課題番号：27指1201
研究課題名 ：膵島移植を目指した機能性β細胞の大量培養法の開発
分担研究課題名：ヒトiPS細胞から膵臓β細胞の大量培養法の検討
主任研究者名 ：大河内仁志
分担研究者名 ：大河内仁志、霜田雅之、安田和基、矢部茂治
キーワード ：iPS 細胞、膵β細胞
研究成果：
ヒト iPS 細胞から膵臓β細胞を分化誘導できるようになったので、さらなる分化法の改善と膵島移植を目指すために大量培養法の開発を目的とした。また細胞移植後の拒絶反応を抑制するための免疫隔離膜の検討も行い、膵β細胞の転写因子の検討も行った。

１浮遊培養法
これまでに接着培養ではブドウ糖濃度に応じてインスリンの分泌量を変化させられるヒト機能性β細胞の分化誘導に成功しているが、マウス１匹に必要な細胞数を確保するためには 6cm の培養皿で１枚必要である。ヒトに対してはマウスに必要とされる細胞数の約 2000 倍が必要となるため、培養皿では枚数が多くなりすぎて、対応が難しい。また接着培養の最終段階で細胞塊を形成させて 3 次元培養をした方がβ細胞の機能が上昇することが判明した。そこで大量培養という観点から浮遊培養に注目し、６段階からなる全分化過程を細胞凝集塊を形成させて浮遊培養を行うことにした。まず基本的な浮遊培養法として回転翼で容器内を攪拌するエイブル社の 30ml 用の自動攪拌培養装置と培養皿全体を回転させる旋回培養装置を購入して、比較検討した。いずれの浮遊培養装置でも細胞凝集塊が形成されるが、後者では細胞凝集塊が中央に集まる傾向にあり、お互いに接着しやすくなってしまうために、前者の浮遊攪拌培養法を選択した。東大医科研で樹立された iPS 細胞（TKDN4-M）については接着培養の培養条件が概ね適用でき、浮遊培養においても in vitro で機能性β細胞の分化誘導が可能であった。回転数を調節することによって、なるべく細胞にストレスをかけないようにするとともに凝集塊の大きさを揃えることも可能になった。STZ（ストレプトゾトシン）を投与した糖尿病モデルマウス（NOD-SCID）の腎被膜下に細胞移植をして、細胞生着を確認した。マウス血中にヒト C-peptide を検出したが、検出濃度としては
数十 pM 程度であり、まだ血糖値を正常化するためには不十分な量しかインスリンが分泌されていないと考えられた。In vitro でインスリンを多く分泌する細胞がマウスへの移植後に必ずしも同等の機能を発揮するとは限らないという結果が得られた。分化法をさらに改善することとともに移植法も試行錯誤して、細胞移植後にマウス血中のヒト C-peptide 濃度を上昇させることができた。また 100 日以上の随時血糖の正常化を確認した。組織学的な検討においてインスリン陽性細胞とグルカゴン陽性細胞、ソマトスタチン陽性細胞が検出され、ヒト膵島様組織が確認できた。ブドウ糖負荷試
験（OGTT）においても、細胞移植群は２時間後に血糖値は正常化した。
浮遊培養においても最初の分化段階での細胞の状態がその後の分化誘導に大きく影響を与えること、すなわち最初の内胚葉への分化条件が重要であることを立証し、
definitive endoderm への新規分化誘導法として特許を出願した。エイブル社の 30ml

