[食品・臨床栄養 e2016_13-20]

研究ノート
原料米の違いが発酵法によるエチル-α- D -グルコシドの生成効率に与える影響
Effect of the differences in the raw materials rice on the fermentation
production efficiency of ethyl -α-d- glucoside
坊垣隆之 *,1,3 、相良純一 2 、尾関健二 1,2（投稿日：2016.8.9、受理日：2016.11.8）
原料米としてうるち米（アミロース 20％前後とアミロペクチン 80％前後）ともち米（アミロペクチン 100％）を用いてエチル-α- D -グルコシド（以下 α-EG）の生成効率を比較すると、清酒発酵（15℃、20 日間）では 1.3倍、みりん発酵（30℃、20 日間）では 1.8 倍もち米の方が生成効率が高くなった。α-1,4 結合のマルトースもしくは α-1,6 結合のイソマルトースからの α-EG 生成効率（50℃、2 日間）はマルトースの方が 1.2 倍高くなった。
発酵法による α-EG の生成には原料米のデンプン質の糊化やアミラーゼ系酵素の作用機構の影響があると考えられた。

キーワード：エチル-α- D -グルコシド、うるち米、もち米、アミロース、アミロペクチン

1. 緒言
エチル-α- D -グルコシド（α-EG）は清酒中に水、エタノール、グルコースに次いで 4番目に高含有される成分であり 1971 年に発見された[1]。その後の研究で並行複発酵によって醸造される清酒に 0.5％(w/v)前後、微生物による発酵が関与しない酵素反応による醸造法に相当するみりん中でもほぼ同量を含有することが報告されている[2]。清酒中で α-EG は、マルトオリゴ糖やデキストリンからエタノールをアクセプターとして麹由来の α-グルコシダーゼの糖転移反応により生成する[3]。この反応の基質となる糖類は原料米のデンプン質が麹由来の α-アミラーゼによって分解されることで生成し、エタノールはデキストリンやオリゴ糖からグルコアミラーゼによって生成したグルコース、マルトース、マルトトリオースなど低分子の糖を酵母が資化しエタノール発酵することで生成する。従って、ビールなど＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿

1

金沢工業大学大学院工学研究科バイオ･化学専攻
2
金沢工業大学ゲノム生物工学研究所
3
大関株式会社総合研究所*著者連絡先所在地：663-8227
兵庫県西宮市今津出在家町 4-9
TEL: 0798-32-2169、FAX: 0798-34-7475
e-mail: takayuki.bougaki@ozeki.co.jp

13の単行複発酵、ワインなどの単発酵では麹を使用しないので α-EG は生産されない[2]。
また、α-EG は清酒の呈味に関与することが報告されているが、それだけではなく、肌荒れ改善効果や保湿効果が確認されており[4]、化粧品素材として利用されている。
我々はこれまでに清酒発酵時に麹量を減らし、α-アミラ ーゼと α-グルコシダー ゼを酵素剤として添加することにより、α-EG濃度が 3％を超える清酒を生産可能であることを示した。この時 α-EG 生成反応の基質であるオリゴ糖の分解を抑制するために、グルコアミラーゼは正常なエタノール発酵に必要な最低限のグルコースが供給可能な量 を 添 加 し た 。 ま た 、 こ の 清 酒 を 2.5 ％α-EG に調整した後、肌に塗布し、保湿効果を示すことを報告した[5]。米および麦焼酎製造においても、同様な考え方でアミラーゼ系酵素剤のバランスを検討することにより、焼酎製造時の醪においてそれぞれ 2％を超える α-EG が製造できた。蒸留した焼酎には α-EG は検出されず、官能評価でも米および麦ともに品質的にそれぞれのコントロールと差がなく α-EG による官能への影響はなかった。また 2.5％α-EG を含有する米焼酎の蒸留残渣には、清酒と同様に保湿効果があり、これまで廃棄していた蒸留残渣が有効活用できる技術開発を報告した[6]。
先行研究ではうるち米ともち米からのα-EG の 発酵法 によ る 生成効 率 を 比較し た[食品・臨床栄養 e2016_13-20]

