バイオプリント技術を応用した医療・創薬研究松.

は じめに崎典弥

細胞プリント

これまで，インクジェットプリンターによる細胞の吐出制
京都大学の山中教授らによるヒト人工多能性幹細胞( iPS御や二次元的な細胞の配置制御などが報告されてき細胞)の樹立が報告され，再生医療だけでなく，医薬品の毒た(3)(5) ．バブルジェットタイプのインクジェットは吐出時性・評価試験への応用が期待されている．しかし，生体組織に発熱が起こるため，細胞への影響が懸念される．従って，は複数種類の細胞で構成され，種々の細胞が互いに相互作用

ピエゾタイプのインクジェットを用いた研究が主流である．

することで組織としての機能を発現しているため，細胞単体吐出された細胞の生存率は高く，条件によるが 70 ～ 90 以で生体組織と同じ薬剤応答を得ることは困難であり，iPS 細上に保つことが可能である．しかし，吐出時のシアストレス胞を用いてもこの課題は解決できない．つまり，iPS 細胞のにより細胞膜が緩むことも報告されており，吐出条件によっ分化誘導技術とは別に，生体組織に類似の 3 次元構造と機ては検証が必要である．吐出細胞数の制御に関してはあまり能を併せ持つヒト組織モデルの構築技術の確立が重要であ報告例が無いが，細胞溶液の濃度を調節する手法(6)やセルソる．また，生体外での組織構築は，動物実験代替法の観点かーターの原理を応用する手法(7)により，1 個レベルで細胞をらも大変重要である．EU では，2013年より化粧品・化成品プリントする試みも報告されている．

開発への動物実験の使用を原則禁止する法律が既に施行されているが，実験動物に代わる具体的な評価方法は確立しておらず，早急の解決が求められている．生体組織を構成する様

組織構築の取り組み

Bose らは，リン酸三カルシウム( TCP )や SiO2 と ZnO を々な細胞とタンパク質を 3 次元で統合し，組織類似の機能混合した粉末を用いた 3D プリントの積層造形により，マテを有する 3 次元組織モデルを構築できれば，医薬品評価試

リアル内部に連通孔を有する骨再生用の足場材料を報告し験や動物実験の代替への応用が可能となり，ライフ・イノベ

た(8)．骨誘導能を有し，骨再生を促進することを明らかにしーションへの貢献が期待される．

た．また，Butcher らは，アルギン酸とゼラチンの溶液に平.

り 2 種類の細胞を連続的にプリントすることで，大動脈弁滑筋細胞と大動脈弁間質細胞を内包させ， 3D プリントによ3D 細胞プリントによる三次元構造体構築の現状類似の構造体を構築した(図(a))(9)．細胞生存率は80以
最近，光または熱硬化性の樹脂を用いた連続積層により，上と高いが，機能の再現には至っていない．

高速かつ高精度に 3 次元構造体を造形する「3D プリンター」

McAlpine らは，軟骨細胞を含むアルギン酸とシリコン，が注目を集めている．インクジェットプリンターは，ピコリ銀ナノ粒子を 3D プリントすることで人工耳介を構築した

ットルオーダーで液滴を精密に吐出できるため，吐出点で溶(図 1(b))(10)．細胞生存率は90以上と高く，無機の銀ナノ液を固化できれば，連続積層により三次元構造体を自在に構粒子も脱離することなく無線電波の受信が可能であった．ま

築可能である．そこで，細胞にダメージを与えることなく，た， Atala らは， I 型コラーゲン溶液にフィブリノーゲンを細胞を吐出溶液ごと瞬間的に固化できれば，生体臓器の複雑混合してプリントし，そこへトロンビン溶液をプリントするな 3 次元構造を構築できると期待されている．以下，いく

ことで，フィブリノーゲンとトロンビンの反応を利用してゲ

つか研究例を紹介する．最近，総説も報告されているため，ルを形成する手法を考案し，皮膚(11)や腎臓(図 1( c)(12)類似

そちらもご参照頂きたい(1)(2)．の構造体の構築を試みた．

大阪大学大学院工学研究科准教授(〒5650871 吹田市山田丘 21)
Biomedical and Pharmaceutical Researches Using Bioprinting Technology; Michiya Matsusaki(Graduate School of Engineering, OsakaUniversity, Suita)
Keywords: Bioprinting, tissue engineering, cell accumulation technique, layerbylayer assembly, nanofilms
2017年11月29日受理[doi:10.2320/materia.57.164]

ミ ニ 特 集

体組織に類似の機能を有する三次元組織体チップの開発にチ

まとめと課題ャレンジしてきた．その概要を紹介する．

最近報告されている 3D 細胞プリントによる三次元組織構築を紹介した．しかし，構築された 3 次元構造体の機能は.

