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重金属の簡便な測定が可能である測定用セット一式（写真はカドミウム測定用）

環境中の重金属の濃度を簡単に測定するために─モノクロナール抗体を用いた重金属濃度測定方法の開発─
■ 重金属簡易測定へのニーズの高まり■ 簡易測定実現に向けた３つの新抗体■ 様々な重金属の簡易測定実現に向けて● ひとこと環境科学研究所 バイオテクノロジー領域 主任研究員

佐々木 和裕重金属簡易測定へのニーズの高まり
水俣病やイタイイタイ病など重金属が原因の健康被害は古くから知られており、環境中のカドミウム、六価クロム、鉛などの重金属には厳しい規制が設けられています。近年では重金属が生態系に及ぼす影響も問題視され、平成 15 年には水生生物の保全を主な目的として亜鉛の環境基準が設定されました。環境中の重金属の濃度を各基準で定める値以下に維持することは我々の健康と生態系を守る上で大変重要であり、そのためには適切に重金属の濃度を把握し、管理することが必要です。
これまで、環境中の重金属の濃度測定は主に大がかりな分析機器を用いて行われてきましたが、近年の規制の強化や国民の安全意識の高まりから、重金属の測定へのニーズは急激に増加しており、大がかりな分析機器だけでは、ニーズに十分応えられない状況となりつつあります。広大な工場跡地の汚染区画や大量に消費される作物の汚染検体を見つけ出すために、簡単で便利な測定方法が求められています。特に迅速性や優れたコストパフォーマンスも合わせ持った測定方法が必要となっています。
電力中央研究所では、そのような測定方法を実現するため、生物の抗原抗体反応に注目し、抗体が特定の重金属と反応する特性を活かして、反応の度合いから重金属を簡便に測定する方法であるバイオセンサーをこれまでに開発してきましたが、今般、バイオセンサーのさらなる活用を目指して、測定対象となる重金属を増やすための研究を行いました。

■実用化したカドミウム簡易測定■鉛測定用抗体の作製

抗体は生物の体内で起きる免疫に重要な役割を鉛と DTPA（ジチオールホスホアミダイド）果たす蛋白質です。
この抗体は体外からの物質（抗を結合させた抗原である Pb-DTPA と反応する原）に特異的に反応（抗原抗体反応）する性質抗体を作製しました。作製にあたっては、図１を持っています。この抗原抗体反応を利用した測で示すような流れで、Pb-DTPA と KLH（ス

定方法は、臨床検査などの医薬分野では広く活ガシ貝ヘモシアニン、タンパク質の 1 種）の複用されていますが、重金属の測定などの食品や環合体をマウスに注射し、このマウスから抗体を境分野での利用の例は限られています。当研究所

生産する脾臓の細胞を採取し、自己増殖をする

ではこれまでにカドミウムに反応する抗体の作製によ能力を持つミエローマ（注 1） と合体させたハイり、米に含まれるカドミウムを簡便に測定する方法

ブリドーマ（注 2）を数万個単位で作製しました。の開発に成功し、関西電力㈱および㈱住化分析セ数万個の中から、Pb-DTPA に優れた反応を示

ンターと共同で「カドミエール」の名称で商品化をす抗体を生産する細胞を選別することにより、しています（電中研ニュース 444 号参照）。

細胞を使った実用性の高い鉛測定用の抗体を作カドミウムにつづいて、それ以外の重金属を測定製することに成功しました。

するための実用的な抗体を開発することを目的とし鉛測定用の抗体の Pb-DTPA に対する解離定て、当研究所では、鉛、亜鉛及びクロムを測定するた数（注 3）は 0.01μM であり、0.01％以上の交差反めの抗体を作製し、その反応特性を評価しました。

応性（注 4） を示す金属は調べた範囲では存在せず、この抗体が優れた感度を持つことが分かり抗原の調整（金属錯体と蛋白の複合体の作製）↓
マウスの免疫（約 2 週毎に 3 ～ 4 回抗原を注射）↓
抗体生産細胞の作製（脾臓細胞とミエローマ細胞の融合）↓
抗体生産細胞の選抜（数万個の細胞から最も優れたものを選抜）↓
抗体生産細胞の単離・培養↓
抗体の分析・評価

図1

重金属測定用抗体の作成手順ました。また、鉛測定用の抗体の反応特性の評価のため、鉛の濃度測定を行った結果、検出できた下限値は約 0.6ppb で、10ppb という土壌環境基準に対応できることが分かりました。
（注 1）主に骨髄に生じる腫瘍細胞。
（注 2）脾臓細胞とミエローマが融合してできた自己増殖する抗体生産細胞。
（注 3）抗体の感度を示す値。単位は濃度。値が小さい程、高感度であることを示す。
（注 4）抗体が目的外の対象物に反応する割合。単位は％。

簡易測定実現に向けた３つの新抗体■亜鉛測定用抗体の作製■クロム測定用抗体の作製

亜鉛と DTPA を結合させた抗原である Zn-クロムは環境中では主にクロム酸または二クロDTPA と反応する亜鉛測定用の抗体を作製しム酸として存在する六価クロムと、これらを還元ました。作製の方法は、鉛測定用の抗体とほぼしたものである三価クロムとして存在していると考同様に行いました（図 1 参照）。亜鉛測定用のえられています。しかしながら、排水基準などで抗体の Zn-DTPA に対する解離定数は 0.3μM

は六価クロムとしての規制となっているため、六であり、銅と DTPA が結合した Cu-DTPA に価クロムのみを測定する必要があります。そこで、は約 20％の交差反応性を示したものの、それ当研究所では、まず三価クロムと EDTA（エチレ以外の金属については 0.32％以下でした。

