2-9 生物の環境適応機構の解明●代表者

澤田博司（生命科学科・教授）●分担者

間瀬啓介（生命科学科・教授）
外川徹（生命科学科・准教授）

井上みずき（生命科学科・准教授）【研究の目的および概要】
本研究は，生物の環境適応機構を多様な生物現象から明らかにすることを目的としている。具体的に本年度は，以下の 4 つの目的で研究を遂行した。
1．カイコの卵休眠は，環境条件の悪化の結果やむをえず発育を休止する休眠ではなく，不良環境が訪れる以前の生育にとって不都合のない環境のもとで感受し記憶され次世代の卵で実行される。この休眠に際し，どのような分子機構で発生を停止させるのかを解明するために，初期発生や胚子活性化に密接に関わる遺伝子の構造や発現などの解析，またその遺伝子産物の機能や機能発現の調節機構を明らかにする。
2．絹糸虫類が外敵から身を守る一手段として繭の多様な緑色化によるカモフラージュがあり，複数の遺伝子が制御している。この複雑な形質の発現様式を解明するために，カイコガの緑繭系統やその染色体置換系統をはじめとした研究素材とゲノム情報を用い，それらの原因遺伝子の同定と機能解明を行う。
3．昆虫の体表面を覆うクチクラは，種・発生段階・体の部位により物理的性質が異なり，昆虫の様々な環境への適応を可能にしている。このクチクラ多様性の分子メカニズムを理解するために，クチクラの 2 つの主要構成成分であるクチクラタンパク質ファミリーとキチンに注目し，両者の相互作用の多様性を解明する。
4．植物の送粉成功は地域生態系の媒介昆虫の種組成や個体数によって左右される。そこで，地域の植物相を明らかにするとともに訪花昆虫の体表についている花粉の種組成を明らかにすることで，植物への忠実度を測定する。これらの技術を用いて，植物と昆虫の交互作用系を明らかにする。
【研究の結果】
1．本研究では，浸酸処理時におけるカイコの Ca2+ 依存的ミトコンドリア溶質輸送体（BmMCSC）に着目し，BmMCSC をコードする cDNA のクローニング，遺伝子の発現，リコンビナント BmMCSC（rBmMCSC）の調製などを行った。まず，浸酸処理した休眠卵で BmMCSC 遺伝子の発現解析を RT-PCR で行った結果，水で処理したコントロールと比較して発現が増加しており，その発現は 浸酸処理直後から認められた。一方，大腸菌発現系を用いて rBmMCSC の調製と精製を行った結果，rBmMCSC が調製できヒスチジンカラムによる精製後のrBmMCSC は SDS-PAGE 上で単一のバンドとし確認できた。精製した rBmMCSC を抗原に用いてポリクローナル抗体の作成を試みたところ，rBmMCSC を特異的に認識する抗体を得ることができた。
2．昨年度までに笹繭発現遺伝子 Ga の候補として，絹糸腺で発現している糖輸送体遺伝子を見出したが，遺伝子変異と繭色との間に対応がない系統が存在していた。一方，ゲノム情報が更新され，この遺伝子の候補領域に中腸で発現している糖輸送体遺伝子など，いくつかの予測遺伝子が存在していた。そこで，これらについても同様に，遺伝子の変異と表現形質との関連性を検討した。その結果，形質に対応した変異を見出されず，昨年の糖輸送体遺伝子が Ga 遺伝子である可能性をさらに高める結果となった。
3．昆虫のクチクラは主にキチンとクチクラタンパク質から構成されている。クチクラの多様性は，クチクラタンパク質の多様性に起因すると考えられている。そのメカニズムの一端を明らかにするためには，クチクラタンパク質最大のグループである CPR タンパク質のキチン結合能を比較することが有効だと考えられる。そこで，

