地球環境研究,Vol.6(2004)

琵琶湖におけるクロモ Hydrilla verticillata 繁茂水域及びクロモ培養水槽から検出されたアオコ形成シアノバクテリアの増殖抑制活性
渡辺真利代＊

仁木拓志＊

上野祐子＊＊

浪越通夫＊＊＊＃

キーワード：アレロパシー､ アオコ形成シアノバクテリア､ 水生植物

１はじめに造決定されていることから (Nakai et al. 2000)､ クロ
モについても同様な活性を持つ物質が放出されている可琵琶湖は､ 周知の通り､ 日本最大の湖であり､ ｢近畿能性がある｡ 水圏生態系におけるアレロパシー現象につの水がめ｣ とも言われる重要な水源でもある｡ しかし､いての報告は少ないが､ 水生植物とシアノバクテリアの戦後の経済発展に伴い､ 大量の産業・生活排水の流入を間のアレロパシー現象は､ 生態系に低負荷なアオコ防除受け､ 富栄養化が進行した結果､ 琵琶湖においても頻繁法への応用が期待されており､ 近年の水圏生態化学の分にアオコの発生が観察されている｡ アオコとは､ シアノ野におけるホットな話題の一つとなっている｡ 本研究でバクテリアが大増殖し､ 水が変色した状態を指す｡ 著しは､ クロモ Hydrilla verticillata とシアノバクテリアのい場合は水面にマット状に集積 (スカムと呼ばれる) す間で起こっていると考えられるアレロパシー現象を､ 化ることもある｡ アオコは景観悪化や､ その分解に伴う悪学生態学的に解明することを目的とし､ 琵琶湖のクロモ臭､ 貧酸素水の形成等､ 多くの問題を引き起こす｡ また､繁茂水域及び琵琶湖産クロモの培養水槽水中において､アオコを形成するシアノバクテリアの中には毒素を産生アオコ形成シアノバクテリアの増殖抑制活性を持つ物質する種も多く､ 中毒や死亡といった被害の他､ 発ガン促を探索した｡

進作用も指摘されている (渡辺ら1994)｡
しかし､ 琵琶湖においては､ 沈水性植物であるクロモ､ホザキノフサモが繁茂している水域には､ アオコ発生が見られないという現象が観察されている｡ これらの水域

２材料と方法２. １

琵琶湖における採水と粗抽出は透明度もよく､ 水深が浅くなる夏季には､ 植物の間を2002年10月12日､ 琵琶湖南湖のクロモ繁茂水域におい泳ぎ回る魚類が観察できるほどである｡ 沈水性植物は根て､ 水深約１m の地点から､ 水中ポンプを用いて､ 800から堆積物中の栄養塩を吸収できるので､ これらを水中L の湖水を採取した｡ 採取した湖水は､ いったんポリタから吸収するシアノバクテリアとの間で栄養塩の競合がンクに移した後､ 以下に述べるバッチ法を用いて溶存有起こっているとは考えにくい｡ また､ 沈水性植物は完全機物の固相抽出を行った｡ HP-20担体 (三菱化成) 10Lに水没した状態で繁茂するため､ ガス胞を有し高い浮上を45L のポリバケツ (底面に小孔を多数開け､ 布を敷い性を持つシアノバクテリアに対して､ 光獲得の点では不た物) に入れたものを固相抽出カラムとした｡ カラムは利であることから､ 光競合の結果として沈水性植物が勝メタノール (20L) で洗浄した後､ 蒸留水 (20L) で置ち残るとも考えにくい｡ 実際､ 琵琶湖では他種の水生植換した｡ 同サイズのポリバケツに上述の固相抽出カラム物の繁茂帯でアオコ発生が見られる場所もある｡ これらを重ね､ ここに湖水を導入した｡ カラム中で湖水を静かのことから､ クロモやホザキノフサモは何らかのアレロに攪拌した後しばらく静置して抽出を行い､ 湖水を捨てパシー物質を放出し､ シアノバクテリアの増殖を抑えてた｡ この操作を繰り返し行うことによって､ 湖水からのいる可能性がある｡ ホザキノフサモについては､ アレロ固相抽出を行った｡ その後､ カラムを蒸留水 (20L) でパシー物質として､ 数種のポリフェノール類が単離・構洗浄し､ 中の HP-20担体をガラスカラムクロマト管＊

