136

浦上財団研究報告書

Vol.21（2014）＜平成 23 年度助成＞

腸管出血性大腸菌 O157 株のアプタマーを用いた
電気化学検出用バイオセンサーの開発
セーボレー那沙・巽

敦郎・阿部

公一・吉田

亘・池袋

一典

（東京農工大学大学院工学府生命工学専攻）

1.

緒

酵素標識アプタマーを用いて高感度なバイオセ

言

ンサーを構築するためには、酵素の活性を維持し、集団食中毒などの発生事例からわかるように、かつ簡便にアプタマーを酵素標識する手法の開発

腸管出血性大腸菌 E. coli O157 をはじめとする病が必要である。一般的な酵素の化学処理を用いた原性細菌の迅速検出法の開発は、人々の食の安全標識手法では、酵 素活性が大きく低下することがや健康な生活を守るために早急に解決すべき課題

知られている。そこで筆者らは、酵素の活性を維である。現行の各種試料中の細菌検査は主に培養持したままアプタマーを標識する方法として、ジ法に基づいており、標的細菌の増殖の有無によっ

ンクフィンガータンパク質（ZIF）と酵素の融合て細菌検出を行う。しかし、この手法では培養にタンパク質 6 ） を作製し、アプタマーの酵素標識

時間がかかることから、その場での検査が困難でへ の 応 用 を 進 め て い る。ZIF は 特 定 の DNA 配ある。そのため、その場で標的の病原性細菌を高列 に 結 合 す る 蛋 白 質 で あ る。 ま た、 分 子 量 は感度に検出できる、迅速・簡便・低コスト、かつ

9 kDa 程度と小さく、酵素と融合した際に酵素持ち運び可能な細菌検出用小型センサーの開発が活性への影響が少ないと期待される。Z I F 融合

強く求められている。

GDH（ZIF-GDH）を作製し、ZIF が認識する塩基

近年、核酸リガンドであるアプタマーが、バイ

配列を DNA アプタマーに付加することで、ZIF-

オセンサーに用いる分子認識素子として注目され

GDH とアプタマーをインキュベートするだけで、ている。アプタマーは核酸分子であり、塩基配列

簡便に酵素をアプタマーに標識できる。

依存的に立体構造を形成し、低分子やタンパク質、本研究では、アプタマーを用いた病原性大腸菌

細胞など、様々な標的に対して高い結合能と特異検出用センサーの開発を最終的な目的とし、病原1, 2）。さらに、化学的に全合成・修飾が容性大腸菌に結合する DNA アプタマーの探索を試易であり、熱に対する安定性も高い。大量に合成

験管内進化法によって試みた。さらに、酵素標識

する場合、将来的には抗体よりも安価な製造が可したアプタマーを用いて電気化学検出用バイオセ能であると期待されている。また、核酸の相補鎖ンサーの構築に取り組んだ。標識用酵素としては、形成を利用して立体構造の設計や、構造変化の可グルコース脱水素酵素（GDH）を選択した。GDH

逆的制御も可能である。そのため、抗体では達成

は市販の自己血糖測定用小型センサーに広く用できないような新しい原理に基づくバイオセン

いられている酵素である。電気化学用バイオセン

性を示す

3, 4）

。特に、酵素を標

サーのプラットフォームとして、これまでに開識したアプタマーを分子認識素子として用いるこ

発されている血管内皮増殖因子（VEGF）に結合とで、標的への結合シグナルを数万倍以上に増幅するアプタマーを用い、Z I F 融合 GDH を用いた

でき、高感度な検出を達成できると期待される 5 ）。

VEGF の電気化学検出を検討した。今後、本研究サーの開発に応用可能である

腸管出血性大腸菌 O157 株のアプタマーを用いた電気化学検出用バイオセンサーの開発137で開発した大腸菌結合アプタマーと ZIF-GDH を

ブラリーは、予め等モル量のプライマー結合配組み合わせることで、病原性大腸菌を電気化学的列の相補鎖を含む条件において 95 ℃で 10 分間熱に検出するバイオセンサーの開発が達成できると処理した後に 30 分かけて徐冷することによって、期待される。

