DG2023-59:
中和抗体分析（Cell-based assay）

DG2023-59:
Neutralizing Antibody Assay (Cell-based assay)

15th JBF Symposium, DG2023-59

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Japan Bioanalysis Forum1

Japan Bioanalysis Forum

Name

Company

小田 祐輝
Yuki Oda

小野薬品工業株式会社
Ono Pharmaceutical Co., Ltd.

小宮 薫
Kaoru Komiya

シミックファーマサイエンス株式会社
CMIC Pharma Science Co., Ltd.

摺木 志保
Shiho Suruki

協和キリン株式会社
Kyowa Kirin Co., Ltd.

𡈽田 諄
Jun Tsuchida

メディフォード株式会社
Mediford Corporation

山中 洋幸
Hiroyuki Yamanaka

科研製薬株式会社
Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.

清水 浩之（オブザーバー）
Hiroyuki Shimizu

田辺三菱製薬株式会社
Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation

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DG menbers

15th JBF Symposium, DG2023-59

2

Japan Bioanalysis Forum

活動の内容
2023
7

8

9

TC

F2F

TC

10

11

12

2024
1

TC

TC

TC

TC

2

7/4

8/3

9/12

10/13

11/14

12/7

1/9

ポスター作成

8/23
推進委員会

10/18
推進委員会

12/20
推進委員会

・1回のF2F meetingと合計6回のTeamsを用いた電話会議
・合計3回のDG推進委員との定期進捗報告会
・活動期間中はeメールでのコミュニケーションをベースとした

15th JBF Symposium, DG2023-59

2/5-7

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JBFシンポ3

Japan Bioanalysis Forum

免責事項
http://bioanalysisforum.jp/❑ 本発表における資料等に対する調査、集計等はDGメンバーが行ったものである。正しくは元の資料等を参照されたい。

15th JBF Symposium, DG2023-59

4

Japan Bioanalysis Forum

背景及び目的➢ バイオ医薬品の臨床試験で薬効を評価する際、抗薬物抗体で陽性と判定された試料については中和抗体分析を実施することが多い。
➢ DG2020-49「中和抗体分析－アッセイフォーマット選択とアッセイパフォーマンス向上のための議論－」では、2015 年から 2020 年に国内で承認されたバイオ医薬品の申請資料を調査した。
➢ 酵素や血液凝固線溶系因子は酵素活性測定、抗体はCell-based assay（CBA）と Ligand
binging assay がアッセイフォーマットとして用いられていた。

中和抗体分析のアッセイパフォーマンス➢ CBA は感度や頑健性に課題があり、中和抗体分析法開発の難易度が高い。

DG2023-59の目的

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中和抗体分析のアッセイフォーマット

➢ 2020 年から 2023 年までに国内で承認されたバイオ医薬品の申請資料を調査し、前回の結果と比較した。
➢ 調査で得られた CBA に関する情報を基に分析面、規制面での課題点及び疑問点について議論した。
➢ 本発表では、DG の議論内容の概要を紹介し、CBA に取り組む方々の一助としたい。
15th JBF Symposium, DG2023-59

5

Japan Bioanalysis Forum

Background and Purpose➢ When evaluating the efficacy in clinical studies of biopharmaceuticals, samples that are
confirmed positive for anti-drug antibodies are often subjected to neutralizing antibody
analysis.
➢ DG2020-49 “Neutralizing antibody analysis: Discussion to select assay format and improveassay performance” investigated CTD of biopharmaceuticals approved in Japan between 2015
and 2020.
➢ The assay formats used were enzyme activity measurement for enzymes and blood
coagulation/fibrinolytic factors, and cell-based assay (CBA) and ligand binding assay for
antibodies.

Assay Performance of Neutralizing Antibody Assay➢ CBA has issues of sensitivity and robustness, and the development of neutralizing antibody
assay is difficult.

Purpose of DG2023-59

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Assay Format of Neutralizing Antibody Assay➢ CTD of biopharmaceuticals approved in Japan between 2020 and 2023 were reviewed andcompared with previous results.
➢ Issues and questions from analytical and regulatory aspects were discussed based on theinformation on CBA obtained from the survey.
➢ In this presentation, we will introduce the outline of the contents of discussions in the DG tohelp those working on CBA.

