課題番号	  	  	 ：２６指３０１	 研究課題名	  	 ：２型糖尿病の創薬のための分子標的の同定に資する転写共役因子CITED2を中心とした代謝制御エピジェネティクスの解明
主任研究者名	 ：松本	  道宏	 
分担研究者名	 ：該当なし	 	 
キーワード	 	 	 ：糖尿病、メタボリックシンドローム、創薬、分子標的、代謝疾患モデル動物	 
研究成果	 	 	 	 	 ：	 	  平成 26 年度は研究計画に基づき、主に骨格筋特異的 CITED2 欠損マウスの高脂肪食飼育下での代謝表現型解析を行うと共に、骨格筋特異的 CITED2 トランスジェニックマウスの普通食飼育下での解析を行った。またアセチル化酵素 GCN5 のマウス肝臓における機能獲得実験を行い、GCN5 を CITED2と共に強発現させると糖新生系酵素の発現が増強し肝糖新生が亢進することを見出した。この詳細なメカニズムをマウス初代培養肝細胞にて検討し、グルカゴン–cAMP シグナル依存的にCITED2–GCN5–PKA 複合体が形成されること、ここで cAMP により活性化した PKA により GCN5がリン酸化を受けるとヒストンアセチル化活性が亢進し、糖新生系酵素の遺伝子転写が活性化することを明らかにした。また CITED2 制御性メチル化酵素 SetU が培養肝細胞において、サーチュインファミリーの脱アセチル化酵素 X をメチル化し、その活性を調節していることを見出した。この調節機
構の代謝における重要性を in vivo で検証するために肝臓特異的 SetU 欠損マウスの作製も行った。さらに、CITED2 とその結合タンパクとして同定した Retinoblastoma タンパクとの相互作用が脂肪細胞分化における意義を 3T3-L1 細胞にて検証し、in vivo においても高脂肪食負荷 CITED2 ヘテロ欠損マウス用いて検証した。CITED2 制御性分子として同定したα-ケトグルタル酸と Fe2+依存性のジオキシゲナーゼに関しても、short hairpin RNA によるノックダウンの系で肝細胞代謝への影響を検討し、本分子が広範な絶食応答遺伝子の発現誘導に必須であることを見出した。これらのうち、大きく進展した GCN5 に関する研究の概要について以下に報告する。
アセチル化酵素 GCN5 による糖新生調節機構の解明A. 肝臓特異的 GCN5 機能欠損／獲得マウスの代謝表現型解析	  本年度はアデノウイルスベクターを用いて野生型 GCN5 ならびにアセチル化酵素活性を欠損する変異 GCN5（ΔAT）を肝臓特異的に強発現させ、その機能獲得が個体レベルでの代謝に与える影響を検討した。野生型 GCN5 は CITED2 と共発現させると、絶食時の糖新生系酵素の発現が増加し、肝糖新生の亢進により空腹時血糖値が上昇した。一方ΔAT にはこの作用は認められなかった。これらの結果
から、in vivo においても GCN5-CITED2 複合体は絶食時の糖新生系酵素の発現誘導に必要であり、この効果発現にはアセチル化酵素活性が必須であることが明らかとなった。
B. GCN5 による糖新生調節のメカニズム̶初代培養肝細胞を用いた in vitro での検討	  本年度から、GCN5 が cAMP・CITED2 依存性に基質指向性を変化させる分子メカニズムの検討に着手した。GCN5 が cAMP 依存的にリン酸化されることから、プロテインキナーゼ A（PKA）の関与を想定し、培養肝細胞における共沈実験・in vitro ヒストンアセチル化酵素アッセイなどよる検討を行った。その結果、GCN5 は CITED2、PKA と複合体を形成すること、cAMP 刺激により PKA 触媒サブユニットが活性化すると GCN5 がリン酸化されること、リン酸された GCN5 はその基質指向性をPGC-1αからヒストン H3 に変化させることを見出した。一方インスリンは、cAMP/CITED2 依存性の GCN5 の HAT 活性の増加を抑制した。また GCN5 内の PKA によるリン酸化モチーフを in silicoで探索し、モチーフ内の各種セリン・スレオニン残基をアラニンに置換した各種変異体を作製し、PKA依存的なリン酸化部位の同定を行った。その結果、275 番目のセリンが PKA 依存的なリン酸化部位であることを見出した。現在、同部位を各々アラニンないしアスパラギン酸に置換した恒常的非リン酸化型変異体 (S275A)・恒常的リン酸化型変異体(S275D)を作製し、アセチル化酵素活性・糖新生系酵素遺伝子の発現に及ぼす影響を検討中である。また、同部位のリン酸化が個体レベルでの代謝に与える影響を検討するために CRISPR/Cas9 システムを用いて S275A ノックインマウスならびに S275Dノックインマウスの作製に着手した。現在ヘテロノックインマウスの系統を樹立中である。

