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浦上財団研究報告書

Vol.15（2007）〈平成17年度〉

酸化LDL受容体の発現制御に着目した動脈硬化の新しい予防法の確立と沖縄産食材に含まれる活性成分の発掘
村上明（京都大学農学研究科食品生物科学専攻）

1.

酸 化LDLは、 内 皮 細 胞 の 接 着 分 子 で あ る

研究背景と本研究の目的

ICAM-1（intercellular adhesion molecule-1）、2004年の日本の死亡数を死因順位別にみると、

VCAM-1（vascular cell adhesion molecule-1）、セ第1位はがん（32万315人、31.1％）、第2位は心疾レクチン（selectin）などの発現を促し、これら患（15万9490人、15.5％）、第3位は脳血管疾患（12に血液中の単球が結合する４）。さらに、酸化LDL万9009人、12.5％）となっている１）。1981年以降、は 内 皮 細 胞 か ら の 単 球 走 化 性 因 子（monocyte

がんは死因の第１位であり、一貫して増加し続けchemoattractant protein-1, MCP-1）およびマクロていることから広く注目されているが、ともに動ファージコロニー刺激因子（macrophage-colony

脈硬化が原因である心疾患と脳血管疾患による死

stimulating factor, M-CSF）の発現を誘導し、内亡数を合計すると、がんのそれに匹敵することは膜への単球の侵入および分化が促進される５）。

特筆に値する。

このマクロファージへの分化過程で発現して動脈硬化は、高脂血症、高血圧、喫煙、肥満、くるマーカーの一群が、スカベンジャー受容体年齢など種々の要因が複雑に絡み合って発症・進（scavenger receptor, SR） で あ る ６）。SRは 酸 化展するものであり、動脈が肥厚、あるいは硬化しLDLを認識して、エンドサイトーシスにより細て弾性を失った状態をいう。これにより、動脈内胞内へ取り込み、結果としてコレステロールエス腔が狭窄し、虚血を起こすと脳梗塞、心筋梗塞、テルを蓄積した泡沫細胞（foam cell）となる。泡

大動脈瘤などの疾病を引き起こす。

沫細胞が増加・集積することで脂肪線条（fatty

いくつもの大規模な疫学研究の結果から、血中の低比重リポタンパク（low-density lipoprotein,streak）と呼ばれる脂質の沈着を伴った初期病変が形成される。

LDL）コレステロール濃度が粥状動脈硬化を基盤

泡沫細胞の増加とともに、酸化LDLおよび泡とする疾患の主要な危険因子であることが知られ沫細胞が産生するサイトカインによって中膜平ている。しかし、最近の研究で、抗酸化物質が動滑筋細胞の遊走も起こる。それに引き続き、壊脈硬化の進展を抑制すること２） や、動脈硬化病

死した泡沫細胞から放出された脂質を中心部分

変部位には変性したLDLが沈着していることが（core）として、血管平滑筋細胞やマトリックス確認されていることから、LDLそのものが動脈硬タンパク質からなる繊維性被膜が覆ったプラー化発症の原因ではなく、修飾を受けたLDLが重要ク（atheroma plaque）が形成される。プラークであることが明らかとなってきた。そして現在でが、マトリックスメタロプロテイナーゼ（matrixは、Steinbergらが提起した、LDLの酸化を引きmetalloproteinase, MMP）により脆弱化・破綻を３）金とする発症機序が広く受け入れられている 。

きたすと、血栓形成を介した血管の閉塞を引き起酸化LDL受容体の発現制御に着目した動脈硬化の新しい予防法の確立と沖縄産食材に含まれる活性成分の発掘

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こすことになる７）。
2000年に発表された都道府県別生命表によると、沖縄県の平均寿命は男性77.6歳（26位）、女性86.0歳（1位）であった ８）。有数の長寿国である日本の中でも特に沖縄は長寿県として知られ、その理由は心疾患の死亡率の低さにあると言われている。沖縄県の死因別死亡率は、心疾患が男性42位、女性47位、脳血管疾患が男女ともに47位で図１ 本試験系の概要あり、動脈硬化による死亡率が非常に低い。
沖縄県は単に野菜の摂取量が多いだけでなく、本土にはない独特の野菜を伝統的に摂取していることが大きな特徴である。最近の健康ブームで、秋ウコンやシークワサーなどが本土にも浸透してきているが、亜熱帯地域に属する沖縄県には本土には見られない植物食材がまだ数多く存在しており、それらの生理機能性が報告されている。

図２

本土産野菜の試験結果

本研究室において、沖縄産植物食材138種の抽出物についてフリーラジカル産生抑制活性試験を培 養 後 のLOX-1 mRNA発 現 レ ベ ル をRT-PCR法行い、本土でも食される通常種と沖縄独特の種とにより解析した。まず、本土の野菜では、キャベの活性を比較したところ、70％以上のO２−およびツとキュウリに強い抑制活性が見られた（図２）。

