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浦上財団研究報告書

Vol.18（2011）＜平成 20 年度助成＞

アレルギーを予防する粉ミルクの開発に向けての基礎研究
中尾篤人（山梨大学大学院医学工学総合研究部）

１. 緒

ムが次々と明らかにされつつある。現在では、

言（研究の背景と目的）

Smad 経路を中心として、さらに細胞内で数多形質転換増殖因子ベータ（transforming growth

くのシグナル促進因子、抑制因子が時間的／空factor [ TGF ] - β、以下 TGF- β）は、多彩な機能間的に協調することによって、ある特定の細胞にをもつサイトカインとして知られており、細胞おける TGF- βシグナルの最終的なアウトプット増殖、アポトーシス、分化、細胞外マトリックが規定されると考えられている（図１参照）。

ス産生等の制御作用を介して、癌や線維化、免免疫系では、特に制御性 T 細胞の分化や機能疫、発生など幅広く生命現象一般に関与していを制御することによって免疫寛容状態の維持にる。細胞の種類や分化段階などに応じ、あまりTGF- β は関与している1）。実際、TGF- βの欠損に多彩な作用を TGF- βがもつため、このようマウスは生後４週頃から自己免疫疾患様の激しいなバラエティーに富んだ作用がいったいどのよ炎症が全身の臓器に惹起され死亡する。この知見

うにして惹起されるのかということがこの分野

は、TGF- βは免疫系が自己抗原やアレルゲンなどの最大の関心事であった。しかしながら 1996 -によって過剰に活性化されることを防いでいる強97 年にかけて、TGF- βの主要な細胞内シグナ力な生理的因子であることを強く示唆している。

ル 伝 達 経 路 で あ る Smad 経 路 が 同 定 さ れ て 以

食物アレルギーは、“原因食物を摂取した後に来、この多彩な作用の基礎となる分子メカニズ

免疫学的機序を介して生体にとって不利益な症状

図1

TGF-βの細胞内シグナル伝達経路

TGF -βが細胞膜上の受容体に結合すると受容体が活性化し、細胞内の Smad2 およびSmad3 がリン酸化され Smad4 と複合体を形成し核内へ移行し、種々の転写因子と協調し標的遺伝子を活性化する。TGF -β自身および TGF -βシグナルを抑制する Smad7 分子は標的遺伝子の１つであり、本研究中では TGF -βシグナルの活性化の指標として用いている。

アレルギーを予防する粉ミルクの開発に向けての基礎研究

41（蕁麻疹、湿疹、呼吸困難、下痢、腹痛、アナフィ

きるレポーターマウスにおけるルシフェラーゼラキシーショックなど）が惹起される現象”と定活性（ 図 ２）２）野生型マウスにおける腸管内で義される。原因食物摂取後すぐ発症する IgE 依存の Smad 経路の活性化（Smad 2 のリン酸化）、３）性の反応と、数時間以上経ってから症状の現れる野生型マウス腸管における TGF- β標的遺伝子

IgE 非依存性、Th 2 細胞依存性の反応が存在する。

（TGF- β自身、Smad 7）の転写活性化の３つを指治療は原因食物の除去が基本であり、いまだ有効標にして経口摂取された TGF- βが生体内で活性な治療法は確立されていない。

を維持しているか否かについて検討した。その結食物アレルギーは、特に１歳までに発症頻度が果、組換え型 TGF- β（活性型）の投与によって、最も高く（約 6 . 8%）、成人においては 1 - 4%であ腸管（特に小腸）において上記いずれのパラメーる。小児例のほとんどは自然緩解すると報告されターの上昇が認められ、経口摂取された TGF- βているが、食物アレルギーはアナフィラキシー

はマウス腸管内において活性を保ち機能することショックの最も多い原因であり、その約 5％は致が証明された３）。

死的な経過をとるため、大きな問題となっている。
したがって、食物アレルギーに対する有効な予防や治療法を見いだすことは、医学的にだけでなく社会的な意義も大きい。
一方、世界保健機関（WHO）は、乳幼児のアレルギー疾患（主には食物アレルギーに起因する乳幼児アトピー性皮膚炎と思われる）の予防に、母乳栄養を推奨している。母乳がどうして食物アレルギーやその他のアレルギー疾患（喘息やアトピー性皮膚炎）の発症を減少させるのかについては未だよく理解されてはいないが、近年、母乳中に存在する TGF- βが、予防の鍵となる重要な因子であるというヒトにおける疫学的報告が相次い
２）

