ワークショップ21世紀の生物多様性研究（通算第16回）

DNAで探る生物多様性
12月18日（土）2021年

13:30〜16:35
オンライン開催

要旨集

主 催：国立科学博物館／東京大学大学院総合文化研究科
共 催：国立遺伝学研究所
連絡先：s-net̲info@kahaku.go.jp

https://www.gbif.jp/v2/activities/workshop_2021.html

はじめに21 世紀の生物多様性ワークショップ（通称 GBIF ワークショップ）も 16 回を数え、今回は生物多様性情報の様々なトピックスから、DNA バーコーディングを始めとする、生物多様性情報と DNA との関わりをテーマにすることにしました。DNA を用いて生物種を特定しようという技術である「DNA バーコーディング」が提案されて 20 年近く経過し、研究での利用も一般化してきました。さらに、次世代シークエンサーなどの技術の進展に伴い、汲んだ水から生息する魚種を特定するような、環境 DNA を用いた解析手法やモニタリング等への活用も進み、現場からの期待も高まっています。一方で、種の特定に利用できる国内での網羅的な DNA バーコードライブラリの構築は道半ばという現状もございます。今回は、DNA バーコーディングに関する現在の様々な進捗、課題や期待についてそれぞれの立場から話題提供をいただきます。
本ワークショップは、文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクトによって支援されている活動拠点「日本生物多様性情報イニシアチブ（旧 GBIF 日本ノード）」によって実施されています。日本の生物多様性に関わる情報、特に標本や観察にもとづく分布に関する情報を、地球規模生物多様性情報機構（GBIF）を通じて国際的に発信するのが主要な活動ですが、DNA バーコーディングの普及やデータの集約もまた、本拠点の活動の一つとなっています。技術の進展を背景として、生物多様性データと DNAデータの連携がさらに求められている中、GBIF を含めた生物多様性データベースも活用しつつ、今後の日本における活動について考える場にしたいと考えております。

プログラム時間

演

題

講演者（敬称略）

所属

13:30 ～ 13:35

開会あいさつ神保宇嗣

国立科学博物館

13:35 ～ 14:00

DNA バーコーディングはどんな技術か

神保宇嗣

国立科学博物館

14:00 ～ 14:30

DNA バーコーディングで迫る
東南アジア植物の多様性

遠山弘法

国立環境研究所

14:30 ～ 15:00

Reverse taxonomy を活用した
日本産 Mollisioid 菌類における多様性の探索

板垣ひより

東京大学大学院

15:00 ～ 15:15

休

15:15 ～ 15:45

日本産昆虫類におけるDNA バーコーディングの現状と課題

山迫淳介

農業・食品産業技術総合研究機構

15:45 ～ 16:15

DNA バーコーディングに関する技術は保全や博物館活動の現場でどう活用できる？

金尾滋史

滋賀県立琵琶湖博物館

16:15 ～ 16:30

質問・総合討論

16:30 ～ 16:35

閉会あいさつ伊藤元己

東京大学

憩DNA バーコーディングはどんな技術か
神保宇嗣（国立科学博物館標本資料センター）

生物の名前すなわち種名を調べることは、生物の多様性を理解するための最初の一歩である。しかし、一から種名を調べるには、分類群に関する膨大な知識と、解剖などの専門的な技術が必要である。専門的な同定作業の主な担い手である生物分類学者の数が減少する中、DNA を用いた同定手法が提案されるようになり、DNA バーコーディングはその一つである。
DNA バーコーディングは、種の特徴となる、決められた短い塩基配列を利用した同定技術で、2003 年にカナダの研究者 Paul Hebert らによって提唱された。この塩基配列は DNA バーコードと呼ばれ、動物ではミトコ
ンドリア DNA の COI 領域の約 650 塩基対である。同定の仕組みは以下のようになる（図 1）。
1）専門家が同定した標本から DNA バーコード配列を決定し、参照用データベースを作成する。
2）未知のサンプルからも同様に DNA バーコード配列を決定し、これを参照用のデータベースで検索する。
3）一定以上一致する DNA バーコードが登録されていれば、その DNA バーコードを得た標本の種名を、同定結果とする。
DNA バーコーディングの重要な点として、参照用の DNA バーコードの同定を担保する証拠標本があり、これを通じて専門家の知見を利用していること、短い塩基配列なので、最新の技術を導入しづらいような所でも利用できること、国際的なプロジェクト（国際バーコードオブライフ）により、DNA バーコードデータの蓄積が世界的に進んでいること等があげられる。DNA バーコード公式のデータベースである Barcode of Life
Data Systems（BOLD）には、1,000 万件を越える DNA バーコードと証拠標本の情報が登録されている（図 2）。

