（別添４）

標準品規格
1.卵検知用標準液
1.1.調製法
以下に示す方法に従い、卵一次標準粉末、卵標準品原液、卵一次希釈液及び卵高濃度標準液を調製する。卵標準品原液から卵高濃度標準液調製までの操作は、1 日の内に行う。
卵一次標準粉末調製方法
白色レグホン種（産卵鶏）の新鮮卵 1 kg の卵殻を外し、均一にホモジナイズした後に凍結乾燥する。乾燥物を微粉砕し、卵一次標準粉末とする。
卵標準品原液調製方法
卵一次標準粉末 0.2 g を 50 mL PP 製チューブに採取し、抽出用緩衝液* 20 mL を加え、よくふり混ぜて混合し、固形物を分散させた後、振とう機（90～110 rpm）で一晩抽出する。抽出液を 10,000×g で 30 分間遠心分離した後、上澄液を孔径 0.8 µm のミクロフィルターでろ過し、卵標準品原液とする。
抽出に際しては、振とう機に遠心管を横にして置き、振とう幅は 3 cm 程度とし、振とうにより液が両端に打ち付けるようになるくらいの振とう回数とする。時々チューブの上下を入れ替えるなどの操作をして、液面に沿って付着するサンプルを分散させる。
*

抽出用緩衝液0.5 % SDS 及び 2 % メルカプトエタノールを含有する PBS（pH 7.4）。

卵一次希釈液調製方法
卵標準品原液を pH 7.4 の PBS で 10 倍に希釈し、卵一次希釈液とする。
卵高濃度標準液調製方法
卵一次希釈液を 0.2 % BSA を含む pH 7.4 の PBS で 2 倍に希釈し、卵高濃度標準液とする。卵標準品原液から卵高濃度標準液調製までの操作は、１日の内に行う。
1.2.規格
卵標準品原液規格
電気泳動像
SDS-PAGE による電気泳動を行うとき、200, 130, 90, 50 kDa 付近にそれぞれ明瞭なバンドを認める。
タンパク量2-D Quant kit（GE ヘルスケアバイオサイエンス社製）により、タンパク質を定量するとき、その濃度は 3.8～5.6 mg/mL である。

参考 以下に示す値は参考値とする。
卵一次希釈液のタンパク質を、2-D Quant kit（GE ヘルスケアバイオサイエンス社製）により定量するとき、その濃度は卵標準品原液のタンパク質濃度の 0.08 倍～0.12 倍である。卵標準品原液について SDS-PAGE を行うとき、7．に示すような泳動像が得られる。
2.牛乳検知用標準液
2.1.調製法
以下に示す方法に従い、牛乳一次標準粉末、牛乳標準品原液、牛乳一次希釈液及び牛乳高濃度標準液を調製する。牛乳標準品原液から牛乳高濃度標準液調製までの操作は、１日の内に行う。
牛乳一次標準粉末調製方法
ホルスタイン種（乳用牛）の新鮮乳 1 L を氷で冷却しながら撹拌し、乳脂肪が凝固して生じる乳脂塊を脱脂綿で濾過する。この操作を 3 回繰り返し脂肪を除去した後、濾液を凍結乾燥し、乾燥物を微粉砕して牛乳一次標準粉末とする。
牛乳標準品原液調製方法
牛乳一次標準粉末 0.2 g を 50 mL PP 製チューブに採取し、抽出用緩衝液* 20 mL を加え、よくふり混ぜて混合し、固形物を分散させた後、振とう機（90～110 rpm）で一晩抽出する。抽出液を 10,000×g で 30 分間遠心分離した後、上澄液を孔径 0.8 µm のミクロフィルターでろ過し、牛乳標準品原液とする。
抽出に際しては、振とう機に遠心管を横にして置く。振とう幅は 3 cm 程度とし、振とうにより液が両端に打ち付けるようになるくらいの振とう回数とする。時々チューブの上下を入れ替えるなどの操作をして、液面に沿って付着するサンプルを分散させる。
*

抽出用緩衝液0.5 % SDS 及び 2 % メルカプトエタノールを含有する PBS（pH 7.4）。

牛乳一次希釈液調製方法
牛乳標準品原液を pH 7.4 の PBS で 10 倍に希釈し、牛乳一次希釈液とする。
牛乳高濃度標準液調製方法
牛乳一次希釈液を 0.2 % BSA を含む pH 7.4 の PBS で 2 倍に希釈し、牛乳高濃度標準液とする。牛乳標準品原液から牛乳高濃度標準液調製までの操作は、１日の内に行う。
2.2.規格
牛乳標準品原液規格
電気泳動像
SDS-PAGE による電気泳動を行うとき、40～25 kDa の範囲に 3 本、20 kDa 付近に 1本の明瞭なバンドを認める。

