アプリケーションノート

食品検査および飲料検査

黒コショウ中の 510 種の農薬の分析

Captiva EMR シーケンシャルパススルークリーンナップおよび
LC/MS/MS を用いた分析

著者

Aimei Zou, Limian Zhao,
Auni Wong, Ruben Garnica,
and Chee Sian Gan
Agilent Technologies, Inc.

概要

本アプリケーションノートでは、黒コショウ中の 510 種の農薬について信頼性の高い定量が行えるよう最適化された高度なサンプル前処理法について解説します。ワークフローは、先に開発したダイナミッ

クマルチプルリアクションモニタリング（dMRM）法を用いて、Agilent 1290 Infinity II LC システムとAgilent 6470B トリプル四重極 LC/MS とを組み合わせて実証しました。

黒コショウサンプルの前処理法には、Agilent Bond Elut QuEChERS EN 抽出キットを使用し、続くシーケンシャルパススルークリーンアップには、Agilent Captiva Enhanced Matrix Removal–General

Pigment Dry （EMR–GPD）および Captiva Enhanced Matrix Removal–General Pigment Fresh（EMR–GPF）の各カートリッジを使用しました。ワークフロー性能は、0.25 ～ 100 μg/L のマトリック
ス適合キャリブレーション標準を用いて、メソッドの感度、検量線の直線性、プレスパイク QC の回収率と精度に基づき、SANTE/11312/2021 に準じて評価し、検証しました。マトリックス効果（ME）は、

510 種のターゲット物質のイオン抑制と MS レスポンスの向上の観点から評価しました。85 % を超える分析対象物で、50 または 100 μg/L の検出限界（LOD）の検量線範囲で R2 ≥0.99 を得る直線性を示し、75 % の分析物で、RSD ≤20 % の場合に 40 ～ 120 % の回収率を達成しました。新たに開発したサンプル前処理メソッドにより、マトリックス効果が著しく低減すると同時に抽出効率が大幅に向上し、ワークフロー全体の簡素化も可能になりました。

はじめに

トリックスパススルークリーンアップが可能で標準および溶液の調製

インドネシア、インド、マレーシア、スリランカ

ある乾燥したマトリックス向けに設計されたものです。一方、Captiva EMR–GPF は、一般薬標準液 はアジレント製です。標準液の詳細

保管、生産時には、黒コショウの収穫と品質

来の QuEChERS 抽出後、黒コショウマトリッ

黒コショウの主な生産・輸出国は、ベトナム、およびブラジルです。黒コショウの植え付けやの確保のため、病虫害防除に農薬が広く使用されています。このように農薬が広く用いられていることで、食の安全性や環境 への影響が懸念されています。このため、欧州連合（EU）

や国際食品規格委員会（CAC）といった世界

中の規制機関は、黒コショウ中の農薬について最大残留限界（MRL）を設けています。

SANTE ガイドラインで 扱 いが 難しい 農産物

または 特有の農産物と見 なされる黒コショウ
は広く認知される、難易度の高いマトリックス

です 1。このサンプルのマトリックス干渉は、従す。Captiva EMR–GPD は 一般的 な 色素 の的な色素のある生のマトリックス向けです。従クスクリーンアップに 2 種類の Captiva EMR

カートリッジを連続して使用しました。複雑 な黒コショウマトリックスのマトリックスクリーニ

ングを改善するため、2 種類の Captiva EMR
カートリッジを使用しました。

サンプル前処理手順、LC/MS/MS 検出メソッ

ド、ターゲット捕捉、データ分析ステップについては、アジレントでご提供しています 2。

ンプルクリーンナップを行 います。こういった

高純度 Milli-Q 水を使用しました。LC/MS グ

本 研 究 で は、QuEChERS EN 抽 出 後 に

ACN に溶解して調製し、残りの実験に使用しました。

対応するマトリックス適合キャリブレーション

標準の反応と比較することで ME を評価する

ため、希釈していない標準液を ACN で調製しました 1。中間標準液 1,000 μg/L を ACN

で適切に希釈して、0.25、0.5、1、2、5、10、25、50 および 100 μg/L の 9 つの異なる濃製し、すぐに使用しない場合 は、冷蔵庫で 4（ACN）（部品番号 5191-4496）およびメタ

