課題番号
研究課題名：２６指１０８：肝疾患診療拠点病院と連携したB型肝炎の病態進展に関連するウイルスとホスト要因の解析
主任研究者名：杉山真也
キーワード：B 型肝炎ウイルス、肝臓内免疫、発癌、１細胞解析、次世代シーケンサー
研究成果：「臨床検体の解析」
本課題の初年度の計画にそって、次世代シーケンス解析に利用するための検体収集を行った。探索用と検証用で独立した２群の検体を準備するために、共同研究関係にある東京大学の徳永勝士教授、北海道大学の坂本直哉教授、大阪府立急性期総合医療センターの田尻仁主任部長、北海道大学の武冨紹信教授、九州大学の前原喜彦教授、国府台病院肝臓内科の溝上雅史センター長らを中心に調整を行った。研究対象として、A）慢性肝炎と肝癌、B）肝癌と肝硬変、C）慢性肝炎と肝硬変、D）家族で肝癌の多発した家系、を計画している。A-C）については、各共同研究先の外来・入院診療で収集を行い、癌部と非癌部でそれぞれ 100 検体、それらの末梢血由来ゲノムを 100 検体、慢性肝炎由来の末梢血由来ゲノムを 200 例について、収集した。一方で、D)は家族例での収集となるため、親子での来院が多い、小児科での収集を小児肝炎の研究班長を勤めている田尻先生に依頼した。小児肝炎班の班員から症例の提示を受けて、検体の精査を行っているところである。
検体収集と平行して、病態進行に関連するヒトゲノム要因の探索をするために、エキソーム解析を計画している。エキソーム解析では、アジレント社から発売されている最新のエキソーム解析用キットが最もカバー率が高いとされているが、そのキットを用いた検証試験では、エキソームのカバー率バラつきと不足領域が観察された。そこで、より優れたエキソーム解析用のプローブが必要と考え、東京大学新領域創成科学研究科の鈴木穣教授と共同で、より精密な解析ができるプローブの設計を行った。合成したプローブセットを用いた解析の結果、エキソームの高密度解析ができ、既存のキットで約 90％であったカバー率を 97％まで向上させた。また、スタートのゲノム量を 3 分の 1 量で解析可能とし、1 検体あたりの価格を 5％ほど削減した。
一方で、得られた大量のシークエンスデータを解析するシステムの構築を進めた。これを作ることで、今後大量検体を処理するときに、自動化して初期段階のデータ処理を行うことができ、時間を節約できる。また、臨床データとヒトゲノムデータを統合解析できるように、データサーバーの機能を追加した。具体的には、ランデータの Fastq 変換、複数検体を混合して解析したシークエンスデータを個々の検体に分離する過程までを自動化し、臨床データを決まったフォーマットで取り込む仕組みを加えた。
「肝臓内免疫機構の解析」
B 型肝炎ウイルス（HBV）の感染過程とそのときの肝臓内の可視化について条件検討を進めた。マウスでの感染実験に先立って、ヒトの初代培養肝細胞とヒト肝細胞置換キメラマウス由来肝細胞を利用した感染実験を行った。HBV ゲノムにレポーター遺伝子を挿入した改変ウイルスを作成し、超遠心でウイルス粒子の精製を行った。その感染粒子分画を肝細胞培養系に投与した。また、HBV のエンベロープ部分を蛍光化したウイルスを作成し、同様に感染の可視化を確認した。その結果、改変 HBV 粒子では、感染後に細胞の蛍光や発光を確認した。来年度では、マウス実験に移る予定であり、現在、使用予定のマウス系統を提供してくれる共同研究先と調整中である。予定しているマウスでの感染実験に取り掛かれる予定ではあるが、共同研究先の施設内での事務的調整が遅れるようであれば、共同研究先の施設を借りて実験を進める予定であり、その了承も得ている（名古屋市立大学医学部）。
平行して、１細胞の RNA-seq 解析系の樹立を行った。本解析系を用いることで、従来集団として解析されてきた細胞を個々に性質をすることができ、未知の細胞系譜や僅かな違いをもつ重要な細胞を同定できると期待できる。本年度では、HBV 感染したヒト肝細胞置換キメラマウスの肝臓を１細胞分離した後に、mRNA の発現を次世代シークエンス解析により比較した。遺伝子発現パターンの違いについての各種条件（HBV 感染の有無、HBV 複製効率の高低など）で比較解析を実施し、HBV 感染受容体が発現している細胞でも HBV 感染が成立しないものがあることを見出した。このことから未知の受容体がまだ存在している可能性が推察された。

Subject No.

