鳥取県産農水産物のブランド化を支援する
化学分析データ解析手法の高度化
環境学部環境学科

山

本

敦

史

１．はじめに
１．１

食品の表示を巡る状況

昨今の健康食品ブームによって、非常に多くの健康食品が市場に溢れている。一部の製品は科学的根拠を示さず、著名人が製品を用いたことによる感想のみを広告として用いるものもある。製品の有効性はその広告において強調表示されることが多く、一般消費者に無条件、無制約に当てはまるものと受け取られることがある。消費者庁は食品等の表示の信頼性を確保する観点から定期的に食品表示に係る取締りを強化しており、2019年度の取締りでは栄養成分等保健事項の表示違反が前年度から34件増の49件見つかっている。2015年に食品表示法が施行され、また同年、機能性表示食品制度が始まっている。機能性表示食品は国が審査する特定保健用食品とは異なり、事業者の責任において科学的根拠に基図 1. 機能性表示食品の登録件数から取り下げ件数を除いた正味の累積登録数

づき機能性を表示したものである。機能性の評価は最終製品を用いた臨床試験を行うか、機能性に関与する成分に関する文献調査によって行われる。文献調査による方法は比較的事業者の負担の少ない方法であるが、それでも機能性に関与する成分の分析を行う必要がある。図１に示すように制度開始から登録件数は増加し、2020年４月時点で2500件以上の食品が登録されている。機能性表示食品制度は食品業界にとって食品のPR手段として受け入れられたといえる。機能性表示食品に関して、届出時に消費者庁は有効性の検証を行わない一方で、届出で有効性の科学的根拠とされる内容に疑義が生じた場合は事業者に確認作業や改善を求めるなどしており、結果として登録の撤回に繋がるケースも増え、2019年度は89件が撤回されている。健康食品等の有効性に対して、十分な根拠を示すことが今まで以上に求められていると言える。
１．２

連携支援計画

2015年10月にまとめられた「鳥取県元気づくり総合戦略」では、高品質な農産物を高付加価値化し農林水産業を活性化していくことが謳われている。
担い手不足などの課題を抱える農業分野であるが、鳥取県の主要な産業の一つである。鳥取県内では近年新規就農者数が増加傾向にある他、果樹・野菜など新品種の開発など将来につながる動きもある。地域の特性を活用した事業を支援するための国の取り組みに2017年に制定された地域未来投資促進法がある。地域未来投資促進法は、地域の特性を活用した事業を支援するために地域が策定した連携支援計画を国が承認する形となっている。二十世紀23

梨やラッキョウが鳥取の農産物として有名であるが、他にも白ネギや日本きのこセンターが開発した「鳥取茸王」等多くの食材が県内に存在している。事業者からは、産品のブランド化・高付加価値化のために、食味や機能性成分の見える化に対する要望がある一方で、それらを実現するための化学分析の環境やデータに基づくマーケティング戦略などの支援体制は十分ではない。そのため、環境大学を中心とした８機関が事業支援を行う連携支援計画を策定し、2019年12月に承認を得ることができた。
計画での支援件数は2020年度２件、2021年度３件としており、策定に際して様々な事業者に聞き取りを行い連携に前向きな姿勢であった事業者と実績作りを行う。
１．３

化学分析による農産物含有成分の見える化

食品には、栄養面でのはたらきである一次機能としての糖類・タンパク質・脂質・ミネラル・ビタミンからなる主要成分、色素・食味・香りといった嗜好面のはたらきを持つ二次機能の成分の他にも非常に多くの成分が含まれる。生活習慣病などの疾患の発症リスクを低減するといったはたらきは三次機能と呼ばれ近年注目を集めている。しかしながら、含まれる成分が膨大であるために、その全てを知ることは極めて困難である。すべての成分が分析することができる技術は存在しないが、非常に多くの成分を同時に分析できる手法は質量分析法等有力とされるものがあり、生命科学系の分野ではタンパク質や低分子代謝物を包括的に評価するプロテオミクスやメタボロミクスといった手法が確立されつつある。疾患の診断や医薬品の開発にも活用されることが期待されており、データ解析等関連する分野の進歩も著しい。質量分析は文字の通り、含まれる成分の質量を測定する技術であり、他の技術に対して、同時に多くの成分が含まれていてもそれぞれの成分の質量を測定できることが特長である。また、測定できる質量の精密さも大きく進化しており、測定できた成分が何であるか事前に分かっていなくても質量の情報からそれが何であるかを明らかにできることも多い。しかしながら、測定できる質量が精密であればあるほど、データの容量が増大し、一回の測定でデータのファイルサイズが数百MBになることも頻繁にある。このため、人の力でデータを読むことには限界があり、データ解析の効率化・高度化は非常に大きな課題である。本研究課題ではプロテオミクス・メタボロミク
スの分野で開発されているソフトウェアも活用し、食品成分から得られたデータを解析し機能性成分の探索や他の産品との差別化に活用できる手法の確立を目指す。
２．実験
２．１

