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浦 上財 団研 究 報告 書Vol.9(2001)

香 辛料 成 分 の生理 機能 一抗 酸化 お よび プ ロオキ シ ダン ト
作 用 の解析 と応用
昌孝 ・ 坪 内

吉野涼子

・ 村上恵子(愛知医科大学医学部生化学教室)

1.はに希釈 し,1.5μMのじ め に

硫 酸銅,及 び各種 の ポ リフ

ェノー ルを加 えて234nmの生 体 にお ける活性酸 素,お よび ラジカル は膜脂質,蛋 白,DNAに傷害 を与 え,多 くの疾 患,とくに虚血 ・再還 流傷害,い くつか の金属毒性 の発

吸光 度 を経時 的 に測定 した4》
。 こ こか ら酸 化 速 度 を算 出 し最 高 値 をpropagationrateと(2)DNA傷した。

害 の測 定:プ ラス ミドpBR322

現 に関与 してい る1)。香辛 料 は化学 的 には多 様 なDNAをgallicacid/CuSO、で処 理 し,ア ガ ロー

成 分の集合 で あるが,そ の多 くは活性 酸素 を消去

ス電気 泳動 に よってDNA切断 を測定 した5)。さす る抗酸化 性 を有 し,食 品の加 工 ・保 蔵 に応用 さらに仔 牛胸 腺DNAをれ て きた2,3)。その抗 酸 化性 は共 役二 重 結 合,あECD(高るいは フェ ノール構造 に由来 し,食 餌 か ら摂 取す的検 出器)に より,ヌ クレオ シ ドとその塩基 アダ

酵 素 的 に分解 し,HPLC‑速液 体 クロ マ トグ ラフ ィー/電 気化 学る植 物由来 の フラボ ノイ ドなどの ポ リフ ェノールク ト(8一ヒ ドロキ シー2'一デ オキ シグア ノシ ン,8‑化合 物 とも共通 の作用機 構 をもつ。 その一 方で ポOHdG)を定量 した5)。

リフェ ノール化 合物 は抗 菌性,抗 腫瘍 性 を示す も(3)銅の 還 元:CuSO4をの があ り,活 性 酸素 を生 成す るプ ロオキ シダ ン ト
作用 と推測 され る例が見 出 され てお り,こ れ らのよって発 色 させ492nmの構造 と活性 発現 の関連 が注 目され る。 本研 究で は量 した5)。

食物 として摂取 され る植 物由来 の ポ リフ ェノール化合 物 とその誘 導体の もつ抗酸 化作用 とプロオキ

還 元 して生 じた 一

価 の銅 イオ ンをバ ソク プロ インー2一スル ホ ン酸 に

3.結

吸 光度 の測 定 に よ り定

果 と考察

シダン ト作 用の構 造特異 性 を明 らか に し,と くにLDLの香辛 料成分 の多 くが示 す抗酸化 作用 を低密度 リボ

phaseの2相蛋 白質(LDL)の類 に分類 され る。即 ち,第 一 にlagphaseを酸 化抑制 を指 標 と して 解析 し,そ の構 造特 異性 の解明 を介 して香辛料 の機能 性食品 としての 役割 を明 らかにす る。
2.実
(1)ヒ

延長

影響 を与 えな いタ

二 のpropagationrateを

抗酸 化物質 はlagphaseに酸 化:

シ グ マ のlipoprotein,lowdensity(5.0‑6。5め に0。5g/mlのchelex100をす るが,propagationrateにイプAと,第ト低 密 度 リ ボ 蛋 白 質(LDL)のン 酸 カ リ ウ ム(pH7.4,重に分 かれ,抗 酸化物 質の効果 は2種

せ る タイ プBで ある(図1)。Aタ験 方 法mgprotein/m1)を0.15MNaClを酸化過 程はlagphaseとpropagation

減少 さイ プに 属す る

添加 する とpropaga‑tionrateを 増 加 させ るプ ロオ キシ ダン トとして
はた ら く傾 向 を示 し,そ の例 はtroloxで あ る。

含 む10mMリ
金属 イ オ ン除 去 のた添 加)によ り200倍植物 由来の ポ リフェ ノー ル としてフ ラボノ イ ドにつ いてプ ロオキ シダ ン トの効果 を検討 した。 フラ
ボ ノイ ドはA環 にレ ゾル シノー ル構造,B環にカ39

香辛料成分の生理機能 一抗酸化およびプロオキシダント作用の解析と応用

図1銅依 存 性LDL酸

LDLを0.03mg/mlのmMリ化 に対 す る 抗 酸 化物 質 の 作 用件 で37℃

で イ ン キ ュベ ー ト し,LDLの添 加 した 条酸 化 を234nmの的 に 測 定 し た 。AntioxidantA;trolox添curcumin添

図2銅

濃 度 で0.15MNaCl,1.5μMCuSO<,10ン酸 緩 衝 液 の 下 で,1uMtrolox,curcuminを吸収で経時加,AntioxidantB;

加.

