DG2017-31
LC-MSによる
内因性高分子の定量
Quantitative analysis of
endogenous large molecule substanceby LC-MS

9th JBF Symposium, DG2017-31

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Japan Bioanalysis Forum1

Japan Bioanalysis Forum 新井 浩司（LSIﾒﾃﾞｨｴﾝｽ）Koji Arai 平本 昌志（ｱｽﾃﾗｽ製薬）
Masashi Hiramoto

 明石 知也（田辺三菱製薬）
Tomoya Akashi

 水落 正慶（ｼﾐｯｸﾌｧｰﾏｻｲｴﾝｽ）
Masayoshi Mizuochi 上野 聡子（味の素）
Satoko Ueno

 若松 明（ｸﾞﾗｸｿｽﾐｽｸﾗｲﾝ）
Akira Wakamatsu 落合 尚子（大日本住友製薬）
Shoko Ochiai

Observer

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DG2017-31メンバー

 酒井 和明（帝人ファーマ）
Kazuaki Sakai

9th JBF Symposium, DG2017-312

Japan Bioanalysis Forum

背景（内因性高分子の定量：昨年と今年の活動）
前処理方法を中心とした議論
DG2016-25（昨年度）

絶対定量か、相対定量か？ Absolute or relative酵素消化の方法 Enzyme digestion
クリーンアップのタイミング Timing of cleanup
I.S.添加のタイミング Timing of IS spiking
データベース&ソフトウェアの活用
Utilizing databases and software

DG2017-31（今年度）アミノ酸配列の検索・確認

http://bioanalysisforum.jp/

Pretreatment of large molecules

Searching and confirming the amino acid sequence測定対象ペプチドの選択 Select target peptide fragmentプレカーサ―／プロダクトイオンの選択 Selection of Q1/Q3
LC-MSとLBA Comparison between LC-MS and LBA
9th JBF Symposium, DG2017-31

3Japan Bioanalysis Forum

活動の経緯 Activities
May 201720 June 2016

 キックオフ会議 Kick off Face to Face meeting (Waters品川)

July 2017～Jan 2018 TC と E-mailの議論 (1 time/Month, TC Total 7 times) Large molecule LC-MSに関するアンケート (Sep 2017) Survey

Nov 2017～Feb 2018

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 メンバー募集 Members application

 アンケート集計 Summarize survey
 ポスター準備 Posters preparation

9th JBF Symposium, DG2017-31

4

Japan Bioanalysis Forum

名称

用途・その他

UniprotKB

 タンパク質の配列DB

Peptide Atlas LC-MS/MSで同定された断片ペプチドのDB

DrugBank

 医薬品のDB⇒抗体医薬品のアミノ酸配列確認

9th JBF Symposium, DG2017-31

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解説（公共データベース）

5Japan Bioanalysis Forum

名称

用途・その他NCBI Blast アミノ酸配列の相同性検索
 定量に用いるペプチドがそのタンパク質に固有のものかどうかを調べることが可能 UniprotのBlastより動作が速い（DGメンバー意見）

Peptide Mass

 タンパク質の理論的消化断片の計算

Protein
Prospector

 タンパク質の理論的消化断片の計算
 ペプチドの理論的開裂の計算など

ExPasyProteomics

 各種データベース、ツールへのリンク集

9th JBF Symposium, DG2017-31

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解説（公共のツール）

6Japan Bioanalysis Forum

名称

用途・その他Skyline SRM/MRM分析支援ソフト（フリーソフト）
 タンパク質やペプチドの配列からMRMメソッドの作
成など

Mascot Server(Matrix Science)Protein Pilot(SCIEX)
Proteome discoverer(Thermo Fisher
Scientific)
ProteinLynx Global
SERVER(Waters)

 Data-dependent scanで測定したタンパク質
消化物のペプチド配列同定
 タンパク質標品の消化結果から定量対象ペプチ
ドを決定
 Mascot Serverは各質量分析機器メーカーに対応（フリー試用可能）

9th JBF Symposium, DG2017-31

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解説（ソフトウェア）

7アミノ酸配列の検索・確認
Search and confirm amino acid sequence

9th JBF Symposium, DG2017-31

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Japan Bioanalysis Forum

8

Japan Bioanalysis Forum

測定対象ペプチド選択までの流れ
目的タンパク質のアミノ酸配列の確認

酵素消化で断片化されるペプチド配列の確認
 データベースやソフトウェアの活用
測定に適したペプチド配列の選定
 構成アミノ酸からの選定
 データベースの活用

http://bioanalysisforum.jp/

 データベースの活用（内因性タンパク質／抗体医薬）

実際に測定してみて絞り込み 感度や保持時間、妨害ピークの確認
9th JBF Symposium, DG2017-31

9Japan Bioanalysis Forum

内因性タンパク質の場合
アミノ酸配列の確認方法
①文献調査

②NCBI

③その他
http://bioanalysisforum.jp/③その他

よく利用するデータベース②Website上のデータベース＜アンケート結果より＞
 データベースを活用することがほとんど
 Uniprotが大多数
9th JBF Symposium, DG2017-31①Uniprot

アンケートQ10 & Q11より

10

Japan Bioanalysis Forum

アミノ酸配列確認方法（内因性）

確認によく用いるデータベース

理由

Uniprot 主にスタンダードなデータベースとして用いられており，汎用性がある Protein IDがそのまま，多くの別のデータベース
や、解析ソフトウェアなどで用いることが出来る
 信頼性，網羅性が高い

NCBI

 他のデータベースを使った経験がないから9th JBF Symposium, DG2017-31

http://bioanalysisforum.jp/

ほとんどの人がデータベースを活用

11Japan Bioanalysis Forum

抗体医薬品の場合
アミノ酸配列の確認方法
①文献調査

②その他
http://bioanalysisforum.jp/③その他

よく利用するデータベース②Website上のデータベース②DrugBank database＜アンケート結果より＞
 データベース活用がほとんど（その他は社内データベース等）
 DrugBank databaseを活用することが多い
9th JBF Symposium, DG2017-31

アンケートQ14 & Q15より

12

Japan Bioanalysis Forum

アミノ酸配列確認方法（抗体医薬）

Trastuzumabの検索結果画面

http://bioanalysisforum.jp/

社内データベースを除けば
DrugBank databaseを利用している人が多い

URL: https://www.drugbank.ca/
9th JBF Symposium, DG2017-31

13

Japan Bioanalysis Forum

タンパク質名を入力（例：albumin）

http://bioanalysisforum.jp/

Uniprotの説明・操作画面

URL: http://www.uniprot.org/
9th JBF Symposium, DG2017-31

14

Japan Bioanalysis Forum

Uniprotの説明・操作画面

http://bioanalysisforum.jp/【Entry】の中のコードをクリック

9th JBF Symposium, DG2017-31

15Japan Bioanalysis Forum

Uniprotの説明・操作画面【FASTA】ファイルをダウンロード

9th JBF Symposium, DG2017-31

http://bioanalysisforum.jp/

配列情報取得16

Japan Bioanalysis Forum

確認方法

補足

Peptide mass

 タンパク質の理論的消化断片の計算

Peptide Atlas LC-MS/MSで同定された断片ペプチドの データベース

Skyline タンパク質・ペプチドの配列からMRMメソッドの作成など

標品を実際に消化して実測 標品が入手可能な場合に限る（抗体医薬の場合など）

手作業でアミノ酸配列から理論消化断片を決定 アミノ酸残基数が少ないものであれば可能

http://bioanalysisforum.jp/

消化ペプチドの配列確認方法

データベースやソフトウェアを活用すると便利
9th JBF Symposium, DG2017-31

17Japan Bioanalysis Forum

消化ペプチドの配列確認例

http://bioanalysisforum.jp/＜PeptideMassを用いた方法＞①アミノ酸配列を貼りつける②【Perform】をクリック

URL: https://web.expasy.org/peptide_mass/
9th JBF Symposium, DG2017-31

18

Japan Bioanalysis Forum

消化ペプチドの配列確認例

http://bioanalysisforum.jp/＜PeptideMassを用いた方法＞

トリプシン消化断片配列

9th JBF Symposium, DG2017-31

19

Japan Bioanalysis Forum

アミノ酸配列確認方法のまとめ

抗体医薬品等の外因性タンパク

内因性
Uniprotで配列確認

Peptide Atlasで同定ペプチド情報確認

情報あり

DrugBank databaseで配列確認

情報なし
Peptide Mass/Skylineで理論消化断片確認

http://bioanalysisforum.jp/

標的タンパクは内因性である

測定対象ペプチド選択法まとめへ（スライド38）

9th JBF Symposium, DG2017-3120測定対象ペプチドの選択
Select target peptide fragment

9th JBF Symposium, DG2017-31

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

21

Japan Bioanalysis Forum

測定対象ペプチドの選択
段階

（１）
候補抽出
スライド
23-32

（２）
適格性の
判断
スライド
P33-35

定量対象とする
ペプチド配列候補を抽
出する．
優先順に
右の①～③を用いる② データベースの参照
実際にLC-MSでペプチドを測定した結果をDBで参照する

A) 目的タンパク質のLC-MS定量例を文献調査
B) Peptide Atlasを参照
する③ in silicoでの抽出タンパク質のアミノ酸配列から，理論的な消化断片を発生させる

http://bioanalysisforum.jp/① タンパク質標品を消化し，LC-MSで分析する抽出したペプチド配列 BLASTサーチ等による配列特異性の確認
候補が定量に適するかを判断 化学的性質上の適性の確認
する
9th JBF Symposium, DG2017-31

