2012 年 3 月号

NGRC ニュースNo. 3

東京農業大学 生物資源ゲノム解析センター

国際シンポジウム「Genome Research」を開催

1

表紙の説明シアノバクテリアの顕微鏡写真（左）とその環状ゲノム地図（中央）、及び次世代シーケンサーに付随する実験機器（右）とデータ解析用サーバー（裏表紙）。シアノバクテリアの形態変化観察には、光合成色素の自家蛍光（左上）や DNA 染色試薬（左下）など様々な手法が用いられます。そのゲノムは環状構造をとり、多数の遺伝子が高密度に分布しています。

2

CONTENTS「戦略的研究基盤形成支援事業」最終年度を迎えるにあたって................. 4
生物資源ゲノム解析センターのご紹介 ...................................................... 5国際ゲノムシンポジウムを開催して ...................................................... 6‑7
次世代シーケンサーによるタラバエビ類の網羅的遺伝子発現解析 ........... 8
日本型イネ品種「雄町」のゲノム情報を元にした
DNA マーカーの利用 ............................................................................. 9
次世代シーケンサーを用いた生殖細胞系列のDNA メチローム解析 ..................................................................... 10‑11
次世代シーケンス技術が解き明かすシアノバクテリアのゲノム小進化と DNA 複製機構 ...................................................... 12‑13
次世代シーケンサーによる新規微生物ゲノムの解析 ............................... 14
学内公募事業とその成果 .................................................................... 15‑21
研究発表実績 ...................................................................................... 22‑25
国際シンポジウム要旨........................................................................ 27‑39

3

NGRC ニュース No. 3「戦略的研究基盤形成支援事業」
最終年度を迎えるにあたって
さまざまなゲノム解析がようやく結実し始めたに対して有効に働いてきたことを示唆する興味深昨年度でしたが、今年度は 2 台のシーケンサーがいものです。ゲノムの小さい微生物に対する先駆

ほぼフル稼働し、データの排出量は膨大なものに的な試みと解析技術は高く評価されており、ゲノなりました。また、ゲノムを解読するだけでな

ム微生物学会での招待講演と今後のゲノム解析にく、ゲノム情報を利用して生物学的意味を探る新関するパネルディスカッションのパネリストに選しいステップの研究もいくつかの方面で始めるこ出されました。

とができました。昨年公開したイネゲノムに関し

学内公募研究では、オホーツクとの共同で行っては、「雄町」に続いて「五百万石」や「山田錦」

たタラバエビの発現解析が大変ユニークです。次など、酒米として非常に名高い品種も全ゲノム解世代シーケンサーはゲノムが未知の非モデル生物

析を終了しました。酒米に関しては世界一の実績の解析は本来得意ではありません。しかし、本研を挙げたセンターということができます。これま究では 2 個体群間の発現解析を行い、決定したで難しかった近縁のイネ品種間でも DNA マー

cDNA 配列のみを用いてアセンブルし、発現遺伝

カーを大量に見つけられるようになったことは、子を再現することによって候補遺伝子の発見に到

日本の農業の発展に大きく貢献したと言えます。

りました。これも新たな挑戦的テーマが成就した

さらに、今年度は「雄町」と「日本晴」間の一塩ものであり、今後、野生生物など他の非モデル生

基多型（SNPs）からタイピングアレイを作製し物へも応用が期待できる、本学らしい素晴らしいた結果、簡単に全領域での品種間の違いを検出で成果です。

きるようになりました。これも単にゲノム解析に

このように我が国有数のゲノムセンターと位置留まらない、発展的成果の代表例です。

づけられるまでに成長したこの機に、成果公表とゲノムサイズがヒト並みと大きいウシゲノムに世界の先駆的ゲノム研究者との交流を兼ね、平成

ついても挑戦的研究を続けています。昨年度の24 年 1 月 21 日に国際シンポジウムを開催しまし「口之島牛」に続き、今年度は山口県萩市の離島、た。佐々木実行委員長の記事にもありますが、国見島で飼育されてきた国の天然記念物「見島牛」

内外 11 人の招待講演者の顔ぶれは参加者から驚の解読を行いました。西洋種の影響を受けていなきを持って迎えられるほどの豪華さで、貴重な、い日本の在来牛は、「口之島牛」と「見島牛」のかつ充実した一日を過ごすことができました。

2 種類しか残っていません。したがって、これら

さて、本プロジェクトも残すところ一年余りとの配列を西洋種の既知ゲノムと比較すること、おなりました。ゲノムセンターの研究遂行能力は開よび、西洋種との交配により成立してきたいわゆ

設当初から飛躍的に向上しており、最終年度へのる黒毛和種と比較することにより、霜降り等の重期待は益々高まっています。解析規模によっては要な経済形質に関わる遺伝子や系統維持に必要なまだまだ十分、開始可能です。同時に、 次遺伝子の抽出に向けて解析を続けています。他の見据えて発展的に締めくくるには、これまでの成品種には見られない見島牛特異的な非同義置換は

果を広く公表することも求められます。学内公募

248 個（173 遺伝子）に絞られてきています。

研究の累積は畜産 5 件、バイオ 3 件、化学、醸を微生物チームの新たな試みは、進化の一側面で造、食品各 2 件、セラピー、栄養、アクア、生ある突然変異のパターン解析です。酵母を材料と産、アイソ各 1 件となっています。成果のまとめし、外界の環境圧力の代表として化学変異剤、そと論文投稿へ向けて加速して頂ければ幸いです。

して内在性要因として DNA 複製装置の変異株を用い、変異スペクトルを解析した結果、複製装置

ゲノムセンター世話人に起因する方がはるかに効率よく非同義置換をも

バイオサイエンス学科

たらすこと、また変異パターンに偏りが少なく、吉川博文（プロジェクトリーダー）

より多様性に富んでいることを見出しました。こ河野友宏

れらの結果は、内在性要因の方が進化のプロセス

矢嶋俊介

4

教授

NGRC ニュース No. 3

東京農業大学生物資源ゲノム解析センターは、文入されたイルミナ社の「HiSeq 2000」は導入後も部科学省の平成 20 年度私立大学戦略的研究基盤形

試薬・ソフトウェアの改良により性能がさらに向上成支援事業として採択された「革新的ゲノム情報解し、ゲノムの大きな動植物に威力を発揮していま析を用いた生物資源ゲノム解析と農学新領域の創す。特長の異なる 2 台の機種を併用することで、出」プロジェクトの一環として、東京農業大学の全

効率的な運用を行っております。

学組織として新設されました。
生物資源ゲノム解析センターには、イルミナ社の研究を支える情報解析システム

ゲノム解析装置が設置され、装置のオペレーターな

2 台の次世代シーケンサーから排出される膨大ならびに情報解析や個別テーマの研究に関わる研究員

塩基配列情報を処理するためには、それらを解析すが常勤スタッフとして活動しています。

るコンピュータシステムにも高い性能が要求されまセンターは東京農業大学の世田谷キャンパスに設す。今年度新たにメモリ容量 500 GB の計算サーバ、置され、運営に当たっては総合研究所の支援のもディスク容量 50 TB のストレージサーバを導入し、と、センター長である大澤学長以下、世田谷・厚ゲノムの大きな動植物向けの解析能力を増強しまし木・オホーツク各キャンパス所属の教員による管理た。当センターでは現在 5 台の計算サーバを有し、運営委員会を設置して行っています。また、解析課

総メモリ容量 1.2 TB、総ディスク容量 150 TB とい

題については、センターの主要課題の他に、学内にうスペックではありますが、それでも大規模な動植

広く公募して共同研究を行い「ゲノム農学」と呼ぶ

物ゲノムの解析には、かなりの計算時間を要します。

にふさわしい、農学新領域の創出に向けて取り組ん

インターネット上での研究成果の公開にも力を入でいます。

れています。当センターのホームページから、「口之島牛」、日本型イネ品種「雄町」のゲノム情報を次世代シーケンサーについて格納したデータベースが閲覧でき、今年度発表され現在 2 台の次世代シーケンサーが稼働しておりた論文に関するデータも公開しています。また、当ま す。 イ ル ミ ナ 社 の「Genome Analyzer IIx」 は、センターと厚木キャンパス、オホーツクキャンパス

前機種の II と比較して得られるデータ量が約 1.5

がネットワークで接続されており、3 キャンパスで倍に増え、操作性も向上しており、主として微生物の共同研究を支援するシステムを構築しています。

等の小規模解析に使用しています。また、昨年度導（志波優）

イルミナ社 HiSeq 2000

生物資源ゲノム解析センタースタッフ

5

NGRC ニュース No. 3

国際ゲノムシンポジウムを開催して招待講演者と実行委員会の先生方

東京農業大学ゲノム解析センターは文部科学省・いしました。また同時に、ゲノム解析センターを利私立大学戦略的研究基盤形成支援事業の支援をうけ用して研究を行っている学内の先生方や大学院生のて平成 20 年度に設置され、最新鋭の自動塩基配列

方々によるポスター発表が行われました。

装置（シーケンサー）を 2 台購入し、また、得らシンポジウムは 1 月 21 日（土）に品川コクヨ

れる配列情報の解析等を行う研究スタッフを雇用すホールで開催されました。当日はあいにくの雨模様

ることにより、学内の動物・植物・微生物に関するの天気でしたが、173 名の参加があり、そのうち多くのゲノム解析研究課題を主担当あるいは分担し

52 名は学外の方々でした。このことからも当日のて遂行しています。これらの成果は著名な国際誌等

プログラムに学内外から高い関心がよせられたことに論文として発表、あるいは国内外の学会等においがわかります。基調講演は国立遺伝学研究所て口頭発表しており、当センターの活動は広く知ら

堀孝教授と米国コールドスプリングハーバー研究所

れるようになってきました。一方、この間、ゲノム

Richard McCombie 博士により行われました。

塩基配列情報の獲得技術あるいはこれを利用して生物の遺伝子機能を解析する手法は大きく進歩しています。例えば、第三世代シーケンサーとよばれる、現在の機種よりも更により速く、より大量に、かつより長く配列を読むことができる装置の開発、そのようにして獲得される大量の配列情報の高速処理を行うための新しいコンピューターソフトウェアの開発、あるいは配列情報を利用して新たな遺伝解析や分子生物学的解析に用いる研究の展開などが挙げられます。今回の国際シンポジウムではこのような分野で研究の最前線にたって世界をリードしておられる国内外の研究者を 11 人お招きしてご講演をお願

五條堀先生による基調講演の様子

6

五條

NGRC ニュース No. 3
五條堀教授はゲノムシーケンスにより大量に得らめにも今回のシンポジウムは参考にすべき点が多れる情報の適切な解析に欠かせないバイオインフォ

く、ゲノム解析センター一同関係者の皆様方にお礼

マティクスの重要性を述べられ、McCombie 博士は申し上げますとともに、心を新たにして一層の努力

遺伝子領域に特化したシーケンス解析方法を含めたを傾注したいと考えています。

最新のゲノムシーケンス解析法の紹介を行われました。その他 9 人の先生方の招待講演では、ヒトの遺伝病あるいは孤発性の病気について原因遺伝子を解明する新たな手段としての全ゲノムアソシエー
ション解析の有効性（Aarno Palotie 博士）、マウス
卵母細胞における後天的なシトシンのメチル化修飾と遺伝子発現の関連（Gavin Kelsey 博士）、鳥類の進化とゲノム構造の特徴（David Burt 博士）、ウシ
ゲノム情報を利用した 1 塩基多型（SNP）の収集（杉本喜憲博士）、ネムリユスリカの乾燥耐性と遺伝子の相関（黄川田隆洋博士）、カイコが桑葉を唯一

McCombie 博士の質疑応答の様子の食草としている生理的理由の解明（嶋田透教授）、
植物の病気防御に関わる遺伝子を制御しているマイ
クロ RNA の特徴（Blake Meyers 教授）、リン欠乏・
過剰ストレス条件下でのイネ発現遺伝子の網羅的解析（大野陽子博士）、およびピロリ菌におけるゲノ
ム構造の動的再編と病原性の関係（小林一三教授）が発表されました（プログラムおよび講演・ポス
ター発表要旨は本ニュース、27 〜 39 ページに掲載
されています）。

東京農大の研究成果に関するポスター発表の様子

東京農大の研究成果に関するポスター発表の様子

以上のように今回の国際ゲノムシンポジウムでは広範囲な生物のゲノムシーケンス情報をどのように利用して更に研究を進展させるのかといった観点か

コクヨホールでの講演の様子

ら講演が行われました。農大ゲノム解析センターは来年で開設 5 年目を迎えます。従来以上に優れた成果を挙げ更に多くの研究者に利用していただくた（シンポジウム実行委員長・佐々木卓治）

7

NGRC ニュース No. 3

次世代シーケンサーによる
タラバエビ類の網羅的遺伝子発現解析
オスからメスへの性転換を行う
タラバエビ類
タラバエビ類は寒海で最も漁獲されている甲殻類です。タラバエビ類の特徴として、性転換をすることが知られています。生まれてからしばらくは未成
熟なオスの状態で、オスとして成熟し繁殖に参加した後、今度はメスに性転換して繁殖に参加します。
漁業においては大型の個体が優先的に漁獲されていますが、このエビはオスからメスへの性転換を行う
ため、体サイズへの選択性は性選択的に作用するこ

図1とになります。つまり、体の大きなメスほどその集

ホッカイエビとその卵（左上）団から漁獲によって除去されることになります。こありません。そこで本研究では、決定した cDNAの漁獲による性比の歪みの結果、有効集団サイズのの配列のみを用いて縮小が起き、持続的漁業の障害となることが懸念されたコンティグを転写の単位として、発現しているれます。

遺伝子を再現することにしました。このデータを基

これまでの研究から、タラバエビ科のホッカイエ
ビ（assembly を行い、得らに、アセンブリに基づく方法とマッピングに基づく）において、生息環境はほぼ方法で個体群間の発現量比較を行いました。いずれ等しいものの、遺伝的交流が乏しい 2 つの個体群の方法においても発現量に 2 倍以上の差が確認さで卵サイズに変異が認められており、漁獲圧との関れた遺伝子は 29 見つかりました。これらのうち機連が示唆されています。これらの個体群は、マイク

能性のタンパク質をコードする遺伝子配列は 9 つ

ロサテライトマーカーを用いた解析により、遺伝的あり、卵における発現や機能が他の生物で報告されに分化していることも明らかになりました。

ているものも複数ありました。
本研究は、次世代シーケンサーを用いることで、

RNA-seq による 2 個体群間の発現比較

配列データの少ない非モデル生物における網羅的発本研究では、遺伝的に分化し、卵サイズに変異の現解析、個体群間での遺伝子発現の比較を行い、卵認められるこのホッカイエビの 2 つの個体群を対サイズという形質の多様性に関わる可能性のある遺象に、卵サイズという形質の差異に関わる遺伝子を伝子候補を同定することができました。今後、野生同定することを目的としました。次世代シーケン生物など他の非モデル生物においても、集団間の形

サーを用いて RNA-seq 解析を行い、個体群間で遺質の差異に関わる遺伝子の同定等への応用が期待で伝子発現を網羅的に比較しました。

きます。

成熟メス卵巣由来の RNA を、個体群ごとに 5 個

本研究は学内公募により生物産業学部千葉晋先体分プールしてライブラリを作製し、発現している

生、和田健太先生との共同研究として実施されまし

遺伝子の配列を決定しました。通常のトランスクリ

た。 ま た 成 果 の 一 部 は 国 際 誌

プトーム解析ではゲノム配列へのマッピングにより

6:e26043）に掲載されました。

（2011,

発現遺伝子の種類と量を解析します。しかし、ホッ川原玲香 （生物資源ゲノム解析センター）

カイエビやその近縁種においては未だゲノム配列が和田健太 （生物産業学部

生物生産学科）

明らかになっておらず、既存の配列情報がほとんど

千葉

アクアバイオ学科）

8

晋 （生物産業学部

NGRC ニュース No. 3

日本型イネ品種「雄町」のゲノム情報を元にした DNA マーカーの利用
これまで、次世代シークエンサーを用いて日本の新規 DNA マーカーの探索

在来品種「雄町」のゲノム解読を終了し、国際プロ

次世代シークエンサーによる解析は、近縁品種間ジェクトで明らかになった「日本晴」ゲノムの配列

以外の多くのイネ品種でも新規 DNA マーカーの探と比較して、DNA マーカーの一種である 1 塩基多索に効力を発揮します。現在、「山田錦」などの新型（SNP）や遺伝子の挿入欠失が 16 万ヶ所以上あたな酒米品種の他にフィリピン、中国など様々な国ることを報告しました（http://www.nodai-genome.

