福岡県保健環境研究所年報第29号，114−118，2002

短報
β-シクロデキストリンを酸化的二量化反応の制限媒体として用いた
2,2'-ジヒドロキシ-5,5'-ジアセチルアミノビフェニルの選択的合成
池浦太莊
無蛍光の p-アセトアミドフェノール（AAP）がオゾンと定量的に反応して酸化縮合し，強い蛍光を発する 2,2'-dihydroxy-5,5'-diacetylaminobiphenyl（ Dimer）を生成する反応は，オゾンや過酸化水素の高感度測定法として利用されている．しかし，Dimer が市販されていないことが，使用上のネックとなっていた．そこで，Dimer の簡単な合成法を検討した結果，AAP をβ-シクロデキストリンで包接した後酸化すると，副反応が抑えられ高い収率で Dimer が得られることを見いだした．
AAP は医薬品名をアセトアミノフェンと称し，鎮痛剤として広く利用されており，Dimer の簡単な合成法の開発は，医薬品の品質管理の分野においても意義あるものと考える．
［キーワード :１

オゾン，p-アセトアミドフェノール，アセトアミノフェン，ニ量体］
点 ８ ） である．過酸化酵素存在下での過酸化水素によるはじめに無蛍光の p-アセトアミドフェノール（ AAP） が，オAAP の酸化反応を検討した David W. Potter らは，水ゾンと定量的に反応して酸化縮合し，強い蛍光を発する

酸基の2箇所のオルト位と酸アミド結合の窒素部分の3箇

2,2 '-dihydroxy-5 ,5 '-diacetylaminobiphenyl（ Dimer） を生所で重合反応が起こり，図1のような多くの副反応が生成する反応を見いだし，大気中オゾン濃度の測定法およじることを報告 ９ − １１ ） している．そこで， AAP をβ -シび高感度オゾン簡易捕集器として報告１−５）した．この方

クロデキストリン（β -CD）で包接した後，フェリシア法は測定感度に優れているが，Dimer が市販されておらン化カリウムで酸化する方法を検討したところ，酸アミず，絶対蛍光強度の測定も通常困難なため，オゾン計とド結合の活性部分がβ-CD に包接されて重合反応が制限

並行測定した試料の相対蛍光強度とオゾン濃度との検量され，β-CD を使用しない方法７）と比較し約1.5〜2倍の線より，他試料のオゾン濃度を求める必要があり，利用高収率で Dimer を合成できることを見いだした．

範囲が限定されていた．純度の高い Dimer を 簡単に合成できれば，Dimer の標準溶液の蛍光強度を元にオゾン２

実濃度を求めることが可能になり，応用範囲は大きく広が

2･1

試薬類

験

AAP は東京化成㈱の特級試薬(H0190)を使用し，そのると考えられる．
AAP の酸化縮合により，強い蛍光を発する Dimer が他の試薬類はすべて和光純薬工業㈱の分析用試薬特級を生成する反応は，過酸化水素の測定においても優れた性使用した．なお，シリカゲルには和光純薬工業㈱のワコ能を有することが報告 ６） されている．また， AAP は医ーゲル C-200を用いた．

薬品名をアセトアミノフェンと称し，解熱沈痛剤として2･2装置類広く使用されているが， AAP の分解反応は中性付近で蛍光光度計には，日立製作所製 F2000を，高速液体クは酸化縮合反応が主である．従って，Dimer の簡単な合ロマトグラフ装置（ HPLC）には，島津製作所製 LC-4 A

成法の開発は，過酸化水素の測定が関与する分野や AAP型を使用した．

を含有する医薬品の品質管理の分野においても意義ある

2･3100ãメスフラスコに AAP 溶液30ãとトリス（ヒドロものと考えられる．
Dimer の合成法としては，海東らが酸化剤としてフェリシアン化カリウムを使用した方法を既に報告

試料溶液の調製

７）

キシメチル）アミノメタン（Tris）1.21g（0.01M）を加してい

えて混合し，酸化液4 ã を加えて直ちに振り混ぜ，30℃るが，副反応が多く単離操作が煩雑で収率が低いのが欠のウオーターバス中で2分間反応させた後，停止液5ãを福岡県保健環境研究所（〒818‑0135 太宰府市大字向佐野39）- 114 -加えて純水で100 ã にメスアップし，試料溶液とした．

② HPLCAAP 溶液：AAP2 g を純水300ãに溶かした後，β-CD

試料量：20μ l

Column：Inertsil ODS-2 ，5μ m，250×4.6mmI. D.

