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水産物摂取によるリンの過剰摂取抑制効果＜平成 25 年度助成＞

水産物摂取によるリンの過剰摂取抑制効果
福永

健治、細見

亮太、吉田

宗弘

（関西大学 化学生命工学部 食品栄養化学研究室）

リン（P）は全ての生物に必須の元素で、エネル

動物実験によって FP の P および Ca 代謝におよぼ

ギー代謝をはじめ様々な代謝課程において重要なす影響について明らかにすることを目的とした。

役割を担っている。しかし、現代の食生活を見ると、加工食品を中心に各種リン酸塩が広く使用されている。国民栄養調査では加工食品に添加されている P は加算されていないため、実際にはこ
2）

実験方法
1. タンパク質の調製
FP はスケトウダラ（Theragra chalcogramma）から

れ以上の P が摂取されている 。長期にわたり P

精製し、スケトウダラと脂質含量やタンパク質含を過剰摂取すると、カルシウム（Ca）の吸収抑制、量が近いニワトリささ身を対照タンパク質とし腎機能の低下、副甲状腺機能亢進などの健康被害た。スケトウダラ可食部およびトリささみをミンを引き起こす可能性が高くなる 3）。P の過剰摂取

サーで細切し、冷蒸留水で十分に水洗いした。次によって吸収が抑制される Ca は、飽食の時代といでアセトンによる脱水・脱脂、n - ヘキサンによ言われて久しい現在でも推奨量に達していない唯る脱脂を行い、凍結乾燥したものをそれぞれ FP

一の栄養素でもある1）。一方、日本の伝統的食品

および CP とした。なお、FP および CP の収率はであるかまぼこなどの水産練り製品の原料としてそれぞれ 10.5 %（wt/wt）および 9.1 %（wt/wt）で用いられる冷凍すり身には、保存時の変性防止やあった。

製品の食感向上を目的に重合リン酸塩が添加され2. 分析方法ている。消費者の食品添加物への関心の高まりか

粗タンパク質量はミクロケルダール法により求ら、重合リン酸塩を使用した練り製品は忌避されめた。各タンパク質を硫酸および過酸化水素による傾向にある。この影響を受け、無リンすり身がる湿式灰化後、P はモリブデンブルー法 9）、Ca は開発されたが，形成される加熱ゲルの物性におい原子吸光光度計（AA-6200, 島津製作所社製）で測て劣ることは否めない 4）。

定した。

練り製品中の魚肉タンパク質（FP）が P およびタンパク質のアミノ酸組成は、常法に従って 6 M

Ca の吸収に及ぼす影響について、報告は皆無で塩酸で 110 ℃、24 時間条件で酸加水分解後、フェある。また、一般的にミネラルの吸収利用性は小ニルイソチオシアネートによるプレカラム誘導体

腸内腔での可溶化が必要条件となることが知られ化後に逆相 HPLC 法により分析した。

ている 8）。そこで、本研究では、FP 給餌によるタンパク質の分子量は Laemmli の方法に従い、生体での P および Ca 吸収に及ぼす影響を検討す

ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）にて測るに先立ち、リン酸塩及び重合リン酸塩過剰存在

定した 10）。

下において、FP が Ca の可溶性に及ぼす影響を人

3. 試料調製

工消化試験により評価し、さらにラットを用いた

Table 1 に人工消化試験に用いた試料の組成を

64

浦上財団研究報告書

Vol.22（2015）

示した。AIN-93G 組成 11）をもとに、リン酸二水

ム溶液で pH 7.4 に調整後、豚由来パンクレアチン

素カリウム（KH 2 PO 4）で P 量を全体の 0.3 %（通常40 mg を加え同様に 120 分間消化した。ペプシン

リン餌料）、KH 2 PO 4 で P 量を 1.5 %（高リン餌料）、

消化では pH 2.0、パンクレアチン消化では pH 7.4

ポリリン酸ナトリウム（重合度、3 および 4）で P 量になるように経時的に確認し調整した。

を 1.5 %（高ポリリン酸餌料）を含む試料を調製し消化開始から 240 分後まで経時的に人工消化液

た。各餌料のタンパク質源は FP または CP とした。

を 1.5 mL 容ポリチューブに 0.2 mL 採取し、600 × g、

またタンパク質をカゼインに 100 %とした餌料、20 秒間遠心分離した上清を分析試料とした。上清

タンパク質をコーンスターチに 100 %置換した無の P 濃度はモリブデンブルー法 9）、Ca 濃度はカル

タンパク質餌料も同様に調製した。各餌料の FP

シウム E – テストワコー（和光純薬工業社製）によと CP 餌料の P および Ca 濃度は同等となるようり測定した。なお、高重合リン餌料の P についてに調製した。動物実験では、本項で調製方法を示

