新奇有用微生物の分離とプロバイオティクスへの応用検討（第2報）－Bacillus coagulansの性状分析－
山下 聡子*1

日下 芳友*1

水城 英一*1

齋藤 浩之*1

Isolation of Novel Beneficial Bacteria and Application to Probiotics (II)- Characterization of Isolated Bacillus coagulans Strains Satoko Yamashita, Yoshitomo Kusaka, Eiichi Mizuki and Hiroyuki Saitoh
当研究所では，プロバイオティクスとしての利用事例があるBacillus coagulansの効率的な分離方法を確立し，様々な分離源から351株の菌株を取得，保有している。本研究では，これらの分離菌株のプロバイオティクスとしての利用の可能性を検討すること目的に，各種性状及び遺伝子の特徴を分析した。その結果，分離菌株は多様性に富んでいることが明らかとなった。

2-2 有機酸分析

1 はじめにBacillus属細菌は，休眠状況下では芽胞を形成する嫌気細菌 用培地 であるGAM液体培 地（GAMブイヨンことが知られており，この芽胞は熱や乾燥に安定であ「ニッスイ」（日水製薬(株)）より使用法に従い調製）ることから，保存や流通に優れているという利点があに分離菌株を接種，三菱ガス化学(株)のアネロパックる。本属は腸内常在細菌ではないが，アサヒカルピス

システムを用い，37 ℃，嫌気条件下で4日間培養した

ウ ェ ル ネ ス( 株 ) の B. subtilis （ 製 品 名 ： 枯草 菌 C-のち，培養上清の有機酸濃度を測定した（n=1）。

3102 株）や三菱ケミカルフーズ(株)のB. coagulans

2-3 炭素源の資化性TM

2-3-1 ラクトース（乳糖）の資化性（製品名：ラクリス ）など，ヒトや家畜用のプロバ

中條らの報告 1) にある分離用寒天培地を参考とし，イオティクスとして利用されている菌株も存在する。
このうち，B. coagulansはL-乳酸を産生することから炭素源をラクトースに換え，0.0025 %のBromocresol「有胞子性乳酸菌」とも呼ばれているが，国内で分離，purple (BCP) をpH指示薬として添加したpH 7.0の液TM利用されている株は，先に紹介したラクリス を含め，体培地を96 wellプレートに100 μL / well分注し，数株しかない。

分離菌株を滅菌した爪楊枝で接種，41 ℃で培養し，我々は，前報「新奇有用微生物の分離とプロバイオ資化による酸生成能をBCPの黄変で確認した（n=1）。

ティクスへの応用検討（第1報）」で報告したとおり，

また，標準寒 天培地に β-ガラクト シダーゼ （β-B. coagulans を様々な分離源（試料）から351株分離gal）の合成基質である5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-し，保有している。 分離菌株はそ れぞれ形態的特 徴

β -D-galactoside (X-Gal) と 発 現 誘 導 物 質 で あ る（大きさや長さ，芽胞の形），増殖能，芽胞形成能，Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)を添及びリアルタイムPCR産物の融解温度（Tm値）に差が加し分離菌株を接種，37 ℃で培養し，X-Galの分解をあることが認められている。本研究では，分離菌株のコロニーの青変で確認した（n=1）。

性状分析並びに遺伝子の解析を行ったので報告する。

2-3-2 でんぷんの資化性
2-3-1の液体培地の炭素源を可溶性でんぷんに換え，2 研究，実験方法

分離菌株を接種，41 ℃で培養し，資化による酸生成

2-1 供試菌株能をBCPの黄変で確認した（n=1）。

当研究所で分離した各 Bacillus 属細菌（候補菌），2-4 遺伝子解析

並びに保有する B. coagulans NBRC12583T 株を供試し

B. coagulansのβ-gal遺伝子，及びacn gene-likecluster2) を標的としたprimerを設計し，それぞれリた。

アルタイムPCRで遺伝子の有無を検出した。各種遺伝子の検索等は，National Center for Biotechnology*1 生物食品研究所- 13 -

Information (NCBI) のwebサイトが提供する検索ツー

細菌用培地であるGAM液体培地に接種し，嫌気条件下ル 並 び に Carbohydrate-ActiveDatabaseで培養したところ，菌株により差はあるものの，時間（ CAZy ） の web サ イ ト を 利 用 し た 。 検 出 に 用 い たが進むに従い培養液の白濁が認められた。嫌気培養4

primerと増幅サイズは表1に示す（配列は非公開）。

日後の培養培地中の各種有機酸（リン酸，クエン酸，enZYmes

ピルビン酸，リンゴ酸，コハク酸，乳酸，蟻酸，酢酸，ピログルタミン酸）の量を測定し，GAM培地中の含有3 結果と考察
3-1量と比較したところ，菌株によって含有量に差が認め

