病原体検出マニュアル 2019-nCoV Ver.2.9.1
令和 2 年 3 月 19 日²

本マニュアル Ver.2.3（令和 2 年 2 月 5 日）について：HP 公開用に多少の文言の修正や追加はありますが、基本的な検査内容は、地方衛生研究所にお配りした「2019-nCoV 検査マニュアル Ver.2.3」と同じになっております。

²

Ver.2.3（令和 2 年 2 月 5 日）から、Ver.2.4（令和 2 年 2 月 13 日）にかけての変更点。キット比較についての情報を追記いたしましたが、検査法の内容についての変更はありません。

²

Ver.2.4（令和 2 年 2 月 13 日）から、Ver.2.5（令和 2 年 2 月 15 日）にかけての変更点。（１）市販キットの製品番号の修正。（２）喀痰処理法の追記。検査方法についての変更はありません。

²

Ver.2.5（令和 2 年 2 月 15 日）から、Ver.2.6（令和 2 年 2 月 17 日）にかけての変更点。（１）陽性基準の記載内容の修正と追加記載。（２）問い合わせ先の記載の削除。

²

Ver.2.6（令和 2 年 2 月 17 日）から、Ver.2.7（令和 2 年 2 月 23 日）にかけての変更点。BSL2+についての説明などの追加。引用文献（Shirato et al. 2020 JJID）の追加。

²

Ver.2.7（令和 2 年 2 月 25 日）から、Ver.2.8（令和 2 年 3 月 4 日）にかけての変更点。リアルタイム
RT-PCR 法に利用できる反応試薬の追加。リアルタイム RT-PCR 法に用いる試薬、機器に関する記載の追加。

²

Ver.2.8（令和 2 年 3 月 4 日）から、Ver.2.9（令和 2 年 3 月 18 日）にかけての変更点。リアルタイム
RT-PCR 法に利用できる反応試薬、機器について別添 2 に記載（それに伴いキット間の比較についての記載の削除）。執筆者一覧を、国立感染症研究所作成に変更。陽性コントロールについての記載の修正。

²

Ver.2.9（令和 2 年 3 月 18 日）から、Ver.2.9.1（令和 2 年 3 月 19 日）にかけての変更点。別添 2 の変更。

新型コロナウイルス（2019-nCoV）の遺伝子領域２か所、open reading flame 1a (ORF1a)および spike (S) を特異的に検出する 2-step RT-PCR 法、あるいは（註）TaqMan プローブを用いたリアルタイム one-step RT-PCR 法による遺伝子検査により 2019-nCoV を同定する。
註）リアルタイム one-step RT-PCR 法による試験が成立している場合、リアルタイム one-step RT-PCR 法のみで結果判定して問題なく、2-step RT-PCR 法及び 2-step RT-PCR 法によるシークエンス解析を併用する必要はない。また、リアルタイム one-step RT-PCR 法については検出感度が担保できれば(p.11)、別添 2 以外の他
試薬、他機器でも使用可能である。

【操作法】
1．検体の採取と保存「2019-nCoV(新型コロナウイルス)感染を疑う患者の検体採取・輸送マニュアル」（国立感染症研究所 HP）最新版を参照のこと。
喀痰検体の扱いについては、別添の「喀痰検体の前処理法」を参照のこと。

1

2．RNA の抽出

広く使用されている QIAamp Viral RNA Mini Kit を用いた方法を示すが、他のウイルス
RNA 抽出キットを用いてもよい。
2.1. 材料、機器、器具および試薬

1) 機器・器具
冷却遠心機、1.5ml エッペンドルフチューブ用高速冷却遠心機、1.5ml エッペンドルフチ
ューブ用卓上遠心機、ボルテックスミキサー、チューブ
2) 試薬
QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN、Cat.No.52904)、エタノール、Distilled water(Deionized, Sterile, autoclaved, DNase free, RNase free、和光純薬工業、Cat No.
318-90105 など (以下 DDW)、陽性コントロール RNA
2.2. 操作上の注意

1) 検体の取り扱いは、バイオセイフティーレベル(BSL)2+でおこなう。BSL2 実験施設内の安全キャビネット内で取り扱い、操作中はディスポーザブルのガウン、手袋(2 重)マスク(サージカルマスクでよい)、キャップ等の personal protective equipment (PPE)を着用する。チューブの蓋を開ける時には遠心し、チューブオープナーなどを用い、エアロゾルの発生を極力防止する。
2) 実験室内遺伝子コンタミネーション防止と RNase の混入防止に細心の注意を払う。コンタミネーション防止には、試薬調製場所と PCR 産物などサンプルを扱う場所を物理的に分けることが望ましい。できない場合は、それぞれの操作を別々のキャビネット内で行う。
2.3. QIAamp Viral RNA Mini キットによる RNA の抽出

