誘電泳動によるエクソソームの迅速分離・回収法の開発
Development of rapid separation and recovery of exosome using dielectrophoresis
九州⼤学 ⼤学院システム情報科学研究院 電気システム⼯学部⾨中野 道彦

研究の⽬的

誘電泳動とは，不平等電界中の誘電体粒⼦に⽣本研究の⽬的は、（1）誘電体微粒⼦に抗原抗体じる現象で，溶媒と粒⼦との電気的特性（分極）反応によってエクソソームを結合して、（2）エクの違いによって⽣じる。すなわち，誘電体微粒⼦

ソソーム結合微粒⼦を選択的に誘電泳動で捕集す（直径数 µm）の分極がエクソソーム（直径数⼗る、という新しいエクソソームの分離・回収法のnm）の結合によって変化する必要がある。そこで，構築をすることである。このとき、捕集に伴う電まずエクソソームの誘電泳動特性を明らかにする

極のインピーダンスの変化から、同時にエクソソこととした。誘電泳動特性が明らかになることで，ームの量も測定する。従来法では数時間から数⽇その分極特性を知ることができる。エクソソーム

要しているが、本法によって簡便かつ迅速な分離・の誘電泳動特性を調べる前に，調製が容易なリポ回収⼿法を実現する。エクソソームは、⽣体内のソームを⽤いてその誘電泳動特性を調べた。リポ細胞外ベシクルの⼀つであり、多様な核酸やタンソームは，リン脂質⼆重膜で形成される液滴で，パク質を含んでいることから、がん細胞などの早エクソソームと構造が似ている。以下，リポソー期発⾒に有⽤ではないかと注⽬されている。本研

ムの誘電泳動特性およびエクソソームの誘電泳動究によって、がん診断などの迅速・簡便化に貢献特性について述べる。

する。

誘電泳動特性評価⽅法
研究の内容、成果

試料溶液を微細電極上に滴下し，交流電圧を印上述の微粒⼦にエクソソームを結合させて検出加して⽣じた誘電泳動を顕微鏡で観察した。誘電する⼿法は，微粒⼦の誘電泳動特性がエクソソー泳動は分極に起因するため，印加電圧の周波数にムの結合によって変化することを期待して考案し依存する。周波数によって誘電泳動⼒の向きが変た（図 1）。
エクソソームは，⽣体内の細胞外ベシクルの⼀つであり，多様な核酸やタンパク質を含んでいることから、がん細胞などの早期発⾒に有⽤ではないかとして注⽬されている。本研究によって，がん診断などの迅速・簡便化に貢献する。
図 2 誘電泳動特性評価に使⽤した電極．
（左）*NQFEBODF%JFMFDUSJDNJDSPCFBET
_tN&YPTPNF&YPTPNFMBCFMFENJDSPCFBET

外観，（右）拡⼤写真．⿊い部分が電極．
5JNF

4FMFDUJWFSFDPWFSBOERVBOUJGJDBUJPO

図 1 本研究が⽬指す⼿法の概念図
Fig. 1. Conceptual image of aim of this research.

Fig. 2. Microelectrode used for evaluatingdielectrophoretic property. Macro (left) andmagnified(right)images.

Black

correspond to the chromium electrode.

regions

化し，粒⼦の分極が溶媒の分極に⽐べて⼤きい時直径に対してプロットしたグラフを⽰す。実験値

は⾼電界領域に移動する⽅向に働き（正の誘電泳を基に，リポソームの電気的特性を予想し計算し動），粒⼦の分極が⼩さい場合は低電界領域移動す極部が⾼電界となる。誘電泳動⼒がゼロになる周波数をクロスオーバー周波数と呼び，これが誘電泳動特性の代表的な値である。
本研究では，キャッスルウォール型微細電極を3000
Cross-over freqeuncy (kHz)る（負の誘電泳動）。微細電極を⽤いた場合は，電⽤いた。これはガラス基板上にクロムで形成したもので，最短ギャップ⻑は 5 µm である（図 2）。

リポソームの誘電泳動特性
リポソームキット: リポソーム調製⽤脂質混合物（L4395，Sigma-Aldrich）をリン脂質として⽤い，NanoSizer Extrusion Kit（T&T Scientific）を⽤いて粒径を調製した。リポソームの粒径は，1，5，10 µm とした。⽣体由来リポソームと同じ浸透圧にするために，リポソーム内部溶液に 9%スクロースを加えた。
図 3 に直径 5 µm に調製したリポソームの誘電泳動を⽰す。リポソーム内部導電率を 1.2 mS/cm，外部⽔溶液の導電率を 20 µS/cm に調製したときの結果で，600 kHz 以上で正の，400 kHz 以下でー周波数を測定した。
図 4 に，リポソームのクロスオーバー周波数をCalculated