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各 CPR タンパク質の融合タンパク質を大腸菌内で合成するための発現プラスミドを構築した。発現誘導したところ，想定される大きさの可溶性タンパク質が合成された。
4．小石川植物園でドクダミの花に接触した昆虫を網でスウィーピングしてサンプリングした。網でスウィーピングできないものに対しては吸虫管を用いた。調査期間中 15 匹の昆虫が訪花し，そのうち 12 匹の捕獲に成功した。
捕獲した 12 匹の昆虫を同定した結果，ホソヒラタアブ・クロヒラタアブ・アシブトハナアブ・アトジマコハナ
バチの 4 種とアリであった。
【研究の考察・反省】
1．BmMCSC 遺伝子は，浸酸処理により発現が誘導され，調整した rBmMCSC は Ca2+ と親和性があることが明らかとなった。BmMCSC は，浸酸処理により遊離した Ca2+ が結合することによりその機能が制御され，結果的に休眠移行を阻害しているのではないかと考えられる。一方，精製した rBmMCSC を抗原として，特異抗体を作製することが出来た。今後，この特異抗体を用いた免疫組織化学で BmMCSC の局在と分布を解明できると思われる。反省点としては，今回の rBmMCSC は，大腸菌内で封入体として発現してしまった。そのため得られた rBmMCSC は，抗体作製用としては適しているが，機能解析には不向きである。機能解析を行う場合，
rBmMCSC を封入体ではなく大腸菌体内で可溶化し発現させることが今後の課題の一つである。
2．更新されたゲノム情報を加えても，絹糸腺で発現している糖輸送体遺伝子が笹繭発現関連遺伝子 Ga の最有力候補であることに変更はなかった。そのため，例外としてこの遺伝子変異と繭色との間に対応がなかった系統については，Ga 遺伝子とは異なる笹繭発現関連遺伝子が関与していることを検証する必要がある。また，Ga の候補遺伝子である糖輸送体遺伝子については，いよいよ遺伝子破壊実験による証明を行う必要がでてきた。
3．クチクラタンパク質 CPR の機能解析については，融合タンパク質を合成することができた。また，可溶性も確認することができたので，キチンを用いたアフィニティークロマトグラフィーによりキチン結合性を評価できると考えられる。そこで今後，これらのタンパク質を精製してキチン結合性を調べる予定である。そして各CPR のキチン結合ドメインの構造的特徴とキチン結合性，そして各 CPR のクチクラにおける分布を調べることで昆虫クチクラの多様性に関する新たな知見が得られると考えている。
4．ドクダミはアポミクシスで繁殖し，結実に他家花粉が必要ないとされる植物であるが，多くの昆虫が訪花することが明らかとなった。今後は，昆虫が運んだ花粉で本当に結実しないのかを明らかにする必要がある。
࠙◊✲Ⓨ⾲ࠚ・平成 30 年度

蚕糸・昆虫機能利用学術講演会

カイコ繭の硬さの要因解明とセリシン成分の関係
2018 年 3 月 19 日− 20 日／名古屋
・第 63 回日本応用動物昆虫学会大会
bHLH 転写因子遺伝子 hairy の幼若ホルモンによる組織依存的な発現誘導2019 年 3 月 27 日／つくば・第 63 回日本応用動物昆虫学会大会
カイコガにおける PTEN-like phosphatase（Plip）の in vivo 機能解析2019 年 3 月 26 日／つくば・日本動物学会関東支部第 71 回大会
混み合いにより変態が抑制されるツヤケシオオゴミムシダマシにおけるホルモン関連遺伝子の発現解析

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2019 年 3 月 9 日／東京
・2018 ESA, ESC and ESBC Joint Annual Meeting（Entomology 2018）
Knockout of PTEN-like phosphatase（Plip）, a selectively-expressed gene in corpora allata in Bombyx mori2018 年 11 月 11 日− 14 日／ Vancouver, British Columbia, Canada
・日本動物学会第 89 回札幌大会
ツヤケシオオゴミムシダマシの成虫の大顎における左右非対称性に関わる遺伝子の探索
2018 年 9 月 14 日／札幌࠙◊✲ᡂᯝ≀ࠚ・Molecular characterization and tissue distribution of mitochondrial Ca2+-dependent solute carrier protein during
preventing diapause with HCl treatment in the silkworm, Bombyx mori. Zoological Science 35, 487-493, 2018.
・蚕遺伝資源における生糸強伸度の品種間差異と新たな特徴としての強伸度蚕品種育成への試み
日本シルク学会誌 27 巻（印刷中）50