1) 使用前に行う試薬の調製等(1) サンプルを室温 (15～25°C)に戻す。
(2) Carrier RNA 溶液 1µg/µl の調製
Carrier RNA (凍結乾燥品)310µg の入ったチューブに Buffer AVE を 310µl 添加し、1µg/µl の溶液を調製する。Carrier RNA 溶液は、-20°C 保存で、凍結融解 3 回までなので、適した量に分注して保存する。Buffer AVL が沈殿を生じていた場合は、80°C でインキュベートし、沈殿を溶解した後、調製に使用する。
(3) Buffer AVL/Carrier RNA 混和物の調製
1 サンプルあたり Buffer AVL 560µl、Carrier RNA 溶液 5.6µl になるように Buffer
AVL/Carrier RNA 混和物を調製する(詳細はキット添付の Handbook Table1.を参照)。2～8°C で保存すると沈殿物が生じるので、使用直前に 80°C でインキュベートし溶解す2

る。このインキュベートは、5 分以内とする。なお、Buffer AVLL/Carrier RNA 混和物
は、あらかじめ 560µl ずつ分注し、-20°C に保存しておくと便利である。
(4) Buffer AW1、Buffer AW2 の調製
Buffer AW1 (Kit Cat.No.51104)に 96～100%エタノールを 25ml 加える。
Buffer AW2 (Kit Cat.No.51104)に 96～100%エタノールを 30ml 加える。
2) 操作手順
以下の操作はすべて室温で行う。
(1) 1.5ml チューブに Buffer AVL/Carrier RNA 560µl を入れる。
(2) 検体 140µl と Buffer を充分混合するため 15 秒間 vortex にかけ、室温 (15～25°C)に 10 分間置く。チューブの壁面等に付着している液体を落とすため卓上遠心機で数秒間遠心する (スピンダウン)。
(3) エタノール (96～100%)560µl をチューブに加え、15 秒間 vortex をかけた後、チューブをスピンダウンする。
(4) (3)の液 630µl を QIAamp スピンカラム(2ml コレクションチューブ中)に入れ、蓋を閉め、6,000×g (8,000 rpm)、1 分間遠心する。QIAamp スピンカラムを新しい 2ml のコレクションチューブに移し、残りの(3)の液 630µl を入れ、同様に遠心し、全ての液が無くなるまで行う (この操作は 2 回で終わる)。
(5) QIAamp スピンカラムを開け、Buffer AW1 を 500µl 入れる。蓋を閉め、6,000×g(8,000 rpm)、1 分間遠心する。QIAamp スピンカラムを新しい 2ml のコレクションチ
ューブに移し、ろ液の入っているチューブは捨てる。
(6) QIAamp スピンカラムを開け、Buffer AW2 を 500µl 入れる。蓋を閉め、20,000×g(14,000 rpm)、3 分間遠心する。スピンカラムとろ液等が接触することが無いよう静かに取り出す。接触した時には(7)を行う。
(7) QIAamp スピンカラムを新しい 2ml のコレクションチューブに移し、ろ液の入っているチューブは捨てる。フルスピード (20,000×g )で 1 分間遠心する。
(8) QIAamp スピンカラムを新しい蓋つき 1.5ml のチューブに移し、ろ液の入っている
チューブは捨てる。
QIAamp スピンカラムの蓋を開け、室温に戻した Buffer AVE を 60µl
入れ、蓋を閉めて 1 分間置いた後、6,000×g (8,000 rpm)、1 分間遠心し、ろ液を回収する。なお、抽出 RNA を保存するときは-80°C が望ましい。
3. 2-step RT-PCR 法による 2019-nCoV の定性的検出法

以下に検査・結果判定の概要図を示す。

3

判定フロー
PCR
2例目から
目的のサイズのバンドが見られない目的のサイズのバンドが見られる
陽性

陰性
シークエンス解析
1例目は念のため2019-nCoV配列を確認する

例として SuperScript IV Reverse Transcriptase (Thermo)および Quick Taq HS
Dymix (Toyobo)を用いた反応条件を示す。詳細はキットに添付のマニュアルを参照すること。尚、本マニュアルではプロトコルを１部変更している。なお逆転写反応、PCR 反応に用いる酵素等について、類似品で各施設において運用実績のあるものがあればそれを用いても良い。試薬等の分注操作は全て氷上にて行うことが望ましい。
3.1 必要な器具と試薬

