骨芽細胞の活性化機序に基づく
金属イオン徐放足場材の創製
小幡亜希子
春1)

日敏宏2)

イオンは体液中に比較的多量に存在するが，一方でケイ酸イ

.

は じ

めにオンにおいてはほとんど含まれていない．しかし，骨組織にはごく微量だけ含まれており，この微量のケイ酸イオンの存

生体組織の再生を促す機能を有した生体材料開発が長年進

在は，骨の成長に影響をもたらすことが見出されている(3)．

められている．これまでに様々なアプローチが報告されてい細胞単位で見てみると，例えばヒト由来の骨芽細胞を培養しるが，そのうちの一つにイオンの効果に着目した例がある．

た際，45S5 Bioglassから溶出したイオンを含む細胞培養培

特に，数種のイオンが骨や皮膚などの再生を担う細胞である地において細胞の増殖が促進されることがわかっている(4)．

骨芽細胞や線維芽細胞に対し，ポジティブな作用を及ぼすこ

この時，イオンによってもたらされたと考えられる細胞の遺とが見出されており，この効果を積極的に利用した新規生体

伝子発現の変化が，このような促進効果に寄与したと報告さ材料の開発が近年増えつつある(1)．材料から溶出されるイオれている(5)．

ンによる細胞への作用が着目されるきっかけとなったのが，45S5 Bioglass に 関す る 研究 報 告で あ る． 45S5 Bioglass.

イオンが骨形成を促進するメカニズム

は，生体活性を示す人工材料として世界で初めて開発されたガラス材料であり，その組成は， 46.1 SiO2 26.9 CaO 24.4

各イオンが細胞に作用を及ぼすメカニズムについては，い)である(2)．ここで生体活性とは，特まだ不明な部分は多い．特に，体液中には本来ほとんど含有に硬組織再建用の材料において自家骨と材料が化学的な結合されていないケイ酸イオンなどについては，現在研究が進めを介して直接接合する機能を意味する．この機序はいくつかられていると言える．しかしこれまでの報告より，少なくと報告されているが，45S5 Bioglassにおいては主に材料表面も骨芽細胞においては，ある特定の遺伝子発現がケイ酸イオで起こる骨類似アパタイトの形成や，材料から溶出されるインによって有意に増大されることがわかっている． Henchオンによる細胞の活性化効果といわれている(2)．

らは，45S5 Bioglassから溶出するイオンで処理した初代骨Na2O2.6 P2O5 (mol45S5 Bioglassを生体内に埋め込むと徐々に溶解を始め，芽細胞の遺伝子を網羅的に解析した結果，7 つのファミリー

ガラス組成に由来した種々のイオンを周囲の体液中へ放出すが増大されていることを見出している(2)．この中には，成長る．本ガラスの様なシリカの含有量が低いケイ酸塩ガラスに因子，転写制御因子，そしてシグナル伝達に関係するものがおいては，生体内に埋め込むと周辺体液の中に存在するプロ含まれる． Han らはケイ酸イオンで処理した骨髄間質細胞トンと迅速にイオン交換を行い，これによりガラス中のにおいて，骨形成に関連する遺伝子だけでなく WNT およNa＋ や Ca2＋ イオンが溶出される．これに続いてシラノール

び SHH シグナル伝達経路に関連する遺伝子の発現が増大す基が形成され，さらにシラノール基同士の縮合によりシリカると報告しており(6) ， Shie らはケイ酸イオンによって骨芽ゲル層が形成される(2)．そのため，一定期間が経過した後は細胞様細胞の MAPK ERK 経路の関連遺伝子の発現が増大溶出が緩やかとなる特徴がある．

すると報告している(7) ．一方で Varanasi らは，骨形成に必45S5 Bioglass から溶出するイオンのうち， Na＋ や Ca2＋須な転写制御因子である osterix/Sp7 が，ケイ酸イオンによ名古屋工業大学大学院工学研究科生命・応用化学系プログラム1)准教授 2)教授(〒4668555 名古屋市昭和区御器所町)
Development of Scaffold Materials with Ionreleasing Ability for Stimulating Osteoblasts; Akiko Obata and Toshihiro Kasuga(LifeScience and Applied Chemistry, Department of Engineering, Nagoya Institute of Technology, Nagoya)
Keywords: biomaterials, osteoblastlike cells, Ions, ceramic, cell cunctions
2020年 6 月17日受理[doi:10.2320/materia.59.606]

