静電気学会誌，48, 1（2024）2-7

J. Inst. Electrostat. Jpn.

論文

周波数変調誘電泳動におけるクロスオーバー周波数と腫瘍細胞ミトコンドリア膜電位の関係
張 晴 ，加藤 英子 ，八木 一平 ，内田 諭
＊

＊

＊

＊, 1

（2023年9月11日受付；2023年12月11日受理）

Correlation of Mitochondrial Membrane Potential of Cancer Cell andCrossover Frequency in Frequency Modulated Dielectrophoresis＊＊＊＊, 1Qing ZHANG , Eiko KATO , Ippei YAGI and Satoshi UCHIDA（Received September 11, 2023; Accepted December 11, 2023）

As Japanʼs population ages, cancer deaths are becoming an increasing problem. Attention is being paid to early diagnosis ofcancer and assessment of treatment status. Therefore, the detection of differences in physiological states within cells and theidentification of cell types are essential. In this paper, we focused on Crossover frequency（ COF ）measurement methods
using Frequency-Modulated Dielectrophoresis（ FM-DEP）, which utilizes the electrical properties of cells. As a result, theexperimental results by different buffer conductivities showed that DEP using FM signals can detect cell behavior with highspeed and accuracy in a homemade object tracking program and that the COF can also be measured with high accuracy. Inaddition, to detect the physiological state of tumor cells using the FM-DEP, experiments on the initial induction of cell
apoptosis by drugs showed that the COF increased with a decrease in mitochondrial membrane potential. On the other hand, it
was found that the COF could not be measured for drug-induced cells in the late apoptotic phase.

1．はじめに漏出することで周辺細胞に炎症を惹起する．これは抗がんがんの治療技術は未だ発展段階にあり，細胞医療に向け剤や放射線治療によるがん治療において副作用として認識た技術である蛍光や吸光分析のフローサイトメトリー やされている．一方，アポトーシス（プログラムされた自己磁気ビーズ 検出法が研究されている．しかしながら，上死）を起こした細胞は縮小し，アポトーシス小体と呼ばれ記手法ではラベリングによる細胞毒性があり，各操作工程る細胞断片を形成した後，生体内で貪食細胞によって除去が煩雑かつ時間を要し，装置の小型化などの課題が指摘さされる ．ほとんどの抗腫瘍化学療法において，ミトコンれている

ドリア制御の内因性アポトーシスを起こすことによりがん

1）

2）

．

3-5）

そ こ で， 著 者 ら は 電 気 的 特 性 を 利 用 す る 誘 電 泳 動（ Dielectrophoresis: DEP ）を用いたクロスオーバー周波数（ Crossover frequency: COF ）計測法

11）

細胞が退縮・消失する ．
12）

本 論 文 で は， 周 波 数 変 調 に よ る 誘 電 泳 動（ Frequencyに着目した．不均一

Modulated-Dielectrophoresis: FM-DEP ）による細胞挙動を解

電界下で誘電体の微粒子を操作する DEP は，力の向きが正析するシステムを構築し，その処理・検出精度を評価した．

から負に切り替わる周波数（ COF ）によりまた，薬剤によりアポトーシス誘導された細胞に対して，6-10）細胞死を評価6-10）し，がんの治療効果を評価する技術として期待される．

アポトーシス発生段階の COF およびアポトーシス発生初

細胞死は，その形態学的および生化学的な特徴などから期の進行過程をミトコンドリア膜電位 ∆Ψm により測定し，ネクローシスとアポトーシスに大別される．ネクローシス

FM-DEP 法による COF との関係を調査したので，これら（壊死）は，細胞が膨張し，最後に細胞内容物が細胞外にを報告する．

キーワード：誘電泳動，周波数変調，クロスオーバー周波数，腫瘍細胞，ミトコンドリア膜電位＊
東京都立大学システムデザイン研究科（〒191-0065 東京都日野市旭が丘 6-6）
Graduate School of Systems Design, Tokyo Metropolitan
University, 6-6, Asahigaoka, Hino-shi, Tokyo 191-0065,
Japan1s-uchida@tmu.ac.jp
DOI：https://doi.org/10.34342/iesj.2024.48.1.2

静電気学会誌48巻1号.indb

22．理論
2.1 誘電泳動
細胞を均一電界に晒すと，表面に分極電荷が誘起される．
一方，不均一電界の場合，細胞両端に係る力が異なるため
細 胞 が 移 動 す る． 本 現 象 を 誘 電 泳 動（ Dielectrophoresis:DEP ）と呼び，その力 FDEP［ N ］は以下の式で表される ．
13）

