Press Release2021 年 4 ⽉ 19 ⽇
横浜市⽴⼤学

筑波⼤学

⼤

阪⼤学

京都⼤

学

東北⼤

学

⽇本医療研究開発機構

タンパク質の抗体ラベリング技術を改良し、構造解析をアシスト〜電⼦顕微鏡や X 線結晶解析による構造決定を加速化〜
横浜市⽴⼤学 ⼤学院⽣命医科学研究科の⽲ 晃和准教授らは、筑波⼤学、⼤阪⼤学蛋⽩質研究所、京都⼤学、東北⼤学との共同研究で、タンパク質に外来の抗原配列を移植して抗体を結合させる技術を開発しました。本技術によって、これまで直接結合する抗体がなかったタンパク質に抗体を結合させることが可能になり、X 線結晶解析*1 や電⼦顕微鏡単粒⼦解析*2で⽴体構造情報が明らかになる可能性があります。
本研究成果は、科学誌「Acta Crystallographica Section D, Structural Biology」に掲載されます。
（英国夏時間 2021 年 4 ⽉ 19 ⽇午前 9 時掲載）
研究成果のポイントl

標的タンパク質の⽴体構造を壊さずに抗原配列を移植し、抗体を結合させてラベリングできる技術を開発した

l抗体ラベリング*3 の適⽤拡⼤で、電⼦顕微鏡や X 線結晶解析による構造決定の可能性も広がった

研究背景
タンパク質の⽴体構造解析は、⽣命現象の解明だけでなく、創薬においても⾮常に重要な研究⼿法です。その解析において、抗体は有⽤な実験ツールとして⽤いられてきました。特にタンパク質の抗体によるラベリングは、X 線結晶解析では、結晶になりにくいタンパク質の結晶化を促進させる効果があり、電⼦顕微鏡解析では、コントラストが低い画像から標的タンパク質を⾒つけ出す⽬印として役⽴ちます。しかしながら、抗体でラベリングを⾏うには、標的タンパク質を直接認識する抗体があることが前提で、適⽤範囲は限られていました。
この課題に対し、⽲准教授らは新たな抗体ラベリング技術の開発に取り組んできました。
これまでに、「PA タグ」と呼ばれる 12 残基のアミノ酸配列を標的タンパク質に移植し、この PA タグと強固に結合する NZ-1 抗体でラベリングする技術を開発しました（図 1）。このPA タグの移植部位を最適化することで、標的タンパク質に NZ-1 抗体が安定に結合することが⽰されましたが、PA タグの移植やその NZ-1 抗体との結合によって標的タンパク質の⼀部の構造が変化してしまうことも明らかになっていました。

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研究内容
そこで今回の研究では、タグの⻑さを伸ばすことで移植した際の標的タンパク質の構造変化を抑えることを試みました。その結果、PA タグの N 末端側にアミノ酸残基を 2 つ付け加えた PA14 タグでは、標的タンパク質を天然の構造に近い状態に維持できることが⽰されました。
標的タンパク質に PA14 タグを移植して X 線結晶解析を⾏ったところ（図 2）、PA14 タグは NZ-1 抗体と結合すると末端同⼠が近づいてリング状の構造をとること（図 3）、そしてNZ-1 抗体が結合しても標的タンパク質の⽴体構造がほとんど壊れないことが確かめられました（図４）。さらに分⼦動⼒学シミュレーション*4 からも、PA14 タグを移植した標的タンパク質の構造が安定に維持されることを確認しました。そして、PA14 タグを細胞膜の中で働くタンパク質に移植し、NZ-1 抗体を結合させて負染⾊電⼦顕微鏡解析*5 を⾏うことで、標的タンパク質の構造情報を取得することにも成功しました（図 5）。
今後の展開
今回の研究から、PA14 タグは標的タンパク質に移植して抗体を結合させるのに適した配列であることが確かめられましたが、その⼀⽅で、標的タンパク質に結合した NZ-1 抗体の向きが完全には固定されず、揺らぐ場合があることも分かりました。今後、標的タンパク質の構造は壊さずに抗体の向きを固定できるようになれば、クライオ電⼦顕微鏡などを⽤いて精密に⽴体構造を調べることが可能になると期待されます。
論⽂情報
タイトル：Moving toward generalizable NZ-1 labeling for 3D structure determination
with optimized epitope tag insertion
著者：Risako Tamura-Sakaguchi, Rie Aruga, Mika Hirose, Toru Ekimoto, Takuya Miyake, Yohei
Hizukuri, Rika Oi, Mika K. Kaneko, Yukinari Kato, Yoshinori Akiyama, Mitsunori Ikeguchi, Kenji
Iwasaki, Terukazu Nogi
掲載雑誌：Acta Crystallographica Section D, Structural Biology
DOI：https://doi.org/10.1107/S2059798321002527
研究費※本研究は、⽇本学術振興会科研費、国⽴研究開発法⼈⽇本医療研究開発機構（AMED）創薬等ライフサイエンス研究⽀援基盤事業（BINDS）、横浜市⽴⼤学 学術的研究推進事業 研究奨励プロジェクトの助成を受けて実施されました。

