筑波大学技術報告

24: 53-56, 2004

全ゲノム連鎖解析法による疾患感受性遺伝子座の検索
伊藤清子1、有波忠雄2
1

筑波大学人間総合等教育研究支援室（医学系）、2 筑波大学基礎医学系〒305-8575 茨城県つくば市天王台 1-1-1

3.2.1 DNA の抽出

概要

EDTA 加採血を行った静脈血 10 ml を 2,000 rpm で全ゲノム連鎖解析法は、多因子疾患の原因遺伝子座や感受性遺伝子座を全染色体上にくまなく検索す 10 分遠心後、血漿成分と血球成分に分離し、Kunkelる方法である。多因子疾患は、複数の遺伝因子と環 らの方法[2] に従い、この血球成分から高分子の DNA境因子の影響により発症する。多因子疾患である小 を抽出した。遠心分離して得られた血球成分を９倍児気管支喘息の感受性遺伝子座の検索を目的として、 量の 抽出液 (0.32 M sucrose、 5 mM MgCl2 、 1%
染色体全域に存在するマイクロサテライト (MS) マ
TritonX-100、10mM Tris-HCL、pH7.6) にて希釈後、ーカーを約 10 cM 間隔で選択し、疾患との連鎖の有3,000 rpm で 15 分遠心して核分画を得た。この核分無を調べた。連鎖の統計解析には、ノンパラメトリ 画を 3 ml の proteinase K 用緩衝液 (10 mM Tris-HCL、ック法の一つである罹患同胞対法を用いた。その結 10 mM EDTA、10 mM NaCl、pH 8.0) に浮遊させた後、果、第 4 染色体 (4q35)、第 5 染色体 (5q31-33)、第 6
最終濃度 0.5 % になるように SDS を加えて核膜を染色体 (6p22-21.3)、第 12 染色体 (12q14-24.2) と第破壊した。次に、0.6 mg の proteinase K を加え、37 °C13 染色体 (13q14-14.3) のそれぞれの領域に小児気 で一晩反応させてタンパク質成分を分解した。さら管支喘息との連鎖が見られ、この領域が感受性遺伝 に Phenol 処理による除タンパク後、透析液（10 mM子座である可能性が示唆された[1]。
Tris-HCL、1 mM EDTA、pH 8.0）に透析し Phenol を完全に除いた。次に、RNase を最終濃度 100 µg/ml になるように加え、37 °C で 1 時間反応させて RNA を１．はじめに分解した。さらに proteinase K 反応、Phenol 処理、近年、多くの疾患感受性遺伝子が、分子遺伝学的 透析を繰り返した。
手法の発達とヒトゲノムプロジェクトの進行により
抽 出 し た DNA は 分 光 光 度 計 で 測 定 し 、明らかになってきている。
1OD260=0.055 mg/ml として DNA 濃度を計算し、最疾患感受性遺伝子を同定する主な研究方法には、 終濃度 10 ng/ml になるように TE (10mM Tris-HCL、連鎖解析法と候補遺伝子解析法がある。連鎖解析法 1 mM EDTA、pH 8.0) で調整し、4°C で保存した。
は、その疾患を発症している構成員を含む家系を対象として、発症に強い影響を与える遺伝子座を染色 3.2.2 遺伝マーカーの選択体上に見い出すことを目的としている。候補遺伝子解析法は、その遺伝子上に存在する多型と疾患との全ゲノム連鎖解析法は、遺伝マーカーとして全染相関を明らかにすることを目的としている。
色体上に存在する一塩基置換多型 (single nucleotide
今回報告する全ゲノム連鎖解析法は、疾患との連 polymorphism : SNP) 、あるいは単純な繰り返し配列鎖の有無を染色体全域にわたって検討する方法であ であるマイクロサテライト (MS) を用いて行われる。
り、疾患感受性遺伝子を同定するための検索法とし 今回、我々は MS マーカーを用いた。MS マーカーて広く用いられている。
は 1 から 4 塩基程度の配列単位で反復しているもの

２．目的
全ゲノム連鎖解析法を用いて、染色体全域にわたって小児気管支喘息感受性遺伝子座を検索する。

３. 方法
3.1 対象日本人の小児気管支喘息を有する 2 人以上の子ども（同胞）がいる家系を対象とした。対象数は 47 家系 197 人で、罹患同胞は 65 対である。本研究は、筑波大学倫理委員会で承認された方法で、本人および親よりインフォームドコンセントを得て行った。

で、反復数が個体間で異なることが多く、しかも反復数がさまざまで対立遺伝子が多いため遺伝子マーカーとしては有用なものである（図 1）。
染色体全域に存在する MS マーカーを全染色体上でほぼ均等 (約 10cM) になるように選択し、それらMS マーカーすべてについてサイズが 100 ~ 400 bpになるように PCR プライマー を作成した。さらに
PCR プライマー の上流側の 5’ 末端に蛍光色素のFAM（青）、HEX（緑）または TET（黄）を標識し、マイクロサテライトマーカー

CACACACACA....

