ホワイトペーパー

分取 LC 精製の戦略

著者

はじめに

and Lakshmi Subbarao

や医薬品開発ラボにおいては、反応物のクリーンアップ、天然物の精製、不純物の単離など、精製の主

Ron Guilliet, Sami Chanaa,Agilent Technologies, Inc.
Wilmington, DE

分取 LC は、混合物から 1 つ以上のターゲット化合物を単離または精製する優れた手法です。創薬ラボな手段として用いられるようになりました。多くの場合、分取 LC ではまず分離を行い、サンプル内のターゲット化合物の存在を確認します。適切な分離ができると、純度、回収率、スループットについてメソッドを最適化してから、分取スケールにスケールアップします。

このホワイトペーパーでは、分析スケールから分取スケールにスケールアップする際の重要な手順の概要について説明します。本書の基本的なクロマトグラフィー原理と数学的原理を適用することで、予測可能な形でシームレスに分取精製へと移行できます。

適切な分離モードと固定相の選択

研究者はまず、適切なクロマトグラフィーモード、 つまり分離 モードを選択することになります。選ぶべきモードは、分析対象物の化学分離の最適化: 移動相•分離に最適な選択性•

移動相は次の点を考慮して選択します。

••

的性質や物理的性質 によって異 なります。表

溶媒純度 (低濃度の非揮発性混入物で揮発性 (単離したフラクションからの除去が容易)

粘度 (粘度が高いと背圧が上昇)

化合物に対する溶解能 (移動相中での•ベースラインノイズが増大する可能性)

1 に、一般的に使用されるクロマトグラフィー

サンプルの溶解)コスト•

モードを示します。

表 1. 一般的なクロマトグラフィーモード
逆相

順相

ほとんどの有機物質

油、脂肪、脂質などの脂溶性物質

メタノールまたは水溶液の混合物

イオン交換

酸、塩基、ペプチド、タンパク質、核酸などのイオン

サイズ排除

タンパク質、核酸を含むポリマー

水溶性緩衝液、水溶性緩衝液、有機溶媒

アセトニトリル、添加剤とエタノールアミン/塩酸

検出器の種類 (UV 透過、MS 互換性)

•

イオン溶液

キラリティ
エナンチオマー

水溶性溶媒または有機溶媒

有機溶媒揮発性緩衝液/最適 pH 範囲

アンモニア/酢酸

トリエチルアミン/炭酸アンモニア/炭酸アンモニウム
トリメチルアミン/炭酸アンモニア/ギ酸

トリメチルアミン/塩酸

トリエチルアミン/酢酸
トリメチルアミン/酢酸
アンモニア/酢酸

トリメチルアミン/ギ酸

緩衝液の残留を避けるため、揮発性緩衝液の濃度はピリジン/ギ酸

アンモニア/トリフルオロ酢酸

20 mmole/L を超えないようにしてください。

01

図 1. HPLC に一般的に用いられる揮発性緩衝液

2234567pH891011121314スループットの最適化:
サンプル注入量とオーバーロードのタイプ

カラムのオーバーロードには、次の 2 つの方法があります。

•液 をカラムに注入します。このとき注入させるためにカラムをオーバーロードします。
オーバーロードにより、ピーク形状がガウス分液 から沈殿する場合 があります。適切 なサン•

たフラクションから蒸発や凍結乾燥によって除去される溶媒量が少ないためです。

最も高い濃度を使用してください。

ができます。

注入量 のオーバーロード: サンプルの可分取スケールで可能 なロード量 を求 めること

溶性 が 低 い場合 は、注入量 のオーバープル量を求 めるには、ロード量の検証を実施
で、貴重 なサンプルを節約でき、溶媒消費量ない最も多い量を使用してください。