出感度を犠牲にすることが少なくありません。

μg/L 濃度の中間標準混合液は、標準原液をAgilent LC/MS グレ ードの ア セトニトリル

は、高い希釈倍率によって ME を低減するか、

従来の方法の場合、望む結果を得るために検510 種 のター ゲット 物 質 から 成 る、1,000

た。

試薬および調製よりクリーンな抽出物 を得るために広範 なサは表 1 に示すとおりです 3。

実験方法

来のサンプル前処理法では 取り除くのが極 めて困難です。既存のサンプル前処理メソッドで本研究に使用したカスタムの 10 種の混合農

ノール （MeOH）（部品番号 5191-4497）、超レードのギ酸、酢酸およびアンモニウムギ酸はSigma-Aldrich から購入しました。

度 のキャリブレーション標準液 を作成しまし
注記：キャリブレーション標準液 は 新たに調℃で保管する必要があります。

サンプル前処理

粉末の乾燥黒コショウは地元の食料品店で購入し、それ 以上処理することなく実験作業 に使用しました。

Captiva EMR–GPD および EMR–GPF パス

スルークリーンアップを用いるサンプル前処理

改良メソッドを開発しました。Captiva EMR–

GPD、EMR–GPF の各カートリッジはいずれも、新たに開発された Agilent Carbon S 吸

着剤 をはじめ、最適化 された 混合吸着剤 が

表 1. Agilent プレミックス農薬標準
部品番号

充填された、Captiva EMR の拡張製品です。

5190-0551

れたポア構造 の 高度 なハイブリッド炭素材でCUS-00000636

Carbon S 吸着剤は、炭素含有量が最適化さす。この吸着剤 なら、乾燥したマトリックスや生のマトリックスなど、植物由来のサンプルマ

トリックスに 対して、選択的 かつ 効率的 なマ

CUS-00000635

CUS-00000637
CUS-00000638
CUS-00000639
CUS-00000641
CUS-00000640
CUS-00000642
CUS-00000643
CUS-00004663

2

部品の説明

LC/MS 農薬包括的テスト混合物

カスタム農薬テスト混合物 1
カスタム農薬テスト混合物 2
カスタム農薬テスト混合物 3
カスタム農薬テスト混合物 4カスタム農薬テスト混合物 5
カスタム農薬テスト混合物 6
カスタム農薬テスト混合物 7
カスタム農薬テスト混合物 8カスタム農薬テスト混合物 9カスタム農薬テスト混合物 10

分析対象物濃度100 μg/mL
100 μg/mL

100 μg/mL
100 μg/mL
100 μg/mL
100 μg/mL
100 μg/mL
100 μg/mL
100 μg/mL
100 μg/mL
100 μg/mL

マトリックス

アセトニトリル
アセトニトリル
アセトニトリル
アセトニトリル
アセトニトリル
アセトニトリル
アセトニトリル
アセトニトリル
アセトニトリル
アセトニトリル
アセトニトリル

バイアル数

分析対象物数

8

254

1

27

1

26

1

27

1

28

1

25

1

26

1

28

1

29

1

30

1

25

サンプル前処理には、以下の製品および機器を使用しました。

– Agilent Bond Elut QuEChERS EN 抽出キット（部品番号 5982-5650CH）せました。次に、すべてのサンプルを、4,000rpm で 5 分間遠心分離機 にかけました。上清 2.5 mL を 15 mL チューブに移し、1 % ギ

マトリックス適合 キャリブレーション標準 は、

全体的 に 十分 に 均質化 させてから Captiva

しました。マトリックス適合キャリブレーション

付いた回収管が下部にある Agilent PPM-48

じですが、ACN 溶媒ブランクではなく、MB を酸水溶液 250 μL と混合しました。混合液をEMR–GPD カートリッジに投入し、ラベルの– Agilent Captiva Enhanced Matrix
Removal–General PigmentedDry（EMR-GPD）カートリッジ）

プロセッサーにセットしました。1 滴下あたり（部品番号 5610-2091）

3 ～ 5 秒 の 流量 に制御できるよう、低圧（1～ 3 psi）をかけました。サンプルすべてがカー– Agilent Captiva Enhanced Matrix
Removal–General Pigmented

Fresh（EMR-GPF）カートリッジ– ジェノグラインダー（SPEX、メアチェン、
ニュージャージー州、米国）– 遠心分離機 5804 R（Eppendorf、– Vortexer および Multi-Tube Vortexer（VWR、プレインフィールド、ニュージャー
ジー州、米国）カートリッジ 48 本用（PPM-48）（部品番号 5191-4101）

使用する点が異なります。

装置構成psi）をかけ、EMR–GPD カートリッジを 2 分

Plus C18 カラム（部 品 番 号 959759-902）

Rapid Resolution High Definition Eclipse

間完全 に乾燥させました。次 に、すべての溶を 使 用 し て Agilent 1290 Infinity II LC でし、自然落下溶出による第 2 段階のクリーンエレクトロスプレーイオン 源搭載 の Agilent

