課題番号：２４指１１５
研究課題名：MODY患者由来のiPS細胞を用いた糖尿病の発症機序ならびに病態の解明
主任研究者名 ：大河内仁志
分担研究者名 ：安田和基、岩﨑直子
キーワード：MODY, iPS 細胞、膵β細胞、糖尿病
研究成果
MODY は、ヒト糖尿病の単一遺伝子病モデルとして Fajans らにより１９７０年代に提唱された、常染色体優性遺伝を示す若年発症糖尿病である。臨床的には、インスリン分泌不全が病態の中心であるが、マウスでは MODY の病態を再現することはできず、ヒト組織で解析する必要がある。これまでに３種類の MODY４症例（MODY1 が１例、MODY3 が 2 例、MODY5 が１例）の患者から iPS 細胞を樹立したので、本研究では膵β細胞の効率的な分化法を検討することを目的とする。
大河内仁志：（１）iPS 細胞から膵臓β細胞への分化と機能解析
ヒト iPS 細胞から膵臓β細胞を分化誘導する in vitro の実験系において、培養法に検討を加えて、健常人由来の iPS 細胞と MODY 患者由来の iPS 細胞からインスリンを産生する細胞の誘導に成功した。そもそも iPS 細胞は同じ線維芽細胞から樹立しても株毎に性質が異なることがわかり、報告されているプロトコールに従ってもなかなか結果を再現できなかったので、細胞株毎に培養条件の最適化が必要と考えた。膵臓の発生段階を模倣した培養プロトコール
において、最初の段階の definitive endoderm への分化が鍵を握ると考えて、内胚葉のマーカーである SOX17 の発現を指標にして検討した。Activin に加えて GSK-3β の阻害剤である
CHIR99021 と FGF2 と BMP4 を添加すると、ほぼ 100% SOX17 が陽性となった。特に分化の最終段階において細胞を培養皿からはがして、強制的に凝集塊を作らせると膵臓β細胞の成熟化が促進することを見いだした。インスリンの産生量も 5000-20000pg/well と昨年よりさらに１０倍以上に増加し, in vitro で高濃度グルコースに反応して 2 倍程度のインスリン分
泌を示すようなグルコース応答性をもつ膵臓β細胞を誘導できるようになった。凝集塊の免疫染色にて c-ペプチド陽性を示すインスリン産生細胞は 30-40%に認められた。グルカゴン陽性細胞は 10%未満であった。免疫不全マウス（NOD/SCID）にストレプトゾトシン（STZ）を投与して糖尿病モデルマウスを作製したのち、これらの細胞 4x106 個を腎被膜下に移植して、血糖降下を検討した。高血糖状態の長く続いたマウスに細胞移植すると随時血糖測定においてほとんど血糖降下は認められなかった。移植して４週間以降の腎臓の組織を検討した所、移植細胞の生着は確認されたが、ほとんどの細胞はグルカゴン陽性のα細胞になっていることが判明した。
（２）MODY 患者由来の細胞から変異 mRNA の検出
MODY3 患者において HNF-1αの P291fsinsC の変異によるフレームシフトがおこり、PTC（premature termination codon）が生じることが予想される症例を検討した。患者由来 iPS細胞からβ細胞に誘導した細胞から mRNA を抽出し、PCR で増幅し、ゲノム配列を解析したところ、確かに変異 mRNA が存在することが証明できた。MODY の遺伝子変異はヘテロ変異なので、理論的には正常と変異 mRNA の発現は半々のはずであるが、正常の HNF-1αの mRNA に比べて変異 mRNA は少量であり、NMD(nonsense mediated decay)が生じて変異 mRNA が速やかに分解されていることが示唆された。そこでシクロヘキシミドを添加してタンパク合成を阻害
すると、変異 mRNA の量が相対的に増加したことより、実際に NMD が起こっていることが証明できた。次に MODY5 の患者においても HNF-1βにおける R177X 変異による nonsense 変異で PTCが形成されると予想されているので、同様に mRNA の解析をした。変異 mRNA の検出はできたが、シクロヘキシミドを添加してタンパク合成を阻害すると、変異 mRNA の量が相対的に増加したことより、やはり NMD が起こって分解されていることが示唆された。MODY においては変異タンパクによる dominant negative 効果が発症原因であるという説があるが、本症例において変異 mRNA は速やかに分解されているので、変異タンパクが蓄積するとは考えにくく、む
しろ haplo-insufficiency によるものと考えられた。これらの結果は Journal of Diabetes
Investigation に投稿し、受理された。
安田和基：MODY 由来 iPS 細胞を用いた、糖代謝関連分子の探索と機能解析
1.
健常人、及び MODY3 患者一名から、レトロウイルスを用いて確立した iPS 細胞（それぞれ 6 株、4 株）と、センダイウィルスを用いた iPS 細胞（それぞれ 4 株、2 株）について、Affymetrix 社 GeneChip システムにより、遺伝子発現を網羅的に比較した。
その結果を以下に記す。
1） 同一人から同じ方法により確立した iPS 細胞についても、株間で遺伝子発現に違いがみられるが、その差は比較的小さく（２倍以下のことが多い）、特に機能的なパ
スウェイなどで一定の傾向は認めなかった。
2） 同一人から、センダイウィルスとレトロウィルスという異なるベクターを用いて作製した iPS 細胞同士では、発現に２倍以上の変化がみられる遺伝子も少なくないが、株間で差がみられ、使用したベクターによる一定の傾向は認められなかった。
LOC51142 という遺伝子の発現が、健常人、MODY 患者に共通して、レトロウィルスで作成した iPS 細胞のほうで低下していたが、この遺伝子の機能は知られておらず、遺伝子発現低下の意義は全く不明である。
3） 由来する個人による発現遺伝子の差では、２倍以上の差が再現性よく認められる遺伝子が相当数みとめられたが、遺伝子レベルで検討すると、MODY 患者由来 iPS 細胞
で発現が大きく上昇している遺伝子の多くが Y 染色体の遺伝子であった。この傾向
は特にセンダイウイルスで作製した iPS 細胞で顕著で、 MODY 由来で発現が増加している遺伝子の９割前後が Y 染色体遺伝子であった。またレトロウイルス、センダ
イウイルスの両者で共通に、MODY で増加していた遺伝子も多いが、そのほとんどが
Y 染色体遺伝子であった（ZFY、EIF1AY、DBY、TTTY15 など）。分担研究者は性別を知らされていなかったが、後日健常対照、MODY 患者がそれぞれ女性、男性だったことが判明した。ただし、こうした遺伝子の多くは精巣での発現が報告されており、獲得した未分化性との関連も否定できない。
4） レトロウイルスで作製した iPS 細胞では、このほかにも個人による発現差が大きい
遺伝子が散見された。特に MODY 由来の iPS 細胞で、健常対照者由来 iPS 細胞に比べ、細胞外基質やその代謝に関連する遺伝子の発現増加をみとめた（LUM、COL3A1、
HAPLN1 など）。これらは MODY 遺伝子との関連は考えにくいため、個人の遺伝的背景の違いを反映する可能性が高いが、もとの皮膚線維芽細胞の性質が少し残ってしまっている可能性もあり、DNA メチル化状態など、ほかの方法で iPS 細胞の「質」の検討が必要かもしれない。
以上のように、同一人に由来する iPS 細胞の遺伝子発現は、作製法の違いによらず予想以上に近似しており、一方で由来する個人の差を大きく反映していた。
2. MODY 原因遺伝子の多くは転写因子であるが、膵β細胞における転写因子の役割としては、
細胞特異的な分子の転写のほか、膵β細胞の発生・分化、増殖、分化度の維持、などへの寄与も注目されている。そこで膵β細胞に最も重要な転写因子の一つである MafA を対
象にマウスでこうした点を検討した。MafA 欠損マウスでは、生下時の膵β細胞数は野生型と有意差はないが、その後 4-8 週で膵β細胞量が野生型より少ないことから、MafA が生後の膵β細胞の増殖に必要なことを示した。MafA の標的遺伝子のうち、この膵β細胞増殖作用を仲介する可能性のある分子として、プロラクチン受容体（Prlr）、及びサイ
クリン D2（Ccnd2）を報告した（Eto K et al, PLoS One 2014）。また細胞の運命を追跡する lineage tracing の手法により、MafA 欠損マウスでは、インスリン陽性細胞が、

