日本微生物生態学会 第33回大会
JSME 2019

講演要旨集

会期

2019 年9月10 日（火）〜13 日（金）

会場

山梨大学

甲府キャンパス（山梨県甲府市武田4−4−37）

目次

シンポジウム1

口頭発表
特別セッション

13

一般口頭発表（9／11

O1-1-27)18

一般口頭発表（9／12O2-1-27)

31

ポスター発表（9／11

P1-01-79)

46

ポスター発表（9／12

P2-01-80)

85

ポスター発表高校生ポスター発表

126

日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meetingSP-1

植物組織に棲む微生物群集の構造・機能を解析する：
植物微生物 “ ならでは ” の課題と研究例○原 新太郎東北大・院生命E-mail: s.hara@m.tohoku.ac.jp
植物組織に棲息する微生物群集は宿主植物の形質に様々な影響を与えると考えられており、その多様性や機能性の解明は重要な課題である。近年、DNA バーコーディングによる微生物叢の解析が比較的容易に行えるようになったが、今後さらなる知見を得るためには植物微生物の解析 “ ならでは ” の課題や注目すべき点がある。
植物組織の内外に棲息する微生物を網羅的に解析するために植物組織から DNA を抽出すると、抽出液中に植物 DNA が多量に混入し微生物解析の妨げとなる。細菌の 16S rRNA 遺伝子アンプリコンシーケンスにおいては、特殊なプローブで植物オルガネ
ラ配列の増幅を抑制する方法が開発され、解析が可能になった 1 。しかし、ショットガンシーケンスによるメタゲノム解析にこの方法は適応できない。そこで、演者らの研究グループでは Bacterial cell enrichment 法 2 を用いて植物組織から細菌細胞を回収し、植物成分を取り除いて各種解析を行っている。本発表では、圃場で栽培したイネ科植物ソルガム根の窒素固定細菌の解析例を紹介する。この研究では、ソルガム根から回収した細菌細胞のメタゲノム解析、さらにプロテオーム解析を行い、非根粒タイプのBradyrhizobium 属細菌が窒素固定を担うことを明らかにした 3 。
また、解析対象とする植物の状態について、考えなければならない点がある。これまで、施肥や植物遺伝型の異なる条件で微生物叢を比較する様々な試験が行われてきた。しかし、圃場サンプル、特に植物地上部を対象とした場合、どの組織（葉や茎など）を解析するのか、どの生育ステージを解析するのか、などの基本的な条件が研究者間で統一されていないのが現状である。演者らが圃場栽培ダイズの地上部細菌叢を経時的に調べたところ、窒素固定が活性化する開花期をピークに細菌叢が劇的に変化しており、植物の生育ステージが重要な要素であることが示された。各種オーミクス解析で多くの情報を得られるようになった昨今、植物の生理状態を把握しながら研究を行うことがより重要になると考えられる。
1
Lundberg et al. (2013) Nat methods. 10, 999 － 1002
2
Ikeda et al. (2009) Microb. Ecol. 58, 703 － 714
3Hara et al. (2019) Front. Microbiol. 10, 407

SP-2

複雑微生物叢を設計・制御する： 「コア微生物叢」の組み立て○東樹 宏和 1
京都大・生態研 , 2JST さきがけ

1E-mail: toju.hirokazu.4c@kyoto-u.ac.jp
陸上への進出が始まったごく初期（4 億 6000 万年前）より、植物は地下部で真菌類と精緻な共生系を構築し、多様化を遂げてきました。地球上で現在生育する植物種の 9 割は、「菌根菌」と呼ばれる真菌たちの関わりを通じて、リンや窒素の供給を受けていると言われています。その一方で、根圏や葉圏にはまだその機能が知られていない、「内生菌」と呼ばれる細菌や真菌が生息しています。

こうした内生菌の中には、土壌中の有機態窒素を無機化して植物に供給するものや、病害虫抵抗性や環境ストレス耐性を宿主植物に付与するものなど、機能性の高いものが数多く存在することがわかってきました。地球温暖化や新規病害虫の出現によって農業生産が不安定化しつつある中、こうした内生菌をうまく利用して「頑健かつ持続可能な農業」を実現することができるでしょうか。

内生菌の機能は種ごとに異なるため、複数の内生菌を 1 個体の植物に共生させることで、多様な機能を植物体に付与することができると期待されます。しかし、菌どうしの間にも相性があります。数千・数万の候補菌種から最適な組み合わせを調べる作業事態、大変な労力を必要とするものです。

私たちの研究グループでは、日本列島の内生菌リソースのデータベース化を進めるとともに、ネットワーク科学を応用し、最適な菌の組み合わせを探索する手法を開発しています。そうした解析で見出される「コア微生物叢」を用いることで、野外環境下であっても安定的に植物体内で管理できる共生微生物叢を設計できると期待しています。

本講演では、植物 - 微生物、および、微生物 - 微生物関係の複雑な相互作用ネットワークに関するインフォマティクスやデー

タ解析についてこれまでの到達点についてお話いたします。その上で、「複雑微生物叢の設計と制御」という、科学研究としても最難関クラスの目標に挑むための戦略について、議論したいと思います。

－1－日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

SP-3

Synthetic community (SynCom) を用いた植物－マイクロバイオータ相互作用の分子生物学的解析○中野 トーマス亮平
Max Planck Institute for Plant Breeding ResearchE-mail: nakano@mpipz.mpg.de

動植物と共存する微生物叢（マイクロバイオータ）は宿主の生育や免疫機構，ストレス応答などに大きな影響を与える．次世
代シーケンサの発達等により，様々な植物種や環境条件における細菌・真菌・卵菌マイクロバイオータの構造が過去１０年ほどで次々に調べられ，そのコミュニティ構築における生態学的・農業的要因の影響や宿主生理との相関が多く記述されてきた．
その一方で，その相互作用を実際に担う分子機構は未だほとんど明らかになっていない．近年，複数のグループがモデル植物

シロイヌナズナやイネを含む多様な植物種から多くの微生物を単離培養することに成功し，それら単離微生物を用いて微生物
コミュニティを再構築することが可能となった．この合成コミュニティ（Synthetic community, SynCom）を用いることで再現性良く多様な条件下で実験的に相互作用を解析することが可能になり，個々の微生物のゲノム情報と併せて，植物―マイク

ロバイオータ相互作用を分子生物学的に解析する技術基盤が整ってきたといえる．すでに多くの研究成果が報告されており，発表者らのグループでも特に宿主免疫機構に着目した研究を推進している．本発表では，植物由来の純粋培養微生物群（カルチャーコレクション）や SynCom を用いた解析成果の実例を挙げながら，今後植物ーマイクロバイオータ相互作用の解析が向かうべき道筋の一例を提案したい．

SP-4

植物のマーカー遺伝子群の可視化技術を活用した有用植物共生微生物の機能解析
および高効率スクリーニング法の開発○清水 将文 1, 別役 重之 2
岐阜大・応用生物 , 2筑波大・生命環境

1

E-mail: shimizma@gifu-u.ac.jp

持続的農業を推進する国際的な潮流を背景に、海外では有用植物微生物の資材化が猛烈な勢いで進められている。微生物資材の開発は、収集した微生物株の中から有用効果をもつ菌株をスクリーニングするところから始まる。この段階で優秀な有用菌株を如何に効率的に選抜するかが微生物資材開発の成否を決める重要なポイントになることは言うまでもないが、なかなか簡単ではない。特に、植物成長促進作用や免疫活性化を介した病害抑制作用は植物体への接種試験でしか評価できない上に、バイオマスの増加や発病レベルの低下といった効果を確認するまでに一定の時間を要するため、それらの作用をもつ菌株の効率的選抜は非常に難しい。我われは、ホルモン応答やストレス応答に関わるマーカー遺伝子群の可視化技術をスクリーニングに活用できないかと考えている。有用菌株を接種した植物体における各種遺伝子群の発現様式の時空間的解析で得られる知見を基に、ハイスループットスクリーニング法の確立を目指したい。また、そのようにして得られた有用菌株自身を可視化して、植物側のマーカー遺伝子と組み合わせることで、有用菌株が植物体のどのような組織に局在し、局所的もしくはシステミックにどのような影響を及ぼすかの詳細な解析も可能となると考えている。

－2－

日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meetingSP-5

微生物叢データ解析の新展開：代替安定性の地図化とその応用可能性○鈴木 健大理研 BRCE-mail: kenta.suzuki.zk@riken.jp
代替安定性とは生物群集が同一の環境条件において複数の安定的な共存状態（安定状態）を示す現象である。例えば、生息場所への種の加入順の違いが、最終的な群集組成を変えることが古くから知られている。代替安定性はしばしば、群集組成の環境依存性と混同される。確かに、緩やかな環境勾配に対して群集組成が劇的に変わることがある。しかし、群集組成の違い
が環境条件で説明できる場合、環境条件を固定すれば群集組成は同じになると期待される。この点が代替安定性とは異なっている。こうした違いはあるものの、両者は対立する概念ではない。ある環境条件での複数の安定状態の存在や関係性が、環境勾配に沿って変化する、というように、環境勾配に沿った代替安定性の変化が起こりうる。群集組成の違いは生物群集の生態
系機能・サービスの違いにつながる可能性があるため、代替安定性を理解することは重要である。

生物群集の安定状態の捉え方として、例えば複数サンプルの群集組成を２～３次元の空間内にプロットし、その中から点の集合（クラスタ）をみつけるアプローチがある。群集組成と環境条件の対応関係を機械学習や統計解析の手法で推定することも難しくない。しかし、こうしたアプローチからは、群集形成プロセスの動的な側面を直接捉えることはできない。また、要素数が少ない系については、時系列データを利用して機構的モデルを構築することが比較的容易になっている。このようなモデルは群集形成の動的な側面の理解に大きく貢献できるだろう。しかし、要素数が多く、かつ代替安定性を示すような系では、パラメー
タ推定に必要な時系列を取得することが困難であり、十分な時系列があったとしても正確なモデル推定は依然として難しい。

本研究では、多数のサンプルから得られた群集組成データを利用して、安定状態の数、安定状態の群集組成、安定状態同士の関係性などを推定できる手法を紹介する。この手法から、生物群集が示す代替安定性を地図化することができる。このような「地図」から、どのような加入順が特定の安定状態に至るか、安定状態同士はどのような遷移のプロセスで結びついているかなどを把握できる。更に、環境勾配に沿って代替安定性がどのように変化するかを推定することもできる。このアプローチ
を微生物叢研究に適用するために考慮するべき点や、植物微生物共生系への示唆、応用の可能性について検討したい。

SP-6

日本らしい植物微生物学○市橋 泰範理研 BRCE-mail: yasunori.ichihashi@riken.jp
人類は様々な農業に関する取り組みにより人口増加を支える食糧供給を大幅に改善しつつある一方、農地への過剰な施肥により農業由来窒素による環境汚染や土壌の劣化など、大量生産・大量消費・大量廃棄型社会の弊害が指摘されています。加えてリン鉱石の枯渇傾向等が指摘されているため、安心・安全の食料生産を維持した上で農地への適正な施肥を実現する持続可能な循環型農業が求められています。植物の根圏は、地球上で最も微生物が豊富な生態系であり、菌根菌などの多様な植物種と共生して土壌中の養分を根に供給する有用な微生物が存在することが知られております。私たちは、植物と微生物の共生関係の理解が進めば、地球規模での持続可能な食料供給や環境負荷軽減への大きな貢献が期待できると考えております。本発表では、2018 年度に発足した新チーム「植物－微生物共生研究開発チーム」で進める、植物と微生物の共生現象の実態解明と産業利用を目指した研究を紹介します。人類に欠かせない食。日本の科学者として、日本農業の匠の技を活用し、質の高い食を作
り出し、人類の健康寿命を延ばす日本発イノベーション基盤を作ることを目指します。

－3－日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

SL-1

メタゲノム解析でひも解く淡水湖のファージの多様性と生態○岡崎 友輔 1, 西村 陽介 2, 吉田 天士 3, 緒方 博之 4, 中野 伸一 5
産総研・生物プロセス , 2東大・大気海洋研 , 3京大・院農 , 4京大・化研 , 5京大・生態研

1E-mail: y.okazaki@aist.go.jp

海洋や湖沼の水中には 1 mL あたり 104-107 細胞もの細菌、さらにその 10 倍の数の細菌ウイルス（ファージ）粒子が存在し、生態系や物質循環の基盤を成している。本研究では淡水環境におけるファージの多様性および生態をゲノム解像度で培養非依存的かつ網羅的に捉えることを目的とし、琵琶湖をフィールドとしたメタゲノム解析を行った。沖合定点（水深約 73 m）において 2 水深・9 か月にわたる時空間的な採水を行い、ホスト（細菌）細胞内（0.2-5.0 μ m）および細胞外 (<0.2 μ m) の 2 つのサイズ画分より全 DNA を抽出し、シーケンスした。その結果、183 系統のファージの完全長ゲノム、および 57 系統のホスト（細菌）のドラフトゲノムを決定した。そのうち、40 系統のファージについて、ゲノム情報からホストの予測が可能であった。
これらの中には淡水環境で普遍的に優占し、生態系・物質循環において中核的機能を担うとされる細菌系統（acI, LD12 など）に感染する新規ウイルスも含まれていた。ウイルス群集は表層と深層で大きく異なっており、ホストとなる細菌群集の鉛直的分布を反映していることが示唆された。総じて、物理化学的に安定した環境である深層のウイルス群集のほうが経時的に安定していたが、溶原化したファージの誘導や湖の鉛直循環によってウイルス群集組成が大きく変動する時期があることが明らかとなった。多くのウイルスゲノム上に、ホストの生理代謝活性を改変することでウイルスの適応度を高める機能があると考えられている細菌由来の遺伝子（Auxiliary Metabolic Genes; AMGs）が見つかった。特に硫黄同化に関係する遺伝子が海洋等の他の環境と比較して多く見つかり、硫黄の供給が限られている淡水環境において、ウイルス感染によって発現する遺伝子が硫
黄循環における重要な機能を担っていることが示唆された。さらに、海洋や他の淡水環境でこれまでに報告されてきたウイル

スメタゲノムとの比較によって、世界中の淡水環境、さらには海洋も含めた水域環境に広く分布するコスモポリタンなウイル
スグループを多数特定できた。

SL-2

水圏の嫌気環境における従属栄養性原生生物－現存量、多様性、生理・生態－○近藤 竜二 , 片岡 剛文
福井県大・海洋

E-mail: rykondo@fpu.ac.jp
水圏の底泥や成層期の底層など、嫌気的な環境は普遍的に存在する。嫌気環境での細菌の生態や機能については詳細に調べられているものの、嫌気性の従属栄養性原生生物（鞭毛虫や繊毛虫）につての研究はほとんどない。本講演では、密度成層湖である水
月湖と硫化水素が蓄積している湖沼底泥中の嫌気性原生生物の現存量と群集組成について述べるとともに、培養株を用いた生理や嫌気性原生生物の培養法についても若干触れる。 底層に多量の硫化水素が蓄積する水月湖の水柱の鞭毛虫の現存量と細菌摂食活性を調べたところ、嫌気環境でも好気環境に生息する鞭毛虫と同等以上の細菌摂食活性を潜在的に有することが明らかとなった。
しかしながら、細菌と鞭毛虫の現存量が低いために細菌の回転率に対する鞭毛虫の寄与は小さいと考えられる。水月湖から単離した通性嫌気性の鞭毛虫の増殖生理と細菌捕食活性を、細菌株との二者培養系を用いて好気と嫌気の条件で調べた。嫌気条件下での最大比増殖速度と最大細菌摂食速度は、好気条件に比べて、それぞれ1/7、1/3程度でしかなかった。細菌摂食速度の半飽和定数は好気と嫌気で差はなかったが、水月湖水中の全菌数から考えると、この鞭毛虫は、現場環境では餌密度に制限されていると考えられた。 一方、福井県の三方五湖と琵琶湖南湖の底泥表層中の鞭毛虫の現存量を調べたところ、その現存量は、湖によって異なる

ものの、底泥直上水の数十倍から数百倍で、嫌気的な環境でも高密度で原生生物が存在することが明らかとなった。同じ底泥試料から抽出したDNAを鋳型として18S rDNAのV4-V5領域をPCR増幅し、NGSにより、原生生物の群集組成を調べた。その結果、嫌気的な底泥中にも極めて多様な原生生物が存在し、塩分環境の異なる湖間では、その群集組成が異なることが明らかとなった。また、未同定の配列の他、既存のどの分類群にも当てはまらないものも多くみられ、未知の原生生物の存在も示唆された。 泥粒子が妨害するために底泥中の原生生物による細菌摂食活性の測定は困難なため、現在、底泥から原生生物を単離してその生理を調べることによって生態の解明を目指している。嫌気性細菌の培養技術を応用して、これまでに数株の原生生物の培養に成功しており、いくつかの培養株については18S rDNAの塩基配列を決定して系統解析を行ったところ、新種の原生生物である可能性が示された。

－4－

日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meetingSL-3

陸域だけじゃない、水域でも重要な真菌類の多様性と機能○鏡味 麻衣子
横浜国大・環境情報

E-mail: kagami-maiko-bd@ynu.ac.jp
生態系の物質循環を理解する上で、細菌・古細菌に加え真核微生物の機能解明は欠かせない。真核微生物のなかでも真菌類は、系統的にも多様で、陸域生態系においては分解者や共生者、寄生者として重要な機能を担っていることがわかっている。
陸域と異なり、海洋や湖などの水域生態系において真菌類はほとんど存在しないと考えられてきた。しかし、次世代シークエ
ンサーが汎用化され、メタバーコーディング研究が進んだ結果、湖沼や海洋においても多様な真菌類が存在することが明らかになった。ただし検出される水生菌類のほとんどは正体不明であり、Dark Matter Fungi(DMF) と称されている。DMF の多くはDNA データベース登録数の圧倒的に少ないツボカビなど下等菌類である可能性が高い。実際、我々は顕微鏡観察と DNA 解析を組み合わせる (Single spore PCR 法 ) ことで、湖における DMF の正体はツボカビやロゼラ菌、アフェリダなど鞭毛をもつ下等菌類で、植物プランクトンに寄生する系統であることを明らかにした。これら鞭毛菌類は真菌類の最も祖先的な系統であり、菌類の進化を考える上でも重要である。現在、ゲノム解析を進めている。
真菌類が水域の物質循環において重要な機能を担うことも見えてきた。ツボカビは植物プランクトンや花粉などの有機物を消費
し遊走子を水中に放出するが、その遊走子はミジンコなど動物プランクトンの重要な餌である。このツボカビを介した物質流は
Mycoloop と称され、食物網の構造や安定性に影響を与えている。またツボカビとバクテリアは有機物をめぐり競争関係にあり、ツボカビがバクテリアの量や種組成に影響をあたえ、ひいては溶存有機物 DOM の質を改変していることも明らかになった。
湖沼だけでなく海洋や河川、雪氷、都市環境からも新奇の水生菌類が続々と検出されている。例えば、北極や沿岸海洋では珪藻に寄生するツボカビが検出され、藻類大量培養系や下水処理場、道路の側溝ではロゼラ菌やアフェリダ菌などが報告されている。Marine snow（凝集体）に菌類が多数付着している様子も観察された。これら菌類は地球レベルでの物質循環に影響を与えている可能性が高い。
参考文献
Grossart et al. (2019) Fungi in aquatic ecosystems. Nature Reviews Microbiology 17, 339-354.
Amend et al. (2019) Fungi in the marine environment: Open questions and unsolved problems. mBio 10, e01189-18.

SL-4淡水産微小甲殻類の多様性と生態○牧野 渡
東北大・院生命E-mail: wataru.makino.e8@tohoku.ac.jp
本発表での淡水産微小甲殻類とは、ミジンコやケンミジンコと総称される生物群（タクサ）を示す。これらのタクサは、会員諸賢が思い浮かべる「微生物」よりも、はるかに大型であるため、その分類についても、はるか昔に整理済みだと思われるかもしれない。ところが近年、従来よりも微細な形態形質が重用され始めたことと、DNA バーコーディングなどの分子生態的手法が用いられ始めた結果、従来は同種とされていたタクサが、複数種に細分化される事例が頻発している。すなわち淡水産微小甲殻類の多様性は、従来の理解よりもはるかに高そうであると、繰り返し指摘されているのが現状である。本発表では、現在進行中の、日本淡水産微小甲殻類から網羅的に DNA バーコードを取得する試みと、現在までに得られた結果について紹介する。例えば、ヒトの生存と生業には水が必須であるため、ヒトは淡水生態系に対して多大な影響を与えてきた。日本では国土
面積の５パーセント程度が水田へと改変され、それを涵養するため池も 20 万個以上も作られてきた。そして水田では毎年（ほぼ）決まった時期に水が入り、決まった時期に水が干上がるというサイクルが繰り返されている。このような人為改変が、淡水産微小甲殻類に与える影響についても、網羅的 DNA バーコーディングの結果をもとに考えてみたい。

－5－日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

SL-5

淡水生態系における好気的メタン生成プロセス○岩田 智也 1, Khatun Santona1, 小島 久弥 2, 福井 学 2, 寺島 美亜 2, 高須賀 太一 3, 田中 健太 4, 篠原 隆一郎 5山梨大・生命 , 2北大・低温研 , 3北大・農 , 4筑波大・山岳セ , 5国環研

1E-mail: tiwata@yamanashi.ac.jp

淡水生態系はメタンの主要な放出源であり、自然起源からのメタン放出量のおよそ 12% が湖や河川から大気へ脱ガスしていると考えられている。湖面から放出するメタンは、酸素の枯渇した堆積物中や深水層においてメタン菌が生成した気体であると考えられてきた。しかし、海洋や湖沼の亜表層には過飽和のメタンが存在していることが古くから知られている（メタンのパラドックス）。また、湖では堆積物中で生成したメタンの多くがメタン酸化細菌によって消費されることから、大気へ脱ガスするメタンは主として亜表層に存在するメタン極大に由来している可能性がある。しかし、湖におけるメタンの亜表層極大の成因やメタン生成に関わる微生物についてはよくわかっていない。

我々の研究により、メタンの亜表層極大は水深の深い湖において夏期に出現する傾向があることが明らかとなってきた。この過飽和メタンは大気からの溶解や湖底・河川・沿岸帯からの輸送により形成されたものとは考えにくく、亜表層で生成している可能性が高い。とくに、ホスホン酸分解酵素（C-P リアーゼ）を有するピコシアノバクテリア（Synechococcus ）の分布とメタン極大の季節消長が一致することや C-P リアーゼ活性が現場で確認されていることから、浮遊性微生物のホスホン酸分解

でメタンが生成しているものと考えている。夏季の成層期にはホスホン酸代謝によるリン獲得機能を有するピコシアノバクテ

リアが貧栄養な表層 - 亜表層で栄養塩を巡る競争に優位となり、それによってメタンが好気的に生成しているというシナリオを想定している。さらに、我々は新たなホスホン酸分解経路によるメタン生成プロセスも発見した。本講演では、細菌以外の微生物にも注目しながら、湖水の好気環境におけるメタン生成プロセスについて紹介する。

SS-1

シロアリ腸内原生生物と細胞内・表面共生細菌間の相互作用○雪 真弘 , 大熊 盛也
理研 BRCE-mail: masahiro.yuki@riken.jp
共生の教科書的な例として、シロアリ腸内の共生系が挙げられる。シロアリは高等シロアリと下等シロアリに大きく分けられるが、下等シロアリの腸内には、十数種の原生生物、古細菌と数百種の細菌が共生している。これらの微生物種のほとんどは宿主シロアリ種に特異的な系統であり、同一シロアリ種内ではこの複雑な腸内微生物叢は高度に保存されている。さらに原生生物の細胞内、細胞表面にも細菌が共生しており、複雑に相互作用した多重共生系が構築されている。これらの腸内微生物の多くが難培養であるため、培養を介さないメタゲノム解析やメタトランスクリプトーム解析により、腸内微生物が木材分解や窒素固定等の共生関係に重要な役割を担っていることが示唆されている。しかし、腸内微生物叢を構成する個々の細菌の役割はほとんどが不明のままであった。我々は、網羅的に腸内共生細菌を 1 細胞からゲノム解析することにより、複雑な多重共生系の解明を進めている。これまでに 100 種以上のシロアリ腸内共生細菌種のシングルセルゲノム解析を行っている。本発表では、近縁な原生生物 2 種の細胞内に共生する細菌の比較シングルセルゲノム解析や原生生物細胞表面に共生する 3 種のTreponema 属細菌の役割分担の例などを紹介し、宿主 - 共生体の相互作用について議論する。

－6－

日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

SS-2

好熱好酸性ナノアーキアの共培養系から探るアーキア間相互作用○加藤 真悟 1, 小笠原 綾香 2, 伊藤 隆 1, 酒井 博之 1, 雪 真弘 1, 高品 知典 2, 大熊 盛也 1
理研 BRC・JCM, 2東洋大・生命

1E-mail: skato@riken.jp

ナノアーキアは，呼び名の通り細胞サイズ（直径 500 nm 以下）もゲノムサイズ（0.6 Mbp 以下）も小さい生物であり，その生理・生態については不明な点が多く残されている．系統学的には、DPANN 群の中でもNanoarchaeota 門に属するアーキアである。ナノアーキアの培養報告例は，これまでに海底熱水噴出孔から１例，陸上温泉から２例あるのみである．いずれのナノ
アーキアも嫌気条件下で増殖し，その生育に好熱性クレンアーキアの存在を必要とする絶対寄生性である．

本発表では，好気条件下で増殖する新規の好熱好酸性ナノアーキアを報告する．栃木県奥塩原で採取した温泉水を，改変

Sulfolobus 用培地（pH2.5）に植菌し，70℃かつ好気条件下で集積培養した．その集積培養液を元にして，改変 MPN 法によりナノアーキアの純化を試みた．最終的に，ナノアーキアの一種である Candidatus Nanopusillus acidilobi に近縁な配列（相同性 85.8%）と，好熱性クレンアーキアのMetallosphaera sedula に近縁な配列（100％）のみが 16S rRNA 遺伝子解析により検出される共培養系を得た．それぞれを，MJ1 株，MJ1HA 株と暫定的に呼ぶ．MJ1 株 -MJ1HA 株共培養系および MJ1HA 株純粋培養系において，両株の細胞数の継時変化を定量 PCR 法により測定した結果，共培養系において MJ1 株の細胞数が MJ1HA 株の細胞数の 3-6 倍程度になると，MJ1HA 株の増殖が阻害されることが確認された．MJ1-MJ1HA 共培養系から DNA を抽出し，Illumina MiSeq および Nanopore MinION を用いてゲノム配列決定を行なった結果，MJ1 株の完全ゲノム配列（0.67 Mbp）および MJ1HA 株の完全ゲノム配列（2.28 Mbp）が得られた．MJ1 株のゲノムからは，遺伝情報の複製や翻訳，細胞分裂，運動性，酸素耐性に関わる遺伝子が見つかった．その一方で，先行研究例と同様に，アミノ酸や核酸，さらには ATP の合成に関わる遺伝子が欠如していた．各種顕微鏡観察により，MJ1 株の細胞が MJ1HA 株の細胞に付着している様子も確認できた．以上の結果に基づいて、ナノアーキア - 宿主アーキア間の共生様式について議論する。

SS-3

カメムシから紐解く昆虫腸内共生の成立メカニズム○大林 翼
農研機構・農環研 / フランス・CNRS

E-mail: tsubasa.ohbayashi@i2bc.paris-saclay.fr
昆虫類の多くは微生物と密接に関わりながら生きている。昆虫の共生微生物は、必須アミノ酸・ビタミンの補給やエサの分解に寄与することから、宿主の生存に重要な役割を果たすことが知られている。このような共生微生物の機能的側面の理解が進んでいる一方、内部共生の成立に関わる分子メカニズムは不明な点が多く残っている。その最大の理由は、共生微生物が昆虫の体内環境に高度に適応しているため、単離培養ができず、遺伝子組換え等の実験手法が適用困難な点にある。ダイズの重要害虫であるホソヘリカメムシは消化管の後方に「盲のう」と呼ばれる袋状組織を多数発達させ、その内腔にたった１種類の共生細菌（Burkholderia insecticola ）を保持している。昆虫の共生微生物としては例外的にB. insecticola は培養可能であり、ホソヘリカメムシ -Burkholderia 共生系は昆虫内部共生の成立機構を解明する上で良いモデル系といえる。

私たちはまず、カメムシ消化管における食物および細菌の動態に着目し、消化管の組織学的観察を行った。その結果、共生器
官の手前にある狭窄部が、餌や雑多な細菌の中からBurkholderia 共生細菌のみを通過させる、高度な “ 細菌選別器官 ” になっていることを発見した（Ohbayashi et al ., 2015 PNAS ）。次に、私たちは RNA-seq・Tn-seq を用いて、B. insecticola の全遺伝子を網羅的に機能解析することにした。培養時・腸内共生時におけるB. insecticola の遺伝子発現について RNA-seq 解析をおこなったところ、硫酸化合物やアラントインの代謝経路に関わる遺伝子が腸内共生時に高発現していた。硫酸化合物やアラントイン
は昆虫の老廃物であることから、B. insecticola は宿主が排出する老廃物を資化しながら昆虫腸内で増殖していることが示唆さ。さらに現在は、
Tn-seq 解析によるB. insecticola の昆虫腸内への定着因子を探索している。
れた（Ohbayashi et al ., 2019 ISMEJ ）Tn-seq 解析は、トランスポゾン挿入変異法と次世代シーケンス解析を組み合わせた、ゲノムワイドな遺伝子スクリーニング手法のひとつである。本講演では、in vivo Tn-seq 解析の最新結果を紹介するとともに、RNA-seq・Tn-seq 解析から見えてきた昆

虫腸内におけるB. insecticola の定着メカニズムについて議論する。

－7－

日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

SS-4

植物病原細菌の植物感染動態と植物の免疫応答○別役 重之筑波大・生命 /MiCS

E-mail: betsuyaku.shige.ge@u.tsukuba.ac.jp
植物はその周囲に存在する微生物と様々な相互作用をしている。それらのうち、特に植物―病原微生物相互作用に関しては、
大きな経済的損失にもつながることからもこれまで精力的な研究が行われてきた。その結果、植物側の「免疫」とそれに打ち勝とうとする微生物側の「病原性」の複雑なせめぎ合いが分子レベルで理解されるようになってきた。植物は一般に、微生物

種に広く保存された細胞壁や鞭毛などの構成成分を「微生物分子パターン」として認識し、パターン誘導型免疫（PTI）を発動することでほとんどの微生物に対して免疫効果を発揮していると考えられている。一方、PTI 抑制能を有する分子（「エフェク
ター」と総称される）を保有する一部の微生物のみが特定の植物の病原体として存在していると考えられている。この病原体に対しても、一部の植物はエフェクターを特異的に認識することでエフェクター誘導型免疫（ETI）を発動させ、その感染を抑制することができる。このような植物―病原微生物相互作用の分子機構は、植物と微生物との長きに渡る共進化の一つの結果であるとも考えられている。

しかし、このような相互作用の様式が理解できるようになっても、実際の感染の現場で、微生物や植物が、いつ、どこで、どのように、「病原性」や「免疫」を発揮しているのかといったことはほとんど分かっていない。そこで、我々は「病原性」と「免疫」の時空間的側面に着目し、植物―病原微生物相互作用のモデルシステムであるシロイヌナズナ－Pseudomonas

syringae pv. tomato DC3000（Pst ）株を用いて、イメージングを基盤とした実験系を立ち上げた。その結果、Pst が植物細胞間隙において、内部で機能分化したバイオフィルム（BF）様構造体を形成すること、また、BF 様構造体の周辺植物細胞で一過的に強い免疫応答が誘導されることを見出した。このような植物―病原微生物相互作用の時空間的動態に関して紹介したい。

S1-1

メタゲノム中のダークマター機能性遺伝子の解析○吉澤 晋 1,2,4, 西村 陽介 1, 岩崎 渉 1,3,4
東大・大海研 , 2東大・院新領域 , 3東大・院理 , 4東大・微生物連携機構

1

E-mail: yoshizawa@aori.u-tokyo.ac.jp

DNA シーケンス技術の飛躍的な発展は、メタゲノム解析を比較的容易に行える研究環境を整え、多くの微生物研究者がビッグデータを扱う時代を生み出した。膨大な遺伝子情報を含むメタゲノムデータは、そこに住む微生物の種の構成や生理的特徴を描き出す情報基盤として、近年の微生物生態の研究にはなくてはならないものになっている。しかしながら、WET を専門とする研究者がかつて扱っていた情報の数万から数百万倍ものデータが一度に手に入ることから、遺伝子情報の海に溺れかかっている研究者も少なくない。一方で、メタゲノム解析に用いられるデータは膨大ではあるが、扱う情報は機能が推定できる遺伝子のみで、半数近くを占める未知遺伝子はダークマターとして解析対象から外されるのが一般的である。つまり、多くの場合

メタゲノムデータの奥深くに隠された生命現象を掘り起こす作業すら行われていないのが現状である。しかしながら、DNA デー

タが増え続けることが確実な状況において、ダークマター遺伝子の機能解明は難攻不落の微生物生態学を築く上で避けて通れない道だと考えられる。それではどのようにしてダークマター遺伝子の機能解析を行えば良いのか？何の手がかりも無い状態
で遺伝子の機能予測をするのはほぼ不可能に近いため、何らかの機能に結びつく情報を得ることが必要不可欠となる。そこで本発表では、膨大なデータが存在するからこそ可能になった、ダークマター遺伝子の機能推定手法の一例を紹介したい。今回対象としたダークマターは、未知の光受容体である。地球上のほぼ全ての生物は太陽光から生態系に流れこむエネルギーを利用して生きていることから明らかなように、クロロフィルやロドプシンなどの光受容体の深い理解は生態学的観点からも重要である。またクロロフィルなどの光受容体が有光層に多く存在することは現場観測から知られていたが、メタゲノム解析からも表層から深層にかけて関連遺伝子が減少することが近年示されている。それでは、既知光受容体と同じように分布するダー

クマター遺伝子を見出すことができれば、やみくもに探すよりも遥かに効率よく未知の光受容体を選別できるのではないだろうか？本発表では、メタゲノムの配列データと環境プロファイルを利用することで、ダークマター遺伝子の機能が推定可能かについて議論したい。

－8－日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

S1-2

大規模マイクロバイオームデータセットの機械学習と微生物群集構造の全体像
○東 光一
遺伝研

E-mail: khigashi@nig.ac.jp
近年、世界中の様々な自然環境から膨大な数のサンプルが取得され、それらの微生物群集構造データが爆発的な勢いで蓄積されている。微生物群集構造を扱う研究の多くは、事前に設計した離散的な環境カテゴリ（河川と海洋、健常と疾患など）を各サンプルに割り当てることで、特定の環境で観察される群集の特徴や、環境間の群集構造の差異を明らかにすることを目的としている。しかしながら、人間が認識する「環境」と微生物が適応し群集構造が最適化される「環境」は必ずしも一致しない。人間の環境分類が粗すぎる（「ヒト腸内」でも異なる複数の群集構造パターンが存在する）場合もあれば、逆に異なる環境
で同じ微生物が検出されることもある。さらに実際の環境は明確な境界の定義が難しく、環境カテゴリの設計とカテゴリ間での群集構造比較が必ずしも適切でない場合も多い。そこで本研究では、微生物群集構造情報（系統組成）と由来環境に関する

自然言語記述文書が対となった３万以上のサンプルを含む大規模マイクロバイオームデータセットに統計的潜在意味解析（トピックモデル）を適用することにより、群集構造を規定する潜在的な「環境」およびそのような環境の連続性を抽出することを試みた。機械学習の結果をもとに、推論されたモデルを可視化して全体を俯瞰するウェブツール LEA（Latent Environment
Allocation）を開発した（http://leamicrobe.jp）。LEA はすべてのマイクロバイオームサンプルを複数の「環境」の混合として表現している。したがって LEA 上でどのような環境が接続されているかを見ることで、どのような環境間で連続的な群集構造の変化が見られるかを評価できる。LEA はインタラクティブなウェブアプリケーションとして実装しており、微生物系統名で検索することでその微生物がどのような環境に生息するのかを調べたり、ユーザが新規に取得したメタゲノムサンプルの系統
組成データをアップロードすることでそのサンプルがどんな環境に由来するのか、LEA 上にマッピングする機能も提供している。LEA は既知の微生物群集構造パターンの全体像を可視化したマップである。メタゲノムデータは現在もさらなる勢いで蓄積し続けており、今後も新たなデータを追加して LEA を拡張していくことで、より詳細なパターンが得られることを期待して
いる。

S1-3

光を使うか、それとも避けるか？
――海洋細菌の二種類の光適応戦略の解明○熊谷 洋平 1, 吉澤 晋 2, 木暮 一啓 2, 岩崎 渉 2,3
海洋研究開発機構 深海バイオリソース研究グループ , 2東京大学大気海洋研究所 , 3東京大学 大学院理学系研究科 生物科学専攻

1

E-mail: kumay@jamstec.go.jp

海洋表層に生息する細菌の約半数はプロテオロドプシン（PR）と呼ばれる光受容体を持ちます。PR は「ソーラーパネル」のような役割を持ち、PR を持つ細菌は光のエネルギーを用いて ATP を作ることができます。その機能から PR は細菌の海洋表層への適応に大きく貢献していると考えられていますが、そもそもなぜ、そのように重要な光受容体である PR を持つ細菌と持たない細菌がいるのでしょう？ PR が本当に「持ち得」なタンパク質なら、海洋表層の細菌すべてが PR を持っていてもいいのではないでしょうか？この疑問に答えるため、私たちは海洋性フラボバクテリアにおいて、PR の有無に着眼した大規模な比較ゲ

ノム解析を行い、それらの遺伝子組成の差を統計的に検出しました。結果として、PR を持たない細菌はその多くが APE/FTP と呼ばれる細胞外膜に局在する色素の合成系遺伝子を持つことがわかりました。APE/FTP は細菌の外膜に局在する UV 吸収性の色素で、細菌の「日傘」として働き光防御に用いられることがわかっています。比較に用いた 76 株に加え、全ての解読された細菌のデータを調べても「ソーラーパネル (PR)」と「日傘 (APE/FTP)」の遺伝子を両方持つ株は１株もおらず、光からエネル

ギーを得る「ソーラーパネル型」と色素で光を遮る「日傘型」の適応戦略にはトレードオフ関係があることが示唆されました。
つまり、太陽からの莫大な光エネルギーにさらされる海洋表層の細菌は、ただその恩恵を受けるだけではなく、「光を利用す

るか、光を避けるか」という " 究極の選択 " を迫られているということになります。本シンポジウムでは、「ソーラーパネル型」と「日傘型」、それぞれの戦略を取る海洋性フラボバクテリアの生理 / 生態 / 進化について、ゲノム解析から得られた結果を発
表します。

－9－

日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

S1-4

メタゲノムデータを活用した常在細菌叢の時系列解析○高安 伶奈 1,2, 須田 亙 2, 渡辺 栄一郎 2, 梅山 大地 2, 黒川 李奈 2,3, 服部 正平 2,3
東大・院医 , 2理研・IMS, 3早稲田・院先進理工1

E-mail: lena.takayasu@humeco.m.u-tokyo.ac.jp

常在細菌叢は個体に特有である一方で、数時間から数年のタイムスパンでさまざまに変動することが調べられている。たとえば、日常的には唾液や腸内細菌叢において、数時間単位で概日リズムに従った菌叢変動が起きており、たとえば唾液から見る

口腔細菌叢では朝と夜で、7~80% もの菌種が変動していることが明らかになっている。また、さまざまな年齢のヒトの腸内細菌叢の比較から、年齢毎の菌叢構造の特徴なども報告されており、無菌マウスの寿命が通常マウスと異なること等からも、長期の腸内細菌叢の変容が様々な機能低下 / 維持と関連を持つと考えられてきた。本講演では、特にヒトにおける前向き研究が困難である、宿主の一生における腸内細菌叢の時系列変動の実際やその個体の機能低下 / 維持への関与について、マウスを用いた最新の結果を報告する。我々は、同腹の SPF マウス (B6)9 匹について、生後直後から死亡まで、定期的に糞便の採取を行い ( 平均 4.3 日に 1 回サンプリング )、16S 解析で細菌叢の変動を詳細に追った。また、マウスは死後解剖を行い、その器官の異常や腫瘍の有無を確認した。9 匹にうち、自然死した７匹を寿命の解析に用いた。マウスの平均寿命は 922.7 ± 71.6 日であり、寿命と若年期 (100-500 日頃 ) のα多様性には正の相関が、老年期 (700-900 日 ) のα多様性には負の相関が見られた。同様の相関は腫瘍の形成においても観察された。また、OTU の時系列ダイナミクスは、大きく 8 つのタイプに分けることができ、ダイ

ナミクスのパターンや、各細菌種の滞在時間は、系統ごとに大きく異なっていた。一生にわたるサンプル中での各 OTU の観察
頻度のヒストグラムは二峰性を示し、一生にわたって存在する「ライフコアマイクロバイオーム」が、その他の一過性の細菌群とは異なったメカニズムで定着している可能性が示唆された。このような機能低下との相関や細菌群の定着に関する特徴は、他の種にも普遍的に見られる可能性があり、さらなる研究が期待される。また、これらの細菌群の挙動と宿主生理の因果関係についても、今後明らかになっていくだろう。

S1-5

環境細菌叢が持つゲノム修飾機構を明らかにする「メタエピゲノム」解析の提唱と実証○平岡 聡史
海洋研究開発機構（JAMSTEC）生命理工学センター
E-mail: hiraokas@jamstec.go.jp

近年、遺伝子の発現制御や細胞の癌化・分化を制御する機構としてエピジェネティクスが注目を集めており、真核生物を対象としたエピゲノム解析が盛んに行われている。一方で、細菌・古細菌といった原核生物においても、DNA メチル化修飾に代表されるエピジェネティクスが起きており、ファージ感染に対する防衛機構 ( 制限修飾系 ) や遺伝子転写制御、DNA 修復等の生理生態学的に重要な役割を担っていることが知られている。近年に至るまで、さまざまな分離培養株を用いた研究が進められてきており、細菌・古細菌のほぼ全ての系統において DNA メチル化が普遍的に起きていると考えられている。ところが環境中の原核生物の大半は培養が難しく、また DNA メチル化修飾の実験的観測の煩雑さや制約の為に、未培養系統が優占する環境細菌叢については解析が行われておらず、エピジェネティクスの普遍性や多様性は検証されてこなかった。そこで我々は、環境
細菌叢のゲノム情報を非培養ベースで解析するメタゲノム解析と、1 分子シーケンシング技術（PacBio シーケンサー）によるDNA メチル化修飾観測技術を組み合わせ、未培養系統が優占する環境細菌叢のエピジェネティクスを観測する新たな手法、「メタエピゲノム解析」を確立し、実際に環境サンプルに対して解析を行ってきた。
本研究では、微生物生態学的な面白さや実験的な制約を考慮し、日本最大の湖である滋賀県の琵琶湖の水圏微生物叢を解析した。表層 5 m と深層 65 m の水サンプルを採取し、Circular Consensus Sequencing (CCS) 法によるショットガンシーケンスとア
センブリを行った結果、細菌・古細菌のドラフトゲノムを 19 株分得られ、その大半は未培養系統に由来していた。これらのゲノム中から DNA メチル化修飾の検出を行い、新規のものを含む多様なメチル化モチーフを発見した。さらに各モチーフを特異的に認識する DNA メチル化酵素遺伝子を推定し、新規の関係性を持つと予測された 4 組について大腸菌を用いた検証実験を行い、対応関係を実証した。本研究は、未培養系統の微生物が優占する環境微生物の DNA メチル化修飾を世界に先駆けて検証した研究であり、メタエピゲノム解析の有用性を実証するものでる。本発表では、本研究の概要を紹介するとともに、技術的な課題や今後の展望等について議論していきたい。
参考文献：Hiraoka, Okazaki, Anda, Toyoda, Nakano, and Iwasaki. Nature Communications. 10, 159. (2019)－ 10 －

日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

S2-1

南極湖沼の硫黄サイクル微生物：優占種の全球分布・ゲノム・プロテオーム○渡邉 友浩 1, 小島 久弥 2, 福井 学 2
マックスプランク研・陸生微生物 , 2北大・低温研

1

E-mail: watanabe1986@gmail.com

南極大陸沿岸には大陸岩盤が露出した地帯があり、そこには雪氷の融解水や海水を起源とする様々な水質の湖沼がある。これ
ら南極湖沼の栄養塩類は乏しいが、過酷を極める陸上環境と比べると湖沼内環境は安定かつ温和であり、微生物を中心とする生態系が築かれている。では、その微生物群集には南極固有の特徴があるのだろうか？本演題ではこの疑問を、硫黄サイクル

微生物を例に考察する。微生物による硫黄循環システムは 35 億年前の太古代地球で発生し、地球の温度低下に応じて機能的・系統的に多様化したと考えられている。このことから類推すると、地球上で最も寒冷な南極の湖沼には固有の硫黄サイクル微生物が存在する可能性がある。我々は、南極の淡水湖（丸湾大池、スカーレン大池、親子池、ウィランズ湖）、寒冷圏の淡水湖（北海道オコタンペ湖）、中温域の淡水湖（滋賀県琵琶湖、山梨県みずがき湖）、亜熱帯の淡水湖（台北フェイツイ湖）の酸化還

元境界層付近に発達する硫黄サイクル微生物群集を解析した。それぞれの調査地から、硫酸還元菌、硫黄不均化菌、硫黄酸化菌から成る固有の細菌群集が見出された。その系統学的位置付けから推察すると、亜熱帯から南極の淡水湖沼にかけて共通の淡水種が分布すると考えられる。特に、硫酸以外の電子受容体を利用する硫酸還元菌や硫黄不均化菌の分布域は広かった。硫黄酸化菌群集の主要構成種は化学合成細菌であり、南極の氷底湖ウィランズ湖では Sulfuricaulis 属が、丸湾大池では同属に加えてSulfuricella denitrificans が優占していた。前者については中温性の培養株のみが知られていたが、その分布域は永久凍土にも及んでおり、耐冷性または好冷性の未培養種が寒冷圏環境に繁茂していると予想される。後者は耐冷性細菌であり、氷河下堆積物を含む様々な低温環境に分布している。オミクス解析によって、両属の培養株が同じ酵素群を用いて硫黄からエネルギーを獲得すること、この機構が他の淡水性硫黄酸化菌と共通することが明らかになった。以上より、硫酸や硫化物が少ない

淡水湖沼には、硫酸に依存しない呼吸（硝酸呼吸や硫黄不均化反応）や ATP 生産を伴う硫黄酸化機構を利用する淡水種が普遍的に分布しているといえる。すなわち、南極の淡水湖沼の硫黄サイクル微生物は、地理的な隔たりや南極大陸特有の環境条件
よりも、淡水湖沼全般に共通する環境因子の影響を強く受けながら進化したと考えられる。

S2-2

無脊椎動物と細菌の共生に着目した新たな雪氷生態系の研究○村上 匠
国立遺伝学研究所

E-mail: tmurakami@nig.ac.jp
雪氷環境中の細菌や藻類の生理や系統的多様性、ゲノム情報に着目した研究が活発に行われている一方で、雪氷無脊椎動物を中心に据えた研究は小規模であり、知見も限られている。しかし無脊椎動物は、上位消費者として雪氷生態系の一角を担う重要な存在である。したがって無脊椎動物の生態、特に他の生物種との関わり合いを理解することは、雪氷生態系全体の構造を理解する上でも欠かせないであろう。我々は、雪氷無脊椎動物への理解を深めるための手がかりの一つとして「細菌共生」に注目した。近年の目覚ましい研究成果によって、動物に共生する細菌群集の活動が、宿主動物の生存や、生息環境の物質循環に影響を及ぼしうることが明らかとなってきている。そこで我々は、「雪氷無脊椎動物にはどのような細菌が共生しているのか」、「共生細菌は宿主である雪氷無脊椎動物、そして雪氷生態系に対してどのような役割を担っているのか」という点を解明するために、雪氷無脊椎動物の主に腸内細菌叢を対象とした、16S rRNA 遺伝子解析とメタゲノム解析を実施した。解析を進めるにつれ、雪氷無脊椎動物の腸内細菌叢の系統組成は、周囲の雪氷環境と大きく異なることが分かってきた。特に、従来の雪氷微生物研究からは報告例の無い、動物の腸内環境に特異的な細菌系統が、雪氷無脊椎動物の腸内において優占していることが判明した。その一方で、本来雪氷上で活動すると考えられている細菌系統の一部についても、雪氷無脊椎動物の腸内などから特異的に検出されることがわかった。こうした結果は、雪氷無脊椎動物を中心に形成される特異な細菌群集が、雪氷生態系内に存在することを強く示唆している。さらに、メタゲノムデータから再構築された各腸内細菌種のドラフトゲノムを解析することによって、腸内細菌種が有する機能遺伝子、特に糖代謝関連遺伝子の詳細が明らとなった。こうしたゲノム情報は、雪氷無脊椎動物と細菌群集との共生の実態に迫るうえで重要な手がかりになると考えられる。発表では、このように最新の研究で明らかとなった、雪氷無脊椎動物と細菌群集の共生の詳細を紹介する。そして、無脊椎動物－細菌間の関係に留まらず、より多様な生物種間の関係性を扱う包括的な雪氷生態系の理解に向けて、メタゲノミクスを始めとする解析技術が果たす役割について議論したい。

－ 11 －

日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

S2-3

氷河上に形成される微生物群集クリオコナイト粒の光合成特性○小杉 真貴子 1,3, 植竹 淳 2, 矢野 充啓 3, 田淵 ゆり 3, 諏訪 裕一 3
NINS・ABC, 2コロラド州立大 , 3中央大・理工1E-mail: kosugi@bio.chuo-u.ac.jp

氷河上の環境は、低温、凍結、強光といったストレスに晒されており、生物の代謝活性を著しく低下させる。こうした極限的な環境にも関わらず、世界各地の氷河表面にはクリオコナイト粒と呼ばれる暗色の微生物群集体が形成され、氷河の融解を早める因子のひとつとして注目されている。クリオコナイト粒の主構成生物であるフィラメント状のシアノバクテリア（ラン藻）は鉱物と絡まることで粒子を形成し、一次生産者として閉鎖的な微生物コミュニティの物質循環に関わっている。本発表では、クリオコナイトの主構成ラン藻の一種であるPhormidesmis priestleyi の生理生態学的特性について紹介する。北極圏のスピッツベルゲン島にあるニーオルスンの氷河で調査を行い、クリオコナイトの氷河上での光合成および呼吸活性と窒素固定活性の測定を行った。生育環境下で代謝は低く抑えられていたが、天然光下ではクリオコナイト全体の呼吸量を十分に上回る炭酸固定速度を示すことが分かった。また、一般的に低温での活性低下が顕著な窒素固定について安定同位体を用いて測定したとこ
ろ、微量であるが活性が検出され、更に光合成活性との相関性が示された。多量のエネルギーを必要とする窒素固定活性と光合成活性が何らかの形で密接にリンクしていると考えられる。P. priestleyi の光合成活性の温度依存性を測定したところ、本種は好冷性ではなく耐冷性の特徴を示し、30℃付近が活性の至適温度であるが、0℃付近でも活性が維持されていた。一方で凍結により光合成器官は大きく障害を受けることが分かった。凍結と同様に細胞に物理的な障害を引き起こす乾燥ストレスに対しては、全く回復を示さず耐性が無いことが示された。氷河後退域における 16SrRNA による細菌叢解析では、P. priestleyi は検出されなかった。したがって、本種は氷河後退域には生育していないことが示唆され、これは乾燥耐性を持たない性質が影響していると考えられる。P. priestleyi がクリオコナイトの優占種となる理由を生理生態学的特性の面から考察する。

S2-4

世界の氷河に分布する雪氷藻類とシアノバクテリアの比較と地理的分布○瀬川 高弘 1, 米澤 隆弘 2, 松崎 令 3, 秋好 歩美 4, 森 宙史 5, 竹内 望 6
山梨大学 , 2東京農業大学 , 3国立環境研究所 , 4国立極地研究所 , 5国立遺伝学研究所 , 6千葉大学

1

E-mail: tsegawa@yamanashi.ac.jp

近年，各国研究者の間で雪氷上に繁殖する微生物への関心が高まってきている．その理由は，地球温暖化に伴い雪氷環境が急激に変化していることと，予想を上回る近年の雪氷の融解量にこの雪氷微生物が関与していると考えられるからである．光

合成微生物のほとんどは緑藻またはシアノバクテリアの仲間で，そのうち積雪上では一般に赤雪として知られるような赤い色
素をもった緑藻の仲間，氷河の裸氷上では暗色物質クリオコナイトを形成する糸状シアノバクテリアの仲間が繁殖する．雪氷上で光合成を行う独立栄養微生物，そしてその生産物を消費する従属栄養微生物は，雪氷上で増殖して表面の暗色化を引き起こすことが知られている．その暗色化が，氷河表面や残雪の太陽光反射率を減少させ，最終的に雪氷の融解を加速させることが近年報告されている．かつて生物学的にほとんど注目されることがなかった雪氷生態系は，今や氷河変動の現状理解や将来予測をするうえで欠かすことのできない，重要な要素として認知されるようになってきた．したがって，雪氷藻類の種分類，それぞれの繁殖，分散過程を理解することは，雪氷上の生態系の理解および生物を介した氷河や積雪の融解過程の理解にとって重要である．

しかしながら，氷河や積雪といった雪氷圏は，極域や高山にそれぞれ地理的に独立して分布していることから，距離的に離れた各地の光合成微生物は同一種なのかどうか，もし同一種だった場合どのくらいの距離を分散可能なのかについてはわかっていなかった．寒冷地でのみで繁殖する雪氷藻類は，気温等の物理的条件で地理分布が制限されているならば，雪氷藻類の分散範囲は気候変動とともに変化してきた可能性がある．

そこで北極域やアジア高山域，南極などの世界各地で採取した雪氷サンプルからの DNA 解析により，氷河上のシアノバクテリアの世界分布，赤雪の緑藻の両極分布の解析をおこなった．その結果，シアノバクテリアと緑藻では，全球スケールの分散過程に違いがあることがわかった．シアノバクテリアの場合は地理的に明瞭な遺伝的構造があることが示されたのに対し，緑藻の場合は特定の種が全球に共通で，かつ現在も分散，交流している可能性が示唆された．シアノバクテリアと緑藻の世界氷河分布から，氷河変動や気候変動との関係について考察する．

－ 12 －

日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

S2-5

古代 DNA を用いた微生物の分子進化速度の推定と集団動態・構造解明への応用○米澤 隆弘 1, 瀬川 高弘 2
東京農大・農 , 2山梨大学 総合分析実験センター

1

E-mail: cyclotis@gmail.com

分子進化速度は集団動態史や集団の遺伝的分化の時間スケールを理解する上で極めて重要なパラメーターであるにも関わらず、多くの生物種とりわけ細菌類や真菌類では研究が進んでいない。培養下ではゲノムレベルでの解析により数ヶ月から数年間という時間スケールで分子進化速度を推定することは可能だが、自然環境下では細胞分裂の頻度や変異源への被曝量、外界からの選択圧が異なることから分子進化速度が異なることが予測されることに加えて、系図の情報が未知のため絶対時間の基準を入れることが極めて難しい。短い塩基配列であっても新規の突然変異が起きるのに充分な時間スケールのなかで経時的に試料を得られれば、試料年代が絶対時間の基準として働くことから直接的に分子進化速度を推定することが可能である。したがって信頼性の高い古代 DNA 配列を得ることでこうした問題を解決することができる。その一方で、古代環境試料に由来する微生

物の DNA 配列と現代の環境からのコンタミネーションとを区別することや、古代試料の年代が統計的に意味のある分子進化速度を得られるのに充分なだけの時間スケールであるかを評価することは困難であった。そこで本発表では、発表者ら自身が提唱する分子進化モデル選択の枠組みでコンタミネーションの評価や試料年代の評価を行う枠組みを紹介し、ここで得られた信頼性の高い分子進化速度をもとに推定したシアノバクテリアの集団動態史について概説する。

E-1

Biogeochemical sulfur isotope fractionation: new insights from biochemistry○ Shawn McGlynn1, Min Sub Sim2
ELSI, Tokyo Institute of Technology, 2Seoul National University, South Korea

1E-mail: mcglynn@elsi.jp

Biological isotope fractionations provide the earliest evidence of life on Earth. In this talk I will discuss how the thermodynamic

potential of a metabolism can be related to isotope fractionation, and also how biochemistry can help us understand metabolic
evolution on Earth. I will focus on microbial sulfate reduction and the determination of enzyme specific kinetic isotope effects,

however, the approaches I will discuss can be used in many other systems and can help us understand life today and in thepast.

－ 13 －

日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

E-2

Evidence of active nitrogen-fixation in hyperthermophilic bacteria fromterrestrial hot springs○ Arisa Nishihara1, Shawn E. McGlynn2,3, Vera Thiel2, Marcus Tank2, Masaru K. Nobu1, Hideyuki Tamaki1,
Shin Haruta2
The National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 2Tokyo Metropolitan University,
Earth-Life Science Institute, Tokyo Institute of Technology (ELSI)

1
3

E-mail: arisa.nishihara@aist.go.jp

Biological nitrogen fixation is an important process in global N cycling and accounts for 70% of the bioavailable fixed nitrogen
supply to the ecosystems. Prior to our studies, nitrogenase activity in hyperthermophilic bacteria ( ≧ 70°C) was not demonstrated.
In a first study, we detected bulk level nitrogenase activity in dense microbial cell aggregates in slightly alkaline hot springs at ≧70°C at Nakabusa (Japan) and analyzed candidate diazotroph in the communities using molecular-based methods. The nifH gene
amplicon sequence analyses performed with DNA material from Nakubusa hot springs obtained high relative abundance of NifH
assigned to three distinct taxa; (i) Thermodesulfovibrio yellowstonii (Nitrospira ) (91.2% amino acid [AA] sequence identity), (ii)
Thermocrinis albus and Hydrogenobacter thermophilus (Aquificae ) (91.5-95.6% AA sequence identity), and (iii) Caldicellulosiruptor
kronotskyensis (Firmicutes ) (100% AA sequence identity). We further successfully isolated a novel hyperthermophilic diazotroph
Hydrogenobacter sp. (Aquificae ). We demonstrated its nitrogenase activity, and revealed the nitrogen fixation gene cluster
arrangement from the isolate`s genome sequence. The complete genome of the novel isolate obtained using PacBio is similar
to H.thermophilus (1.7 Mbp), and contained 1,825 coding gene sequence. A minimum set of six genes for nitrogenase, coding
for structural and biosynthetic components (NifHDK and NifENB), were detected in the nitrogenase cluster. Interestingly, the
NifK related sequence found in the genome showed a stop codon in the center of the sequence, which suggests that either (1)NifK recovered functionality after the mutation occurred, or (2) another yet unknown enzyme might be involved in nitrogenase
assembly in this organism. Our results suggest that biological nitrogen fixation in thermophilic ecosystems is important not only
for supplying fixed-N for the community, but also might reveal unusual nitrogenases and their roles.

E-3

Survival strategies of chemolithotrophic acidithiobacilli in nitrogen-limited
environments○ Shohei Yamada, Atsushi Kouzuma, Kazuya WatanabeLife Sci, Totyo Univ. Pharm. Life Sci.
E-mail: s19805@toyaku.ac.jp

Acidithiobacillus ferrooxidans is an acidophilic iron-oxidizing gram-negative bacterium that can fix atmospheric nitrogen underambient conditions, allowing this bacterium to survive in nitrogen-limited environments, such as acid mine drainages. It is

known that nitrogen fixation activities of diazotrophs are tightly regulated and expressed only in the absence of bioavailable
nitrogen sources in order to save the energy needed for nitrogen fixation. Although the annotated genome of A. ferrooxidans

suggests that this bacterium has putative regulatory genes for nitrogen fixation, detailed molecular mechanisms haveremained unclear. To gain insights into survival strategies of this bacterium under nitrogen-limited environments, we examined

nitrogenase activity and transcriptional profiles of A. ferrooxidans ATCC 23270 in the presence and absence of ammonia. We

also investigated the growth and nitrogen fixation of this bacterium under the supply of electrons from cathodic electrodes inbioelectrochemical systems (BESs). We found that the expression level and enzymatic activity of nitrogenase were increased in

the absence of ammonia, while the expression of nifA , a putative transcriptional activator gene flanking to nifH , (a structuralgene for nitrogenase) was unchanged. We also found that the overexpression of nifA increased the nitrogenase activity. These
results demonstrate that transcriptional regulation of nifA is the key to control the nitrogenase activity in this bacterium. We

also found that, compared to conventional batch cultivation, BESs substantially promoted the growth of this bacterium in theabsence of ammonia in culture medium, suggesting that efficient supply of the reducing power is important for promoting

the growth under nitrogen-limited conditions. We also found that ammonia was produced in culture medium, when the nifA overexpressing strain was grown in BES.

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2019 JSME annual meeting

E-4

The microbial coexistence and functional stability corresponding to flexible
metabolic network in a synthetic microbial ecosystem○ Kenshi Suzuki1, Azwani Fatma2, Masahiro Honjo1, Kensei Masuda3, Koki Amano3,4, Yosuke Tashiro1,
Hiroyuki Futamata1,2,4
Grad. Sch. of Sci. and technol. Shizuoka Univ., 2Putra Malaysia Universiti, 3Grad. sch. of Integr. Sci. and technol. Shizuoka Univ,
Inst. of Green Sci. and Technol. Shizuoka Univ

1
4E-mail: suzuki.kenshi.15@shizuoka.ac.jp

How do multiple microbes coexist and How do microbial community maintain that ecological function? These are fundamental
challenges of microbial ecology and biotechnologies. To understand these things, phenol-fed chemostat reactor consisted withphenol-degrading bacteria-Pseudomonas sp. LAB-08, Cupriavidus sp. P-10, and Comamonas testosteronei R2 was constructed assynthetic microbial ecosystem (SME-I). Real-time qPCR technique targeting gene encoding large subunit of phenol hydroxylase(dmpN ) indicated three strains coexistence over 800 days under substrate limiting condition. Community structure reached anequilibrium in the context of phenol-starvation. LAB-08 and R2 were dominants and P-10 was minor population at equilibrium.
Since genome analyses had predicted that all strains had catechol 2,3-dioxygenase (dmpB ), and also LAB-08 and P-10 had
catechol 1,2-dioxygenase (catA ), gene transcriptional level of dmpN , dmpB and catA were analyzed in SME-II consisted withsame strains and conditions to reveal coexistence mechanism. Although LAB-08 and R2 became dominants and P-10 was minor
population before phenol-starvation, the cell density of R2 similarly decreased with dilution rate. Phenol-starvation led similarequilibrium with SME-I. The gene transcriptional level of P-10 and R2 fluctuated by phenol-starvation. LAB-08 maintainedtranscriptional level of each gene on phenol-starvation and these decreased after phenol-starvation. These results indicatedthat P-10 and R2 sensitively responded to environmental change at the gene transcriptional level. The transcriptional level ofcatA was approximately 10-fold higher than those of and dmpB even strain P-10 was minor population, suggesting that P-10
secreted metabolites and these were used by LAB-08 and R2. In conclusion, microbial coexistence was obtained with metabolic
network and the sensitive responsibility of this network to environmental change enable stable maintenance of system function.

E-5

Analysis of biofilm formation in tight environments○ Andrew S. Utada1, Kana Morinaga2, Tatsuki Kuno1, Masanori Toyofuku1, Nobuhiko Nomura1
Dept. of Life and Env. Sci. and MiCS, Univ. of Tsukuba., 2AIST, Tsukuba

1E-mail: utada.andrew.gm@u.tsukuba.ac.jp

Bacteria exist either freely or as members of biofilm communities, 3D surface-adhered communities encased in a slimy

extracellular matrix. The biofilm lifestyle is fundamental to bacteria biology and ecology, but in many instances the driversof biofilm formation are unclear. Thus, developing tools to aid in the analysis of biofilm formation may enable control and,ultimately, suppression on unwanted surfaces.Many of the environments with the greatest abundance of bacteria are water

filled porous networks. This physical mosaic of fluid networks, full of nooks and crannies, within which the important
ingredients for life are maintained but heterogeneously distributed. Due to the variable characteristic length-scales, which

may vary from nanometers to meters, gradients in shear flow and porosity heterogeneously distributed dissolved gases,

nutrients, repellants, and predators. This heterogenous distribution of important metabolites may contribute to the complex
spatial distributions of bacteria in the local environment. Simultaneously, biofilms themselves can structure and change theenvironment further adding layers of complexity to understanding the ecology of biofilms in the porous environments inwhich they are found.We use microfluidics to study biofilm development in quasi two-dimensional (2D) systems. We fabricate
microfluidic devices that have integrated 2D chambers to trap inoculated bacteria and enable time-lapse observation. The low

ceiling of the 2D chamber prevents bacteria from growing on top of each other, thus enabling easier imaging, segmentation,and tracking of trapped bacteria. We aim to model the natural environment while gaining the ability to visualize growth,intercellular interactions, and to analyze biofilm development of bacteria relevant in bioremediation and water treatment. We
believe that a deeper understanding of the factors controlling biofilm growth in these conditions will enable targeted utilizationof their functions.

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2019 JSME annual meeting

E-6

Effects of supplementation to increase bleaching resilience on hermatypiccoral microbial community○ Sung-Yin Yang1, Ikuko Yuyama2, Naoko Yasuda3, Sayaka Higa3, Tomihiko Higuchi4, Hiroyuki Fujimura3,
Toshihiro Miyajima4, Takashi Nakamura5, Sylvain Agostini1,2Shimoda Mar. Res. Cent., Univ. of Tsukuba, 2Fac. of Life and Env. Sci., Uni. of Tsukuba,
Dep. of Chem., Bio and Mar. Sci., Uni. of the Ryukyus, 4Atm. and Ocean Res. Ins., The Uni. of Tokyo,
5Sch. of Env. and Soci., Tokyo Ins. of Tech.
1
3E-mail: syyang@shimoda.tsukuba.ac.jp

The productive coral-Symbiodiniaceae-microbiome symbiosis (coral holobiont) is the foundation of the thriving reef ecosystem. The
photosymbionts exchange nutrients and provide carbon source to their host, while the microbiome has been shown to be essential
for coral health through its role in nutrient cycle, resistance and resilience to stress and pathogen control. However, the balance of thesymbiosis is easily broken under various stresses, especially high sea water temperature. Over the past decades, climate change has
lead to an increase in the frequency of mass coral bleaching, the loss of the photosymbiont. During the last mass bleaching event of
2016, 97％ of the corals in the largest coral reef of Japan, bleached, resulting in the loss of more than 50% in coral coverage. The lastreport by the Intergovernmental Panel on Climate Change, states that without reduction of greenhouse gas emissions, 70％ to 90％ of
the coral reefs around the world will disappear by 2030. While ocean warming is hard to manage in a short term, actions to mitigate
its impact on coral reefs can be developed. Our group is testing the effects of supplements to assist corals in overcoming bleaching
events. We targeted three type of supplements, Artemia as nutrient, and, Iron and Manganese enriched yeast to provide additional
metals required for the superoxide dismutase enzymes that reduce the stress from reactive oxygen species produced under heatstress. We monitored the changed in the microbiome composition along with the host and photosymbiont physiology under different
supplementation, control and heat stress (27°C and 31°C) for the common hermatypic coral, Acropora hyacinthus . We expect tosee a drastic change in the associated microbial community under heat stress, change that may be mitigated by the supplementation,
especially under the Artemia treatment which was the most effective in increasing the resilience of the corals to the heat stress.

E-7

Azo dye decolorization by Enterococcus faecalis azoreductase activity isenhanced by co-culture with Bacillus sp.
○ Yu Yamanashi, Tsukasa Ito
Dept. of Environ. Eng. Sci., Gunma Univ.
E-mail: t172c002@gunma-u.ac.jp

Textile wastewater discharged into rivers is a serious problem worldwide. Therefore, it is necessary to develop more efficient
microbial decolorization processes for sustainable wastewater management. Recently, the reports of dye-decolorizing bacteria
have increased and several studies reported that bacterial consortia decolorized dyes more efficiently than single strains. It is
important to understand the optimal bacterial consortia for the decolorization processes, and the underlying mechanisms ofsuch consortia. We investigated these issues by comparing the decolorization activity of a mixed culture with that of single

strain cultures under various growth conditions and cell densities. We used two isolated strains: Enterococcus faecalis strain

T6-a1 with dye decolorizing azoreductase activity, and Bacillus subtilis strain S4-ga that did not have dye decolorizing activity.

The dye decolorization rate of the mixed culture of the T6-a1 and S4-ga strains was almost twice as fast as that of the T6-a1
strain single culture despite the same cell density of the T6-a1 strain in both the cases. In our study, although T6-a1 and S4-ga

strains did not affect each other’s growth when mixed, the redox potential (ORP) of the mixed culture was lowered by the S4-ga
strain when the T6-a1 strain was mixed with the S4-ga strain. Interestingly, the ORP value of the mixed culture under aerobic
cultivation was lower than that under N2-purged anaerobic cultivation. At the same time, the dye decolorization activity of themixed culture was accelerated under the aerobic condition compared to that under the anaerobic conditions. These results
indicated that the decolorization activity of the T6-a1 strain was enhanced not only by the lowered dissolved oxygen and ORP,
but also by some interaction with the S4-ga strain.

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2019 JSME annual meeting

E-8

Linking seasonal dynamics of Megaviridae and bloom forming eukaryotic
phytoplankton in Uranouchi inlet, Japan○ Florian Prodinger1, Hisashi Endo1, Yanze Li1, Kento Tominaga2, Tatsuhiro Isozaki2, Yasuhiro Gotoh3,
Takashi Yoshida2, Hiroyuki Ogata1
Bioinformatics center, Kyoto University, 2Graduate School of Agriculture, Kyoto University,
Department of Bacteriology, Faculty of Medical Sciences, Kyushu University

1
3

E-mail: florian@kuicr.kyoto-u.ac.jp“Megaviridae” is a proposed group of NCLDVs (nucleocytoplasmic large DNA viruses). Recent studies have not only confirmedthat several phytoplankton species are preyed upon by these giant viruses, but have also shown that Megaviridae are able toshut down algal blooms. After Megaviridae have been proven abundant in the ocean, an amplicon based sequencing method

revealed their high diversity in several other aquatic environments of Japan. In this study, we investigate seawater samples
collected from Uranouchi inlet, Kochi, Japan. We obtained 43 samples over 18 months from January 2017. The inlet is home
to several blooming algal species. These blooms occur unpredictably, hence sampling was performed sporadically with higher
sampling frequencies during blooming periods. We used an 18S rRNA amplification method and publicly available cell countdata to assess the change in community structure of eukaryotic plankton and bloom-forming species, respectively. We explored
Megaviridae diversity by using a set of 82 degenerate primers (“MEGAPRIMER”) targeting polymerase B genes of Megaviridae.

We utilized different co-occurrence models and machine learning methods on the generated data to investigate the associationof algal and Megaviridae communities, revealing their complex interaction networks.

