サルコペニア予防を⽬的とした⽜乳とシンバイオティクスの創出
京都府⽴医科⼤学⼤学院医学研究科
岡村拓郎

内分泌・代謝内科学

要旨
サルコペニアと肥満が合併したサルコペニア肥満は、2 型糖尿病の病的特徴である。⽜乳がサルコペニア予防に有⽤であることは、いくつかのヒト試験で⽰されている。本研究は、db/db マウスにおけるサルコペニア性肥満の予防に対する⽜乳の効果を明らかにすることを⽬的とした。雄の db/db マウスを⽤いて、無作為化・医師盲検化試験を⾏った。8 週齢のdb/db マウスを 8 週間飼育し、ゾンデを⽤いて⽜乳（100 µL/⽇）を与えた。糞便移植（FMT）
群には、6 週齢から 2 週間抗⽣物質を投与し、その後、16 週齢まで週 2 回 FMT を⾏った。
db/db マウスへの⽜乳投与により、握⼒（⽜乳-：164.2±4.7g、⽜乳＋：230.2±56.0g、p＝0.017）、筋⾁量（ヒラメ筋、⽜乳-： 164.2±4.7mg、Milk+：230.2±56.0mg、p＜0.001；
⾜底筋、Milk-： 13.3±1.2mg, Milk+: 16.0±1.7mg, p < 0.001）、内臓脂肪量の減少（Milk-:
2.39±0.08g, Milk+: 1.98±0.04mg, p < 0.001） が⾒られ、⾝体活動量が⼤幅に増加しました（明期：p = 0.013, 暗期：p = 0.034 ）。⽜乳を与えたマウスの FMT は、サルコペニア型
肥満を改善するだけでなく、耐糖能異常も有意に改善した。⼩腸の遺伝⼦発現をマイクロア
レイ解析したところ、⽜乳を与えたマウスでは、アミノ酸吸収トランスポーター遺伝⼦である Slc7a5 (p = 0.010), Slc7a1 (p = 0.015), Ppp1r15a (p = 0.041), SIc7a11 (p = 0.029) の発現が上昇した。腸内細菌叢の 16S rRNA シーケンスでは、⽜乳を与えたマウスと FMT 群の両⽅で、⽜乳を与えたマウスより Akkermansia 属が増加した。本研究の結果から、⽜乳の摂取はアミノ酸などの栄養素の摂取量を増やす以外に、腸内環境も変化させ、⽜乳によるサ
ルコペニア肥満の改善メカニズムに寄与している可能性があることが⽰唆された。

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緒⾔
超⾼齢社会において、サルコペニアの発症予防は最重要課題であり、申請者らはかねてからサルコペニアの病態解明について研究を続けてきた(Okamura T, et al. J Clin Biochem Nutr
2019. Bamba R, Okamura T, et al. J Cachexia Sarcopenia Muscle 2021)。さらに 2021 年度「⽜乳乳製品健康科学」学術研究の中で、京都府⽴医科⼤学内分泌代謝内科外来通院中の 2型糖尿病患者 110 名を対象とした観察研究において、簡易型⾃記式⾷事歴法質問票により評価した⽜乳の摂取量が 135mL/day 以上の患者は 135mL/day 未満の患者と⽐較し、サル
コペニアの有病率が低く、⾎清中のフェニルアラニンやメチオニン濃度が⾼値であるという結果を得た。その⼀⽅で先述の⽜乳摂取の多い患者と少ない患者の間で 1 ⽇タンパク質
摂取量に有意な差を認めなかったことから、⽜乳が何らかのメカニズムによって消化管からのアミノ酸吸収を変化させているのではないかと考えた。
そこで申請者らは先⾏研究を実施し、野⽣型マウスに通常⾷もしくは粉ミルク混餌⾷を与えたところ、通常⾷投与マウスと⽐較し、粉ミルク混餌⾷投与マウスの⼩腸粘膜ではアミノ酸輸送体である Pept1 の遺伝⼦発現が有意に上昇していることを明らかにしている。
上記の前年度のヒトを対象とした学術研究の結果と先⾏研究における動物実験の結果から、⽜乳の摂取が腸内環境、主には腸内細菌叢を変えることで前述の遺伝⼦発現を変化させていると考えた。そこで本研究では粉ミルクを与えた実験動物の腸内細菌叢を解析すること
で、⽜乳摂取により増加した腸内細菌を同定し、サルコペニア予防を⽬的とした⽜乳と腸内細菌の併⽤法(シンバイオティクス)の開発を⽬指す。
⽅法
実験動物
すべての実験⼿順は、京都府⽴医科⼤学動物実験委員会（承認番号：M2022-84）により承認された。雄の db/db マウスを⽤い、無作為化・医師盲検化試験を実施した。
第 1 ステージ
7 週齢の db/db 雄性マウスを清⽔実験材料（⽇本、京都市）から購⼊し、病原体のない管理された環境で飼育した。個別ケージに収容されたマウスには、8 週齢から 8 週間、普通⾷（ND；345kcal/100g、脂肪 kcal 4.6%；CLEA, Tokyo, Japan）を与えた。サンプルサイズ
は、相対的握⼒を⽬安に EZR を⽤いて解析した。両群間の平均差は 1.02、平均標準偏差は0.44、有意⽔準は 0.05、検出⼒は 80%で計算すると、必要なサンプルサイズは 6 であった。
6 匹のマウスを、（1）⽜乳を与えないマウス、（2）⽜乳（明治特選北海道⽜乳、株式会社明治、東京）を与えるマウスの 2 群に分けた。ヒト研究では⽜乳を 150 mL/⽇以上飲む 2 型
糖尿病⾼齢者において、サルコペニアの有病率が低かった。そこで、約 150mL/⽇（体重 60kg
相当）に対して、100μL/⽇（体重 40g 相当）の⽜乳をゾンデでマウスに 8 週間投与した。
その後、マウスを⼀晩絶⾷させ、16 週齢で⿇酔（4.0 mg/kg midazolam、0.3 mg/kg
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medetomidine、および 5.0 mg/kg butorphanol）に晒して安楽死させた（図 1A）。
第 2 ステージ
FMT は、腸内細菌叢に関連する疾患モデルにおいて、腸内細菌叢の因果関係を明らかにするアプローチとして広く認知されている。より良い⽣着率を得るために、抗⽣物質を⽤いてレシピエントの腸内細菌叢を枯渇させるため（アンピシリン、ネオマイシン、メトロニダゾ
ール：各 1g/L、バンコマイシン：0.5g/L、200μL/⽇、経⼝胃内投与）、FMT 前の 6〜8 週
齢の 2 週間実施した。3 ⽇間の回復後、FMT を週 2 回実施した。FMT ⽤の便は⽜乳を与えずに飼育した 16 週齢の db/db マウスと⽜乳を与えた db/db マウスから、200〜300mg の新鮮な便を採取した。便を 5mL のリン酸緩衝⽣理⾷塩⽔でホモジナイズし、重⼒下で 2 分間沈降させた。こうして得られた上清の 200μL を各レシピエントマウスに投与し、腸の抽出に使⽤した。⽜乳を与えずに飼育した 16 週齢の db／db マウス（FMT（db））と⽜乳を与えた db／db マウスの便を FMT した db／db マウス（FMT（M））について体重変化、グルコース耐性、握⼒の評価を⾏った。その後、マウスを犠牲にし、ヒラメ筋および⾜底筋の筋
⾁量と精巣上体周囲脂肪量を測定した。
運動量の測定マウスは、ランニングホイール（MK-713：室町機械）を設置したケージに個別に収容された。各ケージに設置した⾛⾏輪の回転数は、⾛⾏輪に接続したコンピュータ内のソフトウェ
ア（CompACT AMS Ver.3：室町機械）を⽤いて、12 時間の夜間サイクルでそれぞれ記録した。
グルコースおよびインスリン負荷試験
15 週齢のマウスを、16 時間絶⾷後の腹腔内ブドウ糖負荷試験（iPGTT）（2g/kg 体重）および 5 時間絶⾷後のインスリン負荷試験（ITT）（0.5U/kg 体重）に供試した（S3)。⾎液サ
ンプルは尾静脈から採取した。⾎糖値はグルコメーター（Gultest mint II; 三和化学研究所、名古屋、⽇本）を⽤いて測定した。iPGTT および ITT は、異なるマウスで実施した。⾎糖値は注射後 0 分、15 分、30 分、60 分、120 分にモニターした。iPGTT と ITT の結果の曲線下⾯積（AUC）を分析した。
握⼒測定
握⼒は、16 週齢のマウスに対しマウス⽤握⼒計（モデル DS2-50N、株式会社イマダ、⽇本、
豊橋市）を⽤いて測定した。毎⽇、1 分間隔で 6 回の連続測定を⾏った。研究者は、マウスのグループ分けについて盲検化されていた。握⼒は体重で正規化した。
⾎液⽣化学検査3

