Japan Bioanalysis Forum

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DG2016‐20

February 8-9, 2017
8th JBF Symposium

1Japan Bioanalysis Forum

DG2016-20 メンバー
芦澤 紘子（科研製薬）

中井 直子（第一三共） Naoko kai
Naoko Nakai

石井 琢帆（サンプラネット）

西村 直浩（SCAS）

内村 隆秀（中外医科研）

真弓 剛（全星薬品）

小野 敬太（大鵬薬品）

安田 穣（TRC）

栗山 早織（日本新薬）

山川 達也（富士フイルム）

Takuho Ishii

Takahide Uchimura
Keita Ono

Saori Kuriyama

Naohiro Nishimura
Tsuyoshi Mayumi
Yutaka Yasuda

Tatsuya Yamakawa

小関 望（杏林製薬）

丹羽 誠（日本化薬）
Makoto Niwa

Nozomu Koseki

戸田 亜希子（新日本科学）
Akiko Toda

Observer

副島 呉竹（富士フイルム）

佐野 善寿（JBF SC, サンプラネット）

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Hiroko Ashizawa

Kuretake Soejima

8th JBF Symposium

2活動内容 (1)Japan Bioanalysis Forum

確認 ＆ 議論 するにあたり・・・
前回の報告

EBF white paper [1]（DG2015-16）

今回の報告

詳細な読み込みを実施
DG検討結果⽇本の実態に照らした適否も含めアンケート調査を実施・評価[1] P. Timmerman et al., Tiered approach into practice: scientific validation
for chromatography-based assays in early development – arecommendation from the European Bioanalysis Forum. Bioanalysis (2015)
7(18): 2387-2398.
8th JBF Symposium, 2017

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⽬的に応じた適切な分析⽅法

3

活動内容 (2)

分析法の検証⽅法に⼀定の考え⽅が存在しない

今回の報告
⽬的に応じた適切な分析⽅法
概念が適⽤できるか・・・

⽇本の実態に照らした適否も含めアンケート調査を実施・評価

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in vitro試験 [2]Japan Bioanalysis Forum[2] B. Buscher et al., Bioanalysis for plasma protein binding studies in drug
discovery and drug development: views and recommendations of theEuropean Bioanalysis Forum. Bioanalysis (2014) 6(5):673-82.
8th JBF Symposium, 20174

Japan Bioanalysis Forum

Executive Summary

Status in Japan– Use of scientific validation (SV) is still limited while there is a
desire to use this and BMV guideline includes the addendum
on tiered approach– Some bioanalysts are reluctant to use SV in “main” studies:Different desire for application of SV was detected (nonpivotal study vs preliminary study)– Use of matrix matching is not well-recognized• In vitro Studies

http://bioanalysisforum.jp/• EBF White Paper Items / In vivo Studies– Japanese bioanalysts have high level of interests in thepurity of analytical standards even in in vitro studies– BMV-like format is actually used and desire to use scientificdriven approach was detected
8th JBF Symposium, 20175

Japan Bioanalysis Forum

EBFのWhite Paperを題材とした
DG検討内容※について納得できるか，補うべきものがないか※（7th JBF Symposium, 2016

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アンケート（１）

DG2015－16 DG発表)

8th JBF Symposium, 20176

Japan Bioanalysis ForumEBF による5区分

⾎漿中代謝物（ICH-M3(R2)可否判断のため）
Assay appropriate SV

尿中（未変化体）
組織中（未変化体）

Stage appropriate SV

開発初期の⾮臨床⾎漿中未変化体（初期のGLP-TK測定を含む）
開発初期の臨床⾎漿中未変化体（初期のPhase 1試験を含む）

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EBF White Paperで論じられているにおける5区分EBFによって分類された5区分について、昨年度のDGでの議論を基に各バリデーション項⽬のSV適⽤に関するアンケート調査を実施し検討を⾏った。
8th JBF Symposium, 20177

Japan Bioanalysis Forum

回答者背景

所属および従事年数

アンケート集計結果

海外CRO
0%
国内CRO
21%

公的機関
0%

バイオアナリシス従事年数
その他
2%

国内製薬企業
74%

20年以上
12%

10〜20年
36%

0〜3年
12%

3〜5年
14%

5〜10年
26%

海外製薬企業3%
有効回答数 58

有効回答数 58

国内製薬企業が3/4，
CROが2割，海外企業の割合が低い。

回答者の経験年数分布は広範囲で⼤きな偏りはない。

8th JBF Symposium, 2017

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回答者所属

8

Japan Bioanalysis Forum

Assay appropriate SVStage appropriate SV

代謝物・尿・組織開発初期（未変化体）

EBF

COA不要
同⼀バッチの標準物質での複数動物種の測定で，相対的な暴露量⽐較が可能で，
ICH-M3(R2) 対応の要否判断が可能

COA有が基本
COAが無い場合は，投与と測定で同⼀バッチを使⽤

DG

ICH-M3(R2) 評価を実施するためにはROAは必要。
しかし，ICH-M3(R2)評価の要否判断にはROA不要

ROA有，または投与と測定で同⼀バッチを使⽤

EBF

代謝物︓不要尿，組織︓投与した被験物質と同⼀バッチで測定投与した被験物質と同⼀バッチで測定

SV項⽬
1.標準品のCOA

1-1.必要性

1-2.COA, ROAがない
場合に投与と同⼀バッチで測定することについてDG

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DG Discussion 1

投与量と測定濃度が絡むパラメータでは同⼀バッチで測定する意義が⾼いが国内でCOAやROAが無い場合は考え難い。
8th JBF Symposium, 20179

Japan Bioanalysis Forum1. 標準品のCOA 1.必要性(1/2)

アンケート集計結果

2; 80%

1; 14%

1. EBFに同意
2. DGに同意
3. その他8割がDGに賛成しているがROAについては定義が曖昧であり，回答者間で認識が⼀致していない。

有効回答数 51結論
⇒ ⾎漿中未変化体は少なくともROAは必要。
代謝物や⾮⾎漿マトリックスは必ずしも必要でない。
ICH-M3(R2)への対応には検討が必要
アンケート回答者コメント有
8th JBF Symposium, 2017

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3; 6%

10

Japan Bioanalysis Forum1. 標準品のCOA 1.必要性

(2/2)

•
•
•
•
•

•
•
•

ROAという標準品の把握手法を認めていくDGの議論は理解できる。ただ，現実には，最小記載事
項のみのCOA（簡易COA）を準備することが可能であるかもしれない（保存条件の設定根拠が厳密でなくてよいという社内了解があるなどの条件が整えば）。
純度や含量の程度にもよることと思います。
DGの意見にて，MIST評価の実施にはROAが必要とのことですが，純度または含量で補正をすべきという考えでしょうか？SVでは含量補正のことは議論していません。
あまり多くの経験をしたわけではありませんが，規格値がなくてもCOAとして，書類を発行している
ケースをよく見かけと思います。
『ROAにロットを記載しなくとも，ROAと標準物質の紐づけが可能』，『標準物質の実際の保存条件とその条件で標準物質が安定性であったことを確認可能』な状況とできるのであれば，ROAは許容可能だと思いますSVではROAにロットの記載有無のことは議論していません。ロット記載はあるものとの認識です。
ICH-M3(R2)代謝物試験の必要性判断のための評価において，代謝物の曝露量を種間で比較する場合には，その代謝物のCOA/ROAともに必須ではない。一方，同一種間で未変化体や他の代謝物の曝露と比較する（10％ Totalの判断につかう）のであれば，COA，ROAが必須と考える。
当然TK分析に用いる場合にはCOAは必須。
ROAに記載した結果が有効な期限をどう考えるのか（保存条件はどうなの？ロットを記載しない
ROAがありえるのか？）という点のベースを合わせるのが必要ではないかと思います。

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アンケートコメント

11

Japan Bioanalysis Forum1. 標準品のCOA(1/2)

2. COA, ROAがない場合に投与と同⼀バッチで測定することについて
3; 2%

4; 10%

2; 6%
1; 82%

1. DGに同意
2. 全て同⼀バッチによる測定が良い
3. 投与と測定を同⼀バッチで測定する必要無し
4. その他

COA/ROAはな
くとも化合物を
同定できる
資料は必要

有効回答数 49
アンケートコメント（抜粋）•結論

そもそも，COA/ROAのない被験物質を投与した試験についてその信頼性を確保することは難しいのではないか。

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アンケート集計結果⇒ 投与量と測定濃度が絡むパラメータでは，同⼀バッチで測定する意義が⾼いが，国内でCOAやROAが無い場合は考え難い。
アンケート回答者コメント有
8th JBF Symposium, 201712

Japan Bioanalysis Forum1. 標準品のCOA(2/2)

2. COA, ROAがない場合に投与と同⼀バッチで測定することについて
•
•
•
•
•
•
•
•
•

申請用試験でCOAがない化合物を被験物質にする状況がイメージできません。
非臨床試験の場合は同意します。
バッチサイズが大きくなる場合は，大体のバッチのキャパシティを把握しておく必要があるように思われる。
大きなバッチで測定するよりも，小さなバッチに分けて測定したほうが真度が保たれる場合もある。ここではバッチサイズによってROA補正のことは議論していません。
PKパラメータを算出するような場合は同一バッチの必要があるが，曝露確認等では必ずしも必要ではないと思う。
基本的に異論はありませんが，弊社では，SVが必要な時点において，ROAに該当する情報がない被験物質を投与する状況を思いつきませんでした．また，投与した被験物質と同一バッチで測定することができない状況も思いつきませんでした．
ROAに該当する情報はあるけども，ROAという書類を発行できないときの対応ということでしょう
か？
投与した被験物質の安定性が保証できているならば，同一バッチでなくても良いと思う。
少なくとも低分子の薬物でバッチの違いが定量に影響する様な被験物質は，使用すべきではな
いと思います。
8th JBF Symposium, 2017

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アンケートコメント

13

Japan Bioanalysis Forum

2. 検量線・ＱＣ試料 1.ポイント数 (1/2)

3; 6%2; 43%

1. EBFに同意
2. DGに同意
3. その他

1; 51%

EBF案とJBF案に⼤きな違いはな
いので，ポイント数が４以下でなく，直線性があれば問題無いと考えられる。

結論

有効回答数 49

⇒ 代謝物，尿，組織は5ポイント以上
未変化体は6ポイント以上で合意
アンケート回答者コメント有

8th JBF Symposium, 2017

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アンケート集計結果

14

Japan Bioanalysis Forum

SV項⽬

Assay appropriate SVStage appropriate SV

代謝物・尿・組織開発初期（未変化体）

2.検量線・QC試料

EBF

5ポイント以上

6ポイント以上

2-1.検量線のポイント数

DG

5ポイント以上。定量範囲が広い場合(100倍以上)ではポイント数を増やすべき

EBFに合意EBF

25/30%(LLOQ)

20/25% (LLOQ)

DG

試験の重要度が低い場合は25/30%も可マスバランスなどでは少なくと20/25%

EBFに合意EBF

3濃度，n=34濃度，n=52-2.クライテリア
2-3. QC試料の繰り返し
測定数(Pre-study)
2-3. QC試料の繰り返し
測定数(In-study)
2-4.標準溶液の調製（別々のストック溶液から検量線/QCの標準溶液を調製）

DG

EBFに合意だが，代謝物・尿・組織でも⾼感度分析が求められる時にはLLOQの評価が必要

EBF

BMVガイドライン通り:3濃度，n=2

DG

EBFに合意EBF
DG

代謝物︓不要尿・組織︓必要

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DG Discussion 2

必要

DGの意⾒はまとまらなかった。
8th JBF Symposium, 201715

Japan Bioanalysis Forum

2. 検量線・ＱＣ試料 1.ポイント数 (2/2)
アンケートコメント•

科学的にはDGの意見が好ましいですが，そこは科学的判断にゆだねて，一般的な検量線の精度の必要性から5点とするという決め方でよいのではないでしょうか。
参考文献を見れないため，「5」の根拠をもう少し詳しく教えていただけないでしょうか。
DGコメント
統計的に検量線の精度はポイント数nに依存しますが，主にn-2を⾃由度とすると統計量が関係します．nが4以下になるとt統計量が⼤きくなり，検量線の精度が⼤幅に低くなるので，nは5までが許容できると考えました．

•
•
•
•
•

ガイドラインにポイントを規定されているので仕方ないが，検量線は妥当性が示されれば，少ないほどよいと考える。
「以上」の中にDGで加えられたことが含まれるのではないでしょうか。
SVの場合は，妥当性を自分で評価すべき。必要以上の縛りは入れる必要はないのでは？ もちろんサイエンスとしては，DGの意見に賛成ではありますが。
言っていることは同じですよね。あとは，目的次第だと思いますが，ガイダンスに記載するなら，EBF案。
フォーラム内で，こんな感じですよねーと共有するためならJBF案。ただし”べき”という言い方は受け入れられたくない。

8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/•16Japan Bioanalysis Forum

2. 検量線・ＱＣ試料 2.クライテリア (1/3)
⽰した5区分における適切なクライテリアは︖

2
3

29%

65%
27%
13%

4

49%

38%
13%

60%

27%

5

19%

54%

0%

2%

42%

56%
50%
15/20%

結論

20/25%

1. ⾎漿中代謝物（ICH-M3(R2) 可否判断のため）
2. 尿中（未変化体）
3. 組織中（未変化体）
4. 開発初期の⾮臨床⾎漿中未変化体
5. 開発初期の臨床⾎漿中未変化体

100%
25/30%

代謝物や組織では緩やかな基準で良いが，⾎漿中未変化体（開発初期）ではGL通りが多数

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1

EBFの5区分6%

有効回答数 48

⇒ ⾎漿中未変化体以外ではGLよりも緩いクライテリアにすることは受⼊可
DG検討，アンケート回答者コメント有
8th JBF Symposium, 201717

Japan Bioanalysis Forum

2. 検量線・ＱＣ試料 2.クライテリア (2/3)•••

DGメンバーの所属企業の中には，尿は測定する機会が少ないので，やるときには厳しく（15/20?）するべきであるという社内意見もあった。
開発初期（非臨床）は20/25%という意見が多かったが，この対象範囲に初期GLP試験が含まれることが認知されていない可能性が高い。
尿は20/25%でよいのではないだろうか。尿中排泄が少ない化合物では測定しない場合もあるくらいなので，測定するとしてもSVを用いて出来るだけ負担を減らす方針で良いのではないだろうか。

8th JBF Symposium, 2017

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DGでの検討18

Japan Bioanalysis Forum

2. 検量線・ＱＣ試料 2.クライテリア (3/3)
•
•
•

•
•
•

•

Validated Methodに準じたデータの扱いの場合に15/20%，粗さを許容するときに20/25%，代謝物の概要把握に25/30%という感覚があります。
試験の開発段階や重要度によると思います。重要度が高い試験は15/20%が望ましいと考えます。
未変化体については結局BMVガイドラインに従う必要があるため，最初からそれを念頭に置いた分析法が良いと思います。尿中未変化体についてはBMVガイドラインの範疇かと思っておりましたが，SVが許容できるのであればありがたいと思います。代謝物についてはMIST前であれば基準を緩めるのもありかと思いますが，MIST判定後に分析法を大きく変えたくはないので，広げたとしても5%が良いと思いました。
PKPD解析をする場合は厳格な基準で測定すべきであるが，相対的な確認をしたい場合は少し判定
基準を広げてもよいと考えている。
未変化体なら，本来は15/20でやるべきだが，20/25でもやむを得ない部分もある。SVは，科学的な妥当性を加味して，自ら判断基準を定めるのが本筋。この数字はあくまでも参考値とすべき。
データの使用目的・重要性次第，場合によっては25/30よりも広い範囲も許容可能と考えています
し，逆もあり得ると思います。いずれにしても，感覚的な議論に終始しているようにも思いますので，可能であれば，15/20，20/25，25/30，それぞれのクライテリアで分析した場合に得られるデータの範囲がどのように重なるのかを視覚的に示していただけると良いツールになるのではないかと思います。
開発初期に十分に検討を実施し，未変化体についてはいずれのステージも真度及び精度は15/20%
であることが望ましいと考える。ただし，早期の代謝物測定については，標品が十分でないケースが多いためこの限りではないと考える。
8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

アンケートコメント19

Japan Bioanalysis Forum

2. 検量線・ＱＣ試料(1/2)

3. QC試料の繰り返し測定数

3; 6%

1. EBFに同意
2. DGに同意
3. その他
1; 30%

2; 64%

有効回答数 47

尿中排泄の評価では，定量下限付近の測定値は評価に与える影
響が⼩さいので，LLOQの評価を厳しくする必要性は少ないのではないか。

http://bioanalysisforum.jp/

Assay appropriate SV（代謝物・尿・組織）の
Pre-study validation時のQC試料の繰り返し測定数は︖

結論⇒ 代謝物，尿，組織は3濃度，n=3
⾼感度分析が求められる場合はLLOQの評価を検討
アンケート回答者コメント有
8th JBF Symposium, 201720

Japan Bioanalysis Forum

2. 検量線・ＱＣ試料(2/2)

3. QC試料の繰り返し測定数••••

高感度分析の意味が良く分かりません。実試料中濃度がlow-QCやLLOQ付近に集中する分析法のことでしょうか？「高感度分析が求められるとき」の基準が不明瞭ですので，基本すべて
LLOQは含めた方が良いと考えます。
サンプル中濃度が低濃度付近であることが分かっている場合はLLOQの評価が必要であると考える。
高感度分析が求められる時＝LLOQとLOQの間の測定値が薬物動態的に意味があるというケースですよね。そういうケースがあるなら，DGに賛成ですね。
Scientificに考えて決めればよい。

8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

アンケートコメント21

Japan Bioanalysis Forum

2. 検量線・ＱＣ試料(1/2)

