哺乳類細胞内のRNAを低分子で制御する技術

沖縄科学技術大学院大学 核酸化学・工学ユニット
教授 横林 洋平

遺伝子スイッチ
低分子化合物を投与 → タンパク質発現↑ ↓哺乳類細胞・動物・ヒトで機能する遺伝子スイッチの応用⚫ 遺伝子（タンパク質）機能の解析⚫ 有用物質（二次代謝物・タンパク質・ウイルスベクター）の生産⚫ 遺伝子治療・細胞治療・再生医療

遺伝子スイッチタンパク質（生物製剤）生産

遺伝子スイッチタンパク質（生物製剤）生産

遺伝子スイッチタンパク質（生物製剤）生産

遺伝子スイッチタンパク質（生物製剤）生産

遺伝子スイッチ
遺伝子治療

遺伝子スイッチ
遺伝子治療• ウイルスベクターを投与• 低分子薬を投与することにより、治療用タンパク質発現のレベル・タイミングを制御

遺伝子スイッチ
遺伝子治療• ウイルスベクターを投与• 低分子薬を投与することにより、治療用タンパク質発現のレベル・タイミングを制御• 重大な副作用→タンパク質発現ストップ・ベクター除去（Kill switch）

遺伝子スイッチ
従来技術：人工転写因子
rtTA

rtetR VP16
rtTA
Doxycycline

TRE-PCMVGOI

遺伝子スイッチ
従来技術：人工転写因子
rtTArtetR VP16
rtTA
Doxycycline

TRE-PCMV

GOI

遺伝子スイッチ
従来技術：人工転写因子
問題点• 人工（外来性）転写因子（免疫原性、大きな遺伝子サイズ、ホスト細胞代謝ストレス）• 目的遺伝子は人工プロモーター制御下• 転写因子とプロモーターの量比の最適化• 新しい化合物に応答する系を構築することが困難

遺伝子スイッチ
従来技術：リボスイッチ• 外来性タンパク質がない• 遺伝子サイズが小さい• SELEXにより、さまざまな化合物に結合するアプタマーが得られる可能性
アプタマー

遺伝子スイッチ
従来技術：リボスイッチ• Theophylline, Guanine, Tetracyclineなど

問題点• >100 μM 投与が必要• そもそも哺乳類リボスイッチへの応用を念頭においた、低分子化合物の選定が行われていない（低毒性、細胞透過性など）• SELEXで得られたアプタマーが、哺乳類細胞内で結合能を示し、リボスイッチとして機能するという保証がない（実際機能しない事が多い）

遺伝子スイッチ
従来技術：リボスイッチ• Theophylline, Guanine, Tetracyclineなど

解決策
••
•
•

哺乳類リボスイッチへの応用を念頭に、化合物を選定それらの化合物に結合するRNAアプタマーをSELEX法により取得
哺乳類細胞内でリボスイッチとして機能する化合物ーアプタマーペアを探索2組の化合物ーアプタマーペア取得に成功

新規技術
低毒性化合物（ASP2905）結合アプタマー（AC17-4）
ASP2905（アステラス製薬）• 神経疾患医薬として開発。第I相臨床試験通過
AC17-4• ASP2905およびASP7967を哺乳類細胞内で選択的に認識・結合

AU
G U
G C
C GC
A
G U
G A CCAAAU
GCG
G
CGC A C UAGU G U
G C
A U
A U
C G
G C

新規技術

ASP7967
KD = 8 nM

40(nM)
10080402010530RUAU
G U
G C
C GC
A UG
G A CCAAA
ASP2905UGCG
G
CGC A C UAGU G UG C
A U
A U AC17-4
C G
G C

20100060120 180
Time (sec)240300新規技術
試験管内（in vitro）でのAC17-4・ASP2905 (ASP7967) の結合を確認
L2A U 15M12 (9 nM)
U
U U C
M10 (20 nM) C P2 GG C
GG 10 C C
M6 (30 nM) U
M7 (3.9 μM)
A UG A
M5 (6.7 μM) C
AG C
U M16 (15 nM)G
M4 (3.8 μM) U
20 C
A25 A
A5U
GCG
M3 (NB) C
GU
30UC
GCUAU
M2 (11.6 μM) U
35
G U1 GU P3 A C L4 A C M13 (25 nM)
M1 (NB) C
GG C
G U A U C G
M9 (1.8 μM) P1 A U G M15 (371 nM)
C G
G C M11 (NB)
5’ 3’

G M8 (NB)C M14 (NB)

新規技術：リボスイッチ
哺乳類細胞内（in cellulo）でのAC17-4・ASP2905（ASP7967)の結合は？
Gene expression OFF
PK

Gene expression ONPK
AA..AAP3

AA..AA

L3Cleavage

5’

Pistol ribozyme(自己切断リボザイム）

UU

CA

U

G UG

CGC
A A GCGCCU AGGC CC GU GU A

A Anti-Rz
GA
AG

AC17-4
アプタマー

5’

