コレラ菌のバイオフィルム形成と生きているが培養できない（VNC）状態への移行
Biofilm Formation and VNC (viable but nonculturable) State of Vibrio cholerae
水 之 江義充

Yoshimitsu Mizunoe
東京慈恵会医科大学細菌学講座
要

旨

細菌は飢餓や低温等のストレス下で生存するために種々の適応戦略を有している．代表的なものはグラム陽性菌では芽胞の形成である．一方，グラム陰性菌ではバイオフィルムの形成や生きているが培養できない（VNC：viable but noncalturable）状態への移行などが考えられる．コレラ菌は飢餓等のストレスが加わると，通常見られる平滑な（スムース）コロニーからしわのよった（ルゴース）コロニーに変化することを見出した．ルゴースコロニーはバイオフィルムを形成し，酸化ストレスや高浸透圧のストレスに抵抗を示した．また，コレラ菌を低温や低栄養の培地中で長期間培養すると，培養能が徐々に低下し寒天培地上でほとんどコロニーを形成しなくなった．つまり VNC 状態へ移行した．VNC 状態の菌をカタラーゼ等の抗酸化剤を含む培地に播種することにより蘇生（コロニー形成）に成功した．コロニー形態の相変異や VNC への移行はコレラ菌のストレスに適応するための重要な戦略と考えられる．

キーワード：コレラ菌，バイオフィルム，相変異，ルゴースコロニー，生きているが培養できない状態（VNC）

1.

生きているが培養できない（viable but nonculturable：VNC）
はじめに状態もまた，きびしい環境下での細菌による適応戦略と考え

自然環境中では，細菌は，種々のストレスに曝されている．

られている 3）．VNC 状態の細菌は通常の培養法では増殖しな細菌がある環境から他の環境へ移った場合，温度，栄養状態，い．しかし，細胞は代謝・呼吸活性を有し，膜のインテグリ塩濃度，pH などの変化に直面する．多くの病原細菌や常在ティも保たれ，特殊な mRNA の転写が行われている 4,5）．

菌は環境と宿主の間を移行し，宿主の免疫ばかりでなく，栄養状態の突然の変化に適応しなければならない．細菌は環境

本稿では，コレラ菌のストレス下での生存戦略をバイオフィルム形成と VNC 状態への移行に焦点を絞り述べる．の変化のもとで生存するために，多くの適応メカニズムを進化させてきた．芽胞の形成もその一つであるが，芽胞を形成

2. バイオフィルムしない細菌は，エネルギーや栄養の欠乏した（飢餓）状態で細菌はそのライフサイクルにおいて浮遊細胞としてよりも生存するために，種々の適応プログラムを有している．その何かの表面に固着した共同体（バイオフィルム）として存在一つが相変異である．相変異は，ある遺伝子のスイッチが周している期間が長いと考えられる．バイオフィルム形成は微期的に ON あるいは OFF になることでおこる．鞭毛，線毛，生物の分化に結びつけられ，広い意味では多細胞生物の分化外膜タンパク，菌体外多糖（EPS：exopolysaccharide）などシステムに関連づけられる．発生はいわゆる高等生物に限らが相変異を起こすことが知られている．我々は，コレラ菌がれてはいないともいえる．細菌の発生過程の例としては単個飢餓などの環境ストレスに反応し，通常の透明なスムーズコ細胞の分化（Caulobacter crescentus の遊走細菌から有茎細菌ロニーからルゴース（皺のよった）コロニーに変異することへの移行）と枯草菌の芽胞形成などが含まれる．コレラ菌等を見いだした 1,2）．ルゴース株はスムーズ株に比べ，大量ののグラム陰性菌のバイオフィルムの形成過程は 4 つの段階にEPS を産生し，浸透圧の変化や酸化ストレスに抵抗性を示し，分けられる．1）鞭毛による遊走と表面への軽度の付着，2）バイオフィルム形成を促進する．バイオフィルムは，細菌が線毛によるより強固な定着，3）増殖・マイクロコロニーの存在するあらゆる環境表面（自然，工場，生態系，感染症）（図 1）．形形成，4）成熟（EPS の産生と高次構造の構築）で形成される．バイオフィルムは生態学の立場から見ると細成過程の根幹は多くの微生物に共通であると思われるが，正菌の生存に有利な環境といえる．

