学位論文内容の要旨

博士の専攻分野の名称

博士（医 学）

氏 名

岡本 孝之

学 位 論 文 題 名Prevalence of CD44-positive glomerular parietal epithelial cells reflects podocyte injuries inadriamycin associated nephropathy(CD44 陽性糸球体壁側上皮細胞の出現は、アドリアマイシン腎症-巣状分節性糸球体硬化症マウスモデル-におけるポドサイト障害を反映する)【背景と目的】巣状糸球体硬化症 (focal segmental glomerulosclerosis、FSGS)は、臓側糸球体上皮細胞 (visceral glomerular epithelial cell、別名、podocyte と呼称される)の傷害による糸球体濾過機能減少および進行性糸球体硬化をきたす代表的疾患である。先天的あるいは後天的な原因により podocyte 障害が生じることにより、podocyte が糸球体基底膜（glomerular basement membrane、GBM）の尿腔側から剥離し、GBM が露出する。やがて、糸球体を囲む嚢状構造を支えるボウマン嚢上皮細胞（parietal epithelial cell、PEC）と GBM 間の癒着や、PEC の浸潤、増殖といった一連の病理学的変化が生じ、最終的に硬化病変が形成される。このように、糸球体硬化病変形成においては、糸球体構成細胞を含む細胞の増殖や遊走、癒着、炎症細胞浸潤などの事象が関与していることが特徴である。
CD44 分子は、細胞-細胞間及び細胞-基質間接着に関連した細胞接着分子の一つであり、細胞骨格維持、遊走や接着などの事象に関与していることが知られ、近年は癌細胞の増殖浸潤や転移、アポトーシスなどにも関連深い分子として注目されている。これまで CD44の腎疾患の発症・進展における関与に関しては、炎症性腎疾患や尿細管間質障害における役割を検討するものが多く見られた。以前から FSGS における硬化病変の形成においては、ボウマン嚢を支える PEC が重要な役割を果たしていることが示唆されてきた。最近、ヒト腎炎や動物モデルの腎組織において、PEC の一部が CD44 陽性を示す“活性化”PECが出現することが見出され、CD44 陽性 PEC 細胞の硬化病変の発症や進展過程における積極的関与が示唆されている。また、CD44 の代表的リガンドの一つとして、osteopontin（OPN）が知られる。OPN は、腎炎・腎症の発症や進展に関与するサイトカインとして知られており、半月体形成細胞や PEC における発現も報告されている。CD44 陽性細胞における OPN 発現性は、細胞遊走、接着を積極的に促し得ることも知られる。これまでに糸球体硬化機転のプライマリーな要因であるポドサイト障害と糸球体における CD44 分子発現の関連について、具体的に検討した報告は見られない。そこで我々は、FSGS 病変形成過程におけるポドサイト障害と糸球体における CD44 分子発現の関連性について明らかにすることを試みた。FSGS の動物モデルとして知られるアドリアマイシン(ADR)関連腎症(AAN)マウスモデルを用いた。また、本マウスモデルにおいては、週齢によりアドリアマイシンによって惹起されるポドサイト障害に関する感受性が異なることが知られる。
我々は、異なる週齢における AAN マウスモデルを確立することにより、ポドサイト障害度と糸球体 CD44 発現の関連について探求することとした。
【材料と方法】BALB/c 系マウス (雄、6 週齢あるいは 12 週齢)に対して、１)12 週齢正常対照群（生理食塩水を尾静脈から静注）（n=17）、２）12 週齢 AAN 群（ADR 12mg/kg を尾静脈から静注）（n=30）、３）6 週齢正常対照群（生食投与）（n=10）、４）6 週齢 AAN群（n=15）、の 4 群に分けて検討した。生理食塩水または ADR 静注(day 0)の後、day 5、day 7、day 10、day 14、day 28 において屠殺し、採血 (血清クレアチニン、総蛋白)、採尿 (蛋白、尿クレアチニン)、腎組織の採取を行い解析した。腎組織における CD44、OPN、podocyte マーカー（synaptopodin、podocin、WT1）、PEC マーカー（claudin-1）の発現や病理組織学的変化の解析を行った。
