DNTコーティング技報 No.21
解説-2
イムノクロマト方式検査キット用の抗体標識物（高耐性銀ナノプレート）

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イムノクロマト方式検査キット用の抗体標識物（高耐性銀ナノプレート）
Antibody Label for an Immunochromatographic Test Kit.
（High Resistance Silver Nanoplates）
スペシャリティ事業部門
スペシャリティ事業部 機能材開発グループ
Speciality Business Div.
Speciality Business Dept.
Functional Materials Development Group宗芳和

Yoshikazu SO

１. はじめに感染症は身近に潜む脅威であり、近年では2002年に重症急性呼吸器症候群（SARS）1）、2012年に中東呼吸器症候群（MARS）2）、2014年にはエボラ出血熱3）が流行し、人々の生活に少なからず影響を与えた。
また 、2 0 1 9 年 に 出 現 した 新 型 コロナウイルス（SARS-CoV-2）の蔓延は日本経済に大きな打撃を与え、2020年度の実質GDPは2019年度比で4.8%（約27兆円）の減少となった4）。感染症を引き起こすウイル
スや細菌は、遺伝子変異により感染力や毒性といった性質が変わるため根絶は困難であり、今後も共生せざるを得ない存在である5）。
感染を予防または軽症化する有効な手段としてワクチン接種があるものの、感染症に罹患する人は少なくない。現にインフルエンザのワクチン接種が広く行われているにもかかわらず、2017年/2018年シーズンの全罹患者推計値は1,458万人であった 。
6）

こうした状況の中、感染症の早期発見や治療薬の開発は感染による被害を低減する重要な対策の一つである。早期発見は、感染拡大の防止や重症化リスクの軽減が可能であるため、インフルエンザの場合、迅速・簡便に診 断 が 可 能なイムノクロマト方 式 検 査キット
（Immunochromatographic Test Kit：ICキット）
が広光延

愛美

Manami MITSUNOBU

宮澤雄太

Yuta MIYAZAWA

く利用されている。ICキットは、患者から採取した検体7）を緩衝液で希釈し滴下するだけで10～30分後には診断結果が得られるため重宝されている。陽性と陰性は「検出ライン」と呼ばれる赤色や青色のラインの出現有無で判断される。検出ラインには貴金属ナノ粒子、着色したラテックスナノ粒子およびセルロースナノファイバー粒子などが「抗体標識物」として使用されており、診断薬メーカー各社で様々な検討が進められている。
抗体標識物の一つである貴金属ナノ粒子は、自由電子に由来する局在表面プラズモン共鳴（LSPR：Localized Surface Plasmon Resonance）により光吸収特性を有し8）、ICキットに広く使用されている。特に化学的安定性の高い金を材質とする赤色の球状金ナノ粒子が広く使用されているが、色のバリエーションに乏しいた
め、ICキットの検出ラインの色調が限定的となっている。近年、貴金属ナノ粒子を使用したICキットの検出ラインを多色化する方法として、銀を材質とするプレート状の粒子（銀ナノプレート）の適用が報告されている9）。
LSPRは金属の材質やサイズ、形状、周囲の誘電率によって光 吸 収 特 性が変 化する8 ）1 0 ）。銀は可 視 領 域でLSPRが確認され、かつ波長の調整が可能なため銀ナノプレートはマルチカラーの表現が可能である9）。一方
で、銀は酸化耐性が低いため、ICキットに使用する緩衝液との接触やICキット製造時の乾燥工程において銀ナノプレートの色調が変化、消失する課題があった。

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解説-2
イムノクロマト方式検査キット用の抗体標識物（高耐性銀ナノプレート）

本報では、ICキットとイムノクロマト試験法、抗体標識物に関する概要を解説する。
また、色彩豊かな金属ナ④ 吸水紙⑤ ①～④の土台（バッキングシート）

ノ粒子である銀ナノプレートの酸化や凝集耐性を改良①のサンプルパッドはセルロース製、ガラス繊維製、レし、ICキットの抗体標識物用に適用した高耐性銀ナノプーヨン製などが使用されており、滴下された検体溶液レートについても解説する。

を保持するために使用される11）。
②のコンジュゲートパッドはガラス繊維製やポリエステル製、レーヨン製のものが使用されており、抗体と抗体標識物の複合体を乾燥した状態で保持している11）。

