筑波大学技術報告
28:39-44,2008

ABO 血液型遺伝子多型の PCR-SSCP 法による解析とその応用
中村ᴾ 貴子筑波大学人間総合科学等支援室（医学支援室）〒305-8575 茨城県つくば市天王台 1-1-1
主とする OG allele グループに地域により特徴的な差異があることがわかった。

概要
ABO 式血液遺伝子型の Exon６領域（FragmentⅠ)
および Exon７の二つの領域（Fragment, FragmentⅢ)
を ALF express DNA sequencer を用いた PCR-SSCP 法による遺伝子型解析の開発を行なった。
その結果 主要な 5 種類の対立遺伝子による 15 の遺伝子型を正確に判定することが可能となり日常の法医学業務に使用して成果を挙げている。
また、この方法で領域内の稀な塩基置換部位の検出ができるため、5 遺伝子の他の 16 種類の対立遺伝子を同定した。それらを使用して日本とその他の地域の allele 頻度の比較検討を行い、地域による差異があるという結果を得た。

２．試料と方法2.1 試料
日本各県、中国上海、南米コロンビア、モンゴル、ミャンマー、アメリカミネソタ州白人の一般集団の血液から所定の方法で抽出した DNA を使用した。

2.2 PCR-SSCP (Single Strand Conformation Change )キーワード：ABO 式血液型遺伝子、PCR-SSCP 法、塩基置換、allele 頻度

１．はじめにABO 式血液型多型はその他の遺伝子多型に比べあらかじめ個人の血液型がわかっている場合が多く、法医鑑定をはじめ事故や犯罪の捜査上有用性が高い[1, 2]。
ABO 式血液型を決定する糖転移酵素遺伝子[3,4]は第 9 染色体長腕上（9ｑ34）にあり、7 つの Exon で構成される[5]。これまでに Exon6 及び Exon7 に多数の塩基置換を伴う遺伝子型が報告されており[6, 7]、現在までわかっている対立遺伝子（allele）の数は 70
を 超 え る [8, 9] 。 そ の 検 出 法 も PCR-RFLP 法 [10] 、PCR-APLP 法[11]、PCR-SSCP 法[12, 13]や、最近においてはマルチプレックス一塩基伸長反応法 [14] など多岐にわたり解析が行われているが、多数の primer や制限酵素を使用することや、得られた PCR 産物を精製しなければならないなど煩雑な操作があり、改善するべき点は多い。
そこで ABO 式血液型遺伝子多型を早く正確に判定でき、多数検体を処理する方法として ALF express
DNA sequencer （ Pharmacia Biotech ） を 用 い た
PCR-SSCP 法による解析方法を検討した。ABO 遺伝
子の Exon６領域（FragmentⅠ)と Exon７の二つの領域（FragmentⅡ,FragmentⅢ)を解析することにより
ABO 遺伝子型を主要な alele により 15 種類に分類するばかりでなく、稀な塩基置換の解析によってさらに詳細な遺伝子型を同定した。
それらの方法を司法解剖時の日常業務に使用している他、分散して遺棄された死体からや体液からの血液型検出などの法医学鑑定の場においても使用し成果を挙げている。また日本各県および世界各地域の、allele 頻度を比較検討した結果 A101 と A102 やO-101 型を主とする OA allele グループと O-201 型を(.

