活性化好中球を標的とした心血管疾患に対する新規治療法の開発

福島県立医科大学

医学部

輸血・移植免疫学講座教授 池田 和彦

2021年11月18日

1背景
1. 骨髄増殖性腫瘍（MPN）のドライバー変異 JAK2V617F陽性
クローン性造血と心血管疾患
2. 従来技術とその問題点

2

背景
1. 骨髄増殖性腫瘍（MPN）のドライバー変異 JAK2V617F陽性
クローン性造血と心血管疾患
2. 従来技術とその問題点

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MPN (骨髄増殖性腫瘍)•造血幹細胞の遺伝子異常により、刺激が無いのに活性化した血液細胞が増える– 分化した血球だらけになってしまう（ほとんどの症例）– 線維（コラーゲン）が増えてしまう（一部の症例）– このことによって、• 末梢の血球数が増加• 末梢の血液は活性化しているため、血栓症、心血管疾患（心筋梗塞や脳梗塞など）、肺高血圧症などを起こす要因になる• 骨髄から細胞がはみ出し脾臓などで血液を造る（髄外造血）•進行すると、より予後の悪い病態へ進行– 骨髄線維症– 骨髄異形成症候群（MDS）– 急性骨髄性白血病– 消耗期（造血障害）

4MPNのドライバー遺伝子変異：細胞増殖・活性化の原因•JAK2 V617F (2005年発見)–––PVET
PMF

95%以上
50-60%
50-60%
正常JAK2•

MPL W515K/L (2006年発見)
–––

•PV
ET
PMF

なし
≤10%
≤10%

JAK-STAT経路の正常な活性化

JAK-STAT経路の過剰な活性化

CALR exon 9 変異 (2013年発見)–––•

遺伝子変異を起こしたJAK2(JAK2V617F)

PVET
PMF

なし
20-30%
20-30%

Triple negative (JAK2/MPL/CALRともに陰性)–––PVET
PMF

1-2%
10-20%
10-20%

正常な細胞増殖

無秩序な細胞増殖

5Clonal hematopoiesis（クローン性造血）と心血管疾患
骨髄系腫瘍（MDS・MPN・AML）に見られる遺伝子変異が加齢に伴い血液疾患未発症者に検出されるようになる

頻度

造血器腫瘍

MDS/AMLMPN

全生存心血管疾患

虚血性心疾患
脳血管障害 etc.
Jaiswal S et al. N Engl J Med 2014;371:2488-2498.
Jaiswal S et al. N Engl J Med 2017;377:111-121.

6

JAK2変異はクローン性造血保持者に検出されるドライバー変異として最多
細胞増殖に直接関わる
ドライバー変異

JAK2変異以外はエピジェネティックス関連遺伝子などの疾患修飾因子

Jaiswal S et al. N Engl J Med 2014;371:2488-2498.

造血細胞

池田和彦. 臨床血液. 2016;57(2):156-164.

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背景
1. 骨髄増殖性腫瘍（MPN）のドライバー変異 JAK2V617F陽性
クローン性造血と心血管疾患
2. 従来技術とその問題点

8従来技術とその問題点
従来技術（JAK阻害剤）：
正常なJAKも抑制し、免疫抑制など有害事象が多いため、血液疾患未発症のクローン性造血や軽症のMPNに対しては適用できない

従来技術（JAK2 V617F検査）：
現在、MPN診断に用いられるPCRのcut off変異アリル比率は、1％と低い従来技術（細胞減少療法）：
骨髄抑制など有害事象が多く、急性白血病や骨髄線維化も防げないばかりか、二次発癌リスクなどもあり、血液疾患未発症のクローン性造血には適用できない• 抗がん剤• 代謝拮抗剤• アルキル化剤

JAK2 V617F陽性造血細胞による血管リモデリングを再現する、良い動物モデルが無かった

従来技術（肺血管拡張薬）：
血管リモデリングを抑制しない• プロスタサイクリン誘導体• エンドセリンレセプター拮抗剤• PDE5阻害剤• 可溶性グアニル酸シクラーゼ刺激剤