や廃液量を最小限に抑えられます。

濃度のオーバーロードの方が、注入量のオーバーロードより適しています。これは、採取しこうした 分析スケールでの 試験 の 結果 から、ロードを推奨します。同じサンプルを数します。分析カラムでロード量を検証することです。実用性の観点から言うと、一般的 には量 は 一定 にします。ピークの 割 れ (サンプル沈殿の兆候) や共溶出が発生しない

布 から三角形 に近 い形 へと変 わります。しかの共溶出が発生する場合や、分析対象物が溶る最大濃度を求めるために、低濃度から高濃度 まで数段階 の 濃度 のサンプル 溶

分取 LC では 一般的 に、スループットを向上

し、むやみにオーバーロードすると、不純物と濃度 (質量) のオーバーロード: 注入でき

この 2 つの 方法 を組 み 合 わせることも可能段階の容量で注入します。共溶出が起き注入量のオーバーロード

濃度のオーバーロード

標準の注入

図 2. 注入量と濃度のオーバーロードによるピーク形状3

メソッドのスケールアップ

1

分取 LC の結果を判定する 3 つの重要なパラメータは、純度、回収率およびスループットです。この 3 つのパラメータは相互依存している
ため、分取メソッドを 3 つのパラメータすべて回収率について同時に最適化することはできません。

6分2

最適化すべき最も重要なパラメータは、アプリケーションによって異なります。

図 3 に 示 すクロマトグラム 1 の 分取 HPLC

は、非常に高いスループットとなっていますが、純度スループット

2 つの化合物の分離が不十分です。各化合物

30 分3について高純度 のフラクションがある程度得られる可能性 はありますが、回収率 はかなり低くなります。クロマトグラム 2 では、ピークの分離が良好であるため、両方の化合物を高純度および高回収率で得られる可能性があります。しかし、スループットは 非常 に低くなっています。クロマトグラム 3 は、3 つのパラメータすべてのバランスが取 れた最適 な分取HPLC と言えます。

分析スケールから分取スケールへの迅速かつ簡単 な直線的スケールアップを実現するためには、分析カラムと分取カラムの両方 に同じ固定相と粒子サイズを充填して使用する必要があります。これは 次の 3 つの手順 にって可能になります。

1.

2.

分析条件の改善: pH、移動相、固定相などの適切 な分析スカウティング条件を特定し、分解能を最適化します。

サンプルローディングの最大化: 分解能が限界に達するまで注入量を増やすことで、分析カラムへのサンプルローディングを決定します。

図 3. 分取 LC の目標

3.

計算と直線的スケールアップ式 の 適用:

内径 が 小さいカラム (分析) から内径 が大 きいカラム (分取) に 移行するときにスケールアップしなければならないパラメータは、流量と注入量の 2 つです。粒子サイズ、固定相、移動相など、他のすべてのパラメータは一定にする必要があ

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カストマコンタクトセンタ

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アジレント・テクノロジー株式会社© Agilent Technologies, Inc. 2018
Printed in Japan, May 1, 20185991-9229JAJP

流量と注入量の直線的スケールアップ係数を方程式 1 および 2 を用いて求めます。

こうしたスケールアップ係数を正しく適用して注入すると、予測可能 な形でシームレスに分取スケール精製へ移行できます。

ります。

dP d2P
fp,P =fp,Pfa,A= fa,AdA dA

2d d2
Vinj,PV=inj,PVinj,A= Vinj,AP PdA dA2

ここで:
ここで:

ここで:
ここで:

dP = d分取カラムの内径= 分取カラムの内径P

dP = d分取カラムの内径= 分取カラムの内径P

fa,A =f分析カラムの流量= 分析カラムの流量a,AdA = d
分析カラムの内径= 分析カラムの内径
A

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10 分

方程式 1. 流量の分取スケールへのスケールアップ

Vinj,A V=inj,A
分析カラムの注入量= 分析カラムの注入量

dA = d
分析カラムの内径= 分析カラムの内径A
方程式 2. 注入量の分取スケールへのスケールアップ