革新的環境技術シンポジウム 20142014年 12月 17日

バイオリファイナリーの実用化に向けた取組みの現状と展望公益財団法人 地球環境産業技術研究機構（RITE）
バイオ研究グループ
グループリーダー代行, 主席研究員
奈良先端科学技術大学院大学（NAIST）
バイオサイエンス研究科 客員教授

乾 将行

新規産業: バイオリファイナリー
非可食
バイオマス

C6糖
C5糖

バイオ燃料
増殖非依存型
バイオプロセス・エタノール

反応槽に微生物を高密度充填し反応する・ブタノール 他

・イソブタノール

混合糖完全同時利用可
6

グリーン化学品

5
醗酵阻害
物質耐性

自動車部材、包装材、電気製品部材、
炭素繊維、各種樹脂等

・C2 エタノール

菌体触媒
（非増殖）

・C3 プロパノール

高生産性

・芳香族類
カルボン酸
アミン等

・C4 ブタノール等

2バイオリファイナリー市場予測

市場規模は急拡大と推定$700.7 Billion by 2018
BCC Research 2014（incl. biorefinery application）
3バイオリファイナリー

high volumes
1. バイオ燃料……… low margins
バイオアルコール（エタノール、ブタノール等）
バイオディーゼル

lower volumes
2. グリーン化学品… higher margins
C3～C6化合物
アミノ酸
芳香族化合物等
4グリーンケミカルズ: 市場規模予測
Bio-derived chemicals … $331.3 billion in 2018
BCC Research（2014）

Bio-based chemicals…… €450（$576） billion by 2020
DSM Press Information（2012）

Make green-chemicals firstBy 2030, 30% of chemicals is expected to be bio-based
Joint European Biorefinery Vision for 2030（2013）5バイオポリマー生産量予測
12

Thermosets （熱硬化性樹脂）
PU （ポリウレタン）
CA （セルロースアセテート）
PET
Polyolefins
PBS （コハク酸樹脂）
PBAT
PA
PHA （ポリヒドロキシアルカノエート）
Starch Blends
PLA

10

Million ton

8

6

4

2

0
2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018 2019 2020

http://www.biofpr.com/details/news/4459681/Production_capacity_of_bio-based_polymersm_will_triple_by_2020_according_to_stud.html

Bio-based polymer production will reach nearly
12 million tonnes by 2020 and its share should increase
from 1.5% in 2011 to 3% in 2020（Biofpr.com, 2013）.

6

シェール革命による化学産業への影響
シ
ェ
｜
ル
ガ
ス

メタン

LNG

＞90%

エタン

エチレン

～10%

プロパン

プロピレン

ナフサ

原
油

＜5%

芳香族化合物
芳香族化合物及びC4以上の化学品は、シェールガスからの生成は難しく、
今後、価格上昇が予想される。
CO2排出量削減からもバイオマスからの製造技術確立が期待される。

7

増殖非依存型バイオプロセスの概念図
増殖非依存型バイオプロセス
特許 JP3869788

反応槽に微生物を高密度充填し反応する

JP4451393
US7368268
EP1647594
CH1647594

混合糖完全同時利用可

C5, C6糖

高生産性

醗酵阻害
物質耐性

JP4927297
US7598063
EP1291428
JP4294373

微生物が増殖しないため、

生産物
バイオ燃料
バイオ化学品

菌体触媒（増殖なし）

DE602004026192.0
DK1647594
FR1647594
GB1647594■増殖のためのエネルギーロスがなく、原料収率が高い。
■システムが簡便である。

従来の醗酵法微生物が増殖しながら物質を生成する■微生物が増殖するため、スペースが必要であり巨大な反応槽が必要となる。
■生産（反応）時間は微生物の増殖に依存する。

増殖8

セルロース原料法
増殖非依存型バイオプロセス特性

混合糖類（C6, C5糖）の完全同時利用性“醗酵阻害物質”
への高度耐性9背景: ソフトバイオマスの有効利用
Corn stover

ソフトバイオマス:
不可食性（未利用資源）
草本系バイオマス由来
稲ワラ, corn stover, bagasse, スイッチグラス等

ソフトバイオマス（Corn stover）
Other

BagasseGlucose（36%）
Galactose（2%）

Arabinose（3%）

Mannose（0.3%）
Xylose（22%）

C5 sugars（25%）

C6 sugars（38.3%）
10C6糖、C5糖の同時利用
Cellulose

Cellobiose（C6-C6）

Adaptive mutant for cellobiose uptake ability

1）

bglF

Glucose（C6）ptsG

Corynebacterium
glutamicum

CH2OH
O
OH

Pentosetransporter

Xylose（C5）
HOH2C

OH

O
OH

Chromosomal integration for xylose metabolic ability
promoterpromoter

xylA
OHxylose isomerase

Arabinose（C5）
OH

O
OH

xylB

xylulokinase

Chromosomal integration for arabinose metabolic ability
araB

2）

araA

araD

3）

〜

Hemicellulose

OH
OH

〜

HO

L-arabinose isomerase

HOH2C
OH

L-ribulokinase

L-ribulose-5-P-4-epimerase

RITE論文:1）Microbiology 149:1569-1580. 2003. 2）Appl. Environ. Microbiol. 72:3418-3428. 2006. 3）Appl. Microbiol. Biotechnol. 77:1053-1062. 2008.

