課題番号：２９指２０１３
研究課題名：宿主好中球活性化機序を標的にした、赤痢アメーバ症に対する新たな治療戦略の開発
主任研究者名 ：渡辺恒二
キーワード ：好中球 (Neutrophil)、赤痢アメーバ症 (amebiasis)、腸内細菌叢 (gut microbiome)、病原体宿主相互作用 (pathogen-host interaction)、病態生理 (pathophysiology)
研究成果：
赤痢アメーバ症は、Entamoeba histolytica によって引き起こされる腸管原虫症である。潜伏性持続感染による国内感染例の急速な増加が報告されると共に、現行治療では救命できない死亡例が多数報告されている。そのような現状を打破するためには、従来の治療ターゲットであった『原虫の増殖機構』以外を標的とした治療戦略の創出が急務である。本研究では、『E. histolytica 由来分泌因子による重症化機構』および『腸内細菌による好中球活性化・感染防御機序』を標的にした新たな治療戦略に関する研究を行っている。
１．E. histolytica 由来分泌因子を標的にした、新たな診断・治療法創出（野崎分担、渡辺分担）
実験室 E. histolytica 株 (HM-1 株) を用いたエクソゾーム分離技術の確立)
本研究では、病原体である E. histolytica からの分泌因子に標的を定めた検討を行うため、初年
度は、エクソゾームの分離方法の確立を行った。従来、 E. histolytica の分泌因子はタンパク質を中心とした分子が主と考えられていたが、近年、膜成分に囲まれて、その内部にタンパク質だけでなく、脂質や核酸を含むとされるエクソゾームが、マラリアや E. histolytica のような原虫類からも放出されることが分かってきた。一方で、 E. histolytica 由来のエクソゾームの単離、機能解析は十分に行われていない。来年以降、これらの分離技術を用いて、機能解析を進めて行く予定である。
複数の臨床分離 E. histolytica 株を用いた網羅的遺伝子発現調節機構に関する解析
一方、赤痢アメーバ症を引き起こす病原体である E. histolytica の網羅的な病原性解析を行うため、臨床検体 (糞便や膿) から無菌培養された『臨床分離 E. histolytica 株』を用いて、mRNA (メッセンジャーRNA)発現解析を行っている。その結果、肝膿瘍発症患者由来の高病原性 E. histolytica株で発現が亢進している 43 遺伝子を同定した。
分泌タンパクを標的とした新たな診断法確立のための研究
また、上記のような病原性解析の他、分泌タンパクを標的とした新たな診断法確立を目指した研究を行っている。標的としては、既に米国の共同研究グループが、その構造を明らかになっているタン
パク (非公開) への特異抗体を作成し、病理組織標本の免疫染色の技術を確立した。
２．腸内細菌叢を介した宿主好中球活性化を標的とした、新たな予防・治療法創出（渡辺分担）
腸内細菌叢との構成と赤痢アメーバ症重症度の関連性を同定するための、臨床検体を用いた解析
同一患者さんの糞便検体で、無症候性赤痢アメーバ感染時と赤痢アメーバ性腸炎発症時における腸内細菌叢の比較解析を行った。この検討により、赤痢アメーバ感染に対して感染防御に有利に働く腸内細菌叢の候補、４種類の腸内細菌科 (未公表) を特定した。また、複数かつ異なる赤痢アメーバ症の臨床病型を発症した患者さんから得られた糞便検体(42 検体)を用いた網羅的な腸内細菌叢組成に関する解析を進めている。これらの解析から、『赤痢アメーバ症に対して感染防御に働く腸内細菌』、または『感染に不利に働く腸内細菌』を同定する予定である。
E. histolytica に対する好中球活性を評価するための評価系確立
好中球性自然免疫による抗赤痢アメーバ活性を実験室内で、定量的に評価得するための実験系を確立した。具体的には、宿主由来の細胞 (好中球) と病原体細胞である E. histolytica を同じ試験管内で混ぜて反応させた場合にも、それぞれの細胞を蛍光色素による標識で判別可能とし、その生存率と細胞表面抗原の発現を定量的に評価する実験系を確立した。
今後の計画としては、確立した実験系と、臨床検体から推定される「赤痢アメーバ感染に対して感染防御に働く腸内細菌」を用いて、腸内細菌叢による好中球活性化メカニズムを明らかにし、その分子機構を標的にしたプロバイオティクスの開発などを目指す。

Subject No.