プライマー結合配列の相補鎖形成とランダム配列のフォールディングを行った。ライブラリーと2. 試験管内進化法による病原性大腸菌結合アプ
タマーの探索E. coli NSM59 を TBS buffer（10 mM Tris-HCl ,病原性大腸菌に結合するアプタマーの探索手法

中で 30 分間インキュベートした後に、遠心分離を確立するために、尿路感染症の病院単離株であにより菌体に結合した DNA を回収し、菌体を洗る E. coli NSM59 株を標的としてアプタマーの探

浄 し た。 洗 浄 後、TE buffer（10 mM Tris-HCl ,14

150 mM NaCl , 5 mM KCl , 5 mM MgCl 2 , pH 7.4)

索を試みた。一般的に、アプタマーは 10 種類

1 mM EDTA, pH 8.0）中、95 ℃ で 5 分 間 熱 処 理

以上の配列を含む核酸ライブラリーの中から、試することで、菌体に結合したライブラリー DNA

験管内進化法（systematic evolution of ligands byを回収した。回収した DNA を PCR 増幅し、次exponential enrichment; SELEX）に よ り 探 索 さの Cell-SELEX のラウンドに用いる ssDNA ライ

7, 8 ）。また、近年、細菌や細胞などに対してブラリーを調製した。また、Cell-SELEX の各ラ

直接アプタマーを探索する Cell-SELEX 法が注目

ウンドにおいて、菌体に結合したライブラリーをされている 9 ）。Cell-SELEX では、アプタマーのqPCR 解析により定量することで、ライブラリー

標的となる膜タンパク質を精製する必要がないた

中におけるアプタマーの濃縮を評価した。

れる

め、精製に伴う膜タンパク質の変性を防ぐことが

qPCR 解析の結果、Cell-SELEX の操作サイクルできる。また、未知の膜タンパク質に対してもアを進めるごとに、回収されたライブラリーの量がプタマーの探索を行うことが可能である。

増加し、ライブラリー中で E. coli NSM59 に結合

E. coli NSM59 に結合するアプタマーの探索をするアプタマーが濃縮されていることが示唆され目的とし、Cell-SELEX 法により E. coli NSM59

た（ Fig. 2 ）。そのため、Cell-SELEX の操作サイに結合する DNA アプタマーを探索した（ Fig. 1 ）。

クルを 5 回繰り返した後に回収したライブラリー

アプタマーの探索には、24 塩基のランダム配列の DNA 配列解析を行った。DNA 配列解析の結の両端に、3 塩基のチミンを介して 18 塩基のプ

果、29 種類のアプタマー候補配列を同定した。各

ライマー結合配列を付加した全長 66 塩基の一本DNA 配列が形成する二次構造を M-fold プログラ

鎖 DNA（ssDNA）ライブラリーを用いた。ライ

ム 1 0 ）により予測し、29 種類のうち比較的二次構

DNA library(424 ≈1014 sequences(+

E. coli NSM59(3) PCR amplificationand ssDNA preparation

5 cycles(4) Sequence analysis(1) Binding(2) Separation

Fig.
Cell-SELEX
coli NSM59
Fig. 11.Cell-SELEX法による E. coli NSM59E.
に結合するアプタマーの探索の概念図

138

浦上財団研究報告書

Vol.21（2014）

後、1/10,000 倍 希 釈 し た HRP 標 識 抗 FITC 抗
1.6体（Invitrogen）とインキュベートし、HRP の基質

Bound library (%)!

1.4
1.2

で あ る Immobilon Western Chemiluminescence1

substarate（Millipore）を 添加し、HRP の化学発光を ImageQuant LAS 4000 mini（GE Healthcare）

0.8で検出した。その結果、評価に用いた 6 種類の配

0.6
0.4

列のうち、5 本の配列とインキュベートした E.

0.2
0coli NSM59 を固定化した位置から、アプタマー
1R

2R

3R

4R

5R

の結合を示す HRP の化学発光が検出された（ Fig.

