クルクミンおよび類縁体の培養細胞への取り込み量の評価：細胞内移行と生理作用発現機構の関係解明に向けて49＜平成 26 年度助成＞

クルクミンおよび類縁体の培養細胞への取り込み量の評価：
細胞内移行と生理作用発現機構の関係解明に向けて仲川清隆（東北大学大学院農学研究科）（Fig. 2）13 ）。これらのことから、CUR は何らかの1. クルミンおよび類縁体の培養細胞への取り込み量の評価機構で積極的に細胞内に取り込まれ、生理機能を示すと予想された。

ウコンに含まれるクルクミン（CUR）は、脂質低1-8）。ヒトや動物がこの証明に向けて、はじめに本研究では、CUR

CUR を摂取すると、体内で代謝され、クルクミンや CURG、還元代謝物（テトラヒドロクルクミン

グルクロン酸抱合体（CURG）が主要代謝物として（THC））、類縁体（DMC や BDMC、合成類縁体）下などの生理作用が知られる

9 - 11 ）。しかし、CURG がを HepG2 および THP-1 に加え、取り込み量や代生理作用の主体かは不明な点が多い。先に我々は、謝を比較し、CUR の選択的な取り込みの有無をCURとCURG の生理作用を培養細胞試験で調べ、明らかにしようとした（Fig. 3）。CUR や CURG、CURG は CUR に比べてヒト肝ガン細胞 HepG2 に

THC を細胞に処理し、細胞抽出物を HPLC 分析

血中に認められる（Fig. 1）

12 ）あまり影響しないことを報告した（Fig. 1） 。ますると、HepG2 や THP-1 からは CUR が多く検出た、我々の別の実験では、CUR とともに類縁体され、CURG は検出限界以下で、THC もほとん

デメトキシクルクミン（DMC）、ビスデメトキシクど認められなかった（Fig. 4； HepG2 の解析例）。

ルクミン（BDMC）をヒト白血球単球細胞 THP-1

続 い て、CUR と さ ら に 構 造 の 類 似 し た 化 合 物に 加 え る と、 細 胞 か ら 専 ら CUR が 検 出 さ れ た（DMC や BDMC、および合成類縁体）の取り込み

Animal experiment

PlasmaHPLC-UV 420nm

1 h after oraladministration

CUR
100 mg /kg

Curcumin glucuronide
CURG
CUR
SpragueDawley rat

010Cell culture study
Cell proliferation

Acyl-CoA oxidase 1100100505020 min

CUR showed higher
effects than CURG
on HepG2 cells

Treatmentwith 25 µM of
CUR and CURG
for 24 h0%

Humanhepatocellular
carcinoma cells%

HepG2ContCUR CURG

0Why?
Cont

CUR CURG

Mean±SD (n=6)

	 Fig. of1 CURComparisonof effects of CUR and metabolites
Fig. 1 Comparison of effects
and metabolites

50

浦上財団研究報告書

Vol.23（2016）

HPLC analysis of standard curcuminoids
18

CUR

Bisdemetoxycurcumin
BDMCmV

Demetoxycurcumin
DMC

HPLC-FL

Mixture ofcurcuminoids

001530 min

Cell culture study

CUR

THP-1 cell extract

34

Preferential
cellular uptake of CUR
in THP-1 monocytes

THP-1

Human acutemonocytic leukemia mV
Treatmentwith 10 µM ofcurcuminoids for2hDMC
HPLC-FL

Why?

BDMC

001530 min	 

Fig. 2 Differential
cellular uptake of curcuminoids
Fig. 2 Differential cellular uptakeof curcuminoids

Synthetic analogues

CURMetabolites?

Natural analogues

HepG2THP-1

Fig. 3 Comparison of cellular uptake of CUR and other related moleculesin orderto gainuptake
insightof
onCUR
mechanismof CUR
activities
Fig. 3 Comparisonof cellularand otherrelatedmolecules in order to gain
insight on mechanism of CUR activities	 

CUR

CURG
HPLC-FL

6.0×10Ex 429 nm, Em 539 nm

CUR standardµV06.00100 pmol

1020min×103.0×1001020min

×1006.0

HepG2 extract

×10³

HepG2 extractµV

CURG, N.D.
0020min1010 µM 1 hµV20min

100 pmol

0090 pmol/1× 10 cells
10Absorbance at 280 nmµV

10 µM 1 hµV06.0×10³

THC standard

200 pmolµV

10 µM 1 h0HPLC-UVEx 429 nm, Em 539 nm

CURG standard

3.0

HepG2 extract

THCHPLC-FL

10THC, N.D.