一本鎖 DNA は分子内水素結合などにより一本鎖のまま安定しようとするため、その塩基配列に特異的な高次構造をとる。したがって一組の二本鎖 DNA
allele に由来する 4 本の互いに相補的な一本鎖 DNAを電気泳動すると、それぞれの塩基配列が異なるため異なる位置に泳動される。一塩基置換によってもこの一本鎖 DNA の高次構造は変化し、電気泳動の際 易動度に影響を及ぼす。このような多型を一本鎖 DNA 高次構造多型（single-strand conformationpolymorphism: SSCP）という。PCR-SSCP 法の利点は既知の変異部位だけでなく、領域内の未知の変異部位についても検出が可能であることである。
Exon６の全領域および Exon7 の np703 をふくむ領域[15]を所定の primer で PCR 増幅を行った（図 1）。
PCR 反 応 に は Hotster Taq DNA polymerase(QIAGEN)を使用し、denature 97℃：30 秒 annealing
58℃：30 秒 extension 72℃：30 秒で 35 cycle を GeneAmp 9600 (Applied Biosystems)を用いて増幅した。得られた PCR 産物 1ȝl を Blue Dextran 色素の入ったFormamide 液 14ȝl に加え、97℃で 5 分間 denature の後急冷し、サンプルとした。ALF express (Amersham
Pharmacia Biotech)を用い、それぞれの検出条件に適した Polyacrylamide gel にて電気泳動を行い遺伝子型を検出した。
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図 1．ABO 血液型遺伝子の PCR 増幅領域と Primer 配列

2.3 Sequencing

np467 の塩基が C（Cytosine）であるが、A102 他、十数例の allele は np467 が T（Thymine）に置換している。双方の allele はピーク位置の違いにより容易に判別することができた。
3 レーンで右にシフトしたピークが見られるがこれは np526 に C＞G の塩基置換がある B 型 alleleにあらわれるパターンである。また、コロンビアのサンプルで主な allele と易動度の違うピークが検出され sequence の結果 np542 に G＞A の塩基置換がある O209 allele であることがわかった。さらに np496 の A に deletion がある allele がモンゴルのサンプルで検出されたが、その allele もピーク易動度の違いによって検出が可能であった。

PCR-direct sequencing により PCR 産物から直接塩基配列を決定した。 PCR と同一の primer を用いて 、 Forward 及 び Reverse 方 向 か ら の cycle
sequencing を行った後、Genetic analyzer (ABI,310)により分析した。

３．結果
3.1 SSCP 法による ABO 遺伝子型のパターンと塩基置換部位
3.1.1 FragmentⅠの SSCP パターン
図 2 は FragmentⅠの SSCP パターンである。np261
において O 型は塩基が欠損（del）しているが A 型、B 型とも正常で G（Guanine）である(G/del)。np297 では A 型では塩基が A（Adenine）で B 型では G となっているが、O 型も塩基が A のグループと G のグループの２種類に大別され、OA、OG という。それぞれ数十種類のサブタイプの Allele を含んでいる。それらの塩基置換の組み合わせによる基本的な 10 種の遺伝子型 (AA, AOA, AOG, BB, BOA, BOG, OAOA,OAOG, OGOG, AB) が易動度の差により､10 種のパターンとして検出される[16](Lane 1〜10)。基本的なピー
クと易動度の異なるピークとして検出されたサンプル（Lane11,12）は Sequence の結果、一方の遺伝子上の np318 に C＞T の塩基置換部位があることがわかり OA グループの O109 と同定できた。

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図 3．FragmentⅡ領域の塩基置換 SSCP pattern と変異に対する遺伝子型
np467 は A101 および B、O の大部分は C であるが、A102 他十数例 T に置換している。3 番目レーンの右側にシフトしたピーク（矢印）は np526 に C＞Gの塩基置換がある B にあらわれるパターンである。
7 番目は np542 に G＞A に塩基置換がある O209 alleleの検出パターンである。

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OA

OA

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A

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OA

OG

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3.1.3 FragmentⅢの SSCP パターン
図 4 は FragmentⅢのパターンである。パターンの中央にやや間が開いているがその左のピークがセンス鎖、右がアンチセンス鎖のピークである。ピークを識別するため数字の番号をつけた。大部分の遺伝子型は 1, 2, 3 のピークに相当する allele の組み合わせによって検出される。1 のピークに相当するのはnp703 が G から A に置換している allele で、主なものは B101 である。2 のピークに相当するのは A alleleと OA allele である。3 のピークは np771 が C から Tに置換している OG allele で、主なものは O 201 である。
4, 5, 6, 7 のピークは稀な変異 allele によって出現するピークである[17]。 4 のピークの allele は np771 がC から T に変異している他に np768 が C から A に置換している。5 の allele は np721 が C から T に、6のピークは allele は np743 が G から C に、７のピー
クの allele は np703 が G から A に置換している他、np771 が C から T に変異しているため易動度に変化を起こしている。

