関東森林研究論 文72-1(2021)

容器内でアカマツと共生したマツタケのバイオマス経時変化と自然界のシロ土壌との比較
山口宗義・小林久泰
1)

森林総合研究所, 2)茨城県林業技術センター

要旨：定量 PCR 法(以下 qPCR 法)を用いて開発した土壌中の菌糸体量を特異的に定量可能な技術を用いて，接種後３か月～36 か月の菌根苗土壌断面中のマツタケ菌バイオマスを測定し，菌が成長する過程を定量的に解析した。また，野外のマツタケシロにおける菌糸体量も同じ手法で測定し比較した。その結果マツタケは，３ヶ月では容器中心部では検出されず接種源近くの外側で検出され，６～24 ヶ月では全体的に検出された。30～36 ヶ月では，菌密度が低い箇所が多くなり，検出されない箇所が増えた。培養期間 36 ヶ月に至るほぼ全ての期間で局所的に野外シロに近い菌密度に達していた。このことから，天然のマツタケシロの地下でおこっている共生現象が，容器内で局所的に再現されたのではないかと考えられる。
キーワード：マツタケ，定量 PCR 法，アカマツ，共生，菌糸体定量

Temporal change of the Tricholoma matsutake biomass in soil associated with Pinus densiflora in culture
bottles and its comparison with the biomass of natural mycelial blocks called “shiro” in the forest.
Muneyoshi Yamaguchi1), Hisayasu Kobayashi2)
1) Forestry and Forest Products Research Institute, Tsukuba, Ibaraki 305-8687, JAPAN2) Ibaraki Prefectural Forestry Research Institute, Naka, Ibaraki 311-0122, JAPAN

Abstract: Using a qPCR assay that specifically quantifies biomass, we measured the Tricholoma matsutake biomass in soil
associated with pine seedlings in the culture bottles 3 to 36 months after inoculation. At the same time, we compared them with thatat the natural soil including densely developed T.matsutake mycelia, called “shiro” in the forest. As results, it was detected in themarginal region of the soil in the bottle 3 month after inoculation. They were detected extensively in the soil 6 to 24 months afterinoculation. Soil regions with low density or nondetection increased. High density regions compared with those of the natural soil
were observed partially in the bottles 3 to 36 months after inoculation. They suggested that symbiotic phenomena in the natural soil
could reproduce partially in the culture bottles.
Keywords: Tricholoma matsutake, qPCR method, Pinus densiflora, symbiosis, quantification of mycelium

Ⅰ はじめにく過程は，定量的には明らかになっておらず，できたシマツタケは古くから日本で食されてきたきのこで，季ロのような塊が形態学的に評価されるのみである(１,節を味わう食材として珍重されてきた。近年は収穫量が６)。そこで，本稿はアカマツと共生したマツタケ菌の菌著しく低下し，2020 年現在絶滅危惧種に指定されるまで根苗作出土壌中での拡大蔓延過程を明らかにするため，になった。マツタケは主にアカマツと共生関係を築きな土壌中のマツタケ菌糸量を qPCR による定量法で経時的がら土壌中にシロと呼ばれる塊状の構造を形成して存在に測定するとともに，できたシロのような塊が野外のシし，条件が揃うことによってそこから子実体を発生させロと質的に同等であるか，菌糸密度の観点から比較検討る(４)。このように大半の生活を土壌中で過ごす菌であした結果を報告する。

るため，その生態にはまだまだ未解明な点が多い。我々
は土壌中の生態を明らかにするために，マツタケを特異Ⅱ 材料および方法的に定量可能な qPCR 法を開発した(７)。また，マツタケ

１．材料 マツタケ菌株は，Trichoroma matsutake AT 638

をアカマツの根に共生させ，野外のシロのような構造を株 (茨城県林業技術センター保存株)，アカマツはマツ作らせた苗（以下，菌根苗という）を無菌的に作出する

ノザイセンチュウ抵抗性品種の種子 (茨城県林業技術セことに成功した(１,６)。しかし，この菌根苗を育苗してンター構内採取)を供試した。土壌は，茨城県常陸太田市いる土壌中において，マツタケ菌が拡大して蔓延していと常陸大宮市のマツタケ発生地近傍アカマツ林の B 層土－145 －（受理日 2021 年 2 月 8 日）

