課題番号：２７指１３０３
研究課題名 ：慢性B型肝炎の病態変動を検出するためのT細胞染色試薬の開発
主任研究者名 ：宮寺 浩子
キーワード ：B 型肝炎ウイルス (HBV)、慢性 B 型肝炎、ヒト白血球抗原 (human leukocyte antigens;(HLA)), MHC テトラマー
研究成果：
B 型肝炎慢性化、ウイルス排除、ワクチン応答には顕著な個人差があることが知られているが、そのメカニズムは不明である。近年、ゲノムワイド関連解析により、慢性 B 型肝炎に関連する最も強い遺伝要因がヒト白血球抗原(human leukocyte antigens; HLA) クラス II、なかでも HLA-DP と強く関連することが報告された(Kamatani et al. 2009 Nat Genet; Nishida et al. 2013 PLoS One; Nishida, Sawai et al.
2014 PLoS One).。HLA-DP はインターフェロン(IFN)治療効果とも関与するとする報告がある。これらの知見は HLA-DP 拘束性 T 細胞が抗 HBs 抗体産生において主要な役割を担うことを示唆するが、その詳細は明らかではない。一連の免疫応答に関わる HLA クラス II 拘束性エピトープおよびこれを認識す
る T 細胞を同定することが出来れば、HBV に対する免疫応答の詳細を明らかにする糸口となるだけでなく、B 型肝炎慢性化や再活性化等のリスクを予測する上でも有用である。そこで本研究では、HLA
クラス II の一つであり、B 型肝炎慢性化との関連が報告されている HLA-DP に着目し、HLA-DP 拘束
性 HBV エピトープを同定し、慢性 B 型肝炎の病態に伴う T 細胞免疫系の変動を明らかにすることを目的として研究を行った。そのため、まず HLA-DP が提示する HBV 抗原ペプチドを同定し、中でも T
細 胞 エ ピ ト ー プ と し て 重 要 な HBV 抗 原 ペ プ チ ド 領 域 を 明 ら か に す る こ と と し た 。 そ し て 、
HLA-DP-HBV 抗原ペプチド複合体を認識する T 細胞を染色するための試薬(MHC テトラマー)を開発することを目標として、以下の項目について研究を実施した。
1．HLA と合成ペプチドとの結合測定系の構築：
HLA-DP拘束性HBVペプチドを同定するため、HLA-DPが結合しうるペプチド領域を探索することとし、組換えHLAタンパク質と合成ペプチドとの相互作用を解析するためのアッセイ系を確立した（投稿準備中）。日本人集団に高頻度に維持される、以下に示すHLA-DPハプロタイプ６種類のDPアリル産物を組換えタンパク質として発現した。
・慢性肝炎抵抗性ハプロタイプ：HLA-DP0401 (DPA1*01:03-DPB1*04:01), HLA-DP0402(DPA1*01:03-DPB1*04:02), HLA-DP0201 (DPA1*01:03-DPB1*02:01)、
・感受性ハプロタイプ：HLA-DP0501 (DPA1*02-DPB1*05:01), HLA-DP0901 (DPA1*02:01-DPB1*09:01)、
・中立性ハプロタイプ: HLA-DP0301 (DPA1*02:02-DPB1*03:01)
これらのDPA1-DPB1ハプロタイプを哺乳類細胞株で組換えタンパク質として大量発現し、各HLA-DPアリル産物に結合するHBV抗原ペプチド領域を表面抗原(HBs) （59ペプチド）, コア抗原(HBc)（40ペプチド）をカバーする合成ペプチドライブラリーから探索した。その結果、特定のHLA-DPアリ
ル産物に結合するHBs, HBc領域を複数箇所同定した（投稿準備中）。さらに、短鎖ペプチドを用いた結合解析を行い、これらのウイルス抗原ペプチド配列とHLA-DPとの間の相互作用に大きく寄与するアミノ酸残基を推定した。しかし、疎水性ペプチドの場合は非特異的シグナルを生じるため本方法での測定が困難であった。また、数種類のペプチドについては合成が困難であったため測定を実施することが出来なかった。HBs, HBc ペプチドライブラリーの大半は疎水性が高いことから、これらの領域についてもHLAとの結合アッセイを行うためには、異なるアッセイ系を構築する必要があることが明らかとなった。
2. HLA-ペプチド発現アッセイの構築：
HLA-ペプチド相互作用を疎水性ペプチドについても解析するために、次に、「HLA-ペプチド発現アッセイ」を構築した。この方法では、HLAをペプチドとの融合タンパク質として培養細胞に発現し、内部コントロール(GFP)を用いることにより細胞表面HLA発現量を定量化する（Miyadera, et al. 2015 J.