インスリン発現を失った内分泌細胞になり、ごく一部はグルカゴン陽性細胞に「分化転換」してしまうことを明らかにした。膵β細胞からα細胞の転換は、糖尿病などの MafAの発現が低下した状態でも報告され近年注目されており、MafA が成熟した膵β細胞の分化度の維持に重要であることが示された（Nishimura et al, Diabetologia 2015）。このように転写因子の異常は膵β細胞の様々な表現型に関わる可能性があり、MODY 由来
iPS 細胞から樹立した膵β細胞で今後検討してゆく上で有用な情報と思われる。
岩﨑直子：生細胞ミトコンドリア機能評価システムを用いた MODY 由来 iPS 細胞誘導

細胞機能の評価、ならびに新規 MODY 遺伝子の同定①-1 35名から構成される若年発症糖尿病の1家系（MODY家系、ppt-1）を対象とし、連鎖解析
によって染色体6番上にその原因遺伝子が存在する可能性を既に報告した。新規MODY遺伝子の同定を目的として次世代シークエンサーを用いたwhole exome sequenceを施行した。
しかし、本来1種類の遺伝子により発症が規定される可能性のある家系に2種類の遺伝子において変異が同定される結果となった（2012年,欧州糖尿病学会およびIDF meetingで発表）。その原因としてSoLiDにより解析した4名のうち、Fragment 解析1名を実施した1
例では、paired-end 解析3名と比較して情報量が小さく、10x coverageの割合は53％であり（他3名は81％、84％、74％）、データ自体が不十分であった可能性が考えられた。
このため、再度理研ジェネシスにおいてMODY2例と対照1例の計3例の次世代シークエンサ
ーによるwhole exome解析を実施した（ppt-1）。アウトプットデータは得られているが、最終的にサンガーシークエンスで確認するvariantsを選択する作業を行っているところである。
①-2 30歳未満診断非自己免疫型糖尿病患者276名を対象としてMODY1, 2, 3, 5，Wolfram
症候群遺伝子の検討を行い、39名(14.1%)にいずれかの変異を同定した。変異陽性者の23.0%で家族歴が明らかでなく、変異陽性群は陰性群と比較して有意に診断時年齢が若く、既往最大BMIは低値であった。過去最大BMIが23.3以下、診断時年齢18歳以下では積極的に単一遺伝子異常による糖尿病を疑う必要があると考えられた（2015年日本糖尿病学会
で発表）(ppt-1)。
②日本人 2 型糖尿病で関連が認められた LSS 遺伝子について、既に韓国人において関連の再現性は認められた。英国人とデンマークではほとんど関連は認められなかった。同じ中国人についてあらたに検討したところ、以外にも関連は認められなかった。この理由は明らかではないが、別の研究で中国人集団のゲノム構造は日本人と韓国人とは異なる系統樹上に位置する事が示されたが、これが関係している可能性があるSubject No.

