J. Inst. Electrostat. Jpn.

静電気学会誌，36, 1 (2012) 37-42

投げ込み式水中バブル-パルス放電装置の殺菌特性
谷野 孝徳＊，柳沢 美貴＊，大嶋 孝之＊,1（2011 年 9 月 12 日受付; 2011 年 12 月 27 日受理）

Investigation of Microbial Inactivation Profile by Submerged Style
Pulse Discharge System in Bubble Water
Takanori TANINO,* Miki YANAGISAWA,* Takayuki OHSHIMA*,1,(Received September 12, 2011; Accepted December 27, 2011)

Inactivation profiles of microorganisms by submerged style pulse discharge system in bubble water were investigated.
The survival ratio of 2 L Escherichia coli suspension with the cell density of 107 viable cells per milliliter wasdecreased to 1.1×10-4 by the pulsed discharge system in bubble water within relatively short time 120 seconds. The
discharge plasma frequency increased with air flow rate and gas species used for bubble formation affected on theinactivation efficiency of E. coli suspension. Investigation with L-histidin as the radical scavenger demonstrated thatradicals generated by the discharge plasma was only one of the important factor of inactivation mechanism. And
inactivation efficiency was strongly affected by the initial cell density. The spore of Bacillus subtilis was also
inactivated by pulsed discharge system in bubble water. Although, inactivation of B. subtilis spore required longer
treatment time than that of E. coli, the survival ratio of 2 L suspension with the cell density of 107 viable cells per
milliliter was decreased to 2.2×10-3 within 60 minutes treatment. And B. subtilis spore inactivation efficiency wasalso strongly affected by the initial cell density.

1.

はじめにめの手法の一つとして，放電発生プラズマ発生のトリガー

近年，水中での放電プラズマ発生技術は水系に含まれるとなるバブルを水中へ積極的に混合する手法が検討されて有機物の分解，ならびに微生物の殺菌を可能とする新たないる．筆者らもマイクロバブルを用いて放電プラズマを発技術の一つとして多岐に渡る分野から注目されている．特生させタンパク質 11)，界面活性剤 12)の分解においてその有に排水処理分野においては，水中での放電プラズマの発生効性を報告している．しかしながら，筆者らの報告を含むに伴い放電チャンネルから生成される酸化力の高い様々な多くの研究報告においては電極構造または装置構造が複雑

活性種1-6)に加え，同時に発生する紫外線，衝撃波を相乗的であるため，連続運転ならびにメンテナンスを行うためにに利用することで効率の高い AOTs (Advanced Oxidationは多大な労力が必要となってしまう．また，電極構造体あTechnologies)としての利用が注目されている．しかしながるいは装置内に処理水を循環させる必要がある．

ら，空気中での絶縁破壊電圧は 30 kV/cm であるのに対し，筆者らはこの問題点を解決するための一つの手法とし水中での絶縁破壊電圧は 1 MV/cm 以上とされ非常に高いて，シンプルな電極構造の作製を試みている．その一例とため，水中で安定した放電プラズマを発生させることは困してアース電極としたらせん状ワイヤーと，その中心を通難である．水中での放電プラズマ発生メカニズムとしてはる高電圧電極としたねじからなる電極に，バブル発生用エ

いくつかの説があるが，高電界による水の分解によって生アストーンを組み合わせた単純な構造の放電ユニットを作じるバブルが発生のトリガーとなって放電プラズマが発生

成しこの放電特性を報告している 13)．本放電ユニットはユしているとするバブル説 7-10)が最も有力視されている．そニット自体を処理対象溶液だまりに「投げ込む」ことが可こで，水中で容易に安定した放電プラズマを発生させるた能であり，処理対象溶液の装置内への輸送の必要がなく in

