Japan Bioanalysis Forum

DG2016-25- LC-MS課題検討 –Quantitative analysis of endogenous
substance- LC/MS –-高分子内因性物質のLC-MSによる定量-代替標準物質を使用した測定法-Large molecule endogenous substance &Surrogate analyte-

8th JBF Symposium, DG2016-25

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内因性物質の定量

1Japan Bioanalysis Forum

DG2014-08

DG2015-15

アンケート現状分析 Survey situation in Japanバリデーション実施法の提案 Proposed Validation strategy
LC-MS (Small molecules)
Dosed endogenous substance (like vitamin)代替マトリックスの選択法 Selection of “Alternative matrix”
推奨選択法 Recommendable selection strategy
妥当性確認法 Appropriateness of selected matrix
LBA (Large molecules)
LC-MS (Small molecules)

LC-MS
DG2016-25

LBA
DG2016-26
8th JBF Symposium, DG2016-25

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背景（内因性物質の定量：過去2年間と今年の活動）

FACS etc
DG2016-27
2

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高分子LC-MS Large molecules LC-MS

代替標準物質Surrogate Analyte

加藤望Nozomu Kato

落合美登里Midori Ochiai (Towa)
林善治Yoshiharu Hayashi(Mitsubishi Tanabe)
野田巧Takumi Noda (Ono)保坂信哉Shinya Hosaka (Kaken)
新井浩司Koji Arai (LSI Medience)
たんぱく質(CMIC Pharma Science)

ペプチド
酵素
消化

カニ

カニかま

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Members

若松明Akira Wakamatsu (GSK) : Leader
酒井和明Kazuaki Sakai (TPM) : Advisor
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3

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議論のテーマ Topic Themes
 高分子のLC-MS分析

Large molecules analysis

Absolute or relative quantification

 酵素消化の方法 Enzyme digestion クリーンアップのタイミング Timing of cleanup
 I.S.添加のタイミング Timing of IS spiking

 代替標準物質

Surrogate analyte

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 絶対定量か、相対定量か？

 安定同位体選択のポイント Selection stable isotope
 定量値妥当性の保証方法 Verification of assay results
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4

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活動の経緯 Activities
May 2016

25 Jul 2016

 キックオフ会議 Kick off Face to Face meeting (Waters品川)
 (DG2016-26，DG2016-27と合同 collaborate with 26 & 27)

Aug 2016～Jan 2017

 TC と E-mailの議論 (2times/Month, Total 10 times) Large molecule LC-MSに関するアンケート (Dec 2016)
Surveyhttp://bioanalysisforum.jp/

 メンバー募集 Members application

Jan 2017～Feb 2017

 アンケート集計 Summarize survey
 ポスター準備 Posters preparation
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5

Japan Bioanalysis Forum

用語

定義

Protein A/G/L

細菌由来の抗体結合タンパク質．
・Protein A:免疫グロブリン（特にIgG）のFc領域に特異的に結合・Protein G:免疫グロブリン（特にIgG）のFc領域に特異的に結合し，Fabフラグメントとも弱く結合・Protein L:免疫グロブリン（特にIgG）のκ軽鎖と特異的に結合リコンビナント蛋
白質

遺伝子組み換え技術によって人工的に作製された蛋
白質．
・検量線試料及びQC試料の調製時の標準物質
・内因性物質を投与するPK/TK試験の被験物質として利用．

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用語の定義

Large
Molecule

6

Japan Bioanalysis Forum

用語の定義

Large
Molecule定義

アバンダント蛋白

マトリックス中に大量に存在する蛋白．アルブミン，
グロブリン等．

Target peptide

分析対象タンパク質を酵素消化後の，当該タンパク
質特異的なアミノ酸配列を持つペプチド．高分子のようにダイレクトにLC-MSで測定することが困難な場合，本ペプチド配列のレスポンスを基に当該タン
パク質の定量を行う．

Flanking peptide

Target peptideのC末/N末の片方あるいは両方を数アミノ酸残基伸長したペプチド．酵素消化時の消化効率の補正を意図．

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用語Surrogate peptide Target peptideと同義．
カルタヘナ（法）遺伝子組換え生物などの取扱いの規制に関する国際的条約「カルタヘナ議定書」の国内での実施に必要な取扱いを定めた法律．
8th JBF Symposium, DG2016-25

7

Japan Bioanalysis Forum

用語の定義
用語

Large
Molecule

定義

たんぱく質への処理に関する用語
翻訳後のタンパク質の化学的な修飾．これは多くのタンパク質の生合成の後方のステップの1つ．
例（アシル化，アセチル化，アルキル化，アミド化，グルタミル化 ，リン酸化，・・・etc）

変性

タンパク質の高次構造を破壊すること．酵素消化効率を上げる目的で実施．

還元

ジスルフィド結合を切断すること．酵素消化効率を上げる目的で実施．

アルキル化

ジスルフィド結合切断後に生成するチオール基を保護すること．ジスルフィド結合の再形成を抑制する目的で実施．
8th JBF Symposium, DG2016-25

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翻訳後修飾

8

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用語定義

マトリックス

分析のために選択された全血，血漿，血清，尿又は他の体液や組織．

実マトリックス

対象生物由来のマトリックス．

代替マトリックス

実マトリックスの代わりとして用いるマトリックス

非生体マトリックス 代替マトリックスのうち，実マトリックスを含まないマトリックス（水，緩衝液，artificial CSF，
synthetic urineなど）．
除去マトリックス

代替マトリックスのうち，実マトリックスから分析
対象物質を除去したマトリックス．

低値実マトリックス 性差，日内変動，個体間変動，年齢，食事などの制限により内因性物質濃度を低値に抑えた実マトリックス．このDGでは代替マトリックスに含めない．
実試料

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用語の定義

Surrogate
AnalytePK/TK試験等で分析のために得られた試料．
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9Japan Bioanalysis Forum

用語定義

マトリックス効果

試料中のマトリックス由来成分による分析対象物質のレスポンスへの影響．
・LC/MS：分析対象物質のイオン化への影響
・LBA：分析対象物質のシグナル強度に対する影響

ブランクマトリック 検量線試料やQC試料の調製に用いるマトリックス．
用途や内因性物質レベルに応じて，代替マトリック
スス，実マトリックスから選択する
安定同位体

同一原子番号を持つものの中性子数が異なる核種のうち，放射線を出さない安定な核種．同一元素の同位体の化学的性質は（ほぼ）同等であるが，質量数が異なるため質量分析計で分離が可能．LC-MS分
析では2H，13C，15N等で標識した内標準物質（Stable Isotope Labeled-Internal Standard;
SIL-IS）や代替標準物質が利用される．
8th JBF Symposium, DG2016-25

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用語の定義

Surrogate
Analyte10

高分子LC-MS分析
Large Molecule LC-MS analysis

8th JBF Symposium, DG2016-25

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Japan Bioanalysis Forum

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Japan Bioanalysis Forum

用語の混乱

絶対定量

オミックス
Omix

参考
口頭発表用

相対定量

Absolute quantitation

Relative quantitation

 検量線必要 検量線不要 検体中の濃度

 時間ゼロに対する相対比 Relative ratio to

Need Calib Std

Actual concentration

Not need Calib Stdtime zero

分析化学
Analytical
Chemistry

 検量線不要Not need Calib Std
滴定法等 Titration
容量分析 Gravimetric
重量分析 Volumetric 検量線必要

Need Calib Std

 絶対検量線法

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絶対定量と相対定量

Absolute calib
内標準法Internal Std

容量分析：滴下容量から物質量を定量、重量分析：沈殿物の重量から物質量を定量

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Japan Bioanalysis Forum

絶対定量と相対定量の定義と関係性
絶対定量法

定量分析

自身による

検量線も比較標準も必要としない精確で絶対的な定量法（ものさしが不要な方法）
Ex. 重量分析，容量分析，クーロメトリー*，など

相対定量法

一般的に標準試料を用いて検量線を作成し，得られた検量線から逆推定により，未知試料中の測定対象物質の濃度を推定する定量法（ものさしが必要な方法）
ライフサイエンス（オミクス）分野
絶対定量

サンプル中の物質数の絶対値を定量する解析※濃度既知のサンプルを用いた検量線等は必要!