⾎液サンプルは、⼼臓穿刺により採取し、14,000rpm で 10 分間、4℃で遠⼼分離した後に⾎清サンプルを収集した。 採取した⾎清は、分析のために協⼒会社に郵送されるまで-30℃で保存した。アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）値、トリグリセリド（TG）、⾮エ
ステル化脂肪酸（NEFA）値を測定した。
ヒラメ筋の組織学的解析
ヒラメ筋組織を採取し、10％ホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋、筋⾁は最⼤膨隆部で切断した。筋切⽚を作成し、ヘマトキシリン&エオジン（HE）で染⾊した。BZ-X710
蛍光顕微鏡（キーエンス、⼤阪、⽇本）を⽤いて画像を取り込み、断⾯積と直径を測定した。
マウス筋⾁における遺伝⼦発現解析
16 時間絶⾷させたマウスの⾜底筋を摘出し、直ちに液体窒素で凍結した。氷冷した QIAzol
Lysis reagent（Qiagen, Venlo, The Netherlands）を⽤い、ボールミルで 4000rpm、2 分間ホモジナイズし、製造者の指⽰に従い total RNA を抽出した。High-Capacity cDNA Reverse
Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を⽤いて、製造者の指⽰に従って、全 RNA (0.5 μg)を第⼀鎖の cDNA に逆転写させた。⾜底筋における Foxo1、Mstn、

Fbxo32、および Trim63 の mRNA 発現は、Real time(RT)-PCR を⽤いて定量した。PCR 条
件は、50℃で 2 分、95℃で 20 秒の 1 サイクル、その後 95℃で 1 秒、60℃で 20 秒の 40 サ
イクルであった。各標的遺伝⼦の相対発現は、Gapdh の閾値サイクル（Ct）値に対して正規化し、⽐較閾値サイクル 2-△Ct 法を⽤いて定量化した。⽜乳を与えていないマウスのシ
グナルは相対値 1.0 を割り当てた。各群 6 匹のマウスの発現量を測定し、RT-PCR を各サ
ンプルについて 3 連で実施した。
空腸と結腸の組織学的解析
マウスから摘出した空腸を直ちに 10％ホルムアルデヒドで結腸はカルノア液中で 22℃、24時間固定し、パラフィンに包埋して 4μm 厚の切⽚にし、HE 染⾊と過ヨウ素酸シフ（PAS）
染⾊を⾏った。染⾊した切⽚の画像は、蛍光顕微鏡（BZ-X710；キーエンス）を⽤いて撮影した。絨⽑の⾼さ/幅および陰窩の深さは、6 匹の動物の各グループについて、スライドあたり 5 箇所の HE および PAS 染⾊切⽚を⽤いて、ImageJ ソフトウェア（Version 1.53 k,
NIH, Bethesda, MD, USA）を⽤いて計測した。ムチンおよび杯細胞（PAS+）の数を計測し、ImageJ ソフトウェアを⽤いて 10 個の陰窩あたりの平均杯細胞（PAS+）を算出した。
空腸の mRNA シークエンス
マウスの空腸を摘出し、直ちに液体窒素で凍結した。RNA 抽出⽅法は、"マウス筋⾁における遺伝⼦発現解析 "の項に記載したものと同様であった。TruSeq® Stranded mRNA kit（Qiagen, Carlsbad, CA, USA）を⽤いて、cDNA ライブラリーを構築した。ペアエンドシ
4

