D-AMINO ACID IN FOOD: OCCURRENCE, PRODUCTION MECHANISM, AND
FUNCTION
Tadao Oikawa
Department of Life Science & Technology, Faculty of Chemistry, Materials and Bioengineering,Kansai University
3-3-35, Yamate-Cho, Suita-Shi, Osaka-Fu, 564-8680, Japanoikawa@kansai-u.ac.jp
Fax: 06-6388-8609
Abstract
In general, enzymes are essential molecules formaintaining of life and are composed of various
amino acids.
The amino acids synthesizedchemically contain both D- and L-amino acids, but
enzymes contain exclusively L-amino acids in their
peptide chains. This fact leed to the origin of life,and many theories were mentioned but anyway bothD- and L- amino acids co-existed at the beginning of
the forming of the earth. Accordingly, D-aminoacids exist more than 50 milion years ago in nature,
but the existence of D-amino acids have been ignored
until the analytical methods for D-amino acids
develope. Recently, much attention has been payed
for the relationship between D-amino acid in foodand their function in life.
In this work, I will describe D-amino acid infood, especially in sake, and discuss about occurrence,
production mechanism, and function of D-amino acidin sake. I analyzed D- and L-amino acids contents
of 141 kind of sake by combination of 3 diffenrent
chiral derivertization methods for high-performanceliquid chromatography. I analyzed the relationshipbetwee D- or L-amino acid content and taste of sakeusing principle component analysis. I found that
D-amino acid content of sake increased when it was
produced with Kimoto. The lactic acid bacteria
contained Kimoto produced extracellularly D-alanine,D-aspartic acid, and D-glutamic acid. Principle
component analysis revealed that D-alanine,D-aspartic acid, and D-glutamic acid in sakeincreased umami and total evaluation of sake. This
new function of D-amino acid in food will makevarious functional foods and contribute to humanhealth in daily life.

等量生成するが、酵素タンパク質を構成するアミノ酸はすべて L 体である。生命誕生の起源にもつながるこの謎には、多くの学説が唱えられているが、いずれにしても地球創成期から宇宙には L
体と D 体のアミノ酸が存在していたことは明らかである[1]。したがって、人類が誕生したとされる約 500 万年以上前から自然界には D-アミノ酸が存在していたが、近年分析技術が進展するまでその存在は見過ごされてきた。特にヒトが摂取する食品中の D-アミノ酸は、生命現象との関連性から注目されている[2,3,4,5,6,7]。
	  本論文では、食品中の D-アミノ酸について、
日本の伝統的発酵食品である日本酒を例にその存在、生成機構、機能について、著者の最近の研究成果をもとに論じる。まず 51 社の酒造会社の141 種類の日本酒中に含まれる D-及 L-アミノ酸を定量し、各製品の D-及 L-アミノ酸濃度、生産地、日本酒度、アミノ酸度、原料米の精米歩合、
アルコール度数、原料米の品種、醸造方法を検討する。これらのデータに基づき、日本酒中に含まれる D-及び L-アミノ酸の種類を特定するとともに、それぞれの含有濃度範囲を推定する。また、
D-アミノ酸濃度の高い日本酒の D-アミノ酸濃度と生産地、日本酒度、アミノ酸度、原料米の精米
歩合、アルコール度数、原料米の品種、醸造方法との間に関連性を見出す。また 51 社の酒造会社の 141 種類の開封直後の官能評価試験の結果を主成分分析で解析し、日本酒中の D-アミノ酸が日本酒の味や総合評価に及ぼす影響を解明する。
さらに、生酛、速醸酛、乳酸菌添加生酛（簡易生酛）の 3 種類の日本酒醸造方法のさまざまな工程で採取した試料中に含まれる D-及び L-アミノ酸の定量分析や官能評価の低い日本酒への D-アミノ酸添加と官能評価試験を実施するとともに主成分分析で日本酒中の D-アミノ酸濃度と味の評
価を解析し、醸造方法や醸造工程が日本酒中のD-アミノ酸含有量に及ぼす影響や日本酒中の Dアミノ酸が日本酒の味に及ぼす影響を解析し、D-アミノ酸濃度の高い、味や総合評価が優れた日本酒を製造する方法を、製品情報と製造方法及び工程の両面から解明することを目的とする。

(Keywords)
D-Amino acid, Functional food, Sake, Amino acidracemase, Kimoto, Lactic acid bacteria, Principle
component analysis

食 品 中 の D-ア ミ ノ 酸 ： 存 在 、 生 成 機 構 、
機能
老川	
  典夫
関西大学 化学生命工学部 生命・生物工学科〒564-8680	
  大阪府吹田市山手町 3-3-35
FAX：06-6388-8609
E-mail：oikawa@kansai-u.ac.jp

