川崎医療福祉学会誌
原Vol. 32

No. 1

2022

91 － 98

著

13

C呼気分析法を応用した線虫
Caenorhabditis elegans の短鎖脂肪酸代謝能の測定
三浦紀称嗣＊1

要

宮田富弘＊1

約

本研究では，短鎖脂肪酸であるプロピオン酸（Propionate：PA）の13C 同位体（[13C]PA）を投与した線虫 Caenorhabditis elegans （C. elegans ）に13C 呼気分析法を応用することで，C. elegans における PA の代謝能を測定する13CO2ガス分析法を開発した．線虫に [13C]PA を投与し，自作の13CO2ガス
分析装置に線虫を移して培養した後に装置内の空気を回収し13CO2/12CO2比を測定した．装置から回収された空気からは13CO2の出現が確認された．また，PA を投与した線虫において PA 代謝関連遺伝

子 acdh-1 の発現が有意に増加した．これらの結果から，13CO2ガス分析で確認された13CO2の出現は，投与した [13C]PA を線虫が摂取し，消化管での吸収，代謝を経て空気中に排出された CO2の濃度を反映していると考えられる．したがって，ヒトと類似した PA 代謝経路を有する C. elegans の PA 代謝

能について，13CO2ガス分析法を用いることで比較的簡便に非侵襲的かつ定量的に測定が可能である
ことが示唆された．本研究で開発した13CO2ガス分析法は，短鎖脂肪酸研究において有用な分析ツー
ルの一つになると考えられる．
PA 代謝経路を有する線虫 Caenorhabditis elegans

１．緒言
短鎖脂肪酸は脂肪酸の内，炭素数がおよそ6以下（C. elegans ）がモデル動物として用いられており，のものを指す．代表的な短鎖脂肪酸である酢酸・プ

Watson et al. の研究10-12）によって PA 分解経路に関ロピオン酸（propionate：PA）
・酪酸は，腸内細菌する遺伝子の転写レベルでの発現調節が明らかにさが食物繊維を発酵することで生成され，大腸上皮細れている．

胞から吸収された後にエネルギー源として利用されC. elegans は非寄生性の細菌食性線虫である．孵る．短鎖脂肪酸は脂肪蓄積の抑制やミネラル吸収の化後 L1幼虫期（L1），L2，L3，L4と幼虫の期間を促進などの機能性の他1,2），代謝経路や免疫系などを経て young adult，adult（産卵可能な成虫）と成長3）変化させること ，生体のエピジェネティックな変し，寿命はおよそ1ヵ月程度である．体長約1mm と化を誘導すること4,5）等が明らかになっている．また，多細胞生物の中でも小型であるが，他の高等動物

近年では大腸内で産生された短鎖脂肪酸，細胞外多と類似した機能をもつ組織を数多く有している13）．

糖類やテイコ酸などの細菌の構成成分が宿主の健康

特に，遺伝子の約60% 以上がヒトのオルソログでに寄与するとして，新たな「―バイオティクス」のあり14），遺伝子操作が比較的容易なことから，遺伝概念である「ポストバイオティクス」が提唱されて子機能の解析のツールとして広い分野に普及してい

6-9）

いる

．しかしながら，一部の短鎖脂肪酸の過剰なる．短鎖脂肪酸代謝の研究においても，変異体また蓄積は人体に毒性を示すことが知られており，先天は Ribonucleic acid（RNA）干渉テクニック15）によ性代謝異常症であるプロピオン酸血症は指定難病にる代謝関連遺伝子のノックアウトあるいはノック認定されている．ヒトの高プロピオン酸血症におけ

