課題番号：26指108
研究課題名：肝疾患診療拠点病院と連携したB型肝炎の病態進展に関連するウイルスとホスト要因の解析
主任研究者名 ：杉山 真也
キーワード ：B 型肝炎ウイルス、ヒトゲノム解析、臨床応用、肝疾患診療連携拠点病院
研究成果：「臨床検体の解析」
昨年から、肝疾患診療連携拠点病院と共同研究関係にある厚労科研班会議の各班長（徳永 勝士 教授、坂本 直哉 教授、田尻 仁 主任部長）、北海道大学医学部消化器外科（武冨 紹信 教授）、九州大学医学部消化器外科（前原 喜彦 教授）、群馬大学医学部消化器外科（調 憲 教授）、国府台病院肝臓内科（溝上 雅史 センター長、正木 尚彦 室長）らから検体の収集を行った。解析の対象としては、A）慢性肝炎 vs.肝癌、B)肝癌 vs.肝硬変、C)慢性肝炎 vs.肝硬変、D）肝癌多発家系の解析（後述）があり、それらについて検体収集を継続して実施した。
その結果、探索用の検体として、313 サンプルを収集した。その 303 検体のエキソンキャプチャーとエキソームシークエンスを終えた。収集したデータは、昨年作成した自動解析システムで 1 次解析を実施し、コピーナンバーバリエーション（CNV）と一塩基多型（SNPs）解析を行った。探索検体でのシークエンスから得られた解析結果では、健常者検体と比較して、肝炎に罹患した患者に特有と推定される CNV を二箇所発見した。探索用の全検体をシークエンスした段階で再度追加解析し、バリエーションセットで検証する。SNPs 解析は平行して進めている。
本年度では、北海道大学外科から提供を受けた肝切除検体としては、約 120 検体を解析した。癌部、非癌部での比較解析を実施しており、B 型肝がん部に特有のインテグレーション部位を複数個検出している。昨年度、九州大学の検体から得られた結果と、本年度に得られた結果について、インテグレーションサイトを比較検討する。また、本年度では、次世代シークエンスを使わないインテグレーション領域の同定法の開発を進めた。従来は、高速シーケンサーで全ゲノムシーケンスが必要であったが、本解析法を用いることで、PCR とキャピラリーシークエンスをベースにヒトとウイルスの融合遺伝子を分離同定できることを確認した。
ヒトゲノム因子と併せて、ウイルス因子の解析を進めた。論文発表している E-PAS 法によって、現在保有している検体のウイルスゲノム抽出と HBV 遺伝子型/亜型を決定した。続いて、HBV 抗原となりえる HBs 蛋白領域のシークエンスを実施した。最終的には、ヒトゲノム因子とウイルス因子を組み合わせて解析し、精度の高いリスク分類を目指す。
D）肝癌多発家系の解析：家族検体の収集が必要であることから、親子での来院が期待できる小児科での収集と住民コホートでの収集を進めた。また、北海道大学でも家族検体の収集が可能ということで、その収集を依頼している。現在のところ、2 家系について住民コホートで収集可能となっており、準備を進めた。高速シーケンサーを使った家族解析をすることで少ない検体で、精度の高いリスク遺伝子の抽出ができるようになる。
「肝臓内免疫機構の解析」
昨年の in vitro での条件検討に従って、マウスでの in vivo イメージングを実施した。マウスに肝障害を誘導した部位にマクロファージが遊走し、集合する様子を捉えることが出来た。好中球の遊走についても捉えることができた。
昨年に得た１細胞でのトランスクリプトーム解析について、肝細胞に絞ったうえでのデータ解析を進めた。HBV 感染受容体として NTCP 遺伝子が報告されていたが、NTCP 遺伝子が発現していても感染が起きていない細胞が多数発見された。このことは、NTCP 遺伝子以外にも感染に関わる遺伝子が存在していることを意味している。その後の解析で、NTCP 遺伝子が発現しつつも、HBV 感染していない細胞で発現が低下している遺伝子を抽出した。特に、細胞表面に発現している遺伝子を抽出したところ、４つの遺伝子に絞りこむことが出来た。それらについて、感染受容体としての可能性を確認するために、CRISPR/Cas9 系でのノックアウト細胞を作出し、感染実験によって検証を行っている。

Subject No.

