向科学技術振興財団

研究助成成果報告書

免疫細胞の分離を志向した糖残基修飾界面の創製
Preparation of sugar chain modified bio-interfaces for separation of immune cells
助成年度

令和３年度研究助成

助成番号

MZR2022004

研究期間

2022/04/01

代表研究者

能﨑～優太(Yuta Yoshizaki)

東北大学大学院
キーワード

2023/03/31
薬学研究科

分子薬科学専攻

星型高分子，リン脂質ポリマー，細胞接着抑制，選択的細胞接着

１．研究の背景と目的

重合体，MPC ポリマーは，高分子，ラミックス，免疫細胞を選択的に捕捉し，機能的に均一な細金属など医療機器に幅広く利用されている材料

胞集団を分離することができるインテリジェンにコーティングすることが可能で，人工細胞膜表ト界面を創製することを目的とする。樹状細胞な面 を 作り出すことができる 。MPC と n-butyl

どの抗原提示細胞は獲得免疫を制御するためのmethacrylate (BMA) を共重合したポリマー，鍵となる細胞であり，異常な細胞やウイルス，細poly (MPC-random-BMA) (PMB)でコーティングし菌の排除や自己組織への寛容といったホメオスた表面は生体親和に優れ，とくに MPC ユニットがタシスの維持において重要な役割を果たしてい約 30mol%の PMB を用いたコーティングが最も細る。特にアレルギーや自己免疫疾患においては，胞接着抑制効果が高いことが明らかとなってい抑制性の免疫細胞を局所で生じさせることが重る[1]。またフェニルボロン酸成分を含むリン脂要である。樹状細胞を任意の場所に集め，特定の質ポリマーをコーティングした表面は，ヒト前骨機能を持つ細胞を集めることができれば，免疫が髄性白血病細胞(HL-60)を一時的に接着させ，機関連している疾患の治療に役立つと考えられる。

能的に細胞を分離することに成功している[2]。

最も理想的な生体親和性界面は，天然の細胞膜

一方，スターポリマーは，1 つの原子または複数表面そのものである。細胞膜はリン脂質分子の集の原子団を中心として，そこから 3 本以上のポリ合体からなる二分子膜で構成され，リン脂質二分マー鎖が連結した構造を持つ分岐ポリマーと定子膜の細胞外水相面と細胞内水相面ではリン脂義される。重合技術の発展に伴い，スチレン系，質分子の種類が異なる。細胞の外側と水相との界ジエン系の枝ポリマーを持つスターポリマーが面は電気的に中性なホスホリルコリン(PC)基を種々合成されてきた。分岐構造を持つことでスタ有するリン脂質分子が 80%を占めている。この PCーポリマーはコンパクトな形態・サイズ，低粘度基を側鎖に有するメタクリル酸エステルとして，といった直鎖型ポリマーとは異なる溶液物性を2-methacryloyloxyethyl

phosphorylcholine示すことが明らかになった。近年ではリビング重(MPC) が知られている[1]。MPC を一成分とした共合系やその開始剤，触媒系の飛躍的な進化によりスターポリマーの精密合成と機能化が盛んに研を持つ。さらに機能性のユニットとして糖残基や究されている。特にモノマー配列を制御したブロボロン酸を導入すれば，接着できる細胞を選別すック配列型のスターポリマーを表面に展開したることが可能になると考えられる。本研究では図

場合では，ミクロ相分離構造と呼ばれる周期構造1 に示すような直鎖のポリマーおよび 4 分岐型のをとる場合があり，特定の機能を界面にインストスターポリマー材料を合成し，基板にコーティンールするのに有効である[3]。

グすることで細胞の分離を志向したバイオイン

貪食細胞であるマクロファージや樹状細胞は，ターフェースを創製することを目的とした。まず病原体の表面に存在する分子構造の繰り返しパは最初のステップとして様々なモノマー配列をターンを認識するパターン認識レセプターを持持つ 4 分岐型スターポリマーを合成し，基板にコっていることが知られ，その一つとしてマンノーーティングして，基板表面の元素分析や細胞接着