2. イムノクロマト方式検査キット
2.1③のメンブレンはニトロセルロース製のものが使用されており、液体が展開する速度（Flow Rate）で規格化されている。例えば、90秒/4㎝、120秒/4㎝、180秒/4㎝

概要

ICキットは、イムノクロマト試験法によって細菌やウイルス、またはホルモンなどの抗原（被検物質）の有無を判定する際に使用する。ICキットにはイムノクロマト試験紙の他に、綿棒などの検体を採取する器具、検体を希釈する緩衝液など試験に必要な一式が含まれている。
前述のように、イムノクロマト試験法は患者から採取した検体溶液を滴下するだけで検査結果が数分で得られる迅速・簡便な手法である。本法は1950年代に基本的な概念が発明された後、1980年代までに部材や抗体に関する様々な周辺技術が洗練され11）、1988年にUnipath社が妊娠検査薬として初めて上市した。

12）といったものがあり、試験項目に合わせて選択される。
テストライン（検出ライン）には、検体中の抗原と結合する抗体がライン状に塗布、固定化されている。
コントロールラインには、抗体と結合する二次抗体がライン状に塗布、固定化されており、検査の成否を確認できる。
ナ
イロン製やポリフッ化ビニリデン（PVDF）製のメンブレ
ンもあるものの使用範囲は限定的である11）。
④の吸水紙はセルロース製のものが使用されており、メンブレンを展開した液体を捕集する役割がある11）。
⑤のバッキングシートは粘着剤のついたポリスチレンなどのプラスチックシートであり、①～④を組み立てる際の土台となる11）。

現在ICキット市場では、病院用としてはインフルエン

正面

ザウイルスやアデノウイルス、A群β溶連菌、RSウイル④吸水紙

スの診断用に、市販用としては妊娠判定用に販売されも診断にICキットが使用されており、今後感染症分類が変更され、すべての病院で診断が可能となった

展開方向ている13）。2019年に出現したSARS-CoV-2について

断面図③メンブレン
C：コントロールライン
T：テストライン（検出ライン）14）②コンジュゲートパッド

場合には広く利用されることが予想される15）。

①サンプルパッド

展開方向
④③ CT

②

①⑤2.2 構造
イムノクロマト試験法では幅3～5㎜、長さ60～70㎜ほどの試験紙を使用する。試験紙は以下の五点から構成される。
（図1）① サンプルパッド② コンジュゲートパッド③ メンブレン

図1 イムノクロマト試験紙の概要
2.3 イムノクロマト試験の仕組み
イムノクロマト試験では初めに被験者から検体を採取する。例えば、インフルエンザ検査の場合、長細く柔軟な綿棒で咽頭部をぬぐい、緩衝液で希釈して検体溶液とする。
この検体溶液をサンプルパッドに滴下（図2、

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イムノクロマト方式検査キット用の抗体標識物（高耐性銀ナノプレート）①）
すると毛管現象により展開が始まり、サンプルパッドな方法が挙げられる。貴金属ナノ粒子の場合、抗体と混→コンジュゲートパッド→メンブレン→吸水紙の順に検ぜ合わせるだけで貴金属ナノ粒子の表面に抗体が物体溶液が流れる（図2、②）。
コンジュゲートパッド部で理吸着して複合化されるため、操作が簡便であり主流は「検体用抗体Aと標識物の複合体」が検体と反応しとなっている。

35ながら展開し、メンブレン上に固定化された検体用抗体B部でサンドイッチ構造が形成されると検出ラインが3.

生じる（図2、③）。多くの場合、コンジュゲートパッドに含まれる「検体用抗体Aと標識物の複合体」と結合するコントロールライン用抗体が検出ラインの下流側に固定化されており、試験の成否を確認することが可能となっている。

抗体標識物

イムノクロマト試験では検査結果を示す「検出ライン」の抗体標識物として貴金属ナノ粒子、着色したラテックス粒子およびセルロースナノファイバー粒子が使用されている。本報では当社で開発を進めている貴金属検体溶液ナノ粒子について紹介する。
抗原3.1

球状金ナノ粒子（AuSP）

金ナノ粒子は古来よりステンドグラスやリュクルゴスの聖杯16）、江戸切子などのガラスの着色に使用されている安定性の高い粒子である。合成方法としては①テト
ラクロロ金（III）酸とクエン酸ナトリウムを溶解した水溶①検体滴下検体用抗体A液を加熱する方法17）や②テトラクロロ金（III）酸とポリ標識物（β-シクロデキストリン）をエタノールと水の混合液に溶