でいる 。
しかしながら、タンパク質である TGF- βが経口摂取された場合に、胃酸や消化酵素などによる

図 2 経口摂取された TGF- βは腸管内で活性を保っている
TGF- βシグナルレポーターマウス（SBE-Luciferase マウス）における（活性型）TGF- βの経口投与後３時間及び５時間後のインビボイメージングによるルシフェラーゼ活性の測定腸管を中心にルシフェラーゼ活性があることを示している。

また、我々は、TGF- βを卵アレルゲンと一緒に経口投与することによって卵アレルゲンに対する免疫反応（食物アレルギー）が抑制できることをマウスの実験系を用いて見出した３）。

分解を免れてその生理活性を保てるのか？さらに以上の結果は、母乳中に含まれる TGF- βタンは実際に免疫系に影響を与えることができるのパク質は、胃酸や消化酵素などの作用を免れ、生か？という基本的な問題が未解決であり、母乳中体（腸管）内で活性を保ちかつ免疫系に影響を与TGF- βとアレルギー疾患に関する疫学研究は実える（食物タンパク質に対する免疫寛容を誘導す証的な根拠に欠けていた。

る）ことを明らかにし、TGF- βを飲食物などに含最近、我々を含む複数の国内外の研究グルー有させる（経口摂取させる）ことによって食物アプからこれらの疑問を解明する報告が相次いでレルギーの発症が予防できる可能性を示唆した。

発表されてきている３- ５）。特に、我々は１）TGF-

例えば、TGF- βを多く含有する粉ミルクを摂取βシグナル（Smad 経路）の活性化をモニターですることによって食物成分に対する乳幼児のアレ42

浦上財団研究報告書

ルギー反応（食物アレルギー）を抑制することがVol.18（2011）2-2

将来、可能になるかもしれない。

野生型マウスにおける経口的に投与された潜在型 TGF- βの胃酸による活性化

ただし、上記のこれまでのマウスを用いた我々胃酸中和薬剤（シメチジン）をあらかじめ投与の実験では、実験系の単純化のため、経口投与すし た 野 生 型 マ ウ ス（BALB/c マ ウ ス ）と 非 投 与る TGF- βは活性型を用いてきた。しかしながら(PBS 投与 ) コントロールマウスのそれぞれに潜在母乳中（や一部の食品中）の TGF- βは大部分が潜型 TGF- βを（5μg/mouse）を経口投与し、経時在型として存在する。したがって生体内で潜在型的にマウス小腸を採取し、腸管内での Smad 経路

TGF- βが活性型 TGF- βに変換されるしくみがの活性化（Smad2 のリン酸化）、及び腸管内にお生体内では存在すると考えられるがそのメカニズ

ける TGF- β標的遺伝子（TGF- β自身、Smad 7）

ムは未だまったく明らかにされていない。このメの転写活性化を指標として TGF- βシグナル活性

カニズムの解明は、今後、TGF- βの経口摂取にの活性化の有無について検討した。

よる食物アレルギーをはじめとするアレルギー性2-3疾患の予防法を開発するためには不可欠の基盤とヒト母乳中潜在型 TGF- βの胃酸による活性化

潜在型 TGF- βを含むヒト母乳を、胃酸中和薬なる。
本研究では、アレルギーを予防する粉ミルクの剤（シメチジン）をあらかじめ投与した野生型マ開発などに向けての重要な学術的基礎となる「経ウス（BALB/c マウス）と非投与コントロールマ

口摂取された TGF- βが生体内で活性化される機

ウス野生型マウスに２週間連日経口投与し（1200

構」について、試験管内およびマウスの実験系をμ l/mouse/day）マウス小腸を採取し、腸管内で用いて検討した。その結果、経口摂取された潜在の Smad 経路の活性化（Smad 2 のリン酸化）、及型 TGF- βは生体内で胃酸によって活性化される

び腸管内における TGF- β標的遺伝子（TGF- β自６）ことを見出した 。本研究成果は、“TGF- βを多身、Smad 7）の転写活性化を指標として TGF- β

く含有する粉ミルクの開発”による「経口 TGF-シグナル活性の活性化の有無について検討した。

βによる乳幼児のアレルギー性疾患予防」という魅力的なコンセプトを具現化するための重要な基礎的知見となる。

3.

実験結果

3-1

試験管内における潜在型 TGF- βの酸による活性化とペプシンに対する抵抗性

2.

