57●新規機能性 TOYOPEARL イオン交換グレードの開発
バイオサイエンス事業部

開発部

セパレーショングループ

荒木中村康祐孝司

量が 1 g 未満から約 10 g まで向上）したのに対して、

1．はじめに精製工程に関してはこれに追従できるほど改善が進ん

近年のバイオ医薬品市場の成長は著しく、2009 年でいない。このことがコストダウンの障壁の一つとに 1000 億ドル弱であった市場が、2016 年頃には約なっており、精製工程の生産性向上は、未だ課題とし1500 億ドルまで拡大する見通しである。これには特て残っているのが現状である３）。に抗体医薬品の成長が貢献しており、この傾向は今後
１）

本稿では、バイオ分離向け液体クロマトグラフィーも継続すると予想されている 。一方で、バイオ医薬用充塡剤 TOYOPEARL® のうち、最近上市された二種品は高価であり、その普及が患者や公的機関の経済的類のイオン交換グレードを紹介する。具体的には、ア負担を増加させている点が問題視されている。そのたニオン交換体 TOYOPEARL NH2 − 750F、カチオン交換め、バイオ医薬品の製造コストの低減に向けた取り組体 TOYOPEARL Sulfate − 650F の基本特性について述

みが、一層と医薬品メーカーに求められている状況にべる。これらの充塡剤は新しい機能を有しており、バある。

イオ医薬品の精製効率・生産性の更なる改善に寄与す

バイオ医薬品の原薬製造プロセスは、大別して培養ることが期待される。と精製の二工程から成る。まず、培養工程では微生物や動物細胞を培養し、目的のタンパク質や抗体を産生させる。次に、精製工程で培養液に多く含まれる夾雑物を除去し、目的物を高純度化して原薬を得る。図１２）

2．実

験

［1］試

薬に抗体医薬品の製造プロセスの一例を示した 。抗体

ポリクローナル免疫グロブリン G（IgG）としては、医薬品は動物細胞から産生された後、クロマトグラガンマーグロブリン筋注（化血研製）を用いた。モノフィーや濾過など複数の手法を組み合わせて精製されク ロ ー ナ ル IgG は、Tosoh Bioscience GmbH か ら 提ている。ここで、培養工程の生産性については、この供されたものを使用した。アンチトロンビン III とし20 年ほどで大幅に向上（培養液 1 L 当たりの抗体生産ては、ノイアート静注用（日本血液製剤機構製）を使用した。ウシ血清アルブミン（BSA）などその他の試薬は、和光純薬工業から購入した。

細胞培養［2］動的吸着容量の測定
細胞除去・清澄化

各種充塡剤を 5 mm I.D. × 50 mm（アニオン交換体

Protein A アフィニティークロマトグラフィーの場合）または 6 mm I.D. × 40 mm（カチオン交換体の場合）のカラムに充塡し、測定に用いた。試料溶液としては、濃度 2 g ／ L の BSA（アニオン交換体の場合）

ウイルス不活化

または濃度 1 g ／ L のポリクローナル IgG（カチオン交中間精製（クロマトグラフィー）換体の場合）を含む緩衝液を用いた。充塡カラムを液体クロマトグラフ（東ソーまたは GE ヘルスケア製）

最終精製（クロマトグラフィー）に接続し、UV 280 nm の吸光度をモニタリングしながら、上記の試料溶液を所定の流速でカラムに負荷した。

ウイルス除去中間、最終精製はカチオン交換、アニオン交換、疎水性相互作用クロマトグラフィーなど、基序の異なる手法を組み合わせて行われることが多い。

図１

抗体医療品の製造プロセス例

２）

得られた破過曲線から求めた 10 ％破過までの試料負荷量に基づき、充塡剤の動的吸着容量を計算した。

TOSOH Research & Technology Review Vol.59（2015）58

このような前処理操作の省略、ひいては精製工程の時［3］分離選択性の評価
各種充塡剤を 5 mm I.D. × 50 mm（アニオン交換体間短縮（コストダウン）が可能と考えられる。の場合）または 7.5 mm I.D. × 75 mm（カチオン交換体の場合）のカラムに充塡し、これを液体クロマトグ（2）タンパク質の分離選択性ラフに接続して評価を行った。試料溶液としては、所

TOYOPEARL NH2 − 750F 及び従来のアニオン交換定の緩衝液に BSA（アニオン交換体の場合）、モノク型トヨパールにより得られた BSA のクロマトグラム