22

Japan Bioanalysis Forum

候補抽出① 標品の消化（方法）
タンパク質標品 ➡ 還元＆アルキル化 ➡ トリプシン消化➡ LC-MS/MS （Data-dependent scanで測定）➡ アミノ酸配列解析（Mascot等のソフトがあると簡便，なければ理論的トリプシン断片一覧表と照合）
つまり、プロテオミクスで行われる測定を行い，MSクロマトグラム上のピークのペプチド配列をアサインするhttp://bioanalysisforum.jp/

タンパク質標品が入手できるなら、実際に消化してみるのが一番良い

強度が一番高いピークが適当な鎖長であれば、それを選べばほぼ問題ない。
念のため，選んだ配列が定量したいタンパク質に特異的な配列かどうか調べる

9th JBF Symposium, DG2017-31

23

Japan Bioanalysis Forum

候補抽出② DB情報参照
Peptide Atlas （http://www.peptideatlas.org/)

Top画面からタンパク質名称を入力（Uniprotで最も適切な名称を選ぶ）
Input protein name(refer uniprot)

9th JBF Symposium, DG2017-31

http://bioanalysisforum.jp/

LC-MSで同定されたペプチドのデータベースで、各タンパク質ごとにどのような断片ペプチドが良く分析されたのを推測することができる

24

Japan Bioanalysis Forum

候補抽出② DB情報参照

http://bioanalysisforum.jp/

Example: CCL2 protein

Input protein name (Uniprot)&
Choose appropriate entry

9th JBF Symposium, DG2017-31

25

Japan Bioanalysis Forum

候補抽出② DB情報参照

http://bioanalysisforum.jp/

Sequence motifs view

Peptides observed by LC-MS/MS(red bar)

9th JBF Symposium, DG2017-31

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Japan Bioanalysis Forum

候補抽出② DB情報参照
Sequence view

http://bioanalysisforum.jp/

Peptide observed by
LC-MS/MS is shown in red.

In the web, you can scroll thisbar to see entire sequence.

9th JBF Symposium, DG2017-31

27

Japan Bioanalysis Forum

候補抽出② DB情報参照

Number of
Observation
by LC-MS

PeptideaccessionExperiment
information

http://bioanalysisforum.jp/

Peptide information

Density means No. of observation
In this case, animal and organ is shown (left),link to reference is also shown (below)

9th JBF Symposium, DG2017-31

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Japan Bioanalysis Forum

候補抽出② DB情報参照

Link toProduct ion
spectrumMS instrument

9th JBF Symposium, DG2017-31

Fragmentation

http://bioanalysisforum.jp/

Information of each peptide

29

Japan Bioanalysis Forum

候補抽出② DB情報参照

http://bioanalysisforum.jp/

Product ion spectrum

9th JBF Symposium, DG2017-31

30

Japan Bioanalysis Forum

候補抽出③ In Silico抽出
https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/pa
Skyline (free software)ge.view?name=tutorial_method_edit_ja
is the most favorable among many other method and tools

 「ペプチド設定」・「トランジション設定」にてクライテリアを設定

 FASTA形式のタンパク配列を貼り付けると消化産物とそのトランジションが表示される．
Input the protein sequence in FASTA format, peptide sequence and its transition will be shown>sp|P02769|ALBU_BOVIN Serum albumin OS=Bos taurus GN=ALB PE=1 SV=4
MKWVTFISLLLLFSSAYSRGVFRRDTHKSEIAHRFKDLGEEHFKGLVLIAFSQYLQQCPF
DEHVKLVNELTEFAKTCVADESHAGCEKSLHTLFGDELCKVASLRETYGDMADCCEKQEPERNECFLSHKDDSPDLPKLKPDPNTLCDEFKADEKKFWGKYLYEIARRHPYFYAPELLYY
ANKYNGVFQECCQAEDKGACLLPKIETMREKVLASSARQRLRCASIQKFGERALKAWSVARLSQKFPKAEFVEVTKLVTDLTKVHKECCHGDLLECADDRADLAKYICDNQDTISSKLKE
CCDKPLLEKSHCIAEVEKDAIPENLPPLTADFAEDKDVCKNYQEAKDAFLGSFLYEYSRR
HPEYAVSVLLRLAKEYEATLEECCAKDDPHACYSTVFDKLKHLVDEPQNLIKQNCDQFEKLGEYGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVEVSRSLGKVGTRCCTKPESERMPCTEDYLSLIL
NRLCVLHEKTPVSEKVTKCCTESLVNRRPCFSALTPDETYVPKAFDEKLFTFHADICTLPDTEKQIKKQTALVELLKHKPKATEEQLKTVMENFVAFVDKCCAADDKEACFAVEGPKLVVSTQTALA

9th JBF Symposium, DG2017-31

http://bioanalysisforum.jp/

Fix the criteria to select peptide and transition

31

Japan Bioanalysis Forum

適格性の判断 配列特異性
定量するペプチドが目的のタンパク質に固有なことの確認方法
How to confirm the peptide for quantitation is characteristic to the target protein

PubmedのWeb下方
Blastへのリンクから“Protein Blast”
右赤字部を入力してBLASTボタン押下

Input peptide sequence

Define the database (Uniprot will be fine)

http://bioanalysisforum.jp/

BLAST Search（NCBI）
を用いる方法Define the taxonomy (mammals will be fine)

9th JBF Symposium, DG2017-31

32

Japan Bioanalysis Forum

適格性の判断 配列特異性
Ident (Identity of residue)
Query cover (Identity of length)“Query cover” と “Ident” 両方100％のものが１つしかなければ、その配列は１つのタンパク質に固有である。

http://bioanalysisforum.jp/

BLAST result

When there is only one entry shows 100% both “Query cover” and “Ident”, the sequence is characteristic to the target protein

Isoformがいくつかヒットしても、元のタンパク質が同じ名前なら固有配列と考えてよい（Isoformそのものを区別したい場合を除く）
If some isoforms are shown we can consider “characteristic” as long as protein names are same except that we want to distinguish the isoforms.