4. 検量線とQC試料の標準溶液を別々のストック溶液から調製
1. EBFに同意
2. 必要（標準溶液の確認のため）
3. In-studyは必要，Pre-studyは不要
4. 代謝物で量が限られている場合は不要
5. 秤量値と調製作業の記録が保存されていれば不要
6. BMV－GL-Jに未記載なので，フルバリでも実施しない
7. その他
有効回答数 451

DGの意⾒も回答者の回
答もバラバラであり，DGとして特定の項⽬を推奨す
るのは難しい。

20%

2

22%

3

20%

4

42%

5

40%

6

18%

7

4%
0%

10%

20%

30%

40%

結論
⇒ 意⾒の⼀致は無く
現時点での結論は出ていない。

http://bioanalysisforum.jp/

以下の意⾒（2〜6）に賛同可能か︖

50%

DG検討，アンケート回答者コメント有
8th JBF Symposium, 201722

Japan Bioanalysis Forum

2. 検量線・ＱＣ試料(2/2)

4. 検量線とQC試料の標準溶液を別々のストック溶液から調製•••4割が代謝物では不要，記録があれば不要としている。1～3は2割と，十分な合意には至っていない。
DGの意見もバラバラであったが，回答者の回答もバラけていて，DGとして特定の項目を推奨す
るのは難しい。回答選択肢５（記録が残っていれば別々の秤量必要なし）が40％と高い値を示したのは少し意外だった。
合成量が限られている化合物（代謝物等）の場合は，CCとQCで調製を分けなくても，その旨を断れば問題ないということは言えるのではないか。

アンケートコメント
•
•
•
•
•

検量線とQC試料用の標準溶液を別々に調製することで，どのようなリスクが回避され，どのようなリスクが回避できないのか，それが現実的に起きうるリスクなのか，整理してみるべきではな
いか。
試験の重要度にもよるが，SVではストック溶液を分ける必要はないと思います。
5の試験記録があれば検量線用溶液とQC用溶液は同一濃度であると考えるのは少々難しいと感じる。
当然，秤量値と調製作業の記録が試験記録として保存されていることが前提です。
事前に秤量の妥当性を確認できていれば，その後不要。
DG2016-20
8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

DGでの検討23

Japan Bioanalysis Forum

SV項⽬

Assay appropriate SVStage appropriate SV

代謝物・尿・組織開発初期（未変化体）

3 .マトリックス

EBF

マトリックスマッチング可N/A

3-1.マトリックスマッチング・
代替マトリックスについて

DG

マトリックスマッチング可
状況により代替マトリックスも可能

N/A

EBF

25/30%(LLOQ)

20/25% (LLOQ)

DG

試験の重要度が低い場合は25/30%も可
マスバランスなどでは少なくとも20/25%

EBFに合意EBF

3濃度，n=34濃度，n=5

3-2.マトリックス
マッチングの評価項⽬

3-3.代替マトリックスの評価項⽬

4. (⽇間)再現性

DG

EBFに合意だが，代謝物・尿・組織でも⾼感度分析が求められる時にはLLOQの評価が必要

EBF

Pre-studyで⽇内再現性確認のみ実施。
⽇間再現性確認の必要無し。

同左

DG

EBFの意⾒に加えて，
In-study時のQC試料の結果で評価する。

同左

http://bioanalysisforum.jp/

DG Discussion 3

24

Japan Bioanalysis Forum

3. 検量線・QCのマトリックス(1/3)

1. マトリックスマッチング,代替マトリックスについて

2; 13%

1, 合意可能2, 合意不可1; 87%

有効回答数 45

代替マトリックスとマトリック
スマッチングの認識が回答者によって差があった。
前提条件の提⽰が必要だ
ったかもしれない。

http://bioanalysisforum.jp/

尿・組織はマトリックスマッチング可，状況により代替マトリックスも可としたDGの意⾒に合意可能か︖

結論⇒ DGの意⾒に賛成多数であるが，回答者の代替マトリックスや
マトリックスマッチングへの認識が不⼗分と考えられた。
DG検討
8th JBF Symposium, 201725

Japan Bioanalysis Forum

3. 検量線・QCのマトリックス(2/3)

1. マトリックスマッチング,代替マトリックスについて
DGでの検討
合意可が8割を超え，おおよそDGの意見に賛成であった。しかし，マトリックスマッチングや代替
マトリックスについても，一般的方法とまでは理解が進んでいないのが現状と捕らえるべきで，まだどのような問題があるか，認識が不十分かもしれない。
・ 血漿を用いてのマトリックスマッチングでは血漿でバリデートされていることが前提などの条件の提示は必要だったかもしれない。その点が理解されなければ，EBFはマトリックスマッチングでバリデーションをスキップしたいという意図を持っていることも伝わっていないだろう。

8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/•26

Japan Bioanalysis Forum

3. 検量線・QCのマトリックス

(3/3)

•
•
•
•
•
•
•
•
•
•

どの試料を代替マトリックスで行うのかにもよるが，代替マトリックスしか使わないバリデーションに何の意味があるのか理解できない（実サンプルの測定の保証になっているか，妥当性が説明できないのではないか）。
尿については合意できるが，組織についてタンパクフリーのバッファーをマトリックスに使用することは合意できない。
個人的にはEBFの考え方を好みますが，DGの意見も理解できます。
代替マトリックスとして使用可能な条件（最低限の必要確認事項）についても示していただけないでしょうかマトリッ
クスマッチングでの最大添加割合はどの程度を考えておられるでしょうか。
EMAのmatrix matchingは「試験試料に相当する代替マトリックス」と認識しておりました。検量線試料については何のマトリックスを用いてもよいと思いますが，QC試料は測定試料と同等マトリックスである必要があると思います。
未変化体，代謝物の場合，代替マトリックスに代用する必要がないと考えます。基準も緩めることになるので。
妥当性が説明でき，正確に精度よく分析できるのであれば，代替マトリックスの使用は問題ないと考える。
代替マトリックスについては合意しますが，マトリックスマッチングは賛同しかねます。
測定値の使われ方によります。相対値でいいなら，マトリックスマッチングなど余計なことはしないほうがいいようにも思えます。
科学的にはDGの方法は許容できますが，そもそもSVを適応しようとしてきた背景（医薬品開発の効率化）を踏まえると，血漿の使用が原則となるように思います．なぜなら，基本的な概念として，マトリックスマッチングを用いること
で，一つの核となる分析法を開発することで，他のマトリックスも精度高く分析するということがあると思うからであり，そうすると血漿での希釈が現実的であると思います。

http://bioanalysisforum.jp/

アンケートコメント27

Japan Bioanalysis Forum

3. 検量線・QCのマトリックス(1/2)

2. マトリックスマッチングの評価項⽬

⽇内再現性

9%

⽇間再現性

55%

マトリックス効果
選択性

91%
45%

26%

74%

9%

91%

0%

有効回答数 44

50%

必要ない

100%

必要

これらの項⽬を実施しないで良いと⾔える理由が⾒当たらないという意⾒や，
安定性評価が必要であるという意⾒があった。
⽇間再現性実施については
意⾒が分かれた。

アンケートコメント（抜粋）•http://bioanalysisforum.jp/

Pre-study validationではどの評価項⽬が必要か︖

SILをISに用いる場合はマトリックス効果の評価は必要ないのでは？

結論⇒ ⽇内再現性，選択性，マトリックス効果は基本的に評価する。
アンケート回答者コメント有
8th JBF Symposium, 201728

Japan Bioanalysis Forum

3. 検量線・QCのマトリックス(2/2)

2. マトリックスマッチングの評価項⽬
•
•
•
•
•
•
•

予め別のマトリックスを混合して保存しないなら，安定性評価は必須。
マッチングが用いられる対象マトリックスを考えると，日間は要らない気がします。マトリックス効果と選択性はそれぞれのマトリックスで評価済であれば重ねて評価は不要と思います未評価であれ
ばまとめて評価する必要があると思います。
上記は尿に血漿を添加したブランクマトリックスを用いたQCによる評価であり，血漿中濃度測定はフルバリデートされている仮定という認識です。
ミニマムリクワイアメント。分析法及び目的により，懸念される場合は日間再現性の確認も必要。
これもケースによりますが，一般論としては，やらなくていい理由は見当たりません。
本来のマトリックスも含まれるので，マトリックス効果は確認，しかしながら選択性は意味を成さない。
血漿の分析法でSVが実施されていることが前提として，あとは血漿でどの程度希釈するかで評価の内容を決めると思います．何も評価しないということから，フルバリデーションに近いところまであり得ると思います。

8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

アンケートコメント29

Japan Bioanalysis Forum

3. 検量線・QCのマトリックス(1/2)

3. 代替マトリックスの評価項⽬

⽇内再現性

7%

93%

⽇間再現性

52%

マトリックス効果
選択性

26%

74%

16%
0%

有効回答数 4548%

84%

20% 40% 60% 80% 100%
必要ない

回答結果はマトリックスマッチン
グと同様であった。
マトリックス効果は代替マトリッ
クスで評価しても意味はないと⾔う意⾒もあった。

必要

http://bioanalysisforum.jp/

Pre-study validationではどの評価項⽬が必要か︖

結論⇒3-2（マトリックスマッチング）と同様な項⽬実施。
ISに同位体を⽤いることが有効と考えられた。
アンケート回答者コメント有
8th JBF Symposium, 201730

Japan Bioanalysis Forum

3. 検量線・QCのマトリックス(2/2)

3. 代替マトリックスの評価項⽬
•
•
•
•
•
•
•
•

QC試料は測定対象マトリックス，検量線のみ代替マトリックスという前提。QCが代替マトリックスのバリデーションは妥当性がないと考えられる。
マトリックス効果はISに安定同位体を使用すること，マトリックスに生体試料を用いないことが前提，選択性は試薬ブランクとしての評価。
マトリックス効果と選択性は一応確認としていますが，バッファーで固相抽出のときなど，科学的に無意味なら省略でよいと思います。
上記は，本来のブランクマトリックスを用いたQCを代替マトリックスで作成した検量線で評価する内容という認識です。
ISが安定同位体で，In-studyでISのばらつきを評価できる場合，pre-studyのマトリックス効果評価は不要と思います。
代替マトリックスでは選択性やマトリックス効果の意味がない。
フルバリデーションですよね。
マトリックス効果の必要性はケースバイケース。

8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

アンケートコメント

31

Japan Bioanalysis Forum

4. ⽇間再現性の実施(1/3)

アンケート集計結果

3; 0%

4; 9%

2; 40%

評価⽅法

5; 4%

3; 0%

2; 42%

1; 47%

1. EBFに同意
2. DGに同意
3. 開発初期の⾎漿中未変化体測定では
In-studyで実施するべき
4. Pre-studyで実施するべき
5. その他

有効回答数 45

結論
⇒必要に応じてIn-studyで
追加実施

4; 0%

1; 58%

1. 実試料分析時QC試料の確認のみ（各測定バッチ内での評価で良い）
2. 上記1に，各測定バッチ間での評価を加える
3. 実試料分析⽤QC試料とは別に，
⽇間変動 確認⽤のQC試料を測定して評価
4. その他

http://bioanalysisforum.jp/

必要性

有効回答数 19

結論
⇒実試料分析時のQC試料で評価可能
DG検討，アンケート回答者コメント有

8th JBF Symposium, 201732

Japan Bioanalysis Forum

4. ⽇間再現性の実施(2/3)

DGでの検討【評価方法】
・ 測定内バッチの変動確認だけで良いという人が多数派。
・ In-studyのバッチ内でのQC確認では，日内変動の評価のみでよいとしているEBF案との違いが明確ではないのではないか。
・ 毎回測定時のQCが基準を満たしていることは当然であるといえる。バッチ間の差を確認して初めて日間変動を評価したと言えるのではないか。
・ 回答者に設問の意図が伝わらなかったということも考えられる。

http://bioanalysisforum.jp/【必要性】
・ 日間変動をpre-studyで実施すべきと考える人は少数であったが，DG案とEBF案への支持が拮抗しているので，日間変動をin-studyで評価するか否かについては意見の一致はないといえる。
回答全体の印象としては，基本的にはEBF案（日内のみ実施）でよいが，DGの意見も受け入れられるということのようだ。

8th JBF Symposium, 201733

Japan Bioanalysis Forum

4. ⽇間再現性の実施

(3/3)

•
•
•

QC試料を分析時に調製する方法であるなら，日間再現性の意義はあまりないように思う。日間
再現性の評価，解析方法にもよるが，想定されるリスクに対して，適切な評価方法が何かをすり合わせてみる必要を感じる。
in-studyでデータが取れれば評価しますが，必須とはとらえていないため，EBF寄りと回答しました。
1.と2.の違いが分かりません。実際の操作は同じだと思いますが，考察を文章化するかどうかの違いでしょうか？また，文章化する場合，どのレポートに含められるのでしょうか？pre-study
validation reportへの追加ですか？ DG2016-20
DGコメント１はバッチ内のQCが基準を満たしたことが各バッチで確認することによる評価で、2は各バッチで測定したQC試料の測定結果の平均真度と精度を評価することになります。

•••

ガイドライン適用試験（初期臨床試験及び初期非臨床試験のTK試験）についてはガイドラインに従うべきと思います。それ以外の測定ではPre-studyでは日内再現性のみでよいと思います。結果的にIn-studyの精度管理用QC試料で日間再現性は確認できますが，日間再現性として取りまとめて報告する必要はないと考えます。
サイエンスとしてはDGに賛成だが，GLとしては，EBFでもいいと思う。どっちにしろ，複数日測定
すれば，日間再現性のデータはそろう。ばらついたときに，データを棄却できるかがポイント。
DGの提案に異論はありませんが，それに縛られるものではないと考えます。
8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

アンケートコメント

34

Japan Bioanalysis Forum

SV項⽬
EBF

Assay appropriate SVStage appropriate SV

代謝物・尿・組織開発初期（未変化体）

5. 選択性6 .DDI併⽤薬
存在下の選択性の検討

臨床 n=6,
⾮臨床n=1

n=1

DG

EBFに合意EBF

不要「⼀律不要」ではなく，「状況によって」などと表現できないかという提案あり。但し，評価⽅法は併⽤薬の代謝物が関係する
DG場合も考えられることから，併⽤薬が関わる選択性の問題を
Pre-studyで全て検出できるかは疑問

8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

DG Discussion 4

35

Japan Bioanalysis Forum

5. 選択性(1/2)

選択性検討においてEBFの5区分で適切な⽅法は︖
1

34%

2

2%

35%
7%

85%
27%

0%

34%

20%
n=1

40%
n=6

7%

29%
10%

50%

5

39%

42%

22%

3
4

22%

5%

80%

ﾌﾟｰﾙｺﾝﾄﾛｰﾙﾏﾄﾘｸｽ

1. ICH-M3(R2) 検討時の⾎漿中代謝物
2. 尿中未変化体
3. 組織中未変化体
4. 開発初期（臨床）の⾎漿中未変化体
5. 開発初期（⾮臨床）の⾎漿中未変化体

5%

34%
60%

5%

EBFの5区分100%

有効回答数 41

その他

選択肢にn=3があっても良かった︖
未変化体（⾮臨床）でn=6に偏らなかったのは，早期GLP/TKが含まれることが認識されていなかった可能性あり。
8th JBF Symposium, 2017

結論

http://bioanalysisforum.jp/

5%⇒臨床未変化体はn=6
その他は緩くてもよい。
DG検討，アンケート回答者コメント有36

Japan Bioanalysis Forum

5. 選択性(2/2)

DGでの検討アンケートコメント
•
•
•
•
•
•
•
•

n=1よりはプールコントロールマトリックスが情報が多く好ましいと考えている（本当は違うかも）が，実際には必ずしも都合よく準備できない。
尿中未変化体に関して，臨床試料の場合はガイドラインに従いn=6が必要と思います。それ以外
はn=1でいいと思います。
開発初期段階（非臨床）に関して，GLP/TKの場合はガイドラインに従いn=6が必要と思います。
それ以外はn=1でいいと思います。
対象とする試験と目的により，考え方が異なる。
尿については個体差が大きいため，nを増やした検討が必要と考えます。
DG2016-20
4についてはガイドラインどおりではあるが，6例も必要なのか疑問。
血漿中の未変化体なら，基準を緩める理由はない。
LC/MS/MSを前提とすると，定量下限ピークのS/Nの十分な場合は，少ない例数でもよいかもしれない。
8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

・ 尿でn=6を選んだ人が比較的多かったのは臨床試験を意識してのことか。
・ ｎ=1と6の中間の選択肢（ｎ＝3など）があっても良かったかもしれない。

37

Japan Bioanalysis Forum

6.併⽤薬

1.影響の経験・内容

アンケート集計結果←で「はい」と回答の⽅。
それはどのような影響か︖ （複数回答可）

はい,
17%

63%

選択性
13%

マトリックス効果

いいえ,
83%

クロマトグラムピーク形

50%

状の変化
0%

有効回答数 41

結論

⇒17％の回答者が経験ありで頻度が予想以上。
注意必要か。

結論

50%

100%

http://bioanalysisforum.jp/

併⽤薬⼜はその代謝物が測定系へ影響を及ぼした経験は有るか︖

有効回答数 8

⇒妨害ピークがクロマト上に出現したと思われる。
併⽤薬の代謝物等か︖
8th JBF Symposium, 201738

6.併⽤薬Japan Bioanalysis Forum

2.バリデーションでの評価有無・評価項⽬

アンケート集計結果←で「はい」と回答の⽅。
そのときの評価項⽬は︖
⽇内再現性
⽇間再現性

44%
0%

安定性

いいえ,… はい, 47%

17%
17%

マトリクス効果
選択性

94%

その他

0%
0%

結論

40%

60%

80%

100%

有効回答数 18

有効回答数 38

実施有無は治験デザ
インにも依存か︖

20%

選択性は94％が確認。クロマト分離の確認で⼗分で⽇内再現性は不要，が⼤勢。再現性
実施はケースバイケースで念のため確認。

http://bioanalysisforum.jp/

併⽤薬の影響のバリデーション試験で評価有無⇒ 実施の有無は拮抗。実施の場合，選択性は必須の試験項⽬
8th JBF Symposium, 201739

Japan Bioanalysis Forum

6.併⽤薬

3.評価の必要性(1/2)

