Japan Bioanalysis Forum

DG2017-29

マイクロサンプリング (3)-実施計画と方法の提案Microsampling (3)-Proposals for planning and methodhttp://bioanalysisforum.jp/1Japan Bioanalysis Forum

Abstract
Since 2015, the JBF discussion group (DG) of
microsampling revealed the opinions of companies andprogress in Japan through surveys and clarified theconcerns to be discussed or solved. As the draft Q&A
document of ICH S3A (toxicokinetics) published in 2016reached to Step 4 in November 2017, more practicalinformation would be desired. Therefore, the DG201729 is continuing the activity in order to provide useful
information including practical examples to Japanesecompanies that want to apply microsamping to theirregulated bioanalysis. During the activity, we focused on
issues that were continued from DG2016-21 or seemed
to induce divided opinions.
9 th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/2

Japan Bioanalysis Forum

Topics• In this symposium, we will report the following
issues, under the condition on analysis of wet
samples (e.g. plasma) by LC/MS.
1. Sample dilution with the appropriate solvents(buffer etc.)
2. Sample storage
3. Partial validation for changes to microsampling
4. Ratio of anticoagulant to blood sample
5. Accuracy and precision of liquid handling by
pipetting

9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/3Japan Bioanalysis ForumMicrosamplingDefinition of microsampling Method to collect very small amount of blood(typically ≤ 50 µL) to measure TK parameter ofthe drug and/or its metabolites
 Dry or wet microsampling techniqueAdvantage of microsampling Improving the animal welfares (contribution to
3Rs) Direct evaluation of the relationship the safety
data and drug exposure

9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/4Japan Bioanalysis Forumメンバー
Member (5名)

二橋 陽一郎

塩野義製薬株式会社

家木 克典

株式会社新日本科学

大道 浩三

興和株式会社

原田 智隆

株式会社LSIメディエンス

山本 鉄斎

中外製薬株式会社

Observer (2名)斎藤 嘉朗

国立医薬品食品衛生研究所

中井 恵子

株式会社LSIメディエンス

9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/5Japan Bioanalysis Forum

活動の目的
マイクロサンプリングに関しては、2015年「DG2015-17: 実施状
況と運用上の問題点」及び2016年「DG2016-21: 技術的課題の検討」の活動を通じて、日本国内の製薬企業及び医薬品開発
業務受託機関 (CRO) の現状を把握し、課題を整理するとともに、推進に向けて課題に関する議論を深めてきた。一方で、2016年に発出されたマイクロサンプリングに関する日米EU医薬品規制調和
国際会議 (ICH) S3A (トキシコキネティクス) Q&A案は、2017
年11月にStep 4に到達し、今後はより実践的な情報が望まれるものと考えられる。そこで、規制下の試験にマイクロサンプリングの適用を考えている製薬企業やCROに向けて、具体的な対応例を含む情報を提供することを目的として、今年度もDG2017-29として活動を継続した。
9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/6Japan Bioanalysis Forum

活動内容
 議論
メール及び電話・Web会議にて下記テーマに沿って議論を進めた．
1. 試料の適切な希釈
2. 試料の保管
3. マイクロサンプリングへ変更することに伴うパーシャルバリデーション
4. 抗凝固剤の影響
5. ピペット操作による真度・精度に与える要因•

テーマ選定根拠 「wet (血漿) 試料をLC/MSで分析する」ことを前提
 以前の活動からの継続議論が必要な項目あるいは意見が分かれそうな項目

 学会発表 第44回日本毒性学会学術年会 (2017/7/10-12)
 バイオメディカル分析科学シンポジウム (2017/8/28-29)
 EBF Open Symposium (2017/11/15-17)
9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/7Japan Bioanalysis Forum

トピックス
議論内容の紹介
1. 試料の適切な希釈
2. 試料の保管
3. マイクロサンプリングに変更することに伴うパーシャルバリデー
ション
4. 抗凝固剤の影響
5. ピペット操作による真度・精度に与える要因

第44回日本毒性学会学術年会 ポスター発表
ICH S3A Q&As Final-Step 2からの変更点-

9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/8Japan Bioanalysis Forum

1. 試料の適切な希釈

9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/9Japan Bioanalysis Forum

希釈の必要性• マイクロサンプリングで微量 (全血として≦50 μL) 血漿を取り扱う
際，『希釈 (dilution)』は有用な手段になる【希釈の利点】
1. 微量の血漿の取り扱い (操作・保管) を容易にする
2. 再測定 (再分析) ・ISRに十分なサンプル量を確保できる
3. 採血量をさらに少なくできる※ただし，以下の条件が満たされること

1.
2.
3.
4.
5.

