研究助成業績報告集

第 31 回（2023 年度）バイエル循環器病研究助成『動脈硬化と炎症・免疫メカニズム』

公益財団法人循環器病研究振興財団

No

研

＊

目

次 ＊

究

課

題

研 究 者

頁

1

動脈硬化性疾患における血管炎症・免疫制御メカニズムの解明

安達 裕助

1

2

シングルセルオミックス解析で挑む、動脈硬化性疾患免疫メカ
ニズムの解明

江本 拓央

3

3

心血管システムにおける体細胞モザイクの解析とその臨床的意義に関する研究

佐野 宗一

7

4

クローン性造血が大動脈瘤を進展させる機序の解明

由良 義充

17

動脈硬化性疾患における血管炎症・免疫制御メカニズムの解明
東京大学医学部附属病院 循環器内科・特任研究員

安達 裕助
Ⅰ．緒 言

またヒト大動脈解離患者の病理組織標本を用いて、解心筋梗塞や脳卒中、大動脈疾患(瘤・解離)等の動脈

離した血管周囲組織では誘導型一酸化窒素合成酵素

硬化性疾患による死亡者数は、日本人の死因でがんに（iNOS）陽性炎症性マクロファージの集積を豊富に比肩する高い割合を占めており、動脈硬化性疾患の克認めることを確認した（図 2）。

服を目指した動脈硬化の病態メカニズムの解明が不可欠である 1, 2)。急性大動脈解離は、動脈硬化性疾患の中でも死亡率と健康寿命にとりわけ大きな影響を与える重大な疾患である。申請者らは、動脈硬化性疾患の中でも特に急性大動脈解離に着目し、その炎症・

図２ ヒト大動脈解離における血管周囲炎症性マクロファージ集積

免疫制御メカニズムの解明および新規診断モダリテ

非造影 CT から大動脈を自動認識し、血管炎症を可ィの開発に挑んでいる。

視化することに成功した。解離例では非解離例と比較して、血管炎症のサロゲートマーカーとして知られてⅡ．対象・方法

いる血管周囲脂肪減衰指数(FAI)値 4)が有意に上昇しまず基本となる基礎的知見を得るために、動物実験ており、急性大動脈解離診断に有用なマーカーとして機能することが分かった（図 3）。

と大動脈解離患者の剖検検体による検討を行った。マウスの大動脈解離モデルは、野生型マウス（C57BL/6J）にアンジオテンシン II、β-アミノプロピオニトリル
を浸透圧ポンプで投与することにより誘発した 3)。ヒト剖検標本を用いて大動脈解離患者の血管周囲組織での炎症細胞集積を評価した。さらに、急性大動脈解離患者の非造影 CT 画像を用いて、血管炎症を非侵襲

図 3 非造影 CT による大動脈の自動認識と血管炎症の可視化的に検知する機械学習プログラムを構築した。

Ⅳ．考 察
急性大動脈解離における大動脈周囲脂肪組織の病

Ⅲ．結 果
大動脈解離マウスモデルを用いた解析により、大動態生理学的意義はこれまで十分に分かっていなかっ脈解離では血管周囲組織において炎症細胞（CD45+た。申請者らは、大動脈解離で血管周囲組織に著名な

CD11b+ F4/80+ マ ク ロ フ ァ ー ジ 、 特 にCD11c+

炎症が起きていることをマウスモデルに加えて、ヒトCD206− 炎症性マクロファージ）の集積を認めること

病理検体を用いて初めて示すことができた。また、大を血管周囲脂肪の間質血管細胞群(SVF)を用いた動脈解離で血管周囲の炎症マーカーである FAI が上

FACS によって確認した（図 1）。

昇することを、非造影 CT 画像から検出することがで
きた。

Ⅴ．結 論
申請者らは、マウスモデルおよびヒト臨床サンプルを用いて、大動脈解離における血管周囲組織の炎症・

図 1 大動脈解離モデルの作製と免疫細胞動態の把握

1免疫動態に迫る基礎・臨床研究を展開している。大動
脈周囲炎症をこれまで非侵襲的に捉える方法は乏しかったが、FAI は非造影 CT から算出できる非侵襲的な指標であり、造影剤を必要としない新たなバイオマ
ーカーとして機能する可能性が考えられる。

Ⅵ．研究協力者
小室一成・東京大学循環器内科・教授
上田和孝・東京大学循環器内科・助教
瀧本英樹・東京大学循環器内科・講師

Ⅶ．参考文献1)

Adachi Y, Ueda K, Takimoto E. Perivascularadipose tissue in vascular pathologies-a novel
therapeutic target for atherosclerotic disease?

Front Cardiovasc Med. 2023;10:1151717.
2)

Adachi Y, Ueda K, Nomura S, et al. Beiging ofperivascular adipose tissue regulates its
inflammation and vascular remodeling. Nat

Commun. 2022;13(1):5117.
3)

Hirakata S, Aoki H, Ohno-Urabe S, et al.
Genetic deletion of Socs3 in smooth muscle
cells ameliorates aortic dissection in mice.

JACC Basic Transl Sci. 2020; 5, 126–144.
4)

Antonopoulos AS, Sanna F, Sabharwal N, et al.
Detecting human coronary inflammation byimaging perivascular fat. Sci Transl Med. 2017;9, eaal2658.

2シングルセルオミックス解析で挑む、
動脈硬化性疾患免疫メカニズムの解明

神戸大学大学院医学研究科

内科学講座循環器内科学分野 医学研究員

江

本 拓

央

Ⅰ．緒 言

with indeterminate potential, CHIP)の関与が動脈硬動脈硬化性疾患の予防、治療について、この数十年に化性疾患について報告されている。しかし、免疫細胞

大きく進歩したが、依然として死因として大きな割合に生じる体細胞遺伝子変異がトランスクリプトームを占めていると同時に、健康寿命を縮める原因となっやタンパクレベルで与える影響について未だ分かっている。現在、動脈硬化性疾患、特に腹部大動脈瘤、ていないことが多い。

大動脈弁狭窄症について、腹部大動脈瘤には無症状で

本研究は、腹部大動脈瘤、大動脈弁狭窄症について発見されるが、手術適応の大きさまで有効な進展予防

病変部のシングルセル解析を行い、その特徴を捉える法が存在しない。大動脈弁狭窄症については、高齢化と同時に、オミックス統合解析を行うことで、ゲノム社会の患者数が激増し、経カテーテル的大動脈弁植え解析から疾患のリスク層別化を行い、さらに、疾患モ込み術の適応が広がっているものの、薬物治療法が存デルマウスを用いて発症メカニズムを解明し、リスク在しないという問題点が存在する。

層別化に基づいた治療法を探索することを目的とす

動脈硬化は、免疫が大きく関わる慢性炎症性疾患でる。

あることが様々な研究で証明されてきたが、ヒトの病変部での解析を行うことが困難であった。しかし、近Ⅱ．対象・方法

年病 変部の シング ルセル RNA シ ークエンス

1、腹部大動脈瘤(scRNAseq)を行うことで、詳細に１細胞レベルでそ

ヒトの腹部大動脈瘤で人工血管置換術適応となっの組織の構成細胞を観察することが可能になった。申た患者について、瘤中心部とその中枢側で断端に近い

請者は以前冠動脈疾患において、慢性冠症候群患者

組織を採取し、コラゲナーゼ処理、FACS ソーティン（安定狭心症）と急性疾患群患者（不安定狭心症、心グで CD45 陽性細胞を回収し、10X Chromium にて筋梗塞）の冠動脈粥腫切除術で切除したプラークをシ

シングルセル化し、解析を行った。1、瘤中心部(5 例）

ングルセル RNA シークエンス比較解析を行い、マク2、瘤中枢側断端部(3 例）3、健常大動脈（公開データ

ロファージの subcluster の違いを捉えることに成功

3 例）で比較検討した。また、空間的な位置情報を得している。
（参考文献１）

るために、AKOYA phenocycler システムを用いて多冠動脈プラークのシングルセル解析を行うと、 単重免疫染色を行った。

球、樹状細胞、肥満細胞、TNF+ Mφ、C1Q+ TREM2+
fibrotic Mφ、CXCL3+IL1B+ inflammatory Mφ に分2、大動脈弁狭窄症