報告はなかった。うるち米ともち米ではデンプン中のアミロースとアミロペクチン含量が異なるために物性に違いが生じる。その物性の違いがデンプンから酵素作用によって生じるオリゴ糖等の生成に影響を与え、オリゴ糖等を基質とする α-EG の生成反応に影響するのではないかと考えられた。そこで、本研究ではうるち米ともち米を原料として、清酒発酵とみりん発酵におけるα-EG 生成効率を比較した。さらにマルトースまたはイソマルトースとエタノールを基質とした酵素反応による α-EG 生成効率を比較することにより、発酵法による原料米の違いによる α-EG の生成の特徴を明らかにした。本研究で明らかになった α-EG 生成に対する原料米の違いが与える影響をさらに詳しく研究することで α-EG の効率的な生産が可能になり、化粧品やサニタリー用品等に広く利用されることが期待される。
2. 実験方法(1) 清酒の小仕込み
清酒の小仕込みは、掛米の原料米としてうるち米（精米歩合 70％の α 化米；徳島製麹（株））ともち米（市販品）を蒸して使用した。麹米は精米歩合 70％の乾燥麹（徳島製麹（株））を使用した（表 1）。α-アミラーゼ（AA）剤としてスミチーム L（新日本化学工業（株）12,000 U/g）を 1,000, 1,500 U
または 2,000 U と α-グルコシダーゼ（AGL）剤としてトランスグルコシダーゼ「アマノ」（天野エンザイム（株）300,000 U/g）1,500U を併用した。酵母は協会 7 号酵母 5.6 ×
10 6 cells/mL を使用し、15℃で 20 日間発酵した後、遠心分離で清酒と酒粕に分離した。
清酒の分析は前法[4]に従い α-EG、エタノールおよびグルコースを測定した。
表122.75 g

掛米20.5 g

麹米2.25 g

汲水38.0 ml

みりんの仕込み配合

原料

添加量

総米54.5 g

掛米50.0 g

麹米4.5 g40% エタノール

40.0 ml(3) 酵素反応による α-EG の生成効率
マルトースまたはイソマルトースとエタノールを基質とした酵素反応（AGL 剤
1,200 U）による α-EG の生成効率を調べる目的で、表 3 の配合で 50℃、2 日間反応した。

表3

酵素反応液組成
添加量

80% エタノール

0.5 ml

50% マルトース／イソマル トース

0.4 ml

8% AGL 剤

50 μl

1 M クエン酸緩衝液 pH 5.050 μl

精製水90 μl3. 結果および考察(1) 清酒の小仕込み
酵素剤の配合比率を変化させた小仕込み試
験を行い α-EG を高生産する条件を検討した。清酒醪を遠心分離で固液分離し、その上清である清酒のエタノール濃度を測定した結果を図 1 に、α-EG 濃度を測定した結果を図 2 に示す。AA 剤添加の 3 区分共にもち米を用いた発酵でエタノール濃度は12％を超えていたが、うるち米を用いた場合のエタノール濃度は約 14%であり、うるち米の方がエタノール発酵が進み易いことが分かった。AA 剤と AGL 剤を組合せた清酒の小仕込みでは、AA 剤 1,000 U と AGL剤 1,500 U を併用した場合に、もち米を原添加量

総米

表2

成分

清酒の仕込み配合

原料

みりんの小仕込みは、清酒と同様に掛米としてうるち米ともち米をそれぞれ用い、40％エタノールおよび乾燥麹と AA 剤 600
U と AGL 剤 0, 750, 1,500, 3,000 または 4,500
U を併用し、30℃で 20 日間発酵した（表 2）。

2.2 みりんの小仕込み

14[食品・臨床栄養 e2016_13-20](n=5, ***p<0.001, t-test)
図 1 もち米またはうるち米を用いて醸造した清酒のエタノール濃度
仕込みは表 1 の配合で行いすべての試験区に 1,500 U の AGL 剤を添加し、さらに 1,000、1,500 または 2,000 U の AA 剤を添加して 15℃で 20 日間発酵した。

(n=5, ***p<0.001, t-test)
図 2 もち米またはうるち米を用いて醸造した清酒の α-EG 濃度
仕込みは表 1 の配合で行いすべての試験区に 1,500 U の AGL 剤を添加し、さらに 1,000、1,500 または 2,000 U の AA 剤を添加して 15℃で 20 日間発酵した。

料米とする仕込みで α-EG は 2.8％生産され、うるち米を用いた仕込みで 2.2％ともち米

15

ではうるち米の 1.3 倍程度 α-EG が発酵生産できることが分かった。

[食品・臨床栄養 e2016_13-20]

