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選択的免疫賦活能を示す乳酸菌の構成成分の同定とその高機能性食品への応用＜平成 23 年度助成＞

選択的免疫賦活能を示す乳酸菌の構成成分の同定とその高機能性食品への応用
吉開泰信（九州大学生体防御医学研究所）

目影響について検討した。

的選択的免疫賦活活性を有する高機能性食品の開方法に有用となるのみならず、細胞性免疫能が低下

乳酸菌 Lactobacillus plantarum の活性成分の構造とそのレセプターの同定したために発症する難治感染症や癌、さらにア

本研究において、L-137 株に特徴的な IL-12 産発は免疫機能の低下した患者や高齢者の健康維持

1, 2）

I.

。元

生誘導因子を探索する目的で、L. plantarum の基来、乳酸菌などの菌体成分に有効な免疫賦活作用準株である JCM1149 株との比較解析を行った。

があることがしられていたが、その有効成分は不予備検討から、両菌株では細胞壁画分のアミノ明な点が多く、また同一菌株のロット間でもその酸含有比が異なることが明らかとなったので、細活性化がことなり、安定したサンプル供給は困胞壁成分に着目した検討を行った。Lactobacillus

レルギー疾患の予防と治療に有用である

3）

難である 。Lactobacillus plantarum L-137 株は強plantarum 菌株の細胞壁分画、細胞膜、細胞質分

力なインターロイキン（IL）-12 産生誘導活性を示

画、培養上清を、TLR を発現する腸管上皮細胞株、す乳酸桿菌であり4 )、これまでに我々は、本菌株

マ ク ロ フ ァ ー ジ 株 と 培 養 し て、 １ 型 IFN、IL-の加熱死菌体の抗アレルギー作用、抗がん作用、12p40, IL-13, IL-10, IFN -γ, IL-4, IL-23, IL-17,4, 5 ）。また、健常者

ケモカイン遺伝子の発現を、RT-PCR 法で、上の Th1 に関連した免疫機能を上昇させ、QOL を清中の蛋白産生レベルを ELISA 法によって測定向上させることも既に報告している 6)。さらにした。TLR とレポータープラズミドを導入した

Lactobacillus plantarum L-137 株の加熱死菌体がイ

COS7 細胞株を用いて菌株の細胞壁分画を抽出しンフルエンザウィルス感染マウスの I 型インターて、ルシフェラーゼ活性を測定することによって、フェロン（IFN）誘導を促進し、感染初期のウィNF-κB の転写活性の程度を調べた 8 , 9 ）。L-137 株

ルス増殖を抑制することを報告した 7 )。

および JCM1149 株の加熱死菌体、破砕細胞壁お感染防御作用を報告してきた本研究では Lactobacillus plantarum 由来のペプ

よびペプチドグリカン画分を調製し、マウス脾

チドグルカン、糖脂質、蛋白質の構成の成分とそ臓細胞と共培養して培養上清に分泌された IL-の Toll 様レセプター（TLR）の関係より、最も強12p40 濃度を測定した。両菌株の加熱死菌体を調い活性を示す有効成分の同定を試みた。さらにヒ製し、市販の抗リポテイコ酸抗体に対する反応性トのインフルエンザウィルス感染予防に対する作をフローサイトメトリーによって評価した。遺伝用を調べる目的で、Lactobacillus plantarum L-137

子複製阻害剤処理によって、L-137 株が有する複株の加熱死菌体の摂取が、インフルエンザワクチ数のプラスミドを一部脱落させた変異株を調製しンを接種した健常者および豚の免疫機能に与えるた。それら変異株の抗リポテイコ酸抗体に対する60

浦上財団研究報告書

Vol.20（2013）

反応性と IL-12 産生誘導活性を評価した 10）。
II.

