ブドウ・リンゴ・小豆等に含まれるプロアントシアニジン（植物ポリフェノール）の製法と機能性〜信州大学農学部での取り組み
真壁 秀文1,2、田中 沙智1,2、河原 岳志2、濱渦 康範2、藤井 博2
信州大学先鋭領域融合研究群 バイオメディカル研究所 生体分子イノベーション部門 1
信州大学大学院総合理工学研究科 農学専攻 食品生命科学分野 2

1.ブドウ梗抽出物に含まれるプロアントシアニジンの単離と抗腫瘍活性（１）転移原因遺伝子である脂肪酸結合タンパク質5 (FABP5)の遺伝子発現抑制活性を指標とした農産物抽出物のスクリーニング
FABP5 (Fatty acid binding protein 5):は癌の増殖と転移に関係する（3）ブドウ梗抽出物に含まれるプロアントシアニジンの精製
ブドウ梗 (シャルドネ,1 kg)
切 断 し水 を添 加
加熱還流1時間【ブドウ梗】
シャルドネ

Amberlite XAD-1180N：分子吸着用 (1.5L)

H 2O

レタスの葉AcOEt

MeOH (3.1g)

ブドウ 梗cv

ブドウの梗メタノールフラクションの一部 (1.0 g)
Sephadex LH-20：ゲル濾過 (100 ml) (30% Methanol, 40% Ethanol, 30% Acetone,40% Acetone, 60% Acetone)

Collected in 2006

5つのフラクション

Fraction 5 ( 345 mg)
Toyopearl HW40F：サイズ排除 (63 ml) (30% Methanol, 40% Ethanol, 60% Acetone)
3 Fractions

19種類の農産物の中で, ブドウ梗の抽出物にFABP5の発現抑制活性が見られた。

Fraction 3 (236 mg)
フラクション3の一部

逆相HPLCによる精製で化合物1を単離(4) 化合物1の推定構造 (ESI-TOFMS)
Fujii, H.; Kawahara, S.; Makabe, H. PCT Int. Appl. (2013),
WO 2013081046 A1 20130606.

Calcd for C 127H 102O 54 [M+H]+,
2475.5364; found, 2475.5425

2475.5425(5) 化合物1は前立腺癌細胞PC-3株の増殖と転移関連遺伝子
FABP5の発現を抑制した（2）ブドウ梗抽出物によるFABP5 の発現抑制活性試験
mRNAprotein*P < 0.05

Compound 1 cell count
1.21.0*0.8*

0.60.4

*

0.2

*

0.0

コントロール（リン酸緩衝液）

GSE

VehicleGSE

FABP50化合物 1 で処理した
前立腺癌細胞 PC-3 株

Vehicle153050Compound 1 (μM)

化合物 1 で処理した
前立腺癌細胞 PC-3 株の FABP5 発現抑制試験

FABP53化合物 1 で処理した
前立腺癌細胞 PC-3 株の細胞毒性試験

Kawahara, S.; Hamauzu, Y.; Makabe, H.; Fujii, H. et al. Scientific Reports 2019, 9, 12046.

2. エピカテキンおよびカテキン重合体の前立腺癌細胞におけるFABP5発現抑制活性と浸潤抑制活性（3）合成したflavan-3-ol重合体のヒト前立腺癌細胞PC-3に対する浸潤阻害活性試験→エピカテキン5, 6量体が顕著な活性を有する(1) 化学合成を行ったカテキンまたはエピカテキンの重合体
4量体

単量体は市販品

2量体

エピカテキン重合体における癌浸潤能評価試験
Upper chamber

5量体

Bottom chamber

3量体

ECM : extracellular matrix

赤色の構造式は抗腫瘍活性を示した

6量体

invaded cell（2）合成したエピカテキンやカテキンの重合体のヒト前立腺癌細胞PC-3に対するFABP5発現抑制活性試験→エピカテキン5, 6量体が活性を有する《 mRNA Level 》
FABP5 Gene Expression＊＊・・・P<0.01

0 .61 .20 .20

1Cont rol

0 .8

**

**

0 .60 .4
0 .2
01 .40 .4

Cont rol

Epi-2

Epi-3

Epi-4

Epi-5

Epi-6

Cat-2

Cat-3

Cat-4

Cat-5

1 .2
Relative mRNA
Expression( FABP5 / GAPDH )Relative Cell Number( Sample / Vehicle )1 .2＊・・・P<0.05