特集

るコラーゲン産生の促進作用に関与していると報告していン源となる化合物を溶解させることで「イオン添加培地」をる(8)．この様にケイ酸イオンにおいては，ある種のシグナル作製し，これを用いて細胞を培養することで，イオンによる伝達経路や転写制御因子の活性化を介して，細胞機能や骨形細胞機能への影響を調査した．用いた化合物は， Si 源とし成を促進すると考えられている．その他のイオンについててシリカゲル(3アミノプロピルトリエトキシシランを加水も，イオンの種類に依存した特有のメカニズムが存在すると分解および縮重合させて得たもの)， Ca 源として CaCl2 ，予想される．

Mg 源として MgSO4・7H2O である．

各イオンの濃度範囲は，過去の報告にて骨芽細胞や間葉系

.

イオン徐放足場材の設計に向けて幹細胞に対して作用することが見出されている条件を参照して設定し，組合せ効果におけるイオン濃度依存性も検討し上述のように，45S5 Bioglassから溶出したイオンに対すた．具体的には， Si イオンは 10 ～ 70 ppm ， Ca は 80 ～ 400

る報告を皮切りとして，イオンによる細胞へのポジティブなppm，そして Mg は25～500 ppmとした(10)(12)．上記の各濃作用に関する研究が広く実施されるようになった．現在まで

度範囲内にてそれぞれ 4 ～ 5 段階の濃度条件を設定し， 1 ，に，様々な種類のイオンがその種類に依存した作用をもたら2，そして 3 種のイオンを添加した培地を作製した．サンプ

すことも見出されてきている．そしてこれらの研究成果をベル名は各イオンの濃度数値を用いて表記し，例えば 10 ppmースに，新規ガラス・セラミック材料も開発研究されていの Si イオンのみを添加した培地の場合は 10Si と表記し，一る．特にガラス材料は組成の自由度が高いため，任意のイオ方で 10 ppm の Si イオン， 80 ppm の Ca イオン，そして 25ンの供給源として設計しやすいだけでなく，組成をデザインppm の Mg イオンを組み合わせて添加した場合は， 10Si することで化学的耐久性の制御も可能なため供給スピードを80Ca25Mg と表記する．また，何も添加していない通常の調整しやすい．また，ガラス単体で利用するだけでなく，金細胞培養培地をコントロールサンプルと表記する．

属系基板材料や有機ポリマー材料との複合化の例も数多く報

細胞の接着過程に対するイオンの作用を検討するために，告されており，様々な材料に対して「イオン供給源」としてまずは上記のように作製した各イオン添加培地またはコント機能することが可能といえる．

ロールサンプルを用いて細胞懸濁液を作製した．得られた細これまで多くの知見が報告されてきたイオン種として，ケ胞懸濁液を播種し， 37 °C の CO2 インキュベーターにて 3 時

イ 酸 イ オ ン ， Ca2＋ イ オ ン ， Mg2＋ イ オ ン な ど が あ げ ら れ間培養した．培養後，リン酸緩衝液でリンスした後にウェルる．特に骨形成に寄与する骨芽細胞や骨髄由来間葉系幹細胞底に接着している生細胞の数を代謝活性値から算出すべく，に対する各イオンの作用について，イオンの濃度依存性にもCell Counting Kit8 を用いて吸光度測定から求めた．