エタノール濃度が低いもち米からのα-EG 生産量の方が高くなった。岡らは糖濃度一定の場合、エタノール濃度が高くなると生成する α-EG は多くなることを報告しており[7]、本研究の結果とは異なっている。
このことから、原料米のデンプン質の組成の違いによって、糖化酵素の分解によるマルトオリゴ糖の生成量においてもち米がうるち米を上回り、それによってもち米のα-EG 生 成量が うる ち 米を上 回っ た可能 性がある。また、エタノール濃度はもち米の方が低かったが、転移反応による α-EG の生成にエタノールが利用されたことも一因と 考 え ら れ 、 今 後 の 検 討 課 題 で あ る 。 AA剤の添加量が多くなってもエタノールの生成量に差は無いが、α-EG の生成量は減少した。これは本研究で使用した AA 剤には若干のグルコアミラーゼ活性が含まれているため、添加量が増加することによってマルトオリゴ糖のグルコースへの分解が進み易くなり、α-EG 合成の基質が減少したためと考えられる。また酵母はグルコース、マルトース、マルトトリオースを資化しエタノール発酵が可能なためエタノールの生成量には影響が少なかったと考えられる。
(2) みりんの小仕込み
酵素剤の配合比率を変化させ α-EG を高生産するみりんの小仕込み条件を検討した。
みりん醪を遠心分離で固液分離し、その上清の α-EG 濃度を測定した結果を図 3 に、グルコース濃度を測定した結果を図 4 に示す。AA 剤 600 U および AGL 剤 3,000 U を用いた時に、原料米の種類に関係なく α-EG及びグルコースの濃度が高くなった。α-EGはもち米を用いた仕込みで 0.6％生産され、うるち米を用いた仕込みで 0.32％であり、もち米を用いた方が約 1.8 倍 α-EG が効率良く発酵生産できることが分かった。その時、グルコースももち米の方が高生産であった。
清酒の仕込みは 15℃であるが、みりんの仕込 み は 発 酵 温 度 が 30℃ で あ る た め 酵 素 反応が進みやすいと考えられた。しかし、みりんの仕込み結果では α-EG 濃度は清酒の仕込みの約 20%以下であり、マルトオリゴ糖の生成速度とマルトオリゴ糖を基質とした α-EG の生成速度及びマルトオリゴ糖のグルコースへの分解速度のバランスが悪い(n=5, ***p<0.001, t-test)
図 3 もち米またはうるち米を用いて醸造したみりんの α-EG 濃度
仕込みは表 2 の配合で行いすべての試験区に 600U の AA 剤を添加し、さらに 0、750、1,500、3,000 または 4,500 U の AGL 剤を添加して 30℃で 20 日間発酵した。

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[食品・臨床栄養 e2016_13-20](n=5, ***p<0.001, **p<0.05, t-test,)
図 4 もち米またはうるち米を用いて醸造したみりんのグルコース濃度
仕込みは表 2 の配合で行いすべての試験区に 600U の AA 剤を添加し、さらに 0、750、1,500、3,000 または 4,500 U の AGL 剤を添加して 30℃で 20 日間発酵した。と考えられた。エタノール発酵の進行に伴い、エタノール基質が徐々に供給される並行複発酵方式の清酒仕込みの方が α-EG の発酵生産には有利な発酵方式であると考えられた。

れる。マルトースまたはイソマルトースを糖基質とした場合の α-EG の濃度は、それぞれ 2.76％と 2.32％であった。これは α-1,4グルコシド結合のマルトースからの糖転移反応の効率が α-1,6 結合と比較して 1.2 倍程度高いことを示す結果であった。清酒仕込
み と み り ん 仕 込 み で は ア ミ ロ ー ス （ α-1,4結合）とアミロペクチン（α-1,4 結合およびα-1,6 結合）を含有するうるち米と比較して、アミロペクチンのみを含有するもち米を原料米とする方が α-EG 生成効率が 1.3 倍と1.8 倍それぞれ高くなった。試薬のマルトースとイソマルトースからの生成を比較した実験において、マルトース（α-1,4 結合）の方 が イソ マ ルト ー ス （α-1,6 結合 ） よりα-EG の生産性が高い結果を考慮すると、本(3) 酵素反応による α-EG の生成効率
マルトースまたはイソマルトースとエタノールとの酵素反応条件を検討した結果を表 4 に示す。グルコース濃度と α-EG 濃度の差が小さいことから、マルトースとイソマルトースの分解反応の大部分は、分解によってグルコースと α-EG が生じるエタノールをアクセプターとした糖転移反応であり、分解によってグルコース 2 分子が生成する加水分解反応は僅かであったと考えら
表4