分析感度が十分に得られること希釈による容器への吸着がないこと
希釈試料によるバリデーション*が実施されること
Analyteの溶解性が担保できること
正確な量の試料が分取できること

9th JBF symposium DG2017-29* : スライド30参照
http://bioanalysisforum.jp/10Japan Bioanalysis Forum

希釈のタイミング
タイミング

希釈担当者

考慮すべきポイント

保管前：
サンプリング時

動物実験者•

分析に不慣れな実験者によるピペッティングの精
度 (ただし，規定量の血漿 (全血) を採取できるデバイスであれば問題なし)

分析実験者

•

試料の受け渡しや分析実験者の作業スペースなど，動物実験者との連携

分析実験者

•
•

アッセイ時の操作の増加
保管前後でのマトリックス組成の変化(at sample time)

保管後：
アッセイ時

(at assay time)

保管後：アッセイ時希釈

保管前：サンプリング時希釈

保管
採血

希釈

前処理

保管
採血

前処理
希釈

希釈のタイミングの違いによって得られる血漿 (全血) 中濃度には差がないと考えられる
9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/11Japan Bioanalysis Forum

採血手法による希釈方法の違い
採血法

方法

規定量の血漿 (全血) が採取できるデバイス (e.g.
キャピラリー，MSWTM)*

デバイスを別チューブに入れ，規定量の希釈マトリックスを添加する (washout)

規定量の血漿 (全血) が採取できないデバイス(e.g. キャピラリー，シリン
ジ)マイクロチューブに血漿 (全血) を移した後，規定量の希釈マ
トリックスの入ったマイクロチューブに，規定量の血漿 (全血) を取る* : スライド21, 50参照

いずれの手法でも可能．希釈の均質性に留意すること．

9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/12Japan Bioanalysis Forum

何で希釈するか
試料考慮すべき点

当該動物のブランク血漿 • 3Rsの観点から，使用を避けるほうがよい
代替マトリックス(次頁参照)• 「分析対象の実試料にできるだけ近いものを使用する」(ガイドライン)• 希釈溶液がコンタミすると，測定値がすべて採用できなくなることに注意• 吸着の防止に，内標準物質 (安定同位体標識) が効果的な場合がある

9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/13Japan Bioanalysis Forum

代替マトリックス及び添加剤
水溶液 1)【利点】 入手しやすい

生理食塩水 (Saline)，リン酸緩衝液，リン酸緩衝食塩水 (PBS) (pH 7.4)

1)
2)
3)
4)
5)

水溶液への添加剤【利点】 吸着の防止

ウシ血清アルブミン (BSA)PBS with BSA 1)，2% BSA solution 2)

界面活性剤

非イオン性界面活性剤 (Tween20など)

有機溶媒との混液【利点】 キャピラリー等からのwashout, IS添加, 吸着の防止

25%アセトニトリル in 水 3)

全血15 μL+135 μL (10倍希釈) ⇒ 25 μL/assay

Low %メタノール in 水 4)ペプチドがanalyteのとき吸着防止

代替血清【利点】 実試料に近い

市販の凍結プール血清

L‐コンセーラ「ニッスイ」 5)

http://bcn201211.europeanbioanalysisforum.eu/wp-content/uploads/2016/03/S27.-3_sangster.pdf
https://cdn2.hubspot.net/hubfs/1806452/Content/Microsampling%20eBook%20Final%20(1).pdf?t=1490048661187
Yongyi Luo, Bioanalysis, 7, 18 (2015)
Lars B Nilsson, Bioanalysis, 5, 6, (2013)https://www.nissui-pharm.co.jp/products/clinical_diagnostics/quality_control.html

希釈のための代替マトリックスは化合物，分析手法などによって選択・最適化する
9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/

14Japan Bioanalysis Forum

希釈倍率
例：1回のassayに使用するマトリックス量を25 μLとした場合の採取可能回数
採取
マトリックス量

希釈倍率
x2

x5

x10

x20

5 μL

0 (10)

0 (25)

1 (50)

3 (100)10 μL

0 (20)

1 (50)

3 (100)7 (200)20 μL

1 (40)

3 (100)7 (200)15 (400)※ ( )内はトータル試料量 (μL)

再測定及びISRを考慮すると，最低限3回の採取が必要(DG2015-17アンケート結果)⇒ 10 μLのマトリックスを10倍希釈し，25 μL使用する
20 μLのマトリックスを5倍希釈し，25 μL使用するなどの手法が考えられる．
分析感度を損なわないことを前提に，採取できるマトリックス量とアッセイに使用するマトリックス量を考慮して希釈倍率を決定する必要がある
9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/