立正大学地球環境科学部
東京水産大学大学院水産学研究科海洋環境学専攻＊＊＊
東京水産大学水産学部 (現：東京海洋大学海洋科学部)＃
立正大学大学院地球環境科学研究科オープン・リサーチ・センター＊＊

平成14年度業績

11琵琶湖におけるクロモ Hydrilla verticillata 繁茂水域及びクロモ培養水槽から検出されたアオコ形成シアノバクテリアの増殖抑制活性 (渡辺・仁木・上野・浪越)Fig. 1：琵琶湖湖水からのシアノバクテリア増殖抑制活性物質の分離フローチャート(太字は活性の検出されたフラクションを示す)(５cm i.d.×75cm length) に移した｡ メタノール20L燥し､ HP-20メタノール溶出物を得た (Fig.２)｡を流すことにより､ HP-20に吸着した成分の溶出を行った｡ 溶出液は､ ロータリーエバポレータでメタノールを除去した後､ 凍結乾燥を行って､ HP-20メタノール溶出物を得た (Fig.１)｡

２. ３

活性成分の分離琵琶湖湖水の HP-20メタノール溶出物を少量の蒸留水で溶解し､ ODS 担体 (ODS-SS-1020T､ センシュウ科学) 40g を充填したオープンカラム (２cm i.d.×50２. ２

クロモ培養水中からの粗抽出cm length) に吸着させた後､ 蒸留水 (200ml) で洗浄

琵琶湖から採集したクロモを約300L の培養槽に入れ､した｡ さらに､ 25％､ 50％､ 75％､ 100％メタノール各

MA 培地 (市村1979) でエンリッチして､ 雨水の入ら200ml で順次溶出させた｡ 洗浄水フラクションを b1､ない場所で屋外培養を行った｡ ただし､ 低水温による枯メタノール溶出フラクションを25％メタノール溶出フラ死を避けるため､ 秋から冬にかけては約60L のプラスチッ

クションから順に b2､ b3､ b4､ b5とし､ それぞれ､ ローク水槽を使用し､ 25℃､ 14L：10D の明暗周期でエアレータリーエバポレータ及び凍結乾燥によって抽出物を得た｡

ションをしながら屋内培養を行った｡ 培養期間は１ヶ月

このうち､ b４フラクションについては､ さらに HPLC以上とし､ その間､ 混入・増殖したアオミドロはこまめによる分離を行った｡ カラムには Mightysil RP-18 (10に 除 去 し た ｡ ク ロ モ 培 養 水 槽 水 50L を ､ Whatman

mm i.d.×250mm length､ 関東化学) を用い､ 流速２GF/C フィルターで吸引ろ過し､ 試水とした｡

ml min−1 でグラジエント溶出 (０〜50min：60％→100

試水中の化合物は､ HP-20担体 (三菱化成) 500ml％メタノール､ 50〜60min：100％メタノール) を行っ(膨潤時) を充填したオープンカラム (５cm i.d.×50cmた｡ 検出器にはフォトダイオードアレイ (検出波長：length) に通すことによって固相抽出した｡ 蒸留水210nm､ 230nm､ 254nm) を用い､ 溶出液はフラクショ(1.5L) で非吸着成分を溶出した後､ 1.5L のメタノールンコレクターで回収し､ b41から b47までの７フラクショにより吸着した成分を溶出させた｡ 溶出液はロータリーンを得た (Fig.１)｡