キーワード：パルス電圧，水中放電プラズマ，殺菌，大腸菌，芽胞* 群馬大学大学院工学研究科環境プロセス工学専攻（376-8515 群馬県桐生市天神町 1-5-1）
Departmentof
ChemicalandEnvironmental
Engineering, Graduated School of Engineering, Gunma
University, 1-5-1, Tenjin-cho, Kiryu city, Gunma,376-8515, Japan1
tohshima@cee.gunma-u.ac.jp

situ での AOTs 処理が行えるという利点を有している．本
報告では，in situ での AOTs 処理と同時に微生物殺菌も可能であると考え，投げ込み式放電ユニットを用いた放電プ
ラズマによる溶液だまり中に含まれる微生物に対する殺菌特性について検討したので報告する．

38

静電気学会誌

2.
2.1

第 36 巻実験方法・手順

第 1 号 (2012)

リングを行い生理食塩水により適当に希釈した後，大腸菌高電圧パルス発生装置および放電ユニット
12, 13)

は LB 寒天培地に，枯草菌胞子は枯草菌用寒天培地に植菌と同じ装置を用い，ピ後，37℃で 20 h インキュベートした．寒天プレート上に形ーク電圧 20 kV，周波数 333Hz にて操作を行った．放電ユ成されたコロニー数をカウントすることで生菌数を求め，ニットに関しても前報で報告したらせん状にした 1 mmのこれを処理前の生菌数で除することで生菌率を求めた．まステンレスワイヤーをアース電極とし，この中心に高電圧た，放電により発生するラジカルの殺菌への関与を調べる電極とした 3 mmのステンレスねじ，直下にエアストーン

ためには，ラジカルスカベンジャーとして L-ヒスチジンをが配置されるよう 5×5 mm のアクリル角棒で固定するこ用い菌液試料中に所定の濃度となるように添加した．

高電圧パルス発生装置は前報とで作製した投げ込み放電ユニット
2.213)を用いた（図 1）．

殺液試料の調整殺菌試験対象として大腸菌（Escherichia coli K-12 株）と枯草菌（Bacillus subtilis NBRC 3007）芽胞を用いた．大3.

実験結果および考察

3.1

投げ込み式放電ユニットを用いた水中放電プラズマによる大腸菌の殺菌

腸菌は LB 培地（ペプトン 1% (w/v)，酵母エキス 0.5%，

投げ込み式電極ユニットを用いて水中放電プラズマをNaCl 1%，寒天培地として用いる場合には上記に加え寒天発生させた際の電圧・電流波形を図 2 に示す．1 回の放電末 1.5%）を用い 35℃で一晩培養した後，遠心分離（5,000プラズマで消費されるエネルギーは 0.282J であった．

×g，10 min）により培養液から分離した．枯草菌芽胞は枯

投げ込み式放電ユニットを用いた水中放電プラズマに草菌を枯草菌用寒天培地（ペプトン 1%，酵母エキス 0.2%，よる試料だまり中の大腸菌への殺菌効果を確認した（図 3）．

MgSO4・7H20 0.1%，寒天末 1.5%）に植菌後，室温にて一試験条件は菌液試料の初発大腸菌濃度 107 viable cells/ml，週間インキュベートすることで形成させた．芽胞を形成しエアー流量 4 L/min にて行った．

た枯草菌を滅菌蒸留水に懸濁し，90℃で 15 min 処理することで栄養細胞を死滅させたものを枯草菌芽胞として用いた．
大腸菌ならびに枯草菌芽胞共に，実験目的ごとに所定の菌体濃度となるよう滅菌蒸留水に再懸濁し，水中放電プラズ
マ殺菌試験に用いる菌液試料とした．
2.3

放電プラズマによる殺菌試験

100 mm×300 mm のアクリル円筒容器に菌液試料 2 L と投げ込み式放電ユニットを投入し，パルス電界の印加とバブルを発生させるためのエアーを吹きこみ放電プラズマを発生させることによる殺菌試験を行った．経時的にサンプ
図 2 放電プラズマ発生時の電圧（A）・電流（B）波形
Fig. 2 Voltage (A) and current (B) waveforms of discharged
plasma.