15Japan Bioanalysis Forum

検量線濃度範囲を超過した試料の取り扱い• 希釈試料が検量線濃度範囲を超過した場合，さらに希釈が必要となる．
• 希釈溶媒もしくは，試料と同じ比率で混合されたブ
ランクマトリックス＋希釈溶媒を用いて希釈する
 希釈再現性を確認する．安定性は必須ではない．

• もし希釈溶媒に内標準物質が含まれていた場合は，内標準物質を含む希釈溶媒とブランクマトリックスを混合したものを用いて希釈する

9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/16Japan Bioanalysis Forum

2. 試料の保管

9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/17Japan Bioanalysis Forum

保管に関する課題①マイクロサンプリングDG（DG2015-17）のアンケート結果（Q17-27）より．
1. 乾燥による定量値への影響
2. 適切な容器
3. 安定性への影響
4. 吸着（少量のため影響をうけやすい）
5. 少量のため、ハンドリング時に融解しやすい②今回のDGで新たに挙げられた課題
６．フィブリン塊の析出

9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/18Japan Bioanalysis Forum

本DGにおける論点
1. 試料の乾燥を防ぐにはどうするか？
1-1 最新の保管容器について情報収集
1-2 希釈保管の是非
・溶媒は何か？
希釈の項にて議論
・化合物の溶解性は？
・吸着は？
2. フィブリン塊への対処

9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/19Japan Bioanalysis Forum

1. 保管容器と保管条件
試料の保管容器は？
14%

4%

チューブ（PP, PEなど）
キャピラリー
DBSろ紙⇒ チューブを用いた保管が主流

82%

保管温度は？
11%
11%

60%

18%

室温（DBSのみ）
冷蔵（4℃前後）
冷凍（-20℃前後）
冷凍（-70℃以下）⇒ -70℃以下の冷凍が主流
DG2015-17のアンケート結果より9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/20Japan Bioanalysis Forum

1. 保管容器と保管条件（つづき）
名称
Lub Stuff
PCR チューブ
（0.2 mL）

特徴
自動分注装置にて分注が可能
ラベルが貼りにくい

Specialty
Microcentrifuge Tubes ふたが開きやすい（0.4 mL）

MSW2 Type Udck TM

2.8 μLの血漿を分離
そのまま保管可能

Micronic tube

グラクソスミスクライン社の血漿マイクロサンプリング

カットしたキャピラリー中で保管

アストラゼネカ社の血漿マイクロサンプリング

写真

メーカー名

URL

FCR&Bio CO.,LTD.

http://www.labstuff.jp/product/page0307.html

Thermo Fisher
Scientific Inc.

http://www.qsptips.com/produ
cts/product.aspx?id=128&c=28

株式会社
島津ジーエルシー

https://solutions.shimadzu.co.jp/cgi/ac?cmd=1&url=/glc/shoppi
ng/spe/level2/k13.html

不明

https://www.waters.com/webas
sets/cms/library/docs/local_semi
nar_presentations/NMSS_42_Sm
allMolec_Spooner.pdf

不明

http://focus201206.europeanbio
analysisforum.eu/wpcontent/uploads/2016/04/14-33-Ove-Jonsson.pdf

保管容器変更にともなうパーシャルバリデーションについてはスライド27参照

9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/21Japan Bioanalysis Forum

2. フィブリン塊への対処
微量の血漿試料中にフィブリン塊を認めた場合，適切なサンプリングは可能なのか？
対処法を議論した。
対処案

コメント

フィブリンを避けて分取する。

可能であれば，最も適切な対処法

遠心して除く。

試料よりフィブリンを除去することの影響が不明

分注して保管，1本使い切り

作業量が増加あらかじめ希釈して保管

マトリックス変更，フルバリデーションが必要*

キャピラリーで保管

実際に適切な対処か否かの実績なし

血清を使用する。

当該化合物の評価方法に依存* : スライド30参照

現状，最適な対処法は議論の範疇を出ない。
今後の実績より評価する必要がある。
9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/22Japan Bioanalysis Forum