：24A115

Title：Research on the pathophysiology of MODY using iPS cells derived from MODY

patients
Researchers：Hitoshi Okochi, Kazuki Yasuda, Naoko Iwasaki,

Key word：MODY、iPS cell、pancreatic β cell、diabetes mellitus

Maturity-onset diabetes of the young (MODY) is a heterozygous monogenic diabetes; more than 13
disease genes have been identified. However, the pathogenesis of MODY is not fully understoodbecause of inaccessibility to pancreatic beta cells of the patients. The objective of this study was toestablish MODY patient-derived iPS (MODY-iPS) cells and to investigate the pathogenic mechanismof MODY by inducing pancreatic beta cells from MODY-iPS cells. Non-integrating Sendai virus(SeV) was introduced as a vector to establish the MODY-iPS cells using fibroblast derived frompatients with MODY. Then we differentiated these MODY-iPS cells into pancreatic beta cells using afive stage protocol mimicking the developmental process. Expressions of each stage markers andcausative gene were confirmed by RT-PCR, and transcripts of the causative genes were cloned andsequenced. We established 3 types of MODY-iPS cells from Japanese patients: MODY1 (R127W),
MODY3 (P291fsinsC), and MODY5 (R177X). These MODY-iPS cells possessed the characteristicsof pluripotent stem cells. Disease gene mRNA expression was confirmed and cloned: HNF1a; beta
stage, HNF1b; primitive gut tube stage (PGT), HNF4a; primitive gut tube stage (PaGT). We foundthat R177X and P291fsinsC mutant transcripts were much less frequent than wild ones, but they
increased after adding cycloheximide (CHX) to the medium. R177X and P291fsinsC mutant mRNAs,
which have premature termination codons (PTC), are disrupted by nonsense mediated mRNA decay(NMD) in differentiated MODY-iPS cells. These results indicate that those MODY may be caused bya haplo-insufficiency effect rather than a dominant negative manner.

Pancreatic β cell induction from iPS cells
We tried to differentiate iPS cells into pancreatic beta cells based on the Melton’s method reported
in PNAS in 2009. We modified the protocol to promote endoderm differentiation and replaced FBS(fetal bovine serum) for KSR (knockout serum replacement) to avoid the different effect between lots.
We added FGF2, CHIR99021 and BMP4 in the presence of Activin A, resulting in not only higher
positive rate of Sox17 but also greater viability than FGF2, BMP4 and Activin A treated group.
Expression of marker genes for each stage was investigated by RT-PCR : definitive endoderm (DE),
Sox17, FoxA2; primitive gut tube (PGT), HNF1b, HNF4a; posterior foregut (PFG), HNF6, HB9;
endocrine progenitor (EP), Nkx6.1, pdx1; beta like cells (beta); insulin, HNF1a. We found spheroid
formation in the last stage improved the function of pancreatic β cells. We detected insulin andglucagon gene expression after 4 weeks culture by RT-PCR. Immunohistochemical analysis revealed
that approximately 30% of the cells were positive for c-peptide. We measured insulin concentration
secreted to the media by ELISA and detected 5000-20000 pg/ml of insulin, which was ten times more

Researchers には、分担研究者を記載する。

than last year. Moreover, we confirmed glucose response of induced β cell by increasing glucose
concentration from 3 mM to 25 mM in the media.
When we transplanted 4x106cells of iPS-derived cells under the kidney capsule of NOD/SCID
diabetic model mice in which STZ(streptozotocin) were injected intravenously in advance. We could
not normalize the blood glucose level, because immunohistological examination revealed that almost
all the donor cells were glucagon positive 4 weeks later.
Detection of Mutant Disease Gene mRNA Expression from MODY-iPS cells
We established 3 types of MODY-iPS cells from Japanese patients: MODY1 (R127W), MODY3(P291fsinsC), and MODY5 (R177X). These MODY-iPS cells possessed the characteristics ofpluripotent stem cells. Disease gene mRNA expression was detected and cloned: Because HNF1b and
HNF4a were expressed at the PGT stage, and HNF1a was expressed at the beta stage, we obtained
HNF1b and HNF4a mRNAs from the PGT stage and the HNF1a transcript from the beta stage . After
those disease gene mRNA were sequenced, we found that R177X and P291fsinsC mutant transcripts
were much less frequent than wild ones, but they increased after adding cycloheximide (CHX) to themedium.

R177X and P291fsinsC mutant mRNAs, which have premature termination codons (PTC),

are thought to be disrupted by nonsense mediated mRNA decay (NMD) in differentiated MODY-iPS
cells. The results indicate that those MODY may be caused by a haplo-insufficiency effect rather thana dominant negative manner. These results were accepted in Journal of Diabetes Investigation thisyear.

Gene expression analysis of iPS cells by using GeneChip microarray system
iPS cells from healthy control and MODY3 patient were examined by GeneChip microarray system.
Even if the iPS cells were established by the same method and the same donor, each iPS cell line
showed different expression pattern. However the extent of difference was more diverse between
individuals rather than between the cell lines in the same origin. Therefore we must be careful about
evaluating the data when comparing the gene expression of iPS cells between different origin.
We paid attention to the transcription factors such as MafA and demonstrated that MafA was
required for the proliferation of neonatal pancreatic β cells because the number of pancreatic β cells
was the same at birth between wild type mice and MafA knock out mice, but the number of pancreatic
β cells of MafA KO mice was much less than that of wild ones 4 weeks later. We also demonstrated
that MafA played an important role on maintaining the adult pancreatic β cells because insulin positive
cells converted to glucagon positive cells in adult MafA KO mice.

