Journal of Environmental Biotechnology（環境バイオテクノロジー学会誌）
Vol. 13, No. 1, 47–49, 2013

原著論文（短論文）

バイオサーファクタント生産菌の分離とバイオレメディエーションへの利用
Biosurfactant-Producing Bacteria and Its Application to Bioaugmentation
高松

邦明 1，山津敦史 2，今中忠行 1*

Kuniaki Takamatsu, Atsushi Yamatsu and Tadayuki Imanaka
1
2

立命館大学生命科学部生物工学科〒 525–8577

滋賀県草津市野路東 1–1–1

滋賀県草津市野路東 1–1–1 立命館大学テクノコンプレクス 244 号* TEL/FAX: 077–561–5811* E-mail: imanaka@sk.ritsumei.ac.jp
1
Department of Biotechnology, College of Life Sciences, Ritsumeikan University, 1–1–1 Noji-higashi,Kusatsu, Shiga 525–8577
2
IIB Inc., 1-1-1 Noji-higashi, Kusatsu, Shiga 525-8577

株式会社アイアイビー〒 525–8577（原稿受付2013 年 4 月 16 日／原稿受理2013 年 6 月 20 日）

We isolated a biosurfactant-producing bacterium No. 1 from oil-contaminated soil. The sequences of the 16S ribosomal
RNA gene of No. 1 indicated phylogenetic position of genus Pseudomonas. Strain No. 1 was therefore designated as Pseudomonas sp. No. 1. Strain No. 1 and three oil-degrading bacteria (No. 2, No. 5 and No. 10 ) were simultaneously applied tobioremediation of oil-contaminated soil. As a result it was revealed that No. 1 and three bacteria could be successfully applied to decrease total petroleum hydrocarbons in soil, oil slick and smell.
キーワード：バイオサーファクタント生産菌，バイオレメディエーション，油汚染土壌，油膜，油臭Key words: Biosurfactant-producing bacterium, bioremediation, oil-contaminated soil, oil slick, oil smell

土壌汚染は環境問題だけでなく，ブラウンフィールド化，不動産価値の低下等，社会経済問題としても解決の急がれる重要な問題である。特に，化学工場やボイラー設備の跡地などの油汚染土壌は，切実な問題となっている。油汚染土壌の浄化技術としては，化学的手法，物理的手法が存在するが，コスト，環境負荷の点で問題がある。近年，産業経済情勢や環境意識の高まりに伴い，微生物を利用するバイオレメディエーションが，低コスト・低環境負荷の浄化技術として実用化への取り組みがなされ，これに呼応し，国は平成 17 年に「微生物によるバイオレメディエーション利用指針」を策定し，技術の実用化の支援体制を整えた 1)。微生物を利用するバイオレメディエーションの中でも特に，バイオオーグメンテーションについては，近年注目が高まっており，技術の進展と波及効果が期待されている。
油汚染分野に限らず，バイオオーグメンテーションを意識した汚染物質分解菌に関する研究は数多くの報告があり，主に新規微生物の分離や分解機構の解明，分解に2–6)関する遺伝子の解析などの研究が行われている 。最
終的にはこれらの研究成果を実際の汚染現場に適用し，浄化性能及びコスト等技術的検証が期待されているが，同時に安全性や環境への影響を十分検討する必要がある。平成 17 年に国が策定した「微生物によるバイオレメディエーション利用指針」に，バイオオーグメンテー

ションに利用する微生物の安全性および環境への影響評
1)価について一定の評価手法や考え方が示されている 。
この指針では，利用する微生物の安全性の評価には，動物を用いた病原性・毒性試験等の直接的評価の他に，近縁種の病原性調査，温度・pH 等の好適生育環境の検討，土壌中の利用微生物数の把握，土壌微生物に与える影響の解析などによる多面的な評価の必要があるとしている。
現在，油汚染土壌の微生物を利用するバイオレメディエーションは適用範囲が狭く，高濃度油汚染土壌浄化は物理的手法・化学的手法に頼らざるを得ない状況である。また，C 重油等重質油や多環芳香族に関する微生物分解機能及び分解に関与する微生物についての知見がほとんどないのが実情である。
本研究は，重油を基質としたスクリーニングによりバイオサーファクタント（生物由来の界面活性剤）生産菌（No. 1 株）を取得し，同定や特性解析等基礎的な研究を進めた。同時に，No. 1 株を活用した，油膜・油臭除去及び微生物分解促進技術を確立し，油分解に関与する微生物や分解機構に関する検討を行い，バイオオーグメンテーションへの適用を見据えた応用的研究も行った。即ち，筆者らが研究開発した 3 種類の油7)
分解菌 ，Novosphingobium sp. No. 2（No. 2 株と称する），Pseudomonas sp. No. 5（No. 5 株と称する）及び

