2021 年 4 ⽉ 30 ⽇
報道関係者各位
国⽴⼤学法⼈筑波⼤学
学校法⼈早稲⽥⼤学

ラマン分光法における⼤動脈瘤の診断マーカースペクトルを同定
⼤動脈瘤は、⾎管が瘤（こぶ）のように異常に拡張する疾患で、無症状に経過することが多く、瘤が成⻑して破裂すると死に⾄る、⼤変危険な疾患です。しかしながら、⼤動脈瘤の発症と瘤の成⻑を根本的に阻⽌する薬剤や⼤動脈瘤形成を予測できるバイオマーカーがなく、治療法としては、超⾳波検査やCT検査などで⾎管径をモニターし、瘤径が⼀定基準以上になると⼿術を⾏うしかないのが現状です。
⾎管壁を構成する成分として、コラーゲンなどの膠原線維や、エラスチンなどの弾性線維という細胞外マトリクスが知られており、その異常が⼤動脈瘤形成に関わることが報告されています。従って、細胞外マトリクスの変化を臨床的に観察することができれば、⼤動脈瘤形成の診断マーカーとなり得ると考えられます。
近年、⾮侵襲的に⽣体分⼦構造情報を取得する⽅法として、分光学的⼿法が注⽬されています。その⼀つであるラマン分光法は、物質に光を当てた際に⽣じる、⼊射光とは異なるエネルギーを持つ散乱光（ラマン散乱）から、分⼦の振動などの分⼦構造情報を得るもので、医学分野への応⽤が進んでいます。
本研究では、ラマン分光法と多変量解析を組み合わせたアプローチにより、マウスとヒトの⼤動脈瘤に特異的な、新規マーカースペクトル成分を同定するとともに、⼤動脈瘤の有無により、弾性線維および膠原線維の構造が異なっていることを解明しました。このような、分光学的⼿法により⾮侵襲的に病状を観察する⽅法は、さまざまな疾患への応⽤が期待されます。

研究代表者
筑波⼤学 ⽣存ダイナミクス研究センター
柳沢 裕美 教授
早稲⽥⼤学 理⼯学術院総合研究所
杉⼭ 夏緒⾥ 次席研究員（研究院講師）

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研究の背景⼤動脈瘤は、⼤動脈径が通常の１.５倍以上に拡張し、破裂により死に⾄る疾患で、患者数は年々増加傾向にあります。しかしながら、⼤動脈瘤破裂の予兆は少なく、根本的な治療薬もありません。そのため臨床においては、超⾳波検査や CT 検査で⼤動脈径の拡張をモニターし、既定の瘤径以上になると外科的修復を⾏います。しかし、基礎疾患を抱えた患者や⾼齢者への適応は限定的であり、バイオマーカーなどを⽤いた病状の追跡⽅法や、病態に応じた治療法の開発が求められています。
⼤動脈には、⼼拍出に伴う⾎流によって⽣じるメカニカルストレスに耐えられる伸縮性と硬さが必要です。⾎管壁を構成する主要成分として、伸び縮みを司る弾性線維や、硬さの保持に資する膠原線維などの細胞外マトリクス注１が存在します。弾性線維形成に必要なタンパク質として、フィブリン４やフィブリン５が知られています。本研究グループは、これまでに、マウスの平滑筋細胞特異的フィブリン４の⽋損が⼤動脈瘤をもたらすことや、フィブリン５⽋損マウスでは⼤動脈瘤は形成されないものの、⼤動脈の蛇⾏と伸⻑を引き起こすことを⾒出しています。これらのマウスでは、⼤動脈瘤の有無に関わらず、弾性線維の異常が認められています。そこで、「瘤がある⼤動脈」と「ない⼤動脈」における⾎管壁の分⼦構造の詳細な違いを調べるために、近年、医学分野での活⽤が進んでいるラマン分光法注２を⽤いて、解析を⾏いました。
研究内容と成果
本研究では、マウスとヒトの⼤動脈瘤において、ラマン分光法と多変量解析を組み合わせることで、この疾患に特異的な弾性線維と膠原線維由来のラマンマーカースペクトル成分の同定を試みました（参考図）。具体的には、野⽣型マウス、⼤動脈瘤マウス（平滑筋細胞特異的フィブリン４⽋損マウス）、⼤動脈瘤を伴わない⼤動脈蛇⾏マウス（フィブリン５⽋損マウス）、およびヒトの⼤動脈凍結組織の切⽚をスライドガラス上に作成し、染⾊等を⾏うことなく、洗浄後ラマン顕微鏡でラマン分光測定を⾏います。
そのデータを３種類の多変量データ解析注３⼿法（True Component Analysis; TCA、主成分分析、多変量スペクトル分解）を⽤いて解析しました。
まず、得られたラマン分光スペクトルから、細胞外マトリクスである弾性線維、膠原線維、アグリカンやバーシカンなどのプロテオグリカン注４および、細胞核、脂質、その他のマトリクス成分のスペクトルをそれぞれ抽出し、TCA解析によりラベルフリーイメージング注５を作製しました（参考図左下）。続いて、その中から弾性線維と膠原線維の主成分分析を⾏ったところ、⾎管壁におけるこれらのクラスター分布が、野⽣型と⼤動脈瘤マウスとで異なっていることを⾒出しました（参考図中下）。さらに、弾性線維と膠原線維由来の成分に対して、多変量スペクトル分解を⾏い、マウスにおける⼤動脈瘤部位に特異的なマーカースペクトル成分を同定しました（参考図右下）。ヒト⼤動脈瘤患者の⼤動脈切⽚に対して同様の解析を⾏ったところ、マウスと同じ結果が得られました。ことから、このスペクトル成分が、マウス⼤動脈瘤とヒト⼤動脈瘤にのみ存在する、新たな⼤動脈瘤の診断マーカーとなり得ることが分かりました。
今後の展開
本研究により同定された⼤動脈瘤特異的マーカースペクトル成分は、⼤動脈瘤の発症や経過の予測に有⽤だと考えられます。このような、ラマンスペクトルを、病状を解析するための診断スペクトルとして活⽤する⼿法は、従来の組織学では診断が難しい疾患への診断や、処置後の患部の治癒経過の評価、さらに将来的には、疾患予防へも応⽤可能になることが期待されます。