分析機器と測定条件

分析機器にはサイエックス社の液体クロマトグラフExionLCADと質量分析計X500Rを用いた。液体クロマトグラフィーのカラムは化学物質評価機構のL-Column2 ODSおよび、昭和電工のHILICpak
VG-50 2Dを用いた。L-Column2は疎水性の高い成分の分析に、VG-50は親水性の高い成分の分析に用いた。質量分析計のイオン化はエレクトロスプレーイオン化を用い、正イオンモード、負イオンモードそれぞれで測定した。X500Rは二ヶ所の質量分離部をもつタンデム質量分析計であり、前段の質量分離部で成分の質量を測定した後、質量分析計内で窒素ガスと衝突させることにより、分子を断片化することができる。断片の質量を後段の質量分離部で測定することができる。分子は原子が結合する
24ことでできているが、その結合の強さは同じではなく、弱いもの強いものが必ず存在する。衝突によことができる。分子は原子が結合することでできているが、その結合の強さは同じではなく、弱り、弱い結合が切断することから、分子内のどこに弱い結合があるかがわかる。分子を構成する原子
いもの強いものが必ず存在する。衝突により、弱い結合が切断することから、分子内のどこに弱の質量は炭素を除いて整数ではないために、端数を持つ。これを精密な質量で解析すると、それぞれい結合があるかがわかる。分子を構成する原子の質量は炭素を除いて整数ではないために、端数の断片にどの原子がいくつ含まれているかを導くことができ、分子式を決定できた断片を組み合わせを持つ。これを精密な質量で解析すると、それぞれの断片にどの原子がいくつ含まれているかをることで元の分子の構造を推定することができる。
導くことができ、分子式を決定できた断片を組み合わせることで元の分子の構造を推定することができる。
２．２ 食品試料

食品試料は、県内産を含む赤ワイン、大豆製品、エリンギも用いた。赤ワインの産地等について表
2.2 食品試料１に示す。ワインを水、あるいは90%アセトニトリル水溶液で希釈して0.2μmのディスポーザルメン
食品試料は、県内産を含む赤ワイン、大豆製品、エリンギも用いた。赤ワインの産地等についブレンフィルターでろ過したものを分析した。エリンギはみじん切りにして１ｇ量り取り、味噌は１て表 1 に示す。ワインを水、あるいは 90% アセトニトリル水溶液で希釈して 0.2 μm のディ
ｇとり試験管に入れ10mLのメタノールあるいは水で超音波抽出を20分行った。黒豆茶は80-85℃に加スポーザルメンブレンフィルターでろ過したものを分析した。エリンギはみじん切りにして 1g熱したお湯で３分間抽出した。抽出後の試料をメタノールあるいは水、90%アセトニトリル水溶液で量り取り、味噌は 1 g とり試験管に入れ 10 mL のメタノールあるいは水で超音波抽出を 20100, 1000, 10000倍に希釈したものを作成し、0.2μmのディスポーザルメンブレンフィルターでろ過分行った。黒豆茶は 80-85 °C に加熱したお湯で 3 分間抽出した。抽出後の試料をメタノーしたものを分析した。
ルあるいは水、90% アセトニトリル水溶液で 100, 1000, 10000 倍に希釈したものを作成し、0.2 μm のディスポーザルメンブレンフィルターでろ過したものを分析した。
表表1. 1.
測定した赤ワイン
測定した赤ワイン
番号