020min010Fig. 4 Differential cellular uptake of CUR, CURG, and THC	 Fig. 4 Differential cellular uptake of CUR, CURG, and THC

20minクルクミンおよび類縁体の培養細胞への取り込み量の評価：細胞内移行と生理作用発現機構の関係解明に向けて51を調べたが、いずれも細胞からきわめて微量しか種々の阻害剤を用いた実験を現在進めている。

検出されない、あるいは検出限界以下であった

具体的には、ある種のポリフェノールや脂溶性（Figs. 5, 6 ; いずれも HepG2 の解析例）。以上よ

ビタミンの細胞内移行に関わるとされるトラン

り、CUR は代謝物および類縁体と区別されて積スポーター（カチオントランスポーター、アニオ極的に細胞に取り込まれている可能性が新たに示ントランスポーター）の 阻 害 剤（glibenclamide、唆された。

probenecid、等）を細胞に処理し、その後に CUR

2. クルミンの細胞内移行機構の解明：生理作用発現機構との関係性を細胞に加え、阻害剤の影響を調べている。これ
らの実験において、ある阻害剤の有用性を認めつ

上述の知見から、CUR を特異的に認識できるつあり、重点的に解析を進めている。

タンパク質（CUR レセプター）の存在を想定して、

ちなみに、CUR のレセプターを示唆する論文はCURBDMC

6.0DMC×106.0

HPLC-UV 420 nm
100 pmol standardµV×106.0

HPLC-UV 420 nm
100 pmol standardµV

001020min

Cell extract 10 uM 1 h0×10HPLC-UV 420 nm
100 pmol standardµV

010020min010

6.0 ×10

6.0 ×10

6.0 ×10µVµVµV

HepG2 extract

HepG2 extract

0HepG2 extract

001020 min

20 min001020 min

01020 minFig. 5 Differential cellular uptake of CUR, DMC, and BDMC	 

Fig. 5 Differential cellular uptake of CUR, DMC, and BDMC
6.0×10µVµV006.06.0×10×10µV06.0µV×10µV00025min 025min 025min 06.0×10µV06.0HPLC-UV 420 nm×106.0×106.0µV

25min×10µV00025min 025min 025min 0Fig. 6 Differential cellular uptake of synthetic CUR analogues	 

Fig. 6 Differential cellular uptake of synthetic CUR analogues

25min

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浦上財団研究報告書

Vol.23（2016）

過去にひとつあるが、この論文は取り下げられて作用の個人差とその解決策の構築”、等々、従来にいる。したがって、CUR レセプターの存在は未無い着想と方法論を世界に提案できると考えてだ明らかにされていない。今後も本研究を推進しいる。て CUR レセプターの存在を証明し、CUR レセプ
ターの発現を増強できれば、CUR 作用のより効3. クルクミン封入ナノ粒子の吸収代謝の評価：
生理作用発現機構との関係性

果的な享受法の構築へと展開でき、CUR の健康

昨今、CUR の生物学的利用能の改善に向けて機能に関する新しい方法論の提供が可能になるとCUR を ナノ 粒 子 に 封 入 す る 試 み が 行 わ れ て い

期待される。例えば、“レセプターの発現増強を介る14 - 21）。そこで、本研究を進める過程で、ナノ粒した CUR 作用を受け取りやすい食事の提案”、あ子作製に広く用いられる生分解性ポリマー（ポリるいは“レセプターの発現機構の違いによる CUR

乳酸・グリコール酸共重合体：PLGA）を用いて	 Fig. 7 Comparison of in vivo plasma concentration vs. time profiles
Fig. 7 Comparison of in vivo plasma concentration vs. time profiles	 Fig. 8 Comparison of Fig.
CUR8 concentration
micellesComparison of inCURconcentration in micellesクルクミンおよび類縁体の培養細胞への取り込み量の評価：細胞内移行と生理作用発現機構の関係解明に向けて

53

CUR 封入ナノ粒子（CUR-NP）を調製し、その細文胞への取り込み試験も行ったところ、確かに、細1) Asai, A & Miyazawa, T (2001) Dietary curcuminoids
prevent high-fat diet-induced lipid accumulation in rat liverand epididymal adipose tissue. J Nutr 131, 2932-2935

