35●カチオン交換型ミックスモードゲル
TOYOPEARL MX-Trp-650M の性能
バイオサイエンス事業部

1．背開発部

セパレーションセンター

久保中村雄二孝司

型充填剤 TOYOPEARL MX − Trp − 650M を製品化した。

景この充填剤はリガンドとして、カルボキシル基に由来

近年、バイオ医薬品の中でも免疫グロブリン G（IgG）

するカチオン交換性とインドール環に由来する疎水性を中心とした抗体医薬に対する需要の増加は特に著しの両方の特徴を有したトリプトファンを用いており、い。その抗体医薬品の成功に伴い、生産工程の第一段高吸着容量で、且つ塩耐性にも優れ、従来のイオン交階である培養工程において、抗体の発現量が増加して換体や疎水性相互作用クロマトグラフィーにない新しいる。その結果、生産工程の第二段階である精製工程

い分離選択性を有している。この充填剤は IgG の精製においても、生産性・コストパフォーマンスに優れただけに限らず、インシュリンやその他のタンパク質医

1）新しい分離充填剤の開発が必要とされてきている 。

薬品の精製にも使用可能である。本稿では、この新規その一例が、高吸着容量化であり、この技術によりタ充填剤の基本的性能、特徴について報告する。

ンパク質医薬品の精製工程での生産性を著しく改良することが可能となる。
一般的に IgG の精製には、Capture 工程での分離精製用充填剤として、アフィニティーモードの Protein

2．実験項［1］試薬、充填剤

A 充填剤がよく用いられる。Protein A 充填剤は、IgG

ポリクローナルヒト IgG は、化血研製ガンマグロに対する親和性に優れ、夾雑物との分離能が優れてブリンを購入し用いた。モノクローナル IgG およびいる。その一方で、高価格、低アルカリ安定性、リガCHO（Chinese Hamster Ovary） 細 胞 培 養 液 夾 雑 物

ンドの漏洩によるコンタミネーション、吸着容量が低は、Tosoh Bioscience GmbH（Germany）から入手し2）いことによる低生産性などの欠点を有している 。こた。酢酸、酢酸ナトリウム、NaCl、NaOH などの試れに対し、イオン交換型充填剤は、安価で吸着容量も薬は和光純薬（株）から購入した。Capto MMC は GE高いという利点を有しているが、Protein A 充填剤にHealthcare 社（株）製の製品を用いた。TOYOPEARL は比べ分離選択性に劣り、また塩耐性が低い（高塩濃度東ソー（株）製の製品を用いた。

下での吸着力が低い）という欠点がある。その他に、
IgG 精製によく使用される充填剤として疎水性相互作［2］ポリクローナルヒト IgG 動的吸着量の測定用クロマトグラフィー充填剤が挙げられる。この充填

4 種 類 の 充 填 剤 TOYOPEARL MX − Trp − 650M、剤は、高塩濃度下で使用され、IgG とその凝集体や宿TOYOPEARL GigaCap S − 650M、TOYOPEARL

主細胞由来タンパク質等の不純物とを分離する事が可GigaCap CM − 650M、Capto MMC を、それぞれ 6 mm能であるが、塩濃度が高いためタンパク質の沈殿や変I.D. × 40 mm のステンレス製カラムに充填し用いた。

性を起こしやすいという欠点を有している1），3）。

吸着緩衝液には、0.05 mol ／ L 酢酸ナトリウムを用い、近年、Protein A 充填剤に代わる安価で取扱いが容それぞれ pH を 4.0、4.3、4.7、5.0、5.5、6.0 に調整し易な新しい充填剤として、疑似 Protein A リガンドや用いた。塩化ナトリウム濃度は、0.0、0.1、0.15、0.2

ミックスモードリガンド技術の開発が盛んに行われてmol ／ L の濃度に調整した。タンパク質として、化血いる。特に、ミックスモード充填剤に関しては、種々研製ガンマグロブリンを用い、上記の種々の吸着緩衝の製品が開発され市場に投入され始めており、Protein液へ溶解し、1 mg ／ mL の濃度へ調整した。充填したA 充填剤の代替など Capture 用途での利用だけでなく、カラムへ送液ポンプと UV 検出器（280 nm）を接続し、その後の polishing 工程での不純物分離等、精力的に調 整 し た タ ン パ ク 質 溶 液 を 線 速 度 212、425、637、IgG 精製への応用が検討されている4 − 8）。

