優良醤油酵母の育種−試験管レベル下でのHEMF生成条件の検討−
漆原栄治*
有機酸及びアミノ酸添加液体培地：D 培地に有機酸及びアミノ酸を添加し

1. 緒言
わが国の伝統的発酵食品の一つである醤油は，日本の食卓に欠くことの出来ない総合調味料となっている。また，Soysauceとして諸外国へ普及・浸透た。
2) 培養方法
小型試験管に各々培地4ml を分注し，オートクレーブ滅菌(但し，有機酸及している。
このような消費動向にあって，県内醤油メーカーの多くが諸味の仕込みはびアミノ酸添加培地は0.45μmメンブランフィルターによる除菌処理を行っ天然醸造方式を採っている。このため，年により製品の良し悪しの差が大きた)後，C寒天培地であらかじめ試験管斜面培養した供試菌を一白金耳接種し，く，安定した高品質の醤油を醸造することが難しい。

28℃，12日間の静置培養を行った。

醤油の品質を左右する要素の一つに香りがある。この香りの成分 は現在

振とう培養法は，25ml三角フラスコにD培地を8ml 分注し，オートクレ

までに300 種類ほど明らかにされている。これらの成分の中には，醤油諸味イブ滅菌後，前述と同様に供試菌を接種し，28℃，12 日間，80rpm の速度に生育する酵母の作用で生成する成分も少なくない。ＮＵＮＯＭＵＲＡら３）で回転振とう培養を行った。

は多数の香気成分の中から醤油の特徴香成分として4-Hydroxy-2(or 5)-ethyl-

3) 供試酵母菌株

１）２）5(or 2)-methyl-3(2H)-furanone(以下HEMF)の存在を，ＳＡＳＡＫＩら は

ZygosaccharomycesrouxiiIFO0495，IFO0505，IFO0510,IFO0513及

酵母によりHEMF が生成することを明らかにした。また，木原５）は全国醤び当センター保存菌株H-1，H-2，H-3，H-4，H-5，H-6を供試菌とした。

油品評会の上位入賞品は下位に比しHEMF 濃度が高い傾向にあるとしてい

4) 培養液中のHEMF分析試料の調製４）る。さらに，HEMFの生理活性の面から見ると，当該成分は塩味をやわらげ培養液2mlを採取し，前述の2.1と同様に処理した。

る作用の他に，ＰＡＲＩＺＡら６）７）は市販醤油そのものに抗腫瘍活性を認め，

5) 培養液中のエタノール測定
しょう油試験法のガスクロマトグラフィー法８）に準拠した。

その活性成分の一つはHEMFと同定した。
本研究は，HEMFに富み香味のまろやかで希釈時の伸びが利く, 品質の良2.4 HEMF分析法

い醤油を安定して生産するために必要と思われるHEMF 高生産性酵母の育1) 装置及び分析条件種について検討する。

1.1) ガスクロマトグラフ

本稿では，県内醤油メーカーから市販されている醤油中のHEMF 濃度をガスクロマトグラフGC-9A，データ処理装置C-R4A(いずれも島津製作所

調べるとともに，HEMF高生産性酵母をスクリーニングする際に必要と思わ製)を用いた。注入口温度:200℃，水素炎イオン化検出器:230℃，メイクアッれる培地組成を見いだすため，数種の液体培地における酵母のHEMF 生成

プガス:N2 ガス 40ml/min，試料注入方式:スプリットレス，サンプリング時量を検討したので報告する。

間:1.5min，試料注入量:1μl，イ)FFAP キャピラリーカラム(カドレックス社
製):化学結合型，内径:0.25mm，長さ:50m，膜厚:0.25μm ,カラムヘッド

2 試験方法圧:2.1Kg/cm2、昇温:40℃から230℃(10min保持)まで3℃/min，カラムヘッ

2.1 試薬ド圧力:2.1Kg/cm2(Heガス）。ロ)HR-20Mキャピラリーカラム(信和化工製):
化学結合型，内径:0.25mm，長さ:30m，膜厚:0.25μm, 昇温:40℃から220℃

特に説明の無いものは，市販の試薬特級を用いた。
2.2 県産醤油のHEMF分析試料の調製(10min保持)まで4℃/min，カラムヘッド圧力:1.25Kg/cm2(Heガス）。

県内醤油メーカーの本醸造濃口醤油(特級)を対象に，製造日から30日以内に1.2) HEMFの検量線及び定量法分析に供した。小型試験管(外径：15m，.高さ：105mm)に醤油2mlを採り，内部標準法によった。すなわち，HEMFの2〜100ppm範囲で濃度を変え，NaCl.250mgを溶かし，内部標準物質としてn-ペンタノール1,000ppmエタ

