「計算生命科学の基礎」～タンパク質から見る生命科学～
2014/11/18 神戸大学

タンパク質の量子化学計算
日本大学松戸歯学部

福澤 薫～タンパク質から見る生命科学～【６】計算生命科学のための量子化学基礎（11月11日）【７】タンパク質の量子化学計算（11月18日）【８】分子動力学計算と生体高分子の機能解析：タンパク質の動的構造と機能（11月25日）【９】分子動力学計算における拡張サンプリングシミュレーション（12月2日）【１０】タンパク質の生物学的機能と化学反応（12月9日）

講義内容
タンパク質の量子化学計算（11月18日）
 計算構造生物学とフラグメント分子軌道（FMO）法 核内受容体と転写制御のメカニズム
 インフルエンザの感染・防御のメカニズム

創薬における計算生命科学：量子化学計算を中心に（1月20日）
 インシリコ創薬におけるFMO計算
 タンパク質－リガンド結合性の評価
 相互作用解析ツールとしてのFMO法
 FMO超分解能解析：結晶構造の精密化量子化学計算による次世代計算構造生物学
インフルエンザウイルスの変異メカニズムの解明と創薬

タンパク質－医薬品候補化合物の相互作用に基づく創薬分子設計

パーキンソン病など神経変質
疾患の発症機構を
分子レベルで解明

原因タンパク質の挙動を第一原理分子
動力学で解明FMO計算によって超並列スパコンの能力をフル活用
ユーザーフレンドリー
な FMO 計算環境の創薬現場への普及

統合
可視化環境

インシリコ理論創薬の信頼性向上計算高精度化と
手法の拡張

電子相関

動力学
計算

インシリコ
スクリーニングの速度・精度向上医薬品候補
物質の正確で効率的な探索フラグメント
分子軌道(FMO)法

物性値
算定法

超並列
FMO 計算超高速処理による
統計的な議論2013ノーベル化学賞～ Karplus, Levitt, Warshel
複合化学系のマルチスケールモデルの開発

生体高分子の精密分子シミュレーション
重要な部分は精度良く(QM)それ以外の部分は粗く(MM)QM/MM法

創薬

光合成

触媒反応

排ガス浄化

http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2013/press.html

フラグメント分子軌道(FMO)法
FMO法とは？
 1999年に北浦和夫教授（現神戸大学）により提案
 巨大分子をフラグメントに分割し、部分エネルギーを集積することで、系全体の高速電子状態計算を実現 相互作用解析に適している

インシリコ創薬におけるFMO計算
 タンパク質－リガンド系全体の量子化学（電子状態）計算を高速・高精度に実現
 エネルギー指標による、リガンドー残基間の相互作用の定量的評価⇒ 水素結合、弱い分子間力(CH/p, p/pなど）⇒ 電荷移動(CT)⇒ 官能基単位、主鎖/側鎖ごとの評価が可能
 電子密度解析
 分子軌道（フロンティア軌道）解析
全体の電子状態が得られるので、構造生物学研究に向いているFMO法の主な実装系
産総研 Fedorov、神戸大 北浦ら ⇒ GAMESS/FMO
 長崎大 石川ら ⇒ PAICS

国立衛研 中野、立教大 望月ら（東大生研CISS）⇒ ABINIT-MP/BioStation 純国産プログラム
ABINIT-MP/BioStation
 ABINIT-MP: FMO計算専用エンジン
 BioStation Viewer: ABINIT-MP専用GUIプログラム
配布形態：
東大公開版ダウンロード（無償）http://www.ciss.iis.u-tokyo.ac.jp/dl/index.php
最新版は2014.7.25に公開済、現在はHPCIプログラム（分野４）で開発を継続中

みずほ版MIZUHO/BioStation （有償）
独自機能(PIEDA等）および技術サポートつき

ABINIT-MPの開発に伴う応用系の発展
2004年

2008年

2010年

インフルエンザHA
抗原抗体系~1000残基

インフルエンザHA３量体
抗原抗体系~2400残基

2012年

2013年

計算規模
核内受容体(ER, RXR)
HIVプロテアーゼ~300残基

CRP
11塩基対＋200残基

計算レベル

mFruites
水和DNA
EGFR
12塩基対＋2500wtr
チロシンキナーゼ

MP2

CIS

多体FMO

FMO2
PDB一点計算/
構造最適化 モデル埋め戻し

解析

IFIE

CIS(D)

インフルエンザNA
タミフル~400残基

リガンド水和10Åwtr高次電子相関法
MPnスケーリング法
FMO4
FMO3
ONIOM
FMO-MP2部分opt(QM/MM)

古典MD
サンプリングFILM
CAFIIFIE map 励起エネルギー

電荷、溶媒効果 Mulliken

結晶－ペプチド複合系~(SiO2)250-6残基-wtr

ESP, RESPBSSE FMO4-IFIE
NPA

PB

PIEDA

ABINIT-MPによるFMO計算の計算時間
300残基程度のタンパク質とリガンド（分子量~400）の複合体構造
計算レベル

特徴

計算機(PCクラスタ） 計算時間

MP2/6-31G

標準的に利用R620/SB 192cores

1.5時間

MP2/6-31G*

6-31G*分極関数

R620/SB 192cores

7時間

50残基切り出しモデル
計算レベル

特徴

計算機(PCクラスタ） 計算時間

FMO4-MP2/6-31G

FMO4多体展開

R620/SB 128cores

5.8時間

CD-FMO4-MP2/631G

FMO4多体展開
CDAM高速化

R620/SB 128cores

3.2時間

 最も実用的なのはMP2/6-31G
 HFはMPの３分の1程度
 CDAMによってFMO2-MP2は10倍加速、FMO4-MP2は2倍の加速
 FMO3計算はFMO2の２倍、FMO4計算
では10倍のコスト増⇒ 現実的には切り出しモデルを利用、
CDAM高速化を併用

ER50 主鎖・側鎖分割@fennel(FMO4-MP2/6-31G, 8nodes, 16cores, NP=4)