Eluent：A → 純水78％，メタノール20％，酢酸2％15g を加え40℃で2時間攪拌した．
：ホウ酸 9.9g と塩化カリウム 11.9g を純水緩衝液

ジーエルサイエンス製

800ã に溶かし，0.2M 炭酸ナトリウム溶液
約200ãを加え，pH8.5に調整した．

B → メタノール100％：フェリシアン化カリウム10.0g を純水100ã

酸化液

Gradient

0 - 1min.

A ＝100％， B ＝0％

1 - 26min.

A ＝0％， B ＝100％

26 - 31min.

A ＝0％， B ＝100％

31 - 36min.

A ＝100％， B ＝0％

36 - 45min.

A ＝100％， B ＝0％：に溶かした．
： L-アスコルビン酸4.0 g を純水100 ã に溶か停止液した．

Flow rate ： 1.0ml ／ min.

β-cyclodextrin
CH3
H

H

C
N

O

H

CCN

H

H

Detector ： UV 254nm

CH3CH3NO
H+HO

Oven Temp. ：40℃

H-e -, -H+H

H

H

OH

H

H

H

３OH

O

結果

3･1 アルカリ性物質の影響

(AAP)

NH

フェノール類の C-C coupling は アルカリ性条件下でおOこりやすく，フェリシアン化カリウムによる反応も主に
NH

NHOON

アルカリ性溶液中で行われる １ ２ ）．そして， Dimer の反O

OH

応収率は使用するアルカリ性物質に影響されると考えら(N-Dimer)OH

OHれる．そこで，2･3節で使用した Tris の代わりに，アンOH(Dimer)

モニア水，炭酸ナトリウム，炭酸カリウム，トリエタノールアミン，酢酸バリウム，炭酸水素ナトリウム，酢酸
NH

NH

NH

O

NH

O

O

NH

O

ナトリウム，炭酸アンモニウム，炭酸水素カリウム，リO

N
OH
OH

OH

ン酸二ナトリウムおよび pH8.5Tris/HCl 緩衝液を約0.01

O

M 添加し，2･3節に従い試料溶液の調製を行った．そしOH

OHて，試料溶液の pH と2･3節に従い測定した相対蛍光強(N-Trimer)(Trimer)

OH

NH
NH

O

NH

O

NH

O

NH

度を比較した結果，図2に示すように相対蛍光強度は主に pH に依存し，アルカリ性物質の違いによる影響は見O

Oられないことから，Dimer の収率は主に pH に依存して
N

O

NH

O

OH

(N'-Trimer)

いると考えられる．

OH
OH

OH

OH(Tetramer)OH

図１2･4500

AAP の酸化縮合反応

分析方法

試料溶液1 ml を50 ml メスフラスコに移し，蛍光光度

Fluorescence intensity

OH

計による測定の際には緩衝液で，HPLC による測定の際には純水でメスアップした．分析条件は次のとおりであ4003002001000456789pH of reaction solution

る．
図２①蛍光光度計
励起波長：308nm

蛍光波長：405nm- 115 -

pH と相対蛍光強度の関係

10113･2 Tris濃度の影響

相対蛍光強度は2分で最大となり，その後徐々に減少しDimer の収率は主に pH に依存し，アルカリ性物質のてゆく事がわかった．

違いによる影響は見られないことが3･1節の実験から明Fluorescence intensity

らかとなったが，添加するアルカリ物質の濃度によっても反応収率が変化する事が予想される．そこで，Tris の添加量を0.30g(0.0025M)から4.84g(0.04M)の範囲で変化させ，2･3節に従い試料溶液の調製を行い相対蛍光強度を測定した．
その結果，図3に示すとおり相対蛍光強度は Tris の添加量が増えるに従い増加するが，1.21 g(10 mM)を超え

380370360350340330

ると増加の程度が緩やかになる事が明らかとなった．

05101520Reaction time (min)Fluorescence intensity400

図５反応時間と相対蛍光強度の関係

350

3･5 β‑CD包接化の効果

300

AAP をβ -CD で包接した効果を確認するため， AAP250をβ-CD で包接した AAP 溶液とβ-CD を添加しなかった溶液について，2･3節に従い試料溶液の調製を行い

