加齢に関連した免疫老化ならびに C57BL/6J
同系モデルにおける抗がん剤の毒性および有効性
著者：Jiwon Yang, Andrew Schile, Mingshan Cheng, James G. Keck

The Jackson Laboratory, Sacramento, California

翻訳：順天堂大学国際教養学部 久原 孝俊

CSJ2201A

要旨
高齢者におけるがんの発生率が高くなるにつれ、高齢者におけるがんの免疫療法が広く適用されるようになってきた。しかし、抗がん剤の毒性や有効性を調べるための前臨床試験の多くは、若い健常なマウスを用いておこなわれてきた。本論文においては、われわれは、老齢マウスにおける腫瘍モデルを開発した。このマウスにおいては、免疫老化、すなわち加齢とともに徐々に進む免疫機能の低下がみられる。この老齢マウスは、がん患者の病態をより忠実に再現するので、加齢や免疫老化が抗がん剤の毒性や有効性に及ぼす影響を調べることができる。
本研究においては、われわれは、若齢（7 週齢）、中間年齢（54 〜 58 週齢）、ならびに老齢（76 〜 78 週齢）の雌 C57BL/6J マウスを用いた。さらにわれわれは、異なる 3 種類のマウスがん細胞株（B16-F10 メラノーマ、MC38 大腸腺がん、E0771 乳がん）を用いて、同系腫瘍モデルを確立した。それぞれの腫瘍モデルごとに、加齢にともなう腫瘍増殖キネティクスは異なる。具体的には、B16-F10 メラノーマにおいては、加齢は腫瘍増殖キネティクスに影響を及ぼさなかった。他方、加齢マウスにおいては、MC38 大腸腺がんの増殖は遅く、E0771 乳がんの増殖は速かった。薬剤の最大耐量を評価するために、若齢および老齢マウスに標準治療で使われる抗がん剤（ドセタキセル、シスプラチン、またはドキソルビシン）を投与して、週 3 回体重を測定した。若齢マウスにくらべて、老齢マウスにおいては、標準治療薬に対するより強い毒性がみられた。つぎに、われわれは、チェックポイント阻害薬を使って有効性試験を実施した。MC38 大腸腺がんを有する若齢、中間年齢、老齢のマウスに週 2 回、3 週間にわたって抗 PD1 抗体を静脈内に注射した。対照マウスには、同じアイソタイプの抗体を注射した。全血および腫瘍サンプルを採取し、免疫細胞のプロファイリングを調べた。さまざまな週齢の実験群（マウス）における PD1 応答を比較すると、MC38 大腸腺がんを有するすべての週齢のマウスにおいて、抗 PD1 抗体処置は、腫瘍の増殖を有意に抑制した。
最も大きな効果は、老齢マウスにおいてみられた。また、抗 PD1 抗体で処置をすると、腫瘍組織中への浸潤 T 細胞数が増加していた。他方、老齢マウスにおいては、腫瘍組織中の制御性 T 細胞の数が減少していた。
結論として、われわれは、老齢マウスを用いて同系腫瘍モデルを確立することができた。老齢マウスにおいては、抗がん剤に対する毒性がより強く発現した。
さらに、加齢が腫瘍増殖キネティクスに及ぼす影響には、モデルによる違いが認められた。腫瘍組織中に浸潤している免疫細胞の違いは、加齢にともなう抗 PD1抗体処置に対する反応の違いをひき起こす基盤となっているのかもしれない。がんの研究に加齢の要素を取り入れることによって、前臨床研究と臨床のアウトカムとのあいだに存在する溝を埋めることができる可能性がある。

2加齢に関連した免疫老化ならびに C57BL/6J 同系モデルにおける抗がん剤の毒性および有効性

方法
本研究においては、若齢（7 週齢）、中間年齢（54 〜 58 週齢）、および老齢（76 〜 78 週齢）の雌C57BL/6J（JAX Stock #000664）マウスを使用した。

