生産と技術

第59巻第２号（2007）

ピコ秒時間分解紫外共鳴ラマン分光法によるタンパク質高次構造変化の観測
研究ノート

水 谷 泰 久＊Observation of changes in higher-order protein structureby picosecond time-resolved ultraviolet resonance Raman spectroscopy
Key Words：Raman spectroscopy, time-resolved spectroscopy, protein dynamics
および再生増幅器で構成されるレーザーシステムの１．はじめに出力を基に，第二高調波（波長390-405nm）を発生

タンパク質機能発現の分子機構を解明するには分させた．これをポンプ光発生用と紫外プローブ光発子結合スケールでの構造情報が必須である．ラマン生用とに分割した．後者の光をメタンガスもしくは分光法は分子結合スケールでの構造情報を与える．

水素ガスを封入したラマンシフターに集光し，誘導特にプローブ波長を適切に選ぶと共鳴ラマン効果にラマン散乱を発生させた．この後，（1）１次ストー

よって，分子量の大きなタンパク質であっても部位クスラマン散乱光の第二高調波発生，（2）１次のス特異的な構造情報を得ることができる．例えばヘム

トークスラマン散乱光とレーザー光の第二高調波とタンパク質の場合，プローブ波長を400nm付近にの和周波発生の二通りの方法により，204-244nm

とるとヘムの共鳴ラマンスペクトルを，また200nmの範囲で連続的に波長可変なピコ秒の紫外プロー付近にとると芳香族アミノ酸残基や骨格のペプチドブ光を発生させた．この広範囲の波長可変性は，共結合の共鳴ラマンスペクトルを観測でき，さらに，鳴効果を活用した部位選択的な観測が可能となる点

時間分解測定を行うことによって，動的な構造情報でタンパク質の測定にはきわめて有効である．得らを得ることができる．ピコ秒可視パルスを使った時れた紫外プローブ光の線幅は16cm -１ であった．ま

間分解共鳴ラマン測定は，われわれのグループを含た，誘導ラマン効果，光パラメトリック効果を組みめいくつかのグループによって方法論はほぼ確立さ合わせることによって，390-610nmの広い範囲内れた．これに対して，ピコ秒紫外パルスを使った時で連続波長可変なポンプ光光源を製作した．ポンプ

間分解共鳴ラマン分光法は技術的にいまだ未開拓で光の波長が広い範囲で連続波長可変であるため，広あり方法論の確立を要する．本稿では，われわれの範な色素タンパク質を対象とすることができる．ポ

開発したピコ秒時間分解紫外共鳴ラマン分光装置とンプ光およびプローブ光はダイクロイックミラーをそれを用いた研究例を紹介する．

使って同軸上に重ね合わし，球面レンズおよびシリ２．装置の構成と性能評価
図１に製作したピコ秒紫外共鳴ラマン分光装置の概略を示す．モード同期チタンサファイアレーザー＊Yasuhisa MIZUTANI

1964年３月生
1992年総合研究大学院大学数物科学研究科機能分子科学専攻修了
現在，大阪大学，大学院理学研究科化学専攻，教授，博士（理学），生物物理化学
TEL 06- 6850- 5776
FAX 06- 6850- 5785
E-mail：mizutani@ch.wani.osaka-u.ac.jp

図１72

ピコ秒時間分解共鳴ラマン分光装置の概略

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ンドリカルレンズを使って，200μm×５mmの形状で試料に照射した．試料は肉厚0.5mmの石英セルに入れ，これを自作のセルホルダーに取り付け，高速に回転させながら紫外共鳴ラマン測定を行った．試料セルを高速に回転させることで紫外パルス光による試料の損傷を大幅に抑えることができた．
紫外プローブ光と可視ポンプ光との相互相関幅は2.3psであった．

図３

ヘモグロビンの紫外共鳴ラマンスペクトル（a）主分光器スリット幅：2.8 mm，（b）主分光器スリット幅：1.7 mm

ヘモグロビンはリガンドの脱着に伴い，大きな構造変化を起こし，それがリガンド親和性に協同性を図２製作したプリズム式型前置分光器生み出している．本研究では，ヘモグロビンのサブタンパク質試料に紫外共鳴ラマン分光法を応用すユニットに構造が似たミオグロビンを用い，新たにる場合，分子量が大きいことによる強いレーリー散製作したピコ秒時間分解紫外共鳴ラマン分光装置を乱光やトリプトファンの蛍光が，測定上大きな問題使って，タンパク質の構造変化をとらえることを試となる．これら迷光を効率的に除去するフィルターみた．

として働くプリズム型前置分光器を製作し，CCD製作した装置を用いて得られた，ピコ秒時間分解検出器を装着した主分光器前段に設置した．図2に紫外共鳴ラマンスペクトルを図４に示す．トリプト

