凍結保護剤を用いない細胞の凍結保存技術
信州大学

繊維学部 機械・ロボット学科
教授 秋山 佳丈
２０２３年８月３日

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細胞の維持<継代培養>

細胞凍結保存• バイオバンク
株化細胞，微生物の保存• 畜産業界種の保存、家畜増産のための精子・卵・受精卵の保存• 生殖医療
精子や卵子の凍結保存• 再生医療分野
ヒトES/iPS細胞の臨床用バンキング構想
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細胞の凍結保存
単純凍結

緩慢凍結法

ガラス化法

氷晶による細胞膜，細胞小器官の破壊＊凍結保護剤：DMSOやグリセロール等(Cryoprotectant agent, CPA)

CPAによる凍結保存の問題• CPAの細胞毒性• CPAの分化誘導効果（幹細胞）• 脱水によるダメージ

Department of Mechanical Engineering and Robotics, Faculty of Textile Science and Technology
Biohybrid Engineering (Akiyama) Lab 3

従来技術とその問題点
既に実用化されているものには、凍結保護剤による緩慢凍結法や急速ガラス化法等があるが、凍結保護剤自身の毒性脱水による細胞ダメージ等の問題があることは認識されているが、代替法がないため広く利用されている。

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凍結保存のメカニズム
凍結保存成否：No man’s land帯における氷晶生成をいかに回避し，ガラス化するか？

水

従来の凍結保存法

単純凍結CPAによりNo man’s land帯を狭める

超瞬間凍結法
液滴の微小化により結晶化よりも速く冷却

過冷却
均質核生成温度

過冷却

No man’sland
ガラス転移温度

ガラス化
ガラス化
Y. Suzuki., Low Temp. Sci. (2006) 64, 103-113

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インクジェット超瞬間凍結装置概要
物体を早く冷却するには？
熱容量∝体積＝L3
伝熱量∝面積=L2 (Lは代表長さ）
熱容量 𝐿3
冷却時間 ∝∝ =𝐿
伝熱量 𝐿2
Lを小さくすると，冷却時間が小さくなる＝冷却速度が上がる．
（＝スケール効果）＊液滴サイズ 20-70 nL（実際は，0.04 nL = 40 pL）

超瞬間凍結装置の構成

スロー再生（ 3/200）
100 μm
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Biohybrid Engineering (Akiyama) Lab 6

冷却の様子と冷却速度
温度変化の比較

液滴全体の平均温度の変化

No man’s land
氷晶生成領域

Y. Akiyama et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2019) 116, 7738-7743

冷却速度（-38 ～-137℃間）✕200 pL(t=150μm): 0.72×104 ℃/s
細胞の臨界冷却速度 CCR: 1.0×104 ℃/s〇40 pL(t=150μm): 2.2×104 ℃/s〇40 pL(t=150μm): 3.67×104 ℃/s

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生存率 (%)

動物細胞への適用例
従来法
DMSO10%

タイムラプス観察（解凍後60時間）
超瞬間凍結(40pL)

従来法(DMSO 10%)DMSOフリー
液滴サイズ

40pL

倍加時間の比較

基板厚み
細胞：マウス繊維芽細胞株 NIH-3T3

緩慢凍結法（DMSO 10%）と同等の生存率を達成
C2C12： マウス筋芽細胞株，MSC: ラット間葉系幹細胞

Y. Akiyama et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2019) 116, 7738-7743
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新技術の特徴・従来技術との比較• 従来技術の懸念点であった凍結保護剤を用いずに動物細胞を凍結保存技術を開発した。
• 従来は、超急速な冷却速度が達成できなかったため氷晶（氷の粒）が生成し細胞にダメージを与えていた。この氷晶生成を防ぐために凍結保護剤が必須であったが、インクジェット液滴の利用により冷却速度を毎秒１万℃程度にまで向上できたため、凍結保護剤フリーで凍結保存することが可能となった。
• 本技術の適用により、凍結保護剤や脱水に弱いなどの理由で凍結保存できなかった細胞を凍結保存できるようになることが期待される。
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想定される用途• 本技術の特徴を生かすためには、凍結保護剤の影響を受けやすい多能性幹細胞や希少な細胞に適用することで、凍結保護剤フリーのメリットが活かせると考えられる。
• また、生殖医療（卵子や精子の保存）や微生物の種の保存といった分野や用途に展開することも可能と思われる。

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実用化に向けた課題• 解凍も含めた工程の自動化技術を確立することで再現性を向上させる必要あり。自動解凍装置を開発済み。
• 凍結細胞の増加に向けて高密度吐出が可能なことを確認済み。今後、処理速度のさらなる向上に向けてマルチヘッド化が望まれる。
• 細胞生存率のさらなる向上のために、インクジェット液滴のさらなる微小化が望まれる。ただし、微小化液滴の安定した凍結技術の確立する必要あり。液滴の落下中凍結防止のため、ヘッドヒーターを開発済み。