図 1 投げ込み式放電ユニットの概略図（A）と水中にセットした写真（B）
Fig. 1 Schematics of submerged style discharge plasma unit (A), andphotograph of experimental setup (B).

図 3 水中放電プラズマによる大腸菌の殺菌
Fig. 3 Time courses of E. coli inactivation by discharged plasma
in water.

39

投げ込み式水中バブル-パルス放電装置の殺菌特性（谷野孝徳ら）-4

投げ込み式放電ユニットを用い 2 L の大腸菌試料溶液だに対し，エアー流量 4 L/min では 1.1×10 であり，エアーまり中で放電プラズマを発生させることで，処理時間の経流量の増大に伴い生菌率の減少が確認された．この際，放過と共に菌液試料中の大腸菌生菌数が減少することが確認

電頻度はエアー流量 2，4 L/min でそれぞれおよそ 50，150された．2 L の容量を有する大腸菌試料溶液に対し 120 sec回/s であり，殺菌効果の向上は水中放電プラズマの発生頻の比較的短い処理時間で約 4 桁の生菌率の減少が確認され度の向上に起因するものであると考えられる．しかしながた．電界を印加せずにエアーのみをバブルとして大腸菌試

らエアー流量 6 L/min では，放電頻度はおよそ 190 回/s と料溶液中に通気した場合では生菌数の減少は確認されなか

エアー流量 4 L/min の場合に比べ増加しているにも関わらった．また，エアーの通気を行わず電界のみを印加した場

ず，120 min 後の大腸菌生菌率は 4.9×10-5 とわずかに向上

合では，わずかながら生菌率の減少が確認された．これはしたのみであった．これは前報にてインジゴカルミンおよ

本実験で用いている電源が高電圧パルス発生装置であるたびアルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムの分解を行った

め，電極間に生じたパルス状高電界による大腸菌細胞膜の場合にも見られた傾向である 13)．大腸菌の殺菌においても損傷に起因する殺菌効果であると考えられる．以上の結果

処理対象物の電極近傍に発生し処理槽体積と比較して小規より，投げ込み式放電ユニットを用い水中で放電プラズマ模である放電プラズマ反応場への拡散が律速になっているを発生させることによりエアーの通気のみ，あるいは電界ことを示唆している．以上の結果よりエアー流量 4 L/minの印加のみでは得られない比較的短い処理時間での高い殺として以降の実験を行った．
3.3菌効果が得られることが示された．
3.2

放電プラズマを発生させるためのエアー流量が大腸菌の殺菌に与える影響

放電プラズマ発生に用いるガス種が大腸菌の殺菌に与える影響
放電プラズマ発生のトリガーとなるバブルのガス種が大本研究で用いている投げ込み式放電ユニットにより発生させる水中放電プラズマはバブルの電極への接触をトリガ

腸菌の殺菌に及ぼす影響をガス流量 4 L/min，初発大腸菌濃．
度 107 viable cells/ml にて調べた（図 5）ーとして発生し，その放電頻度はエアー流量ならびに試料バブルのガス種としてアルゴン，酸素を用いることで空溶液の導電率により変化することが明らかとなっており，気を用いていた場合に比べ殺菌効果の向上が確認された．

発生頻度を近似式にて計算可能であることが示されている

この理由として，酸素を用いた場合には空気を用いた場合

13)．そこでエアー流量の変化による水中放電プラズマ発生に比べ雰囲気中の酸素分子が増大することで OH ラジカル7

頻度が大腸菌の殺菌に及ぼす影響を初発大腸菌濃度 10の生成量が増えたためではないかと考えられる．またオゾviable cells/ml にて調べた（図 4）．この際，パルス周波数はンの発生量も増えていると考えられ，この殺菌効果も大き一定であるが，放電頻度はエアー流量により異なるため投いものと考えられる．アルゴンを用いた場合には空気を用入エネルギーは厳密には一定ではない．

