2011 年 4 月 4 日

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Ver.1

エピソーマルベクターを用いたヒト iPS 細胞樹立方法
京都大学 iPS 細胞研究所

本プロトコールは、ヒト線維芽細胞にエピソーマルベクターを用いて初期化因子を導入し、ゲノムへの挿入なく多能性幹細胞を作製する手順を示したものである。

1. 準備するもの
1.1. 細胞およびベクター
OCT3/4、SOX2、KLF4、L-MYC、LIN28 、p53-shRNA 発現用エピソーマルベクター
米国非営利団体 Addgene (http://www.addgene.org/Shinya_Yamanaka) より入手可能となる予定。pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL の 3 種類を混ぜて使用する。
遺伝子導入効率の評価には pCXLE-EGFP 等を利用すると良い。

SNL フィーダー細胞
サンガー研究所 (http://www.sanger.ac.uk/Terms/Term82/) の Dr. Allan Bradley、またはEuropean Collection of Cell Cultures; ECACC (http://www.ecacc.org.uk/) より入手可能。

線維芽細胞
ヒト皮膚線維芽細胞を用意する。
下記の会社および機関などから細胞を入手することが可能。
Cell applications Inc. (http://www.cellapplications.com/)
Lonza (http://www.lonza.com/group/en.html)
American Type Culture Collection; ATCC (http://www.atcc.org/)
理研バイオリソースセンター (http://www.brc.riken.jp/)
医薬基盤研究所 (http://www.nibio.go.jp/index.shtml)

1.2. 必要な試薬Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM; Nacalai tesque 社 14247-15)

Phosphate buffered saline Ca, Mg free (PBS; Nacalai tesque 社 14249-95)

Fetal bovine serum (FBS)

Penicillin/streptomycin (Invitrogen 社 15140-122)

Recombinant basic fibroblast growth factor, human (bFGF; WAKO 社 064-04541)

Bovine serum albumin (BSA; ICN 社 810-661)



0.25% Trypsin/1 mM EDTA solution (Invitrogen 社 25200-056)
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Neon Transfection System Kit (100 µL) (Invitrogen 社 MPK10096)

Primate ES培地 (Primate ES medium; ReproCELL 社 RCHEMD001)

2. 試薬の調製
bFGF 溶液 (10 μg/ml)
4.95 ml の PBS に 50 μl の 10% BSA 溶液を加えて 0.1% BSA/PBS 溶液を作製する。50 μgの bFGF を 5 ml の 0.1% BSA/PBS 溶液に溶解し、分注して-20℃で保存する。

10% FBS 培地 （線維芽細胞用）
50ml のFBS、2.5ml のpenicillin/streptomycin を加え、DMEM で500 ml までメスアップし、0.22 μm フィルターを通して滅菌する。4℃で1 週間保存可能。

ヒトiPS用培地
0.2 ml の 10 μg/ml bFGF を 500ml の Primate ES 培地に加えて使用する。

3. 器具・機材
器具・機材は他メーカーから販売されている同等品でも代用できる。
100 mm 培養ディッシュ (FALCON 社 353003 など)

6-、24-、96-well 培養プレート (FALCON 社 353046、353047、351172 など)

15、50 ml チューブ (FALCON 社 352196、352070 など)

1、5、10、25 ml プラスチックピペット(FALCON 社 357520、357543、357551、357525 など)

0.22 μm フィルター (Millipore 社 SLGP033RS など)



10 ml シリンジ (Terumo 社 SS-10ESZ など)



Coulter counter (Beckman Coulter 社 Z2)



Pippette aid (FALCON 社など)



ピペットマン、チップ (GILSON 社など)



1.5 ml チューブ (WATSON 社など)



CO2 インキュベーター (Thermo 社など)



遺伝子導入装置 Neon Transfection System （Invitrogen 社）＊Nucleofector (Lonza 社) などでも代用可能。

4. 実験方法
本実験方法は、従来のレトロウィルスベクターを用いた樹立方法を改良したものであり、ゲノム挿入がなく効率的に iPS 細胞を樹立できることが特徴となっている。因子導入方法以外に必要とな
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る操作である、線維芽細胞の準備や継代、播種、フィーダー細胞の調整等に関しては、既にホームページに公開されている「ヒト iPS 細胞の樹立方法」
http://www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/research/images/protocol/pdf/hiPS_Protocol_080703a.pdf を参照のこと。

4.1. Electroporation によるプラスミド導入（１日目）
6 well plate に 10% FBS 培地を 3 ml 入れて、CO2 インキュベーターで 37°C に温めておく。
100 mm ディッシュにコンフルエントになった線維芽細胞の培養上清を吸引除去し、PBS 10ml を加える。

