛋白質を大腸菌に発現させた後精製し、抗原としてウサギに免疫した．免疫染色にはヒト
凍結骨格筋及びグリセリン筋、ウエスタンプロットには
ヒト及びマウス凍結骨格筋を用いた．ヒト骨格筋検体は、核画分を精製してウエスタンプロットを行った．その結トでCalpain3が一部検出される患者と完全に欠損している患者が兄い出された．calpain3が一部残存している
患者筋では、Calpain3は核及びN2領域ともに局在していたが、サルコメアの染色バターンは不規則であった．
このことは、Calpain3が核及びN2領域に局在するだけ
でなく、その部位で正常な機能を有していないと筋ジス
トロフィーを発症してしまうことを示している．また、
CaIpain3が検出できなかった患者筋では、筋原線経は染色されないのに対し、核には弱い染色が見られた．この抗体を用いることによってcalpain3の変異による局在の差異を検出できる可能性が示唆された．

国立精神・神経センター倫理委員会で承認された承諾書を用いて、検体の研究使用に対するインフォームドコン
セントを得ているものを使用した．

結論

独自に作製した抗Calpain3抗体によりCalpain3がN2領域と核内に存在することを、はじめて組織学的に確認
した．

結果と考察
ヒト正常骨格筋の免疫染色では、筋細胞核とともに、
筋原線経がユニークな二重線パターンで染色された．
マーカー抗体（α・アクチニン、タイチンTll）との二

参考文献
1）Baghdiguian，S．，etal．：Nat．Med．5：503−511，1999．

重共焦点染色では、α・アクチニンの両側に、またタイテ

2）Sorimachi，H．，etal：J．Biol．Chem．270：31158−31162，1995．

ンTllよりもZ−1ine側にCalpain3のシグナルを認めたこ

3）Richard，I．，Broux，0．，Allamand，V，Fougerousse，F．，とから、Calpain3はタイチン分子のN2領域に存在することが確認された．この結果はYdはt2−hybridのデータを4）Anderson，LⅥ，etal：AmJPathol．153（4）：1169−79，1998．

Chiannilkulchai，N．，etal：Cel18：2740，1995．

●国立精神・神経センター神経研究所疾病研究第一部

一33−

新しいサルコグリカン分子の組織発現と機能に関する研究
今 村 道 博＊
研究協力者

日

西

山 幸
遠 藤

代● 志 賀 和 雄● 吉
剛●● 武 田 伸 一●

岡

弘

樹●

ことが示された．しかし，この分画を用いた解析からは
t−SGが脳内でSGCを形成している証拠は得られなかった．

的

ジストロフィン結合タンパク質複合体の主要構成単位であるサルコグリカン複合体（SGC）はαから∂までの
4つのサルコグリカン分子（SG）から構成されており，ここ・SGの複合体形成能と組織発現：こ●SGは6＿SG及びのうちいずれかに変異が起こるとSGC全体の消失を生じ

7−SGに高い相同性を有する分子として発見されたが3），
その存在様式と発現部位については明らかでない．我々てサルコグリカノバチー（LGMD2C，2D，2E，2F）となる．
SGCの機能については，細胞膜の安定性を保つための機はChinesehamSterOVary（CHO）細胞を用いた発現実験系によりこ−SGの複合体形成における役割を解析すると共に，RT−PCRを用いた組織発現解析を行なった．cHO細械的補強装置であるという理解がなされているが，この他にも，情報伝達系の制御因子としての可能性が論じられている．これらはSGCが横紋筋特異的な構造であることを前提に議論されてきたが，近年になり第5（亡＿SG），

胞にαから；までの6種類のSGを発現させ，形質膜上に現れたSGCを単離してその構成分子を同定したとこ
ろ，こ−SGと7−SGは同一の複合体内には共存し得ない
こと，すなわち，SGC形成における両者の機能は同等で第6（；−SG）の新しいSGメンバーが発見されてからは，
SGCは横紋筋のみならず生体内の様々な領域で機能する可能性が示唆されているl・3）．我々はこれらの新しいSGの存在様式と機能について解析することが横紋筋型あることが明らかになった．こ−SGの発現は横紋筋や平滑筋などの筋細胞よりも中枢神経系に多く認められるため，脳での機能が注目される．

SGCの機能を解明する上でも重要になると考えており，得られた結果をもとにサルコグリカノバチーの新しい治療法開発の可能性についても検討を行なっている．
このように，本研究はサルコグリカノバチーの治療法開発に結びつくようなSG分子の特性を探査するという目的の下に行なわれた．

考察
SG分子は複合体を形成して初めて安定化し，機能的であると考えられているが，脳においては仁一SG以外の
SGタンパク質は検出されていない．これはトSGが単独で存在するか，或いはSG以外のタンパク質と相互作用

方法と結果
中枢神経系におけると・SGの発現と局在：トSG遺伝
子の変異が筋ジストロフィーではなくミオクロヌス＿ジをする可能性を示唆している．但し，ジストロフィンに加えてジストログリカン，ジストロプレピン，シントロフィンなど，SG以外のジストロフィン結合タンパク質

ストニア症候群（M−D）の原因となることから4），e−SGは中枢神経系において重要な機能を担っているものと考えられる．我々はマウスの脳を材料としたRT＿PCRにより翻訳額域全長を含むトSG cDNAをクローニングしたは脳に広く分布しているため，これらの分子との関連を解析する必要がある．さらに；−SGが脳に発現している
ことが示されたため，これとの相互作用を検証しなければならない．しかしながら現時点ではタンパク質としてところ，オルタナティブスプライシングによりユニーク
なC末端構造が付加された新しいe＿SG分子種（E＿SG2）の；−SG検出に困難があるため，より良い特異抗体の作成が課題となった．

を発見した5）．mRNA及びタンパク質の両レベルの解析
からはトSG2が脳特異的に発現していることが明らかになった．また，中枢神経系に於いては，既に報告されているもう一方のと−SG分子種（￡●SGl）の発現も認め

SGC形成ではこ−SGがT−SGと同等の機能を有することを示した．また，組織発現の解析からはこれが横紋筋でも微量ながら発現していることが示されている．このことはγ−SGを欠損しても内在性；−SGの発現を増強さられたが，免疫組織化学的解析からは両分子種が共に脳の神経細胞に広く分布していること，そして，生化学的
膜分画法からは両者がシナプス関連構造に局在しているせることが出来ればγ−SGの機能代償が行なわれる可能性を示唆していた．
今後の展望
SGは筋組織だけでなく中枢神経系においても重要な機能を果たしているものと考えられる．今後，M−Dなど，●国立精神・神経センター神経研究所遺伝子疾患治療研究部●●千葉大学大学院自然科学研究科−34−運動異常に開通した疾患の解析からSGの機能に関する

3）Wheeler，M・etal・‥；−Sarcoglycan，anOVelcomponentof

新しい知見が得られる可能性がある．また，；−SGはγ＿
SGの，トSGはα−SGの代用分子として機能すると考えられるため，これらの発現制御の問題に取り組むことでLGMD2C，2Dの治療法への応用が期待される6）．

thesarcoglycancomplex，isreducedinmusculardystrophy，
肋鳳肋エGe〃eL，11：2147−2154，2002．
4）Zimprich，A・etaL・：Mutationsinthe gene encodinge−
SarCOglycan cause myoclonus−dystonia syndrome，N加Ge〃eL29：66−69，2001．

文献5）Nishiyana，A．elat．：Identificationandcharacterizationof

E−SarCOglycaninthecentralnervous system，肋LBrt7in1）Straub，Vetal・：t−Sarcoglycanreplacesα−SarCOglycanin
SmOOthmuscletoformaunlquedystrophin−glycoprotein
COmplex．Jβわ Ce仇，274：27989−27996，1999．

Re∫．，125：1−12，2004．
6）Imamura，M・etaZ・：E：−SarcogIycanCOmPenSareSforlackof

2）Imamura，M・etal・：Asarcoglycan−dystroglycancomplex

α−SarCOglycaninamousemodeloflimb−girdlemuscular

SyStem，Hurn．肋LGenet．，9：3091−3100，2000．

dystrophy，月加．肋エGe〝れ14：775−783，2005．

−35−

サルコグリカン異常症：日本人における原因サブユニット，
遺伝子変異，及び免疫組織化学染色パターンの再検討
南

研究協力者

金

目

大

成●●

杉

江

成 祐●

和

馬●●

ジストロフィン結合蛋白であるサルコグリカン（SG）

らかとなっているが，本邦ではSG異常症全体の頻度が少なく，亜型間の割合は必ずしも明らかにされていない．
例えば，β−SG異常症は1例しか報告がなく，6−SG異常症はLGMDとしては1例も報告がない．また，全サブ

山

久美子●●

西

野

一

三●●

3．免疫組織化学染色

的複合体の異常は早期発症型の肢帯型筋ジストロフィー（LGMD）を引き起こす．これまでに，α−，β−，γ−，∂＿SGサブユニットの遺伝子異常を原因とする亜型が明村

免疫組織化学染色による各SGサブユニットの染色性を検討するため，今回あらためて対象患者の凍結筋切片を作製し，一連の抗体を用いて同一条件下で免疫染色を行い比較した．その結果，各サブユニットの染色性は表2に示したようになった．β−SG異常症の患者では全サ
ブユニットの染色性が消失したのに対し，α−およびγ＿
SG異常症では各サブユニットの染色性が減弱するものの筋細胞膜への局在が残存する傾向を示した．とくに，γ−SG異常症では6−サブユニットがほぼ正常に保たれていた．

ユニット遺伝子の網羅的な変異検索が行われたことがな
い点も問題である．
そこで，今回，国立精神・神経センターで筋病理検索された患者について各SG遺伝子変異を系統的に検討

表1遺伝子変異解析

するとともに，免疫組織化学染色による各SGサブユ
ニットの染色性の違いについても再検討した．さらに，最近になって骨格筋などでのSG複合体の要素である

遺伝子

患者

α−SG

1

229C＞T（R77C）

229C＞T（R77C）

2229C＞T（R77C）

229C＞T（R77C）

3229C＞T（R77C）

229C＞T（R77C）

4220C＞T（R74W）

220C＞T（R74W）

5325C＞T（RlO9Ⅹ）

325C＞T（R109Ⅹ）

6

325C＞T（RlO9Ⅹ）

325C＞T（R109Ⅹ）

7

325C汀（RlO9Ⅹ）

214221del

499G＞A（G167S）

IVS5＋5G＞A

ことが示された；−SGの遺伝子異常が含まれないか検
討した．
β−SG

方法と結果
1．α−，β−，γ−，6−SG辻伝子変異解析
対象は，臨床・筋病理学的所見と，少なくとも抗ジス
トロフィン抗体と抗α−SG抗体などを用いた免疫組織化
学的検索の結果からSG異常症が疑われた患者11名であ

アレル1

8
γ−SG

∂＿SG

9

アレル2

EX6del EXI EX＄delなし

る．患者らの凍結筋からRNAを抽出し，α−，β−，7−，
6−SG遺伝子の転写産物を RTIPCR増幅してdirect

表2 免疫組織化学

sequence解析した．そして，ゲノムDNAで遺伝子変異を確認した．その結果，表1に示したように，9名につ各サブユニットの染色性患者

いてはSG遺伝子異常を認めた．その内訳は，α−SG遺伝子変異が4名，β−SGが4名，γ−SGが1名で，∂・SG
変異は見つからなかった．
2．と−SG遺伝子変異解析

a−SG

β一SG T＿SG
＋ん

6＿SG

1

＋／●

＋／＿

2

＋／−

＋ん

＋／一

十／＿

＋

3

＋／−

4

＋ん

＋

＋八

十／＿

＋／＿

α−，β−，γ−，6−SG遺伝子変異解析で変異が認められなかった2名（患者10と11）については；−SG遺伝
子異常の可能性があると考え，その検索を行った．こ−SG
遺伝子の変異検索についてはゲノムDNAからPCR増幅
しdirectsequence解析を行った．その結果，；−SG遺伝
子変異を発見することはできなかった．

10
11●国立精神・神経センター武蔵病院…国立精神・神経センター神経研究所

十十

＋

＋

＋

＋＋＋：nOrmal，＋＋：Slightly fhint，＋：faint，＋／−：CXtremely Ehint，−：negatiYe．

ー36−

考

さて，免疫組織化学的にSG蛋白の欠損を認めながら察

本邦で過去に遺伝子解析が行われた報告では，少なくとも，α−SG異常が9家系，β・SG異常は1家系，γ−SGが4家系あり，6−SG異常症はLGMDとしてはない．しかし今回，遺伝子異常を特定できた9名中4名までがβ−SG異常であったことから，日本人のSG異常症の原因サ
ブユニットとして，β●SGもまた主要な割合を占めるものと考えられる．
α＿SG遺伝子変異はいずれもミスセンス型で，R77C変異がgアレル中6アレル（75％）を占めた．この変異は国内外のこれまでの報告でα−SG異常症のcommon
mutationであることが示されている．一方，β−SG遺伝
子変異はナンセンス変異やスプライシング異常による
nullmutationがほとんどであったが，海外からの報告ではミスセンス変異の方が多く，むしろ今回の検索では
RlO9X変異が8アレル中5アレル（62．5％）を占めたことがnullmutationの比率を高めた要因であると思われる．
β−SG遺伝子では海外において特定のcommon mutationの存在は報告されていない．しかし，RlO9Ⅹ変異が本研究で初めて兄いだされた変異であることを考えると，このβ−SG変異は日本人に特有なcommon mutationである
可能性がある．ただし，今後の患者数の積み上げが必要
である．
免疫組織化学染色の結果，遺伝子異常と各サブユニットの染色性の傾向は従来の報告とよく一致しており，β−サブユニットが核となってSG複合体を形成するという培養細胞での発現実験から考えられているモデルを支持

α−，β−，γ−，6−SG遺伝子の全てに異常を認めることのできない患者が2名存在したことは予想外であった．
；−SG遺伝子についても残念ながら異常を発見できなかった．今回用いた遺伝子変異検索法で見逃される変異を持っている可能性も完全には否定できないが，SG複合体の二次性の欠損を引き起こす新たな疾患である可能性もある．
研究の意義・今後の展望
本研究において，日本人ではα一，β−SG異常が患者のほとんどを占め，7−，6−SG異常は稀であることが示唆された．また，免疫組織化学染色による各サブユニットの染色性から遺伝子異常が存在するサブユニットをある程度推定できると考えられた．以上のことは遺伝子検査への応用を考える上でも重要な知見である．患者の筋生検が可能な場合には，免疫組織化学染色の結果によって遺伝子解析を行うサブユニットの第一選択が決まって来るし，筋生検ができないような場合には，α−，β−，7−，
6＿SG遺伝子の順に変異検索を行う手順が良いであろう．
また，α●とβ−SG遺伝子についてはcommonmutationの検索も可能であると思われる．
最後に，遺伝子変異が特定できなかった患者2名については，二次性のSG複合体欠損を引き起こす新たな疾患である可能性も考えられ 候補遺伝子について今後も検討していきたいと考えている．

している．また，各サブユニットの染色性から，ある程度，遺伝子変異のあるサブユニットを推定しうることを示している．

ー37−

日本人dysfbrlinopathyにおける遺伝子変異と臨床型の特徴
青 木 正 志●

直

●
●

輝●

●
●

一泰

●

●
●

木場野山

鈴相西糸

●

村

●

明子子格
理起
好真由

野

寺藤

小伊林木

灯が釘附

俊恵秀

橋藤野藤

高近今責

研究協力者

館

山

真

規●

瞳●●三 浦 優 子●●
三…埜

中

征

哉●●●

人●

我々は1998年三好型遠位型筋ジストロフィーの原因

C4968T変異では12j＝0歳と早く，G3370T変異を持つ症

遺伝子をクローニングLdysfbrlinと名づけたl）．同遺伝
子はエクソン55個から構成され2，080アミノ酸からなり2），肢帯型筋ジストロフィー2B型の原因であることも判明

例は33土6歳と遅かった．肢帯型でもG3370T変異を持
つ症例は発症年齢が35土10歳と遅かった．三好型遠位
型では平均33歳（発症後平均14年），肢帯型では平均した．日本人三好型遠位型筋ジストロフィーでの遺伝子変異の特徴としては，C1939G，G3370T，3746delGおよび4870delTの4種の変異が多く認められる．さらにはG3370T変異を伴う症例は発症年齢が遅くG3510A変異
は発症年齢が早いことを既に報告している3）．

39歳（発症後平均15年）で独歩が不可能になる．三好型遠位型では平均41歳（発症後平均21年），肢帯型では
平均45歳（発症後平均21年）で杖歩行が不可能となった4）5）．（図2）
現在、肢帯型筋ジストロフィーの表現型を呈する

日的

本邦dysfbrlinopathy（dysfbrlin遺伝子異常に伴う筋ジス

dysfbrlinopathy患者の臨床型の詳細な検討を行っている．
これまでに13人の臨床データを解析できた．対象患者は現在23歳から75歳であり、平均年齢は53士15歳であった．そのうち5人にはG3370T変異が存在した．平均発症年齢は25土7歳，平均羅病期間は27士15年であった（G3370T変異を保有する患者の平均発症年齢は32士6
歳，保有しない患者は21士3歳）．ほとんどの患者で下肢の筋力低下が初発症状であった．発症18士14年後に現在トロフィー）患者のdysfbrlin遺伝子変異と臨床的特徴を明らかにする．
特に肢帯型を呈する筋ジストロフィーの表現型を呈す
dysfbrlinopathyの臨床的特徴を明らかにする．
方法と結果の医療機関を初診となっている．Functionalgradescaleによる進行経過は上肢では約30年の経過で伊ade5（手を口に持っていけないが，ベンを握れるか，テーブルのコ

41家系44人の三好型遠位型筋ジストロフィーと23家系26人の肢帯型筋ジストロフィーの表現型を示した日
本人dysferlinopathy患者を対象とした．遺伝子型はインフォームドコンセントを得た患者ゲノムDNAから55個のエクソンごとにPCR−SSCP法にて迫伝子変異をスクリーニングし，直接塩基配列決定法にて確認した．

インを拾える），下肢では約25年の経過でgrade9（車椅子）に至るまで羅病期間とともにほぼ直線状に進行し，その後の進行はゆるやかであった．G3370T変異を有する患者の経過もほぼ同様であった．病初期に下腿屈筋の仮性肥大を思わせる症状を呈した患者（4例）も存在し遺伝子変異は三好型遠位型で28種類，肢帯型で12種類（5種類は共通）が兄いだされた．過去に論文報告されていた．顔面筋や外眼筋の障害，囁下困難，翼状肩甲，前後る外国人での変異と共通するものは1種類のみであった．
日本人では外国人での変異の分布と異なり遺伝子全体にLGMD

広く分布していた．三好型遠位型ではC1939G変異，
G3370T変異，3746delG変異，4870delT変異が多くみら
れ48％をしめた．肢帯型でもG3370T変異と4870delT変
異が多くみられ52％をしめたが3746delG変異はみられな∽ガr
q939G Tま的7c
c1694T（コ016◆lA
4芸旧irちA m9T
G131ひト1A
2331ddG G4144A J∂馳rllll H1111‰ddC

1837ddT C2tE．7T G4376TJe加r G5882A

Gl006◆1c c／A好古

かった．（図1）平均発症年齢は三好型遠位型では22土9
歳（12−48歳），肢帯型では26土10歳（11〜43歳）で

MM

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G刀16◆1A O1968T G馳

CIC64T G2mT W7UT G5CO3T
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G1310◆1A （2131A G礪T
5122−肋CA 607卜2由仏G
T1657◆2C G乃10A C5129T T613iX〕
J禍撼
G54C8A 6159−ち2il下GATCあった．三好型遠位型ではG3510A変異では13土0歳，
図1dysftrlinopathy患者で見出された迫伝子変異．Dysftrlinタ
ンパク上変異の位置をしめす．タンパクより上に肢体型患者．下に三好型遠位型患者の変異をしめす．変兵の位置の太線（イタリック体）はそれぞれの表現型で多く見られた
変異．3746delG変異は三好型遠位方でしか見つかっていない．

●東北大学医学部神経内科…国立病院捜構西多賀病院…国立精神・神経センター神経研究所
細 国立病院機構宮城病院
ー38−

しかし拡張型心筋症を呈した患者（1例）も存在した．％
肺活量は羅病期間とともに低下し非侵異的人工呼吸を施行した患者（2例）も存在した．今後は、筋CT画像を含めてさらに多くに患者の臨床型を解析する予定である．

5
d﹁

考
察
遺伝子型の特徴として肢帯型では三好型遠位型で多くみられる3746delG変異はみられていない．発症後の進行

0
．d﹁

5

︵礪︶垣廿

度で両者に有意な差はみられなかった．G3370T変異を有する患者は，発症年齢は遅いものの羅病期間でみた進行速度は他の変異をもつ患者と大差はなかった．

0

肢帯型筋ジストロフィーの表現型をしめすdysfbrlinopathyの臨床的特徴は現時点までの解析では以下のようにまとめることができる．下肢の筋力低下で発症することが多く，初期には仮性肥大を思わせることもある．進行しても手の機能は比較的長期間保たれ，車椅子乗車可能期間

5
2
0
2

発症

独歩不可

も保たれている．血清CK値は病初期では高値であるが経過に伴って低下していき、正常域まで低下する症例もあった．心機能は比較的保たれるが，呼吸機能は経過とともに徐々に低下していく．

杖歩行不可

経過

研究の意義

図2 三好型遠位型と肢帯型患者の経過．
各経過になった年齢を左側に三好型遠位型，右側に肢帯型をプロットし，同一患者を結んだ．太い実線
は肢帯型の太い破線は三好型遠位型の平均．

本研究の成果により吋S触・lino阿hyの臨床的特徴および発症後の経過が明らかになった．これらは臨床診断や経過観察の留意点の明確化に寄与する．将来
dys知lhopa仙yに対する治療研究を行う際には対照としての自然経過の重要な資料となりうる．

9000

8000

7000
●

一

文

5

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1）LiuJ，AokiM，ⅠIlaI，etal．：Dysfbrlin，anOVelskeletal

37−2

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musclegene，ismutatedhMiyoshimyopathyandlimb

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girdlemusculard ystrophy．Nature Genetics．20：31−36，

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5

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献

●

1998．

一

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2）AokiM，LiuJ，RichardI，etal．：GenomicorganiZationof

1000

the dysfとrlin gene and novel mutations

0
0

10

20

30

10

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in

Miyoshimyopa仙y．Neumlogy57：271−278，2001．

擢痛期間（年）

3）Thkahashill Aoki M，Thteyama M，et al．：Dysftlin

図3 同一患者内での血清CK値の推移

mutationsinJapaneSeMiyoshimyopathy．Neurology60：
1799−1804，2003．

側轡を呈した患者はみられなかった．筋電図では筋原性の所見であるがnbri11ationがみられることもあった．
筋生検所見はジストロフィー様で細胞浸潤を呈するこ

4）AokiM：Dysftrlinopathy．In：GeneReviewsatGeneTests：
MedicalGeneticsInfbrmationResourceldatabaseonline］．

Copyright，UniversityofWashington，Seattle，1997−2004．

ともあった．血清CK値は，病初期は非常に高値であるが羅病期間とともに低下していき正常域まで低下する症例もあった（図3）．心胸郭比は羅病期間とともに

AvailableathttT）：〟www．EeneteStS．OrE．

5）青木正志，高橋俊：Dysftrlinopathy（Dysftrlin異常症），
AmualReview神経2005，中外医学社，Pp277−283．

拡大するが，心エコーによる左室駆出率ははっきりした変化はない．

−39−

SJLマウス骨格筋における遺伝子発現解析
青 木 正 志●研究協力者

鈴 木 直 輝●小野寺 好 明●

日 沼 雄
竪 山 真

二●● 高 橋 俊 明…
規● 糸 山 泰 人●を用いた半定量的mLPCRを用いて確認した．さらに免Dysfbrlinは三好型遠位型筋ジストロフィーの原因遺伝子として1998年にクローニングされ，肢帯型筋
ジストロフィー2B型の原因でもあることが明らかに

疫組織染色およびウエスタンプロット法にて蛋白発現についても検討した．
SJLマウスでは対照と比べて213の遺伝子で2倍以上なったl）．dysfbrlin変異を伴う筋ジストロフィーに対して吋sfbrlinopa山yという疾患概念が提唱されている．
Dys危rlinは筋細胞膜に存在し，膜修復に際し重要な働きの発現の増減を認めた．amotation毎に分類するとinflammation，grOW血／regenerationに関わる遺伝子が多くをもつと考えられているが2），卸S知linopa血yの病態の全体像は未知の部分が多い．一方SJLマウスでは自然発生見られた（図1A）・具体的には1）Proteolysisに関わる

的に筋に炎症の出現が知られていたが，dysfbrlin退伝子

2）Innammationに関わるSmallinduciblecytokineA2（Scyaの異常が報告されdysfbrlinopa也yのモデルと考えられている・本研究ではSJLマウスを用いてdysferlinopathyの病態に関与すると思われる遺伝子群の発現変化について網羅的に解析した．

2）およびScya12；3）Growth／Regenerationに関わるCARP

CathepsinSおよびThsueinhibitorqrmetallqpTDteEnase4；（Cardiac ankyrin repeat PrOtein），Caspasel，Fos，Jun，
myogenin，Myosinlight chain，Ras−related associatedwith
diabetes；4）Extracellularmatrixのosteopontin；5）Membrane
eventに関わるgmLarEn6，Rab6；6）Calciumbindingの機能日的を持つSlOOa4，SlOObなどの発現変化を認めた（斜字はSJLマウスで発現低下）．半定量的RTPCRの結果はマイdysftrlinopathyのモデル動物であるSJLマウスの解析を通じてその病態を明らかにし，治療への糸口とする．

クロアレイで2倍以上の変動を示した遺伝子に関して高い相関を示した．（図1B）

方法と重吉果筋の変性が軽度な2ケ月齢および進行した9ケ月齢のさらに蛋白レベルではcaveolin−3，dystrophinおよび
utrophinの発現は対照とSJLマウスで差異は認められな

SJLマウスの大腿四頭筋からRNAを単離しハイプリダ

かったが，nNOSの発現はSJLマウスにおいて低下してイゼーションを行い，対照と比較した．GenBankを基本いた．一方，α一SarCOglycanの発現は2カ月齢では差異がなかったが，6カ月齢および10カ月齢のSJLマウスで有データベースとしたマウスcDNAからのオリゴアレイ

意に増加していた．myostatinはmRNAと逆にSJLマウ
スで増加を示した．

（CodeLinkm）を用いて約10，000遺伝子の発現プロファイル
を調べた．また遺伝子発現をLightCycler（R∝heDiagnostics）
A．
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考

察

ヒトdysfbrlinopathy患者の筋におけるマイクロアレイ
による検討を行ったCampanaroらの報告3）やSJLマウスで検討したLennonらの報告4）とある程度対応した結果が得られた．Dys蝕linとの相関が報告され膜修復に関与することが想定されているAnnexin2は両方の論文で発現増強が見られたが（対照に比べ約2．2倍と3．7倍），我々の解析では約1．3倍の上昇を認めたのみだった．2倍以上の変動が見られた遺伝子で，Calcium結合能を持つもの
や小胞輸送に関わるものは，C2domainを有し膜修復に関与するとされるdys危rlinと相互作用をする候補遺伝子と考えられる．またCARPに関しては，myOgeninやosteopontinなどと同様に病期の進行に伴い発現が高まっており，DMD患者や脱神経モデルラットで報告された
ように障害筋の再生に関与している可能性がある．nNOS

研究の意義
本研究の成果によりdysfbrlinopathyの病態の一部が明らかになった．これらは今後dysfbrlinopathyに対する治療のターゲットを模索する上で基本的な情報であると考
える．
文

献

1）LiuJetal．：NatureGenet．20：31−36，1998．
2）BansalDetal．：Nature423：168−172，2003．
3）CampanaroSetal．：Genet26：3283−3298，2002．
4）LennonNJetal．：JBioIChem278：50466−50473，2003．

やmyostatinに関してもdysftrlinopathy病態への関与が示
唆された．

一41−

筋ジストロフィー発症機構の理解をめざす関連タンパク質の分子論的研究吉 田 幹 晴＊研究協力者

日BerylN．Ampong●・●●的ジストロブレビン（DB）−1はジストロフィン（dys）結合
タンパク貿（DAP）の一つで，同遺伝子ノックアウトマ
ウスは筋ジストロフィー症状を示すl）．DB●1は分子前半部においてサルコグリカン複合体（SGC）2）と，後半部でシントロフィン（syn）そしてdysと結合する．筋ではDB−1の他，C末端側の長さが異なるDB−2とDB−3が発現しており，その中最短の分子DB−3は唯一Syn及びdys結合部位を持っていないことから，我々はその局在や機能に関心を持ち，研究を進めた．その結果を前半で述べる．

今

村

道

博●

武

田

伸

一●

DB−3を，後者はDB−1を含む複合体を沈降させることが確認された．この時DB−3を含む複合体中にsynの含量の著しく少ないことが見出された．この結果を確かめるため抗synを用いた免疫沈降を行った．その結果沈降物
中にDB−1が検出される一方DB−3は検出されず，上記の結果を補完する結果を得た．また同じ沈降物中にDB＿2も存在することがわかり，SynとDB−2を結合する複合体も存在していることが推察された．図1に同定された3種のdys−DAP複合体を記す．dys並びにDB分子種中，DB−3だけがsyn結合部位を持たないことから「synがジスフェルリン（dysF）は三好型ミオパチー及び肢帯型筋ジストロフィー2Bの原因遺伝子産物として発見された．一昨年その遺伝子ノックアウトマウスが作成され，その骨格筋では筋形質膜障害時にC㌔＋要求性の膜修復シ
ステムが機能しないことが示された3）．しかしこのシス

dys−DAP複合体中に正しく結合するためには，dys及びDB双方のsyn結合部位が対になって存在する必要があ

テムにおいてdysFがいかに関与するかその機構は不明
である．我々はdysFの機能を明らかにしようとする過程
でそれが筋形質膜だけでなく，細胞内にも存在する証拠と考えられ従ってDB−3を含むdys複合体の筋形質膜上での分布は微視的に他の複合体と少し異なる可能性もある．

る」と考えている．近年の結果からdys複合体はDBそしてβ−Syneminを介して筋原線経のZ線と結合していると考えられているが，DB−3だけはその結合が構造上無理を幾つか得たのでそのことを後半で述べる．
方法と材料
抗D8−3は同分子C末端部の短い特異配列を利用して作成した．抗dysFはdysFの配列4）の中からミオフエル
リン5）に存在しない配列（aa＃1281＿1299）を抗原にして作成した．この抗体がdysFと特異的に反応することをイ
ムノブロットにより確認した．骨格筋の免疫組織染色ではアフイニティ精製したものを使用した．dys−DAP複合
体はウサギ骨格筋より調製した．
図1骨格筋において見出された3つのdys−DAP複合体
各複合体は異なるDB分子種を1分子結合している．
DB−3を結合した複合体だけはdys上に結合部位が存在するにもかかわらずsynを結合できない．

結果と考察
1．dys複合体におけるsyn結合の必要条件
抗DB−3はdys−DAP複合体に結合するDB分子中40kDaのものと特異的に反応し，DB−3は同複合体の構成成分であることがわかった．DB−3は構造上dysと直接結合できないが，SGCに結合することで2）間接的に同複合体の構成成分になっていると考えられる．抗DB−3はラッ

2．dysFは筋原線維内にも存在する
我々が作成した抗dysFはマウス骨格筋筋形質膜だけ
でなく線経によっては内部も槙紋様に染めた．有染線経と線維型の相関は認められなかった．この線維内染色はト骨格筋の細胞膜を染めた．また同抗体及び抗DB＿1抗

伸びた筋では二重線様に観察された．横紋マーカー（市体を用いたdys−DAP複合体の免疫沈降において，前者は販の抗体）と比較したところ，dysFの染色はⅠ帯上にあり，Z線を挟むようにして位置していることがわかった．

●国立精神・神経センター神経研究所●●東京医科大学薬理類似の染色パターンは市販のモノクローナル抗体
加CL−hamlet）を使っても，またラット筋でも認められた．
−42−

次に我々はdysFの筋線維内分布について生化学的側面から解析した．マウス骨格筋をホモジェナイズし，低速著減が知られているSJLマウス筋でその発現量を調べた

遠心した場合NaK●ArPaSeの様な筋形質膜成分はほぼ上が，対象として用いたBALB／Cに比べ有意差は認められなかった．

沼に回収されたが，dysFの場合は半分程度であり残りは沈殿画分よりLiBrによって抽出された膜成分，その比較

今後の展望的重い方に検出された．これとは別に筋ホモジネートよ

我々はDHPRがECカップリングの一男を担うタンパクり筋原線経を調製し，その中に留まるdysFを筋ホモジネ
ート中のものと比較した．前述結果と一致して半分程の質であることからSJLマウスの筋収縮特性に関心を持ち，dysFが筋原線維中に残存していることが示された．dysF
は小胞膜に包まれて筋原線維内に存在すると思われるが，

しくこのマウスを利用することの限界を感じた．遺伝子
KOマウスの利用が理想であるが，次善策として最近報

前述の実験でdysFと同様LiBrで抽出されるDHPレセプ
ター（DHPR）やリアノジンレセプターなどと比べると，告されたdysF欠損〟Jマウスの併用も検討する必要があ
ろう．

強く結合しているようであった．

この研究ではdysFが筋形質膜だけでなく，肪原線維内にも相当量存在することが示された．報告された筋形質

それを調べた．しかしこの種の実験では対照の選択が難

次にdys−DAP複合体の各精製段階の中間試料を使ってdysFを検索したところdysFの一部分画がWGAと結合することを見出した．この結果はWGA結合性のタンバ

膜修復におけるdysFの役割を知る，もしくはdysFの未ク質と結合しているdysFの存在を示唆する．結合タンパ
ク質を探るために我々は筋形質膜タンパク質のWGA結いであろう．dysFがそこに留まったまま機能するのか，知の機能を探る上で後者のdysF分画の研究は欠かせな
それともCa等の刺激によって離れ筋形質膜のdysFと行
き交うのかなど興味深い問題である．こうした研究に筋合画分よりdysF抗体による免沈物を調製し，その中にWGAと反応するものを探した．2つのタンパク質を認

原線経は有効な出発物質になると期待している．

め，そのうち140kDaについてはその分画のされ方も考慮してDHPRのα2サブユニットではないかと予想した．
抗DHPRを用いたイムノブロット解析によりこれが確認

文

献1）GradyRMetal．：NatureCellBioll：215−220，1999．

され，また抗DHPRを用いた免沈物の中にdysFが確認されたことからDHPRがdysFの結合タンパク質の1つであると結論した．この結果から我々はdysFが失われた

2）YoshidaMetal．：HumMoIGenet9：1033−1040，2000．

場合，DHPRの発現がどうなるかに関心を持ち，dysFの5）DavisDBetal：HumMoIGenet9：217−226，2000．

3）BansalDetal．：Nature423：168−172，2003．
4）LiuJetal：NatGenet20：31−36，1998．

→43−

三好型筋ジストロフィー（LGMか2B）責任遺伝子産物
ジスフェルリンと（ER）ストレス発生の機構
桃 井
研究協力者

藤

田

隆■

恵理子●

高

鹿

依

子●

ジスフェルリンは肢帯型筋ジストロフィー（LGMD2B）および三好型遠位型筋ジストロフィーの責されること，また過剰発現させることによってERスト
レス細胞死を誘導することを明らかにしてきた．
本研究では，ジスフェルリンの局在と様々な膜融合に任遺伝子であり，線虫αe〝0血ム助ねgJ昭7〃Jの♪山，ミオフェルリンや先天性難聴疾患の原因遺伝子であるオトおける機能の解析を通して，三好型筋ジストロフィーの治療法を探索することを目的とした．

フェルリンと高い相同性を持ちフェリンファミリーを形成している．フェリンファミリーはリン脂質に結合する
C2ドメインを複数持つことから，Ca依存性の膜融合に方法と結果ジスフェルリンの細胞内局在は細胞膜より主にゴル目

的関与する可能性が考えられる．またFER−1との相同性か
ら，精細胞での細胞膜への小胞融合に関与する可能性が示唆されている．細胞内における膜融合は，主に神経シジ体（anti−GM130），小胞体（anti−KDEL，anti−Bap31）に局在が観察された．この結果から，我々はジスフェルリンが小胞体やゴルジ体の小胞輸送の関与しているものと考えた．

ナプスのエクソサイトーシスの機構で知られており，小胞体やゴルジ体の小胞輸送には，小胞体からの順行

vesicle（Ⅴ）−SNAREであるシナプトタグミンはカルシウム
依存性のC2領域を介して，膜融合に関与し，V−SNARE性または逆行性が存在し，この輸送には，シナプト小胞の膜融合で知られるシンタキシン1のかわりにゴルジ体および小胞体に局在しているシンタキシン5が関与している．シンタキシン5は，NSF，α−SNAPと結合する機であるⅤ創MPとt・SNAREであるシンタキシン1，SNAP25が複合体を形成する．融合後にはNSF，α＿SNApと結合
し，ArPからADPに移行する際，それぞれの膜融合複合体を解離するという機能を果たしている．一方，ジス
フェルリンはカルシウム依存的にLAMP＿l陽性の小胞と構とP97（VCP），P47と結合する機構との両方が存在し，両者は括抗的に作用することが報告されている．前者のNSF，α−SNAI，はV創MPやシナプトタグミンと関与するの膜融合に関与することが報告され，筋細胞膜修復機構への関与が示唆されている，しかしながら，ジスフェル
リンの機能に関しては依然として不明な点が多い．

ことが知られているが，P97（VCP），P47については明らかにされていない．
これらを踏まえ，ジスフェルリンとシンタキシン5の結合について検討した．細胞に両遺伝子を共発現させ，一方，小胞体（ER）には，unLbldedproteinresponse（UPR）とendoplasmiCreticulumassociateddegradationという品質管理機構が存在している．upRはIREなどのストレスセ
ンサーを介しシャペロン蛋白の発現を誘導することで異細胞免疫染色にて観察したところ，ジスフェルリンとシンタキシン5は小胞体／ゴルジ体で共局在していた．免疫常タンパク質の折りたたみの正常化，ストレスの回避を図ると共に，新たなタンパク質の合成を抑制して小胞体の負担を軽減させる応答である．しかし，UpRで異常タンパク質が除去できず過度に変異蛋白の蓄積した場合，ERに直結したユビキチン／プロテアゾーム系の分解シス
テムにより分解される．それでも異常タンパク質が除去できない場合には，細胞はアポトーシス様の形態変化を示す．その細胞死には，ストレスセンサーであるIRElが関与する ASKノJNKの活性化や小胞体に局在する
caSpaSe−12の活性化が関与していることが示されている．
これまで我々は細胞にジスフェルリンを導入し，細胞内局在を各種細胞小器官のマーカーを用いた免疫染色法
により，細胞膜より主にゴルジ体，小胞体に局在が観察■国立精神・神経センター神経研究所疾病研究第五部

一44−

図1膜融合の機能
ジスフエルリンはシナプトタグミンと同様C2領域を介して，小胞のドッキングおよびプライミングに関与し，シンタキシン，SNAp25と複合体を形成する．

沈降法においても両者は結合し複合体を形成していることが明らかとなった．またこの結合はカルシウム存在下において増大した．
次にジスフェルリンとP97（VCP）p47との免疫沈降法
による結合実験では，ジスフェルリンはシンタキシンの得られなかった．しかしながら，一部の患者の筋組織について小胞体マーカーであるBap31抗体の染色像とほぼ同様にジスフェルリン抗体陽性の像が兄い出された．
C2C12細胞に過剰発現させたジスフェルリンは，時間経過に従って小胞体とゴルジ体の一部に凝集体として局

他にP47を介してP97（VCP）と結合することが明らかとなった．また複合体にはSNAP25が含まれていたが，α−SNAP，NSFなどは含まれなかった．

在したのち，細胞は細胞縮小などアポトーシスに典型的な像を示し，小胞体とゴルジ体に局在する凝集体はユビ
キチン化されていた．こうした凝集体は小胞体ストレス

また，青木博士らの研究により以前から示唆されていた脳型ジスフェルリンの機能を明らかにするために，ヒト脳のcDNAライブラリーからクローニングした結果，を引き起こし，mKの活性化，小胞体に局在するカスパーゼ12を活性化し，アポトーシスを誘導することが明らかとなった．

筋組織を含む多くの組織に発現するものと異なり，脳に特異的に発現する短いもの（脳型ジスフェルリン）が得られた．また，市販のヒト胎児発達過程および成人脳から得られたcDNAを用いRTPCR法により解析したとこ
ろ，脳型は，胎児でPCR断片が検出されず，成人脳において断片が見られた．このことから脳に脳型ジスフエル
リンが存在し，脳発達過程で変動し，神経細胞に発現すると考えられた．ラット神経細胞に脳型ジスフェルリンとシンタキシン1を共に導入したところ，細胞質とともにアクソン，デンドライトで共局在している像が観察された．
一方，正常人，三好型遠位筋ジストロフィー患者を含む筋疾患者の筋切片をジスフェルリン抗体，Bap31抗体について組織染色を行いスクリーニングを行った．正常ではジスフェルリンは細胞膜に局在しているものの，三考察

脳型ジスフェルリンは，神経系ではシナッブス小胞とシナッブス膜への融合に関与している可能性が考えられる．筋組織においてもジスフェルリンは小胞の融合に関与し，筋細胞膜の修復機構に関与していると考えられる．
これらのことから，ジスフェルリンは様々なシンタキシンと結合し，細胞内の様々な膜融合過程に関与していると考えられる．
一方，一部の筋ジストロフィー患者の筋組織において，
ジスフェルリン抗体陽性の像が小胞体に見出されたことから，ジスフェルリンの小胞体局在によるERストレスと筋ジストロフィーとの関係が示唆された．
今後の展望または研究の意義
ジスフェルリンは細胞内膜輸送，膜融合に関わる蛋白

好病では染色されずBap31抗体陽性領域と一致した像はと結合することから，多くの細胞で膜融合に関与していることが明かとなった．筋組織ではジスフエルリンが細胞膜修復の過程に重要な働きをしており，LAMP−1陽性の小胞との融合が関与していることがBansalやLenonら
によって相次いで報告されたが，未だにジスフェルリンが関与する膜融合の機構についての詳細は明らかにされていない．筋組織での膜融合機構についてさらなる検討が必要であろう．
図2 神経細胞におけるジスフェリンの局在神経細胞をジスフェルリン抗体で染色したもの く左：内在性）とジスフェルリンーEGFP遺伝子を導入したもの（右）．

細胞内膜輸送の異常と筋ジストロフィーが発症する機構との関係は今後の課題である．

ー45一

SJL〟マウス骨格筋における炎症性細胞とNFkappaB発現の経時的検討
栗 原 照 幸●

研究協力者名 根 本

目

博●

浦

的

浩

子●

中

空

浩

志●

の増加・脂肪変性は360日齢のみ認められた．中心核線

SJL〃マウスはむsfbrlinの欠損が報告され人の肢帯経は60日齢までは少数であるが，120日齢以降増加が見られ加齢と共に増加した．その変化は大腿四頭筋が最も強く，ついで上腕二頭筋に強く見られ，排腹筋・ヒラメ筋では軽度であった．

型筋ジストロフィー症（LGMB2B），Miyoshimyopathyのモデルマウスと考えられている．一方加齢によりBcell
lymphomaの出現が見られ免疫機能の障害が推定されている．加齢に伴うSJUJマウスの骨格筋での炎症性細胞浸潤の報告1日）がなされているが，筋の部位による炎

NADH染色：typeⅠ線経は120El齢よりtypeII線経に比べ萎縮傾向があり，240・360日齢ではさらに萎縮の進行が見られた．120日齢以降intracellularnetw。rkの乱れ・症性細胞浸潤・変性の差や炎症性細胞のphen吋peについての詳細な検討は行われていない．転写因子であるNF

targetLiberが出現し，360日齢では約半数にfibertypegroupingとsmallangulatednberを認めた．

kappaBはサイトカイン，ケモカイン，炎症性プロセス，
アポトーシスなどに関与しており，址ibitorkappaBがI
bppaBkinaSeにより活性化され核内で作用する．各種の筋疾患（多発性筋炎3），Duchenne型筋ジストロフィー症3），肢帯型筋ジストロフィー症（LGMB2A））での免疫組抜染色：炎症細胞浸潤（図1）；浸潤細胞数は加齢と共に増加し360日齢で最も多かった．その構成比率
はmacrophage（Mac−1，Mac−3）が全体の60−70％を占めていた・リンパ球subsetではCD4が25−30％，CD8が10−15％，
CD19が2％前後でありCD4／CD8比は2．0●3．0であった．

upregulationが報告されmdxマウスにおいても炎症性細胞浸潤が生じる以前の15日齢よりNFkappaBp65，p50の出現が報告4）されている．sJL〃マウスの筋の炎症性変化，変性の過程を経時的および部位ごとに検討し，その1∝l

分布と肢帯型筋ジストロフィー症（LGMB2B），Miyoshi
myopathyの関連を検討すること．またSJL〟マウスでの筋の炎症性変化が郎sfbrlinの欠損に伴う変性の過程と免疫機能の障害のいずれに起因するかを筋病理学的変化と

餌

巳

警

の

ロ
︻u
﹁

NFkappaBのsignalの変化を通して検討することを目的
とした．

忘

40

幻

0

転＿
（氾

方法と結果
メスのSJL〃マウス（各n＝5）を30，60，120，240，
360日齢で屠殺し，上腕二頭筋・大腿四頭筋・俳腹筋・ヒラメ筋・前脛骨筋を採取し，凍結切片を作成した．筋

la）

2勅

諭

由押

図1大腿四頭筋における炎症性浸潤細胞致（×200／鮎ld）

組織の染色はHematoxylin−Eosin染色，NADH染色を行い，また免疫組織染色としてCD4，CD8，CD19，Mac＿1，

口30

Mac−3，ICAM−1，NFkappaBp65を施行した．同時に血清を採取しCreatinekinaseの活性を測定した．

国60
日120

HE染色：炎症性細胞浸潤は30日齢ではほぼ認められ

Eヨ240

ないが，60日齢ではendomysium内に少数出現が認められた・120日齢でendomysium内の細胞数の増加が見られ日360

240日齢ではperimysium内にも炎症性細胞が出現し，360
日齢ではperimysiumの炎症性細胞浸潤が増強し，一部ではepimysiumにも炎症性細胞が見られた．問質の結合絨

Biceps Quad．F．

図2■東邦大学大橋病院神経内科

Soleus Gastro．Tib．Ant．

NFkappaB陽性細胞の比率
Quad・F＝Quadriceps

ftmoriS，Gastro．＝Gastrocnemius，

Tib．Ant．＝Tibialisanterior−46−この比率は各日齢において大きな変動はなく，主体をなすものはmacrophageであった．またICAM−1は炎症性細胞浸潤の認められる以外に，再生線経の多く見られる部
位に陽性細胞が見られた．NFkappaB（図2）；NFkappaB
陽性線経は炎症性細胞浸潤が出現する以前の30日齢から陽性細胞が少数認められた．中心核線経の増加の認められる120日齢より陽性細胞の比率が増加した．240，360
日齢ではさらに陽性線経が増加していた．陽性線経は排腹筋に最も多く，ヒラメ筋が最も少なかった．血清CK
値：血清CKは30日齢で378士151IU，60日齢で552±
219IU，120 日齢で1571±1470IU，240 日齢で4345±
3720IU，360日齢で5479±4377IUと加齢に伴い上昇が認められた．

であることから当初は変性に起因したsignalの誘導が生じているものと推定された．しかし360日齢では最も陽性細胞が多いことから，変性の要素に加えて炎症の機序
もNFkappaBの活性化に関与していると考えられた．
今後の展望
SJL〟マウスにおける炎症性細胞浸潤は変性の二次的結果と考えられる．sJL／JマウスのNFkappaBの抑制による筋の変性の改善の有無を確認する．NFkappaBの活性化因子としてmF αがあげられていることからTNF
α，NFkappaBp50・p65の遺伝子レベルでの発現を検討する．またSJL／Jマウスでのdysfbrlin欠損にともなう
dystrophinの発現の増加が認められるかを検討する．

考察
筋の炎症性変化・変性は加齢と共に増強が認められ，

文

献1）KostekCA，DominovJA，MillerJB．：Up−regulationof

血清CK値もそれに平行して増加した．筋の部位別には
大腿四頭筋・上腕二頭筋で下肢の屈筋・伸筋群より変化

MHCclassIexpressionaccompaniesbutisnotrequiredが強く，人のLGMB2Bに類似した障害のpattemが認められた．Miyoshimyopa仙yで障害される下腿の屈筋群の変化は最も軽かった．また一部には神経原性の変化を示唆する

mice．AmJPathol160：833−839，2002．

for spontaneous myopathyin dysfbrlin−de月cient SJL／J

2）WellerAH，Magliato SA，BellKPetal．：Spontaneous
myopathyintheSJL〃mouse．Pathologyandstrengthloss．

所見も認められた．炎症性細胞は全経過を通じて

MuscleNerve20：72−82，1997．

macrophageが主体をなしていた．TcellsubsetではCD4が3）MoniciMC，AguennouzM，MazzeoAetal．：Activation

優位であり，Bcellはごく少数のみであった．Macrophage
優位なことから筋の変性による二次性の変化が推定された．しかしSJL／Jマウスにおける実験的自己免疫性筋炎の炎症性細胞の比率とこの変化はほぼ同等であり今後検討が必要と考えられる．

Of nuclear fhctor−KBininnammatory myopathies andDuchennemusculardystrophy．Neuro］ogy60：993−997，

2003．

4）KumarA，BoriekAM．：Mechanicalstressactivatesthe
nuclearfactor−kappaBpathwayinskeletalmusclefibers：aまた転写Eq子であるNFkappaBp65は生後30El齢より活性化が見られ，120日齢で中心核線経の出現する時点において出現頻度は増加した．炎症性細胞浸潤は軽度

possibleroleinDuchemnemusculardystrophy．FASEBJ
17：386−396，2003−47−

Ⅱ．FCMD（福山型先天性筋ジストロフィー）

福山型先天性筋ジストロフィーにみられるてんかんと遺伝子異常との関連
吉 岡 三恵子●・●●
共同研究者

松

本
藤

目

貴
井

達

子●・●●
哉……

樋

池

的

口

田

嘉

浩

久…愛

波

秀

男…●

子●●戸

田

達

史……

いれんに移行していた．脳波で突発波を認めたのはホモ

福山型先天性筋ジストロフィー（FCMD）はフクチン
遺伝子の異常により胎生期の神経細胞遁走障害が引き起こされ，丸石様滑脳症という特徴的な皮質形成異常を持つ1）．我が国のFCMD患者はすべてフクチン遺伝子に3kbの挿入変異を持ち，多くがこの変異のホモ，残りはヘテロ接合体であり，一般に後者が重症と報告されている2）．

群7，へテロ群10例．突発波の部位は両群とも前頭，頭頂，側頭又は後頭部など種々の部分にみられたが，前頭部と側頭部に多かった．発作型は両群とも有熱性では全
身性強直間代けいれん，無熱性では複雑部分，二次性全般化発作であったが，ヘテロ群ではこの他にミオクロ
ニー及び強直発作が認められた．抗てんかん薬はホモ群

今回，FCMDにみられるてんかんと遺伝子異常との関連を調べ，てんかんの予後や治療方針の決定に役立たないか検討した．

8，へテロ群10例に投与．使用薬剤としては，熱性けい
れんで始まることが多いことを受けて，両群ともパルプ
ロ酸が最も多く，ついでフェノバルビタール，カルバマ
ゼピン，クロナゼパム，ゾニサミドであった．2〜3種類の抗てんかん薬を最大限まで用いても尚，抑制困難な発作を持つ難治例はヘテロ群の4例に見られた．cT／MMではホモ群に比べ，ヘテロ群に高度の脳奇形を認めた．
運動・言語能力については，頚定の見られない症例がホ対象および方法
フクチン遺伝子に挿入変異を認め，FCMDと診断された34例．挿入変異をホモで持つか，ヘテロで持つかにより，前者をホモ群，後者をヘテロ群とした．両群とも17例で，共に男8例，女9例．経過観察期間（平均）はホ
モ群16年，ヘテロ群10年．けいれんについては，有熱時のみのものを有熱性，有熱時に始まり無熱性となったもの及び当初から無熱性のものを無熱性とした．病歴と脳波所見より発作型を診断した．又．全例CT／MRlにより脳奇形を調べると共に，最高運動能力，言語能力や眼科的異常も調査した．更に，ヘテロ群についてはハプロ
タイプの分析だけでなく，一部の症例において3kbの挿入変異を持つ染色体以外の，他の染色体に見られる変異について，シークエンスを行って詳細に調べた．
結

モ群2／17例に対し，ヘテロ群では7／17例と多く，座位可能な症例はホモ群14／17例，ヘテロ群4／17例で，一般にヘテロ群で重度の運動障害が認められた．言語についても有意味請を話せない症例はホモ群では2／17例に対し，ヘテロ群では11／17例と多かった．眼科的な異常では特に両群に差が顕著であり，ヘテロ群では網膜変性を7例に，網膜剥離を5例に認めたのに対し，ホモ群には網膜病変を持つ例はなかった．
ヘテロ群において，3kb挿入以外の変異は，エクソン3にノンセンス変異（C250T／Arg47Stop）を4例に，エクソ
ン8にノンセンス変異（ClO30T／Arg307Stop）を1例に，エクソン5にミスセンス変異（T509C／Met133Thr）を1

果けいれんはホモ群11／17例（65％），ヘテロ群12／17例（71％）に出現．内訳では有熱性はホモ群3，へテロ群
4名に，無熱性はホモ群8，ヘテロ群8名に見られた．

例に認めた．これらの症例はいずれも重度の脳奇形を示したが，難治例は2例のみで，他は早期に死亡又はけいれんを認めなかった．

初発年齢（平均）は有熱性ではホモ群3歳4カ月，ヘテ
ロ群2歳3カ月，無熱性はホモ群9歳2ケ月，ヘテロ群
6歳2ケ月．生涯に1回だけ熱性けいれんを認めた例もホモ群に見られたが，一般に両群とも大部分の症例は幼少期に熱性けいれんではじまり，数年の経過で無熱性け

考察
FCMDを疑うと最近では先ず遺伝子解析を行うので，遺伝子異常の種類によって早期に発作の予後が予測されると治療方針が立てやすい．今回の検討ではけいれんの発症率にはホモ群とヘテロ群の間に大きな差は見られなかったが，ヘテロ群では無熱性けいれんを来たした例の●神戸市総合療育センター小児神経科＝神戸市立中央市民病院小児科●●●国立病院機構宇多野病院小児科…●静岡県立こども病院小児神経科●●●●●滋賀県立小児保健医療センター小児科……大阪大学大学院院医学系研究科ポストゲノム解析分野

半数は難治性であった．又，けいれんの発症年齢はヘテロ群で低く，この群では重度の障害のため，早期に死亡する例が多く，けいれんの発症を見ないことも多かった．
−51−

遺伝子診断においてヘテロ群に属する症例では，早期からmusculardystrophy．Nature394：388−392，1998．

てんかんの治療について十分な配慮が必要と考えられた．

Kond0−Iida E，Kobayashi K，Watanabe M，etal．：Novelmutations and genotype−Phenotype relationshipsinlO7

文

献familieswithFukuyama−tyPeCOngenitalmusculardystrophy

1）KobayashiK，NakahoriY；MiyakeM，etal．：Anancient（FCMD）．HumMoIGenet8：2303−2309，1999．

retrotranSPOSalinsertioncausesFukuyama−tyPeCOngenital−52−

福山型筋ジストロフィーおよび類縁疾患の遺伝子異常と蛋白質／細胞病態および治療に関する研究
戸

達

史●
●

●
●
●
●
●
●
●
■
●

玉

●

●
●
●
●

司情夫

雅

●
●
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川口藤

立野遠

●

曙史博

剛

●

●
●
●

永谷

●

●

熊沖萬

●

理

子樹哉

真浩征

●
●
﹂▼

●

口橋中

●

谷倉埜

●

浩美三

代
千妃一

林口野

小谷西

研究協力者

田

見出したものと合わせた13変異は，PO〟G〝〃遺伝子
全体に散在していた．MEBはフィンランドの疾患ではなくアジア人も含め世界中に分布することを見出した．

緒
言福山型先天性筋ジストロフィー症（FCMD）はⅠⅠ型滑脳症及び限奇形を伴う，日本で二番目に多い小児期の常染
色体劣性遺伝性筋疾患である．我々はその原因遺伝子をその変異位置と臨床症状との間に対して，眼・筋・脳に関して計12人のMEB患者の臨床症状を調べたたと9q31にマップし，ポジショナルクローニングにより同定してきた．責任遺伝子であるルb〟加は筋細胞膜上のα−dystroglycan（α−DG）の0−マンノース型糖鎖修飾に関与すると推定されている．また，さらに平成13年に，muSCle−

ころ，比較的，多様な臨床症状が認められ，MEB病には従来考えられていたよりも広い臨床スペクトラムが存在する事が分かった．またPO〟GJ7rJ遺伝子の5，末端側に変異のある患者には水頭症があり，比較的重症なeye−brain（MEB）病の原因遺伝子がprotein0−1inked

phenoW匹であるのに対して，3，末端側に変異のある患者には水頭症がなく比較的軽症なphenotypeであった．
またFCMDでは，西洋では点変異2個のため通常胎生致死になり患者が存在しないが，日本においては，珍mamoseP1，2，ルacetylglucosaminyltranSfbrasel（POMGnTl）

糖転移酵素遺伝子である事を，報告した．その遺伝子産物は0型マンノースに特異的にG叫NAcを転移する糖転移酵素である．この一連の糖転移酵素に変異をもつ

しいレトロトランズポゾンDNAの挿入が起こったため，この疾患が発生した，としてきたが，この考えを裏付けるように，2003年にトルコにおいて出生後10日で死亡した男児が，フクチン遺伝子の一塩基挿入変異をホモで持っていたことを報告した．海外の診断例ではもう一例，

muscle−eye−brain（MEB）病や，Walker−Warburg症候群（WWS）においても，FCMD同様，α−DGと筋基底膜間の結合性の低下をきたし，重度の先天性筋ジストロフィーを呈する．これらは類縁疾患とされ，α−ジストロクリ
カノバチー（α−dystroglycanOpathy）と総称される．
我々は，今回の3年間でこの班として以下のことを明らかにした．

塩基置換によるノンセンス変異をホモで持ち，出生後4ケ月半で死亡した例が報告されている（計2例）．

結果と考察（2）フクチンの構造と機能の解析とMEB病原同根転位
酵素POMGnTlとの連関に関する検討（1）FCMD，MEB病患者の世界各地における分布とその広い臨床スペクトラム
当初は，トルコ・フランス人計6人の患者から6種類

フクチンの糖転移酵素活性を調べるために，フクチン
強制発現細胞，あるいはFCMD患者と健常人の線維芽細胞を用いて，Man転移，GIcNAc転移，Gal転移，Siaの遺伝子変異を見出したが，これらはFCMDの舟山血遺伝子に見られるような特殊な3kbinsertion変異とは異転移活性それぞれを測定したところ，現在のところ，フクチンには明らかな糖転位活性は，認められていない．
動物細胞での強制発現系においてフクチンの細胞内局なり，全てシンプルなpoint mutationであった．今回
FCMD原因遺伝子であるル血肋遺伝子に変異が認められなかった患者を中心に，日本・韓国などアジア地域を含めた世界各国のWWS，重症型のFCMD，MEBが疑在を観察したところ，フクテンはゴルジ体に局在し，フクチンの膜貫通領域にゴルジ体局在シグナルの存在が示唆された．一方FCMD患者で見られたY371Cミスセン

われる患者計30人においてア耶〃〃遺伝子異常のス
クリーニングを行った．その結果，日本・韓国を含む世界各国の患者6人より，7種類の変異を新たに見出した．

ス変異体は小胞体に局在した．
POMGnTl も同様にゴルジ体に局在した．さらにPOMGmTl とフクチンを共発現させると両者は共にゴル

これらの変異も全てpointmutationであり，また今まで

ジ体に局在するが，正常型フクチンの代わりにY371C
変異フクチンと共発現させると，POMGnTlの局在も小胞体へと変化した．フクテンやPOMGnTlと同様に，α−●大阪大学院医ゲノム機能分野●●藤田保健衛生大学総合医科学研究所…大阪大学院医小児事斗…●国立精神・神経センター神経研究所●●●●●東京都老人総合研究所

dystroglycanの糖鎖修飾に関わっているとされるLarge
では，Y371Cミスセンス変異フクチンを共発現させて−53−

も局在の変化は観察されなかった．また免疫沈降法によOfcL−dystroglycanin muscle−eye−braindisease．Biochem

る実験では，フクチンとPOMGnTlは共沈した．この結β甲甲如 e∫Co仰乃〟〝291：1283−1286，2002．

合はtwo−hybrid法でも確かめられた．フクチンの膜貫通

2）ZanoteliE，RochaJC，NarumiaLK，FiremanMA，Moura

領域のみをGFPと融合させた蛋白質を用いた実験でも，LS，01iveiraAS，GabbaiAA，Fukuda Y，Kinoshita M，

POMGnTlの共沈が観察された．これらの結果から，フ辿ユ：Fukuyama−tyPeCOngenitalmusculardystrophy：a

クチンとPOMGnTlは細胞内において，膜貫通領域を通CaSe rePOrtintheJapanesepopulationlivingin Brazil．

して結合していると考えられた．

dcね肋肌）J助α〃d106：117−121，2002．

α−dystroglycanの糖鎖修飾に異常をきたす各α−ジス
トログリカノバチ一において，コア蛋白質に対する抗体

3）HorieM，KobayashiK，TakedaS，NakamuraY，LyonsGE，

でみたα一dystroglycanはいずれも同程度の分子量を示し，

homologue of the Fukuyama−type congenital muscular

またフクチンにはα−dystroglycanとlamininの結合に関わる糖鎖に関して明らかな糖転位活性が検出されない事か

dystrophygene，fukutin．Genomics80：482−486，2002．
4）Taniguchi K，Kobayashi K，Saito K，YamanOuChi H，ら，フクチンはPOMGnTlと複合体を形成し，何らかの

0lmuma A，HayashiYK，Manya H，Jin DK，Lee M，

機能的連関を示すと思われる．

ParanoE，FalsaperlaR，PavoneP，VanCosterR，TalimB，（3）α−ジストログリカノバチーの神経筋接合部異常と筋分化遅延についてSteinbrecherA，StraubV，NishinoI，TopalogluH，VoitT，

FCMD患者の骨格筋をNCNPで独自に開発された

ClinicalspectrumOfmuscle−eye−braindisease．HumMbE

TodaT．：Isolationandcharacterizationofthemurine

Endo T，Toda T：Worldwide distribution and broader

cDNAマイクロアレイにより発現解析を行い，また，0＿Ge〃eJ12：527−534，2003．

dystroglycanOPathyの一疾患であるLARGE変異モデルマ

5）SilanF，YoshiokaM，KobayashiK，SimsekE，TuncM，ウス（q7dマウス）を用い，a−dystroglycanOPathyにおける発現解析及び病態解析を行った．

AIper M，Cam M，Guven A，Fukuda Y，Kinoshita M，KocabayK，TodaT：AnewmutationofthejiLkutingenein