O1-01

ロドプシンから探るシアノバクテリアの多様な光利用○長谷川 万純 1,2, 西村 陽介 1, 吉澤 晋 1,2
東大・大海研 , 2東大・院新領域

1

E-mail: hasegawa.m@aori.u-tokyo.ac.jp
シアノバクテリアは、主にクロロフィル a を用いて赤色と青色の光を利用し、光合成を行う。一方で、近年の遺伝子解析技術の発展に伴いロドプシンによる光利用機構も幅広い微生物分類群に分布していることが明らかとなってきた。ロドプシンはレ
チナール色素を発色団とする光受容タンパク質であり、多くのタンパク質と色素を必要とする光合成系と比較して非常に単純な構造を持つ。ロドプシンはその機能から、イオン輸送型とセンサー型の二種類に大別され、その利用波長も非常に多様であり、海洋細菌が持つプロテオロドプシンは青色光を、高塩古細菌の持つバクテリオロドプシンは橙色光を利用することが知られている。これまでロドプシンを用いた光利用機構は従属栄養細菌に特有であると考えられてきたが、シアノバクテリ
アからも複数のロドプシンが報告されており（Jung et al. 2003, Mongodin et al. 2005, Hasemi et al. 2016, Niho et al. 2017,
Hasegawa et al. in prep.）、シアノバクテリアがクロロフィルのみならずロドプシンを用いて光を利用している可能性が示唆されている。しかしながら、ロドプシン遺伝子がシアノバクテリア内にどの程度分布し、何色の光を、どのように利用するのかなどの基礎的な知見も殆どない。

本研究では、大規模ゲノム解析をすることでシアノバクテリアにおけるロドプシン遺伝子の分布とその系統を、また見出した
ロドプシンの機能と利用波長を異種発現解析から網羅的に調べた。その結果、ロドプシン遺伝子はシアノバクテリアの系統に広く分布すること、またシアノバクテリアは多様な系統のロドプシン遺伝子を持つことが明らかとなった。さらに、異種発現解析から、シアノバクテリアの持つロドプシンは、系統的・機能的に多様であるにも関わらず、利用波長が緑色光領域に制限されていることが分かった。この結果は、クロロフィルとロドプシンの両方を用いて効率よく光利用を行うため、ロドプシンの利用波長が光合成では利用されない緑色光領域に適応した可能性を示唆している。今後、様々な培養条件下における発現解析を行い、シアノバクテリア細胞内におけるロドプシンの生理的役割や光合成との共存メカニズムを調べることで、光合成独立栄養生物が持つロドプシンの役割を明らかにしたい。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meetingO1-02

海洋真核生物ラビリンチュラ類の生態学的役割と影響
浜本 洋子 1,2, 庄野 孝範 1, 中井 亮佑 3, 上田 真由美 4, 長井 敏 5, ○本多 大輔 1,2
1

甲南大・理工 , 2甲南大・統合ニューロ研 , 3産総研 , 4大阪環農水研 , 5水研セ・中央水研

ラビリンチュラ類は，世界中の海洋に広く生息している従属栄養性の直径 10 μ m 程度の単細胞真核生物である。これまで，

セルラーゼなどの難分解性有機物に対する分解酵素を分泌することから，生態系における分解者として認識されてきた。しかし，我々の最近の研究によって，ラビリンチュラ類の 1 属であ るAplanochytrium が生きている珪藻から栄養を摂取することを明らかとなり，未解明の生食連鎖の経路があることが予想された（Hamamoto and Honda (2019) PLoS ONE 14(1):e0208941）。そこで本研究では，Aplanochytrium に着目し，この現存量を計測することから，ラビリンチュラ類全体が海洋生態系に与える影響力を評価した。
大阪湾において，2017 年 5 月から 2018 年 4 月までサンプリングをおこない，Aplanochytrium の細胞密度を測定した。その結果，1年間 のAplanochytrium の細胞密度の平均は湾央で 2,100 cells/L，湾奥で 13,000 cells/L であった。また，次世代シーケンシング（NGS）を用いて 1 年間のラビリンチュラ類の群集構造解析を行った結果，ラビリンチュラ類全体のうち，Aplanochytrium が湾央で 77.1%（min 0.0 ～ max 100.0%），湾奥で 67.8%（min 0.0 ～ max 100.0%）を占めることが明らかになった。さらに，ラビリンチュラ類の単位面積あたりの年間の炭素生産量を試算し，瀬戸内海で示されている炭素循環に適用
して影響力を評価した。その結果，湾央と湾奥に生息するラビリンチュラ類は，真核生物に消費される植物プランクトンの炭素のうちそれぞれ 6.1%，19.0% を消費し，微小動物プランクトンが消費する炭素のうち 3.6％，16.2%，また，植物食性動物プ

ランクトンでは 1.8％，6.3% を供給していると推定された。カイアシ類の食性解析では，カイアシ類は接餌した原生生物のうち，渦鞭毛藻類（約 41%），繊毛虫類（約 36%），珪藻（約 15%），ナノ鞭毛藻類（約 6%），その他の微細藻類（約 3%）を占めることが報告されている（Yang et al., (2009) Journal of Plankton Research, 31(6), 647-659）。以上のことから，ラビリンチュ

ラ類は，浮遊生態系を理解するうえで不可欠な生物群であるナノ鞭毛藻類などと同程度の炭素を供給していることが示唆され
た。

O1-03

海洋性真核微細藻類が原核生物群集構造に与える影響に関する研究○武部 紘明 1, 富永 賢人 1, 礒崎 達大 1, 山本 圭吾 2, 渡邉 哲弘 1, 吉田 天士 1
京大院農 , 2大阪環農水総研

1E-mail: takebe.hiroaki.42n@st.kyoto-u.ac.jp【目的】微細藻類は海洋の一次生産を担い、生産された有機物の少なくとも半分を、海洋性原核生物が基質として消費する。微細藻類は種ごとに異なる組成の有機物を環境中に放出するとされる。従って原核生物の群集構造は、各藻類種が生成する有機物組成の差異に影響を受けると考えられるが、その違いは未解明である。そこで本研究では、二種の真核微細藻類由来の有機物が原核生物群集に与える影響の違いを明らかにするため、ミクロコズム系を構築し、原核生物群集構造の遷移を比較した。

【手法】Heterosigma akashiwo (NIES-293 株 ) とChaetoceros sp. (NIES-3717 株 ) を f/2 培地を用いて対数増殖後期まで培養した。
2 種の培養液中の細胞を洗浄後に破砕し、両種に由来する有機物画分 Ch と Cc を得た。大阪湾で採取した海水を孔径 3.0 μ m、0.2

μ m のフィルターで濾過した。孔径 0.2 μ m のフィルター上に捕集した原核生物を熟成滅菌海水に懸濁し、Ch および Cc 添加区と、有機物を添加しない対照区を作成した。一週間培養を行い、毎日試料を採取した。各試料から DNA を抽出し、16S rRNA 遺伝子を標的にアンプリコン解析を行った。得られた配列を相同性 99% に基づきクラスタリングし、操作的分類単位 (OTU) を作成した。全 OTU のうち培養中の平均相対量が 0.4% 以上、または一日でも相対量 2.5% を超えたものを優占 OTU とした。

【結果】シーケンシングにより、Ch 添加区、Cc 添加区、対照区でそれぞれ合計 599,769 配列、549,439 配列、731,581 配列が得られ、18,201 OTUs、15,094 OTUs、17,486 OTUs を抽出した。まず Shannon 指数に基づき各実験区のα多様性を調べると、
Ch 添加区は他の 2 つの実験区よりも多様性が有意に低かった (p ＜ 0.001)。次に Bray-curtis 非類似度に基づき全試料の菌叢を比較すると、培養 2 日目以降、対照区と有機物添加区で菌叢は異なり、2 種の有機物添加区間でも差が生じた。優占 OTU (85 個 )に注目すると、Ch 添加区で 11 個、Cc 添加区で 12 個の特異的に出現する優占 OTU が得られた。Ch 添加区では Rhodobacterales

目やFlavobacteriales 目、Cc 添加区では Alteromonadales 目や Vibrionales 目に属する OTU が優占した。これらは全て従属栄養細菌であり、添加した有機物に応答して優占したと示唆された。さらに各優占 OTU の相対量は培養経過に伴い日ごとに大きく変化した。以上より藻類種の差異に伴う有機物組成の違いが、微生物群集構造の遷移に影響を及ぼすことが示唆された。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meetingO1-04

微生物由来蓄電性 Mackinawite が嫌気微生物生態系に及ぼす影響○安池 一貴 1, 片桐 美紀 2, 工藤 優輝 1, 大前 貴裕 2, 田代 陽介 1,3, 二又 裕之 1,3,4
静岡大・院工 , 2静岡大・工 , 3静岡大・創造大学院 , 4静岡大・グリーン研

1E-mail: yasuike.kazuki.15@shizuoka.ac.jp

嫌気微生物の中には細胞外電子伝達により他の微生物と共生的代謝をすることが知られており、導電性鉱物を介した微生物電子共生は共生的代謝を促進させる報告がある。そのため、電気エネルギーは光エネルギーおよび化学エネルギーに次ぐ第3のエネル
ギー源として注目されている。本研究室で分離された硫酸還元細菌Desulfovibrio sp. HK-IIを硫酸還元条件および鉄存在下で培養す

ると蓄電性バイオミネラル（Rechargeable bio-mineral : RBM）であるMackinawite（FeX+1S,X=0~0.11）を生成することが知られている。Mackinawiteは深海海底土圏など嫌気環境に遍在しているため、RBMを中心とした微生物電子共生系が構築されていると考えられるが、未だそのような報告はない。そこで本研究ではRBM存在下における嫌気微生物生態系の構築および代謝評価を行った。

汽水湖底泥を摂取源とし、4 mM 乳酸および RBM を添加した系（RBM 系）および対照系として RBM 無添加系（Control 系）を構築し、経時的に有機酸濃度測定を行った。乳酸消費後、乳酸添加を 2 回実施した後に培地上清 95% を除去し、新鮮な培地を加える継代回分培養を数百日間実施した。その結果、両培養系において乳酸の消費に伴う酢酸およびプロピオン酸の生成、酢酸の消費に伴うメタンの生成が確認された。Control 系と比較すると RBM 系では酢酸消費速度およびメタン生成速度は約 1.9倍および 1.5 倍高いことが示され、両培養系で代謝活性の違いが確認された。さらに代謝活性の違いが微生物群集の違いに起因するのかどうかを確認するために、16S rRNA 遺伝子を標的とした PCR-DGGE の結果を基に MDS 解析をした結果、Control 系とRBM 系のみならず各培養系の上清と沈殿物においても異なる微生物群集構造の形成が確認された。微生物の空間的分布を調べるために SYBER GREEN I を用いて蛍光顕微鏡観察をしたところ、RBM 系では RBM 上への偏在が観察された。さらに、酸化還元物質の存在とその反応電位を調べるため DPV 測定を行った結果、RBM 系にのみピークが存在したため、Control 系と異なりRBM 系ではメディエーターを介した電気化学的代謝を行っていることが示唆された。両培養系の反応性を調べるためにギブズ

自由エネルギーを算出した結果、RBM 系は Control 系と比較して負に大きいことが示された。本研究では RBM は特異的な微生物群集の集積を可能とし、RBM を中心とした電子共生を行っていることが示唆された。

O1-05

廃飲料メタン発酵における基質高負荷時の菌相変動解析○松田 修平 1, 山登 貴広 1, 望月 誉志幸 2, 関口 喜則 2, 大槻 隆司 1
山梨大院・医工農 , 2磐田化学工業

1【背景・目的】廃飲料は有機物を豊富に含み、メタン発酵における基質として非常に有用である。しかし、メタン発酵というのは無数の微生物の生命活動により成り立っており、メタン生成プロセスが複雑なため人為的に制御することが困難である。また、基質投入時の pH 低下にしばしば悩まされることがあり、一度メタン生成が抑制されてしまうと回復を図ることは容易ではない。本研究は、廃飲料メタン発酵において基質高負荷時に pH が低下してしまう状況を再現し、ナノポアシーケンサーを用いて pH 低下時の菌相変動を明らかにすることを目的とした。【方法】30 mL 容ガスクロバイアルにて模擬廃飲料混合物 (SBWM)

を基質としてバッチ培養を行った。SBWM 添加量は 0,0.5,2,5,10 mL とし、静岡県で実稼働しているメタン発酵槽より採取した汚泥を、当研究室でジャーファーメンターを用いて SBWM に順化させたものを微生物接種源として 10 mL 加えた。さらに、
SBWM10 mL 添加試験区を除く試験区にはイオン交換水を加え、全量 20 mL としたのちに気相を窒素置換し 15 日間 55℃にて静置培養した。5 日おきにメタン生産量を測定するとともに培養液をサンプリングし、遠心後、上清の pH および VFA 濃度
測定を行なった。培養終了後、サンプリング時に回収した菌体より DNA を抽出した。さらに PCR を行い、Oxford Nanopore

Technologies の MinION を用いて 16S rRNA 遺伝子解析をすることで微生物群を構成する微生物の推定並びに構成割合の変動を調べた。【結果・考察】培養 15 日後の積算メタン生産量は負荷 5 mL 試験区で 970 mL/L culture となり最も多かった。一方、負荷

10 mL 試験区の積算メタン生産量は 299 mL/L culture となり、pH の著しい低下とメタン生産の抑制が見られた。VFA 濃度測定の結果から、添加量が増加するにつれて酢酸の蓄積量が増加したため、pH 低下の原因であることが示唆された。16S rRNA 遺伝
子解析の結果、いずれの試験区においても、真正細菌はCoprothermobacter proteolyticus 、古細菌はMethanothrix soehngeniiの構成割合が最も高かった。また、高負荷になるにつれてSymbiobacterium thermophilum 、Chrostridium chauvoei の 2 種の構成割合が著しく増大し、pH の低下とメタン生産の抑制に深く関与しているのではないかと考えられた。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meetingO1-06

リアルタイム浮遊菌数測定と生態解析によって室内浮遊菌の実態に迫る○中村 孝道 1, 谷口 惠梨 1, 佐藤 嘉則 2
熊谷組・技研地球環境 , 2東文研・保存科学セ・生物

1E-mail: takamichi.nakamura@ku.kumagaigumi.co.jp

背景：カビ毒やアレルギー疾患、真菌症などの病原となることから、カビ汚染は室内環境汚染のなかでも重要視されている。
浮遊菌の測定は、エアサンプラーを用いた培地への空気質の吹付による培養法を基本としている。培養法では選択した培地や浮遊している菌の種類の影響でごく一部の浮遊菌しか捉えることができず、また測定に数日以上を要するという欠点がある。
さらには、研究例が限定的なため浮遊菌の生態的実態は不明であることから、発生するカビ、培地培養で生えるカビ、浮遊するカビ胞子およびその量の関係性は全く分かっていない。
目的：室内環境における浮遊菌の実態調査を目的とした。様々な室内環境を対象に培養法に拠らないリアルタイム浮遊菌数測
定と生態解析を実施しデータを蓄積し、培養法に拠らない室内環境浮遊菌数測定が衛生的基準化や管理指標として有用性があるか検討した。
方法：一般住宅、事務所、作業所を調査対象とした。微生物センサ（シャープ）および温湿度計により連続データを取得した。
エアサンプラーによる浮遊菌測定を定期的に 3 回実施した。液体サイクロンエアーサンプラーを使用して空気質を採取し、そこから DNA を抽出した。真菌 ITS 領域を対象に PCR 増幅し、得られた産物のアンプリコン解析を行うことで試料中に含まれる浮遊菌の分子生態解析を行った。
結果：微生物センサによる浮遊菌推定値は培養法で得られる CFU の 100 ～ 1000 倍であった。培養法では測定しきれていない浮遊菌をリアルタイムで連続測定することができた。人の出入りや外気の流入などにも敏感に反応しており、得られたデータは妥当性があると考えられる。生態解析の結果においては、未培養真菌類の存在が多いことが分かった。つまり、室内環境においては、培養法では捉えきれない浮遊菌が多く存在していることが示された。また、壁などに発生するクロカビ等の存在はほとんど確認できず、さらには、住環境以外では病原性真菌類はほぼ存在しないことがわかった。したがって、ある程度の浮遊菌量で制御できていれば、適切に温湿度を管理することでカビ発生やカビが引き起こす感染症などのリスクを十分に下げることができると考えられる。すなわち、微生物センサによるリアルタイム浮遊菌測定は、室内空気質微生物汚染の測定に大変有効であり、管理指標として有効的に活用できるものと考えられる。

O1-07

水田土壌における鉄還元菌窒素固定の発見と検証○増田 曜子 1, Zhenxing Xu1, 山中 遥加 1, 伊藤 英臣 2, 白鳥 豊 3, 妹尾 啓史 1,4
東京大・院農 , 2産総研・北海道センター , 3新潟農総研 , 4東大微生物連携機構

1

E-mail: ygigico@gmail.com「麦は肥料で、米は地力でとる」と古くから言い伝えられてきた。これは、畑作では作物の生育が施肥に大きく依存するのに対し、水田では水稲の生育を土壌の窒素肥沃度（地力窒素）が支えていることを意味している。窒素肥沃度の維持には、土壌への窒素供給経路である微生物の窒素固定反応が重要である。水田土壌においては、窒素固定微生物として Cyanobacteria が注目され長年研究されてきた。近年、新潟県農業総合研究所内の連作水田土壌を対象としたメタトランスクリプトーム解析によって、我々はこの既往概念を覆す発見に至った。得られた RNA 配列から窒素固定遺伝子（nif）転写産物の由来微生物を調べたところ、驚くべきことに、Deltaproteobacteria 綱の鉄還元菌（ Anaeromyxobacter, Geobacter 属細菌）由来のものが最も高頻度に検出された。これらの細菌は水田土壌の最優占種である。また、日本各地の水田土壌を対象としたメタゲノム解析を行ったところ、これらの鉄還元菌由来の nif 遺伝子がいずれの土壌においても高頻度に検出された。以上のことから、「鉄還元菌による窒素固定」は水田土壌における普遍的事象である可能性が考えられた。そこで、これら鉄還元菌の分離株を用いて窒素固定能の検証を行った。供試菌株は、ヒ素汚染土壌から単離された Anaeromyxobacter sp.PSR-1 株ならびに我々が水田土壌から単離した Anaeromyxobacter sp. Red267 株（両菌株とも nif を保有）とした。その結果、これらは液体培地中だけでなく水田土壌マイクロコズムにおいても窒素固定活性を示した。また、これらの窒素固定活性は、培地中の Fe 3+ 濃度によって変化することが明らかとなった。これは Anaeromyxobacter の窒素固定活性を確認した初めての例である。一方、高い窒素固定活性を示す複数の Geobacter 属細菌の新種を水田土壌から単離することにも成功した。以上の結果は、これら鉄還元細菌が水田土壌において窒素固定を行っていることを強く示唆するものである。謝辞：PSR-1 株を分与して下さいました天知誠吾博士（千葉大学）、窒素固定活性測定に協力をいただきました青野俊裕博士（東大生物生産工学研究センター）に深く感謝します。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meetingO1-08

稲わらとぼかし肥料の併用が水田土壌からの温室効果ガス生成および水稲の生育・収量に及ぼす影響○犬伏 和之 , 長澤 崇 , 谷道 拓郎 , 李 セン , HMWE Kyu Kyu
千葉大・院園芸

E-mail: inubushi@faculty.chiba-u.jp
背景・目的：水稲栽培では、水稲生育と地力向上のため稲わらや有機質肥料が施用されるが、こうした有機物は嫌気的に分解され温室効果ガス、メタン（CH4）生成の基質となり地球温暖化を助長する。そこで CH4 抑制技術の一つとして製鋼スラグ等の含鉄資材の施用が提案され、これまでに CH4 放出量の 6-34% 抑制、単位収量あたりの CH4 放出量の減少等がポット試験で報告されている。一方で、ぼかし肥料など有機質肥料等と含鉄資材を併用した場合の温室効果ガス生成・放出に関する報告は少ない。本研究では、ぼかし肥料と含鉄資材の併用が CH4 放出および水稲生育・収量に及ぼす影響を水田圃場で検証し、ぼかし

肥料および含鉄資材の適切な利用法を開発することを目的とした。実験方法：千葉県横芝光町の農家水田（中粗粒グライ低地
土）に 2017 年には含鉄資材（ミネカル）とぼかし肥料を併用した区、’18 年には含鉄資材 2 種（農力アップ、ミネカル）とぼ
かし肥料を併用した区を設け、ぼかし単用区および化学肥料単用区と比較して、水稲生育期間中に CH4 放出量をチャンバー法

で測定し、水稲生育および収量、’18 年には Real-time PCR (16S, mrcA53) 法により土壌微生物量と CH4 生成菌活性を評価した。
結果・考察：CH4 フラックスは ’17 年には、ぼかし単用区＞ミネカル併用区≧化学肥料区となり、含鉄資材の CH4 放出抑制効

果が確認できた。’18 年は農力アップ併用区＞ミネカル併用区≧化学肥料区の順に高くなり、’17 年と比較して全試験区で大幅に増大した。‘18 年は記録的猛暑だったため CH4 放出抑制効果が確認できなかったと考えられる。含鉄資材を併用した 2 区で差が出たのは、含鉄資材に含まれる鉄含量およびアルカリ成分の影響が考えられる。ミネカルの鉄含量は農力アップの約 2 倍あり、電子受容体として機能し CH4 生成が抑制されたか、mrcA53 がミネカル併用区≧農力アップであったことから、ミネカル施用で高 pH 化し CH4 生成古細菌の活性が抑制されたと考えられた。収量は ’18 年で含鉄資材併用区の一穂籾数の有意な増加が見られた。ミネカル併用区では ’17 年でも同様の結果が得られたが、’18 年では ’17 年に較べ、猛暑や初夏の日照不足で穂数が減少し減収した。ぼかし肥料と含鉄資材の併用はケイ酸が供給され一穂籾数が増加することによる増収が期待できると示唆された。

O1-09

地下圏の脱窒とメタン生成の有機物利用における競合 : 菌叢の違いは関係ない？
○芦沼 完太 1, 松下 慎 2, 木村 浩之 3
静岡大・院理・地球 , 2産総研 , 3静岡大・理・地球

1E-mail: ashinuma.kanta.14@cii.shizuoka.ac.jp

海洋プレートの沈み込みによって形成された付加体の深部地下には嫌気性の地下温水と、CH4、N2を主成分とする天然ガスを大量に含む帯水層が存在している。先行研究によって、深部帯水層では水素発生型発酵細菌と水素資化性メタン生成菌の共生によってメタン生成が起きていることが明らかにされている。一方、天然ガス中の N2の起源は微生物による脱窒による可能性があるが、詳細は不明である。一般的に、脱窒に関する研究は主に土壌、河川や湖沼の堆積物、海底堆積物が対象であり、深部帯水層における脱窒についてはほとんど研究されていない。しかし、地球規模での窒素循環の理解を深めるには、表層だけ

でなく地下における脱窒についても吟味することが重要である。本研究では付加体分布域の静岡県内の４つの掘削井から嫌気性の地下温水と天然ガスを採取した。化学分析の結果、天然ガスの主成分は CH4（36.7-96.9%）であったものの、N2（0.79-

63.2%）も含まれていた。さらに、天然ガスの N2/Ar 比は 13 から 241 を示し、空気が飽和した水の値（40）よりも有意に高い

サイトが存在した。この結果は、天然ガスに含まれる N2が深部帯水層で生成されたことを示している。地下温水に含まれる微生物群集から DNA を抽出し、脱窒菌のバイオマーカーである亜硝酸還元酵素をコードする遺伝子（nirS および nirK ）を対象としたクローニング・シーケンス解析および定量 PCR を行った。さらに、16S rRNA 遺伝子を対象とした次世代シーケンサー解析を行った。その結果、主にα -Proteobacteria 、β -Proteobacteria 、γ -Proteobacteria に由来する nirS および nirK が検出され、それらの機能遺伝子の量はサイトごとに有意に異なっていた。また、地下温水に有機基質を添加したメタン生成菌群集を対象とした嫌気培養および有機基質と硝酸（または亜硝酸）を添加した脱窒菌を対象とした嫌気培養を行った。その結果、脱窒菌とメタン生成菌群集の間で有機物利用における競合が起きており、硝酸または亜硝酸の存在下においては脱窒菌による N2生成が優位であることが示された。さらに、各サイトにおいて天然ガスに占める N2の割合が異なる原因は、深部帯水層における菌叢の違いや脱窒菌の菌叢の違いではなく、深部帯水層への硝酸または亜硝酸の供給量が影響していると推定される。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

O1-10

土壌のバクテリア群集の窒素応答は進化系統的に保存されている○磯部 一夫
東京大E-mail: akisobe@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp
土壌に生息する豊富で多様なバクテリア群集は動植物遺体の分解、物質循環の形成、植物への養分供給、炭素や窒素の貯蔵などの機能を担い、生態系を支えている。そのため生態系が環境の変動に対してどのように応答するのかを理解するためには、土壌に生息するバクテリア群集の環境応答を理解することが重要である。しかしバクテリアはわずか 1 グラムの土壌に数千種もいると推定されるほど多様であるために、土壌に生息するバクテリア群集の環境応答を予測することは非常に困難である。
本研究では、バクテリア群集の環境応答は進化系統的に保存されている ( 進化系統的に近いバクテリアは環境の変動に対して類似の応答を示す ) という仮説を立て、検証した。

バクテリア群集の窒素施肥に対する応答に着目し、世界 13 地点 ( 森林、農耕地、草地 ) で行われた窒素施肥実験において得られたバクテリア群集組成のメタ解析を行った。それぞれの地点で、群集内の各バクテリアの窒素施肥に対する応答 ( 存在量が増えるか減るか ) を算出し、その応答が進化系統的に保存されているかどうかを検証した。続いて、13 地点のうち多くの地点で検出されたバクテリアに着目し、それらバクテリアの応答が、異なる環境下でも一様の応答を示すか、環境毎に異なる応答を示すかを検証した。

その結果、バクテリアの窒素施肥に対する応答は、検証した 13 地点のうち 12 地点において進化系統的に保存されていた。

続いて、すべての地点のデータを合わせた際に見られる窒素施肥に対する応答の系統パターンは各地点で見られた応答の系統パターンと類似していることが認められた。このことから、多くのバクテリアは環境条件 ( 生態系や窒素施肥量 ) が異なったとしても窒素施肥という環境変化に対し一様の応答を示すと考えられ、それらの系統を特定することができた。以上の結果は、進化系統情報を用いることで窒素施肥に対してバクテリア群集の組成がどのように変化するのかを予測できる可能性があることを示している。

O1-11

地球規模で分布する N2O 放出ホットスポットから強力な N2O 消去能をもつ
Chitinophaga 属細菌の探索○橋床 泰之 1, 祐太 高津 1, Sharon YL Lau1,2, Tahvanainen Teemu3
北海道大 ･ 院農 , 2STPRI, Malaysia, 3Univ. Eastern Finland1E-mail: yasu-h@abs.agr.hokudai.ac.jp【背景】亜酸化窒素（N2O）は等モル量当たり二酸化炭素の約 300 倍もの温室効果を示す，化学的に安定なガスで，オゾン層破
壊原因物質としても知られている。熱帯から温 ･ 冷帯，ツンドラ帯の亜北極まで，広く N2O 放出ホットスポットが存在し，多くはヒトによる土地攪乱，過度な施肥，汚水の流入，ならびに地球温暖化に起因している。N2O 生成は，脱窒（嫌気的硝酸塩呼吸）による NO32から N 2への還元途中で，N 2O を最終電子受容体として大気中に放出してしまう不完全脱窒がかなりの部分（7090％）を占めると考えられている。N2O を N2に還元する N 2O リダクターゼ（N2OR）は，酸性条件下あるいは低温条件下で不活性化する。そのため，酸性土壌や寒冷地に棲息する脱窒細菌では N2OR が十分に機能しないか，その遺伝子 (nosZ 等 ) 自体の欠落が起こり，N2O 放出微生物として振る舞うことになる。熱帯泥炭開墾地土壌からBurkholderia 属細菌等を，北海道の黒ボク土
畑地圃場からはPseudomonas 属細菌等を強力な N 2O 放出細菌として分離・同定している。これらのスクリーニングの途上で，
N2O 消去に関わる細菌を見出したため，それらの同定を試みた。
【方法 ･ 結果 ･ 考察】N2O 放出細菌のスクリーニングにおいて，培養開始期のヘッドスペースに存在する大気由来の N2O（0.4 ppmv）が完全なゼロレベルにまで消去されたものが認められた
ため，N2O 消去能を有する土壌微生物の探索を並行して進めた。土壌懸濁を接種した低窒素培地ジェランガム培地（pH 4.5）に出現したコロニーを分離し，10000 ppmv の N2O が封入されたソフトゲル培地で単独培養した。その結果，10000 ppmv の N2O
を 1 週間以内にゼロレベルにまで消去する細菌株をそれぞれの土壌から分離することに成功した。これらは，熱帯と冷帯から得た土壌がそれぞれの分離源であるにもかかわらず，同定した N2O 消去細菌は明らかに種が異なるが同属のChitinophaga spp. であった。前者は NGS にかけ，N2O 消去に関わると考えられる遺伝子クラスターを同定した。また，硝酸アニオン，亜硝酸アニオンの増長を追跡した。さらに北欧亜北極域で採取し，N2O 消去活性が高いパルサ崩壊地土壌サンプルからも，NGS による菌叢解析でChitinophagaceae が比較的高比率に出現していた。そのため，この土壌からも N 2O 消去細菌としてChitinophaga 属細菌が得られる可能性がある。Chitinophaga が共通して持つ消去機構と窒素循環に果たす役割を検討する必要がある。

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2019 JSME annual meeting

O1-12

拮抗菌Bacillus amyloliquefaciens の阿蘇地域での生態的地位○染谷 孝 , 龍田 典子 , 上野 大介
佐賀大・農

E-mail: someyat@cc.saga-u.ac.jp【目的】熊本県阿蘇地方では草原に自生するススキやカヤなどの野草を秋に収穫して大きなロール状ないし刈り芝状にして野外に置き，風雨に半年以上さらして自然に腐熟させたものを野草堆肥と呼び、有機質肥料として田畑に混合施用ないしマルチ
施用している．これにより植物病害が軽減されると経験的に言われており，それを検証するために，野草堆肥およびその施用土壌に含有する拮抗菌を定量・分離し，その生態を探った．【方法】2015 年 -2017 年に阿蘇の 8 地点から，乾燥保管している
野草ロール，熟成した野草堆肥，その施用土壌の計 55 点を採取した．これらの試料に含有する，Fusarium oxysporum F. sp.

cepae に対する拮抗菌を当研究室で開発した直接選抜培養法を用いて定量した．すなわち，Nutrient Agar (NA)3 連に上記糸状菌胞子懸濁液（105 spores/mL）と土壌や野草堆肥試料の希釈懸濁液（103-105）を各 100 μ L 塗抹接種し，30℃で 5 日間培養

し，発育阻止円を形成するコロニーを拮抗菌として計数し，分離純化した．【結果】F. oxysporum に対する拮抗菌は野草ロー

ルでは 104-105 CFU/g 乾物，野草堆肥では 104-108 CFU/g 乾物，その施用土壌では 104-108CFU/g 乾土存在し，野草を堆肥化することで拮抗菌が増殖すること，施用土壌に定着することが示唆された．拮抗菌は Bacillus 属細菌および放線菌で，前者の多くはFusarium のみならず，Ralstonia および Pythium に対しても拮抗能を示したが，後者は Fusarium のみに拮抗能を示した．
API および 16S rRNA の解析により，時期も分離源も異なるBacillus 属拮抗菌分離株 20 株はほぼすべて同一のクローンであることが判明した．一方，NA で非特異的に分離純化して得られたBacillus 属細菌は多様であった．また放線菌は分離源を問わず

Streptomyces 属の特定の菌種（S. albidoflavus ）であった．【考察】阿蘇地方から分離された拮抗菌は，いわば「阿蘇菌」と呼べる一定の抗菌スペクトルを持つ特定の菌種であった．これら阿蘇菌は，阿蘇の草原の植物や栽培作物と「共生」する中で繁栄し特有の生態的地位を占めるようになったと考えられる．

O1-13

The oil-eating gangs: Metagenomics revealed the multi-species oilhydrocarbon-degrading soil bacterial consortium evolved in the lab-scaleenrichment○ Jiro F. Mori, Yuna Tomiyama, Robert A. Kanaly
Grad. Sch. of Nanobiosciences, Yokohama City Univ.
E-mail: morij@yokohama-cu.ac.jp

Oil spills are recognized as a global environmental pollution issue, because many of the hydrocarbon oil components such asalkanes and polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) exhibit acute toxicity and genotoxicity to the surrounding organisms. Oildegrading microorganisms have thus been attracting interest as potentially efficient players for bioremediation of polluted sites.

Former studies proposed certain bacterial genera as potential oil-degraders, however a single bacterial group may only be able

to biodegrade a fraction of the complex oil components. More likely, the collaborative activities of several key bacterial players

are necessary to eliminate the various oil components. Here, we have investigated an oil-degrading soil bacterial enrichment,
which has been maintained for years with a constant supply of diesel fuel as the sole carbon and energy source. We employed
this bacterial consortium as a simplified model to investigate the active oil-degrading soil bacterial community and to identify

the key oil-degrading bacteria and the roles of each bacterial member. In this capacity, a metagenomics functional gene surveyof the consortium to study the potential roles of each bacterial genus growing in the consortium was conducted (e.g., alkane-,

PAH-degradation, biosurfactant production, biofilm formation, etc.). Some bacterial genera were isolated in pure culture andtheir growth / biodegradation capabilities were further tested. Results indicated that the consortium harbors more than 50
bacterial genera and the dominant six genera potentially play the central roles in alkane- or PAH-degradation, or both. These

results suggest that the biodegradation of complex oil hydrocarbons requires multi oil-degrading bacterial groups, and provides
new insight into how the soil bacterial community develops in response to continuous oil pollution exposure.

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meetingO1-14

ベシクル分化に異常を示す窒素固定放線菌Frankia casuarinae の変異株
○飛鳥井 滉也 1, 松山 伸太朗 1, 中條 将希 2, Louis Tisa3, 九町 健一 1
1

鹿児島大・院理工 , 2鹿児島大・理 , 3Dept. of Mol., Cellular and Biomed. Sci., New Hampshire Univ.

E-mail: asukairigaku@gmail.com

窒素固定とは大気中の窒素ガスをアンモニアへと還元する反応のことであり、窒素養分の供給源として必要不可欠な役割を果たしている。Frankia は窒素固定を行うことのできる多細胞の放線菌である。アンモニア欠乏（N-）・好気（O+）条件下では、窒素固定酵素（ニトロゲナーゼ）を発現する球状の構造体（ベシクル）を形成する。ベシクルはホパノイド脂質の厚い膜で覆われている。ベシクル膜は内部への酸素透過を制限することで、酸素に弱いニトロゲナーゼが失活することを防いでいる。N-・
嫌気（O-）条件下では、ベシクルは形成されず、菌糸で窒素固定が行われる。これまで、Frankia におけるベシクル分化を制御する遺伝子は見つかっていない。

私たちの研究室では、N-・O+ 条件でほとんどベシクルを形成できず、アセチレン還元活性（ARA）を示さない変異株 G23D3 を単離した。本研究では、変異株 G23D3 におけるベシクルの表現型をより詳細に特徴づけ、変異原因遺伝子の特定を試みた。

変異株 G23D3 のベシクルの大きさは野生株 WT の約 60％程度であった。さらに、位相差顕微鏡で観察すると、WT と比べて、ベシクルの位相が非常に暗かったことから、変異株 G23D3 はベシクル膜を十分に形成できないと考えられた。これらの結果から、G23D3 はベシクル原基の発生からベシクル成熟に異常を持つ変異株であると考えられた。加えて、N-・O- 条件下での ARAを評価することで、ベシクル分化またはアンモニア欠乏の感知のどちらに異常があるかを調べた。

異常表現型に関与する変異原因遺伝子を決定するために、変異株 G23D3 由来の復帰変異株（G23D3r1、G23D3r2、G23D3r3）を単離した。窒素固定能を評価するために、N-・O+ 条件下における、増殖速度と ARA を調査した。すべての復帰変異株は、野生株と同等の増殖と ARA を示した。また、すべての復帰変異株が形成したベシクル数は野生株と同程度であり、形成されたベ
シクルは野生株と同程度の大きさと位相の明るさであった。これらの結果から、すべての復帰変異株の表現型は野生型に復帰していると考えられた。

変異原因遺伝子を同定するために、変異株 G23D3 と復帰変異集団のゲノム解析を行った。変異株 G23D3 では変異型、復帰変
異集団では野生型を示す塩基を含む遺伝子が変異原因遺伝子だと考えられる。

O1-15

共生・非共生状態での窒素固定能に異常を示す放線菌Frankia の変異体
○九町 健一 1, 飛鳥井 滉也 1, Van Nguyen1, Louis Tisa2
鹿児島大院・理工 , 2Univ. New Hampshire

1

E-mail: k9928078@kadai.jp

Frankia は、窒素固定能を持つ多細胞放線菌である。アクチノリザル植物と呼ばれる 8 科 200 種以上の非マメ科植物の根に根粒を着生して共生し、その内部で窒素固定を行う。加えて、非共生状態においても窒素固定能を示す。Frankia は、ベシクルと呼ばれる球状の酸素耐性構造体を分化することにより、好気条件でも窒素固定を行うことができる。このようなユニークな形質に関わる遺伝子を同定するために、私たちはFrankia casuarinae において窒素固定が行えない突然変異体を単離した。そのひとつである N3H4 株は、非共生状態においてベシクル形成は正常に行えるものの、アンモニア欠乏（N-）培地で生育せずに窒素固定活性（アセチレン還元活性）も示さなかった。加えて、宿主植物Casuarina glauca の根に接種しても根粒形成を行わなかった。これらの結果から、N3H4 変異株は共生・非共生双方の窒素固定に重要な遺伝子に変異を持つと考えられた。この多面的な表現型を引き起こす変異原因遺伝子を同定するために、N- 固体培地上で生育するコロニーを単離した。これらの株は、非共生状態のみならず、共生状態においても窒素固定能を回復していた。よって、変異原因遺伝子は、非共生および共生状態
での窒素固定能を支配していると考えられた。N3H4 変異株と 5 つの回復株のゲノム配列を解析した結果、変異株と回復株は両方とも NAD+合成酵素遺伝子に変異を持っていた（C1751T, T584I）。加えて回復株は同じ遺伝子にもう１つ変異を持っていた（G1432A, D478N）。この結果から、第１の変異が NAD+合成酵素の活性を損なう原因変異であり、第 2 の変異はその影響を抑制するサプレッサー変異であると予想された。この予想を確かめるために、細胞内の NAD(H) 濃度や、NAD+合成酵素活性の測定を行った。

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2019 JSME annual meeting

O1-16

難培養性微生物Nitrospira に共存する従属栄養細菌による増殖促進メカニズムの解明○村上 千穂 1,2,3, 金田一 智規 2, 町田 光史 4, 中尾 洋一 4, 大橋 晶良 2, 青井 議輝 3
安田大・薬 , 2広島大・院工 , 3広島大・院統合生命 , 4早大・先進理工1

E-mail: murakami-ch@yasuda-u.ac.jp

環境中の多くの微生物は難培養性であることが知られている。その事実は微生物学において本質的に重要な課題であるにもかかわらず、なぜそれらが培養できないのか、つまり難培養性という性質についての本質的な理解は全く得られていない。一方で、門レベルで難培養性を示すNitrospira は、亜硝酸酸化反応を主要に担う重要な微生物種であるにも関わらず、分離に成功

した例は極めて少ないが、我々は新規な手法を適用することで、Nitrospira の純粋菌株を獲得している。本研究では、難培養性
微生物Nitrospira をモデルとして用いて、難培養性微生物の増殖を制御する因子やメカニズムについて、微生物間相互作用の観点から解明することを目的とした。

化学独立栄養細菌であるNitrospira は実際の環境中では自身の代謝副産物である有機物を基質として増殖する従属栄養細菌と共存しており、それらの従属栄養細菌の増殖は完全にNitrospira に依存している。しかし、独立栄養細菌（Nitrospira ）側がそれら共存する従属栄養細菌から何らかの利益を享受しているか否かについてはよく分かっていない。そこで、Nitrospira と共存する従属栄養細菌を複数菌株単離し、Nitrospira との共培養を通じて亜硝酸酸化反応を促進する微生物をスクリーニングして、実際にNitrospira の増殖を促進する従属栄養細菌を複数獲得した。この増殖促進メカニズムは、従属栄養細菌が 1) Nitrospiraの増殖を阻害する物質を消費する、または 2)Nitrospira の増殖を促進する物質を供給するという二つが考えられる。そこで、

Nitrospira の培養上清と従属栄養細菌の培養上清を質量分析法によって比較解析したところ、複数得られた従属栄養細菌は、
Nitrospira と共存する微生物は、阻害物質を除去しているものと増殖促進物質を出すものとに分かれることがわかった。つまり、
1) と 2) の両方の役割を分担して増殖を促進していることが分かった。

O1-17

Dynamics of bacterial cell growth impaired by a novel system dedicating
cells to horizontal gene transfer○ Ryo Miyazaki
AIST
Integrative and conjugative elements (ICEs) are widespread mobile DNA elements in the prokaryotic world. ICEs are usuallyretained in a bacterial chromosome, but can be excised and transferred from the donor to other bacterial lineages. Horizontaltransmission of ICEclc, a prevalent ICE in proteobacteria, is accomplished by developing specialized transfer competent (tc)cells in the donor population. The tc cells entirely dedicate to the ICE transmission by sacrificing their proliferation. The cell

growth impairment is mediated by two specific genes, parA and shi, on ICEclc, but its mechanistic details and cellular dynamics
are still unknown. We here developed fluorescence reporter strains to monitor intracellular behavior of ParA and Shi proteins
as well as host cellular proliferation at the single-cell level. Superresolution imaging revealed that ParA colocalized with thehost nucleoid while Shi diffused in cytoplasm during the growth impairment. The two proteins directly interacted in vivo, andmutations in the Walker A motif of ParA diminished the inhibitory effect. Quantitative analysis of time-lapse microscopy data

revealed that ParA and Shi initially blocked chromosome segregation, leading to a delay in cell division, and, as time elapsed,

eventually inhibited cellular elongation. The parA-shi locus is highly conserved in other ICEs, and the ParA-Shi-mediatedgrowth inhibition was still observed in different proteobacterial species, suggesting that the system can become selected toefficiently distribute ICEs in a particular niche. The results of our study provide mechanistic insight into the novel and uniquesystem on ICEs and help to understand such epistatic interaction between ICE genes and host physiology that entails efficienthorizontal gene transfer.

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2019 JSME annual meeting

O1-18

高感度 rRNA-SIP と動態解析で探る環境微生物の代謝様式○青柳 智 , 羽部 浩 , 堀 知行
産総研・環境管理

E-mail: aoyagi-to@aist.go.jp【目的】Stable Isotope Probing (SIP) は環境中の未知微生物の代謝機能と系統を分離培養を介さずに直接的に同定できる。我々が改良した高感度 rRNA-SIP では、同位体標識されて「重くなった」rRNA の塩基配列を次世代シークエンサーにより大規模に解読することで、存在量は少なくとも代謝活性を有する微生物を高感度に検出することが可能となった。本発表では、高感度
rRNA-SIP と微生物動態解析を組み合わせることで示唆される、未知微生物の代謝様式を紹介する。【方法・結果】1,4- ジオキサ

ンは人への発がん性が指摘されているが、石油化学製品の製造過程で副産物として生成される難分解性物質である。石油化学

工場の生物処理槽から取得した活性汚泥試料に、13C 標識 1,4- ジオキサンを加えて培養したところ、1,4- ジオキサン濃度の減少と同時に 13CO2が生成した。その活性汚泥試料から RNA を抽出し、超遠心分離を行った。これにより、 13C 標識 1,4- ジオキサン

由来の 13C を含む「重い RNA」がチューブ下部に集積された。「重い RNA」の上位 3 画分を回収し、次世代シーケンサーで合計

100 万配列以上の微生物 rRNA を解析した。12C 添加区（対象区）との比較解析により、有意に 13C を分解し取り込んだ微生物

として、10 種を同定した。このうち 1 種は既知の 1,4- ジオキサン分解菌と系統学的に同一であったが、他の 9 種はそれぞれ異なる多様な系統学的位置に属した。実廃水の生物処理槽において、今回同定された分解菌の動態を約 1 年間モニタリングした。
その結果、10 種のうち 9 種が検出され、非検出の 1 種の 13C 取り込みは偽陽性だったと判断された。また検出された 9 種の分解菌はいずれも低い年間平均相対存在量（0.001 %-1.523 %）を示し、活性汚泥中で稀少種として存在していた。興味深いことに、最も重い画分から発見された 4 種は、相対存在量が極めて低い傾向があり（平均：0.008%、範囲：0.001%-0.021%）、一方で 3 番目に重い画分で検出された 5 種は、より高い存在量（平均：0.483%、範囲：0.001%-1.523%）を示した。以上から、最も重い画分で同定された分解菌は 1,4- ジオキサンのみを分解し、それで得られる僅かなエネルギーにより生存していること、
さらに 3 番目に重い画分の分解菌は処理槽内に共存する他の有機物（アルカン類等）を分解して得られたエネルギーを基に増殖し、1,4- ジオキサンは共代謝的に利用していることが強く示唆された。

O1-19

繊毛虫Tetrahymena thermophil の増殖に及ぼす可視光照射と細菌由来二次代謝物の複合的影響○佐野 翔平 1, 多羅尾 光徳 2
東京農工大・院農学府 , 2東京農工大・農学研究院

1【はじめに】我々は本学会第 31 回大会にて，可視光照射が繊毛虫 Tetrahymena thermophila の増殖に及ぼす影響を明らかにすることを試み，以下の 3 点を報告した。（1）溶存態有機物を生育基質とした場合は光照射によって増殖が抑制された。（2）培養期間後半で光条件から暗条件に切り替えても増殖抑制が維持された。（3）細菌を生育基質とした場合は光照射下においても増殖は抑制されなかった。これらの結果より，光照射による原生動物の増殖抑制は，光照射によって変質した培地成分が阻害的な影響を及ぼすことが考えられた。しかし，光照射によって変性成分を生じるメカニズムや，細菌を生育基質としたときには光照射による増殖阻害が生じなかった理由を明らかにするには至らなかった。そこで本研究では，（1）光照射により生じた活性酸素種が培地の変質をもたらす，（2）細菌由二次代謝物が光照射による原生動物の増殖抑制効果を緩和するとの仮説を立て，これらを検証する実験を行った。【材料と方法】1．活性酸素種の影響

原生動物として繊毛虫 T. thermophila を，活性酸素種として 過酸化水素を用いた。ペプトン，酵母エキス，グルコースをそれぞれ 300，150，150（単位 mg/L）含む培地（PYG培地）に，過酸化水素（終濃度約 0.06ppm）またはカタラーゼ（終濃度約 0.02mg/mL）を添加し，繊毛虫を約 1 × 102 cells/

mL となるように接種した。明条件 1（培養期間中に光照射），明条件 2（繊毛虫接種前の 6 日間に光照射）または暗条件で 15℃にて培養し，繊毛虫の細胞数を経時的に測定した。2．細菌由来 2 次代謝物の影響（1）PYG 培地，（2）PYG 培地で細菌を定常期まで増殖させた培地（PYG ＋ E 培地），（3）PYG ＋ E 培地から細菌をろ過滅菌し，濃縮した PYG 培地を上記の濃度になるように再添加した培地（PYG-E 培地）に，繊毛虫を約 1 × 102cells/ mL となるように接種，明条件または暗条件で培養し，繊毛虫の細胞数を経時的に計数した。【結果と考察】光照射によって培地中に過酸化水素が約 0.06ppm 検出された。暗条件培養系に過酸化水素を添加した場合T. thermophila の増殖は抑制された。一方，明条件培養系にカタラーゼを添加し過酸化水素を除去してもT. thermophila の増殖は回復しなかった。これらの結果より，過酸化水素が培地を変質することで原生動物の増殖が抑制されたと考えられる。細菌由来二次代謝物の影響の実験結果および考察については，本大会当日に報告する。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meetingO1-20 [

シアノバクテリアはスパイダーマン？

糸の伸縮で動く仕組み○中根 大介 , 西坂 崇之
学習院大・理・物理
IV 型線毛は多くの原核生物に見られる超分子複合体である。Twitching motility と呼ばれるバクテリアの表面運動は，IV 型線

毛からなる繊維構造が伸長・付着・収縮を繰り返すことで，細胞が固体表面上を動く際の推進力を獲得している。IV 型線毛のモーターとしての性質は生物物理学的に精査されているが，その制御メカニズムについては不明な点が多い。本研究では，シアノバクテリアのモデル生物であり，光の向きを『認識』することで知られるSynechocystis sp. PCC6803 を用いて，単一細胞レベルでの IV 型線毛ダイナミクスを詳細に計測した。我々は，光学顕微鏡下で蛍光ビーズを用いて，その動態を検出し，忌避光である青色光刺激によって制御されることを実証した。つまり，細胞が光源から逃げるように，IV 型線毛の伸長と収縮は光照射の前方側でのみ活性化されていた。加えて，我々は線毛を蛍光標識で直接可視化することで，このとき線毛が非対称に分布することを定量化した。細胞は青色光を照射されると，0.2 分以内に細胞全体にある IV 型線毛を均一に活性化するが，1 分

後には光受容タンパク質 PixD を介して，その活性化を光軸に沿って非対称なものへと変化させ，指向性のある細胞運動を達成する。この一連の過程は，IV 型線毛装置だけでなく，アーキアのべん毛や他の分泌装置といった，本質的に共通だと期待されるシステムの制御メカニズムを理解する手掛かりとなるだろう。

O1-21

海産珪藻感染性 DNA ウイルスゲノムに存在する機能不明遺伝子の発現
角野 貴志 1,2, 足立 真佐雄 1, ○外丸 裕司 2
1

高知大・農林海 , 2水産機構 瀬水研

我々の研究グループでは、海洋の重要基礎生産者である珪藻とそれに感染するウイルスの生態学的関係について調査を進めている。珪藻ウイルスは大別して RNA ウイルスと DNA ウイルスに分けられ、両者の基本的なゲノム性状は既に報告されている。
RNA ウイルスは複製酵素関連ならびに構造タンパク質と推定される遺伝子を含む約 9kbの 1 本鎖 RNA である。一方、DNA ウ

イルスは約 5-6kb の環状 1 本鎖 DNA をゲノムとして持ち、比較的長い少なくとも 4 つのオープンリーディングフレーム（ORF）
VP1、VP2、VP3 ならびに VP4 から構成されている。そのうち VP3 は複製関連タンパク質、VP2 はカプシドタンパク質と相同性が見られる。ところが VP1 ならびに VP4 は、既報のタンパク質と相同性が見られず、これらの機能は不明である。本研究では、VP1 ならびに VP4 の発現の有無を確認する事を目的とし、複数の宿主珪藻と珪藻 DNA ウイルスの組合せで感染実験を行った。そして各 ORF の経時的な発現を RT-PCR により解析した。その結果、VP1 と VP4 が VP2 と VP3 よりも早い段階で発現していることが明らかとなった。VP1 のアミノ酸配列には、11 残基からなる保存領域が確認された。一方、VP4 のアミノ酸配列には相同性が見られなかったが、サイレンシング抑制因子より見出されたアミノ酸配列が見られ、上流の塩基配列においても共通配列が見つかった。これらのことから、VP1 と VP4 の機能並びに発現機構は、珪藻 DNA ウイルスの種間で共通であると推察された。本研究の一部は科研費（16H06429, 16K21723, 16H06437, 19H00956）によって行われた。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

O1-22

巨大ウイルスの分布の局所性について～日本の巨大ウイルス分離例から～○武村 政春 1,2, 明石 基洋 1, 青木 啓太 2, 高橋 春菜 2, 佐々木 健太 3, 小林 実桜 1, 深谷 将 2
東京理科大・理 , 2東京理科大・院理 , 3東京理科大・理工1E-mail: takemura@rs.kagu.tus.ac.jp【背景・目的】巨大ウイルスとは、一般的に粒子径が 200 nm 以上、ゲノムサイズが 30 万塩基対を超える大型 DNA ウイルスのうち、2003 年以降、主に単細胞真核生物に感染するウイルスとして分離されてきたウイルスを指す。現在までに、ミミウイル

ス科、マルセイユウイルス科のほか、パンドラウイルス、ピソウイルス、モリウイルス、メドゥーサウイルスなど多くのウイルスが新しく分離されてきた。巨大ウイルスの局所的な分布のありよう、多様性については、メタゲノミクスを用いた研究はあるものの、分離ウイルスを用いた生物学的研究はほとんど行われていない。そこで本研究では、日本の各地から巨大ウイル

スを分離し、そのサンプリング場所の共通性や分離ウイルスの多様性から、巨大ウイルスの局所的な生態の一端を明らかにすることを目的とした。

【方法】日本の様々な水環境（汽水・淡水・土壌）から 50 mL チューブ１本に収まる程度の水もしくは含水土壌サンプルを採取し、そのうち数 mL 程度を P2 実験室内で 96 ウェルプレートにて培養したアカントアメーバ（Acanthamoeba castellanii Neff 株）に抗生物質と共に添加し、数日間培養した。アカントアメーバが丸くなるなどの細胞変性効果を起こしたウェルの上清を植え継ぐと共に、各種巨大ウイルス用プライマーを用いた PCR、または細胞変性効果を起こしたアカントアメーバの透過型電子顕微鏡観察により、巨大ウイルスの存在を確認し、その種の同定を行った。

【結果・考察】東京都内・荒川の水際の土壌ならびに水からサンプリングした数 mLからミミウイルス１株ならびにマルセイユウ
イルス２株を、新潟県柏崎市の溜池ならびに河口の汽水域からサンプリングした数 mLから新たなマルセイユウイルス２種8株（kashiwazakivirus、hokutovirus）を、そして埼玉県の農業用水からサンプリングした数 mLから複数の巨大ウイルス株（現時点では未同定）を、それぞれ分離することに成功した。このことから、数 mLの水あるいは土壌サンプルから複数の巨大ウイルスを分離する

ことか容易であること、また多様な巨大ウイルスが極めて狭い範囲内に生息し、独自の生態系を構築していることが示唆された。今後は、分離した各巨大ウイルスの詳細なゲノム科学的・生態学的研究を推進すると共に、自然宿主の同定を進めていく予定である。

O1-23

未分離の海洋性Bacteroidetes 門細菌感染ウイルスの生物情報学的探索○富永 賢人 1, 緒方 博之 2, 吉田 天士 1
京都大・院農 , 2京都大・化研

1E-mail: tominaga.kento.33x@st.kyoto-u.ac.jp【目的】海洋の微生物ウイルスは、感染による宿主の代謝制御・溶菌を通じ、宿主動態や多様性、さらに海洋物質循環に影響を与える。しかし、宿主微生物の分離の困難さが、海洋ウイルス生態学の律速である。海洋に広く優占する Bacteroidetes 門細菌も主要系統が未分離で、そのウイルスの知見が不足している。本研究は、本門に感染するウイルスの多様性の理解を目指し、
生物情報学的手法によりメタゲノムから新規本門細菌ウイルスを探索した。

【方法】先行研究で海洋メタゲノムより構築された未分離の完全長 1,811 ウイルスゲノムを解析に用いた。宿主の参照配列は公共データベースの本門細菌 3,695 ゲノムと海洋メタゲノム由来の本門細菌 518 ゲノム ( 以降、MAG と略記 ) を用いた。まず、(1)宿主 CRISPR スペーサー領域、(2) tRNA 相同性、(3) 塩基配列相同性、(4) オリゴヌクレオチド頻度距離の既存４指標に基づき宿主予測を行った。次に、ウイルスゲノム上の宿主ホモログの割合に基づく新規予測手法の確立を試みた。分離培養系が確立された 53 本門ウイルスと 100 種の他系統の原核生物のウイルスについて、本門細菌のホモログが占める割合を算出・比較し、閾値を設定した。その閾値を上回るゲノムを新規本門ウイルスとして抽出した。

【結果】既存の指標では、分離株・メタゲノム由来の宿主ゲノムを参照して、それぞれ 7 ゲノム、27 ゲノムが本門ウイルスに予測された。未分離ウイルスの宿主予測には、MAG がより有効だった。また、ウイルスの全遺伝子に占める本門細菌ホモログの割合は、分離された既知本門ウイルスにおいて高く ( 平均 36％ )、他系統を宿主とする原核生物ウイルスでは、最大でも 8％であった ( 平均 1％ )。8％を閾値とし、327 ゲノムを本門ウイルスとして抽出した。手法間での重複を除いた新規本門ウイルス計
339 ゲノム は 、ゲノム類似度に基づき 96 属に分類された。このうち、275 ゲノムはプロテオミックツリー上で既知本門ウイルスの近傍に位置した。64 ゲノムは、ほぼ全てが海洋未分離ウイルスからなる 19 系統に分類され、水圏に普遍的に生息するが宿主不明の Far-T4 ウイルス系統などが含まれた 。本研究により、既知の本門ウイルス分離株とは系統的に異なる多様な海洋
本門ウイルスの存在が明らかになった。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meetingO1-24

シアノウイルス－宿主相互作用解明に向けた海洋シアノバクテリアの高純度分手法の確立○礒崎 達大 1, 富永 賢人 1, 山本 圭吾 2, 左子 芳彦 1, 緒方 博之 3, 吉田 天士 1
京都大・院農 , 2大阪環農水総研 , 3京都大化研

1E-mail: isozaki.tatsuhiro.86w@st.kyoto-u.ac.jp【目的】海洋シアノバクテリアは海洋一次生産の 25% を担い、海洋物質循環の起点となる。先行研究において、大阪湾では本門シネココッカス属の 4 つの種内個体群が毎年優占した。一方、シアノウイルスは年ごとに優占系統の組成が変化した。そこ
で、シアノバクテリアとシアノウイルスの相互作用を詳しく理解するため、環境からシアノバクテリアを選択的に少数分取するミニメタゲノム解析により、感染細胞および細胞内ウイルスのゲノム情報を明らかにすることを目指している。これに先駆
け本研究では、環境試料からのシアノバクテリアの選択的分取法を確立した。
【方法】大阪湾湾口部で、2018年10月30日の13時と18時に採水し、φ3.0 μmフィルターで真核生物を除去した。φ0.2 μm
フィルターに原核微生物を捕集し、ろ液をウイルス画分とした。原核微生物画分からクロロフィルの650 nmの自家蛍光を有する集団をセルソーターにより10万細胞を分取し、蛍光顕微鏡観察と16S rRNAアンプリコン解析に供した。ウイルス画分からDNAを抽出し、ウイルスメタゲノム（ビローム）解析へ供した。
【結果】13時と18時に採取した海水の原核微生物画分では自家蛍光を有する細胞がそれぞれ17%と31%であった。また、16Sアンプリコン解析の結果、13時と18時それぞれでシアノバクテリアOTUs
は全配列の10%(30 OTUs)と25%(52 OTUs)を占めた。これらのシアノバクテリアは先行研究の大阪湾の種内個体群4つが優占した。次に、これらのシアノバクテリアに相互作用し得るシアノウイルスを抽出した。ビローム解析で得た10 kb以上の697コン
ティグのうち、3属14コンティグが既知シアノウイルスと高いゲノム類似度を示し、全配列の約4%を占めた。ポドウイルス科は先行研究と同一の2コンティグが優占する一方、過去の大阪湾のミオウイルス科の6コンティグと異なるコンティグが優占した。
次に、シアノバクテリアのミニメタゲノム解析構築のために、シアノバクテリアの選択的分取法の最適化を行った。環境試料をセルソーターに供し、クロロフィルの自家蛍光が高く、細胞が小さい集団を分取したところ、13 時と 18 時それぞれで 95%と 84% に自家蛍光が観察された。分取した試料のアンプリコン解析で得たシアノバクテリア OTUs は 96%(28 OTUs) と 90%(54
OTUs) を占め、その組成は環境試料中と同じであり、4 つの種内個体群で 90% 以上を占めた。従って、環境試料からシアノバ
クテリアを高純度に分取できた。

O1-25

新規 marseillevirus 感染 acanthamoeba の細胞凝集体形成メカニズムの解析○青木 啓太 1, 深谷 将 1, 小林 実桜 2, 明石 基洋 2, 武村 政春 1,2
東京理科大・院理 , 2東京理科大・理1E-mail: 1718501@ed.tus.ac.jp

Marseilleviridae は 2009 年に marseillevirus が発見されて以降、世界各地から 13 種類以上のウイルスが分離されている。
我々は 2018 年に新潟県内の河川ならびに池から採取した水サンプルを用いてスクリーニングを行い、major capsid protein(MCP) 遺伝子ならびに D5-like helicase-primase 遺伝子による分子系統解析の結果、新規 marseillevirus である hokutovirus、
kashiwazakivirus の 2 種 8 株を分離することに成功した。光学顕微鏡によるウイルス感染 acanthamoeba 細胞の観察の結果、hokuto-、kashiwazakivirus 感染 acanthamoeba 細胞では、細胞同士が寄り集まった細胞凝集体 (bunch) を形成することが明らかとなった (Aoki et al., 2019)。この現象はこれまでに分離された marseillevirus では確認されておらず、これら新規
marseillevirus に特有の性質であることが示唆されている。そこで本研究では、hokutovirus 感染アメーバによる bunch 形成メ
カニズムを明らかにすることを目的として研究を行った。

Hokutovirus 感染アメーバ細胞における bunch 形成過程を当研究室で開発中の細胞動態プログラムを用いて詳細に解析を行った。これまで Mimiviridae の一種である tupanvirus において bunch 形成が認められ、それに tupanvirus 由来 mannosebinding protein が関わっていることが示唆されている (Abrahao et al., 2018)。そこで、hokutovirus 感染 acanthamoeba における bunch 形成に関わる分子の同定を目指し、単糖である galactose、mannose、glucose、さらに二糖である lactose を添加することで bunch 形成が阻害されるか検討した。

タイムラプス撮影画像を用いた細胞動態解析における acanthamoeba 細胞数、bunch の平均サイズと最大多重度の経時的変化

より、galactose を添加した acanthamoeba でのみ、hokutovirus 感染後の bunch 形成が遅延することが確認され、mannose、
glucose を添加した場合では bunch 形成時期に変化は見られなかった。このことから、hokutovirus 感染 acanthamoeba のbunch 形成は tupanvirus の場合とは異なり、acanthamoeba の細胞膜における galactose 認識の変化によって生じるものであることが示唆された。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

O1-26

A persistent algal virus with an unprecedented amount of metabolic genes○ Romain Blanc-Mathieu1,2, Hakon Dahle2, Hiroyuki Ogata1, Ruth-Anne Sandaa2
Bioninf. Center, Kyoto Univ., 2Dept. Bio. Sc., Bergen Univ.

1

E-mail: roblanc@kuicr.kyoto-u.ac.jp

Most isolated eukaryotic microalgal viruses have a narrow host range, are rather acute and can be involved in bloom
termination. These viral traits may not be representative of the majority of viruses in nature. Prymnesium kappa virus RF01 (PkV

RF01) is a recently isolated giant virus able to infect species in two different genera of the order Prymnesiales (Haptophyta), ata relatively slow replication rate compared to other algal viruses (Johannessen et al. 2015 Virology). We obtained and explored
the genome sequence of PkV RF01 to uncover genomic clues associated with its peculiar phenotype. Phylogenetic analysesof nucleocytoplasmic large DNA viruses’ core genes confirmed that PkV RF01 branches deep in the Mimiviridae clade. Its
1.4 million base pairs-long linear genome, the largest for a virus infecting photosynthetic organisms, possesses several genes
predicted to code for enzymes involved in the metabolism of sugars, lipids and in energy production. It is predicted to code

for a succinate dehydrogenase complex, an enzyme involved in the Krebs cycle and in oxidative phosphorylation. This protein-complex, never observed in a virus before, is transcriptionally active during infection and found to be encoded in the genome
fragments of Mimivirus relatives in marine metagenomes, suggesting that it is functional and not anecdotal. Two aminoacyltRNA synthetases present in PkV RF01 and in most other Mimiviridae viruses branched together at the root of the eukaryotic

tree of life supporting the ancient evolutionary history of these viruses. This study identifies PkV RF01 as a promising model
virus to uncover new aspects of marine viral ecology (compared to commonly isolated algal viruses).

O1-27

糸状菌を用いた RNA ウイルス多様性の再検証
千葉 悠斗 1, ○浦山 俊一 2,3, 矢口 貴志 4, 萩原 大祐 2,3,4
1

筑波大院・生命環境科学 , 2筑波大・生命環境系 , 3筑波大・微生物サステイナビリティ研究センター ,4

千葉大・真菌医学研究センター

E-mail: s1821124@s.tsukuba.ac.jp
ウイルスは健常な生物にも高頻度に潜在している、ありふれた存在であることが明らかになりつつある。この普遍性は NGS 技術の登場により明らかになったものであるが、真菌や植物においては、NGS 登場以前から同様のことが知られていた。これは病徴を示す生物以外からウイルスを見出すために必要不可欠な、分子マーカーが利用できたことによる。具体的には、RNA ウ

イルス感染の分子マーカーとして dsRNA が用いられてきた。さらに近年では、真菌や植物においてもRNA-seqが利用されるようになり、これら生物群におけるRNA ウイルスの多様性理解は他生物に比べて進んでいる。しかし、従来用いられてきたdsRNA の検出は電気泳動に基づくため感度が悪いことや、NGSデータからのウイルス遺伝子探索は相同検索に基づくため新規性の高いウイルス遺伝子は検出できないことから、これら手法には RNA ウイルスの見逃しが生じる可能性がある。そこで本研

究では、ウイルスの網羅的探索が最も進んでいる生物の一つである糸状菌を用い、上記のような課題がどの程度の見逃しを生む可能性があるのかを明らかにするため、上記課題を克服可能な FLDS法を用いた RNA ウイルス探索を行った。野外または患者から単離された糸状菌Aspergillus fumigatus およびその近縁種 156 株中、17 株から少なくとも 1 種の RNA ウイルスが検出された。このうち 8 株からは dsRNA バンドが検出されず、そこから見いだされたウイルスは全て ssRNA をゲノムとするウイルスであった。この結果は、dsRNA の電気泳動によるスクリーニングでは見落とされてしまうウイルスが存在し、特に ssRNA ウイ
ルスが過小評価されている可能性が高いことを示唆している。また、A. fumigatus から既に報告のあるウイルスとほぼ同一のウイルスでありながら、当該報告には記載のない分節ゲノムを保持すると考えられるウイルスも複数見出した。これら記載のな

い分節ゲノムは相同性解析で既知ウイルスと十分な類似性を示さなかったことから、RNA-seqデータから抽出できず、見逃された可能性がある。これらの結果は、RNA ウイルスの多様性理解が最も進んでいる糸状菌においても、現在広く用いられている手法では相当数の見逃しが存在しており、現在の想定以上に糸状菌の RNA ウイルス多様性は高いことを示唆している。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meetingO2-01

パン酵母と肥料を使った環境調和型地盤改良技術の開発○谷口 惠梨 , 中村 孝道 , 遠藤 正美
熊谷組・技研≪背景≫ 微生物機能による鉱物化反応（バイオミネラリゼーション）を利用した地盤改良技術は、ここ 10 年の間に大学・研究機関を中心に研究開発が進められており，CO2排出量削減，地下水および周辺地盤環境の保全，コスト低減などのメリットがあげられ，環境調和型施工技術の開発に繋がると考えられる（川崎 , 2015）．前回大会において、入手及び取扱いが容易であるドライイーストと市販肥料を用いることで，砂地盤の土壌固化が可能であることを示した（中村 , 2018）．しかし，強度発現に日数を要すること及び砂地盤以外の地盤における土壌固化は確認できておらず，適用範囲や用途に難があると考えられた．

≪目的≫ 様々な土壌への地盤改良工法あるいは簡易舗装法への適用範囲拡大を想定し，より安価で簡易かつ既存の技術と同程度の強度発現を目指した微生物利用土壌固化実験を実施した．

≪方法≫ 固化対象は、山砂及び粘性土とした． pH調整剤及び2価金属イオン供給源として、市販の農業用肥料、未焼成貝殻資源を使用した．微生物はドライイースト（パン酵母）を使用した．純水を混合し予備発酵させたドライイーストあるいはYPD培地で培養したイーストを酵母液とした．これらを混合・添加したものを供試体とした．恒温恒湿室（30℃ /60%）もしくは室温の嫌気チャンバーにて1週間養生し，経時的に簡易土壌硬度計，土壌pH計，カルシウムイオンメータ，蛍光顕微鏡を用いて測定を行った．

≪結果≫ 貝殻資源の配合により、砂のみならず粘性土も固化することができた．従来法における強度発現には 5 ～ 7 日以上の養生が必要であったが，貝殻資源配合により強度発現を 1 ～ 2 日短縮することができた．微生物機能を利用した土壌固化技術においてより早期の強度発現を促すためには，固化対象土に粉砕された貝殻資源を配合すること，また添加する酵母液はイーストの活性を高めることが有効であった．貝殻資源を配合することは，固化対象土壌の拡大にも寄与すると考えられ，環境調

和型地盤改良技術の対象土壌の広範囲化や用途拡大が見込まれる．しかしながら，地中深くを想定した嫌気条件下においては固化が確認できず，固化対象土の深さには限度があると考えられる．
川崎了 , Journal of MMIJ. 131, 155-163(2015).

中村ら , 日本微生物生態学会第 32 回大会 (2018).

O2-02

電子受容体投与による油汚染土壌嫌気処理効率化の試み○河村 大樹 , 眞鍋 磨弥 , 中村 孝道
株式会社熊谷組

E-mail: daiki.kawamura@ku.kumagaigumi.co.jp
背景：油含有土壌のバイオレメディエーションにおいて嫌気的処理が促進されると，原位置の嫌気環境および好気反応後に形成される嫌気的環境をそのまま浄化反応場として利用することができ，好気的処理と比較して省力化やコストの削減に期待できる．嫌気条件下での油分分解においては，油を電子供与体と想定し、電子受容体（Fe，Mn など）の還元反応により分解が進むと考えられる．

目的：本研究では，嫌気的処理の高効率化を図る目的で，油含有土壌の嫌気的処理において，電子受容体の違いが油分濃度の低減に与える影響と微生物群集との関係性を室内試験によって調査した．

方法：山砂に対してタービンオイルを重量比 0.5% で混ぜ合わせた模擬油汚染土壌を作成し，それに 4 つの実験条件を与えた．
条件 1 では，当該油含有土壌 30 g に対して牛糞堆肥を 3g 添加した．条件 2 では，条件 1 に対して重量比で 0.5% の硝酸カリウムと 0.125% の溶成燐肥を添加し，硝酸イオンを電子受容体とした．条件 3 は，条件 2 にさらに 0.5% のクエン酸鉄を添加し，三価の鉄イオンを電子受容体とした．条件 4 は，条件 2 にさらに 0.5% の硫酸アンモニウムを添加し，硫酸イオンを電子受容体とした．各条件における供試体はそれぞれバイアル瓶（200 ml 容）に入れて密閉しそれを 4 本ずつ作成した．窒素ガスで気相置
換のうえ，恒温槽（30℃）で静置，0，3，6，12 週目に油分濃度分析と NGS 解析を行った．

結果：4 条件の油分（TPH）残存率を比較すると，条件 1 ＞条件 3 ≒条件 4 ＞条件 2 となった．電子受容体の添加により油分分解が促進することが分かった。なかでも、硝酸還元反応が最も油分解効果が高かった．NGS 解析では，条件 2 で，ほかの実験条

件と比べ，微生物群集が多様性に富んでいることが分かった．これは様々な微生物種が活動的になったものと考えられる．TPH
残存率は条件 2 で最も低くなっている．すなわち，土壌の C/N 比が整ったことで微生物が活性化し，油分分解が進行したと考えられることが NGS 解析から推測される．本研究では，酸化還元電位に則した電子受容体の投与が油分分解に有効である可能性があることと多様な細菌の活動が油分分解につながることを実験的検討により明らかにした．今後は，各電子受容体の適切な投入時期あるいは異なる電子受容体の段階的投与の検討と各実験系における DNA 解析を行い，嫌気処理の効率化を目指す．

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meetingO2-03

モエジマシダとヒ素可溶化微生物群を複合的に用いた新規土壌浄化法○柏原 湧太 1, 天知 誠吾 1, 宮内 啓介 3, 黄 毅 4, 山村 茂樹 2
千葉大・院園芸 , 2国環研 , 3東北学院大・院工 , 4東北大・院環境科学

1E-mail: afca1064@chiba-u.jp

我が国の土壌汚染対策法では、ヒ素濃度の基準値が 150 mg kg-1と定められている。現在、基準値を超過した土壌は、主に掘削除去など物理化学的手法で処理されているが、高コストのため新たな処理法が求められている。環境中でヒ素は、主にヒ酸[As(V)] と亜ヒ酸 [As(III)] として存在するが、酸化的環境では As(V) が優占し、鉄やアルミニウム ( 水 ) 酸化物等に吸着している。
一方、還元的環境では、ある種の微生物が As(V) を異化的に還元するため、吸着性の低い As(III) として土壌中から溶出する。この微生物学的プロセスを応用することで、汚染土壌からヒ素を可溶化することが原理的に可能であるが、溶出したヒ素の効率的な回収技術が必要となる。一方、モエジマシダ (Pteris vittata ) はヒ素を高濃度で蓄積することで知られ、ファイトレメディ

エーションへの応用が期待されている。そこで本研究では、微生物によるヒ素可溶化と、モエジマシダによるヒ素吸収・蓄積を組み合わせた新規土壌浄化法の確立を目的として、ラボスケールでの検討を行った。ヒ素汚染土壌 (240 mg-As kg-1)200 g を入れたプラスチック容器に 4 L の水を添加し、発泡スチロールでモエジマシダ 4 株を浮かせた。LED バーライトで光源を確保し、室温は 25℃に設定した。ヒ素可溶化微生物群の炭素源として乳酸 900 mg L-1を 10 日毎に添加した系 ( Ｌ )、乳酸と共に酸化還元メディエーターとしてリボフラビンを 50 μ M 添加した系 (LR)、及び無添加系 ( Ｎ ) の 3 条件で実験を行った。モエジマシダを植栽しない対照系も調製した。液相のサンプリングを経時的に行い、ヒ素濃度を ICP-AES で測定した。90 日後に土壌及びモ
エジマシダを回収し、残存及び蓄積したヒ素を抽出・測定した。実験開始 25 日目に、L 及び LR ではそれぞれ 4.1 mg L-1及び 3.2
mg L--1のヒ素が液相中に溶出した。その後、モエジマシダ存在下ではヒ素濃度が徐々に減少したが、モエジマシダを植栽しない対照系では減少が確認されなかった。一方、炭素源を添加しない N では、実験期間を通して有意なヒ素の溶出が認められなかった。このことから、乳酸添加によって効率的にヒ素を可溶化できることが確認された。実験終了後、L、LR 及び N で土壌中の残留ヒ素濃度がそれぞれ 65 mg kg-1、67 mg kg-1、及び 117 mg kg-1まで低下し、いずれの系でも土壌汚染対策法の基準値を下回った。以上の結果より、本法により効率的にヒ素汚染土壌の浄化が行える可能性が示唆された。

O2-04

嫌気性地下水に含まれる水素発生型発酵細菌を利用した水素ガス生成システムの構築○津布久 卓也 1, 木村 浩之 2
静岡大・院理・地球 , 2静岡大・理・地球

1E-mail: tsubuku.takuya.14@shizuoka.ac.jp
水素ガスは燃焼させても二酸化炭素を排出しないクリーンエネルギーと言われている . 水素ガス貯蔵技術の向上に伴う燃料電池車の普及により , 近年 , 水素ガスの需要は増加している . 需要を賄うための水素ガスの供給は , 天然ガス ( メタン ) の水蒸気改質 ,鉄鋼生成等の工場の副産物 , 水の電気分解等の方法が知られている . しかし , これらの水素ガス生成方法のみでは将来的な水素ガスの需要を満たせないため , より低コストで高効率な水素ガス生成システムの構築が求められている .

そこで , 深部帯水層に由来する嫌気性の地下水に含まれる水素発生型発酵細菌に着目した . 水素発生型発酵細菌は有機基質から水素ガスと二酸化炭素を生成するバクテリアで , 嫌気性の深部帯水層では水素資化性メタン生成菌と共生して , メタンを生成する . 本研究では , 水素資化性メタン生成菌を特異的に阻害し , 水素発生型発酵細菌のみを増殖させることで水素ガスを生成する
バイオリアクターの開発を試みた .

大深度掘削井を介して深部帯水層に由来する地下水を採取した . 最終濃度が 0.22% となるように有機基質を添加した . 地上部での温水に近い温度で保温し , 水素発生型発酵細菌と水素資化性メタン生成菌を共生させることにより , メタンを生成するバイオリアクターを開発した . 一方 , メタン生成リアクターと比べて 10℃高い温度で保温して , メタン生成菌を特異的に阻害し , 水素発生型発酵細菌を増殖させて水素ガスを生成するバイオリアクターを開発した . 培養中 , H2, CO2, CH4の生成量を測定した . 一

連の研究結果より , 水素ガス生成リアクターにおいて水素ガスと二酸化炭素を検出した . 培養開始から 2-5 日で水素ガスは検出され , 培養中の水素ガス最大生成速度は 4.15-6.17 mmol L-1 day-1 だった . 16S rRNA 遺伝子を対象とした遺伝子解析の結果 , 水
素ガス生成リアクターでは水素発生型発酵細菌を含む Clostridiales 目 , Thermales 目の増殖を確認した . また , メタン生成リアク

ターと水素ガス生成リアクターの微生物相を比較したところ , 水素ガス生成リアクターにはメタン生成菌を含むアーキアが検出されず , メタン生成リアクターにはMethanobacteriales 目などのメタン生成菌が検出された . 本研究により , メタン生成リアク

ターと比べて 10℃高い温度で培養することで , 水素資化性メタン生成菌を特異的に阻害し , 水素発生型発酵細菌のみを増殖させる水素ガス生成が可能であることが実証できた .

