Bull. Higashitaisetsu Nature Center, 9, 17–22 (2022)17༑຾ᆅ᪉ࡢᑠἙᕝ࡟࠾ࡅࡿ
ࢽ࣍ࣥࢨࣜ࢞ࢽឤᰁ⑕ Aphanomyces astaci ࡢฟ⌧ᒣ⏣ᫀ⩏㸯 ࣭ᕝ஭၏ྐ㸰

2FFXUUHQFHRIWKHFUD\ÀVKSODJXHAphanomyces astaci on the endangered
IUHVKZDWHUFUD\ÀVKCambaroides japonicus in small rivers
in the Tokachi region, eastern Hokkaido, Japan
Masayoshi YAMADA 㸯㸧7DGDVKL.$:$, 㸰㸧ࠉࡣࡌࡵ࡟

量死滅を引き起こしている（Diéguez-Uribeondo andSöderhäll 1993）．

北海道東部の十勝地方には，日本固有の希少種ニ

水カビ病の原因となる A. astaci は卵菌類の一種であホンザリガニ Cambaroides japonicus (De Haan 1841) がり，水中でのみ生存できる胞子で増殖し，この胞子が生息し（Kawai and Fitzpatrick 2004）保全が必要とザリガニ類の体表に付着すると，宿主の体内に菌糸をされている．当地域には北米原産のウチダザリガニ進展させ，菌糸の先端に胞子嚢が形成され，ここからPacifastacus leniuscurus (Dana 1852) およびアメリカザリ胞子が水中に放出される生活環を送る（漆原・川井

ガニ Procambarus clarkii (Girard 1852) も生息しており2021）．そのため，宿主となる外来ザリガニを採集し（川井ほか 2000），これら 2 種は主にザリガニ類が感なくても，水中における A. astaci の胞子の出現状況を染する水カビ病と称される病気の媒介者であることが把握できれば，本菌の出現状況についての知見が得ら疑われていた（石田 1982）．最近の遺伝子解析技術のれる．ただし，菌の胞子は水中に存在するが肉眼では発達に伴い，北海道に分布する外来ザリガニ類は水カ見えない微細なものである．そのため本研究では，胞ビ病の原因菌である Aphanomyces astaci を約 50％の割子の出現が想定される水系で採水を行い，その試水の合で保菌していることが示された（Mrugalara et. al.

遺伝子解析で出現の有無を判定する環境 DNA の技術

2016，Kamimura and Kawai 2020）． 北 米 産 の ザ リを活用した．環境 DNA を利用した希少生物の出現のガニ類は水カビ病の原因菌に感染しても耐性が強く致有無はニホンザリガニでも活用されたことがある（Ike-

死に至ることは少ないが，欧州で実施された室内試験

da et al. 2016，2019）．本研究では，十勝地方の一河によるとニホンザリガニなど北米産以外のザリガニ類川において，A. astaci の胞子の出現の季節変化，流程が水カビ病に感染すると短い期間で 100％近い致死率分布の把握ができたので報告する．

を示した（Unestam 1969，1972）． 野外での実例として，北海道札幌市ではアメリカザリガニ由来の水カࠉㄪᰝ᪉ἲビ病が原因で死滅した個体群があり（Martin-Torrijos

調 査 は 2021 年，5 月 18 日，7 月 19 日，9 月 ６ 日

et al. 2018）外来ザリガニ類は保全の必要が高い在来および 11 月 16 日の合計 4 回実施した．調査した水ザリガニが感染すると致死の可能性が高い危険な感染系は，十勝川に流入する支流群である．希少種の生息症の媒介者であることが明らかである．国外ではアメ場所を乱獲から保護する観点で正確な場所を示さない

リカザリガニが欧州在来のザリガニ類における水カビが，環境 DNA 分析用の試水を採水する地点を模式的病の媒介者であることも報告され，在来ザリガニの大に図 1 に示した．調査地点は，小河川 A で 5 地点（A-1㸯㸧ᰴᘧ఍♫ࢬࢥ࣮ࢩࣕࠉࠛ 080–0048 ᖏᗈᕷす 18 ໭ 1–17
Zukosha Co., Ltd., :HVW²1RUWK2ELKLUR²+RNNDLGR-DSDQ㸰㸧ࠛ 046–0003 ໭ᾏ㐨వᕷ⏫
Yoichi, 046–0003 Hokkaido, Japan18