の品種について解析を行って日本のイネ品種との違

org/oryza̲sativa̲en.html で閲覧可能）。

いと類似性を明らかにしつつあります。今後、これらの情報も順次公開していく予定です。

DNA マーカーの重要性
従来の育種法では、親品種を交配して得られた後代の形質を調査して、希望する形質を持つ個体を選抜しますが、収量や耐病性などの作物として重要な形質の多くは気温、日照などの環境条件により大きく影響されるため、正確な選抜が困難な場合や、多数の個体を収穫まで育てる必要があります。これに対し、希望する形質を担う有用遺伝子に関連する
DNA マーカーを指標に個体の選抜を行うことができれば、成育時期や環境の変化に影響されることな

図1

く早期の選抜が可能となります。次世代シークエン

DNA アレイ作製のために選んだ SNP の位置

12 本の染色体上で約 500 kbp 離れた場所を選択し、サーでは、全ゲノム配列の解読が短期間で行えるこ

緑の線で表している。

とから、容易にゲノム情報を得られるようになりました。得られたゲノム情報を比較することで、「雄町」と「日本晴」間のように、これまで難しかった
近縁の品種間でも DNA マーカーを大量に見つけられるようになりました。

タイピングアレイの利用
次世代シークエンサーを用いて得られた大量の「雄町」「 日 本 晴 」 間 の SNP（132,462 個 ） か ら、
ゲノム上に分散する 577 個を選抜し（図 1）、タイ

図2

ピングアレイを作製しました。このタイピングアレ

タイピングアレイを利用した染色体 1 番における結果の例

イを用いると一度に全領域での違いを検出すること

SNP タイプが「雄町」のものをピンク、「日本晴」

ができます（図 2）。酒米を含む 32 品種について解のものを緑で示してある。横軸に SNP マーカー、縦析したところ、これらの遺伝的類縁関係を明らかに軸に品種を並べている。

したり、酒米以外の日本稲品種と酒米を分類することができました。このタイピングアレイは、今後、

八田真理 （生物資源ゲノム解析センター）

酒米形質の遺伝解析や育種の効率化に寄与するもの

吉瀬祐子 （生物資源ゲノム解析センター）と思われます。

若狭

9

暁 （生物資源ゲノム解析センター）

NGRC ニュース No. 3

次世代シーケンサーを用いた生殖細胞系列の DNA メチローム解析
次世代シーケンサーの登場：
個々の DNA メチル化解析から
DNA メチローム解析へ
近年登場した次世代シーケンサーは、ゲノム解析
のみならず、生命現象を明らかにする様々な解析への応用が可能です。その一つが
解析

DNA メチローム

図1で す。DNA メ チ ロ ー ム と は、 エ ピ ジ ェ ネ

DNA メチローム解析用の DNA ライブラリー
作製法

ティックな修飾である DNA のメチル化状態をゲノ
ムワイドに解析した情報のことを指します。DNA
メチル化に異常が起これば、先天性疾患、がん化、（MethylC-seq）を改良し、1000 個単位の細胞から不妊などの重篤な問題を引き起こすことが知られてで も 可 能 な 新 た な ラ イ ブ ラ リ ー 調 整 法（Whole

います。これらの異常の原因を正確に特定・診断す

Genome Ampliﬁcation sequencing: WBA-seq）を考るためにも、DNA メチル化を広範囲に調べること案しました（図 1）。この方法により、卵子・精子は不可欠です。

ともに包括的な DNA メチル化マップを作製することが可能となりました。

本センターでは、次世代シーケンサーを用いてマウス全ゲノムレベルでの DNA メチル化を解析することに成功しました。これらの得られた情報は web

マウス生殖細胞の DNA メチル化上で公開しています。研究の成果はオンライン科学

マップの作製雑 誌「

私たちは C57BL/6 純系マウスの精巣上体尾部由（2012,8:e1002440）」に掲載

来 の 精 子、 な ら び に 卵 核 胞 期 の 卵 子 か ら ゲ ノ ム

されました。

DNA を回収し、BSS 用の DNA ライブラリーを作
注）この研究は東京農業大学が基盤研究（S）補製しました。本センターが所有するイルミナ社の助金の支援を受け、東京大学、国立成育医療セン

Genome Analyzer II 、HiSeq 2000 により、それら

ター、広島大学との共同研究により実施されましのライブラリーの大規模シーケンス解読を行い、各た。

生殖細胞の DNA メチル化マップを作製することに成功しました（図 2）。DNA メチローム解析の結果、

微量サンプルからの DNA メチル化

精子はゲノム全体にわたり高メチル化状態（平均メマップの作製

チル化：89.4%）である一方、卵子では高メチル化・DNA メチル化マップを作製する上で重要となる

低メチル化状態に二分しており、全体として中程度のは、解析対象となるサンプル（細胞、組織など）のメチル化状態（40.0％）であることが明らかとなからいかに効率的に DNA ライブラリーを調整する

り ま し た。 一 方 で、 哺 乳 類 ゲ ノ ム 中 に 散 在 す るかという点です。特に哺乳類の卵子は採取できる数

CpG アイランド（CpG 配列が密な領域）の解析でが極めて少なく、一般的なライブラリー調整法ではは、むしろ卵子で高メチル化な領域が精子で高メチ

卵子の DNA メチル化マップの作製は不可能でした。

ル化な領域より多く、またゲノムインプリント制御

しかし、私たちはバイサルファイトショットガン

領域における精子・卵子での明確なメチル化差異がシ ー ケ ン ス（BSS） 用 の ラ イ ブ ラ リ ー 調 整 法

確認できると同時に、1329 の卵子型メチル化差異

10NGRC ニュース No. 3
チロームマップとトランスクリプトームマップを作製しました。

欠損卵子では特定のレトロト

ランスポゾンを除いてほぼ全ゲノムレベルでの低メチル化（平均メチル化：5.5%）が見られる一方、トランスクリプトームは野生型の卵子のそれとの大きな違いは見られませんでした。また、野生型卵子で見られた Gene-body メチル化と、ほぼすべての母性ゲノムインプリントは欠損ではほとんど見られなくなりました。このことから、は受精後に必要となる母性ゲノムインプリントを
Gene-body メチル化とともに確立する機構に必須な
遺 伝 子 で あ る こ と が 示 さ れ ま し た。 一 方 で、に非依存的なレトロトランスポゾンのメチ
ル化は、減数分裂期の染色体対合に必須と考えられます。このように卵子のメチル化は、卵子形成そのものに関わる
図2

卵子・精子の DNA メチロームマップ

非依存的なメチル化と、受精後の胚発生に必須なゲノムインプリント機構に関わる依存的なメチル化に分けられることが提言できました。
領域（DMR）と 349 の精子型 DMR を同定しました。さらに同じく次世代シーケンサーを用いた各生

さらなる生殖細胞の DNA メチローム

殖細胞のトランスクリプトーム解析（mRNA-seq）

解析に向けての結果、マウス精子において mRNA 転写量と転写

独自に改良した BSS 法により卵子などの少量の開始点のメチル化（Promoter メチル化）に強い負細胞からも解析が可能となり、現在、初期の生殖細の 相 関 性 が 見 ら れ る 一 方、 マ ウ ス 卵 子 に お い て

胞の DNA メチロームマップを作製しています。精mRNA 転写量と遺伝子内のメチル化（Gene-body

子・卵子における DNA メチル化の詳細な確立機構

メチル化）に強い正の相関性が見られました。このと役割を明らかにすることは、生殖細胞の新たな評ようにマウスの精子と卵子間ではまったく異なるメ

価基準を設ける上でも重要なステップといえます。

チル化分布を示すことが初めて明らかとなりましまた、日本には同様の解析を十分にできる環境がまた。

だ少なく、このような解析法の開発と普及は卵子だ
けではなく初期腫瘍や特定部位の細胞などの解析がDNA メチル化関連因子の役割極めて困難な検体の解析にも貢献するでしょう。
小林久人 （応用生物科学部 バイオサイエンス学科）

さらに私たちは、卵子型のメチル化インプリントを欠く

河野友宏 （応用生物科学部 バイオサイエンス学科）

遺伝子欠損マウスの卵子の DNA メ

11

NGRC ニュース No. 3

次世代シーケンス技術が解き明かす
シアノバクテリアのゲノム小進化とDNA複製機構
シアノバクテリアは地球上で最初に酸素発生型の光合成を始めた生物であり、海水、淡水、陸上、または他生物との共生状態など極めて多様な自然環境に棲息しています。スピルリナなど食用にされている種も多数いますし、またアオコや水の華と呼ばれ水中で大発生して水質汚染を引き起こす種も存在す
るなど、環境問題や農業・水産業とも密接に関わっている生物です。1996 年に全生物で 4 番目に全ゲ
ノム情報が解読されたシネコシスティスという種をはじめ、多数のシアノバクテリアが光合成やバイオ
マス物質生産などの研究分野で用いられています。
東京農業大学では次世代シーケンサーを用いたシアノバクテリアのゲノム解析を通じて農学分野・基礎

図1

科学分野への貢献を進めています。

シネコシスティス sp. PCC 6803 の様々な亜系
株の歴史的系譜とその変異

橙色の株についてリシーケンス解析を実施した。
個々の株が固有の変異を蓄積している実態がゲノムレ

リシーケンス解析によって明らかになった

ベルで明らかになった。

亜系株間のゲノム配列の不均一性の問題
過去にゲノム解読が終了したシアノバクテリアの
うち、シネコシスティスやシネココッカスなどの種の結果は今後のバクテリアを使った分子生物学的研の DNA 配列情報はデータベースに登録され世界に究におけるリシーケンス解析の重要性、必要性を改広く公開されています。しかし世界中の研究機関でめて示すものです。また本成果により、リシーケン

用いられている個々の菌株には、解読された標準菌

ス解析によるゲノム上の変異部位同定手法の解析技

株とは局所的に異なる DNA 配列や突然変異の痕跡

術的基盤も確立できました。本結果は国際誌（2012, 19: 67‑79）に掲載されました。

が多数あることは経験的に広く知られています。こ
うした DNA 配列の相違の問題は分子生物学的研究をおこなう上で非常に厄介な問題です。そこで我々

シアノバクテリアの DNA 複製機構

はシネコシスティス sp. PCC 6803 という株につい細胞が増えるためにはあらかじめゲノムを複て、次世代シーケンサーを用いた研究室株のリシー

製 、 分配ケンス解析を実施しました。標準菌株と研究室株とす。多くの生物は、この一連の現象を厳密にコントの DNA 配列の相違、即ち変異の蓄積によるゲノム

ロールすることで、細胞あたりのゲノムの数を 1の小進化の歴史をゲノムワイドに解明しようというセットに維持しています。一方で世の中には細胞あ試みです。

たり複数セットのゲノムを持つ生物も見つかってい

した後に

分裂

する必要がありま

その結果、研究室で使われている株、フランスのます。シアノバクテリアもその一種です。しかし、研究機関で冷凍保存されている株、そしてデータ

シアノバクテリアの複数セットのゲノムがどのようベース上の DNA 配列には、予想以上に多数の違いにが存在することが明らかになりました（図 1）。こた。私たちのグループでは、次世代シーケンサーを12複製しているのかは分かっていませんでしNGRC ニュース No. 3
使ってシネココッカスというシアノバクテリアの複製機構を明らかにしました。以下に、研究の一部をご紹介します。
次世代シーケンサーはゲノムを読むだけでなく、ゲノム中のそれぞれの領域の DNA 量の増減についても調べることができます。この特徴に注目し、ゲノム複製が開始する領域を見つけました。シネコ
コッカスは光合成で生きているので、明るい場所でしか増殖しません。新規合成された DNA を標識化合物で標識して DNA の合成活性について調べてみると、DNA の合成も明所でしか行わないということがわかりました。次に、標識した DNA のみを分離し、これを次世代シーケンサーによって定量的に解析しました。シーケンスによって得られたリード（ゲノム中に新しく取り込まれた標識 DNA に相当
します）を参照ゲノム配列上に貼り付けていくと、明所で培養した時のみ特定の領域にリードが集中的に張り付きました（図 2）。一方、暗所で培養した

図2

シアノバクテリアの光依存的な複製場合では全くピークは検出されません。また、明所

新規合成された DNA を標識後、免疫沈降法によりで培養する時間を延ばすことで、このピークは高単離し、次世代シーケンサーを用いて解析した。得られた配列をシネココッカスのゲノムにマッピングし、く、幅広くなりました。ピークの位置は複製が起

複製開始領域、複製様式を決定した。

こっている領域、すなわち複製の開始領域を示し、ピークが幅広くなったということは複製が両方向に進むということを示しています。この結果から、シ

明 し た 初 め て の 事 例 で す。 本 研 究 成 果 は 国 際 誌

アノバクテリアの複製の開始領域と、複製反応が複（2012,) に掲載されま

製開始領域から両方向に進むという事実が明らかにした。

なりました。また、別の研究から複数セットのゲノ

兼崎 友 （生物資源ゲノム解析センター）

ムは一斉に複製せず、細胞間、ゲノム間で非同調的

渡辺 智 （応用生物科学部 バイオサイエンス学科）に複製するということもわかりました。本研究は、吉川博文 （応用生物科学部 バイオサイエンス学科）

シアノバクテリアゲノムの複製開始点を実験的に証13

NGRC ニュース No. 3

次世代シーケンサーによる新規微生物ゲノムの解析
表1

生物資源ゲノム解析センターが設置されてからのゲノム配列の再構築

4 年間でシーケンスした微生物サンプルは 650 に上り、その 1/3 が新規ゲノムの配列決定です。私たち が 解 析 に 用 い て い る イ ル ミ ナ 社 の Genome
Analyzer IIx で は 200‑500 bp 程 度 に 断 片 化 し た
DNA の両端を 100 bp ずつ読み取ることができ、プ
ログラム処理により短い配列情報から元の長い配列を再構築します。ゲノムには多くの繰り返し配列が存在するため、数 Mb ほどのサイズしかないバクテリアであっても完全に再構築することは難しい状況です。ゲノム配列が決定済みの枯草菌で検証を行う

バクテリアを利用する発酵食品の製造工場ではと 142 本のコンティグにまとまり、1 kb より大きファージによる汚染が深刻な問題となります。

な 21 本のコンティグでゲノム全体の 98.6％がカ枯草菌に感染するファージ SP10 のゲノム解析をバーされました（表 1）。ゲノムの全体像を把握す行った結果、約 144 kb の配列に 236 個の ORF がるにはドラフト配列で十分なことも多く、詳細な解見つかりました（図 1）。また、枯草菌 Marburg 株

析を進める上で重要な手掛かりになっています。

が持つ制限系

MR の認識配列（CTCGAG）が

SP10 ゲノムに 36 箇所あることが明らかとなり、
MR によってファージの感染を阻止しているこ

枯草菌ファージ SP10 のゲノム配列決定
ファージとはバクテリアを宿主にするウイルスのとを確認しました。本研究成果は英文科学誌（2011, 75: 944‑952）に掲載さ総称です。ファージが感染して増殖するとバクテリれました。

アは死んでしまいます。納豆やヨーグルトのように

図1

SP10 の ORF マップ

兼崎友 （生物資源ゲノム解析センター）

松本貴嗣 （生物資源ゲノム解析センター）志波優 （生物資源ゲノム解析センター）

吉川博文 （応用生物科学部

14

バイオサイエンス学科）

NGRC ニュース No. 3

平成 23年度
1．桑山岳人（農学部

新規学内公募一覧

畜産学科）「ニワトリの就巣行動発現制御遺伝子の特定」
2．三井裕樹（農学部

バイオセラピー学科）「ダイコンのゲノム解析と遺伝子データベースの構築」
3．喜田聡（応用生物科学部

バイオサイエンス学科）「記憶能力向上を示す CREB 活性型変異マウス群のトランスクリプトーム網羅的解析」
4．中川純一（生物産業学部

食品香粧学科）「食品微生物、生物化学、品質管理学研究室の有用微生物のゲノム解析」
5．中川純一（生物産業学部

食品香粧学科）「フコイダン分解性の海洋乳酸菌と海洋性細菌の探索」
6．坂田洋一（応用生物科学部

バイオサイエンス学科）「ヒメツリガネゴケのアブシジン酸応答に関わるシグナル活性化因子の探索」
7．笠原浩司（応用生物科学部

アイソトープセンター）「出芽酵母をモデルとする真核生物の新規転写開始制御機構の研究」
8．田村倫子（応用生物科学部

栄養科学科）「酵母のアミラーゼ発現調節機構に関する研究」
9．貝沼章子（応用生物科学部

醸造科学科）「酢酸菌におけるゲノムスケールでの系統解析の試み」

学内公募その成果▶▶▶ 野生ウシ バンテン のシークエンス

─遺伝資源としての保全と活用─ ◀◀◀

【目的】バンテン（）は東南アジアに生息する野
生ウシの一種である。アジア大陸に分布するビルマバンテン（）
、インドネシア・ジャワ島に分布するジャワ
バンテン（）
、そしてボルネオ島に分布するボルネ
オバンテン（）の 3 亜種に分類されている。森林の伐採やアブラヤシ・プランテーションなどの開発に伴う生息地の消失や分断化、角や肉を目的とした密猟などにより個体数が激減し、国際自然保護連合のレッドリストにおいてバンテンは絶滅危惧種に指定されている。また、バンテンは家畜ウシにおいて失われた抗病性や耐暑性などの遺伝特性があると考えられ古
くから家畜化も行われており、遺伝資源としての価値も有する。
ボルネオ島北部に位置するマレーシア・サバ州では 500 頭前後が生息していると推定されている。現在、生息地や個体数の減少問題に加え、家畜ウシとの交雑も懸念されており、地域個体群ごとの遺伝的集団構造や家畜ウシとの遺伝的撹乱の把握は、本種の域内保全を考えるうえで重要である。しかし、これまでバンテンの遺伝子情報はビルマバンテンとジャワバンテン
に関するもののみで極めて限定的である。
そこで本研究は、サバ州に生息するボルネオバンテンの遺伝的集団構造の把握と有用遺伝子の検索を行うために、バンテンの全ゲノム塩基配列を決定することを目的とする。
【計画】バンテンの保全：サバ州内の野生バンテン個体群の糞からゲノム DNA を抽出する。常染色体のマイクロサテライ
ト、ミトコンドリア DNA のチトクローム b および D-loop、な15