2000
1500
10005000

図 42468Diameter (µm)

1012

リポソームの直径とクロスオーバー周波数の関係．ポイント：実験値，ライン：計算値．
Fig. 4. Relationship between liposome diameterand the cross-over frequency ofdielectrophoresis. Points and line indicate
measured and calculated values, respectively.
表 1 計算されたリン脂質⼆重膜の性質
Table 1. Calculated electrical characteristics ofphospholipid bilayer.
膜の導電率

4.6 × 10!" S/m膜の⽐誘電率10

膜の表⾯コンダクタンス

2.5 × 10!#$ S

800
Cross-over freqeuncy (kHz)に調製したリポソーム についてもクロスオーバ

Measured0

負の誘電泳動が⽣じた。クロスオーバー周波数はおよそ 500 kHz であった。
同様に直径 1 µm，
10 µm

2500

700

Measured600

Calculated

500
400
300
200
10000

図 550100150
Medium conductivity (µS/cm)

200

⽔溶液の導電率とクロスオーバー周波数の関係（リポソーム：5 µm）．ポイント：実験値，ライン：計算値．
図 3 リポソームの誘電泳動．正（左，600 kHz）

Fig. 5. Relationship between mediumおよび負（右，100kHz）の誘電泳動．

conductivity and the cross-over frequency ofFig. 3. Dielectrophoresis of prepared liposome

dielectrophoresis. Diameter of prepared(5 µm in diameter). Positive (left, 600 kHz) andliposomes was 5 µm. Points and line indicate

negative (right, 100 kHz) dielectrophoresis.

measured and calculated values, respectively.

た結果を曲線で⽰す。計算結果から，リポソーム正の誘電泳動を⽰した。また，⽔溶液の導電率がの電気的特性について表 1 に⽰す数値が⽰された。

1.65 mS/cm では，50 kHz〜5 MHz の範囲において誘電泳動は⽣じなかった。

図 5 に直径 5 µm のリポソームにおいて，⽔溶蛍光染⾊による電気的特性（ゼータ電位）の変液の導電率を変化させたときのクロスオーバー周化は少ないことが⽰されている。そのため，ここ波数を⽰す。表 1 の計算結果を⽤いて計算した結で得られた誘電泳動特性はエクソソームそのもの果を曲線で⽰す。⽔溶液の導電率が⼤きくなるにの分極に起因する。得られた誘電泳動特性は，コつれて，計測値と計算値との間の差が⼤きくなっア−シェル型誘電体の挙動を⽰唆している。エクた。このことは，クロスオーバー周波数から電気ソソームは，そのサイズが⾮常に⼩さいために，的特性を予想する場合には，複数の条件でクロス膜の影響が⼤きく，相対的に内部溶液の電気的特オーバー周波数を取得しなければ，良い予想に繋性の影響が⼩さいと考えられていた。そのため，がらないことを⽰唆している。

コア−シェル構造ではなく，均⼀粒⼦としての挙動を予想していたが，そうではないことが⽰されエクソソームの誘電泳動特性た。すなわち，エクソソーム内部構成によって電⽣乳由来エクソソーム（平均粒径：119 nm，気的特性が変化すれば，その誘電泳動特性が変化

EXMB100L, コスモ・バイオ）を対象として，エクすることを⽰唆している。この結果は，図 1 で⽰ソソーム膜染⾊キット（Red）（EX02，Dojindo）

す⼿法の実現可能性が⾼いことを⽰唆する。

を⽤いて蛍光染⾊した。蛍光染⾊したエクソソー
ムは，限外ろ過膜（Amicon Ultra 10K，Merck）を⽤いて濃縮・精製した。

微粒⼦の核酸増幅検査への応⽤
新型コロナウイルス感染症の⼤流⾏により，

図 6 に蛍光染⾊エクソソームの誘電泳動の様⼦PCR（polymerase chain reaction）に代表される核を⽰す。これは，⽔溶液の導電率を 186 µS/cm に酸増幅検査法の需要が⾶躍的に⾼まっている。こ調製したときの誘電泳動の様⼦で，50 kHz 以下のこでは，微粒⼦を核酸増幅検査に応⽤して，簡便周波数で負の誘電泳動を⽰し，200 kHz〜5 MHzかつ低価格な核酸検査⼿法を検討した。の範囲で正の誘電泳動を⽰した。⽔溶液の導電率

