活性化剤内包型ポーラスガラス上での核酸合成法の開発と光制御

東京工業大学

生命理工学院准教授 大窪 章寛
2021年11月2日

1

従来技術とその問題点
既に実用化されている核酸合成は、核酸医薬に使用される数十量体の合成は得意であるが、百量体を超える長鎖核酸の高効率合成ができない
多数の核酸を高密度・大量に同時合成することができない等の問題があり、ゲノム合成やmRNA医薬の化学合成など長鎖核酸を使用する新産業には適していない。
2

従来の核酸合成プロトコール

3百量体を超える長鎖核酸の高効率合成ができない

4

多数の核酸を高密度・大量に同時合成することができない
X. Gao, Nucleic Acids Res. 2001, 29, 2171-2180

Chemical synthesis of 5'-32P-labeled T14
On glass plate

On porous glass/ Surface area

1 pmol/mm2

0.5 pmol/mm2/ Unit area

1 pmol/mm26.3 nmol/mm2 (1mm厚）
5二つの新技術
新技術(I)
活性化剤内包型固相担体上での高効率鎖伸長
特願2019-031683

新技術(II)
光透過性を向上させたポーラスガラス上での光制御型核酸フロー合成
特願2021-033892• On glass plate

CPGActivator

Glass Plate• On porous glass sheet

Flow

Porous Glass Sheet

Flow

6

新技術(I)の特徴・従来技術との比較• HOBt誘導体を内包した固相担体を用いることで従来技術の問題点であった、鎖伸長効率を向上することに成功した。

• 40量体合成時において従来の合成法と比較して２倍の合成純度を達成することができた。
• この高い鎖伸長効率（>99.8%)は100量体以上の合成においても保たれることを明らかになった。

7

新技術(I)の特徴・従来技術との比較
1. Kinds of immobilized activators

Coupling reagents38

3. Linker length
Nucleoside : Activator = a : b

2. Kinds of reagents
Thymidine 40mer

4. Introduction ratio of nucleoside to immobilized activator

8新技術(I)の特徴・従来技術との比較

リンカーの長さ
4原子+41% (1.9-fold)
リンカーの長さ
14原子+47% (2.0-fold)
リンカーの長さ
17原子+24% (1.5-fold)
リンカーの長さ
30原子Coupling efficiency
99.8%

9

新技術(I)の特徴・従来技術との比較

Absorbance unit

50

高い鎖伸長効率（>99.8%)は100量体以上の合成においても保たれる

25

Isolated yield 56%
002040Retention time (min)A buffer : 25mM Tris-HCl (pH8.0) buffer
B buffer : 500mM NaClO4 in 25mM Tris-HCl (pH8.0) buffer

Flow : 1ml/min
Gradient : 0-50min, Bconc. 20-40%10新技術(I)の特徴・従来技術との比較

Absorbance unitd(TGA TCC GTA TGC GGG TGT TCT GGA TCG TGT TAATTA TGA TCA GAT GAG CGT TTA TGT TGG TCG TGGTGT TGG TGG TGG TAG CCT)

高い鎖伸長効率（>99.8%)はミックス配列の合成においても保たれる
Isolated yield 37%

Retention time (min)A buffer : 25mM Tris-HCl (pH8.0) buffer
B buffer : 700mM NaClO4 in 25mM Tris-HCl (pH8.0) buffer

Flow : 1ml/min
Gradient : 0-50min, Bconc. 0-50%

11新技術(I)の特徴・従来技術との比較

12

新技術(I)の特徴・従来技術との比較

Entry

Capping reagents

Efficiency

15% Ac2O

87%

25% Pac2O

90%

35% PH(OPh)272%

45% P(OPh)381%

50.25 M iPr2NP(OBn)2

>99%

13

二つの新技術
新技術(I)
活性化剤内包型固相担体上での高効率鎖伸長
特願2019-031683

新技術(II)
光透過性を向上させたポーラスガラス上での光制御型核酸フロー合成
特願2021-033892• On glass plate

CPG
Activator

Glass Plate• On porous glass sheet

Flow

Porous Glass Sheet

Flow

14

新技術(II)の特徴・従来技術との比較• 板状ポーラスガラスの光透過性を向上した光制御型核酸フロー合成を構築し従来技術ではできなかった、大量（6,000倍）・高密度（5,000倍）な同時合成を可能にした。
• 200nmの細孔径をもつポーラスガラスを特定の混合有機溶媒に浸潤させることで、光透過性を900倍以上向上できることを明らかにした。
• また、ポーラスガラスの厚さを8mmにしても、1mmの場合と比べて50%もの光を透過できる。
15

新技術(II)の特徴・従来技術との比較
X. Gao, Nucleic Acids Res. 2001, 29, 2171-2180

Chemical synthesis of 5'-32P-labeled T14
On glass plate

On porous glass/ Surface area

1 pmol/mm2

0.5 pmol/mm2/ Unit area

1 pmol/mm2

6.3 nmol/mm2 (1mm厚）

x 6,00016

新技術(II)の特徴・従来技術との比較

Synlett 2015, 26, 2578-2582

10nm porous glass

Reaction efficiency

x 1.3

17

新技術(II)の特徴・従来技術との比較
Porous Glass

250 nm
180 nm
149 nm
146 nm277 nmPore Size: 110 – 461 nm
MEAN: ca. 200 nm
with metal coating [ca. 10 nm]
x2000018

新技術(II)の特徴・従来技術との比較

Solvent A – Solvent B

No solvent19新技術(II)の特徴・従来技術との比較
quartz cell
LED laser

Power meterUV light (365 nm, 56 mW)

No solvent, 厚さ1 mm

0.1x 900

Solvent A – Solvent B, 厚さ1 mmx 490

90.6

Solvent A – Solvent B , 厚さ1 mm

49.00204060

80

100Transmission (%)
20

新技術(II)の特徴・従来技術との比較

21

新技術(II)の特徴・従来技術との比較

8x8 mm の板状ポーラスガラスに1pmolスケールで100万種類の核酸合成が可能

従来法に比べ5,000 倍以上の高密度合成
22想定される用途• 高純度長鎖DNAプールを用いたゲノム合成• 純度長鎖RNAプールを用いたRNA医薬の開発• 長鎖RNA医薬の開発• 三次元核酸合成を利用した新規バイオチップや新規認証システムの開発
23

実用化に向けた課題• 核酸合成試薬の量産化に向けた検討が必要• フロー合成システムの最適化• フロー合成システムの供給体制の強化

24

企業への期待• 核酸合成メーカーや核酸医薬開発企業との共同研究を希望• フロー合成システム開発の実績を持つ、企業との共同研究を希望• 新規バイオチップや新規認証システムに興味のある企業との共同研究を希望
25

新技術(I)に関する知的財産権• 発明の名称 ：核酸合成用固相担体及びそれを用いた核酸の製造方法• 出願番号• 出願人• 発明者：特願2019-031683：東京工業大学：大窪章寛、池田黄介、三宅優26

新技術(II)に関する知的財産権• 発明の名称 ：光透過性を向上させたポーラスガラス上での光制御型核酸フロー合成• 出願番号• 出願人• 発明者：特願2021-033892：東京工業大学：大窪章寛、伊藤優
27

お問い合わせ先
東京工業大学
研究・産学連携本部
ＴＥＬ ０３－５７３４ － ３８１７
ＦＡＸ ０３－５７３４ － ２４８２
e-mail sangaku＠sangaku.titech.ac.jp

28