やはり専用の技術と装置が必要であり観察対象も主として表面形態に限られることなどから，一般の電顕診断にはほとんど用いられてこなかった．ところが，2005 年頃から，操作低真空 SEM を用いた腎生検
パラフィン切片の迅速三次元解析法
Rapid Three-Dimensional Analysis of
Renal Biopsy Paraffin Sections
by Low Vacuum SEM

がとても簡単で高性能の卓上型の低真空走査型電子顕微鏡（低真空 SEM）が各社で開発されはじめ，絶縁物でも煩雑な前処理や金属コーティングをせずに数十倍から数万倍まで任意の倍率で迅速に観察することが可能となり，様々な分野で幅広く活用されるようになった．そこで私達は，卓上型低真空 SEM の特長，特に“簡便性と迅速性”に着目して病理組織診断における応用法を検討し 9），その実用的な方法の一つとして開発したのが，本稿で紹介する「低真空 SEM を用い法は，従来の TEM による電顕診断法とは異なった観点（試Sumire Inaga, Toshio Kameie, Hironobu Nakane,料作製の簡便性と迅速性，広範囲にわたる観察，三次元的なTomonori Naguro and Toshiyuki Kaidoh

微細形態解析）から発案したもので，腎生検に際してどこの鳥取大学医学部解剖学講座
要た腎生検パラフィン切片の迅速三次元解析法」10）である．本

稲賀すみれ，亀家 俊夫，中根 裕信，
名黒 知徳，海藤 俊行

旨

腎生検の電顕診断は，一般的には透過型電子顕微鏡を用いた腎組織の超薄切片像の観察によって行われているが，電顕試料の作製と画像の解析には専門的な技術や知識および時間を要する．私たちは，より簡便で迅速な電顕診断法として，最近様々な分野で広く活用されている卓上型の低真空走査型電子顕微鏡を用いることにより，通常の腎生検パラフィン切片で電顕レベルの三次元情報が得られる新しい解析法を開発したので紹介する．

キーワード：低真空 SEM，腎生検パラフィン切片，白金ブルー染
色，PAM 染色，電顕診断施設でも必ず作製される“光顕用パラフィン切片”を用いて“電顕レベルの三次元解析”を可能とする新しい電顕診断法である．もっとも，腎生検組織の病理診断に有用な所見を得るにはそれなりの前処理や工夫が必要で，本法の場合，組織の“染色法の組合せ”が特に重要なポイントであった．本稿
では，低真空 SEM の特長，効果的な染色法，腎生検標本の観察法および得られた病理所見，また今後の展望について紹介する．
2.

低真空 SEM の特長

低真空 SEM（low vacuum SEM: LVSEM）とは，試料室内の圧力を数十～数百 Pa に上げる（真空度を低くする）ことができる SEM のことで 11,12），VP-SEM（valuable pressure SEM），N-SEM（natural SEM），Wet-SEM なども同様の装置である．

1.

これらの装置では，油や水を含む試料や非導電性試料でも観はじめに察することが可能である．最近では二次電子を検出できる高電子顕微鏡が病理組織診断（電顕診断）に用いられる機会

分解能装置も開発されているが 13），一般的な低真空 SEM 観が近年増加してきており，疾患の鑑別診断や確定診断に重要察には，残留ガス分子による散乱の影響を受けにくい反射電な役割を果たしている．特に，腎臓疾患における「腎生検」

子（backscattered electron: BSE）
シグナルが用いられる（図 1）．の電顕診断は実施率が比較的高く，確定診断のみならず疾患

しかし，反射電子は二次電子に比べてエネルギーが高いので，の進行度や予後の判定などにおいても重要な意義をもってい散乱される率は少ないものの分解能は低下する．そこで，高る 1）．こうした電顕診断のほとんどは透過型電子顕微鏡法

感度の反射電子検出器の採用や反射電子シグナル増強法（重（TEM）を用いて行われているが，ルーチンの病理検査とし金属による染色法）によって解像度の良い三次元像を観察すて実施できる医療機関は限られており，電顕診断が必要な場る方法が工夫されてきた 14 ～ 16）．また，原子番号の大きい元合には専門の受託検査会社に依託されることもある．また，素ほど放出される反射電子シグナルが増大する（原子番号効

