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浦上財団研究報告書

Vol.17（2009）＜平成17年度＞

食中毒原因微生物に特異的なビタミン生合成経路の解明と阻害剤探索による食中毒予防
大利徹（富山県立大学工学部准教授）

研究の目的と結果して生合成されるか不明であったため，変異剤によるメナキノン生合成欠損株の誘導と相メナキノン（ビタミン K）は，微生物にとって補遺伝子の取得も行った。その結果，多くの電子伝達系成分として生育に必須である。筆者は，変異株はバイオインフォマティクスにより絞胃がんの原因菌として知られている Helicobacter

り込んだ 4 つの遺伝子で相補されたが，相補属， 食 中 毒 の 原 因 微 生 物 と し て 知 ら れ て い るされなかった変異株を用いてショットガンク

Campylobacter 属，Wolinella 属などの病原微生物ローニングを行った結果，幾つかの変異株は，や，放線菌 Streptomyces 属などの微生物では，メシキミ酸経路の遺伝子群である chorismate

ナキノンを生合成するにもかかわらず，既知の生synthase （SCO1496），shikimate kinase

合成経路として知られているコリスミ酸からメナ（SCO1495），3-dehydroquinate synthase

キノンに至る５ステップ（図 2 参照）の生合成遺（SCO1494）を含むプラスミドで相補された。

伝子群が全く存在しないことに気づき，以下の手そ こ で， こ の 変 異 株 を shikimate ま た は法でその全容解明を試みた。

chorismate を含む培地に添加し，生育が回最初に，既知メナキノン生合成経路を持つ復するか検討した結果，chorismate を添加大腸菌や枯草菌などが持たず，新規経路を有し た 時 の み 生 育 が 回 復 し た。chorismate

す る と 考 え ら れ る Helicobacter 属，synthase がCampylobacter 属，Streptomyces 属 放 線 菌 が（5-enolpyruvylshikimic acid-3-phosphate →共 通 に 持 つ 遺 伝 子 を， 個 々 の 菌 株 が 持 つchorismate）は不可逆反応であること，またORF の総当り BLAST 解析により探索し，前述したトレーサー実験の結果も考えあわせ得られた候補遺伝子を病原性のないると，新規経路は既知経路同様 chorismate

Streptomyces 属放線菌を用いて組換え手法にを出発基質とするが，その後全く別経路を経より破壊した。その結果，いずれも機能未知ると考えられた。

①と さ れ て い た S. coelicolor の SCO4506，

③

触媒する

反応

さらに，新規経路の化合物レベルでの解明

SCO4326，SCO4327，SCO4550 の 4 つ の 遺を目的とし，生合成中間体を同定するための伝子を新規経路に関与する候補遺伝子としてアッセイ系の構築も行なった。上述の新規経選抜した。

路遺伝子破壊株（図 1，破壊株 A）は，培地②バイオインフォマティクスではこれ以上候にメナキノンを添加しないと生育できない。

補遺伝子の絞り込みができなかったこと，ましかし，右図に示したように生合成上，下流た新規経路が一次代謝の何の化合物から分岐に位置する破壊株（図 1，破壊株 B）と混合

食中毒原因微生物に特異的なビタミン生合成経路の解明と阻害剤探索による食中毒予防

127の結果，SCO4506 破壊株から調製した抽出物を添加した際，他の 3 株の生育は認められなかったが（このことは，SCO4506 が生合成上，最上流の反応に関与することを示唆する），残りの 3 つの破壊株から調製した抽出図１物を加えた際，少なくとも他の 1 つの破壊株

バイオアッセイの原理の生育が認められた。従って，これら破壊株
培養すると，破壊株 B から中間体 B が供給

培養液中には予想通り生合成中間体が蓄積しされ，破壊株 A は生育可能になると考えらていることが分かり，さらに 4 つの遺伝子がれる。そこで実際に上述の破壊株を 2 つ組み関与する生合成上の相対位置も SCO4506 →合わせてメナキノン非存在下で混合培養を行

