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浦 上財 団研 究 報告 書VoL13(2005)〈
平成15年度〉

甘 味受 容体 部分 欠損TIR3‑KOマ
用 い た食 嗜好 に関す る研 究

ウス を

ニ ノ宮

裕

三

(九州大学大学院 ・歯学研究院 ・口腔機能解析学分野)

1.は

じ め

本研 究 はそこで甘 味,う ま味受 容体 に共通す るにコンポ ーネ ン トであ るTIR3の 遺伝 子発 現 を ノッ
ヒ トをは じめ多 くの動 物は甘 味や うま味,等 張

クアウ トしたマ ウス を作出 し8,その味覚 応答 をの 食塩 などを嗜好 し,苦 味や強 い酸味 を嫌 う。甘解析 し,甘 味や うま味応答 が消失 するか ど うか を

味 は,動 物 に とって欠 かせな いエ ネルギー,塩 味

検索 し,さ らにTIR3遺 伝 子 の多型 性 を示 すマ ウ

は ミネ ラル(Na塩),うス系 統 問の差 を検 索す る こ とに より,TIR3受

ま味 はア ミノ酸の情 報 と容して動物 を嗜好 行動 に導 き,苦 味や強 い酸味 は毒体 コンポー ネ ン トがマ ウスの食嗜好 に どの程度 寄物 や腐敗物 の情報 として,忌 避 行動 に導 くもの と与す るか につ いて解 析 した。

考 え られ る。 このよ うに,味 覚 は生理 的要求 に基

2.方法

づ く嗜好忌 避の 食調節 に極め て重要 な役割 をはたしてい る。

2.1動

近年の分 子生物 学的研 究の進 展 によ り,味 覚 領
域 におい て も受容 体や チャ ネル,G一物

用 いたすべ ての実 験動物 とそれ らを用 いた実験

タ ンパ ク質

方法 は,九 州 大学(福 岡,日 本)の 実験動 物取 り

な ど各基本 味 を受 容 し伝 達す るメ カニズムが 明 ら

扱 い委員会 九州大学 大学 院歯学研究 院,大 学院 歯

か にな って きた。最初 にク ロー ニ ングされ た受 容

学府,歯 学部 及び歯 学部付 属病院動 物委 員会 によ

体 は苦 味T2Rs受 容 体で あ るが,こ の 数 は遺伝 子って 許可 されてい る。実験 動物 には,ワ イル ドタに して数十 あ り,現 在 までに ヒ トで少 な くとも24

イプマウ スと してC57BL/6(B6),TIR3遺の 受 容 体 が 機 能 して い る もの と推 定 され て いマ ウス(マ ルゴル スキー研 よ り贈与 され た親系 統るP。 そ れ に遅 れ て甘 味 お よび う ま味 受容 体 のを繁 殖維 持),BALB/c(BALB)マ

TIRsが ク ロー ニ ング され た2〜51。TIR群 は今 の(雄雌,週 齢8‑20週

ところTIR1‑3の3種

2.2鼓で あるが,こ れ らはヘテ ロ ダ

イマー を形 成 する こ とに よ りTIR1/TIR3で味 受容 体,TIR2/TIR3で

うま

甘味 受容 体 と して機 能

す る もの と推定 されて いる蘭 。 したが って,生 体伝子KO

ウ スを用 い た

齢,体 重23‑34g)。

索お よ び舌咽 神経 の舌 味刺激 に対 す る
応 答の記 録動物 を ネンブ タール麻 酔下(50mg/kg,ip)に
頭部 固定器で 仰向位 にて固 定 し,頚 部皮膚 を切 開に とって忌 避すべ き苦味物 質の 受容体 は多様 であし,気 管 カニュー レを装着 し気道 を確保 した。 内

るが,甘 味,う ま味受容体 はそ れぞれ1種 の みで側翼突 筋 を部 分切 除後,通 法に したがい右 側鼓索

あ ると報告 され ている。 しか し,過 去 の報告 な ど

神経 を露出 させ,鼓 室直前 で切断 した。神 経 は周か ら も複数 受 容体 の 関与 の可 能性 も否定 で きな

囲の組 織か ら分離 した後,シ ース を剥い て銀記 録

い。

電極 にのせ た。不 関電極 は手術 によって切 開 され

甘味 受容 体 部分 欠損TIR3‑KOマ
た 皮 膚 の 一 部 に 装 着 し た 。 舌 咽 神 経 も通 法 に 従い,顎二 腹 筋 下 に露 出 し た 。 鼓 索 あ る い は 舌 咽 神

ウス を用 いた 食嗜 好 に関 す る研究57ック製)が セ ッ トで きるよ うになってお り,チ ューブ先端付 近 に光 セ ンサ のフ ァイバー の発光側 と囲 を ミネ ラ ル オ イ ル

受光 側が 向 き合 うよ うにセ ッ トされて いる。 この

あ る い は フ ロ リナ ー トで 満 た し乾 燥 を 防 い だ 。 神

光軸 を遮 る行動,例 え ばチュー ブ中の溶 液を摂取

経 の 活 動 は 微 少 電 極 用 ア ン プ,増しよ う とマ ウス の舌が チ ュー ブの 先端 に触 れ る

経 を 記 録 電 極 に の せ た 後,周積 分 計 に 導 き,全幅装置 を介 して線 維束 の積分応 答 として記録 した 。 積 分 計 の 時 定 数 は1.0秒と した。記録 はマ ッる。