Fig. 2 Cell-SELEX 法 に の 各 ラ ウ ン ド（1R 〜 5R）
で E. coli NSM59 に結合したライブラリ量の3 a ）。E. coli NSM59 に結合を示した 5 種類のアqPCR による定量

プタマーのうち、最も化学発光シグナルが大き造が安定な 6 種類の配列を選択し、E. coli NSM59

かったアプタマー Ec#6 が、その他の細菌に対しへの結合評価実験に用いるために委託合成した。

て結合を示すか検討した。E. coli 以外の尿路感染

合 成 し た ssDNA と E. coli NSM59 と の 結 合症 菌 で あ る Morganella morganii と Pseudomonas

は、 ドットブロッティング 法 に よ り 評 価 し た。

aeruginosa を対象に、同様にドットブロッティン

ssDNA は、FITC 修飾したプライマー結合配列グを行った結果、Ec#6 はこれらの細菌には結合の相補鎖を含む条件でフォールディングすることを示さず、E. coli NSM59 に特異的に結合するこで、5 ’末端に相補鎖を介して FITC で標識した。

とが示唆された（ Fig. 3 b ）。

フォールディング後の ssDNA（終濃度（f.c.）160

ま た、1 × 10 8 CFU の E. coli NSM59 と 種 々nM）と 2 × 10 8 CFU の E. coli NSM59 を 500μLの濃度に調製した FITC 標識 Ec#6 をインキュベートし、洗浄後に FITC の蛍光（励起波長 485のMTBS
buffer 中で 30 分間インキュベートした後、l Varioskan Flash (Thermo)! ĥ      & Ź Ġ  Ec#6 & ń æ  Ï ř % Ǝ  G D T g
nm / 蛍光波長 535 nm）を蛍光プレートリーダー
遠心分離により菌体をTBS buffer で 1 回洗浄しÆ  Scatchard plot ƙ ğ & Ź Ġ Ec#6 ' E. coli NSM59 " 150 nM & ƙ Ǖ Ó ĉ (K ) !
Dた。洗浄後の菌体
2 × 10 7 CFU をニトロセルロー
é Ź °  4  " Ţ  5  (Fig. 4)

Varioskan Flash（Thermo）で検出した。その結果、Ec#6 の 濃 度 依 存 的 に 蛍 光 シ グ ナ ル が 増 加
ス膜（Hybond ECL; GE Healthcare）上に滴下し、  p & Ź Ġ 1 3  Cell-SELEX ĵ % 1 3 E. coli NSM59 % Ǡ  Ź ° Ɨ ¶ ö 7 Ţ  9 \ L `E. coliTBSTbufferTBS
し、Scatchard解析"の7結Ţ果、Ec#6
は
l&²
Ó %（ù
 bufferŋ ðplus  0.05%
9 \ Ltween-20）`lE. coli %ŉ Ŕ ř % Ź °plot
4  { í

K D）
で調製した
4 % スキムミルク中で 30 分間インの解離定数で強く結合す1 3 ŕ ¨ ö & Ǡ  ƅ Ů  Ɛ ö Ê ƅ ƌ E. coli O157NSM59
7 ĩ řと
% 150
 nM
9\
L ` l &（
āŵ7Ƒ。
キE.ュcoli
ベー
ト し、
膜Ŕ
をř
ブ%
ロŹ
ッ°
キ
ン4
グDNA
し た。
O157
%ŉ
9洗
\浄
L ` lることが示された& ² Ó 7 Ŝ ÿ （
Fig. 4 ）
(a)

Ec

#2

Ec

Ec

#3

Ec

#4

Ec

#5

Ec

#6

y
r
ar
fe
br Buf
Li

0.12∆FITC fluorescence intensity (A.U.)

E. coli NSM59

(b)

6
c#

E

yT
ol

P

E. coli NSM59
M. morganii
P. aeruginosaFig . 3. ド ッ ト ブ ロ ッ テ ィ ン グ 法 に よ る ア
3 ー
ドットプロッティング法によるアプタマーの結合
プ Fig.
タマの 結 合 特 性 の 検 討 (a)同 定 し た 6
特性の検討
（a）
種類のア
プタマ
ー同定した
の E. 6c種類のアプタマーのoli N SM59 にE.対する結合確NSM59認 、 (b)
Ec#6
E.認co
に対
す る 結の合確、（libNSM）Ec#659
coli
に対する
合特
異 性 に対する結合特異性の検討の検討
E. coli
NSM59
の結

0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
-0.02



FITC fluorescence intensity (A.U.)