表1依存性LDL酸化に対するフラボノイ ドの効果

図1と 同様 の条件 で,フ ラボ ノイドを混和 した条件でCuSO、 の添加により反応をス ター トした場合(A)と,Iagphaseの30分後にフラボノイドと添加 した場合(B)。Curve1;noaddition,Curve
2:quercetin,Curve3;catechin,Cunpes4&5;tarifolin&rutin。添加 フラボ ノイ ドの濃度 は1μM.
テ コ ー ル,あるい は レ ゾ ル シ ノー ル 構 造 を もつ もの が 多 い。 これ ら はLDL酸化 を抑 制 す る抗 酸 化物 質 と し て 働 く(図2A)が,lagphaseに添加

す る とプ ロ オ キ シ ダ ン トと して 働 き,Aタ
作 用 を 示 し た(図2B)。
い てlagphaseに

各種の フラボ ノイ ドにつ
添 加 し た 場 合 のLDL酸

propagationrateを

求 め た 。 表1に

フ ラ ボ ノ イ ドのpropagationrateのQuercetin

FlavonolProtocatechuicacid

Flavanol

Flavanone

Catechin

Taxifolin

Kaempferol

Rutin

catechol

Scheme1

イ プのGalangin

MyricetinHesperetin

化 の示 す よ うに
促 進,即ち40

浦 上財 団 研究 報 告書Vol.9(2001)

プロ オキシ ダン ト作 用の発 現は カテ コー ル構造 とと して の ア ル キ ル エ ス テ ル(Scheme2)の関連す るが,興 味 ある ことはプ ロオキ シダン ト作

解 析 し た(図3)。LDLの効果 を

酸化 に対 す る防御 作用用を示 すTaxifolinは その 一つの フェ ノール基 がと して の 抗 酸 化 効 果 は ア ル キ ル 鎖 の 長 さ に依 存 し,メ トキシ化 され たHesperetinが長 鎖 のoctylgallate,laurylgallateが強力 な抗酸 化物質 として作用 する こ とで ある。 この ことはプ ロオ

効 果 を 示 す の に 対 し て,遊キ シダン ト作 用の発現 に はカテ コール構造 が必 要

ethylgallateはLDL酸

強 力 な抑制離 のgallate,短化 を 促 進 し,プであ るこ とを示す と ともに,メ トキシ基 の存在 がダ ン ト と し て 作 用 し た(図3)。Gallate誘抗 酸化作 用 に重要 な意 味 を もつ ことを示 して いる

LDL酸(Scheme1)ogationrateのフ ラボノ イ ドを はじめ として,多 くの抗 酸化物質に共 通の 構造 で あるgallicacidとその誘 導体

GallateAlkylgallate

変 化 と し て 表2に

ま と め た 。Gal‑late,ethylgallateはpropagationrateを2倍
上 に 促 進 し,プ以ロオ キシダ ン トとして作用 するのに 対 し,octy1‑,laurylgallateは

い ず れ もprop‑

減 少 さ せ,抗酸 化物質 としての役

割 が 明 ら か と な っ た 。Gallate誘制 ・促 進 効 果 はgallate誘

Scheme2導 体の化 に対 す る ア ル キ ル 鎖 長 の 影 響 をpropa‑

agationrateを

n=1Ethvlaallate
n=2
ProDYIgallate
n=3Butylgallate
n=7Octylgallate

鎖のロオ キ シ

導体 の酸 化 抑導 体 の 還 元 力 と強 い 相

関 を 示 し た 。 即 ち短 鎖 のgallate誘

導 体 ほ ど強 力

な銅 の 還 元 力 を 示 す の に 対 し,鎖長 の延伸 につれて還 元 力 は 低 下 し た(図4)。
Gallicacid誘

導体 のプ ロオ キシ ダ ン トとしての 性 質 に つ い て,DNA鎖の 切 断 とDNA中の8‑hydroxy‑2'‑deoxyguanosine(8‑OHdG)の生 成を 指 標 と し て 検 討 し た 。 プ ラ ス ミ ドDNA鎖Gallicacidに
supercoilからopencircular,1inear型