：29-2013

Title：Research on analyzing pathogenesis of Entamoeba histolytica infection from theanalyses of triangle interactions among immune systems, pathogen, and host microbiome.
Researchers ： Koji Watanabe (Primary investigator), Tomoyoshi Nozaki (Co-investigator)
Key word：Neutrophil, amebiasis, gut microbiome, pathogen-host interaction,

pathophysiology.
Abstract：Amebiasis is enteric infectious disease, caused by Entamoeba histoltyica. Increasing number ofannual reported cases has been reported in recent two decades, mainly due to sexuallytransmitted infection. Also, critical severe cases were reported every year. Thus, it is needed for us
to develop new strategies for controlling epidemiology and pathophysiology of E. histolytica
infection. For these purpose, we are investigating the new targets of E. histolytica infection; 1.
Exacerbation pathway by secreted proteins (or exosome) from E. histolytica, and 2. Disease control
by gut microbiome via enhancing Neutrophil mediated host protection.
1. Investigation for “Exacerbation pathway by secreted factors from E. histolytica”.
For future investigation of secreted factors, including not only proteins but also exosomes, weestablished the method for isolating E. histolytica exosome from culture media of axenic
laboratory strain “HM-1:IMSS”. Also, we’ve done the screening of gene expression bytranscriptome analysis using E. histolytica isolates from clinical specimen. From thistranscriptome analysis, we identified 43 genes which are expressed more in virulent strains thanthat in non-virulent strains. On the other hand, we are trying to develop new diagnostic method
which targeting E. histolytica specific secreted proteins to establish the diagnostic method ofantigen detection in clinical specimen. We already confirmed that detection of one secreted protein
is more sensitive and specific than that of E. histolytica component protein in tissue histology
samples. We will try to develop the diagnostic method of antigen detection in patients’ serum by
ELISA next year.
2. Investigation for “Disease control by gut microbiome via enhancing Neutrophil mediated hostprotection.”
For future investigation of in quantitative Neutrophil protection against E. histolytica, wedeveloped in vitro assay for assessing Neutrophil activation to E. histolytica by Flowcytometry. In
this assay, Neutrophil activation and E. histolytica viability in the same tube and compare them
before and after mixture of Neutrophils and E. histolytica using different fluorescence conjugatedantibodies. On the other hand, in order to identify the disease protective gut microbiome during E.
histolytica infection, we are analyzing the composition of gut microbes in stool collected frompatients who developing various clinical forms of E. histolytica infection. From the data of one
patient who showed various forms of E. histolytica infection in the clinical course, we identified 4protective bacterial species of gut microbiome. Furthermore, we are now analyzing the stool
samples collected from 42 different patients for determining “protective gut microbiome” and“exacerbating gut microbiome” during E. histolytica infection. Next year, we will try to identify themechanism of Neutrophil mediated host protection against E. histolytica infection by gut
microbiomes using “protective gut microbiome” by in vitro Neutrophil activation assay establishedin this year.