ク ラ ボ に て 保 存 解 析 した 。
味 覚

刺

激

と,リ ック記録 システ ム(ユ タカ電子製 作所,岐阜,日 本)が カウ ン トして レコーダー に記録 され各系統 のマ ウスは,固 形飼料 をゲー ジ内で 自由は:0.IMNaC1,0.03‑1.OMsucroseに摂 取で きる環境 下で飼 育 したが,実 験 開始1日(Suc),O.01MHCI,0.5Mglucose(Glc),0.5M
maltose(Mal),0.5Mfructose(Fru),20mM

前 か ら開始後5日 目まで23時 間絶 水条件 下にお いsaccharinNa(Sac),0.3mMSC45647(SC),0.3M

た。 実験 初 日はテス トゲー ジ内 で リック記録 シス

D‑alanine(D‑Ala),0.3ML‑Ala,0.5ML‑proline

テム を介 して 自由に蒸留 水を飲 む トレーニ ングを
1時 間行 った。 第2日 目か ら第5日 目までは トレ(Pro),0.3Mglycine(Gly)O.1Mmonosodium
glutamate(MSG:うーニ ング時間 を1時 間 か ら30分に し,10秒 間蒸 留ま 味),O.1MMSG+0.5mM

水 を与 えた後,20秒 間間隔を あけるス ケジュ ール

IMP,5.OmMIMP,0.02MquinineHCI,2.OmM
quinineH,SO、O.1MNHaCIを

室 温蒸 留水 に溶 か し

用 い た 。0.IMNH、Clを基 準 刺 激 と し,各に 対 す る 応 答 は0.IMNH、Clに

種 味刺激

対 す る 応 答 を1.0とした と きの 相 対 応 答 値 で 表 した 。 ま た,この基準

溶 液 に よ る 刺 激 を 各 種 刺 激 に 挟 ん で 繰 り返 し 行
い,その 応 答 が15%以を30‑50回 行 った。
(1>条

件づ け味覚嫌 悪学習 を用い た検索

水飲み トレーニ ング(第1日
終 了後,第6日

目か ら第5日 目)

目に,TIR3‑KOマ

ウ スを6グ ルー

プに分 け,各 グルー プに異な る新 奇 な甘 味物 質で内 の変動 に留 まってい る時

あ る0.3Msucrose(Suc),0.5MGIucose(Glc),

間 範 囲 に 行 わ れ た 各 種 刺 激 の 神 経 応 答 を安 定 性 が0.3MGIycine(Gly),O.1MD‑phenylalanine(D‑得 ら れ て い る もの と推 定 し,以Phe)溶

後 の測 定 に用 い液(条 件刺 激:CS)を

それぞ れ摂取 させた。 コン トロールグ ループに は,条 件 刺激 に蒸留

た。
2.3味

覚行動 応答特 性の解 析

2種 類 の 短 時 間(10秒た 。TIR3‑KOマ間)リ

水を用 いた。 その後,す ぐに 胃腸の不快 感 を引 き

ッ ク テ ス トを 行 っ

ウ ス に対 して は,条件づ け味覚 嫌悪 学 習(conditionedtasteaversion:CTA)を用

い た 検 索 を 行 い,B6な

ら び にBALBマ

ウスに対 し起 こ す 為 にo.15M塩 化 リ チ ウ ム(LiCl)を230mg/kg腹腔 内投与(無 条件 刺激:US)し味覚嫌悪 条件付 け(CTA)をて,行 った。 第7日 目は回復期 間 としたが,30分 間の水 飲み トレー ニングて は,条件付 け 味覚 嫌 悪学 習 な しの甘 味物 質 とは行 った。第8,9,10日

quinine混

合液 を用 いた検索 を行 った。

用い,蒸 留水 を含む20種 の試験 溶液 に対す る10秒

実 験 器 具 に は,特別 に作製 したプ ラスチ ック製の テ ス ト ゲ ー ジ[240(D)xl70(W)×120(H)mm]
を用 い た 。 箱 の 側 壁 に は,直が あ り,一径5mmの本 の ドリ ン キ ン グ チ ュ ー ブ(プ目に,こ れ らのマ ウス を間の リック数(摂 取量)を 測 定 した。 デー タは,
3日 間計 測 した各マ ウスの平均 値 を用 いた。 試験

円形 の窓
ラスチ

溶液 には,天 然甘味料 の0.3‑1.OMSuc,0。5MGlc,
0.5MMaltose(Mal),0.5MFructose(Frc),1.OM

58

浦 上財 団 研究 報告 書VoLl3(2005)

sorbitol;甘味 系 ア ミ ノ 酸 の30mMD‑Tryptophan

か ら シ ー ト状 に 剥 ぎ わ け た 。 剥 離 し た 上 皮 は,

(D‑'Tryp),O.1MD‑Phe,0.3MGIy,O.1ML‑Ala,
0.1ML‑Phe;人NESで

工 甘 味 料 の20mMSac),0.1Mアセ

洗 浄 し,シ

し,Ca一

リ コ ン皿 上 に 広 げ て ピ ン で 固 定

不 含 細 胞 外 溶 液(2mMEDTA含

サ ル フ ェ ー ムK(AceK),8mMSC45647,2.5mMNES)で20分

Sucralose;そい 状 態 に し た 。 味 蕾 は,FPとCPかの 他 の 基 本 味 と し て1mMHCI,間,室0.01‑0.3mMQHCI,O.1MNaCI,O.1MKCI,O.1M