点 数 が 42 点 以 上 の 健 常 者 78 名（ 男 性 33 名、人と豚への免疫活性の効果

女 性 45 名、 平 均 年 齢 50.6 歳 ）は、 無 作為に（1）16 名 の 被 験 者（ 女 性、 平 均 年 齢 45.4 歳 ）を、2 群に振り分けられ、10 mg の Lactobacillus

1 0 mg の Lactobacillus plantarum L-137 株 をplantarum L-137 株 H を 含 有 す る 錠 剤 あるい

含 有 す る タ ブ レ ッ ト あ る い は Lactobacillus

はプラセボ錠剤を 12 週間摂取した。上気道感plantarum L-137 株不含タブレットを摂取する

染症状は、適合性が検証された自己記入方式

2 群に無作為に割り付け、1 日 1 粒 8 週間摂の調査票（日本語版ウィスコンシン上気道症取させた。インフルエンザワクチン（HA ワク状調査票：WURSS-21）で毎日調査した。免チン「北研」）は摂取 4 週目、6 週目にそれぞ疫機能の指標である単核球コンカナバリン Aれ接種した。被験食品摂取 0 週目、4 週目、6（以下 Con A）刺激芽球化反応、ヘルパー T週目、8 週目に採血を行い、血清のインフル細胞の細胞内 IFN -γ/IL-4 陽性細胞比（以下エンザウィルス抗体価（A 型：H1N1, H3N2,Th1/Th2 比）、血清 IFN -βレベルは、被験食B 型）、IFN -γ濃度、IL-4 濃度ならびに IFN -品摂取前、摂取 4 週後、8 週後および 12 週後β濃度を測定した（Table I）。に測定した。

（2）上 気 道 感 染 症 状 お よ び 免 疫 機 能 に 対 す る（3）供試豚は三元交雑種（LWD・WLD）子豚で、Lactobacillus plantarum L-137 株 摂 取 の 効 果

１ 区 4 頭（ 去 勢 2 頭・雌 2 頭 ）の ４ 反 復 で 実を調べるため、精神的ストレスを強く感じて施した。試験区分は抗菌性飼料添加物を含いる健常者を対象に、二重盲検無作為化比較

まない豚産肉能力検定用飼料（無薬飼料）を試験を実施した。職業性ストレス簡易調査

給与する無薬区と、無薬飼料に Lactobacillus

票の精神的ストレスに関する 18 項目の合計

plantarum L-137 株の加熱死菌体を 0.2 ％添加

Table I

Effect of oral administration of HK L-137 on the Ab response to the trivalent influenza vaccine derived
from A / Brisbane / 59 / 2007 (H1N1), A / Uruguay / 716 / 2007 (H3N2), and B / Brisbane / 60 / 2008 A
H1N10 wk

H3N2B-1

4 wk

6 wk

8 wk

0 wk

4 wk

6 wk

8 wk

0 wk

4 wk

6 wk

8 wk

062.5

62.5

−062.562.5–012.525Seroconversion rate (%)1)

Control–(95% CI)
HK L-137( 0-36.9 )–0(95% CI)( 24.5-91.5 ) ( 24-91.5 )
25

12.5

( 0-36.9 ) ( 24.5-91.5 ) ( 24.5-91.5 )
−075

75

( 0-36.9 )–0( 0.3-52.7 ) ( 3.2-65.1 )
12.5

12.5

( 0-36.9 )( 3.2-65.1 ) ( 0.3-52.7 )( 0-36.9 )( 34.9-96.8 ) ( 34.9-96.8 )( 0-36.9 )( 0.3-52.7 ) ( 0.3-52.7 )( P =1.00 )( P =0.16 )( P =0.06 )( P =1.00 )( P =0.50 )( P =0.50 )( P =1.00 )( P =0.77 )( P =0.50 )

12.5

75

62.5

12.575100

37.5

62.550Seroprotection rate (%)1)

Control( 95% CI )HK L-137( 95% CI )

12.5
62.5

50

HK L-137( 95% CI )

100

87.5

12.5

12.5

50

62.5

25

12.5

37.5

50

( 24.5-91.5 ) ( 15.7-84.3 ) ( 63.1-100 ) ( 47.3-99.7 ) ( 0.3-52.7 ) ( 0.3-52.7 ) ( 15.7-84.3 ) ( 24.5-91.5 ) ( 3.2-65.1 ) ( 0.3-52.7 ) ( 8.5-75.5 ) ( 15.7-84.3 )Geometric mean titier( 95% CI )37.5

