仙台みちのくウイルス塾

節足動物が生み出す次世代の抗菌物質～微生物研究室でのマダニとの出会い～

久光製薬株式会社
筑波研究所 研究員
三好就英
1

Contents
1. 自己紹介

2. 細菌の世界

3. 節足動物の自然免疫とその応用 -修論で行っていた研究-4. マダニ抗菌ペプチドの抗菌メカニズムを探る初期研究

現在の研究

2

1. 自己紹介3自己紹介○東北の福島県郡山市出身<郡山市の有名なもの>
・ビッグアイ
・猪苗代湖
・柏屋の「薄皮饅頭」
・安積疎水○部活→サッカー（中学、高校、大学、そして現在も）○趣味→映画鑑賞

4東北大学農学部入学と卒業後の進路○大学では農学部に所属→ 動物微生物研究室○修士で卒業し、現在は久光製薬の研究員として勤務

筑波研究所

久光の商品“サロンパス”

5動物微生物研究室○微生物に興味を持ち、動物微生物研究室へ
磯貝恵美子教授のもと研究に取り組む

様々な細菌に関する研究を行っている
１． 乳酸菌群の遺伝、代謝特性
２． 工業微生物の代謝工学と有用代謝産物
３． 微生物における代謝産物の細胞外排出機構の解析
４． 高度抗生剤耐性菌のゲノム解析と新規標的分子の探索
５． 自然免疫の一翼を担う抗菌ペプチドの構造と活性－抗菌から抗癌まで
６． 野生動物をモニタリングとした感染疫学
７． アフリカにおける畜産および人の健康に影響を及ぼす病原細菌の調査と制御

なぜかマダニに興味をもつ(これが始まりだった…)

6

研究室時代の経験○マダニの研究の成果を様々な場所で発表
・SADI周氷河大会（稚内）→マダニのプロフェッショナルが集まる会

・日本細菌学会東北支部会（仙台）→細菌やウイルスに関する発表“マダニ由来抗菌ペプチドpersulcatusinの構造と活性”→第4回北斗医学賞受賞!!

西村先生との出会い＜その他＞
・国際学会（タイ、バンコク）
・原著論文2本72. 細菌の世界

8

細菌
細菌とは…

単細胞の微生物で、核膜のない原核生物の一群“もやしもん”より

黄色ブドウ球菌

大腸菌(O-157)

ボツリヌス菌

細菌には典型的に、球形、棒状、らせんの3つの基本的な形がある球菌e.g.
黄色ブドウ球菌

桿菌
e.g.
大腸菌

らせん菌(スピロヘータ)

e.g.

ライム病ボレリア

https://ja.wikipedia.org

9

細菌
細菌とは…

単細胞の微生物で、核膜のない原核生物の一群

細胞壁の性質の違いによる分類(グラム染色により識別)
グラム陽性菌

細胞壁が厚く、ほとんどタンパク質が含まれない

e.g.
黄色ブドウ球菌

細胞壁の構造細胞壁
細胞膜
http://www.eiken.pref.kanagawa.jp/002_kensa/02_microbe/detailed.htm

グラム陰性菌細胞壁が薄く、タンパク質や脂質が多い

e.g.
大腸菌

細胞壁の構造細胞壁(外膜含む)

http://www.matsunami.co.jp/senmonsinryou/jinhinyou.html

細胞膜

10

共生細菌
“共生細菌”をご存知でしょうか
代表例：シロアリ

栄養分を与える
共生細菌

シロアリ

木質消化を助ける

ちなみに…
私達ヒトも腸内に共生細菌がいます!
増殖に必要な栄養素、一定の温度環境

ヒト

腸内細菌
栄養素の分解や合成、免疫の活性化、感染症予防11

抗生物質と薬剤耐性菌
抗生物質
抗生物質はそもそも微生物が作り出す“対微生物兵器”
・世界初の抗生物質はペニシリン
アオカビ・その後様々な抗生物質が発見
http://botit.botany.wisc.edu/toms_fungi/nov2003.html

e.g.
バンコマイシン
(土中の放射菌によって産生)