【結果】正常対照群(生食投与)では day 28 までの間、体重減少や尿所見、腎組織学的変化を認めなかったが、12 週齢 AAN 群では体重減少、day 10 から尿蛋白出現を認めた。day28 には血清クレアチニンの上昇を認めた。腎病理組織学的解析では、day 14 から分節性(一部全節性)糸球体硬化、偽半月体~半月体の散在、尿細管萎縮、間質細胞浸潤~線維化が出現し、day 28 においては著明な糸球体硬化、尿細管間質傷害を認めた。また、6 週齢AAN 群では、12 週齢 AAN 群と比して体重減少、尿蛋白、腎機能低下や、腎病理組織学的変化はより軽度だった。12 週齢 AAN を用いた糸球体における CD44 発現に関しての検討では、尿蛋白出現前である day 7 から一部の糸球体に CD44 発現が出現し、その後 CD44陽性糸球体数の増加を認めた。共焦点顕微鏡による解析では、CD44 陽性細胞は、podocytemarker である synaptopodin、podocin とは共発現を認めず、PEC マーカーであるclaudin-1 と共発現を示した。また AAN における糸球体 CD44 発現部位は、発現早期にはボウマン嚢側に留まるが、糸球体係蹄上皮側や、半月体•偽半月体構成細胞における発現を認めた。さらに、共焦点顕微鏡による三重蛍光染色（CD44、podocyte マーカー、PECマーカー）の解析結果では、podocyte マーカー発現の低下した血管係蹄部位に一致して、
CD44 陽性 PEC の出現を認め、一部の糸球体では、CD44 陽性 PEC は podocyte マーカー発現の低下した血管係蹄へ向けて陥入、架橋形成を示した。6 週齢 AAN を用いた解析では、12 週齢 AAN と比してより早期に podocyte マーカーの発現低下(day 7-10)と、CD44発現が出現(day5)することが分かった。更に、podocyte マーカー発現の減少傾向は緩やかであり、結果として day 28 の時点では 12 週齢 AAN と比して有意に発現が保たれていた。
また、糸球体内 CD44 発現も day28 の時点で有意に発現が低値だった。OPN は、ADR 静注 day 14 から糸球体内での有意な発現を認めた。発現部位は、ボウマン嚢上皮側に出現し、共焦点顕微鏡による免疫蛍光染色による解析では、PEC 細胞の核周囲細胞質への発現を認めた。また、podocyte マーカー発現低下を認める血管係蹄への陥入像を示す PEC 先端部位において、細胞膜下に CD44 と OPN の共発現を示した。
【考察】本研究では、FSGS の代表的な実験動物モデルである AAN マウスを用いて、CD44分子が PEC へ発現することを見出した。CD44 発現は、本モデルにおける分節性糸球体硬化病変の出現時期よりも有意に先行しており、糸球体硬化病変形成の引き金的要因であるpodocyte 障害を反映していることが推察された。共焦点顕微鏡による解析からは、AANマウスモデルにおいて出現する CD44 陽性糸球体細胞は、ボウマン嚢尿腔側に位置するPEC の一部であることが示された。
以上から、
CD44 の新規発現を示す糸球体構成細胞は、PEC が主であり、その出現時期を考え合わせると、近年文献上報告が見られる活性化 PECであることが示唆された。また、CD44 陽性 PEC の局在変化についての解析からは、ADRが惹起した podocyte の障害性変化と CD44 陽性 PEC の出現には深い関連性があることが示唆された。さらに OPN の CD44 陽性 PEC における発現は、同細胞の podocyte 障害部位への遊走、増殖への関与の可能性を示唆していた。また、週齢の異なる AAN マウスを用いて、CD44 陽性 PEC と podocyte 障害度の違いとの関係性を検討したところ、糸球体
CD44 陽性 PEC の出現率は、podocyte マーカー発現低下と反比例して上昇を示した。これらの結果は、糸球体 CD44 陽性 PEC の出現が podocyte 障害の進行度の違いを鋭敏に反映することを示唆していた。
【結論】FSGS の進展過程において、係蹄上皮側に位置する podocyte の障害によって引き起こされる PEC の形質変化（CD44 の新規発現）を明らかにすることが出来た。本知見はFSGS の硬化病変形成における PEC の早期からの関与の可能性を支持するものと考えられ、潜在性のポドサイト障害の早期診断や重症度判定に応用できる可能性があるものと考えられた。