Subject No.

：26S301

Title	  	  	 ：Elucidation of the epigenetic regulatory mechanism of metabolism bytranscriptional coregulator CITED2 to identify target molecules for developing new therapeutic
drugs for type 2 diabetes
Researchers：Michihiro Matsumoto

Key words：Diabetes mellitus, Metabolic syndrome, Drug development, Molecular target,

Animal model for metabolic diseases
Abstract：This year, as planned, we carried out phenotypic analysis of skeletal

muscle-specific CITED2 knockout mice fed a high fat diet and muscle-specific CITED2 transgenic
mice on a chaw diet. We investigated the role of general control of amino acid synthesis 5-like 2(GCN5), an acetyltransferase, SetU, a methyltransferase, and a sort of dioxygenase in theregulation of hepatic glucose metabolism. We also sought to clarify the role of CITED2 and its
binding partner, retinoblastoma protein (Rb) in the regulation of adipose tissue mass. Herein, wepresent full details of the GCN5-related project that has progressed the most within this past year.
The role of GCN5 in the regulation of hepatic gluconeogenesis
Gluconeogenic gene induction via the cAMP–PKA (protein kinase A) pathway requires epigenetic
changes and assembly of transcriptional machinery at the corresponding promoters. Althoughvarious components of this machinery have been identified, how glucagon triggers epigenetic
changes has remained unclear. The histone acetyltransferase (HAT) GCN5 acetylates PGC-1αand thereby suppresses its transcriptional coactivator activity13–15, whereas the transcriptional
coregulator CITED2, which is induced by glucagon, binds to and suppresses this function of GCN5
and thereby activates PGC-1α16. The precise role of GCN5 in the regulation of gluconeogenesis
has remained unknown, however. Here we show that GCN5 functions as a PKA-regulated
acetyltransferase that integrates epigenomic modification and transcriptional coactivation tocontrol gluconeogenesis. The abundance of GCN5 was found to be increased in the liver of diabetic
animal models and in cAMP-treated hepatocytes. Depletion of hepatic GCN5 attenuated, whereasits coexpression with CITED2 increased, cAMP-induced gluconeogenic gene expression andglycemia. GCN5 recruitment to gluconeogenic gene promoters was induced by cAMP-PKA
signaling, and its inhibition attenuated epigenetic changes associated with active genetranscription. In response to cAMP accumulation, PKA phosphorylates GCN5 at serine-275,
thereby increasing its HAT activity and attenuating its PGC-1α acetyltransferase activity. This
substrate switch concomitantly promotes both epigenetic changes associated with transcriptional
activation as well as PGC-1α–mediated coactivation, thereby triggering the gluconeogenic
program. Our results have thus revealed the GCN5-CITED2-PKA module and an associated
GCN5 substrate switch as a key driver of a hormone-regulated pathway that integrates epigenetic
changes and transcriptional coactivation for efficient metabolic gene induction.