9th JBF Symposium, DG2017-31

33

Japan Bioanalysis Forum

適格性の判断 配列特異性＜Skylineを用いた方法＞

https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/
page.view?name=tutorial_method_edit_ja

 Uniprotから目的動物種のproteomeファイルを入手する．http://www.uniprot.org/proteomes/

動物種を入力Input animal species

 Proteomeファイルをskylineにて取り込み，編集→ユニークペプチドを選択すると，タンパクとproteomeのタンパクリストとの配列の一致を確認できる．
We can compare quantitate candidate peptide with protein sequence from the proteome files

http://bioanalysisforum.jp/

Get proteome files of target species from uniprot

Rat Albuminペプチド配列を検索すると，
Proteomeファイルからalbuminタンパク配列だと同定される．

9th JBF Symposium, DG2017-31

34

Japan Bioanalysis Forum

適格性 化学的性質








アルギニンまたはリジン残基がC末端である、trypsin消化ペプチド断片
6～16アミノ酸のペプチド配列
メチオニンまたはシステイン残基を含まない
翻訳後修飾およびSNPを含まない
アルギニン、リジン残基が連続しない(RR, KK, RK, KR)
プロリン残基がC末端のアルギニン、リジン側に存在しない(KP,RP)
膜貫通領域に存在しない（膜タンパク）＜Sufficient conditions＞

ヒスチジン残基を含まない
グリシン・プロリン残基を含む
LCの溶出時間が構成アミノ酸の脂溶性から予測可能構成されるアミノ酸のうち，脂溶性アミノ酸が40%以下

http://bioanalysisforum.jp/＜Necessary conditions＞

Fluids Barriers CNS. 2013 Jun 8;10(1):21

9th JBF Symposium, DG2017-31

35

Japan Bioanalysis Forum

測定対象ペプチドの選択（抗体医薬品）

可変領域
 マトリックス・抗体医薬品が同種由来の場合でも特異性を持たせられる．
 特異性を確認するためのBLAST検索・ブランクマトリックスを用いた検討が必要．
定常領域
 種が異なる場合には好適．
 定量に適した配列情報がある．
 マトリックス・抗体医薬品が同種由来の場合は定量対象抗体に対するアフィニティー
精製が必要である．（コスト高）
 高感度なペプチド配列の報告あり．Bioanalysis. Jun;5(11):1363-76 (2013)

9th JBF Symposium, DG2017-31

http://bioanalysisforum.jp/

抗体医薬品の場合は標品を用いることができる．標品の消化しペプチドの検出・ブランクマトリックスを用いた特異性確認が可能．

36

Japan Bioanalysis Forum

測定対象ペプチドの選択（抗体医薬品）① 可変領域② 定常領域③ 可変領域・定常領域、両方④ その他

 特異的である可変領域の選択が多い．

http://bioanalysisforum.jp/

抗体医薬品定量で使用する定量部位

アンケートQ16より9th JBF Symposium, DG2017-31

37

Japan Bioanalysis Forum

測定対象ペプチド選択方法のまとめ
標的タンパクは内因性である

測定対象ペプチドの決定（可変領域 or 定常領域）
ブランクマトリックスを用いた特異性・定量性確認
タンパク標品が利用可能か

可能

不可能

①

タンパク標品を消化し，測定対象ペプチドを決定する
データベース・論文での定量報告がある

なし
③

あり

• in silicoで測定候補のペプチドを検索する• 目的の生体試料や発現系を用いて，標的タンパクのin silicoで検索した理論消化断片を検出• 検出できたペプチド配列を用いて特異性・定量性の確認

http://bioanalysisforum.jp/

抗体医薬品等の外因性タンパク

内因性②

DBの測定データを参照し，そのペプチドを用いて定量する
選択したペプチドの適格性を判断（Blast検索／化学的性質）

9th JBF Symposium, DG2017-31

38

Japan Bioanalysis Forum

標的タンパク定量情報

候補数

補足

既知情報がない場合

3～5本程度ペプチドの合成品を購入し、測定条件設定後
実マトリックスを消化・測定してみる．

既知情報がある場合

1本でも可

Peptide atlasや参考文献のデータに載っていれば、1本で十分定量が可能．

定量で用いるペプチド本数
① 1本
② 2本
③ 目的により変更する④ その他

http://bioanalysisforum.jp/

測定対象ペプチドの候補数

 複数本使用するという回答では，定量性・特異性を担保するために複数ペプ
チドをモニターするという意見が多かった．
アンケートQ25より

9th JBF Symposium, DG2017-31

39

プレカーサ―／プロダクトイオンの選択
Selection of precursor / product ions

9th JBF Symposium, DG2017-31

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum40

Japan Bioanalysis Forum

定量に使用するMSの種類

三連四重極型（QqQ）

高分解能MS

飛行時間型
（TOF）

m/zによりイオンを選択的に透過するマスフィ
ルターとしての四重極2本の間に衝突室としての四重極1本を配置したタイプの質量分析
計

Kingdon trap型・Orbital trap型

m/zの違いによる検出器までの到達時間の違いを利用するTOF型や電場や磁場により発生させた周回運動の周期からm/zを検出するKingdon trap型，フーリエ変換イオン
サイクロトロン共鳴（FT-ICR）など

9th JBF Symposium, DG2017-31

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四重極MS

41

Japan Bioanalysis Forum• SIM (Selected ion monitoring) ：特定のm/zをもつイオンのみを検出するモード．Precursor ion scanとも呼ばれます．
• SRM (Selected reaction monitoring) ：Precursor ionから生成した特定のProduct ionを検出するモード• MRM (Multiple reaction monitoring) ： SRMに同じ• Product ion scan：
特定のm/zを持つイオン (Precursor ion) から生成したイオンのspectrum(Product ion spectrum) を得るモード• PRM (Parallel reaction monitoring) ：Product ion scanの一種でscan (掃引，スイープ) ではなく同時的に全spectrumを得る機種 (主に高分解能MS）に対して用いる用語

9th JBF Symposium, DG2017-31

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Scanモードの解説

42

Japan Bioanalysis Forum•

Data dependent analysis (DDA， Data dependent scan，Data
dependent MS/MS) ：①LCで分離したペプチドイオン全てを設定したm/z範囲で高分解能Full scan
② ①で強度が高かった上位数個のprecursor ionを四重極で選択しコリジョンセルに導入し, 各々のProduct ion spectrumを取得する. 以降①②を繰り返す.
強度が弱いprecursor ionは取りこぼす可能性がある．

•

Data independent analysis (DIA，Data independent MS/MS，
SWATH，All ion fragmentation)：
予め決めた観測範囲を数Da幅に区切り，その範囲のprecursor ionを全てコリジョン
セルに導入しproduct ion spectrumを得る．区切り順にScanし観測範囲の全
precursor ionに対するproduct ion spectrumが得られる． ただし，Production spectrumには複数のprecursor ionから生じたfragmentが記録されるため，解析には予めDDA法で取得したproduct ion spectrumのライブラリが必要である.
観測できた全てのペプチドを一度に定量できるが, 解析は複雑になる．

9th JBF Symposium, DG2017-31

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Scanモードの解説

43

Japan Bioanalysis Forum

質量分析装置の特徴：タンデム型四重極• データポイント不足の恐れが少ない⇒1transitionあたりのscanが短い• 普及度が高い⇒低分子化合物の定量で利用されている• 高分解能MSより高感度• 異なる装置間でほぼ同様に定量可能

Cons• 設定したtransition以外の情報は取得できない⇒測定後にフラグメントの確認ができない• m/zの上限が低い⇒高感度な装置でもm/z2000程度が限界• 分解能が低い⇒1.0～0.3程度のため，価数違いの夾雑が重なりやすい• バックグランドが高い傾向にある• LCやMS条件検討が必須

9th JBF Symposium, DG2017-31

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Pros

44

Japan Bioanalysis Forum

質量分析装置の特徴：高分解能MS
Cons• データ容量が大きい• m/zレンジが広い• Scan速度が遅い• 精密質量定量⇒高選択性⇒Kingdon trap型の特徴⇒データポイント数が少なくなる• Full scan定量が可能⇒測定後にフラグメント確認が可能• 定量性に懸念あり⇒ダイナミックレンジとして，104が限界、• メソッドの構築が容易⇒プレカーサーのみ選択すればよい
105は飽和領域• PRMやSIMでも定量が可能• Data dependent scanが可能• S/Nが高いため、Transitionの合算がしやすい

9th JBF Symposium, DG2017-31

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Pros

45

Japan Bioanalysis Forum

プレカーサーイオンの選択
1. ホールタンパク質/ホールタンパク質合成品を使用する場合
酵素消化等の前処理を行い，MS分析を行う．
強度の高いペプチドを選択する

タンデム四重極

高分解能MS データベースや文献から想 Data dependent scan
定したトランジションを設から確認する
定して確認する
 2価のプレカーサーイオンが優先的に検出されることを想定してトランジションを組む
 価数違いで複数のトラン
ジションを設定して確認する

http://bioanalysisforum.jp/

着目点⇒ 選択性が悪いため

9th JBF Symposium, DG2017-31

46

Japan Bioanalysis Forum

プレカーサーイオンの選択
1. ホールタンパク質/ホールタンパク質合成品を使用する場合（続き）
保持時間が適当なペプチドを選択する

タンデム四重極

高分解能MS

親水性が高いペプチド，疎水性が高いペプチドは候補から外す⇒ 逆相系の保持時間は，親水性が早く，疎水性が遅いため⇒ ペプチド中の疎水性アミノ酸含有率から判断することもある

