最 近 の ト ピ ッ ク ス

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最 近 の ト ピ ッ ク ス

iPS 細胞樹立の新しいアプローチ
New approaches for generating
induced pluripotent stem (iPS) cells
新潟大学大学院医歯学総合研究科

口腔生化学分野

天谷吉宏

Division of Biochemistry, Niigata University School of Medicaland Dental Sciences

Yoshihiro Amaya

１. はじめに山中らのグループは分化能の無いマウスの胎児繊維芽細胞に４種類の遺伝子調節タンパク質の遺伝子（Oct4,Sox2, Klf4, c-Myc）をレトロウィルスを用いて導入して「初期化」（reprogramming）することにより，さまざ

図１ 線維芽細胞から iPS 細胞への「初期化」
iPS 細胞への初期化に必要な４種類の遺伝子調節タンパク質の機能について，最近の知見を簡略化して模式的に示した 15）。
M, O, S, K はそれぞれ c-Myc, Oct4, Sox2, Klf4 遺伝子調節タンパク質をあらわす。■はトリメチル基をあらわす。
（本文参照）

まな細胞に分化することのできる多能性分化能

valproic acid（VPA）を添加することにより，c-Myc な（pluripotent）をもつ細胞株を樹立し，iPS 細胞（induced

しでも効率よくヒト線維芽細胞を初期化できることを示

pluripotent stem cell）と名づけた（図１）1）。引き続き，した 4）。この結果はエピジェネティックス（染色体の彼らはヒトの繊維芽細胞でも同様の方法で iPS 細胞株

DNA やタンパク質の化学修飾などによるクロマチン構を樹立できることも明らかにした 2）。これ以降，iPS 細造の変化をともなう遺伝子の発現制御）が初期化の過程胞を再生医療や新規医薬品開発に実用化することに大きで影響を及ぼしていることを強く示唆している。さらにな期待が高まり，我が国では文部科学省，厚生労働省，

彼らは VPA が存在すれば，効率はきわめて低いものの経済産業省を中心にオールジャパンの研究体制をバック

c-Myc と同時に Klf4 を除いても初期化できることも明アップして研究を推進している。一方，ガン遺伝子であらかにした。Feng らは Klf4 の代わりにエストロジェ

る c-Myc の導入や遺伝子の導入に用いるレトロウィルン受容体ホモログの Esrrb を導入してもマウス胎児線スの染色体への挿入による発ガンの危険性が強く指摘さ維芽細胞を iPS 細胞に初期化できることを示した 5）。これており，安全な臨床応用への大きな問題点となっていれらの結果は Klf4 も c-Myc と同様に，初期化に必須のる。本稿ではこれらの問題点を回避するための新しいア因子ではないことを示している。ごく最近，Kim らはプローチについて紹介する。

Oct4 のみでマウス神経幹細胞を初期化できることを示した 6）。完全に分化していない神経幹細胞はもともと２. c-Myc は初期化に必須ではないSox2 を発現しており，完全に分化した線維芽細胞にくらべて iPS 細胞に初期化しやすい状態になっていると山中らの最初の報告では iPS 細胞から生まれたマウ推定される。

1）

スの約 40％ に腫瘍が生じていた 。彼らはその後，腫瘍形成の原因は c-Myc とレトロウィルスだけではc-Myc を用いないで iPS 細胞を樹立することに成功し，ない。たとえば，今のところすべての細胞種の初期化にこの iPS 細胞由来のマウスでは腫瘍が認められない 3）。

必要とされている Oct4 は通常の発生分化の過程においこれを突破口として，c-Myc が初期化に必須ではないて発現のタイミング，場所，量が厳密に調節されている 7）。とする結果が相次いで報告された（表１）4-6）。c-Myc

事実，Oct4 の異所発現は前駆細胞の分化を阻害し，上を用いない場合，マウス胎児線維芽細胞から iPS 細胞皮の異形成や腫瘍化を引き起こす 8）。導入した遺伝子がに初期化される効率は大きく低下し，1/10 以下である。

