基礎老化研究 46（3）; 35－45, 2022

【総説】

診断バイオマーカーとしての DNA メチル化
新飯田

俊平、下田

修義

国立研究開発法人国立長寿医療研究センター研究所
研究推進基盤センター

要約
医療現場において血中 DNA メチル化が疾患の診断マーカーとして利用されるのは、メチル化変動の明瞭なインプリンティング異常による疾患にほぼ限られていた。しかしながら、DNA の CpG という並びにあるシトシン塩基のメチル化修飾は共有結合していることから非常に安定しており、疾患部位のメチル化変動が血液でも検出されれば、他の疾患でもサロゲー
トマーカーになりえる。実際、次世代シーケンサーの登場でメチル化 DNA 解析能力が飛躍的に向上したことにより、イギリスではがん患者の血液にわずかに含まれる遊離 DNA のメ
チル化をもとに、多種類のがんを超早期に発見しようとする大規模臨床研究が始まっている。
血液 DNA メチル化は、認知症をはじめとするさまざまな多因子疾患のための新たな早期診断マーカーとして期待が持たれている。

キーワード：DNA methylation, cfDNA, ctDNA, complex disease, EWAS

1．はじめに一方で DNA メチル化は、その物質としての安定性から、11 年前、筆者の一人は本学会誌に、老化の理解には明確なメチル化変化を伴う疾患ではすでにバイオマー

モデル生物における実験的な介入による寿命の伸び縮みカーとして利用されている。高齢者疾患の発症予測にではなく、ヒトの高齢者特有の疾患の予測実現が有効でDNA メチル化を利用しようと考えるのは必然的である。

［1］はないかと記した 。その後の十年で加齢に伴って変動

あるいは、疾患の発症予測とまでいかずとも、たとえばする DNA メチル化は、脊椎動物亜門の様々な動物におマウスを利用した疾患発症機序研究に DNA メチル化のいて年齢をかなり正確に推定できる標的になることがわ

視点を取り入れたいと考えても不思議はない。本稿ではかってきた［2］。この年齢予測は再現性の高さから、老化

そのような興味を持つ方に少しでも参考になればと、診研究分野以外においても活用されはじめている［3, 4］。

断マーカーとしての DNA メチル化について、１）
DNA

加齢の終盤に避けがたく生じるのが老化である。これメチル化が診断マーカーとしてすでに利用されているイを病的なものととらえるかは意見の分かれるところであンプリンティング疾患、２）バイオマーカーとして大きるが、老化そのものが少なからず高齢者疾患の下地をな進展の期待されるがん、３）利用が期待されている多作っていることは確かである（predispose）。がんの発症

因子疾患、という三つの疾患領域に即して紹介する。

率は年齢と共に高まる。認知症に至っては加齢が最大のリスクファクターである。仮に老化を前病的なものと見2．インプリンティング異常疾患の診断なすなら、DNA メチル化による年齢測定の成功は高齢難病であるインプリンティング疾患（表１）は、現在、者疾患の前兆を予見するツールになることを示唆する。

DNA メチル化が補助的あるいは確定的な診断マーカーとして臨床現場で利用されている、おそらく唯一の疾患

連絡先：新飯田〒 474-8522

俊平

愛知県大府市森岡町7丁目430番地

TEL：0562-44-5651
E-mail：sniida@ncgg.go.jp

領域である。
インプリンティングについて簡単に説明してみたい。
父母由来の一対の染色体の相同な場所に位置し、機能的にも相同な遺伝子を対立遺伝子（アレル）という。通常一対のアレルは等しい転写活性を有するが、哺乳類（ただ－ 35 －

表１

DNA メチル化を診断マーカーとする主なインプリンティング疾患
疾患名（英語の略称）

アンジェルマン症候群 (AS)

OMIM

発症頻度*

#105830 1/12,000~1/20,000

プラダー・ウィリ症候群 (PWS)#176270 1/10,000~1/30,000

検査方法

国内検査実施施設

MS-PCR

SRL、LSI

パイロシーケンス

佐賀医、成育医療

MS-PCR

SRL、LSI

パイロシーケンス

佐賀医、成育医療

ラッセル・シルバー症候群 (RSS)#180860 1/100,000

パイロシーケンス

佐賀医、成育医療ベックウィズ・ヴィーデマン症候群 (BWS)#130650 国内推定 200 人以上

パイロシーケンス

佐賀医、成育医療* 発症頻度は GENE Reviews Japan（GRJ）による（BWS を除く）。佐賀医：佐賀大学医学部、成育医療：国立成育医療センター、LSI: LSI メディエンス

