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飲料用井戸水中の Helicobacter pylori 存在に関する疫学的検討
1）

大分医科大学医学部医学科，2）大分医科大学附属病院総合診療部，3）大分県厚生連鶴見病院，
4）

大分医科大学医学部感染分子病態制御講座

1）

緒方 健志1）
明石 光伸3）

今西 康次
藤岡 利生2）

松塚 敦子1）
牧野 芳大4）

田崎 貴子1）西園晃4）＊（平成 14 年 1 月 21 日受付）
（平成 14 年 9 月 26 日受理）

Key words：

Helicobacter pylori, water-borne infection

要旨

慢性活動性胃炎，消化性潰瘍の原因のみならず，その長期にわたる感染が胃 MALT リンパ腫や胃癌の発生にも関係すると考えられている Helicobacter pylori の感染経路については口―口，糞―口感染，特に飲料水がその主なものと考えられているが不明な点も多い．今回，大分県内で飲用に供されている井戸水中の H. pylori 混入の可能性を探るために，同県内 39 箇所 43 検体の井戸水（開放式，閉鎖式，湧き水式）について，H. pylori 特異的 PCR 法と培養による検討を行った．その結果，ureA 遺伝子領域で 4 カ所，16SrRNA 領域で 1 カ所，H. pylori 遺伝子が検出されたが，培養ではいずれも陰性であった．これより H.
pylori の飲料水，特に井戸水を介した感染の可能性が改めて示唆された．
〔感染症誌序文77：18〜23，2003〕

リカのガンビアの幼児の糞便から H. pylori の培

Helicobacter pylori の日本における感染率は 40養にも成功し，糞便中に H. pylori が排泄されるこ

歳以上の成人で 75％ にも達し1），その持続感染はとを示唆した．わが国では佐々木5）らや堀内ら6）が，慢性活動性胃炎をはじめ，消化性潰瘍，胃 MALT

PCR 法を用いて井戸水から H. pylori の遺伝子断リンパ腫，胃癌などとの関連が明らかになってい片を検出している．

る．感染経路については水平感染，なかでも家族

今回我々は，H. pylori の感染様式の一つとして，2）

特に井戸水を感染源とした糞―口感染を推定し，らは H. pylori の感染率が A 型肝炎の年齢別抗体

井戸水中における H. pylori の存在の有無を改め陽性率と並行していることから A 型肝炎と同様て明らかにし，さらに井戸の種類と井戸の深さが内感染や水系感染を示唆する報告がある．Perez3）の糞−口感染を疑い，また Klein らはペルー国リその存在に影響するかどうかについても検討しマ市における小児の H. pylori 感染率が高いのはた．

公営水道が重要な感染源であろうと指摘し，水系
4）感染の存在を示唆している．Thomas らは西アフ

対象と方法
1．対象とその選択
平成 13 年大分県厚生連健康管理センターの健別刷請求先：（〒879―5503）
大分県大分郡挾間町医大ヶ丘 1―1
大分医科大学医学部感染分子病態制御講座
西園晃診受診者にアンケート用紙を配布し，井戸水使用の有無，飲水歴，胃・十二指腸病変の既往歴等についての調査を行った．書面により同意と協力を
感染症学雑誌第77巻第1号

飲料用井戸水中の H. pylori 存在に関する疫学的検討

19得られた受診者の血清を用い，血中抗 H. pylori

16SrRNA（1st sense N1：5 -GGAGGATGAA-抗体を測定し，抗体陽性であった受診者宅より井GGTTTTAGGA, antisense N4 ：5 -TCTCAGC-

戸水を採取した．採取した井戸水は使用している

ATAACCTGTTAGC, 2nd sense N1, antisense N

井戸の様式により，開放式井戸水（open type），閉

3：5 -AGACTAAGCCCTCCAACAAC）

鎖式井戸水（ボーリング式井戸水，closed type），ureA （ 1 st sense 2 F 2 ： 5 -ATATTATGG-湧き水式井戸水（spring water）であった．採取方AAGAAGCGAGAGC,antisense 2R：5 -ATGGA-法は，開放式井戸水は蛇口もしくは直接井戸から，