15th JBF Symposium, DG2023-59

6

Japan Bioanalysis Forum❑ 中和抗体とは❑ 申請資料調査❑ 事例紹介❑ ソムアトロゴン❑ ベストロニダーゼ アルファ❑ ジヌツキシマブ❑ CBAに関する分析面、規制面での課題点及び疑問点について
の議論
❑ まとめ

15th JBF Symposium, DG2023-59

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本発表の流れ7

中和抗体とは15th JBF Symposium, DG2023-59

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Japan Bioanalysis Forum

8

Japan Bioanalysis Forum

バイオ医薬品におけるADA
バイオ医薬品と免疫原性⚫ 一般的に、抗原が抗体の産生や細胞性免疫を誘導する性質を免疫原性と呼ぶ。
⚫ バイオ医薬品は抗原として作用し、抗薬物抗体（ADA）の産生が誘導される場合がある。
⚫ 免疫原性がバイオ医薬品の有効性・安全性に影響を及ぼす可能性があるが、問題とならない場合がほとんどである。
⚫ 稀に有効性が低下した事例や有害な反応を引き起こした事例が報告されている。
• インターフェロンβの活性中和抗体が誘導され、高抗体価の患者で治療効果が低下した。
• 1998年以降、欧州において、エポエチンアルファの中和抗体の誘導により、患者自身の内在性エリスロポエチンも中和されて作用しなくなり、赤血球減
少による再生不良性貧血が増加した（不純物のアジュバント効果）。
15th JBF Symposium, DG2023-59

出典：第11回JBFシンポジウム DG2019-43資料

http://bioanalysisforum.jp/

http://www.nihs.go.jp/dbcb/immunogenicity.html

9Japan Bioanalysis Forum

免疫原性評価フロー
価Negative

終了①Screening
assay

Potential positive②Confirmatry
assay
特異性
なし

①でpositiveと判定された検体に薬物を添加し、薬物に対して特異性を持つ抗体の有無を確認

positive③Titer assay②で特異性が確認された検体について、検体を段階希釈して分析し、抗体価を算出④中和活性評価産生された抗体が薬理活性を中和（減弱）させるか評価⑤Isotyping

産生された抗体のアイソタイプ（IgG1～4、
IgM、IgE等）を決定

15th JBF Symposium, DG2023-59

出典：第11回JBFシンポジウム DG2019-43資料

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評

全ての検体を分析し、ADAの存在の有無を確認

10

Japan Bioanalysis Forum• AAPS Working Group on NAbsから、中和抗体分析のアッセイフォーマット
選択のストラテジーが提言された。
（White Paper）• EBFシンポジウムで発表された。

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Strategy for Selecting NAb Assay Format

https://e-b-f.eu/wp-content/uploads/2018/06/fw201609-12Jim-McNally.pdf

NAb: Neutralizing antibody

15th JBF Symposium, DG2023-59

出典：第12回JBFシンポジウム DG2020-49資料

11

Japan Bioanalysis Forum

Revisiting the rationale and providing a MoA based
approach to select a format• 免疫反応の発現とその影響• ADA産生率の高さ• 豊富でない内因性因子への影響• in vivoで影響のあるNAb濃度• バイオロジーの反映• 標的への薬理作用の組み込み• 薬物-標的相互作用の機序• 目的の効果のためのバイオ医
薬品のデザイン上の特性

薬物のMoA、アッセイパフォーマンス、免疫原性のリスクの3つのファクターを考慮して、アッセイフォーマットを選択 。これらのうち、MoAが第一のファクターと提言。
15th JBF Symposium, DG2023-59

http://bioanalysisforum.jp/

 Scientific basis for NAb assay formats selection• 感度、マトリックス干渉（特異性、選択性）• 薬物耐性（Ctroughでの感度）• 可溶性標的を含む他血清成分に対する細胞の反応性• 経時的な再現性• 受容体発現細胞株の妥当性
出典：第12回JBFシンポジウム DG2020-49資料

12

Japan Bioanalysis Forum

Revisiting the rationale and providing a MoA based
approach to select a format
 Primary Determinant - MoA

申請資料調査におけるMoAによるNAb測定法の分類

http://bioanalysisforum.jp/

アゴニスト
アンタゴニスト（液性因子）
アンタゴニスト（細胞受容体）

アンタゴニスト（リガンド）

細胞傷害活性（ADC）

細胞傷害活性補充療法（酵素）

薬物のMoA、モダリティ、標的、標的との相互作用からアッセイフォーマットを推奨。
15th JBF Symposium, DG2023-59

出典：第12回JBFシンポジウム DG2020-49資料

13

Japan Bioanalysis Forum

Cell-based assay構築例
http://bioanalysisforum.jp/

IC80濃度の目標値およびEC80濃度を用いて実験ウインドウを定義した方法＜図の状況＞
Target：サイトカイン
Drug：サイトカインに対する抗体

細胞はサイトカインの受容体を発現していて、リン酸化STAT結合配列をプロモーター領域に組み込んだルシフェラーゼ遺伝子が導入されている。
まず、細胞にサイトカインを曝露するとシグナル経路が活性化され発光量が上がっていく。