細胞壁合成阻害効果で溶菌

薬剤耐性化
遺伝学的変化によって抗生物質の耐性を獲得

この世界は抗生物質と細菌の耐性化のいたちごっこ!!
123. 節足動物の自然免疫とその応用-修論で行っていた研究「マダニ抗菌ペプチドpersulcatusinの機能的構造と抗菌活性」

関連論文：

Miyoshi N, Saito T, Ohmura T, Kuroda K, Suita K, Ihara K, Isogai E:
Functinal structure and antimicrobial activity of persulcatusin, an
antimicrobial peptide from the hard tick Ixodes persulcatus.
Prasite&Vecters, 2016, 9:85.
13

節足動物の免疫システム
ヒト・自然免疫・獲得免疫

e.g.

節足動物

カブトムシ

チョウ

トンボ

アリ

ゾウムシ

マダニ

・自然免疫のみ

マクロファージ(自然免疫)e.g.
抗菌ペプチドT細胞、B細胞(獲得免疫)

血リンパ14

抗菌ペプチド
抗菌ペプチドとは外敵から身を守るために進化の過程で保存された、植物から無脊椎動物、脊椎動物まで多細胞生物がもつ自然免疫の主要な作用因子

現在、様々な機能が発見されている

抗菌

抗癌

免疫調節
抗菌ペプチド

血管新生

創傷治癒
15

マダニと抗菌ペプチド
強力な自然免疫をもつ節足動物の抗菌ペプチドの研究は注目されている
e.g. カイコガ（Steiner et al., 1981）、カブトムシ（Miyanoshita et al.,1996）

我々はマダニの抗菌ペプチドに着目した!!

マダニ
・全動物種の85%以上を占める
・重症熱性血小板
節足動物の一種減少症候群（SFTS）

イエダニとは異なり山や草原に生息・ライム病などで有名

・吸血鬼

シュルツェマダニ
人や動物に対して深刻な病気を引き起こす病原細菌をもつマダニ種
ex.ライム病ボレリア、ダニ媒介性脳炎ウイルス16

マダニと抗菌ペプチド
やや脱線…

＜マダニの取り方＞
木の棒に白い布をつけて旗を作り、下のような場所で旗を振る

17

マダニと抗菌ペプチド
やや脱線…

＜マダニの取り方＞
木の棒に白い布をつけて旗を作り、下のような場所で旗を振る

先ほどのシュルツェマダニが。

18

マダニと抗菌ペプチド
やや脱線…

＜マダニに咬まれたら・・・＞ マダニが皮膚に吸着しているのを発見した場合は、できるだけ医療機関（皮膚科） で除去してもらう。無理に取ろうとして虫体を押しつぶした場合、 マダニの体液が人の体内に入り感染の危険性が増加する。 また、マダニの一部が皮膚内に残ると、化膿することがある。
 マダニに刺された場合は、その後の体調に注意。 SFTSの潜伏期間は6日～2週間程度だといわれているので、2週間後くらいまでに発熱等の症状があらわれた場合は、医療機関を受診した方がよい。

19

マダニと抗菌ペプチド
強力な自然免疫をもつ節足動物の抗菌ペプチドの研究は注目されている
e.g. カイコガ（Steiner et al., 1981）、カブトムシ（Miyanoshita et al.,1996）

我々はマダニの抗菌ペプチドに着目した!!

マダニ
・全動物種の85%以上を占める節足動物の一種

・吸血鬼

免疫機構は自然免疫のみ

抗菌ペプチド

口下片から様々な生理的効果のある因子を含む
シュルツェマダニ
唾液を宿主体内に注入
人や動物に対して深刻な病気を引き起こす病原細菌をもつマダニ種
ex.

吸血の際に様々な ライム病ボレリア、ダニ媒介性脳炎ウイルス
体内に共生細菌病原体を伝播させるが存在
ベクター
20

マダニと抗菌ペプチド
強力な自然免疫をもつ節足動物の抗菌ペプチドの研究は注目されている
e.g. カイコガ（Steiner et al., 1981）、カブトムシ（Miyanoshita et al.,1996）

我々はマダニの抗菌ペプチドに着目した!!

