生体トリプトファン残基の新規選択的修飾法の開発
東京薬科大学 生命科学部
分子生命科学科 創薬化学研究室（薬学部 薬品化学教室）
教授 林 良雄
2023年8月29日

本技術に関する知的財産権• 発明の名称 ：トリプトファン選択的修飾剤、およびこれを用いたTrp-S結合含有化合物の製造方法• 出願番号：特願2022-154918 (2022-09-28 出願)• 出願人：学校法人東京薬科大学[100%]• 発明者：林 良雄 他3名

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発明の背景と概要
本発明は、チオエーテル基の存在下で、タンパク質等の分子中におけるトリプトファン残基を選択的に修飾する化学式１で表される、トリプトファン選択的修飾剤に関するものである。
トリプトファンは真核生物において全アミノ酸の約１％しか占めていないがほとんどのタンパク質に存在する。そのため、当該残基に対する特異的、選択的な反応は有望な化学修飾法の創製に繋がる可能性がある。トリプトファンは反応性が低いため、修飾するには強酸性、高温、有害な重金属試薬や有機溶媒の使用など過酷な反応条件が必要であり、生体分子への適応は難しいものが多く、また、酸化剤を用いる場合、過酸化体の副生するという課題があった。
本発明は、抗体等の機能性高分子に極力ダメージを与えずに、修飾、機能付加を可能にすることを目的としている。

一般式

修飾試薬を構造規定
修飾方法を規定

本発明により、従来法のような過酷な反応条件を用いずとも、ペプチドやタンパク質等の分子内に含まれるメチオニン残基の近傍に位置するトリプトファン残基を選択的に修飾すること、およびトリプトファン残基に種々機能性物質を連結する、という大きな特徴を持つ。
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発明の特徴チオエーテル基が近傍に存在するときだけトリプトファン残基を選択的に修飾できる
世界唯一の全く新しい化学修飾法
チオエーテル：メチオニン残基

特徴： メチオニンの近傍に位置するトリプトファン残基に種々機能性物質を連結
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発明の特徴 トリプトファンは化学修飾に最適なアミノ残基
トリプトファンの生体分子での位置づけ⚫ ほとんど全てのタンパク質に含まれる→ 普遍的な修飾が可能⚫ 真核生物において存在割合が約1%程度1)→ 非常に少ない → 選択的な修飾ができる⚫ 分子内部に存在場合は修飾できない

選択的なタンパク質の化学修飾に利用できる

Trp1) D. Gilis et al., Genome Biol., 2001, 2, research0049.1-0049.12.

Trpを介した化学修飾の標的（対象）➢ 架橋分子の創製⚫ 合成したペプチド⚫ 組み替えタンパク質体外✓ 生来の Trp残基を修飾点に利用✓ 合成体 / 組み替え体へのTrpの新たな導入⚫ 生体内タンパク質

その応用

体内

⚫ 天然のインドール化合物 体外タンパク質の化学修飾といえば、Lys, Cysが有名だが、選択的修飾は難しい

抗体薬物複合体タンパク質薬物複合体
ペプチド薬物複合体
放射性物質複合体➢ 創薬・診断薬ツール
創薬での多様な置換体提供
インドール天然物の標識

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発明の特徴 トリプトファン化学修飾法の応用例
診断技術

創薬技術
蛍光放射薬物

蛍光分子や放射性タグ修飾によるがん等の診断にADC調製

インドール天然物への標識
薬物
ペプチド医薬品への修飾による新たな機能付与

機能例）脂肪鎖の導入⇨アルブミン親和性向上に伴う作用の持続化

PDC調製

組み換えタンパク+機能機能

ダプトマイシン

遺伝子工学技術を応用し、Trp-Metを挿入した人工タンパクへの修飾

天然物を釣り餌としたケミカルバイオロジー、多様な置換体の提供に繋がる修飾すべき分子や導入すべき分子は今後の科学の発展に伴い多様化できる

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発明の技術概要①

Npysを用いる本発明のユニークな点

なぜチオール選択的なのか？ こんな面白いことができるのか？

チオエーテル依存的なトリプトファン残基インドールの選択的化学修飾法
チオエーテル構造（独自開発品）
メチオニン
スルフェニル化Npys-OPh(pF) 1),2)

一般式の一例近傍

インドール環
トリプトファン
【本技術の特徴】
１） スルフェン酸エステルによるチオエーテル依存的Trp残基インドール環のスルフェニル化
２） Trp残基に対し、高い反応性、選択性
３） 比較的温和な条件で、ペプチド、タンパク質の化学修飾が可能

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発明の技術概要②タンパク質・ペプチドにおける空間的に近いメチオニン残基依存的なトリプトファン残基修飾法 (CAMA-Trp modification)：機能性分子（蛍光分子、薬物等）

メチオニンにより試薬が活性化

Trp残基
機能性分子を導入した
Npys誘導体

中間構造

チオエーテル構造を有する
Met残基

空間的な近接効果による修飾

TrpとMetが空間的に近い場合のみ本修飾反応が進行する【本技術の特徴】
４）メチオニン残基の近傍に位置するTrp残基を選択的に修飾（CAMA-Trp modification）
５）Trp残基に蛍光物質など機能性分子を導入することも可能

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競合技術（先行技術）①
A）従来法１（酸化法）1)
過酸化物やMetなど他のアミノ酸残基への副反応があるため、タンパク質などへの適応は困難
酸化剤1) D. Manzanares et al., Biochemistry, 2007, 46, 5604-5615.

