信州医誌，58⑸：207〜262，2010

信州大学において審査された医学博士論文要旨
学位審査委員

名

学位授与
番
号

学位授与
年 月 日

白川晴章

甲第801号

20. 9.30 Pretreatment prediction of virological re- 宮 川 眞 一 竹 下 敏 一
本田孝行
sponse to peginterferon plus ribavirin therapy

氏

学

位

論

文

題

目

主

査

副

査

in chronic hepatitis C patients using viral andhost factors（Ｃ型慢性肝炎のペグインターフェ
ロンとリバビリン併用療法におけるウィルス及び宿主因子を用いた治療開始前効果予測）
武居俊輔

甲第802号

21. 3.31 Bone morphogenetic protein‑4 promotes 山 田 充 彦 森 泉 哲 次
竹下敏一
induction of cardiomyocytes from humanembryonic stem cells in serum‑based embryoid body development（ヒト ES 細胞由来の心筋細胞誘導は血清依存性の胚様体形成において，BMP‑4によって促進される）

成田伸代

甲第803号

22. 3.31 M ultiwalled Carbon Nanotubes Speciﬁcally 中 山Inhibit Osteoclast Diﬀerentiation and Function（多層カーボンナノチューブは破骨細胞の分化と機能を抑制する）

稲垣

淳 本郷一博佐々木克典

毅甲第804号

21. 3.31 The retinoic acid‑responsive proline‑rich 谷口俊一郎 瀧伸介
新藤隆行
protein is identiﬁed in promyeloleukemicHL‑
60 cells（前骨髄性白血病細胞 HL‑60におけるレチノイン酸応答蛋白 RARP1（Retinoic Acid
Respoinse Prorine‑rich Protein 1）の同定）

逢坂和昌

甲第805号

21. 3.31 Possibility as monosaccharide laxative of 小 山 省 三 山 田 充 彦
田中榮司rare sugar alcohols（希少糖アルコール類が糖類下剤となりうる可能性）

田中洋平

甲第806号

22. 3.31 A transverse ligament located anterosuper- 宇佐美真一 佐々木克典
村田敏規
iorly in the lower orbital fat space restricts
lower eyelid retraction in the Mongoloid eye（モンゴロイドの下眼窩脂肪腔の前上方にある横走靱帯が下眼瞼の退縮を制限している）

岡田芳幸

甲第807号

21. 3.31 Pressor responses to isometric biting are 倉 科 憲 治 松 尾清
川眞田樹人
evoked by somatsensory receptors in periodontal tissue in humans（ヒト静的咬合時の昇圧応答は歯周組織内の感覚受容器刺激によって誘発される）

李甲第808号

22. 3.31 Glucose and glucose transporters regulate 倉 科 憲 治 山 田 充 彦
大森栄lymphatic pump activity through activation‑of the mitochondrial ATP sensitive K channel（グルコース及びグルコース担体はミトコ
ンドリア ATP 感受性カリウムイオンチャンネ
ルの活性化を介するリンパ管ポンプの制御）

向軍

No. 5, 2010207

審査学位論文要旨

本山博章

甲第809号

21. 3.31 In vitro reprogramming of adult hepatocytes 谷口俊一郎 橋 爪 潔 志田中榮司
into insulin‑producing cells without viral
vectors（成熟肝細胞を用いた，非ウイルス性
遺伝子導入によるインスリン産生細胞へのリプ
ログラミング誘導性の検討）

林景栄

甲第810号

21. 9.30 Dermoscopy of pigmented lesions on 倉 科 憲 治 森 泉 哲 次
本田孝行
mucocutaneous junction and mucous membrane（粘膜皮膚移行部と粘膜部における色素性病変のダーマスコピー所見）

張国紅

甲第811号

21. 9.30 Dysfunction in the ABCB1A has only a weak 谷口俊一郎 中 山淳
鈴木龍雄
eﬀect on susceptibility to dextran sulfate
sodium‑induced colitis in SAM strains（ABCB1A の機能障害は SAM 系マウスのデキ
ストラン硫酸による誘発大腸炎に対する感受性には大きく影響しない）

山田幸一郎

甲第812号

20. 9.30 Identiﬁcation of a high incidence region for 谷口俊一郎 中 山
鎌田
retroviral vector integration near exon 1 of
the LMO2 locus（LMO2遺伝子座 Exon1近傍における retroviral vector integration の高頻度領域の同定）吉田順子

甲第813号

21. 3.31 Changes in the expression of E‑cadherin re- 谷口俊一郎 天 野純
加藤博之
pressors, Snail, Slug, SIP1 and Twist, in the淳
徹development and progression of ovarian carcinoma :the important role of Snail in ovarian tumorigenesis and progression（卵巣癌の発生と進展過程における E‑cadherin 転写抑制
因子 Snail，Slug，SIP1および Twist の発現変化：卵巣癌の発生と進展において Snail は重要な役割を果たす）
阿部秀年

甲第814号

21. 3.31 Valve Repair Improves Central Sleep Apnea 天 野
in Heart Failure Patients With Valvular
Heart Diseases（心不全を伴う重症弁膜症患者における弁置換による中枢性無呼吸の改善）加藤修明

甲第815号

純 久保惠嗣岡元和文

21. 3.31 PrimaryAL amyloid polyneuropathysuccess- 本 田 孝 行 中 山淳
樋口京一
fully treated with high‑dose melphalan followed by autologous stem cell transplantation（自己末梢血幹細胞移植併用大量メルファラン療法が有効であった原発性 AL アミロイドポリ
ニューロパチー症例）

森川真悠子

208

甲第816号

21. 3.31 Physical ﬁtness and indices of lifestyle‑ 樋 口 京 一 池 田 宇 一
田中榮司
related diseases before and after interval
walking training in middle‑aged and older（中高年者におけるインター
males and females
バル速歩トレーニングの体力・生活習慣病指標
改善効果）
信州医誌 Vol. 58

審査学位論文要旨

BEKALENGUEM ABENOIT

甲第817号

22. 3.31 Role of ASC in themousemodelofhelicobacter 田 中 榮 司 竹 下 敏 一
本田孝行
pylori infection（ヘリコバクターピロリ感染マ
ウスモデルにおける ASC の役割）

小林

甲第818号

22. 3.31 Surface coating of bone marrowcells with N ‑ 中 山聡acetylglucosamine for bone marrow implantation therapy（骨髄細胞移植療法のための N ‑アセチルグルコサミンの骨髄細胞表面へのコーティング）

淳 天野
純
田中榮司

皆川倫範

甲第819号

22. 3.31 Diﬀerentiation of smooth muscle cells from 佐々木克典 大 森栄加藤博之
human amniotic mesenchymal cells implanted in the freeze‑injured mouse urinary bladder（凍結障害マウス膀胱におけるヒト羊膜間葉系細胞の平滑筋への分化）

元木博彦

甲第820号

22. 3.31 Coagulation Activity is Increased in the Left 田 中 榮 司 天 野純
本田孝行
Atria of Patients With Paroxysmal Atrial
Fibrillation During the Non‑Paroxysmal
Period ‑ Comparison With Chronic Atrial
Fibrillation ‑（発作性心房細動症例の非発作時における左房内凝固亢進―慢性心房細動症例との比 検討―）飯沼伸佳

甲第821号

22. 3.31 Adrenomedullin in sinusoidal endothelial 樋 口 京 一 中 山
能勢cells play protective roles against cold injury（肝類洞内皮細胞においてアドレノメ
of liver
デュリンは，肝臓の冷傷害に対して保護的に働
く）

青柳大樹

甲第822号

22. 3.31 Granulomatous transformation of capillary 中 山
lesions in pulmonary ‑renal syndrome
autologously induced anti‑glomerular basement membrane disease in Wistar‑Kyoto
rats（Wistar‑Kyoto ラットにおける抗 GBM
抗体病により惹起される肺腎症候群の毛細血管
肉芽腫性病変）前澤佳代子

甲第823号

21. 3.31 Cytochrome P450 3As Gene Expression and 本 田 孝 行 久 保 惠 嗣
塩沢丹里
Testosterone 6β‑Hydroxylase Activity in淳博

淳 佐々木克典
樋口京一

Human Fetal Membranes and Placenta
at Full Term（ヒト卵膜および胎盤における
CYP3As 遺伝子の発現とテストステロン6β‑水
酸化活性）
北口良晃

甲第824号

22. 3.31 Clinical characteristics of combined pulmo- 池 田 修 一 角 谷 眞 澄
田中榮司nary ﬁbrosis and emphysema（肺線維症合併
肺気腫症例の臨床的特徴）

三村裕次

甲第825号

21. 3.31 Rat Bladders Augmented with a Novel 天 野Bovine Pericardium ‑Derived Biomaterial
Reconstruct Functional Tissue Structures（ウシ心膜由来生体材料を用いたラット膀胱拡
大術における機能的組織の再構築）

No. 5, 2010

純 加藤博之大森栄209

審査学位論文要旨

城下智甲第826号

22. 3.31 A2BP1 as a Novel Susceptible Gene for 樋 口 京 一 福 嶋 義 光
本田孝行
Primary Biliary Cirrhosis in JapanesePatients（A2BP1 遺伝子は日本人 PBC 患者の疾患感受性と相関する）

及川尚人

甲第827号

22. 3.31 Alzheimer‑type tau pathology in advanced 谷口俊一郎 樋 口 京 一
鈴木龍雄
aged nonhuman primate brains harboring
substantial amyloid deposition（高度のアミロ
イド沈着を伴う超高齢カニクイザル脳におけるアルツハイマー病型タウ病変の形成）

金井敏晴

甲第828号

21. 3.31 Evaluation of a new method for the diagnosis 中 山
of alterations of Lens culinaris agglutinin
binding of thyroglobulin molecules in thyroid
carcinoma（サイログロブリン糖鎖異常の検出による甲状腺癌診断の可能性）

淳 谷口俊一郎
本田孝行

今井弘毅

甲第829号

21. 3.31 μ‑Crystallin, New Candidate Protein in En- 村 田 敏 規 池 田 修 一
瀧伸介
dotoxin‑Induced Uveitis（エンドトキシン誘発ぶどう膜炎における新しいミュークリスタリ
ンの機能解析）塚田景大

甲第830号

21. 3.31 A Large Cohort Study Of GJB2 M utations In 本 田 孝 行 小 池 健 一
福嶋義光
Japanese Hearing Loss Patients（日本人難聴患者における GJB2 遺伝子変異の大規模研究）

山崎和子

甲第831号

21. 3.31 Potentiation of TLR9 responses for human 小 池 健 一 谷口俊一郎
奥山隆平
naıve B‑cell growth through RP105 signaling（RP105シグナルはTLR9と相乗的にヒト ナイー
ブＢ細胞の増殖を促進する）

小林幸弘

甲第832号

21. 3.31 Liquid‑based thin‑layer cytology can be 本 田 孝 行 樋 口 京 一中山淳
routinely used in samples obtained via ﬁberoptic bronchoscope（液状固定による薄層塗抹
細胞診法は気管支鏡で得られた検体に使用可
能）

鶴田悟郎

甲第833号

22. 3.31 Nonalcoholic fatty liver disease in Japanese 小 池 健 一 角 谷 眞 澄
宮川眞一
junior high school students: its prevalence
and relationship to lifestyle habits（日本の中学生における非アルコール性脂肪肝疾患：その有病率と生活習慣との関係）

張鵬尭

甲第834号

21. 3.31 M ouse model to study human Aß M 谷口俊一郎 鈴 木 龍 雄
能勢博
amyloidosis: Generation of a transgenic
mouse with excessive expression of human（ヒト透析アミロイドーシス研
ß‑microglobulin
究のためのモデルマウス：ヒトßミクログロブ
リン過剰発現トランスジェニックマウスの作製）

友澤寛

甲第835号

21. 3.31 BN.MES‑Cyba

210

congenic rats manifest 鈴 木 龍 雄 田 中 榮 司
瀧伸介
focal necrosis with eosinophilic inﬁltration in
the liver without blood eosinophilia（BN.
M ES‑Cyba コンジェニックラットは血中の好酸球増多を発症することなく，肝臓への好酸球浸潤による壊死像を呈する）
信州医誌 Vol. 58

審査学位論文要旨

中山

剛

甲第836号

21. 3.31 Expression of α1 ‑Adrenergic Receptor 中 山
Subtypes and Angiotensin Ⅱ Type 1 Receptor in the Prostate of Spontaneously Hypertensive Rats（自然発症高血圧ラット前立腺におけるアドレナリン α１受容体サブタイプおよびアンギオテンシンⅡタイプ１受容体の発
現）

中島弘毅

甲第837号

22. 3.31 Exercise Eﬀects on M ethylation of ASC 竹 下 敏 一 小 池 健 一
加藤博之
Gene（ASC 遺伝子のメチル化に関する運動効
果）姜

甲第838号

22. 3.31 Trypsin digestion on paraﬃn sections is a 中 山

英松

useful tool for diagnosis of Alport syndrome（トリプシン消化はパラフィン切片でのアルポート症候群の診断に有用である）

淳 田中榮司大森栄

淳 本田孝行青山俊文

子に免疫応答を加味した宿主因子を加え，１型で高ウ

Pretreatment prediction of virologicalresponse to peginterferon plus ribavirin
therapy in chronic hepatitis C patientsusing viral and host factors（Ｃ型慢性肝炎のペグインターフェロンとリバビリン併用療法におけるウィルス及び宿主因子を用いた治療開始前効果予測）
白

川

晴

章

イルス量症例の PegIFN＋RBV 併用療法における治療開始前効果予測の可能性を検討した。
【対象と方法】2004〜2005年の間に PegIFN ＋ RBV併用療法を行った120例（男性65例，年齢中央値61歳）
を対象とした。ウイルス因子として HCV RNA 量，
ISDR（interferon sensitivity determining region）変異を，宿主因子として年齢，
性別，体重などに Th1/Th2比を加え，SVR との関連で多変量解析を行った。
【結果】120例中54例（45％）で SVR が得られた。

（論文の内容の要旨）

SVR と有意に関連した治療前項目は，男性，若年，【背景と目的】Ｃ型慢性肝炎は長年の経過で肝硬変へ

高体重，Cr 高値，WBC 高値，Hb 高値，好中球数高進行し肝細胞癌を合併するため臨床的に重要な疾患で

値，Th1/Th2比低値，HCV RNA 量 低 値，ISDR 変ある。治療はＣ型肝炎ウイルス（HCV）を排除する

異有りであった。また，治療中の因子としては２週目

ことが最も効果的であり，これにより肝発癌率は大幅

HCV RNA 量低値，早期の血中 HCV RNA 陰性化でに低下する。HCV 遺伝子型とウイルス量はインターあった。また，治療因子としては，総 PegIFN 投与

フェロン（IFN）治療効果を規定する大きな因子であ

量，総 RBV 投与量が多いこと，および実際の投与量り，１型で高ウイルス量の症例は最も難治とされていを予定投与量で割った PegIFN 投与率と RBV 投与

る。この治療困難例では，最も効果的であるとされ率が高いことであった。これらの因子について多変量るペグインターフェロン（PegIFN）とリバビリン

解析を行い SVR に寄与する因子を抽出すると，治療（RBV）併用療法を用いてもウイルスが完全に排除さ前因子として，体重＞59kg（OR6.4，P＝0.0106），れる SVR（sustained virologic response）率は約50，好中球数＞2300
ISDR変異＞２（OR86，P＝0.0008）％である。PegIFN＋RBV 併用療法は48週間または/μl（OR 5.5，p ＝ 0.0031），Th 1/Th 2比 ＜ 15.5

これ以上の長期間を要し，副作用が多く，高額である（OR9.6，P＝0.0021）が抽出された。選択された治ことから，治療開始前に治療効果を予測し，個々の患療前因子を用いてロジスティックモデルを構築し，各者に適した治療選択を行うことは非常に有益であると症例の予測 SVR 率を求めた。予測 SVR 率が33％未考えられる。これまで，難治とされる１型で高ウイル

満を低反応群，33％以上66％未満を中反応群，66％

ス量の症例の中でさらに治療効果を予測することは困以上を高反応群とすると，各群の実際の SVR 率は15難と考えられていた。今回我々は，種々のウイルス因％，41％，91％であった（P＜0.001）。また，低反応群

No. 5, 2010211

審査学位論文要旨

では PegIFNおよび RBVの投与率が高くても SVRがによって低反応群，中反応群，高反応群としたとこ得られにくく，高反応群では投与率が低くてもSVRがろ，各群の実際の SVR 率は15％，41％，91％で得られ，中間群では投与率が高い程 SVR が得られた。

（P＜0.001），予測 SVR 率は実際の SVR 率と非常

【結論】Ｃ型慢性肝炎1b 型高ウイルス量患者に対すに相関した。また，低反応群では PegIFN およびる PegIFN ＋ RBV 併 用 療 法 に お い て，治 療 開 始 前

RBV の投与率が高くても SVR が得られにくく，因子である ISDR 変異あり，体重＞59kg，好中球数＞

高反応群では投与率が低くても SVR が得られ，中2300/μl および Th1/Th2比＜15.5が独立に SVR と関間群では投与率が高い程 SVR が得られた。

連していた。これら因子を用いて算出した予測 SVR

今回の研究ではＣ型慢性肝炎1b 型高ウイルス量患率は，高反応群および低反応群において90％以上の者に対する PegIFN＋RBV 併用療法において，治療正診率があり，各患者個人の反応性に合わせた治療方

開始前因子である ISDR 変異あり，体重＞59kg，好針の決定が可能であると考えられた。

中球数＞2300/μl お よ び Th1/Th2比＜15.5が 独 立 に（論文審査の結果の要旨）

SVR と関連しており，これら因子を用いて算出したＣ型慢性肝炎の治療はＣ型肝炎ウイルス（HCV）

予測SVR率は，実際の SVR率と非常に良く相関してを排除することが最も効果的であり，これにより肝発いた。これにより，1b 型高ウイルス量患者に対する癌率は大幅に低下する。インターフェロン（IFN）治PegIFN＋RBV 併用療法の治療前予測は可能である療の効果には HCV 遺伝子型とウイルス量が大きく影ことが示された。将来的には各患者の治療選択および響しており，１型で高ウイルス量の症例は最も治療困

治療継続の方針決定に応用できる可能性があり，臨床難で，ペグインターフェロン（PegIFN）とリバビリ的に意義のある研究である。よって主査，副査は一致

ン（RBV）併用療法を用いてもウイルスが完全に排して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

除される SVR（sustained virologic response）率は約50％である。よって治療開始前に治療効果を予測し，個々の患者に適した治療選択を行うことは非常に有益であると考えられる。今回我々は，種々のウイル
ス因子に免疫応答を加味した宿主因子を加え，１型で高ウイルス量症例の PegIFN＋RBV 併用療法における治療開始前効果予測の可能性を検討した。
その結果，白川は以下の結論を得た。
１．120例中54例（45％）でSVRが得られた。SVRと有意に関連した治療前項目は，男性，若年，高体重，Bone morphogenetic protein‑4 promotes
induction of cardiomyocytes from humanembryonic stem cells in serum‑based embryoid body development（ヒト ES 細胞由来の心筋細胞誘導は血清依存性の胚様体形成において BM P‑4によって促進される）
武

居

俊

輔

（論文の内容の要旨）

Cr高値，WBC高値，Hb高値，好中球数高値，Th1/

現在，幹細胞の多能性が示され，それらを用いた再Th2比低値，HCV RNA 量低値，ISDR 変異有りで生医療への応用が期待されているが，幹細胞による明あった。

らかな組織修復はこれまで証明できていない。重度の２．治療中の因子で SVR と有意に関連したものは２

心筋梗塞に幹細胞の臨床応用を考える際，細胞供給源

週目 HCV RNA 量低値，早期の血中 HCV RNA 陰として，ES 細胞のような増殖能が高く，細胞量を確性化であった。

保しやすい細胞を利用することが現実的である。従っ３．治療因子でSVRと有意に関与したものは，総Peg
IFN 投与量，総 RBV 投与量が多いこと，PegIFN
投与率と RBV 投与率が高いことであった。

て今回計画した ES 細胞から心筋細胞を選択的に誘導する研究は有意義である。
ヒト ES 細胞由来の心筋細胞は心疾患の治療におい４．これらの因子について多変量解析を行い SVR にて，細胞ソースとして直接的で潜在的な可能性を持っ寄与する因子を抽出すると，治療前因子として，体ている。この研究では bone morphogenetic protein

重＞59kg，ISDR 変異＞２，好中球数＞2300/μl，（BMP）‑4を用いた新しい分化誘導法の確立を試みた。

Th1/Th2比＜15.5が抽出された。

（TGF‑
BM Ps は，トランスフォーミング成長因子‑β５．選択された治療前因子を用いてロジスティックモβ）スーパーファミリーに属している多機能性サイデルを構築して予測 SVR 率を求め，予測 SVR 率トカインであり，そのシグナルは，脊椎骨中胚葉誘導

212

信州医誌 Vol. 58

審査学位論文要旨と同様に心臓発生においても中心的な役割を果たす。

心筋梗塞に幹細胞の臨床応用を考える際，細胞供給源

こ れ ま で マ ウ ス ES 細 胞 の 心 筋 細 胞 誘 導 に 関 わ るとして，ES 細胞のような増殖能が高く，細胞量を確

BM P シグナルの効果について多くの研究がなされて保しやすい細胞を利用することが現実的である。従っきたが，心筋細胞分化機序に種間差があるため，ヒトて今回計画した ES 細胞から心筋細胞を選択的に誘導

ES 細胞に動物モデルで確立されている誘導法をそのする研究は有意義である。

まま応用することに無理がある。そこで本研究においヒト ES 細胞由来の心筋細胞は心疾患の治療において，BM P‑4の発生上の役割を考慮し，ヒト ES 細胞て，細胞ソースとして直接的で潜在的な可能性を持っでこのサイトカインの有効性を証明しようと試みた。

ている。この研究では bone morphogenetic protein

FBS（牛胎児血清）の条件検討の結果，20％ FBS（BMP）‑4を用いた新しい分化誘導法の確立を試みた。

による４日間の浮遊培養が初期中胚葉や心筋細胞の分（TGF‑
BM Ps は，トランスフォーミング成長因子‑β化のためには最適であるということが分かった。さらβ）スーパーファミリーに属している多機能性サイに BM P のアンタゴニストである Noggin の添加によトカインであり，そのシグナルは，脊椎骨中胚葉誘導

り，拍動 EB の発生率が23.6％から5.3％まで低下しと同様に心臓発生においても中心的な役割を果たす。

た。このことは通常に見られる心筋細胞分化に BMP

こ れ ま で マ ウ ス ES 細 胞 の 心 筋 細 胞 誘 導 に 関 わ る

シグナリングが深く関与していることを示している。

BM P シグナルの効果について多くの研究がなされてそこで様々な濃度の BMP‑4を添加しその効果を検証

きたが，心筋細胞分化機序に種間差があるため，ヒト

した結果，４日間の浮遊培養 の 間12.5‑25ng/ml のES 細胞に動物モデルで確立されている誘導法をそのBM P‑4を添加する処置がもっとも効率よく心筋細胞

まま応用することに無理がある。そこで本研究におい分化を促進した。BM P‑4 25ng/ml添加の拍動 EB発て，BMP‑4の発生上の役割を考慮し，ヒト ES 細胞

生率は，接着後６日目において95.8％に達し，20日

でこのサイトカインの有効性を証明しようと試みた。

目までにプラトーを維持した。

その結果，武居俊輔は次の結論を得た。

EB 形成過程の BMP シグナリングの活性化 は，

１．FBS（牛 胎 児 血 清）の 条 件 検 討 の 結 果，20％

Smad1/5/8のリン酸化の増加および phospho‑Smad

FBS による４日間の浮遊培養が初期中胚葉や心筋

1/5/8とSmad4の核局在化により確認された。
またreal‑細胞の分化のためには最適であるということが分

time PCR 解析により，25ng/ml の BM P‑4による処かった。

置は心筋細胞関連遺伝子である Mesp1と Nkx2.5の２．BMP‑4の条件検討の結果，４日間の浮遊培養の発現を有意に上昇させることが分かった。誘導された間12.5‑25ng/ml の BMP‑4を添加する処置がもっ心筋細胞はイソプロテレノールの添加により機能的とも効率よく心筋細胞分化を促進した。BMP‑4 25に反応した。また心筋細胞タンパク質である atrial

ng/ml 添加の拍動 EB 発生率は，接着後６日目にお（ANP），
natriuretic peptide
cardiac troponin（
I cTnI）

いて95.8％に達し，20日目までにプラトーを維持の発現は時間の経過とともに増加し，心筋細胞の成熟した。

が示唆された。さらに免疫染色によりこれらの心筋細３．real‑time PCR 解析により，25ng/ml の BMP‑

胞にカドヘリンとコネキシン43の発現が確認され，細4による処置は心筋細胞関連遺伝子である Mesp1と胞間構造が適切に形成されていることが分かった。

Nkx2.5の発現を有意に上昇させることが分かった。

これらのことから BMP‑4の濃度および添加すべき
時期は，ヒト胚性幹細胞から心筋細胞へ効果的に誘導を行うために決定的に重要なファクターであることが４．誘導された心筋細胞は機能的な細胞であり，心筋細胞としての特徴を有していた。
５．誘導された心筋細胞は培養を経るにしたがい，増明らかになった。同時に BMP‑4と FBS を組み合わ殖，成熟していった。

せることでヒト ES 細胞から心筋細胞への分化を有意

これらのことから BMP‑4の濃度および添加すべきに促進するための誘導法を確立できた。

時期は，ヒト胚性幹細胞から心筋細胞へ効果的に誘導（論文審査の結果の要旨）を行うために決定的に重要なファクターであることが現在，幹細胞の多能性が示され，それらを用いた再明らかになった。同時に BM P‑4と FBS を組み合わ

生医療への応用が期待されているが，幹細胞による明せることでヒト ES 細胞から心筋細胞への分化を有意らかな組織修復はこれまで証明できていない。重度のに促進するための誘導法を確立できた。よって，主査，

No. 5, 2010213

審査学位論文要旨

副査は一致して本論文を学位論文として価値のあるもの MWCNTsは 骨 髄 マ ク ロ フ ァ ー ジ の 増 殖 を 抑 制のと認めた。

しなかった。次に，骨髄マクロファージの増殖に影響しない５μg/ml 以下の MWCNTs を用いて，骨芽細Multiwalled Carbon Nanotubes Speciﬁcally
Inhibit Osteoclast Diﬀerentiation andFunction（多層カーボンナノチューブは破骨細胞の分化と機能を抑制する）
成

田

伸

胞と骨髄細胞を１α，25（OH）D 存在下に培養して破骨細胞を形成する系（共存培養系）に対する影響を TRAP染色を行い調べた。その結果，５μg /mlのM WCNTs は破骨細胞の分化を抑制した。そこで，骨芽細胞が産生する破骨細胞の分化に関与するサイトカ

代

イン（RANKL，OPG，M ‑CSF）に対する M WCNTs（論文の内容の要旨）の影響を，RT ‑PCR で調べたところ，MWCNTs は影【背景と目的】 近 年，多 層 カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ

響を与えなかった。

（M ultiwalled Carbon Nanotubes;M WCNTs）を人③ 骨髄マクロファージを単独で培養し，RANKL と工関節等の生体材料や再生医療の scaﬀold として利M ‑CSF 存在下で破骨細胞へ分化させる系において，用する研究が進んでいる。現在整形外科領域で，人工M WCNTs を RANKL と同時に添加すると破骨細胞関節に使用されているポリエチレンは，その磨耗粉が形成を抑制しないが，RANKL 投与24時間前に添加

炎症性サイトカイン産生を促し，破骨細胞を誘導してすると５μg/ml の MWCNTs は破骨細胞形成を抑制

骨融解を起こすことが知られている。そのため，今後した。またこのとき光学顕微鏡で，骨髄マクロファー

MWCNTs を骨組織と接して使用する場合，骨組織

ジ内に MWCNTs が取り込まれている像が観察されへの反応を検討する必要がある。骨組織内では骨芽細た。

胞と破骨細胞が，骨形成と骨吸収をそれぞれ担いカッ④ MWCNTs の破骨細胞分化抑制効果が，骨髄マク

プリングして働いている。破骨細胞の分化には，骨芽ロファージから破骨細胞へ分化する過程の細胞内シグ細胞が産生する RANKL と M ‑CSF が必要であり，ナル伝達のどこに影響して起きているかを，ウエスタ

骨髄細胞由来の骨髄マクロファージから分化するこンブロット法を用いて調べた。その結果，IκBαの分と が 知 ら れ て い る。ま た １α，25（OH ）D 等 の 骨解，p38MAPK のリン酸化，NFATc1の発現には影

吸収促進因子は RANKL の発現を促す。われわれは，響を与えていなかった。破骨細胞の分化に必須といわ

MWCNTs が骨吸収を司る破骨細胞に対して与えるれる転写因子 NFATc1は発現すると細胞質から核へ影響について研究した。

移行して働くため，NFATc1の核移行について，免【方法と結果】材料は，M WCNTs（径80nm，150nm

疫蛍光染色法を用いて調べたところ，MWCNTs はの２種。長さ８〜10μm）と，対象として顔料等で生体にNFATc1の核移行を抑制していた。

以前より使用されているカーボンブラック（Carbon⑤ 形成された破骨細胞の骨吸収機能に MWCNTs がBlack；CB．粒子径80nm）を用いた。

与える影響を調べた。象牙切片上に成熟破骨細胞を培① 骨形成蛋白（rhBMP‑2）を染み込ませてフリーズ

養し，M WCNTs を添加して36時間後に，形成されドライした MWCNTs（80nm）および型コラーゲている吸収窩をマイヤーヘマトキシリン染色して検討

ンのインプラントをマウス背部皮下に埋め込み，術後したところ，50μg/ml の MWCNTs は破骨細胞の骨２週，３週と３カ月で形成された異所性骨を採取した。

吸収機能 を 抑 制 し た。ま た RANKL 存 在 下 で 培 養

２週目の異所性骨の組織切片を TRAP 染色し陽性細中の成熟破骨細胞に MWCNTsを添加して36時間後胞数を評価したところ，MWCNTs 群では破骨細胞数に TRAP 染色したところ，50μg/ml の MWCNTs はは有意に少なかった。また３カ月後の異所性骨の骨密RANKL による破骨細胞の延命を抑制した。このと度は M WCNTs 群が高かった。

きの破骨細胞を透過型電子顕微鏡で観察すると，破骨② 仔マウスの頭蓋骨から採取した骨芽細胞と，６週

細胞内に M WCNTs が取り込まれている像が観察さ齢マウス脛骨から採取した骨髄細胞をそれぞれ培養しれた。

て，M WCNTs を添加し，細胞増殖に対する影響を【結論】 MWCNTs は骨芽細胞には影響を及ぼさず，

アラマーブルーアッセイで調べた。その結果，骨芽細破骨細胞特異的に分化と機能を抑制した。その結果，胞の増殖は抑制されなかった。また，５μg/ml 以下形成された異所性骨において，骨密度が高く保たれた214

信州医誌 Vol. 58

審査学位論文要旨と考えられた。また破骨細胞分化抑制の機序として，

ジを単独で培養し，RANKL と M ‑CSF 存在下で破骨髄マクロファージ内に取り込まれた M WCNTs が骨細胞へ分化させる系において，RANKL 投与24時

転写因子 NFATc1の核移行を抑制していることが示

間前と１時間前に MWCNTs 添加して影響を調べた。

唆された。MWCNTs は，生体材料として骨組織のウエスタンブロット法で，IκBαの分解，p38MAPK

周囲で使用する場合に，破骨細胞の分化と機能を抑制のリン酸化，NFATc1の発現に対する MWCNTs のし骨量を保つ利点を有すると考えられた。

影響を調べた。またNFATc1の核移行について，免疫（論文審査の結果の要旨）

蛍光染色法を用いて調べた。最後に成熟破骨細胞に近年，多層カーボンナノチューブ（M WCNTs）を対する MWCNTs の影響を観察するため，象牙切片

人工関節等の生体材料や再生医療の scaﬀold として上に成熟破骨細胞を培養し，MWCNTs を添加して利用する研究が進んでいる。現在整形外科領域で，人36時間後に，形成されている吸収窩をマイヤーヘマト

工関節に使用されているポリエチレンは，その磨耗粉

キシリン染色した。また RANKL 存在下で培養中のが炎症性サイトカイン産生を促し，破骨細胞を誘導し成 熟 破 骨 細 胞 に M WCNTs を 添 加 し て36時 間 後 にて骨融解を起こすことが知られている。そのため，今TRAP 染色を行った。