エバポレータを用いてメタノールを除去した後､ 凍結乾12クロモ培養水の HP-20メタノール溶出物も同様の操

地球環境研究,Vol.6(2004)

Fig. 2：クロモ培養水からのシアノバクテリア増殖抑制活性物質の分離フローチャート(太字は活性の検出されたフラクションを示す)

作で ODS 担体 (20g) に吸着させた後､ 琵琶湖湖水抽

Microcystis aeruginosa strain TAC20を用いた｡ 検定

出物と同様のスキームで順次溶出させた｡ 蒸留水フラク藻は MA 培地を用いて予備培養を行い､ 使用した｡ 検ションを Hv1､ メタノール溶出フラクションを25％メ定対象となる抽出物は､ エタノールを溶媒として定量的タノール溶出フラクションから順に Hv2､ Hv3､ Hv4､に溶解し､ マイクロプレートに分注した｡ 溶解しなかっHv5 とし､ それぞれ､ ロータリーエバポレータ及び凍た成分については､ 超音波､ ボルテックスミキサーで均結乾燥によって抽出物を得た｡ このうち､ Hv2 につい一に分散させた後､ 分注した｡ 分注後､ クリーンベンチて は ､ さ ら に HPLC で 分 離 を 行 っ た ｡ カ ラ ム に は内で静置してエタノールを完全に蒸発除去した後､ アッCapcell Pak C18 (10mm i.d.×250mm length､ 資生堂)

セイ時の初期細胞濃度が１×105cells ml−1になるようにを用い､ 流速２ml min−1 で20％メタノールによって溶MA 培地で適宜希釈した検定藻を１ml ずつ分注した｡

出を行った｡ 検出器にはフォトダイオードアレイ (検出なお､ アッセイにはマイクロプレートの中央24穴のみを波長：210nm､ 230nm､ 254nm) を用い､ 溶出液はフラ用いた｡ マイクロプレートはプレートシールで密封し､クションコレクターで回収し､ Hv21から Hv26を得た｡

25℃､ 連続光下で､ マイルドシェーカーを用いて緩やか

その後､ カラムに100％メタノールを流し､ その溶出液に攪拌しながら１週間培養した｡ 培養後､ 各ウェルのを Hv27として､ 合計７フラクションを得た (Fig.２)｡

TAC20細胞数を計数した｡ TAC20細胞数の計数には､得られた各フラクションは､ 後述のアオコ形成シアノ

Fucks-Rosenthal 型もしくは Thoma 型の血球計算盤をバクテリア増殖抑制試験を行い､ 活性の検出を行った｡

用いた｡ コントロール (エタノールのみ) の細胞数と各対象抽出物を加えた系の細胞数との差分を､ コントロー

２. ４

アオコ形成シアノバクテリア増殖抑制試験

抽出された化合物のアオコ増殖抑制活性は､ 48穴マイルの細胞数で除した値 (％表示) をもって､ 増殖抑制活性とした｡

クロプレートを用いてアッセイした｡ 検定藻には

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琵琶湖におけるクロモ Hydrilla verticillata 繁茂水域及びクロモ培養水槽から検出されたアオコ形成シアノバクテリアの増殖抑制活性 (渡辺・仁木・上野・浪越)Fig. 3：b4 の HPLC クロマトグラムと各フラクションの分取位置
Table. 1：HP-20メタノール溶出物を ODS オープンカラムにより分離して得られた各フラクションの重量とシアノバ
クテリア増殖抑制活性 (琵琶湖湖水)
フラクション

b1b2b3b4b5

溶出溶媒

蒸留水

25％ MeOH

50％ MeOH

75％ MeOH

100％ MeOH

重量(mg)

163.7

226.5

91.8

33.1

17.0

増殖抑制活性(％)

−−−

38−

増殖抑制試験の際の濃度：100ppm, −：活性なし
Table. 2：b4 の HPLC による分離で得た各フラクションの重量とシアノバクテリア増殖抑制活性
b41b42b43b44b45b46b47