マダニ
・全動物種の85%以上を占める節足動物の一種・吸血鬼

免疫機構は自然免疫のみ

抗菌ペプチド

口下片から様々な生理的効果のある因子を含む
シュルツェマダニ
唾液を宿主体内に注入
人や動物に対して深刻な病気を引き起こす病原細菌をもつマダニ種
ex.

吸血の際に様々な ライム病ボレリア、ダニ媒介性脳炎ウイルス
体内に共生細菌病原体を伝播させるが存在
ベクター
21

マダニと抗菌ペプチド
強力な自然免疫をもつ節足動物の抗菌ペプチドの研究は注目されている
e.g. カイコガ（Steiner et al., 1981）、カブトムシ（Miyanoshita et al.,1996）

我々はマダニの抗菌ペプチドに着目した!!

マダニ
・全動物種の85%以上を占める節足動物の一種

・吸血鬼

免疫機構は自然免疫のみ

抗菌ペプチド

口下片から様々な生理的効果のある因子を含む
唾液を宿主体内に注入
吸血の際に様々な病原体を伝播させる
ベクター

体内に共生細菌が存在22

薬剤耐性菌の蔓延と対策
薬剤耐性化の問題
1980年代後半～

臨床的に重要な菌種の耐性化およびその蔓延が急速に進行
e.g. Staphylococcus aureus （黄色ブドウ球菌）

Enterococcus faecalis （腸球菌）

耐性化
近年では高い病原性を持つ市中感染型が出現!!
抗生物質が効かなくなる

21世紀の感染症学・化学療法学において耐性菌との戦いは最も重要な研究テーマの１つ

新規抗菌剤の開発が急務となっている中
理想的な候補として抗菌ペプチドが期待されている

理由

・ 短時間で殺菌する・ 細菌が耐性化しにくい23

研究の目的シュルツェマダニの抗菌ペプチドpersulcatusin(以下IPとする)を主とした研究!!

すでに報告されていること*1. アミノ酸配列

GFGCPFNQGACHRHCRSIGRRGGYCAGLFKQTCTCYSR*2. マダニ中腸で発現＆吸血時上昇*3. S. aureusなどのグラム陽性菌に対して抗菌活性を示す*1, 2 Saito et al., 2009 3 Saito et al., 2009 Isogai et al., 2011

特にシカにおけるマダニ刺傷部位＆マダニ体内からS. aureusが分離されない（Isogai et al. 2009）

マダニ抗菌ペプチドによる可能性＜研究の目的＞①マダニにおける抗菌ペプチドの役割の解明②マダニ抗菌ペプチドの薬剤耐性S. aureusに対する効果の検討
24以下、結果と考察

25

マダニ抗菌ペプチドIPの構造予測
へリックス
3組のジスルフィド結合（S-S結合）
シート
節足動物特有の構造（ディフェンシンファミリー）2011年の研究（構造予測前）
黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性の比較

IPの三次構造（分子表面）

三次構造

Turn 180°
horizontally

三次構造により両親媒性の性質を持つことで抗菌作用に大きな効果をもたらす可能性

一次構造

赤：親水性
青：疎水性

26

ライム病ボレリアへの影響
140

抗菌ペプチドで処理する前(Before)と後(After)

１視野あたりの生菌数

120
10080

Before60

After

ライム病ボレリア(グラム陰性菌)

40
200TN

IP3 SIKA1 SIKA2 HP1B. garinii
図1 ライム病ボレリアに対するIPの影響

B.garinii はIP に対して抵抗性を示す
マダニ体内に共生する細菌には効果がない!?

