課題番号研究課題名：25指105：膠原病における、ＡＣＥ2阻害病態の分析と治療法開発、および抗ＧＡＢＡ受容体抗体による診断法の開発
主任研究者名 ：三森明夫
分担研究者名 ：石坂幸人
キーワード ：抗アンジオテンシン変換酵素抗体、膠原病、肺高血圧症
研究成果：
1. 現在は、抗 ACE2 抗体測定用 ELISA に用いる ACE2 蛋白の、純度を高める作業に集中している。精製するために、多量の蛋白発現を要する。技術的な問題点について、別紙 PowerPoint に記した。患者
血清中の IgG 分画による in vitro ACE2 抑制は、下記 2.のように効率よく結果が得られた。
2. 膠原病血管病態における抗 ACE2 抗体の ACE2 阻害作用：Ang(1-7)定量による方法
背景：膠原病の血管病態（肺動脈性肺高血圧症 PAH、末端壊死）と相関する抗 angiotensin 変換酵素
2/ACE2 抗体を見出し、SLE 活動期に抗 ACE2 非阻害抗体陽性をみること、ACE2 阻害抗体のみが血管病態と相関することを報告してきた。合成基質による従来の ACE2 活性評価に替え、今回、生理的基質 AngII を用いて再評価した結果を報告する。
方法：SLE 既報 27＋新規 2 人（PAH 4、末端壊死 2、血管病変のない活動期 SLE 19、非活動期対照 4人）および新規 1 例（原発性シェーグレン症候群 SjS-PAH）から、血清 IgG を抽出した。in vitro ACE2による、蛍光標識 FAM-AngⅡから FAM-Ang（1-7）への変換を HPLC（High performance liquidchromatography）で定量し、抗 ACE2 抗体含 IgG 分画による ACE2 阻害を Ang(1-7)/AngII 比で評価した（3 回測定 t 検定）。
結果：IgG 分画による ACE2 活性阻害は、PAH 4/5、末端壊死 2/2、活動性 SLE 3/19 にみられ（6/7 vs 3/19;
p = 0.0022）、対照 0/4 だった。合成基質法に比べ、Ang(1-7)の HPLC 定量では、阻害抗体による ACE2阻害が、再現性よく得られ、血管病患者の 5/7 でほぼ完全抑制をみた。SjS 1 例はステロイド治療後のPAH 再発であり、血清の抗 ACE2-ELISA 低値だったが、再発時の ACE2 阻害、ステロイド再治療後の阻害消失がみられた。
結論：Angiotensin(1-7)定量による in vitro ACE2 活性評価は、血清中の抗 ACE2 阻害抗体を高感度に検出する可能性がある。

課題番号
研究課題名

：25指105：Pathogenicity of autoantibodies to angiotensin converting enzyme 2 or GABA receptors,
and a prevalence of the autoantibodies in patients with connective tissue diseases
主任研究者名 ：Akio Mimori
分担研究者名 ：Yukihito Ishizaka
キーワード ：anti-angiotensin converting enzyme 2, connective tissue disease, pulmonary hypertension
研究成果：

Inhibitory activity of serum autoantibodies to ACE2 in patients with constrictive rheumatic
vasculopathies, using angiotensin(1-7) assay
Backgrounds: We have reported inhibitory serum autoantibodies (Ab) to angiotensin2 (ACE2) inpatients with rheumatic diseases and pulmonary arterial hypertension (PAH) or digital necrosis, andnon-inhibitory antibodies to ACE2 in active SLE patients. This study presents a highly sensitive
method for detecting anti-ACE2 inhibitory Ab, which measures physiological substrate AngII and theproduct Ang(1-7) by High performance liquid chromatography (HPLC). Methods: Serum IgG fraction
was obtained from 29 SLE patients (4 PAH, 2 digital necrosis, 19 active SLE without vasculopathy, 4and control SLE) and one patient with Sjogren syndrome amd PAH. After co-incubation of ACE2 andAngII with patient’s IgG, Ang(1-7)/AngII-ratios were estimated. Results: ACE2 inhibition by serumIgG was shown in 4/5 of PAH, 2/2 of digital necrosis, and 3/19 of active SLE without vasculopthy(6/7 vs 3/19; p = 0.0022), and none of 4 controls. The in vitro ACE2 inhibition by the IgG from aSjogren-PAH patient was diminished after steroid therapy, which treated the PAH successfully.
Conclusion: Ang(1-7)/AngII assay by HPLC may be a sensitive method for detecting inhibitory
autoantibodies to ACE2 in rheumatic vasculopathy.