後を骨組織と接して使用する場合，骨組織への反応を

その結果，成田は次の結論を得た。

検討する必要がある。骨組織内では骨芽細胞と破骨細１．形成された異所性骨術後２週の組織切片をTRAP

胞が，骨形成と骨吸収をそれぞれ担いカップリングし染色した結果，M WCNTs 群では破骨細胞数は有て働いている。破骨細胞の分化には，骨芽細胞が産生

意に少なかった。また術後３カ月の異所性骨骨密度する RANKL と M ‑CSF が必要であり，骨髄細胞由は MWCNTs 群が高かった。

来の骨髄マクロファージから分化することが知られて

２．骨芽細胞の増殖は，MWCNTs により抑制されいる。また１α，25（OH）D 等の骨吸収促進因子はなかった。また５μg/ml 以下の M WCNTs は，骨RANKL の発現を促す。われわれは，M WCNTs が髄マクロファージの増殖を抑制しなかった。５μg/

骨吸収を司る破骨細胞に対して与える影響について研mlの M WCNTsは，共存培養系に お い て １α，25

究した。

（OH）D が誘導する破骨細胞の分化を抑制した。
また

材料は，多層カーボンナノチューブ（径80nm，150

RT‑PCR の結果，骨芽細胞が産生する破骨細胞のnm の２種。長さ８〜10μm）と，対象として顔料等分化に関与するサイトカイン（RANKL，OPG，で生体に以前より使用されているカーボンブラック

M ‑CSF）に，MWCNTs は影響を与えなかった。

（Carbon Black；CB．粒 子 径80nm）を 用 い た。骨

３．骨髄マクロファージを単独で培養し，RANKL

形成蛋白（rhBM P‑2）を染み込ませてフリーズドラと M ‑CSF 存在下で破骨細胞へ分化させる系におイした MWCNTs（80nm）および型コラーゲンのいて，RANKL 投与24時間前に添加すると５μg/

インプラントをマウス背部皮下に埋め込み，術後２ml の MWCNTs は破骨細胞形成を抑制した。また

週，３週と３カ月で形成された異所性骨を採取した。

このとき光学顕微鏡で，骨髄マクロファージ内に術後２週の異所性骨組織を，破骨細胞のマーカーであMWCNTs が取り込まれている像が観察された。

る酒石酸抵抗性酸フォスファターゼ（TRAP）染色４．ウエスタンブロット法の結果，IκBαの分解，を行い評価した。術後３週，３カ月の異所性骨の骨密p38MAPK の リ ン 酸 化，NFATc1の 発 現 に は，度を調べた。次に，仔マウスの頭蓋骨から採取した骨

MWCNTs は影響を与えていなかった。免疫蛍光

芽細胞と，６週齢マウス脛骨から採取した骨髄細胞を染色法の結果，MWCNTs は NFATc1の核移行をそれぞれ培養して，MWCNTs を添加し，細胞増殖抑制した。

に対する影響をアラマーブルーアッセイで調べた。次５．50μg/mlのMWCNTsは破骨細胞の骨吸収機能をに，骨芽細胞と骨髄細胞を１α，25（OH）D 存在下抑制した。また，50μg /mlの MWCNTsは RANKLに培養して破骨細胞を形成する系（共存培養系）にによる破骨細胞の延命を抑制した。このときの破骨

MWCNTs を添加して TRAP 染色を行った。また，骨細胞を透過型電子顕微鏡で観察すると，細胞内に芽細胞が産生する破骨細胞の分化に関与するサイトカ

MWCNTs が取り込まれていた。

イン（RANKL，OPG，M ‑CSF）に対するMWCNTsのこれらの結果により，MWCNTs は骨芽細胞には影響を，RT‑PCRで調べた。次に，骨髄マクロファー

影響を与えず，破骨細胞特異的に分化と機能を抑制し

No. 5, 2010215

審査学位論文要旨ていることが明らかとなった。破骨細胞分化抑制の機

トの胸腺ライブラリーからクローニングした。この遺序として，骨髄マクロファー ジ 内 に 取 り 込 ま れ た伝子は，マウスのプロリンリッチ蛋白76と高い相同性

MWCNTs が転写因子 NFATc1の核移行を抑制してをもつ，ヒトの666アミノ酸をコードしていたため，いることが示唆された。またそれらの結果，形成され我々は retinoic acid response proline‑rich protein

た異所性骨において骨密度が高く保たれたと考えられ，

1（RARP1）と 名 づ け た。RARP1の 転 写 は ATRAMWCNTs は，生体材料として骨組織の周囲で使用によって誘導され，その誘導はサイクロヘキサマイド

する場合に，破骨細胞の分化と機能を抑制し骨量を保によって抑制された。RARP1の mRNA は約2.4kbp

つ利点を有すると考えられた。よって，主査，副査はであり，胸腺や脾臓，末梢白血球といった免疫に関わ一致して本論文を学位論文として価値があるものと認る臓器で強く発現していたほか，
巨核球系のヒト赤白血

めた。

病細胞 HEL 細胞で高発現を示す一方，ヒトＴリンパ芽球系の Jurkat 細胞では発現が低かった。
また，
HL‑

The retinoic acid‑responsive proline‑richprotein is identiﬁed in promyeloleukemic
HL‑60cells（前骨髄性白血病細胞HL‑60におけるレチノイン酸応答蛋白RARP1（Retinoic
Acid Response Proline‑rich Protein 1）の
同定）
稲

垣

毅

60細胞を ATRA で処理すると，110kDa の RARP1
蛋白質が蓄積することを，特異的な抗体を作製して確認した。この RARP1抗体を用いた免疫組織化学染色
では，骨髄と脾臓の巨核球に強い染色を認めたほか，
胸腺に heterogeneous な染色を認めた。RARP1の機能に関しては，
RARP1のタンパク配列が Prolin‑richdomain，Ras‑associated domain および PH domainを含んでいたことから，シグナル伝達や転写調節に関（論文の内容の要旨）

わる可能性が考えられた。そこで，CHO‑K1細胞，【背景と目的】レチノイン酸をはじめとするレチノイ

Jurkat細胞およびCHO‑IR細胞を用いて，リポーター

ドとその代謝活性物質は，分化や形態形成のほか，生アッセイを行った。これらの細胞系において，RARP1

体のホメオスタシス維持において重要な役割を果たす。

は activator protein 1（AP1）と serum response

また臨床的に，レチノイン酸は急性前骨髄性白血病のelement（SRE）を介する転写活性を抑制していた。

治療薬として用いられている。しかしながら，その作

一方，cAMP response element（CRE）を介する転用機序は未だ不明な点が多い。今回，レチノイン酸に

写活性には影響しなかった。より詳しい分析の結果，よる前骨髄性白血病細胞 HL‑60の分化誘導の作用機

RARP1の proline‑rich 領域は，AP1の転写活性の抑序を検討する目的で，我々は，レチノイン酸によって制に関わる機能領域であることが分かった。

活性化される遺伝子を単離し検討した。

【結論】以上の結果は，ATRA によって誘導される【材料と方法】前骨髄性白血病細胞 HL‑60細胞をオー

RARP1が，選択的に細胞内のシグナル伝達を調節す

ル・トランス・レチノイン酸（ATRA）で処理した

ること示しており，RARP1が骨髄球や巨核球の分化

のち，mRNA ディファレンシャルディスプレイ法をに関わる可能性を示唆している。

行った。その結果，得られた遺伝子断片をもとにして，（論文審査の結果の要旨）

胸腺 cDNA ライブラリーから ATRA 標的遺伝子をレチノイン酸は，急性前骨髄性白血病の分化誘導療

クローニングし，５ʼ‑RACE 法を駆使して全長遺伝子法の治療薬として用いられている。しかしながら，そをクローニングした。つぎに，この遺伝子の発現特性の作用機序は未だ不明な点が多い。今回，前骨髄性白を Northern blotting 法，Western blotting 法，免疫血病細胞 HL‑60におけるレチノイン酸の作用機序を組織化学法を用いて検討した。さらに，得られた遺伝検討するために，レチノイン酸によって活性化される子の配列がシグナル伝達に関連するドメインを持って新規遺伝子を検討した。

いたことから，レポーターアッセイを行い，シグナル

オール・トランス・レチノイン酸（ATRA）で処伝達への影響を検討した。

理した前骨髄性白血病細胞 HL‑60細胞を用 い て，

【結果】ATRA で処理した HL‑60細胞を用いて行っmRNA ディファレンシャルディスプレイ法を行い，た mRNA ディファレンシャルディスプレイ法の結果，ATRA の標的遺伝子を検索した。その結果得られた

レチノイン酸によって誘導される遺伝子を発見し，ヒ遺伝子断片をもとに，全長遺伝子をクローニングした。

216

信州医誌 Vol. 58

審査学位論文要旨

つづいて，遺伝子発現の特徴や分布を Northern blot-

は調べられていない。今回，上記３種類の希少な糖ア

ting 法，Western blotting 法，免疫組織化学法を用ルコールが，ソルビトールのような糖類下剤となりえいて検討した。さらに，得られた遺伝子の配列の中にるのかどうか，緩下作用を比 検討した。

シグナル伝達に関連するドメインが認められたことか【材料および方法】3.3〜9.9g/kgまでの５用量の希少

ら，レポーターアッセイを行い，シグナル伝達への影

糖アルコールをマウスに経口投与し，その後に下痢を響を検討した。

呈する動物数および便の状態を３時間まで観察するこ

その結果，稲垣は次の結論を得た。

とで緩下作用を評価した。また便通を促進させる浸透１．前骨髄性白血病細胞 HL‑60細胞におけるレチノ

圧作用を検討するため，各糖アルコールの摂取1.8時

イン酸応答蛋白 RARP1（Retinoic Acid Response

間後の着色物質（炭素末）の小腸移行率を小腸の輸送

Proline‑rich Protein 1）を同定した。RARP1遺伝能として算出した。その後，小腸，盲腸および大腸内

子は ATRA による濃度依存的かつ経時的な発現調の水分含量も測定した。値は，対照群と比 した。対節を受けていた。

照群には，溶媒（蒸留水およびカルボキシメチルセル

２．RARP1は，免疫および造血に関連する臓器（胸ロース）とソルビトールを用いた。緩下作用の比は，腺・骨髄・脾臓）において強い発現を認めた。

フィッシャーの直接確立検定を用い，２群間の比に３．RARP1の配列には，シグナル伝達に関与するドは対応のあるｔ−検定を用いた。どちらも有意水準は，

メ イ ン（proline‑rich domain，ras associated0.05以下とした。

domain， PH domain）が含まれていた。このうち，【結果】マウスにおいて下痢を発現させる用量は，各

血清応答配列（SRE），活性化蛋白質1（AP‑1）を

糖アルコールとも4.95g/kg からであり，用量の増加

介するリポーターの発現は RARP1によって抑制さとともに下痢を呈するマウスは増え，泥状便から水様れた一方で，cAM P 応答配列（CRE）を介するリ便に悪化する。9.9g/kg の用量では，イディトール

ポーターの発現は RARP1による抑制を受けなかっの緩下作用が最も強く，マウス全匹が下痢を呈し，溶た。
さらに AP‑1の発現抑制は proline‑rich domain

媒と比 して有意な差が生じた。一方，ソルビトールに依存性であった。

の9.9g/kg 摂取群では，下痢を呈するマウスは全体

これらの結果より，ATRA による発現調節を受けの半数以下と少なかったが，イディトールとソルビトー

る新規遺伝子 RARP1が，免疫および造血に関連する臓器に発現することが明らかになった。さらに，

ルの間に有意な差は認められなかった。
さらに小腸での炭素末の輸送能は，希少糖アルコー

RARP1は，ドメイン特異的にシグナル伝達を制御す

ル9.9g/kg の投与量で，溶媒と比して有意に増加る因子であることが明らかになった。このことは，新した。また，水分含量も小腸，盲腸において，溶媒と規遺伝子 RARP1がシグナル伝達を調節することで，比 して有意に増加した。なお，輸送能および水分含細胞現象をコントロールすることを示唆している。よっ

量ともに，イディトールが顕著な増加を示した。しかて，主査，副査は一致して本論文を学位論文として価し，ソルビトールも同様に輸送能を亢進させ，腸内水値があるものと認めた。

分量を増加させており，両者に有意な差は認められなかった。

Possibility as monosaccharide laxative ofrare sugar alcohols（希少糖アルコールが糖類下剤となりうる可能性）
逢

坂

和

昌

（論文の内容の要旨）【考察】希少糖アルコールの投与後，小腸と盲腸内の水分含量が増加し，これに伴い小腸の輸送能も亢進しており，浸透圧作用が示された。希少糖アルコールの中でも，イディトールが強い効果を示す傾向にあった。
この効果の違いは，物性または大腸での輸送能などが他の糖アルコールと異なると推測され，今後の研究課【背景と目的】ソルビトールは，自然界に多量に存在題である。

する糖アルコールであり，便秘を治療する糖類下剤と【結論】今回の実験から，希少糖アルコール，特にイして用いられている。一方，アリトール，タリトール，

ディトールは，十分な浸透圧作用を示し，ソルビトー

イディトールは，自然界に微量にしか存在しない糖ア

ルと同等以上の緩下作用を有していた。この点から将ルコールであり，その希少さゆえに，物性や生理活性来強固な便秘症に適用される有用な単糖下剤になり得

No. 5, 2010217

審査学位論文要旨

ると結論付けた。

用を有しており，緩下作用を示した。この作用は，ソ（論文審査の結果の要旨）

ルビトールと同等程度であった。ただし，イディトー

糖類下剤のソルビトールやラクツロースは，浸透圧

ルは，ソルビトールより強い浸透圧作用および緩下効性下剤として便秘の症状に応じて使用されている。一果を示す傾向にあり，強固な便秘症の治療などに用い方，希少糖アルコールと呼ばれる糖アルコールは，そられる可能性を示唆している。よって，主査，副査はの希少性ゆえに緩下作用などの研究は進んでいない。

一致して本論文を学位論文として価値があるものと認

今回，アリトール，タリトール，イディトールの３種めた。

類の希少糖アルコールをマウスに経口投与し，緩下作用などを調べた。
マウスは５週齢の ICR 雄30匹を用いた。実験は投与物質ごとに六群に分類し，一群を５匹とした。なお，六群の内訳は次のとおりである。① アリトール② タ
リトール③ イディトール④ ソルビトール（対照）⑤カルボキシメチルセルロース（溶媒）⑥ 蒸留水（溶A transverse ligament located anterosuperiorly in the lower orbital fat space restricts
lower eyelid retraction in the M ongoloideye（モンゴロイドの下眼窩脂肪腔の前上方にある横走靱帯が下眼瞼の退縮を制限している）媒）。緩下作用では，3.3〜9.9g/kg までの５用量の田

各液体0.2ml を経口投与し，３時間までに下痢を呈

中

洋

平

するマウス数および排出される便の状態を観察した。

（論文の内容の要旨）

また，糖アルコールの浸透圧作用を確認するため，投【目的】モンゴロイドの眼瞼はコーカソイドの眼瞼に

与1.8時間後にマウスを屠殺し，小腸内の着色物質の比べて，瞼裂が細く腫れぼったいとされている。上眼

移動距離から輸送能を算出した。さらに屠殺したマウ

瞼については らが，下位横走靱帯が上眼瞼挙筋の可

スの小腸，盲腸，大腸内の腸内水分量も計測した。

動域を制限し，挙筋前脂肪を上眼瞼挙上時に低い位置

その結果，逢坂は次の結論を得た。

に留め，上眼瞼を厚く瞼裂を狭くしていると報告して

１．希少糖アルコールにおいて，3.3g/kg の用量でいる。そこで我々は上眼瞼と同様に下眼瞼にも横走靱は下痢を呈さず，下痢を誘発させる用量は4.95g/

帯が存在し，下眼瞼の退縮を制限していると考え，一kg であり，ソルビトールも同じであった。

般日本人と献体において，この解剖学的構造を調査し２．下痢を呈するマウス数は，用量の増加とともに増た。

加し，便の性状は，泥状便から水様便に悪化した。

【方法】開瞼時の上下眼瞼の退縮を分析するため，

３．タリトールとイディトールの9.9g/kg の用量で20歳 代 の 眼 瞼 の 手 術 を 受 け て い な い 日 本 人 volun-

は，溶媒と比し，下痢を呈するマウスは有意に増teer101人の dominant eye について調査した。内眥

加したが，ソルビトールでは差を認めなかった。

外眥を結んだ直線より最も上眼瞼が退縮した距離を

４．イディトールの9.9g/kg の用量では，試験した，最も下UERD（upper eyelid retraction distance）

マウス全匹が下痢を起こしたが，ソルビトールでは眼瞼が退縮した距離を LERD（lower eyelid retrac-

半数以下のマウスしか下痢を起こさず，差を示す傾，瞼裂縦径を UERD＋LERD とした。
tion distance）

向が見られた。しかし，両者間で有意差は認められ

また，どのような形で退縮が制限されているかを瞼縁なかった。

の形状で評価するため，UERD，LERD の偏位を測

５．小腸および盲腸内の腸内水分量は，すべての糖ア定した。下眼瞼の横走靱帯の存在位置，走行を確認す

ルコールで，溶媒と比 し有意に増加したため，希るため，下眼瞼疾患で手術を行った患者10人の術中所

少糖アルコールとソルビトールの間に差は認められ

見，献体23体の右下眼瞼の解剖所見，献体９体から採なかった。

取した組織標本において調査を行った。

６．小腸輸送能も，すべての糖アルコールで，溶媒と比し有意に増加したため，希少糖アルコールとソ【結果】瞼裂縦径と上下眼瞼の退縮量に関して，瞼裂
縦径が大きい程，上下眼瞼の退縮量も大きく，正の相ルビトールの間に差は認められなかった。

関が認められた。上眼瞼と下眼瞼の退縮量には正の相

これらの結果より，希少糖アルコール類は，腸内の関は認められなかった。最も退縮した位置は下眼瞼の水分を増加させ，小腸の輸送能も亢進させる浸透圧作

ほうが上眼瞼よりも正中からの偏位が大きく，上眼瞼218

信州医誌 Vol. 58

審査学位論文要旨

では101人中74人で内側に偏位し，下眼瞼では101人全患で手術を行った患者10人の術中所見，献体23体の右例で外側に偏位していた。また，この横走靱帯のため下眼瞼の解剖所見，献体９体から採取した組織標本にに生じると考えられる下眼瞼皮膚の斜めの線状陥凹はおいて調査を行った。

101人中20人で目視され，上方視でさらに強調された。

瞼裂縦径すなわち UERD＋LERD と上下眼瞼の退術中所見の10人全例および献体23体の右下眼瞼の解剖

縮量 UERD，LERD に関して，瞼裂縦径が大きい程，所見全例で横走靱帯が認められた。解剖所見において，上下眼瞼の退縮量も大きく，正の相関が認められた。

この横走靱帯の内側は内眥の後下方の眼窩縁の内側よ上眼瞼と下眼瞼の退縮量には正の相関は認められなかっり生じ，眼窩隔膜の後上方の面に沿って走行し，外側た。最も退縮した位置は下眼瞼のほうが上眼瞼よりもは眼窩縁の下外側の骨膜の内側の表面に融合し，上内正中からの偏位が大きく，上眼瞼では101人中74人で側から下外側に傾斜していた。さらに，組織標本にお内側に偏位し，下眼瞼では101人全例で外側に偏位しいて眼窩部中央標本の矢状断切片でこの横走靱帯を鮮ていた。また，この横走靱帯のために生じると考えら

明に確認できた。

れる下眼瞼皮膚の斜めの線状陥凹は101人中20人で【考察】臨床的および解剖学的に上眼瞼と同様に，下目視され，上方視でさらに強調された。術中所見の10

眼瞼にも横走靱帯が存在することが確認できた。Lock-

人全例および献体23体の右下眼瞼の解剖所見全例でwood 靱帯が眼球を前下方より支持しているのに対しcapsulopalpebral fascia から眼窩隔膜に移行する部て，この横走靱帯は眼球を前上方より支持し，下眼瞼位に横走靱帯が認められた。解剖所見において，このの重要な支持組織となっている。最も退縮した位置の横走靱帯の内側は内眥の後下方の眼窩縁の内側より生正中からの偏位は上眼瞼では内側に偏位し，下眼瞼でじ，眼窩隔膜の後上方の面に沿って走行し，外側は眼は外側に偏位していたが，これは上下眼瞼にある横走

窩縁の下外側の骨膜の内側の表面に融合し，上内側か靱帯の外下がりの走行が瞼裂と眼瞼縁の形態に影響をら下外側に傾斜していた。さらに，組織標本において及ぼしているためと考えられた。この横走靱帯は下眼

眼窩部中央標本の矢状断切片でこの横走靱帯を鮮明に瞼の退縮を制限し，瞼縁の形態を決定し，眼窩脂肪腔

確認できた。

の位置を前上方に維持している。モンゴロイドに特徴

臨床的および解剖学的に上眼瞼と同様に，下眼瞼に的な細く腫れぼったい外観は上下眼瞼の横走靱帯にも横走靱帯が存在することが確認できた。Lockwood

よって引き起こされていると考えられた。

靱帯が眼球を前下方より支持しているのに対して，こ（論文審査の結果の要旨）
モンゴロイドの眼瞼はコーカソイドの眼瞼に比べて，の横走靱帯は眼球を前上方より支持し，下眼瞼の重要な支持組織となっている。最も退縮した位置の正中か

瞼裂が細く腫れぼったいとされている。上眼瞼についらの偏位は上眼瞼では内側に偏位し，下眼瞼では外側てはらが，下位横走靱帯が上眼瞼挙筋の可動域を制に偏位していたが，これは上下眼瞼にある横走靱帯の限し，挙筋前脂肪を上眼瞼挙上時に低い位置に留め，外下がりの走行が瞼裂と眼瞼縁の形態に影響を及ぼし上眼瞼を厚く瞼裂を狭くしていると報告している。そているためと考えられた。この横走靱帯は下眼瞼の退こで我々は上眼瞼と同様に下眼瞼にも横走靱帯が存在縮を制限し，瞼縁の形態を決定し，眼窩脂肪腔の位置

し，下眼瞼の退縮を制限していると考え，一般日本人

を前上方に維持している。モンゴロイドに特徴的な細と献体において，この解剖学的構造を調査した。

く腫れぼったい外観は上下眼瞼の横走靱帯によって引開瞼時の上下眼瞼の退縮を分析するため，20歳代のき起こされていると考えられた。

眼瞼の手術を受けていない日本人 volunteer101人の本研究は以上のような新知見を明らかにしたものでdominant eye について調査した。内眥外眥を結んだあり，主査，副査は一致して本論文を学位論文として

直線より最も上眼瞼が退縮した距離を UERD（upper

価値があるものと認めた。

，最も下眼瞼が退縮した
eyelid retraction distance）
距離を LERD（lower eyelid retraction distance），
瞼裂縦径を UERD＋LERD とした。また，どのような形で退縮が制限されているかを瞼縁の形状で評価する
ため，UERD，LERD の偏位を測定した。下眼瞼の横走靱帯の存在位置，走行を確認するため，下眼瞼疾No. 5, 2010219

審査学位論文要旨

6.0units/beat に対し BLK では5.0±2.4beats/min，Pressor responses to isometric biting are
evoked by somatosensory receptors in periodontal tissue in humans（ヒト静的咬合時の昇圧応答は歯周組織内の感覚受容器刺激によって誘発される）
岡

田

芳

幸

7.5±3.3units/beat と抑制された（ともに P＜0.01）。
FCVC，GVC は 両 条 件 と も 咬 合 時 に 低 下 し た が，
FCVC は低下度が No‑BLK の‑41.8±9.3％に対しBLK で‑13.1±8.5％と抑制された（P＜0.01）一方
で，GVCの低下度には差がなかった（P＝0.414）。このとき，EMG ・咬合力の上昇には BLK，No‑BLKの両条件間で差がなかった（それぞれP＝0.944，P＝（論文の内容の要旨）

0.664）。
〔実験２〕No‑BLK では，No‑BT の血圧反【背景と目的】従来，咬合時の昇圧反応は咀嚼筋内の射ゲイン（HR/SBP，beats/min・mmHg；MSNA/

機械および化学受容器を介すると考えられてきた。しDBP，units/beat/mmHg）がそれぞれ‑0.74±0.05；

かし，歯周組織にも多くの受容器が存在し咬合運動の‑16.8±1.4であったに対し，BTで‑0.53±0.04；‑11.2調節に関与することが示唆されている。そこで，我々±1.6と低下した（P＜0.01）。一方，BLKでは，No‑は「咬合時の昇圧反応には，活動筋内の受容器より歯BT で‑0.72±0.09；‑16.6±2.2であったのに対し，

周組織内の受容器が関与しているのではないか」といBT で‑0.68±0.10；‑16.4±2.4と差はなかった。

う実験仮説をもち，それを検証した。

【結論】咬合運動による昇圧反応は歯周組織内の受容【方法】正常咬合（Angle class I）を有する健常な成器が本体であり，MSNA の増加，末梢血管抵抗の上人男性（23±５歳（平均±SD））８名を対象とした。

昇に起因すること，また，同時に血圧反射ゲインの低〔実験１〕歯周組織からの求心神経である上・下歯下が起きることが明らかになった。

槽神経を遮断する（咀嚼筋からの求心神経は正常）場（論文審査の結果の要旨）合（BLK）と，しない場合（No‑BLK）の２条件につ咬合時には昇圧反応が生ずるが，それは咀嚼筋内のいて，最大咬合力の50％の強度（50％ M VC）で咬機械および化学受容器を介すると考えられる。しかし，合を２分間持続させ，その間の咬合力，咬筋筋電図

動物実験から歯周組織にも咬合運動を調節する受容器（EM G），平均血圧（M AP），心拍数（HR），筋交感が存在し，同求心神経を遮断すると咬合時の腎交感神神経活動（MSNA），指尖部皮膚血管コンダクタンス

経活動増加が抑制されるという報告もある。そこで，（FCVC），歯肉血管コンダクタンス（GVC）を測定

岡田は「咬合時の昇圧反応には，⑴ 歯周組織内の受した。MSNA は腓骨神経より微小電極法により測定容器が関与している⑵ 筋交感神経活動の増加を伴う

し，10秒間当たりのバースト頻度と平均振幅で評価し⑶ 圧受容器反射の低下を伴う」という実験仮説を検た。また，FCVC，GVC はレーザードップラー法に証した。

より測定した血流量を MAP で除して求めた。それぞ

健常な成人男性８名を対象とし，上・下歯槽神経をれの項目を咬合前５分間の平均値に対する変化量で表遮断する場合と，しない場合の２条件で，２分間持続した。
〔実験２〕上記の２条件それぞれについて，さ咬合をさせ，その間の咬合力，咬筋筋電図，血圧，心らに30％ MVC にて咬合する場合（BT）と，しない

拍数，筋交感神経活動，指尖部皮膚血管コンダクタン

場合（No‑BT）に分け，ニトロプルシッド（100μg）

ス，歯肉血管コンダクタンスを測定した。さらに，上およびフェニレフリン（150μg）の投与によって薬理記２条件それぞれで，咬合する場合と，しない場合に学的な血圧変動に対する血圧反射感受性（HR／収縮

分け，ニトロプルシッド（100μg）およびフェニレフ

期血圧（SBP），M SNA／拡張期血圧（DBP））を測

リン（150μg）の投与（オックスフォード法変法）に定し，比 した。

よって血圧変動に対する血圧反射感受性（HR/収縮【結果】〔実験１〕M AP は両条件で上昇したが，その期血 圧（SBP），MSNA/拡 張 期 血 圧（DBP））を 測 定上昇は No‑BLK の13.3±2.2mmHg（平均値±SE）した。

に対し，BLK では3.9±1.5mmHg と抑制された（P＜0.01）。また，HR，Total M SNA（バースト頻その結果，岡田は次の結果を得た。
１．咬合時の昇圧反応は歯周組織感覚をブロックする

度×バースト振幅）も咬合時に両条件とも増加したが，と，咬筋筋電図および咬合力が同等であるにもかか

その上昇は No‑BLK の9.8±3.4beats/min，19.7±

わらず，有意に抑制された。

220

信州医誌 Vol. 58

審査学位論文要旨

２．咬合時の昇圧反応には筋交感神経活動の上昇，血標本を作製した。標本の内腔に７cmH O の内圧を負管コンダクタンスの低下を伴ったが，これらの変化

荷して安定した自発性収縮を誘起させ，径変化はビデ

は歯周組織感覚をブロックすると有意に抑制された。

オマイクロスコープシステムとビデオキャリパーを用

３．咬合時には圧受容器反射の感受性が有意に低下しいて計測した。５％ CO ‑95％ N で通気したクレブ

たが，歯周組織感覚をブロックするとその低下は消ス液（pH7.4，37℃）を保生液として，任意のグル失した。

コース濃度（０，0.1，0.5，１，３，５mM ）の等張

これらの結果より，ヒト咬合時の昇圧反応は，歯周クレブス液を外腔側から灌流した。

組織内の感覚受容器が咬合によって，筋交感神経活動

まずはじめに０mM グルコースを灌流し，リンパを上昇，血管コンダクタンスを低下させるによって引管自発性収縮の影響を調べた上で，グルコース−6−

き起こされることが示唆された。さらに，それには，

ホスファターゼ阻害剤である chlorogenic acid を投圧受容器反射の感受性の低下を伴うことが示唆された。

与し，リンパ管自発性収縮に平滑筋細胞内のグリコー

よって，歯周組織内感覚受容器を健全に保持するこゲンが関与するかどうかを検討した。次に，クレブスとは，循環器ホメオスターシスにとって，大きな意義

液のグルコース濃度を０，0.1，0.5，１，３，５mMをもつことを示しており，主査，副査は一致して本論と漸増させてその影響を調べた。さらに GLUT の阻

文を学位論文として価値があるものと認めた。

害剤である cytochalasin B（CCB）と SGLT の阻害剤であるphlorizinを用いて，それぞれの自発性収縮に対Glucose and glucose transporters regulate
lymphatic pump activity through activation of the mitochondrial ATP‑sensitive
K channel（グルコース及びグルコース担体によるミトコンドリア ATP 感受性カリウ
ムイオンチャネルの活性化を介するリンパ管
ポンプ機能の制御）
李向する影響を0.1，１，３mM グルコース存在下で検討し た。次 に，mitoKの 阻 害 剤 で あ る5−hydroxy-decanoate（5‑HD）の自発性収縮に対する影響を0.1，
１，３mM グ ル コ ー ス 存 在 下 で 調 べ た。mitoKがミトコンドリアのカルシウムイオン取り込みに関与しているかについて調べるため，
ミトコンドリアのカル
シウムイオン輸送の特異的な抑制剤である ruthenium
red 存在下で5‑HD の自発性収縮に対する影響を調べ軍た。さらに mitoKの opener である diazoxide を用（論文の内容の要旨）

いて自発性収縮に対する影響を調べた。最後には，ミ【背景と目的】リンパ系は微小血管壁から漏出した水

トコンドリア内の ATP が自発性収縮に関与するか否

溶性物質やアルブミンを回収し，リンパ節を介してリかについて調べるため，ミトコンドリアプロトンポン

ンパ液を血管系に戻す脈管系である。リンパ管平滑筋

プ作用のプロトン輸送担体である carbonyl cyanideには自発的に収縮する機能があり，リンパ液を能動的4‑（triﬂuoromethoxy）phenylhydrazone（FCCP）に輸送している。このリンパ管の自発性収縮はリンパを用いて，自発性収縮に対する影響を検討した。

管平滑筋細胞にあるATP感受性K チャネルによって【結果】外液グルコースを０mM のまま120分間維持

制御されていることが知られているが，外液グルコーしたところ，自発性収縮は完全に消失することなく，

スとグルコース担体（Glucose Transporter）およびミ〜５回/分の自発性収縮を持続させた。chlorogenic

トコンドリアのATP感受性Ｋ チャネル（mitoK）acid 存在下で０mM グルコースで90〜120分灌流するがどう制御しているかについては不明である。そこと，自発性収縮は完全に消失した。細胞外グルコースで本研究では，まずグルコースと２種類のグルコースを０，0.1，0.5，１，３，５mM まで漸増すると，ポン

担体（促進型グルコース輸送体 GLUT とナトリウム

プ作用の収縮頻度と収縮力を濃度依存性に増加した。

依 存 型 グ ル コ ー ス 共 輸 送 体 SGLT）が リ ン パ 管 の，phlorizin（3x10 M ）は自発性収縮のCCB（10 M ）自発性収縮にどんな影響を及ぼすかを調べた。次に，頻度を有意に減少させ，胸管を拡張させた。5‑HDがリンパ管の自発性収縮にどんな影響を及（3x10 M ）は自発性収縮の頻度を抑制し，5‑HD にmitoK

ぼすかについて検討した。

よる収縮頻度減少作用は ruthenium red（2x10 M ）【材料および方法】Wistarラット（雄・７〜８週齢）をにより完全に抑制された。Diazoxide（10 M ）は１