Analysis of MODY-X family by using whole exome sequencing
Previous linkage analysis indicated unidentified MODY gene (MODY-X) might be locatedchromosome 6, 7, or 22. We picked up two candidate genes, FOXP4 and CUL9 by sequencing. We
performed the whole exome sequence of these genes and we found several heterozygous mutations.
Researchers には、分担研究者を記載する。

We are now confirming the data again using next generation sequencer to increase the rate ofcoverage.
When we examined the genomic sequence of 276 diabetic patients who were under 30 years old andnon-autoimmune diabetes, we detected one of the mutation among MODY1, 2, 3, 5 and Wolfram
syndrome in 39 cases (14.1%). Twenty-three % of them had no family history. We should be careful
about young diabetic patients for monogenic diabetes.

Researchers には、分担研究者を記載する。

２４指１１５ 研究の概要
研究課題名 ：MODY患者由来のiPS細胞を用いた糖尿病の発症機序ならびに病態の解明

MODY患者由来iPS細胞の樹立

MODY患者由来の
iPS細胞から膵β細胞と肝細胞の誘導

東京女子医科大学
糖尿病センター
岩崎直子准教授（新規MODY遺伝子の探索とミトコンドリア機能解析）

膵β細胞と肝細胞の機能の比較解析

MODYの発症機序
ならびに病態解明

国立国際医療医療センター
細胞組織再生医学研究部
匿名化した検体 大河内仁志、矢部茂治（iPS細胞樹立と分化誘導法）
膵臓β細胞

代謝疾患研究部
安田和基部長膵臓β細胞の機能解析

iPS細胞から膵β細胞への分化誘導

レトロウイルス法でMODY3の２例樹立
センダイウイルス法でMODY1：１例
MODY3：２例
MODY5：１例樹立

健常人

MODY3

iPS

位相差像

C-peptide

DAPIMODY3患者の変異HNF1a遺伝子のmRNAは通常では速やかに分解されてしまうが、シクロヘキシミド（CHX）添加で分解が抑制された。
+C

P291fsinsC mRNA+C

P291fsinsC mRNA (+CHX)

Spheroid化によって誘導したβ細胞のインスリン産生とグルコース応答性は向上する

C-peptide

C-peptide

DAPI

Monolayer

C-peptide

C-peptide

DAPI

Spheroid

課題番号
研究課題名

：２４指１１５：MODY患者由来のiPS細胞を用いた糖尿病の発症機序ならびに病態の解明

分担研究課題名：iPS 細胞から膵臓β細胞への分化と機能解析
主任研究者名 ：大河内仁志

分担研究者名 ：大河内

仁志

キーワード

：MODY、iPS 細胞、膵β細胞

研究成果：MODY は、ヒト糖尿病の単一遺伝子病モデルとして Fajans らにより１９７０年代に提唱された、常染色体優性遺伝を示す若年発症糖尿病である。臨床的には、インスリン分泌不全が病態の中心であるが、マウスでは MODY の病態を再現することはできず、ヒト組織で解析する必要がある。
これまでに３種類の MODY４症例（MODY1 が１例、MODY3 が 2 例、MODY5 が１例）の患者から iPS 細胞を樹立したので、本研究では膵β細胞の効率的な分化法を検討することを目的とする。
今年度の大きな成果は２点あり、（１）iPS 細胞から分化誘導したβ細胞のインスリンの産生量の増加ならびにグルコース応答性が改善できたことと（２）MODY 患者由来のβ細胞から原因遺伝子である HNF の変異 mRNA の検出ができたことである。
（１）については昨年度に無血清、無フィーダー細胞の条件で iPS 細胞からグルコースに応答する膵臓β細胞の分化誘導という目標は一部の株で達成できたが、iPS 細胞の株間の違いにより、同じ培養条件ではグルコースに対する反応性が必ずしも一定しないことが問題となっていた。膵臓の発生段階を模した５段階のステップにおいて、最初の definitive endoderm（DE）に誘導する過程が非常に重要であり、誘導効率を挙げるためには、DE への分化は 90%以上にする必要があると考えて培養条件を見直した。ところが Sox17 の発現を分化マーカーにして DE への分化効率を 90%以上にすると、その後の細胞の状態が悪くなり、かえって最終的なβ細胞においてグルコース応
答性がなくなってしまうことが判明した。そこで DE への分化効率を 70-80%にとどめつつ、細胞の活きをよくする
ように培養液を調節することで、高濃度グルコースに反応して 2 倍程度のインスリン分泌を示すようなグルコー
ス応答性をもつ膵臓β細胞を誘導できるようになった。これまで誘導効率はまだ 10%程度であったが、分化の最終段階で平面培養から凝集塊を作成（スフェロイド作成）すると、誘導効率が改善するのみならず、インスリン産
生量が大幅に改善した。具体的にはインスリンの産生量は ELISA 法の測定で 2000-3000pg/well であったものが、