けられた。IL1B を強く発現するのは、単球と大動脈弁狭窄症弁置換術の適応となった、ヒト大動脈inflammatory Mφ であり、いずれも急性冠症候群で弁狭窄症患者（AS）の大動脈弁 9 例とコントロールのみ認めるものであったことから、IL1B 抗体の投与として大動脈弁閉鎖不全症（AR）の大動脈弁 4 例をが心筋梗塞発症患者の 2 次予防に有効であったとす

組織学的に比較、その後シングルセル RNA シークエ

る CANTOS trial (参考文献２) をサポートする結果

ンス比較解析を行った。

であった。また、骨髄の幹細胞に起こる体細胞遺伝子変異によるクローン性造血 (clonal hematopoiesis

3Ⅲ．結 果1、腹部大動脈瘤
全体の細胞の UMAP を描き、annotation を行うとコントロールにおいてはほとんど認めなかった B 細胞が大動脈瘤断端部、中心部ともに著明に増加していることが分かった（図１）。

図 3 図 2 と同一検体の CD4+T 細胞のシングルセル解析
Peripheral helper T 細胞が集積している。

マウスに Western diet を 8 週間投与した後アンギオテンシンⅡを 4 週間持続で infusion するモデル（参考文献 3）を使用している。以前の報告にて、
図 1 ヒト大動脈瘤における、瘤中心部、瘤断端部、健常大動脈でシングルセル比較を行った。B 細胞が大動脈瘤に集積している。

一報抗 CD20 抗体が有効であったことが報告されて

空 間 的 な 位 置 情 報 を 得 る た め に 、 AKOYAておらず、外膜側の B 細胞や TLS の評価が行われて

phenocycler システムを用いて多重免疫染色を行っいない。大動脈の FACS、免疫染色、シングルセル解たところ、CD68 陽性の単球マクロファージは内膜側析で B 細胞や TLS の存在はヒトサンプルほど明らかに集積し、CD20 陽性 B 細胞や CD4、CD8 陽性 T 細

な集積はないが確認している。そこで、もし抗 CD20

胞は外膜側に集積していることが分かった。
また B 細抗体に大動脈瘤抑制効果を確認し、シングルセル

胞、T 細胞は組織に局在するリンパ状の構造物、

RNAseq を用いてそのメカニズムを解明する段階でTertiary lymphoid structures (TLS)を形成しているある。また同時にヒトサンプルで、TLS の集積が何にと考えられた（図 2）。

反応して生じているのかという疑問があり、シングル

いる（参考文献 4）が、詳しいメカニズムが解明されセルレパトア解析を実施し、その clonal expansion を評価すると同時にレパトア配列から抗原を推定する
手法を試している。
2、大動脈弁狭窄症
AS と AR の代表的な手術サンプルの写真を見るとその厚さや層構造に大きな違いが見られ、組織学的な図 2 ヒト大動脈瘤組織における AKOYA phenocycler 多重免疫染色
外膜側における、Tertiary lymphoid structure の形成。

解析においては、AS において石灰化の周囲には

これは現在報告のない新しい発見であり、多重染色をAR の大動脈弁サンプルでは、CD68 陽性のマクロフ行えることで初めて明らかになったと考える。また、

ァージがまばらに認められ、その分布に大きな違いが同じ scRNAseq を行い CD4+T 細胞の集団で UMAP認められた（図 4）。

CD68 陽性のマクロファージの集積を認めた。一方、を 描 い た と こ ろ 、 CD200 を マ ー カ ー と す る
Peripheral helper T 細胞(Tph 細胞)が出現していることが分かった。Tph は CXCL13 を発現しており、
特に CXCL13 は B 細胞を呼び寄せるケモカインとして有名であり、B 細胞を呼び寄せることで、Tph を形

図 4 大動脈弁閉鎖不全症(AR)と大動脈弁狭窄症(AS)の外観の違い
HE、CD68 染色。

成すると考えられる（図 3）。
B 細胞の大動脈瘤へ与える意義を証明するために免疫細胞の比率が低いことが考えられたので、、
CD45

特異的に B 細胞を depletion する抗 CD20 抗体（リ陽性の免疫細胞をソーティングし、シングルセル解析

ツキシマブ）を投与する計画にしている。
腹部大動脈瘤のモデルマウスについては、Apoe-/-4を行い UMAP を描くと、一番多く認められたのは T

唆された（図７）。

細胞で、その次に Myeloid 細胞がくるという順番であった。T 細胞が一番大きな細胞集団であるというのは、冠動脈プラークでも共通した所見であり、マウスの動脈硬化性病変とは異なっている。B 細胞は小さな

図 7 Myeloid 細胞の機能比較。A)Gene ontology(GO)解析。B)それ
ぞれの細胞集団における遺伝子発現。C)Inflammatory マクロファー
ジにおける遺伝子発現の比較。AS vs AR

細胞集団であった（図 5）。
図 5 シングルセル解析。全体。

ヒトサンプルのシングルセル解析からは現象の因

Myeloid 細胞をさらに解像度を上げて UMAP を描く

果関係や、薬物介入の有効性などの評価ができない。

と、マクロファージの細胞集団は My.0 LYVE1

現在、大動脈弁狭窄症モデルについては、いいモデル

resident macs、My.1 Inflammatory macs、My.2 C1Q

がなかなかない現状があるが、山形大学が開発した

resident like macs、My.3 TREM2 macs、 My.4

wire injury モデル（参考文献 5）を用いて、炎症や、

Clasical monocytes、My.5 DCs、My.6 MregDCs とマクロファージの貪食機能にフォーカスを当てて現

7 つの細胞集団に分けることができた。興味深いこと

在介入実験を行っている。

に AS では、My.0 LYVE1 resident macs が減少し、逆に My.2 C1Q resident like macs、My.4 ClasicalⅣ．考 察

monocytes が増加するという特徴を得ることができ

１、腹部大動脈瘤

た。Monocyte の浸潤は急性冠症候群でも認めた所見

B 細胞の集積は他の動脈硬化性疾患では認められなであり、動脈硬化性疾患の病態に深く関わっているとい所見であり、大動脈瘤に特徴的なものである。今回考える（図 6）。

の結果から、
TLS の形成については明らかになった。
しかし、その意義については全く分かっておらず、今後のマウスにおけるメカニズムの研究結果が待たれる。また、腹部大動脈瘤における CHIP の関与についてもまだ分かっていないことが多く、現在その関係を１細胞レベルで解析している。
２、大動脈弁狭窄症
シングルセル RNA 解析から、AS 症例では AR 症例と比べ、スカベンジャー機能を有するレジデントマク
ロファージの割合が減少する一方、単球が多く浸潤し

図 6 シングルセル解析。Myeloid 細胞。

ていることが分かった。病理学的所見からは、AS 症

My.0 LYVE1 resident macs の減少は特徴的であり、例の石灰化周囲にマクロファージの集積が見られ、マGO 解析では、Cargo receptor activity や Scavenger

クロファージ機能への介入は、大動脈弁狭窄症に対す

receptor activity が集積しており、個別の遺伝子発現る今後の新たな治療ターゲットになりうる。大動脈弁

では、COLEC12、MRC1、DAB2 の発現が特徴であ狭窄症モデルへの介入によってより詳細なメカニズ

ることが証明された。この resident macrophage が減ムを解明していきたい。

少することは Scavenger 作用の減弱が病態に関わっていることが示唆される所見であった。さらには、ARⅤ．結 論と AS で My.1 Inflammatory macs 同士の遺伝子発現

シングルセル解析でヒトの手術サンプルから１細胞を網羅的に比較した場合、AS において IL1B の発現レベルでの現象を捉えることに成功した。今後はこのが上昇していることがあり、より炎症が強いことが示

5

結果を用いて治療介入方法をマウスの研究で明らかにしていきたいと考えている。CHIP を含めたリスク
層別化を行なった上で、各々の患者にあった個別化医療の展開へと結びつけることが目標となる。

Ⅵ．研究協力者
岡田健次・神戸大学医学部心臓血管外科・教授
高橋宏明・神戸大学医学部心臓血管外科・准教授
山中勝弘・神戸大学医学部心臓血管外科・講師
井上大志・神戸大学医学部心臓血管外科・特定助教
長命俊也・神戸大学医学部心臓血管外科・特定助教
平田健一・神戸大学医学部循環器内科・教授
山下智也・神戸大学イノベーション研究科・教授
佐々木直人・神戸薬科大学医療薬学研究室・准教授

Ⅶ．参考文献1)

Emoto T, Yamamoto H, Yamashita T et al.
Single-Cell RNA Sequencing

Reveals a

Distinct Immune Landscape of Myeloid Cells
in Coronary Culprit Plaques Causing AcuteCoronary

Syndrome.