ブドウ品種

生産年

原産国・地域

Wine 1

カベルネ・ソーヴィンヨン

2014

フランス

Wine 2

カベルネ・ソーヴィンヨン

2018

アルゼンチン

Wine 3

カベルネ・ソーヴィンヨン

2018

チリ

Wine 4

カベルネ・ソーヴィンヨン

2017

カリフォルニア

Wine 5

カベルネ・ソーヴィンヨン

2015

鳥取

Wine 6

カベルネ・ソーヴィンヨン

2017スペインWine 7

カベルネ・ソーヴィンヨン

2014

フランス

Wine 8

カベルネ・ソーヴィンヨン

2018

チリ

Wine 9ピノノワール2017

ドイツ

Wine 10

ピノノワール2013

ニュージーランド

Wine 11

ピノノワール

2016

チリ

Wine 12

ピノノワール2016

カリフォルニア

Wine 13

ピノノワール2018

フランス

Wine 14

メルロ

2017

イタリア

Wine 15

カベルネ・ソーヴィンヨン

2017

イタリア

Wine 16

メルロ、カベルネ・ソーヴィンヨン

2015

フランス

Wine 17

メルロ

2017

島根

Wine 18

カベルネ・ソーヴィンヨン

2017

フランス

Wine 19

メルロ、カベルネ・ソーヴィンヨン

2012

フランス

Wine 20

メルロ

2012

フランス

Wine 21

コルヴィーナ他

2011

イタリア

Wine 22

マルヴァジア・ビアンカ他

2008

イタリア

25

2.3 データ解析ソフトウェア
２．３ データ解析ソフトウェア
得られたデータはサイエックス社のソフトウェア
SCIEX OS および、理化学研究所研究グルー
2.3 データ解析ソフトウェア
得られたデータはサイエックス社のソフトウェアSCIEX OSおよび、理化学研究所研究グループがプが公開しているソフトウェアである
MS-DIAL [1]を用いて解析した。MS-DIAL
でデータを読得られたデータはサイエックス社のソフトウェア
SCIEX OS および、理化学研究所研究グルー公開しているソフトウェアであるMS-DIAL [1]を用いて解析した。MS-DIALでデータを読込むためにプが公開しているソフトウェアである
でデータを読込むためにデータファイルを
MSConvert MS-DIALを用いて[1]を用いて解析した。MS-DIALmzml 形式に変換した。
データファイルをMSConvertを用いてmzml形式に変換した。
込むためにデータファイルを MSConvert を用いて mzml 形式に変換した。
3. 結果と考察
３．結果と考察
3. 結果と考察
3.1
３．
１ 大豆製品の分析結果
大豆製品の分析結果
3.11 大豆製品の分析結果
図に正イオンモード得られた疎水性成分の分析結果を示す。明るい白色で示されている部
図１に正イオンモードで得られた疎水性成分の分析結果を示す。
明るい白色で示されている部分が、
図 1 に正イオンモード得られた疎水性成分の分析結果を示す。明るい白色で示されている部
分が、成分の検出されたところを表しており、それぞれに精密な質量が測定されている。溶媒だ
成分の検出されたところを表しており、それぞれに精密な質量が測定されている。溶媒だけを測定し分が、成分の検出されたところを表しており、それぞれに精密な質量が測定されている。溶媒だ
600
B
C
600 A
A

