課題番号：２４指１０１

研究課題名：C型慢性肝炎に対するペグインターフェロン・リバビリン・テラプレビル併用療法における有害事象発現に関与する宿主側因子、および耐性ウイルスの出現動態に関する多施設共同前向き研究

主任研究者名 ：正木尚彦
分担研究者名 ：正木尚彦
キーワード：C 型慢性肝炎、ゲノムワイド関連解析（GWAS）、有害事象、高速シーケンサー、遺伝子多型（SNPs）

目的：Ｃ型慢性肝炎１型・高ウイルス量のいわゆる難治例に対するペグインターフェロン・リバビリ
ン２剤併用療法による著効率は初回治療例で約 50％に留まっていた。その後、2011 年 11 月にプロテアーゼ阻害剤テラプレビルが臨床応用されたことにより、本剤を加えた３剤併用療法が可能となり、治療期間が 48～72 週から 24 週に短縮されたにもかかわらず、初回治療例における著効率は 73％と上昇し、再燃例、無効例においても 88％、34％と満足すべき治療効果が得られるようになった。しかし、有害事象として、従来の２剤併用療法に比して高度貧血や重篤な皮膚症状の出現が問題となっている
ほか、他のプロテアーゼ阻害剤に対する交叉耐性ウイルスの出現など新たな課題も提起されている。
さらに、本邦ではペグインターフェロン・リバビリン併用療法の対象患者の年齢中央値は 60 歳と、欧米に比して著しく高齢化しており、特に、貧血が問題となる高齢女性患者での著効率が有意に劣るな
ど、わが国特有の問題点も少なくない。リバビリンによる高度貧血の発現には ITPA 遺伝子多型（SNPs）の関連することが報告されているが（Nature 2010）、ITPA SNP が major の場合に高度貧血をきたす確率は 45％程度であり、必ずしも十分な予測因子ではない。さらに、皮膚症状の発現に関与する宿主側因子については全く不明である。本研究では、新規にペグインターフェロン・リバビリン・テラプレビル３剤併用療法を開始する１型・高ウイルス量患者を前向きに登録し、genome-wide associationstudy (GWAS)により高度貧血、皮膚症状を始めとする有害事象発現に関連する宿主側因子の検出を目指す。それと同時に、テラプレビル耐性ウイルスの出現動態について、高速シークエンサーを用いた詳細な検討を行う。尚、申請者らは、IL28B SNPs がペグインターフェロン・リバビリン併用療法の宿主側治療効果予測因子としてきわめて重要であることを報告しているが（Nature genetics 2009）、新規に開始する３剤併用療法におけるその有用性の検証も併せて行うこととする。
研究成果（3 年間）：
1． テラプレビル３剤併用療法治療効果予測因子に関与する検討
本研究協力施設のほか、東京大学、九州大学の協力を得て症例を収集した。国内の全国 21 施設において 3 剤併用療法を施行された 1 型高ウイルス量 C 型慢性肝炎症例のうち、テラプレビルを 8 週間以上投与した 121 例を対象として、臨床背景および著効率について検討を行った。本療法において IL28B
non-TT では十分な著効率を達成しえず、適応の選択が課題となったため、２剤併用療法において IL28Bとの併用による効果予測の精度の向上が報告されている治療前血清 interferon-gamma-inducible
protein-10（IP-10）値を用いて、IL28B non-TT における３剤併用療法の治療適応選択の可能性について検討した。
全症例における治療前血清 IP-10 値は平均 489 (118–2,011) pg/mL であった。TT における SVR 有無別の IP-10 の差異は認められなかったが、non-TT において SVR 例 480 pg/mL、non-SVR 例 624 pg/mL(p=0.015) と non-SVR 例において高値であった。IP-10 の ROC 解析を行い(AUC 0.691 、p=0.015)、カットオフ値を 450 pg/mL として２群に分けて検討を行ったところ、non-TT における SVR は、IP-10 値