11ペントーストランスポーターの導入による混合糖同時利用能の向上（増殖非依存型バイオプロセス）
Pentose transporter 遺伝子（araE） 導入

200

200
グルコース

キシロース

キシロース

アラビノース

100

100

50

50

0

0
0

2

4

6

8

反応時間（h）

10

アラビノース150

糖濃度（mM）

150

糖濃度（mM）

グルコース

12

0

2

4

6

8

10

12

反応時間（h）
RITE論文: Appl. Microbiol. Biotechnol. 85:105-115. 2009.

12

混合糖（C6&C5）利用能の付与
Galactose

GlucosePyruvate

Glucose-PTS

MannoseManA

Fructose

Fructose-PTS

SucroseSucrose-PTS

Cellobiose

β-Glucoside-PTS

BglA

Xylooligosaccharides

Xyloside symporterand / orABC transporter

XylD

XyloseGlycolysis

XylAB
Pentose symporter

Arabinose

AraBAD

Pentosephosphate
pathway13

セルロース原料法
増殖非依存型バイオプロセス特性

混合糖類（C6, C5糖）の完全同時利用性“醗酵阻害物質”
への高度耐性14醗酵阻害物質とは？
醗酵阻害物質
O
O

バイオマス

CHO

OH

前処理
（加圧高温）
酵素
分解

C6糖 6
C5糖 5

エタノール醗酵阻害混合糖

醗酵

燃料エタノール
15主な阻害物質
バイオマス成分

Hexoseセルロース

リグニン
ヘミセルロース

O

OH

CHO

O

4-HB

OCH3

FuransO

Phenols

Vanillin

PentoseOH

HOH2C

4-hydroxybenzaldehyde

O

O

CHO

O
OH

Syringaldehyde
CH3O

Acetic acidFurfural

5-HMF
5-hydroxymethyl2-furaldehyde

OCH3
OH

E. Palmqvist, B. Hahn-Hägerdal. Bioresource Technology 74:25-33. 2000. より改変

16

阻害物質の影響●RITE Bio-Process■ザイモモナス菌

フルフラール

4-HB
100

Relative ethanol
productivity（%）

Relative ethanol
productivity（%）

100
80
60

O

40
20
0

▲アルコール酵母

OH
0

5

10

15

Concentration（mM）

20

80
60

O

40

CHO

20
0

0

20

40

60

Concentration（mM）

RITE論文: Appl. Environ. Microbiol. 73:2349-2353. 2007.

17

各種前処理糖化液中の阻害物質濃度
Ⅰ 1）

Ⅱ 2）

Ⅲ 3）

Ⅳ 4）

前処理

希酸処理

水蒸気爆砕処理アルカリ処理超臨界水処理原料

コーンストーバ

バガス

麦わら

スギ

Acetate

43

70

28

Furfral

13

11

2.5

5-HMF

2.4

3.2

3

4-HB

0.9

Vanillin

阻害
物質
（mM）

5.4

Formate22

p-coumaric acid

2.9

Ferulic acid

1.1

91

Glycolic acid17

Lactic acid

4.9

Succinate

2.5

Malate1.2

Coniferylaldehyde
1）Nicholas et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 121-124:379-390. 2005.
2）Martin et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 98-100:699-716. 2002.
3）Klinke et al., Bioresour. Technol. 82:15-26. 2002.
4）Miyafuji et al., Appl. Biochem.Biotechnol. 121-124:963-971. 2005.

0.5※文献中0.1g/L以下の成分は除外

18

阻害物質混合液での耐性

Realtive Ethanol
Productivity（%）

100
80

60
40
20
0

I

II

III

IV

希酸
処理

水蒸気
爆砕

アルカリ
処理

超臨界水
処理

RITE論文: Appl. Environ. Microbiol. 73:2349-2353. 2007.

19

Product portfolio by RITE bioprocess（1）バイオ燃料（2）グリーン化学品

 ガソリン混合・代替・エタノール（NREL）

 芳香族化合物
・シキミ酸（インフルエンザ治療薬タミフル原料）
・フェノール（フェノール樹脂、ポリカーボネート）
・4-ヒドロキシ安息香酸（ポリマー原料）
・アニリン（石油外天然資源タイヤ原料（老化防止剤））

 バイオジェット燃料
・イソブタノール（NREL）
・n-ブタノール（NREL）
・C10~C15飽和炭化水素+芳香族化合物 バイオ水素 有機酸
・D-乳酸、L-乳酸（ステレオコンプレックス型ポリ乳酸）
・コハク酸
 アミノ酸・アラニン（医薬品原料、食品）
・バリン（次世代飼料用アミノ酸、医薬品原料、食品）
・トリプトファン（飼料用アミノ酸、医薬品原料、飲料）
・メチオニン（飼料用アミノ酸、調味料）
 アルコール
・イソプロパノール（プロピレン原料）
・キシリトール（甘味料）
20