細胞積層法による三次元組織体の構築不十分であり，生体臓器にはとても及ばないのが現状である．この原因は，主に「細胞の配置制御」，「細胞間接着の誘細胞は，外部との情報交換や機能発現を細胞膜界面で制御起」，「細胞外マトリックス( ECM )」の 3 つにあると考えらしている．生体内において，細胞の界面構造と機能の制御にれる．

重要な役割を果たしているのが，細胞周辺に存在する ECM生体臓器では，上皮・内皮系の細胞は，カドヘリンを介しタンパク質(コラーゲンやフィブロネクチン等のタンパク質た接着結合により密接に接着し，物質の交換を行っているたや多糖類)である．例えば，細胞接着とは細胞膜のインテグめ，細胞間距離は非常に狭い．上皮細胞層の下部には，ラミリン分子と ECM との相互作用であり，また， ECM 成分でニンや IV 型コラーゲンを主成分とする基底膜が ECM としあるフィブロネクチンやビトロネクチンと細胞膜分子の相互て存在し，結合組織との界面を形成している．上皮細胞層作用が細胞の生存や増殖，シグナル伝達，分化誘導に強く影は，その緻密な接着結合により外部からの物質や細胞の侵入響することが明らかにされている．そこで，筆者らはこのを制限するバリア層としての機能も有している．一方，細胞ECM の働きに着目し， ECM のように細胞の界面構造を制成分より I 型コラーゲンやフィブロネクチン，エラスチンな御できれば細胞の組織化や機能を操作できると考え，人工的

どの ECM 成分が多く，強度や弾性など物理的な機能を担っに ECM 成分のナノ薄膜を細胞表面に形成し，細胞を一層ずている結合組織は，細胞間距離が広く，細胞同士も接着結合つ積層する「細胞積層法」を考案した(図)(13)．つまり，などを形成していない．ECM 成分も基底膜とは異なってい細胞の表面に ECM の“ナノレベルののりづけ”をつくるこる．また，骨格筋や平滑筋，心筋組織は，複数の細胞が融合と で 細胞 を 1 層 ず つ 積み 上 げ る手 法 で ある ． 細胞 表 面 へして筋線維を形成し，基底膜で覆われている．細胞間距離

ECM 薄膜を形成する手法として，著者らは，ナノメートルは，上皮系細胞と同様に非常に狭い．このように，生体の組オーダーで高分子薄膜を調製できる交互積層(layer bylay-織や臓器は，複数の構成単位が集合して形成されており，細er : LbL)法を用いた(図 2)．接着タンパク質として知られる胞の種類や細胞間距離，細胞間結合， ECM 成分など，組フィブロネクチン(FN )とコラーゲンの変性体であるゼラチ織・臓器によって様々である．これら種々の構成因子を制御ン(G )の交互積層薄膜( FN G 薄膜)をおよそ 6 nm の膜厚でして構築しない限り，生体に類似の機能と構造を有する 3D細胞表面に形成すると，二層目の細胞が接着した．FN は細人工臓器を作製することは不可能である．また，これらの主胞表面の a5b1 インテグリンやコラーゲン，ゼラチンとの相要因子を制御するためには，プリント技術だけでは困難であ互作用ドメインを有しているため，わずか 6 nm という膜厚る．細胞プリントは細胞の配置を制御する技術であるため，でも細胞接着足場として機能したと考えられる．一方，対照それ以上の機能性，例えば，細胞間接着の誘起や血管・リン実験として薄膜を形成しない場合や膜厚が薄い場合，均一なパ管網の形成などには，別途技術開発が重要である．

二層構造は得られなかった．また，10 nm 以上の薄膜でも同我々は，「細胞間接着を誘起した三次元組織体の構築」と様の効果が確認されたため，少なくとも 6 nm 以上の FNG

「毛細血管・リンパ管網を有する三次元組織体の構築」の技

薄膜が次層の細胞接着の足場として重要であることが明らか

術開発が重要と考え，これまで研究に取り組んできた．まとなった．本手法を繰り返すことで，望みの細胞を望みの層た，それらの技術を細胞プリント技術と融合することで，生に配置した 3 次元構造が構築可能となる．著者らはこれま