ス結合レクチン(MBL)がある。MBL は規則正しい間抑制性を調べた。さらに機能性ユニットの導入に隔で分布するマンノースやフコース残基に結合関する検討を行ない，樹状細胞の分離について基するが，不規則な間隔で分布するマンノースやフ礎的な検討を行なった。

コース残基には結合しないという性質を持っている[4]。したがって，人工的に糖鎖残基の配列を２．研究の内容・方法制御した表面を構築することができれば，特定の(2-1) ポリマーの合成細胞のみを捕獲できる表面の創製が期待できる。

原子移動ラジカル重合（ATRP）により親水性モ

そこで本研究では，原子移動ラジカル重合をノマーMPC，疎水性モノマーBMA を用いて 4 分岐ポ用いて，構造が精密に制御されたポリマーを合成リマーおよび比較対照用の直鎖型ポリマーを合する。ポリマーの分岐数や親水性ブロックと疎水成した。水不溶性ポリマーを得るため，本研究で性ブロックの鎖長を変更したポリマーを合成し，は MPC:BMA の仕込み比を 20:80 (mol%) に固定コーティングした基板に接着する樹状細胞の数してポリマーの合成を行った。分岐構造内での配を調べる。親水性のユニットとして MPC を用い，列の影響を調べるためにランダムコポリマー，お疎水性ユニットには BMA を用いた。MPC は細胞膜よびコア部分が MPC，末端部分が BMA となるブロの構成成分であるリン脂質極性基と類似の化学ックコポリマー，コア部分が BMA，末端部分が MPC構造を持ち，そのホモポリマーや BMA との共重合となるブロックコポリマーを合成した。具体的に体は免疫系に認識されず，生体適合性に優れ，タは，溶媒のエタノールに，ペンタエリスリトールンパク質非吸着性や細胞非接着性といった特性テトラキス(2-ブロモイソブチレート)を開始剤として加え，銅触媒として臭化銅(Ⅱ)，配位子として 2,2’-ビピリジン(bpy)，銅触媒の還元のためにアスコルビン酸を添加した反応系で各モノマーを混合した。アルゴンガスを用いて溶存酸素を除去し，60℃に加熱して 22 時間撹拌することで重合した。精製操作として良溶媒にクロロホルム，貧溶媒をジエチルエーテル/ヘキサンを用い，再沈殿を 2 回繰り返した。
(2-2) 基板へのポリマーコーティング

図１本研究の概要。ポリマーの構造。

合成したポリマーを 0.2 wt%になるようにエタ伸長してから BMA ブロックを伸長したポリマーノールに溶解させた。ポリエチレンテレフタレー(4arm-bPMB)を合成することができた。プロトント（PET）基板は調製したポリマー溶液 1 mL に浸核磁気共鳴（1H-NMR）スペクトルから MPC ユニッ漬することでコーティングした。ウェルプレート

トと BMA ユニットの組成は，MPC:BMA = 2:8 であを用いる場合はマイクロピペットを用いて，各ウることが分かった。この組成は合成時に仕込んだェルに作製したポリマー溶液 1 mL を入れ，すぐモノマー組成に概ね一致した。ゲル浸透クロマトに吸い取ることでコーティングを行なった。そのグラフィー測定から重量平均分子量が 4 万程度の後，油回転ポンプを用いて減圧したデシケーターポリマーであることが分かった。合成したポリマ

内に 24 時間静置して溶媒を留去し，ポリマーコーはエタノールに溶解する一方で，水には溶解しーティング基材を得た。

ないことを確認した。また，BMA ブロックを伸長（2-3)細胞接着

す る 場 合 は 配 位 子 と し て bpy で は な く

10 cm シャーレで培養した HeLa 細胞を PBS で

N,N,N’,N”,N”-ペンタジエチルトリアミンを洗浄後，トリプシン処理により接着した細胞を剥用いることでポリマーを合成できることが分か離させて遠沈管に移し，90 g で 3 分間遠心分離をった。

行った。遠心分離後の上清をアスピレーターで除去した。ウシ胎児血清（FBS）10%，抗生物質のペニシリン/ストレプトマイシン 1％を含む DMEM 培
地に再懸濁し，1.0×105 cells/mL となるように調製した。ポリマーでコーティングしたウェルプレートを 30 分間 PBS に浸漬した。30 分後，アス図2