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高松

Rhodococcus sp. No. 10（No. 10 株と称する）から構成される油分解菌（以下 3 菌株と称する）を利用するバ
イオオーグメンテーションへの適用を目的に No. 1 株の油臭・油膜消滅及び油分分解促進効果を検証した。
まず油汚染土壌は国内の工場跡地より取得し，これを微生物分離源とした。重油を主な炭素源とする無機塩重油培地でのスクリーニングにより，約 200 株の微生物を分離した。これらをそれぞれ栄養培地で培養し，バイオサーファクタントの生産性が高い 1 株を選抜しそれを No. 1 株と名付けた。なおバイオサーファクタント生産菌のスクリーニングおよび油膜排除活性の測定はMorikawa らの方法 8) に従った。ゲノム取得のための微生物の培養は，無機塩 GYT 培地を用いた。また微生物の生理学的特性解析や遺伝子の取得および DNA 塩基配列の決定，系統樹の作成や土壌油分濃度測定は前報の方
7)
法 に準じた。
No. 1 株 の 16S rRNA 遺 伝 子 の 塩 基 配 列 を 決 定 し た（DDBJ の accession 番 号 AB827325）。 こ の 情 報 を 基 に
データベースより相同性の高い塩基配列を検索し系統樹を作成した（Fig. 1）。その結果，No. 1 株は Pseudomonas
citronellolis（99％）と最も相同性が高く，系統樹上でこの属の細菌が形成するクラスターに位置していた。さらに近縁種の病原性を調査した。病原性菌の判定は病原体等安全取扱・管理指針（日本細菌学会）のバイオセーフ
9)ティ指針に沿った 。本菌の近縁種はバイオセーフ
ティーレベル 1 であり病原性のないものであったので，
No. 1 株は安全であると判断した。
No. 1 株は 5–35°C で生育し，最適生育温度は 25°C であった。また pH 6〜10 で良好な生育を示した。また本菌の生理学的特性と抗生物質感受性をそれぞれ Table 1と 2 に示す。硝酸の還元能や糖鎖の β- 結合切断活性はなかった。また抗生物質の抗菌スペクトルはおおむね

Fig. 1. Phylogenetic tree of strain No. 1 and the related bacteria

他
Table 1. Results of API 20 NE test on strain No. 1Oxidase
Reduction of nitrate to nitrites
Reduction of nitrate to nitrogen
Indole production
Acidification of glucose
Arginine dihydrolase
Ureaseβ-Glucosidase
Proteaseβ-Galactosidase
Assimilation of Glucose
l-Arabinose
d-Mannose+––––+––+–+++++–++–++–d-Mannitol
N-Acetyl-d-glucosamine
MaltoseGluconate
N-Capric acid
Adipic aciddl-Malic acid
CitratePhenylacetate+; Positive, –; negative

Table 2. Results of ATB VET test on strain No. 1
Erythromycin
Lincomycin
Pristinamycin
TylosinColistin
Cotrimoxazole
Sulfamethizole
Flumequine
Oxolinic acid
Enrofloxacin
Nitrofurantoin
Fusidic acid
Rifampin
Metronidazole
Penicillin
Amoxicillin
AMOX+CLAV. AC
Oxacillin
Cephalothin
Cefoperazone
Streptomycin
Spectinomycin
Kanamycin
Gentamicin
Apramycin
Chloramphenicol
Tetracycline
Doxycycline
S; Sensitive, R; resistant

RRRRRRRSSSRR
S
S
R
RR
R
R
RS
S
S
S
S
R
S
S

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バイオサーファクタント生産菌の利用
Table 3. Criteria to judge the level of oil slick and oil smell inbioremediation
Level
Oil smell
0 Odorless
123