3. マイクロサンプリングに変更することに伴うパーシャルバリデーション

9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/23Japan Bioanalysis Forum

はじめに
DG2016-21で実施したアンケート調査の結果から、採血量や取り扱う試料容量が微量になることによって、注意すべき点はあるものの、液体試料のマイクロサンプリング特有のバリデーション項目はないと考えられた1）2）。
一方で、従来法があってマイクロサンプリングに変更する際、当然分析法に変更が生じることが予想される。
本DGでは、マイクロサンプリング適用に伴う分析法の変更点を洗い出し、パーシャルバリデーションの必要性について議論した内容を発表する。
議論は、マイクロサンプリング特有の変更点にスコープを当てた。
1） マイクロサンプリング(2)技術的課題の検討、JBFシンポジウム、2017
2） 医薬品開発におけるマイクロサンプリングの技術的課題と対策について（JBF DG2016-21研究活動結果報告より）、BMAS、2017
9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/24Japan Bioanalysis Forum

採血器具の変更ケース

従来法では採血にシリンジを使用していたが、マイクロサンプリング適用に伴いキャピラリーに変更した。

留意点

材質の変化に伴う吸着の影響が考えられる。

PVの実施

不要
材質変化による吸着が懸念される場合は、事前に影響を検証する。
検証法の例

前処理・分析
全血試料の調製9th JBF symposium DG2017-29

血液試料採取分析値の比較

血漿分離
http://bioanalysisforum.jp/25Japan Bioanalysis Forum

抗凝固剤の添加量（割合）の増加
ケース

従来法では500 μLの血液に5 μLの抗凝固剤を添加している。
マイクロサンプリング適用に伴い採血量を50 μLにした（抗凝固剤の添
加量は5 μLのままとした）。
抗凝固剤の割合が1%から10%に増加

留意点

濃度補正が必要なレベル*の増加量* : 「4. 抗凝固剤の影響」の項参照

PVの実施必要（濃度補正が不要なレベルであればバリデーション不要）。

選択性

検量線

真度・精度
（分析内）

真度・精度
（分析間）

マトリックス効果

回収率

キャリーオーバー

安定性

×

○

○

×

×

×

×

△

試料中の血漿成分量は僅かに減少するが、原則、マトリックスは変化していないと考える。ただし、濃度補正が必要な場合、少なくとも検量
線と真度・精度（分析内）は確認しておく必要がある。
吸着の懸念がなければ安定性は不要と考える。

○：実施△：必要に応じて実施
×：不要

9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/26

Japan Bioanalysis Forum

保存容器の変更
ケース

サンプル量の削減に伴い、1.5 mLのマイクロチューブから0.2 mLのマイ
クロチューブに変更
マイクロチューブからキャピラリーに変更する

留意点

材質の変化に伴う吸着の影響が考えられる。

PVの実施

不要
材質変化による吸着が懸念される場合は、事前に影響を検証する。

9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/27

Japan Bioanalysis Forum

保存する血漿量の変更
ケース

保存量が200 μLから20 μLに変更

留意点

フィブリンの析出、保存容器との接触する面積が変化し吸着の影響が変化しうる
長期保存において，試料が乾燥し濃縮しうる

PVの実施

不要
吸着が懸念される場合は、事前に影響を検証する。
また、フィブリンの析出や乾燥による試料濃縮を回避するには、予め必要量分注することや予め試料を希釈する等の対策が考えられる。

9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/28

Japan Bioanalysis Forum

分析試料採取容量と方法の変更
ケース

前処理に供する血漿量を50 μLから5 μLに変更
前処理に供する血漿分取をピペットからキャピラリーに変更（キャピラリーから直接薬物を抽出）

留意点

プロセス試料の濃度が変化する。
回収率が変化する。

PVの実施

必要

選択性

検量線

真度・精度
（分析内）

真度・精度
（分析間）

マトリックス効果

回収率

キャリーオーバー

安定性

○

○

○

○

○

○

○

△

試料が希釈され前処理後試料のマトリックス量が減少するため、前処理後試料安定性は必要と考える。

○：実施△：必要に応じて実施
9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/29

Japan Bioanalysis Forum

予め試料を希釈ケース

試料容量をかさあげするために予め緩衝液を加えて分析試料とする

留意点

マトリックスが変更になる

PVの実施

必要（フルバリデーションが必要になる）

選択性

検量線

真度・精度
（分析内）

真度・精度
（分析間）

マトリックス効果

回収率

キャリーオーバー

安定性

○

○

○

○

○

○

○

○

○：実施
△：必要に応じて実施

9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/30Japan Bioanalysis Forum

4. 抗凝固剤の影響

9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/31

Japan Bioanalysis Forum

抗凝固剤の種類種類

機序

必要量（1mLあたり）

EDTA

凝固に必要な血漿中のカルシウムイオンをキレート

1mg〜1.5mg

ヘパリン

アンチトロンビンと結合して複合体を形成し、 0.01mg〜0.1mg
トロンビン活性を阻害

クエン酸ナトリウ 凝固に必要な血漿中のカルシウムイオンに 109mmol/L液を
ム
結合
0.11mL(1/10容)
フッ化ナトリウム 凝固に必要な血漿中のカルシウムイオンに 5mg〜10mg
結合

