関東森林研究 67-1(2016)

論 文

薬用系木本植物カギカズラの根の液体培養
Root suspension culture of a medical woody plant, Uncaria rhynchophylla
谷口亨＊1・河村文郎＊2
Toru TANIGUCHI＊1 and Fumio KAWAMURA＊2＊１ 森林総合研究所森林バイオ研究センター
FFPRI, Forest Bio-research Center, Ishi 3809-1, Juo, Hitachi, Ibaraki 319-1301＊２ 森林総合研究所
FFPRI, Tsukuba, Ibaraki, 305-8687
要旨：カギカズラはアカネ科のつる性の薬用樹木である。カギカズラの根の培養による薬用成分アルカロイドの生産の可能性を探るため、液体培地での根の培養条件の検討と液体培養した根のアルカロイド含有率の調査を行った。培地中の IBA 濃度の影響を調べたところ 0.2 mg/l 添加の培地における増殖が最も効率的であり、培養 5 週間での増殖率は約45 倍であった。また、光条件の影響を調べるために弱光と暗所で培養したところ、根の増殖率には差は認められなかった。液体培養した根のアルカロイド含有率を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、オキシインドールアルカロイドであるリンコフィリンとイソリンコフィリンの含有率は、自生個体の根の皮における含有率と同様に 0.01%以下と低含有率であった。一方、インドールアルカロイドであるヒルスチンの含有率は自生個体では 0.36%と高含有率であることが報告されているが、培養根では 0.01〜0.02%と低含有率であった。液体培養によるアルカロイドの効率的生産のためには、アルカロイド含有率を高めるための処理が必要である。
キーワード：組織培養、増殖、アルカロイド
Abstract: Uncaria rhynchophylla is a medical woody plant, belonging to the family Rubiaceae. In order to evaluate the possibility ofalkaloid production by root suspension cultures in this species, we developed the methods for root suspension cultures, and then weanalyzed alkaloid contents of suspension-cultured roots. IBA concentration in liquid medium significantly affected root growth.
Optimal concentration of IBA was 0.2 mg/l, being 45-fold increase of root flesh weight after 5 weeks of culture. Light condition(under slight light or under darkness) was not influenced on the root growth. Alkaloid contents of cultured roots were analyzed byhigh performance liquid chromatography (HPLC). Contents of oxindole alkaloids (rhynchophylline and isorhynchophylline) were
below 0.01 % in suspension-cultured roots, as reported for root barks of U. rhynchophylla grown at field. Contents of indole alkaloid(hirsutine) were 0.01-0.02 % in suspension-cultured roots, although hirstine contents were 0.36 % in root barks of field-grown U.
rhynchophylla. In order to produce alkaloids effectively by root suspension cultures, we need some induction treatments for alkaloid
accumulation.
Keywords: tissue culture, root growth, alkaloid
Ⅰ はじめにことが一つの理由と考えられる。釣藤鈎の薬用成分はアルカギカズラ（Uncaria rhynchophylla）は中国南部と日カロイドとされ、日本薬局方には乾燥物に対し総アルカロ本の房総半島以西〜九州に自生するアカネ科のつる性のイド（リンコフィリン及びヒルスチン）0.03%以上を含む木本植物である。本種の枝の葉腋部には枝が変形したものと規定されている。釣藤鈎は神経過敏で興奮しやすい、イとされる鈎（カギ）状の刺（以下、鈎とする）があり、枝ライラする、眠れないなど神経症状を訴える人に効果があを付けた鈎を乾燥させた物は釣藤鈎（チョウトウコウ）とる抑肝散などの漢方薬に配剤される（６）。また、認知症称される生薬である。我が国の釣藤鈎の使用量は 200 トン（６）や高血圧症（９）に効果があるとされている。

程度あり、その全てを中国から輸入している（８）。国内

植物由来の薬用成分や色素などの有用物質を効率的にに自生するカギカズラが生薬として利用されていない理生産する方法として液体培養が知られている。液体培養で由は明らかではないが、まとまった量の収穫が困難である

