光ピンセットの研究
電気通信学研究科 量子・物質工学科専攻
清水和子研究室
0933023 澁川友美子

1 背景

2 目的

光ピンセットとは、対物レンズで集光させた光今後DNAを光ピンセット操作の対象物とするが物体に照射したときに生じる放射圧によって、ため、試料作製技術を獲得し、標準的な緩衝溶液

数十 µm までの大きさの微粒子を非破壊・非接触中DNAの弾性応答を測定してWLCモデルに当てで捕捉し、自由に操作できるものである。この技はまることを確認する。また、リング状の強度分術は、分子生物学、医学等の分野で、細胞等の生布をもつラゲールガウスモード光中にトラップさ物試料に対して傷をつけることなく容易に操作でれた微小球は、光の持つ角運動量のためリングにきる手段として利用されている。

沿って回転運動を行う。これまでに我々の研究室

その 1 つとして我々はDNA分子の操作に着目しでは、ラゲールガウスビーム中の微粒子の回転実た。DNAは高分子生体物質で生物細胞や組織をつ験を行っている[11]。このことを利用してスーパーくり上げるのに必要なすべての情報を蓄えている。

コイル状に凝縮したDNAをほどく操作方法を開発

光ピンセットを利用することによりDNA1 分子のする。

弾性応答の研究が可能になった。緩衝溶液中のDNAを引き伸ばす場合、力が 2～3pN以下では力3 原理と伸びの関係は高分子鎖の形態を記述するモデル

3.1 光ピンセットの原理であるWorm-like chain (WLC みみず鎖)モデルや

屈折率n1の媒質中を伝播する強度Iのレーザー光

Freely Joint Chainモデルで記述できることが明

は運動量をもち、この光が屈折率の異なる媒質(屈らかにされている[1,2]。光ピンセットだけでなく、折率n2)に入射すると、境界面で反射と屈折が生じ微小磁石ビーズをDNAに接着し試料溶液セルの外て光の進行方向が変化し、運動量が変化する。そ部から磁石を用いて磁石ビーズを操作し弾性応答の際運動量保存則により光の運動量の変化分が境を調べることも行われている[3]。

界面に生じる。この力を放射圧という。

また、DNAは負電荷をもつ荷電高分子鎖である

レーザー光を溶液中の微粒子に照射すると、運動ため溶液のイオン強度によって形態が変化する。

量の変化分は微粒子に受け渡され、それがレーザあるイオン強度の範囲では全長が数µm以上あるー光の焦点位置の方向に向かう力に変換される。

DNAが直径 100nm以下のリング状に凝縮する。こ

図 1 のように粒子が Beam waste より上側にあるれはスーパーコイルと言われ、実際の細胞のサイとき、レーザー光の焦点位置の方向に向かう力と、ズに収まるときの状態と思われる。イオン強度に光の進行方向に働く力とが釣り合って微粒子を焦対するDNA凝縮の様子はDNAを引き伸ばすとき点位置付近に捕捉することができる。の力と伸びの関係から研究されている[4-10]。

逆に、粒子が Beam waste より下側にあると、

r

運動量変化によって生じる力は、光の進行方向にるため、鎖のひろがりを両末端間ベクトル R の二向かう力と同じ向きになり、全体に粒子を押し上乗の時間平均値または集団平均値〈 R 〉で評価すげる力が強く働く。そのため、トラップすることる 。 こ こ で R は 両 末 端 間 距 離 (Mean squareは困難になる。

end-to-end distance)で、<r2r>は平均を意味する。

r

高分子鎖の形態がランダムに変化する場合、 R 自身の平均はゼロとなるため、有限の値をもつ二乗

fxn2r

平均値を採用する。また、 R の二乗は、自己ベク

n1r r

粒子

r2r

トルの内積 R ⋅ R = R = R 2 で表されるため、ひろがfyりの程度がベクトルではなく数値で表現できる利点がある。
レーザー光rb2

図 1 光ピンセット原理

rRrb1

3.2 液体中を動く物体に働く抵抗力

rbn

抗力を受ける。しかし、粘性のない完全流体中を

図 2 両末端間距離r
図 2 の定義を用いると〈 R 2 〉の計算式は以下のよ

運動する物体、または完全流体の流れの中に置かうにまとめられる。

れた物体はまったく抵抗を受けないことが導かれr r
R2 = R ⋅ Rr rr r rr
= b1 + b2 + L + bn ⋅ b1 + b2 + L + bnr rr rr rr r
= b1 ⋅ b1 + b1 ⋅ b2 + L + bn ⋅ bn −1 + bn ⋅ bnr rr rr r
= b12 + L + bn2 + 2 b1 ⋅ b2 + b1 ⋅ b3 + L + bn −1 ⋅ bn