検体用抗体B
コントロールライン用抗体

解し紫外線を照射する方法18）など多数の報告がある。
着色力や流動性の観点から粒子径が40～50nmの粒子が使われている（図3）。抗体と混合すると物理吸着によって複合体が形成される。複合化されなかった余剰②展開の抗体は、遠心分離により粒子を沈殿させた後、上澄みとともに除去することが可能である。
③検出

図2 イムノクロマト試験の仕組み
200nm

抗体と標識物は種々の化学結合によって複合化する。例えば、疎水性相互作用による吸着、カルボキシル

分散液

顕微鏡写真

基とアミノ基によるアミド結合、アビジンとビオチンを使用した結合、プロテインAやGを使用した結合など、様々

図3.

球状金ナノ粒子

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3.2 当社開発品

酸化の影響を受けない（乾燥工程を含まない）
ハーフス

当社では2013年よりICキット用の貴金属ナノ粒子を開発しており、これまでに「金ナノプレート」、「パラジウム被覆金ナノロッド」、「銀ナノプレート」を開発した。表1に開発品の特長を示す。銀ナノプレートは粒子表面に金を被覆処理しているが金層が薄膜（1.0nm未満）であトリップ方式イムノクロマト試験に使用が限定される。
当社では2020年に銀ナノプレートの酸化耐性を向上すべく表面処理技術を検討し、一般の製品形態であるフルストリップ方式イムノクロマト試験に使用可能な「高耐性銀ナノプレート」を開発した。

り、酸化耐性が十分に得られず変色や退色するため、
表1 当社開発品の特長
調

材質

被覆材

形状

粒子径
（nm）金ナノプレート

青色

金ー

板状

パラジウム被覆金ナノロッド

黒色

金

パラジウム

多色（Yellow、Magenta、Cyanなど）
多色（黄色、赤色、青色）

名称

色

銀ナノプレート
高耐性銀ナノプレート

分散液

抗体標識法 参考文献番号

図45

物理吸着

194

棒状

長軸：60
短軸：20

物理吸着

20、21

5

銀金板状
（薄く被覆）

20～60

物理吸着

22、23、246

銀金板状（厚く被覆）

20～60

物理吸着

26

9

顕微鏡写真

分散液

図4. 金ナノプレート

分散液（Yellow）

顕微鏡写真

顕微鏡写真

図5. パラジウム被覆金ナノロッド

分散液（Magenta）

顕微鏡写真

図6. 銀ナノプレート

分散液（Cyan）

顕微鏡写真

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イムノクロマト方式検査キット用の抗体標識物（高耐性銀ナノプレート）

4.
4.1

高耐性銀ナノプレート

4.1.2

金被覆の手法

銀ナノプレートに金を被覆する際、金イオンを添加すると銀ナノプレートの中心部に空隙が生じる。
この現象

合成

高耐性銀ナノプレートは、当社の従来品（銀ナノプレート）より厚く金を被覆することで酸化耐性を有する。
4.1.1

オンを穏やかに還元することで積層欠陥を有する平面状の種粒子が合成されるは、銀イオンよりも金イオンの還元電位が高いため、金イオンによって銀ナノプレートが酸化を受けることにより生じる。
（ 図7）。
このように還元電位の差によって金属原子間に生じる酸化還元反応を「ガルバニック置換反銀ナノプレートの合成

銀ナノプレートは種粒子を成長させて合成する。銀イ。
さらに銀イオンを供

22、23、24）

給しつつ還元を継続すると、熱力学的に有利ではない三角形や六角形または角の取れたプレート状の銀ナノプレートが合成される。供給する銀イオンの量を一定に保ち、種粒子量を変化させるとプレート状粒子の最大長と厚さの比（アスペクト比）の異なる銀ナノプレートが合成される。銀ナノプレートはアスペクト比を大きくすると長波長側の光を吸収するため色調の異なる銀ナノプレートの合成が可能である。
◯金イオンと銀イオンの還元電位

