一般財団法人向科学技術振興財団 令和２年度 研究助成 成果報告
抗体工学を駆使して改変した抗体に基づく免疫沈降による精度の高い抗原分離技術の開発
Development of highly accurate antigen separation technology by immunoprecipitation
based on antibodies modified by antibody engineering
国立がん研究センター先端医療開発センター 安西高廣

【研究の目的】細胞あるいは組織溶解液中に含まれるタンパク質（ 抗原）を、そのタンパク質（ 抗原）を認識する抗体を用いて分離する手法が免疫沈降である。免疫沈降は抗原の相互作用分子や複合体形成などの情報を得るための手法として汎用されているが、実際にない結合を数多く拾ってしまうという擬陽性の高さが常に問題となっている。本研究は、免疫沈降に用いる抗体側に改変を加え、このような擬陽性を低減した精度の高い抗原分離技術を開発することを目的とする。
【研究の内容、成果】
1,パラトープ改変抗体の作製
免疫沈降実験でよく使われている汎用性のあるタグ抗体として、抗 FLAG タグ抗体 2H8
Ikeda et al. BBRC, 2017）、抗 His タグ抗体 3D5 Kaufmann et al. JMB, 2002）を選定した。各抗体のアミノ酸配列を論文より取得し、抗体可変領域の遺伝子配列を人工遺伝子合成により作製した。得られた遺伝子配列は PCR 増幅し、抗体定常領域を含むプラスミドベクターに組み込んだ。アミノ酸配列情報を基に 2H8（ 図 1）
、3D5（ 図 2）のホモロジーモデルを構築した。構造上外側を向く可能性の高いアミノ酸残基を各 CDR 領域に対して 3 アミノ酸ずつ選択し、変異導入するためのプライマーを設計した。

図1

図2

2,タグ抗体検出のための抗原作製
2H8 抗体（ N 末端側 FLAG タグを認識）、3D5 抗体（ His タグを認 識 ） を ELISA で 検 出 す る た め の 抗 原 と し て 、 FLAGVenusA206K-His コンストラクトを設計、発現ベクターを作製した。Venus206K は緑色蛍光タンパク質の類縁体で、より明るい蛍光を発することから、精製時でも可視化することが可能である 図 3）
。大腸菌 Rosetta2 株に形質転換した後、LB 培地にて培養、IPTG で発現誘導を行い、FLAG-VenusA206K-His を発現する大腸菌を回収した。超音波破砕を行い、Ni-NTA カラムにてアフィニティ精製を行った 図 3）
。次に、ゲルろ過カラムによる精製を行い、濃縮して ELISA 実験に用いた。

図3

3,パラトープ決定のための ELISA スクリーニング
2 で作製した 2H8 抗体変異体発現ベクターおよび 3D5 抗体変異体発現ベクターをそれぞれCHO 細胞にトランスフェクションし、一過性発現を行った。培養上清を回収し、濃度定量のための ELISA を行って溶液中の抗体濃度を算出した。3 で作製した FLAG-VenusA206KHis タンパク質を ELISA 用プレートに固相化し、各抗体濃度を一定にして ELISA を行った。
2H8 抗体では CDRH1、CDRH3、CDRL1、CDRL2（ 図 4）
、3D5 抗体では CDRH1、CDRH3、CDRL1、CDRL3 図 5）が抗原となるタグへの結合に重要であることが示唆された。

図4

図54,パラトープ決定
4 で絞り込んだパラトープ部位の候補を、H 鎖と L 鎖を組み合わせて CHO 細胞にて一過性発現させた。
2H8 抗体では CDRH1、CDRH3、CDRL1、CDRL2（ 図 4）
、3D5 抗体では CDRH1、CDRH3、CDRL1、CDRL3

図 5）作製した 2H8 抗体変異体発現ベクターおよび 3D5 抗体変異体発現ベクターをそれぞれ CHO 細胞にトランスフェクションし、一過性発現を行った。
4 と同様に ELISA 感度を上げるため、3D5 用の固相化には His タグ融合 Tissue Factor を用いた）を行ったところ、4 と同様に ELISA（ 感度を上げるため、3D5 用の固相化には His
タグ融合 Tissue Factor を用いた）を行ったところ、2H8 抗体では CDRH1 と CDRL1 図6）、3D5 抗体では CDRH3 と CDRL1 図 7）がパラトープであることが示唆された。

図6

図75,パラトープ改変抗体と改変前抗体を用いた免疫沈降
4 で構築に成功したパラトープ改変抗体を用いて免疫沈降を行った。2H8 は ELISA における結合能が 3D5 と比較して 1/5 程度と弱いため、開発には 3D5 を用いることにした。まず、免疫沈降用の抗体付加磁気ビーズを作製した。3D5、3D5 パラトープ改変抗体、コン
ト ロ ー ル と し て 抗 CD20 抗 体 で あ る
Rituximab を ProteinG 付加 FG ビーズ（ 多摩川精機）に結合した。ターゲットとなる His
タグ配列付加融合タンパク質を HEK293T 細胞に一過性発現させ、細胞抽出液を調製した。作製した抗体付加磁気ビーズおよび磁気ビーズのみを室温で 30 分反応させ、磁気によ る 精製 をお こ なっ た。 精 製し た溶 液 のSDS-PAGE および銀染色を行った 図 8）。
3D5 および 3D5 パラトープ改変抗体付加ビーズで免疫沈降を行ったサンプルを比較す
ると、ビーズ由来の抗体重鎖および軽鎖、白い図8

アスタリスクで示した非特異成分が等しく、かつ白い三角で示した His タグ配列付加融合タンパク質が免疫沈降できていることが示された。さらに、一般的な陰性コントロールとなりうる Rituximab 付加ビーズやビーズのみを添加したサンプルと比較して、パラトープ改変抗体付加ビーズを用いた場合、擬陽性が大きく低減されたことが示された。

【今後の研究の方向、課題】
本研究期間において、抗 His タグ抗体 3D5、抗 FLAG タグ抗体 2H8 の 2 つのクローンについてパラトープ改変抗体の作製に成功し、抗 His タグ抗体 3D5 について擬陽性を低減した免疫沈降を実施することができた。抗 FLAG タグ抗体 2H8 については、予想していたよりも抗原への結合能が低く、免疫沈降に用いることを断念した。最も汎用されていると考えられる抗 FLAG タグ抗体 M2 クローンに関する質量分析を用いたアミノ酸配列同定の論文
Peng et al. JProteomeRes, 2021）が公開されたことから、今後はこの抗体に関するパラトープ改変抗体の作製および免疫沈降法の確立を行い、本研究助成で得られた成果と合わせ、論文発表を行いたいと考えている。
【成果の発表、論文等】
本研究に関連する論文発表
Identification of CD73 as the antigen of an antigen unknown monoclonal antibody establishedby exosome immunization, and its antibody-drug conjugate exerts an antitumor effect on
glioblastoma cell linesTakahiro Anzai, Shinji Saijou, Hiroki Takashima, Misato Hara, Shingo Hanaoka, Yasuhiro
Matsumura, Masahiro Yasunaga
bioRxiv 2021 doi:10.1101/2021.09.30.462527

本研究に関連する学会発表
抗体上の抗原認識部位であるパラトープ改変抗体の開発研究
安西 高廣、松村 保広、安永 正浩
第 37 回日本 DDS 学会学術集会(2021.6.29-30 千葉・幕張/オンライン)
エクソソーム免疫により樹立したがん特異的抗原未知抗体の抗原決定と抗体開発研究安西 高廣、安永 正浩
第 38 回日本 DDS 学会学術集会(2022.6.29-30 オンライン)