2. 試料と分析
2.1	
  試料
	
  分析には、51 都道府県の 141 の日本酒をランダムに購入し使用した。これらの日本酒の種別とその数は、大吟醸(9 製品)、純米大吟醸(14 製品)、吟醸(9 製品)、純米吟醸(42 製品)、特別本醸造（2製品）、特別純米酒（9 製品）、本醸造（15 製品）
純米酒（35 製品）、普通酒（6 製品）であった。

１．緒論
	  生命の根幹を担う酵素は、一般にタンパク質から成り、そのタンパク質はアミノ酸で構成されている。アミノ酸は化学合成すると L 体と D 体がViva Origino 40 (2012) 47 - 56
© 2012 by SSOEL Japan2.2	
  分析方法	  日本酒中の D-及び L-アミノ酸の定量には、高47

Viva Origino 40 (2012) 47 - 56

封後保存中に D-アミノ酸の増加が確認された 12
銘柄について、開封直後の日本酒中に含まれる
D-及び L-アミノ酸の分析、定量解析と日本酒中に含まれる微生物の単離と同定を実施した。

速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いた。また、D-及び L-アミノ酸の蛍光キラル誘導体化には、①OPA/NAC プレラベル法（o-フタルアルデ
ヒ ド /N- ア セ チ ル -L- シ ス テ イ ン ） [8] 、 ②
FLEC/AMAM プレラベル法（(+)-1-(9-フルオレニル)エチルクロロホルメート/1-アミノアダマンタン）[9]、③OPA/NAC ポストラベル法[10]を併用することにより、システイン（システインは DLシステインとして定量）とグリシン(光学異性体がない)を除く全ての日本酒中の D-及び L-アミノ酸を定量した。D-及び L-アミノ酸は検量線法で定量した。①～③の蛍光キラル誘導体化法について、それぞれ検量線を作成することにより、蛍光キラル誘導体化法の違いによる蛍光強度の違いを除外した。①、②、③の蛍光キラル誘導体化法
での D-及び L-アミノ酸の測定可能な範囲は、それぞれ 6 nM～20μM、10 nM～20μM、1.5 μMであった。また、D-アミノ酸の相対含有割合(%D)
は、%D = 100×AD/(AD+AL)、
AD:D-アミノ酸のピーク面積
AL:L-アミノ酸のピーク面積で算出した。

3.3	
  日本酒への DL-アラニン及び L-アラニン添加と官能評価試験	  D-アミノ酸含有量が低くかつ官能評価試験の低い日本酒 3 製品に、DL-アラニン及び L-アラニ
ン を 終 濃 度 が そ れ ぞ れ 0, 0.010, 0.020, 0.050,
0.100, 0.200, 0.500, 1.000, 2.000, 5.000, 10.000 mM
及び 0, 0.005, 0.010, 0.025, 0.050, 0.100, 0.250,
0.5000, 1.000, 2.500, 5.000 mM になるように添加し、官能評価試験を実施するとともに、D-及びL-アミノ酸濃度を定量した。また、主成分分析を行い、DL-アラニン濃度と味の評価を解析した。
3.4	
  生酛系日本酒醸造工程で採取された試料中の D-及び L-アミノ酸の分析と定量解析
	  酒造会社 A 社から提供された生酛系日本酒醸
造工程で採取された試料中の D-及び L-アミノ酸の分析と定量解析を行った。A 社は、D-アミノ酸
濃度が高い仕込み方であることが明らかとなった生酛をその製造方法に用いている。A 社の試料には、酒母、酒母もろみ、米麹（酛麹及び掛け麹）、原料米（兵系酒 18 号、五百万石、山田錦、日本晴）を用いた。仕込み方法は、生酛、簡易生酛、
速醸酛の 3 種の異なる方法の試料を用いた。生酛、乳酸菌添加生酛（簡易生酛）、速醸酛の仕込み 2
日目、膨れ前、戻し、上槽の各工程でサンプリン
グした液体画分（39 サンプル）と原料米（4 サン
プル）、米麹（2 サンプル）の合計 39 サンプル中の D-及び L-アミノ酸含有量を定量した。玄米または米麹はミルで粉砕後、ふるいにかけ、米粉を緩衝液(pH 8)に懸濁した。この懸濁液を超音波破砕後、遠心分離し、除タンパク処理後、中和し、遠心後の上清をフィルターろ過したものを分析試料とした。また液体画分は遠心分離し、除タン
パク処理後、中和し、遠心後の上清をフィルター
ろ過したものを分析試料とした。