Researchers には、分担研究者を記載する。

26指301

2型糖尿病の創薬のための分子標的の同定に資する転写共役因子CITED2を中心とした代謝制御エピジェネティクスの解明	

平成26年度 事業実績要旨 （1）	報告者らは平成２３年度まで国際医療研究開発費（21指116）による助成を受け、転写共役因子CITED2がホルモンによる肝糖産生制御の鍵分子であり、２型糖尿病モデルマウスの高血糖に病因的な役割を果たしていることを報告した（Nat Med. 18:612-7,2012）。 本研究から、CITED2は肝臓以外の臓器においても代謝調節に関与し、その機能を抑制することが血糖値を低下させ、糖尿病の治療となる可能性が示唆された。すなわちCITED2の活性を調節する分子は、新規糖尿病治療薬の標的となると考えられた。
本研究では、CITED2の筋肉における代謝調節への関与を明らかにすると共に、これまでに同定したCITED2関連エピジェネティック酵素であるGCN5とSetUの代謝調節における役割を解明する。また、糖尿病治療の分子標的として新規CITED2制御性分子の同定・機能解析を行う。
平成26年度は研究計画に基づき、骨格筋特異的CITED2欠損マウスの高脂肪食飼育下での代謝表現型解析および骨格筋特異的CITED2トランスジェニックマウスの作製、肝臓におけるアセチル化酵素GCN5の糖新生調節の分子機構に関する詳細な解析、メチル化酵素SetUの機能を欠損した肝臓および肝細胞におけるによる代謝解析とSetUの相互作用分子の同定を行った。また、
CITED2ならびに結合分子Retinoblastomaタンパクの脂肪組織量調節における役割、ならびにCITED2制御性分子として同定した
ジオキシゲナーゼ (DioxY)の肝細胞代謝における役割の解析を進めた。以下にサブテーマごとの進捗について要旨を報告する。

肝臓GCN5の代謝制御エピジェネティクスの解明

骨格筋CITED2の代謝調節における役割の解明

肝臓特異的GCN5強発現マウスを用いた検討より
1.野生型GCN5の強発現はCITED2を共発現した場合にのみ肝糖新生系酵素の発現を誘導し、血糖値を上昇させた。これはアセチル化酵素活性を欠損する変異型GCN5では認められなかったことから、GCN5-CITED2複合体の形成とGCN5の酵素活性がともに糖新生に重要であることが明らかとなった。

ー骨格筋特異的CITED2欠損マウスを用いてー
1.高脂肪食飼育での代謝表現型解析を終了。通常食飼育と同様に対照と比べ差を認めなかった。
2.トレッドミルにより運動耐用能を検討するも対照と比べ差を認めなかった。
3.骨格筋特異的CITED2トランスジェニックマウスを作製し代謝表現型解析に着手した。

GCN5による糖新生調節のメカニズムーin vitroでの検討より
1.GCN5が、cAMP依存的にCITED2、PKAと複合体を形成し、PKAによりGCN5が175番目のセリン(S175)がリン酸化されるとヒストンアセチル化活性が亢進することを見出した。
2.GCN5 S175の恒常的な非リン酸化／リン酸化変異体（S175A,S175D）を作製し、アセチル化酵素活性・糖新生系酵素遺伝子の発現に及ぼす影響の検討に着手した。また、S275A/S275Dノックインマウスの作製にも着手した。

今後、CITED2欠損がトレーニング（有酸素運動や無酸素運動）による骨格筋の量や質の変化や全身の代謝に与える影響を検討する。また後肢懸垂による廃用性萎縮などの実験系を確立し、筋萎縮に対するCITED2の関与も検討する。

