1

通電処理による牛乳アレルゲン活性低減化に関連する蛋白高次構造の研究〈平成17年度〉

通電処理による牛乳アレルゲン活性低減化に関連する蛋白高次構造の研究松本知明（熊本大学大学院医学薬学研究部）

1.

はじめにようにして行った。長さ300mm，口径30mmのガラス管を２本用意し，中央部を長さ40mm，口径牛乳は乳幼児にとって基本となる栄養源である25mmのガラス管で連結してＨ型とし，台座に設が，そのアレルゲン活性は高く，わが国の食物置した。左右二本の管口の下方は各々白金電極

アレルギーの原因食品としては２番目に多く報告板および液体採取用ガラスコックを装着したゴムされる。また食物蛋白誘発性小腸結腸炎や好酸球で栓をした。この装置に１％β−ラクトグロブリ性胃腸炎の原因にもなっている。これら患者にはン蛋白溶解液250mlを満たし，１％になるように従来から加水分解ミルクが供与されているが，用食塩を加えた。二本の白金電極を直列に接続したいるブタ膵臓ないし微生物由来蛋白分解酵素の回路にして通電した。１％β−ラクトグロブリン混入は避けられず，乳児への長期飲用は好ましく蛋白溶解液に電圧80V前後で通電した場合の至適ない。さらには食品としての風味もなくなってい電流値は0.6A，電気抵抗は約130オームであった。

る。そこで申請者らは酵素などの異物を添加してこの条件で10分間，全電気エネルギー約28.8キロ化学的反応を行うのではなく，物理的方法によっジュールまで通電した。通電中はペーパータオて乳成分の免疫原性低減化を得るための広範な研ルでガラス管を包み，冷水を常時浸して溶解液を究を行ってきた。その結果，牛乳蛋白の中でも最55℃以下に保った。試料は管口下方にある液体採もアレルゲン活性が強いβ−ラクトグロブリンに取用ガラスコックをひねり50ml採取し蛋白分析

通電処理を行うと，その陰極側においてアレルゲに用いた。なおアレルゲン活性評価には，さらにン活性が著しく減弱化することを発見した（特願20分間通電し，全電気エネルギー90キロジュール

2005-020909,PCT/JP2006/301291）。ここでの研まで印加して用いた。写真１にβ−ラクトグロブ

究目的は，このアレルゲン活性減弱化の機序を生リン蛋白へ通電中の装置の全体写真を示す。

化学的に解析することにある。この研究は電気エ

2. 2

皮膚プリックテスト

ネルギーを用いた食品加工という画期的着想に基

β−ラクトグロブリン蛋白のアレルゲン活性づいており，発展させることで，医療に限らず，の評価は牛乳アレルギー患者に対する皮膚アレ

わが国に新規産業を形成する可能性を与えると考ルギー反応で行った。この検査実施に当たってえる。

は，熊本大学倫理委員会の臨床研究に関する審査を受けている。熊本大学附属病院発達小児科ア

2.

実験方法

2. 1

β−ラクトグロブリン蛋白への通電から，患者本人ないし患者両親に研究内容等につβ−ラクトグロブリン蛋白への通電は，次のいてよく説明し，同意を得て検査を施行した。βレルギー外来を受診した牛乳アレルギー患者の中2

浦上財団研究報告書−ラクトグロブリン蛋白溶解液，それに通電してVol.15（2007）

2. 3

陽極側，陰極側で採取された溶液，さらには陰性

SDS-PAGE， ゲ ル 濾 過 ク ロ マ ト グ ラフィー，ペプチドマッピング

反応対照として生理食塩液，陽性反応対照としてβ−ラクトグロブリンに生じる分子量の変化をヒスタミン1,000倍液を用いた。各々を前腕内側SDS-PAGEによって調べた。各溶液に還元作用を皮膚に20μl滴下して，小児用プリック針（米国