いた場合に比べわずかに殺菌効率が上昇している．これは水中放電プラズマ処理 120 sec 後の試料だまり中の大腸-2

菌生菌率は，エアー流量 2 L/min では 2.2×10 であったの

空気や酸素の場合より激しく水中放電プラズマが発生していたため，OH ラジカルをはじめとする反応性の高い種々のラジカルや分子の生成量の増加，ならびに放電プラズマ

図 4 エアー流量が大腸菌の殺菌に与える影響

図 5 ガス種が大腸菌の殺菌に与える影響

Fig. 4 Effect of air flow rate on time course of E. coli inactivation

Fig. 5 Effect of gas species on E. coli inactivation by discharged

by discharged plasma in water.

plasma in water.

40

静電気学会誌

第 36 巻

第 1 号 (2012)

図 6 ラジカルスカベンジャーが大腸菌の殺菌に与える影響
Fig. 6

Effect of radical scavenger (L-histidine) on E. coli

inactivation by discharged plasma in water.

図 7 初発大腸菌濃度が大腸菌の殺菌に与える影響
Fig. 7 Effect of initial cell concentration on E. coli inactivation

反応場の拡大によりラジカルや分子が大腸菌と接触しやすby discharged plasma in water.

くなり反応性の増大が生じたためと推測される．
3.4

大腸菌の殺菌におけるラジカルの影響

水中放電プラズマによる大腸菌の殺菌メカニズムにおい4.2×10-2，4.5×10-2 /sec であり，死滅速度定数の面からも殺菌効率が減少していることが確認された．てラジカルが大きく関与している可能性が示唆されるため，また L-ヒスチジン濃度が 100-150 mM 付近で熱死滅速度

ラジカルスカベンジャーを用い発生するラジカルをクエン定数の低下は頭打ちとなっていることがわかり，全てのラチングすることによる大腸菌殺菌効果の変化を調べた．ラジカルが大腸菌と反応する前に L-ヒスチジンにクエンチンジカルスカベンジャーとして特定のラジカルではなく種々グされるものとは考えられないことを考慮すると，ラジカのラジカルへのクエンチング能が期待できる L-ヒスチジンルの関与による殺菌の割合は最低 42%程度である．これら

7を用いた．初発大腸菌濃度 10 viable cells/ml の条件にて，の結果から水中放電プラズマで発生するラジカルは殺菌に菌液試料中へ L-ヒスチジンを様々な濃度となるよう添加し，おいて重要な役割を果たしているが，ラジカルが殺菌メカ

ガス流量 4 L/min で水中放電プラズマを発生させ 120 sec のニズムの全てではないことが示された．

処理を行った（図 6）．

3.5

大腸菌の殺菌における初発大腸菌濃度の影響

L-ヒスチジンを菌液試料中に加えることにより大腸菌の菌液試料中の初発大腸菌濃度が水中放電プラズマによ殺菌効果の減少が確認された．この時，L-ヒスチジンを加る殺菌に及ぼす影響を調べるため，初発大腸菌濃度が 105，えることによる菌液試料の導電率変化は微小であり，硫酸

106，107，108 viable cells/ml となるように菌液試料を調整し，アンモニウムを用いて同じ導電率に調整した場合には殺菌放電プラズマ処理を行った（図 7）．

効果の減少は確認されなかった（data not shown）．L-ヒスチ

この際導電率の変化は微小であり放電頻度の変化は確認

ジン添加量の増加に伴い大腸菌の殺菌効果の減少が確認さされなかったが，初発菌体濃度の違いにより殺菌効率に大れ， L-ヒスチジンにより放電プラズマによって発生するラきな違いが確認された．初発大腸菌濃度が低い場合では高ジカルがクエンチングされることで殺菌効果が減少していい殺菌効率が確認されたが，初発大腸菌濃度が高い場合でることが示された．各ヒスチジン濃度を添加した試料菌液は殺菌効率は低くなった．具体的には，初発大腸菌濃度 105における大腸菌の死滅速度定数を式（1）を用い求めた．

