遺伝子治療製品のバイオアナリシス
第13回JBFシンポジウム
第一三共株式会社
花田 雄志

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Japan Bioanalysis Forum赤羽隆文1、稲見真倫1、岸野有紀2、橘田久美子3、中村隆広4、花田雄志2、福永智恵5、森 勇伍31アステラス製薬株式会社，2第一三共株式会社，3シミックファーマサイエ

ンス株式会社，4株式会社新日本科学，5田辺三菱製薬株式会社
13 th JBF Symposium, DG2021-50

1Japan Bioanalysis Forum

AAV
ADA
AE
BD
BLAST
BLOD
CDx
cGMP
CNV
COU
Cq
Ct
ddPCR
dPCR
ELISpot
FCM
FRET
gDNA
GOI
GT
IHC
ISH
ISR

Adeno-Associated Virus
Anti-drug antibody
Amplification Efficiency
Biodistribution
The Basic Local Alignment Search Tool
Below the Limit of Detection
Companion Diagnostics
Current Good Manufacturing Practices
Copy Number Variation
Context of Use
Quantification cycle
Threshold cycle
Droplet Digital Polymerase Chain Reaction
Digital Polymerase Chain Reaction
Enzyme-Linked Immunosorbent Spot assay
Flow Cytometry
Fluorescence Resonance Energy Transfer
genomic DNA (Deoxyribonucleic Acid)
Gene of Interest
Gene Therapy
Immunohistochemistryin situ hybridization
Incurred Sample Reanalysis

ITR
Inverted Terminal Repeat
LncRNA Long Non-Coding RNA (Ribonucleic Acid)
LOD
Limit of Detection
LTS
Long Term Stability
ME
Matrix EffectmiRNA Micro RNA (Ribonucleic Acid)
NAb
Neutralizing Antibody
NBS
Northern Biomolecular Services
NC
Negative Control
NGS
Next-Generation Sequencing
NTC
No Template Control
PBMC
Peripheral Blood Mononuclear Cells
QC
Quality Control
qPCR
Quantitative Polymerase Chain Reaction
RE
Relative Error
RT
Reverse Transcription
siRNA
Small Interfering RNA (Ribonucleic Acid)TA
Test Articles
TAb
Total Antibody
UL
Ultra Low (lowest concentration at QCset)
w/wowith / without
WB
Western Blotting
WRIB
Workshops on Recent Issues in Bioanalysis

13 th JBF Symposium, DG2021-50

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略語一覧

2

Japan Bioanalysis ForumDG2021-50 「遺伝子治療製品のバイオアナリシス」

細胞内在化

我々は何を測る？
ベクター?
導入gDNA？
発現RNA?
発現蛋白？
抗ベクター抗体?
抗発現蛋白抗体?

翻訳
核内へ
転写

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投与

遺伝子治療のBAとして、何を、どんな方法で、どのような基準で測定・評価するか、現時点でのregulation
や知見をもとにまとめた。
13 th JBF Symposium, DG2021-503Japan Bioanalysis ForumDG2021-50 「遺伝子治療製品のバイオアナリシス」
構成メンバー所属

赤羽 隆文

アステラス製薬株式会社

稲見 真倫
（～9月）

アステラス製薬株式会社

岸野 有紀

第一三共株式会社

橘田 久美子シミックファーマサイエンス株式会社

中村

株式会社新日本科学

隆広

花田 雄志

第一三共株式会社

福永 智恵

田辺三菱製薬株式会社

森 勇伍

シミックファーマサイエンス株式会社

13 th JBF Symposium, DG2021-50

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氏名（50音順）

4

Japan Bioanalysis Forum

議論の範囲

In vivo遺伝子治療
AAVなど

Ex vivo遺伝子治療
CAR-Tなど

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遺伝子治療

主にこちらを議論

13 th JBF Symposium, DG2021-50

5Japan Bioanalysis Forum

遺伝子治療とは、治療上有効な蛋白質をコードしたgDNAを患者に投与したり（in vivo)、遺伝子を導入・発現させた細胞を患者に投与する（ex vivo）
ことにより、治療を達成する先端医療である。
本DGでは、主にin vivo遺伝子治療を取り扱う。
遺伝情報（gDNA） を安定かつ高効率に細胞内に送達し発現させるために遺伝情報をカプセル（遺伝子導入ベクター）に包んで投与する。
【遺伝子導入ベクター】

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遺伝子治療とベクター

https://catalog.takara-bio.co.jp/PDFS/transgenesis_experiment.pdf, 遺伝子導入ハンドブック（タカラバイオ）

13 th JBF Symposium, DG2021-50

6Japan Bioanalysis Forum

アデノ随伴ウイルス（AAV）は、ヒトや霊長目の動物に感染する小型の、パルボウイルス科ディペンドウイルス属に分類されるヘルパー依存型のエンベロープを持たないウイルスである。
非常に弱い免疫反応しか引き起こさず、病原性は現在の所確認されていない。
分裂期にある細胞にもそうでない細胞にもゲノムを送り込
むことができ宿主細胞にゲノムを送り込まずとも染色体外で生存することができる。
そのような特色があるためにベクターウイルスを用いた遺伝子治療やヒトの疾患モデ
ル細胞の作成などに用いられる。

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アデノ随伴ウイルスhttps://www.cosmobio.co.jp/support/technology/a/adeno-associatedvirus-aav-apb.asp, アデノ随伴ウイルス（AAV）とは（コスモ・バイオ株式会社）

13 th JBF Symposium, DG2021-50

7Japan Bioanalysis Forum

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遺伝子治療における遺伝子発現 –AAVを例に-１本鎖DNAがカプシド蛋白に包まれた構造
種々の受容体を介して細胞内に侵入し、核移行時にカプシドが脱落する。
核内に侵入した1本鎖DNAはアニーリングにより2本鎖になり、その後遺伝子発現
13 th JBF Symposium, DG2021-50

8Japan Bioanalysis Forum

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AAVベクターの構造

Rep: AAVの複製やgDNAの組込みを担う
Cap: カプシド蛋白をコード
13 th JBF Symposium, DG2021-50→ 組換えAAVベクターはこれらの遺伝子が欠落・・・・・複製やgDNAへの組込みが起こらない

