人工知能および機器分析を活用した
微生物合成培地の設計手法

北見工業大学

工学部

地域未来デザイン工学科・バイオ食品工学コース教授

小西正朗
2024年3月7日

1

微生物培地の種類と特徴
天然培地

合成培地

成分

培養基材(酵母エキス(YE)やペプトン(PP)など)

化学物質

特徴

雑多な成分，高い栄養価，組成が不明

生育に不可欠な栄養素量，組成が明確

メリット

広範な微生物に対して生育支持，安価培養への影響成分の特定が容易，再現性が高い

デメリット

再現性が低い(1, 2)，未特定成分の影響が介在

培地の設計には多大な労力，使用が限定的，高価

添加濃度• 10 g/L
PurechemicalsPurechemicalsPurechemicals• 5 g/L• 1 g/L• 0.5 g/L

実験的検討を繰り返して栄養要求性などのスクリーニング

従来の方法では天然培地を上回る性能の合成培地を設計することは困難(1) Jens L. et al., J. Food Microbiol., 170, 55-60(2014), (2) de la Torre I. et al., Biotechnol. Bioprocess Eng., 102, 10511-10521(2018),

2

先行研究事例
Gibco Bacto CD Supreme Fermentation Production Medium -ペプトン水を元にした合成培地-(1)

実験的検討

成分分析

ペプトン水

性能約60%合成培地

Vieiraらの YE分析結果(2)✔多くて50成分が対象(メーカーの公表は30成分未満)

Unknown,
16.44%✔単一の分析手法では網羅不可

RNA, 4.00%
Ash, 14.0%

性能約200%合成培地

培養基材の組成を網羅できれば可能?

培養基材の定量分析の現状と課題

Vitamin, 0.14%
Vitamins,
0.14%
Fat, 1.32%

模倣だけによる高性能な合成培地設計例はない

Protein,64.1%✔成分を特定しない分析・評価(Ashなど)も一般的
培養基材には多くの成分が含まれるため、網羅的な定量には複数の分析手法(1)Sengupta N. et al., (https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FBPD%2Fposters%2Fchemically-defined-medium-ecoli-poster.pdf, 閲覧日: 2022年2月), (2)Vieira et al., J. Food Compost. Anal., 52, 44-51(2016)

3

高解像度成分プロファイリング手法の開発

13種のYEと24種のPP

GC-MS/MS，LC-MS，PCD-HPLC，IC，ICP- MSで網羅的に定量

組成のデータベース

主成分分析

酵母エキスとペプトン中の成分を網羅的に定量し，定量値から組成をデータベース化

103成分(既往研究の2倍以上)を対象に定量分析を実施
4

高解像度成分プロファイリング手法の開発
YEの定量例(パン酵母由来YE)
核酸, 1.56%
有機酸, 2.77%

ビタミン, 0.03%
不明, 0.04%

ミネラル,
14.55%
ペプチド結合由来アミノ酸,15.89%

糖・糖アルコール,21.08%

PPの定量例(カゼイン由来PP)

有機酸, 0.21% 不明, 0.08%
糖・糖アル
ビタミン, 0.04%
コール, 0.29%
ミネラル,12.06%

遊離ア
ミノ酸,
44.07%

遊離アミノ酸,29.77%

ペプチド結合由来
アミノ酸, 57.54%

99.96%

99.92%

5種類の分析機器を用いることで培養基材中の99.9%以上の組成が定量可能

5高解像度成分プロファイリング手法の開発
10スコアプロット

860.1540.1

20-2

ローディングプロット

0.2

PC2 (14.25%)

PC2 (14.25%)

0.25

0.05
0-0.05

核酸
糖・糖アルコール有機酸
ビタミンタンパク質構成アミノ酸
非タンパク質構成アミノ酸
ミネラル
尿素-0.1-4-6-8

ロット違い

カゼイン由来PP
動物由来PP-0.15-0.2-0.25-10-10-50PC1 (19.62%)

510-0.3-0.2-0.1
00.1
PC1 (19.62%)

0.2

0.3

このデータを使用して合成培地を設計できるか？
6

天然培地組成を模倣した合成培地設計
1. 天然培地と合成培地の性能比較
モデル微生物: Escherichia coli BL21(DE3)pLysS / pRSET-EmGFP (Invitrogen)

定量値をLB培地組成に換算して培地作成(CDM-LB)
濁度，緑色蛍光タンパク質(GFP)由来の蛍光強度を測定

培養条件
50 mL，37◦C，200 rpm， 2時間目にIPTG添加培地
M9最少培地LB培地
CDM-LB-FAA
CDM-LB-TAA

説明
合成培地
天然培地
遊離アミノ酸量を参考
全アミノ酸量を参考

2. 重要成分探索して合成培地を簡素化
2.1. 成分グループ単位での探索

2.2. 成分単位での探索•••••••

Proteinogenic acmino acids (PAAs)
Non-roteinogenic acmino acids (NPAAs)
Sugars and sugar alcohols
Nucleis acids
Organic acids
Vitamins
Minerals