相対定量

相対定量は性質の異なるサンプル間の遺伝子の発現比を求める
Ex. 培養細胞などに刺激を加えその変化を非刺激サンプルと比較

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分析化学*) クーロメトリー：
電流量を時間積分して電荷量として測定する手法。電荷量は分子量に比例するので分子の絶対量がわかる。

8th JBF Symposium, DG2016-25

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Japan Bioanalysis Forum

絶対定量：分析化学とオミクス分野での認識

分析化学用語：
化合物の物理的・化学的性質によって分子の絶対量が分かる分析法

オミクス分野の用例：
検量線等を使って化合物濃度を定量することにより試料中の絶対濃度を算出
する評価法

参考文献
金沢大学理工学域物質化学類化学コース、分析化学研究室HP (2017.2.28確認)
http://chem.s.kanazawa-u.ac.jp/anal/research/area3.html「検量線に関わる理論と評価方法について」北村 恭朗, 農薬調査研究報告 (7), 101-106, 2015 農林水産消費安全技術センター
https://www.acis.famic.go.jp/acis/chouken/chouken/ronbun07_2014.pdf

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絶対定量（法）はオミクス分野では分析化学用語と異なる観点で用いられている「フロー分析法の滴定への応用」田中 秀治 1，中野 惠文 2. 1 徳島大学大学院ヘルスバイオサイエンス研究部： 2 鳥取大学地域学部，愛知工業大学 研究用サイトHP (2017.2.28確認)
http://aitech.ac.jp/~jafia/english/jfia/contents/21_2/Taanaka_Nakano.pdf
ロシュ・ライフサイエンスHP(2017.2.28確認)
https://roche-biochem.jp/support/lets-start-qpcr/04.html

8th JBF Symposium, DG2016-25

14

Japan Bioanalysis Forum

絶対/相対定量に対する本DGの考え方

 しかし，「相対定量」の中でも定量性に幅があり，真値（「絶対定量」）に近くなるように対策を講じることは可能
 特にMSを用いた高分子分析では，消化効率，翻訳後修飾などの定量性の不確
実性が低分子分析と比較して多い 発表内容における定量性は，「低分子と比較して，高分子の定量性はどうか」といった観点で述べる

http://bioanalysisforum.jp/

 厳密な分析化学の定義の中で議論をすると，低分子であれ，高分子であれ，検量線を用いて定量する以上，「相対定量」の範疇となる

本DGではMSを用いた高分子分析特有の不確実性を小さくするアプローチ法を提案する
8th JBF Symposium, DG2016-25

15

Japan Bioanalysis Forum

特徴

低分子定量

中～高分子定量

100＜ MW＜1000
そのものを分析

MW＜10000（酵素消化なし）: 中分子
MW＞10000（酵素消化あり）
翻訳後修飾が存在（既知，未知）
たんぱく質

ペプチド
酵素
消化

Pros

・サンプル前処理が比較的簡易
・情報＆経験が豊富
・分析感度が比較的高感度・ELISAなどの別の方法との比較が可能
・複数のターゲットペプチドによる複数の測定の可能性Cons・分析カラムに保持しなければ測定困難
・MW＜100のものは検出するのが困難

・経験値不足・不確実性要素が大きい
・分析難易度が高い
・前処理方法が画一化されていない

8th JBF Symposium, DG2016-25

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低分子定量と高分子定量の比較（LC-MS）

16

Japan Bioanalysis Forum

高分子分析特有の不確実性とは
ここまで・非特異的な修飾について
・特異性＆選択性の担保について・定量に用いるペプチドの数について
・・・

http://bioanalysisforum.jp/

・酵素消化の方法について
・クリーンアップのタイミングについて
・I.S.添加のタイミングについてMSを用いた高分子分析特有の不確実性を小さくするアプローチ法として，
酵素消化，クリーンアップのタイミング，I.S.添加のタイミングを議論した．
8th JBF Symposium, DG2016-25

17Japan Bioanalysis Forum

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タンパク質定量分析の流れ

参考 Ohtsuki et al., J Phram Sci., 100: 3547-3559 (2011)

8th JBF Symposium, DG2016-2518酵素消化の方法
Enzyme Digestion

8th JBF Symposium, DG2016-25

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Japan Bioanalysis Forum

19

Japan Bioanalysis Forum• 分子量の大きなタンパク質をダイレクトにLC-MS
で定量分析することは難
しい
たんぱく質

（LC-MS）• 酵素消化により断片化したペプチドであればLCMSで定量分析可能となる

ペプチド（LC-MS）

四重極型だとほぼ×（感度や分解能の問題で難易度が高い）

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酵素消化の目的（ほぼ低分子と同様に扱える）

8th JBF Symposium, DG2016-25

20

Japan Bioanalysis Forum

定量向きの消化反応の条件
たんぱく質

目的以外の断片が少ない• 再現性が良好であること
ペプチド

ペプチド

ペプチド

Sample 1

Sample 2

Sample 3• 高効率な酵素を用いること • その他

2 hr

4 hr

・短時間でプラトーに達する

・反応条件の許容が広い（ぶれない）

・必要な酵素の量が少ない（実験上取り扱いやすい）・生成する目的のペプチドが安定
・トータルのコストが安い

8th JBF Symposium, DG2016-25

http://bioanalysisforum.jp/• 特異性が高いこと

・・・など

21

Japan Bioanalysis Forum

酵素消化に関わる主な工程
生体試料
蛋白
変性＆可溶化
還元＆アルキル化

酵素消化に関わる主な工程

酵素消化
ペプチド

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蛋白の抽出

脱塩＆濃縮
質量分析計

アンケート: Q5

8th JBF Symposium, DG2016-25

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Japan Bioanalysis Forum

酵素消化までの一般的な工程
変性 denaturation

S-S

S-S

還元 reduction

S

S

HS

SH

R-S

S-R

ジスルフィド結合の還元
アルキル化 alkylationHSSH

ジスルフィド再形成の抑制

http://bioanalysisforum.jp/

タンパク質高次構造の破壊

酵素消化 enzyme digestion
ペプチドへの断片化
8th JBF Symposium, DG2016-25

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Japan Bioanalysis Forum

酵素消化までの処理パターン
生体試料
精製あり

http://bioanalysisforum.jp/

精製なし
蛋白

変性＆可溶化

還元＆アルキル化

酵素消化
8th JBF Symposium, DG2016-25

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Japan Bioanalysis Forum

処理パターンの比較

消化効率

高い

中程度

中程度

低い

作業工程

多い

中程度

中程度

少ない

目的外のペプ 多い
チド等夾雑物
の生成

中程度

中程度

少ない

 変性→還元・アルキル化→酵素消化の手順が一般的ではあるが・・・

http://bioanalysisforum.jp/

変性＆還元ア （変性なし） 変性後消化
直接消化
ルキル化後に 還元アルキル （還元アルキ （変性＆還元
消化
化後に消化
ル化なし）
アルキル化なし）という選択肢もあり
アンケート: Q13-16

8th JBF Symposium, DG2016-25

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Japan Bioanalysis Forum

変性剤の種類・比較
DOC
SDS(Sodium
Deoxychola
te)

MeOH

Pros

参考文献が多い LC-MS分析前 ・タンパクを 簡便で脱塩がの除去が容易 修飾しない
不要
・Trypsin消化中も使用可能Cons

熱分解によりシ 酵素消化時の イオン化抑制 酵素消化時の濃度に注意が の影響が大き 有機溶媒濃度
アン酸生成
いに注意が必要(一級アミンを 必要
カルバミル化）

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Urea

参考 Jennifer L. Proc et al. J Proteome Res. 2010, October 1; 9(10): 5422−5437
Yuhuan Ji et al. Anal Chem. 2015 June 2; 87(11): 5500-5504
アンケート: Q25