：26shi108

Title：Analyses of viral and human genome factor associated with the diseaseprogression of hepatitis B using the clinical samples from nation-wide core hospitals of hepaticdiseases
Researchers ：Masaya Sugiyama
Key word：Hepatitis B virus, Immunity in liver, Carcinogenesis, Single cell analysis,

next-generation sequencer
Abstract：[Analysis of clinical samples]
We have continued to collect clinical samples, such as genomic DNA and serum, from regional corecenters for the treatment of liver disease since last year. The collaborator of the sample collection
was a group leader directing their research teams of Health Labour Sciences Research Grant.
Main members are Prof. Katsushi Tokunaga of University of Tokyo, Prof. Naoya Sakamoto ofHokkaido University, Prof. Hitoshi Tajiri of Osaka General Medical Center, Prof. Akinobu
Taketomi of Hokkaido University, Prof. Yoshihiko Maehara of Kyushu University, Prof. Ken
Takebe of Gunma University, and Prof. Masashi Mizokami of Kohnodai Hospital. Researchsubjects are below, A) chronic hepatitis vs. liver cancer, B) liver cancer vs. liver cirrhosis, C)
chronic hepatitis vs. liver cirrhosis, D) family cases containing multiple patients of HCC. Total 313
samples were collected in 2015 from the above hospitals for screening assay. After the quality
control of genomic DNA, the 303 samples were prepared with the exome analysis using exon
capture followed by next generation sequencing (NGS). These huge data of genomic sequence werestocked in our database after the base call and the alignment using our analysis pipeline for NGS.
Four candidate SNPs relating with HCC development were determined in comparison between
chronic and HCC patients. For the validation study, independent samples are collected in this andnext year.
Next, we have analyzed 120 genomic DNA from the graft of HCC. Our in house assay to detect
HBV integration sites is PCR-based method but not NGS. We have detected fusion genes
consisting of human and HBV. These integration positions are consistent with NGS data. Thismethod was applied into HIV and HTLV1 infection cells. Therefore, we have developed novel
method for the detection of viral integration site such as HBV, HIV, and HTLV1.
Using serum samples, viral sequences of HBV genomic DNA was collected and registered into ourdatabase to analyze the correlation between human and viral factors. As we have reported that a
HLA genotype was related with chronic infection and HCC development, the viral peptides
binding to a HLA genotype were screened using NGS analysis. Two candidate sequence of aminoacid were determined by HLA-peptide binding assay (collaboration with Dr. Miyadera of Tsukuba
University).
Researchers には、分担研究者を記載する。

「臨床検体の解析」
エキソーム解析（カスタムキット）
サンプル量比較
SureSelectCustom

DNA for start

200ng-3ug

100ng-1ug

Target region

114Mb

114Mb

プローブのカバー率

各Depthを達成した領域長

depth

従来品とターゲット領域は同一であるが、効率的なエキソン領域の回収を可能とした。
• プローブの工夫で、少量のDNAで実施できた。
• ターゲット領域を最も広くカバーしたプローブを複数設計した。
• ハイブリ効率の向上と回収後の精製度の向上で高depth領域を1.5倍に向上させた。

実検体のエキソームシークエンス

In houseプローブで安定したエキソンの回収ができた。B型肝がんに関連するヒト遺伝子領域の高密度解析で、有用なホスト因子が同定できると期待できる。

「肝臓内での感染免疫機構の解析」
肝細胞の１細胞解析「主成分分析による１細胞ごとのmRNA発現変化」
HBV感染の有無で層別化した。同じホスト由来の肝細胞であっても、HBV感染出来る細胞と出来ない細胞があることが明確になった。
感染の有無での遺伝子発現の違いは、受容体遺伝子の探索、ウイルス複製に必要なホスト因子の探索に重要な情報である。