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meetingO2-05

硫酸還元細菌Desulfovibrio sp. HK-II の酢酸酸化型電極呼吸の解析○工藤 優輝 1, 大前 貴裕 2, 安池 一貴 1, 田代 陽介 1, 二又 裕之 1,3,4
静大院・総科技 , 2静大・工 , 3静大創造大学院 , 4静大・グリーン研

1E-mail: kudo.yuki.14@shizuoka.ac.jp

細胞外電子伝達機構（Extracellular electron transfer:EET）とは、微生物がミネラルなどの細胞外の物質を電子受容体として利用する呼吸形態である。このような生物学的能力は土壌や深海海底土圏といった嫌気環境におけるエネルギー獲得手段として発揮されており、微生物生態系そして生物地球化学的物質循環において重要な役割を果たしている。これまで当研究室では、汽水湖底泥を接種源とした微生物燃料電池の負極バイオフィルムから分離したDesulfovibrio sp. HK-II が EET を行うことを見出した。本株は興味深いことに、硫酸還元条件下では乳酸を酢酸に当量変換する不完全酸化型代謝を示す一方で、電子供与体
を乳酸、受容体を電極とした電極呼吸条件下では電流生産に伴い乳酸および生成した酢酸が減少した。更に、酢酸を電子供与体とした場合においても電極呼吸を行ったことから、本株は完全酸化型代謝へと代謝メカニズムを切り替えることが明らかとなっている。Desulfovibrio 属細菌が行う EET に関する知見はほとんどなく、このような新規性の高い本属細菌 EET 機構の解明

は生態学的に非常に興味深く、また微生物燃料電池への応用の観点からも重要である。本研究では生理学的および電気化学的解析により HK-II 株の EET 機構に関する新たな知見を得たので報告する。

これまでに、硫酸還元細菌は TCA サイクルあるいは Wood-Ljungdahl（WL）経路を介して酢酸代謝を行うことが報告されている。そこで、HK-II 株のゲノム情報をもとに本経路を有するかを推定したところ、WL 経路に関わる全ての推定遺伝子が確認された一方で TCA サイクルに関わる 4 つの推定遺伝子が確認されなかった。WL 経路を介した完全酸化型代謝を行うことが推測されたため、その鍵となる酵素である CO dehydrogenase 遺伝子（cooS ）について転写量解析を行ったところ、酢酸を電子供与体とした電極呼吸時に転写は確認されず、WL 経路の関与は認められなかった。続いて、HK-II 株は間接型 EET を行うことが推察されているため、レドックス物質生産能力を評価したところ、硫酸呼吸時にピーク電位 -245mV を示すレドックス物質を生産することが明らかとなった。また、培養液のピーク電位は上清と比較して 60mV 正電位方向にシフトすることが確認され、HK-II 株細胞との相互作用が示唆された。HK-II 株の完全酸化型代謝経路の推定および硫酸呼吸時に生成されるレドックス物質と EET の関連性について、現在解析中である。

O2-06

細菌のヨウ素酸呼吸には新規鉄硫黄モリブデンタンパク Idr が関与する○天知 誠吾 1, 山崎 千尋 1, 笠原 康裕 2
千葉大・院園芸 , 2北大・低温科学研

1E-mail: amachi@faculty.chiba-u.jp

我々が駿河湾の堆積物より分離したPseudomonas sp. SCT は、ヨウ素酸（IO3-）を唯一の電子受容体として生育するヨウ素酸

呼吸細菌である。SCT 株のペリプラズムにはヨウ素酸存在下で誘導されるヨウ素酸還元酵素（Idr）が存在する。Idr を Native-

PAGE ゲル上で活性染色後、活性バンドを切り出し、これを SDS-PAGE で泳動したところ３本のバンドが現れた。これらを LCMS/MS 解析に供したところ、亜ヒ酸酸化酵素のラージサブユニット（AioA）、スモールサブユニット（AioB）、および２種類のシトクロム c ペルオキダーゼ（CCP）とアノテーションされた合計４種類のタンパクが検出された。これらタンパクをコードする遺伝子はゲノム上でオペロン構造を形成し、近傍にはモリブデン補因子の生合成遺伝子が複数存在した。系統解析より、AioA に近縁なタンパクは鉄硫黄モリブデン酵素ファミリー（complex iron-sulfur molybdoenzyme family）の中で新規なクレードを形成することがわかった。このため、これらタンパクを IdrA、IdrB、IdrP1、IdrP2 と名付けた。IdrA にはモリブデン

補因子結合サイトと [3Fe-4S] 結合サイトがあり、IdrB には TAT シグナル配列と [2Fe-2S] 結合サイトが存在した。一方、IdrP1 とIdrP2 は既知の CCP とは系統的に異なるタンパクであった。転写解析の結果、idr 遺伝子はヨウ素酸呼吸条件で転写量が顕著に上昇することがわかった。また比較プロテオーム解析の結果、ヨウ素酸呼吸時には Idr タンパクのみならず、過酸化水素スカベ

ンジャー（Ahp、Cat）、過酸化水素誘導性転写因子 OxyR、SOD、酸素高親和性の末端オキシダーゼ（Cyd、Cco）なども発現上昇していた。以上のことから、ヨウ素酸呼吸には新規タンパク Idr が関与すること、またヨウ素酸呼吸に伴って過酸化水素と酸素が発生することが示唆された。Idr はヨウ素酸の還元反応を触媒することで、地球規模でのヨウ素循環に貢献しているかも知れない。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

O2-07

長時間を要するサンプリングが微生物叢メタトランスクリプトーム解析に与える
影響○元木 香織 1,2, 和辻 智郎 2,3, 高木 善弘 2, 徳田 真紀 2, 笠谷 貴史 2, 高井 研 2, 岩崎 渉 1,4,5
東大・院理 , 2JAMSTEC, 3東筑紫短期大学・食物栄養学科 , 4東大・大気海洋研 , 5東大・微生物科学イノベーション連携研究機

1

E-mail: kaori@bs.s.u-tokyo.ac.jp

微生物叢の RNA の網羅的解析であるメタトランスクリプトーム解析は、微生物生態系が持つ活性やその成り立ちなどの全体像を明らかにする上で有効な手法である。ここで、特に微生物の RNA は分解されやすいことから、ある環境下での微生物叢の状態をなるべく正確に反映した解析を行う上では、一般にサンプル回収後迅速に（ in situ で）RNA を安定化することが望ましいと考えられる。しかし、例えば海洋サンプルなど、サンプリングに長時間を要し RNA の安定化処理を in situ で行うことが難しい場合には、この条件は必ずしも満たすことができない。
そこで本研究では、長時間を要するサンプリングがメタトランスクリプトーム解析に及ぼす影響を評価した。サンプリングに長時間を要する微生物叢の具体例として、海面下約 1000 m に生息する深海無脊椎動物に共生する化学合成細菌叢を対象とした。本
微生物叢は、Gammaproteobacteria に属する Methylococcales、Thiotrichales および Epsilonproteobacteria に属する Sulfurovum の３分類群によって大きく構成される。RNA の安定化処理を in situ で（深海で）行った場合と、約 3 時間かけて船上に揚収した後に行った場合とで、メタトランスクリプトーム解析の結果を比較した。その結果、長時間サンプリング後に RNA の安定化処理を行った場合には、Methylococcales および Sulfurovum において遺伝子発現量が全体的に低下した一方で、Thiotrichales においては全体的に増加していることが明らかになった。これは、Thiotrichales がエネルギー貯蔵の役割をもつ硫黄顆粒の形成とその代謝に関わると見られる遺伝子群を発現していたことから、細胞内の硫黄顆粒によってサンプリングの間にも全体的な代謝活性を保つことができたためであると考えられる。加えて、各分類群内においても、代謝系ごとに発現量の増加・減少の程度にはばらつきが見られた。このばらつきが長時間サンプリングの影響によるものが、あるいは偶然によるものかについても、考察を行なった。
サンプリングに長時間を要するメタトランスクリプトーム解析では、in situ で RNA 安定化を行った場合とサンプリング後に行った場合を比較することで、適切なサンプリング・解析手法を検討することが可能になるだけでなく、サンプリング過程の環境変化を微生物生態系に対する撹乱とみなすことで新たな示唆が得られる可能性もある。

O2-08

微生物膜透過性を有するペプチドの探索と評価○村岡 貴博 , 井上 豪 , 豊原 大智 , モリ テツシ
農工大・院工E-mail: muraoka@go.tuat.ac.jp
微生物細胞内へ透過する膜透過性物質が注目されている。本研究では、特にペプチドに注目し、その構造と微生物細胞膜透過性の関係性について評価することを目的とした。ペプチドは、有機合成化学の手法により、精密かつ多様な分子合成が可能である。中でも、アミノ酸配列、ペプチド鎖長が微生物膜透過性に与える効果に注目した。両構造パラメーターを系統的に変えたペプチドを網羅的に合成し、大腸菌を用いて透過性について調べた。ペプチドを可視化するために蛍光色素を結合し、微生物細胞内への透過を蛍光顕微鏡観察やフローサイトメトリー測定によって調べた。カチオン性ペプチドとアニオン性ペプチドをの比較した結果、カチオン性ペプチドの方が顕著に高い効率で透過することが示された。過去の研究から、動物細胞の場合でも、一般的にカチオン性ペプチドが高い効率で膜透過することが知られており、それと同様の傾向が示された。続いて、カチオン性アミノ酸と疎水性アミノ酸を混合した両親媒性ペプチドについて評価した。その結果、脂肪族型の疎水性アミノ酸を用いた場合に比べて、芳香族型の疎水性アミノ酸を用いた場合の方が、膜透過効率が高いことが明らかとなった。様々な構造
パラメーターが膜透過性に与える効果に関して、詳細に評価した結果を発表する。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

O2-09

Water-in-oil ドロップレット内での環境微生物の培養とシングルドロップレットアイソレーション技術の開発○斉藤 加奈子 1,2, 大田 悠里 1,2, 松倉 智子 2, 高木 妙子 2, 森田 雅宗 2, 常田 聡 1,2, 野田 尚宏 1,2
早大院・先進理工 , 2産総研・バイオメディカル1E-mail: kanako2864@akane.waseda.jp【背景・目的】自然界には約 1 億種もの微生物が存在しており、それらが持つ機能は食品、医療、環境など様々な分野で利用されている。微生物の機能解明のためには、微生物の単離培養が不可欠だが、既存の培養法の利用だけでは、全体の 99 ％以上の微生物が未だに培養されていない。そのため、未培養微生物を培養するためには全く新しい培養手法が必要である。近年、water-in-oil ドロップレットを利用した微生物培養法が注目されている。マイクロ流路を使用すると数十万単位のドロップレッ
トを容易に作製でき、ドロップレット内で微生物を培養することで、ハイスループットな完全液相培養が可能となる。また最近、我々は、微生物が持つ RNase 活性を指標に微生物が増殖したドロップレット集団のみを選択的に分取する方法を開発した(Ota et al., PLOS One, 2019) 。 しかし、新規微生物の単離株獲得のためには、ドロップレット集団からドロップレットを 1 つずつ分離し、個々のドロップレットに対して菌種同定と再培養を行う必要がある。そこで本研究では、新規微生物の単離培養を目指して、環境微生物のドロップレット培養、RNase 活性に基づいたドロップレット集団の選択的分取、1 ドロップレット

への分離からなる一連の技術を開発した。【方法・結果】まず、蛍光 RNA プローブのドロップレット内での安定性を評価した。

蛍光 RNA プローブを含むドロップレットを 37℃でインキュベーションすると、40 日経過後もドロップレットの崩壊が生じず、蛍光基質の漏出もなかった。次に、モデル環境微生物として池由来の複合微生物試料を使用し、蛍光 RNA プローブとともに、
1 nL のドロップレットへ封入した。ドロップレット培養後に顕微鏡で観察すると、池由来の微生物は高密度に増殖した。フ

ローサイトメトリーによってドロップレットの蛍光強度を測定すると、培養の前後で蛍光強度に違いが生じたため、セルソー

ターによって蛍光強度の大きいドロップレット集団を分取した。先端が極細のピペットチップを使用してドロップレットの分離を試みたところ、顕微鏡観察にて 1 ドロップレットずつに分離された様子が確認された。本研究より、1 ドロップレットへの分離を含む water-in-oil ドロップレット培養技術は、様々な微生物の培養や分離に応用できる可能性が示唆された。

O2-10

リポソームを用いたシングルセルレベル培養技術の構築○森田 雅宗 , 加藤 薫 , 野田 尚宏
産総研・バイオメディカルE-mail: morita.m9@aist.go.jp
微生物の物理的特徴や生理学的機能の理解，また，微生物による物質生産や代謝産物の取得において，微生物の分離・培養は非常に重要である。近年，マイクロ流体デバイスを用いてチップ内でマイクロスケールのウェル・ゲル・油中水滴を大量に作製する技術が進展し，一つの区画にシングルセルレベルで微生物を分離，培養し，解析することが可能となり注目されている。
しかし，ゲルや油中水滴等の材料は以前から使用されているもので，多種多様な微生物の獲得に，材料そのもののさらなる技

術的発展は必要である。細胞膜と同様の構造をした脂質二重膜で形成されるカプセル状構造のリポソームは，内部への物質封入が可能である。中でも，マイクロスケールのリポソームは生体分子に限らず，粒子や細胞など多岐にわたる材料を封入することが可能であり，また，リポソームはその内側と外側が水溶液で満たされるので，膜を介した分子 ( 栄養 ) の流入出も可能となり，微生物の培養リアクタとしての可能性を十分秘めている。これまでマイクロスケールのリポソーム内部へ微生物を封入する報告例はあるが，リポソーム内部での微生物の成長・増殖についての報告はない。本発表では，マイクロスケールのリポ
ソーム内部で長時間・安定的に微生物がシングルセルレベルから成長・増殖する技術について報告する。モデル微生物として用いた大腸菌を 1-2 細胞レベルで封入した直径 10-30 μ m 程度のリポソームを遠心型マイクロ流体デバイスを用いて作製した。
得られた微生物封入リポソームを，37℃の培養条件下で長時間・物理的に安定な状態で観察するために，脂質膜でコートした
ガラス基板上に固定化する手法を考案した。通常のガラス基板上に固定化したリポソームは観察開始後 24 時間で 20% 程度しか残存しないのに対し，脂質膜でコートしたガラス基板上に固定化したリポソームは 70% 程度残存することが明らかになり本手法の優位性を明らかにした。また本手法で，大腸菌の培養を行ったところ，48 時間程度の連続観察に成功し，リポソーム内で菌体密度の高い状態にまで培養することに成功した。以上のことから，リポソームは微生物培養器として今後の研究展開に応用できる可能性を示した。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

O2-11

自家蛍光シグネチャーを用いた微生物の生死評価○下段 千尋 1, 高部 響介 2, 野村 暢彦 2, 八幡 穣 2
筑波大・生命環境学群 , 2筑波大・生命環境

1

微生物の生死の判定においては、サンプルを希釈してプレートに撒き、培養してコロニー形成の有無を見る方法が主に用いられている。しかし、この方法では、判定までに 1 日あるいは数日という長い時間を要する上に、生菌の生育に適した条件を用意しなければコロニーとして検出されず、使用できる対象が限られている。そこで本研究では、培養を介することなく微生物の生死を迅速に判定できる技術を開発することを目的とした。細胞の状態を一細胞レベルの解像度かつ無処理、非染色で判定するために、我々は一細胞の “ 自家蛍光シグネチャー “ に注目した。自家蛍光シグネチャーとは、細胞内の酵素や脂質など生体分子に由来する微弱な蛍光の集合体であり、様々な生理状態を反映することがこれまでの研究から分かっている。我々の研究グループでは、一細胞の自家蛍光シグネチャーを網羅的に解析する手法として、共焦点レーザー顕微鏡による自家蛍光取
得と、画像解析、機械学習による分類を組み合わせた Confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate f﻿luorescenceanalysis：CRIF、特許第 6422616 号）をこれまでに開発している。これまでに、この手法を用いて生物種や細胞の増殖段階などの違いが判別できることが分かってきている。本研究では、この CRIF を用いて微生物の生細胞と死細胞の、自家蛍光シグネ

チャーの違いを詳細に比較した。モデル生物としてEscherichia coli K12 株を用い、この株を対数増殖期まで培養し、自家蛍光を取得した。同培養液の菌に対してプレート培養と Live/Dead 染色を行った。培養後エタノールにより殺菌処理をしたものに対しても同様の操作を行い、得られたそれぞれの自家蛍光シグネチャーの違いを評価した。上記により、従来の手法で「生菌」「死菌」と判定された集団どうしでの、自家蛍光シグネチャーを比較した結果を報告する。CRIF で生細胞と死細胞を比較することで、この手法が迅速かつ簡便な微生物の生死判定技術となる可能性を検証できる。

O2-12

陸域深部地下珪藻質泥岩層から単離した鉄還元能を有する新規Bacteroidetes
門発酵性細菌の機能解析○玉澤 聡 1, 上野 晃生 1, 玉木 秀幸 2, 玉村 修司 1, 村上 拓馬 1, 木山 保 1, 猪股 英紀 1, 宮川 和也 3, 長沼 毅 4, 金子 勝比古 1
幌延ライズ , 2産業技術総合研究所 , 3日本原子力研究開発機構 , 4広島大院・統合生命科学

1

E-mail: satoshi.tamazawa@h-rise.jp

北海道北部地域に広がる天塩平野の地下には、新生代新第三紀中新世から鮮新世に掛けて海成堆積物により形成された珪藻質泥岩層が分布している。還元的な同層の地層水からは微生物起源のメタンが検出されていることから、微生物による堆積有機物の発酵分解とメタン生成反応の進行が推測され、その中でも発酵性細菌は嫌気的な有機物分解過程において重要な役割を担っているものと考えられた。これまで珪藻質泥岩層試料の分子生態学的解析によって、発酵性細菌と推定される微生物群は多数検出されていたが、分離培養されておらずその機能の大半は不明であった。そこで本研究では、陸域深部地下珪藻質泥岩層に生息する発酵性細菌の分離培養化と機能解析を目的とした。
JAEA 幌延深地層研究センターの地下 250 m 地点から採水した珪藻質泥岩層の地層水を微生物接種源として用い、地層水のイオ
ン組成を模擬した無機塩培地をベースに、基質としてトリメチルアミン及び酢酸を添加し、気相 N2/CO2 (4:1, v/v) の嫌気的環
境下、25℃で集積培養を実施した。4 回以上の継代培養の後、酵母エキスを単独基質とした限界希釈培養とアガーシェイク法
により、新規発酵性細菌 HJ250 株の単離に成功した。16S rRNA 遺伝子の分子系統学的解析の結果、HJ250 株は Bacteroidetes
門のMarinilabiliales 目に属するものの、最近縁種の Draconibacterium orientale FH5 株とは 88.6% の相同性しか示さず、少な
くとも科レベルで新規な系統群に分類されることがわかった。生理性状解析の結果、HJ250 株は 15-37℃、pH 6.0-9.0、NaCl
0-80 g/L で生育可能な糖資化性の絶対嫌気性発酵性細菌であり、原位置地下環境（20℃ , pH 7, NaCl 4.0 g/L 程度）に適応した生理学的特徴を有していた。加えて興味深いことに、Bacteroidetes 門細菌としては報告例の極めて少ない、鉄還元能を有することが明らかとなった。続いて、分離源として用いた地下 250 m の地層水から抽出した DNA 及び RNA (cDNA) の微生物群集構
造解析の結果、HJ250 株と 100% の相同性（251/251 bp）を示す配列が DNA だけでなく cDNA からも検出された。さらに、地下 140 m と 350 m 地層水由来の DNA 及び cDNA からも検出され、中でも地下 140 m の cDNA においては全 322 OTUs の中で第三番目の相対存在量を示した。以上の結果から、HJ250 株は原位置に確かに生息しており、珪藻質泥岩層の特に比較的浅部域
における炭素及び鉄循環に大きく寄与している可能性が示唆された。

－ 36 －

日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meetingO2-13

シュードフルクトフィリック乳酸菌 Leuconostoc citreum F192-5 株の菌株特異的な環境適応○遠藤 明仁 1, 前野 慎太朗 2, 谷澤 靖洋 3, 梶川 揚申 4, 兼崎 友 5, 久保田 恵理 2,6, 有田 正規 7, Leon Dicks8
農大・食香粧化学科 , 2農大院・生物産業学 , 3遺伝研・DDBJ 研究センター , 4農大・農芸化学 ,静大・グリーン科学技術研究所 , 6農大・ゲノムセンター , 7理研・環境資源科学研究センター ,8ステレンボッシュ大・微生物学
1
5E-mail: a3endou@nodai.ac.jp【背景】
Leuconostoc citreum は植物質環境に生息する一般的な乳酸菌であり、グルコースを糖源として最も好む。しかし、我々が南アフリカの温州ミカンより分離した L. citreum F192-5 株はグルコースを糖源とした培養ではほとんど生育せず、フルクトースを糖源とする
か、グルコースが糖源の場合はピルビン酸や酸素といった電子受容体存在下でのみ良好な生育を見せるというフルクトフィリック様な特徴を有している。本研究ではF192-5 株を用いて、これまでに見出されてこなかった乳酸菌の菌株特異的な環境適応に迫った。
【結果及び考察】
まず、F192-5 株と 9 菌株の L. citreum のゲノムデータを比較したところ、F192-5 株と他の L. citreum 菌株ではゲノムサイズ、
遺伝子数に大きな差はなかった。一方で典型的な FLAB と比較すると、F192-5 株はゲノムサイズが大きく、他の FLAB に見られる糖代謝関連遺伝子の特異的な欠落が全く見られなかった。次に、F192-5 株の菌株特異的遺伝子を抽出したところ、68個の遺伝子が見出され、そのうち 8 個が FLAB の代表菌群である Fructobacillus 属細菌と共有していた。Fructobacillus 属は
adhE を欠損し、フルクトフィリックな特徴を有していたが、F192-5 株は adhE を有しているものの、adhE を発現していない
ことが分かった。これは F192-5 株の adhE 上流にはプロモーター領域が予測されなかったことから、adhE が不活性化しているためであると考えられた。そこで、外来性の adhE を導入したところ、グルコースを糖源として良好な生育を見せたことから、F192-5 株は adhE の不活性化によりフルクトフィリックな特徴を獲得したことが明らかとなった。我々はこれらの結果から、フルクトフィリック様な特徴を有する F192-5 株をシュードフルクトフィリック乳酸菌と分類した。
本研究から、自然界には菌株レベルでフルクトフィリック様な特徴を有する乳酸菌が存在している可能性が示唆された。これは菌種内で多様性をもつという乳酸菌の生残戦略の一つによるものであると考えられる。

O2-14

フルクトフィリック乳酸菌の環境適応と進化○前野 慎太朗 1, 谷澤 靖洋 2, 梶川 揚申 3, 志波 優 4, 兼崎 友 5, 久保田 恵理 6, 有田 正規 2,7, 遠藤 明仁 8
農大院・生物産業 , 2遺伝研・DDBJ 研究センター , 3農大・農芸化学 , 4農大・分子微生物 , 5静大・グリーン科学技術研究所 ,6
農大・ゲノムセンター , 7理研・環境資源科学研究センター , 8農大・食香粧化学
1E-mail: 47617002@nodai.ac.jp【研究背景】

フルクトフィリック乳酸菌 (FLAB) は花やミツバチの消化管などフルクトース豊富な環境に生息する乳酸菌群であり、FLAB としてこれまでに Fructobacillus 属 5 菌種と 2 種の Lactobacillus 属細菌が報告されている。一般的な乳酸菌はグルコースを糖源として最も好むが、FLAB はグルコースを糖源とした培地においてほとんど生育しない。一方で、フルクトースを糖源として培養をするか、グルコースを糖源としても、酸素やピルビン酸といった電子受容体存在下でのみ良好な生育を示すという稀有な特徴を有する。本研究では、FLAB がフルクトース豊富な環境下で行ってきた進化にゲノムレベルで迫る。

【結果及び考察】

まず FLAB とその近縁菌群のゲノムを比較解析したところ、FLAB はゲノムサイズを有意に小さくし、糖代謝関連遺伝子をはじめとする多くの遺伝子を欠落させていた。一般的に乳酸菌は糖を細胞内へ取り込む際に Phosphotransferase system (PTS) を用いることが多いが、FLAB は PTS を完全に欠損していた。これらのゲノムの特徴は FLAB が代謝可能な糖の種類が非常に少ないという生化学的特徴と合致している。また、FLAB は酸素によって生育促進されるが、一般的な乳酸菌と同様に呼吸鎖を有しておらず、FLAB は酸素を電子受容体として用いていることが強く示唆された。さらに、FLAB はグルコース代謝からのエタノール生産に密接に関わるタンパク質 AdhE をコードする遺伝子 adhE を特異的に欠損していることが明らかとなった。この欠損により FLAB は

フルクトフィリックな特徴を有していると考えられたため、FLAB の代表菌種 Fructobacillus fructosus に、近縁種由来の adhE を導入した。その結果、形質転換株は一般的な乳酸菌と同様にグルコースを糖源とする培地で良好な生育を示した。この結果から、FLAB のフルクトフィリックな特徴は adhE の欠損によるものであることが明らかとなった。本研究より、FLAB はフルクトース豊

富な環境に誘導されゲノムサイズを小さくし、代謝系をシンプルにするという退行的進化を行ってきたことが示された。

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O2-15

深海底熱水活動域で発生する電流が現場に優占する化学合成微生物に及ぼす影響○武藤 久 1, 岡本 章玄 2, 丸山 奈津 2, 澤山 茂樹 3, 中川 聡 1,3
京都大・院農 , 2物質材料研究機構 , 3海洋研究開発機構

1

E-mail: mutou.hisashi.78w@st.kyoto-u.ac.jp

暗黒の深海底熱水活動域では、海底から噴出する熱水に含まれる還元的無機化合物が、現場に見られる生態系にとってほぼ唯一のエネルギー源であると考えられてきた。だが近年、深海底熱水活動域では、還元的な熱水と酸化的な海水が導電性の硫化鉱物を介して接することで電流が生成していることが明らかとなった。既知の鉄酸化細菌のなかには、このような電気エネルギーを利用し、二酸化炭素から有機物を合成する能力を持つものが知られている。これらのことから、深海底熱水活動域において、電気をエネルギー源とする（微）生物活動（特に一次生産）の可能性が指摘・検証されるようになってきた。例えば、深海底熱水活動域に由来するチムニーサンプルを電気培養し、Shewanella 属細菌や、Thermococcales 目およびArchaeoglobales 目アーキアのような従属栄養微生物が集積培養されるなど、熱水活動域に見られる微生物群集の電流に対する反応が報告されている。しかしながらこれまでの研究において、世界各地の深海底熱水活動域に優占して検出される絶対化学
合成微生物＝イプシロンプロテオバクテリアに及ぼす電流の影響を解析した例はなかった。そこで本研究では、過去の研究において深海底熱水活動域から得たイプシロンプロテオバクテリア分離株の電気化学的特性、特に電気エネルギーがその増殖に及ぼす影響を明らかにすることを目的とした。

深海底熱水活動域に優占するイプシロンプロテオバクテリアの代表的な分離株について、diaminobenzadine (DAB) 染色に供し超薄切片を作成したところ、いずれも細胞外膜が強く染色され、電気エネルギーの利用に必要な膜表面電子伝達酵素の存在が示唆された。現在当該分離株の電気エネルギー利用能を、熱水活動域を模した様々な条件下で検証しており、本発表ではそれらの結果を含めて議論したい。

O2-16

鉄および硫黄を還元する好熱性タウムアーキア○加藤 真悟 1,2, 伊藤 隆 1, 雪 真弘 1, 大西 真史 1,4, 長森 麻衣 1,4, 植松 勝之 3, 鈴木 勝彦 2, 高品 知典 4, 大熊 盛也 1
1

理研・BRC, 2海洋研究開発機構海底資源センター , 3マリンワークジャパン , 4東洋大・院生命科学

E-mail: skato@riken.jp

これまでに培養されている Thaumarchaeota 門に属するアーキア（古細菌）は、Nitrosopumilus maritimus や Nitrososphaera
viennensis, Candidatus ‘Nitrosocaldus yellowstonii’ 等、すべてアンモニア酸化アーキアである。一方で、培養に依存しないメ

タゲノム 解析によって、Thaumarchaeota 門の根元に位置するアーキアは、非アンモニア酸化アーキアであることが示唆されてきた。それらのアーキア群には、陸上温泉からしばしば検出される Terrestrial Hot Spring Creanarchaeotic Group (THSCG) と呼ばれる未培養系統群が含まれる。本研究では、栃木県奥塩原で採取した温泉水（57℃ , pH2.2）から、THSCG に属するアー

キア NAS-02 株の分離培養に成功した。NAS-02 株は、温度幅 60-70℃、pH 幅 4.5-5.5 の範囲で増殖する嫌気性のアーキアであり、酵母エキスを電子供与体および炭素源として用い、電子受容体として三価鉄および硫黄化合物（チオ硫酸、元素硫黄）を還元して生育することがわかった。
NAS-02 株の全ゲノム配列（約 1.6 Mbp）を決定したところ、NAD(P)H:sulfur oxidoreductase (Nsr)や thiosulfate reductase / polysulfide reductase (Phs/Psr), sulfur reductase (Sre) といった硫黄還元に関わる遺伝子のホモログがいくつか見つかった。系統解析の結果、これらの遺伝子は、クレンアーキオータ門に属するアーキアからの水平伝播によって獲得されたものであると示唆された。公開データベースに登録されている THSCG の 16S rRNA 遺伝子配列を探索したところ、世界各地の高温酸性の陸上温泉や海底熱水地帯から検出されていることがわかった。以上の生理性状および地理分布の結果から、THSCG は高温環境において、他の生物の死骸に由来するタンパク質や脂質を分解する「スカベンジャー」として、生態系の炭素・鉄・硫黄の循環において重要な役割を担っている可能性が示唆された。

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O2-17

水素生成一酸化炭素酸化細菌Parageobacillus sp. G301 株の生理性状およびゲノム解析○日野 太貴 , 井上 真男 , 谷村 あゆみ , 岡元 俊輔 , 吉田 天士 , 左子 芳彦
Grad. Sch. of Agri., Kyoto Univ.

E-mail: hino.taiki.46a@st.kyoto-u.ac.jp【背景・目的】水素 (H2) 生成一酸化炭素 (CO) 酸化細菌は、CO をエネルギー源として増殖する。本菌における CO 酸化は嫌気型 CO デヒドロゲナーゼ (CODH) により触媒され、ゲノム上で CODH に隣接する膜結合型ヒドロゲナーゼ (ECH) と複合体を形成することで CO 酸化と共役した H2生成とエネルギー保存を行う。H2 生成 CO 酸化細菌の分離株は、これまで Firmicutes 門
Clostridium 綱の偏性嫌気性好熱菌に偏在してきた。ごく最近、通性嫌気性の Bacillus 綱 Parageobacillus thermoglucosidasius
が高濃度 CO 存在下で CO 依存的な H2生成を行い増殖することが報告された。こうした背景のなか、鹿児島県鰻池の湖底堆積物
より H2生成 CO 酸化能を有する Parageobacillus 属細菌 G301 株の分離に成功した。そこで本研究では、本分離株のゲノム性状および生理性状を明らかにすることを目的とした。
【方法】本菌のゲノム DNA を抽出し、MiSeq (Illumina) を用いたメイトペアシーケンスを行い、SPAdes を用いてドラフトゲノ
ムを構築した。DFAST を用いて ORF 予測およびアノテーションを行い、近縁株とのゲノム比較解析を行った。気相 100% CO
あるいは N2雰囲気下および大気条件下において 65°C で合成培地を用いて本菌を培養し、直接計数およびガスクロマトグラ
フィーによって菌数と気相の変化を測定した。また、API 50CH (BIOMERIEUX) を用いて糖発酵能を判定した。
【結果・考察】ゲノム解析の結果、G301株は Parageobacillus toebii に最も近縁であり、Average Nucleotide Identity (ANI) が97.3%を示すことから P. toebii と同種と判断した。G301株は P. toebii NBRC 107807 T 株と同様に大気条件下で好気呼吸、100% N2雰囲気下では発酵を行って増殖したが、発酵において利用可能な糖源は異なっていた。一方、既報の本種9株の内、G301株のみがCODH/ECHを有した。さらに、本株のみがCO依存的なH2生成能を示した。Bacillus綱細菌においてG301株は、2例目のH 2生成CO酸化細菌の報告事例であり、本代謝の系統的分布の広がりが推察された。また、G301株ゲノムには既報の P. toebii と同様に P. thermoglucosidasiusには見られない好気型CODHの遺伝子群がコードされており、嫌気型および好気型CODHの両方を有する初めてのH2生成CO酸化細菌であることが明らかになった。このことはG301株が生育環境に応じて両酵素を使い分ける可能性を示唆するものである。

O2-18

養殖場由来多剤耐性伝達性プラスミドのトランスポゾンを介する染色体への組込み○野中 里佐 1, 丸山 史人 2, 杉本 侑大 3, 鈴木 聡 3, 増田 道明 1, 矢野 大和 4
獨協医大・医 , 2広島大・学術院 , 3愛媛大・CMES, 4東北大・院生命科学

1E-mail: nonaka@dokkyomed.ac.jp

細菌間の遺伝子伝達は耐性薬剤菌の出現や拡散の原因として極めて重要である。本研究では、養殖場から分離された多剤耐性菌が保有するプラスミドが大腸菌に伝達されて染色体に組み込まれる現象の背景にある分子機構を明らかにすることを目的とした。養殖場底泥から分離したVibrio alfacsensis 04Ya249 株および同株との接合で得られた薬剤耐性大腸菌株の全塩基配列を

PacBio RSII により決定し、04Ya249 株から大腸菌に伝達された全遺伝情報を明らかにした。その結果、04Ya249 株が保有していたプラスミド pSEA2 の大腸菌への伝達と染色体への部位特異的な組込みが明らかになった。pSEA2 は我々が以前報告したプ

ラスミド pSEA1（Nonaka et al ., PLOS ONE, 2018）と骨格構造を共有しており、IV 型分泌系関連遺伝子や 7 つの薬剤耐性遺伝

子を保持していたが、pSEA1 の染色体への組込みに関わるトランスポゾン Tn6283 は保持していなかった。接合体染色体に組込まれた pSEA2 の両端にはβラクタマーゼ遺伝子（bla ）を含む 7.5 kb の領域がそれぞれ存在していた。この領域は、Tn6283と同様、２つのチロシンリコンビナーゼをコードし、pSEA2 とは独立に環状化して染色体外にも存在することから、インテグ

レーティブエレメントタイプの新規トランスポゾン（TnX）と考えられた。TnX をあらかじめ染色体上に持つ大腸菌を受容菌とした場合、染色体への pSEA2 の組込み頻度は 10 倍高くなった。また、recA 欠損大腸菌を受容菌とした場合、TnX の染色体への組込みは検出されたが、pSEA2 全長の組込みは見られなかった。これらの結果は、接合の際にまず TnX が染色体に組込まれ、この TnX と染色体外の pSEA2 上の TnX との間での RecA 依存的相同組換えによって pSEA2 全長が染色体に組込まれることを示唆している。なお、複数の接合体大腸菌株を解析した結果、染色体上の TnX は最大 3 コピーまで検出され、TnX のコピー数が多い接合体ほどβラクタム系抗菌薬の最小発育阻止濃度が高かった。以上の結果は、プラスミドとトランスポゾンの相互作用を介した遺伝子伝達が、受容菌の多剤耐性化とともに、その高度耐性化にも関与することを示唆する。

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O2-19

Bifidobacterium adolescentis のヒト腸内環境適応因子の探索○藤原 慎 1, 田村 明 1, 馬場 星吾 2, 川畑 球一 3
( 株 ) 明治・乳酸菌研 , 2( 株 ) 明治フードマテリア , 3甲南女子大・医療栄養

1

【目的】

Bifidobacterium 属細菌は乳児から成人の主要な腸内細菌である。B. bifidum 、B. breve や B. longum subsp. longum ではヒト腸管適応に関する研究が数多くあるのに対し、ヒト腸内細菌優勢種の一つであるB. adolescentis についての知見は限られている。

そこで本研究では、分離源の異なるB. adolescentis ( ヒト糞便、ヒト母乳と ( ウシ ) ルーメン ) 間でのゲノム比較を行い、ヒト糞便に特徴的な機能遺伝子を解析した。

【方法】

Genbank より、ヒト糞便由来株としてB. adolescentis ATCC15703、LMG10733 と LMG18897、ヒト母乳由来株として 22L、
ルーメン由来株として DSM20087 と LMG11579 の完全長あるいはドラフトゲノムを取得した。これらのゲノムを DFAST によりアノテーションした。OrthoFinder を用いてオルソログ遺伝子を決定した後、分離源特異的遺伝子の注釈付けを行った。

【結果と考察】ヒト糞便、ヒト母乳とルーメン由来のパンゲノムとして、それぞれ 2041 個、1796 個と 1709 個の遺伝子を決定した。これらのパンゲノムにおいて、分離源パンゲノム毎の特異的遺伝子はそれぞれ 367 個、179 個と 149 個であった。これらの特異的遺伝子において、COG 機能分類されたものはそれぞれ 121 個、58 個と 80 個であった。COG 機能分類において、多くの遺伝子が割り当てられたカテゴリーは、ヒト糞便では K(Transcription：16.5%) や G(Carbohydrate transport and metabolism：14.0%)、
ヒト母乳では G(29.3%) そしてルーメンでは E(Amino acid transport and metabolism：27.5%) であった。G カテゴリー分類された遺伝子において、ヒト糞便では加水分解関連遺伝子が、ヒト母乳では輸送体関連遺伝子がそれぞれ多かった。以上の結果より、B. adolescentis は糖の加水分解関連遺伝子を多くコードすることでヒト腸内環境に適応している可能性が考えられた。

O2-20

古細菌から細菌に水平伝播した鉄ヒドロゲナーゼの進化○渡邉 友浩 1, Tristan Wagner1, Gangfeng Huang1, Joerg Kahnt1, 安宅 憲一 2, Ulrich Ermler3, 嶋 盛吾 1
マックスプランク研・陸生微生物 , 2ベルリン自由大 , 3マックスプランク研・生物物理

1E-mail: watanabe1986@gmail.com

ゲノムデータは遺伝子資源の宝庫であり、未知遺伝子の機能解析はポスト環境ゲノム時代におけるフロンティアの１つである。
相同性に基づき機能が記載されている遺伝子であっても、その真の機能を明らかにするためには、多面的な研究が必要な場合がある。本研究では、公共データベースの解析を出発点として、遺伝子水平伝播を介して酵素が新たな基質との反応性を獲得したことを見出した。好熱性硫黄還元菌Desulfurobacterium 属のゲノムには、鉄ヒドロゲナーゼのパラログ（以下、HmdII）と、鉄ヒドロゲナーゼの補欠分子族（以下、FeGP コファクター）の生合成遺伝子に類似する配列が存在する。しかし、鉄ヒ
ドロゲナーゼはメタン菌以外の生物からは見つかっておらず、その基質である C1キャリアー、テトラヒドロメタノプテリン（H4MPT）はDesulfurobacterium 属を含むほとんどの細菌では合成されない。このため、細菌における HmdII および FeGP コ
ファクター生合成遺伝子の存在意義は不明であった。我々は、Desulfurobacterium 属細菌のプロテオームからこれらの遺伝子産物を検出するとともに、本細菌がメタン菌に匹敵する量の FeGP コファクターを生産していることを確認した。FeGP コファ
クターと細菌 HmdII から合成したホロ酵素は、H4MPT 誘導体を用いた水素化反応を触媒したが、細菌の C1キャリアー、テトラ

ヒドロ葉酸（H4F）の誘導体も同反応に利用した。メタン菌の HmdII は H4MPT 誘導体のみを反応基質としたことから、H4F 誘

導体の水素化反応は細菌 HmdII に固有の特性であるといえる。HmdII の活性は鉄ヒドロゲナーゼの約 10000 分の 1 であり、水素ガスに対する親和性は約 10 分の 1 であった。この様に本酵素は水素ガスと反応するが、異化代謝系酵素であるとは考え難
く、水素センサーとして機能するものと考察している。進化系統樹解析の結果、本酵素がメタン菌において発生した後に遺伝

子の水平伝播を介して細菌に取り込まれたことが分かった。細菌 HmdII は細菌細胞環境に適応するために H4F 誘導体との反応性を獲得したと考えられ、その基質結合部位が H4F 誘導体と結合するために絶妙に調整されていることが X 線結晶構造から示された。

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O2-21

捕食性バクテリアCandidatus Uab amorphum と近縁株 3 株のゲノム比較○白鳥 峻志 1, 鈴木 重勝 2, 柿澤 侑花子 3, 浜崎 大雅 3, 矢吹 彬憲 1, 石田 健一郎 4
海洋研究開発機構 , 2国立環境研究所 , 3筑波大・院・生命環境 , 4筑波大・生命環境系

1

E-mail: tshiratori@jamstec.go.jp

Candidatus Uab amorphum は 2015 年に西太平洋熱帯域の表層海水から分離された Planctomycetes に近縁なグラム陰性細菌である。これまでの研究から、本生物は直径約 5 μ m の大型で柔軟な細胞、発達した繊維状構造をもち、他のバクテリアや小型の真核生物を包み込んで捕食することが明らかとなっている。Ca . Uab amorphum は真核生物のファゴサイトーシスに似た捕食を行う初めての原核生物であり、進化的な重要性だけではなく、捕食者としての生態的な役割についても興味深い。我々は2017 年に西太平洋熱帯域で採集したホヤ、巻貝の殻、表層海水から、Ca . Uab amorphum に近縁な 3 培養株を確立することに成功した（SRT713 株、SRT719 株、SRT722 株）。これらの培養株はいずれもCa . Uab amorphum と同様に、直径約 5 μ m の

大型で柔軟な細胞をもち、他の微生物を包み込んで捕食する様子が観察された。16S rRNA 遺伝子を用いた分子系統解析では、これらの培養株はCa . Uab amorphum と単系統群を形成し、Ca . Uab amorphum との配列の相同性はそれぞれ 82.8%、91.5%、
96.5% だった。本研究ではCa . Uab amorphum に近縁な新規培養株 3 株について、MinION 及び Illumina Hiseq によって全ゲノム配列を決定し、Ca . Uab amorphum との比較を行った。ゲノムサイズはCa . Uab amorphum が約 9.6 Mbp であるのに対し、SRT713 株が約 9.0 Mbp、SRT719 株が約 7.0 Mbp、SRT722 株が約 11.4 Mbp であった。いずれの培養株もCa . Uab amorphumと同様に、シグナル伝達に関わる遺伝子が近縁種に比べて多いことや、プリン、ピリミジンの新規生合成能を欠くことが明らかとなった。また、多くのアミノ酸の生合成能も欠いていたが、合成可能なアミノ酸の種類は株ごとに差異が見られた。発表
ではCa . Uab amorphum 及びその近縁株に見られる真核生物的な特徴に関わる遺伝子についても議論したい。

O2-22

根粒菌の窒素固定遺伝子を含むゲノム欠失と土壌環境適応○嵐田 遥 , 大竹 遥 , 菅原 雅之 , 三井 久幸 , 南澤 究
東北大院・生命E-mail: harashida@ige.tohoku.ac.jp
根粒菌は共生窒素固定能の獲得・欠失を繰り返し、土壌生活と共生生活に適応することが示唆されているが、その実験的証明はない。Bradyrhizobium 属根粒菌ゲノム (9-10 Mb) 上には、共生窒素固定遺伝子群が密集する外来性の共生アイランド(670-1000 Mb) が存在するが、その構造は近縁菌株間でも異なる。 Bradyrhizobium

diazoefficiens USDA122 株とRj2 宿主

ダイズ間で特異的に起こるエフェクター誘導性免疫 (Rj2 共生不和合性 ) を回避し、根粒形成した USDA122 変異株ゲノムを解析したところ、同種・同方向の挿入配列 (Insertion sequence: IS) 間で起こる相同組換えにより、Rj2 共生不和合性に関与する三型

分泌系タンパク質をコードするrhc 、エフェクタータンパク質をコードするnopP 、および窒素固定に関与するnif 遺伝子群を欠失していた。欠失株生成過程として、(i) 根圏における植物との相互作用と、(ii) 確率的な IS 介在型欠失生成の可能性が考えられた。また、根粒形成nod 遺伝子は変化せず nif 遺伝子が欠失すると、宿主を騙す（cheating）根粒菌となるが、IS 介在型欠失で生成されるnif 欠損根粒菌の生態的意義は不明である。

本研究目的は、(i) 自由生活条件下での確率的な欠失株生成の有無と (ii)nif 欠損株の生態的意義を解明することである。 本研究では、USDA122 に対してネガティブ選択マーカ― sacB を共生アイラ
ンドのrhc 遺伝子群の遺伝子間領域に挿入した変異株（122S1）を作製し、スクロース含有寒天培地を用いて自由生活条件における確率的な IS 介在型欠失の検出を試みた。122S1 を 5 日間液体培養後、スクロース含有培地上に生育したスクロース耐性株

を 32 株選抜した。これらゲノムの MiSeq ショートリードを取得し、参照ゲノム配列に対するマッピング解析を行ったところ、
32 株中 22 株でsacB と共に nif, rhc 遺伝子群が同種・同方向の IS を介して欠失していた。したがって、自由生活下で根粒菌の共生窒素固定能欠落が確率的に起こることが示唆された。

自由生活下での IS 介在型欠失によるゲノム縮小は、根粒菌ゲノムの複製効率を上昇させ得る。また、IS 介在型nif 欠損株は野生株に比べ、微好気条件下でのニトロゲナーゼ転写発現コストの軽減等も予測された。そこで、野生株と IS 介在型nif 欠損株の、土壌環境を模した多様な自由生活条件での増殖速度を比較し、IS介在型欠失が複製効率・増殖速度を上昇させるか検討を行った。その結果について議論したい。

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2019 JSME annual meetingO2-23

排水中の細菌が微細藻類の増殖に及ぼす影響○遠山 忠 1, 田中 靖浩 1, 森川 正章 2, 森 一博 1
山梨大・総研部 , 2北大院・環境

1E-mail: ttohyama@yamanashi.ac.jp【目的】微細藻類は、バイオディーゼルなどの燃料や有益な生理学的効果を有する高付加価値物質などを生産する有望なバイオマス資源の一つである。経済的かつ持続可能に微細藻類バイオマスを生産することを目指し、下水や排水を利用して微細藻類を培養する試みが注目されている。一方、海洋や湖沼などの自然環境中では、微細藻類は共存する細菌群の影響を受けながら生育している。そのような環境中では、ある特定の細菌群が微細藻類の増殖を促進していることを示す証拠が多く報告されている。これらの細菌群は、microalgae growth-promoting bacteria (MGPB) と称されている。しかしながら、排水中のMGPB の生態や特徴、その増殖促進効果などの詳細はほとんど分かっていない。本研究では、排水中の細菌群が 3 種類の微細藻類（Chlamydomonas reinhardtii , Chlorella vulgaris , Euglena gracilis ）の増殖に及ぼす影響を明らかにすることを目的とした。【方法および結果】今回我々は、3 種類の排水処理施設から採取した排水をオートクレーブにて滅菌処理したものと、オートクレーブ処理せずに生菌を残したものとに分け、合計 6 種類の排水を用いて 3 種類の微細藻類を培養した。その培養実験を通じて、排水中の細菌群が微細藻類の増殖を有意に促進することが観察され、その細菌群による微細藻類増殖促進は 3 種類の排水および 3 種類の微細藻類に共通していた。すなわち、この結果から、排水中には MGPB が広く存在していることが示唆された。排水を用いた培養中に微細藻類と共生する細菌を 80 株以上分離して系統解析したところ、その分離株のほとんどがAlphaproteobacteria 綱に属の細菌であった。さらに、個々の分離株をそれぞれの宿主藻類と共培養した結果、分離株の 7 割以上が宿主微細藻類の増殖を促進したものの、1 割程度の分離菌株は宿主微細藻類の増殖を阻害した。この結果から、排水中において微細藻類は MGPB と共存しているものの、増殖阻害細菌とも共存していることが示唆された。今後、優秀な MGPB を特定することができれば、微細藻類培養のプロバイオティクス材料として応用し、微細藻類バイオマスの増産が期待できる。

O2-24

オキナワモズク共存細菌群の網羅的解析法の構築○宇江城 蘭 1, 田中 厚子 2, 新里 尚也 3, 伊藤 通浩 3
琉球大・院理工 , 2琉球大・理 , 3琉球大・熱生研

1【目的】大型藻類の生育には共存する細菌が重要である。褐藻および緑藻では形態形成に、紅藻では遊走子着底に細菌が関与する例が報告されている。重要水産資源である褐藻オキナワモズク ( 以下モズク ) でも、共存細菌が藻体の生育に関与すると想定されるが、モズク共存細菌群に関する知見は殆ど無く、その機能は不明である。モズク共存細菌群の生態と機能を解明し、モズクの生長に関与する細菌群を発見することは、共存細菌を利活用する新規養殖技術の開発の端緒となると考えられる。本研

究では、モズク共存細菌群の生態と機能の解明に向け、1) モズクのメタゲノムおよびメタ 16S 解析法の構築、2) メタゲノムおよびメタ 16S データに基づくモズク共存細菌群の多様性と機能の推定を行った。

【方法】沖縄県糸満市で生産された市販モズクおよび同県本部町の天然モズクを藻体サンプルとして用いた。高収率 DNA 抽出法の確立には、抽出キットの種類、抽出に用いるビーズの粒径、クロロホルム・イソアミルアルコール (CIAA) 処理の有無および実施回数等を検討した。メタ 16S 解析に用いる標的領域としては、16S rRNA 遺伝子 V3-V4 領域と V5-V6 領域を比較検討した。シーケンシングには MiSeq ( イルミナ社 ) を用いた。

【結果・考察】植物用と土壌用の両 DNA 抽出キットの標準プロトコルを用いてモズクメタゲノム DNA を抽出したところ、モズ

ク共存細菌群の解析に不十分な DNA 量しか得られなかったため、DNA 抽出法を最初に確立することとした。ビーズビーティン
グの条件および CIAA 処理のタイミングと回数を検討して植物用キットの標準プロトコルと組み合わせた結果、DNA 収量が標準

プロトコルの約 4 倍に向上し、モズク共存細菌群の解析が可能となった。本方法により得たモズクメタゲノム中の微生物の多様度は、収率が比較的低い他の方法で得たメタゲノム DNA のそれより高いことが、メタ 16S 解析により判明した。以上から、
本 DNA 抽出法は多様な微生物を検出可能な優れた方法であると評価できた。次に、本方法で得たメタゲノム DNA をショットガ
ンシーケンス解析したところ、モズクには少なくとも約 400 種もの細菌が共存していることが示唆された。現在、ショットガ

ンメタゲノムのデータに基づいてモズク共存細菌群の機能ポテンシャルの評価を進めるとともに、ショットガン解析の結果に比較的近い菌種組成データが得られるメタ 16S 解析プロトコルを検討している。

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O2-25

一細胞自家蛍光シグネチャーに基づいた細胞集団の不均一性ダイナミクス○平山 智弘 1, 高部 響介 2, 野村 暢彦 2,3, 八幡 穣 1,2
筑波大・院・生命環境科学 , 2筑波大・生命環境 , 3筑波大・微生物サステイナビリティー研究センター

1

E-mail: hirayama.tomohiro.sg@alumni.tsukuba.ac.jp

遺伝的に均一な細胞集団内であっても、細胞の間には驚くほどの表現系の不均一性が生じていること明らかになりつつあり、
例えば遺伝子発現や増殖速度が一細胞ごとに異なることが明らかになっている。こうした表現系の不均一性は、環境変化に備

えた微生物の生存戦略として能動的に作り出されている場合や、あるいは微小環境の違いなどによって生じる場合があることなどが示唆されている。一方で、こうした表現系の不均一性が、進化的系統ごとどのように異なるのか、同じ種でも時間変化によって集団内の不均一性が変化するかといった体系的な知見は非常に限られている。こうした背景には、これまで不均一性の評価には一細胞トランスクリプトーム解析など手間と時間のある手法しか利用できなかったことがある。

そこで我々は「自家蛍光シグネチャー」という新しい細胞の表現型の指標を用いて、生育環境の違いや時間変化が細胞集団の不均一性に与える影響を定量化した。自家蛍光とは、細胞内の生体分子が発する微弱な自家蛍光であり、様々な生理状態を反映することが知られている。自家蛍光を表現型の指標とすることで、レポーターの挿入など侵襲的な処理が必要なくなり、一細胞トランスクリプトーム解析などと比べても圧倒的にシンプルに細胞間の性質の違いを定量的に評価できる。我々の研究グ

ループはこれまでに、細胞集団を顕微鏡観察と画像解析、機械学習を組み合わせ、多様な自家蛍光を「一細胞ごとの自家蛍光シグネチャー」として解析する技術、CRIF ( 特許第 6422616 号 ) を開発している。

CRIFによるクローナルな集団内での表現型の不均一性の定量的評価を行うにあたり、Escherichia coli および Pseudomonas aeruginosaをモデル生物とした。まず、細胞増殖における経時的な不均一性の時間変化を調べるために、経時的に自家蛍光シグネチャーを取得・解析した。その結果、E.coliおよびP. aeruginosa のいずれも増殖段階によって異なる不均一性を有していた。特に、E. coliにおいては対数増殖期から定常期にシフトする時点で不均一性が増加し、定常期になると不均一性が小さくなる様子が見られた。この結果
は自家蛍光シグネチャーの不均一性は時間的に一定でなく、ダイナミックに変化するものであることを新たに示すものである。本研
究は、CRIFが様々な種類の微生物や条件における集団の不均一性の体系的理解を進める研究の青写真となることを示した。

O2-26

Pseudomonas sp. LAB-08 株由来増殖抑制物質に対する大腸菌の代謝スイッチングによる適応機構○本荘 雅宏 1, 鈴木 研志 1, 天野 光喜 2, 田代 陽介 2, 二又 裕之 1,2,3
静大院・自然 , 2静大・工 , 3静大・グリーン研

1E-mail: honjo.masahiro.17@shizuoka.ac.jp

当研究室では環境微生物の一種であるPseudomonas sp. LAB-08 株が他の微生物の増殖を抑制する物質を生産することを発見した。これまでに増殖抑制物質は水溶性の中分子量の物質であることが示唆され、様々な微生物種の増殖に影響を与えることが確認されている。また、大腸菌は増殖抑制物質によって一時的に増殖が抑制されるものの、その後再び増殖が復活する。さ
らに大腸菌の一遺伝子欠損ライブラリである KEIO コレクションを用いた増殖抑制物質に対する耐性株のスクリーニングから解糖系および糖新生の抑制が推測されている。そこで、本研究では増殖抑制物質の作用機序を推定しそれに対する大腸菌の適応機構の推測および増殖抑制物質同定のための精製を行った。
まず、作用機序の解析のためにEscherichia coli BW25113 株を用いてグルコースを炭素源とし解糖系を駆動した場合および酢酸アンモニウムを炭素源とし糖新生を駆動した場合における増殖抑制物質の影響を評価した。その結果、解糖系を駆動した
場合には一時的に増殖が抑制されるものの、その後増殖が復活し適応を示した。一方、糖新生を駆動した場合には増殖の復活は確認されなかった。そこで、グリセルアルデヒド 3- リン酸からホスホエノールピルビン酸までの 4 段階の代謝について、それらの遺伝子転写を解析したところ、1,3- ジホスホグリセリン酸から 3- ホスホグリセリン酸へ変換する酵素遺伝子pgk の転写量が著しく抑制されていた。このことから増殖抑制物質によるpgk 遺伝子の転写抑制、あるいはこの上流の代謝を担う GapA の酵素活性阻害が推測された。さらに大腸菌は上記代謝経路を介さないペントースリン酸経路のグルクロン酸からピルビン酸につながるエントナー・ドウドロフ経路に代謝を切り替えることで、増殖抑制物質に適応していることが示唆された。
次に、増殖抑制物質の構造決定を進めるため、LAB-08 株培養上清を回収し濃縮、脱塩を行ったのち ODS カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにてメタノール濃度を変化させたグラジエント分析により分画を行った。分画溶液を用いて増殖抑制活性試験を実施し、活性が確認された分画を質量分析計にて分析を行ったところ、複数のピークが確認された。現在、増殖抑制物
質の更なる精製方法を検討中であり、今後精製された増殖抑制物質を用いて NMR 解析を実施し物質の同定を図る予定である。

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2019 JSME annual meetingO2-27

ソルガム由来Bradyrhizobium 属細菌株の窒素固定とタンパク質分泌系の多様性○原 沙和 1, 原 新太郎 1, 菅原 雅之 1, 森川 峻志 1, 米田 淳一 2, 徳永 毅 2, 南澤 究 1
東北大・院生命 , 2（株）アースノート

1

Bradyrhizobium 属細菌は根粒菌として知られているが、森林土壌や非マメ科植物の根にも普遍的に分布しており、ダイズ根粒菌とは系統的にも機能的にも異なる。森林土壌の Bradyrhizobium 属細菌は芳香族化合物分解系を有するが、窒素固定能と根粒形成能は見出されない。非マメ科植物根に内生するBradyrhizobium 属細菌は窒素固定能の有用性からイネ科作物（イネ、サトウキビ、ソルガム等）を対象に分離され、一般に窒素固定を行うが、マメ科植物への根粒形成能を欠いていた。しかし、ソルガムからは一部で根粒菌に近縁な株が分離され、Bradyrhizobium 属細菌の土壌 - 植物生態系における多様な生存戦略が考えられた。本研究はソルガムに注目し、内生するBradyrhizobium 属細菌のゲノム解析により、その機能的多様性と特性を明らかにすることを目的とした。圃場栽培ソルガム根から、ポリミキシン B 耐性や根粒形成能を用いてBradyrhizobium 属細菌を選択的に分離した。分離株について根粒形成能、自由生活下における窒素固定能、ITS 配列による系統関係を調査した。さらに代表株のドラフトゲノムを決定し、MAPLE(Metabolic And Physiological potential Evaluator) を用いて機能遺伝子の保存性を比較した。ソルガム根から 44 株のBradyrhizobium 属細菌が分離され、根粒形成株（Rh: 38 株）、自由生活下で窒素固定活性を示す株（Fd: 3 株）、窒素固定活性のない株（Nd: 3 株）に分類された。系統解析では Rh はB. japonicum , B. diazoefficiens , B. ottawaenseに、Fd はB. oligotrophicum や Bradyrhizobium sp. S23321 に近縁であった。Nd はB. ottawaense に近縁で、B. ottawaense クレー

ドは Rh と Fd の両者を含んでいた。代表株におけるゲノム機能解析の結果、タンパク質分泌系遺伝子の保存性の相違が見出された。 特に、他細菌や真核細胞を死滅させるタンパク質を分泌することで知られている VI 型タンパク質分泌系 (T6SS) の有無は系統関係に依存しており、B. japonicum , B. diazoefficiens は保持していたが、B. ottawaense は完全に欠いていた。B. ottawaense
は根粒形成能があるにも関わらず、これまで日本でダイズ根粒から分離された例はない。以上の結果から Bradyrhizobium 属細菌における T6SS が他細菌との競合力や土壌 - 植物系における生息域の分化に影響している可能性が考えられた。

O2-28

Formation of cooperative metabolic network is constructed by chemicallymediated interspecies interaction○ Jabir Mohd Din1, Tomoka Nishimura2, Ayaka Minuora2, Kenshi Suzuki2, Masahiro Honjo2, Koki Amano2,
Yosuke Tashiro1,2, Hiroyuki Futamata1,2,3
Grad. Sch. of Sci. Technol., Shizuoka Univ., 2Grad. Sch. of Integr. Sci. Technol., Shizuoka Univ.,
3
Res. Inst. of Green Sci. Technol., Shizuoka Univ.
1

E-mail: abdrahmanjabir@gmail.com

Understanding interspecies interaction is the key in manipulation of complex microbial ecosystem. Regulation of metabolite
secretion can strongly maintain such complexity in ecological processes. However, it remains unclear chemical mediators canbe a determinant of coexistence and provides new metabolic dependencies that beneficial for bacterial growth populations.
This study aims to clarify how two different species coexist in a cooperative interaction involving the phenol degradation.
Comamonas testosteroni strain R2 and ,Stenotrophomonas sp. strain Y was employed to elucidate essential mechanisms inconstructing a microbial stability, a continuous chemostat fed with phenol as a sole carbon and energy source. Coexistence ofthe phenol degradation capability of the strain R2 was found only in the presence of a non-phenol degrader strain Y. Real-time
qPCR analysis showed that population densities of strains R2 and Y were maintained with 8.0 ± 1.1 × 108 copies mL-1 and 2.2± 0.9 × 108 copies mL-1 respectively. These results suggested that strain R2 produced self-inhibiting metabolites and in return,strain Y utilized them as essential resources, leading to stable coexistence on phenol. Different methanol fractions of strain R2
supernatants was extracted using C18 silica gel based solid phase cartridge and tested for the highest inhibition activity forcompound purification. The highest inhibitory activity was detected in 10% methanol fraction, suggesting the presence of selfinhibiting compound. The H2O fractionated strain R2 supernatant was further analyzed by using gradient HPLC. The effect of
the H2O-fraction on kinetic parameters for the phenol and catechol of strain R2 were investigated. These results suggested thatthe relationship between strains R2 and Y was constructed via cooperative interaction and served as a basis understanding of
metabolite leakage phenomena underlying the functionality of metabolic network in microbial communities.

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2019 JSME annual meeting

O2-29

Mitigating N2O emissions from agricultural soils by fungivorous mites○申 浩洋 1, 白鳥 豊 2, 太田 沙由理 2, 増田 曜子 1, 妹尾 啓史 1,3
東大・院農 , 2新潟・農総研 , 3東大・微生物連携機構

1

E-mail: hoyhn.shen@gmail.com

Nitrous oxide (N2O) is an important long-lived greenhouse gas and ozone-depleting substance. Agricultural soils are thelargest anthropogenic sources of global N2O emissions. N2O emissions from soils are primarily the results of the enhanced

N2O-producing microbial processes in the soil after fertilizer application, including denitrification and nitrification of bacteria,

archaea, and fungi. Thus, suppressing the growth or the N2O-producing processes of these microbes should be the key tomitigate N2O emissions. However, there are many difficulties to do these works at a field-scale so that mitigating N2O emissions
globally is still a big challenge so far. Here we show that fungivorous mites, fungal grazers widespread in most of the dryland
agroecosystems, can be employed to suppress the growth of the N2O-producing fungi and accordingly mitigate N2O emissions
from agricultural soils. We found fungivorous mites had considerable abilities to consume N 2O-producing fungi, and theincreased fungivorous mites in soils could decrease the fungi abundances and accordingly decrease the N2O emissions.

Meanwhile, we found an easy way, applying coconut husk, an agricultural waste, to the soil, to increase the fungivorous mites
in the farm, and so that decreased the N2O emissions at a field-scale. These findings suggest a biological control technique forthe mitigation of N2O emissions, which is cheap, natural, and helpful for alleviating the pressures of solid waste disposal intropical countries. Our study points out that N2O-producing microbes, which are ubiquitous in the soil, can be controlled bytheir also ubiquitous ecological consumers. We anticipate this study to be focused as an ecologically based novel strategy forthe mitigation of soil N2O emissions.

This research was supported by grants from the Project of the NARO Bio-oriented Technology Research Advancement Institute(Research program on development of innovative technology).

O2-30

イネ根圏環境を再現した新規試験管培養系を使用したKlebsiella oxytoca NG13とAzospirillum lipoferum FS の窒素固定の動態解析○吉留 大輔 , 近藤 佐紀 , 鵜沼 廣太朗 , 日高 真誠
東大・院農

E-mail: babum.babuc.babub@gmail.com【目的】水田に投入される化学窒素肥料の削減法の一つとして、当研究室では、イネ栽培時の追肥部分を生物窒素肥料で置き換えることを目指している。一般にイネ根圏での窒素固定活性はさほど強くないとされてきた。しかし、当研究室の研究では、C源資化性の異なる 2 種類の窒素固定細菌Klebsiella oxytoca NG13 とAzospirillum lipoferum FS を追肥時期に接種したイネの籾
収量は、無接種のものより 2 割増加した。そこで本研究では、イネ根圏環境を再現した新規試験管培養系を構築することで、NG13 株と FS 株が発揮する本来の窒素固定活性の測定を目指した。【方法と結果】窒素固定活性の測定には、液体 Rennie 培地を用いるバッチ培養が汎用されてきた。この方法で NG13 株と FS 株を混合培養すると、NG13 株は数日で C 源を消費しつくして窒素固定活性を発揮しなくなった。また、NG13 株の混合有機酸発酵で培地 pH が低下し、FS 株の増殖が阻害された。そこで、イネの根が 1 日に分泌する C 源を含む Rice 培地を考案した。まず、この培地で NG13 株を液体培養し、1 日分の C 源を毎日添加した（培養系 1）。すると、窒素固定活性が 2 週間程度（追肥の肥効期間と等しい）持続したが、培地 pH の低下は改善されなかった。そこで次に、半透膜内の Rice 液体培地に NG13 株を封じ、これを Rice 液体培地に浸して培養する方法に変え、この外側の液体培地を毎日交換した（培養系 2）。すると、培養液の酸性化が緩和され、NG13 株の窒素固定活性は培養系 1 より 5 倍に増大した。さらに、培養系 2 の半透膜を人工鉱物繊維であるロックファイバーに換えて培養系 2 と同様に培養した（培養系 3）。
すると、NG13 株はロックファイバー上にバイオフィルムを形成し、窒素固定活性は培養系２より 2 倍に増大した。この培養系
3 を新規試験管培養系と名付けた。新規試験管培養系で NG13 株と FS 株を混合培養すると、相加的な窒素固定活性が発揮された。 最後に、新規試験管培養系に水田土壌細菌叢を構築した。水田土壌細菌の混合液を、新規試験管培養系で数日間培養し、そこに NG13 株と FS 株を後から添加したところ、系全体の窒素固定活性が 2 ～ 3 割増大した。【結論】以上の結果より、NG13株と FS 株がイネ栽培時の追肥として十分な窒素固定活性を発揮できる可能性を示せた。また今後、イネ根圏に生息する窒素固定細菌全般においても、新規試験管培養系を用いることで既知の窒素固定活性とは全く異なる活性を見出せるであろう。

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P1-01

同位体分析による落水後の水田における N2O 生成反応の解明とバイオ炭による
N2O 削減の検討○伊藤 有里子 , 細見 正明 , 寺田 昭彦 , 利谷 翔平
東京農工大・院工E-mail: yito@st.go.tuat.ac.jp【背景・目的】亜酸化窒素 (N2O) は強力な温室効果ガスであるとともにオゾン層破壊物質である。水田では落水後に突発的に多量の N2O が発生するが、生成反応や削減方法は明らかにされていない。N2O 生成反応の推定については、窒素同位体比が生成反応によって変化することを利用した手法が報告されている。さらに、土壌の N2O 削減方法については、近年、バイオ炭の施用が注目されている。しかし、バイオ炭の施用による N2O 削減効果が確認されている一方で、N2O が増加したという報告もあり、どのような条件下で N2O 削減効果が現れるのかは明らかになっていない。そこで本研究では、まず量子カスケードレー
ザーにより連続的に N2O 濃度と SP 値 (Site Preference) を計測可能な N2O 同位体比アナライザーを用いて落水後突発的に生成する N2O の生成反応を調査した。その上で、水田での施用を想定し、土壌が酸化的な条件下と還元的な条件下のそれぞれにおいて、バイオ炭による N2O 削減効果を評価した。
【実験方法】水田土壌を充填した土壌カラムを調製し、100 kg N ha-1の窒素負荷量で(NH 4)2SO4を添加した後、落水させた。実験は落水方法を変えて2回行い、1回目は土壌浸透無し（自然蒸発）、2 回目は浸透速度 1 cm/dayで行った。ヘッドスペースに純空気を0.2 L/minで流し、N2O 同位体比アナライザーに導入してN2O濃度とSP値を測定した。なお、異なるN2O濃度の標準ガスをアナライザーに導入したところ、1.5 ppm以下で SP 値を安定的に測定できなかったため、1.5 ppm 以上のN2O濃度のSP値を評価した。
【結果・考察】ヘッドスペース中の N2O 濃度は落水後に上昇し、N2O の生成が確認された。N2O 濃度が 1.5 ppm 以上において、土壌浸透がないカラムの SP 値は脱窒によって生成される報告値と近い－ 5 ～ 10‰を示し、土壌浸透を行ったカラムでは硝化（ヒドロキシルアミン酸化）によって生成される報告値と近い 30 ～ 40‰を示した。土壌浸透がない場合では土壌水分量が高く還元的な状態が続いたため脱窒が促進され、土壌浸透を行った場合では土壌に酸素が入り込みやすくなり酸化的な状態になったため硝化が促進されたと推測された。以上より、土壌浸透速度の違いにより生成反応が変化する可能性が示唆された。バイオ炭による N2O 削減の検討はポスターにて発表する。

P1-02

微生物有害元素代謝の多様性：嫌気的アンチモン酸化細菌群の代謝機構と系統分布○大久保 公貴 1, 山下 葉里子 1, 濱村 奈津子 1,2
九州大・院 システム , 2九州大・院理

1E-mail: okubo.tomotaka.251@s.kyushu-u.ac.jp
レアメタルの一種である周期表第 15 族のアンチモン (Sb) は、同族元素のヒ素と同様に生体毒性元素であり、近年、産業利用の増加やそれに伴う鉱山活動による環境への放出が問題となっている。アンチモンは環境中では主に無機態の３価（SbIII）もしくは５価 (SbV) の状態で存在し、３価型はより高い生体毒性を示すが、溶解度が低く吸着性が高いことが報告されている。あら

ゆる生物種の中で唯一微生物は、これら環境中に広く分布している有害元素への耐性のみならず、エネルギー源として利用す

るより積極的な代謝機構も発達させてきた。しかし、これまでにヒ素以外の有害元素の生物代謝に関する知見は限られており、ヒ素と同族元素であるアンチモンの微生物代謝についても未解明な部分が多い。そこで本研究では、新規アンチモン代謝菌群の分離培養による同定とゲノム解析を実施し、有害元素代謝微生物の代謝機構と系統分布を明らかにすることを目的とした。
高アンチモン環境試料を接種源とし、酸素条件や炭素源等の異なる条件で集積培養を実施した結果、通性嫌気性アンチモン酸化能を示すα -Proteobacteria 網Mesorhizobium sp. , β -Proteobacteria 網のHydrogenophaga , Cupriavidus spp. を分離同定した。

さらに、Mesorhizobium 株と Hydrogenophaga 株のゲノム解読の結果、両者とも先行研究で同定されているアンチモン酸化酵

素 (AnoA) の類似配列は保有していなかったが、これら２株は相同性の高いプラスミド配列を共有しており、このプラスミド上には、ヒ素酸化還元酵素グループの属する DMSO リダクターゼファミリーの遺伝子が確認された。これまでに、ヒ素酸化細菌
によるアンチモン酸化が報告されているが、本研究で同定された２株とも同族元素のヒ素は代謝しないことから、異なるアンチモン代謝機構を有する可能性が示唆された。これらの結果は、有害元素ヒ素の微生物代謝と同様に、アンチモンの代謝機構も系統的また生理生態的に多様な Proteobacteria 門の多系統に分布していることを示すとともに、環境中で SbIII の SbV への酸化はアンチモンの溶出を促進することも懸念されることから、今後これらアンチモン代謝細菌の環境分布や環境動態への影響の評価が望まれる。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
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P1-03

土壌抽出液培地を用いた MPN 計数を経由した多様な新規アンモニア酸化アーキ
アの実験室培養○梅澤 千陽 1, 黒岩 恵 1, 橋本 知義 2, 磯部 一夫 3, 諏訪 裕一 1
中央大・院理 , 2農研機構 , 3東京大・院農1E-mail: a14.7d4h@g.chuo-u.ac.jp【はじめに】 選択的でない培地を使用して，積極的には集積培養しないとしたら，どんな硝化微生物（AOM）が培養されるか？土壌抽出液を基礎培地として土壌中の AOM を MPN 計数したところ，選択的な無機培地による計数値を上回り，アンモニ

ア酸化アーキア（AOA）が優占した。AOA は無機培地でほとんど培養されず，AOA の培養で土壌抽出液が有効な可能性が示唆された（Umezawa et al. , 2018, JSME）。では，どれほど多様で新規な AOA を培養できるか？【試料】 20 年以上有機農法を継続しているつくば市の畑地から，表層 10 cm の土壌を採取した（pH，7.48；含水率，25 %）。【実験系】培地；4 種類の培地を調整した。土壌抽出液（TOC は 277.4 ppm，NH4 ＋，NO2 －，および NO3 －は，それぞれ，4.25，7.63 ，72.5 ppm）の pH を 7.6

あるいは 6.5 とし，15N 標識した硫安あるいは尿素を 1.5 mM-15N 添加した。培養；土壌を 10 倍ずつ系列希釈し，5 希釈段階を5 連で各培地に接種し，25℃，8 週間培養した。硝化によって生産された 15NO2 －と 15NO3 －は，15N トレーサー法と脱窒菌法を組み合わせて検出・定量した。AOA の同定；

MPN で硝化陽性と判定された培養中の AOA は，AOA に特異的なアンモニア酸化酵素（amoA）をターゲットに PCR で検出した。アンプリコンの塩基配列を決定し既知の amoA 配列と比較した。【結果と考察】全 100 培養のうち，74 培養で硝化が検出された。無作為に選んだ 56 培養中，14 培養で AOA 陽性であった。残りの 42 培

養中 AOB が検出されたのは 5 培養で、他 37 培養はどちらも検出されなかった。AOA 陽性の内 13 培養について，PCR 産物の塩基配列をクローニングせずに読むことができ，単一の AOA 種が優占した可能性が示唆された。これら 13 培養中の優占 AOA は，
98 % 以上の相同性を基準として，６OTU に類別された。それらのうち，1OTU は既知株と 100 % 相同であったものの，残りの5OTU はいずれも新規性が明確で，既知株との相同性は 84.94 ～ 94.72 % であった。13 培養中 5 培養は 7 代にわたり継代培養
でき，新規な AOA の分離源とできる可能性があるものと考えられる。

P1-04

Water-in-Oil DropLet (WODL) を用いたペプチダーゼ高生産微生物のスクリーニングと菌叢解析○本間 宣行 1, 中村 彰宏 1, 鈴木 義之 2, 志田 洋介 1, 小笠原 渉 1
長岡技科大・院工 , 2長岡高専・専攻科

1

E-mail: s141080@stn.nagaokaut.ac.jp

Water-in-Oil DropLet(WODL) とは油中に微小水滴が分散した系であり、広義にはエマルションを指す。近年、微小量の流体を扱う技術の進歩により、均一で安定な WODL の作成とその内部での長時間の細胞培養が可能になった (W. Liu et al., Lab ona chip, 2009)。また、WODL 内に蛍光基質を封入することで微生物が保持する酵素活性の検出や、数十万を超える WODL の高速分離が可能となっている。これらの特徴を生かし、WODL は微生物スクリーニングに応用されている (Y. Qiao et al., Lab
on a chip, 2018)。しかし、その例は少ない上、市場規模の大きいペプチダーゼ ( プロテアーゼ ) に対するスクリーニング系は未だ確立されていない。そこで我々は、ペプチダーゼを標的とすることで、新規ペプチダーゼ生産微生物の単離を目指し、さらに WODL を用いた高効率なスクリーニングの有用性を提示する。本研究では、ペプチダーゼ高生産菌Pseudoxanthomonas
mexicana WO24 をモデル微生物として、スクリーニング構築のための基礎検討をした。さらに、環境中からペプチダーゼ活性が高い微生物種を網羅的に解析することで、単離が期待される微生物種を同定した。
最初に、WODL を用いたスクリーニング系を用いて、モデル微生物の特異的分離を試みた。ペプチダーゼ高生産微生物P.
mexicana WO24 と低生産Escherichia coli を別々の WODL に封入して混合培養を行い、蛍光基質によりペプチダーゼ活性を検出した。On-chip Sort(On-chip biotechnologies 社 ) による解析の結果、P. mexicana WO24 が増殖した WODL 内でE. coli よりも高い酵素活性が検出され、蛍光に基づいてペプチダーゼ高生産菌であるP. mexicana WO24 の分離に成功した。
次に、環境微生物に対するスクリーニングを実施した。土壌中から微生物を抽出し、蛍光基質を含む培地に懸濁し、WODLを作成した。24 時間の培養後、WODL 内で十分な菌体の増殖とペプチダーゼ活性による蛍光を確認した。そこで、45 万の
WODL から蛍光強度が高い上位 1% を分離し、菌叢解析によりペプチダーゼ活性が高いと予測される微生物種を同定した。その結果、高活性を示した微生物種の中にはペプチダーゼ生産能力に優れたP. mexicana WO24 の類縁種が多数存在した。本研究により、我々は WODL を用いたスクリーニング系の基盤を構築し、菌叢解析の結果からペプチダーゼ高生産微生物の新規単離が期待されることを明らかにした。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

P1-05

X 線マイクロ / ナノ CT による深海海底土壌の微生物細胞可視化
画像処理によるアプローチ○比嘉 勝之 1, 山村 雅幸 1, 諸野 祐樹 2
東工大・生命理工 , 2海洋研究開発機構

1

E-mail: higa.k.ab@m.titech.ac.jp

環境中に生息する微生物およびその生息環境を立体的に可視化することは、様々な微生物反応の「場」を観察するために有効な手段である。この「場」の観察を通し、微生物細胞の分布、微生物と生息環境との相互作用といった、微小な生命現象の理解が深まることが期待される。近年、X 線を利用した CT（Computed Tomography：コンピュータ断層撮影）によって、サブ

マイクロメートルレベルの空間分解能で試料の観察を行うことが可能になっており、微生物レベルの極小物質の分布を可視化することも可能になってきている。しかし、主に軽元素で構成される微生物細胞は、X 線が容易に通過するため、十分なコントラストをもって可視化することができなかった。

海洋研究開発機構の諸野研究員らによって、特定元素により微生物細胞を染色後、CT 撮影を行うことで微生物の可視化をより効率的に行う試みがなされている。さらに、X 線吸収係数が急激に変化する吸収端前後のエネルギーで CT 画像を取得し、これをコンピュータ上で処理することで、染色された微生物細胞のみを可視化することが可能であることも示唆された。

しかし、この吸収端前後のエネルギーで取得された CT 画像間には、「位置的なズレ」が生じていることが判明した。そしてこの位置的なズレは、微生物細胞のみを可視化する処理を行う際に問題となっていることもわかった。本研究では、この位置的なズレをコンピュータ上での画像処理により解消し、より精細に微生物細胞の分布を可視化することを試みている。

P1-06

Alicyclobacillaceae 科の新規好熱・好酸性細菌の単離と特徴づけ○井奥 有希 , 森 美穂 , 城島 透
近畿大・院農リグノセルロース系バイオマスから燃料や化学品を生産するバイオリファイナリー（BR）は、地球温暖化対策技術として期待されている。一方、現在の BR には種々の技術的課題が残されており、石油から製造した同等品よりも製造コストが高く、実用化はそれほど進んでいない。リグノセルロース系バイオマスを原料とした変換プロセスでは、糖化酵素によりバイオマスから生成した糖類は、微生物により各種の有用物質に変換される。この時、糖化反応の最適条件は、およそ 50℃、pH 5 である
ため、一般には糖化工程と発酵工程は分離して実施される。仮に発酵工程を糖化反応の最適条件で実施できれば、並行複発酵が可能となり、製造コストを低減できる。そこで本研究では、リグノセルロース系バイオマスの並行複発酵による効率のよい

バイオプロセスの構築を目指し、好熱・好酸性細菌 TP075 株を土壌から単離した。TP075 株の 16S rDNA 配列を取得して系統解析を行ったところ、最近縁種としてTumebacillus 属の中では T. soli に対して 92.5%、Effusibacillus 属の中では E. consociatusに対して 92.7% の相同性を示した。また、分子系統樹では、TP075 株と 99% 程度の相同性を示す未培養細菌は、Tumebacillus
属、およびEffusibacillus 属細菌とは独立したクラスターを形成していた。次に、生理学的性質を検討したところ、TP075 株の最適培養温度と培養 pH は、それぞれ 47.0℃、4.0-5.0 であり、炭素源としてグルコースやキシロースなどを利用可能であった。また、主要な脂肪酸組成は、iso-C 15:0（21.7%）と anteiso-C15:0（18.9%）であった。これに対してTumebacillus 属細菌の最適培養条件は、培養温度が 28 ～ 37℃、pH は中性付近であり、また、脂肪酸は iso-C 15:0の割合が最も多かった。一方、

Effusibacillus 属細菌の最適培養条件は、培養温度は 30-50℃、pH は中性付近であり、最近縁種である E. consociatus の脂肪酸
組成は、anteiso-C15:0が最も多かった。以上の結果より、TP075 株は新属新種の細菌と考えられた。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

P1-07

運動性乳酸菌の選択分離法の構築と環境中からの分離○真崎 志桜里 1, 田中 悠二 2, 柳田 藤寿 2, 乙黒 美彩 2
山梨大・地域食物 , 2山梨大院 ･ ワイン研

1【目的】乳酸菌は一般的に非運動性であるが、近年 Lactobacillus 属のいくつかの種で運動性が報告されている。しかし、運動性乳酸菌の既知種が少なく、運動性の機能において未解明な点が多いため、運動性乳酸菌の研究開発および産業利用はほとんど行われていない。本研究では化学走性を利用した運動性乳酸菌の選択分離法を構築し、自然界及び発酵食品中からこれらの菌群を効率的に分離することを目的とした。【方法・結果】選択分離法の基盤に毛細管捕集法を用いた。初めに毛細管捕集法の改良として充填する誘引剤の選抜を行った。次に、運動性乳酸菌の分離報告の多いワイン醸造環境を主な分離源として、運動性

乳酸菌の分離を行った。分離乳酸菌の同定を 16S rRNA シーケンス解析にて行うことで分離方法の有効性を検討した。誘引剤

としての効果をアミノ酸水溶液や Yeast extract 水溶液など 10 種類について運動性乳酸菌の既知種 2 株に対する誘引剤の評価試

験を実施した。その結果、フェネチルアルコール、Yeast extract 水溶液、リン酸緩衝液が有効であることを見出した。これらの誘引剤による改良毛細管捕集法を、土壌、植物、ワイン発酵もろみなど計 24 サンプルに適用し、運動性乳酸菌の分離を試みた。分離株計 317 株中 14 株に運動性が認められ、16S rRNA シーケンス解析の結果 14 株はすべて Lactobacillus nagelii と同定
された。

P1-08

白神山地のブナから分離した新規Chloroflexi 門 Ktedonobacteraceae 科細菌
brp13 株に関する研究○大坂 彩瑛 , 殿内 暁夫
弘前大・院農1993 年に世界自然遺産に登録された白神山地は人為的影響をほとんど受けていない原生的なブナ天然林が世界最大規模で分布している。演者は白神山地に生育するブナの根圏から細菌株 brp13 を分離し、Chloroflexi 門 Ktedonobacteraceae 科の新属・新種と推定されること、植物成長促進作用があること、子嚢形成能を有することなどを昨年度の本大会で報告した。今回、brp13
株の化学分類学的解析・ゲノム解析を行うとともに、分離源であるブナに対する植物成長促進能についての解析を行ったので報告する。brp13 株は細胞脂肪酸・キノン・リン脂質・細胞壁アミノ酸・糖の化学分類学的特徴のうち、特に細胞壁アミノ酸
および糖の構成に最近縁種Dictyobacter aurantiacus S-27T との明確な差異が認められた。ドラフトゲノム解析により brp13 株のゲノムサイズは 8.94 Mb で推定遺伝子数は 7,257、KEGG アノテーションでは炭水化物の代謝に関する遺伝子の数が多いことが予測された。ブナ種子を滅菌土壌と滅菌土壌に brp13 株に混和した土壌に播種したところ、発芽開始時期や成長初期には大きな差異は見られなかった。しかし、滅菌土壌のブナが播種後約 50 日で枯死した後も brp13 株を含む土壌のブナは生残したことから、brp13 は自身の有する IAA 生産能や抗細菌・真菌増殖能によりブナの生育に正に関与する可能性が示唆された。以上の結果に基づき、brp13 株を基準株とした新属・新種 “Ktedonosporangium fagi ” を提案する予定である。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

