ストレス社会における過敏性腸症候群の症状改善に向けた新規治療薬の開発
岐阜薬科大学 薬学部生命薬学大講座生化学研究室
副学長 兼 教授
いかり五十里あきら

彰ストレス社会における過敏性腸症候群の症状改善に向けた新規治療薬の開発

主任研究者

岐阜薬科大学 生命薬学大講座 生化学研究室（〒 501-1196
分担研究者

岐阜県岐阜市大学西 1-25-4

湘南医療大学薬学部教授

教授

五十里彰

電話番号：058-230-8124）

石川 吉伸

富山大学研究推進機構研究推進総合支援センター
岐阜薬科大学 生命薬学大講座 生化学研究室

教授

助教

吉野

田淵 圭章雄太【要旨】

目的：過敏性腸症候群 ( IBS) の患者数は 1,200 万人と推定され、働き盛りの 20 ～ 30 代に多い。IBS はストレスや内臓痛覚過敏など様々な原因により起こり、その主症状は便通異常（下痢と便秘を繰り返す）、腹痛、腹部膨満感などである。IBS による QOL の低下が大きな問題になっている。現在、医療用医薬品としてセロトニン 5-HT3 受容体拮抗薬、抗コリン薬、大腸刺激薬、腸液分泌薬などが使用される。しかし、有効性、習慣性・依存性、副作用などの問題点がある
ため、新たな IBS 治療薬の開発が期待される。細胞間バリア機能（水やイオンの透過性）はタイトジャンクションに発現するクローディン (CLDN ) によって制御される。IBS 患者やモデル実験動物で大腸における CLDN2 発現の増加が報告されているが、CLDN2 を標的とした IBS 治療薬は未開発である。そこで本研究では、CLDN2 を標的とした IBS 治療薬の開発研究を実施した。
方法：FDA 承認済み薬剤ライブラリ ( 約 1,700 種類 ) を用いてドッキングシミュレーションを実施し、CLDN2 と相互作用する低分子化合物を探索した。マウス大腸由来 MCE301 細胞を用いて、CLDN2 発現・細胞局在、細胞間バリア機能に対する化合物の作用を検討した。デキスト
ラン硫酸ナトリウム誘発性腸炎モデルマウスを用いて、CLDN2 結合薬の作用を検証した。
結果：ドッキングシミュレーションで得られた化合物 #3 は、炎症性サイトカインである IL-6による CLDN2 タンパク質の発現増加、TJ 局在増加を阻害した。一方、他の TJ 構成因子のmRNA 量は変化しなかった。種々阻害剤を用いた検討により、化合物 #3 は CLDN2 のクラスリン依存性エンドサイトーシスとリソソーム分解を促進することが示唆された。IL-6 による TER の低下は、化合物 #3 の共処理により阻害された。しかし、腸炎モデルマウスの下痢症状と組織損傷は改善しなかった。
考察： MCE301 細胞を用いた解析において、化合物 #3 は IL-6 による CLDN2 発現の増加とTER の低下に対し阻害効果を示した。CLDN2 の発現増加が関与する疾患に対し、化合物 #3は新たな治療薬になることが期待される。しかし、腸炎モデルマウスの解析では改善効果がみられなかったため、その有用性は慎重に検討する必要がある。