これを防ぐため銀ナノプレートに金を厚く応」という25）。
被覆する際は金イオンを錯化し還元電位を低下させる方法が報告されている（図8）26）。
また、金被覆反応時の銀ナノプレートの粒子濃度と金濃度の比率を調整することで凝集のない単分散の分散液を得ることが可能である。
金を厚く被 覆した「 高 耐 性 銀ナノプレート」の分散 液と高 角 散 乱 環 状 暗 視 野 走 査 透 過 顕 微 鏡 法（HAADF-STEM法）で観察した電子顕微鏡像を図9に示す。
いずれも、銀ナノプレートの端面全体が金層で完全に被覆されており、（a）粒子径と（b）端面における◯錯体化金イオンと銀イオンの還元電位

e‒

e‒

Au3+

Au+3+還元電位

還元電位

錯体化 AuAg+Ag+錯体化 Au+◯金イオンによる銀ナノプレートの酸化（ガルバニック置換反応）
Au3+

37

金イオン◯還元力を低減した金イオンによる銀ナノプレート被覆
空隙

Au+Au+Au3+30nm

銀ナノプレート

ナノプレート40nm
40μm

図7 ガルバニック置換反応により空隙が生じた銀ナノプレート

図8

金イオンを錯化し還元電位を低下させる
方法による銀ナノプレートの厚金被覆化

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イムノクロマト方式検査キット用の抗体標識物（高耐性銀ナノプレート）

金層の平均厚みは、黄色調の銀ナノプレートで（a）結晶粒子を酸化する効果27）や銀ナノプレートの角のエ17.1nm、（ b）1.9nm、赤色調で（a）27.3nm、（ b）ッチング（酸化）28）が報告されている。
また、塩化ナトリウ

3.6nm、青色調で（a）43.8nm、（b）5.5nmであった。

ムは、銀ナノプレートを凝集させる効果29）がある。5wt%

合成した①高耐性銀ナノプレート、②従来品およびの塩化ナトリウム水溶液中で、②従来品と③未処理の③未処理の銀ナノプレートの塩化ナトリウムに対する耐銀ナノプレートは変色および退色したのに対し、①高耐性試験結果を表2に示す。水中の溶存酸素と塩化物イの組み合わせは酸化剤として機能し、多オン（O2/Cl-）性銀ナノプレートは酸化および凝集せず色調が変化しなかった。

10nm

分散液
（黄色）

15nm

HAADF像分散液（赤色）

黄色：（a）
17.1nm、（b）
1.9nm

図9
表215nmHAADF像

分散液
（青色）

赤色：
（a）
27.3nm、（b）
3.6nm

HAADF像青色：（a）43.8nm、（b）
5.5nm

高耐性銀ナノプレート[粒子径（a）、金膜厚（b）]

塩化ナトリウム耐性試験（5wt% 塩化ナトリウム水溶液添加）

高耐性銀ナノプレート

従来品

銀ナノプレート

厚い

薄いなし

金被覆膜厚
添加前

添加後

添加前

添加後

添加前

添加後

写真

添加前

添加前

添加前

添加後

分光特性
添加後

添加後

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4.2 イムノクロマト試験

5. おわりに高耐性銀ナノプレートを、妊娠検査薬で使用されている抗ヒト絨毛性ゴナドトロピン抗体に標識し、フルストリップ方式イムノクロマト試験で100mIUのヒト絨毛性ゴナドトロピン（抗原）を検出した結果を図10に示す。高耐性銀ナノプレートの乾燥過程で酸化が抑制されており、分散液と同じ色調の検出ラインの出現（マルチカラー検出）が可能であった。

ICキットと抗体標識物に関する概要を解説した。
当社では金ナノプレートやパラジウム被覆金ナノロッドなど、抗体標識物として利用可能な貴金属ナノ粒子を開発している。本報では2020年に当社で開発した高耐性銀ナノプレートについて解説した。
高耐性銀ナノプレートは、銀ナノプレートに厚く金を黄色

赤色

青色（a） （b）（a） （b）（a） （b）

被覆することによって酸化耐性と凝集耐性が向上し、
フ
ルストリップ方式イムノクロマト試験に使用可能である。
イムノクロマト試験の検出ラインの多色化は、例えばSARS-CoV-2や今後発生する未知のウイルスとインフルエンザウイルスなどを同時に検出する際、検査結果の判定を容易とし、日常的に繁忙な医療現場において一助になることが期待される。
コロナウイルスの出現により検査の重要性が拡大している中、上記材料を通じて社

図10

高耐性銀ナノプレートを使用した
フルストリップ方式イムノクロマト試験[抗原量：（a）0mIU、（b）100mIU]

会貢献を目指す。

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イムノクロマト方式検査キット用の抗体標識物（高耐性銀ナノプレート）

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