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浦上財団研究報告書

Vol.28（2021）＜平成 30 年度助成＞

新規霊長類オルガノイドを用いた消化管センサー細胞の解析
岩槻健 1) ・ 今 井啓 雄 2)（ 1) 東京農業大学 応用生命科学部 食品安全健康学科、 2) 京都大学 霊長類研究所 ゲノム細胞研究部門）

研究目的

研究手法

消化管は栄養の吸収にとどまらず、食品成分や環本研究では、１）オルガノイド培養法にてこれま境因子の認知、生体防御、バリア機能、ホルモンので存在しなかったサル消化管細胞培養系を構築し、コントロールなど様々な機能を有している。消化管

２）サル消化管に存在するセンサー細胞の分化誘導を健康に保つ事は生命活動に不可欠であるが、現代を試みた。また、３）霊長類の甘味受容体 T1R2 に人の消化管は外界からの異物に常に曝されているほ対するペプチド抗体の作製を行い、甘味受容体を発か、精神的ストレスや過剰栄養摂取による代謝異常現している栄養センサー細胞を同定可能なツール作などで、慢性的な炎症状態にある。さらに近年、消りを目指した。

化管には機能性胃腸症、クローン病、潰瘍性大腸炎

まず、京大・霊長類研究所においてサルの消化管など原因不明な疾患が増加傾向にある。こうした消（小腸）を採取し、直ちに東京農業大学へ移送し、化管の不具合の解消には、消化管の幹細胞やそこかオルガノイド培養を開始した。具体的には、クリプら分化した上皮細胞が炎症・食品成分・ストレスなトを組織から取り出し、マトリゲルに包埋した後、どによりどのような影響を受けるかという基礎的理

EGF、Wnt3a、R-Spondin、Noggin、Nicotinamide、解が必要である。しかしながら、消化管機能を in

SB202190 等含む DMEM/F12 培地を重層し培養をvitro にて解析する実験系は限られており、研究のボ開 始 し た。 な お、Wnt3、R-Spondin、Noggin に つトルネックとなっている。最近になり、消化管幹細いては、株化細胞にそれぞれのタンパクを発現させ、胞が特定され、続いて消化管幹細胞の三次元培養系

その培養上清（Conditioned medium）を用いた。

（オルガノイド培養系）が開発されたことで、これ次に、作製された消化管オルガノイド培養系におまで困難であった in vitro での消化管細胞実験が可

いて、消化管本来の性質を有する分化細胞が出現す能となり、各種因子が消化管の細胞に与える影響をる か を 調 べ る た め に、Wnt3a、Nicotinamide、簡単に観察できるようになった。

SB202190 を除き 3 日間培養し、分化したセンサー

本研究では、ヒトへの応用研究を見据え研究対象細胞が誘導されるかを免疫染色にて確認した。

を霊長類に置き、１）オルガノイド培養法を用いて上記と並行して、これまでにないツール作りを試

サルの消化管培養系を構築し、２）in vitro においてみた。特に、霊長類の消化管内分泌細胞に発現する消化管上皮に存在するセンサー細胞である味細胞様と考えられている、甘味受容体である T1R2 を検出細胞へ分化が可能かを確認することを目的とした。

するための抗体作製を行った。抗原ペプチドとして将来、本研究結果で得られた霊長類の消化管細胞を、ヒトおよびサル T1R2 の共通配列を選定し、2 種類食品食品の安全性や有用性を解析するプラットの合成ペプチドを作製した。その後、キャリアタンフォーム細胞として活用し、栄養科学、食品科学、パクである KLH と結合させ、ウサギに合計 6 週に病理学、生理学等への貢献を目指す。

わたり免疫、採血後の血清を一部アフィニティー精新規霊長類オルガノイドを用いた消化管センサー細胞の解析

17製したものを抗 T1R2 抗体とした。抗体が免疫組織

サル小腸オルガノイドにおける消化管センサー

化学染色に利用できるかは、HEK293 細胞にヒト細胞の誘導T1R2 発現ベクターをトランスフェクションし、蛍光免疫染色を行うことで判断した。

本培養系では、Wnt3a が常に培養液に添加されているため、オルガノイドは増殖性の細胞が多くなり、球形を保ち成熟分化した細胞はほとんど観察されな結い（data not shown）。そこで、作製したサル小腸オル

果ガノイドを分化誘導するため、Wnt3a、Nicotinamide、サル小腸からのオルガノイド作製

SB202190 を抜いて 72 時間培養し、免疫染色を行っクリプトを単離しマトリゲルに包埋し培地を添加た結果、Tuft 細胞やセロトニン産生細胞が存在するした 6 時間後に観察すると、クリプトの千切れた端事が確認された（図 2）。この事から、サル腸管オルが融合し膨れる様子が見られた（図 1、6 hr）。翌日

ガノイドを Tuft 細胞や内分泌細胞へ分化誘導できるにはクリプトが球状になり、オルガノイドが形成さことが判明した。

れていることが確認された（図 1、Day 1）。2 日目、3 日目にはオルガノイドが成長し、直径 300µm 以

霊長類抗 T1R2 抗体の作製とその評価上になるものも確認され（図 1、Day 2 および 3）、作製した霊長類甘味受容体 T1R2 が、免疫染色にその後の継代や凍結も可能であった。現在までにサ利用できるかを調べるため、HEK293 細胞にヒト

ル消化管オルガノイドは、一年以上継代可能である

T1R2 を強制発現させ、今回作製した抗体が認識すことが確認されている。

るかを蛍光免疫染色にて確認を行なった。その結果、

図 1 サル小腸オルガノイドの経日的形態変化
クリプト単離後 6 時間から 3 日までの経日的変化。1 日後には多くの球状のオルガノイド形成が観察され、2 日目、3 日目になるに徐々に大きく成長する。Bar : 200 µm