図1

3D 細胞プリントで構築された(a) 心臓弁組織(9)，(b) 耳介組織(10)，(c) 腎臓組織(12)．

ま て り あ 第57巻 第 4 号(2018)Materia Japan




図3

図2

( a ) LbL 法を用いた細胞積層法のイメージ．( b )細胞積層法で構築した様々な積層組織体の組織切片写真．ヘマトキシリン・エオジン(HE)染色による組織染色及び抗 CD31 抗体を用いた血管内皮細胞の染色．

(a) 細胞集積法のイメージ．(b) 細胞集積法で構築 し た NHDF 組 織 お よ び HepG2 組 織 の HE 染色画像．(c) サンドイッチ培養による血管網モデル構築のイメージと蛍光免疫染色による構造観察．( d ) HUVEC 及び LEC のサンドイッチ培養
組織の蛍光免疫染色による共焦点レーザー顕微鏡イメージ(右)． HUVEC と LEC がそれぞれ独立したネットワーク構造を形成．

存せず最大およそ 100 mm ，組織体( NHDF 組織およびヒト肝癌 HepG2 細胞組織)が得られた(図 3(b))．
で，血管内皮細胞と平滑筋細胞を組み合わせた“血管壁モデ

また，本細胞集積法を用いることで，血管網およびリンパル”や筋芽細胞による“骨格筋モデル”，腫瘍間質線維芽細管網モデルの構築にも成功している．生体内には，およそ胞による“腫瘍間質モデル”などを構築しており，生体組織

100 ～ 200 mm に一本の毛細血管が存在することで栄養を供により近い応答が得られることも明らかとなった(14)．

給している．そのため，100 mm 以上の組織体において内部細胞の壊死を防ぐためには，毛細血管網を構築する必要があ.

細胞集積法による組織構築

る．岡野らは，血管内皮細胞を筋芽細胞および線維芽細胞のシートでサンドイッチ培養することで毛細血管様の形態変化

以上のように，細胞積層法は細胞の配置を一層ずつ制御しが起こり，さらに生体への移植時に血管網構造が有効であるて多層構造を構築できる画期的な手法であるが，各層の細胞ことを報告している．本手法においても，層数を制御したが安定に接着するまで半日ほど培養する必要があり，一日二NHDF 組 織 に よ っ て ヒ ト 臍 帯 静 脈 由 来 血 管 内 皮 細 胞層の作製が限度であった．例えば， 20 層の構造を作製する(HUVEC)のサンドイッチ培養を行ったところ，組織内に血ためには約 10 日以上もの日数が必要であるため，産業化す管網様のチューブ構造が構築されることを見出した(図 3るにあたって非常に大きな課題であった．そこで，従来の接(c))．得られた血管網は高密度(面積で約50)かつ均一(約着した細胞表面でなく，分散状態の個々の細胞表面に FNG100 mm 毎に形成)であり，生体の血管新生時に類似の形態薄膜を形成し，1 段階で積層組織を構築する「細胞集積法」が観察された．このように血管新生を強く誘導した理由としを考案した(図(15)．LbL 法は薄膜を形成する基材に制限はては， HUVEC の三次元培養および周囲の NHDF 組織からないため，分散状態，つまり粒子状の細胞表面に対してもの血管新生因子の供給が主に考えられる．さらに驚くべきこFN G 薄膜の形成が可能であり，形成された FN G 薄膜はとに， HUVEC とヒト皮膚微小リンパ管内皮細胞( LEC )を細胞間相互作用を誘起可能であると期待した．FNG 薄膜を同時にサンドイッチ培養したところ，血管とリンパ管が独立形成したヒト皮膚由来線維芽細胞( NHDF )を，コンフルエしてチューブ構造を形成し並走した，生体に非常に類似したント時の細胞数を 1 層分とし，望みの層数分の細胞数を一脈管構造を形成している様子が観察された(図 3(d))(16)．以

度にカルチャーインサートに播種したところ，わずか 1 日

上より，細胞集積法を用いることで，より厚く，かつ脈管構の培養にも関わらず，層数を制御した三次元積層組織が構築造を有する三次元組織体の短期構築を実現することができた．

可能であった．また培地量を増やすことで，細胞の種類に依

ミ ニ 特 集を吐出して接着させ，FN 溶液と G 溶液を交互に吐出するこ.

