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2012A1253

BL40B2

界面活性剤処理によるヒト皮膚角層の構造変化の小角・広角 X 線散乱法を用いた解析(第 2 報)
Study on the Structural Change of Human Stratum Corneum
Induced by the Treatment of Surfactant Solutions
Using Small- and Wide-Angle X-ray Scattering, Part 2
山田 真爾 a, 久米 卓志 a, 内藤 崇 a, 筒井 智恵子 a, 太田 昇 b, 八田 一郎 b
Shinji Yamadaa, Takuji Kumea, Takashi Naitoa, Chieko Tsutsuia, Noboru Ohtab, Ichiro Hattaba

花王株式会社, b（公財）高輝度光科学研究センターaKao Corporation, bJASRI

水またはドデシル硫酸ナトリウム水溶液の処理によるヒト皮膚角層の構造変化を，小角・広角X 線散乱法により解析した．角層のソフトケラチン構造に着目し，q  6 nm-1 近傍に見られるプロトフィブリル由来の散乱ピークについて，溶液処理に伴うピーク位置 q とピーク面積の経時変化を調べた．その結果，溶液の浸透に伴う経時的なフィブリル構造の変化と角層の膨潤には，複数の段階（過程）が存在する可能性が示唆された．
キーワード：

human stratum corneum, surfactant, X-ray scattering, soft keratin, fibril structure

背景と研究目的：
日々の皮膚の洗浄は，皮膚表面を清潔に保つために重要なスキンケアである．しかし，洗浄剤に含まれる界面活性剤は皮膚角層中に浸透し（角層の膨潤），角層構成成分（主としてソフトケラチン）の構造変化や保湿成分の溶出を生じ，結果として角層機能（水分保持能等）の低下を引き起こす場合がある．そのため，界面活性剤の角層への影響を解明することは重要な課題である．
我々は，界面活性剤の皮膚への浸透とそれに伴う角層の構造変化（膨潤）の解明を目指し，特にソフトケラチンに着目した検討を行っている．ソフトケラチンはフィブリル構造を有する高次構造体であるが，界面活性剤の浸透による角層膨潤にはフィブリル構造の変化が関わると仮説を立て，小角・広角 X 線散乱法による検証を試みた．
実験：1） 試料：健常成人の踵から採取した角層粉末を試料とした．処理溶液としては，水（pH7）およびドデシル硫酸ナトリウム（SDS）水溶液（濃度：0.03，0.3，3 wt%，塩酸により pH7 に調整）を用いた．
2） 実験方法：相対湿度 35%のデシケータ内に 72 時間以上保存した角層粉末を溶液セル[1]に充填し，乾燥状態における X 線散乱測定を行った．その後，処理溶液（水または SDS 水溶液）をセル内に注入し，直後（5 s 後）から 60 分まで，時分割の小角・広角 X 線散乱測定を行った．
3） 測定条件：SPring-8 の BL40B2 を利用した．X 線の波長は 0.083 nm（15 keV），カメラ長は 500mm とし，検出器にはイメージングプレートを用いた．散乱像を取得後，円環平均を計算して一次元散乱プロファイルデータを得た．
結果および考察：我々は 2011B 期の実験において，角層構造の界面活性剤水溶液処理による経時変化を調べるた
めの予備検討として，溶液処理 5 分後から 5 分毎の時分割 X 線散乱測定を行った[2]．その結果，
X 線散乱プロファイルは溶液処理後 5 分以内に大きく変化することがわかり，より短時間領域での時分割測定が必要であることがわかった．そこで今回の実験では，①溶液セルにシリンジポンプを接続することで溶液処理を実験ハッチ内で無人で行うこと，②3 枚のイメージングプレートを連続して使用すること，の 2 点の工夫を行い，溶液注入 5 s 後から 1 分間隔での時分割測定を行うことができた．