Clin. Invest.; 宮寺・他 2016 日本臨床免疫学会会誌）。HLAはペプチドと強く結合するとタンパク質複合体が安定化し、細胞表面に高発現する性質を持つ。そのため、細胞表面のHLA発現量を測定することによりHLAとペプチドとの相互作用の相対的な強さを推測、評価することが出来る。この方法を用いることにより、疎水性領域を含むHBs, HBc全領域についてHLAとの結合性を測定することが可能であった。HLA-ペプチド発現アッセイを用いて、6種類のHLA-DPアリルについてHBs, HBc抗原を対象としたHLA結合領域探索を行い、特定のHLA-DPにアリル特異的、かつ強い相互作用を介して提示されう
るHBs, HBc抗原領域を複数箇所、見出した。また、他の疾患を対象として、この結合アッセイ系でT
細胞エピトープを検出しうることを検証した。これらの成果について現在、論文投稿を準備中である。
HLAが提示するHBs抗原領域についての知見は新規ワクチン開発において重要であるため、特許出願を検討中である。
3．MHC テトラマー発現系の構築：
HLA-DP が結合する HBV 抗原ペプチドの中から T 細胞エピトープを絞り込み、また、HLA-HBV ペ
プチド複合体を認識する T 細胞をヒト末梢血中に検出するため MHC テトラマーを作成することとした。MHC テトラマーは MHC-ペプチド複合体を４量体化および蛍光標識し、T 細胞受容体を特異的に検出するためのタンパク質試薬である。HLA クラス I の場合、MHC テトラマーは試薬会社等から入手可能な場合があるが、HLA クラス II については市販品が入手困難もしくは高額であるため、外部研究機関への委託、もしくは各研究者が作成する必要がある。本研究では、複数の HLA-DP アリルと HBV
抗原ペプチドの組合せから成る多種類の MHC テトラマーを使用予定であるため、MHC テトラマーを組換えタンパク質として大量発現、調整することとした。
HLA テトラマーを大量調整するため、まず、既に立体構造が既知である HLA-DQ0602 を材料として発現系の確立を行った。HLA クラス II テトラマー発現用のコンストラクトを設計し、HLA-DQ0602 について安定発現株を樹立した。また、培地中への HLA タンパク質分泌量を定量するための ELISA を構築した。具体的には、HLA-DQA1 と Acidic zipper (AZ)配列(酸性側鎖を配置したロイシンジッパー配列)、ビオチン化配列(BirA)を融合した HLAα サブユニット、HLA-DQB1 と Basic zipper (BZ)配列(塩基性側鎖を配置したロイシンジッパー配列)、His タグ配列を融合した HLAβ サブユニットを発現するベクターを各二種類（LTR プロモーター(pMXs ベクター(東京大学医科学研究所 北村俊雄先生より供与))、CMV プロモーター(pIRES ベクター(BD Biosciences))を持つ各ベクター）に挿入し発現ベクターを作成した。HLA テトラマーの大量発現は、一般的には昆虫細胞発現系を用いて行われる。しかし、多種類のアリルとペプチド複合体について高発現安定株を樹立するのは煩雑であるため、電気穿孔法を用いた哺乳類細胞での一過性発現を試みることとし、遺伝子導入装置を用いたタンパク質発現を試みた。発現プラスミドを mg 単位で大量調整し、遺伝子導入装置を使いて発現宿主細胞(細胞数 2x108)に電気穿孔法で導入し、導入後９日間、培地中に分泌される MHC テトラマー量を ELISA により経時的に測定した。同様の方法で、抗体タンパク質を大量発現出来ることが先行研究で報告されている。
二種類のプロモーター配列を用いて HLA を発現し、プロモーター間で発現量の違いが認められた。しかし、いずれの場合も期待したレベルでの MHC タンパク質発現が認められなかった。
このように、遺伝子導入装置を用いた一過性発現系において十分量の組換え HLA タンパク質を得られなかった。この理由として３点が考えられる。一点目は、培地に分泌された HLA タンパク質を同定する ELISA の感度が低かった可能性である。HLA 検出用の ELISA は市販されていないため、今回は粗精製 HLA タンパク質を標準品とした ELISA を構築したが、精製 HLA タンパク質の量に限りがあり、
ELISA の改良を短期間で行うことが出来なかった。また、培地中の成分（ウシ血清など）により、ELISAの感度が低下する傾向が観察された。そのため、今後、ELISA を改良する必要がある。２点目の理由
として、HLA を哺乳類細胞で発現し培地中に分泌させるためのシグナル配列が最適でなかった可能性が挙げられる。今回、HLA 遺伝子由来のシグナル配列を用いたが、既に宿主細胞での分泌発現が確認されている他のシグナル配列を用いることにより、HLA の細胞外分泌量を増加できる可能性がある。
また、発現ベクターのプロモーターを最適化する余地もある。今回、LTR プロモーター、CMV プロモ
ーターの二種類を用いて予備検討を行い、陽性コントロール（GFP）については、CMV プロモーターを用いた場合により高い発現が観察された。