細胞プリントによる肝組織チップの開発と毒性試
験への応用とで細胞表面にナノ薄膜を形成した．その後，再び筋芽細胞を吐出することで，筋芽細胞の 2 層構造を作製することができた(図 4(g))．

著者らは，FNG 薄膜形成を用いた細胞積層技術とインクチップを作製するためには，各スポットに細胞数を制御しジェットプリント法を融合することで，マイクロメートルサて精密に吐出することが重要となる．そこで，50ヶ所に100イズの様々な組織モデルを集約した「組織チップ」の構築に個の細胞を吐出し，プリントされた細胞数を評価した(図取り組んだ(図( a))(6)．細胞と FN 溶液， G 溶液をインク

)．最初の 3 ヶ所の吐出細胞数は 60 ～ 80 個と少なかった

ジェットプリントで吐出することで，細胞の定点配置とが，それ以降はおおよそ100個の細胞を再現よく吐出できる

FNG 薄膜形成が自動化され，創薬評価に応用可能な組織チことが確認された．初期の吐出不良に関しては，捨て打ちなップが構築できると考えた．発熱の影響の少ないピエゾ式イどにより対応できると考えられる．

ンクジェットを用いて，タンパク質溶液の吐出および細胞の組織チップとして薬剤評価へ応用することを目的として，吐出実験を行った．図 4(b )に示すように，蛍光ラベル化し次に肝組織チップの作製を試みた．肝臓は薬物や化合物を分たローダミンラベル化フィブロネクチン( Rh FN )およびフ解する重要な臓器であり，薬物毒性の 7 割は肝臓で発現す

ルオレセインイソチオシアネートラベル化ゼラチン(FITC

るため医薬品開発では最も重要な臓器である．著者らは，肝G )を各層数で交互に吐出したところ，マイクロメートルオーダーで配置が制御された FN G 薄膜の形成が確認された．また，プリンターヘッドの口径と吐出液滴数を変えることで，細胞の吐出数を 1 個から10000個まで精密に制御可能であった(図 4(c))．また，NHDF，マウス C2C12 筋芽細胞，HUVEC など細胞の種類を変えても生存率は 95 以上であることが確認された．組織チップの基板として，直径 500mm，高さ 200 mm のウェルを440個有するウェル基板を用いた(図 4 ( d )( f )．このウェル基板へマウス C2C12 筋芽細胞

図4

図5

50ヶ所に100個の細胞をプリントした時の各スポットにおける吐出細胞数．

( a ) インクジェットプリントによる三次元組織チップの構築イメージ．( b ) インクジェットプリントによるFNG 薄膜の形成．RhFN および FITCG を使用し，薄膜の層数と配置を制御．(c) 細胞の吐出条件の評価(濃度1×107 cells/mL)．(d) 使用した440マイクロウェル基板．(e)，(f) レーザー顕微鏡によるウェルの構
造解析．(g) C2C12 筋芽細胞の 2 層構造を作製したチップの蛍光顕微鏡写真．細胞はセルトラッカーグリーンで蛍光染色した．

ま て り あ 第57巻 第 4 号(2018)Materia Japan

活性が向上することが明らかとなった．これらの結果より，
本インクジェットプリント法によって作製した組織チップにおいて，他の細胞と共培養した三次元モデルが従来の単層モデルよりも薬剤評価モデルとして有用であることが示された．

.

おわりに

細胞積層法および細胞集積法，細胞プリントに基づく新しいヒト三次元生体組織モデルの構築と薬剤効果判定・毒性評
価への応用について紹介した．本手法によって，皮膚や血管，リンパ管，肝組織，心筋組織など様々な臓器モデル，さらには臓器チップの開発が進められている．細胞プリントに関しては，高粘度による吐出不良や乾燥による細胞へのダメージなど技術的な課題が多いのは事実であるが，実現された時の社会貢献度は非常に大きいと期待されている．研究を加図6

ヒト肝癌細胞( HepG2 )とヒト臍帯静脈血管内皮細胞( HUVEC )で作製した 1 ～ 3 層構造の肝組織チップの写真(上)．トログリタゾン濃度に依存した死細胞の割合と層構造の関係(下)． LIVE /DEAD アッセイにより死細胞を蛍光強度で評価した．矢印は死細胞が剥離して定量できなかったことを示す．