25指105
研究課題名 ：膠原病における、ＡＣＥ2阻害病態の分析と治療法開発、および抗ＧＡ
ＢＡ受容体抗体による診断法の開発
患者血清中の、ACE2阻害自己抗体の臨床評価、最近までの成績は、別紙（和文、英文）に記した。
現在は、抗ACE2-ELISA 系に用いる、抗原ACE2 蛋白の純度を高めて汎用性のあるELISAキットを作成することに集中している。技術的な点を以下に記す。
現在の状況と問題点

膠原病患者血清を用いてのELISA抗原用ACE2タンパクを哺乳類細胞系タンパク質発現システム(FS293、Expi293ExperssionSystem)を用いて発現・精製を試みている。
現在までも同様にhACE2タンパクを精製しELISA抗原として使用してきたが、FS293ではACE2タンパクの発現量が少なく大量に入手することが困難であると共に、精製純度が低い事が問題となっている。
今回は患者血清のスクリーニングに、純度の高いhACE2タンパクを抗原としたELISAを行うことを目的としている。
まずFS293にくらべ高発現とされているExpi293を使用しhACE2を発現精製したが、夾雑たんぱくも多く発現し、それを取り除きhACE2タンパクをメインとすることが困難であった。次にアフィニティー精製するためにTag付のhAEC2プラスミドを作成し、上記システムで発現・精製を行った。FlagTagを付けたものは抗体ビーズで精製する事が出来れば、Flag抗体をコーティングした市販プレートを使用したサンドイッチ法でのELISAを組む事が可能であると考えたが、純度よく精製する事が困難で現在更に検討中。またHisTag付ACE2はProfiniaで自動精製が可能であるか確認したが、Ｓｕｐ・ペレットともにカラムへの吸着が認められず、精製は不可能と判断した。
現在はExpi293でｈACE2を発現させDEAEだ粗精製を行い、次に他のカラムにかけて純度よく精製が行えるか検討中である。

FreeStyle293
培養条件 37℃、8％CO2、125rpm
Transfection
250mL蓋つきフラスコにFS293細胞50ｍL(1×106cell/mLに調整)分注し293FectinReagentを用いACE2プラスミドDNAをトランスフェクションした。
まず1.5ｍLのOputi-MEMに100μLの293fectinを加え、5分間静置した。同時に50μｇ相当のプラスミドDNAを1.5ｍLのOpti-MeMに加えた。二つを混和して20分間静置しDNA-293fectin複合体を形成させ、50MLの培養液に加えた。
トランスフェクション後48時間でMediumを回収・交換し更に48時間培養した。
培養液をスピンダウンし（120ｇ、R.T.5分間、）supを回収、新しいFS293ExpressionMediumを１×106Cell/mLになるように加え更に48時間培養した。
Expi293
培養条件 37℃、8％CO2、125rpm
Transfection
250mL蓋つきフラスコにExpi293細胞50ｍL(3×106cell/mLに調整)分注ExpiFectamine293Reagentを用いhACE2
プラスミドDNAをトランスフェクションした。
まず2.5ｍLのOputi-MEMに133μLの293transfectaminを加え、5分間静置した。同時に50μｇ相当のプラスミドDNAを2.5ｍLのOpti-MeMに加えた。二つを混和して20分間静置しDNA-293fectin複合体を形成させ、50MLの培養液に加えた。
トランスフェクション後20時間でEnhancerを添加し培養、トランスフェクション後48時間でMediumを回収・交換し更に48時間培養した。
培養液をスピンダウンし（120ｇ、R.T.5分間、）Supを回収、新しいmediumを3×106Cell/mLになるように加え、更に48時間培養した。
各培養上清からのACE2タンパク精製
回収した培養上清を25mMTris-HCL(pH8.5)で透析し、セルロファインA-500(陰イオン交換樹脂)で粗精製を行った。溶出はNaClでの塩析で行い溶出液をそのままELISA抗原に用いていた。ｈACE2の純度を上げるため。DEAE
精製後他のカラムを使用し検討を行っている。