100μmのMSG,O.1MMPGを

ま た 味 蕾 を 含

(2)甘

用い た。
味(う

ま み)物

質一quinine混 合 液 を 用いた検 索
試 験 溶 液 に は,1mMQuiとそ れ ぞ れ0.Ol‑0.IM

大 きさでの 味 蕾 又 は 味 蕾 を 含 ま な い 上 皮 組 織 を100u1(1

よ び1‑

溶

解

バ

ッ

フ

ァ

ー[4Mguanidine

thicoyanate,25mMtri‑sodiumcitrate(pH7.0),

100mMMSG+O.1mMIMPとの 混 合 液 を用 い た 。

0.5%sodiumN‑lauroyl‑sarcosine,O.1M2‑

水 飲 み トレ ー ニ ン グ(第1日

目 か ら 第5日

mercaptoethanol]が

Quiを

目)終

目 に 各 混 合 溶 液 に対 す る10秒
取 量)を

間

測 定 し た。 混 合 液 に1mMの 混 合 で,用チ ュ ー ブ に移いた甘 味物質 の濃 度範囲

phenolを1vol.,chloroform‑isoamylalcohol(49:
1)を

た 。4℃

ウ ス 味 蕾 に お け るTIR3,TIR1,ガス ト

ジ ュ ー シ ン と β一actinの 発 現 検 索

す べ て 加 え た 後,混で15分

50mg/kg,AbbottLaboratories,NorthChicago,
IL,USA)腹腔 内 麻 酔 下 に お い て,頚り屠 殺 後,速や か に 舌 を 摘 出 した 。 舌 は 標 準 細 胞

部脱 臼に よ液[normalextracellularsolution(NES);

140mMNaCl,5mMKCI,1mMMgCl2,1mM
CaCI̲〉,5mMglucose,1mMsodiumpyruvate,
洗 浄 し,そ

0.2mlのNES(1.Omg/mlelastase含記 のRNA生

RNAを

抽

出

有)を

の 後,

舌 の上皮

蒸留 水で 溶用 い て ゲ ノ ムDNAを

成 過 程 を 繰 り返 し,トした 。cDNAは,Superscript

用 い て,

逆 転 写 反 応 に よ っ て 合 成 し た 。PCR反応 は,1反行 っ た 。 ゲ ノ ムDNAは

RNAは

状乳 頭

合(RT‑)で

乳

で は,予

と

有

郭

頭

含 む上皮 を筋層

以 下 の2つを用い ての プロ トコー

ル に よ り シ グ ナ ル に は 関 与 し な か っ た 。(1)

せ た26℃

間 置 き,茸

消ー タルsburg.MD)とoligo(dT)一̲,sprimerを

飽 和 さ

で15‑20分

澱 さ せpreamplificationsystem(GIBCO/BRL.Gaither‑と 筋 層 の 問 に 注 入 し,95%0,と5%CO,を[circumvallatepapilla(CP)]を洗 浄 後,50,ulの解 し た 。 そ してDNaselを
化 後,上

沈

度isopropanol,沈

応 当 た り25個 の 味 蕾 に 相 当 す るcDNA量

10mMHEPES‑NaOH(pH7.4)]で[fungiformpapilla(FP)コ

速 遠 沈 して 水 相を分 離 し た 後,全RNAを1voLのisopropanolでた 。75%etanolで2回に よる解析

のNES中

合 液 をボ ルテ ックス し間 静 置 し た 後,高澱 さ せ た 。 遠 沈 後,再マ ウ ス を ペ ン トバ ル ビ タ ー ル ナ ト リ ウ ム(40・外キ ャ リア と し て 加 え た 。

続 け て,2MNa‑acetate(pH4.0)を0.1voL,acidic

3日 間 計 測 し た 各 マ ウ ス の 平 均 値 を 用 い た 。

(1)RT‑PCR法

モ ジ ネ ー ト し た 。YeasttransferRNA(1.0μg)をで 濃 度 応 答 曲 線 が 描 け た こ と に よ る。 デ ー タ は,

2.4マ

入 っ て い る エ ッペ ン ドル フ
し,ホ系 統 す べ て に お い て,

用 い た 理 由 は,各1mMQuiと集 した。

ま な い 舌 上 皮 組 織[tongue

epithelialtissue(ET)]を1×2mm2のvoL)のTryp,0.03M‑O.1MMSG,1‑3mMIMPおの リ ッ ク 数(摂ら別 々に口 径

ガ ラ ス ピペ ッ ト で 吸 い 取 り,収採 取 し た 。 そ れ ぞ れ の 乳 頭 か ら採 取 さ れ た100個

D‑Phe,0.1‑0.3MSuc,1‑IOmMSac,0.03MD‑

了 後,第6‑8日

有 の温 で 処 理 し味 蕾 を 分 離 しや す

逆 転 写 酵 素 の あ る 場 合(RT+)と(2)PCRプ

扱 い,PCR反ない場

応 に 使 用 した 。RT一想 され るサ イズの バ ン ドが なか った。
ラ イ マ ー は ゲ ノ ムDNA由

来 の増幅 産

甘 味受 容体 部 分 欠損TIR3‑KOマ

物 と 区 別 す る 為 に1またはそれ 以上の イ ントロン

ウス を用 い た食 嗜好 に関 す る研 究

TIR1(36),βを挟 む よ う に設計 した。 この よ うに して 行っ た(2)insituhybridization法

PCRでマ ウ スTIR3,TIRIとGustPCR産

は2つの バ ン ドが 見 られ る 。 一 つ は イ ン ト

ロ ン を 挟 む こ と に よ っ て サ イ ズ が 大 き くな っ た ゲ
ノ ムDNA由mRNA由

来 の バ ン ドで あり,もう 一 つ が来 の バ ン ドで ある。以 下 に本 実験 で 使

用 し たPCRプ

用 いた。
による解析
物 を 精 製 し,

pGEMT‑Easyvector(Promega,Madison,WI)
に サ

ブ ク

ロ ー ニ

ン グ

し た 。Biotin‑labeledantisenseRNAprobeは,Biotin‑RNAlabelingmixとSP6まラ イ マ ー を 示 す 。:TIR3primers:

59

一actin(24)をた はT7RNAポ

リ メ ラ ー ゼ(Roche,

5'‑CTACCCTGGCAGCTCCTGGA‑3'と5'‑AGG

IN,USA)を

ACACTGAGGCAGAAGAG‑3'(Kitagawaetal..

