サイクリング・プローブ法による薬剤耐性インフルエンザウイルスの検出法の開発と応用○鈴木康司1、齋藤玲子1、 クライド ダパット1、イゾルデ ダパット1、鈴木貴子1、近藤大樹1、鈴木宏2

1新潟大学大学院医歯学総合研究科国際感染医学講座 公衆衛生学分野
2新潟青陵大学 看護福祉心理学部 看護学科

インフルエンザウイルスとはインフルエンザウイルス

M2タンパク
Mタンパク

核タンパク，核酸合成酵素

A型，B型，C型
A型インフルエンザウイルス

ヘマグルチニン（HA） ･･･1〜16種
ノイラミニダーゼ（NA）･･･1〜9種
ヒトの間での流行

新型A/H1N1
A/H1N1（ソ連型）
A/H3N2（香港型）
B型インフルエンザ

ヘマグルチニン
ノイラミニダーゼインフルエンザウイルスの治療薬
アマンタジン（商品名：シンメトレル、Am）

M2阻害剤。インフルエンザのM2タンパクのイオンチャンネルの機能を阻害し、インフルエンザの複製を防ぐ。A型インフルエンザのみに有効。
オセルタミビル（商品名：タミフル、Tm）

ノイラミニダーゼ（NA）阻害剤。インフルエンザのNAの働きを阻害し、インフルエンザの複製を防ぐ。
A型、B型どちらのインフルエンザにも有効。
内服タイプ。
ザナミビル（商品名：リレンザ）

NA阻害剤。Tmと同様にA型、B型どちらのインフルエンザにも有効。吸入タイプ。

ウイルスの増殖と抗ウイルス薬の作用ℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓ

×ℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓ ℓℓℓℓ ℓℓℓℓ ℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓ ℓℓℓℓ ℓℓℓℓ ℓℓℓ ℓℓ ℓℓℓ ℓℓℓℓ ℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓ
ℓ ℓℓℓ
ℓℓℓℓ
ℓℓℓ
ℓℓℓ
ℓℓℓ
ℓℓℓ

ℓℓ
ℓ ℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓ ℓℓℓℓℓ ℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓ ℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓ ℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓ ℓℓℓℓℓℓ ℓℓℓℓ ℓℓℓ ℓℓℓℓℓ ℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓ ℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓ ℓℓℓℓ ℓℓℓℓℓ ℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓ ℓℓ ℓℓℓℓ ℓℓℓℓℓ ℓℓℓ ℓℓℓℓℓ ℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓ ℓℓℓℓℓ
ℓ

NA阻害剤
•タミフル
•リレンザ
ℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓ ℓℓℓℓ ℓℓℓℓ ℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓ ℓℓℓℓ ℓℓℓℓ ℓℓℓ ℓℓ ℓℓℓ ℓℓℓℓ ℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓ ℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓ ℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓ
ℓℓℓ
ℓ

レセプター
H+イオン

M2阻害剤
•アマンタジン

ℓℓℓ
ℓℓℓ

×

ℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓ ℓℓℓℓℓℓℓℓℓ
ℓ ℓℓℓ
ℓℓℓ
ℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓ ℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓ
ℓℓℓ
ℓℓ

ℓℓ
ℓℓℓ
ℓℓℓ
ℓℓℓ

ℓℓ
ℓℓℓℓℓℓℓℓℓ ℓℓℓℓ ℓℓℓℓ ℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓ ℓℓℓℓ ℓℓℓℓ ℓℓℓℓℓℓ ℓℓℓ ℓℓℓℓ ℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓℓ ℓℓℓℓℓ

核薬剤への耐性変異
Amへの耐性変異
M2タンパクの膜透過部位のアミノ酸変異で耐性化（L26F、V27A、A30V/T、S31N、G34E）
Stouffer AL. Nature 2008;451:596-560

感受性
耐性薬剤への耐性変異
Tmへの耐性変異
NA活性部位のアミノ酸変異で耐性化（H275Y）

Moscona A. N Engl J Med 2009;360:953-956

感受性耐性

薬剤耐性ウイルスの発生動向
Am耐性変異（S31N）ウイルス2005-06年、A/H3N2でAm耐性ウイルスが急増し、世界的に流行2006-07年、A/H1N1でAm耐性ウイルスが増加
2009-10年、新型では全てがAm耐性ウイルス

Tm耐性変異（H275Y）ウイルス2007-08年、A/H1N1のTm耐性ウイルスが北欧を中心に流行2008-09年、本邦ではA/H1N1がTm耐性ウイルス（Am感受性ウイルス）2009-10年、新型はTm感受性ウイルス（散発的にTm耐性ウイルスが発生）

2005-06年以降、薬剤耐性ウイルスは世界的に流行し、薬剤耐性サーベイランスの重要性が高まっている

目的
薬剤耐性変異を持つインフルエンザウイルスの迅速なスクリーニング方法の開発-サイクリングプローブ法による一塩基置換検出半日程度で検出可能
適正な薬剤を選択するのに有効
治療の経過中にも耐性の有無を調べることも可能

