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浦上財団研究報告書

Vol.23（2016）＜平成 25 年度助成＞

新規成長遅延モデル動物を用いた成長キャッチアップフードの探索
浮穴

和義（広島大学大学院総合科学研究科生命科学研究領域）

1.

緒

プチドを Neurosecretory protein GL（NPGL）と言命名した 6 ）。この NPGL の前駆体遺伝子をラッ

生後の成長や発達は、脳下垂体で作られる成長トの視床下部へ過剰発現させると、体重、大腿骨ホルモン（GH）やその標的組織である肝臓で合成長、筋肉量から判断した結果、成長抑制効果が認されるインスリン様成長因子（IGF-1）の働きによめられた。さらに、脳下垂体中の GH mRNA 発現るところが大きい。GH の合成・分泌の調節を行っが減少することから、GH の合成・分泌を抑制しているのが間脳視床下部領域で産生される成長ホている可能性が考えられる。これらのことから、ルモン放出促進ホルモン（GHRH）やその拮抗作用NPGL の働きを高めることで新規成長遅延モデルを有するソマトスタチンである。GH や GHRH の動物が産出できるのではないかと考えた。特に、分泌が十分に行われない場合やそれらの受容体変冒頭の成長ホルモン分泌不全性低身長症と表現型異がある場合、成長ホルモン分泌不全性低身長症が極めて類似していることから、成長回復のためが生じる

1-3）。臨界期での治療を逃すとその後の成長に重大な影響を及ぼすことが一般的に知られの治療薬や食品成分の探索に利用する可能性を考えた。
そこで、本研究の目的は、我々が独自の研究でている。
我々は、脳下垂体ホルモン分泌に関わる視床下4,5）発見した NPGL の過剰作用による成長遅延モデルを経て、未知の視床下部因子ラットを産出し、成長回復（キャッチアップ）フーの探索を目指して研究を開始した。その結果、鳥ドを探索することとした。本研究では、前駆体遺類（ニワトリ）や哺乳類（ヒト、ラット、マウス）に伝子の過剰発現ではなく、NPGL を脳室内へ投与おいて間脳の視床下部に特異的に発現しているすることにより成長遅延が生じるかをまず検討

部ホルモン研究6）。この視床下部領域し、その後、高カロリー食、高脂肪食、高ショ糖は、ラットでは弓状核を含んだ部位であり、摂食食、ショ糖含有脂肪食、マクロ栄養素（炭水化物、調節中枢のひとつである。絶食、肥満モデル、糖脂肪、タンパク質）選択食を用い、どの食餌が成尿病モデル動物を用いた遺伝子発現解析から、新長キャッチアップフードとして適当かを解析する

規遺伝子の発現量が変動することを見出しておこととした。それらの指標として、体重増加量、り、エネルギーホメオスタシスに関与していると摂食量、飼料効率（体重増加量 / 累積摂食量）、大予測している。さらに、新規遺伝子から翻訳され腿骨長を測定した。さらに、視床下部中の GHRHるタンパク質には分泌性ペプチドがコードされてとソマトスタチンの mRNA 発現量、脳下垂体中のいると推測しており、実際に前駆体遺伝子から

GH mRNA 発現量、血中の GH 及び IGF-1 濃度を成熟神経ペプチドが産出されることも確認して測定し、NPGL による成長遅延の原因について解いる。その C 末端部分の配列から、この神経ペ析した。

新規遺伝子を最近発見した

新規成長遅延モデル動物を用いた成長キャッチアップフードの探索

2.