0.12

#1

0.1
0.08
0.06

Ec#6
Library

0.04

Ec#6

0.02
0

Library
0

200

200

400

-0.02

0

400

600

800

Oligo concentration (nM)
600

800

1000

1000

1200

1200

Fig.
4.4 Ec#6
Fig.
Ec#6 とE.
E. colicoli NSM59
NSM59 の結合のアプタマー
Oligo concentration (nM)

濃度依存性の検討

Fig . 4. Ec# 6 と E. co li N SM59 の 結 合 の ア
プタマー濃度依存性の検討

3. GDH ĩ Ƨ 9 \ L ` l 7 Ő   Ǘ į £ Ð ĥ  K j F l & ħ ů

腸管出血性大腸菌 O157 株のアプタマーを用いた電気化学検出用バイオセンサーの開発

139

以上の結果より、Cell-SELEX 法により E. coli

作製した ZIF-GDH を用いてアプタマーを GDH

NSM59 に高い結合親和性を示すアプタマーの同で標識し、GDH 活性を指標に標的分子を検出で定に成功し、獲得したアプタマーが E. coli に特きるか検討するために、筆者らがこれまでに報告

異的に結合することを示した。今後、より病原性している血管内皮増殖因子（VEGF）に結合するの高い腸管出血性大腸菌 E. coli O157 を標的にしアプタマー 11 ）を改良したものを用いて検出系をたアプタマーの探索を行い、E. coli O157 に特異構築した。VEGF は加齢性黄斑変性症の診断マー的に結合する DNA アプタマーの同定を目指す。

カーである。まず、Fig. 5 a に示すような検出原

3. GDH 標識アプタマーを用いた電気化学検出
センサーの構築

理で、分光学的な手法により VEGF の検出を試みた。ビオチン標識抗 VEGF 抗体（BAF293 ; R&D
system）をストレプトアビジンコートされた 96 穴

病原性大腸菌の電気化学検出用センサーの開発

ポリスチレンプレート上に固定し、そこに VEGFを達成するために、まず ZIF-GDH を作製した。

を加えることでプレート上に VEGF を捕捉した。

マウス由来 ZIF の構造遺伝子および Aspergillus

ZIF が 認 識 す る DNA 配 列 を 付 加 し た VEGF 結

flavus 由 来 GDH の 構 造 遺 伝 子 を 連 結 し、ZIF-

合アプタマーをプレートに添加して 30 分間イン

GDH の発現ベクターを構築した。構築したベク

キュベートした。さらに、洗浄後に ZIF-GDH を

ターを用いて E. coli BL21（DE3）株により ZIF-

添加して 30 分間インキュベートすることで、プ

GDH を組換え生産した。その後、ZIF-GDH を精

レート上に捕捉した VEGF に ZIF-GDH 標識アプ

製 し、GDH の 触 媒 活 性 お よ び ZIF の 標 的 DNA

タマーを結合させた。そして、GDH の活性を f.c.

への結合能を評価した。ZIF-GDH の特性を評価

0.6 mM PMS と f.c. 0.06 mM DCIP の存在下で、f.c.