9Japan Bioanalysis Forum

AAVの血清型（カプシドの種類）
AAVは血清型（セロタイプ）の違いによって、感染効率や組織特異性が異なる。

AAV1
AAV2

AAV3

AAV4

AAV5
AAV6

AAV7
AAV8
AAV9

AAV10

●

心臓

肺

●

●

●

肝臓

●
●

●

●

●

●

●

骨格筋
●

●
●

●

●

●

●

●

●

●

●

●

●

●

●
●

●

●

●

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AAVセロタイプとその指向性
CNS/網膜

●https://www.cosmobio.co.jp/support/technology/a/adeno-associatedvirus-aav-apb.asp, アデノ随伴ウイルス（AAV）とは（コスモ・バイオ株式会社）

13 th JBF Symposium, DG2021-50

10Japan Bioanalysis Forum

遺伝子治療の体内動態的特徴
・増えない。
・細胞に感染後、DNAのみ核へ移行。カプシドはlysosomeに取り込まれ、分解される。
・核へ移行後、ずっとそこにいる。（エピソーム性）
・主に、分裂しない細胞に感染し、ずっとそこにいる。
・分裂する細胞に感染すると、gDNAが細胞分裂の際に希釈される。
・分裂しない細胞の場合、細胞死によってのみ消失する。
・カプシドにより、感染効率や各臓器への指向性が異なる。

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・ホストの染色体に組み込まれることはない。

遺伝子治療とは、組織内（細胞内）でタンパク質をほぼ一定濃度で恒常的に暴露させる技術

13 th JBF Symposium, DG2021-50

11Japan Bioanalysis ForumICH S12ガイドライン草案

1. 緒言
2. 非臨床BDの定義
3. 非臨床BD評価の実施時期
4. 非臨床BD試験のデザイン
5. 個別留意事項
6. 非臨床BD試験の適用
13 th JBF Symposium, DG2021-50

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医薬品規制調和国際会議（2021年6月3日改訂）「遺伝子治療製品の非臨床生体内分布の考え方」
https://public-comment.e-gov.go.jp/servlet/PcmFileDownload?seqNo=0000222846

12

Japan Bioanalysis ForumICH S12ガイドライン草案（BAに関する部分を抜粋）
医薬品規制調和国際会議（2021年6月3日改訂）「遺伝子治療製品の非臨床生体内分布の考え方」
https://public-comment.e-gov.go.jp/servlet/PcmFileDownload?seqNo=0000222846

・BDプロファイルを評価するためには、組織や体液中のGT製品の遺伝物質(DNA/RNA) の量 及び、必要に応じて、発現産物の量を測定する必要がある。
・リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応 (qPCR) は、組織や体液中に存在する
特定の DNA（又は、逆転写ステップによりRNAも同様）を測定する 「ゴールドス
タンダード」 と考えられている。
・上記以外の手法として、ELISA, IHC, WB, ISH, dPCR, FCM, 及び様々なイメージング技術、その他進化しつつある技術等が挙げられる。
5.2 発現産物の測定
・GT製品の遺伝物質の定量が主要な BD 評価であるのに対し、様々な組織や体液中の発現産物の濃度を測定することは、GT製品投与後の安全性及び活性プ
ロファイルの特性解析に役立つ。
13 th JBF Symposium, DG2021-50

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5.1 分析法

13

Japan Bioanalysis ForumICH S12ガイドライン草案（BAに関する部分を抜粋）
医薬品規制調和国際会議（2021年6月3日改訂）「遺伝子治療製品の非臨床生体内分布の考え方」
https://public-comment.e-gov.go.jp/servlet/PcmFileDownload?seqNo=0000222846

・動物、特にヒト以外の霊長類及びその他の非げっ歯類におけるGTベクターに対する既存免疫は、BDプロファイルに影響を及ぼす可能性がある。非臨床試験に組み入れる前に、ベクターに対する既存の免疫について動物のスクリーニングを検討すべきである。
・場合によっては、発現産物の種特異的性質のために、動物で発現産物に対する細胞性又は液性免疫応答を生じる可能性がある。また、GT製品投与後にベクター
に対する細胞性免疫応答が生じる可能性もある。この免疫応答により、有益なBDプロファイルが得られない可能性がある。このような状況が予想される場合、申請者は、BDデータの解釈を裏付けるために、免疫原性の可能性に関する解析に適した試料の採取及び保管を検討することができる。

13 th JBF Symposium, DG2021-50

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5.4 免疫原性14

Japan Bioanalysis Forum

ウイルスとベクターの排出に関して -ICH見解-

1. 序
2. ウイルス/ベクターの生物学的特性
3. 分析法に関する考慮事項
4. 非臨床での考慮事項
5. 臨床での考慮事項
6. 第三者への伝播
13 th JBF Symposium, DG2021-50

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厚生労働省医薬食品局審査管理課/厚生労働省医薬食品局 医療機器・再生医療等製品担当参事官室（平成27年6月23日）『ICH 見解「ウイルスとベクターの排出に関する基本的な考え方」について』
https://www.pmda.go.jp/files/000206059.pdf

15

Japan Bioanalysis Forum

ウイルスとベクターの排出に関して -ICH見解（BAに関する部分を抜粋）

厚生労働省医薬食品局審査管理課/厚生労働省医薬食品局 医療機器・再生医療等製品担当参事官室（平成27年6月23日）『ICH 見解「ウイルスとベクターの排出に関する基本的な考え方」について
https://www.pmda.go.jp/files/000206059.pdf（臨床）・排出試験の実施には、適格な分析法を用いることが非常に重要である。分析法は、
特異性、十分な感度、再現性を示すものである必要がある。
・排出されたウイルス/ベクターの検出には、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）と感染性試験の２つの方法が通常用いられる。ウイルス/ベクターの遺伝子配列の検出には定量的PCR（qPCR）に基づく分析法の使用が推奨される。qPCR 法の利点は、高感度、再現性、迅速性である。
・感染性試験は、インタクトで感染性のあるウイルス/ベクターのみを検出するという利点がある。感染性試験の主な欠点は、PCR に基づく分析法と比べて本質的に感度が低いことである。

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3.0 分析法に関する考慮事項

・qPCR で検出された「排出物」の量が感染性試験の検出限界以下の場合、試験感度の制約から、感染性試験による「排出物」の更なる分析を実施しない、という選択も可能である。
13 th JBF Symposium, DG2021-50