「遺伝子ごとでみたときのその発現細胞数（割合）」
全１細胞で発現している遺伝子はハウスキーピン
グ遺伝子群であった。それ以外の遺伝子は、同じ肝細胞であっても、発現の有無と量が異なっていた。
1細胞ごとに特有の性質があるともいえる。

肝がん部位に特有の遺伝子発現データをシングルセルで得た。シングルセルで解析することで、遺伝子発現パターンから、細胞種を推定でき、純化した細胞での検討と同じく、クリアなデータを得られるようになった。

研究発表及び特許取得報告について

課題番号：26指108
研究課題名： 肝疾患診療拠点病院と連携したB型肝炎の病態進展に関連するウイルスとホスト要因の解析
主任研究者名：杉山真也

論文発表
論文タイトルUse of nucleoside analogs in patientswith chronic hepatitis B in Nepal: Aprospective cohort study in a singlehospital.

著者
Masaki N,
Shrestha PK,
Nishimura S,
Ito K,Sugiyama M,
Mizokami M.

Okumura N,
Ikeda M, Satoh
Negative regulation of hepatitis B virus
S, Dansako H,
replication by forkhead box protein A inSugiyama M,
human hepatoma cells.
Mizokami M,
Kato N.

掲載誌掲載号

年

Hepatol Res.

45(12):1163-9.

2015

FEBS Lett.

28;589(10):111
2-8.

2015

Kondo Y,
Kimura O,
Tanaka Y,
Ninomiya M,
Differential Expression of CX3CL1 in
Iwata T,
Hepatitis B Virus-Replicating Hepatoma
15;89(14):7016
Kogure T,
J Virol.
Cells Can Affect the Migration Activity-27.
Inoue J,of CX3CR1+ Immune Cells.
Sugiyama M,
Morosawa T,
Fujisaka Y,
Shimosegawa T.
Komada K,
Sugiyama M,
Vongphrachanh
Seroprevalence of chronic hepatitis B, P, Xeuatvongsa
as determined from dried blood spots,
A,
among children and their mothers inKhamphaphongph
Int J Infect Dis. 6;36:21-26.
central Lao People's Democratic
ane B,
Republic: a multistage, stratified
Kitamura T,
cluster sampling survey.
Kiyohara T,
Wakita T,
Oshitani H,
Hachiya M.

2015

2015

Nishitsuji H,
Ujino S,
Shimizu Y,
A novel reporter system to monitor early Harada K,
stages of the HBV life cycle.
Zhang J,
Sugiyama M,
Mizokami M,
Shimotohno K.

Cancer Sci.

106(11):161624.

2015

Miyakawa K,
Matsunaga S,
Watashi K,
Molecular dissection of HBV evasion from Sugiyama M,
restriction factor tetherin: A new
Kimura H,
perspective for antiviral cell therapy. Yamamoto N,
Mizokami M,
Wakita T, RyoA.

Oncotarget

6(26):2184052.

2015

研究発表及び特許取得報告について

Kiyohara T,
Ishii K,
Seroepidemiological study of hepatitis B
Mizokami M,
virus markers in Japan.
Sugiyama M,
Wakita T.

Vaccine33(45):603742.

2015

Kaneko M,
Watashi K,
Kamisuki S,
Matsunaga H,
Iwamoto M,
Kawai F,
Ohashi H,
A Novel Tricyclic Polyketide,
Tsukuda S,Vanitaracin A, Specifically Inhibits the Shimura S,
Entry of Hepatitis B and D Viruses by
Suzuki R,
Targeting Sodium Taurocholate
Aizaki H,Cotransporting Polypeptide.
Sugiyama M,
Park SY, ItoT, Ohtani N,
Sugawara F,
Tanaka Y,
Mizokami M,
Sureau C,
Wakita T.

J Virol.

89(23):1194553.

2015

Dansako H,
Ueda Y,
Okumura N,
Satoh S,
Sugiyama M,
Mizokami M,
Ikeda M, KatoN.

FEBS J.

283(1):144-56.

2016

Hepatology

63(1):83-94.

2016

The cyclic GMP-AMP synthetase-STING
signaling pathway is required for boththe innate immune response against HBVand the suppression of HBV assembly.