10 .8

1

*

0 .8

*

0 .6

Relative Cell Number( Sample / Vehicle )《 mRNA Level 》

Relative mRNA
expression (FABP5 /GAPDH)

1 .2＊＊・・・P<0.01

10 .8

**

0 .60 .4

**

0 .2

0 .4

00 .2c ontrol

Epi-2

Epi-3

Epi-40Cont rol

Areca tann in Areca tann in Areca tann in
A1A2A3

Fujii, H.; Makabe, H. et al. Scientific Reports, 2017, 7, 7791.

Epi-5

Epi-6

3. ガロカテキンまたはエピガロカテキン重合体の合成と癌細胞増殖抑制活性(2) 前立腺癌細胞に対するプロシアニジンB3とプロデルフィニジンB3の癌細胞増殖阻害活性試験 (Cell Count法)(1) 合成を行ったガロカテキンまたはエピガロカテキンの重合体単量体
（高価）

2量体
活性なし

PBS

顕著な活性
ピロガロール基B環 に 水 酸 基 がもう一 つ 結 合

3量体

OHOH
OH

HOO

OHHOOH
HOOH

OH
HOOH

OHOOH
HOOH

OOHOH

両化合物とも炭素骨格は同じである。唯一の違いは、B環上の水酸基の数である。
ピロガロール基は活性に必須の構造であることを確認した。

OHOH(epigallocatechin) 2-epicatechin

炭素骨格は同じ

OH
OH

OH

O

OH
OH
epigallocatechin trimer

OH
OH
OH

OH
OH

OH
HO

O

OH

O

OH

O

OH
HO

OH
OH
OH

OH
OH
OH

OH
HO

O

OH

O

OH
OH

HO

OH
OH
OH

OH
(epigallocatechin) 2-catechin

Fujii, H., Makabe, H. et al. Terahedron 2013, 69, 8349.

4. ブドウ梗抽出物の抗インフルエンザウイルス活性＊プエルトリコで1934年に単離されたヒトA型 H1N1ウイルス株。
感染性を持つヒトA型インフルエンザウイルスのモデルとして広く用いられている。

◎ 細胞
MDCK（Madin-Darby Canine Kidney）細胞＊イヌ腎臓尿細管上皮由来細胞株であるが、ヒトインフルエンザウイル
スに高い感染性を示すことで知られ、感染標的モデルとして最も一般的に用いられている細胞株◎ 実験タイムコース
MDCK細 胞 播 種
サンプル添加（ 2 10 5 cells/m L）（ 1, 10, 100 μg/m L）

24 h

1h

1hc100活性化吸着80

侵⼊2020分でウイルスが細胞表⾯に吸着、20分〜90分で侵⼊
治療的作⽤イメージ
aaN.D.
NC

PC(PR8 のみ )110100

1XAD-Ac (μg/mL)

定 量 RT-PCR法 に よ る
M1タ ン パ ク 質 発 現 解 析

aN.D.

10100

放出

XAD-Me (μg/mL)

感染成⽴

ゾフルーザ
タミフル、リレンザ、イナビル、ラピアクタ

aaa

侵⼊

予防的

標的細胞

b40

吸着
標的細胞

60

08h

ブドウ
プロアントシアニジン

120

ウイルス添加サンプル、ウイルス洗浄除去

ブドウ梗プロアントシアニジンに期待される作用点

ブドウ梗プロアントシアニジンがインフルエンザウイルス M1 タンパク質発現に及ぼす影響

M1発現量（ /GAPDH）

実験概要◎ サンプル
ブドウ果柄プロアントシアニジン画分XAD-Ac、XAD-Me（60%EtOHに溶解）◎ ウイルス
A/Puerto Rico/8/34（略称: PR8）

ゲノム複製
mRNAの転写タンパク質合成

組⽴

増殖サイクル1回の所要時間は6〜8時間、約100倍に増殖*P < 0.01◎ 統計
Tukey-Kramer多重比較検定

5. 柿に含まれる非抽出性プロアントシアニジンとその機能性
市田柿（干柿）の不溶性タンニン

市田柿NEPP（不溶性タンニン）の分析例

青果物におけるNEPPの形成• NEPA形成が食品機能性に及ぼす影響
一般の柿タンニン（EPP）の構造 NEPP/AISのチオール分解後のHPLCクロマトグラム• 繊維画分の胆汁酸吸着/排泄能