8th JBF Symposium, DG2016-25

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Japan Bioanalysis Forum

DTT:Dithiothreitol

TCEP:Tris(2-carboxyethyl)
phosphine hydrochloridePros・参考文献が多い
・安価

・pH<8の場合はDTTより還元効率が高い
・無臭でチオール非含有

Cons

・DTTに比べ価格が高い
・酸化を受けやすい・pH>7の場合にのみ還元剤 ・塩酸塩なので，Trypsin消化として働く時のpHに注意が必要
・還元力がTCEPよりも低い

http://bioanalysisforum.jp/

還元剤の種類・比較

参考：http://www.gelifesciences.co.jp/technologies/protein_preparation/chapter2_3.html

8th JBF Symposium, DG2016-25

27

Japan Bioanalysis Forum

Trypsin

Lys-C

Pros

・最も一般的に用いられている・C末端がLys 又はArgとなり，ペプチド断片の感度が上昇

・TrypsinよりもpH許容範囲が広い
・自己消化が少ない
・C末端がLysとなりペプチド断片の感度が上昇・Lys-Pro配列も切断可能Cons・自己消化に注意が必要
・切断されないLys部位が残ることがある・切断後のペプチド配列が長い

http://bioanalysisforum.jp/

消化酵素（第一選択）

アンケート: Q11

8th JBF Symposium, DG2016-25

28

Japan Bioanalysis Forum

その他の消化酵素の種類
Asp-N
切断部位：
AspのN末端,およびCysのN末端

Glu-C
切断部位：
GluのC末端およびAspのC末端Pros

Trypsinとの組み合わせでシークエンス カバー率向上

Cons

反応効率が低い
C末端が塩基性アミノ酸とならないのでターゲットペプチドの感度が低い場合あり

http://bioanalysisforum.jp/

Chymotrypsin
切断部位：
芳香族アミノ酸（Tyr, Phe, Trp）のC末端

TrypsinやLys-Cと比較すると反応効率が低い傾向があるため定量には向かない印象
8th JBF Symposium, DG2016-25

29

Japan Bioanalysis Forum 例えば目的のタンパク質が100%消化できていれば理想だ
が，特に内因性物質の場合，それを確認することは難しく，
消化反応の終点を見極めることができない．
酵素消化

未消化タンパク質の可能性

http://bioanalysisforum.jp/

消化効率を確認する意味①

 そのため結果の再現性が悪かったり，目標感度が得られな
い場合，消化効率を確認することでよりよいメソッドの作
成が可能
アンケート: Q17-20

8th JBF Symposium, DG2016-25

30

Japan Bioanalysis Forum

消化効率を確認する意味②

A
B
C

AよりBの位置の方がより
真値に近い
A

B

• 良好な再現性を得るため• 余計な反応を避けるため・目的外の夾雑物の生成や目的ペプチドの分解を防げる

AよりBの位置の方がより実験誤差が少ないA

Aの試薬が最も効率が良く目的のペプチドの生成量も多い

B

http://bioanalysisforum.jp/• 高分子特有の不確実性を小 • 試薬の種類など、条件検討の比較のためさくするため2 hr

24hr ・無駄な時間の消費を防げる

8th JBF Symposium, DG2016-25

31

Japan Bioanalysis Forum

消化効率の確認方法（例） Trypsin量と反応時間を検討し、消化効率をしたグラフ例
Trypsin: 1 ug

時間は長いが、酵素の使用量が少なくて済む

Trypsin: 5 ug

http://bioanalysisforum.jp/(%)

酵素の使用量は多いがプラトーに達する時間は短い(hr)

8th JBF Symposium, DG2016-25

32

Japan Bioanalysis Forum

酵素消化のまとめ変性，還元，アルキル化は，目的に応じてカスタマイズが可能
高効率かつ再現性の優れた酵素の選択が必要
消化効率の検討は，目的の試験条件に合った形で実施．

8th JBF Symposium, DG2016-25

http://bioanalysisforum.jp/

目的は分子量が大きなタンパク質をLC-MSで測定可能とすること

33

クリーンアップのタイミング
Timing for Cleanup

8th JBF Symposium, DG2016-25

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

34

Japan Bioanalysis Forum

クリーンアップの目的
たんぱく質

ペプチド
酵素消化

シンプル

複雑化

http://bioanalysisforum.jp/

高分子特有の問題の一つ

感度獲得を目的として酵素消化を行うため，サンプルが複雑化

クリーンアップの重要性が高い
8th JBF Symposium, DG2016-25

35

Japan Bioanalysis Forum

生体試料

酵素消化前

蛋白の抽出

アルブミン除去
Protein A/G/L
ターゲット蛋白精製抗体
蛋白沈殿法による脱塩
分子量サイズ除去

蛋白
変性＆可溶化
還元＆アルキル化

使用傾向は
酵素消化後

酵素消化
ペプチド
脱塩＆濃縮
質量分析計

酵素消化後

http://bioanalysisforum.jp/

クリーンアップのタイミング

固相抽出
液々抽出
除蛋白（有機溶媒，酸）
8th JBF Symposium, DG2016-25

アンケート: Q12

36

Japan Bioanalysis Forum

酵素消化前
酵素消化後
Target peptide
Recombinant Protein
によるバリデーション
によるバリデーション
・回収率評価，濃度依存性 ・回収率評価，濃度依存性・再現性・再現性（酵素消化含む）
・真度＆精度・真度＆精度全体として経験が少ない
たんぱく質

ペプチド

http://bioanalysisforum.jp/

クリーンアップの定量性の担保

経験値

8th JBF Symposium, DG2016-25

37

Japan Bioanalysis Forum

酵素消化前
難易度高い
・蛋白特有の手法が必要
・濃度依存性の担保が難・条件検討に多くの時間（未知の場合が殆ど）
たんぱく質

酵素消化後
難易度低い
・低分子の手法と同じ・濃度依存の担保が容易
・条件検討が既に画一化

ペプチド

難易度

http://bioanalysisforum.jp/

各クリーンアップの難易度

標準物質の選択によって難易度が異なる
8th JBF Symposium, DG2016-25

38

Japan Bioanalysis Forum

特徴

構成成分

アバンダント蛋白の除去（ProteinG, フィ
ルターなど）

ターゲット蛋白抗体による精製（特異抗体など）

蛋白沈殿法による脱塩（アセトン沈殿など）大量に存在する蛋
白の除去
分子量による蛋白の抽出

特定の蛋白のみを
抽出

塩の除去
蛋白の濃縮

アルブミン，
グロブリンなどの除去

目的蛋白以外の除去

蛋
白塩類

8th JBF Symposium, DG2016-25

塩の除去

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酵素消化前の前処理39

Japan Bioanalysis Forum

アバンダント蛋白の除去（ProteinG, フィ
ルターなど）

ターゲット蛋白抗体による精製（特異抗体など）

蛋白沈殿法による脱塩（アセトン沈殿な
ど）

Pros

・簡便
・精製度が高い・安価
・消化効率の向上
・スループットが高 （効果：中）
い

・簡便
・安価
・消化効率の向上（効果：大）

Cons・ターゲット以外の ・抗体が高価あるい蛋白が多く残存は入手困難
・濃度依存性評価が
必要
・回収率が低い・蛋白選別は不可
・スループットが低
い・回収率が低くなる
傾向あり

共通課題

：

http://bioanalysisforum.jp/

酵素消化前の前処理のPros/cons

回収率の補正が必要

8th JBF Symposium, DG2016-25

40

Japan Bioanalysis Forum

除蛋白（有機溶媒，酸）

固相抽出

液々抽出
（水相回収）

Pros

・簡便
・安価
・スループットが高い
・補正の必要性が低い

・自動化が可能・低分子と同じ原理
・特異性の高い抽出
が可能

・簡便
・安価
・疎水性相互作用
以外の抽出

Cons

・物性による回収率の低下
・希釈に伴う感度低下
・精製度が低い・特異性が低い・補正が必要・対象物によって最適化が必要な場合あり・補正が必要・スループットが比較的低い
・特異性が低い

共通利点
共通課題

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酵素消化後の前処理： ターゲット蛋白に関わらず設定可能： ターゲット蛋白特異的な精製ではない
8th JBF Symposium, DG2016-25