嫌気条件下での増殖能及び有機酸生成能
Bergey's mannual

3)によれば，B. coagulansは通られた（図1）。全ての物質において値が低く生育不性嫌気性菌と言われている。そこで，分離菌株を嫌気表1菌

良と推測されるものは351株中3株（0.9 %）であった。

B. coagulans 用 PCR primer
種

B. coagulans

標的遺伝子（サイズ (bp)）

Primer の名称

配列β-gal (147)

F: B. coa- beta-gal F
R: B. coa- beta-gal R

非公開

F: acnA-like F1
R: acnA-like R1

非公開

acn gene-like cluster
acnA (102)acnA-acnC

F: acnA-like F2 (C-ter)(no-insertion:227,insertion:- (388, 21k))

R: acnC-like R (N-ter)

非公開

3,000

リン酸

50

リンゴ酸

1,500

蟻酸150

クエン酸

250

コハク酸

1,500

酢酸

150

ピルビン酸

5,000

乳酸

2,000

ピログルタミン酸

図1

B. coagulans 分離菌株嫌気培養上清の有機酸量
縦軸：有機酸量（mg/L）。左上の数値は各有機酸グラフの目盛りの最大値を，太線は GAM 培地中の各有機酸の含有量を示す（blank 値）。
横軸：分離菌株（分離順に配列）。黒線は生育不良が想定される菌株。

- 14 -

3-2-1-3

このことから，分離菌株のほとんどは嫌気条件下でもB. coagulansのβ-gal遺伝子増殖可能であることが判明し，プロバイオティクス用報告されているB. coagulansのβ-gal遺伝子をCAZy

途を検討するにあたって，腸内環境での増殖が期待さで 調 べ た と こ ろ ， そ の 転 写 産 物 は glycocideれる結果となった。

hydorolase (GH) familyのGH-42に属するものであっ

コハク酸，乳酸，蟻酸，酢酸，ピログルタミン酸はた。B. coagulans のβ-gal遺伝子を基にprimerを設

GAM培地中の含有量と比較し多くの菌株で増加する傾計し，基準株：NBRC12583T 株並びにX-Gal分解能で陽向にあった。特に，乳酸，蟻酸，酢酸は菌株によって性であった菌株に対しリアルタイムPCRを行い，遺伝生成に著しい差が認められた。また，蟻酸，酢酸の増子 の 存 在 を 確 認 し た う え で ， X-Gal 分 解 能 で 陰 性 で減は連動しているものと示唆された（図1）。一般にB.

あった菌株についてもリアルタイムPCRを行った結果，coagulans はL-乳酸を産生すると言われており，分離17菌株中9株には遺伝子が存在し，8株には遺伝子が確菌株の多くはGAM培地での培養においても多量の乳酸認できなかった。前者はβ-gal遺伝子は存在するが，を産生したが，産生量が少ない，又はほとんど認めら変異あるいは発現の問題等により，酵素活性が認められない菌株も存在することが明らかとなった。

れないのではないかと推察された。

一方，ピルビン酸，リンゴ酸は多くの菌株でGAM培3-2-2 でんぷんの資化性地中の含有量より減少する傾向にあった。クエン酸に可溶性でんぷんを炭素源とした培地での分離菌株のついては，ほとんどの菌株においてGAM培地中の含有増殖能は，菌株によって差が認められた（データ未掲

量と大きな変化はなかったが，一部の菌株では著しい載）。資化性は251株に認められ（71.5 %），うち酸生減少が認められ，これらの菌株においてはクエン酸が成が明確なものが137株（39.0 %）であった。可溶性消費されているものと推測された（図1）。

でんぷんの資化速度も分離菌株によって差が認められ3-2 炭素源の資化性た（データ未掲載）。

3-2-1 ラクトース分解活性と遺伝子の解析

3-3 acn gene-like clusterの解析

B. amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42株

3-2-1-1 ラクトースの資化性
ラクトースを炭素源とした培地に分離菌株を接種し（現在は B. velezensis とされている 4) ）の有する環

好気条件下で培養を行ったところ，菌株により増殖能状 ペ プ チ ド amylocyclicin 遺 伝 子 （ acnA ） 及 び そ のに差が認められた（データ未掲載）。ラクトースの資cluster（4.5 kbp）と類似の遺伝子が B. coagulans

化による酸生成をBCPの黄変で確認したところ351株中36D1株に認められるとの報告2) があったため，他のB.

