メラニン生成制御に関与する有用物質の探索と活用について

玉川大学農学部 生産農学科
准教授 佐藤一臣
令和2年10月13日

● 色素沈着のメカニズムとその原因● 主なメラニン生成阻害剤● メラニン生成促進剤● 本発明に関連する研究手法の紹介

本技術に関する知的財産権• 発明の名称：メラニン生成促進剤、白髪予防又は治療剤、色素異常症予防又は治療剤、組成物、及びメラニン生成促進方法• 出願番号 ：特願2020-010372• 出願人：学校法人 玉川学園
• 発明者
：佐藤一臣

● 色素沈着のメカニズムとその原因● 主なメラニン生成阻害剤● メラニン生成促進剤● 本発明に関連する研究手法の紹介

色素沈着のメカニズム

チロシン

チロシ
ナーゼ

メラニン5

メラニンの構造

ユーメラニン(Eumelanin)

フェオメラニン(Pheomelanin)

黒色～褐色

赤～黄色

The Pigmentary System 2nd edition (2006)

メラニン生成経路L-Phenylalanine

PAH: phenylalanine hydroxylase
TRP: tyrosinase-related protein

PAHL-Tyrosine

L-DOPA

DOPAquinone

Cysteinyldopa+Cysteine

Tyrosinase
5,6-Dihydroxyindole(DHI)

DOPAchrome
TRP-2

5,6-Dihydroxyindole-2carboxylic acid (DHICA)

Eumelanin

TRP-1

PheomelaninInt. J. Cosmet. Sci. (2011) 33, 210-221
Pigment Cell Res. (2003) 16, 523-531

より改変

シグナル伝達経路

ケラチノサイトから放出
α-MSH
MC1R(Melanocortin 1 receptor)

細胞膜

Adenylate Cyclase
小眼球症関連転写因子(Microphthalmia-associatedtranscription factor; Mitf)

cAMP
PKA

CREB

Mitf

CRE

核内MitfTyrosinase TRP1,TRP-2

Melanogenesis

α-MSH: α-Melanocyte Stimulating Hormone

紫外線の分類
280 nmUVC

UVB

400 nm

320 nmUVA

可視光線

UVC: オゾン層で吸収される
UVB、UVA : オゾン層を通過し、地表に降り注ぐ
UVA、UVBはメラニン生成（日焼け）に関与する

紫外線によるメラニン生成の促進メカニズム
melanocyte
DNAへのダメージ
ThymineO

Tyrosinase

Thymine

O

CPD

O

O

Mitf

O
CH3H3CCH3 H3C

HN

UVNH

N

N

R

R

HN
O

O

NH
N

N

R

R

O

MC1R

keratinocyte

メラニン生成

α-MSH
DNA

p53

POMC

Melanin● 色素沈着のメカニズムとその原因● 主なメラニン生成阻害剤● メラニン生成促進剤● 本発明に関連する研究手法の紹介

メラニン生成阻害剤と作用点○ チロシナーゼ活性阻害剤
Hydroquinone、Arbutin、Kojic acid など
チロシナーゼ

COOH
NH2HO

COOH

HONH2HO

L-Tyrosine

COOH

ONH2O

L-DOPA

DOPAquinone

メラニンO
COOH
HON
H+DOPAchrome○ 関連タンパク発現の抑制● C2-ceramide

Cell Signal. (2002) 14, 779-785

Mitf発現の抑制● Retinoic acid、Retinol

Biosci. Biotechnol. Biochem. (2008) 72, 2589-2597

チロシナーゼタンパク質量の抑制● Vitamin E (Tocopherol)

Cytotechnology (2009) 59, 183-190

チロシナーゼmRNA転写の抑制
その他の作用点○ ケラチノサイトへのメラノソーム移行の阻害○ スキンターンオーバーの促進○ チロシナーゼの分解促進 (ユビキチン-プロテアソーム経路)

非ステロイド系抗炎症薬（NSAIDs）のメラニン生成抑制効果
非ステロイド系抗炎症薬とは(non-steroidal anti-inflammatory drugs; NSAIDs)

抗炎症作用、解熱・鎮痛作用を有する薬剤

作用メカニズム
プロスタグランジン生成に関与するシクロオキシゲナーゼ(COX)活性を阻害することで抗炎症作用、解熱鎮痛作用を有する。
NSAIDsのほとんどはCOX-1、COX-2の両方の活性を阻害する。

NSAIDsの1つであるアセチルサリチル酸にメラニン生成抑制効果があることを確認。Sato et al., Biol. Pharm. Bull. 2008, 31, 33-37

非ステロイド系抗炎症薬（NSAIDs）のメラニン生成抑制効果
複数のNSAIDsのメラニン生成抑制効果
Acetylsalicylic
Acid

Mefenamic
Acid

Diclofenac

Nimesulide

Piroxicam

Melanin content(% of α-MSH alone-treated)

120
100806040200MSH
無添加

0 0.5 12 (mM) 0 50 100 (μM)

0 50 100 150 (μM) 0 50 100 (μM) 0 50 100 150 (μM)

MSH 10 nM
Sato et al., Arch. Dermatol. Res. 2011, 303, 171-180 追記

非ステロイド系抗炎症薬（NSAIDs）のメラニン生成抑制効果

NSAIDsのチロシナーゼ活性抑制効果
CompoundMonophenolase activity

IC50 (mM)
Diphenolase activity

ASA アセチルサリチル酸>4Diclofenac>47.1

Diflunisal

0.112

0.197

Ibuprofen
Indomethacin
Mefenamic acid>41.78>1>4>10.509> 0.2

Sato et al., Int. J. Mol. Sci. (2011) 12, 3998-4008

非ステロイド系抗炎症薬（NSAIDs）のメラニン生成抑制効果
 アセチルサリチル酸(ASA)の例
Western blottingRT-PCR

Mitf, チロシナーゼの発現を抑制する効果を持つ
Nishio et al., Mol. Cell. Biochem. (2016) 412, 101-110 から抜粋