図 1 DNA バーコーディングの仕組み

GBIF ワークショップ

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21世紀の生物多様性研究

DNA バーコーディングは、様々な形で利用されている。分類学的研究では、隠蔽種や地域間の比較研究に大いに役立っているほか、幼虫と成虫の組み合わせの確認、古いタイプ標本の DNA バーコード配列を特定しての比較、などが行われている。身近なところでは、食品偽装のチェックなどにも応用可能な技術である。
DNA が残っていれば利用できる特性を生かし、糞の内容物や、汲んだ水の中に含まれる DNA（環境 DNA）を用いた生息する生物の特定などに用いられることがあり、今後は環境調査での利用も増加すると考えられる。
いわゆる種分類を DNA バーコードの情報のみで行うことは難しいが、DNA バーコードを使った分類も試みられている。BOLD データベースでは、DNA バーコードを機械的にグループ分けし、これによって認識された「種の候補」となる各グループに、BIN と呼ばれる番号をつけて整理している（図 3）。この番号を種のように使うことで、熱帯域のように種分類が遅れている地域であっても、およそ種レベルの多様性を比較することが可能になった。
DNA バーコーディングが提唱されて 20 年近くが経過し、世界的に見ればデータの蓄積とその利用が進みつつある。しかし、それぞれの地域や分類群で事情は異なっている。日本の場合には、国として DNA バーコードを推進する枠組みが無く、参照用の DNA バーコードデータの集約も進んでいないのが現状である。今後日本の生物学コミュニティとして、データの蓄積を強調して実施していくことが必要であろう。

図 2 BOLD データベースの概要

図3

従来の種分類と BIN（Barcode Index Number）

DNAで探る生物多様性

5DNA バーコーディングで迫る
東南アジア植物の多様性

遠山弘法（国立環境研究所生物多様性領域）

DNA バーコーディングは、種同定を簡便にする方法として広く使われるようになってきた。植物では rbcLと matK が標準的バーコード領域として適用されており、国立遺伝学研究所にはそれぞれ ca. 32 万件、ca. 22 万件が登録されている（2021 年 11 月現在）
。形態による種同定と DNA バーコーディングによる種同定を比較した熱帯林における研究では、科レベルで 100％、属レベルでは 46−100％、種レベルでは 15−99％の一致が見られている。DNA データバンクにおける reference の有無、分類群における解像度に依存するので、一般的な値を出すことはできないが、科レベル、属レベルではある程度信頼がおけるということが分かってきている。
東南アジア熱帯林は世界的に有数な高い植物多様性を持つ地域であり、その多様性の実態はいまだ解明されていない。一方で、パームオイルやゴム園のための皆伐、開発行為、違法伐採により、その森林は減少しており、多様性評価が急務となっている。しかしながら、形態に基づく種同定や新種記載には多くの時間が必要とされ、多様性評価のボトルネックとなっている。そして、熱帯林で研究を行う分類学者の減少が、この状況に拍車をかけている。本講演では、分類学的発見の手助けとなる DNA バーコーディングをカンボジアのプロット研究（図 1）、東南アジアにおける新種記載に適用した事例（図 2）を紹介する。
DNA バーコーディングは種を識別する際に非常に有効な方法である。しかしながら、区別しようとする種の DNA バーコード情報がデータバンクに登録されている必要があり、熱帯林植物についてはまだまだ情報不足なのが現状だろう。これまで、DNA バーコード情報の取得は、サンガー法によるシーケンスに基づいて行われてきたが、近年、次世代シーケンシングを利用した研究が進んでいる。DNA 劣化が見られるサンプル、複数の種から採取されたサンプル、夾雑物を含むサンプルに対して適用でき、さらに一度に複数のシーケンシング反応、クローンテンプレートの分離、優れた感度、所要時間の短縮など多くの利点がある。最後に、最近の DNA バーコード事情について紹介したい。

GBIF ワークショップ

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21世紀の生物多様性研究

図 1 DNA バーコーディングで驚いた植物

図 2 新種記載

DNAで探る生物多様性

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Reverse taxonomy を活用した日本産 Mollisioid 菌類における多様性の探索
板垣ひより（東京大学大学院理学系研究科国立科学博物館連携大学院）

Mollisioid 菌類（子嚢菌門ビョウタケ目 Mollisiaと、それに近縁な菌類の総称）は、温帯を中心に分布し、小さな子実体（きのこ）をつくる腐生菌として知られる（図 1）。Mollisioid 菌類は形態的な特徴に乏しいにも関わらず（あるいはそのために）、多くの種が記載され、ビョウタケ目で最も多様な菌群である。近年、次世代シーケンサーを用いた研究により植物組織から本菌群の DNA が検出され、腐生だけでなく生きた植物にも潜在することが示唆された（Toju et al., 2013）。このように、生態学・分類学において重要な菌群である一方、日本ではわずか数種の新産種（国内での分布