タンパク量2-D Quant kit（GE ヘルスケアバイオサイエンス社製）により、タンパク質を定量するとき、その濃度は 2.1～3.1 mg/mL である。
参考 以下に示す値は参考値とする。
牛乳一次希釈液のタンパク質を、2-D Quant kit（GE ヘルスケアバイオサイエンス社製）により定量するとき、その濃度は牛乳標準品原液のタンパク質濃度の 0.08 倍～0.12倍である。牛乳標準品原液について SDS-PAGE を行うとき、7.に示すような泳動像が得られる。
3.小麦検知用標準液
3.1.調製法
以下に示す方法に従い、小麦一次標準粉末、小麦標準品原液、小麦一次希釈液及び小麦高濃度標準液を調製する。小麦標準品原液から小麦高濃度標準液調製までの操作は、１日の内に行う。
小麦一次標準粉末調製方法
以下に示す 14 銘柄の小麦混合物を粉砕し、14 メッシュの篩(aperture=1.18 mm)を通過したものを、小麦一次標準粉末とする。
混合物に含まれる銘柄
No.1 Canada Western Red Spring
7.14 %US No.2 or better (Dark) Northen Spring
7.14 %US Hard Red Winter - High Protein
7.14 %US Hard Red Winter - Semi Hard
7.14 %
Canada Western Amber Durum - Triticum durum
7.14 %US Western White (White Club + Soft White)
7.14 %（Club 1.6 % )Australian Premium White for Japan
7.14 %
Australian Prime Hard
7.14 %
ホクシン
7.14 %
ハルユタカ
7.14 %
農林 61 号
7.14 %
チクゴイズミ7.14 %
バンドウワセ7.14 %
シロガネ
7.14 %
小麦標準品原液調製方法
小麦一次標準粉末 1 g を 50 mL PP 製チューブに採取し、抽出用緩衝液* 20 mL を加え、よくふり混ぜて混合し、固形物を分散させた後、振とう機（90～110 rpm）で一晩抽出する。抽出液を 10,000×g で 30 分間遠心分離した後、上澄液を孔径 0.8 µm のミクロフィ

ルターでろ過し、小麦標準品原液とする。
抽出に際しては、振とう機に遠心管を横にして置く。振とう幅は 3 cm 程度とし、振とうにより液が両端に打ち付けるようになるくらいの振とう回数とする。時々チューブの上下を入れ替えるなどの操作をして、液面に沿って付着するサンプルを分散させる。
* 抽出用緩衝液（pH 8.6）

0.5 % SDS 及び 2%メルカプトエタノールを含有する 0.1M Tris-HCl

小麦一次希釈液調製方法
小麦標準品原液を pH 7.4 の PBS で 10 倍に希釈し、小麦一次希釈液とする。
小麦高濃度標準液調製方法
小麦一次希釈液を 0.2 % BSA を含む pH 7.4 の PBS で 2 倍に希釈し、小麦高濃度標準液とする。小麦標準品原液から小麦高濃度標準液調製までの操作は、１日の内に行う。
3.2.規格小麦標準品原液規格
電気泳動像
SDS-PAGE による電気泳動を行うとき、32 kDa～120 kDa の範囲に 4 本以上のバンドを認める。
タンパク量2-D Quant kit（GE ヘルスケアバイオサイエンス社製）により、タンパク質を定量するとき、その濃度は 4.0～6.0 mg/mL である。
参考 以下に示す値は参考値とする。
小麦一次希釈液のタンパク質を、2-D Quant kit（GE ヘルスケアバイオサイエンス社製）により定量するとき、その濃度は小麦標準品原液のタンパク質濃度の 0.08 倍～0.12倍である。小麦標準品原液について SDS-PAGE を行うとき、7.に示すような泳動像が得られる。
4.そば検知用標準液
4.1.調製法
以下に示す方法に従い、そば一次標準粉末、そば標準品原液、そば一次希釈液、そば高濃度標準液を調製する。そば標準品原液からそば高濃度標準液調製までの操作は、１日の内に行う。
そば一次標準粉末調製方法
茨城県産及び中国産(中国北方)産のそばを等量混合した後粉砕し、14 メッシュの篩(aperture=1.18 mm)を通過したものを、そば一次標準粉末とする。

