デザインペプチドを用いた脂質分解による脂肪細胞からの脂肪酸、グリセロールの分離
Separation of glycerol and fatty acids from adipocytes by lipidhydrolysis using a designed peptide
研究代表者(A) 研究の目的

神戸大学理学研究科学術研究員 飯田 禎弘
二色性)測定を行い、二次構造を調べた。その結果、図 1 で示すようなスペ32[]x10 (deg cm /dmol)

近年、カロリー摂取量の増加や運動クトルが得られ、ランダムコイル構造不足の増加、食生活の変化により肥満を取っていることが分かった。これま0になる人口が増えている。2017 年の「New England Journal of Medicine」-5によると、過体重の人は世界全体で約22 億人、肥満に該当する人は約 7 億-101200 万人と推定されている。肥満自-15
体は太っている状態であり疾病を意味するものではないが、肥満に起因、-20関連する健康障害を有するか、そうし
図 1 190 200 210 220 230 240 250
た健康障害が予測される内臓脂肪が過剰に蓄積した時、減量治療が必要とする肥満症になる。
そこで脂質を分解するペプチドを設計することで、脂肪細胞内の脂肪酸、グリセロールを脂肪滴から遊離させ、肥満を解消する新たな方法を開拓することを目的とする。
(B) 研究の内容、成果
これまでの研究で私が設計した脂質分解能を有する人工ペプチドのアミノ酸配列を基に、機能部位を残したまま配列を短くして、膜透過部位を挿入した新規デザインペプチド me5fR6を設計した。
まずこのペプチドについて CD(円wavelength (nm)での研究で得られたデザインペプチ
ドとは活性部位の配列は同じであるが、二次構造が異なるため分解能力に違いが出ることが考えられる。ただ、私の今までの研究より、ランダムコイル構造を有する同様なデザインペプチドが、加水分解能力が上がっている例もあるので、どうなるかは興味深いところである。
次にパルミチン酸とオレイン酸、グリセロールから成るトリグリセリド(POP)を用いて溶液中での脂質分解能の実験を行った。その結果を図 2 に示す。脂質を分解しグリセロールが生成されると、グリセロール検出試薬によって 540nm 付近にピークが見られるが、このデザインペプチドでは分解しPOP_me5fR6_0min
POP_me5fR6_20min
POP_me5fR6_40min
POP_me5fR6_60min
POP_me5fR6_80min
POP_me5fR6_100min
POP_me5fR6_120min
POP_me5fR6_140min

Absorbancex10-35040

POP_me5fR6_10min
POP_me5fR6_30min
POP_me5fR6_50min
POP_me5fR6_70min
POP_me5fR6_90min
POP_me5fR6_110min
POP_me5fR6_130min
POP_me5fR6_150min

3020

図2400

450

500

550
wavelength (nm)600

650700ている様子が見られなかった。その後の実験でこの活性部位の配列を含むデザインペプチドが、グリセロール検出試薬を阻害することが分かり、一概に分解していないとは言えない。
そこで次に、脂肪細胞内に存在するドを加えたものは散乱強度が減った、つまりミセルの大きさが小さくなったことを示す。すなわち、本研究でデザインしたペプチドは脂肪滴を分解または破壊する能力を有していることが示唆された。

脂肪滴を模すためにリン脂質でトリグリセリドを覆ったミセルを作製し、それに対してのデザインペプチドの分解能または破壊能を蛍光分光装置による光散乱測定で調査した。その結果を図 3 に示す。赤で示したのがミセ最後にこのデザインペプチドを用いて脂肪細胞に対して投与し、脂質分解によって脂肪細胞から脂肪酸とグリセロールを分離できるかを調べた。
ラット初代内臓脂肪細胞をプレート

Fluorescence Intensity

90
POPinPOPC_MQ
POPinPOPC_me5fR6807060

図3051015Time (hour)