ーケンスは、Illumina NovaSeq6000 プラットフォームを使⽤して実施した（n = 3）。アミノ酸、脂肪酸、グルコーストランスポーターに関連する mRNA 発現は、ボルケーノプロットとヒートマップを⽤いて可視化した。
マウス⼩腸からの単核球の単離
⼩腸のサンプルは、実験に使⽤するまで、RPMI 中の冷たい 2％FBS 中で保存した。⼩腸の粘膜固有層（LPL）の単核細胞は、Lamina Propria Dissociation Kit (130-097-410; Miltenyi
Biotec, Germany)を⽤いて、分離した。細胞ペレットを 5 mL の 40% Percoll®に再懸濁し、細胞懸濁液を 5 mL の 80% Percoll®の底層を含む遠沈管の上部にゆっくりと添加した。密度勾配遠⼼分離（420×g、20 分）を⾏い、中間層の単核球を 1mL ピペットで静かに抽出した。抽出した単核球を 2%FBS/PBS で 2 回洗浄した。
組織調製とフローサイトメトリー
前項と同様にして得られた細胞懸濁液を、マウス BD™ブロック精製抗マウス CD16/CD32
mAb（394656; clone: 2.4G2; 1/100; BD Biosciences, Piscataway, NJ, USA）と 22℃で 10 分
間プレインキュベートした。⾃然リンパ系細胞のゲートに使⽤した抗体は以下に記載する。
細胞懸濁液を、Biotin-CD3e（100304；クローン：145-2C11；1/200；eBioscience, San Diego,
CA, USA）、Biotin-CD45R/B220（103204；クローン：RA3-6B2；1/200；eBioscience), BiotinGr-1(108404; clone： RB6-8C5；1／200；eBioscience）、Biotin-CD11c（117304；クローン：N418；1／200；eBioscience）、Biotin-CD11b（101204；クローン：M1／70；1／200；
eBioscience）、Biotin-Ter119（116204；クローン：．TER-119; 1/200; eBioscience）、BiotinFceRIa（134304; clone: MAR-1; 1/200; eBioscience）、Brilliant Violet 510™ -Streptavidin（ 405233; 1/500; eBioscience ） , PE-Cy7-CD127 (135014; clone ：A7R34; 1/100;

