2-8 生物の環境適応機構の解明●代表者

澤田博司（生命科学科・教授）●分担者

間瀬啓介（生命科学科・教授）
外川徹（生命科学科・准教授）

井上みずき（生命科学科・准教授）【研究の目的および概要】
本研究は，生物の環境適応機構を多様な生物現象から明らかにすることを目的としている。具体的に本年度は，以下の 4 つの目的で研究を遂行する。
1. カイコの卵休眠は，環境条件の悪化の結果やむをえず発育を休止する休眠ではなく，不良環境が訪れる以前の生育にとって不都合のない環境のもとで感受し記憶され次世代の卵で実行される。この休眠に際し，どのような分子機構で発生を停止させるのかを解明するために，初期発生や胚子活性化に密接に関わる遺伝子の構造や発現などの解析，またその遺伝子産物の機能や機能発現の調節機構を明らかにする。
2. 絹糸虫類が外敵から身を守る一手段として繭の多様な緑色化によるカモフラージュがあり，複数の遺伝子が制御している。この複雑な形質の発現様式を解明するために，カイコガの緑繭系統やその染色体置換系統をはじめとした研究素材とゲノム情報を用い，それらの原因遺伝子の同定と機能解明を行う。
3. 昆虫の体表面を覆うクチクラは，種・発生段階・体の部位により物理的性質が異なり，昆虫の様々な環境への適応を可能にしている。このクチクラ多様性の分子メカニズムを理解するために，クチクラの 2 つの主要構成成分であるクチクラタンパク質ファミリーとキチンに注目し，両者の相互作用の多様性を解明する。
4. 植物の送粉成功は地域生態系の媒介昆虫の種組成や個体数によって左右される。そこで，地域の植物相を明らかにするとともに訪花昆虫の体表についている花粉の種組成を明らかにすることで，植物への忠実度を測定する。
これらの技術を用いて，植物と昆虫の交互作用系を明らかにする。
【研究の結果】
1. 本研究では，浸酸処理時におけるカイコのカルシニューリン調節サブユニット（BmCalR）に着目し，BmCalR をコードする cDNA のクローニング，遺伝子の発現，リコンビナント BmMCSC（rBmMCSC）の調製などを行った。まず，浸酸処理した休眠卵で BmMCSC 遺伝子の発現解析を RT-PCR で行った結果，水で処理したコントロールと比較して発現が増加しており，その発現は 浸酸処理直後から認められた。一方，大腸菌発現系を用いて rBmCalR の調製と精製を行った結果，rBmCalR が調製できヒスチジンカラムによる精製後の rBmCalR は SDSPAGE 上で単一のバンドとし確認できた。精製した rBmCalR を抗原に用いてポリクローナル抗体の作成を試みた
ところ rBmCalR を特異点に認識する抗体を得ることができた。
2. 昨年度までに笹繭発現遺伝子 Ga の候補として絹糸腺で発現している糖輸送体遺伝子を見出したが，矛盾する系統が見つかったので再検証したところ責任遺伝子としての可能性が低くなってしまった。そこで，新たなゲノム情報から，候補領域に見出されたトレハロース輸送体遺伝子をはじめ，他の糖関連遺伝子についても発現様式や塩基配列と表現形質との関連性を検討したところ，形質に対応した変異を見出すことができた。一方，笹繭を緑繭化する遺伝子の実態として見出した P5CR1 遺伝子が，半世紀ほど前に発見された緑繭程度を抑える遺伝子Ign-1 であることを裏付ける結果を得ることができた。
3. 昆虫の体表を覆うクチクラは，主にキチンとクチクラタンパク質 (CP) から構成され，その物理的性質は多様である。この多様性は CP の多様性に起因すると考えられている。そのメカニズムの一端を明らかにするためには，CP 最大のグループである CPR タンパク質群のキチン結合能を比較することが有効だと考えられる。そこで，