今後、発現ベクターの改変などにより、当初の目標であった組換え HLA タンパク質の大量発現に近づける可能性があるが、研究期間および予算に限りがあるため、上記の方法での HLA テトラマー作製は一旦中断することとし、HBV 抗原を認識する T 細胞同定を当初の計画とは異なる方法によって進めることとした。
4. T 細胞エピトープ同定：
当初の研究計画では HLA テトラマーを作成することにより、HLA-DP 拘束性 HBs, HBc 抗原ペプチ
ドを認識する T 細胞を同定する予定であったが、HLA テトラマー作製が困難であったため、他の方法によって抗原特異的 T 細胞同定を進めることとした。具体的には、HLA-DP との結合が示唆された HBs,
HBc 抗原領域について HLA-DP との融合タンパク質を作成し、HLA-抗原複合体として培養細胞表面に安定発現させる。これを抗原提示細胞として用いて反応性 T 細胞をスクリーニングする予定である。
本研究は途中で計画の変更を伴ったが、最終的な目標である HBV 抗原を認識する CD4 陽性 T 細胞の同定に向けた知見を積み重ねつつあり着実に進展している。今後、ヒト検体での免疫学的研究を進めることにより、HBV に対する獲得免疫応答の機序解明に向けた糸口が得られると考える。

