アミノ酸製剤・サプリメントが神経障害性疼痛治療薬の中枢移行・作用発現に及ぼす影響慶應義塾大学 薬学部薬剤学講座とみ登美

まさとし斉俊教授

アミノ酸製剤・サプリメントが神経障害性疼痛治療薬の中枢移行・作用発現に及ぼす影響慶應義塾大学薬学部

調査・研究

実施者氏名

登美斉俊

【要旨】
神経障害性疼痛治療薬であるプレガバリンやミロガバリンの作用部位への移行は、血液脊髄関門や血液脳関門によって制御されている。プレガバリンはアミノ酸トランスポーター LAT1 を介して関門を透過することが明らかなっている一方、ミロガバリンについては LAT1 の基質ではないことが報告されている。本研究は、プレガバリンとミロガバリン間の中枢移行機構の違いが薬理作用発現に及ぼす影響を、特に中枢移行における血中アミノ酸との相互作用に着目して明らかにすることを目的とした。
脳毛細血管内皮細胞におけるミロガバリン取り込みは OCTN2 siRNA 導入により減少した。
また、OCTN2 強制発現 HEK293 細胞におけるミロガバリン取り込み活性も示された。以上より、ミロガバリンは OCTN2 基質であり、LAT1 を介したプレガバリン移行とは異なる中枢移行機構であることが示唆された。LAT1 基質であるプレガバリンと非基質であるミロガバリンの鎮痛効果に対し、血漿中分岐鎖アミノ酸濃度の上昇が与える影響を、oxaliplatin 誘発 cold allodynia
モデルラットを用いた tail immersion test を用いて比較評価した。その結果、プレガバリンの鎮痛効果は、分岐鎖アミノ酸の血漿中濃度上昇に伴って中枢移行性が低下するのと相関し、低下していることが示された。一方、分岐鎖アミノ酸を前投与したミロガバリン投与群において、ミロガバリン単独投与群と比較して鎮痛効果の変化は示されず、ミロガバリンの脊髄中濃度のAUC にもほとんど影響を与えなかった。
以上の結果から、ラットにおいて、LAT1 基質アミノ酸の血漿中濃度上昇に伴いプレガバリンの脊髄移行が低下することで鎮痛効果発現が低下する一方、非基質であるミロガバリンは影響を受けないことを見出した。これら薬物とアミノ酸を含む一般用医薬品・サプリメント、また高プロテインの食品が併用されるケースは数多く存在すると想定される。本研究の結果に基づき、併用時における服用タイミングや薬剤選択の提案が可能となり、セルフメディケーションの推進に寄与できると考えられる。

１、調査・研究目的
神経障害性疼痛治療薬として用いられるα 2 δリガンド（ガバペンチノイド）として、プレガバ2リン（商品名：リリカ）や 2019 年に承認されたミロガバリン（商品名：タリージェ）が挙げられる。
これらガバペンチノイドは、脊髄後角における一次求心性神経終末における電位依存性カルシウムチャネルのα 2 δサブユニットに特異的に結合する。ガバペンチノイドの結合によりカルシウムイオンの流入を抑制し、興奮性神経伝達物質の過剰放出を抑制することで、疼痛抑制効果を発揮する。一方、血中の薬物が標的である脊髄後角におけるシナプスにて疼痛抑制作用を発揮する
ためには、脊髄血管内皮細胞が細胞間で密着結合することで形成された血液脊髄関門を通過する必要がある。また、ガバペンチノイドはめまい・傾眠の出現などの課題もあり、これらの出現は脳に移行した薬物による副作用であると考えられることから血液脳関門の透過性と関連する可能性もある。つまり、ガバペンチノイドの関門を介した脊髄を含む中枢移行機構を明らかにするとともに、中枢移行の変動要因を解明することは有効性と安全性を担保する上で重要である。
プレガバリン及びミロガバリンの pH 7.4 における LogD はそれぞれ -1.35 及び -1.28 と親水性が高いため、中枢移行のためにはトランスポーターを介した移行機構が必要である。申請者は、
プレガバリンのアミノ酸トランスポーター LAT1 を介した中枢移行機構を明らかにしている (1,2)。
一方、 ミロガバリンについては、PEPT1、PEPT2、OAT1、OAT3、OCT2、MATE1 及びMATE2-K の基質である一方で、LAT1 の基質ではないことが報告されている (3)。
基質薬物との併用投与や内因性基質の濃度上昇により、トランスポーターが飽和した場合、薬物の脊髄移行性が変動を受ける可能性がある。LAT1 基質薬物の脳移行性は、LAT1 基質であるロイシンやフェニルアラニンなど分岐鎖アミノ酸（BCAA）の血漿中濃度上昇により低下することが報告されている (4)。これは、分岐鎖アミノ酸の血漿中濃度が LAT1 基質親和性（K m）よりも高いために輸送が飽和しており、分岐鎖アミノ酸の血漿中濃度変動により LAT1 を介した輸送活性が変化することによる。プレガバリンの中枢移行においても分岐鎖アミノ酸血漿中濃度変動の影響を受ける可能性がある一方、ミロガバリンの中枢移行においては異なる挙動となる可能性がある。プレガバリン及びミロガバリンの中枢移行に関して分岐鎖アミノ酸血漿中濃度変動の影響を評価することは、アミノ酸製剤やサプリメントがこれら薬物の薬効に及ぼす影響を理解する上で重要な知見となる。
よって本研究は、プレガバリンとミロガバリン間の中枢移行機構の違いが薬理作用発現に及ぼす影響を、特に中枢移行における血中アミノ酸との相互作用に着目して明らかにすることを目的とした。

