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Introducing the Flexi ® Vector System
タンパク質コード領域のクロー二ングおよび発現のための新しいシステム
By Michael Slater, Ph.D., Jim Hartnett, M.S., Natalie Betz, Ph.D., Jami English, M.S., Ethan Strauss, Ph.D., Becky Pferdehirt, B.S., and Elaine Schenborn, Ph.D.,
Promega Corporation

アブストラクトT7 Sgf I
rrnB
Terminator

Pme I
BarnasePme I
BarnaseT7 Terminatorcer

T7 Terminatorcer

pF1A T7
Flexi® Vector(3455bp)

pF1K T7Flexi® Vector(3450bp)

AmprKanr

ori4816MA

Flexi Vector Systemは、発現ベクターやペプチドタグ融合ベクターなどを含むベクターシリーズ間で迅速、効率的にタンパク質コード領域を移し換えることのできる信頼性高い方法を提供します。制限酵素
処理後、インサートはFlexi® Vector間で方向性、読み枠を維持したまま効率よく移し換えることができます。最初のクローニングステップでは、Flexi® Vectorに含まれる致死遺伝子により、インサートライゲーションの成否判定のためのポジティブセレクションが行えます。また、抗生物質耐性遺伝子は次ステップとなる他のFlexi® Vectorへのサブクローニング時のセレクションをシンプルにします。

T7 Sgf I

rrnB
Terminator

4815MA

®

ori

T7
rrnB
Terminator

T7
rrnB
Terminator

GST

GST

TEV protease
cerpFN2A (GST)
Flexi® Vector(4137bp)

proteincoding
regionPme ISgf IKanr

lethal geneAmprSgf IPme I

BarnasePme Iori

ori

CMV I.E.
Enhancer/Promoter

cer

pF4K CMV
Flexi® Vector(4118bp)

Intronori

T7BarnaseAmpr

4818MA

Kanr

4817MA

Ampr

pF4A CMVFlexi® Vector(4123bp)

T7 Terminator

CMV I.E.
Enhancer/Promoter

Intron
T7
Barnase

Sgf I

Sgf I

Kanr
Pme I
SV40 Late poly(A)Pme I
SV40 Late poly(A)

図2. Flexi® Vector

Pme I

Kanr

Ampr

4597MA

Sgf I

Pme I

pF1AおよびpF1K T7 Flexi® Vectorは、T7 RNAポリメラーゼプロモーターを介した大腸菌およびin vitroでのタンパク質発現用にデザインされた。pFN2AおよびpFN2K（GST）Flexi® Vectorでは、タンパク質のN末端側にグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）が付加される。このGSTペプチドタグはTEVプロテアーゼによる切断/除去が可能。pF4A およびpF4K CMV Flexi® Vectorは、ヒト-サイトメガロウイルス（CMV）intermediate-earlyエンハンサー/プロモーターによる哺乳動物細胞内での恒常的なタンパク質発現が可能。全てのFlexi® Vectorには、
in vitro
タンパク質発現のためのT7 RNAポリメラーゼプロモーターおよびプラスミド多量体を単量体にするE.coli XerCDリコンビナーゼのためのcerサイト（200bp）が含まれる。

Pme I

proteincoding
regionSgf I

pFN2K (GST)
Flexi® Vector(4132bp)

Barnase4819MAori

cerlethal geneSgf Icer

T7 Terminator

イントロダクション
Flexi® Vector Systemは、2種類のレアカッター制限酵素 Sgf IおよびPme Iを使用して、タンパク質コード配列のシンプルかつ確実なディレクショナルクローニング法を提供します。インサートはSgf IおよびPme Iで消化した後、片方のFlexi® Vectorから他方へ効率的に移し換えることができ、しかもインサートの方向性および読み枠は維持されており、移し換えた後にインサートを再度シークエンシングする必要もありません（図1）。このアプローチはハイスループットフォーマットにも容易に対応します。