B）従来法２（C-H activation法）2)

+

ハロゲン化
アリール

Pd触媒
有機溶媒

高価で毒性にある重金属触媒を使用し、反応条件が過酷（高温、有機溶媒の使用）であるため、タンパク質などへの適応は困難
2) J. Ruiz-Rodríguez et al., Chem. Eur. J., 2010, 16, 1124-1127.

9競合技術（先行技術）②C) 従来法３（有機ラジカル法）1)
複数のTrp残基に対する選択性に乏
しく、タンパク質においては単一の修飾体を得ることができないため、タンパク質などへの適応は困難

1) Y. Seki, M. Kanai et al., J. Am. Chem. Soc., 2016, 138, 10798-10801.

D) 従来法４（スルフェニル化法）2)

強酸条件下（トリフルオロ酢酸）の修飾反応であるため、タンパク質などへの適応は困難

2) D. Kobayashi, A. Otaka et al., ACS Med. Chem. Lett., 2022, 13, 1125-1130.

☞従来法とは異なる独自かつ効率的なトリプトファン残基化学修飾法の開発が求められる。

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本発明の優位性

比較表

本発明

酸化法C-Hactivation法

構成

Thioether依存的なNpysによる修飾

H2O2などによるフェントン反応

金属触媒を用いたアリール付加反応

keto-ABNOを用いたC-O結合形成

Cys側鎖スルホキシドによるTrpのスルフェニル化

得られる
特性

Trp残基上にNpys基を介した機能性分子の付与

Trpインドー
ル環開裂による反応性基の構築

Trpインドール環のアリール化を介した機
能化タンパク質のTrp選択的バ
イオコンジュ
ゲーション

Trp-Cys架橋による機能性分子の付与

有機合成
創薬化学
天然物合成
ケミカルバイオロ
ジー

生化学
ペプチド
タンパク質

有機合成
創薬
医化学

有機合成
ケミカルバイ
オロジー
創薬
生物製剤創薬 製剤設計

新規アミノ酸誘導体、修飾
Trpペプチドの提供

タンパク質中表面のTrpを標的

適用
分野

その他

新規修飾法
酸化的不活
新規合成法
性化
位置選択的な制御

有機ラジカル法

スルフェニル化法

GLP-1の脂質化

11本発明の優位性： 結論
既存技術
蛋白中の多様なアミノ酸の中でトリプトファン選択的修飾
本発明
蛋白中の特定のトリプトファン選択的修飾

今は、比類する技術のない
世界唯一の全く新しいTrp選択的化学修飾法
基幹技術となる（特定トリプトファン選択的修飾法）
本発明の試薬へ架橋（導入する）する分子（医薬品など）は特許有効期間中にさらに革新がなされても、本発明の技術上に反映できる

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具体的な内容のご説明

アミノ酸に対する修飾（化学的基礎）

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発明の技術内容 ①【図１】
HPLC conditions :a linear gradient starting from 50%
MeOH to 85% MeOH in 0.1% aqueous
TFA over 35 min at flow rate of 1.0
mL/min and detected at 280 nm.
Column : COSMOSIL Packed Column
5C18-AR-Ⅱ 4.6ID×150mm[M+Na]+
P1：515.1000
P2：515.1000
P3：515.100414発明の技術内容 ②[M+Na]+
P1：515.1000
P2：515.1000
P3：515.1004

【図２】

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発明の技術内容 ③

Npys-OPh(pF)(1.0 eq.)

Z-Trp-OH(1.0 eq.)

Ethyl sulfide (1.0 eq.)
Solvent
rt, 48 h

P1

Entry

Solvent

Yielda (%)

175% AcOH aq.

55

20.4 M LiCl/75% AcOH aq.

60

337.5% AcOH溶液（CH3CN/75% AcOH aq. (1:1)）

134

37.5% TFA溶液（CH3CN/75% TFA aq. (1:1)）

95

537.5% HFIP溶液（CH3CN/75% HFIP aq. (1:1)）

8637.5% TFE溶液（CH3CN/75% TFE aq. (1:1)）

57酸無添加（75% CH3CN aq.）

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TFAのような解離定数が低い（ｐＫａ＝０．２３）酸を用いると、反応は効率的に進行することが示された。

aYield (%) was calculated from peak areas in HPLC using a calibration curve.