41

Japan Bioanalysis Forum

中分子（10kDa未満）の前処理

Cons

酵素消化する・そのまま測定可能・感度の向上・バリデーション評価が低 ・高分子量蛋白と同じメソッ
分子と同じドが使用可能・感度の確保が難・特異的ペプチドの存在有無
・前駆体（プロセッシング前）などとの区別

http://bioanalysisforum.jp/

Pros

酵素消化しない

クリーンアップは高分子に準じる
8th JBF Symposium, DG2016-25

42

Japan Bioanalysis Forum

クリーンアップのパターン
生体試料
特異抗体

蛋白沈殿

精製なし

酵素消化

除蛋白

固相抽出

液液抽出

精製なし

http://bioanalysisforum.jp/

アバンダント蛋白除去

LC-MS/MS

堅牢性，感度および効率を考慮して，組み合わせる必要あり
8th JBF Symposium, DG2016-25

43

Japan Bioanalysis Forum

クリーンアップパターン（DGの傾向）
生体試料
特異抗体

蛋白沈殿

精製なし

酵素消化

除蛋白

固相抽出

液液抽出

精製なし

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アバンダント蛋白除去

LC-MS/MS

選択理由：作業効率，脱塩および濃縮
各項目の経験はあるが，結局上記に落ち着くことが多い
8th JBF Symposium, DG2016-25

44

Japan Bioanalysis Forum

標準品

酵素消化前
クリーンアップ

酵素消化後
クリーンアップ考察

RecombinantProtein◎◎

各クリーンアップのバ
リデーションが可能

Flanking peptide

×○

酵素消化前に関しては別途検討が必要*

Target peptide

×○

酵素消化前に関しては別途検討が必要**酵素消化前のクリーンアップを併用する際は，クリーンアップの再現性および用量依存評価のために，Recombinant Proteinがあると良い．

http://bioanalysisforum.jp/

標準品とクリーンアップタイミングの関係

選択する標準品にも配慮が必要
内部標準品との関係は，I.S.添加タイミングで考察
8th JBF Symposium, DG2016-25

45

Japan Bioanalysis Forum

クリーンアップのタイミングのまとめ 酵素消化前のクリーンアップは，低分子では使用しない方法があり，Pros/Consの考慮が必要．
 酵素消化後のクリーンアップは，低分子の経験が活用
可能．

http://bioanalysisforum.jp/

 議論理由は，酵素消化によるサンプルの複雑化がある
ため，クリーンアップの重要性が高い

 クリーンアップ手法の選択は，標準品の選択も考慮．

8th JBF Symposium, DG2016-25

46

I.S.添加のタイミング
Timing of I.S. spiking

8th JBF Symposium, DG2016-25

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

47

Japan Bioanalysis Forum

低分子
高分子

I.S.の役割
・クリーンアップ補正
・MS分析補正・酵素消化補正・クリーンアップ補正（高分子特有の目的あり）
・MS分析補正

酵素消化
たんぱく質

蛋白の抽出
ペプチド

酵素
消化

http://bioanalysisforum.jp/

I.S.添加タイミングについて

低分子とは別の視点で，I.S.の添加タイミングを考察する必要がある
8th JBF Symposium, DG2016-25

48

Japan Bioanalysis Forum

I.S.の種類と添加タイミング
Therapeutic protein (antibody) in serum / plasma*Heavy-isotope labeled peptide
アンケート: Q6 - 10酵素
消化前Affinity capture （immuno, ProteinA）

精製

Flanking Peptide SIL-IS*

Digestion (by trypsin)

酵素
消化後

酵素消化

(還元，アルキル化等含)Target Peptide SIL-IS*

LC-MS/MS of signature peptides

http://bioanalysisforum.jp/

Whole SIL-IS*

消化以降の操作(前処理，測定等)

Anal. Chem. 2012, 84, 1267−1273

Whole SIL-ISが最も真度が高い．
使用するI.S.の種類によって添加タイミングは異なる．
8th JBF Symposium, DG2016-25

一部改編

49

Japan Bioanalysis Forum

I.S.の種類

Flanking
Target• 高額な合成費など• 酵素消化から補正• 補正は限定的など• 消化後操作の補正• 精製/消化の未補正など

http://bioanalysisforum.jp/

Whole• 全過程を補正

どのような種類のI.S.を用いても課題は存在するため，どの目的でI.S.を添加しているかを明確にする必要性
8th JBF Symposium, DG2016-25

50

Japan Bioanalysis Forum

Pros

Cons

Whole SIL-IS

・サンプル前処理の全ての補正（酵素消化＆クリーン
アップ＆MS補正）・高価
・未販売のものあり
・カルタヘナに該当する場合も物性類似蛋白（種差を利用）・サンプル前処理の全ての補正（酵素消化＆クリーン
アップ＆MS補正）

・比較的高価・消化効率補正が不完全・MS補正が不完全
・カルタヘナに該当する場合も

Flanking Peptide
SIL-IS・酵素消化とMS補正

・消化効率補正が不完全

Target Peptide
SIL-IS

・MS補正

・消化効率の補正は不可

内部標準なし・簡易・消化効率およびMS補正が不可

8th JBF Symposium, DG2016-25

http://bioanalysisforum.jp/

各I.S.の特徴

51

Japan Bioanalysis Forum

Case study1
蛋白の抽出
蛋白
変性＆可溶化

クリーンアップ（特異抗体を除く）での回収率を補正したい！
注：whole_I.S.を準備できない場合
Target peptideを酵素消化前に添加

還元＆アルキル化

WholeあるいはFlankingと定量値が酵素消化同一となることを確認

ペプチド（確認はSILでなくてよい）

脱塩＆濃縮
質量分析計

http://bioanalysisforum.jp/

生体試料

Wholeでは問題ないが，Targetでは吸着が発生する場合もある
8th JBF Symposium, DG2016-25

52

Japan Bioanalysis Forum

Case study2
蛋白の抽出
蛋白
変性＆可溶化

試料中の酵素消化を確認したい！
物性類似タンパクの消化効率を把握した利用

タンパク質を添加

還元＆アルキル化
酵素消化

酵素消化率が既知のタンパ
Wholeの代用として安価にクの消化を実試料中で確認入手できる可能性

し，操作における酵素消化のポジコンとして利用

ペプチド
脱塩＆濃縮

http://bioanalysisforum.jp/

生体試料

抽出，酵素消化に限定的に使用し，測定の補正に関してはTargetを用いる

あくまでも酵素消化操作が問題ないことの確認程度

質量分析計
8th JBF Symposium, DG2016-25

53

Japan Bioanalysis Forum

内部標準とクリーンアップの関係

特異抗体

蛋白沈殿

精製なし

Target Peptide
SIL-IS

酵素消化

除蛋白

固相抽出

液液抽出

精製なし

http://bioanalysisforum.jp/

生体試料
アバンダント蛋白除去

Flanking Peptide
SIL-IS

Whole SIL-IS

内部標準品

LC-MS/MS

8th JBF Symposium, DG2016-25

54

Japan Bioanalysis Forum

I.S.添加のタイミングのまとめ

I.S.の種類は大きく３つに分類可能．それぞれの特徴を理解して，サンプルおよび創薬ステージに合った方法を選択．
目的に応じて，適切なI.S.を追加することで，分析法の定量性は向上．

8th JBF Symposium, DG2016-25

http://bioanalysisforum.jp/

議論理由は，酵素消化および高分子特有のクリーンアップなどがあり，考察が必要なため．

55

Tips

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

8th JBF Symposium, DG2016-25

56

Japan Bioanalysis Forum

検量線関連– 有機溶媒比率とpHを一定にする– DMSOで調製• 代替マトリクスとして他動物種のマトリクスの使用に関して– 吸着防止対策として使用– 代替マトリクス（生食など）に溶解性が悪かったため，そのタンパクを持ち合わせていない動物種を使用
8th JBF Symposium, DG2016-25

http://bioanalysisforum.jp/• 標準溶液の調製媒体に関して57

Japan Bioanalysis Forum

リコンビナント蛋白

合成ペプチドPros・ターゲットの立体構造を反映
・酵素消化効率補正が可能

・複数の準備が可能
・安価
・扱いやすい（安定性，吸着など）

Cons・内因性とリコンビナントは完全には一致しない・高価・扱いにくい（安定性，吸着など）

・立体構造を反映しない
・酵素消化後の補正のみ

http://bioanalysisforum.jp/

標準物質の選択I.S.の選択と同様に求める分析の精度によって，標準物質の選択を行う
8th JBF Symposium, DG2016-25

58

Japan Bioanalysis Forum・ ペプチドの分子量が2000未満
・ 目的蛋白でのみ存在する配列
・ 高感度・ Cysを含まない （還元アルキル化の影響を受ける）
・ Metを含まない（酸化）・ N末端がGlnやGluでない（ピログルタミル化）
・ 修飾されにくい配列
・ その他