た 。 摘 出 し た 舌 をOCTコBBRC(283)236,2001:334bps):TIRIprimers

Finetechnical,Tokyo,Japan)に5'‑GAAGAGTCCTATGTCCAGGCAGTG‑3'とク ラ イ オ ス タ ッ ト を 用 い て 厚 さ5‑10μmに5'‑GGCAGAACCAATGACCTCAAAG‑3'(Gebe‑

イ ス し,シbankNo.AYO32622,396bps):ガ

ス トジ ュ ー シ ン:

使 用 しinvitro転

写 に よって 合成 しン パ ウ ン ド(Sakura
凍 結 包 埋 し,スラ

ラ ン コ ー ト した ス ラ イ ドガ ラ ス に 張 り

付 け た 。 この 凍 結 切 片 を,室

温 で10分

5'‑AGATGGGAAGTGGAATTAGTTCAGA‑3'とホ ル ム ア ル デ ヒ ド含 有PBSで固 定 し た 後,室5'‑GCTCAGAAGAGCCCACAGTCTTTGA‑3'(X65

15分 間 の0.1%ジ

747,1069bps):βPBS処

一actin:5'‑GGTTCCGATGCCCT

温 で15分間,5×SSCでで2時間,5×SSC/50%

浄 し た 。 そ の 後,58℃

GG‑3'(XO3765,360sbp)。PCRはPE9700(Appl‑formamideでprehybridizationを

iedBiosystem,CA,USA)を用 いて以下 の条 件でzationは,50%formamide,5×SSC,5×Denha‑

イ ク ル);94℃,15秒

rdt'ssolution,500,ug/mldenaturedsalmon

間,58℃,30秒
イ ク ル);72℃,5分
液間(1サ間,72℃,40‑80秒
間(1サイ ク ル)。PCR反応溶

各 々 の プ ラ イ マ ー,200μM

行 っ た 。Hybridi‑tRNA,1mMDTT,20‐200ng/mlantisense
riboprobe含有 のHybridizationBufferで58℃,18

時

っ

間

行

た 。Hybridization後,切deoxyribonucleoside5'‑triphosphate(dNTP)とHybridization時

0.05unit/ulTakaraEXTaq(Takara,Japan)を

SSC/50%formamideで

含 有 したもの を用いた 。各 々の遺伝子 増幅 産物の回0.2×SSC/50%formamideで

信 頼 性 は は シ ー ク エ ン ス に よ り確 認 し た 。 増 幅 産

後,切片 を50mMTris/HC1(pH7.5)と150mM

物 は0.52μg/mlethidiumbromide含NaClから 成 るTBSに,室

有2%ア

ガ ロ

ー ス ゲ ル で 視 覚 化 した 。

と 同 じ 温 度 で,5分

片

洗 浄 し,さら に30分 間,2

洗 浄 した。 そ の

温 で5分

間 浸 し,30分

間,0.5%blockingreagent(Roche)含有TBS中に 置 き,室(versionl.62,NIH,MD,USA)をー ス ラ デ ィ シ ュ ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ(HRP)標用い てゲル

温 で30分間,blockingsolution中

上 に 視 覚 化 さ れ た バ ン ドの 濃 度 を 数 値 化 し た 後,

streptavidin(1:200dilution)と

β ア クチ ンの 発 現 量 に 対 し て 相 対 値 化 した 。 計 測

片に 使 用 し た 各 遺 伝 子 のPCRサ

0.05%Tween20か

イ クルは指数 関数的
イ ク ル),TIR3(36),を間,2回,5×

各 遺 伝 子 発 現 量 の 定 量 的 解 析 は,NIHimageに 増 加 し て い るGust(34サ洗testisDNA,250,ug/mldenaturedbaker'syeast

間(18‑38サ

は,10mMTris/HCI,50mMKCI,1.5mM

MgCl,,0.5μMのラ
温でエ チ ル ピロ カ ル ボ ネー ト含 有

理 を 二 度 行 い,室GAGGCTC‑3'と5°‑ACTTGCGGTGCACGATGGA

行 っ た 。95℃,2分

間,4%パ

の ホ
識

反 応 させ た 。 切を50mMTris/HCI(pH7.5)と150mMNaClとら 成 るTNTで5分し た 。Biotinyl‑tyramideは間,3回

希 釈(1:50)さ

洗 浄
れ,

60

浦上 財団 研 究報 告書VoLl3(2005)

Fig.lSamplerecordingsofresponsesofthechordat}・mpaninervetocarioustastestimuliinC57BL6(B6).TIR3‑KO.andB.aLBmice.

