大気圧プラズマ照射によるマクロファージの分化とサイトカイン放出特性○ 小髙沙織1, 林信哉1, 合島怜央奈2, 山下佳雄2 1九州大学総合理工学府, 2佐賀大学医学部

研究背景
マクロファージの重要な役割◼ 食作用: 体内に侵入した病原体を発見し取り込み攻撃する◼ 抗原提示: 病原体の抗原情報をT細胞に渡す⇒免疫応答の開始

近年，がんの第四の治療法として免疫治療が効果を挙げてきている．血液中から免疫細胞を分離するとマクロファージやリンパ球が混在した状態となる．現状では，各免疫細胞ごとに異なる活性化法を用いて，いずれかの免疫細胞を活性化B細胞させる方法が採られている．
これまでの研究より，プラズマ照射によってマクロファージやT細胞，NK細胞などを一度に活性化できる可能性が示されてきた．そこで，複数種類の免疫細胞が混在する場にプラズマを作用させた場合に，免疫で重要な役割を果たすマクロファージの活性化状態を明らかにすることは，プラズマ免疫治療の実用化に大きく貢献する．

Required◼血液に近い環境◼細胞増殖能の向上◼食作用の促進マクロファージの分化単球様マクロファージ

IFN-γ, LPS

IL-1β, TNF-α
M1:攻撃を強化

IL-4, IL-13

IL-10
M2:攻撃を抑制

Solutions◼他の細胞との相互反応◼M1に活性化させる◼LPS，IFN-γ ←This work

インターフェロン-γ（IFN-γ）◼T細胞やNK細胞から産出されるサイトカインであり，腫瘍や病原体への攻撃を強化する◼マクロファージを刺激して食作用を促進させる
マクロファージがT細胞に抗原提示している様子
出典: NHK

M1:病原体の貪食と抗原提示を強化し，病気の進行を抑制する
M2:病原体への攻撃を抑制し，損傷組織の修復を促す

研究目的: マクロファージ-T細胞系に対するプラズマ照射の影響を調べ，マクロファージの分化特性を明らかにする．
最終目標: プラズマにより活性化された血液・リンパ液（マクロファージ-T細胞）を用いた免疫治療法の確立を目指す．
実験方法
本研究でのプラズマ照射と細胞のシーケンス

食作用の評価方法: 蛍光ビーズ
(a)
(b)
(b)

plasmaactivationdifferentiation
Th1 cellCD4 positive
Helper T-cell

IFN-γ

1,000 µm
1,000µm

plasmaFig.2 蛍光ビーズを加えた24時間後の蛍光顕微鏡画像(a)マクロファージのみにプラズマ照射 10 ppm, 40 s．
(b) 拡大図

Fig.1 大気圧DBDプラズマ源

実験条件◼ マクロファージ: J774.1(Mouse)
T細胞: EL-4(Mouse)◼ 生成ガス: 純酸素

気相オゾン濃度[ppm]1030100

プラズマ照射時間[sec]403030蛍光ビーズ（微粒子）• Surface material: FITC
• pH酸性条件で蛍光• 励起波長 / 発光波長：509 nm / 533 nm

IFN-γ
macrophagecell growth

Enhanced phagocytosis: Priming state

プラズマによる効果◼ 細菌に代わってT細胞をTh1細胞に分化誘導 ⇒ IFN-γの放出◼ マクロファージの細胞数と食作用を向上させ，プライミング状態（臨戦態勢）に誘導する

実験結果
細胞増殖能力と食作用: 酸素プラズマとT細胞により産出されるIFN-γがサイトカインがマクロファージに与える影響を評価する(A)~(D)のグラフは，マクロファージへのプラズマ照射条件が異なる．グラフの横軸はT細胞のプラズマ照射条件を示す．
(B) MΦへプラズマ照射(10 ppm)
2phagocytosis

1.2
10.8
0.6
0.4
0.2

cell proliferation
phagocytosis/cell

1.8
1.6
1.4
1.2
10.8
0.6
0.4
0.2
00control

no plasma

10 ppm30 ppmcontrol

100 ppm

1.8

phagocytosis

noadd no plasma 10 ppm

30 ppmcell proliferation

1.6

1.6

phagocytosis

1.4

phagocytosis

1.2

1.2
110.8

0.80.60.60.40.4

0.20.200100 ppm

cell proliferation
phagocytosis/cell

1.4phagocytosis/cellcontrolno add no plasma 10 ppm

Conditions of T cell

Conditions of T cell

1.8

Normalized intensity[a.u.]