15th JBF Symposium, DG2023-59

出典：第12回JBFシンポジウム DG2020-49資料

14

Japan Bioanalysis Forum

Cell-based assay構築例
IC80濃度の目標値およびEC80濃度を用いて実験ウインドウを定義した方法

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Cell-based assayのアッセイパラメーターのシフト

サイトカインとそれに対する抗体の濃度をそれぞれEC80とIC80にTarget EC80の濃度を採用すると、サンプルからのサイトカインの固定しADAの濃度を上げていくと、シグナル経路が活性化され、混入による影響を最小限にできる。次に、サイトカインの濃度を発光量が上がっていく。
EC80に固定しサイトカインに対する抗体の濃度を上げていくと、シグナル経路が抑制され、発光量が下がっていく。
結論：サンプルに含まれるTargetやDrugの濃度によって、NAb評価を混乱させる場合があるため、最適化する必要がある。ADAの相互パートナーであるDrugやそのTargetについても深く理解する必要がある。

15th JBF Symposium, DG2023-59

出典：第12回JBFシンポジウム DG2020-49資料

15

申請資料調査

15th JBF Symposium, DG2023-59

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Japan Bioanalysis Forum

16

Japan Bioanalysis Forum

調査対象：PMDA申請資料概要
薬物 ：バイオ医薬品
期間 ：2020－2023年 に日本で承認
✓
✓
✓
✓
✓
✓
✓

承認年
モダリティ
作用機序
中和抗体の測定法
カットポイント
感度
Drug Tolerance Limit

http://bioanalysisforum.jp/

申請資料調査各項目について調査し、2015–2020年の結果と比較した。

15th JBF Symposium, DG2023-59

17

Japan Bioanalysis Forum

作用機序によるNAb測定法の分類
調査対象：PMDA申請資料概要
薬物 ：バイオ医薬品
期間 ：2020－2023年 に日本で承認

活性測定: 酵素活性測定、血液凝固因子の活性測定等
LBA: Ligand Binding assay

35品目

NAbの測定法
モダリティ

作用（MOA)

合計

活性測定

LBA

酵素

補充療法(酵素）

5

2.5

0

1.5

1

血液凝固関連系因子補充療法(酵素以外）

1

1

0

0

0

ホルモン

アゴニスト

4

0

0

4

0

ワクチン

ワクチン

1

0

0

0

1

5

0

2

2

1

8

0

4

0

4

5

0

0.5

3.5

1

0

0

0

0

0

アンタゴニスト（細胞受容体）
抗体

アンタゴニスト（液性因子）
細胞傷害活性18

補充療法(酵素以外）

CBA 記載無し

融合タンパク質

アンタゴニスト（リガンド）

2

0

2

0

0

ADC

細胞傷害活性

2

0

0

1

1

毒素

細胞傷害活性

2

0

0

2

0

35

3.5

8.5

14

9

http://bioanalysisforum.jp/

CBA: Cell-based assay

開発途中で測定法が変更になった薬物は、それぞれ0.5でカウントした。

15th JBF Symposium, DG2023-59

18

Japan Bioanalysis Forum2020－2023年

ワクチンは記載無しが1品目

15th JBF Symposium, DG2023-59

http://bioanalysisforum.jp/

作用機序によるNAb測定法の分類

19

Japan Bioanalysis Forum

作用機序によるNAb測定法の分類
活性測定 : 酵素活性測定、血液凝固因子の活性測定等
LBA : Ligand Binding assay

53品目

CBA : Cell-based assay

NAbの測定法
モダリティ

作用（MOA)

合計

活性測定

LBA

酵素

補充療法(酵素）

6

3.5

0

1.5

1

血液凝固関連系因子補充療法(酵素以外）

10

6

0

0

4

ホルモン

アゴニスト

3

0

0

2

1

ワクチン

ワクチン

1

0

0.5

0.5

0

8

0

6.5

1.5

0

16

0

11

2

3

5

0

1

3

1

1

0

0

0

1

アンタゴニスト（細胞受容体）
抗体

アンタゴニスト（液性因子）
細胞傷害活性30

補充療法(酵素以外）

CBA 記載無し

融合タンパク質

アンタゴニスト（リガンド）

1

0

1

0

0

ADC

細胞傷害活性

2

0

0

1

1

53

9.5

20

11.5

12

http://bioanalysisforum.jp/

調査対象：PMDA申請資料概要
薬物 ：バイオ医薬品
期間 ：2015－2020年 に承認

開発途中で測定法が変更になった薬物は、それぞれ0.5でカウントした。
DG2020-49資料
15th JBF Symposium, DG2023-59 出典：第12回JBFシンポジウム
20
一部改変

