エンテロウイルス71に関する最近の話題
第10回ウイルス学夏の学校
第回ウ学夏 学校
みちのくウイルス塾
ウ塾
平成23年7月17日（独）国立病院機構 仙台医療センター
財団法人東京都医学総合研究所
ウイル 感染プ ジ クト
ウイルス感染プロジェクト
小池智エンテロウイルス71とは？

ピコルナウイルス科
エンテロウイルス属
Species A

動物に感染するウイルス

ピコルナウイルス pico（小さな）RNAウイルス

近縁のウイルス
ライノウイルス
ポリオウイルス

口蹄疫ウイルス
A型肝炎ウイルスエンテロウイルスの遺伝子構造、粒子構造
ンテ ウイル
遺伝子構造、粒子構造
4 capsid proteins

7 non‐capsid proteins
3’UTR

3B

5’UTR
VPg

VP2
VP4

VP3

VP1

2A

2C
2B

3C
3A

3D

Poly A

Species A enteroviruses

EV71
Species D
Species B
Species C

EV71が引き起こす病気
HAND-FOOT-MOUTHDISEASE 手足口病Coxsackie A 16 virus,
E tEnterovirus
i71,
71 andd othersth
スライド：岩崎琢也博士

エンテロウイルス71感染
経口感染

消化管

糞便

ウイルス血症手足口病

稀に中枢神経系へ
無菌性髄膜炎急性脳炎
急性弛緩性マヒこれまでのエンテロウイルス71流行
地域

発生年

米国
日本(愛媛)
日本
日本
ブルガリア
ハンガリー
豪州
香港
マレーシア
マレーシア
マレ
シア
日本(大阪)
日本
シンガポール
シンガポ
ル
台湾
香港
()
豪州(パース)台湾

1969-1973
1969
1973
1973
1973
1978
1975
1978
1986
1986
1997
1997
1997
1997
1997-1998
1997
1998
1998
1999
1999
2000

症例数

死亡数

2081

10705
1550
34
5?
?
344
45
0029
12339407
2
14078
1041

臨床症状
髄膜炎、脳炎
髄膜炎
脳炎
髄膜炎、脳炎、手足口病
手足口病
手足口病
脳炎、ポリオ様麻痺脳炎、ポリオ様麻痺脳炎
麻痺脳炎、手足口病脳炎、手足口病脳炎、手足口病
手足口病
手足口病脳炎、手足口病
脳炎、麻痺等
脳炎、手足口病
スライド：岩崎琢也博士

EV71の主な流行とその死者数
1975年 ブルガリア 44名
1978年 ハンガリー 47名
1997年 マレーシア 34名
78名
1998年 台湾
126名
2008年 中国
353名
2009年 中国
876名
2010年 中国

問題点の解決案• 危険なウイルスの流行をどのように調べるのか？
EV71の簡単で特異性の高い分離方法を作製する• ウイルスは近年神経毒力がましたのか？そのメカニズムは？
ウイルスの神経毒力を測定できる動物モデルを作製する
デ• ワクチンや抗ウイルス薬の開発は？
適切な動物モデルを用いて有効性や安全性などを検定する

ポリオウイルスの例•ヒトポリオウイルスレセプター（PVR）を同定し、PVRを発現するマウス細胞を作製する
ポリオウイルスを特異的に分離することが可能•PVRを発現するトランスジェニックマウスを作製する
マウスにポリオウイルスを感染させてウイルスの毒力を判定することが可能

ウイルスレセプターの役割
複製の開始
吸着

侵入脱殻

1. ウイルスレセプターは感染の初期過程で、細胞表面への吸着、細胞内への侵入、ウイルスゲノムの細胞質への放ゲ出（脱殻）などに関与する。
1. ウイルス感染の宿主域や標的細胞の選択に重要な役割を果たす。

ピコルナウイルスのレセプター?
ポリオ

コクサッキーB

ライノ(major group)

A型肝炎

コクサッキ−A
コクサッキ−B
エコーなど

口蹄疫

エコー

EV71

ライノ
(minor group)

スライド提供：J Bergelson博士

培養細胞でのＥＶ７１感受性
EV71

RD cells(human)

L cells(mouse)

培養細胞でのＥＶ７１感受性

EV71
infection

L cells(mouse)

EV71 RNAtransfection

L cells(mouse)EV71 受容体の同定
ヒトのDNAを一部分持っているマウス細胞の集団
EV71感受性細胞株

マウス
L929 細胞

この中のヒト由来DNAを探す
SCARB2Ltr051
ヒトRD細胞染色体DNAをトランスフェクション
クシ？

Ltr24670,000 形質転換細胞群のうち２つがEV71感受性

形質転換細胞株のEV71感染EV71感受性細胞の出現頻度
受性細現頻度Exp. No.