TEV protease

Sgf I

4820MA

Flexi® Vector を用いたクローニングはインサートの方向性、読み枠を維持する方法を採用しているため、インサートを移し換えるたびにシークエンシングを行う必要はありません。

®

図1. Flexi Vector Systemにおけるタンパク質コード領域の移し換え
Flexi® Vector Systemは、タンパク質コード領域（ペプチド融合タグ有または無）を発現させるための柔軟性のあるディレクショナルクローニング法を採用。発現に必要な特徴やタンパク質融合タグはベクターのバックボーンに含まれており、タンパク質コード領域は2種類のレアカッター制限酵素（Sgf I およびPme I）を用いてベクター間で簡単に移し換え可能。Flexi® Vectorは、タンパク質コード配列のポジティブセレクション用の致死遺伝子（バーナーゼ）およびFlexi® Vectorを保持するコロニー選択用の抗生物質マーカーを含む。

Prometech Journal

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タンパク質コード領域のクロー二ングおよび発現のための新しいシステム

表1. オープンリーディングフレームにおける制限酵素サイトの出現頻度

ORF平均 ORF
ORF数 サイズ(bp) %GC
Homo sapiens
27,974 1503.8 52.42
Mus musculus
26,538 1370.5 51.65
Rattus norvegicus 22,845 1535.9 51.73
Caenorhabditis
elegans
21,124 1312.1 42.80
Arabidopsis
thaliana
28,951 1253.8 44.20
Saccharomyces
cerevisiae
5,869
1492.4 39.62
Drosophilamelanogaster
18,748 1692.7 53.82
Escherichia
coli K124255
4,255961.5 51.85
生物種

Pme ISgf I Pme I or Sgf I Pac I Swa I Asc I BsiW I Nru I SnaB I Pvu I FspA I
0.42 0.70 1.12 0.87 2.01 2.15 3.23 3.36 3.56 3.63 3.85
0.32 0.81 1.13 0.59 1.43 1.10 3.02 3.04 3.34 4.04 3.88
0.35 0.81 1.15 0.63 1.48 1.08 3.58 3.51 3.86 4.67 3.85

Mlu I Rsr II Fse I
4.04 4.46 4.53
3.36 3.15 2.49
4.04 3.99 2.65

Not I
5.73
3.37
3.47

Srf I
6.02
3.38
3.45

0.81

0.75

1.54

0.77

2.86

0.23

7.44

15.72

7.27

20.51

1.94

9.54

3.37

0.34

0.89

0.18

0.64

1.76

2.39

0.50

1.13

0.08

6.16

8.80

7.71

10.99

1.38

6.59

3.01

0.25

0.37

0.10

0.46

2.52

2.96

3.27

6.13

0.22

8.96

8.43

14.26

8.86

2.42

5.40

1.43

0.15

0.49

0.17

5.03

0.71

5.66

0.62

1.86

2.02

14.90

28.02

8.81

33.37

11.33

15.45

10.65

1.43

5.51

1.27

4.82

1.676.35

1.55

1.29

3.62

11.66

25.10

10.20

23.43

8.04

22.91

7.97

0.09

0.45

0.94

ヒト-オープンリーディングフレーム（ORF）内で最も出現頻度の低い制限酵素サイト 15種類をリストアップした。出現頻度は、表示された制限酵素サイトを含むORFの割合（％）で示した。データはRefSeq Release 6より入手した。（RefSeq Release 6：2004年7月5日までの利用可能なゲノム、転写物、タンパク質のデータが統合されており、2,467種の生物から1,050,975個のタンパク質および配列を含む。現行のRefSeq Release は ftp://ftp.ncbi.nih.gov/refseq/release/より利用可能）