Japan Bioanalysis Forum2015－2020年

15th JBF Symposium, DG2023-59

http://bioanalysisforum.jp/

作用機序によるNAb測定法の分類

21

Japan Bioanalysis Forum

NAb測定法の傾向
補充療法（酵素、血液凝固関連因子）
酵素活性測定が主流。

ホルモン、ADC、毒素
CBAが主流。

NAb測定法の分類結果は2015～2020年の結果と同様の傾向であった。細胞傷害活性をMoAとするバイオ医薬品のNAb測定法
はCBAを推奨する。
15th JBF Symposium, DG2023-59

http://bioanalysisforum.jp/

抗体
LBAが主流。
細胞傷害活性をMoAとする場合はCBAが主流。

DGコメント22

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

事例紹介

15th JBF Symposium, DG2023-59

23

Japan Bioanalysis Forum

事例紹介◆ ソムアトロゴン（2022年承認）◆ ベストロニダーゼ アルファ（2021年承認）◆ ジヌツキシマブ（2021年承認）

15th JBF Symposium, DG2023-59

http://bioanalysisforum.jp/

今回の申請資料調査でCBAに関する情報が多く得られた以下の3品目についてまとめた。

24

Japan Bioanalysis Forum◆ ソムアトロゴン（エヌジェンラ皮下注）• 遺伝子組換え融合糖タンパク質［ヒト成長ホルモン（hGH）、ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットのC末端ペプチド（CTP）］• 骨端線閉鎖を伴わない成長ホルモン分泌不全性低身長症に対する治療薬• 成長ホルモン受容体に結合後、STAT5bシグナル伝達経路の活性化及び血中IGF-I濃度の上昇を引き起こし、その結果、小児成長ホルモン分泌不全性低身長症患者の成長速度を高める。

http://bioanalysisforum.jp/

事例紹介-ソムアトロゴン

15th JBF Symposium, DG2023-59

25

Japan Bioanalysis Forum

事例紹介-ソムアトロゴン

原理及び性能を調査

http://bioanalysisforum.jp/• 免疫原性評価フロー：下図

ソムアトロゴンCTDより、MOD-4023＝ソムアトロゴン

15th JBF Symposium, DG2023-59

26

Japan Bioanalysis Forum

事例紹介-ソムアトロゴン• 抗ソムアトロゴン中和抗体分析法の原理✓ 中和抗体あり

ソムアトロゴン

中和抗体
ソムアトロゴン

hGHR

hGHR
成長ホルモン（hGH）

BaFB2B2

BaFB2B2

hGHR発現
BAF-3細胞

hGHR発現
BAF-3細胞

細胞増殖

細胞増殖

吸光度↑↑

吸光度↓↓

15th JBF Symposium, DG2023-59

成長ホルモン受容体（hGHR）

http://bioanalysisforum.jp/✓ 中和抗体なし

27

Japan Bioanalysis Forum

事例紹介-ソムアトロゴン• 抗成長ホルモン（hGH）中和抗体分析法の原理✓ 中和抗体あり
中和抗体

hGH
hGHR

ソムアトロゴン

hGHR
成長ホルモン（hGH）

BaFB2B2

BaFB2B2

hGHR発現
BAF-3細胞

hGHR発現
BAF-3細胞

細胞増殖

細胞増殖

吸光度↑↑

吸光度↓↓

成長ホルモン受容体（hGHR）

http://bioanalysisforum.jp/✓ 中和抗体なし

ソムアトロゴンは内因性タンパ
ク質の配列を含む。
→内因性タンパク質の作用を中和するか評価する。

15th JBF Symposium, DG2023-59

28

Japan Bioanalysis Forum

事例紹介-ソムアトロゴン

抗ソムアトロゴン中和抗体分析法のバリデーション試験結果まとめ-1（4試験実施）AR2862

Cut point
対象集団, Cutpoint, Cutpointの水準

AR4268【Original】Normal, 【Original】GHD,
1.222OD, Mean- 0.787OD, 5%FPR
2SD※各試験のオリジナルバリデーションと追加バ
リデーションの時系列は明記されていないため、初期・中期・後期の区分は推察

Sensitivity 【Ammendment1】 19.5 µg/mL【Addendum1】
集団不明、0.694NS
predose CP-4-006,
0.538NS 1%FPR【Addendum1】
8.18 µg/mL

AR5265

C0317007

初期？：NCのODで補正な【Original】Normal,
し。約5% FPR
0.826OD, 5%FPR【Addendum1】Normal, 中期？：NCのODで補正なし。1% FPR
1.204OD, 1%FPR【Addendum3】CP-4【Original】GHD
004 in-study,
pediatric, 0.724
0.263NS, 1%FPR【Addendum4】CP-4後期？：NCのODで補正
005 in-study,あり。1% FPR
0.287NS, 1%FPR-