2、調査・研究方法
2-1細胞培養

ラット脊髄内皮血管細胞の初代培養は以下の手順で行った。雄性 SD ラットから脊髄を採取し、ホモジナイズした後、1 mg/mL collagenase/dispase で 30 分間酵素処理を行った。
遠心分離により上清を除去後、22% BSA で懸濁し、遠心分離（1500 × g，4℃，15 min）した。

3

沈殿を再度、1 mg/mL collagenase/dispase で 30 分間酵素処理を行った。Collagen I および fibronectin でコートした 24 well dish に細胞を播種し、2 μM puromycin 存在下、37℃、5% CO2 インキュベーターで培養し、内皮細胞を得た。本研究は、慶應義塾動物実験委員会の承認を得て実施した。
その他の細胞についても、常法に従い培養を行った。
2-2培養細胞を用いたミロガバリン輸送機構の解析

24-well plates に播種して培養した細胞の培地を除去し、37℃の緩衝液で洗浄したのち，ミロガバリンおよび必要に応じて阻害候補物質を含む緩衝液を添加した。任意の時間で緩衝液を除去し、4℃の緩衝液で洗浄することで輸送を停止した。0.1 N NaOH を添加して細胞を可溶化した後、0.1N HCl で中和した。
2-3LC-MS/MS

プレガバリンおよびミロガバリンは LC-MS/MS で定量した。ラット脳及び脊髄は 4 倍量の生理食塩水を添加し 20% ホモジネートを調製した。中和した可溶化細胞液またはラット生体試料を、内標準物質含有 acetonitrile と等量で混合し、遠心分離することで除タンパクし、上清を測定用サンプルとした。0.1% ギ酸含有の水及び acetonitrile をそれぞれ移動相 A 及び B として使用し、流速 0.4 mL/ 分でグラジエントモード（移動相 B: 5%（0-0.8 分）、5 - 95%（0.8-1.7 分）、95%（1.7-3.3 分）、5%（3.3-4.0 分 )）により分析を行った。分析カラムとしては、
ACQUITY UPLC BEH C18 カラム (2.1 mm x 50 mm, Waters, Milford, MA) を 50℃で使用した。質量分析検出は、エレクトロスプレーイオン化 positive mode の多重反応モニタリン
グにて、プレガバリンは m/z 160.2 → 55.1、ミロガバリンは m/z 210.0 → 133.0 で検出した。
2-4

プレガバリン、ミロガバリンの鎮痛効果に対するアミノ酸の影響比較

プレガバリンあるいはミロガバリンを静脈内に投与した後の鎮痛効果を、oxaliplatin 誘発
cold allodynia モデルラットを用いて tail immersion test により評価した。Oxaliplatin 誘発
cold allodynia モデルは、雄性 SD ラットに 5% glucose 溶液に溶解した oxaliplatin を 6 mg/kg の投与量で腹腔内投与することで作製した。Oxaliplatin 投与 4 日後、分岐鎖アミノ酸または生理食塩水を投与し、その 15 分後に、プレガバリンあるいはミロガバリンを静脈内に投与した。投与 2 時間まで経時的に、尻尾を 3 cm 程度氷水槽に浸漬し、浸漬後から反応が起きるまでの潜時時間（withdrawal latency : 秒）を測定した。過剰な損傷を防ぐため、最大の浸漬時間を 15 秒とした。投与化合物の抗 Cold Allodynia 効果として、以下の式により MPE（Maximum Possible Antinociceptive Effect）を算出した。
MPE (%) = (T1-Tt) / (T2-Tt)