なくなったら、カートリッジを 10 psi の圧力でモードで行 いました。LC/TQ オートチューン

し、LC/MS/MS 分析の準備を整えました。サ

た。すべてのデータは、Agilent LC/MS デー

出液を Captiva EMR–GPF カートリッジに移

完全に乾燥させました。溶出液を十分に混合

行 い、検出 は、Agilent Jet Stream （AJS）

6470B トリプ ル 四 重 極 LC/MS で dMRM

を、ユニットモードとワイドモードで実施しまし

ンプル前処理ワークフロー全体で、22 倍の希タ 取 り 込 みソフトウェア（バ ー ジョン 10.1

理ワークフローの全体像を示します。

Analysis for QQQ ソフトウェア（バージョン

釈倍率を用いました。図 1 に、サンプル前処– Agilent 加圧式マニホールド SPEの各濃度の調製は、溶媒標準溶液の作成と同

ク ロ マト グラフ 分 離 は、Agilent ZORBAX

ナップを行 いました。自然落下 による滴下 がハンブルク、ドイツ）

中間標準液を MB にポストスパイクして調製トリッジを通過してカートリッジ 内 に 液体 が残っていない状態になったら、高圧（最大 10（部品番号 5610-2090）

マトリックス適合キャリブレーション
標準の調製以 上） で 取 り 込 み、Agilent Quantitative

10.2 以上）で処理しました。

0.5 ±0.01 g の 分量 の 粉末 の 黒コショウを

50 mL の 遠心分離 チューブに 入 れました。
適切 な 量 の 中間農薬標準液（1,000 μg/L）

を黒 コショウマトリックスに 添加して 品質管理（QC）添加 サンプル（プレスパイク QC）を作成しました。マトリックスブランク（MB）

サンプル抽出• 標準品をスパイク• 水を添加• 1 % 酢酸 ACN 溶液 をを、無添加 の 黒コショウサンプルで調製しました。次 に、プレスパイク QC サンプルを密栓してボルテックスし、さらに 15 ～ 20 分平衡化して、サンプルマトリックスに分析対象物

を浸透 させました。水 10 mL をすべてのサンプルに 添加しました。低水分品（乾燥 サン

プル）の 抽出効率 を向上させるため、 サンプ
ルを 10 ～ 15 分間 ボルテックスしました 。1
1% 酢酸 ACN 溶液 10 mL をチューブに添加し、さらに、QuEChERS EN 抽出塩を添加してセラミック製 ホモジナイザーを使用しました。チューブを密栓し、 ジェノグラインダーを使用して 1,500 rpm で 5 分間激しく振とうさ

黒コショウ（0.5 ±0.01g）

添加QuEChERS 抽出

機械的振とう

遠心分離

サンプルクリーンアップ

上清を取り、

1 % ギ酸水溶液と混合

サンプル注入Agilent Captiva
EMR–GPD カートリッジ

Agilent Captiva
EMR–GPF カートリッジ

図 1. Bond Elut QuEChERS EN 抽出キットによる抽出後、Captiva EMR–GPD と Captiva EMR–GPF
シーケンシャルパススルークリーンアップを行う黒コショウサンプル前処理ワークフロー

3

本ワークフローで使用した LC システム条件お

よび TQ パラメータは、先の研究で参照いただけます 4、5。

EMR–GPD によるシーケンシャルパススルー（B） GC/MS フルスキャンバックグラウンドテに加え、ターゲット回収率 も全体的に極 めて評価を示しています。図 3 では LC/TQ によるジによって、非常に高いマトリックス除去効率

結果と考察

高く、失敗率は著しく低下しました。

ターゲット回収率 に大きな 影響 を及 ぼすことA

ストによる、黒コショウのマトリックス除去 のトータルイオンクロマトグラム（TIC）を示し、黒コショウマトリックスの清浄度を比較してい黒コショウサンプルの前処理とマトリックスクリーンアップの効率性なく、マトリックスの除去で高い選択性と効率

図 2 に、（A）可視化した乾燥残留物と重量、

クリーンアップおよび EMR–GPF カートリッ性が得られる Captiva EMR パススルークリー

ンアップ法 は、効率的で手早く行え、信頼性にも優 れたサンプルクリーンアップ手法です。

特に、マルチクラスの多成分残留分析に最適

で、全体として十分なターゲット透過率と満足のいくマトリックス清浄度 が得られます。従来の dSPE クリーンアップに比べ、パススルーク

リーンアップでは、dSPE チューブの蓋の取り

47 % の乾燥残留物を除去

付けや取り外し、ボルテックスや遠心分離が不要になるなど、ワークフローステップの簡素化

Agilent Captiva EMR–GPD とEMR–GPF によるシーケンシャルが図れます。

化された調合法に基づいて他の充填剤を混合した最新の Carbon S 充填剤が充填されているため、乾燥マトリックスや生のマトリックスなど、植物由来のサンプルマトリックスに対して、選択的かつ効率的なマトリックスパススルーク