電顕試料の作製と画像の解析には専門的な技術や知識および果）ため，組成の違いが明暗コントラストで表示され，異な時間を要し，診断が確定するまでに数週間から数ヶ月かかるる組成の分布状態が観察できるのも低真空 SEM のメリット

こともあり，適切な治療を迅速に施すために，医療現場ではである．

より簡便で迅速な電顕診断法が望まれている．
一方，走査型電子顕微鏡法（SEM）は試料作製から観察まで TEM と比べれば短時間（数日）で実施できるものの 2 ～ 8），〒 683–8503 鳥取県米子市西町 86
E-mail: sumire@med.tottori-u.ac.jp
2014 年 5 月 14 日受付

最近の研究と技術

3. 低真空SEM観察に効果的な白金ブルー染色とPAM染色
一般的な低真空 SEM 観察では前処理や金属コーティングなどは不要ではあるが，生物試料を詳細に観察するのに欠かせないのが，効果的な重金属染色である．本稿で紹介する腎生検組織の観察には，白金ブルー（platinum-blue: Pt-blue）

低真空 SEM を用いた腎生検パラフィン切片の迅速三次元解析法

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図 3 白金ブルー染色したラット舌の同一パラフィン切片の光顕象（a）と低真空 SEM 像（b）．スケール：100 mm．

図1

低真空観察法（画像提供：（株）日立ハイテクノロジーズ）．

図2

マイクログリッドに載せた白金ブルー原液の TEM 観察像．

染色と PAM（periodic acid silver-methenamine：過ヨウ素酸メテナミン銀）染色を用いる 10）．白金ブルー染色は，1993 年に Tanaka と Inagaki によって開発された生物試料のための反射電子シグナル増強法の一つで 14），あらかじめシスプラチンとチミジンから合成した濃青色で液状の錯体・白金ブルー[Pt4(NH3)8(C6H13O5)4]+5 に少量のアンモニア溶液を加えて pH 9

図 4 腎生検パラフィン切片の低真空 SEM 像（膜性腎症）．白金ブルー染色像（a, c）と PAM 染色像（b, d）の比較．染色陽性部位が互いに逆で，その明暗コントラストと形状により細胞や組織の識別が可能．
（a）の挿入図は PAS 染色の光顕像．
（a, b）の矢印：個々の糸球体．
（c, d）は，1 個の糸球体の拡大像．スケー
ル：500 mm（a, b），50 mm（c, d）．に調整し，試料を 10 ～ 20 分程度浸漬するだけなので手順は非常に簡単であり，様々な生物試料の低真空 SEM 観察にお組織特異性（染色強度の差）により細胞や組織の識別が容易いて極めて効果的である 17）．以前は，白金ブルーそのものをである 23）．そこで，腎生検組織を白金ブルーで染色すると使用者自身で作製しなければならない上，合成反応に約一週（図 4a，c），糸球体構成要素である足細胞や血管内皮細胞な間かかるのが難点であったが 18），2008 年に商品化（TI ブルー：

どの細胞成分はよく染まる（Pt 陽性）が基底膜や膠原線維

日新 EM 株式会社）され，現在では誰でも容易に入手出来などは染まりにくい（Pt 陰性）ため，低真空 SEM 下では明るようになった．図 2 は，白金ブルー原液をマイクログリッ暗コントラストの差（反射電子シグナル放出量の差）と形態ドに載せ，TEM（日立 H-7650）で直接観察したものである．

によって個々の細胞や組織の識別が可能となる．一方，PAMほぼ均一な極めて小さい粒子状の外観を呈し，凝集化も結晶

染色は腎生検組織の光顕標本にはルーチンに用いられる染色化も認められず，酢酸ウラニルに代わる電子染色剤として法で，含有する銀によって基底膜や膠原線維，メサンギウムTEM 試料にも使用できる 19 ～ 22）．また，図 3 に示したのはラッ

基質は光顕像では黒く染まる（PAM 陽性）が細胞などは染ト舌の同一パラフィン切片を光顕と低真空 SEM で比較観察まらない（PAM 陰性）．すなわち，腎生検組織を PAM 染色したものであるが，白金ブルーで染色された組織は青い色をすると（図 4b，d），低真空 SEM 下では，特に PAM 陽性の呈するため，他の電子染色剤と違って光顕でも観察可能で基底膜の形状が，表面の細胞など（PAM 陰性）を全く除去あると同時に，低真空 SEM 下においても白金ブルーの細胞することなく明瞭に示され，白金ブルーとは全く逆の明暗コ

