厚生連医誌

原第１６巻

１号 ３５〜３９ ２００７著

Polymerase Chain Reaction
（PCR）
法による
Methicillin-resistant Staphylococcus aureus（MRSA）の疫学的解析法の有用性
長岡中央綜合病院、院内感染対策委員会、病理部；臨床検査士１）、検査科；臨床検査士２）
呼吸器内科；内科医３）
はせがわ ひで ひろ

かねこ長谷川秀浩１）、金子ようこ

あ目的：メチシリン耐性黄色ブド ウ 球 菌（methicillinresistant Staphylococcus aureus : MRSA）は、院内感染の原因菌として最も注意を払わなければならない菌であり、アウトブレークが疑われた際には感染源の確認と感染拡大の防止策を緊急に講じる必要性から分子生物学技術を用いた疫学的解析法の導入が望まれる。
方法：２００６年６月から９月に当院において分離された
MRSA１
１６株のゲノムタイピングを Polymerase
chain reaction（PCR）法 を 応 用 し た ribosome
spacer PCR（RS-PCR）法と Arbitrarily primer PCR（AP-PCR）法を用いて行なった。
結果：検討を行なった１１６株の MRSA の遺伝子型はRS-PCR 法により８種類に分類され AP-PCR 法では１７種類に分類された。さらに双方の結果を組み合わせる事により５１種類にゲノムタイピングされた。
結論：臨床材料から分離された MRSA を迅速にタイピングできる RS-PCR 法および AP-PCR 法は、リアルタイムな対応が求められる院内感染発生時において、感染源の特定と感染拡大の防止に貢献できるものと判断された。

たみこ

いわ しま

あきら

明３）を払わなければならない菌として重要視され、多くの病院に感染対策委員会（ICC）やインフェクションコントロールチーム（ICT）が設けられ動向の把握とともに様々な感染防止対策が施されている。特に本菌によるアウトブレーク（病院感染拡大）発生の際には、その拡大防止のため感染源の究明と感染経路を早急に遮断する事が重要である。そのためには MRSA のタイピングは必要不可欠であり従来、コアグラーゼ型別試験、エンテロトキシン血清型や Toxic shock symdrome toxin−１（TSST−１）の産生試験など生物学的特性を利用した表現型のタイピングが行なわれてきたが、分離される MRSA の表現型が特定のタイプに集中している事が明らかとなり、さらに詳細なタイピングの必要性に迫られてきた!。そこで１９９０年代にはパルスフィールド電気泳動法（pulsed-field gel erectrophoresis : PFGE）に代表されるような分子生物学的解析法が MRSA の感染源や感染経路の特定に用いられるようになってきた"−#。また、近年では PCR 法を応用して、より迅速かつ簡便にゲノムタイピングを行なう方法として１６S〜２３S の rRNA に挟まれた spacer 領域をユニバーサルプライマーにより増幅させる Ribosome spacer PCR（RS-PCR）や９〜１０ner 程度のランダムな塩基配列をしたプライマーを使用し、不特定多数の増幅産物を形成させる Arbitrarily primer PCR（AP-PCR）などが微生物の識別法として 試 み ら れ て いる$−%。今回我々は MRSA によるアウトブレークが発生した際の対応策を構築するにあたり RS-PCR 法とAP-PCR 法により迅速に MRSA のフィンガープリントをおこない感染源の特定と感染経路を遮断するシステムの構築を目的に MRSA のゲノムタイピングを行なった。

キーワード：メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、遺伝子型別、ribosome spacer PCR（RS-PCR）法、Arbitrarily primer PCR（AP-PCR）法緒べ陽子２）、阿部多実子２）、岩島言

メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（methicillin-resistant
Staphylococcus aureus : MRSA）は、ペニシリン耐性
黄色ブドウ球菌に有効な β‐ラクタム薬であるメチシリンに耐性を獲得した黄色ブドウ球菌である。MRSAの病原性は、多種の抗生剤に耐性を示し、治療が著しく困難になるという点を除けば皮膚の常在菌である黄色ブドウ球菌と同等であり、健常者の皮膚や口腔などに定着していても症状は比較的軽微なことが多い。しかし、乳幼児、老人、免疫不全状態、術後患者等では術創感染症や敗血症、MRSA 腸炎などを引き起こしショック症状や多臓器不全を経て死亡に至る場合もあるなど、本菌の蔓延は特に医療現場において深刻に対処すべき菌であることから院内感染において最も注意

材 料 と 方 法
１．材料
２００
６年６月から９月に当院において臨床材料から分離された Staphylococcus aureus より薬剤感受性試
験で Oxacillin に対する最小発育阻止濃度４μg/ml 以上であり、PCR 法で mec A 遺伝子の増幅が認められた１１６株について検討を行なった。