 固体又は液体で抗凝固剤を添加
 昨年度のDG2016-21より、血漿に対する添加量の割合
5%未満：補正なし
5%以上：補正を考慮-ただし、血液に添加した抗凝固剤は全て血漿成分となる⇒血液50μLに対して2.5%（=1.25μL）が補正を考慮するライン
9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/32

Japan Bioanalysis Forum

補正の有無と抗凝固剤の添加例• 補正の必要がない添加例
デバイス

添加方法

キャピラリー

処理済み市販品（ヘパリンNa、EDTA-2Na）を使用

シリンジ

シリンジ*に抗凝固剤を吸引吐出し、針先のみ残して（1μL程度）、その
まま採血

シリンジ

採血チューブに予め1μLの抗凝固剤をとり、全血50μLを添加してよく混和*Dead volumeの無いシリンジ（マイジェクトなど）• 補正を考慮する必要がある添加例
デバイス

添加方法

シリンジ

シリンジに予め10μLの抗凝固剤をとり，全血50μLを添加してよく混和

シリンジ

採血チューブに予め25μLの抗凝固剤をとり，全血50μLを添加

9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/33

Japan Bioanalysis Forum補正の考慮について• ブランクマトリックス中の抗凝固剤の割合と実試料中の抗凝固剤の割合
・同じ⇒補正の必要なし
・異なる⇒補正の必要あり
例：血液のヘマトクリット値が50%と仮定し，抗凝固剤を50%含むブランクマトリックス
を使用する場合
・検量線用標準試料
ブランクマトリックス10μLに標準溶液 5μLを添加
・実試料
血液50μL＋抗凝固剤25μLを添加し，遠心分離後上清10μLを分注
溶媒5μLを添加⇒ 試料中はいずれも血漿5μL + 抗凝固剤5μLとなり，補正の必要はなくなる

9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/34

Japan Bioanalysis Forum

補正の有無と抗凝固剤の添加
ブランクマトリックスの抗凝固剤
固体

実試料の
抗凝固剤

液体

液体
2.5%未満風乾不要

不要

2.5%未満不要

不要2.5%以上要補正

要補正

2.5%以上同じ比率なら
不要

血漿のみを用いたブランクマトリックスで検量線標準試料を調製する場合，次から示すような補正が必要になる
9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/35Japan Bioanalysis Forum補正の方法１• 測定結果に対して補正係数をかける
遠心分離後の上清はすでに抗凝固剤で希釈されている⇒試料に一定割合(A%)の抗凝固剤が含まれると仮定
遠心分離後
のチューブ

血漿
抗凝固剤
血球

求める定量値は算出された値をで割る必要がある

上清
血球成分

9th JBF symposium DG2017-29

補正係数

http://bioanalysisforum.jp/36

Japan Bioanalysis Forum補正の方法２• 検量線の設定濃度を補正する
y: ratio、a:傾き、b:切片
試料に一定割合(A%)の抗凝固剤が含まれると仮定すると求める結果は先ほどの式より、
y: ratioy = a × (1/(1-A/100))× x + b

上の２式を合わせると、

y=a×x+bx：濃度
9th JBF symposium DG2017-29

傾き（＝設定濃度）に 1/（1-A/100）を乗じた
検量線を用いるhttp://bioanalysisforum.jp/37

Japan Bioanalysis Forum補正の方法３• 試料分取時に、補正後の量を分取する
遠心分離後の上清はすでに抗凝固剤で希釈されている⇒試料に一定割合(A%)の抗凝固剤が含まれると仮定
遠心分離後
のチューブ

血漿
抗凝固剤
血球

１回の測定試料量に希釈前の血漿量を含むように補正する

上清
血球成分

9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/38

Japan Bioanalysis Forum補正の方法（適応例）
•
•
•
•
•

採血：50μL（血漿量25μLと仮定）
抗凝固剤：25μL添加
測定：5μL使用
定量範囲：1〜1000ng/mL
検量線用標準試料は血漿のみで調製補正の方法1
測定結果に対して補正係数をかける

