Polymorphic Edge Detection 効率的なNGS配列からの多型検出法○宮尾安藝雄（農研機構）、清宮健愉（農研機構）、飯田恵子（農研機構）、土井考爾（つくば遺伝子研究所）、安江博（つくば遺伝子研究所）

Polymorphic Edgeとは→ 多型のキワを検出する

k-merによるキワの検出
k = 20
個体A AAATGGTACATTTATATTAT個体B AAATGGTACATTTATATTAC

双方向アラインメント法(Bidirectional alignment method)
Chr11 80443004|
TTTTTAATTGAAAAGGCATTAAGCTGGGTCTATGCAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAGATAGGTAGAAAAAAAAAACCACTATCAGCAACA Reference matching from 5'-end|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| | || ||||||||| ||TTTTTAATTGAAAAGGCATTAAGCTGGGTCTATGCAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAGATAGGTAGAAAAAAAAAACCACTATCAGCAACAGT Short read sequence|||||| | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||TTTAATTGAAAAGGCATTAAGCTGGGTCTATGCAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAGATAGGTAGAAAAAAAAAACCACTATCAGCAACAGT Reference matching from 3'-end|
Chr11 80442977

例
個体AではAAATGGTACATTTATATTATのみ検出され個体Bでは、AAATGGTACATTTATATTACのみ検出された場合、最後の塩基は多型(SNP、および、構造変異)のエッジである。

NameValue
個体A AAATGGTACATTTATATTA T
個体B AAATGGTACATTTATATTA C

ショートリードで2塩基のGTの欠失が検出されている

双方向アラインメント法での検出例# 1 115921403 snp A CAAGATTTAATACTATATTTGCTTAAAATATACATGTCTGTCTCCCTCTCTCTCTCTCTATATATATATATGTATATTACATAATCCACATGCTTATCACAC|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||AAGATTTAATACTATATTTGCTTAAAATATACATGTCTGTCTCCCTCTCTCTCTCTCTCTATATATATATGTATATTACATAATCCACATGCTTATCACACk-mer法a# 1 45545715 1 45545704 f insertion 2AGCCTCCTCTGTCGCCACAC TTAGCCCCTCTGGACTGTGA 5k = 20bc

Sorted 20-mer
Count
AAAAGATCTATGAGAAGTAG 1
AAAAGATCTATGAGACAGAC 1
AAAAGATCTATGAGACAGAT 50
AAAAGATCTATGAGACATTT 1
AAAAGATCTATGAGATGCAA 89
AAAAGATCTATGAGATGTTG 1
AAAAGATCTATGAGCAAAAC 49
AAAAGATCTATGAGCACTCA 46AAAAGATCTATGAGCCATCA 1AAAAGATCTATGAGTAATAT 119-mer
AAAAGATCTATGAGAAGTA
AAAAGATCTATGAGACAGA

Last BaseA C G T0 0 1 00 1 0 50

AAAAGATCTATGAGACATTAAAAGATCTATGAGATGCA
AAAAGATCTATGAGATGTTAAAAGATCTATGAGCAAAAAAAAGATCTATGAGCACTCAAAAGATCTATGAGCCATC
AAAAGATCTATGAGTAATA

0 0 089 0 00 0 10 49 046 0 0
1 0 00 0 0

GGTTCCTACTTCAGGGTCATAAAGCCTAAATAGCCCACAC…
GGTTCCTACTTCAGGGTCATGTTCCTACTTCAGGGTCATA
TTCCTACTTCAGGGTCATAATCCTACTTCAGGGTCATAAACCTACTTCAGGGTCATAAAGCTACTTCAGGGTCATAAAGC
TACTTCAGGGTCATAAAGCC
ACTTCAGGGTCATAAAGCCTCTTCAGGGTCATAAAGCCTATTCAGGGTCATAAAGCCTAA