ペントバルビタール麻酔・屠殺後，摘出リンパ管灌流

mM グルコース存在下で自発性収縮の頻度を有意にNo. 5, 2010221

審査学位論文要旨増加させた。FCCP（10 M ）は，ポンプ作用の頻度

意に減少させた。最大径と最小径は有意に増加を示し，を有意に減少させ，振幅も減少させた。

振幅についても，有意な影響を示した。SGLT 阻【結論】以上の事実から，リンパ管平滑筋の細胞内の害剤であるPhlorizinは外液グルコース0.1と１mM

グリコーゲンから転化したグルコース，あるいは，において，収縮の頻度を有意に減少させたが，３GLUT と SGLT による細胞外から，リンパ管平滑筋

mM では頻度の変化は認められなかった。

細胞に流入したグルコースがリンパ管の自発性収縮を⑷ 胸管自発性収縮に対する mitoKの関与を検討

制御していることが示された。さらに，ミトコンドリした。mitoK

ア膜の KATP チャネルがミトコンドリアのカルシウ

管の自発性収縮頻度を有意に減少させた。ミトコン

ムの取り込みを介してリンパ管の自発性収縮の制御に

ドリア内カルシウムイオン uniporter 阻害剤である

一部関与していることも判明した。

Ruthenium Red 存在下で，5‑HD 投与前後での胸（論文審査の結果の要旨）の選択的阻害剤である5‑HD は胸管自発性収縮に有意な差 は 認 め ら れ な か っ た。

リンパ系は微小血管壁から漏出した水溶性物質やア

mitoKの開口薬である Diazoxide は１mM グル

ルブミンを回収し，リンパ節を介してリンパ液を血管コース存在下で自発性収縮の頻度を有意に増加させ系に戻す脈管系である。リンパ管平滑筋には自発的にた。

収縮する機能があり，リンパ液を能動的に輸送してい⑸ 胸管の自発性収縮におけるミトコンドリア内のる。このリンパ管の自発性収縮はリンパ管平滑筋細胞

ATP の関与を検討した。ミトコンドリアプロトンにある ATP 感受性Ｋ チャネルによって制御されてポンプ作用のプロ ト ン 輸 送 担 体 で あ る carbonyl

いることが知られているが，外液グルコースとグル

cyanide 4‑（triﬂuoromethoxy）phenylhydrazone

コース担体（Glucose Transporter）およびミトコンド（FCCP）は0.1，１，３m Ｍグルコースで胸管の収リアの ATP 感受性 K チャネル（mitoK

縮頻度と振幅を有意に減少させた。

）がどう制御しているかについては不明である。そこで李らは，以上の結果から，ラット胸管平滑筋の自発性収縮は，摘出ラット胸管を用いて，リンパ管自発性収縮に対す

GLUT/SGLT を介した細胞外グルコース及び細胞内るグルコースと２種類のグルコース担体（促進型グル貯蔵グリコーゲン由来グルコースによって調節される

コース輸送体 GLUT とナトリウム依存型グルコース

ことが分かった。または，平滑筋の mitoK

共輸送体 SGLT）の影響，及びミトコンドリア ATP

それに連動した Ca ユニポーターによって調節され感受性Ｋ チャネルの関与を検討した。

ることが考えられた。

以下に研究結果を示す。
⑴ 外液グルコースを０mM で維持し，摘出ラット

開閉と主査，副査は一致して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

胸管の自発性収縮の変化を検討した。120分外液グ
ルコース濃度を０mM に維持しても，胸管の自発性収縮は完全に消失することなく，〜５回/分の自発性収縮を持続させた。グルコース−6−ホスファターゼ阻害剤である chlorogenic acid 存在下で０mM グルコースで灌流すると，90〜120分後，自発性収縮は完全に消失した。
⑵ ０mM グルコース外液で120分灌流後，外液グルIn vitro reprogramming of adult hepatocytes into insulin‑producing cells without
viral vectors（成熟肝細胞を用いた，非ウイ
ルス性遺伝子導入によるインスリン産生細胞へのリプログラミング誘導性の検討）
本

山

博

章

コース濃度に対する胸管自発性収縮の変化を検討し（論文の内容の要旨）た。収縮の頻度は，外液グルコース濃度０，0.1，【背景と目的】糖尿病治療への再生医学的アプローチ

0.5，１mM の間で，濃度依存性の増加を示し，１，３，

として，その発生学的相同性を利用し肝臓細胞へ膵臓

５mM の間では頻度の変化は認められなかった。

発生関連転写因子を異所性発現させ膵島 β細胞様細⑶ 胸管自発性収縮における胸管平滑筋細胞にあるグ胞へのリプログラミングを図る試みがなされているが，ルコース担体（glucose transporter）の関与を検討

成熟肝細胞を対象とした場合，① 非ウイルス性遺伝した。GLUT 阻害剤である Cytochalasin B はグル子導入法での誘導例がない，② インスリン分泌能を

コース濃度0.1，１，３mM において，収縮頻度を有有した細胞が得られない，など解決すべき事象が存在

222

信州医誌 Vol. 58

審査学位論文要旨する。今回我々は正常マウスから分離した初代培養肝を対象とした場合，① 非ウイルス性遺伝子導入法で細胞に対して非ウイルス性手法により膵臓発生特異的の誘導例がない，② インスリン分泌能を有した細胞転写因子を導入し，そのリプログラミング誘導性を検が得られない，など解決すべき問題が存在する。今回討した。

本山博章は正常マウスから分離した初代培養肝細胞に【材料及び方法】６週齢の C57BL/6J 雄マウスより分対して非ウイルス性手法により膵臓発生特異的転写因離した成熟肝細胞に対し種々の非ウイルス性遺伝子導子を導入し，そのリプログラミング誘導性を検討した。

入法（リポフェクション及びヌクレオフェクション）

６週齢の C57BL/6J 雄マウスを用い，分離した成による EGFP 発現遺伝子の導入効率と MTS アッセ

熟肝細胞に対し種々の非ウイルス性遺伝子導入法（リイ法による遺伝子導入後の cell viabilityの推移を比

ポフェクション及びヌクレオフェクション）による検討した。次いで，膵臓発生特異的転写因子である，

EGFP 発現遺伝子の導入効率と MTS アッセイ法に

Pancreas and duodenal homeobox 1（Pdx1）及び

よ る 遺 伝 子 導 入 後 の cell viabilityの 推 移 を 比Neurogenin 3（Ngn3）をそれぞれ単独，もしくは共討した。次いで，膵臓発生特異的転写因子である，発現させた場合のリプログラミング誘導性の指標とPancreas and duodenal homeobox 1（Pdx1）及びして，① 膵臓関連遺伝子発現の有無，② 細胞内イン

Neurogenin 3（Ngn3）をそれぞれ単独，もしくは共

スリン及びＣペプチド蛋白質の定量，③ 細胞培地へ発現させた場合のリプログラミング誘導性の指標とのグルコース負荷に伴うインスリン分泌能を評価しして，① 膵臓関連遺伝子発現の有無，② 細胞内インた。この際，共発現系においては Internal ribosome

スリン及びＣペプチド蛋白質の定量，③ 細胞培地へ

entrysite（IRES）を用いた単一plasmidからの共発現のグルコース負荷に伴うインスリン分泌能を評価し（bicistronic expression），及び２種類の発現 plasmidた。この際，共発現系においては Internal ribosomeの co‑transfection を同時に比 した。

entrysite（IRES）を用いた単一plasmidからの共発現【結果】非ウイルス性遺伝子導入法のうち，ヌクレ（bicistronic expression），及び２種類の発現 plasmid

オフェクション法による遺伝子導入効率が有意にの co‑transfection を同時に比 した。

高く（約52％），遺伝子導入後の cell viabilityも有意検

その結果，本山博章は次の結論を得た。

に高値だった。同手法により成熟肝細胞に Pdx 1及

１．成熟肝細胞への遺伝子導入効率はヌクレオフェク

び Ngn3を 単 独 及 び 共 発 現 さ せ た 場 合，bicistronic

ション法において有意に高値であり（約52％），導expression による共発現群において膵島 β細胞に最入後の cell viabilityも有意に高かった。

も近い遺伝子発現プロファイルを示し，内因性インス

２．同手法を用い Pdx1及び Ngn3を単独もしくは共リン産生の指標となる細胞内Ｃペプチド量も有意に発現させた結果，bicistronic expression による共高値であった。また同細胞は細胞培地グルコース濃度

発現群において膵島 β細胞に類似した遺伝子発現に応じインスリン分泌を示すことを確認した。Co‑

プロファイルを示し，内因性インスリン産生の指標

transfection 群においては，Pdx1と Ngn3の共発現がである細胞内Ｃペプチド量も有意に高値であった。

必ずしも担保されないことを併せて確認した。

３．同細胞の細胞培地内にグルコースを負荷すると，【結論】成熟肝細胞に膵臓発生特異的転写因子 Pdx1

濃度依存性に培養液中インスリン濃度は増加し，細及び Ngn3を非ウイルス性手法により導入し，共発現

胞外グルコース濃度に応じたインスリン分泌能を有させた場合，膵島 β細胞様細胞へのリプログラミン

している可能性が示唆された。

グを誘導しうることを示した。この結果は，成熟体細これらの結果より，成熟肝細胞に対して Pdx1と胞においても適切な遺伝子の導入によりリプログラミ

Ngn3を共発現させることにより膵 β細胞へのリプロ

ングを惹起しうることを示唆し，この応答にウイルス

グラミングを惹起しうることが示された。この結果は，ベクターの使用が必須ではない可能性を示している。

成熟体細胞においても適切な遺伝子の導入によりリプ（論文審査の結果の要旨）

ログラミングを惹起しうることを示唆し，この応答に糖尿病治療への再生医学的アプローチとして，そのウイルスベクターの使用が必須ではない可能性を示し発生学的相同性を利用し肝臓細胞へ膵臓発生関連転写ている。このように本論文は再生医学における臨床応

因子を異所性発現させ膵島 β細胞様細胞へのリプロ用を目指すものであり，そのために有用な基礎的知見

グラミングを図る試みがなされているが，成熟肝細胞を示している。よって，主査，副査は一致して本論文

No. 5, 2010223

審査学位論文要旨

を学位論文として価値があるものと認めた。

the same histopathologic ﬁndings as ringlike pattern,and were considered to be variants of ringlike

Dermoscopy of pigmented lesions on
mucocutaneous junction and mucous membrane（粘膜皮膚移行部と粘膜部における色素性病変のダーマスコピー所見）林景栄pattern. Dermoscopic features most frequently observed in malignant melanomas were asymmetry of
structure,multiple colors,blue‑white veil and irregular dots or globules. The standard dermoscopic
algorithms,such as ABCD rule,M enzies method,7‑point checklist, 3‑point checklist and CASH algor-（論文の内容の要旨）

ithm showed high sensitivity (62.5%〜100%) andBackground and objective Pigmented lesions on

speciﬁcity(93.8%〜100%)in diagnosing melanomas

mucocutaneous junction and mucous membraneon mucocutaneous junction and mucous membrane.

cover a wide range of disorders.The diﬀerentiation

Conclusion The use of dermoscopy may also help

between benign lesions and malignant melanomas

in the proper management of pigmented lesions onof these sites is often diﬃcult. In recent years, themucocutaneous junction and mucous membrane,

use of dermoscopy has improved diagnosis of pig-

providing additional diagnostic information invis-

mented skin lesions to great extent.However,little

ible to the naked eye.
（論文審査の結果の要旨）

is known about the role of dermoscopy in the diagnosis of pigmented lesions on mucocutaneous junc-

Pigmented lesions on mucocutaneous junction andtion and mucous membrane. Here we reportmucous membrane cover a wide range of disorders.

the dermoscopic patterns in 40 lesions on

The diﬀerentiation between benign lesions andmucocutaneous junction and mucous membrane,

malignant melanomas of these sites is often

and assess the applicabilityof dermoscopic algorith-diﬃcult. Recently, the use of dermoscopy has im-

ms to these lesions.

proved diagnosis of pigmented skin lesions greatly.

Patients and methods The study was performed

The authors report the dermoscopic patterns andon a consecutive unselected series of 40 pigmented

assess applicability of dermoscopic algorithms in 40

lesions on mucocutaneous junction and mucous

lesions on mucocutaneous junction and mucous

membrane obtained from 37 Japanese patients. All

membrane.

lesions were observed, dermoscopic patterns

Forty pigmented lesions on mucocutaneous junc-

deﬁned, and scored according to standard dermos-

tion and mucous membrane obtained from 37

copic algorithms.

Japanese patients were observed.Dermoscopic anal-

Results Dermoscopic analysis identiﬁed 7 patterns

ysis of these lesions identiﬁed 7 patterns.The benignin our series of lesions. The benign lesions mainly

lesions mainly presented dotted‑globular pattern,presented dotted‑globular pattern, homogeneous

homogeneous pattern,ﬁsh scale‑like pattern,hyphal

pattern,ﬁsh scale‑like pattern,hyphal pattern,ring-pattern, ringlike pattern and ﬁngerprint‑like pat-like pattern and ﬁngerprint‑like pattern.Malignant

tern. Malignant melanomas mainly presented

melanomas mainly presented multicomponent pat-multicomponent pattern and homogeneous pattern.

tern and homogeneous pattern. The ﬁsh scale‑likeThe ﬁsh scale‑like pattern and hyphal pattern are

pattern and hyphal pattern are frequently observed

described here for the ﬁrst time, characterized byin Japanese mucosal melanotic macules, and are

multiple curves of semicircle mimicking the scales

described here for the ﬁrst time, characterized byof ﬁsh and less regularly curved or ﬂexed lines

multiple curves of semicircle mimicking the scales

mimicking the fungal hyphae, respectively. His-of ﬁsh and less regularly curved or ﬂexed lines

topathologic examination revealed that the ﬁshmimicking the fungal hyphae,respectively.The ﬁshscale‑like pattern and hyphal pattern shared almost

scale‑like pattern and hyphal pattern shared almost

the same histopathologic ﬁndings as ringlike pat-224

信州医誌 Vol. 58

審査学位論文要旨

tern. Therefore, the ﬁsh scale‑like pattern andhyphal pattern were considered to be variants ofringlike pattern. Furthermore, they evaluated andscored these lesions according to the standard dermoscopic algorithms, and found quite high sensitivity (62.5%〜100%)and speciﬁcity (93.8%〜100%),
which are comparable with their sensitivity andDysfunction in the ABCB1A has only aweak eﬀect on susceptibility to dextran
sulfate sodium‑induced colitis in SAM
strains（ABCB1A の機能障害は SAM 系マウスのデキストラン硫酸による誘発大腸炎に対する感受性には大きく影響しない）

speciﬁcity in hairy skin.

張From these ﬁndings,the following conclusions were国紅

（論文の内容の要旨）

obtained.
１．The benign lesions on mucocutaneous junction【背景と目的】潰瘍性大腸炎は大腸粘膜へのリンパ球

and mucous membrane mainly presented dotted‑の浸潤によるびらんや潰瘍を主徴とする大腸の炎症性

globular pattern,homogeneous pattern,ﬁsh scale‑疾患である。潰瘍性大腸炎には個人の遺伝子構成，おlike pattern, hyphal pattern, ringlike pattern andよび食生活や腸内細菌叢などの環境因子が複雑に組み

ﬁngerprint‑like pattern. M alignant melanomas

合わさって発症する機序が想定されているが，その詳

mainly presented multicomponent pattern and細は不明である。潰瘍性大腸炎に対する感受性の個人

homogeneous pattern.

差の遺伝的要因の一つとして，生体異物排出ポンプで２．The ﬁsh scale‑like pattern and hyphal pattern

ある ATP‑binding cassette，sub‑family B（MDR/

described here for the ﬁrst time were considered，member 1A をコードする ABCB1A 遺伝子
TAP）

to be variants of the ringlike pattern, and were

上の１塩基置換多型が同定されている。しかしながら

frequently observed in mucosal melanotic

ABCB1A 遺伝子の潰瘍性大腸炎発症への寄与度はmacules in Japanese.

不明であり，発症にはさらに未同定の遺伝的・環境

３．The dermoscopic algorithms deﬁning malignant

的要因の関与が必要であると想定されている。申請者

melanomas on hairy skin also apply toは老化促進モデルとして利用されている SAMR1，

melanomas on mucocutaneous junction and

SAM P1，SAMP6系マウスが，Abcb1a 遺伝子にレト

mucous membrane, with comparable sensitivity

ロウイルスゲノムの挿入による機能喪失突然変異をもand speciﬁcity with those on the hairy skin.

つことを発見した。これらのマウス系統は機能喪失型

In conclusion,the results throw light on the prac-

Abcb1a 遺伝子をもちながらも，その他の遺伝的背景

tical usage of dermoscopy on pigmented lesions ofは異なっている。したがってこれらのマウスは潰瘍性mucocutaneous junction and mucous membrane.

大腸炎発症に対する ABCB1A，およびその他の要因

The use of dermoscopy may also help in theの関与を検定するための有用なモデルであると考えら

proper management of pigmented lesions on

れた。デキストラン硫酸（DSS）は経口投与によりmucocutaneous junction and mucous membrane,

マウスに潰瘍性大腸炎を誘発することが知られている。

providing additional diagnostic information invis-

そこでこれらの Abcb1a 変異系統および正常マウス系

ible to the naked eye.

統を用いて，DSS 誘発大腸炎に対する感受性を比よって，主査，副査は一致して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

検討した。
【材料と方法】Abcb1a変異系統としてSAMR1，
SAMP1，SAM P6，および正常系統と し て C57BL/6J，C3H/
He，
DBA/2J の10週齢の雌性マウスを１群あたり５匹ずつ使用した。0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，および3.0％の DSS 溶液（分子量36,000〜50,000）を給水ボト
ルからの飲水として７日間自由摂取させた。この間の体重の変化，および血便または下痢の有無を調査した。
その後にマウスを屠殺して大腸のヘマトキシリン/エNo. 5, 2010225

審査学位論文要旨

オジン（H/E）染色病理組織標本を作製し，潰瘍性および正常系統として C57BL/6J，C3H/He，DBA/

大腸炎の有無を調査し，大腸炎を誘導する DSS 最低2J の10週齢の雌性マウスを５匹ずつ使用した。0.5，

濃度を決定した。2.0％ DSS 投与群において，大腸

1.0，1.5，2.0，2.5，および3.0％の DSS溶液（分子H/E 標本での炎症性細胞の浸潤深度，浸潤面積，潰量36,000〜50,000）を飲水として７日間自由摂取させ瘍の有無，被覆上皮異常増殖の有無の４指標を３段階た。この間の体重の変化，および血便または下痢の有のスコアで評価し，これらの合計を大腸炎スコアとし

無を調査した。その後に屠殺後の大腸の病理組織検査て，その系統差を Mann‑Whitneyʼ
のＵテストによりし，潰瘍性大腸炎の有無を調査し，大腸炎を誘導する検定した。

DSS 最低濃度を決定した。2.0％ DSS 投与群におい【結果と考察】各系統のマウスに大腸炎を誘導するこて，大腸 H/E 標本での炎症性細胞の浸潤深度，浸潤とのできる DSS 最低濃度は，Abcb1a 変異系統である

面積，潰瘍の有無，被覆上皮異常増殖の有無の４指標

SAM R1，SAMP1，SAM P6ではそれぞれ１％，２％，

を３段階のスコアで評価し，これらの合計を大腸炎ス

2.5％であった。また，2.0％ DSS 投与群におけるコアとして，大腸炎の重篤度を比 した。

大腸炎スコアの平均は SAM R1，SAM P1，SAM P6

その結果，張 国紅は次の結論を得た。

ではそれぞれ7.0，4.0，0.6であり，DSS 誘導大腸炎⑴ 一部の生体異物排出ポンプである ABCB1A の機に対する感受性はSAM R1＞SAM P1＞SAMP6で明ら能欠損をもつ SAM 系マウスは共通して ABCB1A

かな系統差があることが判明した。一方，正常系統で機能を欠損するにもかかわらず，大きく異なる大腸ある C57BL/6J，C3H/He，DBA/2J における大腸炎炎発症特性を示す。

誘導DSS最低濃度はそれぞれ１％，２％，３％であっ⑵ DSS 誘発大腸炎に対する感受性は，ABCB1A 機た。また，2.0％ DSS 投与群における大腸炎スコア能を欠損する SAM 系マウス系統間で異なるが，正の平均は5.2，1.0，1.0であり，いずれの指標もSAM

常系統マウスとは同程度である。

系統群とは差が無かった。以上の結果は，ABCB1A⑶ SAM 系マウス系統間には，Abcb1a 遺伝子以外の機能欠損は DSS 誘導大腸炎に対する感受性には影に自然発症大腸炎，および DSS 誘発大腸炎に対す響を与えず，この感受性はむしろ Abcb1a 以外の遺伝

る感受性を規定する遺伝的多型が存在する。

子による影響を強く受けることを示唆した。SAMP6系

以上の結果より，Abcb1a 遺伝子に共通して機能喪

マウスは DSS 誘導大腸炎に対しては感受性が低いこ

失変異をもちながらも異なる遺伝的背景，および大腸とが明らかとなったが，一方で SAMP6系マウスは慢炎発症特性をもつ一群のSAM 系マウスは，ヒトの潰瘍性大腸炎を SAM R1系マウスよりも高率に自然発症す性大腸炎の研究に有用なモデルである。一群の SAMることが報告されている。これらのデータを総合する系マウスを用いたさらなる研究により，ヒトの潰瘍性と，SAM 系統群には慢性大腸炎と DSS 誘導大腸炎

大腸炎の発症機序の解明，および予防・治療法の開発に対する異なる感受性/抵抗性遺伝子（群）が保有さが可能であることを示唆している。よって，主査，副れていることが示唆される。SAM 系マウスは，大腸査は一致して本論文を学位論文として価値があるもの炎の発症に関わる遺伝的，および環境的要因を検索すと認めた。

るための有用なモデルであると考えられる。
（論文審査の結果の要旨）
申請者は，老化促進モデルとして利用されている
SAM R1，SAMP1，SAM P6系マウスが，Abcb1a 遺伝子にレトロウイルスゲノムの挿入による機能喪失突然変異をもつことを発見した。これらのマウスは潰瘍性大腸炎発症に対する ABCB1A，およびその他の要因の関与を検定するための有用なモデルであると考え

Identiﬁcation of a high incidence region for
retroviral vector integration near exon 1of
the LMO2 locus（LM O2遺伝子座 Exon1近傍における retroviral vector integration の高頻度領域の同定）
山 田 幸 一 郎られた。そこでこれらの Abcb1a 変異系統および正常（論文の内容の要旨）

マウス系統を用いて，DSS 誘発大腸炎に対する感受【背景と目的】Ｘ連鎖重症複合免疫不全症（X‑SCID）

性を比 検討した。

はＸ染色体に位置する IL‑2受 容 体 γ鎖 の 突 然 変 異Abcb1a 変異系統として SAMR1，
SAMP1，SAM P6，226が原因であり，患者は細胞性および液性免疫不全に
信州医誌 Vol. 58

審査学位論文要旨

より生後１年以内に死亡するという致死的疾患であ頻度のウイルスベクター挿入領域（HIR）を見出しる。2000年にパリで報告された遺伝子治療は，レトた。この領域は白血病を発症した実際の患者のベクロウイルスベクターに正 常 な IL‑2受 容 体 γ鎖 遺 伝

ター挿入部位を含む。患者体内にはこの HIRにベク子を組み込み，患者造血幹細胞に導入して著明な効

ターが組み込まれた30個以上のＴ細胞が存在すると算果を得た。しかしながら，少数の患者に白血病が発出された。レトロウイルスベクターを用いた遺伝子治症し，解析の結果，レトロウイルスベクターによる療において，今回の LMO2遺伝子座近傍に見出されinsertional mutagenesisが引き金となることが判明した。

た HIR の解析はウイルスベクター誘導の白血病発症

白血病を発症した患者のうち４症例に T‑cell acute

機構についての解明のみならず，これからのベクター

lymphoblastic leukemia（T ‑ALL）を発 症 さ せ る

開発の助けとなると考えられる。

oncogene である LM O2近傍にレトロウイルスベ ク（論文審査の結果の要旨）

ターの挿入が見出され，なかでもそのうち二例はTSS

Ｘ連鎖重症複合免疫不全症（X‑SCID）はＸ染色（transcription start site）の近傍に挿入部位があるこ体に位置する IL‑2受容体 γ鎖の突然変異が原因であとが明らかとなった。レトロウイルスベクターの染色る。2000年にパリで報告された遺伝子治療は，レトロ体への挿入頻度を含め LM O2 Exon1近傍におけるベウイルスベクターに正常な IL‑2受容体 γ鎖遺伝子

クター組み込みの詳細な解析は未だ行われていない。

を組み込み，著明な効果を得た。しかしながら，少数

今回，我々はＴ細胞株および CD34陽性造血幹細胞にの患者に発症した白血病はレトロウイルスベクターに

マウスレトロウイルスベクターを感染させ，PCR 法

よ る insertional mutagenesis が 引 き 金 と な る こ とを用いてベクター挿入部位の詳細な解析を行った。

が判明し，４症例の患者の内２例は oncogeneである【方法と結果】TPA‑Mat‑ecoR 細胞と Jurkat‑ecoR

LMO2近傍にレトロウイルスベクターの挿入が見出さ

細 胞，HeLa 細 胞，そ し て CD34陽 性 造 血 幹 細 胞 にれ，TSS（transcription start site）の近傍に挿入部

Moloney murine leukemia virus（MLV）ベクター

位があることが明らかとなった。今回，Ｔ細胞株およを感染させ，PCR により LMO2 Exon1近傍のレトロび CD34陽性造血幹細胞にマウスレトロウイルスベク

ウイルスベクター挿入部位を同定した。また，Real

ターを感染させ，PCR 法を用いて挿入部位の詳細なtime PCR等を用いて患者の造血幹細胞への挿入頻解析を行った。

度 を 求 め た。ウ イ ル ス ベ ク タ ー 固 有 の primer とその結果，次の結論を得た。

genome 特異的 primer と組み合わせて LMO2 Exon1

１．Ｔ細胞株である TPA‑Mat 細胞において LMO2を起点に上下3000塩基に渡り PCR を行い，PCR 産

TSS 上流域1700〜3000base の 間 に 高 頻 度 な レ ト

物をクローニングして挿入部位の解析を行った結果，

ロウイルスベクターの挿入領域（high incidenceＴ細胞株である TPA‑M at 細胞において LMO2 TSS

region：HIR）の存在を確認した。

上流域1700〜3000baseの間に高頻度なレト ロ ウ イ

２．この HIR はまた，同じヒト由来のＴ細胞株であルスベクターの挿入領域（high incidence region：

る Jurkat 細胞にも見出されたが，Ｔ細胞系ではな

HIR）の存在を確認した。この HIR はまた，同じヒ

い HeLa 細胞には見出されない。

ト由来のＴ細胞株である Jurkat 細胞にも見出された３．遺伝子治療に使用されている CD34陽性造血幹細が，Ｔ細胞系ではない HeLa 細胞には見出されない。

胞においても TPA‑Mat 細胞と同様に LMO2遺伝

さらに，遺伝子治療に使用された同じ CD34陽性造血

子座に HIR の存在が確認された。

幹細胞においても TPA‑Mat 細胞と同様に LM O2遺４．レトロウイルスベクターが HIR に挿入される頻伝子座に HIR の存在が確認された。遺伝子治療後に度は4.46X10 細胞に一個（TPA‑Mat 細胞）もし白血病を発症した X‑SCID 患者の一人はこの HIR 領

くは1.89X10 細胞に一個（CD34陽性造血幹細胞）域にウイルスベクター組み込みが見出されている。さと見積もられる。

らにレトロウイルスベクターが HIR に挿入される頻これらの結果より，LMO2 TSS 上流1700〜3000

度は4.46X10 細胞に一個（TPA‑Mat 細胞）もしく

base の範囲に高頻度のウイルスベクター挿入領域は1.89X10 細胞に一個（CD34陽性造血幹細胞）と見（HIR）を見出した。この領域には白血病を発症した

積もられる。

実際の患者においてベクター挿入が見出され，患者体【結語】LM O2 TSS 上流1700〜3000base の範囲に高内にはこの HIR にベクターが組み込まれた30個以上

No. 5, 2010227

審査学位論文要旨のＴ細胞が存在すると算出された。レトロウイルスベ

出組織から蛋白質および RNA を抽出しこれらの発現クターを用いた遺伝子治療において，今回の LMO2

を Western blot および RT ‑PCR にて検討した。更

遺伝子座近傍に見出された HIR の解析はウイルスベに卵巣癌同一症例の原発巣と播種巣でそれらの発現をクター誘導の白血病発症機構の解明のみならず，これ比 した。

からのベクター開発の助けとなると考えられる。よっ【成績】OSE において Slug，SIP1の発現は陰性だったて，主査，副査は一致して本論文を学位論文として価が，Snail は8/11例（72％），Twist は3/11例（27％）

値があるものと認めた。

で陽性であった。
上皮性卵巣腫瘍において Snail，Slug，
SIP1および Twist の発現は良性，境界悪性，癌の順

Changes in the expression of E‑cadherin
repressors, Snail, Slug, SIP1 and Twist,に発現が増強し，特に Slug と Twist では癌で有意にin the development and progression ofovarian carcinoma :the important role of
Snail in ovarian tumorigenesis and progression（卵巣癌の発生と進展過程における
E‑cadherin転写抑制因子Snail，Slug，SIP1
および Twist の発現変化：卵巣癌の発生と進展において Snail は重要な役割を果たす）

blot および RT‑PCR でも同様に，良性，境界悪性に

吉

田

順

子

発現が増強していた（p＝0.0032，
p＝0.0026）。
Western
比べて癌で Slug と Twist の発現が増強していた。組
織型別での比では，Twist強発現症例は漿液性腺癌で12/23例（52％）と，他の組織型に比べ有意に高頻度であった（p＝0.0019）。病期に関しては Snail お
よ び Twistの 発 現 が Ⅰ ＋ Ⅱ 期 に 対 し Ⅲ ＋ Ⅳ 期 で 有意に増強していた（p＝0.041，p＝0.047）
。原発巣と
播種巣の比

では Snail および Twist の発現が播種巣 で16/20例，18/20例 と 有 意 に 低 下 し（p＝0.007，（論文の内容の要旨），E‑cadherin 発現と逆相関していた。一p＜0.0001）【背景と目的】卵巣癌は婦人科悪性腫瘍のうちで最も方 Slug の発現は11/20例で原発巣に比べて播種巣で予後不良の疾患であり，その最大の予後因子は播種性増強していた。更に患者生存期間とこれらの発現を検転移である。播種性転移の過程は，まず原発巣から腹討したところ，Snail 陽性症例は陰性症例に比べて生腔内への腫瘍細胞の離脱，腹膜中皮細胞との接着，転存期間が短縮していた（p＝0.038）。Slug，SIP1およ移巣での浸潤や増殖を経て成立する。従って腹膜播種

び Twist の発現と生存期間には有意差が認められなの分子機構を理解するためには細胞接着因子の発現変かった。

化およびその制御機構を解明することが重要であると【考察】E‑cadherin 転写抑制因子は上皮性卵巣腫瘍の考えられる。E‑cadherin は上皮細胞に発現する細胞悪性度とともに増強した。また，同一症例において原間接着分子の一つであり，ヒト悪性腫瘍において腫瘍発巣に比べて播種巣では E‑cadherin の発現は増強し，抑制遺伝子として働く。E‑cadherin の発現は遺伝子

一方，Snail および Twist の発現は減弱していた。この変異，プロモーターのメチル化，翻訳後の修復，転のことから，卵巣癌の播種性転移の過程において E‑

写因子などさまざまな機序により制御されている。卵

cadherin とその転写抑制因子の発現が大きく変化し巣癌においても E‑cadherin の発現は劇的に変化してていると考えられた。特に，転写抑制因子の中でもいることが報告されている。しかし，卵巣癌の進展過Snail の発現は E‑cadherin 発現と逆相関を示し，さ程における E‑cadherin の発現制御機構は明らかでは

らに，Snail 陽性症例は陰性症例に比べ生存期間の短ない。そこで，卵巣癌の発生および進展過程における縮していたことから，Snail の発現は卵巣癌の発生と

E‑cadherin 転写抑制因子である Snail，Slug，SIP1

進展において重要な役割を果たすと考えられた。

およびTwistの発現変化をOSE（正常卵巣表層上皮）と上皮性卵巣腫瘍を用いて免疫組織染色，Western（論文審査の結果の要旨）
卵巣癌は婦人科悪性腫瘍のうちで最も予後不良の疾blot および RT‑PCR 法にて検討した。

患であり，その最大の予後因子は播種性転移である。

【方法】患者の同意を得て採取した OSE 11例および播種性転移の過程は，まず原発巣から腹腔内への腫瘍

上皮性卵巣腫瘍95例（良性14例，境界悪性13例，悪性細胞の離脱，腹膜中皮細胞との接着，転移巣での浸潤68例）について免疫組織染色を行い，染色強度およびや増殖を経て成立する。従って腹膜播種の分子機構を