ATATATATAT....

GAAGAAGAAGAAGAA....

3.2 遺伝子解析
図 1 染色体上に点在する MS マーカーE-mail: s-itoh@md.tsukuba.ac.jp; Tel: 029-853-3352-53-それぞれの MS マーカーを区別できるようにした。 用いた。ゲル板は、36 cm のガラス板に 4% アクリ
本研究では、リサーチジェネテイクス社のヒューマ ルアミドゲル溶液 30 ml (尿素 10.8 g、5xTBE [0.5M
Tris-boric acid、10 mM EDTA] 6 ml、40% アクリルア
ンリンケージマッピングスクリーニングセット
ミド液 [38% acrylamide、2% methylene bis-acrylamide]ver.8 を用い、全染色体で 386 ヶ所の MS マーカーを3 ml、10% 過硫酸アンモニウム 150 µl、TEMED 15検討した。内訳は、第 1 染色体 30 ヶ所、第 2 染色体28 ヶ所、第 3 染色体 25 ヶ所、第 4 染色体 21 ヶ所、 µl) を流し込んで作製した。コームは 36 well コームを使用した。蛍光 (FAM、TET、HEX) とサイズ (bp)
第 5 染色体 23 ヶ所、第 6 染色体 19 ヶ所、第 7 染色が重ならないように遺伝マーカーを選んで、1 つのレ
体 20 ヶ所、第 8 染色体 19 ヶ所、第 9 染色体 16 ヶーンに 8~9 種の PCR 産物を同時に泳動できるように所、第 10 染色体 20 ヶ所、第 11 染色体 15 ヶ所、第した。FAM、TET で標識された PCR 産物は 10 分の12 染色体 18 ヶ所、第 13 染色体 11 ヶ所、第 14 染色1 に、HEX で標識された PCR 産物は 5 分の 1 になる
体 14 ヶ所、第 15 染色体 12 ヶ所、第 16 染色体 14混合液 1 µl にホルムアミド 1.5 µl、ヶ所、第 17 染色体 15 ヶ所、第 18 染色体 14 ヶ所、 ように希釈混合し、Blue Dextran (50 mM EDTA、50 mg/ml Blue Dextran)
第 19 染色体 10 ヶ所、第 20 染色体 10 ヶ所、第 210.3 µl、サイズスタンダードの GS-500 TAMURA (ABI)
染色体 6 ヶ所、第 22 染色体 6 ヶ所、性 (X,Y) 染色0.3 µl を加え、95°C で 5 分間の熱変性を行った後、体 21 ヶ所である。
急冷し 1 本鎖 DNA にした。この 1 本鎖 DNA をサンプルとして 1 レーンあたり 2.5 µl ずつ泳動した。こ3.2.3 PCR 反応 (Polymerase Chain Reaction)の 1 本鎖 DNA が、そのサイズ（bp）によりゲル上に上記の PCR プライマーを患者の DNA 増幅に用 分離され、MS マーカーの繰り返し配列の数によって2~4 bp の倍数の差で検出された（図 2）。
いた。DNA と PCR プライマーを含む反応液 10 µl を
下記のように 96 穴 PCR プレート上に調整し、DNA増 幅 器 (Gene Amp PCR System 9600 、 Applied
3.2.5 遺伝子型の判定
Biosystems [ABI]) にて増幅させた。
反応組成液
10xBuffer (ABI)
10mM dNTP mix
25 mM MgCl2
Forward Primer
Reverse Primer
Taq polymerase (ABI)
Template DNA
滅菌蒸留水

サンプルの 1 本鎖 DNA と同時に泳動したサイズス
タンダード GS-500 TAMURA を基準として、目的のMS マーカーのサイズを相対的に求めた(図 2)。
GENESCANTM software (ABI)と GENOTYPER software(ABI) の両方で波形を見ながら、親子間のサイズを確認し、各 MS マーカーの遺伝子型を決定した(図 3)。

1.0 µl
0.8 µl
0.8 µl
0.3 µl
0.3 µl0.04 µl
0.8 µl5.96 µlPCR 反応は、95°C で 5 分間の鋳型 (Template) DNAの変性後、94°C で 15 秒、55°C で 15 秒、72°C で 30秒の変性、アニーリング、伸長を 10 回繰り返し、さらに 91°C で 15 秒、55°C で 15 秒、72°C で 30 秒の変性、アニーリング、伸長を 25 回繰り返し、最後に 72°C
10 分間の DNA 伸長を行った。

3.2.4変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動
MS マーカーそれぞれについて増幅させた患者のDNA (PCR 産物)を熱変性後、ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、遺伝子型を決定した。電気泳動には DNA シークエンサー ( ABI PRISMTM 377 ) を
図 3 親子間の MS マーカーの遺伝子型

