2-8 昆虫の環境適応機構の解明●代表者

澤田博司（生命科学科・教授）●分担者

間瀬啓介（生命科学科・教授）
外川徹（生命科学科・准教授）【研究の目的および概要】
昆虫は，あらゆる環境に適応し進化して現在地球上で最も繁栄した動物群と考えられている。生活圏をさまざまな環境に拡大するために，生活史に変態や休眠などを取り込み極めて多様性に富んでいる。この昆虫の多様性の背景となっている環境適応の分子基盤や分子機構の解明が本研究の目的であり，その解析を多面的に行うことが本共同研究グループの特色でもある。具体的に本年度は，以下の 3 つの目的で研究を遂行した。
1．カイコの卵休眠は，環境条件の悪化の結果やむをえず発育を休止する休眠ではなく，不良環境が訪れる以前の生育にとって不都合のない環境のもとで感受し記憶され次世代の卵で実行される。この休眠に際し，どのような分子機構で発生を停止させるのかを解明するために，初期発生や胚子活性化に密接に関わる遺伝子の構造や発現などの解析，またその遺伝子産物の機能や機能発現の調節機構を明らかにする。
2．絹糸虫類が外敵から身を守る一手段として繭の多様な緑色化によるカモフラージュがあり，複数の遺伝子が制御している。この複雑な形質の発現様式を解明するために，カイコガの緑繭系統やその染色体置換系統をはじめとした研究素材とゲノム情報を用い，それらの原因遺伝子の同定と機能解明を行う。
3．昆虫の体表面を覆うクチクラは，種・発生段階・体の部位により物理的性質が異なり，昆虫の様々な環境への適応を可能にしている。このクチクラ多様性の分子メカニズムを理解するために，クチクラの 2 つの主要構成成分であるクチクラタンパク質ファミリーとキチンに注目し，両者の相互作用の多様性を解明する。
【研究の結果】
1．本研究では，初期発生におけるカイコのカルモジュリン（BmCalm）に着目し，昨年に引き続き BmCalm 遺伝子の発現解析を行った。その結果，休眠卵産卵後の 24 と 48 時間目，非休眠卵産卵後の 24 と 48 時間目，産卵後 24時間の休眠卵の塩酸処理後 0，12，24，48 時間の全ての発生ステージにおいて BmCalm 遺伝子の発現が確認出来た。大腸菌発現系で作製した rBmCalm は可溶性画分に回収され，精製した rBmCalm は，SDS-PAGE 上で単一バンドを示し，分子量は BmCalm cDNA より予想される分子量と同一な約 16.8kDa であった。精製した rBmCalmを抗原に用いてポリクローナル抗体の作成を試みたところ，rBmCalm を特異的に認識する抗体を得ることができた。また，rBmCalm を用いた Ca 結合実験とプロティンキナーゼ CK2(CK2) によるリン酸化実験も試みた結果，Ca が結合すること及び CK2 によりリン酸化されることが明らかとなった。
2．昨年はカイコガの緑繭化遺伝子である G6 の原因遺伝子の同定とその異常系統の原因を解明することができた。
また，新規に見出した緑繭関連遺伝子 G27 についても，既知遺伝子である Ga と同一であることを明らかにすることが出来たので，本年度はその変異系統である B8 斑油を加えた塩基配列解析を進めた。その結果，G27 と Gaとに共通する塩基置換が見つかり，しかもアミノ酸レベルにおいても，その機能性に影響すると思われる変異であることが推察された。さらにこの変異は他のいくつかの白繭系統においても同様に見られ，G27 の原因遺伝子である可能性が示唆された。
3．昆虫のクチクラは，主に多糖であるキチンと構造タンパク質であるクチクラタンパク質から構成される。クチクラタンパク質最大のファミリーである CPR はキチンに結合することが知られている。CPR には RR-1 と RR-2と呼ばれるサブファミリーが存在するが，その機能の違いはあまり分かっていない。そこで，RR-1 と RR-2 のキ38

チン結合性の比較するために，カイコガの RR-1 である BmorCPR41 と RR-2 である BmorCPR104 の組換えタンパク質を大腸菌内で合成した。これらを粗精製しキチン結合活性を調べたが，キチンへの結合性は認められなかった。
【研究の考察・反省】
1．BmCalm 遺伝子の発現解析では，今回調べた全ての発生ステージにおいて発現が確認されことから，BmCalm は初期発生時の各ステージで恒常的に発現していることが強く示唆される。また，BmCalm は，休眠卵と非休眠卵及び塩酸処理卵において，転写レベルで一定に保たれていることが示唆される。これは Ca2+ の増加に対して迅速に反応すると共に，Ca2+ カルモジュリン複合体が作用する分子にも迅速な機能制御を可能としているのではないかと思われる。
一方，rBmCalm と Ca が結合する事，および CK で rBmCalm がリン酸化される事が確かめられた。しかし，リン酸化した rBmCalm と非リン酸化 rBmCalm とでは Ca 結合能に顕著な差は確認できなかった。CK2 でのリン酸化は他分子との親和性に影響を及ぼすのではないかと考えている。
2．昨年度の緑繭化遺伝子 G6 に引き続き，今回 G27 遺伝子についても，その原因となる候補遺伝子が絞り込まれてきたことは大きな前進であった。古典的な方法により Ga と同一の遺伝子異常であることを突き止め，さらに地道な塩基配列解析と新たな異常系統が使用可能となったことが実を結んだと思われる。今後，この遺伝子に着目し更なる解析を進めると共に遺伝子破壊実験を行う予定である。
3．解析した CPR のうち BmorCPR41 は高いキチン結合性をもつことが報告されている。キチン結合性をしらべた手法も既に確立されているものである。今回解析したどちらのタンパク質においてもキチン結合性が認められなかったことは，タンパク質の性質ではなく，実験手法上の問題があったと思われる。見落としている点がないか再確認し，再度試す必要がある。
【研究発表】
日本比較内分泌学会
カイコの胚子活性化時におけるカルシウム依存性ミトコンドリア溶質輸送体 (MCSC) の役割の解明
2016 年 12 月 10 日／相模原
日本蚕糸学会
カイコ Ga 候補遺伝子の塩基配列解析
2016 年 3 月 21 日／つくば
XXV International Congress of Entomology
Expression of hairy gene is induced by juvenile hormone in tissue-depending manner2016 年 9 月 26 日／オーランド
XXV International Congress of Entomology
BmorPlip, a novel candidate gene involved in juvenile hormone biosynthesis in Bombyx mori2016 年 9 月 27 日／オーランド39

日本応用動物昆虫学会
カイコガアラタ体で高発現する PTEN-like phosphatase (Plip) の機能解析
2017 年 3 月 29 日／小金井
日本応用動物昆虫学会
タカサゴシロアリの兵隊分化における small-RNA シーケンス解析
2017 年 3 月 28 日／小金井【研究成果物】
Nitric oxide synthase during early embryonic development in silkworm Bombyx mori: gene expression, enzyme activity,and tissue distribution.
Development, Growth & Differentiation，58, 750-756，2016.

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