P1-09
講演取下げ

P1-10

難培養性微生物Nitrospira の覚醒シグナルに応答する遺伝子の解明○木村 弥実 1, 木村 聡美 1, 寺地 裕康 2, 村上 千穂 1,3, 木村 康浩 1, 青井 議輝 3
安田・薬 , 2広大・院工 , 3広大・院統合生命1

環境中の多くの微生物は難培養性であることが知られている。その事実は微生物学において本質的に重要な課題であるにもかかわらず、なぜそれらが培養できないのか、つまり難培養性という性質についての本質的な理解は全く得られていない。一方で、門レベルで難培養性を示すNitrospira は、亜硝酸酸化反応を主要に担う重要な微生物種であるにも関わらず、分離に成功

した例は極めて少ないが、我々は新規な手法を適用することで、Nitrospira の純粋菌株を獲得している。本研究では、難培養性
微生物Nitrospira をモデルとして用いて、その増殖制御機構を解明することを目的とした。

難培養性微生物Nitrospira は、増殖と死滅以外に休眠（生きているが増殖しない）といえる状態にも移行することが分かってきた。休眠状態のNitrospira は、エネルギー源である亜硝酸を供給しただけでは増殖を開始しないが、自身の培養上清も同時に加えと速やかな増殖開始が見られる。したがって、この上清中に休眠状態のNitrospira に作用する覚醒シグナルが存在する

ことが予想されているが、それがどのように作用しているかは全く明らかになっていない。そこで、休眠・増殖・覚醒状態のNitrospira の RNA を抽出して次世代シークエンスにより total RNA-seq の解析を行った。

解析の結果、Nitrospira の推定機能遺伝子を含む 4105 個の各状態の遺伝子発現状態が明らかとなった。その内、環境の変化に応答して遺伝子の発現が変化する機構として、RNA ポリメラーゼのシグマファクターと二成分制御系を担うヒスチジンキナーゼに着目した。Nitrospira の 17 個のシグマファクターの内、休眠時に特異的に発現するシグマファクターを 1 個に絞ることができた。また、13 個のヒスチジンキナーゼの内、2 個のヒスチジンキナーゼが休眠からの覚醒時に発現していることが分かった。
これらの結果から、飢餓からの休眠時に特異的なシグマファクターと、覚醒時に働くヒスチジンキナーゼ遺伝子を絞り込むことができた。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meetingP1-11

なぜコロニーを作らないのか？液体培地でしか増殖しない難培養微生物（Nitrospira ）にコロニーを作らせる○田村 淳 1, 寺地 裕康 2, 村上 千穂 3, 金田一 智規 2, 大橋 晶良 2, 青井 議輝 1
広大 院統合生命 , 2広大 院工 , 3安田 薬

1E-mail: m192145@hiroshima-u.ac.jp

環境中の多くの微生物は難培養性であることが広く知られているが、普遍的かつ本質的な理由やメカニズムは全く解明されていない。もしその一端が明らかになれば多くの未培養微生物の培養化につながり、さらには環境中で微生物が増殖を制御している未知なる機構の発見も期待できる。一方で、門レベルで難培養性を示す Nitrospira は、亜硝酸酸化反応を主要に担う重要な微生物であるにも関わらず分離に成功した例は極めて少ないが、我々は新規な手法を適用することで、Nitrospira の純粋菌株を獲得している。また他の多くの硝化細菌がそうであるように Nitrospira は固体培地上でコロニーを形成しない。さらに従来の分離培養法の多くは固体培地上でのコロニー形成を基盤としているため、性質的にコロニーを形成しない微生物は必然的に分離困難と言えるが、その理由はほとんど明らかになっていない。そこで本研究では、難培養性微生物 Nitrospira をモデルとして、コロニーを形成しない理由を明かにすることを目的とした。これまでの我々の検討から、Nitrospira は休眠状態に陥りやすく覚醒にはシグナル様因子が必要であること、そしてそれが難培養性の一つの原因であることが判明しているが、いったん増殖を始めると液体培地では比較的良好に増殖する。そこで我々はコロニーを形成しない理由について以下の仮説を立てた。１）Nitrospira は、自身が産出する特定の代謝（副）産物の蓄積により増殖が停止する。２）固体培地上では、活性のある細胞の周囲にそれらの代謝（副）産物が局在的に蓄積するため、コロニーとして視認できるレベルまで増殖しない。したがって、増殖を停止させている代謝（副）産物の局所的な濃度を常に低レベルに維持できれば、Nitrospira は視認できるサイズのコ

ロニーを形成できるはずである。そこで、本研究では培養中において常に自身の代謝（副）産物の拡散・希釈を進行することを可能にした培養装置をデザインした。そして実際にそれを用いて固体培地中で Nitrospira を培養したところ、１－２カ月程
度で十分に視認できるサイズのコロニー形成が認められた。以上の結果から、自身が産出するなんらかの増殖阻害（停止）物質の菌体近傍における局所的な濃度上昇が Nitrospira のコロニー形成を阻害していると示唆された。

P1-12

Polyhydroxyalkanoate (PHA) がシグナル伝達に与える影響の解析○中島 梨花 1, 森永 花菜 2, 安田 まり奈 1, 野村 暢彦 3,4, 豊福 雅典 3,4
筑波大院・生命環境科学研究科 , 2産業技術総合研究所・生物プロセス研究部門 , 3筑波大・生命環境系 ,4
筑波大・微生物サステイナビリティ研究センター
1

E-mail: shima.rinka7@gmail.com

細菌は、自身が産生するシグナル物質を介して、菌体密度依存的に遺伝子発現を調節することが知られている。この機構はQuorum sensing (QS) と呼ばれており、多くのグラム陰性細菌はシグナル物質としてアシル側鎖を持つ N-acyl-homoserine
lactone (AHL) を産生する。その側鎖の長さは多様性に富んでおり、短鎖 AHL は拡散性に優れているが長鎖の AHL は疎水性が高く、細胞膜に留まりやすいために伝達されにくいと考えられている。グラム陰性細菌である Paracoccus denitrificans は、
QS シグナルとして C16-HSL を産生する。C16-HSL は疎水性が極めて高く、水に拡散しづらい。当研究室の先行研究において、本菌は産生した C16-HSL の約 30％を細胞に蓄積することを明らかにした (Toyofuku, et al., 2017, ISME J) 。一方で、P.

denitrificans は窒素などの栄養の欠乏下において細胞質内に Polyhydroxyalkanoate (PHA) を合成・蓄積し、封入体を形成する。
PHA とは疎水性の高い高分子ポリマーであり、栄養飢餓時に自身のエネルギー源とすることができる。また、産業面では生分解性プラスチックにも応用されている。蓄積された PHA は細胞質内の 80 ～ 90％を占めることから細胞の生理状態、とりわけシグナル伝達を撹乱する可能性がある。しかし、PHA がシグナル伝達に与える影響は解明されていない。そこで本研究では、PHA と QS の関係を明らかとすることを目的とした。

窒素制限下と非制限下における P. denitrificans の QS 活性と PHA 合成

量を調べたところ、PHA 合成量が少ない窒素非制限下では QS が行われていた。その一方で、PHA が多く合成される窒素制限下では QS による遺伝子発現制御がほとんど観察されなかった。しかしながら、この窒素制限下では、QS を行うのに十分な濃度の C16-HSL が細胞に蓄積されており、何らかの理由で QS による遺伝子発現制御が阻害されていることが示唆された。また、
PHA 蓄積量が QS に依存して変化することから、活性が低いながらも QS が窒素制限下でも行われていることが示され、新たなQS 制御機構の存在が示唆された。PHA 合成との関連について、現在解析中である。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

P1-13

熊本県阿蘇郡の高温地熱水に生息する未培養性アーキアの分子系統○淺松 克洋 , 斉藤 誠 , 柳川 勝紀
北九州市立大・院工E-mail: a9mab001@eng.kitakyu-u.ac.jp
高温地熱水は多種多様な未培養系統群を含む微生物ダークマターの宝庫である。本研究では、これまでに分子生態学的研究
例のない熊本県阿蘇郡の高温地熱水を対象とした。熱水試料の温度は 93 度で pH8.6 を示した。沸騰温度に近いにもかかわらず、多くの多様な形態をした微生物が観察され、その密度は 1.5 × 104 cells/mL であった。微生物群集組成は、Aquificae やThermotogae が 7 割を占めていたが、新規性の極めて高いアーキア由来の遺伝子配列も取得された。しかしながら、この解析で取得された配列は 380bp 程度の短い断片であり、詳細な分子系統解析ができないことから、複数のアーキア特異的プライ

マーセットを用いて 16S rRNA 遺伝子の全長配列の決定も試みた。増幅できた PCR 産物はクローニング法を介して塩基配列を決定した。これにより遺伝子塩基配列情報を約 1.8 倍まで増やすことに成功した。得られた情報をもとに系統樹を作成したところ、対象配列と最も分岐が近いと推定されるものは Nanoarchaeota であった。しかし、得られた配列はデータベース上の既知配列との相同性が極めて低いことから、門レベルで新規の系統群であると示唆される。

P1-14

地下帯水層に生息する新規微生物群集の遺伝子解析○内野 正洋 1, 木村 浩之 2
静岡大・院理・地球 , 2静岡大・理・地球

1E-mail: uchino.masahiro.15@shizuoka.ac.jp
静岡県中西部から四国，九州，沖縄にかけて，付加体と呼ばれる堆積層が分布してる．付加体には有機物が豊富に含まれている．また，付加体の地下深部には帯水層があり，メタンを主成分とする天然ガスが存在していることが報告されている．これまでの研究で地球化学的手法および微生物学的手法から，地下帯水層の微生物群集構造や微生物によるメタン生成プロセスが示された．一方で，遺伝子解析を行ったサイトの中で，未知の微生物が高い割合で検出されたサイトも存在した．地下圏や地球全体での物質循環を知るためには，未知の微生物が地下圏でどのような代謝を行い，どの程度物質循環に関与しているか、知見を得ることは重要である．

本研究では，16S rRNA 遺伝子の詳細な解析を行い，微生物群集の系統を明らかにし，地下圏での微生物のエネルギー代謝の推定を試みた．静岡県焼津市にある温泉用掘削井 YZ-50（深度 170 m）と沖縄県那覇市にある温泉用掘削井 LSH（深度 800 m）
でサンプリングを行い，地下帯水層に由来する嫌気性の地下水を採集した．地下水中に含まれる微生物の 16S rRNA 遺伝子を対象としたクローニング・シーケンシング解析を行い，微生物群集の 16S rRNA 遺伝子の塩基配列を決定した．決定した塩基配列をもとに BLAST 検索を行い，系統樹を作成した．そして，微生物分類群を特定するとともに，地下圏での微生物の代謝を推定した．加えて，16S rRNA 遺伝子の塩基配列に含まれるグアニンとシトシンの割合から，微生物の生育温度を推定した．

一連の遺伝子解析の結果，微生物群集は既知の微生物との相同性は 84% ～ 93% と非常に低く，Ca . Altiachaeum 門などの未培

養の微生物分類群や，目および属レベルでにおいて新規の微生物分類群であることが示された．この系統解析から地下帯水層で微生物が行っている代謝を推定したところ，発酵や化学合成を行っている可能性が示唆された．また，生育温度を推定した

結果，約 12℃から約 40℃の間であることが推定された．この生育温度に違いがみられた理由は，低温の海水に由来する微生

物と，地熱によって温められた地下帯水層の温度に適応した微生物が存在したためであると考えられ，一部の微生物は地下帯水層で高い活性を有すると考えられる．これらのことから，本研究で解析した未知の微生物群集は地下圏で，堆積層中の有機物の分解といった炭素循環に関与していることが示唆された．

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2019 JSME annual meeting

P1-15

火山灰を由来とする難培養高度好熱菌の分離の検討○沖村 マイコ 1, 藤本 遼 1, 奥川 友紀 1, Hidayat Fandi1,2, Mae Bienes Kathrina1, 田代 幸寛 1, 酒井 謙二 1
九大院・生資環 , 2IOPRI, Indonesia

1【目的】現在、従来の固体培地では生育できない難培養微生物の分離法の開発が必要とされており、顕微蛍光マニピュレータを用いれば、微生物を液体培地から１細胞のみ吸引し、液系分離することが可能である。しかし、本技術による難培養高度好熱菌の分離例は多くない。一方、先行研究では、種々の火山灰には高度好熱菌が存在していることが明らかになっているが、固体培地による分離は成功しておらず、難培養高度好熱菌であると考えられている。そこで本研究では、本技術を用いた火山灰からの難培養高度好熱菌の集積条件と分離の検討を目的とした。【方法】Sinabung 山（インドネシア）等で採取した火山灰および高度好熱菌Calditerricola satsumensis YMO81T種を接種し、75℃における集積培養条件（液量及び振とう）を検討し、濁度測定により、最適条件を決定した。確立した条件で培養した集積培養液を用いて顕微蛍光マニピュレータによる液系分離を行った。また、集積培養液より DNA を抽出し、16S rRNA 遺伝子を PCR 増幅したのち、ダイレクトシーケンス解析により、主要細菌を帰属した。さらに、主要細菌の近縁種の培養条件をフィードバックした条件下で固体培地によるコロニー分離を行った。【成績】集積培養条件を検討した結果、液量 5 mL より 200 mL の場合に高い濁度を示した。さらに、静置培養より振とう培養の場合に高い濁度を示した。よって、火山灰に存在する高度好熱菌の集積には、好気条件が適していることが明らかとなった。さらに、本集積培養液のダイレクトシーケンス解析結果、Calditerricolaspp.（相同性 99% 以上）に帰属され、高純度で本菌が集積されたことが示唆された。ところが、緑色蛍光を指標とする生菌を顕微蛍光マニピュレータにより液系分離を行ったが、1 細胞分離した細菌は増殖しなかった。次に、フィードバック培養条件下では、固体培地でコロニーを形成したことから、集積培養条件と分離条件の検討により難培養高度好熱菌の分離が可能となったことが示唆された。現在、形成したコ
ロニーの解析を進めている。

P1-16

深海の化学合成生態系に優占する共生微生物の糖鎖生物学的性状○土井 昂大 1, 島村 繁 2, 矢木 宏和 3, 矢木 真穂 4, 谷中 冴子 4, 澤山 茂樹 1, 井町 寛之 2, 高井 研 2,4, 加藤 晃一 3,4,
中川 聡 1,2
京都大・院農 , 2JAMSTEC X-star, 3名古屋市立大学・院薬 , 4ExCELLS

1

E-mail: doi.takahiro.52m@st.kyoto-u.ac.jp

深海底熱水活動域は、高温熱水に含まれる化学物質をエネルギー源とする化学合成独立栄養細菌を基盤とした「化学合成生態系」を育んでいる。現場に生息する多くの無脊椎動物は、特定の化学合成独立栄養細菌と強い共生関係にあり、ほぼ全ての栄養を依存している。深海底熱水活動域に生息する多様な化学合成独立栄養細菌の中でも特に優占するEpsilonproteobacteria

綱の微生物は、巻貝や甲殻類といった様々な無脊椎動物に細胞内あるいは細胞外共生することに加え、チムニー構造物や熱水と海水の混合域において自由生活するなど、多様なライフスタイルを有する水素／硫黄酸化細菌である。深海底熱水活動域に優占する複数のEpsilonproteobacteria を対象として全ゲノム解析が行われた結果、少なくともこれまでに解析された全て の 深 海Epsilonproteobacteria に お い て、 近 縁 の 病 原 性 Epsilonproteobacteria (Campylobacter や Helicobacter ) に 固 有 で あると考えられてきた病原性関連遺伝子群の１つ、N 型糖鎖関連遺伝子群が共通して見出された。病原性Epsilonproteobacteria

では、当該遺伝子群の産物でタンパク質を糖鎖修飾し、宿主との相互作用（感染）や環境適応に利用することが知られている。深海Epsilonproteobacteria における糖鎖の役割に関する知見は皆無だが、病原性 Epsilonproteobacteria と同様に、深海

Epsilonproteobacteria においても、糖鎖が宿主との相互作用（共生）や物理化学的な環境変動の激しい熱水活動域への環境適応に関わっていると考え、深海Epsilonproteobacteria の糖鎖生物学的性状を解析することにした。

本研究では、深海Epsilonproteobacteria の中でも、自由生活型の Sulfurovum sp. NBC37-1 株（分離株）と、それに系統学的に近縁な微生物を含む細胞外共生細菌を対象とし、ヒドラジン分解法により細菌に発現する糖鎖を切り出し、ラベル化・精製の後に種々の質量分析や NMR 法を組み合わせ、その構造を解析した。その結果、細胞外共生細菌において、還元末端にヘキソー

スやデオキシメチルヘキソースを有する、極めて新規性の高い糖鎖が特異的かつ大量に検出され、糖鎖が共生の鍵分子として機能するという当初の仮説を支持する結果を得た。

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P1-17

微生物はなぜ群れを作るのか？：
平板培地実験進化系を用いた BQH の検証○仁平 賢 1, 山本 達也 2, 平野 彰大 1, 野村 暢彦 2,3, 永田 裕二 1, 矢野 大和 2
東北大 院生命 , 2筑波大 生命環境 , 3微生物サステイナビリティ研究センター

1

E-mail: s.nihei.tohoku@gmail.com

微生物群集の形成過程を説明するモデルとして、遺伝子機能欠損変異体の出現とその利己的な振る舞いによって群集が自動形成されるとする Black-Queen-Hypothesis( 黒の女王仮説：BQH) が提唱されている。BQH は微生物生態学に定着してきた考え方ではあるが、BQH を直接支持する実験的証拠は未だに乏しい。私たちは BQH の妥当性を検証するため、人為起源の農薬であるγ -hexachlorocyclohexane( γ -HCH) を分解する細菌として土壌から分離されたSphingobium japonicum クローン集団の実験進化を行った。その過程で、特定の遺伝子機能を失った遺伝系統が出現し、それがそれ以外の系統と集団内で共存し続ける現象が起きるかどうかを調べた。まず染色体領域の欠失を検出するため、Sphingobium japonicum のγ -HCH 代謝遺伝子である

lin A の下流に、蛍光タンパク質遺伝子をレポーターとして組み込んだモデル株を作製した。作製した株を、γ -HCH を唯一の炭素源とする条件、またはグルコースを唯一の炭素源とする条件で、それぞれ５系列の独立した初期クローン集団を平板培地を用いて培養し、その継代培養を行った。その結果、6 系列において蛍光タンパク質遺伝子領域の欠失を持つ細胞集団が出現し、その内 4 系列では欠失を持つ集団と欠失を持たない集団との共存が長期にわたり持続した。この観察結果は BQH と矛盾しない。さらに、進化後集団から当該染色体領域の欠失を持つ株と欠失を持たない株を分離した。現在、同系列から分離した株間の関係を明らかにするため、ゲノム解読と混合実験による解析を進めている。

P1-18

生活環境の改変がメダカの腸内細菌叢に及ぼす影響－日和見菌の蔓延は生活環境だけで規定されるのか－○河野 圭丞 1, 佐野 友紀 1, 木原 稔 2, 菊池 義智 3, 伊藤 英臣 3北海道大・院農 , 2東海大・生物 , 3産業技術総合研究所

1

E-mail: kawano.1021@aist.go.jp

多くの動物が腸内に大量かつ複雑な細菌叢を保有しており、その群集構造は気候条件や食餌といった生活環境によって規定されると考えられている。これまでに我々は、野外で採取したメダカ（野生メダカ）と室内で継代飼育されたメダカ（室内飼育メダカ）の腸内細菌叢を比較解析し、エロモナス症や冷水病といった日和見魚病の原因細菌が室内飼育メダカでのみ優占していることを見いだした。この極端な違いもまた生活環境の違いによるものと考えられるが、メダカの遺伝子型の影響も考えられるためその真偽は不明である。そこで野生メダカを室内飼育メダカと同じ条件で飼育し、「高水温で人工飼料を摂餌する室内飼育環境が腸内の日和見魚病菌の優占を招く」という仮説の検証を試みた。
2017 年 11 月に 4 ヶ所の用水路（水温 12.1-13.8℃）で採取した野生メダカ（n=21）を実験室に持ち帰り、室内飼育メダカと同様に脱塩素した水道水と人工飼料を用いて、25℃、長日条件（14 時間日照）で 30 日間飼育した。飼育前後の個体から消化管を摘出して DNA を抽出し、細菌の 16S rRNA 遺伝子を PCR 増幅した。増幅産物は次世代シーケンサーを用いて塩基配列解読
し、腸内細菌組成を解析した。
室内飼育前後で野生メダカの腸内細菌叢の群集構造は変化したものの、エロモナス症や冷水病といった日和見魚病を引き起こす
Aeromonas 属や Flavobacterium 属細菌の優占度は室内飼育後も 0.13 ± 0.33%, 0.41 ± 0.62% と低く、これまでに解析した室内飼育
メダカの値（25.8 ± 17.1%, 9.6 ± 10.3%, n=36）よりも著しく低かった。このことから本仮説は否定され、高水温で人工飼料を摂餌する室内飼育環境条件下であっても腸内に日和見魚病菌が優占するとは限らないことが明らかとなった。室内飼育しても日和見魚病菌が優占しなかった理由として、生活環境改変前から持っていた腸内細菌の先住効果により、結果として日和見魚病菌の蔓延が抑えられた可能性が考えられた。このように、生活環境の改変のみならず先住する腸内細菌組成もまた、日和見魚病菌の優占度に大きな影響を与える要因であることが示唆された。日和見魚病は幼若魚の肥育養殖現場で頻発する重大な産業問題であり、あらかじめ野生個体の腸内細菌を移植しておくことで、肥育魚の日和見魚病の発症リスクを下げる一助となるかもしれない。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

P1-19

Mortierella humilis /verticillata complex とその内生細菌のトマト生育への影響について○松下 紗季 1, 高島 勇介 2, 西澤 智康 2, 太田 寛行 2, 成澤 才彦 2
茨城大・院農 , 2茨城大・農1

E-mail: 18am216n@vc.ibaraki.ac.jp
近年、土壌に普遍的に存在する腐生性菌類であるMortierella 属菌に植物生育促進能があることが報告され（Wani et al ., 2017;、筆者らの先行研究でもM. humilis S2 がトマト実生の地上部重量を増加させることが明らかとなった。
Johnson et al ., 2019）

さらにこのM. humilis S2 の細胞内に内生細菌Burkholderiaceae -related endobacteria（BRE）が存在することも明らかとなり、
抗生物質処理により同 BRE 除去株を作成し、トマト実生への接種試験を行った。その結果、葉の褐変や根部の生育不良が認められた。そこで本研究では、この現象が選抜菌株である S2 に限定されるのか、あるいは、他のM. humilis および近縁の菌株でも普遍的に認められるのかを明らかにすること、さらに宿主菌類と BRE の組み合わせによる影響を調査することを目的とした。

M. humilis /verticillata complex 7 菌株（BRE 保有 4 菌株、非保有 3 菌株）およびM. chienii 1 菌株（BRE 非保有）をトマト実
生根部に接種し、23℃で 2 週間生育後回収し地上部乾燥重量を測定した。その結果、BRE 保有株である YI11、YTM36 およびCBS130.66、さらに BRE 非保有株 YTM226 を接種したトマトは地上部重量が増加し、健全に生育した。BRE 非保有株 YTM222
および CBS131.66、さらに BRE 保有株 YTM181 は地上部重量を増加させたが、枯死や根部の生育不良も生じた。また、M.

chienii を接種したトマトは全て枯死した。以上より、M. humilis /verticillata complex の BRE 保有株はトマトの生育を促進する傾向があることが示された。さらに、BRE 非保有株を接種したトマトでは枯死した個体が認められた。本研究においても先行研究と同様にM. humilis の植物生育促進に BRE が関与していることが示唆された。また、BRE 保有株 YTM181 はトマト根部の生育不良を起こしたが、同菌株の BRE は供試した他の菌株の BRE とは系統的に異なっており、植物生育促進に関わる BRE に系
統間で差があることが示唆された。

P1-20

２種のシロアリの交雑による腸内共生原生生物の群集構造の経時的変化○嶋田 拓也 1, 北出 理 2
茨城大・院理工 , 2茨城大・理

1E-mail: shimataku44@gmail.com
異なる群集が混合した後、群集構造がどのように変化するのかについては不明な点が多い。Gilpin(1994) は、群集モデルを用いたシミュレーションを行い、構成種が密接な相互作用をもつ群集同士を混合すると、混合後の群集は最終的に片方の親群集

由来の種組成に収束しやすくなることを示した。この結果は、強い相互作用をもつ群集が ” チーム ” として振舞うことで、群集レベルの競争に近い現象を引き起こす可能性を示唆する。シロアリの腸内には多数の原生生物や細菌などの微生物群集が存在し、代謝を介し強く相互作用しながら生息している。先に私達は、ヤマトシロアリとカンモンシロアリの２種のシロアリを交雑させ、各シロアリ種に特異的な原生生物群集を混合する実験を行った。この実験では交雑コロニーの大部分がヤマト型の種組成に収束した。ただし、この実験では群集を構成する各原生生物種の個体数が時間経過に伴ってどのように変化していくかは調査されていない。

本研究では、ヤマトシロアリとカンモンシロアリの２種の生殖虫に交雑コロニーを創設させて、共生原生生物群集を混合させ、生殖虫 ( 親 ) とワーカー ( 子 ) が保有する各原生生物種の個体数の時間経過に伴う変化を調査した。ヤマトシロアリは宮崎県日南市、カンモンシロアリは山口県下関市で採取した。個体数の調査は、光学顕微鏡で各原生生物種の形態を観察して同定・計数を行った。コロニー創設から 120 日後に交雑コロニーでは大部分のコロニーでカンモンシロアリに特異的な原生生物種の消失が見られ、ヤマト型の種組成に収束した。混合型の種組成が群集として安定しておらず、その結果として群集同士での競争が起こり、より群集として安定なヤマト型の種組成に収束したと考られる。さらに、120 日後以降は種組成としてヤマト型に収束した後でも、ヤマトシロアリに特異的な原生生物種の割合が徐々に減少していく傾向が見られた。種組成が収束した後でも、各原生生物種の個体数比の変化という形で群集構造の変化が継続することが新たに確認された。これは混合時に各原生生物種の個体数比のバランスが大きく崩れ、その後構成種の長期共存が可能な最も安定した個体数比に収束するまでに長い時間がかかるためと考えられる。

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P1-21

従属栄養細菌との相互作用を介した硝化菌の増殖促進機構○井出 寛人 1, 石井 拳人 1, 藤谷 拓嗣 2, 常田 聡 1
早大院・生医 , 2産総研・バイオメディカル研究部門

1

E-mail: hrt-sunrocker@moegi.waseda.jp

硝化菌は土壌や水圏に幅広く分布しているにも関わらず，平板培養や限界希釈に代表される古典的な手法では分離培養が難しい。実験室環境で硝化菌を扱うことが困難である原因の 1 つに，分離培養すると従属栄養細菌との共存関係が断ち切られてしまうことが挙げられる。本研究では従属栄養細菌との相互作用が硝化菌の増殖を促進させる鍵であると予想し，そのメカニズ

ム解明を目指す。相互作用を及ぼしあっているモデル微生物として，当研究室で単離した硝化菌 Nitrotoga sp. AM1 と従属栄養
細菌Acidovorax sp. NB1 に着目した。Nitrotoga は亜硝酸を硝酸へ酸化することでエネルギーを獲得する化学合成独立栄養細菌である。Nitrotoga 集積株において，Nitrotoga は特定の従属栄養細菌 Acidovorax と共凝集体を形成していた。これは局所的な環境でAcidovorax と Nitrotoga が相互作用を及ぼしあっている可能性を示唆している。そこで単離株 AM1 の異なる増殖フェー

ズ - 対数増殖期および誘導期 - に単離株 NB1 がもたらす影響を調べた。亜硝酸を含む無機培地で AM1 細胞のみを懸濁した単独

培養系と，AM1 および NB1 細胞を懸濁した共培養系を用意した。2 つの培養系でそれぞれ AM1 細胞数を測定したところ，NB1と共存すると AM1 の増殖速度と増殖収率が上昇することがわかった。培地から活性酸素種を除去すると硝化菌の増殖活性が高くなることが知られており，同様に NB1 が酸化ストレスを低減させたことで AM1 の増殖速度が早くなった可能性がある。共培

養系で増殖収率が高くなった理由として，NB1 が硝酸から AM1 の基質である亜硝酸を生成し，AM1 に再供給したことが予想される。実際，NB1 は硝酸を亜硝酸へ還元する酵素（NAR）をコードする遺伝子を保持している。誘導期において NB1 が及ぼす影響を確かめるため，102-104 cells/mL となるように AM1 細胞の初期菌体数を調製した単独・共培養系を用意した。興味深

いことに，菌体密度が低いと AM1 単独では増殖が休止化した一方，NB1 存在下では AM1 の再増殖が確認された。初期菌体密度が低くても NB1 が分泌する “ 生育因子 ” を受け取って AM1 の増殖が覚醒したと考えられる。今後は単独培養系と共培養系を対象としてプロテオーム解析を実施し，共培養系で見られた増殖促進効果の根底にある分子レベルでの相互作用メカニズムを明らかにしていく。

P1-22

30 年無施肥水田内におけるBurkholderia kururiensis の機能性，挙動ならびに垂直伝播経路の解明○正田 雄紀 1, 立花 誠治 1, 前川 雅彦 2, 橋床 泰之 1
北海道大・院農 , 2岡山大学資源植物科学研究所

1E-mail: ykmii828@eis.hokudai.ac.jp【背景】ハイブリットイネ pLIA-1 (Oryza longistaminata × O. sativa ssp. japonica T-65) は，岡山大学資源植物科学研究所で 30
年以上完全無施肥管理下に置かれている実験水田での高い収穫性を指標に選抜された交雑後代系統イネである。このイネは無施肥条件で籾収量が高くなる傾向があり，これは無施肥水田で栽培した pLIA-1 根圏あるいは根内に共生性の高い窒素固定細菌であるBurkholderia kururiensis が優占することによると考えられている。しかし，水田土壌からも収穫した籾内からもその痕跡さえも検出されないことから，土壌・種子伝播性いずれでもないと分かり，この細菌がどこから伝播するかは分かっていない。そこで，この細菌の機能性とその振る舞いから，水田内でのイネから次年度のイネへの垂直伝播経路の探索を試みた。
【方法と結果・考察】2017 年・2019 年の籾を収穫し，稲わらを全て持ち出した冬季水田土壌から pLIA-1 の当年死根および越年死根残渣を回収し，PBS buffer 中でそれを破砕し，細菌 DNA を回収した。それをテンプレートとして得られる 16S rRNA領域を標的として，次世代シーケンサー (NGS) による菌叢解析を行い，同時にB. kururiensis の分離を試みた。分離には貧栄養 MWG(Winogradsky’s 無機塩 - ショ糖 - ジェランガム ) 平板を用い，死根残渣を PBS buffer に懸濁し，大過剰に希釈して平板に広げ，出現したB. kururiensis 様のコロニーの 16S rRNA 遺伝子領域を増幅して，分離した細菌種の同定を試みた。また，その過程で分離・同定したB. kururiensis 以外の細菌種についても，それぞれニトロゲナーゼ遺伝子 nifH の塩基配列を調べ，B. kururiensis や他の普遍的な窒素固定細菌がもつ nifH との相同性を比較した。死根残渣から回収した細菌 DNA の NGS 解析の結果からはBurkholderia 属細菌および B. kururiensis の優占が認められたが，MWG 平板を用いたスクリーニングでは B.
kururiensis をイネ死根残渣から直接分離することはできなかった。一方，過去の実験で見出した，pLIA-1 芽生え根の MeOH 抽
出物が幾つかの遅育性根面細菌の生育を促進する現象から，死根残渣内で休眠状態にあるB. kururiensis はイネ生根と接触して初めてその休眠が打破されるとの仮説を立てた。ジェランガムベッドで 1 週間育成した無菌 pLIA-1 イネ苗根圏に洗浄後死根残渣を接種し，生きたイネ根周辺で増殖した細菌群集からB. kururiensis や他の窒素固定細菌の探索を開始している。

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P1-23

群体ボヤの被嚢に生息するバクテリア相の解析○山崎 玲 1,2, 新里 尚也 1,2, 伊藤 通浩 1, 広瀬 裕一 2
琉球大・熱生研 , 2琉球大・理

1E-mail: k198397@eve.u-ryukyu.ac.jp【背景と目的】海産無脊椎動物であるホヤ類には、岩などに固着して単独で生息する単体ボヤと、小さな個虫が出芽によって群体を形成する群体ボヤとがある。ホヤ類の体は被嚢と呼ばれるセルロース性の外被組織で覆われており、そこにはバクテリ
アを中心とする特徴的な微生物相が形成されている。また、一部の群体ボヤの被嚢内には、ネジのような独特の形状を持ったバクテリアが存在することも報告されているが (Hirose & Saito,1992)、それらの系統学的帰属や、宿主であるホヤとの関係性については明らかにされていない。そこで本研究では、沖縄近海に生息する同属の群体ボヤ 2 種について、被嚢に生息するバクテリア相を解析することにより、ホヤの被嚢内微生物に関する更なる知見を得ることを目的とした。【材料と方法】2018
年 10 月に沖縄県北谷町砂辺海岸において、2 種の群体ボヤClavelina cyclus と C. obesa 、ならびに周囲の海水を採取して実験に用いた。ホヤの被嚢部分と海水の濾過サンプルから DNA を抽出し、バクテリア 16S rRNA 遺伝子を Illumina MiSeq によって解析した。また、C. cyclus の被嚢部分と C. obesa の個虫のパラフィン切片を作成し、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH) により被嚢内のバクテリアを特異的な蛍光プローブによって検出することを試みた。【結果と考察】微生物相解析の結果、ホヤと海水のバクテリア組成は大きく異なっており、ホヤの被嚢に独特なバクテリア相が形成されている様子が伺えた。
また、同じClavelina 属においても被嚢のバクテリア相は大きく異なっていることが示された。具体的には、 C. cyclus においては Bacteroidetes 門に属するバクテリアの出現頻度が高く、Reichenbachiella 属、Aestuariispira 属、Lutibacter 属のそれぞれ

1OTU で 51.8％を占めた。一方でC. obesa においては、Proteobacteria 門の出現頻度が高く、Amylibacter 属、Maritimibacter 属、

Thiogranum 属のそれぞれ 1OTU で 49.5％の出現頻度を占めた。DAPI 染色ならびにバクテリアのユニバーサル・プローブを用いた FISH による被嚢の蛍光顕微鏡観察の結果から、両種のホヤの被嚢には多様なバクテリアが生息しており、特にC. cyclus の被嚢内には、糸状やネジ状といった独特の形態をもつバクテリアが多数存在することが示された。現在、バクテリアの微生物
相解析において高い頻度で検出されたバクテリア系統について FISH による特異的検出を試みている。

P1-24

微細藻類Scenedesmus sp. YK 共生細菌群を介する Methanol 添加による藻体増殖促進の調査○菅家 雅史 , 佐藤 敏幸 , 日秋 俊彦 , 矢木 修身
日大院・生産工[ 背景 ] 微細藻類は，バイオディーゼル燃料 (BDF) やサプリメント，飼料等様々な分野で注目されているものの，依然としてバイオマス生産性の低さに課題があり，生産性向上を目的として微細藻類の増殖を促進させる培養手法が求められている．既往の研究では，細菌等のコンタミネーションによる藻体バイオマス生産性低下を防ぐため，単一藻類の純培養の維持が重要視されてきた．一方，自然界で存在する藻類を中心とする細菌群との共生環境における相利共生を利用した藻体増殖促進が近年注目されている．また，有機物添加による藻類増殖促進法も報告されているが，増殖促進のメカニズムには未解明な点が多い．
そこで，本研究では，藻類と共生細菌との共生環境に及ぼす有機物添加の影響に着目した．複数の有機物添加による増殖促進が確認されている研究室保有藻類株Scenedesmus sp. YK を用い，添加有機物の中でも比較的低コストである Methanol 添加における藻類と共生細菌への影響を調査した．

[ 実験方法 ]500 mL 三角フラスコに Chu-No.10 改変培地を 300 mL 加え，オートクレーブ滅菌後，藻体前培養液 3 mL を接種した．培養環境は温度日中 25 ± 0.5 ℃，夜間 20 ± 0.5 ℃植物培養用蛍光灯を用いた 12 時間周期の明暗光照射条件下であり，12 日間程度静置培養とした．研究室保有藻類株Scenedesmus sp. YK は山形県霞城公園にて採取したものを継代培養したものであり，単一藻類の純培養 (Axnic 培養 )，共生細菌群を維持した培養 (Xnic 培養 ) を実験に使用した．はじめに，2 つの培養系に対し，Methanol を濃度 0，1，10，50，100 g/L となるように添加し増殖を評価した．次に，共生細菌群をコロニーの形態で 9つに単離し，それぞれに Methanol 濃度 1.0 g/L 下にて藻類と共培養させた．藻体増殖の評価は，吸光度測定 ( 波長 660 nm)，検鏡にて行った．

[ 結果 ]Axenic 培養では，どの濃度の Methanol も藻体増殖促進効果を示さなかった．一方，Xenic 培養では，Methanol 濃度 1，
10 g/L 下において藻体増殖が大幅に促進された．どちらの培養においても Methanol 濃度 50，100 g/L 下では増殖は阻害された．単離した共生細菌と藻類の共培養では，9 つのコロニーのうち，５種において藻体増殖が促進された．

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P1-25

水生植物ウキクサと親和性・定着性の高い細菌の検索○武川 悦子 1, 田中 靖浩 1, 鈴木 山太 1, 岩下 智貴 1, 遠山 忠 1, 玉木 秀幸 2, 牧野 彩花 2, 鎌形 洋一 2, 森川 正章 3,
森 一博 1
山梨大院・医工農 , 2産総研・生物プロセス , 3北大院・環境

1E-mail: g18lr009@yamanashi.ac.jp【背景と目的】
ウキクサを用いて廃水を処理しつつ、得られた植物体をバイオマス資源として利用する浄化システムの開発において、本研究グループでは、バイオマス生産能向上のために植物生育促進細菌（Plant Growth Promoting Bacteria; PGPB）をウキクサに導入する方法を検討してきた。しかし、土着微生物が存在する実廃水中では導入菌が定着せず、活性が発揮されないケースが見受けられた。そこで、ウキクサと親和性・定着性が高い細菌を検索し、その中から PGPB を見出すこととした。
【方法】
ウキクサと親和性の高い微生物を検索するために、無菌化した当該植物に 5 種類の環境微生物群集（河川水、活性汚泥、土壌、Anammox 集積汚泥、雨水）をそれぞれ接種し、10 日間共培養した後の根と葉状体に形成する微生物群集を対象に 16S rRNA ア
ンプリコン解析（次世代シーケンス法）を行った。
PGP 活性の評価は、試験対象とする菌株を接種したウキクサを食品工場廃水中に投入したときの生育促進効果を、無菌ウキク
サを投入した対照試験区と比較することで行った。
【結果と考察】16S rRNA ア ン プ リ コ ン 解 析 の 結 果、Sphingomonadaceae 科（1.2 ～ 11.1 ％）、Comamonadaceae 科（8.1 ～ 30.0 ％）、Methylophilaceae 科（12.1 ～ 39.4％）が全てのウキクサ根および葉状体試料で 1％以上の分布率を示した。特にこれらの中で、Methylophilaceae 科については、ウキクサに接種した環境微生物群集と比較して顕著な分布率の向上が見られた（最大 3145
倍；Sphingomonadaceae 科細菌は最大 20 倍、Comamonadaceae 科細菌は最大 48 倍）。以上より、本研究ではこの細菌群をウ
キクサと親和性・定着性の高い細菌であると判断した。
Methylophilaceae 科細菌に特異的なプライマーを用いた PCR 法によるスクリーニングでは、ウキクサ由来の 308 株中 29 株が陽性となり、それらの 16S rRNA 遺伝子を解析したところ 15 株が目的の細菌群に属していることが分かった。この中で生育が良好であった 11 株を対象にウキクサの生育促進能を評価したところ、2 株に高い PGP 活性が見出された（葉状体数、乾重量の両方において 1.8 ～ 2.7 倍）。

P1-26

クララ（マメ科）の根粒内バクテリア構成の解析○星山 美樹 1, 横山 潤 2
山形大・院理 , 2山形大・理

1

マメ科植物は、一般に根粒内で窒素固定を行うバクテリア（根粒菌）と共生関係を結んでいる。多くの根粒菌の系統は、特定のマメ科植物種と共生関係を結ぶ性質を持っている。これに対して Sophora 属は多様な根粒菌と関係を結ぶことが知られており、植物への異なる根粒菌の効果を明らかにする優れた系になりうる。クララ（Sophora flavescens ）は草地に生育する多年草

で、被食防御機構としてアルカロイドを含有している。アルカロイドは根で合成されるので、宿主が根の成長を促進または高い窒素固定能を付与するバクテリアと共生関係を結ぶと、アルカロイド合成量が変化してクララの地上部での相互作用が変わるかもしれない。本研究ではこれらの相互作用を解析するために、まず日本のクララ集団について根粒内バクテリア構成を調べた。

東日本の５地点（青森県平川市、山形県大石田町、同南陽市、福島県喜多方市、茨城県石岡市）でクララをサンプリングし、これらから根粒を採取して、表面殺菌後にバクテリアを単離した。得られたバクテリアの 16SrRNA 遺伝子の部分配列を決定し、分子同定を行った。さらに４地点のサンプルについては、根粒内バクテリアのメタゲノム解析を行った。

単 離 し た バ ク テ リ ア の 分 子 同 定 の 結 果、 根 粒 菌 ５ 属（Mesorhizobium 属、Rhizobium 属、Bradyrhizobium 属、Methylobacterium 属、Burkholderia 属 ） と そ の 他 の バ ク テ リ ア ７ 属（Pseudomonas 属、Acinetobacter 属、Dyella 属、Paenibacillus 属、Cohnella 属、Lysinibacillus 属、Mycobacterium 属）が同定された。根粒菌５属が同定されたことは、クララが多様な根粒菌と共生関係を持つという中国の先行研究の結果を支持した。本研究では全５地点でMesorhizobium 属が最も高頻度に単離され、メタゲノム解析の結果も同様だった。先行研究でも高頻度で単離されていることから、Mesorhizobium 属はクララにとって最も関係を結びやすいのかもしれない。根粒菌以外のバクテリア７属はいずれもマメ科植物の根粒から記録されている。Cohnella 属を除く６属は、菌株によっては植物の成長を促進する可能性がある。これらのバクテリアもクララの成長に影響しているかもしれない。

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P1-27

資源競合条件下における異属三菌株共存を可能とする菌株間相互作用の数理学的解析
○天野 光喜 1, 鈴木 研志 2, 本荘 雅宏 2, Azwani Fatma3, 齋藤 保久 4, 木村 元彦 1, 田代 陽介 1, 二又 裕之 5
静大・工 , 2静大院・自然科学系教育部 , 3Instit. Trop. Agr. Univ. Putra Malaysia, 4島根大・総合理工 , 5静大・グリーン研

1

単一基質を供給する連続集積培養系において、基質利用特性の異なる微生物種が共存することは原理的に不可能である。その理由は、僅かでも基質利用力が高ければ他の菌株の生育は抑制され、結果的に淘汰される為である。この理論は競合排除理論（competitive exclusion theory）として知られている。しかし、実験室内で構築した合成微生物系においてでさえも、この理論に従わないことが多くの研究成果によって示されている。当研究室に於いても、フェノールを唯一の炭素源とする連続集積培養系において、フェノール利用特性が異なる異属三菌株が共存することが示されている。その要因として、代謝ネットワーク
による微生物間での役割分担や、リアクター内の基質濃度の不均一性が指摘されている。一方、増殖に及ぼす微生物間相互作

用は、菌株間の関係を把握することが出来るものの、その関係性が微生物群集の共存にどの様に影響しているのかを総合的に判断することは未だできていない。そこで本研究では、実測された増殖に及ぼす微生物間相互作用力、増殖パラメーターおよび基質に対する速度論量を基に、数理学的に解明することを目的とした。

供試菌株はPseudomonas sp. LAB-08 株、Comamonas testosteroni R2 株およびCupriavidus sp. P-10 株である。フェノールに対する親和性と増殖速度定数から導出されるJ 値および増殖に及ぼす微生物間相互作用力は LAB-08 株＞ P-10 株＞ R2 株の順に高い。その為、J 値からは R2 株の、相互作用からは LAB-08 株の優占化が推定されたが、実際の合成微生物生態系では三菌株は共存した。そこで増殖に及ぼす微生物間相互作用力は菌密度に依存すると考えられる為、Lotka-Volterra モデル式に微生物間相互作用力を変数として導入したモデルを構築した。微生物が共存するということはJ 値が等しいことと同義である点に着目し上記モデル式を解析した。その結果、純粋培養条件下で得られたJ 値が菌株間相互作用によって変動し得ること、また、共存するために必要な相互作用の関係性を合成微生物生態系全体の中で捉えることを可能とした。以上の結果は、特性の異なる微生物を利用した生態系のデザインにとって有効なツールとなるものと期待される。

P1-28

時系列データから読み解く細菌群集の種間相互作用強度ネットワークと非線形動態○藤田 博昭 1, 阿部 真人 2, 山道 真人 3, 木庭 啓介 1, 潮 雅之 1,4,5, 東樹 宏和 1,4
京大・生態研 , 2理研・AIP, 3東大・総合文化 , 4JST さきがけ , 5京大・白眉

1

E-mail: fujita.h@ecology.kyoto-u.ac.jp

生物群集の安定性や動態は、種数や種間結合度といった群集レベルで定義される指標と関連があると理論的に予測されている。
しかし、複雑な生物群集、特に多種微生物系において、群集動態を決定する要因を厳密に探索する実証研究は、未だに存在しない。

本研究では、森林土壌と淡水由来の細菌群集を 3 種類の培地に投入し、合計で 96 の細菌群集を培養した。その 96 群

集それぞれを 110 日間に亘って、1 日 1 回の連続サンプリングを行なった。DNA 濃度が既知の標準 DNA を用いて、16S-rRNA

アンプリコン解析を行い、定量的に細菌群集を明らかにした。得られた時系列データは非線形性を示していたため、Empirical
Dynamics Modeling (EDM) を適用して種間相互作用強度を算出した。その結果、細菌群集の構造は常に変動し続ける一方、大局的にみるといくつかの群集組成クラスターに分類できることがわかった。また、外的な撹乱を与えない場合でも、この群集組成クラスター間の移動が起こることが確認できた。種間相互作用強度も日毎に変動を示したが、多くの種間で、その強さと正負は一定していた。変動し続ける動態の定常状態を定義づけすることにより、変動の大きさと変動のしやすさを定量化し、種間相互作用強度と変動性の関係について解析を行っている。

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P1-29

Roseomonas 属細菌由来 Penicillin G アシラーゼの N -acylhomoserine lactone
分解活性の評価○関 篤也 , 奈須野 恵理 , 加藤 紀弘
宇大・院地域創生

E-mail: mc196621@cc.utsunomiya-u.ac.jp

Roseomonas sp. TAS13 は、グラム陰性細菌の Quorum Sensing (QS) 機構の主なシグナル物質であるN -acylhomoserine lactone(AHL) を加水分解する細菌として当研究室で活性汚泥から単離された。TAS13 株のゲノムから同定された Penicillin G acylase(PGA) は、既知の AHL acylase とアミノ酸配列相同性が高いことから AirP と命名し遺伝子をクローニングした結果、AHL に対す
る分解活性を示した。AHL を分解する PGA や Penicillin G を分解する AHL acylase は数例報告されているが基質選択性の詳細は明らかにされていない。そこで本研究では、Roseomonas 属細菌に由来する PGA の AHL 分解活性から基質選択性を解析し、自然環境に広く分布しているRoseomonas 属細菌が AHL の分解という形で細菌コミュニティにおいて普遍的に QS 機構に関与している可能性を明らかにすることを目的とした。Roseomonas aerilata と Roseomonas stagni が保有する PGA をそれぞれ RaPGA、
RsPGA と命名し、遺伝子をクローニングした。得られた遺伝子組換え体から抽出したプラスミド DNA を鋳型として、制限酵素
認識サイトを 5’ 末端にそれぞれ付加した PGA 増幅用プライマーを用いて PCR を実施した。制限酵素処理した PCR 産物を MBP 融
合タンパク質発現用ベクターにライゲーションし大腸菌へ形質転換後、大量培養した遺伝子組換え体から PGA を抽出、精製した。Penicillin G またはアシル鎖長が C6 ～ C12 の AHL に各 PGA を 0.25 mg 添加し反応後 (30°C, 3 h)、70°C, 10 min で酵素を失活させた。Penicillin G 分解サンプルは高速液体クロマトグラフィーの逆相 ODS カラムに 20 mM リン酸バッファー (pH = 6) : ア
セトニトリル = 4：1 の移動相を通液し 225 nm の吸光度を検出した。AHL 分解サンプルは AHL レポーター株Chromobacterium
violaceum CV026, VIR07 の QS 応答性紫色色素生産量を指標に分解率を算出した。各 PGA の分解率を見積もった結果、RsPGAと RaPGA でそれぞれ 11%, 23% であった。R. aerilata と R. stagni はどちらも Penicillin G (0.1 mg/mL) への耐性がなく、Penicillin
G 添加培地で増殖可能なRoseomonas sp. TAS13 と比べて Penicillin 分解活性が低い結果と一致する。一方、AHL に対する分解活性は RaPGA よりも RsPGA の方が高かった。Roseomonas sp. TAS13 由来の AirP と比較すると AHL 分解活性は劣るものの、
Roseomonas 属細菌の有する PGA が共通して Penicillin だけでなく AHL を基質として加水分解可能であることが示唆された。

P1-30

可動性因子を用いた緑膿菌の細胞間コミュニケーションの切替○須澤 由希 1, 遠矢 正城 1, 尾花 望 3,5, 吉澤 晋 4, 木暮 一啓 4, 野村 暢彦 2,5, 豊福 雅典 2, 5
筑波大院・生命環境科学 , 2筑波大・生命環境系 , 3筑波大・医・TMRC, 4東大・大気海洋研 , 5筑波大・MiCS

1E-mail: s1821110@s.tsukuba.ac.jp【目的】Quorum sensing (QS) は微生物間コミュニケーション機構の一つであり、シグナル物質を介して周囲の菌体密度を感知し様々な遺伝子の転写を調節する。一方で、本機構が環境中でどのように進化しているかについての知見はほとんどない。
我々は水環境から単離された緑膿菌 (Pseudomonas aeruginosa ) の QS システムを解析したところ、これらの環境単離株の中には臨床単離株 PAO1 と比べてシグナル生産量や応答性が異なる株が複数存在し、特に貧栄養環境である外洋域からは QS の機能が一部欠損した株が単離された。このことから、緑膿菌の QS システムが環境に応じて変遷していることが考えられる。興味深いことに QS 欠損株の中には QS 関連遺伝子 (lasR ) に挿入配列 (IS) を持つ株が存在し、その株では集団から二種類のコロニー形態が出現した。本研究では、環境に応じた QS システムの変遷を理解するために、IS と QS の関係を解析することにした。

【結果】コロニー形態が異なる二種類の株をそれぞれ単離し、シーケンス解析を行ったところ、両者ともにゲノム中のlasR 以外の locus に共通の IS を複数有することが明らかとなった。IS が挿入されていないlasR を持つ細胞を単離し、継代培養すると lasRに IS が挿入された細胞が出現した。また、この株を継代培養すると IS がlasR から転出し、完全な lasR に戻ることが確認された。このことから、IS は可動性を失っておらず、lasR への IS の挿入・転出が QS 活性を変化させることが明らかとなった。興味深いことに、本 IS はメンブレンベシクル (MV) にも含まれており、細胞間で伝播する可能性が示唆された。

【考察】QS システムは一般的にエネルギーコストが高いと考えられていることから、IS の挿入・転出による QS の ON-OFF の切
り替えは、環境に応じた生存戦略であると予想される。当該 IS の挿入・転出メカニズムを理解することは、QS システムが環境に応じてどのように変遷するのか理解する糸口になると考えられる。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

P1-31

発電菌Geobacter sulfurreducens 三株間の比較ゲノム解析及び高発電株におけるトランスクリプトーム解析○藤川 昂 1, 小椋 義俊 2, 河野 好裕 1, 林 哲也 2, 井上 謙吾 1
宮崎大学・農 , 2九州大学・医1E-mail: ac16023@student.miyazaki-u.ac.jp【背景・目的】偏性嫌気性細菌であるGeobacter sulfurreducens は、純粋培養系の微生物燃料電池で高い発電能力を示すことが知られている。また、全ゲノムが明らかになっており、遺伝子改変技術も確立されていることから、細胞外電子伝達メカニズ
ム研究のモデル生物として研究が進められている。しかし、未だ細胞外電子伝達メカニズムの全容の解明には至っていない。G.

sulfurreducens は、これまでに標準株である PCA 株の他に、PCA 株より高い電流生成量を示す KN400 株も単離され、全ゲノムが決定されている。さらに、本研究グループでは宮崎県八重川の土壌から KN400 株と同等の高い電流生成量を示す YM18 株を単離し、全ゲノムも決定された。そこで、PCA、KN400、YM18 株の 3 株間での比較ゲノム解析を行い、さらに、YM18 株において電流生成時と電流非生成時におけるトランスクリプトーム解析により、高い発電能力に重要な遺伝子の絞り込みを行う。

【結果】比較ゲノム解析の結果、YM18 株中の遺伝子の 91％が PCA 株と KN400 株にも共通して存在していた。また、高発電株である KN400 株と YM18 株にのみ共通する遺伝子は 40 個、YM18 株にのみ保存されている遺伝子は 213 個であった。電子の授受に重要な役割を果たす分子であるc 型シトクロムをコードしている遺伝子の数は、PCA、KN400、YM18 株それぞれで、

107 個、104 個、100 個と大きな違いは見られず、TCA サイクルなど中心代謝系に関連する遺伝子も高度に保存されていた。
トランスクリプトーム解析の結果、電流非生成時に比べて電流生成時に有意な発現変動が見られた 168 個の遺伝子のうち 44 個が機能未知の遺伝子であった。発現が上昇していた遺伝子は 97 個であり、3 個の酢酸トランスポーターと 5 個のc 型シトクロ

ム遺伝子が含まれていた。一方、発現が低下していた 71 個の遺伝子の中には、6 個の重金属トランスポーターと 3 個のc 型シトクロム遺伝子が含まれていた。発現変動が見られたc 型シトクロムの中には、過去に PCA 株で電流生成に関与していることが報告されている遺伝子は存在しなかった。また、比較ゲノム解析で特定された高発電株にのみ共通する遺伝子の中では、唯一ジスルフィド結合触媒酵素クラスターのみが発現変動（低下）していた。

P1-32

低有機物負荷 A/O-MBR における膜ファウリング緩和に関与する微生物の推定○滝本 祐也 , 鞍立 大喜 , 三輪 徹 , 幡本 将史 , 山口 隆司
長岡技科大・院工E-mail: s165001@stn.nagaokaut.ac.jp
膜分離活性汚泥法（Membrane bioreactor: MBR）は、高い排水処理水質を得られる一方で、運転中の膜面付着層の形成に伴う
膜面透過流速の低下（ファウリング）が主要な問題である。微生物解析手法の発展に伴い、膜ファウリングを発生させる能力が高い細菌や膜面バイオフィルム形成を担うが推定されている。しかしながら、MBR 活性汚泥の複雑な微生物群集構造の違い
が膜ファウリングに与える影響は明らかになっておらず、安定的な MBR の運転に最適な微生物叢を把握することが重要であると考えられる。

これまでの研究で、低有機物負荷で A/O-MBR を運転することによってバイオフィルム形成を伴う膜ファウリ

ングを誘発することを見出した。低温低有機物負荷条件では、膜ファウリング発生の再現性が実証されているが、高温低有機物負荷運転では膜ファウリングの発生が遅延する場合が確認された。そこで、我々は活性汚泥の 16S rRNA 遺伝子に基づく解析を行うことで微生物群集構造の違いが膜ファウリングに与える影響を調査するとともにファウリングの緩和を担う細菌の推定を行った。

実験では、低温低負荷条件（RL）、高温低負荷条件 1（RH1: ファウリング発生無）、高温低負荷条件 2（RH2: ファ

ウリング発生有）の A/O-MBR をそれぞれ運転し、各種水質項目と活性汚泥中の微生物群集構造解析を実施した。ファウリング
が発生した RL および RH2 では、活性汚泥中に溶解性有機物（TOC）が蓄積していた。一方で、ファウリングが発生しなかった

RH1 では、活性汚泥中に溶解性 TOC の蓄積があまり観察されず、溶存有機物が問題なく分解されている可能性が示唆された。

このとき RH1 では運転中期において Chloroflexi 門に属する Candidatus Promineofilum 属の検出割合が特異的に増加していた。
Ca. Promineofilum 属細菌は、多糖やタンパク質などの高分子物質を分解する機能が報告されており、ファウリングの原因となる物質を分解したことで安定的に運転を継続することができたと考えられる。また、各リアクターの活性汚泥の微生物多様性

指数を比較したところ、RL では多様性は変化せず、RH1 および RH2 では変化が見られた。特に RH2 では大きく多様性が減少していることが明らかとなり、活性汚泥中の微生物多様性が MBR のファウリング発生に寄与したことが示唆された。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meetingP1-33

ヒト毛髪に付着する細菌群集安定性と起源○渡邉 康太 1, 西 英二 2, 田代 幸寛 1, 酒井 謙二 1
九大院・生資環 , 2大分科捜研

1E-mail: kobutin52@gmail.com【背景】
人体には多くの細菌が存在し、部位により独自で多様な細菌群集構造を形成している。我々はこれまでに、一定量の細菌がヒト毛髪に存在し、その群集構造の違いから Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP) 法により異動識別が可能であることを示した (Nishi, et al., Legal Medicine, 2017)。ヒトの異同識別は 6 ヶ月後でも可能であったが、その起源や詳細な群集構造の安定性については不明であった。今回我々は、毛髪を毛根部と毛幹部を 3 部位に分け、より詳細に qPCR 法による細菌数の計測、NGS を用いた OTU レベルでの群集構造解析を行った。
【方法】
被験者 6 名 ( 男性 4 名、女性 2 名 ) から毛髪の提供を受け、毛根および毛幹 ( 基底部・中間部・先端部 ) の 4 つの断片に切断しサンプルを調製した。また、洗髪による影響を調べるため、3 段階の濃度に希釈した TritonX-100 水溶液を用い、毛髪洗浄サンプ
ルを調製した。調製後、各毛髪サンプルを低真空・無蒸着下で電子顕微鏡を用いて表面 1 cm2当たりに付着する細菌の存在量の定量および形態を観察した。また、qPCR 法にて毛髪 1 cm2当たりの 16S rRNA 遺伝子コピー数を定量した。さらに、NGS に
よる 16S アンプリコン解析を行なった。
【結果】
qPCR 法によるコピー数計測の結果、毛幹部ではいずれの部位でも平均 105~106 copies/cm2、毛根部では平均 107 copies/
cm2の細菌を計測した。これらの結果は SEM 観察による細菌数計測の結果と相関があった。また、毛髪洗浄サンプルは全ての被験者でコピー数に有意差がなかった。細菌群集構造解析の結果、主要細菌門は全ての毛髪サンプルで Proteobacteria、Actinobacteria、Firmicutes 門であった。α多様性解析の結果、毛幹では毛根よりも有意に多様度が大きいことを確認した。
OTU レベルでの解析の結果、主要細菌種はいずれの被験者、更に毛根部と毛幹部で共通していることが明らかとなった。また、個々の被験者で主要細菌の占有率は有意に異なっていたが、同一被験者内では毛根と毛幹に付着する主要細菌の占有率が類似していた。以上の結果から、ヒト毛髪の毛根および毛幹には共通した細菌種が定着しており、毛幹定着細菌は毛根に由来する可能性が示唆された。主要細菌種の占有率が個々人で異なる要因については、現在、例数を増やし解析中である。

P1-34

Diel changes in energy metabolism of the thermophilic anoxygenic
photosynthetic bacterium Chloroflexus aggregans in cyanobacteriadominated microbial mats revealed by metatranscriptomic analyses○ Shigeru Kawai1, Joval Martinez1,2, Mads Lichtenberg3, Erik Trampe3, Marcus Tank1, Michael Kuehl3,
Shin Haruta1, Satoshi Hanada1, Vera Thiel1
Dept. of Biol. Sci., Tokyo Metropolitan Univ., 2Dept. of Nat. Sci., Univ. of St. La Salle, 3Dept. of Biol., Univ. of Copenhagen

1E-mail: sk.harmonics.1210@gmail.com

Anoxygenic phototrophic Chloroflexus aggregans are versatile, thermophilic Chloroflexi , which can grow photoheterotrohically,
photoautotrophically, chemoheterotrophically, and chemolithoautotrophically. In hot spring associated microbial mats, C.
aggregans co-exists with oxygenic phototrophic cyanobacteria. In these mats, the micro-environmental conditions undergo dielchanges e.g., in oxygen concentration, light, and pH. To elucidate the predominantly energy metabolism of C. aggregans in thosenatural environments, relative transcription levels of energy-metabolism-related genes were examined in cyanobacteria-dominatedmicrobial mats from Nakabusa hot springs (Japan) at 56 °C over a diel cycle. Relative transcription levels were compared withenvironmental conditions, such as oxygen, sulfide and light data measured with microsensors within the mats. Metatranscriptomic
analyses revealed phototrophic metabolism, with photoautotrophic and photoheterotrophic phases. Consistent with the predictionthat Chloroflexus perform light-driven CO2 fixation during low-light periods, genes encoding sulfide-quinone oxidoreductase anduptake hydrogenases, as well as genes encoding for key enzymes for carbon fixation, were highly transcribed in late afternoon,
when the mats became anoxic but indirect sunlight was still available. These results suggest that C. aggregans in the cyanobacteriadominated mats fixes CO2 photosynthetically using sulfide and hydrogen as electron donors under anaerobic light conditions in thelate afternoon. During the midday with direct sunlight, when the mats are supersaturated with oxygen, C. aggregans is indicatedto perform aerobic respiration. In contrast, in the early morning before sunrise, the peaks of genes encoding uptake hydrogenases,
key enzymes for carbon fixation, and superoxide dismutase were detected in the dark, suggesting the chemolithoautotrophic
lifestyle of C. aggregans and/or preparations for the autotrophy with hydrogen.

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

P1-35

人工の代謝酵素遺伝子クラスターを利用した高機能有機塩素殺虫剤資化細菌の育種○蘇 立俊 , 加藤 広海 , 大坪 嘉行 , 津田 雅孝 , 永田 裕二
東北大・院生命科学

E-mail: soritsushun@ige.tohoku.ac.jp【背景と目的】有機塩素系殺虫剤γ -hexachlorocyclohexane ( γ -HCH) は人為起源の難分解性物質であり、その汚染に対する国際的な取り組みが求められている。一方で、γ -HCH を分解資化する細菌株が世界各地の汚染土壌から単離されている。これら
株はいずれもSphingobium japonicum UT26 株で同定されたγ -HCH 分解代謝酵素遺伝子群 (lin 遺伝子群 ) とほぼ同一の遺伝子群を有しており、UT26 株と同様の代謝経路でγ -HCH を分解資化すると考えられている。しかし、これら天然のγ -HCH 分解細菌株は、(i) lin 遺伝子群がゲノム中に散在し、近傍に存在する挿入配列 IS6100 の影響で遺伝的に不安定であり、γ -HCH 分解

資化能が安定維持されない、(ii) γ -HCH 代謝過程において有毒な dead-end 産物を生じるという特徴を有している。これら特徴
は、天然のγ -HCH 分解細菌株の適応の不十分さを強く示唆すると共に、環境浄化への応用の際に問題となる。そこで、本研
究では、人工のγ -HCH 代謝酵素遺伝子クラスターを作製し、天然株より優れた資化細菌株を育種することを目的とした。【方法と結果】γ -HCH 分解細菌は、γ -HCH を各種芳香族化合物代謝経路における共通の中間代謝産物であるβ -ketoadipate を経て代謝する。そこで、まずγ -HCH をβ -ketoadipate に変換するのに必要な LinA から LinF の６つの酵素遺伝子クラスターを作製した。この際、γ -HCH 初発分解に作用する LinA の活性が次段階に作用する LinB の活性より相対的に強いと、より多くの
dead-end 産物を生じることを考慮し、linB と linA をクラスターの先頭と最後尾にそれぞれ配置した。また、lin 遺伝子群の発現が、高すぎても低すぎても適当な分解細菌が創出できない可能性が考えられたため、発現強度が異なると期待される３種のコンストラクトを作製し、β -ketoadipate 代謝能を有し IS6100 を保持しない様々な環境細菌株に導入した。作製した人工株のγ-HCH 分解特性及び資化能を天然のγ -HCH 分解資化株と比較した結果、lin 遺伝子群の高いレベルでの発現が期待されるクラス

ターを導入した株のうち、Sphingobium chlorophenolicum L-1 株とSphingomonas sangiunis IAM12578 株を宿主とする株が高いγ -HCH 分解効率を示し、かつ dead-end 産物を蓄積しなかった。この２株のうち、L-1 由来株がγ -HCH を資化できることを確認した。さらに、この２株をγ -HCH 汚染化土壌に接種し、汚染環境での生残性とγ -HCH 分解特性を検討している。

P1-36

画像解析を用いたアカントアメーバ位相差顕微鏡写真の動態解析○深谷 将 1, 青木 啓太 1, 小林 実桜 2, 武村 政春 1,2
東京理科大学・院理 , 2東京理科大学・理1E-mail: 1717706@ed.tus.ac.jp

位相差顕微鏡写真は、光学顕微鏡写真や蛍光顕微鏡写真と比べて画像解析が難しいと言われている。位相差顕微鏡の観測対象

は光の強弱ではないため既存の画像解析技術が適用できない場合があり、加えて Halo や Shade-off といった解析の妨げとなる現象が起こることに起因する。一方で位相差顕微鏡は比較的安価な設備で、ラベリングや染色なしに、生きたままの細胞を観察することができるため、生物学的な適用範囲は広い。そこで本研究では、アカントアメーバの位相差顕微鏡写真を解析対象として、新たな画像処理プログラムを開発した。さらにこのプログラムにより静止画の粒子解析、およびタイムラプス画像の粒子トラッキング解析を行い、解析結果を得ることに成功した。この場合「粒子」とは、解析により画像上で一つに繋がった塊として認識されうるピクセルの集合のことを指す。この粒子は、独立して動く一個のアカントアメーバ細胞や、凝集したアカントアメーバ細胞の塊などを示している。解析からは視野内に存在する粒子の数、平均サイズや平均速度を、時系列で得ることができた。また粒子の移動方向の偏りを時系列でプロットすることにより、粒子の動きの同調に関する結果も得ることができた。また粒子の分裂や、複数の粒子が重なり合って一つの粒子になることを想定したアルゴリズムを組むことにより、アカントアメーバの動きに対応した解析を実現できた。これにより、一つの粒子の中に推定いくつのアカントアメーバが存在する

か予測値を得ることができた。さらにこの解析プログラムを用いて、種々の環境に置いたアカントアメーバの動態解析を行い、結果を比較した。これにより、いくつかの巨大ウイルスに感染させたアカントアメーバの動きについて、非感染のアカントア
メーバとの特徴的な違いを観察することができた。

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P1-37

Isolation and characterization of a novel thermophilic purple sulfur
bacterium from Nakabusa hot springs, Japan○ Mohit Kumar Saini, Weng ChihChe, Satoshi Hanada, Marcus Tank
Department of Biological Sciences, Graduate School of Science, Tokyo Metropolitan University
E-mail: mohitvtm@gmail.com

Purple sulfur bacteria are anoxygenic phototrophs with type 2 reaction centers that can be found in anoxic, sulfidic and illuminatedhabitats all over the world. However, only one truly thermophilic species, Thermochromatium tepidum , has been described sofar. In the search for novel truly thermophilic purple sulfur bacteria we could isolate a novel purple sulfur bacterium, strain No.7,
from a microbial mat (collected at 56℃ ) collected in Nakabusa hot springs, Japan. Cells are rod shaped and stain gram negative.

They are motile, red in color and store sulfur globules inside, a key characteristic of purple sulfur bacteria that belong to the family

Chromatiaceae . Similar to Thermochromatium tepidum , the novel isolate contains bacteriochlorophyll a (BChl a ) and carotenoids

as major photosynthetic pigments with a typical type 2 reaction center LH1 and LH2 complexes. Strain No.7 was able to growphotoautotrophically using sulfide as electron donor and bicarbonate as inorganic carbon source, under anaerobic and tungsten

light conditions at 50℃ . Growth under photoautotrophic conditions occurred at temperatures of 35-56℃ with an optimum around
50℃ and a pH value of 7.2. 16S rRNA gene sequence comparisons indicated that the isolate is next related to Thermochromatium

tepidum with a pairwise similarity of only 88％ nucleotide identities. This large phylogenetic distance suggests strain No.7 represents

a novel genus with a truly thermophilic growth behavior. Phylogenetic analysis supported the high novelty of this purple sulfur
bacterium with a long branching phylogenetic position within the family Chromatiaceae next to Thermochromatium tepidum . The

novel isolate will be described as a new species by polyphasic taxonomy, soon. Sample preparation for genome sequencing has been
conducted and the genome will provide more information about the thermophilic adaptation.

P1-38

Isolation and characterization of Geomonas species, a novel genus involved
in reductive nitrogen transformation in paddy soils○ Zhenxing Xu1, Yoko Masuda1, Hideomi Itoh2, Keishi Senoo1,3
Grad. Sch. of Agri., Univ. Tokyo., 2Bioproduction Research Institute, AIST, Hokkaido,
Collaborative Research Institute for Innovative Microbiology, The University of Tokyo1
3

E-mail: xuzx.ut@gmail.com

Reductive nitrogen transformation (nitrogen fixation, dissimilatory nitrate reduction to ammonia (DNRA), and denitrification)in paddy soil, driven by microorganisms, is important for sustainable rice production and environmental conservation. In ourprevious metatranscriptomic study of paddy soil in Japan, we found that most of gene transcripts involved in reductive nitrogentransformation were derived from the order Deltaproteobacteria , especially the genera Geobacter (the sole genus in the family

Geobacteraceae ) and Anaeromyxobacter , known as iron reducing bacteria. However, there has been no Geobacter species witha validly published name isolated from paddy soil, and their ability of nitrogen transformations also has not been reported. In

this study, we successfully isolated 54 bacterial strains in the family Geobacteraceae from paddy soils collected in different
fields in Japan using enrichment culture combined with spread plate method. Based on the 16S rRNA sequence similarities andphylogenetic analysis, the 54 isolates are separated into 4 groups, and every group represents at least one novel species in thefamily Geobacteraceae . With the further genomic analysis, we found 3 of the 4 groups consisted a novel genus in the family

Geobacteraceae , which is obviously distinct with the genus Geobacter , so we proposed the novel genus with the name Geomons

gen. nov.In laboratory cultivation studies, the paddy soil-derived Geomonas strains showed nitrogen fixing and DNRA activity, as

well as ferric reducing ability, consistent with annotated genome results. Further analysis of ferric reduction and nitrogen fixation
using freshwater medium, we found that the higher ferric concentration could promote the nitrogen fixation of Geomonas strains.

These results indicate that the Geomonas strains could be important drivers of biogeochemical cycle in paddy soil.

