−技術資料−●クラミジア／淋菌 rRNA 検出試薬
TRCReady® CT/NG の開発
バイオサイエンス事業部

第二開発部

遺伝子グループ

北森
宇根
俵田
中島
斎藤有加
蔵人
隆哉
直人
寿一

る部位であるため、クラミジアトラコマチス、淋菌と1．はじめにも他の部位に比べて、上皮に存在する菌体数が少ない

クラミジアトラコマチス（Chlamydia trachomatis 、ことが推察されている 3）。よって、咽頭検体においてCT）感染症（以降、クラミジア感染症）は性感染症

は高感度に菌体を検出する核酸増幅法による検査が推1）の中でも最も罹患率の高い感染症である 。クラミジ

奨されている 5）。

アトラコマチスは主に泌尿生殖器に感染し様々な症状

淋菌は抗菌薬を用いた治療において、薬剤耐性をを引き起こすことが知られている。女性で重症化した獲得しやすいことが知られており、現在淋菌に確実場合は、不妊症、流産、早産といった後遺症を残したり、に有効な抗菌薬は限定的であり、当該抗菌薬の多用に出産の際に新生児に感染したりすることもある。ただより耐性菌が増加することは世界的な脅威とされていし、女性の場合、感染しても症状を呈しないことも多る 6）。クララミジア感染症の治療に推奨されているマいため、感染を自覚することが少ない。しかしながら、クロライド系抗菌薬に耐性を持つ淋菌も報告されてお無症候であっても感染者は性的パートナーに感染させり、両者を鑑別し、適切な抗菌薬を選択することは非2）

る可能性が高く、合併症を発症するリスクが高い 。

常に重要である。

一方、男性の場合は、尿道炎が大分部を占め、その他に急性精巣上体炎、直腸炎などを呈することもあるため 2）、疾患負担の低減のために早期の治療開始が求められている。
近年、咽頭感染例も増加しているが、咽頭のクラミ
2）

2．クラミジア／淋菌 rRNA 検出試薬 TRCReady®
CT ／ NG の開発
クラミジアトラコマチスの鑑別には抗体検査や核酸ジア感染症は特徴的な症状に乏しい 。このため、ク増幅検査が用いられるが、感度が高いことなどから核ラミジア感染症と診断されて適切な治療を受ける例が酸増幅検査が推奨されている 5）。一方、淋菌の鑑別に少なく、クラミジア感染症の感染源となっていると指は鏡検法や核酸増幅法、分離培養法などが用いられる摘されている。

が、核酸増幅法はクラミジアトラコマチスとの同時検淋菌（Neisseria gonorrhoeae 、NG）感染症は厚生査が可能で感度が高いとされている 5）。鏡検法は臨床

労働省の定点調査によると 2016 年まではクラミジア現場で検査したその場で結果がわかるが、子宮頸管擦3）に次いで最も感染報告の多い感染症であり 、淋菌性過物など検体によっては、夾雑物が多く検査が難しい尿道炎の患者において、クラミジアトラコマチスもとされている。また、女性の子宮頸管炎の感染診断に20 〜 30％程度検出されるなど、混合感染が比較的多あたっては、尿の使用は言及されておらず、子宮頸管

2）擦過物を採取することとされている 5）。

く認められる 。
淋菌に感染すると、男性では主に尿道炎を呈し、重再診率が低いとされている性感染症患者に対して治症化した場合、不妊症となることがある。女性では主療を来院当日中に開始するために、検査結果をより迅4）に子宮頸管炎の症状を呈する 。また、クラミジア感

速に報告するニーズが存在するが、既存の核酸増幅検

染同様に、淋菌においても咽頭感染が問題となってい査は数時間の検査時間を要するという課題が存在する。女性の淋菌感染者のうち、58％が咽頭より淋菌がる。

検出され、21％が咽頭及び性器から淋菌が検出された
3）と報告されている 。
咽頭は唾液や飲食によって表面が常に洗浄されていそこで、迅速性を有し、簡便で高感度な検査を可能とする TRCReady® − 80 システムを用いて、クラミジアトラコマチスと淋菌の同時検出を可能とする検出試
93