1.4cell proliferetion
phagocytosis/cell

Normalized intensity[a.u.]

Normalized intensity[a.u.]

1.6(D) MΦへプラズマ照射(100 ppm)

(C) MΦへプラズマ照射(30 ppm)
Normalized intensity[a.u.](A) MΦへプラズマ照射なし

30 ppmcontrol

100 ppm

Conditions of T cellno addno plasma 10 ppm

30 ppm100 ppm

Conditions of T cell

Fig.3 細胞数と食作用のプラズマ照射条件依存性

Fig.4 蛍光顕微鏡画像◼ (A)より，プラズマ照射したT細胞を加えたことで細胞増殖能が低下し，同時に食作用の向上が見られた．⇒ 食作用向上を促進し細胞増殖を抑制する一般的なIFN-γの機能を確認．
◼ (B)より，細胞増殖はマクロファージのみの場合では54 %に増加しているが，プラズマ照射したT細胞を加えたことで最大32 %低下した．1細胞当たりの食作用は最大58 %向上した．
⇒ 低濃度のオゾンは食作用向上に適している．また，細胞増殖能と食作用の向上はトレードオフの関係にある．
◼ (C),(D)より，より高濃度なプラズマを照射したT細胞を添加することにより，細胞増殖能が向上することが明らかとなった．一方で，食作用はほぼ変化しない結果が得られた．

M1マクロファージが放出するIL-1β: マクロファージの活性化度を評価する

43210543210control

no plasma

10ppm

30ppm

Conditions of T

100ppm65cell proliferation
IL-1β
IL-1β/cell

43210control

no addno plasma

10ppm

30ppm

100ppmT細胞 IFN-γ

7

Normalized intensity[a.u.]

56cell proliferation
IL-1β
IL-1β/cell

Normalized intensity[a.u.]cell proliferance
IL-1β
IL-1β/cell677

Normalized intensity[a.u.]

Normalized intensity[a.u.]7(D)プラズマ100 ppm MΦ(C)プラズマ30 ppm MΦ

3.5

Normalized IFN-γ
concentration per cell [a.u.](B)プラズマ10 ppm MΦ(A)プラズマなしMΦ

cell proliferation
IL-1β
IL-1β/cell65

no addno plasma

10ppm

Conditions of TConditions of T

30ppm

100ppm100 ppm

32.5421.5

3210.510control

30 ppmcontrolno addno plasma

10ppm

Conditions of T

Fig.5 IL-1βのプラズマ照射条件依存性

30ppm

100ppm0control

5102030

Irradiation Time [s]Fig.6プラズマ照射T細胞が産出するIFN-γ量◼ (A)より，T細胞の培養上清を加えるとマクロファージが産生するIL-1β産出量が増加した．100ppm, 30 secで照射したT細胞培養上清を加えたときIL-1βの産生量が2.8倍に向上した．
⇒ CT値(ozone concentration[ppm]×irradiation time[min])が50のときFig.5が示すようにT細胞がTh1に分化してIFN-γを多く分泌し，M1マクロファージに活性化していると考えられる．
◼ (B)より，マクロファージとT細胞の両方に10 ppm, 40 secの条件で照射すると，マクロファージのIL-1β産出量は1ウェルで約4.3倍，1細胞当たりに換算すると約6倍まで向上した．
⇒ IL-1β産出量増加よりM1マクロファージへの活性化が確認された．T細胞とマクロファージに適量のオゾンが作用するとマクロファージの食作用が飛躍的に向上することが分かった．
◼ (C),(D)より，マクロファージにプラズマを照射しない場合，または30, 100 ppmの条件でプラズマ照射した場合，T 細胞培養上清中の IFN-γ の増加とともにIL-1β産出量が増加した．
一方で，高濃度プラズマのマクロファージへの照射は，未照射の場合よりもマクロファージの活性が抑制されることが分かった．

治療応用
STEP1: 高オゾン濃度のプラズマを照射して細胞数を増加させる
STEP2: 低オゾン濃度のプラズマを照射してM1に活性化させる⇒食作用向上を促進する

採血

plasmaplasma

体内に戻す
出典: 福岡がん総合クリニック

結論✓細胞増殖能と食作用はトレードオフの関係である．
✓マクロファージとT細胞へのプラズマ照射条件を変更することで，細胞増殖能向上かM1活性化(食作用向上)を選択することが可能である．
✓細胞増殖能を向上させるには高オゾン濃度のプラズマを，食作用を向上させるには低オゾン濃度のプラズマを照射する．

謝辞
本研究の一部は，日本学術振興会JSPS科研費23H00100の助成を受けたものです．