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浦上財団研究報告書

Vol.21（2014）＜平成 24 年度助成＞

迅速（3 時間以内）で正確な食品細菌検査法の開発
仁井見英樹（富山大学附属病院検査部遺伝子・先進医療支援部門）

期に同定結果に基づいた適切な微生物汚染対策がはじめに可能となり、食品の衛生管理と食の安全への大き食中毒の発症は細菌によるものが殆どで、食品な貢献となる。の細菌汚染を制御することが必要不可欠である。

そこで、我々は３時間以内に汚染細菌の同定を

食品微生物検査とは、原材料や加工食品がどれだ可能とする新たな方法（Tm mapping 法）を考案

け細菌に汚染されているかを知ることが出来る検し、誰でも簡便に実施できる食品汚染細菌検査シ査である。また、調理場や調理器具などの汚染にステムとして構築した。

対しては、拭き取りによる細菌検査が必要である。

1． 食品汚染細菌迅速同定システムの概要

但し、現行の食品細菌検査法では培養法を用いて食品汚染細菌迅速同定システムの概要を図 1 におり、細菌培養には少なくとも 24 ～ 72 時間はか示す。本システムでは調理器具や原材料、食品検かるため、検査結果の報告までに通常 2 ～ 8 日か体等から直接抽出した微生物 DNA を鋳型とし、かるのが現状である。その結果、食品の微生物汚複数の universal primer を用いて nested PCR を染に対する迅速な対応が行われず、その間にも食行い、melting 解析（HRM 解析とは異なる）で得品汚染が広がるリスクが存在する。

られた複数の melting temperature（Tm）値を二従って、社会的にも、そして食品加工の現場か次元に mapping して、その“形状”をデータベーらも、食品汚染早期に汚染細菌を迅速同定する検スと照らし合わせることで迅速に同定する。PCR査方法の確立が求められている。調理器具や食品に お い て は、1st PCR、2 nd nested PCR 共 に 増

検体からスタートして２～３時間で汚染細菌を同幅曲線が plateau になった時点でストップさせ定するシステムの構築が可能ならば、食品汚染早る。この方法により、食品検体から３時間以内で、

図1

食品汚染細菌迅速同定システムの概要� � 	  � � � � � � � � � � � � � � � � � 	 

迅速（3 時間以内）で正確な食品細菌検査法の開発

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検体中に最も多く存在する汚染細菌が同定され先ず、16S ribosomal RNA 遺伝子 3）の８か所る。データベースとの照合・同定には、食品汚染の conserved region に、７つの bacterial universal

細菌同定ソフトウェアを Web 上で使用する。まprimer（全てのバクテリア DNAを検出する primer）

た、bacterial universal primer を用いた起炎菌のセットを設計した（ 図 2a）。これらの primer をPCR 検出には、（株）北海道三井化学と共同開発

用いた nested PCR の結果、７つの amplicon が1）した eukaryote-made Taq polymerase （真核生得られる。amplicon は７つ以上でも、またそれ物をホスト細胞として作成した Taq polymerase）

以下であってもシステム構築は可能である。しかを用いる。これは bacterial DNA contamination-

し、多菌種の同定には amplicon の数が生み出す

free を初めて実現した Taq polymerase であり、多様性が必要であり、といって多過ぎても系が煩

食品検体より直接、高感度で正確なバクテリア

雑かつコスト高となるため、実用的に７つを適当DNA の検出を可能とする。また、感度・特異度と判断した。次に、amplicon それぞれの Tm 値を更に高め、夾雑物による Tm 値への影響を排除を測定する。得られる７つの amplicon は、菌種するために、本システムでは nested PCR を採用によってその塩基配列が異なる。従って、7 つのした。nested PCR への移行時に 500 倍希釈の工

amplicon それぞれの Tm 値は菌種毎に異なる。

程が加わる為、夾雑物などの影響が無視できるレ

ここでいう Tm 値とは、二本鎖 DNA の 50 ％がベルにまで下がるのである。

一本鎖に解離する時の温度である。Tm 値は一現在のシステムでは７つの bacterial universal

般的に考えられているような、DNA 中の GC 含primer、１つの fungal universal primer の計 8 つ有率（ %）のみで決まる訳ではない。最近接塩基の primer を用いている。これによりバクテリア