らびに Y 染色体の SRY 領域を PCR 増幅し、その塩基配列を解析する。DNA 多型を活用して、サバ州内での分布域、家畜
ウシとの交雑、地域個体群の遺伝的構造を明確にし、サバ州におけるバンテンの具体的な保全計画に資する。
バンテンの活用：バンテンの歯髄および筋肉組織からゲノム
DNA を抽出する。次世代シークエンサーを用いて全ゲノムを解析する。得られた配列情報を、欧米乳肉用種、ならびに和牛
および日本在来牛と比較し、家畜ウシの経済形質向上に資する
有用遺伝子多型を検索する。
【経過】多型解析用のゲノム DNA 試料を 150 検体、ならびにシークエンス用のゲノム DNA 試料を 1 検体分、それぞれ調整した。現在、多型マーカーによる家畜ウシとの交雑の有無の確認、および遺伝的集団構造の解析に着手している。
これまでに、チトクローム b および D-loop の塩基配列からそれぞれ 3 および 2 種類の対立遺伝子を検出すると共に、ボル
ネオ亜種は他の亜種よりむしろ他の野生ウシ種との近縁性が示唆される一方、供試したボルネオ亜種個体は家畜ウシと交雑していないことを確認した。また現在、ゲノムセンターにて全ゲ
ノム配列を解析中である。
松林尚志（Universiti Malaysia Sabah）
半澤 惠（農学部 畜産学科）
Abdul Hamid Ahmad（Universiti Malaysia Sabah）
覚張隆史（東京大学）

NGRC ニュース No. 3▶▶▶ ニホンウズラの免疫応答ならびにストレス応答関連

遺伝子領域の高密度シークエンシング ◀◀◀

【目的】我々はニホンウズラ（）の抗菌ペプ
確認すると共に、計 5 つの多型マーカーを構築し HT を解析しチド（DEFB、NK-lysin）、自然免疫抗原提示分子（TLR）、主た。
要組織適合性複合体領域抗原分子（MHC）、白血球抗原分子 【業績】
原著論文
（CD）、熱ショックタンパク質（HSP）などを含むコスミドク
ローンおよびハプロタイプ（HT）を確定した LR-PCR 産物を横山佳菜・朝治桜子・鈴木進悟・細道一善・原ひろみ・吉田豊・多数保有し、それらの 1 部の塩基配列をサンガー法で決定して水谷豊・藤原哲・椎名隆・半澤惠、2012、ニホンウズラ CD1
いる。今回は次世代シークエンサーにより、これら抗原遺伝子
遺伝子領域の多様性解析、DNA 多型 20、印刷中。
およびその発現調節領域の DNA 多型を解析することを目的と
している。
学会発表
1．横山佳菜・朝治桜子・鈴木進悟・細道一善・椎名隆・水谷【計画】MHC 領域：HT 毎に、コスミドクローンの塩基配列
豊・ 藤 原 哲・ 万 年 英 之・ 原 ひ ろ み・ 吉 田 豊・ 半 澤 惠、を決定し、それらを比較解析することで、組換え領域を推定す
20110328、ニホンウズラ CD1 遺伝子座の多様性解析、日本
ると共に、その機序を考察する。また保有する免疫関連表現型
家禽学会 2011 年度春季大会（中止、講演要旨のみ発行）講の多様性との関係を解析する。DEFB、NK-lysin、TLR、CD：
遺伝子構造を明確にし、機能を考察すると共に、その多様性を演要旨 pp.5。
2．横山佳菜・朝治桜子・鈴木進悟・細道一善・原ひろみ・吉規定する候補領域を検索する。HSP：発現調節候補領域の塩基
田豊・水谷豊・藤原哲・椎名隆・半澤惠、2012032X、ニホ
配列を HT 間で比較する。HSP90AA1 の RT-PCR 産物の塩基配列から、スプライスバリアントに対する熱ショックの影響をンウズラ CD1 遺伝子領域の多様性、日本畜産学会第 115 回
明確にする。それらを比較解析することで、HSP の熱ショック
大会（於名古屋大学）講演要旨印刷中
応答性転写の多寡をもたらす転写調節領域を明確にする。
原ひろみ（農学部 畜産学科）【 経 過 】MHC の ク ラ ス I 亜 領 域（D1 〜 C4）、DM 亜 領 域
鈴木進悟（東海大学）（DMB2）および TRIM 亜領域（BTN2）、ならび DEFB 領域、
椎名 隆（東海大学）
TLR2 あるいは TLR4 を含有する、計 8 つのコスミドクローンの塩基配列を解析した。遺伝子重複領域のコンティグ作成に活細道一善（遺伝学研究所）
半澤 惠（農学部 畜産学科）
用した。また、TRIM 亜領域および CD1 亜領域のシンテニーを▶▶▶ 老化がウシ卵子に及ぼす影響とその制御方法に関する研究 ◀◀◀
加齢による繁殖能力低下は、哺乳動物共通の現象である。ヒ
トでは繁殖能力低下が 30‑40 歳の 10 年以上にわたり起こる。
我々は、繁殖寿命が長く、しかも大型の哺乳動物である牛を用いて加齢が卵子に及ぼす影響について検討している。平成 23
年度は、初期胞状卵胞卵子を用いて加齢の影響を検討した。卵子ではミトコンドリア DNA コピー数の低下が観察され、体外発育した卵子の体外受精後の発生能力も低下していた。顆粒層細胞では、グルタチオン含有量の低下が確認された。次世代
シーケンサーを用いた遺伝子解析では、加齢個体に由来する顆
粒層細胞で発現の異なる遺伝子が多数確認され、その中には、
抗酸化関連の遺伝子が含まれていた［1］。また胞状卵胞の顆粒層細胞においても、テロメアの短縮、低メチル化や増殖活性の低下が確認され［2］、抗酸化能力の減退や酸化ストレスの上昇が観察された［3］。胞状卵胞卵子の体外成熟前後、および体外受精後の 8 細胞期胚を対象に次世代シーケンサーを用いて遺伝子解析を行った。その結果、加齢によって発現が異なる遺伝子を多数同定した。これらの中には、本年度に加齢個体に由来する卵子や胚で確認された異常［4］と関連付けられるものが多く含まれており、この結果は第 53 回哺乳動物卵子学会［5］に発表予定である。

16

1．Endo M, Kawahara R, Goto H, Monji M, Kuwayama T, Kono
T, Iwata H. The Second World Congress in Reproductive
Biology (Cairns, Australia)
2．Goto H, Iwata H, Takeo S, Nisinosono K, Murakami S,
Monji Y, Kuwayama T. Zygote. 2011 Jul 27: 1‑9.
3．第 53 回哺乳動物卵子学会（千里ライフサイエンスセンター）
発表予定 竹尾駿、後藤大也、木村康二、岩田尚孝、門司恭典、桑山岳人
4．Goto H, Iwata H, Takeo S, Murakami S, Monji Y, Kuwayama
T. The Second World Congress in Reproductive Biology(Cairns, Australia)
5．第 53 回哺乳動物卵子学会（千里ライフサイエンスセンター）
発表予定 岩田尚孝、川原玲香、後藤大也、竹尾駿、桑山
岳人、門司恭典、河野友宏
岩田尚孝（農学部

畜産学科）

NGRC ニュース No. 3▶▶▶ ニワトリの就巣行動発現制御遺伝子の特定 ◀◀◀
就巣性はニワトリに限らず、鳥類が種族保存のためにあまねく保持する母性行動の 1 つですが、就巣行動の発現は産卵数を減少させるため、長年に亘る選抜育種により一部の卵用鶏種から排除されました。ただ、それらの卵用鶏種からの就巣性の排除は、その発現制御遺伝子を特定することによるものではなく、産卵成績と就巣行動の発現状況の記録による選抜育種によりなし得た成果です。従って、それらの選抜育種を実施してこな
かった一部の肉用鶏種や七面鳥などでは未だ就巣性が排除されていません。しかし、世界の動物性タンパク質の供給状況を考えると、卵用鶏種ほど就巣性の排除が重要視されなかった家禽においても、動物性タンパク質の供給源としての役割は今後益々増大していくものと考えられます。そこで私たちは、鳥類の就巣行動発現制御遺伝子を特定し、就巣性を排除することにより効率的な家禽の生産性に貢献しようと考えました。
本研究では、まず就巣性を保持しない白色レグホーン種（卵用鶏種）と就巣性を保持する名古屋種（卵肉兼用鶏種）、岐阜
地鶏（天然記念物）、烏骨鶏（天然記念物）の全ゲノムの塩基配列を比較し、就巣性を保持しない種に共通する変異、就巣性を保持する種に共通する変異を同定します。ここでは、他品種間の比較となるため、就巣性保持の有無に限らず、他の表現型の違いや品種の違いに由来する変異も同定される可能性があります。
そこで、就巣行動を発現しない個体も存在する名古屋種と岐阜地鶏を用いて、就巣行動を発現する個体と発現しない個体とに分けて比較をすることにより、特異的な変異を同定することが出来れば就巣行動発現にかかわると考えられる変異を同定できる可能性があります。
さらに、品種間で得られた変異と品種内で得られた変異を比較して、就巣性を保持しない白色レグホーン種のみにある変異の中から、名古屋種や岐阜地鶏において就巣性を保持しない個体に共通している変異を絞り込むなどの解析を行うことで、就巣行動発現に関わると考えられる変異を絞り込んでいく予定で
す。

岐阜地鶏

川原玲香（生物資源ゲノム解析センター）
神作宣男（麻布大学）
中村明弘（愛知県農業総合研究場）
吉村 崇（名古屋大学）
桑山岳人（農学部 畜産学科）▶▶▶ ダイコンのゲノム解析と遺伝子データベースの構築 ◀◀◀
ダイコン（学名、アブラナ科ダイコン属）は古来より日本人に最も親しまれてきた野菜の一つであり、食用、薬用、救荒作物として全国各地の風土や暮らしと密着して多種多様な品種が栽培されてきた。特に、米文化と結びつくことで、白米や糠と合わせて調理・加工され、和食や郷土食を多彩に発展させた。ダイコ
ンは養分の少ない土地でも育ち、ほぼ周年で栽培可能で、短い栽培
期間（1 〜 2 カ月）で収穫に至り、食用となる根部・葉ともに栄養価に富むという優れた農作物である。ダイコンは大きく、太く、深く根を地中に下ろす特徴的な植物である。根の伸長が 2 メートルまで達する守口大根や、直径 50 センチメートルにも肥大する桜島大根をはじめ、根部の肥大・伸長性には驚くべき多様性が見られる。
さらに、含有成分（辛味、糖、デンプンなど）や表皮の色（白・赤・紫・緑・黒・黄）もさまざまであり、生理学、分子生物学、遺伝学、進化学など、生物学的な研究対象としても興味深い。本プロ
ジェクトは、ダイコンのゲノムを世界で初めて解読し、データベースを構築することで、ダイコンのゲノム研究の基盤を確立することを目的としている。
現在、東京農業大学生物資源ゲノム解析センターと農業生物資源研究所を拠点として、ダイコンの新規ゲノムシーケンスを進めている。代表的な栽培品種である青首系大根の 1 系統から核 DNA を抽出し、イルミナ社とロシュ社の次世代シーケンサーを用いて全ゲノム（約 500 Mbp）の 100 倍程度の配列長を得ることを目標としてシーケンスを行っている。参照配列のない新規ゲノムの解読である
ため、出力される配列の長さや量の異なる 2 機種のシーケンサーを組み合わせて、断片配列をつなぎあわせるアセンブル作業を効率的に行っていく。得られたゲノムのドラフト配列は、すでにゲノム解析が進んでいる近縁なハクサイや、モデル植物であるシロイヌナズ
ナのゲノムと比較し、遺伝子機能の予測、ゲノムの全体構造の比較、

17

ダイコンに特徴的な遺伝子群の探索を行う。ゲノム情報が公開されている植物種との網羅的な比較解析を行うデータベースを現在構築しており、平成 24 年中の公開を目指している。本研究によりダイコンのゲノム解析の基盤が確立されることで、品種・系統間で多様な形態や性質のちがいをうみだす分子メカニズムの解析が飛躍的に進展すると期待される。

三井裕樹（農学部 バイオセラピー学科）
八田真理（生物資源ゲノム解析センター）
志波 優（生物資源ゲノム解析センター）
片寄裕一（農業生物資源研究所）
下村道彦（三菱スペース・ソフトウェア）
佐々木卓治（総合研究所）
和久井健司（短大 生物生産技術学科）

NGRC ニュース No. 3▶▶▶ 酢酸菌におけるゲノムスケールでの系統解析の試み ◀◀◀
している位置にある 6 属の解析を行ったところ、いずれもコン
ティグ数、解析深度、ゲノムサイズ等について良好な結果が得られ、目的とする解析に充分な精度を持つゲノム情報が得られた。これらのドラフトゲノム配列に、公開されている 5 属のコ
ンプリートゲノム配列を加えた計 11 属について、全ての属で共通に保存されているオルソログ遺伝子を抽出し（約 600）、それらを concatenate した配列について 16S rRNA 配列と同様の手法による系統解析を行った結果、表現型を強く反映した系統樹が得られた。この際、bootstrap 値は、全ての分岐点において100 となり、本系統解析の信憑性が非常に高いことが示唆された。ゲノム情報より、16S rRNA 配列による系統と表現型等に差異が生じる原因についても推測が可能であり、今回用いたゲ
ノムスケールでの手法は、酢酸菌の分類および系統を考える上で非常に有効であった。現在、さらに株数を増やし、より網羅
的に酢酸菌のゲノムレベルでの系統解析を進めている。本法による考え方は、酢酸菌科の微生物に留まらず、広くバクテリアの分類および系統解析について一石を投じると考えている。

酢酸菌は、酢酸菌科（Acetobacteraceae）に属する偏性好気性のα−プロテオバクテリアの総称である。酢酸菌は、特徴として細胞膜上に多くの脱水素酵素を有しているが、これらの酵素は同じく細胞膜上に存在する電子伝達系と連動しており、細胞外にアルコールや糖が存在した場合、これらを基質とした酸化反応により細胞内に ATP を生成する。この酢酸菌特有のエ
ネルギー代謝により、菌体外には基質の酸化生成物が蓄積されていくが、この現象は一般に酸化発酵と言われ、種々の物質生産に応用される重要な現象となっている。中でも特に基質がエタノール、すなわち生成物が酢酸の場合を酢酸発酵と呼び、これが食酢醸造の原理となって、酢酸菌を重要な産業微生物たらしめている。
酢酸菌科には、現在、産業上重要な 3 属（属、属、属）を含む 28 属が存在する。これらの属は、基本的にはバクテリア分類の定石に則って設置されているが、酢酸菌特有の易変異性という性質のため、一部定石を逸脱し系統に混乱を生じている。一般にバクテリアの分類
は、16S rRNA 配列の類似性および各種表現型や DNA-DNA 相
同性の結果を総合して行っている。しかし、酢酸菌は他のバクテリアと比較して表現型が変異し易いため、16S rRNA 配列に基づく系統と、表現型や DNA-DNA 相同性との間に乖離を生じ、現在の分類基準では整理困難な部分が発生している。このため、16S rRNA 配列では新種レベルのものが新属として設置されるケースも発生しており、酢酸菌の分類・系統解析に関する方法論を考え直す必要性が生じているのが現状である。
我々は、この解決策として、ゲノム情報に基づいた解析手法の導入を試みた。現在、酢酸菌についてコンプリートゲノム情報が公開されているのは 5 属のみであるため、それ以外の属については本学ゲノムセンターの次世代シークエンサーによる
sequence を行った。試験的に、16S rRNA での系統上混乱◀酢酸菌 Acetobacter pasteurianus（山口大学 松下一信教
授提供）

貝沼章子、
石川森夫、小泉幸道（応用生物科学部 醸造科学科）
吉川博文（応用生物科学部 バイオサイエンス学科）
志波 優（生物資源ゲノム解析センター）
松下一信、松谷峰之介（山口大学農学部）▶▶▶ 酵母のアミラーゼ発現調節機構に関する研究 ◀◀◀
微生物が生産する酵素は、食品工業において広く利用されている。当研究室ではネパールの餅麹からアミラーゼ産生酵母のを分離した。
をはじめとする多くの酵母はアミラーゼ分泌能が無く、これをコードする
遺 伝 子 も 有 さ な い が、やといった一部の酵母は、グルコアミラーゼや
α‑アミラーゼを産生することが知られている。しかし酵母におけるアミラーゼ発現制御については、において制御因子が 1 つ明らかにされているに過ぎず、ほとんど解明されていない。一方、カビ類であるの産生するア
ミラーゼは、古くから酒醸造などで広く利用されており、分子レベルでのアミラーゼ発現制御機構が解析されている。
が分泌するα‑アミラーゼ（PBA）をクローニング
したところ、全長 494 残基で、と 60％、と 47% の相同性であった。また、グルコース培地では PBA を分泌しないが、デンプン培地やマルトース培地で PBA を分泌し、さらにマルトースの 10％をグルコースに置換した培地においても PBA を分泌した。そこで、酵母のアミラーゼ発現制御機構を明らかにすることを目的として、次世代シークエンサー
を用いたの全ゲノム配列の解読を行った。
解読されたシークエンス配列を対象に、カビおよび酵母における既知のカーボンカタボライト抑制因子に類似の配列をサーチした。
属のα‑アミラーゼ発現は、転写促進因子である AmyR と抑制因子である CreA が直接的に遺伝子のプロ
モーターに結合することで制御されている。しかしに は 両 因 子 に 相 同 性 の 高 い 配 列 は 存 在 し な か っ た。 よ っ て属とは異なるカーボンカタボライト抑制機構の存在が予測された。
属のカーボンカタボライト抑制機構に着目すると、マルターゼ発現を促進する因子である SUC1.2、1.4、
1.5、さらに抑制する因子である MIG1 および MIG2 が染色体上に存在している。MIG1 は広域転写調節因子として知られ、においてはマルターゼとともにスクラーゼ遺伝子の転写抑制にも関与する。
においてはα‑アミラーゼ遺伝 子 の 発 現 も 抑 制 す る。の ゲ ノ ム に は SUC1.5、
MIG1、MIG2 に 約 70 ％ 類 似 の 配 列 が そ れ ぞ れ 存 在 す る。のマルターゼ、スクラーゼ転写調節は、これらの因子を含めた数十の因子が相互作用することで成り立つことが明らかにされている。今後、のゲノム配列をもとに、α‑アミラーゼの転写調節機構を解明したいと考えている。