27その他の細菌への影響＜MIC試験（液体微量希釈法）＞
Table IP(一次構造)の抗菌活性
SpeciesMIC (µM)＜グラム陽性菌＞

Gram-positive bacteria

Staphylococcus aureus
Bacillus subtilis
Corynebacterium renale
Gram-negative bacteria
Escherichia coli O157
Salmonella Typhimurium

Pseudomonas aeruginosaProteus vulgaris

IP(三次構造)でも0.8
0.5
0.3
10>20>20>20S.aureus → 1.25 µg/ml
腸球菌 →後ほど＜グラム陰性菌＞

E.coli → >160 µg/ml
S. Typhimurium → >160 µg/ml

MIC, Minimum inhibitory concentration.
Saito et al., Insect Mol Biol, 2009

グラム陽性菌には効果を示す一方、グラム陰性菌には効果が弱い
28

哺乳類細胞への影響①
Total cell (×10⁵ cell/mL)

ウシ繊維芽細胞24h448h12382410005105005Concentration of IP (µg/mL)

1050

1050

IP 50 µg/mL

Total cell (×10⁵ cell/mL)

ウシ腸管上皮細胞
48h
1284005Concentration of IP (µg/mL)

controlbar =250 µm

図2 哺乳類細胞に対するIPの影響

IPは細胞の増殖と形態に影響を与えず、

29

哺乳類細胞への影響②＜溶血活性試験＞
100

IP
control（TritonX-100）

Hemolysis (%)

80

630Concentration of IP (µg/mL)
図3 IPのヒト赤血球に対する溶血活性ヒト赤血球に対して溶血活性を示さなかった30

マダニにおける抗菌ペプチドの役割（目的①）“排除”&“共生”マダニ
・全動物種の85%以上を占める節足動物の一種

免疫機構は自然免疫のみ

抗菌ペプチドS. aureus

・吸血鬼

ちなみにヒトでも…

口下片から様々な生理的効果のある因子を含む唾液を宿主体内に注入

感受性

吸血の際に様々な病原体を伝播させる
ベクター

体内に共生細菌が存在

抵抗性

Paneth細胞が産生するαディフェンシン(抗菌ペプチド)は腸における“排除”と“共生”の両方に関与する①病原体に対して強い殺菌作用②腸内の常在菌にはほとんど殺菌活性を示さない

31

薬剤耐性S.aureusに対するIPのMIC評価＜MSSAとMRSAに対するIPの短時間殺菌活性＞
100
MS-3MR-1MR-2MR-3

Viable bacteria (%)

8060

MSSA

メチシリン感受性

MRSA

メチシリン耐性4020001.252.5510Concentration of IP (μg/mL)20

図4 IP処理1 h後のS. aureusの生存率

IPはMSSA及びMRSAの両者に抗菌活性を示す
IPはMRSAに対して1時間でMSSAと同等の濃度依存的な殺菌効果を示す
32薬剤耐性S.aureusに対するIPのMIC評価＜MIC試験（液体微量希釈法）＞
Table MSSA, MRSA, VISA, VRSAに対する各種抗菌剤のMICの比較
MIC (µg/mL)

Bacteria
strainMS-1 (MSSA)
MR-1 (MRSA)

Mu50 (VISA)
VRS1 (VRSA)

IP

IR

HAE

OMBAC

BMAP28Nisin

vancomycin

1282216>3232>32>32>32>3288>328816>323288>3216118>32

VISA →バンコマイシン低度耐性S. aureus
VRSA →バンコマイシン耐性S. aureus
IR, HAE, OMBAC →他種のマダニ抗菌ペプチドBMAP28 →ウシ由来抗菌ペプチド
Nisin →乳酸菌が産生する多環式抗菌ペプチド33

薬剤耐性S.aureusに対するIPのMIC評価＜MIC試験（液体微量希釈法）＞
Table MSSA, MRSA, VISA, VRSAに対する各種抗菌剤のMICの比較
MIC (µg/mL)

Bacteria
strainMS-1 (MSSA)
MR-1 (MRSA)

Mu50 (VISA)
VRS1 (VRSA)

IP

IR

HAE

OMBAC

BMAP28Nisin

vancomycin

1282216>3232>32>32>32>3288>328816>323288>3216118>32

VRSAを含めた薬剤耐性黄色ブドウ球菌に対してIPが最も抗菌活性を持つ抗菌ペプチドである(目的②)34

4,IPの抗菌メカニズムを探る初期研究

関連論文：

Miyoshi N, Isogai E, Hiramatsu K, Sasaki T: Activity of tick antimicrobial
peptide from Ixodes persulcatus (persulcatusin) against cell
membranes of drug-resistant Staphylococcus aureus. J Antibiot(Tokyo). 201635