ンジアミン四酢酸）を結合させた抗原である Cr-亜鉛測定用の抗体と亜鉛の反応は、図 2 のとEDTA と反応するクロム測定用の抗体を作製しおり、銅によって阻害されやすいものの、硫黄ました。作製の方法は、鉛測定用の抗体とほぼが組込まれたチオール基を含む分子の抗体との同様に行いました（図 1 参照）。クロム測定用の共存により、銅の亜鉛測定用の抗体との反応を抗体の Cr-EDTA に対する解離定数は 0.6μM で防ぎながら亜鉛との反応を起こせることが分かあり、鉄と EDTA が結合した Fe-EDTA とは約りました。この独自な方法により、試料に亜鉛24％の交差反応性を示したものの、それ以外のと銅が含まれる場合にも銅の影響を受けずに亜金属については 4.2％以下でした。

鉛の濃度測定を行うことが可能となりました。

このクロム測定用の抗体は三価クロムのみと反応

亜鉛測定用の抗体の反応特性の評価のため、するため、六価クロムを測定するには工夫が必要

亜鉛の濃度測定を行った結果、検出できた下限です。当研究所では試料から六価クロムを分別す

値は 6.5ppb であり、30ppb という水質環境基るカラム処理を利用しました。図 3 のとおり、カラム準に対応できることが分かりました。

処理により、六価クロムと三価クロムを含む試料から六価クロムのみを簡便に分別できることが分かりま

DTT非存在 Cu＋ DTPACu

Cu-DTPAを形成

DTT⇒ジチオスレイトール
Cu

DTT

Cu

DTT存在＋Cuは錯体形成できない
DTPA

図2DTT

DTPA （Znには影響なし）

亜鉛測定用抗体作製における工夫

Fe

2-Cr6+

Cr

3+

2-Cr3+

Fe3+

分離

Cr6+
2-Cr3+

還元

市販の亜硫酸Cr6+
キレートカラムナトリウムEDTAを加えて測定

Cr3+試料中に存在していた六価クロム濃度が推定できる。

図3用の抗体と三価クロムの反応を阻害する鉄も同時に除去できることが分かりました。しかし、分別した六価クロムはこのままでは抗体と反応しません。そこで、図 3 のとおり、抗体を亜硫酸ナトリウムと共存させることにより、六価クロムを三価クロムに還元しながら抗体と反応させることで、最終的に元々試料中2-Cr6+3+した。また、同時に、カラム処理によりクロム測定

六価クロム測定方法における工夫に存在していた六価クロムを抗体で測定することが可能となることが分かりました。
この独自の方法を用いたクロム測定用の抗体の反応特性の評価のため、クロムの濃度測定を行った
結果、検出できた下限値は100ppbであり、500ppbという排水基準に対応できることが分かりました。

様々な重金属の簡易測定実現に向けて■4つの重金属測定抗体への期待■今後の課題

今回紹介した鉛測定用、亜鉛測定用及びクロ

現時点ではまだ抗体を作製した段階ですが、ム測定用の３つの抗体は、重金属の濃度を測定

今後、今回紹介した３つの抗体を活用し、環境するバイオセンサーに適用する抗体として実用中の鉛、亜鉛あるいはクロムの濃度を簡便に測的な特性（反応感度）を有していることが分か定するためのバイオセンサーの開発を目指してりました。既に実用化したカドミウム測定用のいきたいと考えています。

抗体と合わせ、4 つの重金属に対する抗体が準また、土壌中の重金属の濃度測定にあたって備できたことになります。これらの抗体は各重は、測定を妨害する様々な物質が存在すること金属において環境や排水の基準以下の濃度を検が考えられます。そのため、測定対象となる土出できる特性があります。

壌の前処理方法を検討する必要があり、適切な特に、鉛とカドミウムについては、工場跡地などにおける土壌汚染物質として問題になっており、この分野での簡便な重金属の測定方法としての活用が期待されています。

土壌の前処理方法も合わせて開発していきたいと考えています。
さらには、測定の対象となる重金属を今回紹介したもの以外にも拡大することを目指して、新たな抗体を作製していきたいと考えています。

表

今回得られた抗体の感度と関連する基準値
各抗体の検出下限＊1

環境に関わる主な基準とその基準濃度

鉛0.6ppb

土壌環境基準＊2（10ppb）

亜鉛

6.5ppb

水質環境基準＊3（30ppb）

六価クロム

100ppb

排水基準＊4（500ppb）＊１：測定結果から求めた理論値＊２：土壌溶出液中の基準値＊３：水生生物の保全を目的として河川・湖沼において設定された水質環境基準＊４：一律排水基準における健康項目として定められた値● ひとこと近年、バイオセンサーの適用範囲が広がりつつあります
が、センサーの性能はそこに用いられる抗体の性質によって左右されると言っても過言ではありません。
環境科学研究所
バイオテクノロジー領域
主任研究員

佐々木和裕

抗体作製の面白さは、生物の機能を利用して未知の構造を持つ新しい分子を作り出すことにあると思います。

今後は、機能的に優れた抗体を迅速に作製する方法を開発し、新しい抗体を様々なバイオセンサーに応用することで世の中に役立てたいと考えています。

関 連

報告書

●「環境モニタリングを目的とした抗体の開発（５）―クロム、鉛、亜鉛に特異的に結合する抗体の作製―」
電力中央研究所報告：V08007

2009 年５月 11 日発行〒 100-8126（財）電力中央研究所 広報グループ
東京都千代田区大手町 1-6-1（大手町ビル 7 階） TEL.
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（03）3287-2863※この冊子は大豆油インキと
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