研究の概要背景：国内赤痢アメーバ症 (Entaemoeba histolytica 感染症)
増え続ける症例数、後を絶たない重症死亡症例の報告⇒従来の抗菌療法とは異なる治療コンセプトの創出が必要

標的と目標：E. histolytica の増殖機構以外の予防・治療標的の創出
下図１．E. histolytica 由来分泌因子による重症化機構の解明。標的にした新規診断・治療法の創出
下図２．腸内細菌による好中球活性化機構の解明。標的にした予防・治療法の創出

初年度の研究成果
１．E. histolytica 由来分泌機構を標的にした研究（担当：野崎）・実験室 E. histolytica 株 (HM-1株) を用いたエクソゾーム分離技術の確立：E. histoltyica 由来分泌因子として、タンパクだけでなくエクソゾームを分離する技術を確立し、分泌因子の網羅的解析の準備を進めた。
・臨床分離 E. histolytica 株を用いた網羅的な遺伝子発現解析による病原性遺伝子スクリーニン
グ：臨床的に高病原性が判明している E. histolytica の遺伝子発現比較解析により、高病原性遺伝子 43 遺伝子を同定した。この中で、分泌因子に関わる遺伝子同定検索を進めている。
・分泌タンパクを標的とした新たな診断法検証：赤痢アメーバ症発症患者検体を用いて、分泌タンパクを標的とした診断法の確立を進めている。

2．腸内細菌叢を介した宿主好中球活性化機構を標的にした研究（担当：渡辺）・臨床検体を用いた腸内細菌叢の解析：同一患者で赤痢アメーバ症の病型が経時的に変化した患者検体の比較検証から、赤痢アメーバ感染に対して感染防御に働く腸内細菌の候補、4種類の腸内細菌科を特定。複数かつ異なる赤痢アメーバ症の臨床病型を発症した患者検体での腸内細菌叢比較検証は、現在解析中。
・E. histolytica に対する好中球活性を、試験管内で評価する評価系の確立：宿主由来の細胞(好中球) と病原体細胞である E. histolytica を同じ試験管内で混ぜて反応、それぞれの細胞を蛍光色素による標識で判別可能とし、その生存率と細胞表面抗原の発現を定量的に評価する実験系を確立した。
・今後、「赤痢アメーバ感染に対して感染防御に働く腸内細菌」を用いて、腸内細菌叢による好中球活性化メカニズムを明らかにする。