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

P1-39

嫌気性アンモニア酸化細菌 “Ca. Scalindua sp.” の酸素同位体分別の解析○小林 香苗 1, 福島 慶太郎 2, 大西 雄二 2, 眞壁 明子 3, 矢野 翠 2, 押木 守 4, 金田一 智規 5, 木庭 啓介 2, 岡部 聡 1
北大・院工 , 2京大・生態研 , 3海洋研究開発機構 , 4長岡高専・工 , 5広島大院・工1E-mail: k-kanae625@eis.hokudai.ac.jp

環境保全や生物地球化学的物質循環を明らかにするためには，窒素循環の解明が極めて重要である。環境中の硝酸や亜硝酸の窒素安定同位体比（δ 15N 値）は物質循環のトレーサーとして広く用いられてきた。近年、硝酸と亜硝酸の酸素安定同位体比（δ 18O 値 ) についても、δ 15N 値と同様に測定が可能となり、窒素と酸素の 2 軸で亜硝酸と硝酸の挙動を追跡することで、より複雑な反応を推定することが可能になってきた。窒素循環への各生物学的反応の相対的寄与を定量的に把握するためには、各プロセスの固有の窒素・酸素同位体分別ε ( 反応における安定同位体比 ( δ ) の変化量 ) が不可欠である。嫌気性アンモニア酸化（以下アナモックス）細菌は幅広い水圏環境で検出され，脱窒と共に窒素除去へ寄与している。さらに、アナモックス反応
では、二酸化炭素の固定の際に硝酸を生成するため、硝酸生成にも寄与しており、窒素循環に非常に重要な役割を担っている。しかしながら、アナモックス細菌は、増殖速度が非常に遅く培養が困難であり、反応自体も複雑であることから海洋性ア
ナモックス細菌を含め多様なアナモックス細菌の酸素同位体分別に関する情報は皆無であった。そこで本研究では、我々の研究室で膜分離型連続培養リアクター (MBR) を用い、高度に集積培養した (> 90%) 海洋性アナモックス細菌 “Ca. Scalindua sp.” を用いて酸素同位体分別を明らかにすることを試みた。これまでの研究で、我々は膜分離型連続培養リアクター (MBR) の流入水と流出水の濃度と窒素安定同位体比を測定し “Ca. Scalindua sp.” を含む 3 種のアナモックス細菌の窒素同位体分別 15ε (NH 4 ＋→ N2),ε (NO 2 －→ N 2), 15ε (NO 2 －→ NO 3 － ) を明らかにしてきた。しかし、酸素同位体分別を解析する際には、上記の 18ε15(NO2 → N2), 18ε (NO 2 －→ NO3 － ) の２つの分別に加えて、亜硝酸酸化反応時に水の酸素原子を一つ取り込むことによる同位体－

分別（18ε H 2O）、さらに亜硝酸と水の間では 16O と 18O の同位体平衡が成立しており，この時の平衡同位体分別係数（ε eq）

も必要である。これらの値は、連続培養系のみでは独立して求めることができないため、18O でラベルされた水を用いた回分実

験系と、亜硝酸と水の平衡同位体分別を求めるための実験を組み合わせることにより、それぞれの酸素同位体分別の解析を試
みた。

P1-40

細胞ごとに増殖速度のばらつきが大きいアンモニア酸化細菌のしなやかな生存戦略○一色 理乃 1, 藤谷 拓嗣 2, 田中 大器 3, 関口 哲志 3, 常田 聡 1,3
早大・院先進理工 , 2産総研・バイオメディカル , 3早大・ナノライフ

1【背景・目的】環境中の微生物の多くは難培養であり，実験室で継代培養し続けることが困難である。本研究では，安定して培養し続けることが難しい原因として，個々の細胞レベルで増殖速度にばらつきがあるのではないかと考えた。そこで，難培養微生物の増殖速度のばらつきを純菌株で評価し，ばらつきを持つ意義を明らかにすることを目的とした。

【方法・結果】難培養微生物のモデルとして，アンモニア酸化細菌Nitrosomonas mobilis Ms1 を用いた。本微生物種は，過去に複数の研究室で獲得されたがすべて継代の失敗により失われてきた難培養微生物である。はじめに，継代操作による増殖速度のばらつきと継代効率を評価した。1 培養液から均一に継代した培養液を複数用意し，継代条件を 1%，0.1%，0.01%，0.001%
継代の 4 条件で用意した。増殖速度の変動係数は，1% 継代を基準とし継代割合が減少するにつれて 2.1 倍，2.3 倍，2.8 倍に増加した。さらに，継代効率は 0.1% 継代までは 100% であるのに対して，0.01%，0.001% では，92%，66% と減少した。この結果より，N. mobilis 培養液には増殖速度のばらつきがあり，継代する細胞数が減少するにつれて，ばらつきは拡大し，継代が困難になることが明らかになった。次に，増殖速度のばらつきをシングルセルレベルで解析するため，マイクロ流体デバイス上で個々の細胞ごとにタイムラプス観察を行った。観察の結果，1 培養液中でも個々の細胞ごとに世代時間は 0-8 日間の間にばらつき，N. mobilis 細胞集団中にはシングルセルレベルで増殖速度のばらつきがみられた。また，増殖が見られたのは非凝集細胞

のみで，凝集細胞では全く増殖が見られなかった。続いて，増殖能の違いをもたらす遺伝子発現を明らかにするため，増殖能のない凝集細胞と増殖能を持つ非凝集細胞を区別して分取し，RNA シークエンス解析を実施した。遺伝子発現を比較した結果，
非凝集細胞では電子伝達系やリボソームタンパク質などエネルギー生産，およびタンパク質翻訳にかかわる遺伝子の発現が亢進し，凝集細胞では運動性や走化性にかかわる遺伝子の発現が亢進していることが明らかになった。したがって，N. mobilis の細胞集団は増殖と環境適応を分業させ，増殖による集団の拡大と，変動する環境への適応による種の存続を両立させていることが推測された。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

P1-41

深部地下圏環境におけるメトキシ芳香族化合物分解メタン生成共生系の発見○坂本 幸子 1, Masaru Konishi Nobu2, 眞弓 大介 3, 玉澤 聡 4, 五十嵐 雅之 5, 若山 樹 5, 前田 治男 3,5, 坂田 将 3,
鎌形 洋一 2, 玉木 秀幸 1,2
筑波大・院生命 , 2産総研・生物プロセス , 3産総研・地圏資源 , 4H-RISE, 5INPEX

1E-mail: sakamoto-s@aist.go.jp

メトキシ芳香族化合物（MAC）は、リグニン由来の物質であり石炭層や堆積性有機物などに含まれ、深部地下環境や泥炭環境など地球上の様々な場所に存在する。近年、メタン生成アーキアが石炭中の MAC を基質としてメタンを生成する新たな生物機能が発見され、MAC 利用性のメタン生成菌が地下の天然ガス資源の成因に関与している可能性が示唆された。一方で、深部地下環境において MAC の動態に関与する微生物の実態は不明な点が多い。実際に、上述の MAC 利用性のメタン生成アーキアは１種のみでしか知られておらず、また無酸素環境下で MAC を利用可能な細菌に関する知見もホモ酢酸生成細菌等に限られている。そこ
で、本研究では、深部地下環境において MAC 分解を担う未知微生物を探索し、その生理生態機能を解明することを目的とした。

深部地下油ガス田環境から採取した油層水試料を用い、MAC を基質として集積及び分離培養を行った結果、新規嫌気性細菌の純粋分離に成功した。16S rRNA 遺伝子に基づいた分子系統解析の結果、本単離株はFirmicutes 門に属するが、近縁種との相同性が 87.5% 以下と低く、系統的新規性が高かった。本株を MAC 分解細菌と予想し、ゲノム解析を実施した。既知の嫌気性 MAC

分解細菌は、Wood-Ljungdahl（WL）経路と呼ばれる二酸化炭素固定経路を利用し、MAC から酢酸を生成する。一方で、本株のゲノム上には WL 経路の一部しか存在せず、また、ゲノム情報から酢酸ではなくギ酸と水素を生成している可能性が示唆された。このことから、本株は、ギ酸・水素資化性メタン生成菌との共生下で MAC を分解しているのではないか、と考えた。培養実験の結果、本株は予想通り、単独では MAC を単一基質として利用しなかった。そこで、ギ酸・水素資化性メタン生成菌との共培養実験を行ったところ、本株とメタン生成菌の顕著な増殖とメタン生成が確認されたことから、本株はメタン生成菌との共生系において MAC を分解する嫌気共生細菌であることが明らかとなった。無酸素環境下において MAC を分解する細菌は、いずれも単独で MAC を単一基質として利用可能であり、メタン生成菌との共生系で MAC を分解する共生微生物はこれまでに報告されておらず、今回が初めての発見である。この MAC 分解を担う新規メタン生成共生系は、深部地下圏環境において新たな嫌気共生系として存在しうる可能性を示し、今後、その共生機構及び生理生態機能をさらに詳細に解明する予定である。

P1-42

環境ストレスが嫌気性アンモニア酸化（アナモックス）細菌の形態と活性に与える影響○山下 柚子 1, 上垣内 厚志 1, 張 磊 2, 小林 香苗 1, 岡部 聡 1
北海道大・院工 , 2University of Washington

1【目的】嫌気性アンモニア酸化（アナモックス）細菌は原核生物でありながら細胞内小器官アナモキソソームを持つ。ATP 合成
酵素がアナモキソソーム膜上に局在していることから、通常の細菌とは異なり、アナモックス細菌はアナモキソソーム膜を介してエネルギー代謝を行うと考えられている。アナモキソソーム膜は凹凸に富み、この凹凸部分にアナモックス反応に関与する酵素が多く存在することも示唆されている。そこで我々は、アナモキソソームの形態が代謝活性に関係しているのではないかと考えた。本研究では、基質の制限および塩分というアナモックス活性に影響を及ぼすような環境ストレスを与えて細胞構造を比較し、アナモックス活性と形態の関係を明らかにしようと試みた。
【方法】膜分離型バイオリアクター（MBR）にアナモックス細菌Ca . B. sinica、Ca . Scalindua sp. をそれぞれ植菌し、地下水に無機塩を加えた人工合成培地を連続供給して培養した。窒素負荷を徐々に上昇させ、基質濃度の制限を受けずに増殖する状態（対数増殖期）、一定の窒素負荷のもとで増殖が停止した状態（定常期）を作った。定常期の菌体をアンモニア態窒素、亜硝酸
態窒素を含まない培地で 42 日間培養したものを死滅期とした。またCa . B,. sinica、Ca . Scalindua sp. をそれぞれ MBR に植菌し、1% の塩分濃度に馴致した。更にCa . B. sinica は 3%、Ca . Scalindua sp. は 0% と 6% で 10 日間の回分培養を行った。各増殖期・培養条件の細胞を透過電子顕微鏡（TEM）で観察した。
【結果と考察】大腸菌等では飢餓や塩分などのストレスにより細胞の大きさや形状が変化することが知られているが、本研究では細胞の外形に顕著な変化はみられなかった。一方、環境ストレスを受けた細胞でアナモキソソーム膜の凹凸が減少する傾向がみられた。TEM 画像からアナモキソソームの断面積と周長を求め、（4 π×（断面積）÷（周長））で表される円形度を凹凸の指標としたところ、円形度とアナモックス活性の間に相関が認められた。Ca . Scalindua sp. では低塩分濃度による溶菌等の影響で、各塩分濃度における活性と円形度との間に明確な関係を見いだせなかった。本研究の結果はアナモキソソームの形態変化によって活性が制御されている、あるいは活性に関わるタンパク質等の影響でアナモキソソームの形態が変化している可能性を示唆している。変形が生じる機構については今後さらなる調査・検討が必要である。

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P1-43

シアノバクテリアSynechococcus elongatus PCC7942 における概日時計に制御された酸化ストレス耐性○田中 謙也 1, 中西 周次 1,2
大阪大・院基礎工 , 2大阪大・太陽エネ研セ

1E-mail: tanaka@rcsec.chem.es.osaka-u.ac.jp

酸素発生型光合成生物は、外界の光や温度などの変化によって不可避的に発生する過剰量の活性酸素種（ROS）に対処する
様々な機能や酵素群を発達させてきた。一方、昼夜で規則的に変化する外部環境に効率的に適応するために、光合成生物は概日時計を備えている。ROS 発生による酸化ストレスに対処するための各々の酵素群や機構は詳細に知られている一方、概日時

計がそれらに与える影響や役割についてはよく分かっていない。そこで本研究では、多くの遺伝子発現が概日時計によってコントロールされていること、および過酸化物除去酵素であるペルオキシレドキシンのレドックス状態が概日リズムを示すことが知られているシアノバクテリアSynechococcus elongatus PCC7942 において、概日時計と酸化ストレス耐性との相関を解明することを目的とした。

本研究では、メチルビオロゲン（MV）存在下で光を照射させることで任意のタイミングで ROS を発生させ、概日時計の酸化ス

トレス耐性への影響を調べた。その結果、MV による酸化ストレスを加えたあとの酸素発生速度は概日リズムを示すことが分かった。一方、PSII に対する電子受容体存在下での酸素発生速度は酸化ストレスを加える前後でほとんど変化せず、概日リズ
ムを示さなかった。このことは MV による酸化ストレスが PSI 選択的に起こり、PSI 周りの ROS 除去機能が概日時計によってコントロールされていることを示唆している。さらに MV による酸化ストレスを同様に加えたあとのコロニー形成単位（CFU）も
概日リズムを示すことが明らかになった。以上の結果は、光合成活性や生存率といった巨視的な形質に影響するレベルで、酸化ストレス耐性が概日時計によりコントロールされていることを示している。

P1-44

α - アミノ酸添加によるChitinophaga 属細菌の N 2O 消去亢進効果の検証○高津 祐太 1, 長田 彬 2, Sharon Yu Ling LAU3, 橋床 泰之 1
北大・院農 , 2北大・農 , 3Sarawak Tropical Peat Research Institute1E-mail: record@eis.hokudai.ac.jp【背景】亜酸化窒素 (N2O) は，等モルあたり二酸化炭素の約 300 倍もの強さを示し，21 世紀最大のオゾン層破壊原因物質との指摘もある厄介な温室効果ガスである。農地や人為的に攪乱された酸性土壌からの大量に放出される N2O は，地球規模での気象変動に大きなインパクトを与えており，その生成抑制と大気からの効率の良い削減は極めて困難とされている。高い N2O 放出能を示す土壌の微生物群集には，硝酸塩あるいはアンモニウム塩のみを窒素源とした培地でも密閉容器内に N2O は放出されず，逆に無窒素培地で大気レベルの N2O（400 ppb）を完全にゼロレベルにまで消去するものがしばしば見出される。これら N2O

消去微生物として，N2O を菌体に取り込むものを分離し，同定にも成功している。本実験では，各種α - アミノ酸を与え，当該細菌の N2O 消去活性に連動した応答から，N2O 消去経路の解明に迫ろうとした。【方法】本実験では，北海道のコーン畑黒ボ

ク土壌から分離した N2O 消去細菌Chitinophaga spp.SAcf-1 株を使用した。Winogradsky 無機塩溶液を基本培地とし，炭素源に0.5%(w/v) スクロース，窒素源には N 原子が 5 mM になるようα - アミノ酸を添加した。培地はガスクロバイアルに 10 ml ずつ分注し，菌体懸濁液を 100 μ l 接種した。ヘッドスペース（22.5 ml）に N2O を終濃度 10000 ppmv になるよう封入後，25℃暗所で培養し，1 週間後の N2O 濃度を ECD- ガスクロマトグラフィーで測定した。また，N2O 消去亢進が確認されたα - アミノ酸については，それらの濃度を 5 μ M，50 μ M, 500 μ M, 5 mM に振り，炭素源あり／なしの条件下で N2O 消去試験を行った。加

えて，K15NO3含有液体培地で前培養し，菌体タンパク質とアミノ酸の相当量が 15N ラベル化された菌体に 14N2O を消去させた時に 15N が 14N で優先的に希釈されるアミノ酸を ESI-HR-MS で特定し，N2O 代謝経路の解明を試みた。【結論】一部のアミノ酸の添加により，N2O 消去が大きく亢進され，特に 5 μ M L- ヒスチジン添加（0.5% sucrose w/v 存在下）による N2O 消去活性の亢進効果（1 week 以内に 10000 ppmv N2O がほぼゼロになる）が明らかになった。加えて，5 μ M L- ヒスチジン添加による菌体増殖効果を OD660で求めた値は他のα - アミノ酸とほぼ同レベルであったため，L- ヒスチジン代謝経路が N 2O 消去経路の賦活化に連動していることが強く示唆された。

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P1-45

嫌気性原生動物Cyclidium sp. 細胞内に共生可能なメタン生成古細菌の種の特定○平片 悠河 1, 幡本 将史 1, 渡利 高大 1, 山口 隆司 1, 押木 守 2, 荒木 信夫 2, 延 優 3
長岡技科大 , 2長岡高専 , 3産総研

1【目的】嫌気性の原生動物の細胞内には水素資化性メタン生成古細菌が共生しており、原生動物細胞内で発生した水素を利用しメタンを生成していることが報告されている。これまで様々な種の原生動物とメタン生成古細菌による共生が報告されているが、その共生の組み合わせに規則性はなく、細胞内共生が構築される条件は明らかにされていない。そこで本研究では、細胞内にメタン生成古細菌を共生させている嫌気性原生動物 Cyclidium sp. を用いて、どのような種のメタン生成古細菌が共生可能かを調査した。【方法】まず、2- ブロモエタンスルホン酸 (BES) の添加によって Cyclidium sp. 細胞内の共生メタン生成古細菌を除去した。その後、共生メタン生成古細菌を除去した Cyclidium sp. を、Methanobacterium beijinegense、Methanospirillum
hungatei 、Methanosaeta concilii、Methanosarcina barkeri の 4 種のメタン生成古細菌とそれぞれ共培養実験を行った。メタン生成古細菌が Cyclidium sp. 細胞内に取り込まれ、さらに分解されずに生存し続けるか否かは FISH 法によって確認した。【結果】共培養実験の結果、M. beijinegense、M. hungatei の共培養系では Cyclidium sp. 細胞内から古細菌由来の蛍光が確認され、細胞内共生が構築されたことが明らかとなった。細胞内共生が構築された Cyclidium sp. は、継代培養を繰り返しても共生は失われず、メタン生成も確認された。M. beijingense は Methanobacteria 網、M. hungatei は Methanomicrobia 網に属するメタン
生成古細菌であり、Cyclidium sp. は網レベルで異なる種のメタン生成古細菌であっても、細胞内共生を構築し得ることが明らかとなった。一方で、M. concilii、M. barkeri は細胞内に取り込まれず、共生は構築されなかった。M.concilii は酢酸を主に資化する種であり、細胞内共生において重要な水素除去ができなかったため、共生が構築されなかったと考えられる。一方で M.
barkeri のように水素を資化可能な種であっても共生が構築されない場合が存在し、水素資化能以外にも細胞内共生の構築条件が存在すると考えられた。

P1-46

プロファージ遺伝子による微生物間コミュニケーションの制御○安田 まり奈 1, 森永 花菜 2, 尾花 望 3, 野村 暢彦 4,5, 豊福 雅典 4,5
筑波大院・生命環境科学研究科 , 2産業技術総合研究所・生物プロセス研究部門 ,3
筑波大学医学医療系トランスボーダー医学研究センター , 4筑波大・微生物サステイナビリティ研究センター ,5
筑波大・生命環境系
1

細菌は細胞外にシグナル物質を分泌し、周囲のシグナル物質を認識することで、微生物間相互作用を行っている。近年我々は、

Paracoccus denitrificans が生産する疎水性の高いシグナル物質C 16-HSLが、膜小胞（MV）に内包されて放出されていることを報告した（M Toyofuku et al . 2017. ISME Journal）。水中での単純拡散が困難となる疎水性シグナル物質C16-HSLは、MVに内包されることでその拡散性が向上されると考えられる。つまり、このC16-HSLの拡散の鍵となるのはMV産生であり、このMV産生機構の理解が微生物間相互作用の理解につながると考えられる。そこで、P. denitrificans のMV産生機構を解明することを本研究の目的とした。
また、我々はPseudomonas aeruginosa において、集団中の一部の細胞が溶菌することによって MV が産生される新奇 MV 産生機構を発見した（Turnbull, Toyofuku et al . 2016. Nature Communication）。この MV 産生機構は DNA ストレスによって誘導され、プロファージ領域に存在する溶菌遺伝子を必要とする。多くの細菌はゲノム上にプロファージ領域が保持されていることから、この MV 産生機構はP. denitrificans を含むほとんどの細菌に共通したものであることが予想された。
DNA ストレスを与える薬剤 MMC を用いて、P. denitrificans におけるストレス条件下での MV 産生能を解析したところ、ストレス量に応じた MV 産生誘導が見られた。そこで、ストレス条件下で産生された MV に含有される DNA の全ゲノムシークエンスを行ったところ、MV にはプロファージ領域由来の遺伝子が濃縮されていることが明らかとなった。さらに、濃縮されていた遺伝子の中には、プロファージ遺伝子である推定溶菌遺伝子が存在していた。この溶菌遺伝子の欠損株を作製し、ストレス条件
下での MV 産生能を解析したところ、野生株で見られた MV 産生誘導が見られなくなった。また、このストレス条件下では、多量の C16-HSL が MV とともに上清中へ放出されることが分かった。
プロファージは、細菌ゲノム上に存在する溶原ファージであり、環境変化に応じて発現して細胞の溶菌を引き起こす。この溶菌に依存した本 MV 産生機構では、シグナル物質 C16-HSL を一気に放出し、細菌のシグナル伝達を急速に活性化できることが予想される。本 MV 産生機構によって、溶原ファージが微生物間相互作用に干渉している可能性が示唆された。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meetingP1-47

ショットガンメタゲノム解析による厚岸湖アマモ群落の底泥における亜酸化窒素
還元微生物の群集構造解析○中川 達功 1, 石川 直央也 1, 須藤 健吾 1, 森川 翠 1, 宮本 優貴 1, 神宮寺 賢 1, 冨澤 璃乃 1, 土屋 雄揮 1, 上田 眞吾 1,
福井 学 2, 高橋 令二 1
日大・生資 , 2北大・低温研

1

E-mail: nakagawa.tatsunori@nihon-u.ac.jp【目的】北海道厚岸湖アマモ群落内の底泥には、亜酸化窒素（N2O）を吸収するはたらきがあることが明らかになってきた。さらに、N2O 還元微生物（nosZ clade II）が非アマモ群落の底泥に比べアマモ群落内底泥では多いことも明らかになってきた。

しかし、N2O 還元微生物の構成メンバーの特定には至ってない。そこで、次世代シークエンサーを用いた N2O 還元酵素遺伝

子 (nosZ ) を標的としたショットガンメタゲノム解析により培養前後の底泥の N2O 還元微生物の構成メンバーを調べた。【方法】2015 年 7 月に北海道厚岸湖の底泥（アマモ群落と非アマモ群落）をコアサンプラーで採取した。表層 0cm から 4cm を均一に混ぜた底泥と海水を血清ビンに添加し、10 日間 20℃暗所で培養を行った。アマモ群落と非アマモ群落の底泥に対して

１）塩化アンモニウム無添加、２）塩化アンモニウム添加 1 mM、３）100% N2O 添加 0.34 mL の 3 つの実験区を設けた。培

養前と培養後の底泥から DNA を抽出後、Nextera DNA Libray Prep Kit を用いて、ショットガンメタゲノム解析用のライブラリーを作製した。インデックスが付加された各 DNA 断片試料の塩基配列は MiSeq V2 reagent kit を用いて MiSeq で解析した。
CLC Genomic Workbench を用いて NosZ アミノ酸配列データベースと blastx 解析を実施し、E-value が 10-15以下の DNA 断片を

nosZ 遺伝子としてライブラリーから抽出した。【結果】ショットガンメタゲノム解析の結果、nosZ -clade II のDechloromonas -Magnetospirillum -Thiocapsa 系統の硫黄酸化バクテリア（Gammaproteobacteria ）とBacteroidetes (Flavobacteriia ) がアマモ群
落と非アマモ群落の両方の砂泥において主要な構成メンバーであった。続いて、nosZ -clade I のAlphaproteobacteria が主要な構成メンバーであった。アマモ群落の N2O を添加した培養系のみから、Epsilonproteobacteria も主要な構成メンバーとして検出された。アマモ群落の底泥は非アマモ群落の底泥より N2O を吸収した事やnosZ -clade II に属する N2O 還元微生物が多かった
事からも、アマモ群落底泥における N2O 還元微生物の沿岸域 N2O 軽減への大きな貢献が示唆された。

P1-48

18S rDNA 遺伝子のメタゲノム解析により明らかになった微小真核生物の群集構造とその多様性：黒潮周辺海域の海面から深海まで○寒川 清佳 1, 長井 敏 1, 日高 清隆 1, 平井 惇也 2, 清水 勇吾 1, 廣江 豊 3, 日下 彰 1, 瀬藤 聡 1
水産機構・中央水研 , 2東大・大海研 , 3水産機構・西海水研

1E-mail: ssogawa@affrc.go.jp
１．背景と目的

細菌と植物プランクトンは海洋食物網の土台となる重要な生物である。海洋生態系には植物プランクトンが生産した有機物を基礎とする捕食食物連鎖と、生物由来の有機排出物を利用・分解する細菌が原生動物に捕食される食物連鎖（微生物ループ）が存在し、いずれも動物プランクトンを介してより高次栄養段階の魚類等に転送される。

多種多様な魚類の産卵・成育場となっている黒潮周辺海域は、貧栄養海域のため小型のプランクトンが多く、従来の顕微鏡下での分類・同定は困難だった。次世代シークエンサーなど分子生物学的手法の進化により、水中環境に浮遊する生物・生物由来の DNA（環境
DNA）の配列を解析することで、網羅的に生物群集を把握することが可能になった。本研究では、黒潮周辺海域で採集された

環境 DNA の 18S-rDNA 遺伝子による微小真核生物群集の構造解析を行い、各群集の海面から深海までと季節毎の出現特性を把握する。また海洋環境の変動に応じて群集がどのような変化をするか調べる。２．材料と方法 2015-2016 年の海洋調査より、沿岸から沖合にかけて黒潮を横断する全 17 地点で、海面から深海の環境 DNA と環境データを採取した。環境 DNA は 0.2 μ m

フィルターで濾過した後 -30℃で保管した。抽出した DNA から PCR 法で 18S-rDNA 遺伝子を増幅した後、次世代シークエンサー

MiSeq を用いて網羅的に配列を決定した。群集構造と多様性解析には PRIMER v7 と PERMANOVA+ ソフトを使用した。３．結果と考察

全 110 試料から得られた 2175OTUs の内、アルベオラータが約半分の割合を占めた。全リード数ではアルベオラー

タとリザリアが各々 3-4 割を占めた。リード数を元に微小真核生物群集の Bray-Curtis 類似度を用いた nMDS と ANOSIM 解析を行ったところ、群集は水深 100m を境に優位に異なった：アルベオラータは全深度で 3-5 割と大きく、50m 以浅ではオピストコ

ンタ、100m 以深ではリザリアの割合が大きくなった。DISTLM と dbRDA 解析を行い群集の違いを環境変数で説明したところ、
11 つの環境変数の内 6 つと群集との間で優位な関係があることを示した（P=0.001）。１軸は変数の 95%（全変数の 71%）を優位に説明し、水温と強い相関が見られた。重ねたベクターにより栄養塩、特に珪酸が水深とともに増えることが示された。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

P1-49

ピコ藻類を捕食する外洋性プロティストの分子系統解析およびその時系列変化○松田 知樹 1, 柏山 祐一郎 1, 四本木 彰良 1, 日高 清隆 2, 瀬藤 聡 2
福井工業大学 , 2中央水産研究所

1

E-mail: sakura54335433@gmail.com
外洋の貧栄養海域においては，ピコ藻類が基礎生産の大部分を担っていることが知られている。ピコ藻類の主要な一次捕食者と考えられるプロティストは，ピコ藻類が有するクロロフィルを光毒性の無い CPE 類に代謝することが分かってきたが（Kashiyama et al., 2019, ISMEJ），その分類学的な特徴や多様性については未解明である。そこで本研究では，御前崎沖太平

洋の黒潮流軸以南（北緯 27 ～ 30 度，東経 138 度）において表層水を採取し，培養されたProchlorococcus sp.（NIES-2882）
な い しProchlorococcus marinus（NIES-2087） を 船 上 で 添 加 し て 20 °C 弱 光 条 件 で 10 日 間 培 養 し， 回 収 し た 懸 濁 物 中 の

total DNA から SSU 18S rDNA のユニバーサルプライマーを用いて得られた PCR 産物を大腸菌にクローニングして，44 ク
ローンからシークエンシングを行なったところ，6 種類のプロティスト（Neoparamoeba, Goniomonas, Paraphysomonas,

Telonema, Amastigomonas およびHemistasia ）の配列が認められた。また，同様の培養物からプロティストの単離・培養を
試 み，2 種 類 の chrysophycese (Stramenopiles)(Paraphysomonas sp. MZD003 株 ， お よ び chrysophycese の 基 部 で 分 岐 す る
MZD008 株 )，3 種類の Opalozoa (Stramenopiles)(Cafeteria sp. MZD009 株およびBicosoecida spp. SNK004 株，009 株 )，2 種

類 の Cercozoa(Rhizaria，Endomyxa-like MZD015 株 お よ び，Cercomonas sp. MZD 016 株 )，Kinetoplastea-like

MZD004 株(Euglenozoa, Discoba) の 8 種類のナノべん毛虫および，1 種類の amoeba (Neoparamoeba sp.，Discosea，Amoebozoa，YHK003 株 )を得た。さらに本講演では，Prochlorococcus を添加した表層水について，3 日目及び 10 日目に一定量回収し，18S rRNA アン

プリコン解析を行い，プロティストの多様性について時系列変化の解析をおこなった結果もあわせて議論を行なう。

P1-50

ストレス負荷で魚類の腸内細菌叢は変化するか？
- 糞便を用いた非侵襲的健康診断手法の開発 ○伊藤 真奈 , 羽野 健志 , 内田 基晴
水産機構・瀬水研E-mail: nozakim@affrc.go.jp【目的】近年、生物体の健康状態が腸内細菌叢によって創造される腸内環境と密接に関連していることが明らかにされつつあり、ほ乳類等ではストレスにより腸内細菌叢の構成が変化することが知られている。しかしながら、魚類においては両者の関係は明らかになっていない。そこで我々は、腸内環境の通行手形でもある糞便に着目し、糞便を用いた非侵襲的健康診断手法の開発に取り組んでいる。本研究では、有害化学物質の曝露と過密養殖という種類の異なる２つのストレスを魚にそれぞれ負荷し、環境ストレスの負荷によって魚類糞便中の細菌叢が変化するかを調べ、さらにストレスの種類によって糞便の細菌叢が異なるかを比較解析した。【方法】養殖主要魚種であるマダイ稚魚（ Pagrus major ）を用い、２つのストレス負荷試験（有害化学物質曝露、過密養殖）を実施した。試験は室内水槽にて、水温 20℃，14h 明期 10h 暗期の条件下で行った。有害化学物
質曝露試験では、被検物質として石油毒性成分であるフェナントレン（Phe）を選定した。マダイに Phe を 2 週間曝露し、飼育
１、2 週目に糞便を採取した。過密養殖試験は、低密度（約 4.6kg/m ３）と高密度 ( 同 14kg/m ３) を再現した水槽内で 3 週間行
い、飼育 1、3 週目に糞便を採取した。マダイ糞便から DNA を抽出後、次世代シーケンサー（Miseq）を用いて細菌の 16SrRNA
遺伝子の塩基配列を取得することで微生物群集構造を解析した。【結果】マダイ糞便の細菌叢は Gammaproteobacteria 綱が優占し、その他、Alphaproteobacteria 綱、Flavobacteriia 綱および Clostridia 綱が多く検出された。有害化学物質曝露試験における細菌叢を主座標分析した結果、飼育日数およびストレスの有無によって異なるクラスターを形成した。1 週間目の曝露区では、Gammaproteobacteria 綱の割合が増加し、多様性が低くなる傾向が認められた。一方、2 週間目の曝露区では Alpha および
Deltaproteobacteria 綱等が占める割合が増加し、細菌叢の多様性が増加した。過密養殖試験の結果、高密度で飼育することでGammaproteobacteria 綱が増加する傾向が認められた。なかでも飼育 3 週間目の高密度区では 90％以上が Vibrio 属で占められており、細菌叢の多様性も著しく低下した。以上の結果から、魚類であるマダイにおいてもストレスの負荷に対応して糞便の細菌叢が変化することが明らかとなり、その程度や変化の傾向はストレスの種類に依存するものと推察された。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

P1-51

Eukaryotic phytoplankton contributing to seasonal blooms and carbon
export revealed by tracking sequence variants in the western North Pacific○ Takuhei Shiozaki1, Yuu Hirose2, Koji Hamasaki3, Ryo Kaneko4, Naomi Harada1
JAMSTEC, 2Dep. of Environ. Life Sci., Toyohashi Univ. of Tech., 3Atmos. Ocean Res. Inst., Univ. of Tokyo,
Arctic Environ. Res. Cntr., Ntl. Inst. of Polar Res.

1
4

Greater diversity of eukaryotic phytoplankton than expected was revealed recently through molecular techniques, but little is
known about their seasonal dynamics and fate in the open ocean. Here, we examined size-fractionated eukaryotic phytoplankton
communities from the surface to abyssopelagic zone (5,000 m) throughout the year, by tracking sequence variants of the 18S
rRNA gene in the western subtropical North Pacific. The winter-spring algal bloom was seeded by allochthonous, rather than

autochthonous, diatoms belonging to coastal species with the potential to form resting stage cells, which were exported efficiently
to the abyssopelagic zone. In large phytoplankton community ( ≧ 3 μ m), prasinophytes putatively assigned to Pseudoscourfieldia

marina were also major constituents of the winter-spring algal bloom and their relative abundance in deep water is similar withor higher than diatoms. In addition, Mamiellophyceae dominated in picophytoplankton community ( ＜ 3 μ m) during the bloom
period and shared major fraction in the abyssopelagic zone. These results firstly showed the evidences of larger contribution ofprasinophytes in the sinking flux of phytoplankton-derived organic matters than ever expected. Our molecular survey showed thatthese previously overlooked phytoplankton species contribute significantly to the algal bloom and biological carbon pump in thesubtropical open ocean.

P1-52

Relationships between the composition of bacterioplankton communities
and subsurface methane maximum in lakes○ Santona Khatun1, Hisaya Kojima2, Yoshiki Ikarashi1, Kana Yamanami1, Kenta Tanaka3, Ryuichiro Shinohara4,
Tomoya Iwata1
1

Univ. Yamanashi, 2Hokkaido Univ., 3Univ. Tsukuba, 4NIES

Freshwater methanogenesis has become paradox as with the presence of supersaturated methane in aerobic lake waters.
Methane production in oxic lake waters is considered to be produced by planktonic microbes under phosphorus-starved
conditions. These microbes having C-P lyase gene are able to produce CH 4 aerobically by utilizing dissolved organic
phosphorus such as phosphonates under the phosphate-starved conditions. However, the organisms responsible for aerobic
methane production in lake ecosystems are still unknown.
We collected water samples at the different depth of nine lakes throughout Japan to examine the existence of subsurface CH4
maximum in summer. Further, we analysed the community structure of planktonic bacteria in lake water samples through PCR
amplification of bacterial 16S rRNA genes followed by sequencing analysis, where aerobic methane production was observedat subsurface maximum of the lakes.
The subsurface CH4 maximum was observed at thermocline within the upper 10-15m of the nine lakes. The ampliconsequencing analyses of bacterial community detected about 7,229 OTUs of bacteria including 58 phyla from epilimnetic,
metalimnetic (i.e., thermocline), and hypolimnetic samples of all the study lakes. In thermocline, the relative abundanceof Proteobacteria (30%) was dominant, followed by Actinobacteria (20%), Verrucomicrobia (18%), Cyanobacteria (14%),Bacteroidetes (13%) and the others (5%). Among them, Proteobacteria, Actinobacteria, and Cyanobacteria have C-P lyase genein their cells. Moreover, cyanobacteria tended to increase in thermocline where the highest CH4 peak was observed, suggestingthat the P-starved planktonic cyanobacteria might have a connection to DOP decomposition including phosphonates, thereby
producing CH4 in oxygenated lake waters. Further research and data processing is still ongoing to identify the specificmicrobes that could govern aerobic methane production in freshwater lakes.

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2019 JSME annual meeting

P1-53

深海熱水系に形成される電場と電気微生物生態系の関係性○山本 正浩 1,2, 川田 佳史 3, 鹿島 裕之 1, 設樂 真莉子 2, 下新井田 康介 1,2, 谷崎 明子 1, 笠谷 貴史 1, 野崎 達生 1, 高井 研 1
海洋研究開発機構 , 2横浜市立大学 , 3東北大学

1

E-mail: myama@jamstec.go.jp

微生物の中には電気を直接のエネルギー源として利用できる、いわゆる「電気栄養性」の能力を持つものがいることが知られている。また、深海熱水噴出域では発電現象が生じているため、このような環境中には電気栄養性の微生物が生息する可能性が高いと考えられる。我々は、深海熱水噴出域での調査において、電気化学的な探査手法を用いて電場の分布の計測を行った。
その結果、深海熱水噴出域では熱水噴出孔からは離れていても電場の強い場所がいくつかあった。これらの強電場の空間の海底から岩石を採取したところ、その岩石試料の一つが極めて高い導電性を示した。また岩石試料の微生物群集解析を行ったと
ころ、熱水噴出孔近傍の化学合成生態系とは異なる微生物群集構造が観察され、その一部は細胞外電子伝達経路を有する電気
栄養性微生物であることが示唆された。以上の結果は、熱水噴出域には噴出孔近傍の化学合成生態系とは別に、強電場空間での電気エネルギーを利用する生態系が存在する可能性を示している。またその探査に電気化学的手法が有効であると考えられ
た。

P1-54

南極の光合成微生物マットのメタ 16S/18S 解析○広瀬 侑 1, 塩崎 拓平 2, 大谷 真広 3, 浴 俊彦 1, 原田 尚美 2
豊橋技科大・院・工 , 2海洋研究開発機構 , 3新潟大・院・農1

E-mail: hirose@chem.tut.ac.jp

南極に生息する光合成微生物は、栄養分の不足、低温による凍結ストレス、強光・紫外線等の光ストレス、極夜による光エネ
ルギー枯渇といった様々な厳しい環境変化に順応する必要がある。このように、南極は生命活動を維持するためには厳しい環境であるが、実際に様々な光合成生物が生息し、一次生産者としての役割を果たしている。光合成生物の特徴として、光を吸収・遮蔽するための様々な色素を保有し、その結果として、見た目に鮮やかな色を呈した微生物マットを形成する。本研究では、これらの微生物マット生態系の多様性や成り立ちの理解を目的とし、第６０次南極地域観測隊の陸上生物班に同行し、昭和基地から数十 km 離れた位置にある湖沼（雪鳥池、菩薩池、すり鉢池、小鉢池）の近辺にてサンプリングを行った。１６点の光合成生物微生物マットを採取して DNA を抽出し、次世代シークエンサー MiSeq を用いた 16S および 18S rRNA 菌叢解析を行った。データ解析は QIIME2 および Phyloseq パッケージを使用した。１４点の試料は原核光合成生物を主体とする微生物
マットであり、糸状性のシアノバクテリアが多く検出された。一方、単細胞性のシアノバクテリアはほとんど検出されなかった。２点の試料は、緑藻もしくはクリプト藻など、特定の真核藻類が優先した微生物マットであった。本ポスター発表では、
系統解析および多様性解析の詳細についても紹介し、南極における光合成生物生態系の成り立ちを議論する。また、解析パイ
プラインの詳細や、解析の注意点についても議論する。

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P1-55

Nitrate and light dependent growth of thermophilic microbial communities
dominated with Chloroflexus aggregans obtained from Nakabusa hot springs
Shigeru Kawai, ○ Katsumi Matsuura, Shin Haruta
Dept. of Biol. Sci., Tokyo Metropolitan Univ.
E-mail: sk.harmonics.1210@gmail.com
Cyclings of sulfur, hydrogen, and carbon in the thermophilic microbial communities of Nakabusa hot springs have been largely

revealed in the last decade. They have been shown to be related to each other. Kawai et al. have recently shown that sulfide
is oxidized to sulfate by symbiotic cooperation of two species of photoautotroph and chemoautotroph. Based on the genomic

information of environmental samples, many electron transfer systems may function by similar cooperation of different
microbes. Nishihara et al. have shown nitrogen fixation in the chemosynthetic mats of Nakabusa, but other metabolisms ofnitrogen compounds have been poorly studied in thermophilic environments higher than those inhabited by cyanobacteria. In

this study, we tried to obtain cooperative thermophilic microbial consortia to utilize nitrate under photosynthetic conditions
from the microbial mats dominated by Chloroflexus aggregans . C. aggregans was described that it cannot utilize nitrate.

Microbial mats at 65℃ were obtained from Nakabusa hot springs. The mat samples were inoculated in media containing nitrateor nitrite, dinitrogen, dihydrogen, lactate, carbon dioxide, and sulfide. No other carbon, sulfur, and nitrogen sources were notadded in the media. With nitrate under illumination at 55℃ , colored microbial growth was observed, and the growth continued

after transfers. Nitrite did not support the growth, and illumination was necessary for the growth. Lactate was also necessary forthe growth. A large decrease in nitrate concentration was observed in the culture medium without gas generation. From theseresults, we concluded that nitrate is used in the microbial consortia with C. aggregans and additional species that use nitratepossibly for dissimilatory reduction to ammonium working in the nitrogen cycle in Nakabusa. Thermophilic nitrate reducers

seem also interesting from the evolutionary viewpoint since nitrate respiration has been suggested to precede to oxygen
respiration.

P1-56

新規な多機能植物成長促進細菌のゲノム解析と機能性遺伝子の探索○田代 幸寛 1, 浅原 理央 1, Clament Fui Seung Chin1,2, Mohd. Huzairi Mohd. Zainudin3, Norhayati Ramli3, 酒井 謙二 1
九大院・農 , 2Univ. Malaysia Sabah, Malaysia, 3Univ. Putra Malaysia, Malaysia

1E-mail: tashiro@agr.kyushu-u.ac.jp【目的】植物成長促進細菌 (PGPB) の植物成長促進能は不溶性無機塩可溶化能および抗カビ活性などの植物病原菌増殖阻害能に大別される。先行研究にて、25 株の機能性 PGPB を分離・同定し、そのうちの数株はこれまでにほとんど報告のないパームヤ
シ植物病原糸状菌Ganoderma boninense に対する抗カビ活性を有する新規な PGPB であることが判明した（Chin et al., J Biosci

Bioeng, 2017）。しかし、これらの PGPB がどのような機能性遺伝子を持つかは明らかにされていない。そこで本研究では、選定した新規 PGPB 5 株とその基準株 3 株のドラフトゲノム解析を行い、機能性遺伝子、特に抗カビ活性に関する遺伝子の同定を行うことを目的とした。【方法】Citrobacter sedlakii CESi7 株、CE9 株および基準株、Enterobacter cloacae subsp. dissolvens

B3 株および基準株、Bacillus subtilis subsp. spizizenii TSASi1 株および基準株、Bacillus tequilensis CE4 株の計 8 株を MiSeq

Reagent Kit v3(Illumina 社 ) を用いてドラフトゲノムシーケンスを行った。その後、得られたシーケンスデータに関してアセン
ブリ、アノテーションを行い、各 PGPB の植物成長促進能および抗カビ活性に関わる遺伝子群を推定した。【結果】シーケンス解析の結果、8 株全てでドラフトゲノムを得ることができた。アノテーションを行ったところ、アンモニア、シデロフォア生産などの植物成長促進関連遺伝子が基準株、分離株ともに存在した。また、8 株すべてにおいて一次代謝で生産される細胞壁溶解酵素に関する遺伝子は検出されなかった。一方、二次代謝における抗カビ活性遺伝子は検出され、特に抗カビ活性を強く示した CE4 株および TSASi1 株において多く存在した。抗カビ活性遺伝子として既に報告されている他菌種のクラスターと 100% の相同性を示すクラスターが存在する一方、既知の遺伝子クラスターと相同性を示さない新規な遺伝子クラスターも存在した。

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P1-57

東京上空を浮遊する氷核活性微生物の分析化学的解析○大川 雄輝 1, 牧 輝弥 2, 三隅 良平 3, 宇治 靖 3, 真塩 麻彩実 2, 長谷川 浩 2
金沢大・院自 , 2金沢大・理工 , 3防災科学研究所

1E-mail: yuukikawa0829@gmail.com【目的】バイオエアロゾルは真菌および細菌、ウイルス、花粉などを含む生物由来の浮遊粒子状物質である。大気中を浮遊する
微生物は、ヒトや動植物に感染し、健康被害を及ぼすだけでなく、氷核として働き氷雲を形成し、気候変化に影響を与える可能性がある。従って、人口が密集する大都市東京上空を飛び交う微生物に関する知見は、公衆衛生情報を提供するとともに、都市上空の気象予測にも繋がる。そこで、本研究では、東京スカイツリーに大気観測拠点を設け、東京上空を浮遊する微生物の季節変化を、定性定量的に調べる観測調査を行った。【実験】2018 年 4 月および 6 月、7 月、11 月、2019 年 1 月の計 5 回、
東京スカイツリーの観測室（高度 458 m）にて、大気粒子を孔径 0.2 μ m ポリカーボネートフィルター上に採取した。採取した大気粒子試料を DAPI で染色し、蛍光顕微鏡観察によって大気粒子密度を求めた。また、試料に含まれる微生物を希釈培養法
によって分離培養し、得られた微生物株の ITS 領域あるいは rRNA 遺伝子配列を用いて系統分類学的に同定した。微生物株の氷
核活性機能は、小滴凍結実験によって検証した。さらに、大気粒子から抽出したゲノム DNA を使った次世代シーケンシングによって、大気浮遊微生物の群集構造を解析した。【結果・考察】東京上空を浮遊する大気粒子を蛍光顕微鏡で観察したところ、細菌の粒子密度は春から冬にかけて 106 から 104 particles m-3 に減少し、真菌胞子は春夏に 104 のオーダーを維持し、秋冬
では 1/100 に低下した。生物活性の高い春と夏には微生物が多く浮遊し、冬季には浮遊数が減少したと考えられる。また、紫外線などが強い春夏では胞子の形態をとり環境ストレスを軽減する真菌類が増えたと推察できる。大気試料から得られた微生物株を小滴凍結実験に使用した結果、鉱物粒子の凍結温度－ 15℃よりも高い温度で凍結した微生物株が得られ、最も氷核活性が高かった株は－ 11℃で凍結した。真菌類の群集構造では、Aspergillaceae 科の真菌種が、秋に 17.6% で優占し、冬も 15.1%で維持した。一方、細菌群集に関しては、Gammaproteobacteria 網の細菌種が秋に 41.7% を占め優占したのに対し、冬ではActinobacteria 門の細菌種が優占し、群集構造が季節的に変化した。今回検出された核酸塩基配列は、感染菌とも近縁となった。従って、東京上空には潜在的に健康や気候変化に影響を及ぼす微生物が浮遊している可能性が示唆された。

P1-58

微生物により生成されるメタンの濃度測定へのレーザー吸収分光法の適用○川野 誠 1, 中山 洋平 2, 木村 浩之 2
横河電機 ( 株 ), 2静岡大・理・地球

1E-mail: Makoto.Kawano@jp.yokogawa.com
地球温暖化問題が注目されている。COP21 で合意されたパリ協定では、温度上昇を産業革命以前に比べて 2℃以下に保ち、
1.5℃以下に抑える努力をするという目標が掲げられた。その目標を実現するためには、2050 年には二酸化炭素排出量をゼロにする必要があり、現在、研究開発が進められている。これまでは、回収した二酸化炭素を地中に埋める CCS（Carbon dioxide
Capture and Storage）、石油の回収を増進する EOR（Enhanced Oil Recovery）が注目されてきたが、近年では、回収した二酸化炭素を炭素資源として活用する CCU（Carbon dioxide Capture and Utilization）の開発が進められている。CCU 技術の中に二酸化炭素のメタン化（メタネーション）が挙げられるが、微生物においても、メタン生成菌が二酸化炭素からメタンを生成することが知られている。メタン生成菌の活性を知る方法の１つとしてガス組成分析があり、その分析には一般的にガスクロマ

トグラフィーが用いられてきた。しかしながら、ガス試料を採取する際に、空気や雑菌が混入する恐れがあり、嫌気性環境下で生育するメタン生成菌にとって環境の悪化を引き起こす原因となり得る。本研究では、非接触かつ短時間での測定が可能である波長可変型レーザー吸収分光法（Tunable diode laser absorption spectroscopy: TDLAS）のメタンガス測定への適用を検討

し、メタン濃度 0 ～ 100 vol. % において濃度測定が可能であることを確認した。次に、水素資化性メタン生成菌の菌株及び大深度掘削井から採取した嫌気性地下水に含まれる微生物群集をそれぞれ異なる培地を添加したにバイアル瓶に植え付け、ヘッドスペースを H2/CO2（80:20, vol/vol; 250 kPa）で置換して嫌気培養を行った。水素ガスが全て消費され、二酸化炭素のメタン化が完了した後に、再度、バイアル瓶のヘッドスペースを H2/CO2に置換し、培養実験を繰り返し行ったところ、培養回数とともにメタン生成速度が増大することを確認した。また、培地の種類、温度、菌株の種類によってメタン化完了に要する時間が異なることが明らかになった。本発表では、メタン生成特性を経時的に追うとともに、培養条件や菌株、地下圏微生物群集
による違いについて考察する。

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P1-59

海底下堆積物における胞子検出法の確立とその詳細解析○寺田 武志 1, 諸野 祐樹 2, 菅 大暉 3, 武市 泰男 4, 若林 大佑 4, 山下 翔平 4, 高橋 嘉夫 3（株）マリン・ワーク・ジャパン , 2海洋研究開発機構 , 3東京大学 , 4高エネルギー加速器研究機構

1

E-mail: teradat@mwj.co.jp【目的】地球表面積の 7 割を占める海の下に広がる海底下生命圏には、膨大な数の微生物が存在しており、外洋の超貧栄養環境

でも微生物細胞が存在していることが分かっている。これら海底下堆積物において、膨大な数の微生物細胞が存在していることが Acridine Orange や DAPI、SYBR Green I などによる検出で示されてきた。一方、通常の細胞（栄養細胞）の数を凌駕する胞子の存在が、内生胞子に多く含まれるジピコリン酸の検出により示唆されていた（Lomstein et al ., 2012）が、胞子を直接確認した例は未だ存在しない。本研究では、海底下堆積物において内生胞子を検出し解析することを目的として、純粋菌株ならびに海底下堆積物を用いた染色、特異的分取、そして分子生物学および X 線吸収分光解析を試みた。

【方法】Bacillus subtilis 、Bacillus megaterium 等、内生胞子を形成することが知られている純粋菌株を標準試料として用いた。
また、海底下堆積物試料としては地球深部探査船「ちきゅう」を用いた表層科学掘削プログラム（SCORE Expedition 910）によって襟裳岬西方沖海底下より得られた掘削試料を用いた。ハイスピードセルソーターによる胞子の選択的分取を行うための細胞染色剤としてオーラミンを用い、内生胞子の選択的染色を実施した。分取により得られた胞子を用いて、16S rRNA 遺伝子
配列解析のほか、走査型透過 X 線顕微鏡（Scanning Transmission X-ray Microscopy: STXM）による分析を実施した。

【結果と考察】分取された内生胞子に対して、アルカリ溶菌法による DNA 抽出を行い、遺伝子増幅を試みたところ、純粋菌株の内生胞子では 16S rRNA 遺伝子の増幅が認められた。また、STXM による分析においては、胞子、および栄養細胞で異なったスペクトルが得られた他、海底下微生物細胞においてもスペクトルを取得した。海底下環境は極度に栄養源が欠乏した環境であることが知られている。このような環境では微生物細胞は外界との物質の移動を制限すると考えられており、その一つの形態である胞子を直接解析することは、海底下生命とその生存戦略を理解することに繋がると考えられる。

P1-60

大腸菌のコエンザイム A 増産株を用いたポリヒドロキシ酪酸生産○小野 渉 1, 阿部 健太 2, 朝山 宗彦 1,2, 西原 宏史 1,2, 長南 茂 1,2
茨城大・院農 , 2茨城大・農

1【目的】コエンザイム A（CoA）は生体内でアシル基のキャリアとして機能する補酵素で、5 段階の酵素反応で生合成される。
初発反応を触媒するパントテン酸キナーゼ（CoaA）が本生合成経路の鍵酵素となっており、これまでにPseudmonas putida 由

来coaA を用いることにより、大腸菌（Escherichia coli ）の細胞内アセチル -CoA レベルを上げることに成功している。そこで、本要素技術の物質生産への応用を検討した。具体的には、Microcystis aeruginosa 由来ポリヒドロキシ酪酸（PHB）生合成遺伝
子（pha ）を形質転換したE. coli の CoA 増産株を用いて、アセチル -CoA から生合成される PHB の生産量を解析した。

【方法】P. putida 由来 coaA および M. aeruginosa 由来 phaABEC を PCR で増幅し、pSTV28、pUC118、あるいは pQE-60 にクローニングし、発現プラスミドを構築した。構築したプラスミドをE. coli JM109 に形質転換し、5 mM パントテン酸を含む M9 培

地で振とう培養した。菌体を回収し、アセトン菌体を調製後、クロロホルムに懸濁し、3% 硫酸 - メタノール溶液中でメタノリ
シス処理後、生じた 3- ヒドロキシ酪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィーで分析した。

【結果および考察】coaA を pSTV28 に持つ pSTV-Pp-coaA および phaABEC を pUC118 に持つ pUC-Ma-phaABEC の形質転換体では、coaA を持たない対照株のおよそ 3 倍の PHB 生産が観察され、coaA の有効性が確認された。しかし、生産量が 1%(w/w) 未

満と低かったため、次にphaABEC を pQE-60 の T5 プロモーターの下流に連結した pQE-Ma-phaABEC を使って検討した。IPTG

添加の有無にかかわらず、coaA を保持する形質転換体で、より高い PHB 生産が見られた。また、IPTG を添加しない方が形質転換体の生育が良かったため、生産量は高い結果となった。30℃培養では、coaA の有無で生産量がおよそ 2 倍異なり、IPTG 無

添加条件下の pQE-Ma-phaABEC と共に pSTV-Pp-coaA を保持する形質転換体で最も高い 7.27%(w/w) の PHB 生産が観察された。
以上の結果より、coaA によるアセチル -CoA 供給の強化は PHB 生産に有効であることが示された。

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P1-61

ブタンジオール生産能に関わるSerratia marcescens 由来ニコチンアミダーゼのX 線結晶構造解析○大山 拓次 , 大槻 隆司
山梨大院・生命環境
セラチア菌は「霊菌」とも呼ばれ、日和見感染の原因としてネガティブなイメージを持たれるが、健康な人に対しては無毒であるばかりでなく、そもそも主要な常在菌の一つである。また、土壌、大気中、水中など環境にも幅広く存在しているグラム陰性桿菌である。さらに、ブタンジオール生産能を持つなどユニークな代謝システムを有していることから、バイオ産業に有用な酵素群を持つ生物として着目を浴びている。我々はこれまで、化学産業において医薬品や化粧品の基幹化合物であるブタ
ンジエン、ブタンジオールに関して、将来の化石資源の枯渇問題を熟慮し、現在の化石燃料に依存した供給システムから微生物発酵による代替供給システムへの転換を実現するための、微生物スクリーニング、および目的化合物生産に関わる酵素群の同定と工業生産に向けた酵素改良工学を行ってきた。ごく近年、Serratia marcescens NBRC3735 株がグルコースを炭素源として 2,3- ブタンジオール (2,3-BD) を高生産することを見出し、変異導入、代謝マップ解析等から、ニコチンアミダーゼがブタンジオールの生産量に深く関わることを突き止めた（大槻ら 日本農芸化学会年会 2015；張、大槻 日本生物工学会年会 2016）。
今後のより高いブタンジオール生産能を持つ改良株の獲得を見据え、ニコチンアミダーゼ（以下本酵素）に関する構造機能相関を理解するため、本酵素の結晶構造解析に着手した。本酵素遺伝子を上記株よりクローニングし、大腸菌発現系を用い、ア
フィニティタグ融合体として組換えタンパク質を大量発現した。アフィニティクロマトグラフィーにより迅速かつ高純度に本酵素を精製し、結晶化条件を検索し、高分解能構造決定可能な単結晶を得た。シンクロトロン放射光施設（つくばフォトン
ファクトリー）にて 1.4Å分解能の X 線回折データの収集に成功し、アミノ酸配列 90% 同一の構造既知タンパク質をプローブとした分子置換法により基本構造を決定した。本酵素は総質量 184K のホモ 8 量体を形成していることが明らかとなった。講演では本酵素の構造機能相関についてより詳細に議論する。

P1-62

脂肪酸生産におけるマロニル -CoA 供給系強化の有効性○加来 萌菜 1, 佐藤 州朔 1, 石平 芽衣 2, 朝山 宗彦 1,2, 長南 茂 1,2
茨城大・院農 , 2茨城大・農

1【目的】コエンザイム A（CoA）はアシル基のキャリアとして機能する補酵素で、細胞内ではアセチル -CoA、マロニル -CoA、および CoA が主要な CoA 分子種となっている。当研究室では、CoA 生合成経路の鍵酵素であるパントテン酸キナーゼ（CoaA）
遺伝子とアセチル -CoA カルボキシラーゼ（Acc）遺伝子を組み合わせることによって、大腸菌（Escherichia coli ）でマロニル -CoA の増産に成功した。また、細胞内マロニル -CoA レベルの上昇は脂肪酸増産につながり、さらに外来の脂肪酸合成酵素（FasA）遺伝子の追加で脂肪酸生成がおよそ 6 倍になった。これらは培養初期に生育の遅れが観察される IPTG 存在下で得られた結果であるが、今回は生育阻害が解消される IPTG 非存在下での脂肪酸生産を報告する。

【方法】Pseudomonas putida 由来 CoaA 遺伝子および Corynebacterium glutamicum 由来 Acc 遺伝子を pSTV28 に持つマロニル-CoA 増産用プラスミド、C. glutamicum 由来 FasA 遺伝子を pQE-60 の T5 プロモーターの下流に持つ脂肪酸生産用プラスミドを組み合わせてE. coli JM109 に形質転換し、5 mM パントテン酸および 2% グルコースを含む M9 培地を用いて、IPTG 非存在下で 72 時間振とう培養した。菌体から脂質を抽出し、メタノリシス処理後、GC-FID で脂肪酸メチルを測定した。

【結果および考察】37℃で培養した形質転換体の脂肪酸含量を解析した結果、Acc 単独発現株では対象株の 2.1 倍、Acc と CoaAの共発現株で 6.7 倍の 609 mg/L となった。Acc の効果は IPTG 存在下での結果とよく一致していたが、CoaA の効果は大きく、Acc と CoaA だけで脂肪酸生産量を上げるには十分であることが示された。次に、30℃で解析した結果、Acc 単独発現株で 7.0 倍、
Acc と CoaA の共発現株で 8.4 倍の 778 mg/L に増大した。また、FasA に起因するオレイン酸の生産は 37℃ではほとんど観察されなかったが、30℃では IPTG 非存在下にもかかわらず、Acc と FasA の共発現株および前記株に CoaA を加えた共発現株ではそれぞれ総脂肪酸の 16% および 18% を占めた。以上のことから IPTG による FasA の発現誘導がなくても、Acc と CoaA によるマロ

ニル -CoA 供給系の強化だけで脂肪酸生産量を十分に大きくできること、また 30℃培養では FasA が機能していることが分かった。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
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P1-63

モンゴル国土壌および動物乾燥フン中の細菌系統解析と好熱性細菌の探索○佐藤 高則 1,4, 岡部 康平 2, 木村 柚香 1, 三谷 崚馬 1, 林 太功磨 1, Ganbat Orgilbayar3, Logii Narantsetseg3,
Janlav Munkhtsetseg3, 秋吉 研二 4
徳島大・理工・生化 , 2岡部農園 , 3モンゴル国立医科大学 , 4徳島大院・総科・生化

1E-mail: tsatoh@tokushima-u.ac.jp

過去の研究において我々は、四国や和歌山の銅鉱山跡や石灰鉱山の採掘滓、国内外で生産される発酵食品中などの微生物相の特徴について、クローンライブラリー法および細菌の単離同定による検討を行ってきた。その中で、震災前の福島県畜産農家で生産された堆肥より好熱性細菌を探索し、単離・同定を行ったところ、Geobacillus 属および Anoxybacillus 属細菌であることが明らかとなった。このような自然環境や発酵食文化を微生物資源としてとらえ、微生物相に関する知見を得ることは、未利用微生
物資源の有効利用に重要であると考えられる。そこで本研究では、モンゴル国遊牧民が燃料などに利用している乾燥動物フン（ウシ：アルガル (AG)、ウマ：ホモール (KM)、ヒツジ：ホルゴル (KG)）
、およびその周辺土壌 (MS) に着目し、それらに含まれる
微生物相の特徴をクローンライブラリー法により検討した。さらにこれらの乾燥動物フン AG より好熱性細菌の探索を行った。

まず、モンゴル国で採取した各動物フン (AG, KM, KG) およびこれらの周辺土壌 (MS) の滅菌水洗浄液からゲノム DNA を抽出し、これらを鋳型として 16SrRNA 遺伝子の PCR を行ったところ、各試料において約 1.5kbp の増幅断片が確認された。これらを pGEM-T にクローニングし、得られたクローンをそれぞれ DNA 塩基配列決定および相同性解析を行った。その結果、AG では
Methylobacterium 属細菌が優占種であり、一方 KM ではAcinetobacter 属細菌が、KG では Pedobacter 属 および Devosia 属細菌などが検出された。一方 MS では、Flavisolibacter 属や Aquincola 属細菌などが見られた。
上記のクローンライブラリーでは好熱性細菌は検出されなかったが、好熱性細菌が存在する可能性を検討するため AG 洗浄液を65℃で培養したところ、細菌の増殖が見られた。この培養液より 23 種の好熱性細菌の単離 (AGI) を行い、各ゲノム DNA を調製した。これらを鋳型として PCR により 16S rRNA 遺伝子を増幅し、pGEM-T に挿入後、塩基配列解析により細菌の同定を行った。
その結果、解析した 18 種はいずれもThermoactinomyces vulgaris と高い相同性 (98.7-100%) を示し、AG における好熱性細菌
としてはThermoactinomyces 属細菌が優占種であることが示唆された。現在、モンゴル土壌や他の乾燥動物フン由来好熱性細菌の単離同定も行っている。

P1-64

Gluconobacter frateurii NBRC 103465 株のメタノール耐性変異株の解析○新井 裕也 1, 佐藤 俊 2, 小池 英明 3, 薬師 寿治 4, 松下 一信 4, 布施 博之 1, 羽部 浩 5
芝工大・応用生 , 2産総研・機能化学 , 3産総研・生物プロセス , 4山口大・農 , 5産総研・環境管理

1

E-mail: mf18003@shibaura-it.ac.jp[ 目的 ] オレオケミカル産業等において副生するグリセリンの有効活用が課題となっている。副生グリセリンにはグリセリン以外にも、メタノールや脂肪酸等の目的外物質が多く含まれるため、触媒を用いた化学合成の原料とするためには精製が必要となり、エネルギーやコストがかかる。一方、微生物を用いた化学品合成の原料とする場合には、酵素の基質特異性の高さから反応に対する不純物の影響は少なく、副生グリセリンの精製度が低い場合でも化学品原料としての利用が期待される。しかし、目的外物質であるメタノールは、グリセリンを D- グリセリン酸へと高効率で変換可能な酢酸菌 Gluconobacter frateurii NBRC103465
株の生育を阻害する物質であり、実際にメタノール 5 vol% の存在下では増殖できない。そのため化学変異によってメタノール耐性を有する NBRC103465 株の変異株である Gf398 株を取得・解析したところ、10 vol% メタノール存在下においても生育することが確認された。そこで本研究では、Gf398 株のメタノール耐性機構を分子レベルで解析することを目的とした。[ 方法と結果 ]G. frateurii 親株 NBRC103465 と変異株 Gf398 について次世代シークエンサーを用いた比較ゲノム解析を行うことで遺伝子変異箇所の特定を行った。その結果、構造遺伝子内部やプロモーター領域に点変異が確認された遺伝子が少なくとも 30 個確認された。これら遺伝子の内訳は、物質代謝に関与すると推測される遺伝子が 6、核酸の複製や修復に関与すると推測される遺伝子が 6、推定膜タンパク質をコードする遺伝子が 4、転写調節因子をコードする遺伝子が 2、hypothetical protein と相同性を示す遺伝子が 12 であった。2 種類の転写調節因子に着目すると、１つは多剤耐性転写因子としても知られる PadR ファミリーに属する転写調節因子であり、Gf398 株において、構造遺伝子ではなくプロモーター領域に１ヶ所の点変異が確認されたことから、
NBRC103465 株と Gf398 株では本転写調節遺伝子の発現量に差が見られる可能性が考えられた。また、もうひとつの転写調節

因子は、浸透圧や有機酸耐性等に関与する OmpR ファミリーに属する転写調節因子であり、Gf398 株において、構造遺伝子内に１ヶ所の点変異が確認されていることを確認した。これら padR および ompR ホモログをコードする遺伝子を広宿主域ベクター
pBBR1MCS-4 に連結し、三親接合法により NBRC103465 株や Gf398 株に導入することで形質転換株を作製した。

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2019 JSME annual meeting

P1-65

Genomic and functional characteristics of an aerobic anoxygenic phototroph
isolated from an enrichment culture containing aromatic hydrocarbons○ Kyoko Kubo1, Namiko Gibu2, Daisuke Kasai2
Dept. Creative Engineering, NIT, Tsuruoka College, 2Dept. Bioengineering, Nagaoka University of Technology

1

Aerobic anoxygenic phototrophs (AAnPs) distribute widely in marine and freshwater environments. They are recognized as key
players in carbon cycle because of their ability to use various organic substances as carbon sources. An AAnP, Roseibacterium

sp. strain 2-3-A2 was isolated from an anoxic enrichment culture from sandy sediment of a coastal intertidal beach in Okinawa,

Japan. Toluene was added to the enrichment culture as a carbon source. In this study, we obtained a draft genome sequenceof the newly isolated strain and analyzed its functional characteristics. The strain is heterotroph as it lacks the RubisCO coding
genes of the Calvin cycle. A complete photosynthesis gene cluster was detected. Genome sequence and in vivo absorption

spectrum show that the strain possess light-harvesting system LH1 and LH2. Strain 2-3-A2 grow aerobically, and light enhance
the growth. In addition, preliminary results of cultivation experiments indicate that strain 2-3-A2 can grow photosyntheticallyunder microoxic and anoxic conditions. It is contrary to most other AAnPs which can carry out photosynthesis only in thepresence of oxygen. A gene encoding a homolog of the phenol 2-monooxygenase was detected. This enzyme catalyzes thefirst step of the degradation of phenol, and could participate in toluene degradation. AAnPs are so far unknown to be involved
in aromatic hydrocarbon degradation. These unique genetic makeup and physiological characteristics provide hints forunderstanding the ecological role of AAnPs in the aquatic environment.

P1-66

アンモニア酸化古細菌で広範囲に保存され、高発現している銅含有型亜硝酸還元酵素 (NirK) の役割はなにか？
○押木 守 1, 小林 駿 1, 平 大輔 2, 吉田 圭太朗 3, 豊福 雅典 3, 志田 洋介 4, 小笠原 渉 4, 山口 隆司 5, 荒木 信夫 5
Dept. Civil. Eng, Nat. Inst. Technol. Nagaoka Coll., 2Dept. Appl. Life Sci., Sojyo Univ., 3Grad. Sch. Life Environ. Sci., Univ. Tsukuba,
Dept. Bioeng., Nagaoka Univ. Technol., 5Dept. Sci. Technol. Innov., Nagaoka Univ. Technol.

14E-mail: oshiki@nagaoka-ct.ac.jp

好気性アンモニア酸化反応 (NH3 → NH2OH → NO2-) は年間 100-2000 メガトンのアンモニアを酸化しており , 地球上の窒素循環において , 大動脈と言える反応である . 好気性アンモニア酸化反応はアンモニア酸化細菌 (AOB) によって担われていると長らく考えられてきたが , 2000 年代中頃にアンモニア酸化古細菌 (AOA) の存在が発見され , AOA が海洋や土壌といった幅広い自然環境に分布し , アンモニア酸化反応に大きく関与していることが明らかになっている . AOA のアンモニア酸化反応において ,一酸化窒素 (NO) を選択的に除去すると , AOA がアンモニア酸化活性を失うことが明らかとなっている . このことから AOA のア

ンモニア酸化反応において NO は必須の中間代謝物と考えられているが , AOA が NO を生成する機構は解明されていない . NO2を NO まで還元する銅含有型亜硝酸還元酵素 (NirK) は脱窒菌で広く知られている酵素であるが , AOA のゲノム解析から AOA がnirK を共通して保有していることが明らかとなっている . AOA による NO の生成において NirK が関与していることが示唆されているものの , AOA の NirK が NO2- を還元し , NO を生成することは未だ実証されてない . 本研究では , 土壌性アンモニア酸化古細菌 Nitrososphaera viennensis の保有する NirK について , 大腸菌を用いた異種発現を行い , NirK の酵素学的特な特性を明らかにすることを目指した . 本研究で得られた Ns. viennensis NirK について物性を調査したところ , 105 kDa の分子量を持つホモ三量体構造を有し , アミノ酸配列から推定された通り type 1 および 2 銅結合サイトを保有していた . NirK は亜硝酸還元活性を有し ,
15NO2- を 15NO に還元した . また , 興味深い現象として , Ns. viennensis NirK はオキシダーゼ活性を有し , 15NH2OH を 15NO に酸化すること , NO2- と NH2OH から N2O を生成する反応を触媒することを我々は明らかにした . 本研究は AOA の生化学を触媒酵素のレベルで解析した世界初の報告であり , 従来予想されていた NO の生成反応以外にも NirK が AOA の代謝反応に寄与していることを明らかにした .

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P1-67

Roseateles depolymerans の光利用
― 光合成器官形成不能ミュータントの生残能力○陶山 哲志 1, 菅野 菜々子 2, 花田 智 2, 千原 康太郎 1,3, 松倉 智子 1, 野田 尚宏 1,3
産総研・バイオメディカル , 2首都大・院・理 , 3早稲田大学・理工学術院

1

E-mail: t.suyama@aist.go.jp【目的】 飢餓に陥ったとき、多くの細菌は代謝を切り換えサバイバルに有利な状態に移行する。増殖速度の低下、休眠、利用基質の変更、変異出現率の増加、毒素生産など、その方法は様々である。紅色光合成細菌の一種であるRoseateles
depolymerans はエネルギー源として利用できる有機物が欠乏した状況でのみ光合成器官を形成するという特異な性質を持っている。我々はかつて野生株のR. depolymerans を明・暗条件の炭素源飢餓状態で長期間培養することにより「栄養増殖ではなく飢餓状態を生き延びる手段として光合成器官を持っている可能性が高い」という結論を得た。最近になってR. depolymerans の転写調節系の遺伝子破壊株に光合成器官形成能が著しく低下した株（1AA1・1AB1）を見出した。あらためてR. depolymeransの光合成器官が生残に寄与している可能性について吟味したのでこれを報告する。
【方法】 遺伝子破壊株の光合成器官形成不全に関しては、光合成色素の吸収スペクトルで判定したほか、1AA1 株に関しては
6 時間飢餓培養後の全 RNA 配列のリード数を解析し、野生株の結果と比較した。また光生残に関しては 0.4% コハク酸を含む培地で対数増殖中期まで培養した菌体を回収、炭素源フリーの培地に移し白熱電球の光照射下で長期間の振盪培養を行い、コロ
ニー形成能の有無から生残数の判定を行った。
【結果】 1AA1 株は野生株に比べて光合成反応中心複合体のアポ蛋白質をコードするpufL,M,C とpuhA 遺伝子および色素生合成系の酵素群をコードするbch オペロンに含まれる遺伝子の転写産物量比（TPM）が 1/5 以下にまで減少していた。光捕集蛋
白複合体のアポ蛋白質をコードするpufB,A 遺伝子の転写産物にいたっては TPM が野生株の 1% 以下にまで減少していた。遺伝子破壊の影響を受けたのはこれら光合成関連遺伝子がほとんどであったが、一部緊縮応答に関係する遺伝子やトキシン・ア
ンチトキシンの遺伝子転写産物量にも変化が見られた。また、光照射下で生残数の維持を比較したところ、３週目で 1AA1・
1AB1 株の生残数は野生株より一桁低いレベルにまで低下した。また破壊した遺伝子を補完した株では野生株と同等の生残数に回復したことから、R. depolymerans の光合成器官の生残能への寄与が確認された。今後は光合成関連遺伝子と同じ転写調節を受けると推定される他の遺伝子やその調節系に着目してR. depolymerans の緊縮応答システムの全貌を明らかにしたい。

P1-68

生理活性をもつ磁硫化鉄が嫌気性微生物群集へ与える影響の解析○五十嵐 健輔
産総研・生物プロセス

E-mail: igarashi.kensuke@aist.go.jp【背景と目的】環境中の多くの微生物は、鉱物と相互作用しながら生存している。硫化鉄は様々な嫌気環境に豊富に見られる鉱物であり、電子供与体や微生物間電子伝達の介在物質として研究されてきた。

発表者のこれまでの研究により、磁硫化鉄の一種であるグライガイト (Fe3S4) は様々なメタン菌の増殖と代謝を促進する生理活性をもつことが明らかになった。しかし、この生理活性について微生物群集を対象とした研究はなされていない。そこで本研究では、グライガイトが嫌気性微生物群集へ与える影響を、増殖と代謝、および菌叢の観点から明らかにすることを目的とした。【方法】水田の嫌気土壌を微生物源として、グライガイト添加 / 非添加の独立栄養性培地 ( 基質 : H2+CO2または CO) を用い、嫌気的な集積培養を行った。菌密度および代謝産物の経時的な測定によって増殖と代謝速度の定量化を行った。集積培養物から DNA を抽出し次世代シーケンサーによる

網羅的菌叢解析を行った。【結果と考察】グライガイト存在下では非存在下に比べ、増殖とメタンおよび酢酸生産速度の著しい上昇がみられた。このような増殖と代謝の促進は、他の硫化鉄種、酸化鉄種では見られず、グライガイト依存的な代謝の変化が示唆された。この促進傾向は単離菌を用いた先行研究での結果と一致しており、グライガイト依存的な代謝の変化は群集でも共通して起こることが示唆された。グライガイト存在下での継代培養では、増殖と代謝の促進を維持しつつ、徐々にメタン生産より酢酸生産が優性となった。菌叢解析の結果、特にグライガイト存在下の集積培養で、メタン菌よりも酢酸生成菌が優占したことに加え、近縁種と比較的低い相同性 (94%) を示す Bacteroides 属の細菌も集積されていることが明らかになった。グライガイトは、その結晶構造中に生物がもつ鉄イオウクラスターに類似した構造を有しているため、初期生命は環境中のグライガイトなどから鉄イオウクラスターを調達していたと推定されている。更に最近、植物寄生性細菌において細胞外の鉄イオ

ウクラスターを直接取込むトランスポーターの存在が報告されており、微生物と細胞外の鉄イオウクラスターやその類似鉱物との関係性は注目されているトピックである。本研究は、環境微生物と硫化鉱物との相互作用へ新たな知見を提供するとともに、細胞外鉄イオウクラスター依存的な増殖を示す新規微生物の取得の足がかりになると期待される。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meetingP1-69

ポリスチレンビーズを用いた海産原生生物の餌粒子サイズによる捕食選好性
石田 香澄 , ○片岡 剛文
福井県大・海洋
水圏環境の食物網においては、ナノサイズ（2-20 μ m）の従属栄養の鞭毛虫や、繊毛虫などの原生生物が、主な細菌捕食者

として知られており、微生物ループにおいて重要なニッチを占めている。原生生物がどのような餌を好むか（餌選好性）につ

いては、濾過摂食や捕獲接触といった原生生物の捕食形態や、餌となる細菌の細胞サイズ・生死・細胞表面の化学的特性・生理状態など、多くの要因が挙げられる。海洋を含む水圏環境で優占する浮遊性細菌の細胞サイズは細胞長径が 0.2-2.0 μ m であるが、原生生物の存在下で、糸状や螺旋状へ形態を変化することで巨大化したり、逆に小型化したりする応答が知られている。このような細菌は細胞サイズを変化させることで原生生物による捕食を回避していると考えられている。一方、細菌捕食

性の原生生物は自身の細胞サイズに依存して異なるサイズの餌細菌を選択している報告がある。つまり、餌となる細菌の細胞サイズは原生生物の捕食と関係があると考えられる。本研究では、最適な実験方法を確立したうえで、日向湖（海水）と水月湖（汽水湖）から新たに単離された 3 種類の従属栄養性原生生物を用いて、粒子径が異なる蛍光ビーズを用いて蛍光ト
レーサー法により、餌サイズに対する捕食選好性の検証と細菌摂食速度を比較した。海水湖である日向湖由来の原生生物 2 株（Amoebozoa と Stramenopiles）と汽水湖である水月湖由来の原生生物 1 株（Excavata）を、酵母エキスを有機物源（最終濃度25 ppm w/v）とした人工海水中培養した。対数増殖期の原生生物を遠心分離により濃縮し、培養液中の細菌密度の約 10% になるように蛍光ビーズを希釈した。蛍光ビーズは粒子直径が、0.1, 0.5, 1.0 μ m の 3 種類を使用した。濃縮した原生生物とビーズを混合し、室温で 15 分間培養した後、0 分および 15 分後に 1 mL を採集し、冷却した等量の Tris-buffered グルタルアルデヒド（4%, pH=8）で素早く固定した（最終濃度 2%）。DAPI で染色した原生生物を蛍光顕微鏡下で 100 細胞観察し、蛍光ビーズの取り込みを計測した。原生生物 1 細胞あたりの細菌摂食速度を算出した結果、0.1 μ m の蛍光ビーズはいずれの株も摂食が確認されなかった。0.5 μ m と 1.0 μ m のビーズではそれぞれ摂食が確認されたが、どの生物も 0.5 μ m を最も多く摂食しており、0.5
μ m のビーズが原生生物にとって最適な餌サイズであることが明らかとなった。

P1-70

窒素固定遺伝子を有する脱窒細菌による N2O 固定の検証
鈴木 里俊 1, 早川 智恵 1,2, 増田 曜子 1, 西澤 智康 3, 菅原 雅之 4, 嵐田 遥 4, 南澤 究 4, 磯部 一夫 1, ○妹尾 啓史 1,5
1

東大院農 , 2宇大農 , 3茨大農 , 4東北大院生命 , 5東大微生物連携機構

背景と目的：水田土壌において、脱窒は系外に窒素を損失する反応過程であると見なされてきた。当研究室において、脱窒細菌として分離したBradyrhizobium 属などの細菌が窒素固定遺伝子を有し窒素固定能を示すことを見出した。また、これまでの研究から、nif 遺伝子、nosZ 遺伝子を保有する水田土壌中の脱窒細菌が Nos により N 2O を N2へと変換し、Nif によって N 2を同化的に還元する可能性が考えられた。しかし、(1) nif 遺伝子を保有する水田土壌由来の脱窒細菌による N 2O 還元・同化の有無、(2)菌体への N2O 由来の窒素の同化量、(3) 具体的な反応経路については不明である。本研究では、上記の仮説を検証するため、水田土壌から単離された脱窒菌を用いて (1)、(2)を調べると共に、遺伝子破壊株を用いて (3) を解明することを目的とした。今回
は (1)、(2) について報告する。

材料と方法：水田土壌より単離された窒素固定遺伝子を有する脱窒細菌Bradyrhizobium sp. UNPF46 株を用いた。菌体を接種した培養液に 15N2O（99 atom%）を添加・密閉して静置培養し、気相中の 15N2O 濃度、15N2濃度を経時的に GC-MS で測定した。
培養後の菌体を遠心洗浄・集菌し、菌体の窒素同位体比 ( δ 15N) を IR-MS、窒素濃度を NC アナライザーで測定した。同じ条件で培養した菌体懸濁液から RNA を抽出し、定量 PCR によってnosZ 遺伝子と nifD 遺伝子の転写量を測定した。
結果と考察：培養 4 日間で添加した 15N2O の約 75 % が減少し、そのうちの約 24 % が 15N2に変換された。培養後の菌体のδ 15N

は、15N2O 添加前の菌体（1.8‰）と比較して有意な増加が認められ（394.6‰）、15N2O 由来の窒素が脱窒細菌の菌体に同化されたことが定量的に示された。一方、同じ条件で培養した菌体においてnifD 、nosZ の転写が確認できた。これらは UNPF46株
によって N2O が還元・同化されたことを支持する結果であると考えられた。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

P1-71

土壌に存在するγ - プロテオバクテリアに属するアンモニア酸化細菌の分布と多様性○早津 雅仁 1, 王 勇 1, 大久保 卓 2, 廣野 祐平 3, 宇田川 真由美 1, 多胡 香奈子 1
農研機構・農環研 , 2JAMSTEC, 3農研機構・果樹茶研究部門

1

E-mail: hayatsu@affrc.go.jp

土壌の硝化（アンモニア酸化）はアンモニア酸化細菌（AOB）、アンモニア酸化古細菌（AOA）、完全硝化菌（Comammox）に担われている。農耕地のように窒素肥料の施用によりアンモニア性窒素の濃度が高くなる環境では AOB が重要と考えられている。一方、これまで土壌に存在する AOB はβ - プロテオバクテリアに属する（β -AOB）、Nitrosomonas 属と Nitrosospira

属とされてきた。しかし我々は強酸性茶園土壌からγ - プロテオバクテリアに属すアンモニア酸化細菌（γ -AOB）を分離しCandidatus Nitrosoglobus terrae TAO100 と命名した。本発表ではNitrosoglobus 属の土壌部位別分布および国内の各地域での分布および新たに分離したγ -AOB について検討した結果を発表する。（１）TAO100 株を検出するためにアンモニアモノオキ

シゲナーゼサブユニット A（amoA ）の PCR プライマーを設計し、茶園土壌の深度別分布を調べたところ、土壌表層における菌密度が高い傾向が認められた。そこで各地の土壌表層の TAO- amoA の分布を調査することとした。（２）TAO 株類似の amoA 断

片は京都府、滋賀県の茶園にも検出された。そこで集積培養による分離を試みたところ、90% 以上をγ -AOB が占める培養液を得た。この菌株と TAO100 株の 16S rDNA 塩基配列（1.4kb）の相同性は 99% であった。このうち京都から分離した菌株のドラフトゲノム配列を解析したところ、主要な遺伝子は TAO 株と極めて相同性が高かった。（３）鹿児島県の茶園土壌には TAO‐ amoA が検出されなかったため集積培養を行い得られた微生物群集から遠心分離等によりγ -AOB を得た。この菌株のドラフ

トゲノム配列を解析したところ、ゲノムサイズが 2.8Mbp と TAO 株の 2.0Mbp より大きく、16S rDNA およびamoA の解析から

Nitrosoglobus 属と海洋・塩湖由来の Nitrosococcus 属の中間に位置づけらた。 以上によりγ - プロテオバクテリアに属するアンモニア酸化細菌は国内に分布し、その多様性は大きい可能性が示唆された。

P1-72

土壌細菌叢の初期形成過程における移動性細菌の役割○加藤 広海 , 津田 雅孝 , 永田 裕二
東北大・院生命E-mail: katee@ige.tohoku.ac.jp【背景と目的】土壌に棲息する多様な微生物間において形成される複雑なネットワークによって、自然環境変動下でも安定して土壌機能を発揮できると理解されている。また一方で土壌微生物叢が示す安定性は、土壌改良やバイオオーギュメンテー
ション等、人間が望んだ菌叢へと変化させる技術に対しては大きな障壁となっている。土壌機能を有効的かつ持続的に活用するためには、土壌微生物叢が土壌の物理化学的性質とどのような因果関係にあるか、微生物叢の構造を任意に変化させるために必要な要素は何なのか、を解明する必要がある。そこで本研究では土質の異なる 2 種類の土壌（褐色森林土と黒ボク土）において微生物移植実験を行なうことで、菌叢形成プロセスへの物理化学的／生物学的因子を定量的に評価することを目的とした。【方法】褐色森林土と黒ボク土を 10% ずつ段階的に混合することで、両土壌を連続的に繋ぐ人工土壌を創出した。それぞれの滅菌混合土壌に褐色森林土または黒ボク土から回収した微生物集団を移植し、一定培養条件下で半年間培養した。経時的に土壌サンプルを回収し、培養依存的・非依存的解析に供した。【結果と考察】移植する微生物集団には依らず、黒ボク土の含有率が高いサンプルほど高い菌密度を示し、放線菌の占める割合が高くなる傾向が見られた。このことは、細菌叢形成における菌密度や構造に対して生物的因子よりも物理化学的因子の方がより強い影響を与えることを示している。さらに黒ボク土の滅菌土壌に移植された微生物集団は長期間経過しても、元の細菌叢構造を再構成できていないことが明らかとなり、黒ボク
土細菌叢の復元には何らかの要素が必要である可能性が示された。元の細菌叢を再構成できる褐色森林土では、swarming や

gliding といった移動性の高い分類群が移植直後に優占しており、移動性細菌がその後の細菌叢形成を促している可能性が疑われた。そこで swarming 活性のある細菌株を分離した結果、周囲の非移動性細菌を自身の swarming に同調させて移動できる
co-swarming 活性が認められた。さらに一部の swarming 細菌は土壌において他細菌株の生育を促進する効果があることがわかり、これら細菌群が土壌菌叢形成において重要である可能性が示された。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

P1-73

抗菌剤による種イモ消毒がジャガイモ表面の微生物に及ぼす影響○木嶋 伸行 1, 本城 賢一 2, 石井 孝昭 3
農研機構 野菜花き研究部門 , 2九大農学研究院 , 3合同会社 アグアイッシュ

1E-mail: nkijima@affrc.go.jp

ペニシリンの発見以来、抗菌剤は様々な感染症から人類を助けてきた。その一方で、抗菌剤に対する耐性菌が出現し、医療現場における抗菌剤による治療効果の低下が大きな問題となっている。WHO は世界規模での取り組みを呼びかけ、日本政府も2016 年に国家行動計画を打ち出し、省庁横断的な取り組みを行っている。我々は農林水産省の委託プロジェクトを通じ、農業生産環境に農薬として投入される抗菌剤のうち、ヒトへの適用例があるオキシテトラサイクリンとストレプトマイシンを対象に、農業生産環境中の微生物に及ぼす影響を調べている。本大会では、ジャガイモの栽培で慣行的に行われるオキシテトラサ

イクリンとストレプトマイシンによる種イモの消毒処理がジャガイモ表面の細菌に及ぼす影響について報告する。種イモ用のジャガイモ（Solanum tuberosum . L.、トヨシロ）を、オキシテトラサイクリン（0.028 %）およびストレプトマイシン（0.19%）を含む薬液に慣行の手順で数秒間浸漬し、風乾後採取した。採取した種イモを滅菌蒸留水中で撹拌後、水相を PBS（pH 7.4）
で適宜希釈し R2A に塗布し、37℃で 48 時間培養し出現したコロニーから任意に細菌を分離した。また、分離した細菌の 16S
ribosomal RNA の配列を決定し、系統樹を作成した。オキシテトラサイクリンおよびストレプトマイシンによる消毒処理をした種イモと無処理の種イモの表目からはそれぞれ 4 Log CFU/g 程度のコロニーが R2A 上に出現し、両者に差異は認められなかった。一方、16S ribosomal RNA の配列から作成した系統樹では無処理のジャガイモ表面には様々な細菌が存在していたが、消毒処理をしたジャガイモから分離した細菌は一部のクラスターにのみ存在した。この結果から、慣行的なオキシテトラサイ

クリンおよびストレプトマイシンによる種イモ消毒処理では様々な細菌群に影響を及ぼすが、生き残った細菌群は消毒処理によって生じた生物的空間を埋めることで、消毒処理にかかわらず一定の数を保持したと考えられる。

P1-74

西之島新鮮噴火堆積物の微生物生態系の解析○藤村 玲子 1, 吉武 和敏 1, 平野 明則 2, 海老原 諒子 2, 妹尾 啓史 1, 森 英章 3, 川上 和人 4, 上條 隆志 5
東京大・院農 , 2茨城大・農 , 3JWRC, 4森林総研 , 5筑波大・生命環境

1

E-mail: afujimur@mail.ecc.u-tokyo.ac.jp

西之島は小笠原諸島の西に位置する火山島である。2013 年から続いた噴火では、溶岩流の流出や火山噴出物の堆積が進み、島の陸地面積は噴火以前の約 9 倍となった。新たに出現した陸地は陸上生態系形成のプロセスを調査する機会を提供する。本
発表では、西之島生態系遷移の調査の一環として、新鮮噴火堆積物の微生物生態系を解析した結果を報告する。

試料のスコリア堆積物は 2016 年に採取された。低栄養培地での細菌数は 106 cells g-1、無窒素培地での細菌数は 105 cells g-1を示した。堆積物の呼吸活性は弱いが検出され、微生物活性が示唆された。堆積物の全炭素含量は 0.1 mg g-1以下 ( 検出限界 )であった一方で、無機態窒素量（特に硝酸）は一般の土壌あるいはそれ以上存在していた。メタゲノム情報から得た微生物群
集組成には、大気の塵由来と示唆されるTerrabacteria グループや、海洋由来と示唆される細菌群等が含まれていた。発表では堆積物の窒素含量が高い要因や微生物機能に関する調査結果等を紹介する。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

P1-75

土壌微生物の呼吸活性と水稲収量の関連性○橋本 好弘 1, 森 静香 2, 藤井 弘志 2
無所属 , 2山形大学 農1E-mail: y-hashimoto@kd6.so-net.ne.jp【目的】水稲の作物収量においては、特に土壌の地力が重要と言われている。しかし、地力の簡単・迅速・安価な評価方法は未確立である。そこで、著者らは、土壌の生物性診断装置として開発したバイオセンサー 1)を用いて、土壌微生物の呼吸活性を測定し、水稲収量との関係を調査した。【方法】山形県庄内地区の現地圃場を選定した。水稲収量は、JA の営農指導員および生産者の協力の元、圃場の全刈収量より算出した。各圃場 3 か所ずつ、表土を薄く除き、上層 (0-5 ｃｍ )、下層 (5-10 ｃｍ ) を採

取 (2017 年 11 月 14-15 日および、2018 年 10 月 16-17 日 )。生土 50g を 250ml の水によく懸濁し、Flush 処理で土壌粒子を除去後、遠心分離 (8,060xg、15 分 ) により土壌微生物画分を得た。土壌微生物をﾒﾝﾌﾞﾗﾝﾌｨﾙﾀｰ上に固定し、酸素電極に装着した。
ｽﾀｰﾗｰを攪拌し、空気飽和条件でベースラインを安定化させたのち、１% 酵母エキス 1.0ml を添加後、ｽﾀｰﾗｰの攪拌を 15 分間停止して酸素供給を制限条件下での呼吸活性 (RA-U) を測定した、その後スターラーの攪拌を再開し、酸素飽和条件下での呼吸活性 (RA-S) を測定した。重回帰分析は、無料統計ソフト College Analysis( 福井正康、福山大学作成 ) を用いた。【結果・考察】4 種類の呼吸活性データ【(A) 上層 RA-U、(B) 下層 RA-U、(C) 上層 RA-S、(D) 下層 RA-S】を取得した。収量を目的変数とし、呼吸活性データ (A)-(D) を説明変数とした重回帰分析では有効な式は得られなかったが、2 次加工データ (E) = (A) x (B)、(F) = (C) x (D)を説明変数とした場合に有効な重回帰式が現れた。収量 = -16.1940 x (E) +1.6471 x (F) + 624.0757 (2017 年度 )、( 外れ値 2 点を除く ) 収量 = 8.9545 x (E) -.4908 x (F) +470.2810 (2018 年度 ) また、各年度で試験点数の多かった品種：はえぬき (2017 年 )、ひとめぼれ (2018) に絞り、同様の重回帰分析を行った結果より高い相関式が得られた。いずれの式も多重共線性の問題はなかった。以上、土壌微生物の呼吸活性を 2 次元加工することで収量との相関が認められた。1): Y.Hashimoto et. al ., Microbes
Environ. Vol.23, 35-39.