200
010203040

HPLC により分析した．その結果，図6に示すように AAP

Amount of added Tris(hydroxymethyl)aminomethane (mM)をそのまま酸化した場合と比較して AAP をβ -CD で包図３Tris 添加量と相対蛍光強度の関係

接して酸化した場合には，副生成物のピーク高さが全体的に低くなっている．特に N-Dimer および N-Trimer の3･3 酸化液添加量の影響ピーク高が顕著に低くなっており，酸アミド結合のＮ位

Dimer の合成に最適な酸化液の添加量を調べるため，での反応が阻害されたためと考えられる．

酸化剤の添加量を1〜8ã の間で変化させ，2･3節に従い試料溶液の調製を行い相対蛍光強度を測定した．
その結果，図4に示すとおり相対蛍光強度は酸化剤のFluorescence intensity

添加量が3〜4ãで最大となることが明らかとなった．

500400300200

100012345678910%K 3 Fe(CN) 6 solution (ml)図６図４HPLC クロマトグラフの比較（a：β-CD 無添加，b：β-CD 添加）

酸化剤添加量と相対蛍光強度の関係

なお， N-Dimer， Trimer， Tetramer な どの副生成物に3･4 反応時間の影響
反応時間と Dimer の 収率の関係を調べるため，30℃

ついては，標準物質が手に入らないため， Davidに保ったウオーターバス中で2･3節に従い反応を行い，Potter

時間をおって相対蛍光強度を測定した結果を図5に示す．

し，溶出順序などから類推した．

- 116 -W.

らの文献 ９−１１）に記載された分析条件に従い分析

3･6 合成法
3･1〜3･5節の検討結果より次のように Dimer を合成謝辞した．AAP10.0g を2000ãビーカーに取り純水1000ãに溶かした後，β -CD75g と Tris65g を加え，さらに純水

本研究は，財団法人住友財団の研究助成を受け，実施したものであり，ここに謝意を表します．

を追加して1500ãとし25〜30℃で2〜3時間攪拌する．次に10％フェリシアン化カリウム溶液180 ã を加えて素早文献

く攪拌し，2分間反応させた後，10％ L-アスコルビン酸

1)T.Ikeura: Fluorometric Determination of Atmospheric

溶液100 ã を加えて反応を停止する．酢酸50 ã を加えてOzone, J. Japan Soc. Air Pollut., 24(2),pH を約5.0に調整し，トルエン50ãを加えビーカーをサ(1989) [in Japanese] .

ランラップ等で覆って2時間ほど攪拌し，沈殿物をろ取

2)池浦太莊：高感度オゾン簡易測定器する．沈殿物を500ãビーカーに移してメタノール300ã

定器の開発とその実測例−， 環境技術， 19(4), 232〜を加え，十分に攪拌後ろ過し Dimer を 抽出する．この237 (1990).

操作をあと二度繰り返し，ろ液を1000ãナスフラスコに

3)T.Ikeura, Tsuguo Mizoguchi: Sensitive Passive Sampler

合わせ，ロータリーエバポレータで溶媒を留去し残留物

for Ozone,を得る．

[in Japanese] .

残留物に純水250 ã と25％アンモニア水10 ã を加えて160〜162−オゾン簡易測J. Cem. Soc. Jpn., 6, 811-819 (1991)

4)Tasoh Ikeura, Tsuguo Mizoguchi: Performance Test of

溶かした後，酢酸を加えて pH を約5.0に調整し，一晩Ozone Diffusive Sampler, J. Cem. Soc. Jpn.,

沈澱を熟成しろ取する．ろ取した沈殿を風乾するか105824 (1996) [in Japanese] .

℃で乾燥し，沈殿物1 g 当たり30〜40 ã の2 -プロパノー

5)池浦太莊：オゾン測定法, 日本国特許第1660602号.

ルを加え少し加温して溶かし（完全に溶解しなくて良6)青山正明：ペルオキシダーゼおよびそれと同等な触媒い ），2 -プロパノールを溶離液としてシリカゲルカラム作用を有する物質の定量方法, 日本国特許第2079720号.