クリーンアップを行った黒コショウ。

B×109
1.5

Counts新しい Captiva EMR カートリッジには、最適

リーンアップが可能です 6、7。

膨大な量の研究作業を行って、マトリックスク

リーンアップを改善でき、許容可能なターゲッ

トの定量結果 も得られるシンプルかつ堅牢 な

サンプル前処理法を開発しました。このメソッ価しました。クリーンアップ効率 の比較 には、主 としてマトリックスの 乾燥残留物 の 重量 を活用しました 。メソッドの開発にあたっては、

1.0

0.5 g の黒コショウ、Agilent Captiva EMR–GPD と EMR–GPF によるクリーンアップ

GC/MS FS バックグラウンドクリーンアップテストの結果、39 % 除去

0.5
0

×109
1.5

Counts

表ターゲットリストを使用しました。Captiva

0.5

1.5

8

約 100 種の農薬を網羅した、より限定的な代

1.0

×109

ドの 性能 は、黒コショウのマトリックス除去、
ターゲット回収率および再現性 に基づいて評

0.5 g の黒コショウコントロール（クリーンアップなし）

0Counts

黒コショウのマトリックスの著しい複雑性とマ

トリックスクリーンアップの 課題 とを考慮し、黒コショウコントロール（0.5 g の黒コショウ抽出物、1 mL）

1.0

0.5 g の黒コショウ、dSPE とフリーズアウトクリーンアップの組み合わせ
GC/MS FS バックグラウンドクリーンアップテストの結果、10 % 除去

0.5
0
3

4

5

6

7

8

9

10 11 12 13 14
Acquisition time (min)

15

16

17

18

19

図 2. Agilent Captiva EMR–GPD と Captiva EMR–GPF によるシーケンシャルクリーンアップによる、

20

黒コショウマトリックスクリーンアップの評価。
（A）マトリックス乾燥残留物の重量テストでは、乾燥残留物の47 % を除去したことが示されています。
（B）GC/MS フルスキャンバックグラウンドテストでは、サンプルのバックグラウンド干渉またはノイズの 39 % を除去したことが示されています。

4

×107

Agilent Captiva EMR—GPD と EMR—GPF によるクリーンアップ

1.1

dSPE 後にフリーズアウトを行うクリーンアップ

1.0
×105

0.9

2.8
2.6
2.4
2.2
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0

0.8

Counts

0.7
0.6
0.5
0.4
0.3

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

0.2
0.1
0

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

Acquisition time (min)図 3. dSPE 後にフリーズアウトクリーンナップを行う方法と比較した、Agilent Captiva EMR–GPD と EMR–GPF によるシーケンシャルパススルークリーンアップを行う

LC/TQ による黒コショウマトリックスブランクの TIC クロマトグラム

ます。この比較には、Captiva EMR シーケン

マトリックス効果（ME）の評価

示しています。全体として、510 種の化合物のおよび EMR–GPF）で調製したサンプル、従プした黒コショウ中の 510 種の残留農薬を評

ルパススルークリーンアップ後の黒コショウ中を組 み 合 わせて調製したサンプル、 クリーン

ンアップの組み合 わせ 、b）新たな Captiva

れは、新たな Captiva EMR カートリッジのクれます。これらのマトリックス清浄度評価のすプ。SANTE プロトコルに準じた ME 評価は、

シャルパススルークリーンアップ（EMR–GPD

来の dSPE とフリーズアウトクリーンアップ 9

アップを行 わない黒コショウ粗抽出物 が含まべての結果から、Captiva EMR シーケンシャ

本研究では、次の 2 つの方法でクリーンアッ
価しました：a）dSPE とフリーズアウトクリー
9

EMR シーケンシャルパススルークリーンアッ
対応する溶媒標準溶液の反応に対する、黒コ

ルパススルークリーンアップによって、最も清ショウのマトリックス適合標準液のターゲット

ショウマトリックスのバックグラウンドも最も低る 2 つの前処理メソッドによる ME データを浄度の高いマトリックス抽出物が得られ、黒コいことが明らかになっています。