造血器腫瘍

？
肺高血圧症

骨髄増殖性腫瘍（ほぼ全て）動脈硬化性疾患
血栓症

骨髄異形成症候群（一部）

本研究では、活性化した骨髄球系細胞において、血管リモデリングを引き起こし、心血管系疾患に関わる重要な因子を、動物モデルを確立した上で探索した

骨髄線維化

心血管疾患
従来技術（血栓予防）：
有効範囲が限定的で、血管リモデリングを抑制しない• 抗血小板薬• 抗凝固薬9新技術の特徴・従来技術との比較
1. JAK2V617Fクローン性造血による血管リモデリングを肺および大動脈で再現するモデルを確立した。
2. JAK2 V617F陽性の分化・活性化した好中球に特異的に発現するALK1を標的として見出した。
3. 従来薬の効果は血管拡張や血栓予防といった対症的な機序に限られていたが、 JAK2 V617F陽性活性化好中球による肺血管のリモデリング抑制によって肺高血圧症を根本的に治療することが可能となる。
4. 従来技術の問題点、JAK2阻害薬の特異性（野生型JAK2の阻害）や幹細胞レベルへの毒性（骨髄抑制）を回避することに成功した。
5. 我々の手法により、従来法よりも高感度にJAK2 V617Fを検出することができた。このことで、JAK2 V617F陽性者はMPN症例にとどまらず広く見られることが、日本人においても確認された。したがって、新技術がより多くの患者を救うことが期待される。
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新技術の特徴・従来技術との比較
1. JAK2V617Fクローン性造血による血管リモデリングを肺および大動脈で再現するモデルを確立した。
2. JAK2 V617F陽性の分化・活性化した好中球に特異的に発現するALK1を標的として見出した。
3. 従来薬の効果は血管拡張や血栓予防といった対症的な機序に限られていたが、 JAK2 V617F陽性活性化好中球による肺血管のリモデリング抑制によって肺高血圧症を根本的に治療することが可能となる。
4. 従来技術の問題点、JAK2阻害薬の特異性（野生型JAK2の阻害）や幹細胞レベルへの毒性（骨髄抑制）を回避することに成功した。
5. 我々の手法により、従来法よりも高感度にJAK2 V617Fを検出することができた。このことで、JAK2 V617F陽性者はMPN症例にとどまらず広く見られることが、日本人においても確認された。したがって、新技術がより多くの患者を救うことが期待される。
11JAK2V617F陽性骨髄球系細胞（好中球＞単球）はマウス低酸素曝露モデルの肺動脈中膜を肥厚させ、肺高血圧を促進する
JAK2V617F-Tgマウス（骨髄球系細胞、肺中膜細胞ともにJAK2V617F陽性）
右室圧実験デザイン

*†500Analysis↓
2 weeks

Normoxia (21% O2)
Hypoxia (10% O2)

RVSP (mmHg)

WT
JAK2V617F

肺動脈中膜

40

Ly6G+好中球

WT
JAK2V617F*

3020100
Normoxia

Hypoxia

JAK2V617F-Tgマウスをドナーとした、骨髄移植レシピエントマウス（骨髄球系細胞：JAK2V617F陽性、肺中膜細胞： JAK2V617F陰性）
実験デザイン

*†WT recipients
JAK2V617F recipients

V617F

JAK2BM cells

BMT↓
05Analysis↓
8 weeks
Normoxia
Hypoxia

RVSP (mmHg)

50WTBM cells

JAK2V617F-GFPドナーからの移植レシピエント(ドナー由来Ly6G+好中球によりレシピエント肺動脈中膜が肥厚)

右室圧

40

WT recipients
JAK2V617F recipients*

3020100Normoxia

Hypoxia

Kimishima Y, Misaka T*, Ikeda K*, et al. Nature Communications. 2021;12:6177.
(* corresponding author)

