2023 年 2 ⽉ 23 ⽇
報道関係者各位
国⽴⼤学法⼈筑波⼤学
国⽴⼤学法⼈東京⼤学医科学研究所
慶應義塾⼤学医学部

⽣体外でのヒト造⾎幹細胞増幅技術を開発〜⾎液疾患の細胞治療実現に向けて〜
造⾎幹細胞は、⾚⾎球・⽩⾎球・⾎⼩板といったさまざまな⾎液細胞へ分化する能⼒を持っており、難治性⾎液疾患に対して⾏われる造⾎幹細胞移植では、移植後の造⾎および免疫の再構築において重要な役割を担います。しかし、造⾎幹細胞は⾮常に数が少なく、特に臍帯⾎移植においては、移植のリスクが増したり、ドナー選択が制限される可能性があることから、⽣体外増幅技術の確⽴が求められています。
これまで、⽣体外での造⾎幹細胞の維持には、⾎清アルブミンとサイトカインを組み合わせた培地が不可⽋とされてきましたが、実際には、短期間の造⾎幹細胞維持はできるものの、その増幅作⽤は限定的でした。
2019 年に⽇⽶英独共同研究グループは、ポリビニルアルコール培地にサイトカインを加えると、⾎清アルブミンを⽤いずに、⻑期に安定してマウス造⾎幹細胞を増幅できることを報告しています。これに基づき、今回、アルブミンとサイトカインを、それぞれ⾼分⼦ポリマーと特定の化合物に置き換えた培地を⽤いて、ヒト造⾎幹細胞の⽣体外での⻑期増幅を可能とする新規の培養技術を開発しました。
これにより、臍帯⾎に含まれるヒト造⾎幹細胞を 1 か⽉間にわたって増幅することができます。さらに、単⼀細胞 RNA シークエンス解析により、既存の培養技術と⽐較しても、造⾎幹細胞が選択的に増幅されることが⽰唆されました。
今後、この培養技術をヒト造⾎幹細胞の基礎研究ツールとして提供するとともに、より安全な造⾎幹細胞移植の実現とドナー不⾜の解消に向けた臨床応⽤を⽬指します。