1) 器具
サーマルサイクラー、マイクロピペット、チューブ、電気泳動層
2) 試薬
SuperScript IV Reverse Transcriptase (RT) [Thermo, Cat.No. 18090010. 50, 200 または類似品(PrimeScript RT reagent Kit, Takara RR037A 等)]、
[Quick Taq HS Dymix Toyobo
DTM-101 または類似品(PerfectShot Ex Taq, Takara RR005A 等)]、2019-nCoV 特異的プ
ラ イ マ ー 、 Oligo(dT)12–18 Primer (Thermo, 18418012 ま た は 類 似 品 ) 、 Random
Hexamers (Thermo, N8080127、または類似品。特に指定はない)、Recombinant RNase
Inhibitor (Takara-Bio, 2313A、または類似品)、PCR クリーンアップキット(Wizard SV
Gel and PCR Clean-Up System, Promega A9281、または類似品)、DDW。

No.

Name

direction

sequence (5' to 3')

Expectedsize (bp)

ORF1a セット①

1st

NIID_WH-1_F501

Sense

TTCGGATGCTCGAACTGCACC②

1st

NIID_WH-1_R913

Antisense

CTTTACCAGCACGTGCTAGAAGG

4

413

③

2nd

NIID_WH-1_F509

Sense

CTCGAACTGCACCTCATGG④

2nd

NIID_WH-1_R854

Antisense

CAGAAGTTGTTATCGACATAGC⑤

Seq

NIID_WH-1_Seq_F519

Sense

ACCTCATGGTCATGTTATGG⑥

Seq

NIID_WH-1_Seq_R840

Antisense

GACATAGCGAGTGTATGCC

346

S セット
⑦

1st

WuhanCoV-spk1-f

Sense

TTGGCAAAATTCAAGACTCACTTT⑧

1stWuhanCoV-spk2-r

Antisense

TGTGGTTCATAAAAATTCCTTTGTG⑨

2nd

NIID_WH-1_F24381

Sense

TCAAGACTCACTTTCTTCCAC⑩

2nd

NIID_WH-1_R24873

Antisense

ATTTGAAACAAAGACACCTTCAC⑪

Seq

NIID_WH-1_Seq_F24383

Sense

AAGACTCACTTTCTTCCACAG⑫

Seq

NIID_WH-1_Seq_R24865

Antisense

CAAAGACACCTTCACGAGG

プライマー位置模式図

3.2 1st strand cDNA の合成

1) 陽性コントロールは ORF1a セット、S セットそれぞれ専用のものを用いる。105/µlに希釈された陽性コントロール RNA 10µl に DDW を 990µl 添加する。
2) 1)の陽性コントロール RNA 5µl に等量の DDW を加えて 10µl とし、以下に用いる(5000 コピーを用いる)。5000 コピーの検出が困難であるようならば、事前に検討を行い、検出できる濃度で行ってよい。
3) 抽出された RNA 液および陽性コントロール RNA を用いて、表に示した反応液を調製し、0.2ml チューブに入れる
表 1 逆転写反応液の調製
5×SSIV Buffer

5 µl

Random Hexamers

1 µl

5

547
493

Oligo(dT)12–18 Primer

1 µl

dNTP (2mM each)

5 µl

100 mM DTT

1 µl

Recombinant RNase Inhibitor

1 µl

SuperScript IV Reverse Transcriptase 1 µl
RNA

10 µl

Total

25 µl

4) サーマルサイクラーにて以下のプログラムで反応させる。
23℃

10 min50℃

10 min80℃

10 min5) 反応後、35µl の DDW を添加して希釈し、次の PCR 反応に用いる。
3.3 1st PCR 反応

1) 以下のように反応液を調整する。
2×Quick Taq HS DyeMix

25 µl

Forward primer (50µM)

0.4µl

Reverse primer (50µM)

0.4 µl

DDW

19.2 µl

cDNA

5 µl

Total

50 µl

ORF1a セットでは①NIID_WH-1_F501 および②NIID_WH-1_R913
S セットでは⑦WuhanCoV-spk1-f および⑧WuhanCoV-spk2-rを用いる。
2) 陰性対照として DDW 5µl を用いる。
3) 反応条件を以下のように設定し、PCR 反応を行う。
94℃

1 min

94℃

30 sec56℃

30 sec

68℃

1 min

68℃

5 min

40 サイクル3.4 2nd PCR 反応

1) 以下のように反応液を調整する。
2×Quick Taq HS DyeMix

25 µl

6

Forward primer (50µM)