PBS を吸引除去し、ディッシュあたり 1 ml の 0.25% Trypsin/1 mM EDTA solution を加える。

37°C で 3 分間インキュベートする。
＊長時間のトリプシン処理はエレクトロポレーション後の生存率を低下させる。

10% FBS 培地を 4 ml 加え、ピペッティングによりバラバラにする。



細胞数を測る (100 mm ディッシュ一枚から 1-2 x 106 を回収できる)。

6 x 105 を 15 mL チューブに入れ、PBS を加えて 10 mL にする。



200 x g で 5 分間遠心する。



この間に、以下のプラスミド溶液を作製。
Buffer R:

100 L （Neon キットに含まれている）

Plasmid:

3 g (pCXLE-hOct3/4-shp53-F, pCXLE-hSK, pCXLE-hUL を各 1 g)Neon チューブ（Neon キットに含まれている）に Buffer E2 を 3 mL 入れる。

遠心終了後、細胞の上清を 100 L 程度残してアスピレーターで吸い取る。



その後、P200 のピペットマンを用いて、しっかりと上清を取り除く。



プラスミド溶液に細胞を懸濁して、1.5 mL チューブに移す。

Neon 100 μl tip で細胞懸濁液を吸い上げ、機器にセットする（泡を入れないこと）。

以下の条件で Electroporation を行う。
Voltage：1650 V、Width：10 ms、Pulse Number：3



すばやく温めておいた 6 well plate にまく。
＊細胞のプラスミド溶液への懸濁から播種までは 1 サンプルずつ処理すること。

4.2. 培地交換（２日目）


線維芽細胞の培養上清を吸引除去し、2 ml の新鮮な 10% FBS 培地と交換する。
＊以降、培地の交換は 2 日に 1 回行う。

4.3. SNL フィーダー細胞上への継代（７日目）
培地を吸引除去し、PBS を 2 ml 加える。

PBS を吸引除去し、1 well あたり 0.3 ml の 0.25% Trypsin/1 mM EDTA solution を加える。

37°C で 3 分間インキュベートする。
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

10% FBS 培地を 2 ml 加え、ピペッティングにより細胞塊をバラバラにする。



細胞数を計測する。この時点で 1-0.5 x 105 個になっている。

1 x 104 個/ ml となるよう調整する。10 ml の細胞懸濁液 （1 x 105 個） を 100 mm ディッシュの SNL フィーダー細胞上にまく。

37°C、 5% CO2 で一晩培養する。

4.4. ヒト iPS 細胞用培地への交換（８日目）
培地をヒト iPS 細胞用培地に交換する。
＊以降 2 日に 1 回培地を交換する

4.5. iPS コロニーの単離（２１－３０日目）


コロニーが成長し、肉眼で確認できるようになってきたら、分化が始まる前に拾う。(～2mm)

96 ウェルプレートに1 ウェルあたり200 μl のヒトiPS細胞用培地を分注しておく。

P10 のピペットマンを用い、実体顕微鏡下でコロニーをはがす。



拾ったコロニーを、96 ウェルプレートに移す。



ピペッティングによってコロニーが小塊となるまで崩す。
＊重要ポイント!! コロニーはシングルセルの状態までバラバラにしないこと。

24 ウェルプレートのSNL フィーダー細胞 （mitomycin C 処理したもの）上にまき、300 μl のヒトiPS細胞用培地を加え、37°C、5% CO2 インキュベーターで80~90%コンフルエントとなるまで培養する。

4.6. iPS 細胞の培養、継代および凍結
ヒトiPS 細胞の培養、継代および凍結方法はこれまでにヒトES 細胞で開発されてきた方法が適用できる。iPS 細胞研究所では、京都大学 幹細胞医学研究センター 霊長類胚性幹細胞研究分野の末盛博文博士らによって開発された方法にのっとって培養を行っている (文献2 を参照)。

4.7. ゲノム integration の解析導入したエピソーマルベクターは iPS 細胞の継代により、やがて失われていくが、まれにゲノム内に挿入されていることがある。のちの解析に支障をきたす恐れがあるため、ゲノム PCRによりゲノム挿入の有無を検出する。
プライマー、PCR 条件などは以下の通り。(文献 3 を参照）
pEP4-SF1 ： TTC CAC GAG GGT AGT GAA CC
pEP4-SR1 ： TCG GGG GTG TTA GAG ACA AC

94℃

2 min

94℃

20 sec64℃

20 sec30 cycle

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72℃

40 sec72℃

3 min

5. 参考文献
1.

Okita, K. et al. A more efficient method to generate integration-free human iPScells. Nature Methods. (2011) in press

2.

Fujioka, T. et al. A simple and efficient cryopreservation method for primate
embryonic stem cells. Int. J. Dev. Biol. 48, 1149-54 (2004)

3.

Yu, J. et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgenesequences. Science 324, 797-801 (2009)＊本プロトコールは沖田講師の協力のもと、研究戦略本部 研究統括室で作成したものです。
問合せ先：研究戦略本部 研究統括室 collaboration@cira.kyoto-u.ac.jp

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