高細胞阻害物質の生産技術確立への挑戦
生成物による増殖阻害のため高細胞阻害物質を増殖を伴う醗酵法で生産する場合の課題

低生産性（生成速度の低下、最終生成物濃度の低下等）

実用生産は
非常に難

増殖非依存型バイオプロセス

高細胞阻害物質
非可食
バイオマス

前処理
糖化

混合糖
（C6,C5糖）・芳香族化合物（フェノール等）
・アルコール（ブタノール等）

優位点 ■コリネ型細菌は、芳香族化合物やアルコールに対する耐性が高い。
■生成物が高細胞阻害物質の場合、増殖を伴う醗酵法と比較して、増殖非依存型バイオプロセスは影響が低い。
21

芳香族化合物の生産技術開発
PEP

PYR

PYR

HOH2C

CH2OH

Glucose4-HBA: 4-hydorxybenzoic acid
4-ABA: 4-aminobenzoic acidPTS
CA: trans-cinnamic acidFA: ferulic acid
4-HCA: 4-hydroxycinnamic acid(p-coumarate)
4-HS: 4-hydroxystylene
3,4-CHD: S, S-3,4-dihydroxy-3,4EM pathway
dihydrobenzoic acid
G-6-P
2,3-CHD: S, S-2,3-dihydroxy-2,3dihydrobenzoic acid
F-6-P
CHA: chorismate
ANT: anthranilate
F-1,6-P2(2-aminobenzoate)
PPY: phenylpyruvate
4-HPE: 4-hydroxyphenylethanol
GAP
DHAP
4-HPPA: 4-hydroxyphenylpyruvate
NAD+
GAPDH
4-HPAAL: 4-hydroxyphenylacetaldehyde
NADH
4-HA: 4-hydroxyaniline
PGP
4-CAL: 4-coumaryl alcohol
PAAL: phenylacetaldehyde

O

XyloseOH

OH

Arabinose

Pentosetransporter

OH
HO

O
OH

OH

HOH2C

OH

OH

XyloseNADP+ NADPH

PP pathway

6-PGlucono-lactone

Arabinose

xylA

araA

Xylulose

Ribulose
araB

xylB

NADP+

Ribulose-5P

6-PGluconate

NADPH

araD

CO2
Rib5P

PEP

Ribu5P

QuinateSed-7-P

F-6-P
F-6-P
GAP

Ery-4-P

Pyrogallol

Catechol

DHQ

Xlu5P

GAP

DAHP

Pyruvate
3,4-CHD,
2,3-CHD

OH

O
OH

cis, cismuconate

PCA

4-Hydroxyphenylethanol

DHS

Gallate4-Hydroxyphenyllactate

Catechol

Isochorismate

Salicylate
Gentisate

Shikimate

Catechol

Trp

ANT

AnilinePhenyllactate

PPY

Phe

Phenylacetate
CA
4-HCA

PAAL

Chorismate

Styrene2-Hydroxyphenylacetate

4-HPPATyr

Phenol
4-HCA

4-HBA
Phenol PCA

4-ABA

Catechol
Phenyl-acetate
p-Cresol

4-HPAAL

4-Hydroxyphenylacetate

p-Cresol
4-Vinylcatechol
Caffeic acid

Homogentisate

Aniline4-HS
2-Phenylethanol

4-Hydroxyphenylacetate

Tyramine

4-HS
Gentisate

Ferulic acid
4-Vinylguaiacol

4-Hydroxyphenylethanol22芳香族化合物の用途
1. ポリマー原料・プラスチック原料（フェノール樹脂、ポリカーボネート樹脂、
エポキシ樹脂、ポリスチレン等）
・液晶原料
・合成繊維原料（ポリエステル、ナイロン）
・合成ゴム原料（スチレンゴム等）
2. 工業薬品原料・合成洗剤原料（アルキルフェノール、アルキルベンゼン）
・塗料原料、染料、写真現像薬原料
・重合防止剤、可塑剤、紫外線吸収剤
3. 医薬・農薬、香料の原料
23

芳香族化合物の生産技術開発
Glucose

O

PTS

PEP

HOH2C

CH2OH

Xylose

PYR

OH

OH

HO

Arabinose

Pentosetransporter

OH

O
OH

OH

HOH2C
OH

OH

EM pathway

NADP+ NADPH

F-6-P
F-1,6-P2

6-PGlucono-lactone

GAP
DHAP
NAD+
GAPDH
NADH

XylosePP pathway

G-6-P

araA

Xylulose

Ribulose

xylB

6-PGluconate

Rib5P

PEP

CO2

Arabinose

xylA

NADP+

PGP

PYR

OH

O
OH

NADPH
Ribu5P

araB

Ribulose-5P
araD

Xlu5P

GAP

Sed-7-P

F-6-P
F-6-P
GAP

Ery-4-P

DAHP

Pyruvate

DHQ
O

HO

C

OH

OH

OH

DHS

シキミ酸

芳香族化合物、芳香族アミノ酸他

24

芳香族化合物前駆体: シキミ酸の用途、製造法

C7H10O5
シキミの花

シキミの実

シキミ酸

シキミ酸の需要・インフルエンザ治療薬タミフル（oseltamivir）の原料
緊急のインフルエンザ対策のためタミフルの備蓄が必要→原料のシキミ酸が不足。
・3つの不斉炭素原子を有する環状ヒドロキシ酸→様々な医薬品、化成品、化粧品、農薬等の合成原料。