もつ緩衝液（１％2ME，１％SDS，10％グリセリンコリン社製）で穿刺し，20分後に表面に出現ロール，BPB，100mM Tris-HCl

する膨疹の最大直径を測定した。写真２に，牛乳蛋白濃度をそろえてSDS-PAGEに供した。泳動

アレルギー患者の前腕内側皮膚面で生じたアレル

後の染色はクマシーブリリアントブルー（CBB）

ギー反応の典型例を示す。
（−）と皮膚に描記しにより行った。また陰極側採取液での分子量の変た陰極側採取液に対する反応が，（βLG）と皮膚化を非変性状態で観察するため，ゲル濾過クロマに描記した処理を加える前の液，あるいは（＋）

トグラフィーを行った。ゲル濾過クロマトグラと描記した陽極側採取液に対する反応に比べ，著フィーは，GEヘルスケア社のSuperdex200を用しく減弱していることが分かる。

い，カラムを150mM NaClを含む20mM Tris-HClpH6.8）を加え，（pH8.0）で平衡化した。
通電前のβ−ラクトグロブリンおよび陰極側採取液からゲル濾過クロマトグラフィーによって得られた画分のペプチドマッピングを行った。高純度の蛋白を得るため陰イオン交換クロマトグラ
フィーで精製した。精製条件は，50mMを 含 む20mMNaClTris-HCl（pH8.0） で 平 衡 化 し たResouceQ（GEヘルスケア）に試料を添加した後，20分間かけてNaCl濃度を500mMまで直線的に上昇させた。変性剤および還元剤非存在下で蛋白にリジルエンドペプチターゼを反応させ，反応液中
写真１

電気分解装置の蛋白をペプチドに分解した。反応液中のペプチドを逆相クロマトグラフィー（YMC

AP-202C8）に吸着させ，アセトニトリルの直線濃度勾配（0.1％TFAを含むアセトニトリルを60分間かけて０％から60％まで上昇）により疎水性の低いペプチドから順にカラムから遊離させることによってペプチドを単離し，クロマトグラム（ペプチドマップ）を得た。
2. 4

二次元電気泳動

β−ラクトグロブリンに生じる分子量の変化を二次元電気泳動法でも調べた。各々のβ−ラク写真２

皮膚プリックテスト結果

トグロブリン溶液を脱塩し，還元作用をもたない

通電処理による牛乳アレルゲン活性低減化に関連する蛋白高次構造の研究

3

溶媒（７M 尿素，２M チオ尿素，２％ CHAPS）
を 加 え て ２mg/ml の 蛋 白 濃 度 に し た。 そ の200mlを等電点電気泳動ゲル pI３−10に添加し，35,000Vhになるまで等電点電気泳動を行った。その後引き続いてポリアクリルアミドゲル電気泳動法を定電圧200V，60分間行った。染色はクマシーブリリアントブルーを用いた。
一方，各々のβ−ラクトグロブリン溶液に緩衝液（７M 尿素，２M チオ尿素，２％ CHAPS，40mM Tris） を 加 え， ５mM TBPお よ び10mM
アクリルアミドを用いて室温で90分間還元/アルキル化も行った。その後，９倍量（容量）のアセ

図１ 通電によるβ−ラクトグロブリン蛋白分子量の変化（１：分子量マーカー，２：通電前のβ−ラクトグロブリン，３：通電10分後の陰極側採取液，４：同10分後の陽極側採取液）

トンを加え室温で１時間蛋白を沈殿させ，アセトンを除去後溶媒（７M 尿素，２M チオ尿素，２％した溶液にも通電前と同様な18K蛋白のみが検出CHAPS）を加えて2mg/ml の蛋白濃度にし，同された。しかしながら陰極側採取液を用いた分析様に施行した。

では35K蛋白と16K蛋白の２つが観察された。陰2. 5

マトリックス支援レーザー脱離イオン化

極側の蛋白質組成は特徴的であることが分かった

飛行時間質量分析（図１）。

各々のβ−ラクトグロブリン溶液の還元/アル3. 2

ゲル濾過クロマトグラフィー

キル化実施後の二次元電気泳動像から単量体およ

分子量の変化を非変性状態で観察するため，び多量体のスポットを切り出し，そこにトリプシゲル濾過クロマトグラフィーを行った。ゲル濾ン溶液を直接添加してゲル内での酵素消化を37℃

過 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー は，GEヘ ル ス ケ ア 社 ので一晩行った。ゲルから消化されたペプチドをSuperdex200を用い，カラムを150mM NaClを含抽出し，マトリックス支援レーザー脱離イオン化

む20mM Tris-HCl（pH8.0）で平衡化した。

飛行時間質量分析法を用いて，ペプチドの解析を通電前のβ−ラクトグロブリン溶液を分析する行った。マトリックスはCHCAを用い，レーザーと34Kの単一蛋白として検出された。還元状態下は波長337nmの窒素レーザーを使用して正イオンのSDS-PAGEでは18Kの蛋白として検出されたこモードで測定を行った。とから，天然状態においては，β̶ラクトグロブ

3.

