関東森林研究 68-2(2017)

論 文

マツタケ菌糸体定量における qPCR 法とエルゴステロール法の比較
Comparison between qPCR and ergosterol methods in Tricholoma matsutake biomass quantification
山口宗義・下川知子
Muneyoshi YAMAGUCHI, Tomoko SHIMOKAWA
森林総合研究所
Forestry and Forest Products Research Institute, Tsukuba, Ibaraki 305-8687
要旨：土壌中のマツタケの菌糸体量を特異的に定量可能な技術を定量 PCR 法(以下 qPCR 法)により開発した。本稿
では，従来の菌糸体定量法のひとつであるエルゴステロール定量分析法との比較を行った。両手法ともエルゴステロールおよび DNA 量と菌糸体量とに強い相関関係が得られ，両方法によりマツタケの菌糸体量を推定可能であることが示された。また，菌糸体量とエルゴステロール量と DNA 量との量的関係性も明らかとなった。両方法の測定範囲の違いとして，エルゴステロール法は菌量の多い状況下で，qPCR 法は菌量の少ない状況下でそれぞれ効力を発揮することがわかった。
キーワード：マツタケ・定量 PCR 法・エルゴステロール・菌糸体定量
Abstract: A qPCR assay that specifically quantifies Tricholoma matsutake biomass in natural soil was developed. In this study,qPCR and ergosterol analysis, which is a conventional mycelium assay, were compared. A strong correlation was found between
mycelium and ergosterol quantity and between mycelium and DNA quantity. This result showed that both methods could estimate
the quantity of mycelium. In addition, the quantitative association of mycelium with ergosterol and DNA was clarified.
Key-word: Tricholoma matsutake, qPCR, ergosterol, quantification of mycelium

Ⅰ はじめに合研究所所蔵菌株)を使用した。定量に必要なマツタケ菌

マツタケは古来より日本で食されてきたきのこで，季糸体は，液体培養によって得た。培養方法としては，ポ節を味わう食材として用いられてきた。近年は収穫量がテトデキストロース液体培地（Difco Potato Dextrose Broth）著しく低下しているが，日本の秋のきのことして珍重さで 23℃ 3 週間暗所静置培養した。培養菌糸体は濾紙にれている。マツタケは主にアカマツと共生関係を築きなて濾過後，滅菌水にて洗浄し，凍結乾燥した。凍結乾燥

がら土壌中で菌糸や菌根菌として存在し，条件が揃うこした菌糸体をマルチビーズショッカー（安井機械製）にとによって子実体を発生させる。大半の生活を土壌中でて粉砕し，供試菌糸体とした。

過ごす菌であるが，その生態はまだまだ未解明な点が多２．標準試料の作成 既知量のマツタケ菌糸を含む標い。我々は土壌中の生態を明らかにするために，マツタ準試料を作成した。供試菌糸体を 1000 µg/ml となるようケを特異的に定量可能な qPCR 法を開発した（３）が，滅菌水中に分散させ，滅菌水で希釈し，1000，100，10，菌根菌のバイオマスをエルゴステロールといった細胞構1，0.1 µg/ml となるように希釈系列を作成した。作成し成成分の量を指標に定量する従来の方法（１,２）との比た希釈系列を凍結乾燥し，DNA の抽出およびエルゴステ

較はなされていない。そこで，本稿は純粋培養したマツロールの抽出に供した。
３．
DNA の抽出および定量 DNA の抽出はYamaguchi

タケ菌を用いて，qPCR 法と従来法の一つであるエルゴら（３）の方法にしたがった。凍結乾燥された希釈系列

ステロール定量法との比較を行った。

試料に 0.6%スキムミルクを含有した 2%CTAB 液 650 µlを加え，65℃ 1 時間撹拌しながら溶解後，750 µl のクロⅡ 材料および方法
１．材料

ロホルム/イソアミルアルコール（24:1）で 2 回抽出し，供 試 菌 株 は ， Trichoroma matsutake

NBRC33136 (Y1 株，(独)製品評価技術基盤機構分譲株)，

上清を採取した。イソプロパノールで DNA を沈殿，乾Trichoroma matsutake TFM S-08006 (TO-1 株，(研)森林総燥後，滅菌水 100 µl に溶解し，抽出試料とした。抽出試－109 －（受理日 2017 年 6 月 19 日）