3. 方法
3.1	
  日本酒中の D-及び L-アミノ酸の定量的解析
51 社の酒造会社の 141 種類のすべての製品について、D-及び L-アミノ酸の分析と定量解析を行った。サンプルのアミノ酸分析は、プレラベル
型 OPA-NAC キラル誘導体化法でアスパラギン
酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アラニ
ン、チロシン、トリプトファン、バリン、フェニ
ルアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニンの D-及び L-体とグリシンを定量し、また本法
では分離・定量が困難なアミノ酸のうち、システ
インは、DL 体としてポストラベル型 OPA-NAC
キラル誘導体化法で、さらに、メチオニン、アルギニン、グルタミン、アスパラギン、リシン、ヒスチジン、プロリンについては、ADAME 法を用いてそれぞれのアミノ酸の D-及び L-体を分離定
量した。

3.5	
  D-アミノ酸高生産生酛由来乳酸菌の選抜と試験醸造酒の作成
	  生酛由来乳酸菌 Lactobacillus sakei 12 株と生酛
由来乳酸菌 Leuconostoc mesenteroides 16 株は生酛系日本酒醸造会社 A 社から提供されたものを用いた。まず L. sakei 12 株と L. mesenteroides 16
株を、MRS 培地（Glucose 18.5 g, Peptone 10 g, Meat
extract 8 g, Yeast extract 4 g, Sodium acetate 3 g,
K2HPO4 2 g, Ammonium citrate 2 g, Tween 80 1 g,
MgSO4 ・ 7H2O 0.2 g, MnSO4 ・ 4H2O 0.05 g,
Deionized water 1 liter, pH 6.5）で、それぞれ 30℃
で静置培養後、遠心分離を行いその上清を回収した。得られた培養液の上清にトリクロ酢酸を添加し除タンパク後、水酸化ナトリウムで中和し生じた沈殿を微量遠心機で沈殿除去後、その上清をア
ミノ酸分析用サンプルとした。得られた D-及びL-アミノ酸の分析結果に基づき、L. sakei 12 株とL. mesenteroides 16 株から D-アミノ酸高生産株を選抜した。選抜した L. sakei と L. mesenteroides を、
米の酵素分解物を炭素源とする培地で、それぞれ30℃で静置培養後、遠心分離を行いその上清を回収した。得られた培養液の上清にトリクロロ酢酸

3.2	
  日本酒中の D-及び L-アミノ酸の種類・含有量の系統的解析と官能評価分析
51 社の酒造会社の 141 種類のすべての日本酒中に含まれる D-及び L-アミノ酸の種類・含有量の系統的解析と官能評価分析を行った。官能評価試
験は、大阪国税局清酒鑑評会品質評価員 1 名に依頼し実施した。官能評価は、色沢（1. 濁り（あり・なし）、2. 色（無色・黄色・茶褐色）、香り（1. 高低（高い・普通・低い）、2. 酸臭（強い・弱い・なし）、3. 炭臭（強い・弱い・なし）、4. 甘臭（強い・弱い・なし）、5. 特性（新酒臭・吟醸
香・熟成香・個性的））、味（1. 濃淡（旨味ある・
濃醇・普通・淡麗）、2. 苦み（苦みうく・強い・
普通・弱い）、3. 酸味（酸うく・強い・普通・弱い）、4. 旨味（だれる・強い・普通・弱い）、5. 甘味（だれる・甘うく・普通・弱い）、6. その他）、
総合（1. 調和（良好・普通・不調和）、2. 熟度（熟成・普通・若い））について実施した。また、官能評価試験の結果は数値化し、主成分分析で解析した。さらに、開封後一定期間保存中の D-アミノ酸の増加に関与する微生物を特定するため、開48

Viva Origino 40 (2012) 47 - 56を添加し除タンパク後、水酸化ナトリウムで中和し生じた沈殿を微量遠心機で沈殿除去後、その上清をアミノ酸分析用サンプルとした。さらに米の酵素分解物を炭素源とする培地（米培地）で Dア ミ ノ 酸 生 産 量 の 最 も 高 い L. sakei 及 び L.
mesenteroides を選抜し、D-アミノ酸強化日本酒生
産のための試験醸造を行った。試験醸造は①乳酸菌標準菌株を用いる乳酸菌添加生酛、②現在製造に用いられている乳酸菌添加生酛、③D-アミノ酸生産量の最も高い乳酸菌を用いる乳酸菌添加生
酛、④速醸酛の 4 仕込みで行った。また得られら
試験醸造酒の D-及び L-アミノ酸の定量と官能評
価試験を実施した。

カラムには、His-タグ融合タンパク質と強い親和性を示す Ni-NTA アフィニティーカラムを用いた。得られた 7 つの精製酵素標品を用い、7 つの遺伝子産物の酵素科学的特性（分子量、サブユ
ニット構成、基質特異性、補酵素特異性、最適温
度、最適 pH、熱安定性、pH 安定性、酵素反応速度論的パラメーター等）を解明した。