16

Japan Bioanalysis Forum

ウイルスとベクターの排出に関して -ICH見解（BAに関する部分を抜粋）

厚生労働省医薬食品局審査管理課/厚生労働省医薬食品局 医療機器・再生医療等製品担当参事官室（平成27年6月23日）『ICH 見解「ウイルスとベクターの排出に関する基本的な考え方」について』
https://www.pmda.go.jp/files/000206059.pdf

・非臨床の排出試験データは臨床での排出試験を計画するのに役立つ。非臨床の排出試験の目的は、ウイルス/ベクターの分泌/排泄（による排出）のプロファイルを決定することである。
4.4 サンプルの採取・ウイルス/ベクターの特性、投与経路、及び動物種を考慮して、採取するサンプルを決定すべきであろう。最も一般的に採取されるサンプルの例は尿と糞便であるが、他に口腔スワブ（ぬぐい液）、鼻腔スワブ、唾液、気管支洗浄液などのサンプルも含めることができる。

13 th JBF Symposium, DG2021-50

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4.0 非臨床での考慮事項

17

Japan Bioanalysis Forum

このDGでフォーカスする部分
測定対象（想定）
ベクター(カプシドなど)◎〇, △測定対象かどうか（BMとして）

mRNA

〇

〇

発現蛋白

〇

ベクターの
免疫原性

発現蛋白の免
疫原性

◎

〇, △

△

△

測定対象、内容

投与された
AAV中の
gDNA

AAVなど各種
ウイルス、脂質膜等

発現mRNA

発現蛋白

・中和抗体
・Total抗体
・細胞性免疫・Total抗体
・細胞性免疫・その他

測定法

主にqPCR,
ddPCR

LBA
LC/MS/MS

主にRTqPCR

LBA
LC/MS/MSWB, IHC,・感染実験等・LBA
・ELISpot

LBA,
ELISpot★BA◎gDNAのBA
・ベクターのBA
・発現蛋白のBA

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測定対象かどうか（BAとして）

gDNA

★免疫原性
◎ベクターの免疫原性・発現蛋白の免疫原性

13 th JBF Symposium, DG2021-50

18

gDNAのバイオアナリシス

・qPCR, dPCR, ddPCRの特徴及び使い分け
・遺伝子の中のどこを測定するか？
・Validation, criteriaについての考え方

13 th JBF Symposium, DG2021-50

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Japan Bioanalysis Forum

19

Japan Bioanalysis ForumqPCRの基本原理
PrimerS

S

プローブ法
Reporter

S
S

Reporterに対する励起光PrimerQuencherR

R

Q ProbeS
PrimerPrimer

S

S

S

S

S

S

S

S

伸長反応により二本鎖内に蛍光色素(SYBR Greenなど)が挿入し蛍光を発する

R

蛍光の強度を測定し、DNA量を評価
増幅曲線
検量線

蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)

Q

Probe

Reporter Quencher
通常、蛍光反応は近傍のquencherによるFRET反応により吸収されている

Q伸長反応によりプローブ（TaqManなど）が加水分解され、蛍光を発するhttp://bioanalysisforum.jp/

インターカレーション法

Int J Mol Sci. (2020) 21(9):3043.

13 th JBF Symposium, DG2021-50

20Japan Bioanalysis Forum

インターカレーション法

プローブ法

測定原理

二本鎖内に挿入した蛍光色素を検出

加水分解されたプローブの蛍光色素を検出

Multiplex

不可

可

操作性

 専用のプローブを必要としない
 増幅遺伝子配列に依存せず使用可能

 増幅遺伝子配列毎に専用のプローブが必要

特異性

低

高

ランニング
コスト

一般的に低

一般的に高

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各測定原理の比較（最適化などの回数・程度などにより変動）

https://www.thermofisher.com/jp/ja/home/life-science/pcr/real-time-pcr/qpcr-education/taqman-assays-vs-sybr-green-dye-for-qpcr.html
リアルタイムPCRの TaqMan® Chemistry と SYBR® Chemistry の比較（ThermoFisher SCIENTIFIC）

13 th JBF Symposium, DG2021-50

21Japan Bioanalysis Forum

サンプルを多数の分画に分配: 標的DNA: ポジティブ反応: ネガティブ反応

増幅反応

ポアソン分布に当てはめ、標的DNAの濃度(コピー数/µL)を算出

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dPCR及びddPCRの基本原理

ポジティブ/ネガティブを判断
Anal Chem. (2018) 90(15):8919-8926.

dPCRの内、Droplet（液滴）によるサンプル分配法をddPCR
13 th JBF Symposium, DG2021-50

22Japan Bioanalysis Forum

定量範囲
精度/再現性
検量線
Throughput

qPCR

dPCR/ddPCR

9 Log程度

4 Log程度（機種により異なる）

中程度

高い

必要（相対定量）

不要（絶対定量）

高い

低い

Multiplex

実施可能

マトリックスなどの阻害物質による耐性低い

高い

操作性/扱いやすさ

簡便

専門性が必要ランニングコスト

低い

高い（専用機器/キットなどが必要）

主なアプリケーション

•
•
•
•

Rare mutation detection
CNV
Nucleic acid standard validation
NGS

•
•
•
•

Microarray validation
siRNA, miRNA, lncRNA detection
Gene expression
Pathogen detection

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各プラットフォームの比較

SLAS Technol. (2017) 22:369–86.
https://www.bio-rad.com/ja-jp/life-science/learning-center/digital-pcr-and-real-time-pcr-qpcr-choices-for-different-applications?ID=OENHBB15
Digital PCR and Real-Time PCR (qPCR) Choices for Different Applications（BIO-RAD）

13 th JBF Symposium, DG2021-50

23Japan Bioanalysis Forum

各プラットフォームのPros/Cons
dPCR/ddPCR

Pros

 広い定量範囲
 High throughput
 高い汎用性 絶対定量の為、標準品や検量線が不要
 高い感度/精度/再現性
 高い阻害物質耐性Cons マトリックス等による影響を受けやすい 高コスト 専門性

