（参考資料６）

ＤＮＡ分析による小豆のあん品種の識別
北海道立中央農業試験場
独立行政法人農業生物資源研究所
１

小豆加糖餡からの DNA 抽出
加糖餡からの DNA 抽出は独立行政法人農林水産消費技術センターの「JAS分析試験ハンドブック 遺伝子組換え食品検査・分析マニュアル（改訂第2 版）基本操作編」“3.3 CTAB を用いた DNA の抽出”に準じて行った。DNA抽出の操作を以下に示す。
加糖餡からの DNA 抽出（CTAB 法）① 加糖餡約 300mg を 1.5ml チューブに移して CTAB 抽出液 1ml を加え撹拌し、60℃で 30 分間保温した後、14,000rpm、３分間遠心分離する。上清約 700μl を新しいチューブに移す。
② 試料溶液に等量の PCI を加え、２分間激しく振とうし、14,000rpm、15分間遠心分離する。上層を新しいチューブに移し、等量の CIA を加え、２分間激しく振とうし、14,000rpm、３分間遠心分離し、上層を新しいチューブに採取する。
③ 試料溶液と等量の２-propanol を加え、転倒混和し、12,000rpm、３分間遠心分離する。上清を捨て、70％エタノール 800μl を加え、転倒混和し、12,000rpm、３分間遠心分離する。上清を捨て、沈殿物を乾燥する。
④ 沈殿物に TE100μl、RNase A（10mg／ml）２μl を加え、37℃で 30 分間保温する。保温後、CTAB 抽出液を 400μl 加える。
⑤ 試料溶液に 500μl の CIA を加え、軽く混和し、12,000rpm、15 分間遠心分離し、上層を新しいチューブに採取する。
⑥ 試料溶液と等量の２-propanol を加え、転倒混和し、12,000rpm、３分間遠心分離する。上清を捨て、沈殿物を乾燥する。
⑦ 滅菌水 100μl を加え、DNA を溶解する。DNA 濃度を測定し（3.1.7 項参照）、30μg／ml に希釈した DNA 溶液を調製し、1μl（30ng）を PCR に使用する。
使用する試薬溶液
CTAB 抽出液：（２％ CTAB, 0.1M Tris-HCl pH8.0, 1.4M NaCl, １％ PVP）
PCI：（TE saturated phenol / Chloroform / Isoamylalchohol）25：24：
１（v/v/v）
CIA：（Chloroform / Isoamylalchohol）24：１（v/v）
２-propanol、70％エタノール、TE、RNase A（10mg／ml）

参６－１

２SSR マーカーによる加糖餡の品種識別
小豆加糖餡では加熱等により DNA の断片化が予想される。このため、増幅断片長が短く共優性の SSR マーカーを用いて、国産及び輸入加糖餡の識別性を検討した。

（1）PCR の条件等
サーマルサイクラーはアプライドバイオシステム社の Gene Amp PCR
System 9700、合成酵素は同社の AmpliTaq Gold を使用した。反応液量は20μl とし、鋳型 DNA は 30ng を添加、プライマー濃度は上流、下流各 0.3μM とした。合成酵素は 0.5units を使用、その他の反応液組成は酵素添付のバッファーで最終濃度が 10mM Tris-HCl(pH9.0), 50mM KCl, 0.1% Triton X-100, 1.5mM MgCl2, 0.2mM each of dNTPsとなるよう調製した。
PCR の温度サイクルは 94℃；７分の後、94℃；15 秒、60℃；15 秒、72℃；
15 秒を 40 回繰り返し、最後に 72℃；７分を付加した。
・ 反応液組成DNA 溶液（30ng/μl）
10×PCR Buffer
25mM MgCl2２mM each of dNTPs
F-primer(５pmol/μl)
R-primer(５pmol/μl)
Taq polymerase(５u/μl)
滅菌水を加えて 20μl とする。
・ PCR の温度条件
94℃
７分
94℃
15 秒
60℃
15 秒
72℃
15 秒
72℃
７分
４℃
∞

