⽇化協LRI 研究報告会
2021年8⽉20⽇

発達神経毒性のAOP解明に資する神経炎症評価系の開発
三重⼤学⼤学院医学系研究科
⻄村 有平

統合薬理学

神経発達障害 (Neurodevelopmental disorders: NDD)の有病率は増加している

NDDの有病率は増加しているCattane N et al
Neurosci Biobehav Rev (2020)

神経発達の基本的経路

Bal-Price A et al ALTEX (2018)

中枢神経系の細胞間コミュニケーション

Vainchtein ID et al
Trend Neurosci (2020)

中枢神経系における神経・免疫のクロストーク

Salvesen N et al Neurochem Int (2019)

Adverse Outcome Pathway (AOP)

OECD STA No. 260 (2016)

様々なモデル⽣物の特徴

⻄村有平

⽇本薬理学会誌 (2017)https://www.youtube.com/watch?v=4n71hnrs8Y4

ヒト・ラット・ゼブラフィッシュの神経発達⽐較WalterI KM et al PLOS One (2019)

神経分化を可視化するためのマーカー遺伝⼦

ニューロン
Enolase 2
アストロサイトGlial Fibrillary
Acidic Protein

オリゴデンドロサイト
Myelin Basic Protein
Fritsche E. OECD/EFSA Workshop on DNT (2016)

第2-5期⽇化協LRI「ゼブラフィッシュの神経分化を指標とする化学物質の発達神経毒性評価⼿法の開発」
1 kb
XhoI

ニューロン
(eno2)

ClaI
Kozak

Tol2

CFP filter

eno2 promoter exon 1

intron 1

SV40-polyA

Cerulean Tol2

RFP filter
XhoI

アストロサイト(gfap)

ClaI
Kozak

Tol2

intron 1

SV40-polyA

gfap promoter mCherry Tol2

YFP filter
XhoI

オリゴデンドロサイト(mbp)

FseI ClaI
Kozak SV40-polyATol2

mbp
mCitrine Tol2
promoterMerged image

Koiwa J et al. Pharmaceuticals (2019)1 mm

第2-5期⽇化協LRI「ゼブラフィッシュの神経分化を指標とする化学物質の発達神経毒性評価⼿法の開発」
12345 (受精後日数)

化学物質曝露ラ イ ブ イ メ ージ ン グ

RFP

RFP/CFPCFP

YFP

YFP/CFP

DFX

APAP

SAC

DEX

MeHg

RA

BPA

CPF

NCT

CPM

CBZ

VPA

YFP/RFP

TSA

0Koiwa J et al. Pharmaceuticals (2019)

Tapias A et al Genom Proteom Bioinfo (2017)https://shigen.nig.ac.jp/zebra/

中枢神経系における神経・免疫のクロストーク

Salvesen N et al Neurochem Int (2019)マウスの脳発達におけるミクログリアの役割

Lenz KM et al
Front Immunol (2018)マウスとゼブラフィッシュのミクログリア⽐較

Sharma K et al Front Cell Dev Biol (2021)

⽇化協LRI「発達神経毒性のAOP解明に資する神経炎症評価系の開発」
1 kb
XhoI

ニューロン(eno2)

ClaIKozak

Tol2

CFP filter

eno2 promoter exon 1

intron 1

SV40-polyA

Cerulean Tol2

RFP filter
XhoI

アストロサイト(gfap)

ClaI
Kozak

Tol2

intron 1

SV40-polyA

gfap promoter mCherry Tol2

YFP filter

XhoI

ミクログリア(mpeg1)

FseI ClaI
Kozak SV40-polyA

Tol2

mpeg1
promotermVenus Tol2

発達期のバルプロ酸曝露によるマウス⼩脳のミクログリア変化

At GD12.5, pregnant mice were injected subcutaneously with 400 or 600 mg/kg of VPA. Control animals
were injected with saline solution (CON). The Mice (9–11 weeks of age) were injected intraperitoneally eitherwith 25μg/kg LPS or with sterile saline solution (Sal). Two hours after the injection, the mouse brains weresubjected to IHC.
Lucchina L et al Autism Res (2014)

発達期のクロルピリフォス曝露によるラット⿊質のミクログリア変化

CPF was injected subcutaneously at a dose of 5 mg/kg given daily at PND 11–14. Control animals receivedvehicle injections on the same schedule. (A) 12 h after treatment with DMSO, (B) 12 h after treatment withCPF, (C) 24 h after treatment with CPF, (D) 72 h after treatment with CPF. (E, F) CD11b protein of eachgroups was measured by Western blots.
Zhang J et al Toxicology (2015)

発達期のエタノール曝露によるラット海⾺のミクログリア変化

In vivo studies were conducted by feeding rat pups with oral gavage of a milk formula containing 11.34%
ethanol (vol/vol) twice daily at 2 h intervals, yielding a total daily ethanol dose of 2.5 g/kg (AF), fed withisocaloric control (PF), or they were left in the litter with the mother (AD). The feedings were conducted at
10:00 AM and 12:00 PM daily for 5 days (Postnatal days 2–6).
Shrivastava P et al J Neuroinflam (2017)

⽇化協LRI「発達神経毒性のAOP解明に資する神経炎症評価系の開発」
1年⽬

2年⽬

3年⽬

ミクログリアにmVenusを発現する1⾊ZFを作製

ミクログリアにmVenusを発現する1⾊ZFとニューロンにCerulean
アストロサイトにmCherryを発現する2⾊ZFを交配

陽性・陰性化学物質を発達期の3⾊ZFに曝露し蛍光in vivoイメージングを実施。

ニューロンにCerulean
アストロサイトにmCherryを発現する2⾊ZFを作製

陽性・陰性化学物質を発達期のZFに曝露し、⽣存率に影響を与えない濃度を決定

ミクログリアにmVenus
ニューロンにCerulean
アストロサイトにmCherryを発現する3⾊ZFを作製

Cerulean領域内のmVenus⾯積mCherry領域内のmVenus⾯積
ミクログリア形態、などを計測し中枢神経系におけるミクログリア・ニューロン・アストロサイトへの影響を解析

⽇本化学⼯業協会LRI関係者各位に⼼より感謝申し上げます