2.9日
５３％減
1.4日

CDAMによる高速化

フラグメント分子軌道(FMO)法とエネルギー解析◇北浦らが提案：CPL 313 (1999) 701

分子をフラグメントに分割
O

R1

R5

H
N

OH

N
H
O

J

O

H
N

H2N

IJ

R3

R2

N
H
O

R4

O

 フラグメントモノマー、ダイマー、トリマー・・・の電子状態から全体を構築

I 周辺のフラグメントからの影響は、環境静電ポテ
ンシャルとして取り込む。

IK

K

 原子数Nにほぼ比例する計算量で、数 kcal/mol
以内の全エネルギー誤差で、生体高分子の電子状態や相互作用を計算

全エネルギー(FMO2) ：モノマーおよびダイマーのエネルギーから算出~
E   E 'I   EIJ
I JI

IFIE解析の基本式

フラグメント間相互作用エネルギー(IFIE)：~
EIJ  E ' IJ  E ' I  E ' J   TrPIJ V IJ E 'I  EI  Tr P I V I

E 'IJ  EIJ  Tr P IJ V IJ



分子内・分子間の相互作用を定量的に解析できるどうやって分子をフラグメントに分割するか？


C-H間の原子間距離を1.09Åに固定したメタン分子の局在化軌道（sp3混
成軌道に相当）を使った射影演算子を用いて、フラグメントの分子軌道をフラグメント内に局在化する。
sp3炭素でフラグメントに分割
sp2炭素やsp3ケイ素で分割することも可能

Bond Detached Atom (BDA)
I
R1

O
H
N
O

I

J

R2 H

R3
N
H

R1

I

J
O
H
N

R3
N
H

R1

J
O
H
N

R3
N
H

O R2 H
フラグメントIの変分空間

O R2 H
フラグメントJの変分空間

フラグメントIの形式電荷: +1
BDAの炭素原子の核荷電: 5

フラグメントJの形式電荷: -1
BDAの炭素原子の核荷電: 1

フラグメントのHartree-Fock-Roothaan方程式

F C S C εXXXF  H G
X

H

X

X
pq

H



core Xpq

X

X

X

周囲のモノマーからの環境静電ポテンシャル V   Bk p  k  k q ,LL
V pqX   u pq
 v pq

X
pq



k

L X

L
u pq
  p  Z A r  A  q
AL

L
v pq
  PrsL ( pq, rs)
rsL

MOをフラグメント内に局在化させるためのシフト演算子。
Bk=106。kにはメタン分子(RCH=1.09Å)の局在化分子軌道(LMO)を用いる。

FMO2法による分子の全エネルギーおよび全電子密度

EI  E

EIJ  E

elec
I

elec
IJ

 

Z AZ BBA Z AZ B
BAA B
A, BIA B
A, BIJ

E   EIJ  ( N f  2) EI
I J

I (r)    IJ (r)  ( N f  2)  I (r)I JI高速化のための近似


環境静電ポテンシャル計算の高速化
esp-aoc近似 (Mulliken AO population)Lv pq  (P LS L ) rr ( pq, rr)rLfor Rmin ( X , L)  Laoc

esp-ptc近似 (Mulliken atomic charge)Lv pq
  p QA r  A  q
AL

点電荷近似

for Rmin ( X , L)  Lptc

QA   (P LS L ) rrrA

ダイマー計算の高速化（dimer-es近似）



2電子積分のMulliken近似



モノマー間の静電相互作用

I
E 'IJ  E 'I  E ' J Tr P I u J  Tr P J u I    Ppq
PrsJ ( pq, rs)
pqI rsJ

演算量がO(N3)からO(N2)に減少
これらの近似を導入したエネルギー勾配も計算可能

FMO法計算の流れ
分子をフラグメントに分割し、電子を割り当てる
モノマーの初期電子密度を計算する与えられた電子密度を用いて、周囲のモノマーによる環境静電ポテンシャル下での、モノマーのエネルギーと電子密度を計算するNo与えられた電子密度と得られた電子密度の差が閾値よりも小さい
Yes
収束したモノマーの電子密度(Self-Consistent Charge; SCC)を用いて、周囲のモノマーによる環境静電ポテンシャル下での、ダイマーのエネルギーと電子密度を計算する
分子の全エネルギーおよび全電子密度を計算

タンパク質・DNAのフラグメント分割
 アミノ酸を主鎖さらには側鎖に分割
 DNAをヌクレオチド、もしくは塩基を別に分割
タンパク質分割モデル

DNA分割モデル（ａ）主鎖分割（ａ）ヌクレオチド単位

R1

O

H
N

+

Gly3
H
N

H3N

N
H

O
R2

O

-

N
H

N

Cys 10

O

O

O

H
N

+

H3N

N

H

Gly3

R5

O

H
N
O

O

S

R7

O
N

N
H

Pro6
Cys 10

O

H
N

H
N
O

R11

N

NH2

O
H

H

H

H

NH2

H

N

O

S

O

-

O

O
H2
N

N
H

P
O

N

O
-

H
O

O

H

H

O

H

P

O

P

N

O
-

O
H

H
O

H

H

O

H

P

O-

O-

R8

H
N
O

R9

O-

O

O

O

O-

-

NH

N

O

NH2

H

N

N

Cys4
O

P
O

H

H

R2

NH2 O

N

H

H

O

O
H

R9

N
H

O

NH

O

H

H

N

O

（ｂ）主鎖-側鎖分割
R1

H

O

O

R11

H
P

N

O
H

O

O
O

N

N

HO

H

H

R8

N

N

O
H

H
N

H
N

NH2

N

N

HO

O

Pro6

S

O

H2
N

O

S

H
N

R7

O
N

N
H

Cys4
O

R5

O

（ｂ）塩基別NH2化合物をsp3炭素で分割することも可（多体補正が必要）

HO

FMO法と相互作用解析
フラグメント間相互作用エネルギー（IFIE）
フラグメント単位の二体の相互作用解析
受容体－リガンド、DNA、タンパク－タンパク等の相互作用に広く利用
 立体表示、２次元マップ(IFIE map)~
E FMO2   EIJ  ( N  2) EI   E 'I   EIJ
 エネルギー成分分割法 PIEDA
I J
I
I
I J
軌道相互作用解析 CAFI（電荷移動・分極相互作用）、FILM（分散相互作用（CH/p, p/p））
IFIEよりも詳細な、軌道レベルの相互作用解析
CAFI

Arg394Glu353
Arg352

His524

Thr347FILM

IFIE mapによるIFIEの網羅的表示と構造解析
I. Kurisaki, K. Fukuzawa et al., Biophys. Chem. 130, 1-9 (2007).

a-helix

DNA-タンパク質相互作用の例

b-sheetDistance matrixとの比較 蛋白質２次構造やDNAらせん構造を反映
 差マップにより、複合体形成による安定化・不安定化を表現可能

電荷移動相互作用～CAFIによる解析（CAFI:Configuration Analysis for Fragment Interaction）
Y. Mochizuki, K. Fukuzawa, A. Kato, S. Tanaka, K. Kitaura, and T. Nakano, Chem. Phys Lett., 410(2005) 247-253.