Subject No.

：２７指１３０３

Title：Development of T-cell staining reagent for the study of immune responses in chronic hepatitis B

Researchers ：Hiroko Miyadera
Key word：hepatitis B virus (HBV), chronic hepatitis B infection (CHB), human leukocyte antigens (HLA),HLA tetramer
Abstract：

Susceptibility to chronic hepatitis B (CHB) and HBV vaccine responses varies greatly among individuals. One of
the strongest genetic factors that might contribute to differences in HBV infections/vaccinations amongindividuals is the genes encoding human leukocyte antigen (HLA) class II. The strong association of HLA-DP
with CHB was identified by genome wide association studies (Kamatani et al. 2009 Nat Genet; Nishida et al. 2013
PLoS One) and further association studies (Nishida, Sawai et al. 2014 PLoS One). The association of other class IIloci, HLA-DQ and -DR with CHB have also been reported (Mbarek et al. 2011 Hum Mol Genet; Miki et al. 2013
PLoS One; Nishida et al. 2016 Sci Report). There findings indicate that HLA class II is one of the major factorsthat mediate adapted immune responses against HBV, however, the mechanism that might underlie the associationof HLA class II with CHB has not been fully elucidated. Therefore, we attempted to characterize immunologicalprocess of T-cell-mediated immunity against HBV infection in the development of CHB. HLA-DP alleles that areassociated with susceptibility or protection against CHB differs greatly in amino acid sequences and thepolymorphic amino acid residues are found in regions that participate in presentation of peptides. Therefore, it isexpected that CHB-susceptible and -protective HLA-DP alleles might differ in presentation of HBs antigens.
Based on these findings, we planned to identify HBs and HBc antigens that are presented by HLA-DP andfunction as T-cell epitopes and then develop HLA tetramer to analyze antigen-specific T-cells.
1. HLA-peptide binding assay
As the first step, we established in vitro HLA-peptide binding assay to identify HLA class II-restricted HBV
peptides. First, we prepared recombinant proteins encoded by the six HLA-DP haplotypes that are maintained athigh frequencies in the Japanese population, including HLA-DP0401 (DPA1*01:03-DPB1*04:01), HLA-DP0402(DPA1*01:03-DPB1*04:02), HLA-DP0201 (DPA1*01:03-DPB1*02:01), HLA-DP0501(DPA1*02-DPB1*05:01), HLA-DP0901 (DPA1*02:01-DPB1*09:01), and HLA-DP0301(DPA1*02:02-DPB1*03:01).
These recombinant proteins were obtained by large scale expression in mammalian cell line. Briefly, HLA-DPB1
was fused to His-tag at the C-terminus and used to establish HLA-DP stable cells. The HLA-DP stable cells were
cultured at large scale and the cell lysates prepared in the presence of detergents were applied to the plate that
captures His-tag. The binding of HLA with biotin-labeled synthetic peptide were detected by avidin-HRP. The
peptide libraries that cover the entire regions of HBs and HBc antigens were designed and used for screening.
Using this method, we analyzed HBs and HBc antigen peptide interaction with HLA-DP and identified several
regions that can be presented to HLA-DP. The in vitro assay worked well for limited numbers of peptides but notsuitable for large numbers of hydrophobic peptides in the HBs and HBc peptide libraries due to insolubility andhigh level of background signals. Moreover, it was not possible to synthesize certain sequences in HBs and HBc
peptides.

