関東森林研究論 文72-1(2021)

異なる温度条件下で保存したニオウシメジ菌糸体の１年半後の生存状況及び半年間保存した菌糸体の子実体形成能
金田一美有 1 ・小林久泰 1１ 茨城県林業技術センター
要旨：ニオウシメジ菌糸体は５℃での保存が難しいとされるため，茨城県林業技術センターでは約 20℃で管理し，半年に１回以上植え継ぎ作業を行っている。しかし植え継ぎ作業の繰り返しは一般的に突然変異のリスクがあることが知られている。それゆえ，植え継ぎの回数を減らすような菌類保存の技術の開発が求められている。そこで，-80～15℃の間の６つの温度で４菌株の長期保存試験を開始した。おが培地と SMYA 寒天培地の２種類の培地で１年半保存後，菌糸体の生存率を確認した結果，SMYA 寒天培地では生存率が非常に低い一方で，おが培地では-80,-40,10,及び15℃で保存した場合に，80～100%の高い生存率を示した。これによりおが培地が SMYA 寒天培地よりも長期保存に適していると示唆された。さらに，前述の温度で半年間生存した菌株を利用した菌床露地栽培試験を行ったところ，収量は菌株によって異なっていた。
キーワード：ニオウシメジ，菌株，保存，栽培

Survivability of Macrocybe gigantea mycelia preserved for a year and a half at different temperatures
and the fruiting ability of mycelia which was preserved for half a year at the same temperatures
Miyu Kindaichi1, Hisayasu Kobayashi1
１ Ibaraki Pref. For. Res. Inst, Naka, Ibaraki 311-0122, JAPAN
Abstract : In Ibaraki Prefectural Forestry Institute, mycelia of Macrocybe gigantea have been subcultured at about20℃ on every half a year because it is difficult to preserve them at 5℃. Frequent subcultivation generally has amutant risk. Therefore, a new technique for the preservation of the fungus with lesser subcultivations is desirable.
So, we started the long preservation experiment at six temperatures (-80～15℃) with four strains of M. gigantea.
After preserving in two type’s media (sawdust-based and SMYA agar media) for a year and a half, we checkedsurvival rates of the mycelia. As a result, while the survival rates were quite low in SMYA agar medium, thoseof the mycelia preserved at -80,-40,10 and 15℃ were high, 80～100%, in the sawdust medium. It suggested
that sawdust-based medium is more suitable for long preservation than SMYA agar medium. Furthermore, we
conducted mushroom bed cultivation experiments outside by using strains that had survived for half a year at theabove temperatures. As a result, the harvesting data differed from the strains.
Keywords : Macrocybe gigantea, strain, preservation, cultivation
Ⅰ はじめにニオウシメジ(Macrocybeとして，ニオウシメジの栽培研究を進め，菌床露地栽培gigantea)はキシメジ科ニオウシメジ属の熱帯性の食用きのこであり，大きく発方法であるバーク盛土マルチ法を開発し(８)，2013 年度
より茨城県内のきのこ生産者に普及を開始した。

生した際には，一株の重量が 180kg になることもある

ニオウシメジ菌糸体は，冷蔵庫内の５℃での長期保存(３)。日本では群馬県が北限とされており(６)，ほぼ同が難しいとされ(２)，菌株保持のために，約 20℃で管理緯度である茨城県も同様に北限であると考えられる。茨した培養室内で保管し，半年に１回以上という短いサイ

城県では，付加価値の高い露地栽培のきのこ普及を進めクルで菌糸体を培地に植え継いでいる。しかしこの方法る中で，発生可能な菌種が少ない夏季を補完するきのこは手間がかかるだけでなく，菌糸体が突然変異を起こし－149 －（受理日 2021 年 2 月 3 日）

やすい，というリスクがあり，改良の必要があった。そ２．子実体発生試験 １．の方法により(４)の結果かこで，茨城県林業技術センター（以下「当センター」とらおが培地で半年間保存後生存が確認できた菌糸体においう）ではニオウシメジの保存試験を開始し，まずは，いて保存温度の適正，系統間の差を比較するために，次-80℃の条件下でおが培地を用いニオウシメジを半年間に述べる考えで表-3 の「保存温度」及び「系統」に示し保存できることを確認した(９)。次に，おが培地と寒天たとおり選抜した。保存温度間の比較に供した系統は，培地それぞれに接種したニオウシメジ菌糸体を-80℃，-

現在茨城県内のきのこ生産者に普及指導しているニオウ

40℃，-20℃，５℃，10℃，15℃の６つの温度条件に静置

G を中心に行ったが，-20℃の保存試験ではニオウ G の生して，保存半年後に生存状況を調査した結果，10℃もし存を確認できなかったため，ニオウ T を用いた。ニオウ