抗菌ペプチドの作用機序
前スライドより新規抗菌剤の開発が急務となっている中
理想的な候補として抗菌ペプチドが期待されている・ 短時間で殺菌する
理由

・ 細菌が耐性化しにくい

抗菌ペプチドの作用メカニズム・・・

細菌の膜に結合し、物理的な膜孔形成により殺菌する
細菌
膜

抗菌ペプチド・突然変異による細菌の膜透過性への影響は少ない
・細菌膜のチャージや表面の分子を変化させるのは困難

マダニ抗菌ペプチド（IP）は膜孔形成作用 or 異なるメカニズム??
e.g. バンコマイシン（VCM）

細胞壁合成阻害効果で溶菌IPの抗菌メカニズムの研究
1, 走査型電子顕微鏡（Scanning Electron Microscope, SEM）による観察
2, カルセイン-AMを用いたカルセイン漏出アッセイ
36

SEMによる菌体観察2.5×MIC

5×MIC

5×MIC

4×MIC

32 μg/mL

4×MIC

MR-1(MRSA)

VRS1(VRSA)

ControlNisinvancomycin

IPbar =1 µm

図5 MR-1及びVRS1における各抗菌剤処理後30分での菌体の様子

Nisin同様、IP処理したMRSAとVRSAの両者で菌体構造の変化や膜ダメージが見られた
37

カルセイン漏出による膜損傷評価＜カルセイン漏出アッセイ＞
カルセイン-AM

エステラーゼNisin
膜孔形成物質カルセイン

黄色ブドウ球菌
Calcein leakage (%)の算出
PBS処理の蛍光強度 － ペプチド処理の蛍光強度
PBS処理の蛍光強度

×100
38

カルセイン漏出による膜損傷評価＜カルセイン漏出アッセイ＞
MR-1(MRSA)

Calcein leakage rate (%)

80

Nisin

(1×MIC)

60

IP(1×MIC)

40vancomycin(1×MIC)

20PBS0Nisin(1×MIC)

60IP(1×MIC)

40vancomycin(32 μg/mL)

20PBS00-2080

Calcein leakage rate (%)

100VRS1(VRSA)

1001020Time (min)300-20102030Time (min)

図6 MR-1及びVRS1における各抗菌剤処理後30分でのカルセイン漏出

Nisin同様、IP処理したMRSAとVRSAの両者でカルセイン漏出が見られ、膜孔形成が示唆された
39

マダニ抗菌ペプチドIPの抗菌メカニズム
1, 走査型電子顕微鏡による観察
短時間で明らかに膜にダメージが見られる!!

膜孔形成作用を持つ可能性

2, カルセイン-AMを用いたカルセイン漏出アッセイ
膜孔形成作用を持つNisin同様、カルセインの漏出が見られた
そして、抗菌活性が高いIPはNisinよりも膜障害度は低かった

膜孔形成作用別の抗菌メカニズム

IPの抗菌メカニズム研究はまだまだ発展途上・・・
40現在の研究東北大学動物微生物研究室の両角氏よりIPに関する研究を一部紹介していただきます41

というわけで、両角にバトンタッチです「抗菌ペプチドPersulcatusinの腸球菌に対する抗菌活性の探索」

42

自己紹介
»名前 両角一輝（モロズミ イツキ）
»略歴 東北大学・理学部・地球惑星物質科学科 卒業
東北大学大学院・農学研究科・生物産業創成科学専攻 入学
研究対象を”地球”から”ダニ”へ»大学院での研究
三好氏の研究を引き継ぎ、IPの更なる抗菌活性を探っています!!
43

研究内容

»腸球菌、バンコマイシン耐性腸球菌（VRE）をターゲットにIPの更なる抗菌活性を探る

44

腸球菌とは・・・？
腸球菌（Enterococcus faecalis）• 哺乳類、鳥類の腸管内に存在する常在細菌• 黄色ブドウ球菌（S.aureus）と同じグラム陽性菌• 薬剤耐性のバンコマイシン耐性腸球菌（VRE：Vancomycin-ResistantEnterococcus）の出現によって、院内感染症が世界的な問題に!!