3

得られた SDS 水溶液（0.3 wt%）処理角層に180(a)(b)
おける X 線散乱プロファイルの経時変化を図160101a に示す．界面活性剤処理前の乾燥状態のプ
140
ロファイル（図中で Dry と表示）には，q = 1.2120456789nm-1，6.4 nm-1，14 nm-1 付近にブロードなピーq [nm ]クが観測された．これらのピークのうち，q =Time
106.4 nm-1 のピークはケラチンタンパク質のプ5s (red) 
3507 s(blue)
ロトフィブリル構造によるものと考えられている[1, 3]．また，q = 14 nm-1 付近のピークは，Dry（before treated)
ソフトケラチンの-helix 構造のピッチ（0.51nm）に由来すると帰属されている[4]．一方，q101010= 1.2 nm-1 のピークについてはこれまでに帰-1 -1
qq [nm(nm ) ]属の報告は無いが，我々はこれがケラチンのミクロフィブリルに由来するものと推定した 図 1. SDS 水溶液（0.3 wt%，pH7）処理による[2]．
角層の X 線散乱プロファイルの経時変化．
SDS 水溶液で角層を処理すると，散乱プロa) 小角~広角散乱プロファイル．
ファイルに変化が生じた．q = 20 nm-1 近傍のb) q  6 nm-1 のピークのガウス関数による散乱強度が経時的に増加したが，これは角層フィッティング．
への水の浸透を示唆している[2]．一方，0.7nm-1 < q < 3 nm-1 の領域で散乱強度が経時的に増加する傾向が見られた．ピークがブロードであり定量的な解釈は困難であるが，q = 1.2 nm-1 のピークがよりブロード化しながら低 q 側にシフトし，また q = 1.8 nm-1 近傍に新たなブロードなピークが出現しているように見える．別途 SDS 水溶液の散乱プロファイルを測定したところ， q = 1.8 nm-1 近傍にブロードなピークを与えることがわかり，これは SDS ミセルに由来する可能性がある．q = 6.4 nm-1 のケラチンのプロトフィブリル由来のピークは，ピーク位置が低 q 側にシフトしながら，そのピーク面積が減少することが確認された．
我々は，ソフトケラチン構造の界面活性剤処理による経時変化に着眼している．ケラチン構造を反映すると考えられる上述の q = 1.2 nm-1，6.4 nm-1，14 nm-1 の 3 つのブロードなピークのうち，
q = 1.2 nm-1 近傍のピークは剤処理により非常にブロード化すること，14 nm-1 近傍のピークは浸透する水のピークが重複すること，の理由により定量的な解析が難しい．一方，q = 6.4 nm-1 近傍のプロトフィブリル由来のピークは，他のピークとの重なりが無く，その形状が対称形に近い．バックグラウンドを直線近似により除去し，ガウス関数を仮定すると良好なピークフィッティングを行うことができることがわかった（図 1b）．
プロトフィブリル由来のピークの位置 q とピーク面積（界面活性剤処理前のピーク面積で規格化）の溶液処理後の経時変化をピークフィッティングにより解析した結果を，SDS 水溶液（0.3wt%）および水処理の場合について図 2 示す．ピーク位置 q（図 2a）は，溶液処理前には 6.43 ~ 6.45nm-1 であったが，SDS 水溶液または水の処理によって経時的に低 q 側にシフトし，どちらの処理でも処理時間 t = 200 ~ 300 s 後に約 6.0 nm-1 で一定になった．q の変化速度は水処理の場合の方がわずかに速い傾向が見られた．一方ピーク面積(図 2b）について見ると，水については，処理 5 s後以降急激に減少し，t  100 s 以降でほぼ一定となった．このときのピーク面積は処理前のピーク面積の約半分であった．一方 SDS 処理においては，ピーク面積は処理後約 30 s 以降で急激に減少し，t  150 s でほぼ一定（処理前の面積の約半分）となった後，t  1000 s 以降で再び減少する挙動を示した．
これまでの検討から，q  6 nm-1 近傍のピークは，ソフトケラチンのプロトフィブリルを円柱形構造と捉え，その粒子散乱によるものと解釈することができる[2, 5]．その考えに基づくと，ピーク位置の低 q 側へのシフトは，界面活性剤処理によってプロトフィブリルの直径が約 1.5 nm から1.7 nm に増加したことに対応すると解釈できる．q の処理前の値と処理後のシフト量が SDS 水溶液と水で同等であることから，このフィブリル径の増加は水分子の作用（水和）に関連したものと推定される．
一方，図 2b に示したピーク面積は，フィブリル構造の量，構造規則性，さらにはフィブリル構造と周囲の構造の電子密度のコントラスト等に依存し，これらは溶液の浸透によって変化すると考えられる．これらの因子の中で我々は，今回の結果においてはフィブリル構造の量がピーク面Intensity, I [a.u.]

2Intensity (a.u.)
Intensity,I [a.u.]46543-12365432234567 8 90234567 8 9126.51.2(a)Normalized Areaq [nm-1]

6.4(Dry)

6.3SDS(0.3 wt%）

6.2

Water

6.1
6.0
5.910-1100101102103101.00.8Time，t [s]SDS(Dry)(0.3 wt%）

Water

0.60.40.2
0.04(b)10-1

100101102103104Time，t [s]図 2．水および SDS 水溶液（0.3 wt%）処理によるプロトフィブリル構造由来のピークの（a）ピーク位置 q および（b）ピーク面積（Dry の値で規格化）の時間変化．
（処理前の乾燥状態における値を便宜上 t = 10-1 s の位置に示す．）