4
5

Level
Oil slick0 Nonedetectable (onlyOdor barely recognizable
1 barelysmall spots are visible)
Detectable (low) (Silver
Weak odor, but
2 and/or rainbow coloredrecognizable
stripes are detectable)
Detectable (moderate)
and/or rainbow
Clearly recognizable odor
3 (Silvercolored patches are clearly
detectable)
Detectable (high) (Silverrainbow colored
Strong odor
4 and/orslick fully covers watersurface)
Overwhelming odor

Pseudomonas 属細菌の特徴と一致していた。
油臭・油膜強度は「油汚染対策ガイドライン−鉱油類を含む土壌に起因する油臭・油膜問題への土地所有者等
10)による対応の考え方−」 を参考に，6 段階（油臭）または 5 段階（油膜）で評価した（Table 3）。油臭強度の測定方法は，土壌 50 g を 500 ml のガラスびんに入れ，ふたをして約 25°C で 30 分間静置した後，直ちに土壌から発生する臭いを嗅ぎ，Table 3 の基準に沿って 6 段階で判定した。油膜強度の測定方法は，黒い台の上に置いた直径 9 cm のシャーレに蒸留水 50 ml を測り入れ，5 g の対象土壌を静かに入れた。直後の液面を目視し，Table 3 の基準に沿って 5 段階で判定した。
バイオオーグメンテーションへの適用を目的に No. 1株＋3 菌 株 の 油 臭・ 油 膜 試 験 を 行 っ た。 ま ず，
410 mm×610 mm×160 mm の大きさのトレイに油汚染土壌 40 kg（湿土）を入れ均一に混合した。No. 2 株，
No. 5 株，No. 10 株 お よ び No. 1 株 を 1 株 あ た り
106 cells/g 湿土の濃度で油汚染土壌に添加し，よく混合した。菌を添加した土壌は屋外にふたをせずに置き，1日〜4 日おきに油臭・油膜の強度を測定した。対照区として 3 菌株のみを添加した区を作り，同様の実験を行った。No. 1 株を添加することにより油臭・油膜は早期に無くなった。一方 3 菌株のみでは油膜強度 3，油臭強度1 まで低下したがそれ以上の改善が認められなかった（Fig. 2）。なお No. 1 株の菌数は最終的に初発時の 10 分の 1 以下に低下していたので環境に悪影響はないと判断できる。

Fig. 2. Eﬀect of strain No. 1 on oil slick and smell in the process ofbioremediation

No. 1 株を添加することにより，既報の 3 菌株の油分解効果を高める促進効果が認められた。これらの結果は，現実的に最重要な問題となっている油膜，油臭問題を No. 1 株の添加により解決できる方策を示したものと考えられる。なお今後の課題としてここで示されたバイオサーファクタントの分子構造を明らかにすることが必要であろう。
文

献1) 経済産業省・環境省．2005．微生物によるバイオレメディ
エーション利用指針．経済産業省環境省告示第四号．
2) Habe, H. and T. Omori. 2003. Biosci. Biotechnol. Biochem.
67: 225–243.
3) van Beilen, J.B. and E.G. Funhoﬀ. 2007. Appl. Microbiol.
Biotechnol. 74: 13–21.
4) Heinaru, E., M. Merimaa, S. Viggor, L. Merit, I. Leito, J.
Truu, and A. Heinaru. 2005. FEMS Microbiol. Ecol. 51: 363–373.
5) de Carvalho, C.C.C.R. and M.M.R. da Fonseca. 2005. FEMS
Microbiol. Ecol. 51: 389–399.
6) Kweon, O., S.-J. Kim, R.C. Jones, J.P. Freeman, M.D. Adjei,R.D. Edmondson, and C.E. Cerniglia. 2007. J. Bacteriol. 189:4635–4647.
7) 高松邦明，山津敦史，宮北憲治，今中忠行．2012．環境バ
イオテクノロジー学会誌．12: 47–57.
8) Morikawa, M., H. Daido, T. Takao, S. Murata, Y. Shimonishi,and T. Imanaka. 1993. J. Bacteriol. 175: 6459–6466.
9) 篠田純男（編集代表者）．2008．病原体等安全取扱・管理指針，pp. 13–35，日本細菌学会．
10) 中央環境審議会土壌農薬部会・土壌汚染技術基準等専門委
員会．2006．油汚染対策ガイドライン．環境省．