12JAK2V617F陽性骨髄球系細胞（単球＞好中球）はマウス動脈硬化モデルの大動脈肥厚を促進し、大動脈瘤を起こす

Ang II 投与によるJAK2-BMTレシピエントの大動脈壁肥厚
血圧

Yokokawa T, Misaka T*, Ikeda K*, et al. Haematologica. 2021;106:1910-1922.
(*corresponding author)

大動脈壁周囲の単球数13新技術の特徴・従来技術との比較
1. JAK2V617Fクローン性造血による血管リモデリングを肺および大動脈で再現するモデルを確立した。
2. JAK2 V617F陽性の分化・活性化した好中球に特異的に発現するALK1を標的として見出した。
3. 従来薬の効果は血管拡張や血栓予防といった対症的な機序に限られていたが、 JAK2 V617F陽性活性化好中球による肺血管のリモデリング抑制によって肺高血圧症を根本的に治療することが可能となる。
4. 従来技術の問題点、JAK2阻害薬の特異性（野生型JAK2の阻害）や幹細胞レベルへの毒性（骨髄抑制）を回避することに成功した。
5. 我々の手法により、従来法よりも高感度にJAK2 V617Fを検出することができた。このことで、JAK2 V617F陽性者はMPN症例にとどまらず広く見られることが、日本人においても確認された。したがって、新技術がより多くの患者を救うことが期待される。
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JAK2V617F陽性好中球は分化に従いALK1 (Acvrl1) を高発現する
IL6_JAK_STAT3

Upregulated genes
Acvrl1

ALK1 (Acvrl1) 発現（骨髄球系細胞）

末梢血LungPB

BM

LSK

LSK: 造血幹細胞
BM: 骨髄Ly6G+細胞PB : 末梢血Ly6G+細胞Lung : 肺Ly6G+細胞組織

骨髄球

Downregulated genes
造血幹細胞

10

Gene set enrichment 解析
IL6_JAK_STAT3
Ly6G + neutrophils in lung
NES = 1.30
Nom P = 0.053
FDRq = 0.089

Ly6G+ neutrophils in PB
NES = 1.52
Nom P = 0.004
FDRq = 0.020

Ly6G+ myeloid cells in BM
NES = 2.14
Nom P = 0.000
FDRq = 0.000

LSK cells–10

個々の遺伝子発現

NNES = 1.58
Nom P = 0.005
FDRq = 0.017(IL6-JAK-STAT経路)（なお、ALK2の発現は低い）
Il6

Kimishima Y, Misaka T*, Ikeda K*, et al. Nature Communications. 2021;12:6177.
Ueda K , Ikeda K*, et al. Blood Advances. 2017;1:1001-1015. (* corresponding author)

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ALK1 (encoded by Acvrl1)•Activin receptor-like kinase 1.

•1型TGF-βスーパーファミリー受容体であり、セリン・スレオニンキナーゼサブドメインを有する•

主なリガンドはBMP-9で、TGF-β結合は弱い•

Smad1/5/8をリン酸化する•

ALK1は内皮細胞に発現し、造血細胞における発現は弱い•

先天性のALK1変異はヒト遺伝性出血性毛細血管拡張症±肺高血圧症を起こす一方、
ALK1 ligand trapはラット肺高血圧症を軽減したとの報告も見られる
Cunha & Pietras. Blood. 2011; 117:6999-7006

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JAK2V617FはSTAT3リン酸化を介してAcvrl1 発現を促進する
STAT3はJAK2V617F陽性HCT116細胞特異的に
ACVRL1プロモーターに結合 (ChIP-qPCR)

Acvrl1プロモーター領域における
STAT3結合予測モチーフ
Score

Start position

TRANSFAC JASPAR- 8 7 5 G G G C C C T G C C T G G A A G G G G A A 0.712
0.958
Human - 1 6 6 0 T C A G G G T T C T G G G A A T T A A C A 0.7350.974- 6 9 7 7 C A C C A T T T C C T G G C A G T C C G T 0.7520.955
2 1 3 2 T G G G A A T T T C C A G A A C T G G G G 0.722
0.940- 1 1 2 3 A A A G G C T T A C C G G A A G C A A T G 0.738
0.919
Mouse - 4 9 5 1 C G T C T C T T C T A G G A A G T A A G A 0.715
0.974- 5 7 9 5 A C C T A C T T C T G G A A A A T T T G G 0.734
0.965- 8 8 7 3 T G G A G A T T C C A G G A G A G A A A G 0.738
0.914
TRANSFAC
JASPARACVRL1 promoter activity