G C
U AC GU A
G C
C GU A
G C
C G

G C
G C
U A
C GU AG C
C GU AG C
C Ga9a10

No cleavage

U A
G C
C GU AG C
C GC GU AG C
C GU AG C
C GU AC GU AG C
C GU AG C
C Ga6a7a8Cleavage

3’

EGFP
3’

CPP

P25’

EGFP

3’+ Ligand
U
U

Papt=G UG
UA
CGC
GGCG
AAA
C
GC
U AG AGC C
C GU GU ACA-AC17-4-CPP

新規技術：リボスイッチ
哺乳類細胞内（in cellulo）でのAC17-4・ASP2905（ASP7967)の結合は？
1.8mCherry

EGFP

アプタザイム

Empty

1.6Transfection

EGFP/mCherry

15.0×

0.8

12.2×

a8-AC17-4-CPP
0.68.8×

5.8×

0.40.2EC50 = 2.3 μM
0.00246

ASP7967 (µM)

810

新規技術：リボスイッチ
マウス（in vivo）におけるリボスイッチ機能の実証• 制御対象遺伝子：ヒトエリスロポエチン（hEPO）• ベクター：AAV8• 化合物投与：経口（ASP7967, 100 mg kg-1)
a8c-AC17-4-CPP
ITR

CMV

hEPO

Poly(A)

pAAV-CMV-hEPO

ITR

ITR

CMV

hEPO

Poly(A)

pAAV-CMV-hEPO-a8c-AC17-4-CPP

ITR

新規技術：リボスイッチ
マウス（in vivo）におけるリボスイッチ機能の実証• ASP7967を経口投与後、血中hEPO濃度測定
AAV8-CMV-hEPO or AAV8-CMV-hEPO-a8c-AC17-4-CPP

Intravenous
injection

ASP7967 (100 mg kg-1)
013-24h

15 Days

14+2h +4h +6h +8hBlood sampling+24h

新規技術：リボスイッチ
マウス（in vivo）におけるリボスイッチ機能の実証• hEPOレベルが5.1－7.2倍に上昇

新規技術：リボスイッチ
ON/OFF比の向上• Exon-skippingを制御するリボスイッチ（他社特許技術）

新規技術：リボスイッチ
ON/OFF比の向上
EGFP/mCherry (AU)• ON/OFF比 = 290

1.6

290×1.4

Empty

1.2
10.8

ex169-AC17-4a9hp40.60.40.2
00246

ASP2905 (μM)

810新技術の特徴・従来技術との比較• 細胞透過性が高く、低毒性の低分子（医薬品候補化合物）に対するRNAアプタマーを開発した• このRNAアプタマーを利用して開発したリボスイッチは、ヒト由来培養において、低濃度（10 μM以下・従来技術では100 μM以上）で機能する• 低分子投与によって、最大300倍程度のタンパク質発現量の活性化を示す• マウスへの経口投与による、生体内における遺伝子発現レベルの制御に成功

想定される用途• 哺乳類細胞を用いた生物製剤（タンパク質・ウイルスベクターなど）の生産性向上• 遺伝子治療・細胞治療：治療用遺伝子発現のタイミング・レベ
ル調節による、治療効果向上と副作用軽減• 再生医療：幹細胞の分化因子の発現タイミングを制御し、分化効率および生産性を向上させる• 核酸医薬など：合成mRNA、 sgRNA (CRISPR/Cas)、siRNAなど、機能性RNAの化学的制御

実用化に向けた課題• 培養細胞・動物においては、用途にもよるが既に実用性はあると考えられるが、臨床応用には化合物の安全性評価、さらなる低毒性化、リボスイッチのさらなる高感度化（低濃度でのスイッチング）などが必要と考えられる• アプタザイム機構によるリボスイッチのON/OFF比は、10-20程度に留まる• Exon-skipping機構によるリボスイッチは他社の特許技術

企業への期待• 開発済みの哺乳類細胞リボスイッチの非臨床応用（細胞・動物レベル）のアイデアを持つ企業との共同研究もしくはライセンシング• 臨床応用可能な人工リボスイッチの実現を目指し、医薬品・創薬化学の技術・ノウハウを持つ企業との共同研究を希望。ASP2905などの誘導体合成・毒性評価など• 哺乳類細胞以外（植物、昆虫、酵母など）の細胞・生物へのリボスイッチ応用に関心がある企業との共同研究も希望

本技術に関する知的財産権
Patent application status

発明の名称：ASP7967またはその類似体に結合するRNAアプタマー
原題 「AN RNA APTAMER THAT BINDS TO ASP7967 OR AN ANALOGUE THEREOF」

出願番号 ：特願2022-162289
出願人：学校法人沖縄科学技術大学院大学学園

発明者：横林 洋平、ダモダラン ヴェヌゴパル、福永 圭佑、宮平 奈央、

藤安 次郎、石川 静麻、大住 康晃

お問い合わせ先
Contact
沖縄科学技術大学院大学

TEL： 098-966-8937
FAX： 098-982-3424
E-mail : tls@oist.jp .

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