A. 最大耐量試験
a. 若齢および老齢マウスに標準治療で使われる抗がん剤（ドセタキセル、シスプラチン、またはドキソルビシン）を週 1 回、3 週間にわたって静脈内に投与した。

b. 薬剤の毒性を調べるために体重を測定した。

B. 腫瘍増殖キネティクス試験
a. 若齢および老齢マウスの右脇腹にがん細胞を移植した。
b. 週 3 回、体重および腫瘍サイズの測定ならびに臨床症状の観察をおこなった。

C. 薬剤有効性試験
a. 腫瘍を移植した若齢、中間年齢、および老齢マウスに抗 PD1 抗体または対照のアイソタイプ抗体を週 2 回、3 週間にわたって静脈内に注射した。

b. 週 3 回、体重および腫瘍サイズの測定ならびに臨床症状の観察をおこなった。
c. 最後の薬剤投与の 1 週間後に腫瘍および全血を採取し、フローサイトメトリーで解析した。

D. 人道的エンドポイントの基準
a. 20% 以上の体重減少
b. 2000 mm3 以上の腫瘍容積c. 腫瘍の潰瘍化
d. 獣医師の勧告

加齢に関連した免疫老化ならびに C57BL/6J 同系モデルにおける抗がん剤の毒性および有効性

3

結果
図
1.
Figure1.
(B)
Survival Curve（B）生存曲線
Young
D5W
若齢
D5W

Young
Docetaxel 10
若齢
ドセタキセル
10mg/kgmg/kg

生存率︵％︶

Body Weight (%Pre)

体重︵実験前とくらべた％︶

Body Weight Changes (%Pre)
± SEM
（(A)
A）体重変化（実験前とくらべた%）-- Mean
平均値±SEM

Percent survival

YoungDocetaxel 20
若齢ドセタキセル
20mg/kg
mg/kg

Studyday
日数

AgedD5W
D5W
老齢

Agedドセタキセル
Docetaxel 1010
mg/kg
老齢mg/kg
Agedドセタキセル
Docetaxel 2020mg/kg
老齢mg/kg

Study日day数

図 1. 老齢マウスにおいては、若齢マウスにくらべて、ドセタキセルによる毒性および死亡率が高いことが示された。
（A）老齢マウスにおいては、対照の D5W にくらべて、10 mg/kg または 20 mg/kg のドセタキセルを投与すると、有意な体重減少がひき起こされた。（B）老齢マウスにおいては、若齢マウスにくらべて、高い死亡率が示された。

図2.
Figure2.
体重︵実験前とくらべた％︶

Body Weight Changes (%Pre)
± SEM
（(A)
A）体重変化（実験前とくらべた%）-- Mean
平均値±SEM(B)
Survival Curve（B）生存曲線若齢
シスプラチンmg/kg
Young
Cisplatin 22mg/kg

生存率︵％︶

Body Weight (%Pre)

若齢
D5W
Young
D5W
Percent survival

若齢
シスプラチンmg/kg
Young
Cisplatin 24mg/kg

Studyday
日数

老齢
AgedD5W
D5W

老齢
2 mg/kg
Agedシスプラチン
Cisplatin 2 mg/kg
老齢
4 mg/kg
Agedシスプラチン
Cisplatin 4 mg/kg

Study日day数

図 2. 老齢マウスにおいては、若齢マウスにくらべて、用量依存性にシスプラチンによる毒性および死亡率が高いことが示された。
（A）老齢マウスにおいては、4 mg/kg のシスプラチンを投与すると、有意に強い毒性が示された。他方、2 mg/kg のシスプラチンを投与した場合は、毒性は比較的軽度であった。若齢マウスに 4 mg/kg のシスプラチンを投与した場合は、毒性は比較的軽度であったが、2 mg/kg のシスプラチンを投与したときは、対照の D5W にくらべて、有意な毒性は認められなかった。
（B）老齢マウスにおいては、4 mg/kg のシスプラチンを投与した場合は、若齢マウスにくらべて、有意に高い死亡率が示された。

