新たなオンコ-HuTM異種移植モデル
開発に向けた、NSGTMマウスモデル
およびNSGTM-SGM3マウスモデル
におけるヒト免疫系再構成に関する総合評価
Aaron Middlebrook,1 Eileen Snowden,2 Warren Porter,2 Friedrich Hahn,2 Mitchell Ferguson,2 Brian Soper,3 James Keck,3 Joan Malcolm,3 Shannon Dillmore,2Smita Ghanekar,1 Rainer Blaesius2.
1

BD Biosciences, San Jose, CA; 2BD Technologies, Raleigh-Durham, NC; 3The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME

要旨
最近、メラノーマの治療に対する免疫療法が成功をおさめ、さらに他のさまざまながんにおいても同様な治療が有望であることが示されたことによって、がんにおける免疫系の重要性が脚光を浴びている。実際に、効果的な治療法をデザインし、そして評価するためには、免疫系と増殖している腫瘍細胞のあいだにおける相互作用を総合的に理解しなければならない。なぜなら、その相互作用によって、腫瘍のミクロ環境がつくられるからである。患者由来の異種移植片である（PDX）腫瘍を移植されたヒト化マウスモデルは、研究者にとって、きわめて洗練された研究材料である。すなわち、そのようなヒト化マウスモデルは、腫瘍が免疫細胞の攻撃を回避することを防ぎ、免疫細胞による細胞傷害性を亢進させるための治療戦略を考案する際における理想的な研究材料なのである。
NOD scidガンマ（NSG™）マウスやトリプル・トランスジェニックNSG™マウス（NSG™ -SGM3マウス）のような重症複合型免疫不全マウスは、ヒト腫瘍を移植するための宿主として有用であることが示されている。NSGTM-SGM3マウスは、ヒトサイトカインKITLG、CSF2、およびIL-3を発現しているトリプル・トランスジェニックマウスである。このような免疫不全マウスに、造血幹細胞（CD34+）を移植すると、その体内でヒト免疫系を確立することができる。内因性のサイトカインを発現しているので、骨髄細胞系列および制御性T細胞を分化させることができる。このことは、NSGTM-SGM3マウスが通常のNSG™マウスにくらべて、大きく改善されている可能性を示している。
本論文においては、われわれは、4種類の14色フローサイトメトリー・パネルを用いて、あらゆる免疫系の詳細かつ総合的な解析をおこなった。4種類のフローサイトメトリー・パネルは、免疫系の特異的な分岐の特徴を解析することができるように設計した。免疫系の特異的な分岐とは、1） T細胞、2） NK細胞/樹状細胞/B細胞、および3） 骨髄細胞系列である。NSG™マウスおよびNSG™-SGM3マウスの血液、脾臓、および骨髄組織について、移植後10週目、16週目、21週目、および31週目に、4種類それぞれのパネルを用いて評価した。われわれの実験結果は、NSGTMマウスにくらべて、トリプル・トランスジェニックNSGTM-SGM3マウスにおいては、より完全なヒト免疫系が確立していることを示している。とくに、T細胞サブセットの分布および骨髄細胞系列の全般的な成熟において、特異的な改善がみられた。
異系統のヒト腫瘍を移植されたNSGTMマウスは、がん免疫療法の前臨床試験のための貴重なプラットフォームとなる。

翻訳：順天堂大学国際教養学部 久原 孝俊（くはら たかとし）方法
マウス
NSG™マウスおよびNSG™-SGM3マウスは、ジャクソン研究所（Bar Harbor, ME）において、ヒト臍帯血由来のCD34+hSCを移植することによってヒト化された。その後、BDテクノロジーズ（Raleigh-Durham, NC）に輸送されて、処置をされた。