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顕微鏡 Vol. 49, No. 2（2014）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

ントラストによって他の構造物との識別が可能である．従って，組織の連続切片を白金ブルーと PAM で別々に染色すれば相補的な観察が可能となるため，腎生検標本を低真空SEM 像で効果的に評価できる．そして，この二つの方法で染色された標本では，それぞれの反射電子シグナル増強効果によって高い倍率で詳細に微細構造を観察することができるのである．
4. 低真空 SEM を用いた腎生検パラフィン切片の迅速三次元解析法と観察所見
4.1

試料作製法および観察法〈手順〉材料：腎生検標本の未染パラフィン切片（厚さ 5–10 μm）
・ 脱パラフィン ：100％キシレン（3 回）→ 100～50％エタノール→ 蒸留水
・ 染色 ：ⓐ 白金ブルー染色：TI ブルー染色キット（日新 EM 社）
pH 9 に調整（アンモニア溶液添加）した染色液を切片上にマウントして室温 10～20 分間染色ⓑ PAM 染色（過ヨウ素酸メセナミン銀染色）：

図 5 試料室に挿入する前に t-ブチルアルコール乾燥した切片（a, b）と濡れたまま挿入し真空乾燥した切片（c, d）の比較観
察．（a, c）白金ブルー染色像（小矢印：赤血球，大矢印：足突起）と（b, d）PAM 染色像（白矢印：基底膜）のいずれの低真空 SEM 像においても形状の差はほとんど見られない．スケー
ル：5 mm（a–d）．

常法，但し HE 染色は省いてもよい・ 水洗 ：蒸留水 1～2 分（切片周辺の水気を濾紙などで吸い取る）
SEM 用試料台中央にカーボンテープを貼り，スライド4.2

腎生検標本における糸球体の観察所見

本法では実際にどのような所見が得られるのか，すでに診断が確定した腎生検症例（微小変化型ネフローゼ症候群，ガラスを固定・ 低真空 SEM 観察 ：倍率×50～30,000（反射電子像），15 kV，30 Pa（日立 TM-1000，TM3030）

IgA 腎症，膜性腎症）の低真空 SEM 像を供覧し，観察のポイントを解説する．これらの症例では，特に重要な糸球体の基本構造（足細胞と足突起，血管内皮細胞，基底膜，メサン

上記の手順に示すように，汎用サイズのスライドガラスギウム細胞，メサンギウム基質）に注目して形態観察を行っ（76 mm × 26 mm）に貼り付けた未染の腎生検パラフィン切た．低真空 SEM 下では，低倍（×50 ～ 60）で光顕と同様に片（厚さ 5 ～ 10 mm）を，通常の方法で脱パラフィンし，白切片上の全ての糸球体（図 4a：矢印）を俯瞰的に観察する

金ブルーまたは PAM で染色した後水洗し，切片が濡れたまことができる．そこで，個々の糸球体を ×600 ～ 1,000 に拡まの状態でスライドガラスを低真空 SEM の試料室にセット大して観察する（図 4c，d）．糸球体によって，主に表面像して観察する．切片は，しばらくは含水状態であるが，観察が観察される場合や（図 6），断面像が観察される場合（図 7）

しているうちに徐々に乾燥するため，約 10 分程度で真空乾があるので，病変や所見の解析に適した部位をさらに拡大し燥状態となる．この乾燥による組織収縮の影響を評価するたて三次元的な形態解析を詳細に行う．この際，染色特性によめに，あらかじめ t-ブチルアルコール乾燥を行った切片と比り異なる反射電子像（明暗コントラスト）が示されるので，較観察したところ（図 5），糸球体の概形にはほとんど差が組織像の違いに留意する必要がある．本法で得られた染色法見られず，低真空乾燥によって微細形態が大きく損なわれるによる観察所見の違いと，それぞれの症例における糸球体基ことはなかった．これは，染色に用いた重金属（白金，銀）本構造の病理所見を図 6 ～ 8 に示した．