必要のないところで発現してしまった場合に起こる影響

Huangfu らはヒストンデアセチラーゼの阻害剤であるを明らかにしておくことは iPS 細胞の臨床応用におけ－ 57 －58

新潟歯学会誌表１
導入遺伝子39（1）：2009

iPS 細胞の樹立法と効率

導入方法

薬剤細胞種

効率

文献

Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc

レトロウィルス

マウス胎児線維芽細胞

0.1％

3

Oct4, Sox2, Klf4
Oct4, Sox2, Klf4
Oct4, Sox2, Klf4
Oct4, Sox2
Oct4, Sox2
Oct4, Sox2, Esrrb
Oct4
Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc
Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc
Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc

レトロウィルス
レトロウィルス
レトロウィルス
レトロウィルス
レトロウィルス
レトロウィルス
レトロウィルス
アデノウィルス
アデノウィルス
プラスミドマウス胎児線維芽細胞
ヒト線維芽細胞ヒト線維芽細胞ヒト線維芽細胞ヒト線維芽細胞マウス胎児線維芽細胞
マウス神経幹細胞
マウス線維芽細胞
マウス培養肝細胞
マウス胎児線維芽細胞

0.01％
0.001％
1％0.001％
樹立不能0.005％
0.014％
樹立不能0.0006％
0.0015％344445610103VPAVPA

iPS 細胞に初期化することに成功している 3）。

るリスクを正確に把握するためにも重要である。

ごく最近，レトロウィルスを使わないベクターで遺伝

３. レトロウィルスを用いない遺伝子導入子を導入して iPS 細胞を樹立した後，導入した遺伝子をすみやかにほぼ完全に除去することに成功したという

レトロウィルスでマウスの胎児線維芽細胞に初期化に報告が相次いだ 11-13）。これらの方法はこれまで述べてき必要な４種類の遺伝子を導入した場合，それぞれ約 10た iPS 細胞の安全性にかかわる問題点のうち，遺伝子コピーずつ，であわせて 40 箇所程度，導入した遺伝子の導入にレトロウィルスを用いること，および初期化に1）が染色体 DNA 上に挿入されている 。前述のように，必要な遺伝子が iPS 細胞に過剰なコピー数存在してしc-Myc を使わなければ導入にレトロウィルスを用いてまうことをあわせて解決しており，iPS 細胞の安全な臨も腫瘍形成は認められない。一方，マウスの肝臓や胃由床応用に大きく貢献するものと思われる。

来の iPS 細胞では c-Myc を含めた 4 種類の遺伝子をレ低分子化学物質による初期化の試みも活発に行われて

9）

トロウィルスで導入しても腫瘍形成は認められない 。

いる。前述の VPA のように直接エピジェネティックな腫瘍のできない肝臓および胃由来の iPS 細胞では染色状態に影響を及ぼすものだけでなく，リン酸化酵素の阻体 DNA に挿入される遺伝子のコピー数が，腫瘍ができ害剤など細胞内シグナル伝達に影響を及ぼす物質も，iPSてしまう繊維芽細胞由来の iPS 細胞のおよそ 1/5 程度細胞の樹立に寄与できることが明らかになってきた 14）。

であった。線維芽細胞由来の iPS 細胞で腫瘍形成の頻iPS 細胞を樹立する効率を上げたり所要時間を短縮した度が高いのは，染色体に挿入された遺伝子が本来必要のりするためには，このような化学物質の力も借りなけれないところで発現して分化のプログラムを乱す確率が，ばならないかもしれない。我が国でも約 10 万種に及ぶ挿入されるコピー数に比例して高くなるからかもしれな