方2-1

実験動物・飼料19

高 シ ョ 糖 食（High Sucrose Diet ; HSD、Sucrose

法

70 kcal %）、シ ョ 糖 含 有 脂 肪 食（High Fat andSucrose Diet ; HFSD、Fat 32 kcal %・Sucrose

実験動物として Wistar 系統の 8 週齢の雄ラットを用いた。

20 kcal %）、 マ ク ロ 栄 養 素 飼 料（MacronutrientDiet; MD、タンパク質食 99 kcal %、炭水化物食

飼料は、日本クレア社とリサーチダイエット社

100 kcal %、脂肪食 99 kcal %）の組成は表 1 に示す。の製品を用いた。日本クレア社のげっ歯類用の普マクロ栄養素飼料以外は固形飼料とした。マク

通食（Normal Chow; NC）と高カロリー食（Quick

ロ栄養素飼料は、タンパク質、炭水化物、脂肪のFat ; QF）の成分は非公開であった。

みからなる 3 種類の粉末飼料を給餌箱に個別に入リサーチダイエット社 の 高 脂 肪 食（High FatDiet ; HFD、Fat 60 kcal %・Sucrose 7 kcal %）、表1

れ、ラットに自由摂餌を行わせ、それぞれの摂食量を測定した。

本研究で用いた飼料の組成

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2-2. 成長遅延モデルラットの産出と成長キャッチアップフードの探索
NPGL は、 ペ プ チ ド 合 成 機 で 合 成 し 7 ）、15Vol.23（2016）

群と差が見られなかった（図 1E）。
3-2.

高脂肪食、高ショ糖食、ショ糖含有脂肪食、マクロ栄養素食給餌条件下での体重増加、摂食量、飼料効率の解析

nmol/day の投与量になるように溶解し、Alzet 社の浸透圧ポンプに充填した。脳室内投与カニュー

上記の実験 3-1 で使用した日本クレア社製の高レを装着し、背側皮下に埋め込んだ浸透圧ポンプ

カロリー食の組成が公表されていなかったため、と接続し、2 週間の慢性投与を行った。12 時間のリサーチダイエット社製の組成が公表された飼料

明暗周期条件にて飼育し、明期と暗期の摂食量をを用い、同様の解析を行った。

測定した。摂食量はカロリー表示とした。

高脂肪食（HFD）と高ショ糖食（HSD）給餌条件

毎日、体重を測定し、体重増加量を算出した。

下では、NPGL 投与により有意差は無いものの対飼料効率（体重増加量/累積摂食量）は投与開始日照群と比較して体重増加の抑制が観察された（図及び最終日の体重と累積摂食量を基に算出した。

2A, B）。この時、摂食量にも顕著な変化は認めら

さ ら に、HFD、HSD、HFSD、MD 給 餌 群 で は、れなかった（図 3A, B）。

大腿骨長を測定した。
2-3.

成長遅延の原因探索

普通食給餌のラットを用い、NPGL の脳室内慢性投与後に視床下部、脳下垂体、血液を回収した。

一方、ショ糖含有脂肪食（HFSD）給餌条件下では、対照群と体重増加量は等しくなり、NPGL による成長遅延効果がキャンセルされた（ 図 2C）。
この時、摂食量は有意に増加した（図 3 C）。

視床下部中の GHRH とソマトスタチン mRNA

次に、マクロ栄養素食（MD）選択給餌条件下に発現量、脳下垂体中の GH mRNA 発現量をリアル

おいて NPGL を脳室内へ慢性投与した結果、対タイムRT-PCR 法により測定した。

照群と比較して体重増加に差は見られなかった

さらに、血中の GHとIGF-1 の濃度を ELISA 法により測定した。
結3.
3-1.

果

普通食と高カロリー食給餌条件下での体重増加、摂食量、飼料効率の解析（ 図 2 D）。摂食量は有意に増加した（ 図 3 D）。このマクロ栄養素食は、個別の容器に粉末飼料として与えたが、タンパク質食、炭水化物食、脂肪食の内、炭水化物食の摂食量が増加傾向であり、総摂食量は有意に増加していることが明らかとなった（図 4 ）。

まず、げっ歯類用の普通食（NC）給餌条件下に上記の各々の飼料を与えた時の、飼料効率と大おいて、成長遅延が生じるかを解析した。その結腿骨長を測定したところ、HFD､ HSD、HFSD

果、体重増加量が NPGL 投与群で有意に低下して給餌条件では飼料効率が有意に低下していた（図いた（図 1A）。摂食量は殆んど変化が見られなかっ5 A ）。大腿骨長は、HFD 給餌条件下では有意にた（ 図 1C）。さらに、体重増加量を累積摂食量で短かったが、それ以外の給餌では有意な変化は見割った飼料効率を求めたところ、NPGL 投与群でられなかった（図 5 B ）。

有意に低いことが分かった（図 1E）。

3-3.