課題番号：２９指２０１３
研究課題名：宿主好中球活性化機序を標的にした、赤痢アメーバ症に対する新たな治療戦略の開発
分担研究課題名：腸内細菌叢による宿主好中球活性化機構をターゲットにした治療戦略に関する研究主任研究者名 ：渡辺恒二
分担研究者名 ：渡辺恒二
キーワード ：好中球 (Neutrophil)、赤痢アメーバ症 (amebiasis)、腸内細菌叢 (gut microbiome)、病原体宿主相互作用 (pathogen-host interaction)、病態生理 (pathophysiology)
研究成果：
赤痢アメーバ症の重症度は、宿主遺伝的素因 (宿主因子)、病原体 E. histolytica の遺伝的素因 (病原体因子)だけでなく、病原体が生息する腸内環境 (環境因子) によっても影響を受けることが、研究者らの研究によって、明らかにされてきた。特に、研究者らは、腸内細菌の存在が宿主の好中球機能に大きな影響を及ぼすことを、マウスのアメーバ性腸炎モデルで明らかにしている。本分担研究では、宿主の感染防御に好影響を与える腸内細菌を同定し、その防御機構の詳細を明らかにすることを目的としている。具体的には、①赤痢アメーバ感染に対する感染防御に有利に働く腸内細菌の同定すること、②そのような腸内細菌が宿主好中球の活性化・赤痢アメーバ症への感染防御を誘導するための分子学的機序を明らかにすることを目標に、検討を行っている。研究初年度にあたる本年度は、上記目的を達成するために、以下のような研究を行った。
１．腸内細菌叢との構成と赤痢アメーバ症重症度の関連性を同定するための、臨床検体を用いた解析
同一患者さんの糞便検体で、無症候性赤痢アメーバ感染時と赤痢アメーバ性腸炎発症時における腸内細菌叢の比較解析を行い、赤痢アメーバ感染に対して感染防御に有利に働く腸内細菌叢の候補、４種類の腸内細菌科(具体的な細菌名などは専門誌への論文投稿中のため未公開）を特定した。一方、同解析の中で、赤痢アメーバ感染に対して感染防御に不利に働く腸内細菌叢の候補、１２種類の腸内細菌科 (未公開) の同定にも成功している。一方、上記のような同一患者さんの経時的な腸内細菌叢の変化だけでなく、複数かつ異なる赤痢アメーバ症の臨床病型を発症した患者さんから得られた糞便検体(42 検体)を用いて、網羅的な腸内細菌叢組成に関する解析も進めている。具体的には、アメーバ感染例から得られた 30 検体（腸炎 21 件、肝膿瘍 2 件、無症候性感染 7 件）、アメーバ非感染腸管感染症 12 検体を用いた解析を行っており、解析中である。
２．E. histolytica に対する好中球活性を評価するための評価系確立
１年目の本年度は、好中球性自然免疫による抗赤痢アメーバ活性を実験室内で、定量的に評価得するための実験系を確立した。具体的には、宿主由来の細胞 (好中球) と病原体細胞である E.
histolytica を同じ試験管内で混ぜて反応させた場合にも、それぞれの細胞を特殊な蛍光色素で標識し、 Flow Cytometry という特殊な装置により、その生存率と細胞表面抗原の発現による活性化指数を定量的に評価する実験系を確立した。今後の計画としては、これらの実験系を用いて、１．から推定される「赤痢アメーバ感染に対して感染防御に働く腸内細菌」により刺激した好中球の、抗酸化活性や抗アメーバ赤痢活性を評価し、腸内細菌叢による好中球活性化メカニズムを明らかにし、その分子機構を標的にしたプロバイオティクスの開発などを目指す。
３．その他
前述のように、本研究では、腸内細菌叢による宿主免疫特に好中球による感染防御を中心に研究している。一方、病原体である E. histoltyica が宿主好中球の活性化を引き起こしているという報告も成されている。研究者らは、これまでに集積された技術を活かし、臨床検体 (糞便や膿など) から、E. histolytica の無菌培養し、実験室内で継代している。これらの無菌培養された E. histoltyica 株を用いて、その病原性解析を行っている。中でも、好中球活性に影響を与えることが予測される E.
histolytica の分泌タンパク (先行特許申請中のため非公開) に関する解析を進め、そのタンパクを標的とした新たな診断・治療法を模索している。本年度、アメリカの研究者と共に先行特許を申請し、来年度は本特許取得を目指して研究を行う予定である。

課題番号：２９指２０１３
研究課題名：宿主好中球活性化機序を標的にした、赤痢アメーバ症に対する新たな治療戦略の開発
分担研究課題名：Entamoeba histolytica の病原性機構を中心とした、体内での腸内細菌および宿主免疫との相互作用を解明する研究主任研究者名：渡辺恒二
分担研究者名：野崎智義
キーワード：
研究成果：
赤痢アメーバが放出する分泌因子、特に微少小胞(細胞外マイクロベシクル)を介して放出される因子による宿主好中球の活性への影響を病原体の側から理解することを目的として、通常の無菌培養条件下で E. histolytica 栄養型の放出するエクソソーム(後期エンドソーム由来でエクソサイトーシスにより生じる; 内径 30-50nm)及びエクトソーム(細胞質由来で細胞膜の出芽により生じる;100-350nm)の解析を行った。これまでに既に、培養液中に放出される微少小胞の単離のプロトコルを確立した。100kDa カットオフのフィルターで細胞やオルガネラを除去した後、超遠心により簡便に微少少々胞を濃縮する方法を確立した。これまでの解析により、過酸化水素やパラコートなどの酸化ストレスに暴露されると細胞外マイクロベシクルの終了が増えることが観察されており、異なった環境下でのプロファイリングを行っている。また、現在エクソソームの収率を更に向上すプロトコルを検討中である。
更に、エクソソームの膜上で細胞との相互作用やシグナル伝達に関与していることの知られるテトラスパニンの解析を行った。テトラスパニンは 4 回膜貫通型タンパク質で N 及び C 末端に細胞質側に向いた短鎖部分、二つの小大の細胞外ループ(EC1 及び EC2 domain;EC2 domain は CCG motif を有する)を有する。最新のゲノム探索では赤痢アメーバのゲノム中には 16 種類の遺伝子が存在確認した。これらは進化的に 3 つの群に大別された。興味深いことに、2 つのテトラスパニン(EHI_022890 andEHI_174220)は赤痢アメーバミトコンドリアのプロテオームから過去に同定されていた。また、EHI_075690 遺伝子は遺伝的背景が全く同一の(isogenic)株において、発現量が病原性と逆相関していた。以上の 16 遺伝子のうち系統解析と mRNA の発現レベルに基づいて代表的なものを 8 選択し、HA 標識を付加したテトラスパニンを発現する E. histolytica 形質転換体の作成に成功した。細胞内局在と生理機能を明らかにするために、HA 標識を付加したテトラスパニンを発現する赤痢アメーバを作成し、局在解析を行ったところ、その多く(EHI_022890, EHI_174220, EHI_024370, EHI_075690)が細胞内の既知のエンドソーム、小胞体、ミトコンドリアと異なる未同定の小胞に局在し、これらの小胞が細胞外小胞の形成に関与する可能性が示唆された。

