学位研

究紹介267

学 位 研 究 紹 介
属するGrowth factorである。GDF-5も含めBMPは，骨Growth/differentiation factor-5 (GDF-5)の機能とその制御機構に関する研究
Functions and signaling mechanism ofGrowth/differentiation factor-5.の発生や成長などに関与しているが，近年，GDF-5を異所的移植することで，靱帯や腱様の組織形成が誘導される等，GDF-5が靱帯や腱の発育や成熟に関与する可能を示唆する報告がされている。この研究の目的は，PDLL2を用いてGDF-5の作用機序を調査することで，靱帯細胞有の機能制御機構の一端を解明することである。

新潟大学大学院医歯学総合研究科 口腔生命科学専攻【方法】

In vitroにおけるGDF-5発現状態の調査には，PDL-L2

口腔健康科学講座 小児口腔科学

二葉子および各種培養細胞から抽出したTotal RNAを使用し，Division of Pediatric Dentistry

RT-PCRを行った。In vivoでの発現状態はマウス歯周組Department of Oral Health Science

織とアキレス腱を使用したin situ hybridizationにより

飯澤

Niigata University Graduate School ofMedical and Dental Sciences

Futabako Iizawa

調査した。発色にはNBT/BICP，核染色にメチルグリーンを使用した。石灰化の進行とGDF-5の発現量の変化の関係についての調査のために，石灰化促進培地で０〜30
日間PDL-L2と骨芽細胞系細胞株MC3T3-E1を培養し，【目的】

RT-PCRにてGDF-5，各種骨マーカー遺伝子の発現変化を調査した。また，alizarin-red 染色により石灰化基質

歯根膜は靱帯組織の一種であるが，外傷や歯周病等で形成状態を調査した。recombinant GDF-5，BMP-2添加

失ってしまうと，再生が難しい組織である。歯根膜線維したものについても同様の調査を行った。PDL-L2,芽細胞を含む靱帯，腱細胞は間葉細胞由来の細胞である。

MC3T3-E1における各種TGFβ TypeＩ，IIレセプター

他の間葉細胞由来の細胞には骨芽細胞，軟骨細胞，筋細の発現状態についてもRT-PCR Southern hybridization

胞などがあり，近年，これらの細胞特異的な分化誘導遺で比較した。

伝子やマーカー遺伝子が解明されつつあるが，靱帯細胞，【結果と考察】

腱細胞については特異的遺伝子が不明であり，発育や制御に関する分子メカニズムは明らかでない。効果的な治療法を確立する上で，細胞内での機能制御機構を解明す

In vitroにおいてGDF-5はアキレス腱，C3H10T1/2，ることが必要だが，細胞株が樹立されておらず，あまりPDL-L2に強く発現していた。MC3T3-E1は，未分化な研究が進んでいない状態であった。歯根膜についても多状態では発現が強く，分化の進行に伴い弱くなった。

くの研究が行われてきたが，複数の異なる性格を持つ細（図１）In vivoでGDF-5は歯根膜線維芽細胞と腱細胞に胞成分が含まれるため，歯根膜の特性の主体となる細胞強く発現しており，骨芽細胞とセメント芽細胞では弱いがはっきりせず，統一した見解が得られていない。歯根発現のみ認められた。（図２）この結果から，石灰化が膜は，硬組織に挟まれ咬合力に曝されているにもかかわ弱い細胞にGDF-5が強く発現していると考えられる。次らず，一定の厚みを保っていることから，靱帯組織にはに，MC3T3-E1とPDL-L2を用い，分化に伴うGDF-5のosteoblasticな分化を抑制する等，独特の制御機構が存発現変化を調査したところ，GDF-5は，骨芽細胞の石灰在する可能性がある。近年，細胞機能制御学分野にて樹化の進行に伴い減少した。PDL-L2はosteoblasticな分化，立されたマウス歯根膜線維芽細胞株PDL-L2は，BMP-2石灰化が起こらず，GDF-5の発現が高い状態であった。など強力な外因性刺激が加わると石灰化し得るが，通常（図３）このことから，通常，骨芽細胞分化後期にGDF-は石灰化抑制機構が働くため骨芽細胞の分化段階の初期5はほとんど作用していないと考えられる。GDF-5発現にとどまっている細胞と考えることができることから，が強い歯根膜線維芽細胞では，骨誘導活性以外の働きを歯根膜の特性と合致した細胞株であり，靱帯細胞の研究していると考えられる。MC3T3-E1とPDL-L2におけるモデルとして適していると考えられる。この制御メカニ