は、硫酸を添加し 90 ℃で 80 分間加熱しオルトリした餌料を試験餌料理として用いることとした。

ン酸に加水分解後測定した13）。また、上清のアミ4. 人工消化試験

ノ酸量はトリニトロベンゼンスルホン酸吸光光度

人工消化試験は Hosomi らの方法を一部改変して行った 12）。すなわち各餌料を 100 mL 容三角フ法を用いて加水分解率を求めた14）。
5. 統計処理

ラスコに 2.5 g 秤量し、蒸留水 50 mL を加え、塩得られた測定値は、平均値±標準誤差で示した。

酸で pH 2.0 に調整し、豚由来ペプシン 50 mg を統計解析には、Stat View J-5.0（ヒューリンクス

加え反応を開始した。37 ℃、100 rpm で振盪し、社製）を用い、反復測定による二元配置分散分析

120 分間消化を行った。その後炭酸水素ナトリウを行った。なお、有意水準は p < 0.05 とした。

Table 1 Composition of experimental diets.

Normal-phosphorus dietHigh-phosphorus diet High-polyphosphate diet

(P = 0.3%, Ca = 0.5%) (P = 1.5%, Ca = 0.5%)
FP

CP

FP

(P = 1.5%, Ca = 0.5%)

CP

FP

CP

g / 100 g
Fish protein（FP 群 ）

19.77

-

19.77

-

19.77

-

Chicken breast protein（CP 群 ）

-

20

-

20

-

20

Dextrinized corn starch

13.2

13.2

13.2

13.2

13.2

13.2

Corn starch

38.75938.80133.48233.52934.80934.799Sucrose

10.0

10.0

10.0

10.0

10.0

10.0

Cellulose

5.0

5.0

5.0

5.0

5.0

5.0

AIN-93G mineral mix †

3.5

3.5

3.5

3.5

3.5

3.5

Potassium dihydrogenphosphate

1.221

0.949

6.498

6.221

-

-

-

-

-

-

5.171

4.951

AIN-93 vitamin mix

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

L-Cystine

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

Choline bitartrate

0.25

0.25

0.25

0.25

0.25

0.25

Soybean oil

7.0

7.0

7.0

7.0

7.0

7.0

Sodium polyphosphate§

Diets were prepared based on the AIN-93G formula.
†
Excluding KH 2 PO4.
§
Containing 28.6% phosphorus (wt/wt).

65

水産物摂取によるリンの過剰摂取抑制効果

おこなっているために、筋基質および筋形質タン

実験結果および考察1.

パク質は見られず、筋原繊維タンパク質であるミFP および CP の一般成分組成およびタンパク質性状

オシン重鎖（約 200 kDa）とアクチン（約 45 kDa）のバンドが濃くみられた。また FP および CP の主

Table 2 に粗タンパク質、P および Ca 量を示し

要なタンパク質のバンドに大きな違いはみられなた。FP に含まれる P 量は CP と比べ低値であっかった。Table 3 に FP および CP のアミノ酸組成

た。CP 調製の際には FP と同様に十分な水洗いをを示した。FP および CP のアミノ酸組成について行ったが、P 量に差が出たことから、ささ身に含も大きな相違はみられなかった。

まれる P 化合物は遊離しにくい特徴があると推測

Table 3 Amino acid composition of FP and CP.

さ れ る。Fig. 1 に FP お よ び CP の SDS-PAGE の

FP

結果を示した。各タンパク質ともに十分に水洗を% (wt/wt total amino acids)

Table 2 Chemical composition of FP and CP.

FP

CP

CP

Alanine

6.10

6.10

Arginine

7.03

7.16

12.63

11.72

18.06

17.63

Aspartic acid †g/100 g§

Crude protein

94.2

93.1

Glutamic acid

Phosphorus

0.11

0.42

Glycine

3.82

3.82

Calcium

0.04

0.04

Histidine

2.10

2.77

Isoleucine

4.71

5.17

Leucine

8.52

8.76

Lysine9.70

9.66

Methionine

2.95

2.72

Phenylalanine

3.33

3.79

Proline

2.95

2.65

Serine4.44

3.93

Threonine

4.68

4.96

Tyrosine

3.92

4.13

Valine

5.06

5.03

†
§

Aspartic acid + asparagine.
Glutamic acid + glutamine.