料をライトサイクラー2.0（ロシュ社製）を用いて qPCRを行い，菌糸体量を算出した。qPCR の条件および算出方
法は Yamaguchi ら（３）の方法にしたがった。
４．エルゴステロールの抽出および定量
エルゴステロールの抽出は Clemmemsen ら（２）の方法にしたがった。凍結乾燥された希釈系列試料をメタノール（10%KOH）で処理後，シクロヘキサンで抽出し，Chromolith 5-4.6mm カラム（Merck 社製）を用いた HPLCで定量分析を行った。溶離液には 95%メタノールを使用し，UV280nm にてエルゴステロールのピークを検出し定量した。
図－２．エルゴステロールによる菌糸体定量

Ⅲ 結果および考察

Fig.2 quantification of mycelium by ergosterol

１．qPCR 法によるマツタケ菌糸体定量結果

analysis
NBRC33136 株（n=3）および TFM S-08006 株（n=1）の培養菌糸体を用いて調整された 1000，100，10 µg のマツタケ菌糸体から定量することができた（図－２）。1 お
よび 0.1 µg の菌糸体から抽出された試料からはエルゴステロールは検出されなかった。定量された試料データと既知菌糸体量との相関を解析したところ，両菌株とも強い相関を示した（NBRC33136: R2=0.9999，TFM S-08006:R2=1）。菌糸体のみを対象とした本方法の検出限界は 10µg であることがわかった。菌株の違いによるエルゴステ
ロール定量結果については，1000 µg 程度の菌糸体量の多い時に異なる定量値となったが，100 µg 以下では違い
図－１．qPCR 法による菌糸体定量は見られなかった。

Fig.1 quantification of mycelium by qPCR

３．qPCR 法とエルゴステロール法との比較

NBRC33136 株（n=3）および TFM S-08006 株（n=1）

qPCR 法による定量の結果のうち，抽出容量的に限界の培養菌糸体を用いて調整された 1000，100，10，1，0.1を超えていた 1000 µg のデータを除いて，定量された試µg のすべてのマツタケ菌糸体から定量することができ料データと既知菌糸体量との相関を解析した（図－３）。

た（図－1）。1000 µg の試料の菌糸体算出量が低く推定さ両菌株ともエルゴステロールと同様の強い相関を示しれている点については，DNA 抽出に用いる CTAB 液のた（NBRC33136: R2=0.9811，TFM S-08006: R2=0.9996）。

DNA を抽出しうる容量を超えているために起こった結

これらの結果は，qPCR 法による定量もエルゴステロー果と推察できる。また，0.1 µg の試料の菌糸体算出結果

ル分析による定量も，菌糸体定量法として十分に役割をにおいてばらつきが大きくなっている。この結果は，0.1果たし得ると言える。

µg 程度の菌糸体から抽出された DNA が少なく，抽出さ菌株間の違いとしては，菌糸体の多い試料に対してエれた溶液に存在する DNA がポアソン分布に従う状況にルゴステロールの値で多少のずれはあるものの，両方法あることに起因するものと推察できる。このことから，ともに，菌株間の違いで定量結果に相違があるとは言え

qPCR による菌糸体推定法において，菌糸体のみを対象ない結果となった。すなわち，培養菌糸体においては，とした検出限界は 0.1 µg であることがわかった。また，菌糸体量に対して測定対象となる DNA およびエルゴス菌株の違いによる定量結果の違いも見られなかった。

テロールの量が相関し，かつ菌株には影響しないことが２．エルゴステロール分析によるマツタケ菌糸体定量
結果示された。
両方法の測定範囲であるが，エルゴステロール分析は10 µg から 1000 µg 以上の比較的菌量の多い状況下で効－110 －関東森林研究 68-2(2017)

なんらかの方法で他の菌根菌や微生物と区別する必要がある。
一方，qPCR 法を用いる方法においても同様に特異性の担保は重要である。qPCR 法による定量は，使用するプライマーによっては，総細菌量や総真菌量を定量したり( ５，６），特定の菌を定量したりすることが可能である（３，４）
。本稿のように，マツタケ菌糸体を特異的に定量する場合，マツタケ DNA を特異的に増幅することができるプライマーを用いることにより特異性を担保している。これにより，マツタケ以外の菌根菌や真菌，細菌を含む他の微生物が混在している条件であっても，マツタケのみを定量することが可能である。そのため，純粋図－３．qPCR 法による菌糸体定量と相関培養条件でない場合や野外サンプルも，特に区別する手