2. HLA-peptide expression assay
As the alternative to in vitro HLA-peptide binding assay, we next established an assay “HLA-peptide expression
assay” to measure the interaction of HLA with hydrophobic peptides. The assay was developed with modificationof HLA expression assay (Miyadera, H., et al. 2015. J Clin Invest). In the HLA-peptide expression assay, theexpression construct was designed as described in Kozono et al. (Nature 1994), with modification. Briefly, the
HLA-DPB1 was expressed in fusion with peptide by inserting nucleotide sequences that encode HBs or
HBc-peptides or negative control peptides between the signal sequence of HLA-DQB1*06:02 and the mature
protein region of HLA-DPB1 via linkers (SGG and GGGGSIEGRGGGGSGSA) at the N and C termini of thepeptide, respectively). The HLA-DPA1-his-tag and HLA-DPB1 (+peptide)-Strep-tag II were inserted into thepMXs-puro and pMXs-IG vectors, respectively. The retroviruses particles containing pMXs-puro/DPA1 andpMXs-IG/DPB1 were generated using PLAT-E cells as packaging cells (pMXs vectors and Plat-E cells were thegifts from T. Kitamura (The University of Tokyo, Institute of Medical Sciences)). HLA-DPA1–stable cells were
established through the transduction of NIH3T3 cells with a retrovirus containing pMXs-puro/DPA1 and selection
with puromycin (6 μg/ml). The DPA1-stable cells were transduced with a retrovirus containing pMXs-IG/DPB1.
Forty-eight hours after transduction, GFP and cell-surface MHC (in GFP-positive cells) levels were measured byflow cytometry using anti–HLA II β mAb or isotype control with phycoerythrin-conjugated anti-mouse IgG. The
MFI for GFP and MFI for MHC were used to calculate the increase in HLA expression relative to GFP. The ratio
of HLA expression relative to GFP was used as an indicator of HLA-peptide interaction. Using this assay, we
have screened the entire HBs and HBc antigens for the binding to HLA-DP.
3．Expression of MHC tetramer:
To identify T-cells that recognize certain MHC-peptide complexes, we next attempted to prepare MHC tetramers.
MHC tetramer is usually generated through tetramerization of soluble MHC protein with peptide and used for thedetection of antigen-specific T-cells through flow cytometry. The MHC tetramers for MHC/HLA class I can begenerated through large scale production in bacteria followed by refolding. However, generation of recombinant
proteins for MHC/HLA class II are not efficiently achievable in bacterial expression system and are usually
generated in insect cells and mammalian cells. We previously attempted to prepare MHC tetramers using insect
and murine cell lines but the level of expression was limited (data not shown). Therefore, we used alternative
methods, which is a large-scale transfection (electroporation) of tetramer expression vectors into mammalian cells
and transient expression. In this expression system, it has been shown that protein of interest can be expressed at
the orders of mg or gram. To verify whether this expression system is applicable for HLA tetramer expression, we
first generated tetramer expression construct for HLA-DQ0602 in fusion with hypocretin peptide, for which the
crystallographic structure has already been reported. The soluble region of HLA-DQA1 was fused with Acidic
zipper (AZ) and BirA at the C-terminus. The soluble region of HLA-DQB1 were fused with Basic zipper (BZ)
and His-tag at the C-terminus. These constructs were inserted into pMXs plasmid and pIRES plasmids (BDBiosciences), which express the gene of interest under LTR or CMV promoters, respectively. We then established
ELISA assay to monitor HLA protein levels in cell culture medium. The plasmids were prepared at mg scale andused for electroporation of host cells (2x108 cells). The level of the soluble recombinant HLA protein secreted in
the medium was monitored up to 9 days post transfection by ELISA. Among the two different promoters that weretested in this study, one of the promoter showed higher expression levels than the other, however, none of theexpression constructs secreted sufficient amounts of soluble HLA proteins in the medium.
The possible reasons for the low expression of HLA tetramers in this experiment would be the following. First,
the ELISA used for detection of HLA expression was not sensitive enough. Because the ELISA for the detectionof HLA-DP was not commercially available, we established in-house ELISA. Further modification of the ELISA
would be necessary to improve the sensitivity. Second, the signal sequence that was used in the current
experiment may not been appropriate for the cell lines used. The use of other signal sequences that have been
proven to be useful in this expression system may increase the expression and secretion of HLA in the medium.
Third, it would be possible to increase the expression levels using other promoters. To improve HLA protein
expression, it would be also necessary to reconsider the expression host and expression constructs.
4．Search for T-cell epitopes:
Because MHC tetramer preparation was not successful, we reconsidered the method by which to detect T-cell
epitopes. To this end, we are currently preparing cell lines that stably express HLA-DP-peptide complex for the
HBs and HBc peptides that showed strong binding to HLA-DP. These cell lines will be used as antigen presenting
cells in the T-cell assay or ELISPOT assay to identify potential T-cell epitope regions in HBs. By identifying the
HBs antigen regions that are important for activation of T-cells and production of neutralizing antibodies against
HBV, it would become possible to elucidate molecular basis of the key immunological responses against HBV.

国際開発研究費 報告書 (H29年度 報告書 （最終年度））
課題番号

27指1303 （主任研究者：宮寺 浩子）

研究課題名

慢性B型肝炎の病態変動を検出するためのT細胞染色試薬の開発

目的 ：・HLA-DP拘束性HBV抗原ペプチド（T細胞エピトープ）を認識する抗原特異的T細胞を同定することにより、B型肝炎に対する免疫応答機序を解明する。
・抗原特異的T細胞を染色するための試薬(HLAテトラマー)を開発し、B型肝炎の様々な病態でのT細胞の動態を明らかにする。
研究計画概要 / 進捗状況：

