課題番号：26 指 107

研究課題名

：

非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)患者における疾患感受性遺伝子候補としてのHLA ハプロタイプ解析-肝疾患診療連携拠点病院のネットワークを通じた大規模な遺伝子解析への展開主任研究者名 ：柳瀬幹雄
分担研究者名 ：キーワード：NAFLD/NASH、メタボリックシンドローム、脂肪肝研究成果：【研究計画と成果】〔本研究の研究計画の概要〕
1)

本研究の第一段階として、NCGM を含めた数施設でのパイロット研究を先行させる。
NCGM(センター病院・国府台病院)以外には、横浜市立大学付属病院消化器内科、東京医科大学病院消化器内科、順天堂大学医学部付属順天堂医院消化器内科と共同研究をおこなう。
具体的な方法として、対象は肝生検による病理学的診断により NASH と確定された症例で、十分なインフォームドコンセントのもとでの書面での同意が得られた患者の約 300 症例を目標とする。
NASH 診 断 で は 、 Matteoni 分 類 (Gastroenterology.1999;116:1413-9.) 、 Brunt 分 類 (Am JGastroenterol.1999;94:2467-74.)、NAFLD activity score(NAS) (Hepatology.2005;41:1313-21.)を用いて専門病理医がおこなう。
それぞれの NASH 患者について、診断目的の肝生検時に採取された凍結肝組織あるいは末梢血単核球から抽出された DNA 検体を収集し、－80℃下で保管する(NCGM センター病院・国府台病院)。
収集・保管された DNA を用いて、HLA 遺伝子のタイピングをおこなう(肝炎・免疫研究センター)。
NASH 患者の HLA ハプロタイプの分布を比較して、NASH に特徴的なタイプについて検討する。
この際、副次的に身体所見、問診データに加え、血清解析にて NASH 病態に関わる各種マーカー、SNP 解析では PNPLA3 について解析し、データを収集・管理する。
本研究は、NASH 臨床研究における網羅的な遺伝子解析として既に NCGM 倫理委員会で承認されており(遺伝子：受付番号 131；平成 26 年 3 月 17 日承認 承認番号:NCGM-A-000131-01)、また既に UMIN 登録も完了している(UMIN 登録番号; UMIN000009841)。

2)

この第一段階で、予想されるように HLA ハプロタイプと NASH との強い関連性が示唆されれば、その後は更に多くの肝疾患診療連携拠点病院を中心に構成された全国 NASH 研究グループの共同研究を通じて、大規模な臨床研究による検証とデータベースの構築をおこなう予定である。
NASH 病態進展の”2nd hit”にあたる NASH 肝炎と HLA を介する免疫機構との関係について機序解明の基礎研究を立案するというような、基礎と臨床の橋渡し研究の一環として予定する。