5000-20000pg/well とこれまでの１０倍程度に増加した。また京都大学から譲渡された iPS 細胞株２種類についても、同様なインスリン産生を認めたことから、iPS 細胞株間の違いを乗り越えて、使用できるプロトコールの確立に向けて大きな前進がみられたことになる。凝集塊の免疫染色にて c-ペプチド陽性を示すインスリン産生細胞は 30-40%に認められた。グルカゴン陽性細胞は 10%未満であった。免疫不全マウス（NOD/SCID）にストレプトゾ
トシン（STZ）を投与して糖尿病モデルマウスを作製したのち、これらの細胞 4x106 個を腎被膜下に移植して、血糖降下を検討した。高血糖状態の長く続いたマウスに細胞移植すると随時血糖測定においてほとんど血糖降下は認められなかった。移植して４週間以降の腎臓の組織を検討した所、移植細胞の生着は確認されたが、ほとんどの細胞はグルカゴン陽性のα細胞になっていることが判明した。

（２）についてはまず MODY3 患者において HNF-1αの P291fsinsC の変異によるフレームシフトがおこり、PTC（premature termination codon）が生じることが予想される症例を検討した。β細胞に誘導した細胞から mRNAを抽出し、PCR で増幅し、ゲノム配列を解析したところ、確かに変異 mRNA が存在することが証明できた。MODY の遺伝子変異はヘテロ変異なので、理論的には正常と変異 mRNA の発現は半々のはずであるが、正常の HNF-1αの mRNAに比べて変異 mRNA は少量であり、NMD(nonsense mediated decay)が生じて変異 mRNA が速やかに分解されていることが示唆された。そこでシクロヘキシミドを添加してタンパク合成を阻害すると、変異 mRNA の量が相対的に増加したことより、実際に NMD が起こっていることが証明できた。次に MODY5 の患者においても HNF-1βにおける
R177X 変異による nonsense 変異で PTC が形成されると予想されているので、同様に mRNA の解析をしたところ、変異 mRNA の検出はできたが、NMD が起こって分解されていることが示唆された。 MODY においては変異タンパクによる dominant negative 効果が発症原因であるという説があるが、本症例において変異 mRNA は速やかに分解されているので、変異タンパクが蓄積するとは考えにくく、変異タンパクが病態に関与している可能性は低いと思われた。一方で MODY3 の１症例と MODY1 の症例では PTC が起こらない変異のため、NMD はみられず、正常と変異 mRNAは同量検出された。MODY においては変異タンパクによる dominant negative 効果が発症原因であるという説があるが、本症例において変異 mRNA は速やかに分解されているので、変異タンパクが蓄積するとは考えにくく、むしろ haplo-insufficiency によるものと考えられた。これらの結果は Journal of Diabetes Investigation に投稿し、受理さ
れた。

課題番号
：24指115
研究課題名 ：MODY患者由来のiPS細胞を用いた糖尿病発症機序の解明
主任研究者名 ：大河内仁志
分担研究者名 ：安田和基
分担研究課題：「MODY 由来 iPS 細胞を用いた、糖代謝関連分子の探索と機能解析」
キーワード ： MODY, 遺伝子発現、nonsense-mediated decay、転写因子
研究成果： 単一遺伝子病である MODY（maturity onset diabetes of the young）の主な病態は、インスリン分泌障害であり、一般の 2 型糖尿病の発症機序においてもインスリン分泌障害は最も重要な因子である。しかし、MODY における膵β細胞障害の分子機序はほとんど不明であり、MODY 原因遺伝
子ごとの病態の違いも全く不明である。さらにモデル動物はヘテロ変異で糖尿病を呈さないという種差があり、MODY の病態解明にはヒトの細胞を用いる必要があるが、患者から膵β細胞を取り出すことは臨床的に不可能であった。そこで原因遺伝子が明らかにされた MODY 患者由来 iPS 細胞から分化誘導した膵β細胞を用いて、機能異常の分子基盤の解析を行い、さらに MODY だけでなく一般の 2 型糖尿病の、発症機序や病態の解明を目指すこととなった。
1.

当初の研究計画に比べ、iPS 細胞由来の機能的なβ細胞の作製が難航していたため、まず同一人由来の体細胞から異なる作成方法で樹立した iPS 細胞を遺伝子発現の点から比較を行った。初期化遺伝子の導入ベクターとしてレトロウイルスとセンダイウイルスが用いられるが、外来遺伝子がゲノムに組みまれて安定的に発現するか、一定期間後に脱落するか、という違いがあり、それが iPS 細胞の質や、その後の分化誘導効率などに影響する可能性がある。そこで、健常人、及びMODY3 患者一名から、レトロウイルスを用いて確立した iPS 細胞（それぞれ 6 株、4 株）と、センダイウィルスを用いた iPS 細胞（それぞれ 4 株、2 株）について、Affymetrix 社 GeneChip シ
ステムにより、遺伝子発現を網羅的に比較した。
その結果を以下に記す。
1） 同一人から同じ方法により確立した iPS 細胞についても、株間で遺伝子発現に違いがみられるが、その差は比較的小さく（２倍以下のことが多い）、特に機能的なパスウェイなどで一定の傾向は認めなかった。
2） 同一人から、センダイウィルスとレトロウィルスという異なるベクターを用いて作製した
iPS 細胞同士では、発現に２倍以上の変化がみられる遺伝子も少なくないが、株間で差がみられ、使用したベクターによる一定の傾向は認められなかった。LOC51142 という遺伝子の発現が、健常人、MODY 患者に共通して、レトロウィルスで作成した iPS 細胞のほうで低下していたが、この遺伝子の機能は知られておらず、遺伝子発現低下の意義は全く不明である。
3） 由来する個人による発現遺伝子の差では、２倍以上の差が再現性よく認められる遺伝子が相当数みとめられたが、遺伝子レベルで検討すると、MODY 患者由来 iPS 細胞で発現が大きく上昇している遺伝子の多くが Y 染色体の遺伝子であった。この傾向は特にセンダイウイル
スで作製した iPS 細胞で顕著で、 MODY 由来で発現が増加している遺伝子の９割前後が Y
染色体遺伝子であった。またレトロウイルス、センダイウイルスの両者で共通に、MODY で増加していた遺伝子も多いが、そのほとんどが Y 染色体遺伝子であった（ZFY、EIF1AY、DBY、
TTTY15 など）。分担研究者は性別を知らされていなかったが、後日健常対照、MODY 患者がそれぞれ女性、男性だったことが判明した。ただし、こうした遺伝子の多くは精巣での発現が報告されており、獲得した未分化性との関連も否定できない。
4） レトロウイルスで作製した iPS 細胞では、このほかにも個人による発現差が大きい遺伝子が散見された。特に MODY 由来の iPS 細胞で、健常対照者由来 iPS 細胞に比べ、細胞外基質やその代謝に関連する遺伝子の発現増加をみとめた（LUM、COL3A1、HAPLN1 など）。これらはMODY 遺伝子との関連は考えにくいため、個人の遺伝的背景の違いを反映する可能性が高いが、もとの皮膚線維芽細胞の性質が少し残ってしまっている可能性もあり、DNA メチル化状態など、ほかの方法で iPS 細胞の「質」の検討が必要かもしれない。