1450 pg/mL 未満では 76 %、450 pg/mL 以上で 43 % (p=0.0011)と、 non-TT では IP-10 高値群の SVR は有意に低値であった。さらに、RVR 達成の有無により層別したところ、IP-10 低値かつ RVR 達成の場合SVR 82%、IP-10 高値かつ RVR 非達成の場合 SVR 27%と、SVR が期待できる患者の選択が可能と考えられた。本研究成果については、研究協力者（山極洋子研究員）が第 50 回日本肝臓学会総会(平成 26 年 5月)において報告し、現在、原著論文を英文誌に投稿中である。
２．重症皮疹発現に関与する宿主側因子の探索
他の研究班の協力を得て収集した 384 症例について、AXIOM Genome-Wide-ASI1array にてタイピングを行った。背景は男性 214 例、女性 170 例、皮疹グレード 0/1/2/3=182/43/109/50 例である。DishQC>0.82,overall call rate 0.991 とタイピングの品質は担保された。日本人に人種を限定し、SNP フィルタリングにより、最終的に 380 例、417769 SNPs が解析に用いられた。いずれのモデルにおける関連解析においても有意水準である p<10-8 を満たす SNP は同定できなかったため、本検討に使用したアレイに搭載されていない SNP との関連の推定を行うため、imputation 解析を行った。GWAS における関連解析にて p<10-5 を満たす 141 SNPs を対象(グレード 3)とし、1000 人ゲノムプロジェクトの日本人データを参照とし関連解析を行った。p<10-6 を満たす 25 SNPs のうち 22 SNPs は第 6 染色体上の、主として HLA 領域に存在した。その他の SNPs については、実検体においてタイピング、関連解析を施行したところ有意な結果が得られなかったため、本研究では東京大学人類遺伝学教室の Khor 博士が日本人のHLA imputation 測定法として新規に開発した HIBAG R package を用いて解析した（Pharmacogenomics J
2015; 1-8）。その結果、皮疹グレード 0 と 3 との比較において、HLA class Ⅱに分類される HLA-DRB1、HLA-DQB1 領域に重症皮疹発現に関連する有意な allele の存在が明らかとなった（各々、オッズ比 3.376[p=9.12E-06]、オッズ比 2.907 [p=7.15E-05]）。HLA-DRB1 領域における prediction accuracy は 98-99％ときわめて満足すべき数値が報告されているが、最終確認として実検体の allele genotyping を TaqMan法にて現在実施中である。

2Subject No.

：24A101

Title：Nation-wide, multi-center study for host genetic factors contributing to
the severe adverse events of the triple therapy with pegylated
interferon/ribavirin/telaprevir as well as for the predictive factors for thevirologic response in patients with chronic hepatitis CResearchers ：Naohiko Masaki, Yoko Yamagiwa
Key word：chronic hepatitis C, genome-wide association study, adverse events, next
generation sequencer, genetic polymorphism