アンケート集計結果

1. フルバリデーション，SVを問わずにバリデーション試験で実施する
2. フルバリデーションでは実施するが，SVでは実施しない
3. バリデーション試験で実施しない
4. その他

1; 8%
4; 31%

2; 26%

3; 36%

有効回答数 39
アンケートコメント（抜粋）•併用薬必須の試験を予定している場合はPre-studyで，それ事後はIn –studyでの確認でよい。

http://bioanalysisforum.jp/

併⽤薬の影響は原則的にバリデーション試験で評価すべきであると思いますか︖

結論⇒ 意⾒分かれる。各社でやり⽅が異なる。
アンケート回答者コメント有
8th JBF Symposium, 201740

6.併⽤薬Japan Bioanalysis Forum

3.評価の必要性

(2/2)

•
•
•
•

MS/MSでの分析であれば，影響する可能性は低い。
ケースバイケース。分析の目的や開発段階も考慮。
未知の併用薬のケースでは評価できない。
併用薬の影響は定量法の予備検討で確認。

8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

アンケートコメント

41

Japan Bioanalysis Forum

Assay appropriate SVStage appropriate SV

代謝物・尿・組織開発初期（未変化体）

EBF

必要最⼩限，
基準は100±20%

開発初期段階で確認，
または⽤時調製

DG

必要，基準は100±20%

必要，基準は100±15%

EBF

代謝物︓ISSで検証
尿，組織︓1 cycleのみ検証

他の安定性試験に含めて実施

DG

実サンプルの取扱⽅法に従って他の安定性試験に含めて評価
ISSでは試験前に安定性情報が得られないという意⾒有SV項⽬
7 .安定性7-1.標準溶液(1)評価の必要性(2)基準（未変化体）(3)基準（代謝物）

7-2.凍結融解

7-3.凍結保存

7-4.全⾎中未変化体
7-5. Bench-topと前処理後
7-6.併⽤薬存在下

EBF
DG
EBF
DG
EBF
DG
EBF
DG

代謝物︓実施，基準は100±20%尿，組織︓不要

他の安定性試験に含めて実サンプルに合うように実施代謝物︓EBFに合意
EBFに合意尿，組織︓試験⽬的に応じて保存状況での安定性を検討
代謝物︓不要 (問題となる化学構造がない限り）不要 （問題となる化学構造がない限り）
組織︓N/A
EBFに合意EBFに合意不要

Bench-top︓他の安定性試験に含めて実施
前処理後︓Scientific judgment

http://bioanalysisforum.jp/

DG Discussion 5

EBFに合意（不安定であれば検量線やQCで検出可能）
不要

EBFに合意42Japan Bioanalysis Forum

7. 安定性

1.標準溶液(1/4)

アンケート集計結果

3; 5%
2; 19%

1. 必要
2. 不必要（⽤時調製）（2）判定基準（3）判定基準（未変化体）（代謝物）
100±20％;11%

その他; 7%

3. その他

1; 76%

100±15％;82%

有効回答数 37

有効回答数 27

必要が3/4強，代謝物は不安定な物があるため，むしろ実施すべきという意⾒有り。

±15%が8割強
添加試料より厳し
くするという意⾒有り。

結論

その他; 17%100±15％;33%

100±20％;50%
有効回答数 36

何故未変化体と代謝物で基準を変えるか，といった意⾒有り。
ICH M(3)のための評価なら，代謝物の基準は緩くても良い，ということが背景にあると考えられる。

http://bioanalysisforum.jp/（1）評価の必要性⇒ 標準溶液安定性は必要。 基準は未変化体 ±15％， 代謝物±20%
DG検討，アンケート回答者コメント有
8th JBF Symposium, 201743

Japan Bioanalysis Forum

7. 安定性

1.標準溶液(2/4)（1）評価の必要性
•
•
•
•
•
•

必要が3/4を占めた。代謝物は不安定な物があるため，実施したほうが良いという意見もあり。
しかるべき範囲内で確認はすべき。ただし，代謝物の基準は緩くてよいのでは。
標準溶液の基準はQCなどより厳しくするべきでは。
分析方法をどうするか。HPLCで測定し，5％の許容基準とする意見もあるが，通常我々バイオア
ナリストはUVでの測定まで実施せず，LC/MSで測定するので，基準はきつくしても10%か。
不安定な代謝物測定を現在実施していて，基準作りにもどうするべきか迷いがある。
化合物の性質により最後はサイエンティフィックジャッジメントか。

アンケートコメント••••

代謝物については，安定でないものも多く，何らかの形でデータは必要。
保存期間に関わらず，保存容器への吸着の可能性もあり得るので，確認した方が良いと考える。
安定性が確保されない場合は用時調製。
DG2016-20
用時調製する場合は不要。しない場合は必要

8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

DGでの検討447. 安定性Japan Bioanalysis Forum

1.標準溶液(3/4)（2）判定基準（未変化体）••±15%が8割強，添加試料より厳しくする，と言うその他意見有り。
代謝物と未変化体の基準を分けることが，そもそもおかしいという意見はあるが，標準物質としての純度が低い代謝物の場合の基準を同じにするのも疑問が残る。GLP，GCPに関係するため基準は厳しく，という意見が背景にはありそう。

アンケートコメント••••

マトリックス中の濃度測定法ではなく，別のHPLC等による方法で±5%程度の基準で判定するのが，本来は望ましいと思う。保存後に-14%となるような標準溶液を用いて実サンプルを分析する
気にはなれない。
前処理後の測定値の判定基準が100±15%なので，溶液の基準は100±10%としています。
DG2016-20
添加試料の真度より厳しい基準でなければならない。（QC試料の判定基準が100±15%以内ならば，標準溶液中安定性の基準は100±10%以内にするなど）
濃度データの使用目的次第。

8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

DGでの検討45

7. 安定性Japan Bioanalysis Forum

1.標準溶液(4/4)（3）判定基準（代謝物）•

代謝物では±20%が半数，その他では何故未変化体と代謝物で基準を変えるか，といった意見有り。ICH M(3)のための評価であれば，代謝物の基準は緩くても良い，ということが背景にあると考えられる。

アンケートコメント
•
•
•
•
•

正確さが必要な分析方法であるなら，HPLCを用いて±5%で評価することも検討すべきである。
未変化体の判断基準に従う。
形式的には１００±15％であるが，10%以下を目標
１００±1０％
前問と同様． そもそもなぜ未変化体と代謝物で判定基準を変えることがありえるのか，DGの見解を示していただきたい。
DG2016-20
DG回答；代謝物のQC・検量線のクライテリアが未変化体より緩いのでそれに比例して標準溶液の安定性も緩くて良い、と考えています。
• マトリックス中濃度の検量線等のクライテリアに準ずる形で基準を決めればよいと思う。
• ±20%あればよいが，あくまで原則であり，±30%でも許容できるなど文言的には幅が欲しい。
8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

DGでの検討46

7. 安定性Japan Bioanalysis Forum

2.凍結融解

(1/2)

4; 3%

5; 8%

1; 8%

3; 0%

1. EBFに同意
2. DGに同意
3. In-study で実施。実施⽅法は並⾏保存QC，必要回数凍結融解。
4. In-study で実施。実施⽅法はISS。
5. その他

2; 81%

有効回答数 36

DGに賛成が8割と多数を占めたが，少数意⾒では，最終的に安定性が保証出来ればいいのでISSでもOKという意⾒有り。

http://bioanalysisforum.jp/

アンケート集計結果

結論⇒ 実サンプルの取扱⽅法に従い他の安定性試験に含めて実施
DG検討，アンケート回答者コメント有
8th JBF Symposium, 201747

7. 安定性Japan Bioanalysis Forum

2.凍結融解(2/2)••

DGに賛成が8割と多数を占めたが，少数意見では，最終的に安定性が保証出来ればいいのでISSでもOKという意見有り。
DGの意見，実サンプルの取り扱いに合わせて他のPK試験と合わせて実施で良い。

アンケートコメント
•
•
•
•
•

2と3の両方を状況により使い分けるのが適切と思います。
最終的に安定性を保証することでよいと考える。 開発初期は構造からあるいは扱っている
Analog等から安定性を判断してもよいと考える。
Spiked sampleと実sampleが異なる場合あり。ISSも考慮する。
DG2016-20
結果論でいいなら，ISSでもいいですけどね。
代謝物のSVを実施するタイミングではすでに臨床検体を所持していると思われるので，EBFの主張も一理あると思います。

8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

DGでの検討48

Japan Bioanalysis Forum

7. 安定性3.凍結保存

(1/2)

その他;
0%

EBFの意⾒に賛成;8%

DGの意⾒に賛成;
84%

有効回答数 37

DGに賛成が8割と多数を占めたが，少数意⾒では，最終的に安定性が保証出来ればいいのでISSでもOKという意⾒有り。DGに賛成が8割以上，尿や組織についても必要に応じて安定性確認は必要という認識と考えられる。
必要に応じて実施で良い，安定性確認は必要。
クライテリアについてのコメントが無いが，代謝物が20％には同意。

http://bioanalysisforum.jp/

アンケート集計結果

結論⇒EBF案に加え，尿・組織については試験⽬的を考慮して安定性を実施DG検討，アンケート回答者コメント有
8th JBF Symposium, 201749

7. 安定性Japan Bioanalysis Forum

3.凍結保存

(2/2)

•
•
•

DGに賛成が8割以上であった。尿や組織についても必要に応じて安定性確認は必要ということが，大勢と考えられる。
必要に応じて実施で良い，安定性確認は必要。
クライテリアについてのコメントが無いが，代謝物が20％には同意。

アンケートコメント•

EBFが尿と組織の凍結融解安定性を不要とした理由は何でしょうか。

8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

DGでの検討50

Japan Bioanalysis Forum

7. 安定性4.全⾎中未変化体

(1/2)

その他,
全⾎中の安定性確認は必要, 3%

3%

全⾎中の安定性確認は不要, 95%

有効回答数 37

SVでは必要無しが95％と多数。
「必要に応じて」も少数意⾒。
EBFのWPでも不要としているので妥当な結果。
予想通りで，懸念が無い場合は評価していな
い。

http://bioanalysisforum.jp/

アンケート集計結果

結論⇒ 全⾎中の安定性評価は不要
アンケート回答者コメント有
8th JBF Symposium, 201751

7. 安定性Japan Bioanalysis Forum

4.全⾎中未変化体(2/2)

アンケートコメント
必要に応じ全血中の安定性は必要。 安定化剤が必要なときもあると考えられる。
ただし，懸念される場合は実施する。
• 血漿サンプルの場合，採血後遠心分離して血漿分離するまでの想定される時間の間の安定性を評価。全血に標準溶液を添加して，添加直後と添加して保存後のサンプルを評価
DG2016-20

8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/•52

7. 安定性Japan Bioanalysis Forum5. Bench-topと前処理後

(1/2)

3; 3%

4; 5%

2; 8%

1. EBF，DGの意⾒に同意
2. 代謝物，尿，組織でも実施
3. ⾎漿中未変化体は独⽴して実施
4. その他
アンケートコメント（抜粋）1; 84%

有効回答数 37

Bench-Topと前処理後の安定性が濃度データに影響を与えそうか否かを判断する。不安定性が懸念されるような場合，その程度を把握するという手順も可能

予想通り。代謝物や尿中は実施すべきという少数意⾒有り。

http://bioanalysisforum.jp/

アンケート集計結果

結論⇒ 代謝物，尿，組織では実施せず。
未変化体では他の安定性に含めて実施

アンケート回答者コメント有
8th JBF Symposium, 201753

7. 安定性Japan Bioanalysis Forum5. Bench-topと前処理後(2/2)

アンケートコメント
尿中の未変化体については実施すべきかと思います。
なぜ，マトリックスごとに対応が異なるのか，科学的には説明できません。
http://bioanalysisforum.jp/••

8th JBF Symposium, 201754

7. 安定性Japan Bioanalysis Forum

6. 併⽤薬存在下

1
97%

2

0%

3

0%

4

1. EBF，DGの意⾒に同意
2. 代謝物，尿，組織の全て，または⼀部で実施
3. 開発初期段階で他の安定性試験に含めず，
独⽴して実施4. SVではなくフルバリデーション時にも実施していない
5. その他

アンケートコメント
(1/2)

11%

5

3%
0%

50%

100%

これは科学的に必要性がないところだと感じています。併⽤薬よりインパクトの⼤きい因⼦があるような気がします。

http://bioanalysisforum.jp/

アンケート集計結果

ほぼ全員が合意，併⽤薬存在下の安定性試験は必要無。

有効回答数 37

結論
⇒ 併⽤薬存在下の安定性は必要なし。
8th JBF Symposium, 201755

Japan Bioanalysis ForumDG Discussion 6
8. IS variability 評価
8-1.許容値設定
8-2,3.
評価の必要性と許容値の設定⽅法
8-4, 5.
⾼脂⾎漿・溶⾎⾎漿
での影響評価と
評価基準

EBF
DG
EBF

Stage appropriate SV

代謝物・尿・組織開発初期（未変化体）

Scientific judgment

Bioanalysis (2014) 6(20),2767–2774参照（直下のスライド）

現状は実施していないか、±50%
Scientific judgment

DG
EBF
DG

Matrix effects検出のために有効、評価基準はreference paper

EBFに合意不要

http://bioanalysisforum.jp/

SV項⽬

Assay appropriate SV

IS variabilityで検出可
評価基準はreference paper

EBFに合意56

Japan Bioanalysis Forum

8. IS variability 評価＜経験的⽅法＞
EBF Recommendation:

クロマトグラムの異常確認

散発的発生
以下の場合，異常値として再測定し，再測定値を採用
1. IS area >2×Reflowまたは
IS area <10%Reflow
2. IS area <50% Reflowかつ測定値がLLOQ未満

http://bioanalysisforum.jp/

IS areaを注入順にプロットし異常発生の傾向を確認
特定のtime pointまたは被験者ごとなど”群単位”での発生
IS area >2×Refhighまたは<50%Reflowの場合，
Matrixの影響を検討し，再測定の必要性を判断(Pre‐dose matrixで調製したQC試料の測定，
Std・QC調製用のblank matrixでの希釈等）

これらで対処できそうにない場合，
個別に基準設定(Std・QCのIS area 平均値とSDを使用等)
妥当性についてはScientific judgment が必要
Bioanalysis (2014) 6(20), 2767–2774より概略
8th JBF Symposium, 201757

Japan Bioanalysis Forum

8. IS variability 評価(1/2)

1. IS response の変動幅に許容値を設定しているか︖
アンケートコメント（抜粋）その他, 14%

はい, 5%【使用されている基準】
・バッチの平均レスポンス値±50%・ブランク試料を除く全試料の平均値の±50%・CVで50%以下

いいえ, 81%

有効回答数 37

予想通り，8割以上でIS responseの変動幅に許容値設定していない。
設定している場合もEBFのWPとは違なり，50%が⼀つの⽬安となっている。

http://bioanalysisforum.jp/

アンケート集計結果

結論⇒IS response変動幅の許容値設定までは⾄っていない。
アンケート回答者コメント有
8th JBF Symposium, 201758

Japan Bioanalysis Forum

8. IS variability 評価(2/2)

1. IS response の変動幅に許容値を設定しているか︖••

8割以上でIS response変動値で許容値設定していない。設定している場合もEBFのWPとは違い，50%
がひとつの目安となっているよう。
国内の現状は予想通り。

アンケートコメント
•
•
•
•
•
•
•
•
•

まだ試行錯誤の段階だが，バッチの平均レスポンス値±50%としたことがある。
ISピーク面積の最大値と最小値が2倍以上差がある場合は，再分析，再注入の必要性を判断することにしていますが，厳格な許容幅を設けているわけではありません。
ブランク試料を除く全試料の平均値の±50%
DG2016-20
数値基準は設定しないがクロマトレビューして疑義がある場合はリジェクトする。
Case ｂｙ Case
変動は注意するようにしているが，分析対象物質や分析法により幅があるため，許容値は設定していない。許容値の設定にはある程度の測定数（プロット数）が必要ではないかと考える。統計的に評価する等，何らかの許容基準も必要
委託試験では設定した経験がある。CVで50%以下
値は見ているが，Criteriaは設定していない。
積極的には設定していない．ただし，定量下限のピークが検出できなくなるような変動がないかは注視している．また，海外のCROなど自社SOPに設定されている場合には，その内容を把握したうえでそれに従って進めている。
8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

DGでの検討59Japan Bioanalysis Forum

8. IS variability 評価
2. 評価の必要性(1/4)

3. 許容値の設定⽅法

IS response 変動をIn-study で評価 ←で1.を選択した⽅，許容幅設定⽅法
することについてでEBF提唱の経験的⽅法について
4; 25%

5; 0%
1; 22%

3; 14%

2; 39%

1.許容範囲設定有(事前)2.許容範囲設定有(事後)3. 場合によっては同意
4. 評価不要
5. その他

2; 13%

3; 0%
4; 0%

1; 88%

有効回答数 36

事前の許容基準設定は意⾒が分かれる。
同位体ISのときは評価不要，あるいは許容基準を緩くする，と⾔う意⾒多数

結論

1.同意
2.場合によって同意
3.同意できない
4.その他

有効回答数 8

事前の基準を設定すべきと回答した
⽅にEBFの基準は受け⼊れられた。

⇒In studyではIS response 変動は評価すべき
EBF提案のIS 許容幅設定⽅法は受け⼊れ可能
8th JBF Symposium, 2017

DG検討、
アンケート
回答者
コメント有

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アンケート集計結果

60

Japan Bioanalysis Forum

8. IS variability 評価(2/4)

2. 評価の必要性•••

事前に許容基準を設定すべきか意見が分かれている。また，ISに同位体を用いるときは評価不要，あるいは許容基準を緩くする，と言う意見多数あり。
同意の割合が高く，何らかの評価の必要性は感じる。ISのタイプ（SIL-IS or not）でケースバイ
ケースでは。
同僚の意見では不要であり，同意できないが25％は少ないと感じた。ISの添加ミスを検出するには有効と考えられるが，一方でマトリックス効果を確認してあれば評価の必要なしとも考えられる。