用の自動攪拌培養装置は 100ml、500ml にもスケールアップが可能なので、今後は100ml の容器で検討していく予定である。またスケールアップの際には酸素濃度などのモニターも必要とされるので、品質管理に向けてさらなる検討が必要であると考えている。
２誘導した細胞機能評価
移植直前の細胞塊を用いてブドウ糖によるインスリン分泌刺激試験(GSIS)を行った。
NKX6.1 の発現が十分でない時にも GSIS にて高血糖に対してインスリン分泌が大きく上昇することがあり、機能性が保たれていると判断していたが、移植後のマウス血中のヒト C-peptide 濃度を測定してみるとそれほどでもなく、必ずしも in vitro の GSISが移植後の効果判定の指標にならないことが示唆された。一方、NKX6.1 の発現を上昇させることができた細胞塊では GSIS に対する反応性はあまり見られない場合でも、移植後に徐々にマウス血中のヒト C-peptide 濃度が上昇して、随時血糖が正常化する
ものが現れた。マウス生体内でヒト膵島細胞が成熟化している可能性が示唆された。
そこで STZ がマウスの膵β細胞に感受性が強く、ヒトβ細胞には感受性が低いことを利用して、ヒトβ細胞移植後に STZ を投与すれば、マウスのβ細胞は破壊され、ヒトのβ細胞だけが残る実験系を構築した。通常の NOD-SCID マウスにヒト iPS 細胞由来の細胞塊を移植して２、４、６週間後にそれぞれ STZ を投与したところ、細胞移植後２週間では血糖の上昇が見られたのに対して、４週間後と６週間後に STZ を投与した
場合は、血糖値が上昇しなかった。このことから移植前の細胞の状態はまだ未分化な状態のβ細胞である可能性が高く、生体内で４週間程度かけてβ細胞は成熟化することが示唆された。この実験の過程でβ細胞の成熟化のマーカーとなりうる候補分子を幾つか見出したので、今後さらに検討していきたいと考えている。
３CiRA 株の検討
京都大学 CiRA で樹立された HLA ホモの臨床グレード iPS 細胞を用いて同様に 30mlの浮遊培養を行った。１０種類の iPS 細胞を検討したが、同一個体由来でも、株間の差が認められ、それぞれの株に対して培養条件を最適化させる必要があることが判明した。臨床応用に向けて、最も効率良く高機能な膵島を誘導できる最適な iPS 細胞株
を選択する必要があるため、浮遊培養への適応力と内胚葉系の細胞への分化しやすさを指標にして、15M63 を選択した。TKDN4-M 株で得られた培養条件をもとにして培養を行い、６段階に渡る分化過程でそれぞれ細胞塊をサンプリングして RNA 発現を検討した。最終分化段階のβ細胞に対してブドウ糖によるインスリン分泌刺激試験を行った。15M63 から分化した細胞においても in vitro でインスリン産生が認められた。iPS
細胞から分化誘導したこれらの細胞塊を東大生産研にてアルギン酸でできたファイ
バーに封入した。NOD-SCID マウスに STZ を投与して１型糖尿病モデルを作成し、腹腔内に 6~12x106 個の細胞を含んだファイバーを移植したところ、随時血糖が正常化した。マウス血中にヒト C-peptide が検出でき、移植後 120 日以上正常血糖を維持できた。腹腔内からファイバーを取り出し、別の NOD-SCID マウスの腹腔内に再移植して、生体内で機能を発揮し続けるかを継続観察中である。
４免疫隔離膜の開発
免疫抑制剤を使用しない新規膵島移植法の確立を目指して、細胞を包む免疫隔離膜の開発も行った。ブタ膵島およびMIN6細胞を用いて、①ハイドロゲルカプセルに細胞を封入し、in vitroで培養するとカプセル内で細胞は生存して機能を維持し、インスリンを放出することを確認した。

さらにカプセル化細胞を糖尿病化ヌードマウスおよび免疫正常マウスに移植し、最高3か月以上の血糖値の改善効果を認めた。ハイドロゲルのみでも免疫隔離機能も示した。ゲル周囲の癒着や線維化はほとんど認めなかった。しかし、移植後長期的にはゲルが次第に溶解縮小し、グラフト機能が低下していくことが課題であった。
②マクロカプセル（デバイス）に細胞を封入し、in vitroで培養するとカプセル内で細胞は生存して機能を維持し、インスリンを放出することを確認した。
さらにマクロカプセル化細胞を糖尿病化ヌードマウスおよび免疫正常マウスに移植し、最高6か月以上の血糖値の改善効果を認めた。しかし、ハイドロゲルと異なり半透膜性カプセルは長期的に破損することなく強度的には安定であったが、移植後長期的には次第にグラフト周囲の線維化や癒着が発生し、グラフト機能が低下していくことが課題であった。
さらに半透膜性マクロカプセル化ブタ膵島を健常マーモセット腹腔内に移植し、癒着や線維化を起こさず2か月間グラフト内部の膵島を生存させた。今後さらに長期の評価が必要である。
５膵β細胞の転写因子研究
膵β細胞や膵ラ氏島における重要性が従来から示されている MafA 及び MafB について、膵β細胞株および発生工学的手法も駆使して詳細に解析した。その結果 MafA は、インスリン遺伝子の転写に重要な因子として同定された分子であるが、膵β細胞の成熟及び維持に重要であること、その発現維持には DNA メチル化も寄与していること、などを明らかにした。MafA 自体は少なくともヒト MODY の主要な原因遺伝子ではないが、膵β細胞機能のコアとなる転写因子ネットワークを形成しており、MODY 患者由来
iPS 細胞から分化させた膵β細胞の機能解析においても有用な知見である。なおこの研究の過程で、本研究の準備として、バイサルファイト法及び PyroMarkQ24 を用いた、
ヒト DNA メチル化の解析系を立ち上げた。
平成 29 年度には、こうした研究をさらに進展させたほか、ヒト MODY のより広いス
ペクトルの臨床像を得るために、MODY の遺伝子異常のスクリーニング系をより整備した。具体的には、特に MODY5 に多い遺伝子の部分欠失、または全欠失は、従来のサンガー法では検出できない可能性があるため、MLPA（multiple ligation-dependent）
法を導入した。既に HNF1B 遺伝子のヘテロ欠失が同定されている患者 DNA をポジティ
ブコントロールとして用いて、その妥当性を確認した。その上で、若年発症糖尿病患者（腎障害もあり MODY5 疑い）でサンガー法により異常が抽出できなかった患者から、この方法により HNF1B の欠失を新たに同定し、MODY5 の確定診断を得て、学会報告を行った。HNF1B 遺伝子の存在する染色体 17 番長鎖 17q12 領域は、表現型変化を伴う微笑欠失が多く、「17q12microdeletion syndrome」と呼ばれている。したがってこの方法は、特に MODY5 の診断に有用と考えられた。