Circulation.

2022.145:1434-1436.
2)

Ridker P, Everett B, Thuren T et al.
Antiinflammatory Therapy with Canakinumab
for Atherosclerotic Disease. N Engl J Med. 2017.
377:1119-1131

3)

Shinohara R, Nakashima H, and Emoto T et al.
Gut Microbiota Influence the Development ofAbdominal Aortic Aneurysm by Suppressing
Macrophage Accumulation in Mice. Hypertension.
2022. 79 :2821-2829.

4)

Schaheen B, Downs E, and Serbulea V et al. BCell Depletion Promotes Aortic Infiltration of
Immunosuppressive Cells and Is Protective ofExperimental Aortic Aneurys. Arterioscler

Thromb Vasc Biol. 2016. 36 :2191-2202
5)

Honda S, Miyamoto T, and Watanabe T et al.
A Novel Mouse Model of Aortic Valve Stenosis
Induced by Direct Wire Injury. Arterioscler

Thromb Vasc Biol. 2014;34:270-278.

6心血管システムにおける体細胞モザイクの解析とその臨床的意義に関する研究―動脈硬化病変における体細胞モザイク―

国立循環器病研究センター・独立型研究室長

佐野宗一
Ⅰ．緒 言
心疾患は日本の死因の第二位である 1。既知の危険因A子に対する薬物治療や患者教育が普及している今日

体細胞モザイクにおいても、心疾患の患者数は増加し続けており、新
たな危険因子の同定とそれに対する介入が求められている。そこで、本研究では、動脈硬化病変の体細胞

ドライバー変異

モザイクに関する研究開発を提案した。

クローン性増殖

体細胞モザイクは、臓器や組織において正常細胞が変B異細胞に置き換わってゆく現象のことであり、疾患や形質との関連が注目されている（図 1A）。近年のシー
ケンシングテクノロジーの発展を背景に、人体のあら

皮膚、食道

脳

肺

心血管

肝臓

子宮

膀胱

造血器

ゆるパーツの体細胞モザイクが記載されており、その2（図リストには心血管の体細胞モザイクも含まれる．人体は加齢と共に体細胞モザイクを呈する。

1B）。
研究代表者はかねてより、動脈硬化病変の体細胞モザ
イクが病態形成の重要なプレイヤーであるという仮説を提唱してきた 3。それを受けていくつかの研究グループから、動脈硬化病変のシーケンシングデータが報告され始めている 4,5。しかし、体細胞モザイク形成に必須のドライバー変異（図 1A）や体細胞モザイク

図 1．人体は加齢と共に体細胞モザイクを呈する。
ドライバー変異した細胞が、適応優位性を獲得し増殖する
ことで、体細胞モザイクが形成される。血液のモザイク（クローン性造血）は心血管疾患を促進する。心血管システムのモザイクについては研究が遅れている。

化した病変の予後については未だ明らかではないというのが現状である。
本研究では、動脈硬化病変の体細胞モザイクの臨床的意義を明らかにすることを目的としている。私たちの根拠は以下の通りである 3。

仮説は「動脈硬化病変の体細胞モザイク化は、病変の• ヒト、マウスの動脈硬化病変が体細胞モザイク化

進展や不安定化に寄与する」である（図 2）。報告者らしていることが生化学的、遺伝子工学的手法によは特に、病変の平滑筋細胞の体細胞モザイクに注目しり示されている 6-8。また、体細胞モザイク化の一ている（以下）。より大局的には、本研究開発によって因が平滑筋細胞にあることが示唆されている。平

これまでとは全く別の角度から動脈硬化症の新たな滑筋細胞は病変の進展や不安定化への寄与が大

治療標的を探索し、将来の治療薬創出につなげること

きい細胞であり、体細胞変異という視点からそのを目指している。

機能を検証する意義が大きい。

また、これに加えて、動脈硬化病変、とくに病変の平• 病変を形成するその他の細胞（白血球、血管内皮

滑筋細胞の体細胞モザイクの解析を優先する科学的7

ザイクに対して新しい視点からアプローチし、動脈硬化の新たな病態解明を目指している。
また、本研究は、世界で初めて動脈硬化病変の体細胞モザイクを遺伝子レベルで解析し、動物実験や臨床検体の解析によりその臨床的意義を検証するものである。

図 3．同一人物の冠動脈正常部・病変部から単離培養した平滑筋細胞の全ゲノム解析
両者を比較することで、病変部の平滑筋細胞にだけ存在する変異（体細胞変異）を同定することができる。
図 2．内膜平滑筋細胞のモザイクは動脈硬化の進展やプラー
クの不安定化に関わる。
動脈硬化の進展とともに中膜平滑筋細胞が内膜に遊走し、病変の進展や不安定化に寄与する。研究代表者は、ドライバー
変異した平滑筋クローン（赤色）の増大と機能変化が病変の転機に関わっているのではないかと考えている。

Ⅱ．対象・方法
1.

同一個体からサンプリングした冠動脈の正常部と病変部の比較細胞）の関与も当然考えられる。実際、白血球の同一個体に由来する正常部の血管平滑筋細胞と病変

体細胞モザイク化（クローン性造血）については部の血管平滑筋細胞を全ゲノム解析し、それぞれを遺研究代表者らがすでに研究を進めてきた。血管内伝子レベルで比較することで、病変部にのみ存在する

皮細胞の体細胞モザイク化については、先行研究

遺伝子 A の変異を同定する（図 3）。

がなく情報に乏しいため、本研究に関しては平滑サンプル間で、その他のバックグラウンド（SNP や筋細胞にまずは主眼を置くこととした。

変異原への暴露）が同一であるため、本法で同定される体細胞変異は信頼性がきわめて高いと考えられる。

• 正常な動脈は体細胞モザイク化していないことが明らかになっている 6。

2.

本研究開発は、世界で初めて動脈硬化病変の体細胞モ

ヒト冠動脈平滑筋細胞における遺伝子 A の機能解析

ザイクを遺伝子レベルで解析し、動物実験や臨床検体方法 1 で同定した遺伝子 A の変異が血管平滑筋細胞の解析によりその臨床的意義を検証するものである。

へ及ぼす影響を検討するため、ヒト冠動脈平滑筋細胞
心血管システムの体細胞モザイクに関しては、1973（ HCASMC, human coronary artery smooth

年には EP Benditt らの生化学的実験により、動脈硬muscle cells：初代培養細胞）を用いた In vitro の解化病変が体細胞モザイク化していることが観察され析を行う。遺伝子 A をノックアウト（あるいは過剰発ていたが、その後の研究は国内外において進んでいな

現）した HCASMC を樹立し、その表現型を解析すい（Proc Natl Acad Sci USA. 1973）。本研究は、EPる。

Benditt らの研究に基づき、動脈硬化病変の体細胞モ

3.

8遺伝子 A 改変マウスを用いた病態解明研究

血管平滑筋細胞の遺伝子 A の変異が、そもそも動脈■シングルセル RNA シーケンシングのプロトコール

硬化症の進展に寄与するのか、またそのメカニズムは• ライブラリー作成：Chromium Single Cell v3.1 3’

如何なるものか、を In vivo の実験系にて解析する。
4.

