仙台医療センター医学雑誌 Vol. 1 March 2011

原著論文
葉タマネギ由来のレクチン活性成分とそのがん細胞に対する作用
河野（佐々木）智子1），細野雅祐2），菅原栄紀2），立田岳生2），諏江裕1），仁田一雄2）
1) 国立病院機構仙台医療センター

薬剤科2) 東北薬科大学分子生体膜研究所

分子認識学

≪抄録≫
タマネギは，日常的によく食用に供されるネギ科（Alliaceae）の植物で，ニンニクも同属である。葉タマネギ（収穫前の幼若な鱗茎）からレクチン活性画分を部分精製し，がん細胞凝集活性および増殖抑制活性を検討した。セファデックス G-75 によるゲルろ過クロマトグラフィーにより得られた４つの画分（G1～G4）のうち，トリプシン処理ウサギ赤血球凝集活性は主に G4 画分に回収され，分画前の約 27 倍に濃縮された。赤血球凝集活性は，高マンノース型糖鎖を多く含有するチログロブリン（0.2 μg/mL）およびインベルターゼ（0.78 μg/mL）で阻害され，レクチンの存在が確認された。ウェスタンブロット後，標識チログロブリンに結合するバンドを染色したところ，およそ 11 kDa およそ 62 kDa に反応が認められた。G4 画分は P388 細胞や Jurkat 細胞を強く凝集（それぞれ 0.09 μg/mL，0.7 μg/mL）したが， K562 細胞は凝集しなかった（>43 μg/mL）。P388 細胞に対する増殖抑制作用は G1，G2 および G4 画分に認められたが，濃度依存的な抑制活性は G1 画分が最も高かった。G1 処理 P388 細胞では，ゲノム DNA の断片化が観察され，アポトーシスを誘導することが明らかになった。
キーワード：

レクチン，葉タマネギ，がん細胞凝集，アポトーシス（2010 年 1 月 13 日

原稿受領、1 月 24 日

採用）

疇に入れない1,2)。細胞表面の糖鎖構造を認識して結はじめに広義のレクチンは，糖認識部位（carbohydrate合することから，機能分子としての役割が注目され，recognition domain, CRD）を有する（糖）タンパ

細胞接着や分化・増殖など，糖鎖を介した多くの生ク質で，生物全般にわたり広く存在する。また狭義

命現象に関与していることが知られている2)。とりでは，細胞凝集活性をもち，その結合性が糖鎖によわけがん細胞は，正常細胞と比較して，特に細胞表って一義的に規定されるタンパク質であり，免疫産層の糖鎖構造が変化している3)。肝がんにおける -物であるところの糖鎖抗体や糖転移酵素はこの範

フェトプロテイン-L3 分画（マーカーはコアフコー

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葉タマネギレクチンの癌細胞に対する作用溶出した後，0.2 M D-マンノース溶出画分を得た。

ス4)）に対するレンズマメレクチンなどは，まさにレクチンの病理あるいは診断への応用に適合する好例であると言える5)。また近年，がんに限らず，（２）赤血球およびがん細胞凝集反応13)

幅広く臨床分析に応用できるツールとして，「レク赤血球凝集反応はトリプシン処理 2%ウサギ赤血チンマイクロアレイ」システムが実用化されており，球浮遊液を用い，96 穴マイクロタイタープレート

糖鎖の違いを網羅的に検出する「糖鎖プロファイリにて行った。またがん細胞凝集反応には，AH190Aング」技術が実用化され注目されている6)。さらに（ラット肝がん），S180（マウス肉腫），P388（マ

いくつかのレクチンは，がん細胞に対して直接作用ウス白血病），K562（ヒト慢性骨髄性白血病），

し，抗腫瘍活性をもつものもあり，治療薬としてのJurkat（ヒトT細胞白血病），Raji及びDaudi（ヒト応用も検討されている7,8)。

バーキットリンパ腫）の各細胞（1×106 cells/tube）

タマネギ（Allium cepa L.）は，食用に供されるを用い，小試験管にて行った。

ネギ属の最もポピュラーなものであり，ニンニク（Allium sativum L.）も同属である。従来の分類（３）ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミ

