納豆菌で養殖魚の夏バテ対策！？
～ 納豆菌 S-903 株は魚類の水温負荷ストレスを緩和する ～「茨城県の名物は？」と聞かれると、我が国で古くから健康食品として親しまれている「納豆」と答える方が多いと思います。近年、納豆菌はプロバイオティクス［a］（消化管内細菌叢［b ］のバランスを改善することによって宿主の健康に好影響を与える微生物）の1つとしても注目されています１）。一方、プロバイオティクスの多くの研究がヒトに対するものであり、農業や畜産、水産等の異分野での活用知見は少なく、その作用メカニズム等は未解明な点が多いです。
こうした中、近年の夏は猛暑が続いており、養殖魚でも魚体重の減少等の夏バテの様な症状がみられ、生産効率に悪影響が出ています。そこで、茨城県の霞ケ浦北浦で盛んに営まれるコイ養殖業で課題となっている「夏バテ対策」に、納豆菌が活用できないか大手納豆メーカーであるタカノフーズ株式会社との共同研究により検討しました。この結果、コイに納豆菌 S-903株を食べさせると、ストレスが緩和され、夏バテ様症状の低減につながることがわかりました。これらの成果は、世界的に成長産業と位置付けられる養殖業への活用や納豆菌の新たな機能性開発等につながることが期待されます。

茨城県水産試験場内水面支場
増養殖部長

丹羽晋太郎

（にわ しんたろう）

する反応についての科学的な研究事例はヒトや家畜ではじめにも少なく、魚介類における研究事例もあまりありません。

世界的な健康志向や日本食ブーム等から魚介類の消生産性や生理機能に悪影響を与えると考えられていま費ニーズは高まっています。一方、魚類の生産では、天すが、これは体内の酸化ストレスを亢進させ、生命活動然の水産資源に依存する漁獲漁業に比べ、近年は養殖を維持する代謝等に重要なホルモン分泌を含めた生理技術の発展から計画生産が見込める養殖業に注目が集機能に悪影響を与えているためと思われます（例えばまっています。また、世界的にみても令和 2 年の漁業・酸化ストレスの亢進により、DNA損傷、脂質の過酸化、養殖業生産量は 2 億 1,402 万tとなっており、このうちタンパク質変性につながり、細胞死すなわち恒常性の乱

養殖生産量は約 1億 2,258 万 t で全体の約 57.3 ％を占れへとつながる）。養殖業でもヒトのように手軽にクーめ、養殖業がタンパク質の供給面で人類に欠かせないラーや扇風機等が使えれば良いのですが、冷却のコスト重要な位置にあることが伺えます 2 ）。我が国においても、海面や陸上における養殖技術の開発や改良、その普及面を考えると費用対効果が低い問題があります。また、飼育環境に合わせて養殖品種を変えることも一考ですにともない養殖生産量は増加傾向にあり、成長産業の1が外来品種を導入することになる場合が多いため、生物つと位置付けられています。

多様性の保全等を鑑みると現実的には難しい状況です。
茨城県に位置する霞ケ浦の夏季の湖内水温も年々上

新たな魚病の発生や飼料価格の高騰等、厳しい状況が昇傾向にあり、全国1位の生産量を誇るコイ養殖業（令散見されており、中でも我々が特に注目したのは地球

和3年 全国1位の749 t生産、全国シェア36.3％）で温暖化等にともない上昇傾向にある水温です。例えばも、魚種固有の水温飼育適性等を考えると、生産効率のことなく自ら体温を一定に保つことが可能ですが、一般に魚介類は周囲の水温に依存して生活しており、適温な水域でないと生きていけません。また、魚介類は水温刺激に敏感で、それはヒトと魚介類で感じる 1 ℃ジしていただければ良いかと思います。
「暑さ」の影響というと、ヒトでは夏バテや熱中症等がイメージしやすいかと思いますが、実は「暑さ」に対NOVEMBER 2023 JIR NEWS