結果と考察

3. 1SDS-PASGE

リンはジスルフィド結合を介した２量体として存在していることが明らかとなった（図２a）。
陰性側採取液に対しても，同様に変性処理を行

通電前のβ̶ラクトグロブリン溶液に，還元作わずゲル濾過クロマトグラフィーを行ったとこ用をもつ緩衝液（１％２ME，１％SDS，10％ グ

ろ，70Kおよび34Kと思われる蛋白が溶出された。

リセロール，BPB，100mM Tris-HCl

pH6.8）をここで得られた画分を各々SDS-PAGEに供したと加えてSDS-PAGE行うと18Kの単一蛋白として検ころ，各々35Kと16Kの蛋白から形成されている出された。10分間通電処理を行い，陽極側で採取ことが分かった（図２b）。つまり陰性側採取液

4

浦上財団研究報告書

Vol.15（2007）

では，35Kおよび16K蛋白が各々70K，34Kの２量

3. 3陰イオン交換クロマトグラフィー

体蛋白となって溶出していた。SDS-PAGEは強い陰極側採取液の35K，16K蛋白および通電前溶還元状態で実施しているため，これらの２量体は液から得られた18K蛋白画分を陰イオン交換クロジスルフィド結合によって形成されたものでないマトグラフィー法によって精製した。精製条件は，ことが示唆された（図２c）。

50mMNaClを含む20mM

Tris-HCl（pH8.0）で平衡化したResouceQ（GEヘルスケア）に試料を添加した後，20分間かけてNaCl濃度を500mMまで直線的に上昇させて行った。
陰イオン交換クロマトグラフィーによって，陰極側採取液の35Kおよび16K蛋白は，それぞれ図３aおよび図３bに示すようにメインピークの前後に小さなピークとして観察された。これは目的蛋白とその他の蛋白が分離されたことを示す。
また通電前溶液から得られた18K蛋白画分には２
図２a 通電前のβ−ラクトグロブリンのゲル濾過クロマトグラフィー（クロマトグラム中の矢印 は標準蛋白の溶出時間, 標準蛋
白の分子量A：290000，B：140000，C：67000，D：34000，E：12800）

本のピークがみられた（図３c）。各ピークを質量分析（装置：アプライドバイオシステムズ社QSTAR

pulsarI型，イオン化方法：ナノESI，検出方法：Q-TOF）で分子量を測定すると，前半ピー
クが18277，後半が18364であり，β̶ラクトグロ
ブリンのバリアントBおよびAの分子量に合致した。

図２b 陰極側採取液のゲル濾過クロマトグラフィー（クロマトグ
ラム中の矢印は標準蛋白の溶出時間, 標準蛋白の分子量A：290000，B：140000，C：67000，D：34000，E：12800）

図３a

図３b

陰極側採取液からゲル濾過クロマトグラフィーによって得られた35K蛋白（図３a）および16K蛋白（図３b）を多く含む画分の陰イ
オン交換クロマトグラフィー

図２c 陰極側採取液のゲル濾過クロマトグラフィーで得た画分のSDS-PAGE

通電処理による牛乳アレルゲン活性低減化に関連する蛋白高次構造の研究

5

図４a 陰極側採取液から精製した16K蛋白のペプチドマップ
図３c 通電前のβ−ラクトグロブリンの陰イオン交換クロマトグ
ラフィー

3. 4ペプチドマッピング

陰極側採取液から精製した35Kおよび16K蛋白画分および通電前のβ−ラクトグロブリン溶液から精製したバリアントBのペプチドマッピングを行った。変性剤および還元剤非存在下で蛋白に