天然化合物ライブラリーを活用した iPS 細胞の効率的い。レトロウィルスによって導入した遺伝子の挿入されな作製法開発が行われている（NEDO プロジェクト「化る場所を解析したところ，特定部位への挿入は観察され合物等を活用した生物システム制御基盤技術開発」）。多なかった。レトロウィルスが常に特定のガン関連遺伝子くの化学物質の中から初期化に有効な物質を低いコストの近傍に特異的に挿入されることによってガン関連遺伝で選別するには，より確実で効率のよいスクリーニング子を活性化させて腫瘍形成を引き起こす可能性は低そう系を確立する必要があると考えられる。

である。

４. 導入した遺伝子の役割

遺伝子の導入に用いたレトロウィルスが原因となる腫瘍形成の可能性がかなり低くなったとはいえ，iPS 細胞の臨床応用には原理的により安全な方法の確立を求める

導入した４種類の遺伝子調節タンパク質の初期化にお意見は多い。Stadtfeld らは導入された遺伝子が染色体ける役割を明らかにすることは，より効率のよい初期化

DNA に挿入されないアデノウィルスベクターを使っ条件の発見や安全な iPS 細胞の実用化，特に医療の安て，きわめて低い効率ながらマウス培養肝細胞を iPS全基準の策定にとってきわめて重要である。Sridharan細胞に初期化することに成功した（表１） 。アデノウィらは初期化の過程におけるこれらの遺伝子調節タンパク

ルスは細胞腫によって感染効率大きく異なるため，マウ質の動態と機能をゲノムワイドで解析した（図 1）15）。

ス線維芽細胞を初期化することはできなかった。山中ら

c-Myc はまず単独で iPS 細胞になる準備をするためにのグループはウィルスベクターを使わずにプラスミドを繊維芽細胞に特異的に発現している遺伝子群の発現を抑繰り返し導入する方法によって，マウス線維芽細胞を圧する（図 1a）。次に Oct4, Sox2, Klf4 の一部と複合体10）－ 58 －

天谷吉宏

ほか

59を形成して，主に iPS 細胞の代謝調節を行う遺伝子群ると思われる。ひょっとしたら近い将来，ごくあたりまの発現を促進し，iPS 細胞になった後もこの状態を維持

えの歯科診療が iPS 細胞を使った再生医療の最前線のする（図 1b）。

ひとつになるかもしれない。

一方，iPS 細胞になった後，多能性を維持するのに必【参 考 文 献】

要な遺伝子群の発現は Oct4，Sox2，Klf4 の３種類の遺伝子調節タンパク質が揃ってプロモーター（転写調節）領域に結合することによって促進されている（図 1c１）Okita K, Ichisaka T and Yamanaka S:上）。これら３種類の遺伝子は初期化の指標としている

Generation of germline-competent induced

Nanog なども含めた制御回路を形成して iPS 細胞でのpluripotent stem cells. Nature 448: 313-317, 2007

発現を維持している 16）。この遺伝子群のプロモーター

２）Takahashi K, et al.: Induction of pluripotent

領域の DNA に結合するヒストン H3 の尾部は，線維芽stem cells from adult human fibroblasts by細胞では 27 番目のリジンがトリメチル化されているの

defined factors. Cell, 131: 861-872, 2007.

に対し，iPS 細胞では 4 番めのリジンがトリメチル化さ３）Okita K, Nakagawa M, Hyenjong H, Ichisaka Tれるというエピジェネティックな状態の変化が生じていand Yamanaka S: Generation of mouse inducedる（図 1c 下）。３種類の遺伝子調節タンパク質が揃っ

pluripotent stem cells without viral vectors.てプロモーター領域に結合するためにはクロマチン構造

Science, 322: 949-953, 2008.の変化が必要らしい。前述のようにヒストンデアセチ４）Hangfu D, et al.: Induction of pluripotent stem

ラーゼの阻害剤である VPA が初期化に影響を及ぼすこcells from primary human fibroblasts with onlyとからヒストンアセチル化のパターンも初期化にとも

Oct4 and Sox2. Nat Biotechnol, 26: 1269-1275,なって大きく変化しているものと考えられる。この他に

2008.