( 0.3-52.7 ) ( 0.3-52.7 ) ( 34.9-96.8 ) ( 24.5-91.5 ) ( 0.3-52.7 ) ( 0.3-52.7 ) ( 34.9-96.8 ) ( 63.1-100 ) ( 8.5-75.5 ) ( 8.5-75.5 ) ( 24.5-91.5 ) ( 15.7-84.3 )( P =0.06 )Control

12.5( P =0.14 )( P =0.23 )( P =0.28 )( P =0.77 )( P =0.77 )( P =0.30 )( P =0.10 )( P =0.50 )( P =0.28 )( P =0.31 )( P =0.69 )11.943.662.5

9.2

8.4

47.6

61.7

16.8

14.1

28.323.82)

11.9( 5.0-28.2 ) ( 5.0-28.2 ) ( 17.7-107.3) ( 24.5-91.5 ) ( 4.5-18.9 ) ( 3.6-19.9 ) ( 22.6-100.0 ) ( 36.3-104.9 ) ( 6.7-42.0 ) ( 5.3-37.7 ) ( 10.1-79.0 ) ( 9.5-59.5 )
40.0

36.7

80.0

67.3

9.2

10.0

47.6

61.7

13.0

10.0

18.3

15.4

( 13.7-117.0 ) ( 12.3-109.4 ) ( 40.0-159.9 ) ( 26.9-168.2 ) ( 4.5-18.9 ) ( 4.2-52.7 ) ( 10.2-222.1 ) ( 11.0-345.5 ) ( 5.1-32.7 ) ( 4.2-24.0 ) ( 6.4-52.3 ) ( 5.5-43.0 )( P =0.05 )( P =0.07 )( P =0.35 )( P =0.67 )( P =1.00 )( P =0.65 )( P =0.91 )( P =0.91 )( P =0.62 )( P =0.52 )1) Seroconversion rate ( ≧4-fold increase ) and seroprotection rate ( HI titier≧1:40 ) between 2 groups were assessed by the Fisher’s exact probability test.
2) Geometric mean titer between 2 groups were assessed by Mann-Whitney’s U test.

( P =0.42 )( P =0.51 )61

選択的免疫賦活能を示す乳酸菌の構成成分の同定とその高機能性食品への応用

結した乳酸菌区および無薬飼料に抗菌性飼料添

II. （1）Lactobacillus plantarum L-137 株摂取群で加物（クエン酸モランテル 30 ppm、ノシヘプ

は、試験開始 4 週目から血清 IFN -β濃度の上タイド 5 ppm）を添加した有薬区の３区分と昇が認められ、ワクチン接種後も維持された。

した。試験期間は子豚期用飼料給与期間であ

対照群は試験期間中を通じて血清 IFN -β濃度

る 供 試 豚 の 平 均 体 重 30kg か ら 70kg ま で との上昇は認められなかった。その他の測定項し、試験飼料は自由摂取させた。

目は、両群間で差はなかった（Figure I）。
（2）Lactobacillus plantarum L-137 株摂取 群 の果

上気道感染症の新規発症件数は、対照群に比較 し て 有 意 に 低 か っ た。 ま た、 上 気 道 感 染た加熱死菌体および破砕細胞壁は、顕著に高の新規発症件数、罹患期間、重症度および医い IL-12 産生誘導活性を示した。一方、両菌薬 品 の 服 用 件 数 は、Lactobacillus plantarum

株から調製したペプチドグリカンの IL-12 産

L-137 の摂取期間と負に相関した。さらには、

生誘導活性は極めて低値であり、菌株間に差Lactobacillus plantarum L-137 株摂取群の単核はなかった。このことから、細胞壁に存在す球 Con A 刺激芽球化反応は、対照群に比較しるテイコ酸が活性に寄与している可能性が示て有意に上昇した。

唆された。L-137 株加熱死菌体に対する抗リ（3）試験期間中、臨床的に試験区間に差はな

ポテイコ酸抗体の反応性は JCM1149 株と比かった。血液の一般検査と生化学検査、好中較して極めて高かった。一方で、菌体を SDS球・リンパ球比および IgG 検査では試験区間処理して得られた抽出物をウェスタンブロッに有意差はなかった（Table II, III）。日増体量ト法で調べたところ、リポテイコ酸は両菌株

