課題番号：２９指１０２８
研究課題名 ：結核菌の薬剤耐性化能推定方法の確立と薬剤耐性化抑制法開発のための基礎的研究
主任研究者名 ：竹本 訓彦
分担研究者名 ：キーワード：薬剤耐性化、突然変異、ミスマッチ修復
研究成果：Takemoto et al., 2018 Nucleic Acid Res. in press (doi:10.1093/nar/gky481)
結核菌の薬剤耐性化については耐性遺伝子の水平伝搬の例はなく、既存遺伝子への突然変異によることが知られている。生物における突然変異を抑制する機構としては DNA 複製時のエラーを除去・修復するシステムと、ダメージを受け変異原となりうる損傷 DNA を修復する経路がある。ミスマッチ修復機構は DNA 複製時のエラーを修復するシステムとして知られ、中心的役割を果たす MutS は大腸菌からヒトまで報告されている。MutS の欠損は変異率を大幅な上昇を引き起こし、細菌であれば薬剤耐性化・人などにおいては細胞の癌化につながる。
興味深いことに結核菌の属する放線菌門のバクテリアは mutS 遺伝子をゲノム上に持たないにもかかわらず変異率がそれほど高くない。私たちは放線菌門に特異的に保存されている遺伝子の中から、放線菌において変異率抑制に関わる遺伝子のスクリーニングを行い、Corynebacterium glutamicum において endoMS/nucS 遺伝子の破壊により、変異率が大幅に上昇することを見出した。残念ながら、同遺伝子破壊による変異率上昇については、スペインのグループにより先に報告されてしまったが、私たちは NCGM において遺伝学的・分子生物学的解析を進めるとともに、合成生物学分野で世界をリードする成果を上げている立教大の末次正幸准教授との共同研究により生化学的解析をすすめた。結果、EndoMS/NucS がミスマッ
チ特異的な DNA 切断活性をもち、複製複合体の sliding clamp と直接相互作用する事で活性化され、複製時に生じるミスマッチを修復することを示した。また、MutS とは異なりEndoMS/NucS が特定のミスマッチのみを基質とすることから、DNA 複製時には G/T ミスマッチの出現頻度が大幅に高い可能性を見出した。これらの結果を論文としてまとめ、Nucleic AcidResearch 誌(Impact factor 11.561)に発表した。
C. glutamicum において変異率に関わる遺伝子のスクリーニングを進め、現在までに計 45 遺伝子の破壊株及び 2 遺伝子の変異体を作製した。これらについて変異率へのを影響を検討した結果、予想通り、DNA 複製を担う DNA polymerase への変異により変異率の大幅な上昇を確認した。また、これまでに報告のない機能未知遺伝子 1 つの欠失により変異率上昇が観察された。さらなる解析から、この変異率上昇は複製エラーとは独立していたことから、同遺伝子が何らかの損傷 DNA 修復機構に関わることを予想している。また、酸化ストレスによる変異に着目し、酸化ストレスの解消(catalase; katA)、酸化ストレスによる損傷 DNA の分解(Formamidopyrimidine-DNA glycosylase ; mutM)、酸化ストレスによる損傷 DNA(7,8-Dihydro-8-oxo-guanine)を含むミスマッチ DNA の解消（N-glycosylase/APendonuclease; mutY）について C. glutamicum の遺伝子破壊株を作製し、変異率への影響を検討した。
なお、結核菌において catalase は抗結核第一選択薬として使用されているイソニアジドの抗菌活性に必須であり、イソニアジド耐性結核菌の約 7 割が catalase をコードする katG(C. glutamicum katA のホモログ)に機能欠損変異を有することが知られている。C. glutamicum の katA 破壊株は単独ではRifampicin 耐性株出現頻度に影響がないものの、mutM や mutY との二重・三重欠損によりその出現頻度が優位に上昇することを見出した。
結核菌が属する Mycobacterium 属細菌の遺伝子組み換え技術としてはこれまでファージを用いた方法が利用されてきた。しかし、この方法ではファージの調製に手間がかかるうえ、破壊した遺伝子の中に破壊の痕跡が残るため染色体上の遺伝子に 1 アミノ酸変異などを導入することは不可能である。
私たちは、ファージを用いた方法に代わる新たな手法として、Suicide vector を用いる新規Mycobacterium 属染色体組換え法を開発した。すでに 1 遺伝子の破壊に成功しており、現在、評価を続けている。

Subject No.

