500 人程度の新型コロナウイルスの新規感染者が報告される中，私達の生活はウイルスと共存した新しい生活様式への移行が進んでいます。本誌では，コロナウイルスについて，正しく理解するために最小限必要となる基礎的知識を広く会員に提供する必要があると考え，8 号より緊急連載記事を企画しました。本連載は，コロナウ
イルスの感染状況や感染拡大防止に関して，分析化学的視点に基づき，正しく解釈していただくことを目的としております。
この 11 号においては，下水中に存在するウイルス RNA を検出することで，地域の感染状況を把握する「下水疫学調査」について紹介します。採取した下水試料から新型コロナウイルス RNA の検出例についても報告しています。会員皆様の理解の一助としていただければ幸いです。

下水中の新型コロナウイルスの分析

北1は じ め に2019 年 12 月に中国・武漢に端を発した新型コロナウ

イ ル ス 感 染 症 （ COVID 19 ） の 世 界 的 感 染 流 行 は ，島正章， 原本英司介する。

2下水中における新型コロナウイルスの存在
実態と分析の意義

2020 年 7 月 21 日現在で，世界で 14562550 名の報告感

COVID 19 患者の一部には下痢症を含む胃腸炎症状

染者と 607781 名の死者が報告されている1) 。 COVID が認められること及び新型コロナウイルスが腸管で増殖

19 の感染拡大は，世界各地においてヒトの健康や生命する可能性が報告されている。また，数多くの研究によのみならず社会経済活動にも甚大な損害を与えている。

り，不顕性感染者を含む新型コロナウイルス感染者の糞COVID 19 の病因である新型コロナウイルス（ SARS 

便中からウイルス RNA が検出されることが分かってきでん ぱ

CoV 2）の主な伝播経路はヒトヒト間での飛沫感染やている6)～11)。

接触感染であるが，感染者の糞便中及び下水中から新型新型コロナウイルスについては，これまでに諸外国

コロナウイルス RNA が検出されることが報告されてい（本原稿執筆時点で，オーストラリア12)，オランダ13)，る2)。下水道が普及している地域では，不顕性感染者もイタリア14) ，スペイン15) ，アメリカ16) ）だけでなく国含めたあらゆる新型コロナウイルス感染者の糞便中に排内（詳しくは後述)4)からも下水からのウイルス RNA の出されるウイルスが下水処理場に集積する。そのため，検出が論文として報告されてきている。これらの結果を下水中の新型コロナウイルスを定期的に分析する「下水まとめると，未処理下水中のウイルス RNA 濃度は最大疫学調査」（ Wastewater based epidemiology の日本語で 1 L あたり 106 遺伝子コピー以上に達すること，処理訳として著者らが考案し公的文書で初めて使用3)）によ下水中からもウイルス RNA が検出されることがあり，り，特定の地域における新型コロナウイルスの侵入，流その濃度は最大で 1 L あたり 105 遺伝子コピー以上に達行状況，分子疫学及び流行収束を把握できる可能性があすることが報告されている。

る 2) 。

新型コロナウイルスは不顕性感染を引き起こすことが著者らは， COVID 19 の流行状況を把握する上での知られており，主に有症者のみを対象とする臨床検査で下水疫学調査の重要性を世界に先駆けて提唱し2)，下水は真の流行状況を把握することが困難であると言える。

等の環境試料中における新型コロナウイルスの存在実態

一方で，下水調査では，感染者の症状の有無に影響を受

調査4) や，分析手法の開発5) 等の研究に取り組んでいけず感染流行状況を評価することが可能である。過去にる。本稿では，下水中の新型コロナウイルスの分析手法

は，ノロウイルス等の腸管系ウイルスの感染流行動向のとその適用事例について，著者らの研究成果を中心に紹把握のためや，ポリオの根絶計画において公衆衛生的介

ぶんせき 
 411

入の効果の判断材料として下水調査結果が活用された事る。

例もあり，前述の理由から新型コロナウイルスに関して

そこで著者らは，オーストラリア・連邦科学産業研究

も下水疫学調査が感染流行実態把握のための有用な知見機構の Warish Ahmed 上級研究員らと共同で複数のウを提供する可能性がある。実際に，海外で実施された研イルス濃縮法による下水中のコロナウイルスの回収率を究の中には，下水疫学調査の結果より公衆衛生的介入比較測定した5) 。ここではその論文の概要を紹介した（ロックダウンや外出禁止命令）による COVID 19 感い。ウイルス濃縮法による回収率測定実験に新型コロナ染拡大抑制効果を確認できたことを報告する研究事例もウイルスを使用するためには，非常に厳格な安全管理がある2)。