B

C

400
400

m/z
m/z

200
200
100
100

保持時間
保持時間
保持時間
保持時間
保持時間
保持時間
図 1.
1. 正イオンモードで測定した試料の分析結果（A:黒豆茶,C: 味噌）
図正イオンモード出測定した試料の分析結果（A:溶媒のみ,溶媒のみ,B:B:黒豆茶,C: 味噌）
図 1. 正イオンモード出測定した試料の分析結果（A: 溶媒のみ, B: 黒豆茶, C: 味噌）けを測定したデータと比較することにより、大豆製品由来の137.0242(C7H5O3)
たデータと比較することにより、大豆製品由来の成分を見分けけを測定したデータと比較することにより、大豆製品由来の137.0242(C7H5O3)
237.0554(C15H9O3)成分を見分けることができる。試料Aについて最も高い強度237.0554(C15HH9O3)
ることができる。試料Aについて最も高い強度で検出されていた成分を見分けることができる。試料 A について最も高い強度 227.0712(C14 11O3)で検出されていたのはm/z 255.0649の成分であった。m/z 227.0712(C14H11O3)m/z
m/zは質量に相当する値でありのは255.0649の成分であった。
で検出されていたのはm/z 255.0649の成分であった。m/zは質量に相当する値であり実査には質量分析計はm/z を測m/zを測定している。正イオンモードでシ実査には質量分析計はは質量に相当する値であり実査には質量分析計はm/z を測定している。正イオンモードでシグナル強度が強かったもグナル強度が強かったものを順にP1,P2, P3のようにラベル付け定している。正イオンモードでシグナル強度が強かったも
図 2. 断片の精密質量を用いた構造の解析
2. 断片の精密質量を用いた構造の解析
断片の精密質量を用いた構造の解析のを順に
P1, P2, P3 のようにラベル付けした。それぞれ
図 2.
した。
それぞれの断片の質量についても表２に示す。
P1について、 図のを順に
P1, P2, P3 のようにラベル付けした。それぞれの断片の質量についても表2 に示す。P1 について、その断片の質量から構造を解析すると図その断片の質量から構造を解析すると図２のように考えることの断片の質量についても表 2 に示す。P1 について、その断片の質量から構造を解析すると図2 のように考えることができる。
この分子はダイゼインであり、大豆イソフラボンの主要な成分ができる。この分子はダイゼインであり、大豆イソフラボンの主要な成分である。同様に解析して含2 のように考えることができる。
この分子はダイゼインであり、大豆イソフラボンの主要な成分である。同様に解析して含まれると推定される構造についても表まれると推定される構造についても表２に示した。ダイゼイン、ゲニステイン等の遊離イソフラボンである。同様に解析して含まれると推定される構造についても表 22 に示した。ダイゼイン、ゲに示した。ダイゼイン、ゲニステイン等の遊離イソフラボンの他、配糖体であるダイジン、ゲニスチンも多く見られていた。の他、配糖体であるダイジン、ゲニスチンも多く見られていた。また、大豆に含まれるサポニンであニステイン等の遊離イソフラボンの他、配糖体であるダイジン、ゲニスチンも多く見られていた。
また、大豆に含まれるサポニンであるソヤサポニン
II が多く検出されていた。他にも、僅かでるソヤサポニン
I が多く検出されていた。他にも、僅かではあるがソヤサポニンII、ソヤサポニンIII
また、大豆に含まれるサポニンであるソヤサポニンが多く検出されていた。他にも、僅かではあるがソヤサポニンも見られた。ソヤサポニンは血圧上昇因子の阻害活性が知られている[3]。多くの成分は黒豆茶、味噌はあるがソヤサポニンII、ソヤサポニン
II、ソヤサポニン IIIIII も見られた。ソヤサポニンは血圧上昇因子の阻も見られた。ソヤサポニンは血圧上昇因子の阻害活性が知られている。[3]多くの成分は黒豆茶、味噌ともに共通の成分が検出されていたが、ともに共通の成分が検出されていたが、味噌ではオリゴ糖、脂肪酸、アミノ酸誘導体も多く見えていた。
害活性が知られている。[3]多くの成分は黒豆茶、味噌ともに共通の成分が検出されていたが、大豆由来のイソフラボンは現時点の機能性表示食品にも60件以上登録のある良く知られた機能成分で味噌ではオリゴ糖、脂肪酸、アミノ酸誘導体も多く見えていた。大豆由来のイソフラボンは現時
味噌ではオリゴ糖、脂肪酸、アミノ酸誘導体も多く見えていた。大豆由来のイソフラボンは現時もある。一方、サポニンは登録件数３件と機能性表示としての活用はまだされていない状態である。
点の機能性表示食品にも点の機能性表示食品にも6060件以上登録のある良く知られた機能成分でもある。一方、サポニン件以上登録のある良く知られた機能成分でもある。一方、サポニン
26