TOSOH Research & Technology Review Vol.62（2018）

薬の開発を試みた。検出系の設計にあたっては、他

表１の類縁菌と交差反応を示さず、高感度に検出するた
めに、クラミジアトラコマチスは 23S rRNA を、淋菌
法

TRC 法

TMA 法

SDA 法

判定

判定

判定

103＋＋＋＋＋＋＋＋＋3×103＋＋＋＋＋＋＋＋＋104＋＋＋＋＋＋＋＋＋3×104＋＋＋＋＋＋＋−＋105

−＋＋−
判定保留
−−−−3×105−−−−−−−−−

培養物
希釈倍率

については 16S rRNA を増幅対象として選択し TRC7）、8）

クラミジアトラコマチス希釈系列における各検査法比較に よ る「 ク ラ ミ ジ ア ／ 淋 菌 rRNA 検 出 試 薬®

TRCReady CT ／ NG」を開発した。ここにその試薬性能を報告する。

3．基本性能自動遺伝子検査装置 TRCReady® − 80 システム（以下、TRCReady® − 80）9） では、自動的に核酸精製から増幅、検出まで行われる。また、結果の判定においては、増幅されたクラミジアトラコマチス核酸および淋菌核酸とそれぞれ特異的に結合して蛍光増感する INAF プ
ロ ー ブ（INtercalation Activating Fluorescence probe）の蛍光をリアルタイムに検出し、それぞれの蛍光強度に関して一定時間内に蛍光強度から算出された蛍光強度比がカットオフ値以上を示したとき、陽性と判定し＋は陽性、−は陰性の判定結果を示す。

た。
試験結果を表２に示す。検討した 17 菌種全てを陰［1］迅速性®

TRCReady − 80 における本試薬を用いた検査は、検体採取後、前処理を実施し、装置にセットしてから約40 分で結果報告可能であった。
［2］最小検出感度・特異性性と判定された。これよりこれらの菌に対して交差反応性を示さないと考えられた。
また、本試薬はクラミジアトラコマチスおよび淋菌を同時に検出する試薬であるため、2 菌種が同時に検in vitro で合成したクラミジアトラコマチス rRNA出された場合（混合感染）を想定し、片方の菌が大量（以下、CT 標準 RNA）および in vitro で合成した淋菌に存在した際のもう一方の菌の検出感度について標準rRNA（以下、NG 標準 RNA）の希釈溶液を調製し、RNA を用いて評価した。結果を表３に示す。これより、

本試薬で測定した。その結果、本試薬は 1 テストあた

クラミジアトラコマチスまたは淋菌標準 RNA が 1 ×

り CT 標準 RNA 3 × 10 分子相当、NG 標準 RNA 1 ×106 分子相当存在した際も、それぞれの最小検出感度103 分子相当まで検出されることが示された。

濃度の標準 RNA が検出されることが示された。

2

また、クラミジアトラコマチス培養物（ATCC No.
VR − 1500）を健常人尿検体に添加し希釈系列を作成し、既存の核酸増幅検査と比較した結果を表１に示す。検4．臨床評価査は各キットの添付文書に従い実施した。TRC 法に［1］方おける核酸抽出は TRCR® 核酸精製キットを利用し、（1）対照試薬に関してTRCR® 核酸精製キットの取扱説明書に従い精製操作法

本試薬との相関性を評価する既承認体外診断用医薬品としては、SDA 法試薬および TMA 法試薬を用いを実施した。
表１より既存の核酸増幅検査と同等以上の感度が示た。両試薬共に、核酸を増幅し検出するものであるが、TMA 法は本試薬と同じ rRNA を増幅対象とし、SDAされた。
本試薬を用いて Neisseria 属菌 15 種の培養抽出物及び、人体に感染する恐れのある Chlamydophila 属菌
2 種の 23S rRNA の配列を有する合成 RNA 溶液（1 ×910 分子相当／テスト）の 3 重測定を実施した。培養®

法は DNA を増幅対象としている。
（2）検体採取に関して
宮本町中央診療所にて採取された検体（子宮頸管擦過物検体、尿道擦過物検体、男性尿検体、咽頭検体（咽抽出物は TRCR 核酸精製キットにそれぞれ表２に記頭擦過物、うがい液））について、SDA 法、TMA 法

載の菌量を添加し、抽出物を得た。

及び TRC 法（本試薬）でそれぞれ測定した。検体採94

東ソー研究・技術報告表２第 62 巻（2018）

交差反応性に関する検討結果

検討菌種

ATCC No.