確な分子メカニズムは菌により異なる．コレラ菌のバイオフィルム形成は，コロニー形態の相変異に密接に関連してお〒 105–8461 東京都港区西新橋 3–25–8
2012 年 11 月 21 日受付

講座

り，大腸菌等のバイオフィルム形成とはやや異なった様相を呈している．

コレラ菌のバイオフィルム形成と生きているが培養できない（VNC）状態への移行

47【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

図3
図 1 グラム陰性菌のバイオフィルム形成過程
EPS：exopolysaccharide（菌体外多糖）細菌は鞭毛で個体表面に遊走し，付着する．線毛を発現し強固に付着し，増殖する．EPS を分泌し，マッシュルーム様の成熟したバイオフィルムを形成する．

コレラ菌のルゴース株によるバイオフィルム形成
A：ルゴース株
B：スムース株⇨：バイオフィルム

図 4 コレラ菌のバイオフィルム（走査電子顕微鏡像）
コレラ菌とバイオフィルムマトリックスが観察される．菌と菌は細いチューブ（ナノチューブ）で連結されている．
：1 μm

―

O1 型コレラ菌のコロニーの相変異⇨：ルゴースコロニー
：スムースコロニー：2 mm形成の関連性を検討した．O1 および O139 ルゴース株は試―

験管の壁と培地表面に膜状のバイオフィルムを形成した．一方，スムーズ株はバイオフィルムを形成しなかった（図 3）．
走査電子顕微鏡の観察では，菌がバイオフィルムマトリック

2.1

スに埋め込まれた像が見られた（図 4）．菌と菌は細いフィコレラ菌の相変異

これまで血清型が O1 のコレラ菌のみがコレラの流行を起ラメント状の線維（ナノチューブ）で連結している．最近のこしてきたが，1992 年，血清型が O1 とは異なる O139 コレ

研究では，ナノチューブを介して同菌種間および異菌種間でラ菌による流行が起こった 6）．O1 コレラ菌と O139 コレラ菌

様々な物質（DNA，RNA，タンパク）を交換していることを低温・低栄養状態に曝すとスムーズコロニーからルゴースが示された 7）．興味深いことに，バイオフィルム内の一部のコロニーに相変異することを見いだした（図 2）．他のスト菌はねじれた長いフィラメント状や球菌状の形態を呈していレス（高浸透圧，高濃度の抗生物質，酸や凍結）も，コレラる（図 5）．通常私たちが知っているコレラ菌は少しねじれ菌の相変異を誘導した．

たコンマ型の単桿菌であるが，これは栄養豊富な液体培地中

2.2

コレラ菌のルゴース株による EPS 産生とバイオフィで培養された結果であり，むしろ人工的な形態かもしれない．
培養 2 日後および 4 日後のバイオフィルム内の菌と浮遊細菌

ルム形成1,2）．の超薄切片を観察すると，バイオフィルム内の菌は正常な内EPS は種々の細菌種においてバイオフィルムの形成に関与部構造を維持しているが，浮遊細菌の大多数はインテグリ

ルゴース株は多量の EPS を産生することが判明したしていることが報告されている（大腸菌のコラン酸や緑膿菌ティを失い死んでいるように見える（図 6）．バイオフィルのアルギン酸など）．コレラ菌の EPS 産生とバイオフィルム

ム内の菌は飢餓などのストレスに対し抵抗性を示すと考えら

48

顕微鏡 Vol. 48, No. 1（2013）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

3.

VNC（viable but nonculturable）状態

コッホ以来 100 年以上に亘って培養可能であるということが細菌が生きていることの定義であった．しかし近年生きているが培養できない（VNC）状態の細菌の存在が報告されるようになった．VNC とは，通常の培養条件では増殖が認められないものの，菌体が何らかの生物活性を維持している状態を示す．コレラや腸管出血性大腸菌の感染は，汚染された食品や，井戸水等の飲料水を介して起こることが知られているが，感染源の特定は容易ではない．検体中，特に水中では，低温・低栄養状態に曝され原因菌が培養不能（VNC）状態になっている可能性が考えられる．
図 5 バイオフィルム内のコレラ菌の形態（走査電子顕微鏡像）フィラメント状（）や球菌状（）の形態をしたコレラ菌が観察される．
：1 μm―