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OG

BA

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OA

B

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図 2．FragmentⅠ領域の塩基置換 SSCP pattern と遺伝子型
ピーク横に付けられた A,B,OA,OG は対立遺伝子の一本鎖 allele に対応しており、対立遺伝子がホモの場
合は 4 本、へテロの場合は 2 本のピークが観察されるが、この gel 条件では A と OA の片方の allele が分離しないため遺伝子型が AOA の時は 3 本ピークとなる。
Acrylamide:Bis=49:1 7%gel にて泳動。
3.1.2 FragmentⅡの SSCP パターン
図 3 は FragmentⅡの SSCP パターンである。A 型
allele グループの A101 と B 型および O 型の大部分は)%

この allele は前半部が 4 塩基置換（np297A＞G,np526C＞G, np657C＞T, np703G＞A）によって Ballele の特徴をもち、後半部が 2 塩基置換（np771C＞T ,np829G＞A）によって OG allele の特徴を持つ
hybrid allele である[18]。 6 塩基置換のうちの 3 塩基（np526- Arg 176 Gly ,np 703-Gly 235 Ser , np 829-Val277 Met）はアミノ酸置換をともなう。そのうちの 176 と 235 が B 型転移酵素を転写するが 266 leu、268 gly が A 型転移酵素を転写するキメラ構造を有し、A 型活性を呈する[19]。この allele は今回の結果
では日本人において 0.5% 200 人に 1 人程度現われることがわかった。また A104 は FragmentⅠの np297A.＞G で B allele の特徴を持つが、他の部分は A
101 と同じで A 型活性を持ち、日本人の 0.75%に出現する。これらのことは exon 6 において遺伝子型でB allele を示すものであっても血液型の表現形ではA 型であり、検査の上で注意を要する。
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A101 allele と A102 allele はともに A1allele グループに属し、np467 が C から T に置換しそれに伴いアミノ酸 156 コドンが proline から leucine に変化している。しかしアミノ酸置換に伴う糖転移酵素の活性には変化は見られない[20]。
図 5 は、A101 と A102 の出現頻度の比較を行った結果をグラフで示したものである。コロンビアは A型 allele の数が 10 と少ないので統計から除いた。
A101 と A102 の頻度に大きな人種による差が存在する。
今回の調査で Caucasian（米国白人）では遺伝子頻度が A101(0.25) > A102(0.083)で A101 の頻度が高かっ た が 、 Oriental( ア ジ ア 人 ) で は 全 体 の 平 均 で はA101(0.054) < A102(0.199)と A102 の頻度が高く、Caucasian と逆転していた[21]。文献検索によるとペルシャ湾岸のクエートでも A101(0.112) > A102(0.018)
で A101 の頻度が高く[22]、米国白人では A101 が A型全体の 75%であるのに対しクエートでは 86%を占めている。
一方ミャンマーの A101 の頻度は 0.064 で A 型全体で A101 型の占める割合が 32%であるが、中国上海は 0.031 で 14%と低く、一方モンゴルでは 0.038、23%、日本全体では 0.057、21%とその中間の値であった。
太平洋ソロモン諸島では A101(0.180) > A102(0.130)
で A101 が 58％と若干上回っている[23]。A101 を基準とした場合アジアでは古い地域に A101 遺伝子が多く残り、新たに変異した A102 遺伝子があとからアジア地域に広まっていったのではないかと示唆されるが、これにはさらに多くの民族の検証が必要である。
また日本各県の比較では最も A101 頻度の高い高知県と頻度の低い山口県の間に P＜0.03 の有意差があるが、これも日本列島に各地からの民族が移り住んだ結果かもしれない。