着目しながら詳細なデータが報告されており，ある特定濃度

上述のような方法により得られた接着生細胞数の測定結果

条件においてポジティブな作用をもたらすことが分かっていを用いて，複数種のイオンの供給による組み合わせ効果を評る(1)．しかし，これら報告内にて着目されたイオンの種類は価した．評価方法は既報を参照して，図に示す通り実施し一種ずつであり，異なる種類のイオンが同時に細胞に供給さた(13) ．まず，複数種のイオンを組み合わせて供給した培養れた際の相互作用についてはほとんど着目されていなかっ系から実測値( Pobserved )を求める．一方で，各種イオンを単た．しかし，例えばガラス材料の場合，その多くは複数種の独で供給した培養系の結果を用いて，複数種のイオンを組み元素から構成されており，これが溶解した際は程度の差こそあれ複数種のイオンが同時に溶出することが予想される．この複数種のイオンによる細胞への作用が組み合わさった際，例えば単一種が供給された時と比較してどのような違いがあるか考察することは，生体組織の再生に対する理想的なイオン供給システムをデザインするのに重要と考えた．
以上のことをふまえ，我々のグループではケイ酸イオン，Ca2＋ イオン， Mg2＋ イオンの 3 種に着目し，これらのイオンが単独で供給された際，および複数種が同時に供給された際の組合せ効果について検討してきた(9)．本稿では，マウス由来骨芽細胞様細胞(MC3T3 E1 細胞)を用いた培養試験により得られた成果を中心に紹介する．なお以降にて，上記 3種のイオンをそれぞれ Si，Ca，Mg イオンと表記する．

.

細 胞 の 接 着

はじめに，培養試験および評価方法について説明する．系
統的な条件にて培養試験を実施すべく，細胞培養培地にイオ

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図1

本研究の培養系と組み合わせ効果の評価方法の概略図．

合わせた場合の結果の予測値( Pexpected )を算出する．最後

ぼ全条件において正の値を示しており，接着に対して促進効に，得られた数値の差分(実測値予測値)を算出する．この果があることがわかった．さらに，図 3 中の中列のグラフ値が正の値の場合は「相乗効果」，負の値の場合は「拮抗作が示すのは単一種を供給した結果から算出した予測値であ用」が生じたと判断した．

り，これら予測値と実測値を用いて組み合わせによる効果を接着生細胞数の測定結果および，複数種のイオンの組み合評価した結果を右列に示す．得られたグラフより，Mg イオ

わせによる効果の検討結果を図およびに示す(9)．まず，ンの濃度が支配的に影響を及ぼしていることがわかった．ま単一種を供給した際の結果より，多くの条件においてコントた，Mg イオン濃度が高くなるにつれて組み合わせによる相ロールサンプルと有意差のない値を示した．一方で， 30Si乗効果が大きくなっていることから，Si および Ca イオンとおよび 50Si において有意に高い値が， 240Ca において有意共に多量の Mg イオンを供給することで，細胞の接着をよに低い値が確認された．また，図 3 中の左列のグラフが示り促進させることが可能と示唆された．一方で， Si およびすように，複数種のイオンを供給した培養系での実測値はほCa イオンについては，各々の量に依存した組み合わせによ

図2

単一種のイオンを添加した培地を用いて 3 時間培養した時の接着生細胞数の測定結果(9)．Si イオン(a)，Ca イオン(b)，Mg イオン(c)．(p＜0.05)．

図3

細胞の接着に対するイオンの組み合わせ効果の評価結果(9)．3 種のイオンを添加した培地を用いて 3 時間培養した時の接着生細胞数の実測値(左列)，単一種のイオンを添加した時の結果から算出した予測値(中列)，実測値と予測値の差分(右列)．

特集

る効果への影響は観察されなかった．しかし，単一種を供給

本実験ではコントロールサンプルである通常培地を用いて細した時に一部の条件でしか促進効果が観察されず，一方で 3胞懸濁液を作製および播種し，培養 3 時間後に各種イオン種を供給した時に促進効果が確認されたことから，一定量以添加培地に入れ替えた．培養期間中においては，1 および 3上の Si および Ca イオンの同時供給は接着の促進に重要と日目にフレッシュなイオン添加培地に交換した．

いえる．

測定結果を図およびに示す．単一種を供給した結果において， 70Si を除く Si および Ca イオン添加培地では増殖.