補正の方法2
検量線の設定濃度を補正する

補正の方法3試料分取時に，補正後の量を分取する測定結果を2倍する

定量範囲を2〜2000ng/mL測定に使用する血漿量を10μLにする

9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/39

Japan Bioanalysis Forum

ヘマトクリットの考慮について• 各動物種のヘマトクリット値について調査した。
動物種

系統

齢

Mouse1

Crlj:CD1(ICR)

Rat1

ヘマトクリット値 (%)
Male

Female11週

45.3±2.543.6±2.3

Crl:CD(SD)11週

46.0±1.445.2±2.9

Rabbit2

Slc:JW20週

36.4±1.2

36.6±1.3

Dog3

Beagle9カ月

46.7±6.447.2±4.4

Cynomlgus monkey4-

3 – 4年43.7±3.242.5±3.1

1日本チャールス・リバーHPより
2日本エスエルシーHPより
3 Lab Anim Res 2011: 27(4), 283-291
4 Exp. Anim. 1986. 35(4), 443-447

多くの動物種は平均が約45%で、標準偏差が2～3%程度であるため、個体のヘマトクリット値は40%〜50%が通常の変動範囲となる
9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/40Japan Bioanalysis Forum

ヘマトクリットの考慮について• 血漿中濃度を100ng/mLと仮定し，50μLの血液に以下の量の抗凝固剤を加えた時、ヘマトクリット値の違いにより希釈後の血漿中濃度(ng/mL)*は以下のように変動する。
ヘマトクリット値

添加量
10 μL

25 μL

50 μL

35%

76.5

56.5

39.4

40%

75.0

54.5

37.5

45%

73.3

52.4

35.5

50%

71.4

50.0

33.3

55%

69.2

47.4

31.0

*Rb値（血液血漿濃度比）の変動の影響は考慮しない

希釈後の血漿中濃度＝100ng/mL ×

9th JBF symposium DG2017-29（50μL ×（100% – Hct%）/100%）（50μL ×（100% – Hct%）/100% + 添加量）
http://bioanalysisforum.jp/41

Japan Bioanalysis Forum

ヘマトクリットの考慮について• 希釈後の血漿中濃度を逆補正する場合，各試料のヘマトクリット値
ではなく，平均値(45%)を使うと想定される。45%として逆補正した
元の血漿中濃度(ng/mL)は以下になる。（真値：100ng/mL)
ヘマトクリット値

添加量

10 μL

25 μL

50 μL

35%

104.3

107.9

111.0

40%

102.3

104.1

105.7

45%

100.0

100.0

100.0

50%

97.4

95.5

93.9

55%

94.4

90.4

87.5

通常の変動幅である40〜50%で見ると，10μLの添加は誤差±3%以内と意外に小さいが，50μL添加は±6%程度まで変動している。さらに，
 採血量と抗凝固剤の添加量を正確にコントロールする必要あり
 血液の希釈によるRb値の変動が評価できていない⇒補正を考慮しないような抗凝固剤の添加を推奨
http://bioanalysisforum.jp/

9th JBF symposium DG2017-29

42

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5. ピペット操作による真度・精度に与える要因

9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/43Japan Bioanalysis Forum

何μLまで正確に分注可能か？ 1

DG2016-21のアンケート結果より9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/44Japan Bioanalysis Forum

何μLまで正確に分注可能か？ 2• マイクロサンプリング (2) DG（DG2016-21）のアンケート結果（Q2-35）では，70%の方が5 μLまで分注可能と回答。
 5 μL以上であれば，通常使用しているピペットの精度で十分である可能性が高いと考えられる。
 しかしながら，少量のサンプルの取り扱いには注意が必要であるため，粘性の高い液体の扱いに適しているポジティブディスプレイスメント方式のマイ
クロピペットの使用を推奨する（エアーディスプレイスメント方式のマイクロピ
ペットをリバース法で用いる方法も可）。

デバイス

マイクロピペットタイプ

モード

エアーディスプレイス フォーワード法
メント方式
リバース法
ポジティブディスプレ
イスメント方式

9th JBF symposium DG2017-29

備考• 粘性の高い液体に適している• 粘性の高い液体に適している• チップの壁面に液が残りにくい
ため，サンプルのロスがない
http://bioanalysisforum.jp/45

Japan Bioanalysis Forum

ポジティブディスプレイスメント方式• 一般的に粘性の高い液体の取り扱いに適していると言われる。
• 水では差が出ないが，血漿（及び全血）を採取する場合はエアーディスプレイスメント方式のマイクロピペットよりもポジティブディ
スプレイスメント方式のマイクロピペットの方が真度が良い場合がある（次スライドにデータ）。
• 50 μL採取のデータではあるが，血漿のピペッティングでは真度に差が出ており，少量のサンプルを取り扱う場合はポジティブディスプレイスメント方式を推奨する。