◇軌道レベルの相互作用解析
水素結合 ⇔ O上の孤立電子対→O-Hの反結合性軌道⇒ 軌道レベルでの化学的な描像
モノマーの“集積”に対するCERF緩和エネルギー計算⇒ 解析と可視化#1 モノマー計算は通常のFMO#2 リガンドと重要な残基を選択#3 局在化、重み付Lowdin直交化#4 CERFによる多体緩和の導入（N**4、多電子論的な近似）#5 軌道毎の緩和エネルギー評価#6 供与/受容の相互作用軌道（可視化が有効）

水素結合ネットワークの解析に役立つ

Vacant Space

Vacant Space
Charge Transfer

Induced Polarization

Occupied Space(localized)
Fragment A

Pre－Polarized
by ESP in FMO

Occupied Space(localized)
Fragment B

局在化MP2(LMP2)法に基づいたFILM解析
T. Ishikawa, et. al., Theor. Chem. Acc. 118, 937-945 (2007).

FILM: Fragment Interaction based on Local MP2⇒ 分散力（van der WaalsやCH/p相互作用等）の軌道レベルの解析が可能に！
HIVプロテアーゼと阻害剤とのFILM解析

EIJLMP2    ij
iI jJ

FILMによる解析例: HIV-1 Protease - Lopinavir
Lopinavir の中から、ある特定のサイト
をピックアップする
そのサイトに局在化する軌道と、I84 の全ての軌道とのペア相互作用エネル
ギーの和を計算する
Lopinavir のどの部分が、I84との相互作用に、大きく寄与しているかが分かる。

3 個のσ結合-0.002042 （ -1.28 Kcal/mol ）28.8 %-0.000829（ -0.52 Kcal/mol ）6個の C－C σ 結合
5個の C－H σ 結合
3個の C－C π 結合

-0.002223（ -1.39 Kcal/mol ）31.3 %

11.7 %
1 個のσ結合グリッドデータ解析
 電子密度分布
 静電ポテンシャルマップ
 フラグメントの分子軌道(MO)などを可視化

ER-リガンド結合による電子密度分布の変化

Crambinの電子密度(0.001e/Bohr3)の等値面上の静電ポテンシャルリガンド結合による電子的な変化、静電相互作用による分子認識の解釈などに役立つ

核内受容体と転写制御のメカニズム
 受容体とリガンドの相互作用 へリックス12の役割
 転写共役因子との相互作用
 DNAとの相互作用

核内受容体とは
核内受容体(Nuclear Receptor; NR) ER, GR, PR,AR, RAR, RXR, TR, VDRなどから核内受容体スーパーファミリーを形成(48種類)
 ステロイドホルモン、甲状腺ホルモン、ビタミンA,Dなどの低分子量の脂溶性生理活性物質をリガンドとする リガンド依存的に転写を制御するリガンド誘導性転写制
御因子
 生活習慣病や成人病を含むさまざまな疾患に関係している 核内受容体を介した特異的標的遺伝子群の発現調節により、個体発生や器官形成また成体での標的器官の機能維持など幅広い生命現象に重要な役割を果たす
 医薬品標的分子の約2%を占める

核内受容体と転写制御のメカニズム
核内受容体による転写制御のメカニズム

エストロゲン

二量化

核内移行

エストロゲン受容体

コアクチベータとの結合

核

H
R
E

標的遺伝子

細胞

mRNA

タンパク質

① リガンド結合② 構造変化③ 二量化④ 核内移行⑤ 転写共役因子との結合⑥ ＤＮＡ結合
⑦ 標的遺伝子の発現

核内受容体のドメイン構造と機能領域
ドメイン

調節
(NTD)

hRARg 190

A/B
hERa 1

155

C
185

AF-1

リガンド結合
(LBD)

DNA結合
(DBD)

200

D
251

454

E/F
311

551

AF-2

転写活性化

DNA結合
リガンド結合
核内移行

二量体化
抗原性
HSP結合

LBDは核内受容体の様々な機能に重要な役割を果たしている機能

核内受容体の作用機構 Ｉ： リガンドとの相互作用
エストロゲン受容体(ER)・ＥＲは核内受容体スーパーファミリーの一種
・女性ホルモン（エストロゲン）の受容体タンパク質であり、恒常性の維持、生殖、発生などに関わる・乳がん、子宮がん、骨粗しょう症等の疾病と関わっている重要な創薬ターゲット
・2つのサブタイプ(ERa, ERb)が存在し、サブタイプ特異的薬剤も開発されている

エストロゲン

二量化

核内移行

エストロゲン受容体

コアクチベータとの結合

核

H
R
E
標的遺伝子

細胞

mRNA

Helix12

Helix12タンパク質

アゴニスト結合

アンタゴニスト結合

リガンド結合ドメイン(LBD)

各アミノ酸残基とリガンドとの相互作用(IFIE)
立体色づけ表示

Fukuzawa et al., (2006) J. Phys. Chem. B, 110, 16102.