Chr1 45545715|
GTTTCAGCCTCCTCTGTCGCCACACAAGGCCAACCCTGCACACACACATAGGTATGCATTCTGCCTGTTCTACATTAGCCCCTCTGGACTGTGAACCTTGA|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||| | ||| ||||GTTTCAGCCTCCTCTGTCGCCACACAAGGCCAACCCTGCACACACACACATAGGTATGCATTCTGCCTGTTCTACATTAGCCCCTCTGGACTGTGAACCTT| || || | | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CTGTTTCAGCCTCCTCTGTCGCCACACAAGGCCAACCCTGCACACACACATAGGTATGCATTCTGCCTGTTCTACATTAGCCCCTCTGGACTGTGAACCTT|
Chr1 45545704

1000001# 1 72300642 1 72346156 f deletion -45516
AAGGGTACAAGACAAAAATA TAATCTCTTGAACCACTTTC 5
Chr1 72300642|
ATGAAAAGGGTACAAGACAAAAATAAAAGTTAAAGAAAAACCAAATGCAATAGTAGAATTAAAATTCATATTCTAAATATTAAAACATAAAAACATACAAG||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||ATGAAAAGGGTACAAGACAAAAATAAAAGTTAAAGAAAAACCAAATGACTGAGAGATTATCTCAGTGGATTTGACTTAATCTCTTGAACCACTTTCTAAAA|||| ||| || | || |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||AGAGATTTTGTTGATTTAAATGAAGTCCCAGCTTGGTAGATTTTAAGACTGAGAGATTATCTCAGTGGATTTGACTTAATCTCTTGAACCACTTTCTAAAA|
Chr1 72346156

d# 1 197787659 1 197788857 r inversion
CAATGCCCCTAGAAACCCCT ATCACTCTAGAATCTAAATA 5

PEDの特徴Chr1 109304170|TTCTCACCATCTGACATATTAGATACTTTACTTGTTTATTTATTGTCTAGCTCCCTCCACTAGAATCTAACTTCCATGAGGGCAGTTATTTTTACCTATTT||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| || ||| |||| ||TTCTCACCATCTGACATATTAGATACTTTACTTGTTTATTTATTGTCTAGCTCCCTCCAGTACACCTAGAAACAGTTAAGATTCTCACCATTAAAAAAAAA||||||| || ||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||AAGAAGAATTCTAGAGATTGGTTGTGCAGCAATGTGAATGTACCTAACACTACTGAACTGTACACCTAGAAACAGTTAAGATTCTCACCATTAAAAAAAAA|
Chr7 24551505

K-mer法による同一人物の正常組織と癌組織でのSNPの検出
Last-base-count
Chromosome# 2 49334346 2 49334487 f deletion -144
Chr2 49334346|
CAATGAAAGATAAGAAAGATCTGGTTTGTTTTTGTTATTTCTTTATAGTTCAAATATGTCTGAGGCTCTTTTTTTCAGAATGACAAGTGCTCATGGTCTAA|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| | ||CAATGAAAGATAAGAAAGATCTGGTTTGTTTTTGTTATTTCTTTATAGGGTCATGCCAGCATTCTTGTACAGACTACATAGGGGACAAAACACACAACCTG||||||||| | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
AGTTGCTGTGCTGCATTTTGAGGGTAAAATAAAGTCAGGTGGGGGCAGGGTCATGCCAGCATTCTTGTACAGACTACATAGGGGACAAAACACACAACCTG|
Chr2 49334487

144bp deletion
P1F

P1R

272bp

(k -1)-mer (k =20)

Position

Reference SRR2096532 SRR2096535 Direction

SRR2096532(blood)

Chr2 52522549|
GCAAAGCTCATCATTTGAAAGAAAAACATCAGCCTTCTCCAATTAGGTACATTTGCTGAAATAAAGGGTGGTACTTATCCTCCATGTAACATGATGTTGCT||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||
|||||
| | |
||||||GCAAAGCTCATCATTTGAAAGAAAAACATCAGCCTTCTCCAATTAGGTAATTTATAATTTATAAATAAAAGGAGTGTATTTGGCTTAGGGTTCTGCAAGCT| | | ||||
| | || |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||AAGGTCACTGTGTTAGGCCATTTGCATTGCTATAAAGAAGTACCTGAGACTTGGTAATTTATAAATAAAAGGAGTGTATTTGGCTTAGGGTTCTGCAAGCT|Chr2 52558132