2
EGCG
or
GCG

HF + DPAIS

HF + AIS(NEPA & fibers)
ECG• 干柿果肉切片における不溶性タンニンの染色（左上）• 不溶性タンニン塊の顕微鏡観察（上段 無染色および染色100倍 ，下段 染色 400倍）

cc1EGC534EC

各ピークはこれら
カテキン類のシステアミン付加物
67

不 溶 性 タンニ ン = 非 抽 出 性 プロア ントシ ア ニ ジ ンの 構 成 ユ ニ ット
1 = エピガロカテキン (EGC)–cys*

2 = エピガロカテキンガレート (EGCG)–cys

3 = エピカテキン (EC) –cys

4 = ガロカテキンガレート (GCG)–cys

Amount of dry feces and bile acid-excretion at three data sampling points of mice fed experimental diets.
LF, low-fat diet; HF, high-fat diet; HF + AIS, HF diet supplemented with 1% AIS fraction; HF + DP, HF diet supplemented with 4% driedpersimmon powder. Error bars indicate SE (n = 5). Means sharing the same letter are not significantly different (Tukey-Kramer, P < 0.05).

5 = エピカテキンガレート (ECG)–cys 6 = EC 7 = EGCG
* cys = cysteamine thioether

Hamauzu, Y. et al. Food Chem. 2022, 373, 131617.

6.免疫調節機能を有するprocyanidin B2 3,3”-ガレート
ガレート型プロシアニジンの研究

・プロシアニジンB2 3,3”-ジガレートは炎症性のサイトカイン（IFN-g、IL-17）の産生を抑える。

✓免疫調節作用✓抗炎症作用作用機序の解明（基礎研究）

疾患改善効果の検証（応用研究）

Tanaka, S.*, Makabe et al. Int. Immunopharmacol. 2017, 44, 87.
T細胞からのサイトカイン産生低下✓有機合成✓安全性が高い・T細胞における解糖系の抑制を介して、TNF-aの産生を抑える。
Endo, K., Makabe, H., Tanaka, S.* et al. Biochem Pharmacol. 2020, 177,113952.

細胞代謝を介した免疫制御

皮膚炎の抑制効果

OHOHOO・樹状細胞からのサイトカイン産生の抑制を介してT細胞のIL-17の産生を抑える。
ガレート型プロシアニジン（PCB2 3,3”-di-O-gallate）

ガ レ ー ト型 プロ シ ア ニ ジ ン は
細 胞 代 謝 を介 して 免 疫 調 節 作 用 を示 す

OHOHOHO

皮膚炎

OHOH
OH

Endo, K., Makabe, H., Tanaka, S.* et al. Biochem Pharmacother. 2021,137, 111346.

OHOOH

ガレート型
プロシアニジンOOHOHO

代謝経路

OHOH

ガレート基

T細胞

ガ レ ー ト型 プロ シ ア ニ ジ ン の抗 炎 症 効 果 に より、皮 膚 炎 を抑 制 す る

皮膚炎の改善本研究のまとめ1. 抗腫瘍活性
① ブドウ（シャルドネ）の梗由来のプロアントシアニジンはヒト前立腺癌細胞に対する細胞毒性，癌転移関連遺伝子であるFABP5発現抑制活性，浸潤試験において顕著な活性が見られた。
②化学合成を行ったプロアントシアニジンのうちでエピカテキンの5, 6量体は癌転移関連遺伝子であるFABP5発現抑制活性と癌細胞の浸潤抑制試験において顕著な活性が見られた。
③ 化学合成を行ったプロアントシアニジンのうちでピロガロール基を持つプロデルフィニジン類はヒト前立腺癌細胞に対する顕著な細胞毒性が見られた。
2. ブドウ（シャルドネ）の梗由来のプロアントシアニジンは強い抗インフルエンザウイルス活性が見られた。
3. ブドウの種子に含まれるプロシアニジンB2 3,3”-ガレートは免疫調節活性を示した。
4. 柿に含まれる不溶性プロアントシアニジン類は胆汁酸排泄促進作用を持つことを明らかにした。