ではユリ科（Liliaceae）の多年草と説明されている

ドゲル電気泳動（SDS-PAGE）およびウェスタンブが，現在ではネギ科（Alliaceae）と称されている。

ロッティング

これまでに，ニンニクの鱗茎中に存在するマンノー

SDS-PAGEはLaemmuliの方法14)により行った。

ス結合性レクチン（ASA）が，プロテアーゼ活性9)，タンパク質をイモビロン-PSQに転写後，ビオチン標

がん細胞増殖抑制作用10)，リンパ球の活性化作用11)

識チログロブリンおよびHRP標識アビジンと順次などの生物活性を有することが報告されているが，反応させ，コニカイムステンHRP-100 を用いて発タマネギ由来のレクチンについては抗HIV作用 12)色させた。の他はあまり知られていない。
本研究では，タマネギの鱗茎がまだ肥大しないう（４）がん細胞増殖抑制作用
96 穴平底プレートにゲルろ過画分の 2 倍希釈系

ちに収穫した葉タマネギからレクチン活性画分を分離し，がん細胞に対する反応性を観察した。

列（50 μL/well，RPMI1640 培地，10% ウシ胎児血清）を作製し，P388 およびJurkat細胞（2×105

方法cells/mLに調整）を 50 μL加え， 37 ℃，5% CO2（１）レクチン画分の調製

飽湿下で培養した。生細胞数の計測はトリパンブル

葉タマネギは，仙台市近郊で 3 月～4 月に収穫さー色素排除試験により行った。

れたものを購入し，鱗茎を細かく切断して材料とした。リン酸緩衝液（PBS）（20 mmol/L，pH 7.4，（５）DNA 断片化の観察

0.15 M NaCl を含む）に浸し，冷却しながらホモジ

G1 で処理した細胞を溶解緩衝液（50 mmol/L トリナイズした後，遠心分離（10,000 rpm, 20 min）し，ス-塩酸緩衝液，pH 6.8，10 mmol/L エチレンジア

上清を綿栓ろ過した。ろ液を 80%飽和硫酸アンモニ

ミン四酢酸, 0.5% ラウリルサルコシンナトリウ

ウム（硫安）で塩析し，蒸留水に対して透析後, 凍ム）に懸濁し，リボヌクレアーゼ A（10 mg/mL）結乾燥して 80%飽和硫安沈殿画分を得た。この画分を加えて 50 ℃，30 分間，さらにプロテイナーゼ K（1 g）をセファデックス G-75（4 x 40 cm）に付（10 mg/mL）を加えて 50 ℃，60 分間処理した。

し，PBS による溶出画分を G1, G2, G3, G4 とした。

得られた DNA 画分を 2 %アガロースゲルを用いてこのうち，G4 画分をチログロブリン-セファロース電気泳動した。

カラム（1×8 cm）に添加し，PBS で素通り画分を23

仙台医療センター医学雑誌 Vol. 1 March 2011

表 1 セファデックス G-75 ゲルろ過画分の赤血球凝集活性

1HU（Hemagglutination Unit）は，試料が 2%ウサギ赤血球を凝集する最低濃度（タンパク量/mL）である。タンパク質 1 mg あたりの HU を比活性とし，また 80%飽和硫安沈殿画分の比活性を１としたときの各画分の活性値を活性比として示した。

図 1 葉タマネギ成分のゲルろ過パターンおよびウェスタンブロッティング A： セファデックス G-75 によるゲルろ過クロマトグラム

B： ゲルろ過画分の SDS-PAGE パターン（クマシー染色）。M はタンパク質マーカー

セファロースカラムの 0.2 M D-マンノース溶出画分のブロッティングパターン

C： チログロブリン-

レーン 1～クマシー染色，レーン 2～ビオチン標識チログロブリン-HRP 染色

高い凝集性を示した。一方，K562 細胞に対しては結果および考察
本研究では，葉タマネギレクチンの部分精製と細ほとんど凝集が認められなかった。G3 の赤血球凝胞凝集活性および抗腫瘍活性について検討した。

集活性が最も低い（表 1）ことから，G3 画分のメ80 %飽和硫安沈殿画分をセファデックス G-75 によインバンドである 14kDa 付近のバンドは凝集活性

るゲルろ過クロマトグラフィーで 4 つに分画し，ウに関与しないと考えられる（図 1B）。赤血球凝集活サギ赤血球に対する凝集活性を検討したところ，活性の最も高い G4 画分について糖および糖タンパク性は主に G4 画分に回収され，分画前の 27 倍に濃質による凝集阻害反応を行ったところ，単糖では縮された（図 1A および表 1）。また，この画分を用