以上のように、同一人に由来する iPS 細胞の遺伝子発現は、作製法の違いによらず予想以上に近似しており、一方で由来する個人の差を大きく反映していた。
2.

研究代表者大河内らが開発した、iPS 細胞からのβ細胞分化系を用いて、研究代表者らとともに
MODY-iPS 細胞由来β細胞の表現型（機能異常、遺伝子発現変化）の検討に着手した。今回対象とした MODY 患者は、それぞれ MODY1(HNF4A)R127W、MODY3（HNF1A）P291fsinsC、MODY5(HNF1B) R177Xの遺伝子異常をもつ。一般に MODY がヘテロ接合体の異常で発症する機序としては、機能的なタ
ンパク量が少なくなる haploinsufficiency、異常なタンパクが正常タンパクの働きも抑制する
dominat negative 機構、などが考えられる。MODY 研究代表者大河内らは、分化誘導の途中段階からこれらの遺伝子の発現が認められること、ナンセンス変異（HNF1B R177X）及びフレームシ
フト（HNF1A P291fsinsC）による患者由来の iPS 細胞では、分化誘導段階で、野生型のアリルに対して変異型のアリルの RNA が減少していること、cycloheximide 処理で変異型アリルの発現が相対的に回復すること、を示している。こうしたデータを共同で吟味し、これらは prematuretermination codon に対する nonsense-mediated decay により RNA 発現が低下し、haploinsufficiency が生じていると考えられた（Yabe S et al, J Diabetes Invest, published
online）。このように罹患臓器でのメカニズムがヒトで確認された例は非常に少なく、今後、こうした分化段階での遺伝子発現の変化、などを検討してゆく予定である。

3.

MODY 原因遺伝子の多くは転写因子であるが、膵β細胞における転写因子の役割としては、細胞特異的な分子の転写のほか、膵β細胞の発生・分化、増殖、分化度の維持、などへの寄与も注目されている。そこで膵β細胞に最も重要な転写因子の一つである MafA を対象にマウスでこうした点を検討した。MafA 欠損マウスでは、生下時の膵β細胞数は野生型と有意差はないが、その後
4-8 週で膵β細胞量が野生型より少ないことから、MafA が生後の膵β細胞の増殖に必要なことを示した。MafA の標的遺伝子のうち、この膵β細胞増殖作用を仲介する可能性のある分子として、プロラクチン受容体（Prlr）、及びサイクリン D2（Ccnd2）を報告した（Eto K et al, PLoS One
2014）。また細胞の運命を追跡する lineage tracing の手法により、MafA 欠損マウスでは、インスリン陽性細胞が、インスリン発現を失った内分泌細胞になり、ごく一部はグルカゴン陽性細胞に「分化転換」してしまうことを明らかにした。膵β細胞からα細胞の転換は、糖尿病などの MafAの発現が低下した状態でも報告され近年注目されており、MafA が成熟した膵β細胞の分化度の維持に重要であることが示された（Nishimura et al, Diabetologia 2015）。このように転写因子の異常は膵β細胞の様々な表現型に関わる可能性があり、MODY 由来 iPS 細胞から樹立した膵β細胞で今後検討してゆく上で有用な情報と思われる。