Reagent Kit (10x Genomics)

血管平滑筋細胞特的遺伝子 A ノックアウトマウ• シ ー ケ ン ス 反 応 ： P2 2x100 Sequencing Kit(Illumina)

スの表現型解析
タモキシフェン誘導性血管平滑筋特異的遺伝子 A ノ• シ ー ケ ン サ ー ： NextSeq

ッ ク ア ウ ト マ ウ ス （ Myh11CreERTGene A

2000 Sequencer(Illumina)

flox/floxROSAtdTomatoApoe-/- ）とコントロールマウス• パイプライン：Seurat v4.0.4、SCENIC v1.2.4、（Myh11+Gene A flox/floxROSAtdTomatoApoe-/-）に食餌性

PHATE v1.0.7 R package

高コレステロール血症を誘導し、遺伝子 A 欠損平滑筋細胞の増殖優位性（モザイクの形成）、及び動脈硬scRNA-seq の解析データは組織染色法、定量的逆転化病変への寄与を組織学的に評価する。

写 PCR 法（RT-PCR）による裏付けを行う。また、

タモキシフェンの腹腔内投与により、平滑筋細胞特異細胞の遊走能や泡沫細胞化など Ex vivo での実験も活的に遺伝子 A 欠損と tdTomato 発現を誘導する。投用し、多角的に遺伝子 A 欠損平滑筋細胞の機能を解

与 2 週間後に高脂肪食を開始し、その 0、8、16 週間

析する。さらに、一連の実験により治療標的となりう

後に愛護的に屠殺する。タモキシフェンの投与量を調るメカニズム（変異による炎症反応の亢進など）を同整することで、変異細胞量をコントロールすることが定 で き た 場 合 、 Myh11CreERTGene

可能である。以下の 2 通りの実験を計画している。

flox/floxROSAtdTomatoApoe-/-マウスに阻害剤や中和抗体を1.

投与することでその表現型が改善するか検証する。

低容量タモキシフェン：ごく少数の平滑筋細胞にA

のみ Cre を発現させるシステム。遺伝子 A 欠損細胞（tdTomato+）の In vivo での増殖優位性を

5.

組織学的に評価する。
2.

動脈硬化病変の mutational landscape の解明（申請時の項目を以下に示す。
）

高容量タモキシフェン：多数の平滑筋細胞に Cre

多施設共同研究により動脈硬化病変における平滑筋を発現させるシステム。動脈硬化巣のサイズ（Oil細胞の遺伝子 A の体細胞変異およびその他のRed O 染色）・壊死コアの面積（HE 染色）、線維

mutational landscape を解明する。解析は各研究室性被膜の厚さ（Masson Trichrome 染色）などをで行うが、得られたデータの結合をスムーズに行うた組織理学的に評価する。

めに、検体の保存方法、ライブラリー作成とシーケン
ス反応の試薬、シーケンサーの機種、データ解析のた遺伝子発現解析めのパイプライン、などは施設間で同一のプロトコー

In vivo での遺伝子 A 欠損平滑筋細胞の機能を明らか

ルを共有する。

にするために、シングルセル RNA シーケンシング（scRNA-seq, single cell RNA sequencing）による単■臨床試験計画骨子

一細胞レベルでの網羅的な遺伝子発現解析を行い、そ<基本デザイン>の結果を多角的に検証する。また、本項目のマウスで観察研究の知見と方法 2 のヒト冠動脈平滑筋細胞での知見を<対象>突合し整合性を検証する。

・登録基準：

高脂肪食負荷後のクアドラブルおよびコントロール

以上）の頸動脈狭窄病変に対し頸動脈内膜剥離術のマウスから大動脈を採取後、酵素処理により単細胞（carotid endarterectomy, CEA）を施行した症例のに分散する。フローサイトメーターを用いて手術検体。症候性、無症候性は問わない。

tdTomato+平滑筋細胞を単離し、死細胞除去後、ドロ大阪公立大学での解析 --- 同大学脳神経外科学、彦根ップレットベースのシングルセル解析に進む。

市立病院脳神経外科より検体を入手する。

scRNA-seq には研究開発代表者がこれまでに使用し中等度ないし高度（狭窄度 50%

慶應義塾大学での解析 --- 同大学脳神経外科学てきたプロトコールを使用する（Sano S et al. Science.

より検体を入手する。

2022）
。

※検体の入手先については今後、増加する可能性が高い。

9

・除外基準：なし。抗がん剤や放射線による治療歴が2. 塩基の 10%以上が不確かである場合、paired reads

ある症例を除外しない。

とも除去する。

・目標検体数：100~150 検体 (300~450 ゲノム)3. 塩基の 50%以上が低品質（Phred quality<5）の場

・検体の保存：FFPE（ホルマリン固定パラフィン包合、paired reads とも除去する。

埋）Burrows Wheeler Aligner (BWA) 、 Samtools 、

血液検体（-20℃にて保存）

Sambamba ソフトウェアによるリファレンスゲノム●サンプルサイズの積み上げに関して：

へのマッピング、ソーティング、PCR duplicates の本研究項目の目的は、動脈硬化病変の変異パターンを除去を経て最終的な BAM ファイルを生成する。バリ

詳かにするために可能な範囲で多くの臨床検体を解アントの検出には Mutect2 joint-calling による同一析することであるため、申請時には目標サンプル数を患者の手術検体と血液検体の一括解析を行う（図5）。

設定しなかった。

同一患者の動脈硬化検体とバッフィーコート検体の全エキソームシーケンシング<実施期間>
2021 年 12 月〜2026 年 3 月までに手術を行った症例

リファレンスゲノム（GRCh38/hg38）へのマッピングの検体を解析する。
<解析方法>

BAMファイル

全エクソーム解析■手術検体の処理

Mutect2 joint-callingによる同一患者における動脈硬化検体とバッフィーコート検体の一括解析

ホルマリン固定した筒状の手術検体を5mm幅で輪切りにし、個別にパラフィン包埋する。パラフィン切片

ドライバー変異候補の決定：- Read depths > 5- VAF > 0.01
- 2および3から検出されるSNVsの除外- マニュアルによるクオリティチェック

を一枚作製し、平滑筋細胞マーカーであるα-SMA を染色する。α-SMA の染色領域を参考に、対応するパ
ラフィンブロック内の残検体から内膜平滑筋層と考えられる部分を目視にて切り出す（図 4）。検体の全長図 5.ドライバー変異候補の決定までのフローチャート

が 1.5cm の場合、3 個（1.5cm÷0.5cm=3）に分割された検体をそれぞれ解析する。

アノテーションにはANNOVAR ソフトウェアを用いるが、バリアントの選定には dbSNP、1000 Genome、
esp6500、GnomAD、CADD、HGMD、COSMIC な
どのデータベースも利用する。とくに、報告者らはアミノ酸変化を伴う変異に関心があるため、Consensus
CDS、RefSeq、Ensemble、UCSC などのトランスク
リプトデータベースも活用する。
なお、偽陽性を減らすため supportive reads>5 であることも条件に加える。

図 4.手術検体の処理
検体を 5mm 幅ごとの輪切りにし、パラフィン包埋する。-SMA
染色像を参照し、内膜平滑筋細胞が豊富に含まれる部分を目視にて切り出す。

Ⅲ．結 果
1.

同一個体からサンプリングした冠動脈の正常部と病変部の比較による遺伝子 A の機能喪失型変■データ解析に関して

異の同定

シーケンスデータの QC およびトリミングには以下

白人女性（57 歳、高血圧症）からサンプリングした冠の基準を適用する。

動脈の正常部（N: normal）と病変部（P: plaque）の

1. アダプターコンタミネーション（アダプターシー

それぞれから単離した平滑筋細胞（SMC: smooth

ケンスとの 10 塩基以上の一致、10%以下のミスマッ

muscle cells）を全ゲノム解析を実施し、その結果か

チのみ許容）を検出した場合、paired reads とも除去

ら、病変部の平滑筋細胞にのみ存在する遺伝子 A のする。

機能喪失型変異を同定した。なお、サンプルへの血管10内皮細胞や白血球のコンタミネーションの可能性はさらに正常部（N）と病変部（P）の平滑筋細胞を 90:10

フローサイトメトリー、リアルタイム PCR により否の割合で共培養したところ、継代を重ねるごとに後者定した。

由来の変異型シグナルが増強していく様子が観察さ

SMC-N とSMC-P をHuman SMC Growth Medium

れ、本患者における病変部の平滑筋細胞の競合優位性（Cell Applications, Cat# 311-500）下で培養した後、が示された（図 6B）。

ゲノム DNA を抽出し全ゲノム解析した。全ゲノム解

注：この時点では病変部の平滑筋細胞の競合優位性が析のプロトコールの概要は以下の通りである。

遺伝子 A の変異によるものかは不明であり、結果 2 での検討事項とした。

■全ゲノム解析2.

