課題番号：
研究課題名：
主任研究者名 ：分担研究者名 ：キーワード

２６指１１９
自己骨髄由来培養間葉系細胞移植による末梢動脈疾患に対する血管新生治療
福田尚司
大河内仁志

： 再生医療・血管新生・完全自家・間葉系幹細胞【臨床研究】＜意義＞
重症末梢動脈疾患患者を対象に、低侵襲的に局所麻酔下に少量の自己骨髄細胞をより高安全性の自己多血小板血漿にて培養し、下肢虚血筋肉内に投与する。血管新生を惹起することにより下肢切断を防ぐ治療法を確立すべく、その安全性と有効性を検討する。完全自家血管新生療法はＮＣＧＭオリジナルであり、世界初の試みである。
この結果をもって特定認定再生医療等委員会の承認後、ヒトへの応用を経て先進医療申請を行う。
＜目的＞
新しい低侵襲治療法により重症下肢虚血による下肢切断回避を目的とする。
年 1 万人に上る下肢切断患者の QOL 低下を避けることで、波及効果として下肢切断患者に対する膨大な医療・社会福祉費の増加を抑制することができる。
＜対象患者＞
 末梢動脈疾患（閉塞性動脈硬化症・バージャー病）患者 Fontaine 分類Ⅲ度およびⅣ度、Rutherford
慢性虚血肢臨床分類Ⅱ度４群、Ⅲ度５群および６群に属し、安静時疼痛または虚血性潰瘍、壊死を有する患者で、著しく QOL が障害されており血行再建術の適応が無く、将来、下肢切断が予想される患者。
 性別：男性および女性（妊娠中および妊娠の可能性のある女性を除く）
 年齢：２０歳以上７５歳以下 （ただし、75 歳を超えた場合、年齢を考慮しても患者の利益が上回り、J-CHS フレイルスコアで基準値以下、かつ循環器科、心臓血管外科、血液内科の複数の研究者の合議により妥当と判断した場合はこの限りではない。また、この合議の記録は保存する。）
 適応症例：当センター(循環器科、心臓血管外科、血液内科)および研究代表者、研究協力者で決定する。
除外基準
合併症により余命が著しく短いと考えられる患者
過去３ヶ月以内にアルコールもしくは薬物依存の既往のある患者
悪性新生物を有する患者および５年以内にその既往のある患者
諸検査により悪性腫瘍の可能性があると判断された患者
重症の糖尿病性網膜症を有する患者
インフォームドコンセントを得られない患者
その他、主治医が不適当と判断した患者＜方法＞
 静脈血採取約２００ｍｌの静脈血を採取する。
 多血小板血漿の調製
遠心分離により多血小板血漿を調製し、分注後、－３０℃以下で凍結保存する。
 骨髄液採取







局所麻酔下に患者腸骨より骨髄液を１０ｍｌ程度採取する。
細胞培養
比重遠心分離法にて骨髄細胞を分離・濃縮し、予め凍結保存しておいた多血小板血漿を用いて調製した培地にて、目標細胞数約１．０×１０７～８個になるまで約１～２週間培養する。
中間評価
移植前の継代時にエンドトキシン試験、マイコプラズマ否定試験、無菌試験を行う。
細胞の移植
当センター手術室にて全身麻酔下に、培養した骨髄細胞約１．０×１０７～８個、総量約１０～５０ｍｌの懸濁液を、27G 針を用いて１箇所につき０．３～０．５ｍｌずつ、虚血下肢骨格筋に約４０～６０箇所に分割して筋肉内注射を行う。
最終調製時の評価
培養して得られた細胞の一部で無菌試験、マイコプラズマ否定試験、エンドトキシン定量を実施する。
細胞の保管培養後の細胞（最終調製物）および多血小板血漿は研究用と有害事象発生時の原因究明用の二つにわけ、細胞調製室の液体窒素に凍結保管とする。研究用試料は保管期限を特に定めず、有害事象が発生した場合の原因究明用の試料は１０年保管とする。その後、原因究明用試料は研究用に転用する。 本研究は再生医療を受ける患者自身の骨髄及び末梢血を使用する。培養後の細胞を保管することで、患者が感染症を発症した際の原因究明は可能であるので、採取した骨髄及び末梢血の損失を避けるためにもこれらの保管は行わない。