ダウン線虫を用いた毒性実験や Green Fluorescent

る PA 代謝経路を解析するために，ヒトと類似したProtein 実験が行われている16,17）．しかしながら，＊1 川崎医療福祉大学大学院

医療技術学研究科 健康科学専攻（連絡先）三浦紀称嗣 〒701-0193 倉敷市松島288 川崎医療福祉大学
E-mail : ws319003@kwmw.jp

91

92

三浦紀称嗣・宮田富弘

線虫において短鎖脂肪酸の代謝産物の量的な変化をライフステージを揃えるために同調化溶液（脱イオ

確認した報告は少ない．

ン水50mL，5% 次亜塩素酸ナトリウム溶液40mL，

そこで，C. elegans が最終代謝産物として生成

5M NaOH 10mL/100mL）を用いて同調化を行った．
２．３

した CO2を拡散によって大気中に排出することに
13

CO2ガス分析装置の構成と測定方法

13

注目した．すなわち， C でラベルされた標識化合135mL 容量の小型真空デシケーター（AS ONE

物（[13C] 標識化合物）を対象に投与して呼気中のCo.）のチューブコネクタおよびバルブにチューブ

13

CO2/12CO2比（Δ13CO2‰）を測定する13C 呼気分析を取り付け，密閉するためにチューブコネクタ側の法を線虫に応用することで，線虫においても代謝能チューブにコックを取りつけた．6cm シャーレにを定量的に測定できると考えた．実験動物である

作成したペプトンフリー NGM に [1-13C]PA を投与

13

ラットへの C 呼気分析法の応用が検討されており，
13した線虫を移し，直ちにデシケーター内に密閉して13

ラットに投与した [ C] 標識化合物由来の CO2が測測定まで20℃のインキュベータ内で培養した．バル

定可能であることが報告されている18）．本研究では，

ブ側のチューブに標準ガス（95% O2/5% CO2）入C. elegans の代謝能を測定する新しい分析法を確立

りバッグを取り付け，もう一方のチューブにシリンするために，13C 呼気分析法の線虫への応用方法にジを取り付けた．コックを開きながらシリンジでデついて検討した（以下，本研究で開発した分析方法

シケーター内の空気を回収し，呼気採取バッグ（大を13CO2ガス分析とする）．

塚製薬株式会社）に空気を約250mL 採取した．赤外線分光分析装置 POC one（大塚製薬株式会社）

２．方法に呼気採取バッグとベースラインとして標準ガス入

２．
１

りバッグを接続し，デシケーター内のΔ13CO2 ‰を

実験試薬[13C] 標識化合物には，[1-13C] プロピオン酸ナト

測定した（図1）．測定はΔ13CO2 ‰が陰性になるま

13

リウム（[1- C]PA, Cambridge Isotope Laboratories,

で繰り返し行い，測定値の総和（ΣΔ13CO2 ‰）にInc.）および [13C] 重炭酸ナトリウム（[13C]Bicarbonate：て各データの比較を行った．

[13C]BA, Cambridge Isotope Laboratories, Inc.）を

２．４

CO2ガス分析法を用いた13CO2の測定

136cm シャーレ上に75mM[13C]BA 100µL と0.5mol/L

滅菌生理食塩水で必要な濃度に調製して用いた．一12

般的な [ C]PA はプロピオン酸ナトリウム（和光純

硫酸（和光純薬株式会社）200µL をそれぞれの溶薬工業株式会社）を用いた．

液が触れないように添加した後，デシケーター内に２．
２ C. elegans の飼育方法

移して密閉した．その後，デシケーターを軽く傾け

C. elegans お よ び 飼 料 で あ る 大 腸 菌 OP-50はCaenorhabditis Genetics Center（University ofてデシケーター内の溶液を混和して反応させ，デMinnesota） か ら 入 手 し た． 線 虫 は OP-50を 塗 布析を行った．75mM[13C]BA 100µL のみを添加した

し た 線 虫 育 成 培 地（nematode growth medium：

シャーレをコントロールとした．

NGM）上で20℃のインキュベータ内で培養した．1

２．５ 大 腸菌 OP-50株が13CO2ガス分析結果に及シケーター内に13CO2を発生させた後，13CO2ガス分

ぼす影響

週間ごとに線虫が存在する培地の一部を切り取り，
新しい NGM 上に継代した．実験に用いる線虫は，OP-50をLB Broth Base
（Thermo Fisher Scientific）