eBioscience）、Pacific Blue-CD45（103116; clone: 30-F11; 1/100; eBioscience）、および
Fixable Viability Dye eFluor 780（1/400; eBioscience）を 4℃にて 20 分かけて処理した。細
胞懸濁液を 2%FBS/PBS で 2 回洗浄し、固定⽤バッファー（420801; BioLegend, CA, USA）
を⽤いて 30 分間固定した。2%FBS/PBS で洗浄後、細胞懸濁液を PE-GATA-3（clone TWAJ,
1/50; eBioscience）、APC-RORγ（clone AFKJS-9, 1/50; eBioscience）、FITC-T-bet（clone
4B10, 1/50; BioLegend）の混合物でインキュベートした（補⾜図 1）。M1 および M2 マク
ロファージのゲートには、以下の抗体を使⽤した： FITC-CD206（MA516870；クローン：
MR5D3、1／50；eBioscience）、PE-F4／80（12480182；クローン：BM8、1／50；eBioscience）、
APC-CD45． 2 (17045482; clone: 104, 1/50; eBioscience), PE-Cy7-CD11c (25011482;
clone: N418, 1/50; eBioscience), and APC-Cy7-CD11b (47011282; clone: M1/70, 1/50;
eBioscience) (補⾜図 2). 染⾊した細胞を Canto II フローサイトメーターで解析し、FlowJo
ソフトウェア（バージョン 10；TreeStar, Ashland, OR, USA）を⽤いてデータを解析した（n= 6）。
5⾎清および⾻格筋サンプル中のアミノ酸および有機酸レベル、⾎清および糞便サンプル中の短鎖脂肪酸（SCFAs）レベルの測定
マウス⾎清および腓腹筋中のアミノ酸および有機酸、ならびにマウス⾎清および糞便中のSCFA の組成は、Agilent 7890B/7000D システム（Agilent Technologies, Santa Clara, CA,USA）で実施したガスクロマトグラフ質量分析（GC/MS）を⽤いて測定しました。20mg の腓腹筋と糞を 500μL のアセトニトリルと 500μL の蒸留⽔中で、ボールミル（4000rpm、
2 分間）で粉砕してホモジナイズした。⾎清サンプルは、次のステップに進む前にボールミルで粉砕しなかった。次に、サンプルを 37℃で 30 分間 1000rpm で振とうし、室温で 3 分
間 14000rpm 遠⼼分離した。上清（500μL）を分離し、これに 500μL のアセトニトリルを加え、混合物を 37℃で 3 分間、1000rpm で振盪した。14,000rpm、3 分間、室温で遠⼼分離した後、0.1mol/L NaOH で pH を 8 に調整し、アミノ酸、有機酸および SCFA を抽出した。アミノ酸、有機酸、SCFA の濃度は、オンライン固相抽出法（SPE 法）を採⽤した GC/MS
で測定しました。SPE-GC システム SGI-M100（AiSTI SCIENCE, Wakayama, Japan）は、試料をバイアルに⼊れ、オートサンプラートレイにセットすると、SPE と GC/MS システ
ムへの注⼊が⾃動的に⾏われる。固相階層化には Flash-SPE ACXs（AiSTI SCIENCE 社製）を使⽤した。アミノ酸および有機酸のレベルを測定するために、前述の各サンプル抽出物の50μL アリコートを固相にロードし、アセトニトリルと⽔（1：1）で洗浄した。その後、アセトニトリルで脱⽔し、0.5%メトキシアミン-ピリジン溶液 4μL を含浸させた。その後、N-メチル-N-トリメチルシリルトリフルオロアセトアミドを固相に供給して誘導体化時にメトキシル化とトリメチルシリル化を⾏い、ヘキサンで溶出した。最終⽣成物を PTV イン
ジェクターLVI-S250（AiSTI SCIENCE 社製）に注⼊し、温度を 220℃で 0.5 分間維持し、50℃/分で徐々に上昇させて 290℃にし、そこで 16 分間保持した。キャピラリーカラム Vf5 ms（30 m × 0.25 mm [内径] × 0.25 μm [膜厚]; Agilent Technologies）に試料をロードしました。カラム温度は 80℃で 3 分間保持した後、25℃/分で 190℃、3℃/分で 220℃、15℃/分で 310℃まで徐々に昇温し、4.6 分間保持した。サンプルはスプリットモードでスプリット⽐ 50:1 で注⼊した。SCFA を測定するために、前述の各サンプル抽出物の 50μL ア
リコートを固相にロードし、アセトニトリルおよび⽔（1：1）で洗浄した。その後、アセトンで脱⽔し、N-tert-butyldimethylsilyl-N-methyltrifluoroacetamide-toluene 溶液（1：3）4μLを含浸し、固相上で誘導体化した後ヘキサンで溶出した。最終⽣成物を PTV インジェクタ
ーLVI-S250 から注⼊し、温度を 150℃で 0.5 分間維持し、25℃/分で 290℃まで徐々に昇温し、そこで 16 分間保持した。キャピラリーカラム Vf-5 ms (30 m × 0.25 mm [内径] × 0.25μm [膜厚]; Agilent Technologies)に試料をロードしました。カラム温度は 60℃で 3 分間保持し、10℃/分で 100℃まで、20℃/分で 310℃まで徐々に昇温し、7 分間保持した。試料はスプリットモードでスプリット⽐ 20:1 で注⼊した。アミノ酸、有機酸、SCFA はスキャンモードで検出した（m/z、70-470）。すべての結果は、アミノ酸、有機酸、SCFA について、
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それぞれノルロイシン、アジピン酸、テトラデウテロ酢酸（0.01 mM）のピーク⾼さに正規化した（n = 6）。
16S rRNA シーケンシング
QIAamp DNA Feces Mini Kit（Qiagen, Venlo, The Netherlands）を⽤いて、製造者の説明書に従って、凍結した盲腸糞便サンプルから微⽣物 DNA を抽出した。細菌ユニバーサルプ
ライマーセット（341F および 806R）を⽤いて、DNA から 16S rRNA 遺伝⼦の V3-V4 領域を増幅させた。PCR は、EF-Taq（韓国、ソルジェント社）を⽤い、30μL の反応混合液に 20ng のゲノム DNA を鋳型として、以下のサーモサイクルのパラメータで実施した：
95℃、2 分間で Taq ポリメラーゼを活性化し、95℃、55℃、72℃を各 1 分間で 35 サイクル
⾏い、最後に 72℃で 10 分間のステップを⾏った。増幅産物は、マルチスクリーンフィルタ
ープレート（Millipore Corp.、Billerica、MA、USA）を⽤いて精製した。MiSeq シーケンサー（Illumina, CA, USA）を⽤いて、製造者の説明書に従って 16S rRNA のシーケンスを⾏った（Macrogen, Seoul, Korea）。配列の品質フィルタリングには、QIIME バージョン 1.9.1.
(S12). スコアが 75％未満のバーコードまたはプライマーは、ファイルから除外した。運⽤
分類単位（OTU）の数は、類似度 97％で UCLUST アルゴリズムを⽤いて決定した（S13）。
また、BLAST（UNITE, 2017）を⽤いて、Greengenes コアセットの UNITE 配列セットを
UCLUST と ITS で整列した 16S rRNA の分類学的割り当てを⾏った。
KEGG オ ル ソ ロ グ 存 在 量 予 測 は 、 Phylogenetic Investigation of Communities by
Reconstruction of Unobserved States（PICRUSt2）ソフトウェアを⽤いて得た（S14）。
グループ内のフィラの相対的な存在量は、Holm-Šídák 多重⽐較検定付き⼀元配置分散分析を⽤いて評価した。アルファ多様性（個々のサンプル内の多様性と定義）は、Chao1（S15）、Shannon（S16）、Gini-Simpson 指数（S17）を⽤いて分析した。
グループ間の細菌属の相対的存在量は、効果量測定（LEfSe）と組み合わせた線形判別分析（LDA）（http://huttenhower.sph.harvard.edu/lefse/、2022 年 5 ⽉ 15 ⽇にアクセス）を使⽤して評価した（S18）。正規化された相対存在量⾏列を⽤いて、LEfSe は有意に存在量が異なる分類群を⽰し、LDA を⽤いてその特徴の効果量を推定した。本研究で取り上げたすべてのバイオマーカーについて、p 値閾値 0.05（Wilcoxon rank-sum 検定）、効果量閾値 2 を使⽤しました。
さらに、FMT の有効性を判断するために主座標分析（PCoA）を⾏い、Tinn-R Gui version
1.19.4.7, R version 1.36 (S19) を⽤いて、⽣成するクラスター数を 2 と事前指定した⾮階層
K 平均クラスター分析を実施した。
統計解析
データの解析には、JMP ver. 14.0 ソフトウェア（SAS, Cary, NC, USA）を使⽤した。2 つのグループの⽐較には、paired t-test を使⽤した。4 群の⽐較には、Holm-Šídák 多重⽐較検7