＜評価項目＞
 主要評価項目
安全性の評価 移植後１年までにおける有害事象を「有害事象共通用語規準 v4.0 日本語訳 JCOG版（略称：CTCAE v4.0 - JCOG）」3)に従い評価し、Grade2 以上の有害事象の発生頻度を求める。
 副次評価項目
救肢の可否SPP(Skin perfusion pressure)
６分間歩行距離テスト
SF-12(Physical and mental health scores)
Fontaine 分類
Rutherford 慢性虚血肢臨床分類
ABPI(Ankle brachial pressure index)
TcPO2(Transcutaneous partial pressure of oxygen)
皮膚潰瘍の大きさ(皮膚潰瘍を有している場合)
Visual analog scale(VAS)＜結果＞
 特定認定再生医療等委員会への申請・承認（２７年度）
２７年１０月２７日、東京医科歯科大学特定認定再生医療等委員会にて承認。
承認番号 ＲＭ２７－００３
 関東信越厚生局への申請・承認（２７年度）
２７年１１月１２日、関東信越厚生局にて承認。
計画番号 ＰＢ３１５００１２
 前向き介入研究としてヒトへ実施（２８年度）
目標症例数
２例
候補症例数
６例（院内２例、他病院３例、医師会１例）
研究エントリー症例数
３例（除外された３例は、それぞれカテーテル治療１例、バイパス術２例）

実施症例数結果
 先進医療への申請

２例（エントリーした３例中 1 例は担癌にて逸脱）
２例において有害事象は認めなかった。また、有効性が認められた。

当初の計画である５例に残り３例を実施することにより先進医療への申請が可能を構築した。
 治験への可能性
先進医療を２相試験と位置づけ、治験への可能性も創出した。
＜今後の展望＞
 症例の蓄積（２９年度）
 先進医療への申請（３０年度）
 治験に向けた非臨床試験実施（３０年度～）
 先進医療のデータを利用し３相試験を開始（３３年度～）
 薬事承認（３８年度）【基礎研究】


多血小板血漿を用いての骨髄間葉系幹細胞の増殖（２６年度）

健常人ボランティアの末梢血から多血小板血漿を調整し、骨髄液から単核球を分離して、α—MEM の培養液中で接着細胞を培養した。細胞増殖に伴い、適宜継代操作を行い、2 週間で目標の細胞数 10８個程度まで培養することができた。（図１） 安全性の確認（２６年度）
エンドトキシン定量、一般細菌・真菌培養同定、マイコプラズマ否定試験、染色体検査それぞれ異常は見られなかった。
細胞表面マーカーは間葉系細胞の基準とされる CD73、CD90、CD105 が陽性であり、マクロファージマーカー（CD11b､CD14）、造血幹細胞マーカー（CD34）、白血球マーカー（CD45）、Ｂ細胞マーカー（CD19､CD79a）が陰性であることが確認された。
造腫瘍性の確認として免疫不全マウスに培養ヒト間葉系細胞を 107 移植して 3 ヶ月観察したが腫瘍形成は認められなかった。
マウス骨髄由来の間葉系幹細胞の培養と移植実験（２６年度）
細胞移植実験において移植された細胞の生着を確認するために、C57/BL6 マウスの骨髄由来の間葉系幹細胞を 10%FBS（牛胎児血清）添加 DMEM 培地を用いて培養し、5x105 個ずつマウスヒラメ筋の 3 カ所に筋注した。血管内皮細胞に発現するファクターVIII(von Wilbrand factor)に対する抗体を用いて免疫組織学的に検討したところ、細胞移植群の方で筋肉内の血管が多い部分が認められた。
免疫不全マウスの下肢虚血モデルにヒト骨髄由来の培養間葉系幹細胞（BM-MSC）を移植（２６年度）
ヒト骨髄から BM-MSC を培養し、細胞に GFP を発現させるために GFP 遺伝子ベクターを導入。サンプルはホルマリン固定後にパラフィン包埋し、各種染色を行ったところ、ファクターVIII 陽性の管腔形成を認め、血管新生を確認した。（図２）

基礎検討の結果の投稿、掲載（２６年度）
Shoji Fukuda, Shotaro Hagiwara, Satsuki Fukuda, Ryo Yakabe, Hiroko Suzuki, Shigeharu G. Yabe, TechuanChan, Hitoshi Okochi. Safety assessment of bone marrow derived MSC grown in platelet-rich plasma.
Regenerative Therapy, Volume 1, June 2015, Pages 72-79, ISSN 2352-3204, http://dx.doi.org/10.1016/j.

Subject No.:

26-119Title:

Therapeutic angiogenesis with autologous cultured bone marrowderived MSC grown in platelet-rich plasma against peripheral arterial
diseaseResearchers:

Shoji Fukuda, Hitoshi Okochi

Key word:

Regenerative medicine, angiogenesis, autologous, mesenchymal stem cells

Basic research
The injection of endothelial progenitor cells and mononuclear cells derived from bonemarrow at the ischemic region of peripheral artery disease patients is reported to be effective
for therapeutic angiogenesis; however, these cell therapies require large amounts of bonemarrow to obtain sufficient numbers of cells. To solve this problem, we attempted to culturebone-marrow-derived mesenchymal stem cells (BM-MSC), which are supposed to secrete
several cytokines that promote angiogenesis. We also focused on using platelet-rich plasma(PRP) as a supplement for cell culture instead of fetal bovine serum. Human BM-MSC
obtained from healthy volunteers expanded rapidly when cultured with 10% PRP preparedfrom their own blood. FACS analysis revealed that these cultured human MSC were
homogeneous populations, and chromosomal analysis showed a normal karyotype. Moreover,
the angiogenetic effect was apparent two weeks after human BM-MSC were injected into theischemic muscle in SCID mice. Tumor formation was not detected three months after
injection into SCID mice either subcutaneously or intramuscularly. To simulate clinicalResearchers には、分担研究者を記載する。

settings, canine BM-MSC were grown with canine PRP and injected into their ischemic
muscles. We confirmed that donor cells existed in situ two and six weeks after operation
without any side effects. These results suggest that cultured human BM-MSC can be apromising cell source for therapeutic angiogenesis.

Clinical research
Backgrounds:
Previous clinical studies have reported that the implantation of bone marrow (BM)-derived
mononuclear cells (MNCs) or mesenchymal stem cells (MSCs) results in improvement insymptoms and healing of ulcers in patients with critical limb ischemia (CLI) up to stage IV of
Fontaine’s classification. However, most patients with Fontaine stage IV CLI limbs had toundergo amputation even after stem cell therapy. We report on a successful case of
implantation with autologous cultured bone marrow derived MSCs grown in platelet-richplasma against advanced chronic critical limb ischemia in patient with diabetes andhemodialysis.
Patient:
The patient was a 72-year-old male who had diabetes, class 4 CKD and CLI of the right lower
limb with severe calcification in three main arteries and diffuse multiple severe stenosis of the
only patent posterior tibial artery, and a large ischemic, MRSA infected foot ulcer. The ulcer

Researchers には、分担研究者を記載する。

measured 71 mm in maximum diameter at the lateral aspect of the foot, exposing thegastrocnemius and Achilles tendon.
Results:
The patient was followed up at 1 week, 1 month, 2 months, 6 months and 12 months after
implantation. Large ulcer 71 mm in maximum diameter had improved significantly tocomplete endotherialization. 6-minute walk test (0 to 300 M at 6 months after implantation),
ABPI (0 to 0.37 at 6 months after implantation), TcPO 2 (1 to 54 mmHg at 6 months after
implantation), VAS (85 to 0 at 12 months after implantation) and WIQ (53 /400 to 249 /400 at
12 months after implantation) had also improved.
Conclusions:
Limb salvage was possible in diabetic class 4 CKD patient with Fontaine stage IV CLI
following implantation with autologous cultured bone marrow derived MSC grown inplatelet-rich plasma. The procedure was safe without any adverse events.

Researchers には、分担研究者を記載する。

課題番号：２６指１１９（福田・大河内）

自己骨髄由来培養間葉系細胞移植による末梢動脈疾患に対する血管新生治療＜意義＞
重症末梢動脈疾患患者を対象に、低侵襲的に局所麻酔下に少量の自己骨髄細胞をより高安全性の自己多血小板血漿にて培養し、下肢虚血筋肉内に投与する。血管新生を惹起することにより下肢切断を防ぐ治療法を確立すべく、その安全性と有効性を検討する。完全自家血管新生療法はＮＣＧＭオリジナルであり、世界初の試みである。
この結果をもって特定認定再生医療等委員会の承認後、ヒトへの応用を経て先進医療申請を行う。
＜目的＞
新しい低侵襲治療法により重症下肢虚血による下肢切断回避を目的とする。
年1万人に上る下肢切断患者のQOL低下を避けることで、波及効果として下肢切断患者に対する膨大な医療・社会福祉費の増加を抑制することができる。
福田スライド 1/4

課題番号：２６指１１９（福田・大河内）研究結果【臨床】
特定認定再生医療等委員会への申請・承認（２７年度）
２７年１０月２７日、東京医科歯科大学特定認定再生医療等委員会にて承認。
承認番号 ＲＭ２７－００３
関東信越厚生局への申請・承認（２７年度）
２７年１１月１２日、関東信越厚生局にて承認。
計画番号 ＰＢ３１５００１２
前向き介入研究としてヒトへ実施（２８年度）
目標症例数
２例
候補症例数
６例（院内２例、他病院３例、医師会１例）
研究エントリー症例数
３例（除外された３例は、それぞれカテーテル治療１例、バイパス術２例）
実施症例数
２例（エントリーした３例中1例は担癌にて逸脱）
先進医療申請への基盤作り
残り３例を実施することにより先進医療申請が可能。
治験への可能性
先進医療を２相試験と位置づけ、治験３相試験への道筋をつけた。