法 4,5）に よ り、 塩 基 配 列 の 横 の 並 び も ま た Tmの有無と種属の同定、および真菌の有無とが迅

値 に 影 響 す る こ と が 説 明 さ れ て い る。 例 え ば速に判定できる。これらの primer はバクテリア“AGCT”が“ACGT”に変化すると、GC %は変わおよび真菌にそれぞれ特異的に反応し、ヒトのらないが Tm 値は変化する。この原理に従えば、

genomic DNA や mitochondrial DNA とは全く反塩基配列の多様性が Tm 値に十分反映されるこ応しない。このようなプライマーの特異性は、ヒとが分かる。Tm 値そのものの多様性と、その多トが加工に関わる食品検体からの直接検出におい様な７つの Tm 値を二次元に mapping して並べて重要である。

ることで、菌それぞれの塩基配列の相違が Tm

2. 新たな起炎菌迅速同定方法；Tm mapping 法

mapping shape として反映される。

複 数 の Tm 値 を 二 次 元 に mapping し、 そ のところで、リアルタイム PCR 機器での Tm 値

mapping し た Tm 値 が 描 く“ 形（Tm mappingの測定には常に測定誤差を伴う。Tm 値をフィンshape）”を菌種特異的な形として同定する新たガープリントとして同定に利用する以上、測定誤な方法を、我々は Tm mapping 法と命名した。

差は正確な同定にとって大きな問題となる。Tm2）を用いないた値の測定誤差には、施行間誤差とサンプル間誤差め、迅速・簡便・安価な同定が可能である。本（tube-to-tube variation）という２つの誤差が含まシステムでは、７つの Tm 値が２次元に描く Tmれる。施行間誤差とは、施行回毎に Tm 値全体がmapping shape が星座のように菌種毎に異なるこ上下することであり、７つの Tm 値に同様に生じとを利用して同定する。以下、Tm mapping 法にるため、Tm mapping shape には影響しない。問ついて具体的に説明する。

題はサンプル間誤差であり、Tm mapping shape

こ の 方 法 は 培 養 や sequencing

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浦上財団研究報告書

Vol.21（2014）

そのものに影響する。従って、Tm mapping 法を値それぞれの平均値からの距離を計算する（ 図用いて同定するためには、サンプル間誤差を出来2b）。平均値より大きければプラス、小さければるだけ小さくすることが重要となる。そして、そマイナスとする。すると、平均値からの７つの距のサンプル間誤差とは測定機器自体の性能に依存

離のそれぞれは、Tm mapping shape を反映すする。一般的なリアルタイム PCR 機器のサンプる。従って、汚染細菌を同定するには、それら７ル間誤差は± 0.3 ℃前後であるが、それでは Tmつの距離のそれぞれの値が、データベースのそれmapping shape は崩れてしまい、正確な同定はと最も近いものを求めれば良い。計算式で表すと、出来ない。我々はサンプル間誤差の少ない Rotor-「７つの距離それぞれのデータベースとの差」の総Gene Q（QIAGEN）や LightCycler nano（Roche）和（ = Difference Value（D）と表す）が最も０に近を 用 い、 更 に Eva green を 用 い た melting 解 析い菌が、Tm mapping shape の最も相似した菌で（HRM 解析ではない。Melting curve の形状の解あることを意味する（ 図 2c）。すなわち、それが析と本方法とは全く異なる）を行うことで、サン同定結果である。尚、サンプル間誤差が± 0.1℃

プル間誤差を安定的に± 0.1 ℃以内に収められるであれば、Difference Value は理論上 0.24 以下とようにした。サンプル間誤差が± 0.1 ℃以内であなり、同定結果の正確性を判定する１つの指標とれば、Tm mapping shape を用いて、汚染細菌をなる。

種属レベルで正確に同定することが可能となる。

3． 汚染細菌同定ソフトウェア

最後に、得られた Tm mapping shape を“形状”