グラフ表示
10

IFIE (kcal/mol)

Arg3520Phe404
Thr347-10

His524

Arg394-20⊿E=-101.07-30

Arg394Glu353

Arg352

His524

Thr347hydrophobic residues

リガンド結合サイトの構造C

Glu353

Phe404O

HO[FMO-MP2/6-31G*]

黄色のリガンド分子に対して安定化 ・不安定化

His524H2O+5kcal/mol

H2N

Arg394

NH

HN
N

O

-5

547

535

511

523

487

499

463

475

439

451

427

403

415

379

391

355

367

331

343

307

Glu353

319

-40

N
H2

EST

HO

O
Ca

Ca
NH

hydrophobic residues

Leu387

 水素結合ネットワークを形成する極性・荷電アミノ酸残基と強く相互作用する ER-ligand相互作用はリガンド周辺に局在化
 全ての残基に対するIFIEを足し合わせるとリガンド結合エネルギー(⊿E)が計算できる

周囲の疎水アミノ酸残基との相互作用(IFIE解析)
FMO-HF/6-31G*

FMO-MP2/6-31G*

Attractive residues
IFIE < -1kcal/mol

Repulsive residues
IFIE > +1kcal/mol

・HF法では記述できない分散力の効果が大きい
・静電相互作用や水素結合の他に分散力に基づいたvan der Waals相互作用が重要⇒ 電子相関の重要性

極性残基
疎水性残基
合計

HF
-45.42
5.15-40.26MP2-63.31-37.77-101.07

ER-リガンド間の電荷移動相互作用（CAFI）
CAFI:Configuration Analysis for Fragment Interaction⇒ 電荷移動、分極相互作用に対する軌道レベルの相互作用解析
Mochizuki, Fukuzawa, Kato, et. al, Chem. Phys Lett., 410(2005) 247-253.
IFIE: CT + electrostatic
Glu353

His524

Leu387

Arg394

EST

water

Glu3530.000-0.836

5.134-78.749-32.327-19.173

His524-0.836

0.000

0.066

0.557

-6.6430.053

NLeu387

5.134

0.066

0.000

-10.057

1.143-4.935

His524

Arg394-78.7490.557-10.057

0.000-9.055-16.466EST-32.327-6.643

1.143-9.055

0.000

0.056

water

-19.173

0.053-4.935-16.466

0.056

0.000

hydrophobic residues

C

Glu353

Arg394

O

HO

CT

O

H2O

H2N
NH

N
H2

O
Ca

Ca
NH

HN

EST

HO

hydrophobic residues

CAFI: CT / polarization

Leu387

ER-リガンド間の水素結合
ネットワークとCT相互作用[kcal/mol]

From

To

Glu353

His524

Leu387

Arg394

EST

water

Glu353-0.1070.000-0.001-0.525-19.792-9.626

His5240.000-0.295

0.000

0.000

-1.0450.000

Leu387-0.0010.000-0.063-0.067-1.317-4.281

Arg394-0.0310.000-0.013-2.750-0.633-0.373EST-0.870-5.299-0.432-7.090-3.168-0.808water-0.6270.000-1.685-14.138-0.355-1.171Glu353 → EST, EST → Arg394, His524, water → Arg394, Glu353, Leu387

水素結合による電荷移動相互作用～CAFI解析[HF/6-31G*]

ESTno(p) → His524s*NH

Glu353 no(p) → EST s*OH

EST no(s) → Arg394 s*NH

relaxation energy= -0.0159

relaxation energy= -0.0044

relaxation energy= - 0.0034

Glu353 no(s) → EST s*OH

EST no(p) → Arg394 s*NH

ESTno(s) → His524s*NH

relaxation energy= -0.0118

relaxation energy= -0.0019

relaxation energy= - 0.0026

Glu353→ ESTの電子供与、EST→ Arg394, His524の逆供与が起こっている
青－赤：hole orbital, 黄－緑：particle orbital

CH/π相互作用解析～CHPIとIFIE、FILM
 梅沢、西尾らのCHPIプログラムを内蔵
 PDB立体構造から、分子内・分子間のCH/p相互作用を網羅的に検出⇒ IFIE解析、FILM解析と組み合わせた利用が有効 FILM解析
立体構造からのCHPI解析
Phe404

Phe404 CH ⇔ EST p (-0.389)

Leu387
Phe404 CH ⇔ EST p (-0.255)
Ala350リガンドとのIFIE [MP2/6-31G*] (in kcal/mol)
Phe404: -5.1, Leu387: -3.7, Ala350: -3.3

Phe404 p ⇔ EST p (-0.337)
Ishikawa et. al., Theor. Chem. Acc.
118, 937-945 (2007).

ERとリガンドの相互作用：まとめ
リガンド結合ポケットにおけるリガンドとの相互作用：
IFIEによる相互作用エネルギー解析：

いくつかの荷電、極性アミノ酸残基との間に水素結合ネットワークを形成しており、強い静電相互作用がある。

数多く存在する疎水性アミノ酸残基との間に多数の弱い静電相互作用および分散相互作用がある。
両者同程度の寄与によって安定な結合を形成する。特にGlu353とリガンドとの相互作用が主要（全相互作用エネルギーの1/3~1/4）

CAFI, FILMによる軌道相互作用解析：


水素結合を介した電荷移動相互作用 のネットワークが形成されている。Glu353からリガンドへの電子供与、リガンドからArg394, His524
への電子逆供与が起こっている。
Ala350, Leu387, Phe404はCH/p相互作用をしている

核内受容体の作用機構 ＩＩ： Helix12の役割
エストロゲン受容体のアゴニスト orアンタゴニスト結合時におけるHelix12の相互作用解析と電荷移動
C. Watanabe, K. Fukuzawa, S. Tanaka et al., J. Phys. Chem. B 118, 4993–5009 (2014).

エストロゲン受容体(a) アゴニスト結合(b) アンタゴニスト結合(転写亢進)(転写抑制)

転写の制御にHelix12の位置が関わっている↓
どのようにH12の位置は

H12(agonist)
H12(apo)H12(antagonist)

EST

H12(apo)決まるのか？

OHT
アンタゴニスト↓
立体障害によってアゴニストポジジョンへ行けない？

Heavy Atoms : fixed at PDB X-ray crystal structures
Addied Hydrogen Atoms : minimized by using AMBER99SB force field

H12とその他の部分との相互作用（IFIE解析）
hERaLBD-Water-Ligand complex model
Model# of Res.