部位特異的なリコンビネーションによるベクターシステムと異なり、Flexi® Vector Systemは目的のタンパク質に複数のアミノ酸を付加する必要もありません。さらに、本システムは保存用のエントリーベクターも不要で、多くの場合、実験に最適なベクターへ直接組み込むことができます（例. 哺乳動物発現あるいはN末端側GST融合ベクター）。
どのFlexi® Vector も、両端にSgf IおよびPme Iサイトを持つタンパク質コード領域のアクセプターとして機能します。全てのFlexi® Vector は致死遺伝子（バーナーゼ）が組み込まれており、目的のDNA断片と置換されます。そのため、プラスミドの増幅やタンパク質発現で一般的に使用される大腸菌株で、インサートのポジティブセレクションが行えます。Flexi® Vector に含まれる抗生物質耐性遺伝子は、ベクター間でのタンパク質コード領域の移し換えを容易にします。Flexi® Vectorには発現用ベクターまたはタグを付加できるベクターが揃っており、タンパク質の構造、機能あるいはタンパク質間相互作用の研究を行うために必要なネイティブタンパク質や融合タンパク質を発現させることができます（図2）。

PCRを用いたFlexi® Vector SystemによるORFの収集
Flexi® Vector System は2つのレアカッター制限酵素：Sgf IおよびPme Iを利用するシステムです。Sgf Iはヒトのオープンリーディングフレーム（ORF）配列内の切断サイトが最も少ない制限酵素で、Pme Iは2番目に少ない制限酵素です。また、これらの酵素の切断サイトは、その他多くの生物のORFにもほとんど存在しません（表1）。アノテーシ
ョンされたヒトORFのほとんど（99%）では、これら制限酵素を用いたディレクショナルクローニングに影響を与えませんでした。しかし、目的のタンパク質コード領域内のSgf I またはPme Iサイトをスキャニングすることを推奨します。もしタンパク質コード領域にこれらのサイトが含まれる場合、タンパク質コード領域の一部のみをクローニングすることや、タンパク質コード領域内のSgf IおよびPme Iサイトを消化から防護するためにRec Aタンパク質の使用をご検討ください(1)。
また、PCRベースの部位特異的変異導入法 (2, 3) により、アミノ酸配列を変えずに制限酵素サイトを変更することもできます。

12

Prometech Journal

Sgf IおよびPme Iサイトは、PCRによりタンパク質コード領域に付加すことができます。クローニングを容易にするために、タンパク質コード領域の増幅用5'（フォワード）プライマーにはSgf Iサイトを、3'（リバース）プライマーにはPme Iを付加します（図3）。Sgf Iサイトはスタートコドンの1べース上流に配置します。これは、融合タンパク質を作製しないFlexi® Vectorではネイティブな翻訳開始サイトからのdenovoイニシエーションを起こさせ、また、N末端融合タンパク質を作製するFlexi® VectorではSgf Iサイトを翻訳させるためです。Pme Iサイ
トはC末端側に配置すると、タンパク質コード領域の最後のアミノ酸にバリン残基が1つ付加されることになります。バリンのコドンGTTはオーカーストップコドンTAAの直前に位置します。
Sgf IおよびPme Iサイトを両端に持つタンパク質コード領域を、Sgf IおよびPme Iで消化したベクターにクローニングすると、翻訳停止コドンが再生します。また、ネイティブなストップコドンの下流にPme Iサ
イトを配置させると、翻訳がネイティブなストップコドンで停止する
ため、目的のタンパク質にバリンを付加せずに翻訳させることができます。しかし、この方法を行えば、将来的にC末端にタグを融合させたタンパク質の発現が行えなくなります。C末端融合タンパク質は、タンパク質コード領域にPme Iサイトと異なる制限酵素（例：EcoICR I）で作製した平滑末端を持つ配列を融合させることにより作製することができます。プライマーデザイン用のソフトウェアは以下のサイトでご利用頂けます（www.promega.com/techserv/tools/flexivector/）。

pF1A T7 Flexi® Vectorへのウミシイタケルシフェラーゼのクローニング
哺乳動物での発現に最適化されたコドンを有する合成ウミシイタケ
ルシフェラーゼ（hRL）タンパク質コード領域（933bp）をPfu DNA ポリメーラーゼを使用してPCR増幅しました。クローニング戦略の概要
は図4に示し、プロトコルの詳細についてはFlexi ® Vector Systems
Technical Manual #TM254でご確認頂けます。要約すると、まず、958bpのウミシイタケルシフェラーゼPCR産物を精製した後、Flexi ®
Enzyme Blend（Sgf IおよびPme I）で消化し、941bpの断片を生成しました。さらに、制限酵素消化により生じた短いオリゴヌクレオチドを除去するために洗浄しました。増幅後および制限酵素消化後の精製