成長遅延の原因探索

次に、高カロリー食（QF）給餌条件下で NPGL

最 後 の 実 験 と し て、 普 通 食 給 餌 条 件 下 で のを脳室内へ 2 週間慢性投与したところ、体重増加

NPGL 投与における成長遅延の原因を探るためは対照群と差が見られなかった（ 図 1B）。摂食量に、成長ホルモンの合成・分泌に着目して解析をは有意に増加していた（図 1D）。飼料効率は対照行った。

新規成長遅延モデル動物を用いた成長キャッチアップフードの探索

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視床下部領域における GHRHとソマトスタチンして利用可能であると考えた。この過剰発現法はmRNA 発現量、脳下垂体中の GH mRNA 発現量、アデノ随伴ウイルスベクターを用いた遺伝子組換

血中の GH 及び IGF-1 濃度のいずれにおいても対え実験であり、ウイルスベクターの調整や視床下照群と比較して NPGL 慢性投与群で差は認められ部の限局した部位への投与といった煩雑さや精巧なかった。

さが求められることから、熟練した手技を必要と4.

考しており、実験の再現性を得るのが難しい。そこ察で、本研究では、合成 NPGL を用いた脳室内慢性我々の先行研究において、NPGL 前駆体遺伝子投与実験により前駆体遺伝子の過剰発現と同様なの過剰発現系において成長遅延が生じることを見表現型が生じるかを最初に検討した。その結果、出している。このことから成長遅延モデル動物と普通食（NC）給餌条件下で、体重増加の抑制と飼図 1. 普通食（NC）と高カロリー食（QF）給餌条件下での体重増加、摂食量、飼料効率（A）NC 給餌条件下の体重増加量、（B）QF 給餌条件下の体重増加量、（C）NC 給餌条件下の摂取カロリー、（D）QF 給餌条件下の摂取カロリー、（E）NC 及び QF 給餌条件下の飼料効率（n ＝ 8）*p < 0.05, ***p < 0.005

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図 2. 高脂肪食（HFD）、高ショ糖食（HSD）、ショ糖含有脂肪食（HFSD）、マクロ栄養素食（MD）給餌条件下での体重増加（A）HFD 給餌、（B）HSD 給餌、（C）HFSD 給餌、（D）MD 給餌（n ＝ 8）

図 3. 高脂肪食（HFD）、高ショ糖食（HSD）、ショ糖含有脂肪食（HFSD）、マクロ栄養素食（MD）給餌条件下での摂食量（ A ）H F D 給 餌 、（ B ）H S D 給 餌 、（ C ）H F S D 給 餌 、（ D ）M D 給 餌（ n = 8 ）*p < 0.05, ***p < 0.005

新規成長遅延モデル動物を用いた成長キャッチアップフードの探索

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図 4. マクロ栄養素食（MD）給餌条件下での摂食量の内訳
総（Total）摂取カロリー、タンパク質（Protein）摂取カロリー、炭水化物（Carb）摂取カロリー、脂肪（Fat）摂取カロリー（ n = 8 ）***p < 0.005

図 5. 各種飼料給餌条件下の飼料効率と大腿骨長（ A）H F D, H S D, H F S D, M D 給 餌 条 件 下 で の 飼 料 効 率 、（ B）大 腿 骨 長（ n = 8 ） *p < 0.05, * *p < 0.01, * * *p < 0.005

料効率の低下が認められ、成長遅延が生じている料であったため、成分が公開されている高脂肪食ことが確認できた。

（HFD）、高ショ糖食（HSD）、ショ糖含有脂肪食

次に、安価な高カロリー食（QF）を用いて同様（HFSD）を用いて解析を行った。その結果、上の実験を行ったところ、摂食量を増加させ、成長記の QF と同様の効果が認められたのは HFSD で遅延効果をキャンセルする効果があることが認めあった。しかしながら、飼料効率の観点からするられた。残念ながら用いた QF が成分非公開の飼と、HFD､ HSD、HFSD 共 に NPGL 投 与 群 で は24