FCMD及び〝画の筋線経では筋分化過程後期に発現

anon−Japanesepatient．AnnN〟rO153：392−396，2003．

する転写因子である叩〆βや〝叩如月e叩，C力α加2，7の発現低下をきたし，また電顕的観察において，筋細胞の核

6）TakedaS，KondoM，SasakiJ，KurahashiH，KanOH，Arai

及び筋線経の成熟障害を呈した．また神経筋接合部では

Imamura M，Nakamura Y，Shimizu T，MurakamiT，K，Misaki K，Fukui T，Kobayashi K，Tachikawa M，

免疫染色および電顕的観察において，著しい異常像を認SunadaY，FltjikadoT，MatsumuraK，TerashimaT，王旦虫

め，α−dystroglycanのクラスタリングも不良であった．
これらのことより，神経筋接合部由来の筋分化シグナル＝：FukutinisrequiredformaintenanCeOfmuscleintegrity，が基底膜障害により不完全となり，筋線経の成熟障害を

肋JGe〃eJ12：1449−1459，2003．

COrticalhistiogenesisandnormaleyedevelopment．Hum

起こすことが，α−dys廿Oglycanopa血yの筋ジストロフィー
以外の主要な病態生理である可能性が示唆された．

7）TodaT．KobayashiK，TakedaS，SasakiJ，Kural1aShiH，KanoH，TachikawaM，WangF，NagaiY，TaniguchiK，
TaniguchiM，SunadaY，TerashimaT，EndoT，Matsumura

今後の展望

K：Fukuyama−type congenital muscular dystrophy

cL−dystroglycanOPathyの一連の原因遺伝子の中で，その活性がわかっているのは，POMGnTlとPOMTlだけ（FCMD）and a−dystroglycanopathy．Cb77genit Anomである・フクチンにはα−dystroglycanと1amininの結合に関わる糖鎖に関して明らかな糖転位活性が検出されない

8）TodaT．KobqyashiK，TakedaS，SasakiJ，KurahashiH，事から，その働きは通常の酵素ではなく，モデュレ一夕ー

TaniguchiM，SunadaY，TerashimaT，EndoT，Matsumura

43：97−104，2003．

KanoH，TachikawaM，WangF，NagaiY，TaniguchiK，のようなものが考えられるが，日本人に多い疾患のため，

K：Fukuyama−type congenital muscular dystrophy and一刻も早く詐称を兄い出さなければいけない．また今後

abnomal glycosylation ofα−dystroglycan．BasEc4EPlは治療的アプローチが展開していくことが期待される．

坤0713：287−292，2003．
9）Kural1aShiH，TaniguchiM，MenoC，TaniguchiY，Takeda

文献S，Horie M，Otani H，Toda T：Basement membrane

1）KanoH，KobayaLShiK，HerrmannR，TachikawaM，Manya

丘agi1ityunderliesembryoniclethalityinjhkutin−nullmice．

H，NishinoI，NonakaI，Straub V，Talim B，Voit T，

楠〟川あわJかね10：208−217，2005．

TopalogluH，EndoT，YoshikawaH，TodaT：Deficiency−54−

筋ジストロフィーにおける糖鎖異常と病態機序の解明
遠
研究協力者

萬 谷
小 林

日

千

藤

玉

夫●

博●
赤 阪 啓 子
千 葉 厚 郎●●浩…● 地 神 芳 文…●● 西 原 祥 子……

吉 田 有 人…
戸 田 達 史…●

POMGnTlの機能喪失による疾患であると結論した4）．

的

さらに，各変異が酵素活性に及ぼす影響を詳細に検討するため，N末端及びC末端側からアミノ酸を削った
POMGnTlを作製し触媒活性領域を決定した5）．MEBで我々はこれまでにαジストログリカンの糖鎖解析により，マンノース（Man）を介してタンパク質に結合する新しいタイプの糖鎖，0−Man型糖鎖（Siaα2−3GalP1−4GIcNAcβ1−2Man）を発見した．さらに，0−Man型糖鎖の合成に関検出された変異のうち2例は，触媒額域ではない幹領域の1アミノ酸置換であったが，この解析から，これらの変異が幹領域を含めた全体の立体構造を変化させること

わるprotein（｝mamoseP1，2ルacetylglucosaninyltranSftrase（POMGnTl）の遺伝子が，先天性の筋ジストロフィーに限奇形，神経細胞移動障害を伴う常染色体劣性遺伝病でによって酵素活性を阻害することが示唆された．また，MEB骨格筋でのαジストログリカンの糖鎖異常を確認
し，αジストログリカンが本酵素の標的分子の一つであることを示した6）．

あるmuscle−eye−brain（MEB）病の原因遺伝子であることを明らかにした1）．この原因遺伝子の特定により臨床症状が複雑多様であるMEBの遺伝子レベルでの確定診断が可能になり，その結果この疾患は欧州に限らず日本人

0−Man転移酵素について，基質特異性や界面活性剤の要求性など反応条件を検討し，哺乳類における0＿Man転移酵素活性の測定法を世界で初めて確立した7）．そこで，WWSの原因遺伝子産物，POMTlが0−Man転移酵素であるのか検討した．ヒトPOMTl及びPOMT2をHEK293T

を含め世界中に患者が分布していることが判明した2）．
一方，Walker−Warburg症候群（WWS）は，乳幼児期に死亡することが多く MEBより重篤な疾患である．
オランダのグループによって酵母の 0●Man型糖鎖細胞に発現させ酵素活性を調べた．その結果，POMTlとPOMT2を共発現させた細胞で0−Man転移活性は顕著に上昇し，POMTlあるいはPOMT2の単独発現では活性合成の開始酵素である 0−Man転移酵素brotein
O一mannOSyltransferase：pmt）のヒトホモログ，POA爪遺伝子にWWS患者の20％で変異が起こっていることが報
告され，タ0〟打がWWSの原因遺伝子であることが示された3）．哺乳類のpmtホモログとしてこれまでPOMTlとPOMT2が報告されているが，これらの酵素活性については全く明らかにされていなかった．

の上昇は全く見られなかった．このことから，POMTlとPOMT2は0−Man転移酵素であることが明らかとなり，活性発現にPOMTl−POMT2複合体形成の必要性が示唆された刀．さらに，WWS患者の遺伝子解析から検出されこのように，αジストログリカンの糖鎖異常，特に0−Man型糖鎖の修飾不全が筋ジストロフィーの発症原因となることが示唆されていることから，0−Man型糖鎖の生合成経路を解明し，筋ジストロフィーの発症メカニズ

た，PO〟〃遺伝子の変異が酵素活性に及ぼす影響を調べた．これまでに7種の変異が見つかっているが，このう
ち2種は酵素タンパク質の大部分が欠央するため活性はないと考えられることから，残り5種について各変異を

ムを生化学的に明らかにする必要がある．

導入した変異型PO〟TJcDNAを作製し，HEK293T細胞にPOMT2と共発現させた．その結果，いずれの変異体
も酵素活性を消失していたことから，WWSはPOMTl

方法と結果の機能喪失による疾患であると結論した8）．また，WWS
骨格筋でもMEBと同じようにαジストログリカンの糖鎖異常が起こっており，αジストログリカンが本酵素の標的分子の一つと考えられた3）．

我々は，MEB患者の遺伝子解析からPO〟G〃〃遺伝子に13種類の変異を兄いだした．これらの変異遺伝子産物
が酵素活性を有するかどうか調べるため，各変異を導入した変異型ア0〟G〝rJcDNAを構築しHEK293T細胞に発現させ，酵素活性を測定した．その結果，すべての変異体で酵素活性が消失していたことから，MEB はショウジョウバエにも2つのア0〟rホモログがある．
これらの解析から，ヒトと同様にPOMT活性発現には両ホモログの共存が必要であることを示した．また，MAi
によりそれぞれの発現を抑制すると筋形成がうまくできず体がねじれてしまうことを明らかにした．これらの結●東京都老人総合研究所＝杏林大学医学部●●●キリンビール基盤技術研究所…●大阪大学大学院医学系研究科●■●●●産業技術総合研究所糖鎖工学研究センター…＝創価大学工学部

果は，脊椎動物と無脊椎動物を問わず筋形成における
0＿Man型糖鎖の重要性を示している9）．
−55−

0
3

∞

の研究により，MEB病と類似の病態を呈する福山型先天M

C型（MDCIC），先天性筋ジストロフィ，1D型（MDCID）など他の筋ジストロフィーでも，いずれもαジストログ

52∞性筋ジストロフィー（FCMD），先天性筋ジストロフィー1

弼

伴う筋ジストロフィーの発症機序に糖鎖が深く関わると考えられる10・11）．これらの異常を具体的に明らかにする⁝ことは，筋ジストロフィーの糖鎖病理機序の解明の新た50︒︒

言dp︶ゝ一写竜巾OHPq∝

リカンの糖鎖修飾異常が認められ神経細胞移動障害をな道を拓くことが期待される．
文献

椚−NNトロ巾−巾○Er

凸QN寸＞︼OPTN寸﹂

∝￠トロ

︻↑三〇d

N↑≡Od

Tト≡Od

p010虐亡TuOu

1）YoshidaA．，Kobayashi，K．，Manya，H．，1払niguchi，K．，
Kano，H．，Mizuno，M．，Inazu，Tl，Mitsuhashi，H．，
Thkahashi，S．，Thkeuchi，M．，Herrmann，R．，Straub，V，「hlim，B．，Vbit，T．，Tbpal0glu，H．，Tbda，Tl，Endo，T：DeY．
Ce111：717・24，2001．

POMT2（◆）

図1ヒトPOMTlとPOMT2の0．Man転移活性とWWS患者
より検出されたPOMTlの変異による酵素活性への影響．
POMTlあるいは変異POMTlとPOMmを単独あるいは共発現させ，0・Man転移活性を測定した．poMTlとPOMT2の共発現でのみ活性が題著に上昇した．変異POMTlとPOMlつの共発現では活性の上昇は観察されなかった．
G76R：Gly76Argミスセンス，L421del：Leu421欠失，V428D：
Ⅶ428ASpミスセンス，V703色：Ⅶ703フレームシフト729
停止，G722危：Gly722フレームシフト729停止．

2）nniguchiK．，Kobayashi，K．，Saito，K．，Yamanouchi，H．，
0lmuma，A．，Hayashi，Y∴K．，Manya，H．，Jin，D．K．，Lee，
M・，ParanO，E．，Falsaperla，R．，Pavone，R，ⅥmCoster，R．，
Tblim，B．，Steinbrecher，A．，Straub，V，Nishino，I．，
Tbpal0glU，H．，Vbit，Tl，Endo，Tl，Tbda，Tl：Hum．Mol．
Genet．12：527−34，2003．
3）Beltran−ⅥlleroDeBemabeD．，Cumier，S．，SteinbrecheちA・，Celli，J・，unBeusekom，E．，1ねnDerZwaag，B．，
Kayserili，H・，Merlini，L．，Chitqyat，D．，Dobyns，WB．，

Siaa2ナ3GalPl・＞4GIcNAcPl・＞2Manal・＞ThrJSer

Cormand，B．，Lehe可oki，A．E．，CruCeS，J．，Vbit，Tl，Walsh，
C．A．，ⅥmBokhoven，H．，Brunner，H．G：Am．J．Hum．
Genet．71：1033−43，2002．
4）Manya H．，Sakai，K．，Kobayashi，K．，Tbniguchi，K．，
Kawakita，M・，Tbda，T，Endo，T．：Biochem．Biophys．Res．
Commun．306：93−7，2003．
5）Akasaka・ManyaK．，Manya，H．，Kobayashi，K．，Tbda，

図2 0−Man型糖鎖の生合成と筋ジストロフィー．POMTlおよびPOMGnTlの変異により 0＿Man型糖鎖不全となり，それぞれWWSとMEBが発症する．α＿DG：αジス
トログリカン，Sia：シァル酸，Gal：ガラクトース，
GIcNAc：N−アセテルグルコサミン，Man：マンノース

T，Endo，T：Biochem．Biophys．Res．Commun．320：
39−44，2004．

6）KanoH．，Kobayashi，K．，Hemnann，R．，Thchikawa，M．，
Manya，H．，Nishino，I．，Nonaka，I．，Straub，V，Thlim，B．，

考

Vbit，T，Tbpal0glu，H．，Endo，T，Yoshikawa，H．，Tbda，Tl：

察

Biochem．Biophys．Res．Commun．291：1283−6，2002．

本研究により，MEBとWWSの原因が0−Man型糖鎖不7）ManyaH・，Chiba，A．，Ybshida，A．，Wang，X．，Chiba，Y．，

全であることが明らかとなり，神経細胞移動障害を伴う筋

Jigami，Y，Margolis，R．U．，Endo，Tl：Proc．Natl．Acad．

ジストロフィーの発症機序に0−Man型糖鎖が深く関わる

Sci．USAlOl：500−5，2004．

ことが示された．poMTの変異は，0＿Man型糖鎖合成経8）Akasaka−Manya K．，Manya，H．，Endo，T：Biochem．

路でPOMGnTlより初期に働く酵素の変異であり，MEB

Biophys．Res．Commun．325：75−9，2004．

と比べてWWSでは全く0＿Man型糖鎖ができないために

9）Ichimiya T．，Manya，H．，Ohmae，Y，Ybshida，H．，

より重篤な症状を呈するのではないかと考えられる．

Thkahashi，K．，Ueda，R．，Endo，Tl，Nishihara，S．：J．Biol．
Chem．279：42638−47，2004．

研究の意義10）EndoT．，Tbda，Tl：Biol．Pharm．Bu11．26：1641−7，2003．

これらの成果は，生体における0−Man型糖鎖の重要性

11）EndoT．：GlycocortiugateJ．21：3−7，2004．

を明白に示すものであり，さらに筋ジストロフィーの病態解明に向けて大きく責献するものと期待される．最近

ー56−

筋形質膜蛋白質に起因しない筋ジストロフィーの病態解明についての研究
林

●

浩子三
●

奈
加一

●

●

本藤野

●

征

●

松後西

●

み恵哉

る
て

●

ラミンA／Cは核膜に局在できることを示唆している．心

平成15年度はEmeけ−DreiRISS型筋ジストロフィー（EDMD）の原因遺伝子産物エメリンを欠損するモデルマ
ウスについて報告した．また平成16年度は本邦で初めて

電図解析を行ったところエメリン欠損のマウスで房室伝
導時間が有意に延長していた．pR間隔はRR間隔と正の相関を示すためPⅣRR比で検討したところ，エメリン欠損マウスでPⅣRR比0．40±0．05（n＝32），ヘテロ0．37±

MDCIC几GMD2Ⅰ患者を見出したので報告した．本報告書
では各年度の結果をそれぞれ記す．

0．06（n＝14），野生型0．36士0．05（n＝7）であった．心伝導障害が明らかであるにもかかわらず心筋の線維化などの異常は認められなかった．

平成15年度：エメリン欠損マウスの解析
日

上川中

村小埜

●

子美惜

律留

澤川口

小黒野

研究協力者

由起子＊

的

EDMDは遺伝性の筋疾患で，1）病初期から出現する考察・今後の展望

関節拘締，2）緩徐進行性の筋力低下・筋萎縮，3）心伝導障害を伴う心筋症を3主徴とする．核内膜に局在する
エメリンの欠損によるX染色体劣性型，核ラミナの構成
蛋白質であるラミンA／Cの欠損による常染色体優性・劣性型があるが，臨床的に明らかな違いはみいだせない．
モデル動物としてはこれまでにラミン〟C遺伝子のbock−inとbock−Outのマウスが報告されている．これらのマウスは生下時には明らかな異常は認めないが，ホモの変異マウスは出生4〜6日齢で成長率の著明な低下を認め，6〜8週齢までに死亡する．筋病理像は心筋・骨格筋ともに筋線経の発達が見られず低形成で，週齢を追うごとに筋線経の萎縮もみられるようになる．一方，ヘテ
ロマウスに明らかな異常は認めない．今回我々はⅩ染色体劣性型EDMDの病態解明を目的にエメリン欠損マウスを作製し，解析したので報告した．

エメリン欠損マウスは光顕レベルでは骨格筋・心筋ともに病理学的に明らかな異常はみられなかったが，心伝導系の細胞に何らかの異常を生じうるものと考えられた．
今後心伝導型を中心に電顕レベルでの詳細な解析を進めていく予定である．
平成16年度：本邦におけるMDCIC几GMD2Ⅰ
日

的α−ジストログリカン（α−DG）の糖鎖修飾異常は，福山型先天性筋ジストロフィー（FCMD）をはじめ，複数の重症な筋ジストロフィーの病態と深く関わっている．
MDCIC几GMD2Iの原因遺伝子産物，フクチン関連蛋白質（FKRP）はフクチン同様α−ジストログリカン（α＿DG）の糖鎖修飾に関与していると考えられている．

方法と結果
エメリン欠損マウスを作製し，遺伝子型，成長率，筋力低下・筋萎縮の有無，心筋・骨格筋病理所見，心電図変化について解析した．
81週齢まで観察したところエメリン欠損マウスはヘテロや野生型と同様の成長曲線を示した．明らかな筋力低下や筋萎縮はみられず，繁殖も可能であった．骨格筋の病理所見でもジストロフィー変化，筋線経の低形成な
どはみられなかった．免疫染色ではエメリンは欠損していたがラミンA，C，B2，およびLAP2に明らかな異常は認められなかった．これはエメリンが欠損していても●国立精神・神経センター神経研究所−57−

MDCIC几GMD21は，これまでにヨーロッパや中東では多数の報告があるが，本邦からの報告例はない．
MDCICは乳児期より筋緊張低下，運動発達遅滞を示し，歩行獲得に至らない重症の筋ジストロフィーである．
FCMDと異なり，ほとんどの例では脳形成異常は認められず，精神発達も正常であるが，小脳嚢胞，滑脳症など脳奇形や重度の精神発達遅滞の合併例もある．一方，LGMD2Iの発症は乳児期以降成人までと幅広く，独歩可能で精神発達は正常である．脳奇形も伴わない．これまでに報告されている90％以上の患者には共通の遺伝子変異（L276Ⅰ）が認められる．MDCIC几GMD2Ⅰともにα−DGの糖鎖を認識する抗体（VIA4−1）でα−DGの異常が検出される．
我々はα−DGの糖鎖修飾異常を示す患者の中に2例のMDCIC几GMD2Ⅰを見出したので報告した．

方法と結果臨床筋病理学的に非福山型先天性筋ジストロフィー（nonFCMD）と診断された患者63例についてa−DG（VIA4・1）抗体を用いたスクリーニングを行い，免疫反応
で異常を認めた例についてFKRPならびにフクチンの遺伝子解析を行った．
VIA4−1の免疫反応が減弱（23例）あるいは欠損（11例）

弱さ以外には異常は認めない．運動発達歴は定頚3ケ月，独座7ケ月，独り立ち1歳2ケ月，独歩2歳とやや遅れを認め，1歳7ケ月時よりGower，ssignを認める．精神発達は正常で頭部MRlも正常．顔面筋羅患なし．眼所見正常．現
在も独歩可能．排腹筋肥大あり．血清CK値は4，924IU／1と高値．筋病理変化は症例1に比べ軽度．
2例とも骨格筋におけるVIA4−1の免疫反応は欠損してしていた計34例について遺伝子変異検索を行った結果，
フクチン遺伝子の3−kb挿入変異を3例，FKRp変異を2例見出した．FKRP変異例の臨床症状を下記に記す．

いた．α−DGのコア抗体（GT20ADG）では，FCMDとほぼ同じ分子量のα−DGが検出されたが，ラミニンとの結合はみられなかった．FKRf遺伝子検索の結果，患者1に＜患者1＞6歳日本人女児．出生時より筋緊張低下，運動発達遅滞を認め，独歩はできず現在車椅子．精神発達は正常で小学校普通学級に通学中である．顔面筋羅息は266C＞G（P89A）と1169＿1170delGC，患者2に823C＞T（A275C）と987delCといった，いずれも新規の変異が見出された．

なく，先天性の内斜視を認めるものの，眼底異常なし．
四肢筋力低下と下腿の肥大を認めた．血清CK値は6，429IU／1と高値．頭部MRI上脳回の形成異常はないが，小脳に複数の嚢胞を認めた．筋病理像はFCMDと酷似していた．
＜患者2＞9歳台湾在住中国人女児．周生期は吸綴力の考察・今後の展望
本邦にもMDCICrLGMD2Ⅰ例が存在する．これまでの報告例と考え合わせると，FKRP遺伝子変異による臨床症状，
α一DGの変化はきわめて多様である．今後，より臨床症状の軽い例にも検索範囲を広げていく予定である．

一58−

新たなモデル動物を用いたα−dystroglycanopathyの発症機序に関する研究
清 水 輝 夫●

研究協力者

斉

日

藤

史

明●

新

井

謙＊

的

水

谷

誠…

松

村

喜一郎●

α−dystroglycanのIaminin結合能は減少していた．レクチ

福山型筋ジストロフィー，muSCIe−eye−bmin病，ンを用いた糖鎖解析の結果，同鶏の0−dystroglycanにはコⅥhlker・Ⅵねrburg症候群，MDCIC，MDCIDなどの先天性
筋ジストロフィーの発症には，糖転移酵素と推測される

ントロールと比較してGalβ1−3GalNAcが多く，逆にシァル酸が少ないことが明らかとなった．

蛋白をコードする遺伝子群の変異により引き起こされる
α−dystroglycanの糖鎖異常と，その結果生じるlaminin結考察

合能の低下が関与しているものと考えられている．これ

上記結果より筋ジストロフィー鶏における筋線経のらの疾患はα−dystroglycanopathyと総称されているが，最変性，壊死にはα−dystroglycanの糖鎖異常とlaminin結合

近我々は以前から筋ジストロフィーのモデル動物として能の減少が関与していると考えられ，同鶏は知られていた筋ジストロフィー鶏がα−dystroglycanOPathy

α−dystroglycanOPathyのモデル動物として有用であるこのモデル動物として有用であることを兄いだした．本研究の目的はこの新たなモデル動物の解析を通してとが明らかとなった・我々はこれまでにα−dystroglycanの1amininとの結合にはα−dystroglycanのシァル酸が重要な役割を果たしていることを報告しており，同鶏におけα−dystroglycanOPathyの発症機序を解明することである．

るα−dystroglycanのlaminin結合能の減少の一因は方法

α−dystroglycanのシァル酸含量の減少にある可能性が考えられた．

CL−dystroglycanおよびdystrophin糖蛋白複合体の各構成蛋白に対する抗体を用いて免疫蛍光抗体法，ウエスタン
プロット法により筋ジストロフィー鶏の骨格筋における研究の意義

各蛋白の発現を検討した．Trinuoromethanesulfbnic acid

筋ジストロフィー鶏がα−dystroglycanOPathyのモデル動物として有用であることを明らかにした．筋ジストロ（TFMS）による化学的脱糖鎖を行い，α−dystroglycanの分子量の変化をウエスタンプロット法にて観察した．まフィー鶏はα一dystroglycanopathyの分子発病機序を解析し，治療法を開発する際に有用である．

た，α−dystroglycanのlaminin結合能をプロットオーバー
レイアッセィ，ソリッドフェーズアッセイにより検討し文た・さらに，レクチンを用いて同鶏のcL−dystroglycanにおける糖鎖の変化を観察した．

献1）Matsumura，K．，etal．FEBSLett．334：281−285，1993．
2）1bmada，H．，etal．FEBSLett．352：49−53，1994．

結果3）1bmada，H．，etal．J．Neurochem．66：1518−1524，1996．

α−dystrogIycanの糖鎖部分に対する抗体（ⅠIH6）を用い

4）1ねmada，H．，et al．J．Biol．Chem．271：23418−23423，

た免疫蛍光抗体法の結果，α−dystroglycanの免疫反応性は1996．

減少していたが，他のdystrophin糖蛋白複合体構成蛋白

5）Chiba，A．，etal，J．Biol．Chem．272：2156−2162，1997．

の発現は正常であった．IIH6を用いたウエスタンプロッ6）Matsumura，K．，etal．J．Biol．Chem．272：13904−13910，

トではα−dystroglycanの分子量の低下と免疫反応性の減1997．

弱を認めたが，COre prOtein に対する抗体では
α−dystroglycanの分子量の低下のみを認め免疫反応性は保たれていた．TFMSによる脱糖鎖後にウエスタンプ
ロットを行うとコントロールとの分子量の差はなくなる

7）Matsumura，K・，etal．Histol．Histopathol．12：195−203，

ことから，このα−dystroglycanの分子量の低下は糖鎖修飾の異常に起因するものと考えられた．プロットオーバー

10）Sasaki，Tl，etal．Biochim．Biophys．Acta1425：599−606，

レイアッセィ，ソリッドフェーズアッセイの結果，

11）Saito，Fl，etal．J．Biol．Chem．274：8240−8246，1999．

1997．

8）Matsumura，K．，etal．Neuromusc．Disord．7：7−12，1997．
9）Saito，Fl，etal．J．Biol．Chem．272：26708−26713，1997．

1998．

12）Shim（払Y，etal．Pr∝．Natl．Acad．Sci．U．S．A．96：9857−9862，●帝京大学医学部神経内科●●日本生物科学研究所◆1999．

ー59−13）Matsumura，K・，et al．Cell，Molec．Biol．45：751−762，
1999．

19）Matsumura，K・，CtaLCurrentTbpicsinNeurochemistry3：131・140，2002．j

14）Masaki，T，etal．ActaNeuropathol．99：289−295，2000．

20）Matsumura，K・，etal．Neuromusc．Disord．13：796−803，
2001．

15）Claudepierre，Tl，etal．J．CellSci．113：3409−3417，2000．
16）Masaki，T，etaLActaNeuropathol．101：174−178，2001．

21）Matsumura，K・，etal・BasicandAppliedMyology13：17）Ⅵ汀nada，H・，etal．Hum．Molec．Genet．10：1563−1569，2001．

299−304，2003．

18）Masaki，T，etal．Exp．Neurol．174：109−117，2002．

ー60−

Ⅲ．OPMD（眼咽頭筋ジストロフィー）
およびミオパチー

Agrin／MuSK系障害における限局性骨格筋障害の臨床と病因的考察
佐 橋
研究協力者

衣 斐
本 村

功●

達● 中 尾 直 樹●
木 全 弘 治… 平
政 勝…● 田 中 雅 嗣◆…● 大 野 欽 司……

澤

恵

里…

はじめに

陰性，抗MuSk抗体；5．7nMoUl（n＜0．05）陽性，血菜TNF

筋ジストロフィー（PMD）の骨格筋障害には，疾患特異的な筋障害の分布があり，それは神経細胞，骨格筋細胞の自体の機能等との関連が示唆されている．さて神経αは74．5pg／ml（陽性）．病初期の上腕三頭筋生検では生化
学所見を含み特異な所見はなく，進行期の外肋間筋生検

筋接合部疾患である重症筋無力症（MG）では，約80％（DG），Perlecan，lamininα，agrin免疫染色に異常なかった・
胸腺病理は正常であった．

が抗AChR抗体陽性のseropositiveMG；SPMG，10％が抗AChR抗体陰性でneuralagrin（n−agrin）のシグナル伝
達受容体であるmuscle speCinc receptortyrosine kinase（MuSK：MWllOkDaのシグナル伝達受容体）に対するTgG抗体陽性のseronegativeMG（SNMG）があり，多くの
SNMGの慢性期には特徴的な顔面肩甲上腕型筋ジスト
ロフィー（FSHD）様の治療抵抗性・進行性の顔面・咽では軽度の筋原性所見を呈した．なおα−dystroglycan

SNMG骨格筋萎縮の成因
Agrinはheparansulfateproteoglycan（Chromosomelにコード）で，3一端の相違でLNとSNisofbmがあり，LN
isoformの3一端近辺にはX，Y，Zの3つのaltemativeexonsが存在し，ZはZlとZ2の2exonsから構成されZ＋isofo

頭，上肢近位筋萎縮が来るl）2）3）
すなわちSNMGは神経筋接合部の後シナプス領域の基底膜上でシグナル蛋白としての1amininα4等と結合しは強力なAChRclustering活性を持つn−agrinでZ−isofbrm

たneuralagrin（n−agm）誘導性のAChRclustering4）5）の減少を生ずるagrin＞MuSK系の障害である．すなわちn−agrin→MuSK異常（欠乏？）は筋萎縮という病態との関連性が示唆され，慢性期SNMG症例の提示と病態・病因に閑し検討を加えた．

α−Dqα7integrinと結合した基底膜構築蛋白である・
SNMGの筋萎縮発現の機序として，第一にAChR症

例はm−agrinである．n−agrinはlamininα4やAChR
anChoringのためα−DGと結合し，m−agrinはIamininα2，

clusteringに至る経路以外に骨格筋量の維持効果を示す
未知のMuSK経路が抗MuSK抗体で障害された可能性が考えられ実験的にMuSKknock−Outmiceには筋萎縮が出現し，agrin＞MuSK系はmyotrophicefrtctを有する可能性が示されている．ゆえに未知の本経路の解明には，

患者：43歳，女性，23歳時に軽度の限症状で発症し，次第に顔面筋・球麻痔，肩甲帯筋の脱力や軽度の筋萎縮が進行したが，日内変動は乏しかった．以降，胸腺摘出MyoD，myOgenin等のmyogenicdeterminationfhctorsの筋線維内発現量をSNMG とSPMGで比較し，とくに術を受け数回のクリーゼも経験したが，一過性に有効な
免疫吸着療法以外に治療抵抗性であった．1994年7月でこれら的nscription鮎torsの発現量の大差がないと検出は困難で，かつSNMG症例数が必要となる．

AGEngel教授の診察にてSNMGと診断され以降はADLは維持されたため41歳以降は全薬物治療を中止した．しかしFSHD類似の顔面筋・球筋・肩一腕の萎縮・筋力低下は緩徐進行L ADL上の障害も明らかであるが，外眼第二のSNMG筋萎縮の機序として，（A）m−agrin量の変myogeninとMyf6の減少の確認が必要であるが，両者間動に伴う可能性がある．すなわちn−agrinを代償的に増やすためagrinpre−mRNAが専らn−agrinを作るのに使われm−aghが減少一旬1−agin結合分子であるlamininα2，α−Dq

筋，腹部以下の体幹筋・下肢筋は略正常である．主な臨

α7integdnが減少する；（B）n−agdnの代償的な増加→

床検査では抗核・抗uyOglobulin抗体陽性，筋電図は筋原性，Waning陽性，顔面筋のSFEMGで伝導ブロックが明らかであった．四肢骨格筋MRlでは上腕の伸筋優位

agrintranscript総量が増加し，その副次効果としてm・agrinの筋萎柘を認める．各種抗AChR抗体や抗LEMS抗体はすというものである．そのためにm−agrin発現の増減をが増加→m−a如n結合分子であるlamininα2，α−Dqα7integrinの細胞表面分布が変わる等で骨格筋病態を来た
mRNAのtranscript量を定量し，さらにn−／m−agrinタンパ●愛知医科大学神経内科…愛知医科大学分子医学研究所■■●順天堂大学脳神経内科■■■●長崎大学医歯薬学総合研究科病態解析・制御学…＝●岐阜県国際バイオ研究所遺伝子治療研究部●●●◆●●名古屋大学神経疾患腫瘍センター神経遺伝情報学

ク量をみる必要がある．mRNAのtranscript定量のためには，LNisofbrmについて，n−とm一型のZ＋とZ−isoformsのmRNAの比較定量を要する．我々は2つのプライマーのデザイン：（1）ExonZl，Z2を挟むexon内にプライマーー63−

を設定する方法，（2）イントロンをまたぐ形にプライ2）Sanders DB，E1−Salem K，MasseyJM，etal．：Clinical

マーを設定し分析中である．

aspects ofMuSK antibody positive seronegative MG

最後にagrinと筋ジストロフィー治療との関連につき，Thniguchiら6）はFCMDではおそらくagrinのmRNA量が対照筋に比し増加していると報告した．これはFCMDの筋萎縮を代償するためagrinが骨格筋を増加させる重要な膜成分であることを示唆している．また，非シナプ

Neurology60：1978−1980，2003．
3）ⅥncentA，BowenJ，Newsom−DavisJ，etal．：Seronegative
generalisedmyastheniagravIS：Clinical危atures，antibodies，
andtheirtargets．LancetNeuro12：99−106，2003．
4）Willmann R，FuhrerC．：Neuromuscularsynaptogenesis：

ス鏡域のagrin発現量は正常マウスにおいて各骨格筋毎に大きく異なっており，骨格筋の筋線経の筋線維タイプ

Clustering ofacetylcholine receptors revisited．CellMoIや選択的な羅患筋部位の決定には，agrinの発現が重要な役割を果たしている可能性があり，また筋ジス・マウス

5）DeChiara TM，Bowen DC，Ⅵllenzuela DM，etal．：Theなどでその発現量は変化していると報告されている叩）．

muscularJunCtionformationin vivo．Cel185：501−512，

LifbSci．59：1296−1316，2002．

receptortyrosine kinase MuSKis required fbr neuro−

1996．

結

語

6）

mniguchiM，etal．：AmJ

Hum

Gen73：5762003

SNMGにおけるagrin／MuSK系統の障害による特異な筋病態の検討より，ミオパチ一における骨格筋萎縮や萎

7）MollJ，BannghiII Lin S，et al．：An agrin minigene

縮の分布にはagrin（n一血−）の関連が考えられまた骨格筋

rescues dystrophic symptomsin a mouse modelforにおけるagrin系の賦活等が筋萎縮に対する治療システ
ムに繋がることが示唆された．

COngenital（abstract）．

muscular dystrophy．Nature

413：302−307，

2001．

8）EusebioA，OliveriFlBarzadiRetal．：Expressionofmouse文

献agrlnin normal，denervated1）EvoliA，TbnaliPA，PaduaL，etal．：Clinicalcorrelateswith

and dystrophic muscle．

NeuromuscDisord13：408−415，2003．

anti−MuSK antibodiesin generalized seronegative
myastheniagmYis．Brain26：2304−2311，2003．

ー64−

筋型糖原病の生化学・遺伝子診断法の確立および病態に即した治療法の開発

●

輝

ヂ酢が

純

澤本水

大官清

●

●

●
●

病のわが国における実態を明らかにする，（2）診断法の開発および診断ガイドラインの作成，（3）治療法の開発，を研究課題とした．治療については遺伝子治療が根本治●

合併症の予防が可能である．本研究では（1）筋型栃原●

断が必要だが，一部の疾患ではDNA診断が可能である．
早期に診断し，適切な生活指導，治療を行うことにより●為，筋収縮時にエネルギー供給不全を引き起こし筋痛，
筋硬直，横紋筋融解症，筋力低下などを来たす疾患である．本疾患の診断には生検筋，血球などを用いた酵素診

彦一子
代

筋型糖原病は嫌気性解糖における先天的な酵素欠損の

輝浩加

●

●
●

的

木野藤

●

●

日

鈴平斉

●

子子三

季
冬陽一

田江野

福杉西

研究協力者

のⅤ型で約50％に好発遺伝子変異があり，診断に有用である3）．
（3）治療法の開発
Ⅴ型の病態として筋内Ⅵt．B6含量が低下している事，
Ⅵt．B6は内因性のphosphorylase活性を増加させる事，糖分の補給が症状を改善させる事を基礎に，Ⅵt．B6投与とコーンスターチ併用療法を考案し実施した4）．対象は本治療について本人または保護者から文書による同意を得たⅤ型患者5人（女1人，男4人，年齢3歳〜82歳）．
Opentrialによる治療デザインとして2つの投与群を設定した．A群：Ⅵt．B6単独から開始その後Ⅵt．B6＋コーンス

療として位置づけられるが，過渡的な方法として本疾患の病態を考慮し，残存酵素の賦活化及び正常に機能してターチ併用，B群：Ⅵt．B6＋コーンスターチ併用から開始
その後Ⅵt．B6単独の2群である．Ⅵt．B6の投与量は15いる他の代謝経路を利用した基質の補充などにより，新
たな治療法の開発を検討する．

歳以下60mg，15歳以上120mg／day，分2，コーンスター
チ1釘kg，分2．最初の2ケ月観察期を置き，2ケ月の投与期，2カ月半のwash−Outさらに2ケ月治療，その後2ケ月観察を行った．MMTによる評価，副作用の評価およ方法と結果（1）筋型梼原病のわが国における実態

び患者による各尺度の記入（1）Fatigue Severity Scale

平成14年度に質問紙法で全国調査を行った．その結果（FSS），（2）shortForm−36HealthSurvey（SF−36），item3，

ⅠⅠ型（Pompe病：acidmaltase欠損症），ⅠII型（Cori病：
debranching enzyme欠損症），V型（McArdle病：（3）Severity Scale of Exercise−Induced Muscle Painin

myophosphorylase欠損症）で全体の75％を占めたl）・（2）診断法の開発および診断ガイドラインの作成
頻度の多いⅠⅠ，IlⅠ，Ⅴ型のスクリーニングとしてポリク

Muscle Pain in Working Muscles，（5）Clinical Global

WorkingMuscles，（4）FrequencyScaleofExercise−Tnduced
ImpressionScale5）．血液検査として一般採血特殊採血（血清pyridoxalphosphate）を行った・Ⅵt・B6とコーンスター
チの服用について副作用は無く安全に終了した．症状のロナpル抗体を作成し，WeStemblotにより検討した．少量の筋組織でスクリーニングが可能であった．従来の阻分析では有意な改善は認めなかった．しかしながらCKの値がⅥt．B6＋コーンスターチ，Ⅵt．B6服用にともない血下（嫌気性）前腕運動負荷試験に対して，Hogrelらの好気性前腕運動負荷試験（non−ischemiCforearm exercise
test（NIFET））が報告された2）．正常対象5例，PGK欠有意に低下した（P＜0．05）．
考損症1例で検討しその有用性について分析した．正常対察

今までの研究成果を元に，筋型糖原病の診断のための象では好気条件でも乳酸の上昇は前値の2．5倍以上であり，糖原病では乳酸の上昇を認めなかった．本方法は従フローチャートを作成し提案した（図1）6）．このフローチャートに従って検索すれば，筋型糖原病の70％は血球来の阻血下と同様な診断価値があり，患者に対する負荷，危険性が少ないと考えられた．遺伝子診断法では日本人での診断が可能である．Ⅴ型の症状は運動時の筋症状，
特に筋痛，筋硬直をしめすが高齢になるに従い，一部の●浜松市発達医療総合センター小児神経科＝浜松医科大学小児科…国立精神・神経センター神経研究所●●●●東京女子医科大学遺伝子医療センター●…●●帝京大学医学部神経内科

例で進行性の筋力の低下が見られる例がある．これは日
常に少しずつ起こっている筋細胞障害の蓄積によることも推測されている．今回見られたように，Ⅵt．B6投与で−65−蝕 e Jlお e『
Jh foJeJ甘〃Ce

今後の展望

伽 ed
W eah eSS『

本研究の重要課題は治療法の開発である．3年間での研究成果としてV型に対する治療ガイドライン及び筋型
糖原病の診断フローチャートを提案できた．今後は他の

l（
N on）
・
l∝hem k l 帽arm t 帥血相 te＄
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1
【
亘亘 】

糖原病特に予後が不良なⅠⅠ型，ⅠⅠⅠ型について治療法を開発することと，Ⅴ型ではⅥt．B6療法の長期予後について検討を進めたいと考えている．

01

文

献

1）福田冬季子，杉江秀夫，伊藤政孝，杉江陽子，斉藤加代子，西野一三，清水輝夫．筋型糖原病の全国調査
および浜松市発達医療総合センターにおける筋型栃原病診断症例の比較検討．臨休神経 43：243−8，

図1筋型蛤原病診断フローチャート（臨床症状から見た）veLl【精神神経疾患研究委託費．惰水判）：浜松市発達医療総合センター小児神経科杉江】（RBC，赤血球；WBC，白血球；CPTicarnitinepalmitoyltransftrase；VLCAD，
VeけlongchainacylCoAdehyderogenase）

2003．

表1McArdle病（糖原病V型）に対するビタミンB6，コーン
スターチ療法2）HogrelJY，LaforetIllbou B，etal．A non−ischemic
fbrearmexercisetestforthescreenlngOfpatientswith

Recommendation

exerciseintolerance．NeurologyJun26；56（12）：1733−8，
2001．

ビタミンB6は筋細胞の障害を軽減する可能性が示唆されるので，将来的な筋細胞の障害蓄積を緩和することを期待
して一日25−50mgを服用する．ただし血中濃度の上昇には個人差があるため，PALで50−100n少mlとなるように服用量を調節する．
コーンスターチあるいは糖分は特に運動が予想される前に
1・2g八g摂取する事で効果が期待できる．
運動をするにあたって急激な運動は避け，準備運動を穏やかに行った後に運動する事が望ましい．
ビタミンB6の長期服用にあたっては定期的な副作用チェックおよび診察を行う事が必要である．

3）SugieH，SugieY，ItoM，FukudaT，NonakaI，IgaraShi
Y：Genetic

analysis ofJapaneSe Patientswithmyophosphozylase denciency（McArdle，s disease）：
Slngle−COdon deletionin exon17is the predominant
mutation．ClinChimActaApr30；236（l）：81−6，1995．
4）PhoenixJ，Hopkins P，Bartram C，et al．Efftct ofVitamin B6supplementationin McArdlels disease：aStrategiccasestudy．NeuromuscDisord8：210−212，1998．
5）VorgerdM，ZangeJ，KleyR，GrehlT，HusingA，JagerM，

有意にCKが低下した事は本治療により今後筋の障害の蓄積を少しでも抑制できるのではないかと期待される．

MullerK，SchroderR，MortierW，FabianK，MalinJP，

近年本症の患者において朝糖分を補給して運動を行った
結果が報告され7）糖分摂取があきらかに良い効果を示しているため，理論的にはコンスターチは効果があると考SymPtOmS Ofexerciseintolerancein McArdle disease：

える．今回コーンスターチの服用があまり効果として現れなかった点については今後さらに検討する余地がある．
以上CKの値の変化はsubclinicalであるものの有意であり，筋細胞障害に何らかの抑制を期待できる可能性があ6）StJgie H，Sugie Y：Muscle Glycogen Storage Diseases

るため今後はⅥt．B6療法の長期予後についての検討が必要である．最終的に今回の結果からV型の治療方針として表1に示すrecommendationを提案した．

7）VissingJ，HallerRG．Theefftctoforalsucroseonexercise

Luttmann A・・E脆ct ofhighーdose creatine therapy on

double−blind，Placebo−COntrOlled crossover study・Arch
NeuroIJan59（1）：97−101，2002．

（MGSDs）：Overview and Diagnostic Approach．Invited
Lecture，3rdAsia−Oceanean Myology Center（AOMC）

AmualScientincMeeting．Singapore2004
toleranCeinpatientswithMcArdle，sdisease・N EnglJ
Med349（26）：2503−9，2003．

ー66−

コラーゲンVI異常による筋疾患（Ullrich病，Bethlemmyopathy）の臨床的，病理学的および遺伝子学的研究
樋 口 逸 郎●
●

史子人
●

●
●

●

●

匡明雅

●

石藤原

●

白斉末

子一博

桂俊

田嶋

●

東迫高

●
●

過を示し，遺伝形式は常染色体劣性遺伝と考えられる．

●●

幼少時から筋力低下，筋萎縮を認め，近位関節の拘縮と遠位関節の過進展を特徴とする疾患である．進行性の経

一嗣静弘

●

Ullrich型先天性筋ジストロフィ，（Ullrich病）は1930年にUllrichにより初めて記載された疾患であり，生下時・

光

●

的

裕裕

田本

●

公

内岡胡納

●

仁城尚良

尚隆

目

山野切村

新平堀有

研究協力者

遺伝子のexon領域とそのSplieesiteをPCR増幅後にdye−terminator法により塩基配列決定した・その結果
U11rich病の2症例においては，COL6A2遺伝子のtriple
helicaldomain（exon18）に26塩基の欠矢を伴うホモのフレpムシフト変異が認められた．またBethlemmyopathyの患者ではCOL6Al遺伝子のintron14のsplicedonorsite

我々は本症の病因であるcollagenVI蛋白欠損をはじめて明らかにし遺伝子異常を報告したがl）2），本症の病態を明らかにするため本症の生検筋，生検皮膚，および培養＋lpositionにG→Aのヘテロの塩基置換変異が確認された．

線維芽細胞を用いて病理学的に検索した．

び培養皮膚線維芽細胞とBethlemmyopathyの生検筋を用い，組織化学染色ならび免疫組織染色を施行した．免また，Be血lemmyopathyは関節拘綿を合併する常染色体優性遺伝の良性ミオパチーである．Bethlem myopathy
も細胞外マトリックスを構成するcollagenVIの三本鎖を形成する各遺伝子（COL6Al，A2，A3）の変異に起因することが知られているが，同じ遺伝子に変異を有する
Ullrich病とはその臨床像，筋病理像に大きな違いがみられる．Bethlemmyopathyの国内における報告は少なく，我々が経験した1家系（図1）について遺伝子異常を確定しUllrich病との筋病理学的相違点について検討し，両疾患における筋病変の発生機序を解明する．
方法と結果
遺伝子検索はUllrich病2症例とBethlemmyopathy4症
例中3症例の末梢血からDNAを単離し，COL6Al，A2，A3

筋病理学的検討にはUllrich病の生検筋，生検皮膚およ

疫染色は細胞外マトリックス蛋白，筋膜蛋白および筋再生関連蛋白に対するモノクローナル抗体を使用した．
Ullrich病においてはcollagen VIが欠損していたが，Bethlemmyopathyではco11agenVIの染色性は保たれていた．Bethlemmyopathyでは筋基底膜部分でのlaminin
βlの染色性低下が認められたが，Ullrich病では保たれていた．NG2proteoglycanはUllrich病の筋膜で発現が低下していたが，Bethlemmyopathyでは正常に発現していた．またUllrich病の皮膚および培養線維芽細胞においてnbronectinreceptorの発現が著明に低下していた4）．さらにUllrich病においては小径線経に再生線経のマーカとされているdesminやNCAMは強く発現していたが，developmentalmyosinheavychainの発現は弱くneonatal
myosinheavychainは他疾患に比べてより小径の線維のみに発現が限局していた6）．
Ullrich病の電顕的観察では筋形質膜は過伸展し，褒状に変化している部位が存在し，基底膜の肥厚，増殖が認められた））．骨格筋内毛細血管の観察では，血管内腔の狭窄，pino叫Oticvesicleの増加，内皮細胞質の高電子密度，
毛細血管基底膜の層状変化，有窓毛細血管を認めた5）．
Ullrich病2症例については皮膚線維芽細胞を用いた

症例4

図1Be也1emmyopa血yの家系図●鹿児島大学神控内科・老年病学●■国立病院機構南九州病院神経内科…●国立病院機構沖縄病院神経内科

ウェスタンプロッテイングを行ない，症例間のcollagen
VI残余蛋白量を比較した．同じ遺伝子異常を有する2症例の間でcollagenVIの各chainの残余蛋白量は異っており，残余蛋白量を指標にして変異を有するchainを推定することは困難であった．

一67−

表1Ullrich病とBethlemmyopathyの比較

Bethlem m yopatby

UllrichIsdiseaSe

InムeritanceA utosom aldom in ant Autosom alrecessive

M ub ledgenes

CO L6A l，
A 2，
A3

Pathogenesis

Dom inantnegatiYe？ LossofnlnCtion

Collagen V Istaining

N om alD encient

L弧Iinin βls血ning

D ecreaSed

N om alOnset

Bir山to adultB irt
h to in 血It

D isb lIax吋

Rare

A ll

ProxiInalcon打ach reFrequent

Frequent

W eab ess

M ild

SevereRespiratoW h ilure

R are

Frequent

因とするが，COllagenVIと関連する他の細胞外マトリッ
クス分子に質的に異る変化を来しており，それぞれの特徴的病態形成に関与する可能性がある．

CO L6A2，
A 3，
（
A l）

考
察
Duchenne型筋ジストロフィーのような筋膜の欠損に伴う筋線経の壊死のみではUllrich病骨格筋のdystrophic
な変化は説明困難と思われ，接着分子やその受容体異常による筋成熟障害，あるいは筋再生障害が病態に関与する可能性がある．常染色体優性のBethlemmyopathyで報告されているcollagenVI遺伝子のヘテロ変異によるミオ
パチーはdominantnegativeの機序によるとされており，
collagenVI蛋白の完全欠損を呈した報告はみられない．

今後の展望
今後Ullrich病とBethlemmyopathyの接着分子の発現異常，骨格筋の分化，再生異常についてのより詳細な検討が必要である・最近重症例のBethlemmyopathyや比較的軽症例のUllrich病の報告もあり，COllagenVIの遺伝子異常を伴う筋疾患の病態を明らかにするためより多くの
Ullrich病およびBethlemmyopathy患者における臨床病型，collagenVI蛋白異常および遺伝子異常の比較検討が必要
である．
文

献

1）HiguchiI，SueharaM，IwakiH，NakagawaM，ArimuraK，■OsameM．：CollagenVIdeficiencyinUllrich−sdisease．Ann
Neurol．49：544，2001．
2）HiguchiI，ShiraishiT；HashiguchiT；SueharaM，Niiyama
TI Nakagawa M，Arimura K，MaruyamaI，Osame
M．：FrameshiR mutationinthe collagen VI gene causes
Ullrich，sdisease．ArLnNeurol．50：261−265．2001．
3）NiiyamaT；HiguchiI，SueharaM，HashiguchiT；Shiraishi
Ti Nakagawa M，Arimura K，Maruyama T，Osame

Ullrich病では著明なcollagenVI蛋白の低下があり，
loss−OfLhnctionの機序が考えられ，ヘテロの両親は発症

M．：Electronmicroscopicabnormalitiesofskeletalmuscle

しない．しかしUllrich病においてもcollagenVla3遺伝
子のホモ変異で軽症例の報告もあり，今後Ullrich病患者

inpatientswithcollagenVIdenciencyinUllrichsdisease．

ActaNeuropathol（Berl）．104：67−71，2002．

における臨床病型，COllagenVI蛋白異常および遺伝子異常の比較検討が必要である．Ullrich病と Bethlem4）HuJ，HiguchiI，Shiraishi T；Suehara M，Niiyama T；

myopathyの相違点を表1に示す．
我が国におけるBethlemmyopathy家系の遺伝子異常の確定は今回が最初である．本家系ではCOL6Al遺伝子に

receptorreductioninskinand爪broblastsofpatientswith5）NiiyamaT；HiguchiI，HashiguchiT；SuehamM，UchidaYi

異常が確認された．このsplicedonorsiteでの遺伝子異常
はpre−mRNASplicing決定に障害を生じexon14のArimura K，Osame M．：Capillary changesin skeletal

HorikiriT；Uchida Yi Saito A，Osame M．：Fibronectin

Ullrichsdisease．MuscleNerve．26：696−701，2002．

HorikiriT；ShiraishiT；Saitou A，HuJ，Nakagawa M，skippingを来した結果，アミノ酸の欠矢を生じているものと推定される．症例間における1amininβ1発現の差異

muscleofpatientswithUllrichsdiseasewithcollagenVI

denciency．ActaNeuropath01（Berl）．106：137−42，2003．

は，不完全なcollagenVIが引き起こす二次的1amininβ1の変化と加齢的要素が修飾を加えた現象と考えられる．

6）HiguchiI，HorikiriT；NiiyamaT；SueharaM，ShiraishiT；

1amininβ1の低下はUllrich病には見られずcollagenVI
異常のみによる現象としては説明できない．Ullrich病とM．：PathologiCal characteristics of skeletal musclein

BethlemmyopathyはともにcollagenVIの遺伝子異常を病

Disord．13：310−316，2003．

HuJ，UchidaY；SaitoA，NakagawaM，ArimuraK，Osame

Ullrich−68−

sdiseasewithcollagenVIde爪ciency．Neuromuscul

眼咽頭筋ジストロフィーモデルマウスの作製
内

研究協力者

誠＊

野

日 野 洋 健■ 宇 山 英一郎● 前 田寧◆ 三
竹 屋 元 裕…荒 木 喜 美… 山 村 研 一■●

目

池

浩一郎事

的

限咽頭筋ジストロフィー（OCulopharyngealmusculardys廿Ophy：OPMD）は，（1）40歳以降に発症，（2）主症状は
限瞼下垂と囁下障害，（3）外径8．5nmの骨格筋筋鞘核内封入体（ITFI）を特徴とし，POly（A）−bindingprotein，nuClaerl（PABPNl）を原因遺伝子とする常染色体優性疾患であるl）．
PABP2はpolyadenylationに際Lpoly（A）の付加反応を刺激し，POly（A）一tai1の伸長と安定性に関与するとされている2）．pABP2のexonlはATG（GCG）6（GCA）3GCGという塩基配列を持つが，OPMD患者ではArG（GCG）8．13（GCA）3GCGとGCGのshortexpansionを認めることが明らかにされている1）．しかしながら，

図1M43mh6ケ月齢（A），18ケ月齢（B）のひらめ筋軌 筋繊維は代償不動で中心角が増加，中心角の頻度は華麗とともに著しい増加を示した．M43mice，6ケ月齢の輪状咽頭肪（C），上眼筋（D）においてもdystrophicchangesを認めた．

PABPNlのGCGのshortexpanSionが生体内でのPABPNlの働きにどのような影響を与え，その結果いかにして眼咽頭筋ジストロフィーという特異的な疾患像を呈するのかは未だ不明な点が多い．そこで，今回我々は，眼咽頭筋ジストロフィーのトランスジェニックマウスを作製し，その発生機序の解明と治療法開発を進めることを目的と
した．
方法と結果
正常PABPNI cDNAと（GCG）9を持つ変異PABPNI

図2

cDNAをぞれぞれト筋，骨格筋で強く発現するpCAGGS
ベクターにクローニングし，直鎖状にしたトランスジー

A）6ケ月齢のM43mice．抗PABPNl抗体による免疫染色にてひらめ筋の筋繊維核内にMPNlが凝集して染色されている．B）6ケ月齢のM43mice．ひらめ筋ト
ルイジンブルー染色．M43miceの筋繊維核は（a汀OW）「largeinclusionbody」に占められている．

ンをマウス受精卵にマイクロインジェクションにて導入した．得られたマウスはPCR，サザンプロット解析にて導入遺伝子の有無を確認，その後Fl以降のノザンプロ
ット解析にて導入遺伝子の発現解析を行い，ウエスタン
クマウスラインを樹立した．正常PABPNIcDNAを発現であったがnormallittermateでは16．4≒5．8minで，有意にM43miceが落下するまでの時間は低くMlineでは筋力低下が示唆された．組織学的検討として，ひらめ筋，しているトランスジェニックマウスを2ライン（Nline

輪状咽頭筋，上限筋のH且染色を行ったところ，Nline

で21ine；N33，N35），変異PABP2cDNAを発現しているでは異常認めなかったが，Mlinedystrophicchangeを認めた（図1）．また，Mlineの筋組織について抗MPNl抗体にて免疫染色を行ったところ，MPNlが核内に集積プロット法にて蛋白の発現を確認し，トランスジェニッ

トランスジェニックマウスを3ライン（Mlineで31ine；
M38，M41，M43）得た．各ラインは外観上の変化は特に認めなかった．しかしながら，金網捕まりテストにおしているのが確認され 同部位はトルイジンブルー染色において特異的な組織像を呈し（図2），電子蹟微鏡にてintranuClearinclusionの像を呈した（図3）．

ける落下するまでの時間は，M43miceでは6．3幸2．1min■熊本大学大学院医学薬学研究部先端生命医療科学部門
脳・神経科学講座・神経内科学分野
鴨書熊本大学発生医学研究センター・器官形成部門・臓器形成分野
日傘熊本大学大学院医学薬学研究部・総合医薬科学部門・生体機能病態学講座細胞病理学分野
−69−

考

察

今回我々は，OPMD患者に認めるヒト変異MPNlを発現したtransgenicmiceを作製した．このマウスはこの進行しており，この点においてもOPMDと矛盾しない．
また，生後18ケ月のmiceの筋肉は明らかに重度のmyopathicchangeSを呈しており，OPMD患者と比較して，より重度の筋病変を来たしていると考えられた．
今回我々は2種類の血nsgenicmiceを作製したが，正常のRABPNlを導入したN33miceにおいては，その蛋
白発現量がM41やM43miceと同等であるにもかかわらず，いかなる筋変性もきたさず，intranuclearinclusionsも形成しなかった．よって，OPMDの発症にはある程度の変異mLBPNlの発現が必要であると考えられた．M43
miceでの変異nlBmlの発現量はマウス内在性mBPNl
より強く発現しているが，この発現量はヒトOPMDでの変異PABPNlの発現量よりも高いと考えられる．ヒトのOPMDにおいて，inclusionbodyを認める頻度は，筋組織標本において一切片あたり3−6．6％程度といわれている3．
今回作製したM43miceにおいては，図3に示したように，非常に高頻度にinclusionbodyを認め，この結果ヒト
OPMDと比較してより重度の筋病変を認めたと考えられた．

図3 6ケ月齢のM43mice，ひらめ筋筋繊維（A，C）とOPMD患者三角筋筋繊維核（B，D）の電子顕微鏡．
M43miceの筋繊維核において認められた核内の明るく抜
けた部位（んC）は電子顕微鏡において観察すると，低倍率ではヒトOPMDで認めるhmmuclarinclusionと類似している．高倍率で観察すると血的nuclarinclusionは山bularmamentから校正されていることが明らかとなった．ヒトOPMDと比較すると，山bularmamentの集積はやや疎である印象を受ける．
AandB X5000叩慮cadonandCandD X75000magiBcadon

研究の意義
今回，眼咽頭筋ジストロフィーモデルマウスの作成に成功したことで，今後本疾患の発症機序や治療法の確立のための研究において，本マウスが有用であろう．
参考文献

in血IuClearinclusionsはtransgeneであるPABPNlが全身の1）BraisB，etal．NatureGenet，164−167，1998．

諸臓器に発現しているにもかかわらず，eyelidmusclesや
ph町ymmuSClesを含めた，骨格筋の核内にのみ形成された．興味深いことに，筋肉の変性の程度は加齢とともに

2）KellerWetal．Cell，829−832，1995．
3）宇山 英一郎，眼咽頭筋ジストロフィー．神経進歩，
44：212−221，2000．

ー70−

極長鎖アシルCoA脱水素酵素（VLCAD）欠損症の免疫組織化学染色によるスクリーニング
南

●

●

打

消

口

（間接法）を行った．そして，染色性の消失あるいは減弱を認めた患者のアシルCoA脱水素酵素活性の測定とイムノブロット，遺伝子解析，筋病理所見，臨床像の検

山

Reye症候群様などの症状を呈し，確定診断のされていな
い345例を対象とした．
生検凍結筋から厚さ7′上のスライスを作製し，抗Ⅵ一CADポリクローナル抗体を用いて免疫組織化学染色●

例のうち，高CK血症，ミオグロビン尿症，筋症状，SIDS，

●

方法と結果
1978年から2001年までに肪生検を施行された約8000●

脱水素酵素（VLCAD）に着目し，極少量の検体で検査のできる免疫組織化学染色によるスクリーニングを試みた．
Ⅵ一CAD欠損症は，重症型，中間型，骨格筋型の3つの臨床病型があり，1993年の最初の報告後，海外では60
例以上，日本では10数例が報告されている．

紆ごを行うことが事実上不可能であり，有効なスクリーニン
グがなされていない可能性が考えられる．そこで我々は，β酸化の最初のステップを触媒する極長鎖アシルCoA

有一

カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ（CPT）欠損症，脂肪酸代謝異常の可能性があるが，実際に診断に至る例は多くはなく，中でもβ酸化異常症の報告は少ない．
その理由の1つとして，β酸化系，解糖系，CPTの酵素活性測定はそれぞれの測定系が異なるため，1回の筋生検で得られた検体量ですべての生化学的スクリーニング

谷

運動や感染などに起因する筋痛や筋硬直は，糖原病や

川野

的

祐●

長西

で訂

裕征

目

橋中

大埜

研究協力者

成

を認め，約半数の患者にサpel恥erの大小不同を認めたが，脂肪滴の蓄積などは見られなかった．
臨床像は，男性6名，女性8名で，発症年令は3〜29
歳，平均13歳であった．誘因は運動が11例で最も多く，
感染と寒冷が2例ずつ，誘因のないもが2例あった．主症状は何らかの筋症状（筋痛，筋硬直，筋力低下，筋肉の腫脹）を全例に認め，ミオグロビン尿も高率（71％）に見られた．今回の患者は，全例，VLCAD欠損症の臨床病型として骨格筋型であった．
遺伝子変異は多様であったが，クローニングや発現実験が必要な患者も存在し，検討中である．
考

察

抗VLCAD抗体による免疫組織化学染色でのスクリー
ニングは有用であると考えられた．骨格筋型のVLCAD
欠損症では，ミオグロピン尿が高率に認められる．筋病
理所見では特徴的な所見に乏しく，また今回見つかった
患者はこれまでの報告と比べて発症年令が高い傾向があり，まだ診断されていないVLCAD欠損症の患者が多く存在している可能性があると考えられた．
研究の意義
抗VLCAD抗体を用いての免疫染色による新しいスクリーニングを試み，14例のVLCAD欠損症の患者を見出すとともに，この方法の有効性を確認した．
文

献討を行った．
免疫組織化学染色の結果，14例に染色性の消失（9例）
あるいは減弱（5例）を認めた．全例，パルミトイル

1）Ohashi Y，Hasegawa Y，Murayama K，Ogawa M，CoA（C16）／オクタノイルCoA（C8）比の有意な活性の低下を認め，イムノプロットでは蛋白量の低下を認めたことより，VLCAD欠損症と診断した．

S，NonakaI，「ねmaguchiS，NishinoI‥Anewdiagnostic

HasegawaT；KawaiM，SakataN，1bshidaK，Y訂itaH，

ImaiK，KumagaiI，MurakamiK，HasegawaH，Noguchi
testforVLCADdenciencyuslnglmmunOhistochemistry・
Neurology62：2209−2213，2004．

筋病理所見では，ほとんどの患者に筋線経の大小不同●国立精神・神経センター武蔵病院DNA診斬・治療室●●国立神経・神経センター神経研究所疾病研究第一部●●●島根医科大学小児科−71−

悪性高熱症およびセントラルコア病：
リアノジン受容体mlの遺伝子変異検索
南研究協力者

CarlosIbarra
菊．地

緒

博

成

祐●

・…

兵

士

文●●

達……

落

合

亮

言

一……

原

西

靖

野

子●
一

三●●

現在までに全エクソンの約40％を解析し，ホットスポッ
ト飯域の変異検索結果を報告する．

悪性高熱症（MH）はハロセンなどの吸引麻酔によって数万回に一回の頻度で起きる重篤な副作用である．遺伝学的背景をもとに薬物が引き金となって発症する薬剤

方法と結果

遺伝病の一種である．悪性高熱症の感受性（MHS）は，常染色体優性の遺伝形式で遺伝し，これまでにMHSlから MHS6 までの迫伝子座が知られている．このうち

Ca2＋誘発性Ca2＋遊離（CICR）速度の冗進によって確定診断された59名のMHS素因者，および組織病理学的に診断された28名のCCD患者を，対象とした．患者らのゲノムDNAから各エクソンとその隣接するイントロン

MHSlとMHS5では責任遺伝子が判明しており，それぞれ，骨格筋の筋小胞体膜上のCaイオン（Ca2＋）遊離チャ
ンネルであるリアノジン受容体（RYRl）とT管膜上の膜電位検知分子であるジヒドロピリジン受容体（DHPR）

配列を単位としてPCR増幅し，直接シークエンシングによって変異を決定した．

をコードしている．両者は隣接して存在し，興奮収縮連関において中心的な役割を担っている．一方，セントラ
ルコア病（CCD）は先天性ミオパチ一に分類される筋疾患で，酸化酵素染色で筋緑経の中心部が染色されないと