非ステロイド系抗炎症薬（NSAIDs）のメラニン生成抑制効果
 アセチルサリチル酸(ASA)の例

ERKシグナル経路(Mitfの分解に関与)を活性化してMitfの分解を促す
Nishio et al., Mol. Cell. Biochem. (2016) 412, 101-110 から抜粋

NSAIDsのメラニン生成抑制効果○ チロシナーゼの発現を抑制することで結果的にメラニン生成を抑制する。
○ Mitfの転写抑制効果、分解促進効果を有する。
○ チロシナーゼタンパクの分解を誘導している可能性も考えられる。
○ NSAIDsのチロシナーゼ活性阻害効果もメラニン生成抑制効果の要因となっている。

● 色素沈着のメカニズムとその原因● 主なメラニン生成阻害剤● メラニン生成促進剤● 本発明に関連する研究手法の紹介

メラニン生成促進剤
メラニン生成阻害剤については多く報告されている

メラニン生成促進効果を有する物質については報告例は限られている[期待される応用]•

白髪防止剤• 色調維持剤

Salicylamide

サリチルアミドのメラニン促進効果
メラニン含有量(B16F1メラノーマ 3日間処理)

細胞生存率(B16F1メラノーマ 3日間処理)

A

100Vehicle
controlB

60

402000Vehicle
control

250

250

500500100 0500

1000

Salicylamide (µM)

250

Melanin content pg/cell

Cell viability (%)

80

250200150

100501000

Salicylamide (µM)

000

250

250

500

100 0500

1000

Salicylamide (µM)

サリチルアミドのメラニン促進効果
チロシナーゼ酵素活性阻害効果

Tyrosinase activity (% of control)

マッシュルームチロシナーゼ阻害効果の評価を行なった。

1501251007550250102325050041000Salicylamide (µM)

52000

サリチルアミドのメラニン促進効果
細胞内におけるチロシナーゼ活性 (DOPA染色法)
B16F1メラノーマをサリチルアミドで3日間処理し、細胞溶解液をSDS-PAGEで分離後、DOPA染色した
20

Arbitrary Unit

15

Tyrosinase

105CBBVehicle
control

2505001000

Salicylamide (µM)

01Vehicle
control

2250

3500

41000

Salicylamide (µM)

サリチルアミドのメラニン促進効果
リアルタイムRT-PCR
Tyrosinase
15

ウェスタンブロッティング

105

Tyrosinase

0TRP-1β-actin2505001000

Salicylamide (µM)

MITF

5mRNA level

TRP-2MITF

0432100250500

Salicylamide (µM)

1000

サリチルアミドのメラニン促進効果

サリチルアミドのメラニン生成促進メカニズム
 酵素活性の促進効果
 チロシナーゼタンパクの発現促進効果

メラニン生成促進剤(色調改善剤)としての期待● 色素沈着のメカニズムとその原因● 主なメラニン生成阻害剤● メラニン生成促進剤● 本発明に関連する研究手法の紹介

今回の発明に関連する研究手法の紹介
 メラニン生成阻害剤・促進剤の探索
化粧品、美白剤への応用
白髪防止剤
皮膚の色調改善剤などへの応用 皮膚保護効果を有する物質の探索
化粧品への応用

白髪防止剤の応用

 細胞死(アポトーシス)を誘導させる物質・手法の確立
抗癌剤としての応用など

今回の発明に関連する研究手法の紹介
 メラニン生成阻害剤・促進剤の探索
化粧品、美白剤への応用
白髪防止剤
皮膚の色調改善剤などへの応用 皮膚保護効果を有する物質の探索
化粧品への応用

白髪防止剤の応用

 細胞死(アポトーシス)を誘導させる物質・手法の確立
抗癌剤としての応用など

今回の発明に関連する研究手法の紹介
 アポトーシス細胞の検出、細胞周期解析
ストレスを軽減させる物質
細胞保護効果を有する物質
12subG1 cells (%)

10861h42h20010203040

Time after irradiation (h)50今回の発明に関連する研究手法の紹介
 ゲノムDNAの損傷程度を検出 (コメットアッセイ)
ストレスを軽減させる物質の探索
細胞保護効果を有する物質の探索

⊖

損傷（少）

健全な細胞

⊕

損傷（大）

損傷した細胞今回の発明に関連する研究手法の紹介
 細胞内ROS量の検出
ストレス ミトコンドリア膜電位の検出
細胞死に至るストレスを検出

ストレス今回の発明に関連する研究手法の紹介
 Caspase-3活性の検出
細胞死(アポトーシス)を起こした細胞の検出

Unirradiated control

50 W/m2 12 h

Propidium iodide

Dead cells

Apoptotic cells

Phiphilux G1D2 (caspase-3 activity)

今回の発明に関連する研究手法の紹介
 その他：ゼブラフィッシュを利用した研究変異個体(白色型、p53変異型)を利用した研究化学物質が動物個体に与える影響について

お問い合わせ先
玉川大学 学術研究所
知的財産本部TEL : 042-739-8054
FAX : 042-739-8663

e-mail : chizai＠tamagawa.ac.jp