重量(mg)

フラクション

2.8

7.7

7.03.83.43.32.3

増殖抑制活性(％)

−

−65−

68−

−

増殖抑制試験の際の濃度：50ppm, −：活性なし

３結

３. １

果

この b4 フラクションを HPLC でさらに分離したクロマ
トグラムを Fig.３に示す｡ b41から b47の各フラクショ

琵琶湖湖水から得られたアオコ増殖抑制活性ンのうち､ b43と b45の２つにシアノバクテリア増殖抑

琵琶湖湖水からの分離フローチャートを Fig.１に､制活性が認められた｡ これらの増殖抑制活性は､ 50ppm

各フラクションの重量と活性の一覧を Table.１と２示において､ それぞれ65％､ 68％と比較的高い値を示したす｡ 800L の琵琶湖湖水から得られた HP-20メタノール(Table.２)｡

溶出物は710mg であった｡ この溶出物のシアノバクテ
リア増殖抑制活性は300ppm の濃度において33％と低かっ

３. ２

クロモ培養水から得られたアオコ増殖抑制活性た｡ この HP-20メタノール溶出物を ODS カラムで分離

クロモ培養水からの分離フローチャートを Fig.２に､して得られた b1 から b5 の各フラクションのうち､ 増

各フラクションの重量と活性の一覧を Table.３と４に殖抑制活性の認められたフラクションは､ 75％メタノー示す｡ 100L のクロモ培養水から得られた HP-20メタノー

ル溶出フラクションである b4 (33.1mg) のみであり､ル溶出物は142mg であった｡ この溶出物のシアノバク

その活性は100ppm において38％であった (Table.１)｡

テリア増殖抑制活性は200ppm で33％であった｡ また､

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地球環境研究,Vol.6(2004)

Fig. 4：Hv2 の HPLC クロマトグラムと各フラクションの分取位置
Table. 3：HP-20メタノール溶出物を ODS オープンカラムにより分離して得られた各フラクションの重量とシアノバ
クテリア増殖抑制活性 (クロモ培養水)
フラクション

Hv1

Hv2

Hv3

Hv4

Hv5

溶出溶媒蒸留水

25％ MeOH

50％ MeOH

75％ MeOH

100％ MeOH

重量(mg)

274632137

増殖抑制活性(％)−7710−−

増殖抑制試験の際の濃度：100ppm, −：活性なし
Table. 4：Hv2 の HPLC による分離で得た各フラクションの重量とシアノバクテリア増殖抑制活性
Hv21

Hv22Hv23

Hv24

Hv25

Hv26

Hv27

重量(mg)

フラクション

2.84.83.22.62.3

1.44.5

増殖抑制活性(％)−

8361−52−−

増殖抑制試験の際の濃度：50ppm, −：活性なし

この抽出物を ODS カラムに吸着させ､ 水−メタノール(2.3mg) の３フラクションに増殖抑制活性が認められ溶媒で溶出させた Hv1 から Hv5 の各フラクションにおた｡ これらの増殖抑制活性は､ 50ppm において､ それいて､ 増殖抑制活性は25％メタノール溶出フラクション

ぞれ83％､ 53％､ 62％と比較的高い値を示した｡

である Hv2 (46mg) と50％メタノール溶出フラクションである Hv3 (32mg) に認められ､ 特に Hv2 では100ppm 濃度で77％と比較的高い活性が認められた (Table.
３)｡ Hv3 の増殖抑制活性は100ppm において10％であった｡

４考

察

本研究により､ クロモ培養水と琵琶湖におけるクロモ繁茂水域から､ ともにシアノバクテリアの増殖を抑制す高い活性の認められた Hv2 をさらに HPLC で分離しる活性が認められたことから､ 自然生態系にもクロモとた結果を Fig.４､ Table.４に示す｡ 得られた７フラク

