茨城県工業技術センター研究報告第 19 号

多酸性酵母の育種（第 2 報）
一細胞融合のための菌株調整一
郡司章＊ 長谷川裕正＊

市川 重和＊ 遠城

聰＊

1．緒 言
果実酒製造において，各種の原料果実に適合した酵母の育種を目指し，前報１）では酸の少ない原料で仕込む果実酒の香味改善のために多酸性酵母の分離および性質について検討した。しかし，分離選択した酵母は発酵能や香りの点で醸造用としては不十分であった。そこで分離した冬酸性酵母と優良フイン酵母との融合を試みるため半数体化および栄養要求マーカーの付与にっいて検討したので報告する。

2．実験方法2．1 使用菌株
ワイン酵母Ｓassharomyces cerevisiaeＮｏ．71B，多酸性酵母Ｎ0．473，接合型の標凖株として
Ｓaccharo~myces cerevisiaeC4414−4A(5095)(a),Ｓaccharomyces cerevisiaeC5076−2D(α)を使用した。

2．2 使用培地
表 1 に示した培地を使用した。
2．3 胞子の形成法
供試菌株を胞子形成培地に塗布し，25℃，ｌ0 日間培養した。胞子は検鏡にて確認した。
2．4 加熱処理２）および色素培地併用による半数体株の分離法
胞子形成培地より一白金耳量の子索胞子を含む菌体を釣菌し，滅菌水 2ｍ1 に懸濁する。これを 55℃，10 分間湯浴中に浸した後，10 分間の超音波処理により子栞胞子を分散させ適当に希釈して色素培地上に塗布した。生じたコロニーから親株と色調の異なるものを採取した。純化後，胞子形成培地で胞子を形成しないで，しかもＴＴＣ培地上で染色されない株を単離した。
2．5 接合型の判定法
加熱処理で取得した菌株と接合型標準株を混合培養し，適当に希釈して色素培地上に塗布し，色調の異なるコロニーが出現することにより判定した。
2．6 アルコールおよび乳酸耐性試験法
完全培地にアルコールおよび乳酸を各々段階的に加え，全体容量を 5mI としたものに供試菌体を等量加え 25℃，14 日間静置培養した。検体懸濁液の濁度 (OD660nm) が 0．100 以下のときを生育限界とした。

＊食品発酵部＊＊陶々酒製造㈱千代田工場−75−

茨城県工業技術センター研究報告第 19 号

−76−

茨城県工業技術センター研究報告第 19 号

2．7 変異処理法
ＹＰＤ培地で培養した対数増殖期の細胞を 3％エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）を含む 0．ｌＭリン酸緩衝液（ＰＨ7）中で 30℃，設定処理時間静置し，5％チオ硫酸ナトリウムで 1 回，滅菌生理食塩水で 2 回洗浄後，希釈しＳＤ平板培地に塗布し 25℃，7 日間培養した。
2．8 リジンおよびウラシル要求性変異株の分離法 3），4），5）
変異処理した細胞をＡＡまたはＦＯＡ平板培地に塗布し，25℃で 7 日間培養し，コロニーを単離後，ＳＤ培地で生育せず，リジンまたはウラシル添加ＳＤ平板培地で生育可能な株をそれぞれリジンおよびウラシル要求性株として選択した。
2．9 小仕込み試験
凍結保存したナシ果汁にグルコースを加えＢｒｉｘ22℃にし，25℃に静置し発酵を行った。
2．10 成分分析法
一般成分は国税庁所定分析法 6｝，有機酸類は酵素法（べーリンガー・マンハイム社製Ｆ−キット）にて行った。

3．実験結果およぴ考察
3．1 胞子形成および半数体株の分離
Saccharomyces cerevisiae No.71B 株は 4 胞子の形成を確認したが，多酸性酵母Ｎo.473 の胞子形成は認められなかった。そこで，半数体株の分離はＮ0．71Ｂ株について行った。加熱処理条件下で栄養細胞の生存率は 0．3％になった。同条件下で胞子形成菌体の生存率は 7．2％であった。色素培地上で供試菌体と色調が異なり，かっ小コロニーの 35 株を釣菌し，胞子形成培地およびＴＴＣ染色にて 6 株を選別した。
3．2 接合型の判定
選別菌株と接合標準株の交雑でａ型株と接合コロニーを認めたもの 5 株，α型株とは 1 株であった。
以上の結果より Saccharomyces cerevisiae No.71B 株は heterothallic 株と判定した 7）。
得られた 6 株の生理的性質を調べているなかで，トリプトファンを要求するものが 3 株あり，これらはいずれもα型であった。ａ型を示した 1 株はＹＰＤ培地では生育するが wickerham 合成培地ではコロニー形成がみられず要求物質は判明していない（表 2）。