陽性細胞率からスコア化し３段階に分類した。手術摘理解するためには細胞接着因子の発現変化およびその228

信州医誌 Vol. 58

審査学位論文要旨

制御機構を解明することが重要であると考えられる。

７．患者生存期間とこれらの発現を検討したところ，

E‑cadherin は上皮細胞に発現する細胞間接着分子のSnail 陽性症例は陰性症例に比べて生存期間が短縮

一つであり，ヒト悪性腫瘍において腫瘍抑制遺伝子としていた（p＝0.038）。
Slug，
SIP1および Twist の発して働く。E‑cadherin の発現は遺伝子の変異，プロ

現と生存期間には有意差が認められなかった。

モーターのメチル化，翻訳後の修復，転写因子などさこれらの結果より，卵巣癌の播種性転移の過程におまざまな機序により制御されている。卵巣癌においていて E‑cadherin とその転写抑制因子の発現が大きくも E‑cadherin の発現は劇的に変化していることが報変化していると考えられた。特に，転写抑制因子の中告されている。しかし，卵巣癌の進展過程における E‑

でも Snail の発現は E‑cadherin 発現と逆相関を示し，

cadherin の発現制御機構は明らかではない。そこでさらに，Snail 陽性症例は陰性症例に比べ生存期間の吉田順子は，
卵巣癌の発生および進展過程における E‑

短縮していたことから，Snail の発現は卵巣癌の発生

cadherin 転写抑 制 因 子 で あ る Snail，Slug，SIP1おと進展において重要な役割を果たすと考えられた。よっよび Twist の発現変化を OSE（正常卵巣表層上皮）て，主査，副査は一致して本論文を学位論文として価と上皮性卵巣腫瘍を用いて免疫組織染色，Western

値があるものと認めた。

blot および RT‑PCR 法にて検討した。
患者の同意を得て採取した OSE 11例および上皮性
卵巣腫瘍95例（良性14例，境界悪性13例，悪性68例）
について免疫組織染色を行い，染色強度および陽性細胞率からスコア化し３段階に分類した。手術摘出組
織から蛋白質および RNA を抽出しこれらの発現をWestern blot および RT‑PCR にて検討した。更に卵巣癌同一症例の原発巣と播種巣でそれらの発現を比した。

Valve Repair Improves Central Sleep
Apnea in Heart Failure Patients With
Valvular Heart Diseases（心不全を伴う重症弁膜症患者における弁置換による中枢性無呼吸の改善）
阿部

秀年（論文の内容の要旨）

その結果，吉田は次の結論を得た。

【緒言】睡眠時無呼吸症候群（Sleep apnea syndrome

１．OSE において Slug，SIP1の発現は陰性だったが，：SAS）は，睡眠中の呼吸停止と日中過眠などを特Snail は ８/11例（72％）， Twist は ３/11例（27徴とする睡眠障害を基盤とする症候群である。SAS％）で陽性であった。

には，上気道閉塞を原因とする閉塞性睡眠時無呼吸症

２．上皮性卵巣腫瘍において Snail，Slug，SIP1およ候群（Obstructive sleep apnea syndrome：OSA）

びTwistの発現は良性，境界悪性，癌の順に発現がと脳幹呼吸中枢の一過性活動停止を原因とする中枢性睡増強し，特に Slug と Twist では癌で有意に発現が眠時無呼吸症候群（Central sleep apnea syndrome

増強していた（p＝0.0032，p＝0.0026）。

：CSA）とに分けられる。SAS の様々な循環器疾患

３．Western blot および RT‑PCR でも同様に，良性，との関連は，
心不全との関連を含め既知となっている

境界悪性に比べて癌で Slug と Twist の発現が増強

が，心不全をもつ心疾患への外科的治療により SASしていた。

が改善したという報告はなく，今回手術適応の重症弁４．組織型別での比 では，Twist 強発現症例は漿液膜症をもつ心不全患者を対象に，外科弁治療の SAS

性腺癌で12/23例（52％）と，他の組織型に比べ有への効果について検討した。

意に高頻度であった（p＝0.0019）。

【方法】2005年12月から2008年３月までに，重症僧帽

５．病期に関してはSnailおよびTwistの発現がⅠ＋Ⅱ

弁，または大動脈弁の弁膜症が主因で心不全をきたし，期に対しⅢ＋Ⅳ期で有意に増強していた（p＝0.041，

入院となった150名（年齢68.7±9.7歳，男性92名）を

p＝0.047）。

対象とした。基礎弁膜症に関して，僧帽弁疾患では閉６．原発巣と播種巣の比では Snail および Twist

鎖不全症が50名，狭窄症が５名，狭窄兼閉鎖不全症がの発現が播種巣で16/20例，18/20例と有意に低下し１名であった。大動脈弁疾患では閉鎖不全症が52名，（p＝0.007，p＜0.0001），E‑cadherin発現と逆相関

狭窄症が20名，狭窄兼閉鎖不全症が６名であった。そしていた。一方 Slug の発現は11/20例で原発巣にの他，16名であった。心不全は急性期加療後の状態に比べて播種巣で増強していた。

おいて New York Heart Association（NYHA）ⅡNo. 5, 2010229

審査学位論文要旨

度，またはⅢ度で，睡眠時ポリグラフィー（PSG），

能と CSA との関連が確認された。更に，外科的弁治

心臓超音波，右心カテーテル検査を行い，PSG での，療にて心機能の改善に伴って CSA のみ有意に改善す

無呼吸・低呼吸の睡眠1時間あたりの回数を apnea

ることが明らかにされた。

hypopnea index（AHI）として測定した。AHIが20回（論文審査の結果の要旨）/時間未満を M ‑NSA（Mild to no sleep apnea）群

睡眠時無呼吸症候群（Sleep apnea syndrome：（n＝47），20回/時間以上を SAS 群（n＝103）に分類

SAS）は，睡眠中の呼吸停止と日中過眠などを特徴した。まず，心不全と SAS（OSA および CSA）とのとする睡眠障害を基盤とする症候群である。SAS に関連を OSA‑apnea index（OSA‑AI）と CSA‑apnea

は，閉塞性睡眠時無呼吸症候群（Obstructive sleep

index（CSA‑AI）を用いて調査を行った。つづいて，

apnea syndrome：OSA）と中枢性睡眠時無呼吸症候

重 症 SAS（AHI≧ 20）で 外 科 的 弁 治 療 を 行 っ た 74群（Central sleep apnea syndrome：CSA）とに分け

名（69.2±8.3歳，男性55名）に対し，術後の再検査られる。SAS の様々な循環器疾患との関連は既知での結果との比を行い，弁への外科的加療の OSA お

はあるが，心不全への外科的治療により SAS が改善

よび CSA への効果を検討した。施行術式は，僧帽弁したという報告はなく，阿部らは重症弁膜症をもつ心には形成術が15名，弁置換術が５名，大動脈弁置換術不全患者を対象に，外科弁治療の SAS への効果を検が41名，両弁置換術が９名，大動脈弁置換術かつ僧帽討した。

弁形成術が４名であった。

僧帽弁，または，大動脈弁の弁膜症による心不全患【結果】CSA‑AI は左室駆出率（LVEF，r＝‑0.317；

者（New York Heart Association Ⅱ度，またはⅢ，左房径（LAD，r＝0.361；p＝0.041），肺動
p＝0.004）度）150名を対象に睡眠時ポリグラフィー（PSG），心脈楔入圧（PCWP，r＝0.632；p＜0.001），肺動脈圧

臓超音波，右心内圧検査を行い，PSG は，無呼吸・低（PAP，r＝0.423，p＝0.006）との相関を認めたが，呼吸の睡眠１時間あたりの回数を apnea hypopnea

OSA‑AI は 相 関 が な か っ た。ま た，術 後 に PCWP

index（AHI）として測定した。まず，心不全と SAS（14.8±7.9 to 9.7±5.3mmHg，p＜0.001），PAP（OSA および CSA）との関連を調査し，つづいて重（21.4±8.4 to 15.8±5.2mmHg，p＜0.001），AHI症 SAS（AHI＞20）で外科的弁治療を行った74名に（40.3±14.4to 31.9±21.1，p＝0.002），およびCSA‑AI

おいて術後検査を行い，OSAおよび CSAへの効果を（9.0±12.0 to 1.0±2.9，p＜0.001）は有意に改善

解析した。

したが，OSA‑AI は改善がなかった（11.0±9.2 vs.

１．CSA‑apnea index（AI）は左室駆出率，左房径，11.9±12.1，p＝0.712）。心不全を伴う重症弁膜症症

肺動脈楔入圧（PCWP），肺動脈圧（PAP）と相関

例への外科的弁加療により，心機能の改善とともにを認めたが，OSA‑AI は相関がなかった。心機能

CSA のみに改善がみられた。

低下を示すパラメーターと CSA‑AI とに関連が認【考察】本研究では，心不全を伴う重症弁膜症患者にめられた。

対し，PSG，心臓超音波検査，および右心カテーテル

２．手術により，PCWP，PAP，AHI，およ び CSA‑

検査を施行し，OSAおよび CSAとの関係について調

AIは有意に改善したが，OSA‑AIは改善がなかった。

査し，さらに，弁への外科治療の OSA および CSA

以上の結果より，心不全患者では circulation delay

への影響を検討した。心不全と OSAおよび CSAとのや cardiac ﬁlling pressure の 増 大，CO2 sensitivity

関係では，心機能低下のパラメ ー タ ー と CSAと のの増加などから呼吸の制御が不安定化し，チェーンス

関連を認めたが，OSA とは認められなかった。この

トークス呼吸を特徴とする CSA の出現につながるとことは心不全により生じるcirculation delayやcardiac

考えられた。また，外科的弁治療によって上記の機序

ﬁlling pressure の増大，CO2 sensitivityの増加などが影響を受け，心不全の改善とともに CSA のみ改善

から呼吸の制御が不安定化し，チェーンストークス呼した結果が得られたと推測される。

吸を特徴とする CSA の出現につながるものと考えら

本研究により，阿部らは重症弁膜症を持つ患者の心れる。また，外科的弁治療によって上記の機序が影響

機能と CSA との関連を確認し，更に，外科的弁治療を受け，心不全の改善とともに CSA が改善したもの

にて心機能の改善に伴って CSA のみ有意に改善すると推測される。

ことを示した。これまで，心不全と SAS の関連につ【結論】本研究により，重症弁膜症を持つ患者の心機いてはいくつか報告はあるが，心不全をもつ心疾患へ230

信州医誌 Vol. 58

審査学位論文要旨の外科的治療の SAS の影響を検討した報告はない。

標準であり，当科でも標準としている140〜200mg/㎡

阿部らの研究により心不全が改善すれば CSA も改善を，患者の臓器障害の程度に基づいて選択して用いた。

することが明らかになり，臨床的にも重要な知見であ治療の前後で，アミロイド前駆蛋白である血清中の遊ると考えられる。よって，主査，副査は一致して本論

離免疫グロブリン軽鎖（free light chain：FLC）の文を学位論文として価値があるものと認めた。

濃度，臨床症状，多発ニューロパチー重症度スコア，
神経生理検査所見，生検組織上のアミロイド沈着量等

Primary AL amyloid polyneuropathy successfully treated with high‑dose melphalan
followed by autologous stem cell transplantation（自己末梢血幹細胞移植併用大量
メルファラン療法が有効であった原発性 AL
アミロイドポリニューロパチー症例）
加

藤

修

明

を経時的に比 検討した。重症度スコアは当科で家族性アミロイドポリニューロパチー患者の評価に用いている Scoring scale for the symptoms of ATTR
Val30M et FAP patients を用いた。
【結果】患者１は女性。40歳時に足底のしびれ感が出
現し，42歳時より交代性の便秘・下痢症状と歩行困難が出現。しびれの範囲も大腿部まで拡大し，43歳時に当科受診。沈着アミロイドは通常の免疫染色に陰性で（論文の内容の要旨）

当初診断が困難であったが，神経生検組織検体よりア【背景，目的】原発性全身性 AL アミロイドーシスは，

ミロイド蛋白を抽出後，アミノ酸分析を行うことによplasma cell dyscrasia（形質細胞異常症）に伴う全身り ALλの沈着を証明し，原発性全身性 AL アミロイ性疾患で，異常形質細胞クローンの産生する免疫グロ

ドーシスと診断し得た。神経学的には自律神経障害に

ブリン軽鎖がアミロイドとして全身に沈着することに伴う便秘・下痢症状，および下肢の感覚障害と筋力低より発症する。ネフローゼ症候群，うっ血性心不全，下，およびそれに伴う歩行障害を認め，杖歩行であっ肝障害等の多臓器障害を呈し，無治療の場合，診断後た。メルファラン140mg/㎡を用いた HDM /SCT 治

余命は１〜２年と予後不良な疾患である。原発性 AL療を施行したが 蛋白が残存したため，メルファラン

アミロイドポリニューロパチーは，原発性全身性 AL

200mg/㎡を用いた再治療を行った。その結果，アミロイドーシスの約17％に見られ，耐えがたい四

白は微量に残存しているものの血清 FLC は基準値内

肢のしびれや筋力低下に伴う歩行障害に加え，自律神

まで減少して推移し，治療後２年現在まで臓器障害の経ニューロパチーに伴う便秘・下痢や起立性低血圧な悪化を認めていない。減少した体重も回復し，全身状どを呈し，患者の生命予後はもとより QOL も大きく態は改善している。神経学的には，下肢のしびれ感は損なう病態である。原発性全身性 AL アミロイドーシ

やや減弱したのち残存しているものの筋力は改善傾向

スに対する治療と同様に，自己末梢血幹細胞移植を併で，杖なし歩行が可能となり，便秘・下痢症状は消失

用した大量メルファラン療法（high‑dose melphalan

している。胃粘膜生検上もアミロイド沈着の減少を認

followed by stem cell transplantation：HDM /SCT）

めている。重症度スコアは total 14点から８点に改善が有効であり，２例の有効例の報告や，37％のニューした。神経生理学的には，神経伝導検査において正中

ロパチー患者で臨床的改善が見られたとする報告があ

神経の振幅，伝導速度ともに改善傾向を認めている。

る。しかしいずれも血液内科領域からの報告であって，患者２は米国人男性。46歳時に足底のしびれ感が出現

神経生理学的側面まで含めて検討された報告はこれまし，47歳時に同症状の範囲が大腿部まで拡大した。上でにない。そこで今回我々は原発性 AL アミロイドポ

肢先端のしびれ感と腎機能低下も出現し，48歳時に当リニューロパチー患者２名に対して HDM /SCT 治療科受診。原発性全身性 AL アミロイドーシスと診断さを施行し，その臨床的，血液学的評価に加えて，初めれた。神経学的には上下肢の耐えがたいしびれ感を認て詳細な神経生理学的検討も行い，報告した。

め，麻薬性鎮痛薬を要した。感覚障害も強く，下肢の【対象と方法】対象は当科にて原発性全身性 AL アミ

温度覚は高度に低下していた。メルファラン140mg/

ロイドーシスと診断された患者のうちポリニューロパ㎡を用いた HDM /SCT 治療を施行したところ

チーを主症状とし，臓器障害評価の結果 HDM /SCTは消失（完全寛解）し，血清 FLC も基準値内まで減治療の適応と判断された原発性 AL アミロイドポリニ

少して推移し，現在まで臓器障害の悪化なく経過してューロパチー患者２名。
メルファランの用量は，世界的いる。神経学的には下肢のしびれ感および温度覚障害

No. 5, 2010

蛋

蛋白

231

審査学位論文要旨の改善傾向を認めている。重症度スコアは total 10点色に陰性で当初診断が困難であったが，生検組織よりから４点に改善した。神経生理学的には，神経伝導検

アミロイドを抽出後，アミノ酸分析を行うことにより査において正中神経の振幅の悪化の停止および伝導速

ALλの沈着を証明し，原発性全身性 ALアミロイドー

度の改善傾向を認めている。

シスと診断し得た。神経学的には自律神経障害に伴う【考察，結語】原発性 AL アミロイドポリニューロパ

便秘・下痢症状，および下肢の感覚障害と筋力低下，

チー患者２名に対して HDM /SCT 治療を施行し，１

およびそれに伴う歩行障害を認め，杖歩行であった。

名で完全寛解（２回の HDM /SCT 治療の結果，蛋白の消失）を得て，両名で FLC

蛋白は微量に残存の正常化を認めた。いずれの患者でも重症度スコアおしたが血清 FLC は基準値内まで減少した。神経症状

よび神経症状の改善傾向を認めている。患者１では，は改善して杖なし歩行が可能となり，体重も回復した。

蛋白が消失していないにも関わらず臨床的改善が得

胃粘膜生検上もアミロイド沈着の減少傾向を確認。重られている。これは血清中の FLC そのものが臓器に症度スコアは total 14点から８点に改善し，神経伝導

対して toxic に作用しているという過去の報告や，一検査では正中神経の振幅，伝導速度ともに改善傾向を度沈着した AL アミロイドも治療により turn over し認めた。患者２は48歳男性。上下肢の耐えがたいしび得るという当科からの報告に合致しており， 蛋白のれ感を認め麻薬性鎮痛薬を要し，感覚障害も強く下肢の消失と同様に FLC を正常域に保つことが AL アミロ

温度覚は高度に低下していたが，１回の HDM /SCT

イドーシスの進行抑制あるいは改善に重要であること

治療にてを示している。また，２例と少数であるため有意差を

基準値内まで低下した。神経症状は改善して重症度ス

証明することはできないが，神経伝導検査という客観

コアは total 10点から４点となり体重も回復し，神経的な指標において，両症例で悪化の停止あるいは改善

伝導検査では正中神経の振幅の悪化の停止および伝導傾向を示し得たことは，本来進行性であるはずの原発

速度の改善傾向が得られた。

蛋白は消失（完全寛解）し，血清 FLC も性 AL アミロイドーシスにおいて非常に意義のあるこ

以上，原発性 AL アミロイドポリニューロパチーにとであり，今後さらに多数例で検討される必要がある。

対する HDM /SCT 治療において，臨床症状と重症度（論文審査の結果の要旨）
原発性全身性 AL アミロイドーシスは，plasma cell

スコアの改善とともに，初めて神経生理学的検査においても悪化の停止あるいは改善が認められることを明dyscrasia（形質細胞異常症）に伴う全身性疾患で，らかにした。特に患者１では血清中の蛋白消失が得

異常形質細胞クローンの産生する免疫グロブリン軽鎖られずとも臨床的な改善が得られることを明らかにし，がアミロイドとして全身に沈着することにより多臓器

これにより，ゼロでなくとも 蛋白の産生を一定量以障害を呈し，余命１〜２年と予後不良な疾患である。

下に抑えることで沈着したアミロイドが代謝回転によ

原発性 AL アミロイドポリニューロパチーは，原発性り消退し得る可能性や，血清中の FLC そのものも神全身性 AL アミロイドーシスの約 17％に見られ，耐経に対して toxic に作用している可能性を，初めて電えがたい四肢のしびれや筋力低下に伴う歩行障害に加

気生理学的検査という客観的指標をもって示唆した。

え，自律神経ニューロパチーに伴う便秘・下痢や起立

これらの結果は原発性 AL アミロイドポリニューロ性低血圧などを呈し，患者の生命予後はもとより QOL

パチーの病態解明に寄与する新しい知見であり，学位も大きく損なう病態である。原発性全身性 AL アミロ

論文として十分価値のあるものと主査，副査は一致しイドーシスに対する治療と同様に，自己末梢血幹細胞て認めた。

移植を併用した大量メルファラン療法（high‑dose
melphalan followed by stem cell transplantation：
HDM /SCT）が有効であるが，神経生理学的側面まで含めて検討された報告はこれまでにない。そこで原
発性 AL アミロイドポリニューロパチー患者２名に対して HDM /SCT 治療を施行し，その臨床的，血液学的評価に加えて，初めて詳細な神経生理学的検討を行った。
患者１は43歳女性。沈着アミロイドは通常の免疫染232

信州医誌 Vol. 58

審査学位論文要旨【結果】４カ月間のインターバル速歩トレーニング中，

Physical ﬁtness and indices of lifestyle‑related diseases before and after interval
walking training in middle‑aged and older
males and females（中高年者におけるイン
ターバル速歩トレーニングの体力・生活習慣病指標改善効果）森川

脱落者は43名（男性11名，女性32名）であり，残りの783名は４カ月間のトレーニングを完遂した。
したがって，継続率は94％と高比率であった。トレーニングの実施状況は，男女ともに１日の平均速歩時間は25分
で，４日/週であった。トレーニング前では，男女ともに VOの低値群で高値群に比べ脚伸展・屈曲筋

力，HDL コレステロールが低かったが（Ｐ＜0.05），

真悠子

逆に，BMI，体脂肪率，血圧，BG は高かった（Ｐ＜（論文の内容の要旨）

0.05）。トレーニング後では，男女共すべての群で，【背景と目的】従来，体力と生活習慣病（LSD）とのVO

因果関係が指摘されている。しかし，これらの研究は

体脂肪率，SBP，DBP，BG が低下した（Ｐ＜0.05）。

横断的研究にとどまり，実際，大勢の中高年者を対象

しかし，これらの変化量は，男女とも VOに一定期間運動トレーニング介入を行い，その際の体群で最も大きかった。さらに，トレーニング前後の力の増加量と生活習慣病指標（LSD スコア）改善度

VOと LSD ス コ ア を 男 女 別 に プ ー ル す る と，との関係を明らかにした研究はほとんどない。そこで，

VOと LSD スコアとの間に負の相関関係を認め我々は，「中高年者におけるインターバル速歩トレーた（男女とも，Ｐ＜0.001）。すなわち，トレーニング

ニングによる最高酸素摂取量（ VO

前の LSD スコアは VO）の増加と生，
脚伸展・屈曲筋力が上昇し（Ｐ＜0.05），逆に，の低値の低い被験者ほど高く，

活習慣病指標改善に密接な関係があるのではないか」

さらにトレーニングによって VOという仮説を立て，検証した。

ど VO【方法】2005または2006年の４〜９月の期間で，松本

コアが低下した。

市熟年体育大学に参加した826名（男性246名，女性【結論】中高年者において，４カ月間のインターバル

580名，平均年齢65歳）を対象とした。まず，トレー

速歩トレーニングによる VO

ニング前に彼らの体重，体脂肪率，血圧， VO

指標改善度との間に密接な関係があることが示唆され，

等尺性脚伸展・屈曲筋力，血液成分を測定し，その後，彼らに VOの70％強度以上の速歩と普通歩行を交互に３分ずつ繰り返す「インターバル速歩」を，週４日以上を目標に実施させた。 VOの低い被験者ほが増加し，その増加量に比例して LSD スの増加と生活習慣病

た。
（論文審査の結果の要旨）
従来，体力と生活習慣病（LSD）との因果関係がは，運動量計測

指摘されている。しかし，これらの研究は横断的研究

器（熟大メイト）を用いて計測し，その70％を目標にとどまり，実際，大勢の中高年者を対象に一定期間

運動強度とした。トレーニング後に再度トレーニング

運動トレーニング介入を行い，その際の体力の増加量

前と同じ項目について測定を行い，その効果を判定しと生活習慣病指標（LSD スコア）改善度との関係をた。解析対象は，トレーニング前後ですべての項目に明らかにした研究はほとんどない。そこで，我々は，ついて測定を実施した男性198名，女性468名の計666「中高年者におけるインターバル速歩トレーニングに名とした。仮説を検証するために，男女別に，初期のよる最高酸素摂取量（ VOVOの値の低い方から低値群，中値群，高値群の３群にそれぞれ人数が等しくなるように分けた。また，）の増加と生活習慣病

指標改善に密接な関係があるのではないか」という仮説を立て，検証した。

LSD スコアを評価するために，厚労省の「特定健康松本市熟年体育大学に参加した男性198名，女性468

診査・特定保健指導のガイドライン」にしたがって，名の計666名を解析対象とした。トレーニング前に彼

１）最高血圧（SBP）130≧mmHg あるいは最低血圧

ら の 体 重，体 脂 肪 率，血 圧， VO（DBP）≧85mmHg，２）血糖値（BG）≧100mg/dl，

展・屈曲筋力，血液成分を測定し，その後，４カ月間

３）BMI≧25kg/㎡，４）中性脂肪（TG）≧150mg/dlの「インターバル速歩」を，週４日以上を目標に実施

あるいは HDL コレステロール（HDL‑C）≦40mg/dl，させた。トレーニング後に再度トレーニング前と同じの条件のどれかに該当すれば１点加算とし，計４点満

項目について測定を行い，その効果を判定した。仮説

点として，トレーニング前後で比 した。

を検証するために，男女別に，初期の VO

No. 5, 2010

，等 尺 性 脚 伸

の値の
233

審査学位論文要旨

低い方から低値群，中値群，高値群の３群にそれぞれ

inoculated with H. pylori isolate (Sydney strain);

人数が等しくなるように分けた。また，LSD スコア

sacriﬁced 2, 10, and 16 weeks after inoculation,を評価するために，厚労省の「特定健康診査・特定保bacterial load, degree of gastritis, and mucosal

健指導のガイドライン」にしたがって，１）最高血圧

levels of inﬂammatory cytokines were analyzed and（SBP）130≧mmHg あるいは最低血圧（DBP）≧85

compared with those obtained from wild‑type mice.

mmHg，２）血 糖 値（BG）≧100mg/dl，３）BM I≧RESULTS : We found more prominent H. pylori

25kg/㎡，
４）中性脂肪
（TG）≧150mg/dlあるいはHDL

colonization in ASC‑deﬁcient mice, as revealed by

コレステロール（HDL‑C）≦40mg/dl，の条件のどcolony‑forming unit (CFU) counts, 16 weeks after

れかに該当すれば１点加算とし，計４点満点として，

inoculation. Both groups of mice developed gastri-

トレーニング前後で比 した。

tis;however,ASC‑deﬁcient mice showed signiﬁcant

その結果，森川は次の結果を得た。
１．トレーニング前の LSD スコアは， VO

attenuation of inﬂammation despite high H. pyloriの低い被験者ほど，高かった。
２．トレーニングによって， VO
ど VO

colonization. ELISA, immunohistochemistry andquantitative RT‑PCR analysis revealed completeの低い被験者ほsuppression of IL‑1ß and IL‑18, and substantialが増加し，その増加量に比例して，LSD

reduction of IFN‑γ expression, in ASC‑deﬁcient

スコアが低下した。

mice without apparent upregulation of other cyto-

これらの結果より，中高年者において，４カ月間のkines including IL‑10 and TNF‑α.

インターバル速歩トレーニングによる VOの増加

CONCLUSION :These results as a whole indicateと生活習慣病指標改善度との間に密接な関係があるこthat ASC exerts considerable inﬂuence on the hostとが示唆された。

defense acting through IL‑1ß/IL‑18 and subsequent

よって，最高酸素摂取量（ VO）を指標とした

IFN‑γ production, which in turn contributes to

体力の増加は，生活習慣病予防には大きな意義をもつ

continuous chronic inﬂammatory response and con-

ことを示しており，主査，副査は一致して本論文を学

sequent reduction of H. pylori colonization.

位論文として価値があるものと認めた。

（論文審査の結果の要旨）
Apoptosis associated speck‑like protein contain-

Role of ASC in the mouse model of Helicobacter pylori infection（ヘリコバクターピ
ロリ感 染マ ウ スモデ ルに おけ る ASC の役
割）
BEKALE NGUEMA Benoit

ing a C‑terminal caspase recruitment domain (ASC)is an adaptor molecule activating caspase‑1 that
stimulates pro ‑IL ‑1ß and pro ‑IL ‑18, two
proinﬂammatory cytokines with critical functions
in host defense against a variety of pathogens. In
this study, BEKALE NGUEMA analyzed in details（論文の内容の要旨）

for the ﬁrst time,the in vivo role of ASC protein in

BACKGROUND :Apoptosis‑associated speck‑likethe host defense mechanisms against H. pylori infec-

protein containing a C‑terminal caspase recruit-tion using ASC‑deﬁcient mice.

ment domain (ASC)is an adaptor molecule activat

The results from his study showed that :ing caspase‑1 that stimulates pro‑IL‑1ßand pro‑IL‑

1‑There was a defect in bacterial clearancein ASC‑18, two proinﬂammatory cytokines with critical
functions in host defense against a variety of path-deﬁcient mice.
2‑ H. pylori‑induced gastritis was attenuated inogens.

ASC‑deﬁcient mice, and score for activity was

PURPOSE : In the present study, we investigatedsigniﬁcantly lower compared with ASC wild typethe role of ASC in the host defense against

mice.

Helicobacter pylori utilizing ASC‑deﬁcient mice.

3‑ ELISA, immunohistochemistry and quantitative

MATERIAL AND M ETHODS : In three indepen-

RT‑PCR analysis revealed complete suppression

dent experiments, ASC‑deﬁcient mice were orallyof IL‑1ßand IL‑18, and substantial reduction of234

信州医誌 Vol. 58

審査学位論文要旨

IFN‑γexpression,in ASC‑deﬁcient mice withoutが示された。さらに，トリパンブルー染色により糖

apparent upregulation of other cytokines.

鎖修飾に伴う細胞傷害性について検討したところ，This study demonstrated that ASC exerts consid-

GlcNAc 糖鎖の修飾を行った濃度において，細胞傷害

erable inﬂuence on the host defense acting through性がないことが示された。次に，糖鎖修飾を行った骨IL‑1ß/IL‑18 and subsequent IFN‑γ production,

髄細胞のラット心筋細胞への接着能を両細胞の共培養

which in turn contributes to continuous chronic

系により検討したところ，糖鎖修飾をしていない骨髄inﬂammatory response and consequent reduction of

細胞および M altose 糖鎖を修飾した骨髄細胞と比し，H. pylori colonization.

GlcNAc 糖鎖を修飾した骨髄細胞は高い接着能を示しThis study seems to be valuable to understand theた。さらに GFP（Green Fluorescent Protein）発現

molecular mechanism with reference to infection

ラットから骨髄細胞を採取し，GlcNAc 糖鎖を修飾しand inﬂammation in the future, thus this paper isて心筋細胞と１週間共培養を行い，心筋様となる骨髄

qualiﬁed as a thesis of academic degree.