P1-76

土壌微生物群集情報を用いた還元消毒成否判定法の開発○李 哲揆 1,2, 飯田 敏也 2, 中保 一浩 3, 大熊 盛也 2
農工大・BASE, 2理研・BRC, 3農研機構・野菜花き

1E-mail: cglee@go.tuat.ac.jp

土壌伝染性病害は土壌に生存する病原菌によって発生する病害であり、被害が長期間継続するなど防除が困難である場合が多い。これまではクロルピクリンといった、薬剤を用いた土壌くん蒸による防除が一般的であったが、環境保全型農業推進の観点から化学合成農薬を使用しない防除技術が注目されている。土壌還元消毒は、病害発生土壌にふすまや低濃度エタノールな
どの有機物資材を投入し潅水したあと、農業用ポリエチレンフィルムで土壌表面を覆い、太陽熱で加温しながら土壌を強制的に還元状態にすることで、土壌中に存在する病原菌を死滅させる方法である。また可溶性の有機質資材を用いることで、これまで消毒が困難であった土壌深層部までの消毒も可能となる。本手法は環境負荷が少ない土壌伝染性病害防除法として、日本だけでなく中国やアメリカを中心に利用が広まっている。しかし、その消毒効果は地温や潅水量など条件に大きく左右されるため、圃場では安定しない。従って現場では消毒処理後の簡便な成否判定法が求められている。演者らはこれまで 7 道県 11 地域のトマト青枯病および萎凋病汚染圃場を対象とし、発酵食物残渣である、糖含有珪藻土を用いた還元消毒を実施してきた。
これらの土壌について 16S アンプリコンシークエンスを用いて、消毒前後の原核生物群集の変化調べた。その結果、消毒が成功した土壌では、Clostridia に属する細菌が特異的に増えていることを明らかにした。そこで、この微生物の挙動と還元消毒成

否との関係性を調べることで、還元消毒診断指標微生物としての有用性を評価した。増殖した Clostridia 群は３つのクラスターに別れ、それぞれの微生物群に特徴的なプライマーを合計 20 種設計した。Real-time PCR を用いて土壌中での増幅産物の濃度を測定し、還元消毒の成否との関係について決定木分析を用いて明らかにした。その結果、１種類のプライマーを用い、還元
消毒前後の増幅産物濃度を調べることで、77.8% の確率で消毒の成否を判定できることがわかった。また増幅産物のシークエンスを行った結果、Clostridia だけではなく、Bacilli や Acidobacteria といった微生物が増えていた。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meetingP1-77

メタトランスクリプトーム解析を用いたマグネタイトナノ粒子が酢酸資化性メタン生成に与える影響の調査○稲葉 涼 , 高妻 篤史 , 渡邉 一哉
東京薬科大学E-mail: ryo.inaba73@gmail.com【背景・目的】メタン発酵は糞尿や食物残渣などのバイオマス廃棄物を処理し、燃料となるバイオガスを得る嫌気消化法として広く利用されている。しかし、中間代謝産物の蓄積とそれに伴う pH の低下による微生物の不活性化が頻繁に起こる等、運転が難しい技術として知られている。嫌気消化は様々な微生物が触媒する一連の代謝反応系により進行し、最終ステップのメタン
生成はアーキア（メタン菌）が担う。この反応系において、メタン菌と共生菌（メタン生成菌に水素などの基質を提供する発酵細菌）の間の還元力の受け渡し（種間電子伝達、Interspecies Electron Transfer: IET）が律速段階とされている。嫌気消化において主要な種間電子伝達は共生菌が有機物を代謝した時に生じた水素を介したもの（Hydrogen-mediated IET）と考えられている。一方、もう一つの種間電子伝達として直接的電子伝達（Direct Interspecies Electron Transfer: DIET）が最近提唱された。
これは、微生物同士が付着して直接的に電子をやり取りする現象である。近年メタン発酵を行う菌叢に導電性微粒子を加えると DIET が誘発され、メタン発酵が加速されることが報告された。導電性物質添加によるメタン発酵促進機構は環境条件に依存すると考えられるが、その詳細について調査はなされていない。そこで本研究では連続攪拌下での土壌由来の嫌気性菌源においてマグネタイトナノ粒子が酢酸資化性メタン生成に及ぼす影響を調査した。【方法・結果】連続攪拌下での土壌由来の嫌気性菌源にマグネタイトナノ粒子を加えたサンプルを調整し、バッチ培養を行った。化学分析の結果、マグネタイトの添加によりメタン生成速度が上昇した。その際の菌叢を 16S rRNA 遺伝子のアンプリコンシーケンス解析により調べたところ、酢酸資化性
メタン菌 Methanosarcina の割合が増加していたが、DIET に関与する菌叢は得られなかった。同条件のサンプルのメタゲノム・
メタトランスクリプトーム解析により Methanosarcina の優先化が確認された。優先化していた Methanosarcina のメタン生成
経路の主要遺伝子の相対発現量を比較したところ、水素資化性メタン生成経路の発現は低く、酢酸資化性メタン生成経路が主要な反応であることが明らかとなった。以上の結果から、導電性ナノ粒子の添加は連続攪拌条件において酢酸資化性メタン生成を促進することが明らかとなった。

P1-78

メタン生成菌との共生培養を用いたリグニン関連物質分解微生物の分離培養○持丸 華子
産総研・地圏資源
世界の天然ガス資源に含まれるメタンの約 20% は微生物により生産されたと推定されている。地上から隔絶された研究対象の地下深部天然ガス貯留層中には 100 万年以前に堆積した有機物が存在している。堆積物中で有機物は重縮合を繰り返し巨大な分子量を持つ難分解性の有機物に変化していると考えられおり、メタン生成へと続く根源有機物の種類やそれを分解する微生物については明らかではない。そこで本研究では、地下深部油ガス田におけるメタン生成機構を解明することを目的とし、国内の様々な油ガス田の試料から、リグニン関連物質であるメトキシ芳香族化合物を分解する微生物を網羅的に分離し、その生態を解明する。国内油ガス田から地層水を採取し、リグニン関連物質としてメトキシ芳香族化合物を基質として培養を行った。

このメトキシ化合物の分解産物となり得る水素や酢酸をメタン生成古細菌がメタンに変えることでメトキシ化合物分解微生物の生育が促進されるという仮説を立て、水素利用または酢酸利用のメタン生成古細菌を添加する共生培養法を用いてメトキシ
化合物分解微生物の集積培養を行った。試験管に水素利用または酢酸利用メタン生成古細菌を共生菌として基質と共にあらか
じめ添加し、油ガス田試料の希釈培養を行った。この共生を用いた希釈培養を繰り返した後、集積された細菌の 16S rRNA 遺伝
子塩基配列を解析した。メタン生成菌を添加せずに希釈培養を行った系では、希釈倍率が高くなるとメトキシ化合物の分解が見られなくなったのに対し、メタン生成菌を共生菌として添加した系では、高稀釈率の培地においても良好なメトキシ化合物の分解が見られた。多くの系でメタン生成菌の存在により、メトキシ化合物の分解が促進されており、メトキシ基の分解とメタン生成が密接な共生関係により成り立っていることが示唆された。集積された細菌について 16S rRNA 遺伝子塩基配列を解析したところ、採取地や培養温度などが異なる複数の試料から、既知種との相同性が 90% 以下の細菌が 40-100% の存在率で検出された。この中で既知種とそれぞれ 88-90% 離れた新規微生物は 5 種類以上確認され、共生培養法がメトキシ化合物分解微生物の培養に有効である事が明らかとなった。本研究の一部は、公益財団法人発酵研究所平成 29 年度一般研究助成による。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

P1-79

Investigation of a hydrocarbon pollutant-degrading bacterial consortium
and Bradyrhizobium sp. strain KK5○ Yuna Tomiyama, Jiro F. Mori, Robert A. Kanaly
Grad. Sch. of Nanobioscience., Yokohama City Univ.
Petroleum products such as gasoline and diesel fuel consist of many kinds of hydrocarbon compounds such as branched andstraight chain alkanes, aromatics, polyaromatics and aromatics with alkyl chains. Some compounds may exhibit high toxicity,

mutagenicity or carcinogenicity, and therefore there is interest to study the fates of these chemicals in the environment.

Soil bacteria possess powerful abilities to biodegrade hydrocarbons released into the environment. Understanding theinterrelationships of bacterial groups involved in hydrocarbon pollutant biodegradation is useful for understanding thefates of pollutants and for elucidating the roles of bacterial species. In this work, a microbial consortium that was recoveredfrom soil was investigated in regard to its growth on and biodegradation of a model diesel fuel (0.2％ w/v), that consisted ofgreater than 40 hydrocarbon compounds including n -alkanes, monoaromatics, polycyclic aromatics and polycyclic aromaticheterocycles. Quantitative analyses by gas chromatography (GC) showed that after 14 days most compounds were biodegraded

greater than 80％ and by 28 days were undetectable. A slow-growing individual isolate from the consortium was isolated on

the alkylated-polyaromatic hydrocarbon 1-dodecylnaphthalene (1-DDN) and identified by 16S rDNA sequencing to belong to
the genus Bradyrhizobium . Bradyrhizobium sp. KK5 appeared to grow on 1-DDN as the sole source of carbon and energy andwas investigated further by metabolite analyses.

P2-01

クロメジナ腸内由来Microbulbifer sp. が持つセルラーゼ遺伝子のクローニング○大西 健一郎 , 杉本 侑大 , 鈴木 聡
愛媛大・CMES

E-mail: d901001h@mails.cc.ehime-u.ac.jp【背景と目的】セルロースは植物中に豊富に含まれており、地球上の資源量はたいへん多い。原核生物や真菌などにはセルロー

スを分解、利用しているものが多いが、脊椎動物は自身で分解せず、腸内共生細菌がセルロースを分解する。海産魚類では、
セルラーゼ産生菌を単離した報告はあるが、酵素の生化学的な知見の報告はない。我々は雑食性魚であるクロメジナ (Girella

leonina ) の腸内からセルラーゼ産生菌を単離した。本研究では、セルロース分解株Microbulbifer sp. GL-2 株の全ゲノム解析か
らゲノム上に存在するセルラーゼ候補遺伝子のクローニングと発現を行なった。

【結果】PacBio RS II を用いた次世代シーケンスによって得られたリードを SMRT によってアセンブルし、環状化した 1 つのコ
ンティグを得た。GL-2 株ゲノムは全長 4.9 Mbp、GC 含量が 49.6％であった。DFAST によるアノテーションの結果、4973 個のORF が得られた。dbCAN2 を用い、セルロース分解に関わるドメインを標的とした検索により、12 個の ORF がセルラーゼ候補

遺伝子として得られた。これらを TA クローニングによってプラスミド pGEM-TEasy Vecter にライゲーションし、E. coli DH5 α株に形質転換した。得られた形質転換体をカルボキシメチルセルロース (CMC) を含む LB 培地で培養し、プレートをコンゴレッ

ド染色することで透明なハローを形成するセルラーゼ活性陽性コロニーを選択した。その結果、CDS#2744、4155、4160 の 3

つの ORF 産物でセルラーゼ活性が見られた。残り 9 個の ORF ではプレート上でセルラーゼ活性は見られなかった。活性が陽性のものはそれぞれ Glycoside hydrolase family の 5、8 および 9 のドメインを有していた。これらのドメインはエンドグルカナー
ゼの酵素に多く見られるものであることから、CDS#2744、4155、4160 はエンドグルカナーゼである可能性がある。本研究によって海産魚類腸内細菌からセルロース分解に関わる酵素を初めて特定した。今後、今回特定した酵素のより詳細な性状を明らかにすることを目指す。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

P2-02

飢餓状態の海洋細菌のプロテアーゼ産生に及ぼす有機物の効果○新藤 紗音 , 大林 由美子 , 鈴木 聡
愛媛大・CMES

E-mail: d613022x@mails.cc.ehime-u.ac.jp[ 研究の背景と目的 ] 細菌の細胞外酵素による有機物分解は、水圏生態系における物質循環に重要な初期反応である。海洋は巨大な有機物貯蔵庫であり、生物由来高分子タンパク質も存在しているが、土壌等の陸上環境に比べると多くの場合貧栄養状態である。海洋細菌が海水中のタンパク質を利用する過程では、エンド型プロテアーゼによる高分子タンパク質のオリゴペプ
チド化とエキソ型プロテアーゼによるアミノ酸への分解が行われている。この過程には、細菌のみならず原生生物等のプロテアーゼも関与するが、酵素産生において様々な微生物がどのようなトリガーで酵素の産生を調節しているかは分かっていない。
そこで、海洋微生物によるタンパク質利用・変換機能を解明するために、本研究では飢餓状態においた細菌が様々な有機物の添加に応答して増殖する際のプロテアーゼ産生変化に焦点を当てた。[ 方法 ] 有機物として、多糖（セルロース）、単糖（グルコース）、ペプチド（ペプトン）、アミノ酸（20 種混合アミノ酸）を用いた。四国沿岸海水から単離したγ -Proteobacteria の中から、アミノペプチダーゼを産生するPhotobacterium damselae 04Ya311 株を実験に使用した。飢餓状態の細菌（4℃の滅菌

人工海水中で 15 日間インキュベートした細菌）に有機物を添加後、細胞外プロテアーゼ活性を測定した。同時に、菌数測定を行った。また、瀬戸内海海水と宇和海養殖場海水中のプロテアーゼ活性測定を行い、単離株のプロテアーゼプロファイルとの比較を行った。[ 結果と考察 ]04Ya311 株では、ペプトンを添加した時のみ、菌数増加とプロテアーゼ産生が見られた。ペプトンの添加量は、1mg/L ではプロテアーゼ活性は検出されなかったが、10mg/L でアミノペプチダーゼが産生された。アミノ酸、糖類の添加ではプロテアーゼは産生されなかった。この結果から、本株プロテアーゼは酵素基質であるペプチドの存在下で産生されることがわかった。海水中のプロテアーゼ活性分析では、既報と同様に多様な基質を分解するプロファイルが得られた。
また、有機物が豊富な養殖場海水のほうが瀬戸内海海水よりもプロテアーゼ活性が高かった。天然海水中においてもペプチド性基質が多い場合にプロテアーゼ活性が高い可能性がある。

P2-03

ヒトデ類の体腔液における微生物群集構造：病原菌近縁種は普遍的に優占するか○斎藤 貴大 1, 神崎 隼人 1, 高木 善弘 2, 澤山 茂樹 1, 中川 聡 1,2
京都大・院農 , 2海洋研究開発機構・超先鋭研究開発部門

1

E-mail: saito.takahiro.26x@kyoto-u.jp【目的】棘皮動物の体腔液は、脊椎動物の血液とリンパ液を合わせたものに相当する。体腔液には体腔細胞（免疫細胞）や抗菌物質が含まれることから、一般に無菌的であると考えられてきた。しかし、近年我々は、北海道の沿岸域に生息するマヒトデ（最もありふれたヒトデ）の体腔液中にHelicobacter 属（ヒトの胃癌・胃潰瘍原因菌であるピロリ菌など多数の病原菌を含む）に近縁な性状未知の新規微生物が優占して生息することを発見した。これは、Helicobacter 属の近縁細菌が、無脊椎動物に見出された初の例であると同時に、消化管以外に住み着く初の報告例となった。ヒトデ類は北海道に限らず本州沿岸にも広く分布しているが、その体腔液に特異な病原菌近縁種が優占することは安全・安心な水産資源の持続的生産にむけた調査・対策の必要性を示唆している。そこで本研究では、日本の主要な漁港（特定第三種漁港）を中心に、日本各地の浅海に生息するヒト
デ類を採取し、それらの体腔液に生息する微生物の多様性・群集構造について包括的な知見を得ることを目的とした。

【方法】これまで、北海道、東北、北陸、瀬戸内において、マヒトデ、イトマキヒトデ、ヤツデヒトデ等を採取し、各個体の体表や体腔液、周辺海水中の微生物を対象とする 16S rRNA 遺伝子のアンプリコン解析を行った。

【結果・考察】これまでのところ、解析した全ての体腔液試料から微生物が普遍的に検出された。採取された各ヒトデの体腔液中に検出された微生物群集のα多様性は周辺海水よりも有意に低く、個体差が大きいものの、多くの個体において体腔液に周
辺海水にはほとんど検出されない特異な微生物が優占して検出された。例えばマヒトデでは、上記 Helicobacter 属近縁細菌に加え、Thiotrichales 目細菌が全リードの 9 割を超える個体が多数見られた。またイトマキヒトデでは、採取地点に関わらず

Spirochaetales 目細菌や Entomoplasmatales 目細菌が優占する個体が多いなど、ヒトデの種類や採取地点に関わらず、その体腔液中に特異なヒト病原菌近縁種が優占することが示唆されつつある。現在、中国・四国地方に生息するヒトデ類においても解析を進めている。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

P2-04

魚類養殖場における細菌群集構造の変動解析○横地 駿 1, 中瀬 玄徳 2, 家戸 敬太郎 2, 谷口 亮人 3, 江口 充 3
近畿大 ･ 院農 , 2近畿大 ･ 水研 , 3近畿大 ･ 農

1E-mail: 1933660006n@nara.kindai.ac.jp【目的】養殖場では、養殖由来の残餌や排泄物などの多くの有機物が環境に負荷されている。一方で、植物プランクトン由来の有機物の割合も予想以上に大きいことが報告されている。養殖場水域における物質循環に寄与している細菌群を理解することが、持続的な養殖を実現するうえで不可欠である。本研究では、養殖場水域で活発に増殖している細菌群の群集構造の経時変化を、ブロモデオキシウリジン (BrdU) を用いた方法で調べた。

【方法】和歌山県田辺湾の魚類養殖場における養殖生簀のある St. O と養殖生簀のない St. H ( いずれも水深約 15 m) にて、約 5 年間にわたり、水深 1 m および海底直上 1 m (B － 1 m) から海水を採取した。採取した試料は、目合 200 μ m ナイロンメッシュ

で前ろ過した。BrdU ( 終濃度 1 μ M) を加え、現場海水温付近で 3 時間培養した。培養後、孔径 3 μ m ポリカ－ボネ－トフィ

ルタ－および孔径 0.22 μ m カ－トリッジフィルタ－で試料をろ過した。DNA を抽出・精製した後、BrdU 標識 DNA を分取し、ITS 領域に基づくフラグメント解析を行った。

【結果】調査期間中に、水温は 12.18 ～ 28.55 ℃ (20.77 ± 4.81 ℃ ) で変動していた。合計で細菌 199 種が検出された：St. Oの水深 1 m で 10 ～ 43 種および水深 B － 1 m で 6 ～ 44 種、ならびに St. H の水深 1 m で 10 ～ 39 種および水深 B － 1 m で 9 ～35 種であった。観測地点や水深による群集構造の差はほとんどみられなかった。これらの種のうち、OTU 687.2 に代表される細菌のように、通年で優占する “generalist” がいた。一方で、低水温期に優占する OTU964.4 のように、毎年ある季節にだけ活発になる “specialist” もいた。活発に増殖している細菌には季節的変動があり、物質循環に寄与している細菌が季節で変化していることを示す。Chl. a 濃度は、0.14 ～ 8.09 μ g/L (1.19 ± 0.56 μ g/L) で変動していた。Chl. a 濃度と正の相関があった細菌

種は、St. O の水深 1 m および B － 1 m でいずれも 14 種、ならびに St. H の水深 1 m および B － 1 m でいずれも 9 種であった。2か月後の時差相関があったのは、St. O の水深 1 m で 14 種、水深 B － 1 m で 11 種、および St. H の水深 1 m で 10 種、水深 B － 1

m で 17 種であった。Chl. a 濃度と正の相関があった細菌群は、新鮮な光合成産物を好むグル－プ、時差相関があった細菌群は、植物プランクトンの死骸などを好むグル－プであることが考えられる。

P2-05

閉鎖性内湾底層における無機態窒素とアンモニア酸化古細菌の動態○伊藤 尚斗 1, 大塚 健人 1, 森 郁晃 1, 内田 淳 2, 青島 隆 2, 近藤 能子 1, 和田 実 1
長崎大・院水産・環境科学 , 2長崎大・水産

1【目的】閉鎖的な内湾では底層の貧酸素化に伴い堆積物から溶出する栄養塩フラックスが増大し、水柱の生物地球化学過程に大きな影響を及ぼす。主な溶出栄養塩の一つであるアンモニアは底層水中の硝化作用によって亜硝酸や硝酸に変換されると考えられるが、貧酸素化した内湾の硝化細菌の活動については未だ不明な点が多い。本研究では季節的に貧酸素化する長崎県の大村湾底層において無機態窒素の濃度変化とアンモニア酸化古細菌 Thaumarchaea の現存量との関連を明らかにすることを目指した。【方法】2018 年 5 － 10 月に大村湾北部、中央部、南部及び沿岸部で観測を行った。各測点の環境要因（水温・塩分・溶

存酸素量）は多項目水質計（AAQ177）で鉛直断面観測した。各測点で CTD に付属したニスキン採水器を用いて海水を採取し、採取した海水の無機態栄養塩濃度をオートアナライザー QuAAtro 39 を用いて定量した。海水から抽出した DNA を鋳型として、海洋の主要なアンモニア酸化古細菌であるThaumarchaea 16S rRNA 遺伝子 (rrs) に特異的なプライマーを用いて定量 PCR を行った。【結果】全観測点においてアンモニア濃度は 6 月下旬から 8 月上旬にかけて底層付近で上昇した。また、底層で亜硝酸は 8 月に顕著に増加し、硝酸は 9 月に増加する傾向を示した。 Thaumarchaea の rrs コピー数も概ね無機態窒素濃度と同様の増加傾向を示し、8 月下旬から 9 月に最大値 (1.4 × 108－ 5.4 × 10 8copy/L) となった。Thaumarchaea の rrs コピー数は水温と亜硝酸に対して正の相関（水温；r = 0.70, p ＜ 0.05、亜硝酸；r = 0.47, p ＜ 0.05）を、溶存酸素量に対して負の相関（r = -0.44,
p ＜ 0.05）を示した。これらのことから大村湾底層におけるThaumarchaea は水温に大きく影響され、低酸素条件下に適応して現存量を増加させることが示唆された。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

P2-06

化学合成独立栄養細菌は内湾の酸性化を抑制する○大塚 健人 1, 鷲尾 昂祐 1, 森 郁晃 1, 内田 淳 2, 青島 隆 2, 石松 惇 3, 和田 実 1
長崎大・院水産・環境科学 , 2長崎大・水産 , 3長崎大・海セ

1【目的】海洋酸性化は海洋表層だけでなく底層においても顕在化しやすい。閉鎖性内湾では夏季に底層の微生物呼吸による酸素消費と二酸化炭素生成によって貧酸素化と酸性化が同時進行し、特に底生生態系に大きな影響を与えることが危惧される。
我々は季節的な貧酸素海域である長崎県・大村湾において、溶存酸素量（Dissolved Oxygen; DO）と pH の間に強い正の相関を確認したが、貧酸素後期には DO が顕著に低下してもあまり酸性化しない水塊（Less Acidified Hypoxic Water mass; LAHW）が生じることを見出した（大塚ら、平成 31 年度

日本水産学会春季大会）。この水塊形成の微生物学的要因として酸素と二酸化炭素を同時に消費する化学合成独立栄養細菌が関わっている可能性があり、本研究ではその検証を目的とした。

【方法】2017 年 6-10 月と 2018 年 4-10 月に大村湾中央部、南部、北部および沿岸部 ( 計 4 測点 ) の底層で採水した。採水試料からゲノム DNA を抽出し細菌および古細菌の 16S rRNA アンプリコン解析を行った。また、貧酸素期とその前後の海水を暗所培
養 (24 時間 ) して DO と溶存無機炭素 (Dissolved Inorganic Carbon; DIC) の変化量を調べた。

【結果】2017 年 8 月後半に南部において環境要因から予測されるよりも高 pH の水塊 ( 実測値とモデル予測値の差 =0.161) が観測され、その前後で化学合成独立栄養性細菌の一種であるアンモニア酸化古細菌 (Thaumarcheaeota ) と硫黄酸化細菌 (SUP05)の存在割合が、それぞれ 0.54 から 15.9%、0.96 から 12.2% に上昇していた。2018 年には湾中央部の LAHW で同様の傾向を示した。2018 年 8 月後半と 10 月に中央部の海水を培養したところ、DIC が減少し、特にアンモニウムイオンを添加したサンプル
で DIC の減少が顕著だった。これらの結果は、化学合成独立栄養細菌による酸素の消費と二酸化炭素の固定が貧酸素水塊における酸性化の緩和に寄与することを強く示唆している。

P2-07

パルマ藻・珪藻の祖先的形質の解明に向けた比較ゲノム解析○伴 広輝 1, Romain Blanc-Mathieu1, 桑田 晃 2, 佐藤 晋也 3, 吉川 伸哉 3, 一宮 睦雄 4, 緒方 博之 1
京都大・化研 , 2東北区水産研究所 , 3福井県大・海洋 , 4熊本県大・環境

1E-mail: ban@kuicr.kyoto-u.ac.jp

パルマ藻は珪藻の姉妹群であり、珪藻と同様にシリカの殻を持つ単細胞性の微細藻類である。珪藻は海洋や淡水中に広く分布し、非常に富んだ多様性を持ち最も繁栄している藻類である。また珪藻は地球全体の一次生産の 20％以上を担い、海洋生態系全体を支えている。一方でパルマ藻は、珪藻と同様に海洋で広く分布しているにも関わらず、その多様性は乏しく、また現存量も高くない。この二つの系統の存在は対照的であり、これらに対する比較ゲノム解析は現在の珪藻の繁栄や進化の過程を考える上で重要であると考えられる。

我々はパルマ藻と珪藻の共通祖先に近いと考えられる形質を持ったパルマ藻を単離培養することに成功した。一般的なパルマ藻の細胞は 5 から 8 枚のシリカの殻で覆われているのに対し、このパルマ藻の細胞は無数の鱗状の殻で覆われており、この形質はパルマ藻と珪藻の共通祖先に推測されている形質と類似している。この観察を裏付けるように、祖先的パルマ藻は二つの系統間の分子系統樹上で根元に近い場所に位置する。本研究では、祖先的パルマ藻類の特徴を明らかにするため、同時に単離された他のパルマ藻 5 種 6 株のゲノムと既に解読が終了している数種の珪藻類のゲノムと共に比較ゲノム解析を行い、祖先的パルマ藻が実際に特徴的なゲノム構造を持っているかどうかを明らかにする。本発表では、系統解析や遺伝子の共直線性、
進化速度といったこれまでの解析結果について報告する。

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2019 JSME annual meeting

P2-08

養殖場から分離した新規Roseobacter 属細菌に関する研究○村松 壮 1, 高部 由紀 1, 高市 真一 2, 花田 智 1
首都大・院理 , 2東京農大・生命

1E-mail: so_6jqk@outlook.jp

一般に海洋性細菌は難培養性の菌株を含むことが知られ、海洋における主要な系統群に属する細菌の多くは実験室での分離培養に至っていない。主要系統群の 1 つであるRoseobacter 系統群は海洋表層において 10 ～ 20% を占有するグループであり、そこに含まれる培養が比較的容易である株は数々の生理・生態学的研究に用いられてきた。しかし、この系統群に含まれる

Roseobacter 属細菌については報告例が少なく、現在までに 3 種しか記載されていない。我々は愛媛県愛南町の真鯛養殖場海水からRoseobacter 系統群に属する多数の菌株の分離に成功しており、そのうち Roseobacter 属の新種とすべき AI77 株について

その系統学的および生理学的比較研究を行った。16S rRNA 遺伝子配列解析の結果、AI77 株は同属のR. ponti, R. denitrificans,

R. litoralis とそれぞれ 97.5, 97.0 および 97.0% の相同性を示した。最近縁株の R. ponti が光合成活性を示さないのに対し、AI77

株は好気条件においてバクテリオクロロフィルおよびカロテノイドを合成し、嫌気光条件では生育を示さないことから好気性

光合成細菌であると判断した。また、R. denitrificans, R. litoralis と比較し基質利用の多様性が低く、グルコース、ピルビン酸、
コハク酸、マロン酸などの基質を利用できないことも分かった。本研究の結果に基づき、AI77 株を Roseobacter 属における新規好気性光合成細菌として提案する予定である。

P2-09

サンゴの生育を阻害する除草剤ジウロンの分解微生物の分離と解析
與那覇 志人 1, 會田 祥平 1, ○佐藤 龍之介 1, 永山 敦士 2, 伊藤 通浩 3, 新里 尚也 31

琉球大・工 , 2沖縄県農林水産部 , 3琉球大・熱生研【目的】ジウロン（DCMU; 3-(3,4-ジクロロフェニル ) -1,1-ジメチル尿素）は光合成阻害型除草剤である。沖縄県のサトウキビ
畑で多用されており、沖縄島や石垣島のサンゴ礁付近の河口域で残留が認められている。共生する微細藻類に栄養を依存するサンゴの生育を阻害することから、土壌流出に伴うジウロンのサンゴ礁への悪影響が懸念されている。 これまでに、ジウロンを単独で分解・資化する微生物株の報告は無いものの、ジウロンを分解する複合微生物系の報告がある。一方で、我が国の土壌に散布されたジウロンの分解を担う微生物については知見がない。微生物は元々の棲息環境には定着しやすいため、ジウ

ロン分解微生物を用いた沖縄島の環境修復には、沖縄島由来の微生物の活用が有望である。そこで、本研究では、沖縄島の環境試料よりジウロン分解微生物を分離し、その特徴を解明することを目的とした。
【方法】沖縄県内の 5 地点（西原町、今帰仁村、本部町 ( 瀬底島 ) それぞれ 1 地点、読谷村 2 地点）において計 20 の土壌試料を採取し、それぞれから微生物画分を得た。これらをジウロン (100 ppm) を含む無機液体培地に接種して複合微生物培養系を構築し、5 度植え継ぎを行った。ジウロンの定量には高速液体クロマトグラフィーを用いた。複合培養系の微生物叢解析は、MiSeq を用いた 16S rRNA 遺伝子 V3-V4 領域のア
ンプリコンシーケンシングにより行った。複合培養系からのジウロン分解微生物の分離にはジウロンを含む 1/3R2A 寒天培地を用いた。
【結果・考察】構築した 20 の複合培養系のうち 19 でジウロンが減少しなかった。一方、本部町 ( 瀬底島 ) のサトウ
キビ畑由来の培養系ではジウロンが減少した。この培養系を段階希釈し、分解能を保持する培養系と、分解能を失った培養系を作製した。これらの微生物叢を比較したところ、分解能を示す培養系の全てで、16S rRNA 遺伝子部分配列が公知データベー
ス中のPseudonocardia 属細菌株のそれと 100%一致する OTUが検出された一方、分解能を示さない培養系の全てで当該OTUが検出されなかった。当該 OTUの 16SrRNA 遺伝子部分配列を元に特異的検出プライマーを作製し、寒天培地上に生育した約600株をスクリーニングして当該 OTUに属する 13 株を得た。これらは実際にジウロン分解能を示した。Pseudonocardia 属細菌はジウロン分解菌としては報告がない。現在、本菌株のジウロン資化能等の特徴と、ゲノム塩基配列を解析中である。

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P2-10

水酸化テトラメチルアンモニウム（TMAH）分解能を有する
Methanomethylovorans 属古細菌の分離培養○栗原 拓也 1, 倉島 優仁 1, 段下 剛志 2, 竹村 泰幸 3, 惣中 英章 4, 堀 沙織里 1, 重松 亨 1, 井口 晃徳 1, 珠坪 一晃 3
新潟薬大 , 2徳山高専 , 3国環研 , 4長岡技大

1【目的】近年、スマートフォンなどの電子製品の生産量増加に伴い、TMAH やイソプロパノール（IPA）等の有機化学物質を含有する電子産業廃水の排出量が増大している。我々は Up-flow anaerobic sludge blanket（UASB）法メタン発酵プロセスによる

TMAH および IPA 含有廃水の処理性能を評価し、その実用性や優位性を示してきた。TMAH を分解する UASB 汚泥の 16S rRNA
遺伝子に基づく微生物群集構造解析を行った結果、Methanomethylovorans 属（メタン生成古細菌）の未培養 phylotype が優占していた。回分分解試験の結果から、この未培養 phylotype は TMAH を直接的に分解、メタン化している可能性が示されたが、これまでのMethanomethylovorans 属古細菌が TMAH 分解能を有する報告はなく、その分解メカニズムも不明である。本研究は TMAH 分解能が示されたMethanomethylovorans 属古細菌の分離培養を目的とした。

【方法】分離源には TMAH 含有合成廃水（TMAH; 700, IPA; 700, Yeast extract; 100 mg-COD/L）を低温（18-19℃）で処理する

UASB 汚泥を用いた。分離培養には、TMAH を主要基質とした Widdel 培地を用いた限界希釈法および 6 well plate method によるコロニー形成法を適用した。補酵素 F420の自家蛍光観察および Fluorescence in situ hybridization（FISH）法を適用し集積確認を行った。

【結果・考察】限界希釈法による回分培養において、130 day 後の培養液を顕微鏡観察したところ、F420自家蛍光を発するサルシナ型球菌が優占していた。この培養液を植種とし、6 well plate method によりコロニーを形成させた。出現したコロニーを液体培地に植菌し継代培養を 3 回繰り返した結果、標的のMethanomethylovorans 属古細菌と数種の桿菌で占められる集積培養液を得た。この培養液を植種とし、バンコマイシン（100 μ g/ml）を添加した液体培地で 1 回継代培養した結果、ほぼMethanomethylovorans 属古細菌で構成された培養液が得られ、標的古細菌の分離に成功したものと判断した。今後は得られた培養液中の分離株の純粋培養を行い、分離が成功したことを確認する。その後、分離株の機能および生理学的性質の調査を
行う。

P2-11

嫌気性アンモニア酸化細菌 ”Candidatus Scalindua sp.” と ”Candidatus Brocadia
sinica” の維持係数の定量○上垣内 厚志 , Lei Zhang, 山下 柚子 , 小林 香苗 , 岡部 聡
北海道大・院工E-mail: atsushigaito@eis.hokudai.ac.jp
嫌気性アンモニア酸化（アナモックス）細菌は、広範な自然環境や廃水処理槽から検出されており、窒素循環や工学的利用において重要な役割を担っている。環境中において、アナモックス細菌の棲み分けが存在することは明らかであるものの、その原因に関する研究は非常に限られており、現在までに明らかになっていない。また、研究室規模の長期間培養においても、培養系内でアナモックス細菌の優占種が遷移することが複数報告されているが、その原因は不明である。

アナモックス細菌の基質であるアンモニウムと亜硝酸の自然環境中での濃度は極めて低く、このような環境におけるアナモッ
クス細菌の増殖速度は極めて小さいと考えられる。細菌による基質消費は、菌体の増殖のための基質消費と、維持代謝のための基質消費（維持係数）からなり、浸透圧調整など、菌体の維持には一定のエネルギー消費が必要となる。増殖速度が小さくなるにつれ、菌体維持のために使用されるエネルギーの割合は相対的に大きくなるため、自然環境中のような貧栄養環境においては、維持係数が小さい方が生存競争で有利となる。故に、菌体維持に関する知見は、アナモックス細菌の競合において非常に重要であるが、増殖速度を限りなく制限して培養することの難しさから、これまでに維持係数は定量されていない。

本研究では、膜分離型連続培養リアクターを用いて、槽内に菌体を完全に保持した状態で基質濃度を制限することにより、限

りなく 0 に近い増殖速度での培養に成功した。2 種類のアナモックス細菌、”Ca . Scalindua sp.”（海洋性）と、”Ca . Brocadia

sinica”（淡水性）の維持係数がそれぞれ、0.012、0.019 mg-N-NH4+ / mg-BSA / h であることを実験的に定量し、maintenance
rate (h-1) と、増殖に必要な最小基質濃度 (Smin, μ M) についても算出した。

海洋に比べて基質が豊富な廃水処理槽から検出が報告されている ”Ca . Brocadia sinica” が ”Ca . Scalindua sp.” の約 5 倍の Sminを持つ

ことが明らかとなり、菌体維持に必要な基質消費の差が、アナモックス細菌の棲み分けに影響を与えていることが示唆された。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
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P2-12

EGSB リアクターの嫌気性バルキングに関与する未培養糸状性微生物の分離と培養○原田 淳 1, 山口 剛士 2, 成廣 隆 3, 中野 淳 4, 山田 剛史 1
豊橋技大・院工 , 2松江高専・環境建設工 , 3産総研・生物プロセス , 4住友重機械エンバイロンメント

1E-mail: j141853@edu.tut.ac.jp

Expanded Granular sludge bed (EGSB) リアクターは、食品製造廃水を中心とした中・高濃度の有機性廃水を処理する中核的な技術となっている。EGSB リアクターの普及や適用廃水種の拡大に伴って、ある種の糸状性微生物の異常増殖によりリアクター
内のグラニュール汚泥が浮上・流出してしまう現象 ( 嫌気性バルキング ) がしばしば発生している。食品製造廃水を処理する中

温 EGSB リアクターで発生した嫌気性バルキングでは、メタノサエタ属アーキア (1 種 ) およびアナエロリネア綱細菌 (2 種 ) の未培養糸状性微生物が当該嫌気性バルキングに関与していることが示唆されたが、これらの微生物の微生物機能情報すら明らかになっていない。EGSB リアクターの嫌気性バルキングのメカニズムを明らかにするため、本研究では、当該糸状性微生物の分離・培養を試みた。まず、健全なグラニュール汚泥の切片を作製した後、メタノサエタ属アーキアやアナエロリネア綱細菌に特異的な DNA プローブを用いた蛍光 in situ ハイブリダイゼーション法によって、これらの微生物群のグラニュール汚泥における空間分布を評価した。その結果、アナエロリネア綱細菌はグラニュール汚泥表面に分布しているのに対して、メタノサエタ

属アーキアはグラニュール汚泥内部に分布していることが明らかとなった。グラニュール汚泥の形態学的特徴をもとに、アナ
エロリネア綱細菌は廃水中の糖成分を利用している可能性が示唆されたため、10 mM グルコースと 0.1 % 酵母抽出液を基質とした希釈集積培養を行った。アナエロリネア綱細菌の集積割合は、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション法および 16S rRNA 遺伝

子アンプリコン解析によって評価した。既存のアナエロリネア綱細菌が耐性を持つリファンピシンやアンピシリンを用いた希釈培養やロールチューブ法を繰り返すことによって、バルキング原因菌として認知されたアナエロリネア綱細菌が 50% 以上優占する集積培養に成功した。集積培養系内には、アナエロリネア綱細菌に特異的な DNA プローブに反応する糸状性細菌が豊富に存在することも確認した。

P2-13

メタン発酵消化液による土壌伝染性植物病原菌の生育抑制○白井 薫 1, 大川 直人 1, 田中 栄爾 2, 古賀 博則 2, 高原 浩之 2, 楠部 孝誠 1, 河井 重幸 1, 馬場 保徳 1
石川県立大・生物資源研 , 2石川県立大・生物資源環境

1E-mail: ybaba@ishikawa-pu.ac.jp【背景・目的】

世界の農作物生産量の約 16% が，微生物による病害によって，毎年失われ続けている。なかでも，Fusarium oxysporum はお

よそ 140 種の作物に感染する宿主領域の広い土壌伝染性の植物病原菌であり，わが国でもホウレンソウやトマトに難防除病害である萎凋病をもたらし問題となっている。現在のところ，燻蒸剤による土壌消毒が実施されているが，燻蒸剤は毒性の強い化合物であるため，作業者へ危険が及ぶことから，新しい防除法が求められている。これを背景に近年，“ 非病原微生物により

植物病原微生物を抑制する ” 微生物農薬が注目され，わが国でも実用化されはじめている。本研究では，有効利用が求められているメタン発酵消化液（バイオガスプラントから排出される発酵残さ液）に注目し，湛水条件下での土壌伝染性植物病原菌に対する微生物農薬の供給資源としての可能性を探った。

【方法・結果・考察】

ポテトデキストロース寒天（PDA）培地に生育させた植物病原菌 Fusarium oxysporum f. sp. spinaciae（FOS）をコルクボーラー

で培地ごと打ち抜き，嫌気性液体培地に添加した。そこに，メタン発酵消化液を加えて，15℃から 35℃までの複数の温度域にて最大 7 日間インキュベートした。また，メタン発酵消化液未接種の液体培地に，打ち抜いた FOS を添加し，同様にインキュベートしたものを対照区とした。

インキュベート後，液体培地から FOS を取り出し，PDA 培地上に植菌した結果，メタン発酵消化液添加区のみ FOS の生育が抑制された。メタン発酵消化液と共培養した FOS を走査型電子顕微鏡で観察したところ，菌糸の周りに細菌のバイオフィルムが形成され，かつ，DAPI 染色の結果，核が消失していることを確認した。このことから，メタン発酵消化液中に存在する細菌が，FOS の生育を抑制したものと期待された。そこで，当該細菌の分離を試みた結果，植物病原菌生育抑制効果を示す複数の細菌の分離に成功した。今後は，これらの分離株の最適な増殖条件および植物病原菌生育抑制効果を示す培養条件を明らかにし，
メタン発酵消化液の微生物農薬としての利活用を目ざす。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

P2-14

植物成長微生物で強化したウキクサによる栄養塩除去効果の予測○加藤 史章 , 田中 靖浩 , 遠山 忠 , 森 一博
山梨大院・医工農

E-mail: g18tc005@yamanashi.ac.jp【はじめに】水環境の富栄養化対策として、栄養塩除去が広がりを見せている。特に、経済の発展と人口の増加が著しい地域においては状況に合わせて多様な浄化手法の利用が求められている。植生浄化法は、維持管理が比較的容易でエネルギー消費やコストを低く抑えられることから、近年改めて注目される技術の一つといえる。しかし、植生が示す浄化効果は気象条件や水質の影響を強く受けるため、それら環境条件と植物種ごとの特性を加味した合理的な予測・判断の下に施設の計画、設計、維持管理する手法が必要である。本研究では、植物成長促進細菌（PGPB）を活用して機能強化を図った場合を含むウキクサ植生
による栄養塩除去実験の結果と、これまでに開発したウキクサによる栄養塩除去を各種栽培条件から予測するモデルとウキク

サの環境応答パラメータを用いたシミュレーション結果を比較することで本予測手法の有効性を検討した。【方法】供試植物として 2 種類のウキクサ（Spirodela polyrhiza と Lemna minor ）を使用した。また、植物の生長を促進することで植生浄化機能の強化が期待される PGPB にはSinorhizobium sp.SP4 を用いた。栄養塩除去実験では、PGPB で機能強化を図った場合を含む供試

ウキクサを実下水二次処理水に植栽し経時的に栄養塩濃度を測定した。

【結果と考察】各種供試ウキクサを実下水二次処理水に植栽し、栄養塩除去の実測値を得た。その結果、ウキクサは窒素成分を除去する際、アンモニア態窒素を優先的に吸収し、アンモニア態窒素濃度が低下すると共に硝酸態窒素を吸収することで窒素成分の除去が達成されることを確認した。一方、栄養塩除去試験における温度、光、植物密度および栄養塩濃度を元に、1 日
あたりのバイオマス生産量、バイオマス中の栄養塩含有率、栄養塩吸収除去量をモデルから計算し、液中の栄養塩濃度の変化を予測した。その結果、ほぼ正確に実排水においても除去効果を予測できることが示された。特に、窒素については、アンモニア態と硝酸態の形態別に植物の応答モデルとパラメータを求めて予測モデルに組み込んだことにより、実測値に対して従来よりも高い再現性が得られるようになったものと考察された。

P2-15

塩素消毒後の細菌の塩濃度変化による再活性化○野口 直暉 , 伊藤 司
群馬大・院理工E-mail: t191c038@gunma-u.ac.jp【目的】日本の下水処理場の約 9 割が処理水の消毒に塩素を用いている。消毒によって病原性微生物は不活化され、河川や海域に放流される。河口・沿岸域は海水浴等のレクリエーションエリアとしての役割を果たす反面、下水処理水や生活排水等で病

原性微生物による汚染を受ける可能性が高い場所である。日本では水浴場が具備すべき病原性微生物の基準として「糞便性大腸菌群数 1000 個 /100mL 以下」が設定されている。塩素消毒後、放流された細菌は不活化状態であると考えられているが、塩素消毒後の細菌の河川中での再活性化については知見が少ない。そこで我々は、塩素消毒後、放流された細菌が塩濃度変化を受けることを想定し、塩濃度変化が細菌の不活性化や再活性化に与える影響を検討した。

【方法】次亜塩素酸ナトリウムを希釈した塩素水と大腸菌の懸濁液を接触させ、塩素消毒を行った。その後、塩素消毒後の大腸
菌懸濁液に塩濃度 (NaCl) 変化を与えた。塩濃度変化は初期の塩濃度 0% に対して、0%( 変化なし ), 0.8%, 1.5%, 3.0% になるようにそれぞれ調整し、36℃に 24 時間静置した。塩素消毒の前後と、塩濃度変化から 24 時間経過後の大腸菌懸濁液に対し、コロ
ニーカウントによる生菌数測定と、DAPI 染色を用いた全菌数測定を行った。

【結果と考察】塩素消毒後の大腸菌は生菌数が減少した。しかし、塩素消毒後の大腸菌に、0 % から 0.8 % の塩濃度変化と 0 %から 1.5 % の塩濃度変化を与えた場合、塩素消毒直後に比べて生菌数が増加した。逆に塩素消毒なしの大腸菌に、同様の塩濃度変化を与えた場合、生菌数は減少する傾向にあった。このことから、塩素消毒により不活化された大腸菌は、0 % から 0.8 % ～1.5 % の塩濃度変化を与えられた場合、再活性化する可能性が示された。また、生菌数が増加した時の全菌数は、塩素消毒前と塩素消毒直後の全菌数と比較してもほとんど変化がなかった。このことから、生菌数の増加は細胞の増殖ではなく、再活性化であると考えられる。

本研究の結果、塩素消毒後の大腸菌は塩濃度変化にさらされることで生菌数が増加した。特に、汽水域程度の塩濃度変化にさらされた場合の生菌数の増加が大きかったことから、汽水域などの感潮域では細菌の再活性化が起こる可能性があるといえる。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meetingP2-16

環境由来の微生物群集からの薬剤耐性プラスミドの取得とその解析○森 光矢 1, 早川 雅也 1, 中道 孝一朗 2, 前島 由明 1, 仲田 裕貴 1, 森内 良太 3, 道羅 英夫 3, 金原 和秀 1,2, 新谷 政己 1,2,3
1

静岡大・院総合科技 , 2静岡大・工 , 3静岡大・グリーン研

E-mail: mori.mitsuya.15@shizuoka.ac.jp【背景・目的】プラスミドは細菌の細胞内で染色体とは物理的に別個に存在する自律複製可能な遺伝因子であり，同種または異種微生物間での水平伝播が可能である．また宿主の形質はプラスミドがもたらす遺伝情報により大きく変化するため，プラス
ミドは微生物の進化・環境適応に深く寄与している．このような性質から，プラスミドは分子生物学の必須ツールとして用いられるとともに，深刻な院内感染を引き起こす多剤耐性菌の出現と蔓延の一端を担っている．同時に，これまでに多くのプラ

スミドが取得されているが，環境中の微生物群集内で遺伝子の水平伝播を担うプラスミドの実態については不明な点が多い．
従って，こうした微生物群集内で薬剤耐性遺伝子を運ぶプラスミドを特定することは微生物生態系の成り立ちを理解する上でも，多剤耐性菌の出現・蔓延を防ぐ上でも重要である．そこで本研究では，環境試料内における自己伝達性の薬剤耐性プラス
ミドについて取得を試みることとした．

【方法・結果・考察】環境中で実際に伝播するプラスミドの収集を，プラスミド上の薬剤耐性遺伝子がもたらす耐性能や，プラ
スミド自体の自己伝達能を指標として行った．その結果，2 種類の薬剤耐性プラスミド，pSN0726-36 および pMH0621-02 を取得した．全塩基配列の解読結果から，pSN0726-36 は IncP-9 群，pMH0621-02 は IncP-1 群に属することが判明した．また，
pSN0726-36 は，テトラサイクリンなどの抗生物質耐性遺伝子を内部に含む class 1 integron や，ストレプトマイシン耐性遺伝
子を内部に含むトランスポゾン Tn5393 を有し，pMH0621-02 は，抗生物質耐性菌の蔓延に関与するとされる Tn21 とよく似たトランスポゾンを有するなど，それぞれ特徴的な遺伝子配列を有していることも判明した．そして，抗生物質のうち，グラ
ム陰性の多剤耐性菌に対する「最後の切り札」とされたコリスチンに対する耐性を指標としてプラスミド収集を行った．その結果，コリスチン耐性プラスミドを保持すると推定される接合完了体 20 株を得ることに成功した．現在は，これらの菌株のもつプラスミドについて，プラスミド群の同定など詳細な解析を進めている．

P2-17

複合微生物系で実際に伝播する PromA 群プラスミドの取得と解析○早川 雅也 1, 金子 健成 2, 山本 雪絵 2, 前島 由明 1, 森内 良太 3, 道羅 英夫 3, 金原 和秀 1,2, 新谷 政己 1,2,3
静岡大・院総合科技 , 2静岡大・工 , 3静岡大・グリーン研

1E-mail: hayakawa.masaya.15@shizuoka.ac.jp【背景・目的】プラスミドは，染色体とは独立して存在する，自立複製可能な遺伝因子である．また，プラスミドはそれを保持する微生物から保持しない微生物に接合伝達を介して移動し，抗生物質耐性遺伝子など様々な遺伝子群を運ぶことで宿主の形質を劇的に変化させることができる．そのため，プラスミドの伝播は微生物の環境への適応を促す要因の一つとして知られている．このことから，微生物の進化の機構を解明するためには，複合微生物系でどのプラスミドが実際に遺伝子の水平伝播を担うのか，またそれらはどこに存在しているのかという情報が重要である．しかし，これまでに多くのプラスミドが取得されているが，複合微生物系におけるプラスミドの動態は未だに不明のままである．そこで本研究では，プラスミドの接合伝達能を指標とすることで，全国各地の環境試料から自己伝達性プラスミド（それ自体のみで伝達可能）の収集を行い，実際の複合微生物系で伝播するプラスミドの特定を試みた．

【方法・結果・考察】プラスミドの自己伝達能を指標とした三親接合を用い，土壌，河川・湖沼底泥から合計 458 株の自己伝達性プラスミドを有すると推定された接合完了体の取得に成功した．それらのうち 213 株から抽出した全 DNA に対し，既知のプラスミドの遺伝子配列を基に作製したプライマーセットを用いた PCR 解析を行い，プラスミドグループの特定を試みたところ，
66 株が IncP-1 群，94 株が PromA 群プラスミドを有すると推定された．この結果を受け，2 本の PromA 群プラスミドの全塩基配列を決定したところ，これらは抗生物質耐性遺伝子や物質代謝能などのアクセサリー遺伝子を持っていなかった．また，このような性質は，全塩基配列が決定されている全 15 本の PromA 群プラスミドのうち，我々の先行研究で取得された 5 本と合わせた7 本（全長が 38 ～ 42 kb）についても同様に認められた．こうした結果は，得られた PromA 群プラスミドが，それ自体が伝播するよりも，アクセサリー遺伝子を持つ別の可動性プラスミド（それ自体だけでは伝達不可能だが自己伝達性プラスミドの存在下で伝達可能）を伝播させる機能に優れ，自然界における遺伝子の伝播に寄与していることを示唆している．現在，PromA 群と推定された他の 3 本のプラスミドと不和合性群が特定できなかった 1 本のプラスミドについて全塩基配列の解読を進めている．

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meetingP2-18

同一不和合性群に属するプラスミドであってもその宿主域は異なる○徳田 真穂 1, 柳谷 洸輔 1, 井上 謙吾 2, 雪 真弘 3, 大熊 盛也 3, 金原 和秀 1, 新谷 政己 1,3,4
静大・工 , 2宮崎大・農 , 3理研・BRC-JCM, 4静大・グリーン研1【背景・目的】環境中に広く分布することが予測されている，不和合性群 PromA に属する 2 つのプラスミド pSN1104-11 と

pSN0729-62 は同一細胞内で共存できない（不和合性）．しかし双方の GC 含量が 10％異なる（1）．同様に IncP-1 群に属するとされるプラスミド pBP136 と pDS1 においても GC 含量が 18％異なる．プラスミドの GC 含量は宿主染色体の GC 含量よりも低く，その違いは 10％以内であることが多い（2）．従って，上記のプラスミドの宿主域は互いに異なることが推察された．そこで本研究では，これら同一不和合性群に属するプラスミドの宿主域の比較を行うこととした．【方法・結果・考察】pSN110411 と pSN0729-62 をもつ Pseudomonas putida SMDBS 株を供与菌，牛糞堆肥や土壌サンプルを受容菌群として接合実験を行った．GFP 遺伝子が供与菌内では発現しない仕組みを利用し，GFP による蛍光を呈する接合完了体のみをセルソーターを用いて収集した．取得した接合完了体は 16S rRNA 遺伝子の配列に基づいて，属レベルの同定を行った．その結果，pSN1104-11をもつ 17 属と pSN0729-62 をもつ 15 属の接合完了体を取得し，そのうち 8 属，6 属は各プラスミドに特有の属であった．さらに， Alphaproteobacteria, Betaproteobacteriaに属する細菌においては，pSN1104-11 が接合伝達した 4 属の GC 含量はす

べて 60％以上であるのに対し，pSN0729-62 が伝達した 2 属の GC 含量は共に 60％以下であった．以上の結果から，同じ不和

合性群に属するにも関わらず，塩基組成の違いによって宿主域が異なり，プラスミドと宿主染色体の GC 含量に相関があることが示唆された，現在は，pBP136 と pDS1 の宿主域の比較を行っている．同時に，宿主域の違いが塩基組成によるものであるかを検証するため，同じ PromA 群に属し，61％の GC 含量をもつ pMH0613-68 の宿主域の調査を行っている．(1) Yanagiya
et al., 2018, Front. Microbiol. 9:2602.(2) Shintani & Suzuki, 2019, Shintani M., Suzuki H. (2019) Plasmids and Their Hosts. In:
Nishida H., Oshima T. (eds) DNA Traffic in the Environment. Springer, Singapore

P2-19

好熱性古細菌における酸化損傷塩基に起因する自然突然変異の修復機構に関する解析○和田 浩樹 , 久留主 泰朗
茨城大院農
我々は、細胞内変異原性物質である異常塩基の生成・分解・除去による自然突然変異修復機構に着目して研究を行ってきた。異常塩基が生成する一つの要因として塩基の酸化損傷がある。酸化損傷は細胞内での酸化ラジカル反応により行われ、最も主要な異常塩基である 8-hydroxy-guanine（8-OHG）は DNA 中の guanine の酸化、dGTP が酸化されて生成した 8-hydroxydeoxyguanosin-5’-triphosphate（8-OHdGTP）が複製の際に DNA 中に取り込まれることで、G:C → T:A あるいは A:T → C:G の塩
基置換を引き起こす。酵素 MutT は細胞質中の異常塩基 8-OHdGTP を分解することで自然突然変異を抑制している。酵素 MutM

は、DNA 中の 8-OHG を除去、酵素 MutY は adenine と 8-OHG の誤対合を認識し、adenine の除去修復を行う。酸化損傷塩基の除去・修復に関する研究は、これまで大腸菌や枯草菌などの真正細菌、酵母などの真核生物を対象とされてきた。しかしながら、全生物最終共通祖先に最も近いとされる古細菌を対象とした研究の報告は少ない。本研究では、古細菌における酸化損傷

塩基の分解・除去に関する修復機構について明らかにすることを目的とした。好熱性古細菌として全ゲノムが解読されている、

Sulfolobus tokodaii strain 7 とPyrococcus furiosus JCM 8422、Thermococcus kodakarensis JCM 12380 を用いた。３菌株の中で、大腸菌 MutT とアミノ酸配列相同性を示す遺伝子を探索したところ、S. tokodaii からは 3 個見出されたが、大腸菌 MutTとの相同性はいずれも約 30％以下であった。P. furiosus および T. kodakarensis もまた同様の結果であった。S. tokodaii から見出した最も相同性の高い遺伝子を大腸菌内で高発現させ、酵素解析を行ったところ、大腸菌 MutT と比較して基質特異性が低く、8-OHdGTP 以外のヌクレオチドとも反応を示した。同様に、P. furiosus と T. kodakarensis 由来の最も相同性の高いタンパ

ク質も 8-OHdGTP の分解活性が確認された。一方、3 菌株において大腸菌 MutM、MutY と相同性を示す遺伝子は確認できなかった。以上のことから、古細菌における酸化損傷塩基に起因する自然突然変異の修復について考察する。

－ 94 －

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P2-20

超並列シーケンスを用いたメタゲノム解析による黄砂に含まれる細菌の群集構造解析○藤田 達之 1, 牧 輝弥 1, 松葉 悠真 2, 大川 雄輝 1, 作田 裕也 2, 甲斐 憲次 3, 河合 慶 2, 眞塩 麻彩実 1, 長谷川 浩 1,
岩坂 泰信 4
金沢大 , 2名古屋大 , 3茨城大 , 4環境創造センター

1

E-mail: h.y.azarea.yukitoki@gmail.com

中国大陸砂漠地帯から日本列島に飛来する黄砂は微生物を運搬し、そのヒト健康や生態系への影響が懸念される。従って、黄砂に付随する微生物の群集構造を解析し、環境への影響力が強い微生物を特定することは社会的要請の高い課題となっている。
これまで、黄砂が飛来した中国や韓国において、大気浮遊細菌の細胞密度と多様性が増え、風下への細菌の風送拡散が実証されてきた。しかしながら、飛来地と発生地で細菌群集構造を比較した研究例はほとんどない。そこで本研究では、黄砂発生地
であるツォクトーボー（モンゴル）と飛来地である金沢において大気粒子を採取し、粒子に含まれる細菌の群集構造を、両観測サイトで比較することで、黄砂による大気浮遊細菌の風送拡散プロセスを考察した。 黄砂飛来時期である 2018 年 4 月から 5 月にかけて黄砂飛来地 ( 金沢 ) および黄砂発生地（モンゴル、ツォクトーボー）の地上において、孔径 0.2 μｍポリカーボ
ネートフィルター上に大気粒子を捕集し、計 47 試料を得た。DAPI 染色を用いた蛍光顕微鏡観察と OPC（大気粒子濃度を粒子径別に測る測器）測定によって粒子濃度を定量し、後方流跡線解析（気塊起源を解析する手法）によって気塊の起源を推定した。細菌群集構造を解析するためフィルター上のゲノム DNA を直接抽出し、16S rRNA 遺伝子の V4 領域を PCR 法によって増幅した後、超並列シーケンサー MiSeq を使い核酸塩基配列を決定した。決定した配列を使い、Qiime を用いて、門 / 綱レベルでの細菌の群集構造を解析した。 発生地および飛来地地上では、黄砂（砂塵）発生時の試料中の OTUs は非黄砂発生時の試料に比べてそれぞれ 4.2 および 1.3 倍に高くなり、細菌群の多様性も非黄砂試料より高い値となった。また、黄砂試料と非黄砂試料の細菌の群集構造を比較すると、黄砂試料中において、飛来地では Actinobacteria および Bacilli の土壌細菌群が高くなったのに対し、発生地では減少あるいは維持であった。発生地では、砂塵とともに植物や糞便、土壌に由来する細菌種が一挙に巻き上がり、黄砂飛来地では長距離輸送される際に、ストレス耐性のある土壌細菌が残ったと考えられる。PCoA 解析では、発生地と飛来地共に黄砂試料と非黄砂試料は異なるクラスターを形成した。よって、中国大陸から黄砂と共に特定の土壌細菌群が流入し、黄砂飛来地である日本の大気中の微生物群集が変化することが示唆された。

P2-21

環境細菌におけるadhX 遺伝子が関与する貧栄養環境適応機構の普遍性○酒井 洋範 , 加藤 広海 , 大坪 嘉行 , 津田 雅孝 , 永田 裕二
東北大・院生命科【背景・目的】従属栄養細菌にとって自然環境の多くは栄養飢餓状態であり、細菌の当該環境への適応機構として増殖を制限し「耐え忍ぶ」機構が広く知られている。一方で、栄養源が限られた環境下でも増殖する機構を有する従属栄養細菌の存在も見出されており、我々は、好気性従属栄養細菌で Alphaproteobacteria に属する Sphingobium japonicum UT26 株が、alcohol

dehydrogenase (ADH) 遺伝子 (adhX ) の高発現により、有機炭素源非添加の無機塩培地にて二酸化炭素固定を伴い生育する現象（oligotrophic growth (OG) 表現型）を見出し、その機構解明を進めている。本研究では、adhX 関与の OG 表現型の普遍性を検討した。

【方法・結果および考察】細菌における AdhX ホモログ遺伝子の分布を検討した。UT26 株由来のadhX と 99% 以上の identity を示すほぼ同一の遺伝子が複数の sphingomonads 近縁株で見出され、これらの多くはプラスミド上に存在することから、近縁株間での水平伝播の可能性が示唆された。更に、60% 以上の identity を示すものは Betaproteobacteria や Gammaproteobacteria に属するグラム陰性細菌にも広く保存されていた。これら多様な AdhX ホモログ遺伝子の中から、identity のレベルが異なる 6 種類の遺伝子を発現ベクターを用いて UT26 株由来のadhX 遺伝子欠失株に導入したところ、ほぼ identity の程度と相関して OG 表

現型を示し、sphingomonads 細菌群以外の細菌株由来の AdhX ホモログ遺伝子も OG 表現型に寄与し得ることが示された。逆にUT26 株由来のadhX を高発現させると OG 表現型を示す Betaproteobacteria 株の存在も見出しており、adhX 関与の OG 表現型はある程度普遍的な現象であると考えられる。一方、同レベルの identity でも OG 表現型に顕著な差がみられる場合もあった。今後、これら AdhX ホモログのアミノ酸配列や酵素的性質と OG 表現型との関係性を明らかにすることで、OG 表現型の機構解明に繋がる知見が得られると期待できる。

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P2-22

大腸菌コロニー形成パターンの解析○ Heng Xue, Beiwen Ying
筑波大・生命環境

E-mail: s1830194@s.tsukuba.ac.jp
自然界に生息する微生物の特有の形態として、多様なコロニーが形成されている。また、実験室条件下においても微生物のコ

ロニー形成が均一でないことがよく観察されている。このようなコロニーの形成や分布に関する研究がほとんどなされていな
いため、コロニー間のばらつきが何を表しているのか、そのばらつきが何に由来するのかが不明である。本研究はコロニー形

成パターンから微生物の集団増殖を理解するため、モデル微生物の大腸菌を用い、実験室条件下でのコロニー形成パターンを解析する。大腸菌野生株 W3110 を含むゲノム長さや変異の異なる複数遺伝子型を対象に、LB 寒天培地上でのコロニー形成に対する空間分布解析を行った。各大腸菌のコロニー形成の時系列変化を観測し、新規に開発した自動計測プログラムによって、コロニーの数や大きさ ( ピクセル ) などの情報を定量的に評価した。その結果、同一遺伝子型におけるコロニー間のばらつきが確認され、そのばらつきが遺伝子型（菌株）によって異なることがわかった。そして、ボロノイ図をコロニーの空間分布の解析に適用し、コロニー間の空間面積を表すボロノイ領域を評価した。その結果、コロニーの大きさとそのボロノイ領域の面積の間には有意な正の相関が見られた。この相関が遺伝子型に依存するかについて本学会で報告する。

P2-23

クオラムクエンチング作用を有する酵素の添加がAeromonas caviae のバイオフィルム形成に及ぼす影響○細江 彩華 1, 飯泉 太郎 2, 田中 愛里 2, 永井 直宏 2, 細見 正明 1, 寺田 昭彦 1
東京農工大・院工 , 2栗田工業

1

目的 冷却水系におけるバイオファウリングは、熱交換効率の低下等を引き起こし、工場の安定操業に影響を及ぼす恐れがある。対策として抗菌剤等による処理が行われているが、薬剤排出による環境影響が懸念されている。細菌にはシグナル物質を用いて近傍の細菌密度を感知し、細菌密度が閾値を超えると一斉に特定遺伝子を発現するクオラムセンシング (QS) 機構を持つ種類が存在し、このような細菌によりバイオフィルム形成が促進される。QS によるバイオフィルム形成抑制のため、細菌細胞間のシグナル伝達を遮断することで QS を阻害するクオラムクエンチング (QQ) を利用した技術が開発されている。本研究では、
QQ を行う細菌 (QQ 細菌 ) を用いて冷却水系のバイオファウリング抑制を目指した。まず、冷却水系から単離された、QS 阻害物
質としてラクトナーゼを分泌するSphiogopyxis sp. EG6 株由来の精製ラクトナーゼを獲得し、これが他の細菌のバイオフィル
ム形成量に及ぼす影響を調査した。
方法 S . sp. EG6 株のラクトナーゼ生成遺伝子を導入して作製した組換え大腸菌から精製ラクトナーゼを得た。比較のためにブタ腎臓由来のアシラーゼ I と、これをオートクレーブ滅菌して酵素活性を失活させたものを用意した。これらを N - アシル -L- ホ
モセリンラクトン (AHLs) を用いて QS を行うAeromonas caviae に終濃度 5 mg/L となるように添加して 96 ウェルプレートで培養した。培養 4, 7, 20, 48 時間後に形成されたバイオフィルムを 0.1% クリスタルバイオレット (CV) 水溶液で染色し、CV が A590に吸収を持つ性質を利用してバイオフィルム形成量を定量した。
結果 ラクトナーゼ及びアシラーゼによって A. caviae の培養初期のバイオフィルム形成量が減少した。効果は培養 4 時間後に最大となり、酵素非添加系と比較してラクトナーゼによって 40%、アシラーゼによって 19% バイオフィルム形成量が減少したが、培養時間が長いほど抑制効果が低くなり、48 時間後にはバイオフィルム形成抑制効果が見られなくなった。
結論 冷却水系から単離された S . sp. EG6 株由来の精製ラクトナーゼ及びブタ腎臓由来のアシラーゼによって、AHLs を用いてQS を行うA. caviae の培養初期のバイオフィルム形成抑制が確認された。今後はフローセルを用いて基質を連続通水し、酵素がバイオフィルム形成量や構造に及ぼす影響を調査する。
謝辞 本研究の実験アドバイスを頂きました宇都宮大学の諸星知広准教授に厚くお礼申し上げます。

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P2-24

普遍的リボヌクレアーゼを介した大腸菌バイオフィルム形成の分子機構○南 篤 1, 日高 真誠 1,2, 葛山 智久 1,2, 小川 哲弘 1,2
東大院・農生科・応生工 , 2CRIIM

1

RNase T2 は、一本鎖 RNA を非特異的に分解するリボヌクレアーゼである。これはゲノムが解読されたほぼすべての生物に存在し、多様かつ重要な生命現象に関わる。これまで、ヒトや植物、酵母などでは研究が進んでいたが、バクテリアにおける機能はほとんど明らかにされていなかった。最近、大腸菌の RNase T2（RNase I）がバイオフィルム形成を制御することが報告された。大腸菌実験室株はバイオフィルムをほとんど形成しないが、RNase I の遺伝子を破壊するとバイオフィルムを形成するようになる。このメカニズムとして、RNase I による宿主 RNA の分解産物である 2',3'- 環状ヌクレオチド一リン酸が、バイオフィ
ルム形成を抑制する新規セカンドメッセンジャーとして機能することが示された。通常、RNase I はペリプラズムに局在することから、細胞質に流入した RNase I が宿主 RNA を分解すると考えられる。一方で、細胞質リボソーム（16S-rRNA helix 41）がRNase I の活性を阻害することも報告されている。このことから、何らかのタイミングでリボソームによる阻害が解除される必要があると考えられるが、そのメカニズムは不明であった。そこで本研究では、リボソームによる RNase I 活性調節機構を明らかにし、バイオフィルム形成の新たな制御機構を提示することを目的とした。ストレスへの暴露や、定常期まで培養を行うと、構造変化により翻訳活性を停止したリボソームが蓄積する。こうしたリボソームの構造変化により、RNase I の活性が阻害されるようになると考えた。この構造変化を起こしたリボソームを細胞内に蓄積しやすい変異株に対してアミノ酸飢餓を誘導し、この時のバイオフィルム形成能を野生株のものと比較した。その結果、全ての破壊株で、バイオフィルム形成能が有意に上昇した。このことから、この構造が変化したリボソームが、RNase I の活性を阻害することが示唆された。

P2-25

植物病原菌Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum におけるQuorum Sensing の多様性解析○小笠原 祐斗 1, 謝 肖男 2, 濱本 宏 3, 染谷 信孝 4, 諸星 知広 1
宇大院・工 , 2宇大・バイオ , 3法政大・植医 , 4農研機構・野菜花き

1

Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum （Pcc）は、様々な農作物に感染する軟腐病の原因菌として知られている。
多くのグラム陰性植物病原菌では、アシル化ホモセリンラクトン（AHL）をシグナル物質とした細胞間情報伝達機構 Quorum

Sensing により、病原性因子の発現が制御される例が多数報告されており、Pcc においては、ペクチナーゼなどの主要な病原性因子の発現が AHL を介した Quorum Sensing により制御される。過去の報告により、Pcc は主要な AHL として 3-oxo-C6-HSL ま

たは 3-oxo-C8-HSL を生産する 2 つのグループが存在することが明らかになっているが、その分布や多様性は解析されていない。本研究では、カルチャーコレクションに保存されている Pcc 菌株を用い、AHL 生産グループおよび AHL 合成酵素（ExpI）