実験方法

2-1

試験管内における潜在型 TGF- βの酸による活性化とペプシンに対する抵抗性の実験では、実験系の単純化のため、経口投与

試 験 管 内 で 組 み 換 え 型 の 潜 在 型 TGF- β をら母乳中の TGF- βは大部分が潜在型として存在

pH1.2 又は pH7.0 の条件下で TGF- βシグナルのする。したがって生体内で潜在型 TGF- βが活性レポーター細胞である MFB - F11 細胞と一緒に型 TGF- βに変換されるしくみが存在すると考え培養し、上清中に分泌される SEAP 活性を指標られるがそのメカニズムは未だまったく明らかにとして TGF- βシグナル活性をモニターした。一されていない。このメカニズムの解明は、今後、部の実験では、胃液中のタンパク質分解酵素であTGF- βを多く含む抗アレルギー作用を持つ粉ミるペプシンを添加して行った。

ルクの開発のためには不可欠である。

上記のように、これまでのマウスを用いた我々
する TGF- βは活性型を用いてきた。しかしながin vitro では潜在型 TGF- βを活性型に変えるとアレルギーを予防する粉ミルクの開発に向けての基礎研究

き極度の酸性（あるいはアルカリ性）状態にする。

3-2

これは、タンパク質の立体構造を変化させ、活性43

野生型マウスにおける経口的に投与された潜在型 TGF- βの胃酸による活性化型 TGF- βに結合しその活性を阻害している LAP胃酸中和薬剤（シメチジン）をあらかじめ投与し（latency associated peptide）と呼ばれるタンパク胃酸を中和しておいた野生型マウス（BALB/c マ質を取り外すためである。

ウス）と非投与コントロールマウスのそれぞれにそこで我々は経口摂取された潜在型 TGF- βは潜在型 TGF- β（5μg/mouse）を経口投与したとこ

生体内で胃の中にある胃酸によって活性型に変換ろ、投与後３時間目にマウス小腸を採取し、腸管されるという仮説を立て検証した。

内での Smad 経路の活性化（Smad 2 のリン酸化）

試 験 管 内 で の 実 験 に お い て は、 組 み 換 え 型を検討したところ小腸上皮細胞におけるリン酸の 潜 在 型 TGF- β を pH1.2 又 は pH7.0 の 条 件。
化 Smad 2 陽性細胞数の増加が観察された（図 3）下で TGF- βシグナルのレポーター細胞である

またマウス小腸ににおける TGF- β標的遺伝子

MFB-F11 細 胞（Tesseur I et al. BMC Cell Biol

（TGF- β自身、Smad 7）の転写レベルの上昇も認2006 Mar 20 ; 7 : 15）と一緒に培養し、上清中に分められた。

泌される SEAP 活性を指標として TGF- βシグナ

3-3ル活性をモニターしたところ、pH1.2 の状態で顕ヒト母乳中潜在型 TGF- βの胃酸による活性化

著な TGF- βシグナル活性の上昇が認められた。

潜在型 TGF- βを含むヒト母乳を、胃酸中和薬

またこの活性は pH7.0 の状態では認められなかっ剤（シメチジン）をあらかじめ投与した野生型マた。さらに、これらの実験系に胃液中のタンパクウス（BALB/c マウス）と非投与コントロールマ

質分解酵素であるペプシンを添加しても、pH1.2ウス野生型マウスに２週間連日経口投与し（1200の状態で観察された顕著な TGF- βシグナル活性μ l/mouse/day）マウス小腸を採取し、腸管内での上昇には影響しなかった。の Smad 経路の活性化（Smad 2 のリン酸化）、及

図3

経口投与された組み換え型の潜在型 TGF- βは胃酸によって活性化する

野生型マウスに組み換え型の潜在型 TGF- β (latent TGF β ) または活性型 TGF- β (Active TGFβ )（ポジティブコントロール）を胃酸分泌阻害剤 (cimetidine) の存在下あるいは非存在下に投与したあと、小腸における TGF- βシグナルの活性化をリン酸化 Smad2 の免疫染色法によって評価した。
cimetidine 投与によってリン酸化 Smad2 の染色（茶色）が消失していることがわかる。

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浦上財団研究報告書

Vol.18（2011）

び腸管内における TGF- β標的遺伝子（TGF- β自た。これらの結果は、緒言に記述した経口摂取さ身、Smad 7）の転写活性化を指標として TGF- β

れた TGF- βが腸管内で機能するという実験結果シグナル活性の活性化の有無について検討した。

（図１参照）とも一致する。おそらく母乳中に含まその結果２）の結果と同様に、投与終了後３時れる潜在型 TGF- βは胃酸によって活性化され、間目にマウス小腸を採取し、腸管内での Smad 経