NO産生抑制率を示した食材の割合は沖縄独特のキャベツには、発がん予防効果などが知られてい種の方が高いことが判明した９）。したがって、沖るイソチオシアネート（isothiocyanate, ITC）が縄独特の食素材は生理活性が高く、動脈硬化予防多く含まれていることから、ITCによる効果が想に有望な活性成分の探索源として期待できると考定できる。しかし、同じくアブラナ科のダイコえられる。

ンやハクサイには抑制活性がなかったことから、以上から、本研究では動脈効果発症予防の新しITCと同様にキャベツの生理活性成分として知らい方策として、沖縄独特の食材に着目し、ＳＲ発れているビタミンC、ビタミンK（vitamin K）、お現抑制成分を検索することを目的とした。

よびビタミンU（vitamin U）による作用かもし2.

本土と沖縄の野菜の活性比較れない。
沖縄産野菜の添加試験では、ヨモギ、ハナショ

沖縄産野菜16種と、消費量の多い本土の野菜

ウガ春ウコン、秋ウコンおよびアキノワスレグサ

９ 種 の ホ モ ジ ネ ー ト を 調 製 し、 小 腸 吸 収 モ デに非常に強い抑制活性が見られた（図３）。しかル で あ るCaco-2細 胞 単 層 のapical側 培 地 に25 ％しながら、秋ウコンはCaco-2に対する毒性が見ら（v/v）添加し、24時間培養した（図１）。培養後のれ、それとは対照的に、ハナショウガはCaco-2のbasolateral側培地100％中でTHP-1細胞を30分前生存率が２倍以上に上昇した。Caco-2の生存率は培養した後、TPA（30 nM）で刺激し、24時間MTT assayにより評価しているため、ハナショ

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浦上財団研究報告書
表１Vol.15（2007）

スクリーニングに用いた沖縄産野菜

一般名

科

学名

ヨモギ
ハナショウガ
春ウコン
秋ウコン
アキノワスレグサ
チョウメイソウ
シマラッキョウ
モズク
アーサ
シークワサー
スイゼンジナ
ニガウリ
ヘチマ
ニガナ
ベニイモ
サトウキビ

キク
ショウガ
ショウガ
ショウガ
アカザ
セリ
ユリ
モズク
ヒトエグサ
ミカン
キク
ウリ
ウリ
キク
ヒルガオ
イネ

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図３

沖縄産野菜ホモジネート添加Caco-2 basolateral側培地のLOX-1 mRNA発現抑制活性ウガに関しては、細菌の混入によってCaco-2が産とが示唆される。

生したO2−などによってホルマザンへの還元反応

一方、ベニイモとサトウキビにはLOX-1 mRNAが起こり、吸光度が上昇したと推察された。従っ発現増強作用が見られた。この理由としては、試て、本試料の細胞毒性をより正確に測定するため料中に含まれるグルコースの存在が挙げられる。には、乳酸脱水素酵素（LDH）活性の測定法のこれまでに、グルコースによってLOX-1とSR-A方が適しているかもしれない。の発現が増強することが報告されているが、その上述した５種以外にも、チョウメイソウとシマメカニズムとして、プロテインキナーゼC（protein

ラッキョウにも50％以上の抑制が見られた。本土

kinase C, PKC） 依 存 性 のnicotinamide adenineの野菜では、50％以上の抑制活性が見られたのはdinucleotide（NADPH）oxidaseの活性化による活９種のうち２種のみだったが、沖縄産野菜は16種

性酸素種（reactive oxygen species, ROS）の産のうち７種だった。このことからも、沖縄産野菜

生と、それに引き続くactivator protein-1（AP-1）が動脈硬化予防成分の探索源として有望であることNFkBの活性化作用が提唱されている10，11）。ベ

酸化LDL受容体の発現制御に着目した動脈硬化の新しい予防法の確立と沖縄産食材に含まれる活性成分の発掘

図５

図４29

Zerumboneの構造５％（v/v）添加における再評価（n＝2）

ニイモとサトウキビはグルコース含量が多いこと、そしてPBSを使用したホモジネートをアッセイに用いているので、basolateral側培地中にグルコースが高濃度で含まれている可能性も高いことから、上記した可能性は妥当であると考えられる。
図６ ZERのLOX-1 mRNA発現抑制活性

次に、添加濃度25％による試験で高活性を示した５種について、添加濃度を５％に下げて再評価ン（zerumbone, ZER）のピークと一致した。ZERを行なった（図４）。その結果、ヨモギとアキノ