No of susceptible cells／No. of totaltransformants

11 /10,000/10 000

20/20,000

3

1/20,000

4020 000
020,000

total

2/70,000

EV71感受性細胞

EV-GFP感染24時間後

マイクロアレイによる受容体遺伝子の検索
マイクロアレイに競合的にハイブリダイズさせる

Ltr051 cells
Ltr246 cellsmRNA

Cy3 or Cy5で標識する

L cells
候補遺伝子候補遺伝子を発現
PCRで本当に形質転換細胞 遺伝細胞に遺伝子が入っていたか
チ クする
チェックする

L cells
EV71-GFPを感染させてみる

SCARB2 の発現で L929 cell はEV71
感受性を獲得する
Empt
Empty

SCARB2Transfection

L929 cells

L929 cells

Infect EV71-GFPSCARB2(Scavenger receptor class B, member 2)
 SCARB2 は LIMPII, CD36L2，LPG85とも呼ばれているも ばれ SCARB2 はSCARB1，CD36とともにCD36 遺伝子ファミ
リ に属するリー SCARB2 膜貫通領域を２カ所持つ
 SCARB2 は主にendosome，lysosomeに存在は主にendosome lysosomeに存在

SCARB2NC

How many EV71 receptors?

Receptors identified for hand,
hand foot and mouth virus
Patel & Bergelson (2009) Nature Medicine 15:728-729

ウイルスの分離に用いる細胞

RD細胞
Vero細胞1. 検体をinoculateする（ヒトを宿主とする様々なウイルスも増殖可能。まずはウイルスを全部増やす。）
2 増えてきたウイルスを同定する（抗血清への反応性やPCR2.の増殖、塩基配列などを調べる）

ポリオウイルスの分離に用いる細胞

L20B細胞 マウス由来L細胞に、ポリオウイルスの感染受容体PVR
CD155を発現させた細胞。
 ポリオウイルスは感染するが他のヒトのウイルスは大抵感染できない。
きないL‐SCARB2細胞の樹立
SCARB2Transfection

L929細胞Puromycinで選択後、Pi で選択後クローニングL SCARB2細胞
L-SCARB2細胞

Virus titer (LV
Log10 TCID
D50/255ul)

L-SCARB2 細胞でのEV71の増殖
7RD6L-SCARB2543

L929210024

Hour Post-infection48

仙台ウイルスセンター、山形県衛生研究所、愛知県衛生研究所、島根県保健環境科学研究所から臨床分離株の分与を受けてSpecies A enterovirusをRD細胞、L細胞、LSCARB2細胞に感染させた。
SCARB2細胞に感染させたRD細胞

L細胞 L-SCARB2細胞

レセプター

○○○？

○×○hSCARB2○××

NothSCARB2×××？

テストした株

CVA210株
CVA322株
株
CVA411株
CVA510株
CVA67株
CVA817株
CVA10 10株
株
CVA129株
CVA14 17株
CVA16 36株
EV71162株

Species A enterovirusの一部はヒトSCARB2をレセ部はヒトSCARB2をレセプターとしている

××××××××（EV71）

L-SCARB2細胞
L
SCARB2細胞
1. L-SCARB2細胞を用いれば、EV71を分離できる細胞をればを分離 きる可能性がある。
2. ただし特異性は完全ではなく、CVA16, CVA14,CVA7も同時に分離される。これらのウイルスはも同時に分離される れら ウイはEV71と同じレセプターを使うウイルスである。
3. これらのウイルスがEV71と同様に中枢神経系合併症を引き起 す とがな併症を引き起こすことがないのはなぜか？
はなぜか

ヒトSCARB2の発現（kDa）

脳心臓

小腸 腎臓

肝臓

肺骨格筋

胃116
97
66

ponscerebellum

脾臓

卵巣

精巣

PVR t マウスの作製
PVR-tg

ヒトPVR遺伝子の導入

PV感染PVR-tgマウス
PVRtgマウス
PV接種後後肢マヒを示したPVR-tg マウス

脊髄のウイルス抗原

SCARB2 マウスの作製

ヒトSCARB2遺伝子の導入

EV71感染?

今後今後できる可能性のあること
能性 あ
1. L−SCARB2細胞を用いたウイルス分離システムの確立
2. SCARB2マウスを用いたウイルス毒力検定系の確立

EV71を迅速に分離し、マウスによってその神経毒力を検定する
ウイルスの強毒化のメカニズムを明らかにする
強毒化したウイルスの流行に対して迅速かつ的確な情報を提供する
ウイルスの進化、新たな強毒株の出現を予測する
ワクチンや抗ウイルス薬の開発に役立てる

まとめ
1. EV71は手足口病の原因となるウイルスであるが、稀に重病
あ が 稀篤な中枢神経系合併症を起こすので注意が必要である。
2. このウイルスのレセプターの一つSCARB2を同定した。
3. ヒトSCARB2を発現するマウス細胞株を作製して、ウイルス分離用培養細胞系としての有効性をテストした。
4. ヒトSCARB2を発現するトランスジェニックマウスを作製して ウイルスの神経毒力を測定するマウス系としての有て、ウイルスの神経毒力を測定するマウス系としての有効性とテストした。