8th JBF Symposium, 2017

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DGでの検討61Japan Bioanalysis Forum

8. IS variability 評価(3/4)

2. 評価の必要性
•
•
•
•
•
•
•

ISが類縁物質かSIL-ISかによって許容範囲は変えてよい。SIL-ISの場合は，analyteとISが同じ挙動をすると仮定して，検量線のLLOQのレスポンスとULOQのレスポンスの頭打ちが担保できる範囲で広げてよいのではないか。
ISに安定同位体を用いる場合は，評価不要としてもよいと思います。
DG2016-20
例えば代表サンプルの50-200%とかの粗い許容範囲は判断に必要だと思います。
ISが安定同位体であることが前提と思います。またPre-studyでマトリックス効果の評価を実施している場合は不要としてよいと思います。
ISに何を使用するかにより，必要性が異なる。
再分析の指標として，下は0，上は2倍以上とか。
IS Responseが他のピーク面積の2倍以上のものは，IS添加のミスが疑われるため考慮すべきであるが，それ以外のケースでは不要ではないかと思う。

8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

アンケートコメント62

Japan Bioanalysis Forum

8. IS variability 評価(4/4)

3. 許容値の設定⽅法••

IS response変動基準を事前に設定すべきと回答した方に，EBFの基準は受け入れられた。
具体的な基準は他にまだ示されていない。論文化されている基準であれば説得力があるためと考えられる。

アンケートコメント•

最大値(Refhigh)と最小値(Reflow)が平均値から大きくずれていないのであれば同意。平均値か
ら15%以上ずれるようであれば，本値自体が異常値の可能性を否定できないため，その値を基準とすることはできないのではないか。

8th JBF Symposium, 2017

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DGでの検討63

Japan Bioanalysis Forum

8. IS variability 評価(1/4)

4. ⾼脂⾎漿・溶⾎⾎漿での影響評価 5. 評価基準
IS responseによる⾼脂⾎漿/溶⾎⾎ ←で1を選択した⽅，⾼脂⾎漿/溶⾎⾎漿が漿が測定結果に及ぼす影響評価につい 測定結果に対する影響評価の許容基準は︖
て
新たに別の
その他;
基準を設定;
0%17%

同意できない;25%

同意できる;
58%

その他; 5%

EBFの経験的⽅法;
95%

有効回答数 36

コメント（抜粋）
血球移行率の高い薬物の溶血の影響評価は出来ないのでは？

有効回答数 20

同意は6割程度，ISが安定同位体
か否かで対応が違う意⾒有り

具体的な基準は他にまだ⽰されていない。
論⽂化された基準であれば説得⼒があるためと考えられる。

http://bioanalysisforum.jp/

アンケート集計結果

結論 ⇒4. IS response 変動で⾼脂⾎漿/溶⾎⾎漿影響評価は可能⇒5. EBFの基準は受け⼊れ可能

DG検討，アンケート回答者コメント有
8th JBF Symposium, 201764

Japan Bioanalysis Forum

8. IS variability 評価(2/4)

4. ⾼脂⾎漿・溶⾎⾎漿での影響評価••••

同意は6割程度，やはりISが安定同位体であるか否かで対応が違う意見有り。
同意が過半数だが，同意できないの意見のコメント「駄目だった時はどうする」などには納得する。
SIL-ISが前提とも考えられる。
未変化体はSIL-ISの場合が多いが，代謝物では稀。SIL-ISか否かで対応が変わってくる。アン
ケート作成時にはそこまで考えが及んでおらず，今後の課題と考えられた。

8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

DGでの検討65

Japan Bioanalysis Forum

8. IS variability 評価(3/4)

4. ⾼脂⾎漿・溶⾎⾎漿での影響評価
•
•
•
•
•
•
•

•

SIL-ISであることを前提として。
ISと分析対象の感度がバラバラに動く可能性があるので，一概にはいえないが，考え方の根幹には同意できる。SIL-ISであれば許容できる。
IS responseが変動しても，測定対象が同じように変動して，理論値通りの濃度値が出ていればDG2016-20
問題ないと考える。特にISが測定対象の安定同位体を用いているのであれば，高脂質血漿や，溶血血漿を用いた評価は必要ないと考える。
ISが安定同位体の時に限ると思います。
血球移行率の高い場合の溶血の影響は，validationでは評価できないのではないでしょうか？
仮にISのレスポンスが変化した場合，測定結果についてはどう考えることになるのでしょうか。
Analyteのレスポンスが変化したか否かが不明なため，はっきりとしたことは言えないのではないかと思うのですが。
ここでの溶血の問題は血液成分が定量に及ぼす影響であって，血球に移行した薬物の影響ではないと思います。血球で濃縮される様な薬物の溶血サンプルについては開発企業が別途考えるべき事であり，DG（影響力が大きいと思います）の意見として記載されると混乱させるだけだと思います。
上記の血漿の状態は程度問題であり，それらについて定義づけてから議論すべきではないかと思う。
8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

アンケートコメント66

Japan Bioanalysis Forum

8. IS variability 評価(4/4)

5. 評価基準••••

基準についてはEBF提案が受け入れられた。
具体的な基準は他にまだ示されていない。論文化されている基準であれば説得力があるためと考えられる。WPには検討時に実施の記載なし。
SVで対象としていない。
±50％の基準はIS添加ミスなどを検出するためで，この基準で高脂血漿・溶血血漿の異常値を検出できるか疑問

アンケートコメント•

ISが安定同位体であれば前々問で定めた基準と同じで同意します。

8th JBF Symposium, 2017

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DGでの検討67

Japan Bioanalysis Forum

SV項⽬

Assay appropriate SVStage appropriate SV

代謝物・尿・組織開発初期（未変化体）

9.他の試験項⽬

EBF

不要

9-1.回収率

DG

EBFに合意EBF

Pre-study validationでは実施せず，In-study validationで影響評価

DG

予備検討中にキャリーオーバーを検出したときには積極的な対応が必要だが，問題がないときにはEBFに合意

9-2.キャリーオーバー

EBF
9-3.ISR9-4.希釈の妥当性

DG

不要

実施する意義を考えて対応する（薬効評価に重要な場合など)

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DG Discussion 7

実施

EBFに合意EBF

必要に応じて In study validationで実施

DG

単回⽤量漸増試験などでは定量対象の濃度範囲が広いため，Prestudy で希釈の妥当性評価の必要性がでてくる
8th JBF Symposium, 201768

Japan Bioanalysis Forum

1.回収率
2.キャリーオーバー

9.他の試験項⽬(1/2)

アンケート集計結果

3; 0%
2; 43%

1.
2.
4; 3% 3.
4.

実施無（GLで必要無）
実施無（検討時確認）
実施
その他

キャリーオーバー

１. Pre-及びIn-study
共に評価しなくてよい
２. EBFに合意
5; 3%
３. 検討時に懸念の場合
1; 17%
Pre-studyで評価
４. Pre-及びIn-study共、常に評価
５. その他

4; 8%
3; 22%

1; 54%

2; 50%

有効回答数 36

有効回答数 37

アンケートコメント
試験法検討段階で回収率が低い方法は避けるため，試験は必要ない。

結論⇒ 実施しないで⼀致

検討時に評価している回答者が多く妥当と考えられた。

http://bioanalysisforum.jp/

回収率

結論

⇒ 問題がなければ，pre-study
でも実施しないという意⾒が多数

8th JBF Symposium, 2017

DG検討，アンケート回答者コメント有
DG検討，アンケート回答者コメント有69

9.他の試験項⽬

Japan Bioanalysis Forum

2.キャリーオーバー(2/2)

DGでの検討In-studyでは何らかの評価すべきが過半数，Pre-studyで評価すべきは1/3。
少数派(8.3％)ではあるが常に評価する回答者もいた。
検討時に評価している回答者が多く，妥当と考えられた。

アンケートコメント•••

通常は分析法開発時に対策をとって影響ない状況にしてからpre-study validationを実施すると思うので，必ずしもpre-study validationで実施する必要はないが，試料数が多くなってくると影響が考えられるのでin-studyでは評価すべきである。（SV以前に，通常のフルバリでの評価方
法にコンセンサスがあるのか?）
分析法検討時のデータがドキュメント化されているならSVで実施不要。
Pre-study validationで許容範囲外（あるいはぎりぎり）であった場合には，In-studyでも確認（及び対策）が必要と考えます。

8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

•
•
•

70

Japan Bioanalysis Forum9.他の試験項⽬(1/2)

3. ISR (代謝物，尿，組織）

3; 3%

4; 0%
1; 38%

1. 実施しなくてもよい
2. 必要に応じて実施
3. 必ず実施
4. その他

2; 60%

有効回答数 37

実施しないまたは必要に応じて実施が9割以上で，必須とする意⾒は少数となっている。

http://bioanalysisforum.jp/

アンケート集計結果

結論⇒ 代謝物，尿，組織ではISRは必須でない。
DG検討，アンケート回答者コメント有
8th JBF Symposium, 201771

9.他の試験項⽬

Japan Bioanalysis Forum(2/2)

3. ISR (代謝物，尿，組織）•尿はフルバリデーション時でも実施の必要性には疑問が残る。必要性があるのは，尿中薬物が薬理作用に関係するような場合に限られるのでは。

アンケートコメント••••

Pre-study validationで何を評価しているかによる。
血漿中濃度測定もISRは必要ないと考えている。 しっかりした試験方法を作成していれば，必要ないと考える。
SV下の測定を申請データにしないなら不要。同じような試験をやり直すことになるなら，あえてDG2016-20
ISRを義務にする必要はない。
EBFは「実施しなくてもよい。」としており実施を妨げるものではない事から，あえて「必要に応じて実施した方がよい」とする必要は無いと思います。そのような書き方にすることで，拘束力が生じる事は避けるべきと考えます。

8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

DGでの検討72

9.他の試験項⽬

Japan Bioanalysis Forum(1/2)

4. 希釈の妥当性
1. EBFに合意
2. DGに合意
3. その他

3; 3%
1; 31%

Pre-studyで実施が理想的だが，必要が⽣じてからInstudyで実施でもよいという意⾒が多数

2; 67%

有効回答数 36

結論⇒Pre-studyまたはIn-studyのどちらかで実施すれば良い。
8th JBF Symposium, 2017

DG検討，
アンケート回答者
コメント有

http://bioanalysisforum.jp/

アンケート集計結果

73

9.他の試験項⽬

Japan Bioanalysis Forum(2/2)

4. 希釈の妥当性
DGでの検討•

必要性が予測される場合，Pre-studyで実施が2/3，In-studyで実施が1/3であり，どちらかで実施してあれば良いのでは，と考えられる。
Pre-studyで実施が理想的だが，必要が生じてからIn-studyで実施でもよい，という意見が多数。

1,2どちらも可かと思います。
検量線のレンジの強度が合っていない場合もある。濃度を見誤らないようにする。
Pre-study validationの実施を必須とする必要はない。
ここに記載されているSADは非臨床，臨床どちらでしょうか。臨床試験でSADを実施する場合，
DG2016-20
弊社ではフルバリデーションが前提です。

http://bioanalysisforum.jp/•

8th JBF Symposium, 201774

アンケートコメント••••

Japan Bioanalysis ForumDG Discussion 8
SV項⽬

10-1.試料採取⽅法

10-2.検量線の外挿

10-3.再分析

10-4.計画書・報告書

10-5.SOP

Stage appropriate SV

代謝物・尿・組織開発初期（未変化体）

EBF 吸着の影響や安定化剤添加の必要性などを試験の開始前に検討し，⽂書化しておくことが重要
DG 予備検討で吸着の影響や安定化剤添加の必要性は確認しておくべき。
EBF

科学的な判断評価にもとづく外挿は可能

DG

スライド参照EBF

実施しない

n=2で再測定DG

Scientific judgmentで再分析の可否を判断

SOPまたは試験計画書に従って再分析を実施EBF

簡略化を推奨DG

EBFに合意EBF

どの様な場合に実施するか、何を実施するか定めるべき

DG

国内企業ではほとんど整備されていない

http://bioanalysisforum.jp/

10.その他

Assay appropriate SV75

10.その他Japan Bioanalysis Forum

1.試料採取⽅法

(1/2)

4; 3%
3; 19%

2; 0%

有効回答数 37

5; 0%

1. EBFやDGに合意
2. SVとしてpre-studyで実施し，報告書に記載
3. 注意が必要な場合，SVのpre-study で実施し，報告書を作成4. In-studyで問題が⽣じた場合に確認
5. その他

1; 78%

おおよそ事前に検討しておけば良いという意⾒で，予備検討の重要性が増している。

http://bioanalysisforum.jp/

アンケート集計結果

結論⇒ 試料採取⽅法は事前に検討しておけば良い。
8th JBF Symposium, 2017

DG検討，アンケート回答者コメント有
DG検討，アンケート回答者コメント有76

10.その他Japan Bioanalysis Forum

1.試料採取⽅法(2/2)

DGでの検討どのように「文書化」するのがポイントでは。In-studyなどでは報告書に記載できるが，ちょっとした検討結果の残し方はどうするか？会社によって方法はマチマチ。月報で検討実施事項を報告する場合もあるが，意味合いが違う。

アンケートコメント•

サンプルのハンドリングに関する項目は，やり直しがきかないので事前にデータを取っておく必要あり。

8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/•

77

10.その他Japan Bioanalysis Forum

2.検量線範囲外試料濃度の外挿(1/2)

アンケート集計結果

4; 14%

1; 8%

3; 32%

1. 相関係数等を考慮
2. 真度の許容誤差範囲内
であれば採⽤3. 希釈再分析を実施
4. その他LLOQ未満4; 5%

3; 51%

2; 46%
有効回答数 37

1; 16%

1. S/N等を考慮し判断
2. 真度の許容誤差範囲内であれば採⽤
3. BLQまたはゼロとして扱う
4. その他

2; 27%

有効回答数 37

http://bioanalysisforum.jp/

ULOQ以上ULOQ以上は外挿可が多いが，LLOQ未満はSVでも外挿不可が多い。

結論⇒ ULOQ以上は許容誤差以内であれば外挿可能
LLOQ未満は外挿不可で，BLQまたはゼロとして取り扱う。
DG検討，アンケート回答者コメント有
8th JBF Symposium, 201778

10.その他Japan Bioanalysis Forum

2.検量線範囲外試料濃度の外挿(2/2)

DGでの検討外挿容認が過半数だが，データの取扱が面倒では。
ULOQ以上はOKだが，LLOQ未満はSVでも定めた下限値はゼロとするべき

アンケートコメント【ULOQ以上】• DG案に同意です。
• あらかじめ試験計画書に記載していれば上記の外挿は可能と思います。
• 希釈再分析又はULOQとして報告。 DG2016-20• 希釈を実施しているが，検量線の限界でなければ，外挿はありと考える。
• 検量線のレスポンスや真度によって，許容できる場合とできない場合があると思われる。
• 飽和しかかっているULOQ等の場合は，外挿不可。
• 検量線の回帰モデルが直線であれば，EBFまたはDGの意見に賛成する。
• 理由がつけられるならいいが，データの使用目的次第．絶対値が大事であれば，希釈測定することが多いと思う。
【LLOQ未満】• 必要に応じて判断。重要な測定値であれば，何らかの保証（確認）が必要。
• 下限は基本的に認められない。（リスクが大きすぎる）• データの使用目的次第。
8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

•
•

79

10.その他Japan Bioanalysis Forum

3.再分析

アンケート集計結果

5; 0%
4; 19%

1.
2.
3.
4.
5.

⾎漿未変化体（開発初期段階）

EBFに合意DGに合意
追加分析（n=2）
SOP⼜は試験計画書に従って再分析
その他

実施しない
Scientific judgment
EBFに合意SOP⼜は試験計画書に従って再分析
その他

1; 3%

1; 5%

5; 0%

2; 16%
3; 3%

3; 3%

4; 78%

2; 73%

結論

1.
2.
3.
4.
5.

有効回答数 37

⇒ Scientific judgmentの意⾒が多数で事後評価が受⼊れ可
8th JBF Symposium, 2017

結論

http://bioanalysisforum.jp/

代謝物，尿，組織

有効回答数 37

⇒ SOPに従うが約8割で組織・尿と逆転80

10.その他Japan Bioanalysis Forum

4.試験計画書・報告書(1/2)

3; 11%

1. 計画書/報告書いずれも簡略化して問題ない
2. 計画書は簡略化可，報告書は通常レベル
3. 計画書/報告書いずれも簡略化して問題ないが，QA
監査は必要
4. その他

4; 0%

2; 14%

有効回答数 37

1; 76%

アンケートコメント（抜粋）
申請資料にするのであれば，SVでもQA監査は実施すべき。

結論⇒ 簡略化に問題はないがQA監査の是⾮とは切り離して考えるべき。

簡略化は受け⼊れられるが，申請データにSVはNGという回答あり。そもそも 「SVとは」が認識不⼗分な回答者もいるようで，もっと啓蒙が必要。

DG検討，アンケート回答者コメント有
8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

アンケート集計結果

8110.その他Japan Bioanalysis Forum

4.試験計画書・報告書(2/2)

DGでの検討簡略化OKは多数であるが，そのうち10％は監査必要としている。申請資料するか否かは特に触れなかったが，SVは申請に使用されることが前提のはず。その認識がない？

アンケートコメント•••

評価項目は省略しても良いが，実施したことやその結果の判断は正確に記述すべきである。そうでなければ分析の質をコントロールできないし，第三者に対して妥当性を説明できない場合があるのではないか。
実施内容がわかる記録があればよい。
DG2016-20
申請データとして使用しないなら簡略化はOK

8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/•82

Japan Bioanalysis Forum

10.その他

5.SOP

(1/2)

4; 6%

1; 3%

1.
2.
3.
4.