はこれまでに当研究室において、発がん予防効果13）

ワスレグサは５％では抑制活性が見られなかったやO2−産生抑制活性14） などが報告されているセスが、ハナショウガ、春ウコンおよび秋ウコンは５％キテルペンである。

でも強い活性が見られた。

次 にTHP-1細 胞 にZERを １ 〜20μMの 濃 度 でこれまで、秋ウコンは抗動脈硬化作用を持つこ添加し、30分間前培養後、TPAで刺激した。そとがこれまでに見出されており、高脂肪食を投して、24時間培養後のLOX-1 mRNAの発現レベ与したウサギに秋ウコンの水アルコール抽出物をルを評価したところ、ZERは濃度依存的にLOX-11.6 mg/kgの用量で投与し、30日間飼育したとこ

mRNAの発現を抑制し、IC50値は4.7μMであった

ろ、血中の脂質過酸化レベルと、胸部および腹部（図６）。

大動脈の脂肪線条が減少したことなどが報告されている12）。しかし、ハナショウガについては、動4.

SRと接着分子の発現に対するZERの効果

脈硬化に対する研究例はないことから、ハナショ

上で述べたように、動脈硬化の発症および進展ウガに着目し、活性成分の究明、およびSRの発にはLOX-1以外のSRも深く関与している。また、現に対する効果を検討した。

単球が血管壁に接近する段階で発現してくる接着3.

ハナショウガ成分zerumboneのSR mRNA

分子も動脈硬化を悪化させる要因の１つである。

発現抑制作用動脈硬化予防効果が報告されているα-トコフェ

まず、ろ紙濾過後に酸・加熱処理をしたホモジ
ネート1 mLからEtOAc抽出物が1.6 mg得られた。

ロールも、単球の接着分子の発現を抑制することが知られている15）。

そして、HPLCによって分析した結果、tR6.86に

そこで、LOX-1以外のSRと接着分子の発現に非常に顕著なピークが検出され、それがゼルンボ対するZERの効果を検討した。その結果、ZERは

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浦上財団研究報告書

Vol.15（2007）5.

DiI-acLDLの取り込みに対するZERの作用

ZERがLOX-1を 始 め と す る い く つ か のSRのmRNA発現を抑制することが判明したので、次にマクロファージによる変性LDLの取り込みを阻害するか否かを検討した。THP-1細胞にZER（10μM）を添加し、30分間前培養し、TPA（30nM）で刺激して48時間培養した後、DiI-acLDL（10μg/mL）を加え、さらに４時間培養した時の取り込みを比較した。
図７ SRと接着分子の発現に対する効果

その結果、THP-1細胞はTPA刺激なしではDiIacLDLをほとんど取り込まないが、TPAで48時

SR-AとSR-PSOXの 発 現 は10μMで ほ ぼ 完 全 に 抑間刺激すると53％の細胞にDiI-acLDLの取り込みえ、CD36については、５μMでは効果が見られが観察された。（図８）。それに対し、ZERで前処なかったが、10μMで85％抑制した（図７）。し理した場合は、取り込みが13％にまで抑制されかしながら、同じくSRであるCD68とCLA-1、ならた。したがって、ZERはSRの発現抑制作用を通びに接着分子のCD18とCD11bに対しては、10μして、変性LDLの取り込み阻止作用を有すること

Mにおいても10〜20％程度しか抑制活性を示さなが明らかとなり、このメカニズムによってマクロかった。したがって、ZERは分化過程で発現してファージの泡沫化、さらには動脈硬化を抑制できくる全てのマーカーに対して抑制活性を示すのでる可能性が強く示唆された。

はなく、特定のSRの発現を選択的に抑制している可能性が示唆された。

図８

DiI-acLDLの取り込みに対するZERの作用

酸化LDL受容体の発現制御に着目した動脈硬化の新しい予防法の確立と沖縄産食材に含まれる活性成分の発掘

6.

31

of macrophage scavenger receptors. J Lipid Res., 46, 11-20,

おわりに2005.

本研究は、食品素材やその成分に関してＳＲ抑７）Galis Z, et al., Increased expression of matrixmetalloproteinases and matrix degrading activity in

制作用を評価した最初の例の１つである。実際

vulnerable regions of human atherosclerotic plaques. Jに、ゼルンボンがin vivoでもＳＲの発現を抑制

Clin Invest., 94, 2493-503, 1994.

し、その機構によって動脈硬化が阻止できるか否かについての評価は今後の課題として残されてい８）厚生労働省統計情報部「平成12年度

都道府県別生命表」

９）Murakami A, et al., Suppressive Effects of Okinawan
Food Items on Free Radical Generation from Stimulated

るが、新しいアプローチの提示という点では意義

Leukocytes and Identiﬁcation of Some Active Constituents:のある研究例だと自己評価している。
今後さらに、

Implications for the Prevention of Inﬂammation-associated

その方面での研究を進展させると共に長寿をもたCarcinogenesis. Asian Pac J Cancer Prev., 6, 437-48, 2005.
10）Nishimura S, et al., Oxidized low-density lipoprotein（ox-らしている伝統的な食材の機能性に関する網羅的LDL）binding to lectin-like ox-LDL receptor-1（LOX-1）な研究にも挑戦してみたい。

in cultured bovine articular chondrocytes increases
production of intracellular reactive oxygen species（ROS）

謝

resulting in the activation of NF-kappaB. Osteoarthritis

辞Cartilage., 12, 568-76, 2004.