要求されるため，新型コロナウイルスと構造や形態が類

3下水中の新型コロナウイルスの分析法

3･1

ウイルス濃縮法

似したより安全性の高いモデルウイルスを使用するのが現実的である。マウス肝炎ウイルス（Murine hepatitisvirus, MHV）は，新型コロナウイルスと同じベータコ

糞便中に排出された新型コロナウイルスは下水中で希ロナウイルス属に属するウイルス（遺伝的に近縁）であ釈されるため，その検出のためには濃縮操作が必須となり，ヒトに病原性を示さず比較的容易に取り扱えることる。下水中のウイルス濃縮法として，これまでノロウイから，本研究では MHV を新型コロナウイルスのモデ

ルス等の腸管系ウイルスに対して多くの手法が開発されルウイルスとして使用した。未処理下水に MHV を添てきており，ウイルス粒子が水中で主に負に帯電してい加し，図 1 に示す 7 種類のウイルス濃縮法（(A)～(G)）

ることを利用して陽・陰電荷膜への吸着により濃縮するで下水中の MHV を濃縮した。( A)～(C)の方法につい手法や，限外ろ過膜法，超遠心法，ポリエチレングリては，下水をろ過した精密ろ過膜から直接ウイルスコール沈殿法等が開発されている17) 。これまでに下水RNA を抽出し，( D )～( G )の方法については濃縮液かから新型コロナウイルス RNA の検出に成功した事例でらウイルス RNA を抽出した。 RNA 抽出液中の MHVは，これらの既存の濃縮法が使用されている2) 。しかの RNA 濃度を逆転写定量（リアルタイム） PCR 法でし，これらの手法は，元々はノロウイルスなどのエンベ測定し，各ウイルス濃縮法による MHV の回収率を算ロープ（脂質と糖タンパクからなる被膜）を有しない腸出した。

管系ウイルスの検出法として開発されたものであり，エ本研究で評価した 7 種類の下水中ウイルス濃縮法にンベロープを有する新型コロナウイルスの回収率は不明

よ る MHV 濃 縮 回 収 率 は ， 表 1 に 示 す よ う な 結 果 とであった。これは，ウイルス粒子の構造がエンベロープなった。の有無により大きく異なり，ウイルス濃縮法による回収

著者らは，本研究で評価したこれら 7 種類のウイル率がエンベロープの有無に大きく影響を受けるためであス濃縮法の利点，欠点及び改善の余地について，MHV

図1412

著者らの論文5)で評価した 7 種類の下水中ウイルス濃縮法及びモデルコロナウイルス回収率の算出法
ぶんせき  表1著者らの論文5) で評価した 7 種類の下水中ウイルス濃縮法による MHV 濃縮回収率の順位

るため，感染力を判別できる手法の開発と適用が期待される。

順位方法

平均回収率（％)

