技術紹介

FISH 法のカビ検出への適用
山村 隼志＊

古泉 綾子＊

石 井 浩 介 ＊＊Ya m a m u r a

KoizumiIshiiJunji

Ay a k oKousuke

カビの迅速検出・同定に、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション（FISH）法を適用した。FISH 法は、菌体内に蛍光色素で標識した短い DNA 鎖（DNA プローブと称す）を取り込ませ、蛍光染色された菌体そのものを蛍光顕微鏡で検出するものである。また、DNA プローブの塩基配列を検出したい菌の遺伝子と特異的に結合できるように設計することにより、菌種の同定も可能である。
これまで FISH 法をカビ検出に適用した例は少なく、特定のカビの分布情況を調べる研究等に限られていた。問題となるさまざまなカビ（特に胞子）が FISH 法で検出可能となれば、迅速で有用な検査手法となり得る。
キーワード：蛍光 in situ ハイブリダイゼーション、FISH、カビ検査、迅速検出

微鏡で検出するものである。また、DNA プロー

1. はじめにブの塩基配列を検出したい菌の遺伝子と特異的にカビが及ぼす問題は、食品や住環境等の汚染に結合できるように設計することにより、菌種の同よる品質劣化だけでなく、アレルゲンとして健康定も可能である。図 1 に FISH 法の概要を示す。
本稿では、Trichoderma viride（トリコデルマ ビへの影響も懸念されている。
現在、カビ検査は培養・形態観察によるものがリデ、カビの一種）と FISH 法による蛍光染色が主流であるが、培養に時間がかかるため検査に数可能である Saccharomyces cerevisiae（サッカロミ日から一週間程度を要し、迅速性という点においセス セレビシェ、酵母の一種）を用い、双方のて課題がある。また、形態観察による同定には豊蛍光染色の強度を比較することで、カビ検出に富な知識と経験が求められる。

FISH 法が適用可能か検討した結果の一端を報告

培養工程を経ずに微生物を検出する方法の一つする。なお、詳細については別報にて報告する予に、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション *1 法（以定である。

下、FISH 法）があり、細菌の検出方法として研究分野で多く用いられてきた。FISH 法は、菌体*1：ハイブリダイゼーション（Hybridization）：ハ内に蛍光色素で標識した DNA プローブ *2 を取イブリッド形成とも言う。一本鎖の核酸同士が、り込ませ、蛍光染色された菌体そのものを蛍光顕相補性をもつ塩基対間の水素結合により二本鎖核＊＊＊計測事業部 化学・環境部
株式会社 IHI 技術開発本部

総合開発センター 化学システム開発部—37—

主査、博士（理学）図1

FISH 法の概要

酸を形成すること。DNA と DNA、DNA と RNA、

*3：リボソーム（ribosome）：タンパク質と核酸

RNA と RNA の三つのパターンがある。二本の鎖の一種であるリボソーム RNA（rRNA）からなるの相補性が高いほど、二本鎖の形成効率は高くな細胞内小器官。遺伝子の転写産物であるメッセンり、また二本鎖構造の安定性も高くなる。

ジャー RNA（mRNA）に取り付き、その塩基配列に対応したアミノ酸を結合させてタンパク質を合成する役割を持つ。

*2：プローブ（probe）：核酸はアデニンとチミン（またはウラシル）、グアニンとシトシンが水素結合することによって二本鎖構造をつくる性質があ*4：励起光：蛍光物質を励起状態にする光のこと。

る。結合する相手方の核酸配列に対応する相補的蛍光物質は、特定波長の光（励起光）を照射するな DNA 鎖 を 合 成 し（ こ れ を プ ロ ー ブ と す る ）、とそのエネルギーを吸収して励起状態となり、も上記の性質を利用して標的配列を探すことがでとの安定な基底状態に戻る過程で光（蛍光）を放きる。

射する。
2. 実験方法

蛍光顕微鏡でサンプルに励起光 *4 を照射する
2.1 サンプル調製と（図 1（a））、プローブ DNA の標識色素が蛍光を発する。このとき、顕微鏡では菌全体が光ってFISH に供する生物試料には、固定という処理いるのが観察される（図 1（b）、白矢印）。プローを行う。この処理により、菌を生きていた時の細ブ DNA は、塩基配列が相補的な rRNA とだけ結胞構造を維持したまま保存できるようなる（菌そ合（ハイブリダイズ）することができる（図 1（c））のものは死んでいる）。培養して得られた菌を、4が、塩基配列が相補的でないと結合しない。特定% のパラホルムアルデヒド溶液で固定した。以後、の菌が有する rRNA 配列 を特異的に認識するプ

この固定済みの菌を用いて検討した。実験には、

ローブ DNA を用いれば、選択的な蛍光染色によTrichoderma viride（トリコデルマ ビリデ、カビのる菌の判別が可能となる。

一種）と Saccharomyces cerevisiae（サッカロミセ
ス セレビシェ、酵母の一種）を用いた。

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38

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IIC REVIEW/2011/04.  No.45

2.2 FISH 反応2.3

蛍光検出

固定した菌は、直径 25mm、孔径 0.22 μm のポ洗浄・乾燥後、フィルターを蛍光観察用のマウリカーボネートメンブレンフィルターに吸引濾過ント液に浸してプレパラートを作製した。蛍光観して捕集し、そのフィルターを適度な大きさの扇