Fig.3 quantification of mycelium by qPCR and段を必要とせず，定量することができる。本稿では特定correlation analysisの菌を定量することを目的として両手法を比較したが，力を発揮する方法であると言える。それに対し，qPCR 法

目的に応じた手法選択が要求される。

による菌糸体定量は，0.1 µg から 100 µg の比較的菌量の

本研究は農林水産省農林水産技術会議事務局委託プロ少ない状況下で効力を発揮する。分析の特性から，エルジェクト研究「森林資源を最適利用するための技術開発」

ゴステロール分析には比較的菌量を多く必要とすることの一環として実施した。また、本研究は国立研究開発法

から，少ない菌量を分析する際には，サンプリング量を人森林総合研究所エンカレッジモデルによる研究支援を多くし，分析に際し濃縮する必要がある。その点，qPCR受けた。

法はエルゴステロール分析による検出限界値の 100 倍の検出限界を示し，少ない菌量の分析であっても特別な作引用文献業を付加することなく分析可能である。ただ，菌量が多（ １ ） NYLUND, J.E. and WALLANDER, H. (1992)

い場合，抽出容量限界を越えてしまう場合があるため，

Ergosterol analysis as a Means of Quantifying Mycorrhizal

サンプリング量の調整や，サンプルの希釈を行った後にBiomass. Methods in Microbiology 24:77-88分析をする等の工夫が必要である。

（２）CLEMMENSEN, K.E., BAHR, A., OVASKAINEN, O.,DAHLBERG, A., EKBLAD, A., WALLANDER, H.,
STENLID, J., FINLAY, R.D., WARDLE, D.A., LINDAHL,Ⅳ まとめ
本稿では，エルゴステロール定量法と qPCR 法を用い

B.D. (2013) Roots and associated fungi drive long-term carbon

たマツタケ菌糸量の定量法において菌糸体量を推定でき

sequestration in boreal forest. Sience 339: 1615-1618

ることがあらためて示されたとともに，菌糸体量とエル（３）YAMAGUCHI, M., NARIMATSU, M., FUJITA, T.,

ゴステロール量と DNA 量との量的関係性も明らかとな

KAWAI, M., KOBAYASHI, H., OHTA, A., YAMADA, A.,った。

MATUSHITA, N., NEDA, H., SHIMOKAWA, T., MURATA,純粋培養菌体を用いた本稿の結果により，両方法ともH. （ 2016 ） A qPCR assay that specifically quantifies

菌糸体との相関が高いことがわかったが，マツタケ菌糸Tricholoma matsutake biomass in natural soil. Mycorrhiza 26:体を特異的に定量するといった目的の場合，常に特異性

847-861をどのように担保するかが重要となってくる。エルゴス（４）YAMAGUCHI, M., NAKAMURA, M., TAKANO, M.,

テロールは他の菌根菌等の細胞構成成分でもあるために，SEKIYA, A. (2009) Quantification of the mycelial mass of

純粋培養条件でない場合や，野外サンプルを用いる場合，

the white-rot fungus Pleurotus pulmonarius by real-time PCR.

注意が必要である。単にサンプル中のエルゴステロール

Bulletin of FFPRI Vol.8 No.411:133-141を定量したいのであれば問題ないが，目的の菌根菌と他（５）FIERER, N., JACKSON, J. A., VILGALYS, R.,の菌根菌や真菌が混在するような条件の場合，これらのJACKSON, R. B. (2005) Assessment of soil microbial

総量としてエルゴステロールが定量される。エルゴステ

community structure by use of Taxon-specific quantitative

ロール定量法によるマツタケ菌糸体定量を行う場合は，PCR assays. Applied and Environmental Microbiology: 4117-－111 －4120
（６）LANDEWEERT, R., VEENMAN, C., KUYPER, T. W.,
FRITZE, H., WERNARS, K., SMIT E. (2003) Quantificationof ectomycorrhizal mycelium in soil by Real-time PCR
compared to conventional quantification techniques. FEMS
Microbiology Ecology: 283-292－112 －