SCO4327 → SCO4550 → SCO4326 と決定すった結果，予想通り幾つかの菌株の組み合わることができた。

せで生育が認められた。
④⑤

次に本手法を用い生合成中間体の同定，精そこで次に個々の破壊株をメナキノン存在製，構造決定を行った。最初に SCO4327 破下で培養した後，添加したメナキノンを酢酸壊株が蓄積する中間体を SCO4506 破壊株のエチルで繰り返し抽出・除去し，残った水溶生育回復を指標に精製した。SCO4327 破壊性画分を凍結乾燥後，培地に添加し，他の３株をメナキノン存在下で大量培養後，溶媒につの破壊株の生育が回復するか検討した。そよる添加メナキノンの除去，各種クロマトグ

図2

メナキノンの既知，および新規経路

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浦上財団研究報告書

Vol.17（2009）

ラフィーによる分画，SCO4506 破壊株を用合成上 SCO4550 の次の反応を触媒すると考いたバイオアッセイを繰り返すことにより蓄えられる SCO4326 の破壊株が蓄積する中間積中間体を均一に精製することができた。

体（ 本 化 合 物 は DHFL か ら SCO4550/

NMR や MS による解析の結果，本化合物は，TTHA1092 により生成する化合物と同一と以前，放線菌から単離報告のある futalosine考えられる）の精製を行った。SCO4506 破と判明した（図 2）。

壊株の生育回復を指標に精製を試みたが，本SCO4327 破 壊 株 が futalosine を 蓄 積 し た

中間体の蓄積量は極めて少なく，また後で分こ と か ら，SCO4327 産 物 は futalosine を 次

か っ た こ と で あ る が， 中 間 体 が 不 安 定 での中間体に変換すると考えられた。そこで

aldol 縮合により容易に他の化合物に変換さ

SCO4327 産物を His-tag タンパク質として発れることから，大量精製に一年以上費やした

現・精製後，酵素アッセイを行ったが予想にが最終的に極微量ではあるがほぼ純品を得る

反し反応産物は検出できなかった。その理由ことができ構造を明らかにすることができた。

は不明であるが，おそらく組換え酵素が不安

その結果，本化合物は DHFL が環化した構定であるためと考え，高度好熱細菌である造 を 持 つ cyclic de-hypoxanthine futalosine

Thermus thermophilus HB8 株の組換え酵素を（cyclic DHFL）であることが分かった（図 2）。

用いてアッセイを試みた。SCO4327 のオー⑧⑥

次に，メナキノン生合成上 cyclic DHFL

ソ ロ グ と 考 え ら れ る TTHA0556 の His-tagの次の中間体の同定を行った。SCO4326 破組換えタンパク質を futalosine と反応させた壊株が cyclic DHFL を蓄積したことから，結果，2 つの反応産物が生成した。SCO4327

SCO4326 の T. thermophilus HB8 株のオーソ

産物 /TTHA0556 産物はヌクレオシダーゼログである TTHA1568 を組換え酵素としてと極弱い相同性を有していたことから発現・精製後，cyclic DHFL と反応させた結（e-value, 10 − 5）
，これらの酵素は futalosine

果，特異的反応産物が検出できた。LC-MSの塩基部分である hypoxanthine の脱離反応に よ る 解 析 の 結 果， 本 産 物 は 1，を触媒すると考えられた。実際，反応産物の4-dihydroxy-6-naphthoate であることが分か

1 つは hypoxanthine であることを LC-MS でった

確 認 し， も う 一 方 の 反 応 産 物 も 精 製 後，以上述べてきたように，バイオインフォマティ

NMR や MS に よ る 解 析 の 結 果，de-クスと生化学実験を上手く組み合わせることによhypoxanthine（dehypoxanthinyl）futalosine

り，これまで機能未知遺伝子として扱われていた（DHFL）であることを確認した（図 2）。

４つの遺伝子が，メナキノンの新規生合成経路に⑦生合成上 SCO4327 の次の反応は SCO4550関与することを証明し，また生合成中間体の構造に よ り 触 媒 さ れ る と 推 定 さ れ た。 そ こ でも明らかにし，新規経路の概要を明らかにするこSCO4550 および T. thermophilus HB8 株のオとができた。本新規経路は上記病原菌に特異的なーソログである TTHA1092 の組換え酵素を経路であり，乳酸菌など有用な腸内細菌群は既知調製し DHFL との反応を行ったが生成物は経路のみを有している。本研究成果が掲載された

認められなかった。その原因は未だ不明であScience 誌，Perspectives（pp1644-1645）で D. J.