マルトースまたはイソマルトースとエタノールからの α-EG の生成
α-EG

グルコース

(% (w/v))(% (w/v))

マルトース

2.762.98

イソマルトース

2.322.48

基質17[食品・臨床栄養 e2016_13-20]

研究における酵素剤を添加した清酒仕込みとみりん仕込みにおいて α-EG の生成に糖基質であるオリゴ糖の α-グルコシド結合の位置の違いが酵素反応に直接関与している可能性は低いと考えられた。清酒やみりん等の醸造に原料として使用される穀類は予め加熱し糊化することで酵素によって消化され易くする必要がある。吉井らはうるち米ともち米の糊化度の指標となる酸溶解度を比較し、もち米が高く、うるち米が低いことを報告しており[8]、糊化度の違いがデンプンからのマルトオリゴ糖の生成に影響している可能性が考えられた。清酒醸造において、低アミロース米の老化蒸米はうるち米のそれよりも消化性が高いことが報告されている[9]。またアミロース含量が多くアミロペクチンの側鎖が長いほど老化（消化性の低下）が起こり易いことが報告されている[10, 11, 12]。従って、もち米アミロペクチンに存在しない長鎖のアミロペクチン成分を持つ [13]うる ち米はもち米 よりも老化し易いと考えられる。そのためデンプンが酵素による分解を受け難くなったことで、うるち米の α-EG 生成効率がもち米と比較して低くなった可能性が考えられるが、もろみにおけるデンプンの老化が α-EG 生成効率に与える影響については今後の検討課題である。イソマルトースから α-EG が生成することが明らかになったことから、清酒醸造においてマルトオリゴ糖が減少し、イソマルトオリゴ糖が増加する発酵後期には、イソマルトオリゴ糖が α-EG 生成の糖基質となっている可能性があると考えられ今後の研究で明らかにしたい。
これまで α-EG は新規機能性の甘味料としての研究 [14]、紫外 線照射時の荒 れ肌改善による保湿効果[4]、消化吸収で α-EG としてのラット体内動態の研究[15,16]などが報告されている。また、ヒトの線維芽細胞の細胞増殖賦活化によってコラーゲン量が増加する結果が培養細胞を用いた実験で得られており[17]、今後さらに α-EG の各種機能性研究が行われることで、今後内外美容素材としての商品展開が期待できる。本研究で明 らか になっ た原 料米の 違い と α-EG生成効率の関係をさらに詳しく研究することで発酵法による α-EG の効率的な生産方法を確立したい。

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Note
Effect of the differences in the raw materials rice on the fermentation production efficiencyof ethyl -α-d- glucoside
Takayuki Bogaki 1, 3, *, Junichi Sagara 2 , Kenji Ozeki 1, 2
1Graduate Program in Bioscience and Applied Chemistry, Graduate School of Engineering,2
Genome Biotechnology Laboratory, Kanazawa Institute of Technology, 3 General ResearchLaboratory, Ozeki Corporation.
*Corresponding author: Address: 4-9 Imazu, Dezaike, Nishinomiya, Hyogo 663-8227, Japan，
TEL: +81-798-32-2169，FAX: +81-798-34-7475，e-mail: takayuki.bougaki@ozeki.co.jp
Received August 9, 2016; Accepted November 8, 2016
We examined difference in productivity of α-EG by the fermentation method using non-glutinous
rice and glutinous rice as starch materials. When non-glutinous rice was used as starch material,
productivity of α-EG became 1.3 times higher in sake brewing method and 1.8 times higher inmirin (type of sweet sake used for cooking) brewing method compared with glutinous rice wasused as starch materials. When α-EG was produced with maltose or isomaltose as sugar substrate,compared with isomaltose, productivity of α-EG of maltose became 1.2 times higher. It wasthought that gelatinization of the starch of the materials rice and the action mechanism of thestarch degrading enzymes influenced productivity of α -EG by the fermentation method.
Keywords: Ethyl α- D -glucoside, Non-glutinous rice, Glutinous rice, Maltose, Isomaltose（責任編集委員：上野義栄）

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