ローナル IgG（アニオン、カチオン交換体の場合）、を図２に示す。いずれの充塡剤でも同一の塩濃度リニアンチトロンビン III（ヘパリン様アフィニティー分

アグラジエント溶出を行ったが、TOYOPEARL NH2 −離検討の場合）を溶解したものを使用した。試料溶液

750F で BSA の溶出時間が最も遅かったことから、こをカラムへ注入した後、塩濃度リニアグラジエント法のゲルがより高い塩耐性を有することがあらためて示で溶出を行った。

唆された。
次に、分離選択性を比べると、TOYOPEARL NH2 −750F でのみ二峰性のピークが得られていることが分［4］カラム圧力損失の測定
各種充塡剤を 2.2 cm I.D.、4.4 cm I.D. または 30 cm

かる。これらのピークを分取・分析した結果、BSA

I.D. カラムに充塡し、それに純水（室温）を所定の流の単量体（溶出時間：約 65 分）と二量体（同：約 90

速で通液した際の圧力損失を測定した。

分）が分離していることが分かった。このことから、

3．結果と考察7060（1）タンパク質吸着容量
種々の pH、塩濃度条件における BSA 動的吸着容量を、従来のアニオン交換型トヨパール（TOYOPEARL
Q − 600C AR）と比較した結果を表１に示す。pH の低mAU（280nm）［1］アニオン交換体 TOYOPEARL NH2 − 750F50きく低下したのに対して、TOYOPEARL NH2 − 750F は0

このように、生理食塩水程度の塩を含む条件において、従来品では目的タンパク質を効果的に吸着できないため、その精製を行うには、試料溶液の塩濃度を下げる前処理（希釈、脱塩など）が必要となる。一方、
塩 耐 性 を 持 つ TOYOPEARL NH2 − 750F を 用 い れ ば、
表１

GigaCap Q−650M2010ことが分かった。

Q−600C AR

30

下や塩濃度の増加に伴って、従来品では吸着容量が大比較的高い吸着容量を維持できる（塩耐性を有する）

NH2−750F

40Super Q−650M
DEAE−650M
020406080120

カラムサイズ：5mm I.D.×50mm
試料：BSA、1mg
グラジエント：溶離液 A から溶離液 B への 120 分リニアグラジエント：0.02mol ／ L Tris−HCI 緩衝液（pH8.0）
溶離液 A：2.0mol ／ L NaCl＋0.02mol ／ L Tris−HCl 緩衝液（pH8.0）
溶離液 B
流速：1.0mL ／ min
検出：UV280nm

図２

アニオン交換型トヨパールにおける BSA のクロマトグラム

ウシ血清アルブミン（BSA）に対する動的吸着容量の pH 及び塩濃度依存性：
TOYOPEARL NH2−750F と従来のアニオン交換型トヨパール（Q−600C AR）の比較
BSA 動的吸着容量［g ／ L］
試料溶解液

100

Elution time［min］

TOYOPEARL
NH2−750F

TOYOPEARL
Q−600C AR

0.02mol ／ L Tris−HCl 緩衝液（pH8.0）＋0mol ／ L NaCl

65

900.02mol ／ L Tris−HCl 緩衝液（pH8.0）＋0.15mol ／ L NaCl

46

270.02mol ／ L Tris−HCl 緩衝液（pH7.5）＋0.15mol ／ L NaCl

42

160.02mol ／ L Bis−Tris−HCl 緩衝液（pH6.0）＋0.15mol ／ L NaCl

3811

カラムサイズ：5mm I.D.×50mm、試料：2g ／ L BSA、流速：1mL ／ min（滞留時間 1 分）

東ソー研究・技術報告第 59 巻（2015）59

TOYOPEARL NH2 − 750F は、従来品にないユニークな− 650F では、幅広い塩濃度範囲において、競合品と同分離選択性を有すると考えられる。

等以上の吸着容量が得られた。このことから、当該充塡剤は競合品より優れた塩耐性を有しており、3 －［1］－（1）項で述べた TOYOPEARL NH2 − 750F と同様のメ（3）抗体凝集体分離への応用
TOYOPEARL NH2 − 750F に よ る モ ノ ク ロ ー ナ ル