表1シークエンス解析を終えたエクソン数

N末端 中央部 C末端 合計／全エクソン数
MHS lO

いう特徴的な筋病理所見を示す．このCCDも大部分が常染色体優性の遺伝形式を示し，責任遺伝子として
mlが同定されている．
日

市

12

CCD lO

的7

表2

MHS素因者のうち，RYRl遺伝子変異によるMHSl
は50−70％を占めると推測されている．しかしながら，
ml遺伝子が106エクソンを有する大きな遺伝子であexon

ることが遺伝子変異検索を困難にしており，真の頻度は明らかになっていない．従来，RYRl蛋白のアミノ酸配列上のN−末端，中央部，C−末端の3カ所に遺伝子変異のクラスターがあり，ホットスポットであるとされている．
しかしながら，このホットスポット以外の領域について
大規模な変異検索が行われたことがないため，真にホッ
トスポットであるという根拠も十分とは言いがたい．
本研究では，上記の問題点に答えるため，MHSおよびCCDのRYRl遺伝子変異の全容を明らかにすることを目標とし，十分な数の患者を対象として全エクソンの直2120

43／106（41％）
37／106（35％）

MHS素因者より兄いだされたRYRl変眞

遺伝子変異

蛋白への影響6593d＞a Gln154Lvs

6

617C＞t Arg163Cys

6

患者数

新規a

627a＞g Asp166Gly

1■

lO lO77g＞t Arg316Leu1●

ll l152g＞c Gly341Arg

1

151728g＞a Arg533His

1

396618g＞a Arg2163His

1

457434g＞a Arg2435His

2

467485g＞a Arg2452Gln

1

●

1
46￣

接シークエンシングによる大規模な変異検索を計画した．
●国立精神・神経センター武蔵病院DNA診断・治療室●■国立精神・神経センター神経研究所疾病研究第一部●●●東邦大学大学院医学研究科…●東京臨界病院麻酔科●●●●●埼玉医科大学麻酔科……東邦大学医学部麻酔科

7503g＞aArg2458His

51

8318g＞c Asp2730His

95

14070g＞a1

Arg4647GIn

2

●

102

14816g＞a

Ala4896Thr

l

●

104

15015t＞aPhe4962Tyrl■

患者数合計 16（27％）
破線：N末端領域，中央乱 C末端領域の境界
a：過去に報告されていない変異

−72−

●

表3
exon
39

ccD患者より兄いだされたRYRl変異

遺伝子変異
64471＞a蛋白への影響患者数

Va12∩49ril‖

19513900g＞a

Glu4634Lys I

9513912g＞a

Gly4638Ser

lOl14572a＞g

Asn4858Glu

lOl

1458lc＞t

Arg4861Cys

lOl

14582g＞a

Arg4861His I

lO214678g＞c

Arg4893Pro llO2

14693t＞clle4898Thr llO214696g＞a

Gly4899GIu llO21475114752tt＞ac

Phe4919Thr l

10214752t＞cPhe4919Ser llO21479lc＞alllr4920Asn l

患者数合計

新規a

l

●

l

●

4

15

が，CCDでは25％が，そのようなはじめて発見された変異であった．なお，報告例がない変異については，今回の検索だけで，病的変異であると結論づけられるものではない．変化しているアミノ酸の進化上の保存性や，側鎖の性質の変化などから，ポリモルフイズムである可能性のある変異はごく少数であると現在予想している．
とは言え，今後，2世代以上のco−Segregationのような遺伝学的特徴づけとともに，変異RYRlを導入した培養細胞を用いた機能的特徴づけが必要である．
4）変異の種類と頻度に民族や地域による違いがある
ことは従来から指摘されていることではあるが，日本人集団においてもそれが確認された．例を挙げると，欧州のMHSに多いGly341Arg（6〜10％）は我々の検索では1名（1．7％）にしか認められず，ドイツや北米に多い
Arg614Cys（9％，4％）は全く認められなかった．逆に，今回の MHS の検索で複数の患者に認められた

破線： 中央部とC末端領域の境界
a：過去に報告されていない変異

Arg2435His（3．4％）は北米での124名の検索では認められておらず，Arg4647Gln（3．4％）は初めての報告となる．
なお，今回のCCD患者の検索で4名に認められた

シークエンス解析の進捗状況は表1に示したようになっており，ホットスポットに該当するエクソンの解析を

Arg4861Cys（14％）は欧州での検索でも同等の頻度で報告されている．

ほぼ終えた．とくに，過去に変異が見つかったことのあるエクソンに関してはすべて解析を完了した．
その解析結果を表2と表3に示した．MHS素因者からは16名（27％）において14種類のミスセンス変異が研究の意義・今後の展望
本研究は，私たちの知る限り，MHSとCCDの日本人患者を対象とした初めての大規模な変異解析であり，ホットスポットに関する限り，日本人集団においても従来の知見が当てはまることを明らかにした．
欧州や米国ではホットスポットの15＿20種類の代表的な変異パネルによる遺伝子検査が行われている．それは，発見された．このうち8種類は過去に報告例がない変異であった．分布は，N一末端領域が6種類，中央部が5種
類，C一末端領域が3種類である．一方，CCD患者からは15名（54％）で12種類のミスセンス変異が見つかり，うち3種類が報告例のないものであった．分布は，1種類以外はすべてC一末端領域に位置していた．

予防的見地からMHS患者の家族が強いられる，CICR試
験などのための筋生検を少しでも回避するためである．
私たちは，現在進行中の全エクソンの変異検索の完了後，考察1）ホットスポットの解析結果は，従来言われている
ように，MHS素因者の25〜30％，CCDの50％以上に其のRYRl変異分布の解明によって，日本人患者を対象としたより優れた変異検索パネルを確立できると考えている．

RYRl変異が認められた．海外の様々な地域と同様に，この頻度については我が国においても大差ないことが明らかになった．
2）MHSに関連する変異が，3カ所のホットスポット

また，全エクソンの変異決定の意義は，単に遺伝子変異の集積ということではない．MHS とCCDにおいてml変異が原因となっている割合を初めて十分な根拠をもって提示できるであろう．さらに，新しいホットスのうち，N−末端と中央部に多く，CCDに関係するもののほとんどはC−末端から兄いだされた．この結果についても従来の報告と一致している．
3）過去の検索で報告されたことのない変異が多数兄

ポット領域の発見につながる可能性や，表現型との関係の検討，さらにはCaチャンネルの構造と機能という興味深い問題を研究する上で従来不足していた完全な変異分布マップを提供することになる．

いだされた．今回の検索において，MHSでは変異の57％

一73−

X−linkedミオチュブラーミオパチー：日本人患者の遺伝子変異
スペクトラム及び臨床・筋病理学的検討
南

●

ヂご

美
久一

山野

●

●

村西

●

種類や頻度，臨床像および重症度と変異の関連性について検討した．また，生後の成長に伴う病理変化を明らかにするため，患者らの骨格筋標本を生検時年齢別に比較した．さらに，筋病理像が酷似する先天性筋強直性ジスにもなっているように，患者の骨格筋線維（筋細胞）は細く，胎児筋での筋管細胞（myotube）のように一見幼若に見えることが特徴である．良性先天型と乳児重症型とに大別されるが，乳児重症型の大半がⅩ連鎖ミオチュブ

トロフィー（CDM）との比較をし，筋病理学的な鑑別を検討した．
1）MTMl遺伝子変異
31家系において26種類の異なる変異を見出した

ラーミオパテー（XLMTM）であることが明らかにされその責任遺伝子MTMlはミオチュブラリンと呼ばれるタンパク質をコードしている．

（図1）．ミスセンス変異が8種類（9家系），ナンセンス
変異が6種類（8家系），スプライス部位変異が5種類（7家系），微小な欠失・挿入が5種類（5家系），大欠矢が2XLMTM は，出生時からの著明な筋緊張低下（bpotonia），筋力低下，呼吸障害をきたし，人工呼吸管理を必要とする．先に述べたような骨格筋病理像から，種類（2家系）であった．これら26種類の変異のうち，14種類が報告のない新規の変異で，そのほとんどはミス病態機序として筋分化・成熟の遅滞が提唱されてきたが，最近作られたノックアウトマウスの解析からは，筋分化の本質的な障害は疑問視されるようになっている．ミオ
チュプラリンは組織普遍的に発現しており，

センス変異と微小な欠失／挿入であった．これは，ナン
センス変異やスプライシング部位変異の起きる位置が限られているためであろう．すでに200種類あまりの変異が報告されているにもかかわらず，これほど多くの変異が新規に見出されることは，MTMlの変異の多様性をあらためて示している．また，複数の家系に認められた変異が4種類あったが，それらの家系をすべて合わせてもPhosphatidylinosito13−Phosphateなどを脱リン酸化する活性を有し，エンドソーム調節との関連性が有力視されているが，生体におけるその役割には不明な部分が多い．

9家系（29％）であり，突出して高頻度な変異は日本人には存在しないことを示唆している．
2）臨床像

的

MTMl遺伝子変異は欧米を中心に約200種類（約300家系）が報告されているが，本邦からの報告は散発的でまとまった症例数の報告はない．

患者全体では，羊水過多などの周産期異常が高率にみられ ほとんどの患者が鮎ppyi山もntで出生し，出生時より人工呼吸管理を受けていた．しかしながら，胎生期，新生児期異常ともになく，発達歴も正常で，4歳頃より易転倒性が出現した患者が存在した．xLMTMの

今回我々は，本邦の31家系についてMTMl変異を同定した．そして，その遺伝子変異スペクトラム∴臨床像，筋病理像を検討した．とくに筋病理の検討では，筋病理像の酷似する先天性筋強直性ジストロフィー（CDM）との鑑別という観点からも検討した．

自然経過としては，大半の患者が呼吸不全により1歳半までに死亡するとされるが，本症例はきわめて軽症である．このような顕著な軽症例は過去数例しか報告され方法と結果
まず，臨床所見と筋病理所見からミオチュプラーミオ
バチーが疑われた男性患者を対象としてMTMl遺伝子の塩基配列解析をおこない，31家系（32名）について

野方■ ■ 一 ′

言

ミオチュブラーミオパチーは先天性ミオパチーの中でセントラルコア病に次いで多い疾患である．病名の由来

日

宗留

察黒

●
●

●

●

好ぎ

英美

之

緒

内藤

堀甲

研究協力者

成 祐●

ていない．その12歳時の生検筋には筋線経の大小不同があり，ごく少数の小径線経にperipheralhaloが認められた．明らかな軽症例はこの1名だけであったが，生検

遺伝子変異を確定した．これらの患者を対象に，変異の時の病歴書をもとに人工呼吸管理の有無を指標にして検討したところ，人工呼吸管理をおこなっていない（おそらくやや軽症と推測される）患者は，先述の軽症例を●国立精神・神経センター武蔵病院DNA診断・治療室■●国立精神・神経センター神経研究所疾病研究第一部…大分大学医学部免疫アレルギー統御講座（第3内科）

含め，ミスセンス変異やインフレーム型変異による患者にのみ存在した（4名）．

ー74−

Exon12

3

4

5

6

三
＞
GRAMdomdn

78phosphabSe

91011121314

15

41ト イート
SErintemcdon
acdYeSite

doma王n図1見出された遺伝子変異
ミオチュプラリン遺伝子のエクソン構造に沿って，今回見出された変異を示している
欠失，挿入，スプライス部位変異については塩基の変化によって，ミスセンス変異とナンセンス変異については蛋白への影響によって記載している．下線は，過去に報告例がなく，本邦の今回の検索で初めて見つかった変異である．括弧内の数値は，今回の検索で複数の家系に認められた場合のその家系数．下部にはミオチュプラリン蛋白の機能部位との対応関係を示している．

考3）筋病理像，とくにCDMとの比較において

察

MTMl遺伝子変異は多種多様で，本邦においても高頻度な変異はない．ミスセンス変異やインフレーム型変異の患者の中に，軽症例が一部存在する．しかし，遺伝子変異から臨床的重症度を予測することは困難である．筋XLMTMは，中心核やperipheralhal0（以下，halo）を呈する筋線経を特徴とする．しかし，生検時年齢を追って比較検討したところ，生後1ケ月では，中心核は目立
たず，haloは大多数の線経に認めるものの明瞭ではない．
しかし，2ケ月以後，中心核が増加し，haloについても，
筋線維中央部のNADH活性の浪染と周辺部の抜けが明病理では，XLMTMに特徴的な中心核の増加やperipheral
haloは生後1ケ月よりも2ケ月以降の方が明瞭になり，CDMとの鑑別では，筋線維タイプ分布も参考になると，考えられる．

瞭な，より典型的なものになる傾向が強かった．一方，
CDMでは，生後1ケ月ではXLMTMのそれと同様の所見が認められ，鑑別は困難であったが，2ケ月以後では研究の意義・今後の展望
筋病理像では，XLMTMとCDMの形態学的違いは生後2ケ月以後に現れてくることを明らかにした．筋線維

haloが不明瞭になるという点でXLMTMとの違いが現わ
れ，1歳以上ではhaloと呼べる線経をほとんどの症例で認めなかった．また，ArPase染色で筋線維タイプ分布を見ると，XLMTMでは生後1ケ月からタイプ1線維優位タイプ分布も鑑別上の参考になる．診断に迷う場合は
XLMTMもCDMも遺伝子診断が可能である．その際，
XLMTMでは，既知変異検索法では不十分で，塩基配列（＞50％）があって2ケ月以降さらに顕著になる一方，
CDMでは生後1ケ月ではタイプ1線維優位はなく，2ケ月以後の約半数の患者には認めたが，その程度は
XLMTMよりも軽かった．また，タイプ2C線経の増加決定が必要であると考えられた．
また，今回の検索で遺伝子変異が見つからなかった症例もまた存在する．それらについてはミオチュブラリン
と何らかの機能的関連性のある遺伝子に異常がある可能が生後1〜2ケ月のCDMにおいて顕著で，それらすべて
で30％以上であったが，XLMTMでは30％を超える症例はなく，その後も減少傾向にあった．これらの違いは有意な差としてみられた．

性が高いと思われるが，今後どのように原因遺伝子に迫れるのかが課題である．

ー75−

デスミンミオパチー細胞傷害機構の検討

研究協力者

目

大

川

武

田

伸

豊

島

聡●

菅

至●

原

正

伯●

小

林

道

雄●

一●●

的

デスミンミオパチーは，デスミンタンパクの変異による常染色体優性遺伝の心筋・骨格筋・平滑筋傷害である
1．患者筋組織では，デスミンが過剰発現し凝集体を形
成，細胞死を引き起こす．我々は過去にL385Pde n。Y。
変異によるデスミンミオパチー患者を報告した2．デス
ミンミオパテーの報告者の多くは，変異デスミンが正常
デスミンとアッセンブリーし，Z板構築を崩壊させることが筋傷害の原因と考えている．しかし，我々の検討では，デスミンを持たないCOS7，CHO細胞でも変異ヒ
トデスミンが凝集体を形成し細胞死をもたらした2．この事実より，デスミンミオパチーは，変異タンパク凝集体が毒性を獲得し細胞死を引き起こす凝集体病のひとつであると考えるに至った．さらに，この筋傷害の治療法として，凝集体形成を非特異的に抑制するシャペロン活性を持つタンパク，変異デスミンにより特異的に活性の低下したタンパクを見出しこれらによる補充療法を考えた．正常型より変異型デスミンに強く結合するものが補充の候補になると考え，酵母two−hybrid法にて変異デス
ミン結合骨格筋タンパクを22種同定した（平成13年度
本会議で報告）．今回は，これらを変異デスミンとCOS7細胞に共発現させ，結合性を再確認した．また，治療効果判定にはモデル動物も必要と考えられ作製を試みた．これまでにロッドlBの7アミノ酸欠失（R173＿
E179）にてトランスジェニックマウス（TgM）の報告があるが，これは心筋特異性にデスミンを発現させている3
今回我々は，骨格筋でも発現がみられるヒトデスミン

た．変異デスミンとのみ共存を示したものはα●aCtin（部分），myOSinbindingproteinC（部分），heatshock
tranSCriptionfactor4（全長），KIAAO454（全長）であった．mAAO454は単独では核周囲に存在し一部ゴルジ体に分布したが，変異デスミンが存在するとゴルジ体から出て共凝集した．同様の傾向はラベルのない変異全長デスミンでも見られた（図1）．RTPCRでは人各種臓器間で骨格筋，心臓など筋組織に強い発現を示した．
1．ヒトデスミン過剰発現T9Mの作製と解析
mouse muscle creatine kinase promoter／enhancer（MCKpromoter）を用い，導入遺伝子をヒトデスミン正常型とL385P変異型とし，CDNA全長5 側にGFPを組みこんだ．TgMは変異型で2系統，正常型で4系統選抜されサザンプロットでは正常型は最大約50copy，変異型はlcopyだった．ノザンプロット，ウエスタンプロットにて変異型では発現量が少なく，正常型と約20倍の差が見られ，正常型でも発現量は内在マウスデスミンの約10％であった．正常型マウス骨格筋心筋ではGFPを筋鞘膜下に強く認めたがZ帯には一致しなかった．変異型ではFl世代で明らかな表現型が得られずF2世代でホモマウスを作製したところ，一部が約40適齢で歩行不能となった．骨格筋では，血管周囲性に炎症細胞浸潤が見られ，GFP発現と一致した青色細胞質封入体が確認された．電顕ではZ板を断裂する形で，直径約10mmのフィラメントが付着した不定形凝集体が確認できた（図2）．患者筋組織と同様の病理所見であった．

TgMを作製し解析した．ヒトデスミンが内在性マウス
デスミンにアッセンブリー出来ない可能性を考えマウス
デスミンTgMも作製するが，今回はその前段階としてコンストラクトの構築と培養細胞で変異デスミン凝集体
形成と性状の確認を行った．
方法と結果
1）共発現実験による変異デスミン結合タンパクの同定
正常／変異部分デスミンを赤蛍光タンパク（DsRed）ラベ
ル，結合候補タンパクを緑蛍光タンパク（GFP）ラベルL
COS7細胞に共発現96時間後まで細胞内分布を観察し●秋田大学医学部神経内科◆■国立精神神経センター神経研究所遺伝子疾患治療研究部

図1デスミン全長とKIAAO454のCOS7細胞へのC。＿仕弧S危cti。n
デスミン全長とN端にGFPを融合させたKIAAO454を
COS7細胞に共発現させ48時間後に固定．抗デスミン抗体による免疫染色を行い共焦点レーザー顕微鏡で観察した．A段が変異軋B段が正常型．KIAAO454は変異デスミンと共存を示
した．
ー76−

型は細胞膜下に分布した．ロッド2−尾部では小さな凝集体が細胞質内にびまん性に分布した．電顕での凝集体の性状はロッド1−尾部は細かい粒子状物質の集合で，全長変異型では加えて直径10nmくらいのフィラメント
が凝集体に付着していた（図3）．
−500mm考−11−50〝m

察

変異デスミンと共存を示した結合タンパクのうち，
KIAAO454は筋組織に強く発現することが示され筋特異的なシャペロン活性が期待される．この結合性を免疫共沈降などのinvitro実験系でも確認する必要がある．
−100111れ

図2 FP／ヒト変異デスミントランスジェニックマウスの病理像
ゴモリ・トリクローム染色にてみられた青色細胞質封入体は
GFPの発現とほぼ一致した．電顕ではZ板を断裂する形で不定形凝集体がみられ，凝集体には直径約10mmのフィラメント
が多数付着している．

ヒトデスミン正常型TgMでは導入ヒトデスミンが内在性マウスデスミンにアッセンブリーできなかった．
GFPでラベルしたヒトデスミンである事，筋細胞分化後に発現させるMCKpromoterの性質も原因と考えられる4．発症した変異型TgMではアッセンブリーできな
い導入デスミンが筋傷害を引き起こす機序が示唆され，これは変異デスミンのアッセンブリ一障害説に反する．
CAGpromoter下にラベルのないマウスデスミンを導入する事でより安定した表現型が得られ デスミンアッセ
ンプリ一障害説のさらなる検討が期待できる．
COS7細胞内で全長変異型マウスデスミンは患者，
TgMと同様の凝集体を形成したが，部分デスミンの方がより凝集する傾向にあった．凝集体形成におけるデス
ミンのプロセッシングを検討するためにtail以外のデス
ミンドメイン抗体の作製が急務である．

図3マウス変異デスミン全長のCOS7細胞へのせansfbction
A：抗デスミン抗体による免疫染色．上段が蛍光観察像，下段が微分干渉像．変異デスミンは左列のように線維状構造を形成す
るものや，右列のように凝集体を形成するものがみられた．
個々の凝集体にはフィラメントが付着しており核近傍に集合する傾向が見られた．
B：電子顕微鏡像．上の弱拡大では，免疫染色と同様に，核近傍で小さな凝集体の集合がみられる．．下の強拡大では，矢印が示すように凝集体に付着した直径約10mmのフィラメントがみられる．
2．変異マウスデスミンTgMコンストラクト構築と凝集体形成の確認

今後の展望，研究の意義
CAGpromoter／マウスデスミンのTgMを確立させたい・変異型Tgマウス初代骨格筋培養細胞に変異デスミ
ン結合タンパクを導入することで，細胞死抑制効果が確認できる・抑制効果が見られたものは最終的にTgマウス生体内に導入し，表現型の改善を確認する．凝集体形成阻害薬の候補としてShortinter蝕ingRNA（SiRNA）の導入も考えている．以上の研究成果はデスミンミオパチーの治療法開発につながると期待される．

ヒトデスミンTgMから筋傷害が変異デスミン発現量に依存する傾向が見られ，TgMコンストラクトの
proilOterをチキンβアクチン（CAG）に変更した．ヒト
L385Pに相当するL384P変異マウスデスミンcDNAを
クローニングし，変異型正常型全長，ロッド1−尾部，文献l）Dalakas，M．C．et al．Desmin myopathy，a Skeletal
myopathywithcardiomyopathy caused by mutationsin
thedesmingene．NEnglJMed342：770−780，2000．
2）Sugawara．M．etal．A novel de novo mutationin the

ロッド2−尾部の6種のコンストラクトを作製した，こdesmin gene causes desmin myopathy with toxic

れらをCOS7細胞に遺伝子導入し48時間後に固定．尾aggregates．Neurology55：986−990，2000．

部を認識するデスミン抗体による免疫染色と共焦点レー3）Xuqjun Wan．etal．Mouse model of desmin related

ザー顕微鏡，また，電子顕微鏡にて凝集体の有無と性状を確認した．全長では線維状構造を構築する細胞が多か

Cardiomyopathy．CirculationlO3：2402−2407，2001．
4）Johnson，J・E・et aL Muscle creatine kinase sequence

ったが，変異型では核近傍に小さな凝集体の集合を持つ

elements regulating skeletal細胞もみられた．ロッド1−尾部は内部が抗体で認識さexpressionintranSgenicmice．MoICellBio19（8）：3393−

れない大きな凝集体を形成し，変異型は核近傍に，正常3399，1989．

−77−

and cardiac musCle

家族性還元小体ミオパチ一一ERストレス関連疾患？一
西

研究協力者

Teerin Liewluck●
野

背

野

口

一

大

悟●

林

景

還元小体ミオパチー（reducingbodymyopathy）は，病理学的に，Menadione−1inkeda−glycerophosphatedehydrogenase（MAG）染色において，基質であるα−glycerophosphateを抜いてもnitrobluetetrazolium（NBT）が還元されて染色性を示す筋細胞質内封入体（還元小体）の出現を特徴とするミオパテーである．これまでに全世界で18例しか報告のない希な疾患であり，その病態は依然として不明である．この内，12例は孤発例であり，その大部分は後天性疾患と考えられているが，残りの6例（3家系）には家系内発症者がおり，遺伝性還元小体ミオパチーも希にある
ことが知られている．臨床経過も多彩で，病因論的には，
不均一な疾患群であると考えられる．
我々は，最近，11歳男児とその母親（35歳）の両者に
還元小体を認め，常染色体優生遺伝と考えられる還元小体ミオパチ一例を見出した．
日的還元小体の成因を明らかにし，遺伝性還元小体ミオパ
チーの病因・病態を明らかにする．

三●・●●

澤

麻

記●●

由起子●

埜

尾

方

克

中

征

哉●・●●

ソーム活性測定においては，ArF6などのERストレスのセンサー蛋白質群の発現がコントロールと同程度に保たれていたにもかかわらず，ERシャペロンの転写増強が認められなかった．一方，プロテアソーム活性はコント
ロールよりも寧ろ冗進していた．また，カスパーゼ12の発現が認められた．
考発端者には，10歳時より近位筋優位の筋力低下とrigid
spineが出現し，11歳時に筋生検施行．母親は，29歳より非対称性の全般性筋力低下を来し，31歳時に他院で筋生検施行．現在35歳で，車椅子使用．
患者生検筋に対して，電顕による超微細構造の観察，および各種蛋白質に対する免疫染色を行った．また，患察

還元小体に各種の膜蛋白質が蓄積していることを報告したのは初めてである．各種ERシャペロンが共局在していたことから，ERストレスが生じていることが示唆された．さらに，γ−tubulinが共局在し，desminによるcageが形成されていたことから，a鑑reSOme様構造物が形成されていることが明らかとなった．ERストレスのセンサー分子の発現はコントロールと差がないにも関わらず，ERシャペロンの発現誘導が乏しかったことから，
unfoldedproteinresponse（UPR）に何らかの異常がある可能性が示唆された．さらには，これらERストレスの結果として，アポトーシスも誘導されていると考えられた．
結

患者と方法

久●●

論

世界で第4番目の家系となる，家族制還元小体ミオパ
チ一例を報告した．本母子例での還元小体には，多種類の膜蛋白質の蓄積が，ERシャペロン蛋白質と共局在しており，ERでの蛋白質のqualiWCOntrOlシステムの破綻によるaggresome様構造物形成が，本母子例における還元小体形成機構であると考えられた．

者皮膚線推芽細胞を用いて，ERストレス応答の観察，およびプロテアソーム活性の測定を行った．

参考文献
1）Kiyomoto BH，et al・：Fatalreducing body myopathy．
UltrastruCturalandimmunohistochemicalobservations．J

結
果
還元小体は，筋鞘膜蛋白質，emerin，LIMP−1，GM130など，多様な膜蛋白質とともに各種のERシャペロンとポリユビキチンに対する抗体で染色された．さらに，還元小体の中心にγ−tubulinが局在し，さらに，還元小体はdesminにより囲まれていた．また，tunicamycinを加えて培養した患者線維芽細胞での定量的PCR及びプロテア●国立精神・神経センター神撞研究所疾病研究第一部＝国立精神・神経センター武蔵病院

NeuroISci128：58−65，1995．
2）

Goebel HH，etal：Reducing body myopathywith

CytOPlasmic bodiesandrigid spine syndrome：amixed
COngenitalmyopathy．Neuropediatrics32：196−205，2001

3）西野一三：Myopathy，reducingbody．日本臨淋別刷領域
別症候群シリーズ34：255−256，2001．
4）石川晴美，etal．：還元小体ミオパチ一．日本臨休別刷
缶域別症候群シリーズ35：424−426，2001．

ー78−

Ⅳ．遠位型筋ジストロフィー，Emery−Dreifuss

症候群、DMRVなど

DMRVにおける分子生物学的検討および遺伝子変異型と臨床症状の関連についての検討
水 澤 英 洋●

●

●

●
●

⁝ ⁝

彰…●●

−

青 木 正 志日

●
●

一

塚

明…

●

緒

野

垣

史

也夫郎子

西

藤

欽教一恵

新 井 亜 季†

斉

潤●●

川越澤中

清 水

石大金田

研究協力者 富 浦 弘 之●藤ケ崎 活 人●松 村 喜一郎…
三……

も合わせて，66症例の遺伝子変異型と臨床症状の関連について検討した．

言

平成14年度から16年度の3年間で，我々はdistal
myopathywithrimmedvacuoles（DMRV）はGNE遺伝子変異で発症することを報告し，その病態解明に向けて分子生物学的検討を行った．また並行して遺伝子変異を認め

結果・考察
1分子生物学的検討
DMRVと診断されていた患者の95％でGNE遺伝子変

たDMRVの臨床症状についても解析を行ってきたのでここに報告する．

異を認めた．患者生検筋よりmAを抽出し逆転写してcDNAを作製した．pcR法にてGNE遺伝子全長をクローニングした結果，既知の全長mRNAの他に，エクソ

目的と方法および対象
1分子生物学的検討
2001年にDMRV と類似の疾患と考えられてきた

ン4をスキップしたsplicevariantの存在が明らかとなった・これは正常筋でも認められaltemativesplicefbrmと考えた．組織間での発現を検討した結果，このYariant

hereditary inclusion body myopathy（HIBM）がは既知のsplicevariantの中で，唯一骨格筋に多く発現しているものであった．しかしこの2つのmRNAの発現

UDP−N−aCetylglusosamine2−epimerase／N−aCety1mannosaninekinase（GNE）遺伝子変異にて発症することが報告された．そこで筋生検にてrimmed vacuoleを認め，明らかな炎症細胞浸潤を伴わない症例について，infbmed

について対照群およびDMRV群で検討した結果，明らかな差を認めなかった．

consentをとった後，患者ゲノムを用いて直接シークエ
ンス法で遺伝子解析を行った．次にDMRVは常染色体劣性遺伝性疾患であり，原因遺伝子の発現低下や機能タンパクレベルでの発現を調べるため，GNEを特異的に認識する抗体を作製した．これを用いて骨格筋の免疫組織化学的検討を行った．筋線経は他の疾患コン喪失が発症に大きく関与することが考えられるため，
GNE遺伝子の発現についてRNAレベルおよびタンパ

トロールと比較して，染色性に明らかな差を認めず，
DMRVにおいて，GNEはタンパクレベルでも発現している可能性が示唆された．GNEの局在については，筋クレベルで検討した．さらに本疾患は筋線維内に空胞を生じる疾患であり，空胞形成に関係する線維だけでなく，筋線維内および問質の細胞の核にもGNEが存在すると考えられた．DMRVでは空胞も染色されたため，空胞形成にGNEが関与して空胞に沈着しValosin−COntainingprotein（VCP）についてDMRVおよびIBMの病態への関与について検討した．
2 遺伝子変異型と臨床症状の関連についての検討
当教室ではGNE遺伝子変異をもつ症例について臨床症状に関する調査用紙を作成して解析を行ってきた．
さらに本研究班で症例を集積して解析することになり，
東北大学，新潟大学，国立精神・神経センターの症例●東京医科歯科大学大学院脳神経病態学＝東京大学大学院神経内科学●●●帝京大学医学部神経内科学＝●筑波大学臨床医学系神経内科学
MH●京都大学大学院高次生体統御学
細伸 国立精神・神経センター神経研究所†新潟大学脳研究所神経内科††東北大学大学院神経内科学たものと考えられた．つぎにVCP抗体を用いて免疫組
織学的検討を行った結果，DMRVおよびIBMでは変性が進んだ筋線経で強い染色性を示し，rimmedvacuoleに関しては内容物，辺縁共に染色された．しかしイムノ
ブロットの結果からは正常VCPと考えられる単一のバ
ンドのみ認められた．
以上のことからDMRVにおいて，GNEがタンパクレベルで発現していることを確認すると共に，GNEおよびVCPのrimmedvacuole形成および筋線維変性への関与が示唆された．
2 遺伝子変異型と臨床症状の関連についての検討
4施設で集積された情報を解析した結果，発症初期に−81−

近位筋優位の障害を呈する症例も5％存在したが，臨床的にDMRVと診断できる症例が95％を占めた．すなわ

用いてGNEの病態への関与についてさらに詳細に検討

ち，GNE遺伝子変異をもつミオパチーの臨床症状は，
これまで報告されたDMRVの臨床症状とほぼ一致して実験動物レベルで作成することを目指す．

した．しかしながら今回の検討で，血清CK値が1000IU几を越える症例が約20％存在すること，遠位筋だけでなく大腿内転筋群や傍脊柱筋という近位筋も発症早期から障害されること，重篤な心筋障害を伴う症例も存在することが分かり，今後の診療上注意が必要と思われた．また遺伝子変異型と臨床症状との関連にしていく．それとともに疾患モデルを培養細胞レベル，文

献1）Tbmimitsu H，Ishikawa K，ShimizuJ，Ohkoshi N，KanazawaI，MizusawaH．Distalmyopathywithrimmed
VaCuOles：nOVelmutationsintheGNEgene．Neurology
59：451−454，2002．
2）SaitoRTbmimitsuH，AraiK，NakaiS，KandaTIShimizuT；

ついては，31名の同一変異（V572L変異のホモ接合体）
患者間で検討しても，5名が上肢からの発症例であるなど筋障害分布が完全には一様でなく，遺伝子変異型と臨床像の特異的な関連は見出せなかった．

MimaWa H，Matsumura K．AJapanese patientwith
distalmyopathywithrimmedvacuoles：Missensemutations
intheepimeasedomainoftheUDP−N−aCety1glucosamine
2−ePimerase朋−aCetylmannOSamine kinase geneaccompanied by hyposialylation of skeletal muscle

今後の展望
病態の解明を進めるとともに治療法の開発が大切で

glycoproteins．NeuromusculDisord14：158−61，2004．
3）Tbmimitsu H，ShimizuJ，Ishikawa K，Ohkoshi N，ある．そこで我々は，原因とされるGNEの病態への関連を解明するため抗GNE抗体を作製した．この抗体をKana2aWaI，MizusawaH．Distalmyopathywithrimmed
VaCuOles：Newmutationsandsplicevariant・Neurology
62：1607−1610，2004．

ー82−

Rimmedvacuole型遠位型ミオパチーの筋変性機序に関する研究
田

中

憲

子●

研究協力者 新 井 亜 希● 五十嵐 修 一 小 林
辻

目

省

次●，●●

的

遺伝子であるUDP−N acetylglucosamine2−ePimerase爪ト
acetylmannosarrlinekinase（GNE）がコードする蛋白は独立した2種類の酵素活性（epimerase活性とkinase活性）を有するbifunctionalen野meであり，シァル酸の生合成に関与することから，様々な蛋白の糖鎖修飾に重要な役割を果たしているものと考えられている．我々はこれまで連鎖解析を行ってきた多数の本症家系でGNEの遺伝子解析を行い，kinase domainに位置するV572Lというcommon
mutationの存在を報告した．さらに臨床的・筋病理学的にDMRVと診断した症例を追加してGNE遺伝子上の変
異部位を明らかにし，臨床型・遺伝子型の対応について検討した．

系に及ぼす影響を解析し，本遺伝子変異の病因への関与を明らかにする目的で以下の研究を行った．
また，本症の免疫組織学的診断法を確立するため，変異遺伝子産物を検出するための抗体の作成を試みた．

内

健●

西

澤

正

豊●

有する症例においては平均発症年齢24．8歳（18」30歳），
車椅子使用に至るまでの平均経過年数9．7年（3−15年）であった．common mutation以外の部位に変異を有する

Rimmed vacuole型遠位型ミオパチー（DMRV）の原因

DMRVではいずれのdomainにも変異が認められるた
め，本酵素の変異がDMRVの発症にどのように関与するかは不明である．我々は本症の遺伝子変異が培養細胞

池央●compoundheterozygOteの症例においてはその変異の位置に関わらず比較的高齢発症で，緩徐な経過をとる傾向が認められた（平均発症年齢30・6歳：字2〜50歳）・
2．ヒト骨格筋cDNAlibraryからDMRVの原因遺伝子であるGNEgeneの全長をクローニングし，野生型及びV572L変異型（日本人DMRV症例における common
mutation）を発現ベクターに組み入れた．これらをHEK293細胞，ヒト骨格筋筋芽細胞に強制発現させ，経時的に形態変化を解析した．HEK293細胞，ヒト骨格筋
筋芽細胞のいずれにおいても野生型では細胞質にぴまん性に均一なGNEの発現を認めた．V572L変異型ではいずれの細胞においても細胞質での発現がやや凝集傾向を有する不均一なパターンで染色された．培養筋芽細胞への変異遺伝子導入により，細胞内に凝集体や空胞が形成されることを見出した．
GNE遺伝子の各エクソンについて合成ペプチドを合成し，それぞれに対するペプチド抗体を作成し，マウス

方法と結果

およびラットの全身諸臓器を抗原としたウェスタンプロットにて臓器間でのGNE発現パターンを検討した．
今回作成したGNEに対するペプチド抗体は，マウスお1．臨床的，筋病理組織学的にDMRVと診断した19
症例（家族発症例6家系13症例，孤発例6症例）につよびラットの全身諸臓器を抗原としたウェスタンプロッ
トで骨格筋を強く認識した．

き，遺伝子解析の同意を得た上で採血を行い，genOmic
DNAを抽出した・それらにつきGNEのcodingexons

さらに本症患者6例の生検筋組織および対照筋組織（exon2から12）における変異の有無をdirectsequence法を用いて検索した．

（筋病変の軽微な筋炎，先天性ミオパチ一，肢帯型筋ジストロフィー，筋障害のない剖検筋）について免疫組織
化学的に検討を行った．本症患者生検筋および対照筋を家族発症例6家系13症例のうち，3家系7症例において既報のcommonmutationであるV572Lをホモ接合で認用いた免疫組織化学染色では，いずれの筋でもりpeI
負berに強い染色性を認めたが，rimmed vacuoleを有す筋めた．その他の3家系においては各々，新たな変異をヘ線経においてはり匹Ⅰ甜krでも染色性が低下していた．

テロ接合に認めた（家系756；D176V爪635K，家系2219；
G295D／A631V；家系2377；D176V〝675C）．孤発例については4症例においてcommon mutationであるV572Lをホモ接合で認め，そのうち1症例は両親に近親婚を有する例である．その他の孤発例の2症例については各々新たな変異をヘテロ接合に認めた（症例3868；D176V几603F，
症例4219；A148SN421A）．commonmutation（V572L）を●新潟大学脳研究所神経内科＝東京大学大学院医科系研究科神経内科

考察

common mutationであるV572Lを有する症例について
は，その多くが20代半ばで下肢筋力低下（特に前脛骨筋の筋力低下）にて発症，発症数年を経て上肢の筋力低下も自覚するようになった時点で医療機関を受診，その後約10年を経て車椅子を必要とする状態に至るが，その時点でも大腿四頭筋の筋力が比較的保たれる傾向に有るといった比較的均一な臨床像を呈していた．しかし10代で−83−発症する若年症例や，数年で歩行不能に至る経過の早い症例といった予後不良の症例が見られる一方で，発症後7年を経て通常の出産が可能である経過が緩徐な症例も認められた．commonmutation以外の症例については変異の種類に関わらず発症年齢が高く，下肢筋力低下は進行性の経過ではあるものの，比較的長期間歩行能力を維持することができる症例が多く見られた．また初診時には上肢の筋力低下が認められない症例が多く見られた．
現時点では解析例が少なく，臨床型・遺伝子型の対応については今後さらに多くの症例の蓄積と臨床経過の詳細な検討が必要である．
一方，GNEの筋における生理的意義は未だ不明であり，病態の解明においては筋におけるGNEの機能解明が重要であると考える．今回我々は日本人DMRVのCOmmOnmutationであるV572L変異型の培養細胞における影響を検討した．HEK293細胞，ヒト骨格筋筋芽細胞のいずれにおいても，変異型では細胞質におけるGNEの発現が凝集傾向を有する不均一なパターンとして認められ，機能的にも何らかの障害を生じているものと推察された．免疫組織化学染色の結果を併せて考察すると，
GNEの異常により変性した筋線経にrimmed vacuoleが形成されてくる可能性が考えられた．

今後の展望／研究の意義
DMRVではGNE遺伝子の異常により，比較的一定の筋障害分布を有するミオパチーを発症し，筋組織内には多数のrimmed vacuoleを認めること，シァル酸の合成系との何らかの関わりが想定され，筋細胞内の各種構成蛋白の分解に何らかの障害を生じている可能性が考えられるなど，いくつかの研究の方向性を示唆する疾患である．本症は進行性で，多くの羅患者が治療法の開発を待ち望んでいるため，本症の病態を解明す
ることは極めて意義がある．
文

献1）Ikeuchi T；Asaka T；Saito M et al．Genelocusfor
autosomal recessive distal myopathy with rimmed

VaCuOlesmapstochromosome9．AmNeuro141：432437，
1997．

2）EisenbergI，Avidan N，Potikha T etal．The UDP−N−
acetylglucosamine

2−ePimerase／N−aCetylmannosamine

kinasegeneismutatedinrecessivehereditaryinclusion
bodymyopathy．NatGenet29：83−87，2001．
3）AraiA，「hnakaK，lkeuchiT；etal．：Anovelmutationin
the UDP−N acetylglucosmine

GNEはシァル酸合成の最初の2つのステップを触媒

2−ePimerase爪ト

acety1mannOSamine kinase gene and a stronglinkage

するbifunctionalenqmeで，N未にepimerase活性，C末側にkinase活性があり，独立に機能している．DMRVのようにGNEの全長にわたってmutationが散在するような場合は酵素機能そのものの傷害を生じていると考え

disequilibriuminJapaneSePedigreeswithdistalmyopathy

withrimmedvacuolesPonakadistalmyopathy）Ann
Neuro152：516−519，2002．
4）NishinoI，Noguchi S，Murayama K，et al．：Distal

られる．しかしながらRVの形成機序およびその病因的意義はいまだはっきりせず，異常な筋蛋白の細胞内集積

myopathywithrimmedvacuolesisallelictohereditary

がautophagosomeの形成を促進してlysosomalsystemを活性化するのか，これらのhsion過程に障害があるのか，またはカテプシンなどのリソソーム酵素活性そのも2002．

inclusion body myopathy・Neurology59：1689−1693，

5）KlionskyDJ，EmrSD・：Autophagyasaregulatedpathway
Ofcellulardegeneration．Science290：1717−1721，2000．

のが一義的に冗進している可能性，nOn−lysosomalsystem（ATP−ubiquitin−PrOteaSOmePrOteOlyticpathway）の活性化が関与するなどの可能性も指摘されており，今後の課題
である．

6）Kumamoto T；Ito T；Horinouchi H etal．Increased

ー84−lysosome−relatedproteinsintheskeletalmusclesofdistal
myopathywithrimmedvacuoles．MuscleNerve23：1686−
1693，2000．

Rimmedvacuoleを伴うミオパチ一における免疫染色−レクチンを中心に−
佐

橋

研究協力者

目

的

Rimmedvecuole（RV）を伴う筋疾患の3病態には，distal
myopathywithrimmedvacuole（DMRV），封入体（IBM），
眼咽頭型筋ジストロフィー（OPM）等がある．そして，
DMRVはUDP−GIcNAc2epimerase／ManNAckinase（GNE）
遺伝子1），OPMはpolyAbindingproteinnuclearl遺伝子2）の異常によるという．DMRVではGNE異常によりシァル酸
合成障害が起き，糖タンパクの糖鎖のシァル酸等の異常が推察される．レクチンを用い骨格筋のシァル酸を含めた糖タンパクの糖鎖異常につき組織学的に検討し考察した．
対象・方法
対象：DMRV5例，OPD4例，IBM5例．
方法：四肢生検筋につき新鮮凍結切片を作成し，24種類のビオチン化レクチン（下に別途記載）を用いてABC法で免疫染色．

功●

衣

斐

達●

ともに筋細胞膜，血管，問質結合織で陽性であったが，RVではDMRVに染まった．sJあは血管のみ染まり，疾患差がなかった．
Fuco軍eを認識するレクチン：UEAl（図1GJ）は，各疾
患とも血管が染まっていたが，DMRVでは多くの筋細胞膜が染まり，他疾患では陰性であった．またDMRVでは細胞膜陽性の筋線経はRVも染色されたが，細胞膜陰性
ではRVも陰性であった．IJLは各疾患で細胞質がびま
ん性に染まった．
Mannoseを認識するレクチン：LCA，PSAは，3疾患
とも筋細胞膜，血管，問質結合織が陽性であったが，RVについてはDMRVで強く染まった．comAか各疾患で，細胞質と問質がびまん性に陽性を示した．
その他：PHA−AとPHんLは筋細胞膜，血管，問質結合織が陽性であり，PHA−EではRVは3疾患とも同様に染まり，PHA−LではRVにおけるDMRVで強陽性であった．

結果（図1，表1）
シァル酸を認識するレクチン：WGA（図1A−C），

考

察

DMRVではGNE遺伝子異常により，シァル酸合成経

EBL，MALII，Jacalinでは筋細胞膜，血管，問質結合織が3疾患で同様に染色された．Rimmedvacuole（RV）については，WGA，EBL，MALIIはDMRVで他の2疾患より染色性が低下していた．

路のUDP−GIcNAc2epimerase／ManNAckinaseの活性が障害されシァル酸合成が低下すると考えられている3）．
シァル酸の減少は糖タンパクの糖鎖末端のシァル化が障害され，より近位の糖が露出するため，レクチン染色ではシァル酸を認識するレクチンの染色性が低下し，そのG］cNAcを認識するレクチンDSL（図1D−F），LEL，STL
は筋細胞膜，血管、問質結合織が3疾患で同様に染色されたが，RVについてはDMRVで他疾患より染色性が増加していた．swGAは3疾患で血管が強く染まり，筋細他のレクチンの染色性が増強したものと考えた．この傾向は，筋組織の中ではRVにおいて強く見られたため，シァル酸修飾がなされない不完全な糖鎖を持った蛋白が胞膜，問質結合織がごく薄く染まったが，RVは染まらなかった．GSLIIでは筋細胞膜がびまん性に染色され，3疾患での差はなかった．

ライソゾームへ運ばれるようになったものと推察される．
なお筋細胞膜や問質，血管においてはDMRVと他疾患での差が見られなかったことは，染色法の感度の問題も考GIcNAcを認識するレクチン：RCAI，SBAは血管が最も強く染まり，筋細胞膜，問質結合織が3疾患で同様に染色されたが，RVについてはDMRVで強かった．m

慮される．また，fucoseを認識するUEAlにおいて，DMRV
でのみ筋細胞膜が染まったことは，糖鎖末端のシァル酸が蝕coseに置換した可能性も示唆され，RVを呈する他

では3疾患で同様に血管，筋細胞膜が染まり，問質結合織がごく薄く染まり，RVは各疾患で陰性であった．GSLIは各疾患で血管が染色されたが，RVについてはDMRV

疾患との鑑別に有用であると考えた．

でそまるものがあった．DBAは血管のみ染色され，疾患での差は見られなかった．
Galactoseを認識するレクチン：PNAとECLは3疾患

DMRVは，GNEの障害により糖蛋白の糖鎖シァル化が障害され，シァル酸より近位の糖が露出し，レクチンで認識された可能性が示唆された．また，DMRVのRVや●愛知医科大学神経内科

微小空胞での強い染色性は，シァル化障害の糖蛋白はリシゾーム内へ移送され易いことを推察した．

結

−85−

語

∵

略

語

WGA：WheatGermAgglutinin，EBL：ElderberryBalkLectin，Jacalin：BrazilLak加it，MAl．II：MaackiaamurensisLectinⅠⅠ，
LEL：Lycopersicon esculentum Lectin，STL：Solanum
tuberosusmLectin，DSL：DaturastramoniumLectin，SWGA：
Succinylated

Wheat Germ Agglutinin，GSLII：Gri的nia∴

Simplicifolia LectinII．SBA：Soybean Agglutinin，GSLI：
Grifrbnia simplicifolia Lectinl．RCAI：Ricinus communis
AgglutininI，VVL：Ⅵcia villosa Lectin，DBA：Dolichos
bifloruS Agglitini，PNA：Amchis hypogaea Agglutinin，Ecl：
ErythrinacristagalliLectin，SJA：SophorejaponicaAgglutinin，
UEAI：Ulex europaeusI，LTL：Lotus tetragonolobus
Lectin，LCA：LensculinarisAgglutinin，PSA：Pisumsativum
Agglutinin，ConA：Concanavalin A，PHA−E：Phaseolus
Vulgaris Erythroagglitinin，PHA−L：Phaseolus

vulgaris

Leucoagglutinin

図1WGA，DSL，UEAIでのDMRViIBM，OPD似おける染色．
WGAではDMRVでRVの染色性が低下，DSLでは増加しており，UtAIでは筋細胞膜の染色される線経が見られる．（×100）

文献1）KayashimaT；MatsuoH，SatohA，etal：Nonakamyopathy
is caused by mutationsinthe UDP−N−aCetylglucosamin−

表1各レクチンによる生検筋におけるDMRVとmM，OPDと比較した染色結果．
RV書：DMRVでのBM，OPDと比較したRVの染色性
妨細胞膜筋形質JHumGenet47：77−79，2002．

問質＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ト ト ＝＋2）Bmis B，BouchardJR Xie Yq et al．：Short GCG
expanSuinsin The PABP2gene cause oculopharyngeal
musculardystrophy．NatureGenet18：164−167，1998．
3）SaitoRTbmimitsuH，AraiK，etal．：AJapaneasepatient
withdistalmyopathywithrimmed vacuoles：missense
mutationsintheepimerasedomainoftheUDP−N−aCethy1−
glucosamune2−ePinerase仙aceb，lmamosaminekinase（GNE）
gene accompanied by hyposialyation of skeletal

＋
＋
＋
＋
＋
＋
十
十

一
一

＋一＋

一

＋

＋
一
一

＋一＋

■ ＋ ＋ 十 十 十 十 ＋ − ＋ ＋ ＝ ＋ ＋

＋

十

＋

PHA−L

十

PHA−E

＋

一

Fucα

一

m

＋一一＋

UEA−I Fueα

＋一一十

Manα

PSA Manq

＋

LCA

＋

ConA Manα，GIcα＋（GIcNAc）n一（GIcNAc）n

S−WGA

一

STL

一

＋

（GIcNAc）n一（GkNAchGaJβト3GIcNAc

LEL

一

＋

DSL

一

ECL Ga叩1−3GalNAc，Gal＋l

PNA Galβ1−3GalNAc

GSL−ⅠI GIcNAccL，GIcNAcβ，一

SJA GdP，GalNAcP一

GSL−I GalNAcα＋一一一＋

DBA GalNA￠α，Galα＋

GalNAc

一

＋

VVL

＋

一

＋

RCA−l GalNAc，Gal
GalNAc一

MAL−IT Sialylα2−3

血管

＋

一

＋

jacalin Sialyl−GalPト3GalNAc−0−

SBA

一

＋＋

EBL Sialy1−Gal，Sialyl−GalNAc

RV XV●＋ ＋ − ＋ ト ー ＝ ＋ ニ ー ＋ ＋ ＋ ニ ー ＋ 十 ＝ ＋ ＋lectin Sp∝i茄dV
WGA SialicAcid．lGIcNAcln

2−ePimerase／N−aCethylmannOSaminekinasegene（GNE）．

＋

86

glycpproteins．NeummuscDisord14：158−161．2004．

musCleアセチルコリン受容体αサブユニット遺伝子の機能を有さない
エクソンP3A上のミスセンス変異はmRNAスプライシング異常
を誘発する
佐
研究協力者

日

大

野

橋
欽

功●

司●●

AndrewGEngel

COS細胞に導入したミニ遺伝子由来のmRNAのrealtime

的

先天性筋無力症候群は，神経筋接合部の先天的な分子

RTPCR解析を行った．さらに，エクソン特異的siRNA欠損により神経筋接合部の信号伝達が障害される疾患群

をミニ遺伝子と同時にCOS細胞に導入し，治療オプショ
ンの可能性を検討した．

であり，i）骨格筋ニコチン作動性アセチルコリンレセ
プター（AChR），ii）AChRを終板に集積させるrapsyn，揖）骨格筋電位依存性ナトリウムチャンネル，如）アセ
チルコリンエステラーゼをシナプス基底膜に係留する

結

果

先天性筋無力症候群の1例において認められたエクソ

collagenq，Ⅴ）神経終末においてアセチルコリンを再合成するコリンアセチルトランスフェラーゼの5分子の欠ンP3A上のミスセンス変異によりエクソンP3Aが常にmRNAに取り込まれ，P3A（＋）mRNAのみが作られることを患者骨格筋mRNAのRTPCR解析により見出した．

損が知られている・成人型AChRは，α謹，8，8の4つのサブユニットからなる5量体である．αサブユニット遺伝子

COS細胞に導入したミニ遺伝子の解析でも同様な結果（α況肱叫の75塩基からなるエクソンP3Aは，altemative
splicingを受け，P3Aを有するP3A（＋）mRNAと，P3AをスキップしたP3A（−）mRNAは骨格筋において1：1で生が得られた．ミニ遺伝子に対するscarLningmutagenesisに成される．p3A（−）mRNAは正常αサブユニットをコードする．一方，P3A（＋）mRNAによってコードされるαサブユニットはAChRを構成できず，その存在意義は不明で

P3A（−）mRNAが全mRNAの1．8％を占めるまでしか増加させることができなかった．

より，この変異はexonicsplicingsilencerを破断していることが判明した．p3A（−）mRNA量は5倍に増加したが，考ある・エクソンP3Aのaltemativesplicing調節の分子機構は明らかにされていない．
方Altemativesplicingを受ける機能を有きないエクソン上の一塩基置換はサイレントとは限らない．あらゆるエ法

クソン上の変異は，mRNA前駆体スプライシングへの影

HEK細胞に発現をさせた組み換えAChRのαバンガロ
トキシン結合アッセイを行った．骨格筋mRNA，及び，響を常に考慮に入れる必要がある．

● 愛知医科大学神経内科＝ 名古屋大学神経疾患腫瘍センター神経遺伝情報学＋H

察

Mayo＿Clinic，DepanmentofNeuroIogy−87−

Rimmedvacuoleを伴う遠位型ミオパチーの骨格筋における糖蛋白のシァル酸負荷に関する研究
清 水 輝 夫●
研究協力者

日斉 藤 史 明＊ 新 井謙● 富水 澤 英 洋●● 松 村 喜一郎●

的

浦

弘

之●●

kinaseの存在が知られており，kinasedomainに変異を持

Rimmedvacuoleを伴う遠位型ミオパチー（Distalmyopathy
withrimmedvacuole：DMRV）はUDP胡−aCetylglucosamineつ患者では同酵素によりGNEの活性低下が代償されて

2−ePimerase／N−aCetylmannOSaminekinase（GNE）遺伝子の変異で生じることが知られている．GNEはシァル酸合成

常の結果cL−dystroglycanのlaminin結合能が減弱することが先天性筋ジストロフィーの発症機序として注目されてに必須の酵素であり，その機能異常では糖蛋白のシァルいる．しかしDMRVにおいてはcL−DGのlaminin結合能

酸付加に異常を生じる可能性が推測されているものの，本症の発症機序は不明のままである．本研究ではDMRV

は正常であり，α−dystroglycan以外の蛋白の機能異常が本疾患の発症に関わっているものと考えられる．

患者の骨格筋における糖蛋白のシァル酸負荷の異常の有無を検討した．

今後の展望いる可能性が推測された．近年，α−dystroglycanの糖鎖異SGは筋組織だけでなく中枢神経系においても重要な
方法機能を果たしているものと考えられる．今後，M−Dなど，病理学的に診断された日本人DMRV患者7名の生検

運動異常に関連した疾患の解析からSGの機能に関する

骨格筋より蛋白を抽出し，電気泳動，転写の後に，レク新しい知見が得られる可能性がある．また，；−SGはγ＿

チンプロットを行いシァル酸の変化を検討した．また，SGの，e−SGはα−SGの代用分子として機能すると考え

免疫染色，ウエスタンプロットにより同患者骨格筋におられるため，これらの発現制御の問題に取り組むことでけるローdystroglycanの発現を検討するとともに，プロッLGMD2C，2Dの治療法への応用が期待される．

トオーバーレイアッセイによりα−dystroglycanのラミニン結合能を検討した．

研究意義
DMRV患者7名のうち1名において骨格筋糖蛋白のシァル

結果

酸負荷が著減していることを兄いだした．同患者はGNE遺7名中1名のDMRV患者においてシァル酸認識レクチン

伝子のepimerasedomainに稀な点変異を有していた．7名のであるwheat germ agglutinin（WGA），Sambuccus nigra

患者全てにおいてα一dystroglycanの1aminin結合能は正常であった．これらのことはDMRVの一部の患者では骨格筋

agglutinin（SNA），maaCkiaamurensislectin（MAM）の反応性の著明な低下を認め，シアリダーゼ処理後にはこれらコントロールとの差異は消失したことから，同骨格筋における糖糖蛋白のシァル酸の減少が筋細胞変性に関与する可能性を示唆しており，その分子発病機序の解明に重要な発見である．

蛋白のシァル酸負荷の減少が明らかとなった．遺伝子解析の結果，本患者はGNEのepimerasedomainにCys13Ser，
Asp176Ⅶ1という稀な点変異を有することがわかった．一方，

文

7名全てのDMRV患者においてαdys打Oglyc弧の発現は正常であり，明らかなラミニン結合能の低下も認められなかった．

献1）Matsumum，K．，etal．FEBSLeは334：281−285，1993．
2日ねmada，H．，etal．FEBSLett．352：49−53，1994．
3）1ねmada，H．，etal．J．Neurochem．66：1518−1524，1996．

考察

両アリール共にepimerase domainに変異を有する

4）1血mada，H・，etal．J．Biol．Chem．271：23418−23423，1996．
5）Chiba，A．，etal．J．Biol．Chem．272：2156−2162，1997．

DMRV患者において骨格筋蛋白のシァル酸負荷の減少

6）Matsumura，K．，etal．J．Biol．Chem．272：13904−13910．

を認めたが，kinasedomainに変異を持つ他のDMRV患者

1997．

ではレクチンプロットに明らかな変化は認められな

7）Matsumura，K・，etal・Histol．Histopathol．12：195−203，

かった．GNEと同様のkinase活性をもつ酵素GIcNAc

1997．

8）Matsumura，K．，etal．Neuromusc．Disord．7：7−12，1997．

●帝京医科大学神技内科＝東京医科歯科大学脳神経権能病態学−88−9）Saito，Fl，etal．J．Biol．Chem．272：26708−26713，1997．

16）Masaki，T，etal．ActaNeuropathoI．101：174−178，2001．

10）Sasaki，T，etal．Biochim．Biophys．Acta1425：599−606，17）Yamada，H．，etal．Hum．Molec．Genet．10：1563−1569，

1998．

2001．

11）Saito，F．，etal．J．Biol．Chem．274：8240−8246，1999．

18）Masaki，T，etal．Exp．Neurol．174：109−117，2002．

12）Shimqji，Y．，etal．Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．96：

19）Matsumura，K・，etal・CurrentTbpicsinNeurochemistry9857−9862，1999．

3：131−140，2002．

13）Matsumura，K．，et al．Ce11．Molec．Biol．45：751−762，20）Matsumura，K．，etal．Neuromusc．Disord．13：796−803，

1999．

2001．

14）Masaki，T，etal．ActaNeuropathol．299：289−295，2000．

21）Matsumura，K・，etaLBasicandAppliedMyology13：15）Claudepierre，T．，etal．J．Ce11Sci．113：3409−3417，2000．

299−304．2003．

−89−

縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチーPMRV）におけるシアリル化異常
訂﹂

雄

川藤

小後

でヂ
禁ぺ

山

村林

で好

陽玄

良原

●

野

計川

●

悟子哉
●

雅征

緒

口田中

野藤埜

研究研究者

西

言

患者筋では約25％減少していた．レクチン染色では縁取り空胞をもつ筋線推または高度に萎縮した筋線経で，シ縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー（DMRV）は本邦で初めて報告され，前頸骨筋が好んで侵される疾患である．我々はDMRVが海外に多い遺伝性封入体ミオパチー

ァル酸の減少を示す染色が観察された．しかしながら，患者肪全体から調製したサンプルでは，ほとんど有意な（HIBM）のアレル病であり，シァル酸生合成の律速段階酵シァル酸減少を示す糖蛋白質は見られなかった．また，

素UDP−GIcNAc2−ePimerase／ManNAckinase（GNE）遺伝子の機能喪失型変異による疾患であることを明らかにした．

DMRV培養細胞では，シァル酸は血清を加えない時のみ，
約35％低下していた．この低下は，培地に血靖やGNE

これまでに国内外で遺伝子変異の報告があるが，その詳細な病態機序は不明のままである．本研究では，組み換
え変異GNE蛋白質の酵素活性とオリゴマー形成を測定

代謝産物であるManNAc・NeuAcの添加により正常レベ
ルに回復した．これらの結果はレクチン染色でも確かめられた．GNE拓マウスには異常が見られなかったが，し，DMRVにおける変異GNE酵素の生化学的な特性付けをするとともに，DMRV筋・培養細胞におけるシアリ
ル化について解析をした．

GNE−／−マウスは産出されなかった．胎児期9．5日齢以降に胎生致死性を示した．
考察・結論

方

法

Site−directedmutagenesisにより，変異GNE蛋白質発現
ベクターを作成し，COS細胞にて組み換え変異GNE蛋
白質を強制発現させた．標識基質を用いて，酵素活性を測定した．オリゴマー形成は，化学架橋剤を用いて，組み換え変異GNE蛋白質を架橋・精製後，電気泳動で調べた．DMRV患者筋・細胞のシァル酸含量はチオパルピ
ツール酸法で測定した．レクチン及び抗体染色，ラミニ
ンオーバーレイは常法に従って行った．GNE−／＿マウスは，常法に従い，eXOn3をNEO遺伝子に置き換えて作成した．
結果

少しの例外を除き，UDP−GIcNAc2−ePimeraseドメインに変異のあるGNE蛋白質はUDP−GIcNAc2−ePimerase活性が減少し，ManNAc kinase活性は保たれていた．一方，
ManNAckinaseドメインに変異のあるGNE蛋白質はその逆の傾向を示した．正常型GNE蛋白質は6皇体を形成していたが，UDP−GkNAc2−ePimerase活性減少変異体は単量体または3量体であった．このことは，オリゴマー形成がUDP−GIcNAc2−ePimeraseに関連があることを示していた．
患者血清のシァル酸含量はほぼ正常レベルであったが，①UDP−GIcNAc2−ePimerase活性またはMahNAckinase
活性を完全に失っているGNE変異はなかった．②オリ
ゴマr形成はUDP−GIcNAc2−ePimerase活性に必須だと考えられた．③DMRV患者筋の一部に見られる萎縮筋においてシアリル化の減少が観察された．全体では，約25％のシァル酸の減少を示した．なぜ，一部の筋線推のみで減少するのかが解明されなければならない．④
DMRVでのシアリル化の減少はGNE代謝産物である
MahNAc・NeuAcの添加により正常レベルに回復したが，特にNeuAcのほうが効果が高かった．これらの物質による治療効果が期待された．⑤GNE−／−マウスは胎生致死性を示した・つまり，UDP−GIcNAc2−ePimerase活性またはMahNAc kinase活性を完全に失うと致死に至る．シァル
酸減少からDMRV発症に至る分子病態解明にはモデル
マウスが必要であり，変異GNEトランスジェニックマ
ウスとの交配にて得る予定でいる．
参考文献
1）Nishino，Ⅰ．etal．Neurolo訂59：1689−1693，2002．
2）Hiderlich，S．etal．Neurology61：145，2003．
3）Noguchi，S．etal．JBioIChem，279：11402，2004．