Subject No.

：27A1201

Title：Large scale culture of functional pancreatic beta cells from

iPS cells for islet transplantation
Researchers ：Hitoshi Okochi, Shigeharu Yabe, Masayuki Shimoda,
Kazuki Yasuda
Key word：iPS cells, pancreatic beta cells, diabetes mellitus

Abstract：

We aimed at the large-scale culture of functional pancreatic beta cells fromhuman iPS cells for islet transplantation.
1 Floating culture system
We succeeded in differentiating functional pancreatic beta cells from human
iPS cells in adherent culture. We can provide enough cells for mousetransplantation experiment with one 6cm culture dish. Since the number ofislet required for transplantation is 2000 times more in human than inmice, it is not reasonable to use culture dishes manually. We determined touse floating culture system because scaling up was relatively easier infloating system than in adherent culture. We compared the floating culture
methods between 30ml spinner type culture vessels and gyrating culture
dishes. We chose 30ml spinner type culture vessels for floating culture
methods, because cell aggerates (spheroid) were easier to form and lessadhesive each other. We had to optimize the rotation speed of the fan in thevessel to minimize the shear stress to the cells. Although the basic protocols
of adherent culture could be applied to the floating culture, the expression
level of NKX6.1, one of the important markers of the pancreatic beta cells,
was needed to improve. After many trials and errors, we managed to line up
the islet-like spheroids which were almost the same size and we could
enhance the expression level of NKX6.1. Consequently, we detected certain
amount of human C-peptide in vitro secretion experiments (GSIS:Glucose

stimulated insulin secretion). We applied the patent regarding new method
for inducing definitive endodermal cells from iPS cells because we found thefirst differentiation step was very important. When we transplanted humanislet-like spheroids (4-6x106 cells ) under the kidney capsule of STZ- induced
diabetic NOD-SCID mice, non-fasting blood glucose gradually lowered andkept normal level more than 100 days.
2 Functional analysis of induced islet-like cells
We also noticed that good response of GSIS before transplantation did notalways corelate with the rapid lowering the blood glucose level after
transplantation. The possible reasons are difficulty of survival of injected
cells and immaturity of the cells. We improved the methods of injecting cells
to avoid the mechanical damage and survival rate of cells increased. Next,
we injected human iPS-derived islet-like cells into normal NOD-SCID miceand STZ was administered 2, or 4, or 6 weeks later. Since STZ is sensitive tomouse pancreatic βcells while it is resistant to human pancreatic βcells,
administration of STZ led to remove mouse pancreatic βcells. When STZ
was administered 2 weeks after cell transplantation, non -fasting blood
glucose level was elevated more than 200mg/dl. However, when STZ wasadministered 4 or 6 weeks after cell transplantation, blood glucose level was
not elevated and remained within normal range. These results suggest thatit takes about 4 weeks for human iPS-derived islet-like cells to maturate invivo.

3 Use of iPS cell lines established by CiRAWe started to use clinical grade iPS cell lines established by CiRA. However,
we had to optimize culture conditions for each iPS cell line because it has
own characteristics for proliferation and differentiation. Among 10 cell lines
tested, we chose one cell line, 15M63, because it was easily adapted forfloating culture and it was shown for endodermal differential potential. We
differentiated these cells into islet-like cells as spheroid and made fibers inwhich these spheroids were encapsulated with alginate. Then we
transplanted these fibers into intraperitoneal space for STZ- induced
diabetic NOD-SCID mice. Non-fasting blood glucose gradually lowered andkept normal level more than 120 days.
4 Separation devices against immune cells
We developed micro and macro devices for avoiding attack of immune cells
after cell transplantation. As a micro device, porcine islets or MIN6 cells
were encapsulated with hydrogel and transplanted into diabetic nude mice.
Although we found improvement of blood glucose level more than 3 months,hydrogel tended to melt gradually and lose cell function. When these cells
were encapsulated into macrodevices and transplanted into diabetic nude
mice, blood glucose level improved more than 6 months without damage of
device. However, fibrosis and adhesion were noted around the device longtime after transplantation.
5 Study for transcription factors regarding pancreatic βcells
We investigated the important transcription factors for pancreatic βcells
such as MafA and MafB. They are identified as the important factors forinsulin gene expression, however, we found they played important roles on
the maturation and maintenance of pancreatic βcells. We also found MafA
formed the core transcription network for the pancreatic βcell function.