Sequence

Charge（渡邉、日向寺ら）

ERaLBD-Water-Ligand243
307-549
H12-agonist および H12-antagonistとER-mainとのIFIE和
241
12
9
9
1
1

*Sequence length of each H12 is determined from PDB description.
00

Lys529−150
300 Fragment Charge (3ERT)
IFIE:H12−antagonist (3ERT)

400

−1.5

500

3
Lys531

150

Lys362 Arg363

Lys5290

1.5

0ER-mainwater

ligandFragment Charge [au]IFIE [kcal/mol]

ERaLBD
ER-H12(ESPs)*ER-H12-agonist(IFIEs)
300 Fragment Charge (1GWR)*ER-H12-antagonist(IFIEs)
IFIE:H12−agonist (1GWR)
ER-mainArg363
Lys362
150
LigandWater-7307-547-7
536-547-4
538-546
3 -4
536-544-3
Lys531other residue-3
Lys529
1.5 0
548
549
0

Lys529(agonist) or
Lys362(antagonist)

H12と強いLys362

−150
307

350

400

−1.5
450

Residue Number

500

相互作用

549

H12 と ER-mainは引力的！

静電ポテンシャル分布（渡邉、日向寺ら）

1GWR(ERaLBD-WAT-EST: agonist)

0.2

Helix12は負に帯電
Lys362

Lys529ESP [au]

Lys529:H12
ER-main + WAT+ EST + ER-H12

ER-main + WAT + EST

ER-H12

3ERT(ERaLBD-WAT-OHT: antagonist)

アゴニストはLys529
アンタゴニストはLys362
を認識

Lys362

Lys529-0.2

ER-main表面の正ポテ
ンシャル部分(Lys362,
Lys529周辺）が重要な相互作用スポット

ER-main + WAT+ OHT + ER-H12

Lys362:H12

ER-main + WAT + OHT

ER-mainとHelix12との相補的な関係！
ER-H12

Helix12の役割：まとめ
エストロゲン受容体のリガンド結合とHelix12の位置
C. Watanabe, K. Fukuzawa, S. Tanaka et al., J. Phys. Chem. B 118, 4993–5009 (2014).


アゴニスト結合： Lys529との強い相互作用
アンタゴニスト結合： Lys362との強い相互作用
Helix12を除くERリガンド結合ドメインの静電ポテンシャル分布から、
Lys362とLys529の位置に正電荷スポットがあることがわかった。
アゴニスト

アンタゴニスト

レチノイドＸ受容体のリガンド結合とHelix12の関係（M. Ito K. Fukuzawa, et al., J. Phys. Chem. B 112, 12081–12094 (2008)より）


9cRA （アゴニスト） – Helix12結合ポケット - Helix12との間に疎水性ア
ミノ酸残基を介した協同的な相互作用があることがわかった。

核内受容体の作用機構III： RXRと転写共役因子との相互作用
M. Ito et al., J. Phys. Chem. B 111, 3525 (2007).
RXR: ヘテロ二量体型の核内受容体とヘテロダイマーを形成して転写制御を行う
コリプレッサーコアクチベーター（共役転写抑制因子）（共役転写活性化因子）
atRA
9cRA

RXR RAR

転写

RXR RAR

転写

RXRE RARE

標的遺伝子

RXRE RARE

標的遺伝子

H12; helix 12‥‥リガンド結合領域（LBD; ligand-binding domain）C末端に位置
LXXLL; LXXLL motif‥‥コアクチベーター内のH12との直接的な接触部位†1
転写促進能には、リガンド結合によるレセプターの構造変化（H12の移動）と、それに伴うコアクチベーター獲得が必須！†2†1 Heery, D. M.; Kalkhoven, E.; Hoare, S.; Parker, M. G. Nature 1997, 387, 733–736.
†2 Freedman, L. P. Cell 1999, 97, 5–8.

実験的研究の背景
conserved hydrophobic and charged residues in H12
H12 sequence
nuclear receptor
449 T F L M E M L E
hRXRα
408 P L I Q E M L E
hRARα410 P L I R E M L E
hRARγ
453 P L F L E V F E
hTRβ467 P L L Q E I Y K
hPPARγ538 D L L L E M L D
hERα
351 P L L G E I C S
mCARcharged residuehydrophobic residue

mutation L454A, E457A†1,2
mutation L468A, E471A†3

mutation L352A, E355A†4

・核内レセプター群はH12内に保存された荷電残基と疎水性残基を持つ→ミューテーション実験によってH12内の保存された残基の変異により、転写活性が低下する。変異の効果：E453K> E456K†1-4†1 Tone, Y.; Collingwood, T. N.; Adams, M.; Chatterjee, V. K. J. Biol. Chem. 1994, 229, 31157–
31161. †2 Collingwood, T.N. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 248–253.
†3 Gurnell, M. et al. J. Biol. Chem. 2000, 275, 5754–5759.
†4 Andersin, T.; Väisänen, S.; Carlberg, C. Mol. Endocrinol. 2003, 17, 234–246.

9cRAとSRC1の結合による複合体の形成

+

+
R+L+C

ΔE1, Δq1

charge0
R: receptor (RXR)-1
L: ligand (9cRA)
C: coactivator (SRC1) +3
ΔE3, Δq3

ΔE2, Δq2+

Table 1. Energy differences between the receptor
RLC−ligand−coactivator complex (RLC), the receptorC−ligand complex and coactivator (RL +RLC),+andindiviudual molecules (R + L + C)a
Method
Δq1
Δq2
Δq3
ΔE 1
ΔE 2
ΔE 3
MethodMP2/6-31G RXR –0.32
0.27
–0.05
–538.10–665.71
HF/6-31G –127.62
9cRA
0.32
–0.01
0.31
–586.95–768.22
MP2/6-31G –181.27
SRC1
0.00
–0.26
–0.26
a
ΔE1 = (E(RL) + E(C)) － (E(R) + E(L) + E(C)),
リガンド結合よりもコアクチベーターの結合により大きく安定化！
ΔE2 = E(RLC) － (E(RL) + E(C)), and ΔE3 =ΔE1-3: energy difference,Δq1-3: charge difference
E(RLC) － (E(R) + E(L) + E(C)). Energies are inH12とSRC1の相互作用
Table 3. IFIEs between H12 and SRC1 residuesa
H12 residueb
SRC1 residue Thr449 Phe450 Leu451 Met452 Glu453 Met454 Leu455 Glu456
Lys631
0.04
0.42
1.22
1.48 –49.16
0.19
1.83 –33.44
Ile632
1.91
–5.74
1.88
0.32 –27.16
0.52
0.68
–3.62
–0.18
–1.42
0.01
0.11 –27.58
–0.65
0.50
–2.40
L Leu633
–0.44
–2.29
–0.98
0.28 –51.70–2.54
1.22 –28.87
X His634
0.85
–1.73
1.01
1.35 –39.38
0.07
1.51 –21.62
X Arg635
–0.06
–1.22
–0.04
0.04
–4.70
–0.14
0.16
–1.54
L Leu636
–0.01
–0.47
0.05
0.08
–4.18
–0.13
0.17
–1.46
L Leu637
Gln638
–0.01
–0.25
–0.06
0.05
–2.16
–0.08
0.11
–0.68
c
0.17
–7.13
0.05
1.86 –127.55–3.40
3.56 –55.89
Total1
2.11 –12.71
3.09
3.71 –206.02–2.77
6.17 –93.61
Total2daEnergies are in kcal/mol calculated at the MP2/6-31G level. b All SRC1 residues except
保存された疎水性残基Phe450と荷電残基Glu453は、それぞれ同じ性質のfor N- and C-terminal residues are listed. c Sum of IFIEs between each H12 residue and他のアミノ酸残基よりもSRC1と強く相互作用し、SRC1を安定化！
d
LXXLL motif in SRC1. Sum of IFIEs between each H12 residue and all the SRC1
 Glu453は静電相互作用（クーロン力）によりSRC1を固定
resides.