培養条件
1 mL，37◦C，1200 rpm，2時間目にIPTG添加

CDM-LBから1グループずつ抜いて重要な成分グループを探索

CDM-LBから1成分ずつ抜いた培地で重要な成分を探索

7

天然培地組成を模倣した合成培地の組成〔概要〕
Nucleic acids, 1.46%

NPAAs, 0.39%

Sugars and sugar
alcohols, 3.76%

PAAs, 44.72%

Organic acids, 0.29%
Vitamins, 0.03%

CDM-LBの組成と特徴• 72成分を定量• 培地には69種の化学薬品を使用• 1 Lの超純水にYE 5 g，PP 10 g，NaCl 10 g分の試薬を溶解• ペプチド・プロテインフリー• 成分数はミネラルとタンパク質構成アミノ酸が全体の半分以上

Minerals,49.35% (NaCl,39.92%)

CDM-LBの調製方法• 1 M NaOHでpH = 7.0に調製• NaとClは±5%の範囲で調製• フィルターにて滅菌

8

LB培地を模倣した合成培地の性能〔大腸菌増殖〕
1.8
1.6
1.4

1.2

M9最少培地LB培地

CDM-LB-FAA

CDM-LB-TAA

4時間目

1.0
0.80.664倍

OD660 (-)

OD660 (-)

1.20.824倍

1.00.6

0.8

0.4

0.6
0.4

0.2

0.2

0.0

0.002468

101214

Time (h)9LB培地を模倣した合成培地の性能〔GFP発現〕
3000
M9最少培地
CDM-LB-FAA

2500

LB培地
CDM-LB-TAA

Fluorescence intensity (-)

Fluorescence intensity (-)

3000

2000
1500
1000
500002468Time (h)101214

2500

6時間目

1.04倍

1.14倍

2000
1500
1000
500010不要成分の削減

NPAAs，Organic acids，Vitaminsを除いて69成分から56成分へ削減

11不要成分の削減

12アミノ酸生合成の律速段階を推定(良好な増殖時の解析)

栄養豊富な培地中での栄養学的解釈

13

プロファイリング技術活用例
ロットが異なる天然成分の主成分分析(K社-北見工大共同研究)
0.3

100.2

6PC2 (14.4%)

PC2 (14.4%)8

4
20-10-5051015-2-40.1
0-0.2-0.1

00.1

0.2-0.1-0.2○ 遊離アミノ酸(タンパク質構成)● タンパク質由来アミノ酸◇ 遊離アミノ酸△ ビタミン□ イオン◼️ 元素◆ 糖・糖アルコール▲ 核酸＋ その他

-6-0.3886644220-10-50051015-10-50-2-2-4-4-6-6-8-8PC1 (34.4%)

5PC2 (14.4%)

10PC3 (12.7%)

PC3 (12.7%)

-80.3

0.3

0.2

0.2

0.1

0.1

0-0.2

-0.1

000.1

0.2

-0.4

-0.2

0-0.1

-0.1

-0.2

-0.2

-0.3-0.3

PC1 (34.4%)

0.2

0.4

PC2 (14.4%)

物質生産に関連する物質を特定(成分名等の情報は開示不可)
14AI支援培地最適化について(NEDOバイオものづくりPJ)
データ収集・解析技術を組合せた新システム
網羅的・高速解析が特徴

培地AI解析の手順（データ収集～AI解析～提案）

・最適培地組成・阻害成分の特定・培養方法の提案
・育種株の栄養要求性変化

AI・DB

効率的なデータ収集

培養工学との融合による理解

DXによる効率化

ラボオートメーション

少量多検体培養・ハイスループット評価

学習・AI解析

最適化
アルゴリズム

自動培地調合酸素供給・攪拌の最適化
迅速測定系の活用(プレートリーダー)

深層学習モデル
培養基材DB

ベイズ最適化
遺伝的アルゴリズム

One factor at a time(OFAT)= One-by-one method

Experiment••

Statistical method(PBD, CCD，RSM)
often published

Experiment

Experiment

Experiment

最適な初期培地

Experiment

Experiment

実験的に決める方法では時間がかかりすぎる。
成分同士の相互作用を考慮できない = 真の最適値にたどりつかない
CCD-RSM (Optimize 3-4 factors)

PBD (Factor reduction)

Experiment

Calc.

Calc.

Experiment

Validation

Output

解釈・戦略策定・・・・・・

Abbr.:
PBD, Placket-Burman Design;
CCD, Central Composite Design
RSM, Response Surface
Methodology

応答曲面法で扱う因子数は3-4が限界 = 因子削減や最適化の繰り返しが必要

Singh et al., Front. Microbiol. 7, Article 2087 (2017)

Our method
Deep learning supported(OA‐DL‐BO/GA)
研究開発期間OA-DL-BO/GA (Optimize all factors)
Learning••Calc.