Peptone-free NGM 培地 (Φ 6 cm)
デシケーター (容量 135 mL)
13

CO2

13

CO2

13

CO2

95% O2 / 5% CO2 標準ガス

呼気採取バッグ

13

C. elegans + [ C] PA

赤外線分光分析装置

図１

CO2ガス分析装置の構成

13

13

C 呼気分析法を応用した線虫の短鎖脂肪酸代謝能の測定

93を用いて37℃で一晩培養した．未処理の OP-50，

KH2PO4 4.0g，NaCl 5.0g/ 脱イオン水 1L）で回収

75℃の熱水で1時間加温処理した OP-50（75℃ HK

し て 同 調 化 し た 後，2000rpm で1分 間 遠 心 分 離 しOP-50），121℃で20分間オートクレーブ処理した

液量が100µL になるように上清を取り除いて L1幼OP-50（121℃ HK OP-50）をそれぞれ6cm シャーレ虫を含む懸濁液（L1懸濁液）を作成した．96wellに作成したペプトンフリー NGM に1枚当たり40µL

plate に1well あ た り L1懸 濁 液 を20µL，121 ℃ HK

塗布した後，
室温で24時間乾燥させた．75mM [1-13C]

OP-50を30µL 添加した培養液を L4幼虫に成長する

PA 100µL をシャーレ上に投与した後，直ちにデシまで20℃のインキュベータで培養した．それぞれケーター内に密閉した．インキュベータで20℃，72の well に最終濃度が50mM/150µL となるように75

13

時間培養後， CO2ガス分析を行った．

mM [1-13C]PA を100µL 投与した後，6cm シャーレ

２．
６

13

 CO2ガス分析を用いた C. elegans のプロに作成したペプトンフリー NGM に移して直ちにデ

ピオン酸代謝の測定

シケーター内に密閉した．デシケーターを20℃で72

NGM 上 の 線 虫 を M9 buffer（Na2HPO4 6.0g，時間培養後，13CO2ガス分析を行った．L1懸濁液を

表１ プライマーの配列
PCR primers
Gene

Forward

Reverseacdh-1

AAGCTGCAATGGCGAAACTG

ACCACCGAGCCATTTTACAC

alh-8

TCAGCCAAAATGCCAACAGC

ATCCACAGCTTGACAGTTGG

ech-6

GCCGCATTTTCAAGCAAAGC

GCGCACAAAGCATTCAAAGC

gob-1

AATTGGGCAGCTCTGTGAACTTCCAACCAACGCGAATTGC

gsy-1

TTGTGTTCGAATGCGCTTGG

ACTTCAAGCCGCCATTTTCC

hach-1

ACGCGTTGAACCTCGAAATG

AAAGATCGCACAACGGCAAG

hphd-1TTAAAAACGCCGAGCAAGCC

GCTTCGATTTGGCAAATGCG

mce-1

TTTCGCTGTCCACAAGAACC

ACAGCCTCGCTAACTTTTGC

mmcm-1AGGAGCAATGTGCCAAGTTG

TTGCATCCAACGCCTTTTGG

pcca-1TGTCGCGTGATCAAAACTGC

TTTGGCAGTTGGAGCTTCTC

pccb-1

AAAGTTTGCTGCTGGATGCCTGAAAGCATCGCAGAATCGG

pck-1

TGCACGATCCAATGGCAATGAAGATCTTTGGCGCCTTGTG

pfk-1.2

TCGGCAAGAAAGTGTGCTTCTTGCTTCAACAAGGGGATGCTGGAGCGTGATCAGAAGTTGTCTCCACCAATACTTGCGCTTCAG

tre-1

ATCCCAGCCGATTTAAACGC

TCACGCATTTCCCGTTTTGC

tre-2

AAAATCCGGTGGCAAGTTGCAAAGAGGCGAGCAGTTGAAG

tre-3

TATGAAACCGGCCACATGTG

TCCGTTGCTCCATCCAAATC

snb-1(internal control)