シキミ酸の製造方法
従来はシキミ（ハッカク）の乾燥果実より抽出、精製

高コスト、低収量。

安価な再生可能原料からの高生産バイオプロセスが望まれている。

25

生産性比較: シキミ酸生産
宿主

Escherichia coli
SP1.1pts/pSC6.090B

生産量

収率

反応時間

71 g/L1）

27%

60 h

85 g/L1）（+ Yeast extract）

Escherichia coli AR36

43 g/L2）（+ Yeast extract）

研究グループFrost JW., 2003.
（Michigan state university）

33%

41 h

43%

30 h

Gosset G, Bolivar F., 2013.
（メキシコ国立自治大学）

Bacillus subtilis ID36

20 g/L3）―

90 h

Iomantas et al., 2002.
（味の素）

Citrobacter fruendii

10 g/L4）ー100 hShirai M. et al., 2001.
（東レ）

Corynebacterium
glutamicum

141 g/L

51%

48 h

RITE

1）Chandran et al., （Michigan州立大） Biotechnol. Bioeng. 19:808-814. 2003.
2）Rodriguez et al., （メキシコ国立自治大学） Microbial. Cell Factories 12:86. 2013.
3）Iomantas et al., US Patent 6436664（Ajinomoto co., inc） Method for producing shikimic acid. 2002.
4）Shirai et al., EP 1092766（TORAY） Microorganisms belonging to the genus citrobacter and process for producing shikimic acid. 2001.

26

シキミ酸精製
培養液を遠心して
菌体を除去

活性炭処理

イオン交換樹脂で吸着・洗浄・溶出

濃縮・乾燥・ LC/MS/MSで保持時間、フラグメント一致
・ 残存グルコースなし

再沈殿

・ HPLCで純度 99.6%
27

世界のフェノール用途内訳（2013年度）
工業薬品用途、
医薬・農薬、香料用途
繊維用途:
ナイロン66、ナイロン6

カプロラクタム（12%）

その他（12%）（アニリン、サリチル酸、
アルキルフェノール、
2,6-キシレノール等）

フェノール樹脂（26%）

自動車用途:
フェノール樹脂成型材料、工業用フェノール樹脂
半導体用途:
半導体封止材料
回路基板用途:
積層・含浸用フェノール樹脂

出典: “Phenol: 2014 World Market Outlook and Forecast up to 2018”
by Merchant Research & Consulting, Ltd.

ビスフェノールA（50%）

ポリカーボネート樹脂:
各種家電、電子機器、OA機器、携帯電話、CD等のディスク、自動車部品、医療機器、シート
エポキシ樹脂:自動車塗料、缶内面コーティング、
積層板や半導体封止材など半導体用途、土木・建築用接着剤や塗料
28