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Vol.23（2016）

低下しており、完全な成長キャッチアップフードいった生命活動全般に悪影響を及ぼすことが容易とは言い難い。より少ない飼料摂取で最大限の体に想像できる。また、発達期・成長期における栄重増加を示す飼料の同定が望まれた。そこで、最養の偏りは、成人後の体つきや体質、さらには食後の食餌給餌実験として、マクロ栄養素飼料によ嗜好性にも大きな影響を及ぼす。今回は、特にる自由選択性給餌条件を用いることとした。その脂肪やショ糖に着目して餌組成を変更した。その結果、摂食量が有意に増加し、体重増加も対照群

結果、成長キャッチアップフードとしてベストでと比べて増加傾向を示すことが分かった。これらある食餌組成は、マクロ栄養素飼料を用いた研究の原因は、炭水化物食の摂食量の増加が主であるにより明らかにできた。今後は、成長ホルモン分と考えられる。飼料効率も、対照群と一致し、成泌不全性成長遅延モデル動物でも同様な解析を行長キャッチアップフードとしての条件を満たしてい、今回の知見が広く成長遅延への対処法としていると思われる。この自由摂餌の栄養素の組成を有益かどうかを検討したい。さらに、動物実験で計算したところ、タンパク質 39 kcal %、炭水化物の知見を我々人間への応用可能かどうかについて54kcal %、脂肪 7 kcal %となった。今後、この組も、検討していく必要がある。

成からなる固形飼料を作製し、簡単に摂取できる成長キャッチアップフードとしての可能性を検討謝していく必要がある。

辞本研究を遂行するにあたり、学術研究助成を賜

一方、NPGL 前駆体過剰発現や NPGL の脳室内慢性投与によって生じる成長遅延は既知の成長りました公益財団法人浦上食品・食文化振興財団に心より感謝申し上げます。

ホルモン分泌不全性低身長症と比べ、何が違うの

また、本研究の遂行は、所属研究室の岩越栄子であろうか。成長ホルモン分泌不全性低身長症と博士、近藤邦裕氏、鹿野健史朗氏、益田恵子氏らNPGL 作用の表現型が極めて類似していることの協力によりなされたものです。この場をお借りから、成長ホルモンに着目して解析を行った。しして感謝いたします。

かしながら、結果の項目で記した通り、成長ホルモンの合成・分泌を介した作用ではないことを示文

唆するデータが得られた。一方、先行研究からは

1) Toogood AA, Adams JE, O’Neill PA, Shalet SM. Body
composition in growth hormone deficient adults over the ageof 60 years. Clin. Endocrinol (Oxf). 45:399-405 (1996)

NPGL 前駆体遺伝子の過剰発現実験において、脳下垂体中の GH mRNA 発現量が低下していた。過剰発現の期間が約 1 月半であったことから、今回の NPGL 慢性投与の 2 週間とは作用期間が異なることが原因なのかもしれない。したがって、成長遅延のメカニズムに関しては今後の詳細な検討が必要である。
現在、巷ではダイエットのために脂質や炭水化8,9）物の制限が盛んに行われている。しかしながら、成長期での無理なダイエットに関して様々な弊害が指摘されている。特に、特定の栄養素を抜くことはタンパク質合成や脂質合成、新陳代謝と献2) Laron Z, Ginsberg S, Lilos P, Arbiv M, Vaisman N. Body
composition in untreated adult patients with Laron syndrome(primary GH insensitivity). Clin. Endocrinol (Oxf). 65:114117 (2006)
3) List EO, Sackmann-Sala L, Berryman DE, Funk K, Kelder
B, Gosney ES, Okada S, Ding J, Cruz-Topete D, Kopchick
JJ. Endocrine parameters and phenotypes of the growth
hormone receptor gene disrupted (GHR-/-) mouse. Endocr.
Rev. 32:356-386 (2011)
4) Ukena K, Koda A, Yamamoto K, Kobayashi T, IwakoshiUkena E, Minakata H, Kikuyama S, Tsutsui K. Novelneuropeptides related to frog growth hormone-releasing
peptide: Isolation, sequence, and functional analysis.
Endocrinology 144:3879-3884 (2003)
5) Ukena K, Tsutsui K. A new member of the hypothalamic
RFamide peptide family, LPXRFamide peptides: Structure,新規成長遅延モデル動物を用いた成長キャッチアップフードの探索