94

三浦紀称嗣・宮田富弘

M9 buffer に置き換えた培養液をコントロールとし

13

た．

３．３

２．
７

CO2の出現が確認されなかった（図3）．

プロピオン酸投与による C. elegans のプロ CO2ガス分析を用いた C. elegans のプロ

13

ピオン酸代謝の測定およびプロピオン酸代
謝関連遺伝子発現変化の確認

ピオン酸代謝関連遺伝子発現変化の確認
OP-50を塗布した NGM に同調化した L1幼虫を[1- C]PA を投与した C. elegans から13CO2の出現

添加し L4幼虫に成長するまで20℃で培養した後，が確認された（図4）．また，PA 代謝関連遺伝子のM9 buffer で 回 収 し 約1000匹 と な る よ う に15mL発現は，コントロールと比較して PA を投与した線チューブに分注した．PA を最終濃度50mM となる虫で acdh-1 の発現が有意に増加した（図5）．

13ように投与して20℃で24時間培養した．PA を M9
buffer に置き換えて培養した線虫をコントロール
3500

清を取り除いた．さらに M9 buffer で3回洗浄し，3000

液体窒素を用いて線虫を凍結させ乳鉢で粉砕した

2500

ΣΔ13CO2‰とした．培養後，2000rpm で1分間遠心分離して上後，RNeasy Plus micro kit（Qiagen）を用いて線虫から RNA を抽出した．ReverTra Ace qPCR RT
Master Mix with gDNA Remover（東洋紡株式会社）を用いて，抽出した total RNA 200ng を鋳型

2000
1500
1000
500

に complementary DNA を 合 成 し た．primer は0

PA 代 謝 関 連 遺 伝 子 で あ る pcca-1 ，pccb-1 ，mce-

1 ，mmcm-1 ，acdh-1 ，ech-6 ，hach-1 ，hphd- ，alh-8
を用いた
（表1）
．Emerald Amp PCR Master Mix（タ図２ND
Control

13

2[ C]BA＋硫酸

CO2ガス分析法を用いた13CO2の測定

13

カ ラ バ イ オ 株 式 会 社 ） を12.5µL，10µM forward
primer を0.5µL，10µM reverse primer を0.5µL，2500

cDNA を3µL，超純水を8.5µL を混合した後，逆転

2000

PCR 条 件 は94 ℃・2分，（94 ℃・30秒 間，55 ℃・30
秒間，72℃・1分間）×30サイクル，72℃・10分とした．PCR 産物は1% アガロースゲルを用いて0.5×

ΣΔ13CO2‰

写 Polymerase chain reaction（PCR） を 行 っ た．

1500
1000

TBE にて電気泳動した．泳動後，WSE-5300プリン

500

トグラフ CMOSI（アトー株式会社）にてゲル上の0

バンドを撮影し，画像解析ソフト ImageJ を用いてバンドの濃淡を定量化した．なお，遺伝子の発現量はハウスキーピング遺伝子である snb-1 の発現量をND
生菌

75℃ 1 時間 121℃ 20分

図３ 大腸菌 OP-50株が13CO2ガス分析結果に及ぼす影響

もとに正規化した．
３．結果
３．
１

350

CO2ガス分析法を用いた CO2の測定

13

13

300

75 mM[13C]BA を用いた13CO2ガス分析の結果を図密閉したデシケーターから回収した空気から13CO2の出現か確認された（ΣΔ13CO2 ‰±SE ＝2690.5±
340.3）
．
３．
２

200
150
100

大 腸菌 OP-50株が CO2ガス分析結果に及
13

ぼす影響
13

OP-50に [1- C]PA を投与すると，未処理の OP-50
13（ΣΔ CO2 ‰ ± SE ＝1997.4±262.4） お よ び75 ℃
HK OP-50（ΣΔ13CO2 ‰± SE ＝617.3±65.4）から
13