反応の比によって求めました 1。表 2 に、異な85 % で、ME は、Captiva EMR シーケンシャ

で 40 ～ 120 % の範囲 に収まっています。こリーンアップ効率が極めて優れていること、また、その定量もマトリックス適合キャリブレー

ションによって効果的に補えることを示しています。

表 2. dSPE とフリーズアウトクリーンアップを組み合わせた方法と比較した、Agilent Captiva EMR–GPD と EMR–GPF の各カートリッジによるシーケンシャルクリーンナップを行った ME データ
マトリックス

黒コショウ

抽出メソッドA）QuEChERS 抽出 + dSPE とフリーズアウトクリーンアップの組み合わせB）QuEChERS 抽出 + Captiva EMR–GPD 後に EMR–GPF

全 510 ターゲット

有意でない ME 80 ～ 120 % のターゲット数

ME 40 ～ 120 % のターゲット数

120（24 %）435（85 %）16（3 %）

136（26 %）5

図 4 に、QuEChERS EN 抽出後に Captiva

レーション標準、マトリックスブランク、プレスプを行って調製した黒コショウ抽出物中の 10れます。プレスパイク QC の 3 つのテクニカル

2）メソッドの感度

パイク QC および ポストスパイク QC が含ま

EMR シーケンシャルパススルークリーンアッ
μg/L の 濃度 のすべてのターゲットの 代表的メソッドの 感 度 は、LOD ま た は 定 量 限 界（LOQ）に 基 づいて 評 価 しました。本 研 究 でレプリケートは、バッチごとに調製しました。

な MRM クロマトグラムを示しています。鋭いは、最低濃度の標準溶液を用いて、S/N 比 ≥3、1）検量線の直線性

対称ピークと感度の高い反応は、マトリックス

70 ～ 130 % の範囲に収まる精度を考慮して、メソッドの LOD を設定しました 1。黒コショウ

全ターゲットの検量線の直線性は、マトリック

クリーンアップ効率が高いこと、また、新たな抽出物中の 510 種のターゲットの 97 % で、メス適合標準液を用いて 0.25 ～ 100 μg/L の

Captiva EMR カートリッジの 使用 によって、ソッドの LOD は ≤10 μg/L で得ています。さらダイナミックレンジで評価しました。全体とし500 種を超えるターゲットの ME が向上したに、510 種のターゲットのうち 67 % で LOD ≤て、LOD から 50 または 100 μg/L の範囲で、ことを示しています。

0.25 μg/L、81 % で LOD ≤1 μg/L を示してい

510 種のターゲットの 85 % で、検量線の直ワークフロー全体の性能の検証ます。黒コショウ抽出物中のこの LOD 結果は、線性要件である R2 ≥0.99 を満たしています。

6470B LC/MS/MS の感度の高さと新たに開また、直線性の精度 も、全レベルでスパイク

ワークフロー性能は、検量線の直線性、メソッ発したサンプル前処理メソッドによるマトリック

濃度と比較した逆算濃度の精度の偏差に基づドの感度、回収率および SANTE ガイドライン

スの極めて高い清浄度を示しています。カルベ

いて評価しました。例に示すように、キャリブに準じた精度に基づいて検証しました 。バッ1

チ内分析およびバッチ間分析を行って、メソッ

レーションレベル 6 （10 μg/L）では、510 種には、溶媒ブランク、マトリックス適合キャリブ

黒コショウ抽出物中の 100 ±20 % の許容範

ンダジム、カルボフランおよびトリアゾホスは、
サンプルクリーンアップで容易に失 われる可能のうち 90 % を上回る化合物で、逆算精度がドの反復性と再現性を評価しました。各バッチ性のある、典型的 な平面化合物、アルカリ化合物または 酸性化合物として同定されていま囲に収まっています。

×105
5.0
4.5
4.0
3.5

Counts

3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

Acquisition time (min)図 4. 黒コショウマトリックス抽出物中の 10 μg/L の濃度の 510 種の農薬の典型的な MRM クロマトグラム

6

12

13

14

15

16

17

18

す。このため、黒コショウマトリックスにおけるSANTE ガイドラインに準じ、LOQ は、10 以

この結果から、この分析ワークフローの性能に種類の化合物を選択しました。図 5 に、優 れレスパイクしたサンプルから得て、ターゲット度が得られていることがわかります。