切 片 は 希 釈 さ れ たBiotinyl‑tyramideと間(非室 温 で10分

特 異 的 な バ ッ ク グ ラ ン ド染 色 が で な い よ うに,10分

以 上 に な ら な い よ う に し た),遮

反 応 させ た 。TNTで5分
室 温 で30分

間,3回

洗 浄 後,切問,blockingsolution中ォス フ ァ タ ー ゼ(AP)標

片 は,のア ル カ リフ

反 応 させ た 。TNTで5分

間,3回

た 後,切

片 は100mMTris/HCI(pH9.5)と100mMら成 るAPbufferに

洗 浄 し

対

TIR3‑KO<BALB<B6に川頁に大 き く,MSGにす る 応答 はTIR3‑KOマ

ウスの みが や や減 少 して対3種 系統 の鼓索 神経 の各種味 刺激 に対 す る応答を比較す る と,Fig.2に あ る ように,TlR3‑KOマ

浸 した。

シ グ ナ ル は 色 素 基 質 で あ るnitroblue‑tetrazolium
chlorideと5‑bromo‑4‑chloro‑3‑indolylphosphateを

ウス は他 の2系 統 と比 べ ほ ぼすべ て の甘 味物 質
(D‑Alaを 除 く)と うま味 物質 に対す る応 答が 有
意 に減少 してい た(t‑test,P<0.05)。B6とBALB

使 用 して 発 色 さ せ た 。 そ の 後,TEbufferで
イ ド ガ ラ ス を す す ぎ,反にして比較 す ると,HCI,quinineHCI,NaClにす る応答 は差が ないが,SucとSacに 対す る応 答はい た。

識sttreptavidin(1:200

希 釈)と

NaCl,50mMMgCIか

光 下に て

典 型 例 を示 す。0.IMNH、Clに 対 す る応 答 を基 準

ス ラ

で はSuc,Fru,Mal,Sac,SCな

ど糖 や 人工甘 味

応 を停止 した。味細 胞 内

料 に対 す る応 答 に差 が 見 られ た が(P〈0.001‑

グ ナ ルの 特異 性0.05),ア ミノ酸 に対す る応答 には有意差 が なかっのTIR3,TIR1とGustmRNAシは ネ ガ テ ィ ブ コ ン トロ ー ル と し てsenseprobeをた(P>0.05)。

使 用 す る こ と で 確 認 した 。

種系 統マ ウスで差 はなか った。 次に舌咽 神経 応答

3.結塩,酸quinineににつ いてTIR3‑KOと果対す る応答 は3

そ の ワイ ル ドタ イプのB6と比 較 した(Fig.3)。 舌咽 神経 で はSucに対 す る応3.1鼓索 神経 味応答 の比較

B6,TIR3‑KO,BALBマウスの各 種味刺 激に対する鼓 索神 経積 分応 答 を比 較 した。Fig.1は そ の答 のみ に有意 差が見 られ(P<o.ol),他の糖,人工甘 味料,ア ミノ酸な ど甘味 うま味物 質,さ らには塩,酸,quinineに対す る応答 に有意差 は認 め ら甘 味受 容 体部 分 欠損TIR3‑KOマ

ウ スを川 い た食 嗜好 に 関す る研 究

61

Flg.2Responsepro丘lesofthechordatympaninerveTovarioustastestimuliinC57BL(B6}.TIR3‑KOandBALBmice.蓼:t‑test.P<0.05;":P<0.01:"':P<0.001.numbersofsubjectswerefrom3toS.Suc:0.5¥Isucrose:Fru:0.5¥Ifructose:Glc:0.5¥Iglucose:¥4a1:0.5.11
maltose:Sac:20m11saccharin¥a:SC:3m/iSC40647;D‑Try:0.0311D‑tryptophan:D‑.ala:0.131D‑alanine:L‑Ala:0.1/'1L‑alanine:13SG:0」MmonosodiumL‑glutamate;MSG+IMP:0,IMNISG+0.5mMI¥IP:¥aCl:0.ININaCl;HCI:0.OIMHCI:QHC1:20mNIquinineHCI.

Fig.3ResponseprofilesoftheglossopharyngealnervetovarioustastestimuliinC57BL(B6)andTIR3‑KOmice.":t‑test,P<0.01numbers
ofsubjectswerefrom3to8.AbbreviationsarethesameasthoseusedinFig.2exceptQSO4thatis2mMquinineH,SO,.

れ なかっ た(t‑test,P>0.05)。

しか し,神 経 応答の 減少が 少な く応 答の多 くが残3,2行

動応 答の比 較存 していたGlcに対す る条件 付け は容易に成 立 し,

(1)条

件付 け味覚嫌 悪学習 を用 いた検索

Fru,Mal,Sorbitol,1.OMSucに汎化 した。 神経

TIR3‑KOマ

ウス の各 種 味物 質 に対 す る短時 間

応答 の デー タに は示 して いな いが,TIR3を(lo秒 間)リ

ッ ク 数 を比 較 す る と(Fig.4),

す る遺 伝子 とは異 なる遺伝 子に よ り支配 される とquinineと人工 甘味料 を除 く糖,塩,酸,ア

ミノ酸

支配

報告 され てい るGlyとD‑Pheも 容 易 に嫌悪 学 習がな どすべ ての刺激 溶液 に対 して水 と同様の60前 後成立 した。Glyはsorbitolにの み汎 化 し,D‑Pheはの リッ ク数 を示 した。一 方,Sac,AceK,SC,

Gly,Sorbitol,FruにSuroloseの 人工甘 味料 に対 する リ ック数は ワイル

は よ り限定 的な味 のプロ ファ イルをもつ もの と推

ドタ イプ のB6マ ウ スで は通 常水 と同様60前 後 の定 された。

値 を示す のに(デ ータ示 さず),TIR3‑KOマ

ウスではquinineと 同程度 まで リック数 が減少 してい た。
Sucに 対 す る嫌 悪条 件付 けは0,3M以 下 では困 難で(2)甘汎化 した。 したがって,Gly

味(う ま み)物 質一quinine混合 液 を用い た検索

1mMquinineと混合 す る こと によ り甘味 物 質

このFig.4に ある ように1.OMで 条 件付 けが成 立 しに対 す る濃度 応答の 解析 が可 能に なる。Fig.5にた。 他の糖 や甘 味物質 に対す る汎化 は弱か った。