はい
いいえ。SV/TA試験の経験あり
いいえ。SV/TA試験の経験なし
その他
有効回答数 35

3; 49%

2; 43%

アンケートコメント（抜粋）
SVのSOPはあるが，TAのSOPは無い。

結論⇒ ⼿順書はほとんどの会社で整備されていないが実施の拡がりは認められている。

SOP整備までは⾄っていないが，考え⽅は広まってきている印象を受ける。
今後の課題として，後追いで⽂書化するな
どの対応が考えられる。

8th JBF Symposium, 2017

DG検討有

http://bioanalysisforum.jp/

Scientific validation /Tiered approach（以下，SV/TA）の⼿順書は整備されていますか?

8310.その他Japan Bioanalysis Forum

5. SOP(2/2)••

SV，TieredのSOPなどはほとんどの会社で整備されていない。ただし，実施経験は4割以上で，かなり考え方は浸透してきている。
会社のSOPではTieredについてはJガイドラインと同様に付録として記載し，やり方として紹介している

8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

DGでの検討84

Japan Bioanalysis Forum

11. EBFの5区分でのSVによる申請(1/5)

アンケート集計結果
14%

2

8%

3

11%

4
5

61%

17%

56%

28%

64%

6%

14%

56%

31%

8%
8%
11%
8%

将来的には可能現時点では申請は不可能
その他

3%
33%

0%

申請は可能（実施経験または予定あり）

58%

6%

有効回答数 36

20%

40%
60%
80%
100%
EBFの5区分 1. ⾎漿中代謝物（ICH-M3(R2)可否判断のため）測定
2. 尿中（未変化体）測定
3. 組織中（未変化体）測定
4. 開発初期の⾮臨床⾎漿中未変化体測定（初期のGLP-TK測定を含む）
5. 開発初期の臨床⾎漿中未変化体測定（初期のPhase 1試験を含む）

結論

http://bioanalysisforum.jp/1⇒ ⾎漿中代謝物，尿中及び組織中未変化体はSVで申請可能と考えられるが，⾎漿中未変化体は申請不可
DG検討，アンケート回答者コメント有
8th JBF Symposium, 201785

Japan Bioanalysis Forum

11. EBFの5区分でのSVによる申請

•
•
•
•
•

(2/5)

評価資料として申請するか，参考資料として申請するかで意見は分かれる可能性は考えられた（代謝物）。
SVで申請に用いる場合もデータの位置づけ次第では（他のマトリックスでも同じ）。
尿のほうが血中代謝物よりSV申請不可の意見が多いのは意外。尿はヒト排泄率測定に用いる
データとなっていること等を想定しているか。
回答が製薬会社とCROで違う（CROの方が申請不可の意見が多い）
組織中未変化体は血中代謝物とほぼ同様の傾向

4. 開発初期の⾮臨床⾎漿中未変化体測定（初期のGLP-TK測定を含む）
5. 開発初期の臨床⾎漿中未変化体測定（初期のPhase 1試験を含む）

http://bioanalysisforum.jp/

1. ⾎漿中代謝物（ICH-M3(R2)可否判断のため）測定
2. 尿中（未変化体）測定
3. 組織中（未変化体）測定
DGでの検討DGでの検討•••GLPでやり直すならSVのデータは申請に使わないという意見あり。
BMVガイドラインのScopeにSVは困難と考えるのが主流。マイクロドーズ試験はSVという意見あり。
P1をSVで実施は有り得ない，という反応。ICH10でハーモナイズされれば変わる可能性有り。
8th JBF Symposium, 201786

Japan Bioanalysis Forum

11. EBFの5区分でのSVによる申請
1. ⾎漿中代謝物（ICH-M3(R2)可否判断のため）測定

(3/5)

•
•
•
•
•

「代謝物試験必要性判断のための評価」であれば，BMVガイドラインを適用せずSVで実施，その結果を申請資料に盛り込むことは可と考えている。BMVガイドラインやSVという言葉がなかった時代からそうしている状況
申請資料における使用データの位置づけによる。
DG2016-20
参考資料としては問題ないが，申請資料としては現状難しいと思う。
当局側がどの程度の科学的妥当性があるのかが分からないことになるので，受け入れは難しいだろう。
規制当局の判断によるので，何とも言えない。

http://bioanalysisforum.jp/

アンケートコメント

87

Japan Bioanalysis Forum

11. EBFの5区分でのSVによる申請
2. 尿中（未変化体）測定

(4/5)

•
•
•
•
•

臨床検体については，SVとすることでデータの扱いのレベルを下げる想定となるため，データの使い方を戦略的に考える必要があるが，可能か不可能かといえば，可能と考える。
ヒト尿の場合，ガイドライン上フルバリデーションが求められてると理解しています。またガイドラ
インをクリアしても尿中濃度がエンドポイントになる場合はSVは不可と思います。
DG2016-20
申請資料における使用データの位置づけによる。
簡略化したバリデーションをSVと呼ぶなら，可能。申請データの数値は，バリデーションが必要（仮に，In Studyであっても）規制当局の判断によるので，何とも言えない。

3．組織中（未変化体）測定
アンケートコメント
•
•
•
•
•
•

ADMEとして組織分布を把握する目的であれば，必ずしもBMVガイドラインに従わなくてよいので，SVで申請可能と考える。
組織中測定もGLP/TKの場合はフルバリデーションが必要と思います
経験不足で判断できません。
申請資料における使用データの位置づけによる。
尿と同じ。
規制当局の判断によるので，何とも言えない。

http://bioanalysisforum.jp/

アンケートコメント88

Japan Bioanalysis Forum

11. EBFの5区分でのSVによる申請
4. 開発初期の⾮臨床⾎漿中未変化体測定（初期のGLP-TK測定を含む） (5/5)
•
•
•
•
•
•

TK予備試験にはSVを活用しており，その結果を必要に応じて申請資料に盛り込むことは可能と考える。本試験前にややポイントの多いTKプロファイリングを非GLPで行い，申請時に非臨床
PKの項目に表現する等はありうる。
開発初期の試験の一部は，SVまで実施していないため，SVでの申請は不可能
DG2016-20
GLP/TKの場合はフルバリデーションが必要と思います。
申請資料における使用データの位置づけによる。
同じような試験をやり直すはず。あえて，SVのデータを出す必要はない。
規制当局の判断によるので，何とも言えない。

5. 開発初期の臨床⾎漿中未変化体測定（初期のPhase 1試験を含む）
アンケートコメント
•
•
•
•
•
•

http://bioanalysisforum.jp/

アンケートコメント

マイクロドーズはSVでいいと考えるが，予定はない。
ガイドライン上,フルバリデーションが求められてると理解しています。
申請資料における使用データの位置づけによる。
非臨床と同じ考え
FullとSVのPros/Consを踏まえて，積極的にSVとする意義は小さいと原則的には考えている．超高感度分析や，非常に広い定量範囲が必要な場合には考慮するかもしれませんが。
規制当局の判断によるので，何とも言えない。
89

Japan Bioanalysis Forum

12.アンケート結果の要約 (1)(1/3)

SVについてDGでの検討結果からアンケート調査を実施・評価
1. 標準品のCOA︓COA (ROA) は簡易版で良い。
2.
3.
4.
5.
6.
7.

検量線・QC試料︓SVではGLより基準を緩くすることは受⼊可
マトリックス︓代替マトリックス・マトリックスマッチング利⽤の合意形成は不⼗分(⽇間)再現性︓SVでは必要に応じてIn-Studyで追加実施で可
選択性︓臨床未変化体はn=6，他は緩くてOK，プールは有⽤併⽤薬影響評価︓原則不要，ただし妨害ピーク等報告有(17％)
安定性︓

http://bioanalysisforum.jp/

代謝物ICH-M3(R2)対応時は正式版必要

7-1. 標準溶液中安定性︓未変化体±15%，代謝物±20%7-2. 凍結融解︓実サンプル取り扱いに従って実施
7-3. 凍結保存︓実サンプル取り扱いに従って実施
7-4〜6︓全⾎中，併⽤薬存在下，前処理後の評価は不要
8th JBF Symposium, 201790

Japan Bioanalysis Forum

12.アンケート結果の要約 (2)(2/3)

SVについてDGでの検討結果からアンケート調査を実施・評価
8. IS variability評価︓ まだ⼀般的ではないが，有⽤な認識は広がりつつある。
9-1. 回収率︓不要9-2. キャリーオーバー︓検討時⼜はIn-studyで評価
9-3. ISR︓尿・組織は実施しないが9割（必要に応じて、を含む)
9-4. 希釈再現性︓必要性が予測可時はPre-studyで実施が2/3

10. その他
10-1. 試料採取⽅法︓予備検討で確認し，⽂書化しておく

http://bioanalysisforum.jp/

9. 他の試験項⽬

EBF基準は受⼊可。SIL-ISと類縁体ISで別けるべき。

10-2. 検量線の外挿
ULOQ以上の外挿︓＋20％以内OKと不可が半々LLOQ以下の外挿︓過半数が外挿不可でBLQ扱い
10-3. 再分析︓代謝物・尿はScientific Judgment，⾎漿はSOPに従う。
8th JBF Symposium, 201791

Japan Bioanalysis Forum

12.アンケート結果の要約 (3)(3/3)

SVについてDGでの検討結果からアンケート調査を実施・評価
10. その他（続き）
10-5. SOP︓Tiered approach/SVのSOP化はほとんど進⾏せず。
実施経験4割11. SVによる申請︓将来的には可能が過半数，ただし臨床未変化体はガイド

ライン通りが60％。 SV実施が申請時評価資料として扱う
か，参考資料とするかで意⾒は分かれた。
Domesticな今後の課題

8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

10-4. 計画書・報告書︓簡略化を推奨

92Japan Bioanalysis Forum

Conclusion
EBFのWPを題材に昨年度DGで検討

今年度︓DG検討結果についてアンケート調査を実施

BMVガイドラインのスコープ外である尿や組織，代謝物測定，または開発初期段階の⾮臨床・臨床試験のバイオア
ナリシスは，ガイドラインの基準に必ずしも従わないというEBFの主張や，これを国内への導⼊についてDGで検討した結果は，概ね国内で受け⼊れられている状況と考えられた。しかしながら，細部についてはまだ検討や周知が必要と考えられた。
8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

国内のバイオアナリストから有効回答数58の回答を得た。

93

Japan Bioanalysis Forum

12. Summary of survey results (1)(1/3)

Evaluation of survey results about SV in DG
1. COA(ROA): Acceptable for simplification, however, regular COA is required
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Acceptance criteria for CAL and QC︓Acceptable for relaxed criteria
Matrix : Alternative matrix/matrix matching is insufficient agreement(Inter-day) reproducibility︓Evaluation in In-Study, if necessary
Selectivity︓Early clinical: n=6, Others: n=1 or pooled
Evaluation of co-med effect: Not requirement (but 17% positive result)
Stability
7-1. Stock solution stability: Unchanged ±15%, metabolite ±20%7-2. F&T︓Required based on the sample treatment
7-3. Duration of storage︓Required based on the sample treatment
7-4〜6︓Not required in whole blood, with co-med, processed sample

8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

for ICH-M3(R2) test of metabolite

94

Japan Bioanalysis Forum

12. Summary of survey results (2)(2/3)

Evaluation of survey results about SV in DG
8. Evaluation by IS variability: Not common, but recognizing utility of it,
9. Other items
9-1. Recovery: Not required
9-2. Carryover: Evaluation in investigation stage or In-study
9-3. ISR: Not required for urine and tissue(>90%, including if necessary)
9-4. Dilution: If necessary, >2/3 in Pre-study

10. Others
10-1. Sample preparation: the document for sampling method is preparedbased on the preliminary investigation
10-2. Extrapolation
Over ULOQ: Half and half for not accept and within +20%
Under LLOQ: Not accept was major, treat as BLQ or zero.
10-3. Reanalysis: Metabolite, urine: scientific judgment,
Plasma: under, SOP
8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

EBF criteria acceptable, SIL/Analogue IS difference recognized.

95

Japan Bioanalysis Forum

12. Summary of survey results (3)(3/3)

Evaluation of survey results about SV in DG
10-4. Documentation︓Acceptable simplification for protocol and report.
10-5. SOP preparation for Tiered/SV︓ Not progress , but 40% experience.

11. Application by SV: Acceptable in future was majority, but unchanged inclinical adhered to GL was 60%. It is Japanese domestic issue that SV data
treat as evaluation result or reference result in raw data hearing after
submission.

8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

10. Others (continued)

96

Japan Bioanalysis Forum

Conclusion
Discussion in DG based on the EBF WP (2015)

Effective response: 58

SV is generally acceptable in Japanese bioanalysis,
which is EBF opinion that does not always comply BMV
guideline for analysis of urine, tissue, metabolite inplasma, and early non-clinical and clinical study forunchanged in plasma, and result of DG discussion for
introduce SV into Japanese bioanalysis. However, it isnecessary for well-recognized and discussion in detail.
8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

Survey to bioanalyst
from discussion result in DG (2016)97

Japan Bioanalysis Forum

In vitro 試験において目的に応じた適切な分析方法としての概念が応用できるか否か

8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

アンケート（２）98活動内容 (2)

分析法の検証⽅法に⼀定の考え⽅が存在しない

今回の報告
⽬的に応じた適切な分析⽅法
概念が適⽤できるか・・・

⽇本の実態に照らした適否も含めアンケート調査を実施・評価

http://bioanalysisforum.jp/

in vitro試験 [2]Japan Bioanalysis Forum[2] B. Buscher et al., Bioanalysis for plasma protein binding studies in drug
discovery and drug development: views and recommendations of theEuropean Bioanalysis Forum. Bioanalysis (2014) 6(5):673-82.
8th JBF Symposium, 201799

Japan Bioanalysis Forum

活動内容 (2)のポスター発表について

DG2016-20 における議論において、評価項⽬とそのクライテリアに違いがあると考え
本活動では in vitro試験を、⼤きく２つに分類した。

蛋⽩結合試験

その他試験

得られた数値を計算に⽤いる

数値⽐較により傾向を判断する想定される試験
細胞試験
CYP代謝酵素を⽤いた試験トランスポーターを⽤いた試験 など

8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

in vitro 試験の分類

100Japan Bioanalysis ForumEBF の提案に基づき DG2016-20 にて議論し推奨する(1/２)
評価項目及びクライテリア （In vitro 試験）
DG DG Recommendation としてグラフ内に記載

COA（確認試験，純度試験のみ）

その他試験※

蛋⽩結合試験

不要（試験に使⽤したバッチと同じものを使う場合）

検量線（ポイント）6 ポイント以上必要

検量線（評価基準）

全ポイントの 75%以上か少なくとも 6 ポイントが理論値の 15%以内（LLOQ は 20％以内）

マトリックス

試験で測定するマトリックスと同じ

QC（濃度レベル，n 数）

低・中・⾼濃度，n=3

LLOQ・低・中・⾼濃度，n=3

QC（真度）±15%（LLOQ︓20%）

QC（精度）

15%（LLOQ︓20%）

LLOQ

検量線の LLOQ で評価

検量線とは別に評価（n=3）

測定単位間再現性

不要

QC 及び検量線⽤標準原液

同じ標準原液を使⽤
1 個体またはプールのマトリックスで評価（複数の個体のマトリックスを準備しなくともよい）

選択性※ 蛋⽩結合試験以外の in vitro 試験（例として細胞、CYP 等の代謝酵素、トランスポーター等を⽤いて実施する試験での LC-MS/MS を⽤いた濃度測定を想定）

http://bioanalysisforum.jp/

評価項⽬

101

Japan Bioanalysis ForumEBF の提案に基づき DG2016-20 にて議論し推奨する(2/2)
評価項目及びクライテリア （In vitro 試験）
DG DG Recommendation としてグラフ内に記載

回収率
キャリーオーバー

マトリックス効果

希釈の妥当性
安定性（標準原液・室温）

安定性（保存中・凍結融解時）

試験中の安定性・再現性
バリデーション計画書
バリデーション報告書

その他試験※

蛋⽩結合試験

不要
実試料測定と同時に確認（In Study Validation)
限外ろ過であれば⾎清と濾液、透析であれば⾎清と緩衝液、超遠⼼であれば⾎清と上清、それぞれで確認する事が望ましいが、
上記以外の試験法の場合は不要

不要

実試料測定と同時に確認（In Study Validation)
不要
当てはまらない

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評価項⽬

不要
BMV ガイドラインに準拠
BMV ガイドラインに準拠※ 蛋⽩結合試験以外の in vitro 試験（例として細胞、CYP 等の代謝酵素、トランスポーター等を⽤いて実施する試験での LC-MS/MS を⽤いた濃度測定を想定）

102

Japan Bioanalysis Forum

1.回答者背景1.所属 2.従事年数

アンケート集計結果

バイオアナリシス従事年数

国内CRO
32%

0〜3年

20年以上

6%
12%

国内製薬企業

3〜5年
9%

5〜10年
18%

56%

65%
10〜20年

3%
海外製薬メーカー

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回答者所属

有効回答数 34
国内企業が90％以上，内CROが30％，海外企業の割合が低い
回答者の経験年数分布は広範囲で，⼤きな偏りはない
8th JBF Symposium, 2017103