AGTGTGAGCCGATTTG , 2 nd sense 2 F 3 ： 5 -閉鎖式井戸水は蛇口もしくはタンクから，湧き水

CATGAAGTGGGTATTGAAGC , antisense 2 R

式井戸水は直接採取した．井戸の深さについても

3：5 -AAGTGTGAGCCGATTTGAACCG）

聞き取り調査を行った．調査 39 箇所から 43 検体

ureB（sense HPU-2（F）：5 ‐GGTCCTACTA-を採取した．検体間の汚染や実験者からの汚染がCAGGCGATAA , antisense HPU-1 （ R ）： 5 ‐ないように，ディスポーザブルグローブを用い，

7）
AGCAATAGCAGCCATAGTGT）

検体濃縮処理，PCR，電気泳動，培養はそれぞれ予想される増幅産物の長さは各々，16SrRNA専用の実験室で実施した．実験者自身は H. pylori

419bp，ureA 200bp，ureB 500bp で あ る．PCRに感染していないことを尿素呼気試験にて確認し反応は 50µl の反応系で行い，Taq ポリメラーゼている．

（TAKARA Shuzo）を用い，反応時間は 1stPCR

2．H. pylori 特異的ゲノムの検出とその確認では 94℃2 分間の denature 後，94℃1 分 間（de-井戸水の濾過・濃縮，菌体 DNA の抽出nature），55℃2 分間（annealing），72℃2 分間（ex-H. pylori 遺伝子の検出は，佐々木らの方法5）にtension）を 35 サイクル繰り返した．なお anneal-従った．採取した井戸水 5 l を，0.45µm 径の Cel-ing 温度は ureA の場合のみ 54℃ とした．得られlulose Acetate フィルター（Corning）で濾過した．

た 1st PCR 産 物 2µl を 用 い 同 様 の 反 応 系 で 2

濾過 し た フ ィ ル タ ー を HBSS（Hanks BalancedndPCR を行った．条件は 1stPCR に準じるが，an-Salt Solution, GIBCO-BRL）に浸潤後振盪し濾過物

nealing 温度は ureA で 58℃2 分間，ureB で 60℃2を溶解させ，31,200g で 10 分遠心して沈殿物を得分間，16SrRNA で 55℃2 分間とした．

た．次に，あらかじめヒツジ抗ウサギ IgG 抗体で増幅された PCR 産物 10µl を 3％ SeaKem GTG

コートされたイムノビーズ Dynabeads M-280（日アガロースゲル（FMC）で電気泳動し，増幅産物本 Dynal）にウサギ抗 H. pylori ポリクロナル抗体

を Ethidium bromide 染色後確認した．期待され（DAKO）を結合させた磁気ビーズを作製し，沈殿る長さの産物が確認できた場合，PCR 産物を SU-7物を HBSS 1ml に溶解した液とビーズ 1×10 個

PREC01（TAKARA）にて精製後，ABI BigDye（25µl）の 割 合 で 混 合 し，37℃ で 20 分 incubate

Termination kit（PE Applied Biosystems）によるした．ビーズを磁石で回収し HBSS で 3 回洗浄ジデオキシ法に て ABI PRISM 310 Genetic Ana-

後， 100mg!
ml の lysozyme と， 1％SDS を加え，lyzer（PE Applied Biosystems）を用い遺伝子配列

37℃ で 1 時 間 転 倒 混 和 後，96℃ で 5 分 間 incu-を決定した．

bate した．5 分間超音波破砕した後，フェノール，H. pylori の培養

クロロホルム抽出後，エタノール沈殿を行いサン

遺伝子配列の決定により H. pylori の存在が確

プル DNA を得，PCR 反応の鋳型とした．

認された場合には，再び採水し同日のうちに上記

H. pylori 特異的 PCRと同様の濾過濃縮過程を行い，H. pylori 選択培地

PCR 反 応 は H. pylori 特 異 的 16SrRNA コ ー ド（M-BHM ピ ロ リ 寒 天 培 地，日 研 生 物 医 学 研 究領域 DNA（以下 16SrRNA），ureA，ureB に対す所）と 7％ ウマ血液寒天培地（Mueller Hinton IIるプライマーを用いて行った．プライマーの配列