した結果、天然の GDH と比較して 50 %以上の高100 mM のグルコースを加えた際の DCIP の退色

い触媒活性を維持していた。また、標的 DNA 配を 595 nm の波長で測定し、GDH の活性を測定し列への結合能も十分に保持していた。これらの結た。その結果、VEGF 濃度依存的に高い GDH 活

果から、作製した ZIF-GDH は GDH および ZIF性が観察された（ Fig. 6 ）。算出された検出下限はの両方の機能を十分保持していることが示され、330 pM である。この結果から、ZIF-GDH で標識

アプタマーの酵素標識に応用可能であることが示したアプタマーを用いて VEGF を定量的に検出唆された。

できることが示された。

Fig. 5 ZIF-GDH で標識したアプタマーを用いた VEGF 検出の概念図 (a)GDH 活性を指標にした VEGF の分光学的検出、(b)GDH 活性を指標にした VEGF の電気化学的検出140

浦上財団研究報告書

Vol.21（2014）

さらに、ZIF-GDH で標識したアプタマーを用合アプタマー（f.c. 300 nM）中に 30 分間浸漬した。

いて電気化学検出用センサーを構築するために、洗浄後に、さらに金線を Blocking buﬀer で調製同様に VEGF アプタマーを用いて VEGF の電気した ZIF-GDH（f.c. 100 nM）に 30 分浸漬した。洗

化学検出を試みた（ Fig. 5b ）。まず、金の細線を浄後、金線を作用極、Pt 線を対極、Ag/AgCl を

SH-C 10 - COONHS エタノール溶液中に 6 時間浸漬

参照極とした三電極方式で 100 mV の電位を印加することで、チオール基を介して NHS を金線上し、m-PMS（（f.c. 1 mM）の存在下でグルコースに結合させた。洗浄後、ストレプトアビジン溶液（f.c. 100 mM）の添加に伴う応答電流値の変化を中（0.15 mg/mL）に金線を浸漬し、4 ℃で一晩静測定した。その結果、VEGF の濃度依存的に応置することで、金線上にストレプトアビジンを固

答電流値が増加し、検出下限 500 pM で VEGF定した。未反応の NHS は 1 M Tri-Cl（pH 8.0）でを検出することができた（ Fig. 7 ）。一方、VEGF

BSA（f.c.
25Ä
nM）
処理して Tris と結合させた。そして、ビオチン標&  6 3 % BSA (f.c. の代わりに
25 nM)7 Ŀ° を添加した場合は、' ô Ŭ Ǘ ĺ  & Æ
識抗 VEGF 抗体に 30 分間浸漬し、抗 VEGF 抗ŉŔř%ĥ!

4" 52&ŹĠ

2 ZIF-GDH 7 Ő 

体を金線上に固定した。Binding buﬀer（ 10 mM
Tris-HCl , 100 mM NaCl , 0.05 %（v/v）Tween 20,'

応答電流値の増加は観察されず、VEGF を特異的Ţ5に検出できることが示された。

ĩƧ9\L`l7Ő

これらの結果から、ZIF-GDH を用いて標識しÐ řbuﬀ% er
ĥ
!
4"Ţ  5   ZIF
ƣƧ4ǅ79\L`たアプタマーを用いて、標的分子を電気化学的にpH.7.0）で 洗 浄 後、Blocking
（
4%
（w/v）

検出できることが示された。ZIF
skim milk in binding buﬀer）
 でブロッキングし÷&ĩř%× 4 ĥ  ų 7 ħ ů  4 が認識する配列" ®ƃ!4{
た。そして、種々の濃度の VEGF 溶液に金線ををアプタマーに付加することによって、任意の標

30 分間浸漬することで、抗体で VEGF を捕捉し的に対する検出系を構築することが可能である。

た。洗浄後、ZIF 認識配列を付加した VEGF 結

今後、本研究で獲得した病原性大腸菌に結合するŕ ¨ ö Ê ƅ ƌ % Ź °  4 9 \ L ` l 7 ZIF-GDH ! ĩ Ƨ  Ǘ į £ Ð

4W;?KjFl7Ǎŗ4uÓ!4

4"' Ƙ Ö  5   VEGF 7  Ä ° ' ô Ŭ
0.016Ǘ ĺ  & ÆŢ5

2 ZIF-GDH 7 Ő 

"

100"

0.018

0.014
0.012

● VEGFĩ ř  Î
7Ǘį£○○ BSA
●

0.01

ĩƧ9
\L`l7Ő0.008

Ţ  5   ZIF

Δ"Current"(nA)

.c. 25 nM)7 Ŀ

ΔABS/min (GDH activity)