ネパールの餅麹

Pichia burtonii

村 清司（応用生物科学部
田村倫子（応用生物科学部

18

栄養科学科）
栄養科学科）

NGRC ニュース No. 3▶▶▶ 資源生物工学分野における有用微生物のゲノム解読 Ⅱ

─微生物における過酸化物還元酵素の多様性─ ◀◀◀

資源生物工学研究室では、自然界からのスクリーニング、もしくは保存株の中からの表現型からの検索から、有用な原核微生物と真核微生物を数多く保有している。酸素は微生物の生育に影響を与える最大の環境要因のため、保有株には多様な活性酸素防御系を持つ菌群が存在する。活性酸素は食細胞の殺菌作用や、シグナル伝達に関与する有用な面もあるが、過剰に存在すると各種疾病の原因となり寿命の決定要素にもなっている。
なかでも過酸化水素は、細胞障害性が強いヒドロキシルラジカ
ル（ OH）を生じるため、過酸化物分解は生体維持の重要反応である。過酸化物分解酵素としては catalase が古くから知られているが、最近では多様な過酸化物還元酵素が見いだされている。
本報告ではまず、生化学データを微生物系統樹から検討し、新たにゲノム配列に基づく解析を行った。その結果、好気性菌に多様な過酸化物酵素（hem-catalase, 各種 peroxidase, AhpFAhpC（Prx））のタンパク、遺伝子分布が観察された。偏性嫌気性菌は酸素存在下で生育が阻害される菌群の総称であるが、同菌群にも好気性菌と異なる多様な過酸化物分解酵素が分布している。嫌気性下で生育するが、酸素存在で生育可能菌群を通性嫌気性菌と呼ぶ。この菌群には好気性菌と嫌気性菌に存在する過酸化物分解酵素系が多く含まれている。そのなかにはヘム
タンパクを欠如するため、独自に進化した過酸化物分解酵素
NADH oxidase (Nox)- AhpC (Prx) が通性嫌気性菌に見いだされた。NADH oxidase は、酸素代謝に関与し、さらに AhpC（Prx）タンパクと共同して過酸化物分解にも関与し、特異な高速反応性を示した。
の過酸化物分解酵素系 NADH oxidase (Nox)-AhpC（Prx）系は、現在の peroxiredoxin reductase ファミリーに属している。本酵素系は酸素還元活性を持つが、同ファミリーには●

過酸化アルキル分解酵素として発見された AhpF が含まれており、好気性菌から嫌気性菌まで広く分布している。ヘムタンパ
ク欠如の嫌気性菌、通性嫌気性菌には AhpF, Nox-AhpC（Prx）の他、過酸化物分解酵素として、NADH peroxidase（Dolin, 1957）Mn-catalase（河野ら、1983）、嫌気性菌では多酵素複合系による NADH peroxidase 反応系が報告されている。しかし AhpF, Nox-AhpC（Prx）系を除くと、好気性菌から、通性嫌気性菌、偏性嫌気性菌に存在する酵素系は見いだされなかった。そこで同酵素遺伝子を中心に、微生物系統進化とタンパク進化との関係を解析した。

Amphibacillus xylanus 電子顕微鏡写真

望月大地（応用生物科学部 バイオサイエンス学科）
田中尚人（応用生物科学部 菌株保存室）
石川森夫（応用生物科学部 醸造科学科）
遠藤明仁（Functional Foods Forum, University of Turku, Turku, Finland）
佐藤純一（応用生物科学部 バイオサイエンス学科）
川崎信治（応用生物科学部 バイオサイエンス学科）
新村洋一（応用生物科学部 バイオサイエンス学科）▶▶▶ Fructophilic LAB の糖代謝の特性 ◀◀◀
近年、グルコースよりフルクトースを生育基質として好む乳酸 菌 fructophilic Lactic Acid Bacteria（fructophilic LAB） の存在が報告されている 1）。その 1 つである属細菌
は花や果実に生息し他の fructophilic LAB とは大きく異なる性質を有することが知られている。それは、グルコースを基質とした際にフルクトースやピルビン酸、酸素等の生育基質以外の生育因子を必須とするという性質や、培養条件によらずエタノールを産生せず酢酸を産生するという性質である 2）。本属細菌と近縁のヘテロ発酵型乳酸菌は一般に乳酸と共にエタノールも産生する。乳酸菌の糖代謝によるエタノールの産生は NAD/
NADH の酸化還元バランスの維持のために重要な役割を果たしているが、エタノールを産生しない本属細菌は独特の糖代謝経路や酸化還元のバランス維持機構を有することが考えられた。
そこで、ゲノム解析により本属細菌の糖代謝の特性を検討し、乳酸菌の新たな応用利用への可能性を探ることとした。
属の 5 種（）の各基準株のドラフトゲノム配列を決定し、近縁の属の公開ゲノムとの比較ゲノム解
析により属の糖代謝経路の特性を調べた。その結果、本属のゲノムは属が保持するヘテロ型乳酸発酵に関連する遺伝子の一部が欠失していた。欠失遺伝子の多くは同化反応などにリンクする反応系の遺伝子（transketolase や
pyruvate dehydrogenase 遺伝子）で、さらにその遺伝子がコードしている酵素の基質を ATP 産生に利用する反応系は存在し19た。 糖 代 謝 の 中 間 産 物 の ア セ チ ル リ ン 酸 の 利 用 も 同 様 で、属ではアセチル CoA を介しエタノールを産生してNAD/NADH の酸化還元バランスを維持する反応系と ATP 産
生を伴う酢酸産生系に利用されるが、属は後者の遺伝子のみを保持していた。
属がフルクトースやピルビン酸、酸素といった生育因子を利用して NAD/NADH の酸化還元バランスを維持するための酵素遺伝子を保持するかゲノム情報から調べたとこ
ろ、mannitol-2-dehydrogenase, lactate dehydrogenase, NADH
oxidase の各遺伝子を保持していた。これらは属も同様に保持していた。
以上のゲノム解析により、属の糖代謝は他のヘテロ発酵型乳酸菌よりも ATP を効率的に産生する機構となっており、NAD/NADH の酸化還元バランス維持は菌体外の因子に依存的であることが明らかとなった。これはフルクトースなどが豊富な生息環境が影響していると考えられる。また、この特性は特別な機能の獲得によるものではなく進化の過程で近縁の乳酸菌の一部の遺伝子が欠失した結果であると考えられた。
本属のゲノム解析により乳酸菌の発酵生産のための資源としての新たな可能性を少なからず見いだされたと思われる。
1）
A. Endo et al,., 32, 593‑600（2009）2）
A. Endo,., 22, 87‑92（2011）
岡田早苗（応用生物科学部 生物応用化学科）
田中尚人（応用生物科学部 菌株保存室）

NGRC ニュース No. 3▶▶▶ ヒメツリガネゴケのアブシジン酸応答に関わる

シグナル活性化因子の探索 ◀◀◀

陸上植物の ABA シグナル伝達系の進化を紐解く
植物の環境ストレス応答においてアブシジン酸（ABA）は気孔コンダクタンスの調節や種子休眠、およびストレス関連遺伝
子発現制御に関わる重要なホルモンである。細胞の ABA 応答
は、ABA が PYL/PCAR 受容体に結合することで特異的なプ
ロテインキナーゼ「SnRK2」が活性化することで開始される。
活性化された SnRK2 は、ABA 誘導性遺伝子の発現制御に関わる bZIP 転写因子をはじめ、多彩な細胞内調節因子活性化する。
このことから SnRK2 は ABA 情報伝達の「コア因子」として機能していると考えられているが、その活性化メカニズムについては不明な点が多い。本研究では、遺伝子ターゲティングが可能であり、全ゲノム解析が完了しているモデルコケ植物である
蘚類ヒメツリガネゴケ（）において SnRK2の活性化に欠損のある ABA 非感受性変異株 AR7 のゲノム解析
を通して、SnRK2 活性化に関わる情報因子を同定することを研究の目的としている。
従 来、SnRK2 の 活 性 化 は、ABA 存 在 下 で 負 の 制 御 因 子
PP2C が機能しなくなることで、単にその自己リン酸化が促進されて起こると考えられてきた。しかし、坂田らによるヒメツ
リガネゴケ PP2C の完全ノックアウト株の解析により、SnRK2の活性化には PP2C 以外の未知の活性化因子が必須であることが強く示唆された。一方、ヒメツリガネゴケ AR7 株は他の植物にはない著しい ABA 非感受性表現型を示す変異株として単離された。最近、AR7 株では SnRK2 の活性化がほぼ消失していることが明らかとなり、この変異株が SnRK2 の活性化に関わる情報因子に欠損を持つ可能性が高いことが示唆された。
AR7 株の変異遺伝子を特定することは、ABA 応答の初期プロ
セスを理解する上できわめて重要であると考えられるが、従来のマッピングによるポジショナルクローニングが難しいヒメツ
リガネゴケでは、ゲノムシーケンシングよる遺伝子の比較解析が有効であると考えられた。
以上のことから、本研究では AR7 変異株のゲノムシーケン
スを解読し、データベース上の野生型ヒメツリガネゴケゲノム
配列と比較し、変異箇所を明らかにする。機能に影響しない
spontaneous な変異の蓄積が予想されるため、我々が有するヒ
メツリガネゴケマイクロアレーを用いて、遺伝子発現レベルにおける変異パターンと組み合わせることで、変異株の原因遺伝
子特定を試みる。

ヒメツリガネゴケの生活環

坂田洋一（応用生物科学部 バイオサイエンス学科）
竹澤大輔（埼玉大学 大学院理工学研究科）▶▶▶ 乳酸菌の長寿遺伝子を探る ◀◀◀
私達が健康で長生きするために働く長寿遺伝子があることが近年明らかになった。それも単なる長生きではなく、メタボリ
ズムを健全にし、癌抑制遺伝子を活発にし、体内時計も調整するというもので、進化の過程で生き残りのために獲得されたと言われている。その本体はサーチュインと呼ばれるタンパク質
脱アセチル化酵素である。これを活性化することは健康につながるわけで、赤ワインに含まれるレスベラトロールというポリフェノール成分にその働きがあることも分かった。この遺伝子については人のみならず、ネズミ、ショウジョウバエ、線虫、酵母などゲノム解析の進んでいるモデル真核生物で研究が進んだ。
酵素反応の基質として染色体のヒストンタンパク質などがある。
ところで、ゲノムデータベースで検索すると、細菌にもそのホモログが見つかる。そこで、人と共進化したと言われるほどに相性のよい、乳酸菌についてみると、たしかにサーチュイン
ホモログが存在する。この遺伝子は乳酸菌のサバイバルに関与しているのであろうか。染色体を持たない原核生物で酵素は何をしているのであろうか。私達はそれを突き止めようと研究を始めた。
乳酸菌の中で、菌を選んだのは、チーズから採取された ATCC 基準株に加えて、農大コレクションの中の植物性の姉妹菌株を検討できるからである。

20

動物性乳酸菌は腸内環境で保護されている箱入り娘、対する植物由来の菌は農家バイトで鍛えられた農大生のように強いとされる。乳酸菌が腸内で活躍できるかどうかを左右する胆汁酸への耐性を比べてみると、植物由来の菌が強い。興味深いことに、レスベラトロールで菌を前処理すると耐性が上がり、サー
チュイン阻害剤であるスラミンで前処理すると耐性が下った。
そこで、動物性と植物性の菌株の全ゲノム解析をしたところ、
ゲノムサイズは 1 割程度の差があったが、それぞれがサーチュ
インホモログ遺伝子を保有していた。一つの植物由来菌には型 の サ ー チ ュ イ ン に 加 え て、型のホモログが見出された。そこで、これらの株のサーチュインホモログの cDNA をクローニングして DNA 配列を確定したところ、
型はジーンバンクデータと 99％の相同性を示したが、型は 78％であり、それらには人か
ら酵母まで保存されている活性中心のヒスチジン残基が保存されていた。早速大腸菌を用いて組換えタンパク質を生産し、これを精製した。現在酵素解析を進めており、人のサーチュインと同様の脱アセチル化活性を示すことを見出している。
サーチュインの祖先は乳酸菌で何をしていたのか、それは生物界の長寿遺伝子の意義と共通性についての秘密を探る冒険であり、優良なプロバイオティクスを創生するための鍵にもなると考えている。

NGRC ニュース No. 3
学会発表
1．6th Asian Conference on Lactic Acid Bacteria (2011,
Sapporo, Japan) Hotaka Atarashi, Syuki Fujimura, Naoto
Tanaka, Sanae Okada, Junichi Nakagawa. Eﬀect of resveratrol on the cholate-tolerance of lactic acid bacteria.
2．International Genome Research Symposium (2012, Tokyo,
Japan) Junichi Nakagawa, Hotaka Atarashi, Yuya Yoshida,
Syuki Fujimura, Naoto Tanaka, Sanae Okada. Identiﬁcationand molecular cloning of sirtuin homolog of the lactic acidbacteria isolated from fermented milk and plant.
3．日本農芸化学会大会（2012、京都）新 穂高、藤村朱喜、
田中尚人、岡田早苗、中川純一 乳酸菌のコール酸耐性への resveratrol の効果、及びサーチュインホモログの解析

乳酸菌のサーチュインホモログの組換えタンパク質

中川純一（生物産業学部 食品香粧学科）
新 穂高（生物産業学部 食品香粧学科）岡田早苗（応用生物科学部 生物応用化学科）
田中尚人（応用生物科学部 菌株保存室）▶▶▶ 出芽酵母をモデルとする真核生物の新規転写開始制御機構の研究 ◀◀◀
単細胞の真核生物である出芽酵母は、その単純さにもかかわらず、ヒトを含む高等生物にまで普遍的に存在する多くの基本的な生物機能の原型を保持しており、また強力な遺伝学的研究
手法を駆使できる利点もあって、過去数十年にわたり真核生物研究におけるモデル生物として多大な役割を果たしてきた。加
えてここ十数年間、真核生物の中で最初に全ゲノム配列が解読された生物として、全ゲノムレベルの研究の発展における先導役を果たしてきた。
我々は出芽酵母を材料に、真核生物における遺伝子の転写制御機構に関する研究を行っており、最近の成果として、染色体
構 造 因 子 HMGB タ ン パ ク 質 フ ァ ミ リ ー の 1 つ Hmo1（Highmobility group 1）タンパク質が、リボソームタンパク質遺伝子
群のプロモーター上において、ヌクレオソームと排他的な領域に結合し、両者に挟まれた領域に RNA ポリメラーゼ II とその基本転写因子群（TFIIA、B、D、E、F、H）からなる転写開始前複合体（PIC；pre-initiation complex）の形成を導くことを 明 ら か に し た（ 図 ）。 一 般 的 に は、PIC の 形 成 位 置 は、
TATA ボックスなど保存されたコアプロモーター配列を基本転写因子が認識することにより決定されると考えられているが、実際には多くのプロモーターにおいて保存されたコアプロモー
ター配列が見つかっておらず、これらのプロモーターがどのような仕組みで特異的に認識されるかについては不明な点が多い。我々の研究は、そのような未知の転写開始機構の一端を明らかにしたものと考えている。
今後は、①次世代シークエンサーを用いた ChIP-seq 解析による Hmo1、ヌクレオソーム、及び PIC の全ゲノム上の正確な結合位置の決定、及び②遺伝学的手法による上記の仕組みに関与する他の因子の同定（PIC 形成位置に異常が起こる突然変異
株の単離とその原因遺伝子の同定）、の二つのアプローチを柱に研究を進めていく予定である。これらのアプローチにおいて21は、ともに次世代シークエンサーを用いた大規模シークエンスの技術が重要な役割を果たすことは疑うべくもなく、それによってリボソームタンパク質遺伝子群という限られた遺伝子において見いだされた PIC 形成位置決定の仕組みが、他の多くの遺伝子でも普遍的に用いられている可能性を検証できるとともに、そのような仕組みの分子レベルでの解明が飛躍的に進むことが期待できる。
現時点では高等真核生物における Hmo1 のオルソログは明らかになっていないが、このような転写開始位置の決定の仕組み
は、酵母だけでなく高等真核生物においても形を変えて普遍的に存在しているものと考えている。