1C65.7

下水に塩化マグネシウムを添加した後に陰電荷膜でろ過2B60.5

前処理なしの下水を陰電荷膜でろ過

3D56.0

下水を遠心した上澄みを限外ろ過膜ユニット AmiconUltra 15 （分画分子量 30 kDa）で濃縮

イルス RNA の存在実態に関する国内初の環境調査を実

濃縮手順・方法4

国内における環境水中の新型コロナウイル
スの分析事例

4･ 1

分析対象試料

著者らは，下水および河川水中における新型コロナウ
施し，論文として報告した4)。ここでは，その報告につ4F44.0

ポリエチレングリコール沈殿法

いて分析手法を中心に紹介する。この研究では，分析対5G33.5超遠心法

象試料として，2020 年 3 月 17 日～5 月 7 日に山梨県内

E

28.0

下水を遠心した上澄みを限外ろ過膜ユニット CentriconPlus 70（分画分子量 10 kDa）で濃縮において，下水処理場（処理方式：標準活性汚泥法）の

67

A26.7

塩酸を用いて下水を pH 4.0 に調整した後に陰電荷膜でろ過流入水と塩素消毒前の処理水（最終沈殿池流出水）を各5 試料，河川水（当該下水処理場からは十分離れた地点）を 3 試料，計 13 試料を採取した。本下水処理場では，処理水は塩素消毒された後に放流されているが，本研究では放流水は採取しなかった。

回収率だけでなく操作の容易さや汎用性，コスト等の観点から体系的に整理し，濃縮手法選択にあたって参考と4･ 2なり得る一連の情報をまとめた。本研究で示した，下水本研究で採取した試料と新型コロナウイルスの分析手

分析手順と方法中のウイルス検出に適用された実績のある 7 種類のウ順を図 2 に示す。この図に示すように，2 種類のウイルイルス濃縮法による MHV 回収率の比較測定結果は，

ス濃縮法と 6 種類の PCR 法を組み合わせて下水および下水中の新型コロナウイルスの濃縮法を選択する上で広河川水中の新型コロナウイルス RNA の検出を試みた。

く参照されることが期待される。また，濃縮法によるウウイルス濃縮法としては，陰電荷膜破砕型濃縮法18) とイルス回収率を考慮することにより，逆転写定量 PCR

陰電荷膜吸着 直接 RNA 抽出法の 2 種類を用い，下水法に基づくウイルス RNA の定量結果から下水中の新型

流入水は 200 mL，塩素消毒前下水処理水は 5000 mL，

コロナウイルス RNA の濃度をより正確に逆算推定する

河川水は 3000 ～ 4000 mL をろ過濃縮（図 3 ）後，ウイことが可能となる。

ルス RNA を抽出した。陰電荷膜破砕型濃縮法では，MgCl2 を終濃度 25 mM となるように添加した水試料を3･ 2

ウイルス検出法

陰電荷膜（孔径 0.8 nm ，直径 90 mm ， Merck ）でろ過

新型コロナウイルスの検出は主にリアルタイム PCR

後，誘出液中で膜を破砕してウイルスを回収し，遠心式法により行われており，国立感染症研究所や米国疾病予フィルターユニット（ Centriprep YM 50， Merck ）を防管理センター（Centers for Disease Control and用いて 0.42 ～ 9.55 mL に濃縮した。このウイルス濃縮Prevention，CDC）等により多くの検出系が開発されて液から 140 nL を分取し，QIAamp viral RNA mini kitいる。しかし，これらのリアルタイム PCR 法は，限ら（ QIAGEN ）を用いて 60 nL のウイルス RNA 抽出液をれた数・地域の感染者から同定された新型コロナウイル得た。陰電荷膜吸着 直接 RNA 抽出法では，陰電荷膜スの遺伝子情報に基づいて開発されていることから，偽破砕型濃縮法と同様に水試料をろ過した後，1/4 に切断陰性等の問題を解決し，世界標準となる手法の構築に向した膜から RNeasy PowerWater kit （ QIAGEN ）を用けてさらなる研究が必要とされている。特に，下水をはいて 50 nL のウイルス RNA 抽出液を得た。その後，逆じめとする環境試料からの新型コロナウイルス遺伝子の転写反応によりウイルス RNA から cDNA を合成した。

検出を行う際には，臨床検体に比べて存在濃度が低いた

PCR 法として，国立感染症研究所の検出マニュアル

めに非特異的増幅が起こりやすく， PCR 増幅産物の塩に記載されているリアルタイム PCR 法（N_Sarbeco 系，基配列を解読し，偽陽性ではないことを確認することがNIID _ 2019 nCOV _ N 系）と定性 PCR （ ORF1a 系， S推奨される。

protein 系)19) に加え，米国 CDC が推奨する 2 種類のリウイルス RNA の検出法として，専用の機器を必要とアルタイム PCR 法（CDC N1 系および CDC N2 系)20)

