名古屋大学加速器質量分析計業績報告書, ⅩⅩⅠ , 2010.03

酒酵母培養液から単離したジ (2-ェチノレヘキシノレ)フタレート(DEHP) の14c 濃度測定結果について

Analysi
sofnaturalabundance14Ccontent
sofdi(2-ethy血exyl) phthalate(DEHP)isolated
fromacultur
ebrothof “ sake" yeast, Saccharomyc，ω cere陥'iae
浪越通夫・中津孝治・鵜飼和代
MichioN釦likoshi， TakahiroNakazawa, Kazuyoukai

東北薬科大学天然物化学教室
Dep町出ent ofNaturalProductChemis甘y， TohokuPha皿aceutical University Aoba-ku,, Sendai981-8558,Jap阻.

*Corre，司ponding autho.
rE‑mail:mnami@tohoku‑pharm.acjp

Abs仕act

Di(2-e也y血exyl) ph由alate (DEHP) 阻d olei
cac込田 a positiv
e∞ntrol， w
erei
solatedf
romaliquidculturemedi回n ofS
accharomycesce，陀visiae (“ sake" yeast)andanalyzedthenaturalabun也且回 14C
conten飽 ω 也vestiga旬 if 也is DEHPi
sa 田畑ra1 product.1
4C∞nterr旬(PMC) ofDEHP 阻d oleicacidwereand 105.3 土 0.3， respectively. Therefore, DEHPobtained 企'om 也e cultu四 broth of 旦cerev
isiaewillb
eacontaminan
tofi
ndustria1product.
0.778 土 0.029

Keywords:dialkylphthalate; Saccharomyc回 cerevisiae; cul;加re medium; diρ ethylhe.耳yl) phthalate;14Ccontents
キークー戸、:プタノレ鯵ヱステノレ; ;留庫聖母;若養;ジρーエデノレヘキシノv) ブタレ-" ;14C 濃度
1. はじめにDi(2-e由y也exyり ph白ala旬 (DEHP) や di(n-butyl) phthalate (DBP) などのフタル酸エステル類はプラスチック可塑剤として良く知られているが、塗料、接着剤、インクなどの幅広い工業製品にも使われているロこれらのフタル酸エステル類は、土壌、海泥、陸水、海水さらには食品や動植物からも検出され、環境汚染物質といわれている。また、発癌性、変異原性、催奇形性を持っとの疑いがあり、ヒトから水棲生物に至る広い範囲の生物に対する毒性が懸念されている [1-5J 。
一方、植物や海藻などで検出されたフタル酸エステル類はこれらの生物によって作られている天然物ではないかとの考えもある [6ー11J ロそこで我々は、海藻類や醸造品から検出されるフタル酸エステル類、特に DE田と DBP が天然物であるのか、すなわち、生物によって生合成されているのかどうかの検討を 2005 年度から行っている。これまでに、ワカメ、マコンブ、アオサの 3 種類の海藻から分離した DEHP と DBP の 14 C 濃度調u 定を行い、その結果を 2007 年 3 月発行の名古屋大学加速器質量分析計業績報告書(XVI町および学術雑誌に報告した [12， 13J 。今回は、酒、ビール、醤油の醸造に利用されている酵母と麹(糸状菌)の液体培養液からフタル酸エステル類を単離し、14C 濃度を測定する実験を行った。
2. 実験方法

lHNMR (400MHZ) および 13C NMR (100MHz) は日本電子 JEOL AL‑400NMR 測定機を用い、− 152 −名古屋大学加速器質量分析計業績報告書, ⅩⅩⅠ , 2010.03

重クロロホルム溶液で測定した。抽出と分離には全て特級の有機溶媒を使用した。

2.1. 酵母および麹酵母および麹として、以下の酒酵母、ピール酵母、酒麹および醤袖麹を入手した。酵母および麹、それぞれ 2 種類ずつは、東京大学分子細胞生物学研究所(旧応用微生物研究所)細胞機能情報研究センターの保存株 (IAM カルチャーコレクション)の中から選択し、同研究所より購入した。

酒酵母: Saccharomycescerev
isiaeIAM4512
ヒeール酵母: Saccharomycescerev
isiaeIAM4954
酒麹: A
spergillus0ηIzae IAM2735