そば標準品原液調製方法
そば一次標準粉末 1 g を 50 mL PP 製チューブに採取し、抽出用緩衝液* 20 mL を加え、よくふり混ぜて混合し、固形物を分散させた後、振とう機（90～110 rpm）で一晩抽出する。抽出液を 10,000×g で 30 分間遠心分離した後、上澄液を孔径 0.8 µm のミクロフィルターでろ過し、そば標準品原液とする。
抽出に際しては、振とう機に遠心管を横にして置く。振とう幅は 3 cm 程度とし、振とうにより液が両端に打ち付けるようになるくらいの振とう回数とする。時々チューブの上下を入れ替えるなどの操作をして、液面に沿って付着するサンプルを分散させる。
* 抽出用緩衝液 0.5 % SDS、2 % メルカプトエタノール及び 0.5 M 塩化ナトリウムを含有する 20 mM Tris-HCl（pH 7.5）
そば一次希釈液調製方法
そば標準品原液を pH 7.4 の PBS で 10 倍に希釈し、そば一次希釈液とする。
そば高濃度標準液調製方法
そば一次希釈液を 0.2 % BSA を含む pH 7.4 の PBS で 2 倍に希釈し、そば高濃度標準液とする。そば標準品原液からそば高濃度標準液調製までの操作は、１日の内に行う。
4.2.規格そば標準品原液規格
電気泳動像
SDS-PAGE による電気泳動を行うとき、28 kDa 付近に 1 本の明瞭なバンドと 32 kDa～83 kDa の範囲に 4 本以上のバンドを認める。
タンパク量2-D Quant kit（GE ヘルスケアバイオサイエンス社製）により、タンパク質を定量するとき、その濃度は 2.8～4.2 mg/mL である。
参考 以下に示す値は参考値とする。
そば一次希釈液のタンパク質を、2-D Quant kit（GE ヘルスケアバイオサイエンス社製）により定量するとき、その濃度はそば標準品原液のタンパク質濃度の 0.08 倍～0.12倍である。そば標準品原液について SDS-PAGE を行うとき、7.に示すような泳動像が得られる。
5.落花生検知用標準液
5.1.調製法
以下に示す方法に従い、落花生一次標準粉末、落花生標準品原液、落花生一次希釈液、落花生高濃度標準液を調製する。落花生標準品原液から落花生高濃度標準液調製までの操作は、１日の内に行う。
落花生一次標準粉末調製方法
千葉県産バージニア種落花生を乳鉢で粉砕しペースト状としたもの 1 g を 50 mL PP 製チューブに採取し、アセトン 10 mL を加え、ボルテックスミキサーを用いて 1 分間撹拌した後、10,000×g で 30 分間遠心分離し、上清を除く。この操作を３回くり返す。チューブを 45℃のアルミバス上に置き、約 7 h 乾燥し、落花生一次標準粉末とする。
落花生標準品原液調製方法
落花生一次標準粉末 0.4 g に抽出用緩衝液* 20 mL を加え、よくふり混ぜて混合し、固形物を分散させた後、振とう機（90～110 rpm）で一晩抽出する。抽出液を 10,000×gで 30 分間遠心分離した後、上澄液を孔径 0.8 µm のミクロフィルターでろ過し、落花生標準品原液とする。
抽出に際しては、振とう機に遠心管を横にして置く。振とう幅は 3 cm 程度とし、振とうにより液が両端に打ち付けるようになるくらいの振とう回数とする。時々チューブの上下を入れ替えるなどの操作をして、液面に沿って付着するサンプルを分散させる。
* 抽出用緩衝液 0.5 % SDS、2 %メルカプトエタノール及び 0.5 M 塩化ナトリウムを含有する 20 mM Tris-HCl（pH7.5）
落花生一次希釈液調製方法
落花生標準品原液を pH 7.4 の PBS で 10 倍に希釈し、落花生一次希釈液とする。
落花生高濃度標準液調製方法
落花生一次希釈液を 0.2 % BSA を含む pH 7.4 の PBS で 2 倍に希釈し、落花生高濃度標準液とする。落花生品標準原液から落花生高濃度標準液調製までの操作は、１日の内に行う。
5.2.規格
落花生標準品原液規格
電気泳動像
SDS-PAGE による電気泳動を行うとき、70 kDa 付近に 1 本の明瞭なバンドと 15 kDa～30 kDa の範囲に 3～4 本の明瞭なバンドを認める。
タンパク量2-D Quant kit（GE ヘルスケアバイオサイエンス社製）により、タンパク質を定量するとき、その濃度は 3.6～5.3 mg/mL である。
参考 以下に示す値は参考値とする。
落花生一次希釈液のタンパク質を、2-D Quant kit（GE ヘルスケアバイオサイエンス