細胞の割合をフローサイトメトリーにて解析し，同時に共焦点レーザー顕微鏡を用いた，心筋細胞マーカー

Surface coating of bone marrow cells with
N ‑acetylglucosamine for bone marrow
implantation therapy（骨髄細胞移植療法のための N ‑アセチルグルコサミンの骨髄細胞
表面へのコーティング）
小林

聡の免疫染色および GFP との観察による心筋様となる骨髄細胞の確認を行ったところ，GFP 陽性（骨髄細胞由来）の心筋様となる細胞が GlcNAc 糖鎖を修飾した骨髄細胞に多く発現しており，共焦点レーザー顕微鏡観察により，その存在が実際に確認された。
【考察】糖鎖導入試薬を用いることにより，安全かつ簡便に骨髄細胞表面への GlcNAc 糖鎖修飾が可能で（論文の内容の要旨）あることが明らかとなった。さらに骨髄細胞表面に対【目的】近年，難治性心疾患に対する新たな治療法として GlcNAc 糖鎖を修飾することにより，心筋細胞して，骨髄幹細胞を用いた細胞移植治療が注目され，への接着が亢進し，それによってその骨髄細胞の一部

既に一部臨床応用が始まっている。分離した骨髄細胞

は心筋様の細胞となることが示された。このとき，心をそのまま心筋に注入するという現在の移植法は，簡筋細胞へ生着した骨髄細胞が心筋様となるメカニズム便ではあるが，移植した細胞の心筋組織への生着率がが，細胞融合であるか分化であるかという点において低いことが欠点である。以前我々は，細胞骨格タンパ

は更なる検討が必要であり，議論の余地がある。本研

ク質のデスミン，ビメンチンが心筋細胞表面に発現し，究から，骨髄細胞への GlcNAc 糖鎖修飾により，難GlcNAc（N ‑アセチルグルコサミン）糖鎖を認識す

治性心疾患の細胞移植効果が向上することが期待される機能を持つことを報告している。そこで本研究では，る。

骨髄細胞を効率良く心筋組織へ集積させることを目的（論文審査の結果の要旨）に，骨髄細胞表面にGlcNAc糖鎖を修飾することによ

近年，難治性心疾患に対する新たな治療法として，り，骨髄幹細胞と心筋細胞との接着を始めとする相互

骨髄幹細胞を用いた細胞移植治療が注目され，既に一作用が増強するかについて検討した。

部臨床応用が始まっている。分離した骨髄細胞をその【方法および結果】今回使用した骨髄細胞はラット大まま心筋に注入するという現在の移植法は，簡便では腿骨より採取した。この骨髄細胞と糖鎖高分子 PV

あるが，移植した細胞の心筋組織への生着率が低いこ（poly N‑p‑vinylbenzyl）‑GlcNAc にアルキル基を導とが欠点である。以前小林聡らのグループは，細胞骨入したポリマー（GlcNAc 導入試薬）とを混合して反格タンパク質のデスミン，ビメンチンが心筋細胞表面

応させ，細胞表面への人工的な糖鎖修飾を行った。そに発現し，GlcNAc（N ‑アセチルグルコサミン）糖して，これらの骨髄細胞を GlcNAc 結合レクチンで鎖を認識する機能を持つことを報告している。そこである sWGA（succinylated wheat germ agglutinin）

本研究では，骨髄細胞を効率良く心筋組織へ集積させを用いて染色し，フローサイトメトリーにて骨髄細胞ることを目的に，骨髄細胞表面に GlcNAc 糖鎖を修

表面の GlcNAc 修飾を解析したところ，骨髄細胞表飾することにより，骨髄幹細胞と心筋細胞との接着を面に対して人工的に GlcNAc 糖鎖を修飾できること始めとする相互作用が増強するかについて検討した。

No. 5, 2010235

審査学位論文要旨

今回使用した骨髄細胞はラット大腿骨より採取した。
この骨髄細胞と糖鎖高分子 PV（poly N‑p‑vinylbenzyl）‑GlcNAcにアルキル基を導入したポリマー（GlcNAc
導入試薬）とを混合して反応させ，細胞表面への人工的な糖鎖修飾を行った。そして，これらの骨髄細胞を
GlcNAc 結 合 レ ク チ ン で あ る sWGA（succinylated
wheat germ agglutinin）を用いて染色し，フローサ
イトメトリーにて骨髄細胞表面の GlcNAc 修飾を解Diﬀerentiation of smooth muscle cells
from human amniotic mesenchymal cells
implanted in the freeze‑injured mouse urinary bladder（凍結障害マウス膀胱におけるヒト羊膜間葉系細胞の平滑筋への分化）
皆

川

倫

範

析した。このとき，トリパンブルー染色により糖鎖（論文の内容の要旨）修飾に伴う細胞傷害性についても検討した。次に，糖【背景と目的】ヒト羊膜間葉系細胞（HAMCs）は多鎖修飾を行った骨髄細胞のラット心筋細胞への接着

分化能があり，再生材料としての可能性が報告されて能を両細胞の共培養系により検討した。さらに GFPいる。今回我々は凍結障害マウス膀胱の組織学的およ（Green Fluorescent Protein）発現ラットから骨髄細び機能的再生における HAMCs の役割について，免胞を採取し，GlcNAc 糖鎖を修飾して心筋細胞と１週

疫組織学的解析及び筋条片実験による機能的解析によ間共培養を行い，心筋様となる骨髄細胞の割合の解析

り明らかにした。

を行った。

【材料および方法】HAMCs を羊膜から分離し，培養その結果，小林聡は次の結論を得た。

した。凍結障害を受けた３日後のヌードマウスの膀胱

１．GlcNAc 導入試薬を用いることで，細胞に傷害を筋層に，培養した HAMCs を注入した。凍結障害は与えることなく，骨髄細胞表面に対して人工的に

ドライアイスで冷却した金属棒を膀胱後壁に30秒間接

GlcNAc 糖鎖を修飾出来た。

することにより作成した。細胞移植群は障害部位を中２．In vitro の検討において，人工的に GlcNAc 糖鎖

心に細胞を移植した。コントロール群は培養液を注入を修飾した骨髄細胞は，心筋細胞に対して高い接着することにより作成した。細胞移植の１，２，４，６週

能を示した。

間後に膀胱を摘出した。摘出した膀胱は α smooth

３．骨髄細胞に GlcNAc 糖鎖を修飾することによっmuscle actin（SMA）を用いて免疫組織学的解析をて，心筋細胞に対する生着能と，その生着した骨髄行った。組織中の HAMCs はヒト抗核抗体（HuNu）

細胞における骨髄細胞由来の心筋様細胞となる割合

を用いて検出した。また，筋条片実験を行い，高濃度が上昇した。

カリウム（124mM ）とコリン作動薬であるカルバコー

これらの結果より，骨髄細胞に対して，人工的なルによる収縮反応を解析した。

GlcNAc糖鎖修飾が可能であることが示された。骨【結果】１週間後の細胞移植群では，マウス膀胱筋層

髄細胞移植療法において，骨 髄 細 胞 表 面 に 対 す る

内に HuNu 陽性の HAM Cs を認めた。HAMCs は培

心筋組織へのターゲッ
GlcNAc糖鎖を修飾するにより，養の段階では HuNu に陽性で，SMA に陰性であっティングと高い生着が得られ，難治性心疾患の細胞治た。しかし，組織中の HAMCs は SMA 陽性細胞に療効果が向上することが期待される。今後の再生医療

分化していた。２から４週間かけてマウス膀胱筋層内にも非常に貢献する内容であり，主査，副査は一致しの HAM Cs はより緻密な筋層を形成するようになって本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

た。１週間後のコントロール群では，凍結障害の部位の筋層は脆弱で，SMA 陽性細胞はわずかであった。
６週かけて徐々に膀胱筋層が回復したが，細胞移植群
では早期に回復した。また，高濃度カリウム刺激による膀胱の収縮力は，正常膀胱に比 し１週間後の両群で著しく減弱した。しかし，細胞移植群の収縮力の減弱は，コントロール群に対して軽度であった。また，コントロール群の収縮力は６週までに回復したが，その回復過程は細胞移植群よりも緩徐であった。カルバ
コールに対する収縮力は同様に減弱したが，高濃度カ236

信州医誌 Vol. 58

審査学位論文要旨

リウムでの収縮力に対する比率はどの時点でも変化し

胱の組織学的および機能的回復を早期に促した。

なかった。凍結障害による収縮力の減弱は，コリン受４．凍結障害による膀胱収縮力減少の機序は，主に平容体の減少に伴った変化ではなく，細胞数の減少に伴っ

滑筋細胞数減少が関与することが示された。

たものであり，HAMCsは膀胱平滑筋細胞数の維持に５．移植された HAM 細胞は，障害後の平滑筋細胞関与して収縮力の減弱を軽度にし，早期回復を促した

数を維持することにより，膀胱収縮力の早期回復に可能性がある。

寄与した。

【結論】細胞移植群の凍結障害マウス膀胱は，組織学

これらの結果より，障害を受けた膀胱に対して，的および機能的にコントロール群より早期に回復した。

HAM 細胞注入療法が有効な治療となる可能性が示唆

HAMCs の尿路における再生材料としての可能性がされた。よって，主査，副査は一致して本論文を学位示唆された。

論文として価値があるものと認めた。

（論文審査の結果の要旨）
ヒト羊膜間葉系細胞（HAM Cs）は多分化能があり，再生材料としての可能性 が 報 告 さ れ て い る。今 回
HAMCs を凍結障害マウス膀胱に移植し，尿路での治療的役割に関して検討した。
凍結障害の３日後に HAMCs を移植し，移植１，
２，４，６週間後に免疫組織学的検討および機能的検討を行った。免疫組織学的検討では，ヒト抗核抗体

Coagulation activity is increased in the left
atria of patients with paroxysmal atrial
ﬁbrillation during the non‑paroxysmal
period ‑Comparison with chronic atrial
ﬁbrillation‑（発作性心房細動症例の非発作時における左房内凝固亢進‑慢性心房細動症
例との比 検討‑）（HuNu）と α smooth muscle actin（SMA）を用い元て検討した。また機能的検討においては，筋条片実験を行い，高濃度カリウム（124mM ）とコリン作動薬であるカルバコールによる収縮反応を解析した。

木

博

彦

（論文の内容の要旨）【目的】本研究では発作性心房細動症例の非発作時

１週間後の細胞移植群では，マウス膀胱筋層内に（洞調律時）における凝固活性評価を目的とし，発作

HuNu 陽性の HAMCs を認めた。また，HAM Cs は性心房細動患者の左房内の凝固線溶マーカーと血小板SM A 陽性細胞に分化していた。２から４週間かけて機能を測定し，慢性心房細動症例と比マウス膀胱筋層内の HAMCs はより強固な筋層を形【方法】心房細動に対するカテーテルアブレーション

成するようになった。１週間後のコントロール群では，治療患者20例（発作性心房細動症例10例，慢性心房細凍結障害の部位の筋層は脆弱で，SM A 陽性細胞はわ

動症例10例）を対象とした。入院後抗凝固療法を中止

ずかであった。６週かけて徐々に膀胱筋層が回復した

し，心臓超音波検査にて心機能を評価し，経食道超音が，細胞移植群では早期に回復した。また，高濃度カ波検査で左房内血栓を認めないことを確認した。入院

リウム刺激による膀胱の収縮力は，１週間後の両群で５日目に右鼠径静脈アプローチにて，ブロッケンブロー

著しく減弱した。しかし，細胞移植群の収縮力の減弱

針を右房内へ挿入。心臓内超音波ガイド下に心房中隔は，コントロール群に対して軽度であった。また，コ穿刺を施行し，左房内へカテーテルを挿入後，速やかントロール群の収縮力は６週までに回復したが，そのに左房内血液の採取を行った。採取された検体につい回復過程は細胞移植群よりも緩徐であった。
カルバコーて，トロンビン・アンチトロンビン III 複合体，α2プルに対する収縮力は同様に減弱したが，高濃度カリウ

ラスミンインヒビター・プラスミン複合体，血小板

ムでの収縮力に対する比率はどの時点でも変化しなかっ第４因子を測定し，発作性心房細動群と慢性心房細動た。

群で凝固線溶状態，血小板機能，臨床背景を比 検討

その結果，皆川倫範は次のような結論を得た。

検討した。

した。

１．凍結障害マウス膀胱に移植された HAM 細胞は，

【結果】左房血のトロンビン・アンチトロンビン III

膀胱壁内に生着し移植６週間後にも残存していた。

複合体値は発作性心房細動群，慢性心房細動群いずれ

２．生着したHAM 細胞は，マウス膀胱平滑筋細胞へも高値を示し，両群間で有意差を認めなかった。α2と分化し，膀胱壁を構成していた。
３．移植された HAM 細胞は障害を受けたマウス膀
No. 5, 2010

プラスミンインヒビター・プラスミン複合体値は両群共に正常値であり，有意差も認められなかった。血小237

審査学位論文要旨

板第４因子活性は両群で軽度上昇傾向を認めたが，やはり両群間で有意差は認められなかった。
【考察】本研究では，発作性心房細動症例の洞調律時

２．PIC は両群共に平均値が正常範囲内であり，有意差も認められなかった。
３．PF4活性は両群で軽度上昇傾向を認めたが，やはにおける左房内凝固活性亢進が初めて証明された。過り両群間で有意差は認められなかった。

去の発作性心房細動例の凝固活性上昇を報告した研究

これらの結果より，発作性心房細動症例の洞調律時

は，末梢静脈より検体が採取されており，左房内でのにおける左房内凝固活性亢進が証明された。本研究で凝固活性を評価した研究はこれまでにない。

示された左房内凝固亢進は，心房細動症例の血栓予防

発作性心房細動症例においては，非発作時であってに抗凝固療法が，抗血小板薬治療より有効であるとす

も左房内凝固活性は慢性心房細動症例と同等に亢進しる過去の研究データを裏付けるものであった。これまており，このことから心房細動患者においてはたとえ

でに，左房内での凝固活性を評価した研究はなく，局非発作時であっても抗凝固療法が適応となることが示所における凝固亢進が，血栓形成の一因であることがされた。一方，血小板活性については軽度上昇にとど初めて示唆された。発作性心房細動症例においては，

まっており，これら患者の血栓の予防には抗血小板薬

非発作時であっても左房内凝固活性は慢性心房細動症

よりも抗凝固薬が望ましいと考えられた。

例と同等に亢進しており，非発作時であっても抗凝固（論文審査の結果の要旨）

療法が適応となることが示された。

心房細動は血栓塞栓症のリスク因子として広く認識

心房細動に対する抗凝固療法に関する重要な知見でされているが，血栓形成の機序は明らかでない。これあり，主査，副査は一致して本論文を学位論文としてまでは，心房細動後の有効な心房収縮の消失によって価値があるものと認めた。

血栓形成が促されると考えられてきたが，一般に，血管内における血栓形成は，内皮機能異常や凝固異常の関与が認められる。過去に発作性心房細動症例で，洞調律時に虚血性脳卒中を発症したことが報告されており，AFFIRM 研究においても，洞調律維持群における虚血性脳卒中の発症は少なくなかった。今回，元木らは発作性心房細動症例の非発作時（洞調律時）における左房内凝固活性，線溶活性，血小板機能を評価し，慢性心房細動症例と比 検討を行った。

Adrenomedullin in sinusoidal endothelial
cells play protective roles against cold
injury of liver（肝類洞内皮細胞においてア
ドレノメデュリンは，肝臓の冷傷害に対して保護的に働く）飯沼伸佳（論文の内容の要旨）

症例は心房細動に対するカテーテルアブレーション

肝移植の際，ドナー肝を一時的に保存する方法とし

予定患者20例（発作性心房細動10例，慢性心房細動10て，University of Wisconsin（UW ）solution を用い例）。心臓超音波検査にて心機能を評価し，経食道超た冷処理がとられている。しかしながら，根本的な，音波検査で左房内血栓を認めないことを確認した。抗

虚血再灌流障害の抑制にはなっておらず，より確実な凝固療法中止後５日目に右鼠径静脈アプローチにて，臓器保護法の確立が待たれている。

ブロッケンブロー針を右房内へ挿入。心臓内超音波ガ

アドレノメデュリンは，血管を始め全身の組織で広イド下に心房中隔穿刺を施行し，左房内へカテーテル

範に産生される生理活性ペプチドである。当初，AMを挿入後，速やかに左房内血液の採取を行った。採取は強力な血管拡張作用を有する血管作動性物質としてされた検体について，トロンビン・アンチトロンビン

注目されたが，それ以外にも多彩な生理活性を有する，α2プラスミンインヒビター・プラ
III 複合体（TAT）

ことが報告されている。
我々は，
エンドトキシンショッ

スミン複合体（PIC），
血小板第４因子
（PF4）
を測定し，

クモデルで AM 過剰発現マウスが肝障害に対し強い発作性心房細動群と慢性心房細動群で凝固線溶状態，

抵抗性を示し，生存率が高いことを報告した。そこで

血小板機能，臨床背景を比本研究では AM による肝保護作用のメカニズムと，検討した。

その結果，元木らは以下の結果を得た。

臓器冷保存への有効性について検討を進めた。

１．左房血の TAT 値は発作性心房細動群，慢性心房

まず，マウス肝臓から，two step collagenase per-

細動群いずれも高値を示し，両群間で有意差を認め

fusion and centrifugation method により，各細胞分なかった。

画の初代培養を行った。肝類洞内皮細胞（LSEC）に238

信州医誌 Vol. 58

審査学位論文要旨

特徴的なfenestration構造や，LSECの機能であるエンとして重要であり，類洞内皮細胞における AM の有ドサイトーシスの検討により，分離細胞の純度を検討

効性が期待される。

したところ，本法での非実質細胞分画の90％以上が（論文審査の結果の要旨）

LSEC であることが確認できた。初代培養 LSEC に肝移植の際，ドナー肝を一時的に保存する方法とし

おいて，AM 関連遺伝子の発現を検討したところ，て，University of Wisconsin（UW ）solution を用い

AM ，及びその受容体である CRLR，AM 受容体活性た冷処理がとられている。しかしながら，根本的な，調節タンパク RAM P2，3が，極めて強く発現してい虚血再灌流障害の抑制にはなっておらず，移植の適応ることを確認した。一方，肝実質細胞（HC）では，拡大の可能性を含め，より確実な臓器保護法が期待さ

AM とその関連因子は，殆ど発現が認められなかっ

れている。

た。

以前に，飯沼らのグループは，
エンドトキシンショッ

次に，AM の外因性投与が，LSEC に与える影響

クモデルでアドレノメデュリン（AM ）過剰発現マウの検討を進めた。WST assayによる細胞生存率の評

スが肝障害に対し強い抵抗性を示し，生存率が高いこ

価では，冷傷害モデルにおいて，AM （0.1 μM ）処とを報告した。ＡＭの生理活性には抗炎症作用があり，理は，LSEC の生存率を有意に改善させた。また内皮

このことが上記の結果に結びついたと思われる。近年，細胞の傷害マーカーとして，LSEC 培養上清中の An-

虚血再灌流障害は免疫応答の推移として捉えられ，炎nexin V 陽性の EMP（endothelial micro particle）

症性サイトカイン，接着分子，自然免疫などが強く関を，FACS にて評価したところ，AM 処理により，係するとされている。そのことに注目し，AM の肝冷LSEC からの EMP 放出が有意に抑制されることが確

傷害に対する保護的作用を検討した。

認された。

まず，肝臓での AM 及びレセプターの発現につい

冷処理による臓器傷害には，血球細胞接着に始まるて確認し，類洞内皮細胞に対する作用を検討した。類炎症反応も大きく関与している。そこで次に，GFP

洞内皮の冷処理におけるＡＭの保護的作用を検討し，

ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス よ り，Buﬀy coat 分 画

さらに，炎症性サイトカイン，接着分子の発現を検討（白血球＋血小板分画）を採取し，GFP 蛍光を利用しした。GFP マウス由来の白血球，血小板を用い，類て，培養 LSEC への接着性を，FACS 及び蛍光顕微鏡

洞内皮細胞への接着性も検討した。また，肝冷処理でにて検討した。AM の投与により，白血球の LSECの AM 投与の有用性を TUNEL 染色，免疫染色を用への接着は有意に抑制された。更に AM 投与により，い検討した。

冷処理した LSEC の ICAM ‑1，VCAM ‑1などの炎症

その結果，飯沼伸佳は次の結果を得た。

関連接着分子の発現は抑制され，TNF‑α，IL‑1ß，

１．肝臓でのアドレノメデュリン及びそのレセプター

IL‑6などの炎症性サイトカインの発現も抑制された。

は類洞内皮細胞を主体とした非実質細胞で発現して最後に，ドナー肝の冷保存による組織傷害を想定しいる。

て，マウスを麻酔下で開腹後，門脈からカニュレーショ

２．アドレノメデュリンは類洞内皮細胞のアポトーシンを行い，肝臓を University of Wisconsin solution

スを抑制し，冷処理での細胞減少を抑制した。

で灌流処理後，肝臓を摘出して冷保存（４℃，30hr）

３．アドレノメデュリンは冷処理によって亢進する類を行い，病理組織所見の検討を行った。AM 及び，洞内皮細胞での炎症性サイトカイン，接着分子の発野生型マウスに比RAM P2ノックアウトマウスでは，現を抑制し，白血球，血小板の接着も抑制した。

して肝臓のアポトーシスの増悪が認められたが，AM

４．肝臓に対する冷処理でもアポトーシスや接着分子を灌流したものでは，アポトーシスが抑制されることの発現を抑制した。

が観察された。また AM 灌流群では，肝臓の脈管系

これらの結果より，アドレノメデュリンは肝類洞内における ICAM ‑1，VCAM ‑1の発現が抑制されるこ

皮細胞のアポトーシスや炎症細胞の接着の抑制を介しとも観察された。

て臓器保護作用を発揮していると考えられた。肝類洞以上の結果から，AM は，肝臓類洞内皮細胞のア内皮細胞は移植における肝保護のための治療標的としポトーシスや，炎症細胞接着の抑制を介して，臓器保て重要であり，肝類洞内皮細胞におけるアドレノメ

護作用を発揮していると考えられた。肝臓類洞内皮細デュリンの有効性が示唆された。よって，主査，副査は一胞は，移植におけるドナー肝の保護のための治療標的致して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

No. 5, 2010239

審査学位論文要旨の CD8陽性Ｔ細胞からなる肉芽腫性病変を形成した。

Granulomatous transformation of capillary lesions in pulmonary‑renal syndrome
autologously induced anti ‑glomerularbasement membrane disease in Wistar‑
Kyoto rats（Wistar‑Kyoto ラットにおける
抗 GBM 抗体病により惹起される肺腎症候群の毛細血管肉芽腫性病変）
青

柳

大

樹

（論文の内容の要旨）

Wistar ラットの糸球体にみられる主たる変化は，管内性の細胞集積とメサンギウム融解で，半月体の形成は23.0％の糸球体にとどまった。WKY ラットの肺では巣状の肺出血，単核球の浸潤を伴った肺胞壁の肥厚および肺胞構造の破壊を伴った肉芽腫性病変を認めた。腎臓を用いたreal time RT‑PCR法では，より高度な組織傷害がみられたWKYラットは，Wistarラットと比して有意に高い Th2サイトカイン（IL‑10）mRNA の発現を示した。WKY ラットの Th1サイト
カイン（IFN ‑γ，TNF‑α）の mRNA発現は Wistar【背景と目的】肺腎症候群の特徴は毛細血管の障害をラットと比 して高値を示さなかった。

原因とする肺出血と急速進行性糸球体腎炎である。

【結論】本研究の病理組織学的検討により，肺腎症候

Goodpasture 症候群は肺腎症候群の代表的な疾患の群の肉芽腫性病変はマクロファージの浸潤が優位な毛一つであり，糸球体および肺胞の基底膜に対する抗細血管炎から進展することが示唆された。免疫組織化体によって引き起こされる。Goodpasture症候群の実学的検討では組織傷害部位に CD8陽性Ｔ細胞が観察

験モデルにおいて現在最もよく使用されている WKYされたが，CD4陽性Ｔ細胞はごくわずかしか認めら

ラットは細胞性免疫優位の遺伝的背景を有しているとれなかった。CD8陽性Ｔ細胞が組織傷害に重要な役割推定されているが，細胞性免疫に伴う肺腎症候群の病を果たすと報告されているが，我々が観察した CD8

理組織学的な変化は十分に解析されていない。本研究

陽性Ｔ細胞が糸球体傷害を直接引き起こす細胞であの目的は，ラットに肺腎症候群を惹起して，その病理るのか，あるいは病変を抑制するのかは不明である。

組織学的検討を行い，helper T cell サイトカインのWKY ラットでは Wistar ラットと比関与について明らかにすることである。

な腎臓と肺の組織傷害を認め，WKY ラットは Th1【方法】ウシ の 腎 臓 か ら 得 ら れ た IV 型 コ ラ ー ゲ ン

優位の免疫反応性を有しているものと推定されるが，NC1領域を用いて WKY ラットと Wistar ラットを感

real time RT‑PCR 法の結果はこの推定と矛盾するも作した。毎週尿中蛋白量を測定した。５週間後に，のとなった。肉芽腫性変化を伴う組織傷害が進行中の

ELISA 法により血清中の抗 NC1抗体を測定し，腎臓段階では，Th2サイトカインは高度な炎症反応を抑制と肺を取り出して光学顕微鏡，免疫組織化学および電するために増加することが考えられた。あるいはまた，

子顕微鏡により組織学的検討を行った。さらにラット

Th2免疫反応は炎症を抑制するだけでなく，肉芽腫性の腎臓組織を用いた real time RT‑PCR 法により，病変の形成に関与している可能性がある。

Th1サイトカインと Th2サイトカインの mRNA の発
現レベルを測定した。

してより高度（論文審査の結果の要旨）
肺腎症候群の代表的な疾患の一つである Goodpas-【結果】尿中蛋白量は WKY ラットでは NC1投与開始

ture 症候群は糸球体および肺胞の基底膜を構成するから３週間後から，Wistar ラットでは４週間後から

IV型コラーゲンNC1領域のα3鎖に対する抗体によっ増加した。
ELISA 法では WKY ラットと Wistar ラッて引き起こされる。今回，ウシの腎臓から得られた

トの血清で同程度の抗 NC1抗体の上昇がみられた。

NC1領域でラットを感作して肺腎症候群を引き起こ

蛍光抗体法では両ラットともに腎糸球体毛細血管壁，し，その病態の解析を行った。

尿細管基底膜および肺胞毛細血管壁に IgG の沈着を実験では NC1を投与した Wistar‑Kyoto（WKY）

認めた。WKY ラットの糸球体では，毛細血管内の細ラットの群と Wistar ラットの群および WKY ラット

胞集積，毛細血管の破綻，Bowman 嚢腔へのフィブの対照群の３群を作成した。毎週蛋白尿測定を行い，リンの析出等，種々の段階の病変が認められ，86.6

NC1投与開始から５週間後，ELISA 法により血清中％の糸球体に細胞性ないし細胞線維性半月体の形成をの抗 NC1抗体を測定し，腎臓と肺を取り出して病理認めた。細胞性半月体の一部はマクロファージ，類上組織学的検討を行った。さらにラットの腎臓組織を用

皮細胞，多核巨細胞などの ED1陽性細胞および少量

いた real time RT‑PCR 法により，helper T cell サ

240

信州医誌 Vol. 58

審査学位論文要旨

イトカインの mRNA の発現レベルを検出した。
その結果，青柳大樹は次の結論を得た。

A5および CYP3A7が知られている。CYP3A4は，ヒト成人肝における総 CYP 含量の約30％を占めると共１．尿中蛋白量は WKY ラットでは NC1投与開始かに，現在市販されている医薬品の半数以上の代謝に関ら３週間後から，Wistar ラットでは４週間後から与する最も主要な分子種である。CYP3A5は遺伝的多増加した。

型により，発現や活性に顕著な個人差があることが胎２．ELISA 法では WKY ラットと Wistar ラットの児および成人の肝臓で同定されている。
また，
CYP3A7

血清で同程度の抗 NC1抗体の上昇がみられた。

は胚，胎児および新生児の肝臓に発現している主要な

３．NC1を投与された WKY ラットの糸球体では，分子種であり，胎児の肝臓においては総 CYP の30％

管内性の細胞集積，毛細血管の破綻，86.6％の糸から50％を占める。ヒト胎盤の栄養芽層細胞には複球体の細胞性ないし細胞線維性半月体形成等，種々数の CYP 分子種が発現しており，その種類と量は妊の段階の病変が認めた。細胞性半月体の一部はマク

娠時期と母体の状態に依存して大きく変化することがロファージ由来の ED1陽性細胞主体の肉芽腫性病

報告されている。たとえば，胎盤の CYP は出産期よ変を形成した。Wistar ラットの糸球体変化は軽度

りも妊娠初期においてより多く発現していることが一で，半月体の形成は23.0％の糸球体にとどまった。

般的に知られている。これは，妊娠初期から中期の胚WKY ラットの肺では巣状の肺出血，肺胞壁の肥厚形成や器官形成期，すなわち最も催奇形物質に影響を

および肺胞構造の破壊を伴った肉芽腫性病変を認め受け易い時期に異物代謝で重要な CYP の発現が最大た。

となることから，CYP は胎児に対して保護的に働い

４．Real time RT‑PCR 法では，NC1を投与された
WKY ラットは，Wistar ラットと比ていると推測されている。このように，ヒト胎盤ではして有意に薬物動態に影響する因子に関して様々な研究が報告

高い Th2サイトカイン（IL‑10）mRNA の発現をされているが，胎盤と同様胎児由来の組織である卵

示 し た の に 対 し て，Th1サ イ ト カ イ ン（IFN ‑γ，膜についてはほとんど研究がなされていなかった。近

TNF‑α）の mRNA 発現は高値を示さなかった。

年，薬物排泄型トランスポーターであるMDR1/P‑gp

これらの結果より，肺腎症候群の肉芽腫性病変はマ（multidrug resistance protein 1/P‑glycoprotein）とクロファージの浸潤が優位な毛細血管炎から進展する

BCRP（breast cancer resistance protein）がヒト卵ことが示唆された。WKY ラットは Th1優位の免疫膜でも発現していることが報告された。しかし，我々反応性を有しているものと推定されるが，肉芽腫性変の知る限り卵膜における CYP3A 分子種の発現につい化を伴う組織傷害が進行中の段階では，Th2サイトカては，これまで mRNA レベルでも研究がなされていインが高度な炎症反応を抑制するために増加することない。本研究は，胎児の薬物動態に影響する因子を解が考えられた。以上より，主査，副査は一致して本論明するため，卵膜における CYP3A 分子種の発現と活文を学位論文として価値があるものと認めた。

性を明らかにすることを目的とした。
【方法】ヒト卵膜（羊膜・絨毛膜/脱落膜）および胎Cytochrome P450 3As Gene Expression
and Testosterone 6β‑Hydroxylase Activity in Human Fetal Membranes andPlacenta at Full Term（ヒト卵膜および胎盤における CYP 3As 遺伝子の発現とテスト
ステロン6β‑水酸化活性）
前

澤

佳代子

盤は，同意の得られた正常分娩（５名）と帝王切開（15名）の産婦から提供された。各組織の CYP3A4，CYP3A5お よ び CYP3A7の mRNA 発 現 は，リ ア ル
タイム RT‑PCR 法にて解析した。また，タンパク質レベルでの発現解析は，組織ホモジネートを用い，Western blot 法にて行った。さらに，酵素活性は組織ホモジネートを用い，CYP3A のプローブ活性であるテストステロン6β‑水酸化活性を測定した。なお，（論文の内容の要旨）

本研究は倫理委員会の承認内容を遵守して行った。

【背景と目的】Cytochrome P450（CYP）は，生体内【結果】CYP3A の mRNA 発現は，個体間で 著 し い成分と共に医薬品，発癌物質，環境汚染物質など生体差を認めるものの，胎盤だけでなく羊膜や絨毛膜/脱外異物の酸化的代謝に関与する重要な酵素である。ヒ

落膜にも発現していることを明らかにした。胎盤のト CYP3A の 主 要 な 分 子 種 と し て CYP3A4，CYP3

CYP3A4 mRNA 発現は，羊膜と絨毛膜/脱落膜の約No. 5, 2010241

審査学位論文要旨２倍であった。絨毛膜/脱落膜の CYP3A5の mRNA

析は，組織ホモジネートを用い，Western blot 法には胎盤の約２‑10倍，CYP3A7は胎盤の約３倍というて行った。さらに，酵素活性は，
CYP3Aのプローブ活性高い発現を示した。また，CYP3A7の抗体と免疫学的であるテストステロン6β‑水酸化活性を測定した。

に交差性を有するタンパク質が羊膜・絨毛膜/脱落

その結果，前澤は次の結論を得た。

膜および胎盤の全てにおいて検出することができた。

１．CYP3A の mRNA は，個体間で著しい差を認めその含量は，胎盤と絨毛膜/脱落膜に比べ羊膜で若るものの，胎盤だけでなく羊膜や絨毛膜/脱落膜に干 少 な い 傾 向 が 認 め ら れ た。さ ら に，各 組 織 ホ モも発現していることが明らかになった。

ジネートのテストステロン6β‑水酸化活性を測定した

２．胎盤の CYP3A4 mRNA 発現は，羊膜と絨毛膜/

ところ，胎盤（26.6pmol/hr/mg protein）と比 して脱落膜の約２倍であった。絨毛膜/脱落膜の CYP3羊膜（3.7pmol/hr/mg protein）および絨毛膜/脱落膜

A5の mRNA は胎盤の約２‑10倍，CYP3A7は胎盤（4.6pmol/hr/mg protein）の活性は明らかに低いもの約３倍という高い発現を示した。

のの，いずれの組織でも活性が認められた。

３．CYP3A7の抗体と免疫学的に交叉性を有するタン【考察】今回の研究で CYP3A4，CYP3A5および CYP-

パク質が羊膜・絨毛膜/脱落膜および胎盤の全てに

3A7は胎盤だけでなく，羊膜や絨毛膜/脱落膜にも発おいて検出できた。

現していることが明らかになった。また，テストステ

４．各組織ホモジネートのテストステロン6β‑水酸化

ロンの6β‑水酸化活性が検出されたことにより，これ活性を測定したところ，胎盤と比 して羊膜およびら組織の CYP3A 分子種は異物の代謝に寄与している

絨毛膜/脱落膜の活性は低いものの，いずれの組織ことが推察された。以上の結果より，ヒト卵膜にはでも活性が認められた。

CYP3A 分子種が発現しており，その機能として母体

これらの結果より，胎盤だけでなく，新たに卵膜側から胎盤を通って移行する薬物や，子宮を介して羊（羊膜，絨毛膜・脱落膜）でも，mRNA レベルとタ

水へ流入する薬物などの暴露から胎児を防御する役割

ンパク質レベルで CYP3A の存在が示された。また，を担っている可能性が示唆された。

胎盤，羊膜，絨毛膜・脱落膜，全てにテストステロン（論文審査の結果の要旨）

6β‑水酸化活性が認められたことにより，発現していCytochrome P450（CYP）は，生体内成分と共にるタンパクが，明らかにその機能を有していることが医薬品，発癌物質，環境汚染物質など生体外異物の酸示された。よって，主査，副査は一致して本論文を学化的代謝に関与する重要な酵素である。ヒト CYP3位論文として価値があるものと認めた。