3.6	
  生酛由来乳酸菌の D-アミノ酸代謝関連酵素
活性の探索と D-アミノ酸代謝関連酵素遺伝子のクローニング	  生酛由来乳酸桿菌 Lactobacillus sakei NBRC
15893 のアラニンラセマーゼホモログ遺伝子(alr)、グルタミン酸ラセマーゼホモログ遺伝子(murI)、
アスパラギン酸ラセマーゼホモログ遺伝子(aspr)と生酛由来乳酸球菌 Leuconostoc mesenteroides
subsp. sake NRRC 102480 の 3 つのアラニンラセ
マーゼホモログ遺伝子(alr1、alr2、alr3)と 1 つのグルタミン酸ラセマーゼホモログ遺伝子(murI)を、それぞれ発現ベクターに挿入し、大腸菌に形質転換した 7 つのクローン株を培養し、菌体を集菌した。これらの遺伝子産物は、精製が容易な
His-タグ融合タンパク質として発現するよう発現ベクターを選択した。それぞれの菌体を、超音波破砕機により破砕後、遠心分離を行い、その上清を無細胞抽出液とした。得られたそれぞれの無細胞抽出液から、7 種の遺伝子産物を精製した。
精製には、GE ヘルスケア・ジャパン（株）社製	
 AKTA purifier UPC 10 ベースシステムを用いた。

49

4.	
  結果と討論4.1	
  日本酒中の D-及び L-アミノ酸の定量的解析
	  本研究により、日本酒中の D-アミノ酸の含有
量は、製品によって大きく異なることが明らかとなった（Table 1, Table 2, Table3）。51 社の酒造会
社の 141 種類の日本酒に含まれている各 D-アミノ酸の割合は、D-アスパラギン酸(97.8%)、D-ア
ラニン(96.4%)、D-アルギニン(82.9%)、D-プロリン(71.4%)、D-グルタミン酸(66.4%)、D-バリン(65.7%)、D-リシン(60.7%)、D-フェニルアラニン(59.9%)、D-イソロイシン(58.4%)、D-ヒスチジン(52.1%)、D-アスパラギン(51.4%)、D-チロシン(51.1%)、D-グルタミン(33.8%)、D-ロイシン(4.4%)、
D-セリン(2.5%)、D-スレオニン(0%) 、D-メチオ
ニン(0%)、D-トリプトファン(0%)であることが明らかとなった。一方、51 社の酒造会社の 141 種
類の日本酒に含まれている各 L-アミノ酸の割合
は 、 L- ア ス パ ラ ギ ン 酸 (100%) 、 L- ト レ オ ニ ン(100%)、L-アラニン(100%)、L-メチオニン(100%)、
L-アルギニン(100%)、L-ヒスチジン(100%)、Lアスパラギン(100%)、L-セリン(99.3%)、L-バリン(99.3%)、L-フェニルアラニン(99.3%)、L-プロリン(99.2%)、L-グルタミン(99.2%)、L-イソロイ
シ ン (97.8%) 、 L- リ シ ン (97.1%) 、 L- ロ イ シ ン(88.3%)、L-チロシン(75.9%)、L-トリプトファン(0%)であることが明らかとなった。さらに、DLシステインとグリシンの含有割合は、それぞれ

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75.6%、100%であることが明らかとなった。得られた D-及び L-アミノ酸濃度のデータに基づき、アミノ酸濃度が高い日本酒と D-アミノ酸濃度が低い日本酒について、それぞれ種別、日本酒度、酸度、アミノ酸度、精米歩合、アルコール度数、原料米のデータを比較検討した。その結果、日本酒中の D-アミノ酸含有量と種別、日本酒度、酸度、アミノ酸度、原料米の精米歩合、アルコール
度数、原料米の品種とは、明確な関連性はないことが明らかとなった。しかし、生酛、山廃、赤色
酵母、海洋深層水、長期熟成で仕込まれている日
本酒の D-アミノ酸濃度は、高い傾向が確認された(Table 4)。

4.2	
  日本酒中の D-及び L-アミノ酸の種類・含有量の系統的解析と官能評価分析	  51 社の酒造会社の 141 種類の開封直後の官能評価試験の結果を主成分分析で解析したところ、
第 1 主成分に濃淡と調和が第 2 主成分に甘味と酸味・苦味が寄与する評価結果が得られ、今回解析した日本酒は様々な評価結果をもつことが明らかとなった。これら主成分得点と D-アミノ酸との関係を検討した結果、日本酒中の D-アラニン、D-アスパラギン酸、D-グルタミン酸は、低濃度
では、味や総合評価に影響を及ぼさないが、高濃度にこれらの D-アミノ酸を含む日本酒は、味や50

Viva Origino 40 (2012) 47 - 565)。また、日本酒に L-アラニンを添加すると、官能評価試験の苦みが増強されることが明らかとなった(Table 5)。この L-アラニンによるに苦味の増強は、D-アラニンが共存すると、減少することが明らかとなった(Table 5)。また得られたデータ
を主成分分析で解析したところ、DL-アラニンは、L-アラニンより低濃度で第 1 主成分得点である
濃淡を増加させることが明らかとなった(Table
5)。

Figure 1. The effects of the D-Ala and D-Asp
concentrations in 141 sakes on the PC1 score.