醤油麹: Aspergill凶 0り'zae IAM26032.2. 酵母の培養
酒酵母とビール酵母の培養には Y-l 培地を用いた。

ブドウ糖 (gl田ose) 、ベプトン、酵母エキス (y聞te副都心、麦芽エキス印国lt 回出ct) を蒸留
水 1 リットルに務かした。これをオートクレーブ(1 21 .C、 20 分)で滅菌し、ろ過滅菌した 0.1% 塩
酸でが1 を 6.2 に調整したロ
この培地 15 mLを 100-mL容の三角フラスコに分注し、それぞれの酵母を植菌した。これを 24 "cで 4 日間振とう培養し、次いで 1 週間静置培養した。
酵母用 Y-1 培地の組成

G
1ucose

10.
0g

関東化学

PeptoneYeastex佐act

5.
0g

大玉栄養化学3.
0g

Ma1tex住'act

3.
0g

DIFCODIFCO

蒸留水で1.00 L にするオートクレープ後、 pH を 6.2 に調整
2.3. 麹の培養

酒麹と醤油麹の培養には F-l 培地を用いた。
市販の男爵イモ (po旬旬)の皮を剥き、およそ 1 cm 角のサイコロ状に切り、その 200 g を金属製の鍋に入れた。これに蒸留水 1 リットルを加えて加熱した。煮崩れしないように注意しながら、弱火で約 20 分煮た後、ガーゼでろ過して煮汁を取った。これにショ糖(四ロ'Ose) を加えて溶解した
後、 1 リットルのメスシリンダーに移し、蒸留水で溶液量を 1 リットルに合わせた。これをオートクレーブ(1 21 .C 、 20 分)に掛けた後、ろ過滅菌した 0 .1%塩酸で戸主を 5.6 に調整した。
この培地 15 mLを 100-mL容の三角フラスコに分注し、それぞれの麹を植菌したロこれを 24 .
Cで 4 日間振とう培養し、次いで 1 週間静置培養した。
麹用 F・ 1 培地の組成Pωato
S田町田200g

男爵イモ

15.
0g

和光純薬

蒸留水で1.00 L にする
オートクレーブ後、 pH を 5.6 に調整− 153 −

名古屋大学加速器質量分析計業績報告書, ⅩⅩⅠ , 2010.03

2.
4.HPLC による DEHP と DBP の分析
DE田と DBP を同じ条件で分析できるかどうかを検証する目的で、グラジエント溶出によるHPLC 分析を試みた。

まず、 DEHP と DBP の標準試料を用いてカラムと溶出溶媒の選定およびグラジエントの条件設定を行ったロ DEHP と DBP をそれぞれ 10.0 mg ずつ取り、メタノール1.0 mLに溶解させた。この溶液の一部をとり、メタノールで 100 倍に希釈して標準試料溶液(最終濃度は 100μg/mL)を調整した。それぞれの溶液を 20μL ずつ HPLC に注入して分析条件を検討した。 HPLC は東ソーのシス

テム(ポンプ CCMP-II、コントローラー PX-8020 、フォトダイオードアレイ検出器 PD-8020、オンラインデガッサー SD-802、カラムオーブン CO-8010) を使用した。その他の HPLC の条件を下記に示した。

田LC による分離条件(グラジエント溶出)
カラム: CAPCELLPAKC・ 18AQ (内径 3mm、長さ 250mm)(資生堂)

カラム温度: 40 ・c
溶媒・ 0.10%

トリプルオロ酢酸水溶液 (A 液)とメタノール (B 液)

リニアグラジエント

A:B=2:3(Om血)→(50 min)• 1:9 (60m血)流速: 0.
50mL/min
検出: UV200‑400nm

2ふ酒酵母の培養と化合物の単離継代培養した酒酵母(液体)を Y-l 培地 15 ml の入った 100 mL三角フラスコ(1 5 本)に 1mLずつ添加し、 4 日間、 25T で振重量培養した。次にそれらを Y-l 培地 135mL の入った 500 mL三角フラスコ(1 5 本)にそれぞれ移し替え、 10 日間、 25'C で振渥培養した。

上記培養液 (2025 mL)に同量のジクロロメタンを入れ、液ー液抽出後、ジクロロメタン層を採取した。さらに同量のジクロロメタンで培養液の抽出を 2 回行った。計 3 回分のジクロロメタン抽出液(約 6 L) を合わせ、エパポレーター (40 ・C 以下)で減圧濃縮した。濃縮物(1 20 mg) はシリカ

ゲルカラムクロマトグラフィー (100 mL、ヘキサンー酢酸エチル 15 :1 で作製)により粗分画した。

溶離液には、へキサンー酢酸エチル 15 :1 、 15 ・ 1 、 10 :1 、 9: 1 、 8 ・ 1 、 5 ・ 1 、及び酢酸エチルのみ、をそれぞれ 100 mL用いた。各溶離液を減圧濃縮することで、溶出物 (0 、 49 、 4.2、1.2、 0.50、 40、4.
4mg)を得た。標準品の DEHP を用い、各溶出物について TLC (展開椿媒.ヘキサンー酢酸エチ