 Phe450は疎水性相互作用（分散力の寄与が大）によりH12を固定

残基単位の電荷移動
CT1：リガンド結合

CT2：コアクチベータ結合

blue: positive
red: negative

Ile632
Arg316
Leu326

Lys631Glu453
Leu455
Leu4519cRA

conserved
charged residue

リガンドおよびリガンド結合ポケット内の残基の電荷の変化が大H12内の残基とH12に隣接している残基およびSRC1内の残基とSRC1に隣接している残基の電荷の変化が大残基単位の電荷移動（E453K, E456K変異体 ）: charge clamp
Lys284
Leu637
Ile632

blue: positive, red: negative
Lys284
Leu637
Ile632

Lys631

Lys631

Lys453Glu456Glu453
Lys456

E453K (MD 1 ns)

E456K (MD 1 ns)

E453Kでは、RXR(AF2C)からSRC1への電子供与がLys453によって阻害され、E456Kでは、SRC1からRXRへの電子逆供与がLys284周辺で阻害されるため、RXRからSRC1への電荷移動が減少する！

RXRと転写共役因子との相互作用：まとめ
1. RXRとコアクチベータSRC1の結合では、H12とSRC1の相互作用が主要である。
2. H12-SRC1相互作用のうち、特にH12内の保存された残基「Phe450とGlu453」との相互作用が強い。
3. RXRからSRC1への電荷移動も、主にH12とSRC1との間で起こっている。

電子の流れ：9cRA → RXR(H12) → SRC1
3. WTではのGlu453とLys284がRXR–SRC1間の電子供与–電子逆供与に関わっており、E453K, E456K変異により電荷移動が阻害されることがわかった。

SRC1

H12
9cRA

LXX
LL
H12
RXR

LL
LXX
H12
RAR

RXRE RARE

転写
標的遺伝子

H12は、リガンド結合とコアクチベータ結合との間の架け橋という重要な役割を果たしている！

核内受容体と転写のメカニズム：まとめ 受容体－リガンドの相互作用(ER)①9cRA 9cRA

coactivatortarget cell

 Helix12の役割(ER, RXR)③

 転写共役因子との相互作用(RXR) DNAとの相互作用(ER)actiondirect contact ④②
RXR

transcription ⑤

RXR

RXRE RXRE

重要な幾つかの段階での分子認識のメカニズムを“電子レベル”で明らかにする試みに成功
特異的
分子認識

電荷の
移動

静電ポテンシャル
の変化

IFIE
CAFI
FILM

原子電荷
CAFI

静電ポテンシャルマップ

target gene⑥

mRNA
nucleusprotein

次の分子認識インフルエンザの感染・防御のメカニズム

インフルエンザ ～迫る脅威～
間断なき新型の出現とパンデミック(大流行)の脅威
1918年: スペイン風邪(H1N1亜型)の世界的流行
６億人が感染，4000-5000万人に上る死者
1957年: アジア風邪(H2N2亜型)の出現・流行
1968年: 香港風邪(H3N2亜型)の出現・流行
それぞれ死者100万人
2005年: H5N1亜型鳥インフルエンザウイルスのトリからヒト，
さらに，ヒトからヒトへの感染が確認
2008年1月: 新型ウイルスでの死者100名超
2009年6月: WHOが新型ウイルス（ブタ由来H1N1亜型）によるパンデミックを宣言
2010年8月終息宣言までに、214以上の感染国と地域で18,449人以上の死者が確認（現在は季節型に移行）

インフルエンザウイルスの構造
Hemagglutinin(HA)

インフルエンザウイルスの構造：

ウイルスは膜に覆われた球状の構造



ウイルス遺伝子は8本の分節RNAからなる







膜表面からは，三量体タンパク質ヘマグルチニン(HA)や四量体タンパク質ノイラミニダーセ(NA)がスパイク状に突き出している

Neuraminidase(NA)

Membrane Protein 2(M2)
Matrix Protein(M1)

Lipid Bilayer

1

Nucleoprotein (NP)Polymerase
2
3 (PB1,PB2,PA)
4

5 6
7

HAはウイルスの細胞侵入時に宿主細胞表面のシアル酸を認識し，細胞膜に結合する
HAは抗原として中和抗体に認識される（抗原抗
体反応）

RNA

8

NS1
PB2 PB1 PA HA NP NA M1 NEP
M2NEP

インフルエンザウイルスの変異：







RNA（マイナス鎖）ウイルスである ⇒ 変異が容易

ワクチンには抗原変異、薬剤には薬剤耐性を起こす
毎年流行を起こし、数年ごとに抗原性の違うウイ
ルスが出現する

２種類のウイルスが１つの細胞に同時に感染す
ると遺伝子交雑が起こる

HA:ウイルスが感染する過程で重要
NA:増殖したウイルスが脱出する過程で重要インフルエンザウイルスの宿主への吸着と遊離(2) HAタンパク質の抗原抗体反応とウイルス
変異予測