研究代表者
筑波⼤学医学医療系／東京⼤学医科学研究所 幹細胞⽣物学分野
⼭﨑 聡 教授／特任准教授
慶應義塾⼤学医学部 内科学教室（⾎液）櫻井 政寿 専任講師

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研究の背景造⾎幹細胞は、⾻髄中に存在し、⾚⾎球・⽩⾎球・⾎⼩板といったさまざまな⾎液細胞へ分化する能⼒を持つ細胞です。⾎液疾患の治療に広く⽤いられており、化学療法だけでは治らない⽩⾎病や悪性リンパ腫などの難治性⾎液がん、あるいは再⽣不良性貧⾎などの造⾎不全をきたす疾患に対して、健常⼈ドナーから採取した造⾎幹細胞を移植する造⾎幹細胞移植が広く⾏われています。
しかしながら、この造⾎幹細胞は⾮常に稀な細胞であり、特に国内で広く⽤いられている臍帯⾎移植では、含まれる造⾎幹細胞の数が少ないために、⽣着注１が遅れて感染症のリスクが増したり、ドナー選択が制限される可能性が⽰唆されています。そのため、より安全な造⾎幹細胞移植の実現には、とりわけ臍帯⾎に含まれる造⾎幹細胞の⽣体外増幅を⾏うことが重要です。また近年は、鎌状⾚⾎球貧⾎や先天性免疫不全症などの遺伝性⾎液疾患に対して、患者⾃⾝の造⾎幹細胞を採取・培養し、異常な遺伝⼦を修復した後に再び体内に戻して正常な造⾎を回復させる遺伝⼦治療法の開発も進められています。
このようなヒト造⾎幹細胞の増幅においては、これまで、⾎清アルブミン注２とサイトカイン注３を組み合わせた培地が、⽣体外での維持には不可⽋であると考えられてきました。しかし実際には、造⾎幹細胞の短期間の維持は可能ですが、その増幅作⽤は限定的でした。
⽇⽶英独共同の本研究グループ注４は、マウス造⾎幹細胞について、ポリビニルアルコール（PVA）注５に stem cell factor（SCF）とトロンボポエチン（TPO）の 2 種類のサイトカインを加えることによって、⾎清アルブミンを⽤いずに、⻑期に安定して増幅できる培養技術を報告しています。そこで今回、これに基づき、⾎清アルブミンやサイトカインを⽤いることなく、化合物で構成された培地を⽤いて、⻑期に安定したヒト造⾎幹細胞の増幅技術の開発を⽬指しました。
研究内容と成果
PVA に SCF と TPO を加えた培地条件では、マウスと異なり、ヒト造⾎前駆細胞の増幅は限定的でした。そこで、マウスとヒトの造⾎前駆細胞の違いを調べるために、培養中の主要なシグナル伝達経路のリン酸化状態を分析したところ、ヒトではホスファチジルイノシトール 3-キナーゼ（PI3K）/AKT の有意な減少が観察されました（図１）。そこで、PI3K-AKT シグナルを活性化させるため、740Y-P（PI3K を活性化させる化合物）を加えたところ、7 ⽇⽬時点ではヒト造⾎前駆細胞の増幅率が改善しました。さらに、
740Y-P を加えると SCF が不要であること、また TPO 受容体作動薬注６であるブチザミドを⽤いると TPOも不要になることを⾒出しました。これらの結果から、PVA に 740Y-P とブチザミドを加えた培地（2a培地）では、サイトカインを⽤いずともヒト造⾎前駆細胞を 7 ⽇間培養可能であることを確認しました。
しかし、この⽅法では、14 ⽇間経過すると巨核球（⾎⼩板をつくる細胞）に分化してしまうことも分かりました。
⻑期に安定化した培養を実現するため、造⾎幹細胞の分化を防ぐ化合物を探索し、ピリミドインドール誘導体 UM171 を 2a 培地に加えた 3a 培地注７では、30 ⽇間安定してヒト造⾎前駆細胞が培養可能になることを⾒いだしました。この培地で培養後の細胞を放射線照射した免疫不全マウスに移植することによって、造⾎を再構築する能⼒の維持を確認しました。
また、増殖効率のさらなる向上を⽬指し、PVA よりも優れたポリマーの探索を⾏いました。スクリー
ニングの結果、ポリビニルカプロラクタム-ポリ酢酸ビニル-ポリエチレングリコールグラフトコポリマー（PCL-PVAc-PEG）注８が著しい細胞増殖能を有することを発⾒しました（図２）。PVA の代わりに PCLPVAc-PEG を基盤とし、740Y-P、ブチザミド、UM171 注９を添加した培地を⽤いると、ヒト造⾎前駆細胞の増殖能がさらに改善しました（図３）。この培地中で培養した細胞も、同様に、造⾎を再構築する能⼒を維持していました。
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次に、PCL-PVAc-PEG を基盤とした 3a 培地で培養した細胞の特性を調べるために、単⼀細胞 RNA シークエンス解析注１０を⾏ったところ、造⾎幹細胞に特異的な遺伝⼦を発現した細胞が多くを占めており、これは近年すでに臨床試験が実施された、UM171 あるいは SR-1 注９を⽤いたヒト造⾎幹細胞の培養技術と⽐較しても⾼い傾向にあることが分かりました（図４）。以上より、PCL-PVAc-PEG を基盤とした 3a培地は、造⾎幹細胞を選択的に増幅することが⽰唆されました。
今後の展開
本研究チームは、今回得られた知⾒をもとに、ヒト造⾎幹細胞の培養技術のさらなる改良を続けます。
これらの培養技術を、ヒト造⾎幹細胞の基礎研究ツールとして提供するとともに、より安全な造⾎幹細胞移植の実現とドナー不⾜の解消に向けて、臨床応⽤に取り組んでいく予定です。
参考図

図１ マウスおよびヒトの造⾎前駆細胞における PI3K/AKT リン酸化
SCF と TPO を含む PVA 培地で培養した場合、ヒト造⾎前駆細胞における PI3K と AKT のリン酸化状態はマウス造⾎前駆細胞と⽐較し、有意に低かった。****P < 0.0001.

図２ 3a 培地における合成ポリマーのスクリーニング
ヒト臍帯⾎由来造⾎前駆細胞をさまざまな合成ポリマーを含む 3a 培地で 7 ⽇間培養した後に⽣じた全細胞数の⽐較。PCL-PVAc-PEG は著しく⾼い細胞増殖能を有する。

3図３ PVA または PCL-PVAc-PEG を含む 3a 培地で 30 ⽇間培養した際の全細胞数と CD34 陽性細胞数（CD34 は造⾎前駆細胞のマーカー）
PCL-PVAc-PEG を基盤とした 3a 培地では、PVA を含む培地に⽐べ、30 ⽇間の培養で全細胞が約 75 倍、CD34 陽性細胞が約 55 倍に増加し、より⻑期的な細胞増殖の促進が確認された。*P < 0.05; **P < 0.01;***P < 0.001.