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5´
20–35
complementary
nucleotides

3´
5´
3´

5´NNfSg

GNNICGATCCG

TTT
AA e I
APmC

高効率的なFlexi® Vector間の移し換え

NN
Carboxy-terminal(reverse) primer

3´
5´

3´TG
20–35
C A complementary
nucleotides

Amplification

Sgf I

Translation stop codon

Translation start codon

5´ N NNN GCG ATC GCC ATG
3´ N NNN CGC TAG CGG TAC

Valprotein-coding region

GTT TAA ACN NNN 3´
CAA ATT TGN NNN 5´

4604MA

Amino-terminal(forward) primer

protein-coding region

NGN

Pme I

図3. Sgf IおよびPme Iサイトを付加するためのPCR増幅
Sgf Iサイトはスタートコドンの上流に配置。これは、ベクターバックボーンにより、スタートサイトでのde novoイニシエーションまたはアミノ末端融合ペプチドを付加するための翻訳を可能にする。Pme Iサイトの付加は、タンパク質コード領域の3'末端に単一のバリン-コドンを付け加えた、翻訳停止またはC末端融合ペプチドを付加するための翻訳を可能にする（ベクターバックボーンによる）。
ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を増幅するために、N末端(5')プライマー配列
はGTCAGCGATCGCCATGGCTTCCAAGGTGTACGAC、C末端(3')プライマー配列をCTTCGTTTAAACCTGCTCGTTCTTCAGCACGCとした。

正しいなサイズの合成ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子をコードするSgf I/Pme I消化DNA断片の存在からプラスミドDNAをスクリーニングすることによりFlexi® Vector間の移し換えの成功率を計測しました。ドナー側のhRL-Flexi® Vectorは、異なる薬剤耐性を持つアクセプター側のFlexi® Vectorとペアーを作ります。ドナー側とアクセプター側のプラスミドDNAを合わせ、Flexi® Enzyme Blend（Sgf IおよびPme I）で同時に消化し、ライゲーションを行います（図5）。連結された産物はJM109（DE3）にトランスフォームし、アクセプター側のベクターを選別するために適切な薬剤を添加したLBプレートで菌体を選別します。その結果得られたクローンは、ウミシイタケ活性およびSgf IおよびPme Iサイトの有無を調べてスクリーニングされます。Flexi® Vector
間の移し換えの成功率は89.5%〜100%で、平均95.2％を示しました（表2）。平均および最低の移し換え成功率でもそれぞれN=2.3および3.1を示しました。これは、この実験で2〜3個のクローがあれば充分であることを示しています。

Sgf I
protein-coding region®

はWizard SV Gel and PCR Clean-Up System（カタログ番号 Ａ9281）を用いて行いました。941bpのhRL産物は、Flexi® Enzyme Blend（Sgf IおよびPme I）で消化したpF1A T7 Flexi® Vectorにライゲーションしました。ライゲーション混合液をコンピテントセルJM109（DE3）にトランスフォームし、アンピシリンを含むLBプレートで選別しました。

Pme IPCR
Sgf I

選別されたクローンはウミシイタケルシフェラーゼ活性およびSgf IおよびPme Iサイトの有無によりスクリーニングされました。アンピシ
リン耐性クローンのほとんど（93.7%, 267/285）にはhRLタンパク質コード領域が含まれており、それらhRLポジティブクローンの94.5%（86/91）は、アガロースゲル電気泳動によりSgf IおよびPme I の両制限酵素で消化されることを確認することができました。スクリーニン
グに要するコロニー数（N）を算出するために、ハイ・フィデリティーな増幅の精度を99%（4）と仮定し、目的のクローンを見つける可能性を99.9%とした。