●国立精神・神経センター神撞研究所ー90−

Ⅴ．DMD／BMD、およびジストロフィンその他

新しい中間径フィラメントであるβ−Syneminの分化に関する研究
水 野 裕 司■研究協力者 水 島 和 幸■

岡 本 幸 ガJe飴eyR．Guyon…
SimonC．WatkinS…

LouisM．Kunkel●●

目

的

5個のエクソンから翻訳されるβ一野neminl）2）3）（当初はdesmuslinl）と命名された）は，ジストロフィン結合タ
ンパク質のひとつであるα−dystrobrevin−1（エクソント21Aで構成）とα−dystrobrevin−2（エクソン1〜17Bで構成）に共通な配列（エクソント16に相当）をおとりタン
バク質として獲得した中間径フィラメントである．β−synemimはN端側が10個，Rod部分（1んlB−2ん2Bで構成）が312個，C端側が931個のアミノ酸より構成される分子量約170kDaのタンパク質で，中間径フィラメン
トのタイプ6に類似の構造をしている．免疫沈降実験の結果，両タンパク質が結合するためには，β−SyneminはN末端からRodのIA−1B−2Aまでが，α−dystrobrevinは
エクソン8〜16が必要であった．また，β−Syneminはdesminにも結合したので，このタンパク質はジストロフ
ィン結合タンパク質と細胞骨格系タンパク質の両者を結ぶ役割をしていることが推定された．β−Syneminの局在に関しては，光学顕微鏡レベルや電子顕微鏡レベルでの解析により，Z線に沿って存在していることを明らかに

β一S叩eminの電子顕微鏡レベルでの局在について
β−SyneminはZ線が筋細胞膜に接する箇所（costamereに相当）に多く存在している（A、B）。また、筋細胞内ではZ線に沿って存在している（C、D）。

した（図）l）．本研究ではβ−Syneminに特異的な抗体を用いて，（1）β一野neminの骨格筋における詳細な局在，（2）β−Syneminの発現時期及び他のタンパク質との比較，（3）コントロールマウスとmdxマウスの骨格筋におけdystrobrevin−2は胎生20日よりバンドとして認識でき，
1日から発現を認め，生後5日，7日と急速に増加した

るβ−Syneminの変動の有無ついて検討した．

が，その時期においてもβ−Syneminの発現量の急激な増加はなかった．同じ中間径フィラメントのvimentinは方法と結果

胎生16日にすでに発現し，生後7日まで明らかなバン（1）共焦点レーザー顕微鏡レベルでβ−Syneminの局在を検討した．β一SyneminはZ線に沿って存在するが，特にcostamereに強いシグナルを認めた3）．

ドを認めたが，13週になるとバンドは見られなかった．
以上の結果より，抗体の力価の違いはあるが，β＿syneminはα−dystrobrevin−2よりもα−dystrobrevin−1に発（2）ラットBrlHan：WIST（GALAS）の胎生16日，18日，20日，生後1日，3日，5日，7日，13週の下腿筋を使現パターンが類似しており，両タンパク質の親和性を示用した．イムノブロット法を用いて，β−Syneminの他に的に検討すると，胎生20日に細胞内にドット状のシグ

α−dystrobrevin−1，α−dystrobrevin−2，dystrophin，

ナルが検出できた．生後3日から細胞膜周囲及び細胞内唆していると考えた．また，ラット下肢筋を免疫組織学

vimentinの発現時期を検討した．β−Syneminは生後5日よりバンドとして見えるようになり，徐々に発現量が増にも発現が明らかになってきた．

加していった．α−dystrobrevin−1はβ−Syneminと同じく生後5 日よりバンドとして認識できた．一方，α一徐々

ホモジネートを電気泳動し，イムノブロット法によりにシグナルが強くなっていった．Dystrophinは生後とされるα−dystrobrevin−1をマーカーとした．Utrophin，（3）コントロールマウスとmdxマウスの大腿四頭筋のβ−Syneminの発現状況を比較した．両マウスで差がない
α−dystrobrevin−1，α−dystrobrevin−2，β−Syneminのバン＊群馬大学大学院 脳神経内科学＝HaⅣard大学 ボストン小児病院
書目Pittsburgh大学 CenterforBiologiclmaging

ドをNIHImageを使用して数値化した．Mdx／コントロ，ル比はα−dystrobrevin−1が0．99であり，両方のタンパー93−

ク質がほぼ同量泳動されているものと解釈した．その際157例のコントロール群と71例の疾患群（Nemaline

utrophinが5．72とmdxで増加し，α−dystrobrevin−2が0．57とmdxで低下していた．一方，β−Syneminに関しては1．00と差がなかった3）．この結果から推測できる

myopathy 50 例，Muticore／minicore disease 6 例，

ことは，β−Syneminの発現量が両マウスで変動がなかったことより，β−Syneminはα−dystrobrevin−1に親和性があるのではないかということであった．
考察（1）ラットの下腿筋を用いてイムノプロット実験を行った結果，β−Syneminとa−dystrobrevin−1の発現を認識できたのがともに生後5日であったこと，コントロール
マウスとmdxマウスの大腿四頭筋におけるβ・Syneminの発現量が，a−dystrobrevin−1と同様に差がなかったことより，β−Synemin はα−dystrobrevin−2 よりもα−dystrobrevin−1に対して強い親和性があると考えた．
（2）β−Syneminの発現パターンを経時的に検討するためにラットの骨格筋にマーカインあるいはカルジオトキ
シンを注射して，人工的に再生を起こさせ，観察する必要があると考えた．

Myotubularmyopathy2例，Spheroidbodymyopathyl例，
Limb−GirdlemusCulardystrophy4例，Undeflned8例）の両方に認めたことより，検索し得た71例の疾患群の原因となるべき変異ではないと判断した2）．最も興味深
かったことは，β−Syneminのエクソン1に存在した
SNPである．これは核酸番号598がC→T（C598T）に置換しており，CAG→mGとなり，グルタミンが停止
コドンに変化しているものであった．この患者はヘテロ変異で，患者の健康な両親を検索したところ，父親にも同様のへテロ変異を認めた．さらに157例のコントロー
ル群を調べたところ，同じヘテロ変異の人が1人見つかった．計算上，ヘテロ変異の確率は2／456（（71＋157）x2）＝0．44％，ホモ変異になる確率は0．44x O．44＝
0．002％になった．C598Tのホモ変異の患者は見つかっていないので，β・Syneminのノックアウトマウスを作製して，筋力低下などの症状を呈するか否かを検討することが必要と考える．β−Syneminのノックアウトマウスの研究が，β・Syneminの筋組織における機能を探るうえでとても大切であると考える．

今後の展望
文

β一Syneminはa−dystrobrevin−1とα−dystrobrevin−2の両献者，あるいはどちらかに優位に結合している可能性のあるタンバク質である．どちらとより強く結合するかを解

1）MizunoYiThompsonTqGuyonJR，LidovHGWBrosius
M，Imamura M，Ozawa E，Watkins SC，Kunkel LM：

明することは，β一町neminの局在及び機能を考える上でDesmuslin，a nOVelintermediate mament protein thatinteractswithalpha−dystrobrevinanddesmin．Proc．Natl．
Acad．Sci．（USA）98：6156−6161，2001．

とても重要である．神経筋接合部において，β−Symeminがcrestに存在しているか，それともdeepportionに存在しているかを検討することは意義がある．なぜならα＿2）MizunoY，PucaAA，0BrienKFiBeggsAH，KunkelLM：

dystrobrevin・1はcrestに多く，a・dystrobrevin−2がdeep
portion に優位に存在していること，desmin がGenomicorganizationandsingle−nuCleotidepolymorphism

acetylcholine receptorの豊富なcrestに接して存在していることが報告されているからである．

OnChromosome15q26．3．BMCGenetics2：8，2001．

mapofdesmuslin，anOVelintermediatenlamentprotein3）MizunoYiGuyonJR，WatkinsSC，MizushimaK，Sasaoka

以前我々が報告したβ−Syneminのアミノ酸置換を伴う12個の変異とアミノ酸置換を伴わない9個の変異の計

Tllmamura M，KunkelLM，OkamOtO K：β−Synemin

21種類のsingle−nuCleotidepolymorphisms（SNPs）は，

myonbers．MuscleNerve30：337−346，2004．

localizes to regions ofhighstressin humanSkeletalー94−

ジストロフィン欠損骨格筋におけるMAI，Kおよび
matrixmetalloproteinase−2，−9の検討
池

田

修

一●●

研究協力者 吉 田 邦 広●・†中 村 昭 則●● 福 島 和 広●●
飯

日

島

尚

子●●

植

田

秀

穂…

武

田

伸

一…●

的

化は組織やストレスの種類により異なっている．ジスト
ロフィン欠損筋では正常筋に比べ機械的ストレスをより受けやすいことから，MAPKsの発現異常が起こっている可能性を考えた．我々は以前に運動負荷により mdx
マウスの心筋ではp38MAPKの活性化が強く起こることを報告した1）．そこで，この3年間に（1）運動負荷によるmdx骨格筋のMAPKsの発現の検討，（2）ヒトジス
トロフィン異常症の骨格筋におけるp38MAfK，
ERKl／2の発現・局在の検討，（3）MAPKの下流の分子である matrix metalloproteinase−2，−9（それぞれ
gelatinaseA，B）のジストロフィン欠損筋での活性・局
在の検討，を行った．
方法と結果①骨格筋における運動負荷によるMAPKsの発現
6週齢の対照およびmdxマウスそれぞれ5匹ずつを運動負荷群，非運動負荷群の計4群に分け，運動負荷群にはトレッドミルを用いて傾斜7度，15m／min（5週）
続いて23mノmin（5週）を1時間，週2回の計10週間の運動負荷を行った．各マウスの後肢筋を用いて，各々活性化型であるp−ERKl／2，P−P38MAPK，P−JNKの蛋白量について比較・検討した．
p−ERKl／2，P−p38MAPK，P−JNK2の発現は運動負荷群の対照およびmdxマウスの骨格筋で増加していたが，特にmdx運動負荷群でより増加していた．p一mKlはどの群においても発現は極めて少なく，運動負荷との関連はみられなかった（図1）．MAPKpathwayの下流に位置するp90RSKやmatrixmetalloproteinase−9の発現も検討したが，同様にmdx運動負荷群で強かった．2）●信州大学医学部附属病院遺伝子診療部●●信州大学医学部第三内科…信州大学医学部保健学科解剖学…●国立精神・神経センター神経研究所†平成16年度︵の雲つと旦石しく︶シスなど多彩な機能を有している．MAPKsは主にp3S
MAPK，ERKl／2，JNKに分類され，各々の発現・活性S⊃一再石目O竜一と〇五sOエd

Mitogen−aCtivatedproteinkinases（MAPKs）は機械的刺激などの様々なストレスにより活性化される細胞内伝達
シグナル伝達分子であり，細胞の分化，増殖，アポトー

ERKl／2

p38MAPK JNKI JNK2

図1運動負荷群（Ex），非運動負荷群（NEx）のmdxおよびC57BL／10（BlO）マウス骨格筋におけるERXl／2，
p38MAPK，JNKl，JNK2の活性化の比較．各群ともn＝5，Bar：mean土S．E．M，■p＜0．05，Hp＜0．01，nS：nOt

Sign描cant．

②ヒトジストロフィン異常症の骨格筋におけるp38
MAPK，ERKl／2の発現・局在
ジストロフィン異常症11名，対照として自己免疫性筋炎11名，神経原性筋萎縮症5名，正常者2名の骨格筋について，p−p38MAPKおよびp−ERKl／2の発現を比較した．また両分子の局在を免疫組織化学的に検討した．
ジストロフィン異常症ではp−P38MAPKは炎症性
ミオパチーおよび神経原性筋萎縮症の2．5倍と有意（p＜0．01）に増加していた（図2A）．また，p−ERKl／2 は自己免疫性筋炎との間に有意差（p＞0．05）はなかったが，神経原性筋萎縮症に対しては2．5倍と有意（p＜0．05）に増加していた（図2B）．ジ
ストロフィン異常症ではp−p38MAPKは壊死線経の38％，再生線経の35％に陽性，p−ERKl／2は壊死緑経の25％，再生線経の 52％で陽性であった．一方，自己免疫性筋炎ではp−p38MAPKは壊死線経の50％，
再生線経の33％に陽性，p−ERKl／2は壊死線経の50％，再生線経の75％で陽性であった（図2C）．神経原性筋萎縮症では萎縮線経の核・細胞質に両分子の弱い染色性を認め，正常ではいずれの染色性も極めて弱かった．3）

一95−

pく0．01

H＆E p−P38MAPK p−ERKII2

pく0．054ー￠＞0−qrゞ∝山と

3

2

1

0

三デミぎ
図2
A：正常者，神経原性筋萎縮症，自己免疫性筋炎およびジストロフィン異常症患者の骨格筋におけるp−p38MKの発現量．Bar：
mean土SEM，NS：nOtSignificant

B：正常者，神経原性筋萎縮症，自己免疫性筋炎およびジストロフィン異常症患者の骨格筋におけるp−ERKl／2の発現量．Bar：mean士
SEM，NS：nOtSignifkant
C：DMD患者，正常者の骨格筋におけるH＆E染色p−p38MAPKおよびp−ERKl／2の免疫組級化学書Opaquenber，Bar：50FLm．

③筋ジストロフィー犬（CXMPj）の骨格筋におけるMMP−2，−9の活性・局在

cxMqで有意に増加し，月齢に関わらず高値が持続していた．正常犬ではproMMP−2の活性は月齢との有意な負の相関を認め，低月齢において増加していた．また，4

正常犬およびCXMPjそれぞれ9匹（1，4，5，6，11，
11，12，14，28ケ月齢）の前脛骨筋を用いてgelatin
zymographyを行い，MMP−2，−9の活性について検討した．

ケ月齢のCXMPjでは壊死・再生部位に強いgelatinase活性を認めた．MMP−2およびMHCdは再生線経に共局在を認

また，4ケ月齢の正常犬およびCXMPjの前脛骨筋を用い

め，MMP−2陽性筋線経はMHCd陽性筋線経よりも少数でてnlminsitu野mOgraPhyを行い，gelatinaseの活性の局在部位を検討した．さらに，4ケ月齢の正常犬およびあり，再生早期の筋線経に限局していた（図3A）．MMP−
9は炎症細胞の侵入した壊死線経やその周囲問質に局在

CXMDjの前脛骨筋でMMP−2，−9，CDllb，1amininB2およびMHCdの局在を免疫組織化学的に検討した．

を認め，CDllbと共局在を示した．また，細胞浸潤を認

proMMP−2，MMP−2，prOMMP−9の活性は正常犬と比較し均一に低下していた（図3B）．4）

めるMMP−9陽性の壊死線経ではLamininB2の染色性が不

ー96−

A

図3
A：4ケ月齢のCXM巧の前脛骨筋におけるMMP−2，MHCdの免疫組織化学
B：4ケ月齢のCXM巧の前脛骨筋におけるMW−9，CDllb，lamininB2の免疫組織化学

考

察

今後の展望

Mdxの運動負荷群の骨格筋では対照の運動負荷群に比①ジストロフィン異常症において，p38MAPKが壊死やして，p−ERXl／2，P−p38MAPK，P−JNK2の発現が増加していたことから，これらの分子が機械的ストレスに伴う変性に関与している可能性があることから，p38MAPKの抑制剤をmdxマウスに授与し，病態変化の有無について検討する予定である．

ジストロフィン欠損骨格筋の病態に関与している可能性がある・ジストロフィン異常症ではp−p38MAPKの発現が他の対照疾患に比べて有意に増加し，より壊死線経に染色性がみられた．p38MAPKは死のシグナルと考えられ，
p38MAPKがジストロフィン欠損筋の変性に促進的に働いている可能性がある．一九p−ERKl／2はより再生線経に染色性がみられERXl／2が生のシグナルと考えられていることから．筋再生への関与もしくは変性に対して抑②MMP−2，−9については，さらにジストロフィン異常症の病態との関連を深めるために，（1）衛星細胞との関連，（2）実験的筋壊死・再生モデルおよびmdxマウ
ス筋における発現様式について検討する予定である．
参考文献
1）Nakamura A，Ⅵ）Shida K，Thkeda S，DohiN，Ikeda S．
Progression of dystrophic fbatures

制的に働いている可能性がある．最近，heregulinがERK
pa也wayを介してユートロフィンの発現を増強（Gyrd−
HanSenetal，JNeruOSci2002；197：27）し，またheregulinがutrophinの発現を増強して，mdxマウスのジストロフィー

and activation of

mitogen−aCtivated protein kinases and calcineurin by
Physicalexercise，in hearts ofmdx mice．FEBS Letters
520：18−24，2002．
2）NakamuraA，YoshidaK，UedaH，TbkedaS，IkedaS．Up−

変化を改善（Kragetal，PNAS2004；101：13856）することが報告された．ジストロフィー変化の機序にMAPKsの果たす役割は重要と考えられる．

regulation ofmitogen activated protein kinasesinmdx
SkeletalmusClefo1lowlngChronictreadmillexercise．BBA
MoIBasisDis．Inpress．

MMP−2，−9の活性はCXMqでは月齢に関わらず高値

3）Iiiima−DohiN，NakamuraA，UedaH，YoshidaK，恥kedaS，を持続していたが，prOMMP−2は低月齢の正常犬で有意に高く，生理的な筋組織の成長発達に関与している可Nishinol，Ikeda S・Alteration ofp38mitogen activated能性がある．MMP−2はMHCd陽性線経の一部に共局在をinskeletalmuscle舟ompatientswithdystrophinopathyand

PrOteinkinaseandextracellularslgnalregulatedkinasel／2認め，筋の再生の早期に関与していることが示唆された．MMP−9は壊死線経と炎症細胞に局在しており，壌

autoimmuneinnammatOrymyOPathy．Insubmission4）FukusimaK，NakamuraA，UedaH，YuasaK，ThkedaS，

死線経の除去による筋再生への促進的な役割を果たし

lkeda S．Activationている可能性や過度な発現が組織障害性に働き，筋壊死に対して促進的に働いている可能性が考えられる．

metalloproteinase−2and−9inthe skeletal muscle ofin

ー97−

and localization of matrix

dystrophicdog（CXmdJ）．Inpreparation

筋原線経から筋形質膜への分子連関構築と筋ジストロフィー発症機序の相関解析
土 方 寅 雄●，†依 藤
研究協力者

日

依 藤
村 上

宏●・†…†

宏●・†土 方 貴 雄●，†t●●・＝
徹●

シネミンのドメイン相互作用をプルダウンアッセイによ

的

骨格筋では細胞内の細胞骨格を細胞外の基底膜につなぎ止めるものに，ジストロフィンージストログリカ
ン軸およびインテグリン軸の二つのものが存在する．
ところで，筋原線経は中間径フィラメントープレクチ

り検討した．その結果，プレクチンN末はβ−シネミンのロッドドメインC末，テールドメインN未にかけての敵城に結合し，反対にβ−シネミンはプレクチンのエン系により，相互に束ねられ，全体としては筋形質膜のジストロフィンージストログリカン軸につなぎ止められているl）が，後者の分子連関は明確にはなっていない．本研究ではこの点の解明を目的として，（1）中間径フィラメントプレクチン系がどのような分子を介して細胞膜のジストロフィンージストログリカン軸と連関するのか．（2）（1）の研究過程でジストロフィンージ
ストログリカン軸はビンキュリンあるいはアクチンを介してインテグリン軸とも分子連関を持つ可能性が出てきた．この可能性の有無の検証を目的として，両軸の関係を電顕レベルの免疫組織化学により検討することにした．（3）不明な点の多いインテグリン軸について，ユートロフィンとの分子連関の有無を調べるため，神経筋接合部におけるインテグリン及びそれと相互作用を持つ蛋白の局在を検討した．
方法と結果（1）中間径フィラメントプレクチン系とジストロフィ
ンージストログリカン軸の分子連関 プレクチンのN末のリコンビナントタンパク質を用いたプロットオーバー
レイアッセイによりβ−シネミン（デスマスリン）がプレク
チンと結合することが明らかになった．また，ラットの骨格筋切片の抗β−シネミン抗体と抗ジストロブレビン
抗体での二重染色によりβ−シネミンはZ線延長上の筋形質膜においてジストロプレピンと共局在を示した．これらの結果ならびに水野らのβ−シネミン（デスマスリン）
はジストロプレビン結合タンパク質であるという報告2）から，プレクチンは筋形質膜直下でβ−シネミン，ジス
トロブレビンを介してジストロフィンに分子連関性を示

クソン1ドメイン，カルポニンホモロジードメイン，N
末最初のスペクトリンリピートドメインに結合することが明らかになった．カルポニンホモロジードメイン
はアクチン結合部位でよく知られているので，このドメインにF−アクチンが結合しβ−シネミンとの結合が阻害されるかどうかF−アクチン，β−シネミン，プレクチンを用いた競合的沈降実験を行った結果，プレクチンとF一アクチンとの結合はプレクチンとβ−シネミンとの結合を阻害するものでないことが明らかになった．さらに，β−シネミンのテールドメインは弱いながらもF＿
アクチンへの結合能をもつことも明らかになった．
（2）ジストロフィンージストログリカン軸とインテグリ
ン軸の分子連関の可能性 抗インテグリンβlD抗体および抗ジストロフィンあるいは抗ジストログリカン抗体の二重染色を電子顕微鏡レベルでおこなうことにより，両軸の分子連関の可能性を検討した．抗ジストロフィン抗体との染色にはクリオスタット切片上で免疫染色をおこない再包埋，持切した試料を用い，TritonX＿
100で処理したものとしていないものの2種類を試みた．
抗ジストログリカンとの組み合わせではchemica11y
skinnedfiberl）に免疫染色を施した．前者の方法では2つのラベルが近接して存在する場合が認められ，その際は二つのラベル間の距離のヒストグラムを描くとTriton
処理（＋）で20〜30nmに，Triton処理（＋）で30−40nmにピークが認められた．ジストログリカンとの二重染色では細胞膜を挟んで二種類のラベルが相対する像が認められた（図1）．
（3）神経筋接合部におけるインテグリンβlDの局在
モルモット長祉伸筋においてシナプス後膜のヒ夕の山の部分か谷の部分に局在するかを共焦点レーザー顕微すものと考えられた．そこで，次にプレクチンとβ−鏡により他の裏打ち蛋白の局在とともに検討した．イ
ンテグリンβlD，ジストロフィン，ターリン，ビンキ●群馬大学大学院医学系研究科器官機能構築学＝武蔵野大学薬学部機能形態学†平成14年度††平成15年度†††平成16年度

ユリン，パキシリン，bcaladhesionkinase，スぺクトリ
ンはすべて谷の部分に局在し，山と谷の両方に分布す
るβ・ジストログリカン，山の部分に局在するユートロ
フィンとは分布が異なることが明らかになった（図2）．
ー98−α，β−DystroglycanlZ−diSCS

図3 ジストロフィン筋形質膜裏打ちからデスミン中間径フィラメントへの分子連関モデル．デスミン中間径フィラメ
ントはプレクチンーβ−シネミンージストロプレビンー
ジストロフィンを介して筋形質膜にアンカーしている．
図1抗インテグリンβlDと抗ジストロダリカンの二重染色の電子顕微鏡阻5mmコロイド金（矢印）はインテグリンβlDの，10nmコロイド金はジストログリカンの局在を示す．
両者が細胞膜を隔てて相対する像が観察される．A：縦断切片，B：横断切片

プレクチンやアクチンに結合したβ一シネミンはそのN未のロッドドメインでα一ジストロブレビンに結合し，さらにα一ジストロブレビンがジストロフィンに結合していると考えられる・（2）ジストログリカン軸とインテグリン軸の連関の可能性については抗体の分子サイズ，介在する可能性のあるビンキュリンのサイズなどを考慮すると，両者は相互に分子連関を持っていても矛盾はしない．（3）神経筋接
合部のシナプス後膜の免疫染色からインチグリンはユート
ロフィンとは分子連関を持つ可能性は少ないと考えられた．
今後の展望（1）上記の中間径フィラメントージストログリカン軸の分子構築モデルをもとにデスミン欠損，ジストロフィン欠損，
α−ジストロブレビン欠損マウスでの，それぞれ連関する分子の存在有無や局在異常の解析を行うことでモデルの検討，さらに欠損による筋疾患の表現形との対応関係をはかり，分子構築の機能的役割と生理学的意義の検討を行うつもりである．（2）ジストログリカン軸とインテグリン軸の連関については形態学的証拠は得られたので，今後免疫沈降実験，プロットオーバーレイ法などを用い，生化学的に両軸の分子連関を検討するとともに，今は全くデータのな

図2 神経筋接合部の共焦点レーザー顕微鏡像．A：α−プンガ
ロトキシン（αBT）インチグリンβlD（IntβlD）の二重染色．
8：α−プンガロトキシンとユートロフィンの二重染色．
α一ブンガロトキシンとユートロフィンは局在が完全に一致し，シナプス後膜の山の部分に存在するが，インテグ
リンはα一プンガロトキシンより細胞質側に染色がみられ
後膜の谷の部分に局在することが分かる．
考いinvivoの成熟骨格筋におけるインテグリンと細胞内細胞骨格との連関を明らかにし，インテグリン軸の骨格筋において果たす役割を明らかにしてゆく予定である．
参考文献
l）HijikataT，MurakamiT；IshikawaH，YoriRtjiH：Plectin察

tethers desmin intermediate nlaments onto（l）中間径フィラメントとジストログリカン軸の分子連Subsarcolemmaldense plaques containing dystrophin

関を上記の結果からまとめると，図3のような分子構築

andvinculin．HistochemCellBio1119：109−23，2003．

モデルが提唱できる．プレクチン分子は筋形質膜下でそ

2）MizunoY，ThompsonTqGuyonJR，LidovHGBrosiusのN末でβ−シネミンのテールならびにF−アクチンに結M，lmamura M，Ozawa E，Watkins SC，Kunkel LM：

合し，反対のC末端でデスミン中間径フィラメントに結Desmuslin，anintermediateBlamentproteinthatinteract

合する．プレクチンに結合しているβ−シネミンのテー

withalpha−dystrobrevinanddesmin．ProcNatlAcadSci

ルとF−アクチン間にも弱いながらも結合能がみられる．

USA98：6156−61，2001．
ー99−

Duchemme型筋ジストロフィー筋における浸潤細胞の解析
田

日

中

子●

研究協力者 河 内泉●

的胞はCD8＋T細胞が優位であり，いずれも非壊死線維周囲への浸潤が観察された．また両者ともHLAclassIが陽DucheFlnC型筋ジストロフィー（DMD）では，生検筋組
織に多数の炎症細胞浸潤が見られる．時に非壊死線経の周囲にもCD8＋T細胞を認め，また一部の筋線経にMHC
classIの発現を認めるなど，炎症所見という側面では多発筋炎（PM）との区別は困難である．一方，DMDにおいて，副腎皮質ホルモン療法が筋力低下の進行を遅らせることが知られている．顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーやdysfbrlinopathy，その他の筋ジストロフィーでも，筋組織にリンパ球浸潤が見られ，これらの細胞の筋線維
傷害過程への関与も考えられる．筋細胞膜異常に伴い通常提示されない筋抗原が免疫応答を生じる可能性も指摘されている．このような異常な筋線経に由来する一定の抗原を認識する免疫反応であるならば，細胞障害性T細胞を抑制する治療が一時的にでも筋力低下の進行を遅らせることができる可能性がある．そこで我々はDMDの病態の一部に筋組織の傷害を早める自己免疫的機序が存在する可能性を考え，浸潤T細胞のT細胞受容体（TCR）のレパトア解析を行った．共通のアミノ酸構造を有するT細胞受容体（TCR）が01igoclonalに浸潤している
場合は，一定の抗原を認識する自己免疫機序が存在する
ことを示唆するため，DMDの病態に筋組織を積極的傷害
する自己免疫的機序が存在する可能性がある．
方法と結果
対象：HLAclassI型が同一のDMDl例，PM3例，皮膚筋炎（DM）2例の生検筋凍結標本を用いた．
方法：リンパ球表面マーカー等に対するモノクローナル
抗体（CD4，CD8，B，Macrophage，HLAclassI，ClasslI，granqme，Perfbrin）を用いて，それぞれのクリオスタッ
ト切片をABC法にて免疫組織化学染色を行った．
また，各筋組織からISOGENにてRNAを抽出しRT．PCRで作成したcDNAについて，TCRVβ鎖のプライマーを用いてTCRVβCDR3領域PCR産物を得た．クローナルに出現していると考えられたTCRVβ13．1PCR産物をサブクローン化し，インサートを含むコロニーをランダムに選択して塩基配列を決定し，その出現頻度を算出することで浸潤T細胞のクロナリティーを検討した．
結果：DMDおよびPMではいずれの筋組織でも浸潤細●新潟大学脳研究所神経内科

恵

西

澤

正

豊●

性の筋線経が散在性に認められた．DMではCD4＋T；B，Macrophageの浸潤が多数を占め，筋線経でのclassIの発現は認めなかった．
PMでは3例すべてでVβ13．1鎖を有するT細胞のCDR3領域に優位に出現するクローンが得られ，その中に特定のモチーフ構造が認められた．一方，DMDおよびDMでは特定の優位なクローンは得られなかった．
考察
PMでは浸潤リンパ球がCD8＋T細胞優位であり，筋細胞にHLAclaSSIの発現が見られることから，その傷害機序として細胞傷害性T細胞（CTL）が関与していると推察される．また浸潤細胞が特定クロナリテーを有し，そのTCR CDR3領域に特定のモチーフ構造を有することは，PM筋が，比較的一定の抗原を呈示しており，それに対してantigen−drivenにT細胞が浸潤してCTLによる筋傷害が生じていることが推察される．
DMDでは免疫組織化学的にはPMとの区別が困難で，本症の筋傷害の一部に自己免疫機序が関与している可能性が示唆されたが，浸潤細胞のTCR解析では特定の抗原を認識するT細胞がクローナルに浸潤している証
拠は得られなかった．今回は一例のみの解析であり，普遍化するにはさらなる検討が必要と考えられるが，DMDに見られるT細胞浸潤の機構はPMとは異なる可能性が示唆された．
研究の意義
DMDでは，筋組織に多数のリンパ球浸潤が見られ，
非壊死線経の周囲にも浸潤していること，筋線経にHLAclassI分子の発現がみられることから，筋傷害の一部に多発筋炎と同様の細胞傷害性T細胞が関与している可能性が考えられてきた．今回の浸潤T細胞のTCRの解析では，浸潤T細胞が特定の抗原を認識して浸潤しているとの証拠は得られなかった．しかしながら多数のリンパ球が浸潤して筋線経を包囲して見える所見はリンパ球が筋線維崩壊に積極的に関与している可能性が否定できず，細胞浸潤の意義を解明することは，
DMDの筋障害を少しでも遅延させるための治療法を考える上で重要な意義を有する．

−100−

文

献

2）ConfhIonieriIl OIiva L，Andreetta E etal．Muscle

1）Dalakas MC．Muscle biopsy findingsininnammatory

innammationandMHCclassIup−reguIationinmuscularmyopathies．Rheum Dis Clin North Am28：779−798，

dystrophywithlack dysftrlin：animmunopathological

2002．

Study．JNeuroimmunol142：130−136，2003．

一101−

mdxマウスに対する同系筋前駆細胞移植によるジストロフィン導入
三 池 輝 久●
研究協力者

池

澤

誠●

BaohongCao●

日的

これまでDuchennC型筋ジストロフィー（以下，DMD）の治療として，遺伝子導入，細胞移植，薬物治療などが試みられてきた，ウイルスベクターを用いる遺伝子
導入にはそれぞれのウイルスにより，アデノウイルス
ベクターでは免疫応答があり，レトロウイルスベクタ
ーでは感染効率が悪い．また，アデノ随伴ベクターでは導入できる遺伝子サイズが短いなど，それぞれ問題

木

村

重

美●

JohnnyHuard＋．

しかし，その陽性線維数は100本程度と低く，また筋
注後2，4週目の骨格筋においてCD4，CD8陽性リンパ球の浸潤を認めた．また，一度目の移植後2週目に対側のヒラメ筋に2度目の移植を行うと，その効率は著明に低下していた・次に移植に用いたmdxLP／Dys3999よりサブクローニングを行い，得られたサブクローンのうち
8クローン（MD3903−MD3927）を同様にmdxマウスヒ
ラメ筋に筋注し，2週後に免疫組織染色を行った．（図3）を抱えている．一方，筋芽移植も充分な効果を上げておらず，効率のよい細胞が求められている．そのひとつとしてpreplate法を用いて得られるLP細胞は筋前駆細胞として移植効率が改善することが知られている（文献1）．
われわれは今回，mdxマウスよりpreplate法により筋前駆細胞（LPcell）を単離し，約4Kbに短縮したジスト
ロフィン遺伝子をレトロウイルスベクターによって導CD34

SGal desmin
図1

入し，同系筋前駆細胞移植をこころみた（文献2）．
方法と結果
われわれはCMV−IEプロモーター下に3999bpに短縮したヒトミニジストロフィン遺伝子を挿入し，選択マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を持ったレトロ
ウイルスベクター（RetroDys3999）を作成した，また，
DMDモデルマウスである mdxマウス筋肉より
Preplate法を用いて筋前駆細胞（mdxLP）を単離し，mdx
LP培養細胞にRetroDys3999を用いてヒトミニジス
トロフィン遺伝子を安定導入した（mdxLP／Dys3999）．レトロウイルスによるヒトミニジストロフィン遺伝子導入後もmdx LP／Dys3999は幹細胞のマーカーである
CD34，Sca−1を発現し，また筋細胞のマーカーである

図2 ジストロフィン染色，B陽性線維数00−desminも発現していることが，免疫細胞染色にて確認された．（図1）

0
6
0
0
0
0
0
＄
0
▲ ▼
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■ ↓
0
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0
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0
2
一 t

mdxLP／Dys3999をmdxマウスのヒラメ筋に筋注し，
筋注後2，4，8，12，24週のヒラメ筋を組織化学的に検討した．免疫染色にて確認されたジストロフィン陽性線維数は筋注後2週目より24週目まではば安定していた．（図2）

†

− 8
一 ︼

■熊本大学医学部発達小児科■■Children

MD3903

MD39￠●

Mm905

MP3907MD3011MD3010

MD3820日．丁◆†・3u 正好○■・10日 117■〃・1IJ lO書．0岬・14．1 17．▼■・■● 】1量■・1】1轟 ●1．0●トp．0
tl■l】
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小事勾
Ih■わ
l〝qI t叫小切

sHospita10fPittsburgh

図3
−102−

MD3827■．0吋，l．ltmq】

ジストロフィン陽性線維数は347＋／−32．3から0まで，各クローン間で移植効率に著明な差が見られた．サブクローンのうちのひとつ（MD3927）では，invitroではジスト
ロフィン遺伝子の発現と，筋管細胞への分化が確認されたーン（MD3927）については，レトロウイルスベクターの遺伝子導入のポジション効果によるとおもわれるが，詳細については更なる検討が必要である．

にもかかわらず，移植部位には未分化な筋線経が多数見られ，これらはジストロフィン染色陰性であった．

今後の展望
今回の実験で充分な効率が得られなかった原因として考えられる免疫応答，細胞移植の効率についてそれぞれに考察検討を加えたい．免疫応答についてはジストロフィン蛋白

今回われわれが用いたm血LPのys3999細胞は，m血マウス由来でありながら，ジストロフィンを発現するばかり
でなく，幹細胞マーカーを発現し筋肉に分化する筋前駆細を筋芽細胞の段階でなく，充分分化した後に発現するよう
例えばMCKプロモーターなど，筋特異的に発現するプロモーターを用いることによって拒絶反応を回避できる可胞と呼べるものであった．この細胞を用いることにより安定した遺伝子導入がみられたが，その効率は期待されたよ能性がある．一方，さらに移植効率のよい細胞を得るためりも低く，充分ではなかった．その原因として，免疫応答と，移植細胞の効率が考えられた．今回の実験では，本来ウイルス蛋白を発現せず，免疫原性を持たないレトロウイ
ルスベクターををもちい，かつ同系細胞移植を行ったにもによって，より効率のよい細胞のマーカーとなるものが見かかわらず，CD4，CD8陽性リンパ球の浸潤が見られかつ反復移植にて効率の減少が見られた．免疫反応の原因については今後更なる検討が必要であるが，ジストロフィ
ン蛋白そのものが候補として考えられる．
また，サブクローン間の検討において，移植効率がク
ローンによって差があることが明らかになった．今後の細胞移植のためにはさらに移植効率のよい細胞の確立が必要であると思われた．特異な表現形を示したサブクロには今回得られたサブクローンをそれぞれ検討することつかる可能性がある．また，筋肉から得られる幹細胞だけ
でなく，embryonicstemcellを用いることも検討したい．
文献1）Qu，Z．，etalDevelopmentofapproachtoimprovecell
Survivalinmyoblasttransftrtherapy．JCellBiol142．
1257−1267，1998．
2）Ikezawa M et．al．Dystrophindelivery indystrophin−−103−

eficient DMDmdx skeletal

muscle by isogenic

muscle−derivedstemcelltransplantation．HumGeneTher
16．153546，2003．

Syntrophin，aquaPOrinの骨格筋における発現と局在の研究
若 山 吉 弘●

●

ヂ灯

宏弘

嶋木

小鬼
●

●

俊

訝．一ぎ

昌

谷

●

●
●

上

●

井原熊

●

二弘正

誠隆純

谷見下

溢白山

研究協力者

はじめに

表面を連続的に染色した．超微局在としてはγ2●SYTの

我々は骨格筋細胞膜異常による筋疾患を中心に研究し信号は骨格筋細胞膜の内面に沿って局在していた．抗γ
2−SYT抗体を用いた正常骨格筋抽出液のイムノブロット
では約60kDaの分子量の蛋白を一本のバンドで認識した．

ているが，平成14年から16年に本研究委託費の支援で実施した主要な研究の概要を報告する．
1）Syntrophinの正常骨格筋における発現と局在の検討とDuchenne型，福山型筋ジストロフィー症生検筋における
発現の変化
日

的

Syntrophinはdystrophinassociatedglycoproteinの細胞内成分の一つで筋細胞膜の内面に存在する．このSyntrOphinには今までのところα1−，β1−，β2＿，Tl＿，γ2−のisofbmが同定されている．このうちγ1−は中枢神経系に分布し，残りは骨格筋細胞膜に発現しているとされている・本研究ではγ2−SyntrOPhin（γ2−SYT）の超微局
在と，α1−SyntrOPhin（al−SYT）のDuchenne筋ジストロフ
ィー症（DMD）と福山型筋ジストロフィー症（FCMD）での発現の変化につき検討した．

抗β−SPC抗体は正常骨格筋線経の表面膜を連続的に染色したが，DMD，FCMD筋では部分染色，陰性染色の筋線経が散在し，抗α1−SYT抗体ではこれら疾患筋では抗β−SPC抗体より更に多くの部分染色線経や，陰性染色線経がみられた．DMD筋ではα1−SYT陽性線経が部分発
現線経を含め55％あり，FCMD筋ではα1＿SYT陰性線経が46％みられた．
考察と今後の展望
72−SYTの正常骨格筋での発現と局在に関する研究は少なく，γ2−SYTについてはその発現を確認出来なかった報告もあり，正常・病的筋での発現の更なる検討を要

方法と結果する．DMD筋，FCMD筋における抗β＿SPC抗体染色陰性筋線経では何らかの原因により筋細胞膜が欠損していることが考えられる．しかし抗β−SPC抗体染色陽性でかつ抗αトSYT抗体染色陰性筋線経では筋細胞膜でのα【抗体】抗α1−SYT抗体・抗72−SYT抗体，抗β一SPeCtrin（β，SPC）抗体ともに我々の教室で作製した．抗α1＿SYT

1−SYTの発現が陰性と考えられる．α1−SYTの発現に関してはDMD筋で半数以上の筋線経で発現していたのは抗体は既報1）のように作製した・抗γ2−SYT抗体はNigro
ら2）の報告した7・2−SYTのアミノ酸配列からC端のアミ

予想外であり，dystrophinが欠損しているにもかかわらずα1−SYTが発現しているということはこのα1．SYT分

ノ酸14残基MDSQSLARKYMYSSを合成しこのペプチドのN端にcysteineをハブテンとして付加し抗原とし，ウサギに免疫して作製した．イムノブロットは正常骨格筋の抽出液を対象にウサギ抗72−SYT抗体について実施

子がどのような筋細胞膜分子と結合しているのか不明である．今後この点を解明するとともに，FCMD筋ではdystrophinが陽性であるにもかかわらず約半数の筋線経でα1−SYTの発現が陰性であった原因は何かを研究したした．【筋組織】72−SYTの超微局在の研究には組織化学的に正常な生検筋6例を用いた．α1−SYTのDMD，FCMD筋における発現の検討にはDMD5例，FCMD5例，疾患い・更にβ1−，β2−，72−SYTの筋ジス筋での発現の解析も今後の課題である．

対照として筋緊張型ジストロフィー症3例と顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー症2例の合計5例，正常対照5例の大腿四頭筋生検筋を用いた．【抗体標識方法】免疫光顕2）Aquaporin（AQP）の正常骨格筋における発現と局在，AqP4のFCMD筋における発現の検討

標本は間接蛍光抗体法，免疫電顕標本はイムノゴールド
法にて標識した．【結果】抗γ2−SYT抗体は正常骨格筋の■昭和大学藤が丘病院神経内科＝昭和大学藤が丘病院電顕室…神奈J】にとも医療センター神経内科…●愛知県コロニー中央病院小児神経科

日的AqP分子は現在10個以上が同定されている．このう
ち骨格筋にはAqP4が発現していることは確立されているのでFCMD筋（DMD筋は検討済み）での発現を検討した．更に他のAqP分子の発現が正常骨格筋にあるかど
うか，あればその局在を検討した．

−104−

方法と結果とがあり，筋疾患以外でも生活習慣病や脂質代謝にも【方法】組織化学的に正常な6例のヒト生検筋を対象に

AqPは関与しているので，今後まず筋疾患を手始めにそのAQpの関与がどのようなものであるのかにつき研究を進めていきたい．

AQp分子の検索を実施した．またFCMD6例と正常対照
6例の大腿四頭筋を対象にFCMD筋のAqP4分子の発現をRNAレベル（競合的RTPCR法），蛋白レベル（イムノブロット，免疫組織化学）で検討した．【結果】骨格筋
におけるAqPの発現は現在までにAqPl，3，4，7で認められた．新しく発現があることが発見されたAqP33），
74）の局在は両者とも筋禄維表面であり，AqP3はけpe1
線経，AqP7はけpe2線維により強く発現していた（図1）．
FCMD筋ではAQP4のmRNAは著減し，蛋白レベルでも発現は減少，免疫組織化学的にも多くの筋線経で部分発現や発現がみられなかった（図2）．

図2 ヒト正常骨格筋の抗aquaporin（Aqp）7抗体の免疫染色所
見．（A）各々の筋線経の表面が免疫染色され筋線経の内部には免疫反応は見られない．（B）AqP7の合成ペプチドの過剰量とあらかじめ反応させた抗AQP7抗体液では免
疫反応はみられない．（D）抗AqP4抗体での免疫染色標本
はタイプ1線経は＊印の線経のように筋線経の表面が淡く染色されるが，（C）の抗A（）P7抗休による連続切片の染色では＊印のタイプ1筋線経もその他のタイプ2節線経と同様に筋線維表面が濃く染色される．（A＿D：×330：scale
b訂SatA−D＝50〟m）

文

図1正常骨格筋（A−C）と福山型先天性筋ジストロフィー症（FCMD）（D・F）の免疫組織化学所見．A，Dは抗aquaporin（AQP4）抗体，B，Eは抗β−dystrophin抗体，C，Fは抗β−SpeCtrin抗体染色所見 正常筋組織ではこれら抗体で筋線維表面に連続性の免疫反応がみられる．fCMD筋では抗dystrophin抗体（E）と抗β一SpeCtrin抗体げ）染色では各筋線誰表面に陽性染色所見が認められるが，抗AqP4抗体
染色では著明な染色性の低下がみられ かなりの筋線維
表面が陰性染色で残りの筋緑維表面もpatchyな染色性を示す．（んF：×350）

献l）WakayamaY，InoueM，MurahashiM，ShibuyaS，JimiT；
Kqjima H，OnikiH：UltrastruCturallocalization ofα
1−SyntrOPhinandneuronalnitriCoxidesynthaseinnomal
Skeletalmyonber，andtheirrelationtoeachotherandto
dystrophin．ActaNeuropath0194：455−464，1997．
2）WhkayamaY，JimiT，InoueM，KqjimaH，YmashitaS，
KumagaiT，MurahashiM，HaraH，ShibuyaS：Alteredaquaporin4expressioninmuscles of Fukuyama−type

考察と今後の展望

COngenital muscular dystrophy．Virchows Arch

水分子は生体活動において必須の分子であり，骨格筋
は生体では最大の臓器であることを考えるとA（〕P分子は骨格筋において重要な役割を果たしていると考えられ

761−767，2003．

3）Wakayama Y；JimiT，Inoue M，Kqjima H，Shibuya S，MurahashiM，HaraH，OnikiH：Expressionofaquaporin

る．特にAqP4分子は水特異的チャネルであり，水分子の通過が非常に速いといわれているので骨格筋細胞内外への水分子の急速な移動に対応しているものと考えられ

443：

3

anditslocalizationin normal skeletal myonbres．

HistochemJ34：331−337，2002．
4）WakayamaY，InoueM，KqjimaH，JimiT；ShibuyaS，Hara

る．AqP分子はAqPl，AqP4など水特異的チャネルと水分子以外グリセロール，尿素など非イオン性小分子をH，OnikiH：Expressionandlocalizationofaquaporin7in

通すAqP3，AqP7，A（〕P9などの水グリセリンチャネル

2004．

normalskeletalmyonber，CellTissueRes316：123−129，

ー105−

Aquaporin4過剰発現トランスジェニックマウスの作製とmdxマウスの治療
若 山 吉 弘●
●
●

●
●

●
●

●

●

●

●
●

●

清輝

●
●

●
●

⁝

田水

●

●
●

子一二夫

宏

嶋

●

博

●
●

●
●
●

小原塩清

●

●
●

二弘悟子

丈隆

●

橋見田井

高自荒大

●

二彦明秀

誠昌弘芳

目

谷上木田

溢井鬼砂

研究協力者

蛋白レベルの解析のため，イムノブロット法，免疫組織化学法およびF−Fレプリカ法で検討した．イムノプ

的

我々はDuchennC型筋ジストロフィー症PMD）やその動物モデルである m血 マウス骨格筋細胞膜のロット法ではTgマウスとwildマウスのsoleus筋からの抽出液を抗A（〕P4抗体で染色した．また免疫組織学的Freeze−Fmchre（F一円レプリカ電顕標本の解析において，
orthogo血my（OA）という非常に明瞭な膜内粒子の集合体が著滅していることを以前に見出しているlJ）．近年，
この微細構造物は水チャネルの1つであるaquaporin4（AqP4）からなることが判明している3）．筋症状の軽いmdxマウスに比べて，臨床症状の重いDMDの筋細胞膜中のOAの方がより顕著に減少している事実や，より若いマウスではOAが非常に多いということからも，OAは骨格筋において重要な役割をしていると考えられる．

には抗AQP4抗体と抗Slowmyosin抗体を用いて，AQP4
過剰発現Tgマウスとwildマウスのsoleus筋の連続凍結切片による免疫組織標本を作製し検討した．またF＿F
レプリカ法では各々5匹ずつのAqP4過剰発現Tgマウスとwildマウスのsoleus筋を摘出し，￣2．5％グルタール
アルデヒドリン酸緩衝液で固定した後，F＿F法で筋細胞

今回，AqP4遺伝子をm血マウスに導入して治療の試み

膜レプリカ電顕標本を作製した．筋細胞膜電疏写真を無作為に撮影し，1匹のマウスにつき，異なる20本の筋線経の最終倍率16万倍の筋細胞膜電顕写真（10Pをするという目標の前段階として，AqP4を過剰発現させたトランスジェニック甘めマウスを作製したので，現在までに得られているこのTgマウスの特性について報告する．

面および10E面）中にみられるOA密度をsingleblind法で算出し，両群マウスで統計的（T検定）に比較検討
した．

方法と結果

結

【方法】caveolin3／MCKgenecassette（川崎医科大学砂田教授，帝京大学医学部大井博士・清水教授より供与）
をbackboneとして利用し，そのMCKpromotorおよびCaVeOlin3をdigestした上で，903bpマウスAQP4cDNA（Ⅶrkman教授より供与）とMCKpromotorをligationすることでAQP4／MCKgenecassetteを作製した．このgene
CaSSetteを遺伝子導入法により正常マウス（C57BL／6J）胚細胞へ導入し，正常マウス子宮へ移植することにより

果（1）ヘテロ同士を交配させ，繁殖し生まれたAqP4過剰発現Tgマウスの外観はwildマウスと大きく変わらず，
行動，活発性も現在までの限られた匹数の観察では大きな差がないようにみえた．（2）realtimeRTIPCR法において，housekeepinggeneG3PDHのmRNAのcopy数で補正したsoleus筋AQP4mRNA量は，wildマウス群（n＝5）
で0．133±0．076（Mean±SD）で，AQP4過剰発現Tgマウ

AqP4過剰発現Tgマウスを作製した．
mAレベルでの解析のため，各々5匹ずつのAqP4過ス群（n＝5）では1．560士0．978であり，A（〕P4Tgマウス群

剰発現Tgマウスおよびwi1dマウスのsoleus筋を摘出し，totalRNAを抽出後，realtimeRIIPCRを施行した．得ら

AQP4抗体と抗Slowmyosin抗体によるsoleus筋の連続れたAQP4mRNA量は，同時に施行したhousekeeping
geneとしてG3PDHgeneのmRNAを定量し，そのcopy数で補正した上で両群マウスで比較検討した．

おいて，通常AqP4発現の乏しいタイプ1筋線経にも●昭和大学藤が丘病院神経内科…昭和大学藤が丘病院電顕皇●●●昭和大学組換えDNA実験室…●昭和大学第1解剖学教主…＝川崎医科大学神経内科……帝京大学神経内科

値1．07（25％〜75％Midrange値0〜2．69）に対して，AQP4

で著明に増加していた（p＜0．02，T検定）（図1）．（3）抗切片の免疫染色標本では，AqP4過剰発現Tgマウスに
AqP4の過剰発現がみられた．（4）F−F法において，Wild
マウス群（n＝5）のsoleus筋OA密度（／LLm2）はMedian
過剰発現Tgマウス群（n＝5）では8．17（1．60〜20．36）であり，
AQP4過剰発現Tgマウス群でOA密度は明らかに増加していた（p＜0．0001，ノンパラメトリック検定）（図2）．

−106−

考察と今後の展望
AQP4過剰発現Tgマウスの作製を試み，従来，Wild
マウスではOAの発現の少ないsoleus筋でAQP4mRNA

AQP4の合成冗進と蛋白量の増加，筋表面膜におけるAQP4の過剰発現，分子レベルでのOA密度増加を確認できた．
Soleus筋は多数のけpe1線経から構成されOAを多く含むサpe2線経が主体のEDL筋とは生理的な働きを異にする．今後soleus筋だけでなく，EDL筋や心筋などでも同様な検討をしていきたい．一般臨床像ではwildマウス

G3PDHと比較して明らかな違いはみられなかったが，同様に一見運動能に差が見られないmdxマウスと正常対照マウスの間でもcomputerizedwheelを使えば明瞭な運動能の

講

賓呈手塩

説

甚班混葦嵩

↓
−
︷
■
⁚
ト

∴㍉∵∴二

や二雪辱㍉㍉㍉∴∵∴∵

図1ReaItimeRTPCR法によるaquapodn（AqP）4トランスジェニックマウス（T）とwi1dマウス（W）のsoleus筋のAQP4mRNA量．上段はAQP4mRNAのRJIPCR所見で，下段はhousekeepinggeneであるgLyceraldehyde−3−Phosphate
dehydrogcnase（G3PDH）geneのmRNAのRIIPCR所見である・Wildマウスに比べてAqP4トランスジェニック（AQP4Tg）マウスのmRNA量が明らかに多い．また
AqP4TgマウスではAqp4のバンドの濃さにかなりの個体によるばらつきがみられる．

差が見られる4）ことからこの方法を用いてTgマウスとwildマウスとの運動能の差を今後検討していきたい．またrealtimeRトPCR法で行ったAQP4mRNA量の検討において，AQP4過剰発現Tgマウスでそのcopy数はほとんどのTgマウスでwildマウスより増加していたが，Tg
マウス間でAqP4mRNA量に大きなばらつきが見られたことから，今後TgマウスのAQP4mRNAcopy数と臨床症状の相関を考えながら，より定量的にTgマウスの活動能力をcomputerizedwheelなどを使って詳細に調べていきたい．最終的にOAが著減しているm血マウス骨格筋にAql）4遺伝子を導入してその活動能力の変化等を検討していきたい．
文

献l）Wakayama Y，Okayasu H，Shibuya S，Kumagai T：
Duchennedystrophy：Reduceddensityoforthogonalarray
Submit particlesin the muscle plasma membrane．
Neurolo訂（Clevea肌d）34：1313−1317，1984．
2）Shibuya S，Wakayama Y：Freeze一打acture studies ofmyo茄ber plasma membranein X chromosome−1inked

muscular dystrophy（mdx）mice・Acta Neuropathol
Perl）76：179−184，1988．
3）RashJE，YasumuraT，Hudson CS，Agre P，Nielsen S：
Directimmunogoldlabeling ofaquaporin−4in square
arraysofastrocyteandependymocyteplasmamembranes
inratbrainandspinalcord．ProcNatlAcadSciUSA

95：1198日1986，1998．
4）HaraH，NolanPM，ScottMO，BucanM，WakayamaY，
図2 Freeze−FmctuTe法により作製したsoleus筋の筋細胞膜p面（A，C）およびE面（B，D）レプリカ電顕写真でA，Bはwildマウス，C，DはAQP4Tgマウスのものである．
AqP4Tgマウスでは著明な0仙ogonala汀町Sおよびそのpitsの増加がみられる（矢印）．（A−D：×160，000）−107−

Fischbeck K：Running endurance abnormalityin mdx
mice．MuscleNerve25：207−211，2002．

ジストロフィン遺伝子のスプライシング制御機序の解明とその治療への応用
松 尾 雅 文●研究協力者 竹 島 泰 弘● 八 木 麻理子●日的たアンチセンスオリゴヌクレオチドのmA佗NAキメラ

ジストロフィン遺伝子のエクソンのスキッビングを誘を合成した．RNA佗NAキメラは，お互いにオーバーラ

導するDuchenne型筋ジストロフィー（DMD）の治療が注目されている．私達は，ジストロフィン遺伝子のエクソップする3種のものを合成した．そして，それぞれのン19のスプライシング促進配列を解明し，スプライシ
ング促進配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることによりエクソン19のスキッビングを誘導することに世界で初めて成功した．これまで，このエク
ソン19のスキッビングを誘導する方法の臨床応用もはかってきた．
一方ジストロフィン遺伝子には79ものエクソンがあり，またDMD患者の有するエクソンの欠失形式も多様である．そのため，それぞれのエクソンの欠失異常に対応したエクソンのスキッビングを誘導するアンチセンス
オリゴヌクレオチドの同定が必要となっている．
本研究では，ジストロフィン遺伝子のエクソン内のス
プライシング促進配列の解明，スプライシング促進配列のスプライシング制御に関与する核タンパクの役割，エクソンスキッビングを誘導するアンチセンスオリゴヌク
レオチドの開発等を実施してきた．ここでは，エクソン41のスキッビングを誘導するアンチセンスオリゴヌク
レオチドの同定と，アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたDMD患者由来筋細胞でのジストロフィン発現について検討し，ジストロフィンの発現に成功した結果を報告する．

MA佗NAキメラを筋細胞に導入し，ジストロフィン
mRNAの解析をRTPCR法を用いて行い，エクソン41
スキッビング誘導能について解析した．
ジストロフィン発現誘導能の解析
エクソン41にナンセンス変異を持つ患者から筋細胞株を樹立した．この例では，エクソン41のスキッビン
グを誘導することにより，ジストロフィンmRNAから
ナンセンス変異が消失し，183塩基の欠失した新しいインフレームのジストロフィンmRNAが産生される．そして，この新たなmRNAからジストロフィンの産生が期待される．このことを検証するため，合成した
RNA佗NAキメラを樹立した培養筋細胞に導入した．ジストロフィンmRNAをRTPCR法で解析するとともに，ジストロフィンの発現の有無を培養細胞をジストロフィン染色することにより検討した．
結果

ジストロフィン遺伝子のエクソン41のスプライシン
グ促進配列に相補的なMA佗NAキメラを3種合成し，それぞれを筋細胞に導入した．導入した筋細胞でジスト
ロフィンmRNAを解析したとろ，エクソン41のスキッ

方法と結果

ビングはRNA佗NAキメラのCを導入した筋細胞で最も強く誘導された．この結果は，この領域が予想通りス

スプライシング促進配列の解明
DMD患者の1例でジストロフィン遺伝子のエクソン41内の1塩基の置換のためにナンセンス変異となった

プライシング促進配列であることを示すとともに，
RNAJENAキメラCが強力なエクソンとスキッビング誘症例を見出した．この症例のジストロフィンmRNAを解析したところ，エクソン41のスキップしたmRNAが産生されていることが判明した．
この結果は，この1塩基置換により，スプライシング
促進配列の機能が破綻したことを示唆し，この領域がス
プライシング促進配列である可能性を強く示唆した．
アンチセンスオリゴヌクレオチドの作成
エクソン41の1塩基置換が発見された敵城がスプライシング促進配列と考えられたので，この領域を標的とし●神戸大学大学院医学系研究科小児科

導能を有するものと確認した．
そこでジストロフィン遺伝子のエクソン41にナンセ
ンス変異を有する患者由来の筋細胞にRNA佗NAキメラCを導入した．導入した筋細胞においてジストロフィン
mRNAを解析したところエクソン41の配列が消失しているmRNAが一部で産生されていることが確認され，患者筋細胞でもエクソン41のスキッビングを誘導することに成功した．この結果はRNA佗NAキメラ導入細胞でジストロフィンが発現することを強く示した．そこで，導入細胞のジストロフィン染色を行うと，ジストロフィ
ン陽性細胞が90％近くで認められた．

ー108−

考

察

MatsuoM．HeterogousdystrophinmRNAsproducedbya

ジストロフィン遺伝子のエクソン41にナンセンス

novel splice acceptor site mutationinintermadiate

変異をもつDMD患者由来筋細胞でのジストロフィン

dystrophinopathy．Ped．Res．53；1−7，2003．

発現に成功した．この結果は，mRNAのアミノ酸読み7）Rohman MS，Emoto N，Takeshima Y，Yokoyama M，取り枠を修正する治療法が有効なことを改めて示すもMatsuoM．DecreasedmAKAnryanodinereceptor，andのである．

SERCA2a gene expression

今後さらに他のエクソンを対象として強力にエクソン

inmdx hearts．Biochem

BiophysResCommun．310；228−235，2003．

スキッビングを誘導するRNA佗NAキメラの同定を推進

8）NakayamaY；NaraN，KawakitaY，ThkeshimaY；Arakawa

し，すべての欠失変異を有するDMD患者の治療が可能

M，KatohM，MoritaS，IwatsukiK，TbnakaK，Okamotoとなる様にする予定である．

S，KitamuraT，SekiN，MatsudaR，MatsuoM，SaitoK，Hara rII Cloning ofcDNA Encoding a Regeneration−

文

献associated Muscle Protease Whose Expressionis
Attenuatedin Cell Lines Derived

1）Suminaga，R，Tbkeshima，TI Adachi，K，Yagi，M，Nakamura，H，Matsuo，M．Anovelcrypticexoninintron

Muscular Dystrophy Patients．AmericanJoumal

3 0f the dystrophin gene wasincorporated intodystrophinmRNAwithasinglenucleotide deletionin

丘om DuchenneofPathology．164；1773−1782，2004．
9）1ねgiM，1bkeshimaY；SAgus，ThkagiM，KoizumiM，

exon5．JHumGenet．47；196−201，2002．

Matsuo M．Chimeric RNA and2

−0，4㌧C−ethylene−

2）Sait0−0haraFJHukudaYiItoM，AgarwalaKL，Hayashi

bridged nucleic acids have stronger activity than

M，Matsuo M，ImotoI，1bmakawaK，InazawaJ．The

phosphorothioateoligodeoxynucleotidesininductionof

Xp22inversionbreakpointinterruPtedanovelras−likeexon−19

GTPase genein a DMD patientin profound mental

Oligonucleotides．14；33−40，2004．

retardation．Am．J．Hum．Genet．71；637−645，2002．

skipping

indystrophin mRNA．

10）SuronoA，KhanhTViTbkeshimaYiWadaH，YagiM，

3）LaiP−S，TbkeshimaY；AdachiK，VanTmnK，NugyenH．

TbkagiM，Koizumi

M，Matsuo M，Chimeric

TLowP−SMatsuoM．Comparativestudyondeletions

RNA／ethylenebridgednucleicacidspromotedystrophin

Ofthe dystrophin geneinthreeAsianPOPulations．J．

expressioninmyocytesofDuchennemusculardystrophy

Hum．Genet．47；552−555，2002．

byinducingskippingofthenonsense−mutation−enCOdingexon．HumGeneTher．15；749−757，2004．

4）YagiM，「hkeshimaYiWadaH，NakamuraH，MatsuoM．
Two alternative exons can result舟om activation ofthe11）SuminagaR，TbkeshimaYiWadaH，YagiM，MatsuoM，CryPticspliceacceptorsitedeepwithinintron20fthe

C−terminalTrunCatedDystrophinIdentinedin Skeletal

dystrophingeneinapatientwithasyetasymptomatic

MuscleofanAsymptomaticBoywithaNovelNonsense

dystrophinopathy．Hum．Genet．112；164−170，2003．

Mutation ofthe Dystrophin Gene．Pediatric Research．
56；739−743，2004．

5）ItoT∵hkeshimaYiYagiM，KameiS，WadaH，Matsuo
M，AnalysisofdystrophinmRNA丘omskeletalmuscle

12）ThkagiM，「ねgiM，IshibashiK，1払keshimaYiSuronoA，butnot什omlymphocytesledtoidenti抗Cationofanovel

MatsuoM，KoizumiM，Designof2，−0−MeRNAJENATM

nonsense mutationina carrier ofDuchenne muscular

Chimera oligonucleotides toinduce exon skippingln
dystrophinpre−mRNA．NucleicAcidsSymposiumSeries．

dystrophy．J．Neurol．250；581−587，2003．
6）AdachiK，TbkeshimaY；WadaH，YagiYiNakamuraH，−109−

48；297−298，2004．

ヘルパーウイルス依存型アデノウイルスベクターによる骨格筋へのジストロフィン遺伝子導入効率と治療効果
内

貯ど

徹寿

本馬

阪有

ルス依存型アデノウイルスベクター（以下HDAd）は免疫原性が低く，クローニングキャパシティーが十分にあり，
全長dystrophincDNAが導入可能であるという利点を持ざ甘し，dystrophin遺伝子の異常に起因するX染色体劣性の迫伝性筋疾患である．現在，臨床応用されている有効な治療法はなく，その開発が待たれている．ヘルパーウイ

達Duchenne型筋ジストロフィー（以下DMD）は，全身の骨格筋および心筋に生じる進行性の壊死，変性を特徴と

田出

的

誠●

前小

ゴア打

友亮

田本村

日

内杉木

研究協力者

野

して，dystrophinが導入されていない筋線経の中には，ジストロフィー筋線経でみられるパターンと同じように中心核を持つ筋線経が多く存在していた．さらにはdystrophin陽性筋線経がほとんど含まれていない缶域では壊死，再生，炎症細胞浸潤などの明らかなジストロフ
ィー変化を示していたのに対して，dystrophin陽性筋線
経が多く含まれる領域ではそのような変化は認められなかった．
さらに，HDAdCAR−dysを成熟期に繰り返し注入した