JAK2V617F陽性HCT116細胞特異的なACVRL1プロモーター活性上昇とJAK2阻害剤による低下*

2.0

JAK2V617F/+ HCT116 cells

1.5

Cytokine (+/-)
JAK2 V617F
STAT31.0

ALK1 (Acvrl1)
0.5

Smad1/5/8
K2
JAJA
K

2 +/

V6
17F/++0.0

Kimishima Y, Misaka T*, Ikeda K*, et al. Nature Communications. 2021;12:6177.
(* corresponding author)

17新技術の特徴・従来技術との比較
1. JAK2V617Fクローン性造血による血管リモデリングを肺および大動脈で再現するモデルを確立した。
2. JAK2 V617F陽性の分化・活性化した好中球に特異的に発現するALK1を標的として見出した。
3. 従来薬の効果は血管拡張や血栓予防といった対症的な機序に限られていたが、 JAK2 V617F陽性活性化好中球による肺血管のリモデリング抑制によって肺高血圧症を根本的に治療することが可能となる。
4. 従来技術の問題点、JAK2阻害薬の特異性（野生型JAK2の阻害）や幹細胞レベルへの毒性（骨髄抑制）を回避することに成功した。
5. 我々の手法により、従来法よりも高感度にJAK2 V617Fを検出することができた。このことで、JAK2 V617F陽性者はMPN症例にとどまらず広く見られることが、日本人においても確認された。したがって、新技術がより多くの患者を救うことが期待される。
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低酸素曝露JAK2V617Fマウスの肺高血圧症はALK1阻害薬により予防できる
ALK1阻害薬K02288は低酸素曝露 JAK2V617F マウスにおける肺血管肥厚を予防する

ALK1阻害薬K02288 は低酸素曝露 JAK2V617F マウス
における右室圧を正常化させる

ALK1阻害薬K02288は低酸素曝露 JAK2V617F マウスの肺好中球の浸潤を抑制しエラスターゼ活性を低下させる

有意な血液毒性なし
Kimishima Y, Misaka T*, Ikeda K*, et al. Nature Communications. 2021;12:6177.
(* corresponding author)

19

Kimishima Y, Misaka T*, Ikeda K*, et al. Nature Communications. 2021;12:6177.
(* corresponding author)

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新技術の特徴・従来技術との比較
1. JAK2V617Fクローン性造血による血管リモデリングを肺および大動脈で再現するモデルを確立した。
2. JAK2 V617F陽性の分化・活性化した好中球に特異的に発現するALK1を標的として見出した。
3. 従来薬の効果は血管拡張や血栓予防といった対症的な機序に限られていたが、 JAK2 V617F陽性活性化好中球による肺血管のリモデリング抑制によって肺高血圧症を根本的に治療することが可能となる。
4. 従来技術の問題点、JAK2阻害薬の特異性（野生型JAK2の阻害）や幹細胞レベルへの毒性（骨髄抑制）を回避することに成功した。
5. 我々の手法により、従来法よりも高感度にJAK2 V617Fを検出することができた。このことで、JAK2 V617F陽性者はMPN症例にとどまらず広く見られることが、日本人においても確認された。したがって、新技術がより多くの患者を救うことが期待される。
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日本人心血管疾患患者におけるJAK2V617Fクローン性造血• 2018年3月〜2019年11月に福島医大病院の循環器内科に入院した心血管疾患患者（血液疾患なし）の832名について、MPNドライバー変異を検査• JAK2V617F変異陽性：15例（1.8％）• Variant allele frequency (VAF) 0.06%-1.73%• CALR変異陽性：1例（0.12%）• MPL変異陽性：なし
JAK2V617F検査（JAK2遺伝子検査、区分番号D006-6）のcut offは1％

血管性
冠動脈疾患
末梢動脈疾患
大動脈瘤
脳卒中
深部静脈血栓症
急性肺血栓塞栓症

非血管性
特発性心筋症
弁膜症
不整脈
先天性心疾患心筋炎

高齢になるほど、JAK2V617F陽性者が多い

血管性疾患の方が、JAK2V617F陽性者が多い

Yokokawa T, Misaka T, Ikeda K, Takeishi Y, et al. JACC CardioOncology. 2021;3:134–6.