対象
季節性 A/H1N1（ソ連型）
zAm耐性変異（M2-S31N）
zTm耐性変異（NA-H275Y）
季節性 A/H3N2（香港型）
zAm耐性変異（M2-S31N）

新型インフルエンザ （A/H1N1）
zAm耐性変異（M2-S31N）
zTm耐性変異（NA-H275Y）

サイクリングプローブ法とはQ ）とRNase H（9RNAとDNAからなるキメラプローブ（ FRNA
組み合わせによる高感度な検出法）の9増幅産物中の相補的な配列とプローブがハイブリッドを形成した後Q
Q（ F）にRNase HによりRNA部分で切断される（ F）
ことにより、強い蛍光（ Ｆ ）を発する
9この蛍光強度を測定することで、増幅産物量をモニターすることができる
9プロー ブのRNA部分がミスマッチであればRNase Hにより切断されることはないので、一塩基の違いも認識できる非常に特異性の高い検出方法

サイクリングプローブ法④熱変性→
プローブのアニーリングと切断遺伝子（DNA）
F
Ｆ

Q
F

Q

Q

Ｆ

①熱変性

F

F

②プローブのアニーリングと切断

Q
Q
Q⑤伸長反応と蛍光検出

Q

Ｆ

F

F

Q
Q

③伸長反応と蛍光検出
Ｆ

Q

Ｆ

Q
Ｆ

Q

サイクリングプローブ法‐一塩基置換の検出‐＊2種類の蛍光色素（FAMとROX）で感受性と耐性を検出＊
FAMを検出（感受性遺伝子）

感受性の遺伝子
FAM

Q

FAM

Q

FAMがマッチ
Q

ROX

FAM

Q

Q

ROXミスマッチ

RNase Hによる分解耐性の遺伝子
FAM

Q
Q

FAM
ROX

Q

ROXを検出（耐性遺伝子）

ミスマッチ
ROX
ROX

Q

ROXがマッチ

Q

Am耐性M2-S31N変異検出のプライマーとプローブ
a亜型

プライマーとプローブ

プライマーとプローブの配列 (5'-3')

位置

季節性 A/H1N1（ソ連型）

H1N1_MPF_primer

5'-GCTCTAGCACTGGTCTGAAA-3'696-715

H1N1_MPR_primer

5'-AGGCGATCAATAATCCACAA-3'

831-850b5'-(FAM )-TGCCGCAA G TA-(Eclipse )-3'

H1N1_N31 probe
H3N2_MPF_primerb

H3N2_MPR_primer

H1N1_S31 probe
季節性 A/H3N2（香港型）

d797-807

5'-(ROX )-TGCCGCAA A TA-(Eclipse )-3'5'-AGACCTATCAGAAACGAATG-3'cd797-807

5'-CACAGTATCAAGTGCAAG -3'818-835

c5'-(FAM )-TGCTGCGA G TA-(Eclipse )-3'

H3N2_N31_probe
H1N1pdm_MPF_primerb5'-(ROX )-TTGCTGCGA A TA-(Eclipse )-3'5'-TCCAGTGCTGGTCTGAAAG-3'796-807

H1N1pdm_MPR_primer

5'-TCCACAATATCAGGTGCAAG-3'818-836

cb5'-(FAM )-TGCAGCAA A TA-(Eclipse )-3'c

H1N1pdm_N31_probeb5'-(ROX )-GCAGCAA G TA-(Eclipse )-3'c

プライマーとプローブの位置は A型インフルエンザの M遺伝子（1027bp）に設定b
蛍光物質を標識したキメラプローブ（ RNA は太字の斜体で表記）
蛍光色素d

クエンチャーd

H1N1pdm_S31_probe
acd738-757b

H3N2_S31_probe
新型 A/H1N1c：耐性変異部位：RNA置換部位

dd796-807
698-716797-807798-807

実験フローチャート
RNA抽出EXTRAGEN Ⅱ （カイノス）のプロトコールに準じて行った

咽頭ぬぐい液，培養検体

RNA抽出

cDNA合成約45分

cDNA合成
M-MLV Reverse Transcriptase （invitrogen）を用いて行ったサイクリングプローブ法
CycleavePCR® Core Kit （タカラバイオ）のプロトコールに準じて行った

40cycle

約60分

95℃

95℃

00:10

00:05

72℃
55〜59℃

サイクリングプローブ法

約85分

00:10

合計約3時間で薬剤耐性変異ウイルスの検出が可能

00:15

H1N1（ソ連型）

H3N2 （香港型）

新型H1N1Fluorescence (Primary Curve)

Fluorescence (Primary Curve)

Fluorescence (Primary Curve)

Am耐性変異検出プローブとコントロールプラスミドの反応（FAM（変異なし；S31）とROX（変異あり;S31N））

S31
FAM
ROX

S31
FAM
ROX

ROX

ROX
FAM

Cycles

S31N
ROX
FAM

CyclesFluorescence (Primary Curve)

S31N

CyclesFAM

CyclesFluorescence (Primary Curve)

Fluorescence (Primary Curve)

