2021.12.18 GBIFWS

Reverse Taxonomyを活用した日本産Mollisioid菌類における種多様性の探索

板垣 ひより（国立科学博物館連携大学院生）

菌類とは？

カビ

きのこ

酵母

共通する特徴・体の基本構造は菌糸（糸状の細胞の連なり）・胞子で分散＆増殖
拡大・小さく見つけにくい

菌類の種多様性▶ 100,000：現在知られている種（既知種）の数▶ 12,000：日本で既知の種数▶ 1,500,000～6,000,000：推定される種数

つまり…
既知種の数は、推定種数の1割に満たない
日本における菌類の多様性はほぼ未解明

Mollisioid菌類とは？
▶ 子嚢菌門ビョウタケ目に属する代表属Mollisiaとそれに近縁な菌類▶ 非常に多くの種が記載されている▶ 冷温～亜熱帯に分布し、倒木や落葉上に小さなきのこをつくる腐生菌（基質を分解して生活する菌類）と考えられてきた▶ 次世代シーケンサーによる研究から、生きた植物からMollisioid菌類に関連するDNAが検出(Toju et al., 2013)

腐生だけでなく共生もすることが示唆日本におけるオカレンス▶ 最も多くの種が知られるMollisia（既知種700種）

でも、たった3種のみが報告（日本産菌類集覧, 2010）▶ 温帯を中心に分布する菌類が日本にだけいないとは考えられない
これまで報告されてこなかった観察記録や、標本の情報はどれくらいあるだろうか？
Mollisiaを対象にGBIF (https://www.gbif.org/ja/)で国内のオカレンスを検索してみると…

https://www.gbif.org/ja/

Mollisiaは全国で記録されている

https://www.gbif.org/ja/

ほとんどが国立科学博物館の標本に由来する
しかし、標本の97％には種名がついていない
多くの標本が所蔵されているにも関わらず、なぜ、種同定されていないのか？

Mollisioid菌類の同定のむずかしさ① 属や種間で形態が非常に類似する
Mollisioid菌類に共通する形態は比較的安定
・無柄かつ無毛の子嚢盤・褐色の球形菌組織で構成される托外皮層
・生きた側糸内の液胞

子嚢盤⇒ 形態だけでの種同定はほぼ不可能
子嚢盤の托組織② 記載された種が多すぎる⇒ 膨大な既知種から形態的特徴が一致する種を探し出すのは大変③ 記載が不十分な種が含まれている+ タイプ標本（属や種の基準となる標本）の喪失⇒ 実態が不明な属や種が多い

側糸菌類のDNAバーコード領域① すべての菌類に存在する② 種内で遺伝的変異が少ない（≒配列の類似度が高い）③ 種内の変異よりも種間での変異の方が大きい
これらの3条件を満たす遺伝子領域の塩基配列▶ リボソーム(rRNA)をコードする遺伝子間のInternal Transcribed Spacer (ITS-5.8S) (Schoch et al., 2012)
小サブユニット
SSU (18s)

ITS1

5.8s

ITS2

大サブユニットLSU (28s)

ca.450塩基対▶ ITS領域における98.5％以上の遺伝的相同性が種の範囲の指標として提唱 (Nilsson et al., 2012)DNAバーコーディングによる同定方法
確実に同定された標本・標本・採取地・年月日・宿主・形態情報 Mollisia cinerea

レファレンス① 参照バーコード配列の取得+② 参照データベース

未知の菌類標本登録
蓄積
仮同定 Mollisia sp.

他にも…
分類形態のない試料④ 相同性検索③ バーコード配列の取得
環境DNA

内生菌の分離菌株“M. cinerea”
同定結果

DNAバーコード配列が収集・蓄積されると…
『形態に基づいて分類された種からDNAを決定』することから『まずDNAから種を特定し、形態・生態的特徴から分類を検討』できるようになった⇒ Reverse Taxonomy：逆分類法 (Marmann et al., 2005)

本研究では標本（実体）はあるが、形態だけでは種同定が難しいMollisioid菌類の種多様性を把握する

材料と方法形態に基づく
仮同定

乾燥標本

中身

採集試料
一部から分離・培養
111
菌株① DNA抽出とバーコード領域の解析② 遺伝的相同性≧98.5％に基づいてクラスタリング③ 各クラスターの代表配列を参照データベースで相同性検索し、Mollisioid菌類に関連しない配列を除く④ 既知種の参照配列を加えて分子系統樹を作成

Mollisioidと考えられる標本に由来する
186配列から65個のクラスターを検出
20

遺伝子配列の相同性≧98.5%

1816

標本数

1412108
65割はSingleton（1度しか採集されていない）

4201357

9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 63 65

クラスター数仮同定の再検討：やはり形態での種同定は難しい
Mollisioidに形態が似ている別系統の属に誤同定

2018

遺伝子配列の相同性≧98.5%16

3つの属名が与えられた標本が含まれるが、遺伝的に同一

標本数141210

形態的にMollisioid菌類と識別可能な属が混在する⇒分離時のミス？

86Mollisia sp.