では 100 sec 処理後には大腸菌の生存は確認されず滅菌さ

1NK   lntN0

れたものと考えられ，106 では 120 sec 処理後には大腸菌の（1）生菌率は 2.5×10-6 であった．一方で初発大腸菌濃度が 108の場合では殺菌効率の著しい低下が確認され，120 sec 処理

ここで N0：初発生菌数，N：処理後の生菌数，t：処理時後の大腸菌生菌率は 3.5×10-1 となり一桁の殺菌も確認さ間である．L-ヒスチジン濃度 0, 5, 50, 100, 150 mM においてれなかった．これらを（1）式を用いて求めた熱死滅速度定

死滅速度定数はそれぞれ 7.7×10-2，7.1×10-2，5.8×10-2，数で表すと初発大腸菌濃度 105，106，107，108 においてそ投げ込み式水中バブル-パルス放電装置の殺菌特性（谷野孝徳ら）-1-1-2-341

れぞれ 1.7×10 ，1.1×10 ，7.7×10 ，8.7×10 /sec と明確における殺菌メカニズムは確定できないが，本研究でこれに死滅速度が減少していることがわかる．以上の結果よりまでに示してきた実験データは上記メカニズム解析におい水中放電プラズマを用いた殺菌では初発大腸菌濃度が殺菌て非常に有益な情報となるものと考える．

効率に大きな影響を及ぼし，初発大腸菌濃度の上昇に伴い殺菌効率は低下してしまうことが明らかとなった．

3.6

投げ込み式放電ユニットを用いた水中放電プラズマによる枯草菌芽胞の殺菌

水中放電プラズマによる殺菌メカニズムとして考え

枯草菌は生育環境の栄養状態不良時に非常に強固な構造られる一つの可能性としては，放電プラズマ反応場に存を有する芽胞を形成する．芽胞は栄養細胞に比べ種々のス在する大腸菌が加熱殺菌と同様に一定の割合で殺菌さトレスに対し非常に高い耐性を示し 14)，芽胞発芽に関するれる可能性である．しかしながら，上記に示したように様々な研究 15, 16)がなされているがメカニズムは完全には解初発大腸菌濃度に依存して殺菌効率に変化が生じてい明されていない．このため枯草菌胞子は殺菌を行うことがることから，このメカニズムに従い殺菌されている可能最も難しい微生物の一つに挙げられる．

性は否定される．つまり従来の加熱殺菌とは異なる説明が必要となる．
殺菌メカニズムとして考えられる別の可能性としては一水中放電プラズマにより大腸菌は容易に殺菌可能であったので，殺菌が難しいとされる枯草菌芽胞に対して殺菌作用を示すことができるかを調べた（図 9）．

度の放電で一定数の殺菌効果を有するファクターが発生し，試験条件は菌液試料の初発芽胞濃度 107 viable cells/ml，その発生数に依存した殺菌がなされている可能性である．

エアー流量 4 L/min にて 2 L の芽胞溶液試料に対し処理をこの可能性は最も現実的であると考えられるが，図 8 に示行った．大腸菌を殺菌対象とした場合とは異なり，エアーすように初発大腸菌濃度によらず死菌数は一定というわけ

を通気しない電界効果のみでは生菌数の減少はほぼ確認さではなく単純にこの可能性を当てはめることは出来ない．

れなかった．これは芽胞が強固な細胞構造を有しているた

殺菌効果を有するファクターとしては酸化力の高いラジカ

め，パルス状高電界による細胞膜損傷に起因した殺菌効果

ル，紫外線，衝撃波を挙げることができる．これらのファが発現しなかったためであると考えられる．水中放電プラ

クターと大腸菌とのアクセシビリティを考慮した大腸菌殺ズマを発生させた場合では，大腸菌を対象とした場合と異菌メカニズムの構築が必要となる．言い換えるならば，水なり殺菌効果を確認するためには分単位の処理時間か必要中における酸化力の高いラジカルについてはその寿命を，ではあるが，処理時間の経過に伴う生菌率の減少が確認さ