：26shi108

Title：Analyses of viral and human genome factor associated with the diseaseprogression of hepatitis B using the clinical samples from nation-wide core hospitals of
hepatic diseases
Researchers ：Masaya Sugiyama
Key word：Hepatitis B virus, Immunity in liver, Carcinogenesis, Single cell analysis,

next-generation sequencer
Abstract：Along the study plan, we have advanced the sample collection for an analysis

in next-generation sequencing (NGS). We have collected a specimen independent two groups
for screening and verification studies by several collaborators belonging to core hospitals of
hepatic diseases. Research subjects are below, A) chronic hepatitis vs. liver cancer, B) livercancer vs. liver cirrhosis, C) chronic hepatitis vs. liver cirrhosis, D) family cases containing
multiple patients of HCC. We have collected 100 paired-samples of cancer and non-cancerous
part, 100 specimens of their peripheral blood monocyte cells (PBMC)-derived genome, 200
samples of PBMC-derived genomes from chronic hepatitis B. The family samples of Group D
were obtained from pediatrics hospital.
Exome sequencing using NGS and these data analysis pipeline were developed to reveal thefactors of human and viral genome associated with disease progression. The latest
commercial kit for exome sequencing provided by Agilent Technologies showed higher
cover-ratio than the other kits. However, the areas of low or loss coverage were observed in
our analysis. Therefore, we developed in house exome kit for NGS sequencing in collaboration
with Prof. Yutaka Suzuki, University of Tokyo. The coverage rate of in house kit reached up
to 97%, whereas that of the commercial kit was approximately 90%. The total amount ofgenome required for the preparation in our kit was 1 out of 3 against the commercial kit, andthe price per specimen was reduced about 5%.
We optimized experimental conditions for visualization of the HBV infection process in theliving liver. Human primary hepatocytes and human liver separated from chimeric mice withhuman hepatocytes were used for infection experiments in culture system. A modified HBVgenome inserting the reporter or fluorescent gene was used to produce infectious virion, andviral particles were purified in ultracentrifugation. The infectious particles fraction wasadministered into cultured primary hepatocytes. Fluorescence or luminescence was observedin the cells after infection. These virion are planned to apply into a mouse model to observe
infection dynamics in the living liver.
RNA-seq analysis system based on single cell was established to identify novel lineage cellswith unique gene expression. The hepatocytes of HBV-infected chimeric mice were separated
into single cell to analyze the gene expression by NGS. In the part of data analysis, several
filters for data selection were applied to detect the characteristics of cells with the potential of
HBV infection. Then, unknown infection receptor would be existence in addition of NTCP.

Researchers には、分担研究者を記載する。

「臨床検体の解析」
エキソーム解析用カスタムプローブ設計
Custom Probe(HG19_ExV5Regu_EZ_HX1)

サンプル量比較

Features

Data

Consolidated/Padded Regions

334820Target Bases

114Mb

Target bases covered

111Mb

SureSelectCustom

DNA for start

200ng-3ug

100ng-1ug

Target region

114Mb

114Mb

コスト比較

Percent target bases covered

97%

CaptureTarget bases not covered

3Mb

SureSelectHiseq¥124,110Percent target bases not covered

3%

CustomHiseq¥118,399

Sequencer

Cost/sample

カスタムデザインを工夫することで、実験精度の向上と低価格化を実現した。

次世代シーケンス用データサーバー
自動解析システムの確立

Fastq変換
Demultiplex処理

シークエンスデータ
自動解析の流れ
次世代シーケンサー→解析サーバ―→Fastq変換→demultiplex処理（以下構築中 →ヒトゲノムへのアライメント→ベースコール→関連解析）
解析の自動化により、多数検体の処理を簡便化した→今後のあらゆるシークエンス解析に応用可「肝臓内での感染免疫機構の解析」
感染初期過程の可視化
蛍光化HBV