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お問い合わせ先＜研究成果に関する窓⼝＞
横浜市⽴⼤学 ⼤学院⽣命医科学研究科
准教授 ⽲ 晃和
Tel：045-508-7226 E-mail：nogi@yokohama-cu.ac.jp＜取材対応に関する窓⼝＞
横浜市⽴⼤学 広報室担当課⻑ 上村 ⼀太郎
Tel：045-787-2414 E-mail：koho@ yokohama-cu.ac.jp
筑波⼤学 広報室 報道担当
Tel：029-853-2040
京都⼤学 国際広報室
Tel：075-753-5727 Fax：075-753-2094
E-mail：comms@mail2.adm.kyoto-u.ac.jp
⼤阪⼤学 蛋⽩質研究所 広報室
E-mail：kouhou@protein.osaka-u.ac.jp
東北⼤学 ⼤学院医学系研究科・医学部広報室
Tel：022-717-8032 E-mail：press@pr.med.tohoku.ac.jp＜AMED事業に関すること＞
国⽴研究開発法⼈⽇本医療研究開発機構（AMED）
創薬等ライフサイエンス研究⽀援基盤事業（BINDS）
創薬事業部 医薬品研究開発課
Tel：03-6870-2219 E-mail：20-DDLSG-16"AT"amed.go.jp

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参 考
⽤語説明
*1

X 線結晶解析：結晶化した物質に X 線を照射して回折パターンを解析し、⽴体構造情報を取得する研究⼿法。タンパク質のような巨⼤な分⼦でも結晶化すれば、解析が可能になる。
*2 電⼦顕微鏡単粒⼦解析：
タンパク質試料に電⼦線を照射して撮影した透過像から⽴体構造情報を取得する技術。重⾦属塩を満たしてタンパク質に浸潤させ形状を解析する負染⾊電⼦顕微鏡法*5 とタンパク質を薄い氷の中に閉じ込めて構造を解析するクライオ電⼦顕微鏡法が代表的な解析⼿法である。
*3

抗体ラベリング：

標的となるタンパク質に抗体を結合させる技術。⽴体構造解析で利⽤する際は、抗原結合部位を含む抗体の⼀部分を結合させる場合が多い。
*4 分⼦動⼒学シミュレーション：
計算機シミュレーションの１つで、分⼦を構成する各原⼦の運動を解析する研究⼿法。実験的に観測が難しい、分⼦の動的な性質を解析することが可能となる。
*5 負染⾊電⼦顕微鏡解析
タンパク質などの⽣体試料を重⾦属塩で染⾊すると、試料の隙間や周囲に重⾦属塩が浸潤する。染⾊後の試料に電⼦線を照射すると、主に電⼦散乱能の⼤きい重⾦属塩が形成するコントラストにより間接的にタンパク質など⽣体試料の形状を観察できる。透過像で実際に観察しているのは重⾦属塩の分布であることから負染⾊と呼ばれる。