52522549
母息子

P2F

Verify by counting supported reads
SRR2096532

SRR2096535

A

C

G

TA

C

G

T

RefAltRef

117349814

CCTGCCTCTCCAGCACCAT

A

A

ACr

011300

SRR2096535(cancer)
1131711064H

129218111

GTAAGTCCCTCTGCTCATG

G

G

AGf002901001803502310H

129218111

TGGGTCTTGGACACCATGG

GG

AGr

028000200113502310H

155801587

ATCAGTACAATTTCTCCAC

GGCGr

020000161002201710H

157340521

CTGTATTGATTTGTGCAGC

CC

CT

f02700021010310199H

159092356

GTTATCATGACATCTGAGTTTGT

f100320010212901910H

159243427

TCTTCTGTAAGACCAAAATCC

ACr

003100018123602517H

159243427

TTCTATACTATCTCTGAAA

CC

AC

f

031001424013602517H

169085463

TTTAACCAACAGTGGAAAAAA

AG

r

000500120452501911H

169350262

TAGAGGAAAATAGCAAAGG

AA

AGr000250160262902914H

171920419

CTATGGCTATCACTTCATGCCCTf027000210153101917H

171920419

CTTGTAATTAAACCTCAAGCCCTr002801202103101917

Genotype

HAlt

数字は検出されたリード数を示している。

35579bp deletion
P3R# 2 52522549 2 52558132 f deletion -35579

父Last Base
T Cont. Targ. Genotype
50 T
T
Wild-type
0A
A
Wild-type
0C
C
Wild-type
0A
AG Heterozygous
0A
GHomozygous

・次世代シーケンサーの配列データから塩基置換や挿入・欠失変異等の構造変異を効率よく検出します。
・リファレンス配列がない生物の2つのショートリード配列を直接比較してSNPが検出できます(k-mer法)。
・同一個体の組織間の多型が高精度に検出できます。
・数100kbを超える大きな欠失も正確に検出します(bidirectional法)。
・大きなゲノム(コムギ、ヒトの5倍)も解析できます。
・従来法(bwa+GATK)に比べて、2～3倍高速です(bidirectional法)。
・ Linuxが走る普通のコンピュータで解析可能です。
・ Fastq配列データに対して単一のスクリプトを実行するだけで、SNPおよび構造変異の検出結果が得られます。

# 1 109304170 7 24551505 f translocation
ACCATCTGACATATTAGATA TAAGATTCTCACCATTAAAA 5

Chr2 49334346
父母息子

Target
AC
G000107 10054 040 0380050

T500000このようにK-mer法では、マッピングの前に多型を検出できるので、リファレンスゲノムが存在しない生物での多型検出ができる

Chr1 197787659|
TGCTACAATGCCCCTAGAAACCCCTCACAGCAAAGGCCCTCAAATTGGAGACTGGTTAGGAGCCTAGGACTGTGGATAGTGGCCTCATGCCTGAAGCCATG||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||| ||| |||TGCTACAATGCCCCTAGAAACCCCTCACAGCAAAGGCCCTCAAATGAGTTTACATCTATTGTGTCCCCAAACTTTAATCACTCTAGAATCTAAATATATAG||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||TTGGGGCTGGCCTGCTGCTGGGGCAGGTGTTGAGCCTGGGTTTGTGAGTTTACATCTATTGTGTCCCCAAACTTTAATCACTCTAGAATCTAAATATATAG|
Chr1 197788857