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CPR のうち，属するサブグループの異なる 2 つの CPR の組換えタンパク質を合成し，そのキチンへの結合性を調べた。その結果，両者は非常に異なるキチンへの結合性を示した。
4. 小石川植物園でドクダミの花に接触した昆虫を網でスウィーピングしてサンプリングした。網でスウィーピングできないものに対しては吸虫管を用いた。調査期間中 20 匹の昆虫が訪花し，そのうち 16 匹の捕獲に成功した。
捕獲した昆虫を同定した結果，昨年と同様，ホソヒラタアブ・クロヒラタアブ・アシブトハナアブ・アトジマコ
ハナバチの 4 種とアリが捕獲されるとともにセイヨウミツバチが捕獲された。また捕獲できなかったが小型のハチが確認された。
【研究の考察・反省】
1. BmCalR 遺伝子は，浸酸処理によりその発現が誘導される事が強く示唆された。この結果は，浸酸刺激により誘導される BmCalR は，浸酸処理により遊離した Ca2+ が結合することにより BmCalR がさらに触媒サブユニットに結合し，フォスファターゼとしての機能が活性化されることが示唆される。そして，その結果，休眠移行を阻害する因子を活性化しているのではないかと考えられる。反省点としては，今回の rBmCalR は，大腸菌内で封入体として発現してしまった。それにより可溶化剤で可溶化し可溶化剤存在下で精製する事になった。そのため得られた rBmCalR は，抗体作製用としては適しているが，機能解析には不向きである。Ca2+ との結合能以外の機能解析を行う場合，rBmCalR を可溶化状態で発現させることが今後の課題の一つである。
2. 笹繭発現関連遺伝子 Ga の責任候補遺伝子が複数となり，さらなる解析による絞り込みが必要となった。これまで変異形質と遺伝子変異との対応関係から責任遺伝子の同定を試みてきたが，より直接的な検証方法として，これまでの候補遺伝子を含めた遺伝子破壊実験による機能喪失が生じるかを調べる必要がでてきた。そのため，今年度からゲノム編集技術の導入を着手しており，次年度その実験系が整い次第 Ga 候補遺伝子について実施し，その検証を本格化する予定である。
3. 異なるサブファミリーに属する 2 つの CPR のキチン結合性が大きく異なっていたことから，このことがクチクラの多様性に大きく寄与している可能性が考えられる。しかしながら，今回用いた組換えタンパク質は部分精製したものであったため，精製度をあげて解析する必要がある。また，各 CPR サブファミリーに属する 1 種類のタンパク質しか調べていないため，それぞれ複数種類のタンパク質について同様の解析を行い，タンパク質の構造とキチンへの結合性の関連について検討する必要がある。
4. 昆虫に体表花粉が付着しているのは確認でき，またドクダミの花粉と思われる花粉が見つかった。
ただし，花粉の種組成判定や花粉一粒からの DNA 抽出はできなかったため，実体顕微鏡下での花粉の分離方法の改善を進めたい。
【研究発表】
・ 第 44 回日本比較内分泌学会大会及びシンポジウム
カイコガの休眠阻害時におけるカルシニューリン調節サブユニットの生化学的解析
2019 年 11 月 8 日 -10 日／さいたま市
・ 平成 31 年度蚕糸・昆虫機能利用学術講演会
蟻蚕の探索行動に関与する遺伝子の座乗染色体の同定2019 年 3 月 22 日 -23 日／東京農工大学小金井キャンパス
・ 第 5 回蚕糸・昆虫機能利用関東地区学術講演会
カイコ緑繭抑圧遺伝子 Ign-1 とピロリン 5 カルボン酸還元酵素遺伝子 P5CRR1 との関係解明

362019 年 11 月 16 日／東京農工大学府中キャンパス
・ 日本蚕糸学会第 90 回大会
CPR クチクラタンパク質のサブファミリー間でのキチン結合性の比較
2020 年 3 月 6 日／上田・ Eighth International Symposium on Molecular Insect Science
Cuticular protein genes are expressed not only in epidermis but also in endocrine organs
2019 年 7 月 8 日／ Sitges, Barcelona, Spain
・ Eighth International Symposium on Molecular Insect Science
Functional analyses of PTEN-like phosphatase (Plip) in silkworm, Bombyx mori2019 年 7 月 8 日／ Sitges, Barcelona, Spain・ 4th International Insect Hormone Workshop
Tissue dependent induction of hairy gene by juvenile hormone in Bombyx mori2019 年 7 月 1 日／ Kolymbari, Crete, Greece・ 4th International Insect Hormone Workshop
Functional study of PTEN-like phosphatase (Plip) in silkworm, Bombyx mori2019 年 7 月 1 日／ Kolymbari, Crete, Greece【研究成果物】
・ Identification of novel genes expressed highly and selectively in the corpora allata of the silkworm, Bombyx mori(Lepidoptera: Bombycidae). Appl. Entomol. Zool., 55, 45-54 (2020)
DOI:https://doi.org/10.1007/s13355-019-00652-y37