27指1201：膵島移植を目指した機能性β細胞の大量培養法の開発

ヒトiPS細胞から膵臓β細胞の６段階分化法
definitive
endoderm

iPS細胞

primitive
gut tube

posteriorforegut

pancreatic
progenitor

iPS細胞由来膵島

endocrine
progenitor

pancreatic
β cell

隔離膜による細胞性免疫回避

Spinner型容器を使用した浮遊回転培養
Spinner culture

30ml

Undiff.

beta
differentiation

200μm

200μm

ヒトiPS細胞から誘導した膵島様細胞の免疫染色とインスリン分泌実験
PDX1/DAPI

C-peptide/DAPI

dithizone stainning

C-pepteide secretion/ 2 X106 cellspM

ヒト c-peptide 分泌量

ブドウ糖濃度糖尿病モデルマウス（NOD‐SCID）への細胞移植実験
細胞移植後の随時血糖糖負荷試験OGTT

mg/dl

非移植群
血糖値

血糖値

mg/dl

移植群
Week after transplantation

0

15

30

細胞移植後４週の腎組織の免疫染色像

C-peptide / Glucagon

60

120 min課題番号：27指1201
研究課題名 ：膵島移植を目指した機能性β細胞の大量培養法の開発
分担研究課題名：ヒトiPS細胞から膵臓β細胞の大量培養法の検討
主任研究者名 ：大河内仁志
分担研究者名 ：大河内仁志
キーワード ：iPS 細胞、膵β細胞
研究成果：
ヒト iPS 細胞から膵臓β細胞を分化誘導できるようになったので、膵島移植を目指すために大量培養法の開発を目的とした。
これまでに接着培養ではヒト iPS 細胞からブドウ糖濃度に応じてインスリンの分泌量を変化させられる機能性β細胞の分化誘導に成功しているが、ヒトに対してはマウスに必要とされる細胞数の約 2000 倍が必要となるため、培養皿では対応が難しいと考えられた。そこで大量培養という観点から浮遊培養に注目し、回転翼で容器内を攪拌するエイブル社の 30ml 用の自動攪拌培養装置と培養皿を回転させる旋回培養装置を購入して、比較検討した。いずれの浮遊培養装置でも細胞凝集塊が形成されるが、後者では細胞凝集塊がお互いにくっつきやすくなってしまうために、前者の浮遊攪拌培養法を選択した。東大医科研で樹立された iPS 細胞（TKDN4-M）については接着培養の培養条件が概ね適用でき、浮遊培養においても in vitro で機能性β細胞の分化誘導が可能であった。回転数を調節することによって、凝集塊の大きさを揃えることも可能になった。糖尿病モデルマウスの腎被膜下に細胞移植をして、細胞生着を確認し、マウス血中にヒト C-peptide を検出したが、検出濃度としては数十 pM 程度であり、まだ生体における機能としては不十分と考えられた。In vitro でインスリンを多く分泌する細胞が移植後に必ずしも同等の機能を発揮するとは限らないという結果が得られた。分化法を改善することにより、移植後にマウス血中のヒト C-peptide 濃度を上昇させることができ、100 日以上の随時血糖の正常化と細胞生着も確認した。浮遊培養においても最初の分化段階がその後の分化誘導に重要であることを立証し、
definitive endoderm への新規分化誘導法として特許を出願した。
また京都大学 CiRA で樹立された１０種類の臨床グレード iPS 細胞を用いて同様に30ml の浮遊培養を行ったが、株間の差が認められ、それぞれの株に対して培養条件を最適化させる必要があることが判明した。臨床応用に向けて、最も効率良く高機能な
膵島を誘導できる最適な iPS 細胞株を選択する必要があるため、浮遊培養への適応力と内胚葉系への分化しやすさを指標にして、15M63 を選択した。TKDN4-M 株で得られた培養条件をもとにして培養を行い、６段階に渡る分化過程でそれぞれ細胞塊をサンプリングして RNA 発現を検討した。最終分化段階のβ細胞に対してブドウ糖によるイ
ンスリン分泌刺激試験を行った。15M63 から分化した細胞においても in vitro でインスリン産生が認められた。iPS 細胞から分化誘導したこれらの細胞塊を東大生産研にてアルギン酸でできたファイバーに封入した。NOD-SCID マウスに STZ を投与して１型糖尿病モデルを作成し、腹腔内に 6~12x106 個の細胞を含んだファイバーを移植したところ、随時血糖が正常化した。マウス血中にヒト C-peptide が検出でき、移植後 120 日以上正常血糖を維持できた。ホストのマウスに胸腺腫が認められたため、腹腔内からファイバーを取り出し、別の NOD-SCID マウスの腹腔内に再移植して、生体内で機能を発揮し続けるかを継続観察中である。
また分化した膵島の移植部位の検討については、TkDN４−M 株由来の膵島細胞を用いて、腎被膜下移植と同様に皮下移植においても血管新生を誘導することなしに細胞が生着することを確認した。ファイバー化した細胞塊では腹腔内の方が皮下よりも血糖降下作用が強いことが判明した。