ひがし大雪自然館研究報告第9号〜 5），小河川 A の下流域に流入する支流で 2 地点（B-1と移し替えた．採水量は 1 L とし，採水後転倒混和し〜 2)，小河川 A の上流域の湧水起点部で 1 地点（C-た．なお，容器には 9 割程度に試水を入れた．採水容1），小河川 A が合流して十勝川に流入する支流の河川

器は，ペーパータオルで拭き取ったのち，チャック付で 1 地点（D-1）の合計 9 地点とした．小河川 A では，きのポリ袋に入れ，保冷して実験室に持ち帰った．同2015 年 6 月には 20 分で 2 名の採集者が 130 個体以

一河川における採水は，下流地点から上流地点の順に上のニホンザリガニを得ていた．しかし，その後一年行った．

間で消滅し，その後はニホンザリガニが最も得られや

小河川 A の最下流地点（A-1），中間地点（A-3）おすくなる夏季に調査を試みても得られておらず（以よび最上流地点（A-5）では，小型絶対圧水位計（応下，消失した，と略す）水カビ病の発生が疑われてい用地質（株），S&DL mini）で水温を 1 時間間隔で自る．小河川 A に流入する湧水起点部（C）と小河川 A動記録した．の支流（B）には 2021 年現在もニホンザリガニの分採取した試料は速やかにろ過した．ろ過に用いる布が確認でき，小河川 A が合流する十勝川の支流（D）

フ ィ ル タ ー は 厚 さ ǍP の メ ン ブ レ ン フ ィ ル タ ー

では外来と在来のザリガニ類の分布記録は無い．各採（ADVANTEC， ポ リ カ ー ボ ネ ー ト タ イ プ ） と し た．

水地点の間隔は清野ら (2020）を参考に約 500m としろ過したフィルターに Lysis Soluton F（ニッポンジーた．調査時期の間隔については，既往の報告（Turnerン）を添加した後，Shake Master Neo (BMS) を用いet al. 2015）を参考に約 2 ヶ月毎とし，採水日は採水て，1,500 rpm で 2 分間破砕した．破砕したサンプルは，作業に伴う底質の巻き上げが生じやすい降雨時および65 ℃ で 10 分 間 静 置 し た 後，12,000 × g で 1 分 間 遠降雨直後を避けた．

心分離を行い，上清を分取した．MPure-12 システム

採水は，A.astaci の混入防止のため，マスクおよびおよび Mpure Bacterial DNA Extraction Kit (MP bio)

ゴム手袋を着用した上で，新品の容器で行った（図 2）．

を用いて，分取した溶液から DNA を精製した．DNA

また，胴長などの水域内に入る可能性がある資材につ濃度は，QuantiFluor dsDNA System (Promega) を用いては，採水前に次亜塩素酸ナトリウムを含む塩素系い，Synergy LX (Bio tek) で測定した．

漂白剤で DNA の除染を行った．採水は，浮遊物を混分析は 3 系統行い，1. 解析対象サンプル，2. 陽性入させないようにしながら，対象水域に採水容器を沈の指標となるサンプル，3. 陰性を示すサンプルで，リめて行った．ただし，水深が浅く，採水容器を沈める

アルタイム PCR による種特異的解析を行った（高原と底質を巻き上げる可能性があった場合には，使い捨ほか 2016，山中ほか 2016）．増幅のためのプライマーてのプラスチックカップを用いて採水し，採水容器へとプローブは，Vrålstad et al. (2009) に基づいた．解ᑠἙᕝ $ ࡢྜὶඛ༑຾ᕝᨭὶ 㸸ࢨࣜ࢞ࢽࡢศᕸグ㘓࡞ࡋ'