22日本人肺高血圧症患者におけるJAK2V617Fクローン性造血• 肺高血圧症は、MPN患者に多く見られる（5％-60％）。
• このため、血液疾患のない肺高血圧症患者において、JAK2V617Fを検査したところ、7％が陽性だった。

Kimishima Y, Misaka T*, Ikeda K*, et al. Nature Communications. 2021;12:6177.
(* corresponding author)

23

想定される用途• ALK1阻害剤– ALK1阻害剤は低分子化合物の他、抗体なども考慮される。
– 従来の薬剤は対症的に肺循環を改善するものであり、根本にある肺動脈の中膜肥厚を特徴とする血管リモデリングに関与するカスケードをターゲットした薬剤は存在しない。このためALK1阻害薬は肺動脈中膜肥厚を直接抑制する最初の薬剤となる可能性がある。
– 肺高血圧症以外に、JAK2 V617Fが関与する血管病変として動脈硬化や血栓症への効果も期待される– MPNによる骨髄線維化にも白血球活性化、TGF-β亢進に伴う炎症が関与する。
TGF-β-Smad2/3阻害が試みられているが、効果は限定的であり、ALK1阻害剤の効果がむしろ期待できる可能性がある。

• JAK2 V617F検査– 心血管リスクファクターとしてのクローン性造血の検出– MPN検査（VAF<1%のJAK2 V617F陽性MPNが多数報告されている）
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実用化に向けた課題• ALK1阻害剤– 我々が用いたものも含め、ALK1の阻害剤は動物実験データのみである。
– 少なくとも試薬として購入可能なALK1阻害剤は他のALKファミリータンパクも阻害するもののみであり、ALK1特異的な阻害剤開発が求められる。
– これまで、腎癌についてALK1のリガンドとの結合を阻害するdalanterceptについては、臨床第2相試験が行われ、認容性良好だが、効果は不十分と報告されている（Cancer.
2019;125:2400-2408.）。
– 今後、動脈硬化や血栓について実験データを取得し、血管病変全般に適用していく場合の条件設定を行っていく。
– 骨髄線維化や脾腫等、心血管疾患以外に対する効果も検討する。

• JAK2変異検査– 標準試薬として開発していきたい25

企業への期待• 未解決の血栓や動脈硬化に対するALK1阻害剤の効果については、動脈硬化マウスモデルの技術により検証・克服できると考えている。
• 骨髄線維化に対する効果についても、我々の持つ動物モデルにより検証できる。
• ALK1阻害剤開発について、低分子化合物and/or抗体薬の技術を持つ企業との共同研究を希望。
• また、新たな遺伝子検査を開発中の企業、検診や診断薬分野への展開を考えている企業には、JAK2 V617F検査の導入が有効と思われる。
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本技術に関する知的財産権• 発明の名称 ：好中球抑制剤、及びクローン性造血の予防又は治療用医薬組成物• 出願番号： 特願2021-7922• 出願人： 福島県立医科大学• 発明者： 池田和彦、三阪智史、竹石恭知
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産学連携の経歴• 2017年- 北陽電機株式会社と共同研究実施（新規凍結血漿解凍装置など）• 2018年- 極東製薬株式会社と共同研究実施（細胞凍害保護液など）

28

問い合わせ先
福島県立医科大学
医療研究推進課 佐藤浩樹
ＴＥＬ 024-547-1791
ＦＡＸ 024-581-5163
e-mail liaison@fmu.ac.jp

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