し単孔類は除く）では父親由来遺伝子と母親由来遺伝子

AS）について紹介する。プラダー・ウィリ症候群は胎児のうち、決まってどちらかの親に由来したアレルのみが期の胎動減少、乳児早期の重度の筋緊張低下と摂食障害、発現する遺伝子があり、それをインプリンティング（刷乳児期後期から小児早期に始まる過食、徐々に進行するり込み）遺伝子と呼んでいる。インプリンティング遺伝

病的肥満症と中程度の発達障害を特徴とする。一方、ア子は染色体上の複数箇所にまとまって存在し、それぞンジェルマン症候群は重度の運動・言語発達障害、精神れドメイン（インプリンティングドメイン）を形成する。

遅滞、特異な行動などを特徴とする。実はこれら二つのインプリンティングドメインと同じ遺伝子座には CpG

異なる疾患は 15 番染色体上の 15q11.2-q13 に存在するアイランドか CpG に富んだ配列からなる「インプリン

同じインプリンティングドメインの異常に起因する［5］。

ティングセンター」がある。ここでは父性染色体と母性

そのインプリンティングドメインで、父由来の染色体で染色体で異なる DNA メチル化を示すメチル化差異領域発現すべき遺伝子が発現できないとプラダー・ウィリ症（Differentially Methylated Region; DMR）を 形 成 す る。

候群となり、対照的に母親由来の染色体で発現すべき遺インプリンティングセンターがメチル化されているか、伝子が発現できないとアンジェルマン症候群となる（図逆にメチル化を免れているかで cis に存在するインプリ

２）。

ンティングドメイン内の個々のインプリンティング遺伝検査に使われるのはメチル化を定性的もしくは定量

子がオフになるかオンになるかが決まる［5］。なお、イン［1］。たとえば検査会社の的に解析する手法である（表 1）

プリンティング遺伝子は父性発現型と母性発現型がほぼ（small
SRL では 15q11.2 領域に存在する SNRPN 遺伝子

同数存在する。DNA メチル化がインプリンティングに

nuclear riboprotein-associated peptide N） の 5’CpG

重要な役割を果たしていることは、DNA メチル化を欠アイランドを対象としたメチル化特異的（Methylation

損したマウス胎児ではインプリンティング異常が見られ

［8］
。ちなみ
Specific; MS）PCR 法を採用している（図１）［6, 7］に SNRPN 遺伝子の CpG アイランドこそが上述のインることからも明らかである。

インプリンティング疾患はインプリント遺伝子の発プリンティングセンターに相当する。この CpG アイラ

現異常により引き起こされる。その原因は以下の四つ

ンドは父由来アレルではメチル化されていないのに対に求められる。１）インプリンティングセンターのメ

し、母由来アレルではメチル化されている。そのためメ

チル化異常、２）染色体不分離などの原因により、一チル化状態の SNRPN にのみアニールできるプライマー

対の相同染色体が丸ごと、あるいは部分的（partial orと、それとは逆に非メチル化状態の SNRPN にのみアsegmental）に 片 親 由 来 に な っ て し ま う 片 親 性 ダ イ ソ

ニールできるプライマーで PCR をかけると、前者は父

ミー（uniparental disomy; UPD）、３）発現すべき父性あ由来のアレルのみを、後者は母由来のアレルのみを区

るいは母性アレルの欠損、４）インプリンティング遺伝

別して増やすことができる（図２）。これを利用すれば子の変異。１）〜３）は図２からイメージしていただきた

15q11.2-q13 の１）片側アレルの欠損、２）UPD、３）インい。代表的なインプリンティング疾患を表 1 に示す。そプリンティング異常について、父アレルの異常であるの

れぞれの疾患の詳しい臨床像、発症機序等についてはか、母アレルの異常であるのか見分けることができる。
実際のところプラダー・ウィリ症候群やアンジェルマ

OMIM を、またメチル化解析法の原理については下田の総説を参照いただければ幸いである［1］。

ン症候群の場合、１）、２）で発症原因の 8 割近くを占め

DNA メチル化が診断に使われるわかりやすい例としるが、MS-PCR を使えば１）、２）の染色体構造異常だて、プラダー・ウィリ症候群（Prader-Willi Syndrome;

けでなく、３）のメチル化異常も確認できるので、DNAPWS）とアンジェルマン症候群（Angelman Syndrome;