FDEP = 2πε m r Re［ K（ω ）］∇| E |32（1）2024/01/25

10:43:38周波数変調誘電泳動におけるクロスオーバー周波数と腫瘍細胞ミトコンドリア膜電位の関係（張 晴ら）

3

ここで，ε m は溶媒の誘電率，r は細胞半径，ω は電界の角周 波 数，E は 電 界 の 実 効 値 で あ り，Re［ K（ω ）］をClausius–Mossotti 関数と呼び，式（2）により算出する．
K（ω）=

ε p－ε m＊＊ε p + 2ε m（2）ε = ε－iσω

（3）

＊＊＊

ここで，ε は複素誘電率，σ は導電率，添え字の m は溶＊媒，p は粒子を表す．
Re［ K（ω ）］は細胞の電気特性により変化し，負数の場合，負の誘電泳動（ nDEP ）が働き，細胞は電場の弱い方へ移動し，細胞は電極から斥力を受ける．正数の場合，正の誘電泳動（ pDEP ）が働き，細胞は電場の強い方へ移動し，細胞は電極から引力を受けて電極に近づく．実際の細胞は，細胞膜と細胞膜内部の細胞質について，それぞれ固有の電気特性を持つため，式（4）
により 2 層モデルとして扱う ．
14）r0
ε int－ε mem＋2 ε ＊int＋2ε ＊mem
ri＊3＊ε p=＊r0
ε int－ε mem－ ε ＊int＋2ε ＊mem
ri3＊＊（4）

ここで，ε int は細胞質の誘電率，ε mem は細胞膜の誘電率，riは細胞膜までの半径，r0 は細胞膜を含む細胞半径を表す．

2.2 クロスオーバー周波数
クロスオーバー周波数とは，Re［ K（ω ）］の値が正負に切り替わる周波数を指し，これを閾値として誘電泳動力の］の計算値
図 1 バッファ導電率別の Re［ K（ω ）］with buffer conductivity.
Fig.1 Simulated value of Re［ K（ω ）表 1 浮遊がん細胞 Jurkat の物理および電気特性
Table 1 Physical and electrical parameters of Jurkat cells.
Parameter15）
Cell outer radius r015）
Cell inner radius ri, 15）
Cell membrane thickness r15）
Cytoplasmic permittivity ε int
15）
Cytoplasmic conductivity σ int
15）
Solvent permittivity ε m15）
Vacuum permittivity ε 015）
Membrane conductivity σ mem
15）
Cell membrane dielectric constant ε mem

Value
-6
5.31×10 ［ m ］-65.30×10 ［ m ］-8
1.00×10 ［ m ］-10
5.93×10 ［ F/m ］-1
3.00×10 ［ S/m ］-10
7.08×10 ［ F/m ］-12
8.85×10 ［ F/m ］-7
1.10×10 ［ S/m ］-10
1.04×10 ［ F/m ］

向きが反転する ．
14）

図 1 は，浮遊がん細胞 Jurkat の諸特性（表 1）と式
（2）
，および式
（4）
よりバッファの導電率別に求めた Re［ K（ω ）］である．Re［ K（ω ）］= 0 となる点を COF と呼ぶ．

2.3 周波数変調誘電泳動
周波数変調誘電泳動（ Frequency Modulated-Dielectrophoresis: FM-DEP ）とは，単一の交流電圧の代わりに FM 信号を用いた誘電泳動解析法である．先行研究で FM-DEP が新たな誘電特性を評価する手法として開発された ．COF
16）をまたぐ周波数帯の FM 信号を用いた場合，Re［ K（ω ）］の符号反転により，細胞は pDEP および nDEP を受けるた

図 2 FM-DEP 細胞ホッピングモデル
Fig.2 Cell hopping model FM-DEP.

め，図 2 のように細胞の移動方向は，電極近傍で変調周期に同期して交互に電極を行き来する．先行研究によると
pDEP が作用して細胞が電極に近づく時間（ ∆tp ）を細胞の挙動から算出すると，下記の過程のより，細胞の固有のCOF を求めることができる．

16）

fCOF = fc + fd cos（ πfm ∆tp ）（6）

ここで，∆tp は正の誘電泳動作用時間とする．時間的にFM 信号の被変調波周波数 fFM は次式で表される．
fFM = fc + fd sin（2πfm t ）囲に存在する場合，次のように変形が可能である ．

変化する FM 信号に対する COF および DEP 力の方向の関（5）連を図 3 に示す．

2.4 細胞挙動の追跡法

ここで，fc は FM 信号の中心周波数，fd は周波数偏差，fm

本研究では，細胞の自動追跡および高精度化を実現するは FM 周波数とする．クロスオーバー周波数 fCOF が fFM 範ため，細胞追跡プログラムを作成した．画像処理ライブラ