4

Tt ; 薬剤投与 t 分の潜時時間 ( 秒 )T1 ; 薬剤投与直前の潜時時間 ( 秒 )T2 ; 15 秒 (cut-off )また，同条件で薬物投与したラットを投与後 15、30、及び 120 分後に頸静脈採血し、直ちに脊髄を摘出して見かけの脊髄 / 血漿濃度比（Vd,spinal cord）を評価した。
本研究は、慶應義塾動物実験委員会の承認を得て実施した。
2-5

統計処理

データは Mean ± S.E.M.（standard error of the mean）で表し、統計 解 析は Student’s t 検定または Dunnett’s post hoc test 処理する一元配置分散分析（one-way analysis ofvariance; one-way ANOVA）により解析した。統計的有意差は p ＜ 0.05 を基準とした。

３、調査・研究成果
3-1

ミロガバリン中枢移行機構

血液脳関門モデルとして使用されるラット脳毛細血管内皮細胞 TR-BBB13 細胞及びヒト脳毛細血管内皮細胞 hCMEC/D3 細胞におけるミロガバリン輸送を評価し、ミロガバリンを輸送するトランスポーターの同定を行った。両細胞におけるミロガバリン取り込みクリアランスは、ミロガバリン濃度を 200 μ M から 10 mM に増加させることで有意に低下したことから、担体の関与が示唆された。TR-BBB13 細胞におけるミロガバリン取り込みは、OCTN2 阻害剤である 1 mM pyrilamine、1 mM verapamil、1 mM quinidine、及び 1 mM L-carnitine を添加することにより有意に減少した。hCMEC/D3 細胞におけるミロガバリン取り込みは OCTN2阻害 剤である 1 mM L-carnitine で有意に減 少し、hOCTN2 siRNA 導入により OCTN2mRNA 発現が 52% 減少した条件において、ミロガバリン取り込みは有意に 36% 減少した。
以上の結果より、TR-BBB13 細胞及び hCMEC/D3 細胞におけるミロガバリン取り込みに
OCTN2 の寄与が示された。
OCTN2 強制発現 HEK293 細胞における d3-L-carnitine 取り込みは、10 mM ミロガバリン添加により有意に低下した。OCTN2 強制発現 HEK293 細胞におけるミロガバリン取り込みは、非発現 mock 細胞に対して有意に増加した。また、その取り込みは Na+ 依存的であった。以上より、ミロガバリンは OCTN2 基質であることが示された。
一方、ラット脊髄血管内皮初代培養細胞におけるミロガバリン取り込みは LAT1 阻害剤
BCH で阻害されなかっただけでなく、OCTN2 阻害剤 L-carnitine でも阻害されなかった。
以上の結果から、ミロガバリンの中枢移行においてアミノ酸トランスポーターの関与を示唆する結果は得られず、LAT1を介したプレガバリン移行機構とは異なる機構であることが示唆された。

53-2

プレガバリンおよびミロガバリンの疼痛抑制効果に対する分岐鎖アミノ酸の影響

LAT1 基質であるプレガバリンと非基質であるミロガバリンの鎮痛効果に対し、血漿中分岐鎖アミノ酸濃度の上昇が与える影響を、oxaliplatin 誘発 cold allodynia モデルラットを用いた
tail immersion test を用いて比較評価した。
プレガバリン単独投与群において、投与後 120 分における潜時時間（percent of maximalpossible effect; %MPE）の AUC が vehicle 群と比較して有意に増加したことから、鎮痛効果が確認された。一方、分岐鎖アミノ酸を前投与したプレガバリン投与群において、%MPEの AUC がプレガバリン単独投与群と比較して有意に低下したことから、鎮痛効果が減弱した。
プレガバリンの投与後 120 分までの血漿中及び脊髄中濃度推移を比較すると、プレガバリン単独投与群と比較して分岐鎖アミノ酸前投与群において血漿中濃度の変化は示されない一方、脊髄中濃度の AUC が低下していることが示された。以上の結果から、プレガバリンの鎮痛効果は、分岐鎖アミノ酸の血漿中濃度上昇に伴って中枢移行性が低下するのと相関して、低下していることが示された。
ミロガバリン単独投与群において、投与後 120 分における MPE の AUC が vehicle 群と比較して有意に増加し、鎮痛効果が確認された。一方、分岐鎖アミノ酸を前投与したミロガバリン投与群において、ミロガバリン単独投与群と比較して鎮痛効果の有意な変化は示されなかった。さらに、ミロガバリンの脊髄中濃度の AUC の変化はミロガバリン単独投与群と比較して分岐鎖アミノ酸前投与群において、わずかな増加傾向が示されたものの、影響は小さかった。
ミロガバリンの中枢移行に OCTN2 が関与する可能性が考えられたため、OCTN2 基質である L-carnitine の血漿中濃度の変動が与える変動を評価した。50 mg/kg の L-carnitine を腹腔内投与することで L-carnitine及び acetyl-L-carnitine の血漿中濃度は 8-12 倍に上昇した。
しかし、本条件において、ミロガバリンの脊髄移行性の低下は認められなかった。以上より、今回の実験条件下において、ミロガバリンの脊髄移行における OCTN2 及び LAT1 の寄与は検出されなかったとともに、これら基質の血漿中濃度上昇が鎮痛効果に与える影響も示されなかった。