抗体による防御ウイルス（侵入）HA：シアロ糖鎖認識(1) HAタンパク質のシアル酸認識と宿主結
合特異性

転写と複製
（増殖）

ウイルス（脱出）NA ：シアロ糖鎖切断

Nature News 2012/1/20より

NA阻害剤による防御「分子間相互作用」
が鍵となる

従来の分子力場では限界

宿主細胞

タミフルやリレンザ(3) NA-阻害剤相互作用解析⇒ 創薬への応用 次回（1/20）
Neumann et. al, Nature 459, 931 (2009)より一部図利用

HAのシアル酸認識における宿主結合特異性
新型ウイルス誕生のメカニズム

宿主におけるシアル酸－ガラクトース結合様式

トリ：α2-3結合

ヒト：α2-6結合

ブタ：α2-6結合
α2-3結合ブタはα2-6結合とα2-3結合の両方を持つ

シアル酸結合は種特異的(a) ブタがトリ・ヒトウイルスに同時に感染することによるハイブリッド
ウイルスの誕生、ヒトへの感染(b) トリウイルスに感染したブタの体内でのウイルス変異によりヒトに感染（野田、善田、河岡「新型インフルエンザウイルス襲来」別冊日経サイエンス143より）

(1) HAタンパク質のシアル酸認識と宿主結合特異性
Iwata, Fukuzawa, Nakajima et al., Comp. Biol.Chem. 32, 198-211 (2008).

1968 H3 avian
HA

Receptor 結合サイト*3+3=6量体

HA:81残基受容体SIA-GAL ：60原子*(172＋318)×3＝490残基*11948原子

α2-3(avian)α26(human)
Subtype

Year

Place

OriginReceptor

PDB

H1N1

1934

Puerto Rico

Human

Human

1RVX

Avian

1RVZ

Human

1RVT

Avian

1RV0

Human

1MQN

Avian

1MQM

H1N1
H3N2

1930
1963

Iowa
Ukraine

Swine
Avian

HAと糖鎖レセプターとの相互作用
Program: ABINIT-MP
Method: FMO-MP2/6-31G
Fragmentation: each amino acid residue, each sugar(1) 結合エネルギー
E  Ecomplex  EHA  Ereceptor 
HA-糖鎖レセプターの結合エネルギー (kcal/mol)[FMO-MP2/6-31G]
receptor

H3avianHA

H1humanHA

H1swineHA

H5avianHA

avian-352.9-293.3-363.3-299.2human-292.4-335.9-390.5-283.9ヒトウイルスはヒト受容体に、トリウイルスはトリ受容体に強く結合する
ブタウイルスはヒト受容体に結合しやすいH3 avian HAと糖鎖受容体の相互作用解析(2) フラグメント間相互作用エネルギー(IFIE)
IFIEs between Avian/Human receptors and the residues inthe binding site of H3 avian HA
60
40

IFIE

1. IFIEtotal はAvianが大きい
Avian ：-242.6 kcal/mol
Human：-158.1 kcal/mol

0

-20

TYR98
GLY135
SER136
SER137
ALA138
TRP153
HIS183
GLU190
GLN191
THR192
ASN193
LEU194
TYR195
VAL196
GLN197
ALA198
PRO221
TRP222
VAL223
ARG224
GLY225
GLN226
PRO227
GLY228

IFIE(kcal/mol)

20

-40
avian
human

-60

-80

⊿IFIEｓ ; IFIEavian -IFIEhumanAmino acid residue

5

⊿IFIE

H３ avian HAのReceptor結合特異性：
Human < Avian

2. Avian receptor とHuman receptorでは TYR98, SER137,ALA138, HIS183,
GLU190, GLN226との相互作用に違い⊿IFIE(kcal/mol)

-5

TYR98
GLY135
SER136
SER137
ALA138
TRP153
HIS183
GLU190
GLN191
THR192
ASN193
LEU194
TYR195
VAL196
GLN197
ALA198
PRO221
TRP222
VAL223
ARG224
GLY225
GLN226
PRO227
GLY228

0

-10
-15
-20

SER137

GLN226

HIS183

-25
-30
-35

GLU190Amino acid residue(⊿IFIE = IFIE(avian)-IFIE(human))α2-3(avian)

α2-6(human)

H1 human HAと糖鎖受容体の相互作用解析
IFIEｓ between Avian/Human receptors and the residues in the binding site of
H1humanHA

IFIE

60
40

IFIE(kcal/mol)

20

PRO221
LYS222
VAL223
ARG224
ASP225
GLN226
ALA227
GLY228

GLU190
GLN191
GLN192
ASN193
LEU194
TYR195
GLN196
ASN197
GLU198

VAL135
THR136
ALA137
ALA138-20

TYR95
TRP153
HIS183

0

-40

avian
human

-60

Amino acid residue⊿IFIEｓ; IFIEavian - IFIEhuman

⊿IFIE

45

LYS22235

H1 human HAのReceptor結合特異性：
Human>Avian
2. Avian receptor とHuman receptor
LYS222, ASP225との相互作用に違い-80

ASP22525

15

ALA227
GLY228

ASP225
GLN226

ARG224

VAL223

PRO221
LYS222

ASN197
GLU198TYR195
GLN196

ASN193
LEU194

GLN191
GLN192

HIS183

GLU190

ALA138
TRP153-5

THR136
ALA137

5

TYR95
VAL135⊿IFIE(kcal/mol)

1. IFIEtotal はHumanが大きい
Avian ：-175.3 kcal/mol
Human：-243.1 kcal/mol-15

Amino acid residue(⊿IFIE = IFIE(avian)-IFIE(human))α2-3(avian)

α2-6(human)新型インフルエンザの対策に向けたFMO計算
2009年6月: WHOが新型ウイルス（ブタ由来H1N1亜型）によるパンデミックを宣言

ヒト 2009H1N1/pdm
Fukuzawa, Omagari, Nakajima, Nobusawa and Tanaka, Protein &Peptide Lett., 18, 530 (2011).