VNC 状態の菌は温度の上昇や動物通過により蘇生され感染を起こす可能性があることが示されているので，公衆衛生上大きな関心事になっている 9）．しかしながら，VNC 状態が飢餓へのプログラムされた適応反応であるという概念は論争の的となっており，菌体細胞の変質のため培養不能となり，結果として瀕死の状態になっているという説もある 10）．コレ
ラ菌や腸炎ビブリオは環境からの分離頻度は夏期より冬期の方がずっと低くなるが，Colwell らは，低温の水系環境で細菌は培養されないが存在していることを示した 3）．この培養能の低下が VNC 状態へ移行しているためであると考えら
れ 11,12），現在まで少なくとも 30 種の細菌の VNC への移行が報告されている 12）．VNC は芽胞を形成しない細菌のストレス環境中での生存反応とも考えられる 11）．低栄養と低温がVNC への誘導の主な原因ということが示されている 11,13）．腸炎ビブリオ，コレラ菌は低温で VNC へ誘導され，菌液の温度を上げて 10 数時間培養（temperature upshift）した後寒天

図 6 バイオフィルム内のコレラ菌と浮遊コレラ菌の超薄層切片電子顕微鏡像：1 μm―

培地に播種するとコロニーが形成され，培養能が回復し蘇生されることが示された 12 ～ 14）．しかしながら，この蘇生が真の蘇生か，検出を免れて生存していた少数の培養可能細菌の増殖によるものかは判定が困難である 12,13）．かように液体培
地中で行われる蘇生法は常に多くの論争を巻き起こしてきれる．また，バイオフィルム内のフィラメント状の菌は捕食た．temperature upshift とは違った方法を用いた VNC 細菌細胞からの貪食に抵抗しているのではないかと考えられる．の蘇生の試みについて述べる．

8）

コレラ菌の VNC

これは尿路病原性大腸菌の研究でも示されている ．バイオ3.1

フィルム形成とそれに関連した形態学的変化（フィラメントコレラ菌は大量の下痢を起こす病原細菌であり，その感染状変化等）は，宿主および環境中での細菌の生存に有利であ源は川や池，井戸等のような自然環境の表層水である．しかると思われる．

しながら，流行地では自然環境からコレラ菌を検出すること

O139 コレラ菌は O1 コレラ菌以外で初めてコレラの流行は必ずしも容易ではない．Colwell らは，コレラ菌は VNC へを起こした菌である．O1 コレラ菌に既に感染したヒトは，移行することを示唆した 3）．Wai らはコレラ菌を低温低栄養

O139 の感染に交差防御（免疫）を示さなかった．それはで数十日間培養することにより VNC 状態へ誘導した後，非2 つのコレラ菌のリポ多糖抗原が違うからである．一方，ル

常に短い熱ショック処理をし寒天培地に播種すると VNC 細ゴース型 O1 コレラ菌の産生する EPS に対する抗体はルゴー

菌の真の蘇生が観察されたと報告した 15）．Kell らは蘇生に関2）

ス型 O139 コレラ菌の EPS と交差反応を示した ．O1 コレする 31 の報告をレビューした結果 3 つの報告が真の蘇生でラ菌と O139 コレラ菌の EPS の分子生物学的研究は，このあり，コレラ菌の熱ショックによる蘇生はその内の 1 つと結2 つの菌に共通したワクチンの開発に繋がる可能性がある．

論づけた 16）．熱ショックにより，VNC 状態の菌が培養能を回復するメカニズムは明らかでない．細菌が，高温などのストレスに曝されると，一過性にある一群のタンパクの発現が講座

コレラ菌のバイオフィルム形成と生きているが培養できない（VNC）状態への移行

49【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】

ムされた生存型であり，適切な環境に出会うと再び増殖する可能性がある．今後，バイオフィルム形成や VNC 状態に関わる分子生物学的解析が医療や公衆衛生の観点からも必要だと考えられる．
文

図 7 VNC 細菌の寒天培地上での蘇生
人工海水中で数十日間培養し VNC 状態に誘導されたコレラ菌を普通寒天培地上に 100 μl 播種し，37°C で 24 時間培養した．
（A）
普通寒天培地．
（B）カタラーゼ添加普通寒天培地．
（C）ピルビン酸添加普通寒天培地．