且つ内部標準物質が10ppmとなるよう調製した酢酸メチル溶液数点より1μノール溶液20μl，酢酸メチル2ml を加え，ジェネレーター式ホモジナイザlをガスクロマトグラフへ注入し，得られた濃度比，面積比をプロットした検ー(IKA製.ULTRA-TURRAX)で2分間撹拌した後，遠心分離（4,500rpm，量線を基に供試液中のHEMF濃度を求めた。

10℃，5分間)し，酢酸メチル層をガスクロマトグラフ供試液とした。

1.3) ガスクロマトグラフ質量分析計
GCMS-9100MK(島津製作所製)でガスクロマトグラフはGC-14 である。

2.3 酵母菌によるHEMF生成試験
1) 供試培地の調製

FFAP キャピラリーカラムをパックド流路へ接続し使用した。数種の分析条

A 液体培地：麦芽エキス(Difco製)2%，ペプトン(Difco製)0.1%，ブドウ糖2%，NaCl17%，pH5.5。

件は前述のイ)と同じであるが，カラムヘッド圧力:2.0Kg/cm2、ジェットセパ
レート温度:220℃，イオン源温度:220℃，イオン化電圧:70eV(EI法)，加速電B液体培地：カザミノ酸(Difco製)0.4%，酵母エキス (Difco製)0.2%，ぶど

圧:3KV。

う糖3%，KH2PO40.1%，MgSO4・7H2O0.05%，CaCl2・2H2O 0.01%，NaCl17%，pH5.5。

3. 結果及び考察

C液体培地：麦芽エキス0.3%，ペプトン0.5%，酵母エキス0.3%，ブドウ

3.1 ガスクロマトグラフによるHEMF分析の最適化
HEMF に関する異性体の化学構造が研究者により異なっており，

糖1%，NaCl17%，pH5.5。

NUNOMURA ら３）は 4-Hydroxy-2(or 5)-ethyl-5(or 2)-methyl-3(2H)*発酵食品部D液体培
地：ブドウ糖を6%にし，他はC培地と同じ。

furanone の混合物であるとし，最近になって木原ら９）は HEMF は 41

培地の種類(単位:ppm)

Hydroxy-2-ethyl-5-methyl-3(2H)-furanoneのみであり，あと一つの異性体は3.4-Dihydroxy-2(or5)-ethyl-5(or2)-methylfuranと報告している。
いずれにしても2 種類の異性体が存在することは明らかと思われる。本稿では取りあえA

供試菌

BC

──────────────────
IFO 0495<2.0 <2.0 <2.0

IFO 0505<2.0 <2.0 <2.0

HR-20Mのクロマトグラムでは異性体に由来すると思われる2つのピークがIFO 0510<2.0 <2.0 <2.0存在し，その分離状況は不完全でピーク間に盛り上がりが見られた。他方のIFO 0513<2.0 <2.0 <2.0

FFAP においては，ピーク形状は良好な単一ピークを示しピークの面積は容H-1<2.0 <2.0 <2.0

易に求まる。このことから，HEMF 分析用カラムとしてFFAPキャピラリ

H-2<2.0 <2.0 <2.0ーカラムを採用することにした。

H-3<2.0 <2.0 <2.0

次に，カラムにより分離されたHEMF を検出する装置として，質量分析

H-4<2.0 <2.0 <2.0計，水素炎イオン化検出器及び原子発光検出器等を列挙することが出来るが，H-5<2.0 <2.0 <2.0

ずNUNOMURAらの研究結果を採用し考察を行った。
まず，2種類のカラムを用いてHEMFのピーク形状を比較検討したところ，HEMFの異性体については前述のような未解決な点があり，また高純度の各──────────────────

異性体の標準品が入手困難であるため，感度面において化学構造に由来する影響を受けにくい原子発光検出器による炭素原子等の測定法を採用するのが

表3 有機酸添加D 培地とHEMF生成量最良と思われる。しかし，当センターに当該検出器を装備したガスクロマト────────────────────────

グラフが無いため水素炎イオンカ検出器付ガスクロマトグラフィー法により供試菌 (単位:ppm)HEMFを測定した。

有機酸名

3.2 県産醤油中のHEMF濃度(g/l) 0493 0505 0510 0513

県内醤油メーカー約20社の中から7社について調査した結果を，表1に示した。醤油中のHEMF濃度は最
表１ 県産醤油中のHEMF量──────────────────
メーカー名添加量 IFO- IFO- IFO- IFO-