測定におけるdPCR/ddPCRのアドバンテージは大きいが、新規技術である点、コスト面などにより
現状ではqPCRと比較して実績は少なく、まだ発展途上。

13 th JBF Symposium, DG2021-50

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qPCR

24

Japan Bioanalysis Forum

gDNA測定：創薬ステージでの各プラットフォームの利用状況

・創薬初期はもっぱらqPCR。

qPCR・dPCRは現在は主にtitrationに用いられている。
非臨床

dPCR
臨床

・開発ステージでも現時点では
qPCRの使用実績が多いが、FDAのガイドライン（LOQとして
50 copies/μg gDNA）を満たすためにdPCRが有用であるなら
ば、今後dPCRが増える可能性がある。

13 th JBF Symposium, DG2021-50

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探索25

Japan Bioanalysis Forum

gDNA測定遺伝子の中のどこを測定するか？

目的遺伝子配列（GOI）を最適化するまでの間は、ITR認識
プライマー、プローブなど、共通のプライマー、プローブを使用する
ことにより迅速評価可能例) ITR領域に設計
Forward primer
5’-

ITR

Transgene

ITR

-3’

3’-

ITR

Transgene

ITR

-5’

Probe

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探索段階でのプライマー、プローブ配列選択

Reverse primer

13 th JBF Symposium, DG2021-50

26

gDNA測定

Japan Bioanalysis Forum

遺伝子の中のどこを測定するか？
GOIとベクター特異的配列を跨ぐかたち，あるいはGOI内にプライマー，プローブを設計し，良いものを選ぶ
より望ましいプライマー、プローブ
 増幅効率が良い
 特異性が高い（非特異的検出が認められない）
 目的遺伝子配列を特異的に増幅する
他の内在性遺伝子が検出されないことをBLAST等のin silico
ツールを用いて確認する

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GOI決定後のプライマー，プローブ配列設計

良いものという意味ではITR認識プライマー、プローブも可13 th JBF Symposium, DG2021-50

27

Japan Bioanalysis Forum

gDNA測定遺伝子の中のどこを測定するか？
最も推奨する設計_優先順位①（理想はA、設計困難であればBのパターン）
ベクター特異的配列とGOIを跨ぐ部分にプライマーを設計し、目的遺伝子を特異的に増幅・検出
Forward primer
5’- ITR

Transgene

ITR -3’3’- ITR

Transgene

ITR -5’

Probe

Reverse primer

設計例B_GOIとベクター特異的配列を跨ぐ部分に片方のプライマーを設計
Forward primer
5’- ITR

Transgene

ITR -3’3’- ITR

Transgene

ITR -5’

Probe

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設計例A_GOIとベクター特異的配列を跨ぐ部分にそれぞれのプライマーを設計

Reverse primer

13 th JBF Symposium, DG2021-50

28

Japan Bioanalysis Forum

gDNA測定遺伝子の中のどこを測定するか？

Probe

Forward primer
5’- ITR

Transgene

ITR -3’3’- ITR

Transgene

ITR -5’
Reverse primer

設計例D_GOIと、ベクター特異的配列やITRを跨ぐパターン
Forward primer

Probe

5’- ITR

Transgene

ITR -3’3’- ITR

Transgene

ITR -5’

Reverse primer

13 th JBF Symposium, DG2021-50

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優先順位② ベクター特異的配列からGOIにかけて増幅し、目的遺伝子を特異的に増幅・検出
設計例C_GOIとベクター特異的配列を跨ぐパターン

29

Japan Bioanalysis Forum

gDNA測定遺伝子の中のどこを測定するか？

設計例E_GOI内に設計するパターン
Forward primer
5’- ITR

Transgene

ITR -3’3’- ITR

Transgene

ITR -5’Probe

13 th JBF Symposium, DG2021-50

Reverse primer

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優先順位③ GOIを増幅・検出（優先順位①②の設計と比較して、特異性は少し低い）

30

Japan Bioanalysis ForumqPCR: Validation, criteriaについての考え方
ー DG2017-33のおさらい －項目

現状を考慮すると50%程度

検量線

r2≧0.98, 増幅効率が85～110%

特異性

試薬コントロールと動物gDNAの両方で増幅が認められない、あるいは動物gDNAで増幅が認められてもCq値の差<1.5、または定量下限との乖離の差で妥当と判断することもありうる

マトリックス効果

動物gDNA原液 vs. H2O or bufferにQCサンプルをスパイクし、その間でCq値差が<1.5、検量線slopeが-3.6～-3.1 。
阻害が認められる場合、・DNA抽出法の再検討、・希釈の適用・定性的な判断に用いる

定量下限

真度及び精度のクライテリアを満たす最低濃度

検出限界

95%信頼性で検出できる濃度

安定性

Cq値変動が＜1.5

選択性、キャリーオーバー、希釈直線性は必要なし。

13 th JBF Symposium, DG2021-50

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真度及び精度適合基準

31

Japan Bioanalysis Forum

Validation, criteriaについての考え方：
参照論文リスト表記

DG2017-33：
qPCRを用いた定量におけるバリデーションの考え方

2017年JBFシンポジウム DGからの発表

DG2017-33

Mol Ther Methods Clin Dev. (2021) 20:152-168.

米国CRO: Northern Biomolecular Servicesが著者のqPCR評価基準に関するReview

NBS

Bioanalysis (2021) 13(6):415-463.

第14回WRIBワークショップでの議論内容をまとめたReview

WRIB
2020-3

Guidance for Industry:Long Term Follow-Up After Administration of
Human Gene Therapy Products

FDA発行ガイダンス:
ヒトGT製品長期フォローアップ試験の推奨事項まとめ

FDA
Guidance_1

Guidelines for the Validation of Analytical Methods for
Nucleic Acid Sequence-Based Analysis of Food, Feed,
Cosmetics and Veterinary Products Edition 1.1

FDA発行ガイドライン:DNA配列分析法バリデーション

FDA
Guidance_2

http://bioanalysisforum.jp/common/pdf/event/dg/9t
h_JBF_DG2017-33.pdf

https://www.fda.gov/media/113768/download
https://www.fda.gov/media/121751/download

以下はDG-50での参照論文(備考)

Clin Chem. (2009) 55(4):611-622.

MIQE Guideline

Bioanalysis (2019) 11(24):2207-2244.

WRIB white paper 2019-3

Bioanalysis (2018) 10(22):1781-1801.

WRIB white paper 2018-1

Bioanalysis (2018) 10(24):1973-2001.