4

加齢に関連した免疫老化ならびに C57BL/6J 同系モデルにおける抗がん剤の毒性および有効性

図
3. 3.
Figure(B)
Survival Curve（B）生存曲線
Young
D5W
若齢
D5W

Young
Doxorubicin 22 mg/kg
mg/kg
若齢
ドキソルビシン

生存率︵％︶

Body Weight (%Pre)

体重︵実験前とくらべた％︶

Body Weight Changes (%Pre)
± SEM
（(A)
A）体重変化（実験前とくらべた%）-- Mean
平均値±SEM

Percent survival

Young
Doxorubicin 44 mg/kg
mg/kg
若齢
ドキソルビシン
AgedD5WD5W
老齢

Agedドキソルビシン
Doxorubicin 22mg/kg
老齢mg/kg
Agedドキソルビシン
Doxorubicin 44mg/kg
老齢mg/kg

数
Study日day

Study日day
数

図 3. 老齢マウスにおいては、用量依存性にドキソルビシンによる毒性および死亡率が高いことが示された。
（A）老齢マウスにおいては、ドキソルビシンは、用量依存性に毒性を示した。他方、若齢マウスにおいては、体重の減少はみられなかった。
（B）老齢マウスにおいては、ドキソルビシンは用量依存性に有意に高い死亡率を示した。

若齢

老齢

老齢

Studyday
日数

Mean Body Weight Changes (%) ± SEM

Mean Body Weight Changes (%) ± SEM

老齢

若齢

MC38 Colon tumor
MC38 大腸がん担癌マウス
bearing mice
若齢
若齢

老齢
老齢

Studyday
日数

平均体重の変化︵％︶
±SEM

若齢

平均体重の変化︵％︶±SEM

平均体重の変化︵％︶±SEM

B16-F10 Melanoma tumor
B16-F10 メラノーマ担癌マウス
bearing mice

Mean Body Weight Changes (%) ± SEM

図4. 4.
Figure

E0771 Breast tumor
E0771 乳がん担癌マウス
bearing mice
若齢
若齢

老齢
老齢

Study日 数day

図 4. 老齢の担癌マウスにおいては、体重の減少がみられた。
若齢マウスおよび老齢マウスに異なる細胞数の B16-F10 メラノーマ細胞株、MC38 大腸がん細胞株、または E0771 乳がん細胞株を移植した。老齢マウスにおいては、時間の経過とともに体重が減少した。他方、若齢マウスの体重は増加した。

加齢に関連した免疫老化ならびに C57BL/6J 同系モデルにおける抗がん剤の毒性および有効性

5

図 5.
Figure 5.

Study日day数若齢

老齢
老齢若齢3

老齢E0771 Breast tumor
E0771
乳がん担癌マウス
bearingmice

Tumorvolume)
腫瘍サイズ（(mmmm 3）

老齢

若齢

3

若齢

MC38 Colon tumor
MC38
大腸がん担癌マウス
bearing
mice

腫瘍サイズ（(mmmm 3）
Tumorvolume)

Tumorvolume)
腫瘍サイズ（(mmmm33）

B16-F10 Melanoma tumor
B16-F10
メラノーマ担癌マウス
bearing
mice

Study日day数

若齢

老齢

若齢

老齢

Study日day数

図 5. 齢依存性の腫瘍増殖キネティクスは、腫瘍モデルごとに異なる。
若齢マウスおよび老齢マウスに異なる細胞数の 3 種類の腫瘍細胞株を移植した。B16-F10、MC38 がん細胞株の増殖キネティク
スには、週齢による有意差はみられなかった。E0771 乳がん細胞株の増殖は、若齢マウスにおいて遅かった。

Study日day数

3Mid-aged,アイソタイプ対照抗体
Iso Ctrl
中間年齢、Mid-aged,抗Anti-PD1
中間年齢、PD1 抗体

3Tumor 腫瘍サイズ
volume (mm)mm ）（Young,若齢、抗 Anti-PD1
PD1 抗体3Young,Iso Ctrl
若齢、アイソタイプ対照抗体（3 mm ）
Tumor 腫瘍サイズ
volume (mm)3Tumor 腫瘍サイズ
volume (mm)mm3）（図 6.
Figure 6.