は Lactobacillus plantarum L-137 株 摂 取 区 が、から同程度に検出された。（抗リポテイコ酸抗無薬区に比べ有意に高かったが有薬区間に有体に対する反応性が低い L-137 変異株は、親意 差 は な か っ た（Table IV）。IFN -βmRNA株と比較して IL-12 産生誘導活性が低かった。

レ ベ ル は 40 日 目 に Lactobacillus plantarum

また、活性が低い変異株は共通したプラスミ

L-137 株摂取区で有意に高かった（Figure II,ドを欠損していた。）

P<0.05）。

221.6

1.61.21.2Log 10 (IU/ml)

Log 10 (IU/ml)

I. JCM1149 株と比較して、L-137 株から調製し0.8

0.8

0.4

0.4

000wk 4wk 6wk 8wk

4 wk

0wk 4wk 6wk 8wk

Figure I6 wk

8 wk

62

浦上財団研究報告書

Vol.20（2013）

Table II Biochemical examination of blood at day 40 and day 98 after the beginning of feeding
D40
TG ( mg/dl )GOT ( U/l )a

ALB ( g/dl )GLU ( mg/dl )BUN ( mg/dl )TCHO ( mg/dl )a

110 ± 10aa

67.2 ± 3.0 a

5.2 ± 0.2a

3.4 ± 0.2

22.8 ± 8.6

Antibiotics

19.3 ± 4.8 a39.7 ± 13.4 a

47.7 ± 16.3 a

5.6 ± 0.3 a

3.9 ± 0.2 b

106 ± 8 a

10.9 ± 0.4 a

67.7 ± 7.7 a

HK L-137aaaaabaa

71.5 ± 6.3 a

BUN ( mg/dl )TCHO ( mg/dl )87.0 ± 7.2 a
84.2 ± 3.5 a

41.7 ± 10.4

46.7 ± 10.7

TP ( g/dl )
a

Basal

20.3 ± 4.8

40.7 ± 8.8

GGT ( g/dl )a44.3 ± 11.0

5.6 ± 0.2

3.6 ± 0.2

107 ± 512.3 ± 1.8
11.0 ± 1.8

D98
TG ( mg/dl )GOT ( U/l )GGT ( g/dl )TP ( g/dl )ALB ( g/dl )GLU ( mg/dl )23.2 ± 3.9

a37.8 ± 9.9a

55.8 ± 15.8a

7.4 ± 0.3

a4.1 ± 0.3a

104 ± 4a11.3 ± 1.3

aAntibiotics

17.5 ± 6.1

a37.3 ± 9.4

a53.0 ± 11.8a

7.1 ± 0.3a4.4 ± 0.3a

103 ± 7

a11.4 ± 1.5

a

HK L-137

21.3 ± 5.2 a

34.7 ± 9.4 a

57.0 ± 14.8 a

7.6 ± 0.7 a

4.4 ± 0.3 a

107 ± 9 a12.3 ± 2.0 a

Basal

89.5 ± 13.5 a

Values are means ± SD. Basal group, n=6. HK L-137 group, n=6. Antibiotics group, n=6.
Values in the same column without a common superscript letter differ significantly ( P<0.05 ) by Tukey Kramer’s multiple comparison tests.
Table III Effect of oral administration of HK L-137 on blood cell counts in pigs
D40
7RBC ( 10 / ml )Basal
Antibiotics
HK L-137634 ± 28a642 ± 22a643 ± 26a5WBC ( 10 / ml )5Lymp ( 10 / ml )179 ± 16b115 ± 16

154 ± 10a106 ± 8a175 ± 13b109 ± 7aa5Neut ( 10 / ml )48.6 ± 9.1b33.9 ± 6.1

a49.9 ± 11.6b5

Mono ( 10 / ml )11.9 ± 2.4a

11.2 ± 2.3b12.6 ± 2.0a

I gG ( mg / dl )N / L ratio
0.44 ± 0.15

a4.76 ± 0.70 a

0.32 ± 0.07

a4.29 ± 0.63 a

0.46 ± 0.11

a4.37 ± 1.07 a

D9875555RBC ( 10 / ml )WBC ( 10 / ml )Lymp ( 10 / ml )Neut ( 10 / ml )Mono ( 10 / ml )N / L ratio