察は、励起光として青色光（460-495nm）を照射状に裁断してサンプルとした（図 2（a））
。フィルしながら行った。

ターサンプルはプローブ DNA を含む反応溶液にFITC 等の緑色蛍光色素の励起には、緑色蛍光浸し（図 2（b））、46℃で 2 時間のハイブリダイゼー（波長：520nm 前後）より波長の短い青色光を用ションを行った（図 2（c））
。次に、フィルターサいる。

ンプルを 48℃のウォッシングバッファーに 15 分間浸漬し、余分なプローブ DNA を除去する洗浄を行った。洗浄終了後、フィルターサンプルは、99.5 % エタノールに浸して脱水・乾燥させた。
カビと酵母はどちらも真核生物 *5 である。そこで、今回は真核生物を認識し検出可能なプロー図3ブで ある EUK516（配列：5'-ACC AGA CTT GCCCTC C-3'）と、どの微生物にも反応しない配列の蛍光観察用プレパラート
3．結果と考察

陰 性 コ ン ト ロ ー ル 用 プ ロ ー ブ（ 配 列：5'-TGA
GGA TGC CCT CCG TCG-3', 以下 nonprobe と称す）

Trichoderma viride（カビ）および Saccharomyces

を FISH に供した。プローブは緑色蛍光色素であcerevisiae（酵母）の試料に対し、真核生物用プローる FITC（ﬂuorescein isothiocyanate）で標識した。

ブ EUK516 または nonprobe を添加した場合、 プ（a）

ローブ未添加の場合で FISH を行った。その結果（b）を図 4 および図 5 に示す。
nonprobe の結果から、ランダムな配列のプロー
ブは菌の rRNA の配列を認識し、ハイブリダイズすることができないため蛍光が検出されなかったことが確認できる（図 4（b）、 図 5（b））。 また（c）

プローブ未添加の結果からは、励起光の照射による菌自身の蛍光（自家蛍光）ではないことが確認できる（図 4（c）、図 5（c））。一方、EUK516 プロー

図2

ブ使用のサンプルでは緑色蛍光が検出された（図FISH 操作概要4（a）、図 5（a））。nonprobe およびプローブ未添*5：真核生物：細菌とは異なる、細胞中に核構造加の結果と併せて、プローブが rRNA にハイブリを持つ生物。カビ、酵母、キノコと呼ばれる生物ダイズし、FITC 由来の蛍光が検出されたことがは、真核生物の一つの分類群である菌界に属し、示された。
蛍光強度について、Saccharomyces cerevisiae と総称して菌類と呼ぶ。細菌などと区別するために比較して Trichoderma viride の胞子も検出に十分真菌と呼ばれることがある。

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（a）

（b）（a）

（c）

（b）

（c）

図 4 Trichoderma viride の蛍光顕微鏡観察画像（a）EUK516 添加、（b）nonprobe、（c）プローブ未添加
緑色に光っている粒子が蛍光染色された胞子図 5 Saccharomyces cerevisiae の蛍光顕微鏡観察画像（a）EUK516 添加、（b）nonprobe、（c）プローブ未添加
緑色に光っている粒子が酵母の菌体な強度で蛍光染色されていた。カビは生育の過程ず、蛍光染色が困難なことが予想された。しかし、でまず菌糸が伸長し、やがて胞子を形成する。成

今回の結果から、FISH 法によってカビ胞子も検長を続ける菌糸（活発に代謝を行っている）と比出可能であることが確認された。

較して胞子中には十分な量のリボソームが存在せ

表1

従来法と FISH 法の比較—

40—

IIC REVIEW/2011/04.  No.45

参考文献

4．おわりに⑴

食品等の製造所・貯蔵所における品質管理や居住環境の衛生管理という観点から、迅速なカビ検

高鳥浩介、小菅旬子、李憲俊、村松芳多子、太田利子、田中真紀 . カビ検査マニュアル

査は重要である。形態観察を主とする従来の検査⑵

では、胞子が形成されるまでカビが成長している

宮治誠、西村和子 . 住まいとカビと病原性、八坂書房

必要がある。そのため、観察でカビかどうかが容⑶

Rudolf I. Amann, Wolfgang Ludwig, Karl-Heinz

易に判別できないような試料では、一週間以上のSchleifer.（1995）Phylogenetic Identiﬁcation and培養を行って胞子を形成させる必要があり、迅速In Situ Detection of Individual Microbial Cellsな対応が難しいという課題があった。また、試料

without Cultivation. Microbiological Review. 59,

によっては菌糸の伸長のみで胞子が形成されない

143-169

ことがあり、そのような場合には観察での判定は⑷困難になる。

Rudolf I. Amann, Brian J. Binder, Robert J. Olson,
Sallie W. Chisholm, Richard Devereux, David A.

一方 FISH 法では、菌体内の核酸をターゲット

Stahl.（1990）Combination of 16S rRNA-Targetedとし菌体を蛍光染色して検出するため、生育初期

Oligonucleotide Probes with Flow Cytometry for

段階であっても検出・判定ができる。今回、カビAnalyzing Mixed Microbial Populations. Appl.

胞子についても FISH 法による検出が可能である

Environ. Microbiol. 56, 1919-1925

ことが確認できた。従来法の課題であった培養工程が基本的に不要となる、新たな迅速カビ検査法として FISH 法の有用性が示された。

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