研 究 ノート

タカアミラーゼＡ高生産麹菌の形質転換系の開発
北 本 則 行 ＊１ 、松 井 淳 子 ＊２ 、安 田 庄 子 ＊２

Development of the Transformation System for a High-Taka-amylase
A-producing Aspergillus oryzae
Noriyuki KITAMOTO, Junko MATSUI and Shoko YASUDA
Food Research Center, AITEC* 1 * 2
醤 油 麹 菌 Aspergillus oryzae KBN616 株 の 約 20 倍 の ア ミ ラ ー ゼ 活 性 を 有 す る 麹 菌 A. oryzae KBN6217
株を取得することができた。本菌は２個のアミラーゼ遺伝子を保有し、その遺伝子構造は既知の麹菌アミラ ー ゼ 遺 伝 子 と 一 致 し て い た 。 本 菌 の 5-FOA 耐 性 株 の 中 よ り ウ ラ シ ル 要 求 性 を 示 す pyrG ー 株 を 分 離 す る
こ と が で き た 。得 ら れ た pyrG ー 株 は 約 50 形 質 転 換 体 /µ g プ ラ ス ミ ド DNA の 効 率 で pyrG 遺 伝 子 に よ り 形質転換することができた。また、ピリチアミン耐性遺伝子を選択マーカーとしても形質転換することができた。

１．はじめに

2.4 A. oryzae の染色体 DNA 調製方法

古くから醤油や酒類などの醸造食品の製造に使用され染色体 DNA は Raeder らの方法３）にしたがって、凍結乾ている麹菌(Aspergillus oryzae)は、極めて安全性が高い

燥後粉砕した菌体より調製した。

うえに菌体外に多量の酵素タンパク質を分泌生産する能2.5 A. oryzae の形質転換方法

力を備えていることなどから、異種有用タンパク質生産

形質転換用培地で培養して得られた A. oryzae の菌体をの微生物宿主として期待されている。非常に優れたタンNovozyme234 でプロトプラスト化した後、PEG 存在下でプラパク質分泌能力を持つ麹菌と遺伝子の転写量を増加させスミド DNA を取り込ませて形質転換を行った。

る強力な麹菌遺伝子プロモーターとを組み合わせて用い

2.6 サザンブロット解析

れば、異種有用タンパク質の効率的な分泌生産が可能と種々の制限酵素で消化した A. oryzae の染色体 DNAなる。そこで、タカアミラーゼ A 高生産麹菌を宿主とすを 0.8％アガロースゲル電気泳動に供した後、AlkPhos

るエコザイム効率的生産システムの確立を最終的に目指

Direct System (Amersham Biosciences)を用いてハイして、形質転換系の開発を行った。

ブリダイゼーション及びシグナルの検出を行った。

２．実験方法

３．実験結果及び考察

2.1 使用菌株

3.1 タカアミラーゼＡ高生産麹菌の検索

A. oryzae KBN616 株 、 A. oryzae KBN930 株 、 A.

実験方法に記述した７株の麹菌の液体培養時のアミラ

oryzae KBN1010 株、A. oryzae KBN1015 株、A. oryzaeーゼ活性を測定した結果、A. oryzae KBN6217 株が A.

KBN6217 株、A. oryzae KBN6319 株及び A. oryzae

oryzae KBN616 株の約 20 倍のアミラーゼ活性を有してJCM2239 株の７株の麹菌をアミラーゼ高生産株の選択に用いることが判った（表１）。これら７株の麹菌の培養液いた。一般的な遺伝子操作には E. coli DH5α株を用いた。

中のタンパク質を SDS-PAGE で解析したところ、タカ

2.2 アミラーゼ活性測定方法

アミラーゼＡ及びグルコアミラーゼと考えられるタンパ

アミラーゼ活性は、Saito の方法１）にしたがって可溶性デンプンを基質に用いて測定した。

ク質が認められた。また、そのタンパク質量は、アミラーゼ活性に比例して増加していた（図１）。

2.3 SDS‑ポリアクリルアミドゲル電気泳（SDS‑PAGE）

麹菌は菌株により異なるが、２〜３種類のタカアミラに し た が い 12.5%ゲ ル 濃 度 でーゼＡ遺伝子を保有しており、小さいながら一種のファSDS-PAGE を行った。電気泳動後、タンパク質を CBB

ミリーを形成している４）。サザンブロット解析の結果及染色によって検出した。

び PCR 反応によるタカアミラーゼＡ遺伝子の増幅のLaemmli の 方 法

２）

結果から A.oryzae KBN6217 株には taaG1 遺伝子及び＊1 食品工業技術センター

応用技術室

＊

2 食品工業技術センター

加工技術室

から A. oryzae KBN6217-56 株は目的とする pyrG 遺伝

表 1 A. oryzae のアミラーゼ活性の比較
Amylase Activity (U/ml)

子破壊株ではなかったが、pyrG 遺伝子の一部が欠失しKBN621726,800 (21.1)ていると考えられた。A. oryzae KBN6217-56 株を A.