WRIB white paper 2018-3

13 th JBF Symposium, DG2021-50

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内容

文献・資料

32

Japan Bioanalysis Forum

Validation/criteriaの比較（1/6）
Calibration
curve
LLOQ
LOD

Acceptance criteria

備考、コメント

DG2017-33

NBS

WRIB2020-3

AE: 85% - 110%R^2 >0.980

AE: 90% - 110%R^2 >0.980%RE <±25% (<±45% for
LLOQ)
Ct %CV ≤ 2.0% in duplicate(≤ 3.0% for inter assay)
LLOQ:50 copies/ug gDNA
with 95% confidence(50 copies/reaction forshedding)

AE: 90%(85%) 110%
Some assays meet
LBA criteria basedon COU(%CV %RE<20%,<25% for LOQ

LOD: the lowest standard
level, which gives a Ct ≤40 in
all replicates tested
throughout the 5 vali-runs.

LOD: Y intercept
using a standard
calibration curve(theoretical LOD)

LLOQ: lowest
standard level withacceptable assay
precision andaccuracy
LOD: the lowest
standard level with
95% confidence

LLOQ:50 copies/ug
gDNA

FDA Guidance_1
LLOQ: ≤50
copies/ug gDNA with
95% confidence
FDA Guidance_2
LLOQ: all 12
replicates are
positive with %CV ≤50%.
LOD: all 12
replicates are
positive with 95%
confidence> 75% and a minimum ofseven non-zero standard
concentrations, LLOQ~ULOQ,
should meet the above
criteria in each validation run

本DG見解 増幅効率、決定係数、定量限界、検出限界の推奨基準はDG33を継続。
NBS論文の相対誤差及びCq値変動係数の基準を満たすケースは限定的。
13 th JBF Symposium, DG2021-50

http://bioanalysisforum.jp/

Item

33

Japan Bioanalysis Forum

Validation/criteriaの比較（2/6）
Acceptance criteria
DG2017-33
Within-run/
Between run
precision &accuracy%CV~<50.0%%RE~<±50.0%

NBS%CV <25%(<45% for LLOQ）%RE <±25%(<±45% for LLOQ)

備考、コメント
WRIB2020-3＜満たす場合がある＞
Some assays meet
LBA criteria based on
COU%CV & %RE <20%,(<25% for LOQ)

しっかりと基準を示したガイドラインはない。
COUに合わせて
Sponsorが設定。
FDA Guidance_2%CV <25%%RE <±25%

本DG見解
適切なPrimer設計（in silico活用）及び予備試験（3 setを目安）を実施。
その上で、％CV及びRE：45~50％以内を判断の基準に使うことを推奨。
（Cq ±0.5=変動幅70.7~141%:2±0.5、各社の経験を参照して考察）
臨床用にprimerの再設計が必要なケースも考えられる。
NBS論文の変動係数及び相対誤差の基準を満たすケースは限定的。
13 th JBF Symposium, DG2021-50

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Item

34

Japan Bioanalysis Forum

Validation/criteriaの比較（3/6）
Acceptance criteria
DG2017-33
Specificity

NTC and
NC: undetermin
ed or Cq >LLOQ(>1.5)

NBS

備考、コメント
WRIB2020-3

All naïve DNA samples
NTC and baseline
should test BLOD (Lackshould be clear &of amplification or BLOD). clean.
(distinguish GOINaïve DNA samples:& interfering
Biodistribution: pool ofendogenous
matrix DNA from tissues
gene)
at least 3 animals,
including at least 1 male
Vector shedding: DNAfrom each type of sample
from 3 to 6 hosts,
including at least 1 male

本DGの見解FDA Guidance_2
BLASTなどで適切なIn silico設計、及び実験（w/wo標的)
で確認

http://bioanalysisforum.jp/

Item

原則として、NTC/NCが増幅されないことを推奨。Primer設計位置を考慮する（P26-30参照）。
標的特異性により、困難な場合はNTC/NCに対してCq値1.5以上の差を確保することを推奨。
LLOQを定量的に定義できることを判断基準とする。
13 th JBF Symposium, DG2021-50

35

Japan Bioanalysis Forum

Validation/criteriaの比較（4/6）
Matrixeffect(ME)
代替

Acceptance criteria
DG2017-33

ΔCq <1.5
Matrix DNAs fromtissues vs
H2O/Buffer
AE: 90% - 110%(-3.6~-3.1)
If not, reconsider
DNA extraction,
dilution, or use for
qualitative
purpose.

NBS%CV <25%(<45% for <UL)
%RE <±25%(<±45% for <UL)of spiked copies of target DNA
each DNA sample is run in
triplicate; however, the third well is
spiked with a known copy numberof the target DNA to monitor any
amplification inhibition.

備考
WRIB2020-3

Calibrator material
should be equivalentor very similar to test
samples.

FDA参照資料にクライテリアとしては記載なし

It is recommended that the matrix
effect from each type oftissue/sample is evaluated for eachnew strain and species.

本DG見解

http://bioanalysisforum.jp/

Item

DG-33推奨基準は継続。ただし、真度/精度がとれていれば、同一matrix内、もしくは代表臓器(肝臓など)を代替matrixとして測定することは可能と考える。
実測の際に、n=3の1つに既知濃度を添加し、増幅阻害について確認することを推奨。
NBS論文の変動係数及び相対誤差の基準を満たすケースは限定的。
13 th JBF Symposium, DG2021-50

36

Japan Bioanalysis Forum

Validation/criteriaの比較（5/6）
Acceptance criteria
DG2017-33

Recovery
test

設定なし

NBS

30% - 80% can be expected frommost of sample types.
Vector: Recovery from biofluid samples
and clinical shedding samples should
be demonstrated using the validated
assay.
DNA: recovery from various animal
tissue and blood samples should beestablished when setting up the qPCR.
It is not necessary to evaluate every
sample type for every study if theanalytical site has an established DNA
extraction method.

備考
WRIB2020-3

Spike recovery withqualified internal
control in samples ispreferable to assess forinterference.