3.0
2.0
1.0
0.0

0.9
0.1

0.0

1.7

1.90.6

2.7 2.8

2.3
1.0

1.6

1.5

0.8

-0.3 -0.1

1.1-0.1

0.7-0.2
2002 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22-0.8-1.0-1.1-2.0
2001年以降、過去30年平均水温を上回る年は14回あった。
-2.5-3.0▲の温度差には生物学的に大きなギャップがあるとイメー

夏季の過去 30 年平均水温に対する2001年以降の平均水温差

一方、養殖魚の飼育環境や経営状況等に着目すると、ヒトでは、限度はありますが周囲の気温に左右される

24

一般に、「暑さ」は養殖魚の体温上昇を引き起こすことで、

図1 茨城県水産試験場内水面支場桟橋における水深１ｍの夏季霞ケ浦平均
湖水温の推移（８-9 月の過去 30 年平均水温（1971-2000 年、26.1 ℃）と 2001 年以降の平均水温差の比較）

Information
魚も夏バテするんだ ! というのが最初の強い印象でした。それ自体は当たり前かもしれませんが、かなり水温に敏感で、成長量に大きく差が出るようです。
水温上昇による悪影響とその原因を科学的・定量的に示したこと、さらに納豆菌によって大きく改善できることを示したのが、この研究の肝です。
暑さに対する反応についての科学的研究事例は、ヒトや家畜・魚介類のいずれにおいても少ない現状に対し、今回、コイを対象として研究が進められました。
温度の違いに対する成長量の違いと、その原因の一端を明らかにされたこと、さらにそれに基づき納豆菌の有効性を示されたことは非常に興味深く、学術・産業への貢献も大きいと考えられます。
世界的に養殖業は成長産業として注目されており、生産量は漁業全体の半分以上（ 2020 年では57%）となっていますが、粗放的［ h ］な飼育環境では、地球温暖化等の影響により水温が上昇（変動）し、適正飼育が難しくなることが予想されます。茨城県水産試験場
内水面支場は霞ケ浦湖畔にあり、同県が全国シェア1位の養殖コイに関する研究を行っていますが、課題となっている夏場の水温上昇による魚への負担解決法が世の中に無い状況でした。タカノフーズ株式会社（小美玉市、納豆の製造販売）から、納豆菌の水産養殖業への有効性を調べる提案が 6 年前に出され、共同研究が始まりました。

低下が心配されています（図1）3）。

納豆菌は、プロバイオティクスの一つとして近年注目されつつありますが、その作用機構は未解明な部分が多いのが現状です。今般の研究により、その一端が明らかにされました。成果の重要な点を以下に整理します。
（1）魚類を試験対象とする場合、馴れさせることや試験維持管理が難しいがこれをクリアに実施したこと。
（2）納豆菌株の投与方法（凍結乾燥菌体活用）を工夫し、試験魚が反応性を示す条件を見出したこと。
（3）水温負荷ストレス影響について、次世代シーケンサーを活用した消化管内菌叢の解析や二次元電気泳動によるプロテオーム解析、RNA-seq解析等を駆使し、成長量の減少抑制に至る作用機序の一端を遺伝子レベル・タンパク質レベルで発見したこと。
本研究の成果により、成長産業である養殖業への応用や納豆菌の新たな機能性（活用方法）が見いだされ、産業貢献等が期待されます。
なお本稿は、SATテクノロジー・ショーケース2023でプレゼン賞の最高賞となる総合得点賞を受賞された内容を、詳しく解説いただいたものです。
ナビゲーター つくばサイエンス・アカデミー（SAT ）コーディネータ 渡辺 正信

体を0.001 ℊ使用する程度です。納豆菌の投与試験はそこで、我々はコイを試験魚とし、春季から夏季のこの条件の下で進め、日間給餌量は飽食となるよう魚

水温上昇をコイの感じる「暑さ」≒「水温負荷ストレ体重の2％に調整し、残餌等の影響を排除するために常ス」として考え、近年プロバイオティクスとしても注目に飼育水が入れ替わる流下式水槽を用いました。