図1

Mollisioid 菌類の子実体が確認された既知種）報告にとどまっている。
本菌群の中で最も種数の多い Mollisia を対象に、GBIF（https://www.gbif.org/ja/）でオカレンス検索したところ、日本では 508 件がヒットし、本属の菌は全国的に分布していることが明らかになった（図 2）。このうち450 件は国立科学博物館（科博）の標本であり、その 9 割以上は種名が不明であった。これは、形態観察のみに基づく種同定が難しいことが原因と考えられる。
Mollisioid 菌類は、子実体からの菌株の分離と培養が比較的容易であることから、科博では菌株も保管されている。近年、菌類の核リボソームの Internal Transcribed Spacer（ITS）を種の識別領域とする DNA バーコー
ディングは広く利用されつつある（Schoch et al., 2012）。
そこで本研究では、まず科博の菌株から DNA を抽出し、ITS 領域における相同性から遺伝的なまとまりを把握し、次に標本の形態観察によって再同定を試みる逆分類学的な手法を用いて、日本産 Mollisioid 菌類における種多様性を探索した。
その結果、Mollisioid 菌類と思われる標本由来の 186 配列が、98.5％以上の遺伝的相同性を示す 65 のクラス
ターにまとまった（図 3）。このうち 13 のクラスターでは、ITS 領域が得られている既知種と 99.5％以上の遺伝的相同性を示された。標本を詳細に観察し、既存の文献の記載と形態を比較したところ概ね一致し、計 2 属 13種の日本新産種が明らかとなった。

GBIF ワークショップ

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21世紀の生物多様性研究

図 2 国内における Mollisia 属菌の分布図 3 科博標本から見出されたクラスター

以上から、本研究においても DNA バーコーディングは菌類の多様性解明に有効であることが示された。今後は、菌類の DNA バーコードデータベース UNITE（https://unite.ut.ee/）を活用することで、本菌群の世界レベルでの地理的分布や新たな生態的側面、そして分類学的な新知見が期待される。
・ Schoch, C.L., Seifert, K.A., Huhndorf, S, et al. (2012) Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as auniversal DNA barcode marker for Fungi. PNAS, 109, 6241– 6246.
・ Toju, H., Yamamoto, S., Sato, H., et al. (2013) Community composition of root-associated fungi in a Quercus-dominatedtemperate forest: “codominance” of mycorrhizal and root-endophytic fungi. Ecology and Evolution, 3, 1281– 1293.

DNAで探る生物多様性9日本産昆虫類におけるDNA バーコーディングの現状と課題
山迫淳介（農業・食品産業技術総合研究機構植物防疫研究部門）

昆虫は、生物の半数以上を占めるといわれる地球上で最も多様な生物群である。全世界で 100 万種以上が知られているが、なお未記載種も多く、実際には 3000 〜 5000 万種が存在するともいわれる。これら昆虫は、多様な環境に様々な種が適応しており、多くの農林業の害虫も含むため、生物多様性のみならず、経済分野においても極めて重要なグループである。
こうした多様な昆虫種に対応するためには、まずは同定が必要となる。昆虫の同定には、高度な専門的知識が要求される場合が多く、専門の昆虫分類学者が研究を進め、同定に資する情報を提供している。しかし、近年昆虫分類学者の高齢化および減少が著しく、専門家不在の分類群も増加している。これは即ち、多様な昆虫種を近い将来に同定できなくなる恐れに直面しているということに他ならない。そのような状況の中で注目されている手法が、DNA を用いて同定を行う DNA バーコーディングである。
DNA バーコーディングは、未知のバーコード配列をライブラリデータ（データベースに登録された既存情報）と照合し、同定を行うものである。近年、バーコーディングを活用することで、生物多様性や種間関係、食物網など、生態系についての理解は飛躍的に発展している。しかし、バーコーディングを用いた同定の正確性や解像度は、構築されたライブラリの精度や規模に強く依存するため、ライブラリが充実していない生物群
では実用に至っていない。
そのような背景から世界的にバーコードライブラリ構築が急速に進む中で、日本産昆虫類は大幅な遅れをとっている。実際に、国際データベース Barcode of Life Data Systems に登録されている DNA バーコード配列を検索すると、日本産昆虫の登録配列数は、ごく一部の分類群を除いて著しく少ない。さらに、登録配列のみならず、分類群によっては同定やライブラリ構築の基礎となる分類情報すらも十分に整備されていないものも少なくない。そのため、昆虫類において DNA バーコーディングを広く実用化するためには、その基盤情報の整備が喫緊の課題となっている。
そこで、昆虫分類研究者や昆虫愛好家と連携し、正確な分類情報に紐づいたライブラリ構築を目指す取り組みを開始した。この取り組みでは、DNA バーコード情報を収集するのみならず、得られたデータを分類学にフィードバックし、分類情報の整備、高度化、およびデジタルアーカイブ化も同時に進めている。今回のワークショップでは、日本産昆虫における DNA バーコーディングの現状や課題、今後の展望について紹介したい。