I gG ( mg / dl )Basal

720 ± 55 a

197 ± 24 a

124 ± 17 a53.2 ± 7.8 ab

12.6 ± 3.1 a

0.43 ± 0.06 ab

11.43 ± 2.13 a

Antibiotics

704 ± 23 a

177 ± 22 a

118 ± 16 a

43.8 ± 8.1 a

9.6 ± 1.7 a

0.37 ± 0.04 a

9.23 ± 1.79 a

HK L-137aaabab

12.19 ± 3.05 a

712 ± 40

194 ± 11117 ± 1056.2 ± 4.9

13.1 ± 2.3

0.48 ± 0.07

Values are means ± SD. Basal group, n=6. HK L-137 group, n=6. Antibiotics group, n=6.
Values in the same column without a common superscript letter differ significantly ( P<0.05 ) by Tukey Kramer’s multiple comparison tests.
Table IV Effect of oral administration of HK L-137 on body weight in pigs
intervention periods
D0D40D98(kg)BasalAntibiotics
HK L-137

10.7 ± 0.7 a

31.4 ± 2.3 a

72.3 ± 3.6 a

10.7 ± 0.7

a35.0 ± 2.8

b81.5 ± 5.0 b

10.7 ± 0.5

a33.0 ± 1.8

ab78.5 ± 4.5 b

Values are means ± SD. Basal group, n=6. HK L-137 group, n=6. Antibiotics group, n=6.
Values in the same column without a common superscript letter differ significantly ( P<0.05 ) by Tukey Kramer’s multiple comparison tests.

結論
細胞壁表面に存在しているテイコ酸、特に、リポテイコ酸が、L-137 株の強力な IL-12 産生誘導活性に寄与しており、特定のプラスミドがリポテイコ酸の発現強度に関与している可能性が示された。

Lactobacillus plantarum L-137 株 摂 取 群 は 健 常者の血清 IFN -β濃度を上昇させたことから、ウィFigure II選択的免疫賦活能を示す乳酸菌の構成成分の同定とその高機能性食品への応用

ルス感染、特に感染初期のウィルスの増殖抑制に有用であることが示唆された 11）。HK L-137 の日常摂取は、免疫機能の増強を介し、健常者の上気道感染の発症や重症度を低下させることが示唆された。
謝

辞
本研究を実施するにあたり、研究助成を賜りました（公財）浦上食品・食文化振興財団ならびに関係各位の皆様に心より感謝申し上げます。
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64浦上財団研究報告書

Vol.20（2013）

Heat-killed Lactobacillus plantarum L-137 enhances type Iinterferon production in healthy humans and pigs
Yasunobu Yoshikai
Division of Host Defense, Medical Institute of Bioregulation
Kyushu UniversityAbstract
We have previously reported that oral administration of heat-killed Lactobacillus
plantarum L-137 (HK L-137) stimulates innate immunity for production of type I interferon(IFN) which subsequently augments host defense against influenza A virus infection inmice. We here examined the effect of HK L-137 intake on type I IFN in humans. Sixteen
subjects were randomly assigned to receive a tablet containing 10 mg of HK L-137 or amatching tablet for 8 weeks (wk) and the serum levels of type I IFN were examined before
and after the first or second dose of the trivalent inactivated influenza vaccine. There were
no differences in the seroresponse rate, the seroprotection rate and the geometric mean
Ab titers after either the first or second dose of vaccine between the HK L-137 group andthe control group. On the other hand, the levels of IFN-β were significantly higher in theHK L-137 group than in the control group before vaccination although the vaccination
conferred little additional induction of IFN-β. We further examined IFN-β gene expression
in the wholeperipheral blood mononuclear cells (PBMC) of pigs fed on a diet containing
HK L-137 or control and found that the IFN-β mRNA levels were significantly higher inthe HK L-137 group than in the control group. The finding that daily intake of HK L-137
enhances type I IFN production and host defense against influenza A virus infection inmice may be applied to at least two differentadditional species.