されている納豆菌で、この水温負荷ストレスが緩和でまた、水温負荷ストレス条件ですが、コイは温暖性の魚きないか検討しました。納豆菌には、免疫機能性が高種で水温23 ℃程度の水温を心地よく感じています。そこ

いと考えられているタカノフーズ株式会社の「納豆菌で、水温23 ℃で7日間納豆菌入りの飼料を投与後、水温S-903 株」を用い、先端技術を駆使し遺伝子レベル・負荷ストレスとならない23 ℃条件の他、水温負荷ストレタンパク質レベルにおいて、魚体内で水温負荷ストレスとなる 26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃への昇温を500スがかかった際に何が起きているのか調べてみました。

Wヒーターによりそれぞれ5日間施すこととしました（図2）。

コイは納豆を食べるのか？
～ 納豆菌投与条件の検討 ～試験を始めるにあたり、試験条件の設定は重要な項目です。そもそもコイが納豆を食べるのかどうかの学術的な知見はありません。そこで、納豆をそのまま食

7日間
納豆菌投与

23℃（7日間）

26, 28, 30, 32℃（5日間）

7日間
納豆菌非投与べさせてみたり、エサに納豆を混ぜてみたりと、コイが▶ 夏バテ様の症状確認のため、魚体測定▶ ストレス指標となる血中コルチゾール値測定▶ プロテオーム解析やトランスクリプトーム解析

反応性を示す投与条件を地道に調べてみました。この

図2 納豆菌 S-903 株投与及び水温負荷ストレス付与の飼育試験イメージ

結果、納豆自体の投与では吐き戻し等で安定した摂餌（せつじ）がみられませんでしたが、再現性良く摂餌した条件は、凍結乾燥した納豆菌 S-903 株をペレット飼

納豆菌 S-903株はコイの水温負荷ストレスを緩和するのか？

料 1 ℊ当たり 106 個となるよう飼料へ万遍なくふりか水温負荷ストレス付与時の成長量及びストレス指標値けて食べさせる方法でした。実際、凍結乾燥菌体の量の比較は極少量で、ペレット飼料 100 ℊに対し、凍結乾燥菌

納豆菌S-903株の投与の有無により、水温負荷スト
NOVEMBER 2023 JIR NEWS25

レス付与時の成長量に興味深い差がみられました。水

らく納豆菌自身が消化管内細菌叢を変化させるという

温28 ℃以上の区画では納豆菌投与区画の方が良い成長よりも、コイの消化管内細胞や特定の消化管内の細菌量を示しました。例えば水温28 ℃における菌株を食べ等に対して、細胞表面の糖タンパク質や菌体内成分等させなかった対照区画では水温23 ℃飼育区画に比べ成を介し働きかけることで、宿主反応が得られたのでは長量が36.1％にまで減少しましたが、菌株を食べさせないかと考えています。

両区画の成長差は約2.1倍にもなりました（図3左図）。
また、成長量に差異がみられたことから、ストレス指標となる血中コルチゾール値を調べてみました。コイの血液は尾静脈から500μl程度を注射器で採血し、これ平均区画魚体重（g）た場合は81.4％までの減少に抑制されており、この時、大幅に減少することが確認できました（図3右図）。このことから、納 豆 菌S-903株を食べさせることで、水温負荷ストレスが40

22.5
2010様の症状の抑制効果

50.2
OHOO

89日目

k̲Bacteria;p̲WS3:c̲PRR-12;o̲Sediment-1;f̲PRR-10;g̲k̲Bacteria;p̲Verrucomicrobia;c̲Verrucomicrobiae;o̲Verrucomicrobiales;f̲Verrucomicrobiaceae;g̲Prosthecobacterk̲Bacteria;p̲Verrucomicrobia;c̲[Pedosphaerae];o̲[Pedosphaerales];;Other;Otherk̲Bacteria;p̲Verrucomicrobia;c̲[Methylacidiphilae];o̲Methylacidiphilales;f̲̲LD19;g̲