1. HLA-DP提示HBV抗原の同定
達成目標：HLA-DPアリル拘束性T細胞エピトープをHBs, HBc抗原から同定する。→

1. 順調に進展した。

2. T細胞染色試薬作成
達成目標：T細胞染色試薬(HLAテトラマー)の大量調製系を確立する。
→

技術的な課題があり計画を一部変更した。HLAテトラマーに代わる方法としてHLA-抗原複合体の安定発現株（抗原提示細胞）のパネルを作成し、これを用いたT細胞染色を行うこととした。
３. B型肝炎検体におけるT細胞染色
達成目標：HLA-DP拘束性HBV反応性CD4陽性T細胞を同定する。
→

当初の計画を一部変更して進めることとした。T細胞エピトープ探索を行うための、HLA-抗原複合体の安定発現株（抗原提示細胞）の作成を開始した。

背景１：B型肝炎慢性化の感受性には個人差があるが要因・機序は不明である

80-90%
母子感染
乳幼児期の感染

無症候性キャリア

DP0401, DP0402

無症候性キャリア

10-20%

慢性肝炎

背景３： HLAクラスIIがB型肝炎慢性化の抑制、促進に関わる機序は不明である

肝硬変

肝癌

・慢性化抑制と関連・ウイルス排除と関連・ワクチン応答と関連

慢性B型肝炎発症に至る免疫応答機序は不明である

CTL活性化
(Th1)

ウイルス排除

B細胞活性化(Th2)

中和抗体産生DP0501, DP0901

背景２：B型肝炎慢性化抵抗性・感受性とHLAクラスIIとの関連が見出された・慢性化と関連・ワクチン不応答と関連

？

慢性肝炎

HLA class II

HLA-DP
HLA-DPA1 DPB1

背景4：B型肝炎慢性化抵抗性・感受性と関連するHLA-DPB1ア
リルは抗原結合部位に多型性を持つため提示抗原が異なると推測される

Nishida N, et al. (2012) Pros ONE

Modified from Nishida, Sawai et al. 2014 PLoS One
DPB1

慢性B型肝炎とHLA-DPとの関連
Kamatani et al. 2009 Nat Genet; Nishida et al. 2013 PLoS One;
Nishida, Sawai et al. 2014 PLoS One

慢性B型肝炎とHLA-DR, -DQとの関連
Mbarek et al. 2011 Hum Mol Genet; Miki et al. 2013 PLoS
One; Nishida et al. 2016 Sci Report

抵抗性
感受性

DPB1*0402
DPB1*0401
DPB1*0201
DPB1*0301
DPB1*0501
DPB1*0901

8 9 11 35 36 55 56 57 65 69 76 84 85 86 87
L F G F V D E E I K M G G P M. . . . A A A . . . . . . . .
. . . . . . . . . E . . . . .
V Y L . . . . D L . V D E A V. . . L . E A . . . . D E A V
V H L . . . . D . E V D E A V

結果１－１

HLA-DP提示HBV抗原の同定

HLA-ペプチド結合解析法を確立し、HBs, HBcライブラリーからHLA-DPアリル特異的に結合する領域を見出した。

①組換えHLAタンパク質を用いたHLA-ペプチド結合測定法を確立し、HLA-DP結合HBV抗原ペプチドを同定した （データ非開示）

M Q L F H L C L I

preS1
10

1

20

30

40

50

30
10
20
I S C S C P T V Q A S K L C L G W L W G M D I

5040
D P Y K E F G A S V E L L S F L P S D F F P S I

60
R D L L

ビオチン化ペプチド60

M G G W S S K P R Q G M G T N L S V P N P L G F F P D H Q L D P A F G A N S N N P D W D F N P N K D H W P E A N Q V G A

preS2
70
80
G A F G P G F T P P H G G L L G W S P Q A Q G I

90100
L T T V P A A P P P A S T N R Q S G R Q P T P I

110120
S P P L R D S H P Q A M

N M G L K I

S
140
130
150
160
Q W N S T T F H Q A L L D P R V R G L Y F P A G G S S S G T V N P V P T T A S P I

HBs(表面抗原）
ペプチドライブラリー

200
190
G F L G P L L V L Q A G F F L L T R I L T I

S S I

70
80
D T A S A L Y R E A L E S P E H C S P H H T A L R Q A I

130R Q L L W F H I

HBc(コア抗原）
ペプチドライブラリー

140
150
S C L T F G R E T V L E Y L V S F G V W I

160
R T P P A Y R P P N A P I

250
C P G Y R W M C L R R F I

I

190
200
210
R G R S P R R R T P S P R R R R S Q S P R R R R S Q S R E S Q C

210
220
230
240
P Q S L D S W W T S L N F L G G A P T C P G Q N S Q S P T S N H S P T S C P

260
F L F I L L L C L I

Ni-NTA plate(96-well)