90

１、調査研究目的
厚生労働省の調査によると、過敏性腸症候群 ( IBS) の患者数は 1,200 万人と推定され、働き盛りの 20 ～ 30 代に多い。IBS はストレス、腸管運動機能の異常、内臓痛覚過敏など様々な原因により起こり、その主症状は便通異常（下痢と便秘を繰り返す）、腹痛、腹部膨満感などである。
便通異常は直接生死に関わる症状でなく、病気と認識していない患者が多い。しかし、QOL の低下を招き、特に下痢型 IBS では通勤や通学の外出が困難になることがある 1)。さらに、IBSから潰瘍性大腸炎やクローン病となるリスクが高いため、適切な薬の使用によるセルフメディケーションの推進が期待される。IBS 患者の治療満足度と薬剤貢献度は 70% 程度であるにも関わらず、過去 10 年間における IBS の薬剤承認件数は 2 件と少なく、スイッチ OTC 化を含めた IBS治療薬の開発研究を加速させる必要がある。
現在、医療用医薬品として下痢型 IBS を対象としたセロトニン 5-HT3 受容体拮抗薬のラモセ
トロン、腸管蠕動運動抑制薬のロペラミド、抗コリン薬のブスコパン、便秘型 IBS を対象とした大腸刺激薬のセンノシドや腸液分泌薬のリナクロチドなどが使用される。一方、OTC 薬として承認されているのは、消化管運動調律剤であるセレキノンとポリカルボフィルカルシウムの 2 剤のみである。既存薬の OTC 化の問題点として、有効性、習慣性・依存性、副作用などが挙げられる。
大腸の水分量は、腸管上皮細胞の管腔膜に発現するイオン輸送体と細胞間接着装置（タイトジャンクション）に発現するクローディン (CLDN ) によって制御される。近年、大腸のイオン輸送を担う塩素イオンチャネルを標的としたルビプロストン 2 ) やナトリウム／プロトン交換体を標的としたテナパノル 3 ) が臨床開発され、IBS 治療薬の新しい道が切り拓かれた。一方、IBS 患者やモデル実験動物で大腸における CLDN2 発現の増加が報告されているが 4, 5 )、CLDN2 を標的とした IBS 治療薬は未開発である。近年申請者は、大腸 CLDN2 の発現増加因子としてアルドステロンを 6 )、発現抑制因子として HNF-4 αを発見した 7 )。さらに、がん細胞を用いた解析において、CLDN2 の発現低下作用をもつ短鎖ペプチドと低分子薬の開発に成功した。しかし、IBSにおける大腸 CLDN2 の発現低下薬は未開発である。本研究では CLDN2 を標的とした IBS 治療薬の開発に向け、ドッキングシミュレーション、ウエスタンブロット解析、細胞間バリア機能解析、デキストラン硫酸ナトリウム ( DSS) 誘発性腸炎モデルマウスの組織解析を行った。

2. 調査研究手法
2.1. ドッキングシュミレーション
共同研究者の石川 ( 湘南医療大学 ) とともに、FDA 承認済薬剤ライブラリを対象として、
CLDN2 の第二細胞外ループ領域の予測構造と相互作用する化合物をコンピュータシミュレーションにより探索し、検討に用いた。

91

2.2. 細胞の培養
実 験にはマウス大 腸由来の MCE301 細胞を使用した。細胞は 5% 牛胎児血清を含む
Dulbecco’s modified Eagle Medium で培養した。0.5% trypsin 溶液を用いて 3 ～ 4 日ごとに継代し、実験に用いた。
2.3. RNA 抽出とリアルタイム PCR
化合物を処理後、TRI reagent ( コスモバイオ社 ) を用いて細胞から RNA を抽出した。
ReverTra Ace ( 東洋紡社 ) を用いて逆転写反応を行い、cDNA を調製した。定量的リアルタ
イム PCR 法では、Real time PCR Eco ( アズワン社 ) を用いて mRNA 量を解析した。
2.4. SDS- ポリアクリルアミドゲル電気泳動とウエスタンブロット法
Lysis buffer (1% Triton X-100, 0.1% sodium dodecylsulfate, 150 mM NaCl, 1 mM
EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4) を用いて細胞内タンパク質を可溶化し、遠心操作により可溶性画分を抽出した。7.5 ～ 15% SDS- ポリアクリルアミドゲルにタンパク質サンプルをアプライし、30 mA で約 80 分間電気泳動した。ゲルを PVDF 膜に転写後、2% スキムミルクで 30分間処理し、ブロッキングを行った。各種一次抗体 (1,000 倍希釈 ) を 4℃で一晩処理した。
PVDF 膜の洗浄後、二次抗体を室温にて 60 分間反応させた。EzWestLumi plus (ATTO 社 )を用いて各タンパク質のバンドを検出した。
2.5. 蛍光免疫染色
細胞をカバーガラス入りの培養皿で培養した。メタノールによる固定後、0.5% Triton X-100
含有 PBS で可溶化処理を行った。4% ブロックエースでブロッキング後、各種一次抗体 (100倍希釈 ) を 4℃で一晩処理した。一次抗体を洗浄後、AlexaFluor 488 または AlexaFluor
plus 555 で標識した二次 抗体を室温で 90 分間反 応させた。細胞 核を可視化するため、
DAPI を使用した。カバーガラスをスライドガラスに固定し、共焦点レーザー顕微鏡 ( LSM700、Zeiss 社 ) を用いて標的タンパク質の細胞局在を解析した。
2.6. 細胞間透過性の評価細胞をトランスウェルに播種後、4 日間培養した。Volt-ohmmeter ( Millipore 社 ) を用いて上皮膜間電気抵抗値 (TER) を測定した。管腔側溶液に水溶性蛍光マーカーであるルシファー
イエロー (LY、50 μg/mL) を添加し、30 分後に血管側溶液を回収した。Infinite F200 PRO(TECAN 社 ) を用いて蛍光強度を測定し、LY 透過性を算出した。
2.7. DSS 誘発性腸炎モデルマウスの作製
C57BL/6J マウス ( 雄性、8 週齢 ) に 3% DSS を自由飲水投与し、大腸炎モデルを作成した。
腹腔内投与により、化合物 #3 (10 mg/kg) を連日投与した。なお、動物実験は本学動物実92験委員会の承認を得て行った。

