研究の進展で見えてきたノロウイルスの本当の姿
北里大学北里生命科学研究所
感染制御科学府ウイルス感染制御学I教授 片山和彦

Norovirus%bind%&%entry%

Enterocyte

GobletEntero-endocrine
PanethGenome%RNA%
ORF1%

ORF2%ORF3%+"
Assemble%

Structure%proteins%

Subgenome%RNA%
Polyprotein%
New%genome%RNA%

Non%structure%proteins%

Intestinal stem cell

NegaAve%strand%RNA%synthesis%

上級編：ノーウォークウイルスの発見から1968年10月: オハイオ州ノーウォークの小学校で、冬季おう吐ゲリ症の流行が発生- 50% の発症率
- 吐き気 、おう吐、下痢、発熱- 潜伏期間は24∞48 時間- 約24時間の病期- 27% の二次感染率
1972年にNIHのアルバート・カピキアン博士が免疫電子顕微鏡観察によって発見した
1990: NV68 prototype GI.1 genome の全塩基配列が決定され、ノーウォークウイルス（ノロウイルス）研究の新時代が幕を開けた。

ゲノム全長塩基配列の解明とノロウイルス研究の進展
1990年

プロトタイプNV68のゲノム全長塩基配列決定

ゲノムはsingle stranded positive sense RNA; 7.6K
3つのORFを持つ。ORF1に非構造蛋白質、ORF2に構造蛋白質をコード
構造蛋白質は複製段階で合成されるサブゲノムから大量に発現
ORF2をバキュロウイルスで発現させウイルス様中空粒子（VLP）作製

ゲノム

ORF1

ORF2

VPg?
Proteasepoly A

Polymerase

非構造蛋白質

サブゲノム

ORF3

構造蛋白質
VPg?

poly A

VLPs
抗原性の差異は構造蛋白質領域の塩基（アミノ酸）配列の多様性に起因する

ノロウイルスの遺伝子タイプと遺伝子型(2014年）

Porcineブタ

オハイオで発見されたノーウォーク
ウイルス

Predominant
2015年まで
strain with
主要流行株だった
variants

プロトタイプFeline
イヌCanine
ネコBovineウシ
Murineネズミノロウイルス中空粒子作出と抗原検出系構築
ノロウイルスには、遺伝的に異なる5つのグループ（GI, GII, ・・・）が存在し、それぞれのグループに複数の遺伝子型が存在する。ノロウイルスの各遺伝子型は、それぞれ異なる抗原性を示すが、同一遺伝子型は同じ抗原性を示す。

1992年 組換えバキュロウイルスを用いた発現系により、ウイルス様中空粒子 (VLPs)作製に成功した。
それぞれの遺伝子型からクローニング、VLPs発現までをシステム化
各遺伝子型のVLPs発現、蓄積、抗原性の研究が進展

便の中にある
感染性粒子

VLPs

ノロウイルス中空粒子作出と抗原検出系構築
ノロウイルスには、遺伝的に異なる5つのグループ（GI, GII, ・・・）が存在し、それぞれのグループに複数の遺伝子型が存在する。ノロウイルスの各遺伝子型は、それぞれ異なる抗原性を示すが、同一遺伝子型は同じ抗原性を示す。

1992年 組換えバキュロウイルスを用いた発現系により、ウイルス様中空粒子 (VLPs)作製に成功した。
それぞれの遺伝子型からクローニング、VLPs発現までをシステム化
各遺伝子型のVLPs発現、蓄積、抗原性の研究が進展

便の中にある
感染性粒子

VLPs

ノロウイルス研究の課題
ヒトノロウイルスは、なぜ培養細胞で増殖させることができないのか
組織血液型抗原（HBGA)は、レセプター？
ネズミ、ネコ、ブタ、ウシのノロウイルスはヒトに感染しない。宿主特異性は？（感染モデル動物がない）
感染性ウイルスとウイルス様中空粒子（VLP）は同じ
形
感染性ウイルスの中にゲノムRNAが一本だけ入ってる？
ノロウイルスに何度も感染するのは何故？
ノロウイルス病原性発現機構は？何故、おう吐、下痢？
ワクチンや抗ウイルス薬は開発可能か？

Schema'c(diagram(of(the(Norovirus(replica'on(

ノロウイルス患者から排泄された便に含まれるウイルスからTransfec'on(of(viral(RNA(to(HuhF7(cells(leads(to(viral(replica'on(However,(infec'on(was(not(spread(to(neighbor(cells.(
ゲノムRNAを取り出して、細胞に入れたらどうなる？
and(release(of(viral(par'cles(into(medium.((Norovirus(release(Genome(RNA(from(stool(sample(Norovirus(bind(&(entry(Genome(RNA(ORF1(ORF2(ORF3(X"+"
Assemble(Structure(proteins(Subgenome(RNA(Polyprotein(New(genome(RNA(Non(structure(proteins(Nega've(strand(RNA(synthesis((Guix(et(al,(2007).(
Guix, S et. al. JVI 2007
ヒト株化細胞（293T, Huh7, Caco2など）にノロウイルスRNAを入れると、ノロウイルスが出てきた！
しかし・・・・出てきたノロウイルスは、細胞に感染できない。なぜ？