その 結果 を示す 。甘 味ア ミノ酸D‑Pheに 対 する リ

浦上 財 団研 究報 告書VoL13(2005)

62

ック数 は系 統差が 顕著 で,BALBに

比 べB6マ ウス

が 高 い 。 また,0.3NISuc,10mMSac,0.03MD‑
tryp,さ らには うま味物 質に対 する リッ ク数 も有意 に高 い値 を示 した。
3.3TIR3,TIR1受mRNAの
RT‑PCR法

容体,ガ ス トジュ ー シ ン
発現検 索

を 用い た解 析 に よる結 果 をFig.6に示 す。TIR3,TIR1受

容体 さ らには味細 胞特 異的に発現 す るGタ ンパ ク質 で ある ガス トジュ ー シ
ン91を表す バ ン ドが,B6およびBALBマ

ウ スの味

蕾 をふ くむ茸状 乳頭(fungiformpapilla:FP)な
らび に有 郭乳頭(Circumvallatepapillae:VP)に
認 め られ た 。ま た 味 蕾 を含 ま な い舌 上 皮 組 織(Tongueepithelialtissue:ET)には発現が 見 ら

れなか ったの で,そ れ らの発現 は味蕾 特異 的である ことが 確 認 され た。 またTIR3‑KOマ

ウス では

TIR3の 発現 が消 失 してい る こ とが 確認 され た。
ハ ウ ス キ ー ピ ン グ ジー ンで あ る β一actinはFP,
VPそ してETに 発現 して いた。半 定量解 析 によ る
結 果 は,ガ ス トジュー シ ンに関 して は3種 系 統でTIR3はB6とBALBマ
Fig.4

lumbersoflicks(perIOs)inresponsestovarioustaste

ウ ス問 でFPお よ びVPに お

ける発 現量 に差 は な く,TIR1はTIR3‑KOマウス

solutionsafteravoidanceconditioningwithconditioning
stimulus(CS).1.OMsucrose(Suc).0.5Mglucose(Glc)。03M
glycine(Gly),orO.11D‑phenylalanine(D‑Phe)andwithout
CS.Numbersofsubjectswerefrom5to7.

のFPに お け る発現 量が 他 の2種 系統 に比 べ やや多か った。
またinsituhybridization法 によ る検索 に おいて

Fie.5Numbersoflicks(DerIOs>inresDonsestovarioustastesolutions.8't‑test,P〈0.05;騨
20.

・P〈0.01.:GumbersofsubiectswerefromlOto

目'味受容 体 部分 欠損TIR3‑KOマ

ウ スを 用 いた 食嗜 好に 関す る研 究

63

Fig.6Expressionofgustducin,TIR3andTIRImRNAinTIR3‑KO,B6andBALBmicemeasuredbyRT‑PCRanalysis.Beta‑actinwasused
aspositivecontrol.¥umbersofc5‑cleswerefrom18to38.Lowerpanelindicatesexpressionlevelsforgustducin.TIR3andTIRI
relativetobeta‑actin.F:fungiformpapillae:、・:circumvallatepapilla;E:epithelialtissue.

Fig.7Expressionofgustducin.TIR3andTIRlmRNAoffungiform(FP)andcircumvallate(VP)papillaeinTIR3‑KO.B6andBALBmice
measuredbyinsituhybridizationanalysis.

も,TlR3,TIR3おはRT‑PCR法

よ びガス トジュ ー シンの発現に よる結果 と一致 してい た(Fig.7)。

嗜 好 を示 す 系 統 と して 知 られ て い る。一 方,BALBマ

ウ スはTIR3遺 伝 子 に6種 の ア ミノ酸 変

TIR1に 比べTIR3の 発現 は よ り味蕾 特異性 が高 か

異 が あ り,そ の変 異がSacに 対 す る嗜好性 を減 少った。

させ て い るこ とが 推定 され てい る2、3。 す なわち,本 研 究で はTIR3遺 伝子 の正常 系,変 異系,欠4.考察

損 系の3種 のマ ウス系 統の甘 味 うま味 応答 を比較
本研 究 は,甘 味 うま味受 容の両種 に共 通す る受

し た こ と に な る。RT‑PCR法とlnsituhybridi‑

容体 コ ンポ ーネ ン トで あ るTIR3の 働 きを,そ のzation法 によ り,B6,BALBマ

ウスで はTIR3の 発

受容体 発現 と遺伝子機 能が 異な る3種 のマ ウス系

現 が確認 され,TIR3‑KOマ

ウスで はその欠損 が確統で 比較 した。B6マ ウス はTIR3遺 伝 子の ワ イル

認 され た。B6とBALBでは その発現量 や,茸 状乳

ドタイ プと して,行 動 実験 におい て もSacに強 い

頭 と有 郭乳頭 におけ る分布 など差 は検 出 されなか

64

浦 上財 団 研究 報 告書VoLl3(2005)

っ た。 した がっ て,味 覚 応答の 相違 は,受 容 体の

短時 間 リック測定 を用い た二つ の実験手 法 によ発現 特性 によ るのでは な く,ア ミノ酸 変異 によるり行動 実験 を行っ たが,そ の結果 は,い ず れ も神相違 に基づ くことが示唆 され た。鼓索 神経の 各種

