平成28年10月11日（火）17:00-18:30

神戸大学
計算化学教育センター

計算生命科学の基礎Ⅲ
ゲノムに記された遺伝ビッグデータを読む
ーヒトゲノム計画から大規模個人ゲノム解読時代の到来までー

岩手医科大学 いわて東北メディカル・メガバンク機構
生体情報解析部門 部門長代理 特命教授
清水 厚志

0

本日の内容• ヒトゲノム計画• 次世代シークエンサー概要• 個人ゲノム解読• ゲノム解読の課題

1

ヒトゲノム2

ゲノム（Genome）

Genome = Gene + ome
Body

Cell

DNA

Chromosome

eGenwikimedia.org

wikimedia.org

Gene

Methylome = Methylation + -ome
GenomeTranscriptome = Transcript + -ome
Proteome = Protein + -ome
Metabolome = Metabolism +‎ -ome
and kinome, lipidome, glycome etc ...
3omicsヒトの核型

2n = 46

from Na/onal Ins/tutes of Health

4St. Rosemary Educa/onal Ins/tu/on.
"Cell Cycles: Interphase, Mitosis, Cytokinesis."

染色体異常ダウン症候群(47,XY,+21)

from Na/onal Ins/tutes of Health691出産に１件（米国）

5hFp://www.prenatal-diagnosis.info/ Oct. 4 2016

染色体異常クラインフェルター症候群
47, XXY

1/500 to 1/1000
live male births

6ターナー症候群
45, XO

1/2000 to 1/5000
phenotypic females

Image source : genmed.yolasite.com

性染色体▲ PAR; Pseudoautosomal region
hFp://genomeref.blogspot.jp/2013/09/tech-/p-pseudo-autosomal-region-of.html Oct.4 2016

CC BY-NC-SA by Jenny GravesX染色体不活化により遺伝子機能としては１本として扱える。

7Source: Na/onal Academy of Sciences

ゲノム解析の際には XとYを区別する必要がある。

Genome Res. 2008 Jul; 18(7): 1030–1042.

DNAシークエンシング

8

DNA と RNA

ACGT/UDNA 二重らせん

水素結合
A-Tは2本G-Cは3本二重らせんの安定性は水素結合によって維持
10

サンガーシークエンス法
Dideoxy 法、Sanger 法
DNA鎖合成に必要なdNTPに3ʼ-OH基を欠いた一定量ddNTPを混ぜることで、「DNA鎖の合成をランダムに終了させ、異なる長さのDNA鎖を合成させる方法」である。
PCRの原理を組み込むことでサイクルシークエンシング法に発展し、微量の試料からのシークエンシングが可能となった他、放射性ラベルから蛍光ラベル、ゲルではなくキャピラリーを用いるシークエンサーが開発されたことで、ヒトゲノム計画の主流となった。現在ではDye terminator 法が主流。

プライマーP

PA

T

P
POH H

O

P

GCH2PO
CH2

T

H2O

O
O-P=OX

PO
HH

OH H

G

CH2ddNTP
HdNTP
11

鋳型DNA
3ʼ

H

C

キャピラリーシークエンサーの原理
Chain-termination法 (dideoxy 法、Sanger 法)

hFp://www.adfg.alaska.gov/index.cfm?
adfg=ﬁshinggeneconserva/onlab.microsatellite_dna_anal
ysis Oct.4 2016

hFp://jgi.doe.gov/archived-educator-resources/sanger-sequencing-archive/how-sanger-sequencing-isdone/step-10-capillary-sequencing/ Oct.4 2016

キャピラリーと呼ばれる極細の金属チューブに粘性の低いゲルをつめることで平板のゲルの作成が必要なくなった。
自動化が進み、解読速度が大幅に向上した。
12by sigmaaldrich次世代シークエンサーの種類
第一世代（キャピラリーシークエンサー）と次世代シークエンサーの違い
塩基配列決定時に電気泳動を必要としない。

第二世代と第三世代シークエンサーの違い
鋳型のPCR増幅が必要ない。

第三世代と第四世代シークエンサーの違い
蛍光色素を使わない。

次世代シークエンサー
第二世代
Roche

Illumina

Complete Genomics
QIAGEN

13

第三世代
Life Tech

Helicos

PacBioAzco Bio

第四世代
OxfordSequencing-by-synthesis
Polony Sequencing 法

(B)

(A)