長さが妥当なペプチドを選 分子量の目安は800～2000程度⇒ 装置のm/zレンジ内に入るようにする
択する
価数が低いペプチドを選択する

２価＞３価＞４価の順に選択する⇒ 価数が大きいものはプロダクトイオンが複雑化し，強度が分散するため，感度が落ちる傾向にある⇒ チューニングを行い，2価イオンの強度を上げる⇒ 装置により，検出価数が異なることがある

9th JBF Symposium, DG2017-31

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着目点

47

Japan Bioanalysis Forum

プレカーサーイオンの選択

着目点は，「ホールタンパク質/ホールタンパク質合成品を使用する場合」と同様



合成ペプチドは複数用意することが望ましい• 測定候補のペプチドの実測の感度を確認して，選定するため• 予備検討を効率的に実施するため→ 1つずつの購入の場合，合成→納品に時間がかかってしまう• 実マトリックスの影響を確認するため→ マトリックス効果や夾雑物の影響などを判断する



価数違いで確認を行う→ 保持時間とスペクトルパターンから目的物質であることを確認

9th JBF Symposium, DG2017-31

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2. 合成ペプチドを使用する場合測定するタンパク質の標品が入手できないときの対策

48

Japan Bioanalysis Forum

プロダクトイオンの選択
1. トランジションの選定方法
確認事項及び理由

強度が高いプロダクトイオンを選択する

プロダクトイオンの実測データから判断する

プレカーサーイオンのm/zよりも大きいプロダクトイオンを選択する

S/N比が高くなり，ベースラインが低くなるため、特異性が高くなる

アミノ酸の帰属が可能なものを選択する

帰属不可のピークは選択しない

yイオンを選択する• イオントラップ型や高分解能型はyイオンを検出しやすい• KもしくはRをラベル化したISを用いる場合には，ISとAnalyteのプロダクトイオンが異なるので干渉しにくい
9th JBF Symposium, DG2017-31

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着目点

49

Japan Bioanalysis Forum

プロダクトイオンの選択
2. トランジションの設定数
着目点

メソッド構築• 可能な限り，たくさんのトランジションを設定した方がよい• ピークのデータポイント数は気にしない• Skylineなどのソフトを上手に活用し，手間を省く

実マトリックスを用いた検討• 定量に使用するモノも含めて，最低3トランジションを設定
する
ただし，バリデーションを実施し，1トランジションでも測定可と判断した場合，1トランジション設定でも構わない• 複数トランジションの保持時間、強度比パターンから
Analyteであることを確認する• 高分解能MSは測定後に検証できることから複数トランジションを設定する必要はない

9th JBF Symposium, DG2017-31

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ステージ

50

Japan Bioanalysis Forum

測定法の検証 標品を添加した実マトリックスや代替マトリックスを前処理し、分析を行う

 測定法の妥当性評価は，BMVガイドラインに倣って目的に応じた評価を実施する
アンケートQ13より：LC-MS/MSにて抗体医薬品の定量分析を実施した時の目的，
適応基準を教えて下さい．（複数回答可）① GLP適用の定量試験（バリデーション試験含む）② 信頼性基準適用の定量試験（バリデーション試験含む）③ 適応規制なしの定量試験（バリデーション試験含む）④ 探索、検討レベル⑤ 経験なし ⑥ その他
9th JBF Symposium, DG2017-31

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 感度，夾雑物質との分離，ピーク形状，キャリーオーバー，保持時間やS/N比などを総合的に判断してトランジションを決定する

51

Japan Bioanalysis Forum

プレカーサ―／プロダクトイオン選択方法のまとめ使用する装置を選択
タンデム四重極
想定トランジションを設定した分析

II. プレカーサーイオンの選択
①
②
③
④

①
②
③
④

強度
保持時間
長さ
価数

III. タンパク質・合成ペプチドの購入
IV. プロダクトイオンの選択
①
②
③
④

強度
m/z
アミノ酸帰属yイオン or bイオン

V. 測定法の検証

LC-BMVを参考

高分解能MS
Data dependent scan

強度の高いものを選択
親水性、疎水性が極端に高いペプチドは外す
MW 800～2000程度
2価＞3価＞4価の順に選択

複数の合成ペプチドもしくはタンパク質を購入①②③④

強度の高いものを選択
プレカーサー ＜ プロダクトを推奨
帰属ができる配列を選択
yイオンの方がBetter

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I.

直線性、日内/日間再現性、添加回収率･･･

9th JBF Symposium, DG2017-31

52

Japan Bioanalysis Forum

Q＆A 消化せずにホールタンパク質を定量

A：① 高分解能MSを使用装置に選択する② Deconvolution*を行う⇒ 分子量が単一であることを確認する⇒ 修飾を受けていないことを確認する③ 価数が低いものから強度の高いイオンを選択する④ CIDスペクトルから強度の高いフラグメントを選択する

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Q：10kDa程度のタンパク質を消化せずにホールで分析したい．
（標準品と生体中のAnalyteが同一である場合）*：ESIでイオン化して分析を行う場合，多価イオンが生じることにより１つの化合物に対して複数のm/zのスペクトルが観測されます．観測された多価イオンに対して，PCを用いて数学的な処理を行うことにより，元の化合物の分子量または１価におけるm/zを算出することができます．この値と化合物データを比較することにより，観測しているピークが化合物由来であることを確認します．

9th JBF Symposium, DG2017-31

53

Japan Bioanalysis Forum

Q＆A
デコンボリューションとは抽出イオンクロマトグラム(m/z 1700-4000)

デコンボリューション
マウス細胞由来の抗体スペクトル

デコンボリューションして質量に変換

エリスロポエチンのインタクトMS

抗体医薬品のマススペクトル
抗体の質量およびその分布により，• 目的のタンパク質が生合成されていること• ガラクトース付加の大まかな分布が推察される

非常に複雑なマススペクトルが得られているが，ほぼすべてのピークが糖鎖構造の違いとして帰属される。
• 結合するシアル酸の分布や糖鎖の分岐• ラクトサミン構造の付加の程度

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68-75分のマススペクトル

J. Mass Spectrom. Soc. Jpn Vol. 64, No.3, 2016

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54

Japan Bioanalysis Forum

Q＆A

Q：ISでラベルした箇所のプロダクトイオンの選択は必須なのか
A：必須ではないが，分子量差が小さいものがある場合は価数違いで重なる可能性が高いので留意する必要はある

9th JBF Symposium, DG2017-31

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 プロダクトイオンの選択

55

Japan Bioanalysis Forum

Q＆A
Q：感度が低い場合，設定した複数トランジションの強度を合算した解析を行うべきか
A：合算しなければならないようでは正確な定量が難しい．定量下限やマトリックスの量などを見直した方がよい（DG内での意見より）
四重極型MSよりも高分解能MSの方がS/N比が高い
ため，合算の恩恵が得られやすい

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 解析

合算解析をする前に･･･
 定量下限域にて，真度精度が改善するかを確認する
 クロマトグラムのS/N比が改善するかを確認する
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56

LC-MSとLBA
Comparison between LC-MS and LBA

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Japan Bioanalysis Forum57

Japan Bioanalysis Forum

LC-MS

LBA

検出

○ 直接的（ただし消化断片）

△ 間接的

感度

△ LBAよりは低感度（μg/mL）前処理なしの場合○ 高感度（pg/mL）

分析対象○ 多成分同時定量可能△ 単一成分分析

抗体の必要性○ 抗体は不要△ 良い抗体が必要（抗体作成に要6か月）

測定系構築難易度

比較的容易

抗体作成に6か月の期間と作製費用スループット△ スループットは低い○ 高スループット

機器の価格

△ 高額

○ 比較的安価

標品○合成ペプチドは安価・品質が安定△高価・Lot間差のおそれ

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LC-MSとLBA

LC-MSとLBAは相補的に用いることが出来る
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58

Japan Bioanalysis Forum

LC-MSとLBA
Q35.タンパク質をLC-MSとLBAの両方で定量した経験

① YES
② No
③ others

Q36. LC-MSとLBAの結果が異なった経験及びその考察
結果

考察

異なった

タンパクの部分分解が示唆された異なった

原因不明。交差性や修飾の差異がみられたのか，断片の選定が良くなかったのか不明

異なったプログラム全体で特定の測定方法が用いられていれば特に問題はない

異なった測定法のダイナミックレンジや前処理含め考察

異なった抗体の特異性に起因

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アンケート結果より同じ
異なった

抗抗体，トータルフリー議論

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アンケートQ35 & Q36より

59

Japan Bioanalysis Forum

Summary of a questionnaire for quantitative analysis for large
molecules by LC-MS
実施期間：
配布先：
有効回答数：

2017年10月8日～10月20日
DGサポーター（213名）
JBFパートナー(38社)
58名

Term
Distributed to
Valid responses

8 Oct 2017 to 20 Oct 2017
DG supporters (213), JBF partners (38)51
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DG2017-31
高分子のLC-MS定量分析
アンケート結果

60

Japan Bioanalysis Forum

回答者背景

BackgroundQ1 所属について教えてください。
① 製薬
② CRO
③ その他

その他（全4件）③ Others① Pharmaceuticals② CRO③ Others

・食品（3件） ・未記入（1件）
Food products
No comments

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Working at?