Background and Aims：
The rates of sustained virologic response (SVR) to pegylated interferon(Peg-IFN)/ribavirin (RBV) in hard-to-cure chronic hepatitis C (CHC) with genotype 1 andhigh viral load had remained as low as 50%. However, after the introduction of the triple
therapy with Peg-IFN/RBV/telaprevir (TVR), SVR rates increased up to 73% in theinterferon-naïve CHC patients. As for TVR, several kinds of the severe adverse events(SAE) such as anemia and skin rashes have been special concern in Japan, as comparedwith the other developed countries. In particular, the higher incidence of severe skinrashes such as Stevens-Johnson syndrome or toxic epidermal necrosis has been reported
in the phase 3 clinical study, which was performed in Japan. Thereafter, dose reduction ofTVR and earlier use of corticosteroid seemed to lower the incidence of severe skin rashes
in clinical settings, however the possibility of the ethnic genetic factors has not been fully
investigated so far. The aims of this study were 1) To evaluate the predictive factors forvirologic response to the triple therapy, and 2) To explore the host genetic factors
contributing to severe skin rashes in Japanese CHC patients.
Results:
1. The predictive factors for virologic response to the triple therapy
Two hundred and eighteen patients were initially enrolled from nation-wide 21
hospitals participating in this study. Out of them, 121 patients were selected for the final
analysis with the following exclusion criteria: TVR less than 8 weeks or Peg-IFN/RBV
less than 24 weeks (n=49) except cessation because of virologic failure such as viralbreakthrough or persistent detection of HCV-RNA; splenectomy (n=11); partial splenicartery embolization (n=1); missing data (n=36). Among 121 patients, SVR and non-SVR
were obtained in 96 patients (79.3%) and 25 patients (20.7%), respectively. By univariate
analysis, higher WBC counts, higher hemoglobin levels, higher albumin levels, lower
FIB-4 index, and higher initial dose of TVR were significantly associated with SVR. Inaddition, response to prior IFN treatment, IL28 genotype, HCV core 70 aa substitution
and RVR achievement were sifgnificantly different between SVR and non-SVR. The SVRrates were 96% and 55%, in patients with IL28B TT genotype and non-TT genotype,respectively. We measured serum levels of interferon-gamma-inducible protein-10 (IP-10),
a cytokine belonging to the CXC chemokine family and one of the interferon-stimulated
genes (ISGs). Serum IP-10 levels were significantly lower in patients with SVR (3591[250-589] pg/mL) than those in patients with non-SVR (566 [378-802] pg/mL); P = 0.016).
By multivariate analysis including these 10 variables, IL28 B TT genotype and RVR
achievement were selected as predictive factors for SVR in the triple therapy. In the ROC
curve analysis of serum IP-10 levels for SVR, the area under the curve was 0.656 (P <0.05), and a cut-off value of 450 pg/mL, determined at a sensitivity of 70%. After
stratification of virologic response by IL28 genotype and serum IP-10 levels, the SVR
rates were not significantly different between the higher IP-10 group and the lower IP-10group, in patients with the IL28B TT genotype. In contrast, in patients with the IL 28B
non-TT genotype, SVR rates in the higher IP-10 group (38%) were significantly lower thatthose in the lower IP-10 group (74%, P < 0.05). It is strongly suggested that
determinations of serum IP-10 levels before treatment could be useful for predicting
favorable virologic response to the triple therapy, especially in patients with IL28B
non-TT genotype.
2. The host genetic factors contributing severe skin rashes in Japanese CHC patients
We performed genotyping by AXIOM Genome-Wide ASI 1 Array in 384 patientstreated with the triple therapy (male: female = 214:170). The gradings of skin rashes
were categorized into 0 to 3, of which numbers of the cases were 182, 43, 109, and 50,
respectively. After confinement of the ethnicity to Japanese and SNP filtering, 380 cases
and 417769 SNPs were utilized for further analysis. However, no significant SNPs wereidentified by GWAS with the P-value less than 10-8. To speculate the association with theother SNPs, which are not equipped in AXIOM Genome-Wide ASI 1 Array platform,imputation analysis was preliminarily performed in patients with grade 3 skin rashes,using 1000 Genomes Project JPT data as reference. Twenty-two out of 25 SNPs withP-value less than 10-6 were located in HLA region on chromosome 6th.
The novel methodology for HLA imputation, HIBAG R package, which wasrecently developed by Dr. Khor, Department of Human Genetics, Graduate School ofMedicine, The University of Tokyo (Pharmacogenomics J 2015; 1-8), demonstrated twoalleles in HLA-DRB1 and HLA-DQB1 regions, significantly contributing to severe skinrashes (grade 3). Although the prediction accuracy was reported to be as high as 98-99%
in HLA-DRB1 region, we are now performing allele genotyping by the TaqMan assay,using extracted DNA samples of these targeted patients.

2C型慢性肝炎に対するペグインターフェロン・リバビリン・テラプレビル
併用療法における有害事象発現に関与する宿主側因子、および耐性ウイルスの出現動態に関する多施設共同前向き研究（平成24～26年度）
研究代表者：正木尚彦
研究協力者：山極洋子

１．Ｃ型慢性肝炎に対するペグインターフェロン・リバビリン・テラプレビル併用療法の治療効果予測因子に関する検討（全国21施設との多施設共同研究：分担研究）

・ISG（interferon-stimulated gene）の一つであるinterferon-gammainducible protein -10 (IP-10)値を含めて解析した。
・SVRに関連する因子として単変量解
析では白血球数、ヘモグロビン値、アルブミン値、FIB-4値、前治療歴、
IL28Bゲノタイプ、IP-10値、HCVコア70番アミノ酸変異、テラプレビル初期投与量、およびRVR（治療開始4週目までのウイルス消失）が選択された。
・多変量解析ではホスト側因子である
IL28Bメジャー、治療因子であるRVR達成のみが有意であった。