250

ΣΔ13CO2‰2に示した．硫酸と [13C]BA を添加したシャーレを

CO2の 出 現 か 確 認 さ れ た．121 ℃ HK OP-50で は

50

0

ND
Control

13[1- C]PA＋線虫

図４ 13CO2ガス分析を用いた C. elegans のプロピオン酸代謝の測定

13

C 呼気分析法を応用した線虫の短鎖脂肪酸代謝能の測定

*

1.0
0.8
(/snb-1)

Relative gene expression

1.2

95

0.6
0.4

0.2
0.0

pcca-1 pccb-1

図５

mce-1 mmcm-1 acdh-1

ech-6

hach-1 hphd-1

Control

50 mM プロピオン酸

alh-8

プロピオン酸代謝関連遺伝子発現変化の確認

設定して実験を行った．C. elegans は PA の代謝経４．考察
本研究では，C. elegans が排出した13CO2を13CO2路について，ビタミン B12に依存した代謝経路とビガス分析にて測定することで，短鎖脂肪酸の代謝能

タミン B12に依存しない代謝経路（シャント経路）

13を実測可能であることを証明した．まず，[ C]BAの2つを有しており（図6），PA が豊富な環境下でと硫酸を反応させてデシケーター内に13CO2を発生

はシャント経路での PA 代謝が優勢となる12）．シャさせ，その空気を回収して分析したところ，
デシケー

ント経路ではマロン酸セミアルデヒドからアセチル

ター内から回収した空気から高濃度の13CO2が検出-CoA に代謝される段階で CO2が生成される．さら13

された．そのため，作製した CO2ガス分析装置をにアセチル -CoA は TCA 回路で完全に代謝される

用いて13CO2を測定可能であることが確認された．

ため，最終的に PA を構成する炭素はすべて CO2とC. elegans の培養には一般的に非病原性大腸菌

OP-50株が飼料として用いられており，飼料である
13

OP-50が CO2ガス分析結果に影響を及ぼす可能性がなって体外に排出される．50mM PA 溶液で24時間培養培養した線虫の遺伝子発現を確認すると，プロピオニル -CoA をアクリリル -CoA に変換するアシ示唆された．実際に，OP-50の生菌に [1-13C]PA を

ル CoA デヒドロゲナーゼをコードする acdh-1 の発

13

現がコントロールと比較しておよそ1.2倍誘導され13投与したところ高濃度の CO2が検出された．[ C]13

BA の結果が発生した CO2を100% 回収した場合のた．また，C. elegans に [1-13C]PA を投与したとこ

値と仮定すると，OP-50から出現した13CO2の回収率

ろ13CO2の出現が確認された．C. elegans は PA をは約74% となることから，投与した [1-13C]PA の大消化管細胞で代謝することから17），13CO2ガス分析

部分を OP-50が代謝することが確認された．OP-50

装置内で確認された13CO2は，投与した [1-13C]PA をを75℃で1時間処理した OP-50においても [1-13C]PA

C. elegans が摂取し，消化管で吸収，代謝した結果の代謝が確認されたことから，本研究ではオートを反映していると考えられる．これらの結果より，クレーブで滅菌した OP-50を飼料として用いた．

本研究で開発した13CO2ガス分析法を用いることで，121℃ HK OP-50で培養した C. elegans は実験終了

C. elegans の短鎖脂肪酸代謝能の測定が可能である

後も活動していたことから，加熱処理された飼料がことが示唆された．近年は動物愛護の観点から実験

C. elegans の活動に及ぼす負の影響は少ないと考え動物の使用規制が強まっており，動物実験の対象にられる．しかしながら，過剰な殺菌処理は OP-50の含まれない C. elegans において比較的簡便かつ定

栄養価を低下させる可能性があるため，OP-50の適量的な代謝変化の検出を可能にする13CO2ガス分析

切な殺菌条件については今後検討する必要がある．

法は，短鎖脂肪酸研究において有用な分析ツールのまた，線虫の培養に必要な栄養素成分を含む液体培一つになると考えられる．また，この分析法は短鎖

地によって無菌的に培養する方法があり19,20），13CO2

脂肪酸のみならず最終的に CO2に代謝される物質でガス分析のより適切な条件を設定するために今後検あれば適用可能なことから，代謝関連遺伝子発現の討する必要がある．

変化が表現型（実際の代謝変化）に及ぼす影響を調C. elegans に CO2ガス分析を適用するにあたり，
1360mM 以上の高濃度では線虫の生存率が急激に低11）下することから ，本研究では PA 濃度を50mM にべるためのスクリーニングとしても有用であると考
えられる．