くは 15℃での生存率は，おが培地では両温度とも 100%，C も同様の生存率でありながら，ニオウ T を選抜した理寒天培地では 10℃が 40%，15℃が 15%であるのに対し，

由は，表-2 の寒天培地の保存半年後の試験において，ニ５℃で半年間ニオウシメジ菌糸体を保存した場合の生存オウ C よりもニオウ T の生存率が高かったためである。

率はおが培地では 10%，寒天培地では０%という結果(４)系統間の比較は予備試験で実績のある-80℃で行った。-になった。

40℃では，さらにもう１系統ニオウ C を用いた。対照区

今回は，より長期にわたって，保存した時の温度の影として，常温(約 20℃)で保存しているニオウ G を用いた。

響を評価するために，半年間保存時と同様の培地及び温

子実体発生試験は寺崎ら(８)を参考に次のとおり行った。

度条件下で，１年半保存したニオウシメジ菌糸体の生存

おが粉：バークたい肥：ふすま＝６：４：１で混合し，状況を調査した結果を報告する。また半年間保存後生存含水率を約 65%に調製したおが培地を栽培用 P.P.袋に２していた菌株について，生きていた菌糸体が正常な子実kg 詰め込んだ。120℃で 120 分間高圧殺菌し，翌日まで体形成能を維持しているか評価するために，生存菌株に放冷後，あらかじめ同様の培地で培養しておいた菌糸体よって作成した菌床の栽培試験結果について報告する。

を１袋当り約 20mL 接種した。接種後の培地は，20～22℃の温度条件下で約３か月間培養した。菌床があめ色に完Ⅱ 材料と方法熟していることを確認し，当センターが開発したバーク

１．長期保存試験 培地は，おが培地と SMYA 寒天培地

盛土マルチ法(８)により，2019 年６月に２kg 菌床４個を用いた。おが培地は，おが粉：バークたい肥：ふすまを１組として隙間なく静置後，土盛り状にバーク堆肥を＝６：４：１で混合し，含水率 65%に調製した培地を内３cm 厚に覆土し，その上に切りワラを敷き，さらにビニ径 30mm の試験管に 55g 詰め，121℃で 60 分間滅菌した。

ールシート(P.E.製 0.02mm 厚)で覆い，当センター内の寒天培地は，蒸留水１L 当たりサッカロース 10g，麦芽エスギ林地に伏せ込んだ。伏せ込みは３反復行い，伏せ込

キス 10g，酵母エキス４g，寒天 20g を混合し，内径 18mm

み後は自然降雨によるほか，降雨がない時期には週３回の試験管に 15ml 詰め，121℃で 20 分間滅菌した。両培地

程度散水を行った。発生時期には，断続的に子実体発生とも一昼夜放冷後，当センター保有の菌株である，ニオの有無を調査し，収穫日とその株数を記録した。
その後，

ウ K，C，G，T の４系統を５反復ずつ接種した。25℃で 19

傘が十分に開いて採集可能になった子実体を採集し，株日～１か月培養後，-80，-40，-20，5，10，15℃の６段毎に収量を測定し，株当たりの平均収量と培地１kg 当た階に設定した超低温フリーザー，冷凍庫，冷蔵庫またはりの収量を算出した。

インキュベーターに静置し，長期保存試験を開始した。
-80，-40，-20℃については，馬場崎ら(１)の方法を元に，Ⅲ 結果段階的に温度を下げずに急速冷凍した。保存１年半経過

１．長期保存試験 ニオウシメジ菌糸体の保存１年半後に熊田ら(７)の方法を参考に，次のとおり解凍作業を後の生存率について表-1，表-2 に示す。表-1 のおが培地行った。-80℃，-40℃，-20℃保存菌株については 35℃の-20℃，５℃においては，全てにおいて生存を確認できで２時間静置後，12℃で 24 時間静置した。５℃，10℃保ず，０%となった。-80，-40，10，及び 15℃では，15℃の存菌株については，12℃で 24 時間静置のみ行った。15℃

ニオウ G が５枚中１枚のシャーレにおいて死滅してしま保存菌株については解凍温度である 12℃に近いため，解い，生存率が 80.0%となった以外は，生存率は 100.0%で凍作業を行わなかった。その後，全ての温度の保存菌株あった。系統別では，ニオウ K が 66.7%,C が 66.7%，G がを，前述の組成による寒天平板培地に移植した。
その後，63.3%，T が 66.7%となった。表-2 の寒天培地では，-80℃約 20℃の培養室に移動して，１か月後菌株の生存状況を