るが，DHFL の次の中間体を得るため，生Payne（GlaxoSmithKline）も言及しているが，

食中毒原因微生物に特異的なビタミン生合成経路の解明と阻害剤探索による食中毒予防

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H. pylori のように迅速な診断方法が確立されて行するに当たりご支援いただいた（財）浦上食いる病原菌であれば，この新規経路の阻害剤を探品・食文化振興財団にこの場を借りて深謝申し上索することにより副作用が無い有用な抗生物質のげます。

開発が期待できると考えられる。近年，新しい作用機作を持つ薬の開発が難しくなりつつあること，

文

また非特異的な抗生物質の使用は多剤耐性菌の出１） Seto, H., Jinnnai, Y., Hiratsuka, T., Fukawa, M.,

現にもつながることから，今回見出した経路のよFurihata, K., Itoh, N., and Dairi, T.：Studies on A New

うに，特定の菌株のみが持つ特定の代謝経路をタ

献

Biosynthetic Pathway for Menaquinone, J. Am. Chem.
Soc., 130, 5614-5615（2008）

ーゲットとした抗生物質の開発は今後の薬剤開発

２） Hiratsuka, T., Furihata, K., Ishikawa, J., Yamashita, H.,のための 1 つの方向性を示していると考えられる。

Itoh, N., Seto, H., and Dairi, T.：An alternative

本研究は，平塚知成 博士（現在 Cornel 大学博士研究員，生化学実験担当），東京農業大学 瀬戸

menaquinone biosynthetic pathway operating in
microorganisms, Science, 321, 1670-1673（2008）
３） Hiratsuka, T., Itoh, N., Seto, H., and Dairi, T.：

治男 教授（トレーサー実験），国立感染症研究所

Enzymatic properties of futalosine hydrolase, an enzyme

石川 淳 博士（バイオインフォマティクス），東essential for a newly identiﬁed menaquinone biosynthetic

京大学 降旗一夫 博士（中間体の構造決定）との共同研究で得られた成果である。また本研究を遂

pathway, Biosci. Biotech. Biochem. in press（2009）.

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URAKAMI FOUNDATION MEMOIRS

Vol.17（2009）

An Alternative Menaquinone Biosynthetic Pathway Operating in Actinomycetes

Tohru Dairi（Biotechnology Research Center, Toyama Prefectural University）

In prokaryotes, ubiquinone and menaquinone（MK）are obligatory component of theelectron-transfer pathway. Escherichia coli, which is a facultative anaerobe, utilizes ubiquinone
under aerobic conditions, but uses MK 8 when it is grown anaerobically. By contrast, many
Gram-positive aerobes such as Streptomyces strains contain only MKs. MK biosynthesis istherefore essential for the survival of these strains. In E. coli, MK is biosynthesized fromchorismate by seven enzymes（MenA‒MenG, see below）. However, a bioinformatic analysisof whole genome sequences has suggested that some microorganisms such as Streptomyces
coelicolor, Streptomyces avermitilis, Helicobacter pylori and Campylobacter jejuni do not haveorthologs of the men gene, even though they synthesize MK. Here, we investigated thisnovel pathway in a nonpathogenic Streptomyces strain. On the basis of bioinformatic
screenings, gene knockouts, shotgun cloning with isolated mutants and in vitro studies withrecombinant enzymes, we deduced the outline of the pathway, which is branched atchorismate in a manner similar to the known pathway, but then follows a different route［1,2］. As humans and some useful intestinal bacteria, such as lactobacilli, lack this novel
pathway, it represents an attractive target for the development of chemotherapeutics.
References：［１］ Seto, H. et al.：Studies on a New Biosynthetic Pathway for Menaquinone, J. Am.
Chem. Soc., 130, 5614-5615（2008）［２］ Hiratsuka, T. et al.：An alternative menaquinone biosynthetic pathway operating in
microorganisms, Science, 321, 1670-1673（2008）