80

13.5k̲Bacteria;p̲Tenericutes;c̲CK-1C4-19;o̲;f̲;g̲k̲Bacteria;p̲Proteobacteria;c̲Gammaproteobacteria;o̲Xanthomonadales;f̲̲Sinobacteraceae;g̲

H

納豆菌 S-903 株投与時の消化管内菌叢はどうなっているのか ?
今般の納豆菌S-903株の投与試験において、我々はk̲Bacteria;p̲Proteobacteria;c̲Gammaproteobacteria;o̲Methylococcales;f̲Methylococaceae;g̲Methylomonask̲Bacteria;p̲Proteobacteria;c̲Gammaproteobacteria;o̲HTCC2188;f̲HTCC2089;g̲k̲Bacteria;p̲Proteobacteria;c̲Gammaproteobacteria;o̲Alteromonadales;f̲
125ds10;g̲

50k̲Bacteria;p̲Proteobacteria;c̲Gammaproteobacteria;o̲Aeromonadales;f̲
Aeromonadaceae;g̲40k̲Bacteria;p̲Proteobacteria;c̲Deltaproteobacteria;o̲MIZ46;f̲;g̲k̲Bacteria;p̲Proteobacteria;c̲Deltaproteobacteria;o̲MBNT15;f̲;g̲k̲Bacteria;p̲Proteobacteria;c̲Betaproteobacteria;o̲Rhodocyclaled;f̲Rhodocyclaceae;g̲Dechloromonas

30k̲Bacteria;p̲Proteobacteria;c̲Betaproteobacteria;o̲Burkholderiales;f̲
Comamonadaceae;Otherk̲Bacteria;p̲Proteobacteria;c̲Betaproteobacteria;o̲Burkholderiales;f̲
Comamonadaceae;g̲Hydrogenophagak̲Bacteria;p̲Proteobacteria;c̲Betaproteobacteria;o̲Burkholderiales;f̲Burkholderiaceae;g̲10Cortisol

図3 水温負荷ストレス後の区画成長量（左図）及びストレス指標値（右図）の比較

k̲Bacteria;p̲Proteobacteria;c̲Gammaproteobacteria;o̲Vibrionales;f̲
Pseudoalteromonadaceae;g̲Vibrio

60

20

OH

HHOHがあると考えられました。

k̲Bacteria;p̲Proteobacteria;c̲Betaproteobacteria;o̲Burkholderiales;f̲;g̲0
対照区画（％）

S­903 霞ケ浦湖水株投与区画 （飼育水）

k̲Bacteria;p̲Proteobacteria;c̲Alphaproteobagreria;o̲Rickettsiales;f̲Rickettsiaceae;g̲k̲Bacteria;p̲Proteobacteria;c̲Alphaproteobagreria;o̲Rhodospirillales;f̲Rhodospirillaceae;g̲

図4 夏季の霞ケ浦湖内での飼育データ（上図）と次世代シーケンサーによる消化管内菌叢の比較（下図）プロテオーム解析［c ］によるタンパク質レベルの網羅的解析

コイの消化管内細胞や消化管内細菌叢（消化管内微生物

魚体重の変動には魚体を構成する筋肉組織が関与し叢）等が投与菌株と相互作用し、水温負荷ストレス付与ている可能性があることから、筋肉組織を二次元電気時の反応を呈したと考えました。そこで、霞ケ浦湖内に泳動によるプロテオーム解析に供してみました。二次

網いけす試験区画を設け、夏季の高水温時に菌株投与の元電気泳動は、一次元目として等電点で電荷によりタ有無で消化管内菌叢に差異がみられるのか、次世代シーンパク質を分け、さらに二次元目として電気泳動によケンサーを活用して、消化管内菌叢を調べてみました。

りタンパク質を大きさごとに分ける手法です。これにこの結果、対照区画に比べ菌株投与区画の方が良いよりタンパク質をスポット状に見ることが可能となり、成長を示し、また、消化管内内容物の色調にも差異が認