感度は10 μg/mL付近
審査報告書に006試験陽性率の記載あり。

15th JBF Symposium, DG2023-59

http://bioanalysisforum.jp/•

FPR: false positive ratio
GHD: 成長ホルモン分泌不全性低身長症
NC: Negative control
NS: Normalized signal【Original】
13.6 µg/mL(rabbit pAb),
11.5 µg/mL(goat pAb)
審査報告書に009試験陽性率の記載あり。

29

Japan Bioanalysis Forum

事例紹介-ソムアトロゴン

抗ソムアトロゴン中和抗体分析法のバリデーション試験結果まとめ-2（4試験実施）AR2862

AR4268AR5265

C0317007

Precision【Original】【Original】【Addendum1】【Original】【Addendum1】【Original】

Drug
tolerance--【Addendum1】【Addendum2】【Original】

Selectivity, 【Original】GH【Original】 normal
matrixdeficient serum serum
effect【Addendum1】集団
不明, Hemolysis,
lipemia, Icterus【Addendum1】【Original】Patient,normal and GHD
hemolysis,
pediatric, Hemolysis, lipemia
Lipemia

Dilutional
linearity-【Addendum1】-【Original】No
prozoneStability【Original】24h
RT, 5F&T-【Addendum1】72h
RT【Original】24h
ambient
temperature,
8F&T

審査報告書に009試験陽性率の記載あり。

審査報告書に006試験陽性率の記載あり。

Robustnes 【Original】s--

15th JBF Symposium, DG2023-59

http://bioanalysisforum.jp/•

GHD: 成長ホルモン分泌不全性低身長症【Original】

30

Japan Bioanalysis Forum

事例紹介-ソムアトロゴン

FPR: false positive ratio
GHD: 成長ホルモン分泌不全性低身長症
NC: Negative control
NS: Normalized signal

1. 抗hGH中和抗体分析法のバリデーション試験結果（4試験実施）
AR2919AR4266

AR5266

C0317008

Precision【Original】【Original】【Ammend1】Add3【Addendum1】【Ammend2】【Original】

Cut point【Original】
Normal, 0.810OD,
Mean-2SD【Ammend1】0.856OD, Cutpoint factor 0.275※各試験のオリジナルバリデーションと追加バリ
デーションの時系列は明記されていないため、初期・中期・後期の区分は推察

Sensitivity

Amend1, 4.90
µg/mL

【Ammend1/2】in-study CP4-004, 0.126NS, 1%FPR【Ammend1/3】in-study CP4-006, 0.395NS, 1%FPR
0.574NS, 1%FPR (control)【Ammend1】0.48-0.31µg/mL【Addendum1】【Ammend2】
normal, 1.008OD, 1%FPR【Addendum3】in-study CP4-005, 0.400NS, 1%FPR

中期？：NCのODで補正なし。1% FPR【Original】
GHD pediatric, 0.636

後期？：NCのODで補正あり。1% FPR-【Original】
0.52 µg/mL (goatpAb), 0.57 µg/mL(rabbit pAb)

感度は0.5-5 μg/mL付近。

Drug
tolerance-【Ammend1】【Addendum1】【Original】

Selectivity,
matrix effect【Original】
GH deficient serum【Ammend1】Add3,
pediatric GHD, Hemolysis,
lipemia, Icterus【Addendum1】【Ammend2】
normal, Hemolysis, Lipemia【Original】Patient,hemolysis, lipemia

Dilutional
linearity【Original】--【Original】No prozone

Stability【Original】
24h RT, 5F&T

【Ammend1】24h RT in
pediatric GHD, 5F&T

【Addendum1】【Ammendment2】72h RT【Original】24h ambient
temperature, 8F&T

Robustness【Original】【Ammend1】-【Original】

15th JBF Symposium, DG2023-59

http://bioanalysisforum.jp/

対象集団, Cutpoint, Cutpointの水準

初期？：NCのODで補正なし。約5%
FPR31

Japan Bioanalysis Forum＜審査報告書（免疫原性）まとめ＞•
ADA陽性となった被験者：18/22例（009試験）、84/109例（006試験）•
抗ソムアトロゴン中和抗体陽性となった被験者：2/18例（009試験）、
2/84例（006試験）⇒006の1例を除き一過性であり陽性率は低い。
•
抗体産生による本剤の安全性及び有効性への影響は認められなかった。
•
抗hGH中和抗体は審査報告書に記載なし。
※1時点以上で陽性となった被検者＝陽性＜考察＞•
006試験（AR4268）と009試験（C0317007）は別にバリデートされた分析法で測定している。
•
抗ソムアトロゴン中和抗体陽性率が非常に低いので、分析法による陽性率の違いは明らかではない。
15th JBF Symposium, DG2023-59

http://bioanalysisforum.jp/

事例紹介-ソムアトロゴン

32

Japan Bioanalysis Forum

事例紹介-ベストロニダーゼ アルファ•••ムコ多糖症（GUS欠損）に対する治療薬
酵素補充療法マンノース-6-リン酸 (M6P)受容体を介して細胞内に取り込まれた後、リソソーム内でGUS活性を示す。