Japan Bioanalysis Forum

1.回答者背景

3.実施レベル 4.試験選択
DG

アンケート集計結果

実施レベル
（基準︓
BMVガイドライン等）

3% その他
26%
71%

試験選択 「その他試験」としてSVでの実施が想定される試験（コメントとして寄せられたご意⾒）⾎球移⾏性試験
PK試験
薬物の⽖透過性試験

DG

BMVガイドラインを準⽤した基準で実施

http://bioanalysisforum.jp/

基準外で実施DG Recommendation薬物のケラチン親和性試験
細胞内取り込み試験
ベシクルを⽤いた試験
8th JBF Symposium, 2017104

Japan Bioanalysis Forum

1.回答者背景

5.実施タイミング

アンケート集計結果

⼀部の項⽬をIn-Study Validation
のみで実施
20%

24%

DG Recommendation

その他試験

実施しない

実施しない

8%

DG
Pre-Study
Validationで実施

⼀部の項⽬をIn-Study Validation
のみで実施

8%

DG
Pre-Study
Validationで実施

25%

42%

48%
25%

Pre-Study Validationでも実施するが⼀部の項⽬はIn-Study Validationで実施

蛋⽩結合試験
どちらも
その他試験

Pre-Study Validationでも実施するが⼀部In-Study Validationで実施

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蛋⽩結合試験DG(1/3)

Pre-Study Validationで実施する

Pre-Study Validationの実施有無にかかわらず、
⼀部の項⽬はIn-Study Validationで実施するとの意⾒も多く⾒られた
8th JBF Symposium, 2017105

Japan Bioanalysis Forum

1.回答者背景

5.実施タイミング(2/3)

アンケートコメント【 Preで実施するが⼀部の項⽬はIn-Studyで実施】•••

現状、安定性についてはIn-Study Validationで確認するが、それ以外の項
⽬はPre-Studyで実施する。
ヒト⾎漿でPre-Study Validationを⾏い、他の動物種の⾎漿はIn-Study
Validationで特異性、真度を確認する。
バリデーション試験を⽴てることもあるが、本試験内でバリデーションを実施するパターンがある。

【Preで実施せず
⼀部の項⽬をIn-Studyで実施】••

選択性、再現性、キャリーオーバー
特性、検量線直線性、⽇内再現性、オートサンプラー中安定性

【その他】

•

現時点ではフルバリデーションで実施•

本試験はHotで実施
8th JBF Symposium, 2017

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蛋⽩結合試験

106

Japan Bioanalysis Forum

1.回答者背景

5.実施タイミング(3/3)

アンケートコメント【Preで実施するが•⼀部の項⽬はIn-Studyで実施】•••【Preで実施せず•
⼀部の項⽬をIn-Studyで実施】

先に実施している試験のValidationデータからIn-Study Validationで問題が生じなさそうとの見当がつけば、ほとんどの項目をIn-Studyで実施する。
試験によるが、キャリーオーバーに関してはIn-Study Validationにて確認している。
バリデーション試験を立てることもあるが、本試験内でバリデーションを実施するパターンがある。

真度を実試料分析のQCで評価。
特性、検量線直線性、日内再現性、オートサンプラー中安定性

8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

その他試験

107

Japan Bioanalysis Forum

2. COA(ROA)(1/3)

蛋⽩結合試験 被検物質と標準物質とが
その他

4%

その他試験

同⼀Lotである場合、COA (ROA)は不要19%

その他 4%DG

DG Recommendation

被検物質と標準物質とが同⼀Lotである場合、COA (ROA)は不要
DG
29%

申請資料に使う試験である以上
COA (ROA)は必要
77%

蛋⽩結合試験
どちらも
その他試験

申請資料に使う試験である以上
COA (ROA)は必要
67%

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DG

アンケート集計結果

申請資料に使う以上COA (ROA) は必要

⼀⽅、 DG In Vitro試験においては、通常、被験物質と標準物質とが同⼀であり純度等の影響がキャンセルされるため，COA(ROA)は不要であると考えた。
8th JBF Symposium, 2017

会場のご意⾒をお聞かせください。

108

Japan Bioanalysis Forum

2. COA(ROA)(2/3)

アンケートコメント【必要】 • HotはCOA有りが通常。（蛋白結合試験）
•
•
•
•
•
•
•

濃度を得ることが最終目的であれば、COAは必要。（その他試験）
純度すらわからないのでは添加濃度が計算できないのではないか。（蛋白結合試験）
純度が試験の結果に影響する可能性があると考えCOA（未変化体と代謝物等では記載内容に差がある）は必ず準備する。
CROは最終的なデータの取り扱いは不明。入手できる情報は、入手しておきたい。
COAがなくてもよいとは思うが、通常COA（あるいはROA）があるため添付する。
定量性からは不要というのは理解するが，新医薬品適合性書面調査（品質・非臨床）
チェックリストをクリアするのに純度が必要。
明らかに純度が低い場合や、安定性に問題がありそうな場合はCOAをつける。

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蛋⽩結合試験・その他試験 共通【不要】 • ある程度の純度があり、1 測定で全測定が終了し、相対値で正しい評価ができるのであれば（平衡透析法）COAは必須ではない。

8th JBF Symposium, 2017109

Japan Bioanalysis Forum

3.検量線

1.範囲

(1/2)
EBF Recommendation ︓ 特になし

アンケート集計結果

その他試験

3オーダー
（例︓1〜1000 ng/mL）

3オーダー（例︓1〜1000 ng/mL）

42%

35%
46%

その他

その他
9%

13%

2オーダー
（例︓1〜100 ng/mL）

57%

2オーダー
（例︓1〜100 ng/mL）

http://bioanalysisforum.jp/

蛋⽩結合試験

蛋⽩結合試験︓
フレキシブルに設定するという意⾒が3オーダーとほぼ同数であった

その他試験︓

3オーダーとした意⾒が過半数を占め，蛋⽩結合試験と若⼲異なっていた
8th JBF Symposium, 2017110Japan Bioanalysis Forum

3.検量線
アンケートコメント

1.範囲

(2/2)

すべて【その他】としていただいたご意⾒

•
•
•
•
•
•

予想される濃度により試験毎に設定。
実検体濃度を考慮して検量線範囲を設定する。
結果として必要な濃度範囲を考慮して決める。
実検体の濃度を考慮して検量線範囲は設定しています。
MS感度、実験体濃度を考慮して検量線範囲を設定する。
化合物による。

蛋⽩結合試験
••••血漿，緩衝液のそれぞれについて想定される実検体濃度に基づき定量範囲を設定
実検体の濃度を考慮して検量線範囲は設定しています。
実検体を考慮して、検量範囲を設定する．希釈操作が不要な最大の検量範囲（評価系）を設定できるほうがありがたい。想定される結果が10倍なら10倍で十分。
実検体濃度を考慮して検量線範囲を設定する。できればfree側と血漿（清）側を同一検量線で希釈再現性なしで測りたいので、無理な時はあきらめて希釈再現性をとります。

http://bioanalysisforum.jp/

蛋⽩結合試験・その他試験 共通

その他試験
•
•

実験体濃度を考慮して設定します。
実態にあわせて実施。
8th JBF Symposium, 2017111

Japan Bioanalysis Forum

3.検量線

2.ポイント数(1/5)

EBF Recommendation ︓ 6ポイント以上

蛋白結合試験・その他試験DG

DG Recommendation
蛋⽩結合試験

40%
30%

38％
25％

その他試験

33％
25％

25％

21％

17％

20%

13％

10%
0%

0％
8ポイント以上
DG

７ポイント
DG

６ポイント
DG

4％

５ポイント以下

その他

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アンケート集計結果

蛋⽩結合試験︓回答者の9割近くが6ポイント以上と回答した
その他試験︓6ポイント以上と回答した割合が1割程度減少した
蛋⽩結合試験の検量線は若⼲厳しめに設定しているとも考えられる
DG 6ポイント以上であり、多数の回答者と同じ意⾒であった
8th JBF Symposium, 2017112

Japan Bioanalysis Forum

3.検量線

2.ポイント数(2/5)

アンケートコメント【8ポイント以上】

•
•
•
•
•
•
•

【7ポイント】••

in vivoの測定との併用を想定して分析条件を作成することが多いのであえてポイント数を減らすことはしません。
BMVに合わせています。
Bioanalysisの基準をベースにしているため。
200倍の検量範囲では，公比2～2.5倍で8ポイントとれるため。
広い範囲をカバーするほうがリスクが軽減できる。 2点外れても問題な
いため，8点を選択している。
現実にはBMVガイドラインを意識して8ポイント準備（2ポイント外しても6ポイント残る）する。
In vivoの検量線と同様のポイント数であり、検量線のポイント数を減らすことで作業量が大きく減るとも思わないため。

http://bioanalysisforum.jp/

蛋⽩結合試験 (1/2)

1ポイント外してもバッチ成立条件を満たすため。
BMVガイドラインを参考にしているため。 TKバリデーションの方法の一部改変で実施する場合が多いため。

8th JBF Symposium, 2017113

Japan Bioanalysis Forum

3.検量線

2.ポイント数(3/5)

アンケートコメント【7ポイント（続き）】

•
•
•
•

１オーダーあたり2点を基本とする。
BMVガイドラインの最小点数を考慮。
原則6ポイントで1ポイント逸脱しても対応できるよう7ポイントに設定する。
TKなどの測定系を使うことが多いので7か8が多いです。

【6ポイント】•••

BMVガイドラインの最低水準。
BMVガイドラインに基づいて設定。
実際には6ポイント以上としています。検量線範囲に因ります。血漿中濃度については先に血漿中濃度測定法のValidationが実施されていればそのValidationデータを引用しますので、6ポイント以上となり
ます。

【その他】

•

外れ値を除外する可能性を考慮して、ポイントを増やしているが、おおよその直線性を求めている場合、かつ再現性の良い方法の場合
は3～5ポイントあれば十分。
8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

蛋⽩結合試験 (2/2)

114

Japan Bioanalysis Forum

3.検量線

2.ポイント数(4/5)

アンケートコメント【8ポイント以上】

•
•
•
•
•

【7ポイント】

•
•
•
•
•
•

BMVに合わせています。
Bioanalysisの基準をベースにしているため。
200倍の検量範囲では、公比2～2.5倍で8ポイントとれるため。
広い範囲をカバーするほうがリスクが軽減できる。2点外れても問題な
いため，8点を選択している。
現実にはBMVガイドラインを意識して8ポイント準備（2ポイント外しても6ポイント残る）する。
1ポイント外してもバッチ成立条件を満たすため。
BMVを参考にしているため。 TKバリデーションの方法の一部改変で実施する場合が多いため。
１オーダーあたり2点を基本とする。
BMVガイドラインの最小点数を考慮。
原則6ポイントで1ポイント逸脱しても対応できるよう7ポイントに設定する。
TKなどの測定系を使うことが多いので7か8が多いです。
8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

その他試験 (1/2)

115

Japan Bioanalysis Forum

3.検量線

2.ポイント数(5/5)

アンケートコメント【6ポイント】••

BMVガイドラインの最低水準。7ポイント以上を否定するものではない。
BMVガイドラインに基づいて設定。

【その他】

•

検量線の下限から上限までのおおよその直線性が示せれば問題ない
ため、ポイント数を限定していません。

8th JBF Symposium, 2017

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その他試験 (2/2)

116

Japan Bioanalysis Forum

3.検量線

3.採用基準(1/2)

蛋⽩結合試験

その他試験

結果的に15/20%に収めることが多いが、5%は軽微な逸脱と考え、20/25%を基準とする
33%

結果的に15/20%に収めることが多いが、5%は軽微な逸脱と考え、20/25%を基準とする
39%

67%

61%

DG

DG

BMVガイドラインの基準（15/20%）が妥当

BMVガイドラインの基準（15/20%）が妥当

http://bioanalysisforum.jp/

DG DG Recommendation
アンケート集計結果
BMV : 検量線⽤標準試料の75%以上かつ、少なくとも6 ポイントが15% (LLOQは20%)
EBF : 検量線⽤標準試料の75%以上かつ、少なくとも6 ポイントが20% (LLOQは25%)

両試験とも，BMVガイドラインに従う意⾒（15/20%）が過半数（6割以上）を占め，それ以外の回答者は20/25%を選択した．
その他を選択した回答者は居なかった．
8th JBF Symposium, 2017117

Japan Bioanalysis Forum

3.検量線

3.採用基準(2/2)

アンケートコメント【結果的に15/20%に収めることが多いが、5%は軽微な逸脱と考え、20/25%を基準とする】•BMVを参考にしているため。TKバリデーションの方法の一部改変で実施する場合が多いため。
•%は厳しくし、逸脱するポイントは使用しないという選択がありうる。
•基準を緩める必要性がない。
•実際には逸脱が想定しにくいので15/20%のままとする。
•MS/MSでの測定である以上15％未満の基準は厳しい。マトリックスが血漿に比して単純な系で基準を緩める必要はない。

8th JBF Symposium, 2017

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蛋⽩結合試験・その他試験 共通

118

Japan Bioanalysis Forum

3.検量線

(1/2)

EBF Recommendation︓LLOQ理論値の-25%からULOQ理論値の20%（許容誤差を25/20%とする場合）

蛋⽩結合試験

その他試験

許容誤差範囲外の外挿も許容する
検量線サンプルの内
標⽐範囲（peak area ratio）

を超えた外挿は許容しないが、範囲内は許容する

8%

4%（peak area ratio）

44%

DG Recommendation

許容誤差範囲外の外挿も許容する
検量線サンプルの内
標⽐範囲

0%その他

DG

を超えた外挿は許容しないが，範囲内は許容する

9%4%0% その他
39%
許容できない許容できない48%

44%

DG
許容誤差範囲内の外挿は許容する

DG

http://bioanalysisforum.jp/

アンケート集計結果

4.外挿

許容誤差範囲内の外挿は許容する

両試験とも，何らかの形も含め「許容する」とした意⾒が過半数を占めた．
その⼀⽅，どんな形でも「許容しない」とする意⾒も約4割認められた．
8th JBF Symposium, 2017

119Japan Bioanalysis Forum

3.検量線

4.外挿

(2/2)

アンケートコメント【許容できない】••••【許容誤差範囲内の外挿は許容】•••

BMVを参考にしているため。TKバリデーションの方法の一部改変で実施する場合が多いため。外挿について，世間では許容されていることを知りませんでした。
定量上限超えはin vitroでは有り得ない。BLQはXXng/mL 未満，or
XX%未満などとなる。
許容できる根拠に乏しい。検量線に入るように試験デザインすべき。
LLOQの値から結合率を算出し、例えば99.99＜という報告でいいのでは？誤差範囲の値をがんばって採用しても評価は変わらないと思います。

http://bioanalysisforum.jp/

蛋⽩結合試験・その他試験 共通

もともと各点ともその誤差は許容しているため。
検量線の直線性が担保できていればいいと思いますが、実際には「できない」として実施しています。
「誤差範囲です」と言い切れるので正当化が可能と考えます。
8th JBF Symposium, 2017120

Japan Bioanalysis Forum

4.検量線・QC試料に使用するマトリックス
アンケート集計結果
EBF Recommendation:
検量線・QC試料に使⽤するマトリックスは評価試料と合わせることが基本

蛋⽩結合試験・
その他試験

0% その他

特に評価しない

9%
妥当性を必ず評価

DG
DG DG Recommendation

評価試料に応じて妥当性を評価39%
52%

in vitro試験においてはPBSなどの緩衝液で代⽤が可能となるケースもある。

http://bioanalysisforum.jp/

1.緩衝液を代替マトリックスとして使用する場合の評価

代替マトリックスを使⽤する場合，約半数が評価試料に応じて妥当性を評価する
⼀⽅，必ず妥当性を評価するとの回答も４割程度あり、妥当性を評価すること⾃体への賛成は多かったが、その基準について意⾒は分かれた
8th JBF Symposium, 2017121

Japan Bioanalysis Forum

4.検量線・QC試料に使用するマトリックス
2. 代替使用に際し妥当性評価が必要なマトリックス
前問で「評価試料に応じて妥当性を評価」を選択した⽅からのご回答

蛋⽩結合試験・その他試験
87％（複数回答）

80％

100%

73％

60％

80%
60%
40%

0%

20%
0%

⾎清

超遠⼼上清

限外ろ過液

懸濁した
マトリックス

http://bioanalysisforum.jp/

アンケート集計結果

その他（ミクロソーム，細胞等）

全てのマトリックスとの妥当性を評価する例が多い
8th JBF Symposium, 2017122

Japan Bioanalysis Forum

4.検量線・QC試料に使用するマトリックス
4.3-1.マトリックスマッチング：実施経験
蛋⽩結合試験・その他試験
経験なし

35%

30%

探索的試験においてのみ経験あり35%

マトリックスマッチング

例えば蛋⽩結合率を測定する
際、平衡透析法を⽤いて評価する場合には、⾎清画分に等量の緩衝液を、緩衝液画分に等量の⾎清を添加し、⾎清:緩衝液(1:1)混液で検量線・QCを調製し定量するという⼿法

http://bioanalysisforum.jp/

アンケート集計結果

申請資料となる試験で実施経験あり

探索的試験のみならず申請資料となる試験でも実施経験あり
過半数（60%以上）の⽅がマトリックスマッチングの経験あり
8th JBF Symposium, 2017123

Japan Bioanalysis Forum

4.検量線・QC試料に使用するマトリックス(1/2)