8th JBF Symposium, DG2016-25

http://bioanalysisforum.jp/

ペプチド選択条件59

今後の議論内容（例）Future discussion (example)

8th JBF Symposium, DG2016-25

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum

60

Japan Bioanalysis Forum

ペプチド本数

１本

２本以上

Pros

・定量値が一定・感度面を重視可能

・蛋白全体を考慮した定量が可能
・スプライシングバリアントなどとの区別が可能Cons・真の値であるかどうかの判断が不可・候補ペプチドを複数選ぶことが困
難な場合も・選択した各ペプチドで定量値が異なることがあり，複数の測定値から真値の選択が困難

8th JBF Symposium, DG2016-25

http://bioanalysisforum.jp/

定量に用いるペプチドの本数61

Japan Bioanalysis Forum

トランジショ
ン数

1つ

２つ以上

Pros

・定量値が一定
・感度重視の選択が可能

・ターゲットペプチドの配列情報をサポート
・特異性の確認が可能

Cons・真の値であるかどうかの判断が不可・選択した各トランジションで定量値が異なることがあり，複数の測定値から真値の選択が困難

8th JBF Symposium, DG2016-25

http://bioanalysisforum.jp/

定量に用いるペプチド１本あたりのトランジションの数

62代替標準物質
Surrogate Analyte

8th JBF Symposium, DG2016-25

http://bioanalysisforum.jp/

Japan Bioanalysis Forum63

Japan Bioanalysis Forum

代替標準物質定量法とは（内因性物質のモニタリングイオン＝標準物質のモニタリングイオン）

Blank sample*• 代替標準物質を用いた定量（内因性物質のモニタリングイオン≠代替標準物質のモニタリングイオン）

Blank sample
内因性由来の分析対象物質LLOQ sample

標準物質添加内因性由来のピークなし

LLOQ sample

内因性由来の面積値の影響を受ける

代替標準物質添加http://bioanalysisforum.jp/• 標準物質を用いた定量

内因性物質の安定同位体
等の面積値で評価*：実マトリックスに標準物質を添加せずに調製したサンプル

8th JBF Symposium, DG2016-25

64

Japan Bioanalysis Forum

標準物質 マトリックス

分析対象

標準物質 実マトリックス

一般化合物
内因性化合物*－

標準物質 代替マトリックス

内因性化合物DG2015-15

代替
実マトリックス
標準物質
代替
代替マトリックス
標準物質

内因性化合物
内因性化合物DG2016-25

http://bioanalysisforum.jp/

議論の範囲*低値マトリックス入手可能な場合

8th JBF Symposium, DG2016-25

65

Japan Bioanalysis Forum

実マトリックス中の内因性濃度

分析対象物質分析のステージ

LLOQより高濃度

内因性物質

検討レベル

LLOQの20％～
LLOQの間LLOQの20%未満

DG2016-25での議論の範囲高分子
低分子

内因性物質を投与する場合

8th JBF Symposium, DG2016-25

相対的変化をモニターするレベル*

http://bioanalysisforum.jp/

議論の範囲

レギュレーション下での分析***Within Validation**Full Validation

66

Japan Bioanalysis Forum

代替標準物質vs代替ﾏﾄﾘｯｸｽ
代替標準物質 実マトリックスを用いて評価可能
・ IS候補を含めて2種類以上の候変動するファクターを加味した評
補化合物が必要
価が可能→実マトリックスの変動→前処理時の変動

 組成の単純な代替マトリックス→安定供給可能 除去マトリックス→マトリックス効果/回収率が実マトリックスと近い

cons  適切な代替標準物質入手時に限る．  組成の単純な代替マトリックス
 安定的な入手が困難→マトリックス効果，回収率，吸 クロストークの考慮が必要
着等が実マトリックスと異なる
 逆回帰計算をマニュアルで実施
 除去マトリックス→解析ソフトを使用できない→ロット間差が大きい、安定的な 希釈時の計算が煩雑
入手が困難→実マトリックス由来の内因性
成分濃度の考慮が必要
 マトリックス中安定性→Analyteと異なる場合あり
1)DG2015-15から引用
8th JBF Symposium, DG2016-25

http://bioanalysisforum.jp/

pros

代替マトリックス １）
 実マトリックス中の内因性成分濃度より低濃度域の検量線を作成可能

67

Japan Bioanalysis Forum

代替標準物質の使いどころ
平常時の濃度よりも低い推移をするバイオマーカーの定量

代替マトリックスと実マトリックスで溶解性や前処理回収率が異なる場合
代替マトリックス中で容器への吸着が大きい場合

http://bioanalysisforum.jp/

実マトリックスで定量範囲全域の試料調製が可能．
→マトリックス効果を加味した真度・精度の評価が可能

実マトリックス中の生体由来タンパク質が溶解性，前処理回収率，容器吸着を改善する可能性がある

8th JBF Symposium, DG2016-25

68

Japan Bioanalysis Forum

代替標準物質の選択のポイント
Ideal surrogate analyte :The response is equal to that of authentic analyte

本来の標準物質とレスポンスが比例する②の化合物も候補
Compound ② also should be candidate as surrogate analyte①②

http://bioanalysisforum.jp/

理想の代替標準物質:
本来の標準物質のレスポンスと一致する①の化合物

本来の標準物質と代替標準物質のresponseの関係性のイメージ

8th JBF Symposium, DG2016-25

69

Japan Bioanalysis Forum

推奨する代替標準物質
分析対象物質の安定同位体【理由】
分析対象物質と近似した物性近似したレスポンスが得られやすい．
（ピーク強度，R.T, 回収率，ME等の近似性）
重水素体は以下の欠点あり

 水素置換、リテンション変化1)、置換数↑に伴うLCピーク割れ
1) Nico, Trend in Analy Chem 27(10) 924-933, 2008.

http://bioanalysisforum.jp/

13C, 15Nなど（重水素以外）

分析対象物質と近似したレスポンスが得られる場合
下記も利用可能重水素ラベルの安定同位体
類縁物質（安定同位体以外）

8th JBF Symposium, DG2016-25

70

Japan Bioanalysis Forum

Response Factor評価の課題①
 Response Factor (RF) 分析法の構築には“本来”と“代替” のRF算出が不可欠．
分析目的に応じてRFの評価法の検討が必要．

補正した定量値の算出法は？

“一致“の判断基準は？
①レスポンスが一致（RF=1，補正不要)② レスポンスが比例する（RFでの補正が必要）

http://bioanalysisforum.jp/“本来の標準物質のレスポンス” vs ”代替標準物質のレスポンス”

RFの確認頻度？
（分析バッチごと？）
8th JBF Symposium, DG2016-25

71

Japan Bioanalysis Forum① レスポンスを完全一致させる？

②RFで補正する？

（RF=1）
MS条件を揃える手間

定量値の補正の煩雑さ

一致の定義（判断基準）の補正係数の評価法の検討

検討など

など

8th JBF Symposium, DG2016-25

どちらを選択すべき？

http://bioanalysisforum.jp/

Response Factor評価の課題②72

Japan Bioanalysis Forum

RFの確認頻度•分析バッチの前1)• 分析バッチの前後3)

RFの評価方法

RFの判断基準• “本来“と“代替“のmixtureを測定．
• MSレスポンスを比較1)• “本来“と“代替“のMSレスポンス比が±10%以内1)• 検量線の各濃度でMSのレス• 分散分析を実施し，バラポンスを比較2)
2)
ツキが無いことを確認（サンプルは“本来“と“代替“のmixture)• “代替“を用いて検量線を作成．
• 乖離が±5%以内3)• “本来“の濃度と理論値との乖離を確認3)

http://bioanalysisforum.jp/

RFの評価の実例

1) M. Leahy. al., ASMA 20162) W. Li, et. al., Analytical Chemistry 2003;75(21):5854-5859.
3) L Liu. Al., J Chromatogr B 2016;1011:69-76
8th JBF Symposium, DG2016-25