FDA参照資料にクライテリアとして
は記載なし

http://bioanalysisforum.jp/

Item

Extraction efficiency canbe evaluated withencapsulated ss/ds
DNA orcloned/synthesized
DNA

本DG見解

Sheddingを評価する際に回収率の基準を考慮する。
/ g tissueで臓器間比較や糞中排泄、または/ mLで尿、唾液排泄を考察する際は回収率のばらつきについて考慮する。
各社の経験では一般的な回収法で10~20%程度が目安。
30%以上回収できるケースは限定的で最大50%程度。
13 th JBF Symposium, DG2021-50

37

Japan Bioanalysis Forum

Validation/criteriaの比較（6/6）
Acceptance criteria
DG2017-33

Stability

ΔCq <1.5
凍結融解やLTSの細分化は未実施

NBS

For ｇDNA QC; freeze-thaw
stability (2QC set, 3cycles at 1
validation)%CV <25%(<45% for <UL)
%RE <±25%(<±45% for <UL)For TA vector; benchtop andstorage stability of all clinicalmatrices
30-170% compared to t0

備考
WRIB2020-3

Storage for each matrix andDNA using spike in controls
and processing

FDA参照資料に記載なし

For long term calibrators, it ispreferred to use cGMP
material but research lots may
be used with bridging

本DG見解<抽出後のgDNA>
凍結融解：3 cycleの凍結融解安定性評価を推奨。
短・長期安定性：ヌクレアーゼの混入がなければ、-80℃で保管可能（評価は必須でない)。
<Test article>
検討が必要な項目は他のmodalityと同じと考えるが、基準については引き続き要議論。
NBS論文の変動係数及び相対誤差の基準を満たすケースは限定的。
13 th JBF Symposium, DG2021-50

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Item

38

Japan Bioanalysis Forum

Validation/criteriaの比較（ext: ISR）
Acceptance criteria
DG2017-33

ISR

記載なし

NBS

>67% of sample <±45% of meanvalue.
(required for clinical studies inwhich a larger sampling pool isaccumulated)

備考
WRIB2020-3
現状なし。
Limited data is available for
ISR to understand thesuitable criteria

本DG見解
ISRについては現時点での基準設定は難しく、知見の蓄積が必要。

13 th JBF Symposium, DG2021-50

FDA参照資料に記載なし

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Item

39

Japan Bioanalysis Forum

項目

適合基準

真度及び
精度

適切なprimer設計（in silico活用）及び予試験（3 setを目安）を実施した上で、％CV及びRE：45~50％以内を判断の基準に使うことを推奨。

検量線

R^2≧0.98, 増幅効率が85～110%

特異性

NTCとNCの両方で増幅が認められないことを推奨。困難な場合はCq値の差<1.5を確保。LLOQを定量的に定義できることを判断基準とする。

マトリックス効果

動物gDNA原液 vs. H2O or bufferにQCサンプルをスパイクし、その間でCq値差が<1.5、検量線slopeが-3.6～-3.1 。阻害が認められても、同じマトリックスで真度/精度がとれていればOK。

代替マトリックス

真度/精度がとれていれば、代表臓器（肝臓など）を代替マトリックスとして用いることは可能と考える。

定量下限

真度及び精度のクライテリアを満たす最低濃度。

検出限界

95%信頼性で検出できる濃度。

回収率

Sheddingの評価に回収率の基準を考慮。

安定性

抽出後のgDNAについて3 cycleの凍結融解安定性を評価。及び短・長期安定性。基準は真度及び精度のクライテリアを踏襲。
13 th JBF Symposium, DG2021-50

http://bioanalysisforum.jp/

qPCRバリデーション項目と適合基準（2021年版！）

40

gDNA以外のバイオアナリシス

・ベクター（カプシドなど）のバイオアナリシス
・mRNA, 発現蛋白のバイオアナリシス

13 th JBF Symposium, DG2021-50

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Japan Bioanalysis Forum

41

Japan Bioanalysis Forum

ベクター（カプシドなど）のバイオアナリシス

 毒性、副作用が認められる場合はconcernが生じるので、測定の必要あり。
 封入率の評価などには用いるが、毒性が無いかぎりは
BAには積極的には用いない。（薬効本体とは関連性が薄いため）
 カプシド蛋白は主にLBAで測定。

http://bioanalysisforum.jp/

ベクター：AAVなどのウイルスベクター、脂質ナノ粒子（LNP）など

 LNPは新規成分については測定が必要。（LC/MS/MS）

13 th JBF Symposium, DG2021-50

42

Japan Bioanalysis Forum

mRNA, 発現蛋白のバイオアナリシス（発現蛋白）
 薬効に直接繋がるバイオマーカーであり、測定は必須。
http://bioanalysisforum.jp/

 ただし、標品の入手が難しい場合もあり、対応は一様ではない。
 項目や基準はcase by case。
 臨床で測るときはバリデーション実施。非臨床ではバリデーションは必須としない。
 分析法は主にLC/MS/MSまたはLBA。IHCやWBを実施するときは主に定性（
BAとは目的が異なる）。
（mRNA）
 RT-qPCRで実施。簡易的にバリデーションを実施。
 特異的な配列で検出するか、内因性も含めて検出するかは、目的に応じてcaseby caseで考える。
13 th JBF Symposium, DG2021-50

43

Japan Bioanalysis Forum

ベクターの免疫原性

Total抗体、中和抗体、細胞性免疫【Cellular Immunity】

ELISpot

http://bioanalysisforum.jp/【Humoral Immunity】
TAb assay, NAb assay

Hum. Gene Ther. (2017) 28(11):1061-1074.

13 th JBF Symposium, DG2021-50

44

Japan Bioanalysis Forum

遺伝子治療製品では、AAVウイルスを利用して創薬開発されている例が多くある。
AAVは自然界に存在するウイルスなので、既感染に伴い抗AAV抗体が血中に存在する可能性がある。
AAVはヒト及び霊長類に感染するので、AAVを利用した遺伝子治療薬をヒトに投与する場合や、サルを使用した非臨床試験を実施する際には抗AAV抗体の有無を予め検査することが大切である。
体内に存在する抗AAV抗体が中和抗体の場合、投与したAAV製剤は中和されてしまうため効果が減弱する可能性が危惧される。
また、体内でIgE抗体などが産生されている場合はアナフィラキシーのようなアレ
ルギー反応が生じる懸念もある。

13 th JBF Symposium, DG2021-50

http://bioanalysisforum.jp/

ベクターの免疫原性45

Japan Bioanalysis Forum

http://bioanalysisforum.jp/

Prevalence of anti-AAV

Hum. Gene Ther. Methods (2013) 24:59-67.