組織の構造に着目し，ヒト肝がん細胞( HepG2 )を HUVECで挟んだ積層構造を構築することで肝組織としての機能の向上を試みた．
まずは，HepG2 と HUVEC の 13 層構造を一枚のチップの中に作製して種々の活性を評価した(図)．基礎的な細胞機能を評価するために，蛍光免疫染色によって各層数の肝組織におけるアルブミン産生量を定量した．その結果，7 日間培養後において，アルブミンを産生する肝細胞の細胞数は一定であるにも関わらず， HUVEC でサンドイッチした 3 層構造が 1 層構造と比較して 4 倍以上多く産生していることが明らかとなった．
また，薬物代謝酵素の一種であるシトクロム P450 3A4(CYP3A4)の活性を評価した結果，やはり 3 層構造が最も高い産生量と代謝活性を有していることが確認された．そこ
で，実際に毒性がある薬物を用いて評価を行った．トログリタゾン( TGZ )は，インスリン抵抗性を軽減する糖尿病治療薬として市販されたが，肝障害が明らかとなり 2000 年に自主回収された薬剤である．その後の分析で， CYP3A4 で代謝された反応性代謝物が毒性を示すことが明らかとなった．

速したい．

文( 1 ) S. V. Murphy and A. Atala: Nat. Biotech. 32(2014), 773785.
( 2 ) B. Derby: Science, 338(2012), 921926.
( 3 ) V. Mironov, T. Boland, T. Trusk, G. Forgacs and R. R.
Markwald: Trends Biotechnol., 21(2003), 157161.
( 4 ) T. Xu, J. Jin, C. Gregory, J. J. Hickman and T. Boland:
Biomaterials, 26(2005), 9399.
( 5 ) R. E. Saunders, J. E. Gough and B. Derby: Biomaterials, 29(2008), 193
203.
( 6 ) M. Matsusaki K. Sakaue, K. Kadowaki and M. Akashi: Adv.
Healthcare Mater., 2(2013), 534539.
( 7 ) A. Yusof, H. Keegan, C. D. Spillane, O. M. Sheils, C. M.
Martin, J. J. O'Leary, R. Zengerle and P. Koltay: Lab Chip, 11(2011), 24472454.
( 8 ) G. Fielding and S. Bose: Acta Biomater., 9(2013), 91379148.
( 9 ) B. Duan, L. A. Hockaday, K. H. Kang and J. T. Butcher: J.
Biomed. Mater. Res. Part A, 101A(2013), 12551264.
(10) M. S. Mannoor, Z. Jiang, T. James, Y. L. Kong, K. A.
Malatesta, W. O. Soboyejo, N. Verma, D. H. Gracias and M. C.
McAlpine: Nano Lett., 13(2013), 26342639.
(11) A. Skardal, D. Mack, E. Kapetanovic, A. Atala, J. D. Jackson,
J. Yoo and S. Soker: Stem Cell Transl. Med. 1(2012), 792
802.
(12) T. Xu, W. Zhao, J.
M. Zhu, M. Z. Albanna, J. J. Yoo and A.
Atala: Biomaterials, 34(2013), 130139.
(13) M. Matsusaki, K. Kadowaki, Y. Nakahara and M. Akashi:
Angew. Chem. Int. Ed., 46(2007), 46894692.
(14) M. Matsusaki: Bull. Chem. Soc. Jpn., 85(2012), 401414.
(15) A. Nishiguchi, H. Yoshida, M. Matsusaki and M. Akashi: Adv.
Mater., 23(2011), 35063510.
(16) M. Matsusaki, C. P. Case and M. Akashi: Adv. Drug Deliv.
Rev., 74(2014), 95103.
★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★

つまり，CYP3A4 代謝活性が高いほど低濃度の TGZ で毒性

2003 年が発現して死細胞数が増加するため，肝組織モデルとしての機能が TGZ で評価可能である．図 6 下に， TGZ 濃度に対する 13 層構造の死細胞数変化のグラフを示した．3 層構造においてより低濃度でも死細胞が顕著に観察され，特にTGZ が 50 mM の場合， 1 層構造では16の死細胞割合であっ た のに 対し て 3 層 構造 で は 60 (約 4 倍 )ま で増 加し ，HUVEC で挟んだ 3 層構造にすることで HepG2 の薬物代謝献

松崎典弥

鹿児島大学大学院理工学研究科博士課程短期修了
2006 年 8 月 大阪大学大学院工学研究科応用化学専
攻 助教
2008 年 10 月2011 年 3 月および 2015 年 10 月現在，さきがけ研究者(兼任)JST
2015年10月現職
専門分野生体材料，機能性高分子，組織工学◎高分子化学に基づいた細胞制御技術の研究に従事．
Scientific Reports 誌(Nature Publishing group)やPLoS ONE 誌(PLoS group)の Academic Editor.

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