〔研究計画〕NCGM 倫理委員会にて本研究に関する研究期間延長と多施設共同研究への移行に関する承認を完了し(遺伝子：受付番号 131；承認番号:NCGM-A-000131-01)、臨床試験登録システムへの多施設共同研究の形式にて新規登録を完了した(UMIN 登録：UMIN 登録番号; UMIN000014850)。共同研究施設として、横浜市立大学医学部肝胆膵消化器病学(平成 26 年 9 月 25 日開催、同 29 日承認通知)と東京医科大学消化器内科(平成 26 年 6 月 25 日承認通知：受付番号 2757)での倫理委員会承認。
症例登録と検体収集に関して、末梢血単核球から抽出し－80℃保存した DNA について、主施設のNCGM センター病院消化器内科の 50 例、共同研究施設の横浜市立大学肝胆膵消化器病学の 256 例、東京医科大学消化器内科の 2 例の計 308 例 を症例登録と検体・データ収集し、多施設共同データベース作成した。
収集された DNA 検体を用いて、肝炎・免疫研究センターにて HLA ハプロタイプ解析を実施(使用試薬：TaqMan® SNP Assays, Human SM HLA complex group22)した。
〔研究結果〕
解析に用いた疾患群の一覧は表の通り (表 1)。HLA ハプ
ロタイプ毎の病理所見や臨床データ、PNPLA3 の SNP 等、NASH 病態に関わる各因子を表 2 に示す通り。
まずは NAFLD/NASH 患者を対象とした Genome-wideassociation studies (GWAS)で、肝脂肪化と炎症に強い相関を示すことが報告されている PNPLA3 (Romeo S,et al. Nat Genet. 2008)の SNP (rs738409)について評価した。日本人を対象とした GWAS では、
Matteoni 分類 4 vs Control 群間で有意差を認めた と 報 告 され てい るが (Kawaguvhi T, et al.
PLoS One. 2012)、本母集団では、Matteoni 分類
1-2 vs 3-4 の群間で有意差を示し、risk allele (G)と炎症による肝細胞変性や線維化との関連が示唆された (表 3, 4)。
次に HLA SNP について、haplotype×表現型(Matteoni 分類での重症度分類)の 2×3 分割表で評価した
ところ、当初予想した Matteoni 分類 1-3 vs 4 群間では有意差は認めず (表 3)、肝脂肪化・炎症(肝炎)・肝線維化といった肝病態の評価項目毎に、各々の重症度別に網羅的解析をおこなったところ、NAFLD
Activity Score (NAS)における Ballooning 0-1 vs 2 群間と、線維化 F0 vs 1-4 群間で有意差を認めた (表5, 6) 。本解析結果は、ターゲットとした HLA ハプロタイプが、NAFLD/NASH 肝における炎症や線維化と関連する可能性を示唆するものである。
今後、本結果を踏まえ、異なるサンプルセットを用いた replication study での確証を要する。

Subject No.

：26-Shi-107

Title：Analysis of the HLA Haplotype as a Candidate Gene Encoding the Disease

Susceptibility in Patients with Nonalcoholic Steatohepatitis (NASH)-Progression into Large-Scale Gene Analysis via the Network of Core
Hospitals for Linked Liver Disease ManagementResearchers ：Mikio Yanase
Key word：NAFLD/NASH, metabolic syndrome, fatty liver
Abstract：Study Outcome:[Study Plan and Outcome](Study Plan Outline)
1) As a preliminary step to this study, a pilot study shall be carried out at several facilities,
including NCGM.
The study shall be conducted jointly by the Yokohama City University Hospital
Department of Gastroenterology, the Tokyo Medical University Hospital Department ofGastroenterology and the Juntendo University Hospital Department of Gastroenterology,
in addition to NCGM (Center Hospital, Kohnodai Hospital).
The goal is set at enrolling about 300 patients with a definitive diagnosis of NASH
confirmed by pathological examination of biopsied liver tissue, who are willing to provide
written informed consent after receiving a thorough explanation about the study.
The diagnosis of NASH shall be made by specialists in pathology, based on the Matteoni
classification (Gastroenterology. 1999;116:1413-9), Brunt classification (Am JGastroenterol. 1999;94:2467-74) and the NAFLD activity score (NAS) (Hepatology.
2005;41:1313-21).
In each patient with NASH, DNA shall be extracted from the frozen liver tissue (collectedby liver biopsy for diagnosis) or from peripheral blood mononuclear cells, and stored at-80°C (NCGM Center Hospital/Kohnodai Hospital).
The DNA collected and stored thus shall be used for HLA gene typing (Research Centerfor Hepatitis and Immunology).
The distribution of the HLA haplotypes in NASH patients shall be compared between
groups to analyze the HLA types characteristic of NASH patients.
This analysis shall be accompanied by secondary analysis of the physical findings, history,
data on various markers of NASH obtained by serological testing, and data on thePNPLA3 gene obtained by SNP analysis. Data collection and management shall be
conducted in this way.
This study has been approved as a thorough gene analysis within the framework ofclinical studies on NASH by the NCGM Ethics Committee (Genetic: Application No.
131； Approved on March 17, 2014, Approval No.: NCGM-A-000131-01). It has alreadybeen registered with UMIN (UMIN Registration No.; UMIN000009841).
2) If a strong association between an HLA haplotype and NASH is suggested, as anticipated,in this first step of the study, verification through a large-scale clinical study andestablishment of a database will subsequently be undertaken through collaborative studies
by the Nationwide NASH Study Group organized primarily by many core hospitals forlinked liver disease management.
This study is planned within the framework of bridging research between basic andclinical fields, including planning of basic research for elucidation of the mechanism
underlying the relationship between NASH hepatitis and the HLA-mediated immune
system (corresponding to the “2nd hit” of NASH progression).
[Study Plan]
Researchers には、分担研究者を記載する。