250

0.006

ƣƧ4
ǅ79\L`l%~
0.004

200

% ×  4 ĥ  ų 7 ħ ů  4  " 0.002® ƃ !  4  { í  ě Š ŧ ! ŋ ð  

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

5.5

°  4 9 \ L ` l 7 ZIF-GDH ! ĩ Ƨ  Ǘ įconcentration£ Ð ř %(nM)
ŕ¨öÊƅƌ7ĥ
Protein

6 ZIF-GDHで標識したアプタマーを用いた
VEGFの分光学的検出F l 7 Ǎ ŗ  4 u Ó !  4 Fig.Fig. 6. ZIF-GD
H で標識したアプタ
マ ー を 用 い た VEG F の 分 光 学 的 検 出
 
250

5

0"

1"

2"

3"

100

50

0

0"

150

4"%1

0

50"

0"

5"

10"

15"

Protein concentra

Fig . 7. ZIF -GD H で 標 識 した VEG F の 電 気 化 学 的 検

Δ"Current"(nA)

100"● VEGF○ BSA

200

50"

4.

0"

63%

150

0"

1"

 ěŠŧ%

1002"

● VEGF○ BSA

●3"○

 Cell-SELEX ĵ % 1 3 ŕ ¨ ö Ê ƅ ƌ !  4 E. coDNA
9\L`l7­ðð259\L`l'ǠŹ°ƃ7Ţ
50
ŉ
Ŕř%Ź°4"
0

3

3.5

4

4.5

5

0"

5.5

10"

15"

Ţ ¸  5  +  ZIF-GDH 7 Ő   9 \
20"

25"

30"

Ǎ ŗ  Protein
ZIF-GDH!ĩƧ  VEGF Ź ° 9 \ L ` l 7 Ő concentration(nM)

centration (nM)

で標識したアプタ
GF の 分 光 学 的 検 出

5"

 

W;?

FigFig.
.ħ
7.
ZIF
-GD
プ
マ
7ů
ZIF-GDHで標識したアプタマーを用いたの電気化学的検出

WH
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K識
jし
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Őタ

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た VEG F の 電 気 化 学 的 検 出
Ĺ ö 7 ÿ ĩ %     Ð ř ª ( Ǘ į £ Ð ř $ ú ĵ & r ď ! VEGFĥ!

4  " 7 Ţ    ZIF-GDH % 1 4 9 \ L ` l & ĩ Ƨ ú ĵ '腸管出血性大腸菌 O157 株のアプタマーを用いた電気化学検出用バイオセンサーの開発

アプタマーを ZIF-GDH で標識し、電気化学的に

謝

病原性大腸菌を検出するバイオセンサーを開発する予定である。
4.

おわりに
本研究において、Cell-SELEX 法により病原性大腸菌である E. coli NSM59 株に結合する DNA
アプタマーを取得した。得られたアプタマーは高い結合能を示し、E. coli NSM59 に特異的に結合することが示唆された。また、ZIF-GDH を用いたアプタマーの酵素標識法を開発し、ZIF-GDHで標識した VEGF 結合アプタマーを用いてバイ
オセンサーを構築した。構築したバイオセンサー
を用いることで、アプタマーの標的である VEGF
を GDH の酵素活性を指標にして、分光学的及び電気化学的な手法の両方で VEGF を高感度かつ特異的に検出できることを示した。ZIF-GDH によるアプタマーの標識手法は、ZIF が認識する塩基配列をアプタマーに付加するだけで任意のアプタマーの標識に応用できる。
今後、本研究で取得した病原性大腸菌に結合するアプタマーを ZIF-GDH で標識し、病原性大腸
菌の電気化学検出用バイオセンサーの構築を行う。また、本研究で E. coli NSM59 に結合するアプタマーの探索が可能であることを示した。今後、より検出ニーズの高い腸管出血性大腸菌 E. coli
O157 株 に 対 し て Cell-SELEX 法 で ア プ タ マ ーを探索することで、ZIF-GDH と組み合わせて E.