我々は上記の計算式にて Difference Value をとして測定するために、次のような計算を行う。

自動的に計算し、同定結果を瞬時に表示する汚染

まず７つの Tm 値の平均値を算出し、７つの Tm。本ソフ
細菌同定ソフトウェアを開発した（図 3）

図 2 Tm mapping 法
a. プライマーデザインを示す。 b. Tm mapping shape を“形状”として測定する方法。
c. 未知の汚染菌とデータベースとの“Tm mapping shape の相違”を表す Difference Valueの計算式。Difference Value が０に近ければ近い程、Tm mapping shape が相似する。

� � 	  Tm m apping 法 	 a. プライマーデザインを示す。	 
b. Tm mapping shape を“形状”として測定する方法。	 

迅速（3 時間以内）で正確な食品細菌検査法の開発

161

トウェアの使用により、専門性やトレーニング双方の平均値を adjust して重ねた図形である。

を必要とせず、誰でも簡単に汚染細菌の同定がこれにより、視覚的にも Tm mapping shape が行える。ソフトウェアはクラウドで作成しておほぼ一致したことが分かる。逆に汚染細菌以外のり、Web 上で何処からでも使用できるシステム

菌をチェックしてみると、Tm mapping shape がとなっている。データ・インプット画面（ 図 3a）

重なり合わないことが視覚的にも明らかであるに食品検体から得られた未知の汚染細菌の７つ（ 図 3d）。データベースは食品分野で重要な細菌の Tm 値をインプットし、search ボタンを押す。

種 67 菌（表 1 ）の AT C C 株を購入して DNA を抽すると、瞬時に Difference Value の０から近い順出し、Tm mapping data を登録している。更ににデータベース上の菌が表示される。
（図 3b）。こ

当検査部でヒト臨床検体から得られた菌株を加の結果、Difference Value が最も０に近い菌が汚え、現時点で計 107 菌種の登録に至る。データベー

染細菌と同定される。また、info（information）

ス 内 の Tm mapping shape の 一 部（18 菌 分 ）をボタンを押すと Tm mapping shape のデータベー示す（ 図 3e）。菌種毎にそれぞれの Tm mapping

スとの相同性を視覚的に確認することができる

shape が異なることが分かる。但し、菌によって（ 図 3c）。図左が Tm 値の実測値での比較、右がは必ずしも７つの bacterial universal primer の図3

食品汚染細菌同定ソフトウェア

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浦上財団研究報告書

表1

食品分野で重要な細菌種リストM)E
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163

迅速（3 時間以内）で正確な食品細菌検査法の開発

全てが結合する訳ではなく、Tm 値が７つ未満と一致した場合、我々は“broad match”という表現なる場合もある。その場合は primer の結合しなで定義した。また、Difference Value が最小でもいパターン同士で汚染細菌を検索するシステムと0.5 以上の場合、Tm mapping shape はデータベーなっているため、primer が結合しないこともまスと明らかに異なる（データベースに存在しない）た菌の特徴として利用される。

ため、汚染細菌を同定しないことにした。この場

4． 本システムの判定基準と正確性の評価

合、「食品検体中にバクテリアが存在する」と判定

Tm mapping 法による汚染細菌同定を正確にするのみである。

行うために、我々は先ず Difference Value を基

我々は本システムにおける汚染細菌同定の正確にした判定基準を作成した（ 表 2 ）。サンプル間性を評価するために、以下の 2 つのテストを行っの測定誤差を考慮すると、Difference Value 0.3た（表 3 ）。先ずデータベース登録に用いた 107 菌未満の同定結果が 2 菌種得られた場合、どちら種のバクテリア DNA を用いて、ブラインド・テも共に汚染細菌の可能性がある。この場合、同ストでの同定を試みた。その結果、match が 106

定結果は「共に汚染細菌の可能性あり」と判定菌、broad match が 1 菌であった。また、この時するに留まる。但し、0.3 未満に 2 菌種入る場合の Difference Value は 0.15 ± 0.05（SD = 0.021）の殆どは Staphylococcus 属であり、2 菌の属がであり、理論値（D ≤ 0.24）の範囲内に収まった。

異なることは殆どない。正確性のテストにおいこのことは、Tm 値のサンプル間誤差が± 0.1 ℃て、Difference Value 0.3 未満に 2 菌種が同定さの範囲内であったことを意味する。