細 胞 の 増 殖が促進される様子が観察された．一方で Mg イオン添加培細胞の増殖に対する組み合わせの効果を検討すべく，上述ンプルと同等もしくは抑制されたことがわかった．複数種の地においては， 100Mg を除く条件においてコントロールサとほぼ同様な方法にて 5 日間まで培養を行い，培養開始後 1，イオンが供給された系においては，多くの条件において促進3 ， 5 日目の生細胞数をカウントすることで増殖挙動を観察されたことがわかった．一方で，組み合わせの効果に着目すした．なお，接着過程におけるイオンの影響を排除すべく，ると， 70Si が添加された条件を除くほぼ全ての条件におい

図4

単一種のイオンを添加した培地を用いて 5 日間培養した時の接着生細胞数の測定結果(9)．Si イオン(a)，Ca イオン(b)，Mg イオン(c)．(p＜0.05)．

図5

細胞の増殖に対するイオンの組み合わせ効果の評価結果(9)．3 種のイオンを添加した培地を用いて 5 日間培養した時の接着生細胞数の実測値(左列)，単一種のイオンを添加した時の結果から算出した予測値(中列)，実測値と予測値の差分(右列)．

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て拮抗作用が観察された．つまり，増殖に対するイオンの組る報告例ほど明確に“組み合わせ”を見据えた内容のものはみ合わせの効果においては， Si イオン濃度が支配的に影響ない．しかし，例えば Si イオンによる細胞の活性化効果をを及ぼすことがわかった．また， Si イオン濃度が高い条件利用して，既存のリン酸カルシウム系や炭酸カルシウム系材にて組み合わせによる相乗効果が確認されたことから， Ca料に新たに Si を添加し，その結果，より高い活性化効果をおよび Mg イオンと共に多量の Si イオンを供給すること得たといった報告例はある(17)(18)．敢えて“組み合わせ”をで，細胞の増殖をより促進させることが可能と示唆された．

意識したものではないにせよ，結果的に組み合わせによる効以上のように，単一種のイオンによる影響および複数種の果を反映した結果といえる．我々の実験結果においても，今イオンの組み合わせの効果において，細胞の接着と増殖に対回着目した 3 種のイオンについては，2 種または 3 種が同時する作用は異なることがわかった．特に組み合わせの効果にに供給されることで促進効果が確認されており，既報と共通

おいては，接着に対しては Mg イオンが，増殖に対してはする部分があると考える．これに加えて今回，この促進効果Si イオンがより強く影響を及ぼすことが示唆された．さらを高める因子として Si イオンが支配的であるという事実もに，単一種のイオン供給では促進効果が観察されなくとも，新たに見出すことができた．このことから，今後は標的とす複数種を供給した場合には観察されたことから，今回着目しる細胞の挙動に対してより有効な材料組成の設計が可能になた 3 種のイオンにおいては，どれもある一定量以上の供給ると考える．

が促進効果を発現するには必要であると考えられる．

.
.

おわりに組み合わせの効果
本稿では細胞の接着および増殖に対する 3 種のイオンのイオンの組み合わせの効果に着目した報告例はまだ数少な効果，およびそれらの組み合わせの効果について紹介した．

いが，このうちの一つに， Mg と Ca イオンによる細胞の接一方で，今回は取り上げなかったが，分化および石灰化に対着に対する影響に関する報告がある． Grzesiak らは，コラする効果についても同様に検討している．詳細は割愛する

ーゲン結合インテグリンの一種である a2b1 インテグリンをが，細胞の各挙動に対してポジティブな作用を示すイオンの介した線維芽細胞(線維性組織の形成を担う細胞)の移動にお供給条件は異なることを見出している．さらに，今回は骨芽いて，Mg イオンを供給した場合に促進効果を観察したこと

細胞様細胞を用いた試験結果を紹介したが，破骨細胞様細胞を報告している．さらに， Mg と Ca イオンを同時に供給しを用いた検討も進めている．以上の様な検討を進めることた際，Mg イオン単体を供給した時に比べてさらに 2 倍の促で，骨形成のプロセスに対して理想的なイオンの種類や組み進効果を確認している(14)．本稿で紹介した実験結果と比較合わせを導くことが可能と考えている．さらに，骨組織に限すると，Mg イオンのみを供給した際の促進効果の発現の有らず皮膚や血管などの軟組織の再生に対しても今後は展開し無に違いはあるが，2 種を組み合わせた際に促進効果が観察ていく予定である．