0.4µl

Reverse primer (50µM)

0.4 µl

DDW

23.2 µl

1st PCR 反応液

1 µl

Total

50 µl

ORF1a セットでは③NIID_WH-1_F509 および④NIID_WH-1_R854
S セットでは⑨NIID_WH-1_F24381 および⑩NIID_WH-1_R24873
を用いる。
2) 陰性対照として DDW 1µl を用いる。
陰性対照の 1stPCR 産物を 1µl 用いても構わない。
どちらでも非特異増幅が起きないことは確認済みである。
3) 反応条件を以下のように設定し、PCR 反応を行う。

4)

94℃

1 min

94℃

30 sec56℃

30 sec

68℃

1 min

68℃

5 min

40 サイクル

反応終了後、1stPCR、2ndPCR 反応液ともに 5uL の増幅産物を用いて 2％アガロースゲ
ル(アガロース ME, 岩井化学または同等品)で TAE バッファー(ニッポンジーンなど)電気泳動し、エチジウムブロマイド(または代用品)による染色後、バンドの有無について確認を行う。1stPCR 終了後に 1st PCR のみの電気泳動を行っても構わない。泳動に際し、必ずマーカーを置き、バンドサイズの確認ができるようにする。2～4％のアガロースゲ
ルを用いることを推奨するが、他濃度でもバンドサイズの確認ができるようであれば用いて構わない。
陽性コントロールの増幅サイズは以下のとおりである。
ORF１a セット 1stPCR

292bp

2ndPCR 261bp
S セット

1stPCR 329bp
2ndPCR 294bp

7

2019-nCoV nested PCR 参考泳動図

100

100

346bp

493bp

261bp

Control

500
400
300
200

Positive
specimen

MarkerControl

Positive
specimen

Marker
500
400
300
200

294bp

陽性検体とコントロールのnested PCRのPCR産物を泳動するとこのような位置関係になります。
5) 陽性コントロールで目的サイズのバンドが検出され、陰性コントロールで検出されないときに試験成立とする。2nd PCR で目的のサイズに近い大きさのバンドが検出された
場合は陽性とする。されなければ陰性とする。Nested RT-PCR においてはバンドが確認されれば陽性と考えることができるが、各施設における 1 例目の検出においては、シークエンス解析を行う事を推奨する。増幅産物から 2019-nCoV 配列が確認されれば 2
例目からはシークエンス解析を行わなくてもよい。本 Nested RT-PCR の検出感度は遺伝子配列解析に成功した検体中のコピー数から、3 コピー前後と推定される。
3.5．(シークエンス解析を行う場合)PCR 産物のクリーンアップ

PCR 産物のクリーンアップをしたのち、シークエンス解析を行う。例として Wizard SV
Gel and PCR Clean-Up System を使用したものを示す。なお、他のクリーンナップ（Agencourt AMPure XP 等）を使用してもよい。
1) 残りの PCR 産物(45µl)を PCR 産物と等量（45ul）の Membrane Binding Solutionと混合する。
2) SV minicolumn を Collection tube に挿入し、１）をアプライし、室温で 1 分間培養

8

し、16,000 ×g で 1 分遠心する。
3) Collection tube 中の廃液を捨て、SV minicolumn を戻し、エタノール添加済みのMembrane Wash Solution を 700µl アプライし、16,000 ×g で 1 分遠心する。
4)

Collection tube 中の廃液を捨て、SV minicolumn を戻し、エタノール添加済みのMembrane Wash Solution を 500μl アプライし、16,000 ×g で 5 分遠心する。

5)

Collection tube 中の廃液を捨て、SV minicolumn を戻し、16,000 ×g で 1 分遠心する。

6) SV minicolumn を 1.5ml チューブに挿入し、30µl の TE バッファー(あるいは DDW)
をアプライし、室温で 1 分間培養し、16,000 ×g で 1 分遠心する。溶出液をシークエン
ス解析に用いる。
3.6. (シークエンス解析を行う場合)シークエンス解析

ORF1a セットでは⑤NIID_WH-1_Seq_F519 および⑥NIID_WH-1_Seq_R840
S セットでは⑪NIID_WH-1_Seq_F24383 および⑫NIID_WH-1_Seq_R24865
を用いてサイクルシークエンス反応を行い、定法通りにシークエンス解析を行う。
配列が得られたら Blast 解析等を行い、MN908947 の配列と比較し、ほぼ一致(おおむね95％以上)するようであれば陽性とする。一致しない場合、ヒト染色体配列など明らかに
2019-nCoV と異なる配列であった場合は陰性とする。シークエンス解析で波形が重なるな
どして明瞭な配列が得られなかった場合、シークエンサーのメンテナンス状況を考慮した
うえで、シークエンス解析をサイクルシークエンスから改めて行う。2 回目の解析でも明瞭な配列が得られない場合は、なんらかの非特異増幅である可能性が高いと考えられるため、陰性とする。
・ORF1a セット、S セットのどちらか一方で 2019-nCoV 配列が確認できれば陽性と判断する。
4. TaqMan プローブを用いたリアルタイム one-step RT-PCR 法による 2019-nCoV の検出