我々は、最近、新しい構造を有するミックスモード

849 cm ／ hr の流速で負荷させた。得られた吸着破過曲線から、充填剤の動的吸着容量（Dynamic binding

TOSOH Research & Technology Review Vol.56（2012）36

capacity：DBC）を算出した。吸着させた IgG は、脱アルカリ洗浄条件は、0.1 mol ／ L NaOH 溶液を洗浄液

着緩衝液 0.30 mol ／ L の塩化ナトリウムを含む 0.1 molとして用いた場合、5 倍の column volume（CV）で洗／ L Tris − HCl pH 8.5 で回収し、その回収液の UV 吸光

浄し、次いで 0.3 mol ／ L の塩化ナトリウムを含む 0.1度から、IgG の回収率を計算した。

mol ／ L Tris − HCl pH 8.5 を 用 い、10 CV で 洗 浄 し た。
これを洗浄 1 サイクルとし、所定の回数洗浄後、再度吸着容量の測定を繰り返した。0.5 mol ／ L NaOH 溶［3］モノクローナル IgG 動的吸着量の測定
吸着緩衝液として、0.10 mol ／ L 塩化ナトリウムを液を洗浄液として用いた場合は、3 CV で洗浄後、0.3含む 0.05 mol ／ L 酢酸ナトリウム pH 4.7 を用い、こmol ／ L の塩化ナトリウムを含む 0.1 mol ／ L Tris − HClの緩衝液にそれぞれ濃度が 1 mg ／ mL、4 mg ／ mL とpH 8.5 を用い 5 CV で洗浄し、これを洗浄 1 サイクルなるようにモノクローナル IgG と CHO 細胞由来夾

として洗浄、吸着実験を繰り返した。洗浄回数はそれ雑物を溶解させた。得られたタンパク質混合溶液を、ぞれのアルカリ洗浄液で 200 回実施した。

TOYOPEARL MX − Trp − 650M を充填したステンレス製カラム（6 mm I.D. × 40 mm）に、流速 1 mL ／ min.

3．結果と考察で負荷させた。Flow − through フラクションは、採集しサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）で分析した。

［1］TOYOPEARL MX − Trp − 650M の構造

一定量のタンパク質混合溶液を負荷させた後、吸着緩TOYOPEARL MX − Trp − 650M は リ ガ ン ド と し て、衝液で洗浄し、次いで脱着緩衝液 0.30 mol ／ L の塩化

疎水性アミノ酸であるトリプトファンを結合させたナトリウムを含む 0.1 mol ／ L Tris − HCl pH 8.5 でタンミックスモード型充填剤である。その構造は、Fig. 1

パク質を脱着させた。脱着フラクションは、同様に採に示した様にトリプトファンのアミノ基を利用し、ア集しサイズ排除クロマトグラフィーで分析した。脱着ミド結合で TOYOPEARL に共有結合させている。官フラクションの UV 吸光度（280 nm）から、モノクロー能基としては、トリプトファン由来のカルボキシル基

ナル IgG の濃度を定量し、負荷量に対する回収率を計（弱カチオン交換基）とインドール環（疎水性官能基）算した。

を有している。疎水性アミノ酸であるトリプトファン
は、過去様々なタンパク質の分離精製用充填剤のリガンドとして用いられている 9）− 12）。また、分離膜を利用［4］サイズ排除クロマトグラフィー測定条件
上記 2.［3］項で得られた各フラクション及び各溶液した技術では、γ−グロブリンを吸着分離する例が報を SEC で分析した。カラムは TSKgel G3000SWXL（カ告されている 13）。血液浄化用ゲルに固定化された例でラムサイズ：7.8 mm I.D. × 30 cm）を用い、溶離液とは、血液中の抗体成分分離にも利用されている 14）。

して 0.3 mol ／ L の塩化ナトリウムを含む 0.1 mol ／ L リ

我々は、既存製品である TOYOPEARL GigaCap シン酸緩衝液 pH 7.0 を用いて分析した。流速は、1 ml ／リーズの開発時に確立した高吸着容量化技術 15） とトmin. で、検出は UV 検出器（280 nm）で測定した。

リプトファンリガンドにみられるタンパク質分離精製能を組み合わせることにより、高吸着容量でタンパク質、特に IgG に対する分離精製能が優れた新規ミック［5］充填剤の使用耐久性の測定

スモード型充填剤を開発、製品化した。

6 mm I.D. × 40 mm の ス テ ン レ ス 製 カ ラ ム に
TOYOPEARL MX − Trp − 650M を充填し、ポリクローナル IgG の DBC を測定した。測定後、吸着タンパク［2］ポリクローナルヒト IgG の吸着容量
TOYOPEARL MX − Trp − 650M のポリクローナルヒ