胞への取り込みが見られた。現状で、CUR-NPの体内への取り込み量や CUR 代謝におよぼす影響は未だ不明な点が多いことから、本研究において in vivo および in vitro 試験を行い、CUR-NP の吸収代謝を明らかにしようとした。
その結果、CUR-NP を投与したラット血漿からは多量に CURG が検出されたものの、CUR は微量であることがわかった。他方、CUR を与えたラット血漿の CURG 濃度は低く、CUR はほとんど存在しなかった（Fig. 7）。したがって、CUR-NP はCUR の吸収性を高めるが、ほとんど CURG に代謝されると考えられた。In vitro 試験では、CUR を用いて調製したミセルよりも、CUR-NP を用いたミセルの方が CUR 溶解量が多く（Fig. 8）、このことからラットにおける CUR-NPとCUR の吸収性の違いは、両者の胆汁酸ミセルへの取り込まれ易さの違いと予想された。これらのことから、CUR の吸収性を高めるには、CUR をナノ粒子に封入することは有効であるが、ナノ粒子化による生理作用向上に関しては更なる研究が必要と考えられた。
おわりに

4.

CUR をはじめとする多くのポリフェノール等の食品成分は、吸収代謝と生理作用発現機構の関係について、十分な解明がなされているとは言えない面がある。こうした中で、本研究の成果は、CUR の吸収・代謝的特性を明確にし、食品の新しい機能発見に繋がり、疾病予防に役立つので、社会的意義が大きいと思われる。
謝

辞
本研究の実施に当たり、研究助成を頂きました（公財）浦上食品・食文化振興財団に心より御礼申し上げます。今後も、引き続き本研究を進めていく所存です。

献2) Sharma, RA, Gescher, AJ & Steward, WP (2005) Curcumin:
the story so far. Eur J Cancer 41, 1955-1968.
3) Ejaz, A, Wu, D, Kwan, P & Meydani, M (2009) Curcumin
inhibits adipogenesis in 3T3-L1 adipocytes and angiogenesis
and obesity in C57/BL mice. J Nutr 139, 919-925.
4) Zingg, JM, Hasan, ST & Meydani, M (2013) Molecularmechanisms of hypolipidemic effects of curcumin.
Biofactors 39, 101-121.
5) Zingg, JM, Hasan, ST, Cowan, D, Ricciarelli, R, Azzi, A &Meydani M (2012) Regulatory effects of curcumin on lipid
accumulation in monocytes/macrophages. J Cell Biochem
113, 833-840.
6) Sawada, H, Saito, Y & Noguchi, N (2012) Enhanced CD36
expression changes the role of Nrf2 activation from antiatherogenic to pro-atherogenic in apoE-deficient mice.
Atherosclerosis 225, 83 - 90.
7) Kou, MC, Chiou, SY, Weng, CY, Wang, L, Ho, CT & Wu
MJ (2013) Curcuminoids distinctly exhibit antioxidant
activities and regulate expression of scavenger receptors andheme oxygenase-1. Mol Nutr Food Res 57, 1598-1610.
8) Gupta, SC, Sung, B, Kim, JH, Prasad, S, Li, S & Aggarwal,
BB (2013) Multitargeting by turmeric, the golden spice:from kitchen to clinic. Mol Nutr Food Res 57, 1510-1528.
9) Pan, MH, Huang, TM & Lin, JK (1999) Biotransformationof curcumin through reduction and glucuronidation in mice.
Drug Metab Dispos 27, 486-494
10) Asai, A & Miyazawa, T (2000) Occurrence of orallyadministered curcuminoid as glucuronide and glucuronide/sulfate conjugates in rat plasma. Life Sci 67, 2785-2793.
11) Anand, P, Kunnumakkara, AB, Newman, RA & Aggarwal
BB (2007) Bioavailability of curcumin: problems andpromises. Mol Pharm 4, 807-818.
12) Shoji, M, Nakagawa, K, Watanabe, A, Tsuduki, T, Yamada,T, Kuwahara, S, Kimura, F & Miyazawa, T (2014)
Comparison of the effects of curcumin and curcumin
glucuronide in human hepatocellular carcinoma HepG2cells. Food Chem 151, 126-132.
13) Nakagawa, K, Zingg, JM, Kim, SH, Thomas, MJ,Dolnikowski, GG, Azzi, A, Miyazawa, T & Meydani, M(2014) Differential cellular uptake and metabolism ofcurcuminoids in monocytes/macrophages: regulatory effects
on lipid accumulation. Br J Nutr 112, 8-14.
14) Sun, M, Su, X, Ding, B, He, X, Liu, X, Yu, A, Lou, H &Zhai, G (2012) Advances in nanotechnology-based deliverysystems for curcumin. Nanomedicine (Lond) 7, 1085-1100.
15) Maradana, MR, Thomas, R & O’Sullivan, BJ (2013)
Targeted delivery of curcumin for treating type 2 diabetes.
Mol Nutr Food Res 57, 1550-1556