4.4	  生酛系日本酒醸造工程で採取された試料中の D-及び L-アミノ酸の分析と定量解析
	  本研究により、生酛、乳酸菌添加生酛は、日本
酒中の D-アミノ酸濃度を増加させるのに有効な醸造方法であることが明らかとなった。まず各種原料米中の D-アミノ酸濃度を測定したところ、
兵系酒 18 号には D-アスパラギン酸、D-アラニン、D-バリン、D-グルタミン酸が、五百万石には Dアスパラギン酸、D-アラニン、D-バリン、D-グ
ルタミン酸が、山田錦には D-アスパラギン酸、D-アラニン、D-セリン、D-バリン、D-グルタミ
ン酸が、日本晴には D-アスパラギン酸、D-アラ
ニン、D-セリン、D-バリン、D-グルタミン酸がそれぞれ含まれていることが明らかとなった。
D-セリンは山田錦と日本晴にのみ検出された。しかし、原料米中の D-アミノ酸の濃度は全て 1 μ
M 以下であり、日本酒中の D-アミノ酸にはほとんど影響を及ぼさないことが明らかとなった。仕込み後 2 日目の試料中には、簡易生酛では D-ア
スパラギン酸、D-アラニン、D-バリン、D-イソ
ロイシン、D-フェニルアラニンが、速醸酛ではD-アスパラギン酸、D-バリンがそれぞれ存在す
ることが明らかとなった(Figure 3)。D-アラニン、
D-イソロイシン、D-フェニルアラニンは簡易生
酛の試料中には検出されたが速醸酛の試料中には検出されなかったことから、簡易生酛に存在する乳酸菌によってこれらの D-アミノ酸が生産さ

Figure 2. The effects of the D-Glu concentration in 141
sakes on the PC1 score.

総合評価が高いことが明らかとなった(Figure 1,
Figure 2)。一方、日本酒中の L-アラニン、L-アス
パラギン酸、L-グルタミン酸には、D-アラニン、D-アスパラギン酸、D-グルタミン酸のような日本酒の味や総合評価を高める効果がないことが明らかとなった。
4.3	
  日本酒への DL-アラニン及び L-アラニン添加と官能評価試験
	  本研究により、日本酒に DL-アラニンを添加す
ると、L-アラニンよりも低濃度で官能評価試験の旨味が、増強されることが明らかとなった(Table

51

Viva Origino 40 (2012) 47 - 56

れることが明らかとなった。膨れ前の試料中には、
生酛では D-アスパラギン酸、D-グルタミン酸、
D-アラニン、D-セリン、D-バリンが、簡易生酛
では D-アスパラギン酸、D-グルタミン酸、D-ア
ラニン、D-バリンがそれぞれ存在することが明らかとなった(Figure 3)。D-セリンは生酛の試料中には検出されたが簡易生酛の試料中には検出されなかったことから、生酛に存在する微生物によって D-セリンが生産されることが明らかとなった。
戻しの試料中には、生酛では D-アスパラギン酸、
D-グルタミン酸、D-アラニン、D-セリン、D-バ
リンが、簡易生酛では D-アスパラギン酸、D-グ
ルタミン酸、D-アラニン、D-バリン、D-ロイシ
ンが、速醸酛では D-グルタミン酸、D-アラニン、D-バリン、D-ロイシンがそれぞれ存在することが明らかとなった(Figure 3)。D-アスパラギン酸は
生酛、簡易生酛の試料中には検出されたが速醸酛の試料中には検出されなかったことから、生酛、