質を脱着させ、その後、アルカリ洗浄液で洗浄した。

OOCH2CNH

HCCOONa

Weak cation exchange

CH2
TOYOPEARL

HydrophobicN
H

Fig.１

The structure of TOYOPERL MX−Trp−650M

東ソー研究・技術報告第 56 巻（2012）37

ト IgG に対する吸着容量を評価した。結果を Table 1

分離を行う。従って、通液速度が速い方が精製に要すに示した。吸着条件としては、塩濃度が 0.10 ～ 0.15る時間の短縮につながり、結果として製造コストの削mol ／ L（導電率 12 ～ 17 mS ／ cm）と高い条件下での減が可能になるため、高流速下でも吸着容量が高い充DBC を測定した。抗体だけに限らず、タンパク質医填剤が望まれている。そこで、TOYOPEARL MX − Trp

薬品などの培養液は、一般的に導電率が高く、この培− 650M のポリクローナルヒト IgG に対する DBC の通養液を精製工程初期の Capture 工程で精製するには、液速度依存性を測定した。結果を Fig. ２に示したが、充填剤の塩耐性が必要となる。塩耐性の低い充填剤をここでは通液速度は、単位時間当りに溶液がカラム内用いるためには、あらかじめ培養液を希釈して導電率を移動する距離である線速度で表した。この充填剤はを下げる、脱塩する等の操作が必要となる。しかしな

非常に速い通液速度でも吸着容量の低下が少なく、十がら、TOYOPEARL MX − Trp − 650M は、高塩濃度下分に高い吸着容量を示した。

でもポリクローナルヒト IgG に対し高い吸着能を有し、高い塩耐性を示すことを確認した。

［4］充填剤の塩耐性
TOYOPEARL MX − Trp − 650M の吸着容量の塩耐性を更に詳細に測定した。Fig. ３では塩濃度 0.1 mol ／ L［3］動的吸着量の流速依存性カラムクロマトグラフィー充填剤を用いたタンパクの吸着条件下での、DBC に対する pH の影響を確認し質医薬品等の精製では、充填剤をカラムに充填し、こた。既存製品に比べ TOYOPEARL MX − Trp − 650M は、れにタンパク質溶液を通液して目的成分と不純物との高い pH でもより高い DBC を示した。競合品 Capto

Comparison of dynamic binding capacitya for polyclonal human IgG

Table１

Particle Ion exchange Dynamic binding
Dynamic binding
Recoveryb
Recoverycsizecapacityb
capacityc
capacity［μm］ ［meq ／ mL］ ［mg ／ mL−gel］［％］［mg ／ mL−gel］［％］
50−1000.1295974896
TOYOPEARL MX−Trp−650M0.2418−0−TOYOPEARL Giga Cap CM−650M 50−1000.162−0−50−100
TOYOPEARL Giga Cap S−650M
0.0691486118575
Capto MMCaDynamic binding capacities were determined at 10 % breakthrough curve. Column size: 6 mm I.D. × 40 mm height.
Sample: polyclonal human IgG 1 mg/mL. Flow velocity: 212 cm/hr. Detection: UV at 280 nm.
bBinding buffer: 0.05 mol/L sodium acetate buffer, pH 4.7, 0.10 mol/L sodium chloride. The conductivity of buffer: 12 mS/cm.
Elution buffer: 0.1 mol/L Tris-HCl buffer, pH 8.5, 0.3 mol/L sodium chloride.
cBinding buffer: 0.05 mol/L sodium acetate buffer, pH 4.7, 0.15 mol/L sodium chloride. The conductivity of buffer: 17 mS/cm.
Elution buffer: 0.1 mol/L Tris-HCl buffer, pH 8.5, 0.3 mol/L sodium chloride.

Polyclonal human lgG DBC［g／L］

Resin

120
TOYOPEARL MX−Trp−650M

100

Capto MMC

8060402000200

400600800

1000Linear Velocity［cm／h］

Fig.２ DBCs for IgG at various linear velocities
Dynamic binding capacities were determined at 10 % breakthrough. Column size: 6 mm I.D.×40 mm
height. Sample: polyclonal human IgG 1 mg/mL. Binding buffer: 0.05 mol/L sodium acetate buffer,pH 4.7, 0.1 mol/L sodium chloride. Feed rate: 212, 425, 637, 849 cm/hr. Elution buffer: 0.1 mol/L
Tris-HCl buffer, pH 8.5, 0.3 mol/L sodium chloride.