空気中や水中を運動する物体は空気や水から抵る。それゆえ抵抗のすべての原因は粘性にある。
流体中を運動する物体の受ける抵抗力はストークスの法則により、

F visc = 6 πη rv()({} {)}r r= ∑ bi2 + 2∑∑ bi ⋅ b jn(1)i =1(2)i< jと表される。ここで、 η は水の粘性、 r は物体の右辺第一項はボンドベクトルの長さの二乗平均の半径、 v は物体の運動速度である。

和で、高分子鎖の長さと関連した値である。第二項はボンドベクトルの間の角度の相関を表してい3 DNA の構造についてる。高分子鎖内のすべてのボンドベクトルの長さDNAはヌクレオチドという単量体(monomer)かが等しく、方向が完全にランダムな場合(ランダムらできた重合体(polymer)で数億ヌクレオチドにも鎖)、第二項は 0 になる。また、図 3 に示すようになる。この大きなDNAはたんぱく質と一緒になっ結合角(π-θ)で自由回転する高分子鎖の場合、右て染色体を形成する[12]。

辺第二項は実在の高分子鎖では、数多く連結した単結合の 1つ 1 つが任意の回転角をとることができるため、

r rn −1 n − ir r∑ ∑ b ⋅b = ∑ ∑ b ⋅bi< jiji =1 k =1ii+kn −1= b 2 ∑ (n − k ) cos k θk =1(3)同一のエネルギーをもつ高分子鎖であっても無数となり、<R2>はnが大きいとき以下のように近似でのコンフォメーションが考えられる。したがって、きる。

高分子鎖の形態を細かく表現することが困難であR2= nb 2

1 + cos θ
1 − cos θ①ビーズをトラップした状態で片方を固定し、も(4)う片方を DNA を引き伸ばす方向へ移動させる。

結局、<R >の値は高分子鎖の長さと折れ曲がり具合②レーザー光で DNA をに関する項の和で、空間的な広がりの程度を表し引っ張る力より DNA の2[13]ている①固定

弾性力の方が強くなる。と、ビーズがトラップかθ②固定ら外れる。
③ビーズがトラップから外れたときのレーザ

図 3 自由回転鎖
DNA のらせん構造は半屈曲性鎖を表すモデルのみみず鎖(Worm-like chain)で表せる。これは、③xーパワーとビーズ間の距離 x を測定する。

図 5 測定方法

ある結合角で自由回転する場合の極限として定義

4.2 ビーズに働く力の測定される空間的に連続なモデルである。
結合の長さb、結合角(π－θ)、ボンド数nの自由DNA の弾性応答を測定するために、まずはレー回転鎖を考える。この鎖の最初の結合方向への両ザー光によってビーズに働く力(DNA を引っ張る末端間距離の射影の平均値〈Rz〉は、n→∞の極限力)を測定する。

ではレーザー光によってトラップされたビーズを一lim R z =(b 1 − (cos θ )1 − cos θn)=b=P
1 − cos θ(5)定の速度 v で動かしたとする。v が小さいときはビーズはトラップされたままレーザー光についていとなる。ここで、Pは持続長(Persistene length, P)

くが、v が大きくなると液体からの抵抗力が大きくと呼ばれ、あるコンフォメーションをとった鎖のなりトラップから外れる。そのときレーザー光に中でほとんど曲がっていないとみなせる部分の長よる力と液体からの抵抗力が等しくなると考え、さである。高分子がこの長さの棒が繋がってできそのときの速度 v をストークスの法則に代入し、ているということもできる。Pが長ければ長いほどビーズに働く力を求めた。