61

Japan Bioanalysis Forum

タンパク質のLC-MS/MSによる分析経験
Experience of quantitative analysis for proteins by LC-MS/MSQ2 LC-MS/MSでのタンパク質定量分析の実施経験について教えて下さい。
①経験あり②これから実施予定③経験はないが興味はある
④経験なし
⑤その他
① YES
② No but have plans in the near future③ No but interested in it④ No experience⑤ Others

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Do you have experience of quantitative assay for proteins by LC-MS/MS?

62

Japan Bioanalysis Forum

タンパク質のLC-MS/MSによる分析経験
Q3 LC-MS/MSにて定量分析を実施した経験のあるタンパク質はどのようなものがありますか（前の設問で「②これから実施予定」を選択された方は今後の予定をご回答ください、以下同様）
What kinds of proteins have you analyzed quantitatively by LC-MS/MS?
(For person to select “②No but have plan in the near future”, select your plan.
① 内因性成分② 抗体医薬③ 内因性成分と抗体医薬どちらも④ 経験なし⑤ その他① Endogenous substance② Antibody drug
③ Both ①and②④ No experience⑤ Others

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Experience of quantitative analysis for proteins by LC-MS/MS

その他（全2件）
・内因性物質、抗体以外のタンパク医薬（1件）⑤ Others
・微生物由来タンパク質（1件）
Endogenous substance and protein drug other than antibody,
microorganism-derived proteins

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63

Japan Bioanalysis Forum

タンパク質のLC-MS/MSによる分析経験
Experience of quantitative analysis for proteins by LC-MS/MS

LC-MS/MSにてタンパク質を定量分析を実施した経験のある試料は（血漿，尿，組織，細胞）どのようなものがありますか．
（自由記述）

What kind of matrices (plasma, urine, tissue, cells etc) have you analyzed todetermine protein concentrations by LC-MS/MS?
# of answers
Plasma

19

Cells

9

Tissue/Tissue homogenate

10

Serum

5

Urine

3

Tears

1

No experience/No

2

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Q464

Japan Bioanalysis Forum

HPLC for quantitative analysis of proteins
Q5 タンパク質MS定量分析に使用しているHPLCを教えてください．
（複数回答可）① コンベンショナル② マイクロフロー③ ナノフロー
④ その他① Conventional② Microflow③ Nanoflow④ Others

コメント（1件）
Comment

・2D-LC（カラムスイッチング）（①を選択された方）
2D-LC (Column Switching)

その他（3件）④ Others

・経験なし（2件） ・未記入（1件）
No experience
No comments

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What kinds of HPLC do you use for quantitative analysis of protein by LC-MS?

65

Japan Bioanalysis Forum

HPLC for quantitative analysis of proteins
前の設問で回答いただいたHPLCを使用している理由があれば教えてください．
Reasons to use the HPLC selected in Question 5

HPLC

Reasons# ofanswers

Conventional

ナノフローやマイクロフローはイオン化に対しては効果的ではあるが，注入量の制限やクロマトグラムへの影響がありますので，状況に応じてバランスを取る必要があると考えております．

1

Throughput

3

No reasons

3

Nanoflow and microflow works efficiently for ionization. But it has limitation of
injection volume and long analysis time. Choice HPLC case by caseStability/Nexcera

1 eachOnly conventional LCs are in my facility1

定量はコンベンショナル、探索・同定はナノを基本としていますが、マイクロ、ナノでの定量の必要がある場合は変更可能 Basically, conventional is used for quantitative analysis, and1

コンベンショナルはサンプルの注入量を増やすことにより感度が稼げる場合がある。 Sensitivity of1

コンベンショナルより感度が良く、取扱いがナノフローほど手間が掛からない。
More sensitive than conventional and takes less time than nanoflow

1

Sensitivity

1

Nanoflow

Sensitivity

6

2D-LC (column switching)

9th JBF
Symposium, DG2017-31
Purification of digestive
peptides1

nanoflow is used for detection and identification (qualitative analysis)

analysis with conventional can be achieved by increasing injection volume

Microflow

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Q666

Japan Bioanalysis ForumMS

for quantitative analysis of proteins

Q7 タンパク質分析に使用している質量分析計を教えてください．
（複数回答可）① タンデム四重極 (QqQ)② orbital trap（電場型/磁場型）③ TOF MS / Q-TOF MS④ その他① Triple quadrupole (QqQ)② Orbital trap
③ TOF MS / Q-TOF MS④ Others
その他（3件）④ Others

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What kinds of mass spectrometer do you use for analysis of proteins?

・経験なし （2件）・未記入（1件）
No experience
No comments

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67

Japan Bioanalysis ForumMS
Q8

for quantitative analysis of proteins

前の設問で回答いただいた質量分析計を使用している理由があれば教えてください．

MS

Reasons

QqQ, orbi trap, and TOF
MS/Q-TOF MS

分析対象や目的に応じてDepending on analyte or purpose

1

QqQ and orbi trap

アイソバリックタグを用いた相対定量分析ではQ-Exactive、安定同位体ペプチドを用いた定量分析ではQqQを使用。Q-Exactive for relative quantitation with isobaric tag,
QqQ for quantitation with peptides of SI

1

QqQ and TOF MS/Q-TOF
MS

No reasons

1

QQQでの定量が難しい場合は精密質量分析計を使用。精密質量分析計は主に断片検索、網羅解析等に使用。TOF MS/ Q-TOF MS for qualitative assay when it’sdifficult to measure target peptides quantitatively with QqQ.

1

TOF-MSでペプチド断片検索し、四重極で定量分析している
TOF-MS : qualitative (peptide fragment) , QqQ : quantitative analysis

1

QqQ

Orbi trap# ofanswers

Stability/QTRAP6500/dynamic range/improvement of quantitative
performance

1 eachSensitivity

3

Only QqQs are in my facility

1High resolution

2

9th JBF Symposium, DG2017-31

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Reasons to use the mass spectrometer answered in Question 7

68

Japan Bioanalysis Forum

試験目的と適応基準（内因性タンパク質の定量分析）
The purpose and criteria of the studies (analysis of the endogenous protein)

What’s the purpose and criteria when performing quantitative analysis of
endogenous proteins by LC-MS/MS① GLP適用の定量試験（バリデーション試験含む）② 信頼性基準適用の定量試験（バリデーション試験含む）③ 適応規制なしの定量試験（バリデーション試験含む）④ 探索、検討レベル⑤ 経験なし、⑥ その他

コメント（1件）
Comment

・測定法開発時④、実測定
時②④ for Method Development② for sample analysis① Quantification for GLP (include validation)② Quantification for reliability standard(include validation)③ Quantification without regulatory requirement(include validation)④ Research or method development⑤ No experience, ⑥Others

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Q9 LC-MS/MSにて内因性タンパク質の定量分析を実施した時の目的、適応基準を教えて下さい．（複数回答可）

69

Japan Bioanalysis Forum

アミノ酸配列確認（内因性タンパク質の定量分析）
How to confirm amino acid sequence of the target endogenous protein

How do you confirm amino acid sequence of the target protein for
quantitative analysis for endogenous protein?
① 文献調査② Website上のデータベースを利用③ その他① Literature survey② Database on the Website③ Others
コメント1
Comments