す る た め,傷害 の 程 度 を 半 定 量 化 で き る6)。 こ のDNA傷
図3銅依 存性LDL酸

図2Bと同 様 の 条件 で反 応 開 始 後30分

化 に 対 す るGallicacid誘

はよ っ て 銅 イ オ ン 存 在 下 で 切 断 され,へ と変化

害 能 は 遊 離 のGallicacidが最 も強力 で導体 の 効 果のlagphaseにgallicacid

誘 導 体 を 添 加 し た。Curve1:noaddition,Curve2:gallicacid,Curve3;ethylgallate,Curve4:butylgallate.Curve5:1aur‑ylgallate,Curve6;octylgallate.Gallate誘導 体 の濃 度 は す べ て1μM.

表2

図4Gallicacid誘
硫酸 銅 とGallicacid誘

導 体 に よ る鋼 イ オ ンの 還 元
導 体 を混 和 し,還元 型 銅 イ オ ン を バ ソク

ア ロ イ ン スル フ ォン 酸 に よ っ て定 量 した(5)。 ◆,gallicacid;■,ethylgallate;△,prop}・lgallate:=,butylgallate;C,octy1・gallate;・,laun‑lgallate.

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香辛料成分の生理機能 一抗酸化およびプロオキシダン ト作用の解析 と応用AB
図6Gallicacid誘
導 体1Cuに よる仔牛胸腺DNA中8一シー2'一デオキシグアノシンの生成

ヒ ドロキ

図5と 同様 の条 件で 仔牛 胸 腺DNAを処理 し,酵 素 分解 後
HPLC‑ECD法により定量した。8‑OHdGは デオキシグアノシ ンとの比で表した。

還 元 され,次 い で還 元銅 イオ ンが酸素分 子 と反 応
して生 じたスーパ ーオ キシ ドか ら過酸化 水素,ヒ
図5Gallicacid誘導 体/Cuによ る プ ラ ス ミ ドDNAのpBR322DNAの0.5μgを0.2mMCuSO,存誘 導 体 と1時間,37℃

分解

在 下 で 次 のgallate

で イン キ ュ ベ ー トし た後,アガ ロ ー ス 電 気泳

動 を 行 っ た 。A.(lane1)Noaddition(DNAcontrol);(lane2)gallicacidwithoutcopper;(1ane3)gallicacid;(lane4)

ドロ キシル ラジカ ルを生成 した結果,DNA鎖の切 断 とグアニ ンに特 異的 な修飾 を起 こす もの と解
釈 され る。従来 報告 され てい るGallicacid誘

ethylgallate;(lane5)propylgallate;(1ane6)butylgallate;(lane7)octylgallate;(1ane8)1aurylgallate.Gallicacid言秀導体 濃 度 は0.2mM.B。(lane1)DNAcontrol;(lane2)com‑るDNA傷

pletesystemwithgallicacid;(1ane3)gallicacld十25μg/ml

導体 の細胞 毒性7‑9)は今回 の銅 イオ ン存 在下 にお け
害作 用,と くに8‑OHdGの生成 と強catalase;(lane4)gallicacid+00hg/mlcatalase;(laneo)

く関連す る ことが推 測 され る。

gallicacid+75μg/mlcatalase;(lane6)75μg/mlcatalase十gallicacid(cQpperな(gallicacidなし):(!ane7)75μg/mlcatalase+copper

ポ リフェノー ル誘 導体 の中 には一つ のフ ェノーし);(1ane8)galIicacid+25μg/mlsuperoxidedismutase;(lane9)gallicacid+50μg/mlsuperoxidedis‑

ル がメ トキシ化 されて,一 つの 水酸基 と一つ のメ

mutase;(lane10)gallicacid十75ug/mlsuperoxidedis‑mutase;(lane11)75μg/mlsuperoxidedismutase(gallicacidなトキ シ基 を もつ化 合物が 自然界 には多 く存在 する。

し);(lane12)75μg/mlsuperoxidedismutase+copper(gallicacidなし).