73

Japan Bioanalysis Forum

レギュレーション下での分析における分析法バリデーション項目の案

直線性
真度・精度
マトリックス効果
キャリーオーバー
希釈の妥当性
安定性

・凍結融解，短期・長期保存
・前処理後試料中

回収率
RFの評価

本来の標準物質○×

代替標準物質
◎
◎

×

◎

○

◎

○

◎

×？

◎

△

△
△

○
○
○

◎
◎

http://bioanalysisforum.jp/

バリデーション項目
選択性
定量下限

必須
（実施基準はPoster73参照）◎：必須．BMVガイドラインの評価基準に従い実施○：可能な範囲で実施．
△：必要に応じてBMVガイドラインの評価基準に従い実施．
×：不要
8th JBF Symposium, DG2016-25

74

Japan Bioanalysis Forum

Poster74の追加説明
 代替標準物質+実マトリックスで実施
 代替標準物質の分析法の妥当性を検証する．
本来の標準物質+実マトリックスについても可能な範囲で実施し，代替標準物質の利用の妥当性を検証
する．

安定性

 本来の標準物質+実マトリックスで実施
 実マトリックス中の内因性由来濃度を利用するなど可能な限り実試料に近い試料で評価する．

http://bioanalysisforum.jp/

フルバリデーション

選択性 実マトリックス中の内因性由来濃度で実施
 内因性由来ピークが分析対象物質なのか評価する．
8th JBF Symposium, DG2016-25

75

Japan Bioanalysis Forum

項目

本来の標準物質

代替標準物質検量線（ブランク・ゼロ試料も含む）

×

◎

QC試料

×

◎

RFの評価＊

必須（実施基準はPoster73参照）◎：必須．BMVガイドラインの評価基準に従う
× ：不要＊） RFは装置感度により変動するため分析バッチ毎に評価することが 望ましい．
 異なる装置を使用する場合，同一型式の装置であっても装置毎にRFの評価をすることが望ましい．
 RF評価は，検量線の濃度間で変動を確認するため，低濃度・中濃度・高濃度付近を含む最低3濃度以上で評価することが望ましい．
8th JBF Symposium, DG2016-25

http://bioanalysisforum.jp/

レギュレーション下での分析における実試料分析時の分析バッチ毎の妥当性確認案

76

Japan Bioanalysis Forum

代替標準物質/代替マトリックス選択のフロー
No

類縁化合物の候補
がある？

Yes

Yes

重水素体以外（13C, 15N）を入手可？

本来の標準物質と
responseの差異は許容範囲内？

No

No

代替マトリックスの利用を検討http://bioanalysisforum.jp/

安定同位体（I.S.以外）をCoAとともに入手可？

Yes
代替標準物質
としての
利用を検討

RFの確認
判断基準等の設定（Poster73）

必要に応じてバリデーション
(Poster73-74)

内因性物質はLCガイドラインの対象外であるが、代替標準物質を使用する場合は、経験や事例が少ないことから目的に応じてバリデーション実施を提案

8th JBF Symposium, DG2016-25

77

Japan Bioanalysis Forumまとめ実試料と同じマトリックスの影響の評価が可能
実マトリックス中の内因性濃度より低濃度域の検量線試料作成可能

課題

http://bioanalysisforum.jp/

代替標準物質

試験目的ごとに評価基準等の設定が必要．
利用できる条件が限定的で情報・経験者が少ない．
文献調査や継続議論が必要？
8th JBF Symposium, DG2016-25

78

Japan Bioanalysis Forum

アドバイザーからの一言“標準物質”と“代替標準物質（安定同位体）”のレスポンスは常に一致するのでしょうか？
・そもそも「同じ濃度」に調製できる？
多くの安定同位体は
 高価
 少量合成 不純物含量が不明

正確に秤量しても，含量や純度を考慮しないと正確な濃度の溶液は調製できない？

http://bioanalysisforum.jp/

レスポンス比較（標準物質 vs 代替標準物質）（正確な同位体置換率不明）

8th JBF Symposium, DG2016-25

79

Japan Bioanalysis Forum

アドバイザーからの一言
極微量の
正確な秤量

調製した代替標準物質
溶液の濃度を測定

 標準物質と代替標準物質の分子吸光係数は同じ

http://bioanalysisforum.jp/

レスポンス比較（標準物質 vs 代替標準物質）

代替標準物質の標準原液の濃度はHPLC-UV法で規定
類縁物質，塩，水分含量，揮発性成分（有機溶媒等）なども補正可もし類縁物質量が僅かであれば、吸光度測定のみでも対応可

8th JBF Symposium, DG2016-25

80

Japan Bioanalysis Forum

アドバイザーからの一言 調製濃度を厳密に揃えてもLC-MSのレスポンスが一致しなければ，多分イオン化でレスポンスを調整するしかない．
 逆に濃度が一致していないのに，イオン化の調整でレスポンスを一致させるのは難しいのでは？
A

A=εCl

C

A: 吸光度ε: 分子吸光係数
C: 濃度
l: 光路長

http://bioanalysisforum.jp/

レスポンス比較（標準物質 vs 代替標準物質）

低分子/高分子で分子吸光係数を利用して濃度を合わせた経験があります
8th JBF Symposium, DG2016-25

81

Japan Bioanalysis Forum

Summary of a questionnaire for quantitative analysis for large
molecules by LC-MS
実施期間：
配布先：
有効回答数：

2016年12月12日～12月16日
DGサポーター（195名）
JBFパートナー(38社)
21名

Term
Distributed to
Valid responses

12 Dec 2016 to 16 Dec 2016
DG supporters (195), JBF partners (38)21
8th JBF Symposium, DG2016-25

http://bioanalysisforum.jp/

DG2016-25
高分子のLC-MS定量分析
アンケート結果

82

Japan Bioanalysis Forum

回答者背景 BackgroundQ1 所属について教えてください．
②
23.8%
(5件)

①
76.2%
(16件)

① 製薬
② CRO
③ その他

① Pharmaceuticals② CRO③ Others

Q2 LC-MS/MSによる高分子の定量経験の有無について教
えてください．
②
9.5%
(2件)

①
90.5%
(19件)

Do you have an experience quantitative assay forLarge molecules by LC-MS/MS?

http://bioanalysisforum.jp/

Working at

① Yes
② No
8th JBF Symposium, DG2016-25

83

Japan Bioanalysis Forum

高分子のLC-MS/MSによる分析経験
Experience of quantitative analysis for large molecules by LC-MS/MS

What kinds of large molecules do you have experience of quantitative assay
by LC-MS/MS?
④
0.0%
②
38.1%
(8件)

③
14.3%
(3件)

①
47.6%
(10件)

① 内因性成分② 抗体医薬③ 内因性成分と抗体医薬どちらも④ その他① Endogenous substance② Antibody drug
③ Both ①and②④ Others

8th JBF Symposium, DG2016-25

http://bioanalysisforum.jp/

Q3 LC-MS/MSにて定量分析を実施した経験のある高分子
はどのようなものがありますか？

84Japan Bioanalysis Forum

高分子のLC-MS/MSによる分析経験
Experience of quantitative analysis for large molecules by LC-MS/MS

The purpose and criteria when performing quantitative analysis of large
molecules by LC-MS/MS① GLP適用の定量試験（バリデーション試験含む）② 信頼性基準適用の定量試験（バリデーション試験含む）③ 適応規制なしの定量試験（バリデーション試験含む）④ 探索、検討レベル
⑤ その他

①

②

③

④

⑤
0

2

4

その他の回答⑤ Others

6

8

10

12

14

・技術検討
For technical investigation

16① Quantification for GLP (include validation)② Quantification for reliability standard(include validation)③ Quantification without regulatory requirement(include validation)④ Research or method development⑤ Others