ル 4: 1 、硫酸噴霧)分析を行ったところ、 2 回目のヘキサンー酢酸エチル 15 :1 溶出画分 (49 mg)に DEHP のスポット(Rf値 0.75) が確認できた。

2 回目のへキサンー酢酸エチル 15 ・ 1 溶出画分 (49 mg) を 1 mLのメタノールに溶解させ、その50μL を GC (島津 GC・ 8A) に注入したロ GC 条件は以下の通りである。

GC 条件
カラム:島津ガラスカラム内径 3.2mm x 長さ 3.0m

UniportHP
TCD 検出器感度: 90mV
ゲル: GL サイエンス

カラム温度: 150→230・C (5T/分で昇圧)
注入口温度: 240・c
29 分に溶出されるピーク(他に保持されるピークは無し)を1.5 mLのガラスチューブに分取した。この GC 分取操作を同じガラスチューブにさらに 3 回行った(合計 4 回、メタノール溶液 200μL− 154 −名古屋大学加速器質量分析計業績報告書, ⅩⅩⅠ , 2010.03分)。ガラスチューブに収集した液体を少量のヘキサンで希釈し、コレクションパイアルピンに移し、減圧濃縮することで化合物 1 (7.
1mg) を得た。
また、ヘキサンー酢酸エチル 5 :1 (40mg) 溶出画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (60mL、ヘキサンー酢酸エチル 6 :1 で作製、溶離液も同様)により精製した。溶出液は 60 mLずつ分画し、 TLC (展開溶媒:ヘキサンー酢酸エチル 5 :1 、硫酸噴霧)でモニターした。 Rf 値 0.23 のスポットが現れる 3 番目の画分を減圧濃縮することで化合物 2 (14mg) 得た。

単離した化合物 1 および化合物 2 は、 l H -NMR 、 13C-NMR、及び EI-MS スベクトルにより、それぞれ DEHP および 01eic 配id と同定したロ
GC により精製した DE田(化合物 1) の純度検定は、財団法人化学物質評価研究機構東京事業所に依頼した。

3. 結果と考察標品として使用した DEHP と DBP は石油から作られた工業製品であるので、 14C は検出されなかった [12， 13J 。酵母や麹の培養液から単離した DEHP が、これらの真菌によって生合成されているものであれば、現代炭素と同等の 14C が含まれているはずである。そこでまず、酵母と麹それぞれ2 種類ずつを選び、培養液中の DEHP と DBP の検出を試みた。
3.1. 実験用菌株の選定
Y-l 培地で培養した酒酵母 (Saccharomyc回 cerev，加áe IAM4512)とビール酵母 (Saccharomyc回cen併'isiae IAM4954) および、 F-l 培地で培養した酒麹 (Aspergillus oryzaeIAM2735) および醤油麹(A司pergilli削 oryzae IAM2603) の培養液から、それぞれジクロロメタンで脂溶性物質を抽出し、グラジエント HPLC で DEHP と DBP の分析を行った。
グラジエント溶出法において DEHP は 49 .5分、 DBP は 20.5分に溶出した。酒酵母、ビール酵母、酒麹、醤油麹の培養液から調整した粗抽出物の試料についても、この条件によるグラジエント溶出

HPLC 分析を行ったところ、すべての抽出物から DEHP のピークを検出することが出来た。 DEHPの同定には、フォトダイオードアレイ検出器を用いて各ピークの uv スベクトルを測定することにより行ったロ酒酵母、酒麹および醤油麹の培養液から調整した抽出物からは、 DEHP のピークが明確に観測できた。中でも、醤油麹のクロマトグラムでは DEHP の非常に大きなピークが検出された。
ビール酵母のクロマトグラムには多数のピークがあって同定が難しかったが、フォトダイオードア