小腸においてその活性が発揮され食物タンパク質路の活性化（Smad2 のリン酸化）を検討したとこに対する免疫寛容の誘導に寄与しているものと考ろ小腸上皮細胞におけるリン酸化 Smad 2 陽性細えられた。本研究成果は文献６）に公表したので詳胞数の増加が観察され、またマウス小腸ににおけ細は原著にあたっていただけると幸いである。

る TGF- β標的遺伝子（TGF- β自身、Smad 7）の転写レベルの上昇も認められた（図 4）。

試験管内における潜在型 TGF- βの酸性条件下に よ る 活 性 化 の 検 討 は、2 - 4 時 間 の incubation
time で行われた。我々は、結果には示していな
いがより長時間による潜在型 TGF- βの酸性条件下での活性化の検討およびペプシン存在下での検討では、潜在型 TGF- βの分解およびその活性の低下を認めている。したがって、TGF- β（潜在型）が、酸や胃内の消化酵素（ペプシンなど）に比較的耐性のタンパク質であって、まったく分解されないというわけではない。
組み換え型の潜在型 TGF- βの投与と比べて、ヒト母乳の投与は２週間行われた。したがって胃酸による活性化後の組み換え型の潜在型 TGF- βの小腸における TGF- β活性は直接的な作用である可能性が高いが、母乳のそれは、２週間の投与期間の間に起った様々な生物学的変化による二次的なものである可能性は現時点では否定できな

図4

ヒト母乳中潜在型 TGF- βの胃酸による活性化

潜在型 TGF- βを含むヒト母乳を、胃酸中和薬剤（シメチジン）をあらかじめ投与した野生型マウス (BALB/c マウス）と非投与コントロールマウス野生型マウスに２週間連日経口投与
し (1200 μ l/mouse/day) マウス小腸を採取し、腸管内での TGF- β標的遺伝子（TGF- β 2、Smad7）の転写活性化を検討した。その結果、マウス小腸ににおける TGF- β標的遺伝子（TGF- β 2、Smad7）の転写レベルが母乳投与群においてコントロール群と比して上昇していた。

い。
母乳中の潜在型 TGF- βの濃度は比較的低いため、我々はたった一回の投与では、組み換え型の潜在型 TGF- βの投与のときのような生物活性を小腸において検出することは困難であった。
胃酸は、これまで消化機能における役割のみが4.

考察注目されてきた。しかしながら、本知見は、胃酸の新しい役割（経口的に摂取された生理活性分子以上の試験管内及びマウスを用いた検討の結果の活性化）にも言及した興味深いものである。実は、TGF- β（潜在型）が、酸や胃内の消化酵素（ペ際、胃酸中和剤を長期に投与されている胃潰瘍患プシンなど）に比較的耐性のタンパク質であり、者さんにおいては食物タンパク質に対する IgE 抗かつ胃酸によって活性型に変換することを示唆し体の上昇が認められるという報告もあり、今後アレルギーを予防する粉ミルクの開発に向けての基礎研究

ヒトにおけるこのような検討（胃酸中和剤投与患

謝者さんにおける食物アレルギーへの成り易さの有無）が必要かもしれない。

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辞本研究に対して多大なご助成を賜りました財団

法人浦上食品食文化振興財団に厚く御礼申し上げ

経口的に摂取された TGF- βによる抗アレルます。また研究遂行にご協力いただきました山梨

ギー作用については、米国、豪州の研究者からも大学医学部免疫学講座および順天堂大学医学部ア２）４）。本

トピー疾患研究センターの方々とりわけ中村勇規

研究成果を含め、これまでの我々や諸外国の研究氏、大沼裕子氏、原むつ子氏、奥村康教授、小川者の研究成果をもとに、最近我々は「経口 TGF-秀興教授に深く感謝いたします。

報告がなされ現在非常に注目されているβによる乳幼児のアレルギー性疾患予防」という魅力的なコンセプトを英国アレルギー学会誌にお文いて提唱した７）。さらなる基礎的な検討およびヒ

1) Yoshimura, A., Wakabayashi, Y., and Mori, T.: Cellularand molecular basis for the regulation of inflammation byTGF-β. J. Biochem., 147, 781-792 (2010).