クロマトグラフィーにより，Dimer を含む分画を分取し，7 ) Tsunetoshi Kaito,

500 ã ナスフラスコに合わせ，ロータリーエバポレータ

Yoshida, Yuji Ito : Sutudies on Fluorometric Analysis of

Kazuhiko

Sagara,9, 819-Tsuguchika

Phenol Derivatives. Ⅱ . Fluorometric Determination

で溶媒を留去し粗生成物を得る．
粗生成物をメタノール：水（２：１）混液に粒状活性of

Acetaminophen. (1), Yakugaku Zasshi, 94(5), 633-638

炭を数粒加えて加温して溶かし吸引ろ過する．ろ液に当(1974) [in Japanese] .

容量の熱水を加え一晩沈殿を熟成させた後，結晶をろ取8 ) 池 浦 太 莊 ， 溝 口 次 夫 ： 2 , 2 '-dihydroxy-5 , 5 '-する．さらに1〜2度の再結晶を行い，白色針状結晶（mpdiacetylaminobiphenyl の 単離約220℃）を得る．収量約1.5〜2ｇ（収率15〜20％）．

中オゾン濃度測定−, 第32回大気汚染学会講演要旨集,−蛍光光度法による大気p477 (1991).
４考9)David W. Potter, Dwight W. Miller, Jack A. Hinson:

察AAP をβ -CD で包接して酸化すると，立体障害のた

Identification of Acetaminophen Polymerization Products

めトリマーやテトラマーなどへのさらなる重合反応もあCatalyzed by Horseradish Peroxidase,る程度抑制されると考えられる．実際，図6を見るとト260, 12174-12180 (1985).

リマーやテトラマーのピーク高さが，β-CD で包接せず

10)David W. Potter, Dwight W. Miller, Jack A. Hinson:に酸化した場合と比較して若干低い．しかし，逆にβ-CDHorseradishで包接する事によりピーク高さが大きくなる副生成物もAcetaminophen to Intermediates that Form Polymers or

見られる．

Conjugate with Glutathione,

α -シクロデキストリン（α -CD） もβ -CD と同様に

J. Biol. Cem.,

Peroxidase-Catalyzed

O x i da t i o nofMol. Pharmacol., 29, 155-162 (1985).

AAP と包接化合物を形成することを確認したが，α-CD11)David W. Potter, Jack A. Hinson: The 1 - and 2 -Electronはかなり高価なので，本研究では安価なβ-CD について

Oxidation of Acetaminophen Catalyzed by Prostaglandin H

のみ検討を加えた．α-CD は空洞の内径が4.5Åとβ-CD

Synthase, J. Biol. Cem., 262, 974-980 (1987).の7.0Åよりもかなり小さい１３）ので，β-CD よりも強く

12)亀谷哲治，福本圭一郎：フェノールオキシデーショ

副反応を抑制する可能性が高く，また，溶解度もβ -CDン，技法堂，pp.11-15 (1970).

より大きく合成に都合が良いので，将来，価格が下がれ13)戸田不二緒，上野昭彦：シクロデキストリン，産業ば検討する価値が出てくると思われる．

図書，pp.1 (1995).

- 117 -

Selective Synthesis of 2,2'-dihydroxy-5,5'-diacetylaminobiphenyl
using β-cyclodextrin as constrained medium for oxidative dimerization
Tasoh IKEURA
Fukuoka Institute of Health and Environmental Sciences
39, Mukaizano, Dazaifu, Fukuoka, 818-0135 JapanThe reaction of an oxidative dimerization of p-acetamidophenol( AAP), which gave a strongly fluorescent Dimer (2,2'dihydroxy-5,5'-diacetylaminobiphenyl), is used as an highly sensitive measuring method for atmospheric ozone and hydrogen
peroxide. However, it is a problem in practical use that Dimer is not marketed. Then, the convenient synthetic method ofDimer was surveyed. As a result, it was found that Dimer was obtained with high yield, when AAP was oxidized after
inclusion to β-cyclodextrin.
Since AAP, also called Acetaminophen as a drug name, is used widely as an analgesic, this convenient synthetic method
will be useful in the field of the quality control of the drugs.
[Key Words：Ozone, p-acetamidophenol, acetaminophen, dimer]- 118 -