Pme I

DNA Purification
Digestion with Flexi®
Enzyme BlendDNA Purification
Sgf I

Pme I

lethal gene

Ｎ＝In(1-P) / In(1-f)
要求する確率をP（＝0.999）、要求するクローンが得られる確率を f（＝増幅精度Ｘ挿入頻度Ｘ再切断頻度）とした場合
f = (0.990)(0.937)(0.945) = 0.8766となり、その結果 N = 3.3

lethal gene
Sgf I

Pme I
Acceptor
Flexi®
VectorDigestion with Flexi®
Enzyme Blend

LigationTransformationand Selection

そのため、目的のクローンは3〜4つのコロニーをスクリーニングするでけで同定することができることになります。インサートの配列を確認するために、3つのpF1A-hRLクローンをシークエンシングした結果、変異は認められませんでした。次の実験に使用するために、クローンを1つ選びました。

protein-coding region
Pme I4599MA

Sgf I

図4. Flexi® Vectorへのタンパク質コード領域のクローニング
PCRプライマーには、タンパク質コード領域の一部にSgf IまたはPme Iサイトを付加。増幅後、DNAポリメラーゼやプライマーを除くためにPCR産物を精製。制限酵素処理後に生じた小さなオリゴヌクレオチドを除去するために再度DNAの精製を行う。消化したPCR産物は、同様にSgf IおよびPme Iで消化したアクセプターとなるFlexi® Vectorにライゲーション。トランスフォーメーションの後、使用するアクセプターFlexi® Vectorに対応する適切な抗生物質で大腸菌を選別。

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タンパク質コード領域のクロー二ングおよび発現のための新しいシステム

表2. Flexi® Vector間の移し換えの成功率®

Flexi Vector（ドナー側）

pF1A-hRL
pF1K-hRL
pF2A-hRL
pF4K-hRL

proteincoding
region

®

pF1A
95.6%
96.7%

Flexi Vector（アクセプター側）
pF1K
pFN2A pFN2K
pF4A
95.3%
97.8%
91.0%
96.9%
100%
93.3%
93.8%
95.8%

Sgf I

pF4K
89.5%
96.8%

lethal gene
Pme IDonor
Flexi®
VectorPme IAcceptor
Flexi®
Vector+Antibiotic A
resistancepF1A-hRL からpF1K VectorへhRL配列を移し換えるために、190個のコロニーを分析した。その他の移し換えについては、89〜96個のコロニー（平均93個）を分析した。