かにする、黒コショウ中の 0.25 ～ 100 μg/L

対象物 の 回収率 と精度 についてのメソッド性

メソッド性能を示すのに、この扱いの難しい 3た 直線性とワークフローの 感度 の 高さを明らの濃度のカルベダジム、カルボフランおよびト

リアゾホスの LC/MS/MS MRM クロマトグラ
ムの重ね表示を示しています。

上の S/N 比 が得られる最低濃度レベルでプ同定に加え、黒コショウマトリックス中の分析

能基準も考慮しています。表 3 では、本研究で測定した LOQ と、EU が設 けた黒コショウ

マトリックス中の MRL とを比較しています 10。

A

BC:: 314.0 → 162
×105 Triazophos
RT = 12.45 min
1.5×105 Carbofuran: 222.1 → 165.1
RT = 8.76 min
3.6
3.4

1.4

3.2

1.3

3.0
2.8

1.2

2.6

1.1

2.4

1.0

2.2
2.0

Counts×105 Carbendazim: 192 → 160.1
4.6 RT = 4.41 min
4.4
4.2
4.0
3.8
3.6
3.4
3.2
3.0
2.8
2.6
100 μg/L
2.4
2.2
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.25 μg/L
0.6
0.4
0.2
0
4.2
4.3
4.4
4.5
4.6

CountsCounts

よって、規制要件を満たせるだけのメソッド感

100 μg/L

1.8

0.9

1.6

0.7

1.4

0.6

1.2

0.5

1.0

100 μg/L

0.8

0.4

0.8
0.6

0.3

0.25 μg/L

0.4

0.25 μg/L

0.2
0.1

0.2
0

8.6

Acquisition time (min)

8.7

8.8

8.9

9.0

0

12.3 12.35 12.4 12.45 12.5 12.55 12.6

Acquisition time (min)Acquisition time (min)図 5. 黒コショウ抽出物中の 0.25 ～ 100 μg/L の濃度の（A）カルベダジム、（B）カルボフラン、（C）トリアゾホスの MRM クロマトグラムの重ね表示
表 3. EU が設けた黒コショウマトリックスの MRL と本アプリケーションノートで解説したワークフローに従って測定した、対応する LOQ との比較
農薬

アセタミプリド
アトラジン

ブプロフェジン

カルベンダジム
カルボフラン

クロチアニジン
シプロジニル

ジフェノコナゾール

エポキシコナゾール

フロラスラムEU 規定の MRL

本研究の LOQ

100

10

100

10

50

10

100

10

50

10

50

10

100

10

300

10

100

25

*

50

10

（μg/kg）（μg/kg）

農薬

フルトリアホルヘキサコナゾール

イミダクロプリド
イソプロツロン

メタラキシルメソミル

パクロブトラゾール
ピリミカルブプロクロラズピリダベン

EU 規定の MRL

本研究の LOQ

50

10

50

10

50

10

50

10

50

10

50

10

50

10

50

10

150

10

50

10

（μg/kg）（μg/kg）

農薬

ピリメタニル

テブコナゾール

チアベンダゾール
チアメトキサムトリアゾホストリシクラゾール

EU 規定の MRL

本研究の LOQ

50

10

50

10

50

10

50

10

70

10

50

10

（μg/kg）（μg/kg）* 黒コショウマトリックス中に正電荷が発生したため、LOQ が上昇。

7

図 6 に、10 μg/kg のプレスパイク QC（LOQのメソッド性能合格基準に準じ、整合性がある

不合格の農薬の許容不可となった回収率 は、

140 % を超えないことが条件です。本研究でウ中 のマトリックス干渉 に関連していました。

ンプル前処理に用いた 22 倍の希釈倍率を考範囲をさらに厳しい 40 ～ 120 % としました。

リックスではごく一般的で、完全にクリーンな

大濃度 0.45 μg/L に相当します。図 6 に示すのターゲットの回収率分布を示しています。全

す。結果として、特定の農薬の正電荷の発生レベル）の 3 つの技術的反復のカルベンダジ（RSDr ≤20 %）場合 には 30 % を下回らず、

クロマトグラムの重 ね表示を示しています。サ

は、RSDr ≤20 % の場合の許容可能な回収率

ム、カルボフランおよびトリアゾホスの MRM

慮すると、これは、黒コショウ抽出物中の最図 7 に、黒コショウマトリックス中の 510 種

ように、RSDr <3 % の場合に、扱いが難しい、体として、開発したワークフローを用いた場合

LOQ レベルの 3 種類の化合物で高い反応がに、510 種のうち 382 種の化合物で上記の得られたことから、メソッドの感度と再現性が優れていることが示されました。