2. 通常リン餌料
Fig. 2A に通常リン餌料の人工消化過程におけるタンパク質加水分解率を示した。FP 餌料は CP
餌料と比較し、パンクレアチン消化過程の加水分解率が有意に高かった（p = 0.01）。
Fig. 1

Fig. 1 SDS-PAGE patterns of FP and CP.
SDS-PAGE was performed using 15.0%
polyacrylamide separation gel; Lane (M),molecular weight marker; Lane (FP), fishprotein; Lane (CP), chicken breast protein.

Fig. 3A および 3B に通常リン餌料の人工消化過程における遊離 P および Ca 濃度を示した。CP 餌料と比較すると、FP 餌料の遊離 P 濃度はペプシ

66

浦上財団研究報告書

ン及びパンクレアチン消化過程で有意に高い値をVol.22（2015）

3. 高リン餌料示した（p = 0.02）。しかし、FP は CP よりもタン

Fig. 2B に高リン餌料の人工消化過程におけるパク質中に含まれている P 量が少ないため、餌料

タンパク質加水分解率を示した。FP 餌料は CP 餌中に含まれる P の化学形態の違いが影響している料と比較し、ペプシンおよびパンクレアチン消化ことが考えられる（Table 2）。またペプシン消化

過程の加水分解率が有意に高かった（p = 0.03）。

過程では餌料中 P のほとんどが遊離しており、パFig. 3C および 3D に高リン餌料の人工消化過程

ンクレアチン消化過程では約 50 %の P が遊離してにおける遊離 P および Ca 濃度を示した。通常リいた。ペプシン消化過程における FP および CP

ン餌料と比較し、高リン餌料の人工消化過程にお餌料の遊離 Ca 濃度は 4.63 ± 0.17 mg/g、4.26 ±ける遊離 P 濃度は、餌料 P 濃度と同様に約 5 倍高

0.11 mg/g（mean ± SEM., n = 3）であった。しか値を示した。また FP 餌料の遊離 P 濃度は、CP 餌

し、パンクレアチン消化過程ではタンパク質の加料と比較してペプシンおよびパンクレアチン消化

水分解率が高くなるにつれて（Fig. 2A）、遊離 Ca

過程で高い傾向にあった（p = 0.10）。

濃度の低下する傾向がみられ、240 分では FP お

高リン餌料は通常リン餌料と比較し、ペプシン

よ び CP 餌 料 そ れ ぞ れ、0.75 ± 0.19 mg/g、0.92

消化過程の遊離 Ca 濃度はほぼ同等であったが、± 0.14 mg/g（mean ± SEM., n = 3）まで低下した

パンクレアチン消化過程ではより低値を示す傾向（Fig. 3B）。以上から遊離 Ca 濃度の低下、タンパにあった。このことから、高リン餌料中の Ca は、

ク質加水分解率とは無関係に餌料中の他の成分がオルトリン酸と結合することで可溶化を阻害さ消化されることに起因していると考えられる。しれていると考えられる。パンクレアチン消化過程

かし、高リンおよび高ポリリン酸餌料でパンクレにおける FP および CP 餌料の遊離 Ca 濃度は 0.47

アチン消化過程における遊離 Ca の減少はみられ± 0.11 mg/g、0.39 ± 0.16 mg/g（mean ± SEM.,なかった（Fig. 3D, 3F）。またカゼイン餌料では、

n = 3）であった。FP 餌料では遊離 P 濃度が高値

パンクレアチン消化過程の遊離 Ca 濃度は 2.80 ±な傾向があり（p = 0.10）、Ca との不溶化を抑制

0.13 mg/g（mean ± SEM., n = 3）と高値を示した

していることが期待されたが、遊離 Ca 濃度とのが、これは消化過程に生成したカゼインホスホペ

関連は確認されなかった。カゼイン餌料のパンク

プチドに Ca が結合し、可溶化されたためである

レアチン消化過程における遊離 Ca 濃度は 3.20 ±

15）と考えられる

Fig. 2。

0.23 mg/g（mean ± SEM., n = 3）であり、高リン

Fig. 2 Course of protein digestibility of FP and CP diets prepared using pepsin (added attime 0 min) and pancreatin (added at time 120 min) digestion.
Each point represents means ± SEM (n = 3).
Degree of hydrolysis = Amino acid content of supernatant / Amount of protein × 100(A) Normal-phosphorus diet, (B) High-phosphorus diet, (C) High-polyphosphate diet.