壌を５-６ mm メッシュの篩で篩った後，乾燥して保存しを含有した２ %CTAB 液 650 µl を加え，65 ℃ １時間撹たものを１:１ (V/V) で混合後，含水率を 10 % (W/W)に拌しながら混和後，750 µl のクロロホルム/イソアミル調整したものを使用した。容器はナルゲン社製１L 広口

アルコール（24:１）で２回抽出し，上清を採取した。イ

円筒容器を既報(１)にしたがった方法で加工したものをソプロパノールで DNA を沈殿，乾燥後，滅菌水 100 µl に用いた。

溶解し，抽出試料とした。抽出試料をライトサイクラー

２．マツタケ菌糸体およびアカマツ実生の調整と育苗2.0（ロシュ社製）を用いて qPCR を行い，菌糸体量を算

予め modified Norkrans's “C”(MNC) 寒天平板培地を出した。qPCR の条件および算出方法は Yamaguchi ら(７)用いて，20 ℃で培養したマツタケ菌糸体を切り出し，の方法にしたがった。

MNC 液体培地 20 ml を入れた 100 ml 容のポリメチルペン

４．野外マツタケシロ土壌の採取，抽出および定量テン製広口ボトル(アズワン社製)に移植し，20 ℃で２-野外におけるマツタケシロ土壌は，岩手県岩手町のマ３ヶ月間培養した(１)。その後，１L 広口円筒培養容器

ツタケ発生地の子実体直下土壌を採取した。土壌サンプ中の滅菌土壌へ，容器あたりボトル１-２本分の培養菌糸ラーとして直方体状(５ cm×５ cm×14 cm) ステンレス体を接種した。培養菌糸体は１ cm 角程度に切り分け，サンプラーを用い（図－５），２ cm 深さ毎の土壌を切り広口容器中の中央部に深さ２ cm 程度の所に１箇所，周分け，深さ毎の土壌を３分割し土壌サンプルとした。DNA辺部に均等に深さ６ cm 程度の所に４箇所，計５箇所接抽出は Yamaguchi ら(７)の方法にしたがい，上記と同様種した。
その後，
20 ℃暗黒条件下で３ヶ月静置培養した。に土壌中のマツタケ菌糸体量を算出した。

アカマツ種子を既報(１)に従い表面殺菌後，MNC 培地

Ⅲ 結果および考察上で発芽させて無菌状態が確認された実生のみを用いた。

１．qPCR 法によるマツタケ菌糸体定量結果

実生 1 本を上記で３ヶ月培養した土壌表面中央部に無菌

36 ヶ月間育苗したもののうち，６, 12, 24, 36 ヶ月

的に移植し，蓋をしてから，地下部容器表面をアルミフ間経過した菌根苗の写真を示す（図－２）。12 ヶ月でアォイルで遮光した。苗を 20 ℃，20,000 Lx で 24 時間連

カマツの根はポット内の隅々まで伸び，36 ヶ月にわたっ続照射している人工気象室で育苗し，滅菌水を用いて２て分岐しながら拡がっていた。一方マツタケ菌糸も白色ヶ月に一度の間隔で潅水した。育苗期間は 36 ヶ月間で，この間３ヶ月，６ヶ月 12 ヶ月，24 ヶ月，30 ヶ月，36 ヶ月間経過した苗を 1 本ずつ以下に示す qPCR 法による定量分析に供試した。
３．
DNA の抽出および定量 DNA の抽出は Yamaguchi ら(７)の方法にしたがった。各培養期間後，育苗した苗を容器のまま凍結し，円筒状の苗の土壌部を直径に対して平行に直径線に沿った断面を得た。また、本断面は接種源を含むように設定した。断面に対し，中心軸から垂直・水平方向に１ cm3 の土壌を採取し（図－1），各々個別に状に局所的にシロのような塊を形成していた。地上部のアカマツも順次成長し，葉の形成も培養期間に沿って増加していることが観察された。
次に，各期間後の容器内土壌中のマツタケ菌糸体量分布を示す（図－３）。容器内の土壌中の菌糸は，培養期間によって異なる分布様式を示しながらも，36 ヶ月間マツタケの DNA が検出された。３ヶ月では容器中心部では検出されず外側の接種源に近い場所で検出され，６～24 ヶ月では全体的に検出されていることが検出箇所分布状況から確認された。30～36 ヶ月の培養後期では，断面全体で検出されている傾向は変わらないが，菌密度が低い箇所が多くなり，検出されない箇所が増えることが確認さ凍結乾燥した。乾燥した土壌試料に 0.6 %スキムミルク－れた。アカマツ根の拡がり状況と比較すると，アカマツ