メチル化が有効なバイオマーカーになり得ている。

－ 36 －

バイサルファイト処理後の塩基配列の変化

+

非メチル化

+

C

G

C

T

-

G

C

G

A

C

G

C

G

U

T
PCR

バイサルファイト

メチル化

+

U

G

C

G

T

T

A

C

A

A

C

A

C

T

G

U

G

A

G

T

G

A

+

C

G

U

T

C

G

T

T

G

C

A

A

C

G

C

T

G

C

G

A

T

PCR

A
-

図１

G

-

バイサルファイト

-

T

G

C

G

A

メチル化 DNA 解析の基本
DNAを一本鎖に変換後、バイサルファイト処理するとメチル化されていないシトシンはウラシルに変わる。一方、メチル化されたシトシン（直後はグアニン）はシトシンのままである［46］。ここで DNAの +鎖と－鎖はもはや相補的ではなくなる。通常の DNAメチル化解析では、バイサルファイト処理後、CpG配列を含まない領域に対してデザインしたプライマー
で PCRをかける。シーケンスして、その産物に“CpG”という配列が存在すれば、そのシトシンはメチル化されていたことを表す。メチル化特異的 PCRでは逆に、CpGが複数存在する領域に PCRプライマーを設定する。このときプライマーは非メチル化 DNAの配列（+鎖でも、－鎖でもよい）に合わせた配列と、メチル化 DNAの配列（+鎖でも、－鎖でもよい）に合わせた配列の２種類用意する。この両者のプライマーで個々に PCRを行えば、標的配列のメチル化・非メチル化を PCR産物の有無に変換し検出することができる。










  





図２



メチル化特異的 PCR によるインプリンティング疾患の診断の例
向かい合う矢印がインプリンティングドメインに存在する SNRPN 遺伝子の CpG アイランドに対するプライマーセット。ここでは青色が非メチル化アレルに、ピンク色がメチル化アレルにハイブリできる。横向きの短い実線が PCR
産物のイメージで、点線は産物ができなかったことを表す。アンジェルマン症候群（AS）では、母親由来のメチル化
した SNRPN 遺伝子に由来する PCR 産物が得られない。プラダー・ウィリ症候群（PWS）ではその逆となる。UPD:
uniparental disomy－ 37 －

3．ctDNA によるがんの診断

どになる［12］。放射線治療でその量が減ることから、がこれまで胎児の染色体異常（異数性）のスクリーニング

ん患者での cfDNA の増加分は ctDNA ではないかと推では母体に負担のかかる侵襲性の羊水穿刺による出生前測されている。核に由来する健常者の cfDNA の最頻サ検査が行われてきた。現在ではリキッドバイオプシー（血イズはおよそ 166 bp で［13］、がんに由来する最頻 cfDNA液）による低侵襲性の出生前検査が一般的になった。が（ctDNA）サイズはおよそ 143 bp とやや小さい。いずれ

んのサブタイピングと診断は、病理組織標本に基づく解もゲノムが断片化したものであることに変わりはない。

析が昔も今もゴールドスタンダードである。そこから治DNA のヌクレオソーム一巻きがおよそ 147 bp で、こ療法の選択、予後予測、がんの原発巣やがんの分類など

れにリンカー断片がつくとおよそ 167bp になることかについて貴重な情報を得る。ただしこの伝統的な手法に

ら［14］、cfDNA は主にアポトーシスの結果から生じるのは、侵襲的な生検（バイオプシー）が必要となる。最近はではないかと想像されているが［15］、それ以外にもネク

血漿の中に存在する DNA でがんを早期発見しようとす

ローシス［16］やヌクレオプロテインとして細胞から積極る取り組みが盛んである。この方法ならがんのモニター

的に排出される［17］という経路も示唆されている。

を in situ でできる。うまくいけば低侵撃性のリキッド

発がんにおいて、DNA メチル化の変化はもっとも初

バイオプシー検査で治療法の選択、がん細胞の残存・再期かつもっとも広範に生じるゲノム変化と考えられてい発のモニターも可能になる［9］。

る［18, 19］。正常な脊椎動物の細胞では CpG アイランドは特に注目されているのはさまざまな組織の細胞から非メチル化されており、繰り返し配列を含むそれ以外の放出され、血液や尿の中を自由に漂う断片化した DNA

領域は高度にメチル化されている。しかし、がん細胞ので あ る（ 図 ３）。 そ れ ら は 無 細 胞 核 酸、cell-free DNA

ゲノム（以下、がんゲノム）のメチル化パターンはちょう（cfDNA）と 総 称 さ れ、 血 液 の 場 合、 主 に 造 血 幹 細 胞

［20］
。がんゲノ
どそれと反転するイメージである（図４）に由来するが、そればかりではなく、一部は血管内皮

ムでは、巨視的には繰り返し配列を主とするゲノムの全［10］。がんが存在する場合、体的な低メチル化と、逆に、多くの CpG アイランドを

cfDNA にはがん細胞の細胞死に由来する cfDNA も含含む局所的な高度メチル化が同時発生している［21］。がまれる。それを特に「血中循環腫瘍 DNA（circulating