図４ 各培養法で 10 ⽇間培養した細胞における単⼀細胞 RNA シークエンス
PCL-PVAc-PEG を基盤とした 3a 培地では、造⾎幹細胞に特異的な遺伝⼦を発現する細胞（⿊点線で囲まれた部分）が既存の培養法よりも、多く含まれていた。
⽤語解説
注１）

⽣着

移植した造⾎幹細胞が⾻髄で分化増殖し、⽩⾎球数が増えてくること。
注２）

アルブミン

⾎清中の 60％を占めているタンパク質で、細胞培養に広く⽤いられている。精製アルブミンとは主にウシ⾎清から分離されたアルブミン分画で、組み換えアルブミンとは⼈為的にアミノ酸配列を変更し酵⺟や稲などの細胞で⼈⼯的に作られたアルブミンである。
注３）

サイトカイン

細胞から分泌されるさまざまな細胞刺激因⼦。
注４）

⽇⽶英独国際研究グループ

筑波⼤学（⽇）、東京⼤学医科学研究所（⽇）
、慶應義塾⼤学（⽇）
、理化学研究所（⽇）
、ヨーク⼤学（英）、
4オックスフォード⼤学（英）、スタンフォード⼤学（⽶）
、塩野義製薬（⽇）
、BASF（⽇、独）で構成された研究グループ。
注５）

PVA（ポリビニルアルコール）

機能性樹脂の⼀種。液体のりなどの⽇⽤品にも⽤いられる⼀⽅で、医療⽤としての GMP グレード（治験に⽤いることのできる品質保証）もあり、社会⽣活には⽋かせない化学物質。
注６）

TPO（トロンボポエチン）受容体作動薬

⾎⼩板産⽣を調節する⾎液中のサイトカインであるトロンボポエチンに代わって巨核球を刺激し、⾎⼩板を増やす薬。実臨床でも特発性⾎⼩板減少性紫斑病や再⽣不良性貧⾎の治療に⽤いられている。
注７）２a 培地と３a 培地

2a 培地は PI3K 活性化剤と Mpl（トロンボポエチン受容体）作動薬を⽰し、3a 培地は２a 培地に UM171を加えた培地を表す。
注８）

PCL-PVAc-PEG（ポリビニルカプロラクタム-ポリ酢酸ビニル-ポリエチレングリコールグラフトコポリマー）

独 BASF が医薬品添加剤として開発した⾼分⼦ポリマー。医薬品は体内で溶けないものが多いが、それを溶かして吸収を助けるために開発された。
注９）

UM171 と SR-1

ヒト造⾎幹細胞の未分化性を維持するために同定された低分⼦化合物
注１０） 単⼀細胞 RNA シークエンス解析
1 細胞ごとに転写産物（mRNA）の種類と量を網羅的に検出し、各細胞に特徴的な遺伝⼦発現プロファイルを元に細胞集団を分類することで各細胞の特徴的な発現情報を取得する解析技術
研究資⾦
本研究は、JSPS 科研費 JP20H03707; JP20H05025; JP20K17407; JSPS 20181706）、国⽴研究開発法
⼈⽇本医療研究開発機構 再⽣医療実現拠点ネットワークプログラム事業 「機能予測と安全性を担保したゲノム編集造⾎幹細胞による遺伝⼦治療技術の開発（22bm0404077h0002）」および「造⾎幹細胞の医学への最新技術強化（22bm0704055h0003）」、the Leukemia and Lymphoma Society（3385-19)、
National Institutes of Health（K99HL150218)、the California Institute for Regenerative Medicine(grantsLA1_C12-06917)、the US National Institutes of Health (grants R01DK116944, R01HL147124
and R21AG061487)、the Virginia and D.K. Ludwig Fund for Cancer Research、他の研究プロジェクトの⼀環として実施されました。
掲載論⽂【題 名】 Chemically-defined cytokine-free human hematopoietic stem cell expansion.
（化合物で構成された培地によるヒト造⾎幹細胞増幅）【著者名】 Masatoshi Sakurai*, Kantaro Ishitsuka*, Ryoji Ito, Adam C Wilkinson, Takaharu Kimura,
Eiji Mizutani, Hidekazu Nishikii, Kazuhiro Sudo, Hans Jiro Becker, Hiroshi Takemoto,Tsubasa Sano, Keisuke Kataoka, Satoshi Takahashi, Yukio Nakamura, David G Kent,
Atsushi Iwama, Shigeru Chiba, Shinichiro Okamoto, Hiromitsu Nakauchi**, and SatoshiYamazaki***共同筆頭著者**共同責任著者5【掲載誌】 Nature【掲載⽇】 2023 年 2 ⽉ 22 ⽇
【DOI】

10.1038/s41586-023-05739-9

問合わせ先【研究に関すること】（基礎研究の概要について）
⼭﨑 聡（やまざき さとし）
筑波⼤学医学医療系 幹細胞治療研究室 教授
https://www.md.tsukuba.ac.jp/basic-med/sct/index.html（臨床応⽤への可能性について）
櫻井 政寿（さくらい まさとし）
慶應義塾⼤学医学部 内科学教室（⾎液）【取材・報道に関すること】
筑波⼤学広報局
TEL: 029-853-2040
E-mail: kohositu@un.tsukuba.ac.jp
東京⼤学医科学研究所 国際学術連携室（広報）TEL: 090-9832-9760
E-mail: koho@ims.u-tokyo.ac.jp
慶應義塾⼤学信濃町キャンパス総務課
TEL：03-5363-3611
E-mail：med-koho@adst.keio.ac.jp

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