A の主要な分子種として CYP3A4，CYP3A5および
CYP3A7が知られている。ヒト胎盤の栄養芽層細胞には複数の CYP 分子種が発現しており，その種類と量は妊娠時期と母体の状態に依存して大きく変化するこ

Clinical characteristics of combined pulmonary ﬁbrosis and emphysema（肺線維症
合併肺気腫症例の臨床的特徴）とが報告されている。しかし，胎盤と同様胎児由来の

北組織である卵膜についてはほとんど研究がなされてい

口

良

晃

なかった。近年，薬物排泄型トランスポーターがヒト（論文の内容の要旨）

卵膜でも発現していることが報告されたが，CYP3A【背景と目的】肺気腫を引き起こす破壊メカニズムに分子種の発現については，これまで mRNA レベルで肺胞中隔の肥厚や線維化は含まれていない。肺気腫とも研究がなされていない。本研究は，胎児の薬物動態

特発性肺線維症を含む特発性間質性肺炎とは，臨床的に影響する因子を解明するため，卵膜における CYP3および病理学的に異なった疾患と考えられている。しA 分子種の発現と活性を明らかにすることを目的と

かし，肺気腫に肺線維症を合併する症例がしばしば見して検討を行った。

られ，国内外で報告がなされてきている。本研究は，同意の得られた正常分娩（５名）と帝王切開（15名）

肺線維症合併肺気腫症例の臨床的特徴を肺気腫型の産婦から提供された卵膜（羊膜・絨毛膜/脱落膜）

COPD と比および胎盤を用い，各組織の CYP3A4，CYP3A5およ的としている。

び CYP3A7の mRNA発現は，リアルタイム RT ‑PCR

【方法】2004年10月〜2007年６月に信州大学医学部附法にて解析した。また，タンパク質レベルでの発現解

属病院呼吸器・感染症内科外来を受診し，肺気腫，肺242

することにより明らかにすることを目

信州医誌 Vol. 58

審査学位論文要旨

線維症，肺癌などを疑われ胸部 CT 検査を施行した症対する修復機転の過程においてアポトーシスの誘導，

例で，CT 上，視覚的評価法による低吸収域が25％以

蛋白分解，線維化のいずれが主体であるかによって，上の明らかな気腫性病変と，両側肺野に原因不明の肺生じる病態が異なることを示唆しているのではないか

線維症の所見を認める肺線維症合併肺気腫症例47症例と考えられた。

を対象とした。また，2004年10月〜2005年６月に同外【結論】肺線維症合併肺気腫は線維化を伴わない肺気来を受診し，低吸収域が25％以上の明らかな気腫性腫が優位な COPD とは異なった臨床的特徴を有し，病変を認めるが，肺線維症所見を認めない COPD82

特に肺癌の合併には注意を払うべきと考えられた。

症例を対照として，画像所見の解析，呼吸機能検査，（論文審査の結果の要旨）

６分間歩行試験を行い，肺線維症合併肺気腫症例の臨

肺気腫を引き起こす破壊メカニズムに肺胞中隔の肥床的特徴について検討した。

厚や線維化は含まれていない。肺気腫と特発性肺線維【結果】肺線維症合併型肺気腫患者47人中46人は男性症を含む特発性間質性肺炎とは，臨床的にも病理学的であった。肺線維症合併型肺気腫群において bodyにも異なった疾患と考えられている。しかし，肺気腫

mass index が有意に高値であった。また傍隔壁型肺と肺線維症を合併した症例がしばしば見られ，国内外気腫が多く見られた。肺線維症の所見は全例下肺野優で報告がなされてきており，その臨床的特徴を明らか

位に認められ，蜂窩肺，スリガラス影，網状影はそれにする必要があると考えられる。2004年10月〜2007年

ぞれ75.6％，62.2％，84.4％に見られた。肺線維症

６月に信州大学医学部附属病院呼吸器・感染症内科外合併型肺気腫患者47人中22名（46.8％）に肺癌を合来を受診し，肺気腫，肺線維症，肺癌などを疑われ胸併していた。肺癌の組織型については扁平上皮癌，腺部 CT 検査を施行した症例で，視覚的評価法による低癌，小細胞癌，大細胞神経内分泌癌の各種が見られた

吸収域が25％以上の明らかな気腫性病変と，両側肺が，扁平上皮癌が12名（54.5％）と最も多く見られた。

野に原因不明の肺線維症の所見を認める肺線維症合

肺線維症の外科的肺生検により組織学的診断が得られ併肺気腫症例47症例を対象とした。また，2004年10た症例は６例あり，３例が通常型間質性肺炎，３例が月〜2005年６月に同外来を受診し，低吸収域が25％

非特異的間質性肺炎であった。呼吸機能検査について

以上の明らかな気腫性病変を認めるが，肺線維症所見

肺線維症合併型肺気腫群において有意に気流制限の程を認めない肺気腫型 COPD 82症例を対照として，画度は軽く，肺過膨張の所見も乏しく，肺拡散能は低かっ

像所見の解析，呼吸機能検査，６分間歩行試験を行い，た。肺線維症合併型肺気腫群において６分間歩行試験

COPD と比後の SpO 低下がより大きい傾向にあった。

特徴について検討した。

【考察】肺癌合併の頻度について，Nakayama らは
COPD の患者の14％に経過中肺癌を合併したと報告した（Chest 2003；123：1775‑6）。Araki らは特発性肺線維症の患者の剖検例において23％に肺癌を合併した肺線維症合併肺気腫症例の臨床的その結果，北口は次の結論を得た。
１．肺線維症合併型肺気腫患者47人中46人は男性であった。
２．肺線維症合併型肺気腫群において body mass

していたと報告した（Intern． Med．2003；42：483‑

index が有意に高値であった。

9）。本研究において肺線維症合併肺気腫症例の46.4

３．傍隔壁型肺気腫が多く見られた。

％に肺癌合併を認めた。このため上記２報告と比 す

４．肺線維症の所見は全例下肺野優位に認められ，蜂ると肺線維症合併肺気腫症例における肺癌の合併率は窩肺，スリガラス影，網状影はそれぞれ75.6％，高いことが示唆された。肺癌は臨床経過に大いに影響

62.2％，84.4％に見られた。

するため厳重な経過観察が必要と考えられた。

５．肺線維症合併型肺気腫患者47人中22名（46.8％）

肺線維症合併肺気腫症例が一定の割合で存在する以は肺癌を合併した。肺癌の組織型については扁平上上，肺気腫と肺線維症に共通の発症機序が存在する可皮癌，腺癌，小細胞癌，大細胞神経内分泌癌の各種能性があると言える。1982年に Niewoehnerらは動物が見られたが，扁平上皮癌が12名（54.5％）と最も実験で両疾患に共通の特徴があり何らかの原因による多く見られた。

肺損傷後の修復期の回復機序において何らかの要因で

６．肺線維症の外科的肺生検により組織学的診断が得

肺気腫になったり特発性肺線維症になることを報告しられた症例は６例あり，３例が通常型間質性肺炎，

た（Science 1982；217：359‑60）。肺の炎症や損傷に３例が非特異的間質性肺炎であった。

No. 5, 2010243

審査学位論文要旨

７．呼吸機能検査について肺線維症合併型肺気腫群にマーキング縫合した。CardioDISC または SIS を切おいて有意に気流制限の程度は軽く，肺過膨張の所除膀胱と同じ大きさに形成し，7‑0吸収糸にて連続縫見は乏しく，肺拡散能は低かった。肺線維症合併型合。吻合部に漏れがないことを確認して手術を終了と肺気腫群において６分間歩行試験後の SpO 低下がした。

より大きい傾向にあった。

移植前，移植後１，２，４，８週目に，セボフルレン

これらの結果より，肺線維症合併肺気腫は線維化をによる吸入麻酔下において，
膀胱容量，
膀胱コンプライ伴わない肺気腫が優位な COPD とは異なった臨床的アンスを測定した。４週目，８週目に膀胱を摘出し，平特徴を有し，特に肺癌の合併には注意を払うべきと考滑筋マーカーである smooth muscle actin（αSM A），

えられた。よって主査，副査は一致して本論文を学位

尿路上皮マーカーである uroplakin Ⅲ（UP Ⅲ），神論文として価値があるものと認めた。

経組織マーカーであるＳ‑100による免疫組織学的解析
にて摘出標本を評価した。

Rat Bladders Augmented with a Novel
Bovine Pericardium‑Derived Biomaterial
Reconstruct Functional Tissue Structures（ウシ心膜由来生体材料を用いたラット膀胱
拡大術における機能的組織の再構築）
三

村

裕

次

（論文の内容の要旨）【結果】
１．組織学的検査（免疫染色法）
Ａ．CardioDISC 利用膀胱拡大術群
移植４週目には，拡大膀胱と正常膀胱の境界は明瞭であった。拡大膀胱上の境界部付近に，正常膀胱組織から伸びるような形で αSMA 陽性細胞が認められた。
拡大膀胱頂部では，UP Ⅲ陽性細胞の下に，αSMA
陽性細胞が薄い層として認められた。

【背景と目的】神経因性膀胱や委縮膀胱などの疾患に移植８週目には拡大膀胱と正常膀胱の境界は不明瞭

おいて，膀胱拡大術が必要となる場合がある。組織再となっていた。拡大膀胱上に αSMA 陽性細胞が認め建のためには適切な素材が必要となる。膀胱拡大術のられた。拡大膀胱頂部では，UP Ⅲ陽性細胞，αSMA

際，一般的には腸管が広く用いられているが，腸管蠕

陽性細胞が多数認められ，正常膀胱と類似した構造と動による尿失禁，電解質異常，結石形成，癌化などの合なっていた。

併症が指摘されている。腸管に代わるものとして，生また，４，８週目の境界部，頂部では，αSM A 陽

体臓器を脱細胞化した小腸粘膜下層 small intestinal性細胞の間にＳ‑100陽性細胞が認められた。

（SIS）や膀胱無細胞間質 bladder acellularsubmucosa

Ｂ．SIS 利用膀胱拡大術群

matrix（BAM ）などのコラーゲン性分解性素材が４，８週目には，CardioDISC 利用膀胱拡大術群適するとされ，膀胱拡大術に SIS や BAM を利用しとほぼ同様に，拡大膀胱上に αSMA 陽性細胞，UPた研究は多くの報告があるが，日本産ウシの心膜をⅢ陽性細胞，Ｓ‑100陽性細胞が認められた。

原材料とした細胞培養基材である CardioDISC を

２．膀胱機能検査

膀胱拡大術に利用した研究は見受けられない。本研究Ａ．膀胱容量では，ヒト血管内皮細胞，マウス血管平滑筋細胞など

膀胱部分切除単独群において，観察期間中，膀胱容の培養に使用されおり，生体適合性に優れ，十分な強量に変化を認めなかった。SIS 利用膀胱拡大術群にお度を持ち，取り扱いが容易であるという利点を有する

いて，８週目の膀胱容量は１，２週目と比 し有意にCardioDISC を膀胱拡大術に利用できないかについ増加していた。４週目と比 した場合は明らかな増加て，形態的，機能的に検討した。

は認められなかった。CardioDISC 利用膀胱拡大術【方法】雌性Sprague Dawleyラット（体重：337.9±

群において，８週目の膀胱容量は１，２，４週目と比30.2g）を用いた。① 膀胱部分切除後 CardioDISC
利用膀胱拡大術群，② 膀胱部分切除後 SIS 利用膀胱
拡大術群，③ 膀胱部分切除単独群の３群（それぞれn＝5）について検討を行った。

して有意な増加を認めた。
Ｂ．膀胱コンプライアンス
SIS 利用膀胱拡大術群，膀胱部分切除単独群において，観察期間中，膀胱コンプライアンスに変化を認め

セボフルレンによる吸入麻酔下において，ラットのなかった。CardioDISC 利用膀胱拡大術群において，膀胱を約50％部分切除し，7‑0非吸収糸にて４箇所を８週目の膀胱コンプライアンスは，１，２，４週目と244

信州医誌 Vol. 58

審査学位論文要旨

比 して有意な増加を認めた。

が認められた。拡大膀胱頂部では，UP Ⅲ陽性細胞【考察，結論】本研究において，CardioDISC によるの下に，αSM A 陽性細胞が薄い層として認められ

膀胱拡大術群は，SIS による膀胱拡大術群と同様な組た。

織学的所見が得られた。移植膀胱上に平滑筋組織，尿２．移植８週目には拡大膀胱と正常膀胱の境界は不明

路上皮組織，神経組織の再構築が認められた。４週目

瞭となっており，拡大膀胱上に αSMA 陽性細胞がの組織において，境界部周辺で，正常膀胱組織からの認められた。拡大膀胱頂部では，UP Ⅲ陽性細胞，

平滑筋細胞の進展が確認できており，これらの組織は，

αSMA 陽性細胞が多数認められ，正常膀胱と類似

拡大術に使用したマテリアル周囲の正常膀胱組織からした構造となっていた。

進展してきたものと考えられた。
CardioDISC 利用膀胱拡大術後８週目に，膀胱容

３．４，８週目の境界部，頂部では，αSMA 陽性細胞の間にＳ‑100陽性細胞が認められた。

量，膀胱コンプライアンスの増加を認めた。SIS，４．CardioDISC 利用膀胱拡大術群において，SIS

CD 移植群の膀胱容量，膀胱コンプライアンスにおい利用膀胱拡大術群と同様の組織学的所見が認められて差を認めた。SIS と比た。

して CardioDISC の方がより進展性，強度があり，これらの違いが影響しているのではないかと考えられた。
CardioDISC は膀胱拡大術の１つの素材として利用できる可能性を持っていると考えられた。
（論文審査の結果の要旨）
神経因性膀胱や委縮膀胱などの疾患において，膀胱

５．CardioDISC 利用膀胱拡大術群において，８週目の膀胱容量は１，２，４週目と比して有意な増加を認めた。
６．CardioDISC 利用膀胱拡大術群において，８週目の膀胱コンプライアンスは，１，２，４週目と比して有意な増加を認めた。

拡大術が必要となる場合がある。膀胱拡大術の際，一CardioDISC による膀胱拡大術群では，移植膀胱

般的には腸管が広く用いられているが，腸管蠕動によ上に平滑筋組織，尿路上皮組織，神経組織の再構築をる尿失禁，電解質異常，結石形成，癌化などの合併症認めた。また，術後８週目において，膀胱容量，膀胱が指摘されている。日本産ウシの心膜を原材料としたコンプライアンスの増加を認めた。これらの結果より，

細胞培養基材である CardioDISC は，生体適合性に

CardioDISC は膀胱拡大術の１つの素材として利用

優れ，十分な強度を持ち，取り扱いが容易であるといできる可能性を持っていると考えられた。よって，主う利点を有する。今回，膀胱拡大術に CardioDISC

査，副査は一致して本論文を学位論文として価値があを利用できないかについて，形態的，機能的に検討しるものと認めた。

た。
雌性 Sprague Dawleyラットを用いた。① 膀胱部分切除後 CardioDISC 利用膀胱拡大術群，② 膀胱
部分切除後 SIS 利用膀胱拡大術群，③ 膀胱部分切除
単独群の３群（それぞれｎ＝５）について検討を行った。
移植前，移植後１，２，４，８週目に，セボフルレ

A2BP1 as a Novel Susceptible Gene forPrimary Biliary Cirrhosis in JapanesePatients（A2BP1 遺伝子は日本人 PBC 患者の疾患感受性と相関する）
城下

智

ンによる吸入麻酔下において，膀胱容量，膀胱コン（論文の内容の要旨）

プライアンスを測定した。４週目，８週目に膀胱を摘【目的】原発性胆汁性肝硬変（PBC）は，中年女性に出し，平滑筋マーカーである smooth muscle actin

好発する慢性進行性の胆汁うっ滞性肝疾患であり，抗（αSM A），尿 路 上 皮 マ ー カ ー で あ る uroplakin Ⅲ

ミトコンドリア抗体が本疾患特異的に血清中に検出さ（UP Ⅲ），神経組織マーカーであるＳ‑100による免疫れる。また，他の自己免疫性疾患を合併する頻度が高

組織学的解析にて摘出標本を評価した。

いことからその病態に自己免疫的機序が関与している

その結果，三村裕次は次の結論を得た。

と考えられる。本研究ではマイクロサテライトマー

１．CardioDISC 利用膀胱拡大術群において，移植

カーを用いて全染色体を対象とした相関解析を行い，４週目には，拡大膀胱と正常膀胱の境界は明瞭であPBC 疾患感受性に関与する遺伝子が存在する領域をり，拡大膀胱上の境界部付近に，αSM A 陽性細胞

明らかにし，さらに，これらの領域近傍に位置していNo. 5, 2010245

審査学位論文要旨

る遺伝子について一塩基多型（SNPs）を用いた相関する慢性進行性の胆汁うっ滞性肝疾患であり，他の自解析をすることにより，PBC 疾患感受性遺伝子を検

己免疫性疾患を合併する頻度が高いことからその病態討することを目的とした。

に自己免疫的機序が関与していると考えられる。本研【方法】PBC 患者126例〔男性15例，女性111例，中央

究では PBC 患者126例〔男性15例，女性111例，中央値57歳（範囲30‑83歳）〕と健常者95例を対象とした。

値57歳（範囲30‑83歳）〕と健常者95例を対象とし，全全染色体を５〜10cM でカバーする400のマイクロサ

染色体を５〜10cM でカバーする400のマイクロサテ

テライトマーカーを用いて相関解析を行った。次に，

ライトマーカーを用いて相関解析を行い，PBC 疾患

疾患感受性を呈した４領域のうち，統計学的に最も相感受性に関与する遺伝子が存在する領域を明らかにし，関の強かった D16S423マーカー近傍27kb に位置する，

さらに，これらの領域近傍に位置している遺伝子につataxin 2‑binding protein 1（A2BP1）遺伝子について，

いて一塩基多型（SNPs）を用いた相関解析をするこ

その遺伝子上に存在する７つの SNPs（rs17139207，とにより，PBC 疾患感受性遺伝子を検討した。

rs12926282， rs17139244， rs6500742， rs4146812，
rs4124065，rs889699）について，TaqMan PCR 法をその結果，城下は以下の結論を得た。
１．患者群で頻度が高いマーカーは，D1S207（Pc＝用いて SNPs 解析を行った。

0.042）， D12S86（ Pc＝0.003）， D16S423（ Pc＝【成績】PBC 患者と健常者を比 したところ11カ所の0.002），D21S1256（Pc＝0.006）の４カ所であった。

マーカーで有意差を認めた。患者群で頻度が高いマー

一方，患者群で頻度が低いマーカーは，D1S2726

カ ー は1p31，D1S207（Pc＝0.042），12q24.2，D12（Pc＝0.047），D 3S 1300
（Pc＝0.013），D 5S 426

，16p13.3，D16S423（Pc＝0.002），
S86（Pc＝0.003）（Pc＝0.017），D 10S 249（Pc＝0.004），D 14S 275

21q21，D21S1256（Pc＝0.006）の４カ所であった。

（Pc＝0.040），D 20S 186（Pc＝0.012），DXS 1060

一方，患者群で頻度が低いマーカーは，1p13，D1（Pc＝0.012）の７カ所であった。

，3p14.2，D3S1300（Pc＝0.013），
S2726（Pc＝0.047）

２．疾患感受性を示す D16S423マイクロサテライト

5p13.3， D 5S 426（ Pc＝ 0.017）， 10p15， D 10
S249（Pc＝0.004），14q12，D14S275（Pc＝0.040），

マーカーと PBC の間に最も強い相関関係を認めた。
３．D16S423マーカーの近傍にある遺伝子を検索し，20p12， D 20S 186（ Pc ＝ 0.012）， X p 22.3，

候補遺伝子として ataxin

2 ‑binding

DXS1060（Pc＝0.012）の７カ所であ っ た。A2BP 1（A2BP1）を同定した。

遺伝子多型と PBC 疾患感受性について，rs17139244

４．A2BP1遺伝子上に存在する７つの SNPs（rs171の SNP は additive model において有意な相関（ ＝39207， rs12926282， rs17139244， rs6500742，

0.027）を認めた。また，rs6500742の SNP は additivers4146812，rs4124065，rs889699）に つ い て SNPs

moedel において有意な相関（ ＝0.006）を認め，解析を行い，rs17139244の SNP は additive model

遺伝子型頻度においても有意な相関（ ＝0.024）をにおいて有意な相関（ ＝0.027）を認めた。また，認めた。

rs6500742の SNP は additive moedel において有意【考案】A2BP1 遺伝子は calcitonin‑calcitonin gene‑

な相関（ ＝0.006）を認め，遺伝子型頻度においrelated peptide（CGRP）との関連が報告されている。

ても有意な相関（ ＝0.024）を認めた。

protein1

その亜型の αCGRP は腫瘍壊死因子‑α（TNF‑α）

５．A22BP1 遺伝子は calcitonin‑calcitonin gene‑やインターロイキン（IL）‑12産生との関連が示唆さ

related peptide（CGRP）との関連が報告されていれ，TNF‑αや IL‑12の遺伝子多型と PBC 疾患感受る。その亜型のαCGRPは腫瘍壊死因子‑α（TNF‑性が報告されている。以上の報告と今回の我々の成績

α）やインターロイキン（IL）‑12産生との関連がから，A2BP1 遺伝子多型が PBC 疾患感受性に関与示唆され，TNF‑αや IL‑12の遺伝子多型と PBC

していることが示唆された。

疾患感受性が報告されている。A2BP1遺伝子多型が【結語】A2BP1 遺伝子多型は PBC 疾患感受性との関

PBC 疾患感受性に関与していることが示唆された。

連が示唆された。今後，さらにこの遺伝子多型と疾患

今回の研究は日本人 PBC 患者において400個のマ発症に関する機能解析が必要と考えられる。
（論文審査の結果の要旨）
原発性胆汁性肝硬変（PBC）は，中年女性に好発
246

イクロサテライトマーカーを用い，全染色体領域の解析を行った最初の研究である。PBC の発症には複数の遺伝子が関与していると考えられるが，その一つの信州医誌 Vol. 58

審査学位論文要旨

遺伝子を同定できたことは病態解明に寄与するもので，リン酸化タウの増加がみられる個体が多数確認された。

PBC の病態や予後の解明，将来的には治療法の開発

不溶性 Aß量とリン酸化タウの増加との間に相関性はにもつながると考えられる。よって，主査，副査は一確認されなかった。組織染色の結果，神経細胞とオリ致して本論文を学位論文として価値があるものと認めゴデンドロサイトにおいて，可溶性タウのリン酸化状た。

態に連動したタウの細胞内凝集が観察された。高度の不溶性 Aß蓄積を伴う超高齢個体においては，神経細Alzheimer‑type tau pathology in advanced
aged nonhuman primate brains harboring
substantial amyloid deposition（高度の ア
ミロイド沈着を伴う超高齢カニクイザル脳におけるアルツハイマー病型タウ病変の形成）
及

川

尚

人

胞やグリア細胞，変性神経突起内にガリアス銀染色に陽性の嗜銀性構造物が確認された。また，36歳の個体
では，側副溝付近の皮質領域に選択的なタウの細胞内凝集と嗜銀性構造物の形成が観察された。
【結論】カニクイザル脳においてヒト脳と同様の加齢依存的で部位特異的な不溶性 Aßの蓄積が確認された。
リン酸化タウ量の増加も確認されそれと連動した細胞（論文の内容の要旨）

内タウ凝集が確認されたが，不溶性 Aß量とリン酸化【背景と目的】アルツハイマー病脳においては老人斑

タウの増加との間に相関性は認められなかった。超高と神経原線維変化の形成，神経細胞の脱落が主な病理

齢でかつ高度のアミロイド沈着を伴う個体において神像として観察されているが，その形成機序については

経原線維変化の形成も確認された。加えて，それら病明らかにされていない。現在その機序の解析モデルと変がヒト脳で最早期にタウ病変が出現する脳領域におして当該分子を過剰に産生する遺伝子改変マウスが専いて選択的に観察されたことから，カニクイザル脳はら用いられているが，それらの脳で形成される病理像

アルツハイマー病関連分子である Aßとタウ各々の病がヒトの場合と異なる点のあることが確認されている。

態発症機序だけでなく，両者の形成上の相互依存関係

非遺伝子改変のモデル動物としては，老人斑の形成がをも追求可能な有用なモデルであると結論した。また，確認され病理像がヒトと類似するカニクイザルが注目

不溶性 Aß量とリン酸化タウの増加との間に相関性がされる。今回，カニクイザル脳におけるアルツハイマー

認められなかったことは，不溶性 Aß量の増加そのも病関連分子である Aßとタウ病理の加齢依存的また部のは直接的にはタウ病変を誘導し得ない可能性を提示

位依存的変化について検討を行った。

しており，ヒト脳における老人斑形成と神経原線維変【材料及び方法】若齢（４歳）から超高齢（36歳）の化との因果関係を考える上での示唆を与えたと考えら

計34頭のカニクイザルの脳試料について解析を行った。

れた。

不溶性 Aßの脳内蓄積についてはトリス緩衝生理食塩（論文審査の結果の要旨）

水（TBS）不溶性画分を，可溶性 Aßの脳内存在量

アルツハイマー病脳においては老人斑と神経原線維についてはTBS可溶性画分を対象にウエスタンブロッ変化の形成，神経細胞の脱落が主な病理像として観察ト法により解析した。タウに関しては可溶性タウのリされているが，その形成機序については明らかにされン酸化状態について，TBS 可溶性画分を対象にウエていない。現在その機序の解析モデルとして当該分子

スタンブロット法により解析した。タウの細胞内凝集を過剰に産生する遺伝子改変マウスが専ら用いられてと神経原線維変化については免疫染色とガリアス銀染

いるが，それらの脳で形成される病理像がヒトの場合

色による組織染色により検討した。

と異なる点のあることが確認されている。非遺伝子改【結果】側頭葉皮質と海馬において，24歳齢の個体よ変のモデル動物としては，老人斑の形成が確認され病り不溶性 Aßが増加し始め，32歳と36歳の超高齢個体

理像がヒトと類似するカニクイザルが注目される。今において著しい量の不溶性 Aßが検出された。前頭葉

回，カニクイザル脳におけるアルツハイマー病関連分と後頭葉皮質，小脳試料を含めた解析の結果，側頭葉子である Aßとタウ病理の加齢依存的また部位依存的と前頭葉において顕著な不溶性 Aßの蓄積が観察され変化について検討を行った。

た。可溶性 Aßの存在量は，遺伝子改変マウスのそれと比若齢（４歳）から超高齢（36歳）の計34頭のカニク

し極少量であった。可溶性リン酸化タウは19歳

イザルの脳試料について解析を行った。不溶性 Aßの齢個体より増加が検出され，より高齢の個体において脳内蓄積についてはトリス緩衝生理食塩水（TBS）

No. 5, 2010247

審査学位論文要旨

不溶性画分を，可溶性 Aßの脳内存在量については良性疾患でも高値を示すことがあり，現在行われていTBS 可溶性画分を対象にウエスタンブロット法による検出方法では術前の Tg 値による腫瘍の良悪性の鑑り解析した。タウに関しては可溶性タウのリン酸化状

別は困難であり，甲状腺癌スクリーニング検査として態について，TBS 可溶性画分を対象にウエスタンブ

は不充分である。Tg は分子量33万 kD のサブユニッ

ロット法により解析した。タウの細胞内凝集と神経原

ト２つからなる複合体で，複数の糖鎖の存在が知られ線維変化については免疫染色とガリアス銀染色によるている。癌化に伴いこの糖鎖に変異を生ずることが知組織染色により検討した。

られており，すなわち通常２分枝であるものが３〜５

その結果，及川尚人は次の結論を得た。

分枝となったり，ハイマンノース型から複合型などに

１．カニクイザル脳においてヒト脳と同様の加齢依存変化することが報告されている。今回われわれはこの的で部位特異的な不溶性 Aßの蓄積が確認された。

Tg の糖鎖変異に着目し，糖鎖変異が起きていると推

２．カニクイザル脳においてはリン酸化タウ量の増加

測される甲状腺癌由来の Tg を，レンズ豆レクチンも確認され，それと連動した神経細胞やオリゴデン（LCA）との親和性の違いを用いて識別する新しい測

ドログリア細胞体内タウ凝集が確認された。

定法の構築を試みた。さらに，この方法を利用して，

３．不溶性 Aß量とリン酸化タウの増加との間に相関性は認められなかった。

甲状腺疾患罹患患者の血清や，甲状腺腫瘍の穿刺吸引細胞診（FNA）の際に得られる穿刺針洗浄液中のレ４．超高齢でなおかつ高度のアミロイド沈着を伴う個クチン親和性 Tg 測定による甲状腺癌診断の可能性を体において，嗜銀性の神経原線維変化の形成が確認

検討した。

された。

【対象および方法】甲状腺疾患手術時に得られた組織

５．それらタウ病変が，ヒト脳で初期にかつ高頻度に検体49例（甲状腺乳頭癌18例，濾胞癌６例，未分化癌

出現する脳領域において顕著に観察された。

１例，濾胞腺腫11例，腺腫様甲状腺腫７例，バセドウ

これらの結果より，カニクイザル脳はアルツハイマー病６例），甲状腺疾患罹患患者の血清検体203例（良性病関連分子である Aßとタウ各々の病態発症機序だけ疾患115例，乳頭癌83例，濾胞癌５例），および甲状腺

でなく，両者の形成上の相互依存関係をも追求可能な腫瘍の FNA 検体176例（良性143例，悪性21例，鑑別有用なモデルであると結論した。また，不溶性 Aß量

困難12例）を対象とした。FNA 検体は，超音波ガイとリン酸化タウの増加との間に相関性が認められなド下に穿刺吸引した内容を細胞診検査用にプレパラー

かったことは，不溶性 Aß量の増加そのものは直接的

トに吹き付けた後の，穿刺針の洗浄液を用いた。

にはタウ病変を誘導し得ない可能性を提示しており，

まず手術検体から Tg を抽出しレクチンとの親和性

ヒト脳における老人斑形成と神経原線維変化との因果の違いを解析した。さらに，マウスに Tg を免疫する関係を考える上での示唆を与えたと考えられた。よっことで抗 Tg モノクローナル抗体を作製し，レクチンて，主査，副査は一致して本論文を学位論文として価と組み合わせた ELISA 法による測定系を構築した。

値があるものと認めた。

この測定系を用いて，甲状腺疾患罹患患者の血清検
体203例，および甲状腺疾患の FNA 時に得られた検Evaluation of a new method for the diagnosis of alterations of Lens culinaris agglutinin binding of thyroglobulin moleculesin thyroid carcinoma（サイログロブリン糖鎖異常の検出による甲状腺癌診断の可能性）
金

井

敏

晴

体176例を対象に，検体中の全 Tg に対する「LCA 親
和性 Tg の比（％，LCA 親和性 Tg 比）」を算出し，
これを用いての良悪性の鑑別が可能かを検討した。
【結果】⑴ LCA を含む4種類のレクチンのそれぞれを用いて解析した結果，LCA において良性疾患由来 Tg と悪性腫瘍由来 Tg 間で親和性に差が出ることが確認され（論文の内容の要旨）た。各組織由来の Tg と LCA の親和性は，悪性腫瘍【緒言】甲状腺癌の診断法として，甲状腺超音波検査

由来の Tg で低く良性疾患由来の Tg で高い傾向が認

および穿刺吸引細胞診と血清サイログロブリン（Tg）

められた。

測定が有用とされている。しかし Tg は甲状腺全摘術⑵ 上記の性質を利用した測定系で血清検体と穿刺液後の再発マーカーとしては有用であるものの，甲状腺検体を解析したところ，血清検体の LCA 親和性 Tg

248

信州医誌 Vol. 58

審査学位論文要旨

比は，良性群と悪性群との間で有意差を認めた（ ＜疾患罹患患者の血清検体203例，および甲状腺腫瘍の0.001）。すなわち悪性群では血清中の LCA 親和性

FNA 検体176例を対象とした。まず手術検体から Tg

Tg 比が低く（79.6±6.0），良性群では高い（84.9±を抽出し LCA との親和性の違いを解析した。さらに，

3.5）結果となった。カットオフ値を81.8％と定めた

マウスを用いて抗 Tg モノクローナル抗体を作製し，場合，良性群での陽性率が11.3％であるのに対し，LCA と組み合わせた ELISA 法による測定系を構築

悪性群では61.4％であった。比対象として現行のした。この測定系を用いて，血清検体203例，および

方法で両者の血清 Tg 値を測定したが，現行の方法で

FNA 時に得られた検体176例を対象に，検体中の全は良性群と悪性群の間に有意差は見られなかった。

Tg に対する「LCA 親和性 Tg 比」を算出し，これを⑶ 穿刺液検体中の LCA 親和性 Tg 比でも，良性群用いての良悪性の鑑別が可能かを検討した。

と悪性群との間に有意差を認めた（ ＜0.001）。穿刺

その結果，金井は次の結論を得た。

液検体においても，悪性群では LCA 親和性 Tg 比が１．各組織由来の Tg と LCA の親和性は，悪性腫瘍

低く（75.8±18.9），良性群では高い（85.6±3.9）結由来の Tg で低く良性疾患由来の Tg で高い傾向が果となった。また，良性群と鑑別困難群の間にも有意認められた。