1	

26指301
平成26年度 事業実績要旨 （2）	CITED2制御性分子の探索
CITED2結合核タンパク
CITED2結合性核タンパクとして同定したRetinoblastomaタンパク(Rb)とCITED2の相互作用が、脂肪細胞のBiologyへの関与を検討した。共沈実験などからCITED2-Rb複合体形成が前駆脂肪細胞の増殖・分化に必要であり、CITED2がRbとcyclin-CDK複合体との相互作用を増強させ、本複合体によるRbのリン酸化・不活化を促進し、細胞周期回転を促進することを明らかにした。この結果、脂肪細胞分化のマスターレギュレーターであるPPARγの発現誘導が起こると推察された。また高脂肪食負荷CITED2ヘテロ欠損マウスを用いてCITED2の脂肪組織量や脂肪細胞数の調節への関与を検討した。
欠損マウスは脂肪組織量と脂肪前駆細胞数の減少に基づく肥満抵抗性を示し、CITED2がマウス脂肪組織においても脂肪前駆細胞の増殖を介して脂肪組織量を調節していることが示唆された。

肝臓SetUの代謝調節における役割の解明
昨年度、肝臓特異的SetU機能抑制マウスならびに初代培養肝細胞における機能喪失実験から、SetUの機能抑制が、グルカゴン/cAMP依存性の肝糖新生系酵素の発現誘導を抑制し、糖新生抑制に基づく血糖値の低下を起こすことを見出した。本
年度は、SetUと相互作用する分子として同定したサーチュインファミリーの脱アセチル化酵素の1つである分子Xと SetUとの相互作用の意義の検討、ならびにSetUの標的遺伝子の網羅的同定を行った。
1.SetUはin vitroで、脱アセチル化酵素Xをメチル化し脱アセチル化酵素活性を増強させることを見出した。
2.肝臓特異的SetU欠損マウスの肝臓、SetUノックダウン肝細胞を用いた検討からSetUの標的分子の候補としてG6pc,Pck1の他、Rev-erbαおよびSREBP2とそのターゲット遺伝子であるLdlr、Hmgcrなどを同定した。

CITED2制御性分子
報告者らが同定したCITED2の標的分子ジオキシゲナーゼY (DioxY)の標的分子の同定を行った。候補分子として糖新生系酵素（G6pc, Pck1, Pgc1a, Nr4a1-3）、アミノ酸異化系酵素 (Got, Sds,Hal, Bhmt, Tat)など広範な絶食応答遺伝子を見出した。これらの遺伝子発現誘導に関与する転写制御分子 (CREB, CRTC2, CBP,p300など)に対するDiox Yの関与についても検討を進めている。また、Diox Yの臓器特異的役割を検討するためのfloxマウスの作製を終え、現在、肝臓特異的欠損マウスを作製中である。

今後SetUのメチル化酵素としての特性や関与するエピゲノム変化を明らかにする。また、未同定の基質の探索に着手する。

＜平成26年度 研究発表・論文など＞
招待講演（松本道宏）
International Symposium for the Study of Obesity, Miyazaki, Japan,4th Annual Diabetes Conferences for Clinicians by Clinicians (DCCC) ,東京，第14回日本蛋白質科学会年会 ワークショップ 生命素子による転写
環境とエネルギー代謝のクロストーク制御，横浜，The 9th Atherosclerosis & Cardiovascular Research Conference, 東京
学会発表等	
第51回 臨床分子医学会学術集会２題（酒井真志人、八木孝他）、第87回
日本内分泌学会学術総会1題 (酒井真志人他、若手研究者シンポジウム )、2	

第57回日本糖尿病学会年次学術集会総会3題， (松本道宏、酒井真志人、八木孝他)、第35回日本肥満学会2題（八木孝 (YIAプレゼンテーション)、松本道宏他）、第１９回アディポサイエンス
シンポジウム2題（八木孝、松本道宏他）、第１回肝臓と糖尿病・代謝研究会 1題(八木孝他)、自然科学研究機構 生理学研究
所研究会 1題(松本道宏）、第29回日本糖尿病合併症学会 2題(八木孝、酒井真志人)、9th Metabolic Syndrome, Type 2
Diabertes and Atherosclerosis Congress 2題(酒井真志人、松本道宏（Poster award）他)