組織処理
マウスを安楽死させた後、脾臓、骨髄、および末梢血を採取した。脾臓を2枚のスライドガラスの間に挟んで、押しつぶした。2枚のスライドガラスを50mLのチューブに入れ、10-20mLのPBSですすいだ。つぎに、70mmのメッシュを用いて濾過をして、単細胞浮遊液を得た。骨髄は、大腿骨をフラッシングして採取し、先の太いピペットの中を出し入れしてばらばらにした。つぎに、70mmのメッシュを用いて濾過をして、単細胞浮遊液を得た。最終的な全採血において、200-400mLの末梢血を採取した。すべての赤血球を溶かすために、末梢血サンプルならびに脾臓および骨髄から得た単細胞浮遊液を、室温において、4mLのACKバッファー（Gibco A10492-01）で7分間処理した。つぎに、サンプルを45mLのDPBS/2%FBSで1回洗浄した。上清を吸引除去し、沈査をヒトFcRブロックの中でインキュベーションした。つぎに、細胞をPBSに浮遊させ、BD Falcon™96穴プレートに移し、抗体カクテルで染色した。さらに詳細なマウスモデル作製方法については、jax.org/onco-huを参照されたい。

フローサイトメトリー
3種類のサンプル（血液、脾臓、および骨髄）それぞれから得た細胞浮遊液を、「結果」の項に記載したように、4種類の14色パネル
そ れ ぞ れ を 用 い て 30分 間 染 色 し た 。 そ れ ぞ れ の パ ネ ル の 蛍 光 色 素 は 、 B D ホ リ ゾ ン ・ ガ イ デ ッ ド ・ パ ネ ル ・ ソ リ ュ ー シ ョ ン（BD Horizon™ Guided Panel Solution）を利用して選択した。さらに詳細なツール情報については、bdbiosciences.com/us/tools/s/gpsを参照されたい。抗体カクテルは、50mLのBDホリゾン・ブリリアント・ステイン・バッファー（BD Horizon™ Brilliant Stain Buffer：BD Biosciences Cat No.659611）で希釈した。細胞を染色した後、PBSで2回洗浄し、遠心分離（300g, 7分間）して細胞を回収した。
BDフォルテッサ・X-20スペシャル・オーダー（BD Fortessa™ X-20 Special Order: BD Biosciences Cat No. 658226R1）を使って、BD FACSDivaTMソフトウェアを利用してサンプルのデータ解析をおこなった。

図1. NSG™マウスとNSG™-SGM3マウスの比較
NSG™マウス（NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, 005557）は、成熟したB細胞、T細胞、およびNK細胞をもっていない。NSG™-SGM3（NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl
Tg(CMV-IL3, CSF2, KITLG)1Eav/MloySzJ, 013062）マウスは、次の導入遺伝子をもつトリプル・トランスジェニックNSG™マウスである。すなわち、ヒト幹細胞因子（KITLG）、GM-CSF （CSF2）、およびIL-3遺伝子である。レシピエントマウスは、3-4週齢において放射線を照射した後、ヒト臍帯血由来のCD34+造血幹細胞を移植された。ヒト腫瘍を移植する前に、レシピエントマウスが多系列の造血細胞を有し、ヒト免疫系が確立していることを確認した。

結果
T細胞パネルサンプル組織（骨髄、脾臓、および末梢血）を14色パネルで染色した（試薬リストは次ページの図に示す）。色パネルは、T細胞サブセットを計数することができるように設計した。下に示す代表的なフロー・プロット（移植後の週数）は、解析のために利用したゲーティング方法を示している。算出した細胞集団は、ボックスプロットとしてプロットした（次ページ、下）。それぞれのプロットを通る緑色のバンドは、同じ色パネルを用いて測定した、正常な健常成人ドナー（n=6）末梢血中のそれぞれのサブポピュレーションの範囲を示している。すべての算出したポピュレーションのプロットが示されているわけではない。基準値（緑色のバンド）と比較して、ほとんど違いがないプロット、または基準値ときわめてよく一致しているプロットは示していない。中間の16-17週目、および23週目のデータは示していない。

図2. T細胞パネルポピュレーションの階層およびゲーティング方法
青色で示す細胞集団（上）は、すべての組織タイプおよびすべての系統群について測定した（10週目、16-17週目、23週目、および31週目）。細胞集団（ポピュレーション）の階層は、ガイデッド・パネル・ソリューション・ツール（Guided Panel Solution Tool）を利用して作成した（「方法」参照）。
それぞれのポピュレーションは、下に示すゲーティング方法に従って決定した。示すデータは、移植後の週数によってプロットした代表的なセットである。

4

Reagents usedin T cell panel.