は、栄養分や植物ホルモンなどを含む人工培地で植物の組－53－(2016 年 3 月 15 日受理)織 や 細 胞 を 培 養 す る 。 ム ラ サ キ （ Lithospermumた。遠心分離し、濾過した抽出液は高速液体クロマトグラerythrorhizon）の細胞培養によるシコニン色素の生産（３）フィー（HPLC）（日本分光、PU2080）で分析した。分析やオタネニンジン（Panax ginseng）の根の培養による薬項目は、オキシインドールアルカロイド２種（リンコフィ用成分ジンセノイドの生産（11）は実用化されている。

リンとイソリンコフィリン）とインドールアルカロイド１種（ヒルスチン）とした。

本研究では、カギカズラの根の培養による薬用成分アルカロイドの生産の可能性を探るため、液体培地での根の培養条件の検討と液体培養した根のアルカロイド含有率のⅢ 結果と考察調査を行った。

1. 根の液体培養
根の増殖に及ぼす IBA 濃度の影響を調べた。IBA 濃度

Ⅱ 材料と方法の影響は顕著であり、IBA 濃度の増加に従い、根の増殖は１． 植物材料有意に促進された（図−１、図−２）。光条件については、高知県内に自生するカギカズラ１個体を掘取り、温室で供試した弱光条件と暗条件の間では差は見らなかった（図栽培し、伸長した枝より採取した鈎付きの枝を培養した。

−３）。弱光条件下で IBA を 0.2 mg/l 添加した液体培地で鈎より誘導したシュートを伸長させ、シュートの発根によ５週間培養した際の増殖曲線を図−４に示す。培養１週間

り無菌植物体を作製した（５）。無菌植物体の先端部 3〜4後から直線的に増殖を開始し、５週間目には増殖速度が鈍

cm を切取り、1/2 濃度の MS 無機塩に 1/2 濃度の B5 ビタ化した。根の生重量の平均値は、５週間で 40mg から 1.8g

ミンを添加した基本培地にインドール-3-酪酸（IBA） 0.02へと約 45 倍に増加した。

mg/l と 15 g/l のショ糖、8 g/l の寒天を加えた発根培地で培

オタネニンジンの場合は、根の液体培養にはサイトカイ養して発根させることを４〜６週間間隔で繰返して継代ニンの添加も必要である（１１）。これに対し、カギカズラ培養を行った。培養条件は 25℃、16 時間日長の明条件（冷の根の液体培養では、IBA を加えるのみという単純な方法

陰極蛍光灯による赤色光、45 μmolm-2s-1PPFD）とした。

で根は増殖する。また、増殖率に関する他の報告では、オ2. 根の液体培養

タネニンジンの根では４週間で 4.7 倍（１１）、カギカズラ

発根した無菌植物体の長さ 5 cm 程度の根 3 本（約 40の固形培地でのカルス培養では50 日間で 8 倍である（７）。

mg）を液体培地に入れた。液体培地は、1/2 濃度の MS 無

また、カギカズラと同じ属のキャッツクロー（ U.

機塩に 1/2 濃度の B5 ビタミンを添加した基本培地に IBAtomentosa）の培養細胞の液体培養での増殖率は 5 倍程度と 15 g/l のショ糖を加えた培地である。IBA の根の増殖にである（２）。ムラサキの培養細胞では 20 倍程度である。

及ぼす影響を調べるために IBA の添加量を 0、0.02、0.2

これらと比較してもカギカズラの根の液体培地での増殖mg/l の３処理とした。 容量 100 ml の培養瓶に液体培地率は高いと考えられる。

25 ml を入れ、旋回培養器（120 rpm）で培養した。培養

２. 培養物のアルカロイド含有率

条件は、25℃、16 時間日長の弱光（冷陰極蛍光灯による図—５に無菌植物体の葉、茎、液体培養した根のリンコ

赤色光、1.7 μmolm-2s-1PPFD）とした。また、光環境のフィリンとイソリンコフィリンの含有率を示す。これらの影響を調べるために、IBA を 0.2 mg/l 加えた液体培地での含有利率は部位における差が顕著であり、葉と茎では 0.3培養を暗所でも行った。