プライマリー細胞系へ感染

HBV粒子を蛍光物質でマーキングし、可視化した。
また、HBVゲノムに蛍光遺伝子やレポーター遺伝子を組み込んだ人工ウイルスの作成をした。

Phase

PKH26

Hoechst33342

Phase/Hoechst33342/PKH26

Vero細胞におけるHPV 可視化

肝細胞の１細胞解析
１細胞ごとのmRNA解析（感染感受性、感染前後の変化）

C1™ Single-Cell
AutoPrep System••

感染受容体とされているNTCPが発現しているだけでは、HBV感染が成立しない例が多数あった。
これらの遺伝子発現を解析して、シングルセルレベルで感染に必要な遺伝子を明らかにする。

研究発表及び特許取得報告について

課題番号：26指108
研究課題名：肝疾患診療拠点病院と連携したB型肝炎の病態進展に関連するウイルスとホスト要因の解析
主任研究者名：杉山真也

論文発表
論文タイトル

著者

掲載誌

掲載号

年

Tsukuda S,
Watashi K,
Iwamoto M,
Dysregulation of retinoic acid receptor Suzuki R,
diminishes hepatocyte permissiveness to Aizaki H,
hepatitis B virus infection throughOkada M,
J Biol Chem
modulation of sodium taurocholate
Sugiyama M,
cotransporting polypeptide (NTCP)
Kojima S,expression.
Tanaka Y,Mizokami M, LiJ, Tong S,
Wakita T.

290

2015

Differential
Expression of
CX3CL1 in
Hepatitis B
VirusKondo Y, Kimura O, Tanaka Y, Ninomiya M,
Replicating
Iwata T, Kogure T, Inoue J, Sugiyama M,J Virol.
Hepatoma Cells
Morosawa T, Fujisaka Y, Shimosegawa T.
Can Affect the
Migration
Activity of
CX3CR1+ Immune
Cells.

89

2015

Nishida N, Sawai H, Kashiwase K, Minami
M, Sugiyama M, Seto WK, Yuen MF, Posuwan New
N, Poovorawan Y, Ahn SH, Han KH,Susceptibility
Matsuura K, Tanaka Y, Kurosaki M,
and ResistanceAsahina Y, Izumi N, Kang JH, Hige S, Ide HLA-DP Alleles
T, Yamamoto K, Sakaida I, Murawaki Y,
to HBV-Related
PLoS One
Itoh Y, Tamori A, Orito E, Hiasa Y,
Diseases
Honda M, Kaneko S, Mita E, Suzuki K,
Identified byHino K, Tanaka E, Mochida S, Watanabe M, a Trans-Ethnic
Eguchi Y, Masaki N, Murata K, Korenaga Association
M, Mawatari Y, Ohashi J, Kawashima M,
Study in Asia.
Tokunaga K, Mizokami M.

92014

学会発表
タイトル発表者

学会名

場所

年月

宿主因子を標的とした新規抗B型肝炎ウイル 杉山真也、田中 第50回日本肝臓学
東京
ス製剤の開発と作用機序の解析
靖人、溝上雅史 会総会

2014年5月

The 2ndInternational
Symposium ofCatholicKorea
University Liver
Research CenterSymposium

2014年7月

MasashiMizokami, Nao
Clinical Significance of Host Factors in
Nishida, andViral Hepatitis
MasayaSugiyama

研究発表及び特許取得報告について

MasayaSugiyama,
Yasuhito
Association of sphingolipid biosynthesis
Tanaka, Makoto
pathway as a novel therapeutic target
Nakanishi,
for HBV replication.
Masayuki
Sudoh, andMasashi

International
Meeting onMolecular Biology LosAngels
of Hepatitis BViruses

2014年9月

Incidence of HBV infection in MSM cohort
Masayain Ulaanbaatar and new therapies forSugiyama
hepatitis B and C.

Japan-Mongolia
Collaborative
Study for HIV and Ulaanbaatar
Hepatitis in MSM
in Mongolia.

2014年10月

その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等)
タイトル

特許取得状況について※出願申請中のものは(

発明名称発表者発表先場所年月日)記載のこと。
登録番号※該当がない項目の欄には「該当なし」と記載のこと。
※主任研究者が班全員分の内容を記載のこと。

特許権者(申請者）
登録日(申請日)（共願は全記載）

出願国