マーカー

ControlC
G
100049 0000019-mer
A
AAAAGATCTATGAGACAGA 0
AAAAGATCTATGAGATGCA 89
AAAAGATCTATGAGCAAAA 0
AAAAGATCTATGAGCACTC 46
AATTCATTTTGTGTGGAGG 61

P2R

P3F

Bidirectional法によるCRISPR/Cas9処理したマウスでの欠失の検出Accession

249bp
495bp

Chr2 49334346

bp

500
Chr2 52522549

Junction by 5' to 3' alignment

Junction by 3' to 5' alignment

Chromosome

Chromosome

Position

PositionType

GRCm38Size

TargetGenotype Sequence between junction

Ref

Alt

Ref

Alt

ERS374107

1645,512,593

16

45,518,970

deletion-6,392

10

1

5

3

H

ERS374108

1647,502,608

16

47,502,713

deletion

-106

16

1

6

3

H

ERS374109

175,470,888

175,471,035

deletion

-152

35

0

1010H

CAGA

ERS374108

1849,793,476

1849,793,609

deletion-165

1403HAGGGAGAGAGGTAAGGAAGGAGGGAGGGAGG

ERS374105

1911,966,045

1911,966,089

deletion-5611055H

GGCGGCGGCGG

ERS374108

1950,486,921

1950,529,041

deletion-42,1234301216

H

GT

ERS374109

1950,486,921

1950,529,041

deletion-42,123

4309

14

H

GT

ERS374108

X

89,414,716

X

89,414,796

deletion-10815053HTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTERS374104

X

98,150,098

X

98,150,168

deletion-58350117H

TGGGGCGGCCACCERS374105

X

98,150,099

X

98,150,174

deletion

-78

35086

H

CC

ERS374109

X

98,150,103

X

98,150,171

deletion-56

350138H

CTGCCTCCCCGAG

ERS374107

X

98,150,120

X

98,150,177

deletion

-60

34012

9

HGA

ERS374108

X

98,150,120

X

98,150,177

deletion-60

340108HGA

ERS374107

X

123,000,254

X

123,662,411

deletion-662,172

8

154

H

TTTTTTTTTTTTTTERS374106

X

127,841,379

X

127,841,489

deletion

-95

5

153

H

AACTTTTGGAAGTTAT6TCAAAACACTTCTT

黄色の部分がターゲットのアンドロジェンレセプター遺伝子領域
100

ジャポニカイネとインディカイネの交配後代の早生、晩稲個体バルクの遺伝子型分布図

農林8号/コシヒカリのグラフィカルジェノタイプの比較
bwa+GATK

農林8号

農林８号はコシヒカリの祖父

コシヒカリ

bidirectional method

日本晴(ジャポニカ)とカサラス(インディカ)の交配後代より、早生になった個体と晩稲になった個体をバルクにして解析したNGS配列が公開されている。早生をコントロール、晩稲をターゲットにしてBidirectional法で解析し、変異型を示した座位数の差分(晩稲－早生)をプロットした。第6染色体の上腕部分が早生、その後に晩稲に強く関与する領域が存在することがわかる。
perl bidirectional.pl late early IRGSP1.0とスクリプトを実行すれば、プロットのもとになる結果が出力される。

コシヒカリの農林8号由来のSNP(青)は全SNPに対してGATKでは14%であったが、PEDでは25%で理論値と一致した。

ベンチマーク秒

一般に用いられているbwa+GATKに比べてbidirectional法は2～2.5倍程度高速に処理できる。Kmer法は非常に大量
これだけ高速 のk-merの比較処理が必要なので、GATKよりは時間がかかる。

プログラムはこちら
論文はこちら
Polymorphic edge detection (PED): two efficient methods ofpolymorphism detection from next-generation sequencing data
BMC Bioinformatics. 2019 20(1):362.
https://rdcu.be/bH7e8

Licensed under a Creative Commons表示4.0国際ライセンス(c)2019 宮尾安藝雄（農研機構）

https://github.com/akiomiyao/ped

日本語のプロトコール
https://tos.nias.affrc.go.jp/~miyao/ngs