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localization and function (review). Mass Spectrom. Rev.
24:469-486 (2005)

composed of 80 amino acid residues. J. Pept. Sci. 21:454460 (2015)

6) Ukena K, Iwakoshi-Ukena E, Taniuchi S, Bessho Y,Maejima S, Masuda K, Shikano K, Kondo K, Furumitsu
M, Tachibana T. Identification of a cDNA encoding a novel
small secretory protein, neurosecretory protein GL, in thechicken hypothalamic infundibulum. Biochem. Biophys.
Res. Commun. 446:298-303 (2014)

8) Stern L, Iqbal N, Seshadri P, Chicano KL, Daily DA,
McGrory J, Williams M, Gracely EJ, Samaha FF. The effectsof low-carbohydrate versus conventional weight loss diets inseverely obese adults: one-year follow-up of a randomized
trial. Ann. Intern. Med. 140:778-785 (2004)

7) Masuda K, Ooyama H, Shikano K, Kondo K, Furumitsu
M, Iwakoshi-Ukena E, Ukena K. Microwave-assisted solidphase peptide synthesis of neurosecretory protein GL

9) Cardillo S, Seshadri P, Iqbal N. The effects of a lowcarbohydrate versus low-fat diet on adipocytokines inseverely obese adults: three-year follow-up of a randomized
trial. Eur. Rev. Med. Pharmacol. Sci. 10:99-106 (2006)

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浦上財団研究報告書

Vol.23（2016）

Search for catch-up foods that can promote growth inanimal models of delayed growth
Kazuyoshi Ukena
Graduate School of Integrated Arts and Sciences
Hiroshima University
We recently identified a cDNA encoding a novel small secretory protein in thehypothalamus of birds and rodents and named it neurosecretory protein GL (NPGL). Inrats, NPGL-producing neurons are localized to the arcuate nucleus of the hypothalamus,
which is involved in the regulation of feeding behavior and energy homeostasis. NPGLmRNA expression in the hypothalamus was altered in fasted rats, streptozotocininduced diabetic rats, and genetically obese (fa/fa) Zucker rats, suggesting that NPGL
modulates energy homeostasis. Moreover, the overexpression of the precursor gene in thehypothalamus showed the dwarf phenotype in rats. Therefore, this animal over-expressing
NPGL may be a good model for studies on the dwarf phenotype. The purpose of thepresent study was to determine the ideal catch-up food among various foods including
high-fat foods, high-sucrose foods, foods with high contents of both fat and sucrose, andmacronutrient-rich diets, which can help promote the growth of these dwarf rats.
We chronically injected NPGL into the cerebral ventricle of male rats for 2 weeks
using an osmotic pump. We then fed the rats a normal chow or one of several high-calorie
diets, measured their body weight and food intake, and calculated food efficiency. In thenormal chow-diet group, the infusion of NPGL suppressed body weight gain, without
affecting food intake. However, the injection of NPGL into the high-calorie–diet groupincreased food intake without suppressing body weight. These results indicated that a highcalorie diet is a candidate catch-up food that can promote growth in rat models of delayedgrowth. Furthermore, we investigated the growth and food intake in more detail in the rats
fed the different diets, and found that the macronutrient-rich diet with 39 kcal% protein,
54 kcal% carbohydrate, and 7 kcal% fat was the most effective in preventing the dwarf
phenotype.
These results suggest that chronic central infusion of NPGL in rats is a good technique
to develop dwarf models for animal studies. Furthermore, a high-carbohydrate diet is agood catch-up food that can promote growth in these rat models of delayed growth.