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同一の遺伝子型の場合は同一の波形を示すため、部分死体や遺留品などの DNA 検査において遺伝子型を視覚的にとらえることができる。また別の易動度のピークを検出することにより、他の DNA のコンタミネーションを容易に識別することができる利点がある。

4.2 人類学分野への応用㪞㪆㪘㩷㩷㩷㪚㩷㩷㩷㩷㪞㩷㩷㩷㩷㪚㩷㩷㩷㪚㪆㪫 㪙㪈㪇㪈㪆㪦㪉㪇㪐䋶䋵㪘㪈㪇㪉㪆㪦㪈㪇㪎㪞㩷㩷㩷㩷㩷㪚㩷㩷㩷㩷㪞㩷㩷㩷㩷㪚㩷㩷㩷㩷㪫 㪦㪉㪇㪈㪆㪦㪉㪇㪐䋳㪚㩷㩷㩷㩷㪚㩷㩷㩷㩷㩷㪞㪚㩷㩷㩷㩷㪚㩷㩷㩷㩷㩷㪞㪞㩷㩷㩷㩷㩷㪚㩷㩷㩷㩷㪞㩷㩷㪚㪆㪘㩷㩷㩷㪚 㪘㪈㪇㪈㪆㪦㪈㪈㪎䋲㪞㪆㪻㪼㫃㩷㩷㩷㪘㩷㩷㩷㩷㩷㩷㪚 㪚㪆㪫㩷㩷㩷㪚㩷㩷㩷㩷㩷㪞㪎㪇㪊㩷㩷㪎㪉㪈㩷㪎㪋㪊㩷㩷㪎㪍㪏㩷㩷㪎㪎㪈㪞㪆㪘㩷㩷㩷㪚㩷㩷㩷㩷㪞㩷㩷㪚㪆㪘㩷㪚㪆㪫 㪙㪈㪇㪈㪆㪦㪈㪈㪎䋴䋲㪚㩷㩷㩷㩷㪚㩷㩷㩷㩷㩷㪞㪞㪆㪻㪼㫃㩷㩷㩷㪘㩷㩷㩷㩷㩷㩷㪚㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㩷㪫㪆㪫㩷㩷㩷㪚㩷㩷㩷㩷㩷㪞㪻㪼㫃䋴

FragmentⅠでどのサンプルも AB 型と判定、Ⅱでも np467C>T の ピ ー ク が 出 現 し た た め す べ て
A102/B101 型であると判定した。この形は日本人では 100 人のうち約 7〜8 人にしか表れない血液型であることや、ABO 以外の遺伝子型検査結果を含め同一人の可能性が高いと鑑定された。
②．女性屍。膣内に精液の痕跡があり、死亡前に関係した男性の血液型を検出することになった。
FragmentⅠにおいて被害者（血液）の遺伝子型は BOAであったが膣内容物からＡ型であらわれるピークが検出され、Fragment Ⅱにおいても A102 型(467C>T)であらわれるピークが検出されて、被害者遺伝子型と異なる A102 型の存在が示唆された。
後に逮捕された容疑者は A102/O101 であった。

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図 4．FragmentⅢ領域の塩基置換 SSCP pattern と変異に対する遺伝子型ピークを識別するため数字の番号をつけた。大部分の遺伝子型は 1, 2, 3 のピークで表された allele の組み合わせであらわされる。ピピーク１は np703 が G＞
A に置換しているもので 主なものは B101 型である。ピーク 2 は A 型 および OA 型で出現し、主なものは A101, A102 ,O101 型等である。
ピーク 3 は np771
が C＞T に置換している OG 型 で検出され主なものは O201 型 O209 型等である。ピピーク 4, 5, 6, 7 は稀な allele によって出現する。ピピーク４は np768 が C＞A に置換している O117 型で検出される。