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32024/01/25

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静電気学会誌 第48巻 第 1 号（2024）4するため，PBS を溶液に添加することで，誘電泳動特性に影響を与えるバッファ導電率を 200，300，800 µS/cm に調整した．先行研究の知見により誘電泳動が観察可能な導電率を 300 µS/cm を基準として設定した ．
21）

3.1.2 薬剤によるアポトーシス誘導
アポトーシス後期細胞のサンプル調製を行うために，脱共役剤である FCCP（ SML2959，シグマアルドリッチジャ
パン合同会社，Tokyo, Japan ）を添加後 48 時間経過したの
ち，Annexin V と Propidium Iodide（ PI ）（ Annexin V-FITCKit，医学生物学研究所，Tokyo, Japan ）という 2 つのアポ

図 3 FM 信号と DEP, COF の関係
Fig.3 Correlation of FM signal DEP and COF.

トーシス検出薬を入れたのち，暗室で 15 分間放置した．
迅速なアポトーシス誘導剤であるラプチナール

リである OpenCV に含まれる Kernelized Correlation Filter（ Raptinal，東京化成工業社，Tokyo, Japan ）により，ミト（ KCF ）法を使用して，指定サンプルの特徴を学習し，サンコンドリア膜電位 ∆Ψm の低下が発生した内因性のアポト

プルをわずかに移動した画像を大量に生成することで，疑似ーシス細胞死を誘導することができる ．

17）22）的に学習量を増やした．また，フーリエ変換を用いることでメ節 3.1.1 で述べた PBS に対して，ミトコンドリア膜電位モリと計算量を削減したため，多くのサンプルを容易に追加し，アッセイ MT-1（ MitoMP Detection Kit，同仁化学研究所，手動計測と比較して高精度かつ高速な挙動追跡を実現した．

Kumamoto, Japan ）を細胞懸濁液で 1/1000 に希釈して，302.5 アポトーシス誘導におけるミトコンドリアの役割分間インキュベーションした．その後，DMOS により溶

ミトコンドリアは，アポトーシス制御において中心的な解済みのラプチナール 3 µL を細胞懸濁液 2 mL に添加し，役割を果たす．アポトーシス発生時に，小胞体からの18, 19）

直ちに細胞懸濁液の導電率を 300 µS/cm に調製した．

放出された Ca イオンがミトコンドリアに流入することに

3.2 実験手順

より，膜透過性が亢進し，分子の漏出，膨化，ミトコンド

本研究で用いた実験装置の概略を図 4 に示す．

リア膜電位 ∆Ψm の減少が生じ，ミトコンドリアの機能低下

3.2.1 正常細胞のCOF測定を誘導する ．このようなミトコンドリアを介したシグナ

本 実 験 は， 小 型 落 射 顕 微 鏡（ CM-10L，Nikon, Tokyo,

ル伝達を介して内因性アポトーシスと呼ばれる細胞死が進Japan ）と 20 倍対物レンズ，CCD カメラ，および流速制御行する．この際，ミトコンドリア膜電位の低下と同期して，機構を持つエレスタクロスソータ（ ELESTA CROSSORTER

細胞が縮小して，細胞各層の電気・幾何学定数が変化する．

ECS-001, 株式会社 AFI テクノロジー, Kyoto, Japan ）に対

特に細胞膜の誘電率および細胞質導電率が正常細胞と比べして，電極間隔 200 µm のクロム材質の直線 DEP デバイス，て著しく変化するため ，当該細胞の COF が変化する．

ファンクションジェネレータ，1 mL シリンジを設置した．

2+19）

20）

シリンジは送液チューブを介してデバイス流入口側方に接3．実験方法続した．細胞懸濁バッファを流した後，デバイスに FM 信

3.1 細胞株およびサンプル調製号を印加する．導電率別の条件に対して細胞 10 個の挙動

実験にはヒトＴ細胞性白血病由来細胞株である浮遊がん細胞 Jurkat を使用した．細胞培養液には RPMI1640 培地（富士フイルム和光純薬社，Osaka, Japan ）に 10％FBS と 1％ペニシリン・ストレプトマイシンを加えた．Jurkat 細胞を播種，均一に分散させ，5％ CO2，37℃のインキュベータで細胞密度が 1×10 cells/mL 以上になるまで恒温培養した．
63.1.1 細胞懸濁液の調製
Jurkat 細胞を含んだ培養液を遠心分離機による 1800 rpm
× 5 min 後に上清を取り除き，バッファを加えて再度遠心分離を行い，上清を取り除いた後にバッファを 4.5 ml 加えて懸濁液を作製した．細胞濃度は 1.01 × 10 cells/ml とした．
6

自作細胞追跡プログラムを用いて COF 測定の精度を確認

静電気学会誌48巻1号.indb4

図 4 実験装置概要
Fig.4 Schematic of experimental apparatus system.