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19D ࢥࣥࢱ࣑ࢿ࣮ࢩࣙࣥࡢ㜵Ṇ ‽ഛ࣭㛗㠐➼ࡢ㝖ᰁ ሷ⣲⣔⁻ⓑ๣࣭࣐ࢫࢡ࣭ࢦ࣒ᡭ⿄ࡢ╔⏝࣭᪂ရᐜჾࡢ౑⏝E ᥇Ỉసᴗ᫬ࡢ␃ព஦㡯
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析の反復数は 8 とした．陽性か陰性の判別は，ポリも出現することが明らかである．なお北海道札幌市でメラーゼ連鎖反応の過程で消光物質が働かなくなるこは外来ザリガニ類が存在しないにも関わらず水カビとにより検出される蛍光強度の増幅傾向が陰性を示す病が発症して死滅したニホンザリガニ個体群がありサンプルとは明らかに異なり，陽性のサンプルと同様（Martin-Torrijos et al. 2018），本結果と同じであった．に指数関数的に増幅した場合を陽性（図 3a），蛍光強小河川 A では過去にニホンザリガニが分布していた度が微増して陰性サンプルと同様な場合を陰性としたが，外来ザリガニ類の侵入が無い状況であったにもか（図 3b）．なお，蛍光強度の増幅はみられるが，PCRかわらず，在来種の個体群が消失した．その原因とし阻害物質等の影響で増幅が指数関数的ではない場合にて，水カビ病の可能性が疑われていたが，本研究によは，陰性対照における最終的な蛍光強度と比較し，蛍り，その可能性はより高まった．検出した A. astaci の光強度が陰性対照よりも高い（＋ 0.04）ものを陽性，起源は不明だが，十勝川支流から胞子が遡上した可能同程度（± 0.03）かそれ以下のものを陰性と判定し性は考えにくいことから，水カビ病によるニホンザリた．ただし 8 反復中の全てが陰性または陽性を示さガニの大量死滅が発生した以降も残留している可能性ず，一部が陰性で残りが陽性の場合については，反復と，A. astaci の胞子を含む十勝川支流の水が伏流水な8 のうち 1 反復でも陽性を示すものがあれば，この試どの形で侵入している可能性が考えられる．またニ水は水カビ病の胞子を検出したと判断し，8 反復全てホンザリガニが生息している小河川 A の支流でも A.

が陰性の場合は当該地点では未検出と判断した．

astaci の胞子が検出されていることから，胞子が出現ࠉ⤖ᯝ࡜⪃ᐹ
ニホンザリガニが消失した区間 A のうち，最下流することにより，必ず水カビ病が発症してニホンザリガニの大量死滅に結びつく訳では無いものと考えられる．の A-1，中間地点の A-3 および最上流の A-5 の水温の水温の推移と検出数の関係を見ると，最上流部は湧推移を図 4 に示した．A-1 および A-3 では 5 月から 8水の影響で月別の変化があまり明確では無いが，中間月頃まで月平均水温が上昇し，9 月以降には低下した．と最下流は水温が最も低い 2 月から 8 月にかけて昇しかし，A-5 では水系の起点部である湧水の影響を強温し，9 月に最高平均水温を記録し，その後は 11 月く受けており，水温が比較的一定していた .

にかけて降温している（図 4）．検出反復数の割合は

9 月の採水では，全地点で水カビ病の胞子が検出

各地点において 9 月が最も高かった（図 5）．本研究された（表１）．これは，調査対象の全水域において，の調査月では，各地点の平均水温が最も低いのが 5 月，A. astaci が出現することを示している．本調査水系で次が 11 月，その次が 7 月となっており（図 4），全体は外来ザリガニ類が見られないため，水カビ病の原因の検出地点数も同じく最も低いのが 5 月，次が 11 月，菌の胞子は宿主である外来ザリガニ類が生息しなくてその次が 7 月となっている．そのため，水温と検出