1.0μl
2.0μl
1.2μl
2.0μl
1.2μl
1.2μl
0.1μl

40 回繰り返し（2）PCR 産物の電気泳動
電気泳動の条件等は小豆種子と同様であるが、泳動槽は BIO-RAD 社のPROTEAN II を使用、350V で３時間 30 分泳動した。

参６－２

（3）小豆加糖餡の品種識別
国産の加糖餡３点、中国産加糖餡５点を供試した結果、国産加糖餡-１は「エリモショウズ」、国産加糖餡-２は「きたのおとめ」、国産加糖餡３は「しゅまり」に遺伝子型が一致した。また、中国産の加糖餡とは増幅断片のパターンが異なり、識別が可能であった。中国産の加糖餡では増幅断片の泳動像が明瞭ではなく、遺伝子型の判定が困難な試料があった（表１、図１）。
表１

SSR マーカーによる加糖餡の品種識別（目視による増幅断片の塩基対数）

加糖餡

G029

G008G024

G015

G007

１国産加糖餡-1

185120144

206

128

エリモショウズ２国産加糖餡-2

185118144

206

128

きたのおとめ３国産加糖餡-3

179

120144

206

128

しゅまり

４中国産加糖餡-1

18570/100

144

204

128

５中国産加糖餡-2

185100136/144

210

128

６中国産加糖案-3

17990/100130/144

170/204128

７中国産加糖餡-4

185

104

130/144210128

８中国産加糖餡-5179

100136206128

図１判

定SSR マーカーによる増幅結果（数字は表１に対応、M は 100bp ラダー）

参６－３

中国産加糖餡では増幅 DNA の電気泳動像が明瞭ではない試料が認められた。原料となる中国小豆の遺伝子型が均一でないことが原因と考えられる。輸入小豆の東北小豆５粒から DNA を抽出し、１粒ずつ単独の試料と５粒の DNA を均等に混合した試料を作成し、SSR マーカーによる増幅を行った。比較として「きたのおとめ」を供試、混合試料と「きたのおとめ」を等量混ぜた試料も供試した。その結果、５粒はいずれも異なる遺伝子型を示し、混合試料では遺伝子型の頻度を反映して DNA 断片の増幅が認められた。さらに、混合試料と「きたのおとめ」を等量混ぜた鋳型
では、泳動像がさらに不明瞭となった（表２、図２）。
表２

SSR マーカーによる中国小豆の検定（目視による増幅断片の塩基対数）

G029

G008

G024

１きたのおとめ

185118144

２東北小豆-1

191

100140３東北小豆-2193118

134

４東北小豆-3191

116

138

５東北小豆-4

169

90140

６東北小豆-5191

90140

７東北小豆 Mix

169/19190140

８Mix+きたのおとめ

169/185

90/118140/144

図２

SSR マーカーによる増幅結果（数字は表２に対応、M は 100bp ラダー）
参６－４

以上の結果から、SSR マーカーによる小豆加糖餡の品種識別については、① 日本品種を原料とした加糖餡では、抽出した DNA の遺伝子型は種子と一致し、品種判別が可能である。品種により固有の遺伝子型を示すので、中国小豆を原料とした加糖餡との識別も可能である。
② 中国小豆は SSR マーカーによる遺伝子型が多様で、一定の傾向は示さない。このため、中国小豆を原料とした加糖餡では、銘柄の特定は難しい。
③ 原料として中国小豆に日本品種を混合した場合、対象となる中国小豆の遺伝子型が多様なため、日本品種の混入が少量の場合は検出が難しい。
今後、少量の日本品種の混入を検出するためには、日本品種のみに特異的なマーカーの開発が必要である。
３

シークエンサーを用いた加糖餡の品種識別
加糖餡では複数の品種が混合されていることも考えられるので、一種類の蛍光化 SSR プライマーを用いた PCR を行い、加糖餡の品種同定を試みた。
解析手順は参考資料５「DNA 分析による小豆品種の識別（４）シークエンサーによる品種識別」とほぼ同様に行った。