投与前から抗AAV中和抗体を有している患者がいる可能性がある。
13 th JBF Symposium, DG2021-50

46

Japan Bioanalysis Forum

カニクイザルのNAb保有率

カニクイザルの抗AAV抗体保有率は非常に高い！！
⇒ サルで安全性試験を実施する際には、事前にNAbを測定して抗AAV抗体を保有していない個体を選別しないと試験が成立しない。

13 th JBF Symposium, DG2021-50

http://bioanalysisforum.jp/

4～8歳カニクイザル50匹の中和抗体保有率47

Japan Bioanalysis Forum

免疫原性：TAb及びNAb評価方法
TAb測定例:薬物とのサンドイッチassay

NAb測定例:Cell based assay

ADA (TAb)

標識capsid

13 th JBF Symposium, DG2021-50

http://bioanalysisforum.jp/

標識検出抗体48

Japan Bioanalysis Forum

免疫原性：NAb評価方法について
NAb測定例:Cell based assay

しかしながら、P8に示す通り、AAVのレセプターは１つではなく、さまざまな分
子がレセプターまたコレセプターとして働くことが報告されている。
このため、レセプターが１つであることを前提とした競合ELISA法はAAVのNAb assayには相応しくなく、現時点ではCell based assayが第一選択になると考える。

13 th JBF Symposium, DG2021-50

http://bioanalysisforum.jp/

抗体などのNAb測定法として、右記
Cell based assayのほか、競合
ELISA法が一般的に用いられている。

49

Japan Bioanalysis Forum

中和抗体 ？ 総抗体？

【TAb】

AAVに結合するすべての抗体を測定する。
LBAで測定する。

【NAb】

AAVの感染を中和する抗体を測定する。
培養細胞を使って測定する。

薬効を考えるなら、NAbを測定する方が意味があるだろう。
一方、アナフィラキシーなどのリスクを考慮するならばTAbを測定すべきではないか。

13 th JBF Symposium, DG2021-50

http://bioanalysisforum.jp/【Question】
総抗体（TAb）と中和抗体（NAb）どちらを測定すべきか？？

50

Japan Bioanalysis Forum

中和抗体 ？ 総抗体？

TAbとNAbの結果が相関しない場合、どう解釈したらよいだろうか？

13 th JBF Symposium, DG2021-50

http://bioanalysisforum.jp/

TAbとNAbの測定結果に相関はあるのだろうか？？？
⇒現時点ではわからない。
まずはTAb、NAbの両方を測定して結果を比較してみる（データの蓄積）。

51

Japan Bioanalysis Forum

TAb測定：Pros vs Cons
セロタイプごとの抗AAV抗体測定キットや抗AAV抗体（陽性対照抗体）が市販されている。
バリデーションは既存のガイドライン（後述）が参考にできそう。
LBAは測定経験者が多くいるので系の立ち上げが容易。
コンパニオン診断薬（CDx）への対応が容易である。

【Cons】

市販抗体を使用する場合、エピトー
プを考慮するならばモノクローナル抗体よりポリクローナル抗体のほうが適切だろう。
ポリクローナル抗体を使用する場合はロット間差のコントロールが難しいかもしれない。
薬効（特に薬効が充分に得られない場合の解釈）を考えるとTAbでは直接的な説明をしにくい（かも）。

13 th JBF Symposium, DG2021-50

http://bioanalysisforum.jp/【Pros】

52

Japan Bioanalysis Forum

NAb測定：Pros vs Cons
薬効が充分に得られない場合の解釈が容易。

【Cons】

細胞を使用するアッセイなので熟練経験者が少なく系の立ち上げが難しい。
参考にできそうなガイドラインがない。
適切な陽性対照抗体（血清）の作製が必要。
バリデーションの判定基準や結果解釈の基準がない。
CDx化が現時点では困難。

13 th JBF Symposium, DG2021-50

http://bioanalysisforum.jp/【Pros】

53

Japan Bioanalysis Forum

TAb、NAb測定共通の問題点

抗体価の上がり方には個体差があることが推測される。
カットオフ値、thresholdを決めるための陰性血清の入手が困難であることが推測される。
サンプルの保存安定性の担保をどうしたらよいか、基準の設定が難しい。
臨床検体でTAbやNAbの値と薬効減弱化にはどのような関係があるのか。

13 th JBF Symposium, DG2021-50

http://bioanalysisforum.jp/

TAbとNAbは、検出感度は異なるのではないか？
見ているものが違うので致し方ないが、両者の相関を考えると悩ましい。

54

Japan Bioanalysis Forum

TAb、NAb測定のバリデーション– TAbはLBAガイドライン及び免疫原性ガイダンスを参考にできそう。ただし判定基準はLBAガイドラインでは厳しすぎるのではないか⇒妥当と思われる基
準範囲の設定が必要– NAbは参考にできそうなガイドラインがなく、基準の設定も困難⇒知見を積み重ねて基準を設定する。
– 患者数を考慮したカットポイントの設定の工夫が必要
特に希少疾患では50例の患者のマトリクスを入手するのは困難

http://bioanalysisforum.jp/– 事前にバリデーションの実施が必要

健常人のマトリクスで代替可能か？
→患者と健常人のマトリクスにおけるbaselineの同等性を評価

13 th JBF Symposium, DG2021-50

55

Japan Bioanalysis Forum

TAbのバリデーション項目と判定基準(例)
評価内容と判定基準

選択性

個体別マトリクス（陰性対照試料）及び個体別マトリクスに陽性対照（低用量）を添加した試料（陽性対照試料）
全ての個体において、陰性対照試料＜陽性対照試料

再現性*1

プールマトリクスの陰性対照試料及び陽性対照試料低・中・高の3用量
日内再現性：N=3/用量 CV＜20%
日間再現性：N=3/用量、6日間 CV＜20%

FactorNormalization factor(選択性試料のmean+1.645 SD)/陰性対照試料のmeanFactorの平均値

Screening cut point*2

各試験の陰性対照試料のmean×Normalization factor

Drug-tolerance

Screening cut point以上の陽性判定となる最大希釈倍率

Confirmatory cut point

選択性試料の陰性対照試料及び陽性対照試料に、それぞれ被験物質を添加した 試料を調製 Inhibition=被験物質添加試料の値/非添加試料の値
Confirmatory cut point= Inhibition Mean+3.09 SD