ドの 性能 と食品マトリックス中 の 残留農薬測

クス中 の 農薬 に 対して設 けられた 最低 MRLは、10 μg/kg 濃度のプレスパイク QC を用い3）に対する、マトリックス適合検量線から算

クグラウンドによって引き起こされるマトリック

ス干渉 は、正確 なピーク積分 を難しくする一

析対象物の回収率が得られることが裏付けら

ル、メプロニル、ニコチン、テルブトリンといっ

ル前処理メソッドが、複雑 なマトリックス中のき起こすことが確認されており、一貫性のあるいます。

は、プレスパイク QC 中 の 濃度期待値（n =ナゾール、フルオメツロン、クインチオホスな

プル前処理メソッドで、黒コショウ中のほとん

多数 の農薬 の分析 に適していることを示しててターゲット回収率 を評価しました。回収率の精度に大きな影響を及 ぼしました。こういっ
どがあります。また、未確認のマトリックスバッ

れました。この結果は、新たに開発したサンプ

が 50 μg/kg であることを考慮し、本研究では、ターゲット定量のマトリックス適合検量線

μg/kg の濃度で回収率 70 ～ 120 % を示しまどのターゲット農薬 について、許容可能 な分

定の真度の重要な指標です。コショウマトリッ

マトリックスブランクを見 つけるのは 困難 でた化合物には、ジウロン、DEET、エポキシコした。この回収率結果によって、開発したサンターゲットの回収率は、サンプル前処理メソッ

残留農薬の正電荷の発生 は、黒コショウマト

基準を満たしました。また、510 種のターゲッ

トのうち 358 種（70 %）で、黒コショウ中 103）メソッドの回収率

主としてターゲットの正電荷の発生と黒コショ因でもあります 1。アニラジン、 ジニコナゾー

たターゲットは、重大なマトリックス干渉を引ターゲット定量を難しくしています。

出した分析対象物の濃度の比に基づいて得ています。平均回収率は、SANTE ガイドライン

A
1.5
1.4

B
×104

Carbendazim: 192.0 → 160.1
RT = 4.41 min
RSD = 2%

1.5
1.4

1.1

1.1

0.7

1.0

1.0
Counts

0.9
0.8

0.9
0.8

0.7

0.7

0.6

0.6

0.5

0.5

0.4

0.4

0.3

0.3

0.2

0.2

0.1

0.1
4.1

4.2

4.3

4.4

4.5

4.6

Acquisition time (min)4.7

0Triazophos: 314.0 → 162
RT = 12.45 min
RSD = 2%

0.8

1.2

1.2

Counts

0.9

1.3

1.3

0

C
×104
1.0

Carbofuran: 222.1 → 165.1
RT = 8.76 min
RSD = 2%

Counts

×104

0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1

8.5

8.6

8.7

8.8

8.9

Acquisition time (min)

9.0

0

12.3

12.4

12.5

Acquisition time (min)図 6. バッチ内の黒コショウマトリックス中の 10 μg/kg の濃度のプレスパイク QC の 3 回のテクニカルレプリケートにおける（A）カルベンダジム、（B）カルボフラン、（C）トリアゾホスの MRM クロマトグラムの重ね表示

8

12.6

510
480
450
420

Number of targets

390

358 (70%)

360
330
300
270
240
210
180
150

128 (25%)

120
90
60

24 (5%)

30
0

Recovery 40 to 70%
with RSDr ≤20%

Recovery 70 to 120%with RSDr ≤20%

Recovery 40 to 120%with RSDr ≤20%

図 7. 黒コショウ中の 510 種のターゲットすべてのプレスパイク QC の回収率の分布

4）メソッドの精度

メソッドの精度は、10 μg/kg 濃度のプレスパ
イク QC の反復に基づいて、バッチ内回収率の反復性とバッチ間回収率の再現性 によって評価しました。RSD （%）は、バッチ内プレス

パイク QC の 3 回 の 反復 の 回収率 に 基 づいて算出しました。全体として、黒コショウ中の80 % のターゲットで、このサンプル前処理メ

ソッドの一貫した性能を示す、RSDr ≤20 % が得られました。

率値を示しています。この結果から、開発した

調製したそれぞれのバッチのプレスパイク QC

析で一貫した定量結果 が得られることが示さの 6 回の繰り返し分析の回収率に基づいて算出しました。510 種のターゲットのうち 78 %れました。

た。図8に、黒コショウ中の 10 μg/kg の濃度のプレスパイク QC の 6 回の反復における 3種の代表的ターゲット（カルベンダジム、カル
ボフランおよびトリアゾホス）のバッチ間回収

Batch 1
Batch 2

A

分析ワークフローによって、日々のルーチン分で、黒コショウ中で RSDiR ≤20 % を示しまし120

RSDiR = 2%

Batch 1
Batch 2B

120

RSDiR = 4%

100

100

80

80

80

60

Recovery (%)

100

Recovery (%)

Recovery (%)