簡易生酛の試料中に存在する乳酸菌によって Dアスパラギン酸が生産されることが明らかとなった。また D-セリンは生酛の試料中には検出されたが簡易生酛、速醸酛の試料中には検出されなかったことから、生酛に存在する微生物によって D-セリンが生産されることが明らかとなった。
上槽の試料中には、生酛では D-アスパラギン酸、
D-グルタミン酸、D-アラニン、D-セリン、D-バ
リンが、簡易生酛では D-アスパラギン酸、D-グ
ルタミン酸、D-アラニン、D-バリンが、速醸酛
では D-アスパラギン酸、D-グルタミン酸、D-ア
ラニン、D-バリンがそれぞれ存在することが明らかとなった(Figure 3)。試料中の D-アスパラギン
酸、D-グルタミン酸、D-アラニンの濃度は、いずれも生酛が最も高いことが明らかとなった。以上の結果から、生酛、簡易生酛、速醸酛の醸造工
程中には D-アラニン、D-アスパラギン酸、D-グ
ルタミン酸が存在し、D-アラニン、D-アスパラ
ギン酸、D-グルタミン酸は膨れ前から戻しにかけて増加することが明らかとなった(Figure 3)。また、
これらの D-アミノ酸濃度は、醸造方法によって大きく異なり、特に生酛、簡易生酛の醸造工程中の試料に D-アミノ酸が多量に含まれていることが明らかとなった。これらの結果から、日本酒中の D-アラニン、 D-アスパラギン酸、D-グルタミン酸は、生酛、簡易生酛の醸造に関与する乳酸菌
によって生産されることが明らかとなった。
4.5	
  D-アミノ酸高生産生酛由来乳酸菌の選抜と試験醸造酒の作成
	  MRS 培 地 で 培 養 し た 結 果 、 L. sakei, L.
mesenteroides いずれの乳酸菌でも D-アミノ酸の生産総量やその構成比に違いがあることが明らかとなった。L. sakei 117 株が 12 株の L. sakei 中
MRS 培地を用いた場合には最も D-アミノ酸生産
能 が 高 い こ と が 明 ら か と な っ た 。 ま た L.
mesenteroides 103 株が 16 株の L. mesenteroides 中

Figure 3. Comparison of D-amino acid concentrations
in various brewing processes of Kimoto, Lactic acidbacteria added kimoto, and Sokujomoto.

52

Viva Origino 40 (2012) 47 - 56

MRS 培地を用いた場合には最も D-アミノ酸生産能が高いことが明らかとなった。さらに L. sakei
117 株と L. mesenteroides 103 株の米の酵素分解物
を炭素源とする培地での D-アミノ酸能を検討したところ、L. sakei 117 株及び L. mesenteroides 103
株いずれも D-アミノ酸生産が確認されたが、MRS 培地での D-アミノ酸生産量とは違いがある
ことが明らかとなった。そこで D-アミノ酸生産能が高い Lactobacillus sakei 6 株と Leuconostoc
mesenteroides 6 株の米の酵素分解物を炭素源とする培地での D-アラニン、D-アスパラギン酸、
D-グルタミン酸の生産能を検討したところ、L.
sakei 145 株が 6 株の L. sakei 中米の酵素分解物を炭素源とする培地を用いた場合には最も D-アラ
ニン、D-アスパラギン酸、D-グルタミン酸生産
能 が 高 い こ と が 明 ら か と な っ た 。 ま た L.
mesenteroides 151 株が 6 株の L. mesenteroides 中米の酵素分解物を炭素源とする培地を用いた場合には最も D-アラニン、D-アスパラギン酸、D-グ
ルタミン酸生産能が高いことが明らかとなった(Table 6)。そこで L. sakei 145 株と L. mesenteroides
151 株を用い、乳酸菌添加生酛で試験醸造を行った。対照 3 仕込みを含め 01：L. sakei 基準株とL. mesenteroides 基準株を用いたもの； 02：L.
sakei 117 株と L. mesenteroides 103 株を用いたもの；03：L. sakei 145 株と L. mesenteroides 151 株を用いたもの；04：速醸酛の 4 仕込みで行った。
得られた 01～04 の 4 種の試験醸造酒中の D-及びL-アミノ酸含有量を定量したところ、乳酸菌添加
生酛 01～03 中で、D-アミノ酸高生産乳酸菌 L.
sakei 145 株と L. mesenteroides 151 株を用いた試
験醸造酒 03 の D-アスパラギン酸、D-グルタミン
酸、D-バリン、D-ロイシン濃度が最大となった(Table 7)。また試験醸造酒 01～04 の官能評価試
験を行い、主成分分析で解析したところ、試験醸
造酒 03 の濃淡を示す第 1 主成分得点が最も高く、
前年度までに日本酒の味に寄与することを特定した D-アラニン、D-アスパラギン酸、D-グルタ
ミン酸の強化が味に影響していることが明らか
となった。
4.6	
  生酛由来乳酸菌の D-アミノ酸代謝関連酵素
活性の探索と D-アミノ酸代謝関連酵素遺伝子のクローニング53