水産物摂取によるリンの過剰摂取抑制効果

Fig. 367

Fig. 3 Course of soluble phosphorus and calcium concentration prepared using pepsin(added at time 0 min) and pancreatin (added at time 120 min) digestion.
Each point represents means ± SEM (n = 3).
(A) Soluble phosphorus content of normal-phosphorus diet, (B) soluble calcium
content of normal-phosphorus diet, (C) soluble phosphorus content of highphosphorus diet, (D) soluble calcium content of high-phosphorus diet, (E) soluble
phosphorus content of high-polyphosphate diet, (F) soluble calcium content of highpolyphosphate diet.

餌料においても通常リン食と同様に高値を示した

4. 高ポリリン酸餌料（データ未掲載）。一方、無タンパク質餌料の遊離Fig. 2C に高ポリリン酸餌料の人工消化過程にP 濃度はほぼ 0 mg/g であったことから（データ未

おけるタンパク質加水分解率を示した。FP 餌料掲載）、FP および CP はカゼインより微弱であるは CP 餌料と間で有意な差はみられなかった。

が高リン条件下で Ca を可溶化させていると予測される。

Fig. 3E および 3F に高ポリリン酸餌料の人工消化過程における遊離 P および Ca 濃度を示した。
12

68

浦上財団研究報告書

Vol.22（2015）

遊離 P 濃度は、通常リンおよび高リン餌料とは異して抑制的に作用するかを評価することにある。

なり、パンクレアチン消化に移行する際の pH 変

しかし、ポリリン酸は小腸刷子縁膜に存在するホ化では大きな影響を受けなかった。高リン餌料とスファターゼによって加水分解を受けるが、人工比較し、各餌料ともに遊離 P 濃度が低値を示す傾消化試験ではホスファターゼを含まないために加向にあったことから、重合リン酸は可溶化しにく

水分解が起きていない18）。

いことが考えられる。各餌料で遊離 P 濃度の有意

現在、高ポリリン酸およびオルトリン酸餌料にな上昇がみられたが（ p < 0.01）、ペプシン消化過

おける FP の P および Ca 吸収、排泄に与える影響程で含まれる塩酸によるポリリン酸の加水分解がについてラットを用いた動物実験を実施し、解剖

起き、可溶性が高くなったと考えられる。パンクを経て試料を得ている。血清および糞の P および

レアチン消化過程の遊離 Ca 濃度は、通常リン食・Ca 量、大腿骨 Ca 量の定量を行い、さらに腹部大高リン食と比較し高値を示す傾向にあった。この動脈を摘出して血管内壁の病理切片解析、各種結果から、ポリリン酸餌料では pH の変化によっ

Ca 依存性酵素活性の評価を実施中である。ホスて遊離 P 濃度の溶解性が変わらないため、遊離ファターゼの影響については、本動物実験の結果

Ca 濃度は P の影響を受けずに pH の変化のみが影から判断せざるを得ない。

響していると予測される。またポリリン酸はオル

これまでにアミノ酸組成の違いが Ca 吸収に影

トリン酸より Ca と結合しにくく、高ポリリン酸条響を与えることが報告されており、ヒスチジン、

件下では逆に Ca の可溶化を促進している可能性

グリシン、アルギニンは促進、スレオニン、グルタもある。今後詳細なメカニズムについて検討してミン酸、アスパラギン酸は抑制する19）。本研究にいく必要があると考えられる。一方、FP 餌料の用いた FP および CP のアミノ酸組成を比較する

遊離 Ca 濃度は、CP 餌料と比較し高い傾向にあっと、Ca 吸収に影響を与える各アミノ酸濃度に大た（p = 0.10）。食品から摂取した Ca は、小腸上

きな差はみられなかった（Table 3）。しかし、通部では活性型ビタミン D による調節を受ける Ca

常リン餌料・高リン餌料において、人工消化過

トランスポーターから能動輸送で吸収され、小腸程での消化率は FP 餌料で有意に高い値を示した

16）。

（Fig. 2）。以上から高ポリリン酸餌料で確認されEDTA キレート態の利用性で論じられているようたパンクレアチン消化過程における Ca 可溶性の増に、可溶性がただちに生体内での利用性を反映す