納豆菌S-903株の投与の有無や水温負荷ストレス付与められたことから、飼料の消化過程に差異があること時におけるそれぞれの区画の画像を重ね合わせることで、が考えられました（図4上図）。消化管内菌叢解析の結約 12菌種で優占率が変動することがわかりました（図4 下図）。飼育環境水はバラエティーに富んだ菌種がみられましたが、消化管内は嫌気的な環境下なので出現菌種は限られます。特に興味深い点は、投薬等と異なり、比較的マイルドに消化管内菌叢の変動がみられた点で、コイにとって負担の少ない反応であると考えられました。投与菌株が消化管内に入る量は極小で、次世代シーケンサーでも検出できない程度の濃度ですので、おそNOVEMBER 2023 JIR NEWS

pI４
250kDa150kDa100kDaタンパク質の大きさ

果、魚病の原因となるエアロモナス属細菌が減少する等、2633日目
61日目
試験後経過日数（日）70

対照区画S-903 株投与区画

試験開始時

k̲Bacteria;p̲Verrucomicrobia;c̲[Pedosphaerae];o̲[Pedosphaerales];f̲R4-41Bl;g1500

対照区画S­903 株投与区画

901030

緩 和され、魚 体 重 の減少といった夏バテ

47.3

200

100

消化管内菌叢割合（％）

でストレス指標値が5028℃時のコルチゾール値（μℊ/dl）

豆菌S-903株の投与

水温負荷ストレス時（28℃）の魚体成長（ℊ）

与の有無でコルチゾール値に約67倍の差がみられ、納300100をヒト用コルチゾール測定キットに供しました。この結果、28 ℃の水温負荷ストレスを与えた区画では菌株投

400

50kDa
37kDa

25kDa
20kDa
15kDa

10kDa

等電点

pI７

スポット数の差
水温負荷ストレス （対照区画vs S-903株投与区画）※Fold ２倍以上の変動スポット数

23℃飼育
26℃飼育
28℃飼育
30℃飼育
32℃飼育

28個36個50個34個36個ex.）選抜スポット
23℃

26℃

28℃

30℃

32℃

■LC-MS/MS解析でアミノ酸配列取得■タンパク質データベースで同定■エネルギー代謝に係る酵素と同定

図5 二次元電気泳動によるプロテオーム解析（紫：納豆菌 S-903 株投与個体、緑：対照区画）

発現 / 消失するタンパク質が発見できます。

時の遺伝子発現量をモニタリングしたところ、CTRP3

この結果、魚体重の変動と同様に水温28 ℃区画におは納豆菌S-903株の投与時のみ、水温変動依存的に発いて、最多となる50スポットの変動が確認できました（図現することがわかり、これが水温負荷ストレス緩和に5）。そこで、特に顕著な発現/消失を示したスポットに［d］ついて、LC-MS/MS解析係る注目因子であると考えました（図6）。に供し、アミノ酸配列を調べ、得られた部分配列をタンパク質データベースと照合［e］

した結果、エネルギー代謝に関与するクレアチン代謝

まとめ
我々は養殖コイを対象に、①納豆菌S-903株の投与に係る酵素であると判明したことから、菌株投与によりにより、水温負荷ストレスが緩和され、体重減少等の夏エネルギー代謝が調整されていることが考えられました。

バテ様症状が抑制されること、②この反応は水温依存的に発現するCTRP3等を介し、遺伝子レベル・タンパ［f］

トランスクリプトーム解析

による遺伝子レベルの網羅的解析及び注目因子の発見

ク質レベルでエネルギー代謝等を上手に調整している可能性を明らかにできました。

これまでのタンパク質レベルでの解析から、納豆菌

今後、養殖業は地球温暖化等の影響にともない過度

S-903株の投与効果はエネルギー代謝に寄与することがな水温負荷ストレスに晒される機会が増加すると予想考えられましたので、タンパク質が合成される前の段階で、されます。そこで、今回の成果を基に納豆菌を活用しどのような因子が関与しているのかを網羅的に調べるため、た新たな「夏バテ対策」となるような養殖技術開発や次世代シーケンサーを用いたトランスクリプトーム解析