安定性

プールマトリクスの陽性対照試料低・高の2用量: 初期値に対して RE=±20%以内

http://bioanalysisforum.jp/

項目

医薬品開発における生体試料中薬物濃度分析法（リガンド結合法）の バリデーションに関するガイドライン,
Guidance for industry, Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products

非臨床/臨床などの試験の目的やcaseによって評価方法の詳細は異なる*1: N=6/用量のcaseもある。
*2: 臨床試験では外れ値の取り扱いに注意。また投与前matrixにおける95%信頼性区間上限を設定するcaseもある。
13 th JBF Symposium, DG2021-50

56

Japan Bioanalysis Forum

細胞性免疫評価の必要性

一方、T細胞によりベクターあるいは発現蛋白が排除される可能性も考えられ、液性免疫に加えて細胞性免疫評価も重要である1)。
細胞性免疫評価法の一つに、サイトカイン検出を目的としたELISpot法がある。
測定法及びがんワクチンコンソーシアムから報告されたガイドラインが参照可能。
– Cancer Immunol. Immunother. (2008) 57:303-315.
– J. Immunol. (2002) 168:545-553.

http://bioanalysisforum.jp/

バイオアナリシスの観点では免疫応答＝抗体産生のイメージが強く、ADAの評価の必要性は広く認知されている。

1) Bioanalysis (2021) 13(6):415-463.

13 th JBF Symposium, DG2021-50

57

Japan Bioanalysis Forum

http://bioanalysisforum.jp/

細胞性免疫：サイトカインの役割

13 th JBF Symposium, DG2021-50

58

Japan Bioanalysis Forum

http://bioanalysisforum.jp/

ELISpot法の原理

抗原により産生されるサイトカインを検出
T細胞ELISPOTアッセイキット（株式会社エムエステクノシステムズ）
https://www.mstechno.co.jp/categories/view/85

13 th JBF Symposium, DG2021-50

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Japan Bioanalysis Forum

Assayに供する細胞；PBMCの品質、ロット差
PBMCを刺激するペプチド、蛋白等の抗原の品質、純度
サイトカインを検出する重要試薬の組み合わせ指標とするサイトカインの選抜– Interferon-γ: 複数のがん免疫剤で細胞障害性T細胞の反応性と相関– Interleukins: IL-2, IL-4
– Tumor necrosis factor-α
Assay系、assay技術の標準化– 測定プロトコールの標準化– 複数施設で実施した測定結果の標準化/結果解釈– Spot検出のautomation化
ELISpot validation項目
陽性判定の基準
Assay系のメンテナンス
13 th JBF Symposium, DG2021-50

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ELISpot実施時の留意点

60

発現蛋白の免疫原性・Total抗体
・細胞性免疫 (P57-60参照）

13 th JBF Symposium, DG2021-50

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

61

Japan Bioanalysis Forum

遺伝子治療製品では、治療上有効な蛋白質をコードしたgDNAを患者に投与し、患者体内で転写、翻訳を経て蛋白質となり薬効を発揮する。
患者は発現蛋白を欠損している場合が多く、その場合は発現蛋白が異物と見なされ、抗体が産生される可能性がある。
翻訳された蛋白質が細胞外に分泌されて薬効を発揮する場合、遺伝子治療を始める前に同様な蛋白質を補充投与されていた患者では蛋白質に対する抗体を持っている可能性が高い。
既に抗体を持っている患者では充分な薬効が得られない可能性がある。
一方、事前に蛋白質を投与されていない患者
では抗体を持たないことが予想される。
遺伝子治療製品の投与により恒常的に蛋白質が分泌させると、抗体が作られにくいため、高い治療効果が見込まれる。

http://bioanalysisforum.jp/

発現蛋白に対する抗体

13 th JBF Symposium, DG2021-50

62

Japan Bioanalysis Forum

翻訳された発現蛋白が循環血を介して薬効を発揮する薬剤の場合は、その蛋白質に対する中和抗体の有無を必ず評価する必要がある。
局所投与されるものや、翻訳された蛋白質が細胞内で薬効を発揮する遺伝子治療薬では抗体を気にしなくてもよいかもしれない。

遺伝子治療開始前の患者の抗体の評価（TAb）はとても重要

13 th JBF Symposium, DG2021-50

http://bioanalysisforum.jp/

発現蛋白に対する抗体

63

Japan Bioanalysis Forum

重要試薬（発現蛋白に対する陽性対照）の調達– 市販品の活用– 標的蛋白を動物に免疫して取得– 調達の難易度はターゲット蛋白の特性と用途に依存
バリデーション
– 事前にバリデーションの実施が必要– 既存のガイドライン（前述）を参考にできそう。ただし判定基準は既存ガイド
ラインでは厳しすぎるのではないか⇒妥当と思われる基準範囲の設定が必要– 患者数を考慮したカットポイントの設定の工夫が必要
特に希少疾患では50例の患者のマトリクスを入手するのは困難
健常人のマトリクスで代替可能か？
→患者と健常人のマトリクスにおけるbaselineの同等性を評価
13 th JBF Symposium, DG2021-50

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発現蛋白に対する抗体：測定における留意点

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Japan Bioanalysis ForumDG2021-50 「遺伝子治療製品のバイオアナリシス」
Summary
我々は何を測る？
どんな方法でどのような基準で

ベクター

主にLBA

必要に応じて導入gDNAqPCR, dPCR

適切な項目、基準の設定

発現mRNA

RT-qPCR

発現蛋白

LBA, LC/MS/MS

抗ベクター抗体

TAb: LBA
NAb: Cell-based
細胞性免疫: ELISpot

抗発現蛋白抗体

http://bioanalysisforum.jp/

何をCase by caseで、重要BMとして測定

TAb: LBAやADAのGLを参考
NAb, ELISpot:
技術に応じた基準の設定

 測定項目が多々あり、それぞれ重要性や必要な基準が異なる。
 遺伝子治療の拡がりとともに方法論や基準も提言されている。都度updateしたい。
13 th JBF Symposium, DG2021-50

65

Japan Bioanalysis Forum

皆様からのご意見・経験について、ぜひお寄せください！
連絡先：hanada.takeshi.gt@daiichisankyo.co.jp
第一三共株式会社 花田 雄志

13 th JBF Symposium, DG2021-50

http://bioanalysisforum.jp/

DG2021-50 「遺伝子治療製品のバイオアナリシス」

66