エイブル社の 30ml 用の自動攪拌培養装置は 100ml、500ml にもスケールアップが可能なので、今後は 100ml の容器で検討していく予定である。またスケールアップの際には酸素濃度などのモニターも必要とされるので、品質管理に向けてさらなる検討が必要であると考えている。

課題番号：27指1201
研究課題名：創薬を指向したヒト膵β細胞機能評価系の構築
主任研究者名 ：大河内 仁志
分担研究者名 ：安田 和基
キーワード：転写因子、MafA、MafB、脱分化、DNA メチル化
研究成果：
本分担課題では、全体課題の中で作成される予定の、iPS 細胞由来ヒト膵β細胞について、
オミックス解析の手法等を用いて機能と発現分子との関係について解析し、普遍的な指標を抽出して、病態評価や創薬への応用を目指す。
当初の予定では、研究期間前半では、ヒト iPS 細胞から作成した「正常膵β細胞」について、in vitro でトランスクリプトームやエピゲノムなどの分子的解析、インスリン分泌能などの細胞学的解析を行い、各分化・成熟段階における特徴を得ること、期間後半ではこの情報を元にして、健常人と MODY 患者 iPS 細胞由来の膵β細胞を比較検討すること、としていた。
しかし作成したβ細胞の「量」及び「質」が必ずしも常に安定しないという事情もあり、本解析に十分な量の細胞を有ることでできなかった。そのため、前年度までは、本研究で対象とする MODY 原因遺伝子は転写因子であることから、基盤的研究として、膵β細胞や膵ラ氏島における重要性が従来から示されている MafA 及び MafB について、膵β細胞株および発生工学的手法も駆使して詳細に解析した。その結果 MafA は、インスリン遺伝子の転写に重要な因子として同定された分子であるが、膵β細胞の成熟及び維持に重要であること、その発現維
持には DNA メチル化も寄与していること、などを明らかにした。MafA 自体は少なくともヒト
MODY の主要な原因遺伝子ではないが、膵β細胞機能のコアとなる転写因子ネットワークを形成しており、MODY 患者由来 iPS 細胞から分化させた膵β細胞の機能解析においても有用な知見である。
なおこの研究の過程で、本研究の準備として、バイサルファイト法及び PyroMarkQ24を用いた、ヒト DNA メチル化の解析系を立ち上げた。
平成 29 年度には、こうした研究をさらに進展させたほか、ヒト MODY のより広いスペクトルの臨床像を得るために、MODY の遺伝子異常のスクリーニング系をより整備した。具体的には、特に MODY5 に多い遺伝子の部分欠失、または全欠失は、従来のサンガー法では検出できない可能性があるため、MLPA（multiple ligation-dependent）法を導入した。既に HNF1B 遺伝子のヘテロ欠失が同定されている患者 DNA をポジティブコントロールとして用いて、その妥当性を確認した。その上で、若年発症糖尿病患者（腎障害もあり MODY5 疑い）でサンガー法で異常が抽出できなかった患者から、この方法により HNF1B の欠失を新たに同定し、MODY5の確定診断を得て、学会報告を行った。HNF1B 遺伝子の存在する染色体 17 番長鎖 17q12 領域
は、表現型変化を伴う微笑欠失が多く、「17q12microdeletion syndrome」と呼ばれている。
したがってこの方法は、特に MODY5 の診断に有用と考えられた。

課題番号：２７指１２０１
研究課題名 ：膵島移植を目指した免疫隔離膜の開発
主任研究者名 ：大河内仁志
分担研究者名 ：霜田雅之
キーワード：膵島移植、免疫隔離膜、再生医療、ヒト iPS 細胞

研究成果：平成 29 年度の研究成果

研究開始時の研究目的：
ヒトiPS細胞から機能的な膵臓β細胞を大量に培養する方法を開発し、平行して細胞を包む免疫隔離膜の開発も行い、免疫抑制剤を使用しない新規膵島移植法の確立を目指す。分担研究者は、３年以内に誘導した膵臓β細胞を半透膜に包んで、霊長類のマーモセット糖尿病モデルに移植して、前臨床デー
タを取得することを目的とする。