Study
日 day数

Aged,アイソタイプ対照抗体
Iso Ctrl
老齢、老齢、
PD1 抗体Aged,抗Anti-PD1

Study
日day数

図 6. MC38 腫瘍細胞株に対する抗 PD1 抗体の抗腫瘍効果は、老齢マウスにおいて最大であった。

MC38 腫瘍細胞株を移植した若齢、中間年齢、ならびに老齢マウスを抗 PD1 抗体またはアイソタイプ対照抗体によって処置をした。すべての週齢のマウスにおいて、抗 PD1 抗体は、腫瘍の増殖を抑制した。最大の抑制効果は、老齢マウスにおいてみられた。

6

加齢に関連した免疫老化ならびに C57BL/6J 同系モデルにおける抗がん剤の毒性および有効性

図
7. 7.
Figure
(A)
（A）

(B)
（B）

若齢、アイソタイプ対照抗体
Young,Iso Ctrl
中間年齢、Mid-aged,アイソタイプ対照抗体
Iso Ctrl

パーセント

PD1 抗体中間年齢、Mid-aged,抗Anti-PD1

Percentage

Percentage

パーセント

PD1 抗体若齢、
抗 Anti-PD1
Young,

T TCells
細胞

CD34TT細胞
Cells
CD34

CD8 TT Cells
CD8細胞

老齢、Aged,アイソタイプ対照抗体
Iso Ctrl

PD1 抗体老齢、Aged,抗Anti-PD1
Tregs
制御性T 細胞図 7. 抗 PD1 抗体で処置をすると、MC38 大腸がん組織中に浸潤する T 細胞数が増加した。
老齢マウスにおいては、制御性 T 細胞の浸潤は減少していた。抗 PD1 抗体で処置をすると、すべての週齢のマウスにおいて、が増加していた。老齢マウスにおける増加が最大であった。全体としては、腫瘍組織中に浸潤する T 細胞数（おもに CD8+ T 細胞）
老齢マウスにおいては、若齢マウスおよび中間年齢のマウスにくらべて、制御性 T 細胞数は減少していた。

図8. 8.
Figure
若齢、アイソタイプ対照抗体
Young,Iso Ctrl

PD1 抗体若齢、
抗 Anti-PD1
Young,Percentage

パーセント

アイソタイプ対照抗体
中間年齢、Mid-aged,
Iso Ctrl

PD1 抗体中間年齢、抗Anti-PD1
Mid-aged,

老齢、Aged,アイソタイプ対照抗体
Iso Ctrl

PD1 抗体老齢、Aged,抗Anti-PD1

CD4
ナイーブ
CD4
Naive

CD8
ナイーブ
CD8
Naive

図 8. 老齢マウス血中のナイーブ T 細胞数は減少していた。
血中のナイーブ T 細胞数は、加齢にともなって減少していた。抗 PD1 抗体で処置をしても、ナイーブ T 細胞数には有意な影響はみられなかった。

加齢に関連した免疫老化ならびに C57BL/6J 同系モデルにおける抗がん剤の毒性および有効性7

まとめと結論•

老齢マウスにおいては、若齢マウスにくらべて、標準治療で使われる抗がん剤（ドセタキセル、シスプラチン、またはドキソルビシン）に対するより強い毒性がみられた。

•

本研究においては、さまざまな腫瘍を移植された老齢マウスにおいては、体重が減少していた。他方、さまざまな腫瘍モデルにおいて、若齢マウスでは体重が増加していた。これは、がんに関連した悪液質の初期の徴候であるかもしれない。

•われわれは、老齢マウスにおいては、免疫老化の徴候がみられることを確認した。たとえば、血中におけるナイーブ T 細胞や制御性 T 細胞の減少などである。

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