鎖は固いことになる[14]。

4.2.1 ピエゾ素子の動作テスト
トラップが動く速度を操作するためにピエゾ素子を用いた。使用したピエゾ素子は最大駆動電圧150V で作動距離 18µ m のものである。

P

ピエゾ素子の動作速度を算出するため、
図 4 高分子鎖40Line/mm、スリット幅 12.5µm の回折格子を用いて、ピエゾ素子を取り付けた対物レンズで集光

4 実験された光が 12.5µm を通過する時間を測定した。

4.1 DNA の弾性応答の測定方法

図 6 のように、ピエゾ素子を取り付けた 20 倍の対DNA の両端に球体のビーズを結合させ、そのビ物レンズに He-Ne レーザーを入射させ、光が集光ーズをレーザー光でトラップする。図 5 に方法をする位置に回折格子を設置した。回折格子のスリ示す。

ットを通過したレーザー光をフォトダイオードに入射させその信号をオシロスコープで観測した。

monitorHe‐Ne Laser

CCD
microscope

12.5μmLens×20

piezo×50
stage

Diffraction
grating
Photo‐diode×50

High Speed
Bipolar Amplifier

発振器

piezo

laser

150V
Oscilloscope

図 8 顕微鏡

図 6 配置図
図 7 は 12.5µm の距離を通過する光の通過時間か4.2.3 測定結果、考察

ら速度を計算し周波数との関係を表したグラフで1µm と 2µm のビーズがトラップから外れるとある。3 度の測定の平均を取った。直線の方程式はきの周波数の値を(6)式に代入し、レーザーパワー(6)である。と速度の関係に変換したグラフを図 9 に示す。そy=64.5x(6)れぞれの方程式は以下のようになった。ここで xはレーザーパワー[mW]、y は速度[µm/s]である。
1µm ビーズ

y=16.7x(7)2µm ビーズ y=19.0x(8)図 7 測定データの平均値

4.2.2 ビーズに働く力の測定
図 8 のように顕微鏡のステージ下の対物レンズにピエゾ素子を取り付け、電圧をかけて対物レン

図 9 レーザーパワーと速度の関係ズが水平方向に動くようにした。レーザー光でビーズをトラップし、ピエゾに 150V 印加し、駆動周

これよりストークスの法則(1)の速度vに(7),(8)式

波数とレーザーパワーを変化させ、ビーズがトラから求まる速度yの値を代入し、ビーズに働く力をップから外れるときの周波数を測定した。

求めた。その結果を図 10 に示す。ここでηは水温20℃での粘性係数 1.0× 10-3[Pa・ s]とした。

5 分間遠心した。

レーザー光によりビーズに働く力[pN]

3.53③λ-DNA と Biotin1 の結合

2.521μm

λ-DNA と Biotin1(Oligo 3bio1)と TE を混合し、1.52μm

70℃で 10 分温めることで DNA の環状を切り、そ1の後室温で 3 時間 incubate した。

0.5002468④TE+BSA を緩衝液とし、①、②、③を混合して10レーザーパワー[mW]

室温で 12 時間 incubate することで完成した。
TE

図 10 レーザー光によりビーズに働く力

cut
T A C G

TE+BSA

TE+BSAA T G CBeads

図 10 の直線の方程式はDNA＋Oligo 3bio2

Oligo 3bio11µm

F=0.16x(9)2µmF=0.36x(10)となる。ここで x はレーザーパワー[mW]、F はビ＋Beads

DNA①③②TE+BSABeads

DNA

Oligo 3bio2Beads

Oligo 3bio1ーズに働く力[pN]である。
図 9 から、1µm と 2µm では 2µm のビーズの方④

図 11 DNA の試料作製がレーザー光による捕捉力が強いことがわかる。
これは、対物レンズにより集光されたレーザー光

4.3.3 測定結果のビーム径とビーズのサイズとの差によってトラDNA の弾性応答を図 12 に示す。7 つのサンプルップの安定性が異なるためだと考える。の測定データをまとめた。

DNA の操作には 2µm のビーズを使用する。2µmのビーズにおける式(10)から、4.3 で述べる DNA操作において DNA を引き伸ばすのに必要な力が求められる。