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参考図

図 本研究に⽤いた実験⼿法と結果
マウスとヒトの、コントロール（野⽣型）と⼤動脈瘤組織において、染⾊等の前処理を⾏わずにラマン顕微鏡による測定を⾏いました。得られたデータの多変量データ解析から、⾎管壁におけるラマンイメー
ジングの作製、細胞外マトリクス成分の⼤動脈瘤の有無によるクラスター分布の特定、⼤動脈瘤に特異的なマーカースペクトル成分の同定を⾏いました。
⽤語解説
注１） 細胞外マトリクス
⽣体の臓器や組織は、細胞と⾮細胞物質で構成されており、⾮細胞性物質の主要な構成成分を細胞外マトリクスという。細胞を⽀える⾜場や組織の形成や分化、細胞接着を担っており、主に、線維状タンパク質とプロテオグリカンの⾼分⼦から成る。
注２） ラマン分光法
物質に光を当てると散乱光が⽣じ、そのうち、⼊射光とは異なるエネルギーを持つものをラマン散乱という。このラマン散乱を利⽤し、分⼦構造の情報を得る⼿法をラマン分光法という。⾮侵襲的に物質の構造情報が得られるため、分⼦の指紋とも呼ばれる。
注３） 多変量データ解析
複数の変数に関わる⼤量のデータに対して、変数間の相互関係を分析する統計的⼿法を、多変量デー
タ解析という。変数を数学的に変換したり、⾏列因⼦分解したりすることで、結果が可視化される。
注４） プロテオグリカン

3コアタンパク質に、原則としてウロン酸とアミノ糖の２糖の繰り返し構造からなる直鎖状糖鎖が結合したもの。
注５）ラベルフリーイメージング
染⾊等の前処理を⾏わず、ありのままの細胞や組織を⾮標識で画像化する⼿法。
研究資⾦
本研究は、科研費、JST 戦略的創造研究推進事業（さきがけ）、先進医薬研究振興財団、他の研究プロジェクトの⼀環として実施されました。
掲載論⽂【題名】 Raman microspectroscopy and Raman imaging reveal biomarkers specific for thoracic
aortic aneurysms(胸部⼤動脈瘤におけるラマン顕微鏡とイメージングによるバイオマーカーの同定)【著者名】Kaori Sugiyama†, Julia Marzi†, Julia Alber, Eva M. Brauchle, Masahiro Ando, Yoshito
Yamashiro, Bhama Ramkhelawon, Katja Schenke-Layland*, Hiromi Yanagisawa*.
†Co-first authors, ＊Co-corresponding authors本研究は、筑波⼤学、早稲⽥⼤学、Eberhard Karls University Tübingen（ドイツ）、New York University
Langone Health（アメリカ）との国際共同研究によって⾏われました。

【掲載誌】 Cell Reports Medicine【掲載⽇】 2021 年 4 ⽉ 28 ⽇
【DOI】

10.2139/ssrn.3606775

問合わせ先【研究に関すること】
柳沢 裕美（やなぎさわ ひろみ）
筑波⼤学⽣存ダイナミクス研究センター 教授
URL: http://saggymouse.tara.tsukuba.ac.jp/【取材・報道に関すること】
筑波⼤学広報室
TEL: 029-853-2040
E-mail: kohositu@un.tsukuba.ac.jp
早稲⽥⼤学広報室広報課
TEL: 03-3202-5454
E-mail: koho@list.waseda.jp

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