笠原浩司（応用生物科学部

アイソトープセンター）

NGRC ニュース No. 3

研究発表実績
●論文発表
Watanabe S, Ohbayashi R, Shiwa Y, Noda A, Kanesaki Y, Chibazakura T, Yoshikawa H. Lightdependent and asynchronous replication of cyanobacterial multi-copy chromosomes. Molecular Microbiology (2012)
Kobayashi H, Sakurai T, Sato S, Nakabayashi K, Hata K, Kono T. Imprinted DNA methylation
reprogramming during early mouse embryogenesis at thelocus is linked to long-intergenictranscription. FEBS Letters (2012)
Kobayashi H, Sakurai T, Imai M, Takahashi N, Fukuda A, Yayoi O, Sato S, Nakabayashi K, Hata
K, Sotomaru Y, Suzuki Y, Kono T. Contribution of intragenic DNA methylation in mouse gametic DNA
methylomes to establish oocyte-speciﬁc heritable marks. PLoS Genet. 8:e1002440 (2012)
Kanesaki Y, Shiwa Y, Tajima N, Suzuki M, Watanabe S, Sato N, Ikeuchi M, Yoshikawa H.
Identiﬁcation of substrain-speciﬁc mutations by massively parallel whole-genome resequencing of
sp. PCC 6803. DNA Research 19: 67‑79 (2012)
Yee LM, Matsumoto T, Yano K, Matsuoka S, Sadaie Y, Yoshikawa H, Asai K. The genome ofphage SP10: a comparative analysis with phage SPO1. Biosci. Biotechnol. Biochem. 75: 944‑952 (2011)
Shintani M, Matsumoto T, Yoshikawa H, Yamane H, Ohkuma M, Nojiri H. DNA rearrangement
occurred in the carbazole degradative plasmid pCAR1 and the chromosome of its unsuitable hostPf0-1. Microbiology 157: 3405‑3416 (2011)
Kawahara-Miki R, Wada K, Azuma N, Chiba S. Expression proﬁling without genome sequence informa), by next-generation sequencing. PLoS

tion in a non-model species, pandalid shrimp (ONE 6:e26043 (2011)

Tajima N, Sato S, Maruyama F, Kaneko T, Sasaki NV, Kurokawa K, Ohta H, Kanesaki Y,
Yoshikawa H, Tabata S, Ikeuchi M, and Sato N. Genomic structure of the cyanobacterium
sp. PCC 6803 strain GT-S. DNA Research 18: 393‑399 (2011)
Nakamura K, Oshima T, Morimoto T, Ikeda S, Yoshikawa H, Shiwa Y, Ishikawa S, Margaret C.
Linak, Hirai A, Takahashi H, Md. Altaf-Ul-Amin, Ogasawara N and Kanaya S. Sequencespeciﬁc error proﬁle of Illumina sequencers. Nucleic Acids Research 13: e90 (2011)●学会，セミナー等での発表
2012 年 3 月 27 日〜 30 日
日本畜産学会第 115 回大会

名古屋

河野友宏
最新ゲノム解析から探る和牛肉質のルーツ．公開講演会「『持続的な食糧生産と食の安全を支える新たな動物生産科学の進展』新たな科学でつくる安全で安心な動物性タンパク」
川原玲香
次世代シーケンサーを用いたニホンウズラのゲノム解読．シンポジウム「鳥類バイオサイエンス研究の新たな展開」
2012 年 3 月 22 日〜 26 日
日本農芸化学会

京都

吉川博文，渡辺智，志波優，西田洋巳，板谷光泰

合成生物学の申し子 ｢シアノバチルス 1 号｣ のゲノム機能解析． シンポジウム「ゲノムを知って作る：
ゲノムはどこに向かうのか？」
笠原

堅，志波

優，田中（福島）早苗，堀内貴之，越智幸三，吉川博文

22

NGRC ニュース No. 3
新しい育種技術「不均衡変異導入法」におけるゲノムワイドな変異スペクトル解析
松本貴嗣，吉川博文
枯草菌におけるゲノムワイドな転写開始点解析．
岩田修，松本貴嗣，新谷政己，高妻篤史，山根久和，野尻秀昭

各宿主特異的なプラスミド pCAR1 上の分解遺伝子群の発現を調節する因子の解析
高瀬識之，能登優，高橋裕里香，松本貴嗣，吉川博文，土金恵子，細山哲，藤田信之，山根久和，野尻秀昭
プラスミドの負荷を軽減する新規遺伝因子の探索．
Yee Lii Mien，堀嵜允文，土金恵子，細山哲，藤田信之，松本貴嗣，吉川博文，春田

伸，朝井

計，

五十嵐泰夫，山根久和，野尻秀昭
ドリン系農薬分解菌の環境汚染物質分解能の解析と分解関連遺伝子の探索．
2012 年 3 月 16 日〜 18 日
日本植物生理学会

京都宮本皓司，松本貴嗣，小宮山紘平，岡田敦，中条哲也，岡田憲典，吉川博文，渋谷直人，野尻秀昭，山根久和
ChIP-seq 解 析 に よ る イ ネ の ジ テ ル ペ ン 型 フ ァ イ ト ア レ キ シ ン 生 産 を 制 御 す る bZIP 型 転 写 因 子
OsTGAP1 の標的遺伝子の同定．
清水崇史，宮本皓司，中条哲也，松本貴嗣，吉川博文，西澤洋子，南栄一，渋谷直人，岡田憲典，野尻秀昭，山根久和
イネの病害抵抗性発現に関与する転写因子 OsWRKY53 の標的遺伝子の探索．
2012 年 3 月 13 日〜 14 日
第 4 回高資源ポリマーセンターシンポジウム
兼崎

東京

友

次世代シーケンス技術によるラン藻ゲノム研究の現状と展望．
2012 年 3 月 10 日〜 12 日
第 6 回日本ゲノム微生物学会

東京

吉川博文
シーケンスセンターの経験と課題〜微生物ゲノムを中心に〜．シンポジウムならびにパネルディス

カッション「我が国の微生物ゲノムと新型シーケンサー」
高瀬識之，能登優，高橋裕里香，松本貴嗣，吉川博文，土金恵子，細山哲，藤田信之，山根久和，野尻秀昭
プラスミドの負荷を軽減する染色体因子の発見．
兼崎

友，志波

優，田島直幸，鈴木まり絵，渡辺

Whole-genome resequencing of
志波

優，田中（福島）早苗，笠原智，佐藤直樹，池内昌彦，吉川博文

sp. PCC 6803 substrains by massively parallel sequencer．
堅，堀内貴之，吉川博文

不均衡変異導入法におけるゲノムワイドな変異スペクトル解析．
2012 年 1 月 21 日
Genome Research: Current Challenges and Future Directions International Symposium of
NODAI Genome Research CenterTokyo

Kanesaki Y, Shiwa Y, Tajima N, Suzuki M, Watanabe S, Sato N, Ikeuchi M, Yoshikawa H.
Identiﬁcation of substrain-speciﬁc mutations by massively parallel whole-genome resequencing of the
cyanobacterium,

sp. PCC 6803.

Kanesaki Y, Shiwa Y, Suzuki M, Watanabe S, Yoshikawa H.
Resequencing analysis of the laboratory strains of the cyanobacterium,
7942.
Matsumoto T, Yoshikawa H.
Genome-wide analysis of transcription start sites in

23

.

PCC

NGRC ニュース No. 3
Shiwa Y, Kanesaki Y, Matsumoto T, Yajima S, Yoshikawa H.
Analysis pipeline for microbial mutation from next-generation sequencing data.
Arai-Kichise Y, Shibata-Hatta M, Shiwa Y, Ebana K, Yoshida S, Yamasaki M, Yoshikawa H, Yano M,
Wakasa K.
Identiﬁcation and utilization of genome-wide DNA polymorphisms in rice cultivar for sake-brewering.
Endo M, Kawahara-Miki R, Cao F, Monji Y, Kuwayama T, Kono T, Iwata H.
Eﬀect of age on bovine early antral follicles.
Kawahara-Miki R, Wada K, Azuma N, Chiba S.
Expression profiling without genome sequence information in a non-model species, pandalid shrimp(), by next-generation sequencing.

Kawahara-Miki R, Sano S, Kuwayama T, Matsuda Y, Yoshimura T, Kono T.
Genome sequence of the Japanese quail.

Kawahara-Miki R, Tsuda K, Shiwa Y, Oda S, Ebihara S, Kono T.
Whole-genome resequencing of the Japanese native cattle.

Tsuda K, Kawahara-Miki R, Noguchi T, Kono T.
Whole-genome sequencing reveals many genetic variations in the Japanese native cattle.

Ozaki M, Matsuoka K, Takada T, Ohno T, Tsuda K, Kono T, Yonekawa H, Kikkawa Y.
Identiﬁcation of susceptibility genes associated atopic dermatitis in NC/Nga.
2011 年 12 月 13 日〜 16 日
第 34 回日本分子生物学会年会

横浜川原玲香，後藤大也，河野友宏，岩田尚孝
加齢がウシ卵子に及ぼす影響：次世代シーケンサーを用いた遺伝子発現解析．
志波

優，兼崎

友，松本貴嗣，矢嶋俊介，吉川博文

次世代シーケンサーのための微生物ゲノム変異解析パイプラインの構築．
2011 年 12 月 2 日〜 3 日
ラン藻の分子生物学会 2011
兼崎

友，志波

千葉

優，田島直幸，鈴木まり絵，渡辺智，佐藤直樹，池内昌彦，吉川博文

sp. PCC 6803 substrain のリシーケンス解析から見えてきたこと．
2011 年 11 月 1 日〜 2 日
植物化学調節学会

宇都宮宮本皓司，松本貴嗣，小宮山紘平，岡田敦，中条哲也，岡田憲典，吉川博文，渋谷直人，野尻秀昭，山根久和
イネにおけるジテルペン型ファイトアレキシン生産を制御する bZIP 型転写因子 OsTGAP1 の機能解析．
2011 年 9 月 20 日〜 22 日
日本遺伝学会第 83 回大会
志波

京都

優，田中（福島）早苗，笠原堅，堀内貴之，吉川博文

不均衡変異導入法におけるゲノムワイドな変異スペクトル解析．
2011 年 9 月 15 日〜 17 日
第 104 回日本繁殖生物学会大会

岩手

遠藤美和，川原玲香，山本千尋，和田光，恒松数磨，沖愛弓，後藤大也，河野友宏，岩田尚孝

加齢がウシ初期胞状卵胞卵子に及ぼす影響．
2011 年 8 月 24 日〜 25 日
グラム陽性菌ゲノム機能会議

福山松本貴嗣，吉川博文
Illumina GAII を用いた枯草菌の転写開始点解析．
山下悠美，横川朋美，川島秀嗣，田中（福島）早苗，松本貴嗣，吉川博文
枯草菌の胞子形成に関与するクエン酸回路因子の新規機能解析．

24

NGRC ニュース No. 3
2011 年 8 月 20 日〜 21 日
ゲノム微生物学会ワークショップ

仙台松本貴嗣，吉川博文
Illumina GAII を用いた枯草菌の転写開始点解析．
岩田修，松本貴嗣，新谷政己，高妻篤史，山根久和，野尻秀昭

カルバゾール分解系制御系遺伝子の宿主依存的な発現制御機構の解明．

2011 年 8 月 18 日〜 19 日
第 154 回農林交流センターワークショップ
吉瀬祐子，若狭茨城暁

農大発ゲノム研究〜酒米ゲノムを中心に〜
2011 年 8 月 9 日〜 12 日
World Congress on Reproductive Biology Australia
Endo M, Kawahara-Miki R, Goto H, Kono T, Iwata H.
Eﬀect of age on bovine preantral follicles.
2011 年 7 月 29 日〜 31 日
日本進化学会第 13 回大会

京都川原玲香，和田健太，東

典子，千葉

晋

ホッカイエビ個体群における遺伝子発現の網羅的比較．
2011 年 5 月 28 日〜 29 日
次世代シークエンサ現場の会第一回研究会
志波

優，兼崎

熱海

友，松本貴嗣，矢嶋俊介，吉川博文

次世代シーケンサーのための微生物ゲノム変異解析パイプラインの構築．
2011 年 4 月 28 日
「革新的ゲノム情報解析を用いた生物資源ゲノム解析と農学新領域の創出」学内公募テーマシンポジウム
千葉

東京晋，川原玲香次世代シーケンサーを用いたホッカイエビのトランスクリプトーム解析．

●招待講演
2011 年 9 月 29 日
イルミナ社バイオインフォマティクス講習会中級
志波

秋葉原

優

バクテリアゲノム De novo Assembly への挑戦

●マスメディア
2012 年 2 月 9 日
マウスの精子と卵子の DNA メチル化全ゲノム解析の研究成果が，日経バイオテクで紹介されました．
2011 年 7 月 18 日
雄町米のゲノム解読の研究成果が，山陽新聞に紹介されました．
2011 年 6 月 9 日
次世代シーケンサーが特定の配列パターンで読みとりエラーを起こしやすい事を解明した研究成果が，日経新聞に紹介されました．

●その他
川原玲香

巻頭言：遺伝資源としての日本在来牛．生物科学 63（in press）

25

ᵧᶌᶒᶃᶐᶌᵿᶒᶇᶍᶌᵿᶊᴾᵱᶗᶋᶎᶍᶑᶇᶓᶋᴾ ᶍᶄᴾᵬᵭᵢᵟᵧᴾᵥᶃᶌᶍᶋᶃᴾᵰᶃᶑᶃᵿᶐᶁᶆᴾᵡᶃᶌᶒᶃᶐ

ࣤंऋऌऊंࢽ࣯ंऐंࣾएऀअ
࣠ऒएएंऋऑࢽ࣠अࣾउउंऋऄंऐࢽࣾऋँࢽࣣऒऑऒएंࢽ࣡आएंऀऑआऌऋऐ

㪘㪙㪪㪫㪩㪘㪚㪫㪪㪡㪸 㫅 㪅 㩷㪉 㪈 㩷㪆㩷㪉 㪇 㪈 㪉 㪢㪦㪢㪬㪰㪦㩷㪟 㪘㪣㪣㪃 㩷㪪㪿 㫀㫅 㪸 㪾 㪸 㫎 㪸 㪃 㩷㪫㫆㫂㫐㫆ᧄ䉲䊮䊘䉳䉡䊛䈲ᢥㇱ⑼ቇ⋭䊶⑳┙ᄢቇᚢ⇛⊛⎇ⓥၮ⋚ᒻᚑᡰេ੐ᬺ 䇸㕟ᣂ⊛䉭䊉䊛ᖱႎ⸃ᨆ䉕↪䈇䈢↢‛⾗Ḯ䉭䊉䊛⸃ᨆ䈫ㄘቇᣂ㗔ၞ䈱ഃ಴䇹䈮䉋䉎ഥᚑ䉕ᓧ䈩ⴕ䉒䉏䈢䇯䋨ᐔᚑ20ᐕᐲޯᐔᚑ24ᐕᐲ䋩

27

NGRC ニュース No. 3

Genome Research: Current Challenges and Future Directions
Jan. 21, 2012 International Symposium of NODAI Genome Research Center
9:00㧙9:05

Welcome address

Kanju Ohsawa (Tokyo Univ. Agric.)

9:05㧙9:10

Opening remarks

Takuji Sasaki (Tokyo Univ. Agric.)

9:10㧙9:40

Keynote address 1

Takashi Gojobori (NIG)

Genome Research with Big Data
~ How can we make "data-driven scientific discovery" possible? ~9:40㧙10:20

Keynote address 2

W. Richard McCombie (Cold Spring Harbor Lab.)

Chllenge and opportunities in the application of next generation sequencing technology
10:20㧙10:35

Coffee break

10:35㧙11:05

Symposium speech 1

Yoshikazu Sugimoto (SIAG)

New approaches to drive discovery in Bovine Genomics
11:05㧙11:45

Symposium speech 2

David W. Burt (The Roslin Institute)

Evolution of Avian Genomes
11:45㧙12:15

Symposium speech 3

Takahiro Kikawada (NIAS)

The sleeping chironomid genome project toward understanding molecular context underlying theextreme desiccation tolerance, anhydrobiosis
12:15㧙13:20

Luncheon Seminar (Illumina K.K.)

13:20㧙14:00

Symposium speech 4

Aarno Palotie (Sanger Institute)

Identification of human disease genes after the GWAs era
14:00㧙14:40

Symposium speech 5

Gavin Kelsey (The Babraham Institute)

Epigenomic approaches to understanding DNA methylation establishment in mice
14:40㧙15:10

Symposium speech 6

Ichizo Kobayashi (The Univ. Tokyo)

Evolutionary genome dynamics revealed by microbial genome comparison
15:10㧙15:25

Introduction of NODAI Genome Research Center

15:25㧙16:15

Poster session

16:15㧙16:55

Symposium speech 7

Blake C. Meyers (Univ. Delaware)

MicroRNAs as master regulators of the plant NB-LRR defense gene family via the production ofphased, trans-acting siRNAs
16:55㧙17:25

Symposium speech 8

Youko Oono (NIAS)

A genome-wide transcriptional analysis by mRNA-Seq of Pi-stressed rice seedlings
17:25㧙17:55

Symposium speech 9

Toru Shimada (The Univ. Tokyo)

Genomic studies on the relationship between the silkworm and its food plant, mulberry
17:55㧙18:00

Closing remarks

Tomohiro Kono (Tokyo Univ. Agric.)