ん化によりメチル化される CpG アイランドには主要な細胞や肝細胞にも由来する［11］。たとえば健常者のがん抑制遺伝子のものが含まれるため［22, 23］、がん抑制

血清には cfDNA はほとんど含まれていないが（1 ミリ遺伝子のサイレンシングが起こる［24］。繰り返し配列のリットル当たり 0 ～ 50 ナノグラム、平均 13 ナノグラ

低メチル化はゲノムの不安定性をもたらすなど、それ自ム）、がん患者ではその十数倍の平均 180 ナノグラムほ体に発がん性リスクがある。そのため、体細胞突然変異

tumor DNA: ctDNA）」と呼ぶ

図３

リキッドバイオプシーによる多種のがんの同時検査
血液中の無細胞核酸（cfDNA）の変異や DNAメチル化から、さまざまながんを超早期に発見しようとする試みがなされている。DNAと異なりメチロームは組織ごとに異なる。そのため cfDNAのメチローム解析からは異常メチル化を受ける遺伝子の情報のみならず、がんの原発部位の情報も含まれる。あらかじめそれぞれのがん患者の cfDNA
メチル化パターンをデータベース化しておけば、未症状のがん患者の血液からがんの種類を推定できる。図は［50］からの引用で BioRender.comが作製。CTCs: circulating tumor cells, EVs: extracellular vehicles－ 38 －

正常

Gene body

RepeatGene body

がんA

Gene body

RepeatGene body

がんB

Gene body

RepeatGene body

メチル化CpG

非メチル化CpG
図４

がん細胞のゲノムで見られる DNA メチル化異常のイメージ
がんの種類によってメチル化を受けやすい遺伝子のグループが存在する。その情報を利用した、特定のがんの有無を検査するキットが販売されている。

によるがんのドライバー変異にこれらのメチル化異常が伴うアポトーシスにより組織からの cfDNA 流出が増加

組み合わさることで、がんの発生が容易になる［25］。

したことを示唆する。これは通常の DNA 配列からは得

がんゲノムに生じる DNA メチル化の変化は微視的にはられない情報である［10］。そしてそれらの情報を組み合多様かつ複雑であるが、その変化は多くのがんで組織をわせることで、がんの有無と原発巣が推定できることに越えて、あるいは原発巣において高度に一致している。こなる［28］。体内にがん細胞が見つかるものの、その細胞の特徴と DNA メチル化の物質としての安定性はがんのが増殖を開始した場所（原発部位）を特定できないがん、診断開発のための魅力的な特性であり、すでに血漿や便、いわゆる原発不明がん（cancer/carcinoma of unknown

FFPE サンプルからの DNA でがんを検出するための検primary; CUP）についても cfDNA により原発巣が明ら

査キットが上市されている［26］。上述のように、がん細胞

かになる可能性がある。

ではがん抑制遺伝子やがん種に応じた固有遺伝子の体細cfDNA の変化を見る方法は、それが体細胞突然変異

胞突然変異、あるいは繰り返し配列の不安定性などが見にしろ、メチル化の変化にしろ、血液検査で済むので繰られ、当然ながら ctDNA も同じ変異を有する。そのためり返し検査にそれほどの抵抗がないことから、がんの集

cfDNA の網羅的な配列解析から ctDNA の含有、すなわ

団検診に向いている。多種のがんを早期に発見すること

ちがんの有無を知ることができ、その変異部位（遺伝子）
かは治療の機会を増やし、死亡リスクを下げるために極めらがんのタイプがある程度推定できる。そこで複数の企業て重要である。米国では、多種のがんに対する早期発見がリキッドバイオプシーで得られる cfDNA を用いたがん検査法の開発を目指した「循環無細胞ゲノム地図帳研究」

早期診断技術の開発を行っている。たとえば、イルミナ社

The Circulating Cell-free Genome Atlas study（CCGA）

からは 500 を超えるがん関連遺伝子の体細胞変異を一度という症例対照観察研究コンソーシアムが組織され、に ctDNA から検出するキットが販売されている。

ctDNA の体細胞変異解析とメチル化解析が比較された。

一方、前項に記したようにがん細胞ではそれぞれのその結果、がん発見能力においては、メチル化が上述

がんに特徴的なメチル化の異常も生じ、それも ctDNAの ctDNA の体細胞変異解析を遙かにしのぐことが判明に保存される。このとき往々にしてメチル化の変化はした。アメリカのスタートアップ企業で「聖杯」の意味

単独の CpG 部位ではなくドメインとしてひとかたまりをもつグレイル（GRAIL）社（イルミナのスピンオフ企業の CpG 部位に及ぶため、異常なメチル化のハプロタイ