➢ 中和抗体分析法••

http://bioanalysisforum.jp/◆ ベストロニダーゼ アルファ（メプセヴィ点滴静注液）➢ 遺伝子組み換えヒトβ-グルクロニダーゼ(GUS)

Cell-based assayを行っており、定性的な分析である。
ADAのスクリーニング分析及び確認分析の両方が陽性であった被験者試料でのみ測定。
15th JBF Symposium, DG2023-59

33

Japan Bioanalysis Forum

事例紹介-ベストロニダーゼ アルファλem446nm

中和抗体あり
UX00
3

中和

4-MUG

患者血清由来抗体

蛍光
↓↓

4-MU
UX003
ベストロニダーゼ
アルファ細胞を凍結融解
し、溶解させる。

中和抗体なし

UX00
3

4-MUG
4-MU

GUS欠損ヒト
線維芽細胞

http://bioanalysisforum.jp/

中和抗体分析法

蛍光↑↑

UX003：ベストロニターゼ アルファ15th JBF Symposium, DG2023-59

34

Japan Bioanalysis Forum

事例紹介-ベストロニダーゼ アルファ成績

Minimum required dilution

1：10

Cut point

0.892×陰性対照の平均RFU

Sensitivity

17.8 µg/mL

Selectivity

許容範囲Precision(within-run)

3.6～14.5%

Precision(between-run)

低濃度陽性対照 CV 9.6%
中濃度陽性対照 CV 12.5%
高濃度陽性対照 CV 38.6%

Short-term stability

2～8℃及び17～27℃で24時間
保存で標準対照の30%以内

Freeze and thaw stability

3～5回の凍結融解サイクルで標準対照の30%以内

Drug tolerance

1.13 µg/mL

15th JBF Symposium, DG2023-59

感度は低いが結果は陽性陰性の判定のみで、許容範囲である。

高濃度でCVが高いが陽性陰性の判定のみで、許容範囲である。

http://bioanalysisforum.jp/

バリデーションパラメータ35Japan Bioanalysis Forum

事例紹介-ベストロニダーゼ アルファ•

ただし、NAb分析法は定性的であるため高濃度に存在するときの精度は重要ではない。

•

臨床試験においてADAの産生が認められた被験者がおり、一部でNAbも検
出された。

•

ADA価とNAb産生との間に明らかな相関は認められず、ADA存在は薬力学的マーカーであるuGAGの減少にも影響しない。

http://bioanalysisforum.jp/• NAb分析法のバリデーションパラメータは高濃度陽性対照の分析単位間精度を除き、すべて許容基準を満たした。

uGAG：urinary glycosaminoglycan (尿中グリコサミノグリカン)

15th JBF Symposium, DG2023-59

36

Japan Bioanalysis Forum

事例紹介-ベストロニダーゼ アルファ• ADA及びNAbの産生が散見される。
• また、ADA及びNAb陽性患者ではIARの発現が高い傾向だった。
しかし、症例数が限られており、 IARは適切な処置で管理可能であった。
• 現時点では抗体産生による安全性上の明らかな懸念は認められない。
• 抗体産生が本剤の有効性に対して特段の影響は認められなかった。

http://bioanalysisforum.jp/• 海外第1/2相(CL201) ADA陽性66.7%（2/3例） NAb陽性50.0%（1/2例）• 海外第2相(CL203)
ADA陽性100%（8/8例） NAb陽性37.5%（3/8例）• 海外第3相(CL301)
ADA陽性58.3%（7/12例） NAb陽性71.4%（5/7例）• 国内試験(SDG001)
ADA陽性66.7%（2/3例） NAb陽性0.0%（0例）

IAR：Infusion associated reaction（投与関連反応）

15th JBF Symposium, DG2023-59

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Japan Bioanalysis Forum

事例紹介-ジヌツキシマブ

ヒト神経芽腫細胞表面に発現するジシアロガングリオシド（GD）2を特異的に認識し結合するマウス抗GD2モノク
ローナル抗体の可変部領域とヒト免疫グロブリンGの定常領域からなるマウス-ヒトキメラ型モノクローナル抗体➢ 適応症：大量化学療法後の神経芽腫➢ MOA：ADCC、CDC作用を介した細胞傷害活性• 日本での承認申請では、中和抗体評価として、2種類のcell based assayの結果が用いられた
15 JBF Symposium, DG2023-59。
th