TOSOH Research & Technology Review Vol.56（2012）38

Polyclonal human lgG DBC［g／L］

1401201008060

TOYOPEARL MX−Trp−650M
TOYOPEARL GigaCap S−650M

40TOYOPEARL GigaCap CM−650M
20Capto MMC03.8

4.0

4.2

4.4

4.6

4.8

5.0

5.2

Loading buffer pHFig.３ DBC salt tolerance on TOYOPEARL MX−Trp−650M
Dynamic binding capacities were determined at 10 % breakthrough. Column size: 6 mm I.D.×40 mm height.
Sample: polyclonal human IgG 1 mg/mL. Binding buffer: 0.05 mol/L sodium acetate buffer containing 0.1 mol/L
sodium chloride. Binding buffer pH: 4.3, 4.7, 5.0. The conductivity of buffer: 12 mS/cm. Elution buffer: 0.1 mol/L
Tris−HCl buffer, pH 8.5, 0.3 mol/L sodium chloride. Linear flow velocity: 212 cm/hr. Detection: UV at 280 nm.

MMC（GE Healthcare 社製ミックスモード型充填剤）

不純物との分離能は、pH 等を最適化することによりに比べても、十分に高い吸着容量を示すことを確認し改善できることがあるため、より広い範囲の pH で使た。また Fig. ４では、0.0 ～ 0.2 mol ／ L の範囲の様々用できることが好ましく、本製品はその利用可能な範な塩濃度下での、DBC に対する pH の影響を確認した。

囲が広いと考えられる。

塩濃度が低下するに従い、吸着容量に対する pH の影響は変化し、より高い pH で吸着可能になる傾向を確［5］モノクローナル IgG の分離精製例認した。タンパク質医薬品の精製は、通常 Capture 工

モノクローナル IgG 抗体と、その培養時の不純物で程、Intermediate purification 工程、Polishing 工程の 3ある CHO 細胞培養液夾雑物を混合した溶液を調整し、工程からなり、後者の 2 工程では、分離モードによっその分離精製能を評価した。結果を Fig. ５、Fig. ６ても異なるが、低塩濃度下で実施されることが多い。に示した。ここで吸着緩衝液は、0.10 mol ／ L 塩化ナ

Polyclonal human lgG DBC［g／L］

120
10080

0.00 mol／L NaCl
0.10 mol／L NaCl

60

0.15 mol／L NaCl
0.20 mol／L NaCl

4020
0
3.5

4

4.5

55.5

66.5Loading buffer pHFig.４ DBC salt tolerance at various salt concentration
Dynamic binding capacities were determined at 10 % breakthrough. Column size: 6 mm I.D.×40 mm height.
Sample: polyclonal human IgG 1 mg/mL. Binding buffer: 0.05 mol/L sodium acetate buffer. Salt concentrationof the buffer: 0.0, 0.1, 0.15, 0.2 mol/L sodium chloride. pH of the buffer: 4.0, 4.3, 4.7, 5.0, 5.5, 6.0. Elution buffer:0.1 mol/L Tris−HCl buffer, pH 8.5, 0.3 mol/L sodium chloride. Linear velocity: 212 cm/hr. Detection: UV at 280 nm.

東ソー研究・技術報告第 56 巻（2012）

39

1000
mAb／CHO Cell Protein Breakthough curve

800mAb DBC ＝ 93 g／L
Yield 96％mV

600
400
2000020406080

100120140−200Time［min.］Fig.５

Breakthrough curve of CHO cell culture solution containing monoclonal IgG on TOYOPEARL MX−Trp−650M
Column size: 6 mm I.D.×40 mm height. Binding buffer: 0.05 mol/L sodium acetate buffer, pH 4.7, 0.1 mol/Lsodium chloride. Elution buffer: 0.1 mol/L Tris−HCl buffer, pH 8.5, 0.3 mol/L sodium chloride. Linear velocity:
212 cm/hr. Detection: UV at 280 nm. Loading Sample: monoclonal IgG, CHO cell culture in 0.05 mol/L sodium
chloride buffer, pH 4.7, 0.1 mol/L sodium chloride. Monoclonal IgG concentration of loading sample solution:
1 mg/mL. Conduvtivity of loading sample: 12 mS/cm.

1200
1000mV800
DBC flow−through fraction

600

DBC elution fraction

400

DBC loading sample solution
CHO celln protein

200

Pure monoclonal antibody

005101520Retention time［min.］Fig.６ Purity check of IgG in elution fraction by analytical SEC
Column: TSKgel G3000SWXL, 7.8 mm I.D. ×30 cm. Elution buffer: 0.1 mol/L sodium phosphate buffer,
pH 7.0, 0.3 mol/L sodium chloride. Flow rate: 1.0 ml/min. Detection: UV at 280 nm. Injection volume:
100 μL. Injection sample: Each fractions derived from frontal analysis experiment in Fig. 5.