リットを持つと考えられる。

IgG の分離例を図３に示した。サイズ排除クロマト
グラフィーによるフラクション分析の結果、図中の（2）抗体凝集体分離への応用

Fraction #1 に IgG の単量体が、Fraction #2 に IgG のTOYOPEARL NH2 − 750F と 同 様 に、TOYOPEARL凝集体（二量体～）が主に溶出していることが明ら

Sulfate − 650F も優れた IgG 凝集体分離性能を有するかとなった。つまり、前項で述べた BSA だけでなく、ことを確認した。図６に、種々のカチオン交換型充塡IgG の単量体と凝集体の分離にも有用であることが確剤によるモノクローナル IgG の単量体と凝集体の分離認された。

結果をまとめた。競合品や従来のカチオン交換型トヨIgG（抗体）の凝集体は免疫原性を有し、副作用をパール（TOYOPEARL GigaCap® S − 650M）と比べて、引き起こす可能性が示されているため、抗体医薬品の精製プロセスにおいて、抗体の単量体（有効成分）と4.4cm I.D.×29cm凝集体を分離することは重要な課題の一つとされてい0.35精製効率の改善に寄与し得ると考えられる。

0.3（4）カラムスケールアップ
TOYOPEARL NH2 − 750F を 4.4 cm I.D.、
30 cm I.D. カ
ラムに充塡し、カラム圧力損失を評価した結果を図４

Pressure drop［MPa］る４）。この場面において、TOYOPEARL NH2 − 750F は30cm I.D.×20cm

0.250.20.150.10.05に示す。工業スケールの精製プロセスで用いられる0ような大型カラム（30 cm I.D. × 20 cm）においても、0200

線速度 300 cm ／ h 以上（滞留時間 4 分以内）での通液

400600Linear velocity［cm ／ h］が可能であった。

カラムサイズ：4.4cm I.D.×29cm、30cm I.D.×20cm
移動相：H2O（室温）

図４［2］カチオン交換体 TOYOPEARL Sulfate − 650F
（1）抗体吸着容量

TOYOPEARL NH2−750Fにおける流速（線速度）とカラム圧力損失の関係

IgG 動的吸着容量の塩濃度依存性について、競合品と比較した結果を図５に示した。TOYOPEARL Sulfate

Fraction ＃13020Fraction ＃2100010Sulfate−650F

100
DBC for IgG［g ／ L］

mAU（280nm）

4012020304050

カラムサイズ：5mm I.D.×50mm
試料：モノクローナル IgG、0.5mg
グラジエント：溶離液 A から溶離液 B への 60 分リニアグラジエント：0.02mol ／ L Tris−HCI 緩衝液（pH8.0）
溶離液 A：1.0mol ／ L NaCl＋0.02mol ／ L Tris−HCl 緩衝液（pH8.0）
溶離液 B
流速：1.0mL ／ min
検出：UV280nm

図３ TOYOPEARL NH2−750FによるIgG単量体と凝集体の分離

競合品 B80

競合品 C604020060

Elution time［min］

競合品 A

00.0250.050.075

0.10.125

NaCl concentration［mol ／ L］
カラムサイズ：6mm I.D.×4cm
試料：1g ／ L ポリクローナル IgG＋0.054mol ／ L
酢酸緩衝液＋NaCl（pH5.5）
流速：0.28mL ／ min（滞留時間；4 分）

図５

TOYOPEARL Sulfate−650F及び競合品における、IgG 動的吸着容量（DBC）の塩濃度依存性

TOSOH Research & Technology Review Vol.59（2015）60

も有用である可能性が示された。

IgG 単量体
凝集体

UV280nm［mV］

400（4）カラムスケールアップ

Sulfate−650F
300200

ムに充塡し、カラム圧力損失を評価した結果を図８に競合品 B示す。30 cm I.D. × 20 cm の大型カラムにおいても、極端な圧力損失の上昇がなく、線速度 300 cm ／ h 以上

競合品 C

1000TOYOPEARL Sulfate − 650F を 2.2 ～ 30 cm I.D. カラ

競合品 A（滞留時間 4 分以内）での通液が可能であった。従って、GigaCap S−650M
01020304050

TOYOPEARL NH2 − 750F と同じく、実験室から工業ス
60

Elution time［min］
カラムサイズ：7.5mm I.D.×7.5cm
試料：モノクローナル IgG（酸・熱処理品）、0.3mg
グラジエント：溶離液 A から溶離液 B への 58.5 分リニアグラジエント：0.025mol ／ L NaCl＋0.054mol ／ L 酢酸緩衝液（pH5.5）
溶離液 A：1.0mol ／ L NaCl＋0.054mol ／ L 酢酸緩衝液（pH5.5）
溶離液 B
流速：1.0mL ／ min
検出：UV280nm