28

NGRC ニュース No. 3
Genome Research with Big Data
~ How can we make “data-driven scientific discovery” possible? ~New Approaches to Drive Discovery in Bovine
Genomics

Takashi Gojobori

Yoshikazu Sugimoto, Takashi Hirano

Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan (DDBJ), National
Institute of Genetics, Mishima, Japan

Shirakawa Institute of Animal Genetics

In our beef industry, renal tubular dysplasia was a serious
problem in 1990s, because most of elite sires apparently harboredthe causative mutation. We started genetic analysis of the disorderin 1995, and identified a deletion mutation in novel claudin-16
gene in 1999 by the help of lucks; the deletion spanned 37 kb at 7
kb from the most linked microsatellite marker.
At an intermediate stage, we mapped forelimb-girdle
muscular anomaly on BTA 26 with microsatellites in 2007,
detected 1,700 SNP candidates by re-sequencing two sires in2010, and identified one deleterious SNP causing nonsense
mutation in 2011.
Last February we mapped weak calf syndrome with thebovine 50K SNP beadchip (Illumina) and identified a deleterious
mutation with newly developed exome sequencing technology(NimbleGen) last October. Encouraged by this finding, we haveapplied this strategy to other genetic disorders. Now 3,000 DNA
from calves stillborn or died in 20-days old are at hand. Stillbirthwith unknown reasons is the most abundant incidence. In near
future exome sequencing in conjunction with family-based
phenotypes will partly reduce the incidence.

The Next-Generation Sequencers (NGS) has produced
enormous amount of nucleotide sequence data in the genome
research and its related research fields. The amount of data is sohuge that scientists cannot handle it in a proper way. This is calleda problem of “Big Data.” According to the late Jim Gray who
used to be a prominent database researcher in Microsoft, we havebeen confronted by the fourth paradigm “Data-driven scientificdiscovery.” Jim Gray had claimed that when the first paradigm
was the “experiments”, the second and third paradigms were the“theory” and “simulation,” respectively. It is no doubt thatgenome research is currently under the fourth paradigm and its
scientific success relies heavily upon how we can makesignificant discovery from the Big Data. One of the answers is
obviously the database construction. Thus, I would discuss therole of the database in the genome research, taking our
experiences as an example. Moreover, the NGS has changed not
only the paradigm of genome research but also the perspective of
our society. For example, the personalized medicine on thebasis of genomic information has become almost realistic.
Moreover, the so-called meta-genomics will provide us withenvironmental monitoring of the marine, the revolutionary
approach of intelligent agriculture, and prompt detection of
emerging and reemerging viruses and bacteria in the air. In thissituation, we should be able to make a proposal of the vision of
our future society focusing upon the genome and its related
information in particular. Thus, I would like to call it as the“Genome Information-oriented Society (g-Society).”

Evolution of Avian Genomes
David W. Burt
The Roslin Institute and Royal (Dick) School of Veterinary Studies, University of
Edinburgh, UK

Our knowledge of avian genomes has increased rapidly overthe past few years, culminating in the publication of the chicken
genome in 2004, a milestone in avian genetics and evolutionary
biology. This was followed by the Zebrafinch genome a model forstudies in neurobiology. Recent advances in sequencing
technology now make it possible to produce draft sequences ofany vertebrate genome. This year, we have seen the completion of
the genome sequences of the turkey and mallard, and soon otherbirds will join this list. I will review some of the insights and new
directions in avian biological research these new genome
resources enable. Comparative analysis of avian genomes reveal
the history of genome reorganization, the structure of genes, thediversity of protein coding genes, the nature of gene regulatory
regions, etc. These genome sequences promise to be valuable
resources for ecological and evolutionary studies of other bird
species í in this new genome era.

Challenges and Opportunities in the Applicationof Next Generation Sequencing Technology
W. Richard McCombie
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New YorkThe rapidly increasing capabilities of next-generation
sequencing have led to revolutionary changes in modern biology.
This is particularly true in the fields of genetics; both in humans
and plant systems. The challenges that one faces in using thistechnology fall into two large categories. The first of these is how
to use the technology to most effectively identify and characterize
genetic variation in a way that can be correlated with biologicalphenotype. The second challenge is using the next-gen
sequencing technology to carry out the de novo assembly ofcomplex genomes. Both of these challenges are common to bothplant and animal researchers, although in different researchcontexts. I will discuss how our group is using this technology toapproach both of these challenges. I will discuss understanding
how genetic variation affects phenotype studies in the context ofstudies of the genetics of major psychiatric disorders. For de novo
assembly I will describe our work on sequencing of plant
genomes with next gen technology and approaches both in the lab
and computationally to generate higher quality genome
assemblies from next-gen data.

The sleeping chironomid genome project toward
understanding molecular context underlying theextreme desiccation tolerance, anhydrobiosis
Takahiro Kikawada, Oleg Gusev, Richard Cornette and Takashi Okuda
National Institute of Agrobiological Sciences

To cope with drought stress, organisms have evolved several
strategies for surviving. Anhydrobiosis is one of the most extreme
strategies. Just after water addition, anhydrobiotic organisms can

29

NGRC ニュース No. 3
experiments that would identify low frequency and rare variants
associated to human diseases. Just as the HapMap projectprovided a scaffold and fundament for GWA studies, theinternational 1000 genomes project (www.1000genomes.org)
aims to provide a similar scaffold for rare and low frequency
variant studies. This project aims to sequence the whole genome
and catalogue variants of 2500 individuals from different
ethnicities.
A number of large scale sequencing studies that aim to
identify low frequency and rare variants associated with common
traits are in progress. One example is the Wellcome Trust funded
UK10K project that aims to sequence 10 000 individuals fromUK, 4000 whole genomes from two population cohorts (UKtwins
and ALSPAC) and 6000 exomes from three disease groups (2000extreme obesity, 2000 from 10 rare congenital traits and 3000
autism or schizophrenia cases). The aim is to provide a variant
catalogue of the British population and to identify low frequency
variants associated with extreme traits.
Population isolates provide a special opportunity to study thecontribution of low frequency and rare variants in human traits.
The enrichment of rare, Mendelian, mostly recessive diseases in
population isolates is well documented and widely studied. The
unique population of Finland is one of the prime examples of long
lasting isolation and multiple population bottle necks resulting in
the enrichment of some 36, mostly recessive, diseases that are
extremely rare in other Caucasian populations. The newopportunities for large scale sequencing have stimulated
investigators around the world to focus on identification of low
frequency variants enriched in the Finnish population. This
collaborative sequencing project SISu (Sequencing Initiative
Suomi (Suomi is the name of the country in Finnish) combines
the effort of the Broad Institute, University of Michigan, UCLA,
University of Oxford, University of Lund, Wellcome Trust Sanger
Institute, Finnish Institute of Molecular Medicine (FIMM) and
The National Institute for Health and Welfare, Finland. By mid
2012 we estimate to have the sequence of about 8000 Finns. This
provides a scaffold that should provide more targeted sequencing
opportunities for trait association studies using samples in the
Finnish National Biobank that houses DNA from 200 000 Finns,
representing about 4% of the population.

revive from complete desiccation. Larvae of the sleeping
chironomid, Polypedilum vanderplanki, inhabiting semiarid area
in Africa are a representative example. Thus far, although genes
and molecules involved in anhydrobiosis in the sleeping
chironomid have been isolated and characterized, these studies
fall short of complete understanding of the molecular context.
To comprehend the molecular mechanisms underlying
anhydrobiosis in the chironomid, we started omics research, suchas genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics. At
this time, 1.4 Gb of the genome sequence was determined by 454
next generation sequencer, indicating that estimated coverage
equaled to 14-fold of the genome size of P. vanderplanki (100Mb). The obtained sequence was assembled into contigs having
an N50 length of 6.1 kb using the Newbler Assembler software.
Total length of the contigs reached to 113 Mb, and the largest
contig was 71 kb. To fill gaps among the contigs, we planed to
exploit another next generation sequencer, such as Illumina
Genome Analyzer. Transcriptome analysis is also ongoing. We
have already established EST database for the desiccating larvae,
and have developed the database for the rehydrating larvae.
Our gene expression studies showed that larvae ability ofsuccessfully recovers after anhydrobiosis is directly linked tooverexpression of defensive genes, such as antioxidants, heatshock proteins and DNA reparation enzymes upon desiccation.
Having a relatively small genome size and typical for insects total
genes number, the sleeping chironomid is characterized bysignificant expansion in homologous and obviously paralogous
copies of defensive genes, such as major antioxidants ofthioredoxin-based cycle, heat shock proteins and proteinreparation methyltransferases. Furthermore, we have observed
clear differences in expression patterns of the paralogs in relation
to anhydrobiosis. Such differentiation in expression suggests anexistence of “dehydration-specific” set of protective genes in thisunique species of insect.

Current trends in identification of human disease genevariants
Aarno Palotie M.D., Ph.D., Professor
The Wellcome Trust Sanger Institute, Cambridge, UK
The Finnish Institute for Molecular Medicine (FIMM) University of Helsinki,
Finland

Epigenomic approaches to understanding DNA
methylation establishment in mice

Recent technological advances have boosted theidentification of genome regions associated with human diseases.
More than 1500 Genome wide association studies (GWAs) havebeen published covering more than 200 human traits. The GA
strategy uses tools that genotype a standard set of variants that arecommon in the population. This strategy has been especiallysuccessful in metabolic and immune mediated traits. The progresshas been slower in neurodevelopmental traits, but recently also
this field has progressed providing some fundamental new insightin neurological and severe mental diseases, such as schizophrenia
and bipolar disease. While GWA is effective to identify
genomic regions that are common in the population and have a
low effect size, they explain only a modest amount of theheritability of each trait. Thus it has been hypothesized is that alarge number of low frequency (population frequency <5%) andrare variants contribute to the disease susceptibility of common
traits. The decrease of the sequencing cost has enabled to design

Sébastien A. Smallwood1, Shin-ichi Tomizawa1, Felix Krueger2, Nico
Ruf1, Claire Dawson1, Natasha Carli1, Shun Sato3, Kenichiro Hata3, Simon
R. Andrews2, Gavin Kelsey1,41

Epigenetics Programme and 2Bioinformatics Group, The Babraham Institute,Cambridge, UK
3National Research Institute for Child Health and Development, Tokyo, Japan
4
Centre for Trophoblast Research, University of Cambridge, Cambridge, UK

The mechanisms by which DNA methylation is establishedin mammalian cells are still poorly understood. Imprinted genes
are an important model, as they are methylated in a
gamete-specific manner and because in the female germline denovo methylation occurs in non-dividing cells arrested in meiosis.
We are investigating why germline differentially methylated
regions (gDMRs) of imprinted genes become methylated,
whereas the great majority of CpG islands (CGIs) remain

30

NGRC ニュース No. 3
discovery of birth and death of genes through DNA duplication
associated with inversion (DDAI), in which duplication of a DNA
part in a locus to a new locus in inverse orientation isaccompanied by inversion between the two loci. This represents a
novel mechanism of genome evolution.
Sequence comparison of DNA sequence recognition subunitof a restriction-modification system led to discovery of domain
movement (DoMo), movement of an amino-acid sequence
between different domains of a protein, which is mediated byrecombination at DNA sequences flanking the domain sequences.
This represents a novel mechanism of protein diversification. It
may switch recognition sequence of DNA methyltransferases anddiversify DNA methylation pattern of a genome. Such epigenome
diversification, in turn, may lead to diversification in genomewide gene expression and adaptive evolution.

unmethylated. We have shown, using the imprinted Gnas locus,that transcription through gDMRs is required for their
methylation in oocytes1. We hypothesise that transcription
remodels chromatin at gDMRs to histone modifications
permissive to the DNMT3a:DNMT3L methylation complex2; forexample, transcription may deposit the permissive modification
H3K36me3. We are testing whether a similar requirement applies
at all maternally methylated gDMRs and whether the same
principles also govern methylation of other CGIs in germ cells. A
particular challenge in studying methylation in oocytes is thelimitation on the number of cells that can be obtained, particularly
for genome-wide epigenetic analyses. We are optimizing
techniques to profile CGI methylation, transcription and histone
modifications in mouse fetal germ cells and oocytes. Consistent
with our model, mRNA-Seq analysis of growing oocytes at theonset of de novo methylation reveals that gDMRs at allmaternally imprinted loci coincide with inactive promoters within
active transcription units. Using reduced representation bisulphite
sequencing (RRBS), an effective method for providing single
base-pair resolution of methylation at CGIs, we identified >1000
CGIs methylated in mature oocytes3. These CGIs depend on
Dnmt3a and Dnmt3L for methylation, revealing a general role for
Dnmt3L beyond imprinting. Methylated CGIs are notdiscriminating by sequence features, indicating that non-sequencebased properties primarily determine their methylation. Instead,methylated CGIs are preferentially located in active transcription
units and depleted in H3K4me3, supporting a generaltranscription-dependent mechanism of methylation2,3.

Figure 1. DNA Duplication

Figure 2A. Domain Movement

Associated with Inversion (DDAI)

within a protein gene (DoMo)R

M

S (specificity)

1. Chotalia et al. (2009) Transcription is required for establishment of germline
methylation marks at imprinted genes. Genes & Dev. 23:105-117.
2. Smallwood and Kelsey, De novo DNA methylation: a germ cell perspective.
Trends Genet. (in press).

N

3. Smallwood et al. (2011) Dynamic CpG island methylation landscape in oocytes

C

TargetRecognition
Domains

and preimplantation embryos. Nat. Genet. 43:811- 814.

5ÕEvolutionary genome dynamics revealed by microbial
genome comparison

3Õ

Figure 2B. Specificity subunit of a restriction-modification

Ichizo Kobayashi
1. Kawai, Furuta, Yahara, Tsuru, Oshima, Handa, Takahashi, Yoshida, Azuma,

University of Tokyo, Japan

Hattori, Uchiyama, Kobayashi. BMC Microbiology, 11:104 (2011).
2. Furuta#, Kawai#, Yahara, Takahashi, Handa, Tsuru, Oshima, Yoshida, Azuma,

Innovation in genome decoding now allows comparison ofmany closely-related genomes within a species, which reveals
dynamics in genome evolution. Helicobacter pylori infect half
the human population since childhood and causes gastritis, ulcers
and stomach cancer. Their genomes rapidly evolve and show
wide geographical divergence. We used newly developed
comparative methods to follow the evolution of East Asian H.
pylori genomes using complete genome sequences of Japanese,
Korean, Amerind, European, and West African strains.
A phylogenetic tree of concatenated core genes supported
divergence of the East Asian lineage from the European lineage
ancestor, and then from the Amerind lineage ancestor. The East
Asian strains appear to differ greatly from the European strains inhost-interaction, cell surface, redox reactions, genome/proteome
maintenance, and epigenetics.
Phylogenetic profiling revealed difference in the repertoireof outer membrane proteins. Their sequence comparison led to

Hattori, Uchiyama, Kobayashi. PNAS, 108: 1501-1506 (2011) (#: Equal
contribution).
3. Furuta, Kawai, Uchiyama, Kobayashi. PLoS ONE, 6: e18819 (2011).

31

NGRC ニュース No. 3
MicroRNAs as Master Regulators of the Plant NB-LRR
Defense Gene Family via the Production of Phased,
Trans-acting siRNAs

Plants have developed several morphological and physiologicalstrategies to adapt to phosphate (Pi) starvation (íP) or Pi
over-abundant (++P). The molecular mechanisms by which plants
respond to changes in the nutritional Pi concentration are complex
but of great importance and could be useful in developing
strategies for elucidating the gene networks involved in plant
response to various kinds of abiotic stress. We therefore used themassive parallel sequencing technology by mRNA-Seq to
elucidate the rice transcriptome under stress due to íP and ++P inorder to provide a comprehensive overview of the primary
molecular events resulting from phosphate stress.
Fifty-three million reads obtained from 16 libraries undervarious phosphate stress were uniquely mapped to the ricegenome and tagged Rice Annotation Project (RAP:
http://rapdb.dna.affrc.go.jp/) transcripts in the roots and shoots.
Transcripts identified specifically tagged to 40,574 (root) and
39,748 (shoot) RAP transcripts. We also detected uniquely 10,388
transcripts with no match to any RAP transcript. Totally, we
identified ѭ7,000 Pi-stress-responsive transcripts in the roots or
shoots during íP or ++P.
We constructed transcriptome viewer in GBrowse format tofacilitate visualization of all uniquely mapped mRNA-Seq reads
in the rice genome under Pi stress, a deeper understanding of thestructural and functional features of both annotated andunannotated Pi stress responsive transcripts can provide useful
information in improving Pi acquisition and utilization in rice andother cereal crops.