大は、消化過程で生成されるペプチド相違が影響るとは限らない。しかし、ミネラルの吸収は可溶

している可能性がある。タンパク質加水分解物中化が必要条件となる17）。そのためパンクレアチンに含まれるペプチドに Ca と複合体を形成し可溶

消化過程は小腸内を想定しているため、FP 餌料化を促す効果が報告されているが 6, 7）、実際に経における遊離 Ca 濃度の上昇傾向は Ca 吸収を促す

口摂取した場合については、脂肪などの消化産物、可能性があると考えられる。

界面活性作用を有する胆汁酸の影響があるため、下部では濃度差による受動輸送で吸収される

人工消化試験の結果からは、Ca 可溶化に及ぼ

Ca 可溶性のみで評価できないと考えるのが妥当

す重合リン酸塩の影響はオルトリン酸塩よりも小である。これらについては、現在、解析中の生体

さく、また FP はカゼインと比較し、Ca の可溶化試料を用いた結果と人工消化試験の結果とを比較を促す傾向があることが確認された。本研究の最検討して、高 P 摂取時に魚肉タンパク質が及ぼす

終目的は、魚肉タンパク質の摂取が高リン酸食の影響について総合的に判断したい。

影響、すなわち動脈硬化や腎機能、骨粗鬆症に対

水産物摂取によるリンの過剰摂取抑制効果

謝

辞本研究の実施にあたり、多大な研究助成を賜りました（公財）浦上食品・食文化振興財団ならびに関係者の皆様に心より感謝を申し上げます。
文献1) 厚生労働省（2014）平成 24 年国民健康・栄養調査報告.
http://www.mhlw.go.jp/bunya/kenkou/eiyou/h24houkoku.html : pp. 54 – 65, 2014 年 8 月 9 日アクセス．
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浦上財団研究報告書

Vol.22（2015）

Effect of fish protein on excessive intake of the phosphorus
Kenji Fukunaga, Ryota Hosomi and Munehiro Yoshida
Laboratory of Food and Nutritional Science
Faculty of Chemistry Materials and Bioengineering, Kansai University
Summary
Phosphorus (P) is an essential nutrient that is required for all organisms. On the otherhands P is used as phosphates in a variety of processed food, such as Surimi (Kamaboko),processed meat, cheese, frozen bakery products and carbonated beverages. Additives usedin processed foods frequently are high in inorganic phosphorus, which is readily absorbed.
P intake in excess of the nutrient needs of healthy subject thought to disrupt hormonal
regulation of P, calcium (Ca), and vitamin D, contributing to impaired peak bone mass,bone resorption, various negatively affects and greater risk of fracture. Phosphates areadded to surimi to improve water retention and prevent alteration during freezing. Attention
is given to phosphorus intake from processed foods rich in phosphorus additives, whichsignificantly contribute to phosphorus intake. There is a tendency for consumers to avoid
surimi because of the added phosphates. Currently, no information is available concerning
the P and Ca solubility effect of fish protein (FP), which is contained in surimi. Therefore,at first we investigated the effect of FP on P and Ca solubility in vitro experiment.
Experimental diets were formulated as follows: normal-P (0.3% P wt/wt, potassium
dihydrogenphosphate) diet, high-P (1.5% P wt/wt, potassium dihydrogenphosphate) dietand high-polyphosphate (1.5% P wt/wt, sodium polyphosphate) diet. The protein sourceof each experimental diet was FP or chicken breast protein (CP). The experimental diets
were exposed to simulated gastric digestion including HCl and pepsin for 120 min (pH2.0) and then small intestinal digestion including NaHCO 3 and pancreatin for 120 min(pH 7.4). When the high-polyphosphate diets were digested, the FP diet tended to behigher Ca solubility than the CP diet (p = 0.10). When the normal-P and high-P diets weredigested, there were no significant differences in the Ca solubility between the FP and CP
diets. These results show that FP might enhance Ca solubility under excess polyphosphateconditions. Further, now we examine the effect of fish protein on excessive intake ofthe phosphorus in rats using high-dihydrogenphosphate and high-polyphosphate diets
mentioned above.