特集

学生の研究活動報告−国内学会大会・国際会議参加記 26

日本陸水学会第 81 回大会に参加して
垣2.2

材料と方法

2.2.1

野外実験

2014 年 4 月に琵琶湖の内湖の 1 つである伊庭内

希湖（35°11’N, 136°08’E）で水試料の採取し，47­mm

Naoki KAKIMI

ガラス繊維濾紙（GF/F，孔径 0.7 μm ; GE Healthcare

環境ソリューション工学専攻修士課程

見直2016 年度修了

Japan, Tokyo, Japan）で 500 mL の 湖 水 を 濾 過 し，環境 RNA 試料とした．環境 RNA 試料は濾過後，1．はじめにRNAlater（AM 7021, Ambion, Foster City, CA, USA）

私は 2016 年 11 月 3 日から 6 日に琉球大学で開催に浸漬して抽出まで保存した．

された日本陸水学会第 81 回大会（那覇大会）に参

環境 RNA 試料は RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit

加し，「野外における魚類由来の環境 RNA 回収・（cat. no.74704, Qiagen, Hilden, Germany）で抽出し定量の試み」という題目でポスター発表をおこなっ−80℃ で逆転写反応まで保存した．環境 RNA のた．

存在形態が不明であったことから，濾紙から RNAを抽出する過程で proteinase 処理の有無による収量

2．研究内容2.1の違いについて検討を行った．また，サンプリング地点間で環境 DNA および環境 RNA の存在量に違はじめに近年，環境水に含まれる DNA 断片を検知し生物いがあるかを調べるため，2014 年 9 月に伊庭内湖

種を特定する環境 DNA 分析が注目されている．環において各 6 地点から試料水を採取し，それぞれ定境 DNA 分析では生物の在／不在のモニタリング

量 し た．環 境 RNA 試 料 は RNeasy Fibrous Tissue（Ficetola et al. 2008 ; Minamoto et al. 2012）や生物

Mini Kit を用いて抽出し−80℃ で逆転写反応まで量 の 推 定（Takahara et al. 2012 ; Thomsen et al.

保存した．環境 DNA 試料は DNeasy Blood & Tis­2012）が行なわれている．しかし，環境 DNA 分析

sue Kit（cat. no.69504, Qiagen, Hilden, Germany）をでは資源管理において重要な指標となる代謝や産用いて抽出し，PCR まで−20℃ で保存した．抽出

卵，ストレスなどの生物の状態を推定することは不した環境 RNA サンプルは PrimeScriptTM RT reagent

可能である．生物の代謝や産卵状況などのモニタリKit（Perfect Real Time）（RR 047 A，タカラバイオング手法としておこなわれる捕獲や目視調査などで（株），大津市，日本）を用いて逆転写反応を行ないは広範囲を調査することは困難である．ここで，生相補的 DNA（cDNA）を合成し PCR まで−20℃ で物の代謝を反映することで知られる RNA（Palstra保存した．環境 DNA および環境 RNA の定量はコet al. 2010）に着目す る．こ の RNA を 環 境 DNAイ（cyprinus carpio L.）のミトコンドリア，チトクと同様に環境水中から回収することで生物の活動をロム b 領域を対象とし，この領域を特異的に増幅推定することが可能になると考えられる．しかし，できる既存のプライマープローブを使用した．定量

RNA は分解されやすく環境水からの分析は困難で

PCR は Step One­PlusTM Real­Time PCR（Life Tech­あると考えられる．このことから，本研究は環境

nologies, City of Carlsbad, CA, USA）を用いて定量RNA 分析手法を確立することを目的として，野外PCR により定量した．

における環境 RNA の回収の試みと水槽による環境2.2.2

RNA の持続性について検証した．

環境 RNA の持続性の検証

対象種はコイとして，供試魚 3 個体を試験用水槽（60×30×36 cm：約 57 L, 7­19 時 の 12 時 間 明 期）
で 5 日間馴化した．水温は 20℃（n＝4）と 30℃（n― S­23 ―＝3）として，馴化後各水槽から飼育水を 4 L を採定量することが可能であることが明らかになった．

水した．採水後に飼育水と等温で濾過行程まで保存

また，proteinase を用いた抽出方法が用いない場合した．試料水は採水直後および 3, 6, 12, 24 時間経に比べて格段に効率よく環境 RNA を回収できるこ

過ごとに RNA 用サンプルとして 300 mL, DNA サとが示された．このことから，環境 RNA は細胞やンプルとして 150 mL をガラス繊維濾紙で濾過し細胞小器官などの膜構造に含まれた状態で環境水中た．に 存 在 し て い る こ と が 考 え ら れ る．ま た，環 境

濾過後はろ紙から RNA を NucleoSpin RNA Plus

RNA の持続性についても長時間水中に存在してい（740984.50, MACHEREY­NAGEL, Düren, Germany）

ることが明らかになったことから，環境 RNA を用を用いて抽出を行ない，野外実験と同様に cDNAいて水試料のみから生物の生理的状態を推定できるの合成を行なった．また，DNA 用サンプルも野外可能性が高まったといえる．

実験と同様に DNA を抽出を行ない，定量 PCR により分析した．cDNA 濃度は環境 DNA 濃度で補正して cDNA 相対量の経時変化および水温間で比較

3．おわりに学会では発表を通して様々な意見を頂くことができました．最後に，研究や学会発表に関して指導いした．

ただきました山中裕樹講師に深く感謝いたします．
2.3

結果

野外実験より環境水から環境核酸を回収し，抽出，定量できることが確認された．環境 RNA については proteinase を添加した試料において，添加し引用文献
Ficetola GF, Miaud C, Pompanon F, Taberlet P（2008）Spe­
cies detection using environmental DNA from water sam­ples. Biology Letters, 4 : 423­425.ていない試料より 10 倍程度多く環境 RNA を回収

Minamoto T, Yamanaka H, Takahara T, Honjo MN, Kawabata

できた（Welch’s t­test, p＜0.05）．湖内の 6 地点中，

Z（2012）Surveillance of fish species composition using

3 地点で定量 PCR の定量限界以上の環境 RNA を

environmental DNA. Limnology, 13 : 193­197.
Palstra AP, Tudorache C, Rovira M, Brittijn SA, Burgerhout

回収でき，定量することができた．
環境 RNA の持続性については採水後 24 時間後も採水直後と同様に環境 RNA が検出された（Wil­coxon rank sum test, p＞0.05, n.s.）．また，採水直後

E, Thillart GE, Spaink HP, Planas JV（2010）Establishingzebrafish as a novel exercise model : swimming economy,
swimming­enhanced growth and muscle growth marker
gene expression. PloS One, 5（12）, e14483.の cDNA/DNA 比に水温間で差 は 見 ら れ な か っ た

Takahara T, Minamoto T, Yamanaka H, Doi H, Kawabata Z（Steel­Dwass test, p＞0.05, n.s.）．

（2012）Estimation of fish biomass using environmental
DNA. PLOS ONE, 7 : e35868.
Thomsen PF, Kielgast J, Iversen LL, Wiuf C, Rasmussen M,

2.4

考察

Gilbert MT, Orlando L, Willerslev E（2012）Monitoring

本研究の結果から，分解速度が早く野外では回収が困難であると考えられていた RNA を環境水から

endangered freshwater biodiversity using environmental
DNA. Molecular Ecology, 21 : 2565­2573.

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