トにおけるさまざまな臨床的検討が今後も必要であることはいうまでもないが、我々は今後も、経口 TGF- βによるアレルギー予防に関するより詳細な免疫学的メカニズムを明らかにして、このようなコンセプトを、“TGF- βを多く含有する粉ミルクの開発”のような形で具現化し、人類の福祉、健康の維持およびその発展に貢献したいと考えている（図 5）。

献2) Oddy, WH., and Rosales, FA.: A systematic review of theimportance of milk TGF-β on immunological outcomes in
the infant and young child. Pediatr. Allergy Immunol., 21,
47-59 (2009).
3) Ando, T., Hatsushika, K., Wako, M., Ohba, T., Koyama,K., Ohnuma, Y., Katoh, R., Ogawa, H., Okumura, K., Luo,J., Wyss-Coray, T., and Nakao, A.: Orally administered
TGF- β is biologically active in the intestinal mucosa andenhances oral tolerance. J. Allergy Clin.Immunol., 120, 916923 (2007).
4) Verhasselt, V., Milcent, V., Cazareth, J ., Kanda, A., Fleury,S., Dombrowicz, D., Glaichenhaus, N., and Julia, V.: Breast
milk-mediated transfer of an antigen induces tolerance andprotection from allergic asthma. Nat. Med., 14, 170-180(2008).
5) Okamoto, A., Kawamura, T., Kanbe, K., Kanamaru, Y.,
Ogawa, H., Okumura, K., and Nakao, A.: Suppression ofserum IgE response and systemic anaphylaxis in a foodallergy model by orally administered high-dose TGF-β. Int.
Immunol., 17, 705-712 (2005).
6) Nakamura, Y., Miyata, M., Ando, T., Shimokawa, N.,Ohnuma, Y., Katoh, R., Ogawa, H., Okumura, K., andNakao, A.: The latent form of transforming growth factor-β
administered orally is activated by gastric acid in mice. J.
Nutr., 139, 1463-1468 (2009).

図5

経口 TGF- βによる食物アレルギーなどのアレルギー性疾患の予防（写真は食物アレ
ルギーを合併したアトピー性皮膚炎の乳児）

TGF - βを多く含む粉ミルクなどを開発することによって乳幼児が TGF - βを多く摂取すれば食物アレルギーなどのアレルギー疾患の発症を乳幼児期に減らすことができるかもしれない。

7) Nakao, A.：The role and potential use of oral TGF-β in theprevention of infant allergy. Clin. Exp. Allergy, 40, 725-730(2010).

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浦上財団研究報告書

Vol.18（2011）

The latent form of TGF-β administered orally is activatedby gastric acid in mice
Atsuhito Nakao
Department of Immunology, Faculty of Medicine
University of Yamanashi
Transforming growth factor-β (TGF-β) is a regulatory cytokine with a pleiotropicrole in immune responses. TGF-β is secreted in a latent complex in which TGF-β
homodimers are non-covalently associated with homodimers of the pro-peptide called thelatency-associated peptide (LAP). The release of TGF-β from its LAP is required for thebinding of TGF-β to the cellular receptors and subsequent activation (phosphorylation) of
intracellular signaling mediators of Smad2 and Smad3. Extensive work on the activationof latent TGF-β led to two classes of putative TGF-β activators which liberate TGF-βfrom the constraints of LAP through either conformational change or LAP proteolysis. For
example, extremely low or high pH activates latent TGF-β by altering the structure of LAP
whereas certain proteases activate latent TGF-β through proteolytic digestion of LAP. Incontrast, the mechanisms involved in latent TGF-β activation in vivo are still only partially
understood.
Human milk contains a significant amount of the latent form of TGF-β. The humanmilk borne TGF-β is thought to play a role in the development of both the intestinal barrier
function and mucosal immunity. However, it is unclear how the latent TGF-β in humanmilk is converted into the active one in vivo to mediate its activity.
This study showed that recombinant human latent TGF-β or human milk-borne latent
TGF-β increased Smad-responsive promoter activity in MFB-F11 reporter cells at pH 1.2,but not at pH 7.0, regardless of the presence or absence of the gastric protease pepsin. Inaddition, mice treated orally with latent TGF-β (5μg/mouse) showed significant increases
in the phosphorylation of Smad2 and TGF-β and Smad7 mRNA expression in the small
intestine, which was inhibited by cimetidine (100 mg/kg, i.p.), an antagonist of histamine
H2-receptors. Similarly, mice treated orally with 1200μL of human milk containing latent
TGF-β (3μg/L) daily for 2 weeks increased TGF-β and Smad7 mRNA expression in thesmall intestine, and this expression was also inhibited by the anti-acid treatment. Therefore,
the latent form of TGF-β, such as TGF-β in human milk, can be activated by gastricacid following oral administration in mice. This process may therefore be involved in theconversion of human milk-borne latent TGF-β to the active form in vivo. Given a potential
role of human milk TGF-β in the prevention of allergic diseases during infancy, thesefindings might be also useful to develop infant formula maintaining TGF-β activity for
reducing the prevalence of allergic diseases in neonates and infants.