：29A1028

Title：Construction of methods to estimate the strain-specific risk for emergence ofdrug-resistant strains in Mycobacterium tuberculosis
Researchers ：Takemoto Norihiko
Key word：mismatch repair, mutation, replication error

Abstract：

During the course of this research project, we have recently published a research article in Nucleic
Acid Research (Impact factor: 11.561). It is known that drug-resistance of M. tuberculosis is due tomutations but not to horizontal gene transfer of drug-resistant genes. Mismatch repair (MMR)
systems based on MutS eliminate mismatches originating from replication errors. Despiteextensive conservation of mutS homologues throughout the three domains of life, Actinobacteria(including M. tuberculosis) and some archaea do not have genes homologous to mutS. In the article,
we demonstrated that EndoMS/NucS of Corynebacterium glutamicum is the mismatch-specificendonuclease that functions cooperatively with a sliding clamp. EndoMS/NucS function in MMR
was fully dependent on physical interaction between EndoMS/NucS and sliding clamp. A
combination of endoMS/nucS gene disruption and a mutation in dnaE (encoding replication DNApolymerase), which reduced the fidelity of DNA polymerase, increased the mutation rate
synergistically and confirmed the participation of EndoMS in replication error correction. EndoMS
specifically cleaved G/T, G/G, and T/T mismatches in vitro, and such substrate specificity wasconsistent with the mutation spectrum observed in genome-wide analyses. The observed substratespecificity of EndoMS, together with the effects of endoMS gene disruption, led us to speculatethat the MMR system, regardless of the types of proteins in the system, evolved to address
asymmetrically occurring replication errors in which G/T mismatches occur much more frequently
than C/A mismatches.
We also developed a new genetic method to edit genes of bacteria belonging to Mycobacteria family.
So far, utilization of phage-based genetic editing methods was general. However, preparation ofphage, which is designed to edit chromosomal genes, is complicating and takes time. In addition,
when this phage based method was used, it is impossible to eliminate the trace of edition andtherefore it is impossible to introduce point mutations into original chromosomal locus of target
gene. To overcome these difficulties, we developed a new genetic method using suicide vector.
Using this new method, we became able to reproduce point mutations found in clinically isolated
strains and to test the effects of the mutation on drug susceptibility in genetically identicalbackground.

課題番号：２９指１０２８
研究課題名 ：結核菌の薬剤耐性化能推定方法の確立と薬剤耐性化抑制法開発のための基礎的研究
主任研究者名 ：竹本 訓彦

結核菌薬剤耐性化は突然変異が原因各菌株の突然変異率⇓
その菌株の薬剤耐性化リスク
変異率抑制に関わる遺伝子を同定しそれぞれの遺伝子への変異が変異率に与える影響を確認する
損傷DNA修復に関する研究
カタラーゼ遺伝子は抗結核第一選択薬であるisoniazid (INH)の活性化に必要で、同遺伝子の破壊は INH 耐性化を引き起こす
C. glutamicum においてカタラーゼ遺伝子と酸化ストレス損傷DNA除去遺伝子を同時に破壊することで変異率上昇を確認した
INH 耐性株は遺伝的バックグラウンドによっては他の薬剤に対する耐性を獲得しやすくなる可能性が示唆されたモデル生物として結核菌と同じ放線菌門 Corynebacterineae 亜目に属する Corynebacterium glutamicum を使用（遺伝子工学技術が発達しており、遺伝学的・生化学的解析が容易)

DNA複製エラー修復機構に関する研究
放線菌門の細菌はMutSによるミスマッチ修復機構を欠損するにもかかわらず、変異率は低く抑えられている
放線菌門の細菌で低い変異率を担保する因子を探索
ミスマッチ特異的DNA切断酵素 EndoMS/NucS を同定
EndoMS/NucS がsliding clamp (複製複合体) と相互作用することで活性化し、複製エラー修復に関わることを確認した。

Mycobacterium 属細菌用新規染色体組換えシステムの作製
従来型 Mycobacterium
染色体組換えシステム

Suicide vector による新規システム

・作業ステップを大幅に省略できた・短時間で完成(M. smegmatisなら約2週間短縮)
・もともとのlocusにある遺伝子にマーカーレスで変異導入が可能になった

研究発表及び特許取得報告について

課題番号：２９指１０２８
研究課題名： 結核菌の薬剤耐性化能推定方法の確立と薬剤耐性化抑制法開発のための基礎的研究
主任研究者名：竹本訓彦
論文発表
論文タイトル

Bacterial EndoMS/NucS acts as a clampmediated mismatch endonuclease toprevent asymmetric accumulation ofreplication errors

著者

掲載誌

NorihikoTakemoto
Itaru Numata
Nucleic Acid
Masayuki
Research
Su'etsugu
Tohru MiyoshiAkiyama

掲載号

in press

年

2018

学会発表
タイトル

発表者

竹本
放線菌で見出した新規ミスマッチ修復機構の 沼田
解析
末次
秋山
竹本
放線菌において見出した新規DNAミスマッチ 沼田
修復機構の解析
末次
秋山訓彦
格
正幸
徹訓彦
格
正幸
徹

竹本 訓彦
祝 弘樹
結核菌とその近縁種における薬剤耐性化抑制
沼田 格
機構の解析
末次 正幸
秋山 徹

学会名

場所

年月

第14回21世紀大腸
熱海菌研究会2017/6/9

2017年度生命科学系学会合同年次大 神戸会

2017/12/8

第91回日本細菌学
福岡会総会

2018/3/27

その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等)
タイトル

発表者

発表先

場所

年月日

該当なし

特許取得状況について※出願申請中のものは(発明名称)記載のこと。
登録番号該当なし※該当がない項目の欄には「該当なし」と記載のこと。
※主任研究者が班全員分の内容を記載のこと。

特許権者(申請者）
登録日(申請日)（共願は全記載）

出願国