による組織の硬化に起因すると考えられた 10）．組織の解析に〈白金ブルー染色標本〉（図 6a，b，図 7，図 8b）

あたっては，腎生検切片の全体像から各部分の拡大像まで任

各症例の表面像において，光顕では観察困難な足細胞およ意の倍率（×50 ～ ×30,000）で観察を行う．前述したように，び足突起の微細構造が，立体像として広範囲に捉えられた腎組織における白金ブルーと PAM の染色特性は相補的で，（図 6）．症例によっては足突起の形状の変化（消失，癒合，互いに異なった細胞や組織の明暗コントラスト像が描出さ微絨毛化）と同時に，基底膜の厚さの変化（菲薄，肥厚：計れるため，両方の染色標本を観察することによって，病変部測も可）や蛇行，メサンギウムの増生などが断面像で認めらの三次元形態を迅速かつ詳細に解析できるのが低真空 SEMれた（図 7，図 8b）．

を用いる本法の大きな利点である．また，必要があれば，同〈PAM 染色標本〉（図 8a，d，e）

一サンプルの光顕像，蛍光像とも対比して観察することが膜性腎症に特徴的な PAM 陽性の基底膜の形状が，断面像できる．

だけでなく表面像としても上皮側と血管内皮側の両面から観察された．これは，基底膜から放出される反射電子シグナル

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低真空 SEM を用いた腎生検パラフィン切片の迅速三次元解析法

149【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図 6 糸球体表面の低真空 SEM 像（白金ブルー染色）．（a）微小変化型：正常と思われる部分では，足突起の特徴的な形状が明瞭に観察される（直接倍率 ×10,000）．（b）IgA 腎症：足細胞の表面に顆粒状の構造物（黒矢印）やボウマン腔にリークした赤血球（白矢印）が認められる．P：足細胞．スケール：5 mm（a, b）．

が表面を覆う足細胞および血管内皮細胞を透過して検出されけでは診断が難しい場合には，低真空 SEM を用いる本法にるためである．その結果，基底膜の形状の違いや変化（菲薄，よってより幅広い腎生検標本の解析が可能になると思われる．

肥厚，蛇行，免疫物質の基底膜内沈着によるスパイク形成，点刻像，新生，二重化など）が明瞭に捉えられた（図 8）．

5.

疾患の進行度によっては，光顕ではとらえ難いごく初期の微日頃から電顕診断に携っておられる方や SEM 経験者は，細なスパイク形成なども高倍率で観察でき（図 8e），さらに「パラフィン切片を SEM で観察！？」と驚かれたかもしれ

TEM 像の所見（図 8c）から提唱されている膜性腎症におけない．しかし，染色方法や観察手段などを工夫して低真空る病期（stage）分類

1）に有用な知見が低真空 SEM 像でも得られた 10）．

おわりにSEM で観察してみると，特に腎生検標本では予想以上に糸球体の微細構造が立体的に描出され，なおかつ光顕や TEM以上述べたように，本法では糸球体の表面や断面の形状変ではとらえ難い三次元情報が比較的容易に得られることが明化だけでなく，基底膜の厚さ計測や免疫物質の沈着状況（病らかとなった．「たかがパラフィン切片，されどパラフィン状の進行度）といった，従来は TEM でしか得られなかった切片」である．もちろん，質的診断レベルおいては TEM に詳細な病理所見をパラフィン切片を使用して解析することがは及ばないものの，本法は，TEM による詳細な診断結果が出来た．特に，生検時に電顕用の標本が得られず光顕観察だ出てくるまでに，臨床医自身が低真空 SEM を操作して鑑別点の検索をすることができる簡便な手段になり得ると考えている．実際に低真空 SEM によって糸球体基本構造の三次元像をパラフィン切片上で把握することで，光顕像の理解が一層深まってくることも実感している．また，パラフィン切片が残されていれば，レトロスペクティブな三次元構造の解析も可能である．腎生検以外の他の病理組織標本や臨床材料においても電顕用のサンプルが得られない場合，パラフィン切片からの戻し電顕法も有用であるが，より簡便で迅速な本法を試してみることを是非お勧めしたい．特に，PAM 染色標本のように重金属染色をうまく利用すれば，表面の細胞や組織を全く除去することなくその下に存在する基底膜や結合組織の形態を捉えることも可能であり，様々な応用法があると思われる．さらに，最近開発された免疫蛍光染色像と低真空SEM 像を重ね合わせて検証できる画像検証ソフト（AZblend：（株）アストロン）なども利用可能で，TEM 標本の作製や診図 7 糸球体断面の低真空 SEM 像（白金ブルー染色：IgA 腎症）．
1 個の糸球体（a）と，その矢印で示す部分の拡大像（b）．白金ブルー陽性の足細胞（P），血管内皮細胞（E）が最も明るく，メサンギウム細胞（M）はやや明るい．白金ブルー陰性で暗いライン状を呈する基底膜（GBM →）と暗い領域としてメサンギウム基質（MM）が識別できる．Bs：ボウマン腔，L：毛細血管腔．スケール：50 mm（a），5 mm（b）．
150