濃度(ppm)──────────────────
A社20.1────────────────────────
L-乳酸

7<2.0 <2.0 <2.0 <2.0L-リンゴ酸

5<2.0 <2.0 <2.0 . <2.0クエン酸

5<2.0 <2.0 <2.0 <2.0コハク酸

5<2.0 <2.0 <2.0 <2.0ピルビン酸

5<2.0 <2.0 <2.0 <2.0L-酒石酸

5<2.0 <2.0 <2.0 <2.0マロン酸

5<2.0 <2.0 <2.0 <2.0B社

20.5

α-ケトグルタル酸 5<2.0 <2.0 <2.0 <2.0C社

31.9

L-ピログルタミン酸 5<2.0 <2.0 <2.0 <2.0D社

52.1────────────────────────E社

51.4

F社

36.4

G社

40.6

平均36.1──────────────────
低値が20.1ppm，最高値が52.1ppmnの範囲にあり，約2.5倍の差が見られた。このような差が生じる要因として，醤油醸造における諸味工程，諸味圧搾後の貯蔵管理，火入れ工程等がメーカーごとに異なっており，これらの違いが濃度差に影響したものと考えられるが今後詳細に検討する必要があると思われる。
3.3 数種の液体培地における酵母のHEMF生成量
各種の培養条件下での試験結果を表2，3，4，5にまとめた。培地A，B，C，有機酸及びアミノ酸添加培地並びにD 培地については静置及び振とう培
養法について検討した。いずれの試験区もHEMF 生成量は検出限界値である2ppm以下であった。このため，ガスクロマ

表2 培地の種類とHEMF生成量──────────────────

表4 アミノ酸添加D培地とHEMF生成量22) 横塚 保，佐々木正興，布村伸武，浅尾保夫：醸協，75，717(1980)────────────────────────────
供試菌 (単位:ppm)
アミノ酸名3) N.NUNOMURA，M.SASAKIandY.ASAO：Agr．Biol．Chem.,40，

添加量 IFO- IFO- IFO- IFO-491(1976)(g/l) 0495 0505 0510 0513

4) M.SASAKI, N.NUNOMURA and T.MATSUDA：J. Agric. Food
Chem.,39,934(1991).

────────────────┬───┬───┬───
L-グルタミン酸

10 <2.0 │<2.0│<2.0│<2.05) 木原 清：醤研,14,147(1988)

L-アスパラギン酸 5<2.0│<2.0 │<2.0│<2.06) H. BENJAMIN, J. STORKSON and A. NAGAHARA：Cancer Res.,L-ロイシン<2.0│<2.0 │<2.0│<2.051,2940(1991)

5L-イソロイシン

3<2.0│<2.0│<2.0│<2.07) A. NAGAHARA, H. BENJAMIN, J. STORKSON, K. SANG, W. LIU

L-アラニン4<2.0│<2.0│<2.0│<2.0and W．PARIZA：CancerRes.,52,1754(1992)

L-バアリン4<2.0│<2.0│<2.0│<2.08) しょう油試験法：(財)日本醤油研究所編,201(1985)

L-セリン

3<2.0│<2.0│<2.0│<2.09) 木原 清，大谷 肇，益田勝吉，榊原仁作：醤研，20，7(1994)

L-プロリン3<2.0│<2.0│<2.0│<2.0

L-フェニルアラニン 3<2.0│<2.0│<2.0│<2.0L-リジン3<2.0│<2.0│<2.0│<2.0

L-スレオニン2<2.0│<2.0│<2.0│<2.0

L-グリシン2<2.0│<2.0│<2.0│<2.0

L-アルギニン2<2.0│<2.0│<2.0│<2.0

L-メチオニン

1<2.0│<2.0│<2.0│<2.0

L-ヒスチジン

1<2.0│<2.0│<2.0│<2.0

L-チロシン

0.4 <2.0 │<2.0│<2.0│<2.0

L-トリプトファン 0.01

<2.│<2.0│<2.0│<2.0────────────────┴───┴───┴───
表5 培養方法とHEMF生成量───────────────────────
D培地
供試菌(単位:ppm)

静置培養(ｴﾀﾉｰﾙ生成量％）振とう培養───────────────────────
IFO 0495<2.0 (0.73)<2.0IFO 0505

<2.0 (0.72)<2.0IFO 0510

<2.0 (0.63)<2.0

IFO 0513<2.0 (0.80)<2.0───────────────────────
トグラフ質量分析計によるSIM(m/z=142)法で，表5 の静置培養液について分析したところ，供試菌の4株いすれも極く少量のHEMFを生成しており，酵母菌自体のHEMF生産力は微弱であることが分かった。
以上の結果から，HEMFをある程度培地に生産させ, HEMF 高生産性酵
母のスクリーニングに適した培地組成を構築するには，SASAKI４）らが報告したリブロース-5-リン酸等のリン酸化エステル糖をHEMF 前駆物質として培地に添加する試験研究を今後検討する必要があると思われる。
4. 要約
県内醤油メーカー全社の調査でないが，本醸造濃口醤油(特級)のHEMF濃度は最高値が52.1ppmであった。
HEMF高生産性酵母をスクリーニングするための培地を検討したが，試験に供した培地中に極く微量のHEMFを検出した程度であった。
文献1) 横塚 保，佐々木正興，布村伸武，浅尾保夫：醸協，75，516(1980)
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