D-マンノース，糖タンパク質ではチログロブリン，いて各種がん細胞に対する凝集活性を観察したとインベルターゼで阻害が観察され，最低凝集阻害濃ころ，表 2 に示すように，P388 細胞に対して最も度はそれぞれ，120 μM，0.2 μg/mL，0.78 μg/mL

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葉タマネギレクチンの癌細胞に対する作用

大きく２つに分けられる。一つは，タマネギやシャロットの根あるいは葉部分に由来するもので，含有量は非常に少ない。ホモオリゴマー構造をもち，強い抗ウィルス作用を有するのが特徴である。もう一つはニンニクやラムソンの茎（鱗茎）に存在するグループで，含有量が高く，ホモあるいはヘテロオリゴマー構造をもち，抗ウィルス作用はないか，または非常に弱い12,16)。今回，葉タマネギから得られた
表 2

G4 画分のがん細胞凝集活性a) がん細胞（1×106

レクチンは，前者に属すると考えられるが，抗ウィcells/ tube）に対する最低凝集濃度ルス作用について今後確認する必要がある。
前述したように，ASAはU937 およびHL60 細胞であった。既知のAllium属由来レクチンは，D-マに対してアポトーシスを誘導することが知られてンノース結合性のものが知られていることから12)，いる 10) 。一方，タマネギレクチンについては，抗G4 画分からチログロブリン-セファロースによりHIV作用に関する報告はあるものの12)，がん細胞にレクチンの精製を試みたが，0.2 M D-マンノース溶対する作用は報告されていない。そこで，G1～G4出画分（図 1C）のクマシー染色では多数のバンド画分についてP388 細胞の増殖に対する効果を検討が観察され，レクチンの単離はできなかった。ビオ

したところ，図 2Aに示したようにG1，G2 およびチン標識チログロブリンを用いて結合タンパク質G4 画分に用量依存的な増殖抑制効果が認められ，の同定を行ったところ，62 kDaおよび 11 kDa付近

24 h培養処理後のLD50値は，それぞれ 28.3，63 おに顕著なバンドが認められたので，これらが葉タマよび 54g/mLであった。

ネギレクチンの本体であると推測された（図 1C）。
これまで報告されているタマネギ由来レクチンは，12.5 kDaのサブユニットから成るホモ四量体であるとされている。今回の結果では，サブユニット構成として，ほぼ六量体に近い分子量のバンドが染色されていた。しかし，図 1Cの電気泳動は還元条件下で行ったものであるため，葉タマネギレクチンは既知のタマネギレクチンとは若干異なる構造をもち，かつレクチン以外のタンパク質と複合体を形成している可能性が示唆された。このような例として，

図 2 ゲルろ過画分のがん細胞増殖抑制効果

A : P388 細

ニンニク由来レクチン（ASA）はアリシン（ニンニ胞を各濃度で 24 h 処理後，トリパンブルー色素排除試験にクの臭気成分）の生成に関与するアリナーゼと複合より生細胞数を計測。未処理コントロールの細胞生存率を体を形成していることが知られている15)（実際には100%とした。B : G1 画分（3.5 mg/mL）で 24 h 処理した

ASAは，ヘテロ二量体であるASAIとホモ二量体でP388 細胞からゲノム DNA を抽出し，アガロースゲル電気あるASAIIの二種類が報告されているが，ここでは泳動により検出した（詳細は本文参照）。レーン 1～未処理，便宜上，総称してASAと記載した）。

レーン 2～G1 処理。

ネギ科植物由来のマンノース結合性レクチンは，ASAを含め，これまでに数種類報告されているが，結果は示さないが，Jurkat 細胞に対してもほぼ同サブユニット構造および抗ウィルス作用を指標に様の増殖抑制効果が認められた。赤血球およびがん25

仙台医療センター医学雑誌 Vol. 1 March 2011

細胞凝集活性を有する G4 が増殖抑制作用も併せて参考文献示したことから，G4 画分中のレクチン活性成分は1) Goldstein IJ, Hughes RC, Monsigny M, et. al.