図 2 サル小腸オルガノイドにおけるセンサー細胞の可視化分化誘導培地に切り替え 72 時間後の免疫染色像。左から抗 DCLK1 抗体、抗 5HT（セロトニン）抗体にてそれぞれ検出した。右端は DAPI 染色とそれぞれの抗体染色像を重ね合わせたもの。Bar : 100 µm

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Vol.28（2021）

図 3 作製した甘味受容体に対するヒト T1R2 発現細胞の反応
HEK293 細胞にヒト T1R2 を強制発現させ、作製したヒト T1R2（hT1R2）抗体を反応させ、488 Alexa anti-Rabbit IgG を用いて検出した（左）。免疫前の血清（中）、トランスフェクションなし（右）。

受容体を発現させた細胞においてのみ特異的な染色体である、霊長類の甘味受容体の作製に成功した。

が観察された（図 3）。一方、免疫前血清を使った場

今後の更なる確認は必要であるが、甘味受容体が生合およびヒト T1R2 を発現させなかった細胞群では体内のどこで発現するかなどの解析に利用すること染色が観察されず、作製した抗体はヒト T1R2 を特ができる。げっ歯類を用いた先行研究では、味覚受異的に認識することが示された。

容体は体の多くの器官で発現すると報告されている。特に甘味受容体は消化管内分泌細胞、膵臓や精考察

霊長類ではヒトの消化管オルガノイドが既に存在するが、ヒトのサンプルの入手が困難なことなどか巣での機能に注目が集まっている。本研究で作製した抗体を使い、霊長類組織やオルガノイドにおける甘味受容体の発現と機能についても調べていきたい。

ら、ヒトの代替となる動物の存在は重要である。こ今回、霊長類の消化管研究に必要なツールである

れまで食品機能および栄養学の研究には、げっ歯類消化管オルガノイドと抗体を揃えたことで、様々なが用いられてきた。しかし、味覚センサーをはじめ消化管研究に利用されることが期待できる。例えば、とするセンサー機能を解析する上で、げっ歯類と霊オルガノイドを用いることで、消化管上皮細胞によ長類では隔たりがある。甘味、うま味、苦味に対する食品因子の吸収や毒性解析が可能となっている。

る応答の違いは、行動学実験や細胞生物学実験で明また、本研究により、内分泌細胞や Tuft 細胞などのらかとなっている。これらの違いの多くは、受容体センサー細胞への分化誘導が可能であると分かったの数や構造の違いに起因していることが分かっていことから、将来は内分泌学や免疫学の分野で霊長類る。また、ヒトや霊長類が有する消化管ホルモンで消化管オルガノイドの利用が進むと考えられる。具あるモチリンは、げっ歯類には存在しない。このよ体的には様々な食品因子による種々のホルモン分泌

うなことから、ヒトの細胞機能の多くを有するサルについての解析、あるいは寄生虫や常在細菌と消化を研究材料にする意義はある。

管上皮細胞との関係についての解析に活用されるで我々は本研究において、ヒトの消化管モデルになあろう。オルガノイドを扱う技術は日々洗練化される可能性を秘めたサル消化管オルガノイドを構築ており、最近ではオルガノイドを単層培養化するこし、内分泌細胞や Tuft 細胞など味覚受容メカニズムとが可能になっており、従来困難であった細胞の頂を有するセンサー細胞を分化誘導できることを明ら端側からの外来因子の暴露による影響などについてかにした。さらに、センサー研究に必要不可欠な抗も解析が進められている。

新規霊長類オルガノイドを用いた消化管センサー細胞の解析

このように、霊長類消化管オルガノイドはセン

謝

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辞

サー細胞研究のためのツールを与えてくれただけで本研究は、公益財団法人 浦上食品・食文化振興財なく、栄養科学、食品科学、病理学、生理学等の分団による研究助成により遂行された。ここに深く感野へ新たな知見を加える様々な研究に利用されるこ謝いたします。とが期待されている。

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Vol.28（2021）

Analysis of intestinal chemosensory cells using nonhumanprimate organoids

Ken IWATSUKI1), and Hiroo IMAI2)
1)
Department of Nutritional Science and Food Safety, Faculty of Applied Biosciences,
Tokyo University of Agriculture2)
Department of Cellular and Molecular Biology, Primate Research Institute, Kyoto University
Abstract
Several types of chemosensory cells exist in gastrointestinal tracts to sense
nutrition and contaminants such as bacteria or parasites. Although rodent
tissues are used extensively as a human gut model, recent studies show thatthe chemical sensing system in ro dents differs from that in humans. For
instance, rodents do not produce hormones such as motilin, while human andother primates do. In addition, the specificity and selectivity of taste receptors
are known to differ slightly between rodents and primates. This suggests that
performing experiments using rodents may not always represent the optimalchoice. Nonhuman primates in biomedical research are valuable animalmodels for advancing our understanding of biological responses in humans,as the availability of human tissues is limited. It has been reported that a 3D
organoid culture produces functional gastrointestinal epithelial cells in vitro ,and can be generated from both animal and human tissues. Herein, we report
the generation of intestinal chemosensory cells from nonhuman primates,
macaques, using an organoid culture system. We were able to maintain monkey
intestinal organoids in proliferation medium for more than one year. Uponswitching to differentiation medium, we observed a drastic change in organoid
morphology and chemosensory cell marker protein expression. In order todetect chemosensory cells within the organoids, we have generated antibodies
that are capable of detecting the primate sweetness receptor.
In summary, we have generated intest inal org anoids from a nonhumanprimate. The organoids that were generated in this study are suitable forstudying the functions of primate chemosensory cells in vitro .