アッセイプロトコル
ATP 測定創薬研究用ヒト腎細胞

3D-RPTEC®

Ver. 0.04

はじめにこのたびは、”3D-RPTEC”をお買い上げいただきありがとうございます。本稿は 3D-RPTECを用いた ATP 測定のプロトコル例を示したものになります。3D-RPTEC を用いた評価のご参考になれば幸いです。

目次
1.

使用機器・試薬類........................................................................................................ - 3 -2.

実施方法 ...................................................................................................................... - 3 2-1. 事前準備 .................................................................................................................. - 3 2-2. 実施プロトコル ....................................................................................................... - 4 -3.

腎毒性評価の試験例 .................................................................................................... - 6 -4.

その他 .......................................................................................................................... - 6 -5.

参考文献 ...................................................................................................................... - 6 -6.

問い合わせ先 ............................................................................................................... - 7 --2-

1. 使用機器・試薬類
以下に ATP 測定に必要な機器や試薬の一例を示しております。各施設でのご使用に合わせて適宜改変していただければと思います。
測定機器
・蛍光発光測定用マイクロプレートリーダー
測定用機材（例）
製品名

製造

カタログ番号

規格/容量

Nunc™ F96 MicroWell™ Black andThermo Scientific23610596well plate

White Polystyrene PlateWhite（白色プレート）

50 個/箱またはCorning® 96 ウェル 白 透明ボト

Corning

3610

96well plate
48 個/箱ム 平底 細胞培養表面処理 ポリ
スチレン マイクロプレート（白色クリアボトムプレート）
セルセーバーチップラック入

QSP

FG-FB205R（広口チップ）

200 µL / 96 本×10 ラック

試薬類
製品名

製造

カタログ番号

規格/容量

CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay

Promega

G9681

10 mL

rATP

Promega

P1132

10 mM, 0․5 mL

2. 実施方法
2-1. 事前準備
1. Celltiter-Glo 3D Reagent を 4℃冷蔵庫で事前に一晩解凍する。
2. アッセイに必要な分の Celltiter-Glo 3D Reagent を分注しておく。
（1 ウェル 100 µL × ウェル数＋α）
3. Celltiter-Glo 3D Reagent は使用前に室温(22 – 25℃)に戻しておく。
（目安：30 分程度）

-3-

（検量線から ATP 量を算出する場合)
4. ATP 標準液（rATP）を段階希釈する。下記に段階希釈の例を示す。
調製は 0.6 mL チューブを使用する。調製した各 rATP 溶液は、10 nmol/L～1000 nmol/Lの溶液を 100 µL ずつ白色プレートに添加する。

図1

rATP 標準液の調製例

2-2. 実施プロトコル
培養プレートから 3D-RPTEC を広口チップで培地とともに 100 µL 吸引し、下図のように白色プレートまたは白色クリアボトムプレートに移す（細胞の回収漏れが懸念される場合は白色クリアボトムプレートを用いて細胞回収の確認が可能）。回収漏れを防ぐため、シングルピペットの使用を推奨する。

図 2 3D-RPTEC の移動方法
1. ブランクとして 3D-RPTEC が入っているプレートとは別の白色プレート※に培地 100 µLを添加する。
2. 検量線から ATP 量を算出する場合は、2-1.で調製した ATP 標準液（rATP）を 3D-RPTECが入っているプレートとは別の白色プレート※に 100 µL ずつ添加する。下図に配置例を示す。
-4-

※ 検量線の高濃度域は発光値が高いため，サンプルとは別プレートを推奨します。ブランクとともに、別プレートにて測定を行ってください。
※ 被験物質サンプルは 1 群 n=6 以上とすることで精度の良いデータを得ることができます。下図の例は n=6 で示しています。
下図に薬物評価する際の配置例を示します。レイアウトは実験条件に合わせて適宜変更してください。
Plate 1：検量線およびブランク用プレート、Plate 2：被験物質測定用プレート

Plate 1：検量線、ブランク用プレート

Plate 2：被験物質測定用プレート-5-3. 白色プレートのウェル内容量と等量（100 µL）の Celltiter-Glo 3D Reagent を各ウェルに添加し、軽く混和する。
4. 室温(22 – 25℃)・遮光で 30 分間静置する。
5. 蛍光発光測定用マイクロプレートリーダーで発光測定を行う（積算時間：1000 msec）。

3. 腎毒性評価の試験例
以下に 3D-RPTECⓇの ATP 測定による腎毒性評価の試験例を示す。詳細は 5. 参考文献の文献 3（Arakawa H et. al）を参照。
薬物曝露濃度：有効血中濃度の 100 倍濃度を最高用量とし、公比約 3 で用量を設定
曝露日数：7 日間
測定対象：CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay による 1well あたりの発光値
評価対象：７日間曝露後のスフェロイド ATP 量の減少（Control 群との比較）

4. その他
3D-RPTECⓇを用いた腎毒性評価は、細胞数の観点から MTT 法や WST 法のような培地の吸光度による毒性評価では感度が低い傾向がある。一方、CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assayのような「発光測定」による毒性評価の方が高感度に薬物の毒性を検出することができる。
また、培地中の LDH（乳酸脱水素酵素）を LDH-Glo Cytotoxicity Assay を用いて測定することも可能である。なお、CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay を用いた細胞内 ATP 量測定と、
LDH-Glo Cytotoxicity Assay による培地中の LDH の測定は併用して評価することができる。

5. 参考文献
1. CellTiter-Glo® 3D Cell Viability Assay Protocol
2. Xia, M. et al. (2008) Compound cytotoxicity profiling using quantitative high-throughput
screening. Environ. Health Perspect. 116, 284–91.
3. Arakawa, H. et al., Three-dimensional Culture of Human Proximal Tubular Epithelial Cells for
an in vitro Evaluation of Drug-induced Kidney Injury. Journal of Pharmaceutical Sciences.
August 15, 2024 [Epub ahead of print]-6-6. 問い合わせ先
日機装株式会社
創薬研究用ヒト腎細胞お問い合わせアドレス
Mail: 3D-RPTEC@nikkiso.co.jp
HP: https://www.nikkiso.co.jp/products/industrial/3drptec/-7-