血清IP-10値測定はIL28B non-TT群で有用

Yamagiwa Y, Masaki N, et al. (Manuscript submitted)

２．テラプレビル重症皮疹に関連する宿主因子（GWAS解析結果）

384例（男性214例、女性170例）
皮疹グレード 0/1/2/3＝182例/43例/109例/50例

・収集し得た検体のN数が十分ではないため、GWAS結果をreplicationすることは断念した。このプラット
ホームに載っていないSNPで有意なものがあるかを調べる目的で、fine mappingは行わず、In silicoのImputation解析を実施したところ、p<10-6以上のSNPが５番染色体上2個、6番染色体上に22個、11番染色体上に1個見出された。これらの中にはp<10-7以上のSNPが3個含まれていた。
・しかし、5番、11番染色体上のSNPについて実検体においてタイピング、関連解析を施行したが、有意な結果は得られなかった。

・6番染色体はMHCの産物HLAをコーディングしており、薬疹発現に関連する可能性が高いと考えられた。
最近、東京大学人類遺伝学教室のKhor博士らにより開発された日本人のHLA imputation測定法HIBAG Rpackageを用いた解析を行った。
・皮疹グレード0と3との比較において、HLA class Ⅱに分類されるHLA-DRB1、HLA-DQB1領域に重症皮疹発現に関連する2つのalleleの存在が明らかとなった（各々オッズ比3.376 [P = 9.12E-06]、2.907 [P = 7.15E-05]）。
・現在、実検体のallele genotypingをTaqMan法で実施中である。

Yamagiwa Y, Masaki N, et al. (Manuscript in preparation)

Ｃ型慢性肝炎に対するペグインターフェロン・リバビリン・テラプレビル併用療法の治療効果予測因子に関する検討（24指101研究の分担研究として遂行した全国21施設との多施設共同研究）

分担研究者：正木尚彦
研究協力者：山極洋子

・ISG（interferon-stimulated gene）の一つであるinterferon-gammainducible protein -10 (IP-10)値を含めて解析した。
・SVRに関連する因子として単変量解
析では白血球数、ヘモグロビン値、アルブミン値、FIB-4値、前治療歴、
IL28Bゲノタイプ、IP-10値、HCVコア70番アミノ酸変異、テラプレビル初期投与量、およびRVR（治療開始4週目までのウイルス消失）が選択された。
・多変量解析ではホスト側因子である
IL28Bメジャー、治療因子であるRVR達成のみが有意であった。

血清IP-10値測定はIL28B non-TT群で有用

Yamagiwa Y, Masaki N, et al. (Manuscript submitted)

研究発表及び特許取得報告について

課題番号：２４指１０１
研究課題名：C型慢性肝炎に対するペグインターフェロン・リバビリン・テラプレビル併用療法における有害事象発現に関与する宿主側因子、および耐性ウイルスの出現動態に関する多施設共同前
向き研究主任研究者名：正木尚彦
論文発表
掲載号

年

Ex vivo induction of IFN-k3 by a TLR7
agonist determines response to PegIFN/Ribavirin therapy in chronic
hepatitis C patients.

論文タイトル

Murata K,
J Gastroenterol
Sugiyama M,
Kimuta T,
Yoshio S,
Kanto T,
Kirikae I,
Saito H, AokiY, Hiramine S,
Matsui T, ItoK, Korenaga M,
Imamura M,Masaki N,
Mizokami M.

著者

掲載誌

49(1):126-37

2014

IL28B polymorphisms and clinicalimplications for hepatitis C virus
infection in Uzbekistan.

Khudayberganov PLoS ONE
a D, Sugiyama
M, Masaki N,
Nishida N,
Mukaide M,
Sekler D,
Latipov R,
Nataliya K,
Dildora S,
Sharapov S,
Usmanova G,
Raxmanov M,
Musabaev E,
Mizokami M.

2014 Mar24;9(3):e93011. doi:
10.1371/journa
l.pone.0093011. eCollection

2014

Pretreatment prediction of the outcomeof response-guided peginterferon-α andribavirin therapy for chronic hepatitis
C.