Agar，BBL Becton Dickinson and Company）
を用は以下のとおりである．

いて，10％CO2，5％O2，85％N2 の微好気 37℃ の平成15年 1 月20日

20今西Table 1 Positive rate of H. pylori specific amplified
product in the well water
PCR primer for theamplification of H. pylori genome

positive rate（%）

康次 他

井戸水 20 検体中 2 検体（10％），閉鎖式井戸水 19
検体中 2 検体（10.5％），湧き水式井戸水 4 検体中1 検体（25％）であった．これら 5 検体の培養検査を行ったが H. pylori の培養には成功しなかった．

16SrRNA

1/43 （2.3%）

ureA4/43 （9.3%）

H. pylori の遺伝子が検出された 5 個所の検体にureB0/43 （0.0%）

関して，井戸水使用者の H. pylori 関連胃疾患既往があったのは 1 検体のみであった．
考察

条件下で 4 日間の培養を行った．培養にあたって

H. pylori は慢性活動性胃炎をはじめ，萎縮性胃は 5 l の井戸水より得られた濾過濃縮産物を生理炎，消化性潰瘍，胃 MALT リンパ腫，胃癌などと食塩水 30ml に浮遊させた後，1,500g で 20 分間遠の関連が疑われている．H. pylori 感染は世界中に心し，沈殿物を再び 1ml の生食に浮遊させた．そ広がっており，その頻度は地域や社会生活環境にの後，原液，10 倍，100 倍，1,000 倍の段階希釈物より異なることが知られているが，その病態，感を 30µl ずつ培地上に塗布した．

染経路，疾患の発生機序などはいまだ不明である．

結果

糞便，唾液，歯垢から H. pylori に特異的な DNA

開放式井戸水 20 検体，閉鎖式井戸水 19 検体，が検出されており，様々な感染経路の中でも，現湧き水式井戸水 4 検体の計 43 検体について検討

在は糞―口感染，口―口感染が最も有力と考えらした．PCR の結果，16SrRNA のプライマーを用いれている．

ることで 1 検体（2.3％）に，ureA のプライマーを近年，PCR 法により H. pylori 遺伝子が種々の検用いることで 4 検体（9.3％）に増幅産物が確認さ体から検出可能となり，H. pylori の自然環境中でれた（Table 1）．ureB のプライマーを用いた PCRの存在も報告されはじめた．1996 年に Hulten ら8）

では，いずれの検体でも増幅産物は確認されなはペルーでの蛇口及び貯水槽での水から H. pyloriかった．

遺伝子検出を 16SrRNA の遺伝子断片を増幅する予想される長さの増幅産物が確認できた 5 検体ことで行っている．佐々木ら5）は井戸水を含む環境について塩基配列の決定を行った．4 検体（No. 25，中の各サンプルから ureA 遺伝子を nested PCR

39，45，47）
で，H. pylori ureA 遺伝子（26695 strain，により検出した．堀内ら6）は東京近郊の 2 つの井戸

map position ： section 7 ，2322 ― 2123 ，ACCES-

水から，H. pylori の 16SrRNA 遺伝子を検出した

SION AE000529 AE000511）配 列 と 99％ の ho-が ureA は検出できなかったと報告している．わmology を示し，H. pylori ureA 遺伝子（J99 strain，れわれは今回，16SrRNA については H. pylori に

map position：section 7, 2338―2139, ACCESSION

対する特異性が高く，また遺伝的変異の影響が少AE001446 AE001439）配 列 と 97％ の homology

ない配列を新たに採用し，ureA に対するプライを示した（Fig. 1A）．また，1 検体（No. 27）で H.