coli O157 の電気化学検出用センサーを開発可能である。本研究で標識用酵素として用いた GDH
は、市販の自己血糖測定用グルコースセンサーのセンサー素子として広く普及している酵素である。従って本検出系を確立することで、既存の小型検出機器を応用して病原性大腸菌を電気化学的に簡便に検出する技術開発を達成できると期待さ
れる。

141

辞
本研究を遂行するにあたり、多大な御援助を賜りました公益財団法人浦上食品・食文化振興財団に厚く御礼申し上げます。
文献1) Savory, N., Abe, K., Sode, K. & Ikebukuro, K. Selectionof DNA aptamer against prostate specific antigen using a
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浦上財団研究報告書

Vol.21（2014）

Development of aptamer based biosensors forelectrochemical detection of pathogenic E. coli
Nasa Savory, Atsuro Tatsumi, Koichi Abe, Wataru Yoshida, Kazunori Ikebukuro
Department of Biotechnology and Life Science,
Tokyo University of Agriculture and Technology
The development of highly sensitive biosensors for rapid detection of pathogenic
bacteria including Escherichia coli is urgently required for food safety and healthmonitoring. Aptamers are nucleic acid ligands that display high specificity and affinity
to a wide range of target molecules. In biosensors for detection of microbial pathogens,aptamers represent an alternative to antibodies as molecular recognition elements.
In order to establish selection of DNA aptamers against pathogenic bacteria, we
performed selection of aptamers against E. coli strain NSM59, which was isolated froma patient of catheter-associated urinary tract infection. After five cycles of Cell-SELEX,
we identified 29 oligonucleotide sequences. For further characterization, we chose six
from those sequences, which showed relatively stable 2D structures predicted by M-foldprogram (Zuker et al. 2003). As a result of aptamer-blotting assay, five sequences boundto E. coli NSM59 cells. We also demonstrated Ec#6, which displayed the highest binding
signal for E. coli NSM59, bound to E. coli NSM59 and neither to Morganella morganii
nor Pseudomonas aeruginosa. These results suggest Ec#6 would be valuable in thedevelopment of biosensors for detection of pathogenic E. coli NSM59.
Furthermore, we developed a biosensor platform for electrochemical detection using
DNA aptamer labeled with glucose dehydrogenase (GDH). Enzyme-labeling techniques
enable to amplify target-binding signals in aptameric sensors to achieve highly sensitive
detection. GDH is one of the most common enzymes used in commercial glucose sensors
for self-monitoring of blood glucose. Therefore, aptameric sensors based on enzymatic
activity of GDH ultimately can be applied to commercial glucose sensor systems.
To label an aptamer with GDH, we constructed a GDH fused zinc finger protein (ZIFGDH). ZIF is a DNA binding protein, and its molecular weight is small as 9 kDa. Thus, ZIF
shows the minimum effect on enzymatic activity when fused to GDH. We chose vascularendothelial growth factor (VEGF) as a model target prior to construction of aptasensors forpathogenic bacteria.
For electrochemical sensing, VEGF was captured on a gold wire electrode by antiVEGF antibody immobilized on the electrode. Then, the electrode was incubated with theanti-VEGF aptamer tagged with ZIF-recognition sequence followed by incubation withZIF-GDH. The response current to addition of glucose (f.c. 100 mM) was measured byusing the electrode as a working electrode, Pt wire as an counter electrode, and Ag/AgCl
as a reference electrode; the applied potential was +100 mV vs. Ag/AgCl. As a result, theresponse current increased with VEGF concentration dependent manner, and the lower
detection limit of VEGF was estimated to be 500 pM. These results suggest electrochemicalsensing of target can be achieved using aptamer labeled with ZIF-GDH.
In conclusion, we developed aptamers that specifically bound to E. coli NSM59
compared to M. morganii and P. aeruginosa. We also established an electrochemical
biosensor platform using aptamer and ZIF-GDH. The labeling technique using ZIFGDH can be applied to any aptamers tagged with ZIF-recognition sequences. Therefore,
the combination of the aptamer against pathogenic E. coli and ZIF-GDH techniqueultimately would achieve electrochemical sensing of pathogenic E. coli for food and healthmonitoring.