〜0.9％と含有率が高く、根では弱光で培養した場合は３.アルカロイド含有率の測定0.007%、暗所で培養した場合は 0.009%と低い。これに対液体培養した培養根、無菌植物体の葉と茎を凍結破砕しし、ヒルスチンの含有率は、葉が 0.004%と最も低く、暗た。即ち、生重量 1〜2 g のサンプルを破砕容器に入れ、液所培養の根が 0.02%と最も高い（図—６）。オキシインドー

体窒素で凍結した。その後、破砕容器を破砕機（Retsch 社

ルアルカロイドであるリンコフィリンとイソリンコフィ製、Mixer Mill MN300）にセットし、30 rpm で 30 秒間リンの濃度とインドールアルカロイドであるヒルスチンサンプルを破砕した。破砕したサンプルを２分割し、一方の濃度を比較すると、葉と茎ではオキシインドールアルカを含有率分析用に、もう一方を含水率測定用とした。破砕

ロイドの濃度が高く、培養根ではインドールアルカロイドしたサンプルは分析に供するまで凍結保存した。の濃度が高い（図−５、６）。

分析に供するため、粉砕サンプルに 5 倍量の蒸留水を加野外自生個体の部位別のアルカロイドの含有率を調査

え、30 分間放置後、20 倍量の 2-メトキシエタノールを添した報告（１０）によると地上部（鉤、葉、枝）と地下部加して 10 分間の超音波処理を行った。その後、ドライバ（根の皮）ではアルカロイド含有率は異なる。最もアルカス中で加温（80℃、10 分間）してアルカロイドを抽出しロイド含有率が高いのは根の皮であり、地上部の２〜３倍－54－関東森林研究 67-1(2016)程度である。また、組成も異なり、地上部ではオキシイン(４) HUERTA-HEREDIA, A.A., MARÍN-LÓPEZ, R.,

ドールアルカロイドが全アルカロイドの 95%以上を占めPONCE-NOYOLA, T., CERDA-GARCÍA-ROJAS, C.M.,

る。一方、地下部ではインドールアルカロイドが全アルカ

TREJO-TAPIN, G., and RAMOS-VALDIVIA, A.C.

ロイドの 95.7%である。本研究においても無菌植物体の地(2009) Oxidative stress induces alkaloid production in

上部では、オキシインドールアルカロイドであるリンコフ

Uncaria tomentosa root and cell cultures inィリンとイソリンコフィリンの含有率が高く、インドール

bioreactors. Engineering in Life Sciences 9: 211-218

アルカロイドであるヒルスチンの含有率が低い。培養根で(５) ISHII, K., TAKATA, N., KONGAYA, K., andは、野外自生個体と同様にオキシインドールアルカロイド

TANIGUCHI, T. (2011) In vitro propagation of Uncariaの含有率が低い。しかし、インドールアルカロイドである

rhynchophylla – a medical woody plant. Proceedings of

ヒルスチンの含有率は野外自生個体と比べると弱光で液IUFRO Conference; Integration Vegetative Propagation,

体培養した根で 30 分の１、暗所で液体培養した根では 18

Biotechnologies and Genetic Improvement for Tree

分の１といずれも低い値であった。

Production and Sustanable Forest Management.
IUFRO Working Party 2.09.02, Brno, Czech Republic:

根の液体培養によるアルカロイドの生産のためには、アルカロイド含有 率を高 める処 理が必 要である。 U.

153-154

tomentosa では、過酸化水素添加による酸化ストレスが培(６) 川上善治（2013）抑肝散の抗精神作用におけるグルタ養細胞や培養根のアルカロイド含有率を増加させる（４）。

ミン酸神経系の関与に関する研究. 福岡大学薬学集報 13：

また、培地成分のうちアンモニウム塩、ショ糖、植物ホル121-130

モンが、培養細胞の二次代謝成分の含有率に関係するとさ(７) KOHDA, H., NAMERA, A., KOUAMA, A.,

れている（２、３、７、１２）。さらに紫外線も二次代謝

YAMASAKI, K. and TANI, T.(1996) Indole alkaloid

成分の蓄積を促進するという報告もみられる（１）。これproduction in callus cultures of Uncaria rhyncophylla

らのことより、培地成分、培養環境、ストレス処理により(MIQ) MIQUEL. Chemical and pharmaceutical

カギカズラの培養根のアルカロイド含有率を高めること

bulletin 44: 352-357ができる可能性がある。

(８) 日本漢方生薬製剤協会（2015）原料生薬使用量等調査報告書（３）—平成 23 年度および 24 年度の使用量—. 日
本漢方生薬製剤協会, 東京：41pp