配列の多様性を明らかにすることを目的とした。農業生物資源ジーンバンク及び NBRC に保管されている 282 株の Pcc を用い、培養上清から抽出した AHL の構造を LC-MS/MS により解析したところ、3-oxo-C8-HSL を主に生産するクラス（QS class I）が212 株、3-oxo-C6-HSL を主に生産するクラス（QS class II）が 70 株存在していた。さらに、QS class II の中には、一定濃度の3-oxo-C6-HSL を生産するクラス（QS class II-1）と、ごく微量の 3-oxo-C6-HSL のみ生産するクラス（QS class II-2）の 2 つのサブクラスが存在していた。次に、全ての菌株から ExpI のアミノ酸配列取得したところ、75% の配列同一性で QS class I と II を完全に分類することが可能であった。また、expI 遺伝子を大腸菌に導入したところ、QS class II-1 と比べて QS class II-2 の expI を導入した大腸菌は 3-oxo-C6-HSL 生産量が大幅に低下していたことから、この活性の低下はわずかなアミノ酸配列の違いに由来するものと推察された。

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P2-26

BT 剤による植物病原菌の Quorum Sensing 阻害効果
○野呂 文峻 1, 染谷 信孝 2, 諸星 知広 1
宇大・院工 , 2農研機構・野菜花き1

BT 剤は、Bacillus thuringiensis を主成分とする生物農薬であり、B. thuringiensis が生産する結晶性殺虫タンパク質により、鱗翅目幼虫による食害を防除することが可能である。植物病原性グラム陰性細菌の多くは、アシル化ホモセリンラクトン（AHL）
をシグナル物質とした Quorum Sensing により、病原性に関連する様々な遺伝子発現を制御することが報告されている。これ
らの病原菌の Quorum Sensing を阻害すると、病原性発現の抑制が可能なことから、Quorum Sensing 阻害は新しい植物病防除技術への応用が期待されている。B. thuringiensis が属する B. cereus グループの多くは、AHL を加水分解する AHL ラクトナーゼ

活性を有しており、AHL 分解により植物病原菌の病原性抑制が可能である。本研究では、市販の BT 剤由来菌株とカルチャーコ
レクション（NBRC、JCM）由来B. thuringiensis を用い、AHL 分解活性及び Quroum Sensing 阻害効果を検証した。試験菌株を

AHL を添加した培地に接種して培養後、上清の残存 AHL を AHL レポーター株を用いて検出したところ、すべての株で AHL の応答が消失していたことから、AHL 分解活性を有することが明らかとなった。次に、既知のB. cereus 由来 AHL ラクトナーゼ遺伝子（aiiA ）の配列を基にしたプライマーを設計し、試験菌株からaiiA を PCR で増幅したところ、すべての菌株から aiiA が増幅し、アミノ酸配列を基にした系統解析から 4 つのグループに分類された。また、aiiA をクローニングして大腸菌に導入し、AHL

分解活性を調べたところ、すべてのaiiA を導入した大腸菌が AHL 分解活性を示したことから、実際に AHL ラクトナーゼとして機能することが明らかになった。

P2-27

植物病原菌Pseudomonas syringae における Quorum Sensing の多様性解析○大嶋 旭昇 1, 謝 肖男 2, 染谷 信孝 3, 諸星 知広 1
宇大院・地域創生 , 2宇大・バイオ , 3農研機構・野菜花き1

植物病原性グラム陰性細菌の多くは、アシル化ホモセリンラクトン（AHL）をシグナル物質とした Quorum Sensing により、病原性に関連する様々な遺伝子発現を制御することが報告されている。Quorum Sensing を阻害すると、病原性発現を効果的に抑制することが可能であることから、Quorum Sensing 阻害は新しい植物病防除技術への応用が期待されている。斑点症状を引き起こすことで知られる植物病原菌Pseudomonas syringae は、様々な病原型が存在するなど分類上も多種多様であるため、微生物カルチャーコレクションに登録された膨大な P. syringae 菌株における Quorum Sensing 機構の全体像は明らかになっていない。本研究では、カルチャーコレクションに保管されている日本国内で分離された P. syringae に着目し、AHL 生産を伴う

Quorum Sensing の多様性を明らかにすることを目的とした。まず、農業生物資源ジーンバンクに保管されているP. syringaeの中から、主に野菜類に対する病原菌として登録されている 91 株を選択し、AHL レポーター株であるChromobacterium

violaceum CV026 株 及 び VIR07 株 と ク ロ ス ス ト リ ー ク さ せ る こ と に よ り AHL 生 産 を 調 査 し た。 そ の 結 果、 病 原 型 が pv.

lachrymans 、pv. mellea 、pv. tabaci に分類される 51 株が明確な AHL 生産を示すことが明らかになり、LC-MS/MS 解析を行った

ところ、すべての株で C6-HSL と 3-oxo-C6-HSL が 90％以上の割合を占めることが明らかになった。次に、すべての株においてAHL 合成遺伝子（psyI）の存在を特異的プライマーで調査したところ、AHL 生産を示す 51 株に加えて、AHL 生産を示さない
pv. maculicola 、pv. solidagae 、pv. tomato に分類される 29 株も AHL 合成遺伝子を有していたことから、これらの菌株では AHL

合成遺伝子が発現しないか、AHL 生合成活性が欠損している可能性が示唆された。

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P2-28

亜酸化窒素還元能を持つ硝化細菌Nitrobacter の発見○高橋 悠 1, 藤谷 拓嗣 2, 末永 俊和 3, 寺田 昭彦 3, 廣野 祐平 4, 多胡 香奈子 5, 早津 雅仁 5, 常田 聡 1
早大院・生医 , 2産総研・バイオメディカル研究部門 , 3農工大・応用化学 , 4農研機構・果樹茶業研究部門 , 5農研機構・農環研

1E-mail: SpinningTop02765@ruri.waseda.jp＜背景＞茶園土壌には大量の窒素がアンモニアとして施肥されるが、硝化により土壌から溶脱しやすい亜硝酸、硝酸に変換され、窒素の 50% 程は作物に吸収されずに経済的損失や地下水汚染を引き起こす。また硝化反応の副生成物として、高い温室効

果やオゾン層の破壊をもたらす亜酸化窒素（N2O）が発生する。これを除去する唯一の経路は脱窒細菌による N2O 還元であるが、茶園土壌のような低 pH 環境では N2O 発生量が多く、この還元反応の活性は低いと推測されている。そのため茶園土壌における硝化は N2O の発生経路として問題視されている。本研究では、茶園土壌から分離した亜硝酸酸化細菌のゲノムを解読し、

N2O 還元能を持つ世界初の硝化細菌であることを明らかにした。

＜方法＞茶園土壌をサンプル源とし，本研究室で開発した混合型連続培養槽を用いて亜硝酸を供給して培養した。増殖したNitrobacter が凝集体を形成することを利用し、形態に基づく選択的なセルソーティングによって凝集体を分取し、分離株

NbAS を樹立した。次世代シーケンサーで NbAS のゲノム配列を取得し、データベースに公開されているNitrobacter の 6 個のホールゲノムシーケンスと比較すると、NbAS に固有の遺伝子として N2O 還元酵素遺伝子nosZ が同定された。この NosZ のアミノ酸配列を脱窒細菌の保有するホモログと比較し、系統を解析した。NbAS による N2O 還元能を確認するため、N2O を溶解させた水を添加し、溶存 N2O の濃度変化を微小電極で測定した。

＜結果・考察＞ NbAS のゲノム配列は既存株Nitrobacter vulgaris Ab1 と非常に相同性が高く、Average Nucleotide Identity は

96% であった。一方でnosZ を含むコンティグは他のどの Nitrobacter とも相同ではなかった。NosZ のアミノ酸配列に基づく系

統解析の結果、NbAS は clade I type に属し、最も近縁なのは同じくRhizobiales 目に分類される Bradyrhizobium 属であった。この結果は「nosZ の系統樹は微生物の進化系統に対応する」という既往研究の報告と一致した。ただし Bradyrhizobium 属と異なり、NbAS は一酸化窒素還元酵素遺伝子 (nor ) を欠損していた。無機嫌気環境下の試験で、NbAS の N2O 還元活性が示された。

P2-29

土壌の複雑な微環境における土壌細菌群集構造のミクロレベル解析○高山 清一郎 1, 和穎 朗太 2, 荒井 見和 2, 濱村 奈津子 3
九大・院・システム生命科学 , 2国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 , 3九州大学理学研究院

1

土壌は、ナノ - ミリメートルレベルの様々なサイズと化学組成を有する鉱物粒子と有機物の相互作用によって形成された団粒構造を持ち、地球上で最も多様な微生物生態系を育むミクロ環境である。微生物は土壌構造中で不均一に分布しており、特にミクロメートルレベルの団粒では、バイオマスが局在化し高い代謝活性を示す一方で長期的に貯留する炭素の大半が存在する
ことも報告されている。加えて、農地などの土壌においては耕作や肥料条件等の栽培管理により、多様な系統の微生物が刺激を受け群集構造や機能が変化するという報告もある。本研究では、土壌の物理構造と物質循環を駆動する微生物群集の相互関係を明らかにするため、土壌の機能ユニットである団粒サイズと栽培管理に着目し、栽培条件と団粒サイズの構成割合が大きく異なる農地から採取した土壌の細菌群集構造の比較解析を実施した。土壌サンプルは農研機構・農業環境変動研究センター（茨城県つくば市）の圃場の不耕起・落葉堆肥区および耕起・化学肥料区２種の黒ボク土 (pH 6.2) を用いた。不耕起土壌では落葉堆肥が投入されており、耕起および化学肥料の施肥が行われてきた対照区に比べて、約 2 倍の全炭素濃度と全窒素濃度であること、団粒構造が発達していることが先行研究により明らかにされている。これら２つの処理区の土壌を湿式篩別法により4 つの団粒サイズ（＞ 1 mm, 0.25-1 mm, 0.053-0.25 mm, ＜ 0.053 mm；それぞれ n=3）に分画し、DNA 抽出後 16S rRNA 遺伝

子の V1-V3 領域を NGS により配列解読を行った。その結果、不耕起土壌は対照区よりも高いα多様性を示し、細菌群集構造の

UniFrac 解析では、不耕起土壌と対照区の細菌群集構造は団粒サイズに関わらず異なっていた。団粒サイズごとの比較では、両処理区において＜ 0.053 mm サイズで他の 3 つのサイズと顕著に異なる群集構造が形成されており、対照区では特に団粒サイ

ズ間で群集のバラツキが増大する傾向が見られた。これらの結果は、栽培処理条件や＜ 0.053 mm サイズにおける微生物群集の機能性の違いを示唆しており、今後さらに団粒や栽培処理の物理化学特性と微生物活性の評価が望まれる。

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2019 JSME annual meeting

P2-30

日本の森林における土壌微生物群集の物質代謝機能- メタゲノムと生物地理 ○伊澤 航太郎 1, 伊勢 裕太 1, 高見 英人 2, 大手 信人 3, 妹尾 啓史 1, 磯部 一夫 1
東京大 , 2JAMSTEC, 3京都大1E-mail: kotaro.hanaserebu@gmail.com
森林土壌において微生物は有機物の分解、物質循環の形成、植物への養分供給、炭素や窒素の貯蔵などの機能を担い、生態系を支えている。日本は森林が国土の約 70%（天然林が約 40%、人工林が約 30%）を占め、気候に応じて北から南まで植生は大きく異なる。森林の物質循環はたとえ隣り合った森林間でも異なる。このような差異はどのようにして生まれるのだろうか。
本研究では、物質循環過程の多くが土壌微生物の物質代謝であることに立脚して、土壌微生物群集が有する物質代謝機能の観点から、森林間における物質循環の差異の理解を試みる。

日本の北海道から沖縄まで全国 40 地点（天然林と人工林がそれぞれ約半数ずつ）から土壌を採取し、Hiseq を用いて土壌微生物群集のメタゲノムの配列決定を行った。MAPLE2.3.1（metabolic and physiological potential evaluator）を用いて、メタゲ

ノム配列から土壌微生物群集の物質代謝機能を推定した。その他、森林環境データ、土壌環境データ、窒素循環（窒素無機化、硝化）速度を測定した。

物質代謝機能（MAPLE に基づく機能モジュール）の構成は、土壌の酸性度が異なる森林間で明確に異なった。天然林と人工林の間、あるいは土壌分類が異なる森林間で差異は見られなかった。北海道、本州、四国、九州と沖縄で構成は異なっていたが、その差異は小さかった。特に、中性土壌の森林では酸性土壌の森林と比較して、窒素代謝のほか、無機・有機イオン、糖、脂質、リン酸、アミノ酸、金属カチオン等の輸送を担うトランスポーターに関するモジュールが多く検出された。一方、酸性土
壌の森林では、酸性環境や浸透圧といった外部環境やストレスに対する応答に関するモジュールが多く検出された。

以上のことから、土壌微生物群集が有する物質代謝機能にはストレス応答と養分吸収・エネルギー生成の間に負の相関関係があり、それにより土壌の酸性度が群集の物質代謝機能を制御していることが示唆された。現在、群集の物質代謝機能の差異が窒素循環速度にもたらす影響について検証している。

P2-31

干潟土壌中での複合有機物分解と発電に関与する微生物の同定○猪鼻 淑乃 , 勝矢 祥平 , 高妻 篤史 , 渡邉 一哉
東薬大院・生命【目的】

近年、外界と電気的相互作用する能力を持つ微生物が注目を集めている。これらは電気化学活性菌（electrochemically active

bacteria, EAB）と呼ばれ、基質となる有機物が存在するときそれらを酸化分解して発生する電子を細胞外の電極などの導電性物質に放出して発電することができる。今までの研究において、EAB は土壌や湖沼堆積物などから単離されている。EAB を利用した発電システムは微生物燃料電池（microbial fuel cell, MFC）と呼ばれ、バイオマス廃棄物や有機汚濁物質を分解しながら電力が回収できることから、環境分野での利用が期待されている。今までにヘドロなどが堆積した海洋底泥の浄化を目的としたMFCも検討され、一方で海洋底泥から酢酸を基質として EAB が単離された例もある。しかし、複合有機物を基質として海洋環境からEABが単離された例はなく、ヘドロ等で汚染された海洋底泥の浄化にどのような EAB が関与するか不明であった。そこで本研究では、干潟などで複合有機物が分解される際に発電に関与する EABを同定することを目的とし、東京湾沿岸の4カ所の干潟（多摩川河口、小櫃

川河口、三番瀬、江戸川河口）で採取した土壌を植菌源、デンプンやペプトンからなる複合有機物を基質としてMFCを運転した。

【結果】

4 つの干潟土壌のうち、小櫃川河口と江戸川河口の土壌を用いた MFC で高い出力が測定された。菌叢解析の結果、両 MFC のアノードにおいて EAB として知られるShewanella 属細菌が比較的多く検出され、分子系統解析では S. algae の近縁種と同定された。また、これら MFC のアノードには発酵細菌として知られるAminobacterium 属細菌も集積されており、この細菌の代謝産物を基質としてS. algae が発電する可能性が考えられた。そこで、電極プレート培養法を用いて小櫃川 MFC のアノードから S.

algae の近縁種を単離し、Aminobacterium 属細菌の主な代謝産物である酢酸などを基質として電流生成実験を行った。その結果、EAB として広く研究に用いられているS. oneidensis MR-1 は酢酸を基質とした電流生成できないのに対し、単離株では顕著な電流が確認された。これらの結果は、S. algae の近縁種は多様な基質を利用して電流を生成できること、干潟などの環境中で複合有機物を発酵分解する細菌の代謝産物を利用して発電することを示している。

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P2-32

土壌細菌叢の液体培養系における遷移の動態解析○東 豊浩 , 加藤 広海 , 長田 穣 , 永田 裕二 , 近藤 倫生
東北大・生命科学研究科【背景と目的】近年の塩基配列解析技術の発達により、細菌群集において群集の網羅的な菌叢組成データを比較的容易に得ることが可能になった。本研究では、マクロ生物では観察の難しい群集形成の原理を探るため、高い多様性を持つ土壌細菌叢の遷移過程について継時的に観察を行った。

【方法】褐色森林土より採取した微生物集団を、同じ褐色森林土から調整した土壌抽出液を主成分として含む液体培地に添加し、30℃暗所で攪拌培養しながら、12 時間ごとにサンプルを採取した。3 反復で同条件の培養を行った。採取したサンプルからメタゲノム DNA を抽出し、16S rRNA 遺伝子アンプリコンシーケンスにより菌叢解析を行った。また、全体の菌数について
real-time PCR による 16S rRNA 遺伝子コピー数の絶対定量を行い、全 16S rRNA 遺伝子コピー数に菌叢解析で得られた各属の存在割合を乗することで擬似的な個体数データを算出した。さらに、得られたデータについて、同微生物集団を滅菌土壌に接種した場合 ( 日本微生物生態学会前年度大会等で発表 ) と比較した。

【結果】菌叢解析の結果、2 週間で様々な細菌属の増減が起こるなど大規模な菌叢遷移が観察された。1% 以上の存在割合を示した族を優占属とし、液体培養と土壌培養で比較した結果、両培養でそれぞれ約 60 の優占属が検出され、その半数ほどが共通していた。中でも培養初期のBacilli 綱や Betaproteobacteria 網、Bacteroidetes 門の細菌属の優占、培養後期の Acidobacteria
門など難培養性細菌属の増加など、変動パターンについても共通点が見出された。一方で Bdellovibrio 属などの細菌捕食性

Deltaproteobacteria 網の中期優占など、液体培養に特徴的な変動パターンも観察された。

また、同条件下で培養した 3 系列とも概ね同様の菌叢遷移を辿った。実験開始初期段階ではほぼ同じ菌叢組成に速やかに収束したが、時間経過に従い、遷移の方向に系列間で差が見られるようになった。以上、初期の細菌叢の遷移が決定論的動態として理解できる可能性とともに、時間経過に伴う何らかの要因によって菌叢組成に分化が生じることが示唆された。

P2-33

Bacillales 目細菌および自活性線虫を優占化させた土壌改良資材施用効果の分子生物学的解析○蔵下 はづき 1, 池田 匠児 2, 平片 悠河 2, 高木 素紀 3, 幡本 将史 2, 牧 慎也 2, 山口 隆司 2, 青井 透 4, 黒田 恭平 1
都城高専・物工 , 2長岡技大 , 3茨城県農総セ , 4群馬高専

1

E-mail: kurashitaqd@miyakonojo.kosen-ac.jp

日本では年間約61,500 tのレンコンが生産されているが、寄生性線虫（Hirschmanniella diversa , H. imamuri ）によって引き起こされる黒皮症等の病害が問題となっている。石灰窒素、太陽熱消毒等による防除が行われているが、人体への影響の懸念や労力に対する防除効果が低いことから新たな防除方法が求められている。我々は化学農薬に依らない簡便・安価な防除方法としてBacillales

目細菌および自活性線虫を優占化させた土壌改良資材（以下、資材とする）を開発している。本資材を施用することにより、Bacillales 目細菌の産生する抗生物質（iturin等）による寄生性線虫の防除、自活性線虫の寄生性線虫捕食等による線虫害抑制効果が期待される。本資材をレンコン栽培実圃場に施用した結果、レンコンの黒皮症被害の低減効果が確認され、資材中のBacillales 目

細菌および自活性線虫が線虫害抑制に関与したことが示唆された。しかし、資材中のBacillales 目細菌が実圃場内で抗生物質産生能を有するか不明であること、土壌中における自活性線虫と寄生性線虫の動態を評価する方法が無いことが課題として挙げられた。

本研究では、資材による寄生性線虫害の防除機構を解明することを最終目的とし、資材からのBacillales 目細菌の分離培養および抗生物質生産能の評価、18S rRNA 遺伝子を対象としたレンコン栽培土壌の真核生物群集構造解析を行った。結果、資材から芽胞形成能を有する微生物 15 株の分離培養に成功した。Bacillus 属特異的プライマーによる分離株の PCR 増幅を行った結果、全 15 株の遺伝子増幅が確認され、分離株はBacillus 属に属する可能性が示唆された。今後、得られた分離株の抗生物質生産能の有無を評価する。レンコン栽培土壌の真核生物群集構造解析の結果、線虫門に属する系統は全体の 1-3% 程度検出され、Triplonchida 目を含む自活性線虫の系統分類群は確認された一方で、植物寄生性線虫を含む Tylenchida 目は検出されなかった。
真核生物全体を対象とした群集構造解析では、系統間のゲノムサイズの違いがコミュニティの構成比に影響を及ぼす。そのため、土壌中の線虫群集構造を正当に評価するためにも、線虫門特異的な群集構造解析を行う等、新たな評価技術が必要であると考えられた。

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P2-34

Energy-balance evaluation of aerobic and anaerobic wastewater treatments
specially focusing microbial fuel cell
Mari Sugioka1, ○ Naoko Yoshida1, Ken Fuji1, Hirokazu Matsubara2, Mitsuhiro Sakoda3, Yoshinori Genda3,
Kazuki Iida2
1

Grad. Sch., Dept. Civil Eng., Nagoya Inst. Technol., 2Nippon Koei, 3Tamano Consultants Co., Ltd.

This study evaluated the performance of a tubular microbial fuel cell (MFC) having a core of air-chamber wrapped with ananion exchange membrane in sewage wastewater treatment. Three MFCs were vertically assembled into one module andfloated in sewage water channels before and after the treatment in primary sedimentation tank. The two MFC-modules
showed almost similar electricity production in the range of 1.3-5.7 Wh/m3-MFC, while the bottom MFCs (60-90 cm) showeda decrease in electricity than the top MFC (0-30 cm) and the middle MFC (30-60 cm). One of the MFC modules was thenevaluated for the COD removal rate with two external resistances of 27ohm and 3ohm, in a chemostat reactor (MFC:reactor =1:5, v/v) under three hydraulic retention times (HRTs), 3 h, 6 h, and 12 h. The best COD removal rate of the MFC (COD-RTMFC)

was observed with 3 ohm of resistance and 12 h of HRT, resulting in 3.8 ± 2.0 A/m3 of current recovery and 15 ± 7.5 % of
Coulombic efficiency. Electricity generation efficiency (EGEMFC) was the best with 27 ohm of resistance and 12 h of HRT andaccounted for 0.18 ± 0.11 kWh/kg-COD with 17 ± 6.4 % of COD-RTMFC and 0.65 ± 0.10 Wh/m3 electricity production. Basedon the calculation using the COD-RTMFC and EGEMFC, wastewater treatment can reduce electricity consumption by 55% via
integration of the MFC-3ohm prior to the aeration. That was advantegeous in the comparion of the other anaerobic treatmentswith higher values of EGE, i.e. methane fermentation and MFC-27ohm.

P2-35

高圧ジェット装置を組み込んだ硝化液循環活性汚泥法による余剰汚泥排出削減と微生物群集構造の変化○吉野 寛之 1, 堀 知行 2, 細見 正明 1, 寺田 昭彦 1
農工大・院工 , 2産総研

1E-mail: yhiroyuki@m2.tuat.ac.jp
活性汚泥法による排水処理では、余剰汚泥の発生が問題視されている。余剰汚泥の処理に要する費用が排水処理場の管理において大きな割合を占めることから、その削減が求められる。これまでにオゾンやアルカリによる余剰汚泥減容化技術が提案されてきたが、コストや維持管理などの課題から広く普及するには至っていない。そこで我々は、これらの課題を解決した汚泥
減容化システムとして高圧ジェット装置を開発した。高圧ジェット装置は高圧ポンプと活性汚泥中の微生物細胞を破砕する配管で構成されるシンプルな構造を有し、摩擦、キャビテーション、衝突などの機構により汚泥中の微生物を破壊することが可能である。これまでパイロットスケールの標準活性汚泥法へ高圧ジェット装置を導入し、約 30% の汚泥減容化を達成し、活性汚泥中の微生物群集の変遷を示してきた。本研究はパイロットスケールの硝化液循環活性汚泥法を採用したシステムの汚泥返送ラインに高圧ジェット装置を導入した実験系、従来の硝化液循環活性汚泥法である対照系を設置し、装置導入が余剰汚泥減
容化性能、処理水中の懸濁物質（SS）の排出量、窒素除去性能へ及ぼす影響を評価した。また、活性汚泥のフロック構造や微生物群集構造の変化を確認することで高圧ジェット装置の有効性を明らかにした。111 日間の実生活排水の連続通水試験において、実験系から排出された余剰汚泥積算量は対照系と比較して 27% となった。処理水中に含まれる SS を加味した高圧ジェット装置導入による汚泥減容化率は 56% であった。実験系と対照系の処理水中の有機物・窒素除去率に有意差はみられなかった。運転終了時の活性汚泥に対して、次世代シーケンサーによる 16S rRNA 遺伝子に基づくアンプリコン解析、FISH 法を適用した。次世代シーケンサー解析の結果、実験系・対照系の活性汚泥中の微生物群集構造が大きく異なることを確認した。実験系において細胞外ポリマー物質を資化する Thermomonas 属の増加、糸状性細菌として知られる Chloroflexi 門の減少が見られた。FISH 法の適用により、高圧ジェット装置の導入で活性汚泥フロックのサイズは減少しなかったものの、Chloroflexi 門の相対存在率の減少を確認した。これらの変化は、高圧ジェット装置の細菌細胞の可溶化による有機炭素源の供給や、物理的衝撃に弱いと考えられる形状を有する糸状性細菌の破壊が原因であると考えられた。

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P2-36

土壌カラムを用いた揮発性有機塩素化合物の浄化における細菌叢への温度影響○鈴木 市郎 1,2, 田 小維 2, 川村 美帆 1, 東 瑤子 1, 山崎 祐二 3, 奥田 信康 3, 小林 剛 2,4
横浜国大・院理工 , 2横浜国大・リスク共生セ , 3（株）竹中工務店 , 4横浜国大・院環

1E-mail: suzuki-ichiro-db@ynu.ac.jp【緒言】テトラクロロエチレン (PCE)、トリクロロエチレン (TCE) などの揮発性有機塩素化合物の生物的浄化において、土壌、地下水を 30℃程度に加温することにより浄化の短期間化を図ることができる。加温による土壌中の細菌叢の組成への影響、また、加温や通水方法の違いによる土壌カラム内の細菌叢の分布への影響などを調べるため、土壌カラムを用いた実験を行い、土壌内の細菌叢の組成を解析した。

【方法】通水性の異なる 2 種類の土壌をそれぞれガラスカラムに充填し、Dehalococcoides 属を含む集積培養系を添加した。
PCE, TCE, cis- ジクロロエチレン（cDCE）および電子供与体となる添加剤を含む溶液を、(1) 連続、(2)4 日に 1 回 100 ml（半止水）、の条件で通水し、15℃、30℃で浄化実験を行った。浄化実験終了後のカラムより土壌を採取し、細菌 DNA を抽出して16S rRNA 遺伝子アンプリコンの組成を Illumina MiSeq により解析した。

【結果と考察】細菌 16S rRNA 遺伝子アンプリコンの組成を Weighted UniFrac を用いて比較した結果、土壌の違いよりも温度の違いによる細菌叢の類似度への影響が大きいことが明らかとなった。異なる土壌で通水量が同じ半止水型カラムでは同じ温度での細菌叢が類似していたが、連続通水では透水性の異なる土壌で通水量を変えたため添加された PCE 等の総量が異なり、土壌ごとの細菌叢が比較的異なっていた。従って、土壌の物性の違いよりも、加温や栄養源の添加量などの操作による細菌叢の組成への影響が大きいことが判明した。Dehalococcoides 属は、半止水型カラムでは入口側の割合が最大で全細菌中の0.1% 程度存在して出口側に向けて減少していたが、連続通水型カラムでは最大 3% 程度の割合まで存在し入口よりも内部での割合が増加していたことから、おそらく通水方法の違いによりカラム内での PCE 等の濃度分布が異なり、それが各カラムでのDehalococcoides の分布に反映されたと考えられた。

P2-37

脱ハロゲン化呼吸細菌の大量培養および還元的脱ハロゲン化酵素の精製○秋田 明日香 1, 森田 悠揮 1, 鈴木 智美 1, 吉田 奈央子 1, 押木 守 2
名古屋工業大・社会工学 , 2長岡高専・環境都市

1

E-mail: akita.asuka@nitech.ac.jp

塩素化エチレンの脱塩素化呼吸細菌 (ORB) として各国で流通するDehalococcides 属細菌 ( 以下 Dhc) 製剤は , 炭素数 3 以上の炭水化物をエネルギー源とした基質レベルでのリン酸化により増殖する , いわゆる発酵微生物 , を含む複合微生物群集である . 我々

は , 製品評価技術基盤機構が開発した「ビア樽などの耐圧力容器を用いた大量培養方法」に基づき , Dhc 単独でも安定して大量培養することができるか試みるとともに , 菌体からの還元的脱ハロゲン化酵素 (Rdh) の精製を試みた .ORB として , 最大で 4 mMのトリクロロエチレン (TCE) をエチレンまで脱塩素化し増殖するDehalococcoides mccartyi NIT01 株および最大で 10mM の1,2- ジクロロエタン (1,2-DCA) をエチレンに脱塩素化し増殖するGeobacter lovleyi AY 株を用いた . ORB は , ミネラル塩 , 5 mM 酢
酸ナトリウム , および 1 mM TCE を含む液体培地に , 80% H2 および 20% CO2の混合ガスを含むガラス製密閉瓶で維持し , 必要に応じてビア樽にスケールアップした . 脱塩化酵素の精製は、菌体の超音波破砕液を超遠心して得た膜画分について界面活性剤抽出し , 脱塩・濃縮の後 , HiTrap Q XL および Superose6 Increase カラムを用いたクロマトグラフィーにより精製した . NIT01 株の前培養物を容量比 18％（最終細胞密度：1.2 × 107 cells/mL 程度）で接種した結果，8 日間で添加した TCE が cisDCE および VCを介してエチレンまで脱塩素化し，最終的に 1.2 × 108 cells/mL 程度の菌体密度を得た . 本培養物を遠心分離することで得た菌体ペレットの湿重量で 0.77g 程度であり , 小スケール培養物と同様に培養可能であることが示された .RDh の抽出精製について検討した結果 , 界面活性剤として DDM を用いた場合で最も脱ハロゲン化活性の収率がよく 2 種のクロマトグラフィーでおよそ 1
本の SDS-PAGE バンドが観察される状態まで精製可能であった .

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P2-38

新規海洋性 DMSO 分解細菌
○石丸 悟 1, 木村 一平 2, 賀川 一郎 2, 長谷川 尚哉 2, 布施 博之 2
芝浦工大・院 , 2芝浦工大

1≪背景・目的≫海洋で生産される硫化メチル (DMS) が地球規模での硫黄循環において重要な役割を果たしている。海水中で生産した DMS の多くが微生物によって分解されていると考えられているが、その分解材料は未解明の点が多い。海水中で DMS

は DMSO と相互に変換しており、一般に DMSO の濃度の方が高い。そこで当研究室では DMS 及び DMSO を資化する微生物を海水から単離し、それらの菌について研究を行ってきており、Methylophaga 属に近縁な 3 株についてその性状の報告を行ってきた。( 第 31 回本学会大会、環境微生物系学会合同大会 2017) 今回与那国島近海の海泥試料から DMSO を資化する yona 株を単離できたことから、これについて報告する。

≪方法≫ DMS、DMDS をガスクロマトグラフィーにて、硫酸イオン、チオ硫酸、テトラチオネートを吸光光度法にて測定した。
≪結果・考察≫ 16S rRNA 遺伝子解析の結果から標準株の Thiohalobacter thiocyanaticus と 93 % の相同性を示した。新属新種の菌の可能性が高い。pH6-8 の範囲で生育を確認し、pH7.5 の条件下で最も早く生育が見られた。15-37℃の範囲で生育が確認され、25 ℃の条件下で最も早く生育した。 NaCl 濃度 0.045-0.45 M( 天然海水比 0.1 倍、0.5 倍、等倍 ) の範囲で生育が確認できたが、生育速度に差は見られなかった。NaCl 無添加では生育は見られなかった。生育基質としては DMS、DMSO、ピルビン酸、
DMSP、酢酸で生育が可能であったが、メタノール、アミン類 (MMA、DMA、TMA) では生育が確認できなかったが。DMSO の代謝産物として DMS と硫酸イオンが確認できたが DMDS、チオ硫酸、テトラチオネートは検出されなかった。このことから、この菌は DMSO をはじめに DMS に還元した後に硫酸イオンにまで変換すると推定された。今後はドラフトゲノムの解析を行い、DMSO の代謝関連遺伝子の解析を行っていきたい。

P2-39

新規海洋性プロピレン資化性菌○山嵜 一輝 1, 滝田 園子 2, 立林 日向子 2, 布施 博之 2
芝浦工業大・院 , 2芝浦工大

1

非メタン炭化水素（NMHC）は、植生や燃料の燃焼などを発生源とし環境中に存在し、化学物質の生産や大気中の炭素循環に重要な役割を果たしています。NMHC は反応性が高いため、ヒドロキシルラジカルを吸収し、対流圏でのオゾンの生成と破壊に重要な役割を果たし、大気中で起こる光化学反応に影響を与える。NMHC の中でも特にエチレンやプロピレンなどの短鎖アルケンは、重要な化学原料であり、植物や微生物だけでなく、他の天然および人工の発生源によっても環境に放出される。したがって、短鎖 NMHC の微生物分解は、地球規模の炭素循環にとってきわめて重要であるとされ、バイアオレメディエーショ
ンへの応用へ期待される。当研究では短鎖炭化水素資化性菌に関して研究を行っており、プロピレン資化性菌である Halliea

属近縁の PE-TB08W 株について報告されている。今回当研究室では、新規プロピレン資化性菌を取得することができたことか
ら、その性状に関して報告を行う。日本沿岸の海水より、プロピレンを基質として単離を行った結果、yui 株、bigsight 株を取得した。これらをダイレクトシーケンス法を用いた結果、yui 株がPorticoccus hydrocarbonoclasticus MCTG13d と 99.8% の相同性を示した。bigsight 株はPorticoccus hydrocarbonoclasticus MCTG13d と 95% の相同性を示した。また、初発酸化酵素遺伝子に関しては、全ゲノム解析の結果、可溶性のモノオキシゲナーゼ（SDIMO）のみ所持していることが分かった。yui 株及びbigsight 株の VOC 分解能試験結果、1,1- ジクロロエチレン、ジクロロメタン、cis-1,3- ジクロロプロペン、trans-1,3- ジクロロプ

ロペンの 4 種類の VOC に対する分解能を有することが分かった。生育としては、bigsight 株は pH7.0~7.5 で生育、生育基質としては、アセトンを用いることができる。また、アセトン、ピルビン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、プロピレン、2- ブタノー
ル、1- ブテン、エタノール、n- ブタン、1- プロパノールを用いることができる。

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P2-40

鉄に富む淡水堆積物中での嫌気的メタン酸化○柳川 勝紀 1, 菊池 早希子 2, 白石 史人 3, 狩野 彰宏 4
北九州市立大学 , 2JAMSTEC, 3広島大学 , 4東京大学

1

E-mail: kyanagawa@kitakyu-u.ac.jp

嫌気的メタン酸化（AOM）は，海水環境のみならず淡水環境でも重要なメタンシンクとして考えられている．海水環境では

AOM を担う嫌気的メタン酸化アーキアとして，ANME-1 から -3 のサブグループが，淡水環境では主に AAA (AOM-associatedarchaea）が関与する．淡水環境での AOM では，硝酸塩，硫酸塩，鉄 (III)，マンガン (IV) といった電子受容体が利用されるという報告があるが，多くが集積培養系からの考察に基づくものであり，自然環境中で実際に働く電子受容体の寄与や AOM を担う系統群に関する知見は少ない．本研究では，溶存鉄に富む湧水域近傍の堆積物中で期待される AOM に焦点を置き，生物地球化学的研究を実施した．堆積環境ではメタンと溶存鉄が高濃度で含まれており，硝酸塩や硫酸塩はほとんど検出されなかった．
鉄 (III) に依存的な代謝を想定し，14C トレーサーを用いて，嫌気条件下でのメタン分解活性を測定したところ，0.9 pmol/cm3/

day の反応速度が示された．AAA に属する系統は微生物群集の 5% ほど存在しており，対応する mcrA も検出された．さらに，
定量 PCR で mcrA の分布を調べたところ，堆積物表層で最大値が示された．以上の結果より，水酸化鉄の供給が顕著な表層堆積物では，AAA による鉄依存的なメタンサイクルが活発であることが示唆された．

P2-41

メタン排出量の異なる 2 種類の水田土壌のメタン生成活性とメタン酸化活性の比較○酒井 順子 1, 常田 岳志 1, 上薗 一郎 2, 酒井 英光 1
農研機構・農環研 , 2鹿児島農総セ

1E-mail: kyoriko@affrc.go.jp[ 背景と目的 ] 水田は農業分野における主要なメタン排出源の一つであり、メタン排出量の低減が求められている。新たなメタン排出低減法の作出を目的として、メタン排出量の大きく異なる 2 種類の水田土壌のメタン発生・抑制メカニズムの解明を行う。本研究ではその第一段階として、ガスフラックスと微生物活性の両面からメタン生成活性とメタン酸化活性を比較した。

[ 方法 ] 鹿児島県農業開発総合センターのメタン多量排出水田と国内平均量排出水田の作土層土壌を採取し、農研機構農業環境

変動研究センターにおいて水稲（ヒノヒカリ）をワグネルポット（1/2000a）で 5 週間栽培した。対照として水稲無栽培区を設けた。土壌二価鉄量（酢酸緩衝液抽出）とポーラスカップで採取した土壌水の溶存メタンおよび二酸化炭素の量を 1 週間ごとに調査した。また移植後 3 週目と 5 週目にチャンバー法でメタンフラックスを測定した。メタンフラックス測定時には、水稲栽培ポットにメタン酸化阻害剤（ジフルオロメタン）を処理し、無処理との差からメタン酸化能と生成能を算出した。たん水前、移植後 3 週目および 5 週目の土壌、試験終了時の水稲根から DNA と RNA を抽出し、定量 PCR 法で細菌と古細菌の rDNA、およびメタン生成遺伝子mcrA とメタン酸化遺伝子 pmoA の存在数と発現量を計測した。

[ 結果と考察 ] 作土層土壌を用いたポット試験において、メタン多量排出水田土（多量土）と平均量排出水田土（平均土）でメ
タン排出量とメタン生成遺伝子発現量に大きな差が検出され、メタン多量排出の要因の少なくとも一部は作土層土壌にあることが示された。メタン酸化活性は、メタンフラックス解析およびメタン酸化遺伝子解析の双方において多量土で高く、メタン

酸化活性の低いことがメタン多量排出の要因ではないと判断された。水稲を栽培しない場合でも、土壌水溶存メタン濃度とメタン生成遺伝子発現量は多量土が平均土を上回り、植物との相互作用の違いが多量排出の主因ではないことが示唆された。多量土では平均土に比べて細菌と古細菌の rDNA 発現量及び CO2 排出量の多いことに加えて、二価鉄の生成が速やかに進み還元状態に至るまでの期間が短かった。すなわち多量土では平均土に比べて微生物全体の活性が高いために、有機物の低分子化と土壌の還元化が急速に進み、その結果として多量のメタンが排出されると考えられた。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meetingP2-42

手のひらとスマートフォン表面の菌叢比較解析○吉原 静恵 1, 中上 奈都美 2, 木村 恒介 3, 幡鉾 威吹 3, 倉橋 健介 3, 徳本 勇人 1
阪府大・院理 , 2阪府大・生命環境 , 3阪府大高専・環境物質科学

1E-mail: yoshihara@b.s.osakafu-u.ac.jp【目的】人間の体には様々な細菌が存在しており、部位特異的な菌叢が盛んに解析されている。先行研究によって、手のひらに定着している常在菌叢に手洗い方法や洗浄剤が与える影響を解析した結果、健康な手のひらに存在する常在菌叢は、水による手洗い、洗剤による手洗いの影響を受けないことを明らかにしている。しかし、手のひらと、手で触れる接触物表面の菌叢に関する知見は少ない。本研究では、手のひらと頻繁に触れるスマートフォン表面に存在する菌叢を解析することにより、手のひら常在菌叢と接触物の菌叢との相関性を解析した。【方法】手荒れや傷のない健康な手のひらと、被験者が保有するスマートフォンの表面に存在する常在菌叢をスワブ法により回収した。菌叢の DNA を MORA-EXTRACT を用いて抽出した後、16S rRNA遺伝子の V1-V2 領域を標的として PCR により増幅し、次世代シーケンサーを用いた菌叢のメタゲノム解析を行った。得られた配列情報の解析には、16S rRNA 解析のアプリケーションのひとつである QIIME を用いた。さらに、Operational Taxonomic
Unit (OTU) 配列を用いて 16S rRNA 配列データベースに対して BLAST 検索を行い、最も高い相同性を示す全長 16S rRNA 配列を抽出して系統解析を行った。【結果および考察】手のひらとスマートフォン表面から、それぞれ約 10 万リードの配列情報が得られた。QIIME を用いて V1-V2 領域の OTU 配列をもとに系統解析を行い、菌叢を属レベルまで分類した。その結果、スマートフォン表面には、健康な手のひらの常在菌として検出される Staphylococcus、Clostridiale、Bacillaceae、Veillonellaceae などの菌叢が検出された。これらの結果から、皮膚の常在菌叢が接触物に伝播すること、さらに無機的な物質の上でも常在菌は維持されることが明らかになった。今後、抗菌性材料の開発において、皮膚の常在菌として単離されている菌の付着性、定着性などを調べることにより、抗菌性の評価につなげることができると期待される。

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手のひら常在菌叢の構造解析とその評価
木村 恒介 1, 中上 奈都美 2, 幡鉾 威吹 1, 吉原 静恵 3, 倉橋 健介 1, ○徳本 勇人 31

阪府大高専・環境物質科学 , 2阪府大・生命環境 , 3阪府大・院理

E-mail: k-kurahashi@osaka-pct.ac.jp【目的】一般に、皮膚に存在する菌は常在菌と通過菌に大別でき、通過菌は伝染性膿痂疹（とびひ）や食中毒などを引き起こ
すものが多く含まれるのに対して、常在菌が存在すると通過菌の増殖が抑制され、身体が保護されることが知られている。本

研究では、手のひらの常在菌叢をメタゲノム解析し、健康な手のひらに定着する菌叢を同定した。また、比較として、手洗い
後の手のひらに定着する菌叢を解析し、手のひらの常在菌叢としての評価方法の検討を加えた。そこで、次世代シーケンサー

解析で得られる 16S rRNA の部分配列をもとに全長 16S rRNA 配列を予想することによって、菌叢の種レベルでの分類を実施した。
【方法】洗浄剤を用いて、手のひらの洗浄を行い、風乾して 1 時間 30 分放置したものを定常状態とした。定常状態の手のひらを、流水で 30 秒洗浄したものを条件 1、洗浄剤で 15 秒、流水で 15 秒洗浄したものを条件 2 として洗浄した。被験者 3 人

に対し、手荒れや傷のない健常な手のひらからスワブを用いて菌叢を採取した。菌叢の DNA を MORA-EXTRACT を用いて抽出した後、16s rRNA 遺伝子の V1-V2領域を標的として PCRにより増幅し、次世代シークエンサーを用いた菌叢のメタゲノム解析を行った。得られた配列情報の解析には、16S rRNA 解析のアプリケーションのひとつである QIIME を用いた。Operational

Taxonomic Unit (OTU)配列を用いて 16S rRNA 配列データベースに対して BLAST検索を行い、最も高い相同性を示す全長 16S
rRNA 配列を抽出して系統解析を行った。
【結果および考察】各サンプルから、それぞれ10万リードの配列情報が得られた。
V1-V2領域の OTU 配列をもとに系統解析を行い、菌叢を属レベルまで分類した結果、手のひらの菌叢は被験者にかかわらずほ

とんど同じ菌叢構造を示し、個人差は非常に小さいことがわかった。また、手洗い前後についても、洗浄剤使用の有無にかか

わらずほとんど変化がなかったことから、本解析条件では手のひら常在菌叢は安定的に存在することがわかった。一方、OTU
配列をもとに抽出した全長 16S rRNA を再解析した結果、皮膚常在菌として知られている Staphylococcus 属を 12 の種に分類することができ、1 種は洗浄剤使用によって有意に減少することを見出した。

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P2-44

麹甘酒および乳酸発酵甘酒がデキストラン硫酸ナトリウム誘発性大腸炎
モデルラットの腸内細菌叢に及ぼす影響○井口 晃徳 1, 櫻井 美仁 1, 堀 沙織里 1, 山口 利男 2, 重松 亨 1, 久保田 真敏 1, 倉橋 敦 3, 小黒 芳史 3, 西脇 俊和 4,
相原 浩太郎 4, 佐藤 眞治 1
新潟薬大・応生科 , 2新潟薬大・薬学部 , 3八海醸造（株）, 4新潟農総研食研セ1E-mail: a_iguchi@nupals.ac.jp【目的】麹甘酒はその栄養価から滋養剤として古くから親しまれており、整腸効果や美肌効果、抗酸化活性を有するという報告がなされている。最近では麹甘酒の機能性向上、風味改善の目的で乳酸発酵を行った『乳酸発酵甘酒』も市販されている。本研究では麹甘酒と乳酸菌による整腸効果に着目し、麹甘酒と乳酸発酵甘酒がデキストラン硫酸ナトリウム (DSS) 誘発性大腸炎
モデルラットの腸内細菌叢に及ぼす影響を調査した。
【方法】試験試料として、米麹甘酒 ( 八海醸造製 )、Lactobacillus sakei strain Uonuma ( ウオヌマ株 ) で乳酸発酵を行った乳酸発酵甘酒、およびウオヌマ株 ( 殺菌 ) を用意し、それぞれ凍結乾燥を行ったものを AIN-93M 飼料に混餌した。供試動物として
Wistar 系雄性ラット (8 週齢 ) を用い、1 週間の馴化後、試験飼料を 4 週間摂餌した後、飲水を 2.0% DSS 含有蒸留水に切り替え 2週間飼養した。馴化後、摂餌後、飼養後の各群の糞便試料を回収し、16S rRNA 遺伝子アンプリコンシーケンス解析に供した。
【結果・考察】摂餌量および飲水量については、全期間において各群有意差が認められなかった。しかし Disease Activity Index
スコアは DSS 群で非 DSS 投与 (Normal) 群と比較して有意に高い値を示した一方、麹甘酒 (A) 群、乳酸発酵甘酒 (LA) 群およびウ
オヌマ株 (L) 群では DSS 群よりも低い値を示し、大腸炎に対する抑制傾向が認められた。腸内細菌叢解析の結果、馴化後および摂餌後の細菌叢は試験群によらず S24-7 科細菌が最も優占しており、次いでErysipelotrichaceae 綱 , Phascolarctobacterium 属 ,Lactococcus 属等に属する細菌が高頻度に検出された。飼養後では Normal 群を除くほとんどの試験群において Allobaculum 属
細菌が高頻度に検出され、S24-7 科細菌の検出頻度が低下した。飼養後の DSS 群および L 群においては S24-7 科細菌がほぼ検出されなかったが、A 群および LA 群では比較的検出される傾向が見られた。各試験群の腸内細菌叢を主座標分析に供したところ、飼養後の Normal 群と DSS 群のプロットが異なる位置にクラスターを形成していたが、A 群および LA 群のプロットはいずれもNormal 群のクラスターと近い距離に位置する傾向が見られた。このことから麹甘酒ならびに乳酸発酵甘酒の摂取は大腸炎モデ
ルラットの腸内細菌叢を発症以前の状態に維持できる可能性が示された。

P2-45

Distribution and phylogenic diversity of Campylobacter jejuni HS:19 inJapan○ Hiroshi Asakura1, Junko Sakata2, Satoru Akase3, Shiori Yamamoto1, Jun Kawase4Nat. Inst. Health Sci., 2Osaka Inst. Public Health, 3Tokyo Metropolitan Inst. Public Health, 4Shimane Pref. Inst. Public Health1Campylobacter jejuni is one of the leading foodborne pathogen that causes gastroenteritis in humans in the developed

countriesworldwide. Epidemiological data have mounted evidence that C. jejuni expressing certain classes oflipooligosaccharides (LOS) have potential to develop Guillain Barre Syndrome (GBS). C. jejuni categorized to HS:41, HS:19,

HS:23 are mainly considered to associate the development of GBS in western countries, while little is known about the
distribution of such C. jejuni subpopulation in foodborne infection cases in Japan. As was considered the much numbersof incidences of foodborne campylobacteriosis, this study thus aimed at investigating the distribution of representative HS

types of C. jejuni based on the foodborne statistic records including pathogen typing. The result showed the relative greater

proportion of C. jejuni HS:19 than other GBS-associated HS types such as HS:41, which were one of the main types in US and

EU. A total of 15 C. jejuni HS:19 strains were then genome-sequenced, revealing high genomic similarity of the HS:19 strains

regardless of their source and geographical differences, compared with the other HS types. In this support, sequence type ofthe former was identical. We are currently exploring the phenotype characterized by the HS:19 strains.

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P2-46

国内水冷塔のバイオフィルムおよび循環水における細菌叢のメタ 16S rRNA 解析○重松 奈公子 1, 齊藤 啓太 2, 山本 哲司 3, 菅井 由也 2, 西尾 正也 3, 矢野 剛久 1, 森本 拓也 1, 永井 智 1
花王（株）安全性科学研究所 , 2花王（株）生物科学研究所 , 3花王（株）ハウスホールド研究所

1E-mail: arima.naoko@kao.com【背景と目的】水冷塔は機能的・物理的観点から微生物が混入しやすく、その熱交換器内部にバイオフィルム（BF）を形成しやすい。BF が形成されると、レジオネラを始めとする危害菌の増殖や電気使用量の増加によるコストの増大を引き起こすため、その制御が求められている。BF 制御を考える上では、BF を形成する微生物叢を理解することが重要であると考えられる
が、水冷塔における BF 形成量と BF を形成する微生物叢との関連を検討した報告はない。そこで、水冷塔 BF 制御法を探索するため国内水冷塔における BF 形成およびその菌叢の実態を初めて網羅的に調査し、BF 形成量に寄与する因子およびその菌叢の特徴を検討した。【方法】花王工場にて稼働している水冷塔のうち冬期 27 機、夏期 36 機を用いて検討した。同水冷塔内に

SUS 板を沈め、SUS 板上に付着した BF 量を測定した。また、水冷塔循環水および BF を採取し、次世代シーケンサーを用いて

16S rRNA V3V4 領域情報に基づく菌叢解析を行った。水温、pH、塩素濃度および各種無機イオン濃度等の水質については、
水冷塔循環水を用いて測定した。【結果】水冷塔における BF 形成量は時期によらず一定であるが、BF が形成されやすい水冷
塔は冬期と夏期で必ずしも同一ではなかった。また、BF 形成量に寄与する因子を検討したところ、水冷塔における BF 制御には、塩素濃度を適正に保つことと有機物のコントロールが重要であることが示唆された。一方、水冷塔循環水および BF における菌叢を解析した結果、水冷塔循環水および BF の菌叢類似性は高かった。さらに、それらは Commamonadaceae, Bacillaceae,
Flavobacteriaceae の構成比により４つにクラスタリングされ、それらは水質によらないことが明らかとなった。

P2-47

嫌気性繊毛虫 GW7 株におけるメタン生成アーキア、バクテリアとの共生関係
竹下 和貴 1,4, 山田 尊貴 1, 川原 邑斗 1, 成廣 隆 2, 伊藤 通浩 1, 鎌形 洋一 2, 山崎 玲 1,3, ○新里 尚也 1,3
1

琉球大・熱生研 , 2産総研・生物プロセス , 3琉球大・理 , 4秋田県立大・生物資源

嫌気性繊毛虫の一部の系統では、しばしばメタン生成アーキアとバクテリアが細胞内に共生していることが報告されている。

このような 3 者間共生系は、宿主と共生者がそれぞれ異なるドメインに属している点においてユニークであり興味深い研究対象となっている。その一方で、嫌気性繊毛虫の培養株は極めて少なく、宿主繊毛虫と共生体との生理学的な関係性については多くが明らかとなっていない。当研究室では、2016年に沖縄県内の排水処理場より、Scuticociliatia 亜綱に属する新規な嫌気性繊毛虫として GW7株の培養に成功した。また、GW7株は 2 種の原核共生体を保持しており、その一つはMethanoregula 属の未同定メタン生成アーキアであり、もう一つは Alphaproteobacteriaに属する未報告種であった。現在、この未報告種に関して、“Ca . Hydrogenosomobacter endosymbioticus” という種名を提案している（Takeshita et al., in revision）。これらの共生体
はいずれも繊毛虫内においてプロトン還元により余剰還元力を処理する細胞内小器官であるヒドロゲノソームに密着して存在しており、水素等の共通の代謝産物に依存している可能性がある。そこで本研究では、両共生体の宿主繊毛虫への寄与を明らかにすることを目的に、メタン生成の特異的阻害剤であるブロモエタンスルホン酸（BES）とバクテリアの生育を広く阻害するテトラサイクリンを添加して両共生体を選択的に欠失させ、宿主繊毛虫への影響を代謝産物分析により評価した。その結果、いずれ場合も GW7株の生育が著しく阻害され、宿主繊毛虫の生育に両方の共生体の存在が不可欠である可能性が示唆された。
一方の代謝産物分析では、無処理では同定可能な有機酸は検出されず、テトラサイクリンを投与した系では、プロピオン酸が、BESを投与した系ではさらに酢酸が検出された。抗生物質を投与したことによる有機酸の蓄積は、共生体の欠失によって繊毛虫内の水素消費（余剰還元力処理）が滞ったことで基質酸化が十分に行えなくなり、中間代謝産物である有機酸が生成した可能性が考えられた。しかしながら、これらの共生体がいずれも水素消費に寄与しているかについては、今後詳細に検討していく予定である。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meetingP2-48

活性汚泥から単離されたN - アシルホモセリンラクトン分解細菌Roseomonas sp.
TAS13 の LuxR solo 機能解析
○奈須野 恵理 1, 遠藤 瑞歩 2, 加藤 紀弘 1
1

宇大・院地域創生 , 2宇大・工E-mail: e-nasuno@cc.utsunomiya-u.ac.jp【目的】当研究室で活性汚泥から単離されたRoseomonas sp. TAS13 は、グラム陰性細菌の Quorum Sensing (QS) 機構で主なシグナル物質として利用されているN -acylhomoserine lactone (AHL) の加水分解活性を有する。TAS13 株のドラフトゲノムからは、既知の AHL 加水分解酵素とアミノ酸配列相同性が高い複数のタンパク質だけでなく、LuxR 型の AHL レセプターが同定された。しかし、対になる AHL 合成酵素の遺伝子は存在しないことから、LuxR solo であることが示唆された。これまでに、
NCBI データベースに登録されている細菌ゲノムから同定された LuxR 遺伝子のうち約 80％は LuxR solo であることが明らかとなっているが、LuxR solo と AHL の相互作用解析はわずか数例しか報告されていない。そこで、本研究では TAS13 株の LuxR
solo を RotR と命名し遺伝子をクローニングしてアシル鎖長の異なる AHL に対する相互作用を解析することを目的とした。

【方法】TAS13 株ゲノム配列から RotR 増幅用プライマーを設計し、PCR 産物を MBP 融合タンパク質発現用ベクターに挿入してEscherichia coli DH5 αへ形質転換した。アシル鎖長が C6 ～ C12 の AHL を終濃度が 20 μ M となるよう添加した 300 mL の

LB 培地中で MBP-RotR を発現する遺伝子組換え大腸菌を振とう培養した (37℃ , 24 h)。遠心分離した培養液から回収した菌体ペレットを PBS buffer で 4 回洗浄し、RotR と相互作用していない AHL を除去した。洗浄後のペレットから酢酸エチルを用いて RotR-AHL 複合体を抽出し、薄層クロマトグラフィー (TLC) 法及び AHL レポーター株Chromobacterium violaceum CV026,
VIR07 を用いたバイオアッセイにより AHL を検出した。

【結果】アシル鎖長が C6 の AHL では RotR との親和性が確認できなかったのに対して、疎水性の強い C8 ～ C12 の AHL ではビオラセインの生産が誘導されたことから RotR-AHL の相互作用が示唆された。さらに、C10 の AHL と比較して疎水性の強い C12 の

AHL に対する RotR の親和性がより高いことが示唆された。RotR が AHL 以外のシグナル分子に応答する可能性も残されているが、今後さらに LuxR solo の知見が増えることで RotR と親和性のある AHL 以外のシグナル分子の情報が得られると期待される。

P2-49

種間相互作用が駆動する病原性細菌の適応進化動態：
進化実験アプローチによる解析○山本 京祐 1,2, 草田 裕之 1, 田村 具博 1,3, 鎌形 洋一 1, 玉木 秀幸 1,2,4
産総研・生物プロセス , 2筑波大・生命環境 , 3CBBD-OIL, 4東大・生セ

1

E-mail: k.yamamoto@aist.go.jp【背景・目的】緑膿菌Pseudomonas aeruginosa （PA）と黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureus （SA）は共に環境常在菌かつ重要な病原菌であり、自然突然変異や外来遺伝子獲得、バイオフィルム形成等によって薬剤耐性が容易に生じることから、院内感染等の原因菌として特に注意を要する菌である。両種はヒト慢性感染創においてしばしば共存し相互に排除し合う競合関係にあることから（例：PA による SA 生育阻害、SA による PA バイオフィルム形成阻害等）、両種間の相互作用が選択圧となりそれぞれの進化動態に影響を与えることで薬剤耐性等に繋がる様々な表現型の進化をもたらしている可能性がある。そこで本研
究では、モデル共培養進化実験系を用いて PA と SA の進化動態を解析することで、病原菌間の相互作用が進化の方向や速度に及ぼす影響を評価することを目的とした。

【方法・結果】緑膿菌 PAO1 株と黄色ブドウ球菌 Newman 株および Mu50 株を用いてそれぞれの純粋培養系および PA-SA 共培養系を構築し、静置条件下で約 3 週間継代培養（24h 毎に継代）を実施した。両種の生育と進化をそれぞれ生菌数とコロニー形

態変化を指標にモニタリングしたところ、PA は純粋培養系、共培養系どちらにおいても培養期間を通じて一貫して高い生菌数を維持し（109 cell/mL 程度）、培養開始 3~5 日程度でコロニー形態の変化した様々な進化株が現れ始め、それら進化株はその後集団内で優占化していった。一方 SA のコロニー形態変化はほとんどみられず、また、PA との共培養系では比較的小さな個
体群サイズのまま推移した（106~107 cell/mL 程度）。培養終了時の細胞集団から全ゲノムを抽出し、集団ゲノムリシークエン

シング解析によって各菌株の変異箇所を解析した。PA 集団ゲノムにおける変異箇所は c-di-GMP シグナリングや線毛合成系関連

遺伝子を中心に見出され、純粋培養系と共培養系とで大きな差はみられなかったが、SA 集団ゲノムでは PA との共培養系で病原性や薬剤耐性に関与することが知られる複数の遺伝子上に高頻度で変異がみられた。このように、病原菌の医学上重要な表

現型の進化に種間相互作用が寄与することが示唆された。発表では、単離した進化株の表現型試験の結果も合わせて議論する。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

P2-50

カブトムシ幼虫の腸内環境と微生物群集構造について○和田 典子 1, 岩淵 範之 1, 瀧原 速仁 2, 奥田 修二郎 2, 砂入 道夫 1, 岩田 隆太郎 1, 安齋 寛 1
日大・生資科 , 2新潟大院・医歯学

1E-mail: wada.noriko@nihon-u.ac.jp【目的】一般に森林において、落葉落枝として林床に供給される有機物は、土壌中の微生物や土壌動物などにより分解され循環利用されている。この物質循環への土壌動物の役割を明らかにするには、その腸内環境の物理化学的、生化学的な側面と共生微生物叢とを調査し、総合的に理解する必要がある。森林性昆虫であるカブトムシ ( Trypoxylus dichotomus ) 幼虫は、森林土壌を摂食・分解することで生育している。また、他の森林性昆虫の幼虫よりもサイズが大きいため、森林生態系中の物質循
環に与える影響が大きいと考えられる。そのため、森林生態系の中での物質循環に対する土壌動物の影響を調査するための格

好のモデル動物である。我々はこれまでに、カブトムシ幼虫の消化管を 10 分割し、それぞれの画分についての腸内環境の物
理化学的、生化学的条件を検討してきた。その結果、中腸に pH、カリウムイオンと酢酸の濃度に部位特異的な勾配があることを見出した。カブトムシ幼虫の消化管は基本的に高アルカリ性であるが、この中でも特に、中腸の部位、pH、カリウムイオン
濃度に高い相関があることを見出した。本研究では、これら特徴的な腸内環境中にどのような微生物が存在するのかを明らかするために各種解析を行った。【結果と考察】カブトムシ幼虫の消化管を 10 分割し、それぞれの画分から Total DNA を取得し、PCR-DGGE、Miseq 解析を行った。PCR-DGGE の結果、中腸と後腸ではその微生物叢が大きく異なることが示された。特に中腸では、中央部から終わりにかけて部位特異的に優占化している配列を見出した。本配列は、既知の配列とは高い相同性を示さない特徴的なものであり、この配列を GTD (Gut T. dichotomus) と名付け、その全長をクローニングした。続いて Miseq による

シークエンス解析を行い、消化管の各画分での GTD 配列の存在比を検討したところ、多くの画分で高い存在比を示し、GTD 配列を有する細菌が中腸で部位特異的に優占化していることが示された。また、GTD の次に存在比の高かった配列群にも、既知の配列と高い相同性を示すものは含まれなかった。以上の結果は、カブトムシ幼虫の中腸には多くの未知微生物が存在していることを意味しており、現在、当該細菌の単離や局所的な環境との関連性を検討している。

P2-51

カメムシが環境中から獲得する細胞内共生細菌のゲノム特性○竹下 和貴 1, 菊池 義智 2
秋田県大・生物資源 , 2産総研・生物プロセス

1

E-mail: kazu-t@akita-pu.ac.jp

多くの昆虫が体内に共生細菌を保持し緊密な相互作用を行っているが、共生の分子基盤や進化プロセスに関してはいまだ不明な点が多い。特に昆虫に広く見られる細胞内共生では、母から子へと共生細菌が受け継がれることから、極端に遺伝子流入機

会が低くボトルネック効果が高い。このため、共生細菌は独自の進化を遂げ、ゲノムが大幅に縮退してしまっている。次世代
シークエンス技術の発展とともに昆虫細胞内共生細菌の解読ゲノム数は増加しているものの、近縁といわれる自由生活性細菌のゲノムとは 10 倍程度もサイズ差があり、ゲノム比較から共生細菌へと至る進化プロセスに迫ることは困難である。植食性カ

メムシ（カメムシ下目）の中でもホシカメムシ上科、ヘリカメムシ上科、ナガカメムシ上科に属する多くのカメムシ類は、毎世代環境中からBurkholderia 属の細菌を獲得し、消化管後端部に発達させた袋状組織（盲嚢）の内腔に保持する「環境獲得型の腸内共生」を築いている。我々は最近、コバネヒョウタンナガカメムシ（ナガカメムシ上科・ヒョウタンナガカメムシ科）やオオホシカメムシ（ホシカメムシ上科・オオホシカメムシ科）において、環境中から獲得された共生細菌が盲嚢内腔だけでなくその上皮細胞内にも侵入し細胞内共生していることを発見した。他の昆虫では例を見ないこの「環境獲得型の細胞内共生」
は、細胞内共生関係が成立してからまだ日が浅いためか、共生細菌の単離培養が容易であり、昆虫における細胞内共生の分子

基盤や進化プロセスを理解する上で最適な研究対象であるといえる。本発表では、コバネヒョウタンナガカメムシとオオホシ
カメムシそれぞれの細胞内共生細菌について完全ゲノムを決定したので報告する。予想通り、これら細胞内共生細菌ゲノムは他の昆虫細胞内共生細菌と比べてサイズがはるかに大きく、近縁の自由生活性細菌と比べてもゲノムの縮退は起きていなかった。これら細胞内共生細菌ゲノム間やホソヘリカメムシの腸内共生細菌ゲノム、近縁の自由生活性細菌ゲノムとの比較解析結果にも触れ、環境獲得型の細胞内共生細菌についてそのゲノム特性を炙り出す。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

P2-52

トカラ列島におけるヤマトシロアリ属のシロアリと共生原生生物組成○北出 理 1, 石神 広太 2, 嶋田 拓也 2, 野田 悟子 3
茨城大・理 , 2茨城大・院理工 , 3山梨大・生命環境

1

E-mail: osamu.kitade.sci@vc.ibaraki.ac.jp

シロアリ類はその後腸内に、副基体類・オキシモナス類に属する共生原生生物の群集を保有し、群集の種構成は基本的に宿主種に特異的である。これは宿主と嫌気性原生生物の緊密な共生関係と、コロニー・世代間での伝達様式を反映するものと考えられる。 ヤマトシロアリ属Reticulitermes のシロアリは、日本列島では北海道南部から八重山諸島にかけて 7 種が分布する。
これらの種では、宿主種ごとに原生生物の基本的な種組成が一定であること、群集構成種の類似性が地理的分布と対応し、とくに屋久島と奄美大島の間に最大の組成の差があること、が示されている。この２島の間に存在するトカラ列島には 7 つの有人島が含まれる。トカラ列島域は、動物地理学上の旧北区と東洋区の境界（渡瀬線）がある場所に相当し、その南北ではシロアリに限らず、多くの動物分類群の組成に大きな差が見られる。トカラ列島にヤマトシロアリ属が分布することは報告されているが、詳しい種と共生原生生物の組成については不明確であった。

本研究では、2018 年 12 月と 2019 年 5 月にトカラ列島の口之島、中之島、諏訪之瀬島、悪石島、宝島の 5 島を調査し、本属のシロアリのコロニーを採集した。採集したコロニーはソルジャーの形態の観察、宿主の腸内容物の鍍銀染色標本を作成と観察を行った。さらに計 26 のコロニーについて、各 5 個体のシロアリの後腸内容物中の共生原生生物を生きた状態で検鏡し、種組成とその変異を調査した。

調査を行った 5 島のうち、北部の口之島・中之島・諏訪之瀬島では北方系のヤマトシロアリR. speratus と南方系のアマミシロアリ R. amamianus の２種

が、南部の悪石島と宝島からは南方系のアマミシロアリのみが採集された。トカラ列島は両系統の分布の移行域になっていると考えられる。ヤマトシロアリの原生生物組成は基本的にトカラ列島外と共通する組成であったが、コロニーレベルでの特定の種の欠損が比較的多かった。またアマミシロアリでは、中之島を除く 4 島の個体群で、日本産宿主ではヤマトシロアリだけ
から見つかっている原生生物種Trichomonoides sp. が確認された。これまでの知見を総合し、ヤマトシロアリ属の宿主系統と共生原生生物組成の対応、シロアリの交雑と原生生物の種間感染の可能性についても議論する。

P2-53

シロアリ腸内から分離された新規Paraburkholderia 属細菌 2 種の比較解析○雪 真弘 , 高島 昌子 , 清水 美智留 , 加藤 真悟 , 大熊 盛也
理研 BRC・JCM

E-mail: masahiro.yuki@riken.jp
シロアリは木材を効率的に分解することで知られている。この高効率の分解を担っているのは、腸内に共生する微生物であることがメタゲノム解析やメタトランスクリプトーム解析から推定されている。しかし、シロアリ腸内共生微生物の多くが難培養性であるため、実際の木材分解能に関する生化学的解析を行うことは非常に困難である。特に、木材の主成分であるリグニンの分解に関しては、これまでのメタゲノム、メタトランスクリプトーム解析からも詳細はわかっていないのが現状である。
本研究では、リグニンの分解に関わるシロアリ腸内細菌の分離を目指し、芳香族化合物を含む培地を用いて分離培養を試みた。

イエシロアリの腸管を前腸、中腸、後腸に分画し、各腸内内容物を芳香族化合物含有寒天培地に撒き、好気条件で培養した。
その結果、前腸と後腸から２種の新規Paraburkholderia 属細菌 Fg33 株、Hg4 株の分離に成功し、イルミナ MiSeq とナノポア

テクノロジー MinION を組み合わせたゲノム解析を行った。Fg33 株のゲノムは 3.8 Mb, 2.4 Mb, 0.9 Mb の 3 本の環状染色体から構成され、Hg4 株は 3.2 Mb, 1.7 Mb, 1.1 Mb, 1.1 Mb の 4 本の環状染色体から構成される。この配列から得られた Fg33 株、Hg4 株の 16S rRNA 遺伝子はともに、分離培養されている株ではParaburkholderia phymatum に相同性 96% で最も近縁であった。Average Amino acid Identity (AAI) を用いて Fg33 株、Hg4 株とP. phymatum の比較した結果、それぞれ 72.2%、72.5% であった。両菌株はリグニン由来の芳香族化合物分解に関連する遺伝子を有しており，低分子性リグニンを資化できることが確認された。今後は、高分子性リグニンの分解能力を明らかにし、シロアリ腸内の高効率のリグノセルロース分解への寄与を解明する。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

P2-54

原生生物細胞内共生Endomicrobium 属細菌の宿主環境への適応進化による基幹代謝系の改変
伊澤 和輝 1, 雪 真弘 2, 吉岡 拓哉 1, 桑原 宏和 1, 大熊 盛也 2, ○本郷 裕一 1,2
1

東工大・生命理工 , 2理研 BRC-JCM

E-mail: izawa@bi.c.titech.ac.jp

Endomicrobium 属細菌（Elusimicrobia 門）は下等シロアリ腸内に優占種群として存在し、多くの種は特定の木質分解性
原生生物種の細胞内に絶対共生している。ヤマトシロアリ腸内原生生物Trichonympha agilis の細胞内共生体である "Ca .
Endomicrobium trichonymphae" Rs-D17 系統のゲノム解析（Hongoh et al 2008 PNAS; Izawa et al. 2016 GBE）によると、同細菌系統はグルコース 6 リン酸とウロン酸を宿主細胞質から取り込み、水素、酢酸、エタノール、二酸化炭素へと嫌気的に発酵すると予測され、共生体としての役割は木質に不足するアミノ酸と補酵素類の合成・供給であると考えられている。今回我々は、新たにシロアリ腸内原生生物細胞内共生Endomicrobium 属細菌 5 種の完全長あるいはドラフト・ゲノム配列を取得し、上記の Rs-D17系統とシロアリ腸内自由生活型細菌であるEndomicrobium proavitum を含めた比較ゲノム解析を行った。その結果、いずれも多種のアミノ酸・補酵素合成経路を保持しており、共生体としての役割は同様であると予測されたが、解糖系及び発酵経路において大きな差異が見出された。特に、グルコース 6 リン酸とウロン酸の利用比率、発酵産物の種類とその産物量の予想比率等が各種間で異なると推定しており、宿主原生生物細胞の環境の相違との関連を考察する。

P2-55

沖縄微生物ライブラリーを利用した植物病原糸状菌の抑制（２）○上野 誠 1,3,4, 田村 朋子 2, 権藤 由理 3, Ganphung Rattrikorn4, 新里 尚也 5, 伊藤 通浩 5島根大・生資 , 2元島根大・生資 , 3島根大・自然科学 , 4鳥大院・連農 , 5琉球大・熱生研

1E-mail: makoto-u@life.shimane-u.ac.jp

沖縄微生物ライブラリーには、亜熱帯地域である沖縄県内の島々で分離された微生物が保存されており、植物病原菌の防除に利用可能な微生物が存在する可能性がある。実際に沖縄微生物ライブラリーからは、植物病原糸状菌（イネいもち病菌、キュウリ褐斑病菌及びマンゴー炭疽病菌）に対して抑制効果を示す複数の微生物がスクリーニングされた。前回の大会（第 32 回
大会）では、沖縄微生物ライブラリーに保存されているStreptomyces erythrochromogenes と高い相同性を示す 3-45 菌株やStreptomyces levis と高い相同性を示す 4-27 菌株が、特殊な培養により、イネいもち病菌の付着器の異常な拡大の誘導及び付着器のメラニン化を抑制する物質を菌体内に生産し、イネ植物体上でもイネいもち病菌の発病を抑制することを報告した。また、菌体抽出液中に生産される付着器の異常な拡大の誘導及びメラニン化を抑制する物質は高分子で熱安定な糖や脂質を含む物質である可能性が示された。今回、イネいもち病菌のメラニン合成遺伝子の発現をリアルタイム PCR により調査した。その結果、3-45 菌株及び 4-27 菌株の菌体抽出液のイネいもち病菌への処理は、メラニン合成遺伝子の発現を抑制した。一方、S.

levis である NBRC15423 は、イネいもち病菌の付着器の異常な拡大とメラニン化の抑制を誘導したが、S. erythrochromogenes

で あ る NBRC3304 菌 株 の 菌 体 抽 出 液 で は、 そ れ ら は 誘 導 さ れ な か っ た。 さ ら に、3-45 菌 株 及 び 4-27 菌 株 の 菌 体 抽 出 液の他の植物病原糸状菌に対する影響を調査した。その結果、3-45 菌株及び 4-27 菌株の菌体抽出液は、イネごま葉枯病菌（Cochliobolus miyabeanus ）、キュウリ褐斑病菌（Corynespora cassiicola ）及びキュウリ炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare ）の発芽管の先を球状に膨潤させ、イネ（品種：コシヒカリ）及びキュウリ（品種：北進）での植物体への感染を抑制した。これらの結果は、3-45 菌株及び 4-27 菌株の菌体抽出液中の物質が、イネいもち病菌だけでなく、複数の植物病原糸状菌の発芽先端部を球状に膨潤させ、植物体への感染を抑制できることを示した。現在、イネいもち病菌を用いて、付着器の異常な拡大やメラニン化の抑制に関わる菌体抽出液中の物質の同定とその作用機構について調査中である。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meetingP2-56

トマトかいよう病菌を用いた乳酸菌のスクリーニング○乙黒 美彩 1, 柴谷 浩平 1, 山村 英樹 2, 早川 正幸 2, 柳田 藤寿 1
山梨大院・ワイン研 , 2山梨大院 ･ 生命環境学域

1E-mail: motoguro@yamanashi.ac.jp【目的】トマトかいよう病はグラム陽性菌のClavibacter michiganensis subsp. michiganensis を原因菌とした細菌性植物病害であり，種子伝染，接触伝染，土壌伝染をすることが知られている．本研究では，トマトかいよう病菌に対して抗菌活性を有す
る乳酸菌のスクリーニングを行い，土壌中での乳酸菌の施用効果を調査することを目的とした．【材料および方法】試験乳酸菌株は当研究室で 2009 年に京漬物から分離・保存した乳酸菌と比較対象菌としてバクテリオシン生産菌のLactococcus lactis

subsp. lactis NBRC 12007 の 計 180 株 を 用 い た． 被 試 験 菌 株 はC. michiganensis subsp. michiganensis 3 株 (MAFF 301040,

MAFF 301041, NBRC 13762) を供試した．アガーウェル拡散法を用いてスクリーニングを行った．抗菌性が認められた分離株については 16S rDNA 解析，recA 遺伝子解析から同定を行った．一部の分離株については，殺菌土壌に乳酸菌分離株とC. michiganensis を接種し，各菌数を計測することで，土壌への施用効果および施用方法を検討した．【結果および考察】Lac.

lactis NBRC 12007 はC. michiganensis 3 株に対して抗菌活性を有していた．一方、乳酸菌保存株 23 株はC. michiganensis

MAFF 301041 または NBRC 13762 に対してL. lactis NBRC 12007 と同程度の活性が認められた．これら 23 株は 16S rRNA 遺伝子配列解析の結果Lactobacillus plantarum グループと同定した．さらに recA 遺伝子解析から 20 株が Lactobacillus plantarumに，2 株がL. paraplantarum ,1 株がL. pentosus と同定した．C. michiganensis に汚染された土壌に乳酸菌分離株 068-3 株を添加すると 12 日後の土壌中のC. michiganensis は有意に減少しており，068-3 株の効果が認められた．

P2-57

Pseudomonas 属植物保護細菌における二次代謝物産生能間調節機構○染谷 信孝 1, 竹内 香純 2, 諸星 知広 3
農研機構・野花研 , 2農研機構・生物研 , 3宇都宮大・院工1E-mail: someyan@affrc.go.jp

Pseudomonas 属は様々な環境に生息するグラム陰性細菌である。本属は約 190 種で構成され、多くの種は土壌、水圏および動植物周辺などで腐生的生活環を送るが、一部の種は動植物病原体として知られる。土壌または植物周辺で生息する非病原性

種中には、植物近傍に定着すると結果的に植物病害を抑えるものが存在し、このような能力を有する細菌を近年では植物保護細菌と呼ぶ。Pseudomonas 属では、Pseudomonas protegens および Pseudomonas chlororaphis 種に属する多くの菌株が植物保護細菌として認められている。これらの植物保護細菌は抗菌性二次代謝産物を産生して植物病原体の生育を阻害する。P.

protegens および P. chlororaphis 両種が共通して産生する抗菌物質として、Hydrogen cyanide（HCN）および Pyrrolnitrin（PRN）がある。一方でP. protegens のみが産生する抗菌物質として、2,4-diacetylphloroglucinol（PHL）および pyoluteorin（PLT）、P.

chlororaphis のみが産生する抗菌物質として phenazines（PHZ）がある。両種における抗菌物質産生は、環境条件によって変動する他、全ての物質が同時に産生されることはない。一部の抗菌物質間については互いの生合成を抑制する調節機構が判明している。本研究では両種におけるそれぞれの抗菌物質産生能が他の表現形質に与える影響を解析した。その結果、特定の抗菌物質産生能の欠失が他の抗菌物質産生能を含む様々な表現形質の発現に影響を与えており、特定の二次代謝産物産生能が相互的に調節し合っていることが分かってきた。細菌の二次代謝産物はスクリーニングの経緯等から抗菌物質や毒素として見出されてきたが、その多くは本来の生理的役割、生合成能力の獲得や進化的経緯などが明らかになっていない。人間の農業活動において有益な存在である植物保護細菌における二次代謝産物産生能の役割について検討してみた。