Masaki N,
Sugiyama M,
Shimada N,
Tanaka Y,
Nakamuta M,
Izumi N,
Watanabe S,
Tsubota A,
Komatsu M,
Masaki T,
Enomoto N,
Yoneda M,
Murata K, ItoK, Koike K,
Mizokami M.

29(12): 19962005

2014

Comparison of Peginterferon alfa-2a andalfa-2b for treatment of patients withchronic hepatitis C: a retrospective
study using the Japanese Interferon
Database.
Efficacy and safety of interferon
treatment in elderly patients withchronic hepatitis C in Japan: A
retrospective study using the JapaneseInterferon Database.

Sato I, Shimbo Drug Design,T, Kawasaki Y, Development andMasaki N.
Therapy

9: 283-290

2015

Sato I, Shimbo Hepatol Res
T, Kawasaki Y,
Mizokami M,
Masaki N.

in press

J Gastroenterol
Hepatol

研究発表及び特許取得報告について

Association of serum IFN-λ3 with
inflammatory and fibrosis markers inpatients with chronic hepatitis C virus
infection.

Aoki Y,J Gastroenterol
Sugiyama M,
Murata K,
Yoshio S,
Kurosaki M,
Hashimoto S,
Yatsuhashi H,
Nomura H, Kang
JH, Takeda T,
Naito S,
Kimura T,
Yamagiwa Y,
Korenaga M,
Imamura M,
Masaki N,
Izumi N, KageM, Mizokami M,
Kanto T.

A thymine-adenine dinucleotide repeat
polymorphism near IL28B is associatedwith spontaneous clearance of hepatitis
C virus.

Hiramine S,
J Gastroenterol
Sugiyama M,
Furusyo N, Uto
H, Ido A,
Tsubouchi H,
Watanabe H,
Ueno Y,
Korenaga M,
Murata K,
Masaki N,
Hayashi J,
Thomas DL,
Mizokami M.
Regional disparities in interferon
Masaki N,
BMC Public Healththerapy for chronic hepatitis C in
Yamagiwa Y,
Japan: a nationwide retrospective cohort Shimbo T,study.
Murata K,
Korenaga M,
Kanto T,Mizokami M,
prefecturalmembers
contributing
to theJapaneseInterferon
Database.

in press

in press

15:566

2015

学会発表
タイトル

発表者

学会名

多施設共同研究における３剤併用療法のウイ 山極洋子、正木 第17回日本肝臓学
ルス学的効果と副作用の検討．
尚彦、西田奈会大会
央、杉山真也、 （JDDW2013）
竹田努、青木孝彦、是永匡紹、村田一素、今村雅俊、溝上雅史．

場所

年月

東京

2013年10月

研究発表及び特許取得報告について

ペグインターフェロン/リバビリン/テラプレ 山極洋子、正木 第50回日本肝臓学
ビル3剤併用療法における血清IP-10値による 尚彦、村田一
会総会
治療効果予測の検討．
素、西田奈央、杉山真也、考藤達哉、是永匡
紹、今村雅俊、
青木孝彦、竹田努、国際医療研
究開発費24指
101協力施設、
平峯 智、古庄憲浩、小池和彦、溝上雅史．
Regional differences should beconsidered for the more effective
interferon treatment of chronic
hepatitis C: Evidences on Japanesenation-wide database.

Masaki N,
Yamagiwa Y,
Mizokami M.

APASL Liver Week
2013

C型慢性肝炎に対するペグインターフェロ
正木尚彦、山極 第50回日本肝臓学
ン・リバビリン併用療法の患者受療状況、治 洋子、新保卓会総会
療効果における地方圏差に関する検討．
郎、協力自治体、溝上雅史．

東京

2014年5月

SingaporeJune, 2013東京

2014年5月

場所

年月日

その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等)
タイトル

発表者

発表先

該当なし

特許取得状況について※出願申請中のものは(発明名称)記載のこと。
登録番号

該当なし
※該当がない項目の欄には「該当なし」と記載のこと。
※主任研究者が班全員分の内容を記載のこと。

特許権者(申請者）
登録日(申請日)（共願は全記載）

出願国