社製）により定量するとき、その濃度は落花生標準品原液のタンパク質濃度の 0.08 倍～0.12 倍である。落花生標準品原液について SDS-PAGE を行うとき、7.に示すような泳動像が得られる。
6.甲殻類検知用標準液**えび、かにのスクリーニングに使用する ELISA キットはえびとかにを区別せずに検出するため、本標準液の名称は甲殻類検知用標準液とする。
6.1.調製法
以下に示す方法に従い、甲殻類一次標準粉末、甲殻類標準品原液、甲殻類一次希釈液及び甲殻類高濃度標準液を調製する。甲殻類標準品原液から甲殻類高濃度標準液調製までの操作は、1 日の内に行う。
甲殻類一次標準粉末調製法
ウシエビ（ブラックタイガー）（養殖エビ）の尾部筋肉を採取し、氷冷しながら均一にホモジナイズした後に凍結乾燥する。乾燥物を微粉砕し、甲殻類一次標準粉末とする。
甲殻類標準品原液調製法
甲殻類一次標準粉末 0.1 g を 50 mL PP 製チューブに採取し、抽出用緩衝液*20 mL を加え、よくふり混ぜて混合し、固形物を分散させた後、振とう機（90～110 rpm）で一晩抽出する。抽出液を 10,000×g で 30 分間遠心分離した後、上澄液を孔径 0.8 μm のミクロフィルターでろ過する。ろ過した液を、100℃で 10 分間加熱し、甲殻類標準品原液とする。
抽出に際しては、振とう機に遠心管を横にして置き、振とう幅は 3 cm 程度とし、振とうにより液が両端に打ち付けるようになるくらいの振とう回数とする。時々チューブの上下を入れ替えるなどの操作をして、液面に沿って付着するサンプルを分散させる。
* 抽出用緩衝液 0.5% SDS、2%メルカプトエタノール、1% Inhibitor Cocktail 及び 5mM EDTA（Halt Protease Inhibitor Cocktail Kit（Thermo Fisher Scientific 社製））
を含有する PBS（pH 7.4）
甲殻類一次希釈液調製法
甲殻類標準品原液を pH 7.4 の PBS で 10 倍に希釈し、甲殻類一次希釈液とする。
甲殻類高濃度標準液調製法
甲殻類一次希釈液を 0.2% BSA を含む pH 7.4 の PBS で 2 倍に希釈し、甲殻類高濃度標準液とする。甲殻類標準品原液から甲殻類高濃度標準液調製までの操作は、1 日の内に行う。
6.2.規格甲殻類標準品原液規格
電気泳動像
SDS-PAGE による電気泳動を行うとき、160、41、37kDa 付近にそれぞれ 1 本、20～16kDa の範囲に 4 本の明瞭なバンドを認める。
タンパク量2-D Quant kit（GE ヘルスケアバイオサイエンス社製）により、タンパク質を定量するとき、その濃度は 2.7～4.1mg/mL である。
参考以下に示す値は参考値とする。
甲殻類一次希釈液調製のタンパク質を 2-D Quant kit（GE ヘルスケアバイオサイエンス社製）により定量するとき、その濃度は甲殻類標準品原液のタンパク質濃度の0.08 倍～0.12 倍である。甲殻類標準品原液について SDS-PAGE を行うとき、7.に示すような泳動像が得られる。

7.各標準品原液の SDS-PAGE 電気泳動像
卵牛乳
Maker

原末Maker

E001 E002 E003

kDa200→←200kDa200→131→←130131→←9079→

原末 M001 M002 M003

79→←5039→39→

40-2532→32→←2018→18→

小麦
kDa
210－
119－

そば
M 原末 1

23kDa M 原末 1
210－
119－

落花生
23kDa M 原末1 原末2 1210－
119－

83－

83－
32120
41－

41－

32－

32－

83－

2

3

←70

32-83 41－

32－
←28

15-30
17－

17－

17－

甲殻類
M

kDa
250
150
100

原末T001

T002

T003

←160

75
50
37

←41
←3725
20

←20

←1615

原末：卵・牛乳・小麦・そば・甲殻類標準粉末
原末 1：落花生脱脂前粉末
原末 2：落花生脱脂後粉末
E001-003，M001-003，1-3, T001-003 ：ロット番号