定付き One-way ANOVA を⽤いた。統計的有意性は、p<0.05 とした。図は、GraphPad Prism
ソフトウェア（バージョン 9.3.1; San Diego, CA, USA）を⽤いて作成した。
結果
マウスの体重、運動量、iPGTT および ITT、肝酵素、および脂質代謝
⽜乳⼊り ND を与えたマウス（Milk+群）と⽜乳なしの ND を与えたマウス（Milk-群）の体重に差は⾒られなかった（図 1B）。⾛⾏輪の回転数は、Milk+群で有意に増加した（Fig.
1C）。耐糖能は、iPGTT および ITT を⽤いて評価した。iPGTT で測定した⾎糖値には、両群間で有意な差は認められなかった（図 1D）。しかし、ITT の結果、Milk+群の⽅が⾎糖値が低いことが明らかになった（図 1D）。握⼒の絶対値および相対値は、Milk+群で Milk-群に⽐べ有意に増加した（図 1E)。AST、ALT、TG 値は両群間で有意な差は認められなかっ
たが、NEFA 値は Milk+群で Milk-群に⽐べ有意に低下した（図 1F）。
マウスのヒラメ筋および⾜底筋の評価と筋萎縮遺伝⼦の発現量
HE 染⾊したヒラメ筋切⽚の代表画像を図 2A に⽰す。ヒラメ筋の断⾯積は、Milk+群の⽅が Milk-群よりも⼤きかった（図 2B）。ヒラメ筋および⾜底筋の絶対重量および相対重量は、
Milk+群で有意に増加した（図 2C, D）。Milk+群の精巣上体脂肪の絶対重量および相対重量
は、Milk-群のそれよりも低かった（図 2 E）。ヒラメ筋の萎縮に関連する遺伝⼦の発現を測定した。Foxo1、Mstn、Fbxo32、Trim63 の発現は Milk+群で Milk-群に⽐べ有意に低かった（図 2F）。
マウスの空腸と⼤腸の組織学的分析、ILC1s、ILC3s、M1 マクロファージの⽐率、トランスポーターの発現の変化
空腸と結腸の切⽚を HE と PAS で染⾊した代表画像を図 3A に⽰す。Milk＋群では、Milk-群に⽐べ、絨⽑の重量と幅が有意に増加した（図 3B）。さらに、Milk+群では、クリプトの深さが有意に減少し、クリプトに対する杯細胞の割合が増加した（図 3C）。⼩腸におけるILC1s および ILC3s と CD45+細胞の⽐率、M1 マクロファージと M2 マクロファージの⽐率を評価した。Milk+群では ILC1 が有意に減少し、ILC3 が増加した（図 3D）。また、M1/M2
⽐は⽜乳＋群の⽅が⽜乳-群より低かった（図 3D）。⾻格筋におけるいくつかのトランスポーターの発現の違いを、次世代シークエンスを⽤いて解析した。特に、Slc7a5、Slc7a1、

Ppp1r15a、Slc7a11 などのアミノ酸トランスポーター遺伝⼦は、Milk＋群で Milk-群よりも発現量が⾼かった。脂肪酸トランスポーター遺伝⼦である Tbc1d1、Ager1、Abca1 は Milk+
群で発現量が多く、Pparg、Myc は発現量が少なかった。Tbc1d1 や G6pc などのグルコー
ストランスポーター遺伝⼦は、Milk+群で⾼い発現量を⽰した（図 3E および F）。
マウスの⾎清および⾻格筋サンプル中のアミノ酸および有機酸、⾎清および糞便サンプル8

中の短鎖脂肪酸の分析
次に、⾎清および⾻格筋中のアミノ酸および有機酸の濃度を GC/MS システムを⽤いて調査した。Milk+群の⾎清中のバリン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、セリン、スレオ
ニン、メチオニン、フェニルアラニン、クエン酸、リジンの濃度は Milk-群に⽐べ有意に⾼かった（表 1）。同様に、Milk+群の⾻格筋中のバリン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、
セリン、アスパラギン酸、メチオニン、フェニルアラニン、クエン酸、リジンの濃度は、Milk群のそれよりも有意に⾼かった。逆に、Milk+群の⾎清中のコハク酸の濃度は、Milk-群よりも⾼かったが、⾻格筋では逆の結果が⾒られた。
⾎清および糞便中の SCFA の濃度を測定した。⾎清中の酢酸濃度は両群間で差がなかった
が、⽜乳＋群のプロピオン酸および酪酸の濃度は⽜乳-群に⽐べ有意に⾼かった（表 1）。また、Milk+群の⾻格筋中の酢酸、プロピオン酸、酪酸の濃度は、Milk-群より⾼かった。
糞便移植マウスの体重、運動量、iPGTT および ITT、肝酵素、および脂質代謝
腸内細菌叢の役割と⾷事による⽜乳補給の効果を明らかにするために、FMT を実施した（図4A）。⽜乳-群の FMT（FMT(db)群）と⽜乳＋群の FMT（FMT(M)群）の間で体重に差は⾒られなかった（図 4B）。また、⾛⾏⾞輪の回転数は、FMT(M)群が FMT(db)群に⽐べ有意に⾼かった（図 4C）。さらに、FMT(db)群の iPGTT と ITT の AUC は、FMT(M)群よりも低かった（図 4D）。握⼒の絶対値および相対値は、FMT(M)群が FMT(db)群よりも有意に⾼かった(図 4E)。AST、ALT、TG、NEFA の値は、両群間で差は認められなかった（図4F）。
糞便移植マウスのヒラメ筋および⾜底筋の評価と筋萎縮遺伝⼦の発現量
HE 染⾊したヒラメ筋切⽚の代表画像を図 5A に⽰す。ヒラメ筋の断⾯積は、FMT(M)群の⽅が FMT(db)群より⼤きかった（図 5B）。また、ヒラメ筋と⾜底筋の絶対重量と相対重量
は、FMT(M)群で有意に増加した（図 5C, D）。さらに、FMT(M)群の精巣上体周囲脂肪の絶対重量および相対重量は、FMT(db)群に⽐べ低くなっていた（図 5E）。また、ヒラメ筋における Foxo1、Mstn、Fbxo32、Trim63 などの筋萎縮関連遺伝⼦の発現は、FMT(M)群で減少していた（図 5F）。
糞便移植マウスの⾎清および⾻格筋試料中のアミノ酸および有機酸、⾎清および糞便試料中の短鎖脂肪酸の解析
FMT(M)群のバリン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、セリン、スレオニン、メチオニ
ン、フェニルアラニン、リジンの⾎清濃度は FMT（db）群に⽐べ有意に⾼かった（表 2）。
同様に、FMT（M）群の⾻格筋におけるバリン、ロイシン、イソロイシン、グリシン、メチ
オニン、フェニルアラニン、クエン酸、リジンの濃度は、FMT（db）群のそれよりも有意に⾼かった。この結果は、Milk-群および Milk+群で観察された結果と同様であった。⼀⽅、
9