4.1. 機材および試薬
マイクロピペット（10、20、200、1000μl）、DDW、滅菌微量遠心チューブ（1.5ml）、96well
リアルタイム PCR 反応プレート等、8 連ストリップキャップまたはプレートシール、リア
ルタイム PCR 装置、プライマー、TaqMan プローブ、リアルタイム RT-PCR 試薬。
リアルタイム PCR 装置、リアルタイム RT-PCR 試薬については別添 2 参照のこと

4.2. リアルタイム RT-PCR 用プライマーおよびプローブについて
N セット

①

Name

Sequence (5’ to 3’)

Position*

Concentration

N_Sarbeco_F1

CACATTGGCACCCGCAATC

28723-28741

600nM

9

②
③

GAGGAACGAGAAGAGGCTTG
FAM-ACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCA-BHQ
N_Sarbeco_P1(または QSY**)
増幅産物の長さ 128bp
N_Sarbeco_R1

28850-28831

800nM

28770-28794

200nM

参照：
https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/wuhan-virus-assay-v1991527e512
2341d99287a1b17c111902.pdf?sfvrsn=d381fc88_2
N セット No.2 (N2 セット)

Sequence (5’ to 3’)

Position*

Concentration

AAATTTTGGGGACCAGGAAC

29142-29161

500nM

29299-29280

700nM⑥ NIID_2019-nCOV_N_P2 FAM-ATGTCGCGCATTGGCATGGA-BHQ(ま 29239-29258

200nM

Name
④ NIID_2019-nCOV_N_F2⑤ NIID_2019-nCOV_N_R2 TGGCAGCTGTGTAGGTCAAC***
たは QSY**)
増幅産物の長さ 158bp*:Position は Wuhan seafood market pneumonia virus isolate Wuhan-Hu-1
MN908947.1 由来である。
**: TAMRA でも動作確認済み。
***：Ver3 配列(TGGCACCTGTGTAGGTCAAC)とミスマッチがあるが、ウイルス RNA の検出感度に影響がないことを確認済み。Ver3 配列も使用可能。

https://www.jstage.jst.go.jp/article/yoken/advpub/0/advpub_JJID.2020.061/_pdf
4.3. リアルタイム one-step RT-PCR(TaqMan プローブ法)反応

例として QIAGEN 社の QuantiTect® Probe RT-PCR kit を用いた反応条件を示した。詳細
はキットに添付のマニュアルを参照すること。なお、試薬等の分注操作は全て氷上にて行う。
反応プレートの準備と解析

1) 陽性コントロール RNA は N セット用、
N2 セット用それぞれ専用のものを用いる。
105/μlに希釈された陽性コントロール RNA 10μl を DDW に 90μl 添加し、十分混合したのち
スピンダウンする。次に希釈した陽性コントロール RNA50μl を DDW450μl に添加し、十分混合したのちスピンダウンする(103/μl)。陽性コントロール用 RNA は、外来塩基配列を挿入してあるなどして、実験室内コンタミネーションを起こした場合に判別可
能なのものを用いることを推奨する。

10

2) 1)の陽性コントロールを 5×103/5µl から 5×100/5µl コピーまで 10 倍階段希釈する。
希釈方法は例えば DDW450μl にコントロール RNA50μl を添加し、十分混合したの
ち次の希釈へ移る。5×101/5µl コピーが安定して検出されればよい。5×100/5μl コピ
ーもおおむね検出される。陽性コントロールの検出精度が確認されていれば 1 点を用
いでも構わない。
3) RNA 抽出を行ったサンプルを用いて、表に示した反応液を調製する。
表 1 リアルタイム RT-PCR 反応液の調製
N セット

N2 セット2×Master mix

10.0 µl10.0 µl

Forward primer (10µM)

1.2 µl

1.0 µlReverse primer (10µM)

1.6 µl

1.4 µlTaqMan probe (5µM)