濃度判定

Neisseria cinerea

14685

106
CFU ／ test−−−

Neisseria elongata

25295

107
CFU ／ test−−−

Neisseria flava

14221

107
CFU ／ test−−−

Neisseria flavescens

13120

107
CFU ／ test−−−

Neisseria lactamica

23970

107
CFU ／ test−−−

Neisseria mucosa

25999

107
CFU ／ test−−−

Neisseria sicca

29256

107
CFU ／ test−−−

Neisseria subflava

49275

107
CFU ／ test−−−13077

106
CFU ／ test−−−

BAA−335

106
CFU ／ test−−−31275

106
CFU ／ test−−−

700532106
CFU ／ test

−−−

13113

106
CFU ／ test−−−35559

106
CFU ／ test−−−35561

106
CFU ／ test−−−

・109分子相当／ test−−−・109分子相当／ test−−−

Neisseria meningitidis
Serogroup A

Neisseria meningitidis
Serogroup B

Neisseria meningitidis
Serogroup C

Neisseria meningitidis
Serogroup C, serotype 2a

Neisseria meningitidis
Serogroup D

Neisseria meningitidisSerogroup W-135

Neisseria meningitidis
Serogroup Y

Chlamydophila pneumoniae
合成 RNA

Chlamydophila psittaci
合成 RNA＋は陽性、−は陰性の判定結果を示す。CFU は colony forming unitを示す。

95

TOSOH Research & Technology Review Vol.62（2018）

表３

クラミジアトラコマチスまたは淋菌が大量に存在した際の最小検出感度に関する検討

濃度［分子相当／ test］
NG

CT
3×102

NG

判定

判定＋＋＋−−−

103＋＋＋＋＋＋

3×102

104＋＋＋＋＋＋

3×102

105＋＋＋＋＋＋

3×102

610103＋＋＋＋＋−−−＋＋＋10103＋＋＋＋＋＋

104

103＋＋＋＋＋＋

5103＋＋＋＋＋＋106103＋＋＋＋＋＋10

全検体（クラミジアトラコマチス核酸の検出）
TMA 法
陽性

陰性

合計

95398

陰性

12328

340

合計

107331438

陽性
本試薬＋30い相関性を示した（表５）。

表５

23×100CT

における全体一致率は 96.6％（423 ／ 438）であり、高全体一致率
陽性一致率
陰性一致率

96.6％
88.8％
99.1％

（2）淋菌核酸検出に関して＋は陽性、−は陰性の判定結果を示す。

1）本試薬と SDA 法との相関性について
臨床検体 501 例（子宮頸管擦過物検体：123 例、尿取に際しては各試薬に付随する採取キットを使用し、道擦過物検体：36 例、尿検体：182 例、咽頭検体：160 例）

添付文書に従い測定を実施した。本試薬測定用の検体における全体一致率は 96.8％（485 ／ 501）であり、高®

は TRCR 核酸精製キットの変性試薬にそれぞれ規定い相関性を示した（表６）。

®

量を添加し、精製物を得た。精製操作は TRCR 核酸精製キットの取扱説明書に従い実施した。
（3）本試薬の結果の判定に関して

表６

全検体（淋菌核酸の検出）
SDA 法

本試薬においてクラミジアトラコマチスまたは淋菌に由来する蛍光強度比がカットオフ値を超えたものをそれぞれ陽性と判定した。
［2］結本試薬果（1）クラミジアトラコマチス核酸検出に関して
1）本試薬と SDA 法との相関性について
臨床検体 501 例（子宮頸管擦過物検体：123 例、尿陽性陰性

合計

陽性78381陰性

13407420

合計

91410501

全体一致率
陽性一致率
陰性一致率

96.8％
85.7％
99.3％

道擦過物検体：36 例、男性尿検体：182 例、咽頭検体：160 例）における全体一致率は 97.4％（488 ／ 501）であり、高い相関性を示した（表４）。

2）本試薬と TMA 法との相関性について
臨床検体 438 例（子宮頸管擦過物検体：106 例、尿道擦過物検体：36 例、尿検体：179 例、咽頭検体：117 例）