・既報があれば文献から（②を選択された方）
From literatures if possible

コメント2
Comments

・経験なし（③選択2名、コメントのみ入力1名）
No experience

9th JBF Symposium, DG2017-31

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Q10 内因性タンパク質を定量する場合，目的タンパク質のアミノ酸配列はどのように確認していますか．

70

Japan Bioanalysis Forum

アミノ酸配列確認（内因性タンパク質の定量分析）
Q11

前の設問にて「Websiteのデータベースを利用」と回答された方のみご回答下さい．タンパク質のアミノ酸配列の確認によく利用する
データベースを教えて下さい．
For person to select “②Database on the Website” in Q10,
What database on Web do you utilize to confirm amino acid sequence of thetarget endogenous protein would be measured?
① Uniprot② NCBI③ その他① Uniprot② NCBI③ Others

その他（2件）③ Others

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how to confirm amino acid sequence of the target endogenous protein

・経験なし（2件）
No experience

9th JBF Symposium, DG2017-31

71

Japan Bioanalysis Forum

アミノ酸配列確認（内因性タンパク質の定量分析）
How to confirm amino acid sequence of the target endogenous protein

Q12 前の設問で回答いただいたデータベースをよく利用する理由があれば教えてください．
Data baseReasons① Uniprot（18件）① 他のデータベースを使った経験がないから

12

信頼性 Reliable6

No experience to utilize another data base on Webs.

②他と比べて気に入っている
ところがある
More favorite
than anotherdata base

気に入っている点# ofanswers

見やすさや機能 Visible and function
主にスタンダードなデータベースとして用いられており、汎用性がある。 Versatility
Protein IDがそのまま、多くの別のデータベースや、解析ソフトウェアなどで用いることが出来る。

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The reason to utilize its data base on Webs. - continued Q10 and Q11.

It is possible to use Protein ID at a lot of anotherdatabase and analysis systems.

網羅性が高い Completeness
内容が詳しい Detailed content② NCBI（1件）① 他のデータベースを使った経験がないから
No experience to utilize another data base on Webs

9th JBF Symposium, DG2017-31

172

Japan Bioanalysis Forum

試験目的と適応基準
Q13 LC-MS/MSにて抗体医薬品（注：内因性タンパク質でなく抗体医薬品、
以下の質問も同様）の定量分析を実施した時の目的、適応基準を教えて下さい．（複数回答可）
What’s the purpose and criteria when performing quantitative analysis of
antibody drugs by LC-MS/MS① GLP適用の定量試験（バリデーション試験含む）② 信頼性基準適用の定量試験（バリデーション試験含む）③ 適応規制なしの定量試験（バリデーション試験含む）④ 探索、検討レベル⑤ 経験なし、⑥ その他① Quantification for GLP (include validation)② Quantification for reliability standard(include validation)③ Quantification without regulatory requirement(include validation)④ Research or method development⑤ No experience, ⑥Others
9th JBF Symposium, DG2017-31

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The purpose and criteria of the studies

73

Japan Bioanalysis Forum

アミノ酸配列確認（抗体医薬品の定量分析）
How to confirm amino acid sequence of the target antibody drug

When quantitating antibody drugs, How do you confirm the amino acidsequence of the target antibody for quantitative analysis of antibody drugs?
① 文献調査② Website上のデータベースを利用③ その他① Literature search② Database on the website③ Others

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Q14 抗体医薬品を定量する場合、目的抗体のアミノ酸配列はどのように確認していますか．

その他（9件）③ Others
・社内データベース（2件） ・開発品目であり、実際にアミノ酸配列は調べられている・合成している人に確認すると思う。 ・ケースバイケース
・経験なし（3件）
In-house database, Already known because of new chemical entities, ask to the synthesis group, case by case, …

9th JBF Symposium, DG2017-31

74

Japan Bioanalysis Forum

アミノ酸配列確認（抗体医薬品の定量分析）
How to confirm amino acid sequence of the target antibody drug
前の設問にて「Websiteのデータベースを利用」と回答された方のみご回答下さい．抗体医薬品のアミノ酸配列の確認によく利用する
データベースを教えて下さい．

For person to select “②Database on the Website” in Q14, what database on the Web are
frequently used to confirm the amino acid sequence of antibody drugs?
① DrugBank database② その他① DrugBank database② Others

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Q15

その他の具体的回答（全5件）② Others
・利用しない・経験なし
・意見無し（2件）
・Skyline
Not use, no experience, no comments, Skyline (software)・便利（だが一部間違いもある） （①を選択された方）
コメント
Comments
Convenient (but a part of incorrect is existed)

9th JBF Symposium, DG2017-31

75

Japan Bioanalysis Forum

抗体医薬品の定量部位
Region of antibody drugs to use for quantitative analysis

Q16

抗体医薬品の定量で使用する定量部位について教えてください．

① 可変領域② 定常領域③ 可変領域・定常領域、両方④ その他① Variable regions② Constant regions③ Both variable / Constant regions④ Others

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Which region is used for quantitative analysis of antibody drugs?

その他の具体的回答（全4件）④ Others
・経験なし（3件）No experience
コメント
Comments

・意見無し（1件）No comments

・基本は可変領域をねらいます（1件） （③を選択された方）
Targeted variable regions basically

9th JBF Symposium, DG2017-31

76

Japan Bioanalysis Forum

抗体医薬品の定量部位
Region of antibody drugs to use for quantitative analysis

Q17 前の設問にて，その定量部位を選択する理由を教えて下さい．
定量部位

Reasons①可変領域
Variable regions

選択性が高いため (同様3件) Highly selectivity (3 same answers)③可変領域・
定常領域、両方
Both regions

部位にこだわらずターゲットペプチドのアミノ酸配列薬物に応じて分析上頑健と思われる配列を選択する

マトリックスが動物血漿であったため Matrix was animal plasma
Regardless of the regions, the sequence which was suitable for analysis was selected.

測定だけなら選択性などの状況が優先されるが，抗体の構造や何を捉える必要があるかによってわけている．
The target region was selected according to the purpose of the analysis.

特異性、感度等を注意深く評価

From the score of sensitivity, selectivity, etc.,

定常領域は他抗体医薬品にも応用可能だから。可変領域は臨床試験を想定して実施。 The Constant region
was also can be used for other antibody drugs. The variable region was selected for clinical trials.
特異性がとれれば、どちらでも選択可能だと考えているため。

Both regions can be selected if selectivity would be confirmed

可変領域は臨床、定常領域は非臨床（ただし特許が絡むので研究目的）Variable regions are used in clinical

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Why the region was selected for the quantitation in Q16?

studies, and constant regions are used in nonclinical studies (only research purpose).

可能であれば可変領域のペプチド，特異的な抗体などがあれば定常領域のペプチドで。Use peptides fromvariable regions if possible, otherwise use peptide from constant regions with affinity purification.

定常領域は、普遍的に抗体を定量できる。可変領域は特異的な抗体の定量ができる。 Constant regions can beapplied for various antibodies. Variable regions can be used for quantitation of specific antibodies.

特異性（基本は可変領域を狙います） Specificity (Basically variable regions are targeted.)

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77

Japan Bioanalysis Forum

測定対象ペプチド配列の検索
Q18

内因性タンパク質を酵素消化して、ペプチド断片にて定量する場合，定量候補ペプチドはどのよ
うに検索していますか．LC-MS測定文献がなく、タンパク質標品が入手が難しい場合のアプロー
チ方法を教えて下さい．
How to search target peptides when endogenous protein concentration would be determined
quantitatively as peptide fragment after digestion? (In case it is difficult to obtain the whole protein
standard or get literature of LC-MS.)① アミノ酸配列から酵素による理論的断片を作成して選択② Website上のデータベース③ その他① Select by making a theoretical fragment from theamino acid sequence when enzymatically digested② Databases on the website③ Others
コメント（2件）
Comments

・②と併用することも（①を選択の方）、・Skyline（①を選択の方）
Both 1 and 2, skyline …

その他（4件）③ Others

・①と②の両方＋Blast
Both 1 and 2 + Blast

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How to search target peptide fragments

・経験なし（3件）
No experience

9th JBF Symposium, DG2017-31

78

Japan Bioanalysis Forum

測定対象ペプチド配列の検索
How to search target peptide fragments

For person to select “②Database on the Website” in Q18,
which databases do you use frequently to search for fragmented peptides.