3. 調査研究成果
3.1. CLDN2 の発現低下作用をもつ化合物の探索
CLDN2 と化合物のドッキングシミュレーションにより ( Fig. 1)、CLDN2 の第 2 細胞外ループとの相互作用が予測される化合物を 20 種類選出した。CLDN2 を高発現するがん細胞を用いた予備検討において、CLDN2 の発現低下作用をもつ化合物を 1 種類同定した。特許申請の都合上、本化合物を #3 として記載する。
マウス大腸由来 MCE301 細胞に炎症性サイトカインの IL-6 を処理したところ、CLDN2 のタンパク質量が増加した ( Fig. 2)。この効果は化合物 #3 の共処理により阻害された。一方、
IL-6 処理によりCLDN2 の mRNA 量が増加したが、化合物 #3 の共処理により阻害されなかった。さらに、IL-6 や化合物 #3 の処理により、タイトジャンクション構成因子である CLDN1、CLDN15、ZO-1、occludin (OCLN ) の mRNA 量は有意に変化しなかった。以上の結果より、
化合物 #3 は CLDN2 タンパク質に直接作用し、発現を低下させることが示唆された。
3.2. CLDN2 の細胞局在の解析
蛍光免疫染色により、CLDN2 タンパク質の細胞局在を調べた。コントロール細胞では、CLDN2 の発現量は少ないが、ZO-1 とともにタイトジャンクションに分布していた ( Fig. 3)。
IL-6 処理により、タイトジャンクションにおける CLDN2 の分布量が増加した。この効果は化合物 #3 の共処理により阻害された。以上の結果から、IL-6 によって発現誘導された CLDN2は、タイトジャンクションで機能することが示唆された。
3.3. 細胞間バリア機能の解析
CLDN2 はナトリウムポアとして機能することが報告されている 8 )。IL-6 や化合物 #3 の処理により、タイトジャンクションにおける CLDN2 の分布量が変化したため、トランスウェルを用いて TER と LY 透過性を調べた。IL-6 処理により TER が低下し、この変化は化合物 #3の共処理により阻害された ( Fig. 4)。これらの変化は CLDN2 タンパク質発現の変化と相関するため、CLDN2 のバリア機能に起因することが示唆される。一方、IL-6 や化合物 #3 の処理
により LY 透過性は有意に変化しなかったため、低分子化合物の透過性に対する影響は小さいことが示された。
3.4. DSS 腸炎モデルマウスの症状解析
DSS の投与により 4 日目から体重減少がみられた ( Fig. 5)。化合物 #3 の投与により、体重減少が部分的に改善した。ルミノール反応を用いて便潜血を調べたところ、DSS 投与の 3 日93