課題番号
研究課題名

：25指105：膠原病における、ＡＣＥ2阻害病態の分析と治療法開発、および抗ＧＡＢＡ受容体抗体による診断法の開発

主任研究者名 ：三森明夫
分担研究者名 ：石坂幸人
キーワード ：抗 ACE2 抗体
研究成果
：下記

【背景と目的】我々は、血管保護因子である Angiotensin converting enzyme 2（ACE2）に対する自己抗体を同定し報告した（Takahashi et al., Arthritis Res Ther, 2010;12(3):R85）。抗 ACE2 抗体は、膠原病（SLE、強皮症、MCTD）の収縮性血管病態（肺動脈性肺高血圧症/PAH、末端壊死）患者において、非血管病態の患者に比べ有意に高値を示した。さらに収縮性血管病態患者が有する抗 ACE2 抗体の中には、ACE2に対し中和活性を示す抗体が存在した。そこで本研究では、抗 ACE2 抗体が病因性抗体として作用するか否かを動物モデルで評価するため、中和活性を有する抗 ACE2 抗体の作製を試みた。
【方法】
ヘマグルチニンを付加した rat ACE2 タンパク質を発現する cDNA を 3 匹の Wister rat に直接皮下投与し免疫した。血中抗体価の上昇の有無を検定するため、DNA 免疫後６週間目に血清を採取し、ACE2 タンパク質を一過的に強制発現させた HEK293T 細胞に作用させた後、フローサイトメトリー解析を行った。次に得られたクローンのうち特に ACE2 への反応性が高かったクローンについて限界希釈によるクローニングを行った。さらに高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて、ACE2 タンパク質に対する中和活性の有無を評価した。
【結果】
2 回のスクリーニングを経て最終的に 3 クローンを選出した（図 1）。さらに HPLC による ACE2 活性の測定の結果、クローンNo.A41 が、リコンビナント ACE2 と混合することで、市販 ACE2 抗体
図 1. ラット ACE2 中和抗体の作製。HEK293T 細胞に強制発現させたラット ACE2 タ
ンパク質に抗血清を反応させ、タンパク質に反応性を示す抗体をスクリーニングした。コントロール：市販 ACE2 抗体。コントロールと同様にシグナルのシフトが起こり、抗体が反応したことが分かる。

濃度依存的に ACE2 に対し中和活性を示す傾向が検出された。しかし、他の 2 クローンについては、中和活性は認められなかった。

平成 26 年度、in vivo 実験を行うことを目的に、クローン No.A41 を大量に調製し、同様の中和活性を評価した。その結果、阻害作用に関する再現性を得ることはできなかった。さらに条件を改良して、中和活性について検討中である。
一方、平行して進めていた「肺高血圧症モデルに対する ACE2 活性化化合物作用」に関する研究成果を論文としてまとめた(添付 ppt)。

ACE2活性化化合物の作用点
NCP-2454
モノクロタリン肺組織
カベオリン-1の発現低下

eNOSの発現低下

ACE2/Ang(1-7)/
MASaxisSTAT3のリン酸化

TGF-b/IL-6の発現誘導

血管肥厚

肺高血圧症

(Haga et al. Experiment. Lung Res., 41:21-31, 2015)

研究発表及び特許取得報告について

課題番号:25指105
研究課題名:膠原病における､ＡＣＥ2阻害病態の分析と治療法開発､および抗ＧＡＢＡ受容体抗体による診断法の開発
主任研究者名:三森明夫
論文発表
論文タイトル
Identification of novel autoantibodies
to GABA-B receptors in patients withneuropsychiatric systemic lupus
erythematosus.

著者

掲載誌

掲載号

Tsuchiya H, HagaS, Takahashi Y, Rheumatolgy
Ishizaka Y,(Oxford)
Mimori A

53:1219-28

2014

41:21-31

2015

A novel ACE2 activator reduced
monocrotaline-induced pulmonary
Haga S, Tsuchiya
hypertension by suppressing the JAK/STAT H, Mimori A,
Exp Lung Res
and TGF-β cascades with restored
Ishizaka Y
caveolin-1 expression.

年

学会発表
タイトル

発表者

学会名

場所

高橋裕子、芳賀し膠原病血管病態における抗ACE2抗体のACE2阻
日本リウマチ学会
おり、石坂幸人、
名古屋
害作用：Ang(1-7)定量による方法
総会
三森明夫

年月
2015年4月

その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等)
タイトル

特許取得状況について※出願申請中のものは(発明名称

発表者

発表先

場所年月日)記載のこと。
登録番号なし※該当がない項目の欄には「該当なし」と記載のこと。
※主任研究者が班全員分の内容を記載のこと。

特許権者(申請者）
登録日(申請日)（共願は全記載）

出願国