CTRP3等を指標とした新たな機能性納豆菌株の探索等の一種のRNAシーケンス解析（RNA-seq解析）により、が期待されます。我々も暑さに負けず、技術の実用化どのような遺伝子が発現しているのか調べてみました。に向けて研究を進められればと考えています。

通常、タンパク質は遺伝情報となるDNAがmRNAに転写され、このmRNAが翻訳されることでアミノ酸となり、アミノ酸が繋がりタンパク質が合成されます。細胞が外部刺激等を受け、これに応じ遺伝子情報を基に様々なmRNAが外部刺激依存的に発現することにより、タンパク質を合成しているとイメージいただければと思います。
そこで、菌株投与の有無と水温負荷ストレス付与時の mRNA 発現量を調べた結果、特に 28 ℃区画において、13の因子について発現が促進され、57 の因子の発現が抑制されていました。このことから、菌株投与区画では対照区画に比べ発現する因子が約4.4倍抑制側に偏っていることがわかりました。抑制された因子は、主に細胞骨格やエネルギー代謝に係る因子であり、菌株投与により高水温という異常環境下で無駄なエネルギーを使っていないことが考えられました。
さらに、変動した因子の遺伝子情報の中から、近年、糖尿病やメタボリックシンドローム等の重要因子と考えられている「C1q/TNF-Related Protein 3（CTRP3［g］）」4 ）を発見しました。そこで我々は、CTRP3を特異的に検出する手法を開発し、水温負荷ストレス付与
対照区画期間平均地に対するCTRP3発現量（倍）1550.710.890

対照区画S­903 株投与区画

11.16

100

14.35

5.630.46
2345S-903株投与（7日間）
23℃飼育

673.30

4.63
1.52

0.90
0.65 0.92 1.150.900.65

8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
経過日数（日）28℃飼育（水温負荷）

23℃飼育

図6 水温負荷ストレス時における CTRP3 発現量の経時モニタリング

本研究は、茨城県水産試験場とタカノフーズ株式会社との共同研究成果です。

＜用語＞[a] プロバイオティクス：宿主に有益な効果を与える生きた微生物[b] 菌叢（きんそう）：体内の特定部位に生息する微生物（細菌等）の集まり[c] プロテオーム解析：二次元電気泳動等により、生物の全てのタンパク質の構造や機能を網羅的に解析する方法[d] LC-MS/MS解析：液体クロマトグラフ質量分析計により、アミノ酸の組成を分析することで不明なタンパク質を調べる方法[e] クレアチン代謝：筋肉等でのエネルギー調整に関わる代謝経路[f] トランスクリプトーム解析：次世代シーケンサー等を活用し、遺伝子から作られる転写産物（mRNA等のトランスクリプトーム）を網羅的に解析する方法[g] CTRP3：C1q/TNF-Related Protein 3の略で、近年は糖尿病やメタボリックシンドローム等に関わる因子として注目される脂肪細胞から分泌される生理活性物質[h] 粗放的：自然に近い環境で、労働力やお金をかけないで行うこと＜参考文献＞
１） Fuller, R. （1989） Probiotics in Man and Animals.
Journal of Applied Bacteriology, 66, 365-378.
２） 令和４年度水産白書 水産庁, 第１部, 第４章, P146－147
３） 令和３年漁業・養殖業生産統計
４） Ying Li, et al.（2017）,C1q/TNF-Related Protein
3 （CTRP3） Function and Regulation, Compr
Physiol. Jun 18; 7（3）: 863–878.
＜特許情報＞【特許第5090754号】免疫に対する機能性を高めた納豆及び抗アレルギー用組成物【特開2022-165041】経口投与用組成物及びその使用【特開2022-169087】抗ＳＡＲＳコロナウイルス－２用組成物及びその製造方法＜連絡先＞

s.niwa@pref.ibaraki.lg.jp

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