0.8 µl

0.8 µlQuantitect RT mix

0.2 µl

0.2 µlDDW

1.2 µl

1.6 µlTemplate RNA

5 µl

5 µl

Total

20 µl

20 µl

プライマー・プローブはあらかじめ混合して mix`を作製し、－30 度に保存して置いて構わない。
4) プレートあるいは 8 連チューブのウェルに 15µl ずつ反応液を入れる。陰性コントロー
ルを 5uL ずつ 2 ウェルに添加する。
5) RNA を 5µl ずつ 2 ウェルに加える。
6) 陽性コントロール RNA を 5µl ずつ 2 ウェルに加える。(段階希釈したものを用いる場
合は濃度の薄いものからウェルに添加する)。陽性コントロールのコンタミネーション等を防ぐため、シーリングあるいはアルミ箔によるカバー等による工夫を勧める。
7) 反応条件を以下のように設定して反応を開始する。
＜反応条件＞
使用するリアルタイム PCR 装置、試薬および反応容器等によって、最適な反応条件は異なるので、必ず事前に検出感度等の確認をしておく。以下に例として、試薬に QIAGEN 社
QuantiTect® Probe RT-PCR Kit、リアルタイム PCR 装置に Applied Biosystems 社 Applied
Biosystems 7500 Fast リアルタイム PCR システムもしくは Roche Diagnostics 社 LightCycler
480 (または 480II、96)を使用する場合の反応条件を示した。他の機器については機器のマ
ニュアル等を参考のこと。

Applied Biosystems 7500 Fast リアルタイム PCR システムを使用する場合

11

機器の設定は以下の通り(Standard モードで使用)
50℃

30min.
↓

95℃

15min.
↓

95℃

15sec.

60℃

60sec.(Data Collection)

×45 cycles

LightCycler 480 II (480、96)を使用する場合
Analysis Mode
RT

None

Cycle
1

Temperature
(℃)
50*

Ramp
Time

( ℃/sec)
30min.

Assay

Absolute Quantification (Standard Curve)

Run ModeStandard 7500

Repoter

FAM

Quencher

None

Denature

None

1

PCR

Quantification

45

Cooling

None

Rate

Acquisition
Mode

4.4

None

95

15min.

4.4

None

95

15sec.

4.4

None

60

60sec.

2.2

Single40

30sec.

4.4**

None

**:Cooling の Ramp Rate は機器の上限値でよい。
8) 陽性コントロールの増幅曲線の立ち上りが 40 サイクル以内にみられ、かつ陰性コントロールの増幅曲線の立ち上がりが見られないときに試験が成立するとみなす。これまでの解析結果からは、N セットよりも N2 セットの方が高い感度を示す傾向にある。検体において、N2 セット 2 つのウェルのうち、一方あるいは両方で反応時間内に増幅曲線の立ちあがりが見られた場合に陽性とみなす。N2 セットが陰性で、N セットだけが陽性の場合
で、陽性が 1 ウェルのみであり、しかも Ct 値（または Cp 値）が高い場合には、非特異的な増幅の可能性が考えられるが、頻度は低いものの再解析の結果、N2 セットでの陽性が確認できた例もあるため、再試験を実施することを推奨する。N セット、N2 セットのい12

ずれのウェルにおいても、反応時間内に増幅曲線の立ち上がりがない場合は陰性とする。
2nd derivative 法による自動判定などでは曲線が見られなくとも陽性と判断される場合がある。
必ず増幅曲線、曲線の立ち上がりについてコントロールのものと比較して確認する。
分離ウイルスから抽出した RNA(Accession LC521925)を使って本リアルタイム RT-PCR
法の検出感度を測定したところ、N セットは 7 コピー、N2 セットは 2 コピーのウイルス
RNA を検出できる計算である。
参考文献（検査法、陽性コントロールの配列などの情報を含む）

Shirato et al. (2020) Development of genetic diagnositic methods for novel coronavirus
2019 (nCoV-2019) in Japan. Jpn J Infect Dis doi: 10.7883/yoken.JJID.2020.061.