図６

種々のカチオン交換型充填剤による IgG 単量体と凝集体の分離

当該充塡剤はより優れた選択性・分離能を示した。この結果から、TOYOPEARL Sulfate − 650F を抗体精製ケールまでの分離精製プロセスに適用可能であると考えられた。

GigaCap S−650M60

競合品 D50UV280nm［mV］

50040
Sulfate−650F

30AF−Heparin HC−650M

2010

プロセスに組み込むことで、これまで以上に効率的な0凝集体除去が可能となることが示唆された。

051015202530

Elution time［min］（3）ヘパリン様アフィニティー分離への応用
ヘパリンとは、化学構造中に多くの硫酸基をもつムコ多糖の一種であり、血液凝固因子や成長因子などに対して特異的な親和性を示すことが知られている。この親和性を利用するヘパリンアフィニティークロマト
グラフィーは、血液製剤などの精製プロセスにおいて

カラムサイズ：7.5mm I.D.×7.5cm
試料：アンチトロンビンⅢ、0.15mg
グラジエント：溶離液 A から溶離液 B への 30 分リニアグラジエント：0.02mol ／ L リン酸緩衝液（pH7.5）
溶離液 A：2.0mol ／ L NaCl＋0.02mol ／ L リン酸緩衝液（pH7.5）
溶離液 B
流速：1.0mL ／ min
検出：UV280nm

図７

各種充填剤におけるアンチトロンビンⅢのクロマトグラム

重要な役割を果たしている５）。
TOYOPEARL Sulfate − 650F はヘパリンと類似した

2.2cm I.D.×20cm

表面構造（多くの硫酸基）を有することから、ヘパリ30cm I.D.×20cm

ン親和性物質の一つであるアンチトロンビン III を用剤のアンチトロンビン III に対する保持力は、ヘパリン固定化トヨパール（TOYOPEARL AF − Heparin HC− 650F）に及ばなかったものの、他社製のヘパリン様アフィニティー充塡剤（競合品 D）と同等以上である

0.35
Pressure drop［MPa］いて、その保持挙動を評価した。その結果、当該充塡0.30.25
0.20.150.1ことが明らかとなった（図７）。また、TOYOPEARL

0.05

GigaCap S − 650M で は ア ン チ ト ロ ン ビ ン III は 保 持

0

さ れ な か っ た こ と か ら、TOYOPEARL Sulfate − 650F
は、一般的なカチオン交換体にはない独特のヘパリン様アフィニティーを有すると考えられる。即ち、
TOYOPEARL Sulfate − 650F は 抗 体 精 製 だ け で な く、
血漿タンパク質のアフィニティー精製の分野において4.4cm I.D.×28cm

0500

1000

1500

Linear velocity［cm ／ h］
カラムサイズ：2.2cm I.D.×20cm、4.4cm I.D.×28cm、30cm I.D.×20cm
移動相：H2O（室温）

図８

TOYOPEARL Sulfate−650Fにおける流速（線速度）とカラム圧力損失の関係

東ソー研究・技術報告

4．まとめ
本 稿 で は、 バ イ オ 分 離 向 け 新 規 液 体 ク ロ マ ト グ
ラ フ ィ ー 用 充 塡 剤 TOYOPEARL NH2 − 750F 及 びTOYOPEARL Sulfate − 650F の 基 本 特 性 を 紹 介 し た。
両グレードとも、従来のトヨパール製品でカバーできていなかったニーズに答え得る、新しい機能を有することを示した。これらの充塡剤が、バイオ医薬品の品質向上のみならず、現在の課題に位置付けられている製造コスト低減の一助となることを期待したい。

引用文献
１）青木謙治、Mizuho Industry Focus、156（2014）２）福澤時秀、抗体医薬品における規格試験法・製造と承認申請、14 − 26（2009）３）P. Gronemeyer, R. Ditz, J. Strube, Bioengineering,
1, 188 − 212（2014）４）M. Vazquez-Rey and D. A. Lang, Biotechnol. Bioeng.,
108, 1494 − 1508（2011）５）A. Johnston and W. Adcock, Biotechnol. Genet. Eng.
Rev., 17, 37 − 70（2000）

第 59 巻（2015）61