・担当する分担研究：
免疫隔離膜の開発

・分担研究内容：
半透膜はグルコースやインスリンなど低分子は透過するが、細胞や免疫グロブリンは透過しないものとする。物質の透過性やデバイス封入時の細胞生存をまずはマウスインスリノーマ細胞株であるMIN6細胞（インスリンを分泌する細胞株）や動物の膵島を用いて、in vitroの培養系で評価する。

・研究成果
ブタ膵島およびMIN6細胞を用いて、①ハイドロゲルを用いたカプセル②半透膜性のポリマー樹脂を用いたマクロカプセル（デバイス）の2種類の開発を行った。

①ハイドロゲルカプセルに細胞を封入し、in vitroで培養するとカプセル内で細胞は生存して機能を維持し、インスリンを放出することを確認した。
さらにカプセル化細胞を糖尿病化ヌードマウスおよび免疫正常マウスに移植し、最高3か月以上の血糖値の改善効果を認めた。ハイドロゲルのみでも免疫隔離機能も示した。ゲル周囲の癒着や線維化はほとんど認めなかった。しかし、移植後長期的にはゲルが次第に溶解縮小し、グラフト機能が低下していくことが課題であった。

②マクロカプセル（デバイス）に細胞を封入し、in vitroで培養するとカプセル内で細胞は生存して機能を維持し、インスリンを放出することを確認した。
さらにマクロカプセル化細胞を糖尿病化ヌードマウスおよび免疫正常マウスに移植し、最高6か月以上の血糖値の改善効果を認めた。しかし、ハイドロゲルと異なり半透膜性カプセルは長期的に破損することなく強度的には安定であったが、移植後長期的には次第にグラフト周囲の線維化や癒着が発生し、グラフト機能が低下していくことが課題であった。

さらに半透膜性マクロカプセル化ブタ膵島を健常マーモセット腹腔内に移植し、癒着や線維化を起こさず2か月間グラフト内部の膵島を生存させた。今後さらに長期の評価が必要である。

考察：①②とも有望なカプセルであり、特に異種細胞であっても免疫抑制剤なしで数か月以上のグラフト機
能の維持が可能である点が優れていた。反面、それぞれにカプセルの物性による課題が明らかになった。特に長期的に機能を維持するためにはさらなる技術開発が必要である。

課題番号：27指1201
研究課題名 ：膵島移植を目指した機能性β細胞の大量培養法の開発
分担研究課題名：ヒトiPS細胞から膵臓β細胞の分化法の検討
主任研究者名 ：大河内仁志
分担研究者名 ：矢部茂治
キーワード ：iPS 細胞、膵β細胞
研究成果：
ヒト iPS 細胞から膵臓β細胞を分化誘導できるようになったので、膵島移植を目指すために大量培養法の開発を目的とした。臨床応用を視野に入れると、109 以上の細胞数が必要となるため、コストも意識する必要が生じる。より高機能なβ細胞の誘導が望ましく、そうすれば必要細胞数を減らせることになり、コストの削減にもつながる。
これまでにヒト iPS 細胞の接着培養ではブドウ糖濃度に応じてインスリンの分泌量を変化させられる機能性β細胞の分化誘導に成功しているが、ヒトに対してはマウスに必要とされる細胞数の約 2000 倍が必要となるため、培養皿では対応が難しいと考えられた。そこで大量培養という観点から浮遊培養に注目し、エイブル社の 30ml の
自動攪拌培養装置を購入して、浮遊培養を行った。東大医科研で樹立された iPS 細胞（TKDN4-M）については接着培養の培養条件が概ね適用でき、浮遊培養においても invitro で機能性β細胞の分化誘導が可能であった。糖尿病モデルマウスの腎被膜下に細胞移植をしたところ、細胞生着を確認し、マウス血中にヒト C-peptide を検出していたが、検出濃度としては数十 pM 程度であり、随時血糖を正常化するには十分量とは言えないと考えられた。まだ生体における機能としては改善の余地があると考えら
れ、特に誘導したβ細胞において転写因子の NKX6.1 の発現が十分でないために、細胞の成熟度が低いことが一つの原因ではないかと考えられた。そこで NKX6.1 の発現を指標にして細胞の分化法を改善することにより、NKX6.1 の発現を上昇させることができた。実際に改善したプロトコールで誘導した細胞をマウスに移植したのち、血中のヒト C-peptide 濃度が経時的に上昇し、数百 pM まで達することが確認された。徐々に随時血糖の降下も認められ、120 日以上の細胞生着も確認した。浮遊培養においても６段階のうち最初の分化段階がその後のβ細胞への分化誘導に重要であることを立証し、definitive endoderm への分化誘導法で特許を出願した。
移植前の細胞塊を用いてブドウ糖によるインスリン分泌刺激試験(GSIS)を行った。
NKX6.1 の発現が十分でない時にも GSIS にて高血糖に対してインスリン分泌が大きく上昇することがあり、機能性が保たれていると判断していたが、移植後のマウス血中のヒト C-peptide 濃度を測定してみるとそれほどでもなく、必ずしも in vitro の GSISが移植後の効果判定の指標にならないことが示唆された。一方、NKX6.1 の発現を上昇させることができた細胞塊では GSIS に対する反応性はほとんどない場合でも、移植後に徐々にマウス血中のヒト C-peptide 濃度が上昇して、随時血糖が正常化するものが現れた。そこで移植後のβ細胞の成熟化には時間が必要と考え、まず通常のNOD-SCID マウスにヒト iPS 細胞由来の細胞塊を腎被膜下に移植し、2 週後または 4 週
後または 6 週後に STZ(ストレプトゾトシン)を投与して、血糖値が上昇するか否かの実験を行った。マウスのβ細胞は STZ によってダメージを受けるので、インスリンを分泌できなくなって STZ 投与で通常は血糖値が上昇する。ヒトのβ細胞は STZ に耐性を示すことから、もしヒトβ細胞がマウス内で機能を発揮していれば、STZ 投与後も血糖値の上昇は見られないと予想した。細胞移植後２週間では STZ 投与にて血糖の上昇が見られたのに対して、４週間後と６週間後に STZ を投与した場合は、血糖値が上昇しなかった。マウス血中に確かにヒト C-peptide が検出され、マウス C-peptide は検出されていないことを ELISA で確認した。このことから移植前の細胞の状態はまだ