Viva Origino 40 (2012) 47 - 56	  生酛由来の乳酸桿菌 Lactobacillus sakei NBRC
15893 には、アラニンラセマーゼ、グルタミン酸
ラセマーゼ、アスパラギン酸ラセマーゼをコードする alr、murI、racD の 3 遺伝子が、また生酛由
来 の 乳 酸 球 菌 Leuconostoc mesenteroides
subsp.sake NRRC 102480 には、3 つのアラニンラ
セマーゼをコードする alr1、alr2、alr3 とグルタ
ミン酸ラセマーゼをコードする murI が存在する
ことが明らかとなった。L. sakei NBRC 1589 のア
ラニンラセマーゼは、Corynebacterium glutamicum[11]、Escherichia coli [12]のアラニンラセマーゼとそれぞれ 33%、29%の一次構造相同性を示すことが明らかとなった。分子質量は 91 kDa で、ホモダイマー構造を有することが明らかとなった。
ヒドロキシルアミンによる阻害や 420 nm 付近に吸収極大を有することから、本酵素は、ピリドキ
サール 5’-リン酸(PLP)を補酵素とすることが明らかとなった。最適温度は 35℃、最適 pH は 10.5であることが明らかとなった。本酵素は、アラニンだけでなくセリンも基質とすることが明らかとなった。本酵素の Keq は約 1 となり、アミノ酸
ラ セ マ ー ゼ で あ る こ と が 明 ら か と な っ た 。 L.
sakei NBRC 1589 のアスパラギン酸ラセマーゼは、
Lactobacillus brevis [13]、Lactobacillus casei [13]、Bifidobacterium bifidum [14]、のアスパラギン酸ラセマーゼとそれぞれ 59%、53%、42%の一次構造相同性を示すことが明らかとなった。分子質量は52 kDa で、ホモダイマー構造を有することが明らかとなった。最適温度は 45℃、最適 pH は 6.5であることが明らかとなった。本酵素は、アスパラギン酸に高い特異性を有することが明らかとなった。本酵素の Keq は約 1 となり、アミノ酸ラセマーゼであることが明らかとなった。L. sakei
NBRC 1589 の グ ル タ ミ ン 酸 ラ セ マ ー ゼ は 、Pediococcus pentosaceus [15]、Escherichia coli [16]のグルタミン酸ラセマーゼとそれぞれ 54%、51%、
49%、50%、29%の一次構造相同性を示すことが明らかとなった。分子質量は 35 kDa で、モノマー構造を有することが明らかとなった。最適温度は37℃、最適 pH は 10 であることが明らかとなった。本酵素は、グルタミン酸に高い特異性を有することが明らかとなった。5,5´-ジチオビスなどの SH 阻害剤による阻害から、本酵素は SH 酵素であることが明らかとなった。本酵素の Keq は約1 となり、アミノ酸ラセマーゼであることが明らか と な っ た 。 ま た Leuconostoc mesenteroides
subsp.sake NRRC 102480 には、3 つのアラニンラ
セマーゼホモログ遺伝子(alr1、alr2、alr3)と 1 つのグルタミン酸ラセマーゼホモログ遺伝子(murI)が存在することが明らかとなった。これらの 4 遺伝子を、大腸菌で発現し各々の遺伝子産物を精製する方法を確立できた。
	  また L. mesenteroides subsp.sake NRRC 102480の alr1 はアラニンラセマーゼをコードしている
ことが明らかとなった。Acetobacter aceti [17]、Corynebacterium glutamicum [11] 、 Geobacillus
stearothemophilus [18]、Helicobacter pyrori [19]のアラニンラセマーゼとそれぞれ 33.3%、29.0%,
38.0%、26.7%の一次構造相同性を示すことが明らかとなった。分子質量は 82 kDa で、ホモダイ
マー構造を有することが明らかとなった。ヒドロ
キシルアミンによる阻害や 420 nm 付近に吸収極大を有することから、本酵素は、ピリドキサール