研究発表及び特許取得報告について

課題番号： ２６指３０１
研究課題名：２型糖尿病の創薬のための分子標的の同定に資する転写共役因子CITED2を中心とした代謝制御エピジェネティクスの解明
主任研究者名： 松本 道宏
論文発表
論文タイトル

著者

A Mutant Allele Encoding DNA-BindingDeficient Foxo1 Differentially
Regulates Hepatic Glucose and LipidMetabolism

MatsumotoM, Accili
D. 他

MatsumotoGadd34 regulates liver regeneration inM, Inoue
hepatic steatosis
H.他

掲載誌

掲載号

年

Diabetes

64(6)

2015年

Hepatology

61(4)

2015年

学会発表
タイトル

発表者

学会名

場所

年月

CITED2-GCN5 複合体による肝糖新生制御機構の解明

酒井 真志人 新学術領域研究 若手ワーク
他
ショップ＠伊香保

群馬2015/2/5

CITED2-GCN5 複合体による肝糖新生調節機構の解明

酒井 真志人 第26回分子糖尿病学シンポジウ
他
ム高知

2014/12/6

ヒストンアセチル化酵素GCN5はCITED2依存的に基質指向性を変化させ肝臓の糖新生を制御する

松本他

第37回日本分子生物学会ワークショップ 「食」と「カラダ」の相互作用：メタゲノミクスからニュートリゲノミクスまで

東京

2014/11/27

ヒストンアセチル化酵素GCN5による肝臓の糖新生調節機構の解明

酒井 真志人 他

第29回日本糖尿病合併症学会東京

2014/10/4

第29回日本糖尿病合併症学会

東京

2014/10/3

第14回日本蛋白質科学会年会
ワークショップ 生命素子による横浜
転写環境とエネルギー代謝のク
ロストーク制御2014/6/27

CITED2-GCN5複合体による肝糖新生調節機構 酒井 真志の解明
人 他

第87回日本内分泌学会学術総会
シンポジウム16若手研究者シンポジウム

福岡2014/4/25

CITED2-GCN5複合体を介して糖新生制御機構
松本の解明

道宏

自然科学研究機構 生理学研究
所研究会 臓器相関による生体制 岡崎
御システムとその変容の仕組み

2014/9/28

2型糖尿病の肝代謝障害の分子機構〜脂肪肝
松本と糖新生亢進を中心に〜

道宏

4th Annual Diabetes
Conferences for Clinicians by 東京
Clinicians (DCCC)

2014/7/4

第１回肝臓と糖尿病・代謝研究会

東京2014/7/4

The 9th Atherosclerosis &Cardiovascular ResearchConference

東京

2014/5/17

第29回日本糖尿病・肥満動物学会年次学術集会（若手研究奨励賞審査）

京都2015/2/13

肝臓特異的な脂肪酸合成酵素の欠損はob/ob
八木
マウスの脂肪肝と耐糖能を改善するが随時
他高血糖を惹起する
松本
CITED2-GCN5複合体による肝糖新生調節機構
他

過栄養による脂肪肝・糖尿病における肝臓
八木のde novo lipogenesis亢進の病態生理学的他意義の検討
インスリン抵抗性による肝代謝障害の分子機構–肝糖新生と脂肪肝を中心に–