マーと併せて井戸水中の H. pylori ゲノムの存在

pylori 16SrRNA 遺 伝 子（26695 strain,map posi-を検討した．この方法により 39 箇所 43 検体中 5tion：section 122, 5826―6214, ACCESSION AE

箇所 5 検体から H. pylori の 16SrRNA 遺伝子もし000644 AE000511）配列と 99％ の homology を示

くは ureA 遺伝子のいずれかを検出した．これまし，H. pylori 16SrRNA 遺 伝 子（J99 strain，mapでの報告を含め ureA と 16SrRNA の両方では H.

position：section 117, 5285―5673, ACCESSION

pylori の遺伝子断片は検出されておらず，いずれ

AE001556 AE001439）配 列 と 99％ の homology

かのみで陽性の報告しかなく，我々の結果もいずを示した（Fig. 1B）．聞き取り調査によって得られれか一方のみでの検出となった．一方でしか検出た各々の井戸の種類・深さと H. pylori 遺伝子検できていない理由を今後検討する必要があろう．

出の相関を検討した（Table 2）．その内訳は開放式

Thomas4）らは西アフリカのガンビア在住の子
感染症学雑誌第77巻第1号

飲料用井戸水中の H. pylori 存在に関する疫学的検討

21Fig. 1 A：Alignments of ureA nucleotide sequence of H. pylori obtained from well
samples. #25, 39, 45, 47 were positive for ureA PCR and determined for the nucleotide sequence. 26695 and J99 were the corresponding sequences of the referredstrain from GeneBank （ 26695 strain ： ACCESSION AE 000529 AE 000511, J 99
strain：ACCESSION AE001446 AE001439）.
B：Alignments of 16SrRNA nucleotide sequence of H. pylori obtained from wellsamples. #27 was positive for 16SrRNA PCR and determined for the nucleotide sequence. 26695 and J99 were the corresponding sequences of the referred strain
from GeneBank（26695 strain：ACCESSION AE000644 AE000511, J99 strain：ACCESSION AE001556 AE001439）.

A

B

供の糞便から，23 検体中 9 検体で H. pylori の分離の生菌が存在することを示唆するものである．す培養に成功している．また Kelly9）らも，イギリス

なわち上下水道の整備が不十分な地域では，下水において H. pylori 陽性の成人 25 検体中 12 検体

から水源への大腸菌や H. pylori の混入，および汚で H. pylori を糞便から培養することに成功して染の可能性が考えられる．H. pylori 感染との関係いる．これらの報告は，人の糞便中に H. pyloriを明らかにするためには，今回陽性になった井戸

平成15年 1 月20日

22

今西康次 他

Table 2 Correlation between the presence of H. pylori and well type, depth
typeOpen type

depth

number ofsamples

number of ureA
gene detected

number of
16SrRNA genedetected

1〜 10m1210 〜 20m

41unknown〜 50m

49150 〜 100m

6

Closed type

Spring water

100m 〜2unknown

211m

41434Total

1

水を飲用している人から採取した H. pylori と井ている井戸水中に存在しており，これらの飲用が戸水から採取した H. pylori の遺伝子レベルでの感染経路となりうる可能性が十分考えられる．飲相同性を検討することも今後必要である．