http://bioanalysisforum.jp/◆ ジヌツキシマブ（ユニツキシン点滴静注）➢ キメラ抗GD2抗体

38

Japan Bioanalysis Forum

事例紹介-ジヌツキシマブ
・分析法1: CDC法

・分析法2: ADCC法**✓中和抗体なし✓中和抗体なし

細胞死*（吸光度↑）

シグナル伝達↑✓中和抗体あり✓中和抗体あり［ Luc発光（RLU）↑］

細胞死*（吸光度↓）*: 490nmの吸光度を測定し評価：ジヌツキシマブ

http://bioanalysisforum.jp/**:市販キットを使用

シグナル伝達↓［ Luc発光（RLU）↓］

15th JBF Symposium, DG2023-59

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Japan Bioanalysis Forum

事例紹介-ジヌツキシマブ
分析法バリデーション

Parameters

分析法1

分析法2

MRD

50倍

100倍

Cut point

陰性対照検体の吸光度で補正した吸光度に1.33を乗じた値

陰性対照検体のRLU で補正した発光量に 0.844 を乗じた値

Sensitivity

55.0 μg/mL（陽性対照）

5.04 μg/mL（陽性対照）

Selectivity

－

許容範囲内

Specificity

許容範囲内（ヒトIgG 存在下）

許容範囲内（ヒトIgG 存在下）

Precision（within-run)

30%以下

30%以下

Precision（Betweenrun)

30%以下

1Run以外（操作ミス）許容範囲
内

Drug
Tolerance

許容範囲内

許容範囲内

15th JBF Symposium, DG2023-59

http://bioanalysisforum.jp/•40Japan Bioanalysis Forum

事例紹介-ジヌツキシマブ• 中和抗体評価法の開発経緯と使用分析法

US承認（2015.3）
分析法2

★
★

★：分析法2で再評価★

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分析法1

ジヌツキシマブCTD 1.5項 開発の経緯図を一部改変

・分析法1を使用したFDA審査時に、被験物質存在下での中和抗体分析法の感度が不足しているとコメントされた（Postmarketing Requirements）。その後、分析法を改良し（分析法2） 、GD2-PII試験では分析法2を使用した。国内申請時の中和抗体の評価はGD2-PII試験の結果を使用して考察した。
・分析法1で実施した試験の一部については、ADA陽性検体を分析法2で再評価（★）したが、国内申請の考察には使用していない［検体取得後の保存期間が長いことが一因である可能性が示唆された（最長で7-8年保存）］。
15th JBF Symposium, DG2023-59
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Japan Bioanalysis Forum

事例紹介-ジヌツキシマブ• 分析法による陽性率の違い（DIV-NB-201、DIV-NB-302及びDIVNB-303試験の合計）
分析法1

4% ［15/414例（ADA陽性:83例）、ただし11例はジヌツキシマブ投与前) ］

分析法2

10.8%［45/418 例（ADA陽性:86例）］

分析法の改良により陽性率が上昇し、改善が認められた。
• ADAがジヌツキシマブの有効性及び安全性に及ぼす明確な結果は得られていないが、臨床試験での検討結果は限られていることから、ADAがジヌツ
キシマブの有効性及び安全性に及ぼす影響について結論付けることは困難と判断（PMDA）。

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陽性率• FDAは、分析法1の分析感度（55.0 µg/mL）では低感度との判断であり、その後改善された分析法2の感度（5.04 µg/mL）を考慮すると、両者の間にFDAが許容する中和抗体の分析感度があると推察された。
15th JBF Symposium, DG2023-59

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Japan Bioanalysis Forum

事例紹介-ジヌツキシマブ
参考：Postmarketing Requirements

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FDAから、NAb分析に必要な分析感度について言及されているが、今回の分析法の分析感度は、分析法1、2ともに、500µg/mLを満たしており、FDAの意図はわからなかった。

15th JBF Symposium, DG2023-59

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Japan Bioanalysis Forum

事例紹介まとめ❑ 薬剤のMoA及びアッセイ系の性能を考慮して構築していると推察された。
❑ バリデーション項目として、共通してCut point、感度、選択性、精度、Drug toleranceが含まれていた。
❑ 複数の分析法を構築・使用した薬剤もあった。
時系列が不明なものもあるが、その時点での最新の科学に基づき分析法を見直し、評価していくことが必要と考えられた。
15th JBF Symposium, DG2023-59

http://bioanalysisforum.jp/❑ 一口にCell based assayと言っても、その原理は多様であった。

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CBAに関する分析面、規制面での課題点及び疑問点についての議論15th JBF Symposium, DG2023-59

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Japan Bioanalysis Forum45

Japan Bioanalysis Forum

本DG活動期間中にDGメンバーからCBAに関する分析
面、規制面での課題点及び疑問点が挙がった。その際の議論内容をカテゴリーごとにQ&A形式でまとめた。

15th JBF Symposium, DG2023-59

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CBAに関する分析面、規制面での課題点及び疑問点についての議論