20

ひがし大雪自然館研究報告第9号

D⺯ගᙉᗘࢧ࢖ࢡࣝᩘࢧ࢖ࢡࣝᩘE⺯ගᙉᗘ

ᅗ 3 㝧ᛶ࣭㝜ᛶࡢุู㸬(a) ࡣ 㝧 ᛶ㸪(b) ࡣ㝜ᛶࢆ⾲ࡍ㸬ᅗ୰ࡢᐇ⥺ࡣㄪᰝࢧࣥࣉ ࣝ ࡢ ቑ ᖜ ᭤ ⥺㸪Ⅼ⥺ࡣ㝜ᛶᑐ↷ࢆ⾲ࡍ㸬⦪㍈ࡣ࣏࣓࣮ࣜࣛࢮ㐃㙐཯ᛂ(PCR) ࡢ ⤖ ᯝ㸪 ᾘග≀㉁ࡢస⏝ࡀാ࠿࡞ࡃ࡞ࡿࡇ࡜࡟ࡼࡾ᳨ฟࡉࢀࡿ⺯ගᙉᗘࢆ⾲ࡍ㸬ᶓ㍈ ࡣ PCR ࡟ ࠾ ࡅࡿ DNA ࡢ ྜ ᡂ ᅇ
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Ⅼ (D) ࡣࢨࣜ࢞ࢽ࡜እ᮶ࢨࣜ࢞ࢽࡢศᕸグ㘓ࡀ↓࠸⟠ᡤࢆ⾲ࡍ㸬⎔ቃ DNA ศᯒ⤖ᯝࡢ＋ࡣ᳨ฟ㸪㸫ࡣᮍ᳨ฟࢆ⾲ࡍ㸬ᣓᘼෆࡢᩘᏐࡣ 8 ཯᚟ࡢ࠺ࡕ A. astaci ࡢDNA 陽性の反復数を表す ( ᳨ฟᩘ / ཯᚟ᩘ 8)㸬ᆅⅬྡࡢ఩⨨࠾ࡼࡧỈᇦࡢ఩⨨㛵ಀࡣᅗ 3 ࡟♧ࡍ㸬ᆅⅬྡ

環境中の DNA の検出率が高いことが明らかになっている（Fukumoto et. al. 2015）．この結果について高原ら（2016）は，水温が低い方が環境中の微生物などによる DNA の分解が遅くなり，それによって環境中の DNA の検出率が高くなったと考察している．本
研究では水温が比較的低く DNA の検出率が高まることが想定される 5 月と 11 月で検出率が低いことから，⎔ቃ'1$ศᯒ⤖ᯝ ᭶

水温の高い 7 月と 9 月に急激に A. astaci の胞子が放出$    $    $    

有無を環境 DNA で検査する場合は，年間で最も昇温$    する時期に実施することが合理的と考えられる．ま$    た，ザリガニの保全を目的として移植などの対策を講%

    %

    &    することが望ましいので，水温が高い時期は避けるこ'    とが望ましい．

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ᆅⅬᆅⅬᆅⅬ

ᆅⅬされた可能性が考えられる．今後，A. astaci の胞子のじる場合，ザリガニへのリスクが最も低い時期を選択

ニホンザリガニが消失した区間における A. astaci 検
出反復数の流程による変化をみると，下流側ほど高く数の高低は同調していると考えられる．オオサンショなる傾向があった（図 6）．本研究の対象水域は，年ウウオ Andrias japonicus を対象とした野外調査事例に間を通して水温が安定している湧水に起源を有し，そよると，年 4 回の調査を行った結果，冬にもっともの影響が強いため，上流域では年間を通して水温の変Bull. Higashitaisetsu Nature Center, 9, 17–22 (2022)

21$ ᭱ୗὶ$ ୰㛫$ ᭱ୖὶ

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A-1 〜 5 の位置は図１に示した㸬22

ひがし大雪自然館研究報告化が小さく，下流域にいくほど気温や日射の影響を受けて水温が変化しやすい傾向があると考えられる．このことから，下流域では，水温の上昇に伴い A. astaci
胞子の放出量が増加したことで，検出が多くなった可能性がある．その他の可能性として A. astaci の胞子は，河川の流れを遡るほどの移動能力は無いことから（漆第9号

capoda: Cambaridae) with allocation of a type locality
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き，結果として下流域で濃度が高くなることが考えら

des japonicus. PLOS ONE, 13(4), e0195353.

れる．
ࠉㅰࠉ㎡
本研究を進めるにあたり，環境 DNA を使った水カビ病の検出方法について情報を頂いた株式会社パシフィック
コンサルタンツの池田幸資博士に深謝します．

ࠉᘬ⏝ᩥ⊩Diéguez-Uribeondo, J. and Söderhäll, K., 1993. Procambarus clarkii GirardDVDYHFWRUIRUWKHFUD\ÀVKSODJXHIXQ-Mrugala, A., Kawai, T., Kozubikova-Balcarova, E. andPetrusek, A., 2016. Aphanomyces astaci presence in JaSDQDWKUHDWWRWKHHQGHPLFDQGHQGDQJHUHGFUD\ÀVK
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