も iPS 細胞への初期化の過程で，ES（embryonic stem,５）Feng B, et al.: Reprogramming of fibroblasts胚性幹）細胞と同様に DNA の脱メチル化，雌性 X 染

into induced pluripotent stem cells with orphan

色体の再活性化，テロメラーゼの活性化などが起こってnuclear receptor Esrrb. Nat Cell Biol, 11: 197-いるものと考えられる。また，Oct4, Sox2, Nanog とともに RNA のプロセシングに必要な Lin 28 を組み合わ

203, 2009.
６）Kim JB, et al.: Oct4-induced pluripotency in

せても初期化が可能なことから，非コード RNA による

adult neural stem cells. Cell, 136: 411-419, 2009.

初期化制御の重要性も強く示唆されている 17）。初期化

７）Pesce M, Gross MK and Scholer HR: BioEssays,の機構の解明はまだ始まったばかりで，安全な iPS 細胞の実用化のためにも今後の進展が期待される基礎研究

20: 722-732, 1998.
８）Hochedlinger K, et al.: Ectopic expression of
Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and分野のひとつである。

causes dysplasia in epithelial tissues. Cell 121:

５. おわりに465-477, 2005.
９）Aoi T, et al.: Generation of pluripotent stem cells

以上述べてきたように，患者様が iPS 細胞による再生医療を安心して受けられるようになるためには基礎研from adult mouse liver and stomach cells.
Science, 321: 699-702, 2008.

究を含めてまだまだ多くの努力が必要とされている状況

10）Stadtfeld M, Nagaya M Utikal M, Weir G andだが，最近歯科の臨床においても iPS 細胞の研究に貢Hochedlinger K: Induced pluripotent stem cells

献できる可能性がでてきた。大串らは抜歯後凍結保存しgenerated without viral integration. Science, 322:

た親知らずの歯胚由来間葉系細胞に Oct4, Sox2, Klf4 を945-949, 2008.

レトロウィルスで導入することにより iPS 細胞を樹立

11）Yu J, et al.: Human induced pluripotent stem

したことを広報している 18）。手塚らもごく最近，同様

cells free of vector and transgene sequences.の報告をしている（第８回再生医療学会総会）。間葉系

Science, DOI:10.1126/science.1172482, 2009.

幹細胞は完全に分化していないためか，前述の神経幹細12）Wolten K, et al.: piggyBac transposition

胞と同様に初期化に c-Myc はいらないようである。こreprograms fibroblasts to induced pluripotent

れらの方法が確実なものになれば，捨てている親知らず

stem cells. Nature, 458: 766-770, 2009.

を凍結保存しておいて，必要な時に iPS 細胞を樹立で13）Kaji K, et al.: Virus-free induction of pluripotency

きるということになる。このようなシステムが確立すれ

and subsequent excision of reprogramming

ば真のオーダーメード再生医療の可能性は大きく前進すfactors. Nature, 458: 771-775, 2009.

－ 59 －60

新潟歯学会誌39（1）：200914）Silva J, et al.: Promotion of reprogramming toground state pluripotency by signal Inhibition.
PLoS Biol, 6: e253, 2008.

cells. Cell, 132, 1049-1061, 2008.
17）Yu, J, et al.: Induced pluripotent stem cell lines
derived from human somatic cells. Science, 318,15）Sridharan R, et al.: Role of the murinereprogramming factors in the induction ofpluripotency. Cell, 136: 364-377, 2009.

1917-1920, 2007.
18）大串 始 , 小田泰昭 : 産業技術研究所

広報記事 ,

http://www.aist.go.jp/aist_j/new_research/

16）Kim J, et al.: An extended transcriptional
network for pluripotency of embryonic stem

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nr20080825/nr20080825.html