つものの，成熟骨格筋でのむS廿Ophinの高率かつ長期にわたる発現はこれまで困難とされてきた．その主因のひ筋で，一回注入した筋に比べて，dystrophin陽性の筋線
維数が9倍増加し，24週齢時点で前脛骨筋全体の19％

とつは，アデノウイルス（以下Ad）の感染に重要な役割を果たしているアタッチメントレセプターであるの筋線経にdystrophinの発現が認められた．また，それに伴いdystrophin結合蛋白の発現も回復していた．
HDAdLacZ−dysを反復注入した筋では，このような増加◆

COXSaCkieviruSandadenoviruSreSePtOr（以下CAR）の発現が成熟骨格筋においては著しく低いことにある．我々はDMDの根本的治療法の開発を目指し，骨格筋でのdystrophinの発現を長期間維持し，それにより治療効果をもたらすことを目的として以下のような研究を行った．

はみられず，HDAdCAR−dysとHDAdLacZ−dysが注入された筋で惹起された細胞性免疫には明らかな違いは認められなかった．
考方法と結果
我々は，HDAdのクローニングキャパシティーの大きさを活用し，全長dystrophin発現カセットおよびHDAdの増幅時にマーカーとして使用するLacZ発現カセットをもつHDAdLacZ−dysと，全長dystrophin発現カセットとCAR発現カセットをもつHDAdCAR−dysの2種類のHDAdを作製した．この二つのHDAdを用いてmdxマウスの前脛骨筋にdystrophinを導入し，その導入効率や発現期間，病理変化の改善度などを検討した．さらにHDAdを成熟筋に繰り返し注入して，繰り返し注入時の郎strophin遺伝子の導入効率およびこれまで不可能とされてきたアデノウイルスベクター（以下Adv）の反復投与の有効性についても検討した．
はじめに，HDAdLacZ−dysを幼若期に注入した筋において，dystrophinが正常骨格筋と同様に筋線維膜に一致して高率に発現することを確認した．ほとんど全ての

上述のようにHDAdを用いて導入されたdystrophinの発現が持続することによってm血マウスの筋病理所見が改善することが確認された．これは，導入された
dystrophinにようて筋が壊死一再生のサイクルに入ることが効果的に妨げられ それによって炎症細胞浸潤などの二次的な変化も抑えられたものと考えられた．さらに成熟筋においては，HDAdCAR−dysを注入された筋のみで反復注入後のdystrophin陽性筋線総数が明らかに増加しており，HDAdCAR−dys繰り返し注入時のHDAdの感染効率ひいてはdystrophin遺伝子の導入効率が改善したものと考えられた．またこの結果から，ある特定のアデノウイルスの血清型に対して既に感作されている宿主に対しても，それと同型由来のAdvの投与が可能であることが示唆された．以上の結果は，DMDに対する新しい遺伝子治療法を提示しており，他の遺伝性筋疾患に対する迫伝子治療にも応用できる可能性があると考えられた．

dystrophin陽性筋線経では，正常の筋線経でみられるパターンと同じように核は辺縁に位置していた．それに対●熊本大学大学院 医学薬学研究部 神経内科学分野

察

研究の意義
HDAdを用いた全長dystrophin遺伝子導入により，mdxマウスの筋病理所見に改善効果が認められた．さ

−110−

−

｝．1

●．0

0．7t．0

3．才

川

2．2

■

さa鵬I

■

と考えられる．

■u湖山加これらの結果はDMDの根本的治療の実現に寄与する

崇撃昔慈

HOAdCAR・dy●

なり，効率的なdystrophin遺伝子導入が達成された．

■

することで成熟骨格筋へのHDAdの反復投与が可能と

■

●

M

らにアデノウイルスノのレセプターであるCARを利用

文献1）En Kimura，Y由ushi Maeda，Tbshiyuki Arima，et al．
Efncientrepetitivegenedeliverytoskeletalmuscleuslng
recombinant adenoviruS VeCtOr COntaining theCoxsackieviruSandadenoviruSreCePtOrCDNA．GeneTher
8：20−27，2001．
2）YasushiMaeda，EnKimura，YitjiUchida，etal．Cre／loxP−
mediated adenovirus type5packaging signal excisiondemonstratesthat core elementVIis sumcientforviruS
packaging．Virology309：330−338，2003．
3）YitjiUchida，1bsushiMaeda，EnKimura，etal．E飴ctive
repetitivedystrophingenetransferintoskeletalmuscleof
adult mdxmice uslng a helper−dependent adenoviruS
VeCtOr eXpreSSlng the coxsackieviruSand adenoviruS

receptor（CAR）and dystrophin．TheJournalof Gene
Medicine，lnPreSS

図2 HDAdCAR−dysの構造とdystrophinおよびCARの発現（a）ITR，アデノウイルスのinverted teminalrepeat；ゆ，パッケ
ージング・シグナル；PA，SV40polyadenylationsignal；dystrophin，
マウス全長dystrophincDNA；CAG，CAGプロモータ；Stu晩r，マウスEmx2遺伝子の一部（SwaI−SpeIフラグメント（10kb））；
RSVi RSV プロモーター；CAR，ヒト coxsackieviruS a．ld
adenovirus receptor cDNA．HDAdCAR−dys の構造図の下にBamHIで切断される部位と切断によるDNAフラグメントのサイズを示した．
（b）IDAdCAR−dysの構造解析・プラスミドppN10−CAR−
mFLdys（左側のレーン）と精製後のウイルスHDAdCAR−dys（右側のレーン）から回収したDNAをBamHIで切断し，アガロースゲルに泳動することで分離した・フラグメントは（a）に示された期待されたフラグメントと一致した．DNAのサイズ（kb）はゲルの左側に示した・dystrophinの免疫染色とX一gal
染色をそれぞれ（C）と（d）に示した．dystrophin（C）とCAR（d）の発現がHDAdCAR−dysを成熟期に注入して2週後の筋の筋線経に認められた．スケールバー，50匹m．

︵事︶一■一一︐竜一u一昔■●り図1dystrophin導入による筋病理所見の改善
HDAdLacZ−dysを幼若期に注入して8過後の筋の連続凍結切片のdystrophin免疫染色（a），X−gal染色（b），H＆E．染色（C）．（C）のblackboxとwhiteboxの領域を拡大し，それぞれ（d）と（e）に示
した・スケールバー，50LLm．（f）dystrophin陽性筋線経とdystrophin陰性筋線経での中心核線経の割合を検討した．・はdystrophin陰性筋線経でのデータと比較して著明な差があることを示した．

図3 HDAd反復注入後のdystrophin免疫染色
反復注入実験では柑匹のmdxマウスを使用した．それぞれのマウスの前脛骨筋にHAD d LacZ−dys（a，b，C）もしくは
HDAdCAR−dys（d，e，f）を注入した・一回注入群は8週齢時に（a，d），二回注入群は8週齢時および12週齢時に（b，e），三回注入群は8適齢時，12週齢時および16適齢時に（C，りそれぞれのHDAdを注入した．いずれの群のマウス数も3匹であり，最終注入から8週後に評価した．スケールバー，50〝m．

ー111−

Read−Through活性物質を検索するためのダブル・レポーター遺伝子を導入したトランスジェニックマウスの開発
松

田

良

一

研究協力者 嶋 田 健 一● 塩 塚 政 孝● ァレックスマッケレル●●

はじめに定し，局在を活性染色にて検討した．トランス遺伝子を有するC2C12細胞は蛍光基質を用い，蛍光セルソータ一にデュシェンヌ型筋ジストロフィーPMD）発症例の5−15％はジストロフィン遺伝子上に起きたナンセンス突て分取後，クローニングをおこない，これを2回繰り返して導入細胞を増殖させてた．

然変異によるものといわれている．もし，生じたprematureterminationcodon（PTC）を薬剤等で読み越え（read−through）
させ，ジストロフィン全長たんばく質を合成させることができれば治療手段として有効である．この戦略は，米国ではユダヤ系人種に多いナンセンス型の嚢胞性絨維症の治

また，トランスジェニックマウスの骨格筋細胞を初代培養するため，大腿筋にマーケインを注射し，その3日後に筋細胞を採取，20％胎児牛血清，4％ウルトローザー（和光）を含むダルベッコ改変イーグルMEM培養液を用い，ゲラチンコート培養皿にて培養した．その培養液療方法として有望視され アミノグリコシド系抗生物質，
特にゲンタマイシンを用いて研究が進み，今や臨床への応用が試みられている．さらに，ゲンタマイシンの毒性を回中にゲンタマイシン，ネガマイシン，アミカシン，スト
レプトマイシンを最終濃度300ug／ml加えて，細胞をさらに2日間培養し，細胞ホモジェネートのβ−ガラクトシ
ターゼおよびルシフェラーゼ活性を測定し，その活性の避するため，様々な化学物質からread一山ough活性をもつ物質の検索が進んでいる．
我々は，ゲンタマイシンと同様にread−tkough活性を有し，ゲンタマイシンとは全く構造を異にするジペプチ
ド系抗生物質ネガマイシンに注目し，mdxマウスへの投与効果を検討してきた．その結果，投与されたmdxマウスの骨格筋と心筋においてジストロフィンの発現を認めた．しかし，そのread−through効果の検定に微量筋たんばく質であるジストロフィンを指標にすることは，検出感度等の問題から容易ではない．そこで，read−through活性を検出する新たな検出系の構築を目的として研究をおこなった．さらに，ネガマイシン分子の立体構造に類似した分子をメリーランド大学薬学部A．マッケレル教
授グループが開発した立体構造データバンク中からコン
ピュータ検察した．
材料と方法
β−ガラクトシダーゼ遺伝子とルシフェラーゼ遺伝子を繋ぎ，その2遺伝子の連結部位にm血マウス由来のPTC

相対比をもってread−through活性とした．さらに，ネガ
マイシン分子の立体構造に類似した分子をメリーランド
大学薬学部A．マッケレル教授グループが開発した立体構造データバンクに登録された105万分子種の中からコンピュータ検察した．
結果と考察
1）トランスジェニックマウスの作出
TGAをもつdual−rePOrtergeneを発現するトランスゲ
ニックマウスの作出に成功した．トランスジェニックマ
ウス体内では，脳，心臓，骨格筋，膵臓，肝臓，腎臓，
小腸，牌臓について凍結切片および組織ホモジェナート
におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を検討したところ，
骨格筋，心筋および大脳において高い活性が検出された．
このトランスジェニックマウスの骨格筋初代培養細胞においてもβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現が確認された．TAAトランスジェニックマウスでは，生体組織にお周辺配列にTAA，TGA，TAGの3種類を別々に含む配列を挿入し，β−アクチンプロモーターで制御されるように設けるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現は認められなかった．TAGマウスについては現在，検討中である．

計したコンストラクト（dual−repOrtergene）を作った．これをC2C12細胞とマウス受精卵に導入し，invitroとinvivo
での検出系の構築を試みた．トランスジェニックマウスにread−through物質のアッセイ系として今回作出できた
TGAマウスを活用していきたい．

おけるトランス遺伝子の有無は尾端より DNAを採取しPCRにて確認した．さらに，各種臓器の凍結切片およびホモジェナートにおけるβ−ガラクトシダーゼ活性を測■東京大学大学院総合文化研究科生命環境科学系（生物学）…メリーランド大学薬学部薬物科学教主

2）細胞培養系におけるread−through活性の測定
TGAトランスジェニックマウスの骨格筋から分離した初代培養細胞における種々の抗生物質のread−through活性を検討した所，特定バッチのゲンタマイシンのみルシフェラーゼ活性の上昇を認めた．この細胞においてはネガマイシンによるread−throughは認められなかった．

ー112−

また，TAAを含むトランス遺伝子を組み込んだリコンビ
ナントC2C12細胞の作出にも成功した．
3）ネガマイシン類似構造体のコンピュータ検索
ネガマイシン分子の立体構造に類似した分子をメリー
ランド大学薬学部A．マッケレル教授グループが開発した立体構造データバンクに登録された105万分子種の中からコンピュータ検察した所，27分子種が検出された．
今後，TGAトランスジェニックマウス及び，TAAリ
コンビナントC2C12細胞を用い，read−through物質の検索をおこなう．

ー113−

筋ジストロフィー治療法の開発
一培養骨格筋細胞におけるステロイドおよびゲンタマイシンの影響一斎 藤 加代子●
研究協力者 近 藤 恵 里●・●● 河 北 有規子● 木 村 一 郎…

日

観察された．各CK値の推移は分化阻害の程度をよく繁栄していた．

的筋ジストロフィーに対する根本治療の実現に向け，
培養骨格筋細胞における分子生物学的検討を行い，疾患の病態を明らかにするとともに，培養系における治療効果判定の指標とすることを目的とした．

dysイムノブロット：正常筋では，MEPDの添加でdysの発現が増強した．DMD筋でもMEPDの添加によりごDuchenne型筋ジストロフィー（DMD）において副腎皮質ステロイド剤は，現時点で臨床的有効性が唯一証明されている薬物である．また近年あらたな分子治療

くわずかなdys発現が見られた．また，GM添加でわず
かな発現，GM＋MEPD添加ではそれよりも強い発現が見られた・培地中のGM濃度は，25−50〝少m1時が最も強い発現が見られ200−300′上釘mlではむしろ阻害された．

の概念として研究がすすむ「prematurestopmutationの抑制に作用する薬物」の一つであるゲンタマイシン

考

MEPDは，正常筋においてもdys発現量を増加させると考えられた．DMD筋ではリバータント細胞のdys発現をも増強させている可能性もある．

（GM）は，ナンセンス変異に起因するDMD症例の治療薬として期待されている．しかしGMの臨床応用にあたっては，GMの有する聴神経障害，腎障害の回避が必要である．
我々は種々の筋ジストロフィー患者由来の筋衛星細DMD筋におけるGMは，GM単独では極めて弱い効果であるが，GMとMEPDの両者を併用することによりdysの発現量を単独投与時よりもかなり高めることがで胞の培養系を確立し，筋特異的蛋白およびmRNAの発現状況を確認した．これを用い，まずはDMDにおいて有効性が示される副腎皮質ステロイド剤とGMの効果，
相互作用についての検討を開始した．

きた・GMでのreadthroughが起こりdys全長蛋白が発現，さらにMEPDの作用が加わってdys産生量が増えるものと示唆された．MEPD併用時におけるGMの至適濃度は対象と方法
インフォームドコンセントのもと，生検筋組織から筋衛星細胞の初代培養を得た．対象はナンセンス変異DMD
患者筋（G4003A：TGGtoTGA）1例と正常コントロール筋
1例・培地中にα−Methylprednisolone（MEPD：lLLM）存在下，GM（300，200，100，50，25〟釘ml）存在下，さらに両者の存在下で，培養における増殖・分化の形態学的観察とともに，筋細胞の分化レベルの指標として細胞内CK値の推移を測定した．ジストロフィン（dys）蛋白の発現量の評価は，主としてイムノプロット法にて行った．
結察

25−50〟釘mlと判断された．これはm血マウスでの報告（300J上釘ml）よりも低く，臨床応用の際には，MEPDとGMを併用することでGMの投与量を減らし，GMの副作用を軽減できる可能性が示唆された．
今後の展望
患者生検筋由来の培養細胞を用いた治療効果の検定というのは，いわばその個人のinvitroシステムにおけるパイロットスタディーとなる．効果の認められた症例において，その治療法を臨床にフィードバックすることができる．これは薬物療法のみならず，筋再生および移植治療，遺伝子治療においても同様の活用が期待できる．
いわゆるオーダーメイドの治療を目指していく上では，

果

形態学的所見：増殖期ではDMD筋，正常筋とも有意な差はなかった．分化期においてはDMD筋，正常筋とも，MEPD存在下の方がmyotubeへの分化がやや阻害されていた．GM存在下では濃度依存的な分化阻害がみら個々の患者由来の細胞株の作成を基本的手段とし，治療研究に生かしていくことが可能と思われる．
さらに我々は，痛みを伴わない非侵聾的なドラッグデリバリーシステムとして，MEPDとGMの桂皮投与法の検れGMlOO〝釘ml以上＋MEPD添加ではmyotubeの形
態変化が起こり，全体として管状ではなく塊状の細胞が討を開始した．「イオントフォレシス法」とは，電場を利用したイオン性薬物を皮膚透過させる方法である．バ
イポーラー電極により溶媒中のイオン化された薬物が，● 東京女子医科大学遺伝子医療センター■■東京女子医科大学小児科●●●早稲田大学人間科学部

カチオン性イオン（GM）はプラス極から，アニオン性イオン（MEPD）はマイナス極から，2剤同時に経皮吸収させらー114−

れる仕組みである．現在，イオントフォレシス法による

2）Hardiman

0，

Sklar RM，Brown RH Jr・：

薬剤吸収能の確認を，前述の培養細胞実験で得られた

Methylpredonisolone selectively afrbcts dystrophin

GM，MEPDそれぞれの至通濃度を参考にすすめている．

expressionin human muscle cultures・Neurology
43：342−345，1993．

文献3）Barton−DavisER，CordierL，ShoturmaDl，Leland SE，

1）SklarRM，BrownRHJr．：Methylpredonisoloneincreases

Sweeney HL：Aminoglycoside antibiotics restore

dystrophinlevels byinhibiting myotube deathduring

dystrophinnlnCtiontoskeletalmusclesofmdxmice．J

myogenesisofnormalhumanmuscleinvitro．JNeuroI

ClinInvest104：375−381，1999．

ScilOl：73−81，1991．

ー115−

Ⅵ．先天性ミオトニー、筋強直性ジストロフィー、
治療法の開発筋強直性ジストロフィー骨格筋におけるmRNAスプライシングの異常
佐古田 三 郎●研究協力者 中 森 雅 之● 木 村
高 橋 正 紀●日

卓●・●● 青 池 太 志●

的細胞核

筋強直性ジストロフィー症（DM）の病態にpre一mRNAのスプライシング異常が関与することが近年示されてきている（図1）．われわれはThomtonらⅣniv．Rochester
Nりと共同で本症のモデルマウス岬SA−LR）を解析し，骨格筋型クロライドチャネルの異常なスプライシングに・＼︑．．＝か■両．．∫．

「←DllPK pre−mRNA
ノノ
J、

CUG−BPl？
日用L l？

、−1−−−−−−−

？

−−BNL

＼

常 性
異？書
直能脈幼
強糖整の
筋耐不筋

Pre一mRNA

el

↓↓↓↓

霞忍−

幼若型スプライシング変異l

ー1
n−
de
・
L
J肝
t
a

⑳

I n r yニンT，インスリン受容体などのスプライシング異常が他のグループにより示され，不整脈，耐糖能異常の原因である可能性が示されている．しかし，本症の最も重要な症状である筋萎縮・変性のメカニズムについてはまだ明らかにされていない．以前より本症の骨格筋で細胞内

ノーー＼

CITHH

SpliGing調節 CU6−BP

m
m
∵
鞘

よりクロライドコンダクタンスが低下し，筋の興奮性が冗進していることを見出した（文献1）．また，トロボ−？
→ 筋萎縮？
図1 筋強直性ジストロフィーの病態仮説
リピートの伸長したmRNAは核内に凝集体を形成する．異常なCUGリピートの存在の結果，MBNLやCUG−BPといった
mRNA結合タンパクの量的異常が生じ，それらタンパクが制御しているClチャネル，インスリン受容体などのmRNAスプ
ライシング機構に異常をきたし，筋強直，耐糖能異常など種々の症状を呈すると考えられている．

カルシウム動態が異常であるとの報告があること，上述のスプライシング変異は全て正常の筋分化の過程で見られる，いわゆる 幼若型 の増加であることから，われ
われは筋成熟の過程でスプライシングパターンが変化す
ることが知られており，しかも細胞内カルシウム制御にて電気泳動した後にエチジウムブロマイドにて染色，イ

重要な2つの遺伝子，リアノジン受容体（町叫および筋メージアナライザーで定量しスプライシングアイソフォ

小胞体カルシウムポンプ（SarCOplaLSmiC／endoplasmic
reticulumCa2＋−ATPase，Serca）に注目し，それらのスプラ
イシング異常を患者生検筋および先述のモデルマウス筋ームの比を求めた．また，Ryrl（骨格筋型），Ryr3（心筋型），
Sercal（速筋型），Serca2（遅筋そのほか型）の総mRNA発現量についても検討した．

において検討した．

Ryrlには，筋分化の過程で選択的スプライシングが起こる2つのエクソン（ASI，ASII）がある．幼君なタイプ

方法と結果
ヒト生検筋23例（DM5例，多発性筋炎5例），筋萎
縮性側索硬化症5例，肢帯型筋ジストロフィー症 2例，正常コントロール6例），手術時に採取した筋5例（すべてDM），生検筋より培養した筋管細胞2例（DMl例，
正常コントロール1例），胎児筋1例（先天性DM）．上述のモデルマウス岬SA−LR）は，ヒト骨格筋アクチン遺伝子岬SA）の3 末に250回CTGリピートが伸長した
鵬nsgeneを発現しており，筋強直現象に加え，中心核増加・問質増生などの筋病理所見が存在する．
患者筋あるいはマウス大腿筋からmRNAを抽出，
cDNAに逆転写．各種プライマーにてcDNAをPCR法
で増幅，アクリルアミドゲルあるいはアガロースゲルに●大阪大学大学院医学系研究科 神経機能医学（神経内科）…オーストラリア国立大学

ASI（−），ASII（−）から成熟タイプASI什），ASII（＋）への変換は，ASlIのほうがASIに比して分化の早い段階で生じることも知られている．幼君なスプライスアイソフォーム
ASI（−）のASI什）に対する割合がDM患者およびHSA−LR
マウスで有意に増加していたが，ASIIのスプライシン
グについてはコントロールと差を認めなかった．
Sercalも分化段階によってスプライシング／，てターンが変化し，成人型のSercalaと幼君型のSercalbが存在す
る．本症患者およびHSA−LRマウスの筋では幼君型のSercalbの割合が有意に増加していた．一方Serca2は臓
器特異的なスプライシングを示し，遅筋にはSerca2a，他の多臓器ではSerca2bが発現する．Serca2a，Serca2bのスプライシングはDM患者筋で特に変化を認めなかったが，イントロン19を含んだ未報告のスプライス変異体が本症患者筋で減少していることが判明した．

−119−

なお，Ryrl，Ryr3，Sercal，Serca2mRNAの総発現量については有意な変化は認めなかった．

である．以前より本症における細胞内カルシウム異常の報告があり，今回見出したリアノジン受容体，筋小胞体カルシウムポンプのスプライシング異常が原因で考察
患者筋に加えモデルマウスでもスプライシング異常が認められたことから，CUGの延長したmRNAが，スプライシング機構の異常に重要であることが示されある可能性がある．さらに，RyrlおよびSercalはセン
トラルコア病，Brody病といった筋疾患の原因遺伝子でもあることなどから，本症の未解決な病態である筋変性への関与が示唆される．

た．さらに，Ryrlでは2箇所のうち1箇所でのみすプ
ライシング異常が生じていたことから，スプライシン
グはランダムなものではなく，筋分化の過程に関与することが示唆された．リアノジン受容体，筋小胞体カルシウムポンプはともに筋小胞体に存在し，筋興奮に

1）A・Mankodi，M．P11hkallaShi，et al．Expanded CUG

伴う一過性のカルシウムの遊離，その後の回収に必須

myotonicdystrophy．MolecularCelllO：3544，2002．

文

献

repeatstriggeraberrantSplicingofCIC−lchloridechannel
Pre一mRNA

ー120−

and

hyperexcitability

ofskeletal

muscleinクラスIc抗不整脈薬の骨格筋型ナトリウムチャネルに対する作用− ミオトニー治療薬としての検討一
佐古田 三 郎◆研究協力者 青 池 太 志 高 橋 正 紀●日抗CD8抗体固着ビーズの細胞への付着をチャネル発現
細胞の手がかりとした．Transfbctionの48−72時間後，

的

筋強直（ミオトニー）の症状緩和にナトリウムチャネ
ルを主に抑制する抗不整脈薬が経験的に使用されるが，CD8陽性細胞に対しパッチ電極によるホールセルクラ
ンプ法を適用し，電位固定下でナトリウム電流を記録した．メキシレテンあるいはフレカイニドを細胞外液に投有効性の検討は必ずしも十分であるとはいえない．ミオ
トニーの定量化，症状の個人差などの問題から臨床的評
価には困難がある．一方，基礎薬理学研究も十分であるとはいえない．多くの薬物については心筋型Naチャネ
ルでは比較的詳細な研究がされているが，その結果をそ与し，ミオトニーを摸した刺激条件下（膜電位を−90mVに固定し，＋10mV；3msec，50Hzの高頻度脱分極刺激）でナトリウム電流に対する影響を検討した．
ミオトニーを摸した刺激を与えた時には，骨格筋型Naのまま骨格筋型Naチャネルに適用することは危険である．例えば，骨格筋型は速い不活性化過程の時定数（時間経過）ひとつをとっても，心筋型に比して1オーダー小さい（速い）ように，チャネルの性質に違いがある・骨格筋型チャネルでの研究もいくつかあるが，チャネルに対する親和性など薬理学的パラメーターの計測に主眼が置かれ，●150mVといった過分極状態に膜電位を固定したり，数100msといった長い脱分極刺激を用いたりしており，実際の骨格筋での静止膜電位（−90mV）や活動電位の幅
卜3m5）と，乗離した条件下での実験である（文献1）．
ナトリウムチャネルを主に抑制する抗不整脈薬はⅦughan−Wlliams分類でclaSSIに分類され，心電図変化など電気生理学的性質からさらにA，B，Cに再分される．
これまで，ミオトニーの治療にはメキシレチンに代表されるチャネルからの解離の速いclaSSIB薬剤が良く用いられてきた．いっぽう，ClassIC群の薬剤はチャネルからの解離が遅いという特徴があり，心筋型ナトリウムチ
ャネルの遺伝子異常により引き起こされるLongqT症
候群に対し有効である可能性が示されている．しかし，骨格筋に対する作用を薬理学的に検討した報告はほとん
どなく，ミオトニーに効果があったという症例報告も1例のみである．そこでメキシレチンおよびフレカイニド

チャネルは薬物の存在しない場合でもチャネルの不括化により10％程度の漸減を認める．−90mVに膜電位を固定した時には＿120mVといった過分極時とは異なり，治療域濃度のメキシレチン（10J上M），フレカイニド（lJ上M）が，チャネルを30％程度に抑制した（図1）．フレカイニドによるブロックからのチャネルの回復の時定数は−90mVの膜電位では10S程度と，メキシレチンの数100ms〜数Sに比し遅延しており，チャネルからの解離が遅いというクラスICの性質を反映しチャネルブロックの持続がみられた．さらに脱分極性の麻痺を摸した300msの長い脱分極刺激時にはメキシレチンとは異なり，フレカイニド
によるチャネルの抑制はほとんど認められず，オープン
チャネルブロッカーとしての性質によると考えられた．
考察

従来より臨床で使用されてきたメキシレチンに加えフ
レカイニドも治療域濃度での抗ミオトニー効果を有する可能性がin vitroのチャネル発現系を用いた系で示された．フレカイニドのチャネルからの解離の遅さも考え合わせると，難治性ミオトニーに対し非常に有効である可能性が示された．さらに，高カリウム性周期性四肢麻痺の骨格筋型Naチャネルに対する作用について，in vitroのチャネル発現系を用い臨床条件を摸した刺激を与えた
際のNa電流に対する効果を計測し検討した．

などでは，ミオトニーに加え麻痩症状（脱分極性）も存在する．フレカイニドは高頻度発火にのみ有効で，長い脱分極刺激にはその作用を示さないことから，ミオトニーにのみ作用する可能性が示唆された．脱分極性麻痔に対方法と結果する，抗不整脈薬の効果・安全性が確立されていない現状では，麻痩発作を有する患者ではClassIC薬剤の使用も考慮されるべきかもしれない．

Humanembryonickidney（HEK）293細胞にヒト骨格筋型Naチャネルαサブユニットおよびβ1サブユニットの発現ベクターをリン酸カルシウム法によりtransfection
した．同時にCD8発現ベクタ，を少量transftction L，●大阪大学大学院医学系研究科 神経機能医学（神経内科）

今後の展望
骨格筋には独自のチャネルの発現が多く，骨格筋タイプのチャネルに対する薬剤作用の検討は不十分であるこ−121−

とが多い．本研究のようにin vitroチャネル発現システ

付けることも目指すべきである．

ムを用いて骨格筋タイプのチャネルに対する候補薬剤の薬理学的基礎データを収集する必要がある．一方で，これらの実験データが実際の臨床効果を反映しているかを文

1）M．P．Thkahashi＆S．C．CannOn Mexiletine block of

検証しなければならない．また，骨格筋細胞生理機能のin silicoモデルを利用し，候補薬剤の治療効果のシミュ
レーションシステムをも目指し，治療応用の促進に結び

disease−aSSOCiatedmutationsinS6segmentsofthehumanskeletalmuscleNa（＋）channel・J・Physiol．537：701−714，

2001．

Vh−120mV

0
▲．

4
0

0
2

2

250

8
0

0

2（1）

盲○と300＞pjO∝

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150

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︼U〇・−・500＞つ■●●∝1∝1

Puls●nU汀血●r

Vh−90mV
．80
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04・2
︼亡●ヒコり○＞p■−○∝

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0

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1∝I

150

PulS●lMmbr

2（氾

250

1

10

100

ReG■抽姉川）

図1 高頻度脱分極時のフレカイニドの作用＋10mV；3msec，50Hち250回の高頻度脱分極刺激時のフレカイニドのナトリウム電流に対する作用をホールセルクランプ法にて計測した．左のように膜電位が−120mVの時には，治療域濃度のlJ上Mではほとんど電流を抑制しないが，中央のように膜電位が＿90mVの時には，有意に電流を抑制する．なお，薬物の存在しないcontrolでも電流の減少が見られるのは＿90mVではチャネルが不活化しやすいためである．右は浪度依存性を示したものである．膜電位が−90mVのときのIC50は3．日tMである．

−122−

ミオトニーの筋活動電位反復発火の減衰に関する研究
栗 原 照 幸●

研究協力者 中 空 浩 志 岸

目

雅

彦●

根

的

本

博●

考

察

Thomsen病及びmyotonicdystrophy（DMl）では，神経反復刺激によって誘発筋電位が漸減することがBrownl）
により報告されているが，その詳細な病態生理が不明である．10Hz以下の神経刺激でも，刺激後3−5分の安静をしてから神経刺激をすると誘発筋電位が平均58％まで漸減する．演者らは，CIconductanCeの低下によるミ筋細胞膜のCIconductance低下によるミオトニー標
本では，膜電位は活動電位の出るごとに脱分極して行

オトニー標本で膜電位，epp，meppを含めて検討を加えたので報告する．

って，eppを実測することができ，eppは31・1−40・O
mvと高く，ePpから筋活動電位の出現する開値4）（16．

き，活動電位も膜電位の脱分極に伴って漸減することが観察された．またt−SyStemをdisruptしておいても
myotonicburstが起こることを実験的に示した・コント
ロールの筋標本で〟＿COnOtOXinGIIIAを用いることによ

方法と結果
Wstar系ラットの横隔膜一神経標本を用いて，細胞内記録を行なった．ミオトニーはCIconductanceを低下させるためにmthaCene−9−Carboxylicacidを用いた．ガラス管微小電極を用いて筋細胞内記録を行なった．Eppの記録を行なうためにはLL−COnOtOXinGIlIA2，3）を用いて，骨格筋のNa channelを選択的にblockして記録した．ミオトニーの連続記録のためには，筋収縮を阻止するため
t−tubularsystemを選択的にdisruptして筋収縮を止めて筋細胞内記録をした．
骨格筋のNachannelを選択的に阻止するLL−COnOtOXin
GlIIAを用いることによって哺乳動物骨格筋のeppを実測することができた．コントロールの筋標本ではeppは，2mv）を安全に越えるものであることを示した・表1に示すように，30Hzの高頻度神経反復刺激に伴うeppの漸減は，ミオトニー標本でも，コントロール筋標本と変わりがないことと，20秒間程度の短時間の神経刺
激では，神経筋疲労が起こらないことから，ミオトニ
ーにおける筋活動電位の漸減は神経筋接合部における疲労現象ではなく，筋細胞膜の異常による脱分極が関係していると考えられた．
表1神経反復刺激とeppの漸減
コントロールとミオトニーの神経筋標本で30Hzの神経刺激をしたときの終板電位の減衰の仕方を比較した．11箇所の神経筋接合部において記録したeppの平均値と1S．D．を示す・両者に統計的な有意差はなかった．
神 経 刺 激c o n tro l31．1−40．OmV（平均33．3土2．9mV），ミオトニー標本では，

の回 数

epp

S．
D ．

epp

S ・
D ・

eppは，24．4−44．4mV（平均34．56．5mV）で両者に統計学的有意差は認めなかった．30Hzの神経反復刺激を12

l St

3 3．
3 m V

2 ．8

35 ．
9 m V

5．
9

3 3 ．1

3．
2

34 ．
0

6．
3
6．
3

2 nd

回すると，eppはコントロールの筋標本では，平均20．1土3．5mVまで漸減し，ミオトニー標本では，eppは，
平均22．6土4．7mVまで漸減した．神経刺激ごとのeppの漸減の仕方は両者で有意差はなかった．30Hzの神経
反復刺激を300msec，10sec，20sec行なった前後のmeppの素量は減少がないので，上記の刺激回数12回の短時間に起こったepp漸減は，ePpquantalcontent（素量の数）が減少したものである．コントロール筋標本のepp実測値
より，哺乳動物の骨格筋における素量の数は平均94．6
個と計算できた．E−C uncouplingをして記録した
myotonicburstの筋細胞内記録では，初め−78．6mVの膜電位が，98個の活動電位が出たあと−50．OmVまで脱分極し，筋活動電位も85．7mVから，最後は7．14mVにまstim ．

M y o to n ia

3 rd

30．
9

2．
7

32 ．
8

4 th

29．
6

3．
2

3 1．
6

6．
1

5 th

27．
6

3．
2

3 1．
6

6．
1

6 th

25 ．
3

4．
2

2 9．
6

5．
2

7 th

24 ．
5

2．
7

2 8．
2

4．
6

8 th

2 3 ．1

3．
7

26．
1

4．
7

飢九

2 2．
2

3．
7

26．
2

4．
6

1 0 th

20．
3

4 ．1

24，
7

4．
9

l l th

20．
3

4．
3

23．
7

4．
5

1 2 th

20．
1

3．
5

22．
6

4．
7

今後の展望

で低下している．

ミオトニー疾患の中で特にDMl及びDM2では，ミオトニー以外に筋力低下があり，後者は日常生活に支障●東邦大学大橋病院神経内科を来たす要因となっている．その主たる原因はジストロ−123−フィーによる筋の変性，萎縮によるが，チヤネロパチーのために反復発火時の脱分極により，筋活動電位の低下が見られるので，これも筋力低下の一因となる．今後更文献1）BrownJC：Muscle weakness after restin myotonic
disorders：anに筋力低下の病態生理を明らかにすることが重要である．

electrophysiological study．J NeuroI

NeurosurgPsychiatry37：1336−1342，1974．
2）SosaMA，ZengelJE：Useof LL−COnOtOXinGIIIAfbrthe

研究の意義
ミオトニーにおける筋活動電位の漸減は神経筋接合部

StudyofsynaptictranSmissionatthe丘ogneuromuscular
JunCtion．NeurosciLett157：235−238，1993．

における疲労現象ではなく，筋細胞膜の異常によるものである．cIconductanceが低下していると，筋活動電位が反復して出現するごとに，脱分極が起こり，それと共に筋活動電位が漸減する．〟＿COnOtOXin GIIIAを用いる

3）MichelleM，VanLunterenE：Efrtctofphasicactivationon

ことによって哺乳動物骨格筋のepp（平均33．3mV）を実測することができたことは意義深い．

fhtigue．AstudyofmammalianmuscleuslngeXCitation−

endplatepotentialinratdiaphragm．JNeurophysio182：
3030−3040，1999．
4）KuriharaTiBrooksJE：Themechanismofneuromuscular

COntraCtionuncoupling．ArchNeuro132：168−174，1975．

−124−

筋強直性ジストロフィーの分子病態と治療
石

研究協力者

日

浦

笹 川
竹 下

章

一●

昇● 紀
裕 也● 森的

強直性ジストロフィー1型（DMl）は，筋強直，精巣萎
縮，白内障，耐糖能異常などを特徴とする全身性疾患である．責任遺伝子は，第19染色体にあるDMキナーゼ（DMPK）という小胞体結合型セリン・スレオニンキナー
ゼであり，その3，非翻訳領域にあるCTGリピートの伸長が病気の直接の原因である．また最近，筋強直性ジス
トロフィー2型（DM2）も発見されたが，これは第3染色体にあるジンクフィンガータンパク質ZNF9遺伝子中のイントロン1にあるCCTGリピートの伸長であることが判明した．すなわちDMという症状が，責任遺伝子の機能異常ではなく，3または4塩基リピートの伸長に深く関係していることが明らかになってきた．また，伸長したリピートだけを骨格筋に発現させたマウスでも同じ
ミオトニア（筋強直）症状が見られることも，この説が有力になる証拠の1つとされている．しかしながら，同様の症状が，なぜ異なる遺伝子中の異なる塩基リピート伸長で起こるのかについては，その理由は明らかではな
かった．
私たちの研究室では，塩基リピート結合タンバク質の研究を2000年より開始し，2つの異なる型のRNAリ
ピートに結合するタンパク質MBNLl／EXPの同定に世界で初めて成功した（助血∴勿れ坤′0ム 2003；肋研d〃
肋エGe〃eJ．2004）．このタンパク質は，リピートDNAにも結合はするものの，CUGやCCUGなどのリピートRJJAの方に強く結合することが酵母threehybridの系とgel
retardationanalysisによって明らかになった．また最近，
MBNLlのノックアウトマウスが作成され，これにDM症状が見られることから，RNA機能異常説は強く信じられるようになっている．
本研究の目的は，筋強直性ジストロフィー発症に関わるmA結合タンパク質を同定し，その遺伝子の機能を解析することで，本症の分子的基盤の理解を進めることで
ある．
方法と結果
本研究では，このmA機能異常を調べるため，リピー

嘉
大

浩●
輔●

ニングし，結合するRNA配列の特異性を酵母threehybrid法で調べた．その結果，CUGとCCUGリピートに結合するのは，今まで知られていたCUG−BPではなく，
MBNLlであることが明らかになった．また，そのオーソログであるMBNL2，筋特異的に発現しているMBNL3もMBNLlと同様の基質特異性を持つことがわかった．
またこれらRNA結合タンパク質同士も結合することが酵母twohybrid法で明らかになった．これらのRNA結合
タンパク質は，スプライシングにも関わることが示唆されている．そこで，塩素チャネルやαアクチニンなどの加vfJmスプライシング系を用いて，これらmA結合タ
ンパク質がスプライシングに関係するかを調べたとこ
ろ，確かにMBNLlの発現の有無によってスプライシン
グバターンが変化することが明らかになった．
一方これらと共に3年間の研究で，基礎的なことでは，
DMPKタンパク質の精製と小胞体局在の同定，トリプ
レット・リピートを人工的に伸長させる新しいPCR法の開発などを行った．従来，リピートを含む遺伝子のクローニングが難しかったが，我々が開発した手法によってリピートが簡便にクローニングできるようになった．また，
RNAとタンパク質の結合に関しては，酵母three hybrid法という手法を駆使して，定量的に結合を解析する手段を確立した．同時に，表面プラズモンバイオセンサを用いてRNA結合タンパク質の1つである CUG−BPや
MBNLlとRNAとの結合を直接的に解析することにも成功した．
また，これら基礎研究の一環として，DMPKの生理機能を調べる実験を酵母を用いて行った．酵母にはDMPK
ホモログが存在するが，この遺伝子を欠損させた株が形態異常を示すことを発見した．遺伝子導入でレスキュー
できること，ATP結合部位を変異させると機能を欠失することから，活性が形態維持に必要なことがわかった．
この研究によって，DMPKは細胞骨格の機能維持に働いている可能性も示唆された．
また，本症の発症に関わる新規因子の同定をCTGリピー
ト増加筋細胞株を使ったDNAチップ解析によって行った．リピート伸長に関連する新規発現（抑制）遺伝子のトRNA結合タンパク質9種（MBNLl，MBNL2，MBNL3，
CUG−BP，CUG−BP2，PKR，CELF3，PTB，FOXl）をクロー探索を行っている．CTG160伸長細胞では，SCAMP3遺伝子の発現が上昇し，反対にendosumne遺伝子の発現が低下することがわかった．また，ノーザンプロット解析●東京大学・大学院総合文化研究所

によって，Cu−SOD，Mn−SOD，GPX，Catalaseなどの酸−125−

化ストレス関連酵素の遺伝子発現が変化することも明らかになった．リピート伸長によってαBクリスタリンの

2）Watanabe T．，1hkagiA．，Sasagawa N．，Ishiura S．and
NakaseH．：AlteredexpressionofCUGbindingproteinl発現低下を発見した．

mRNAinmyotonic dystrophyl：pOSSible RNA−RNA
interaction．Neurosci．Res．49：47−54，2004．

考察
筋強直性ジストロフィーの多岐にわたる症状は，原3）Takeshita YリSasagawa N．，Usuki F．andIshiura S．：

Decreasedexpressionofalpha−B−CryStallininC2C12cells

因遺伝子そのものではなく，リピート自身が引き起こしている．そこで，伸長リピートに結合する因子を探したところ，CUG−BPやMBNLlなどいくつかのRNA
結合タンパク質が候補に挙がってきた．つまり，本症

that express human DMPK／160CTG repeats．Basic
Appl．Myol．13：305−308，2003．
4）SasagawaN．，KinoY，TakeshitaY，OmaYland圭shiura
S．：OverexpressionofhumanmyOtOnicdystrophyprotein

はRNA結合タンパク質がリピートRNAに捕捉され；正常機能が果たせなくなるために起こる可能性がある

kinasein

Sdccharv叩′CeS Pombeinduces abnormal

POlarizedandswollencellmorphology．J．Biochem．134：

ことが，本研究によって明らかになった．これは，MBNLlがCUGとCCUGリピpトに結合すること，
MBNLlが症状に関係する遺伝子のスプライシングに関わること，などの証拠から推測できることである．

537−542．2003．

5）KinoY，OmaY．，ThkeshitaY．Tbkal1aShiN．，SasagawaN．
andIshiura S．：Direct evidence that EXP／musCleblindinteractswithCCUGtetranuCleotiderepeats．BasicAppl．

また同時に，リピート伸長細胞には酸化ストレスの影
響があり，これによって種々の遺伝子が動いていることも明らかになった．

Myol．13：293−298，2003．
6）SasagawaN．andIshiuraS．：Myotonic dystrophyprotein
kinase．Wiley Encyclopedia ofMolecular Medicine5：2203−2205，2002．

今後の展望
本研究によって，筋強直性ジストロフィーがRNA結合タンパク質の機能異常で発病する可能性が高くなった．

7）Usuki F Yasutake A．，Umehara Fi，1bkunaga H．，

今後は，これらRNA結合タンパク質を標的にした治療法の開発が期待できる．

Trolox，againstmethylmercury−intoxicationinthe rat．

MatsumotoM．，EtoK，lshiuraS．andHiguchil．：Invivo
protectionofawater−SOluble derivativeofvitaminE，
Neurosci．Lett．304：199−203，2001．
8）1払kahashiN，SasagawaN，UsukiF，KinoY；KawaharaH，

文

献

Sorimachi H，Maeda T；Suzuki K andIshiura S．：
Coexpression ofthe CUG−bindingproteinreduces DM

1）KinoY二，OmaY，SasagawN．andIshiuraS．：Muscleblind

PrOtein，MBNLl佗XIlbindsspeCi爪CallytoCHHGrepeats．

PrOteinkinaseexpressioninCOScells．J．Biochem．130：

HumanMol．Genet．13：495−507，2004．

58ト587，2001．

−126−

RNA結合因子としてのSIX5と筋強直性ジストロフィーの関わり
川

上

研究協力者

潔●

佐

藤

滋●

緒
言
筋強直性ジストロフィー1型（DMl）はCTGリピートの伸長を原因とする神経筋疾患である．リピート伸長は，

ルシフト実験を行った．その結果，野生型Six5もHD中

1）cUGリピートを含む異常RNAの蓄積とそれに伴うRNA結合タンパク質の量と分布の変化，2）DMPKの発現量低下，3）下流に位置する乱打遺伝子の転写抑制，を同時に引き起こす．そして，1）・3）の異常を個別に有する

異常蓄積するのアミノ酸を置換した4種類の変異型分子もcad＿RNAプ
ローブに結合することがわかった．次にDMlで核内にCUGリピートとGSTSix5の結合をCUGB−RNAプローブによって調べたが，シフトしたバンドは検出されなかった．興味深いことに，CCUG8−RNA
プローブでは弱いながらシフトしたバンドが検出された．
トランスフェクション実験では過剰発現させたCUG

モデルマウスは，それぞれDMl症状を部分的に再現することが報告されている．長田は水晶体，骨格筋，脳，生殖腺で発現する転写因子をコードしており，肋∫欠損マウ
スは白内障と性腺機能低下症を発症する．私たちは，

リピートのVP16−Six5に対する特異的な影響は観察されなかった．

rcUGリピートを含む異常RNAが引き起こすSIX5の機能低下が，DMl，Six5欠損マウス及びCCTGリピート伸長によるDM2に共通して観察される症状の発症機序の可能性がある」という新たな仮説をたて，研究を行った．

考察

SIX5はRNA結合能を持っていることがわかった．sIX5のCCUG8−RNAプローブへの結合は，SIX5がDMlだけでな
くDM2の発症過程にも関与するという可能性をはじめて示唆する結果であった．私たちは種々の細胞種における方法
Six型ホメオドメイン（HD）タンパク質であるSix5

Six5標的遺伝子をすでに同定しているが（Satoeta1．，
2002），DMではSix5がCUGあるいはCCUGリピ，トに結の配列・構造上の特徴を明らかにするために全HDタン
パク質とアミノ酸配列の比較を行った．4種類の合してしまい，標的遺伝子の転写活性化という正常な機

GSTISix5融合タンバク質（野生型，W48R，K50Q，Q54A）
を精製し，ゲルシフト法により種々のDNA及びRNAプ
ローブに対する結合活性を調べた．強力なROSA26プロ

CUG及びCCUGリピートとのinvitroでの結合は，長いモーター下でCUGリピート（5個または200個）を含む
DMPKmRNA3．＿UTRを過剰発現するプラスミド（Amack

ピート発現細胞株の使用が有効だと思われる．

andMahadevan，2001）をHEK293とCOS7細胞にトラン
スフェクトし，CUGリピートがVP16−Six5 の機能

結能を果たせなくなっている可能性が考えられる．Six5とRNAプローブを作製して再度確認する必要がある．また，
細胞内でCUGリピートがSix5に及ぼす影響の解析は，リ論

Six5はbcdの標的であるcad＿RNAとCCUGリピートにinvi廿0で結合した．sIX5はRNA結合能を持つ転写因子であ（叩・聯血及び的∫プロモーターを活性化する能力）を変化させるか否かについて調べた．

ることが示唆された．sIX5がDMlとDM2の両者において共通な症状である白内障と性腺機能低下症の発症過程に

結果
Six5はHDの50番目にリジン（K50）を持つユニークなタイプのHDタンバク質であることがわかった．その関与する可能性が考えられる．

1つであるショウジョウバエbicoid（bcd）は，Caudal（cad）
mRNA3■−UTRに結合し，翻訳を阻害することが知られている．また，bcdとcad−RNAとの特異的な結合にはK50

1）AmackJD，Mahadevan MS．The myotonic dystrophyが必須であることも明らかとなっている．
そこで，DMにおけるRNAの重要性を考慮し，Six5のRNA結合活性を解析するために，GSTSix5融合タン

参考文献
expandedCUGrepeattractisnecessarybutnotsufncient
to disruPt C2C12myoblast difrtrentiation．Hum MoI
GenetlO：1879−1887，2001．
2）Sato，S．，Nakamura，M．，Cho，D．H．，

パク質とbcdの標的であるcad＿RJIAプローブを用いてゲ

H．and Kawakami，K．Identincation oftranSCriptionaltargetsfor Six5：Implication fbr the pathogenesis of
myotonic dystrophy●自治医科大学分子病態治療研究センター細胞生物研究部

ll：1045−1058，2002．

ー127−

mpscott，S．J．，Ozaki，typel．Hum．Molec．GenetNonsense−mediatedmRNAdecay（NMI））抑制による神経筋疾患の病態と治療に関する研究
白 杵 扶佐子●
研究協力者

山

目

的

下

暁

朗◆●・…

樋

口

逸

郎…

大

野

茂

男

∴ rJ

Prematuretranslationteminationcodon（PTC）をもたらす
フレームシフト変異あるいはナンセンス変異は，遺伝性疾患の主な原因である．pTCを有する変異mRNAは

COL（X2（Vl〉

ニー ＼・

β・aCtin

言∈旨u−〇㌔︶u笥？箕S︶NつJOU

nonsense−mediatedmRNAdecay即MD）の標的となり分解されるため，その変異蛋白質は作られないことが多い．
NMDは，PTCを有する変異mRNAを排除するmRNA監
視機構である．しかしながら，変異蛋白質の中には正常な蛋白質の機能を代償するものもあり，このような例ではNMDはその病態に負に作用することになる．常染色体劣性遺伝を示すUllrich病を対象に，NMDの抑制が病態に及ぼす影響とNMDを標的とした治療の可能性について検討した．

磨対象と方法
collagenⅥcL2鎖（COLα2（Ⅵ））のtriplehelicaldomainをコードするexonに26塩基のホモの欠矢があり，フレー
ムシフト変異がおこってPTCが出現したUllrich病の患．

l

者織維芽細胞を対象とした．CouagenvIの三鎖構造を認識する抗coll喝emVI抗体を用いた免疫染色で，COllagen
VI蛋白質の完全欠損を認めた．ヒトNMDにおけるmRNAhelicaseであるhUPFlのリン酸化を薬理学的にあるいはRNAinterferenceを用いて抑制し，COLα2（VT）
mRNAパ011agenⅥ蛋白質の発現変化と細胞機能に及ぼす影響について検討した．

U暮柄Ch，＄di＄eaSe
図1No血mblot解析．ひⅨ（100帽／mり，WOnmamh（10pM），
ca飴he（7．5mM）をそれぞれ6時間投与後．tobrRNAを抽出してNo血mblotを行い，デンシトメトリーで解析した（n＝4）．

Ul壬rkh，sd如粥冶Fb

結果および考察

NoaddItion CHXlOOllM

hUPFl proteinkinaseであるhSMG−1をwortmannin，ca飴ineで抑制するとCOLGL2（VI）mRNAは未添加時のNomatFb

2．8t3．4倍に増加した（図1）．抗collagenVI抗体を用いた免疫染色では，欠損していた細胞内および細胞外マトリックスにおけるco11agenVIの三鎖構造がwortmannin，ca飴ine添加後認められた（図2）．35S＿メチオニンラベル
後の培養液を用いた抗collagenⅥ抗体による免疫沈降後電気泳動にて，変異collagenVIの細胞外への分泌が確認された．即ち，変異COLα2（Ⅵ）mRNAの増加により合WortmanninlOILM Caffeine7．51¶M成された変異COLα2（ⅤⅠ）鎖は，正常に合成された■国立水俣病総合研究センター…横浜市立大学大学院医学研究科分子細胞生物学＝■鹿児島大学医学部老年、神経内科、■■●■Dep．Biochem．＆Mol．Biol．，Univ．Texas

図2 colIagenVI三鎖構造を認識する抗体を用いた免疫染色
CHX，WOnmannれ ca能ineをそれぞれ6時間投与後，細胞を固定し免疫染色を行った．欠損していた細胞内
collagenⅥの三鎖構造がwortmamh ca飴ine添加後認められた・BaF20四m．
−128−

COLα1（VI）鎖，COLα3（VI）鎖と細胞内でco11agenVI
三鎖構造を作り細胞外へ分泌され，さらに細胞外マトリッ
クスへとりこまれることが明らかになった．患者線維芽捜したUlIrich病患者繊維芽細胞において，変異蛋白質の細胞では，且bronectinreceptorの減少と細胞易遊離性が認められたが，WOrtmamin，CafrtineによるcoHagenVIの回復はこれらの細胞機能を部分的に回復した．

今後の展望

増加とそれによる細胞機能の部分回復が明らかになった．

NMDは，PTCを有LNMDが負に作用しているUllrich
病など劣性遺伝病の治療標的となる可能性が考えられる．
今後，表現型を改善する最適なNMDの抑制法について

hMG−1は，Phosphatidylinosito13−kinase−relatedprotein
kinase（PIKK）fhilyに属する．wortmamin，Cafrtineは，患者線維芽細胞におけるhUPFlリン酸化を抑制したが，さらに検討していく必要がある．
文

NMD以外の他の分子への作用も知られている．co11agen
VI蛋白質の増加がNMDを特異的に抑制した結果である

献1）UsukiF，YamashitaA，HiguchH，OhnishiT；ShiraishiT；

ことを確認するために，hUPFlとそのリン酸化酵素であるhSMG−1を標的としたRNAinterftrenceを用いて検討

Osame M，Ohno S：Ⅰnhibition of nonsense−mediatedmRNAdecayrescuesthemutantphenotypeincolIagen

した．患者繊維芽細胞内にsiRNAを発現させ，Si−hSMG＿1の発現によるhSMG−1のknockdownおよびsi＿hUPFlの発現によるhUPFlのknockdownをW由temBlotにより確認した．hSMG−1，hUPFlいずれのknockdown細胞でもVI−deficientUl］richsdisease．Ann

Neuro155：740−744，

2004．

2）1bmashita A，OhnishiTiKashimaI，Thya Y；Ohno S：
HumanSMG−1，anOVelphosphatidylinosito13−klnase−related

hUPFlのリン酸化低下が認められNMDは特異的に抑PrOteinkinase，aLSSOCiateswithcomponentsofthemRNA制された．抗colIagenVI抗体を用いた免疫染色では，
hSMG−1，hUPFlいずれのknockdown細胞においてもSurVeillancecomplexandisinvoIvedintheregulatiorLOf

emptyvectorあるいはnon−SilencingsiRNA導入のcontrol細胞では認めなかった細胞内および細胞外マトリックス

2215−2228，2001．

3）OhnishiT∵ねmashitaA，KashimaI，SchellllAndersKR，におけるcollagenVIの三鎖構造が認められた．このGrimsonA，HachiyaT；HentzeMW；AndersonROhnoS：

collagenVIの回復はnbronectinreceptorの発現増加と細胞易遊離性の改善をもたらした．

Phosphorylation ofhUpflinducesformation ofmRNA

nonsense−mediated mRNA decay．Genes＆Dev15：

SurVeillancecomplexescontaininghSMG−5andhSMG−7．

以上，NMDの特異的な抑制により，CO11agenⅥが欠

Mol．Ce1112：1187−1200，2003．

ー129−

PC12細胞を用いた筋強直性ジストロフィーモデル細胞の作成：
薬剤スクリーニングシステムの確立を目指して
吉

良

潤

一●

協力研究者 古 谷 博 和● 池 添 浩 二●
大八木 保 政● 林

日

的

利 光●●

効果）と，LDHCytotoxicityDetectionKit（Thkara）を用いてCTGリピートを含むmRNAが神経細胞に及ぼす細胞毒

筋緊張性ジストロフィー（以下DMl）はミオトニア等の筋症状が日立つが，難治性糖尿病，甲状腺機能障害，
良性・悪性腫瘍の合併などの全身症状を認め，中枢神経系では異常リン酎ヒしたタウ蛋白が沈着する也uopathyが生じる．DMlはdystrophiamyotonicaproteinkinase（以下DMPK）遺伝子の3，非翻訳額域に存在するCTGリピ
ートの延長によって発症するが，最近では，リピートの延長したmRNAが核内に存在することでaltemative
splicingの異常等のtoxicityが出現するという，RNA性を調べた．さらに，これらの効果を減弱する薬剤を見つけるために，分化誘導後に235種類のbionavonoidを加えて培養し，Cis−効果や細胞毒性を軽減する薬剤のスクリーニングを行った．
結最初からNGF（−）で培養した場合，コントロールと比較してCTG−250に有意なcis＿効果と細胞死は起こらなかっ
たが，いったんCTG−250を分化誘導した後は，CTG＿250に有意な細胞死が起こり，lucの発現も減少した．この時，toxicity説が有力視されている．この場合，リピート延長
がDMPK遺伝子自身の発現に影響を及ぼすcis＿効果のみ
ならず，同時に発現する他の遺伝子の発現に影響を及ぼすというtmns−効果も起こすと考えられる．しかし，こcaspase−3の活性型が増加していることより，結果としてのことをきちんと証明できるinvitroのシステムはなく，リピートがどのような機序で他の遺伝子発現に影響を及
ぼすかについての詳細な検討は行われていなかった．
私どもはこれまでにリポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）の3，非翻訳敵城に250繰り返しのCTGリピートを含むmRNAを恒常的に発現するPC12細胞のstablecel11ine
を作成し，分化誘導によって細胞死が起こることを示してきたが，今回，この細胞でのbu遺伝子の発現を調べるとともに，Cis一効果を軽減するbionavonoid（BF）のスクリーニ
ングを行った．その結果，このシステムは薬剤スクリーニ
ングシステムとして有用であることが判明した．

apoptosisが生じていると考えられた．また，Northem
blottingでは，コントロールとCTG−250で，mRNAの発現量に差は認められず，luc活性の低下は，転写後に生じるものと考えられた．
RTPCR法で調べたrau遺伝子の発現は，eXOn3

法

250繰り返しのCTGリピートをルシフェラーゼ（luc）遺伝子の下流に挿入し，それをpcAGGSneoベクターに組
み込み，PC12細胞のstable細胞を作成した（CTG−250）．
この細胞をnervegrowthfactor（NGF）存在下で分化誘導を行った後，まずNo血emblo班ngでIuc遺伝子の転写量を測定した．次にRTIPCR法でtau退伝子の発現とaltemative
splicingの違いを検出した．これらの細胞をneⅣe許OW山
bctor（NGF）存在下で1週間培養して分化誘導を行った後，新しいプレートにまき直してさらに1週間NGF（＋）もしくはNGF（・）でほぼ6日間培養し，この間のluc活性（Cis−とexonlOのsplice−Outされたtauisofbrmの発現が増えており，tauOPathyの所見に一致していた．これらのcis一効果や細胞死は，naVOne（toringin），isonavone（OnOnin とformononetin），fLavanone（isosakuranetin），XanthylatinおよびDHEA・S（dehydroepiandrosteronesulfhte）などで有意に抑制された．
考方果察

pc12細胞はNGFが培地に加えられるまでは分裂を繰り返し，核膜が一定の周期で消失する．NGFが加えられると分裂を停止し，軸索や樹状突起の形成を開始する．cTG＿250
では，延長したCTG（CUG）を含むniRNAが核内でtoxicに働き，Cis−効果と細胞死を起こすと考えられる．四種類のbionavonoidは，これを改善するものと考えられた．
これまでにDMlで，ミオ・トニアや脱力の改善に多少効果があるとされているDHEA−Sがこのシステムでも有効であったことから，この細胞はDMl治療薬のスクリーニングのために有用な系であると考えられた．
研究の意義●九州大学大学院医学研究院脳神経病研究施設神経内科●●富山医科薬科大学薬学部

今後のDMl治療薬の開発に不可欠の細胞系を樹立し，かつその候補薬剤を発見した．
一130−

参考文献
1）古谷博和．神経進歩45：92γ933，2001・
2）TapscottSJ．etal．Science293：816−7，2001・
3）SergeantN，etal．HumMoIGenetlO：2143−55，2001・
4）SeznecH，etal．HumMoIGenetlO：2717−26，2001・
5）FuruyaH，etal．BiochemPharmacol，inpress−131−

Schwartz−Jampel症候群におけるミオトニア発症機序の解明
平 澤 恵 理●緒言

SchwartzJampel症候群（SJS）はパールカン機能の部

しかし，pは有意に増加し，アセチルコリンが刺激に対して放出されやすいことを示唆した．

分欠損による疾患であることが解ったが，本疾患におけるミオトニアの発症機構は解明されていない．パールカ

考察および結論

ンを欠損させたマウスモデルを用い，神経筋の形態学的，軟骨以外で／トルカンを欠損するマウスにおいて，SJSにおけるミオトニアと同様な筋電図所見が再現された．こ

電気生理学的検討を行うことにより，SJSにおけるミオト
ニアの発症機序の解明を試みた．
方のマウスにおいて，形態学的，生理学的にアセチルコリン
エステレースの部分欠損が確認され，神経筋接合部での法

アセチルコリン伝達の異常の可能性が示唆された．今後，
このマウスを用いてSJS患者に観察されるミオトニアと／トルカン欠損マウスに，ⅠⅠ型collagenプロモーターにより軟骨特異的にパールカンを発現させたトランスジェニ

神経筋接合部の異常の関連についてさらに検討し，治療研究をすすめることが可能となった．アセチルコリン遊
離のパラメーターにはm＝nXpの相互関係がある．
Coトq欠損による先天性終板アセチルコリンエステレー

ックマウスを交配し，軟骨病変をレスキューしたマウス（SJSマウス）を作成し，病理，電気生理学的検討を加えた．
電気生理学的検討としては，針筋電図に加え，横隔膜神経
筋標本を用いた微小電極法にて，MEPREPPおよび静止膜ス欠損症ではnは有意に減少するがpが増加せず，結果としてmが有意に低下している．これはシナプス間隙でのアセチルコリン増加を抑制する代償機序と考えられて電位を記録した・またMEPP記録では，neOStigminel．0′上
釘mLを潅流液に加えその作用を検討した．さらに，EPP
記録と40Hzの高頻度連続神経刺激（EPP40Hzrun＿d。Wn

いる・パールカン欠損では，nの減少が有意でないにもか法）を行い，アセチルコリン遊離のパラメーターである皿

かわらずpが有意に増加している．これは，アセチルコリンが刺激に対して放出されやすいことを示すと考えられ（quantalcontent），D（thestoreofneurotransmitterquanta
immediatelyavailableforrelease），およびp（theprobability
Ofreleasebyanerveimpulse）を求めた．
結果

SJSマウスでは，筋病理学的に壊死再生，中心核，結合組織の増勢を認めた．電顕的には，筋基底膜の異常は認められなかった．全身麻酔下針筋電図にて自発性持続性放電を認めた．この持続電位はクラレ局所投与にて消失した．

る・pの増加はnの減少を補う二次的な変化のみではな
く，パールカン欠損による直接的な機序である可能性が考えられた．これはSJS患者の顔面筋の持続収縮に対しアセチルコリン放出を抑制するボツリヌス毒治療などの有用性を示唆すると結果と考えられた．また，大動脈などの平滑筋を使った収縮試験も検討中である．アセチルコ
リン放出が冗進している機序につき電顕レベルでの神経終末の形態変化観察も必要と思われた．