2024/01/25

10:43:38周波数変調誘電泳動におけるクロスオーバー周波数と腫瘍細胞ミトコンドリア膜電位の関係（張 晴ら）

5を CCD カメラにより撮影した．保存した動画ファイルをを保存して，蛍光視野で同一細胞の画像を取得した．保存細胞追跡プログラムにより，細胞の位置 - 時間情報を取得した動画ファイルを物体追跡プログラムに読み込み，COFし，COF を導出した．一細胞ごとに約 20 回の COF を取得

値を導出した．そして，ミトコンドリア膜電位 ∆Ψm の測し，平均値および標準偏差を求めた．印加電圧が 8 Vpp，定において，同一細胞の蛍光強度を保存した tif ファイルを

FM 周波数 fm はすべて 0.5 kHz と設定し，FM 信号中心周ImageJ

波数 fc が 80，120，300 kHz の場合，その偏差 fd をそれぞ

蛍光部分のピクセル数を分離した．対象細胞に対して関心

れ 40，60，180 kHz として印加した．

領域（ ROI ）で囲み，蛍光強度を算出した（図 5）．

で解析した．解析は，大津の二値化により背景と

23）

3.2.2 アポトーシス細胞の∆ΨmによるCOF測定
本実験は蛍光観察機能を持つ倒立顕微鏡（ Eclipse Ts2，4．実験結果

Nikon, Tokyo, Japan ），CCD カメラ（ FLOYD-4K, Sony, Tokyo,

4.1 FM信号印加時の細胞挙動

Japan ）
，電極間隔 150 µm の無色透明 ITO 材質の平行平板

FM 信号による細胞の周期的な挙動を観察し，細胞の挙DEP デバイス，ファンクションジェネレータ，1 mL シリ

動軌跡から得られた正の誘電泳動時間から COF を算出しンジで構成されている．

た．電極内の細胞挙動から時間 - 位置情報を図 6 に示す．

実験手順は節 3.1.2 のサンプル 2 mL を DEP デバイスに細胞軌跡の極大値は約 2 秒ごとに現れ，変調周期（1/fm ）流し，FM 信号を印加する．FM 変調中心周波数 fc は 110～と一致したため，FM-DEP による細胞挙動と判断された．

270 kHz の間を手動で調整して，明視野で細胞挙動の動画

4.2 バッファの導電率別の細胞COF測定結果
図 7 のように，バッファ導電率を 200，300，800 µS/cm とした COF 測定値はそれぞれ 82.27± 4.37（5.3％），119.03±

図 5 ImageJ による ∆Ψm の解析手順
Fig.5 Analysis procedure of ∆Ψm by ImageJ.

図 6 電極内細胞挙動軌跡の位置 - 時間特性
Fig.6 Trajectory of cell behavior between the electrodes.

静電気学会誌48巻1号.indb

5

図 7 バッファ導電率別の COF 値バッファ導電率
Fig.7 COF values by buffer conductivity.
（ a ）200 µS/cm,（ b ）300 µS/cm, and（ c ）800 µS/cm.

2024/01/25

10:43:38

静電気学会誌 第48巻 第 1 号（2024）

6

図 8 バッファ導電率別の COF 値正規分布
Fig.8 Normal distribution of COF values according to bufferconductivity.

図 9 ∆Ψm の時間変化
Fig.9 Time variation of ∆Ψm fluorescence.

2.66（2.2％），295.12± 15.31（5.2％）kHz であった．これらは，
図 1 に示す Re［ K（ω ）］計算から得られた COF の理論値である 79.25，117.70，308.14 kHz とほぼ一致した．
バッファ導電率別の COF の測定結果を正規分布として
図 8 に示す．バッファの導電率の増加に伴い，COF が増加すること，300 µS/cm において最も標準偏差が少なく，測定精度が高いことが分かった．本実験装置を用いた場合，300 µS/cm が最も標準偏差が小さくなったため，以降の実
験では 300 µS/cm の導電率を採用した．

4.3 アポトーシス後期のCOF測定結果
アポトーシス誘導薬剤を使用したアポトース後期の細胞に 対 し て FM-DEP による COF の計測実験 を 行 っ た．50
µM FCCP（脱共役剤）を生存率 9 割以上の細胞懸濁液に添

図 10 ∆Ψm 蛍光強度と COF の関係
Fig.10 Correlation of ∆Ψm fluorescence and COF.