国立感染症研究所 作成

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別添 1

喀痰検体の前処理法 ver. 1
鼻腔拭い液、咽頭拭い液、鼻汁、鼻洗浄液などに比べて、喀痰は粘性が非常に高いため、ピペット操作でそのまま検体を取り扱って検査を行う事は困難である。
喀痰を PBS(-)等で懸濁した場合は、喀痰表面に存在するウイルスを浮遊させる事は可能だが、喀痰内部に閉じ込められたウイルスまでは効率よく浮遊させる事ができないと考えられる。さらに PBS(-)等の懸濁液を多く添加する事によって喀痰そのものが希釈されてしまうため浮遊ウイルス濃度が薄くなり、ウイ
ルス RNA の抽出効率やウイルス分離の効率が低くなる可能性がある。
一方、喀痰を溶解した場合は、喀痰内部に閉じ込められたウイルスも浮遊させるため、ウイルス RNA の抽出およびウイルス分離の高効率化が期待できる。しかし、喀痰に含まれるゲノムなどの夾雑物も同時に溶出される事になるため、DNase 処理や溶解液の希釈などの処理を行うなどして、ウイルス RNAの抽出またはウイルス分離の効率に影響しないようにする事が重要である。
本マニュアルでは、PBS(-)等を用いた喀痰懸濁法と DTT を用いた喀痰溶解法
による喀痰検体の前処理法について、参考までに例示する。また、例示した前処理法以外にも、ビーズ式破砕機を利用した破砕法などの前処理方法もあるので、施設毎に検討して実施していただくことも可能である。

1. ウイルス遺伝子検査のための喀痰検体の前処理方法について
DTT 溶解液または PBS(-)懸濁液の上清を RNA 抽出に使用する。これら溶液の粘性は非常に高く、そのままではピペット操作が困難であるため、先切りチッ
プ*1 を使用するとよい。
*1

コンタミネーション防止のため、あらかじめ試薬調製用のキャビネット内などのきれいな環境下でアルミホイルを敷くなどして、カミソリ・カッターナイ
フ・ハサミ等（コンタミネーションを防ぐために常に新品もしくは専用のものを1使用する）でチップの先を切った先切りチップを準備しておく。
1.1.

喀痰処理に必要な器具および試薬

マイクロ遠心機、マイクロピペット（200、1000μL）、滅菌遠心チューブ（15mL、50mL など）、カミソリの刃・カッターナイフ・ハサミ等、滅菌微量遠心チューブ（1.5mL、2.0mL）、PBS (-)（細胞培養グレード）、ジチオトレイトール（dithiothreitol,
DTT: 分子生物学用グレードを推奨、Wako Cat#044-29221, 29223）、滅菌蒸留水、（使い捨てピンセットなど）
1.2

喀痰検体の輸送と保存

空容器に採取された喀痰検体は下記 1.3.1 もしくは 1.3.2 の方法で前処理を行う。ウイルス輸送培地等に採取された喀痰検体は PBS(-)をウイルス輸送培地等に読み替えて、下記 1.3.2 の方法において前処理を行う（フローチャート図を参照)。なお、空容器またはウイルス輸送培地等に採取された喀痰検体の輸送と保存については、「2019-nCoV（新型コロナウイルス ）感染を疑う患者の検体採取・輸送マニュアル」に準じて行う。
1.3.1 喀痰検体を DTT で溶解する場合
1)

PBS(-)を用いて 10% w/v DTT 溶液を作製する（用時調製*2、以下 10% DTT
in PBS とする）。

2)

喀痰に対して容量で 1 倍量の 10%DTT in PBS を加えボルテックスミキサー
および転倒混和により懸濁する。
（あらかじめ喀痰を別のチューブに取り分ける場合は、デカンタもしくは使い捨てピンセット等を用いて分取すると
よい。）

3)

室温で 15 分間インキュベートする。（この段階で喀痰の粘性が低下し扱いやすくなる。口径の広いチップであれば先を切らないでも使用出来る場合
がある。）

4)

溶解液を用いてウイルス分離を行う。RNA 抽出を行う場合は事前に 2 のDNase 処理を行う。

*2

10% DTT in PBS は用時調製が望ましいが、あらかじめ小分け分注したものを-20℃で１年程度保存する事も可能である。凍結融解は避ける。

2

1.3.2
1)

喀痰検体を PBS(-)で懸濁する場合
喀痰に対して容量で 1〜3 倍量の PBS(-)を加えボルテックスミキサーおよび
激しい転倒混和により懸濁する。
（あらかじめ喀痰を別のチューブに取り分ける場合は、デカンタもしくは使い捨てピンセット等を用いて分取するとよい。喀痰により粘性が異なるので、容量の変更は適宜行う。）

2)

先切りチップで懸濁液（1mL 程度）を 1.5 mL もしくは 2 mL 滅菌微量遠心
チューブに移す。

3)

20000 x g、30 分間、4℃で遠心する。

4)

懸濁液の上清を用いてウイルス分離および RNA 抽出を行う。

2

RNA 抽出を行う前の DNase 処理について
QIAamp Viral RNA Mini Kit を用いて RNA 抽出を行う際、喀痰成分は Buffer

AVL を加える事で溶解する。しかし、Buffer AVL 溶解液中の喀痰由来のゲノム
等の夾雑物により、RNA 抽出効率が著しく低下する事があるため、10%DTT in
PBS 溶解液を RNA 抽出に供する場合は溶解液を事前に DNase 処理する必要がある。
2.1