課題番号
研究課題名

：２４指１１５：生細胞ミトコンドリア機能評価システムを用いた MODY 由来 iPS 細胞誘導

細胞機能の評価、ならびに新規 MODY 遺伝子の同定
主任研究者名 ：大河内仁志
分担研究者名 ：岩﨑直子
キーワード：2 型糖尿病、MODY、β細胞、LSS、ミトコンドリア、次世代シークエンサー
研究成果：①-1 インスリン分泌障害は糖尿病の発症機序において主要な役割を担っている。このインスリン分泌障害を遺伝的に有するMODY（maturity onset diabetes of the young）は1種類の遺伝子の機能障害によって糖尿病を発症することからヒト糖尿病の成因研究において重要な疾患モデルである。原因遺伝子が未だ明らかにされていないMODY家系も多数存在しており、この様な家系から新たなMODY遺伝子が同定することによって糖尿病の成因を明らかにすることができると期待される。
35名から構成される若年発症糖尿病の1家系（MODY家系）を対象とし、連鎖解析によって染色体6番上にその原因遺伝子が存在する可能性を既に報告した。新規MODY遺伝子の同定を目的として次世代シークエンサーを用いたwhole exome sequenceを施行した。しかし、本来1種類の遺伝子により発症が規定される可能性のある家系に2種類の遺伝子において変異が同定される結果となった（2012年,欧州糖尿病学会およびIDF meetingで発表）。
その原因としてSoLiDにより解析した4名のうち、Fragment 解析1名を実施した1例では、
paired-end 解析3名と比較して情報量が小さく、10x coverageの割合は53％であり（他3
名は81％、84％、74％）、データ自体が不十分であった可能性が考えられた。このため、再度理研ジェネシスにおいてMODY2例と対照1例の計3例の次世代シークエンサーによる
whole exome解析を実施した。アウトプットデータは得られているが、最終的にサンガー
シークエンスで確認するvariantsを選択する作業を行っているところである。
①-2 若年発症非自己免疫性糖尿病集団におけるMODYもしくは単一遺伝子病としての糖尿病の頻度は未だ明らかにされていない。
30歳未満診断非自己免疫型糖尿病患者276名を対象としてMODY1, 2, 3, 5，Wolfram症
候群遺伝子の検討を行い、39名(14.1%)にいずれかの変異を同定した。変異陽性者の23.0%
で家族歴が明らかでなく、変異陽性群は陰性群と比較して有意に診断時年齢が若く、既往最大BMIは低値であった。過去最大BMIが23.3以下、診断時年齢18歳以下では積極的に単一遺伝子異常による糖尿病を疑う必要があると考えられた（2015年日本糖尿病学会で発表）。
②2型糖尿病は多因子疾患であるが、その成因に人種差が存在する事が注目されている。
我々は罹患同胞対法によって得られたデータを基に新規の日本人2型糖尿病感受性SNPを2 種 類 見 出 し 、 う ち 1 つ が KCNJ15 遺 伝 子 内 に 存 在 す る こ と を 報 告 し 、 も う 一 方 がLSS(Lanosterol synthase)遺伝子内に存在する事を見出した。このSNPの人種による2型
糖尿病発症への関連を検討する必要がある。
日本人2型糖尿病で関連が認められたLSS遺伝子について、既に韓国人において関連の再現性は認められた。英国人とデンマークではほとんど関連は認められなかった。同じ中国人についてあらたに検討したところ、以外にも関連は認められなかった。この理由は明らかではないが、別の研究で中国人集団のゲノム構造は日本人と韓国人とは異なる
系統樹上に位置する事が示されたが、これが関係している可能性がある（2015年第75回
米国糖尿病学会、ならびに第58回日本糖尿病学会で発表）。現在論文はほぼ完成。

③β細胞の機能異常を評価する方法も多岐に渡るが、生細胞ミトコンドリア機能評価シス
テムを用いて、MODYiPS細胞由来β細胞予定である。本年度は、本検討に用いるための
MODYiPS細胞由来β細胞が得られていないため、入手でき次第本検討を行う予定である。

研究発表及び特許取得報告について

課題番号：24指115

研究課題名： MODY患者由来のiPS細胞を用いた糖尿病の発症機序ならびに病態の解明
主任研究者名：

大河内仁志

論文発表
論文タイトル

著者

掲載誌

掲載号

年

Establishment of maturity-onset
diabetes of the young (MODY)-induced
pluripotent stem cells from aJapanese patient.

Yabe S, Iwasaki N,
Yasuda K, Hamazaki
T, Konno M, Fukuda
published
J Diabetes Invest
S, Takeda F,
onlineKasuga M, Okochi
H.

2015

MafA is critical for maintenance ofthe mature beta cell phenotype inmice.

Nishimura W,
Takahashi S,
Yasuda K.

58(3)

2015

Generation and characterization of
MafA-Kusabira Orange mice.

Nishimura W, Oishi
H, Funahashi N,
Fujiwara T,
Endocr J
Takahashi S,
Yasuda K.

62(1)

2015

Murine Insulinoma Cell-Conditioned
Medium with ΒETA2/Neurod1
Transduction Efficiently Induces the
Differentiation of Adipose-Derived
Mesenchymal Stem Cells into β-LikeCells both In Vitro and In Vivo.

Kawamoto K, Yabe
S. et al.

Eto K, Nishimura
W, Oishi H,
Udagawa H,
MafA is required for postnatal
Kawaguchi M,
proliferation of pancreatic β-cells. Hiramoto M,
Fujiwara T,
Takahashi S,
Yasuda K.

Quantitative assessment of pdx1
promotor activity in vivo using asecreted luciferase reporter system.

J Stem Cell Res
Ther

PLoS One

Ogata M, Iwasaki
N, Fujimaki R,
Takiazawa M,
Uchigata Y

4

2014

9(8)

2014

154(11)2013

Diabetology
International

5(2)

2014

Biochemical andBiophysicalResearch
Communications

447(1)

2014

Nishimura W, Eto
K, Miki A, Goto M,
Kawaguchi M, Nammo
T, Udagawa H,
Hiramoto M,
Endocrinology
Shimizu Y, Okamura
T, Fujiwara T,
Yasuda Y, YasudaK.