8th JBF Symposium, DG2016-25

http://bioanalysisforum.jp/

Q4 LC-MS/MSにて高分子の定量分析を実施した時の目的，
適応基準を教えて下さい．（複数回答可）

85

Japan Bioanalysis Forum

サンプル処理方法 Sample treatment procedures
Q5 酵素消化前のサンプル処理方法はどのような手順が多いですか？（複数回答可）① 変性、還元、アルキル化なし② 変性→酵素消化③ 変性→還元→アルキル化→酵素消化④ 還元→アルキル化→酵素消化（変性なし）⑤ 精製→変性→還元→アルキル化→酵素消化
⑥ その他

①
②
③
④
⑤
⑥
0

2

その他の回答⑥ Others

4

6

8

10

12

・酵素消化後に精製
Purify after enzyme digestion

http://bioanalysisforum.jp/

Most frequent sample treatment procedures before enzyme digestion① Nothing② Denaturation only
③ Denaturation, reduction, and alkylation④ Reduction and alkylation⑤ Purification, denaturation, reduction, and alkylation⑥ Others

8th JBF Symposium, DG2016-25

86

Japan Bioanalysis Forum

内標準物質 Internal Standard
Q6 内標準物質として用いるものはどれですか？（複数回答可）① 安定同位体標識したWholeのタンパク質② 安定同位体標識したターゲット配列のペプチド③ 安定同位体標識したターゲット配列のペプチドを数アミノ酸残基延長したペプチド
④ その他

①

②

③

④

0

2

4

その他の回答④Others

6

8

10

12

14

16

① Stable-isotope-labeled whole protein② Stable-isotope-labeled target peptide③ Stable-isotope-labeled flanking peptide④ Others

http://bioanalysisforum.jp/

Most frequently used Internal standards?

・ターゲット配列ではない適当なペプチド
Peptide sequence irrelevant to target peptide
・入手可能なもの
Available peptide

8th JBF Symposium, DG2016-25

87

Japan Bioanalysis Forum

内標準物質 Internal Standard
設問6で「①安定同位体標識したWholeのタンパク質」を選択された方に質問です。
内標準物質の添加のタイミングはいつですか？（複数回答可）（精製→変性→還元→
アルキル化→酵素消化のフローで実施した場合でお答え下さい。）

For a person chose “①Stable-isotope-labeled whole protein” in Q6. When do
you add I.S. in the workflow of purification, denaturation, reduction,
alkylation, and enzyme digestion?

②
16.7%
(1件)
①
83.3%
(5件)

① 精製前
② 精製後、変性前③ 還元・アルキル化後、酵素消化前④ 酵素消化後⑤ その他① Before purification② After purification, before denaturation③ After reduction/alkylation, before enzyme digestion④ After enzyme digestion⑤ Others

8th JBF Symposium, DG2016-25

http://bioanalysisforum.jp/

Q788Japan Bioanalysis Forum

内標準物質 Internal Standard
設問6で「②安定同位体標識したターゲット配列のペプチド」を選択された方に質問です。内標準物質の添加のタイミングはいつですか？（複数回答可）（精製→変性→
還元→アルキル化→酵素消化のフローで実施した場合でお答え下さい。）

For a person chose “②Stable-isotope-labeled target peptide” in Q6. Whendo you add I.S. in the workflow of purification, denaturation, reduction,
alkylation, and enzyme digestion?

④
68.8%
(11件)

①
②
6.7% 6.7%(1件) (1件) ③
20.0%
(3件)

① 精製前
② 精製後、変性前③ 還元・アルキル化後、酵素消化前④ 酵素消化後⑤ その他

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Q8① Before purification② After purification, before denaturation③ After reduction/alkylation, before enzyme digestion④ After enzyme digestion⑤ Others
8th JBF Symposium, DG2016-25

89

Japan Bioanalysis Forum

内標準物質 Internal Standard
設問6で「③安定同位体標識したターゲット配列のペプチドを数アミノ酸残基延長したペプチド」を選択された方に質問です。内標準物質の添加のタイミングはいつですか？（複数回答可）（精製→変性→還元→アルキル化→酵素消化のフローで実施した
場合でお答え下さい。）

For a person chose “③Stable-isotope-labeled flanking peptide” in Q6. Whendo you add I.S. in the workflow of purification, denaturation, reduction,
alkylation, and enzyme digestion?

④
25.0%③0.0% (1件)

⑤0.0%

②
50.0%
(2件)

①
25.0%
(1件)

① 精製前
② 精製後、変性前③ 還元・アルキル化後、酵素消化前④ 酵素消化後⑤ その他

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Q9① Before purification② After purification, before denaturation③ After reduction/alkylation, before enzyme digestion④ After enzyme digestion⑤ Others
8th JBF Symposium, DG2016-25

90

Japan Bioanalysis Forum

内標準物質 Internal Standard

For a person chose “④Others” in Q6. When do you add I.S. in the workflow
of purification, denaturation, reduction, alkylation, and enzyme digestion?

⑤
33.3%
(1件)
③0.0%
④0.0%

その他の回答⑤ Others

①
33.3%
(1件)
②
33.3%
(1件)

① 精製前
② 精製後、変性前③ 還元・アルキル化後、酵素消化前④ 酵素消化後⑤ その他① Before purification② After purification, before denaturation③ After reduction/alkylation, before enzyme digestion④ After enzyme digestion⑤ Others

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Q10 設問6で「④その他」を選択された方に質問です。内標準物質の添加のタイミングはいつですか？（複数回答可）（精製→変性→還元→アルキル化→酵素消化のフローで実施した場合でお答え下さい。）

・利用するI.S.によって変える
The timing depends on the kinds of I.S.

8th JBF Symposium, DG2016-25

91

Japan Bioanalysis Forum

酵素消化 Enzyme Digestion
Q11 よく使用する酵素をお教え下さい。（複数回答可）① Trypsin② Lys-C③ Trypsin/Lys-C Mix④ Others

①

②

③

④

0

2

4

その他の回答④ Others

6

8

10

12

14

16

18

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Most frequently used enzyme for digestion?

20・酵素消化はしません
Omit enzyme digestion process

8th JBF Symposium, DG2016-25

92

Japan Bioanalysis Forum

酵素消化 Enzyme Digestion
Q12 酵素消化前のサンプル精製は実施していますか？
（複数回答可）

②
40.0%
(8件)

その他の回答③ Others

③
10.0%
(2件)

①
50.0%
(10件)

① していない② アフィニティ精製を実施している
③ その他
① No
② Yes (affinity purification)③ Others

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Do you purify the sample before enzyme digestion?

・限外濾過
Ultrafiltration

8th JBF Symposium, DG2016-25

93

Japan Bioanalysis Forum

酵素消化 Enzyme Digestion

Do you have an experience of enzyme digestion without denaturation
process?

②②
No
76.2%
(16件)

①①
Yes
23.8%
(5件)

① Yes
② No
③ Others

8th JBF Symposium, DG2016-25

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Q13 サンプルを変性させずに，酵素消化をした経験はあり
ますか？

94

Japan Bioanalysis Forum

酵素消化 Enzyme Digestion
設問13にて「ある」と回答された方のみご回答ください．サンプルを変性させた方が一般的に酵素消化効率が上がると思いますが，実施しない理由をお教えください．（複数回答可）

For a person chose “①Yes” in Q13. Why did you omit denaturation process
which is expected to improve enzyme digestion efficacy?
①実施しなくても測定可能であったため②作業効率を上げるため③測定対象以外の夾雑物を極力抑えるため
④その他

①

②

③

④

0

1

2

3

4

① Analyte was measurable without denaturation② Improve operating efficiency③ Suppress production of interfering substances④ Others

8th JBF Symposium, DG2016-25

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Q14

95

Japan Bioanalysis Forum

酵素消化 Enzyme Digestion

Do you have an experience of enzyme digestion without reduction/alkylation
process?