― 35 ―

Polymerase Chain Reaction（PCR）法による Methicillin-resistant Staphylococcus aureus（MRSA）の疫学的解析法の有用性

２．DNA 抽出
テンプレート DNA の抽出にはミュラーヒントン
培地にて純粋培養された MRSA を１エーゼ（１mmのエーゼにて１ loopful）を滅菌蒸留水に浮遊させ、９５℃にて１０分間過熱した後、１０．
０００rpm にて１０分間遠心分離を行い上清を回収し、DNA 濃度を５０ng/μ!に調整した。

結果

RS-PCR 法では２００bp〜７００bp の間で確認されるバンドの本数とその位置から図２のようにⅠ型〜Ⅷ型の８種類に分類された。タイピングの結果は表１に示すようにⅠ型が全体の約４割を占め、次いでⅡ型が３割を占めていた。また、AP-PCR 法では図３に示すように２００bp〜１０００bp の間に認められたバンドの位置を用いて A 型〜Q 型の１７種類に分類された。表２に示すようにタイピングの結果から A 型が優位を示して おり、双方のタイピングの結果を組み合わせる事により表３に示すように１１６株の MRSA は５１種類にゲノムタイピングされた。

３．mec A の検出
Song 等が mec A 遺伝子の増幅に用いた sense 5'AGT TGT AGT TGT CGG GTT TG-3'と antisense 5'AGT GGA ACG AAG GTA TCA TC-3'のプライマーを合成し２０pM に調整した。Taq polymerase には Ampli Taq Gold（Applied Bio Systems）を使用し PCR反応液は２０μ!で調整した'。（d-DW：１４μ!, PCR
２mM dNTP：２μbuffer with １
５mM MgCl２：２μ!，!, Primer G１：０．
５μ!, L１：０．
５μ!, Taq polymerase
１U, DNA テンプレート：１μ!）PCR 反応には Program Temp Control System PC７０１（アステック）を使用し９４℃３分の hot start を行なった後、denerture
９４℃１分、annealing５２℃１分、extension７２℃２分を４０サイクル行った後、７２℃ １０分の last extensionを行なった。PCR 反応産物は１０％ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行い EtBr 染色を施 し た
後、UV イルミネーター下で６０４bp のバンドを確認できた株を陽性とした（図１）。

考４．MRSA のタイピング
RS-PCR 法
プライマーには Jensen 等#が細菌のタイピングに用いた G１：5'-GAA GTC GTA ACA AGC-3'と L 1：5'-CAA GGC ATC CAC CGT-3'を合成し各２０pM に調整した。PCR 反応液は２０μ!で調整し（d-DW：１４μ!, PCR buffer with １５mM MgCl２：２μ!，２mM
dNTP：２μ!, Primer G１：０．
５μ!, L１：０．
５μ!, Taqpolymerase １U, DNA テンプレート：１μ!）、PCR
サイクルコンディションは９４℃１０分の Hot start を行なった後、denature９４℃１分、annealing４１℃２分、extension７２℃２分を４０サイクル行った後、７２℃１０分の last extension を行なった。
AP-PCR 法
Mahenthialingam E 等$が AP-PCR 法 に よ り P.
aeruginosa のタイピングを行なった際に用いたプラ
イマー２７２：５'-AGG GGG CCA A-3'を合成し２０pMに調整した。RS-PCR 法と同様に PCR 反応液は２０μ!（d-DW：１４μ!, PCR buffer with １５mM MgCl２：２μ!，２mM dNTP：２μ!, Primer２７２：１μ!, Taq
polymerase１U, DNA テンプレート：１μ!）で調整した。尚、RS-PCR 法、AP-PCR 法ともに Taq polymerase は Ampli Taq Gold（Applied Bio Systems）を使用した。PCR のサイクルコンディションは９４℃１０分の hot start を行なった後、denerture９４℃１分、annealing４１℃２分、extension７２℃２分 を４０サ イ ク ル行った後、７２℃１０分の last extension を行なった。
反応終了後、RS-PCR および AP-PCR の増幅産物は１０％ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行いEtBr 染色を施した後、UV イルミネーター下で泳動像を Printgraph（ATTO）で撮影し、その泳動パターンよりタイピングを行なった。