図４b 陰極側採取液から精製した35K蛋白のペプチドマップ

リジルエンドペプチターゼを反応させ，反応液中の蛋白をペプチドに分解した。反応液中のペプチドを逆相クロマトグラフィー（YMC

AP-202C8）に吸着させ，アセトニトリルの直線濃度勾配（0.1％TFAを含むアセトニトリルを60分間かけて０％から60％まで上昇）により疎水性の低いペプチドから順にカラムから遊離させることによってペプチドを単離した。

図４c

マップ左半分に示されている溶出時間が早い

通電前溶液から精製したβﾑラクトグロブリン・バリアン
トBのペプチドマップ

ピークのうち，ほぼすべてのピークの溶出時間は3つの蛋白で完全に一致した。これは，ペプチり，35Kおよび16K蛋白が受けた化学修飾もしくドのアミノ酸配列が同じであることを示す。35Kはアグリゲーションによるパターンの違いである

および16K蛋白はβ−ラクトグロブリン・バリアと示唆された（図４a〜図４c）。

ントBとアミノ酸配列が同じであり，35Kおよび

3. 5

二次元電気泳動

16K蛋白はβ−ラクトグロブリンであると考えら

β−ラクトグロブリンに生じる分子量の変化をれた。ペプチドマップ後半は，35Kと16K蛋白の二次元電気泳動法で調べた。通電前および通電間ではほとんど同じであったが，通電前のβ−後に陽極側，陰極側で得られたβ−ラクトグロブ

ラクトグロブリン・バリアントBのパターンとはリン溶液を各々脱塩し，還元作用をもたない溶媒大きく異なっていた。35Kおよび16K蛋白のマッ（７M 尿素，２M チオ尿素，２％ CHAPS）を加プ後半ピークが幅の広いものであることから，アえて２mg/mlの蛋白濃度にした。その200mlを等ミノ酸配列の違いによるパターンの違いというよ

電点電気泳動ゲルpI３−10に添加し，35,000Vhに

6

浦上財団研究報告書

Vol.15（2007）b）。通電前溶液および陽極側採取液では，単量体および２量体と思われるスポットが強く検出されたが，陰極側採取液では多量体と考えられるスポットも依然として強く検出された。
3. 6

マトリックス支援レーザー脱離イオン化
飛行時間質量分析

図５a 還元/アルキル化未実施のβ−ラクトグロブリン溶液の二次元電気泳動像
１：分子量マーカー，２：通電前溶液，３：陽極側採取液，４：陰極側採取液

各々のβ−ラクトグロブリン溶液の還元/アルキル化実施後の二次元電気泳動像から，単量体および多量体と思われるスポット７ヶ所（図５bのなるまで等電点電気泳動を行った。その後引き続＃１〜＃７）を切り出し，そこにトリプシン溶液いてポリアクリルアミドゲル電気泳動法を定電圧を直接添加してゲル内での酵素消化を37℃で一晩200V，60分間行った。染色はクマシーブリリア行った。ゲルから消化されたペプチドを抽出し，ントブルーを用いた（図５a）。通電前および通マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間

電後に陽極側，陰極側で得られた各々のβ̶ラク質量分析法を用いて，ペプチドの解析を行った。

トグロブリン溶液すべてに多量体と考えられるス

マトリックスはCHCAを用い，レーザーは波長ポットが観察された。

337nmの窒素レーザーを使用して正イオンモード

一方，各々のβ−ラクトグロブリン溶液に還で測定を行った

元作用をもつ緩衝液（７M 尿素，２M チオ尿

通電前および陽極側の２量体と思われる部分

素，２％ CHAPS，40mM Tris）を加え，さらに（＃１および＃３）は同様な質量分析ピークパター

５mM TBPおよび10mMアクリルアミドを用いンを示した。また通電前，陽極側採取液，陰極て室温で90分間還元/アルキル化を行った。その側採取液の単量体と思われる部分（＃２，＃４，後，９倍量（容量）のアセトンを加え室温で１時＃７），陰極側採取液の２量体と思われる部分

間蛋白を沈殿させ，アセトンを除去後溶媒（７M（＃６），および多量体部分（＃５）は同様な質量尿素，２M チオ尿素，２％ CHAPS）を加えて分析ピークパターンを示した（図６）。すなわち，2mg/mlの蛋白濃度にし，同様に施行した（図５