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Japan Bioanalysis Forum

Q1.継代数はどのように決定しているかA1.活性の指標（細胞生存率、サイトカイン濃度等）やダブリングタイム等を考慮する。
最終的にはバリデーションにて決定。

Q2.細胞の管理はどうしているか
A2.液体窒素（気相）での管理が望ましい。
同日に分注したロットでも活性が変わってしまう事もあるので、担当者で細かい手技の統一が必要。

15th JBF Symposium, DG2023-59

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Q&A（細胞）47

Japan Bioanalysis Forum

Q3.FBSのLotの切り替わりはどのようにしているか
A3.Lotの切り替わりの際は細胞の反応性の確認を実施してLot間差を見る事を推奨。
初期実験の段階から複数Lot確認しておくと良い。
製薬メーカーからCROへ試験を依頼する際は検討の段階からLotを揃えることが望ましい。

15th JBF Symposium, DG2023-59

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Q&A（細胞）48

Japan Bioanalysis Forum

Q4.細胞購入の際に気を付けることは？
A4.第三者が使用する際の権利の関係を事前に確認しておく必要がある。
委託の際に細胞を譲渡できず、細胞の選定からやり直す場合があるので注意が必要。

15th JBF Symposium, DG2023-59

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Q&A（細胞）

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Japan Bioanalysis Forum

Q&A（重要試薬）

Q2.品質の担保について
A2.ICH M10ではRetest dateの記載が求められている。
NAbはスコープ外であるが、必要時にNC及びPCのシグナル値を確認し、系全体の品質を担保することを推奨する。

15th JBF Symposium, DG2023-59

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Q1.どのような項目を評価しているか
A1.作製時に標識率の確認、蛋白定量を行う。

50

Japan Bioanalysis Forum

Q1.ポリクロ？モノクロ？
A1.ポリクローナル抗体を選択する方が望ましいが、感度を考えて選択する必要がある。
ポリクローナル抗体では中和活性が低いことがあり、モノクローナル抗体を選択するケースもある。

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Q&A（PC）

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Japan Bioanalysis Forum

Q&A（実験）Q2.感度はどれくらいあればいいか？
A2.1～10 μg/mLを目標に系を構築するのが望ましい。
55.0 μg/mLで感度不足と当局から指摘され、別の系に変えたケースがある（ジヌツキシマブ、
42枚目）。

15th JBF Symposium, DG2023-59

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Q1.DTL評価に対するDrugの濃度はどう設定する？
A1.予想されるトラフ濃度以上に設定することが多い。

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Japan Bioanalysis Forum

Q3.精度はどこまで許容するか？
A3. CBAは30%程度。
高濃度側では精度が30%を超えても陽性判定
自体には影響しないため、許容されたケースがある（ベストロニダーゼ アルファ、35枚目）。

15th JBF Symposium, DG2023-59

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Q&A（実験）53

Japan Bioanalysis Forum❑ 2020-2023年に日本で承認されたバイオ医薬品35品目の申請資料から、
中和抗体分析で選択されたアッセイフォーマットをまとめた。補充療法（酵素、血液凝固関連因子）では酵素活性測定が、抗体ではLBAが、ホルモン、
ADC及び毒素ではCBAが主に用いられていた。細胞傷害活性がMoAの場
合はCBAが主流であった。上記の結果は、前回の調査結果（2015-2020年）と同様の傾向であった。
❑ 調査でCBAに関する情報が多く得られた3品目（ソムアトロゴン、ベストロニダ
ーゼ アルファ、ジヌツキシマブ）の事例を紹介した。
❑ 調査で得られた CBA に関する情報を基に分析面、規制面での課題点及び疑問点について議論し、Q&A形式で紹介した。

15th JBF Symposium, DG2023-59

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まとめ

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Japan Bioanalysis Forum❑ We summarized the assay format selected for neutralizing
antibody analysis from CTD of 35 biopharmaceuticals
approved in Japan between 2020 and 2023. Enzyme activity
assay was mainly used for replacement therapy (Enzymes,
coagulation factors). LBA was mainly used for antibodies. CBA
was mainly used for hormones, ADCs, and toxins. When thecytotoxic activity was MoA, CBA was dominant. The above
results showed a similar tendency to the results of theprevious survey (2015 to 2020).
❑ We introduced the cases of 3 products (Somatrogon,
Vestronidase Alfa, Dinutuximab) from which muchinformation on CBA was obtained from the survey.

http://bioanalysisforum.jp/

Summary❑ Based on the information on CBA obtained from the survey,
issues and questions from the analytical and regulatory
aspects were discussed and introduced in the form of Q & A.
15th JBF Symposium, DG2023-59

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