Ⅳ まとめ
カギカズラの根の液体培養条件を検索し、５週間で 45(９) 尾崎幸紘（1989）本邦産植物カギカズラおよびチョウ倍という高い増殖率となる条件を開発した。しかし、液体

ジソウに含有されるインドールアルカロイドの薬理研究.

培養した根のアルカロイド含有率は低い。薬用成分を効率

日薬理誌 94: 17-25

的に生産するためには、培地成分の改変、培養環境の調整、(１０) 山中悦二・君塚ゆみ子・相見則郎・坂井進一郎・萩庭丈

ストレス処理などにより、培養根におけるアルカロイド含寿 (1983) Indole 系アルカロイド含有植物の検索 (第 9 報)日有率を高める必要がある。

本産カギカズラ (Uncaria rhynchophylla MIQ.) の各部位におけるアルカロイド分析. 薬学雜誌 103：1028-1033

引用文献(１１)吉川孝文（2002）植物組織培養による有用物質の生産.

(１) 海老澤聖宗・庄子和博・加藤美恵子・下村講一郎・

ファルマシア 38: 846-850

後藤文之・吉原利一（2008）UV-B, UV-A および青色光の夜(１２) YU, K.W., GAO, W.Y., SON, S.H. and PAEK, K.Y.

間補光がサニーレタスの成長と着色に及ぼす影響. 植物(2000) Improvement of ginsenoside production by jasmonic

環境光学 20：58-164

acid and some other elicitors in hairy root culture of ginseng(２) FERIA-ROMER, I., LAZO, E., PONCE-NOYOLA, T.,(Panax ginseng CA Meyer). In Vitro Cellular &CERDA-GARCÍA-ROJAS, C.M. and ROMAS-VALDIVIA,Developmental Biology-Plant 36: 424-428

A.C. (2005) Induced accumulation of oleanolic acid andursolic acid in cell suspension cultures of Uncaria

tomentosa. Biotechnology letters 27: 839-843(３) 藤田泰宏・菅忠三・松原浩一・原康弘 (1986)植物細胞培養によるシコニン系化合物の生産. 日本農芸化学会
誌 60：849-854－55－cab

図−１. 根の液体培養における IBA 濃度の影響
Fig. 1 Effect of IBA concentration on growth of rootsuspension cultures
Data show mean of fresh weight with SD (n=5) after
24 days of culture. Different letters indicate

図−４. 液体培養における根の増殖曲線

significant difference (Tukey test, p<0.05).

Fig. 4 Growth curve of root suspension cultures
Data show mean of fresh weight with SD (n=3).

(a)(b)(c)(d)図−５. 培養物のリンコフリンとイソリンコフィリンの含有率
図−２. 液体培地で培養した根Fig. 5 Contents of rhynchophylline and isorhynchophylline

Fig. 2 Root suspension cultures at liquid medium within tissue culturesdifferent IBA concentration

Data show mean of contents with SD of leaf, stem and roota, IBA 0 mg/l, b: IBA 0.02 mg/l, c and d: IBA 0.2 mg/l.

suspension cultures. Sample numbers were three, but
sample number of stem was one.

20.0251.5
10.5率(% dry wt)

ns

含有

生

重量(g)/培養瓶

0弱光

0.020.015
0.010.005

暗光条件0葉

図−３. 根の液体培養における光条件の影響

茎根（弱光） 根（暗）図−６. 培養物のヒルスチンの含有率

Fig. 3 Effect of light condition on growth of root

Fig. 6 Contents of hirsutine in tissue culturessuspension cultures

Data show mean of contents with SD of leaf, stem and root

Data show mean of fresh weight with SD (n=6)

suspension cultures. Sample numbers were three, but sample

after 28 days of culture. ns: not significant

number of stem was one.

difference (t-test, p>0.05).

－56－