紫外線・衝撃波については伝達に伴う減衰とシャドウエフれた．具体的には 10-2 の殺菌率を達成するために大腸菌でェクトを大腸菌の流動状態・拡散と組み合わせたシミュレ

はおよそ 60 sec 必要であったのに対し（図 3），枯草菌芽胞ーションモデルを in silico にて構築し，本報告で示す実際ではおよそ 40 min 必要であった．枯草菌芽胞殺菌におけるの実験データとの照合により優位性を立証することではじ死滅速度定数は 1.7×10-3 /sec であり，大腸菌殺菌と比べ 45めてメカニズムの解明が可能になる．現時点で本システム

分の 1 であった．殺菌に時間を要する原因としては，芽胞細胞の強固な構造に加え，芽胞細胞調整時に熱殺菌した栄養細胞の残骸がラジカルスカベンジャー様効果をもたらしていると推測される．以上の結果より，投げ込み式放電ユ

図 8 各初発大腸菌濃度における大腸菌の死菌数
Fig. 8 Time course of total inactivated cell number in E.
coli inactivation by discharged plasma in water.

図 9 水中放電プラズマによる枯草菌芽胞の殺菌
Fig. 9 Time courses of B. subtilis spore inactivation by discharged
plasma in water.

42

静電気学会誌

第 36 巻

第 1 号 (2012)
った．これらの中でも初発菌体濃度は殺菌効果に大きな影響を与えることが明らかとなった．

(3)

ラジカルスカベンジャーを用いた実験結果から，ラジカルの関与による大腸菌の殺菌割合は最低 42%程度であった．水中放電プラズマで発生するラジカルは殺菌において重要な役割を果たしているが，ラジカルが殺菌メカニズムの全てではないことが示された．

(4)

大腸菌に比べ長時間の処理時間が必要となるが，投げ込み式放電ユニットによる放電プラズマにより枯草菌芽胞が殺菌可能であることが示された．また大腸菌の場合と同様に，初発芽胞濃度が殺菌効率に大きな影響を与えることが明らかとなった．

本研究の一部は科学研究費補助金、基盤研究 C
図 10 初発芽胞濃度が殺菌に与える影響（22510082）を受けて行われたものであり、深く感謝いた

Fig. 10 Effect of initial cell concentration on time course of B.

します。

subtilis spore inactivation by discharged plasma in water.

ニットを用い水中で放電プラズマを発生させることで枯草菌芽胞も殺菌可能であることが示された．
3.7

枯草菌芽胞の殺菌における初発芽胞濃度の影響

大腸菌を殺菌対象とした場合に確認された初発菌体濃度の殺菌効果に及ぼす影響について，枯草菌芽胞を殺菌対象とした場合についても調べた．初発芽胞濃度が 105，106，107 viable cells/ml となるように芽胞溶液試料を調整し水中放電プラズマ処理を行った（図 10）．
60 min 処理後の生菌率は初発芽胞濃度 105，106，107 viable
cells/ml においてそれぞれ 2.3×10-4，4.9×10-4，2.2×10-3 であり，枯草菌芽胞を殺菌対象とした場合においても初発芽胞濃度の違いにより殺菌効果の差が確認された．大腸菌を対象とした場合と同様に，メカニズムの解明には種々のファクターの考慮が必要であると推測される．
本研究では投げ込み式放電ユニットを用いた放電プラズ
マによる AOTs のアプリケーションとして殺菌に使用可能であることを実証した．病原性微生物や医療排水の in situでの殺菌へと応用可能であると考えられる．
4.

結言

投げ込み式放電ユニットを用いた in situ での試料だまりへの殺菌処理を行い，以下の結果を得た．
(1)

投げ込み式放電ユニットによる放電プラズマにより大腸菌が殺菌可能であり，比較的短時間で高い殺菌効果が得られた．

(2)

大腸菌の殺菌効果はエアー流量に起因した放電頻度，ガス種，初発菌体濃度により影響をうけることがわか

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