松本

肝臓特異的な脂肪酸合成酵素の欠損はob/ob
八木
マウスの脂肪肝と耐糖能を改善するが随時
他高血糖を惹起する

道宏

孝

道宏

孝

道宏
孝

CITED2-GCN5 複合体による肝糖新生調節機構の解明

酒井 真志
人 他

第29回日本糖尿病・肥満動物学
会年次学術集会京都

2015/2/13

転写調節分子CITED2は癌抑制遺伝子産物Rbの不活化による前駆脂肪細胞の増殖を誘導し脂肪細胞分化を促進する

辻村–早川知子 他

第29回日本糖尿病・肥満動物学
会年次学術集会京都

2015/2/14

研究発表及び特許取得報告について

肝臓特異的な脂肪酸合成酵素の欠損はob/ob
八木
マウスの脂肪肝と耐糖能を改善するが随時
他高血糖を惹起する
肝臓特異的な脂肪酸合成酵素の欠損はob/ob
八木
マウスの脂肪肝と耐糖能を改善するが随時他
高血糖を惹起する

孝

第18回 日本病態栄養年次学術集
京都会

2015/1/11

孝

第35回日本肥満学会（YIAプレゼ
宮崎ンテーション）

2014/10/24

第35回日本肥満学会

宮崎2014/10/24

転写調節分子CITED2は癌抑制遺伝子産物Rbの機能調節を介して脂肪細胞分化を制御す
る

松本
他

道宏

転写調節分子CITED2は癌抑制遺伝子産物Rbの不活化による前駆脂肪細胞の増殖を誘導し脂肪細胞分化を促進する

松本
他

道宏

第19回アディポサイエンスシン
ポジウム

大阪

2014/8/23

孝

第19回アディポサイエンスシン
ポジウム

大阪

2014/8/23

道宏

第57回日本糖尿病学会年次学術集会

大阪

2014/5/24

孝

第57回日本糖尿病学会年次学術集会

大阪

2014/5/24

肝臓特異的な脂肪酸合成酵素の欠損はob/ob
八木
マウスの脂肪肝と耐糖能を改善するが随時他
高血糖を惹起する
転写調節分子CITED2は癌抑制遺伝子産物Rbの機能調節を介して脂肪細胞分化を制御する

松本
他

脂肪酸合成酵素FASの脂肪肝・インスリン抵 八木
抗性における機能の解析
他
ヒストンアセチル化酵素GCN5による肝臓の糖新生調節機構の解明

酒井 真志
人 他

第57回日本糖尿病学会年次学術集会

大阪

2014/5/24

13. ヒストンアセチル化酵素GCN5による肝臓の糖新生調節機構の解明

酒井 真志
人 他

第51回日本臨床分子医学会学術集会

東京

2014/4/11

14. 肝臓の脂肪酸合成酵素は肥満・糖尿病の病態において肝脂肪蓄積の促進と高血糖の抑制に寄与する

八木他

孝

第51回日本臨床分子医学会学術集会

東京

2014/4/11

道宏

第28回日本糖尿病・肥満動物学会年次学術集会シンポジウム２

宮崎

2014/2/15

9th Metabolic Syndrome, Type2 Diabertes andAtherosclerosis Congress京都

2014/9/13

CITED2-GCN5複合体による肝糖新生調節機構 松本の解明
他
The transcripional coregulator CITED2regulates adipocyte differentiation by 松本
interacting with retinoblastoma
他
protein.

道宏

Histone acetyltransferase GCN5
regulates hepatic gluconeogenesis
through CITED2-dependent substrateswitch.

酒井 真志
人 他

9th Metabolic Syndrome, Type
2 Diabertes andAtherosclerosis Congress京都

2014/9/13

Transcriptional coregulator CITED2
stimulates adipogenesis by enhancing
preadipocyte proliferation and PPARγ
expression through Rb inactivation.

松本International Symposium forthe Study of Obesity

宮崎2014/10/26

道宏

その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等)
タイトル

発表者

発表先

場所

年月日

登録日
(申請日)

出願国

該当なし
特許取得状況について※出願申請中のものは(発明名称)記載のこと。
特許権者(申請者）
登録番号（共願は全記載）

該当なし※該当がない項目の欄には「該当なし」と記載のこと。
※主任研究者が班全員分の内容を記載のこと。