ヒトノロウイルスは、どのようにして細胞に侵入し、感染するのか？

ノロウイルスVLPはHBGAに結合する✦ 組織血液型抗原:HBGAがVLPに結合する。レセプター（受容体）か？
✦ HBGAを発現させた細胞にHuNoV,VLPは取り込まれない？
ウイルス様中空粒子（VLP）を用いたレセプター探索
HuNoV-VLPはHBGAと結合する

HBGAはヒトノロウイルスレセプターか？
培養細胞へVLPを結合させ、HBGAとの関係を可視化する

結腸由来培養細胞Caco-2（長期培養）の場合
H1-HBGAH2-HBGA

Leb-HBGA

50 μm

VLPはHBGAを発現していない細胞にも結合する

VLPは細胞上の何に結合しているのか？
Murakami et al., PLoS ONE 2013

ヒト小腸のバイオプシの場合

100µm20µm

緑：ノロウイルスVLP、赤：H1型HBGAVLPは上皮細胞だけでなくゴブレット細胞にも結合/侵入する
Murakami et al., PLoS ONE 2013

HBGAを認識しないVLPも小腸に結合して、多量に取り込まれる
HBGAに結合するVLPHBGAに結合しないVLP
100µmMurakami et al., PLoS ONE 2013

つまり、ヒトノロウイルスは• HBGAと異なる分子を利用して細胞に結合/侵入している？
• 細胞結合/侵入はムチンを分泌するゴブレット細胞からの逆方向取り込みがある？
Murakami et al. PLoS One (2013)

1. ノロウイルスの消化管への吸着は、ムチンに多く存在するHBGAを使って行う
2. ５人に１人はHBGA非分泌型の体質である（非分泌型のヒトはノロウイルスに感受性が低い）
3. その後、細胞表面の真のレセプター分子（未知）を介して細胞に感染する

実際のヒトノロウイルス感染者の小腸を見てみる

ノロウイルス感染者の小腸バイオプシの免疫染色
10 µm

RdRp

VP1

RdRp VP1

RdRp VP1 DAPI

小腸上皮細胞の中に VP1 と RdRp, VPg 等のノロウイルスたんぱく質が検出された（細胞の中で増殖している）
小腸をパトロールしている貪食細胞（マクロファージ）、樹状細胞の中にもノロウイルスたんぱく質（VP1）が検出された

やはり小腸上皮で増殖している
Karandikar, U. C. et al., JGV 97(9), 2291-300, 2016

ヒトノロウイルスの遺伝子を細胞の中に入れると？
EF-1α

ORF1

ウイルスが出てくる

ORF2 ORF3Assemble
ORF1 polyprotein

EF-1α

ORF1

ORF2 ORF3

VP1, VP2 translation
Cleaved functional NS proteins(N-term, NTPase, 3A, VPg, Pro, RdRp)

Genome & subgenome RNA
Negative strand RNA

ウイルスタンパク質が発現し、genomeの複製が起き、新生ウイルスが産生された。
新生ウイルスの感染性を証明するためには、感染細胞が必要。
Katayama et al, PNAS 111(38), E4043-52, 2014.

このシステムは、ヒトノロウイルスに近縁なマウス
ノロウイルス（MNV）で動くのかどうかを検証した
pKSF-MNVS7
EF-1α

Transfection

Progeny viruses
Infection
Infected to RAW264.7

293T, 293, Huh7, COS7, COS1
培養上清の中に出てきたウイルス粒子

Progeny MNVKatayama et al, PNAS 111(38), E4043-52, 2014.

リバースジェネティックス（RGS）は新生ウイルス粒子（MNVは感染性）を作る
HuNVcDNA

感染性クローン（全長cDNA)

新生ウイルス粒子

MNVcDNA

HuNoV
MNV

HEK293T細胞
粒子形成+ウイルスRNA

Assemble

翻訳

Structure proteins
感染できない転写

感受性細胞

Subgenome RNA
Polyprotein
New genome RNA
複製

Non structure proteins

Negative strand RNA synthesis

非感受性細胞ウイルスの侵入にレセプターが必須
カギはレセプター
Katayama et al, PNAS 111(38), E4043-52, 2014.

CRISPER/Cas9によるゲノムワイド遺伝子ノックアウトを利用したレセプター検索

ゲノムワイドランダ
ムノックアウトでは細胞は死なない
Haga K., et al, PNAS, 113(41) E6248-E6255, 2016 .

MNV感染で細胞は死滅する。生き残った細胞はMNVが感染できなくなった細胞

NGSでどの遺伝子がKOされたか調べると、CD300lfが見つかった。
特異的にKOするとMNVが感染できなくなった。

CD300lfを導入すると、MNV感受生細胞になる

Haga K., et al, PNAS, 113(41) E6248-E6255, 2016 .