Blake C. Meyers1, Jixian Zhai1, Dong-Hoon Jeong1, Emanuele De Paoli1,
Sunhee Park1, Benjamin D. Rosen2, Yupeng Li3, Alvaro J. Gonzalez1, Zhe
Yan4, Sherry L. Kitto1, Michael A. Grusak5, Scott A. Jackson3, Gary
Stacey4, Douglas R. Cook2, Pamela J. Green1, Janine Sherrier1
1

Department of Plant & Soil Sciences, University of Delaware, USA
Department of Plant Pathology, University of California, Davis, USA
3
Institute for Plant Breeding, Genetics and Genomics, University of Georgia, USA
4
Department of Plant Microbiology and Pathology, University of Missouri, USA
5
USDA-ARS Children's Nutrition Research Center, Baylor College of Medicine,USA
2

Legumes and many non-leguminous plants enter symbiotic
interactions with microbes, and it’s poorly understood how hostplants respond to promote beneficial, symbiotic microbialinteractions while suppressing those deleterious or pathogenic.
Trans-acting siRNAs (tasiRNAs) negatively regulate target
transcripts and are characterized by siRNAs spaced in
21-nucleotide “phased” intervals, a pattern formed by
DICER-LIKE 4 (DCL4) processing. A search for phased siRNAs
found at least 114 Medicago loci, the majority of which were
defense-related NB-LRR-encoding genes. We identified threehighly abundant 22-nt miRNA families that target conserved
domains in these NB-LRRs and trigger the production oftrans-acting siRNAs. High levels of small RNAs were matched toover 60% of all ~540 encoded Medicago NB-LRRs; in potato, amodel for mycorrhizal interactions, phased siRNAs were also
produced from NB-LRRs. DCL2 and SGS3 transcripts were alsocleaved by these 22-nt miRNAs, generating phasiRNAs,
suggesting synchronization between silencing and pathogen
defense pathways. In addition, a second example of “two-hit”
phasiRNA processing was identified, utilizing miR156-miR172
sites. Our data reveal complex tasiRNA-based regulation of
NB-LRR that potentially evolved to facilitate symbiotic
interactions, and demonstrate miRNAs as master regulators of alarge gene family, a new paradigm for miRNA function.

Funding: This work was supported by a grant from the Ministryof Agriculture, Forestry and Fisheries of Japan (Genomics for
Agricultural Innovation, Rice gene expression profiling,
RTR-001).

Genomic studies on the relationship between thesilkworm and its food plant, mulberry
Toru Shimada1, Takaaki Daimon1,2, Tsuguru Fujii1, Yan Meng1,3, Huabing
Wang1, Hiroaki Abe4, Akio Onuma5, Takashi Kiuchi1 Susumu Katsuma1
1Graduate School of Agricultural and Life Sciences, University of Tokyo, Tokyo,
Japan
2
National Institute of Agrobiological Sciences, Tsukuba, Japan
3
Anhui Agricultural University, Hefei, China
4
Tokyo University of Agriculture and Technology, Fuchu, Japan
5
Institute of Sericulture, Ami-machi, Iabaraki, Japa

A genome-wide transcriptional analysis by mRNA-Seq
of Pi-stressed rice seedlings
Youko Oono1, Yoshihiro Kawahara1, Hiroyuki Kanamori1, Hiroshi
Mizuno1, Harumi Yamagata1, Mayu Yamamoto1, Satomi Hosokawa1,
Hiroshi Ikawa2, Jianzhong Wu1, Takeshi Itoh1 and Takashi Matsumoto1*

The mulberry contains 1-deoxynojirimycin and othersugar-mimic alkaloids in the latex. The alkaloids inhibit
glucosidases in insects, and accordingly act as defense substances
for herbivores. The silkworm, Bombyx mori, is one of themulberry specialists. We have been studying why the silkworm istolerant to the toxic alkaloids in the mulberry, and found that two
ȕ-fructofuranosidase (FFase) genes on chromosome 17 of thesilkworm1. In general, the metazoan animals use Į-glucosidases
as sucrases and do not have FFases. We compared the FFasegenes among lepidopterans and other organisms, and concluded
that they had been acquired through a horizontal gene transferfrom eubacteria to ancient lepidopterans, and that the mulberry
specialists such as Bombyx and Glyphodes (a mulberry-specificpyralid) have evolved to achieve high expression of FFases intheir midguts.

1

National Institute of Agrobiological Sciences (NIAS)
2
Institute of the Society for Techno-innovation of Agriculture, Fotrestry and
Fisheries

Phosphorus (P) is a component of key cellular molecules
such as nucleic acids, proteins, phospholipids, phytic acid, and
ATP in plants. However, P is the most dilute and the least mobile
in soil among the major nutrients necessary for plant growth;hence it is often a limiting factor for crop yield. Pi starvation
during farming is alleviated by the massive application offertilizers. However, continuous usage of phosphate fertilizers
may have a negative impact on the environment as the rockphosphate in the world is now in short supply and maybe depleted
within the next century. On the other hand, massive Pi
fertilization is also known to inhibit plant growth and productivity.

32

NGRC ニュース No. 3
To understand the mechanism of food selection, we utilize
the "polyphagous" mutants of B. mori, which feed not only
mulberry but also the beet and other plant leaves. We succeededin the positional cloning of two mutants, spli and Bt mapped on
the Z chromosome, and found that both are alellic mutations ofBmacj6, a gene encoding a transcription factor with the
POU-homeo domain. Recently, we found that the spli and Bt
mutations do not affect not only food preference but also
pheromone preference. Although the normal male adult is
attracted by the female sex pheromone "bombykol"((10E,12Z)-hexadecadienol), the spli male is attracted by thealdehyde derivative, "bombykal" ((10E,12Z)-hexadecadienal) 2. It
indicates that Bmacj6 controls both the food preference in thelarval gustatory neurons and pheromone preference throughtranscriptional regulations. To further understand the function of
Bmacj6, we are performing transcriptome analysis based on
next-generation sequencing.
1. Daimon, T., Taguchi, T., Meng, Y., Katsuma, S., Mita, K., and Shimada, T. (2008)
ȕ-fructofuranosidase genes of the silkworm, Bombyx mori: Insight into enzymatic
adaptation of B. mori to toxic alkaloids in mulberry latex. J. Biol. Chem. 283:
15271-15279.
2. Fujii, T., Fujii, T., Namiki, S., Abe, H., Sakurai, T., Ohnuma, A., Kanzaki, R.,
Katsuma, S., Ishikawa, Y., and Shimada, T. (2011) Sex-linked transcription factor
involved in a shift of sex pheromone preference in the silkmoth, Bombyx mori. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. 108: 18038-18043.

33

NGRC ニュース No. 3

3RVWHUVHVVLRQ
No.



Title
PresenterP1

DNA methylomes and transcriptomes in mouse germ cells
Hisato Kobayashi

P2(Tokyo Univ. of Agric.)

Identification of a novel large intergenic non-coding RNA at the imprinted Gpr1-Zdbf2 locus
Hisato Kobayashi

P3(Tokyo Univ. of Agric.)

Memory enchancement by up-regulation of CREB
Hotaka Fukushima

P4

Identification of susceptibility genes associated atopic dermatitis in NC/Nga
Mao Ozaki

P5(Tokyo Univ. of Agric.)

Effect of age on bovine early antral follicles
Miwa Endo

P6(Tokyo Univ. of Agric.)(Tokyo Univ. of Agric.)

Expression profiling without genome sequence information in a non-model species, pandalid shrimp(Pandalus latirostris), by next-generation sequencing
Ryouka Kawahara-Miki

P7

Ryouka Kawahara-Miki

P8(Tokyo Univ. of Agric.)

Genome sequence of the Japanese quail Coturnix japonica(Tokyo Univ. of Agric.)

Whole-genome resequencing of Japanese native cattle Kuchinoshima-Ushi
Ryouka Kawahara-Miki(Tokyo Univ. of Agric.)

P9

Whole genome sequencing shows many gene variations in Japanese native cattle Mishima-Ushi

P10

Identification and utilization of genome-wide DNA polymorphisms in rice cultivar for Sake-brewing

Kaoru Tsuda(Tokyo Univ. of Agric.)

Mari Shibata-Hatta

P11

De novo genome sequencing of the Japanese radish "Daikon"
Yuki Mitsui

P12(Tokyo Univ. of Agric.)

Genome sequence of a hydrogen producer Clostridium sp. Sa44
Akihiro Ohnishi

P13(Tokyo Univ. of Agric.)(Tokyo Univ. of Agric.)

Distribution of enzymes to protect from oxygen toxicity and utilize oxygen by facultatively anaerobic
bacteria based on biochemical and genomic analysis
Daichi Mochizuki

P14(Tokyo Univ. of Agric.)

Identification and molecular cloning of Sirtuin homolog of the lactic acid bacteria isolated from fermented
milk and plant
Junichi Nakagawa

P15

Naoto Tanaka

P16(Tokyo Univ. of Agric.)

Light-dependent and asynchronous replication of cyanobacterial multi-copy chromosomes
Satoru Watanabe

P17(Tokyo Univ. of Agric.)

Genome analysis of fructophilic lactic acid bacteria(Tokyo Univ. of Agric.)

Genome-wide analysis of transcription start sites in Bacillus subtilis
Takashi Matsumoto

P18(Tokyo Univ. of Agric.)

Identification of substrain-specific mutations by massively parallel whole-genome resequencing of the
cyanobacterium, Synechocystis sp. PCC 6803
Yu Kanesaki

P19(Tokyo Univ. of Agric.)

Resequencing analysis of the laboratory strains in the cyanobacterium, Synechococcus elongatus PCC
7942
Yu Kanesaki

P20(Tokyo Univ. of Agric.)

Analysis pipeline for microbial mutation from the next generation sequencing data
Yuh Shiwa(Tokyo Univ. of Agric.)

34

NGRC ニュース No. 3
P1 DNA methylomes and transcriptomes in mousegerm cells

loss-of-CREB-function by inhibiting CREB-mediated transcription
impairs LTM without affecting short-term memory (STM), indicating that
CREB-dependent gene expression is required for memory consolidation.

Hisato Kobayashi1, Takayuki Sakurai1, Misaki Imai2, Nozomi Takahashi1,
Atsushi Fukuda1, Yayoi Obata1, Shun Sato3, Kazuhiko Nakabayashi3,
Kenichiro Hata3, Yusuke Sotomaru4, Yutaka Suzuki5, Tomohiro Kono1,2

Thus previous studies have suggested that CREB is a positive regulator
for memory consolidation. To understand effects of gain-of-function of

1

CREB on memory performance, we generated and analyzed four lines of2transgenic

Department of BioScience, Tokyo University of Agriculture, Tokyo, Japan,
NODAI Research Institute, Tokyo University of Agriculture, Tokyo, Japan3
Department of Maternal-Fetal Biology, National Research Institute for Child Healthand Development, Tokyo, Japan, 4Natural Science Center for Basic Research andDevelopment, Hiroshima University,  Hiroshima, Japan, 5Graduate School of
Frontier, The University of Tokyo, Chiba, Japanadominant

activeCREB

mutantExpectedly, Y134F-A

transgenic lines exhibited enhanced long-term memory but normal STM.
These observations indicated that up-regulation of CREB-mediatedtranscription resulted in enhanced formation of long-term memory
without affecting STM.

Expectedly, our observations strongly suggested

that CREB positively regulates memory consolidation.
Interestingly, Y134F-C mice displayed enhanced 2 hrs STM but
normal 30 min-STM. Similarly, two lines of DIEDML mice displayedenhancement of even 30 min-STM but displayed normal 5 min-STM.
These observations indicate that up-regulation of CREB activity led toenhancement of STM without affecting memory encoding or learning.
To understand molecular mechanisms by which up-regulation of
CREB leads to the enhancement of STM and LTM, we are trying toanalyze transcriptional profiles of hippocampus of these transgenic lines
displaying enhancement of LTM and STM

P4 Identification of susceptibility genes associatedatopic dermatitis in NC/Nga

P2 Identification of a novel large intergenic
non-coding RNA at the imprinted Gpr1-Zdbf2 locus
Sato2,

expressing

transgenic mice displaying the lowest expression of transgene among all

Genome-wide dynamic changes in DNA methylation are
indispensable for germline and embryonic development inmammals. Here, we report single-base resolution DNA
methylome and transcriptome maps of mouse germ cells,
generated using whole-genome shotgun bisulfite sequencing andcDNA sequencing (mRNA-seq). Our results show a significant
positive correlation between gene transcription and gene-bodymethylation in the wild-type oocytes. However, the intragenic
methylation was not observed in Dnmt3L-/- oocytes, whichshowed genome-wide hypomethylation. Along with theidentification of a large number of Dnmt3L-dependent germline
differentially methylated regions, Dnmt3L-mediated intragenic
methylation was found to be required for the establishment ofoocyte-specific methylation marks.

Hisato Kobayashi1, Takayuki Sakurai1, ShunNakabayashi2, Kenichiro Hata2, Tomohiro Kono1,3

mice(CREB-Y134F or CREB-DIEDML) in forebrain.

Mao Ozaki1,2, Kunie Matsuoka2, Toyoyuki Takada3, Tamio Ohno4, Kaoru
Tsuda5, Tomohiro Kono5, Hiromichi Yonekawa6, Yoshiaki Kikkawa2
1
1Departmentof Bioproduction, Tokyo University of Agriculture, 2Mammalian
Genetic Project, Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science, 3Mammalian
Genetic Laboratory, National Institute of Genetics, 4Division of Experimental
Animals, Graduate School of Medicine, Nagoya University, 5NODAI Genome
Research center, Tokyo University of Agriculture, 6Basic Technology ResearchCenter, Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science

Kazuhiko1

Department of BioScience, Tokyo University of Agriculture, Tokyo, Japan,
Department of Maternal-Fetal Biology, National Research Institute for Child Healthand Development, Tokyo, Japan, 3NODAI Research Institute, Tokyo University ofAgriculture, Tokyo, Japan
2

NC/Nga (NC) is a model of atopic dermatitis (AD) originated from

We previously identified an imprinted gene cluster
containing two paternally expressed genes, Gpr1 and Zdbf2, andthe opposite imprinted-methylated regions. Here, we identified anovel imprinted large intergenic non-coding Zdbf2 variant(Zdbf2linc) which transcribed from the maternally methylated
Gpr1 DMR during blastula- and gastrula-stages. Furthermore, theGpr1 DMR displayed complete-biallelic methylation and theZdbf2linc expression was rarely observed in post-gastrula-stage,
despite of positive correlation between methylation of paternallymethylated Zdbf2 DMRs and mono-allelic original Zdbf2 variant
transcription. Our finding illuminates the rule of the large
non-coding RNA for the establishment of secondary DMRs byintergenic de novo methylation after implantation

Japanese fancy mice. NC mice develop human AD-like skin lesions
spontaneously in an air-unregulated conventional circumstance and shows
elevated levels of serum IgE. We previously reported that the locus for the
major determinant (derm1) was mapped to a 5.5 Mb region on mouse
chromosome (Chr) 9. However, application of a hapten, such as
2,4-dinitrofluorobenzene (DNFB), also evokes an AD-like lesion in NC.
In this study, we examined responsible gene regulating DNFB-induced
AD in NC. To perform linkage analysis, we selected C57BL/6J (B6) strain
that did not develop AD by carnage of DNFB and generated 96 N2 bybackcrossing between [NC x B6] F1 and NC. By inducement using by
DNFB, 67 N2 mice showed severe or mild dermatitis. Whole genome
scanning using 111 microsatellite markers revealed two loci on Chr 3 (24Mb interval) of and Chr 9 (30 Mb interval) associated for onset of AD in
NC. Moreover, we performed QTL analysis based on epidermal thickness
because affected mice showed a thickened epidermis. By this analysis, a

P3 Molecular mechanisms of memory enhancement
by up-regulation of CREB

trait was mapped on a 30 Mb region on Chr 9. Although this position wascorresponding with AD-linked map position, it significantly differed withspontaneous AD-linked derm1 region. Therefore, these result suggested

Hotaka Fukushima, Shunsuke Hasegawa, Ryouka Kawahara-Miki,
Satoshi Kidathat onsets in spontaneous AD and DNFB-induced AD were associatedwith different genes in NC genetic background. As another approach, weDepartment of Bioscience, Tokyo University of Agriculture, CREST, JST

resequenced NC genome on the next generation sequencer. 1,787,559,018
reads were mapped B6 reference sequence giving and average ~14x

Memory Consolidation is a gene expression-dependent process tocoverage, total ~49.36 Gbp of NC genome. By this analysis, we detected

generate a long-term memory (LTM). Previous studies have shown that

4,916 and 7,577 SNPs between NC and B6 mice in coding regions on

35

NGRC ニュース No. 3
only next-generation sequencing (NGS), and obtained 86 Gb ofsequence data. In addition to de novo assembly analysis, we also
performed mapping analysis using chicken genome sequence as areference; the obtained quail sequences covered almost 80% of
the chicken genome. This study demonstrates the feasibility ofusing aligning and assembling strategies to derive thewhole-genome sequence of the Japanese quail.

chromosomes 3 and 9, respectively.

P5

Effect of age on bovine early antral follicles

Miwa Endo1, Ryouka Kawahara-Miki2, Feng Cao3, Yasunori Monji1,
Takehito Kuwayama1, Tomohiro Kono3, Hisataka Iwata1
1

Department of animal science, Tokyo University of Agriculture, Tokyo, Japan,
Genome Research Center, NODAI Research Institute, Tokyo University ofAgriculture, Tokyo, Japan, 3Department of Bio-Science, Tokyo University ofAgriculture, Tokyo, Japan
2

P8 Whole-genome resequencing of the Japanesenative cattle Kuchinoshima-Ushi

Present study demonstrates that bovine follicle numbers areaffected by aging. When the early antral follicle of old cows were
cultured, rate of antral formation and the quality of the blastocysts
derived from these in vitro grown oocytes was lower than thosederived from young cows. Furthermore, there were differentiallyexpressed genes in the granulosa cells between the two age
groups. In addition, oocytes enclosed in the early antral follicle ofold cows had different characteristics compared with those ofyoung cows. Collectively, quality of oocytes and granulosa cells
has already affected by aging at the early antral follicle stage.