グリーンフェノール生産法
vs 現在の工業的フェノール生産法（A）グリーンフェノール生産法
本技術
CH2OH
O HOH C
2
OH

糖化

非可食
バイオマス
（セルロース）

HO

OH
OH

O
OH

OH

O
OH
HOH2C

OH

C6（グルコース等）
C5 キシロース、
アラビノース等OH

増殖非依存型
バイオプロセス

OH

OH
30-33℃
フェノール（B）現在の工業的フェノール生産法（クメン法）
アセトン
プロピレン
H2C＝CH－CH3
＋

CH3
二段目
|
CH
|
O2
CH3 （80-130℃）

一段目

原油・接触改質法・ナフサ分解・抽出法

HCl, AlCl3（200-250℃）

ベンゼン

クメン

O
ǁ
H3C－C－CH3
＋

CH3
三段目
|
C－O－OH|
H2SO4
CH3（60-90℃）

クメンハイドロパーオキサイド

OH

フェノール

29

グリーンフェノール生成プロセス（二段反応方式）

非可食
バイオマス

前処理
糖化

第1段反応

第2段反応

増殖非依存型プロセス（多段階反応）

One step 菌体反応

4-ヒドロキシ
ベンゾエート（4HBA）

混合糖（C6,C5糖）

COOH

4-ヒドロキシ
ベンゾエート（4HBA）

フェノール

回収・精製

COOH

OH

高濃度セル液高濃度セル液OH

OH

IC50濃度相対比
増殖への阻害度

増殖非依存型ﾊﾞｲｵﾌﾟﾛｾｽ
への阻害度

フェノール

1

1／ 3

4-HBA

1／10

1／20

30

二段反応に用いる、2種の遺伝子組換え菌第1段反応用第2段反応用混合糖から4-HBA生成菌の構築

4-HBAからフェノール生成菌の構築

Glucose（C6）Xylose, Arabinose（C5）4-HBA

Pentose phosphatepathway

Glycolysis
Glucose 6-phosphate

D-ribulose 5-phosphate

Phosphoenolpyruvate

Erythrose 4-phosphate2-dehydro-3-deoxy-D-arabino-heptonate
7-phosphate

4-Hydroxybenzoate（4-HBA）

CO24-ヒドロキシベンゾエート
デカルボキシラーゼ

6 steps
Chorismate

Phenolコリスミ酸リアーゼ（UbiC）

4-Hydroxybenzoate（4-HBA）

4-HBA

Phenol31

生産性比較: フェノール生産

宿主

生産量

反応
時間

Escherichia coli 1）

1.69 g/L

27 h

B. Kim et al., 2014.
（KAIST）

Pseudomonas
putida 2）

0.47 g/L

30 h

N. J. P. Wierckx et al., 2005.
（デルフト大）Corynebacterium
glutamicum 3）

22 g/L～24 h

研究グループRITE（二段反応）

1）Biotechnol. J. 9:621-629. 2014. チロシン経由, fed batch2）Appl. Environ. Microbiol. 71:8221-8227. 2005. チロシン経由, fed batch3）RITE（tentative data）コリスミ酸経由

32

4-hydroxybenzoateの用途
パラベン類

液晶ポリマー用の原料（モノマー）

可塑剤

重合選択性触媒
4-hydroxybenzoate（4-HBA）

農薬等中間体感熱紙用顕熱剤
写真薬・香料の原料
感光材料の原料
染顔料中間体紫外線吸収剤の原料

33

グリーンフェノール開発（株）の設立【設立目的】
世界初となるグリーンフェノールの生産、及びグリーンフェノール樹脂製造に関わる基盤技術を「増殖非依存型バイオプロセス」の基本技術を保有する（公財）地球環境産業技術研究機構とフェノール樹脂製造に関する技術を保有する住友ベークライト（株）
が協同開発し、その事業化を目指す。
【経緯】
2010年2月:
グリーンフェノール・高機能フェノール樹脂製造技術研究組合（GP組合）を設立。
2010年3月～2011年3月:
NEDOプロジェクト「グリーンフェノール及びこれを原料としたグリーンフェノール
樹脂製造に関わる基盤技術開発」を実施。
2011年5月～2013年3月:「グリーンフェノール及びこれを原料としたグリーンフェノール樹脂製造に関わる基盤技術開発」を実施。
2014年5月:
・経済産業省大臣承認を受けてGP組合が発展的に新会社に移行。
・NEDO実用化ベンチャー支援事業採択、パイロットプラント（500L反応槽）建設中。
2015年:
グリーンフェノールサンプルの国内企業への提供予定。
34

石油代替効果によるCO2排出抑制
世界2030年、フェノールの世界生産量の50%をグリーンフェノールに置換えた場合、約2600万トンのCO2を削減可能。

日本

グリーンフェノールへの置換によるCO2排出抑制効果。
CO2削減量

国内フェノール生産量（トン）200万⊿263万トン
CO2削減量⊿90万トングリーン
フェノール（25%代替）

100

グリーン
フェノール
（50%代替）

石油起源
フェノール
0

2010

2020

2030年

35

生産性比較: L-アラニン生産
最終濃度
（g/L）

最大生産性
（g/L/h）- Corynebacterium glutamicum AL107（1994）1）※増殖→酸素供給制限条件

71

1.1

- Escherichia coli ALS929（2006 University of Georgia）2）※増殖→嫌気条件

88

5.7- Escherichia coli ZX132（2007 Florida Univ.）3）

114

4

235

10.3

菌 株
増殖プロセス

非増殖・非通気プロセス- RITEバイオプロセス（C. glutamicum）4）
1）JP6277082. 1994.
2）Biotech. Lett. 28:1695-1700. 2006.
3）Appl. Microbiol. Biotechnol. 77:355-366. 2007.
4）Appl. Environ. Microbiol. 78:4447-4457. 2012.

36

生産性比較: L-バリン生産
菌 株

最終濃度
（g/L）

最大生産性
（g/L/h）- Brevibacterium lactofermentum No.487 1）

31

0.8

- Brevibacterium flavum AA54（1992）2）

55

0.6

50

1.2

227

13.8

通気・増殖プロセス

通気・非増殖プロセス- Corynebacterium glutamicum 3）
非通気・非増殖プロセス- RITEバイオプロセス（C. glutamicum）4）
1）Agric. Biol. Chem. 39:1319-1322. 1975.
2）JP4045160. 1992.
3）Appl. Microbiol. Biotechnol. 79:471-479. 2008.
4）Appl. Environ. Microbiol. 79:1250-1257. 2013.