Extension of the study period and transition of the study into a multicenter study have been
approved by the NCGM Ethics Committee (Genetic: Application No. 131; Approval No.:NCGM-A-000131-01). New registration of this study in the form of a multicenter study has
been carried out with the Clinical Study Registration System (UMIN Registration: UMIN
Registration No.; UMIN000014850). Regarding approval by the ethics committees of theother participating facilities, approval has been obtained from the Ethics Committee of theYokohama City University School of Medicine Department of Gastroenterology andHepatology (meeting held on September 25, 2014, approval announced on September 29 ofthe same year) and the Tokyo Medical University Department of Gastroenterology (approvalannounced on June 25, 2014: Application No. 2757).
Concerning DNA extracted from the peripheral blood mononuclear cells and stored at-80°C, case registration and sample/data collection have been completed for 421 cases in total,
including 50 cases from the NCGM Center Hospital Department of Gastroenterology (mainfacility), 256 cases from the Yokohama City University Department of Gastroenterology andHepatology (one of the participating facilities), and 2 cases from the Tokyo MedicalUniversity Department of Gastroenterology (another participating facility). A database has
been created jointly by multiple facilities.
HLA haplotype analysis has been conducted on the DNA samples collected to date at theResearch Center for Hepatitis and Immunology (reagents used: TaqMan SNP Assays,
Human SM HLA complex group22).
[Outcome]
The characteristics of all groups were as follows(Figure 1). Factors associated with thepathophysiology of nonalcoholic steatohepatitis(NASH), such as the pathological findings, clinicaldata, and PNPLA3 single nucleotide polymorphism(SNP) are shown in Figure 2.
At first, we evaluated PNPLA3 SNP (rs738409)
that was reported to be strongly associatedwith hepatic steatosis and inflammation
by genome-wide association studies(GWASs) conducted on nonalcoholic fatty
liver disease (NAFLD)/NASH patients(Romeo S et al. Nat. Genet. 2008). A
significant difference in PNPLA3 SNPvariant distribution between Matteoni
classification 4 versus the control group was reported by GWASs conducted on Japanesepatients (Kawaguvhi T et al. PLoS One. 2012). However, we detected a significant differencein PNPLA3 SNP variant distribution between Matteoni classification 1/2 and 3/4, whichsuggested a correlation between the risk allele (G) and inflammation-induced hepatocyte
degradation or hepatic fibrosis (Figures 3, 4).
Next, when we analyzed HLA SNP using 2×3 contingency table analysis of haplotype andphenotype (Matteoni classification), we did not detect a significant difference between
Matteoni classifications 1–3 and 4 that had been expected in advance (Figure 3). So, we
Researchers には、分担研究者を記載する。

performed comprehensive analysis of each evaluation item,
such as hepatic steatosis, inflammation (hepatitis) or hepatic
fibrosis, then detected any significant differences between
ballooning score of NAFLD activity score 0/1 and 2 andbetween hepatic fibrosis F0 and F1–4 (Figures 5, 6). These
results suggest that the targeted HLD haplotype is associatedwith hepatic inflammation and/or fibrosis in NAFLD/NASHliver.
In future, we need to validate our results by replicating thestudy using different sample sets.