― 36 ―察MRSA による院内感染の拡大を防ぐため感染源の迅速なる把握および、それに対する適切な対策が要求されており、そのためには感染源の特定と分離された菌との同一性に関する科学的データを迅速に収集することが必要不可欠である。一般に患者から分離された菌の分子生物学的手技を利用したタイピン グ 法 はPFGE 法がゴールドスタンダードであり、院内のアウトブレークの確認に利用されている。しかし、PFGE法は分離、解析能に優れているものの特殊な電気泳動装置が必要であり、解析のための全行程は煩雑なうえ５日から一週間程度の日数が必要とされ迅速性や簡便さに欠ける。PCR 法を応用した新しいゲノムタイピ
ング法として RS-PCR 法を利用した Warren N 等)による Clostridium のタイピングや D N kumari 等*により MRSA のゲノムタイピングが行われており、それぞれ PFGE 法と比較した結果 RS-PCR 法の解析能力はPFGE 法にはやや劣るもののスクリーニングの解析には極めて有用であると報告している。一方、AP-PCRの再現性は PFGE 法に比較すると不安定であると報告されており、特に PCR 反応液の Mg イオンの濃度やテンプレート DNA 量が泳動パターンに大きく影響することが知られている。Antonio O．等(による AP-PCR
法の最適条件の検討では、分解能や再現性を向上させるにはテンプレート DNA 量は５０ng/μ!に調整し、Mgイオン濃度を高くすることによりプライマーのプライミング効率を向上させたと報告しているが、我々は高濃度のテンプレート DNA 量は反対にプライマーのプライミング効率低下の原因になる可能性があることから PCR 反応液の組成と反応条件を検討した。その結果、テンプレート DNA 量の最終濃度が２．
５ng/μ!が適正と判断し、Mg イオン濃度は１．
５mM と通常の PCR反応に供される程度の濃度とし、アニーリングの温度を下げることによりプライミングの効率を向上させ充分タイピングが可能な安定した結果を得る事ができた。AP-PCR 法を用いて細菌のゲノムタイプを行った
向川等%は結核菌の集団感染事例において、迅速に原因菌株を型別できる方法であると報告しており、また中村等&はセラチア菌の IMP−１型メトロ−β ラクタマーゼ産生株の検出が可能であったと報告している。
さらに小林等"は MRSA の PFGE 法と AP-PCR 法によるタイピングの比較を行なった結果、PFGE 法では検出できない薬物感受性などの内在的な特異部位での違厚生連医誌

第１６巻

１号 ３５〜３９ ２００７

いに対し AP-PCR 法を用いた解析で検出が可能であったと報告しており、RS-PCR 法と AP-PCR 法の解析結果を合わせてゲノムタイピングを行った場合、解析能力の向上とともに薬剤感受性など生物学的特性をも網羅できるゲノムタイピングが行える可能性が考えられる。また、予め各遺伝子型の検出頻度が明らかであるならば院内感染が疑われた場合、本法を用いたゲノムタイピングのみにより同一発生源か否かを検討するということだけではなく、それぞれの遺伝子型の検出頻度から、その遺伝子型が偶然一致する確率や同一発生源である可能性を数値化し、更に客観的な報告が可能とされる。今回行った MRSA のタイピングではⅠ AおよびⅡ A 型が優位に検出されたが、これは本解析に用いたプライマーを使用した場合に検出 さ れ る
MRSA のスタンダードな型が反映されているものであると考えられ、さらに検討数を重ね当院における検出傾向の把握を含めデータの蓄積が必要であるものと考えられた。PFGE 法に比べ手技が簡易で特殊な機器の必要がない本法は、実用面において充分な菌株識別能力を有しており、病院検査室に導入しやすい解析法である。また、リアルタイムでの結果報告が可能である事から緊急な対策を講じなければならない必要のある院内感染において、本法により得られた疫学的データを解析することにより感染経路の詳細な解析が可能となり感染拡大の防止に貢献できると判断された。

参 考 文

献１．脇孝博．整形外科病棟入院患者および同医療従事者より分離されたメチシリン耐性黄色ブドウ球菌
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２．一山智．パルスフィールドゲル電気泳動法 Staphylococcus aureus．臨床と微生物 １
９９６；２
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３．Ichiyama S, Ohta M, Shimokata K, Kato N,Takeuchi J .Genomic DNA fingerprinting by pulsed-fildgel electrophoresis as an epidemiological marker forstudy of nosocomial infections caused by methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Clin Microbiol １９９１；
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７．Jensen M A, J A Webster, N Straus. Rapid identification of bacteria on the basis of PCR-amplified ribosomal DNA spacer polymorphisims. Appl. Environ.Microbiol．
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４：１
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０４０−１０４７．
１０．中村竜也、柴田尚宏、土井洋平、奥田和之、中村千代、平城 均、他．
１９９１年から２０００年の間に血液培養により分離された Serratia marcescens におけるIMP−１型 メ タ ロ−β−ラ ク タ マ−ゼ 産 生 株 の 解析．感染症誌 ２００２；７６：２
４６−２５３．
１
１．Song MD, Wachi M, Doi M, et al. Evolution of aninducible penicillin-target protein in methicllin-resistant
Staphylococcus aureus by gene fusion. FEBS Letter２２１ １９８７：１６７−１７１．
１２．Antonio O, Juan J C, Jose M U, et al. Application ofan optimized and highly discriminatory method basedon arbitrarily primed PCR for epidemiologic analysis ofmethicllin-resistant Staphylococcus aureus nosocomial
infections. Clin Microbiol １
９９８；３
６：１
１２８−１
１３４．
１
３．Warren N F, Peter P, Paul V, et al. Molecular epidemiology of endemic Clostridium difficile infection andthe significance of subtypes of the United Kingdom
epidemic strain（CPCR ribotype１）．Clin Microbiol
２００５；４
３：２
６８５−２６９６．
１４．D N Kumari, V Keer, P M Hawkey et al. Comparison and application of ribosome spacer DNA amplicon
polymorophisms and pulses-field gel electrophoresis fordifferentiation of methicillin-resistant Staphylococcus
aureus strains. Clin Microbiol １９９７；３
５：８
８１−８８５．