差（＜0.001）が認められたが，悪性群と鑑別困難

２．血清検体の LCA 親和性 Tg 比は，良性群と悪性群の間では有意差は認められなかった。カットオフ値群との間で有意差を認めた。すなわち悪性群では血を80％と定めた場合，良性群での陽性率6.3％に対し清中の LCA 親和性 Tg 比が低く，良性群では高い

悪性群での陽性率は42.9％であった。穿刺液検体中結果となった。

18例は同じ腫瘍に対して異時的に２回の FNA がされ

３．穿刺液検体中の LCA 親和性 Tg 比でも，良性群た検体であったが，同一腫瘍での測定値は２回の測定と悪性群との間に有意差を認めた。穿刺液検体におでほぼ同じ値が得られ，測定値の再現性が確認された。

いても，悪性群では LCA 親和性 Tg 比が低く，良【考察】今回の研究から，LCA は甲状腺で産生される性群では高い結果となった。また，良性群と鑑別困

Tg の通常型の糖鎖には結合できるが甲状腺の癌化に難群の間にも有意差が認められたが，悪性群と鑑別

伴い変異した Tg の糖鎖には結合できないことが示唆

困難群の間では有意差は認められなかった。穿刺液され，甲状腺癌由来の Tg と LCA との親和性の違い

検体中18例は同 じ 腫 瘍 に 対 し て 異 時 的 に ２ 回 のを用いることで，血清および FNA 時の穿刺針洗浄液

FNA がされた検体であったが，同一腫瘍での測定中に含まれる LCA 親和性 Tg 比の値から甲状腺腫瘍

値は２回の測定でほぼ同じ値が得られ，測定値の再の良悪性の鑑別ができる可能性が示唆された。本方法

現性が確認された。

は甲状腺腫瘍の良悪性診断の補助診断法として有用と考えられる。
（論文審査の結果の要旨）

以上より，LCA は Tg の通常型の糖鎖には結合できるが癌化に伴い変異した Tg の糖鎖には結合できな
いことが示唆され，血清および FNA 時の穿刺針洗浄

甲状腺癌の診断法として，甲状腺超音波検査および液中に含まれる LCA 親和性 Tg 比の値から甲状腺腫

穿刺吸引細胞診と血清サイログロブリン（Tg）測定

瘍の良悪性の鑑別ができる可能性が示唆された。よっが有用とされている。しかし Tg は甲状腺全摘術後のて，主査，副査は一致して本論文を学位論文として価再発マーカーとしては有用であるものの，甲状腺良性値があるものと認めた。

疾患でも高値を示すことがあり，現行の検出方法ではTg 値による腫瘍の良悪性の鑑別は困難である。今回
糖鎖変異が起きていると推測されTgの糖鎖に着目し，る甲状腺癌由来の Tg を，レンズ豆レクチン（LCA）との親和性の違いを用いて識別する新しい測定法の構築を試みた。さらにこの方法を利用して，甲状腺疾患罹患患者の血清や，甲状腺腫瘍の穿刺吸引細胞診

μ‑Crystallin, New Candidate Protein in
Endotoxin‑Induced Uveitis（エンドトキシ
ン誘発ぶどう膜炎における新しいミュークリ
スタリンの機能解析）
今

井

弘

毅

（FNA）の際に得られる穿刺針洗浄液中の LCA 親和（論文の内容の要旨）

性 Tg 測定による甲状腺癌診断の可能性を検討した。

【背景と目的】μ‑クリスタリンは種特異の水晶体タン甲状腺疾患手術時に得られた組織検体49例，甲状腺パクである。今回我々はマウスエンドトキシン誘発ぶNo. 5, 2010249

審査学位論文要旨

どう膜炎における μ‑クリスタリンの機能について研タリンの発現，リアルタイム PCR 法により０，12時究した。

間後，１，２，３，５日目の μ‑クリスタリン mRNA

【材料及び方法】C57BL/6J マウスと C57BL/6J を遺の発現を解析した。

伝子背景にもつ野生型マウス，μ‑クリスタリンノッ

C57BL/6J 遺伝子背景の μ‑クリスタリンノックア

クアウトマウスの足底部にリポポリサッカライドを注

ウトマウス８‑10週齢，雄の同腹の野生型マウス，ノッ

射し，エンドトキシン誘発ぶどう膜炎モデルを作成しクアウトマウスにエンドトキシン誘発ぶどう膜炎を発た。リポポリサッカライド投与後12時間後，１，３，症させて，１，３，５，７日目の前房内へ滲出した炎

５日目の虹彩毛様体を採取し，ウェスタンブロット法

症細胞数を比にて μ‑クリスタリンタンパクの発現変化を，リアル

サイトカインであるIL‑1α，IL‑6，GM ‑CSF，TNF‑α

タイム RT‑PCR 法にて mRNA の発現変化を検討しの５日目の発現レベルを測定して比 した。

た。また１，３，５，７日目に μ‑クリスタリンノッ

１．マウスエンドトキシン誘発ぶどう膜炎の虹彩毛様クアウトマウスと野生型マウスの前房への浸潤細胞数体において μ‑クリスタリン mRNA，タンパクのを比発現が増加していた。

した。また虹彩毛様体における IL‑1α，IL‑6，

TNFα，GM ‑CSF mRNA の発現変化を比 した。

した。採取した mRNA より，炎症性２．リポポリサッカライド投与後５日目に野生型マウ【結果】μ‑クリスタリン mRNA はリポポリサッカラ

スと比し，μ‑クリスタリンノックアウトマウス

イド投与後12時間後に発現が増加し，μ‑クリスタリでは有意に炎症細胞の滲出が抑えられていた。

ンタンパクは３日後に発現が増加した。μ‑クリスタ

３．IL‑1α，IL‑6 mRNA の発現レベルが野生型マウリンノックアウトマウスと野生型マウスにリポポリスと比し μ‑クリスタリンノックアウトマウスでサッカライド投与後１日目の前房への浸潤細胞数に有有意に少なかった。

意差はなかったが，５日目には野生型マウスと比 し，

これらの結果より，μ‑クリスタリンはエンドトキ

ノックアウトマウスにおいて有意に少 な か っ た。

シン誘発ぶどう膜炎における眼内炎症発症に関与して（17.9±1.6vs.27.1±2.4cells/section）いると考えられた。しかし μ‑クリスタリンノックア

また IL‑1α，IL‑6 mRNA の５日目の発現が野生

ウトマウスで早期の炎症は抑えられておらず，好中球型マウスと比 しノックアウトマウスで有意に低かっ

主体の病初期炎症ではなく，主にマクロファージが関た。

与する後期炎症の形成に関わっていることが示唆され【結論】μ‑クリスタリンはマウスエンドトキシン誘発た。よって，主査，副査は一致して本論文を学位論文

ぶどう膜炎の後期炎症形成に関与していると考えられとして価値があるものと認めた。

る。
（論文審査の結果の要旨）
μ‑クリスタリンは有袋類の水晶体の主な構成タン
パクであるが，哺乳類において水晶体以外の組織にも発現することが知られている。以前我々はエンドトキ
シン誘発ぶどう膜炎ラットの虹彩毛様体でマイクロア
レイ解析を行い，網羅的に遺伝子の発現変化を調べた。

A Large Cohort Study Of GJB2 Mutations
In Japanese Hearing Loss Patients（日本人
難聴患者における GJB2 遺伝子変異の大規模
研究）
塚

田

景

大

エンドトキシン誘発ぶどう膜炎の発症に関連した因子（論文の内容の要旨）について検討する中で，クリスタリンファミリーに着【研究目的】GJB2遺伝子変異は，遺伝性難聴の中で最目した時に μ‑クリスタリン遺伝子の発現だけが著明も頻度が高く，先天性難聴の原因としても非常に大きに増加していることを確認した。今回マウスエンドト

な位置を占めると考えられている。現在全世界で100

キシン誘発ぶどう膜炎モデルの虹彩毛様体に発現する種類以上の GJB2 遺伝子変異が報告されており，変μ‑クリスタリンの機能について検討した。

異の頻度および種類の分布は人種によって大きく異C57BL/6J の８‑10週齢雄マウスの足底部にリポポなっていることが広く知られている。
また，
これらの多彩リサッカライド140μg を注射し，エンドトキシン誘な遺伝子型と表現型の間にはある一定の関係性がある

発ぶどう膜炎を惹起した。虹彩毛様体を採取しウェスと考えられており，今回，我々は日本人における GJB2

タンブロット法により０，１，３，５日目の μ‑クリス

遺伝子変異の頻度およびこれらの変異をもつ症例に関250

信州医誌 Vol. 58

審査学位論文要旨

する臨床像について大規模調査により検討を行った。

群では最も頻度が高い変異である結果が得られた。こ【対象と方法】日本人難聴患者1511家系（3056例）にれは V37I 変異症例が軽度難聴および非進行性の特徴

対して直接シークエンス法により GJB2 遺伝子変異を有しているために，患者が病院を受診しないもしく

スクリーニングを行い，遺伝子変異の頻度検索およびは診療医が遺伝子検査まで患者に勧めない可能性があ変異症例における臨床像（聴力レベル，聴力の進行性，ることが考えられた。GJB2 変異症例では，耳鳴，めめまい，耳鳴，内耳奇形の有無）について検討を行っ

まい，内耳奇形の頻度が両側感音難聴患者と比 し有た。

意に低く，GJB2 変異による難聴の臨床的特徴と考え【結果】難聴家系発端者1511名のうち両側感音難聴患られた。

者1,343例について GJB2 遺伝子変異頻度を検討した【結論】今回の大規模研究により日本人におけるGJB2

ところ，191例（14.2％）に遺伝子変異を認めた。難遺伝子変異の頻度および臨床像がより明確となり，こ聴の発見年齢別（０〜３歳，４〜５歳，６歳〜）で検の遺伝子変異を持つ患者への詳細な情報提供が可能と討したところ，０〜３歳の難聴患者の25.7％（108/なったと考えられる。

420）で遺伝子変異を認めた。また，遺伝子変異の種（論文審査の結果の要旨）

類は26種類発見され，その中でも235delC 変異の頻度

先天性難聴は1,000人に１人の割合で発症し，少なが最も多く，次いで V37I，G45E/Y136X，R143W ，

くとも半数は遺伝性難聴であると考えられている。そ176‑191 del16bp 変異の順に多く認められた。同様にのなかでもGJB2 遺伝子変異は遺伝性難聴のなかで最発症年齢別に検討した場合，０〜３歳では235delC がも頻度が高く，先天性難聴の原因として重要な位置づ

58.5％と高く発見年齢が高くなるほどその頻度は減けにあることは広く知られている。

少を認めた。一方，V37I は発見年齢が高くなるほど

本論文において塚田景大は，多施設，大規模調査に頻度は上昇し，V37I は発見年齢が遅れる可能性が示

より日本人における GJB2 遺伝子変異の頻度調査お唆された。日本人において235delC を持つ遺伝子型がよび臨床像の検討を行った。頻度調査を行った結果，高い頻度で認め，また，この遺伝子を持つ表現型は高両側感音難聴患者1,343例のうち191例（14.2％）に

度難聴になる傾向を認めた。しかし，V37I と R143W

遺伝子変異を認めた。難聴の発見年齢別（０〜３歳，をもう一方のアレルに持つ場合，それぞれ軽度難聴ま

４〜５歳，６歳〜）で検討を行ったところ，特に０〜たはより高度難聴になる傾向を認め，遺伝子型と表現

３歳の難聴患者では25.7％（108/420）と高率に遺伝型にある程度傾向があることが確認された。２年以上子変異を認め，GJB2 遺伝子変異は言語獲得前または聴力検査上経過観察ができた26例のうち両側性に進行

先天性難聴の原因として重要な位置づけにあることがを認めた症例は２例のみで GJB2 遺伝子変異による確認された。また，遺伝子変異の種類を検討したとこ

難聴は進行性を認めない可能性が考えられ，また，めろ日本人では多型を含め26種類発見され，その中でもまい，耳鳴，内耳奇形は両側感音難聴全体と比 し有235delC 変異の頻度が最も多く，次いで V37I，G45E

意に頻度が低かった。

/Y136X，
176‑191 del16bp 変異の順に多く認
R143W ，

【考察】先天性または言語獲得前難聴の難聴患者の約められた。同様に発見年齢別に検討した場合，０〜３25％に GJB2 変異が認められ，日本人先天性難聴患

歳では235delC が58.5％と高く発見年齢が高くなる者の重要な原因の一つであることが再確認された。東ほどその頻度は減少を認めた。一方，V37I は発見年

アジア領域では235delC 変異の頻度が最も高いと報告

齢が高くなるほど頻度は上昇し，V37I 症例は難聴のされており，今回，日本人においても同様に235delC

発見が遅れる可能性が示唆された。日本人において変異の頻度が最も高かった。聴力像の検討では，遺伝235delC を持つ遺伝子型が高い頻度で認め，この遺子型と表現型に相関関係が認められ，遺伝子検査は難伝子を持つ表現型は高度難聴になる傾向を認めた。さ聴患者の聴力を予測する上で有用であると考えられた。

らに，V37I または R143W をもう一方のアレルに持V37I 変異は軽度難聴で進行性も認めないと考えられ

つ場合，それぞれ軽度難聴またはより高度難聴になるるため，本来は先天性難聴と考えられるが，難聴が軽傾向を認め，遺伝子型と聴力の表現型の間には傾向性度であるため難聴の発見が遅れる可能性が示唆された。

があることが確認された。進行性について検討を行っ

また，V37I 変異症例は日本人における GJB2 遺伝子た結果，２年以上聴力検査上経過観察ができた26例の変異の中でも２番目に多い変異だが，対照（正常聴力）

うち両側性に進行を認めた症例は２例のみで GJB2

No. 5, 2010251

審査学位論文要旨

遺伝子変異による難聴は進行性を認めない可能性が考見られ，刺激で発現が２倍に上昇した。メモリーＢ細えられ，また，臨床像の検討では，めまい，耳鳴，内胞では，抗 RP105抗体を加えても増殖増強効果は見

耳奇形いづれも両側感音難聴全体と比し有意に頻度られなかったが，ナイーブＢ細胞では特に CpG DNAが低く GJB2 遺伝子変異症例の臨床的特徴と考えらに抗 RP105抗体加えたところ，著明な増殖が認められた。

れた。細胞表面および細胞内 TLR9の発現は，ナイー

本論文は，GJB2 遺伝子変異をもつ難聴患者およびブＢ細胞，メモリーＢ細胞ともに RP105刺激で増強

その家族に情報提供を行う上で非常に重要な情報を得した。生存細胞数を解析したところ，CpG DNA に抗られたと考えられる。主査，副査は一致して本論文をRP105抗体を加えるとナイーブＢ細胞の生存細胞数

学位論文として価値があるものと認めた。

が有意に増加していた。細胞増殖と生存に関係する
Akt のリン酸化と NFκB の活性化を検討したところ，

Potentiation of TLR9 responses for humannaı
ve B‑cell growth through RP105 signaling（RP105シグナルは TLR9と相乗的にヒト ナイーブＢ細胞の増殖を促進する）
山

崎

和

子

CpG DNA と抗 RP105抗体の刺激で Akt のリン酸化が増強した。CpG DNAおよび抗RP105抗体によって細胞質内ではIκBαがdegradationを起こし，RelA，p50の NFκB の核内移行がみられた。さらに CpG DNAと抗 RP105抗体の刺激では IκBαの degradation が遷延した。TLR9シグナルは免疫グロブリン産生と（論文の内容の要旨）

ナイーブＢ細胞の形質細 胞 分 化 を 誘 導 す る が，抗【背景と目的】Ｂ細胞は自然免疫と獲得免疫をつなぐ

RP105抗体刺激はその作用には影響を与えなかった。

重要な役割を担っているが，Ｂ細胞自体の自然免疫に

しかし IL‑21を添加することで，ナイーブＢ細胞の形おける機能は十分に解明されていない。Ｂ細胞には質細胞分化作用と免疫グロブリン産生が増強し，ナ

Toll like receptor（TLR）９，10が強発現し，このイーブＢ細胞から肺炎球菌特異抗体の産生がみられた。

うち TLR9シグナルはＢ細胞のクラススイッチや形質CVID 患者末梢血Ｂ細胞においても同様に抗 RP105

細胞分化を誘導し，病原体による初期の感染防御に重抗体刺激で TLR9発現が増加し，TLR9による細胞増要である。TLR9シグナルはメモリーＢ細胞を直接活殖，生存が増強した。IL‑21の添加によって CVID B

性化し作用するが，ナイーブＢ細胞においては付加的細胞からの肺炎球菌特異 IgM の産生がみられた。

なシグナルが必要であるといわれている。本研究では【結 論】RP105シ グ ナ ル は TLR9と 相 乗 的 に 作 用 し

Ｂ細胞に特異的に発現している RP105（CD180）シてナイーブＢ細胞の増殖と生存を促した。この作用にグナルの TLR9シグナルに対する作用について検討しは RP105シグナルによる TLR9発現の 増 強 と Akt‑

た。

NFκB 経路の活性化が関係していた。RP105シグナ【方法】健常成人末梢血よりＢ細胞を分離し，抗 CD27

ルは TLR9シグナルの免疫グロブリン産生作用には影

抗体付着 magnetic micro‑beadsを用いて CD27 メモ

響を与えなかったが，IL‑21を加えることで，ナイー

リーＢ細胞と CD27 ナイーブＢ細胞に分画した。メ

ブＢ細胞の形質細胞分化誘導と抗体産生が増強された。

モリーＢ細胞とナイーブＢ細胞を黄色ブドウ球菌

成人ナイーブＢ細胞，臍帯血Ｂ細胞，CVID 患者Ｂ細Cowan strain（SAC），抗 CD40抗体，TLR9のリガン

胞はこれらの混合刺激によって肺炎球菌特異 IgM 抗ドである CpG DNA などの刺激に抗 RP105抗体を加体を産生した。ナイーブＢ細胞，CVID 患者Ｂ細胞は，えて培養し，RP105および TLR9の発現，細胞増殖，細菌などの病原体の侵入に際し，germ‑line encoded

個々の細胞のサイズ，生存細胞数，免疫グロブリン産の抗体を産生し，急性期の感染防御を行っている可能

生，形質細胞分化誘導などについて検討した。更にメ性が示唆された。

モリーＢ細胞がなく，ナイーブＢ細胞のみで構成さ（論文審査の結果の要旨）

れている分類不能型免疫不全症（common variable

Ｂ細胞は自然免疫と獲得免疫をつなぐ重要な役割

immunodeﬁciency：CVID）患者３名の末梢血Ｂ細胞を担っているが，Ｂ細胞自体の自然免疫における機について同様の検討を行った。

能は十分に解明されていない。Ｂ細胞には Toll like

【結果】CD27 メモリーＢ細胞と CD27 ナイーブＢ細receptor（TLR）９，10が強発現し，このうちTLR9シ

胞ともに無刺激の状態で細胞表面に RP105の発現がグナルはＢ細胞のクラススイッチや形質細胞分化を誘252

信州医誌 Vol. 58

審査学位論文要旨

導し，病原体による初期の感染防御に重要である。

Ｂ細胞，CVID 患者Ｂ細胞は，細菌などの病原体の侵TLR9シグナルはメモリーＢ細胞を直接活性化し作入に際し，germ‑line encoded の抗体を産生し，急性用するが，ナイーブＢ細胞においては付加的なシグ期の感染防御を行っていることが示唆された。

ナルが必要であるといわれている。本研究ではＢ細胞に特異的に発現しているRP105（CD180）シグナルの主査・副査は一致して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

TLR9シグナルに対する作用について検討した。
健常成人末梢血よりＢ細胞を分離し，抗 CD27抗体
付着 magnetic micro‑beadsを用いて CD27 メモリー
Ｂ細胞と CD27 ナイーブＢ細胞に分画した。メモリー
Ｂ細胞とナイーブＢ細胞を，黄色ブドウ球菌 Cowan，抗 CD40抗体，TLR9のリガンドであstrain（SAC）

Liquid‑based thin‑layer cytology can beroutinely used in samples obtained via
ﬁberoptic bronchoscope（液状固定による薄層塗抹細胞診法は気管支鏡で得られた検体に使用可能）

る CpG DNA などの刺激に抗 RP105抗体を加えて培

小

養し，
細胞増殖，
個々の細胞
RP105およびTLR9の発現，

林

幸

弘

のサイズ，生存細胞数，免疫グロブリン産生，形質細（論文の内容の要旨）

胞分化誘導などについて検討した。更にメモリーＢ細【目的】 Liquid‑based cytology（LBC）を 用 い た

胞がなく，ナイーブＢ細胞のみで構成されている分類不Thinlayer 法は婦人科膣部細胞診の見落としを防止す

能型免疫不全症（common variable immunodeﬁciency

る目的のために米国で開発された標本作製法であり，： CVID）患者３名の末梢血Ｂ細胞について同様の検採取された全ての細胞を専用固定保存液で固定後に討を行った。

薄層塗抹する方法である。従来法に比べて① 乾燥変その結果，山崎は次の結論を得た。
1） RP105シグナルはTLR9と相乗的に作用してナイーブＢ細胞の増殖と生存を促した。
2） この作用には RP105シグナルによる TLR9発現の増強と Akt‑NFκB 経路の活性化が関係していた。

性がない，② 血性背景の影響を受けない，③ 塗抹範囲が狭いため鏡検時間が短縮，④ 同質かつ複数枚の標本作製が可能など様々な利点がある。一方，気管支鏡検査において細胞診は組織診と共に腫瘍性病変の鑑別に有用である。採取材料としては擦過（brush）が最3） RP105シグナルは TLR9シグナルの免疫グロブリも多く，組織片が採取出来ない場合は経気管支的穿刺

ン産生作用には影響を与えなかったが，IL‑21を加吸引（TBNA）のみで診断を決定しなければいけなえることで，ナイーブＢ細胞の形質細胞分化誘導とい場合もある。しかし検体量過少による乾燥変性や，抗体産生が増強された。成人ナイーブＢ細胞，臍帯出血による血性背景のために診断に至らないことも少血Ｂ細胞はこれらの混合刺激によって肺炎球菌特異なくない。そこで我々はThinlayer法に着目し，気管IgM 抗体を産生した。

支鏡検体に応用可能かどうかを検討した。

4） CVID 患者Ｂ細胞においても TLR9シグナルと【対象】信州大学医学部附属病院にて2006年１月〜2007年

RP105シグナルは相乗的に作用し，CVID B細胞の増９月の期間に気管支鏡検査を施行された62患者114件

殖，生存が促された。IL‑21の添加によって CVIDのbrush材料，および33患者34件の TBNA材料を用いB 細胞からの肺炎球菌 IgM 抗体の産生がみられた。

て検討した。

CVID はＢ細胞が欠損する無 γグロブリン血症に【方法】① 従来法にて作製されたbrush材料，および比し症状が軽い傾向があるが，この臨床上の重症度のTBNA材料について Papanicoraou（Pap.）染色を行

差はナイーブＢ細胞の自然免疫による直接的な感染防い，
この標本を conventional smear（CS）slide とした。

御機構が役立っていると思われ，ナイーブＢ細胞の維② 従来法で処理した後の器具を CytoRich RED にて持は重要である。RP105シグナルは TLR9シグナルと洗浄・固定し，これを LBC とした。③ LBC を用い相乗的に作用してナイーブＢ細胞の増殖と生存を促し，（TriPath 社の SurePath 法）によって標Thinlayer 法

ナイーブＢ細胞の維持に役立っている可能性がある。

本を作製しPap.染色を行い，この標本をLBP slideとまた，このような自然免疫刺激に IL‑21を加えることした。④ LBP slide と CS slide について診断一致率

によって成人ナイーブＢ細胞，臍帯血Ｂ細胞，CVIDの他，細胞量，細胞形態（収縮，染色性，乾燥変性），

患者Ｂ細胞は肺炎球菌特異抗体を産生した。ナイーブ

標本背景（炎症細胞，赤血球，アーチファクト）等の

No. 5, 2010253

審査学位論文要旨

比検討を行った。比

方法は各項目ごとに１〜４段階（数字が大きいほど診断に有益）のカテゴリーを設けて評価し客観性をもたせた。

はなかった。中には核小体の明瞭化が見られ，悪性所見が強調された症例もあった。
３．従来法で見られた幾つかの欠点が解消され，診断【結果】疑陽性も悪性とみなした場合の LBP slide とに有用な標本が得られた（乾燥変性，血性背景，

CS slide との診断一致率は brush においては98.4％，

stick like を示すアーチファクトの消失）。

TBNA においては100％であった。brush および

４．形態学的検索以外にも免疫細胞化学的染色に応用

TBNA 共に組織型においても LBP slide は CS slide，可能（大細胞神経内分泌癌の診断のための神経内分あるいは生検や手術材料による組織診と殆ど一致して

泌系マーカーの検索において有効）であった。

いた。brush および TBNA 共に細胞量は CS slide に

５．Thinlayer 法による LBP 標本は従来標本に比べ比べ LBP slide の方が少なかったが評価には十分なて鏡検時間の短縮にもなり細胞検査士の疲労回避や量であった。LBP slide は形態学的に細胞質や核が収業務軽減によるコスト削減が期待できる。

縮したり，染色性において核の濃縮が見られるが，診これらの結果より，LBP 標本は従来標本に比べて断に支障はなかった。また CS slide では診断の弊害

形態学的にも遜色がなくかつ標本作製上生じる様々なとなる乾燥変性や血性背景が多くの症例で見られたが，欠点も解消され，気管支鏡検体に利用可能と結論付け

LBP slide では認められなかった。炎症細胞や壊死にられる。よって主査，副査は一致して本論文を学位論

ついては多い少ないの差はあるが両標本間で見られた。

文として価値があるものと認めた。

ア ー チ フ ァ ク ト に つ い て は 特 に TBNA で は LBP
slide おいては全く見られなかった。

Nonalcoholic fatty liver disease in Japanese【考 察】LBP slide は CS slide に 比 べ て 細 胞 同 定 上

junior high school students: its prevalence andの弊害はなく，むしろ従来障害となっていた乾燥変

relationship to lifestyle habits（日本の中学生に性や血性背景の問題が解消された。さらに免疫細胞おける非アルコール性脂肪肝疾患：その有病率と生活習慣との関係）

学的染色も利用可能であり，特に今回TBNAにおいてSynaptophisin 染色が大細胞神経内分泌癌の診断に有用となった症例もあった。このことは特に TBNA 材

鶴

田

悟

郎

料のみで生検組織採取が困難な症例の時に診断価値が（論文の内容の要旨）高い。以上より気管支鏡細胞診（brush や TBNA 材【背景と目的】小児期より脂肪肝がみられ，それは肥料）において LBP slide は CS slide に比べて極めて満度と強い相関があるという報告は以前よりみられる。

有益と考えられた。
（論文審査の結果の要旨）

すでに肝硬変にまで至っていた症例の報告もみられるが，脂肪肝から非アルコール性脂肪肝炎 NASH に

Liquid‑based cytology（LBC）を利用した Thin-

至る原因は未だ全てが明らかではなく，小児肥満はlayer 法による LBP 標本は婦人科において既にある

年々増加しており，小児脂肪肝の早期発見・治療は大程度普及している。その特徴は直径13mm の円形に

変重要な問題である。

均一に塗抹され鏡検時間の大幅な短縮が可能，採取さ本研究では中学生における脂肪肝の有病率，また生れた全ての細胞を回収可能，細胞集塊の重なりが少な

活習慣との関連について調査を行った。

い，乾燥変性がない，標本作製において標準化が可能【対象と方法】2004年と2007年の２回，中学生計537名

といった利点がある。本研究ではその利点を生かしてに対し，体格の評価，血液検査，超音波検査による脂従来法では様々な問題があった気管支鏡検体（brush

肪肝の診断を行った。超音波検査では肝腎コントラス

および TBNA）において利用可能かどうかを検討し

ト，深部エコー減衰，肝内脈管の不明瞭化の３項目をた。

スコア化し脂肪肝の程度を評価した。2007年には食習

１．従来法に対する診断一致率は suspiciousも malig-

慣と運動習慣についてアンケートを用いて調査し，脂nant とみなした場合，brush で98.4％，TBNA で肪肝との関連について検討を行った。

100％と良好な成績であった。

【結果】中学生全体の約２割の生徒が太りぎみ，もし

２．従来法に比べ，形態学的には一部で細胞収縮，染くは肥満の体格であった。脂肪肝を認めた生徒は2004

色性の低下傾向を認めたが細胞同呈上は大きな支障

年では全体の4.4％，2007年で4.5％であった。体格254

信州医誌 Vol. 58

審査学位論文要旨

によって３群に分けそれぞれで脂肪肝の割合を比 したところ，痩せから適正体重の群の約１％に軽度の脂肪肝を認めた。2007年の太りぎみの群の12％にやは（論文審査の結果の要旨）
小児期より脂肪肝がみられ，それは肥満度と強い相関があるという報告は以前よりみられる。

り軽度の脂肪肝を認めた。肥満の群の約３割が脂肪肝

すでに線維化や肝硬変にまで至っていた症例の報告であり，中等度から重度の脂肪肝は全てこの群に含まもみられるが，脂肪肝から非アルコール性脂肪肝炎

れた。脂肪肝の有無で２群に分け比 を行ったところ，

NASH に至る原因は未だ全てが明らかではなく，小脂肪肝がある群で男子が有意に多く，肥満の体格が多児肥満は年々増加しており，小児脂肪肝の早期発見・かった。また生化学検査では ALT ・ γGT，中性脂治療は大変重要な問題である。本研究では中学生にお肪は有意に高く，HDL‑C は有意に低かった。脂肪肝

ける脂肪肝の有病率，また生活習慣との関連についての程度により，脂肪肝を認めない・軽度の脂肪肝・中調査を行った。

等度から重度の脂肪肝の３群に分け比を行ったとこ2004年と2007年の２回，中学生計537名に対し，体ろ，脂肪肝の程度は肥満の程度と相関があり，また脂格の評価，血液検査，超音波検査による脂肪肝の診断

肪肝の程度が強いほど ALT，γGT，中性脂肪は有意を行った。超音波検査では肝腎コントラスト，深部エに高値であり，逆に HDL‑C は低値であった。肥満

コー減衰，肝内脈管の不明瞭化の３項目をスコア化しであることと，ALT30U/L 以上であることが独立予

脂肪肝の程度を評価した。2007年には食習慣と運動習

測因子であることが証明され，学校健診に ALT の項

慣についてアンケートを用いて調査し，脂肪肝との関目を加えることは脂肪肝の早期発見に有用であること

連について検討を行った。

が示唆された。
脂肪肝の有無で２群に分け生活習慣との関連を検討したところ，食習慣では「朝の欠食が週に２回以上ある」と，「麵類の汁を半分以上飲む」に，運動習慣では運動量の減少と脂肪肝との間に有意な相関がみられた。

その結果，鶴田は次の結論を得た。
１．中学生全体の約２割の生徒が太りぎみ，もしくは肥満の体格であった。
２．脂肪肝を認めた生徒は2004年では全体の4.4％，
2007年では4.5％であった。
３．痩せから適正体重の群の約１％に軽度の脂肪肝を，【考察】本研究は日本人中学生における脂肪肝の有病

2007年の太りぎみの群の12％に軽度の脂肪肝を，率と臨床的特徴，さらに脂肪肝と生活習慣との関連を

また肥満の群の約３割に脂肪肝を認めた。中等度か検討した初めての疫学的研究である。中学生の約４％

ら重度の脂肪肝は全て肥満の群に含まれた。

に脂肪肝が認められ，肥満と運動量の減少に相関があることが証明された。
肥満とALT 30U/L以上が脂肪肝の独立予測因子と４．脂肪肝がある群には男子が有意に多く，肥満の体格が多かった。また生化学検査では ALT ・ γGT，
中性脂肪は有意に高く，HDL‑C は有意に低かった。

証明され，また脂肪肝の程度とも有意な相関が認めら

５．脂肪肝の程度は肥満の程度と相関があり，また脂れることより，ALT の測定を学校検診に取り入れる

肪肝の程度が強いほど ALT，γGT，中性脂肪は有ことで早期の脂肪肝の発見に有用である可能性が示唆

意に高値であり，逆にHDL‑Cは低値であった。肥満された。また運動量の減少，朝の欠食と脂肪肝との関であることと，ALT が30U/L 以上であることが脂連も認められ，それらを改善する指導が小児の脂肪肝