9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/46Japan Bioanalysis Forum

マイクロピペットの吸引方式の比較
水50 μLをピペッティング
真度・精度とも差がない(いずれも1%未満)

血漿50 μLをピペッティング

-1%未満

-5%程度

精度には差がないが，真度に差がある

左側：Regular pipette = エアーディスプレイスメント（フォーワード法）
右側：MICROMAN E = ポジティブディスプレイスメント
Systematic error = (mean volume – nominal volume) x 100 / nominal volume
Random error = SD / mean x 100

Gilsonのアプリケーションノートより

http://www.gilson.com/Resources/AN0996_Exact_and_Secure_Pipetting_of_Plasma_and_Whole_Blood.pdf
9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/

47

Japan Bioanalysis Forum

リバース法• エアーディスプレイスメント方式のマイクロピペットを用いたサンプル
採取方法の１つ。
• ピペットメーカーのHPでは粘性の高い液体を扱う方法として推奨していることがある。

DG2014-12
LBAを用いる定量（PK/Biomarker）のポスターより引用
9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/

48

Japan Bioanalysis Forum

新しいデバイス• 今後は，より少量のサンプリングが要求される可能性もあり，さらに精度の高いデバイスが期待される。
 さらなる低容量分取用マイクロピペット
 特殊なデバイス（Microsampling Wingやそれに続くデバイス）

 Microsampling Wingは容量が2.8 μLまたは5.6 μL固定だが，血漿を高精度に採取できるかもしれない（次スライドにデータ）。

9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/49

Japan Bioanalysis ForumMicrosampling Wing
Plasma zone
LZ

Plasma zone: 5.6 μL
LZ: 2.5 μL
LZ: Lucky zone→
ヘマトクリット値（≦50%）や遠心環境により血漿になる領域
島津製作所のテクニカルレポートよりhttps://www.shimadzu.co.jp/products/opt/products/msw2/images/u815-1001.pdf
9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/50

Japan Bioanalysis Forum

マイクロピペットの検定時の注意点• 予備検討段階で血漿（または全血）を用いて精度を確認した
上で，規制下の検定ではSOPに従った方法で実施することが望
ましいと考えられる。
• 血漿 (全血) を用いて重量法で検定する場合は，血漿（全血）を使用するときに毎回密度を測定する必要があり，手間が増える• 規制下での試験の場合は，血漿（全血）の使用はマイクロピペットのSOPとの整合性が懸念される• 検定時に重量法で少量を測定する場合は，揮発の影響を抑えるために何らかの対策を取って測定した方が良いかもしれない。
• 容器にふたをする• 何かに染み込ませる• 加湿する，あるいはあらかじめ一定量の水を入れた容器に追加で添加する

9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/51

Japan Bioanalysis Forum

第44回日本毒性学会学術年会
ポスター発表

9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/52

Japan Bioanalysis Forum

第44回日本毒性学会学術年会 ポスター発表
2017年7月に行われた日本毒性学会学術年会において，昨年度（DG201621）の活動内容から以下の項目を選択し，ポスター発表を行った。
 文献調査• 採血量が生理学的データに及ぼす影響• 採血部位によるPKの違いについて
 JBFでのアンケート調査• マイクロサンプリングの実施方法，デバイスとメリット・デメリットについて• マイクロサンプリングに関する意識や新たな課題，使用デバイスについて
また，上記とは別に毒性学会の来場者の方に，毒性試験の中でTK動物をどのように設定するか，アンケートを行った。

9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/53

Japan Bioanalysis Forum

毒性学会の来場者の方へのアンケート
質問内容
ICH S3AガイダンスのQ&A案の，1.2 (Q2) マイクロサンプリングのベネフィット/利点は何か？で，「マイクロサンプリングが主試験群で実施されるため，安全性に関するデータと薬物曝露との関連を同じ動物で直接評価できることも主たる利点である．」との記載があります．
その上で，以下の①，②の場合に，TKをどのように評価するのが適切であると考えますか？
①採血量が毒性評価に影響を及ぼさない場合
毒性評価群から採血（サテライト群をおかない）
全動物から
全ポイント採血

特定の数例
から採血

スパース
サンプリング

０名

１９名

５名

サテライト群をおいて，採血
２名②採血量が毒性評価に影響を及ぼす場合
毒性評価群からのスパースサンプリング

サテライト群をおいて採血

２名

２４名

・採血量が影響を及ぼさない場合，毒性評価群の特定の数例から採血を行うとの回答が多かった
・採血量の影響の有無に関らず，スパースサンプリングを実施する回答は少ない傾向にあった
9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/54