4.3-2.マトリックスマッチング：メリットデメリット
メリット
•
•
•
•
•
•
•

検量線の数が減らせる。(8/14)
緩衝液画分に⾎清のペプチド等の成分が流⼊しており、バリデーションの時に代替マトリックスで緩衝液のみを⽤いると、本測定の実試料でイオンサプレッションが⾒つかることがあるが、本法は⾎清を混ぜているので、（代替）マトリックスは⾎清:緩衝液(1:1)混液となり、その⼼配がない。
⾎漿中濃度がバリデートされていれば蛋⽩結合測定もカバーされる。
マトリックス効果がキャンセルできる。
FreeとTotalを同条件下で測定できるので結果の精度に⾃信が持てる。
緩衝液画分の容器等への吸着防⽌。
複数の動物種でバリデーションを取ろうとすると2倍の時間を要し、またデータが複雑になるが、マトリック
スマッチングにするとシンプルかつ短時間で済む。

http://bioanalysisforum.jp/

アンケート集計結果

メリットとしては，検量線の本数減少，時間の短縮など，作業量の削減に関する意見が最も多く，また，マトリックス効果の相殺や吸着防止などの利点も挙げられた．
8th JBF Symposium, 2017124

Japan Bioanalysis Forum

4.検量線・QC試料に使用するマトリックス(2/2)

4.3-2.マトリックスマッチング：メリットデメリット
デメリット•試料採取時の作業⼯程が複雑になる。(3/11)•⾼感度が必要とされる。(4/11)•等量の⾎清⼜は緩衝液を添加する前に試料の重量を測定する必要があり、⼿間が多い。⽐重も1と仮定しての添加となるため、必ずしもすべてのサンプルが⾎清:緩衝液が(1:1)と揃っているとは限らない。TK
バリデーションとマトリックスが変わるので、結局、バリデーションが必要。
•（蛋⽩結合率が⾼い場合）緩衝液側の感度が⾜りないことがある。また、緩衝液側と⾎清側の濃度差が⼤きいため、広範囲の測定が可能な測定法の確⽴が必要となる。
•添加するブランク試料を要する。
•特にデメリットを感じた経験がない。

http://bioanalysisforum.jp/

アンケート集計結果

デメリットとしては，試料採取時の作業の複雑化，MSの⾼感度化などの意⾒が最も多く，また結合率が⾼い化合物の場合には広い検量線範囲を要する，といった意⾒も挙げられた．
8th JBF Symposium, 2017125

Japan Bioanalysis Forum

5. QC試料の評価 1.LLOQの必要性
アンケート集計結果

DG DG Recommendation

DG

必要でない

その他試験
必要
41%

必要でない
30%

59%

70%

蛋⽩結合試験 : 必要でない
⼀⽅、 DG

必要

その他試験

DG

http://bioanalysisforum.jp/

蛋⽩結合試験

: 必要想定される定量値を考慮して，蛋⽩結合試験では不要，その他試験では必要と考えた。
8th JBF Symposium, 2017126Japan Bioanalysis Forum

5. QC試料の評価
2. LLOQの評価時期 （SVで評価 以外）
アンケート集計結果

蛋⽩結合試験・その他試験
その他

8%

31%

実測定における検量線のLLOQで評価

アンケートコメント
【その他】

評価しない

•

62%

基本的にLQC-HQCの濃度範囲で定量するため、LLOQの評価は不要と考える。または、LLOQ〜LQCのサンプルが出たら評価する。

http://bioanalysisforum.jp/

前問で「必要ない」を選択した⽅からのご回答

蛋⽩結合試験 ・ その他試験
過半数（60%以上）が基本的にはLLOQを評価しないが，実測定における検量線のLLOQで評価するとの回答も30%程度あり．
8th JBF Symposium, 2017127

Japan Bioanalysis Forum

5. QC試料の評価 3.試料の繰り返し数DG DG Recommendation

アンケート集計結果

その他試験
n=5

ｎ= 5
26%

74%

蛋⽩結合試験
その他試験

29%

n=3
DG

どちらも

n=3
71%

DG

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蛋⽩結合試験

過半数(70%以上)がn = 3 で実施
8th JBF Symposium, 2017128

Japan Bioanalysis Forum

5. QC試料の評価
1.LLOQの必要性 2.評価時期 3.繰り返し数
蛋⽩結合試験
【その他】

•
•
•
•
•
•
•

LLOQ～LQCの間のサンプルの有無によって判断する。
評価はして、クライテリアをゆるくしたらいいと思う。
確認はしておく必要があるのでは。
測定値がばらつくのであればn=5でもよい。
蛋白結合の高い化合物、評価濃度が低い化合物の場合は、
LLOQ付近で定量される可能性もある。
LLOQの評価を省くのであれば挟み込みの考え方でlow-QCをLLOQの代わりに用いる。

その他試験
【その他】

•
•
•

LLOQ～LQCの間のサンプルの有無によって判断する。
測定目的に併せて定量範囲を設定するのは妥当であるが、目的に併せてQCの濃度範囲を設定するのは妥当ではない。
（バリデーションは設定された定量範囲における分析法
自体の妥当性を担保するためのものなので）8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

アンケートコメント

129

Japan Bioanalysis Forum

5. QC試料の評価 4.評価基準(1/2)

蛋⽩結合試験
より許容範囲の広い基準（20/25%）で実施

その他試験
0% その他より許容範囲の広い基準（20/25%）で実施

35%

41%

65%

DG

DG

BMVガイドラインの基準（15/20%）で実施

0% その他

59%

BMVガイドラインの基準（15/20%）で実施

http://bioanalysisforum.jp/

DG DG Recommendation
アンケート集計結果
BMV Recommendation : QC試料の評価基準︓15% (LLOQは20%)
EBF Recommendation : QC試料の評価基準︓20% (LLOQは25%)

蛋⽩結合試験
どちらも 半数以上がBMVガイドライン(15/20%)の基準で実施
その他試験
⼀⽅で，４割程度はより広い許容範囲(20/25%)を⽀持し，意⾒は分かれた．
8th JBF Symposium, 2017130

Japan Bioanalysis Forum

5. QC試料の評価 4.評価基準(2/2)

アンケートコメント【BMVガイドラインの基準で実施】••

基本的に15/20%基準で実施するが，この基準を満たすことが困難な場合，妥当性を確認した
後，20/25%基準で評価する．
MS/MSでの測定である以上15％未満の基準は厳しい。マトリックスが血漿に比して単純な系
で基準を緩める必要はない。

8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

蛋⽩結合試験・その他試験

131

Japan Bioanalysis Forum

6. 測定単位間再現性
アンケート集計結果(1/2)

蛋⽩結合試験

その他試験

測定単位間再現性は評価する
5%
4% その他

測定単位間再現性は評価する
5%9% その他

91%

86%

測定単位間の再現性は評価しない（測定単位内の確認のみで⼗分）DG

蛋⽩結合試験
どちらも
その他試験

測定単位間の再現性は評価しない（測定単位内の確認のみで⼗分）
DG

http://bioanalysisforum.jp/

DG DG Recommendation

85%以上が測定単位間の再現性は評価しない
8th JBF Symposium, 2017132

Japan Bioanalysis Forum

6. 測定単位間再現性(2/2)

アンケートコメント【測定単位間の評価は不要】•••

1測定で評価が終了する試験かつ相対的な濃度で正確な評価ができる試験については、測定
単位内再現性の確認のみで十分。
測定単位間再現性を実施しない理由として「繰り返し測定する試験ではないため」は適切ではない。本来、測定単位間再現性は、測定を他の日に何回行おうと同じ結果が得られることを担保するものなので、一回限りの測定結果が申請データになるからこそ、測定単位間の再現性は重要になると考えます。また，in vivoでも実試料に対して繰り返し測定は通常行いません。｢
測定単位間は評価しない｣を選択したのは実試料分析時にもQCを設定して、そのときの分析の妥当性を評価可能との理由からです。
単位間再現性も評価した方がいいと思うが、必須ではないと思います。

8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

蛋⽩結合試験・その他試験

133

Japan Bioanalysis Forum7. 標準溶液(1/2)
DG DG Recommendation

蛋⽩結合試験・その他試験
その他
13%
別々に調製した
ストック溶液を使⽤
Pre-Study Validationでは同じストック溶液を使⽤するがIn-Study Validationでは別々に調製したストック溶液を使⽤

蛋⽩結合試験
その他試験

同じストック溶液を使⽤

DG（Pre-Study ValidationとIn-Study Validation共に）

52%

22%

13%

http://bioanalysisforum.jp/

アンケート集計結果

回答者の約半数がValidationでは同じストック溶液を使⽤する

Pre-Study、In-Study Validation共に｢同じストック溶液を使⽤する｣傾向が⾒られたがIn-Study Validationにおいては｢別々のストック溶液を使⽤する｣との回答も35%あり
8th JBF Symposium, 2017134

Japan Bioanalysis Forum7. 標準溶液(2/2)

アンケートコメント

【その他】
•
•
•

相対的評価で問題ない場合は、同じストック溶液の使用が可能。
別々のものを使用しなくとも、調製が他の方法で問題ないことが確認できればよいのでは。検量線、マトリックスが貴重で入手しにくいのであれば、同じストックで問題ないことを確認する。
今は別々のストック溶液を使用しているが、同じストック溶液でいいなら同じものを使用したい。

8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

蛋⽩結合試験・その他試験

135

Japan Bioanalysis Forum

8.選択性

(1/3)
DG DG Recommendation

アンケート集計結果

蛋⽩結合試験・その他試験

蛋⽩結合試験

60%
50%

41％

40%

36％

33％
23 %

30%
20%
10%
0%

0％

0％
複数の個体
マトリックスプール DG
マトリックス

5％

1個体の DG 試験に応じてマトリックス

0％ 0％
確認せず

0％

5％

その他

蛋⽩結合試験 : 複数個体／プールマトリックスがいずれも約4割
その他試験: プールマトリックスが約6割

http://bioanalysisforum.jp/

その他試験

57 ％

＜評価基準＞ ブランク試料のレスポンスが、LLOQにおける分析対象物質20%以下
かつ内標準物質の 5%以下

⼀⽅、 DG（意⾒全数 両試験とも）

In vitro試験では均⼀なマトリックスを使⽤する場合も多いことから「1個体またはプールマトリックス」で⼗分と考えた。
8th JBF Symposium, 2017

会場のご意⾒をお聞かせください。

136

Japan Bioanalysis Forum

8.選択性

(2/3)

アンケートコメント【複数個体】••

n=3 (8/9)
使用予定のロット毎にn=1

【プール】

•
•

n=6
実際のサンプルと同じマトリックスを使用。

【試験毎】

•
•

n=3
蛋白結合試験(血漿中濃度)はBMVに従うのがベスト。上清やろ液はプールで
n=1-3でよい。
複数の動物種を1つの測定系で定量する場合（ラット、マウス、ブタ、ヒト血漿について、ラット血漿の検量線で評価）は、各動物種についてn=6のプールマトリ
ックスを用いて評価する。
試験デザインにもよるが使用予定のロットごとにn=1で確認する個体試験を実施していれば、用いた個体のマトリックス（数）プールであれば試験に用いたプール1試料。
代替マトリックスを使用しない場合、検量線のブランク試料で評価する。

•
•
•
•

8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

蛋⽩結合試験

137

Japan Bioanalysis Forum

8.選択性

(3/3)

アンケートコメント

【プール】

•

n=1(1 lot)(2/4) 、1-3(1/4)、6(1/4)

【1個体】

•

細胞毎に評価

【試験毎】

•
•
•

ロット間差を評価する（n=3）
細胞・条件毎に実施するがn=1でよいと考える。
代謝試験は使用するミクロソーム（目的により個別n=1またはプールドミクロソー
ム当該ロット現物）で実験直前に確認する
マトリックスロットにおける画一性を考慮（例えばS9により、より精製度の高いミク
ロソームは画一性が高いと考えられる）肝細胞を使用する際はn=3以上のプールマトリックスにて、トランスポーター発現細胞・ベシクルを使用する際は実施条件毎に評価する。
代替マトリックスを使用しない場合、検量線のブランク試料で評価する。

•••

8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

その他試験

138

Japan Bioanalysis Forum

9.回収率

(1/2)
DG DG Recommendation

蛋⽩結合試験

Pre-StudyあるいはIn-Study Validation（以下Validationとする）

その他 0%
DG
確認しない

35%

その他試験

で確認する

9%

その他 0%
DG
確認しない

測定法の検討時に確認する（Validation試験では評価しない）

どちらも（以下Validationとする）

5%

で確認する

38%
57%

56%

蛋⽩結合試験
その他試験

Pre-StudyあるいはIn-Study Validation

測定法の検討時に確認する（Validation試験では評価しない）

http://bioanalysisforum.jp/

アンケート集計結果

測定法の検討時に確認する（Validationでは評価しない）

⼀⽅、DG BMVガイドラインで不要となっていることから確認は不要とした
8th JBF Symposium, 2017

会場のご意⾒をお聞かせください。

139

Japan Bioanalysis Forum

9.回収率

(2/2)

アンケートコメント【Validation時】 ••血漿中濃度は実施した方が良い。
上清やろ液は回収できない要素がないので不要。（蛋白結合試験）【測定法検討時】 ••BMVガイドラインで不要となっているため、試験内では確認しない。
SVなのでバリデーションでの評価は不要。

【確認しない】委託者による要望がない。検量線、QCが判定基準を満たしていれば、定量値に問題ないため（そのために予備検討で定量範囲内に入るように検量線レンジを変更して、定量値を確認している）。TKバリデーションで確認しており、緩衝液画分や超遠心の上清では、血漿より回収率が上昇する傾向を多く経験しているため。
QCが正確に測定できればよいと考える。
除タンパク法ではPBS溶液からの回収は100％と想定。
事前検討で回収されることを確認し，試験内では確認しない。
BMVガイドラインで不要となっているため、試験内では確認しない(2/8)
多くの場合、回収されるので改めて確認の必要なし。方法開発の段階でバラつ
8th JBF Symposium, 2017
きが多い等問題があれば、問題解決のために確認する。

•

•
•
•
•
•

8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

蛋⽩結合試験・その他試験 共通

140Japan Bioanalysis Forum

10.キャリーオーバー(1/2)

蛋⽩結合試験
確認しない 4%その他
0%Pre-Study Validation
または
実検体測定の試験内で
評価する

その他試験
その他
0%
確認しない 0%27%32%

試験に応じて対応
14%

試験に応じて対応
Pre-Study Validation
でのみ評価

14%

23%

実検体測定の試験内でのみ評価 DG

蛋⽩結合試験
その他試験

33%

Pre-Study Validation
または
実検体測定の試験内で
評価する
34%

Pre-Study Validation
でのみ評価
19%

実検体測定の試験内でのみ評価 DG

どちらも実施タイミングならびに⽅法はそれぞれだが実測定の実施までには確認する

http://bioanalysisforum.jp/

DG DG Recommendation

アンケート集計結果＜評価基準＞ ULOQの検量線⽤標準試料を測定後のブランク試料のレスポンスが、LLOQにおける分析対象物質 20%以下
かつ内標準物質の 5%以下（意⾒全数 両試験とも）

⼀⽅、 DG 実検体測定の試験内で評価できるため、SVとしての実施は不要と考えた
8th JBF Symposium, 2017

会場のご意⾒をお聞かせください。

141

Japan Bioanalysis Forum

10.キャリーオーバー(2/2)

アンケートコメント【Validation＋実測】•【試験に応じて】•••【確認せず】

TKバリデーションと前処理方法が変わるため。
(基本的に固相抽出から除タンパクになる)（その他試験）• バリデーションでは、簡単に評価する。
(検量線の直後にブランクを入れて、n=1で評価)
予備検討で懸念がある場合は、その時点で測定系を再検討する。(2/5)
バリデーションで問題なければ、実測定では確認しない
基本的には実検体測定の直前でバリデーション試験を実施し、バリデーションにてキャリーオーバーの懸念があった場合は実検体測定の試験内でも確認する。
• バリデーションで評価することも、実検体測定の試験内で確認することもある。
•

http://bioanalysisforum.jp/

蛋⽩結合試験・その他試験 共通

TKバリデーションの一部改変のみのため。
予備実験の時にULOQの後にWash試料を測定し、確認しているため。
8th JBF Symposium, 2017
8th JBF Symposium, 2017

（蛋白結合試験）142

Japan Bioanalysis Forum

11. マトリックス効果(1/3)
DG DG Recommendation

アンケート集計結果

確認しない
45%

その他試験
Pre-Study Validation
で評価
30%

確認しない

Pre-Study Validation
で評価
25%

DG 40%

35%

25%
DG

試験に応じて対応

蛋⽩結合試験
どちらも
その他試験

試験に応じて対応

http://bioanalysisforum.jp/

蛋⽩結合試験

アンケート回答は「評価する」約3割「確認しない」4-5割で意⾒が分かれた。

⼀⽅、 DG マトリックスが異なることが明らかな⼀部の蛋⽩結合試験のみ「評価が必要」とした
8th JBF Symposium, 2017143

Japan Bioanalysis Forum

11. マトリックス効果(2/3)

アンケートコメント【評価する】 •••【試験毎】

LC-MS（ESI）法を使用する限り避けて通れない。
基本的にマトリックスマッチングであるが、マッチした状態でのマトリックス効果が顕著でないことを確認する。
血清のみ評価。

••

マトリックスが異なる場合は必要。
超遠心で血清と上清の2本の検量線を作成しない場合、検量線と異なるマトリックス
でのマトリックス効果を確認する。

【確認せず】 ••••実検体と同一のマトリックスで調製したQCが正確に測定できればよい。
ISに標識体を使用するため。
プールしたマトリックスで検討するためMFのばらつきは小さいと考えられる。
血清とろ液，動物種ごとでQCを確認しているので，項目として実施しなくても、効果があれば分かると思います。
血清でマトリックス効果を確認しており、測定に問題なければ、血清成分の一部分をマトリックスにしているので、その影響は小さくなる傾向を多く経験しているため。

•

8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

蛋⽩結合試験

144

Japan Bioanalysis Forum

11. マトリックス効果(3/3)