目から便潜血が確認された。化合物 #3 の投与により、7 日目の便潜血が部分的に改善したが、有意差はなかった。体重、便潜血、下痢症状のスコアをもとに Disease Activity Indexscore ( DAI スコア ) を算出したところ、化合物 #3 の投与により有意な改善はみられなかったが、7 日目に DAI が低下した ( Fig. 6)。
3.5. DSS 腸炎モデルマウスの組織解析
DSS と化合物 #3 の投与から 7 日目にマウスを安楽死させ、大腸組織を摘出した。DSS 腸炎モデルマウスでは大腸の長さが短縮し、化合物 #3 の投与により有意に改善しなかった。ヘマトキシリン・エオジン染色により大腸組織の形態を観察したところ、DSS 投与により激しい組織損傷が確認され、化合物 #3 の投与により改善しなかった。

4. 考察
マウス大腸由来 MCE301 細胞を用いた解析において、IL-6 による CLDN2 タンパク質の発現増加、TJ における局在増加、電気抵抗値の低下に対し、化合物 #3 が改善効果をもつことを解明した。化合物 #3 の処理により、CLDN2 を含めた TJ 構成因子の mRNA 量が有意に変化しなかったため、化合物 #3 は CLDN2 タンパク質に選択的に作用することが示唆された。CLDNを標的とした抗体薬の開発が進められているが、TJ は非常に狭い領域であり、分子量の大きい抗体の接近は難しいことが予想される。一方、本研究で見出した化合物 #3 は分子量が 500 Da程度であり、TJ に分布する CLDN2 への作用が容易であると考えられる。
DSS 誘発腸炎モデルマウスを用いた解析において、化合物 #3 の投与により下痢症状の顕著な改善は認められなかったが、投与 7 日目に DAI が低下した。また、大腸の組織損傷に改善は認められなかった。近年、CLDN2 ノックアウトマウスを用いて、CLDN2 が腸管組織の修復に必要であることが報告された 9 )。そのため、組織損傷の激しい急性期に CLDN2 の発現を低下させることは、IBS の症状を悪化させることが推察される。一方、慢性期に CLDN2 の発現が増加したままでは電解質イオンや水の漏出によって下痢症状が悪化するするため、CLDN2 の発現を低下させることが効果的であると考える。現時点では、下痢型 IBS 治療薬としての化合物 #3 の有用性は低いが、投与のタイミングや濃度を検討し、再評価を行う必要がある。

5. まとめ本研究において、CLDN2 のドッキングシュミレーションにより得られた化合物 #3 が IL-6 誘発性 CLDN2 発現増加を阻害し、細胞間イオン透過性を低下させることを見出した。DSS 腸炎モデルマウスにおいて、化合物 #3 の投与により 7 日目に DAI が低下したが、組織損傷は改善