経応答 で得 られた結 果 と矛 盾 しなかった 。す なわ

甘 味物 質に対 す る応答 を比 較す る と,3種 の マウ

ち,TIR3‑KOマス 系 統 で大 き く異 な っ て い た。例 え ば,Suc,

やSCな ど人工 甘味 料 に対す る摂取 量 はquinineとFru,Mal,Sac,SCとMSGとIMPの相 乗効果 は3

ほぼ 同様の値 を示 し,嗜 好 度が著 し く減 少 して い

種 系 統がB6>BALB>TIR3‑KOマ

ウス の順 に小る ことが示唆 され た。おそ ら くそ のサ イ ドテー ス

ウスの 短時 間リ ック測定 で はSac

さ くなって お り,す なわ ちTIR3受 容 体 のア ミノトで ある苦味 に近 い感覚 をひ きお こ して いる こと酸 変異での 応答 の低下,そ の 欠損に よる さらなるが推 定 され る。 残念 な が らTIR3‑KOマ

ウス の 数応 答の 減少 が見 られ,こ れ らの応 答へ のTIR3のが限 られ ていた こ とか ら,SacやSCなどを条件 刺強 い関与が 示唆 された。特 に,SCとD‑trypに対す

激に用 いた味 覚嫌悪 学習 による実験 がで きてお ら

ウ スで消 失 してい た。 したず,マ ウスが どの ような味 で感 じてい るのか本研が って,こ れ らの甘 味物 質の 受容 にはTIR3が 不

究で は追求す る ことがで きなか った。 この件 に関可 欠であ るこ とがわか る。 しか し,一方 で,食 塩,

して は今 後追加 実験 を行 う必要 が ある。Sucに 関

る応答 はTIR3‑KOマ酸,quinine,MSG,D‑Alaな

ど塩味,酸 味,苦 味

しては その 感受 性 は低 下 して い るもの の1.OMで物 質に対す る応 答や,う ま味や 甘味 ア ミノ酸 の一

嫌悪条 件付 けが成立 し,応 答は残 ってい るこ とが部 の応 答 は全 く変 化 が な く,こ れ らの応 答 には確認 され,神 経応答 と一致 した。 また,神 経応 答

TIR3は 全 く関与 して いな い ことが 明 らかに なっが残 って い たGlcに対す る条件 付 け も容 易 に成 立た。 また,Suc,Fru,Glcなどの応答 はTIR3‑KOした。GlcはSucに も汎化す るが,SucはGlcに は 汎で 著 し く減 少 す る ものの 消失 す る こ とはな く,

化 しなかっ た。 このこ とは同 じ様 に残存 してい る

TIR3受 容 体 以外 の受容 システ ムの 関与 が示 唆 さ

SucとGlcに 対す る神経応 答の由来 は,実 際は異 なれ た。 また,舌 咽神 経の 応答 の比較 か ら,Sucにって い るこ とが推 定 され る。す なわ ちTIR3以 外

対す る応答 のみが 変化 してお り,舌 の前 と後 の味の受容 体 コンポー ネ ントはさ らに少 な くと も2種

蕾 に発現す る受容 体の性 質の相 違 も考 え られ る。

類(SucのTIR3以

い ずれ に して も,そ の応答 発現 がTIR3受 容体 コ

る ことにな る。 また,遺 伝子 レベ ルでそ の感受性

ンポー ネ ン トに依存 してい るの は鼓索 神 経のSC支配がTIR3と 異 なってい る と推 定され るGly'""ととD‑trypに 限 ら れ て い る とい う結 果 で あ り,

D‑Phe"'も それ ぞれ異 なる汎化 パ ター ンを示 してTIR3は 糖 応 答 にも大 き く寄与 して い るが,他 のお り,さ らに2種 類 の甘味 関連受容 機構 の存在が受容 体 も少 な くとも一部 関与す るこ と,う ま味ア

示唆 される。 これ らの点 について は,少 な くとも

ミノ酸の応 答の大 部分 には関係 せず,相 乗効 果に

TIR3‑KOマ

関 わ る 応 答 の み に 関与 す る こ とが わ か っ た。

ベルで の研究 に より明 らか にする必 要が ある。

MSGの 応答 に関 しては,舌 後 部に おける受 容,舌本研 究で は,甘 味 う ま味受 容体 の主要 なコ ンポ
ー ネン トであ るTIR3の 性 質の 異 なる3種 のマ ウ

咽神 経に よる情報 が重要 であ るこ とが示 唆 されて
お り1°},うま味の受 容体 はTIR1/TIR3以(tastemGluR4,mGluR1)lllの外の もの

方 が応 答 の発 現に よ り大 きな貢献 を している もの と推定 され た。

外,Glc感 受 性の もの)は 存在 すウ スを 用い た味 細胞 や 味神経 線 維 レ

ス系統 の味応 答を解析 し,そ の役割 につ いて解析した。 そ の結果,TIR3は

人工甘 味 料 など に対 しては ほぼすべ ての応 答に関与 し,そ の受容 体欠損

甘 味受 容 体部 分 欠損TIR3‑KOマに よ りそれ らに対 する嗜 好は消 失す るこ と,糖 や
甘味 ア ミ ノ酸 に対 す る応 答はTIR3以 外の 受容 体
もそ の程度 の差 はある ものの関与 して いる ことがウ スを用 い た 食1嗜好 に 関す る研 究

655)Sainz,E.,Korley.J.N,.Battey,J,F.,andSullivan,S.L.
工dentificatiollofanovelmemberoftheTIRfamilyof
putauvetastereceptors.J.Neurochem.,77:896‑903.2001.
6)NeIson,G.Hoon,N.1.A..Chandrashekar,J.,Zhang,Y,,

明 らかに なった。 今後,そ れ らに関与す る新 たな
受容 体 が発 見 され る可 能性 が 高い もの と思 わ れ

Ryba,N.J.P..andZuker.C.S.Mammaliansweettaste
receptors.Cell106:381‑390,2001.
7)Nelson.G..Chandrashekar.J.,Hoon.':¥LA..Feng.L.

