乳酸菌等を利用した食品加工技術開発
乳酸菌利用研究チーム
橋本 俊郎＊
田畑 恵＊
1. はじめに
発酵食品にはさまざまな微生物が用いられており，独特の風味付けや品質の向上に寄与している。酵母は酒やパン製造の主役となって，アルコールや発酵ガスの利用が行われる。乳酸菌はヨーグルト等の乳製品や味噌，醤油等の発酵大豆食品及び漬物で重要な役割を果たしている。
乳酸菌はその生育環境の違いから，動物性乳酸菌（肉，ミルク）と植物性乳酸菌に大別され，各々生理的性質の異なることが知られている。
当センターでは，植物性乳酸菌，特に漬物に生育する乳酸菌に着目し，これまでに Lactobacillus.sakei HS-1という乳酸菌を分離し，漬物製造用スターター株として実用化した。HS-1 を漬物に使用した場合，食味の向上，大腸菌群の増殖抑制等の効果が認められている 1) 。一方，乳酸菌はプロバイオティクス（＝宿主の腸内細菌のバランスを改善することにより，宿主に有益な作用をもたらす微生物）として注目されており，整腸作用や免疫賦活などの効果が期待されている。そこで今回，L.sakei HS-1のプロバイオティクスとしての可能性について検討を行った。
また，機能性（＝抗菌物質生産性やプロバイオティクスとしての作用）を持った新たな有用乳酸菌の開発を目的として，伝統的な発酵食品から乳酸菌の分離を行ったので，それについても併せて報告する。
2. 実験方法
2.1 人工胃液耐性試験
MRS培地に 0.32%ペプシンを添加し，塩酸で所定のpH に 調 製 し た も の を 人 工 胃 液 と し ， HS-1 を 2 ×10 6 CFU/mlとなるように接種して，37℃の好気条件下で振とう培養した。１時間ごとに，0.5%炭酸カルシウムを添加したMRS寒天培地で，生菌数を測定した。
2.2 人工腸液耐性試験
MRS培地に胆汁末（oxgall）を添加したものを人工腸液とし，HS-1 を 2×10 6 CFU/mlとなるように接種して，37℃の好気条件下で振とう培養した。16 時間培養後の濁度（Abs.650nm）を測定し，相対増殖度を算出した。
2.3 摂取回収試験
低温殺菌した野菜ジュースと牛乳の混合物に HS-1 を＊食品バイオ部門接種し，25℃で２日間発酵させた。この発酵物 100mlを被験者に５日間毎食後摂取させ，糞便中の HS-1 の有無を調査した。HS-1 摂取前と摂取後の糞便から，0.5%炭酸カルシウム添加 MRS 培地および HS-1 用選択培地（GYP 寒天培地 1L あたりにアジ化ナトリウムおよびシクロヘキシミドをそれぞれ 10mg，0.5%炭酸カルシウム，5%食塩を添加したもの）を用いて，乳酸菌を分離培養した。顕微鏡で形態を観察し，乳酸桿菌について，以下の方法により分類同定を行った。
(1) 生理的性質による同定試験
分離された乳酸菌の生育温度および糖類発酵性について，乳酸菌実験マニュアル 2) に従って調べた。
(2) 16S rDNA の塩基配列による同定試験
糞便から回収された乳酸桿菌および HS-1 について，16S rDNA の塩基配列の解析を行い，相同性を検討した。
培養菌体を Lysozyme および Acromopeptidase で処理後，フェノール/クロロホルムでゲノム DNA を抽出した。
PCR およびシーケンスに使用したプライマーの配列を
表 1 に示した。抽出したゲノム DNA を鋳型として，プライマー10F と 1540R を用いて，16S rDNA を増幅した。
PCR 反応条件は，96℃で５分，ついで 95℃で 45 秒，54℃で 45 秒，72℃で 90 秒を 30 サイクル，さらに 72℃で５分とした。PCR 産物（約 1.5kb）は，1.2%アガロースゲ
ル電気泳動で確認後，精製を行い，直接 DNA シーケンスに供した。
表１

プライマーの塩基配列
塩基配列（５’→３’）

10F
350F
350R
520F
800F
800R
1100F
1100R
1540R

AGTTTGATCCTGGCTCTACGGGAGGCAGCAG
CTGCTGCCTCCCGTAG
ACCGCGGCTGCTGGC
ATTAGATACCCTGGTACTACCAGGGTATCTAATGCAACGAGCGCAACCC
AGGGTTGCGCTCGTTG
AAGGAGGTGATCCAGCC

2.4 有用乳酸菌の分離茨城県鹿島灘沿岸の伝統的な発酵食品であるごさい漬
をはじめ，長野県木曽地方のすんき漬，中国の包菜を分離源として用い，0.5%炭酸カルシウムを添加した MRS培地で乳酸菌の分離培養を行った。分離した乳酸菌は，2.3(1)に示した生理的性質による同定試験および 2.3(2)に示した 16S rDNA の塩基配列による同定試験を行った。
2.5 抗菌物質生産性の検定試験滅菌した MRS 寒天培地を 45℃まで冷却し，これに指示菌の一晩培養液を 0.25%（v/v）接種し混合後，シャーレに分注して，指示菌プレートを作製した。固化後，指示菌プレートは 4℃に保存し，２週間以内に使用した。
各供試菌株の一晩培養液を遠心分離し，培養上清を指示菌プレートに 10μl ずつ滴下した。抗菌物質生産性の判定は，30℃で 24 時間培養後，試料滴下部位における生育阻止円の有無により行った。
3. 結果と考察
3.1 人工胃液耐性試験
人工胃液における乳酸菌HS-1 の生菌数の変化を表２に示した。pH３では，１時間後の生菌数が 10 6 CFU/mlから 10 2 CFU/ml以下に減少したが，pH3.5 以上では，４時間後でも高い生残性を示した。食後の胃のpHは４〜５に上昇すること，また摂取した食物が胃から腸に移送されるまでの時間がおよそ２時間であることから，食品として摂取したHS-1 は，生存したまま胃を通過し，腸管へ移送される可能性が高いと考えられる。
表２