Validation

全ての成分の一斉最適化が可能
トータルの開発期間を短縮

Abbr.: OA, orthogonal array; DL, deep learning; BO,Bayesian optimization; GA, genetic algorithms

Yoshida et al. J. Biosci. Bioeng. 135: 127-133 (2023)
Kobayashi et al. Biosci. Biotech. Biochem. 87: 1068‐1076 (2023)

15

AI支援培地最適化について(NEDOバイオものづくりPJ)
培地最適化手法比較
独自技術

最適化できる因子数
因子間相互作用必要実験数(例)
スループット
予測精度
可読性
解析コスト

一因子探索

因子削減/応答曲面

アンサンブル決定木-網羅探索

深層学習-最適化アルゴリズム

OFAT
1
×
水準数×因子数

PBD/RSM
3-4△
12条件(PDB)+(RSM)+
検証実験
△〇
〇
中Gradient boosting decision tree

DNN-BO/DNN-GA<31〇
64~81×3~4条件(学習)+32~64×3条件(検証)

×◎
低<31〇
232×3~4条件(学習)+2×2(検証)
〇◎△高◎
〇
△
中(最適値探索にスパコン使用)

最適化計算量参考文献(1) Singh et al., Front. Microbiol. 7, Article 2087 (2017)(2) Hashizume et al. NPJ Syst. Biol. Appl. 9: 20 (2023)(3) Yoshida et al. J. Biosci. Bioeng. 135: 127-133 (2023)(4) Kobayashi et al. Biosci. Biotech. Biochem. 87: 1068‐1076 (2023)

1(1)10,000,000(2)・網羅探索にはベクトルコンピューター(スパコン)が必要

900(3, 4)
・少ない実験量かつ迅速に・適切な培地組成を探索可能
ワークステーションで実行可能

16

AI支援培地最適化について(NEDOバイオものづくりPJ)

組成を基準にクラスタリング

特徴量を基準にクラスタリング

50モデルから6モデルを選抜

900種類の培地から54種の代表培地

大腸菌による組換えタンパク質生産培地の最適化1)
乳酸菌によるヒアルロン酸生産用培地の最適化 (2022年度旗影会研究助成)
コリネ菌(芳香族化合物変換)の細胞生産培地の最適化2)
油脂生産酵母による油脂生産用培地の最適化 (NEDO PJ)(1) Watanabe K. (2024) J. Biosci. Bioeng. (accepted)(2) Konishi M. (2024) J. Biosci. Bioeng. (accepted) 17

新規合成培地作成手順２ (AI支援培地最適化と培地DBの組合せ)
大腸菌合成培地設計手順
AI活用培地最適化(半合成培地*)カザミノ酸・酵母エキス
・トリプトンの定量分析(GC-MS/MS，LC-MS,イオンクロマト，アミノ酸分析
ICP-AES)

最適化
半合成培地

定量データ

＋緩衝液
AI活用最適化＋DBを用いた再構成

市販合成培地(52成分)
再構成

天然培地

OptSM培地(完全合成培地)
添加剤添加

GFP生産評価

OptSM＋培地*カザミノ酸・トリプトン・酵母エキス・グルコース・グリセロール・硫安・リン酸緩衝液・無機塩類等19種類の成分で構成されるオリジナル
半合成培地

52成分+添加剤
医薬品用タンパク質
核酸合成分野で活用可能
・全成分既知unknown成分によるリスク低減
・組成の安定性高再現性向上が期待される
・高性能
天然培地・市販の合成培地を凌駕(他に類を見ない性能)
Escherichia coli BL21(DE3)pLysS/pRSET-emGFP
Deepwell cultivation (1 mL)
1,200 rpm, 37C
GFP detection: Plate reader (Varioskan, Thermo)*CD：市販合成培地
Bacto™ CD Supreme Fermentation Production Medium (Thermofisher)18

企業への期待プロファイリング技術
・ 製造現場での培地トラブルを解決できる可能性があります。
天然培地模倣培地
・ 製剤化技術を開発すれば試薬等として販売可能
協業・提携先募集中

本技術に関する知的財産権
発明の名称：合成培地の製造方法、大腸菌の培養方法、及びタンパク質、核酸、又は代謝物の合成方法
出願番号：特願2023-016849
出願人：国立大学法人北海道国立大学機構
発明者：小西正朗、中島拓都、渡辺一樹
19

お問い合わせ先
北見工業大学 知的財産センター（研究協力課）
ＴＥＬ 0157－26 － 9152
ＦＡＸ 0157－26 － 9155
e-mail chizai@desk.kitami-it.ac.jp20