シアノバクテリア Microcystis aeruginosa の間にアレロションのうち､ Hv22 (4.8mg)､ Hv23 (3.2mg)､ Hv25

パシー現象が存在する可能性が示唆された｡

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琵琶湖におけるクロモ Hydrilla verticillata 繁茂水域及びクロモ培養水槽から検出されたアオコ形成シアノバクテリアの増殖抑制活性 (渡辺・仁木・上野・浪越)

アレロパシー物質は植物から放出される物質であるたいることから､ 各フラクションに含まれる活性物質を分め､ 生命維持に必要な一次代謝産物とは考えにくく､ 二離・精製するためには､ その分離条件をさらに詳細に検次代謝産物に含まれると考えられる｡ 従来､ 水生植物か討する必要がある｡ また､ 各フラクションの回収量が少ら抽出されたシアノバクテリア増殖抑制物質の中には､ないため､ その中に含まれる活性物質を単離し､ 構造決

脂 肪 酸 類 (Kakisawa et al. 1988) ､ ス テ ロ イ ド 類定を行うためには､ さらに大量の試水から物質を回収す(Aliotta et al. 1990) 等､ それ自身の生理的役割等から､る必要があるだろう｡ また､ 実際には各フラクションにアレロパシー物質としては機能しないのではないかと考含まれている活性物質が相乗的に働くことによって､ 活えられるものもある｡ しかし､ 一方で､ 水生植物の生育性を増強させている可能性もある｡ 複数の物質の相乗効する水中からアレロパシー物質を分離することは､ 水中果による活性の増強については､ 現在のところほとんどで化合物が容易に拡散・希釈されてしまうことから､ 非知られていない｡ 水生植物−アオコ形成シアノバクテリ

常に困難であり､ そのような報告も少ない (宝月ら1960；

ア間の相互作用を明らかにするためには､ 今後､ これら

Sho-wen et al. 1991)｡ 一方､ 中井らのグループによっの課題について詳細に検討することが必要である｡て､ ホザキノフサモ Myriophyllum spicatum 草体及びその培養水から抽出された数種のポリフェノール類が､謝辞

シアノバクテリア増殖活性を示すことが報告されている

琵琶湖サンプリングの際に多大なるご助力をいただいきまし(Nakai et al. 2000)｡ フェノール性化合物は､ 植物細胞た琵琶湖研究所中島拓男博士､ 濱端悦治博士､ 村上泰三氏､ ク内のシキミ酸経路という生合成経路で合成される｡ また､ロモ水槽や検定藻株の維持､ 採水､ 生物検定などでご助力をいキノンやフェニルプロパノイドもシキミ酸経路で合成されることから､ 中井らのグループではこれらシキミ酸経ただきました代紀世美氏に深く感謝いたします｡ また､ 研究の遂行にあたりご助力いただいた､ 立正大学地球環境科学部環境システム学科水界生態系研究室､ 東京水産大学水産学部海洋環路で合成される主要な化合物についてシアノバクテリア境学科水圏生態化学研究室の学生諸氏に深く感謝いたします｡

増殖抑制活性を試験し､ いくつかの物質で活性を確認し

なお､ 本研究は､ 文部科学省オープン・リサーチ・センターている (Nakai et al. 2001)｡ しかし､ シキミ酸経路は整備事業により実施した｡

陸上植物､ 水生植物共に持っている生合成経路であり､アレロパシー現象を引き起こす植物に限った経路ではな

引用文献

い｡ また､ ポリフェノール類はさまざまな抗菌､ 抗藻作

Aliotta, G., M. D. Greca, P. Monaco, G. Pinto, A. Pollio and用が知られていることから､ 特異的なアレロパシー現象