断に先立って，免疫物質の沈着部位のような病変部の把握にも本法は役立つであろう．
以上紹介したように，低真空 SEM を用いた本法が，従来の光顕法，電顕法（TEM）を補う新規の迅速電顕解析法として，腎生検診断において今後幅広く活用されることを期待している．
顕微鏡 Vol. 49, No. 2（2014）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図 8 糸球体基底膜の低真空 SEM 像と TEM 像（膜性腎症）．（a, d, e）PAM 染色像：PAM 陽性の基底膜（GBM →）とメサンギウム基質（MM）が明るく明瞭．断面像では，膜性腎症に典型的な基底膜のスパイク形成像を呈す．表面を覆う足細胞（P）と血管内皮細胞（E），および免疫物質（黒矢印）やメサンギウム細胞（M）は PAM 陰性のため，暗く不明瞭．（b）白金ブルー
染色像：陽性部が PAM とは逆で，足細胞（P），血管内皮細胞（E）は明るく，陰性部の基底膜（GBM）は暗く示されるため境界が明瞭で，基底膜に肥厚および蛇行がみられる．また，その厚さを計測することができる（挿入図）．基底膜中の免疫物質（黒矢印）はやや明るく認められる．（c）同一サンプルの TEM 像．基底膜（GBM）や免疫物質（黒矢印）は電子密度が高い．（d, e）
基底膜の足細胞側（★）と血管腔側（☆）の表面形状が観察でき，（d）では，血管腔側の基底膜面は平坦で様々な大きさのホール様構造（白矢印）が認められる（症例 1：stage II ～ III）．（e）では，基底膜の足細胞側に高さ 0.5 mm 以下の小さな突起（白矢印）が多数認められる（症例 2：初期～ stage I）．L：毛細血管腔，Bs：ボウマン腔．スケール：5 mm（a, d, e），2 mm（c）．

謝辞

本研究を進めるにあたり，腎生検病理診断に関して貴重なアドバイスを頂きました元新見公立短期大学教授

内藤一郎

先生，鳥取大学医学部分子病理学分野助教

加藤雅子先生，鳥取大学医学部周産期・小児医学分野准教授

岡田晋一先生，

鳥取大学医学部機能病態内科学分野講師

宗村千潮先生，および低真空 SEM 観察にご協力頂きました（株）日立ハイテ
クノロジーズの各氏に感謝致します．
文献1）日 本 腎 臓 学 会・ 腎 病 理 診 断 標 準 化 委 員 会： 日 本 腎 病 理 協 会（編），腎生検病理アトラス「腎生検病理診断標準化への指針」
病理改訂版，東京医学社，東京，56–67（2010）2）頼岡徳在：広島大学医学雑誌，28(6)，711–764（1980）3）Arakawa, M.: Am. J. Path., 64, 457–466 (1971)4）Arakawa, M. and Tokunaga, J.: Lab. Invest., 27, 336–371 (1972)5）Hidaka, S., et al.: J. Clin. Electron. Microsc., 23, 5–6 (1990)6）NG, W., So, K.F. and Ngai, H.K.: Pathology, 14, 299–302 (1982)

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臨床分子形態学会総会合同学術集会講演予稿集，96（2007）10）Inaga, S. et al.: Arch. Histol. Cytol., 73, 113–125 (2010/2011)
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低真空 SEM を用いた腎生検パラフィン切片の迅速三次元解析法

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