96

三浦紀称嗣・宮田富弘

Propionate

Propionyl-CoA

ech-6
3-Hydeoxy

D-Methylmalonyl-Propionyl-CoA
hach-13-Hydroxy

L-Methylmalonyl-Propionate-CoA
mmcm-1

hphd-1
Malonate

Succinyl-CoA

CO2

Shunt Pathway

-CoA
mce-1

(Vitamin B12-independent)(Vitamin B12-dependent)

pcca-1
pccb-1
Canonical Pathway

Acrylyl-CoA

acdh-1semialdehyde
CO2

alh-8

Acetyl-CoA

TCA cycle

図６ C. elegans のプロピオン酸代謝経路

文

献1）Hara H, Suzuki T, Kasai T, Aoyama Y and Ohta A：Ingestion of guar-gum hydrolysate partially restores
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The gut microbiota suppresses insulin-mediated fat accumulation via the short-chain fatty acid receptor GPR43.

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short-chain fatty acid pentanoate suppresses autoimmunity by modulating the metabolic-epigenetic crosstalk inlymphocytes. Nature Communications ，10（1），2019．

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10）Watson E, MacNeil LT, Arda HE, Zhu LJ and Walhout AJM：Integration of metabolic and gene regulatory
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13

C 呼気分析法を応用した線虫の短鎖脂肪酸代謝能の測定

9711）Watson E, Macneil LT, Ritter AD, Yilmaz LS, Rosebrock AP, Caudy AA and Walhout AJM：Interspecies
systems biology uncovers metabolites affecting C. elegans gene expression and life history traits. Cell ，156
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（2022年5月19日受理）

98

三浦紀称嗣・宮田富弘

Measurement of Short-Chain Fatty Acid Metabolismof Caenorhabditis elegans Using 13C Breath Test
Kiyoshi MIURA and Tomihiro MIYADA（Accepted May 19，2022）
13
Key words : Caenorhabditis elegans ，short-chain fatty acid，
propionate metabolism，
CO2 gas analysis

Abstract
In this study, we developed 13CO 2 gas analysis to measure the metabolic capacity of propionate (PA) in

Caenorhabditis elegans (C. elegans) using 13C breath analysis. 13C-labeled PA ([13C]PA) was administered to the worms,
and after transferring to a 13CO2 gas analyzer and culturing, the air in the analyzer was collected and the 13CO2/12CO2
ratio was measured. The appearance of 13CO2 was confirmed in the air collected from the analyzer. In addition, theexpression of the PA metabolism-related gene acdh-1 was significantly increased from the C. elegans to which PA
was administered. These results suggest that the appearance of 13CO2 confirmed using 13CO2 gas analysis reflects
the concentration of CO2 excreted into the air through absorption and metabolism in the gastrointestinal tract afteringesting the administered [13C] PA by worms. Therefore, it was suggested that the PA metabolic capacity of C.

elegans , which has a PA metabolic pathway similar to that of humans, can be measured by using the 13CO2 gas
analysis. This analysis can contribute to further understanding of the physiological effects of short-chain fatty acids.
Correspondence to : Kiyoshi MIURA

Doctoral Program in Health Science
Graduate School of Health Science and Technology
Kawasaki University of Medical Welfare
288 Matsushima，Kurashiki，701-0193，Japan
E-mail ：ws319003@kwmw.jp（Kawasaki Medical Welfare Journal Vol.32，No.1，2022 91－98）