（1）PCR の条件等サーマルサイクラーはアプライドバイオシステム社のGeneAmp® PCR
System 9700、PCRにはQIAGEN社のQIAGEN® Multiplex PCR Kitを使用した。
反応液量は10μlとし、キットに含まれる２x QIAGEN Multiplex PCR
Master Mix及び５ｘQ-solutionに、鋳型DNA10ngと各プライマー対（５pmol/μl）を混合した。PCRの温度サイクルは95℃；15分のポリメラーゼの活性化後、94℃；30秒、57℃；90秒、72℃；１分を40回繰り返し、最後に72℃；10分の伸長反応を行った。
・ 反応液組成DNA 溶液（10ng/μl）
２x QIAGEN Multiplex PCR Master Mix
５x Q-solution
プライマー対 (5pmol/μl)
精製水

参６－５

1.0μl
5.0μl
2.0μl
0.4μl
1.6μl

・ PCR の温度条件
95℃
15 分
94℃
30 秒
57℃90 秒
72℃
1分
72℃
10 分
4℃
∞

40 回繰り返し（2）アリールデータの取得
小豆の品種識別に用いるSSRマーカーは、(AG)nからなる２塩基の反復配列を含むので、図３のように約２bpおきにスタッターとよばれる複数のピークが現れる。そのなかで一番右の最も高いピークのbp値をアリールデータとして記録した（図３、①と②の矢印）。遺伝的に異なる複数の品種が混合された試料の場合はスタッターが数多く出現するが、それらが重なり合わなければ容易に解釈できる。また図３の①＋②では、一番右のピークがその左隣のピークよりも低くなっている。このような状態は①と②のDNAが混じっている時に現れる。また、餡などの加工製品における品種の混合比率は不明なので、複数のアリールが認められた場合は最高の蛍光強度(rfu)を示したピークから、その約１/１０程度の蛍光強度のピークまでをアリールとし、bp値を記録した。

図３

品種識別に用いたピーク（例 CEDG008、矢印）（3）小豆加糖餡の品種識別国産加糖餡２点、中国産加糖餡５点を検定した結果、国産加糖餡Ａは「エリモショウズ」と「きたのおとめ」の混合品、国産加糖餡Ｂは銘柄のとおり「しゅまり」であった(表３、図４)。日本品種を原料とした国産加糖餡
は遺伝子型が均一なのに対し、中国産加糖餡では複数のアリールが検出された。このことから、原料となった中国小豆の遺伝子型は雑多と考えられる。

参６－６表３

中国産及び国産加糖餡の検定結果
中国産加糖餡

(数値はシークエンサーで測定された bp 値)

国内産加糖餡

マーカー

AB

C

DE

A

B

きたのおとめエリモショウズ

しゅまり

CEDG029

186

176

186

176

186

186

180

186

186

180

178

178

188

180

180

182

182
120

118

120

120

CEDG00886

94102110102110

108

102

118110

120

212

212

212

212

212

141

141141141141130

130

130130130108110
CEDG015

212

198

208

218

212

212216206

210247247

216212218247

CEDG024129

129

139141

113

131

129

129

133

133

133

141

141
CEDG007

128

126

128

128

128

130

130130130

130

参６－７一方、今回検定した中国産加糖餡には、北海道の登録品種「きたのおとめ」や「しゅまり」が混入したものは認められなかった。ただし、今回の中国産加糖餡の識別に最も有効であった SSR マーカーCEDG008（図４）がなければ、中国加糖餡Ａ,Ｃ及びＥは「きたのおとめ」と全マーカーでアリールが一致し（表３）、「きたのおとめが含まれる」という結果になった可能性がある。このように加工品では複数の品種が混在する可能性があるので、今後日本品種特異的なマーカーの開発やマーカー数の増加などによって識別精度を向上させる必要がある。

図４ SSR マーカーCEDG008 による中国産加糖餡及び国産加糖餡の解析結果(矢印はアリールとして記録したピークを示す)

参６－８