れ、そのうち 1 菌種が sequencing の同定結果と表 � 	  � � � � � � � � � � � � � �
表2

次に、150 の培養コロニー（51 菌種）からそれDifference Value を基にした判定基準	 	 表3

Tm mapping 法を用いた汚染細菌迅速同定システムの正確性の評価

表 2	  ����������	 ����� � � � � � � � � � 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 	 p164浦上財団研究報告書

Vol.21（2014）

ぞ れ DNA を 抽 出 し、Tm mapping 法 を 用 い て

常温放置５日後のクリームから真菌は検出されな菌の同定を試みた。そして、sequencing との一かった（極微量の真菌 DNA が検出されているが、致率、すなわち正答率を算出した。その結果、全く増殖が認められない為、シューの部分のイーDifference Value 0.5 以上の 10 コロニーを除いた

スト DNA の混入と考えられる）。しかし、新し140 コロニー中、match が 115 コロニー、broadいクリームから細菌は全く検出されなかった（＝match が 11 コ ロ ニ ー、mismatch が 4 コ ロ ニ ー

検出感度以下）にもかかわらず、常温放置５日後であり、match と broad match を合わせた正答のクリームからは、クリーム 1 g 中に 1.5 × 10 7

率は 97 ％であった。尚、broad match の全てはCFU（ E. coli 換算値）という大量の細菌が検出さStaphylococcus 属であり、mismatch は全て複数れた。この細菌を Tm mapping 法で迅速同定し菌の存在が認められた。

た結果、Staphylococcus aureus（ 黄色ブドウ球

最後に、食中毒の代表的な食品例としてシュー菌）、Difference Value = 0.21 であった。クリー

クリームの微生物汚染テストを行った。店頭販売

ム部分には細菌にとって豊富な栄養が存在するたされている賞味期限内の新しいシュークリームをめ、菌にとって最適な温度環境では 30 分程度で 2コントロールとし、5 日間常温放置したシューク倍、すなわち指数関数的に増えていく。特に夏場リームを微生物汚染疑いの検体として、それぞれの暑い環境では 5 日の放置は非常に危険であるこクリーム部分をテストした。汚染菌の濃度単位はとが示された。

一般的に CFU/mL が用いられる。従って、DNA

5． Tm mapping 法の利点および今後の課題濃度で計算される PCR 定量法との単位を合せる

Tm mapping 法ではデータベースを組み込んだために、McFarland 比濁法を介し、検量線を描

汚染細菌同定ソフトウェアを用いるため、データ	 図 4 に示す。その結果、いて計算を行った。結果をベースの修正・拡張などの更新が容易である。従っ	 	 新しいシュークリーム（クリーム）	 

常温放置５日後のシュークリーム（クリーム）	 	 	 真	 菌	 	 	 	 	 細	 菌	 	 	 

図4シュークリームの微生物汚染テスト	 � � 	  � � � � � � � � � � � � � � � � 	 	 	 迅速（3 時間以内）で正確な食品細菌検査法の開発

165て、例えば mutant strain が新たに見つかった場のための前処理が異なる。一般的に物理的に破砕合、直ぐにデータベースに加えさえすれば、迅速して後、蛋白や脂肪、繊維成分の除去を必要とすに同定に反映される。これは、固相の抗体やオリる。食品検体が一定であれば、それぞれ前処理プ

ゴプライマーを用いた方法 6）と比較してより優れロトコールを最適化しておく必要がある。

た点である。また、プライマー数を７つに固定し今後、Tm mapping 法を食品汚染検査でルーチて広範な菌種を同定出来ることは、同定菌種がプン化するには、登録菌種を適宜、増やしていく必

ライマー数に依存する、特異的プライマーを用い要がある。また、PCR buffer の塩濃度が大きくる方法 7,8）と比較してより優れた点である。更に異なると Tm mapping shape に影響する。従って、

eukaryote-made Taq polymerase を 用 い た PCR

同じデータベースを同定に用いるならば、７つのにより、食品検体から直接、高感度にバクテリアbacterial universal primer、eukaryote - made Taq