GDF-5の骨形成誘導能の違いについて検討するために，ズムを解明していくことを目的とし，靱帯や腱において石灰化基質形成状態を調べたところ，rmGDF-5は特有の機能をもつと考えられるGrowth differentiation

MC3T3-E1の石灰化基質形成を促進したが，作用はfactor-5(GDF-5)に着目した。GDF-5はBMPファミリーにrhBMP-2に比べて弱かった。rhBMP-2はPDL-L2の石灰−103−268

新潟歯学会誌

34（2）
：2004

化 を 誘 導 す る が ， r m G D F - 5 は し な か っ た 。（ 図 ４ ）pathwayにおけるリン酸化と核内移行，ALK-1を過剰発

GDF-5を含めBMPsはBMPレセプターファミリーの複合現・発現抑制したMC3T3-E1，PDL-L2へのGDF-5の作体を介して，細胞内へ刺激を伝達し，SmadやMAPKを用の変化について検討中である。

介してターゲット遺伝子の発現を行っているが，異なるリガンドでもレセプターやパスウェイを共有している部

本研究は，新潟大学大学院医歯学総合研究科顎顔面再建学講座細胞機能制御学分野にて行ったものである。

分もあり，どこに決定的な違いがあって機能の違いが現れるのか不明な部分が多い。まず，MC3T3-E1とPDLL2における各種レセプター発現状態を調査したところ，発現量に差があったのはALK-1のみで，PDL-L2で認められるがMC3T3-E1ではほとんど発現していなかった。
（図５）本研究において，GDF-5は靱帯，腱細胞において強く発現しているが，osteoblasticな分化が進行した細胞ほど，減少すること，MC3T3-E1においてGDF-5はBMP-2より弱い石灰化誘導能を持っているが，PDL-L2にGDF-5を添加しても石灰化が促進されないことが明らかになった。PDL-L2におけるGDF-5の独特の役割につ

図３．分化に伴うGDF-5と各種骨マーカー遺伝子の発現態の変化

いてはわかっていないが，その作用は，GDF-5の石灰化促進機構とは別の経路でおこっている可能性が高い。
ALK-1を介した別の下流シグナリング機構を介した作用という可能性もあるが，GDF-5のALK-1への結合性については不明である。現在，詳細を解明するために，
GDF-5刺激時のPDL-L2とMC3T3-E1のSmad，MAPK

図１．各種間葉系細胞のGDF-5mRNA発現状態図４． :recombinant GDF-5が細胞の石灰化に及ぼす影響

図５．MC3T3-E1,PDL-L2におけるBMPレセプターの
図２．In vivoにおけるGDF-5の発現状態

発現状態

−104−

飯澤二葉子269

part of which can be overcome by bone

【参 考 文 献】

morphogenetic protein-2. J Cell Sci., 115:41914200, 2002.

１）Saito Y, Yoshizawa T, Takizawa F, Ikegame M,

２）Yoshizawa T, Takizawa F, Iizawa F, Ishibashi

Ishibashi O, Okuda K, Hara K, Ishibashi K,O, Kawashima H, Matsuda A, Endo N,Obinata M, Kawashima H.: A cell line withKawashima H.: Homeobox protein MSX2 acts ascharacteristics of the periodontal ligamenta molecular defense mechanism for preventing

fibroblasts

ossification in ligament fibroblasts. Mol Cell Biol.,

isnegatively

regulatedfor

mineralization and Runx2/Cbfa1/Osf2 activity,−105−

24: 3460-3472, 2004