327株に認められ（93.2 %）うち，酸生成が明確なもcoagulans 菌株で該当する遺伝子を調査したところ，のが280株（79.8 %）であった。24株ははっきりとし

36D1株と同様にacn gene-like cluster（4.8 kbp）をた黄変が確認できなかった。ラクトースの資化速度は有する菌株が存在する一方，基準株：NBRC12583T 株を分離菌株によって差が認められ（データ未掲載），こ含めacnAを持たない菌株も存在した。また，acnAとそれは増殖能の差に関連するものと考えられた。のすぐ後ろに位置するacnCの間に挿入が認められる菌

3-2-1-2 X-Galの分解活性株も存在することが判明し (LBSC株：161 bp, S-Lac

ラクトースの資化による酸生成をBCPで確認する場

株：21 kbp），B. coagulansのacn gene-like cluster

合，黄変の程度に差があり，鮮やかに黄変する菌株がを解析すれば少なくとも3群に分けられると予想されある一方，十分な黄変を待たず再度紫色に変色する菌た。

株も認められた。このため，酵素活性をより明確に確

そこで，まず，acnAを増幅するprimer対でリアルタ認する目的で，β-gal（EC 3.2.1.23）の合成基質でイムPCRを行い，遺伝子の有無を確認した。基準株：

あり分解により青色の不溶性物質を生じるX-Galを含NBRC12583T 株は acnA 陰性であった。次に， acnA 陽性有した標準寒天培地に菌株を接種し，コロニーの青変であった菌株にacnAのC末端とacnCのN末端に設計したを確認した。その結果，334株（95.2 %）で青変が確primer対を用いてリアルタイムPCRを行い，増幅が認認された。陰性であった17株には，分離源を同じくすめられた菌株はacn gene-like clusterが正常に保有るものが含まれていた（表2）。

されているもの，陰性であった菌株は標的領域に塩基- 15 -載）。

配列の挿入があるためリアルタイムPCRでは増幅が確認できなかったものと推察した。その結果，351株中，本研究において，分離したB. coagulansには性状及acn gene-like cluster を 保 有 す る 菌 株 は 178 株

び遺伝子に多様性が認められることが明らかとなった。

（50.7 %），clusterに変異があると推測される菌株が11 株 （ 3.1 % ）， cluster を 持 た な い 菌 株 が 162 株

5 参考文献（46.2 %）であった。

1) 中條均紀，森山裕子：日本食品工業学会誌，41巻，第4号，pp. 281-286 (1994)

4 まとめ2) Scholz R, et al.: J. Bacteriol., Vol. 196, No.

プ ロ バ イ オ テ ィ ク ス と し て の 利 用 事 例 の あ る B.

10, p. 1842-1852 (2014)

coagulans について，嫌気条件下での有機酸生成量，

3) Rogan NA, De Vos P.: Bergey's mannual of

好気条件下でのラクトース資化性とβ-gal遺伝子，でSystematics of Archaea and Bacteria, Bacillus,んぷんの資化性，及びacn gene-like clusterの解析

Online. John Wiley & Sons, Inc. (2015)を行った。その結果,例えば分離源（試料）が同じで4) Dunlap CA, et al.: Int. J. Syst. Evol.

あっても，分離条件の違い等により炭素源の資化性やMicrobiol., Vol. 66, No. 3, p. 1212-1217 (2016)

保有遺伝子に差がある菌株が得られた（表2，試料名及び分離条件については非公開）。性状分析においては，ラクトースの資化性とX-galの分解結果が一致しない菌株も認められるが（試料：W），試験回数が少ないこともあり，今後精査が必要である。一方，GAM培
地培養中の有機酸生成量に特徴が認められる菌株は，分離源を同じくするものも含まれていた（データ未掲

表2B. coagulans 分離菌株の多様性

試料 a)
D分離条件 a)-1-2-3-4ラクトース
資化性X-gal 分解

陽性631416陽性
631416陰性

8E-1-2-3-4V-5-1

731054172611873
1054
1726111W-1-2陰性

1111β-gal
保有63141687310541726111114

でんぷん
資化性

gene欠失a) 非公開。
- 16 -陰性
63141cluster
保有変異8731687310105544117722616111111141114

欠失6314611114陽性

acn gene-like1111114