肪肝の独立予測因子であった。

を予防することにつながる可能性もあわせて示唆され

６．食習慣については「朝の欠食が週に２回以上あた。相当数の小児肥満が成人肥満に移行すると考えらる」と，「麵類の汁を半分以上飲む」に，運動習慣

れ，小児期の肥満と脂肪肝への適切な介入は成人期のについては運動量の減少が，脂肪肝と有意な関連が脂肪肝の有病率低下につながるかもしれない。しかしあった。

一方ではっきりとした症状がないうちは，脂肪肝の治

これらの結果より，中学生の約４％に脂肪肝を認め，療の重要性を理解してもらうことは本人にとっても家

肥満と運動量の減少との関連が証明され，学校検診に族にとっても困難であることも予想される。

ALT 検査を追加することは早期の脂肪肝の発見に有医療と地域社会とが連携し，生活習慣病予防と脂肪用であることが示唆された。よって主査，副査は一致

肝のスクリーニングを行っていく必要があると考える。

して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

No. 5, 2010255

審査学位論文要旨

L に達し，透析患者の４倍以上であった。24カ月齢のMouse model to study human AßM
amyloidosis: Generation of a transgenic
mouse with excessive expression of human
ß‑microglobulin（ヒト透析アミロイドーシス研究のためのモデルマウス：ヒト ßミク
ログロブリン過剰発現トランスジェニックマ
ウスの作製）張鵬

Tg マウスでアミロイド沈着を認めたが，AßM アミ
ロイド沈着は観察されず，AApoA Ⅱアミロイドの沈着であった。患者組織から抽出した AßM 線維や
AApoA Ⅱ線維を投与したマウスでは，アミロイド線維を投与しなかったマウスや試験管内で合成した
AßM 線維を投与したマウスよりアミロイド沈着程
度は重篤であったが，やはり AßM アミロイド沈着は観察されず，AApoA Ⅱアミロイド沈着のみが認尭められた。特に，DRAの主要な 沈 着 部 位 で あ る 椎（論文の内容の要旨）

間板及び膝関節にもアミロイド沈着を観察したが，【背景と目的】長期透析患者では，ß‑ミクログロブ

AApoA Ⅱアミロイドの沈着であった。正常マウスでリン（ßm）がアミロイド線維（AßM ）を形成・沈は血中 ßm の濃度は非常に高いが，マウス ßm はタ

着し，全身関節症状を主症状とする透析アミロイドー

ンパク質構造的にアミロイド線維を形成し難いため，

シス（dialysis‑related amyloidosis：DRA）が重篤

アミロイド沈着が起こらないと考えられてきた。そこな合併症である。最近の生化学的・タンパク質化学でマウス ßm 遺伝子のノックアウトマウスとヒト ß

的解析の急速な進展にかかわらず，DRA患者におmTg マウスを交雑してヒト ßm のみを高発現するマ

けるアミロイドーシス発症の機序はほとんど解明さウスを作製したが，マウスの寿命である２年齢以上のれていない。その原因の１つは有用なモデル動物がマウスでも AßM アミロイド沈着は観察できなかっ存在しないことである。DRA 患者における AßM ア

た。また試験管内での AßM アミロイド線維形成で

ミロイド線維の形成と病態発症機構の解明のためには核形成依存性線維伸張反応（seeding）が基本的反

ヒト ßm を過剰発現し，アミロイド線維を形成しない

応モデルとして実証されているが，Tg マウスにアミとされるマウス内在性 ßm を欠失したモデルマウス

ロイド線維を投与しても AßM アミロイド沈着を誘（hB2M Tg

発できず，cross‑seeding によって AApoA Ⅱアミロ

mB2m）を作成し，アミロイドーシ

スの発症を解析した。

イドの沈着が引き起こされた。これらの結果は血中【方法】 CAG（cytomegalovirus immediate early

hßm 濃度の上昇と seeding 効果だけではアミロイド

gene enhancer /chicken ß‑actin promoter and rab-

沈着を誘発できないことを示唆している。

bit ß‑globin poly（A） signal）プロモーターの下流【結論】血清中 ßm 濃度の上昇を示す Tg マウスに ヒ ト ßm cDNA を 持 つ コ ン ス ト ラ ク ト を，C57（hB2M Tg

BL/6マウス受精卵に投与し，Tg マウスを作製した。

シスの発症を解析した結果，持続的高 ßm 濃度とア

さらに ßm ノックアウトマウスと交配し，ヒト ßm

ミロイド線維による seeding 効果は，アミロイド線維のみを発現する交雑マウスを作製した（hB2M Tg

形成に十分ではないことが明らかになった。このモデ

mB2m）。自然発症アミロイド沈着の他に，① 試験管内でリコンビナントヒト ßm から作成した AßM
アミロイド線維，② DRA患者組織から抽出したAßM

mB2m）を作成して，アミロイドー

ルマウスは DRA 発症に必要な他の要因を解析するためにも有用なモデル動物である。
（論文審査の結果の要旨）

アミロイド線維，③ マウス肝臓から抽出したマウス

長期透析患者では，ß‑ミクログロブリン（ßm）

老化アミロイド線維（AApoA Ⅱ），を Tg マウスにが ア ミ ロ イ ド 線 維（AßM ）を 形 成 ・ 沈 着 し，全投与してアミロイドーシスの誘発を行い，アミロイド

身関節症状を主症状とする透析アミロイドーシス

沈着を調べた。アミロイド沈着と沈着線維の同定は，（dialysis‑related amyloidosis：DRA）が重篤な合併

組織切片のコンゴ赤染色後の偏光顕微鏡による観察と，症であるが，アミロイドーシス発症の機序はほとんど

ヒト ßm 及びマウス apoA‑Ⅱ抗体を用いた免疫組織解明されていない。DRA 患者における AßM アミロ

染色で行った。

イド線維の形成と病態発症機構の解明のためにヒト【結果と考察】hB2M Tg

マウスは全身臓ßm を過剰発現し，アミロイド線維を形成しないと器でヒト ß2m を発現し，血漿中 ß2m 濃度は193mg/

されるマウス内在性 ßm を欠失したモデルマウスを

256

mB2m

信州医誌 Vol. 58

審査学位論文要旨

作成し，アミロイドーシスの発症を解析した。全身臓機能を担っているが，寄生虫感染時のみならずアレル器で高発現する CAG プロモーターの下流にヒト ßmギー反応の際にも増殖し，浸潤組織を傷害する原因とcDNA を持つコンストラクトをマウス受精卵に投与もなる。これら好酸球の関与する病態の制御には，未して作製した Tg マウスを ßm ノックアウトマウス

だ不明な好酸球の恒常性に関する分子遺伝学的メカニと交配し，ヒト ßm のみを発現する交雑マウスを作

ズムの解明が必須である。MES 系ラットは，シトク

製した（hB2M Tg

ロームｂ（‑245）αポリペプチド（Cyba）遺伝子の

mB2m

）
。

この Tg マウスの血漿中 ßm 濃度は193mg/L に達

機能喪失型突然変異に起因する，骨髄での好酸球の異し，透析患者の４倍以上であった。自然発症アミロイ

常増殖，末梢での好酸球増多，胃腸炎や大動脈炎を含ド沈着の他に，① 試験管内でリコンビナントヒ ト

む各臓器での好酸球浸潤に起因する炎症性病巣形成をßm から作成した AßM アミロイド線維，② DRA

自然発症する，好酸球研究に有用なラット系統である。

患者組織から抽出した AßM アミロイド線維，③ マ

本研究では，好酸球の動態に関して異なる表現型を有ウス肝臓から抽出したマウス老化アミロイド線維する新たなモデル動物を確立することを目的として，（AApoA Ⅱ），を Tg マウスに投与してアミロイドー

M ES 系ラットとは異なる遺伝子背景をもつ BN 系

シスの誘発を行い，アミロイド沈着を調べた。

ラットをレシピエントとするコンジェニック系ラット

その結果，張は次の結果を得た。
１．マウスの寿命である24カ月齢の Tg マウスで，ア
ミロイド沈着を認めたが，AßM アミロイド沈着（BN.M ES‑Cyba）を作製し，その血液学的，病理学的，および分子遺伝学的特性を MES 系ラットと比検討しつつ詳細に解析した。

は観察されず，AApoA Ⅱアミロイド線維の沈着で【材料と方法】BN 系ラットへの８回の連続戻し交配あった。

とその後 の 兄 妹 交 配 に よ り BN.MES ‑Cyba

２．３種類のアミロイド線維を投与して seeding 効果

コン

ジェニック系ラットを確立した。MES系ラットおよびによるアミロイドーシスの誘発を試みたが，AßM

BN.M ES‑Cyba

コンジェニック系ラットを15週齢アミロイド沈着は観察されず，AApoA Ⅱアミロイで採血した。安楽死後に肝臓，脾臓，および肺を摘出

ド沈着のみが認められた。とくに DRA の主要な沈し，ヘマトキシリン/エオジン染色病理標本を作製し着部位である椎間板及び膝関節にもアミロイド沈着た。骨髄および末梢血は自動セルカウンターを用いてを観察したが，AApoA Ⅱアミロイドの沈着であっ好酸球の数量を測定した。好酸球遊走に関わる因子

た。

である３種のエオタキシン CCL11，CCL24，およびこれらの結果より，持続的な血中高 ßm 濃度とア

CCL26の，好酸球の浸潤標的である骨髄，脾臓，腸ミロイド線維による seeding 効果だけでは，アミロイ

間膜リンパ節，肝臓および腸管での転写発現量をRT‑

ド線維形成に十分でないことが明らかになった。今後

PCR 法により調査した。好酸球上でのエオタキシン受

このモデルマウスは DRA 発症に必要な要因を解析す

容体をコードするケモカインレセプター３（Ccr3 ）るために活用されることが期待でき，主査，副査は一遺伝子，および好酸球の移動や組織への接着に関与致して本論文を学位論文として価値があるものと認めする４種のインテグリンをコードする遺伝子（Itga4，

た。

Itgam，Itgb1，Itgb2）のコード領域を，骨髄からのmRNA により RT ‑PCR 法により増幅し，その塩基

BN.M ES‑Cybacongenic rats manifest
focal necrosis with eosinophilic inﬁltrationin the liver without blood eosinophilia（BN.MES‑Cyba コンジェニックラットは血中の好酸球増多を発症することなく，肝臓への好酸球浸潤による壊死像を呈する）
友澤寛

配列を比 してラット系統間の多型の有無を調査した。
さら に，（M ES×BN.MES ‑Cyba）F 交 雑 仔 ラ ット群を作出し，Ccr3 ，およびItga4遺伝子に認められた塩基配列多型と末梢血好酸球レベルとの遺伝相関解析を行った。
【結果と考察】BN.M ES ‑Cyba

コンジェニ ッ ク 系

ラットは骨髄中での好酸球比率は雌で平均25.2％，
雄で平均29.4％と MES 系ラットと同様に異常な好（論文の内容の要旨）

酸球増殖を呈する一方で，末梢血中好酸球レベル，お【目的】好酸球は，ある種の寄生虫に対する生体防御

よび好酸球性炎症の臓器分布に関しては MES 系ラッNo. 5, 2010257

審査学位論文要旨

トとは異なる表現型を示した。末梢血中好酸球は，雌エオタキシン（好酸球遊走因子）の，好酸球の浸潤標で平均150/μl，雄で平均127/μl と正常値を示した。

的組織である，骨髄，脾臓，腸間膜リンパ節，肝臓おまた，コンジェニック系ラットには MES 系ラットによび腸管での転写発現を RT‑PCR 法で調査した。好は観察される好酸球性胃腸炎が認められない一方で，酸球上でのエオタキシン受容体をコードするケモカイ

MES 系ラットには認められない肝臓での好酸球浸潤

ンレセプター３（Ccr3 ）遺伝子，および好酸球の移による巣状壊死が観察された。好酸球の浸潤標的組織

動や組織への接着に関与する４種のインテグリンをにおける３種のエオタキシンの転写発現量には，肝臓コードする遺伝子（Itga4，Itgam，Itgb1，Itgb2）のを含む全ての組織で両ラット系統間に差は認められなコード領域を，骨髄のｍ RNA を RT ‑PCR 法によりかった。両ラット系統間に Ccr3 ，および Itga4 遺伝

増幅し，その塩基配列を両系統間で比子内でのミスセンス塩基置換多型を認めた。しかしな（M ES×BN.MES‑Cyba

がら，20匹の（M ES×BN.MES‑Cyba

出し Ccr3 ，および Itga4 に認められた塩基置換多型）F 交雑仔

ラット群においては両遺伝子多型と血中好酸球レベルとの遺伝相関は認められなかった。したがって，エオ
タキシンの転写発現，および２種の遺伝子多型が血中した。さらに，）F 交雑仔ラット群を作と末梢血好酸球レベルとの遺伝相関を解析した。
その結果，友澤寛は以下の結果を得た。
１．BN.M ES ‑Cyba

コンジェニック系ラットは好酸球レベルの系統差の原因である可能性は棄却さ

MES 系ラット同様に骨髄中での異常な好酸球増殖れた。以上の結果より，本研究において確立されたを呈する一方で，末梢血中好酸球レベルに関してはBN.M ES‑Cyba

BN.MES‑Cyba

コンジェニック系ラットは，好酸球の動態に関して MES 系ラットとは異なる表現型を有する新たなモデル動物であることが明らかとなった。

コンジェニック系は正常値となり，MES 系とは異なる表現型を示した。
２．BN.M ES‑Cyba

コンジェニック系ラットには

これらの表現型の系統差は遺伝的多型に起因すると考MES 系ラットに観察された好酸球性胃腸炎が認めえられた。特に，BN.MES‑Cyba

コンジェニック

られない一方で，M ES 系ラットには認められない系ラットには，骨髄中で異常増殖した好酸球の末梢血

肝臓での好酸球浸潤を伴う巣状壊死が観察された。

中への移行を強力に抑制する遺伝子（群），および好３．好酸球の浸潤標的組織における３種のエオタキシ酸球の肝臓への浸潤を誘起する遺伝子（群）が存在す

ンの転写発現量には両系統間での差は認められなることが示唆された。両系統のラットのさらなる解析

かった。

により，好酸球の増殖，およびその後の体内動態を規４．両系統間にCcr3 および，Itga4遺伝子にミスセン

定する分子遺伝学的メカニズムの解明が可能と考えら

ス塩基置換多型を認めたが，20匹の（MES×BN.

れた。

MES‑Cyba（論文審査の結果の要旨））F 交雑仔ラット群で両遺伝子多型と血中好酸球レベルとの遺伝相関は認められなかっ

申請者は好酸球増多症を自然発症する MES 系ラットから，好酸球の動態に関して異なる表現型を有する

た。
以上の結果より，本研究において確立された BN.

新たなモデル動物を確立する目的で，MES 系ラット

M ES‑Cybaとは異なる遺伝子背景を持つ BN 系ラットをレシピ

動態に関して MES 系ラットとは異なる表現型を有す

エントとするコンジェニック系ラット（BN.MES‑

る新たなモデル動物であることが明らかとなった。こ）を作製し，その血液学的，病理学的，およれら表現型の系統差は，MES 系ラットと BN.MES‑

Cyba

び分子遺伝学的特性を MES 系ラットと比

検討しつ

つ詳細に解析した。
コンジェニック系

ラットを確立した。MES系ラットおよび BN.MES‑
Cyba

コンジェニック系ラットとの間に存在する好酸球の体内動態に関する遺伝的多型に起因すると示唆BN 系 ラ ッ ト へ の ８ 回 の 戻 し 交 配 と そ の 後 の 兄
妹交配に よ り BN.M ES ‑Cyba

Cyba

コンジェニック系ラットは，好酸球のコンジェニック系ラットを15週齢で採血し，安楽死後に肝臓，脾臓，肺を摘出しヘマトキシリン/された。両系統ラットのさらなる解析により，好酸球の増殖，およびその後の体内動態を規定する分子遺伝学的メカニズムの解明が可能であると考える。よって，主査・副査は一致して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

エオジン染色病理標本を作製した。骨髄および末梢血は自動血球分析器で好酸球の数量を測定した。３種の258

信州医誌 Vol. 58

審査学位論文要旨

α1D，α1B および AT1の発現は生食投与群で有意にExpression of α1‑Adrenergic Receptor
Subtypes and Angiotensin Ⅱ Type 1 Receptor in the Prostate of Spontaneously
Hypertensive Rats（自然発症高血圧ラット
前立腺におけるアドレナリン α1受容体サブタイプおよびアンギオテンシンⅡタイプ１受容体の発現）
中山

剛

増加していた。
WKY においては生食投与群と非投与群では SBP
および前立腺重量に有意差を認めなかった。また，
ventral lobe および lateral‑dorsal lobe ともに α1A，
α1D，α1BおよびAT1の発現に有意な差を認めなかった。
【考察】SHR では生食投与群で ventral lobe において α1A，α1D，α1B および AT1の発現が有意に増加していた。ラットの ventral lobe はヒトでの BPH の（論文の内容の要旨）

発生部位である移行域（transition zone）に相当し，【背景と目的】前立腺肥大症（benign prostate hyper-

BPH の発生機序と何らかの関係があるものと考えら

plasia；BPH）に伴う下部尿路症状（lower urinary

れた。また降圧薬である AT1阻害薬の BPH によるtract symptoms；LUTS）の発生機序において高血

LUTS に対する治療薬としての可能性および血圧の圧症との関連は明確になっていない。本研究は自然発コントロールや塩分摂取の制限が BPH 進行の抑制に症高血圧ラット（spontaneously hypertensive rats；

寄与する可能性が示唆された。

SHR）前立腺における，上皮細胞の α1アドレナリン【結論】SHR において認められる生食投与による α1受容体サブタイプ（α1A，α1D，α1B）とアンギオテ

A，α1D，α1Bおよび AT 1の増加は BPH の発症，さンシンⅡタイプ１受容体（AT1）の発現に着目し検討らに BPHにともなう LUTSの発生に関与している可を行った。

能性が推察された。

【対象と方法】25週齢オス SHRと25週齢オス Wistar‑（論文審査の結果の要旨）

Kyoto ラット（WKY）をそれぞれ12匹とし，各ラッ

前立腺肥大症の発症機序は明らかになっていない。

トを生食投与群６匹と非投与群６匹に分けた。生食投臨床的に高血圧症と前立腺肥大症との関わりが注目さ与群は0.9％塩化ナトリウム水溶液（生理食塩水；生れている。両者に影響を及ぼす因子として，交感神経食）を体重１kg 当たり20ml，７日間経口投与した。

系とアンギオテンシンⅡがある。これらはそれぞれ投与７日後，体重および収縮期血圧（SBP）を測定

α1アドレナリン受容体およびアンギオテンシンⅡタ

し前立腺を摘出した。摘出した前立腺組織の重量を測

イプ１受容体（AT1）を介した経路で血圧上昇と細定した後，前立腺組織を ventral lobe および lateral‑

胞増殖に関与することが知られている。一般的に塩

dorsal lobe に分け，パラフィン包埋を行った。組織分の負荷により高血圧症を引き起こすことが知られ標本に対して細胞増殖能，アポトーシスによる細胞死ているが，今回，25週齢オス自然発症高血圧ラットについて，さらに α1A，α1D，α1B および AT1の発（SHR）12匹と正常血圧コントロールである25週齢

現を免疫組織染色で観察し，画像解析を行った。

オス Wistar‑Kyotoラット（WKY）12匹を用いて，【結果】SHR においては，生食投与群と非投与群でそれぞれ生理食塩水20ml/kg を７日間投 与 し た 群

は SBP は205.5±5.4mmHg，192.2±4.6mmHg，（生食投与群）６匹と，非投与群６匹とに分け，塩分負および前立腺重量は1.24±0.03g，1.18±0.017gであ荷による前立腺の ventral lobe および lateral‑dorsal

り，生食投与群でそれぞれ上昇，増加する傾向にあっlobe における α1アドレナリン受容体および AT1のたが，有意差はみられなかった。Ventrallobeでは，両発現に及ぼす影響につき検討した。SHR ではさらに群間で細胞増殖能には違いが認められず，アポトーシ

細胞増殖能（PCNA），アポトーシスについても検討

スによる細胞死は両群ともにほとんどなく，有意な差した。

も認めなかった。この部位でのα1A，α1D，α1Bおよ

その結果，中山は以下に示すような結論を得た。

び AT1の発現は生食投与群で有意に増加していた。

SHR においては

一方 lateral‑dorsal lobe における細胞増殖能は生食

１．両群間で収縮期血圧，前立腺重量に有意な差を認

投与群で有意な増加が認められた。アポトーシスによる細胞死は両群ともにほとんどみられなかった。α1A，No. 5, 2010

めなかった。
２．両群間で HE 染色における前立腺肥大症の組織259

審査学位論文要旨の程度に変化を認めなかった。

ピジェネティック研究の良きプローブと考えられてい３．ventral lobe において，細胞増殖能は両群間で多る。今回，ASC 遺伝子のメチル化の年齢依存性およく認めたが有意な差は認められず，アポトーシスに

び長期間にわたる運動，すなわち６カ月間のインターよる細胞死は両群ともほとんどみられなかった。

バル速歩によって ASC 遺伝子のメチル化がどの様に

α1A，α1D，α1B および AT1の発現は生食投与群影響を受けるかを検討した。また。メチル化による発で有意に増加していた。

現抑制が知られている癌抑制遺伝子 p15 についても

４．lateral‑dorsal lobe において，細胞増殖能は生食同様の検討を行った。

投与群で有意な増加が認められたが，アポトーシス【材料及び方法】熟年体育大学に参加し，インターバによる細胞死は両群ともほとんどみられなかった。

ル速歩（40％ VO

α1A，α1D，α1B および AT1の発現は生食投与群

けて70％ VOで有意に増加していた。

セットとし，５セット以上繰り返す）を６カ月間行っ

以下の強度で３分間歩行し，続以上の強度で３分間歩き，これを１

５．ventral lobe と lateral‑dorsal lobe との比 では，た人で週２日以上実施した群をシニア運動群（n＝生食投与群において ventral lobe に α1A が多く，

230，年齢分布41‑86，平均年齢66.2±7.1）とし，非lateral‑dorsal lobe に α1B と AT1が有意差をもっ処方のシニア層（n＝153，年齢分布40‑87，平均年齢て多く発現していた。

64.8±7.5）と青年層（n＝34，年齢分布18‑22，平均

WKY においては

年齢19.4±0.9）のコントロール群と ASC のメチル

６．ventral lobe および lateral‑dorsal lobe において，化率を比 した。また，メチル化率がどの因子によっα1A，α1D，α1B および AT1の発現は両群間で有て影響を受けるか多変量解析を用いて検討し，ステッ

意差を認めなかった。

プワイズ重回帰分析を用いて有意な説明変数を解析しこれらの結果より，SHR においては短期間の塩分た。

の負荷によって血圧の上昇が見られない状態でも，前メチル化率の測定は被験者の末梢血より DNA を立腺における受容体発現が変化しており，BPH の発抽出し，bisulﬁte処理によって非メチル化シトシンを症機序に関わることが示唆された。

チミンへ変換したのち，ASC 遺伝子の CpG island の以上より，主査，副査は一致して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

中から特定した７つの CpG サイトについて pyrosequencing 法によって行った。
【結果】ASC のメチル化は年齢依存的に低下し，そのExercise Eﬀects on Methylation of ASC
Gene（ASC 遺伝子のメチル化に関する運動
効果）
中

島

弘

毅

（論文の内容の要旨）

メチル化率に影響を及ぼす因子は，年齢のみが有意な独立変数として採用された。また，運動群（6.29±
0.26％）は，シニアのコントロール群（5.33±0.14％）に比して有意に高いメチル化を示し（ｐ＜0.01），
青年のコントロール群（6.73±0.38％）に近づいた。
癌抑制遺伝子 p15 のメチル化は年齢及び運動による【背景と目的】適度な運動は，炎症性サイトカインを変化は認められなかった。

低減させ，炎症を弱めることが明らかにされている。

【結論】適度な運動は，炎症性サイトカインを低減さ

最近，Toll‑like 受容体に加え，細胞質における病原せ，炎症を弱めることが明らかにされている。今回，体受容体を介する炎症反応の要として inﬂammasome

運動が ASC 遺伝子のメチル化に及ぼす影響を検討しが注目されているが，ASC はアダプター蛋白質とした結果，６カ月のインターバルウォーキングによって，て inﬂammasome 形成の中心的働きをする。ASC は，遺伝子レベルでもエピジェネティック効果として若年proapoptotic 蛋白質として当分野で発見されたが，齢方向へシフトすることが分かった。長期の適度な運

procaspase‑1を inﬂammasome にリクルートし活性動による ASC 遺伝子のメチル化の増強は ASC 蛋白化する機能もあり，caspase‑1による炎症性サイトカ質の発現抑制を介し，余分な炎症性サイトカイン発現

イン IL‑1β，IL‑18の活性化と産生の鍵分子であるこを抑制すると考えられた。

とが明らかになっている。一方 ASC 遺伝子は，CpG
island のメチル化による発現制御が知られており，エ260（論文審査の結果の要旨）
適度な運動は，炎症性サイトカインを低減させ，
信州医誌 Vol. 58

審査学位論文要旨

炎症を弱めることが明らかにされている。ASCは，を世界で初めて示した論文であり，主査，副査は一致

procaspase‑1を inﬂammasome にリクルートし活性して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

化する機能もあり，caspase‑1による炎症性サイトカ
イン IL‑1β，IL‑18の活性化と産生の鍵分子であること，CpG island のメチル化による発現抑制が明らかになっている。今回，ASC 遺伝子のメチル化の年齢依存性および長期間にわたる運動，すなわち６カ月間のインターバル速歩によって ASC 遺伝子のメチル化がどの様に影響を受けるかを検討した。
被験者は，熟年体育大学への参加者と大学生である。
運動は，インターバル速歩（40％ V0Trypsin digestion on paraﬃn sections is a
useful tool for diagnosis of Alport syndrome（トリプシン消化はパラフィン切片でのアルポート症候群の診断に有用である）
姜

英

松（論文の内容の要旨）

以下の強度【背景と目的】アルポート症候群の診断においては，以上の強度で３凍結切片を用いて，Ⅳ型コラーゲン α鎖の免疫染色

分間歩き，これを１セットとし，５セット以上繰り返を行い，α鎖の異常が認められたならば，遺伝子のす）を６カ月間行った。週２日以上実施した群をシニ異常を確認しなくとも診断できる。しかし，凍結切片

ア 運 動 群（n＝230，年 齢 分 布41‑86，平 均 年 齢66.2を利用できない場合は診断が困難である。腎臓糸球体±7.1）とし，非処方のシニア層（n＝153，年齢分布

基底膜とボウマン囊基底膜 α5鎖の染色結果から，ア40‑87，平均年齢64.8±7.5）と青年層（n＝34，年齢

ルポート症候群の可能性と，さらにＸ連鎖優性型か，

分布18‑22，平均年齢19.4±0.9）のコントロール群と常染色体劣性型かの情報が得られる。パラフィン切片

ASC のメチル化率の比で抗原賦活化によってアルポート症候群が診断できる

で３分間歩行し，続けて70％ VOを行った。また，メチル化率がどの因子によって影響を受けるか多変量解析を用かどうかが，本研究の目的である。

いて検討し，ステップワイズ重回帰分析を用いて有意【材料及び方法】抗体：アルポート症候群研究用蛍光な説明変数を解析した。

色素標識抗体（FITC 標識抗ヒトⅣ型コラーゲン α5

メチル化率の測定は被験者の末梢血より DNA を抽鎖抗体と Texas Red 標識抗ヒトⅣ型コラーゲン α2出し，bisulﬁte 処理によって非メチル化シトシンをチ抗体）；コントロールは７例（手術例１例，微小変化ミンへ変換したのち，CpG island の中から特定した群６例）；電顕所見と凍結切片での α5鎖蛍光染色結７つの CpGサイトについて pyrosequencing法によっ果によりアルポート症候群確定例は12例；電顕所見のて行った。

みのアルポート症候群疑い例は９例；IgA 腎症は７例

その結果，中島は次の結論を得た。

である。パラフィン切片での抗原賦活化の条件：１）

１．ASC のメチル化は年齢依存的に低下し，そのメトリプシン消化60分，90分，120分；２）マイクロウ

チル化率に影響を及ぼす因子は，年齢のみが有意なエーブ（EDTA ないしクエン酸バッファー＋プロテ

独立変数として採用された。

アーゼ消化５分，10分，15分；３）オートクレープ

２．運動群（6.29±0.26％）は，シニアのコントロー（115℃，121℃）６分間加熱；４）プロテアーゼ消化ル群（5.33±0.14％）に比して有意に高いメチル化40分。抗原賦活化後，バッファーで３回洗浄し，抗を示し（ｐ＜0.01），青年のコントロール群（6.73±

α5＋α2標識抗体を４℃で overnight incubation して，0.38％）に近づいた。

レーザー顕微鏡で観察した。

３．癌抑制遺伝子 p15 のメチル化は年齢及び運動に【結果】トリプシン消化90分の条件が最も抗原がよくよる変化は認められなかった。

賦活化され，アルポート症候群と確診された12例ではこれらの結果より，長期の適度な運動（６カ月間の凍結切片と同じパターンでかつほぼ同程度に染色されインターバル速歩）は，ASC メチル化率においてエた。電顕的にアルポート症候群が疑われた10例のうち，ピジェネティック効果として若年齢方向にシフトする

９例はＸ連鎖優性型アルポート症候群で，１例だけはことが分かった。長期の適度な運動による ASC 遺伝

常染色体劣性型アルポート症候群であった。Ｘ連鎖優子のメチル化の増強は ASC 蛋白質の発現抑制を介し，性型アルポート症候群の女性例では加齢につれてモザ

余分な炎症性サイトカイン発現を抑制すると考えられイクパターンを呈する糸球体が増加していた，そのう

た。本論文は運動処方によるエピジェネティック効果

ちの２例の40歳以上の患者では血清クレアチニン値がNo. 5, 2010261

審査学位論文要旨高かった。IgA 腎症ではトリプシン消化90分により免片での α5鎖蛍光染色結果によりアルポート症候群が疫複合体の沈着も証明できた。

確定した例12例，電顕所見のみのアルポート疑い例９【結論】1）パラフィン切片でも抗原賦活化によって凍例の計21例である。抗原賦活化の最適条件を検討する

結切片とほぼ同じ程度に蛍光染色することが可能だっために，脱パラ後，次のような条件で抗原賦活化をた。2）トリプシン90分消化が最も優れていた。3）パ行った。1）トリプシン消化60分，90分，120分；2）

ラフィン切片しか得られない症例でもα5の蛍光パター

M icrowave with EDTA or CA ＋プロテアーゼ消化ンから遺伝形式が明らかになった。4）女性では加齢５分，10分，15分；3）オートクレープで115℃，121℃

につれてモザイクパターンを呈する糸球体が増加してのいずれかの温度で６分間加熱；4）プロテアーゼ消いた。5）免疫複合体の沈着も証明できた。

化40分。抗原賦活化後，PBS で３回洗浄し，α5＋α2以上のことよりトリプシン90分消化によりパラフィ
ン切片でもアルポート症候群を診断できることが示唆される。

抗体を４℃でovernight incubationして，レーザー顕微鏡で観察した。
その結果，姜 英松は以下の結論を得た。

（論文審査の結果の要旨）
アルポート症候群の診断においては，腎生検組織の凍結切片を用いて，Ⅳ型コラーゲン α鎖の免疫染色

1） トリプシン90分消化の条件が一番よく，アルポート症候群と確診された12例では凍結切片と同じパターンでかつほぼ同程度に染色された。

を行い，糸球体に α鎖の異常が認められたならば，

2） 電顕的にアルポートが疑われた10例のうち，９例

遺伝子の異常を確認しなくとも診断できる。しかし，はＸ連鎖優性型アルポート症候群で，１例は常染色凍結切片を利用できない場合は診断が困難である。腎体劣性型アルポート症候群であった。

臓糸球体基底膜とボウマン囊基底膜 α5鎖の染色結果

3） 女性では加齢につれてモザイクパターンを呈するから，アルポート症候群の可能性と，さらにＸ連鎖優

糸球体が増加していた，そのうちの２例の40歳以上性型か，常染色体劣性型かの情報が得られる。パラフィの患者では血清クレアチニン値が高かった。

ン切片を抗原賦活化処理することによってアルポート症候群が診断できるかどうかが，本研究の目的である。

4） IgA 腎症ではトリプシン消化90分により免疫複合体の沈着も証明できた。

アルポート症候群研究用蛍光色素標識抗体（FITC

これらの結果は，トリプシン90分消化によりパラフィ

標識抗ヒトⅣ型コラーゲン α5鎖抗体と Texas Red

ン切片でもアルポート症候群を診断できることを示唆

標識抗ヒトⅣ型コラーゲン α2抗体）を用いた。コンしている。よって，主査，副査は一致して本論文を学

トロールは７例で手術例が１例，微小変化群の腎生検位論文として価値があるものと認めた。

６例である。アルポート症候群は，電顕所見と凍結切262

信州医誌 Vol. 58