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図、画像、表図 1 外来の抗原配列を利⽤した抗体ラベリング法
標的タンパク質のループ領域に、外来の抗原配列を移植し、これを認識する抗体の断⽚を結合させることで、特異的に結合する抗体がない標的タンパク質にも抗体ラベリング法を⽤いることが可能になる。
抗体ラベリング法は、X 線結晶解析では結晶化を促進させる効果があり、クライオ電⼦顕微鏡でも⼩さくて判別が難しいタンパク質を画像の中から⾒つけ出すのに役⽴つことから、⽴体構造解析での有⽤なツールとなっている。

図２ PA14 タグの移植によって作製した抗体断⽚と標的タンパク質の複合体⽔溶性のタンパク質を標的タンパク質として⽤いて、PA14 タグの挿⼊と抗体断⽚の結合が可能かどうかを調べた。⽔⾊の標的タンパク質の表⾯からマジェンタ⾊の PA14 タグが突き出し、濃淡２⾊のオレンジ⾊で⽰した抗体の Fab 断⽚が結合している様⼦が、X 線結晶解析で明らかになった。

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図 3 PA14 タグの配列と抗体との結合状態
PA14 タグは、12 個のアミノ酸からなる PA12 タグの先頭に E（グルタミン酸）と G（グリシン）の 2 つのアミノ酸を付け加えたものである。新たに付け加えた 2 つのアミノ酸によって、抗体と結合した時の PA14タグは、最初と最後のアミノ酸が接近することが可能になり、全体では閉じたリング状の形をとる。このような性質があることで、分⼦表⾯から⾶び出していないループ領域にも PA14 タグを移植して抗体を結合させられることが、今回の研究でも確かめられた。

図 4 タグの移植と抗体の結合によって⽣じる標的タンパク質の構造変化
以前の研究と今回の研究では、いずれも標的タンパク質のβ-ヘアピン領域の先端に抗原配列を移植した（左の図）。以前の研究で、PA12 タグ（⼀般的には、PA タグと呼ぶ）を移植して抗体を結合させた時は、⻘⾊で⽰したβ-ストランド構造が壊れてしまう問題が起きた（真ん中の図）。今回、⻩⾊の 2 つのアミノ酸を付け加えた PA14 タグを移植して抗体断⽚を結合させたところ、⻘⾊のβ-ストランド構造は、タグを挿⼊していない野⽣型とよく似た状態に保たれることがわかった（右の図）。

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図５ PA14 タグによる抗体ラベリング法の電⼦顕微鏡解析での応⽤
PA14 タグを膜タンパク質（膜に埋もれた状態ではたらくタンパク質）に移植し、抗体ラベリングを⾏った。
この膜タンパク質の⽔溶性の領域にあるループに PA14 タグを移植した変異体を細胞の中で発現させてから、界⾯活性剤で膜から溶かし出し、抗体断⽚を結合させた。この膜タンパク質と抗体断⽚の複合体に重⾦属溶液を添加し、負染⾊電⼦顕微鏡単粒⼦解析によって概形を調べた。抗体断⽚や膜タンパク質の⽔溶性ドメインの形状がはっきりとわかるデータが得られた。

研究体制
横浜市⽴⼤学 ⼤学院⽣命医科学研究科
准教授 ⽲ 晃和教授 池⼝ 満徳助教 浴本 亨
筑波⼤学⽣存ダイナミクス研究センター
教授 岩崎 憲治
⼤阪⼤学 蛋⽩質研究所
特任研究員（常勤） 廣瀬 未果
京都⼤学 ウイルス・再⽣医科学研究所
教授 秋⼭ 芳展
助教 檜作 洋平
東北⼤学未来科学技術共同研究センター / ⼤学院医学系研究科
教授 加藤 幸成

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参考⽂献
PA タグを利⽤した抗体ラベリング技術の開発の先⾏研究に関する論⽂
タイトル：Application of the NZ-1 Fab as a crystallization chaperone for PA tag-inserted
target proteins
著者：Risako Tamura, Rika Oi, Satoko Akashi, Mika K. Kaneko, Yukinari Kato, Terukazu Nogi
掲載雑誌：Protein Science (2019) 28, 823-836
DOI：10.1002/pro.3580

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