ー77ー茨城県工業技術センター研究報告第 19 号

色素培地による倍数体の確認は Ssccharomycodes ludwigii およびパン酵母で調べられている 8）。今回醸造用酵母でも有効であることが確認できた（図 1）。また，接合能の確認にも活用でき，従来の検鏡による方法より確実性や処理能に優れていた。ただし，色素培地によるクローンの識別効果は供試菌により大きな差異があり，有効な培地組成や色素の組み合わせとその含量はそのつど検討する必要がある。

−78−

茨城県工業技術センター研究報告第 19 号

3．3 アルコール・乳酸耐性ナシ果汁の発酵試験において，No.473 株は No.71B 株に比べ酸度で倍以上の値を示し，その内の大部分は乳酸であった。 No.71B 株は乳酸を産生しなかった（表 3）。清酒酵母についてのアルコールと乳酸の耐性についての解説 9）を參考にして試験したところ,アルコール耐性は No.71B 株で 13％，No.71B-h-32 株と No.473 株は 10％であった。乳酸耐性は No.71B 株と No.473 株は 1.6％以上を示し，No.71B -h-32 株は1.3％であった。次に乳酸とアルコール共存化での耐性を試験した。Ｎｏ．71Ｂ株は乳酸濃度 0．2〜0．5％の範囲ではアルコール濃度 10％で増殖を制限され，乳酸 0．6〜1．0％，アルコール 3〜9％の範囲では，ほぼ比例して制限されていた。Ｎ0．473 株は乳酸 0．2〜1．2％，アルコール 1〜8％の範囲でほぼ比例して制限されているが，ただアルコール 5〜6％の範囲ではアルコールの方が乳酸よりも強く制限していた。

この事はＮｏ．473 株を使用して発酵試験を行ったときに，アルコール 5．5％，乳酸 0．4％を生産した時点で発酵が終了し，また，アルコールの生成速度が乳酸のそれよりも速くなったこととも合う。
No.71B-h-32 株はアルコール単独耐性に比べて乳酸が共存すると大幅に増殖が抑制される。
No.71B-h-32 株のアルコール生成は親株の No.71B-h32 株と同等であるが乳酸に対する耐性は著しく低くなっていると考えられこれは半数体化することにより膜構造が変化し物質の透過能が変わった 8）ためと思われる（図 2）。
3．4 変異処理およびリジン，ウラシル要求性変異株の分離
実験室株についての栄養要求性株の取得は変−79−茨城県工業技術センター研究報告第 19 号

異処理 nystatin 濃縮，レプリカという一連の操作で得られるが，醸造用酵母については醸造用としての特性を損なうことのないように変異処理も穏やかにする必要がある。そのため変異株出現頻度は低く，取得には多大のの労力を要する。近年清酒酵母についてポジティブセレクシ
ョン法を用いて栄養要求性株を効率よく取得した報告 3），10）があり，この方法を用いてワイン酵母および多酸性酵母に応用した。
まずＥＭＳ処理による各菌の生存率を調査した。Ｎ0．473 株はＮｏ．71Ｂ株より生存率が低かった。また，Ｎｏ．71Ｂ−ｈ−
32 株は 2 時間の処理でしコロニーの発育速度は遅れるが，生存数は変わらなかった。Ｎ
0．71Ｂ−ｈ−21 株では処理時間とともに生存率は低下していた（図 3）。
つぎに，それぞれ菌株の生存率 40〜90％範囲で変異処理を施した菌体をＦＡＯおよびＡＡ培地で選別した。
Ｎｏ．71Ｂ株においては比較的容易に栄養要求性株を得ることが出来たがＮｏ．473 株はポジティフセレクション法を用いても株の出現頻度は低かった（表 4）。

−80−

茨城県工業技術センター研究報告第 19 号得られた変異株を用いてリジンおよびウラシルを添加した小仕込試験を行ったところ，製成酒の一般分析値は親株と比較して差はなかった（表 5）。

参考文献
1）郡司章，長谷川裕正，市川重和，石神靖裕：当所報告第 17 号（1989）
2）飯塚廣，後藤昭二：酵母の分類同定法第二版東京大学出版会（1973）3）小田佳緒子，北本勝ひこ，高橋康次郎，吉沢淑：日本醸造協会誌，83，（9），614（1988）4）北本勝ひこ：日本醸造協会誌，84，（1），34（1989）
5）小田佳緒子，北本勝ひこ，五味勝也，高橋康次郎：日本醸造学会講演要旨集（平成元年度）6（1989）
6）注解編集委員会編：第 3 回改正国税庁所定分析法注解日本醸造協会（1974）
7）秋山裕一編：酵母の利用と開発第二版学会出版センター（1983）8）永井進編：酵母研究における方法論第一版学会出版センター（1982）
9）橋谷義孝編：酵母学第一版岩波書店（1967）
10）小田佳緒子，北本勝ひこ，五味勝也，高橋康次郎：発酵工学会誌，68，（5），339〜403（1990）−81−