94

しなかった。CLDN2 を標的とした下痢型 IBS 治療薬の開発に向け、さらなる検討が必要である。

6. 調査研究発表なし

7. 引用文献
1) Pimentel M.: Evidence-based management of irritable bowel syndrome with diarrhea,
Am. J. Manag. Care, 24, S35-S46, 20182) Zong Y., Zhu S., Zhang S., Zheng G., Wiley J.W., Hong S.: Chronic stress and intestinal
permeability: Lubiprostone regulates glucocorticoid receptor-mediated changes in colon
epithelial tight junction proteins, barrier function, and visceral pain in the rodent andhuman, Neurogastroenterol. Motil., 31, e13477, 20193) Curro D., Ianiro G., Gasbarrini A.: A pharmacokinetic evaluation of tenapanor for thetreatment of irritable bowel syndrome with constipation: an update of the literature,
Expert Opin. Drug Metab. Toxicol., 19, 889-894, 2023
4) Martinez C., Rodino-Janeiro B.K., Lobo B., Stanifer M.L., Klaus B., Granzow M.,
Gonzalez-Castro A.M., Salvo-Romero E., Alonso-Cotoner C., Pigrau M., Roeth R.,
Rappold G., Huber W., Gonzalez-Silos R., Lorenzo J., de Torres I., Azpiroz F., Boulant S.,Vicario M., Niesler B., Santos J.: miR-16 and miR-125b are involved in barrier function
dysregulation through the modulation of claudin-2 and cingulin expression in thejejunum in IBS with diarrhoea, Gut, 66, 1537-1538, 2017
5 ) Yu Y.B., Zhao D.Y., Qi Q.Q., Long X., Li X., Chen F.X., Zuo X.L.: BDNF modulates
intestinal barrier integrity through regulating the expression of tight junction proteins,
Neurogastroenterol. Motil., 29, 2017
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Matsunaga T., Ikari A.: Inverse regulation of claudin-2 and -7 expression by p53 andhepatocyte nuclear factor 4alpha in colonic MCE301 cells, Tissue Barriers, 9, 1860409, 2021
8) Fromm M., Piontek J., Rosenthal R., Gunzel D., Krug S.M.: Tight junctions of theproximal tubule and their channel proteins, Pflugers Arch., 469, 877-887, 2017959) Ahmad R., Kumar B., Thapa I., Tamang R.L., Yadav S.K., Washington M.K., Talmon G.A.,
Yu A.S., Bastola D.K., Dhawan P., Singh A.B.: Claudin-2 protects against colitis-associatedcancer by promoting colitis-associated mucosal healing, J. Clin. Invest., 133, 2023

Fig.
Fig. 1.
1. Docking
Docking model
model ofof thethe extracellular
extracellular loop
loop 2
2 ofof CLDN2
CLDN2 andand small
small molecularmolecular compoundcompoundFig. 1. Docking model of the extracellular loop 2 of CLDN2 and small molecular compoundFig. 1. Docking model of the extracellular loop 2 of CLDN2 and small molecular compoundFig. 2. Effects of IL-6 and compound #3 on the expression of TJ components

cellsofwere
treatedIL-6 and #3
compoundfor 24 (A) and6 h components(B and C). (A) The protein
Fig.MCE301
2. Effects
Effects
and with
compoundon thethe #3
expressionof TJ
TJ
Fig.
2.
of IL-6IL-6andcompound#3 onofcomponents
levelofcells
CLDN2
wasinvestigatedby Westernblotting.expression(B forand 24C) (A)ThemRNAlevelsof C).
TJ components
MCE301
weretreatedwith
IL-6andcompound#3and6h(B(A) The protein
Fig. 2. Effects
of IL-6andwith
compoundon the expression
ofandTJ# 6components
NS (A) The protein
MCE301
cells weretreated
IL-6 and #3
compound#3
forvs24Control.
(A)
h 0.05(B andandC).
wereexaminedbyquantitative
renal-time
PCR.
**
P<0.01
P<andPTJ> components
0.05 vslevelofCLDN2
wasinvestigatedby
Westernblotting.
(BandC)
ThemRNA
levelsofMCE301cells
weretreatedwith IL-6
and compound24C)(A)
andmRNA
6#h (Blevelsand C).
The protein
levelof CLDN2
wasinvestigatedby Western
blotting.#3(BforandTheof (A)TJ
ControlorIL-6alone.
NScomponents
wereexamined
quantitative
renal-time
PCR.
**0.01
P# P <levels
NScomponents
level of
CLDN2bywasinvestigatedby Western
blotting.
andvs
The mRNAof TJ
wereexaminedbyquantitative
renal-time
PCR.
** P
P<<(B0.01
vsC)Control.
Control.
P < 0.05
0.05 andandP>> 0.050.05 vsvs#NS
ControlorIL-6alone.
were
examinedquantitative renal-time PCR. ** P < 0.01 vs Control. P < 0.05 and P > 0.05 vsControlor IL-6 byalone.
Control or IL-6 alone.

96

Fig. 3. Effects of IL-6 and compound #3 on the cellular localization of CLDN2
The cells were treated with IL-6 and compound #3 for 24 h. The cellular localization of CLDN2and ZO-1 were investigated by immunofluorescence staining. Scale bar indicates 20 μm.