レイ検出器によって DE田のピークを確認することが出来た。また、酒酵母、ピール酵母および醤油麹のクロマトグラムにおいて、 DBP は非常に小さなピークとして検出されたが、酒麹のクロマトグラムでは明確なピークとして検出されたロ以上の予備実験から、醤油麹と酒酵母を選定して化合物の単離を進めたが、醤油麹の物質生産の再現性が乏しかったため、今回は酒酵母の実験のみを行うこととした。
3ム酒酵母培養液からの DEHP の単離・精製
酒酵母の培養液をジクロロメタンで抽出し、得られた脂溶性フラクションをシリカゲルカラムで分離した。本試験では DBP はほとんど検出されなかったため、 DE田の単離・精製のみを行った。
DEHP を含む (TLC で確認)フラクションを分取 GC で分離し、 DEHP を精製した。単離した DEHPは 99.8%の純度であることを、外部機関による検定で明らかにした。
2005 年度に 3 種類の海藻から単離した DEHP と DBP は GC による精製を行うことが出来なかったため、 75-85% の純度であった。そのため、検出された 14 C が不純物に由来するとのレフェリーコメントにより最初に投稿した雑誌からリジェクトの判定をされたロこの時の DBP の結果では不− 155 −名古屋大学加速器質量分析計業績報告書, ⅩⅩⅠ , 2010.03

純物の影響はなかったと考えられたが、 DEHP については唆味な結果となってしまった。そこで、別の雑誌に投稿し直した際は、主に DBP の結果について考察した口 3J 。
今回の実験では同じことがないように、 GC による精製を行い、純度を高めた。
また、天然物としての標準物質とするため、酒酵母培養液から DEHP の他にオレイン酸(化合物2) を単離した。

3ふ酒酵母培養液から単離・精製した DEHP の 14C 濃度測定
DEHP およびオレイン酸の 14C 濃度は名古屋大学年代測定総合研究センターにおいて測定して頂いた。その結果を下表に示した。 14C 濃度は pMC (percentmoderncarbon) で表している[t 4J 。
酒酵母培養液から単離した DE田およびオレイン酸の 14C 測定結呆Naturalabundance14Ccon旬nts ofdi(2-e'白ylhexyり ph出alate (DEHP)andoleicacidisolated仕om 血e culturebrothofS
accharomycescerev，山田 IAM4512
compound14ontentCc)(pMCDEHP

0.778 土 0.029

Oleicacid105 .3士 0.3この結果、標準試料として単離したオレイン酸には適正な値が観測されたが、 DEHP は天然物ではなく、工業製品が混入したものであると結論できる。培養、抽出、単離・精製の全ての実験行程と操作で人工 DE田の混入が無いように細心の注意を払っていたが、避け難いことが分かったロこのことは今後の実験に生かしたいと考える。
微生物からフタル酸エステルが得られたという文献のうち、その生物によって生合成されている可能性が示唆されている論文を検索した結果、 DEHP は放線菌の Streptomyc回 banglad，回 hens日 [15Jと糸状菌の Penicillium olsonii [16J から、 DBP が 3 種類の放線菌 S的ptomyces albidojlm叩 [17J 、Streptomycesmelanosporofaciens[18J 、 Streptomyces nasri[t9J 、糸状菌の Penicillium bilaii [20J お
よび緑藻シオグサ科ジュズモの仲間の Chaetomorpha basiretorsa[21J から報告されている。さらに、die血yl phthalate (DEP) がピロリ菌 Helicobacter pylori [22J および南極の海泥から分離された放線菌 Sか'eptomyc回 sp. [23J から得られたとの報告があるロしかしながら、いずれの文献においても天然物であることの確証はない。これらが当該の微生物によって生合成されていることを実証するた
めには、 14C 濃度測定あるいは 13C 前駆体の取り込み実験が必要である。

我々は引き続き、海藻と醸造用真菌を試料に使用して 14 C 濃度調u 定および 13C 前駆体の取り込み実験を行っている。

謝辞
14C 濃度測定をして頂いた名古屋大学年代測定総合研究センターの中村俊夫教授ならびに池田晃子さんに御礼申し上げます。また ， DBP と DEHP の標準試料を提供して頂いた昭和エーテル株式会社とシージーエスター株式会社に感謝致します。

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名古屋大学加速器質量分析計業績報告書, ⅩⅩⅠ , 2010.03

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日本語要旨
酒、ピール、醤油の醸造に利用されている酵母と麹の培養液中に検出される di(2-e也lylhexyl)

ph由alate (DEHP) などのフタル酸エステル類が、これらの真菌によって生合成されている天然物であるかを検討するため、まず酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) の液体培養液から DEHP を単離・精製した。この酵母によって生合成されていることが明らかなポジティブコントロールとして、オレイン酸を同じ培養液から単離した。これら DE田とオレイン酸の 14C 濃度測定結果 (pMC) はそれぞれ 0.778 土 0.029 と 105 .3土 0.3 であった。この結果から、酒酵母の培養液から単離した DEHPは工業製品の混入物であったと考えられる。

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