されている点においては共通する．実際，我々のグループで開発された Si と Ca イオンの供給機能を有するセラミック粒子であるシロキサン含有バテライトに，Mg イオン供給機

本研究の一部は，泉科学技術振興財団の助成を受けたものです．ここに感謝申し上げます．

能をさらに加えた材料を作製し培養試験を行ったところ，細胞の接着を促す効果があることを見出している(15)．

文

献

一方で， Shie らはケイ酸カルシウムセメント上にてヒト由来間葉系幹細胞および歯髄細胞を培養した際，セメント組成中のケイ酸量の割合が高いほど細胞表面でのインテグリンの発現が促進され，加えてインテグリン媒介シグナル伝達に関与する focal adhesion kinase (FAK)なども活性化されることを報告している(16) ．しかし，我々の実験結果において接着に対する Si イオンの濃度依存性は確認されなかった．
これら報告例においては，促進・抑制効果の発現における各イオンの濃度依存性について具体的な数値をもって検討されておらず，また，用いた細胞の種類も各々異なるため，一概に我々の実験結果と比較するのは難しいかもしれない．しかし我々の実験結果と合わせて考察するに，イオンによる細胞の接着に対する作用は，濃度だけでなく同時に供給されるイオン種の組み合わせも重要であることは明らかと考える．
細胞の増殖に対するイオンの組み合わせの効果に関する報告例については，著者の知る限りでは，上記した接着に関す( 1 ) A. Hoppe, N. S. Guldal and A. R. Boccaccini: Biomaterials, 32(2011), 27572774.
( 2 ) L. L. Hench and I. Thompson: J. R. Soc. Interface, 7(2010),
S379S391.
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( 4 ) I. D. Xynos, A. J. Edgar, L. D. K. Buttery, L. L. Hench and J.
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465.
( 5 ) I. D. Xynos, A. J. Edgar, L. D. K. Buttery, L. L. Hench and J.
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( 6 ) P. Han, C. Wu and Y. Xiao: Biomatr. Sci., 1(2013), 379392.
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( 8 ) V. G. Varanasi, T. Odatsu, T. Bishop, J. Chang, J. Owyoung
and P. M. Loomer: J. Biomed. Mater. Res. PartA, 104A
(2016), 26052615.
( 9 ) A. Obata, T. Ogasawara and T. Kasuga: J. Biomed. Mater.
Res. PartA, 107A(2019), 10421051.

特集(10) A. Obata, N. Iwanaga, A. Terada, G. Jell and T. Kasuga: J.
Mater. Sci., 52(2017), 89428956.
(11) S. Maeno, Y. Niki, H. Matsumoto, H. Morioka, T. Yatabe, A.
Funayama, Y. Toyama, T. Taguchi and J. Tanaka: Biomaterials, 26(2005), 48474855.
(12) S. Keim, J. G. Brunner, B. Fabry and S. Virtanen: J. Biomed.
Mater. Res. B Appl. Biomater., 96B(2011), 8490.
(13) J. C. Wataha, C. T. Hanks and R. G. Craig: J. Biomed. Mater.
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(14) J. J. Grzesiak, G. E. Davis, D. Kirchhofer and M. D.
Pierschbacher: J. Cell Biol., 117(1992), 11091117.
(15) S. Yamada, Y. Ota, A. Obata and T. Kasuga: BioMed. Mater.
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(16) M. Y. Shie, H. C. Chang and S. J. Ding: Int. Endod. J., 45(2012), 337345.
(17) K. A. Hing, P. A. Revell, N. Smith and T. Buckland: Biomaterials, 27(2006), 50145026.
(18) A. Obata, S. Tokuda and T. Kasuga: Acta Biomater., 5(2009),
5762.

ま て り あ 第59巻 第11号(2020)
Materia Japan★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★★
小幡亜希子
2004年 東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究科博士後期課程修了
2008年 名古屋工業大学大学院工学研究科 助教
2015年 現職
専門分野バイオマテリアル，無機材料◎セラミックス，ガラス，そして無機有機複合材料を用いた新規バイオマテ
リアルの開発研究に従事．

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小幡亜希子

春日敏宏

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