ニオウ T，15℃ニオウ K，G 及び T において生存が見られ，確認し，保存温度・系統別に生存率を調査した。

それぞれ 40.0%，20.0%，60.0%及び 40.0%であったが，そ－150 －関東森林研究れ以外は全て 0.0%であった。-80℃全体の生存率の平均72-1(2021)た。10℃保存菌株では 1/3，33.3%となった。

は 10.0%，15℃は 30.0%となった。系統別では，ニオウ K

温度別の比較試験として用いたニオウ G の発生区画にが 3.3%,C が 0.0%，G が 10.0%，T が 13.3%となった。

ついては，-40℃及び 10℃ではそれぞれ 1/3，33.3%とな

２．子実体発生試験 露地栽培試験の結果を表-3 にった。それ以外の-80℃，５℃，15℃ではそれぞれ 0/3，示す。保存温度別の発生率をみると，-80℃では発生区画0.0%となり，対照区であるニオウ G 常温保存についても数/伏せ込み区画数が 6/12，発生率は 50.0%となった。-

発生区画数が 1/3，33.3%と少なかった。培地１kg 当たり40℃では 1/6,16.7%となった。-20℃では 2/3，66.7%となの収量では-80℃ニオウ K が，株平均重量は-40℃ニオウった。5℃，15℃保存菌株ではそれぞれ 0/3，0.0%となっ

G が，１区画当たり株数は-80℃ニオウ T が最も高かった。

表-1. おが培地で１年半保存したニオウシメジ菌糸の生存率（%）
Table.1 Survival rates of M. gigantea mycelia preserved for a year and a half in a sawdust based medium
保存温度

-80℃

-40℃

-20℃

5℃

10℃

15℃

平均

K

100(100)

100(100)

0(20)

0(20)

100(100)

100(100)

66.7(73.3)

CGT100(100)
100(100)
100(100)

100(100)
100(100)
100(100)

0(40)
0(0)
0(40)

0(0)
0(20)
0(0)

100(100)
100(100)
100(100)

100(100)80(100)100(100)

66.7(73.3)
63.3(70.0)
66.7(73.3)

平均100(100)

100(100)

0(25)

0(10)

100(100)95(100)65.8(72.5)

系統※カッコ内の値は保存半年後の生存率（日本きのこ学会第 23 回大会で発表済(４)）
表-2. 寒天培地で１年半保存したニオウシメジ菌糸の生存率（%）
Table.2 Survival rates of M. gigantea mycelia preserved for a year and a half in an agar culture medium
保存温度

-80℃

-40℃

-20℃

5℃

K

0(0)

0(0)

0(0)

C
G
T

0(0)
0(0)
40(0)

0(0)
0(0)
0(0)

0(0)
0(0)
0(0)

平均

10(0)

0(0)

0(0)

系統

10℃

15℃

0(0)

0(0)

20(20)

3.3(3.3)

0(0)
0(0)
0(0)

0(60)
0(0)
0(100)0(0)60(20)40(20)0.0(10.0)
10.0(3.3)
13.3(20.0)

0(0)

0(40)

30(15)

6.7(9.2)

平均※カッコ内の値は保存半年後の生存率（日本きのこ学会第 23 回大会で発表済(４)）
表-3. 半年間保存した菌糸体で栽培した子実体の収量
Table.3 Harvesting data of the M. gigantea fruiting bodies made from mycelia preserved for half a year

保存温度

-80℃

-40℃
-20℃
5℃
10℃
15℃
常温保存（対照区）

系統
ニオウK
ニオウC
ニオウG
ニオウT
ニオウG
ニオウC
ニオウT

ニオウG

１区画当培地１kg
株平均重量 たり株数
当たり収(g)（株／区量(g/kg）
画）
357.6
1,716.6
1.7
24.3
582.0
0.3
―――
278.4668.1
3.3
90.5
2,172.0
0.3
―
―
―
119.4
716.3
1.3
―
―
―
6.6
158.0
0.3
―
―
―
86.4

1,037.0

－

151 －

0.7

発生区画
数／伏せ
込み区画
数
2/3
1/3
0/3
3/3
1/3
0/3
2/3
0/3
1/3
0/3

2019/8/28～9/9
2019/9/11―
2019/8/29～9/19
2019/9/11―
2019/9/5～9/13―
2019/8/23―

1/3

2019/9/13

収穫日

Ⅳ 考察っては高価な超低温フリーザーを用意することは困難で１年半の長期保存試験について，寒天培地の-40，-20,ある。一方，高温域で生存率の高かった 10℃，15℃保存