料用井戸水の H. pylori 感染源としてのさらなる佐々木らは，胃癌の発生率の高い地域での調査で，井戸水 52 検体中 8 検体から H. pylori 遺伝子を検出している．我々の調査においても井戸水 43
検体中 5 検体から H. pylori 遺伝子が検出された．
このことは，他の地域においてもほぼ同程度の割合で井戸水から検出されることを示しており，自然環境中には普遍的に H. pylori が存在している可能性を示唆するものである．井戸水の飲用に限らず，日常生活をとりまく様々な環境の中に感染の機会があると考えられる．
開放式井戸では水面が直接外界と接しているため汚染の危険性が高く，閉鎖式井戸の方が衛生的には優れている10）とされる．したがって，開放式井戸である一般的な井戸と，閉鎖式井戸であるボーリング井戸では，前者のほうが汚染の危険性は高く，H. pylori の検出率も高いだろうと当初予想された．しかし Table 2 に示すように，開放式井戸水では 20 検体中 2 検体，閉鎖式井戸水では 19 検体
中 2 検体から検出され，予想とは異なる結果となった．単に開放式か閉鎖式かという区別だけでは外界からの微生物混入の有無は判断できないことを示していると思われる．開放式井戸では深さと汚染は関連が低く，閉鎖式井戸でも浅ければ汚染の危険があると考えられる．
結論として，H. pylori は飲料水として使用され検討が必要であると考える．
文献1）Asaka M, Kimura T, Kudo M, Takeda H, MitaniS, Miyazaki T, et al .：Relationship of of Helicobacter pylori to serum pepsinogens in an asymptomatic Japanese population . Gastroenterology
1992；102：760―6.
2） Perez-Perez GI , Taylor DN , Bodhidatta L ,Wongsrichanalai J, Baze WB, Dunn BE, et al .：Seroprevalence of Helicobacter pylori infections inThailand. J Infect Dis 1990；161：1237―41.
3）Klein PD, Graham DY, Gaillour A, Opekun AR,
Smith EO：Water source as risk factor for Helicobacter pylori infection in Peruvian children. Gastrointestinal physiology working group . Lancet
1991；337：1503―6.
4） Thomas JE , Gibson GR , Darboe MK , Dale A ,Weaver LT：Isolation of Helicobacter pylori fromhuman faeces. Lancet 1992；340：1194―5.
5）Sasaki K, Tajiri Y, Sata M, Fujii Y, Matsubara F,Zhao M, et al .：Helicobacter pylori in the NaturalEnvironment . Scand J Infect Dis 1999 ； 31 ：275―9.
6）Horiuchi T, Ohkusa T, Watanabe M, Kobayashi
D, Miwa H, Eishi Y：Helicobacter pyroli DNA in
Drinking Water in Japan , Microbiol . Immunol .
2001；45（7）：515―9.
7） Labignet AF , Cussac V , Courcoux P ： Shuttle
cloning and nucleotide sequences of Helicobacter
pylori genes responsible for urease activity.J. Bacteriol. 1991；173：1920―31.
感染症学雑誌第77巻第1号

飲料用井戸水中の H. pylori 存在に関する疫学的検討
8）Hulten K, Han SW, Enroth H, Klein PD, Opekun
AR, Gilman RH,et al .：Helicobacter pylori in thedrinking water in Peru. Gastroenterology 1996；
110：1031―5.
9） Kelly SM , Pitcher MCL , Farmery SM , Gibson

23

GR：Isolation of Helicobacter pylori from feces ofpatients with dyspepsia in the United Kingdom.
Gastroenterology 1994；107：1671―4.
10）齋藤和雄，上田直利：井戸 新しい環境衛生 改訂第 5 版．南江堂，東京，1994；p. 138.

Possibility for the Presence of Helicobacter pylori in Drinking Well WaterYasutsugu IMANISHI1）, Takeshi OGATA1）, Atsuko MATSUZUKA1）,
Takako TASAKI1）, Toshio FUJIOKA2）, Mitsunobu AKASHI3）,
Yoshihiro MAKINO4）& Akira NISHIZONO4）
1）

School of Medicine 2）Oita Medical University, Department of General Medicine Center 3）Oita
Medical University hospital. Oita ken Kouseiren Tsurumi hospital
4）
Department of Infectious Diseases Control Oita Medical University, Oita, Japan

Forty three well waters which are currently used as drinking water were studied for the presence of Helicobacter pylori . Using magnetic-beads purification and PCR amplification of H . pylorispecific gene, 4 of the 43 samples were positive for H. pylori-ureA gene（9.3％）and 1 of the 43 samples
was positive for H. pylori-16SrRNA gene（2.3％）. The presence of H. pylori-specific amplified productdid not correlate with the type, depth and location of the wells. This study demonstrated that H. pylori can be transmitted via drinking water, especially well water in Japan.

平成15年 1 月20日