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21世紀の生物多様性研究

図 1 DNA バーコーディングの概要

図 2 昆虫分類学研究との連携図 3 集積されたコレクション・データ

DNAで探る生物多様性

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DNA バーコーディングに関する技術は保全や博物館活動の現場でどう活用できる？
金尾滋史（滋賀県立琵琶湖博物館）

DNA バーコーディングに関する技術は、その進化が目まぐるしく、正直に言うと演者はその技術の発展に全くついていけていない。そんな演者が、さまざまな保全活動や博物館活動に立つ側として、この技術がどのように活用できるのか考えてみたい。
近年、環境 DNA メタバーコーディングなどによる解析は、魚類をはじめ、様々な分類群で活用されるようになってきた。このような技術は地域の生物相の可能性を示すだけではなく、現地調査によって確認が困難な希少種などの検出や、外来種の早期発見などでも有効なツールとなる。近年では、研究者のみならず、NPOや保全団体でも広く活用できるよう、様々な議論やマニュアルの整備などが進められており、試行的に市民参加型で採水を行い、解析を専門機関で行う取り組みも増えてきた。今後、このような技術を使った地域の生物相の把握や生物多様性の保全、モニタリングを進めていく上で、多くの市民や専門家が集う場所としての博物館がその拠点やネットワークハブのような役割を果たしていけると考えられる。
技術の発展と作業の簡略化に伴い、様々な報道でこのような技術が紹介されるようになった。ところが、「コップ一杯の水で生き物がわかる」のような簡略化された表現が広がり、多くの人はそれが本当に水をすくって機械に入れて、ボタンを押せばできると思ってしまうこともある。理想と現実をどう示していくのか、そしてその中で得られた結果を鵜呑みにせず、既存の手法と並行してどう活用していくのか、解釈のあり方も含めた伝え方が今後は重要となってくるだろう。
DNA バーコーディングによる同定は、通常の種の同定過程とは全く逆の手順でいきなり答えが示される。
これらの技術が進んでいく中で、バーコーディングによる結果だけで終わるのではなく、多くのステイクホルダーにとって「ホンモノを見る目」が失われないよう、実体に迫るプロセスとの複合化をこの分野に期待していきたい。

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21世紀の生物多様性研究

図 1 琵琶湖博物館はしかけグループ「うおの会」調査時における環境 DNA 調査の採水作業

DNAで探る生物多様性

13日本生物多様性情報イニシアチブ（JBIF）の活動
GBIF（地球規模生物多様性情報機構、https://www.gbif.org/）はインターネットを介して、世界の生物多様性情報＊を共有し、誰でも自由に利用できる仕組みをつくっています。日本生物多様性情報イニシアチブ （JBIF、https://www.gbif.jp/v2/）は協力機関から収集された生物多様性情報データを国内および GBIF で公開し、国内での普及活動を行っています。日本での GBIF 関連の活動は JBIF によって運営されており、主に文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクト（NBRP）によって支えられています。日本からは国立遺伝学研究所および国立科学博物館からGBIF にデータが提供されています。
国立科学博物館では、全国の博物館・研究機関から標本情報の提供を受け、GBIF および S-Net（サイエンスミュー
ジアムネット、http://science-net.kahaku.go.jp/）を通じて国内外に発信しています。S-Net は国立科学博物館が運営する情報ポータルサイトで、国内の自然史標本情報や自然史系の研究員・学芸員の情報を検索できます。
国立遺伝学研究所では、東京大学土畑重人准教授の研究室と協力し、大学や各種研究機関・プロジェクト研究の成果・印刷物などに公表されている既存の生物多様性情報を整備することで、GBIF に情報を公開しています。

＊ JBIF は 2021 年 6 月に GBIF 日本ノード（GBIF Japan Node）から、日本生物多様性情報イニシアチブ（Japan Initiative for Biodiversity Information）に名称が変更されました。

地球規模生物多様性情報機構（GBIF, https://www.gbif.org/）
日本生物多様性情報イニシアチブ（JBIF, https://www.gbif.jp/v2/）
サイエンスミュージアムネット（S-Net, http://science-net.kahaku.go.jp/）
これまでに開催した「21 世紀の生物多様性研究ワークショップ」のプログラムや資料は JBIF のサイトでご覧いただけます。

https://www.gbif.jp/v2/activities/index.html