4.3 DNA の操作
4.3.1 試料の作り方
試料作製にあたり、緩衝液となる TE buffer とTE+BSA を作製した。TE buffer はあ Tris-HCl と

図 12 DNA の弾性応答

EDTA からなる緩衝液で、2 価の金属イオンをキレートし、DNA の分解を防ぐ働きがある。

4.3.4 WLC モデルとのフィッティング①ビーズの洗浄7 つのサンプルを WLC モデルとフィッティング

Streptavidin でコートされたビーズを TE+BSA でした。フィッティングの様子は代表して 2 つ目の洗浄した。

サンプルを図 13 に示した。P=50nm、L=15.5µm②ビーズと Biotin2 の結合で測定値とほぼフィットした。

洗浄済みのビーズと Biotin2(Oligo 3bio2)を混合し、P の値は高分子によって異なり、DNA は約室温で 8 時間 incubate した後、TE+BSA を加えて50nm といわれている。この値を基準としてそれぞれの値を決めた。また、L の値も今回用いた DNAた。の長さが 48000bp、約 16.5µm であることから値DNA の弾性応答のグラフから、力が 1pN を超を決めた。サンプル 6,7 は P の値が 100 となり基えてからは伸びは同じ値でありそれ以上は伸びな準値の約 2 倍となっていた。これは高分子鎖の本かった。もっとレーザーパワーを大きくすると更来回転するはずの結合部が固定され棒状とみなせに伸び始めるということも実験的にわかっている。

る部分が 2 つくっついて 1 本の棒とみなされたた

我々の今の実験系ではレーザーパワーを更に上げめだと考えた。ての測定は難しいが、光学系を工夫し行っていきた。
今後は、ラゲールガウスモードを生成し、DNAのらせん構造の状態変化を観測するための実験を行う。

参考文献
図 13

WLC とのフィッティング[1]M.D.Wang,H.Yin,R.Landick,J.Gelles,S.M.Block,BiophysicalJournal 72,1335(1997)

5 まとめと今後の課題
DNA のらせん構造が WLC モデルで表せること[2]StevenB.Smith,YujiaCui,CarlosBustamante,
Science 271,795,February(1996)

を確認するため、光ピンセット技術を用いて DNA[3]StevenB.Smith,LauraFinzi,CarlosBustamante,の弾性応答を測定した。結果から、DNA を引き伸Science 258,1122,November(1992)

ばすのに必要な力は数 pN ほどであった。今回の実[4]T.R.Strick,J.-F.Allenmand,D.Bensimon,.Croquette,

験では 7 つのサンプルでの測定データをまとめた

Biophysical Journal 74,2016(1998)

が、それ以外にも様々なサンプルを観測し測定を[5]T.R.Strick,V.Croquette,D.Bensimon,Nature試みた。しかし測定途中で DNA が切れてしまった

404,901(2000)

り、おそらく DNA が絡まっていてほとんど引き伸[6]V.A.Bloomfield, Biopolymers 44,269(1997)

ばせなかったものも多かった。7 つのサンプルは全[7]Yoshihiro Murayama, Masaki Sano, Journal of theて DNA の両端にビーズが結合しており、ビーズがPhysical Society of Japan 70, No.2,345,February(2001)

どちらもガラスに付着することなく液体中に浮遊[8]YoshihiroMurayama,Yoshihiko

していたものである。測定のためにはどちらのビ

Sano,Phys.Rev.Let 90,N0.1,018102,January(2003)

ーズもガラスに付着していないことが望ましい。

[9]Hirofumi Wada, Yoshihiro Murayama, Masaki Sano

それは、トラップされた 2 つのビーズと DNA をカ

Phys.Rev.E 66, 061912 (2002)

バーガラスからの距離が等しい位置に固定できる[10]Y.Murayama,M.Sano,Biopolymers 77,354(2005)からである。しかし、DNA の溶液を作製するごと[11]茂泉に必ずこのようなサンプルが観測されるとは限ら[13]野田春彦・丸山工作・石川ない。1 つも観測されたいこともあった。見えない物学（上）DNA を探すことはとても根気のいる作業であっ純

Sakamaki,Masaki

修士論文 H.15 年度
統他著

分子細胞生