未分化な状態のβ細胞である可能性が高く、生体内で４週間程度かけてβ細胞は成熟化することが示唆された。この実験の過程でβ細胞の成熟化のマーカーとなりうる候
補分子を幾つか見出したので、今後さらに検討していきたいと考えている。

研究発表及び特許取得報告について

課題番号：27指1201

研究課題名： 膵島移植を目指した機能性β細胞の大量培養法の開発
主任研究者名：

大河内仁志

論文発表
論文タイトル

著者

掲載誌

掲載号

年

Optical clearing of the pancreas forvisualization of mature β-cells andvessels in mice.

Nishimura W,
Sakaue-Sawano
A, Takahashi
Islets,S, Miyawaki A,
Yasuda K, Noda
Y.

(10)3: 106-112

2018

Efficient Generation of Functional
Pancreatic β Cells from Human iPS
Cells.

Yabe SG,
Fukuda S,
Takeda F,
Nashiro K,
Shimoda M,
Okochi H

J Diabetes

9：168-179

Methods for Microencapsulated Porcine
Islet Production.

Shimoda M,
Matsumoto S.

Methods Mol Biol. 1479:347-356.

2017

Microencapsulation in Clinical Islet
Xenotransplantation.

Shimoda M,
Matsumoto S.

Methods Mol Biol. 1479:335-345.

2017

Imamura M,
Genome-wide association studies in the Takahashi A,
Nature Commun
Japanese population identify seven novel Yamauchi T,loci for type 2 diabetes.
Hara K, Yasuda
K, et alPancreatic developmental defectevaluated by celiac artery angiography
in a patient with MODY5

Iwasaki N,
Tsurumi M,
Shimizu W,
Watanabe A,
Ogata M,
Takizawa M,
Ide R,
Yamamoto T,
Saito K

Human Genome
Variation

発表者

学会名

2017

7: 10531

2016

DOI:10.1038/hg
v.2016.22

2016

学会発表
タイトル

Yabe SG,
Generation of the hiPS cells derived
Fukuda S,
pancreatic beta (hiPS-beta) cells by 3D
Shimoda M,
spinner culture.
Okochi H

Kyoto Diabetes
Mini-Symposium
Beta-Cell
Replacement
Strategies

場所

年月

Kyoto

2017/6/5

研究発表及び特許取得報告について

A novel beta cell replacement therapy
with human iPS cells.