高い細胞反応性をもつことが明らかとなった。また，

What should be called a lectin. Nature. 1980;

興味深いことに，赤血球凝集活性が低い G1（G4258 :66.の 1/40）に G4 を凌ぐがん細胞増殖抑制効果が認め

2) Sharon N, Lis H 著、山本一夫、小浪悠紀子訳：られた。ゲルろ過クロマトグラフィーによる挙動か

レクチン

ら，この画分に G4 レクチンが混入していることは

京 2006;pp233-326.

考えにくいため，葉タマネギ抽出物中に，新たな活3) 山下克子，五艘行信，堀田恭子，他：癌と糖鎖性物質の存在が示唆された。現在，増殖抑制作用を異常 グリコパソロジー

指標に，G1 タンパク質の精製を検討している。

ィフィク 1993; pp50-130.

P388 細胞を用いて，最も増殖抑制効果の高かった

4) 三善英知：コアフコース糖鎖と腫瘍マーカー

G1 の作用がアポトーシスによるものか否か検討し生化学 2007;79:790-794.

た。アガロースゲル電気泳動により，G1 処理細胞

5) 久保定徳，松川正明：肝細胞がんの腫瘍マーカ

でゲノム DNA の断片化が観察されたことから，アーポトーシスが誘導されていることが明らかとなっ

6) 平林淳，久野敦，内山昇：レクチンマイクロア

た。

レイを用いた糖鎖プロファイリング応用技術の開タマネギあるいはニンニクは，食品としては勿論，

東京：シュプリンガー・フェアラーク東

東京：講談社サイエンテ

癌と化学療法 2004;31:2203-2206.

発 分子レベルから迫る癌診断研究～臨床応用への東京：羊土社 2007;pp164-171.

薬用植物として最も古く（一説では 4000 年以上前）挑戦～から利用されてきた。有効成分はネギ科植物の特徴

7) Pryme IF, Bardocz S, Pusztai A, Ewen SWB.

である硫化アリルなどの有機イオウ化合物が主で，Suppression of growth of tumour cell lines in

その効能は高脂血症，高血圧，高血糖といった成人

vitro and tumours in vivo by mistletoe lectins.

病の予防を始め，多岐にわたって報告されている17)。

Histol Histopathol. 2006;21:285-299.

タマネギの摂取量と胃がんの発症率が逆相関する

8) Nitta K, Ozaki K, Tsukamoto Y, et. al.という結果も報告されており18)，がん予防の見地か

Catalytic lectin (leczyme) from bullfrog (Ranaら社会的な関心も高まっている。また，ASAにおけcatesbeiana) eggs: Mechanism of tumoricidal

る知見では，そのアポトーシス誘導活性は腫瘍細胞activity. Int J Oncol.1996;9:19-23.

に対して特異的であり，正常白血球に対しては毒性

9) Parisi MG, Moreno S, Fernandez G. Isolationを示さないことから，日常摂取する食品中に存在し，and characterization of a dual function protein

しかも副作用が軽微であることが期待できること

from Allium sativum bulbs which exhibits

は重要である10)。前述したように，タマネギのようproteolyticに水分含量の高い植物は相対的にタンパク質含量

Plant Physiol Biochem 2008;46:403-413.

が低く，生理活性タンパク質の精製には困難が伴う

10) Karasaki Y, Tsukamoto S, Mizusaki K, et. al.

が，本研究でも明らかにしたように，葉タマネギレ

A garlic lectin exerted an antitumor activity and

クチンあるいはASAは，抗腫瘍活性という点で非常

induced apoptosis in human tumor cells. Foodに有用である。これらレクチンの活性メカニズムを

Res Int. 2001;34:7-13.

さらに検討することにより，単なる健康食品にとど11) Clement F, Pramod SN, Venkatesh YP.

まらず，疾病予防に関わる機能食品として新たな価Identity of the immunomodulatory proteins from

値を見いだすことができれば意義深い。

garlic (Allium sativum) with the major garlicandhemagglutinatingactivities.

lectins or agglutinins. Int Immunopharmacol.

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葉タマネギレクチンの癌細胞に対する作用

2010;10:316-324.
12) Van Damme EJM, Smeets K, Engelborghs I,
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