アンケートコメント【評価する】•••

既存のTKバリとマトリックスが大きく異なるため。
LC-MS（ESI）法を使用する限りMEは避けては通れない。
出来上がったサンプルの状態でのマトリックス効果が顕著でないことを確認する。

【試験毎】

•
•
•

BSA添加の有無等があれば検討する。
試料種中の内因性成分量やその画一性で要否を判断。
測定ｻﾝﾌﾟﾙが細胞抽出液となる場合は、検量線と実サンプルが厳密には同一とならないため、確認する。
酵素源を含む反応液と有機溶媒などで調製した標準試料を比較して確認したことがあります。

•【確認せず】••••

http://bioanalysisforum.jp/

その他試験

マトリックス効果がある試験系であることがほぼないので実施しない。
ISに標識体を使用するため。
検量線と実検体で同一のマトリックスを使用するため不要。
実検体と同一のマトリックスで調製したQCが正確に測定できればよいと考える。

8th JBF Symposium, 2017145

Japan Bioanalysis Forum12. 希釈の妥当性(1/2)
DG DG Recommendation

アンケート集計結果

確認しない
試験に応じて
14%
対応

10%

その他試験
Pre-Study Validation
で評価

確認しない
試験に応じて対応

Pre-Study Validation
で評価
10%

20%

57%

50%

19%
DG

DG

必要に応じて、
実検体測定試験内で確認

必要に応じて、
実検体測定試験内で確認

蛋⽩結合試験
その他試験

20%

どちらも

http://bioanalysisforum.jp/

蛋白結合試験

必要性が明らかであれば「Pre-Study Validationで評価する」との回答が多数を占めた

⼀⽅、DG 必要に応じて実検体測定の試験内で評価すればよいと考えた
8th JBF Symposium, 2017

会場のご意⾒をお聞かせください。

146

Japan Bioanalysis Forum12. 希釈の妥当性(2/2)

アンケートコメント【評価する】

•
•
•
•

【試験毎】

•

•
•

予備検討で希釈が必要か確認してから、バリデーション項目に入れるかどうかを決めているため、必要又は不要は事前に明らかになる。
分析上の制限で検量線範囲を狭く設定する場合は希釈込のメソッドとしあら
かじめ確認する。
希釈が不要な濃度範囲で実施するため、確認しない。
非結合型濃度のみを測定する場合、希釈が不要なケースも。（その他試験）••

濃度範囲が既知だから。
操作が適切であれば理論値どおりに希釈されたと解釈する。

•【確認しない】希釈測定が必要な試験のみ確認する。
希釈操作が入るのであればバリデートは必要。
超遠心前後の濃度を測定するため、濃度範囲が広く、希釈が必要になる場合が多い。（蛋白結合試験）
必要性が生じた場合、実検体測定の試験内で確認する。（その他試験）

8th JBF Symposium, 2017

http://bioanalysisforum.jp/

蛋⽩結合試験・その他試験 共通

147

Japan Bioanalysis Forum13. 安定性

1.評価項目(1/3)
DG DG Recommendation

アンケート集計結果（複数回答）

60%
50%

60％ 60％40％ 40％

蛋⽩結合試験
その他試験

40%
30%

20％

20%

15％ 15％15％

25％ 25％

10%
0%

DG
凍結融解

ベンチトップ

⻑期保存

前処理後

実施しない

http://bioanalysisforum.jp/

蛋⽩結合試験・その他試験

前処理後とベンチトップの安定性を確認する例が多いが、全く実施しないとの回答も20%以上あった。
⼀⽅、 DG

調製直後に測定し、保存しない場合が多いと考えられることから基本的には「不要」とした。
8th JBF Symposium, 2017

会場のご意⾒をお聞かせください。

148

Japan Bioanalysis Forum13. 安定性

1.評価項目(2/3)

アンケートコメント【凍結融解】•

誘導評価や阻害評価など、測定サンプル数が多い試験では測定までに時間を要するため、基本的には凍結融解・ベンチトップ・前処理後の安定性を確認する。再測定の可能性もある場合は、長期保存安定性も確認する （その他試験）【ベンチトップ】

•
•
•
•
•

【⻑期保存】•••

測定に時間を要する可能性があるため実施。
長期保存はしないため、ベンチトップの安定性のみ。前処理後の安定性は、実試料測定の前後のQCで判断できるため、実施しない。
試験日に測定するため、凍結融解・長期保存は不要。
実際のサンプルの取扱に応じて設定する。
前処理時間は短時間ではあるが、念のためベンチトップ、前処理後の安定性は実施する。（その他試験）

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蛋⽩結合試験・その他試験 共通 (1/2)

結合試験と測定日が異なる場合があるため。（蛋白結合試験）
酵素反応と測定日が異なる場合があるため。（その他試験）
基本的にサンプル発生日に測定するが、再測定の可能性を鑑み、1回凍結融解＋（長期）保存＋ベンチトップを合わせた評価として、長期保存安定性を評価する。
8th JBF Symposium, 2017149

Japan Bioanalysis Forum13. 安定性

1.評価項目(3/3)

アンケートコメント【前処理後】【実施しない】••••落雷等の機器トラブルにも対応するため。（その他試験）
凍結保存はせず、即座に前処理を行うためベンチトップも実施しない。
測定が実験の翌日になることが多いため、48時間ぐらいの凍結保存安定性、
オートサンプラー内安定性はとります。
再注入の可能性を考慮して、前処理後のみ実施する。（その他試験）•••保存しないため。
基本的には一連の操作で実験するため安定性は検討しない。
実試料時のQCを並行保存QCと見なし，その真度を以て間接的に保証する。

8th JBF Symposium, 2017

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蛋⽩結合試験・その他試験 共通 (2/2)

150Japan Bioanalysis Forum13. 安定性

2.標準原液の安定性評価

アンケート集計結果

アンケートコメント

⽤時調製し
安定性は
評価しない
DG

他の試験
（TKバリ等）の結果を使⽤Pre-Study Validation
で評価

14.3%

14.3%

【Validation内で評価】
・評価基準
5/10/15% (各n=1)【他の試験（TKバリ等）の結果を使⽤】
・左記の３つの選択肢
いずれも許容できると判断する

71.4%

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蛋⽩結合試験・その他試験

他の試験結果を使⽤する例が多いが、試験内で評価または⽤時調製との回答もあった。
8th JBF Symposium, 2017151

Japan Bioanalysis Forum

14. まとめ(1/7)

【アンケート集計結果】
有効回答数 34
国内企業が90％以上，内CROが30％，海外企業の割合が低い。
回答者の経験年数分布は広範囲で，⼤きな偏りはない。
・実施タイミング
蛋⽩結合試験、その他試験どちらもPre-Study Validationで実施する。

2. COA

申請資料に使う以上COA (ROA) は必要。
⼀⽅、DGでは被検物質と標準物質とが同⼀であり、純度の影響がキャンセルされるため、COA(ROA)は不要と考えた。

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1. 回答者背景

ご意⾒をお寄せください

3. 検量線
3-1 範囲蛋⽩結合試験 ︓ フレキシブルに設定する意⾒が3オーダーとほぼ同数であった。
その他試験 ︓ 3オーダーとした意⾒が過半数を占めた。
8th JBF Symposium, 2017152

Japan Bioanalysis Forum

14. まとめ(2/7)

3. 検量線（続き）
蛋⽩結合試験 ︓ 回答者の9割近くが6ポイント以上と回答した。
その他試験 ︓ 6ポイント以上と回答した割合が1割程度減少した。

3-3 採⽤基準
両試験とも， BMVガイドラインに従う意⾒（15/20%）が過半数（6割以上）を占めそれ以外の回答者は20/25%を選択した。

3-4 外挿両試験とも，何らかの形も含め「許容する」とした意⾒が過半数を占めた。
その⼀⽅，どんな形でも「許容しない」とする意⾒も約4割認められた。

4. 検量線・QC試料に使⽤するマトリックス

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3-2 ポイント数

4-1 緩衝液を代替マトリックスとして使⽤する場合の評価
代替マトリックスを使⽤する場合，約半数が評価試料に応じて妥当性を評価する。⼀⽅，必ず妥当性を評価するとの回答も４割程度あり，妥当性を評価すること⾃体への賛成は多かったが，その基準について意⾒は分かれた。
8th JBF Symposium, 2017153

Japan Bioanalysis Forum

14. まとめ(3/7)

4. 検量線・QC試料に使⽤するマトリックス（続き）
⾎清・超遠⼼上清・限外ろ過液・懸濁したマトリックスなど。
全てのマトリックスとの妥当性を評価する例が多い。

4-3 マトリックスマッチング
探索的試験のみならず申請資料となる試験でも実施経験あり。
過半数（60%以上）の⽅がマトリックスマッチングの経験あり。

5. QC試料の評価
5-1 LLOQの必要性

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4-2 代替使⽤に際し妥当性評価が必要なマトリックス

蛋⽩結合試験 ︓ 必要なし
その他試験 ︓ 必要
DGでは想定される定量値を考慮して，蛋⽩結合試験ではLLOQの評価は不要，その他試験では必要と考えた。
ご意⾒をお寄せください
8th JBF Symposium, 2017154

Japan Bioanalysis Forum

14. まとめ(4/7)

5. QC試料の評価（続き）
両試験とも，過半数（60%以上）が基本的にはLLOQを評価しないと回答。
しかし，実測定における検量線のLLOQで評価するとの回答も30%程度あり。

5-3 試料の繰り返し数
両試験とも，過半数(70%以上)がn = 3 で実施。

5-4 評価基準
両試験とも，半数以上がBMVガイドライン(15/20%)の基準で実施。
⼀⽅で， ４割程度はより広い許容範囲(20/25%)を⽀持し，意⾒は分かれた。

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5-2 LLOQの評価時期 (SVで評価しない場合）

6. 測定単位間再現性
両試験とも， 85%以上が測定単位間再現性は評価しないと回答。
8th JBF Symposium, 2017155

Japan Bioanalysis Forum

14. まとめ(5/7)

両試験とも，約半数がValidationでは同じストック溶液を使⽤すると回答。
Pre-study，In-study Validation共に｢同じストック溶液を使⽤する｣傾向が⾒られた⼀⽅で，In-study Validationにおいては｢別々のストック溶液を使⽤する｣との回答
も35%あり。

8. 選択性
蛋⽩結合試験 : 複数個体あるいはプールマトリックス
その他試験: プールマトリックス
評価基準はどちらもブランク試料のレスポンスが， LLOQにおける分析対象物質 20%
以下かつ 内標準物質の 5%以下。
DGではIn vitro試験では均⼀なマトリックスを使⽤する場合も多いことから「1個体またはプールマトリックス」で⼗分と考えた。

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7. 標準溶液

ご意⾒をお寄せください

9. 回収率

両試験とも，測定法の検討時に確認すると回答。（ Validationでは評価しない）
DGではBMVガイドラインで不要となっていることから確認は不要とした。
8th JBF Symposium, 2017

ご意⾒をお寄せください

156

Japan Bioanalysis Forum

14. まとめ(6/7)

両試験とも，実施タイミングならびに⽅法はそれぞれだが、実測定の実施までには確認すると回答。
評価基準はどちらもULOQの検量線⽤標準試料を測定後のブランク試料のレスポンスが， LLOQにおける分析対象物質 20%以下。
DGでは実検体測定の試験内で評価できるため， SVとしての実施は不要と考えた。
ご意⾒をお寄せください

11. マトリックス効果

両試験とも， 「評価する／しない」で意⾒が分かれた。
DGではマトリックスが異なることが明らかな⼀部の蛋⽩結合試験のみ「評価が必要」とした。
ご意⾒をお寄せください12. 希釈の妥当性

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10. キャリーオーバー

両試験とも、必要性が明らかであればPre-Study Validationで評価するとの回答が多数を占めた。
DGでは必要に応じて実検体測定の試験内で評価すればよいと考えた。
ご意⾒をお寄せください
8th JBF Symposium, 2017157

Japan Bioanalysis Forum

14. まとめ(7/7)

13. 安定性
両試験とも，前処理後とベンチトップの安定性を確認する例が多いが，全く実施しないとの回答も20%以上あった。
DGでは調製直後に測定し、保存しない場合が多いと考えられることから基本的には「不要」とした。
ご意⾒をお寄せください

13-2 標準原液の安定性評価
両試験とも，安定性が確認された溶液を使⽤する、または⽤時調製とする。
ご意⾒をお寄せください

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13-1 評価項⽬

アンケートでの回答多数のご意⾒とDGの推奨が異なる項⽬もあります。
是⾮、会場からもご意⾒をお寄せください。
158

Japan Bioanalysis Forum

14. Summary(1/7)

34 effective responses≥90% are Japanese companies, of which 30% are CROs.
A few responses are from foreign companies
Years of experiences vary with balanced distribution.

・When do you conduct assays?
Both Protein Binding Assay (“PBA”) and other assays are conducted as part of prestudy validation.

2. COA

Many respondents: COA (ROA) is necessary as part of application documents.
DG : COA (ROA) is NOT necessary.
A test article and a reference standard have the same lot#;
effect of their purity does not need to be considered.

3. Calibration curve

http://bioanalysisforum.jp/<Summary of questionnaire>
1. Backgrounds of respondents

Give us your inputs.

3-1 Range

PBA: the number of respondents who set the range flexibly is almost the same as thenumber of those who set 3 orders.
Other assays: Majority choose 3 orders.
8th JBF Symposium, 2017159

Japan Bioanalysis Forum

14. Summary(2/7)

3. Calibration curve (cont.)
PBA: Nearly 90% choose ≥6 points.
Other assays: the number of respondents who choose ≥6 points is about 10% lessthan the above numbers.

3-3 Acceptance criteria
Majority (≥60%) follow BMV guideline (15/20%) in both assays.
The other respondents choose 20/25%.

3-4 Do you use extrapolation?
Majority: applicable under certain conditions in both assays.
About 40%: NOT applicable under any condition.

4. Matrix for calibrators and QCs

http://bioanalysisforum.jp/

3-2 How many points?

4-1 Assay diluent used as surrogate matrix
About 50% evaluate equivalency between surrogate and authentic matrices on asample-by-sample basis. Nearly 40% always investigate equivalency. Most are in favorof the evaluation. Opinions on the criteria are divided.
8th JBF Symposium, 2017160

Japan Bioanalysis Forum

14. Summary(3/7)

4. Matrix for calibrators and QCs (cont.)
Serum, ultracentrifuged supernatant, ultrafiltrate, suspension matrix, etc.
Many evaluate equivalency every time matrix is different.

4-3 Matrix matching
Respondents have used matrix matching not only in exploratory study but in studies
for applications .
Majority (≥60%) have used matrix matching.

5.

Evaluation of QCs

5-1 Is LLOQ necessary?

http://bioanalysisforum.jp/

4-2 What surrogate matrix needs to be proved equivalent?

PBA: NOT necessary
Other assays: necessary
DG: Considering expected concentrations, LLOQ is necessary not for PBA but for otherassaysGive us your inputs.
8th JBF Symposium, 2017161

Japan Bioanalysis Forum

14. Summary(4/7)

5. Evaluation of QCs (cont.)
Majority (≥60%) do not evaluate LLOQ in either assay, in principle. About 30% evaluate
LLOQ calibrator in study sample analysis.

5-3 Number of replicates
Majority (≥70%) conduct both assays in triplicate.

5-4 Acceptance criteria≥50% use criteria of BMV Guidelines (15/20%) in both assays.
About 40% prefer less stringent criteria (20/25%).
Opinions are divided.

6.

http://bioanalysisforum.jp/

5-2 When do you evaluate LLOQ? (When SV is NOT used）

Inter-assay reproducibility≥85% do not evaluate inter-assay reproducibility in either assay.

8th JBF Symposium, 2017162

Japan Bioanalysis Forum

14. Summary(5/7)

7. Standard working solutions

8. Selectivity
PBA: multiple individual lots of matrix or pooled matrix
Other assays: pooled matrix
Criteria: response of blank is ≤20% of LLOQ for analyte and ≤5% for IS.
DG : As homogeneous matrix is often used for in vitro study, one individual lot or pooled
matrix works enough.
Give us your inputs.

9. Recovery

http://bioanalysisforum.jp/

About 50% use the same stock solution in validation of both assays.
Many tend to use the same stock solution both in pre-study validation and in in-study
validation. 35% use separate stock solutions in in-study Validation.

Majority evaluate recovery during preliminaries in both assays (not assessed in validation)
DG: NOT necessary because BMV guideline does not require assessment.

Give us your inputs.

8th JBF Symposium, 2017163

Japan Bioanalysis Forum

14. Summary(6/7)

When and how do you evaluate carryover?
Timing are different for both assays. Assessment is completed no later than study
sample analysis.
Criteria
Response of blank following ULOQ calibrator is ≤20% of LLOQ for analyte in bothassays.
DG : carryover does not need to be assessed in SV as it can be evaluated during study
Give us your inputs.
sample analysis.

11. Matrix effects
Opinions are divided over whether to assess matrix effects or not for both assays.
DG : evaluation is necessary only for some of PBAs when matrix is different.

Give us your inputs.

12. Dilution integrity

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10. Carryover

Majority evaluate dilution integrity in pre-study validation if assessment is obviously
necessary.
DG : evaluation should be done in study sample analysis, as necessary.

Give us your inputs.
8th JBF Symposium, 2017164

Japan Bioanalysis Forum

14. Summary(7/7)

13. Stability
Many investigate processed sample and bench top stability, but ≥20% do notevaluate any stability in either assay.
DG: stability testing is NOT necessary in principle as samples are analyzed
immediately after being prepared in many cases.

Give us your inputs.

13-2 Standard stock solution stability
Many use solutions whose stability is verified or freshly prepared solutions.

Give us your inputs.

http://bioanalysisforum.jp/

13-1 What do you test?

Not all DGʼs recommendations
match responses to questionnaire.
Please give us your inputs.
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