するリアルタイム PCR 法よりも簡便で実施が容易なを使用した。リアルタイム PCR 法には Thermal Cycler

Loop Mediated Isothermal Amplification （ LAMP ）法

Dice Real Time System TP800（タカラバイオ）を使用等の手法の開発も望まれる。下水中の新型コロナウイル

し，新型コロナウイルス RNA の濃度を定量した（図スが感染力を有しているかどうかは現時点では不明であ4 ）。 定性 PCR 法で は ， Nested PCR 後の PCR 産物 をぶんせき  413

PCR 法の組み合わせによる 12 種類の検出法（ 3 月 17日に採取した下水は陰電荷膜破砕型濃縮法による 6 種類のみ）を適用した結果， 4 月 14 日に採取した塩素消毒前下水処理水 1 試料から 2400 遺伝子コピー/ L の濃度で新型コロナウイルス RNA が検出された。陽性反応が得られた検出法は，陰電荷膜破砕型濃縮法と N _ Sarbeco 系リアルタイム PCR 法の組み合わせによるもので，それ以外の 11 種類の検出法では陽性反応は得られなかった。陽性反応を示した試料中のウイルス RNA 量は，逆転写リアルタイム PCR 法による検出限界値を僅かに上回る値であった。特に低濃度域ではウイルスRNA 定量値が変動しやすいため，今回非検出となった
図2

著者らの論文4)における試料採取と新型コロナウイルスの分析手順

検出法においても，検出限界値未満の濃度でウイルスRNA が存在していた可能性がある。

陽性反応が非特異的な PCR 増幅に由来するものではないことを確認するため，陽性反応を示したリアルタイ
ム PCR 反応液から PCR 産物を回収し，サンガー法を用いたダイレクトシーケンシングにより PCR 産物の塩基配列を解読することで，新型コロナウイルスに由来する塩基配列が特異的に PCR 増幅されていることを確認した。また，検出作業中の実験室内汚染による偽陽性の有無を判別可能とするため， N _ Sarbeco 系において検量線を作成する際に使用した標準試料には新型コロナウイルスに由来しない外部塩基配列を挿入しており，当該試料からはリアルタイム PCR 法によって外部塩基配列が増幅されないことを確認した。さらに，ダイレクトシーケンシングによる塩基配列解読結果からも外部塩基図3

ウイルス濃縮法のろ過作業の様子配列は確認されなかった。これらの結果により，本研究で得られたリアルタイム PCR 陽性反応は，塩素消毒前下水処理水中に存在した新型コロナウイルス RNA に由来するものであると判断した。
塩素消毒前下水処理水から新型コロナウイルス RNAが検出されたものの，リアルタイム PCR 法は感染力の有無にかかわらずウイルス RNA を検出する手法であるため，検出されたウイルス RNA が感染力を有するウイルスに由来していたかどうかは不明である。
下水流入水 5 試料と河川水 3 試料からは，塩素消毒前下水処理水から陽性反応が得られた 4 月 14 日に採取した流入水も含め， 12 種類の検出法の組み合わせのいずれを用いた場合にも新型コロナウイルス RNA は検出されなかった。下水流入水から新型コロナウイルス

図4

リアルタイム PCR 法の試薬調整作業の様子

RNA が検出されなかった原因として，膜の目詰まりを避けるため，塩素消毒前下水処理水（5000 mL）に比べて下水流入水（200 mL）ではろ過水量が少なく，また，アガロースゲル電気泳動に供し，目的産物の生成を確認

ウイルス濃縮液量も十分に減容できなかったため，検出した。

下限値（下水流入水： 4000 ～ 82000 遺伝子コピー/ L ，塩素消毒前下水処理水： 140 ～ 2500 遺伝子コピー/ L ，

4･3

分析結果

各試料に対し， 2 種類のウイルス濃縮法と 6 種類の414

いずれも検出効率を 100 ％ と仮定した場合）に大きな差があったことが考えられる。また，下水流入水と塩素ぶんせき  

消毒前下水処理水はほぼ同時刻に採取したため，下水処理工程での水理学的滞留時間は考慮されておらず，ウイルス RNA 濃度の時間変動による影響を受けていた可能性も考えられる。新型コロナウイルスはヒト等の宿主動物の体内以外では増殖不可能であるため，下水処理工程でウイルスの増殖が生じた可能性はない。
河川水は塩素消毒前下水処理水と同程度の検出下限値であったが，本論文研究では測定していない下水放流水