37

生産性比較: Ｄ-乳酸生産研究グループ

最終濃度
（g/L）

対糖収率
（%）

生産培地

インド国立化学研究所

110

73

栄養培地（Cane sugar）

Lactobacillus plantarum 2）

神戸大

74

78

栄養培地（MBS+Glc/Xyl）

Sporolactobacillus sp. 3）

上海交通大学

207

93

栄養培地（Peanut meal）

Bacillus coagulans QZ19 4）

フロリダ大

90

96

栄養培地（LB）

豊田中研、東大62

62

栄養培地（YPD）

Escherichia coli TG114 6）

フロリダ大

120

98

最少培地（+Glc）

Escherichia coli B1103-070 7）

江南大

118

87

最少培地（+Glc）

RITEバイオプロセス
Corynebacterium glutamicum 8）

RITE

125

86

最少培地（+Glc）

RITEバイオプロセス
Corynebacterium glutamicum 9）

RITE

264

95

最少培地（+Glc）

生産株
Lactobacillus lactis 1）

Saccharomyces cerevisiae OC2 5）

1）Biotechnol. Lett. 32:517-520. 2010.
2）Appl. Microbiol. Biotechnol. 92:67-76. 2011.
3）Appl. Microbiol. Biotechnol. 89:1009-1017. 2011.
4）Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 108:18920-18925. 2011.
5）J. Biosci. Bioeng. 101:172-177. 2006.

6）Biotechnol. Lett. 28:1527-1535. 2006.
7）Curr. Microbiol. 62:981-989. 2011.
8）Appl. Microbiol. Biotechnol. 78:449-454. 2008.
9）RITE（unpublished）

38

生産性比較: イソブタノール生産
Isobutanol（g/L）

Isobutanol
productivity（g/L/h）

Escherichia coli 1）

22

Saccharomyces cerevisiae 2）

Aerobic/
Anaerobic

KDC

ADH

0.20

Micro-aerobic

kivD

adh2

0.63

0.007

Aerobic

aro10

adh2

Bacillus subtilis 3）

5.5

0.09

Micro-aerobic

kivD

adh2

Synechococcus elongatus 4）

0.45

0.003

Aerobic

kivD

yqhD

Corynebacterium glutamicum 5）

13

0.26

Shift tooxygen deprivation

kivD

adh2

Corynebacterium glutamicum 6）

27

0.53

RITE bioprocess

kivD

adhP

Microorganisms

1）Nature 451:86-90. 2008.
2）Biotechnol. Biofuels 5:65. 2012.
3）Microb. Cell Fact. 11:101. 2012.

4）Nat. Biotechnol. 27:1177-1180. 2009.
5）Appl. Environ. Microbiol. 77:3300-3310. 2011.（Germany）
6）Biotechnol. Bioeng. 110:2938-2948. 2013.（RITE）

kivD : Lactococcus lactis
aro10: Saccharomyces cerevisiae

adh2: Saccharomyces cerevisiae
yqhD: Escherichia coli
adhP: Escherichia coli

39

100%グリーンジェット燃料生産技術の開発40

石油からのジェット燃料製造
現在使用されているジェット燃料は石油を沸点別に分留して得られた灯油留分から製造されており、炭素数がC10～C15の鎖状炭化水素と芳香族化合物を主成分とする炭化水素の混合物。

ジェット燃料: 融点が-47℃以下、引火点38℃以上等の厳しい規格有。
常圧蒸留装置のしくみ
常圧蒸留装置タクシーの燃料

ガスレンジの燃料

石油ガス留分
LPガス

加熱炉

35～180℃

原油
原油タンク

車の燃料

石油化学製品の燃料

ｶﾞｿﾘﾝ・ﾅﾌｻ留分

ガソリン: C5～C12

ｶﾞｿﾘﾝ・ﾅﾌｻ等
170～250℃

灯油留分

石油ｽﾄｰﾌﾞの燃料ｼﾞｪｯﾄ機の燃料

ジェット燃料: C10～C15

灯油・ｼﾞｪｯﾄ燃料
240～350℃

軽油留分

トラックの燃料

バスの燃料

ディーゼル燃: C10～C20

軽油
石油蒸気

あたためる
出典: 石油情報センター

350℃以上残油
重油・ｱｽﾌｧﾙﾄ

船の燃料

火力発電所の燃料

41

石油系ジェット燃料の組成
石油系ジェット燃料の平均的組成
直鎖飽和炭化水素28%
分岐鎖飽和炭化水素 29%
環状飽和炭化水素20%
芳香族化合物18%・飽和炭化水素は発熱量が大きく、ジェット燃料の推進力源として必須。
・直鎖飽和炭化水素の融点はジェット燃料の規格よりもかなり高く、直鎖飽和炭化水素のみではジェット燃料に不適。
・分岐鎖や環状飽和炭化水素の融点はジェット燃料の規格より十分低い。
・芳香族化合物はジェットエンジン等に使用されるニトリル系O-リングを膨潤させる性質があり、燃料系機器の気密性維持に必須。
42