人工胃液における乳酸菌 HS-1 の生菌数の変化
生菌数（log CFU/ml）

培養時間（ｈ）pH3pH3.5pH4０１２３４6.4<２<２<２<２6.4
6.5
6.46.4
6.56.46.56.56.56.6

3.2 人工腸液耐性試験
人工腸液における乳酸菌HS-1 の相対増殖度を表３に示した。腸管内の胆汁濃度は胆汁末 0.2％に相当するが，この濃度でも胆汁末無添加時（100％）に比べ，91％という高い増殖を示した。また生菌数を測定したところ，培養開始から 16 時間後には，2×10 6 CFU/mlから３×10 8 CFU/mlに増殖していた。胆汁耐性が高いことから，
HS-1 の腸管生残性はきわめて高いと考えられる。

表３

人工腸液における乳酸菌 HS-1 の相対増殖度
胆汁末濃度（％）
相対増殖度（％）
00.10.20.30.51.01009691878376

3.3 摂取回収試験
乳酸菌HS-1 の発酵物摂取前の糞便からは，主に乳酸球菌が検出され， L.sakei は検出されなかった。一方，
HS-1 発酵物摂取後の糞便からは，乳酸桿菌が生酸性コロニーの 20〜50％の割合で検出された。ヒトの糞便から高率（30％以上）で検出される Lactobacillus属の菌種 3)は，いずれも 15℃での生育を示さないが，今回のHS-1摂取期間に検出された乳酸桿菌は，いずれも 15℃で生育を示し，糖類に対する発酵性も，L.sakeiの性質と完全に一致した。また，回収された乳酸菌およびHS-1 の 16SrDNAの塩基配列を比較したところ，100％の相同性を示し た 。 回 収 さ れ た 乳 酸 菌 は L.sakei に 帰 属 さ れ ， 16S
rDNAの塩基配列がHS-1 と 100％の相同性を示すことか
ら，回収された乳酸菌は L.sakei HS-1 であると判断した。
3.4 有用乳酸菌の分離
漬物から分離した乳酸菌の性質を表４に示した。生育温度，発酵形式等の生理的性質および 16S rDNA の塩基配 列 の 相 同 性 検 索 に よ り ， 各 菌 株 は L.plantarum ，L.fermentum， L.plantarum， L.brevis に帰属された。
3.5 抗菌物質生産性の検定試験
指示菌として，セレウス菌（ Bacillus cereus）を用いたときの指示菌プレートを図１に示した。ごさい漬から分離した乳酸菌の培養上清を滴下した部分に，セレウス菌の増殖阻止円が認められ，抗菌物質生産性が確認された。また培養上清を 60℃で 30 分加熱した場合および121℃で 15 分オートクレーブした場合でも，抗菌活性は失われないことが明らかとなった。

表４
形態
15℃での生育45℃での生育6.5%食塩存在下での生育
発酵形式
糖類発酵性
アラビノース
キシロース
フラクトースシュクローストレハロースソルビトール
マルトース
ガラクトース
16S rDNA による帰属

図１

漬物から分離した乳酸菌の性質

ごさい漬

すんき漬

包菜１

包菜２桿菌＋−＋ホモ桿菌−＋＋ヘテロ桿菌＋−＋ホモ桿菌＋−＋ヘテロ＋−＋＋＋＋＋＋＋−＋＋＋−＋＋−−＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋−−＋＋

L.plantarum

L.fermentum

L.plantarum

L.brevis

セレウス菌を用いたときの指示菌プレート

control

121℃, 15min

４℃

60℃, 30min

認されたことにより，プロバイオティクスとしての可能性が示唆された。
また，新たな機能性乳酸菌の探索を目的として，漬物から乳酸菌の分離を試みた結果，４株の乳酸菌を得ることができた。各菌株は，16S rDNA の塩基配列の結果から，Lactobacillus 属に帰属された。さらにごさい漬から分離した１株については，抗菌物質生産性が確認された。
今後は各菌株の性質について明らかにするとともに，抗菌物質についても，その種類，抗菌スペクトル，さらに利用法について検討していく予定である。
5 参考文献１）橋本俊郎：漬物用乳酸菌スターターの開発，茨城県
工業技術センター研究報告，30，34-38（2002）
２）小崎道雄監修，内村泰，岡田早苗著：「乳酸菌実験マニュアル」，初版（朝倉書店，東京），pp36-59（1992）３）辨野義己：ヒトにおける常在乳酸菌のエコロジー，「乳酸菌の科学と技術」，第３版（学会出版センター，東京），pp287-298（2000）

4. まとめ人工消化液耐性試験と摂取回収試験の結果から，
L.sakei HS-1 は生きたまま腸管に達し，排泄されたと結論づけられた。HS-1 は漬物を安全に，そしておいしくするスターターとして開発されたが，腸内での生存が確