54

浦上財団研究報告書

16) Ghalandarlaki, N, Alizadeh, AM & Ashkani-Esfahani, S(2014) Nanotechnology-applied curcumin for different
diseases therapy. Biomed Res Int. 2014, 394264.
17) Ahmad, MZ, Akhter, S, Mohsin, N, Abdel-Wahab, BA,Ahmad, J, Warsi, MH, Rahman, M, Mallick, N & Ahmad,FJ (2014) Transformation of curcumin from food additive tomultifunctional medicine: nanotechnology bridging the gap.
Curr Drug Discov Technol 11, 197-213.
18) Lee, WH, Loo, CY, Young, PM, Traini, D, Mason, RS& Rohanizadeh, R (2014) Recent advances in curcumin
nanoformulation for cancer therapy. Expert Opin Drug Deliv
11, 1183-1201.

Vol.23（2016）19) Hu, L, Pang, S, Hu, Q, Gu, D, Kong, D, Xiong, X & Su,J (2015) Enhanced antitumor efficacy of folate targeted
nanoparticles co-loaded with docetaxel and curcumin.
Biomed Pharmacother 75, 26-32.
20) Leung, MH, Harada, T, Dai, S & Kee, TW (2015)
Nanoprecipitation and spectroscopic characterization ofcurcumin-encapsulated polyester nanoparticles. Langmuir
31, 11419-11427.
21) Yallapu, MM, Nagesh, PK, Jaggi, M & Chauhan, SC (2015)
Therapeutic applications of curcumin nanoformulations.
AAPS J 17, 1341-1356.

Cellular uptake of curcumin and structurally related compounds: its relation to biological activity

Cellular uptake of curcumin and structurally related compounds:
its relation to biological activity
Kiyotaka Nakagawa
Graduate School of Agricultural ScienceTohoku University
Curcumin (CUR), also known as diferuloylmethane (IUPAC name (1E,6E)-1,7bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione), is obtained from therhizome of turmeric (Curcuma longa L.) and is present in dried turmeric powder at aconcentration of 2 – 5%. CUR has been known to have anti-oxidative, anti-inflammatory,anti-tumor and lipid-lowering activity in vivo. Our laboratory also reported that CUR
decreases accumulation of triglyceride in rat liver by up-regulating the expression ofacyl-CoA oxidase mRNA and promoting peroxisomal fatty acid β-oxidation. However,
several studies have reported that the bioavailability of CUR is very low because of its
low absorption rate and rapid metabolism. We also previously reported that when CUR
is absorbed through intestinal cells in rats, most of the CUR is conjugated as curcumin
glucuronide (CUR-G). Unmetabolized CUR is found in blood at extremely low levels.
Thus, it is still unclear whether CUR itself and/or CUR conjugate are responsible for above
biological activities of CUR inside the body.
In our recent study, we confirmed again that CURG is the major metabolite of CUR
found in the plasma after oral administration of CUR in rats. And, we synthesized CURG
and compared the effects of CUR and CURG on gene expression in a human hepatoma
cell line (HepG2). We found that the effects of CURG are weaker than those of CUR andthat this difference is related to relative absorption rates of CUR and CURG into HepG2cells. In another study, we found that CUR is readily taken up by THP-1 monocytes. By
contrast, the uptake of structurally related compounds (demethoxycurcumin (DMC) andbisdemethoxycurcumin (BDMC)) was low. From these results, it is hypothesized thatCUR is readily taken up by cells, which determine its biological activity. To evaluate thehypothesis, in this study, we performed cell culture studies.
Liquid chromatography with UV, fluorescence, and mass spectrometric detection
revealed that CUR is readily taken up by HepG2 cells and THP-1 monocytes. By contrast,
the uptake of CUR metabolite (CURG) and structurally related compounds (DMC, BDMC,and synthesized related compounds) was low. Hence, it is possible to deduce that CUR
uptake into cells determines its biological activity. The remarkable differential cellular
uptake of CUR, relative to CURG, DMC, BDMC, and other similar molecules, may
imply that the CUR uptake into cells may occur via a transporter. Despite the fact that theexistence of a CUR transporter appears to be the best explanation for the transport specificity,
other possibilities (e.g., simple diffusion of curcuminoids into cells due to their different
polarities and/or solubilities) cannot be ruled out. Obtaining direct evidence of a CUR
transporter is part of ongoing studies, involving saturation kinetic analyses, inhibitor usage
and temperature dependence of the phenomenon. In addition to the ongoing studies, we areperforming experiments about CUR nanoformulation in order to increase bioavailability ofCUR.

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