270
280
290
300
F L L V L L D Y Q G M L P V C P L L P G T S T T S T G P C K T C T I

TM2
310
320
P A Q G T S M F P S C C C T K P S D G N C T C I

S P T V W L S V I

370
380
W M M W Y W G P S L Y N I

P I

330
340
350
360
P S S W A F A R F L W E W A S V R F S W L S L L V P F V Q W F V G L390
L S P F L P L L P I

400F F C L W V Y I

TM3

TM4

Peptide[uM]
0
2

・DP0402
・DP0401
・DP0201
・DP0301
・DP0501
・DP0901
・Mock

・HBs(表面抗原）
・HBc(コア抗原）

組換えHLAを用いたペプチド結合アッセイ(C. Chen, manuscript in preparation)

5
10
20
50

Mock

z

組換えHLA-DP

Peptide_#2 (HBc)

DP*aa
DP*bb
DP*cc
DP*dd
DP*ee
DP*ff

DP*ee
DP*ff

DP*aa
DP*bb
DP*cc
DP*dd

Peptide[uM] Peptide_#1 (HBs)
0
0.01
0.05
0.1
0.25
0.5
1
2.5
5
10
20
50
Mock

170
180
L S T L P E T T V V R R

170180
F S R T G D P A P N M E N T T S

TM1
P I

アビジン-HRP

100
110
120
90
L C W G E L M N L A T W V G S N L E D P A S R E L V V S Y V N V

manuscript in preparation

結果１－２

HLA-DP提示HBV抗原の同定「HLA-ペプチド発現アッセイ」を構築し、HBs, HBc全領域からHLA提示領域を見出した

HLA発現アッセイの概要

HLA発現アッセイによる、HLA-DP結合スクリーニング結果（HBs, HBcペプチドライブラリー）（データ非開示）（Miyadera, et al. 2015 J. Clin. Invest. を改変）

①HLA-DPをHBsと融合

アッセイ系の詳細

signal sequence①HLAII α鎖 安定発現株
DR, DP, DQβ

ペプチド

DPA1

puroR

安定発現

(G9) GGGGGGGGG②HLAII β鎖を一過性発現(G12)GGGGGGGGGGGG（レトロウイルスベクター pMXs-IG)
異なるウイルス濃度（2～3点）で感染(GGS)GGSGGSGGSGGS

7.0

アリル１
アリル２
アリル３

HBs ライブラリー

Ratio to GGS12

6.0

HLA

ネガティブコントロール
DPA1

puroR

5.0
4.0
3.0
2.0

0.0

-ve ctrl

GFP

一過性発現

6

アリル１
5

ネガティブコントロール配列

x4

GFP

(内部コントロール）

アリル３

3
2
1
0

-ve ctrl

ds91
ds92
ds77
ds79
ds95
ds107
ds109
ds94
ds108
ds93
ds78
ds76
ds82
ds106
ds83
ds100
ds96
ds104
ds97
ds114
ds86
ds110
ds89
ds102
ds103
ds85
ds80
ds75
ds87
ds84
ds99
ds71
ds69
ds101
ds81
ds74
ds72
ds105
ds111
ds88
ds70
ds68
ds98
ds117
ds73
ds112
ds113
ds90
ds115
ds116

（ネガティブコントロール配列に対して何倍発現上昇しているか）

GFP

アリル２

4

ggs12
g9
g12

HLA

x1

ペプチドライブラリー #1

HLA-ペプチド結合アッセイで強く結合③HLA, GFP発現量測定

表面発現量の定量

GGS
g9
g12

線維芽細胞株で表面発現

GFP

Ratio to GGS12

②

IRES

ds31
ds35
ds37
ds57
ds36
ds29
ds20
ds32
ds49
ds19
ds42
ds27
ds46
ds43
ds40
ds28
ds34
ds48
ds51
ds50
ds26
ds39
ds41
ds44
ds47
ds22
ds25
ds30
ds33
ds21
ds23
ds24
ds54
ds53
ds52
ds38
ds55
ds45
ds56
ds58