DNA を検出でき、sequencing も必要としないた

polymerase、そして PCR buffer の組成を固定しめ、食品検体採取後 3 時間以内での迅速同定が可た上でキット化することが望ましい。

能となる。これは、一般的にバクテリア・コロニーからスタートする質量分析法 9,10） と比較して、おわりにより優れた点である。

以上、食品汚染細菌迅速検査法として新たに開Tm mapping 法では、食品検体中の最も多い菌発した Tm mapping 法について、方法論と正確性、を同定する。もし、食品検体中に複数の菌が同程今後の課題などについて執筆した。正確である限度存在すれば、Tm 値が重なってしまい、同定すり、食品微生物検査は早ければ早いほどその後ることが出来ない。仮に複数の菌が存在したとしの対策がより効果的になる。今後、Tm mappingても、1 菌のみが数的に優位であれば同定は可能

法を迅速な食品汚染検査として実用化することである。複数の菌が同程度存在するような検体でで、食の安全に多少なりとも貢献したいと考えては迅速同定とはいかず、細菌コロニーからスターいる。

トした同定となる。
Tm mapping 法では培養法を用いないため、迅謝

辞速であることに加え、コンタミ菌を見分けられる本研究を遂行し、実用化するにあたり、富山大という利点がある。培養では菌毎に増殖の速さが学附属病院・検査部の上野智浩主任臨床検査技師、異なり、また、長時間の培養では菌の多少に関わ石川県立大学・生物資源工学研究所の森正之先生、らず、増殖後の菌量が plateau に達することによ三井化学株式会社の伊藤潔様をはじめとする研究り、時として汚染細菌とコンタミ菌との判別がつ所の皆様方へ、多大なご理解とご協力を感謝いたかなくなる。しかし、本法では最も多い菌のみをします。そして、（公財）浦上食品・食文化振興財

同定するため、少量のコンタミ菌を汚染細菌とし団より本研究の食文化に対する貢献へのご理解をて迅速同定することは無い。

頂き、多大な助成を頂きましたことを心より御礼

真菌については現在、有無のみの確認を行っ申し上げます。ている。しかし、真菌もバクテリアと同様、Tmmapping 法による同定が可能であるため、真菌文データベースの構築も行う計画である。

1) Niimi, H., et al.: A novel eukaryote-made thermostable
DNA polymerase which is free from bacterial DNA
contamination, J Clin Microbiol, 49: 3316-3320, 2011.

食品検体の場合、それぞれの食品で DNA 抽出

献

166

浦上財団研究報告書

2) Wellinghausen, N., et al.: Diagnosis of bacteremia in wholeblood samples by use of a commercial universal 16S rRNA
gene-based PCR and sequence analysis, J Clin Microbiol,
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temperatures of nucleic acids, BMC Bioinformatics, 13:101, 2012.
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bacterial pathogens causing bloodstream infections by DNA
microarray, J Clin Microbiol, 44: 2389-2397, 2006.
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in positive blood culture bottles by matrix-assisted laser
desorption ionisation time-of-flight mass spectrometry,
PLoS One, 4: e8041, 2009.

Rapid identification system of food contamination by using a novel melting temperature (Tm) mapping method 167

Rapid identification system of food contaminationby using a novel melting temperature (Tm) mapping method
Hideki Niimi
Department of Molecular Genetic Pathology, Clinical Laboratory Center,Toyama University Hospital
ABSTRACTThe earliest possible identification of microorganisms is critical for microorganism test
method for food. Here we report the development of a novel method for rapid identificationof the dominant bacteria in a food sample within 3 hours of sample collection.
The Tm mapping method consists of three major steps: First, bacterial DNA isextracted directly from a food sample. Then, nested PCR is performed using the sevenbacterial universal primer sets. To achieve accuracy in this PCR step, we have developed
a eukaryote-made Taq polymerase which is free from bacterial DNA contamination.
Using this polymerase, sensitive and reliable detection of bacteria without any falsepositive results becomes feasible, thereby making PCR directly from a food sample toidentify the dominant bacteria possible. Second, seven melting temperature (Tm) values
are obtained by high resolution melting (HRM) analysis of the amplicons. These seven
Tm values, when mapped on two dimensions, create a unique shape of a specific bacteria,like a constellation. This unique shape reflects the different DNA base sequences present
among bacterial species. Finally, by comparing this Tm mapping shape to the shapes in thedatabase, the dominant bacteria in a food sample can be rapidly identified.
The Tm mapping method would be widely useful for the test of food contaminationthat require prompt measure, and would contribute to the food safety.