Cycles

S31

S31N
ROX
FAM

CyclesH1N1（ソ連型）

新型H1N1

Fluorescence (Primary Curve)

Fluorescence (Primary Curve)

Tm耐性変異検出プローブとコントロールプラスミドの反応（FAM（変異なし；H275）とROX（変異あり;H275Y））

H275
FAM
ROX

H275
FAM
ROX

CyclesH275YROXFAM

CyclesFluorescence (Primary Curve)

Fluorescence (Primary Curve)

Cycles

H275Y
ROX
FAM

Cyclesコントロールプラスミドによる検出限界

H275
1×107
1×106
1×105
1×104

FAM

1×103
1×102
1×10
CyclesFluorescence (Primary Curve)

Fluorescence (Primary Curve)

新型H1N1（H275Y検出系）のプローブとコントロールプラスミドの検出限界

H275Y
1×107

ROX

1×106
1×105
1×104
1×103
1×102
1×10
Cyclesz新型A/H1N1用のプローブでは、10コピーのプラスミドまで検出可能であった。
z他のプローブでも同様の結果が得られた。

プローブの特異性
H275Y検出系のプローブと型、亜型間の特異性
プローブ
インフルエンザウイルス

NA遺伝子の変異

検体数
sH1N1-His275

sH1N1-Tyr275

H1N1pdm-His275

H1N1pdm-Tyr275

季節性 A/H1N1（ソ連型）-

1010000H275Y

1001000

新型 A/H1N1-

1000100H275Y

30003

季節性 A/H3N2（香港型）-

100000

B型インフルエンザ-100000

z季節性A/H1N1用のプローブでは、季節性A/H1N1のみに反応し、その他の型、亜型には反応しなかった。
z新型A/H1N1も同様な結果が得られ、Am耐性変異検出用のプローブでも同様の結果が見られた。

Am耐性変異S31N検出系の反応性
2007-2008

流行時期

2008-20092009-2010

亜型(検体の種類)A/H1N1(培養検体)

A/H3N2(培養検体)

A/H1N1(培養検体)

A/H3N2
A/H1N1pdm(培養検体) (培養検体と臨床検体)

検体数66968743334601

FAMプローブの検出数

245

0740

02

ROXプローブの検出数

411620333598

未反応検体数1363

11

プローブの反応率 (%)

98.1(656/669)

91.2(62/68)

99.6(740/743)

99.7(333/334)

99.8(600/601)

耐性ウイルスの頻度 (%)

62.7(411/656)

100(62/62)0(0/740)100(333/333)

99.7(598/600)

耐性ウイルスの頻度 (%)（シーケンスによる結果）

62.9(421/669)

100(68/68)

0(0/743)

100(334/334)

99.7(599/601)

z全てのシーズンを通しての亜型で検討すると98%以上の株で検出可能
A/H1N1 ：（1396/1414、98.9%）
A/H3N2 ：（395/402、98.3%）A/H1N1pdm ：（600/601、99.8％）

Tm耐性変異H275Y検出系の反応性
流行時期

2007-2008

2008-20092009-2010

亜型(検体の種類)A/H1N1(培養検体)

A/H1N1(培養検体)

A/H1N1pdm(培養検体と臨床検体)

検体数

385

743601

FAMプローブの検出数

382

0592

ROXプローブの検出数

0742

0

未反応検体数3

1

9

プローブの反応率 (%)

99.2(382/385)

99.9(742/743)

98.5(592/601)

耐性ウイルスの頻度 (%)

0(0/382)

100(742/742)

0(0/592)

耐性ウイルスの頻度 (%)（シーケンスによる結果）

0.4(3/669)

100(743/743)

0(0/601)z全てのシーズンを通しての亜型で検討しても98%以上の株で検出可能
A/H1N1 ：（1124/1128、99.6%）
A/H1N1pdm ：（592/601、98.5％）

まとめ
9サイクリングプローブ法を用いた薬剤耐性変異ウイルスの迅速で特異的な検出法を開発
9薬剤耐性株の発生頻度
流行時期

亜型

Am耐性頻度 [%] Tm耐性頻度 [%]2007-2008 季節性H1N162.90.4

季節性H3N2100-

2008-2009 季節性H1N10100

季節性H3N2100-

新型H1N199.702009-2010※耐性ウイルスは発生しているが、同時に2つの薬剤耐性になることは稀である。

既知の耐性変異ウイルスの検出には非常に有効
しかし未知の耐性ウイルス発生の可能性もあり、遺伝子型だけでなく表現型や臨床型についても注意が必要である

ちょっと紹介 -ミャンマーで分離された季節性H3N2のリレンザ耐性変異（Q136K）Q136

D151
Zanamivir

Zanamivir

R156

E276
K136
D151
Zanamivir
R156

NA
E276

136位のグルタミンは、156位のアルギニン及び、酵素活性中心の151位のアスパラギン酸と、水素結合ネットワーク（緑の破線）を形成している。 136位がリジンに変わることで水素結合が破れ、NA蛋白とザナミビルの複合体が安定的に形成されなくなる。→その結果、耐性化