3) 北海道大学・山梨大学共同プレスリリース：下水中の新型
コロナウイルスに関する世界初の総説論文を発表～
COVID 19 の流行状況を把握する上での下水疫学調査の有用性を提唱～， available from〈 https: // www.hokudai.
ac.jp / news / 2020 / 05 / covid 19.html 〉( accessed 2020 07 22).
4) E. Haramoto, B. Malla, O. Thakali, M. Kitajima : Sci. TotalEnviron., 737, 140405 (2020).
5) W. Ahmed, P. M. Bertsch, A. Bivins, K. Bibby, K. Farkas,や浄化槽排水等に仮に新型コロナウイルス RNA が含ま

A. Gathercole, E. Haramoto, P. Gyawali, A. Korajkic, B. R.
McMinn, et al. : Sci. Total Environ., 739, 139960 (2020).

れていた場合でも，河川流量による希釈の影響で検出さ6) Y. Wu, C. Guo, L. Tang, Z. Hong, J. Zhou, X. Dong, H.

れなかったものと推察される。

Yin, Q. Xiao, Y. Tang, X. Qu, et al. : Lancet Gastroenterol.
Hepatol., 1253, 20 (2020).

山梨県内における COVID 19 累計感染者数は，調査

7) R. W äolfel, V. M. Corman, W. Guggemos, M. Seilmaier, S.

を開始した 3 月 17 日時点では 2 名であったが，その後Zange, M. A. Mueller, D. Niemeyer, P. Vollmar, C. Rothe,
M. Hoelscher, et al. : Nature, 581, 465 (2020).

増加し，塩素消毒前下水処理水から新型コロナウイルス
RNA が検出された 4 月 14 日における累計感染者数は36 名（人口 10 万人あたり 4.4 名）であり，県内での感8) J. Gu, B. Han, J. Wang : Gastroenterology, 158, 1518
(2020).

染流行がピークを迎えている時期であった22) 。この数

9) Y. Song, P. Liu, X. Shi, Y. Chu, J. Zhang, J. Xia, X. Gao, T.
Qu, M. Wang : Gut, 69, 1143 (2020).

値は，下水処理場の処理区域内の居住者数に対応したも

10) M. Holshue, C. DeBolt, S. Lindquist, K. Lofy, J. Wiesman,のではなく，また，処理区域を越えての人の移動等も考慮されていないことに留意する必要はあるが，臨床データ（いわゆる PCR 検査）から把握されている感染者数が少ない国内の非流行地域においても，下水中から新型コロナウイルス RNA を検出できることが示された。今後，下水試料中の新型コロナウイルス RNA 検出感度を向上させることで，下水流入水からの検出も可能になることが期待される。

H. Bruce, C. Spitters, K. Ericson, S. Wilkerson, A. Tural,et al. : N. Engl. J. Med., 382, 929 (2020).
11) A. Tang, Z. D. Tong, H. L. Wang, Y. X. Dai, K. F. Li,J. N. Liu, W. J. Wu, C. Yuan, M. L. Yu, P. Li, et al. :Emerg. Infect. Dis., 26, 1337 (2020).
12) W. Ahmed, N. Angel, J. Edson, K. Bibby, A. Bivins, J. W.
O. Brien, P. M. Choi, M. Kitajima, S. L. Simpson, J. Li, etal. : Sci. Total Environ., 728, 138764 (2020).

13) G. Medema, L. Heijnen, G. Elsinga, R. Italiaander, A.
Brouwer : Environ. Sci. Technol. Lett., 7, 511 (2020).
14) S. G. Rimoldi, F. Stefani, A. Gigantiello, S. Polesello, F.

5Comandatore, D. Mileto, M. Maresca, C. Longobardi, A.