PeptideMass
SRMAtlas (2)、 peptide atlas
Proteomics DB
Uniprot

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Q19 前の設問にて「Websiteのデータベースを利用」と回答された方のみご回答下さい．酵素消化後のペプチド断片検索によく利用するデータベースを教えて下さい．（記述式）

iMPACT

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79

Japan Bioanalysis Forum

測定対象ペプチド配列の選択 （BLAST検索）
Q20

候補ペプチド断片の絞り込みとして、そのペプチドのアミノ酸配列がユニークな配列であるかをBLAST検索する場合，どのプログラムを使用していますか．
Which program do you use when using BLAST to determine if the amino acidsequence of the target peptide is unique?
① BLAST (UniProt)② BLAST (NCBI)③ BLAST (PBIL)④ その他① BLAST (UniProt)② BLAST (NCBI)③ BLAST (PBIL)④ others

コメント（1件）
Comments

・combination（①を選択された方）

その他（4件）④ Others

・Protein prospector ・Skyline
・経験なし（2件）
No experience

9th JBF Symposium, DG2017-31

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How to select target peptide fragments (BLAST search)

80

Japan Bioanalysis Forum

測定対象ペプチド配列の選択 （BLAST検索）
How to select target peptide fragments (BLAST search)

Q21 前の設問で回答いただいたデータベースをよく利用する理由があれば教えてください．
定量部位

Reasons# ofanswers①BLAST (UniProt)①他のデータベースを使った経験がないから

10②他と比べて気に入っているところがある3

No experience to utilize another data base on Webs.

More favorite thananother data base

見やすい。FASTAファイルが作りやすい。
It’s easy to see and create FASTA files

UniProtをメインで使用しているためMainly use Uniprot

個人的に使いやすい（併用することもある）
Easy (Sometimes used together)②BLAST (NCBI)①他のデータベースを使った経験がないから
No experience to utilize another data base on Webs.

7

気に入っている点②他と比べて気に入っているところがある
More favorite than another data base

検索が早い
Search fast1

④その他 others (protein
prospector)①他のデータベースを使った経験がないから
No experience to utilize another data base on Webs.

1④その他 others (Skyline)

意見無し No opinion

1

9th JBF Symposium, DG2017-31

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Why do you often use the database that you answered in the previous question ?

81

Japan Bioanalysis Forum

測定対象ペプチド配列の選択（skyline）
How to select target peptide fragments (skyline)

Q22 ターゲットペプチドの絞り込みの際、Skylineというソフトウェアの使用経験はありますか．

① ある② 使用経験はないが存在は知っている
③ ない
④ その他
① Yes
② No, but I know the software③ No④ others

9th JBF Symposium, DG2017-31

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Have you used software called “Skyline” for selecting target peptide?

82

Japan Bioanalysis Forum

測定対象ペプチド配列の選択（skyline）
How to select target peptide fragments (skyline)

Q23 前の設問にて「①ある」に回答された方のみご回答下さい．
Skylineの使用用途を教えてください．

パラメータ最適化 Parameter optimization
様々な用途に使用しているが，予測候補断片の確認（2nd Opinion）Confirm target peptide fragment and various propose
トランジションの作成、ピーク抽出など Creation of transition, peak detection
タンパク質のアミノ酸配列から酵素消化により得られるペプチド断片のSRMトランジション作成
Creation of SRM transition using digested peptides
定量ペプチドの選定とMRM/SRM条件の設定（同様2件）Selection of target peptides and setting MRM/SRM conditions
ユニーク検索，アミノ酸配列のm/z情報 Unique search and obtaining m/z information on sequence of amino acid
自動的なMSMS条件設定 Setting MS/MS conditions automatically

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For person to select “①Yes” in Q22, what is intended use of Skyline?

フラグメンテーションパターンからSRM Transitionの設定、定量解析（同様2件）
Setting SRM transition form fragmentation pattern and Quantitative analysis
消化断片予測、候補ペプチドの選定、ユニークペプチドの確認（全生物種のFASTAを入れて参照する）、検量線作成、定量値算出 Predictive digested peptides, selection of target peptides, confirmation of unique peptide (referenceof all species FASTA file) , creation of calibration curve and calculation of quantitative values.
比較定量 Comparative quantitation

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83

Japan Bioanalysis Forum

測定対象ペプチド配列の選択（その他のソフトウエア）
How to select target peptide fragments (other software)Frequently used software and the intended use for quantitative analysis of
endogenous proteins?
SoftwareIntended use

PeakView

プロダクト確認 Confirmation of product ion

MultiQuant

定量値算出・精密質量MS定量 （同様3件）

Calculation of quantitation value
Quantitation by high-resolution MS

shimadzu Insight 定量解析

Quantitative analysis

Skyline

定量解析

Quantitative analysis

Analyst定量（同様2件）Quantitation

MS Quant
Manager

精密質量MS

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Q24 内因性タンパク質の定量を行う際に他に使用しているソフトウェアと，その使用用途を教えてください．

High-resolution MS

9th JBF Symposium, DG2017-31

84

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測定対象ペプチド配列の選択（測定ペプチド数）
How to select target peptide fragments (number of monitored peptides)

How many peptides should be used for quantitative analysis for endogenous
proteins ?
① 1本
② 2本
③ 目的により変更する
④ その他
① one
② two
③ case by case
④ others

その他（5件）④ Others

・3,4本から絞り込んでいく。 Select form 3 or 4 peptides
・3個は目標にします It is there 3 peptides as a goal
・3本以上 3 or more
・経験なし（2件） No experience

コメント（1件）
Comments

・3個は目標にします（③を選択の方） It is there 3 peptides as a goal

9th JBF Symposium, DG2017-31

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Q25 内因性タンパク質を定量する場合、定量に用いるペプチドは何本が適切だと思いますか．

85

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測定対象ペプチド配列の選択（測定ペプチド数）
How to select target peptide fragments (number of monitored peptides)
Q26

前の設問にて「2本以上」または「目的により変更する」と回答された方のみご回答下さい．定量に複数のペプチドを使用する時の理由を差支えない範囲で教えて下さい．

断片により違う定量値を返すので。 Each peptide shows different value
目的に応じて，対象を決めている．1本だけだと定量性の問題点を把握しにくい（何が正なのかが掴みにくい）．
Depends on the purpose of quantitation. It’s difficult to confirm the quality of quantitation with single peptide only.

検証と定量性の担保目的

To guarantee the quantitativity and validity

特異性の担保(同様3件)/ 検出しているものが測定対象であることを確認したい To ensure the quantitated target is right.
データの信頼性を高めるため / 念のため To enhance reliability of data
基本的に3本以上設定することが多いが、定量に適したペプチドが少ない場合などは1本で実施することもある。
Basically more than three peptides

Run with single peptide when suitable peptide are limited

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For a person to select “②2” or “③case by case” in Q25, why multiple peptides are used for ?

修飾の影響、夾雑物の影響 It depends on the post-translational modification or contaminant
トリプシン消化効率が十分であるか否かを確認する指標の一つとして To confirm the efficiency of trypsin digestion.
定量性の担保（特に特異的なペプチドを使用しない場合は必要と考えている） To guarantee the quantitativity（Especially the peptide is not specific)
同定のため / タンパク質配列全体的に定量できるから For target identification / Quantitate the protein as a whole

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測定対象ペプチド配列の選択（トランジション数）
How to select target peptide fragments (number of transitions)Q27 内因性タンパク質を定量する場合、定量に用いるペプチド1本あたりのトランジション数はいくつが適切だと思いますか．

① 1トランジッション② 2トランジッション③ 目的により変更する
④ その他
① one
② two
③ case by case
④ others
コメント（2件）
Comments
その他（6件）④ Others

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How many transitions should be used to quantitate endogenous protein ?

・5つくらいを目標（②を選択された方）・3トランジションを目標としているが、ペプチドの特性上難しい場合は減らしている（③を選択された方）
・Preferably up to five ・Three, if possible
・最初3つ以上設定し、絞り込んでいく
・3 transition以上 three or more
・5つくらいを目標 about five・定量には1本，ただ，複数のトランジションをモニター ・経験なし（2件）
Monitor one transition for quantitation and others for confirmation
No experience

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測定対象ペプチド配列の選定（トランジション数）
How to select target peptide fragments (number of transitions)Q28 前の質問で、複数のトランジションを設定して分析すると回答された方、定量値をどのように算出していますか① トランジッションを合算② 各トランジッションから得られた平均値③ その他① Sum of analytical result of each transition② Mean of analytical result of each transition③ others

コメント（1件）Comments
・網羅的に測定する際には、ある程度決めますが、少数のタンパク質であれば、定量性の高い方法を設定すると思います。
その他の回答（6件） ③ Others

Define calculation method for multiple target analysis. The mostquantitative method will be chosen for a few target analysis.