DNase 処理に必要な器具および試薬

マイクロピペット（10、200、1000μL）、滅菌微量遠心チューブ（1.5mL、2.0mL）、
シリンジ、針、RNase-Free DNase Set（QIAGEN Cat#79254)
2.2

喀痰検体の DNase 処理

1)

RNase-Free DNase Set（QIAGEN Cat#79254)に添付の DNase I, RNase-Free を
添付の RNase-Free Water 550μL を用いて溶解する（溶解後の DNase 濃度は2.7 units/μL である)。溶解時に DNase(凍結乾燥品)の散逸を防ぐため、ゴム蓋は開けずに針付きのシリンジをゴム蓋に刺してバイアル内に直接 RNaseFree Water 550μL を加え、転倒混和にて DNase を溶解するとよい(ボルテックスは使用しない)。溶解した DNase I, RNase-Free は凍結融解を避けるため小分けにして-20℃で保存する(9 ヶ月保存可能）。2-8℃で保存する場合は 6週間以内に使い切る。

2)

10%DTT in PBS 溶解液の一部に 1/10 量の Buffer RDD（RNase-Free DNase Set）と 1/100 量の DNase I, RNase-Free（RNase-Free DNase Set）を加える。（例：3445μL の溶解液に 50μL の Buffer RDD および 5μL の DNase I, RNase-Free を
加える。）
3)

室温で 10 分間インキュベートした後、QIAamp Viral RNA Mini Kit 等を用いて RNA 抽出を行う。

＊ 本マニュアルでは DNase に RNase-Free DNase Set（QIAGEN Cat#79254)を用いた方法を例示したが、他社製品を使用してもよい。ただし、他社製品を使用する場合は室温反応で問題がないかどうか、また、RNA 抽出に影響を及ぼさないかどうかを事前に検討しておく必要がある。

本マニュアルは、インフルエンザウイルス遺伝子検査およびウイルス分離のための喀痰検体の前処理（第１版）国立感染症研究所インフルエンザ研究センター（平成 25 年 10 月）を参考に記載されています。

4

図喀痰検体前処理方法フローチャート

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別添 2

2019-nCoV 検出に利用できることが確認できている
反応試薬、機器の組み合わせ
反応試薬

使用機器

Thermo Fisher ScientificRoche LightCycler (96, 480.
480II)ABI 7500
QuantiTect Probe RT-PCR kit (Cat# 204443 等)

シリーズ

ABI QuantStudio シリーズ
ABI StepOne シリーズ
Bio-Rad CFX96 Touch シリーズ
Bio-Rad CFX96 Touch Deep wellシリーズ
Roche LightCycler (96, 480.

AgPath-ID One-step RT-PCR Reagents (Cat#AM1005 等)

480II)ABI 7500

シリーズ

ABI QuantStudio シリーズ
ABI StepOne シリーズ
Roche LightCycler (96, 480.

TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix (Cat#4444432 等)

480II)ABI 7500

シリーズ

ABI QuantStudio シリーズ
ABI StepOne シリーズ

タカラバイオOne Step PrimeScript RT-PCR Kit (Perfect Real
Time)(Cat# RR064A 等)
One Step PrimeScript III RT-qPCR Mix（Cat#RR600A 等）
One Step PrimeScript III RT-qPCR Mix, with
UNG（Cat# RR601A 等）

Roche LightCycler 96, 480II
ABI 7500

シリーズ

ABI QuantStudio シリーズ
ABI StepOne シリーズ
Takara-Bio Thermal Cycler Dice
Real Time System Lite, II または III シリーズ1

Takara-Bio CronoSTAR Portable シリーズ

Bio-Rad CFX96 Touch Deep wellシリーズ
東洋紡
Roche LightCycler (96, 480.
480II)
THUNDERBIRD Probe One-step qRT-PCR Kit (東洋ABI 7500 シリーズ

紡 Cat#QRZ-101 等)

ABI Step One シリーズ
Takara-Bio Thermal Cycler Dice
Real Time System III シリーズ
Bio-Rad CFX96 Touch シリーズ

Bio-RadReliance One-Step Multiplex Supermix(Cat#12010220)

Bio-Rad CFX96 Touch シリーズ
Bio-Rad CFX96 Touch Deep wellシリーズ

他試薬でも検出感度の担保ができれば使用可能。

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