Sgf I

Antibiotic B
resistance

Digestion with Flexi®
Enzyme Blend

proteincoding
regionlethal gene

表3. JM109（DE3）におけるウミシイタケルシフェラーゼ活性

Untransformed JM109(DE3)
pF1K-hRL
pFN2K-hRL

発光値の平均（RLU）*100 ± 10
42,487 ± 1,775
151,329 ± 17,444

Antibiotic A
resistance

Antibiotic B
resistance

Ligation* RLU factor＝1.0; delay time=2.0 秒; read time＝2.0秒。
結果は平均±標準偏差で示した（n=4）。

Transformationand Selectionwith Antibiotic B

JM109（DE3）におけるウミシイタケ ルシ
フェラーゼの発現
JM109（DE3）にトランスフォームしたpF1K-hRLおよびpFN2K-hRL
vectorからのウミシイタケルシフェラーゼの発現レベルを測定しました。JM109（DE3）はIPTG誘導性プロモーターにより制御されるT7RNA ポリメラーゼを発現する菌株です。IPTGで誘導後、各培養菌をLB培地で1000倍に希釈し、15µlを2X Renilla Luciferase Assay Lysis
Buffer 15µlと混和しました。菌体を最大限溶解するために、この混合液を1回 -70℃で凍結/融解しました。Renilla Luciferase Assay Reagent（100µl, カタログ番号 E2810）を添加し、EG&G plate-reading luminometerで発光を測定しました。両方のベクターはウミシイタケルシフ
ェラーゼを発現していました（表3）。Coomassie® 染色したSDSポリア
クリルアミドゲルにより、ネイティブなタンパク質（pF1K-hRL）およびGST融合タンパク質（pFN2K-hRL）が正しいサイズで、しかも検出可能な分解が見られないことを示しました（データ未掲載）。このことはpF1KおよびpFN2K Flexi® Vectorに含まれるT7 RNAポリメラーゼプロモーターが大腸菌内でネイティブおよびGST融合タンパク質の発現を駆動する機能を有していることが示されました。

表4 pF4K-hRL または phRL-CMV Vector をトランスフェクションしたCHO細胞のウミシイタケルシフェラーゼ活性ベクター
pF4K-hRL
phRL-CMV*結果は平均±標準偏差で示した（n=3）。

14

Prometech Journal*
発光値の平均（RLU）
2,806,000 ± 377,754
3,456,183 ± 768,855

proteincoding
region
Sgf I

Pme I

Antibiotic B
resistance4600MA

ベクター

図5. Flexi® Vector間でのタンパク質コード領域の移し換え
ドナー側のタンパク質コード領域を含むFlexi® Vectorと、ドナー側と異なる抗生物質耐性を持つアクセプター側Flexi® Vectorとを混和。この2種類のプラスミドをFlexi® Enzyme Blend（Sgf Iおよび Pme I）で消化し、この混合液をライゲーションした後、大腸菌にトランスフォーメーションした。アクセプター側Flexi ®
Vectorに対して適切な選択培地に菌体を播種。

哺乳動物細胞におけるウミシイタケルシフェラーゼの発現
pF4K-hRLまたはphRL-CMV Vector（カタログ番号 E6271）をTransFastTM Transfection Reagent（カタログ番号 E2431）でCHO細胞にトランスフェクションしました。ホタルルシフェラーゼを恒常的に発現するpGL4.13 [luc2/SV40] Vector（カタログ番号 E6681）は、トランスフェクション効率の違いを補正するためにコトランスフェクションしました。ルシフェラーゼレベルは、Dual-GloTM Luciferase AssaySystem（カタログ番号 E2920）を用いて測定しました。ウミシイタケ
ルシフェラーゼレベルは表4に示しました。ホタルルシフェラーゼレベ
ルとウミシイタケ/ホタルルシフェラーゼレベル比は、pF4K-hRLとphRL-CMV Vectorで同様の値を示しました。これはpF4 Flexi® Vectorからのタンパク質発現レベルがその他のCMV駆動発現ベクターと同程度であることを表しています。

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表5 TNT® Quick Coupled Transcription/Translation Systemによる翻訳後のウ
ミシイタケルシフェラーゼ活性ベクター

発光値の平均（RLU）*/No-DNA control
167.5 ± 12.0
pF1K-hRL
1,106,418 ± 155,552
pFN2K-hRL
292,691 ± 38,055
pF4K-hRL
838,061 ± 61,998
pRL-SV40 (Cat.# E2231)
190,797 ± 54,347
phRL-null (Cat.# E6231)
462,695 ± 7,525* delay time=2.0 秒; read time＝5秒。結果は平均±標準偏差で示した（pF1K-

参考文献

1. Schoenfeld, T., Harper, T. and Slater, M. (1995) Promega Notes 50, 9–13.
2. Higuchi, R., Krummel, B. and Saiki, R.K. (1988) Nucl. Acids Res. 16, 7351–67.
3. Ho, S.N. et al. (1989) Gene 77, 51–9.
4. Slater, M. et al. (1998) Promega Notes 68, 7–10.
プロトコル◆ Flexi ® Vector Systems Technical Manual #TM254. Promega Corporation.
www.promega.com/tbs/tm254/tm254.html

hRL, pFN2K-hRL およびpF4K-hRL vectorではn=9、pRL-SV40およびphRL-null
Vectorではn=3、no-DNA controlではn=2）。