120

RSDiR % は、別々の日に異なるロットのサンプ

ルマトリックスを用 いてラボの 科学者 2 人 が

60
40

40

20

20

20

T1

T2

T3

T4

T5

T6

0

T1

T2

T3

T4

T5

Technical replicates acrossTechnical replicates across

two batches

two batches

T6

RSDiR = 3%

60

40

0

Batch 1
Batch 2

C

0

T1

T2
T3
T4
T5
Technical replicates across

T6

two batches

図 8. 2 つのバッチの 10 μg/kg 濃度のプレスパイク QC の 6 回のテクニカルレプリケートにおける（A）カルベンダジム、（B）カルボフラン、（C）トリアゾホスの回収率値

9結論析およびバッチ間分析によってワークフローの再現性を評価し、黒コショウ中の 500 種を超

サンプル前処理、クロマトグラフィーによる分える残留農薬の定量で高い再現性と信頼性のトで解説した一連のワークフローにより、黒コ

また、高濃度色素や脂肪分を含む他の複雑な選択的かつ高感度の定量分析が可能です。

も示唆しています。

離、MS 検出といった、本アプリケーションノー

ショウマトリックス中の 510 種の残留農薬のAgilent Bond Elut QuEChERS EN 抽出キッ

ト に よ る 抽 出 後、Agilent Captiva EMR–GPD と EMR–GPF の各カートリッジを使用

したシーケンシャルパススルークリーンアップ

乾燥食品のマトリックスに拡張できる可能性を

note, publication number 59944765JAJP, 2022.

参考文献
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SANTE/11312/2021: Analytical
Quality Control and Method
Validation Procedures for Pesticide
Residues Analysis in Food and Feed.

2.

Quantitative Analysis of Multiresidue
Pesticides in Food Matrices Using
Agilent 6470 Triple Quadrupole
LC/MS System – Method Protocol,2022.

に排除できます。このメソッドにより、75 % の農薬で、許容可能な定量結果が得られました。

これらの結果から、従来のサンプル前処理法に勝る方法であることがわかります。より清浄度の高い抽出サンプルが得られることで、LC

カラムや MS イオン源 の汚染やキャリーオー

バーを防ぐこともできるため、メンテナンス頻

3.

www.agilent.com/chem/standards

4.

Zou, A. et al.Comprehensive
LC/MS/MS Workflow of Pesticide
Residues in Food Using the Agilent
6470 Triple Quadrupole LC/MS
System, Agilent Technologies
application note, publication number
5994-2370EN, 2020.

度を減らせ、ワークフロー全体の長期的堅牢性も向上します。

メソッドの LOD は、黒コショウ中の 81 % のターゲットで 1 ng/mL 未満で、97 % のター

ゲットで 10 ng/mL で達成しています。LOQ

は、EU 農薬データベースで規定されている、

黒コショウマトリックス中の化合物の MRL 要件を満たしており、日々残留農薬分析を行う

ラボに優れた結果をもたらします。バッチ内分

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カストマコンタクトセンタ

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本文書に記載の情報、説明、製品仕様等は予告なしに変更されることがあります。
DE87036491

アジレント・テクノロジー株式会社© Agilent Technologies, Inc. 2022
Printed in Japan, April 28, 2022
5994-4768JAJP

薬の測定 - Capitva EMR-HCF パスス

ルークリーンアップと LC/MS/MS の利なら、効率的に黒コショウマトリックスを除去できると同時にマトリックス効果を低減し、黒Zhao, L.; Wei, T.-C. スプリングリーフミッ

クス中のマルチクラス、多成分残留農

高 い分析性能 が 明らかになりました。これはによる簡素化したサンプル 前処理プロトコル

コショウ中のマトリックス干渉をこれまで以上

6.

5.

Zou, A. et al. Analysis of 510 Pesticide
Residues in Honey and Onion on an
Agilent 6470 Triple Quadrupole LC/
MS System, Agilent Technologies
application note, publication number
5994-3573EN, 2021.

用, Agilent Technologies application

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Zhao, L. ピーマン中のマルチクラスの多成分残留農薬の測定 - Agilent Captiva
EMR–GPF パススルークリーンアップを用いた LC/MS/MS および GC/MS/
MS による分析, Agilent Technologies
application note, publication number
5994-4767JAJP, 2022.
Zhao, L.; Lucas, D. Agilent Bond Elut
QuEChERS EMR Lipid とLC/MS/MS
によるアボカド中の農薬残留物の分

析, Agilent Technologies applicationnote, publication number 59916098JAJP, 2015.
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EURL-FV (2017-M21) Evaluation ofDifferent Extraction.

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