で再度イルミナが買収）は、このようながん発見におけ［27］。これは点突然変異などの体る DNA メチル化の優位性を活かし、ctDNA のメチル

細胞突然変異よりも正常型と区別しやすい。またゲノ化の特徴（シグニチャー）からがんの存在のみならず、そムには組織特有のメチル化パターンを持つ領域が存在の原発部位までを捕らえられることを可能にしたサービする。そのため網羅的に cfDNA のメチル化解析をする

ス、ガレリ（Galleri）の提供を始めた。インターネットのと cfDNA の由来組織とその割合が計算できる（いわゆ

情報によると、すでに 2021 年には全米で医者の判断でるデコンボリューション）。たとえば、ある組織のメチ

ガレリを利用できるようになっている。ただし FDA のル化パターンをもつ cfDNA の割合が全 cfDNA 中で異承認はされておらず、約 1,000 ドル（13 万円）の費用がか常に増えたとすれば、それはその組織のがん化とそれにかる。これについてイルミナは、メディケイドによる保プブロックを形成する－ 39 －

険適用がなされるよう望んでいる。ガレリは CCGA コ

発性硬化症患者でのオリゴデンドロサイト由来 cfDNA

ンソーシアムのサブコホートでテストされ、一般的なスの増加、２）心停止による脳障害での脳由来 cfDNA の

クリーニング検査の手法がない固形腫瘍（食道がん、肝増加、３）外傷性能損傷での脳由来 cfDNA の増加、の臓がん、膵臓がんを含む 50 を超える種類）の検出を可能

三つの知見を得た［32］。さらにそれぞれの疾患において、にするらしい［29, 30］。実はそれ以前に他のグループによ

異常な DNA メチル化を示す遺伝子や領域を見出した。まり、ガレリとは別の免疫沈降を用いた手法で、ctDNAという遺伝子の CpG
た、LIM ホメオボックス２（LHX2 ）のメチル化シグニチャーにより複数のがんを見分けられアイランドは脳で特異的にメチル化を受けることが知らることが Nature 誌に報告されていた［31］。こちらの方はれている。実際、アルツハイマー病における cfDNA に神その後の展開についての報告はない。一方、CCGA 研

経細胞から浸出してきたと推定されるメチル化を受けた

究は、15,000 人以上からなる前向きのコホートの構築

LHX2 の CpG アイランドが含まれていた［33, 34］。比較的最近では、神経とグリア由来の cfDNA を血漿から同定するなど細胞種の分離も可能であることが示された［35］。これらの結果は、未だ病因の理解が進んでいない神経変性疾患、とりわけ認知症発症のメカニズム解明における cfDNA メ
チローム利用の有効性に期待を持たせ、異常なメチル化を示す遺伝子がすでにいくつか報告されている［33, 34］。

と、そこから得られる血液およびがん組織の収集、機械学習を利用したがんの分類指標の設定など、領域横断的で圧倒的に豊富なデータ量とデータの質の高さがあり、それは結果としてガレリの有効性にお墨付きを与えることになった（ただし CCGA 研究はガレリ販売元のグレイル社からサポートを受けており、論文著者の多くはグレイルとの関係がある）。そこでイギリスの国民保険サー
ビス、National Health Service（NHS）は試験的に、ガ

5．血中 DNA による複合疾患の診断

レリを用いた 165,000 人を対象とする大規模な血液テス

血中の DNA メチル化を診断マーカーに利用しようとトを 2021 年からスタートした（https://www.nhs-galleri.

する研究は cfDNA ではなく、主に白血球に由来する血球

org/）。ここには 14,000 人からなる 50 歳から 79 歳まで

DNA を利用して始まった。対象は多因子疾患である［36, 37］。

未症状の人が含まれ、３年にわたり毎年ガレリ検査を実

現在、様々な多因子疾患がエピゲノムワイド関連解析

施する。この結果は 2023 年に報告される予定で、もし（epigenome-wide association study; EWAS,「イーバス」

結果が良好であれば２年延長し、参加者をおよそ 100 万と発音）と称される研究手法の対象になっている。多因人まで拡大する計画である。そして NHS は、治療でき子疾患とは、その名の通り、疾患をもたらすそれぞれ重る可能性が高いステージ１〜２でのがんの発見を、現在

みの異なる複数の要因の積み重なりが、ある閾値を超えの 50% から 2028 年までに 75% へと高めることを目標た時に発症すると考えられる疾患である。代表的なものにしている。この結果次第では、cfDNA のメチル化解として認知症、糖尿病、自己免疫疾患、アテローム動脈