製品案内®

T N T ライセートにおけるウミシイタケルシ
フェラーゼの発現
Flexi ® Vectorクローンからの合成ウミシイタケルシフェラーゼのinvitro発現は、TNT® T7 Quick Coupled Transcription/Translation System（ウサギ網状赤血球ライセート系、カタログ番号 L1170）を利用しました。プラスミドDNA（500ng）はTNT® 反応 25µlに添加し、30℃、90分間インキュベーションしました。また、pRL-SV40（カタログ番号E2231）およびphRL-null（カタログ番号 E6231）を用いて、2つのポジティブコントロール実験も実施しました。合成タンパク質は、
FluoroTectTM GreenLys in vitro Translation Labeling System（カタログ番号 L5001）で標識しました。TNT® 反応液の一部（2.5µl）を、Renilla
Luciferase Assay Reagent 100µlに 加 え 、 Orion Microplate
Luminometer（Berthold Detection Systems）で測光しました。その結果を表5に示しました。また、タンパク質はSDS-PAGEで分離し、合成ウミシイタケルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼ-GST融合タンパク質が予想したサイズであることを確認しました（データ未掲載）。これらの結果は、TNT® Systemによるタンパク質発現に際してFlexi® Vector上のT7 RNA ポリメーラーゼプロモーターが機能することを実証していました。異なるベクターからの発現レベルはそれぞれ異なり、この要因は、融合タンパク質合成やタンパク質コード領域5'および3'両端の配列の違いなどが考えられます。

製品名

pF1A T7 Flexi® Vector
pF1K T7 Flexi® Vector
pFN2A (GST) Flexi® Vector
pFN2K (GST) Flexi® Vector
pF4A CMV Flexi® Vector
pF4K CMV Flexi® Vector
Flexi® System, Entry/Transfer
Flexi® Vector System, Transfer
10X Flexi® Enzyme Blend(Sgf I and Pme I)

サイズ

カタログ番号

価格（￥）

20µg
20µg
20µg
20µg
20µg
20µg
1 system
1 system

C8441
C8451
C8461
C8471
C8481
C8491
C8640
C8820

42,00042,00045,00045,00045,00045,00030,00098,000

25µl
100µl

R1851
R1852

12,00040,000

結論
我々は、2つの希少な切断頻度を持つ制限酵素（Sgf I、Pme I）をベースにしたタンパク質コード配列の新しいディレクショナルクローニ
ングシステムを開発しました。Flexi® Vector Systemは、様々なベクター間でタンパク質コード領域を移し換えることのできる迅速、効率的で、しかも精度の高い方法を提供します。部位特異的なリコンビネーションによるベクターシステムと異なり、Flexi® Vector Systemは、目的のタンパク質やドメインのN、C末端に余分なアミノ酸を付加する必要がありません。さらに、本システムは、日常的に使用する、確実な分子生物学的手法および試薬を利用します。
我々は、PCR後にインサートであるタンパク質コード領域をFlexi ®
Vectorに効率的にクローニングできることを示しました。インサートは、Sgf IおよびPme Iで消化した他方のFlexi® Vectorへ90%以上の効率で簡単に移し換えることができます。このクローニング法によりインサートは方向性と読み枠を維持することができるため、移し換えた後にインサートを再度シークエンシングする必要がありません。我々は、Flexi® Vectorが大腸菌、哺乳動物細胞、in vitro翻訳システムで、ネイティブまたは融合タンパク質を発現することを実証しました。将来的に、新しい発現機能（C末端融合タンパク質発現）を持つベクターを発売する予定です。

Prometech Journal

www.promega.co.jp

Number 16 2005

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