Nature Reviews Genetics 11, 31-46

プライマーが結合した基盤上で鋳型をPCRにより増幅し、鋳型DNAのクラスター（Polony）を形成させる(A)。増幅した鋳型にプライマーをアニールさせる。蛍光ラベルした４種類の塩基を順次加え、撮影したDNA
ポリメラーゼの１反応ごとのイメージを配列に変換する(B, C)。世界で最も使用されている次世代シークエンサーである。

(C)

HiSeq2500

14配列データ取得方法；線と面
キャピラリーシークエンサーと次世代シークエンサーの違い

TGGA
CTT
CCTCT
C
T TC CT AA
TC C
C CA A GC
T A
A AC C T
T
C CT GT G GC
T
T T G GTT
G G TG G T G
T TG GTG G GTAC

CCDカメラA
CT
A
T
GC
C

15

“線”のデータ取得

キャピラリーシークエンサー

AATGAGGGAACGCATGCTGATGTAGATGGAAGCTAGCTAG
TGCTGATAGTGGCTAGTAGACGCTAGTAGTGCATGTATAC“面”のデータ取得

次世代シークエンサー

次世代シークエンサー各機種性能概要

PacBio Sequel16

ヒトゲノム計画

17

ヒトゲノム計画
Apollo program (1961-1972)

Human Genome Project (1991-2003)$2.7-billion$25.4-billion

18ヒトゲノム解読の歴史（１）
1928年
1945年
1952年
1953年
1968年
1970年代
1984年
1985年
1987年
1988年

形質転換因子の発見（グリフィス）
形質転換因子がDNAであることを証明（エイブリーら）
DNAが遺伝物質であることの証明（ハーシーとチェイス）DNA２重らせんの発見（ワトソンとクリック）
遺伝暗号表の完成（コラーナら）
DNA配列決定法の確立（サンガー、マキサム、ギルバート）
ヒトゲノム計画発案（シンスハイマー）
ヒトゲノム計画初の会合（シンスハイマー）
DOE（エネルギー省）からヒトゲノム解析予算獲得（デリシ）ヒトゲノム解析機構（ＨＵＧＯ）の創設（ワトソン）
National Center for Human Genome Research の創設
NIH（アメリカ国立衛生研究所）からゲノム解析予算獲得（ワトソン）

James D. Watson

19

Robert L. Sinsheimer
hFp://oralhistories.library.caltech.edu/Charles DeLisi
hFp://www.os/.gov/

The Human Genome Organisation

ヒトゲノム解読の歴史（２）1991年

ヒトゲノム計画開始（ワトソン、15年で完成を目指す）

1992年

ヒトゲノム計画のリーダーがコリンズに交代

1994年

ヒトゲノム遺伝子地図の完成

1996年

バミューダ会議（第１回国際戦略会議）

1998年

Celera社がヒトゲノムを３年で解読すると発表（ベンター）

1999年

２２番染色体配列発表（日・英・米）

2000年

２１番染色体配列発表（日・独）2000年

ヒトドラフト（概要）配列発表

2001年

ヒトドラフト配列論文発表

Francis Collins

Bermuda MTG
20

Craig Venter

Chr.22 Press releaseヒトゲノム概要配列と成果を発表

Time cover, July 3, 2000

和田 (藤山) 榊
理研
21

清水蓑島

慶應

菅原DDBJ
平成12年6月26日

ヒトゲノム解析の戦略

222000年頃のヒト８番染色体の解読状況

232001年頃のヒト８番染色体の解読状況

24

ヒトゲノム解読の歴史（３）2002年

横浜会議（第12回最終国際戦略会議）

2003年4月

全ヒトゲノム配列発表

2004年10月 ヒトゲノム計画終了宣言

Yokohama MTG

25

Nature Oct 21; 431 931-45 (2004）

2003年 ヒトゲノムプロジェクトの完了宣言
真正クロマチン領域の95%を解読
テロメア

紫が真性クロマチン
オレンジがヘテロクロマチン
セントロメアGene Number>100,000
100,000
80,00060,00040,00032,00020,00020,68722,287
2012

2005

2004

Sequence :Gap :Protein-coding
Gene Number :Error Rate:
Tiling Path:

2001

1993

1985

1980

26

39,0872.85 Gb
341 (308 in euchromatin)
22,287 (20,000~25,000)~1 / 100,000 bases
26,720 clones

ヒトゲノムの構成（2000年頃）
coding genes
conserved regionsbetween human andmouse27