②
61.9%
(13件)

①
38.1%
(8件)

①Yes
②No
③Others

8th JBF Symposium, DG2016-25

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Q15 還元・アルキル化の工程を実施せずに，酵素消化をした経験はありますか？

96Japan Bioanalysis Forum

酵素消化 Enzyme Digestion
設問15にて「ある」と回答された方のみご回答ください．還元・アルキル化の工程を実施した方が一般的に酵素消化効率が上がると思いますが，実施しない理由をお教えください．（複数回答可）

For a person chose “①Yes” in Q15. Why did you omit reduction/alkylation
process which is expected to improve enzyme digestion efficacy?
① 実施しなくても測定可能であったため② 作業効率を上げるため③ 測定対象以外の夾雑物を極力抑えるため
④ その他

①

②

③

④

0

1

2

3

4

5

6

7

① Analyte was measurable without denaturation② Improve operating efficiency③ Suppress production of interfering substances④ Others

8th JBF Symposium, DG2016-25

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Q16

97

Japan Bioanalysis Forum

酵素消化 Enzyme Digestion
Q17 高分子を酵素消化して分析する場合，検討時に消化効率を確認しますか？

③
5.0%
(1件)
②
40.0%
(8件)

①
55.0%
(11件)

① Verify② Not verify③ Depend on purpose of assay

8th JBF Symposium, DG2016-25

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Do you verify enzyme digestion efficiency?

98

Japan Bioanalysis Forum

酵素消化 Enzyme Digestion
消化効率を確認する場合、その目的についてお教え下さい．（複数回答可）設問17で「②確認しない」と回答された方は設問20へお進み下さい．設問17で「③分析の目的による」と回答された方は取り組まれている内容に応じて回答ください．

For a person chose “②Not verify or ③Depend on purpose of assay” in Q17.
What is the purpose of verifying the enzyme digestion efficiency?
①① 100%に近い方が、定量値がより真値に近づくと思うから② 確認した方が再現性の良いデータを得られると思うから③ 感度不足の場合、問題解決の一助となるから
④ その他

②

③

④

0

2

4

6

8

10

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Q18

12

① If the efficiency is approximately 100%, it means the quantitative value is near to the true value② It contributes to obtain reproducible data
③ This information is helpful for improving the sensitivity of analysis④ Others
8th JBF Symposium, DG2016-25

99

Japan Bioanalysis Forum

酵素消化 Enzyme Digestion
消化効率がほぼ100%となったと判断する方法についてお教え下さい．（複数回答可）設問17で「②確認しない」と回答された方は設問20へお進み下さい。設問17で「③分析の目的による」と回答された方は取り組まれている内容に応じて回答ください．

For a person chose “②Not verify or ③Depend on purpose of assay” in Q17.
How do you judge the enzyme digestion efficiency reached to approximately 100%?
① 測定するペプチドの面積値が頭打ちになることで確認② 安定同位体ペプチドを内標準物質に用いて、面積比が頭打ちになることで確認
③ その他

①

②

③

0

1

その他の回答（抜粋）③ Others

2

3

4

5

6

7

① Peak area of target peptide reached to plateau② Peak area ratio of target peptide/I.S. reached toplateau③ Others

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Q19・既知量のリコンビナントタンパク質をサンプルに添加しその回収率を以てサンプルの消化効率を評価するという間接的な方法
Recovery of spiked recombinant protein (known amount) is used for evaluation of digestion efficacy.
・非標識ペプチドをブランクに添加した際の面積値と同等の値となることで確認
Confirm the peak area of standard peptide and target peptide from digested protein are same.

8th JBF Symposium, DG2016-25

100

Japan Bioanalysis Forum

酵素消化 Enzyme Digestion
消化効率を確認しない場合、その理由についてお教え下さい．（複数回答可）設問17で「②確認する」と回答された方は回答不要です．設問17で「③分析の目的による」と回答された方は取り組まれている内容に応じて回答ください．

For a person chose “②Not verify or ③Depend on purpose of assay” in Q17.
Why don’t you verify enzyme digestion efficiency?
①① 再現性や濃度依存性が見られれば確認する必要はないから② 確認方法がわからないから③ 内標準物質で補正をかけているから
④ その他

②

③

④

0

1

2

3

4

5

6

http://bioanalysisforum.jp/

Q20

7① If reproducibility and/or concentration dependency is observed, there is no necessity for
confirming the enzyme digestion efficiency② How to confirm it is unclear③ Enzyme digestion efficiency is corrected by internal standard④ Others
8th JBF Symposium, DG2016-25

101

Japan Bioanalysis Forum

容器への吸着 Adsorption on Laboratory container

How do you care about adsorption of analyte to container when preparing
working solution?

① マトリックス試料（血清など）を調製し、マトリックスで段階希釈② 溶媒と容器をいくつか試して、容器吸着 の
検討を実施
③ その他

①

②

③

0

2

4

6

8

10

12

14

① Dilute with matrix② Search best combination of solvent and container③ Others

8th JBF Symposium, DG2016-25

http://bioanalysisforum.jp/

Q21 標準溶液調製の際，容器への吸着はどのようにケアしていますか？（複数回答可）

102

Japan Bioanalysis Forum

Q22

設問21にて「②溶媒と容器をいくつか試して，容器吸着の検討を実施」と回答された方のみご回答ください．溶媒は何を試すことが多いですか？（
複数回答可）For a person chose “②Search best combination of solvent and container” in Q21.
What kind of solvent do you usually use?
① 水と有機溶媒の混液② 水と有機溶媒と酸の混液③ 界面活性剤を添加した溶媒
④ その他

①

②

③

④

0

1

2

3

4

5

6

7

8

① Mixture of water and organic solvent② Mixture of water, organic solvent, and acid
③ Solvent containing some surfactant④ Others

8th JBF Symposium, DG2016-25

http://bioanalysisforum.jp/

容器への吸着 Adsorption on Laboratory container

103

Japan Bioanalysis Forum

容器への吸着 Adsorption on Laboratory container

For a person chose “②Search best combination of solvent and container” in Q21.
What kind of solvent and composition do you usually use?
・ 水／メタノール（50:50）他ケースバイケース
Water/MeOH (50:50), case by case・ 0.1%BSA, Tweenなど
0.1%BSA, Tween, etc.
・ 水/エタノール
Water/EtOH

8th JBF Symposium, DG2016-25

http://bioanalysisforum.jp/

Q23 設問21にて「②溶媒と容器をいくつか試して，容器吸着の検討を実施」と回答された方のみご回答ください．よく使用する溶媒の組成を，答えられる範囲でご回答下さい．

104

Japan Bioanalysis Forum

容器への吸着 Adsorption on Laboratory container

For a person chose “②Search best combination of solvent and container” in Q21.
What kind of container do you usually use?
① ガラス製チューブ② 不活性化処理したガラス製チューブ③ 通常のポリプロピレン製チューブ④ 低吸着のポリプロピレン製チューブ⑤ シリコナイズ処理したポリプロピレン製チューブ
⑥ その他

①
②
③
④
⑤
⑥
0

1

2

3

4

5

6

7

8

① Glass② Glass with deactivation treatment③ Polypropylene④ Polypropylene with low adsorption treatment⑤ Siliconized polypropylene⑥ Others

8th JBF Symposium, DG2016-25

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Q24 設問21にて「②溶媒と容器をいくつか試して，容器吸着の検討を実施」と回答された方のみご回答ください．容器は何を試すことが多
いですか？

105

Japan Bioanalysis Forum

変性剤・お悩み Denaturing reagent＆Others
よく使用する変性剤の種類を，答えられる範囲でご回答下さい．

What kind of denaturing
reagent do you mostfrequently use?

Q26

# of answers
Rapigest (Waters)

4

Urea

3

Deoxycholic acid,2

Guanidinium chloride

2

DTT, SDS, MTBE

1

LC-MS/MSでの高分子定量分析を実施するにあたり，ご意見・悩み等あればご記載下さい．

Comments

・surrogate peptideの選択
How to choose surrogate peptide?
・タンパク標品が販売されていない場合の対応が悩ましい
How to take action when the whole protein is not available?
・ターゲットペプチドの選択（選択性）
How to choose target peptide which have sufficient selectivity?
・トリプシンの中に含まれるキモトリプシン量はメーカー等によって異なると思われるが，
トリプシンは複数メーカー検討が必要かどうか気になります．精製なしで実施をした方が感度が得られると聞いたことがあるが，その場合の酵素量等を聞いてみたい．
Manufacturer of trypsin is important (e.g. chymotrypsin content)?
Appropriate amount/concentration of enzyme when digest protein without purification?

8th JBF Symposium, DG2016-25

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Q25106