学位論文内容の要旨

博士の専攻分野の名称

博士（医 学）氏 名

野田 なつみ

学 位 論 文 題 名Role of Hes1 on contact inhibition of cell proliferation in 3T3-L1 preadipocytes(脂肪前駆細胞における細胞増殖のコンタクトインヒビションに関する Hes1 の役割)
[背景と目的] 細胞増殖は生物における発生や発達過程に重要な現象であり、無秩序な細胞増殖は細胞の癌化のような異常を来たすことから、細胞増殖の制御は生存のために必須な役割を果たしている。培養細胞においても細胞がコンフルエントに到達する際、細胞間接触により、細胞増殖のコンタクトインヒビション（接触阻害）といわれる細胞増殖の停止が生じる。この接触阻害は、細胞の運命や発達過程において重要なシグナル伝達の一つである Notch シグナリングの関与が報告されている。しかしながら、Notch あるいは Notchエフェクターのどちらが細胞増殖の接触阻害を誘導するかは明らかではない。
Notch エフェクターの一つである Hes1(Hairy and enhancer of split 1)は、細胞増殖に関与するサイクリン依存性キナーゼ(Cdk)インヒビターである p21Cip1, p27Kip1, p57Kip2 の転写を抑制することが知られている。そのため、細胞増殖の接触阻害における Hes1 の役割を明らかにすることは重要であり、Hes1 に焦点を当てた。
Hes1 の役割を明らかにするため脂肪細胞分化のモデル細胞である 3T3-L1 脂肪前駆細胞に注目した。この細胞はコンフルエントに到達すると一時的に増殖を停止するが、ホルモン等の分化誘導試薬を加えることで細胞周期は同調し再開、数サイクルに渡って細胞分裂を行う。この細胞分裂は特に MCE(mitotic clonal expansion)とよばれている。3T3-L1 細胞において、Hes1 は脂肪細胞分化のために必要であることが報告されており、Hes1 の細胞周期に関する役割を明らかにすることは、MCE や脂肪細胞分化の詳細な理解のためにも重要である。そこで、3T3-L1 細胞における細胞増殖の接触阻害に及ぼす Hes1 の影響を明らかにすることを目的として研究を行う。
[材料と方法] Hes1 の役割を明らかにするため、3T3-L1 細胞に二つの処理を行う。一つは、
N-[N-(3,5-difluorophenacethyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT)を用いて Notch シグナリングを薬剤で抑制する。Hes1 低分子ヘアピン型 RNA (shRNA)を発現する安定発現細胞株を作成、遺伝子レベルで Notch シグナリングを抑制する。細胞増殖の接触阻害の測定は、細胞数の計測と細胞増殖マーカーである Ki-67 の免疫染色により行う。遺伝子発現をリアルタイム PCR により、タンパク質発現量をウエスタンブロッティング法で、それぞれ測定する。

[結果]

Hes1 の発現が細胞間接触によって増加するかどうか 3T3-L1 細胞にて測定した。
Hes1 の発現は増殖中の細胞と比較して、コンフルエントの細胞で上昇したことから、
3T3-L1 細胞において、Notch は細胞間接触によって活性化することが示唆された。
次に 3T3-L1 細胞の MCE 時において、DAPT による Cdk インヒビター抑制効果をリアルタイム PCR にて測定した。DAPT は p21Cip1, p27Kip1, p57Kip2 の発現を促進した。MCE時におけるこれらの遺伝子発現の上昇の効果を細胞数の変化で確認した結果、DAPT 処理

により細胞数増加が減少し、細胞分裂過程を直接抑制した。
そこで DAPT による Cdk インヒビターの上昇に Hes1 が関与するかどうかを明らかにするため、
Hes1-shRNA を発現する 3T3-L1 細胞を作成した。
Hes1 ノックダウン細胞において、p21Cip1 と p27Kip1 の発現は増加したが、p57Kip2 の発現は増加しなかった。
この結果から、
Hes1 が p21Cip1 と p27Kip1 の発現を抑制することが示唆された。
さらに、Hes1 が細胞増殖の接触阻害に関与するかどうかを調べるため、Hes1 ノックダウン細胞を用いて、コンフルエントに到達後から 2 日間に渡り細胞数を測定した結果、この細胞では細胞数は増加し細胞増殖が停止しないことが明らかになった。Ki-67 による免疫染色においても、細胞増殖は同様に停止されなかった。このように、3T3-L1 細胞において、Hes1 の遺伝子発現量を減少させた細胞では無限に細胞増殖する可能性が示唆された。
Hes1 は 17エストラジオールやヘレグリン1 を介した条件下で、E2F-1（細胞周期の進行に必要な転写因子）の発現上昇を抑制することが乳がん細胞において報告されている。
そのため、E2F-1 の遺伝子発現量を Hes1 ノックダウン細胞にて測定した結果、E2F-1 の発現は上昇した。一方この細胞において、E2F-1 を転写因子とする遺伝子である、Myc, cyclin
E1, cyclin A2 の遺伝子発現を測定した結果、これらの遺伝子発現は上昇した。さらに、cyclin
E1 と cyclin A2 のタンパク質の量も上昇した。以上の結果から、3T3-L1 細胞において Hes1は E2F-1 とそのターゲット遺伝子の発現を抑制することが示唆された。
[考察] Hes1 の発現はニューロン間において、神経突起の接触による Notch シグナリングの活性化によって上昇することが報告されている。本研究でも Hes1 の発現は 3T3-L1 細胞において、細胞間の接触により増加することが示された。
このように、
Hes1 の発現は 3T3-L1細胞において Notch シグナリングの活性化を介して増加し、細胞増殖における接触阻害を誘導することが示唆された。
E2F-1 と Myc の発現は G0 期で抑制されるため、E2F-1 と Myc の発現上昇は細胞周期の進行を示唆すると考えられる。また、Myc は p27Kip1 による細胞増殖停止を抑制するため、Myc の発現上昇は Hes1 ノックダウン細胞において細胞周期の進行に重要な役割を果たす可能性がある。さらに、cyclin A2 及び cyclin E タンパク質の増加は S 期への進行を促進することから、3T3-L1 細胞においても同様に機能したことが予想される。
p21Cip1 と p27Kip1 は cyclin E/Cdk2 複合体に結合し、Cdk の触媒活性を阻害することが報告されている。しかしながら、Hes1 ノックダウン細胞において p21Cip1 と p27Kip1 の発現は上昇したが細胞周期は停止しなかった。これらの結果は、上昇した cyclin E1 タンパク質が p21Cip1 と p27Kip1 の効果を限定的にした可能性がある。一方で、p21Cip1 あるいは
p27Kip1 は、安定した cyclin D1/Cdk4 複合体の構築を促進し、さらに p21Cip1 は cyclin D1の核内移行を阻害する。
そのため、p21Cip1 と p27Kip1 の発現上昇は 3T3-L1 細胞において、細胞周期の進行に影響を及ぼした可能性がある。
[結論] Hes1 の発現は 3T3-L1 細胞において、細胞間接触により増加し、さらに E2F-1, Myc,
cyclin E1, cyclin A2 の発現を抑制し、細胞増殖の接触阻害を引き起こす。また、細胞間接触による Hes1 の発現上昇は、p21Cip1 と p27Kip1 の発現を抑制する。以上の結果から、Hes1は 3T3-L1 細胞において、細胞増殖の接触阻害に重要な役割を果たすことが明らかとなった。