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5’-リン酸(PLP)を補酵素とすることが明らかとなった。最適温度は 15℃、最適 pH は 6.5 である
ことが明らかとなった。本酵素は、アラニンだけ
でなくセリンも基質とすることが明らかとなった。本酵素の Keq は約 1 となり、アミノ酸ラセマー
ゼであることが明らかとなった。L. mesenteroides
subsp.sake NRRC 102480 の alr2 はリシンラセマー
ゼをコードしていることが明らかとなった。
Acetobacter aceti[17]、Corynebacterium glutamicum[11] 、 Geobacillus stearothemophilus [18] 、
Helicobacter pyrori [19]、Pseudomonas putida [20]のアラニンラセマーゼとそれぞれ 23.0%、29.8%、
39.7%、30.2%、24.9%の一次構造相同性を示すことが明らかとなった。分子質量は 89 kDa で、ホモダイマー構造を有することが明らかとなった。
ヒドロキシルアミンによる阻害や 420 nm 付近に吸収極大を有することから、本酵素は、ピリドキ
サール 5’-リン酸(PLP)を補酵素とすることが明らかとなった。最適温度は 25℃、最適 pH は 8.0であることが明らかとなった。本酵素は、リシンの他、オルニチンやアルギニンにも作用することが明らかとなった。本酵素の Keq は約 1 となり、
アミノ酸ラセマーゼであることが明らかとなった。L. mesenteroides subsp.sake NRRC 102480 の
alr3 はヒスチジンラセマーゼをコードしている
ことが明らかとなった。Acetobacter aceti[17]、Corynebacterium glutamicum [11] 、 Geobacillus
stearothemophilus [18]、Helicobacter pyrori [19]、Pseudomonas putida [20]のアラニンラセマーゼとそれぞれ 31.4%、29.8%、34.6%、25.1%、24.6%の一次構造相同性を示すことが明らかとなった。
分子質量は 89 kDa で、ホモダイマー構造を有することが明らかとなった。ヒドロキシルアミンによる阻害や 420 nm 付近に吸収極大を有することから、本酵素は、ピリドキサール 5’-リン酸(PLP)
を補酵素とすることが明らかとなった。最適温度
は 50℃、最適 pH は 9.5 であることが明らかとなった。本酵素は、ヒスチジンに高い特異性をもつことが明らかとなった。本酵素の Keq は約 1 となり、アミノ酸ラセマーゼであることが明らかとなった。ヒスチジンラセマーゼについてはこれまで全く報告がなく本酵素が最初の例であり新規酵 素 で あ る こ と が 明 ら か と な っ た 。 L.
mesenteroides subsp.sake NRRC 102480 の murI はグルタミン酸ラセマーゼをコードしていることが 明 ら か と な っ た 。 Bacillus subtilis [21] 、
Mycobacterium tuberculosis[22]のグルタミン酸ラセマーゼとそれぞれ 42.6%、36.9%%の一次構造相同性を示すことが明らかとなった。分子質量は42 kDa で、モノマー構造を有することが明らかとなった。本酵素は補酵素を要求しないことが明らかとなった。最適温度は 25℃、最適 pH は 7.5であることが明らかとなった。本酵素は、グルタミン酸に高い特異性をもつことが明らかとなった。本酵素の Keq は約 1 となり、アミノ酸ラセマー
ゼであることが明らかとなった。以上の結果、生酛 由 来 の 乳 酸 桿 菌 Lactobacillus sakei NBRC
15893 のアラニンラセマーゼ、グルタミン酸ラセ
マーゼ、アスパラギン酸ラセマーゼをコードする
alr、murI、racD の 3 遺伝子産物と生酛由来の乳酸 球 菌 Leuconostoc mesenteroides subsp.sake
NRRC 102480 の 3 つのアラニンラセマーゼをコードする alr1、alr2、alr3 とグルタミン酸ラセ

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マーゼをコードする murI の遺伝子産物の酵素科
学的性質が明らかとなった(Table 8)。

持に貢献していくことが期待される。
謝辞
	  本研究は、独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構イノベーション創出基礎的研究推進
事業（平成２０年度〜平成２４年度）、菊正宗酒造株式会社との共同研究（平成２１年度〜平成２５年度）、私立大学戦略的研究基盤形成支援事業（平成２５年度）により実施したものである。

5.	
  まとめ
	
  ヒトが生命を維持していく為には、食品を摂取し食品から栄養素を体内に吸収し利用する必要がある。ヒトが持続的に食品を摂取するには、やはりその食品の味が大きな食品選択の要素となる。本研究で D-アミノ酸には L-アミノ酸にはない食品の味を向上させる特異な機能があることが明らかとなった。冒頭にも述べたように、D及び L-アミノ酸のうちなぜ L−アミノ酸のみが生命の根幹を担う生体分子である酵素の構成要素となったのかは未だに解明されてはいないが、
L-アミノ酸のみならず D-アミノ酸が L-アミノ酸にはない食品中での特異な呈味性という機能によってヒトの生命維持に直接あるいは間接的に関わる重要な機能を持つことは非常に興味深い。
現在筆者は、さまざまな生酛由来乳酸菌株からD-アミノ酸生成能が高い菌株を選抜し、これらの乳酸菌株を乳酸菌添加生酛仕込みで用い、製品中の D-アミノ酸濃度を高めることにより味や総合
評価のより優れた日本酒の生産を行うための試
験醸造を行っている。また、D-アミノ酸生成能が高い生酛由来乳酸菌は、日本酒以外の食品製造にも応用でき、これらの乳酸菌を用いる D-アミノ酸強化食品の開発も行っている。さらに、D Lアラニン（食品添加物グレード）は日本国内で入手が容易であり、また厚生労働省により食品添加物として認可されていることなどから、D L-アラ
ニンを旨味や甘味を増強する調味料として用いた新たな食品の開発も行っていきたいと考えている。われわれが確立した日本酒中の D-及び Lアミノ酸の定量法は、日本酒以外の食品中の D及び L-アミノ酸の定量分析にも応用可能であり、発酵食品を中心としたさまざまな食品中の D-及び L-アミノ酸の分析を行い、新たな D-アミノ酸
高含有食品の探索もさらに行っていきたいと考えている。今後 D-アミノ酸によって機能が向上
した食品が次々に開発、上市され、ヒトの生命維

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