グリーンジェット燃料の生産技術開発
O

http://www.jica.go.jp/

O
O

O

水素化処理

O
O

油脂: トリグリセライド
C12 - C18
http://biodiesel-news.com/

50%混合

http://www.treehugger.com/

ヤトロファ

カメリナ

藻（Algae）

50%混合
有機
廃棄物他

ガス化/熱分解syngas

FT法

水素化処理

H3C

O
OH

CH2OH
O
OH

OH

HO
OH

バイオマス
（セルロース系）

酵素加水分解～50%混合

OH
OH

微生物
変換

CH3

C10 - C15
パラフィン系
炭化水素

熱分解油
HOH2C

CH3

ブタノール

オリゴマー化
水素化処理

成分調整
CH3

<25%

S

<5%

微生物
変換

分岐鎖飽和炭化水素化合物
環状飽和炭化水素化合物
芳香族化合物100%
ジェット燃料43

グリーンジェット燃料製造法の比較

油脂抽出法

ファルネセン
/脂肪酸
発酵生産法

RITE法

外部からの水素供給
の必要性

必要

必要

不要

製造できる
炭化水素化合物

飽和炭化水素化合物のみ1種類の飽和炭化水素化合物のみ

飽和炭化水素と芳香族化合物

認可されているジェット
燃料との混合比率50%10%（ファルネセン）

100%利用

既存のグリーンジェット燃料は最大で50%までしか混合できない。

RITE法は、外部からの水素供給が不要で、飽和炭化水素と芳香族化合物の両方を製造可能な世界初の低コスト・低炭素型100%グリーンジェット燃料製造法
44100%グリーンジェット燃料製造法（RITE法）
非可食バイオマス

分岐鎖飽和炭化水素
化合物

C6糖
C5糖

6

5

グリーン
ジェット燃料生産菌

環状飽和炭化水素化合物
芳香族化合物

100%グリーンジェット燃料45

まとめ
増殖非依存型バイオプロセス
・高生産性・混合糖類（C6, C5糖）の完全同時利用性・醗酵阻害物質への高度耐性

芳香族化合物生産
・シキミ酸生産（芳香族化合物前駆体）;
代謝工学的改変技術を駆使して、従来法を大幅に上回る生産性を達成。
・フェノール生産;
二段反応方式により、フェノールによる細胞毒性を回避し、従来法と比較し大幅な高生産性を実現。

100%グリーンジェット燃料生産
・飽和炭化水素と芳香族化合物の両方を製造可能。
・外部からの水素供給が不要。
・世界初の低コスト・低炭素型100%グリーンジェット燃料製造法。

46

鎖状化合物生産技術開発
Xylose P3),2),4) ArabinoseP4),3)

GlucosePTSPEPPentose 5),6)transporter

P15),12),17),19),23),21),22)

PYR
XyloseEM pathway

PP pathway

NADP+ NADPH

G-6-P

Arabinose

xylA

araA

Xylulose

Ribulose
araB

xylB

F-6-P

6-PGlucono-lactone

F-1,6-P2
DHAP
GAP
P8),15),16),20)
NAD+
GAPDH
NADH
PGP

NADP+
6-PGluconate

Rib5P

Ribulose-5P
NADPH
Ribu5P

araD
Xlu5P

GAP

Sed-7-P

F-6-P
F-6-P
GAP

Ery-4-P

PEP

PYR
P9),24),25)

L-AlanineP14),11),13),

D-Lactic acid 14),28)

P13),P14),P16),P17),
P18),P19),P20),7)

P14),9)L-Lactic acid

Ethanol

P1),P2),1)

P10),P11),P12),
P14),8),10)

Isopropanol

Succinic acid

Patent application / registration by RITE

Publication by RITE

P1) WO2009028582
P2) WO2009131040
P3) PCT/JP2009/060637
P4) JP2009050236(A)P5) JP2009083668
P6) JP2009039031
P7) JP2009183259
P8) JP2007295809
P9) JP2007043947
P10) EP1647594A1

1) Appl. Microbiol. Biotechnol. 77:1219-1224. 2008.
2) Appl. Environ. Microbiol. 72:3418-3428. 2006.
3) Appl. Microbiol. Biotechnol. 77:1053-1062. 2008.
4) Appl. Microbiol. Biotechnol. 81:691-699. 2008.
5) Appl. Environ. Microbiol. 75:3419-3429. 2009.
6) Appl. Microbiol. Biotechnol. 85:105-115. 2009.
7) J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:243-254. 2004.
8) J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196. 2004.
9) Appl. Microbiol. Biotechnol. 68:475-480. 2005.
10) Appl. Microbiol. Biotechnol. 81:459-464. 2008.