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急速解凍の重要性
水

従来の解凍法：
予温した培地に凍結基板ごと浸漬する

均質核生成温度

ガラス転移温度

手技による生存率のバラツキ大12自動解凍装置開発
カバー (PMMA)
ロック板
ヒンジ
スプリング
解放

予温した培地 (37 °C)

アルミ
ベース

ガラス基板のみ落下

液体窒素
リザーバー

基板

エッジ

アルミ製
トランスポータ ヒンジ
スプリング

固定フレーム(Agilista,Keyence)

液滴

H. Watanabe & Y. Akiyama, Cryobiology(2020) 96, 12-18

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熱流体解析による温度上昇評価
熱伝導方程式ρ : Density
Cp : Specific heat capacity at constant pressure
T : Temperatureu : Velocity fieldt : Time
λ : Thermal conductivity

解析モデル

Lid (PMMA)
Vapor nitrogen-137℃
回転後も液滴は約-190 °C
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凍結解凍後の生存率評価*P < 0.05
n=5

10 % DMSOManualAutomatic

Operationtimeー∼3s

20 ms

Viability (%)

83.4

75.3

84.0

S. D. (%)

2.3

4.1

1.3

S. D. : Standard Deviation

自動解凍装置により生存率・再現性が向上

細胞種 : NIH-3T3培地 : DMEM(10 % FBS & 1 % AB)
吐出培地：DMEM(25.7% Percoll, 10%FBS, 1 %AB)
着滴基板：Glass (t = 150 μm)
細胞吐出頻度 : 1 cell / 5 droplets(1.0 × 107 cells / mL)
1操作あたりの吐出液滴数 : 1480 droplets / substrate
染色液 : Double Staining Kit CS01 ; Dojindo
解凍後3時間培養し，15分間の細胞染色

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超瞬間凍結法の高効率化に向けて
従来方式（急速凍結法）
細胞数：> 1.0×106～個/操作
CPA添加

超瞬間凍結法
細胞数： < 300個/操作
基板: ～1 cm
約1500滴/基板
Cell
5滴に1細胞⇒ 300細胞Vitrification

Cell

高効率化に向けて①長時間の低温維持• 冷却機構の改良②細胞数の増加• 吐出密度の増加• 吐出面積の拡大• 細胞濃度の増加

Vitrification

LN (-196 ℃)①長時間の低温維持⇒ 冷却機構の改良②細胞数の増加⇒ 吐出密度の増加

細胞凍結装置，特願2021-073792 （R3.4.26）
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Biohybrid Engineering (Akiyama) Lab 16

保存性の向上（液滴のみ保存）
凍結液滴のみをバイアルに高密度保存
回転の衝撃で落下
自動解凍装置を改良

室温の空気中を落下する
凍結液滴(40 pL)

衝撃で落下

画像解析による落下速度MEMRECAM HX-3(10000 fps), nac-180-140-100-60-2020[°C]

落下時間（< 2 ms)の間の温度維持（< -170℃）を確認
H. Watanabe & Y. Akiyama, Cryobiology(2020) 96, 12-18
渡部広機 他，低温生物工学会誌，2022
凍結細胞内包液滴の取扱方法およびそれに用いる装置，特願2020-180254

17企業への期待• 処理細胞数の増加については、インクジェットプリンター同様に装置化により克服できると考えている。
• 装置の自動化や製品化技術を持つ、企業との共同研究を希望。
• また、再生医療等における細胞凍結保存技術分野への展開を考えている企業には、本技術の導入が有効と思われる。

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本技術に関する知的財産権• 発明の名称 ：細胞凍結装置及び細胞凍結方法• 出願番号 ：特願2023-030921
• 出願人
：信州大学
• 発明者
：秋山 佳丈、渡部広機
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本技術に関する知的財産権• 発明の名称 ：細胞凍結装置• 出願番号 ：特願2021-073792
• 出願人
：信州大学
• 発明者
：秋山 佳丈、渡部広機、湯浅裕太
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本技術に関する知的財産権• 発明の名称 ：凍結細胞内包液滴の取扱方法及びそれに用いる装置• 出願番号 ：特願2020-180254
• 出願人
：信州大学
• 発明者
：秋山 佳丈、渡部広機
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お問い合わせ先
株式会社信州TLO

ＴＥＬ 0268－25－5181
ＦＡＸ 0268－25－5188
e-mail info＠shinshu-tlo.co.jp

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