https://gl.wikipedia.org/wiki/Enterococcus_faecalis

腸球菌に対してもIPは抗菌活性を持つかもしれない！？

• 短時間殺菌試験• MIC試験• SEM観察 を通して効果を探っていく!!
45

短時間殺菌試験（short-time killing assay）
IP処理1 h後のS. aureusの生存率

MS-3 MSSA
MR-1
MR-2 MRSA
MR-3

100

140
120
100
80
60
40
200E.fl(752K)
E.fm(1052K)
01.25 2.551020

Viable bacteria (%)

Viable bacteria (%)

IP処理1 h後の腸球菌(E.faecalis, E.faecium)の生存率

Concentration of IP (μg/mL)

806040200010 20
1.25 2.5 5Concentration of IP (μg/mL)

E.fl = E.faecalis 、E.fm = E.faecium

腸球菌(E.faecalis, E.faecium)に対するIPの殺菌効果は見られなかった‼
46

最小発育阻止濃度（MIC）測定試験
Table 腸球菌 (E.fl, E.fm)、VRE(E.fl, E.fm)に対する各種抗菌剤のMICの比較
Bacteria
strainMIC (μg/mL)IP
IR HAE OMBAC Nisin vancomycin
1.25752K (E.fl)>40 >40 >4040
401.251052k(E.fm)
20
101.25 20 >40>40
Cue709(VRE,E.fl)
2040 >40 >40
10>40
Cue850(VRE,E.fm) 0.625 10 >401010E.fl = E.faecalis 、E.fm = E.faecium

腸球菌（特にE. fm）に対してIPは増殖抑制効果を示した‼
47

S.aureus の僕はSEM（走査型電子顕微鏡）観察
ボロボロなのに・・・
・E. faecalis

・E. faecium

HBSSのみ
1.0µm

1.0µm

5×MIC

5×MIC

1.0µm

1.0µm

IP
（5×MIC）

腸球菌に対しては、IPによる膜の傷害性は見られなかった48

腸球菌に対するIPの効果まとめ»短時間殺菌試験→IPは短時間(1h)では腸球菌に殺菌効果を示さない» MIC試験→腸球菌に対してIPは増殖抑制効果を示した» SEM観察→黄色ブドウ球菌の時と異なり、腸球菌では菌体構造の変化や膜ダメージは見られなかった

IPは腸球菌の増殖を抑制するものの殺菌していない！？
黄色ブドウ球菌と何が異なるのか？
殺菌はせず、抑制するというのはどのようなメカニズムなのか？
49

今後の展望» 黄色ブドウ球菌と腸球菌に対するIPの効果の違いについて探っていく（実験手法は探索中です・・・）» 検討中の試験を進める（１）IPに対する菌の耐性化実験（２）IPの細菌DNAに対する効果検討（３）菌体におけるIPの局在調査

VS
IPと細菌との戦いはこれからも続く・・・
50

本日の講演まとめ
マダニの免疫を司るマダニ抗菌ペプチドIP＜マダニ体内における役割＞

・“排除”と“共生”に関与している可能性＜薬剤耐性S. aureusに対して＞・vancomycin同等もしくはそれ以上の抗菌活性を持つ
・短時間かつ細菌が耐性化しにくいメカニズムで作用・哺乳類細胞やヒト赤血球に対する細胞毒性なし

薬剤耐性黄色ブドウ球菌

IP
シュルツェマダニ

毒性無し

哺乳類細胞

新規抗菌剤
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謝辞と今想うこと【謝辞】○仙台医療センター ウイルスセンター長

西村秀一先生○東北大学農学研究科 動物微生物研究室

磯貝恵美子教授【企業研究者2年目の私が想うこと】
企業での研究とは最終的に“モノの開発”が目的であることが多いアカデミアのような研究に触れることは少なくなっていくかもしれない…
ですが、学生時代の研究は意識していて、今後関わるかもしれないと思っています
特に学生の皆様、どうかご自身の研究は大切に!!

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