は登録件数 3 件と機能性表示としての活用はまだされていない状態である。
表２.精密質量の解析から推定した含有成分の構造

表 2. 精密質量の解析から推定した含有成分の構造
番号 質量

断片の質量

推定される成分名

65.0389, 91.0550,
P1

255.0649

137.0242, 181.0659,
199.0759, 227.0712,

ダイゼイン

237.0554

P2417.1192

P3459.1284

137.0251, 199.0760,
227.0714, 255. 0660

137.0251, 199.0760,
227.0714, 255.0660

ダイジン

アセチルダイジン

65.0389, 91.0550,
P4271.0599

149.0235, 153.0189,
197.0613, 243.0685,

ゲニステイン

253.0515

P5943.5264

P6433.1129

P7475.1236

423.3622, 441.3724,
599.3933, 797.4670

153.0192, 215.0710,
243.0673, 271.0619

153.0192, 215.0710,
243.0673, 271.0619

ソヤサポニン I

ゲニスチン

アセチルゲニスチン

69.0341, 97.0294,
P8

330.0599 98.9852, 119.0358,

環状-AMP

136.062427

構造式

3.2 エリンギの分析結果
３．２エリンギはエリンギの分析結果
3 社で生産されたものについて分析した。図 3 に正イオンモード得られた親水性エリンギは３社で生産されたものについて分析した。図３に正イオンモードで得られた親水性成分
成分の分析結果を示す。二糖類やグリセロリン酸コリンなど A, B, C に多くの共通の成分が含の分析結果を示す。二糖類やグリセロリン酸コリンなどA,B, Cに多くの共通の成分が含まれていた
まれていた一方で、図中白い円で記した中の成分についてA 社のエリンギのみで検出されてい一方で、図中白い円で記した中の成分についてA社のエリンギのみで検出されていた。この成分につた。この成分についての精密質量を解析すると、これはベタインと考えられた。A 社の製品にはいての精密質量を解析すると、これはベタインと考えられた。A社の製品にはベタインが多く含まれベタインが多く含まれていることが示唆された。栽培条件が A と B, C のものでは異なっておていることが示唆された。栽培条件がAとB,Cのものでは異なっており、栽培条件が含まれる成分にり、栽培条件が含まれる成分に影響していることが考えられた。ベタインはてん菜の学名
BetaBetavulgarisに由来するアミノ酸の一種で、影響していることが考えられた。ベタインはてん菜の学名vulgaris に由来するアミノ酸の一種で、てん菜の他、ホウレンソウやキノコ類に含まれることてん菜の他、ホウレンソウやキノコ類に含まれることが知られている。ベタインには動脈硬化の危険が知られている。ベタインには動脈硬化の危険因子として知られるホモシステインを低減する因子として知られるホモシステインを低減する作用や非アルコール性肝炎における肝臓の脂肪変性を作用や非アルコール性肝炎における肝臓の脂肪変性を減少させる効果等が報告されている。
減少させる効果等が報告されている[4]
[5]。
[4,5]
750

A

B

C

500m/z

100

保持時間

保持時間

保持時間

正イオンモードで測定した試料の分析結果（A 社,社, BB 社,
図図3.3. 正イオンモード出測定した試料の分析結果（A社,CC社）
社）

28

表３.精密質量の解析から推定した含有成分の構造

表 3. 精密質量の解析から推定した含有成分の構造番号

質量P1360.1491

断片の質量推定される成分名85.0281, 97.0288, 109.0290,
二糖類
127.0391, 145.0494, 163.0604

P2118.0863

P3258.1098

58.0648

ベタイン

60.0813, 86.0974, 98.9847,
グリセロリン酸コリン
104.1075, 125.0002

P4225.123

P5138.0547

84.0815, 96.0452???

65.0394, 78.0346, 92.0502,
トリゴネリン
94.0660

77.0393, 79.0548, 91.0548,
P6

166.0861

フェニルアラニン
93.0706, 103.0550, 120.0814

P7175.1186

P8162.1121

60.0562, 70.0660

アルギニン

43.0182, 60.0816, 85.0292,
カルニチン
102.0921, 103.0394

29

構造式

３．３

ワインの分析結果

液体クロマトグラフ質量分析計の測定では一度で数千の成分を検出できるが、試料数が増えた場合、膨大なデータを用いて試料間の比較をすることは容易ではない。MS-Dialを用いると検出された成分について各試料間での差異を図４に示すように明確に視覚化することができる。

図 4. 検出された成分の試料間での比較画面

また、各成分のシグナル強度を用いて主成分分析等の統計解析を行い、試料の違いを視覚化することも可能である。しかしながら、各試料の測定ごとの誤差の許容範囲や、成分の検出精度にばらつきがあり、解析手法にはさらなる最適化が必要と考えられた。
参考文献［1］H. Tsugawa, T. Cajka, T. Kind, Y. Ma, B. Higgins, K. Ikeda, M. Kanazawa, J. VanderGheynst, O.
Fiehn, and M. Arita, Nat. Methods, 12, 523 (2015).
［2］R.Adusumilli and P. Mallick,“Proteomics – Methods and Protocols”ed. by L. Comai, J. E. Katz
and P. Mallick, Springer Verlag, Berlin (2017), Chap. 23, p.339.
［3］高橋砂織：日本醸造協会誌、110：636-648 (2015).
［4］M. A. Pajares and D. Pérez-Sala, Cell. Mol. Life Sci., 63, 2792 (2006).
［5］B. A. Neuschwander-Tetri, Am. J. Gastroenterol., 96, 2534 (2001).
30