SJSマウスではほぼ正常な神経筋接合部が形成されたが，神経筋接合部におけるアセチルコリン受容体とアセチル
コリンエステレースの共局在に欠損がみられた．微小電極記録では，MEPP振幅はcontrolに比べて有意に増加していたが，EPPquantalcontentおよび静止膜電位はC。ntr。1と比べて有意差を認めなかった・MEPPのdecaytime
COnStant（T）はcontrolに比べて延長していなかったが，EPPの丁は延長していた．contr。1マウスではNeostigmineにより，MEPP振幅は有意に増加し丁も延長したが，SJSマウスではて延長したものの，MEPP振幅増加
は有意ではなかった．これらの所見から神経筋微小電極を用いた終板電位の検討からも終板におけるアセチルコ
リンエステレースの部分欠損を示唆する所見が得られた．
40Hzの高頻度連続神経刺激SJSマウスではコントロー
ルに比べて皿と刀が減少していたが有意ではなかった．

文

献1）Arikawa−HirasawaE，WatanabeH，恥kamiH，HassellJR，
ⅥmadaY‥Perlecanisessentialforcartilageandcephalicdevelopment．NatGenet23：354−358，1999．
2）CostellM，Gustaf岳sonE，AszodiA，MorgelinM，BlochW

HunzikerE，Addicks K，TimpIR，FasslerR：Perlecan
maintainstheintegrityofcartilageand somebasement
membranes．JCellBiol147：1109−1122，1999．
3）Nicole，S・，Davoine，C・S・，Tbpaloglu，H．etal．：Perlecan，
them句OrPrOteOglycanofbasementmembraneS，isalteredinpatientswithSchwartz−Jampelsyndrome（Chondrodys−
trophicmyotonia）．NbtuTeGenetics26：480−4832000．
4）Arikawa−Hirasawa，E．，Le，A．H．，Nishino，Ⅰ．etal．：StruC−●順天堂大学脳神経内科

turalandfunctionalmutationsoftheperlecangeneCause
SchwartZ−Jampelsyndrome，withmyotonicmyopathyand−132−

Chondrodysplasia．AmJ月bmGenet70：1368−1375，2002．
5）Arikawa−HirasawaE，RossiSqRotundoRL，1ねmadaY．
Absence of acety1cholinesterase at the neuromuscular
JunCtionsofperlecan−nullmice．NbtNburosci．5：119−23，
2002

−133一

Ⅶ．骨格筋形成、壊死、アポトーシス

骨格筋の脱分化と再生：筋ジストロフィーの再生治療にむけて
遠

剛●
●

広史明郎
●

●

●

●

●

●

●

●

和隆浩志

●

村瀬上次

●

河黒水末

●

●

●

一 一 子 也

●

有宗澄敬

●

越田村澤

●

大栗木小

儀子子啓臣

和晴敬晃忠

●

●

●

目

野遠田米縄

高波山久竹

研究協力者

藤

日日あたりまで著しく増加していった．AAVベクター

的筋ジストロフィーの細胞治療には，筋衛星細胞や成は染色体に組込まれずにエピソームの状態で存在するた

体の筋幹細胞が有用であると考えられている．しかしめに，細胞が分裂することにより希釈されて，Msxlのこれらの細胞は数が限られており単離も容易ではない．

発現が低下する．その結果，14 日日以降は脱分化細そこで細胞治療を行うためには，衛星細胞や成体幹細胞の再分化・成熟による筋再生が進行した．28 日目ま胞に代わり十分な数が得られる細胞を利用することがでには筋再生はほぼ完了した．

望まれる．私たちはホメオボックス遺伝子血Jをマウ

Msxlの発現がみられる筋線経の核や脱分化によっス骨格筋に形質導入すると，脱分化により分化の多能て生じた単核細胞の核には，BrdUの取り込みがみら性をもった単核細胞が多数生ずることを明らかにした．

れた．また筋線経から分裂している細胞には紡錘体のこの脱分化細胞をm血マウスに移植することにより，形成がみられた．これらの結果は，細胞がそれぞれ細脱分化細胞が筋ジストロフィーの細胞治療に有用である可能性が示された．

胞周期のS期とM期にいることを示している．さら筋再生の過程では，衛星細胞は走化性により損傷部に

dystrophinが残存しているものがみられた．以上の結果
から，単核細胞は筋練経から細胞分裂し脱分化するこに，Msxlを発現している単核細胞にはミオシン重鎖や向かって遁走して行く．衛星細胞は損傷部で増殖した後に，分化，成熟して筋線経を形成する．さらに再生筋線とによって生じたものであることが実証された．

経は運動などの刺激により肥大する．衛星細胞の遁走に脱分化細胞を単離してmCSで解析した．脱分化細は，損傷部から放出された肝細胞増殖因子（HGF）が走化性因子として働いている．一方，成熟や肥大はインス

胞はcardiotoxin注射により生じた衛星細胞や浸潤細リン様増殖因子Ⅰ（IGF−Ⅰ）によってもたらされる．IGF−Ⅰにはm血マウスの筋細胞死や線維化を抑制する作用もあ著に発現していた．このことは脱分化細胞が衛星細胞る．しかしHGFがどのような分子機構で細胞遁走を引

胞様の状態になっていることを示している．単離したき起こすのかは明らかになっていない．またIGF●Ⅰによ脱分化細胞を適切な分化条件下におくと，筋管細胞にる成熟・肥大の機構も不明な点が多い．そこで筋ジスト再分化するだけでなく，脂肪細胞や骨細胞に分化転換

ロフィーにおいて筋再生を促すことによる治療を行うたをした．このことも脱分化細胞が幹細胞状態になってめの手がかりを得るために，これらの分子機構の解明におり，分化の多能性をもっていることを示している．

取り組んだ．

以上の結果を図1に示す．

胞の集団と比べて，幹細胞マーカーであるSca−1を顕とは異なる細胞であること，そして脱分化細胞が幹細EGFPトランスジェニック C57BL／6マウス（グリ方法と結果ーンマウス）のm筋にMyc−Msxlを形質導入して生じた脱分化細胞を単離して，mdxマウスのm筋に（1）骨格筋の脱分化と幹細胞化
ICRマウスの前脛骨筋（m筋）にMyc−tagを付加したMsxI cDNAをAAVベクターを用いて形質導入した．5日後には筋線経の脱分化により，Myc−Msxlを発現している単核細胞が検出された．単核細胞の数は14●千葉大学理学部生物学教主●● 自治医科大学分子病態治療研究センタ一事●●東京大学医科学研究所腫瘍分子医学分野移植した．14 日後までにはEGFPの蛍光を発する筋線
経が効率よく再生した．これらの筋線経はdystrophinを発現していた．したがってこの脱分化一再生の系は，
筋ジストロフィーなど変性をともなう筋疾患の細胞治療への応用が期待できる．

ー137−

云1巧至

月句叩帽的〃

0

0

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仙血〝■此れ

Myotぬ餅血伽I血〟oJI

M暮Xll＿＿川＿．象＿−＿＝豊＿＿M椚el即血叫myonbo−

仁1

掴i仔erentiatedcelIs

m伽I血〟○乃

肌は‖−）苛写せ，岬￣苛戸

撃紛lTrmdi什erOntaledco脂（adi仰S．DSt00CytOS．8敗）⑳⑳⑳

図1Msxlによる筋線経の脱分化と脱分化細胞の分化転換および筋再生．成熟筋線経にMsxlを発現させると，脱分化が起きて単核の脱分化細胞が多数生じる．これらの脱分化細胞は幹細胞マーカーのSca−1を発現しており，多能性幹細胞の状態になっている．そのためMsxlの発現が消失した後に，筋管細胞に再分化するだけでなく，脂肪細胞や骨細胞に分化転換する．生体内では筋管細胞はさらに成熟して筋線経を形成し，筋再生に至る．

図2

HGFによるC2C12細胞の遊走のシグナル伝達経路．
HGFによりPI3Kが活性化され，その下流でN−WASPとWE2が活性化される・これらはArp2／3複合体を活性化してアクチン重合を引き起こし，葉状仮足の形成を誘導する．これによりHGFに対する走化性がもたらされる．

（2）骨格筋細胞の遁走の分子機構（3）再生・筋肥大における筋原線経のアクチン線推形
成の分子授構筋再生過程におけるHGFに対する衛星細胞の走化性の分子機構を解明するために，衛星細胞由来のマウス
C2C12細胞を用いて解析した．C2C12細胞をHGFで刺激すると，アクチン細胞骨格の再構成が起こり葉状仮足が形成された．さらに3次元遊走チャンバーアッセイ
で，HGFに対する著しい走化性が示された．そこで細胞内でAIp2／3複合体を介した迅速なアクチン重合を引き起こし糸状仮足の形成にかかわっているN−WASPや，同様にして葉状仮足の形成にかかわっているWE2の関与を調べた．N−WASPとWE2はいずれもHGFによって形成される葉状仮足にアクチンと共存していた．

N−WASPは単離した筋庶線経においてZ帯に局在していることが免疫蛍光染色により示された．また筋再生の過程で，早期に細胞質に分散していたN−WASPはZ帯が形成されるにつれてZ帯に局在するようになった．
このZ帯へのN−WASPの局在化は，N＿WASPのプロリンに富む部位がZ帯に入り込んでいるnebulinのC末端のSH3部位に結合することにより起こることが示

ドミナントネガティブ変異体N−WASPとWE2を発現させると，いずれもHGFによる葉状仮足形成とHGFに対する走化性を阻害した．また RNAiによって

N−WASPとnebulinの加γ加および血y加での結合

N−WASPとⅥ仇VE2の発現をノックダウンすると，いずれの場合にもHGFによる葉状仮足形成とHGF対する走化性が阻害された．さらにHGFによって活性化されることが知られているホスフアチジルイノシトール3＿
キナーゼげⅠ3K）の阻害剤LY294002を作用させるた場合にも，HGFによる葉状仮足形成とHGFに対する走化性は著しく阻害された．したがって，HGFに対する
C2C12細胞の走化性にはPI3Kの下流で働く N＿WASPとWm2の両者が不可欠であることが明らかになった．
このシグナル伝達経路を図2に示す．HGFに対する衛星細胞の走化性にも同様の機構が働いていると考えられる．

された・またN−WASPによるArp2／3複合体を介したアクチン重合は，nebulinのSH3部位を含む断片により著しく促進された．
は，IGF−Ⅰ刺激により誘導されることがpull−downアッセイと免疫共沈アッセイにより示された．IGF＿Ⅰ刺激によって活性化される PI3K のシグナリングにより
AktnKBが活性化される．AktはGSK−3β をリン酸化
して不活性化する．NebulinのC末端側には，GSK−3βによりリン酸化されるコンセンサス配列が存在しており，
この配列に含まれるアミノ酸が実際にGSK＿3β によりリン酸化された．これらのアミノ酸を非リン酸化アミノ酸に置換することにより，N−WASPのnebulinへの結合は血γ〟和および加V血で促進された．さらに肪
再生過程およびIGFによる筋肥大の過程で，N＿WASP
ドミナントネガティブ変異体を発現させた筋線経は，

ー138−

用が期待できる．実際に治療に用いる場合には，患者
Aの骨格筋の一部にMsxlを導入し脱分化を起こす．その脱分化細胞を単離して，ジストロフィンなどの原因遺伝子をレトロウイルスベクターにより導入し，安定

lGF・l

一姫

l

IOFIR

lGF・lR

悶K

P13K

Akt／PK8

Akt仲KBGSK・叩QSKdp一◎Iに発現する細胞株を得る．これらの細胞を患者の骨格筋に移植することにより，細胞治療を行う．また脱分化細胞にIGF＿Ⅰ遺伝子を導入し，安定に発現する細胞ll

1
Nebu肋−N−WASP一人叩2月COmPlex

鵬加伽−（BNJWASP

できる可能性が考えられる．

IA叩2僧￠Ompl●X

株を得る．これらの細胞はドラッグデリバリーシステ
ムとして患者に移植することにより，筋ジストロフィ
ーやその他の筋萎縮を伴う疾患の再生治療に広く利用

AC伽POIyme血雨lonl

文叫0¶br川OgOneSl●

献1）Endo，Tl：Reversalofterminally difrtrentiated stateinlskeletal

A叫叫

myocytes by SV401arge T

antigen・In

RedCかαJJo〝げJゐeCeJJq′CJe山花r〝血α砂か炉柁〝JねJed
Celli（Crescenzi，M．，ed．）LandesBioscience，Georgetown，

図3IGF−Ⅰによる筋再生，肪成熟，筋肥大における筋原線維形
成のシグナル伝達経路．（A）IGF−Ⅰがないと，GSK−3βがリン酸化されずに活性状態でいて，nebulinのC末端側をリン酸化する．リン酸化nebulinにはN−WASPは結合できず，N＿WASPは活性化されない．そのためアクチン重合に基づく筋原線維形成は起こらず，骨格筋は萎縮する．（B）IGF−Ⅰがあると，PI3Kが活性化される．PI3Kシ
グナリングはAktを活性化し，さらにAktはGSK−3βをリン酸化して不活性化する．そのためnebulinのC末端例はリン酸化されず，N−WASPが結合して活性化される．N−WASPはArp2／3複合体を介してアクチン重合を引き起こし，筋再生，筋成熟，筋肥大における筋原線
推形成を誘導する．

断面積が小さく成熟や肥大が抑制されていた．以上の結果から，IGF＿Ⅰによって誘導されるPI3Kシグナリン
グを介して，nebulinのC末端側のリン酸化が阻害されることにより，N＿WASPはnebulinに結合して活性化され，筋原線経のアクチン線推形成がもたらされると考えられる．筋成熟や筋肥大には，このアクチン線

Tbxa5pp．63−75，2002．

2）Abe，T．，Kato，M．，Miki，H．，1bkenawa，T，andEndo，Tl：
Small

GTPase¶ニ10andits

homologue

RhoTinduce

N−WASP−mediatedlong processformation and neurite
OutgrOWth．JCellSbil16：155−168，2003．
3）Sun，R，Yamamoto，H．，Suetsugu，S．，Miki，H．，1bkenawa，T，andEndo，T．：SmallGTPaseRah／Rab34isassociatedwithmembranerufnesandmacroplnOSOmeSandpromotes
macroplnOSOmeformation．JBiol．Chem278：4063−4071，
2003．

4）Abe，T，Thkano，K．，Suzuki，A．，Shimada，Y，Inagaki，M・，
Sato，N．，Obinata，Tl，and Endo，T．：Myocyte
di舵rentiationgenerates nuclearinvaginationstraversed
bymyofibrilsassociatingwithsarcomericproteinmRNAs・
J CeJJ駄目17：6523−6534，2004．
5）Kawamura，K．，1bkano，K．，Suetsugu，S・，Kurisu，S・，
Yamazaki，D．，Miki，H．，Tbkenawa，T，and Endo，T．：

維形成に基づく筋原線維形成が不可欠である（図3）．

N−WASP and WE2 acting downstream of

研究の意義

Phosphatidylinosito13−kinasearerequiredfbrmyogenic

Msxlによる脱分化細胞を移植することにより，筋ジストロフィーをはじめとした筋疾患の細胞治療への応

Ce11migrationinduced by hepatocyte growth fhctor．J
βわエαem279：54862−54871，2004．

−139−

ミオフィラメント動態制御因子の変異に起因する筋異常に関する研究−コフイリンおよびC−蛋白質に焦点をおいて
大日方

昂●

研究協力者 佐 藤 成 樹● 鈴 木 加奈子●● 宮 内 沙映子●■田 中 健太郎…花 岡 和則…

目細胞をもつキメラマウスを作成した．肢部の筋の凍結横断および長軸切片を作成，MCFイー細胞に由来LMCFの発現量が減少した骨格筋をLacZの産物であるβガラク

的

ミオフィラメントの動態制御因子，即ち，筋原線経のアクチン線経やミオシン線経に結合してそれらの維持や動的変化に関わる因子は筋収縮装置の形成と維持に重要

トシダーゼ（以下β一gal）に対する抗体で染色して個別
細胞レベルでMCFの欠損あるいはMCFの発現量低下を顕在化し，その細胞の形態変化，特に長軸切片組織像においてその細胞におけるサルコメア蛋白質の局在パターな役割を果たすと考えられる．本研究では，主として，
アクチン結合蛋白質であるコフイリン，ミオシン結合蛋
白質であるC一蛋白質に着日して研究した．コフイリンはンの変動を観察した．ミオシンを指標とした観察で，βリン酸化・脱リン酸化やPIP2の結合などによる活性制御を受けながら，様々な細胞でアクチンの集合およびアクチン線練の動的な再編成を担うアクチン結合蛋白質である．例えば，精子形成でも重要な役割をもつ1）．我々は，これまで哺乳類には非筋組織に広く分布する非筋型コフ

一galが強く発現している細胞（MCFが大きく減少している細胞）では横紋不全が顕著にみられ，筋収縮装置に大イリンに加え，筋で顔著に発現する筋型コフイリン（以下MCFと略す）の存在を見出し，コフイリンの過剰が培養筋細胞のアクチンフィラメントの集合状態を異常にすること，コフイリン遺伝子欠損ES細胞を導入したキきなダメージが生じていることが見られた．β一galが弱く発現している細胞では横紋構造がみられた．コフイリ
ン欠損は，まずアクチン線維系の変化を導くと思われるが，生体内では長い時間を経るとサルコメア全体に影響がおよぶと考えられる．
2）コフイリンとADFのリン硬化型，脱リン酸化型のメラマウスに生ずるコフイリンを欠く筋組織に局所的な崩壊・再生状態が生じ，筋原線経を損傷した筋細胞が出現することを報告した．一方，C一蛋白質は横紋筋に特異定量解析： 幼若筋にはコフィー」ン類似蛋白質である
ADFが存在するので，この蛋白質の関与も検討する必要がある．そこで培養筋細胞から抽出した蛋白質を2次元的なミオシン結合蛋白質で，ミオシンのフィラメント形成に関わるが，コネクチンやアクチンとも結合し，ミオ
シンフィラメントをサルコメア内で正しく配置させる上でも重要な役割を果たす．しかし，C一蛋白質の分子の機電気泳動で展開して，抗コフイリン抗体および抗ADF抗体によりそれぞれの脱リン酸化型，脱リン酸化型を検出，
デンシトメトリーにより，それらの量的なバランスおよび脱リン酸化型（活性型）とリン酸化型（不活性型）としてどの程度に存在するかを調べた．その結果，培養初期能ドメイン，分子機能はまだ未解明の点が多い．
本研究では，特にこれらの蛋白質が筋原線経の形成と維持にどう関わるか，その分子機構を明らかにしつつ，
これらの変異や欠矢が筋原線経にどのような障害をもたにはADFが主であるが，筋管細胞の発達とともにコフイリンの発現が上昇し，また活性のある脱リン酸化コフイ
ミスセンスオリゴ導入

らすかを探り，これらの変異に起因する筋疾患の可能性を探求することを目的とした．

アンチセンスオリゴ導入

方法と結果
1．コフイリンの欠損が筋原緑維形成に及ぼす影響について
日マウスのMCF欠損筋における筋収縮構造の変化の解
析：既報告のように，MCF遺伝子の蛋白質コード域
をLacZで置き換えたMCF欠損ES細胞（MCF＿／＿細胞）をマウス胚（胚盤胞）に注入して発生させ，MCFt／一筋■千葉大学理学部生物学科
目北里大学理学部分子発生学講座

図1アンチセンスオリゴヌクレオチドによるコフイリンの発現抑制による筋原線維形成の抑制．培養3日目の筋管細胞にアンチセンスオリゴまたはミスセンスオリゴ（対照）を導入し，更に培養3日後にアクチンの筋原線経への集合状態を抗アクチン抗体で検出した．

−140一

CCPH H

コフイリンの翻訳開始領域から25塩基に対するアンチ
センスモリフォルノオリゴヌクレオチド（以下アンチセンスオリゴ）および対照としてミスセンスモリフォルノ

CCP卜｝N弧虻14ココュ⊂貰二二艇コC／＼

オリゴ（開始コドン及び第3，6，8コドンに変異）を1mMの濃度でニワトリ初代培養骨格筋細胞（培養3日目）

A

アクチン繊札駿食
CO CI C2

コネクチン（タイチン〉総合
83

C▲

亡き

C●

C7

e●

C9

clO

RVLPSFnLQにマイクロインジェクションにより投与した．細胞内の，アクチン集合は横紋筋アクチン特異抗体SkA−06を用い

Ⅷ心筋叫日朝ン⊂右。…，∈ヨ恥インし冊て解析した．アンチセンスオリゴを投与された培養骨格筋細胞について，投与後2日，3日目に，抗コフイリン抗体（MAB−22）で間接蛍光抗体染色し，コフイリンのF一アクチン結合館あり

発現の量的な変化を蛍光測定により解析したところ，コ
フイリン量が有意に減少する事が認められた．細胞がDMSO処理されるとコフイリンは核内に移行して特徴

あリ。，。2 凸ピコ屈
。2餌
旺通

ウ

なし

的なロッド構造を作ることを利用すると，高感度でコフイリンが検出される．アンチセンスオリゴを導入された
培養筋細胞ではDMSO処理による核内ロッドが見られ

図2 A：マウス心筋C−蛋白質の分子構造と機能ドメイン．
C端に10アミノ酸の挿入あり，なしの2つの変異体（CCP（−），CCP（＋）があり，いずれもC端にアクチン結合部位がある．B：大腸菌発現系で作成した組み替え
タンパク質断片のF−アクチンとの結合能ず，コフイリン量の顕著な減少が導かれたことが確認された．また，蛋白質合成阻害剤を投与されたコフイリンの消長から，コフイリンの代謝回転はかなり速いことが確認されており，コフイリンの発現を阻害された筋細胞においては，コフイリンが迅速に量を減少するとみなさ

ミオシンフィラメント

れる．アンチセンスオリゴ導入後，1日，2日，3日後の時点で，アクチンの線維形成，横紋構造への構築の状況を調べたところ，無処理あるいはミスセンスオリゴ導入の培養筋細胞ではアクチンが明瞭な横紋構造に組み込まれるのに対して，アンチセンスオリゴ導入でコフイリン
量が減少した筋細胞の多くはアクチンが不規則な集合物
や太い線維状構造を形成し，横紋への構築はほとんど見られず，筋原線維形成が異常な状態となるのが観察された．アクチン線経を生細胞で可視化できるプローブ（蛍光標識したモエシンのC端断片）を細胞に導入して，ミスセンスオリゴ導入後のアクチン集合の経過を同一細胞

図3 C−蛋白質（MyBP−C）の分子構造と筋原線経における局在のイメージ．N端でアクチン線経に結合し，C端でミオシン，コネクテンに結合する．

で数日間追跡し，不規則なアクチン線経の束化形成を確認した．このようにコフイリンの筋原線維形成におけるリンが主要となることが認められた．次に，筋細胞においてはどちらがより優位にアクチン線経に作用するかを比較検定するために，精製された組み替え体コフ
イリンおよびADトを培養骨格筋細胞にそれぞれの内不可欠的重要性が実証された．しかし，ミオシンの集合に大きな影響は認められなかった．コフイリン欠損は，
初期にはアクチンの集合に大きな影響を与えるものの，短期的には筋原線経におけるミオシンの局在までその影響が及ぶわけではないと考えられる．
2．C−蛋白質の分子構造及びその変異が及ぼす影響について

在蛋白質の約10倍程度まで注入し，アクチン線経に与える影響を比較検討した．コフイリン注入の場合には，
速やかなアクチン線経の崩壊，アクチン・コフイリン
ロッドの形成，およびアクチン線維からのトロポミオ
シンの離脱が見られたが，ADF注入の場合にはそのようなアクチン線維系のダメージは顕著には生じなかった．従って，筋細胞ではコフイリンがより強くアクチ

マウス心筋では単一遺伝子由来でC一端側のミオシン
結合・コネクチン結合に関わる領域に10アミノ酸の挿入の有無で異なり，機能的に違いのある2つのC−蛋白質変ン動態に関与し，ADFが存在してもその役割は少ないと結論された．
3）アンチセンス法によるコフイリンの発現抑制と筋原異体が生じ，挿入をもつ機能的に脆弱なタイプが心筋の老化に伴い発現上昇することを明らかにした2）．一方，線経への影響：コフイリンの筋原線維形成への影響をより明確に調べるために，ニワトリ初代培養骨格筋細胞で，アンチセンス法によりコフイリンの発現抑制を試みた．

C−蛋白質のアクチンへの結合も筋原線経の構造，機能の制御に関わることが想定されているが，詳細は不明であり，またC−蛋白質分子におけるアクチン結合部位も十分明らかになっていない．そこで，トリ心筋C−蛋白質

ー141−

cDNAの操作により，C・蛋白質の断片蛋白質を大腸菌発研究期間内に筋原線維Z線に局在するアクチン結合タン

現系で作成して，アクチンとの結合をF＿アクチンとの共沈法で，およびアクチン・ミオシン相互作用への効果を
アクトミオシンArPアーゼ測定により解析した．その結

パク質CapZ（βアクチニン）に結合して機能抑制する蛋
白質を明らかにしたことを付記する3）．更に検討されるべき蛋白質と考えられる．

果，N一端側の4つのIgドメインを含むドメインCO−C4
フラグメント（MW約95kDa）がアクチン線経への結合能をもつこと，その結合はアクチン線経がトロボニン・
トロボミオシンをもつ，もたないにより大きな影響をう

本研究では，コフイリンおよびC＿蛋白質に焦点をおいて，分子機能および筋原線経の構築と維持における重けないこと，このCO−C4フラグメントはアクチン・ミオ
シン相互作用に抑制的に作用すること，しかしトロボニ
ン・トロボミオシンの存在により抑制が解除されること要性を明らかにした．これらミオフィラメント動態制御
因子の変異は，骨格筋異常の一因となることが推定される．本研究の範囲では，筋疾患との関わりまで具体的になどを兄いだした．さらに小断片の組み替え蛋白質を作成して検討の結果，C−蛋白質の主要アクチン結合部位はN一端に近いCO−Clに存在することを確かめた．

検討するに至らなかったが，本研究の成果が基盤的情報として寄与できることを願っている．

今後の展望

文

考

察

献

1）GuttmanJA，ObinataT；ShimaJ，GriswoldMandVbgl

コフイリンはアクチン線経の筋原線経への構築と維持に極めて重要であることが明らかになった．その欠損（機能不全）は当初，アクチン線経のに大きな影響を与え，時間を経て筋原線維全体の障害を導くと推測される．

AW：Non一muSClecominisacomponentoftubulobulbar

COmplexesinthetestis・BioIReprod70：805−812，2004．
2）SatoN，KawakamiT NN止and

分化途上の筋にはコフイリンの類似蛋白質ADFが存在するが，コフイリンが主たる役割をもつと考えられる．
一九分子量約14万のC−蛋白質はC＿端側でミオシン線
経，コネクテン線経に結合しつつ，N＿端側でアクチン線
経と相互作用して，筋原線推構造の支持や収縮運動調節に関与することが想定される．C一蛋白質分子のN＿端側における変異もまた筋原線経の構造と機能に変化をもたObinataamaA，SuzukiH，KasahamH

T・‥Anovelvariant

ofcardiac

myosin−bindingprotein−C（MyBP−C／C−PrOtein）thatisunabletoassmbleintosarcomeresisexpressedintheagesmouseatrium・MoIBioICell14（8）：3180−3191，2003．
3）ThokaM，IchimuraT；Wakamiya一恥urutaA，KubotaY；

らし，疾患の一因となる可能性を秘めている．なお，本ー142−

ArakiT；ObinataTandIsobeT：Vl，aPrOteinexpressed
tranSiently during murine cerebelIar development，

regulates actin polymerization viainteraction

with

CaPPlngPrOtein．JBioIChem278：5864−5870，2003．

筋肉形成におけるマイオスタチンの役割
野 地 澄 晴＊
■

●

⁝
⁝

●
●

分化に対する制御を，MuscleCreatinKinase（MCK）プロ
モーターの活性化を指標として解析した．細胞膜上に
ActRⅡBを発現する293細胞に，ルシフェラーゼ遺伝
子の上流にCAGAプロモーターとTGF＿βⅠ型レセプ

訂灯財のⅡ型レセプターとしてactivintypeⅡreceptor（ActR
ⅡB）がすでに報告されているので，Ⅰ型レセプターに着目し研究を行った．また，マイオスタチンによる筋啓直なった．TGF−βファミリーのシグナル伝達にはⅠ型，Ⅱ型レセプターの両者が必要である．マイオスタチン

山谷野

方法と結果
マイオスタチンのシグナルカスケードの解析を行

森中濃に近縁のTGF−βファミリー細胞増殖因子であることに着目し，マイオスタチンの天然由来の阻害タンパク質の探索および人工タンパク質の開発を行い，マイオス
タチンを利用した治療法を検討した．

●

であることがわかった2）．本分担研究においては，マイオスタチンのレセプターとシグナルカスケードについて解析を行い，さらにマイオスタチンがアクチビン●

発現するトランスジェニックマウスを作製し，筋肉の変化を解析してきた．その結果，骨格筋量が野生型同腹仔に比べ約2倍増加し，その原因は筋線維数の増加⁝

まず，肉牛において発見された点突然変異マイオスタチンに着目し，同じ突然変異を持つマイオスタチンを●スタチンのノックアウトマウスにおいては，筋肉の形成が促進されることが報告されている1）．そこで，分
担者らは筋ジストロフィーなどの疾患の治療に，マイオスタチンの誘導体が使用できるかどうかを検討した．

⁝（insulin−1ikegrowthfactor）が筋肉の量を正に調節する増殖因子として働き，一方，マイオスタチン（GDF8）が負に調節する因子であることが知られており，マイオ＊

るメカニズムが存在する．これまでの研究から，IGF

厨厨貯

●

●

ヒトの筋肉の量は通常一定に保たれているが，刺激などによりその量は増減するので，筋肉の量を調節す

章邦伸

江田松

⁚

的

■徳島大学工学部生物工学科●■徳島大学大学院ヘルスバイオサイエンス研究部■●■徳島大学ゲノム機能研究センター＝…徳島大学分子酵素センター…＝川崎医大学分子生物学教室

泰土西

●

●

■

目

●

●

美夫弘

寿光

真倉野

西板杉

研究協力者

ターであるALK（activinreceptor−likekinase）1・7のそれぞれを連結したプラスミドを導入し，ルシフェラーゼ
アッセイによりプロモーターの転写活性を比較した．
その結果ALK5存在下でマイオスタチンにより活性が上昇した．しかし，突然変異体の場合は，活性化が阻害された．解析の結果，マイオスタチンはまずActRⅡBに結合し，さらにそこにALK5、が結合することによってALK5がActRⅡBによってリン酸化をうけ，その結果，細胞内のシグナル分子であるSmad3を活性化させ，シグナルを伝達させていることが分かった．活性化されたSmad3は骨格筋細胞の分化因子であるMyoDの作用を阻害することにより，骨格筋の分化を抑制することがわかった．マイオスタチン突然変異体は，ドミナ
ンドネガティブ型のリガンドとして働き，正常なシグナルが細胞内に伝達されることを阻害することがわかった．次に，マイオスタチン結合タンパク質について調べた．ヒトおよびマウスの血清において，フォリ
スタチン・ファミリー（フォリスタチンおよびFLRG）の
主要な血清中の結合分子はマイオスタテンであることを明らかにした．また，DMD，BMD，FSHDなどの種々の筋ジストロフィー患者の血清を，マイオスタチン抗体
で免疫沈降し共沈するFLRGをwestemblottingで検出した．さらに，フォリスタチンをシーズとした探索研究を行い，アクチビンへの親和性が低下し，マイオス
タチンにより特異的なタンパク質分子（FSH）の構築にも成功した．そこで，この分子の機能解析のために，
MLC（ミオシン軽鎖）プロモーターの下流にcDNAを組
み込み，骨格筋特異的トランスジェニックマウスを作製した．得られた数系統のラインにおいて，組織学的な解析から，骨格筋は正常な形態を保ったまま，2倍程度肥大した．フォリスタチン・ファミリーおよび独自に開発したタンパク分子が生体内でマイオスタチンの阻害タンパク質として作用することがわかった．マウ
ス胚におけるFLRGとマイオスタチンのmRNAの局在を解析した．また，FLRGに対するモノクローナル抗体を用いて抗体染色を行なった．胚ではFLRGは骨格筋の遅筋に特異的に発現し，マイオスタチンと局在を共にしていることがわかった．

ー143−

今後の展望マイオスタチンに突然変異をもつヒトについての報告があり，そのヒトは筋肉が増大している以外は健康であることが報告されている3）．従って，われわれの研究か
ら，ドミナントネガティブ型のマイオスタテンやホリス
タチン誘導蛋白質を用いて，筋ジストロフィーなどの疾患の治療を行なえる可能性が示唆された（図1）．

文献1）泰江華博，西松伸一郎，波野 勉，森山啓司，野地澄
晴，骨格筋形成におけるマイオスタテンの役割，生体の科学，52：256−260，2001．
2）NishiM，N可iS．etal．，Biochem．Biophys．Res．Commun．
293：247−51，2002．
3）SchuelkeM，etal．：N．Engl．J．Med．350：2682−2688，2004．

筋ジストロフィーモデルマウスでの検討に成功
図1ドミナントネガティブーマイオスタテンとフォリスタチンをシーズとした
マイオスタチン特異的な阻害分子による筋肉形成の促進

ー144−

筋細胞特異的に必須な役割を果たしているインテグリン＿
ILK−amXin系シグナル伝達の研究
鈴
研究協力者

目

木

厚＊

山 路
聡＊＊ 三
松 田 知 栄＊＊＊ 林

島渉＊＊
由起子＊＊＊＊

的筋細胞の勝原線経と基底膜を連結する分子装置としてはIntegrin系，およびDystroglycan系が知られており，
これらいずれの欠損も筋ジストロフィーの発症に結びつくことがこれまでに明らかとされてきている．本研究では，integrin−ILK−afrixinからなる新規のintegrinシグナル伝達系の基礎的解明を，まず非筋細胞で，そして最終的には筋肉細胞で進めることにより筋ジストロフィー発症機構に関する基礎的研究の推進をめざした．
方法と結果①我々はすでにILK−affixin系を介したintegrinシグナルが非筋細胞の伸展初期に決定的に重要な役割を果たしていることを明らかとしてきている（Yamqjietal．J．C．B．
153：1251−1264，2001）．このシグナル系の実態を明らかとするために，活性型a疏xin変異体（N末端断片：以下，RPl）の細胞伸展活性への影響を培養上皮細胞（MDCK細胞）を用いて詳細に解析した．Rplを高発現したMDCK
細胞は上皮様のコンパクトな形態を消失し，葉状突起をいくつも伸ばした線維芽細胞様の形態となるが，その変化は，Raclおよび，その活性化因子の一つ，αPixそれぞれの優性抑制変異体の発現によって顕著に抑制された．
αPixはa餌XinのRp−1領域に結合すること，また，RPl
高発現細胞においてはRacl，Cdc42が活性化する（Rh。
は変化なし）ことも示された．以上の結果から，amxinの下流ではαPixを通じてRacl／Cdc42の活性化が起こり，そのことによってactinの重合，葉状突起の形成が進むと考えられた（1）・実際の細胞内ではIntegrinからの刺激を受けて活性化したILK（2）がamXinのRP2嶺域をリン酸化
し，そのことによってRPlが開放され以下にシグナルが伝わると思われる（図1）．
②一方，amxinをbaitとしてさらに結合タンパク質を検索したところα−aCtininが同定されさらに内在性にもこれらが基質接着依存的に結合することがわかった．したがって，amxinはi山egrin刺激に応じてαPixとともにα−aCtininとも結合し，これら両者との結合を介して相乗的

ACUnpo暮ymorkatbn

図1本研究によって明らかとなった，非筋細胞における
integrin−ILK−af罰xinシグナル系の分子機構 （詳細は本文参照）③一方，RNAi法を利用してa餓Xinをヒト線維芽細胞においてノックダウンすることに成功しこれまで優性抑制
変異体を使って示してきた基質接着におけるa餓Xinの重要性をさらに確認した．また，筋肉における
integrin−ILK−afnxin系の役割を研究する第一歩として，培養筋芽細胞，C2C12においてもamXinノックダウンの効果を検討し，amxinの発現低下がsarcomericmyosinII，
myogeninなどの筋分化マーカーの発現誘導の遅れを引き起こすことを明らかとすることができた（図2）．
A餌xinは，分化した筋管細胞に見られる発達した焦点接着様の構造において強くILKと共局在していることも明らかとなり（図3），こうした構造において筋原線維構造の発達に寄与している可能性が強く示唆された．
考にアクチン重合を促進するものと思われる（図1）．

察ILK，afnxinはヒト骨格筋において形質膜，特にZ膜と接＊横浜市立大学大学院医学研究科 分子細胞生物学教室
相同
病態免疫制御内科学教室…独立行政法人，産業技術総合研究所，神経情報研究部門
日日国立精神神経センター，神経研究所，疾病研究第一部

するコスタメアに濃縮していることをすでに我々は明らかとしている・線虫，ショウジョウバエのamXin，ILKのホモログは，integrinとともに筋原線経の発達，筋細胞−145−

研究の意義本研究は，筋ジストロフィーの病態やその発症メカ
ニズム，さらには治療を直接の対象として正面からその解明を目指すものではない．しかし，それらの研究ために必須な土台を築くという意味で意義がある．実
SartOmedt
Myo血ⅡC（Ml陀0）嶋縛繭靡戦醜細戚

叫喝e血
（F5D）

線輪醸静秘・感激際，本研究班を通じた林，松田両博士との共同研究により，amxinが肢帯性筋ジストロフィーの一種，
LGMD28や三好型筋ジストロフィーの原因遺伝子産物，
dys氏rlinと形質膜で結合し，かつ患者筋においては

図2 a取inノックダウンによるC2C12筋芽細胞の分化抑制．
図は汀Sによる分化誘導3日目の結果を示している．
lLK

dysfbrlinとともに強くその局在が乱されていることが明らかとなった．本研究は，これら筋疾患の研究に直A仙接深く関わる可能性もあり，その点でも今後なお一層研究を進める意義があると考える．

孝 一≠

文

献

1）MishimaW；A．Suzuki．S．1ねmqji，R．ヽbshimi，A．Ueda，TKaneko，J．1hnaka，YMiwa，S．Ohno，andY．Ishigatsubo．
The坑rstCHdomainofa伍xinactivatesCdc42andRacl

図3 分化誘導3日日のC2C12におけるILK（左），およびamxh（右）の細胞内局在．Amxinは，分化した筋管細胞で見られる発達した焦点接着様構造においてのみILKと共局在していることがわかる（矢印）．

through α PIX，a Cdc42／Racl−SPeC摘c guanine
nucleotideexchanginghctor．GenestoCells9：193−204，
2004．

の成熟に必須な役割を果たしていることが遺伝的にわかっている．これらの結果は，本シグナル系がヒト骨格筋の発生においても必須な役割を果たしている可能性を強く示している．非筋細胞を用いて詳細に進めてきた解析
結果は，今後筋細胞におけるこの基質接着系の働きを明らかとしていく上で重要な基礎となるはずである．筋細胞における解析はまだ緒についたばかりであるが，培養
筋芽細胞を用いた予備的実験では，予想通りamximが骨2）1hm頑，S．，A．SuZ：uki，H．KanamOri，W Mishima，M．
Tbkabayashi，K・Fttjimaki，N．Tbmita，S．Fttjisawa，S．
Ohno，and Y．Ishigatsubo．Possble role ofILK−a餌xin
COmplexinintegrln−CytOSkeletonlinkageduringplatelet
aggregation．Biochem Biophys Res Commun297：1324−1331，2002．

3）％mqji，S．A．St）Ztlki．H．Kanam0ri，W Mishima，R．

格筋の発生，成熟に必須である可能性を強く示唆する結果が得られた．この三年間の成果を基礎に研究をさらに展開することによって，ヒト骨格筋の形成，維持の基礎
的メカニズムに迫れるものと確信している．

−146−

ヽbshimi，H・1hkasaki，M．Thkab町aShi，K．Fqjimaki，S．
F可isawa，S．Ohno，YIshigatsubo．Afnxininteractswith
a−aCtinin and mediates integrln SlgnalingforreorganizationofF−aCtininducedbyinitialcell−Substrateinteraction．J．Cell．Bio1165：539−551，2004．

筋分化・筋形成とSix遺伝子とのかかわり
川

上

潔●

研究協力者 尾 崎 秀 徳● 池 田 啓 子●

緒

低下し，筋繊維の太さはやや増加し本数が減少傾向がみ

言肋遺伝子群は保存領域としてSixドメインとホメオド
メインを有するホメオボックス遺伝子ファミリーであり
ヒト及びマウスでは肋Jから助βの6種類が存在する．ぷⅩタ

られたが，有意な差があるとは認められなかった．
筋肉量の低下の原因を探るために，坤0那加遺伝子の発現を10．5日胚で調べたところ，蝕ノ欠損マウスでは，は筋緊張性ジストロフィーの病態の一部，白内障や性腺異常をになうことが遺伝子欠損マウスの解析から明らかとなっている．ショウジョウバエや，線虫においては且Ⅸ〜

その発現バターンがほとんど変化していないのに対し，ホモログであるD−Six4やCbh−35遺伝子の変異体匹irbyet
al，2001，Ⅵmowitzetal，2004）で，骨格筋融合や，筋細胞の分化に異常が見られ，且乙打ホモログの骨格筋形成への関与がしめされてきた．一方マウスでは，ぶ加J，肋4および肋Jあると考えられた．

は体節や筋芽細胞，骨格筋細胞に発現し，骨格筋の分化・増殖の制御を行うと考えられてきたが，生体内での実証はなされていなかった．私たちは，g加4遺伝子欠損マウス

肋4βの3つのサブファミリーからなる．ショウジョウ

の作成解析を行ったが，骨格筋細胞の分化や増殖には影響が見られなかった（Ozakietal，2001）．また，Sik5欠損
マウスにおいても骨格筋細胞の分化や増殖には異常がみられず，肋Jとの機能重複が示唆されていた．私たちは∫加J
遺伝子欠損マウス及び肋J助4遺伝子欠損マウスを作成

蝕4によって担われている．

することで，両遺伝子が骨格筋の形成に重要な役割を果たすことを兄いだした．

しており，少なくとも坤0騨肋の発現を生体内で調節していることがその機能の一つである．

方

助J助イ二重変異においては，叫のge肋の発現は大きく低下しており，このことが筋分化の異常の原因の一つで考察

ぶ正遺伝子群は，構造上の類縁関係からぶ加J〝，ぶ加j佃，
バエや線虫ではぶ江沼サブファミリーが骨格筋の分化や形成に必須であるが，この機能はマウスでは主に助Jと結論

マウスの発生過程において体節での発現が見られた
肋J及びぶ正4は骨格筋の分化と形成に重要な機能をはた

法

参考文献

Sixlタンパク質のコード領域にEGFP遺伝子を挿入することで助〟遺伝子欠損ES細胞を作成し，キメラマウ

1）Kitby，R．J．，Hami1ton，G．MりFinnegan，D．J．，Johnson，K．J．

andJarman，A．P．Drosophilahomologofthe myotonic

スを経て蝕J欠損マウスを作成した（Oakietal．2004）．
また，肋J倣4二重欠損マウスは肋4遺伝子欠損ES細胞（Ozakietal．2001）に肋Jを標的遺伝子組み換えすることで作成した．肋J遺伝子の欠損はPCR，サザン法にてdystrophy−aSOCiatedgene，SIX5，isrequiredformuscleand

伊nddeWlopmLCumBiolll：1棚−1049，2001．
2）Yanowitz，J．L．，Shakir，M．A．，Hedgecock，EりHutter，H．，

Fire，A．Z．andLundquist，E．AUNC−39，theC．eleganS

確認し，肋J遺伝子の発現についてはノザン法および，
insituハイプリダイゼーションによって欠損マウスでの消失を確認した．

homolog ofthe human myotonic dystrophy−aLSSOCiatedhomeodomain proteinSix5，regulates ce11motilityand
diffbrentiation．Dev．Bio1272：389402，2004．

3）Ozd亘HりW輌Y，肋hi，KりK血murちKり叫
結果A．，Urase，K，Momoi，T，Sudo，KりSalngami，J，Asan0，M．，

肋J欠損マウスでは野生型に比べ，胴部の脊椎周囲の骨格筋の低形成がみられ，体壁の骨格筋層も薄くなっていた．肋J倣4二重欠損マウスでは，胴・頚部ともに脊椎の周囲の骨格筋が低形成となり，体壁の骨格筋は著しく減少していた．また，四肢の骨格筋は全く観察されな

Iwakura，YandKawakamLK．Six4，aPutativemyogenin
gene regulator；is not essemial

for motue embryonal

development．Mol．Cell．Bio121：3343−3350，2001．
4）Ozaki，H．，Nakamura，K．，Funahashi，J．，lkeda，K．，Yamada，かった．脊椎周辺の筋肉の筋繊維密度は約半分くらいに

G，Tbkano，H，，Okamura，HりKitamura，KりMuto，S．，

Kotaki，H．，Horai，TりSudo，K．，Iwakura，Y，and

Kawakami．K．SixIcontroIspattemingofthemouseotic●自治医科大学分子病態治療研究センター細胞生物研究部

VeSicle．Development131：551−562，2004．

一147−

SIX5の標的分子と筋緊張性ジストロフィーの関わり
川

上

潔●

研究協力者 佐 藤緒

言

DMlはD朋Pg遺伝子下流のCTGリピートの伸長が原因で起こる全身性疾患である．リピート伸長がDMlの病態に関与する機構は，伸長したCUGを含むRNAの核内への蓄積によるドミナントネガティブ効果とCTGリピート周辺の遺伝子，β〟搾り，β〟Pだ及びぷ〃行の発現低下による
Loss or魚InCtionの効果の両方が原因と考えられている．
肋5遺伝子欠損マウスの表現型からは丘以3遺伝子の発現低下がDMlの一部の症状（白内障や性腺機能低下症）に関与していると示唆された．本研究ではDMlの性腺機能低下症の発症における㍊符遺伝子の関与を明確にすることを目的に，ヒト顆粒膜細胞でのSIX5タンパク質の標的遺伝子の同定を試みた．

滋●

2）五択J：エストロゲン受容体α（ERα）．遺伝子欠損マ
ウスは両性ともに不妊．
3）刃R〃リ：ERαのコリブレッサー．遺伝子欠損マウスのメスは排卵異常，さらに妊娠を維持できないため不妊．
4）Gdmイ：転写因子．Gab4uマウスでは性腺形成が初期段階でブロックされる．
5）βか〃F：ニューロトロフィン．BDNF阻害抗体は卵原細胞の生存率を低下させ，受容体のnkB欠損マウスは卵胞を形成しない．
また，ジスフェルリンやジストロブレビン，白内障の原因遺伝子（αBクリスタリン，キヌレニン・モノオキシゲナーゼ）も標的候補として同定された．
考方法

Six5タンパク質の標的遺伝子群を同定する方法を開発した（Satoeta1．，2002）．Ⅵ〉16タンパク質の強力な転写活性化ドメインを融合させた野生型Six5タンパク質（W16−Sk5），及び特異的DNA結合能を欠く変異型Si裏タンパク質（VP16−Si癌W241R）をウイルスベクターに組
み込み，顆粒膜細胞株に感染させ，野生型融合タンパク質
で特異的に誘導され変異型タンパク質では誘導されない遺伝子群をマイクロアレイを用いてスクリーニングした．
用いた細胞株は子宮癌（顆粒膜細胞腫）より樹立されたヒト顆粒膜細胞株KGN（Nishieta1．，2001）である．用いたアレーはAgi1ent社製Humarlマイクロアレイ（12，814ク
ローン，97％がマップされたヒト遺伝子に対応）である．
アデノウイルスベクターをKGN細胞に感染させ，24時間
後にRNAを抽出，Cy3とCy5標識のcDNAプローブを合成した．マイクロアレイに対する競合ハイブリダイゼーシ
ヨンを行い，野生型と変異型とで2倍以上発現レベルが異なる遺伝子を標的候補として同定した．
結果

アレイ上にスポットされた12，814遺伝子の内の2．4％，
310遺伝子が標的候補として同定できた．不妊症や遺伝子欠損マウスの表現型から卵胞の形成や機能に関与することが強く示唆される以下の5遺伝子が含まれていた．
1）C】？J鋸J：アロマターゼ．遺伝子欠損マウスのメスは察

スクリーニングの結果，性腺機能低下症と関連があると考えられる遺伝子（標的候補）が複数同定された．
性腺の形成や機能にはステロイドホルモンが深く関わっているが，今回SIX5の標的候補として，その代謝や作用を制御する複数の遺伝子が同定された．さらに性腺の発生に重要な役割を果たす転写因子やシグナル分子の遺伝子も含まれていた．si点の卵巣周辺での主要な発現部位は顆粒膜細胞であり，そこでのSi裏の発現低下がこうした遺伝子の発現レベルを局所的に変動させ，卵胞の形成や機能を低下させるという機序が示唆され非常に興味深い．今後，肋J遺伝子欠損マウス
でこれらの標的遺伝子群が発現異常を起こしているかどうかを検証し，性腺機能低下症との関連を明確にする必要があると考える．
結論

顆粒膜細胞において，SIX5タンパク質によって制御される遺伝子群の候補を310同定した．これらの中には，性腺機能低下症や不妊との因果関係が示されている遺伝子が含まれており，それ以外にも性腺の形成や機能に関係する可能性の高い遺伝子群が多く含まれていた．
参考文献
1）Sato，S・，Nakamura，M．，Cho，D．H．，Tbpsco吼S．J．，Ozaki，

卵胞形成不全のため不妊，オスも進行性の精子形成不全．
●自治医科大学分子病態治療研究センター細胞生物研究部

H・and Kawakami・K・Identincation oftranscriptionaltargetsfor Six5：lmplicationforthe pathogenesis of
myotonic dystrophytype1．Hum．Molec．Genetll：
1045−1058，2002．

ー148一2）NishiY，Yanase T，Mu YiOba K，IchinoI，Saito M，CharaCterizationofasteroidogenichumangranuIosa−like

NomuraM，MukasaC，OkabeT；GotoK，TbkayanagiR，tumor cellline，KGN，that expresses nInCtional

Kashimura YiHqiiM，Nawata H．Establishment andfo11icle−Stimulating hormone receptor．Endocrinology
142：437−45，2001．

−149−

Dystroglycan結合蛋白質MAG1−1の生理機能の研究
二 宮 治 明＊
研究協力者

緒

細 川

言

MAGI−1（MAGUKwith aninverted amngement of
PrOtein−prOteiniLlteraCtion domains−1）はそのWW domain
を介してβ−DGに結合する．培養細胞での発現系において，MAGI−1はそのPDZdomainを介してβ−Cateninと結合し，TCF几EF−1を活性化させた，また，mdxマウス，

浩●

く発現していた・これらの上皮系組織で†和一DGも発現していたが，MAGI−1は上皮細胞同士のjunctionおよび基底膜側面に広く分布したのに対し，β−DGは基底膜側に比較的局在していた．皮膚切片の染色の結果，毛母
乳頭周囲および毛髄鞘の表皮細胞にMAGI●1の発現を認めた（図2）．

ヒトDMD骨格筋の形質膜では，抗MAGI−1／抗β一Cateninのいずれの染色性も増強しており，その増強は再生線経で特に顕著だった．これらの結果から「PDG伽AGHノβ−
catenin／取rシグナル伝達系が骨格筋の再生に必要であSA LacZ

る」という仮説を提唱した（図1）．われわれの目的は，マウスモデルを用いてこの仮説を検証することである．

血
：感

方

イ
十

法

①MG1−1ノックアウトマウスを作製し，m血マウスと交配して筋再生に対する効果を検討する．
②MAG1−1に対するdominant−negativeconstruCtを発現するtmnsgenicmouSeを作製し．これとmdxマウスと交配して，筋再生に対する効果を検討する．
結果①MAGト1ノックアウトマウスの表現型
MAGト1ノックアウトマウスは胎生致死であり，遅く
ともElOまでに死亡した．E12へテロ胎児のwhole
mountx−gal染色（LacZがMAG1−1promoterでドライブされている）では全身の皮膚での発現を認めた．組織切
片のX−gal染色，抗MAGI−1染色の結果，MAGI−1は心筋，脳脊髄の他，皮膚，舌の表皮および消化管上皮に強図1筋再生におけるMAG1−1の役割についての作業仮説＊鳥取大学医学部神経生物学
拍京都大学大学院情報学研究科

図2 MAGI・1KOヘテロマウスでのMAGI−1およびβ一DGの発現
A：geneけapcons加Ctのhsertionの位置．
B：アダルト心筋、LacZ染色
C：アダルト骨格筋、LacZ染色．
D：E12胎児、WholemountLacZ．
E：E12胎児切片、抗MAG日免疫染色．
F：E12胎児舌上皮切片、LacZ＆免疫染色
G：E12胎児小腸上皮切片、LacZ＆免疫染色−150−

MAGト1ノックアウトマウスは胎生致死であり当初の目的であったmdxマウスとの交配には使えない．pDZA♂♂ ♂♂ B

ファミリータンパク質のいくつかについて，そのPDZ
domainのみを発現させると，dominantnegativeformとして働くことがわかっている．そこで，MAGl＿1の5つのPDZ domaihの各々を単独で発現するコンストラクトを作製し，培養細胞での発現系でその効果を検討した．

撫

亨甚⊆頑ま

②MAGl−1／PDZ5のdominant−negative効果（1）COS細胞でのβ−Cateninのpulsechase一全長のMAGト1の発現により，β−Cateninのhalf・1iftは延長する．pDZ5の発現は全長MAG1−1の効果を阻害するのに対して，
PDZ1−4にはそのような効果はなかった．

Di和ぎin2％HS（2）HEK293細胞でのTbf−1ucreportergeneassay一全長のMAGI−1の発現により，β−CateninによるTbflluc発現誘導効果は増強される．pDZ5の発現は全長MAGI＿1の効
果を阻害するのに対して，PDZ1−4にはそのような効果はなかった．
（3）DG発現量を低下させたC2細胞の分化誘導での細胞死一全長のMAG1−1の発現により，細胞死は抑制される．
PDZ5の発現は全長MAG1−1の効果を阻害するのに対して，PDZト4にはそのような効果はなかった（図3）．この系では，PDZ5単独の発現でも細胞死が増加した．

‡0

40

20

40

F M舶トI
PpZ5

考

併P
MAGトI
MAGトトPpZ5

嚢

MAGHノックアウトマウスの胎生致死の原因は不明
であるが，上記の発現パターンから胎児期での上皮系器官の形成にMAGト1が必要であると推察される．また，心筋で強い発現が認められたことは筋発生・再生におけるMAG日の役割というわれわれの仮説を支持する．毛根基底細胞の増殖分化にはβ−Catenin爪fシグナル伝達が重要な働きをすることが知られている．毛根基底細胞にMAGト1の強い発現が認められることは，その増殖分化におけるMAG1−1の役割を示唆している．
一方，少なくとも培養細胞系では，PDZ5がMAGI＿1％P卜pog沼押／￠FP−pOg汁ive

図3MAGHPDZ5のdominantnegative効果（DGantisense
DNAを発現するC2細胞の分化培地での細胞死）
A：AntisenseDNAの発現によるDGの発現抑制．
B：分化培地でのMHCの発現，抗MHC免疫染色．
C：分化培地での細胞死，PIの取り込み．
D：分化培地での細胞死，hnTアッセィ．
E：β−Catemi（wild−typeおよびS26Aconstitutiveactivefbm）
による細胞死の抑制．
F：MAG1−1による細胞死の抑制とPDZ5のdominantnegadve
効果．

によるβ−Catenin安定化効果に対してdominant negative
bnnとして働く．
研究の意義
MAG1−1ノックアウトマウスを作製し，MAGI−1は胎生期においておそらく上皮系組織の器官形成に必要であることを示唆した．また，胎生期の心筋で強い発現が認められたことは筋発生におけるMAGl＿1の役割を示唆した．しかし，これまでの結果では，筋再生におけるMAGト1の役割を証明できていない．ノックアウトマウ
スを使わない方法として，MAGI＿lに対するdominant

参考文献
1）Dobrosotskaya，I．etal．：MAG1−1，amembrane−aSSOCiatedguanylate kinasewith a unlque arrangement Ofprotein−proteininteractiondomains．J Biol．Chem．272：31589−
31597，1997．

2）Cossu，GandBorello，U．：Wntsignalingandtheactivation
Ofmyogenesisinmammals．EM80J18：6867−6872，

negativeformの発現を試み，これまでにPDZ5がMAGI−1によるβ−Catenin安定化効果に対してdominantnegativeゐmとして働くことを明らかにした．このコンストラ

1999．

3）LauraRPetal．：MAGI−1：awidelyexpressed，altematively

クトの組織特異的発現により，MAGトlの筋肉での機能を解析することが可能であると期待している．
ー151−

Splicedtightjunctionprotein．Exp．CellRes．275：155−170，2002．

細胞死抑制の蛋白質細胞内導入治療法の開発
都め研

甘隊

大

崎

●

尾森

●

美也朗
●

●

●

●

久信秦

●

解井山

山永片

●

ぐ一

背景と目的
私たちは，アポトーシス抑制因子Bcl＿XL蛋白の立体構

男●

朗み郎

●

●

成

澤辺

●

田

大波桂

●

光行晴

定正智

生川出

麻荒平

研究協力者

太

ノ酸に富むので，軟骨基質を通過して軟骨細胞へ到達するのは困難と思われたが，PTD−FNKは軟骨基質を通過して，軟骨細胞内へ導入され細胞死を抑制できることがわかった3）．

造を決定し，その構造を基に強力にアポトーシスを抑制する蛋白をデザインした．BcトxL遺伝子を3箇所変え，3個のアミノ酸残基を置換することによって，アポトー
シス抑制活性が飛躍的に上昇したスーパーアポトーシ（3）アポトーシスの抑制：PTD−FNKはpMレベルでスタウロスボリンによって誘導されたアポトーシスをス抑制因子を人為的に作成することに成功した（1）．その蛋白を変異させた3アミノ酸FNXをもじってFNKと命名した．FNK遺伝子を導入し，FNKを発現させた細胞抑制した．また，初代培養神経細胞のグルタミン酸によは，種々の細胞死誘導刺激（カルシウムイオノホア，酸化ストレス，スタウロスボリン，血清除去，mti−FaS，温熱処理，m−16，カンプトテシン，トリコスタチンA，ヒン酸による神経細胞死をPTD−FNXが抑制した場合に，細胞質内カルシウムの挙動が変化した．グルタミン酸

る細胞死もpMオーダーで抑制した2）（図2）．これらの効果はPTD−Bcl−XLよりも明らかに強かった．グルタミ

官学≡ト芦屋モ色
合顎亡〇一u；uOu笠L〇三﹂

本研究の目的は，このアポトーシス抑制因子を用いて細胞死を抑制して治療に実際に用いるために，HIVのT如

PTD−FNK（30nM

…炉

方法と結果
FNK遺伝子に恥析∬V蛋白由来の11アミノ酸ペプチ
ド（PTD）遺伝子を結合した遺伝子を結合し，PTD＿FNK
遺伝子を作成した．同様に，PTD−Bcl−XL遺伝子と，PTDとFNKの間にmycペプチドを挿入した遺伝子も作成した．これらの遺伝子を大腸菌に導入し蛋白質を合成させ，

身空●l亡；＞焉−○∝蛋白の蛋白質導入領域（PTD：prOteintranSductiondomain，
11アミノ酸残基）をFNKに結合させ，蛋白質を細胞の外から細胞内へ導入させ，細胞死を抑制する治療法を開発することである．

訂＝冊
叫

ドロキシウレア）に対しBcl−XLよりも細胞死を強く抑制した1）．

TimothrI

図1PTD−FNKタンパク質の培養細胞内への導入．pTD＿FNKを添加して各時間毎に免疫染色をした（上図）．経時的に取り込まれ（左図），除去することによって速やかに細胞内から除去できた（右図）．

側
3 0
卸
Ⅷ
○

（1）培養細胞への導入：PTD−FNX蛋白を神経芽培養
細胞の培養液に添加すると，PTD−FNKは速やかに細胞内にはいり，ミトコンドリアへ達した．60分で定常状態に達した（図1）．逆の培養液からPTD−FNXを除去すると半減期2時間で減少した（図1）2）．

弱＞OJL星空OUぎ芸とnめー○しき∈コ之

PTD−FNK蛋白，PTD−Bcl−XL蛋白，PTD−myC−FNK蛋白を精製した．これらの蛋白を培養細胞に添加して，その影響を調べた．

0

0．3

3

30

3003000

PTD−FNK（PM）（2）軟骨スライス培養細胞への導入：軟骨基質はコンドロイチン硫酸などの酸性基に富む．pTDは塩基性アミ■日本医科大学大学院医学研究科加齢科学系専攻細胞生物学分野＊＊日本医科大学第二内科−152−

図2 初代神経培養細胞の細胞死の抑制．各濃度のPTD＿FNXで処理後グルタミン酸により細胞死を誘導した．
A：PTD−FNKはpMレベルの低濃度でも細胞死を抑制した．B：PTDTFNXの効果は少なく，PTDを結合しない，
m蛋白質だkでは効果がなかった．

PTD−FNK（0．4mg／匹，i．p．）
Pretreatment

VehicleOfPTD−FNK

5minischemia

考

【コ ノ

250mm

5011m

図3 前脳虚血による神経細胞死の抑制．pTD−FNK投与後，頸動脈を梗塞し，5分間の虚血状態にした後，血流を再開した．遅延性神経細胞死への効果を見た．対照スナネズ
ミではCAl神経細胞がほぼ全滅している（左図）のに対し，PTD−FNKは神経細胞死を抑制している（中央図）．
による細胞死はネクローシスと考えられているので
PTD−FNKはアポトーシスのみならずネクローシスも抑制できることが示唆された．
（4）PTD−FNKのネクローシス抑制：四塩化炭素は典型的ネクローシスをおこすことが知られている．pTD＿FNK
は四塩化炭素処理した細胞をアポトーシス経路へ変換
して，細胞死を抑制することが明らかとなった4）．すな
わち，PTD−FNKはアポトーシスだけでなく，ネクロー
シスも有効に抑制できるので，治療としてもちいるのは広い範囲で有効であることが期待できる．
（5）PTD−FNKの動物組織への導入：実験動物（マウスとスナネズミ）の腹腔，静脈，皮下にPTD＿FNKへ注入した．pTD−FNKの動態について軋抗Bcl−Xモノクロー
ナル抗体と抗myc抗体を用いた免疫染色によって定量した．ミトコンドリアの細胞内局在場所を明らかにするために，蛍光色素MitoTrackerRedで染色した．腹腔や静ルでは，pMレベルで細胞死を抑制できるので極めて微量で効果を発揮する．pTD−FNK蛋白は軟骨基質を通過して軟骨細胞内へ導入され，脳血管関門を通過して神経細胞へも到達できた．また，PTD−FNKはアポトーシス
のみならずネクローシスも抑制できるので，広い範囲の治療法に応用可能であると期待される．
今後の展望
人工的に細胞死抑制効果を強くしたスーパー細胞死
抑制因子RNKはPTDと結合することによって，効率良く細胞内へ導入され，微量で細胞死を抑制したので，一般的に細胞死を抑制し，広い範囲で細胞死を抑制する治療法に適用しうることが示された．様々な疾患モデル動物を用いて適用範囲を拡大することを進行中である．
文

献1）Asoh，S．，Ohtsu，T，andOhta，S．：TheSuperAnti−q）OPtOtic
FactorBcl−XFNKConstruCtedbyDisturbingIntram01ecular
PolarInteractionsin Rat Bcl−XL．J．Biol．Chem．275：
37240−37245，2000．

2）Asoh，S．，Ohsawa，I．，Mori，T．，Katsura，K．，Hiraide，T．，
Katayama，Y，Kimura，M．，Ozaki，D．，1hmagata，K．and
Ohta，S・＝Protection againstischemic brain叩ury by