P11) WO2005010182A1
P12) US7368268
P13) JP4294373
P14) JP3869788
P15) JP4171265
P16) EP1291428A1
P17) US7598063
P18) CN1436240
P19) IN209524
P20) JP2002510689

Branched-chain P9),26),27)
amino acids（L-Valine）

P5),29)P6),P7),18)

Isobutanol

Butanol11) Appl. Microbiol. Biotechnol. 78:449–454. 2008. 21) Biochem. Biophys. Res. Commun. 289:1307-1313. 2001.
12) Microbiology 155:3652-3660. 2009.
22) J. Biosci. Bioeng. 92:502-517. 2001.
13) J. Bacteriol. 191:4251-4258. 2009.
23) Microbiology 149:1569-1580. 2003.
14) Appl. Microbiol. Biotechnol. 83:315-327. 2009. 24) Appl. Microbiol. Biotechnol. 87:159-165. 2010.
15) J. Bacteriol. 191:968-977. 2009.
25) Appl. Environ. Microbiol. 78:4447-4457. 2012.
16) Appl. Microbiol. Biotechnol. 81:291-301. 2008. 26) Appl. Environ. Microbiol. 78:865-875. 2012.
17) Appl. Microbiol. Biotechnol. 78:309-318. 2008. 27) Appl. Environ. Microbiol. 79:1250-1257. 2013.
18) J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 15:16-30. 2008. 28) Appl. Microbiol. Biotechnol. 97:6693-6703. 2013.
19) Microbiology 154:264-274. 2008.
29) Biotechnol. Bioeng. 110:2938-2948. 2013.
20) J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103. 2004.

47

Host vector system

RITE bioprocess (Production of chemicals and fuels)

Physiology of corynebacteria- Agric. Biol. Chem. 54:443-447. 1990.
- J. Industrial. Microbiol. 5:159-165. 1990.
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- Biosci. Biotechnol. Biochem. 57:2036-2038. 1993.
- Plasmid 36:62-66. 1996.
- ACS Symposium Series 862 Fermentation Biotechnol. 175-191. 2003.
- Appl. Microbiol. Biotechnol. 81:1107-1115. 2009.
- Appl. Microbiol. Biotechnol. 87:1855-1866. 2010.
- Microbiology 156:3609-3623. 2010.
- J. Microbiol. Methods. 85:155-163. 2011.
- Appl. Microbiol. Biotechnol. 97:8219-8226. 2013.
- J. Appl. Microbiol. 115:495-508. 2013.

- Process Biochem. 1:124-128. 1985.
- Process Biochem. 21:164-166. 1986.
- Process Biochem. 21:196-199. 1986.
- Process Biochem. 24:60-61. 1989.
- J. Industrial. Microbiol. 5:289-294. 1990.
- Appl. Microbiol. Biotechnol. 35: 348-351. 1991.
- Catalysis Today 22:621-627. 1994.
- Microbiology 149:1569-1580. 2003.
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- Appl. Microbiol. Biotechnol. 68:475-480. 2005.
- Appl. Environ. Microbiol. 72:3418-3428. 2006.
- Nat. Biotechnol. 24:761-764. 2006.
- Appl. Environ. Microbiol. 73:2349-2353. 2007.
- Microbiology 153:2491-2504. 2007.
- J. Chem. Technol. Biotechnol. 82:693-697. 2007.
- Appl. Microbiol. Biotechnol. 77:853-860. 2007.
- Appl. Microbiol. Biotechnol. 77:1053-1062. 2008.
- Appl. Microbiol. Biotechnol. 77:1219-1224. 2008.
- Appl. Microbiol. Biotechnol. 77:1305-1316. 2008.
- J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 15:16-30. 2008.
- Appl. Microbiol. Biotechnol. 78:449-454. 2008.
- Appl. Environ. Microbiol. 74:5146-5152. 2008.
- Appl. Microbiol. Biotechnol. 81:459-464. 2008.
- Appl. Microbiol. Biotechnol. 81:505-513. 2008.
- Appl. Microbiol. Biotechnol. 81:691-699. 2008.
- Appl. Microbiol. Biotechnol. 85:105-115. 2009.
- Appl. Microbiol. Biotechnol. 85:471-480. 2010. (Mini-Review)- Biomass to Biofuel 311-330. 2010.
- Appl. Microbiol. Biotechnol. 86:1057-1066. 2010.
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- Appl. Microbiol. Biotechnol. 89:1905-1916. 2011.
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- Appl. Environ. Microbiol. 78:4447-4457. 2012.
- Annu. Rev. Microbiol. 66:521-550. 2012.
- FEBS Lett. 586:4228-4232. 2012.
- Appl. Environ. Microbiol. 79:1250-1257. 2013.
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- DNA seq. 4:87-93. 1993.
- DNA seq. 4:95-103. 1993.
- DNA seq. 4:177-184. 1993.
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- Future Microbiol. 5:1475-1481. 2010. (Review)- Microbiology 157:21-28. 2011.
- J. Bacteriol. 193:349-357. 2011.
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- Appl. Microbiol. Biotechnol. 91:677-687. 2011.
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- Microbiology 158:975-982. 2012.
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C. glutamicum R

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RITE バイオ研究グループ↑
RITEバイオ研究グループ←奈良先端科学技術大学院大学
教育連携研究室
微生物分子機能学（乾研究室）

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