析ががん検診におけるゲームチェンジャーになると予想

硬化性疾患、神経障害や精神障害などがある。他にもさされている。なお ctDNA は単独で存在するわけではな

まざまな疾患がこのカテゴリーに分類される。

く、他の cfDNA と混在するため早いステージのがんほ多因子疾患の診断発症の要因は、遺伝子と環境に大別

ど ctDNA の量が少ない。したがってガレリであってもできる。環境には、食事や運動、学習というある程度自検出感度は落ちる。たとえば、死因となるがんのうち分の意思でコントロールできる生活習慣一般から、大気過半数を占める 12 のがん種においてステージ別にみる

汚染や心的障害、幼児期における母親からの愛情といっと、ステージ IV では 90.1％、ステージ III で 77.0％だが、た不可避的で数値化の困難な経験まで、様々な要因を含ステージ II では 40.4％、ステージ I で 16.8％となる［29］。

む。これらの環境により DNA メチル化が影響を受ける

ただしこの時の特異度は 99.5% と疑陽性の割合は極めてことが明らかにされつつある。そのため、それぞれの疾

低く、また原発部位予測の正解率はがん全般で 88.7% と患に対し、発症に寄与するメチル化異常の検出を求め、こ高い。今後 cfDNA のメチル化解析技術の向上により、れまで多数の EWAS が行われてきた。しかし残念ながら、より感度が高まることが期待される。

それらの研究からマーカーの上市に至った例を筆者らは知らない。そもそも筆者らの関心がある認知症に限っていえ4．ctDNA による複合疾患の診断ば、再現性の確認された EWAS の結果〜具体的にはメチ

cfDNA が細胞死に伴い流出する核酸であるならば、

ル化変動の見られた遺伝子〜というものはほとんど報告さ神経変性疾患では神経細胞に由来する cfDNA が増加す

［38, 39］、ソルビ
れていない。せいぜいアンキリン （1 ANK1 ）るのであろうか？もしそうであれば、がんのケースと同［40, 41］、そしてヒストンンと SH3 ドメイン含有 （3 SORBS3 ）じように、中枢神経（CNS）由来の cfDNA はそのメチル［42, 43］くらいではなかろう
脱アセチル化酵素２（HDAC2 ）化パターンから判断できるはずである。加えて、異常なか。一方、候補遺伝子アプローチにより、アルツハイマー

メチル化パターンを持つ遺伝子は CNS 由来である可能

病関連遺伝子 TREM2 がアルツハイマー病患者の血中性が高く、そこから診断マーカーや発症機序のメカニズ

で高メチル化傾向にあると報告されたが［44］、筆者らはムの手がかりが得られるかもしれない。

その再現性を確認できた［45］。したがって認知症でのメ

それを最初に検討したのが Lehmann-Werman らの研

チル化異常は確かに存在する。しかし現状の EWAS で究で、彼らは cfDNA メチロームから由来組織をデコン

はその検出に不確実性があるように見受けられる。このボリューションできることを利用して、１）（神経の）多ままでは、DNA メチル化異常をバイオマーカーに、あ－ 40 －

図５

イルミナ社のアレイによるメチル化測定原理と問題点
イルミナのメチル化アレイには 2種類のプローブが搭載されており、どちらのタイプもビーズ（図中 Ⓑ）に個々のプローブが多数結合している。バイサルファイト処理後の一本鎖 DNAをプローブにハイブリダイズさせた後、プローブ
から蛍光物質の付加された塩基を一つ取り込ませる。注意すべきはターゲットのシトシンが多型によりチミンに置き換わっていると（図６）、それは非メチル化シトシンとして測定されてしまうことである。またターゲット CpG周辺の、
つまりプローブの 3’末端側に存在する多型もハイブリに影響を与え、メチル化レベルの測定を誤らせる要因となる。

⾮メチル化シトシン

TpG

CpG

T はバイサルファイト処理前にC or T︖

バイサルファイト処理

⾃然に⽣じる塩基置換

5mCpG

TpG

TpG

脱アミノ基

図６

多型がもたらすメチル化レベルの測定誤差
バイサルファイト処理後の TpG配列のチミンは、元は非メチル化 CpGだったのか、多型によりはじめから TpG
だったのか判別できない。イルミナ社のアレイプローブは CpG/TpG多型部位には設計されていないという前提だが、そうでない場合、TpG多型部位は非メチル型 CpG部位と誤認されることになる。

るいは発症機序につなげるという研究は、EWAS の再なっている。それらの CpG 部位はほぼすべての遺伝子現性の低さから疑問視されてしまうことも危惧される。

をカバーしていて、それらの遺伝子の内部にはサーベイ

なぜこのような状況になったのか？筆者らの見立てされる CpG 部位が少なくともいくつかは存在する。もっでは EWAS でほぼ独占的に用いられているプラット

ともヒトゲノムには CpG 配列が 2,800 万箇所存在するフォームであるイルミナ社のメチル化解析用ビーズアレ

ので、測定される CpG 部位の割合としては全体の 3%

イそのものの問題（図５）と、研究者によるその利用の仕にすぎない。また、それらの大半は遺伝子のプロモーター方に問題があるのではないかと考えている。そこで最後領域に偏重する傾向にあり、ゲノムワイドに敷設されたにこのアレイの問題点を提起したいくつかの報告をまとプローブというイメージからは実はほど遠い。最善の手めてみたい。メチル化アレイの使用を検討している方々