合成したポリマーの概要図

ピレーターで PBS を除去し，FBS を 10%，抗生物質のペニシリン/ストレプトマイシン 1％を含む
DMEM 培地を 0.5 mL ずつ各ウェルに入れた。その5(3-2) ポリマーコーティング表面の分析
PET 基板にコーティングしたポリマーについて

後 1.0×10 cells/mL の細胞懸濁液を 0.5 mL ず

X 線光電子分光法（XPS）を用いて表面の化学組成つ各ウェルに加え，37℃，5％CO2 条件下のインキを分析した（検出角度:45°）。図 3 に 122 eV からュベーター内で 24 時間培養した。24 時間後に位144 eV を走査したスペクトルを示す。131 eV 付相差顕微鏡で観察を行い，アスピレーターで培地近にリン元素（P）の 2p 軌道の光電子に由来するを除去後，PBS 1 mL で 3 回洗浄後，PBS 1mL を添ピークが見られた。

加し，再度観察を行った。洗浄後の表面に接着伸展している細胞の数をカウントした。
３．研究の成果(3-1)ポリマー合成の結果
モノマー配列の異なる３種類のポリマーを合成に成功した（図 2）。MPC と BMA がランダム配列のポリマー(4arm-rPMB)，開始剤から BMA ブロックユニットを伸長させてその後MPC のブロックを伸長させたポリマー(4arm-bPBM)，MPC ブロックを

図 3 各 ポ リ マーコーティング PET 表 面 の P 2 p ス ペ ク ト ル

したがって，本研究で合成した 4 分岐型スター

ポリマーを用いてPET 基板をコーティングできるがみられた。ランダムポリマーコーティング表面

ことを確認した。

では，洗浄しきれなかった球状細胞や細胞同士が(3-3)細胞接着抑制効果接着した細胞凝集塊が洗浄後の表面でも見られ接着細胞を培養する際に汎用されるウェルプたが，ブロックポリマーコーティング表面，特にレートを用いてポリマーコーティング表面への4arm-bPMB コーティング表面ではそれらがほとん細胞接着挙動の評価を行った。コントロールとしど見られなかった。その理由として，ブロックポてポリマーをコーティングしていない Tissue-

リマーであることにより，ランダムポリマーよりculture polystyrene(TCPS)表面，さらに既報[1]も１つの PMB ユニットのサイズが大きいことで，で優れた細胞接着抑制効果を示すことが報告さ

コーティング表面の粗さが異なり，その差が関与れている Poly(MPC-random-BMA)30 (rPMB30)をコしていることが理由の一つとして考えられる。まーティングした表面を用いた。rPMB30 は α,α'-た，この結果から 4arm-bPMB 表面では，末端部分

Azobis(isobutyronitrile) (AIBN)を開始剤としがコア部分の下に隠れるように基材表面へポリて合成した。結果を図４に示す。TCPS では細胞接マーがコーティングされていると考えられる。そ着が確認されたが，rPMB30 コーティング表面ではの結果，非接着細胞の除去が容易だったと考えら