色別にPCR増幅
サイズを決定する。

3.3 統計解析
3.3.1 連鎖解析法
父 母 123

父母1 2

赤はサイズマーカー

図 2 変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動による MS マーカー遺伝子型決定の原理

家系を用いた連鎖解析には、パラメトリック法解
析とノンパラメトリック法解析がある。ノンパラメ
トリック法解析は、遺伝形式を規定しないで解析することができるため、多くの遺伝子と環境が複雑にからみあって発症する多因子疾患の感受性遺伝子の同定に広く用いられている。

-54-

今回、我々が対象とした小児気管支喘息は多因子疾患であるので、ノンパラメトリック法にて解析した。しかも、ともに患者である同胞とその両親からなる家系を対象としているので、ノンパラメトリッ
ク法解析の一種である罹患同胞対解析を行った。
罹患同胞対解析では、患者である子ども達すべてが必ずしも疾患の原因となる感受性遺伝子を持っているとは限らないが、同胞がともに親から感受性遺伝子を受け継いでいる可能性が高く、そのため疾患と連鎖している領域では、対立遺伝子を偶然より高い確率で共有していることが期待される。故に、疾患と MS マーカーの連鎖の有無を解析することによって、疾患感受性遺伝子座を検索できる。実際には、
小児気管支喘息と MS マーカーとの連鎖を、同胞間で観察された共有する同祖遺伝子 (alleles identical bydescent、IBD) の割合から、多点ノンパラメトリックスコアである MLS (multipoint maximum lod score) を求めた。解析にはコンピュタープログラム
MAPMAKER/SIBS ver2[3] を用いた。

3.3.2 連鎖の可能性を示す基準
本研究では、E.Lander らの提唱した多因子疾患の全ゲノム検索の判定基準[[3] に従い、Lod (logarithymof odds) 値 3.6 以上を有意な連鎖、Lod 値 2.0 以上を有意な連鎖を示唆する基準とした。なお、Lod 値は、2 つの遺伝子座が連鎖している可能性としてない可能性の比であるオッズ (odds) 比の対数値で表される。Lod 値 3.0 は、連鎖している可能性がしてないものより 1000 倍高いことを意味する。

４．結果と考察
全ゲノム連鎖解析法により、小児気管支喘息の感受性遺伝子座を染色体全域にわたり検索した結果を
図 4-1、4-2 に示した。疾患との連鎖の可能性を示す
領域は、第 4 染色体 (4q35、 lod 2.74)、第 5 染色体(5q31-33、lod 4.52)、第 6 染色体 (6p22-21.3、 Lod 2.13)、
第 12 染色体 (12q14-24.2、Lod 2.0) と第 13 染色体

図 4-1 小児気管支喘息患者の全ゲノム解析の結果各染色体ごとの結果を示した。縦軸は MLS (Lod) 値を示し、横軸はテロメア側からの MS マーカーの距離 (cM) を示した。

-55-(13q14-14.3、 Lod 2.82) にそれぞれ見られた。この 参考文献
領域に、疾患発症にかかわる遺伝子が存在している[1] Y. Yokouchi, E. Noguch, S. Ito, T. Arinami, et al.,可能性が示唆された。そこで我々は、これら領域をSignificant evidence for linkage of mite-sensitive
さらに細かく分析し、この領域に存在し疾患との関
childhood asthma to chromosome 5q31-q33 near theinterleukin 12B locus by a genome-wide search in Japanese
与が考えられる候補遺伝子を解析した。これまでにfamilies, Genomics 66 (2000) 152-160.
[4][5]
第 6 番染色体上にある TNF 、PAFAH などの遺伝[2] L. M. Kunkel, K. D. Smith, S. H. Boyer, D. S. Borgaonkar,
et al., Analysis of human Y-chromosome-specific reiterated
子が小児気管支喘息に関連していることを見い出し、
DNA in chromosome variants, Proc Natl Acad Sci USA
疾患感受性遺伝子として報告している。
74 (1977) 1245-1249.
このように全ゲノム連鎖解析法は、疾患感受性遺 [3] E. Lander, L. Kruglyak, Genetic dissection of complex traits:
guidelines for interpreting and reporting linkage results
伝子座の検索に有用である。現在、我々はこの方法[see comments], Nat Genet 11 (1995) 241-247.
により花粉症、精神疾患などの感受性遺伝子の検索 [4] E. Noguchi, Y. Yokouchi, M. Shibasaki, T. Arinami, et al.,
Association between TNFA polymorphism and theを行っている。

development of asthma in the Japanese population, Am J
Respir Crit Care Med 166 (2002) 43-46.
[5] S. Ito, E. Noguchi, T. Arinami, et al., Evidence for an
association between plasma platelet-activating factor
acetylhydrolase deficiency and increased risk of childhood
atopic asthma, J Hum Genet 47 (2002) 99-101.

図 4-2 図 4-1 の続き-56-