英 文 抄録Original article
The Epidemological analysis of the epidemiology of methicillin-resistant staphylococcus aureus（MRSA）by polymerase chain reaction（PCR）
Nagaoka central general hospital, Infection control teamof Nagaoka Central General Hospital, Department of Pathology ; Medical tecnologist １），Department of Cclinicallaboratory ; Medical tecnologist ２），Department of Respiratory diseases ; Physician ３）
Hidehiro Hasegawa １）， Yohko Kaneko ２）， TamikoAbe ２），Akira Iwashima ３）
Objective : methicillin-resistant staphylococcus aureus（MRSA）has been one of major causative agentsof nosocomal infections. When was prevalent ,therapid MRSA-genotyping guaranteed the confirmation of both its of infectious source and transmission route to prevent its expansion.
Study design : 116 specimens of MRSA separated fromour hospital were genotypically studied by ribosome spacer polymerase chain reaction（RS-PCR）
and Arbitrarily primed polymerase chain reaction（AP-PCR）．
Results : RS-PCR showed 8 different genotypes. AP-PCR― 37 ―Polymerase Chain Reaction（PCR）
法による Methicillin-resistant Staphylococcus aureus（MRSA）の疫学的解析法の有用性

defined 17 different DNA banding pattern. The
combination of RS-PCR and AP-PCR patterns define 51 clusters.
Conclusion : Genotypes of MRSA strains were determined by RS-PCR and AP-PCR to analyze the in-fection source and transmission route of infection.
Key words : methicillin-resistant Staphylococcus aureus（MRSA），genotype, ribosome spacer PCR（RS-PCR），Arbitrarily primed PCR（AP-PCR）

表 1 RS-PCR 法による MRSA のタイピング結果と検出頻度型

ⅠⅡⅢⅣⅤⅥ

ⅦⅨ

株数

４５３５４６１７３３３

検出頻度（％）

３８．
７％

３０．
２％

３．
５％

５．
２％

１４．
６％

２．
６％

２．
６％

２．
６％

表 2 AP-PCR 法による MRSA のタイピング結果と検出頻度型

A

B

CDEFGHI

株数

３８１３４３５５８１１３

検出頻度（％）

３２．
８％

１１．
２％

３．
５％

２．
５％

４．
３％

４．
３％

６．
９％

９．
５％

２．
５％型

JKL

M

NOPQｎ株数

１１１２２１１１７１１４

検出頻度（％）

０．
９％

９．
５％

１．
７％

１．
７％

０．
９％

０．
９％

０．
９％

６．
０％

１００．
０％

Ⅵ型

Ⅶ型

Ⅷ型

表 3 RS-PCR 法と AP-PCR 法による MRSA のタイピング結果
Ⅰ型

Ⅱ型

Ⅲ型

Ⅳ型

Ⅴ型

型数型数型数型数型数型数型数型数型数型数型数

A

１９I

１A

１１H

１B

１A

１A

３N

C

１A

２A

２B

４J

１B

４I

１C

１B

２B

１G

１B

１I

１D

２K

１C

１K

３E

１F１C

１O

１E

１L

１D１L

１F

１G１E

１F

２M

１E２M

１K

１G３G２Q

１F

１P

１H

１H

９G

１Q

６K６小計４５小計３５小計４小計６― 38 ―

小計１７

１

小計３

小計３小計３

厚生連医誌

第１６巻

１号 ３５〜３
９ ２００７

図１

PCR 法による mec A 遺伝子の検出

図２RS-PCR 法によりタイピングされた MRSA の泳動パターン

図３AP-PCR 法によりタイピングされた MRSA の泳動パターン― 39 ―