前実験で⾎清および筋⾁中のコハク酸濃度について観察された傾向は、FMT 群では観察されなかった。⾎清および糞便中の SCFA の濃度を測定した。酢酸、プロピオン酸、酪酸の濃度は、FMT（M）群で FMT（db）群に⽐べ有意に⾼かった（表 2）。
Milk-群、Milk＋群、FMT（db）群、FMT（M）群の腸内細菌叢の構成について
4 つのグループにおける異なる⾨の相対的な存在⽐を調べた。Milk+と FMT(M)群では、
Milk-と FMT(db)群よりも Bacteroidetes ⾨が多く、Firmicutes ⾨は少なかった（図 6A)。
OTU 数は、Milk+群と FMT(M)群で増加した（図 6B）。多様性の指標である Chao1、Shannonindex、Simpson index は、Milk+群と FMT(M)群で Milk-群と FMT(db)群より⾼かった（図6B）。LEfSe アルゴリズムを⽤いて、Milk-群と Milk+群、FMT(db)群と FMT(M)群の間で変動的に分布する特定の分類群を特定した。Milk+群では、Milk-群に⽐べて 6 つの分類群（Verrucomicrobia ⾨、Akkermansia 属など）が多く、5 つの分類群（Deltaproteobacteria
綱、Bdellovibrionaceae 科など）が少なかった（図 6C）。また、FMT(M)群では FMT(db)
群に⽐べて 7 つの分類群（Verrucomicrobia ⾨、Akkermansia 属など）が多く、5 つの分類
群（Lactobacillaceae 科、Bacteroides ⾨など）が少なかった（図 6C）。
次に、PICRUSt を⽤いて、Milk-群と Milk+群、および FMT（db）群と FMT（M）群の間の腸内細菌叢の KEGG パスウェイの差異を解析した。KEGG パスウェイクラス I のうち、Milk+群では Milk-群に⽐べ、細胞プロセスや環境情報処理のパスウェイが上昇し、代謝や⽣体システムのパスウェイは低下していた。⼀⽅、FMT(M)群では、FMT(db)群に⽐べ、
環境情報処理のパスウェイがアップレギュレートされ、ヒト疾患、代謝、⽣体系のパスウェ
イがダウンレギュレートされた（補⾜表 2、図 6D）。KEGG パスウェイクラス II のうち、細胞運動、遺伝情報処理、膜輸送、シグナル伝達、転写のパスウェイは、Milk+群に⽐べア
ップレギュレートされ、アミノ酸代謝、他の⼆次代謝物の⽣合成、糖質代謝、細胞プロセスとシグナル伝達、酵素ファミリー、糖鎖⽣合成と代謝、他のアミノ酸の代謝、ヌクレオチド
代謝、複製と修復、輸送と異化は、ダウンレギュレートされた。FMT(M)群では FMT(db)
群に⽐べ、膜輸送と転写の経路が上昇し、その他の⼆次代謝物の⽣合成、内分泌系、エネル
ギー代謝、選別、分解、糖鎖⽣合成と代謝の経路がダウンレギュレートされた（補⾜表 3，
図 6E）．FMT の有効性は PCoA を⽤いて判定した。重み付けなし、重み付けありのクラス
タリングの結果、Milk+群と FMT(db)群、Milk+群と FMT(M)群は同じクラスタに属することがわかった（図 6 F）。
考察
今回、サルコペニア肥満モデルマウスに⽜乳を投与したところ、筋⼒と筋⾁量が増加し、内臓脂肪量が減少したため、⾝体活動量が有意に増加した。さらに、⽜乳＋群の糞便を移植す
ると、サルコペニア肥満が改善されるだけでなく、耐糖能異常も有意に改善された。このことから、栄養補給だけでなく、⽜乳の投与による腸内細菌叢の改変がサルコペニア肥満の改10