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P2-58

木喰いガニ消化管の微生物群集構造解析－リグニン・セルロース分解機序の解明－○馬場 保徳 1, 後藤 暢宏 1, 楠部 孝誠 1, 河井 重幸 1, 三宅 克英 1,2
石川県立大学・生物資源研 , 2名城大・理工1E-mail: ybaba@ishikawa-pu.ac.jp【背景・目的】
セルロースおよびリグニンは，地球上に最も多く存在する天然高分子であり，難分解性である。とくに，嫌気下では分解され難く，これらを含む紙類や野菜残さの可溶化が，メタン発酵の課題として残されており，効果的な前処理法の開発が望まれている。そこで私たちは，メタン発酵前処理への応用を目ざして，落ち葉・木片を食べるアカテガニの消化管に着目し，そのリ
グニン・セルロース分解酵素活性および消化管細菌の群集構造を解析してきた。本発表では，あらたに解析した消化管真菌の群集構造解析の結果をあわせて，アカテガニにおけるリグニン・セルロース分解機序を考察したい。
【方法】
微生物群集構造解析は，カニの消化管内容物から DNA を抽出し，16S rDNA および ITS 領域を増幅した後，次世代シーケンサー
Miseq に供した。得られた配列情報は QIIME software により解析した。セルロースおよびリグニン分解微生物の分離は，好気もしくは嫌気条件下にて，CMC ー congo red およびリグニン試薬を寒天培地に添加し，これらにハロが形成されることを指標に実施した。
【結果・考察】消化管細菌および真菌の群集構造解析の結果，リグニンおよびセルロース分解性好気性真菌と，セロビオース，単糖および芳香族化合物を利用する好気性細菌が検出され，嫌気性微生物はほとんど検出されなかった。一方，別稿で報告した宿主の RNAseq の結果，宿主自身もリグノセルロース分解に関与することが示唆された。以上より，カニ消化管内では，宿主自身の酵素および好気性真菌によりリグノセルロースの分解がおき，細菌はその分解物を利用しているものと考えられた。また，群集構造解析の情報に基づき，好気性培地を用いることで，本研究で検出されたリグノセルロース分解性真菌を分離することにも成功した。一方，分離源が消化管にもかかわらず，嫌気性リグノセルロース分解微生物はまったく分離されず，この結果は次世代シーケンスで得た解析結果と矛盾しなかった。今後は，本研究で得られた集積培養および分離株を，メタン発酵前処理に利用
し，リグノセルロースからのメタン発酵効率化を目ざす。

P2-59

ヤマトシロアリ腸内に共生する原生生物の多様性と機能の解析○西村 祐貴 , 佐藤 渚 , 大熊 盛也
理研・BRCE-mail: yuki.nishimura@riken.jp
シロアリの腸内には多種多様な細菌・古細菌・原生生物からなる複雑な微生物叢が存在しており、シロアリの生存に必須の役割を果たしていることが古くから知られている。しかし腸内を構成する微生物のほとんどは培養することができないため、その詳細な機能については未解明である。近年になって一部の細菌種では培養を介さない実験手法によってゲノムが解読され、窒素固定やアミノ酸合成、還元的酢酸生成を通して共生系に貢献していることが示された。しかし腸内微生物叢の体積の大半を占める原生生物については、個々の微生物種の機能はもとより、その集団構造も不明瞭であるのが現状である。

ヤマトシロアリReticulitermes speratus は日本国内に広く分布するシロアリ種であり、形態に基づく分類により 13 種の原生生物が報告されている。しかし分子配列を使った現代的な手法による研究例が少なく、腸内原生生物の多様性は過小評価されているだろうと予測されている。そこで我々はヤマトシロアリにおける腸内原生生物叢の全体像を明らかにするために、アンプ
リコンシーケンスやシングルセル PCR、シングルセルトランスクリプトームから得られたデータを用いて、群集構造解析と系
統解析を行なった。その結果、幾つかの形態種が複数の phylotype を含むことや、属レベルでの分類の見直しが必要であることが判明した。現在はヤマトシロアリ腸内原生生物の全 phylotype に対して、シングルセルまたは数個の細胞を出発材料としたトランスクリプトームを行うことを目指して研究を進めている。発表ではその進捗と、これまでに明らかとなった個々の原生生物の機能を報告する予定である。

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P2-60

RNA-seq データが示す共生状態への移行に伴う褐虫藻の変化－光合成・アンモニア利用効率 UP －○湯山 育子 , 宇川 尚登 , 小林 祐介 , 橋本 哲男
筑波大・生命環境
サンゴ - 褐虫藻の共生のメカニズムは、サンゴの白化現象にも関連するため多く研究されている。しかし、その共生が成立する際の褐虫藻側の変化についてはほとんど分かっていなかった。本研究では、サンゴ - 褐虫藻共生系の共生が成立する過程において褐虫藻側の変化を明らかにすることを目的として、褐虫藻培養株 Durusdinium trenchii のトランスクリプトームデータ（リード）を取得した。培養株由来のトランスクリプトームデータと、D. trenchii がサンゴに共生した後のトランスクリプトー
ムデータを比較することで、褐虫藻が非共生状態から共生状態へ移行する際の遺伝子発現変化を捉えた。

まず、D. trenchii の培養株から RNA を抽出し、RNA － seq（Hiseq4000 生物技研で実施）を行い、D. trenchii 由来の遺伝子配列セットを得た。その際、Hiseq により得られたリードをアセンブルし、タンパク質コード領域をもつ配列を得た後、既存の褐虫藻由来の配列と高い相同性をもつ遺伝子を抽出した。その結果、25,069 個の遺伝子配列がD.trenchii 由来と推定された。さらに培養株由来のリード、サンゴ共生体由来のリードをそれらの遺伝子配列にマップし、各配列のそれぞれの条件（培養株と共生体）における発現量を推定した。edgeR による検定（FDR ＜ 0.05）の結果、共生開始後 20 日目の共生体で、発現上昇する遺伝子が 395 個、減少する遺伝子が 1,108 個得られた。変動する遺伝子が多いため、発現変動の程度で順位付けし、その上位に該当する遺伝子にまず注目した。発現上昇する遺伝子のうち、上位 1％以内には、光合成系のタンパク質やアンモニア輸送体が複数検出され、発現減少する上位 1％以内には、アクチンや熱ショックタンパク質が検出された。現在、オリジナル RNA-seq
データをブートストラップリサンプルしたデータセットをもとに、より詳細な統計解析を進めている。本発表ではそれらの結果を含めて報告する。

P2-61

DPANN 群に属す新奇好熱好酸性アーキアの性状およびゲノム解析～複数種の宿主に依存するナノサイズのアーキア～○酒井 博之 1,2,3, Naswandi Nur4, Antonius Suwanto4, 加藤 真吾 1, 伊藤 隆 1, 大熊 盛也 1, 黒沢 則夫 3
理研・BRC, 2学振・特別研究員 PD, 3創価大・理工 , 4ボゴール農科大・数理科学

1E-mail: hiroyuki.sakai.vs@riken.jp

近年、ゲノム配列情報に基づいた系統解析により、アーキアの暫定的な新門が次々と提唱されている。なかでも DPANN 群に属するアーキアは、細胞およびゲノムサイズが小さく、増殖するために必要な多くの遺伝子を欠く事から、宿主に依存して生育する共生性アーキアであると考えられている。実際に、本群に属す Nanoarchaeota 門のアーキアは（ナノアーキア）、単独では増殖せず「特定の宿主」の細胞にびっしりと張り付き増殖する。ナノアーキア以外の DPANN 群では、Micrarchaeota 門または Parvarchaeota 門に属すアーキアの培養報告が 3 件ある。しかしながら、再現性のある継代培養ができない為に、多くの性状が未だ謎に包まれている。我々は、Micrarchaeota 門に属する新奇アーキアを、高密度かつ再現性よく継代培養する事に成功した。本発表では、この新奇アーキアが「複数種」の宿主に依存して生育する共生性アーキアであることを報告する。

インド

ネシアで採取された酸性温泉試料を MBSY 培地に植菌し、好気条件下で集積培養を行ったところ（65°C、pH 3.0）
、培養液中に Micrarchaeota 門に属す新規アーキアと、2 種の既知好熱好酸性アーキアが確認された。本集積培養液を元にして、最終的にMicrarchaeota 門アーキア（ARM-1 株）と Metallosphaera 属アーキア（AS-7 株）が高度に集積された共培養系を構築した。この共培養系を用いて、ARM-1 株の培養性状、細胞形態、宿主範囲について調査した（両株の増殖は定量 PCR により測定した）。
ARM-1 株は直径約 300 nm の極小球菌であり（生育温度：50 ～ 75°C、生育 pH：1.5 ～ 4.5）
、酵母エキスなど 4 種の複合基質または 2 種の糖を含む培地、さらには有機物の代わりに単体硫黄や黄鉄鉱を加えた無機培地でも増殖した。ARM-1 株の細胞のみを集め、AS-7 株とは別の 7 属 9 種の好熱好酸性アーキアと共培養したところ、3 属 4 種が ARM-1 株の増殖を支持できる事が確認された。ARM-1 株のゲノムは 814,439 bp と小さく、その特徴はこれまで報告されている Micrarchaeota 門アーキアのゲノムの特徴と概ね一致していた。本研究により、Micrarchaeota 門は自然環境中の様々な種に頼る生存戦略をとる系統である事が示唆された。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

P2-62

酸性条件下におけるコエンドロの生育を促進する根部エンドファイト DSE の探索○赤嶺 真由美 , 成澤 才彦
茨大・農E-mail: akamayum@gmail.com
根部エンドファイト DSE(dark septate endophyte) は、植物に病害を引き起こすことなく、内生する菌類をさす。DSE が内生することにより、植物にストレス（乾燥や病害など）に対する耐性を付与することが知られている（Zhang et al. 2017, Surono& Narisawa 2018）。DSE の効果を利用することにより、作物収穫量を増加させることが期待される。土壌は作物を育てることにより、ｐ H が低くなる傾向がある。酸性条件下では多くの場合、作物の生産量は低下するため、多くの生産者は炭酸カルシウムなどを施用し、土壌ｐ H を矯正して対応している。本研究では、ハーブとして世界的に利用されているコエンドロ

Coriandrum sativum （以下、パクチー）の生育を酸性条件下で促進する DSE の探索をおこなった。パクチーの最適な土壌 pH

は 6.3 とされている（Sharma et al. 2014)。そこでまず茨城県内で栽培されているパクチーの酸性耐性を調べるため、塩酸によってｐ H 3 － 6 に振り分けた培地（無機窒素のみ）上でパクチーを 2 週間生育させ、各ｐ H の地上部と根部の乾燥重量を測定した。その結果、地上部、根部でそれぞれ、ｐ H5.4 と 5.2 で最大の平均乾燥重量が得られた。次に、培地に植物が直接利用できない有機窒素肥料を混合することにより、酸性条件ｐ H 4.0―4.4 を設定し、DSE を培養した。DSE は、茨城大学微生物学
研究室の DSE コレクションからランダムに選んだ 10 種 18 菌株を用いた。2 週間培養した DSE 培地に、発根させたパクチー種
子を置いて、2 週間生育させて地上部乾燥重量を測定した。その結果、Cladophialophora 属の 1 種 4 菌株が上位を占め、次いでVeronaeopsis 属の 1 種 1 菌株、Exophiala 属の 3 種 3 菌株と Helminthosporium 属の 1 種 1 菌株の順で、対象区に比べて地上部乾燥重量が有意に増加した。DSE 処理区のすべてで培地のｐ H は対象区に対して有意に増加していた。上記 9 菌株中７菌株ではｐ H5.5 － 6 であり、その平均乾燥重量は、無機窒素のみの培地ｐ H5.4 で得られた最大平均乾燥重量の約 1.1 － 1.4 倍となった。

P2-63

共生細菌のゲノム縮小進化を駆動する要因○金城 幸宏 , Bourguignon Thomas
沖縄科学技術大学院大学

E-mail: yukihiro.kinjo@oist.jp
内部共生において , 共生関係の偏性化に伴い共生細菌は普遍的に大規模なゲノムの縮小進化を経験する . 共生細菌における縮小
ゲノム進化を説明する仮説は , 1) 集団構造の変化に由来する遺伝的浮動の効果 , 2) 突然変異率の増加 , 3) 細胞内環境への適応 ,の３つに大別される . これらの要因を識別する際には主に , ゲノム間で比較可能な全ての遺伝子について , 作用する純化選択圧
並びにその分布を系統間で比較することにより , どちらがより支配的であるかを推定するのが一般的である . しかしながら , こ

れまでの先行研究においては利用可能なゲノム情報が限られており , 統計的に十分な因果推論を行うことが難しいことから上記の諸要因を包括的に検証するような研究はなされてこなかった . 本発表では近年のゲノム科学の発展に伴い拡大してきたゲノム

データベースの情報を利用することで , 共生細菌ゲノムにおける置換率や選択圧などの各種進化パラメータを推定し , 共生細菌

種内ならびに種間で比較することで既存の仮説の妥当性について検証した . その結果 , これまで広く支持されてきた遺伝的浮動の効果は限定的であり , 突然換率の増加が最も支配的にゲノム縮小進化に寄与していることが示唆された .

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

P2-64

メタノールに依存しないメタン酸化細菌と非メタン酸化細菌のクロスフィーディング○竹内 美緒 1, 尾崎 遼 2, 平岡 聡史 3, 鎌形 洋一 1, 坂田 将 1, 吉岡 秀佳 1, 岩崎 渉 4
産業技術総合研究所 , 2筑波大学 , 3JAMSTEC, 4東京大学

1

地球温暖化ガスであるメタンの大気中濃度は増加し続けており、自然界における挙動や、それに関わる微生物活動の解明は重要である。一般的に、メタンは環境中でメタン酸化細菌により酸化され、メタン酸化細菌が排出するメタノールをメタノール

酸化細菌が利用し ( クロスフィーディング )、さらに排出された物質やバイオマスを従属栄養細菌が利用する、と考えられている。我々は海底堆積物からメタン酸化細菌である Methylocaldum marinum S8 と通性メチロトロフであるMethyloceanibacter

caenitepidi Gela4 を分離した。これら２株はメタンのみを炭素源として安定した共培養系を構築したことから、詳細な共生機構の解明を試みた。共培養系において Gela4 株の RNA-seq 解析を行ったところ、acetyl-CoA synthetase や TCA サイクルに関わる遺伝子の発現がメタノールでの単独培養時に比べ増加した。また、S8 株の単独培養時、共培養時いずれにおいてもメタノー
ルは検出されず (<310 nM)、酢酸が排出されていた（< 16 μ M）。Gela4 株の acetyl-CoA synthetase と serine pathway 遺伝子である hydroxypyruvate reductase の発現量比を調べたところ、Gela4 株をメタノールあるいは酢酸で単独培養した際にはそれぞれ 0.2、5.3 であり、共培養系においては増殖前期、後期で 7.9、6.8 と酢酸での単独培養時の値に近かった。以上より、S8 株とGela4 株の共培養系では、従来考えられてきたメタノールではなく、酢酸がクロスフィーディング物質になっていると考えられた。このような「メタノールに依存しないメタン酸化細菌と非メタン酸化細菌のクロスフィーディング」が環境中のメタン酸化においてどの程度寄与しているのか、今後明らかにする必要がある。
< 文献 >

Takeuchi M. et al. 2019. Possible cross-feeding pathway of facultative methylotroph Methyloceanibacter caenitepidi Gela4 on
methanotroph Methylocaldum marinum S8. PLoS ONE 14(3): e0213535.

P2-65

落葉分解のホームフィールド・アドヴァンテージと土壌微生物群集の固有性の時間的変化○執行 宣彦 1, 梅木 清 2, 平尾 聡秀 1
東大・秩父演 , 2千葉大・院園芸

1E-mail: shigyo@uf.a.u-tokyo.ac.jp
落葉分解は森林生態系の炭素循環の起点となる重要なプロセスである。これまで、落葉分解率は気候と落葉の質によって決まると考えられてきたが、分解率には高い変動性があり、分解者である微生物群集を考慮する必要性が指摘されている。近年、落葉分解におけるホームフィールド・アドヴァンテージ（HFA）と呼ばれる現象により、落葉分解率がよく説明できることが指摘されてきた。
HFAは、ある場所の落葉を別の場所の樹木の下に移したとき、分解率が著しく低下する現象であり、その場所の環境に固有な微生物群集の存在によって起こる可能性がある。本研究では、１）落葉分解にはHFAが存在しており、２）HFAは微生物群集の固有性によって説明され、３）HFAの効果は落葉分解の初期よりも中期以降で強くなるという仮説を立て、検証することを目的とした。
東京大学秩父演習林の天然林において、コメツガの優占する高標高地（1800 m）とイヌブナの優占する低標高地（900 m）の間で、土壌とリターバッグの相互移植実験を行った。この実験により気候と土壌の環境がホームであるときに、落葉分解が促進しているかどうかを検証できる。2016 年 7 月に移植実験を開始し、117、376、527 日後に土壌とリターバッグを回収した。
各土壌及びリターについて、真菌類の rDNA ITS 領域と真正細菌の 16S rRNA 遺伝子部分領域を対象としたアンプリコンシーケ
ンス解析と定量 PCR を行った。
本研究の結果、コメツガとイヌブナの落葉分解が、ホームの気候ではなく、ホームの土壌で促進され、ホームの土壌の効果
は埋設日数とともに強くなることが明らかになった。各リターの微生物の多様性・DNA コピー数・群集構造は由来の土壌と似ており、落葉の微生物群集は土壌微生物群集をよく反映していた。また、ホーム土壌には固有な微生物群集にはPenicillium 属やStreptomyces 属などの抗生物質を生産する微生物が含まれ、ホームの土壌に固有な微生物群集の相対優占度は落葉分解率を説明することが明らかになった。これらの結果は、ホーム土壌に固有な微生物群集が落葉分解を促進するという HFA 仮説を支持した。また、直接的に落葉分解に関与する微生物だけでなく、抗生物質生産などにより間接的に関与する微生物の存在によっても HFA が引き起こされることも考えられた。発表ではさらに、相互移植実験の経過日数に応じた、固有な土壌微生物群
集とリター形質、土壌特性の関係についても議論する。

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2019 JSME annual meeting

P2-66

土壌微生物の群集構造を数理で読み解く
島田 尚 1,2, 美世 一守 3,4, ○大塚 重人 4,51

東大数理情報 , 2東大院工 , 3東大院理 , 4東大院農 , 5東大 CRIIM【目的】近年、次世代シーケンサーを用いた大量の塩基配列データにより、土壌微生物の群集構造を詳細に調べることが可能になった。その複雑な群集構造データをいかにして表現すれば、生態学的な知見・仮説を得ることができるのだろうか。本発表
では、数理的な評価を加え可視化の方法を工夫することによって、群集構造やその変遷に見られる特性を明らかにする。

【方法】黒ぼく土に炭素源や窒素源を添加し、継時的にとられた細菌群集構造データ（16S rDNA のアンプリコン解析）を用い、土壌の群集構造間の類似度を、相対種個体数（Relative Species Abundance, RSA）の「ランクサイズ関係」および「順序構成」に注目して評価した。

【結果】まず、炭素源や窒素源を添加しないコントロール土壌の細菌群集構造において、RSA 分布が冪（べき）や対数正規分布
で特徴づけられる幅の広い（多様性の高い）特有の形状を共通に呈することが分かった。コントロール土壌間での RSA分布の類似性は非常に高い。この共通形状を基準とすると、炭素源や窒素源の添加を行った後の土壌では、相対存在量の上位 10 位程度までの OTU が卓越する方向に RSA 分布形状が大きく変化した。またこの分布のゆがみは、時間の経過とともにコントロール
で見られた分布形状に回復する傾向が認められた。一方で、各土壌での OTU 存在量の順序に注目すると、添加後の RSA 分布の
ゆがんだ状態においても順序構成の変化は少ないことも分かった。順序構成の変化が大きいのはむしろこれに続く RSA分布形
状の復元期であった。

以上のように、OTU存在量のバランスと順序構成とを分離した非線形なデータ解析から、土壌細菌の群集構造が示す頑健性と可塑性の両側面を評価できることが示された。

P2-67

根部エンドファイトVeronaeopsis simplex Y34 のトマト根部微生物叢への時空間的な影響○野口 愛 1, 高田 圭太 2, 橋本 実佳 1, 松下 紗季 1, 坂上 伸生 1, 郭 永 1, 西澤 智康 1, 太田 寛行 1, 成澤 才彦 1
茨大・農 , 2茨大・iFC

1E-mail: mana.noguchi.mesc@vc.ibaraki.ac.jp【背景】 近年、植物内部に共生することで宿主に成長促進など正の効果をもたらす菌類（エンドファイト）の農業利用が注目されている。例えば、Veronaeopsis simplex Y34 をトマト根部にエンドファイティックに定着させることで、ポット栽培したトマトの果実収量が向上し、その際に根圏や根内の微生物叢が変化することが報告された（Guo et al, 2016）。本研究では、V.

simplex Y34 を定着させたトマトをハウス内で栽培し、トマト根圏や根内、また周辺土壌の微生物叢の時空間的変化を解析した。

【方法】 実験室にて調製したV. simplex Y34 資材と有機栽培用培土（有機の土、サカタのタネ）を 10%（v/v）にて混合し、ト
マト（ロッソナポリタン、パイオニアエコサイエンス）を 2018 年 3 月 23 日に茨城大学農学部附属国際フィールド農学センターの育苗用ハウス内にて播種し、V. simplex Y34 のトマトへの定着を行った。同年 4 月 25 日に鉢上げ後、5 月 1 日に栽培用ハウス

への定植を行い、栽培を継続した。5 月 1 日、5 月 28 日、6 月 24 日に処理区・対照区各 3 本の植物体を回収し、ハウス土壌と根部・根圏土壌の微生物叢解析（細菌 16S rRNA 遺伝子 V3/V4 領域、菌類 ITS1 領域）を行った。根部試料は直径に応じ 2 種類（約1 mm 未満、1 mm 以上）、根圏試料も根部からの距離に応じ 2 種類（tight、loose）に分け、局所的な微生物分布の把握を試みた。

【結果・考察】 定植時のV. simplex Y34 のトマト根部への定着率（再分離率法）は 77% であり、トマトへの高い定着が確認された。各試料の operational taxonomic unit（OTU）構成を非計量多次元尺度構成法にて解析したところ、菌類叢は処理区・対照区間で大きく分かれており、V. simplex Y34 が優占することによる影響が大きく示された。しかしその影響は時間経過とともに小さくなり、両区の菌類叢の類似度が増していった。一方、細菌叢はハウス土壌・根部・根圏土壌といった試料間差が大きく、処理区・対照区間の差は小さかった。また、時間が経過しても異なる試料間の微生物叢の類似度は変化しなかった。以上より、ハウス栽培においてトマトにV. simplex Y34 を処理することにより根圏や根内の微生物叢が変化した。特に菌類は生物的そして時間的な影響が、細菌は空間的な影響が大きいことが示唆された。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

P2-68

ダイズの根近傍領域における微生物叢の動態解析○山崎 真一 1, 青木 裕一 1, Hossein Mardani Korrani2, 海田 るみ 2, 藤井 義晴 2, 小林 優 3, 杉山 暁史 3
東北大 ToMMo, 2東京農工大 , 3京都大1E-mail: yamazaki.shinichi@megabank.tohoku.ac.jp
根圏（Rhizosphere）は「植物の根から影響を受ける根のごく近傍の土壌領域」と定義される。根圏は植物の養分吸収や微生物との相互作用が起こる、植物の健全な生育にとって重要な領域である。根圏では根からの光合成産物の分泌や特定の微生物の繁殖が活発になるなど、非根圏（バルク土壌）とは異なる特異な環境が形成されていると考えられている。その重要性にもかかわらず、根圏環境の成立に寄与する植物微生物間の相互作用分子や、植物体の生長に伴う微生物叢の変遷は未解明な点が多い。本研究ではダイズ（Glycine max ）を対象とし、バルク土壌、根圏、根面（Rhizoplane）、根内（Endosphere）の４つの根近傍領域について、微生物叢の継時的変化を解析した。

栽培は、2018 年に東京農工大学農学部附属の研究圃場で行い、6 月上旬にダイズを播種したのち計４回（7/4, 7/18, 8/1,

8/21）試料を採取した。ダイズの根が及ばない範囲の土壌をバルク土壌、引き抜いたダイズ根系を空中で穏やかに振とうして大部分の土をふるい落とした後に根の表面に残留した土壌画分を根圏と定義した。また、根を緩衝液に浸して超音波処理し遠心分離で得られた土壌画分を根面と定義し、各土壌画分および根（根内）から DNA を抽出した。微生物プロファイルは 16S
rRNA 遺伝子の V4 領域をターゲットとしたアンプリコンシークエンス解析で推定した。

α多様性を表す shannon 指数は、バルク土壌と比べて根圏、根面、根内では有意に低く、根近傍では特定の微生物が繁殖することが示唆された。また、β多様性の指標として Weighted UniFrac 距離を用いて主座標分析を行った結果、根圏、根面、根内ではサンプリング時期により群集構造が明確に分離したが、バルク土壌では時系列による分離はみられなかった。Phylum レベルでの微生物の相対頻度の解析の結果、バルク土壌、根圏、根面では Proteobacteria が全ての時点で最も優勢であり、根内では生育初期（7/4）は Actinobacteria が優勢であったが後期（8/21）には Proteobacteria が優勢となった。また、バルク土壌では Phylum

レベルの微生物頻度に大きな継時的変動はみられなかったが、根圏、根面、根内では生育段階によって頻度分布が異なっていた。
以上の結果から、バルク土壌と比べて根近傍領域ではダイズの生育に伴い微生物叢が大きく変化することが示唆された。

P2-69

伝統農法 “ ネギ類の混植・輪作 ” による土壌伝染性植物病害抑制機構を
微生物生態学的視点から紐解く○西岡 友樹 1,2, Malek Marian2, 小林 一成 3, 小林 裕子 3, 山本 京祐 1, 玉木 秀幸 1, 須賀 晴久 4, 清水 将文 2
産総研・生物プロセス , 2岐大応生 , 3三重大地域イノベ , 4岐大科基セ

1E-mail: tomoki-nishioka@aist.go.jp

日本や中国の伝統農法であるネギ類の混植や輪作には，土壌伝染性の植物病原糸状菌Fusarium oxysporum が引き起こすフザリ

ウム病の発生を軽減する効果が知られている。我われは，このフザリウム病抑制現象の原因解明をネギ類の根圏微生物の視点から進めてきた。これまでの研究から，ネギ類根圏に集積する拮抗性グラム陰性細菌がフザリウム病抑制現象の主因であることを明らかにした（西岡ら，環境微生物合同大会 2017）。本研究では，それらグラム陰性細菌群の中でも特に重要な役割を担う細菌群を特定するため，以下のような実験を行った。

まず，Miseq を用いた 16S rRNA 遺伝子アンプリコンシーケンス解析によりネギ類（ネギおよびタマネギ）とキュウリの根圏
細菌叢の属構成を比較したところ，グラム陰性細菌のFlavobacterium 属細菌がネギ類根圏に特徴的な優占細菌群であることが明らかとなった。そこで，Flavobacterium 属細菌用の半選択培地（PSR2A-C/T 培地）（Nishioka et al., 2016, Microbes andEnvironments）を用いて同細菌をネギおよびタマネギの根圏から 19 菌株分離し，キュウリつる割病（病原菌F. oxysporum f.

sp. cucumerinum ；以下，Focu）に対する抑制効果をキュウリ幼苗試験で評価した。その結果，分離細菌株はいずれも同病を顕著に抑制する能力をもつことが明らかとなった。さらに，Flavobacterium 菌株を接種した土壌中における Focu の挙動を共焦点レーザー顕微鏡で観察したところ，Focu の胞子発芽および菌糸伸長が顕著に抑制されることが明らかとなった。以上の結果
から，ネギ類の混植・輪作によるフザリウム病抑制効果には，ネギ類根圏由来の拮抗性Flavobacterium 属細菌が重要な役割を果たしていることが示された。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

P2-70

網羅的なロドプシン系統解析から理解する微生物の進化と生態○西村 陽介 1, 吉澤 晋 1,2
東大・大海研 , 2東大・院新領域

1

E-mail: ynishimura@aori.u-tokyo.ac.jp
微生物はロドプシンを光受容体として光エネルギーを利用する。微生物型ロドプシンは細菌・古細菌・真核生物・ウイルスの多くの系統群に分布しており、光がほとんど届かない深海を含む、多様な環境下における微生物から発見されている。環境微生物がロドプシンによって受け取る光エネルギー量は光合成系に匹敵すると推定されており、ロドプシンによる光利用が微生物生態系へ与える影響は極めて大きい。微生物型ロドプシンの生物化学的機能は、主に分離株のロドプシン遺伝子を大腸菌等において異種発現させることによって調べられてきた。これまでの研究から、H+ポンプ、Na +ポンプ、Cl -ポンプ、イオンチャ

ネル、光センサー／酵素共役型と多様な機能を持つことが知られている。一方で、ロドプシンは極めて大きな配列多様性を持つため、機能未知のロドプシンも依然として多い。特に近年、次世代シーケンサーによって読まれた大量のゲノム配列情報の蓄積によって、環境中に存在する未分離の微生物についての知見は爆発的な広がりを見せているが、そこには、配列新規性が高く機能が推定できない未知ロドプシン遺伝子が大量に存在する。そこで我々は、海水・淡水・高塩環境のみならず、これまであまり探索されていない土壌、永久凍土、温泉、腸内環境等の様々な環境のメタゲノム配列からロドプシン遺伝子を探索し、今までに報告がない規模での遺伝子系統解析を行うことで、ロドプシンの系統関係を網羅的に把握した。その結果、多くの新規ロドプシン系統群が見出された。また、この系統解析結果を用いて、各環境におけるロドプシンの系統プロファイリングを行うことにより、ロドプシンの遺伝子進化と、微生物のロドプシンを用いた環境への適応について、生物化学的機能・環境特異性・遺伝子水平伝播等の観点で論じる。

P2-71

Evidence of microbial CH4 production in surface water and surface sediment
during cyanobacterial bloom in Lake Suwa
○ Makoto Matsushita1, Yoshinori Takano2, Hiroyuki Imachi2, Atsushi Urai2,3, Ho-Dong Park4, Hiroki Iwata4,
Naohiko Ohkouchi2
AIST, 2JAMSTEC, 3Dept. Science and Technology, Grad. Sch. of Medicine, Science and Technology, Shinshu Univ.,
4
Dept. Environ. Sciences, Faculty of Science, Shinshu Univ.
1

E-mail: m-matsushita@aist.go.jp

Methane (CH4) is an important greenhouse gas and contributes substantial budget to global warming. Freshwater lakes are
identified as one of the main CH4 sources, as it is estimated that they contribute to 6-16% of natural CH4 emissions [1]. The
main part of CH4 released from lakes is considered to be produced by methanogenic archaea in anoxic sediments as terminal
step in the degradation of organic matter. Microbial CH4 production is still regarded by many as a process limited to anoxic
environments. Nevertheless, over the past few decades, increasing evidence of CH4 accumulation in oxygen-saturated lake
surface water has emerged [2]. Oxic CH4 peaks have been found to be closely associated with phytoplankton dynamics
across multiple lakes. Additionally, some studies suggest the presence of a CH4 production process by methanogenic archaea
associated with cyanobacteria [3][4]. However, it is unclear whether the CH4 production is taking place in actual environments.
In this study, we investigated microbial CH4 production in surface water and surface sediment of Lake Suwa in Nagano
Prefecture, Japan based on the analyses of genes (16S rRNA genes and mcrA genes) and Coenzyme F430 (a biomarker formethanogenic archaea) [5][6]. Especially, we focused on cyanobacterial bloom and tried to identify a CH4 production processby methanogenic archaea associated with cyanobacteria. Our results suggest the presence of CH4 production processes bymethanogenic archaea in surface water as well as surface sediment during cyanobacterial bloom in Lake Suwa.References: [1]Bastviken et al., Global Biogeochem. Cycles, 18, GB4009 (2004). [2] Tang et al., Environ. Sci. Technol. Lett., 3, 227-233 (2016).
[3] Grossart et al. PNAS, 108, 19657-19661 (2011). [4] Berg et al. World J. Microbiol. Biotechnol., 30, 539-545 (2014). [5]Kaneko et al., Anal. Chem., 86, 3633-3638 (2014). [6] Kaneko et al., Geochem. J. 50, 453-460 (2016).

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meetingP2-72

アマモ葉表面に形成されたバイオフィルム内の微生物群集構造の解析○土屋 雄揮 , 村中 優紀 , 中川 達功 , 高橋 令二
日大・生物資源【目的】アマモは海水中に見られる水生植物で、沿岸域で群落を形成し、生物多様性や水質の維持に貢献していると言われている。近年、アマモの生長に、アマモの葉表面に形成されるバイオフィルム（以下、BF）が影響を与えていることが解ってきた。
しかし、BF 内の微生物の種類や機能についてはまだ十分な知見は得られていない。そこで本研究では、アマモの葉表面の BF 内の微生物群集構造を調べ、微生物とアマモの生長との関係を明らかにすることを目的とした。

【方法】日本大学生物資源科学部下田臨海実験所付近のアマモ群落から、アマモの葉表面に形成された BF を採取し、DNA を抽出した。抽出した DNA を用いて Nextera DNA Library Prep Kit で解析用のライブラリーを作製し、MiSeq V2 reagent kit を用いて MiSeq でショットガンメタゲノム解析を行った。得られた塩基配列を Local BLAST による相同性検索に供した（e-value 10-15
以下で検索）。

【結果および考察】16S rDNA のデータベースで検索したところ、約 1,700 reads について結果が得られた。20 門 445 属が検 出 さ れ、Proteobacteria 門（28.9 %） と Cyanobacteria 門（26.0 %） で 過 半 数 が 占 め ら れ て い た。Proteobacteria 門 で は、Alpha-proteobacteria 綱 の Rhodobacterales 目 と Gamma-proteobacteria 綱 の Chromatiales 目、Oceanospirillales 目、 お よ び
Cellvibrionales 目が多く見られ、光合成細菌や窒素固定能を持つ種類が検出された。Cyanobacteria 門では、綱や目レベルでは未分類のものが多かったが、ポリヒドロキシ酪酸（PHB）生産能を持つNeosynechococcus 属や窒素固定能を持つ Oscillatoria

属などが検出された。藻類の 18S rDNA の検索では、約 3,400 reads の結果が得られた。9 門 295 属が検出され、Stramenopiles（71.0 %）が過半数を占めており、Saccharina 属や Nannochloropsis 属などが多く見られた。また、Chlorophyta 門（13.7 %）のPrototheca 属も比較的多く見られた。これらは、多糖や脂肪酸を生産する種として知られている。他にも窒素固定能を持つ

もの、生理活性物質を生産することで知られる藻類などが検出された。光合成や窒素固定により貧栄養な海水中でも栄養が供給され、有機物の生産や分解、BF の形成が可能になっていることが考えられた。発表では群集構造解析の結果をもとに微生物とアマモの生長との関係について考察する予定である。

P2-73

微生物の生き残り戦術に使われる特殊環状ペプチドの生合成機構を
タンパク質立体構造から探る○澄田 智美 1,2,3, Svetlana Dubiley4, Brendan Wilcox4, Konstantin Severinov4,5, 田上 俊輔 2,3
海洋研究開発機構 (JAMSTEC), 2理研 CLST, 3理研 BDR, 4Russian Academy of Science, 5Waksman Institute for Microbiology

1E-mail: sumidat@jamstec.go.jp

ラッソペプチドは約 20 アミノ酸からなる特徴的な投げ縄構造を持つペプチドで、系統的に近縁な微生物の増殖を阻害する抗微生物ペプチドとして生産されている。特に微生物が貧栄養環境に置かれた際に多く発現し、栄養物を巡る競争で有利に働く微生物の生き残り戦術の一つと考えられている。RNA ポリメラーゼ等の酵素を阻害する抗微生物活性以外にも、抗 HIV 活性や受容体のアンタゴニストなどの生理活性も報告されており、ペプチダーゼや熱に対して耐性を示すため、ペプチド創薬への応用も期待されている。
ラッソペプチドは翻訳後修飾ペプチド (Ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides (RiPPs)) の一種で、N 末端の 7-9 アミノ酸で環状構造を形成し、C 末端側がその環の中を通り抜ける特殊な投げ縄構造をしている。このような投げ縄構造の形成には、リーダーペプチドとコアペプチドから成る前駆体ペプチド (LasA) と、ラッソペプチド合成酵素群 (LasB1,
B2, C) と呼ばれる一連の酵素が必要である。LasB1 がリーダーペプチド認識タンパク質、LasB2 がリーダーペプチド切断酵素、
LasC がコアペプチドの環状構造形成酵素である。これらの酵素群の活性に重要な触媒残基は、酵素学的な検討から同定されているが、構造解析の研究は進んでおらず、詳細な反応機構は未だ解明されていない。そこで本研究では、酵素の作用機構を視覚的に捉えることのできるタンパク質の X 線結晶構造解析を手法とし、ラッソペプチド生合成機構の解明を試みた。
今 回 は ラ ッ ソ ペ プ チ ド 生 合 成 経 路 の 第 一 段 階 で あ る LasB1 の リ ー ダ ー ペ プ チ ド 認 識 機 構 に 関 し て 報 告 す る。 我 々 は
Thermobifida fusca の LasB1 とリーダーペプチドの複合体の構造を、世界に先駆けて高分解能で明らかにした。LasB1 の立体構
造は、他の様々な RiPPs のリーダーペプチド認識を担っている RiPP recognition elements (RREs) と良く似た winged helix-turnhelix 構造を持っていたが、リーダーペプチドの認識様式は、既報の RREs による標的ペプチドの認識様式と様々な部分で異なっていた。例えば、リーダーペプチドは LasB1 の N 末側の anti-parallel β -sheet の一端に、β -sheet を一本付加する形で結合していた。さらに構造情報からリーダーペプチドの認識に重要なアミノ酸を同定し、その特徴が広範囲の微生物種間で保存されていることを、Bacillus pseudomycoides の LasA, B1, B2 を用いた点変異体分析から明らかにした。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

P2-74

世界各地のメタゲノム解析で解明する氷河シアノバクテリアの多様性○村上 匠 1, 瀬川 高弘 2, 広瀬 侑 3, 森 宙史 1, 竹内 望 4
遺伝研 , 2山梨大 総合分析実験センター , 3豊橋技科大 応用化学・生命工学系 , 4千葉大 院理

1

氷河表面で繁殖する糸状シアノバクテリアは、周囲の鉱物や有機物を巻き込みながら凝集することで、「クリオコナイト」と呼ばれる泥粒子状の構造体を形成する。クリオコナイトは、氷河表面における代表的な一次生産の場であるとともに、多様な従
属栄養生物を育む場でもあるため、まさに氷河生態系の基盤的存在といえる。近年、クリオコナイトを構成するシアノバクテリアの系統組成が、地域間、特に極域とアジア高山域とで大きく異なることが明らかとなってきており、地球規模での氷河シ

アノバクテリアの多様な生態に注目が集まっている。しかし、氷河は生物学的調査が容易でない地域に位置することも多く、広範な地域間で氷河シアノバクテリアのゲノム情報や生理機能を実際に比較した研究例は乏しい。そこで我々は、両極域やアジア高山域など世界各地の様々な氷河環境からクリオコナイト試料を収集し、培養を介さないメタゲノム解析を駆使すること
で、氷河シアノバクテリアの種構成や遺伝子機能の地域間差異を調査した。シアノバクテリアの系統組成を解析した結果、アジアでは極域に比べより多様なシアノバクテリア種がクリオコナイト内に生息していることが明らかとなった。さらに、シアノバクテリアの光受容体関連遺伝子の組成を調べた所、北極域ではシアノバクテリア共通の赤色光吸収タンパク質であるフィ
コシアニンとアロフィコシアニンの遺伝子のみをもつ系統が優占していた。一方アジアのクリオコナイトでは、それら色素タ

ンパク質に加え、より短波長の緑色光を吸収するフィコエリスリンや、それらの量比を調節する光受容体の遺伝子をもつ系統が優占していた。これらの結果から、極域とアジアでは、シアノバクテリアの光環境へ順化する戦略が異なることが推察された。本発表では、光受容体以外の遺伝子機能の地域間比較解析の結果からも、各地域の氷河シアノバクテリアの生態を議論し
たい。

P2-75

Microbial communities enriched on conductive metal surfaces at a deep-sea
hydrothermal field that potentially involve extracellular electron transfer
reactions○ Hiroyuki Kashima, Masahiro Yamamoto, Ken Takai
SUGAR program, JAMSTEC

E-mail: kashimah@jamstec.go.jp
Electrotrophy with extracellular electron uptake from insoluble electron donors such as minerals or syntrophic partner cells
have been studied in the interest to better understand microbial ecologies and biogeochemical cycles. Electrotrophic microbialactivities have been investigated in laboratory reactors by using electrochemically controlled polarized electrodes as model
extracellular electron transfer (EET) substrates, but such microbial activities under natural environments remains virtually
unknown. Thus, the present study conducted on-site electrotrophic microbial enrichment experiments with metal electrodesthat cathodically polarized by exploiting galvanic corrosion reactions as the stable extracellular insoluble electron donor, inorder to explore microbial EET activities under the environment.The enrichment for 24 months at a deep-sea hydrothermal
field in Mid Okinawa trough, Japan yielded distinctive bacterial communities that potentially involve EET reactions. Specifically,

16S rRNA gene analysis showed that microbial community on the surface of cathodically polarized electrodes dominated by
gammaproteobacteria were different from control metal surfaces or rocks at the same field. Within the community, several
abundant OTUs associated with Thiomicrospiraceae, up to 60% of the retrieved sequences from a sample, were potentiallyassociated with electrotrophic reactions. By contrast, non-polarized stainless-steel surfaces (control metal surface) retained

sequences associated with neutrophilic iron-oxidizing zetaproteobacteria, Mariprofundaceae, as well as deltaproteobacteria

represented by Geobacteraceae within the reddish corrosion product. This suggests that, in contrast to polarized electrodes,
microbial activity at the control electrode was supported by iron-oxidizing chemolithoautotrophy. This presentation discusses
phylogeny and estimated functions of enriched communities.

－ 122 －

日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meeting

P2-76

鶏肉におけるカルバペネム耐性菌汚染実態及びStenotrophomonas maltophilia
分離株のゲノム特性○山本 詩織 , 朝倉 宏
国衛研・食品衛生管理部
カルバペネム系薬剤は多剤耐性菌感染症治療に用いられる重要な抗菌薬であり、近年ではカルバペネム耐性腸内細菌科細菌の感染事例が増加傾向にある。国内における本菌感染症例の多くは院内感染によると目されているが、国外では家畜生産現場や食品からの分離も報告されつつあり、食品を介した同耐性菌の伝播も懸念される。国内では食品由来耐性菌の年次推移を示す
報告媒体は存在しておらず、食品中のカルバペネム耐性菌汚染実態並びにその健康影響の多くが未だに不明であることを鑑み、本研究では国内の鶏肉中における当該菌の汚染実態を検討すると共に、鶏肉より分離されたStenotorophomonas maltophilia のゲノム特性について解析を行った。
国内に流通する鶏肉 226 検体についてカルバペネム耐性菌分離試験に供した。試料 10g に 4 倍量の 1 μ g/ml セフォタキシム加
緩衝ペプトン培地を加えて 37℃ 24 時間培養後、2 μ g/ml メロペネム加 VRBG 寒天培地を用いて選択分離培養を行った。得られた分離株は菌種同定試験、薬剤感受性試験、カルバペネマーゼ産生遺伝子検出試験に供した。S. maltophilia 分離菌株は Ion
CHEF/GeneStudio S5 を用いたドラフトゲノム解析に供した。
カ ル バ ペ ネ ム 耐 性 菌 は 鶏 肉 226 検 体 中 4 検 体（1.8%） よ り 検 出 さ れ、S. maltophilia 1 株、Pseudomonas otitidis 2 株、P.
protegens 1 株、P. putida 1 株の計 5 株が分離された。S. maltophilia 株及び P. otitidis 株はメロペネムに対する MIC 値が > 64 μ g/
ml と高く、それぞれbla L2又は bla POM遺伝子を保有していた。これらのうち、食品からの分離報告が極めて少ない S. maltophilia
CRB139-1 株についてゲノム解析を行ったところ、ゲノムサイズは 4,618,049 bp であり、MLST 型別は ST202 に属した。カルバ
ペネム耐性に関わる遺伝要因である多剤排出ポンプ SmeDEF は認められなかった。また、当該菌株はアミノグリコシド系薬剤にも耐性を示したが、ゲノムデータに基づき、当該株は同剤耐性を付与する排出ポンプ SmeZ 遺伝子の保有が確認された。
以上より、国内流通鶏肉検体におけるカルバペネム耐性菌汚染率は概して低いと想定されたものの、流通食品への当該菌汚染が今後拡散する可能性も否めない。鶏肉由来S. maltophilia の検出は国内で初めての事例であり、食品を通じた同耐性菌による健康危害性を判断する上では、広範な食品における同耐性菌の汚染実態の探知並びに分離株のゲノム特性解析が有用と考えられる。

P2-77

生活習慣や住居構造が住環境菌叢に与える影響解析○矢野 剛久 1, 齊藤 加奈 2, 万条 奈央 3, 野田 恵 4, 青野 恵太 4, 鈴木 不律 4, 深井 尚子 3, 山本 貴子 1
花王（株）・安全性科学研 , 2花王（株）・ホームケア事業部 , 3花王（株）・生活者研究部 , 4花王（株）・ハウスホールド研1E-mail: yano.takehisa@kao.com【背景と目的】住居構造やそこに住む人々の生活習慣は極めて多様であり、各変動因子によって菌叢は極めて容易に変化する。
加えて、日本では他国にない生活習慣や住居構造、家具等が多いことから、家庭内の衛生課題を発見したり、新たな衛生習慣を提案したりする上では国内の家庭環境菌叢の徹底的な理解が欠かせない。そこで、我々は国内の家庭の大規模な菌叢を解析し、生活習慣等との関連性を解析することで、新たな衛生習慣の提案を目指した。【方法】2017 年より 2 年間に亘って 136 家

庭、2500 ～サンプルの解析を行った。解析では、一般生菌数と大腸菌群数の解析に加えて、16S rRNA V3V4 領域情報に基づ

く次世代シーケンサーによる菌叢解析を行った。また、住居構造や生活習慣に関する情報として 300 ～個のメタデータを収集して互いの関連性を解析した。【結果・考察】キッチンからダイニング、リビング、洗面台周辺、浴室等の菌叢を比較したところ、キッチンシンク等の排水溝に加え、キッチンスポンジや台ふきんで有意に菌数が多かった。また、冷蔵庫の野菜室は他の場所と比べて菌数に有意な差は見られなかったものの、菌叢については他の場所と比べて有意に chao1 指数が大きく、同箇所に多様な菌が存在することが示唆された。次に、食品分野で環境衛生度の評価指標として使用される腸内細菌科の分布を解析したところ、キッチンシンクと冷蔵庫の野菜室等で腸内細菌科が多い傾向が確認された。こうした特徴を有する冷蔵庫の野菜室に関して、菌どうしのネットワーク解析を行ったところ、Rhizobiaceae や Pseudomonadaceae 等、植物や土壌に関係する菌と腸内細菌科との間に関連性が示唆され、野菜由来の土壌細菌として腸内細菌科が野菜室に混入した可能性が考えられた。さらに、腸内細菌科存在比と関連する住環境や生活習慣を解析したところ、ウェットシートの使用、ベタつき等が抽出されたことから、清潔なウェットシートによるベタつきの除去が腸内細菌科の制御手段の一つとして有用である可能性が示唆された。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meetingP2-78

二価鉄およびメタン生成菌の共存によるクロロエチレン類分解細菌
Dehalococcoides の多様性への影響○吉川 美穂 , 張 銘 , 川辺 能成
産総研・地圏資源

E-mail: m.yoshikawa@aist.go.jp【目的】地下水・土壌の汚染物質であるクロロエチレン類の浄化対策として、Dehalococcoides 属細菌等による還元的脱塩素分解を利用したバイオレメディエーションが実用化されつつある。一方、2017 年度からは分解産物であるクロロエチレン（VC）
も土壌汚染対策法における特定有害物質に指定され、クロロエチレン類の完全分解が求められている。これまで、発表者らは
二価鉄やメタン生成菌の共存がクロロエチレン類の完全分解の可否を決定することを示してきた。本研究は、これらの共存がクロロエチレン類分解菌であるDehalococcoides の多様性へ与える影響を明らかとすることを目的に行った。
【方法】国内の汚染サイトから採取した地下水を用いて、PCE の脱塩素分解実験を行った。二価鉄やメタン生成菌の共存による Dehalococcoidesの多様性への影響を解明するため、塩化鉄（II）および 2- ブロモエタンスルホン酸ナトリウム（BES）の添加有無を組み合わせた 4 条件で分解実験を行った。実験はバイアル瓶内で行い、PCE 初期濃度は 1 mg/L とした。クロロエチレン類およびエチレン、
エタン、メタンを GC および GC-MS で経時的に分析した。培養液から DNA を経時的に抽出し、Dehalococcoides 16S rRNA 遺伝子、脱塩素分解酵素遺伝子tceA 、vcrA 、bvcA のｑ PCR および Dehalococcoides 16S rRNA をターゲットとしたアンプリコンシーケ
ンスに供試した。
【結果および考察】メタン生成菌の生育阻害剤である BES を添加しなかった 2 条件では、Dehalococcoides 16S
rRNA 遺伝子は実験開始時の 1.9 × 104 copies/mL から、2.7 × 105-6.6 × 105 copies/mL まで増加し、tceA や vcrA も検出された。
塩化鉄（II）の添加により VC の完全分解速度は 1.6 倍大きくなり、またtceA や vcrA の増加も早く検出された。メタン生成菌共存下における二価鉄の共存がDehalococcoides の増殖を促進し、クロロエチレン類の完全分解を促進したと推察される。一方、BES を添加した 2 条件では、cis ‐ ジクロロエチレンや VC などで分解が止まり、不完全分解となった。そのうち、塩化鉄（II）
および BES を添加した条件では、実験開始 42 日目でDehalococcoides 16S rRNA 遺伝子は 8.0 × 105 copies/mL、vcrA は 5.3 ×
105 copies/mL まで増加したものの、tceA は検出されなかった。本地下水におけるクロロエチレン類の完全分解には tceA を保持するDehalococcoides の生息が不可欠であり、この細菌はメタン生成菌と強い共生関係にあることが示唆された。

P2-79

アナモックス細菌と共生する亜酸化窒素還元細菌の検出 -15N トレーサ法の応用○末永 俊和 1, 太田 琢 2, 堀 知行 3, 利谷 翔平 1,2, 細見 正明 2, Kartik Chandran4, Sussane Lackner5, Barth F. Smets6,
寺田 昭彦 1,2
東京農工大院・GIR, 2東京農工大院・工 , 3産総研 , 4Dep. Earth Environ. Eng., Columbia Univ.,
Dep. Civil Environ. Eng. Sci., Darmstadt Univ., 6Dep. Environ. Eng., Denmark Technical Univ.

1
5

嫌気性アンモニア酸化 (Anammox) は省エネルギー型の排水処理システムとして着目されている一方で、亜硝酸に由来する高濃度の N2O が蓄積することが報告されている。近年のメタゲノム解析により、Anammox 細菌と共生する細菌群に N2O 還元能を持つものが含まれることが報告されているが、その生態や活性の有無は明らかになっていない。本研究は独立栄養な Anammox
汚泥における N2O 還元活性の検出とその定量化を目的とした。15N トレーサ法を応用し、15N でラベリングした NO2-と 14N のNH4+を添加してアナモックス活性を 15N14N(29N2) で検出した。また N2O 還元細菌の活性検出のために 14N14NO の N2O を添加し、その消費速度と 15N15N(30N2) の生成速度の和から正味の N2O 消費速度を算出した。また、16S rRNA アンプリコンシークエンス

により菌叢解析を、DNA , RNA レベルでの N2O 還元機能遺伝子の存在をリアルタイム定量 PCR により検出した。200 mgN/L のNO2-と NH 4+をそれぞれ添加した人工無機培地で連続的に培養している Anammox リアクターの N 2O 存在量を調べたところ、中央値で溶存態として 0.963 mgN/L, ヘッドスペースには 528 ppm が恒常的に検出された。このバイオマスを用いて回分で 15N

トレーサ試験を行ったところ N2O の生成は 15N15NO が大部分を占め、NO2-由来の N 2O が生成していた。ここに添加した 14N14NO

は NO2-や NH 4+存在下でも消費されており N 2O 還元活性の存在を定量的に確認した。本研究により、N2O 還元活性が Anammox
汚泥において確認された。このような極めて独立栄養的な環境にある状況下でも活性を発現できる N2O 還元細菌は新たな N2O

放出抑制技術に繋がることが期待される。

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2019 JSME annual meeting

P2-80

西日本における有毒渦鞭毛藻Karenia mikimotoi の赤潮発生時に優占する
粒子付着性細菌
○菅野 菜々子 1, 山本 信二 2, 谷口 越則 3, 湯口 真実 4, 鈴川 健二 5, 井口 大輝 6, 山砥 稔文 7, 吉村 直晃 8, 朝倉 大河 9,
菊地 淳 9, 長井 敏 1
水研機構・中央水研 , 2三重県南勢種苗セ , 3高知水試 , 4愛知水試 , 5愛媛水産研 , 6大分水産研 , 7長崎水試 , 8熊本県水産課 ,理研環境資源1
9E-mail: kanno4n3a@affrc.go.jp

微細藻類の大発生による海洋の着色現象（赤潮）は周辺海域の環境状態を大きく変化させ、時に有毒藻類の増加や貧栄養化による漁業被害をもたらす。赤潮の発生、発達、消滅機構の生物学的要因のひとつとして、微細藻類の生育促進や阻害に関与す
る細菌が考えられている。しかし天然海洋環境での赤潮発生時にどのような細菌種が出現し影響を与えているのかは十分明らかにされているとは言えない。本研究では主に西日本で赤潮による漁業被害が報告される有毒渦鞭毛藻 Karenia mikimotoi の天然海洋での赤潮に関連する細菌種を探索するため、赤潮最盛期から消滅までの間の細菌組成解析を行った。
海水中のK. mikimotoi の形態形状による種同定と細胞数の計数は顕微鏡観察により行った。海水サンプルを 8 μ m ポアサイズ
フィルターで集菌した画分を粒子付着画分とし、そのろ液を 0.22 μ m ポアサイズフィルターで集菌した画分を浮遊画分として
DNA 抽出を行った。16S rRNA 遺伝子の V3-V4 領域を増幅し、MiSeq によって配列決定を行い、OTU は 99％相同性で作成した。
また愛知、愛媛、大分、長崎県沿岸での赤潮発生時の細菌組成も解析した。
三重県沿岸の付着画分より赤潮最盛期に優占する 2 つの OTU が検出され、それぞれ最大で 25％以上の相対割合を占めた。
2OTU の相対割合はK. mikimotoi 細胞数に正相関しており、K. mikimotoi 細胞表層に付着していたことが示唆される。2OTU は
共にPseudomonas 属に分類された。愛媛、愛知、長崎県からは Proteobacteria 門とBacteroidetes 門に属する 7OTU の優占が見られたが、三重県で検出された OTU とは属レベルで異なった。大分県では特定の OTU の優占は見られなかったが、付着画分に特徴的な 2OTU が検出された。この 2OTU はProteobacteria 門に分類されたが、他地域の OTU とは属レベルで異なった。
天然海洋環境下でのK. mikimotoi 赤潮に関連する細菌株が属レベル以上で複数存在する可能性が示された。今回検出された細菌株と微細藻類との関係性や細菌株間での競争関係を解析することで、天然環境下での赤潮の発達および消滅への細菌の関与の一端が明らかになることが期待される。

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PH-001

光触媒反応による放線菌二次代謝物の殺菌力向上
奥居 美音
東京工業大学附属科学技術高等学校
多くの抗生物質が放線菌二次代謝物である中、その殺菌力向上を目的に、放線菌培養時における TiO2 触媒による光触媒反応の付与が生成物に及ぼす影響について、定性的に検討した。土壌由来の４種類の放線菌を、きな粉（0.8％）、グルコース（1.2％）、TiO2 粉末（0.04％）添加の 1.6％寒天培地に塗布し、30ºC 暗条件で培養した。培養から約 4 日後、ブラックライト（波長 315 ～ 400 nm）を 1 日 2 時間、計 4 日間照射した。培養後、二次代謝物を濃度の異なる 5 つのメタノール（0 ～ 100 vol%）に分画回収した。各試料を含ませた円形ろ紙を、標準培地に塗布した枯草菌上に置き、30℃で約 24 時間、抗菌活性試験を行った。結果から、1 つの放線菌で得た 2 つの分画試料において、ブラックライト照射により阻止円径が増大した。すなわち、TiO2による光触媒反応の付与により、抗菌活性の高い二次代謝物が合成されたもと考えられる。

PH-002麹菌の成長に光が与える影響
吉村 涼矢
横浜市立横浜サイエンスフロンティア高等学校
これまでの本校の研究により、麹菌はコロニーをつくる際、規則的に輪を形成することがわかった。本研究では体内時計と光との関係に注目し、麹菌に当てる光の条件を変えたときの菌糸の成長を比較することで、麹菌の輪の形成に光が与える影響を考察した。

麹菌を培養するのに特異な培地である PDA 培地を用いて麹菌を 30 度で５日間培養した。光を当てる周期は 24 時間周期とし、24 時間遮光、24 時間照射、1 時間照射後 23 時間遮光の３つの条件で行った。麹菌は赤と青の光受容体をもっていることから、当てる光の色を白、赤、青の３種類で行った。培養後の輪と輪の幅、形成された分生子量を測定し、比較した。24 時間遮光、
24 時間照射した場合には輪が形成されなかったことから、麹菌の場合は光の明暗の切り替えが輪をつくるスイッチになっていると考察した。

現在、1 時間光をあてる時間帯を変化させた場合と、1 時間光をあてる回数を増やした場合とで比較実験を続けている。

PH-003

学校内で獲得したメタン細菌による食品廃棄物のエネルギー化の研究
山中 陽太 , 多田 千夏 , 今関 勇斗 , 清野 碩 , 成田 紗由美
横浜市立横浜サイエンスフロンティア高等学校
現在、日本では約 2700 万ｔもの食料が焼却され、埋め立てられている。この食料廃棄物には糖などの高エネルギー化合物が多く含まれているが、運搬や焼却のために逆にエネルギーを使って処理している状況である。私達は食料廃棄物からエネル
ギーを取り出すことにより、資源が乏しい日本のエネルギー問題を解決できるのではないかと考え、高校の食堂から出る食料
廃棄物を利用し、メタンやエタノールを生成して、活用することを目的として研究をしている。私達は研究の過程で自然に混入したメタン菌が、効率よくメタンを発生させていることに気が付いた。またこのメタン菌は常温よりも高温の方がよりメタンを発生させることを発見した。本発表では、私達が利用しているメタン菌の性質や、より効率よく働く条件について研究した結果を発表する。

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PH-004

酵母に光を当ててみたら～カラフルな光と発酵～
村上 春菜
横浜市立横浜サイエンスフロンティア高等学校
酵母が行う発酵という活動は古くから幅広く利用されており、酵母についてより詳しい事象が明らかになることで、酵母利用の効率化がはかれるのではないかと考え研究を始めた。本研究は酵母と同じ真菌である一部のカビが青色光で増殖が抑制されることに注目し、酵母にも同じ性質はあるのかを、様々な色の光を培養時に照射することによって発酵量、増殖量、死滅率はどうなるのか調べることを目的とした。

酵母を白・赤・青の光を照射し続けた場合と光をあてない場合で三日間嫌気培養した。嫌気培養後すべての培地を遮光条件

下で一週間培養し、死滅率、増殖量、発酵量の三つの点について毎日計測した。その結果、培養時に青色光を照射すると発酵作用が抑制され、死滅率が増加し、赤色光照射下では発酵量が最大となった。現在、光自体が反応に影響を与えているのか、
酵母の青色光受容体が光を吸収して影響を与えているのではないかと考え、光の透過量を比較している。

PH-005

麹菌の分泌物が菌糸の成長に与える影響
崩岡 万由希横浜市立横浜サイエンスフロンティア高等学校
和食はユネスコの無形文化財に指定されている。本研究では和食に欠かせない味噌や醤油、日本酒などの製造に用いられ日

本の国菌である麹菌 (Aspergillus oryzae ) に着目した。麹菌は同一の培地上で培養した際、他のコロニーを認識し麹菌自身が分泌する化学物質により互いに菌糸の成長を抑制し合うことがわかっている。本研究では、麹菌が分泌する化学物質と菌糸の成長の関係を明らかにすることを目的とし、以下の実験を行った。懸濁液を用いて麹菌を液体培地上に 1 点と 2 点それぞれ植菌
し、5 日間 30 度で静置培養した後、液体培地を回収した。回収した液体培地をろ過滅菌し、固体培地上の麹菌のそばに滴下した。その結果、1 点植菌したものは気中菌糸を抑制したのに対し、2 点植菌したものは気中菌糸と基底菌糸を抑制するという違いが見られた。この差は回収した液体培地中の物質の濃度によるものではないかと考え、現在２点植菌した培地を希釈したものを滴下し、検討している。

PH-006木材腐朽菌を利用した雑草の効率的な肥料化
多田 千夏 , 今関 勇斗 , 山中 陽太 , 成田 紗由美
横浜市立横浜サイエンスフロンティア高等学校
刈り取った雑草などには、作物の生育に必要な栄養素が豊富に含まれている。しかしこのような有機物が分解されて再び植物が利用できるようになるには、長い時間が必要となる。焼き畑などで知られるように、「焼却」は有機物を肥料化するために有効な手段であるが、近年はダイオキシンの発生が問題視されているために、特に日本では用いることが出来ない状況である。
私達は木材を分解することが知られている木材腐朽菌を利用して、雑草からメタンガスなどのエネルギーを取り出す研究を行っている。この過程で私達は、環境条件を工夫すれば付着している木材腐朽菌を用いて、雑草を効率良く分解することが可能であることを発見した。分解の過程で、生育地での白い菌から黒い菌への推移より、この分解には複数種の木材腐朽菌が段階的に関わっていると考えられる。私達はこの発見を基に、温度や水分量、日照条件に着目して、最適条件の検討を行っている。

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2019 JSME annual meeting

PH-007

細菌のアンピシリンに対する感受性の違い
佐藤 真菜
横浜市立横浜サイエンスフロンティア高等学校
本校の研究により、アンピシリンに対する細菌の感受性は鶴見川において上流では弱く下流では強いことが分かっている。

要因として上流と下流の環境の違い、特に周囲の施設の違いが挙げられているが、天候条件などの環境要因には触れられていない。そこで本研究では周囲の施設に加え、新たに天候と川の水質に着目し細菌のアンピシリンに対する感受性の違いを調べることを目的とした。雨天時は周囲の土や植物が晴天時より多く流れるため、下流の細菌の感受性が変化するのではないか。
また、生息している細菌数や種類が水質によって変化し、それにともない細菌の感受性も変化するのではないかという仮説を立てた。天候による感受性の違いを比較するため、雨天時と晴天時に上流、下流から採取した水を植菌し、アンピシリン含有

ディスクを置く。培養後、阻止円直径を測る。また、水質を比較するため、上流と下流で pH、COD、NO2- のパックテストをし、仮説を検証していく。

PH-008

カイコセリシンの抗菌作用
森井 瑛都
横浜市立横浜サイエンスフロンティア高等学校
本研究では、セリシンの保護作用に着目した。カイコからつくられる繭糸は主に２つのタンパク質から構成されている。繭

全体の 30% を構成しているセリシンは繭糸の外側にあり、カイコが安全に羽化できるよう保護している。本研究の目的は、セリシンが生物の生存にどのように関わるのかを調べることであり、本発表では大腸菌を扱った。

カイコに与える餌を人工飼料のみ、ソイプロテイン、ホエイプロテインを混ぜた飼料、に分け飼育し、繭糸をつくる器官である絹糸腺を取り出した。取り出した絹糸腺の懸濁液をシャーレの蓋にコートした。大腸菌を植菌し、シャーレの上から紫外線を 15 分あてた。大腸菌を１日培養後、エサの条件別に死滅率を調べた。結果、プロテインを与えたカイコの絹糸腺をコー
ティングすると死滅率が低くなり、ホエイプロテインを与えた方がより低くなった。現在、抽出したセリシンを塗布した培地
で大腸菌を培養し、増殖の様子を比較している。

PH-009

大貫谷公園微生物群集発見捕獲大作戦

その３

梅村 隆人 , 小河原 真人 , 阿部 光彰 , 杉本 響
学校法人国際学園 星槎高等学校
神奈川県横浜市の大貫谷公園には、200 年以上前の手つかずの土壌が保存されている。ここに生息している顕微鏡サイズの微生物群集を対象にその動態に関して、仙台大会の高校生ポスター発表で、つまようじで土壌団粒を割り直接スライドグラスに分散して観察する微生物計数方法（つまようじ法）を発表し、沖縄大会の報告では異なる６地点において微生物群集の種類
構成を比較したが、計数値に０が多く違いを明確にすることはできなかった。原点に戻って、計数法はこれで良いのか？

計

数値０をなくすもっと良い方法はないのだろうか？について検討したが、方法がより繁雑になるためつまようじ法を用いることとした。種類構成は上部の植生の影響を受けている様子が見られたので、今回は手つかずに保存されている地下 20 ｃｍの微生物群集の種類構成に関して報告する。表層との比較が十分に行われていないが、現段階では有殻アメーバが土壌の微生物群
集の中心にあると考えられ、生きている有殻アメーバを検出する方法を検討中である。

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2019 JSME annual meetingPH-010

トウキョウサンショウオを守るために～アメリカザリガニの生態調査及び防除

2019 ～

檜山 凌太 , 木内 康太郎 , 加藤 大起 , 本間 満 , 川村 颯 , 千葉 悠喜 , 梁島 遥輝 , 福澤 崇吾
栃木県立宇都宮北高等学校 科学研究部
栃木県宇都宮市の戸祭山緑地に棲息しているトウキョウサンショウウオ（人里に暮らしており山奥にはいない）は、2008 年

10 月に宇都宮市の天然記念物に指定され守るべきであり、宅地造成がすすむこの地区で、産卵地と林も残すことになった。しかし、ザリガニが捕食していることが知られている。本研究の目的は、ザリガニの個体数を推定し、サンショウウオの個体数減少との関係を考察するためである。一度捕ったザリガニが分かるようにマーキングをして放し、その後ボランティア団体などの駆除活動で再び捕まった数をかぞえた。調査期間：2018 年 6 月 9 日～ 10 月 28 日。本校による再捕獲日：12 回。ボラン
ティア団体などによる再捕獲日：15 回。マーキングは、すべて本校生が行った。マーキングし放した個体は、90 個体。マーキ

ングして再び捕獲された個体が 3 個体。少ないデータの中ではあるが、現段階では、駆除しているザリガニは、東池に棲息しているザリガニの 3.3% といえる。他の地点に比べて、東池でトウキョウサンショウウオの卵嚢数が極めて少ないことと、駆除率の低さが関連していると考えられる。トウキョウサンショウウオの保全には、ザリガニの捕獲防除が必要と考えられる。

PH-011

プロポリスの摂取によるマウス腸内フローラの変化工藤 隼己
山村学園 山村国際高等学校 生物部
生物部では、微生物をマーカーとして、近年、健康食品として注目されているマヌカハニーの抗菌効果やモデルマウスから病気の予防や治療の研究を行っている。今回の研究は、長年にわたり民間療法の健康食品として飲み続けられているプロポリスの人気の秘密に迫るために実験を実施した。

プロポリスは、ハチミツの様に日本でも広く飼育されているセイヨウミツバチの巣由来の成分であり、健康食品として人気が高いことから、これをマウスに経口投与し腸内細菌フローラの変化を解析した。プロポリスの投与によりマウス腸内細菌フ
ローラは、善玉菌として知られている乳酸桿菌が３～５倍に増加し、日和見菌のプロボテラは平均 24.1 分の１（日本製は 42.5
分の１；イタリア製は 13.4 分の１；ブラジル製は 16.4 分の１）に減少した。

以上の結果から、一定期間のプロポリス摂取は、腸内の善玉菌を増やし、日和見菌を減らすなど、腸内細菌フローラのバランス改善に作用する可能性が強く示唆された。

PH-012

加工抗菌食材の食中毒原因菌におよぼす抗菌効果
田中 さくら山村学園 山村国際高等学校 生物部
生物部では、微生物を対象に健康食品の抗菌や、モデルマウスから病気の予防や治療の研究を行っている。1 年生部員の私は抗菌に興味があったので、家庭にあるチューブ入りの加工抗菌食材でも食中毒原因菌に抗菌効果があると考え（仮説）研究に取り組んだ。

加工抗菌食材としては、「本わさび」・「本からし」・「生にんにく」の３種類を使用した。抗菌効果の測定はペーパーディスク

法とし、マーカーの食中毒原因菌は黄色ブドウ球菌と腸炎ビブリオの 2 株を使用した。

黄色ブドウ球菌や腸炎ビブリオへの抗菌効果は、「本わさび」と「本からし」では阻止円範囲も広く、高い抗菌効果が観察された。この効果は、「本わさび」と「本からし」に含有される揮発性の辛味成分によるものと考察した。一方「生にんにく」では、阻止円範囲も狭く抗菌効果が低下した。これは、「生にんにく」では臭気成分が強く、揮発性の辛味成分は低下したものと考察した。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meetingPH-013

女子必見！マウス腸内細菌フローラから瘦せる乳酸菌チョコレート発見！
稲田 未来
山村学園 山村国際高等学校 生物部
先輩による潰瘍性大腸炎モデルマウスの研究は、機能性食品による腸内細菌フローラの変化から、この疾患の治療を検証した。しかし私は１年生、しかも女子部員。そこで、女子に関心のあるダイエットに注目して、乳酸菌チョコレートを摂取すれば腸内環境を改善してダイエットにつながると考え（仮説）研究を実施した。

マウスに「おやつ」として、乳酸菌が添加された乳酸菌チョコレートと普通のチョコレートを、10 代後半から 20 代の若い女性の平均体重に換算してメーカー奨励量を摂取させた。

マウスの腸内細菌フローラの観察から、乳酸菌チョコレートを摂取すると乳酸菌やビフィズス菌が増加した。また、瘦せ菌を含むバクテロイデスの増加も観察され、マウスの体重も５％ほど減少した。

乳酸菌チョコレートの摂取により腸内細菌フローラが改善され、特に瘦せ菌を含むバクテロイデスの増加からか、体重も減

少すると考察した。女子必見！のダイエットにつながる発見となった。

PH-014

ヤーコンによる２型糖尿病モデルマウスのインスリン抵抗性の改善効果
今井 柚貴
山村学園 山村国際高等学校 生物部
これまでの研究は、マウスに「高脂質飼料」を与え２型糖尿病モデルを完成させ、これにグルコースやインスリンを投与し、２型糖尿病の病理形態の理解を図ってきた。本研究では、このモデルから２型糖尿病の予防を考えた。予防にはフラクトオリ
ゴ糖を豊富に含むヤーコンを与え、インスリン抵抗性の改善効果（仮説）を研究した。

「普通飼料」・「高脂質飼料」・「ヤーコンと高脂質飼料」の３区に分け、体重増加や空腹血糖値、また腸内細菌フローラの観察と短鎖脂肪酸の産生量から改善効果を検討した。

「ヤーコンと高脂質飼料」区は、空腹血糖値や体重の増加が改善され、また腸内細菌フローラのバクテロイデスも増加し、短鎖脂肪酸の産生量も増えた。

２型糖尿病モデルマウスに「ヤーコン」を投与すれば、腸内細菌フローラのバクテロイデスの増加からか、短鎖脂肪酸が産生され腸管内での脂肪の取り込みや蓄積を抑える等、インスリン抵抗性の改善効果が得られた。

PH-015

身近な食材には薬剤耐性を持つバクテリアが存在する
Antibiotic-resistant bacteria are present in familiar foods
山下 明孝 , 棗 一世 , 市川 潤
山梨県立上野原高等学校 科学部
加熱調理には殺菌作用があるが、高温で死滅しない耐熱性バクテリアの存在とそれが原因で起こる食中毒の問題を知った。

そこで食材を滅菌 PBS で拭き取り、煮沸し、ウェルシュ菌選択培地に塗布した。好気条件および嫌気条件下で 48 時間培養し、コロニーの性状を観察した。

煮沸した場合コロニーは検出できなかったが、煮沸しない鶏肉サンプルから、好気条件下で必ず黄色ブドウ球菌様のコロニーが検出された。選択培地はカナマイシン含有なので、耐性菌の可能性を疑った。コロニーから DNA を抽出し、カナマイシ
ン耐性遺伝子を標的とする PCR を試みた結果、耐性の原因となる aadD 遺伝子を持つことがわかった。さらにブドウ球菌選択培地から多数のコロニーが検出された。耐熱性バクテリアは検出できなかったが、薬剤耐性のブドウ球菌が鶏肉には高頻度で付着していると思われる。その原因は、鶏の飼育方法や加工過程にあると推測する。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meetingPH-016

ミドリゾウリムシのナゾに迫る！
天野 隼 , 市原 慶悟 , 佐橋 浩太郎
岐阜県立加茂高等学校 自然科学部
ミドリゾウリムシ (Paramecium bursaria ) はクロレラが細胞内に共生していて光合成を行っている。私たちは、ミドリゾウリ

ムシの再共生の過程から共生のメカニズムを解明すること、共生後の変化を明らかにすることを目的としている。ミドリゾウ

リムシはレタスと枯草菌を混ぜた液体を使うことで培養し、これを暗条件で飼育することで白化した個体を作成することができた。再共生に必要なクロレラはミドリゾウリムシをホモジナイザーで細胞をしたり、超音波処理と冷凍の後解凍したりする
ことで取り出した。再共生は、上記の実験でできた 2 つを混ぜることで、確認することはできたが、培養して、形質が遺伝するのか、子孫は残せるのかの確認まではできていない。白化したミドリゾウリムシは、光合成という手段を失ったためか、ゾ
ウリムシよりも繁殖しにくかった。ミドリゾウリムシに進化したことで、クロレラに依存するようになってしまったのではな
いかと考える。

PH-017

オカダンゴムシのフンから単離したBrevibacterium 属放線菌による抗カビ物質
生産片岡 柾人
島根県立出雲高等学校 自然科学部
私の過去の研究で、オカダンゴムシのフンに、カビであるPenicillium steckii を抑制する効果があることがわかった。本研究

では、フンの中の細菌が、そのカビを抑制するか調査した。まず、３種類の寒天培地にフンを塗布して計 39 株の細菌・放線菌・カビを単離し、カビ (P. steckii ) を抑制した面積が最も広い一株を選抜した。この株を H4 株と呼ぶ。H4 株は、形態観察、

16S rRNA 遺伝子による系統樹解析、生化学性状解析から、Brevibacterium 属の放線菌で、B. sediminis と最も近縁であった。
次に、H4 株が生産する抗カビ物質の性質を調べた。H4 株とカビの間で寒天培地を分断した状況下で、発芽前と成長後のそれぞれの段階のカビへの抑制効果を検証し、その後 H4 株を除去し以後の経過観察を行った。結果、H4 株は、カビの発芽前と成長後の両方に抑制効果を示し、除去後にカビの形質異常を引き起こす揮発性の抗カビ物質を生産していることがわかった。

PH-018全国の酢屋で受け継がれてきた酢酸菌の遺伝子の比較と特徴
田中 千遥
愛媛大学附属高等学校 理科部
人類最古の調味料のお酢は、酢酸菌によって作られる。伝統的な製法でお酢を作る企業は、自社の酢酸菌を代々植え継いでいる。また、企業の創業時や災害復興時には、酢酸菌を含む種酢を同業他社から譲り受けていると知った。そこで本研究では、企業が植え継ぐ酢酸菌の遺伝子解析によって、種酢の授受の記録を分子系統解析で証明できるのか、地理的距離が近ければ遺伝的距離も近いのかを調べた。伝統的な製法でお酢を作る全国 23 の企業から種酢サンプルを集めて細菌を単離し、16S
rRNA 遺伝子に基づいて同定した結果、32 株の酢酸菌を得た。その中で 17 株と最も多くの株が得られた酢酸菌Acetobacter

pasteurianus のアルコール脱水素酵素遺伝子領域の塩基配列を解析した。系統解析した結果、過去に種酢の授受を行った企業

間、距離が近い企業間ともに系統関係は近くなく、企業が使用している原料の種類によって系統が分かれた。現在は、他領域の解析、野外株の解析も進めている。

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日本微生物生態学会第 33 回山梨大会
2019 JSME annual meetingPH-019耐塩性 ･ 好塩性細菌の塩分濃度を下げるメカニズムの解明
山田 宗草
愛媛県立今治西高等学校 生物部
私は好塩性細菌の土壌中の塩分濃度を下げるメカニズムの解明を目指し研究を行っている。最終的には、好塩性細菌を用いた塩害土壌の改善を行っていく。まず、19 種類の天日塩からマリンブロス寒天培地（以下 MB 培地）と標準寒天培地を用いて菌体を単離した。その結果、MB 培地では 15 種類、標準寒天培地では 3 種類の天日塩から好塩性細菌と考えられる菌体を単離した。これは MB 培地の方がイオン組成が豊富で、菌体にとって浸透圧調節がしやすかったためだと考えられる。単離菌株の好塩性を検証するために前述の MB 培地の 10 倍希釈の MB 培地を 3% と 15% に設定して培養を行った。その結果、天日塩 H 株

でのみ、3% と 15% の両方で増殖を確認でき、ほかの株は 3% でのみ増殖を確認できた。今後は天日塩 H 株を用いて高塩分濃度
下での細胞膜の作用や、菌体内蓄積物質に着目して好塩性細菌の土壌中の塩分濃度を下げるメカニズムを解明していく。

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