その概略を示す．入射光は凹面鏡で平行化された後ファン残基に由来するW３，W16,，W18バンドとに，リトロプリズムで分散され，主分光器の入射スチロシン残基に由来するY８aバンドにおいて，ピリットに再び集光される．ここでラマン散乱光のみ主分光器入射スリットを通過し，レーリー散乱光と可視域の蛍光は入射スリットに遮られるように，この位置での分散を定めてある．前置分光器のフィルターとしての性能を評価するために，主分光器の入射スリット幅を変えて，ヘモグロビン（HbA）の紫外共鳴ラマンスペクトルを測定した結果を図３に示す．
（a）にみられるレーリー散乱による高いバックグラウンドが，スリット幅を狭めた（b）では著しく低減されていることがわかる．本前置分光器によって，タンパク質を測定対象とする場合でもレーリー散乱の妨害を受けずに質の良い共鳴ラマンスペクトルを測定できることが確かめられた．
図４３．リガンド脱離に伴うミオグロビンの構造ダイナミクス
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一酸化炭素光解離ミオグロビンのピコ秒時間分解紫外共鳴ラマンスペクトル．最上段および最下段のスペク
トルはそれぞれCO結合形Mbのスペクトルおよびデオキシ形ミオグロビンと一酸化炭素結合形ミオグロビンの間の差スペクトルを示す

生産と技術第59巻第２号（2007）

コ秒からナノ秒の領域における段階的な強度変化が反映すると考えられる．CO結合形とデオキシ形の観測された．CO解離後５ピコ秒でトリプトファン

X線立体構造の比較から，COの解離によりFへリッとチロシンのラマンバンドは強度減少を示し，続いクスが変位するだけではなくEへリックスのヘム方て300ピコ秒程度でY8aバンドの強度が回復した．

向への変位も起こることが報告されている．立体構

トリプトファンのラマンバンドは初期の強度減少の造から推測されるCO解離後の構造変化とトリプト後，ピコ秒の時間領域では変化せずナノ秒以降に強ファン周囲における疎水性の低下を考慮すると，５度の回復を示した．

ピコ秒でのトリプトファンバンド強度の減少は，E

ウマミオグロビンはトリプトファンとチロシンをへリックスの変位によってAとEへリックス間にお２残基ずつ含み，Trp７とTrp14はAへリックスに，ける間隙が開くことを反映していると解釈できる．

Tyr103とTyr146はそれぞれGおよびHへリックス

これに対しナノ秒におけるトリプトファンバンドのに存在する．Tyr103はCO結合形とデオキシ形の強度回復は，Aへリックスがヘムの方向へ移動し，両状態において表面に露出する一方，Tyr146の側Eへリックスとの距離が再び狭まることを示唆す

鎖はF G コ ーナーに位置し，近位ヒスチジンる．トリプトファンとチロシンのバンド強度の減少（His93）における主鎖のカルボニル基と水素結合はCO解離後５ピコ秒以内でFとEへリックスが速やしている（図５（A））．時間分解可視共鳴ラマン測かに変位することを示すが，これはヘムの構造変化

定の結果によるとヘムの構造変化はCO解離後２ピにともないFとEへリックスが単一の構造体として，コ秒以内に完了する．ヘムの構造変化はHis93を介５ピコ秒以内の時間で連動して動くことを意味す

してFへリックスの変位を誘起する．したがって５る．

ピコ秒でのY8aバンドの強度減少は，Fへリックス

４．まとめの速やかな変位がTyr146とHis93間の水素結合に以上のように，ピコ秒時間分解紫外共鳴ラマン分影響するためと解釈できる．
トリプトファンは両残基ともAとEへリックスの光法を用いることによって，タンパク質で起きる速接触部位に位置する．Trp７はタンパク表面付近にい構造変化を明らかにすることができた．ピコ秒の存在する一方，Trp14はEへリックス上の疎水性側時間分解能でタンパク質の構造ダイナミクスを部位鎖群に近接する（図５（B））．トリプトファンバン

特異的に観測できるという利点は，タンパク質の立

ドの強度減少は周囲の環境における疎水性の低下に

体構造研究に広く用いられているX線回折法や起因し，AとEへリックス間の相対的距離の変化をNMR法にはない，紫外共鳴ラマン分光法の特色である．現在われわれは，この手法を用いて，ここで報告した２種類のタンパク質以外にも種々のヘムタンパク質および光センサータンパク質の構造ダイナミクスについて研究を開始している．タンパク質の構造変化に見られる共通性，特異性を明らかにすることで，「構造変化がタンパク質の機能をどのようにして生み出すか」という問題を理解したいと考えている．
参考文献
１． Picosecond Protein Dynamics ofMyoglobin upon Ligand Dissociation
Studied by Ultraviolet Resonance Raman
Spectroscopy

図４

ミオグロビンの立体構造（A）チロシン残基周辺の拡大図（B）トリプトファン残基周辺の拡大図, Akira Sato and Yasuhisa

Mizutani, Biochemistry, 44, 14709-14714（2005）.
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