ゲノム DNA：SMC, 200ng

ヒト冠動脈平滑筋細胞における遺伝子 A の機能
解析

ライブラリー作製：NEB Next® UltraTM DNA
Library Prep Kit
シーケンス反応：Novaseq 6000 S4 Reagent Kit(Paired-end, 150bp)
解析装置：Novaseq 6000 PE150
クオリティコントロール：アダプターシーケンスの除去、Phred quality によるリードの選定など
リファレンスゲノムとマッピング方法：GRCh38,
Burrows Wheeler Aligner (BWA)
シーケンシングの Average depth は 30x (N)、39x (P)であった。解析の結果、病変部の平滑筋細胞にのみ存在する遺伝子 A の変異（p.Xnnfs, 28bp ins, VAF=N）を同定した。遺伝子 A の変異は最も確からしいドラ
イバー変異での一つであると考えている。

図 6.変異型遺伝子 A の確認
A.Genotyping PCR 産物のアガロースゲル電気泳動。野生型=193bp、変異型=221bp。
B.正常部と病変部の平滑筋細胞の共培養。継代毎に A の
genotyping PCR を施行した。病変部の平滑筋細胞は競合優位性があることが分かる。

また、SMC-N と SMC-P が確かに同一個体に由来する（サンプルの取り違えがない）ことを Conpair ソフ
トウェア（Bergmann EA, Bioinformatics. 2016）を用いて確認した。
リシーケンシングによるバリアントの確認

結果 1 で同定した遺伝子 A の欠損が血管平滑筋細胞同定したバリアントを Sanger シーケンシングによりへ及ぼす影響を検討するため、ヒト冠動脈平滑筋細胞確認した。

（ HCASMC, human coronary artery smooth

同定した遺伝子 A の変異部位はエクソン X であるた

muscle cells：初代培養細胞）を用いた In vitro の解め、その部位をはさむ形で genotyping PCR を設計し析を行うこととした。遺伝子を A ノックアウトした

た。PCR 産物をアガロースゲル泳動したところ正常

HCASMC を樹立した。

部（N）サンプルでは 200bp 付近に単一シグナルを認遺伝子 A ノックアウト冠動脈平滑筋細胞の樹立

め、病変部（P）サンプルではその数十 bp 上側に追加

CRISPR/Cas9 遺伝子編集技術により遺伝子 A ノッのシグナルを認めた（図 6A）。Sanger シーケンシン

クアウト HCASMC（Gene A-KO-HCASMC）を樹立

グはした。具体的には、レンチウイルスによって細胞にNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

Cas9/gRNA を送達し遺伝子編集する手法を習熟しての 28 塩基が挿入された、遺伝子 A 変異体であること

おり、本項目でもその系を用いた（Sano S et al. Circが確認された。

Res. 2018; Sano S et al. Science. 2023）。レンチウイアッセイの性質上、この 28 塩基挿入型遺伝子 A は高ル ス ベ ク タ ー に は pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP

い確率で生殖細胞変異ではなく体細胞変異であると（Addgene, Cat#57823）を使用した。レンチウイル

言える。

スベクターに gRNA 配列をクローニングし、psPAX2

の

結

果

、

同

シ

グ

ナ

ル

11

（ Addgene, Cat#12260 ）、 pMD2.G （ Addgene,

できた（図 8）。

Cat#12259）とともに HEK293T 細胞にトランスフ

gRNA- GeneA -2 で樹立した細胞についても同様のェクトすることでレンチウイルスを作製し、精製した。

傾向が認められた。

HCASMC にレンチウイルスを感染させ、tRFP 陽性
3.

細胞をソーティングすることで細胞の樹立を完了し血管平滑筋細胞特異的遺伝子 A ノックアウトマ

た。

ウスの作製

樹立した Gene A-KO-HCASMC は、親株（野生型細胞、wild type (Wt)-HCASMC）とその他の遺伝的背景が同一（isogenic）であるため、遺伝子 A ノックア
ウトの効果だけを検討できるという利点がある。また、
CRISPR/Cas9 システムによるオフ・ターゲット効果の可能性を除外するために異なる gRNA を用いて複数のクローンを作製した。

図 8．GeneA 欠損ヒト冠動脈平滑筋細胞の競合優位性
野生型との共培養アッセイでは、継代ごとに GeneA 欠損細胞の比率が増加することが観察された。

gRNA のクローニングに用いる配列は以下の通りである。コントロールである Wt-HCASMC の樹立にはゲノムを切断しない gRNA（Non-targeting）を送達した。

Gene A-1:

以下の 4 系統のマウスの交配による血管平滑筋細胞

5’-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3’

特異的ノックアウトマウス（4 遺伝子改変マウス）のGene A-2:

樹立には時間を要し、現在は交配が完了している。
• Apoe ノックアウトマウス（Apoe-/-）5’- XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX -3’• Cre ノックインマウス（Myh11CreERT）

Non-target:• tdTomato ノックインマウス（ROSAtdTomato）

5’-CACCGGCAGCGCGGCTATCGTGGC-3’• Gene A-flox マウス（Gene Aflox/flox）（図 9）

ソーティング前の細胞の TIDE（Tracking of Indel by
DEcomposition）の結果を図 7 に示す。

A

wt locus

Exon2

Ex3

Ex4

Ex5 Ex6

flox locus
PGK-Neo-pA

+

M

/+
f lo
x/
f

lo
x

B

flox
wt

図 9．GeneA-flox マウスのセットアップ(A)ターゲティングコンストラクト。loxP 配列を赤三角形で示している。
(B)GeneA-flox マウスのジェノタイピング PCR。

図 7.遺伝子 A 編集ヒト冠動脈平滑筋細胞の TIDE 解析結果
TIDE 解析はゲノム編集技術を用いた後に生じる挿入や欠失（イ
ンデル）
を特定し、
分析するためのツールである。
いずれの gRNAが効率良く機能していることが分かる。

遺 伝 子 A ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス （ Gene A-KO:

gRNA-GeneA-1 を用いて樹立した GeneA -KO-

Myh11CreERT Gene Aflox/flox ROSAtdTomatoApoe-/-）ではApoe-/-バックグラウンドであるため食餌性に動脈硬HCASMC（tRFP）および WT-HCASMC（GFP）を
10:90 の割合で混合して培養・継代を繰り返したとこ
ろ、前者の割合が継代ごとに増加するのが観察され、GeneA 遺伝子欠損によって平滑筋細胞に競合優位性（competitive advantage）が付与されることが確認

12

化症を誘導できる。また、タモキシフェン投与により遺伝子A領域を標的とする
196種類のプローブ

血管平滑筋細胞特異的に Cre リコンビナーゼが誘導され遺伝子 A がノックアウトされるとともに赤色蛍
光（tdTomato）を呈するため、組織学的な局在判定やUMI

ソーティングに利用できる。
Limitation：Myh11CreERT locus は Y 染色体上にある

Lig.

Ext.

UMI（分子バーコード）

一つのプローブでコピーする領域

ため GeneA-KO は必然的にオスでの解析となり、メライゲーション、エンドヌクレアーゼ処理

スでの In vivo 解析はできない。
4.