誘導されることが知られているが，誘導されたタンパクがコレラ菌の VNC からの蘇生に関与している可能性がある．これまでなされてきたほとんどの研究は真の蘇生とわずかばかり残っていた増殖可能な菌の再増殖（regrowth）との鑑別が困難である．そこで我々は今まで行われてきた温度の上昇やある特別な培養液を用いた方法ではなく，直接寒天培地上に播種し蘇生させる方法を考案した．著者等は，VNC 状態の腸管出血性大腸菌や腸炎ビブリオなどをカタラーゼやピルビン酸などの過酸化水素を分解するような化合物を添加した寒天培地に播種することにより，培養能を回復することに成功した 17,18）．VNC 状態のコレラ菌についても同様の蘇生結果を得た（図 7）．飢餓状態におかれた培養不能菌は，酸化ストレスに感受性となっており，突然栄養豊富な培地に移されると，代謝により発生した活性酸素を処理できず，菌の増殖が認められない．すなわち，過酸化水素感受性であることがVNC 細菌の生理学的状態の一端であると考えられる．
4. 結語

ストレスに対する細菌の適応は広範な細胞の生理学的変化を伴っている．バイオフィルムの形成は様々な環境中での生存の重要な要素である．我々はコレラ菌がルゴースコロニーに相変異し多量の菌体外多糖を分泌しバイオフィルム形成を促進することを示した．また，ルゴース株は浸透圧や酸化ストレスに抵抗を示した．VNC 状態もまた，悪条件下での生存戦略と考えられている 19）．VNC 状態は遺伝的にプログラ

50献1）Wai, S.N., Mizunoe, Y., Takade, A., Kawabata, S. and Yoshida, S.:
Appl. Environ. Microbiol., 64, 3648–3655 (1998)
2）Mizunoe, Y., Wai, S.N., Takade, A. and Yoshida, S.I.: Infect. Immun.,
67, 958–963 (1999)
3）Colwell, R.R. and Huq, A.: in Kaye, T. (Ed.), Vibrio cholerae andCholera, ASM Press, Washington D.C., 117–133 (1994)
4）Rahman, I., Shahamat, M., Kirchman, P.A., Russek-Cohen, E. andColwell, R.R.: Appl. Environ. Microbiol., 60, 3573–3578 (1994)
5）Lleò, M.M., Pierobon, S., Tafi, M.C., Signoretto, C. and Canepari, P.:Appl. Environ. Microbiol., 66, 4564–4567 (2000)
6）Waldor, M.K. and Mekalanos, J.J.: J. Infect. Dis., 170(2), 278–283(1994)
7）Dubey, G.P. and Ben-Yehuda, S.: Cell., 144, 590–600 (2011)8）Anderson, G.G., Palermo, J.J., Schilling, J.D., Roth, R., Heuser, J.
and Hultgren, S.J.: Science., 301, 105–107 (2003)
9）Colwell, R.R.: in Colwell, R.R. and Grimes, D.J. (Eds.), ASM Press,
Nonculturable Microorganisms in the Environment, Washington
D.C., 325 (2000)
10）Desnues, B., Cuny, C., Grégori, G., Dukan, S., Aguilaniu, H. andNyström, T.: EMBO. Rep., 4, 400–404 (2003)
11）Oliver, J.D.: in Kjelleberg, S. (Ed.), Starvation in a Bacteria, Plenum
Press, New York, 239–272 (1993)
12）Oliver, J.D.: FEMS. Microbiol. Lett., 133, 203–208 (1995)
13）Ravel, J., Knight, I.T., Monahan, C.E., Hill, R.T. and Colwell, R.R.:
Microbiology., 141, 377–383 (1995)
14）Brayton, P.R., Tamplin, M.L., Huq, A. and Colwell R.R.: Appl. Environ. Microbiol., 53, 2862–2865 (1987)15）Wai, S.N., Moriya, T., Kondo, K., Misumi, H. and Amako, K.:
FEMS. Microbiol. Lett., 136, 187–191 (1996)16）Kell, D.B., Kaprelyants, A.S., Weichart, D.H., Harwood, C.R. andBarer, M.R.: Antonie. Van. Leeuwenhoek., 73, 169–187 (1998)17）Mizunoe, Y., Wai, S.N., Ishikawa, T., Takade, A. and Yoshida, S.:FEMS. Microbiol. Lett., 186, 115–120 (2000)
18）Mizunoe, Y., Wai, S.N., Takade, A. and Yoshida, S.: Arch. Microbiol.,
172, 63–67 (1999)
19）Hall-Stoodley, L., Costerton, J.W. and Stoodley, P.: Nat. Rev. Microbiol., 2, 95–108 (2004)

顕微鏡 Vol. 48, No. 1（2013）【著作権者：社団法人 日本顕微鏡学会】