法は全ゲノムのバイサルファイトシーケンスであるが、の参考になれば幸いである。

多サンプルに対してはコストの面から見て現実的ではな

イルミナ社はヒトゲノムのメチル化解析用のアレい。そのため現在 EWAS といえば、比較的廉価に行え、イを 2009 年から販売している。2016 年に販売された受託業者も複数登場したメチル化アレイ解析のことを指“Infinium MethylationEPIC BeadChip”（以下、メチル

すといってよい。

化アレイ）は三代目となる。検出原理については図５おそのメチル化アレイの深刻な問題は、アレイに搭載さよび参考文献１を参照していただきたい。このメチル化れたプローブが不可避的に DNA 多型をメチル化の差とアレイでは、ヒトゲノムに存在する 85 万箇所の CpG 部

誤認してしまうことである（図６）。原因は以下になる。

位のメチル化レベルを一度に測定できるという説明にメチル化シトシン（通常 CpG サイトのシトシン）は自然－ 41 －

の脱アミノ化によりチミンへと変化する。この C（pG）

チル化アレイのプローブの実に７割がそのような多型部

から T（pG）へのトランジションは最も頻度の高い多型位に設置されていたという［49］。ちなみに、最近マウス

生成で、当然、同一の民族でも、ましてや異なる民族間の 280K メチル化チップが販売されたが、純系の利用でではより頻繁に見られることになる。一方、日本人研究

きるマウスではもちろんこのような問題とは無縁のはず者、早津が開発し、現代のメチル化解析において欠かせである。

ない技術となったバイサルファイト法はバイサルファイ

イルミナはプローブ設計において多型部位は避けたと

ト処理により非メチル化シトシンをチミン（正確にはウ

しているが、すべての多型部位を避けられるわけでもな

ラシル）に変化させることで、同処理により変化しない

く、またそうしようとすることも現実的ではない。要は［46］。さて、もしこ
メチル化シトシンと区別する（図１）

ユーザーが多型の問題の存在を認識して、提示されたメこである CpG サイトが、メチル化の測定対象となってチル化異常のデータを視覚化するなど精査すると共に、いるときに、メチル化アレイはバイサルファイト処理後メチル化異常部位候補については必ず他の手法を利用しのサンプルを利用するので、そこが TpG であると、そてバリデーションをすればよいのである。

の CpG サイトのシトシンは非メチル化シトシンとしてイルミナ社は、３代目アレイに続いて、 バ イ サ ル

認識する。しかしその TpG はそもそもバイサルファイ

ファイト処理後の標的領域を濃縮する技術（ツイストバ

ト処理前から多型によって TpG だったかもしれないの

イオサイエンス）を次世代シーケンサーと組み合わせた

である
（図６）
。このときサンプル集団内での T のアレ

TruSeq Methyl Capture EPIC（ メ チ ル キ ャ プ チ ャ ー）ル頻度が高いほど、見かけ上、低メチル化に振れてしまを販売した（図７）。メチル化測定できる CpG サイトがうことになる。ここで二つのグループ間でのメチル化差

330 万箇所と現行アレイの４倍近くになった。当然、サを比較すると、その二グループ間でのアレル頻度の差にンプル当たりのコストはそれ以上になった。
しかし、
シー応じて、偽のメチル化差となって提示される。もっとも、

ケンスリードならば CpG/TpG 多型部位があったとして多型が原因のメチル化異常はサンプルのメチル化レベルも、その近傍の SNP からハプロタイプブロックとしてをプロットするとガウス分布ではない、特徴的な分布を認識できるのではないか。これはメチル化アレイに対す示すので［47］、メチル化マーカーの候補が得られたらそるメチルキャプチャーの大きなアドバンテージとなる。

のメチル化レベルのサンプル集団における分布を視覚化

次世代シーケンサーの性能向上に伴いデータ産出量あたすることが大切である。実際、明らかに多型によると見りの単価は下落しており、もし多因子疾患に対するメチ

られるメチル化差のプロットが論文で提示されている

ル化アレイの限界が見えてくるようになれば、EWAS

ケースがある［48］。ある民族間のメチル化差を調べた研の主要なプラットフォームは今後このメチルキャプ

究においては、異なる民族の間ということもあるが、メチャーが取って代わるかもしれない。

イルミナ社 TruSeq Methyl Capture EPIC の検出原理① ゲノムの剪断

メチル化シトシン
非メチル化シトシン

プロモーター 遺伝子(CpGアイランド)② ターゲット領域プローブのハイブリ③ ターゲット領域のキャプチャー
コントロール疾患④ バイサルファイト処理
メチル化シトシン