遺伝子A領域のエンリッチメント

遺伝子 A シーケンシング法の確立

申請時の計画では、頸動脈内膜剥離術で得られた

増幅、アダプター付加（ライブラリ調整）

FFPE 検体より内膜平滑筋層をマイクロダイセクシ
ョンにより切り出し、全エクソーム解析を行う予定

シーケンシング（変異検出）であった。しかし、ゲノム量が微小であり、十分な
図 10. smMIPs プローブの構造と動作原理
smMIPs プローブは捕捉するゲノム領域に特異的に結合するための二つのキャプチャアーム（Lig、Ext）を有する単鎖 DNA である。ゲノム領域に結合すると、リガーゼ反応でキャプチャアームの間隙が埋められ、関心領域がプローブに「コピー」される。その後、Inverse PCR 反応で関心領域が増幅され、アダプター付加を経てライブラリが構築される。

カバレッジを確保することが困難であったため、このアプローチからの撤退を決定した。
代わりに、標的を遺伝子 A に絞った解析に方針を転換した。そして、単分子分子逆位プローブ（single
molecule molecular inversion probes, smMIPs）を設計した。

その他の成績 1（Nat Cardiovasc Res. 2024）

報告者の研究室は、22 個の CHIP 遺伝子（血液の体細胞変異によって引き起こされるクローン性造血の男性の血液細胞は加齢と共にY染色体を喪失する

原因遺伝子）をターゲットシーケンシングするために「Y 染色体モザイク」という現象を示すことが知ら

smMIPs を使用している。本研究では、対象とする遺れている（mosaic loss of Y chromosome, LOY）
。報

伝子を遺伝子 A 一つに限定して smMIPs プローブを

告者はこれまでの研究で、UK バイオバンクの登録設計した。

者 223,550 人の末梢血遺伝子データを解析し、血液smMIPs は、特定のゲノム領域を捕捉する技術で、単の LOY と心血管疾患の関連を解析し、血液の LOY

一鎖の DNA 分子を使用する（図 2）。これらのプロー

細胞の割合が高い男性ほど、心血管疾患の死亡リス

ブには、ゲノムの特定の配列に相補的な配列が含まれクが高いことを明らかにした。特に、血液の LOY 細ており（キャプチャアーム）、ターゲット配列と結合胞の割合が 40%以上の男性では、心不全による死亡する。プローブがターゲット配列に結合すると、リガリスクが 2.42 倍に増加していた。さらに、動物実験

ーゼ反応によってキャプチャアーム間のギャップがにより、血液の LOY は様々な臓器の障害を引き起埋められる。その後、関心領域が増幅され、シーケンこすことが明らかになった。心臓では、Y 染色体をシング用のライブラリが作製される。各プローブには欠損したマクロファージが TGF-1（transforming

バーコードが付与され、個別のターゲットの識別が可

growth factor-beta 1）を過剰に産生することで線維能である。報告者は、MIPGEN ソフトウェア

芽細胞を活性化し、心臓線維化を促進していること（https://github.com/shendurelab/MIPGEN）を使用を明らかにした 9。

して、遺伝子 A のエクソん領域全長をカバーするた

本研究助成金の一部は、血液の体細胞モザイクの一めに196 個のsmMIPs プローブを設計した（図 10）。

つであるY染色体モザイクが心不全を促進するメカ

シーケンス深度が不足しているゲノム領域に対してニズムを解明するために使用された。

は、追加のプローブを手動で設計し、プローブセット

報告者は、マウスの白血球にある Y 染色体の中の特を最適化した。

定の遺伝子（Uty、Kdm5d、Ddx3y、Eif2s3y）が失従来の全エクソーム解析が１検体あたりわれることが、血液の LOY で心不全が悪化する原40,000~5,0000 円と高額であったが、smMIPs では、因であると考えた。そこで、これらの遺伝子が血液１検体あたりのコストが 2,000~3,000 千円に抑えら

特異的に欠損したマウスを作製し、それぞれのマウれる。

スの心不全感受性を圧負荷モデル（横行大動脈狭窄13術）を用いて解析した 10。その結果、血液特異的 Uty

応用しており、細胞を PCR 反応液とともに液滴に封欠損マウスのみが、コントロールマウスに比べて心入し、PCR 反応により生成される Y 染色体や X 染色

不全感受性が高いことが明らかとなった。この結果体由来のシグナルを検出するものである。それぞれのから、加齢に伴う血液の Y 染色体喪失によって Uty

染色体に、約 20 セットのプローブがデザインされて遺伝子欠損が引き起こされ、それにより心不全が悪おり、染色体のコピー数を蛍光強度に変換することで化すると考えられました。

性染色体欠失細胞を単細胞レベルで検出することがUTY は他の遺伝子の転写を調整するエピジェネティ

できる（検出感度：<0.1%）。Y 染色体についてはシグック分子であることから、Uty 遺伝子を欠損する白血ナルの完全欠損を持って LOY と判定し、女性の X 染

球の心臓における機能を解析した。本研究では、白血色体についてはシグナルの（男性の XY 細胞レベルへ球の中でも特に心臓マクロファージに焦点を当てての）減弱をもって LOX と判定する（図 12）。

解析した。心臓マクロファージには炎症を亢進するマ
クロファージや、線維化を促進するマクロファージが存在する。横行大動脈狭窄術 7 日目に心臓に集簇した
白血球をセルソーターによって単離し、シングルセル
マルチオミクス解析を行なったところ、Uty 遺伝子を欠損したマクロファージは、線維化を促進するマクロファージの性質を帯びる傾向が強いことが明らかとなった。このことが、血液の LOY において心不全が悪化する一因と考えられた。さらに、の LOY を示した男性の心臓の検査を実施したところ、やはり線維化が強く引き起こされていることが分かりました（図11）。
本 成 果 は 国 際 科 学 誌 Nature Cardiovascular
Research に掲載された（Horitani K et al. Nat

Cardiovasc Res. 2024）。

図12. Multiplexed sc-dPCR法による血液中の性染色体喪失細胞（XO 細胞）の測定。
縦軸が Y/X 染色体由来のシグナルであり、緑で囲まれた領域の細胞が XO 細胞である。
上：男性、下：女性

彦根中央病院の職員および患者の血液を検査した結図11. 血液のY 染色体モザイクが心不全を促進するメカニズムの解明
血液の Y 染色体モザイクでは、Y 染色体上に存在する Uty 遺伝
子が欠損するために、心臓マクロファージの活性化状態が線維化促進型に偏るため、心臓線維化が促進し心不全が悪化すると考えられた。

果、次のことが明らかとなった。
• 全ての男性の血液サンプルにおいて、Y 染色体を欠失した細胞が存在した。
• Y 染色体を欠失した細胞の割合は、年齢とともに急激に増加するカーブを示した。

その他の成績 2（Advanced Biology. 2024）• 全ての女性の血液サンプルにおいても、X 染色体

性染色体欠失細胞を高感度、ハイスループット、かつを欠失した細胞が存在した。

コスト効率よく測定する方法を開発した 10。この方法
は、multiplex single-cell droplet PCR（sc-dPCR）を

14

• X 染色体を欠失した細胞の割合は、年齢とともにるのと同様、動脈硬化巣の体細胞モザイクはより直接増加する傾向があった。

的にプラークの性状を変化させる可能性があるが、動• X 染色体欠失細胞の割合は Y 染色体欠失細胞の割

脈硬化巣の体細胞モザイクに関しては世界的にも全合よりかなり低く、ほとんどの症例で 5%以下であく研究が進んでいない。また、体細胞変異は発がんのった。

文脈で研究されることがほとんどであったが、シーケ

本成果は国際科学誌 Advanced Biology に掲載された

ンシングテクノロジーの進歩を背景に、現在ではあら（Tsuchiya J et al. Advanced Biology. 2024）。

ゆる正常組織での体細胞変異が記載されるに至っている。本研究がテーマとしているのは血管（血管平滑Ⅳ．考 察筋）という、発がんとはほとんど無縁の組織・細胞で

私たちの細胞には一生を通じて変異が蓄積する。ヒトあり、体細胞変異研究の新たな展開が期待れる。

が生きてゆく過程で生じる後天的な変異のことを体細胞変異といい、親から受け継ぐ先天的な変異とちが

Ⅴ．結 論

い、子孫に受け継がれることはない。体細胞変異は、心血管疾患における体細胞モザイクの臨床的意義は最初に変異が起こった細胞が増殖し、その結果生まれ

まだほとんど解明されておらず、今後も継続的な研究

る細胞にのみ受け継がれる。

が必要である。

体細胞変異の大部分は変異細胞の適応性（生存や増殖）に影響しない。一方、変異細胞に増殖、生存の優位性

Ⅵ．研究協力者を与える稀な体細胞変異はドライバー変異と呼ばれ

千原英夫・彦根市立病院・脳神経外科部長

るが、ドライバー変異する遺伝子（ドライバー遺伝子）

牧貴紀・彦根中央病院・脳神経外科医長

は、組織や細胞のタイプごとに異なることが明らかに

安西淳・慶應義塾大学医学部循環器内科学・特任講師なっている。
例えば、食道上皮では TP53 や NOTCH1

渡邊陽介・山梨大学大学院総合研究部医学域内科学講

がドライバー遺伝子であり、血液細胞では DNMT3A

座循環器科内科学教室・助教

や TET2 がドライバー遺伝子となっている。また、ドライバー変異があるからといって、その細胞ががん化

Ⅶ．参考文献していることはなく、この場合の変異細胞は病理学的1.