表４全検体（クラミジアトラコマチス核酸の検出）

い相関性を示した（表７）
。

SDA 法

本試薬

陽性

陰性

合計

陽性

92799陰性

6396402

合計

98403501

全体一致率
陽性一致率
陰性一致率

97.4％
93.9％
98.3％

2）本試薬と TMA 法との相関性について
臨床検体 438 例（子宮頸管擦過物検体：106 例、尿道擦過物検体：36 例、尿検体：179 例、咽頭検体：117 例）

96における全体一致率は 98.4％（431 ／ 438）であり、高表７全検体（淋菌核酸の検出）
TMA 法
陽性

本試薬

陰性

合計

陽性80181

陰性635135786352438

合計
全体一致率
陽性一致率
陰性一致率

98.4％
93.0％
99.7％

東ソー研究・技術報告

5．考察［1］クラミジアトラコマチス核酸検出における本試薬との不一致例に関して
本試薬で陽性となり SDA 法で陰性となった乖離検第 62 巻（2018）謝辞

本報における臨床評価は宮本町中央診療所 院長 尾上泰彦先生（当時）との共同研究によって実施されました。厚く御礼申し上げます。

体 7 例のうち、4 例は TMA 法で陽性と判定された。
残り 3 例は増幅産物の配列を解析したところクラミジアトラコマチスの塩基配列が確認された。
本試薬で陽性となり TMA 法で陰性となった乖離検

参考文献
１）小野寺 昭一、性感染症に関する予防、治療の体

体 3 例は増幅産物の配列を解析したところクラミジア系化に関する研究トラコマチスの塩基配列が確認された。

20 − 39（2011）

本試薬で陰性となり SDA 法で陽性となった乖離検平成 22 年度総括研究報告書、

２）田中正利、性感染症 STD、南山堂（2008）

体 6 例のうち、5 例は TMA 法で陰性と判定された。

３）厚生労働省健康局結核感染症課情報管理係、感染本試薬で陰性となり TMA 法で陽性となった乖離検症発生動向調査、[online]http://www.mhlw.go.jp/

体 12 例のうち、11 例は SDA 法で陰性と判定された。

topics/2005/04/tp0411-1.html、（accessed 2018 −それぞれの残り 1 例については、SDA 法及び TMA 法

07 − 02）にて陽性と判定された。本検体は子宮頸管擦過物検体

４）余田敬子、淋菌の咽頭感染、クラミジアの咽頭感であり、菌体の局在の影響、もしくは陽性が否定でき染に関する更新、改定について、泌尿器外科 25（9）なかった。

1783 − 1787（2012）［2］淋菌核酸検出における本試薬との不一致例に関して本試薬で陽性となり SDA 法で陰性となった乖離検５）2016 ガイドライン委員会、性感染症断ガイドライン

治療・診2016、日本性感染症学会誌第体 3 例のうち、2 例は TMA 法 にても陽性と判定された。

27 号 第 1 号 Supplement（2016）

残り 1 例は増幅産物の配列を解析したところ淋菌の塩

６）WHO, WHO/RHR/11.14 1 − 2（2011）

基配列が確認された。

７）Ishiguro T. et al ., Intercalation activating

本試薬で陽性となり TMA 法で陰性となった乖離検

fluorescence DNA probe and its application to

体 1 例は増幅産物の配列を解析したところ淋菌の塩基

homogeneous quantification of a target sequence

配列が確認された。

by isothermal sequence amplification in a closed

本試薬で陰性となり SDA 法で陽性となった乖離検

vessel., Analytical Biochemistry, 314, 77 − 86（2003）.

体 13 例のうち、12 例は TMA 法で陰性と判定された。

８）保川清、TRC 反応による RNA の増幅とリアルタ

本試薬で陰性となり TMA 法で陽性となった乖離

イム検出、医学のあゆみ、206（8）、479 − 483（2003）.

検体 6 例のうち、5 例は SDA 法で陰性と判定された。

９）伊澤祐一、自動遺伝子検査装置 TRCReady® − 80 のそれぞれの残り 1 例については咽頭擦過物検体であ開発、TOSOH Research & Technology Review、り、同時期に採取したうがい液からは本試薬陽性と判

59、47 − 50（2015）

定された。これより、咽頭中の菌体の局在の影響を受けているものと推測された。

6．まとめ
迅速、簡便にクラミジアトラコマチスおよび淋菌を同時検出可能な試薬を開発した。感度においても既存品と同等以上の性能を有していることが示された。また、臨床検体を用いた評価においても高い感度、特異度が示された。

97