先行研究でも報告されているように接着細胞はれる。また，洗浄後の表面に再び細胞を播いたと観察されなかった。4 分岐型スターポリマーコー

ころ，同じように細胞接着の抑制効果を確認した。

ティング表面でも細胞接着は抑制されることがしたがって，本研究で構築したポリマーコーティ分かった。これはスターポリマーでも表面コーテ

ング表面は，繰り返し使用できる再利用性を示すィングをすることが可能であり，MPC ユニットにことが分かった。

由来する細胞接着抑制効果を発現した結果であると考えられれる。

図5

各ポリマーコーティング表面の洗浄操作前後の位相差顕微鏡像

図 4

各ポリマーコーティング表面への接着細胞数(3-4)免疫細胞分離に関する実験
4 分岐型のスターポリマーについて MPC ユニッスターポリマーをコーティングした表面ではそのモノマー配列の違いにより，接着細胞数がわずかに異なった。この結果についてより詳細に検討するため，細胞懸濁液との接触させた後の洗浄操作を行なう前後で，光学顕微鏡による観察を行なった(図 5)。4 分岐ポリマーコーティング表面
では，細胞接着数に大きな差は見られなかった。
3 種類のポリマーコーティング表面への細胞接着数に大きな差はないものの，洗浄後の様子に違いトと BMA ユニットさらに図 1 に示したようにフェニルボロン酸ユニットを導入した三元系スターポリマーを合成し，(2-2)および(2-3)と同様の方法で細胞懸濁液と接触させた。細胞の種類はマウス樹状細胞株 DC2.4 細胞を用い，予めリポ多糖(LPS)で刺激した細胞群と未処理の細胞群と分けて実験を行なった。三元系スターポリマーをコーティングした表面では LPS で刺激した DC2.4 細胞は接着せず，LPS 未刺激の細胞は接着した。DC2.4細胞は LPS の刺激によって，細胞表面に発現する糖タンパク質などの発現が変化する。つまり，細細胞の分離が可能なバイオインターフェースを胞表面に発現している分子の変化に応じてポリ構築することができた。

マーコーティング表面への細胞接着性が変化したと解釈することができる。以上より，機能的に５．今後の研究方向性・課題

異なる免疫細胞を分離できる表面を構築できる

今後の課題として，BMA と共重合した PMB スタ

コーティング材料として 4 分岐型スターポリマーーポリマーにとどまらず，MPC のホモポリマーをが有用であることが示唆された。

スターポリマー化し，その末端官能基変換により物理吸着ではなく化学吸着により表面修飾が可

４．結び

能なスターポリマーの合成および表面修飾を行

本研究では,生体親和性に優れた MPC ポリマーい，その特性評価をおこなうことや，PMB スターを４分岐型のスターポリマーとして合成し，細胞ポリマーに新たな機能を持つ第三のモノマーユ分離を目的としたバイオインターフェースの開ニットを組み込んだ三元系スターポリマーを合発をおこなった。疎水性ユニットとして n-butyl成する。特に本研究では糖残基を修飾したスターmethacrylate (BMA)を用い，MPC ユニットが仕込ポリマーの合成については未だ十分に検討でき

み比で 20 mol％のランダム ポリマーと 2 種類ていないため，糖分子を導入したポリマーの合成1のブロックポリマーを合成した。H-NMR 解析の結をおこなう予定である。さらに接着した細胞と接果，合成したポリマーはおおよそ仕込み通りの組着しない細胞についてその機能を調べることで，成比であることわかった。ブロックポリマーに関分離可能な細胞に関する基礎的な知見の確立をしては末端側に重合したユニットの組成比が 低行なう。新たなバイオインターフェースの創製を下する傾向が認められた。溶解性試験により，合目指し，コーティング用ポリマー材料の合成と評成したすべてのポリマーは水不溶性であり，エタ価をおこなっていく。

ノールに可溶であることが分かった。ディップコート法により合成したポリマーを基板にコーテ

６．参考文献ィングすることで，MPC スターポリマーコーティ[1] K. Ishihara. J Biomed Mater Res A.

ング表面を作製した。表面の XPS 解析の結果，基2 0 1 9 , 107A , 933-943.

板へのポリマーコーティングができていること[2] K. Ishihara et al. Macromol Biosci. 2021,を確認した。HeLa 細胞を用いたコーティング表面

21 , 2000341.

への細胞接着挙動を評価した結果，ポリマーの分[3] J. Chen et al ., Smart Mat . 2021, 2 , 367-

岐構造や配列に関わらず優れた細胞接着抑制性377.

があることが分かった。また，スターポリマーコ[4] B. Lepenies et al ., Adv Drug Deliv Rev.

ーティング表面については，各ユニットの配列を2 0 1 3 , 65 , 1271-1281.

明確に規定したブロックポリマーにおいて，配列が不明瞭なランダムポリマーと比較して，非接着学会発表

細胞の除去性（洗浄性）に優れることが示唆され第 71 回高分子討論会 「星型リン脂質ポリマーた。さらにフェニルボロン酸構造を機能性ユニッによる細胞内デリバリー」能﨑優太，金野智浩

トとして導入した4 分岐型スターポリマーコーテ
ィング表面は，LPS で刺激した DC2.4 細胞は接着しないが，未刺激の細胞は接着したことから免疫