KBN6319

11,999 (8.7)

oryzae KBN616 株 pyrG 遺伝子で形質転換したところ、

KBN10109,380 (7.4)

約 50 形質転換体/µg プラスミド DNA の効率で形質転KBN9304,940 (3.9)

換できた。また、A. oryzae KBN6217-56 株は他の麹菌

KBN1015

5,050 (4.0)と同レベルのピリチアミン濃度（0.1µg/ml）で生育が抑JCM22392,750 (2.2)

制され、ピリチアミン耐性遺伝子（ptrA 遺伝子）を選択

KBN616

1,270 (1.0)

マーカーとしても形質転換することができた。

Strain-Uracil

KBN616

JCM2239

KBN1015

KBN930

KBN1010

KBN6319

KBN6217

MarkerSP 培地（2%可溶性デンプン）で 30℃、4 日間振盪培養+Uracil6217(kDa)
97.466.3
TAA
42.46217-56

30.020.1

図２
図1

A. oryzae KBN6217 株からの pyrGー株の取得

培養上清の SDS‑PAGE 解析

４．結びtaaG3 遺伝子の２個のタカアミラーゼＡ遺伝子が存在し醤油麹菌、A. oryzae KBN616 株の約 20 倍のアミラーていた（データ省略）。この２個のタカアミラーゼＡ遺伝ゼ活性を持つ A. oryzae KBN6217 株を取得し、その形子のプロモーター領域の塩基配列を比較した結果、他の質転換に成功した。本菌を用いた異種有用タンパク質の麹菌のタカアミラーゼＡ遺伝子プロモーターと同様に効率的生産に向けて、種々の変異株取得や各種発現ベク

taaG1 遺伝子プロモーター及び taaG3 遺伝子プロモーターの構築などを行っていく予定である。

ターの塩基配列は、転写促進因子(HAP complex)の結合

文献

配列（CCAAT 配列）中の１塩基を除いて完全に一致し1)Saito, N.: Arch. Biochem. Biophys., 155, 290(1973)ていた。一方、タカアミラーゼＡ遺伝子の誘導発現に関

2)Laemmli, U. K.: Nature, 227, 680(1970)

わる因子（AmyR）をコードする amyR 遺伝子の塩基配3)Raeder, U., and P. Broda: Lett. Appl. Microb., 1,

列を解析した結果、A. oryzae KBN6217 株の amyR 遺伝子の塩基配列は既知の麹菌の amyR 遺伝子５，６）とは３か所（-227、577 及び 1149）で塩基の違いが確認され、１か所のアミノ酸置換（Glu-193→Lys-193）が認められ17(1985)4)Tsukagoshi, N., M. Furukawa, H. Nagaba, N. Kirita,
A. Tsuboi, and S. Udaka: Gene, 84, 319(1989)
5)Petersen, K. L., J. Lehmbeck, and T. Christensen:Mol. Gen. Genet., 262, 668(1999)

た。
3.2 A. oryzae KBN6217 株の形質転換系の開発

6)Gomi, K., T. Akeno, T. Minetoki, K. Ozeki, C. Kumagai, N.

pyrGー株は 5-FOA 耐性株として positive selection によOkazaki, and Y. Iimura: Biosci. Biotechnol. Biochem., 64,

り容易に選択・分離できる 。A. oryzae KBN6217 株の816(2000)

７）

優れた性質へのダメージを考慮して遺伝子破壊による取得を試みた。pyrG 遺伝子破壊用ベクター、pdprG100
で形質転換し再生してきたコロニーより 5-FOA 耐性を示すウラシル要求株、A. oryzae KBN6217-56 株を分離することができた（図２）。サザンブロット解析の結果

7)Boeke, J. D., F. LaCroute, and G.R. Fink: Mol. Gen.

Genet., 197, 345(1984)