Researchers には、分担研究者を記載する。

【目的と必要性】
本邦で急増するメタボリックシンドローム患者の予後に大きく関わる進行型
NASHの病態解明を進める。
多因子疾患であるNASH病態には環境因子、遺伝的因子双方の強い関与が明らかであるが、本研究ではNASHの疾患感受性遺伝子として、免疫に関与するヒト白血球抗原(HLA)のハプロタイプに注目する。

【方法】
NCGMを主とした多施設共同研究の形式で、NASH診療に携わる複数施設の検体提供のもと、肝炎・免疫研究センターにおいてNASH患者の遺伝子解析をおこない、NASHとHLAハプロタイプとの関連性とその意義について検討する。

【期待される成果】
NASH病態の中でも、関連性の強い遺伝子因子としてHLAの関与を明らかにすることで、NASH病態進展に影響する「炎症」との機序解明に繋がる。

研究発表及び特許取得報告について

課題番号：26指107

研究課題名： 非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)患者における疾患感受性遺伝子候補としてのHLAハプロタイプ解析-肝疾患診療連携拠点病院のネットワークを通じた大規模な遺伝子解析への展開-

主任研究者名：柳瀬幹雄

論文発表
論文タイトル

著者

掲載誌

掲載号

年

Hepatitis B virus vaccination-related
Yanase M, etseroprevalence among health-carepersonnel in a Japanese tertiary medical al.
center.

Hepatol Res.

46(13):13301337

2016

Generalized granuloma annulare
Mikami E,
successfully treated with narrowband
Yanase M, etultraviolet B and anti-hepatitis C virusal.
therapy.

J Dermatol.

43(8):975-7

2016

Mizokami M,
Yokosuka O,
Takehara T,
Sakamoto N,
Korenaga M,
Mochizuki H,
Nakane K,
Enomoto H,
Ikeda F,
Yanase M, etal.

Lancet InfectDis.

15(6):645-53

2015

Deficiency of eNOS exacerbates earlyNozaki Y, etstage NAFLD pathogenesis by changing theal.
fat distribution.

BMCGastroenterol.

15(1):177.
doi:
10.1186/s12876-015-0409-9

2015

Usefulness of Magnetic Resonance Imaging
for the Diagnosis of Hemochromatosis
Nozaki Y, etwith Severe Hepatic Steatosis inal.
Nonalcoholic Fatty Liver Disease: A Case
Report.

Intern Med.

55(17):2413-7

2016

Ledipasvir and sofosbuvir fixed-dose
combination with and without ribavirinfor 12 weeks in treatment-naive andpreviously treated Japanese patientswith genotype 1 hepatitis C: an openlabel, randomised, phase 3 trial.

研究発表及び特許取得報告について

Hepatocellular carcinoma in Japanesepatients with nonalcoholic fatty liverdisease and alcoholic liver disease:
Multicenter survey.

Tokushige K,
Hyogo H,
Nakajima T,
Ono M,
Kawaguchi T,
Honda K,
Eguchi Y,
Nozaki Y,
Kawanaka M,
Tanaka S,
Imajo K,
Sumida Y,
Kamada Y,
Fujii H,
Suzuki Y,
Kogiso T,
Kario Y,
Munekage K,
Kuromatsu R,
Ooeda S,
Yanase Y, etal.

J Gastroenterol. 51(6):586-96

2015

学会発表
タイトル

発表者

学会名

場所

年月

発表者

発表先

場所

年月日

該当なし

その他発表(雑誌、テレビ、ラジオ等)
タイトル

該当なし

特許取得状況について※出願申請中のものは(発明名称)記載のこと。
特許権者(申請者）
登録番号
登録日(申請日)（共願は全記載）

該当なし※該当がない項目の欄には「該当なし」と記載のこと。
※主任研究者が班全員分の内容を記載のこと。

出願国