1.0

DPB1

ペプチドライブラリー #2

HBs ペプチド

DP5-g9

DP5-HBs (p50)

弱い結合

強い結合

Miyadera, 臨床免疫学会会報(2017)manuscript in preparation

研究発表及び特許取得報告について

課題番号：

２７指１３０３

研究課題名： 慢性B型肝炎の病態変動を検出するためのT細胞染色試薬の開発
主任研究者名：宮寺浩子

論文発表
論文タイトルHLAクラスII結合ペプチドの探索・同定法の開発

著者

掲載誌

宮寺浩子、野口恵美
子、溝上雅史、徳永勝 臨床免疫学会会誌
士

掲載号
40(1)

年
2017年

学会発表
タイトル

HLA-DP提示B型肝炎ウイルス抗原ペプチドの探索

発表者

学会名

岡部由紀, Cindy ChiaJung Chen, 宮寺浩子, 第24回 日本組織適徳永勝士, 溝上雅史
合性学会大会

岡部由紀、Cindy ChiaScreening of the HLA-DP binding peptides from
第44回日本免疫学会
Jung Chen、宮寺浩子、
the HBV surface and core antigens
学術集会
徳永勝士

場所

年月

水戸市

2015年 9月

札幌市

2015年 11月

A large scale screening of HLA-binding
peptides from HBs and HBc peptide libraries

宮寺浩子、岡部由紀、
第25回アジア太平洋
Cindy Chia-Jung
肝臓病学会議年次総Chen、徳永勝士、溝上
会
雅史

東京

2016年 2月

Stability profiling of HLA class II protein
for disease association studies

The 13th
Miyadera, J. Ohashi, International
and K. Tokunaga
Congress of Human
Genetics

京都2016年 4月

A large scale screening of HLA-class IIbinding peptides from HBs and HBc peptide
libraries

The American
Miyadera H, Okabe Y,
Association ofChen C, Tokunaga K,
Immunologist (AAI)
Mizokami M
annual meeting米国

2016年 5月

HLA-DP提示HBs、HBc抗原領域の探索

宮寺浩子、岡部由紀、
Cindy Chia-Jung
第52回 日本肝臓学会
Chen、徳永勝士、考藤幕張
総会達哉、溝上雅史

2016年 5月

HLA class II protein stability and diseasesusceptibility.

16th International
Miyadera, J. Ohashi,
Congress ofand K. Tokunaga
Immunology

豪州

2016年 8月

HLA結合ペプチドの大規模探索法の開発

宮寺浩子、徳永勝士、 第44回 日本臨床免疫
東京
野口恵美子
学会総会

2016年 9月

HLAクラスII提示B型肝炎ウイルス抗原領域の探索

Large scale analysis of HLA-peptide
interactions

HLAクラスII結合ペプチドの網羅的解析法の開発

宮寺浩子、岡部由紀、
Cindy Chia-Jung
第25回 日本組織適合
札幌
Chen、徳永勝士、溝上 性学会大会
雅史
66th Annual Meeting
H. Miyadera, Y.
of the American
Okabe, K. Tokunaga,
カナダ
Society of Human
E. Noguchi
Genetics
宮寺浩子、野口恵美
日本人類遺伝学会第子、徳永勝士、溝上雅
62回大会
史

神戸

2016年 10月

2016年 10月

2017年11月1日

研究発表及び特許取得報告について

その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等)
タイトル

発表者

発表先

場所

年月日

特許権者(申請者）（共願は全記載）

登録日(申請日)

出願国

該当なし

特許取得状況について※出願申請中のものは()記載のこと。

発明名称

該当なし

※該当がない項目の欄には「該当なし」と記載のこと。
※主任研究者が班全員分の内容を記載のこと。

登録番号