Yoshio S,
Sugiyama M,
Shoji H, Mano
Indoleamine-2, 3-dioxygenase as anY, Mita E,
effector and an indicator of protective Okamoto T,
immune responses in patients with acute Matsuura Y,
hepatitis B.
Okuno A,
Takikawa O,
Mizokami M,
Kanto T.

研究発表及び特許取得報告について

Ito K,
Yotsuyanagi H,
Sugiyama M,
Yatsuhashi H,
Karino Y,
Takikawa Y,
Saito T, AraseY, Imazeki F,
Kurosaki M,
Umemura T,
Ichida T,
Toyoda H,
Geographic Distribution andYoneda M,
Characteristics of Genotype A Hepatitis
J Gastroenterol
Tanaka Y, Mita
B Virus Infection in Acute and Chronic
Hepatol
E, Yamamoto K,
Hepatitis B Patients in Japan.
Michitaka K,
Maeshiro T,
Tanuma J,
Korenaga M,
Murata K,
Masaki N,
Koike K,
Mizokami M,
and theJapanese AHB
and CHB Study
Group.

Hepatocyte Factor JMJD5 Regulates
Hepatitis B Virus Replication throughInteraction with HBx.

Kouwaki T,
Okamoto T, Ito
A, Sugiyama Y,
Yamashita K,
Suzuki T,
Kusakabe S,
Hirano J,
Fukuhara T,
Yamashita A,
Saito K,Okuzaki D,
Watashi K,
Sugiyama M,
Yoshio S,
Standley DM,
Kanto T,
Mizokami M,
Moriishi K,
Matsuura Y.

J Virol.

31(1):180-9.

2016

90(7):3530-42.

2016

学会発表
タイトル

発表者

学会名

場所

B 型肝炎の抗原・抗体測定キット間の比較と 杉山真也、考藤 第51回日本肝臓学
熊本
新規測定系の開発
達哉、溝上雅史 会総会
MasayaEffect of toll-like receptor 4 signaling
Sugiyama,
on liver fibrosis in uPA/SCID mice with
Tatsuya Kanto,
human hepatocytes persistently infected
Masashiwith hepatitis B virus
Mizokami

2015
InternationalMeeting onBad Nauheim
Molecular Biologyof Hepatitis BViruses

年月2015年5月

2015年10月

研究発表及び特許取得報告について

MasayaTLR4 signaling mediate liver fibrosis in Sugiyama,
chimeric mice persistently infected with Tatsuya Kanto,
HBVand Masashi
Mizokami.

The 63rd Annual
Meeting of The福岡Japanese Societyfor Virology

2015年11月

MasayaSugiyama,
Tatsuya Kanto,
Masaaki
Impact of toll-like receptor 4 signaling
Korenaga,on liver fibrosis in uPA/SCID mice withKazumoto
human hepatocytes persistently infectedMurata,
with hepatitis B virus
NaohikoMasaki, andMasashi
Mizokami

The Liver Meeting
2015: The 66thSan Francisco
Annual Meeting ofAASLD

2015年11月

第29回日本エイズ学会学術集会・総 東京会

2015年11月

西田 奈央、大橋順、杉山 真也、
第38回日本分子生土浦 貴代、石井
日本人におけるB型慢性肝炎とHLA-DPB1遺伝物学会年会、第88神戸真由美、山本
子型の関連
回日本生化学会大健、笹月 健彦、 会 合同大会
徳永 勝士、溝上雅史

2015年12月

A Survey of Human Immunodeficiency
Virus/Hepatitis B Virus Infection in aMen who have Sex with Men Cohort inUlaanbaatar

MasayaSugiyama,Masashi
Mizokami, andShinichi Oka

その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等)
タイトル

特許取得状況について※出願申請中のものは(

発明名称発表者発表先場所年月日)記載のこと。
登録番号※該当がない項目の欄には「該当なし」と記載のこと。
※主任研究者が班全員分の内容を記載のこと。

特許権者(申請者）
登録日(申請日)（共願は全記載）

出願国