に正常である。

厚生労働省 令和 2 年（2020）人口動態統計（確定
数）の概況

2.

ドライバー変異のある細胞から増殖した細胞も元の

Yizhak K, Aguet F, Kim J, Hess JM, et al. RNA細胞と同じドライバー変異を持つため、時が経つにつsequence analysis reveals macroscopic somatic

れて、組織内には変異を共有する細胞の集団（クローclonal expansion across normal tissues. Scienceン）が形成される。この変異細胞のクローン性増殖が2024;364:eaaw0726.
3.

組織の至るところで起こるため、ヒトが加齢するととSano S, Wang Y, Walsh K. Somatic mosaicism:
implications for the cardiovascular system. Eur

もに、組織に多彩なクローンがパッチワークのようにHeart J 2020;41:2904-2907.

混在する「体細胞モザイク」が形成される（本申請書
4.

では、体細胞モザイクをクローン性増殖とほぼ同義語

Sleptcov AA, Zarubin AA, Bogaychuk PM, etとして用いている）。近年のシーケンシング技術の進

al. Human exome sequence data in support of歩を背景に、検体中の変異細胞の割合が一定以上にな

somatic mosaicism in carotid atherosclerosis.

るとシーケンシングによりその変異を検出すること

Data Brief 2021;39:107656.
5.

ができるようになった。今では、あらゆる組織が体細Steffensen LB, Kavan S, Jensen PS, et al.

胞モザイクを呈していることが明らかになっており、Somatic mutations reveal clonal cell populations

その臨床的意義に関心が集まっている。

in atherosclerotic plaques. medRxiv 2022.
6.

報告者はこれまで、造血の体細胞モザイクであるクロ

Benditt EP, Benditt JM. Evidence for aーン性造血の研究に従事し、クローン性造血では変異

monoclonal origin of human atherosclerotic

した白血球が炎症を亢進することで、心不全や動脈硬plaques. Proc Natl Acad Sci U S A 1973;70:1753-

化といった循環器病が悪化することを明らかにした。

1756.

造血の体細胞モザイクが血液細胞の性質を変化させ

15

7.

Chappell J, Harman JL, Narasimhan VM, et al.
Extensive

ProliferationofaSubsetofDifferentiated, yet Plastic, Medial Vascular
Smooth Muscle Cells Contributes to Neointimal
Formation in Mouse Injury and Atherosclerosis
Models. Circ Res 2016;119:1313-1323.
8.

Jacobsen K, Lund MB, Shim J, et al. Diverse
cellular architecture of atherosclerotic plaquederives from clonal expansion of a few medial
SMCs. JCI Insight 2017;2:e95890.

9.

Sano S, Horitani K, Ogawa H, et al.
Hematopoietic loss of Y chromosome leads tocardiac fibrosis and heart failure mortality.
Science 2022; 377:292-297.

10. Sano S, Oshima K, Wang Y, et al. Tet2-MediatedClonal Hematopoiesis Accelerates Heart Failure
Through a Mechanism Involving the IL1β/NLRP3 Inflammasome. J Am Coll Cardiol
2018;71:875-886.
11. Sano S, Oshima K, Wang Y, et al. CRISPRMediated Gene Editing to Assess the Roles ofTet2 and Dnmt3a in Clonal Hematopoiesis andCardiovascular Disease. Circ Res 2018;123:335341.
12. Sano S, Wang Y, Yura Y, et al. JAK2V617F Mediated Clonal Hematopoiesis Accelerates
Pathological Remodeling in Murine Heart
FailureJACC Basic Transl Sci 2019;4:684-697.
13. Sano S, Wang Y, Ogawa H, et al. TP53-mediatedtherapy-related

clonalcontributes

tohematopoiesis

doxorubicin-induced

cardiomyopathy by augmenting a neutrophilmediated cytotoxic response. JCI Insight.
2021;6:e146076.
14. Horitani K, Chavkin NW, Arai Y, et al.
Disruption of the Uty epigenetic regulator locus
inhematopoietic

cells

phenocopies

theprofibrotic attributes of Y chromosome loss inheart failure. Nat Cardiovasc Res 2024;3:343–
355.
15. Tsuchiya J, Maki Y, Ayano M, et al. A Novel
Methodfor

Acquired

Sex

Chromosome

Mosaicism. Adv Biol 2024.

16

クローン性造血が大動脈瘤を進展させる機序の解明
国立大学法人東海国立大学機構 名古屋大学大学院医学系研究科循環器内科

由

Ⅰ．緒 言

良

義

充

ローン性造血に着目した新規診断・治療の開発が期待

ヒト骨髄に存在する造血幹細胞は、①白血球（免疫されている。

細胞）、赤血球、血小板の 3 系統に分化する多分化能、加齢と共に頻度がする心臓血管病の中で、日本人の②自身と同一の細胞を複製する自己複製能の両方を10 万人あたり 3−10 人の頻度で発症する大動脈瘤は、持つことで、全身の臓器に必要な血液細胞を供給しな症状なく経過し破裂した場合には救命することが極がら骨髄における造血幹細胞の数を維持している。造めて難しく、外科的な治療以外には有効な治療が存在

血幹細胞が複製する際に一定の確率で遺伝子変異（体しない医療ニーズの高い疾患である（2020 年、大動

細胞変異）が起き、その変異により細胞の複製能が高脈瘤･大動脈解離診療ガイドライン）。高血圧や脂質異まった場合には、最初は１つの細胞（クローン）であ常などの動脈硬化の危険因子をコントロールしてもった変異造血幹細胞が増殖し、時間の経過とともに骨瘤が進行する患者が多く存在するため、未知の因子が髄中で一定の割合を占めるようになる。この状態はク病態の進行に関連していると思われる。大動脈瘤の進ローン性造血と呼ばれ、加齢と共に頻度が増加し 70

展に単球やマクロファージ、マクロファージから分化

歳以上の高齢者の 1-2 割に認められる。この際に変異した破骨細胞による細胞外マトリックスプロテアー

造血幹細胞から分化した免疫細胞にも遺伝子変異がゼの過剰分泌が関連することが指摘されており引き継がれる。これまでクローン性造血は血液がんの（Raffort J, et al. Nat Rev Cardiol. 2017.）、我々がお原因となる以外に病的な意義は不明であったが、近年こなった解析においても、大動脈瘤病態マウスの大動

疫学的、実験的な検討から心臓血管病の独立した危険脈において、これらの自然免疫系の細胞が著明に浸潤因子であると報告された（Jaiswal et al. Nat. Rev.

している。

Cardiol.2020）。我々もクローン性造血が複数の心臓大動脈瘤の病態に免疫細胞が重要であるという知

血管病を悪化させることを動物実験から報告してき

見とクローン性造血が免疫細胞を介して慢性炎症をた。これは体細胞変異を受け継いだ免疫細胞が機能変惹起するという新知見を合わせて考えた時、免疫細胞化を起こし、心臓、血管で過剰な炎症、組織傷害を起が大動脈瘤の病態に大きく関与しており、クローン性こすという全く新しい病態メカニズムである(図 1.