100LASERFLUOR

T CELLBD CATALOG #488

FITC
PerCp-Cy™5.5*Mouse Dump
CD8(at right)
560662561PE
PE-CF594
PE-Cy™7

CD38
CD197
CD28555460
562381560684652

APC
APC-H7
AF 700CD3CD45
CD4555342
560274557922405

BV 421
BV 510
BV 605
BV 711
BV 786

CD45RAFVS Live/Dead
HLA-DR
CD25
CD127

562885564406562845563159563324355

BUV 395

Hoechst 33342

561908

10*MOUSE DUMPANTIBODYBD CATALOG #mCD45

553079mH2Kd553592

mTer119561032mCD31558738

mCD41561849

mCD71553266

3175
50
25040

60304020201003002010105040010.0307.5205.0102.500.040303020201002015151050311001010505DC/NK細胞およびB細胞パネル
サンプル組織（骨髄、脾臓、および末梢血）を14色パネルで染色した（試薬リストは次ページの図に示す）。色パネルは、DC細胞、NK細胞、およびB細胞サブセットを計数することができるように設計した。下に示す代表的なフロー・プロット（移植後の週数）は、解析のために利用したゲーティング方法を示している。算出した細胞集団は、ボックスプロットとしてプロットした（次ページ、下）。
それぞれのプロットを通る緑色のバンドは、同じ色パネルを用いて測定した、正常な健常成人ドナー（n=6）末梢血中のそれぞれのサブポピュレーションの範囲を示している。すべての算出したポピュレーションのプロットが示されているわけではない。基準値（緑色のバンド）と比較して、ほとんど違いがないプロット、または基準値ときわめてよく一致しているプロットは示していない。
中間の16-17週目、および23週目のデータは示していない。

図3. DC/NK細胞およびB細胞パネルポピュレーションの階層およびゲーティング方法
青色で示す細胞集団（上）は、すべての組織タイプおよびすべての系統群について測定した（10週目、16-17週目、23週目、および31週目）。細胞集団（ポピュレーション）の階層は、ガイデッド・パネル・ソリューション・ツール（Guided Panel Solution Tool）を利用して作成した（「方法」参照）。それぞれのポピュレーションは、下に示すゲーティング方法に従って決定した。示すデータは、移植後の週数によってプロットした代表的なセットである。

6

Reagents usedin DC/NK andB cell panel.

LASER

FLUOR

NK/B/DC PANEL

488

FITC
PerCp-Cy™5.5*Mouse Dump
CD3(at right)
560835

PEPE-CF594
PE-Cy™7

CD19CD11c
NKp46561

100

10BD CATALOG #*MOUSE DUMPANTIBODYBD CATALOG #mCD45553079

mH2Kd

553592555413562393562101

mTer119561032mCD31558738

mCD41

561849mCD71553266652

APC
APC-H7
AF 700CD16CD14CD45561304
560180560566405

BV 421
BV 510
BV 605
BV 711
BV 786IgD
FVS Live/Dead
HLA-DR
CD123
CD56562518
564406562845563161564058355