Japan Bioanalysis Forum

来場者の方からのコメント
項目

コメント

全般

・マイクロサンプリングには踏み切れない．過去データとの違いが出そう．特に採血部位の違いによって毒性の出方にも差が生じうるのではないか．
・ラットはできそうだが，マウスでできるかどうかが問題ではないか
・自分たちの会社で率先して実施する勇気はない．周囲の状況が変わったり，データが蓄積されたりすれば踏み切
れるかも・代謝物の定量などが必要となる場合が多く，マイクロサンプリングを使う発想にない・主群での毒性評価とTKの相関を考察することは，現状からは一歩踏み込んだ考え方で先進的であるが，そこまで重要性が高いとは考えられない．群評価でよい
・薬物濃度測定以外の目的（バイオマーカーなど）で使用することもあり，マイクロサンプリングの実施を躊躇する
・毒性が出た動物のTKについて，それは特異な個体であり，またその選択方法自体が恣意的であるため，そこまで確認しようとは思わない

生理学
的影響

・採血による負荷が動物の毒性にどう表れるのかは，生化学的な数値の変化だけではなく，それ以外にもあると考えられる
・頸静脈採血でASTが上がる傾向がある

PKの違い

・尾静脈採血と頸静脈採血とではPKが変わる印象を持っている・採血部位によって異なるTKのプロファイルが得られてしまうと，どの濃度が妥当であるのか，ヒトへの外挿性など，
やっかいな話になる

採血・ラットは頸静脈，マウスは尾静脈からとっていることが多い
・人によって採血の方法(頸静脈と尾静脈)が異なっている

アンケート・スパースサンプリングではTKプロファイルの個体差を検出することができない・スパースサンプリングでは平均値とはいえ，異なる個体から得られたプロファイルを描くのが気持ち悪い

9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/55

Japan Bioanalysis Forum

DG2017-29 ー補足資料ー

ICH S3A Q&As Final-Step 2からの変更点-

9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/56

Japan Bioanalysis Forum背景 トキシコキネティクス（TK）評価：• 従来の測定方法では、200μL以上の採血が必要• げっ歯類では、サテライト動物の使用が必要

 マイクロサンプリング手法が一般化（機器分析感度の上昇により、50μL以下の採血量で評価が可能に）
1. サテライト動物でなく、メイン（毒性評価）動物でTK評価– 個体毎の毒性評価値とTK値との関連性解析が可能
2. サテライト動物数の削減（全廃含む）による動物福祉への貢献（3Rsのうち、Refinement, Reduction)

 – 2014年10月 ICH SCによりコンセプトペーパー承諾 – 2016年5月 パブリックコメント募集（Step 2b）
 – 2017年11月 最終文書公開
9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/57

Japan Bioanalysis ForumQ&As作成の目的
トキシコキネティクス評価におけるマイクロサンプリ
ング手法の利用についてQ&Aを作成⇒マイクロサンプリングの利用を促す
1. 同じ動物において、TK値と毒性評価との直接関連
2. TKサテライト動物数と採取試料量の削減

9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/58Japan Bioanalysis Forum

Q&Asの目次
前文
1. 緒言及び適用範囲（Q1, Q2）
2. マイクロサンプリングの適用に関する基本原則（Q3, Q4,Q5）
3. 安全性評価への影響（Q6）
4. 生体試料中薬物濃度分析法に関する課題（Q7）
5. 別紙： 本Q&AsのICH S3Aガイドライン各項との対応
文書はICH、PMDAホームページ等に掲載

http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Safety/S3A/S3AIWG_Step4_2017_1116.pdf
https://www.pmda.go.jp/files/000221581.pdf

9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/59Japan Bioanalysis Forum

Step 2からの主な変更点• 血液 (血漿・血清) 以外のマトリックスをScope外とすることを明確化（尿も明確にScope外に）• 従来の採血法からマイクロサンプリングに移行する際の確認が必要なケースを大幅に緩和• S3A GLに明記のように、一部の動物のみをTK評価して良いことを、本Q&Aにも記載• Sparse samplingの説明を追加• 液体試料取扱い留意点の「1）試料の均一性の確認」を「1）試料の均一性の確保」に修正、「5)容器への吸着、6)保存条件、7)コンタミネーションと繰り返し採血のリスク」について追加
9th JBF symposium DG2017-29

http://bioanalysisforum.jp/60