善に関与している可能性が⽰唆された。
⾻格筋のアミノ酸濃度および有機酸濃度は、Milk+群で増加した。⽜乳には、必須アミノ酸を含む多くのアミノ酸が含まれている。⾎清と⾻格筋の両サンプル中のこれらのアミノ酸の濃度は、Milk+群で Milk-群よりも⾼かった。栄養摂取量の増加に加え、⼩腸からのアミノ酸吸収量が増加したことも、Milk+群の⾻格筋におけるアミノ酸濃度が⾼くなった理由である。アミノ酸吸収トランスポーター遺伝⼦である Slc7a1、Slc7a5、Slc7a11 の発現は、Milk+
群で有意に上昇した。これらの結果から、⽜乳が腸の炎症を改善することが⽰唆された。フ
ローサイトメトリーの結果、ミルク＋群では⼩腸の粘膜固有層で、腸管で IL-22 を分泌し杯細胞からのムチン分泌を促進する ILC3 数が増加した 1。組織学的解析では、⽜乳投与により絨⽑の萎縮が改善され、ムチン層が厚くなっていることが確認された。⽜乳＋群では、⼩腸前膜の ILC1 や M1 マクロファージなどの炎症細胞が減少していた 2。Milk+群の糞便中
では、酪酸を含む SCFA の産⽣が増加した。SCFA は ILC3 からの IL22 の分泌を促進する
ことが報告されていることから 3、⽜乳投与による腸内の SCFA の増加は、⽜乳が誘導する
抗炎症メカニズムの 1 つであると考えられる。腸の炎症は、筋⾁の⽣合成を促すのに重要なアミノ酸などの栄養素の吸収不良を引き起こすことが、これまでのいくつかの報告で指摘されている 4。興味深いことに、KEGG パスウェイの結果、アミノ酸代謝に関与する細菌叢が Milk+群および FMT(M)群で減少していることが判明した。このことから、⽜乳摂取によるアミノ酸吸収量の増加は、腸内細菌叢の変化よりも、抗炎症作⽤を介したアミノ酸吸収トランスポーターの発現量の増加との関連性が⾼い可能性が⽰唆されました。以上のことから、⽜乳投与に伴う腸内 SCFA 濃度の上昇による抗炎症細胞数の増加、および炎症細胞数の減少により⼩腸からのアミノ酸吸収が増加し、⾎中および⾻格筋のアミノ酸濃度が上昇し、サルコペニアが改善された可能性が考えられる。
⽜乳を投与した際の腸内細菌叢の変化と、⽜乳＋群の FMT を検討した。腸内細菌叢は、栄養吸収、代謝の恒常性、感染防御、全⾝および粘膜免疫の発達に重要な役割を担っている 5。
腸内細菌叢の異常は、肥満やメタボリックシンドロームと密接な病理学的・⽣理学的相互作⽤がある 6。したがって、⾷事に関連する代謝の変化を評価するために腸内細菌叢を調べる
ことは適切である。本研究では、⽜乳＋群および FMT（M）群の糞便において、⽜乳群および FMT（db）群と⽐較して、Akkermansia 属の存在量が有意に増加していることが確認された。A. muciniphila は、上⽪の粘液層で粘液溶解酵素を⽣産し、ムチンを窒素や炭素源として利⽤でき、これらの物質を酢酸やプロピオン酸に分解する 7。本研究で観察された酢
酸、プロパン酸、ブタン酸などの SCFA の増加は、A. muciniphila の増加にも⼀因があると考えられる。また、A. muciniphila の濃縮は、ヒトの耐糖能、⾎清脂質、脂肪細胞の分布など、⾝体の代謝状態を評価する指標として⽤いることができる 8。A. muciniphila の濃縮度
は、2 型糖尿病患者の腸内では低いことが報告されている 9。A. muciniphila の濃縮度はメ
タボリックシンドロームの指標となるだけでなく、動物実験では A. muciniphila の経⼝投与により⾼脂肪⾷による肥満が解消されることが報告されている 10。⽜乳投与後の腸内細菌
11

叢における Akkermansia 属の増加も報告されている 11。 本研究では、⽜乳＋群における内臓脂肪量の減少が FMT(M)群でも認められたことから、腸内細菌叢の改変と A. muciniphilaの増加が内臓脂肪量の減少に関与している可能性が考えられる。
筋⾁量の減少と A. muciniphila の関連性については、ほとんど報告がない。ヒトを対象とした観察研究では、肝硬変のサルコペニア患者の腸内細菌叢において Akkermansia 属の減少が報告されており 12、慢性腎臓病のサルコペニア患者の腸内細菌叢において Akkermansia
属が増加した 13。マウスモデルでは、中強度の運動が、Akkermansia 属などの腸内細菌叢の組成に有意かつ再現性のある変化を⽰している 14。本研究では、⽜乳を与えたマウスと⽜乳を与えたマウスから FMT を⾏ったマウスにおいて、運動量の増加が観察された。これは主に筋⾁量と筋⼒の増加によるものと予想され、運動量の増加が腸内細菌叢の改変に寄与している可能性がある。この点については、さらなる研究が必要である。
最後に、⽜乳摂取と耐糖能異常の改善との関連について説明する。いくつかのメタアナリシ
スで、⽜乳の摂取が耐糖能と関連することが報告されています。また、21 カ国の 147,812⼈を対象とした最近の研究では、全脂乳製品の摂取量が多いほど、糖尿病の発症率が低いことが⽰されています 15。⼀⽅、デンマークの 97,811 ⼈を対象とした観察研究では、⽜乳の摂取は 2 型糖尿病や肥満のリスク低下と関連しないことも報告されています 16。また、
1,904,220 ⼈を対象とした UK バイオバンク研究では、⽜乳の摂取と 2 型糖尿病の発症との間に有意な相関は認められなかった 17。本試験では、ペアフィーディングにより両群に同量の餌を与えたが、⽜乳を与えたマウスは餌に加えて⽜乳を摂取したため、⽜乳を与えなかったマウスと⽐較して総摂取カロリーがわずかに増加した。このことが影響したのか、ミルク＋群の iPGTT の AUC はミルク-群のそれよりも低い傾向にあったが、その差は統計的に有意ではなかった。⼀⽅、FMT(M)群では FMT(db)群に⽐べて明らかに耐糖能が改善したことから、⽜乳による耐糖能改善のメカニズムには腸内細菌叢の改変が関与していると考えられる。A. muciniphila と 2 型糖尿病との関連性については、いくつかの報告がある。動物
実験では、低温殺菌した A. muciniphila またはその外膜タンパク質 Amuc_1100*を投与すると、Toll 様受容体 2 が活性化され、tight junction protein の発現が増加し、⾼脂肪⾷による肥満が回復し、インスリン抵抗性も低下することが報告されている 18。また、ヒトの研究では、2 型糖尿病や糖尿病予備軍と診断された患者において A. muciniphila の存在量の減少が観察されており 9、A. muciniphila の相対⽐率はヘモグロビン A1c 値と有意な負の相関があることが報告されている 19。⽜乳による耐糖能の改善には、Akkermansia 種を含む腸内細菌叢の改変が⼤きく寄与している可能性が⽰唆される。
以上のことから、⽜乳で ND を摂取したマウスから FMT を⾏ったマウスにおいて、サルコ
ペニア型肥満と⾎糖値の改善が⾒られたことから、⽜乳摂取に伴うアミノ酸などの栄養素の摂取量の増加だけでなく、⼩腸の炎症の改善を介した⼩腸上⽪のアミノ酸トランスポー
ター関連遺伝⼦の改変によるアミノ酸の吸収量の増加が、⽜乳によるサルコペニア型肥満の改善に寄与する可能性があると考えられる。
12