３種類のH1N1ウイルスについて、α2-6糖鎖との結合性を解析
 新型ヒトウイルス：
A/California/04/2009 (2009/H1N1pdm)
 ブタウイルス：
A/swine/Iowa/1930 (1930swine) 旧型ヒトウイルス：
A/Puerto Rico/8/1934 (1934human)

H7N9 トリからヒトへの感染＠中国 2013
Anzaki, Watanabe, Fukuzawa, and Tanaka, J. Mol. Graph. Model., 53, 48-58 (2014).

２種類のH7型ウイルスについて、α2-6 およびα2-3糖鎖との結合性を解析
 （新型）ヒトウイルスH7N9：
A/Anhui/1/2013
 トリウイルス：
A/Turkey/Itary/214845/2002
同様の手法を用いて、ウイルスHAとシアロ糖鎖との結合親和性の評価
および相互作用に重要なアミノ酸残基を特定依然として脅威のウイルス：高病原性H5N1 トリインフルエンザ

(2) HAタンパク質の抗原抗体反応とウイルス変異予測
ウイルス変異の歴史 (A/Aichi/68)※

Influenza H3N2 (A/Aichi/68)の抗原領域E近傍に起こった
mainstream変異（1969年～
2002年）

抗原領域E近傍

変異を予測できないか？
※Hemadsorption 実験値なし

K. Nakajima et al., J. Virol. 77 (2003) 10088.

ウイルス変異予測のスキーム
Takematsu, Fukuzawa, Omagari et al., J. Phys. Chem. B 113, 4991-4994 (2009).

主流となる変異体ウイルスHAは，以下の条件を満たすと考えられる
１．HA本来の機能を保持
ランダム一アミノ酸置換体の変異後のHAの赤球吸着反応によってシアル酸結合活性を判定
２．抗体に認識されにくい性質をもつ
FMO計算から各アミノ酸と抗体との相互作用の強さを定量的に評価。
強い引力相互作用を持つ残基＝抗体から認識されやすい残基→変異が主流になりやすいのではないか？

HA上のある残基に注目

①

シアル
酸結合
活性

変異は出現
しない

なし
（非許容変異）あり（許容変異）
②

抗原抗
体反応

変異は出現
しにくい

なし
あり （反発・弱い）

変異体がmainstreamになる可能性が高い

抗体と各アミノ酸残基の相互作用(IFIE sums)
50IFIE Sum [kcal/mol]

疎水性アミノ酸残基

荷電アミノ酸残基
Mutation
observed

Mutation
observed

0

ASP63

ILE62 LEU66 ILE67 ALA69 LEU70 LEU71 PRO74 VAL78 PHE79 TRP84

Mutation
observed

Mutation
observed

ASP68

ASP73

ASP77

GLU82

ASP85

-50

-5

1969
-100
1987

-10
-150

-15

-20

-200

1977
1995

1972
-250

極性アミノ酸残基10Mutation
observed

5

フラグメント分割の改良により安定化！

Mutation
observed

0
CYS64

-5

-10
-15
-20

THR65

GLY72

HIS75

2002

CYS76

GLN80

許容変異
非許容変異
未測定

ASN81 THR83

1973
1989
2002

変異が生じた６ヶ所
全ての予測が可能！

HAタンパク質の抗原抗体反応とウイルス変異予測：まとめ

HIS75は実験値が無かったが、計算による変異可能性が高かったため、追実験により許容変異であることを確認
許容部位のうち，IFIE Sumの値から，THR65，ASN81の変異は他の許容部位比べ変異しにくいと予想
自然界ではTHR83の変異が確認されている ⇒ フラグメント分割(BDA)の位置をCにすることで解決（Yoshioka et. al., TCA 130 (2011) 1197-1202)
残基名

許容/非許容 IFIE(kcal/mol)

変異可能性

変異有無

ILE62

許容

-15.1

高い

1977, 1995

ASP63

－

-201.5

高い

1972

THR65

許容

0.6

低い

なし

HIS75

許容

-5.2

高い

2002

VAL78

許容

-3.5

高い

1969

ASN81

許容

-0.4

低い

なし

GLU82

許容

-104.4

高い

1987

THR83

許容

-4.9

高い

1973, 1989, 2002

追実験

フラグメント分割を改良

インフルエンザウイルスの対策に向けて
国立感染症研究所や名古屋市大ウイルス学教室との共同研究を進行中(1) ワクチン開発 シアル酸結合性の改良
α2-3結合を認識するようなアミノ酸変異の特定⇒ 卵での培養の効率化(2) ウイルス変異予測
ＦＭＯ計算による抗原性予測⇒ 薬剤耐性ウイルスへの対策(3) 抗ウイルス薬の設計
より効率的にNAを阻害する新薬の設計
別のタンパク質を標的とした新薬の開発

現行インフルエンザワクチンの製造方法

Rui Xu, et al. Science 328, 357 (2010)

講義内容
タンパク質の量子化学計算（11月18日）
 計算構造生物学とフラグメント分子軌道（FMO）法 核内受容体と転写制御のメカニズム
 インフルエンザの感染・防御のメカニズム⇒ IFIEや静電ポテンシャルマップなどを駆使することで、メカニズム解明とともにウイルス変異などの「予測」ができるレベルに！
次回の講義
創薬における計算生命科学：量子化学計算を中心に（1月20日）
 インシリコ創薬におけるFMO計算
 タンパク質－リガンド結合性の評価
 相互作用解析ツールとしてのFMO法
 FMO超分解能解析：結晶構造の精密化

謝辞
神戸大学

田中成典、伊藤三香、吉岡彬生、竹松和友、岩田達則

国立衛研

中野達也

立教大学

望月祐志

みずほ情報総研

加藤昭史、渡辺尚貴、塚本貴志、加藤幸一郎

ＮＥＣ山本純一、坂倉耕太

産総研

古明地勇人

名古屋市立大学

中島捷久、尾曲克己

国立感染症研究所

信澤枝里

東京工業大学

渡邊寿雄

東海大学

日向寺祥子

理化学研究所

本間光貴、渡邉千鶴、沖山 佳生、渡邉博文

プロジェクトJST-CREST「フラグメント分子軌道法による生体分子計算システムの開発」(H16-H21)
文部科学省「イノベーション基盤シミュレーションソフトウェアの研究開発」 (H20-H24)
文部科学省HPCI戦略プログラム 「分野4 次世代ものづくり」(H25-)

立教SFRプロジェクト(H22-H24, H26-)