PrOteintherapeutics．Proc．Natl．Acad．Sci．USA．99：
17107−17112，2002．
3）Ozaki，D・，Sudo，K・，Asoh，S．，1ねmagata，K．，Ito，H．，Ohta，S．：
Transductionofanti−qPOptOticproteinSintochondrocytes

脈にPTD−myC−FNKを注入すると脳神経細胞にも抗myc抗体で染色される細胞が出現した．皮下注射によって，
少なくとも肝細胞へPTD−FNKは導入された．
（6）PTD−FNKの治療への応用：スナネズミの5分間全脳虚血による海馬CAl領域の神経細胞死は，PTD−FNKを腹腔投与することによって抑制された2）（図3）．四塩
化炭素はステロイド，アルコールによる肝障害にも効果的であることがわかった4）．

察

PTD−FNKを用いた細胞死抑制の特徴として，PTD−を結合させた蛋白は核に移行することが一般的であるが，PTD−FNKはミトコンドリアへ到達した．培養細胞レベ

Non−treatment

incartilagesliceculture．Biochem．Biophys．Res．Commun
313：522−527，2004．
4）Asoh S，Mori1㌧NagaiS，Ⅵ汀nagataK，NishimakiK，

MiyatoY，ShidaraY，OhtaS．：Zonalnecrosispreventedby
tranSductionoftheartincialanti−deathFNKprotein．Celldeath＆di飴rentiation，2005（inpress）−153−

Ⅷ．ミトコンドリア異常症と治療

ミトコンドリア脳筋症のタウリン療法−培養細胞を用いての効果検定
太 田 成 男●
研究協力者

石

井

徳

恵●

西

槙

貴代美●

山

解

安 川 武 宏●● 桐 野 洋 平●● 鈴 木美●MltochondrIa）tRNALJ

尉

澤

郁

（UURI

朗●

転写後の修飾o Nmlt即仏

○

ぶ芋かヰ
鵬

U
T

l
▲
▲▼C
リ■

■ヂ

定された．MELASはtRNA−Leu（UUR）遺伝子，MERRF
はtRNA−kS遺伝子の点変異（それぞれ，塩基番号3243，3271と8344など）によって発症する．長年の私たちのグループの研究により変異tRNAに関して以下のこ

大

勉●●

⁝
幸
・
■

背景と日的
ミトコンドリア脳筋症のMELASとMERRfの原因はミトコンドリアtRNAの点変異であることが1990年に同久

0人32436Stl諷叫Irさd0

カ→カとがらが明らかになった．
変異tRNAを精製して構造を決定するとMELASの3243変異tRNAと3271変異tRNAでいずれも変異tRNAのアンチコドンの塩基で本来修飾されるべき塩基が共通

TmSU▲■uⅦd

Tm；taUrinomethylgroupに修飾されていなかった（図1）1）．さらにMERRfの

MELAS

MERRF

mttRN人血（肌呵mttRNAL昨鴇

8344変異をもつtRNA−bSにおいてもアンチコドンの塩基修飾が欠損していた2）．さらに解析をすすめるとアンチコドンが修飾されていない変異tRNAはmRNAに結合

舛UAA

西

できなくなり蛋白合成を停止させることが判明した3）．
この結果は，MELASとMERRFの変異tRNAではアンチコドンの塩基修飾が欠損しているために，tRNA機能が不完全となり蛋白合成が途中で停止し，不完全な蛋白を合成することを示唆している．さらに，この修飾塩基の構造を決定すると正常tRNA一Leu（UUR）とtRNA−Lysのア
ンチコドンにはタウリン基が結合して修飾していた4）．
すなわち，MELAS，MERRFの原因であるmtDNA点変異によって，それぞれ変異tRNA−Leu（UUR），変異tRNA一旬Sのアンチコドンへのタウリン修飾が欠損し，蛋白合成が途中で停止すると考えられた．
本研究の目的は，分子整形法を用いてタウリン欠損によるタンパク質合成伊停止の分子機構をさらに詳細に解析し，変異tRNAにおけるタウリン修飾の役割を明確にすることである．次に，MELASとMERRFの変異mtDNAをもつサイプリド培養細胞を用いて，タウリンがミトコ
ンドリア脳筋症の改善に効果があるかどうかを判定し，病態改善の方法を開発することが目的である．

−UUA−

−UUG−

報

晒UUU

西

−AAA−

−AAG−

図1MELAS，MERRFの原因遺伝子変異によるtRNAのアンチコ
ドン部のタウリン修飾欠損．（上図）正常tRNA−Leu（m）のアンチコドンには転写後タウリン修飾されるが，変異tmAでは修飾されない．（下図）分子整形によって，変異点に対応する塩基は正常でタウリン修飾だけが欠損している tmA を人工的に作製した．すると，tRJIA−Leu（m）ではUUAのみを認識し，UUGではタン
バク質合成を停止すること，tRNA−uSではタウリン修飾の欠損によってAAAとAAGのコドンを双方とも識別で
きずタンパク質合成が停止することがわかった（4，5）．

（図1）．この結果，変異tRNAの機能不全は変異塩基にあるのではなく，アンチコドンのタウリン修飾の欠損が原因であることが明確になった．さらにtRNA−Leu（UUR）にタウリン修飾が欠損した場合にはUUAコドンを読み取ることができるが，UUGコドンは読みとることができないこと，tRNA−けSのタウリン修飾を欠損させた場合はAAAとAAGを読みとることができないことが明らかとなった5）．

方法と結果
ヒトミトコンドリアtRNAをヒト胎盤より大量に精製

培養液に高濃度タウリンを加えるとtmA機能が回復するのではないかという考えのもと，3243変異，3271

して，変異点の塩基は正常であるがタウリン修飾のみが欠損したtRNAを分子整形法によって人工的に作製した

変異，8344変異をもつサイブリド細胞（核はHeLa細胞で●日本医科大学大学院医学研究科加齢科学系専攻細胞生物学分野＝東京大学大学院新領域創成科学

それぞれの変異mtDNAをもつように作製した人口細胞）に10mM〜60mMのタウリンを加えて1〜4日間培養して，ミトコンドリアの機能が回復するかどうかを調べた．

ー157−

ミトコンドリア膜電位はMit血ackerRedの蛍光染色の強度をフローサイトメーターで調べたく図2）．酸素消費速
度は酸素電極により測定し，ミトコンドリアの形態は共焦点顕微鏡により観察した．ミトコンドリア内タンパク
質合成はエメチン存在下でアイソトープメチオニンを取

リン存在下で4日間培養すると，30％程度酸素消費速度が回復した．タウリン添加によって分子量の大きい蛋白の合成が改善させたので，tRNAの機能が回復したことを示唆する．
しかし，以上の結果は，タウリンが10mM濃度以上の高濃度で効果が見られたので，現実的にタウリンを飲用した時の効果を示すものではない．そこで，細胞内のタウリン合成を抑制するためにタウリン合成の材料である

り込ませ，ミ十コンドリアを分画後電気泳動によって合成タンパク質を測定した．すると，高濃度タウリン存在下で，MELAS，MERRFの点変異mtDNAをもつサイブリド細胞では，膜電位，酸素消費速度，形態．ミトコン
ドリア蛋白合成速度，いずれも改善した．40mMのタウ
LOqE⊃NニOU

メチオニンとシステインを必要最小限の濃度として，4日間培養し，その後0．1mM・1mMの低濃度のタウリンの効果を調べた．すると，特に8344変異を持つサイブリ
ド細胞では，MitoTrackerの蛍光強度が濃度依存的に増加し，形態も糸状になりミトコンドリア機能が回復したことが示唆された（図3）．
考察

LOqEコZニ00

MELAS3243変異tRNAとMEFFR8344変異tRNAではアンチコドンの塩基のタウリン修飾が欠損することによ

Fluorescencelntensi吋（logscale）

図2 高濃度タウリンによる変異mtDNAをもつサイブリド細胞のミトコンドリア膜電位の改善．8344変異（上図），ある
いは3243変異（下図）をもつサイブリドに40mタウリン
を加えて培養し，フローサイトメーターでミトコンドリ
ア膜電位を測定すると経時的に増加した（左図）．また，濃度依存的にタウリンの効果が見られた（処理4日後）佑図）．タウリンによって，ミトコンドリア膜電位が改善されたことが明瞭である．

ってミトコンドリア内のタンパク質合成が途中で停止することが確定された．また，タウリン添加によって分子量の大きい蛋白の合成が改善させていることは，変異tRNAの機能を改善していることを示唆している．タウ
リン合成を抑制した場合には0．3mM程度の低濃度のタウリンでも十分効果があるので，飲用によってミトコン
ドリア脳筋症の病態改善に有効である可能性がある．
研究の意義
MELAS，MERRFのtRNA遺伝子変異によってtRNAのタウリン修飾が欠損するという基礎的研究を背景に，タウリンが少なくとも培養細胞ではミトコンドリア脳筋症患者由来の変異mtmAをもつミトコンドリアの機能改善することを明らかにした．タウリンは副作用が認められないので，積極的に病態改善に利用すべきであると
結論した．
文

献

1）Y鮎ukawaT．，Suzuki，T，SuzukiTh．，UedaT．，OhtaS．and
Watanabe K．：ModincationDefbctatAnticodon Wobble
Nucleotide of MitochondrialtRNAsLEU（UUR）with
Pathogenic mutations of Mitochondrial Myopathy，EncephaJopathy，LacticAcidosis，andStroke−1ikeEpisodes．
J．Biol．Chem．275：4251−4257，2000．．
2）YぉukawaT，SuzukiTりIshiiN．，UedaT．，OhtaS．and

図3 低浪度のタウリンの効果．タウリン合成の材料であるメチ
オニンとシステインの濃度を必要最小限まで下げ8344変
異をもつサイプリドを培養し，低濃度のタウリン（0．1〜1mM）の効果を調べた．A：OmM，B：0．1mM，C：0．3mM，
D：lmMタウリンで4日間培養した細胞をMitoTmcker
で染色した．タウリンによりMitotrackcrRedの蛍光が強くなり，ミトコンドリア膜電位が上昇したことが明らかである．また，形態も糸状になりミトコンドリア機能が回復したことが示唆された．

Whtanabe K．：Defむtin Modi茄cation attheAnticodon

WbbbleNucleotideofMitochondrialtRNAuSWiththe
MERRFEncephalomyopathyPathogenicMutation．FEBS
Letters．467：175t178，2000．
3）1ねsukawaT．，SuzukiT．，IshiiN．，OhtaS．andWatanabe−158−

K．：Wobble modindation defectin tRNA disturbs
COdon−anticodoninteractionina mitochondrialdisease．

EMBOJ．20ご4794−4802，2001．

5）Kirino Y，「hukawa T Ohta S，Akira S，Ishihara K，4）Suzuki T；SuzukiT Vhda T；Saigo K，Watanabe K．：

Watanabe K，Suzuki Tl：Codon−SPeCinc translational

Tburine as a constituent ofmitochondrial tRNAs：neW

deftct caused by a wobble modincation denciencyln

insightsinto the functions of taurine and humanmutanttRNA舟omahumanmitochondrialdisease．Proc

mitochondrialdiseases．EMBOJ．21：6581−6589，2002．

NatlAcadSciUSA．101：15070・15075，2004．

−159−

ミトコンドリアALDH2欠損によるミトコンドリア病病態モデルマウスの作製とその病態改善法−ビタミンEの効果
太 田 成 男ヰ
研究協力者

大

澤

郁

肘

西

槙

貴代ぎ

背景と日的
ミトコンドリア脳筋症の治療あるいは病態改善にはモデルマウスの作製が不可欠である．ミトコンドリア
ALDH酵素活性を低下させることによってミトコンドリ
ア脳筋症の特徴である筋萎縮，ミトコンドリアの増加を示す赤色ぼろ繊維の出現を指標としたモデルマウスの作製を試みた．

小

平

恵

好

鈴

木

吉

彦＊

離して測定した．酸化ストレスの蓄積は，過酸化脂質の分解物であるマロンジアルデヒドと4−ヒドロキシァルケ
ナールを定量した．赤色ぼろ繊維はゴモリトリクロム染
色改変法を用いて染色し，ミトコンドリアの蓄積の指標として，は，MitotrackerGreenも併用した．電子顕微鏡によってミトコンドリア形態異常を観察した．

ミトコンドリアのマトリクスに局在するアルデヒド脱水素酵素ALDH2は，エタノール代謝においてアセトア
ルデヒドから酢酸への反応を触媒する．その一塩基置換の遺伝子多型である」は8月2＊2はドミナント・ネガティ
ブにALDH2活性を抑制する．私たちは，d上か〟2＊2が晩期発症型アルツハイマー病（AD）の危険因子であり1），
此以招■2をもつ健常人集団の血清には，過酸化脂質濃度が有意に高いことを示した2）．過酸化脂質は，毒性の強いアルデヒド類である4−ヒドロキシ＿2＿ノネナール（4−HNE）に自然に分解されることから，4−mEがALDH2の標的基質であり，ALDH2酵素活性が低下すると4●肌が蓄積し，毒性を発揮すると想定した．マウス型
d上か〃2■2遺伝子をラットPC12細胞に導入し，ALDH2
活性を低下させ，活性酸素を発生させると，4−mが蓄積し，細胞死が促進されたので，ALDH2は酸化ストレスへの防御機構として働いていることが示唆された3）．
本研究の目的は，ALDH2酵素欠損マウスを作製してミトコンドリアと骨格筋への影響を調べ，ミトコンドリ
ア脳筋症のモデルとなりうるかを検証することである．
さらに，骨格筋の萎縮と酸化ストレスを食餌によって改善できるかどうかを調べた．

図1ALDH2酵素活性欠損DALマウスにおける骨格筋の萎縮
皮をはいだDALマウス（下写真）と同腹同胞の対照マウス（上写真）．

方法と結果
マウスdムD〟2遺伝子を改変し，欠損型遺伝子
d上かガ2＊2を作製した．アクチン・プロモーターとEF＿1
αプロモーター下にそれぞれマウスのAエ8月2・2を挿入
し，トランスジェニック（Tg）マウスを作製し，DALマウス（DominantNegativeALDH2dencientmice）と命名した．トランスジェニックマウスのDNAをPCRとS。uthernblotにより確認し，ALDH2＊2の導入を確認した．
ALDH2＊2蛋白の確認はWtstemblotにより行った．
ALDH2酵素活性は，骨格筋からミトコンドリアを分＊日本医科大学大学院医学研究科加齢科学系専攻細胞生物学分野

大嶺筋中のMDA幾

大鵬中のMDA＋4−HAE農大心筋中の4−HAE慮

図2 DALマウスにおける酸化ストレスの上昇。大腿筋中における過酸化脂質の蓄積．
過酸化脂質の分解物であるアロンアルデヒド（MDA）と4−ヒドロキシァルケナール（4−M）の定量結果。左のTgがDALマウスの結果である．

ー160−

22退後
2．4
2．2

0U
6

4

4

掛已只智増せ

6

せ1．4

8

芸t6

2

2

隙U只智倒せ

彗1．8
・R

1．2
1

0

5

10

15

摂食日数（遇）

20

25

VE

一

一

十

Wtld

DAL

VE

一

一

Wild

＋

DAL

●p＝0．0394

図3 DALマウスにビタミンEを食餌に与えることで筋萎縮の改善．7週齢のマウスを群分けした後にビタミンE（VE）添加食を与えた．vE摂食量90m釘day血ouse．

DALマウスをVE投与群とコントロール群に分け，VE

よって生じるアルデヒド類の解毒能が低下した結果とし投与群にはVE添加食（α−トコフェロール3g／100g飼料）を与えた．それとは別に，異なる時期に生まれたDALて筋萎縮が生じたものと考えられる4）．ミトコンドリア脳筋症の指標である筋萎縮と赤色ぼろ繊維，ミトコンドリアの蓄積とミトコンドリア形態異常が観察されたことから，
ミトコンドリア脳筋症のモデル動物となる可能性がある．

マウスをカテキン投与群とコントロール群に分け，カテキン投与群にはカテキン添加食（カテキン混合物，緑茶由来100mg／100g飼料）を与えた．これらのマウスの体重を定期的に計測した．
VE投与群とコントロール群に関しては，大腿筋に蓄積した過酸化脂質の分解物の量をマロンジアルデヒド（MDA）と4−ヒドロキシァルケナpル（4−HAE）の量として測定した．また，下肢筋肉を病理学的に観察した．
3系統のTgマウスについて解析したところ，筋肉で」上か〃2■2が高発現しており，ALDH2酵素活性が低下していた．体重が低下しており，著しい筋萎縮を認めた．
筋繊維数が少ないのではなく，筋繊維自体が細かった．
骨格筋において，過酸化脂質の分解物であるマロンジア
ルデヒドと4−ヒドロキシァルケナールが蓄積していた．
筋繊維は生後直後正常であるが，1ケ月後には筋繊維が正常マウスに比較して著明に萎縮した．

また，ビタミンEが酸化ストレスを減少させ，筋萎縮を改善したことから，ミトコンドリア脳筋症の改善にはビタミンEが有効であることが示唆された．
研究の意義
本研究から，DALマウスが酸化ストレス防御法を検討する上での有効なモデル動物であることが示された．ミトコンドリア脳筋症の病態改善のための治療薬の開発に重要な役割を果たす事が期待できる．筋萎縮の軽減，赤色ぼろ紙椎の減少を指標に，ミトコンドリア脳筋症の病態改善薬，治療薬をスクリーニングが可能になった．ビ
タミンE以上の改善薬の開発が期待できる．
参考文献

さらに，ALDH2欠損筋繊維では，正常マウスと同じ筋の場所を比較するとミトコンドリア脳筋症の指標である赤色ぼろ繊維とミトコンドリアの蓄積が認められた．

1）Kamino，K．，Nagasaka，K．，Imagawa，M．，Ⅵ汀namOtO，H．，

ミトコンドリアの蓄積は出生直後には見られず1ケ月後に出現した．
さらに神経伝導速度の低下，骨密度の低下，白髪の増加など老化の指標も認められた．

DehydrogenaseIncreases the Risk fbr Late−Onset

1bneda，H．，Ueki，A．，Kitamura，S．，Namekata，K．，Miki，
T，andOhta，S．：DenciencyinMitochondrialAldehyde

AlzheimersDiseaseintheJapanesePopulation．Biochem．

Biophy．Res．Commun．273，192−196，2000．

2）Obawa，Ⅰ．，Kamino，K．，Nag的K．，Ando，E，Niino，N．，

雄のVE投与群ではコントロール群に比較して体重が増加し，発育不良が改善した．この時，後肢断面積が増

Shimokata，H．，Ohta，S．：Genetic deficiency of a

加しており，筋萎縮が抑制されていた．また，大腿筋に蓄積したMDAと4−mEもVE投与群では減少傾向にあった．雌ではVE投与群がコントロール群に比較して体重増加することはなかったが，大腿筋に蓄積したMDA

lipidperoxidesincommunity−dwellingfbmales．J．Hum．

mitochondriala］dehyde

dehydrogenaseincreases

serum

Genet．48：404−409，2003．
3）Ohsawa，I．，Nishimaki，K．，Ⅵ迫uda，CりKamin0，K．，Ohta，S．：

Denciencyln amitochondrialaldehyde dehydrogenascと4−HNEは雌においてもVE投与群で減少傾向にあった．

increasesvulnerabilitytooxidativestressinPC12cells．J
胎〟和ぐ鮎爪．84（5）：1110−1117，2003．

考察4）Ohta，S．，Ohsawa，I．，Kamino，K．，Ando，Fl，Shimokata，H．：

ALDH2欠損DALマウスでは，欠損型であるALDH2＋2の導入によりALDH2活性が抑制され，酸化ストレスに−161−

MitochondrialALDH2De爪ciencyasanOxidativeStress．

Ann．N．YIAcad．Sci．1011：3644，2004．

MELAS筋芽細胞における細胞死とその抑制
桃 井 真里子●
研究協力者

日

森

雅

人●

山

形

崇

倫●

後

藤

珠

子●

の染色が確認された．（訃細胞内ATP量，カスバーゼ活性の検討：通常培養下での細胞内ATP量は80％変異株

的

MELASでは感染，過労などのストレスを誘因として
けいれん，脳梗塞様発作などのepisodicな症状を繰り返し，部分改善をしながら次第に進行していく．また，
episodicな病態とは別に難聴，知的障害などの慢性進行性の病態もあり，現在の治療では病気の進行を完全に抑制するのは困難である．我々はこのようなMELASの病態にどのような細胞内機構が関与するかを検討し，有効な治療法を開発する目的で培養筋芽細胞を用いて細胞死プロセスを検討してきた．

でも対照と差がなかったが，80％株では対照の0％株の培養条件をグルコース欠乏や，血清除去培養条件下と同様のATP変化を示していた．（図1）また，80％株ではcaspase3／7活性が確認された．このcaspase3／7活性は血清除去により更に増加した．（図2）DCAを添加した
検討では，80％変異株にのみArP量の有意な増加が見られた．（図3）

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材料・方法

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株（0％株）を使用した．通常培地で培養した後，グルコース欠乏培地に変更し培養を続けることにより，80％株

卸80％有する細胞株（80％株）と対照として0％有する細胞棚

不死化し，クローン化して使用した．3243AノG変異を

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採取した生検筋細胞を初代培養後，Ori●SV40DNAにて

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︵nJ虚もUUOUSOu叫EnJMELAS患者よりインフォームドコンセントのもと

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は細胞死が誘導される．（9この細胞死過程へのアポト

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ーシスの関与を検討するため，以下の抗体による蛍光抗体染色，同時にTUNEL法，Hoechst染色を行った．：
抗チトクロームC抗体，活性型caspaSe−3，−8，−9抗体，ER
ストレス細胞死の特異蛋白である活性型ヒトcaspase−4抗体（国立精神神経センター，桃井隆博士より供与）．

図1細胞内ATP量の変化：それぞれを通常培養（G＋，FCS＋），グルコース欠損（6−，FCS＋），血晴欠損（G＋，FCS一），グルコース・血清欠損（G−，FCS−）の条件で培養し，経時的にATP量を測定した．
×10■②各クローンの細胞特性と細胞死誘導，抑制の検討の：；＝．モため，細胞内ATP量，CaSPaSe3／7活性をキット（Promega，USA）を用いて検討した．上記2クローンを使用し，通常培養後，通常培地（血清を含む），無血清培地に変

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￣・）

＊

︵⊃貞︶OUuUOSUU⁝EnJ

更し，経時的に細胞内ATP量，CaSpaSe3／7活性を測定した．また，MELAS治療薬であるDCAを加え，同様の検討を行った．
結≡≡≡＝サ ＝
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株ではチトクロームC放出，カスパーゼー9，．3の活性化，活性型caSpaSe−4抗体にても80％株では細胞質に湧浸性∴ ＝■￣＝さき‡・
完

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TUNEL陽性となるミトコンドリア（mt）を介するカスパーゼ依存性のapoptosisの経路が作動していた．また，

；：−＝＝
：二二．
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①アポトーシス過程の検討：細胞死が誘導される80％

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図2 CaSpaSe3〝活性の変化：図1と同じ条件でCぉpぉe3／7活性を測定した・80％株は刺激がなくても軽度のcaspase3／7の活性が確認された．

● 自治医科大学小児科学

−162−

∞
︸

5）が，長期的には慢性の病態は抑制は困難であり6），DCAを補充することで改善できるか，長期の効果が得られるのか検討が必要と思われた．

岬
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●
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今後の展望

カ

×10 5さ00喜S眉弓J

臨床的にDCAは短期的にはepisodicな症状を軽快させる

かMELAS3243A／G変異を80％持つ筋芽細胞はATP産生低

川下により，CytOChromec放出によるCaspase9／3系とERスト●レスによるcaspase4系の双方が活性化されていた．
図3 DCA添加によるArP量の変化：0％株，80％株に通常培

Cytochrome c放出系もArP産生低下によるERストレス

養条件下においてDCAを250上吋mlで添加し，．劇？量を測定した．80％株では添加6時間後に有意なÅⅣ量の増加が確認された．一万，0％株では12時間後にDCAを添加した細胞で有意なÅⅠで量の低下がみられた．

過程によるものである可能性もあり，ERストレスの制御が治療的戦略になりうると考えられ今後の検討が必要と思われた．更に，この系を用いて通常培養条件下でもみられているアポトーシスの制御検討を行い，容易に細胞考察

MELAS培養筋芽細胞の細胞死にはmtを介したCytOChromcc放出，CaSPaSe−9，−3活性化を経るapoptosisの経路が作動していることを確認し1），さらに近年，神経変性疾患などの病態への関与が報告されているERス
トレスによるapoptosisの経路も活性化されていることが確認された．このようにMELAS筋芽細胞ではグルコース欠乏というストレスによりERストレスに惹起されるcaspase−4の活性化による経路，mtからのcytochiomec
放出，CaSpaSe9／3活性化による経路の2つがメカニズム
として存在していていることが確認された．ERストレスによりcaspase−12のみならず，CytOChromecの放出も誘発されるという報告2）もあり，今回確認されたこの2つの経路がERストレスによって誘導されたものか，
別々の刺激により誘導されたものかは今後の検討が必要と思われた．また，細胞内ArP量の検討では，通常培養
下での細胞内ArP量は80％変異株でも対照と差がなかっ
たが，培地の変更により容易にÅⅣ量は低下した．これ

死へと傾く細胞を制御できる薬物の検討を行うとともに，他の変異や病型においてこの系がinvitroでの治療薬の効
果判定に利用できる可能性があると思われ適応症例の選別が困難である治療薬の検討を行い，有効症例の選別が行えるかどうか検討したいと考えている．
参考文献
1）MoriM，MomoiYM．Caspase−9and−3Wereactivatedin
MELASmyogeniccelldeath．Submitted．
2）JimboA，FttjitaE，KourokuY；OhnishiJ，InoharaN，KuidaK，SakamakiK，YbneharaS，MomoiT．ERstressinducescaspase−8activation，Stimulatingcytochromcc
releaseandcaspase−9activation・ExpCellRes・2003Feb
15；283（2）：156−66．
3）MoudyAM，HandranSD，GoldbergMRRumnN：KarlI，Kranz−EbleII DeVivo DC，Rothman

SM．Abnormal

Calciumhomeostasisandmitochondrialpolarizationina
humanenCePhalomyopathy．ProcNatlAcad SciUSA．

までに患者線維芽細胞を用い，通常状態での細胞内ArP

1995Jan31；92（3）：729−33．

量は異常細胞も正常と変わらず3），ATP合成刺激を与えたときの刺激に対する反応が2−20倍程度低下している

4）JameSAM，SheardPWWeiYH，MurphyMRDecreasedという報告があり4），筋芽細胞でも同様の結果であった．
このように80％変異を持つ細胞でも通常状態でのArP

energy demandin瓜broblasts containingmitochondrial量には問題がなかったが，増殖が悪く，CaSpaSe3／7依存性のアポトーシスが常に活性化されていることが確認され このcaspase3／7活性は血清除去により著明に増加した．このことはMELASの慢性進行性の病態を反映して

ATPsynthesisisphenotypicallyexpressedduringincreased

tRNAmutations・EurJBiochem．1999Jan；259（1−2）：462−9．
5）Saitoh S，MomoiMY；1ねmagataTlMoriY；ImaiM．
E晩ctsofdichloroacetateinthreepatientswithMELAS．
Neurolo訂」1998Feb；50（2）：531−4．
6）MoriM，Ⅵ汀nagata TI Goto T；Saito S，Momoi MY．

いる可能性もあると考えられた．MELAS治療薬の検討
ではDCAは80％株でのみDCA添加によって有意なArP
量の増加が見られたが，効果は12時間では消失していた．

ー163−

Dichloroacetate treatmentformitochondrialcytopathy：long−term e晩cts in MELAS．Brain Dev．2004
0ct；26（7）：453−8．

ミトコンドリアゲノム多型データベースを用いた病的変異と多型の鑑別
田 中 雅 嗣＊
＊

＊

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典功

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れているので，ミトコンドリアゲノムの多型頻度はきわめて高い．領域ごとに見ると，ミトコンドリアゲノ
ムの非翻訳敵城における変異率は21．5％と最も高かっ

的

ミトコンドリアDNA（mtDNA）の塩基配列は多様性が高いため，ミトコンドリア脳筋症などの疾患の病因となる変異を同定する場合に，一般集団における多型と疾患の直接的病因となる変異とを鑑別することが重要な作業である．我々は日本人672名のmtDNA全塩
基配列の分子進化系統樹を解析し，110

典

＊

福衣

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岳雅

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安藤

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研究協力者

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subhaplogroupに分類した（文献1）．これらのmtDNA全塩基配列データを基礎として，ミトコンドリアゲノム

た．タンパク質コード領域には870か所の多型があり，変異率は7．7％であった．2種のrRNA遺伝子および22
種のtRNA遺伝子における変異率は，それぞれ3．6％および4．6％であり，タンパク質コード領域の変異率より低かった．
一方，MITOMAP（http：〟W．mitomap．org／）において，に分布する多型をデータベース化し，多型の相互連鎖，疾患との関連，多型の機能的相違に関する総合的情報

蛋白質コード領域および発現制御領域では88ヶ所に92
種類，rRNAおよびtRNA遺伝子飯域では105ヶ所にの提供を開始した．ここでは，ミトコンドリアゲノム
における多型とミトコンドリア脳筋症の病因となる変異を鑑別できるかどうかを検証した．

107種類の変異が登録されていた．蛋白質コード領域および発現制御領域の88ヶ所変異のうち16ヶ所の変異がmtsNPdbにおいて検出された．

方（a）MITOMAPにおいて疾患病態への関与が確認されたと分類されていた変異18 ヶ所のうち 2 ヶ所が

法

百寿者，パーキンソン病患者，アルツハイマー病患者，

mtsNPdbで検出された．Leber病の病因変異として確血管病変を伴う糖尿病患者，一般糖尿病患者（文献2），
若年肥満者，若年非肥満者，計7群，各96名の血液細胞あるいは口腔粘膜細胞からDNAを単離し，mtDNA

認されていた4216T＞C PDl：Y304H）はアルツハイマー病患者1名と血管病変を伴う糖尿病患者1名において検出された．同じく Leber病の病因変異とされていたの全塩基配列を決定した（16，569塩基対×672例＝11，134，368塩基対）．これに基づいてミトコンドリアゲ

14484T＞C（ND6：M64V）は血管病変を伴う糖尿病患者1名において検出された．

ノム一塩基多型データベース（mtsNPdb，
http：〟www．giib．orjphntsnp／indexj．html／）を構築した．
MITOMAPに登録されている既報のmtDNA変異と日本人で観察された多型（mtsNP）を比較した．

（b）MITOMAPにおいて暫定的に病的変異と分類されていた変異64ヶ所のうち6変異がmtsNPdbで検出され結果と考察672人についてミトコンドリアゲノムの全塩基配列を決定した結果，1，294か所に多型が見出された．非翻訳

4136A＞G（NDl：Y277C）はアルツハイマー病の1名で検出された．これらの変異は百寿者では検出されなかったので有害変異と推定され，加齢に伴う神経変性疾患

飯域のhypervariableregion（変異発生頻度の高い領域）
における塩基置換・挿入・欠失はデータベースの別表にのみならず特発性心筋症にも関与している可能性が考えられた．

記載している（http：／／www．giib．or．jp／mtsnp／search
LengthPolymorphisms＿e．html）．16，620bp（重複領域の51bpを含む）の中から1，294か所という頻度は約13塩
基に1個の割合で多型が検出されることを意味する．核（C）9804G＞A，11696G＞A，12026A＞GはLeber病あるいは糖尿病への関与が示唆されていたが，百寿者において検出されたので病的意義はないと判断された．

ゲノムにおける多型頻度は1，000塩基に1個であるとさ●東京都老人捻合研究所健康長寿ゲノム探索＝岐阜県国際バイオ研究所遺伝子治療研究部●●●愛知医科大学神経内科

た．アルツハイマー病とパーキンソン病で報告されている3397A＞G（NDl：M31V）はパーキンソン病患者の1名で検出された．Leber病への関与が示唆されている（d）非翻訳領域の多型16198T＞CはPoultonらにより，
拡張型心筋症のリスクファクターであると報告されていたが，百寿者96人中37人で検出されたので，病態への関与は小さいと推定された．

ー164−

（e）感音性難聴の病因であることが確定している
1555A＞G（12S rRNA）変異がアルツハイマー病患者1名において検出された．

るので，mtSNPに登録されていない変異が脳筋症の患（り感昔性難聴の病因であると推定されている961T＞C（12SrRNA）置換は百寿者でも検出された．
（g）matemallyinheritedcardiomyopathy（MICM）の病因変異として12192G＞A（tRNA−His）がMITOMAPに登録されていたが，百寿者において検出されたので多型であるとの確認作業が必要となる．さらにサイプリッドを用い者でmtDNAがheteroplasmyの状態にあるか，変異mtDNAの割合が臨床的重症度と関連するかどうかなどたミトコンドリア機能の解析が必要である．
文

献1）Tanaka M，Cabrera VM，GonaIez AM，LarrugaJM，判断された．

TakeyasuT，FukuN，GuoLJ，HiroseR，FltiitaY，KurataM，etal．MitochondrialgenomevariationineastemAsiaand

研究の意義
MITOMAPとmtsNPの両データベースを比較するこthepeOPlingofJapan．GeT70meRes14：1832−1850，2004．
2）GuoL−J，OshidaY，FukuN，TakeyasuT，FltiitaY，Kurataとによって，mtDNAの病的変異と多型を鑑別することが可能であることが確認された．mtsNP databaseには
日本人において兄いだされる多型がほぼ網羅されていAla●t舶戎empolymorphismsassociatedwithtype−2diabetesorobesity．
〟言わC力0〝かわ〃inpress，2004．

Glll

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芸；ヱ諾）晶，2人，冊，M，SatoY，ItoM，andTanakaM．Mitochondrialgenomeho：：・dT−G−C■G）‥1㈹bCt5I），日日∵竿呼1器盟㍍†㌣㌍（？
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図1肥満者あるいは糖尿病患者において検出されたtRNA迫伝子の多型．それぞれの置換の位置をミトコンドリアtRNAの二次構造上に示した．白丸は若年肥満者のみに兄いだされた塩基置換の位置を示し，黒丸は糖尿病患者のみに検出された塩基置換の位置を示す．

−165−

筋形成に関わる細胞間相互作用の解明
瀬

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月本

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日

葉増正

研究協力者

原

的

私達は，骨格筋形成の分子機構の解明を目指している．
運命決定を受けた筋芽細胞から骨格筋が形成される過程
は，さまざまな要因に規定される．（1）細胞基質間接着に依存したプロセス，（2）細胞間の直接的な接着に依存したプロセス，（3）細胞融合，（4）腱・神経など異種組織との構造的・機能的な結合などがそれである．これらのプロセス一つ一つに不明なことが多いばかりか，（5）プロセス同士の共役も未解明である．筋形成を理解する
ためには，これら個々のプロセスにかかわる分子群を見つけ，それらを有機的に結びつけていく作業が必要である．本研究は，主に細胞間細胞基質間相互作用の視点か
ら筋形成に関わる分子の検索とその機能の解明をおこなうことを目的とした．
方法
まず，これまでにすでに筋形成にかかわることを明らかにした2つのADAM（メタロプロテアーゼ／ディスイ
ンテグリン）分子メルトリンα・βに関して，間乗組織形成におけるそれらの機能をさらに追求し，筋形成過程
における位置づけを明らかにする．そのために，これまでに作成したメルトリンα・メルトリンβノックアウト
マウスの形態形成における役割や生理的役割についての検討をおこなう．
これと並行して，筋形成にかかわるあらたな分子の同定とその機能に関して，未知遺伝子を中心に，研究のあまり進んでいない細胞間・細胞基質間相互作用にかかわりうる遺伝子を見つけ出し，CDNAの単離，SiRNAによる筋形成における役割，機能の解析を行う．

etal．，DevelopmentalBiol，2004）などを明らかにした．メルトリンβに関しては，心室中隔欠損・房宝弁大動脈弁形成不全で，生まれてまもなくほとんどのホモ個体が死んでしまうが，生き残ったものは拡張型の心肥大を起こ
すこと，その症状は人の恥tralo訂OrFallot様であることがわかった．そして，メルトリンβの心臓における表現
型を細胞生物学的あるいは生化学的な手法で調べ，心室中隔・弁など心臓の内膜組織を形成する心クッション間葉細胞の分化に異常があることを明らかにした．
またその分子機能を調べたところ，膜型プロテアーゼ
として膜型ErbBリガンドの切断活性化を担うことを明らかにし，確かにノックアウトマウスの解析からも，メルトリンαはErbBリガンドのひとつHB＿EGFの膜型から可溶性増殖因子としてのproteinkinaSeCに依存した変換に，メルトリンβは心臓形成に関与するErbBリガン
ドニューレグリンの活性化に関与することを示した．これらのErbBリガンドがなんらかのプロテアーゼ制御を受けることは知られていたが，ノックアウトマウス作成
により ADAMプロテアーゼがそのプロセスに関与することを示すことができたのは初めてであり，その意義はきわめて大きい．形態形成におけるメルトリンの役割や機能を探る中で，発生過程における増殖因子の放出とレセプターの活性化が，複数のプロテアーゼによって制御される，予想以上に複雑な制御によって行われていることもわかってきた．
メルトリンβが，心臓のみならず胎児神経や骨格筋でも発現していることから，それらの組織や機能に関しても，野生型と欠損マウスで比較検討してきた．その結果，大部分の欠損マウスは生後1週間以内に死んでしまうものの，物学的アプローチにより，ADAMプロテアーゼ・ディス
インチグリンファミリーに属するメルトリンα・メルト

生き延びたマウスをみると，骨格筋に中心核絨経が顕著に多いこと，胎児型のアセチルコリンレセプターの発現が一部の筋絨経に残ること，などの異常がみられることがわかつつてきた．メルトリンβは，神経直下におけるアセチル
コリンレセプター遺伝子を活性化させるニューレグリンと，

リンβ遺伝子の役割と機能を探り，メルトリンαは骨格筋形成ばかりでなく脂肪組織の形成にも関わること

神経における発現部位や発現時期が一致すること，そして
上記のようにノックアウトマウス胎児由来繊維芽細胞では（Kurisakictal．Mol．Cell．Bio1．，2003），メルトリンβは心臓形成・骨格筋形成・神経形成にかかわること（Kurohara

膜型ニューレグリンの切断制御に異常が見られることなどから，メルトリンβは，ニューレグリンあるいは類似の膜型増殖因子の制御を介して神経筋接合部の形成や筋形成と●京都大学 再生医科学研究所 再生増殖制御学分野

その維持を制御していることが考えられる．

結果
これまでにノックアウトマウスの作成と分子・細胞生

一166−

さらに，筋系列で発現が活性化される新規ADAMプ
ロテアーゼとして，メルトリンと／ADAM35のクローニングに成功した．これは，体節から筋系列の細胞が生じる段階で，筋節特異的に発現の活性化が見られる．その発現は，デスミン発現細胞で見られることから，この遺伝子は筋芽細胞で活性化され，骨格筋になったあとも発現する遺伝子であることがわかった．メルトリン亡の発現はきわめて限局しているが，興味深いことに，それらは，未分化なレンズ上皮，耳砲上皮，小腸上皮など，未Shimamura K，Yasuda K，and Sehara−Fuiiawa A．．A
NovelMetalloprotease−Disintegrin，Meltrinf（ADAM35），
Expressed in Epithelial Tissues during Chick

Embryogenesis．Dev．Dymics230：557−568，2004．
2）WakatsukiS．，KurisakiT．，andSehara−FuiisawaA．Lipid
raftsidentined as10cations of ectodomain shedding
mediatedMeltrinβ／ADAM19J．Neurochemistry89（1）：119−23，2004．
3）Kurohara，K．，KomatsuK．，Kurisaki，T．，Masuda，A．，Ⅰrie

分化な上皮組織に限局されていることがわかった．現在，それらが筋形成にどのような役割を果たしているか，あるいはどのような機能を担っているか検討中である

N．，Asano，M．，Sudo，K．，Nabeshima，Y．，Iwakura，Y，andSehara−Fuiisawa A．．Essential Roles of Meltrinβ／
ADAM19in Heart Development．DevelopmentalBio1（Watabe−Uchidaetal．，DevelopmentalDynamics，2004）．

267：14−28，2004．

4）KurisakiT，MasudaA，SudoK，SakagamiJ，Higashiyama

研究の展望・意義
メルトリンα，βが，細胞増殖制御因子の制御を介して筋形成その他の形態形成に関わることを明らかにする

S，MatsudaYJNagabukuro A，TbttjiA，Nabeshima Y，ことができた．これらのプロテアーゼの活性化が筋形成に必要であることがわかったことから，それらの活性化機構を検討することによって，筋ジストロフィーやミオ

invoIvement of Meltrin alphain adipogenesis andAsanoM，IwakuraY，Sehara−Fuiisawa A．Phenotypic
analysis of Meltrin alpha（ADAM12）de爪cientmice：

myogenesis．MoICellBio123（1）：55−61，2003．
5）KurisakiT；WhkatsukiS，Sehara−Fuiisawa A．Meltrin

パチーの病態の改善への応用を検討していきたい．

beta

mini，a neW ADAM19isofbrm lacking

metalIoprotease and disintegrin domains，induces

文

献morphologiCalchangesin neuronalcells．FEBS Lett

1）Watabe−UchidaM，Masuda A，ShimadaN，Endo M，−167−

532（3）：419−22，2002．

Ⅸ．筋ジストロフィー骨格筋の酸化ストレス、耐性系、遺伝子治療など

筋ジストロフィーに対するゲンタマシン治療対象患者のスクリーニング

及びハイブリット型リボソームを用いた治療法の開発

●
●

甜ガ

雅

●

●

澤属

地松

●

恵子子

●

●
●

●

●

●
●

一▼

弘聖陽

▲T

野田本

河増松

●

責誠一

言

DuchennC型筋ジストロフィー（DMD）の治療を目的にSweeneyら1）はゲンタマイシンをDMDのモデルマウスであるmdxマウスに投与したところ，ほぼ正常なジストロ

龍

●
●

●

藤倉岡

●

伊松上

●

美郎弘

重史泰

緒

村篠島

木小竹

研究協力者

患者6；G2444T：GAAtoTAAT，患者7：C6107T：CGAto
TGAA，患者8：C4937T；CGAto TGAA，患者9：C6631A；TACtolAAA，患者10；G4965A：TGGtoIAGC
以上のジストロフィンの発現を解析した結果，TGA

フィン（dy）が発現していることを報告している．ゲンタ
マイシンが，mdxマウスが持つdy遺伝子の点突然変異を持つ患者のみdyの発現をdy染色及びウエスタンプ
ロット解析で認めた．しかし，TGAを持つにもかかわら（終止コドン）を翻訳段階で読み飛ばし（リードスルー），

ず，dyの発現を認めない線維芽細胞（患者8）も存在した．
2．ハイブリット型リポソームを用いたケンタマイシン
投与法
蛍光物質をつけたハイブリット型リボソームをマウス

ほぼ正常dyを発現させたためである．一方，点突然変異
により終止コドンをが生じたことによりDMDとなった
患者はDMD患者の5〜15％といわれている．dy遺伝子
内の点突然変異を見つけるには，dyのcDNAが14kbと長く，多くの時間と複雑なテクニックを必要とする．
また，終止コドンの種類によりリードスルーする効率が違うという報告もある2）．そこでゲンタマイシン治療
対象患者をスクリーニングする方法を確立する．また，
DMDに対するゲンタマイシン治療法の問題点はゲンタの腹腔内注射し筋組織への移行するか検討した結果，投与後2時間がピークを示し，6時間後まで蛍光物質を認めた．
マウスは8−12週齢のmdxマウスを使用し，ゲンタマシン（GM）の34mかkgを1倍量とし決めた．その濃度の何倍かで投与量を設定し，以下の投与量で実際に腹腔内にマイシンの半減期が短く，腎毒性，聴神経毒性などの副作用である．そのため，リードスルーするための十分な投与量を患者に投与できないことにある．このことを投与した．GMを封入したハイブリット型リボソームは，作製時に存在する水溶液中に存在するゲンタマシンをゲル濾過法で取り除きGMの封入率が100％であるハイブ解決するため，ハイブリット型リボソームをもちいて骨リット型リポソーム（GM−Lip）を作製した．そのGM−Lip

格筋へ効率よくゲンタマイシンを運ぶ方法【DDS（DrugDeliverly SysytemHを開発をする．

とGMのみとハイブリット型リボソーム（Lip）のみを，
それぞれ1，5，10倍量を14日間連日，腹腔内投与に投与した．投与2週間後，ABR（聴性脳幹反応），Cre値，CK

方法と結果

値，dy陽性線経の出現率を測定した．cKの平均値は1．ゲンタマイシン患者スクリーニング法
インフォームドコンセントを行い同意を得たDMD患

GM−Lip投与群の1倍，5倍，10倍がそれぞれ，685．3±242．4，
758．5士171．8，610IU／1であり，GMの1倍，10倍が1521．3

者より線維芽細胞を分離培養し，MyoDを発現させることのできるアデノウイルスベクター（AdMyoD）を感染させた．その後，ゲンタマイシン存在下でマイオチュー

2145士1350．5であった（図1）．なかでも，10倍量のGM−Lip
投与群がもっとも小さい値を示した．

ブに分化誘導し，dy染色とウエスタンプロット解析を行った．今回は点突然変異が既に分かっている下記の患者の線維芽細胞を用いた．
患者1；エクソン48・50欠損，患者2；C2510T：CGA
to TGAG，患者3；G562A：TGG to TGAC，患者4；C6491T：CGAtoTGAC，患者5；C932T：CAAtoTAAG，●熊本大学医学薬学研究部発達小児科…熊本大学・耳鼻咽喉科…神戸大学大学院医学系研究科・小児科学…●崇城大学応用生命科学科±731．5，1236．66士716．99，Lipの1倍，5倍は2114士745．1，

dy陽性線経は排腹筋よりとり出した筋組織をdy染色
し，無作為に組織の写真をとり，1匹につき3視野を選
びその平均を算出した．dyの陽性線経の平均値はGM・Lip
投与群の1倍，5倍，10倍はそれぞれ，3．87士1．65，5．57
士3．2，7．73士6．95％であり，GMの1倍，10倍が3．23土1．75，
4．62士3．76％であり，Lipの1倍，5倍は2．44±2．04，1．738
土1．10％であった（図2）．dy陽性線経の出現する割合はGM−Lipの10倍が一番高く（図3），次にGMのみが高値を示した（図2）GM−Lipを投与されたマウスの排腹筋のウエスタンプロット解析でもdyの発現が確認された．

−171−

SOrumCIくat14daySpO＄tl．P．0IG・L，G．L（IU／L）

GMの副作用である聴毒性はGM−Lip投与群ではすべてのABRにおいて聴毒性は認めなかったが，10倍量のGM投与群では65dBにおいてⅤ波は確認できず，聴毒性を示した．腎毒性はすべてのマウスについてCreの上昇は認めなかった．10倍のGMのみの投与群ではすべてのマウスで体重減少を示したが，10倍のGM−Lipは増加
していた．
考
察
DMDにおけるゲンタマシン治療対象患者のスクリー

6−LO・5X G−L5X G−L10X GIX G10X LO．SX L5‡

mdx

図1GM−Lip，qLipを2週間授与して，CKを測定した．
GM−Lip投与群がGより低い傾向を示した．

Theemciecyofdystrophinpositive

ニング法を確立した．TGAの点突然変異をを持つ患者の線練芽細胞にdyの発現を認めたことにより，TGAを持
つ患者がゲンタマイシン治療が一番有効ではないかと考える・しかし，TGAにもかかわらず，dyの発現を認めない患者（患者8）が存在し，単にナンセンス変異の種
類だけの問題ではないことを示唆している．この様な現象があるため実際に患者の細胞を用いて治療対象患者
であるかどうかをinvitroで調べることは有意義である．
GM−Lipを使用することにより聴毒性が軽減できた．
また，DMDにおける10倍のGMを投与されたマウスで体重の減少を示し，副作用を示した．それは，ハイブリッ
ト型リボソームを使用することで回避された．また，CK
はGM−Lipを使用した場合が一番低値を示し，dyの陽性
線経の率はGM−Lip投与群が高値を示した．このことはゲンタマシンが筋細胞内でリードスルーを引き起こし，ジストロフィンの発現を誘発したと考える．以上より，
ハイブリット型リボソームで封入してゲンタマイシンを投与する治療法は有効であること示した．
今後の展望

図2 GM−Lip，qLipを2週間投与して，dyの陽性率を算出した・dy陽性繊維の出現率はGM−Lip投与群の方が高い傾向を示した．

今後，GM−Lipの投与する個体の数を増やし，有効性の検討を確認する．また，反復投与による有効性も検討する．有効性が確認出来れば，ヒトへの投与を前提として，大型動物で本当に副作用を示さないか解析する．
文献l）・Barton−Davis ER，etal．：JClinInvestlO4：375−381，
1999．

2）・HowardMT；etal．：AmNeuro148：164−169，2000．

図3 ジストロフィン陽性線経がクラスターをなして出現した．

−172−

筋疾患と小胞体ストレスの関連
吉

良

潤

一＊

研究協力者 池 添 浩 二 西 野 一 三●●埜 中 征 哉●● 古 谷 博 和●目

的

近年小胞体ストレスの概念が確立され，種々の神経変性疾患においてその関与が指摘されている．小胞体スト
レスは様々な原因で惹起されるが，細胞内Ca2＋ホメオス
タシスの乱れもその一因である．骨格筋細胞では収縮・弛緩時にCa2＋が中心的な役割を果たすため，興奮収縮連関の異常は筋細胞内C㌔＋ホメオスタシスの乱れを引き起こすことが予想され，その結果として筋疾患でも小胞体ストレスが惹起されている可能性がある．そこで，興奮収縮連関が障害される筋疾患として，周期性四肢麻痺（PP）と筋強直性ジストロフィー（DMl）に着目し，小胞体ストレスの関与を検索した．

た．また，同じくpyboticnuclearclumpを有する脊髄性筋萎縮症ⅠⅠⅠ型の生検筋で検索したところ，やはり
pyknoticnuclearclumpにGRP78，GRP94，XBP−1，リン酸化eIF−2α，Calnexin，Calreticulinの発現を認め，一部筋
核はTUNtL陽性であった．
考察

PPではTAsの出現を特徴とする．TAsは筋小胞体（SR）
由来の構造である．その形成機序は判明していないが，SRが筋細胞内でのCa2＋濃度を調節することと，TAsにもCa2＋貯蔵能があることより，筋細胞内でのCa2＋ホメオス
タシスの維持やCa2十を介するシグナル伝達に何らかの関与をしていると思われる．またDys托rlinはmsに発現することがわかった．これは少なくとも病的状態下では対象と方法
TubularaggregateS（TAs）を有するヒト生検筋12例（周期性四肢麻痔11例，myalgia／crampssyndromel例）に対し，
unfbldedproteinresponseのひとつとしてその発現が増加す
るGRP78およびGRP94の局在および発現量を免疫組織化
学的に，およびウエスタンプロット法を用いて解析した．

dysferlinは筋細胞膜のみならずSRにも発現することをまた遺伝子検索により診断が確定しているDMl生検
筋6例に対し，GRP78，GRP94，XBP−1，リン酸化eIF−2α，calnexin，Calreticulinに対する抗体を用いて免疫組織学的検索を行った．

ことが判明した．それはSarcoplasmicmassおよびpyknotic

示唆する．またdysfbrlinのTAsにおける発現，およびTAsの生成は小胞体ストレスに対する反応である可能性が考えられる．
一方DMl骨格筋でも小胞体ストレスが存在している
nuclearclumpを有する筋線経にほぼ限られているものの，DMlにおける骨格筋障害に何らかの関与をしているものと思われる．加えて脊髄性筋萎縮症ⅠⅠⅠ型で出現する
pyknoticnuclearclumpでも小胞体ストレスが存在した．
したがって，骨格筋萎縮の終末状態においては小胞体ス

結
果
PP生検筋ではGRP78およびGRP94がTAsに強く発現しており，ウエスタンプロット法でも正常筋に比べ有意トレスが疾患にかかわらず惹起されている可能性がある．

にその発現は増加していた．また全症例において
dysferlinがTAsに強く発現していた．しかしdystrophin，cL−およびβ−SarCOglycan，β−dystroglycan，CaVeOlin−3，
1aminin−2はTAsには陰性であり，dysftrlinのみが特異的にTAsに発現することもわかった．
一方DMl 生検筋では特徴的な病理所見である研究の意義
PPおよびDMlにおける小胞体ストレスの関与を示した．また従来成熟筋細胞においては細胞膜にしか局在しないとされていたdysferlinが筋小胞体にも局在しうることを示した．
参考文献

Sarcoplasmicmassおよびpyknoticnuclearclumpを有する
筋線経においてGRp78，GRp94，Ⅹ8P−1，リン酎ヒeIF−2α，calnexin，Calreticulinの発現が認められ，一部筋核は2）MartinJEetal．MuscleNerve14：291−225，1991．

TmL陽性であった．これらの蛋白の発現はDMPK遺伝子のCTGリピート延長と正の相関を示す傾向にあっ

3）ReskeJNielsen E etal．JBioIChem273：15879−15882，
1998．

1）AndersonLVBetaZ．HumMoIGenet8：855−861，1999．

4．）SalViatiGetal．MuscleNerve8：299−306，1985．

■九州大学大学院医学研究院脳神経病研究施設神経内科●■国立精神神経センター

5）Ikezoeketal．ActaNeuropathol105：603−609，2003．

ー173−

Small Group Workshop
1) 2002.11.16

縁取り空砲を伴う遠位型ミオパチー (DMRV)
国立精神・神経センター神経研究所 西 野 一 三

1772) 2002.11.26‑27

Molecular Therapy for Muscular

179

Dystrophy

東京大学大学院総合文化研究科

松

田

良

一

3）2003.7.26 薬剤による遺伝子発現調整
東京大学大学院総合文化研究科

182

石

浦

章

一

4）2003.10.4 先天性筋ジストロフィー研究の進歩：
翻訳後修飾異常と筋ジストロフィー

184

東京都老人総合研究所 遠 藤 玉 夫
5) 2003.10.24

三好型筋ジストロフィー/LGMD2B;ジスフェリンの機能と筋ジストロフィー
187

国立精神・神経センター神経研究所 桃 井
6）2004.9.25

7) 2004.11.12‑13

隆

リソソーム再訪
東京大学大学院総合文化研究科 石 浦 章 一

191

Molecular Therapy of Muscular Dystrophy, Part Ⅱ

東京大学大学院総合文化研究科

松

田

189

良

一

Sma

groupworkshop

縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー（DMRV）
2002年11月16日（土）全共連ビル地下1階 No．19
プログラム
清水輝夫班長挨拶

9：55−10：00

GNE遺伝子解析（座長：田中恵子） 10：00−11：20（15分発表、討論5分）
新井亜希（新潟大学脳研究所神経内科）
水澤英洋（東京医科歯科大学神経内科）
永田哲也（国立療養所岩手病院神経内科）
西野一三（国立精神・神経センター神経研究所）
休憩

教育講演（1）（座長：水澤英洋） 11：30−12：20（40分発表、討論10分）
シァル酸生合成経路

遠藤玉夫（東京都老人総合研究所）
昼食

教育講演（2）（座長：青木正志）
13：30−14：20（40分発表、討論10分）
オートファジーと筋疾患
水島 昇（基礎生物学研究所）
休憩

DMRVの病態解析（座長：西野一三）14：30−16：10（15分発表、討論5分）
オートファジー
熊本俊秀（大分医科大学第三内科）
タウ、アミロイド等
中野 智（関西医科大学神経内科）
杉江和馬（国立精神・神経センター神経研究所）
アポトーシス
埜中征栽（国立精神・神経センター武蔵病院）
生化学
野口 悟（国立精神・神経センター神経研究所）
休憩

総合討論（司会：西野一三）

16：20−16：40−177−

縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー
distalmyopathywithrimmedvacuoles：DMRV
文責 西 野 一 三
国立精神・神経センター神経研究所疾病研究第一部

わせは様々で，GNE領域同士，MNK領域同士，GNE領
域・MNK領域の組合せの何れのバターンも認められた．

SGW開催の背景と目的
DMRVは，臨床的には，15歳から40歳に発症して，主に前脛骨筋，大腿後面筋群を中心に筋力低下と筋萎縮を呈する，常染色体劣性遺伝病である．筋病理学的には，多数の縁取り空胞の出現と径 20 mm 前後のtubulonlamentousinClusionの出現により特徴づけられる．
これまでに，本邦においては，新潟大学グループが連鎖解析を行い，第9染色体上に遺伝子座があることが明らかとなっていた．
一方，欧米では，1984年にArgovらにより，quadriceps−SParingmyopathyとして報告され現在では，
hereditaryinclusionbodymyopathy（HIBM）として広く知られる疾患がある．この疾患では，しばしば前脛骨筋が強く侵されること，筋病理学的変化は，事実上同一であることから，DMRVとの異同が問題となっていた．事実，イスラエルのグループは，DMRVの報告に先駆けて，
HIBM遺伝子座が第9染色体上にマップされることを報告していた．このような状況の下，2001年にイスラエル
グループは，HIBM患者では，UDP−GIcNAc2−ePimerase（GNE）／ManNAckinase（MNK）の二つの酵素活性を有する分子をコードするGNE遺伝子に変異があることを報告した．
この結果を受けて，本邦の新潟大学，東京医科歯科大学，東北大学，国立精神・神経センターの4グループを中心にそれぞれGNE遺伝子変異検索を行い，DMRV患者においてもGNE遺伝子変異が認められることを確認した．本SGWは，この4施設のデータを持ち寄り，本邦DMRV患者の遺伝子型と表現型の全容を把握するこ

本邦では，V572L変異が最も高頻度で，D176V▼が次に多かった．v572L変異には創始者効果が認められた．遺伝
子変異が確認された例の大部分は典型例であったが，心筋障害を認めた兄弟例（東北大学）や無症状ホモ接合体
例（国立精神・神経センター）などの特異な例の報告もあった．また，従来考えられていたよりも発症年齢は幅広く，また，症状の進行速度や程度にもかなり幅があることが明らかとなった．
教育講演（1）シァル乾生合成経路（遠藤玉夫）：GNEがシァル酸生合成経路の律速酵素，MNKはその次のステップを触媒する酵素であることから，シァル酸生合成経路の概要について，講演を頂いた．
教育講演（2）オートファジーと筋疾患（水島昇）：DMRVの筋病理を特徴づける縁取り空胞は，電顕的には自己会
食空胞の集塊であることから，オートファジーの冗進あ
るいは何らかの異常が示唆される．そこで，近年相次いで明らかにされたオートファジーの分子機構について，筋疾患の病態との関連から講演を頂いた．
DMRVの病態解析（熊本俊秀，中野智，杉江和馬，堂中征我，野口悟）：現時点で考え得るDMRVの病態について，オートファジー，アミロイド，アポトーシス，シア
リル化異常の観点から，各種データと病態に対する仮説の検討を行った．
まとめと，GNE遺伝子変異を踏まえて，DMRVの分子病態を捉え直すこと，本邦でのDMRV共同研究を推進することを目的として開催された．

東京医科歯科大学神経内科で使用している臨床調査票に改変を加えたものを共通に用いることで，4施設を中心に，本邦におけるDMRV患者の大規模調査を行うこととなった．GNE遺伝子変異同定後も，依然としてDMRV

演者と講演内容の分子病態の全容は明らかではないが，GNE変異により，
低シアリル化を来たし，その下流現象として，オートフ
ァジー，アミロイド形成，タウ異常リン酸化，ユピキチ

GNE遺伝子解析（新井亜希，水澤英洋，永田哲也，西野一三）：4施設での変異結果を報告した．イスラエルの報告と同様に，大部分がミスセンス変異であり，GNE飯域にも，MNK領域にも変異が認められた．変異の組み合

ン・プロテアソーム系活性化，アポトーシスなどの様々な現象が生じ，それが，病理学的には縁取り空胞や封入体の形成として捉えられるものと考えられた．

−178−

InternationalSymposiumof
一一MolecularTherapyforMuscularDystrophy

OrganizedbyTbruoShimizuandRyoichiMatsuda

SponsoredbyMuscularDystrophyGroup，TheMinistryofHealth，LabourandWelhre，JapanI）ate：November26（nle）through November27（Wed），2002．
Place：Gakushi−Kaikan
3−28KandaNishiki−Cho，Chiyoda・ku，TbkyolO1−8459，Japan
Phone＃＋81−3−3292・5936
http：〟www．gakushikai．orjp／hcilities／index．html

ー179−

November26（恥e），2002
Chairpersons：Drs．TbruOShimizuandRyoichiMatsuda
9：30TbruoShimizu

R5（DepartmentofNeurologyandNeuroscience，TbikyoUniversitySchoolofMedicine，Tbkyo173・8605，Japah）
Openlngremarks
9：45RichardC．Strohman

R6（DepartmentofMolecularandCellBiology；Univ．ofCalifornia，Berkley；CA94720・3206，USA）
Modernbiology＆medicinein crisis：Di皿cultiesin，and new solutions to，understandingthe onglnS Of
diseasephenotype

lO：30H．LeeSweeney（DepartmentofPhysiology；UniversityofPennsylvania，Philadelphia，m19104，USA）

R7

Stopcodonsuppressionfortreatmentofasubsetofdystrophinmutations
ll：30Ryoi血iMatsuda

R8（DepartmentofLifeSciences，GraduateSchoolofA止SandSciences，TileUniversityofTbkyo，Tbkyo153・8902，
Japan）

NegamyclnCanreStOredystrophininmdxmuscles
12：15Lunch
Chairpersons：Drs．PaulL．McNeilandShigeoOhta
14：00ⅥllerieAmamand

R9

GNSERM U523，Institut de Myologie・BatimentJoseph Babinski，Groupe Hospitalier Pitie・Salpetriere，
75651ParisCedex13，France）

Exvivo treatment oflanininalpha2chain・deficient myotubes with antibioticsforcingreadthroughof
PrematureStOpCOdons
14：45ElisabethBarton

RlO（DepartmehtofPhysiology；UriversityofPennsylvania，Philadelphia，m19104，USA）
SystemicadministrationofL−argininebene丘tsskeletalmusclefunctioninmdxmice

15：30Co蝕ebreak
Chairpersons：Drs．T rrencePartridgeandShoichiIshiura
16：00Ybsb払辻0Ⅹasbiwaya

Rll（UnitofMetabolicControILaboratoryofMembranebiologyandbiophysics／NationalInstitutesofAIcoholabuseandAIcoholism／NationalInstitutesofHealth／DepartmentofHealthandHumanServices，Rockville，
MD．20852，USA）
D・b・hydroxybutyratereversesheartfailureandinsulinresistanceinperfusedheartshomMDXmice．
16：45ShigeoOhta

R12（DepartmentofBiochemistryandCellBiology，InstituteofGerontology；NipponMedicalSchool，Kanagawa，Japan）

Proteintherapeuticsbyusingthesuperanti・aPOPtOSisfhctorFNK
17：30PaulLMcNeil

R130）epartmentofAnatomyandCellularBiologyandInstituteforMolecularMedicineandGenetics，Medical
CollegeofGeorgia，Augusta，GA30912・2000，USA）
HowcellsrepalrPlasmamembranedisruptions
18：30Socialbour−180−