Shimoda M,
Yabe SG,Shinohara K,
Yuan W, Fukuda
S, Watanabe A,
Ozawa F,
Shinohara M,
Inoue T, Ibuki
M, Sakai Y,
Takeuchi S,
Michiue T,
Okochi H,
Sasaki E,
Nakatani M and
Miyajima A

Kyoto Diabetes
Mini-Symposium
Beta-Cell
Replacement
Strategies

Kyoto

矢部茂治、福田
浮遊培養系によるヒトiPS細胞由来膵β細胞
第16回日本再生医
沙月、霜田雅
仙台
の分化誘導
療学会総会
之、大河内仁志南茂隆生、宇田
川陽秀、舟橋伸「遺伝子cis調節領域の網羅的エピゲノム解昭、川口美穂、 第60回日本糖尿病
名古屋析と膵島代償機序に関与する転写因子モチー
上番増喬、平本 学会年次学術集会
フの検討」
正樹、西村渉、
安田和基

2017/6/5

2017年3月

2017年5月「糖尿病の遺伝素因—最新のトピックスと展
安田和基
望—」

第5回Diabetes
Research
Conference inTochigi「肥満や関連疾患の遺伝素因は、どこまでわ
安田和基
かったのか」

肥満と糖尿病を考佐倉える会

2017年12月

寺川瞳子、中條
大輔、仲村明香、菊地智彦、 第55回日本糖尿病「リラグルチドが有効であったMODY5疑いの1
上野圭佑、濱野 学会関東甲信越地 新潟例」
方会
頌子、安田和基、植木浩二郎、梶尾裕

2018年1月

宇都宮

2017年6月

霜田雅之, 矢部茂治, 篠原孝也, 元文姫, 福田沙月, 渡邊亜美, 渡邊貴一,
篠原満利恵, 井iPS細胞を用いた次世代型膵島移植療法の開第59回日本糖尿病
上貴史, 伊吹将
京都
発学会総会
人, 酒井康行,
竹内昌治, 道上達男, 大河内仁志, 佐々木えりか, 加藤智久,
宮島篤.

2016年5月

Laboratory Animal
Research Center
Symposium in
Seoul
Samsung Medical
Center.

2016年8月

Development of small non-human primate
diabetes model (Common marmoset).

Masayuki
Shimoda研究発表及び特許取得報告について

Analysis of post-transplant islet byorgan transparency and macro threedimensional image.

Koya
Shinohara,
Masayuki
Shimoda.

26th
International
Congress of The
Transplantation
Society

Hongkong,
China

August 17-23,
2016

The availability of marmoset diabetes
modeling as a transplantation model.

Wenji Yuan,
Satsuki
Fukuda,Takashi Inoue,
HitoshiOkochi, Erika
Sasaki,
Masayuki
Shimoda.

26th
International
Congress of The
Transplantation
Society

Hongkong,
China

August 17-23,2016

南茂隆生、宇田
川陽秀、舟橋伸「ゲノム網羅的解析結果を用いた膵島代償機 昭、川口美穂、 第59回日本糖尿病
京都序の検討」
上番増喬、平本 学会年次学術集会
正樹、西村渉、
安田和基

2016年5月

宇田川 陽秀、
舟橋伸昭、西村
第59回日本糖尿病「脂肪細胞培養上清によるグルココルチコイ 渉、平本 正
京都
学会年次学術集会
ド受容体を介した膵β細胞機能変化」
樹、川口 美穂、南茂隆生、
安田 和基

2016年5月

Iwasaki N,
Prevalence of MODY subtype and clinical Ogata M,
characteristics in patients with early Fujimaki R,
onset diabetes in Japanese
Uchigata Y,
Saito K

April, 2016

The 13th
International
Kyoto
Congress of Human
Genetics

その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等)
タイトル「膵臓・膵島」

発表者
大河内仁志

発表先

場所

年月日

『移植』第52 巻
4/5 号

2017年10月1日「1型糖尿病」根治

ふるさと納税が後押し 霜田雅之

佐賀新聞

4-6-2016「1型糖尿病」根治

ふるさと納税が後押し 霜田雅之

NHK佐賀版

4-8-2016「インスリン分泌不全の感受性遺伝子のゲノ
安田和基
ム検索」

Diabetes Frontier
27巻4号 特集：糖尿病の遺伝素因の解明研究

2016年8月「発症遺伝子の解析」

安田和基『糖尿病専門医研
修ガイドブック改訂第7版』診断と治療社、P92-94

2017年5月

企画編集『糖尿病の「体質」：発症する人と安田和基
しない人の違いはなにか？』

月刊糖尿病l9巻7号（P7-P109）

2017年7月「DTC(direct-to-consumer)検査としての遺
安田和基
伝子検査」

糖尿病診療マスター 15巻7号

2017年7月

研究発表及び特許取得報告について「2型糖尿病全ゲノム解析の現状と今後の展
安田和基望」
特許取得状況について※出願申請中のものは(発明名称
内胚葉系細胞集団、及び多能性細胞から三胚葉のいずれかの細胞集団を製 造する方法。

Medical View
Point 39巻 3
号.P1-2

2018年3月)記載のこと。
特許権者(申請者）
登録日(申請日)
登録番号（共願は全記載）

特許
特願2017012802

大河内仁志、矢部
2017年1月27日
茂治、伊吹将人

出願国
日本