４、考察
ミロガバリンは血液脳関門の実体である脳毛細血管内皮細胞株において OCTN2 を介して取り込まれることが示された。ミロガバリンは OAT1、OAT3、OCT2、PEPT1、PEPT2、及びMATE1 の基質であること及び LAT1 非基質であることが報告されているが (3)、脳毛細血管内皮細胞においてこれらトランスポーターを介した輸送は観察されなかった。HEK293 細胞による OCTN2 を介したミロガバリンの輸送は Na+ 依存的であった。ミロガバリンは血漿中で両性イオンとして存在していると考えられ、両性イオンの OCTN2 基質（carnitine や midronate）がNa+ 依存的な輸送特性を持つことと一致した (5,6)。本研究にて、ミロガバリンは OCTN2 の基6質となることを初めて明らかとした。一方、脊髄移行においても OCTN2 が関与する可能性が考えられたが、それを裏づけるデータは得られなかった。既報において、OCTN2 ノックアウト
マウスにおける OCTN2 基質 acetyl- [3H ]L-carnitine の脳細胞外液中濃度は野生型マウスと比較して低い一方、脳組織ホモジネート中濃度では差が検出されていない (7 )。マウス脊髄 single
nuclei RNA-sequencing データより、内皮細胞としてクラスタリングされた細胞集団のうち 40%程度が LAT1 を発現する一方、OCTN2 を発現する細胞は 10% 以下だった (8)。よって血液脊髄関門における OCTN2 を介したミロガバリンの脊髄移行は、in vivo において検出が難しいもしくは寄与が小さい可能性がある。いずれにせよ、ミロガバリンの中枢移行機構は LAT1 を介したプレガバリン輸送機構と異なるものであり、血漿中アミノ酸との相互作用が生じる可能性は低いことが示された。
ラットにおけるプレガバリンの脊髄移行性は、血漿中分岐鎖アミノ酸上昇による LAT1 活性低下の影響を受けることが示された。さらに、プレガバリン脊髄組織中濃度の低下と相関して、プレガバリンの鎮痛作用も減少することが示された。ヒトにおいて、アミノ酸補充薬の服用時や、アミノ酸やプロテインサプリメント、高蛋白食を摂取した際には血漿中分岐鎖アミノ酸濃度が上昇する。本研究から、治療及び日常的な分岐鎖アミノ酸摂取による血漿中アミノ酸濃度の変動が、LAT1を介したプレガバリンの脊髄移行および薬効発現に影響を与える可能性が示された。また、脂質異常症治療薬である clofibrate を服用すると、分岐鎖アミノ酸代謝が活性化されることで、血漿中の分岐鎖アミノ酸濃度が約 30-50％低下することが報告されている (9)。したがって、プレガバリンとフィブラート系薬剤を併用することで、血漿中アミノ酸濃度が減少しプレガバリンの脊髄への移行が上昇し、薬理効果が増強する可能性がある。一方、ミロガバリンの鎮痛効果は血漿中分岐鎖アミノ酸濃度の上昇による影響を受けなかった。ミロガバリンの血液脊髄関門透過メカニズムの更なる解析は必要ではあるが、ミロガバリンはプレガバリンと比較してアミノ酸補充薬や高蛋白食との併用による薬効の変動リスクは低いというメリットがあることが示唆された。