福田スライド 2/4

術前： 最大径７１ｍｍ

細胞移植後の足潰瘍の変化
術１月目： 最大径６０mm

術２月目：最大径 ５４ｍｍ

課題番号：２６指１１９（福田・大河内）【症例】
72歳 男性【診断】
ASO・右CLI・MRSA骨髄炎および菌血症

術４月目：最大径 ３４ｍｍ

術６月目：最大径 ７ｍｍ

術１２月目： 上皮化【既往歴】
糖尿病・人工透析中（DM腎障害）
福田スライド 3/4

課題番号：２６指１１９（福田・大河内）研究結果【基礎】
多血小板血漿を用いての骨髄間葉系幹細胞の増殖（２６年度）
健常人ボランティアの末梢血から多血小板血漿を調整し、骨髄液から単核球を分離して、α—MEMの培養液中で接着細胞を培養した。細胞増殖に伴い、適宜継代操作を行い、2週間で目標の細胞数10８個程度まで培養することができた。
安全性の確認（２６年度）
エンドトキシン定量、一般細菌・真菌培養同定、マイコプラズマ否定試験、染色体検査それぞれ異常は見られなかった。
細胞表面マーカーは間葉系細胞の基準とされるCD73、CD90、CD105が陽性であり、マクロファージマーカー（CD11b､CD14）、造血幹細胞マーカー（CD34）、白血球マーカー（CD45）、Ｂ細胞マーカー（CD19､CD79a）が陰性であることが確認された。
造腫瘍性の確認として免疫不全マウスに培養ヒト間葉系細胞を107移植して3ヶ月観察したが腫瘍形成は認められなかった。
マウス骨髄由来の間葉系幹細胞の培養と移植実験（２６年度）
細胞移植実験において移植された細胞の生着を確認するために、C57/BL6マウスの骨髄由来の間葉系幹細胞を10%FBS（牛胎児血清）添加DMEM培地を用いて培養し、5x105個ずつマウスヒラメ筋の3カ所に筋注した。血管内皮細胞に発現するファクターVIII(von Wilbrand factor)に対する抗体を用いて免疫組織学的に検討したところ、細胞移植群の方で筋肉内の血管が多い部分が認められた。
免疫不全マウスの下肢虚血モデルにヒト骨髄由来の培養間葉系幹細胞（BM-MSC）を移植（２６年度）
ヒト骨髄からBM-MSCを培養し、細胞にGFPを発現させるためにGFP遺伝子ベクターを導入。サンプルはホルマリン固定後にパラフィン包埋し、各種染色を行ったところ、ファクターVIII陽性の管腔形成を認め、血管新生を確認した。
基礎検討の結果の投稿、掲載（２６年度）
Shoji Fukuda, Shotaro Hagiwara, Satsuki Fukuda, Ryo Yakabe, Hiroko Suzuki, Shigeharu G. Yabe, Techuan Chan, Hitoshi Okochi. Safetyassessment of bone marrow derived MSC grown in platelet-rich plasma. Regenerative Therapy, Volume 1, June 2015, Pages 72-79,
ISSN 2352-3204, http://dx.doi.org/10.1016/j.
大河内スライド1/2

課題番号：２６指１１９（福田・大河内）

大河内スライド 2/2

課題番号：２６指１１９（福田・大河内）

今後の展望• 症例の蓄積（２９年度）• 先進医療への申請（３０年度）• 治験に向けた非臨床試験実施（３０年度～）• 先進医療のデータを利用し３相試験を開始（３３年度～）• 薬事承認（３８年度）

福田スライド 4/4

研究発表及び特許取得報告について

課題番号：

２６指１１９

研究課題名： 自己骨髄由来培養間葉系細胞移植による末梢動脈疾患に対する血管新生治療主任研究者名：福田尚司

論文発表
論文タイトル

著者

Safety assessment of bone marrow derived MSC
grown in platelet-rich plasma.

Shoji Fukuda, et.
al.

掲載誌

掲載号

Regenerative
Therapy

Volume 1

学会名場所

年
2015

学会発表
タイトル

発表者

多血小板血漿を用いて培養した自己骨髄由来間葉系細胞の投与により著効した重症虚血肢 福田尚司に対する血管新生療法の1例

日本再生医療学会 仙台年月2017年3月

その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等)
タイトル

発表者

発表先

場所

年月日

「再生医療講演会」
自己骨髄由来培養間葉系細胞移植による末梢 福田尚司
動脈疾患に対する血管新生治療

新宿医師会会員

新宿区医師会館 2016年11月25日

新宿区民医療公開講座『足を救いたい！ 自己骨髄由来幹細胞移植 福田尚司による血管新生療法について』

新宿区民

新宿区民ホール 2017年5月20日

特許取得状況について※出願申請中のものは(発明名称)記載のこと。
登録番号

該当なし

※該当がない項目の欄には「該当なし」と記載のこと。
※主任研究者が班全員分の内容を記載のこ

特許権者(申請者）
登録日(申請日)（共願は全記載）

出願国