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発明の技術内容 ④

アミノ酸における反応選択性
本反応はトリプトファン選択的であることが示唆された

Amino acid derivatives(AA, 1.0 eq.)

Npys-OPh(pF) (1.0 eq.)
Ethyl sulfide (1.0 eq.)
AcOH : H2O (3 : 1, v/v)
rt, 1.5 hNpys-modified derivatives(AA(Npys))【表２】【Yielda of AA(Npys)】
EntryAAAA(Npys)

Yielda (%)

1Z-Trp-OH

Z-Trp(Npys)-OH

79%2Z-His-OH

Z-His(Npys)-OH

N. F.

3

Z-Lys-OH

Z-Lys(Npys)-OH

N. F.

4

Z-Arg-OHZ-Arg(Npys)-OH

N. F.

5

Z-Tyr-OH

Z-Tyr(Npys)-OH

N. F.

6

Z-Ser-OH

Z-Ser(Npys)-OH

N. F.

7

Z-Thr-OH

Z-Thr(Npys)-OH

N. F.

aPercent yield = 100 x [integ. AA(Npys) / (integ. AA + integ. AA(Npys))]N.F.: Not Found

ただし、Cysには注意が必要、ジスルフィドは問題なし

17具体的な内容のご説明

ペプチドに対する修飾

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発明の技術内容 ⑤

H––NH2

H––NH2

モデルペプチド・ Ac-Ala-Ala-Trp-Ala-Met-NH2
・ Ac-Ala-Ala-Trp-Ala-Ala-NH2それぞれに対する反応性を確認する

Ac-Ala-Ala-Trp-Ala-Met-NH2

Ac-Ala-Ala-Trp-Ala-Met-NH2

Metあり

91%
Npys-OPh(pF)
75% AcOH aq.
rt, 72 hMet

Ac-Ala-Ala-Trp-Ala-Ala-NH2

Metなし

Ac-Ala-Ala-Trp-Ala-Ala-NH2
生成しない

Met非含有では反応が進行しない

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具体的な内容のご説明

タンパク質における修飾

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発明の技術内容⑥

タンパク質おけるTrp残基修飾【図５】

FL(3.25 mM, 6.5 eq.)

AcOH : H2O (3 : 1)
rt, 19 h

Lysozyme (a)(0.5 mM)

19 h

修飾体 (b)MALDI-TOF（19時間後の反応溶液）
Lysozyme

a14305.20

Npys修飾体

b15653.86

2Npys修飾体
17014.45

精製後m/zHPLC conditions, Gradient: milli Q water (0.1% TFA)/CH3CN = 95 : 5 to 5 : 95
over 45 min, Flow rate : 1.0 mL/min, UV : 230 nm, Column : COSMOSIL PackedColumn 5C18-AR-II 4.6ID x 150 mm.

01530
Retention time (min)4521実用化に向けた応用①
機能性分子

基礎研究

応用研究

有機化学
ケミカルバイオロジー

創薬

親和性標識
（ビオチン等）

医薬分子（ADC）の創製【ADC調製への応用】

薬物ADC, PDCの調製（均一な薬物結合による医薬品の安定供給）
蛍光標識

放射性同位体標識

Met-Trp の仕組みにより、位置選択的で均一な ADC の調製・供給

基礎研究をはじめ臨床研究に至るまで数多くの分野への応用が期待できる

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実用化に向けた応用案②

新規ラベル化手法開発

選択的ラベル化指向型タグペプチドシステム
オフターゲット
標的タンパク質

オフターゲット

高反応性
タグペプチドNpys誘導体によるラベル化

機能性分子(蛍光分子、ビオチンなど)生成した標的タンパク質のみを、選択的にラベル化⇨ 標的タンパク質の細胞内での局在 / 動態を解明する研究に応用生成した標的タンパク質のみを、タグを介してビオチン化⇨ アフィニティクロマトグラフィーにより精製が可能

タンパク質特異的な抗体やプローブを使用せずに、組み換えタンパク質に特異的な検出・精製が可能になる
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技術移転活動の現状と計画⚫ 想定するビジネスモデル➢ 試験研究用試薬

ジスルフィド形成試薬◆ Trp修飾剤（キット）としての販売
国産化学社、富士フィルム和光を通じて販売➢ Met-Trpを足掛かりとする新規架橋技術◆ 架橋技術の導出◆ 架橋技術を利用した架橋体の共同創製➢ ペプチド医薬（ペプチド-薬物複合体の製造法）

薬物➢ 抗体医薬（抗体-薬物複合体の製造法）

国際出願（PCT出願）にご協力いただける企業様を募集中です。
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お問い合わせ先
東京薬科大学
イノベーション推進センター 林・稲場
ＴＥＬ 042－676－5349
ＦＡＸ 042－676－4714
e-mail sangaku-ml＠toyaku.ac.jp