Fig. 4. Effects of IL-6 and compound #3 on paracellular barrier function
The cells were cultured on transwells for 4 days. Then, the cells were treated with IL-6 and compound#3 for 24 h. (A) TER was measured using volt-ohmmeter. (B) LY flux from the apical to basal chamber
was measured using an Infinite F200 Pro fluorescence plate reader. ** P < 0.01 vs Control. ## P < 0.01
and NS P > 0.05 vs Control or IL-6 alone.

97

Fig. 5. Effect of compound #3 on DSS-induced diarrhea
DSS and compound #3 were administered by drinking water and intraperitoneal injection, respectively.
(A) Body weight was measured everyday. (B) Fecal occult blood of mice was detected by a luminol
solution. (C) Disease activity index (DAI) was estimated by body weight, fecal occult blood, anddiarrhea.

Fig. 6. Effect of compound #3 on DSS-induced colon injury
DSSandcompound#3 were#3
administeredfor 7 daysby drinking water and intraperitoneal injection,
Fig. 5.
Effectof compoundon DSS-induced
diarrhea
respectively.
Afterremoving
thecolontissues,they
are stainedwith hematoxylin
andrespectively.
eosin. The
DSS and compound #3 were administered by drinking waterand intraperitoneal
injection,
imagesarecollectedusingaKeyence
BZ-X810
microscope.
(A) Body weight was measured everyday. (B) Fecal occult blood of mice was detected by a luminolsolution. (C) Disease activity index (DAI) was estimated by body weight, fecal occult blood, anddiarrhea.

98Development of novel therapeutic agents for irritable bowel syndrome in a stressful society
Name: Akira Ikari, Professor
Affiliation: Laboratory of Biochemistry, Department of Biopharmaceutical Sciences,
Gifu Pharmaceutical University
Address: 1-25-4 Daigaku-nishi, Gifu 501-1196, Japan
Tel: +81-58-230-8124

Abstract
The number of patients with irritable bowel syndrome (IBS) is estimated to be 12 million inJapan. IBS is evoked by a variety of causes including psychological stress and visceral
hyperalgesia, and so on. The main symptoms are abnormal bowel movements, recurring diarrhea
and constipation, abdominal pain, and a feeling of bloating. The decline in QOL due to IBS
remains a major problem. At present, various agents including serotonin 5-HT3 receptor
antagonists and anticholinergic drugs are used for IBS treatment. However, there are problems
with its effectiveness, habitual/dependency, and side effects. Therefore, we have to develop novel
therapeutic agents for IBS. The paracellular barrier function such as water and ion permeabilities
is controlled by claudins (CLDNs), which are expressed in tight junctions. Increased CLDN2expression in the colon has been reported in IBS patients and experimental animal models. In thisstudy, we searched for CLDN2-targeting compounds to develop novel therapeutic agents for IBS.
CLDN2-interacting compounds were obtained from FDA approved drugs by in silico docking
simulation screening. The mRNA expression, protein expression, and cellular localization ofCLDN2 were investigated by real time-PCR, Western blotting, and immunostaining, respectively.
Paracellular barrier ability was estimated by transepithelial electrical resistance (TER). Irritablebowel syndrome (IBS) model mice were constructed by drinking dextran sulfate sodium.
In mouse colon-derived MCE301 cells, interleukin-6 (IL-6) increased the protein level of
CLDN2, which was inhibited by compound #3. Pharmacological analyses suggested that IL-6
may enhance clathrin-dependent endocytosis and lysosomal degradation of CLDN2. IL-6 reducedTER, which was inhibited by compound #3. However, the diarrhea symptoms and tissue damageof colon were not rescued by compound #3 in DSS-induced colitis mice.
In conclusion, we found that compound #3 can inhibit the IL-6-induced elevation of CLDN2
expression and ion permeability in MCE301 cells. However, compound #3 did not show
significant effects in IBS model mice under current experimental conditions. We need further
study to develop CLDN2-targeting therapeutic agents for IBS.

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