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14

15

16

17

18

19

20

Table 1. Amino acids and organic acids in sera and skeletal muscle, and short-chain fatty acids in sera and feces
Amino acids
AlanineValineLeucineIsoleucine
GlycineSerineThreonine
Aspartic acid
Methionine
Phenylalanine
LysineOrganic acids
Oxalic acidMalonic acid
Succinic acid
Citric acid

Sera (µmol/L)

Skeletal muscle (µmol/mg)

Milk -

Milk +

p-value

Milk -

Milk +

p-value

176.8 (58.9)
114.4 (92.2)
168.5 (25.5)
333.8 (13.1)
67.6 (7.8)
30.5 (20.3)
55.6 (17.2)
31.4 (5.9)
363.3 (12.5)
6.5 (15.1)
48.2 (22.5)

110.5 (50.5)
1003.7 (434.2)
594.6 (162.4)
363.2 (22.2)
83.4 (9.6)
64.7 (10.9)
116.1 (15.1)
31.0 (7.5)
424.8 (11.0)
53.0 (12.9)
96.6 (16.5)

0.139
0.002
0.001
0.046
0.027
0.008
0.012
0.933
0.011
0.001
0.017

3.2 (1.0)
0.0 (0.0)
0.2 (0.0)
2.3 (0.2)
0.5 (0.1)
0.2 (0.1)
0.3 (0.0)
0.5 (0.0)
3.3 (0.1)
2.1 (0.6)
0.3 (0.0)

2.2 (0.4)
0.9 (0.7)
0.5 (0.1)
2.8 (0.2)
1.5 (0.4)
0.5 (0.1)
0.4 (0.1)
0.6 (0.1)
4.7 (0.6)
3.6 (1.0)
0.4 (0.0)

0.057
0.038
0.001
0.027
0.003
0.026
0.111
0.010
0.045
0.025
0.015

p-value

Skeletal muscle (µmol/mg)
Milk Milk +p-value

0.092
0.749
0.013
0.034

2.6 (0.2)
0.2 (0.2)
0.2 (0.0)
0.1 (0.0)

Milk 391.3 (44.5)
23.7 (19.7)
57.2 (7.4)
93.5 (4.3)

Sera (µmol/L)
Milk +
454.9 (65.6)
21.2 (8.3)
46.7 (8.2)
103.1 (6.2)
21

2.7 (0.3)
0.2 (0.2)
0.3 (0.1)
0.3 (0.1)

0.503
0.956
0.010
0.004

Short-chain fatty acids

Sera (µmol/L)

Feces (µmol/mg)

Milk -

Milk +

p-value

Milk -

Milk +

p-value279.0 (42.8)

307.2 (59.8)

0.369

5.6 (1.2)

8.2 (2.2)

0.029

Propanoic acid

4.8 (0.5)

213.6 (25.7)< 0.00114.2 (1.4)

18.9 (3.2)

0.009

Butanoic acid

65.4 (5.0)

109.6 (19.0)

0.037

14.6 (0.3)

41.2 (9.9)< 0.001

Acetic acid

Data are expressed as mean (SD). Student's paired t-test were conducted between two groups.
Table 2. Amino acids and organic acids in sera and skeletal muscle, and short-chain fatty acids in sera and feces
Amino acids
AlanineValineLeucineIsoleucine
GlycineSerineThreonine
Aspartic acid
Methionine
Phenylalanine

Sera (µmol/L)

Skeletal muscle (µmol/mg)

FMT (Db)

FMT (M)

p-value

507.2 (412.2)
479.0 (20.0)
336.9 (5.8)
210.4 (15.7)
89.9 (3.5)
51.7 (1.9)
64.6 (7.7)
26.7 (8.2)
237.1 (36.8)
81.3 (2.9)

683.5 (594.9)
691.2 (143.5)
482.3 (131.)301.7 (88.7)
170.1 (4.8)
91.8 (6.6)
166.1 (0.6)
30.4 (13.2)
480. (2.8)
146.4 (5.5)

0.576
0.006
0.023
0.034
< 0.001< 0.001< 0.001
0.585
0.001< 0.00122

FMT (Db)
3.7 (0.8)
0.5 (0.0)
0.3 (0.0)
0.2 (0.0)
1.9 (0.1)
0.3 (0.0)
0.3 (0.0)
0.1 (0.0)
7.2 (0.4)
1.7 (0.0)

FMT (M)
4.3 (0.3)
0.7 (0.2)
0.4 (0.1)
0.3 (0.0)
2.3 (0.2)
0.4 (0.0)
0.2 (0.0)
0.1 (0.0)
8.5 (0.6)
2.0 (0.1)

p-value
0.146
0.018
0.003
<0.001
0.001
0.138
0.586
0.197
0.008
< 0.001

LysineOrganic acids

53.3 (2.3)
Milk -

237.8 (14.9)< 0.001

Sera (µmol/L)
Milk +

p-value

1.9 (0.1)

3.3 (0.5)

0.001

Skeletal muscle (µmol/mg)
Milk Milk +p-valueOxalic acid11.2 (1.0)

12. (2.1)

0.423

0.1 (0.0)

0.1 (0.0)

0.410

Malonic acid
Succinic acid
Citric acid

8.2 (1.1)
8.6 (3.2)
148.9 (21.5)

7.8 (1.1)
10.1 (6.4)
164.4 (39.1)

0.590
0.622
0.426

0.1 (0.0)
0.2 (0.0)
0.1 (0.0)

0.0 (0.0)
0.3 (0.1)
0.2 (0.1)

0.534
0.042
0.005

Short-chain fatty acids

Sera (µmol/L)

Feces (µmol/mg)

FMT(Db)FMT(M)

p-value

FMT(Db)FMT(M)

p-value

Acetic acid242.4 (26.7)

343.8 (43.9)< 0.001

4.2 (1.5)

7.3 (0.9)

0.002

Propanoic acid

4.5 (0.2)

64.9 (3.2)< 0.001

9.5 (1.7)

16.0 (6.2)

0.033

Butanoic acid20.9 (1.0)

31.3 (1.6)

0.037

6.3 (1.0)

42.1 (22.4)

0.003

Data are expressed as mean (SD). Student's paired t-test were conducted between two groups.

23

24

25