A sibling case of Wolfram syndrome
Iwasaki N, Fukawa
with a novel mutation Y652X in WFS1.
K, et al.
GLP-1 related proteins attenuate theeffects of mitochondrial membrane
damage in pancreatic beta-cells.

Diabetelogia

研究発表及び特許取得報告について

学会発表
タイトル

発表者

学会名

場所

年月

第14回日本再生医
療学会

横浜

平成２７年３月

矢部茂治、岩﨑直

遺伝性糖尿病 (MODY)患者由来iPS細胞の子、安田和基、浜膵β細胞分化過程におけるNMDによるMODY
崎辰夫、福田沙変異mRNAの分解

月、大河内仁志「転写因子MafAは成熟膵β細胞の機能維持に重要である」

西村渉、三木玄方、
大江総一、木戸敬
第120回日本解剖学
治、中井吉保、高橋 会総会・全国学術 京都智、安田和基、野田 集会泰子

平成27年3月
21-23日「糖尿病と遺伝子—今、臨床でどこまで応安田和基
用できるのか―」湖東糖尿病セミナー

彦根

平成27年1月
24日「次世代シークエンサーとは、どのようなものか？」

安田和基

糖尿病遺伝子Basic
東京
Seminar

平成26年11月
26日

MafA is important for maintenance ofthe mature beta-cell phenotype.

Nishimura W,
Kawaguchi M,
Udagawa H,
Funahashi N, Nammo
T, Yasuda K.

9th Metabolic
Syndrome, Type 2 International
Diabetes andConference
Atherosclerosis Center, Kyoto
Congress.

Sep 12-14,
2014.

「教育講演：遺伝子異常と糖尿病」

安田和基

第57回日本糖尿病
大阪
学会年次学術集会

平成26年5月「細胞系譜追跡実験による膵β細胞障害の時間経過の解析」

西村渉、川口美穂、
宇田川陽秀、衛藤弘
第51回 日本臨床分城、舟橋伸昭、南茂
東京
子医学会学術集会
隆生、平本正樹、安田和基

平成26年4月
11日-12日「転写因子MafAによる膵β細胞の分化可塑性制御」

西村渉、川口美穂、
宇田川陽秀、衛藤弘
第57回日本糖尿病
城、舟橋伸昭、南茂
大阪
学会年次学術集会
隆生、平本正樹、安田和基

平成26年5月「糖尿病の遺伝子と臨床」

安田和基

第32回糖尿病研修東京
セミナー

平成26年10月
19日「MafA KOマウスβ細胞のlineage
tracing study」

西村渉、川口美穂、
分子糖尿病学シン
宇田川陽秀、南茂隆
大阪
ポジウム生、安田和基平成25年12月「Lineage tracingによる膵β細胞障害の西村渉
解析」

第5回北海道若手糖札幌
尿病研究会

平成25年10月「教育講演：糖尿病診療に遺伝情報は役立つのか」

第13回糖尿病・情徳島報学会

平成25年8月

73rd Annual
meeting ofChicagoAmerican Diabetes
Association2013年6月

安田和基

Application of MODY probability
N Iwasaki, M
calculator for Japanese patients with
Takizawaet al
MODY3.

研究発表及び特許取得報告について「分泌型ルシフェラーゼによる膵島の評
価」

西村渉、衛藤弘城、
三木厚、南茂隆生、
川口美穂、宇田川陽 第56回日本糖尿病
熊本秀、平本正樹、佐久 学会年次学術集会
間康成、安田是和、
安田和基

平成25年5月「糖尿病の遺伝子と臨床」

安田和基

第23回糖尿病研修東京
セミナー

平成25年2月「糖尿病の遺伝因子」

安田和基

第24回糖尿病研修東京
セミナー

平成25年3月「糖尿病の遺伝子と臨床」

安田和基

第28回糖尿病研修神戸セミナー

平成25年12月「分泌型ルシフェラーゼを利用した生体におけるPdx1プロモーター活性の定量的評価」

西村渉、衛藤弘城、
川口美穂、南茂隆
第35回日本分子生
福岡生、宇田川陽秀、平 物学会
本正樹、安田和基平成24年12月「膵β細胞における転写因子MafAの機能解析」

衛藤弘城、西村渉、
第85回日本生化学
平本正樹、南茂隆
福岡会生、安田和基平成24年12月

Kazuki Yasuda,“Genetic factors for type 2 diabetes Haruhide Udagawa,mellitus in Japanese”
Takao Nammo,
Masaki Hiramoto.

9th IDF-WPR
Congress & 4th
AASD Scientific
Meeting

Kyoto

2012年11月「膵β細胞における転写因子Mafファミ
リーの機能解析」第139回分泌セミナー、 西村渉
平成24年6月2日、東京

第139回分泌セミナー

東京2012年6月

Mechanism regulating proliferationand mutation of β-cells in new natal Wataru Nishimuraand young mice.

5th Incretin andInsulinTokyo
Initiative

2012年9月「膵β細胞における転写因子Mafファミ
リーの機能解析」第139回分泌セミナー、 西村渉
平成24年6月2日、東京

第139回分泌セミナー

2012年6月

東京

その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等)
タイトル

発表者

発表先

場所

年月日

該当なし

特許取得状況について
発明名称※出願申請中のものは()記載のこと。
登録番号該当なし※該当がない項目の欄には「該当なし」と記載のこと。
※主任研究者が班全員分の内容を記載のこと。

特許権者(申請者）
登録日(申請日)（共願は全記載）

出願国