クライオ電子顕微鏡によって得たMNV感染性粒子とレセプターCD300lf（クリスタル）の結合様式

Haga K., et al, PNAS, 113(41) E6248-E6255, 2016 .

小腸の構造（腸管断面、絨毛組織）
食物消化のプロセスの中核
3つの部分に分けられる
十二指腸空腸回腸
層状の構造をしている
基底膜
平滑筋上皮
粘膜層（ムチン層）
ムチン層は意外と薄い

小腸の上皮を作る細胞たち

Enterocyte

GobletEntero-endocrine

PanethIntestinal stem cell

クリプトと絨毛幹細胞が4つの細胞種に分化する

ヒトの腸管オルガノイドってなに？
十二指腸空腸Ile
回腸
幹細胞のある絨毛の付け根（クリプト）を採取

••
•
•
•
•

成長因子添加培地の中で増殖細胞塊状のオルガノイド（裏表が逆）

慶応大学の佐藤、オランダのクレバーが培養方法を開発した
全ての腸管上皮細胞がクリプトの幹細胞から分化誘導される
小腸の組織が再現できる幹細胞は、脱分化増殖誘導により無限に増殖可能（継代培養可能）
96ウェルプレートに細胞の塊（スフェロイド）形成後、分化誘導すると小腸になる
開いて、バラして捲腸管上皮細胞、ゴブレット細胞、パネート細胞など分化状態を保っ き込める（培地側が腸管内部側になる）
たままモノレイヤーにすることも可能ノロウイルス（GI）はアルコールで消毒できる？
ＧＩノロウイルスのアルコール感受性を示した
縦には、ゲノムRNAレベルがどれぐらい下がるか（消毒によってどれぐらい分解されたか）が示されている遺伝子型によって差はあるが、消毒効果は最大で4桁。効果は99.99%消毒！
でも、10の7乗以上のウイルスタイターがあるなら、アルコールが99.99%の消毒効果を発揮しても1000個以上が生き残る
1000個も体内に入ったら、感染してしまいます
100％消毒で無ければダメ
ちなみに次亜塩素酸ナトリウムは100%Park GW et al., PLoS ONE 2016

ノロウイルス（GII）はアルコールで消毒できる？

GII.4 ノロウイルスのアルコール感受性を示した
消毒効果は最大で3桁（99.9%）
GIよりも平均10倍強い！
10の7乗以上のウイルスタイターがあるとするなら、アルコールが最大限の効果を発揮しても10000個以上が生き残る
特に、最近主流だったGII.4（NewOrleans株）は、アルコール耐性がめちゃくちゃ強く、消毒効果無し！
では、ヒトノロウイルス増殖培養系（オルガノイドシステム）で検証ししたらどうなる？（未発表）。

Park GW et al., PLoS ONE 2016

まとめ
• ノロウイルスは、ウイルスゲノムを細胞に導入すると複製サイクルが動き、ウイルス粒子を産生する• HuNoV-VLPは組織血液型抗原糖鎖HBGAに結合するが、細胞への接着、侵入には別の分子が関与している• リバースジェネティックスは、宿主細胞に関係なく、ノロウイルス感染性粒子を産生する• MNVレセプター分子は、シアル酸などの糖鎖では無く、細胞外ドメインを有する膜タンパク質CD300lf, CD300ldであった• MNVレセプター分子を強制発現させた細胞は、マウス以外の細胞でもMNV感受性になり、MNVが増殖可能となる• ノロウイルスの宿主特異性は、主にレセプター依存的である• ヒト腸管オルガノイドは、ヒトノロウイルスの増殖培養を可能にした

これからの展望• ヒトノロウイルスが増殖可能なヒト腸管オルガノイドを用いて、レセプターを同定を行い、レセプターを導入した汎用性の高いヒトノロウイルス感受生細胞を構築する• リバースジェネティックス系を利用して、MNVのレセプター結合サイトを移植した遺伝子改変キメラウイルスを作出し、感染モデルマウスを作る

謝辞
北里大学北里生命科学研究所・感染制御

国立長寿医療センター：中西章

科学府ウイルス感染制御学I：芳賀慧、藤本陽、戸高玲子、宇田川悦子

自然科学研究機構生理学研究所：
村田和義

国立感染症研究所ウイルス第二部第一室：
村上耕介、Doan Hai Yen、染谷雄一

Baylor College of Medicine：
Mary K. Estes, Sue E.

国立感染症研究所感染症疫学センター

Crawford, Robert L. Atmar：木村博一、長澤耕男
慶応大学医学部：杉本真也、佐藤俊朗
国立感染症研究所病原体ゲノム解析セン
ター：横山勝、佐藤裕徳

東京工業大学：上野隆史

全国地方衛生研究所

名古屋市立大学：鈴木善幸

横浜市立大学大学院：河合文博、朴三用

デンカ株式会社：三木元博

これらの研究は、AMEDの新興再興感染症実用化研究、文部科学省科研費基盤Bによってサポートされた
国立感染症研究所、北里生命科学研究所の共同研究契約に従って実施された