る。

,

Zhao,G..Ryba.N.J.P.,andZuker,C.S.Anamino‑acidtaste
receptor.Nature416:199‑202.2002.

本研 究 を遂 行す るに当 た り,研 究助成 金を賜 り

8)Damak.S,Rong,M.Yasulnatsu,K,Kokrashvili.Z,

ま した浦上 食品 ・食文化振 興財団 に心 よ り感謝 い

Varadaralan.V,Zou,S,Jiang.P.Ninomiya

た します。 また,TIR3‑KOマ

Margolskee.RF.Detectionofsweetandumamitastein

ウスを提供 して くれ.Y,andtheabsenceoftastereceptorTIR3.Science301:850‑853.

たDr,Margolskee(ハワー ドヒ ュー ズ 医 学研 究所),研 究 を実 際 に遂行 して くれ た教室 の重 村憲
徳 助手,安 松 啓子学術 研究 員,吉 田竜介学 術研究

2003.
9)McLaughlinSK,MckinnonPJ,andMargolskeeRF.
Gustducinisataste‑specificG‑proteincloselyrelatedtothetransducins.Nature,357:563‑569,1992.

員に感謝 します。

10)NinomiyaY..NakashimaK,FukudaA.,NishinoH..
SugimotoK..HinoA.,DanilovaV".andHellekantG.

文 献

Responsestoumamisubstancesintastebudcells
innervatedbythechordatympaniandglossopharyngeal

1)Hoon.VIA.idler.E,Lindemeier.J..Battey

nerves.J.Nutri.,130:9505‑9535.2000.

.JF.A.J.

Ryba.NJ,andZuker,CN.Putativemammaliantaste‑‑)SugimotoK.andIVinomiyaY.Introductoryremarkson

receptors:aclassoftaste‑specificGPCRswithdistinct

umamiresearch:candidatereceptorsandsignaltransdu‑

topographicselectivity.Cell96:541‑551.1999.

ctionmechanismsonumami.Chem.Senses,30:i21‑i22,2005.
12)Inoue.M..Reed,D.R.,Li.X.,Tordoff,M

2)Kitagawa,̲VL,Kusakabe.Y..Miura,H.,Ninomiya,Y.,
andHino,A.Moleculargeneticidentificationofacandidate

G.K.,andBachmanov,A.A.AllelicvariationoftheTaslr3

receptorgeneforsweettaste.Biochem.Biophys.Res.

tastereceptorgeneselectivelyaffectsbehavioralandCommun.283:236‑242.2001.

neuraltasteresponsestosweetenersintheF2hybrids3)Max,M。Shanker,Y.G.,Huang.L,Rong,M..Liu.Z.,

betweenC57BLi6ByJand129P3/Jmice.J.Neurosci..24.

Campagne.F..Weinstein,H..Damak.S.,andMargolskee.
R.F.Tas1R3,encodinganewcandidatetastereceptor

2296‑2303.2004.
,is13)Shigemura.N.,Yasumatsu,K.,Yoshida,R.,Sako.1¥'.,allelictothesweetresponsivenesslocusSac.i¥at.Genet.

Katsukawa,H.,Nakashima,K..Imoto,T。andNinomiva.Y.

28.:58‑63,2001.

Theroleofthedpalocusinmice.Chem.Senses.30.i84‑i85.

4)Montmayeur,J.P..Liberles.S.D.,Matsunami.H..and
Buck,L.B.Acandidatetastereceptorgenenearasweet
tastelocus.Nat.Neurosci.4:492‑498,2001.

200.

.G.,Beauchamp,

URAKAMIFOUNDATIONMEMOIRSVo1.13(2005)

66

Tastepreferenceinmicelackingsweetandumamitastereceptorcomponent,
TlR3

YuzoNinomiya(SectionofOralNeuroscience,KyushuUniversityGraduateSchoolofDentalSciences)
RecentprogressinmolecularstudiesontasteperceptionprovidedevidencethatTIR3istheimportanttastereceptorcomponentthatcouldformaheterodimerwithTIR20rTIRl
protein.ItscombinationwithTIR2respondstomanysweetcompounds,whilethatwith
TIRIdoestoaminoacidsincludingumamicompounds.ThisindicatesthatTIR3isakey
moleculeforreceptionforbothsweetandumamitastes.Inthepresentstudy,weused
knockoutmicelackingTIR3(TIR3‑KOmice)anditswildtypestrain.B6andTIR3genetic
variantstrain,BALBandexaminedwhatextentTIR3wouldbeinvolvedinbehavioralandneuralresponsestosweetandumamicompoundsinmice.TheresultsindicatedthatB6and
BALBmiceshowedclearexpressionofTIR3mRNAinbothfungiformandcircumvallate
tastebudcellsbutnotinsurroundingepithelialtissues,whereasnosuchexpressionofTIR3
wasobservedinTIR3‑KOmice.InTIR3‑KOmice,neuralresponsestoartificialsweeteners,
suchassaccharinandSC45647werealmostabolishedandtherebybehavioralpreferenceforthesecompoundsdisappeared.Responsestosugarswerediminished,butnotabolishedandbehavioralpreferenceremained.Theresidualneuralresponsestosugarsandbehavioral
similarityanddifferencesintheconditionedaversionparadigmamongsugarsandothersweetcompoundsindicatedexistenceofmultiplesweetreceptorsystemsinmice.Also,
responsestoumamicompounds,suchasMSG,werenotdecreased,suggestingthatTIR3isnotinvolvedforresponsestoMSGbyitself(onlyforsynergisticresponsestothemixtureof
MSGandIMP).Together,thepresentstudyrevealedthatTIR3isinvolvedinsweet
perceptionbutmultiplereceptorsystemforbothsweetandumamitastesexist.