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実生の根が拡がっていない培養３ヶ月時は，マツタケ菌を介してマツタケ菌によって利用されていると考えられ

糸は接種された外縁部地点の土壌周辺でマツタケ菌のみる。
今回の人工気象室条件で 36 ヶ月間マツタケの DNA がで成長していたために，このような菌糸体の分布になっ検出され、アカマツも生育し続けたことが確認されたが，たと推定できる(３)。一方，根が拡がり始めた６ヶ月お容器内のマツタケ菌糸体総量が期間を通じて一定で推移

よび容器底部まで拡がった 12 ヶ月以降は，アカマツ根したのは，人工光源を用いた小さな苗木の光合成能力でに沿ってマツタケ菌糸は全体的な蔓延をしたと推定されは限界があり，それによって供給される光合成産物が均る。次に，未検出箇所の分布に着目すると，24 ヶ月以降等に地下部に分配されず，そのため菌の成長は局所的にマツタケ検出できていない箇所が増えている。一旦は蔓なっていたのではないかと想像される。元々，アカマツ延した菌糸体が衰退したようにも見えるが，生残していは太陽光を強く好む植物であり，野外のアカマツが生育る領域の菌糸体密度は作出初期と同等のものも散見されしている地点は尾根線や他の植物に影響されにくいとこた。時間が経つ毎にマツタケ菌糸はアカマツ根と局所的ろである。一般的に，野外の快晴で 100,000 Lx，曇天で共生関係を結ぶようになっていったと推定される。

30,000 Lx であり（５），20,000 Lx という人工照明とし次に，容器内におけるマツタケ菌糸体密度の推移を示す（図－４）。ばらつきは大きいものの，ポット内のマツては非常に強力な光でもアカマツにとっては足りない可能性がある。

タケ菌糸は，期間後期ではマツタケ菌が検出できない土

２．野外マツタケシロ土壌のマツタケ菌糸体定量結果

壌も存在したが，概ね 40 µg 菌糸体/g-土壌前後で推移

マツタケ子実体が発生した地点直下のシロ土壌におけるマツタケ菌糸の分布を示す（図－５，図－６）。
本採取地点におけるＡ層は０-４ cm,Ｂ層は４-14 cmであった。深さ６-８ cm および８-10 cm のＢ層土壌にマツタケ菌糸が高密度に検出され，６-10 cm での全ての採取分割サンプルで 200µg 菌糸体/g-土壌程度の菌密度が検出された。各分析値は１分割あたり約 17 cm3の体積に相当し，その菌密していた。本実験条件は閉鎖系であり，１個体のアカマ度を平均的に示しており，ツの根から供給される炭素源栄養でマツタケ菌は生育す

６-10 cm 深度範囲全体ではる。それゆえ，アカマツの光合成産物のうち，アカマツ

約 100 cm3 の土壌体積に相当する。自然状態におけるマ自身の利用した後の残りが地下部土壌に供給され，菌根ツタケシロにおいては，少なくともシロ範囲面積 25 cm2－147 －法も適用しやすく，共生状態の解明や菌根形成の解明のために大変有用なモデルと考えられる。菌糸密度が全体的に低いが，部分的に高いところもあり，そのばらつきの原因究明のためにこれらの手法を用いることも効果的なのではないかと考えられる。
一方，子実体形成を目的としてこの菌根苗を利用するためには，菌密度を高める必要があると考えられる。光条件等を検討して，局所的に再現された共生関係を如何にして容器全体に広げていくのか，ということが次への課題となる。
本研究は農林水産省農林水産技術会議事務局委託プロ
ジェクト研究「森林資源を最適利用するための技術開発」
において約 100 cm3 の体積に平均 200 µg/g-土壌の菌密の一環として実施した。また，本研究は国立研究開発法度の状態を形成していることがわかった。