造血が病態を悪化させる可能性があるとの着想に至Yura et al. JACC Basic Transl Sci. 2020)。今後はクった。そこで本研究ではこの仮説を基礎的解析と疫学的解析から検証し、将来の新規診断・治療の可能性を提唱する。

Ⅱ．対象・方法
実験 1. 大動脈瘤病態におけるクローン性造血の与える影響の解明
ApoE 欠損マウスにアンジオテンシン II を刺激として加え、大動脈瘤を引き起こすマウスモデルを用いる。本研究では、疫学的に最も高頻度に検出される遺伝子の一つである DNA 脱メチル化酵素 TET2 に着目する。Tet2 欠損マウス（Tet2-/-）から採取した骨髄細胞を放射線照射された ApoE 欠損マウスに移植し、

17

Tet2 変異を持つクローン性造血モデルマウスを作成

オテンシン II を投与し、エコー解析により大動脈のする。次に、このマウスにアンジオテンシン II の刺激拡張を確認した。結果、Ctrl 群と比較して、Tet2 変異を加え、大動脈の径を経時的にエコーで測定する（図群では顕著な血管径の拡大が確認された（未発表デー

2 参照）。組織学的検討としては、結合組織染色（エラタ、図 3）。組織学的検討では、結合組織染色（エラス

スチカ・ワン・ギーソン染色）と各種免疫細胞の免疫

チカ・ワン・ギーソン染色）および各種免疫細胞の免染色を行い、Tet2-/-群において特に変化の顕著な所見

疫染色を行った。Tet2-/-群では弾性繊維の菲薄化と断を同定する。

裂が観察された（未発表データ、
図4）。
免疫染色では、
Tet2 変異群において血管内皮細胞下にマクロファー
ジの著しい浸潤が確認された。

実験 2. Tet2 変異免疫細胞が大動脈拡張を促進するメカニズムの解明
Tet2 変異免疫細胞が大動脈壁に及ぼす影響を調べるため、腹部大動脈瘤モデルマウスの大動脈に浸潤している免疫細胞をフローサイトメトリーで分析する。
腹部大動脈瘤モデルマウスの大動脈における変異免
疫細胞を確認後、これらの細胞を FACS によって単離し、RNA シーケンス解析を実施する。その結果に基づき、Tet2 変異免疫細胞が大動脈の拡大を促進するメカニズムを細胞実験を通じて検証する。
実験 3. 大動脈瘤患者におけるクローン性造血の検出とその臨床所見との比較
実験 1.-2.の動物・細胞を用いた基礎実験に加えて、より強固に仮説を検証するために、ヒト検体を用いた解析を計画している。大動脈瘤患者における末梢血液実験 2. ApoE 欠損マウスにアンジオテンシン II を検体から DNA を抽出し、エラー修正ターゲット次世

刺激として与えた後、大動脈組織を単離し免疫細胞の代シークエンスを用いてクローン性造血の遺伝子変

フローサイトメトリー解析を行った結果、単球やマク異を検出する。高齢者に高頻度に見られるクローン性

ロファージといった自然免疫に関わる細胞群が大動造血遺伝子としてエピジェネティック修飾因子

脈壁に多く浸潤していたことが確認された。これによ（DNMT3A, TET2, ASXL1）、DNA 傷害応答因子

り、大動脈瘤の病態にこれらの細胞群が影響を及ぼし（TP53, PPM1D, ATM, CHK2）、スプライシング因ている可能性が高いと考えられる。その後、大動脈に子（SRSF2, SF3B1）をターゲットとする。クローン

浸潤するマクロファージを FACS によって回収し、性造血のステータス（有無、程度）と病態の進展の関RNA シークエンス解析を行ったところ、炎症、免疫連を明らかにして、クローン性造血が大動脈瘤の進展

応答、破骨細胞分化に関連する多数の遺伝子の発現がに及ぼす影響を明らかにする。

顕著に変化していた（未発表データ）。この知見を検証するために、Tet2 変異マクロファージの破骨細胞への分化能を評価する細胞実験を行った。骨髄由来マ

Ⅲ．結 果

クロファージを培養し、RANKL（Receptor activated

実験 1. Tet2 クローン性造血モデルマウスにアンジ

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nuclear factor kappa ligand）を添加して破骨細胞へ可能性があるため、そのメカニズムを明らかにするこ分化させた結果、Tet2 変異マクロファージでは、とが重要である。先行研究でも、Tet2 変異マクロファ

TRAP 陽性破骨細胞への分化が優位に亢進しているージは破骨細胞様の特性への分化が増強されることことが確認された（未発表データ、図 5）。破骨細胞へが示唆されており（Kim PG et al. J Exp Med. 2021）、の分化において鍵となる分子は RANK であり、

これは我々の研究結果と一致する。

RANK 欠損マクロファージでは破骨細胞への分化が動脈硬化や虚血性心不全において、Tet2 変異マク抑制される（Boyce BF et al., Arch Biochem Biophys,

ロファージは NLRP3 インフラマソームを活性化し、

2008）。現在、レンチウイルス/CRISPR-Cas9 のシス

IL1βの分泌を亢進させることで病態の進行を助長す

テム（Yura Y et al., Circ Res, 2021）を用いて、Tet2

るとこれまでの研究で提唱されている。今回、大動脈と RANK の両欠損骨髄細胞を作成中であり、この遺瘤におけるメカニズムはこれとは異なるものであり、

伝子編集骨髄細胞を ApoE 欠損マウスに移植し、病態ごとに Tet2 クローン性造血が病態を助長するメ

Tet2/RANK 両欠損骨髄細胞を持つマウスを作成する。

カニズムが異なる可能性がある。そのため、個別病態

このマウスの解析を通じて、Tet2 変異破骨細胞の病ごとの検討の重要性が強調される。

態への影響を明らかにする予定である。

今後、クローン性造血と心血管病の研究が進むことで、将来の医療に変革をもたらす可能性がある。例えば、大動脈瘤患者におけるクローン性造血の遺伝子変異の種類や変異細胞の割合を特定することにより、病態の進行が高リスクである群を同定し、この知見に基づく個別化医療が検討される。クローン性造血という新たな視点は、現行の医療を超える可能性を持ち、その実現は社会的に大きな意義を持つ。

Ⅴ．結 論

実験 3. ヒト検体を用いた解析では、実験計画書が倫理委員会の承認を受けており、目標検体数に対するモデルマウスを用いた解析から、クローン性造血が同意書の取得、血液検体の採取、および DNA の抽出

大動脈病態を悪化させること、そのメカニズムの一端が完了している。今後は次世代シーケンスを用いた解が明らかとなった。この知見を活かして、今後新たな析を進め、クローン性造血のプロファイルを明らかに

ゲノム医療への道が開かれる可能性がある。

し、大動脈瘤の臨床経過との関連性を検証する予定で

Ⅵ．研究協力者ある。

竹藤 幹人・名古屋大学医学部循環器内科・講師
米川 淳・名古屋大学医学部循環器内科・大学院生

Ⅳ．考 察
ここまでの研究では、主に動物実験を通じてクローン性造血が大動脈瘤の悪化に寄与している可能性をⅦ．参考文献示唆する結果が得られている。その機構については現

1)Jaiswal S et al. Nat Rev Cardiol. 2020
Mar;17(3):137-144.

在、研究を進行中であり、Tet2 変異を持つマクロファ
2)ージの分化が重要な役割を担っていると考えられる。

Yura Y et al. JACC Basic Transl Sci. 2020 Feb
24;5(2):196-207.

引き続き、細胞実験、動物実験、およびヒト検体の解3)析を通じて、この仮説の検証を進める方針である。

Raffort J et al. Nat Rev Cardiol. 2017
Aug;14(8):457-471.

大動脈瘤において、破骨細胞は多くの細胞外マトリ4)ックスプロテアーゼを分泌し、結果として弾性繊維のBoyce BF et al. Arch Biochem Biophys. 2008
May 15;473(2):139-46.

傷害を引き起こし、病態の進行に寄与していることが5)

報告されている（Raffort J, et al. Nat Rev Cardiol.

Yura Y et al. Circ Res. 2021 Sep 3;129(6):684698.

2017）。Tet2 変異を持つマクロファージが破骨細胞に6)分化しやすくなることで、大動脈瘤の進展を助長する

Kim PG et al. J Exp Med. 2021 Dec
6;218(12):e20211872.

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