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How do you calculate the quantitative result of multiple transition ?

・基本的には感度の高い一つを選択もしくは合算
Basically the most abundant transition only, sometimes summed.
・最も高感度なものを採用他は確認程度（同様3件） The most abundant transition only, others are used for confirmation.
・用途によるが、QQQでのトランジションの合算は可能であれば避けたい（特異性が不安）。1トランジショ
ンを定量値とする場合もあれば（残り2トランジションは特異性確認）、3ペプチドの平均値（＋CV）を定
Depend on the purpose, and avoid the adding up. Some case one transition for quant, and others for
量値とする場合もある
・経験なし

No experience

confirm. Other case mean and CV value of three transition is used

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測定対象ペプチド配列の選定（トランジション数）
How to select target peptide fragments (number of transitions)
２つ前の設問にて「2トランジション以上」または「目的により変更する」と回答された方のみご回答下さい．複数トランジションを設定する理由を差支えない範囲で教えて下さい．
For a person to select “②2” or “③case by case” in Q27, why multi transitions
are used for if possible.
内因性夾雑物のかぶりを評価 （同様4件）
不安定であるため

To confirm no other contaminants are overlapped

In case target peptide ( or signal) is not stable

感度が足りないときに合算するため (同様4件）

Sum up transitions when the sensitivity is deficient

検証目的です。すべてのトランジションを定量に使う必要はないと思っています
データの信頼性を高めるため

To ensure the reliability of data

ターゲットペプチドの分析の特異性担保のため

Only for confirmation
No need to sum up all transition

To ensure the specificity of the target peptide

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Q29

ノイズピークによる定量結果のばらつきの影響を考慮して To consider the variation of result depends on noise peaks
特異性の確認To confirm the specificity of the target peptide

定量性の担保To ensure the qunatitativity

同定精度を上げるため

To ensure the identification

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実測定による検出確認
Detection and confirmation of the target peptide in samples

Q30 定量候補ペプチドの検出確認のために使用したことがある試料を教えててください．（複数回答可）① タンパク質標品② 強制発現細胞③ 分析標的の組織④ その他① Standard protein② Target forcibly expressing cell
③ Target Organs④ Others

その他の回答④ Others

・普通の（強制発現もしていない）細胞
Normal cells (not forcibly expressed)

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What kind of samples do you use for the target peptide detection

・経験なし（2件）
No experience

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実測定による検出確認
Detection and confirmation of the target peptide in samples

Q31 定量候補ペプチドの検出確認のために実施する分析法を教えてください．

① サーベイスキャン法（Data dependent scan）
による検出② 候補ペプチドの複数トランジションを指定
し検出
③その他

① Survey scan (Data-dependent scan)② SRM, with multiple transitions for thetarget peptide defined③ others
その他の回答③ Others

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What method do you use for the detection of target peptide ?

・経験なし（1件）
No experience

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実測定による検出確認
Detection and confirmation of the target peptide in samples
前の質問にて「①サーベイスキャン法（data dependent scan）による検出」と回答された方のみご回答下さい．検出されたピークをどのように
アミノ酸配列に帰属させていますか
For a person to select “①Survey scan (Data-dependent scan)” in Q31, how do you
attribute the detected peaks to amino acid sequences ?
① アミノ酸配列解析ソフトウエアを使用② プロダクトイオンスペクトルをDBと比較③ その他① Use amino acid sequence analysis software② Compare product spectrum with DB③ Others

その他の回答③ Others

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Q32

・経験なし（1件）
No experience

9th JBF Symposium, DG2017-31

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LC条件
LC condition

Q33 内因性タンパク質定量に用いるLC分析法について教えてください．

① ペプチドに拘らずGenericなmethodを使用②ペプチド毎にmethodを最適化する③その他① Generic method② Optimized method to quantitate specific peptide③ Others
コメント（1件）
Comments

・経験なし（②を選択の方）
No experience

その他（3件）③ Others

・①or② depend on target
・経験なし
No experience

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What LC method do you use to quantitate endogenous protein by LC-MS/MS?

・② if ① is not possible

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LC条件
LC condition

Q34 Generic methodで分析できない場合では，どのようなことが原因となりますでしょうか．経験がありましたら教えてください

ペプチドの物性が異なるものを同時に測定することが出来ない場合がある。Cannot determine simultaneously
when deferent characterization of peptides
選択性が悪い（夾雑成分が重なるなど、同様6件）Poor selectivity
イオンサプレッションの程度がひどい large ion suppression
できなかったことはない。ペプチドごとに特徴的なメソッドを設定できれば高感度が狙えるかもと思う。Not have any
experience
多価イオンとpHの相性が悪い時 Incompatible multi-charged ion of analyte and the generic method pH

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What is the cause why peptide quantitative analysis by “Generic method” doesn’t work?

ピーク形状不良の時 Peak shape
カラムから溶出しないor保持されない （同様2件）Column separation
親水性または疎水性が強すぎる場合 Hydrophilic or hydrophobic

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LC-MS vs LBA
Q35 タンパク質をLBAとLC-MSの両方で定量した経験がありますか？

① ある
② ない
③ その他

① YES
② No
③ others

9th JBF Symposium, DG2017-31

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Have you perform quantitative analysis of proteins both by LBA and LC-MS ?

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LC-MS vs LBA

For a person to select “1, YES” in Q35,
have you got the different results by using LBA and LC-MS?
タンパクの部分分解が示唆される結果が得られたことがある。 Partially degradated
原因は正確には掴めていない．抗体でキャプチャーする部位や箇所の数などによって，交差性や修飾の差異がみられたのか，断片の選定が良くなかったのかは不明 Not know the reason. Cross-reactivity or modification may
be happened or peptide selection is not good.
一定の差異が認められたが、プログラム全体で特定の測定方法が用いられていれば特に問題はない。Different
results were got but it is not the problem if the specific method is used in the whole programあります。測定法のダイナミックレンジや前処理含め考察しました。Yes. Considered about dynamic range andsample preparation in that situation

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Q36 前の設問で「①ある」と回答した方、結果や解釈が異なった経験があれば差支えない範囲で考察のなど含めて教えてください。

LBAの方が定量値が高くなった．抗体の特異性に起因すると考察 The quantitated result from LBA ishigher because of antibody specificity同等であった The quantitated results of both are the same.
抗抗体，トータルフリー議論 Because of anti-antibody or total and free antibody

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その他
others

Q37 高分子LC-MS定量に関して「これが知りたい」と思うものがあれば記載お願いします．

レギュレーション（ガイドライン構想、規制下分析での対策と問題点）（2件）Regulation
ペプチド断片による定量値への影響の要因や対策方法(2件）Effect and countermeasure of peptide fragment
低分子LC-MSと比較して高分子LC-MSで気を付ける点 Cautions in large molecule analysis
安価で安定供給できる内標準物質 Internal standard, can be supplied continuously at low cost
定量値の算出方法（複数のペプチドから定量する方法、ばらつきの程度、MSパラメータの設定）
How to calculate quantitative results

高分子LC-MS定量で十分と考える / 抗体医薬品のLC-MS分析の実績件数 / MSで実施の場合ELISAの必要性

Enough to use LC-MS/MS / The number of experiment to quantitate antibody using LC-MS / Necessity of ELISA if
the quantitation is already performed using LC-MS

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Do you have any other questions for large molecule analysis by LC-MS?

多くの情報から選択破棄する際の判断基準 Criteria to select the target peptide
免疫系を用いない高感度化 High sensitivity not using immuno-assay
タンパク質標品を合成して検量線に用いている実例

Actual examples to prepare calibration standards using synthetic protein analyte

検出上の工夫、イオンモビリティー Good ingenuity for detection, ion mobility

9th JBF Symposium, DG2017-31

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ご協力有難うございます

9th JBF Symposium, DG2017-31

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Japan Bioanalysis Forum98