陰極側では単量体の構造を保ったまま，２量体，

図５b 還元/アルキル化実施後のβ−ラクトグロブリン溶液の二次元電気泳動像
１：分子量マーカー，２：通電前溶液，３：陽極側採取液，４：陰極側採取液＃１〜＃７：ペプチド解析用に切り出したスポット部分を示す

図６

マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析ス
ペクトル＃〜＃7：還元/アルキル化実施後のβ−ラクトグロブリン溶液の二次元電気泳動像からペプチド解析用に切り出したス
ポット部分を示す

通電処理による牛乳アレルゲン活性低減化に関連する蛋白高次構造の研究

7多量体化していることが示唆された。陽極側の２謝量体は通電前と同じようにジスルフィド結合によ本研究を遂行するにあたり，由緒ある浦上食品・るものと考えられた。
4.

まとめ

辞

食文化振興財団から研究助成を賜ることができました。ここに厚く御礼申し上げます。また貴財団の益々のご発展を心より祈念いたしております。

β−ラクトグロブリン蛋白に通電処理を行うと，陰極側において，β−ラクトグロブリン蛋白はその単量体の構造を保ったまま多量体化していくことが分かった。この構造変化がアレルゲン性減弱化をもたらしていると考えられた。通電する前の溶液および陽極側で採取された溶液にある２量体はジスルフィド結合によって形成されていると思われ，ジスルフィド結合による２量体構造がβ−ラクトグロブリンのアレルゲン活性に関連していると推測される。

文献１）松本知明（著）。わかりやすい小児のアレルギー疾患。金芳堂（2003）
２）Rosendal A., Barkholt V.

Detection of potentiallymaterial in 12 hydrolyzed milk formulas. J Dairy Sci 83:
2200-2210（2000）.
３）Del Val G, Yee BC, Lozano RM, et al. Thioredoxin
treatment increases digestibility and lowers allergenicityof milk. J Allergy Clin Immunol 103: 690-697（1999）.
４）Matsumoto T.

Mitigation of the action of wheatallergen by acidic oxidative potential water. Allergy 57:
926-930（2002）.

8URAKAMI FOUNDATION MEMOIRS

Vol.15（2007）

Structural changes accompanying mitigation of the allergic action of cow's
milk after passing an electric current
Tomoaki Matsumoto（Department of Child Development, Graduate School of Medical Sciences,
School of Medicine, Kumamoto University）

β −lactoglobulin（BLG）is not only the main whey protein without any counterpart
in human milk, but a major cow's milk allergen. I previously observed mitigation ofthe allergic action of BLG in the cathode side after passing an electric current（PCT/JP2006/301291）.By the grant from Urakami Foundation, I advanced the research on thephysicochemical mechanisms related to the mitigation of the allergic action of BLG.
The gel electrophoresis, run under reducing conditions, revealed an 18 KDa band
both in the untreated BLG solution and in the anode side solution after passing an electriccurrent. On the contrary, two bands showing 16KDa and 35 KDa were observed in thecathode side solution. The gel ﬁltration, run under non-denaturing conditions, revealed
a single 34 KDa fraction in the untreated BLG solution and two fractions with 34 KDa
and 70 KDa in the cathode side solution after passing an electric current. Since the gelelectrophoresis has been performed under reducing conditions, natural BLG seems to form
dimer structures with disulﬁde bonding. The multimers such as 34 KDa or 70 KDa obtained
from the cathode side were formed without disulﬁde bonding fashion. The examinations
with two dimensional gel electrophoresis, run under non-denaturing or reduced/alkylated
conditions, and the analysis of peptides from the gel spots using MALDI-TOF-MS also
conﬁrmed the ﬁndings as described above. In addition, the multimers in the cathode sidesolution seemed to retain the monomer structure of BLG.
It is postulated by this study that the dimer structures of BLG with disulﬁde bonding
are closely associated with the allergic action of cow's milk, and formation of the BLG
multimers retaining the monomer structure in the cathode side may contribute to mitigate
the allergic action of BLG after passing an electric current.