今後への期待著者らは，下水中のウイルス検出に適用された実績のある 7 種類のウイルス濃縮法による MHV 回収率の比較測定を実施するとともに，現在世界各国で精力的な取Mancon, F. Romeri, et al. : Sci. Total Environ., 744, 140911(2020).
15) W. Randazzo, P. Truchado, E. CX. Ferrando, P. Simon, A.
Allende, G. Sanchez : Water Res., 181, 115942 (2020).
16) S. P. Sherchan, S. Shahin, L. M. Ward, S. Tandukar, T. G.

り組みが始まっている「下水疫学調査」を国内で初めて

Aw, B. Schmitz, W. Ahmed, M. Kitajima : Sci. Total Envi-

実施し， COVID 19 感染流行ピーク時に採取した下水

ron., 743, 140621 (2020).

試料から新型コロナウイルス RNA の検出に成功した。

17) E. Haramoto, M. Kitajima, A. Hata, J. R. Torrey, Y.

今後は，これらの研究で使用した分析法を含む様々な方

Masago, D. Sano, H. Katayama : Water Res., 135, 168(2018).

法を対象に，新型コロナウイルス検出への有効性を評価し，標準的な分析法を確立することが求められる。さら18) E. Haramoto, H. Katayama, M. Asami, M. Akiba : J. Virol.
Methods, 182, 62 (2012).に，その標準法を用いることで，国内外の様々な地域を19) K. Shirato, N. Nao, H. Katano, I. Takayama, S. Saito, F.

対象とした下水中の新型コロナウイルス RNA の存在実
態調査を実施し，将来起こり得る第 2 波以降の感染流行に備え，下水疫学調査の COVID 19 流行状況監視へ

Kato, H. Katoh, M. Sakata, Y. Nakatsu, Y. Mori, et al. :Jpn. J. Infect. Dis., 73, 304 (2020).

20) Centers for Disease Control and Prevention: Research UseOnly 2019 Novel Coronavirus (2019 nCoV) Real timeRT PCR Primers and Probes, available from 〈https://の活用が期待される。

www.cdc.gov/coronavirus/2019 ncov/lab/rt pcr panel primer probes.html〉(accessed 2020 09 07).
文献1) World Health Organization : WHO Coronavirus Disease(COVID 19) Dashboard, available from〈https://covid19.
who.int〉(accessed 2020 07 22).

21) 山梨県：新型コロナウイルス感染症に関する発生状況等，
available from〈 https: // www.pref.yamanashi.jp / koucho /coronavirus / info_ coronavirus _ prevention.html〉( accessed2020 07 22).

2) M. Kitajima, W. Ahmed, K. Bibby, A. Carducci, C. P.
Gerba, K. A. Hamilton, E. Haramoto, J. B. Rose : Sci. Total
Environ., 739, 139076 (2020).
ぶんせき  415
北島正章（Masaaki KITAJIMA）

原原本英司（Eiji HARAMOTO）

北海道大学大学院工学研究院環境工学部門

山梨大学大学院総合研究部附属国際流域環（〒060 8628 北海道札幌市北区北 13 条西境研究センター（〒400 8511 山梨県甲府8 丁目）。東京大学大学院工学系研究科都市武田 4 3 11 ）。東京大学大学院工学系

市工学専攻博士課程修了。博士（工学）。

研究科都市工学専攻博士課程修了。博士≪現在の研究テーマ≫新型コロナウイルス（工学）。≪現在の研究テーマ≫微生物指標の下水疫学。≪趣味≫ランニング，読書，を活用した水環境管理。≪趣味≫ウエイト

英会話。

トレーニング。

E mail : mkitajima＠eng.hokudai.ac.jp

E mail : eharamoto＠yamanashi.ac.jp

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Innovation の I, D は Design, Development ある
いは Device の D を意味しています。

五反田サンハイツ 304 号(公社)日本分析化学会「ぶんせき」編集委員会

執筆上の注意： 1 ) 2000 字以内（図・表は 1 枚 500〔E mail : bunseki＠jsac.or.jp〕

字に換算）とする。 2 ) 簡単な図などを積極的に

416

ぶんせき  