研究発表及び特許取得報告について

課題番号：29指2013
研究課題名：宿主好中球活性化機序を標的にした、赤痢アメーバ症に対する新たな治療戦略の開発
主任研究者名：渡辺恒二
論文発表
論文タイトル

著者

Learning from the research on amebiasis
Watanabe K,
and gut microbiome: Is stimulation by
gut flora essential for effective
and Petri WA
neutrophil protection from externalJr.
pathogens?
Shirley DT,
A Review of the Global Burden, New
Farr L,
Diagnostics, and Current Therapeutics
Watanabe K,
for Amebiasis.
Moonah S.
Ngobeni R,
Entamoeba Species in South Africa:
Samie A,
Correlations With the Host Microbiome,
Moonah S,
Parasite Burdens, and First Description
Watanabe K,
of Entamoeba bangladeshi Outside ofPetri WA Jr,
Asia.
Gilchrist C.

掲載誌

掲載号

年

Gut Microbes

25:1-5.

2018Open Forum
Infectious
Diseases

5(7)

2018

Journal ofInfectious
Diseases

216(12)

2017

学会発表
タイトル

発表者

学会名

場所

年月

Yanagawa Y,
Nagashima M,
Shinkai T,
Seroprevakence of E. histolytica
Kikuchi Y,
infection among individuals who havetested voluntary counseling and testing Gatanaga H,
Oka S,
for sexual transmitted infections in
Sadamasu K,
Japan.
and WatanabeK.

ASM microbes

A lineage-specific mitosomal membraneprotein possibly involved in vacuolemitosome contact in Entamoeba
histolytica.

Santos HJ,
Hanadate Y,
Imai K, andNozaki T.

The U.S.-Japan
Cooperative
Medical Science
Nagasaki,
Program. The 48thJapan
Joint Conference
on Parasitic
Diseases,2018年2月

Nozaki T.

XIVthInternational
Conference ofParasitology

Deagu, Korea

2018年8月

柳川泰昭, 渡辺
病原性遺伝子解析による赤痢アメーバ重症化 恒二, 津久井久 第20回白馬シンポ
鹿児島, 日本機構の解明
美子, 野崎智ジウム義.

2018年9月

Vesicular and lipid trafficking in
Entamoeba histolytica.

Atlanta, USA

2018年6月

その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等)
タイトル

発表者

該当無し

特許取得状況について※出願申請中のものは()記載のこと。

発表先

場所

年月日

研究発表及び特許取得報告について

発明名称

登録番号

該当無し

※該当がない項目の欄には「該当なし」と記載のこと。
※主任研究者が班全員分の内容を記載のこ

特許権者(申請者）
登録日(申請日)（共願は全記載）

出願国