20ルのみで、青で示したものがデザインペプチドをミセルに混合したものである。この結果より、デザインペプチに播種し、培養 6 日目(d6)まで培養した。6 日目に培養上清を回収した後、デザインペプチド me5fR6 を最終濃度100μM,10μM になるように添加した。また、比較のため PBS を加えたものも用意した。これらを 2 日間培養し、8 日目(d8)に培養上清を回収したのち、オイルレッド O 染色を行った。回収した培養上清にグリセロール検出試薬を使用し、脂肪分解によって生成、分離されたグリセロールを検出した。
まずオイルレッド O 染色の結果を
図 4、図 5 に示す。オイルレッド O 染

(b)

(a)

図4
PBSのほうが PBS(生理食塩水)を加えたものよりも赤色が少ないように見える。
この染色をイソプロパノールで溶解し半定量化したものを図 5 に示す。
0.35

脂質が分解され、グリセロールが生成されていることを示唆する。この図の1.6lipolysis by me5fR6

1.5Absorbance540nm

色は脂肪細胞の脂肪滴を赤く着色するものである。図 4 の顕微鏡観察画像
より、デザインペプチドを加えたもの

me5fR6 100μM1.4

図61.11.3
1.21.0d6_Control d6_10uM d6_100uM d8_Control d8_10uM d8_100uM

Absorbance492nm-630nm

0.30

図50.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
beforecontrol me5fR6_10uM
me5fR6_100uM

この図の棒グラフが低いほどオイルレッド O が少ない、つまり脂肪滴が少なくなっていることを示す。このグラフから、一番右のデザインペプチドを 100 μ M 加 え た も の は control(PBS)を加えたものよりも小さくなっており、このペプチドが脂肪滴を少なくしていることが示された。
次に培養上清にグリセロール検出試薬を使用した結果を図 6 に示す。このグラフでは棒グラフが大きいほど左 3 つが 6 日目でのグリセロール量を、右 3 つが 8 日目でのグリセロール量を示す。また、それぞれ左から PBS、me5fR6 10μM、me5fR6 100μM を加えたものとなっている。6 日目までの培養上清にもグリセロールが生成されている結果だが、これは培養中に死んだ細胞由来や自然に発生したもの、脂肪細胞を播種するときに細胞の保存のために使用していたものなどが存在していたと考えられるので、この d6 は無視して、d8 の結果のみでグリセロールの分離生成が議論できるものと考えられる。その結果、PBS を加えたものよりも明らかにデザインペプチドを 10μM、100μM を加えたものが多くグリセロールを生成していることが言える。この結果を、グリセロール検出試薬を用いてグリセロールの検量線を作成したものに対して当てはめて、デザインペプチドが精製したグリセロールの濃度を算出した。計算の結果、PBS: 8.31mg/L、me5fR6 10μM: 9.59mg/L、me5fR6100μM: 10.97mg/L の濃度であった。
この値を引き算しデザインペプチドが課題に挙げられる。そのためには、溶液中での脂質分解が見られることが必要になってくると考えられる。なので、今後の方向性としては、今回のデザインペプチドを基に、膜透過部位を維持しつつ、今までの研究で得られていたような二次構造を有するペプチドを設計していく。の効果によるグリセロール生成量を出すと、2.66mg/L となり換算すると29μM となる。この分解量は有意な差であると考える。また、膜透過部位を付与したこのデザインペプチドは細胞外から細胞の中へ侵入し脂肪滴の脂質を分解してグリセロールと脂肪酸を細胞外に分離することができたと言える。ここで、溶液中での脂質分解実験では脂質を分解していないと(D) 成果の発表、論文等特になしみられる結果だったのに対して、脂肪細胞を用いた実験では脂質を分解している結果になったことに関しては、培地中や細胞内では分子が夾雑している環境になっているので、ペプチドの構造が変化し適切な構造を取ったのではないかと考えられる。
まとめると、本研究で開発したデザインペプチド me5fR6 は脂肪細胞内に侵入し脂肪滴の脂質を分解して、グリセロールと脂肪酸に分離することに成功した。
(C) 今後の研究の方向、課題
今の段階では脂肪の分解量がまだ少ないと考えられるので、もっと多くの脂肪を分解することができること