核酸増幅検査法では，検出対象（ウイルスなど）

が 20 µS/cm において，50 kHz〜2 MHz の範囲でから核酸（DNA や RNA）を抽出して，酵素を⽤

図 6 蛍光染⾊エクソームの誘電泳動．電圧印加前（左），負（中，50 kHz）および正（右，200 kHz）の誘電泳動．⽔溶液の導電率は 186 µS/cm．
Fig. 6. Dielectrophoresis of fluorescent-labeled exosomes. Before applying voltage (left), negative(middle, 50 kHz) and positive (right, 200 kHz) dielectrophoresis. The medium conductivity was adjusted
to 186 µS/cm.

いて特異的に核酸を増幅し，その増幅核酸を検出可能である。

する。すなわち，抽出，増幅，検出の三つの⼯程からなる。本研究では，微粒⼦を⽤いて検出⼯程を今後の研究の⽅向、課題簡便かつ無電源に実施する⽅法を考案した。

本研究期間において，リポソームおよびエクソその⼿法は，微粒⼦に磁性微粒⼦を⽤いて，増ソームの誘電泳動特性を明らかにした。この結果

幅⼯程にて得られた増幅 DNA をその微粒⼦に結を基に，図 1 に⽰すエクソソームの迅速分離・検合する。その後， DNA 微粒⼦を親⽔性基板上に出⼿法を実現する。そのためには，最適な誘電率滴下し，基板下⾯に永久磁⽯を設置する。すると，および表⾯コンダクタンスを有する微粒⼦の選択

検出対象 DNA が結合した磁性微粒⼦は，永久磁が必要であり，また，エクソソームの種類，特に⽯の中⼼付近に凝集する⼀⽅で，未結合磁性微粒病気に関連するエクソソームの電気的な特徴付け⼦は，底⾯に均⼀に付着する。この違いは，⽬視が必要となる。

判定可能であるため，増幅 DNA を無電源で検出成果の発表、論⽂等することができる。
図 8 は，PCR 増幅した新型コロナウイルス遺伝⼦を磁性微粒⼦に結合して検出した例を⽰す。

学会発表
1.

陳 皓，吉⽥ 諒，稲葉 優⽂，中野 道彦，末廣NTC は non-template control を⽰し，検出対象

純也，“リポソームの誘電泳動特性の数値計算

DNA がない場合である。数字は PCR に導⼊した解析”，2020 年度電気・情報関係学会九州⽀部

遺伝⼦数を⽰しており，10 個以上で微粒⼦の凝集連合⼤会（第 73 回連合⼤会）．

が⾒られた。

2.

吉⽥ 諒，陳 晧，末廣 純也，中野 道彦，稲葉

磁性微粒⼦の凝集は 1 分以内に完了するため，優⽂，“DNA 増幅と微粒⼦誘電泳動を⽤いた

従来のゲル電気泳動法に⽐べて格段に速く，Real-DNA 検出を⾏うデバイスの検討” ，2020 年

time PCR のような蛍光検出に⽐べて安価に実施

度電気・情報関係学会九州⽀部連合⼤会（第73 回連合⼤会）．
3.

Before陳 皓，吉⽥ 諒，⼭川 翼，稲葉 優⽂，中野道彦，末廣 純也，“リポソームの誘電泳動特性

Initial copy number
in PCR sol.

NTC

10100に関する基礎検討” ，令和 3 年電気学会全国1000⼤会．
論⽂発表

After

10 mm

1.

M. Nakano, M. Inaba, J. Suehiro, “Rapid andlow-cost amplicon visualization for nucleic

Initial copy number
in PCR sol.

NTC

101001000

acid

amplification

tests

usingmagnetic

microbeads,” Analyst (2021) 146, 2818-2824.
図 7 DNA 結合磁性微粒⼦の凝集の様⼦．
Fig. 7. Accumulation of DNA-labeled magnetic
microbeads. Permanent magnets were placed
under the hydrophilic substrate. NTC means
non-template control. Numbers indicate initial
copy numbers of target DNA poured in PCR
solution. (Analyst, 2021, 146, 2818)