BUV 395

Hoechst 33342

5619083175
5025101007515501025

50075

60

50

40

25

200010.060
40

317.5
5.020

2.500.015105010507骨髄性細胞パネルサンプル組織（骨髄、脾臓、および末梢血）を14色パネルで染色した（試薬リストは次ページの図に示す）。色パネルは、骨髄性細胞サブセットを計数することができるように設計した。下に示す代表的なフロー・プロット（骨髄、10週齢のNSGTMマウス）は、解析のために利用したゲーティング方法を示している。算出した細胞集団は、ボックスプロットとしてプロットした（次ページ、下）。
それぞれのプロットを通る緑色のバンドは、同じ色パネルを用いて測定した、正常な健常成人ドナー（n=6）末梢血中のそれぞれのサブポピュレーションの範囲を示している。すべての算出したポピュレーションのプロットが示されているわけではない。基準値（緑色のバンド）と比較して、ほとんど違いがないプロット、または基準値ときわめてよく一致しているプロットは示していない。
中間の16-17週目、および23週目のデータは示していない。

図4. 骨髄性細胞パネルポピュレーションの階層およびゲーティング方法
青色で示す細胞集団（上）は、すべての組織タイプおよびすべての系統群について測定した（10週目、16-17週目、23週目、および31週目）。細胞集団（ポピュレーション）の階層は、ガイデッド・パネル・ソリューション・ツール（Guided Panel Solution Tool）を利用して作成した（「方法」参照）。それぞれのポピュレーションは、下に示すゲーティング方法に従って決定した。示すデータは、10週齢のNSGTMマウスの骨髄を用いてプロットした代表的なセットである。

Reagents used
in Myloid cellpanel.

LASER

FLUOR

MYELOID PANELBD CATALOG #488

FITC
PerCp-Cy™5.5*Mouse Dump
CD195

(at right)
560635

PEPE-CF594
PE-Cy™7

CD163
CD206
CD11b

560933564063557743652

APC
APC-H7
AF 700

CD16
CD14
CD45

561304560180560566405

BV 421
BV 510
BV 605
BV 711
BV 786CD192
FVS Live/Dead
HLA-DR
CD33
CD15564067
564406562845563171563383355

BUV 395

Hoechst 33342

561908561

10*MOUSE DUMPANTIBODYBD CATALOG #mCD45553079

mH2Kd553592

mTer119561032

mCD31558738

mCD41561849

mCD71553266

3160
402004030
2010060
40200151050252015105030
20100103130
201007550250
2.01.51.00.50.0
105030201009結論
NSGTMマウスにおいて、3種類のヒト成長因子（SCF、GM-CSF、およびIL-3）を発現させると、適切な異種移植モデルの開発が著しく改善することが示された。BDの柔軟性のある洗練されたフローサイトメトリー・ツールによって、これらのマウスにおける免疫系を深く総合的に解析することができるようになった。NSG™-SGM3マウスは、NSG™マウスにくらべて、ヒト免疫系の再構成がより改善していた。すなわち、大部分の主要な免疫細胞サブセット―T細胞、B細胞、NK細胞、およびDC細胞―の数が改善していたのである。
骨髄性細胞集団数の著しい低値（とくに、単球数および好中球数の低値が最も顕著である）が、NSGTMマウスおよびNSGTM-SGM3マウスの両系統においてみられた。NSG™-SGM3マウスにおいては、制御性T細胞（Treg）が増加していた（NSG™マウスにおいては、Tregはほとんど見られなかった）。また、NSG T M -SGM3マウスにおいては、記憶T細胞プールが増大しており、それにともなって、未熟なT細胞（CD4+およびCD8+）の数が減少していた。重要なことは、JAX® In Vivo ファーマコロジー・サービス（JAX® In Vivo
Pharmacology Services）のデータによると、NSG™-SGM3マウスにおいては、NSG™マウスにくらべて、骨髄性細胞およびリンパ系細胞ともに有意に数（個数/μL）が多かったということである。NSG™マウスにくらべて、NSG™- SGM3マウスにおいては、ヒト免疫系の再構成が全般的に改善していたという研究結果は、PDX腫瘍の宿主としてNSG™- SGM3マウスが有用であること、そして研究者が腫瘍のミクロ環境内における免疫細胞と腫瘍細胞のあいだの複雑な相互作用の研究をさらに進展させることができることを示している。
このことは、がんの治療において、がん免疫療法を設計し、さらにそれを発展させることにつながるのであろう。

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