５、まとめ
本研究により、OCTN2 の新規基質薬物としてミロガバリンを見出し、脳毛細血管内皮細胞を介したミロガバリン輸送に大きく寄与することを明らかとした。また、ラット脊髄移行において、LAT1 基質アミノ酸の血漿中濃度上昇に伴い LAT1 基質であるプレガバリンの脊髄移行が低下する一方、非基質であるミロガバリンは影響を受けないことを見出した。鎮痛効果についても、
プレガバリンでは脊髄移行性の低下による効果の減弱が観察されたが、ミロガバリンの鎮痛効
果は分岐鎖アミノ酸の影響を受けなかった。本研究から得られた知見は、中枢移行に関わるトランスポーターを介した相互作用が、薬効の発現強度に影響を与えることを示唆したものであり、これまで十分でなかった血液脊髄関門における薬物動態研究の重要性を裏付けるものである。

7

アミノ酸を含む医薬品は一般用医薬品に多く、サプリメントにも多く含まれ、さらに高プロテインの食品などもセルフメディケーションの一環として取り入れられやすい。プレガバリンやミロガバリンの処方患者数も極めて多いため、アミノ酸製剤などと併用されるケースは数多く存在することが想定される。本研究の結果に基づき、併用時における服用タイミングや薬剤選択の提案が可能となり、一般用医薬品服用時における薬物治療の最適化を通じたセルフメディケーションの推進に寄与できる。

６、調査・研究発表（口頭叉は誌上発表）
Akashi T, Noguchi S, Nishimura T, Tomi M. Plasma concentration of LAT1 substrateamino acids affects the spinal cord transfer and the analgesic effect of pregabalin. 日本薬物動態学会（JSSX）第 39 回年会 / 第 26 回 North American ISSX Meeting 合同年会、2024
年 9 月、ホノルル・アメリカ合衆国（発表予定）

７、引用文献1. Takahashi Y, Nishimura T, Higuchi K, Noguchi S, Tega Y, Kurosawa T, Deguchi Y,Tomi M. Transport of pregabalin via L-type amino acid transporter 1 (SLC7A5) inhuman brain capillary endothelial cell line. Pharm Res . 35: 246 (2018).
2. Akashi T, Noguchi S, Takahashi Y, Nishimura T, Tomi M. L-Type amino acidtransporter 1 (SLC7A5)-mediated transport of pregabalin at the rat blood-spinal
cord barrier and its sensitivity to plasma branched-chain amino acids. J Pharm Sci .
112:1137–1144 (2023).
3. Yamamura N, Mikkaichi T, Itokawa K, Hoshi M, Damme K, Geigner S, Baumhauer C.
Mirogabalin, a novel α 2 δ ligand, is not a substrate of LAT1, but of PEPT1, PEPT2,OAT1, OAT3, OCT2, MATE1 and MATE2-K. Xenobiotica . 52:997–1009 (2022).
4. Leenders KL, Poewe WH, Palmer AJ, Brenton DP, Frackowiak RSJ. Inhibition ofL-[18F]
fluorodopa uptake into human brain by amino acids demonstrated by positron emission
tomography. Ann Neurol . 20:258–262 (1986).
5. Grigat S, Fork C, Bach M, Golz S, Geerts A, Schömig E, Gründemann D. The carnitinetransporter SLC22A5 is not a general drug transporter, but it efficiently translocatesmildronate. Drug Metab Dispos . 37:330–337 (2009).
6. Ohashi R, Tamai I, Yabuuchi H, Nezu J, Oku A, Sai Y, Shimane M, Tsuji A.
Na+-dependent carnitine transport by organic cation transporter (OCTN2): Its

8pharmacological and toxicological relevance. J Pharmacol Exp Ther . 291:778–784 (1999).
7. Inano A, Sai Y, Nikaido H, Hasimoto N, Asano M, Tsuji A, Tamai I. Acetyl-L-carnitine
permeability across the blood-brain barrier and involvement of carnitine transporter
OCTN2. Biopharm Drug Dispos . 24:357–365. (2003).
8. Blum JA, Klemm S, Shadrach JL, Guttenplan KA, Nakayama L, Kathiria A, Hoang PT,
Gautier O, Kaltschmidt JA, Greenleaf WJ, Gitler AD. Single-cell transcriptomic analysisof the adult mouse spinal cord reveals molecular diversity of autonomic and skeletalmotor neurons. Nat Neurosci . 24:572–583. (2021).
9. Kadota Y, Kazama S, Bajotto G, Kitaura Y, Shimomura Y. Clofibrate-induced reductionof plasma branched-chain amino acid concentrations impairs glucose tolerance in rats.

J Parenter Enteral Nutr. 36:337–343 (2012).

9