C→C

非メチル化シトシン

C→U⑤ 次世代シーケンス⑥ メチル化異常の検出

図７

ターゲット濃縮型メチル化解析法
ゲノムをランダムに剪断後、シーケンス用のアダプターを付加する。ついで、主に遺伝子に対して設計されたビオ
チン付のプローブとハイブリさせ、ストレプトアビジンとのアフィニティーを利用して標的配列の濃縮をかける。濃縮された DNAに対しバイサルファイト処理する。ここで一本鎖となった DNAを鋳型として PCR反応を行い、シーケンスの鋳型となる DNAライブラリーを作製する。そのライブラリーを両側から 100 bpずつ読み、リードはイル
ミナ社のクラウド上に置く。同クラウド上で利用できるソフトウェアを用いてメチル化レベルの比較を行う。

－ 42 －

6．まとめhealth and disease. Nat Commun 9: 5068, 2018.

本稿では DNA メチル化が診断マーカーとして、１）

11.

Lo YMD, Han DSC, Jiang P, et al. Epigenetics,

すでに利用されている、２）利用されつつある、３）利用

fragmentomics, and topology of cell-free DNA inが期待されている、三つの疾患領域について概説した。

liquid biopsies. Science 372, 2021.

このうち、２）の体液（リキッドバイオプシー）に含まれ12.

therapy. Cancer Res 37: 646-650, 1977.

報に基づくがん検診は近年特に注目を集めており、詳しく解説した。その理由は、cfDNA メチロームががんにLeon SA, Shapiro B, Sklaroff DM, et al. Free DNA
in the serum of cancer patients and the effect of

る無細胞核酸（セルフリー DNA; cfDNA）のメチル化情
13.

Snyder MW, Kircher M, Hill AJ, et al. Cell-free

とどまらず、将来的に認知症やフレイルを初めとする高DNA comprises an in vivo nucleosome footprint

齢者疾患の発症予測にも利用できるかもしれないというthat informs its tissues-of-origin. Cell 164: 57-68,
2016.

期待があるからである。前者は神経細胞死を後者は筋繊維の減少を伴うため、それぞれの細胞から特徴的なメチ

14.

Heitzer E, Auinger L, and Speicher MR. Cell-Free

ロームを持つ cfDNA が流出している可能性がある。年

DNA and apoptosis: how dead cells inform about

齢のみならず、将来的にこれらの疾患も DNA メチル化

the living. Trends Mol Med 26: 519-528, 2020.

から予測できるようになり、加えて DNA メチル化の加15.

Martins-Ferreira R, Leal BG, and Costa PP. The

齢変化がもたらす遺伝子発現への影響が理解できるよう

potential of circulating cell-free DNA methylationになれば、老化という現象がより理解されるのではない

as an epilepsy biomarker. Front Cell Neurosci 16:852151, 2022.

か、と筆者らは期待する。したがって、高齢者疾患のマー
カーを DNA メチル化に求め探索するということは、予16.

Ja h r S , Hent ze H , Engl isch S , et a l . DNA

防医学や先制医学への貢献はもちろんのことではある

fragments in the blood plasma of cancer patients:

が、筆者らからすれば、老化の根本原理を解明するとい

quantitations and evidence for their origin from

う老化研究そのものなのである。

apoptotic and necrotic cells. Cancer Res 61: 16591665, 2001.

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DNA methylation as diagnostic biomarkers

Shumpei Niida, Ph.D., Nobuyoshi Shimoda, Ph.D.
Research Core Administration,
Research Institute, National Center for Geriatrics and Gerontology

Abstract
Methylation modifications of cytosine bases in the CpG sequence of DNA are covalently
bound and very stable, and can be a good surrogate marker if disease-associatedmethylation variations are found not only at the site of disease but also in the blood.
Until now, the use of DNA methylation as a diagnostic marker in blood has been almost
exclusively limited to imprinting diseases with clear methylation changes. However, withthe advent of next-generation sequencers, the ability to analyze methylated DNA has
dramatically improved, and a large-scale clinical study has begun in the UK to detect many
types of cancer at very early stages based on the methylation of a small amount of free
DNA in the blood of cancer patients. Blood DNA methylation has also shown promise as an
early diagnostic marker for a variety of complex diseases, including dementia.

Keywords：DNA methylation, cfDNA, ctDNA, complex disease, EWAS

－ 45 －