4Dactylospora sp.

201357"Mollisia"

9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 63 65"Tapesia""Phialocephala""Belonopsis""Pyrenopeziza"otherバーコード配列が得られている既知種と99.5％以上の相同性を示す13クラスター

20
18

Mollisia caesia or fallens

16

Ph. nodosa

14

標本数

遺伝子配列の相同性≧98.5%

Phialocephala oblonga

M. cinerea

Ph. scopiformis

12

Ph. piceae

10日本産標本と既知種の形態がおおむね一致⇒ 計2属13種の新産種
他は、配列が得られていない
既知種 or 未記載種の可能性

M. nigrescens
M. melaleucaPh. mallochii

86M. amenticola
M. rava

4Ph. biguttulata

M. diesbachiana
Ph. glacialis

M. olivascens

201357

9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 63 65

クラスター数Phialocephala s.s.

TS-5.8S rDNA
無根NJ tree※Boldは参照配列

分子系統解析
▶ 日本産標本と既知種が近い

遺伝的距離を示す▶ タイプ種を含むMollisia およびPhialocephala のいずれからも独立するクレード（枠内）を特定

Mollisia s.s.

標本に共通する形態＆生態的特徴から、Mollisioid菌類に属するBelonopsisの新種であることが示唆

Belonopsis sp. nov.

Mollibase (http://mollibase.jboli.org/ja)

国立科学博物館に所蔵されている
Mollisioid標本のデータ（採集情報、バーコード配列、形態のスケッチ etc.）を公開

UNITE：菌類DNAバーコードによる種認識と分子同定を支援するデータベースhttps://unite.ut.ee/

2020年12月11日時点のITS配列登録数は約250万件、遺伝的差異1.5％の閾値で認識されるSHはおよそ12万件⇒ 12万種に相当すると考えられる

識別子SH (種仮説：Species Hypothesis)▶ DNAバーコードにおける遺伝的差異が1.5%（＝相同性98.5％）でまとまる配列集団に付与▶ 種同定されている/いない配列の両方に共通するSHが与えられる場合もあるhttps://unite.ut.ee/

同様に、バーコード配列が得られているMollisiaにおいて認識されるSHから、79種ほどが存在すると予想

Mollisiaに関連する79SH

種名の付いたSHも含まれる

SHで認識されるMollisiaは79種650配列からなる
SH1523467.08FUは種名不明

https://unite.ut.ee/https://unite.ut.ee/

個々のSHはデジタルオブジェクト識別子としても機能するため、論文やインターネットサイトからのアクセスやデータの特定が可能

SH1523467.08FU
土壌の環境DNA配列とともに、子嚢盤由来の配列（赤枠）が含まれる

形態的な情報のない菌類の配列でも、子実体由来の配列とリンクすれば種が記載できる
https://unite.ut.ee/

Mollisia cinerea : SH1524851.08FU

https://unite.ut.ee/

針葉樹の葉やツツジ科・ブナ科の菌根、土壌などから分離/検出された配列（例：青枠）と、子嚢盤由来の配列（赤枠）に同じSHが付与され、学名も与えられている

新たな宿主や生息場所など、知られざる生態的側面を明らかにできる

菌類DNAバーコード

ワークベンチ
遺伝子配列

オカレンス情報

学名目録

生物情報

記載文献

様々なデータベースや情報機関と連携し、未記載の種でも、実体から分子に至るあらゆる情報を入手・活用できる環境が整っているまとめ▶ DNAバーコーディングは、実体のない菌類サンプル（環境配列や分離菌株）や、形態での識別が難しい分類群の種同定に有効的▶ DNAバーコードの蓄積によって、遺伝子配列に基づいた種多様性の把握や、分類の検討（逆分類）が可能になりつつある▶ バーコードデータベースを活用することで、これまで知られてこなかった菌類の生きざまを知ることができる