５,10℃の生存率が全ての系統において０%となっており，について，菌の活性を完全に止めているわけではないの

保存用培地として寒天培地は不適であると考えられた。

で，いずれは活性が落ちてしまうリスクは残っている。

おが培地保存菌株の生存率が高かった理由としては，寒今後保存２年半，３年半経過後について生存状況を調査

天培地よりも培地全体に占める水の割合が少なく，冷凍し，保存可能期間を明らかにしたいと考えている。

した場合の氷の生成による菌糸体の細胞への損傷が少な

子実体発生試験については，耐凍性の系統差によるもいためだと思われる。のか，菌株の劣化によるものか，評価が難しかったこと

ただし，おが培地においても-20℃，５℃の生存率が全から，発生子実体からの再分離株等を用いたさらなる試て０%と，半年後と同様の傾向となっており，これらの温験を検討したい。

度帯が菌株保存に向かないことが再確認できた。-80℃，-40℃保存菌株の生存率が高かった原因としては，急激に謝辞：本研究は，特別電源所在県科学技術振興事業「ニ温度が超低温に下がるため，氷の結晶が大型化せず，細オウシメジの安定生産技術及び菌株保存技術の開発に関胞への損傷が小さかったものと考えられる。馬場崎らする試験研究事業」により実施した。

(１)の試験においても，直接凍結維持法において-20℃は不適当な温度であるとの記述があり，-40℃程度までの低引用文献温下で適用可能な方法であることが裏付けられた。

(１) 馬場崎勝彦(1999) 栽培きのこ菌株の直接凍結維持-80℃，-40℃での保存には，高価な超低温フリーザー法及び DNA 判別法．
微生物遺伝資源利用マニュアル(５)，が必要であることを考慮すると，15℃での保存が最も実

農業生物資源研究所編，つくば：3,17用的であると考えられる。表-2 に示すとおり，寒天培地(２) 新原修一(2002) ニオウシメジの栽培．鹿児島県林においてもこの温度では一部の培地で菌の生存がされて試研報 7:4ppおり，特に，10℃よりも 15℃の生存率が高かった。今井(３) 本郷次雄 監修・解説(2000) きのこ．株式会社 山ら(５)の試験においても，ニオウシメジは５℃と 25℃貯と溪谷社，東京：36pp

蔵で 10 日間，15℃で 25 日間貯蔵可能であることが明ら(４) 市村よし子・金田一美有・小林久泰(2019) 異なるかになっている。

温度条件におけるニオウシメジ菌糸の半年間の保存．日

子実体発生試験では，系統によって結果が大きく異な

本きのこ学会第 23 回大会講演要旨集：50ppっており全般的な傾向は見出せなかった。特にニオウ G(５) 今井具子・佐々木弘子・菅原龍幸(1999) キシメジ

では，３区画伏せ込んだうち，各温度で最大１区画でし科の栽培キノコ類の鮮度に及ぼす貯蔵温度の影響．日本

か発生がなかった一方で，-80℃ニオウ K は培地１kg 当

食生活学会誌 Vol.10 No.3：31pp

たり収量と株平均重量が高く，またニオウ T では-80℃(６) 今関六也・大谷吉雄・本郷次雄編(2011) 山溪カラ菌株で伏せ込み３区画全てにおいて子実体が発生し，生ー名鑑 日本のきのこ．株式会社 山と溪谷社，東京：存率の低かった-20℃菌株でも 2/3 の発生であった。系74-75

統によって耐凍性に差があるため，子実体形成能に影響(７) 熊田淳・竹原太賀司・青野茂(1999) Ⅱ－１.ナメコが出たのか，ここまで多くの植え継ぎを経た菌株であっ種菌の製造過程における菌株の取り扱い方法．きのこのたために劣化が始まってしまったか，今後更なる検討が変異判別と変異発生予防．44pp

必要である。

(８) 寺崎正孝・山田晴彦・倉持眞寿美(2011) ニオウシ
メジの菌床露地栽培における伏せ込み方法の検討．関東

Ⅴ おわりに森林研究 62：277-278

長期保存試験については，馬場崎ら(１)が菌糸成長試(９) 富田莉奈・小林久泰・山口晶子・倉持眞寿美(2015)

験で継代培養保存法と直接凍結維持法を比較したところ，-80℃の低温条件下に半年間保存したニオウシメジ菌糸継代培養保存法で保存した菌糸体は初期成長遅延期を有の生存について．日本きのこ学会第 19 回大会講演要旨する成長パターンを示す一方で，直接凍結維持法で維持集：44pp

した菌糸体は素早く成長を開始し，初期成長遅延期は殆どないということを示している。これらにより，直接凍結維持法の有用性が示されているが，きのこ生産者によ－152 －