加することで，48 時間直接作用させた．脱共役剤とは，生わずかに減少し，20 分から 70 分間に著しく減少した．従物の酸化的リン酸化において，電子伝達系および ATP 合って，ラプチナール刺激によりアポトーシス誘導時の ∆Ψm成反応のいずれも阻害せずに両反応の共役を阻害する化合をコントロールと比較し，著しい低下が観察された．

物である．その結果，AnnexinV と PI 染色により，およそ9 割の細胞がアポトーシス後期であることが判明した．

図 10 にアポトーシス誘導薬剤ラプチナールを作用した 2時間の間に 70 個の細胞の ∆Ψm および COF を測定した結果

一方，FM-DEP による細胞のホッピング挙動は観察されを示す．正常状態の Jurkat 細胞の COF 理論値は 117.70 kHzなかった．つまり，アポトーシス後期において COF を測であり，その時の ∆Ψm を基準とした．∆Ψm は約 60％まで低定することは困難であることが分かった．

下し，COF 値は約 78 ％まで増加した．∆Ψm の低下に反比例4.4 アポトーシス初期∆ΨmとCOFの関係するように COF 値が上昇した．そのため，初期アポトーシ

薬剤によるアポトーシス後期の COF の測定はできないスが誘導されることで，COF 値は上昇することが示された．

ことが判明したため，薬剤によるアポトーシス初期の ∆Ψm5．考察と COF の測定実験のみを行った．
2.5 節に述べたように，ミトコンドリア膜電位 ∆Ψm の低腫瘍細胞 Jurkat のアポトーシスによって，細胞膜の構造下が細胞のアポトーシス初期の特徴である ．蛍光の経過が変化し，原形質膜の外側の表面電荷の変化が引き起こさ時間による変化を図 9 に示す．最初にラプチナール 15 µM

れると ，細胞膜静電容量 Cmem および細胞質導電率 σint のと薬剤刺激なしのコントロール細胞を MT-1 で染色し，経電気特性が変化し ，COF が変化したことが考えられる．

時変化による ∆Ψm の変化を確認した．結果としては，コ測定したアポトーシス細胞の COF は正常状態と比較して増ントロールの ∆Ψm は緩やかに減少し，130 分後に 73.9％だ

加したので，Cmem および σint は減少したと考えられる ．細ったが，ラプチナール作用により，20 分後までは ∆Ψm が胞膜の構造が破壊される場合，細胞内イオンがバッファ中17）

静電気学会誌48巻1号.indb

624）

25）

26）

2024/01/25

10:43:38周波数変調誘電泳動におけるクロスオーバー周波数と腫瘍細胞ミトコンドリア膜電位の関係（張 晴ら）に流出し，COF が非常に高くなることで，COF 測定ができないことが知られる ．アポトーシス後期においても細胞膜の26）構造が破壊されて，細胞内部の導電率がバッファに近づくため，誘電泳動力が働かなくなり COF が測定できなくなったと考えられる．ラプチナールによるアポトーシス細胞死がAnnexinV と PI で確認された一方，ミトコンドリア膜電位∆Ψm の低下も一連のアポトーシス細胞死に関連していると考えられる．しかし，これを断定するためには，蛍光観察における細胞への断続的な励起光の照射による細胞ダメージおよび蛍光色素の退色の可能性を否定する必要があり，今後，∆Ψm蛍光強度の測定結果に対する影響を評価する必要がある．

6．おわりに
本報告では，FM 信号を用いた誘電泳動において Jurkat 細胞のバッファ導電率により COF 測定精度が影響を受けることが示された．細胞追跡プログラムによる細胞挙動の検出，および COF の算出の自動化により，手動計測と比較して高速処理が可能なシステムを開発した．アポトーシス誘導薬剤によりミトコンドリア膜電位 ∆Ψm は低下し，COF 値は増加した．
これら 2 つの現象には強い相関があることを示した．一方で，アポトーシス後期の細胞の COF を測定することができないと判明した．以上の事実により，FM 信号を用いた誘電泳動は，腫瘍細胞のアポトーシス初期において，個別の COF 値から細胞の生理状態を検出できる可能性があると結論付ける．
謝辞
ご助言を頂いた脇坂嘉一氏，円城寺隆治氏に感謝する．
また本研究は JSPS 科研費 JP23H03765, JP21H01317 の助成を受けた．
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