４．考察
4.1 法医学分野への応用
事件概要①．上腹部、下腹部、左右上肢、左右大腿、左右下肢が、つくば市内の別々の河川から発見されたもので、頭部は発見されていない。同一人物のものであるかが鑑定の対象になった。

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文献によるとヨーロッパのバスク地方やアフリカのアイボリーコーストでは検出されず、エクアド
ルで O allele 全体の 4%、ボリビアで 12%ブラジル
で 43% [25]など、南米地域で多く観察されることがわかった。この結果は人種の特定に利用できるものではないかと考えられる。今後さらに地域、民族の調査地点を増やし検証を続けていく必要があると考える。

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図 5．A101 と A102 の allele 頻度の A 型全体に対する割合の地域別比較
米国白人とアジア人では頻度が大きく異なっている。またアジア各地域の他、日本各県の頻度にも差がある。

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O allele は np261 が欠損している。そのためアミノ酸コドン 117 にフレームシフトをきたし、不完全なタンパク質しか合成されないため、糖転移酵素活性を有しない。
O 型には大きく 2 つのサブグループがある。
OA allele group は O 型 allele のうち np297 が A のもので、O101 が主な allele である。OG allele group はnp297 が G に置換したもので O201 が主な allele で、O101 と比較するとその他にも np646、np771 などに塩基置換がある[24]。
日本各県を比較すると岐阜県や高知県は OA allele
group 頻度の高く、沖縄県や鹿児島県は OG allele
group 頻度が高いなど日本各地において頻度の差がある（図 6）。
しかし高い有意差とは言えず日本全体においてはOA(0.299) > OG(0.276)という結果で若干 OA allele
group 頻度が高いがほぼ同率で、これは中国上海
OA(0.301) > OG(0.281) や ミ ャ ン マ ー OA(0.277) >OG(0.261)の結果と類似している。しかしモンゴルはOA(0.258) < OG(0.340)で OG allele group の頻度が高く、アジア各地域において頻度の差があることが示唆されたため今後他のアジア地域のデータを調査する必要がある。
コロンビアは OA(0.368) < OG(0.560)という結果でG
O allele group 頻度が高く、そのうち np542 に G から A に塩基置換がある O209 が、O allele 全体の 15%を占める。この allele は日本人と中国上海のサンプルでは検出されず、今回の調査でモンゴル、ミャンマー、米国白人に数例見られる程度であった。

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図 6．O グループと O グループの allele 頻度のO 型全体に対する割合の地域別比較
アジア各地域で OA と OG の頻度が異なる他 日本各県においても異なり沖縄県と岐阜県ではP < 0.04 の有意差があった。

５．謝辞
本研究を行うにあたり、手厚くご指導を賜りまし
た人間総合科学研究科法医学教授本田克也先生に深く感謝いたします。
本研究は平成 15 年度独立行政法人日本学術振興会科学研究費(奨励研究)課題番号 15922051、平成 16
年度研究費(奨励研究)課題番号 16922159、平成 17
年度科学研究費(奨励研究)課題番号 17927024の補助を得て行われました。
よって関係者の方々に篤く御礼いたします。

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PCR-SSCP analysis of ABO blood genotypes polymorphism
and its application
Takako Nakamura
Institute of Medical Science, Academic Service Office for Comprehensive Human Science, University of Tsukuba
1-1-1 Tennodai, Tsukuba, Ibaraki, 305-8575 JapanWe developed a new analyzing system of one region of Exon6 (FragmentⅠ) and two regions of Exon7 (FragmentⅡ, Fragment Ⅲ) in ABO blood genotypes using ALF express DNA sequencer. The system made it possible todiscriminate 15 major genotypes including combination of five kinds of main alleles accurately it is useful for practicalforensic examination. The rare single base substitutions can be detected with the system. We identified 16 kinds of rare
alleles besides five main alleles. Using these results we compared the allele frequency of Japanese population with otherfive countries populations. It showed that there are significant differences among these populations.
Keywords: ABO blood genotypes; PCR-SSCP analyze; single base substitutions; allele frequency))