トリウムを含む 0.05 mol ／ L 酢酸ナトリウム緩衝液 pH定した。それぞれ、モノクローナル IgG 純品、CHO4.7 を用い、その導電率は 12 mS ／ cm であった。吸着細胞培養夾雑物、それらを混合した吸着タンパク質混タンパク質混合溶液中のモノクローナル IgG の濃度合溶液、脱着成分、Flow − through 成分を分析し、モは 1 mg ／ mL に調整し、TOYOPEARL MX − Trp − 650M

ノクローナル IgG と CHO 細胞由来不純物とが高純度を充填したカラムに負荷させた。Flow − through でカで分離できることを確認した。

ラムを素通りした成分と充填剤に吸着した成分を分離し、最後に 0.3 mol ／ L 塩化ナトリウムを含む 0.05 mol［6］充填剤の使用耐久性／ L Tris − HCl pH 8.5 で吸着成分を脱着させた。脱着し一般的にタンパク質の精製に使用されたカラムは、た溶液の吸光度からモノクローナル IgG の DBC を算タンパク質の吸着・脱着操作の後、カラムの殺菌の出した。

ため、NaOH による洗浄操作（CIP 操作：Cleaning in

結果は Fig. ５に示したが、DBC は 93 g ／ L（回収率place）が行われ、再利用される 16）。この時、NaOH96 ％）であった。また、精製物の純度を、SEC で測に対する安定性が低いと、充填剤の選択性や吸着能がTOSOH Research & Technology Review Vol.56（2012）40

Polyclonal human lgG DBC［g／L］

120
1008060
DBC buffer pH 4.7＋0.10 mol／L NaCl（0.1 N−NaOH CIP）

40

DBC buffer pH 4.3＋0.15 mol／L NaCl（0.1 N−NaOH CIP）
DBC buffer pH 4.7＋0.10 mol／L NaCl（0.5 N−NaOH CIP）

20

DBC buffer pH 4.3＋0.15 mol／L NaCl（0.5 N−NaOH CIP）

0020406080100120140160

180200220

CIP cycle［times］

Fig.７ Cleaning in place stability test
CIP conditions; Alkaline washing solution: 0.1, 0.5 mol/L sodium hydroxyde. Buffer washing solution:
0.1 mol/L Tris-HCl, pH 8.5, 0.3 mol/L sodium chloride. Washing flow rate: 1 ml/min. Alkaline washingcolumn volume: 5 CV/cycle for 0.1 mol/L sodium hydroxyde, 3 CV/cycle for 0.5 mol/L sodium hydroxyde.
Buffer washing column volume: 10 CV/cycle for 0.1 mol/L sodium hydroxyde, 5 CV/cycle for 0.5 mol/Lsodium hydroxyde. DBC conditions; Column size: 6 mm I.D.×40 mm height. Sample: polyclonal humanIgG 1 mg/mL. Binding buffer: 0.05 mol/L sodium acetate buffer. Salt concentration of the buffer: 0.1, 0.15mol/L sodium chloride. pH of the buffer: 4.3, 4.7. Elution buffer: 0.1 mol/L Tris-HCl buffer, pH 8.5, 0.3 mol/Lsodium chloride. Flow linear velocity: 212 cm/hr. Detection: UV at 280 nm.

低下し、その結果充填剤の交換頻度が高くなるため、タンパク質医薬品の製造コストが高くなる。ここでは、アルカリ性洗浄液として、0.1 ～ 0.5 mol ／ L NaOH を使用して、その繰り返し使用耐久性を評価した。結果を Fig. ７に示した。タンパク質としてポリクローナ
ルヒト IgG を用い、その DBC の変化を確認したが、200 回の洗浄操作の後でも吸着能の変化は認められなかった。

引用文献
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TOYOPEARL MX − Trp − 650M の基本的な性能を紹介した。本製品は、トリプトファンという疎水性アミノ酸をリガンドとして用いることで、弱カチオン交換基と疎水性官能基を有し、その結果、高い塩濃度下でもIgG に対し高い吸着能を有する従来に無い新しい充填剤を提供することができた。モノクローナル IgG とCHO 細胞由来不純物も高純度で分離できることを確認した。本製品は、Protein A 充填剤と比べ、高吸着容量であり、且つ安価で繰り返し使用耐久性にも優れることから、IgG などタンパク質医薬品の生産性の向上及び製造コスト削減に寄与することが期待できる。

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