人森林総合研究所エンカレッジモデルによる研究支援を

３．容器内土壌と野外シロ土壌との比較受けた。また、岩手県マツタケ発生地土壌の調査協力を容器内のマツタケ菌糸体量分布の各箇所における菌糸受けた岩手県林業技術センターの成松眞樹氏に感謝いたします。

体密度は概ね 40 µg 菌糸体/g-土壌前後であり，野外のシロの平均 200 µg/g-土壌と比べ，育苗期間を通じて約５分の１であり，どの培養期間においても野外シロの菌引用文献密度には達していないことがわかった。これは，前述の（１）小林久泰, 綿引健夫, 倉持眞寿美, 小野瀬究明,ように苗の光合成産物供給不足が原因ではないかと考え

山田明義.（2007） 大型培養容器によるマツタケのシロられる。菌根苗を用いてシロ定着から子実体発生を目指様構造を有するマツ菌根苗の生産. 日本きのこ学会誌

す研究も行われているが（２），野外のシロを再現させる

15: 151-155

ためには，全体的な菌密度をさらに高める必要があるこ（２）Kobayashi H, Terasaki, M, Yamada A (2015) 2-yearとが明らかになった。

survival of Tricholoma matsutake ectomycorrhizas on Pinus
densiflora seedlings after outplanting to a pine forest.

一方、容器内で野外シロ土壌の菌密度に匹敵する高菌密度を検出する箇所が多点存在していた(図－３)。
また，

Mushroom Science and Biotechnology 23: 108-113

培養期間 36 ヶ月に至るほぼ全ての期間で局所的に野外（３）Narimatsu M, Yamaguchi M, Yamanaka T, Gisusi S,シロに近い菌密度に達していた。
これは，部分的にせよ，Azuma T, Tamai Y, Fujita T, Kawai M, (2019) Comparison of

天然のマツタケシロ土壌内でおこっているような共生関

mycelial growth of different Tricholoma matsutake strains in

係が容器内で人工的に再現され，マツタケが局所的に高soil medium at varying temperatures. Asian Journal of

密度に生育できたためではないかと考えられる。

Biotechnology and Bioresource Technology 5(4): 1-8（４）小川真. (1978) ｢マツタケの生物学｣. 築地書館
（５）産総研 「実際の照度例」

Ⅳ まとめ
以上のように，人工環境下でアカマツとマツタケの二https://www.aist.go.jp/science_town/standard/standard_03/sta

者のみで作出された菌根苗という人工共生系において，ndard_03_04.html

マツタケ菌バイオマスの経時変化の把握を試み，育苗初（６）Yamada A, Maeda K, Kobayashi H, Murata H. (2006)期から菌体量が概ね一定であること，時間の経過ととも

Ectomycorrhizal symbiosis in vitro between Tricholomaに菌糸が局在化することを明らかにした。また，天然でmatsutake and Pinus densiflora seedlings that resemblesの共生系であるシロ土壌との比較から，人工共生系は全naturally occurring ‘shiro’. Mycorrhiza 16: 111-116

体的に菌糸密度が低いが，局所的に同程度になっている（ ７ ） Yamaguchi M, Narimatsu M, Fujita T, Kawai M,ことも明らかとなった。

Kobayashi H, Ohta A, Yamada A, Matushita N, Neda H,

人工共生系は比較的系を単純化でき，経時変化を追跡

Shimokawa T, Murata H. （ 2016 ） A qPCR assay that

しやすいことから，遺伝子発現解析等の分子生物学的手

specifically quantifies Tricholoma matsutake biomass in naturalsoil. Mycorrhiza 26: 847-861－148 －