Ryouka Kawahara-Miki1, Kaoru Tsuda1, Yuh Shiwa1, Sen-ichi Oda2,
Shizufumi Ebihara2, Tomohiro Kono1,3
1
Genome Research Center, NODAI Research Institute, Tokyo University ofAgriculture, Tokyo, Japan, 2Graduate School of Bioagricultural Sciences, Nagoya
University, Aichi, Japan, 3Department of Bioscience, Tokyo University ofAgriculture, Tokyo, Japan

Because the Japanese native cattle Kuchinoshima-Ushi isisolated on a small island, it is assumed that numerous genomic
variations are conserved in this breed. In this study, genetic
features of Kuchinoshima-Ushi were evaluated by whole- genome
sequencing. A total of 64.2 Gb of sequence was generated, andthe number of mapped reads corresponded to 15.8-fold coverage.
From these data, we identified 6.3 million single nucleotide
polymorphisms (SNPs), of which more than 5.5 million (87%)
were found to be new. Out of the SNPs annotated in the bovine
sequence assembly, 20,432 were found in protein-coding regions
containing 11,713 nonsynonymous SNPs in 4,643 genes.
Furthermore, phylogenetic analysis showed that KuchinoshimaUshi is distinct from European domestic breeds.

P6 Expression profiling without genome sequence
information in a non-model species, pandalid shrimp(Pandalus latirostris), by next-generation sequencing
Ryouka Kawahara-Miki1, Kenta Wada2, Noriko Azuma2, Susumu Chiba2
1

Genome Research Center, NODAI Research Institute, Tokyo University ofAgriculture, Tokyo, Japan, 2Faculty of Bioindustry, Tokyo University of Agriculture,
Tokyo, Japan

This study explored the utility of next-generation sequencing
technologies for studying phenotypic variations between 2
populations of a non-model species, the Hokkai shrimp (Pandalus
latirostris; Decapoda, Pandalidae). First, we examined the genetic
and phenotypic differentiation between the populations. Then, bytranscriptome analysis, a total of 13.66 Gb was obtained and used
for de novo assembly. Two approaches were used to analyze theseassembled contigs; both approaches identified 29 sequences thatwere considered to be differentially expressed genes. The present
study provides a strategy for identifying sequences showing
significantly different expression levels between populations of a
non-model species, using only short-read sequence data.

P9 Whole-genome sequencing reveals many genetic
variations in the Japanese native cattle Mishima-Ushi
Kaoru Tsuda1, Ryouka Kawahara-Miki1, Tatsuo Noguchi2, Tomohiro
Kono1, 3
1

NODAI Genome Research Center, Tokyo University of Agriculture, Tokyo, Japan,
Fuji Experimental Farm, Tokyo University of Agriculture, Shizuoka, Japan,
3
Department of Bioscience, Tokyo University of Agriculture, Tokyo, Japan
2

The Japanese native cattle Mishima-Ushi may possess
numerous peculiar and valuable genetic variations in theirgenome. In this study, we evaluated the genetic features of 8
Mishima-Ushi cattle by whole-genome sequencing. We identified
approximately 7 million SNPs; of these, 678 non-synonymous
SNPs occurring in 462 genes were shown to be polymorphisms
specific to 8 Mishima-Ushi cattle. We found that 4 genes wererelated to the Mishima-Ushi-specific phenotype. These results
provide a framework for further genetic studies in theMishima-Ushi population, and facilitate research into molecularmechanisms underlying the phenotypic variation in economicallyimportant traits of domestic cattle breeds.

P7 Genome sequence of the Japanese quail Coturnix
japonica
Ryouka Kawahara-Miki1, Satoshi Sano1, Takehito Kuwayama2, Yoichi
Matsuda3, Takashi Yoshimura3, Tomohiro Kono1,4
1

Genome Research Center, NODAI Research Institute, Tokyo University ofAgriculture, Tokyo, Japan, 2Department of Animal Science, Tokyo University ofAgriculture, Kanagawa, Japan, 3Graduate School of Bioagricultural Sciences,
Nagoya University, Aichi, Japan, 4Department of Bioscience, Tokyo University ofAgriculture, Tokyo, JapanThe Japanese quail (Coturnix japonica) has long been an
excellent model organism used in a range of scientific disciplines,
including studies of development, behavior, physiology, andgenetics. It is also valued for its eggs and meat. We aspired to
decode the whole-genome sequence of the Japanese quail using

36

NGRC ニュース No. 3
P10 Identification and Utilization of Genome-wide
DNA Polymorphisms in Rice Cultivar for Sake-brewing

P12 Genome sequence of a hydrogen producer
Clostridium sp. Sa44

Yuko Arai-Kichise1, Mari Shibata-Hatta1, Yuh Shiwa1, Kaworu Ebana2,

Akihiro Ohnishi1, Yukiko Bando1, Yuh Shiwa2, Naoshi Fujimoto1,

3

4

1, 5

Masaharu Suzuki1

Shinya Yoshida , Masanori Yamasaki , Hirofumi Yoshikawa , Masahiro
2

1

1,5

Department of Fermentation Science, Tokyo University of Agriculture, Tokyo,
Japan, 2NODAI Genome Research Center, Tokyo University of Agriculture, Tokyo,
Japan

Yano , Kyo Wakasa
1

Genome Research Center, NODAI Research Institute, Tokyo University ofAgriculture, Tokyo, Japan, 2Natl. Inst. Agrobiol. Sci., 3Hyogo Pref. Agric. Res. Cent.,
4
Grad. Sch. Agric., Kobe Univ., 5Dept. Biosci., Tokyo Univ. Agric.

In this study, we obtained 8 stable hydrogen fermentation
microflora using Beer Lees. Composition of microflora andhydrogen productivity of main bacterium were analyzed byculture -independent and -dependent methodologies. Clostrdium
sp. Sa44 was the most useful bacterium in hydrogen fermentationfrom Beer Less. In addition, genome sequencing of Clostridium
sp. Sa44 was carried out with the GAII (Illumina) in NODAIGenome Research Center (NGRC). A total of 10,560,940 reads ofan average length of 80 bp were assembled by using Velvet
algorithms. This resulted in 223 contigs, with the largest contig
encompassing 333,773 nucleotides.

DNA markers are of growing importance in molecular
breeding approaches. However, DNA markers are often
unsatisfied between closely related cultivars, because of their
genetic relatedness. To obtain informative DNA markers for
distinction between japonica rice cultivars, we performed
whole-genome analysis of an ancestral cultivar of japonica rice,
Omachi, using next-generation sequencing. As a result, wediscovered numerous SNPs, insertions, and deletions that differed
between the two japonica rice cultivars. A high-throughput arrayfor genotyping by the identified SNP sites was then developed.
Genotyping of japonica cultivars by this array provided
information on their pedigree.

P13 Distribution of enzymes to protect from oxygen
toxicity and utilize oxygen by facultatively anaerobic
bacteria based on biochemical and genomic analysis.

P11 De novo genome sequencing of the Japaneseradish “Daikon”

Daichi Mochizuki1, Naoto Tanaka2, Morio Ishikawa3, Akihito Endo4,
1

Yuki Mitsui , Yuichi Katayose , Michihiko Shimomura , Takuji Sasaki

Junichi Sato1, Sinji Kawasaki1, Youichi Niimura1

1

1
Department of Bioscience, Tokyo University of agriculture, Tokyo Japan, 2 NODAI
Culture Collection Center, Tokyo University of Agriculture, Tokyo, Japan,
3
Department of Fermentation Science, Tokyo University of Agriculture, Tokyo,
Japan, 4Functional Foods Forum, University of Turku,Turku, Finland

3

2

3

1, 2

2

Tokyo University of Agriculture, National Institute of Agrobiological Sciences,
Mitsubishi Space Software Co., Ltd.

Radish is a useful vegetable crop with a long cultivation
history, and is grown around the world. Radish is a very important
ingredient, especially in Japan, China, and Korea. In Japan, morethan 700 varieties of radish, called as “Daikon” (large root), arecultivated and diverse local races have differentiated in eachregion. Compared with the other root crops, radish has distinct
variation in root characteristics, e.g., shape, size, color and thematerials contained within root such as starch, sugar and pungent
component.
Cultivated radish is included in the genus Raphanus (R.
sativus: 2n=18) in Brassicaceae family. The closest relative ofRaphanus is the genus Brassica, another important group of crops.
The genomic researches of Brassica species are rapidly
progressing, however, there is limited information of radish
genome despite its importance for diverse gene resources.
We aim to firstly determine the whole genome sequence of
the Japanese radish (the genome size is approximately 500 Mbp)
using the Roche 454 GS-FLX Titanium and the Illumina HiSeq
2000 sequencers. To construct the contigs and scaffolds as long as
possible, single read, short-insert and long-insert (more than 20kb) paired end reads are used for the assembly. The project has
just launched and we would like to present the background of the
project and the progress. By establishing the genome database ofradish, it is possible to investigate the genetic basis of diverse root
traits. Furthermore, the origin of domestication and history ofdiversification of the cultivated radish are expected to be revealed
by molecular phylogenetic analysis based on the genomic data.

As oxygen has a big impact positively or negatively forbacterial growth, enzymes to protect from oxygen toxicity and toutilize oxygen must be related to the growth properties of bacteria.
We first revealed the distribution of peroxide-scavenging andoxygen metabolic enzymes in facultative anaerobes, in thegeneral bacterial based on biochemical data.
In order toconfirm the distribution, we had a genomic analysis using
genome information publicly available in database.
Based onthe data analyzed, we finally try to compare the distributions of
the enzymes with bacterial phylogenic taxonomy.

P14 Identification and molecular cloning of Sirtuin
homolog of the lactic acid bacteria isolated fromfermented milk and plant.
Junichi Nakagawa1, Hotaka Atarashi1, Shuki Fujimura1, Naoto Tanaka2,
Sanae Okada2
1

Department of Food and Cosmetic Science, Tokyo University of Agriculture,
Hokkaido, Japan, 2Culture Collection Center, Tokyo University of Agriculture,
Tokyo, Japan

Cholate is the major component of bile acid causing stress tointestinal bacteria. Lactobacillus casei strain NRIC 0644T,
originally isolated from cheese, showed sensitive phenotype tocholate, while strains NRIC 1917 and NRIC 1981, isolated fromcompost and sugar cane wine, respectively, were more resistant to
it. Pre-treatment of these strains with resveratrol, a polyphenol
known to stimulate Surtuin, helped their survival. Furthermore,

37

NGRC ニュース No. 3
To understand the regulatory mechanism underlying theexpression of each gene, the transcription start sites (TSSs) havebeen identified one by one. According to the database, 930 TSSs
for 578 transcription units have been determined so far. We
aspired to perform global analyses of TSSs using massively
parallel sequencing. Because intact prokaryotic RNAs possess a5'-tri-phosphate and processed or degraded RNAs display a5'-mono-phosphate, we were able to identify more than 1000
novel TSSs by selective sequencing of the 5'-tri-phosphate ends.

whole genome analysis revealed existence of the ORFs encoding
Sirtuin homolog in these strains. Following cDNA cloning,recombinant Sirtuin homolog proteins have been generated to
examine the role of the putative ancestor of the master epigenetic
regulator.

P15 Genome analysis of fructophilic lactic acidbacteria
Naoto Tanaka1, Yo Oikawa2, Sanae Okada1,2
1

P18 Identification of substrain-specific mutations bymassively parallel whole-genome resequencing of the
cyanobacterium, Synechocystis sp. PCC 6803

NODAI Culture Collection Center, Tokyo University of Agriculture, Tokyo, Japan,
Department of Applied Biology and Chemistry, Tokyo University of Agriculture,
Tokyo, Japan2

Lactic Acid Bacteria (LAB) are facultative anaerobes andmost of them grow by the fermentation of glucose under aerobic
and anaerobic conditions. Fructophilic LAB inhabiting flowers
and fruits, however, cannot grow anaerobically on media
containing glucose as a sole carbon source, but growanaerobically on fructose-containing media. Also, unlike general
LAB, they surly produce lactate and acetate from glucose. To
study their unique characteristics, we analyzed Fructobacillus
genomes, representative fructophilic LAB and compared themwith their close LAB genomes. As a result, it was revealed genedeletion in the evolutionary process might result in the uniqueenergy metabolism of Fructobacillus.

Yu Kanesaki1, Yuh Shiwa1, Naoyuki Tajima2, Marie Suzuki3, Satoru
Watanabe3, Naoki Sato2, Masahiko Ikeuchi2, and Hirofumi Yoshikawa1,3
1
Genome Research Center, NODAI Research Institute, Tokyo University ofAgriculture, 2Department of Life Sciences, Graduate School of Arts and Sciences,
The University of Tokyo, 3Department of Bioscience, Tokyo University ofAgriculture

The cyanobacterium, Synechocystis sp. PCC 6803, was thefirst photosynthetic organism for which the whole-genome
sequence was determined, in 1996. It thus plays an important rolein basic research on the mechanism, evolution, and molecular
genetics of the photosynthetic machinery. However, it is known
that there are a lot of substrains with distinct phenotypes that aresupplied and used as wild-type strains in different laboratories.
We deciphered the genome of 3 substrains of Synechocystis sp.
PCC 6803, i.e. PCC-P, PCC-N, and GT-I, to reconstruct thebioinformatics basis for molecular biological research on
Synechocystis sp. PCC 6803. By massively parallel sequencing,
we identified a number of substrain-specific SNPs and indels,
which differ from the reference sequence. Especially,
determination of the genome sequence of PCC substrains willcontribute widely to cyanobacterial research making use of thefrozen stock cells supplied by the Pasteur Culture Collection
Center.

P16 Light-dependent and asynchronous replication of
cyanobacterial multi-copy chromosomes
Satoru Watanabe1, Ryudo Ohbayashi1, Yuh Shiwa2, Asuka Noda1, Yu
Kanesaki2, Takayuki Sakurai1, Taku Chibazakura1, Hirofumi Yoshikawa1,2
1
Department of Bioscience, Tokyo University of Agriculture, Tokyo, Japan, 2NODAIGenome Research Center, Tokyo University of Agriculture, Tokyo, Japan

While bacteria such as Escherichia coli and Bacillus subtilis
harbor a single circular chromosome, some freshwater
cyanobacteria have multiple chromosomes per cell. The detailed
mechanism(s) of cyanobacterial replication remains unclear. We
show here the replication origin (ori), form, and synchrony of themulti-copy genome in freshwater cyanobacteria Synechococcus
elongatus PCC 7942. Mapping analysis of nascent DNA
fragments using a next-generation sequencer indicated that
replication starts bidirectionally from a single ori, which locatesin the upstream region of the dnaN gene. In addition, thereplication is initiated asynchronously not only among cell
populations but also among the multi-copy chromosomes. Ourfindings suggest that replication initiation is regulated lessstringently in S. 7942 than in E. coli and B. subtilis.

P19 Resequencing analysis of the laboratory strainsin the cyanobacterium, Synechococcus elongatus PCC
7942.
Yu Kanesaki1, Yuh Shiwa1, Marie Suzuki2, Satoru Watanabe2, andHirofumi Yoshikawa1,2
1

Genome Research Center, NODAI Research Institute, Tokyo University ofAgriculture, 2Department of Bioscience, Tokyo University of Agriculture

It is empirically known that cyanobacteria easily give rise tospontaneous mutations on their genome sequences. These
differences of genotype and phenotype between laboratory strains
and the sequenced reference strain sometimes cause great
difficulty on post-genomic analyses. Here, we carried out
resequencing analysis of the laboratory strain of acyanobacterium, Synechococcus elongatus PCC 7942. Using
mapping analysis, we identified 7 SNPs and a large continuous
deletion of a 48.7 kb region in the laboratory strain. These results
highlight the importance of resequencing analysis in the bacterial
genome research.

P17 Genome-wide analysis of transcription start sites
in Bacillus subtilis
Takashi Matsumoto1, Hirofumi Yoshikawa1,2
1
Genome Research Center, NODAI Research Institute, Tokyo University ofAgriculture, Tokyo, Japan, 2Department of Bioscience, Tokyo University ofAgriculture, Tokyo, Japan

Bacillus subtilis strain 168 is one of the best-studiedprokaryotes. Its genome of 4.2 Mb is comprised of 4422 genes.

38

NGRC ニュース No. 3
P20 Analysis pipeline for microbial mutation fromnext-generation sequencing data
Yuh Shiwa1, Yu Kanesaki1, Takashi Matsumoto1, Shunsuke Yajima1,2,
Hirofumi Yoshikawa1,2
1
2

NODAI Genome Research Center, Tokyo University of Agriculture, Tokyo, Japan,
Department of Bioscience, Tokyo University of Agriculture, Tokyo, Japan

Multiplexing sequencing can enable sequencing of many
dozens of samples at a time, accelerating the analysis of bacterial
mutation. However, it is necessary to use a variety of softwaretools for alignment, de novo assembly, detection of structuralvariants, functional annotation, and genome browsing. To
expedite bacterial data analysis, we have developed a suite ofautomated tools—NODAI Sequence Annotation Pipeline (NSAP).
We also have developed the Variation Annotator software, which
can annotate variations detected by NSAP. NSAP has beensuccessfully integrated with several tools for alignment, de novo
assembly, and detection of structural variants. This pipelinemarkedly shortens analysis time.

39

NGRC ニュース No. 3

NGRC ニュース No. 3

2012 年 3 月発行

学校法人東京農業大学 生物資源ゲノム解析センター〒 156‑8502
TEL

東京都世田谷区桜丘 1‑1‑103‑5477‑2769

FAX

E-mail nodaigc@nodai.ac.jp

03‑5477‑2377
URL http://www.nodai-genome.org

40