November27（Wed），2002
Chairpersons：Drs．H．LeeSweeneyandMasafumiMatsuo
9：30UgoCarraro
R14（C．N．R．Institute of Neuroscience，Unitfor Muscle Biology and Physiopath0logy；Ch Department of
BiomedicalSciences，PaduaMedicalSchool，UniversityofPadova，Padova，Itali）
Basicstogenetherapy：Quantifyandstageregenerativemyogenesisinmusculardystrophies
R15

10：15NaohiroHashimoto（StemCellResearchUnit，MitsubishiKagakuInstituteofLifeSciences，Tbkyo194−8511，Japan）
Plasticityofmusclestemcells

11：00ShinlichiTakeda

R16（DepartmentOfMolecularTherapy；NationalInstituteofNeuroscience，NationalCenterofNeurologyand
Psychiatry；Tbkyo187・8502，Japan）
Newtherapeuticapproachestodystrophin・de丘cientmusculardystrophy：
Over・eXpreSSionofendogenousutrophin
ll：45Lunch
Chairpersons：Drs．UgoCarraroandX立chiroMatsumura
13：00TbrencePartridge

R17（MuscleCellBiologyGroup，MRCClinicalSciencesCentre，HammersmithHospital，Lendon，W120NN，UX）
BehaviorofsatellitecellsinregeneratingmuscleAndCorrectionofthemutateddystrophingenebycasual

anddeliberateexonskipping
14：00MasafumiMatsuo

Pl18（DivisionofMolecularMedicine，EobeUniversityGraduateSchoolofMedicine，Hyogo，650・0017，Japan）
Treatment ofDuchenne muscular dystrophy with01igonucleotides against an exonic splicing enhancer
SequenCe
14：45ThtsushiTbda

Pl19（DivisionofFunctionalGenomics，DepartmentPost−GenomicsandDiseases，OsaknUmiversityGraduate
SchoolofMedicine，Osaka565・0871，Japan）
RecentadvancesinFukuyamaCMDandmuscle・eye・braindisease
15：30Coffbebreak
Chairpersons：Drs．ElisabethBartonandShin

ichi恥keba

16：00ShoichiIshiura

R20（DepartmentofLifeSciences，GraduateSchoolofArtsandSciences，TheUniversityofTbkyo，Tbkyo153・8902，
Japan）

DirectevidencethatRNA・bindingproteinsinteractwithCUGtri−andCCUG
tetra・nuCleotiderepeatsinmyotonicdystrophy：itstherapeuticimplications

16：45FhichiroMatsumura

R21（DepartmentofNeurologyandNeuroscience，TbikyoUniversitySchoolofMedicine，Tbkyo173・8605，Japan）
DisruPtionofdystroglycanaxisbymatrixmetalloproteinaseincardiomyopathichamstermuscle
17：30RyoichiMatsuda（I）epartmentofLifeSciences，GraduateSchoolofArtsandSciences，TheUniversityofTbkyo，Tbkyo153・8902，
Japan）
Closingremark−181−

清水班ワークショップ「薬剤による遺伝子発現調整」

日時：平成15年7月26日（土）13時−17時
会場：全共連ビル地下1階No．14

あいさつ

清水輝夫（帝京大学医学部）

1大野茂男（横浜私立大学医学部）
Nonsense−mediatedmRNAdecay（NMD）について（総論）

13時−14時
2 白杵扶佐子（国立水俣病研究センター）
MDの応用例
14時−14時30分
3 松田良一（東京大学）
抗生物質によるstopcodon読み飛ばし
14時30分−15時

4 松尾雅文（神戸大学医学部）
エキソンスキッビング（総論）
15時−16時

5 木村重美（熊本大学医学部）
ゲンタマイシンによる治療実験
16時−16時30分
総合討論 石浦章一（東京大学），清水輝夫（帝京大学医学部）
16時30分−17時ー182−

薬剤による遺伝子発現現調節
文責 石 浦 章一
東京大学大学院総合文化研究科

分解が抑制されるので，停止コドンが入ったmRNAが安定化し，短いタンパク質が作られて細胞膜に取り込まれることを示した．

厚生労働省委託研究：筋ジストロフィー清水班Small
松田良一博士（東京大学）は，停止コドンの入ったmgroupworkshop「薬剤による遺伝子発現調節」は，平成15年7月26日，全共連ビルで行われた（オーガナイザ
ー，石浦章一，東大・院・総合文化）．これは，NMDやエ
キソンスキップ，停止コドン読みとはし，など遺伝子疾
患の薬剤治療を目指したものである．

RNAを読み飛ばすネガマイシンという抗生物質の機能について議論した．ジストロフィン遺伝子に停止コドンが入ったmdxマウスにネガマイシン投与すると，ジスト
ロフィンの蛍光染色が回復することを示した．欧米では班長の挨拶のあと，大野茂男博士（横浜市立大学）がゲンタマイシンですでに同様の結果が報告されており，今後は，効率の良い抗生物質の開発が望まれる．

NMD（nonsense，mediatedmRNAdecay）について1時間，総論を述べた．これは，停止コドンが入ったmRNAが，選択的に分解されてしまう機構で，数多くの因子の参加によって行われている．大野は，線虫とヒトを対比して，
NMDの基本メカニズムは種に関わらず保存されていることを示した．特に，hsMGlという大きなキナーゼが松尾雅文博士（神戸大学）は，以前から行っているジ
ストロフィン欠損患者をエキソンスキッビングという方法で治す試みについて講演した．この方法は，すべての患者で使えるわけではないが，症例によっては強力な武器になるものと思われた．

関与していて，このキナーゼの阻害剤によってNMDが抑制されることを示した．
臼杵扶佐子博士（国立水俣病研究センター）は，大野と共同研究を行っているが，臨床材料を用いてNMD阻害を行い，遺伝性疾患が治る可能性を示した．材料はUllrich病で，コラーゲンⅤⅠが欠損している細胞に，hSMGlの阻害剤であるウォルトマニンやカフェインを培
養外液に添加すると，NMDが阻害され，異常mRNAの

木村重美博士（熊本大学）は，ゲンタマイシンによる治療実験について述べた．ゲンタマイシンも，前述のネ
ガマイシンも，難聴や肝毒性など種々の副作用が出ることが予想される．今後は，副作用のない治療薬の開発や，NMDとの併用によって不安定なmRNAを保存して，翻訳時に抗生物質を使って停止コドン読み飛ばすことによって，機能を保持したタンパク質をつくる試みもすべき
だろう．

−183−

Smallgroupworkshop

先天性筋ジストロフィー研究の進歩：翻訳後修飾異常と筋ジストロフィー

平成15年10月4日
全共連ビル地下一階No．19

プログラム
9時55分（開始）（座長：遠藤玉夫）
清水輝夫班長 挨拶 （5分）
糖鎖とは 遠藤玉夫（東京都老人総合研究所） （5分）
動物レクチンと糖鎖認識 平林 浮（産業技術総合研究所糖鎖工学研究センター）（35分）
休憩（10分）（座長：戸田達史）
糖タンパク質の品質管理とユビキチン・プロテアソーム系 田井 直（東京都臨床医学総合研究所）（35分）
細胞内糖修飾0−GIcNAcの生理学的意義 亀村和生（理化学研究所）（35分）
昼食（12時00分・13時10分）（座長：西野一三）
神経細胞移動と脳の構築異常 寺島俊雄（神戸大学）（35分）
福山型先天性筋ジストロフィーと類縁疾患（MEBとWWS）戸田達史（大阪大学）（30分）
DystroglycanconditionalKO miceの解析 斉藤史明（帝京大学）（30分）
マトリックスメタロプロテアーゼ：ジストログリカンによる細胞内外の架橋構造を破壊する
別のメカニズム 松村喜一郎（帝京大学）（10分）

休憩（10分）（座長：松村喜一郎）
パールカンの神経筋発生及び疾患における役割 平澤恵理（順天堂大学）（30分）
FCMDにおける網膜病変の病理学的検討 福興なおみ 大澤真木子 斎藤加代子
小林槙雄（東京女子医科大学）（25分）
αジストログリカン関連筋ジストロフィーの遺伝子解析 林由起子（国立精神・神経センタ
ー神経研究所）（20分）
DMRV研究：最近の進歩 西野一三（国立精神・神経センター神経研究所）（20分）
総合討論（座長：遠藤玉夫）（10分）
16時50分（終了）−184−先天性筋ジストロフィー研究の進歩：
翻訳後修飾異常と筋ジストロフィー
遠 藤 玉 夫＊複合糖質の糖鎖が，多細胞生物で営まれているさまざまな生命現象（発生，分化，炎症，免疫，感染症，がん，細胞接着，老化など）において重要な役割を果たしていることが分かってきた．もし，それらの糖鎖の欠損あるいは構造異常が生じるとさまざまな病態が生じることは想像に難くない．動物細胞で合成されるタンパク質の50％以上
は糖鎖が付加されていると推定されている．αジストログ
リカンにマンノース（Man）を介して結合する新しいタイ
プの糖鎖，0−Man型糖鎖（Siaα2−3Ga］P1−4GIcNAcP1−2Man）が発見された．0−Man型糖鎖は，脳，神経，あるいは骨格筋など限られた糖タンバク質に存在する．0＿Man型糖鎖■の合成に関わる protein O・mannOSe P1，2
ルac吋lglucosaminyltmnsfimse（タ肌〝〃）の遺伝子が先
天性の筋ジストロフィーに眼奇形，神経細胞移動障害を伴う常染色体劣性遺伝病であるmuscle−eye−brain（MEB）病の原因遺伝子であることが明らかになった．さらに最近の研究により，MEB病と類似の病態を呈する福山型先天性筋
ジストロフイpO；CMD），Whlker−Warburg症候群（WWS），
先天性筋ジストロフィー1C型（MDCIC），先天性筋ジスト
ロフィー1D型（MDCID）など他の筋ジストロフイPでも，いずれもαジストログリカンの糖鎖修飾異常が認められ神経細胞移動障害を伴う筋ジストロフィーの発症機序に糖鎖が深く関わると考えられるようになった．これらの異常を具体的に明らかにすることは，筋ジストロフィーの糖鎖病理機序の解明の新たな道を拓くことが期待される．
糖鎖というのは多様性があり取扱いが難しく，余り馴染みのない生体高分子であるというイメージがある．そこで
今回の「先天性筋ジストロフィー研究の進歩：翻訳後修飾
異常と筋ジストロフィー」のワークショップを開催した．
まず，前半で糖鎖研究の第一線で活躍されておられる先生
方に糖鎖について分かりやすく解説して頂いた．さらに後半で糖鎖異常とされる筋ジストロフィーについて最新のデータを発表して頂き討議した．

チン化するシステム，つまり糖鎖を介したタンパク質の品
質管理機構について解説した．亀村和生（理化学研究所）
は，やはり細胞内における糖鎖の役割として，タンバク質のaGIcNAc修飾について解説した．aGIcNAcの生理学的意義は細胞内情報伝達で重要な役割を果たしているリン酸化を調節している可能性を示唆した．これら二つの講演は，従来糖鎖は細胞の表面あるいは細胞の外で機能していると考えられていたが，実は細胞内でも大変重要な役割を果たしていることを明らかにしたものである．
2）糖鎖異常とされる筋ジストロフィーについて最新の知見
寺島俊雄（神戸大学）は，神経細胞移動障害と脳の構築異常を示すさまざまなミュータントマウスを取り上げ，解剖学的所見について報告した．リーラーマウスは従来層構造異常と単純に説明されていたが，詳細に形態を解析すると従来言われているような第一層がなく層構造が逆転という単純な異常ではなくdimISibleな障害，鮎btinは基底膜グリア性境界異常，CDK5とp35はpost−Ptate異常，
Reelin，DABl，VLDLR，APOER2は皮質ニューロンがpre−Plateに侵入できずoutside−in配列になる異常，などについて解析結果を報告した．また，ヒトでREELN変異患
者がみつかったことも報告した．この講演は出席者の注目を浴び，年度末の班会議の席上改めて，より多くの班員の前でお話頂くことにした．
戸田達史（大阪大学）は，FCMDと類縁疾患（MEBとWWS）について概説した．次にfukutin欠損マウスは胎生致死であることを報告した．そこで鮎btin欠損細胞キメ
ラマウスを作製し，その様々な病態について報告した．筋力低下，運動失調様行動を呈すること，骨格筋では筋線経の大小不同，問質の増大，壊死および再生像を呈すること，
抗糖鎖αジストログリカン抗体によりαジストログリカ
ンの発現低下が認められること，大脳では左右半球の癒合，皮質および海馬の構造異常，第V層ニューロンは皮質深最初に「糖鎖とは」と題して私が簡単なイントロダクシ
ョンを行なった．引き続いて講演に入り，平林 浮（産業部から表層にかけて広く分布すること，眼では眼球の奇形や角膜の混濁などを報告した．さらに餌kutinはゴルジに局在しており，患者から見つかった点変異の蝕kutinはゴルジに到達できないことを示した．さらに知kutinはN型技術総合研究所糖鎖工学研究センター）は，生体における糖鎖の役割について糖鎖と結合する動物レクチンの立場

糖鎖の修飾を受けていることを明らかにした．
斉藤史明（帝京大学）は，ジストログリカン組織特異的から解説した．田井 直（東京都臨床医学総合研究所）は，細胞内における糖鎖の役割について糖鎖を認識しユビキ

欠損マウス（脳，骨格筋，末梢神経それぞれ）の解析について報告した．脳でのみ特異的にジストログリカンを欠くと，大脳皮質層構造の欠如，異常脳回，グリア性境界膜一●東京都老人総合研究所

基底膜の破壊などの脳奇形，筋でのみ特異的にジストログ

1）糖鎖についての教育講演

一185−

リカンを欠くと，DGCの構成成分の消失，緩和な筋ジスト
ロフィー，末梢神経でのみ特異的にジストログリカンを欠くと，ミエリンと絞輪の形成不全，ランヴユエ絞輪でのナトリウムチャネルの減少，などが観察され改めてジスト
ログリカンの重要性が認識された．これらの異常にジスト
ログリカンの糖鎖がどの位関与するか興味がもたれる．

福興なおみ，大澤真木子，斎藤加代子，小林槙雄（東京女子医科大学）は，FCMDにおける網膜病変の病変について報告し，網膜においても基底膜異常が認められるが，これはグリア様細胞である網膜ミューラー細胞の関与と，
FCMD脳での形態形成異常，すなわちグリア性境界膜の断裂と共通する糖鎖異常で説明できるのではないか，とした．

松村喜一郎（帝京大学）は，ジストログリカンの糖鎖異常だけでなく別の翻訳語修飾であるタンパク質分解，マト
リックスメタロプロテアーゼによってジストログリカンを介した細胞内外の架橋構造が破壊される可能性に言及

林由起子（国立精神・神経センター神経研究所）は，日本におけるαジストログリカン関連筋ジストロフィーのした．癌細胞で特に顕著にジストログリカンは分解を受けていること，心筋症ハムスター（LGMDのモデル）でも認められること，さらにサルコグリカン欠損LGMD2Eでも認められることを報告した．

起こりこれは421番目のロイシンの脱離となる変具について報告した．これらすべてジストログリカンのコアタンパ
ク質は検出されることから，すべて糖鎖異常であろう，とした．

平澤恵理（順天堂大学）は，パ・ルカン（へパラン硫酸
プロテオグリカン）のノックアウトマウスを作製し，／ト
ルカンの機能完全欠損はノックアウトマウスの症状とよ西野一三（国立精神・神経センター神経研究所）は，シァル酸供与体の中間体の合成に関与する遺伝子

く似た周産期致死性のSilverman−Handmaker型軟骨異形成症PDSH）を発症することを示した．このマウスは，神経筋接合部アセチルコリンエステラーゼが特異的に消失していた．さらに，このマウスに対して軟骨特異的にバール
カンを発現させたマウス作製に成功した．この機能部分欠損マウスは，軟骨病変と筋持続収縮（ミオトニア）を併せ持つSchwartZ＞Jampel症候群（SJS）を発症すること，ミオ
トニアのメカニズムを研究するのに良いモデルであることを示した．

遺伝子解析（FCMD，FKRP，WWS，MEB）について詳細な報告をした．また，WWSで三つの連続した塩基の脱離が（UDP−GIcNAc−2−ePimerase，ManNAckinase）変異が原因（GNEの変異）である，DMRV研究について最近の進歩をまとめて報告した．骨格筋でシァル化されている糖鎖が少なくGalNAcがむき出しになっていることや培養細胞レ
ベルでは，MahNAc，NeuNAcを培地に加えることによりシアリル化が回復することを示した．遺伝子変異があっても発病しない例を報告し，シァル酸の複雑な代謝系（サルベージ回路）によりシァル酸が補償されている可能性を示
唆し，DMRVの複雑な病態の奥深さを示唆した．

−186−

三好型筋ジストロフィー／LGMD2B；
ジスフェルリンの機能と筋ジストロフィー（Moderator：桃井 隆）
日時：平成15年10月24日（金）午後1時00分・午後5時20分
場所：全共連ビル地下1階 No．19
問い合せ先：Tel：042−341−2711（内線5273）
プログラム
午後1時00分（開始）（座長：桃井 隆）
清水輝夫班長 挨拶 （5分）
（座長：青木正志）
常染色体劣性遠位型筋ジストロフィー（三好）の臨床と原著論文症例のジスフェルリン遺伝子異常
川井尚臣（高松市民病院 名誉院長）（30分）
細胞膜修復とリソソーム
木南 英紀（順天堂大学医学部生化学教室）（15分）
三好型筋ジストロフィーの病理
埜中征哉（国立精神・神経センター武蔵病院長）（30分）
日本人dysftrlinopathyにおける遺伝子変異と臨床型
青木正志，高橋俊明（東北大学神経内科）（30分）

2：50−3：05（休憩）（15分）（座長：桃井 隆）
メンブレントラフイツク・分子機構から高次機能への展開・
吉森 保（国立遺伝学研究所）（40分）
カルシウム結合ドメインの構造と機能
反町洋之（東京大学大学院農学生命科学研究科）（30分）
ジスフエルリンの膜融合機能について
藤田恵理子，桃井 隆（国立精神・神経センター神経研究所疾病5部）（20分）
ジスフェルリン結合タンパク質の発現
林 由起子（国立精神・神経センター神経研究所疾病1部）（30分）
総合討論（座長：桃井 隆）（20分）
5：25（終了）−187−

三好型筋ジストロフィー／LGMD2B；
ジスフェルリンの機能とジストロフィー
桃井

三好型／LGMD2B筋ジストロフィーの原因遺伝子として，ジスフェルリンが兄い出され，その塩基配列からジスフェルリンはカルシウムが結合するC2ドメインをもち，膜融合に関係する蛋白であると推定されてきたが，実際の機能や筋ジストロフィーを誘導する機構，また他の筋ジストロフィーの原因蛋白との関係など依然不明な点が多く残されている．
本ワークショップでは，常染色体劣性遠位性筋ジスト
ロフィー（三好）とLGMD28の臨床症例，ジスフェル
リン遺伝子の変異，および筋細胞膜の修復とジスフェル
リンとの関係，ジスフェルリンの機能欠損と三好型／
LGMD28筋ジストロフィーの発症との関係を考える機会とした．
川井尚臣先生（高松市民病院 名誉院長）は三好型筋
ジストロフィーの臨床的特徴について，1967年の発表以来の原著症例（Miyoshiら，Brain，1986を含む）を中心に述べた．原著論文症例の3家系4症例のジスフエルリン
遺伝子解析で，C4968T（Thr1532Met），C1939G（Try522stop），
6048delT（StOp COdon）の変異が検出されdysfbrlinopathy
であることが確認された．
青木正志先生（東北大学神経内科）は日本人

隆●dysftrlinopathyにおける遺伝子変異と臨床型について報告し，特に神経症状を示す症例を報告し，注目を集めた．
埜中征哉先生（国立精神・神経センター武蔵病院長）
はdysftrlinopathyの筋組織の細胞膜は不連続の断片化がおきており，明らかにジストロフィン欠損の筋ジストロ
フィーとは異なることを，美しい電顕写真で示した．
反町洋之先生（東京大学大学院農学生命科学研究科）
はジスフェルリンのカルシウム結合領域であるC2ドメインの立体構造を紹介した．
木南 英紀先生（順天堂大学医学部生化学教室）は細胞膜修復におけるリソソームの関与について，現在考えられている分子機構を説明した．
青森 保先生（国立遺伝学研究所）はエンドゾーム融合と膜輸送の分子機構，オートファジーからリソゾームの生成の機構について紹介した．
藤田恵理子／桃井隆先生（国立精神・神経センター神経研究所疾病5部）は膜融合過程におけるジスフェリン
分子の結合蛋白とその分子機構を示した．
林 由起子先生（国立精神・神経センター神経研究所疾病1部）は新たなジスフェルリン結合タンパク質の存在を示唆するデーターを紹介し，注目を浴びた．

● 国立精神・神経センター神経研究所疾病5部

ー188−

ワークショップ：「リソソーム再訪」
場所：全共連ビル地下No．18室
日時：平成16年9月25日（土）午後1時から午後4時半
演者：1）13：00

あいさつ2）13：05−14：00

BorisTurk（JozefStefanInst．，Slovenia）

LysosomalCathepslnS3）14：00−14：45 木南英紀 （順天堂大学医学部）
リソソームとオートファジー
4）14：45−15：30 山本健二 （九州大学歯学部）
MedicalAspectsofEndolysosomalAsparticProteinases5）15：30−16：15 桃井 隆 （国立精神・神経センター）
変異蛋白凝集と小胞体ストレス…細胞死とオートファジー
6）16：15−ディスカッション

オーガナイザー：石浦章一（東大・大学院総合文化研究科）
班長：清水輝夫（帝京大神経内科）−189−リソソーム再訪
文責 石 浦 章 一
東京大学大学院総合文化研究科

山本健二博士（九州大学歯学部）は，リソソーム酵素，
特にアスパラギン酸プロテアーゼであるカテプシンDや
カテプシンEの権威である．講演は，rMedicalAspectsof

厚生労働省委託研究：筋ジストロフィー清水班

EndolysosomalAsparticProteinases」と題して行われ，山本研究室で初めて行われたカテプシンEノックアウトマ
ウスの表現型について詳しく解析した．

（14B−4）のSma11groupworkshop rリソソーム再訪」は，
石浦章一（東大・大学院総合文化研究科）をオーガナイ
ザーとして，平成16年9月25日（土）午後1時から午後4時半，全共連ピル地下No．18室で行われた．

桃井隆博士（国立精神・神経センター）は「変異蛋白

主演者は，スロベニア国のJozefStefan研究所のBoris
Turk博士で，「LysosomalCathepsinS」と題してリソソー
ムタンパク分解酵素についてのオーバービューを行った．
Turk博士は，世界プロテオリシス会議のヨーロッパカウ
ンシルメンバーであり，カテプシンの世界的権威である．
講演では，11種類のカテプシンの機能，構造の差異，筋肉疾患での活性化など，最新の知見を紹介した．
次に講演した木南英紀博士（順天堂大学医学部）は，「リソソームとオートファジー」と題して，オートファ
ジーの最新の知見を述べた．空胞変性とオートファジーとの関係，オートファジーに関わる十数種類の因子の同定，ノックアウトマウス，など筋変性とオートファジー
がどのように関わるかについてまとめた．

凝集と小胞体ストレス一一一細胞死とオートファジー」という題で，主に小胞体ストレスについてまとめた．このあたりは，本年度のノーベル化学賞のテーマである細胞
内タンバク質分解とも重なり合うところがあり，興味深
い議論がなされた．

神経筋疾患にタンパク分解が関与していることは周知の事実だが，かつてリソソームと細胞質分解に分けて議論してきた時代から，個々の機能を分子生物学的に明らかにする時代がきている．このSmallgroup workshop「リソソーム再訪」は，もう一度，リソソームの機能を見直そう，という目的で行われ，最新のオートファジーや小胞体ストレスがリソソーム機能に関係していることが明らかになった．

−190−

SGW（MolecularTherapyofMuscularDystrophy，PartII）報告松

田良Group，TokyoMetropolitanInstituteofGerontology・Tokyo・一

東京大学大学院総合文化研究科生命環境科学系（生物学）

Japan

toda＠cl坤弧jp

平成16年11月12（金），13（土）の2日間，東京大13：35−14：00

学教養学部キャンバス内の駒場ファカルティーハウスに
おいて，国際シンポジウム MolecularTherapyofMuscular

Restorationoramyopatbicpbenoけpeolmubnt

Dystrophy，PartII（筋ジストロフィーの分子治療／／トト2） を開催した．公用言語は英語．2日間の合計参加

myostathtransgeniemice

者数は80名を越えた．外国からの発表者はD．Bedwell（アラバマ大学医学部教授），H．LeeSweeney（ペンシルヴェニア大学医学部教授），Jean−Pie汀eRousset（南パリ大shizukaSasanol），ⅥyoiMori1），MasumiNishi2），Akihiro

学分子生物学教授）の3名．筋ジストロフィー研究およびストップjドンの読み越え（read−through）によるナンセ
ンス突然変異の薬物治療研究の最前線について発表と活発な質疑がおこなわれた．

KawasakiMedicalSchool，Okayama，Japan

caveolin−3tratIgenicmicebycrossitlgwithmutant
YoshihideSunada！），YぬkaOhsawal），HirokiHagiwaraI），
Ⅶsue2），Thtsu餌niMurakamil），andSumihareN可i3）l）DivisionofNeurology，DepartmentofIntemalMedicine・2）DepartmentofOrthodontics，FacultyofDendstry・and3）
DepartmentofBiologicalScienceandTtchnology，Facultyof
Engineering，TheUniversityonbkushima，Tbkushima，Japanysunadaプログラム

14：00−14：25
CharacteriZation of Ebllistatin and FLRG as myostatin
inhibiting proteins and novel therapeutic tooIs Ebr

AnInternationalSympositlmOrgatlizedbyJapanesereatmentofmusculardystrophy

MuscularDystrophyResearchGrotlP

KunihiroTsuchida．

Institutefor Enzyme Research，University ofTbkushima，〟〃Jgc〟ね′mgr叩yq／肋∫C〟ね′坤Jか叩わ，′劫〟〃

3−18−15Kuramoto，Tbkushima770−8503，Japan

NoYember12（Fri）−13（Sat），2004

tsuchida＠ier呵

AtKomabaFacuItyHouseItJniversityofTokyoIJapan
LoCatiotl，Chairpersonaナ

http：／／www．C．U−tOkyo・aC・jp／en釘kyoyo／map・html＃a

恥tsushi Tbda

＆Jean−Pierre Rousset

14：25−14：50

NoYember12（Fd）2004

1nductionofdystrophinexpressioninDuchennemuscular

ChairpersotlSナRyoichiMatsuda＆H・LeeSweeTley

dyStr叩by by mathgim−hmeI止RNAwitb antkense

13：00−13：10

Oligonucleotides

0pemingremark5

Ma，afumiMatsuol．MarikoYagi1，MakotoKoizumi2，Kazuto

TeruOShimizu
Department of Neurology and Neuroscience，Teikyo

Ishibashil，AtsushiNishiyamaIY鮎uhiroThkeshimal

Univers吋

lDepartmentofPediatrics，KobeUniversityGraduateSchool！shimizu＠med．teikyo−u・aC・jp

ofMedicine，2：SankyoCo．，Ltd．
matsuo侃kobe−u．aC．b

13：10−13：35

14：50−15：15

Fukutinanddystroglycanopathy
Xiong Huil，Kazuhiro Kobayashil，Masqji Tachikawat，Nobuhiro FLjikakel，Yoshitaka Nagai1，HiroshiManya2，

patbogeneskolmyotoniedys什Ophy
YoshihiroKino，NoboruSasagawa，ShoichHshiura

TamaoEndo2，TatsushiTodat

lDivision of Functional

RNA−binding protein MちNLlisimvoIYedin tbe

Genomics，Department of

DepartmentofLifbSciences，GraduateSchoolofArtsand

Post−Genomics and Diseases，Osaka University Graduate

Sciences，TheUniversityonbkyo

SchoolofMedicine，Osaka，Japan2GlycobiologyResearchcishiura−191−

Jean−PierreRousset（1115；15−15；45ColrbeBreak（1）Institut de Ginitique et Microbiologie，Universiti

15；45−16：10

Paris−Sud，914050rsayCedex，FranCe

1dentification or a novel mtlSCle gene whichis

iDrOuSSet伝）servljmors．U＿DSud．丘tIP−regulatedinm血miceanddown−regulatedincelHines
derivedhmDuchennemusculardystrophypatients（2）INSERM U582

YbkiNakayamal，NorikoNaral，YukikoKawakita2，Y貼uhiro−Institut de Myologie，IFR14，GroupeHospitalierPitii−Salpetriere，47Boulevard

Thkeshima3，Masayuki Arakawa4，Ryoichi Matsuda4，

deltH6pital，75651ParisCedex13，FranCe

MasafumiMatsuo3，KayokoSaito2，andTakahikoHaral
lDepartmentofTumorBiochemistry，TheTbkyoMetropolitan
Institute ofMedicalScience，2Department ofPediatrics，
Tbkyo Womcn，s Medical University，3Dep加ment ofPediatrics，Kobe UniversityGraduate SchoolofMedicine，

18：15−18：40
CurrentsituatioJ10rNegamycinresearch
RvoichiMatsuda，MasatakaShiozukaandKenichiShimada

4DepadmentofLifbSciences，TheUniversityonbkyo
tharararinshoken．or．it）

Department of Lift Sciences，Universityof Tbkyo，

3−8−1Komaba，Tbkyo153−8902，Japan
ChairpersonS，KayokoSaito＆MasafumiMatsuo

Rvoichi侶）matsuda．C．u−tOkYO．aC．iD

l ：10−1 35

Dehing dyStrOglycanlunction necessary to preYent
muSCleceudegemeration
FumiakiSaitol，TbruOShimizul，KevinItCampbel12，Kiichiro

NoYember13（Sat），2004

MabumuTal

Chairpersons，Shoichilshiura＆DavidBedweu

lDepartment of Neurology and Neuroscience，Tbikyo

9：00−9：50

University，2Department of Physiologyand Biophysics，

Nonsense−mediatedmRNAdecay（m）：Molecular

UniversityorIowa

mecbanismSandpotenthlapplieations．

flsaito偲med．teikYO−u．aC．iD

ShigeoOhno
DepartmentofMolecularBiology，YokohamaCityUniversitylSchoolorMedicine

35−17；00Mu托lestem celkas a toollorceIltherapy ofmuscularohnos伝）mail．vokohama−Cu．aCjD

dystropby
YukoMivaEOe−Suzuki．Shin，：50−10；00

ichilbkeda

Department of Molecular Therapy，NationalInstitute of

StruCtureandfunctionrehtionshipofhSMG−1，amember

Neuroscience，NCNI14−1−10gawa−Higashi，Kodaira，Tbkyo

Ol仙ePIKKhmiけprotein出血鮎eS，tbatplaysanessenthl

187−8502，Japm

mlei皿nOmSemSかmediatedmRNAdecay

mivaEOe庇ncnt）．tZOjD

lTbmokoMorita，2lsaoKashima，2NatsukoIzumi，lshoichi
Ishiu叫2shigeoOhno
IUniv・OfTbkyo，Grad・Sch・OfArts＆Sci・，Dept・OfLifeSci．，

17；00−17：25

2YokohamaCityUniv・，Grad・Sch・Med・，Dept・Mol・Biol．
CofihiJHnyOfibriIEbrmationandmaiJltenanCe

cishiuraramail．ecc．u＿tOkvo．ac．iD

TakashiObinataandNarukiSato：
DepartmentofBiology，ChibaUniversity，JapanlO：00−10：25

tobinatarabio．S．chiba−U．aC．iD
ElhctortbeinbibitionornonsenSe一mediatedmRNA

decayonthemutantpheJIOtyPeintJllrich，sdisease
FusakoUsukil．AkioYmashita2・4，ItsuroHiguchi3，Shigeo
Chairperson，ShiJl，ichilbkeda

Ohno2
1．Department ofClinicalMedicine，NationalInstitutefor

17：25−18；lS

MinamataDiseaLSellSuki庇肌imd．EO．iD
StopcodonconteItandresponsetoreadthrough−induciJlg
drugs．

2．Department of Molecular Biology，Yokohama City
UniversitySchoolofMedicine，

LaureBidou（1），ValirieAllamand（2），IsabelleHatin（1）and

Department of Neurology

ー192−

and Geriatrics，Kagoshima

UniversityGraduateSchoolofMedicalandDentalScience，

ShiE！emi

Kimura叫，Kaori

Tto＆，Hiroe Kawan08，Thkashi

3・Department of Biochemistryand Molecular Biology，HiranumaA，Kowasi Yoshioka＆，Shiro Oza氾＆，Makoto

UniversityofTexas

Matsukura＆，MakotoIkezawa8，MasafumiMatsuob，％uhiro
Thkeshimab，RyuichiUeokaC，Yoko MatsumotoC，Teruhisa

Chairpersons｝IchizoNishino＆TeruyukiKurihar

MiikealO：25−11；15

aDepartment ofChild Development，Kumamoto Unitersity

SupressioT10fprematurestopmutationsthatcausegenetic

School of Medicine，Kumamoto，Japan，bDepartment ofdiseasesPediatrics，KobeUniversityGraduateSchoolofMedicine，Kobe，

M．Du＋，E．Welch＃，J．Zhuo＃，S．Peltz＃，S．Hwang＃，GJapan，CDepartment ofappliedlifb science，Sqio University，

Chen＃，J．Thkasugi＃，L．Miller＃，S．Yeh＃，andD・Bedwell●・

KumamOtO，Japan＋DepartmentofMicrobiologyandCysticFibrosisResearchkimusi

輌

Center，UniversityofAlabamaatBirmingham，Birmingham，AL35294；and＃PTC Therapeutics，South Plainfield，NJ

13：55−14：20

O7080．

TheeErbctofcorticosteroidandgentamicitladministration

dbedweIl（筏uab．edu

to cultured muscle cells hm a DuchenTIe muSCular
dysh℃pbypatientll；15−12：05

Kavoko Saito．EriKond0−Iida，Ⅵlkiko Kawakita，Kiyoko

Suppression of premature stop codons as a potentiaI

比町もHirokoHosab

therapybrasubsetofpatientswithDuchennemuscuIar

InstitutedyshⅦpby

University，Department

H．bSweeney

MedicalUniversity
baitorapd．hvmu．ac．b

Department of Physiology，University of Pennsylvania・ofMedicalGenetics，Tbkyo

of

Women

Pediatrics，TbkyosMedical

Womens

SchoolofMedicine，3700Hamilton Walk，B400Richards
Building，Philadelphia，PA19104JO85

14：20−14：30

1sweenev偲rnail．med．uDenn．edu

Closhgremarks
TeruyukiKurihara

12：05−13：30Lumcb

Division of Neurology，l，050yen／person

Medicine，TbhoUniYerSity OhashiHospital，2−17−60hashi，Meguro，Tbkyo153−8515，Japan

Chirpersons，T ruoShimizu＆RyoichiMatsuda
h雨hamraoha．toho−U．aC．iD

13：30−13；55

AnovelapproachofthegentamicintherapyfbrDuchenne
mtlSCtllar dystrophy using hybrid liposome andestablishmentofasystemtoidentifythepatientseligible
Ibrthetmtment．

ー193−

Department of lntemalSummary

Clinico−PathophysiologLCalresearchanddevelopmentofmedicaltreatment
formusculardystrophyandrelateddisorders
乃r〟0g鋸mk〟

Theprqject，StartedinApri12002，isaimedto（1）analyzethemolecularmechanismofmusculardystrophies
andrelatedmyopathiesandtherelationshipbetweenthemoleculareventsandclinicalphenotypes，（2）establish
diagnosticproceduresofthesediseases，and（3）developgeneandcelluartherapiesandchemicalswhichcan
rescueand／orpreventclinicaldeteriOrationofmusculardystrophypatients・ThefbllowlngreSultsareobtained
intheresearchyears，Apri12002−March2005．
1．DMDand BMD．
Intheaspectoftherapeutics，（l）theefftctofnegamycinonread−throughofthecausativepointmutation

ofdystrophingeneisassessedandfbundtoexpressdystrophinattheleveloflO％tocontrolinbothcultured
myotubesandtibialisanteriormusclesofmdxmousewithnotoxicity・NegamyclnWillbeanpromisslng
altenativecandinateinsteadofbiologicallytoxicgentamicin・Animprovedmethodisessentialtogetenoughdystrophinexpressiontotesttherecoveryofmusclestrengthinthedystrophydog・（2）AsachemiCaltocause
theskippingofanmutated−eXOnOfthedystrophingene，anti−SenSeOligonucleotide（AS−01igo）againstthe
splicing−enhancersequenceofexon19andENA（2−0，4−C−ethylene−bridgednucleicacid）／DNAchimerais

synthesizedandfbundtobeef托ctivetoexpressthein一正amedystrophinmisslngtheexon19incultured
myocytes ftom controIs andexon20−deficientDMDpatients・ENA／DNAchimerais more efftctive thanAS−01igointheculturesystem丘ombothhumanandmousecontroIsandmdxmousethanAS−01igo・Invivo
trialuslngDNA／ENAchimerademonstratedhopefu1resultsinmouse・TheAS−01igoisnowtriedto anexon−20deficientDMDboybyintravenousirjectionsonceaweekfor4weeks．Atthetimeof5thweek，nO
improvlngefftctsareobservedinthelevelofserumCKandclinicalmusclestrength・However・nOSideefftcts
areapparentandthedystrophinexpressionisdefiniteinbothperipherallymphocytesandbiopsiedskeletal

musclebyimmunofluorescentmicroscopyandimmunoblotting・Thisispromising・（3）Msx1−inducedstem
cellsftommaturemousemusclesissuccessivelyfbundtodeveloptomaturemyotubes，adiposecellsorbone
cellsintheindividualconditions，reSPeCtively・Theywereefftctivelytransplantedtothemdxtibilalismuscles
andshowntodevelopdystrophin−POSitivemyotube／myonbers・Msx−1isanexcellentcandidatetoinducestem
Cellsandahopefu1celltherapyfbrmusculardystrophy・Intheaspectsofpathophysiology，（1）itisgenerallybelievedthatdystrophin−dencientdystrophicmyonbers
are丘agiletomechanicalandhypertrophicstressbecauseofthedeftctivememranoskeleton，Whichcausesa
localized destruCtion ofsarcolemma（delta region），Ca−influxfrom outside ofthe cells，and muscle cell
damage（S）ofproteolysis（Catheory）．Duringthisprocess，α／β−dystroglycan（DG）issomehowdestroyedanddystrophicmusclesundergoto deteriorate・ItturnS Outthatamembrane−boundmatrixmetalloproteinasel（MMPl）cleaves the extracellular domain（13kDa）ofβ−DG（43kDa）in vitro andin vivo（humandystrophic muscles）experiments．Particularly，the cleavageincreasesin the clinical progress of

DMD侶MD．The MMPinhibitor，BPHA，is a candidate fbr the prevention of clinical progression of
DMD／BMD．（2）itisfbundthattheintracellulardomainofβDGbindstoanothersignaltransductionsysytem
ofMAGI−1／−Catenin／Tbfinadditontothealready−knownGrb2system，thedeftctofwhichcausesmyocell
death．Themolecularpathomechanismofdystrophicmusclesisstillunclear・
2．LGMDs．
（1）There are severalprogresses onthe dysftrlinfunction，the causativeprotein ofLGMD2B・In
additiontothesarcolemmallocalizationandaputativeCa−bindingproperty，dysftrlinisfoundtolocalizeon
thecytoplasmiCmembranes（1ysosome，endstage−endosome，Golgibody，andER）andtoplay arole onthe
fusionofthecytoplasmicmembranetotheplasmamembranebybindingtosyntaxinandSNAP25andby−197−

fbmingaCa−dependentcomplexwithAAATPase（VCP）．Thisisanessentialprocessintherepairofthe
damagedplasmamembrane，membrano−fusionand−tranSPOrtintheGolgibody．
A

clinico一genetic

relationshipofdysftrlinopathyisdemonstratedinJapanesefamilies．41unrelated

Japanese fami1ies（44patients）showbothdistalandLGMDtypes，and23unrelatedJapanesefhmilies（26patients）showtheLGMDtype．Genetically，28mutaions arefoundinthedistaltype，12mutaionsinthe
LGMD type，and5mutaionsin both types．Mutations ofC1939G、G3370T、3746delG and4870delT are
丘equentinthedistaltype，eSPeCiallythe3746delGmutationisnotfbundintheLGMDtype．Ontheother
hand，mutaionsofG3370Tand4870delTarepopularintheLGMDtype．ThemutantsofG3370Tareclinicallybenign．

Ananimalmodelforaninflammatorymyopathy，SJL／Jmouse，isfbundtobedeftctiveinthedysfbrlingene，and to show a sequentialmyopathology oftypel fiber atrophy，Centralnuclei，Cellinfiltration，and
demyelination ofintramuscular motor nerveS，Which suggests a pathological diffbrence

丘om human

dysftrlinopathy．

（2）Asregards to the pathogenesis and therapy．ofsarcoglycanopathy（LGMDs2C，2D，2E and2F），the
activation ofa membrane−type matrix metalloproteinasel（MMP−1）is specincally shown to cleave theextrace11ulardomainofP−dystroglycanwiththeresultantdisruPtionofthedystroglycanlinkagebetweenthe
Subsarcolemmalcytoskleletonandbasallamina，WhichisidenticaltoDMD／BMD．Thisraisesatherapeutic
POSSibilityfbrsarcoglycanopathybyaspecificinhibitorBPHAofmembrane−tyPematrixmetalloproteinase
I（MMP−1）．
（3）Trial of a myostatininhibitor，myOStatin prodomain，fbr transgenic caveolinopathy（LGMDIC）
mouse．Myostatininhibitionis reported ftom USAto cause theincrease ofthe muscle volumewith theenlargement ofbothnumber and diameterofmyonbers，and anti−myOStatin antibodyis expectedtobe a
POSSiblemedicationforvariousmyopathies．However，Webelievethattherepeatirtjectionoftheantibodyhas

ahighPossibilityofanallerglCreaCtion，andweexploreothercandidatesofmyostatininhibitionsuchas
fbllistatin，fo11istatin−related gene FLRG，and myostatin prodomain・Double transgenic mouse of mutated
CaVeOlinandmyostatinprodomainisfoundtoremarkablyimprovethemusclevolumeandstrengthinspiteof
unchangedmyopathologyandpoorexpressionofmutatedcaveolin．Myostatinprodomainisagoodcandidate
fbrtherapyofmusculardystrophies．
（4）InUllrichdisease，WhichiscausedbygeneticdeftctsofcollagenVIα−Subunit，theinhibitionofthe
nonsense一mutatedmRNAdecaybyeitherwortmanninorcaffbineisdemonstratedtorestoretheexpressionof

in−frame trunCated collagen VIα−Subunit and the fbmation ofcollagen nbrilsin the cytoplasm andextracellularmatrixofculturedfibroblasts丘omapatientwithanin一正amesmalldeletionintheexon26，and

topromoteafunctionalrecoveryoffibronectinreceptorexpression・Thisresult presentsanotherpossibility
fbrthetherapyofnonsense−mutationssuchasDMD／BMDbythecombinationwithnegamycln・
3．CongenitalmuscuIardystrophies．
FukuyamatypecongenitalmusculardystrophyFCMDandtherelateddisorders，Muscle−eye−braindisease
MEBandWalker−WarburgsyndromeWWSareknowntohaveanomaliesofeyeandbrain（overmigrationof
nerve Cells through the glialimitans of brain surface，lissencephalyII）as well as severe muscular
dystrophy・Inthecommonmusclepathogenesis，itisalreadydemonstratedtobedefectiveinthebindingsof
boththeanti−SugarmOietyantibodytoα−dystroglycanandtheextracellularlaminintoα−dystroglycanin
Spiteofthepresenceofα−dystroglycancoreprotein，SuggeStingdefbctivefbrmationsof0−mannOSylglycan，Ser／thr−mannOSe2−βlGIcNAc4−β1Ga13−2Siaofα−dystroglycan（α−dystroglycanopathy）．
Ⅰnadditiontotheabove−mentionedthreedisorders，geneticdeftctsoffukutin−relatedproteinFKRPcauses

human muscular dystrophies，COngenital type MDCIC and LGMD type2I，and myodystrophy

mouse（myd，Large）andits human homologic congenital dystrophy MDCID are reported to beα−dystroglycanopathy．
（1）In this research group，anOther

α−dystroglycanopathyis fbund，Chicken dystrophy of autosomal

dominanttrait．Furtherdetailsisunderthestudy．
（2）Aprogressismadeinthephysiologyoffukutin，adeftctiveproteininFCMD．①AGolgibody−binding−198−

domainis demonstratedintheN−teminalmembrane−bindingdomain，6−27aa．②AN−gIycosylation siteis
fbundatthe92thAsn．③Fukutinhasnoapparentglycosylationactivitiesfbrthebiosynthesisof0−mannOSyl
glycanofαDG④FukutincanbindtoPOMGnTlattheN−terminaltransmembranedomain．Itisstrongly
SuggeSted thatfukutinisnot aglycosylation enzymeitselfbutakindofmodulatorfbrPOMGnTl ora
COmPOnentOfthemulticomplexPOMGnTlactivity．
Untilnow，FCMDisfoundexclusivelyinJapanwheretheunlquemutationofthe3kbretrotransposonis
insertedontotlleeXOnlOoffukutingene．Aturkeyboy，however，isdeterminedin2003tobeafftctedwith
wWS，SeVerementalreturdationandseverecongenitqalmusculardystrophy，andheishomozygousfbrthe

fukutinmutaionofGlnl16stop．TheclinicalftatureisconsistentwithWWS．Thisobservationsuggestsus
that the3kb retrotransposon mutationin the exonlO causes a relativelymildform（typicalFCMD）in
COmParisontotheseverefbrm（WWS）ofpointmutantsinthetranslationexonsoffukutingene．

MyopathogenesisofFCMDisalsoanalyzedbyDNAmicroarayandindicatedthat①fttalcomponentsof
extracellularmatrix，neurOmuSCularJunCtion and contractileproteins are continuouslyupregulated during

fttalandchildstages，and②growthfactorsinthefinalmyogenesissuchasMYH7andMRF4arealways
down−regulated．The resultsindicates that the development ofFCMD muscles ceases at the stage ofthe
neuromuscularJunCtionformation．
In2003，thecausativegeneofMEBisfbundtoexpressaGIcNActransftrasePOMGnTland，SOfar，13
POint mutations are fbund．The biochemicalassay systemis established and confirmed that the thirteen
mutantslosestheenzymeactivitycompletely（lossoffunction）．Now，WeCanmakethedennitebiochemical
diagnosisofMEB丘ombiopsiedmuscles．
Beltran−ValerodeBemabeetaldemonstratedthatlO％ofWWSpatientshadmutaionsof0−mannOSyltransftrasePOMTl．However，thetransftraseisnotknowntohavetherealactivityinmammals．In2004，itis
ClarifiedbytheestablishmentofabiochemicalassaysystemforthePOMTactivityandmolecularbiologlCal

techniquesthat①theprotein0−mannOSyltransftrase（pmt）homologuesinhumansormammalsarePOMTl
andPOMT2，②eitherPOMTlitselforPOMT2itselfdoesnothavetheactivity，butwhenbothPOMTland
POMT2areco−eXPreSSed，theactivityisfu11yobserved，③coexpressionofareportedPOMTlmutantof
WWS（7mutants）andthewi1dPOMT2demonstratesnothemannosetransftraseactivity，④transgenicfliesof
theknock−downOfeitherPOMTlorPOMT2geneshowsaprominentdefbrmityofthetrunCkandthemuscle
maldevelopment，and⑤poMT2mutAtionisnotfbundintheotherWWSpatients．Theresultsrevealthatthe
POMTlmutationcausesthelossof0−mannOSyltransftraseactivityanddevelopstheWWSphenotype（loss
Offunction），WhichexplainsaboutlO％ofWWS．Thenextproblemisthemolecularmechanismoftherestof
WWS．
Ajapaneseftmalechildisreportedtobe deftctiveintheFKRPgene．Sheisafftctedwithcongenital
musculardystrophywhichmimicstoFCMD，butherintelligenceiswell−developedinspiteofmultiplecysts
inthecerebellum．Itissuggestedthatthemuscle

αDGglycosylationisdeftctive．

FCMD，MEB，WWS，FKRP mutaions（MDCIC and LGMD2I），and Large mutations（MDCIDandmyodystrophy mouse）have a common characteristics（α−dystroglycanopathy）such as the decrease ofbindingoflamininwithα−dystroglycan，thedecreaseofbindingofanti−SugarmOietiesofαDGantibodyto
αDGIn addition，dystrophy chickenis fbund to be a new type ofα一dystroglycanOpathy．The chicken

myopatholgy demonstrates atypicaldystrophic changewithvacuoles ofTLtubules，nO Obvious anomaly ofbrain．Thegenemutationremainstobeclarified．
4．DistalmyopathywithrimmedvacuolesDMRV．
DMRVinJapanisconfimedtobecausedbythemutationsofthesameGNEgeneasHIBM．GNEisfbund
tobeacytoplasmicenzymeandDMRVmusclescontainedadecreasedamountofsialicacid．However，themolecularpathomechanismisunclearinthem再ority．
Japanese66pateintsfrom4institutesareanalysedanddemonstrated25mutations（missense23，nOnSenSe
2）inthewholeregionofthegene．Nohotspotsarefbund．V572Lismost丘equent，and3lpatientsarethehomozygote．ThenextftequentisD176VTheaverageonsetis25．4yearsold．TheinitialinvoIvementstartsat
thebilateraltibialisanteriormuscles，andproximallegmusclesexceptthequadricepsfbmorismusclesare−199−alsoinvoIvedintheearlystageofthem再oritypatients．Theyareabletowalkin9．4yearsofaverageafter
theonset・CardiacinvoIvementisobservedin4patients・SerumCKisraisedin90％ofthepatients，and
20％havemorethanl．000IU／1．WewillpublishaguidelinefbrthediagnosisofDMRVonthebasisofthe
66japanese，gene−COnfirmedpatients．

5．Myotoniasyndromes．

①MyotonicdystrophyisknowntObecausedbyeitherelongatedCTGrepeatsinthe3，−regiOnofthe
DMPKgeneorelongatedCCTGrepeatsinthefirstintronofZFF9．Theskeletalmusclesofthemyotonic
dystrophyisfoundtoexpressembryonicfomsofmanygenessuchasinsulinreceptor，NMDAreceptor，CI
Channel，ryanOdinereceptor，SRCa−ATPase（Sercal），Six5，tauPrOtein，amyloidprecursorprotein，Cardiac
troponinI，and myotubularin−related proteinl．The result suggests the presence ofa common splicing
abnormalityinmanygeneexpressions．Inordertoexplainthishypothesis，aCUG／CUGG−bindingprotein（S）
is fbundandthey are named as CUG−bindingprotein，MBNLl，2，and3．Theyarefound to havevarious
expressionefftctsatthesplicingprocess．TheseproteinsstronglybindstotheelongationpartofmutatedRNAwiththeresultofdeficiencyoftheprotein（S）．Futherstudyisnecessarytoconfimthishypothesisinthenextstep．

②schwartz−Jampelsyndromeisfbundtobeapartialdeficiencyofperlecan，anECMprotein，anditis
Clari且edthattheabnormalfunctionofthe

αDG−Perlecan−AchElinkagecausesmyotonia．

6．Mitochondrialencephalomyopathy．
Mutaionsat3243，3271and83770fmtDNA，WhicharemaingeneabnormalitiesinMELASandMERRF，
arefbundtocausethedeftctivebindingofthetRNAfbrtaurinewithresultantdeftctsinthemitochondrial
functions suchasmembranepotentials，reSpirationand ATPsynthesis．ItisalsodemonstratedthatMmolar
levelsoftaurinerescuethemitochondrialdysfunction．Tburineisanexcellentcandidatefbrthetherapyof
MELASandMERRF．
7．1n others．

Aprominentprogressismadein①ILK−Phosphorylatedaffin−Racl／Cdc42astheintracytoplasmicsignaltransductionsystemunderthelaminin−integrincomplex，②anneWanti−aPOPtOSisprotein，PTDFNKaBc12
homologue，fbrischemiC，glutamine−induced，andstaurosporine−inducedcelldeaths，and③geneanalysesin
JapanesepatientsofaSRproteinselenoproteinlinSEPN（selenoproteinN）−relatedmyopathy（COngenital
myopathy such as rigid spine syndrome，multiminicore disease and desmin−relatedmyopathy），ryanOdine
receptorinmalignanthyperthermia／centralcoredisease，andmyotubularin（MTMl）inX−1inkedmyotubular
myopathy．

8．ProbIemsto bestudied．

①NoprogressismadeinFSHD．Thegenemutationisalreadyanalysedandthegenediagnosisispossible．
However，themolecularpathomechanismistotallyunclearandtherapeuticapproachisnotmade．

②MoleculareventsintheprocessofDMD侶MDcelldeathisstillnotsatisfied．CainfluxandMMPPrOteOlysisofβDGaredefinitebuttheintracellulardeteriorationisstillunclear，ParticularlyβDGsignaltransductionsystem（S）shouldbestudied．

③Possible therapeutic agents such as negamycin，AS−01igo，myOStatininhibitors（antibody，fo11istatin，
fbllistatin−relatedgeneFLRG，myOStatinprodomain），taurine，PTDFNK，Msx−1inducedstemcellsareneeded
toapproachtoclinicaltrials．

④Poorprogressismadeinmitochondrialencephalomyopathy．Membershouldbechanged．
⑤InFCMDandtherelatedcongenitaldystrophy，aremarkableprogressismadeinthepointofmolecularmechanism．Finalanalysisofthefukutinfunction，GalT，andSiaT；andFKRPisnecessary．Anewanimalmodel，dystrophychicken，muStbeclarified．

⑥sincethemolecular−ClinicalrelationshipisclarifiedinJapanesepatients，adiagnosticguidelineふillbe
Publishedindysfbrlinopathy，DMRViandFCMD／MEB／WWS．
−200−平成14〜16年度班員名簿

筋ジストロフィーに関連する疾患の病態解明と治療法の開発に関する研究
平成14〜16年度
区

分

主

任

氏

名

清 水 輝 夫所
所

担

栗 原 照 幸石 浦 章 一

〝
（
監

事）

事）

（
幹

功

瀬 原 淳 子〝（幹

戸 田 達 史〝（幹

吉 田 幹 ・晴〝（幹

松 田 良 一〝（幹事）
西 野 一 三

〝
（
幹

事）

〝

〒 187 −85 02
青 木 正 志〝太 田 成 男

教

授

教

授

03−
54 5 4−67 39

03＿
33 5 3＿8 111 （内 3 82 1 1）

0 5 6 1＿6 2●
33 11 （内 2 8 30 ）Sah ashi＠ai ch i−m ed−
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aC j p授

0 7 5−
7 5 1−
3 826
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教

授

大 阪府吹 田市山田丘 2−
2＿
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6 87 9 −3 38 0to d a＠clg ene ．
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室

長

東 京都小 平市小川東 町 4＿1＿
1

04 2 −
34 6 −
172 0
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助 教授

東 京 都 目黒 区 駒 場 3 −
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5 4 54 −6 63 7ry oich i＠m atsud a．
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部

長

東京都 小平市小川東 町 4＿1＿
1

04 2 −
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手宮 城 県 仙 台 市 青葉 区 星 陵 町 ト1

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03＿
34 6 8＿12 5 1 （内 2 3 22 ）Sa
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川都
原府町京
5 3都市 左 京 区 聖 護 院

神1−3奈
96川 県 川 崎 市 中 原 区 小 杉 町

03−
39 64 −
12 11 （内 19 10）

C ish iu ra＠ m a
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教

日本 医 科 大 学 大 学 院 医 学 研 究 科 加 齢 科 学〒2 11−
8 53 3授

愛 知県愛 知郡長久手町岩作雁又 2 1

東北大 学病 院神経 内科〒9 8 0−85 74

教

東 京 都 新 宿 区 河 田 町 10 −22

国 立 精 神 ・神 経 セ ンタ ー 神 経 研 究 所■E −m a il アド レス

kuri h ara＠ oh a．
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東 京 都 目黒 区 駒 場 3 ＿8＿1東京大学 大学 院総 合文化研究科〒 153 −89 02

授

東 京 都 目黒 区 大 橋 2 −17−6

国 立 精 神 ・神 経 セ ン タ ー 神 経 研 究 所〒 187 −
85 02

事）

授

連絡 の際の電話番号

tsh imi z u＠ m ed ．
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教

大阪大学 大学 院医学 系研究科臨床遺 伝学〒5 65 −
0871

事）

所属施設に
おける地位
教

京都大学 再生 医科学研 究所〒6 06 −
8 5 07事）

名簿

東京 都板橋 区加賀 2＿
1ト1

愛知医科 大学 内科学 講座神経内科〒4 80 −
119 5

事）

地

東 京 女 子 医 科 大 学 附属 遺 伝 子 医 療 セ ン タ ー〒 162 −
0 0 54佐 橋〝

名東京大学大 学 院総合文化 研究科〒 153 −
8 90 2斎 藤 加代子

〝
（
幹

設

在

東邦大学大 橋病 院神 経内科〒 153 −
8 5 15（
運営幹事）

施

帝 京 大 学 医 学 部 神 経 内科
〒 173 −
8 60 5分属清水班

0 2 2−
7 17−
7 189
ao k im ＠ m ail．
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toho k u ・
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教

授

0 4 4−
7 3 3−
9 2 67O h ta＠ nm s．
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分

担

反町洋之

（旧）東京大学大学院農学生命科学研究科（現）東京都臨床医学総合研究所酵素機能制御研究部門助教授（現）03−3823−2181

室長

SOrimach＠rinshoken．orjp

研究部長

03−3964−3241（内3080）〒113−8613東京都文京区本駒込3＿18＿22

遠藤玉夫

財団法人東京都高齢者研究・福祉振興財団
東京都老人総合研究所

endo＠tmig．orjp〒173−0015東京都板橋区栄町35＿2

遠藤剛

千彙大学理学部

助教授〒263−8522千葉県千葉市稲毛区弥生町l＿33

大日方

昂

千葉大学理学部t・endo＠faculty・Chiba−ujp
教授〒263−8522千葉県千葉市稲毛区弥生町1＿33

杉江秀夫

浜松市発達医療総合センター

樋 口逸郎

O43−290−2804

tobinata＠fhculty．chiba−U．aCjp
所長〒434−0023静岡県浜北市高薗775＿1

松尾雅文

043−290−3911

O53−586−8800（内100）
h−Sugie＠umin．acjp

神戸大学大学院医学系研究科〒650−0017兵庫県神戸市中央区楠町7．5●1

教鹿児島大学医学部・歯学部附属病院〒890−8520鹿児島県鹿児島市桜ヶ丘8＿35●1

講授O78−382−6080

matsuo＠kobe−u．aCjp
師O99−275−5332

ihiguchi＠m2．kuhl．kagoshima−
u・aCJp

若山吉弘

昭和大学藤が丘病院神経内科〒227−8501神奈川県横浜市青彙区藤が丘教

授

Wakayama＠showa・university一

ト30

旬igaoka．grJp

吉田邦広
14−15年度
池田修一
16年度

信州大学医学部附属病院遺伝子診療部

土方貴雄
14年度
俵藤 宏
15−16年度

群馬大学大学院医学系研究科器官機能構築学〒371−8511群馬県前橋市昭和町3＿39●22

川上自治医科大学細胞生物学

潔

O45−971−1151（内6269）

信州大学医学部第三内科

0263−37・3216〒390−0861長野県松本市旭3＿1．1

ikedasi＠bp・md・Shinshu−u．aCjp
O27−220−7910，7912

教授〒329−0498栃木県河内郡南河内町薬師寺

0285−58．7311

kkawakam＠iichi．acjp

3311−1二宮治明

鳥取大学医学部生命科学科神経生物学〒683−0826鳥取県米子市西町86番地

助教授

0859−34−8276

ninomiya＠grape．med．tottori・u．
acjp

田 中恵子

新潟大学脳研究所神経内科

助教授〒951−8585新潟県新潟市旭町通一番町757−204−

O25−227−0664

keiko＠bri・niigata−u．aCjp

砂田芳秀

鈴木

厚

川崎医科大学神経内科〒701−0192岡山県倉敷市松島577

教

横浜市立大学・大学院医学研究科

講授

ysunada＠med・kawasaki一m．aCjp

師〒236−0004神奈川県横浜市金沢区福浦3＿9
吉良潤一

九州大学大学院医学研究院脳神経病研究施設
神経内科

086−462−1111（内86087）

O45−787−2598

abell＠med・yOkohama−Cu．aCjp
教

授O92−642−5340

kira＠neuro．med．kyushu−U．aCjp〒812−8582福岡県福岡市来区馬出3＿1＿1

佐古田三郎

桃井真理子

大阪大学大学院医学系研究科神経機能医学〒565−0871大阪府吹田市山田丘2＿2

教

自治医科大学小児科学

教

授06−6879−3571

Sakoda＠neuml．med．osaka−u．aCjp
授〒329−0498栃木県河内郡南河内町薬師寺

O285−58−7366

mymomoi＠iichi．acjp

3311−1

野地澄晴

徳島大学工学部生物工学科

教

授〒770−8506徳島県徳島市南常三島町2＿1

内野誠

熊本大学大学院医学薬学研究部神経内科学分野

088−656−7528

n可i＠bio．tokushima−u．aCjp
教

授O96−373−5893

uchino96錮u．medic．kumamoto〒860−0811熊本県熊本市本荘1●1＿1−u・aCJp

桃井隆

国立精神・神経センター神経研究所室長〒187−8502東京都小平市小川東町4＿1＿1

水澤英洋

南

成祐

萩原康子

水野裕司

三池輝久

東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究科
脳神経機能病態学〒113−8519東京都文京区湯島1＿5＿45

O42−341−2711（内5273）
momoi＠ncnp．gojp

教

授O3−5803−5233

h−mizusawa・nurO＠tmd．acjp

国立精神・神経センター武蔵病院〒187−8551東京都小平市小川東町4＿1＿l

042−341−2711（内3590）

国立精神・神経センター神経研究所〒187−8502東京都小平市小川東町4●1●1

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群馬大学大学院医学系研究科脳神経内科学〒371−8511群馬県前橋市昭和町3＿39＿22

講

熊本大学大学院医学薬学研究部〒860−8556熊本県熊本市本荘1−1＿1

教師

O27−220−8064，8061

mizunoy＠med．gunma−u．aCjp
授O96−373−5197

miketeru＠b恥medic．kumamOtO−u・aCJp

ー205−

研究協力者

今村道博

臼杵扶佐子

国立精神・神経センター神経研究所〒187−8502東京都小平市小川東町4＿1●1

室

環境省国立水俣病総合研究センター臨床部理
学診療科

室

長

042−346−1720

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長O966−63−3111

usuki＠nimd．gojp〒867＿0008熊本県水俣市浜4058＿18

田 中雅嗣

東京都老人総合研究所健康長寿ゲノム探索

03−3964−3241（内3095）〒173−0015東京都板橋区栄町35−2

豊島

林

至

由起子

土方貴雄

平澤恵理

吉岡三恵子

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秋田大学医学部内科〒010−8543秋田県秋田市本道l●1＿1

O18−884−6104

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国立精神・神経センター神経研究所〒187−8502東京都小平市小川東町4＿1＿1

室

武蔵野大学薬学部機能形態学講座〒202−8585東京都西東京市新町1−1−20

教順天堂大学医学部神経学講座〒113−8421東京都文京区本郷ユ＿1−1

講

神戸市総合療育センター〒653−0875兵庫県神戸市長田区丸山町

所2−3−50一206−

長O42−346−1712
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