Normalized Cell Volume

Normalized Area

積に最も大きく影響していると考えている．SDS 水溶液または水の処理により角層は膨潤する．
今回の X 線散乱実験では，角層試料は溶液セル内のろ紙に穴を開けてそこに充填されているが，溶液の浸透に伴い角層はろ紙の穴を押し広げて膨潤すると考えられる．角層が膨潤するとケラチン線維の体積密度が減少するため，X 線照射領域内に存在するケラチン線維の数が減ることになり，それが散乱強度に反映されたと考えられる．別の実験で，SDS 水溶液で処理した 1 個の角層細胞体積の経時変化を共焦点レーザー顕微鏡により調べたところ，角層体積は処理後数分以内に初期体積の約 2 倍に膨潤した後に一定値を取り，約 1000 s 後に再び増加する傾向を示した（図 3）．
角層体積が約 2 倍で一定となる時間領域で X 線散乱のピーク面積は初期値の約半分になっており，両者は定量的に対応している．また，その後に再び角層体積の増加が生じる時間（約 1000 s）は，ピーク面積が再び減少を始める時間にほぼ一致した．水処理系についても，共焦点レーザー顕微鏡で得られた角層細胞体積の時間依存性は，散乱ピーク面積の経時変化と良好な対応を示した．
以上のことから，図 2b に示したピーク面積の変化は，主として角層粉末の体積増加（膨潤）を反映していると考えられ，水では経時的に一段階，SDS（0.3 wt%）では二段階の膨潤を示すことがわかった．
図 4 に，プロトフィブリル由来のピークの SDS 水溶液処理による q（図 4a）とピーク面積（図 4b）の経時変化の SDS 濃度依存性を示す．SDS 水溶液処理前には q は 6.43  6.49 nm-1 の範囲にあり，0.03，0.3 wt%の水溶液処理によって，約 200 s以内に 6.01  6.02 nm-1 にシフトし，その後一Cell Volume1.2定となった．3 wt%水溶液の処理では約 30 s
31.0
後に q = 5.96 nm-1 にシフトした．処理時間がPeak(Dry)
それより長くなると今後の課題で述べるよArea
0.82うに，それ以降の q の変化は現時点では解析0.6できないが，先に述べたようにこの変化は水分子の作用によると考えられることから，0.41SDS 濃度は主として変化速度に影響し，低 q(Dry)0.2側へのシフトは q  6.0 nm-1 で収束すると推定している．すなわち，SDS の処理によって0.0 -20-10123451010101010101010プロトフィブリル直径は約 1.5 nm から 1.7Time, t [s]nm に増加し，その変化速度は濃度 3 wt%で最も速いことがわかった．
図 3. プロトフィブリル構造由来のピークの面一方ピーク面積については，SDS 濃度に依積の SDS 水溶液処理後の時間変化（デー存して異なる変化の傾向を示した．0.03 wt％
タは図 2b に対応）と，共焦点レーザー顕では，t  100 s までにピーク面積が未処理の微鏡法により評価した角層体積の SDS 処約半分に減少した後，ほぼ一定となった（水理後の時間変化（処理前の体積で規格化）処理と同等の変化）．0.3 wt%は先に述べたよの比較．

1.2

6.6

0.3 % ( )0.03 % (䕔)-1q [nm ]6.4 (Dry)

Normalized Area

(a)a)

6.2

6.0

5.8

SDS 3 %
10-110010(b)b)

1.0(Dry)

0.03 %

0.8
0.6
0.4

3%

0.2
1102Time, t [s]1031040.010-110010

0.3 %1102103104Time, t [s]ᅗ 4㸬⃰ᗘࡢ␗࡞ࡿ SDS Ỉ⁐ᾮ䠄0.03㸪0.3㸪3%䠅ࡢฎ⌮࡟ࡼࡿゅᒙࣉࣟࢺࣇ࢕ࣈࣜࣝᵓ㐀⏤᮶ࡢࣆ࣮ࢡࡢ a䠅఩⨨ q ࡜ b䠅ࣆ࣮ࢡ㠃✚ࡢ⤒᫬ኚ໬㸬ฎ⌮๓ࡢ್ࢆ౽ᐅୖ㸪t = 10-1 s ࡢ఩⨨࡟♧ࡍ䠄Dry ࡜⾲♧䠅㸬࠺࡟㸪஧ẁ㝵ࡢ㠃✚ኚ໬ࢆ♧ࡋࡓ㸬3 wt%࡛ࡣ㸪t | 30 s ࡲ࡛࡟ࣆ࣮ࢡࡣ࡯ࡰᾘኻࡋࡓ㸬3 wt%ࡢฎ
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