本研究を行うにあたり（財）浦上食品・食文化

11）Fukuhara T, et al., Expression of class A scavenger

振興財団には多大なご援助を賜りました。また、

receptor is enhanced by high glucose in vitro andご指導頂いた大東肇教授（京都大学名誉教授）と研究協力頂いた金子友紀さんと江口愛さんに深く御礼申し上げます。

under diabetic conditions in vivo: one mechanism for an
increased rate of atherosclerosis in diabetes. J Biol Chem.,
280, 3355-64, 2004
12）Quiles J.L, et al., Curcuma longa extract supplementation
reduces oxidative stress and attenuates aortic fatty streak

文development in rabbits. Arterioscler Thromb Vasc Biol., 22,

献１）厚生労働省統計情報部「平成16年度

1225-31, 2002.
死因別死亡数の割合」

２）Kita T, et al., Probucol prevents the progression ofatherosclerosis in Watanabe heritable hyperlipidemic
rabbit, an animal model for familial hypercholesterolemia.
Proc Natl Acad Sci U S A., 84, 5928-31, 1987.

13）Murakami A, et al., Zerumbone, a sesquiterpene in
subtropical ginger, suppresses skin tumor initiation andpromotion stages in ICR mice. Int J Cancer., 110, 481-90,2004.
14）Murakami A, et al., Zerumbone, a Southeast Asian３）Steinberg D, et al., Beyond cholesterol. Modiﬁcations ofginger sesquiterpene, markedly suppresses free radical

low-density lipoprotein that increase its atherogenicity. N

generation, proinﬂammatory protein production, andEngl J Med., 320, 915-24, 1989.

cancer cell proliferation accompanied by apoptosis: the４）Kume N, et al., Lysophosphatidylcholine, a component of
atherogenic lipoproteins, induces mononuclear leukocyte
adhesion molecules in cultured human and rabbit arterial
endothelial cells. J Clin Invest., 90, 1138-44, 1992.
５）Glass C, et al., Atherosclerosis. the road ahead. Cell., 104,503-16, 2001.
６）Greaves D, et al., Thematic review series: the immune
system and atherogenesis. Recent insights into the biology

alpha,beta-unsaturated carbonyl group is a prerequisite.
Carcinogenesis., 23, 795-802, 2002.
15）Terasawa Y, et al., Alpha-tocopherol protects against
monocyte Mac-1（CD11b/CD18）expression and Mac1-dependent adhesion to endothelial cells induced byoxidized low-density lipoprotein. Biofactors., 11, 221-33,
2000.

32URAKAMI FOUNDATION MEMOIRS

Vol.15（2007）

Establishment of novel means for atherosclerosis prevention directing theexpression regulation of oxidized LDL and a search for active compounds
in Okinawan food items
Akira Murakami（Division of Food Science and Biotechnology, Graduate School of Agriculture, Kyoto University）

Unregulated uptake of oxidized low-density lipoproteins（ox-LDL）via macrophagescavenger receptors（SRs）, such as lectin-like ox-LDL receptor-1（LOX-1）, is a key event
in atherosclerosis. In the present study, we used differentiated Caco-2 cells as a model ofthe human small intestine to evaluate the suppressive effects of 16 traditional food items
selected from Okinawa on 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate（TPA）-induced LOX-1
mRNA expression in THP-1 human monocyte-like cells. Three Zingiberaceae plants,Curcuma aromatica Salisbury, Curcuma longa L., and Zingiber zerumbet Smith, markedly
suppressed that expression. When added to the apical sides of Caco-2 monolayers,zerumbone, a sesquiterpene from Z. zerumbet Smith, was found to permeate into thebasolateral medium as an intact structure in a time-dependent manner. alpha-Humulene, astructural analog of zerumbone lacking the alpha,beta-unsaturated carbonyl group, did not
suppress LOX-1 mRNA expression, indicating that its electrophilic moiety might play pivotal
roles in its activities. Further, zerumbone attenuated the expression of SR-A, SR-PSOX, andCD36, but not that of CD68 or CLA-1, leading to a blockade of DiI-acLDL uptake, while italso inhibited the transcriptional activities of activator protein-1 and nuclear factor-kappaB.
Together, our results indicate that zerumbone is a potential phytochemical for regulating
atherosclerosis with reasonable action mechanisms.