L. Previtera (1990) In vitro algal growth inhibition byに関与するとは考えにくい｡
本研究は､ 天然のクロモ繁茂水域とクロモ培養水から､ともに比較的高いアオコ形成シアノバクテリア増殖抑制活性を抽出できたという点で､ 今後のこの分野の研究に大きな貢献をすることができると考えられる｡ しかし､現時点では､ 活性フラクションに含まれる化合物がどのphytotoxins of Typha latifolia L. J. Chem. Ecol. 16(9): 2637
−2646.
宝月欣二, 岡西良治, 菅原久江 (1960) 植物プランクトンと大型水生植物との拮抗的関係について. 陸水学会誌21：124−130.
市村輝宜 (1979) 藻類の分離と培養法：淡水藻類. 西澤一俊,
千原光男 (編) 藻類研究法. 294−305. 共立出版.

ような物質であるかは､ 物質の精製が不十分であること

Kakisawa, H., F. Asari, T. Kusumi, T. Toma, T. Sakurai, T.

から､ 不明である｡ 琵琶湖湖水とクロモ培養水から抽出

Oohusa, Y. Hara, M. Chihara (1988) An allelopathic fatty

された活性フラクションは､ ODS 分離の段階で別のフラクションに溶出している｡ 草体から放出された物質が､acid from the brown alga Cladosiphon kamuranus.
Phytochem. 27(3): 731−735.
Nakai, S., U. Inoue, M. Hosomi and A. Murakami (2000)

微生物や光等により何らかの変換を受けてなお､ 活性をMyriophyllum spicatum-released allelopathic polyphenols

維持している可能性もあり､ 活性物質が同一起源である

inhibitingかどうかについては､ それぞれのフラクションから活性

growthof

blue-green

algae

Microcystis

aeruginosa. Wat. Res. 34 (11): 3026−3032.

物質を単離し､ 構造決定を行う必要がある｡ シアノバク

Nakai, S., U. Inoue and M. Hosomi (2001) Algal growth in-

テリア増殖抑制活性は複数のフラクションから見出されhibition effects and inducement modes by plant-producingており､ クロモから放出されるシアノバクテリア増殖抑制物質は複数あると考えられる｡ また､ それぞれの活性フラクションの中には依然として複数の物質が存在して16phenols. Wat. Res. 35(7): 1855−1859.
Sho-wen, Y., S. Wen-hao and Y. Zi-wen (1991) Detection ofantialgal compounds of water hyacinth. In: Bioindicators

地球環境研究,Vol.6(2004)

and Environmental Management. p.255 − 262. AcademicPress, London, Tokyo.

渡辺真利代, 原田建一, 藤木博太 (1994) アオコ−その出現と毒素−. 東京大学出版会.

Anti-cyanobacterial Activities Found in Water Samples Taken from aHydrilla vercitillata -rich Area in Lake Biwa, Japan and H. vercitillata Culture
Mariyo F. WATANABE＊, Takushi NIKI＊, Yuko UENO＊＊ and Michio NAMIKOSHI＊＊＊＊

Faculty of Geo-environmental Science, Rissho University
Graduate Student of Marine Environmental Science, Tokyo University of Fisheries＊＊＊
Faculty of Tokyo Fisheries, Tokyo University of Fisheries＊＊

To investigate an allelopathic interaction between bloom-forming cyanobacteria and aquaticplants in the environment, anti-cyanobacterial activities in a Hydrilla vercitillata-rich area in Lake
Biwa, Japanand H. vercitillata culture were assayed. The organic compounds in the water samples
were extracted by solid-phase extraction. Both of the extracts showed growth inhibition of abloom-forming cyanobacteria, Microcystis aeruginosa strain TAC20. The extracts were separated
into several fractions using ODS open column and HPLC. The activities were found in two fractions
for the Lake Biwa sample and three fractions for the culture sample. These results suggests thatH. vercitillata may inhibit cyanobacterial bloom in the environment by producing and releasingsome allelochemicals against cyanobacteria.

Keywords: allelopathic interaction, cyanobacteria, aquatic plants

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