先 に 示 した フ ラボ ノ イ ドのtaxifolinとhesper・あ り,ethyl‑,propyl‑,butylgallateが

こ れ に

続 い た 。octyl‑,laurylgallateは

弱 い傷 害 作 用

し か 示 さ な か っ た(図5A)。Gallicacid化によるDNA鎖合物の切 断 はカタ ラーゼ の添 加 によ って 抑 え ら れ た が,Superoxidedismutaseは無効で あった(図5B)。
仔 牛 胸 腺DNAもプ ラ ス ミ ドDNAと同様 に断 と並行 して8‑OHdGの生成 が 認 め られ た(図6)。GallicacidのDNA傷
害能 はLDL酸のGに

saicin,eugenol,gingero1はpropagationrate
を強 く減少 させ た。2つ の ベ ンゼ ン環を もつcur‑cuminの抗酸 化効 果 は比較 的弱 か った(図7)。

結 合 し た 銅 イ オ ン がgallicacidに対 す る効果 を まとめて表3に 示す 。
こ こに あ げたcapsaicin,dihydrocapsaicin,gingerol,eugenol,curcuminな

どは従 来用 い ら

れ て きた香 辛料 の主成分 をなす物 質で あ り,こ れ化 の場合 と同様 に銅 イ オン に依 存

し,そ の還元 力 と相関 す る。DNAのGC塩化に

対 す る作 用 を検 討 した。ア ルキ ル基 を もつcap‑

これ らの化合物 のpropagationrateにGallate/銅 イオ ンで処 理す る ことに よ り断片 化するが,こ のDNA切

etinが この関 係 にあた る。 これ らのLDL酸

らがいず れ もメ トキシ基 を もつ フェ ノール化合 物

基対で あ って抗 酸化作 用の みを示 し,プ ロオキ シダ ン

よってトと して の機能 をもた ない ことは多 くのフ ラポノ

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浦上 財 団研 究 報告 書Vo1.9(2001>
表3

図7銅依 存 性LDL酸

化 に対 す る メ ト キ シ基 を有 す る フ ェ ノ ー ル化合物の効果
図2Bと同様 の条 件 で,メ添 加 し,LDL酸

本研 究 を遂 行す るに あた り,多 大な ご援助 を賜トキ シ 基 を有 す る フ ェ ノ ー ル 化 合物 を化 に対 す る 効 果 を 検 討 し た 。Curve1;noaddi・りま した浦 上食品 ・食文化 振興財 団 に,厚 く御 礼tion,Curve2;capsaicin,Curve3;eugenol,Curve4;ginger‑
ol,Curve5;curcumin.添加 濃 度 は す べ て1μM.

申 し上げ ます。
イ ドとは対 照的 であ り,香 辛料 の役割 を よ く反映
して い る。香 辛 料 に特 異 的 な 成 分 で あ るCap‑

文

献

saicinな ど強 い抗酸 化効 果 を示 す 物質 の 構造 は

1)Comporti,M.(1985)Lab.Invest.53,599‑623.

強 力 な 合 成 抗 酸 化 剤 で あ るbutylhydrox‑2)Chawla,A.S.,Hande,S.S.,Sharma,A.K.and
Kalik,B.S.(1987)J.Sci.IndustrialRes.46,214‑

yanisoleの 構造 と類似 してい る(Scheme3)。

香辛 料の作用 に特 異的 な構 造の解 析 はその機能 性食品 への応用 を考 え るうえで重 要で ある。

223.
3)Salimath,U.,Sundaresh,C.S.andSriniva,L.
(1986)Nutr.Res.6,1171‑1178.

Capsaicin

GuaiacolDihydrocapsaicin

GingerolEugenol

Curcumin

Butylhydroxyanisole

FerulicAcid

Scheme3

香辛料成分の生理機能一抗酸化およびプロオキシダント作用の解析 と応用
4)Puhl,H.,VVaeg,G.andEsterbauer,H.(1994)
MethodsEnzymol.233,425‑441.
5)Murakami,K.andYoshino,M.(1998)Anal.Bio‑Arch.Toxicol.72,33‑37.
8)Serrano,A.,Palacios,C.,Roy',G.,Cespon,C.Villar,
M.L.,IV'ocito,M.andGonzales‑Porque,P.(1998)

them.257,40‑44.

∠4rclt.Bioclzem.B∫oρ6)Yoshino,M.,Haneda,M.,Naruse,M.andMura‑

9)Inoue,M.,Suzuki,R.,Koide,T.,Sakaguchi,N.,乃ys.350,49‑54.

kami,K.(1999)Mol.GeneticsMetabolism68,468‑

Ogihara,Y.andYabu,Y.(1994)Biochem.Biopl2ys.

472.

Res.Comrnun.204,898‑904.

7)Nakagawa.Y..Moldeus.P.andMoore.G.(1997)

43

44

URAKAMIFOUNDATIONMEMOIRSVo1.9(2001)

BiochemicalEffectsofSpiceIngredients:StructuralSpecificityof
AntioxidantandProoxidantAction
MasatakaYoshino,RyokoTsubouchiandKeikoMurakami(DepartmentofBiochemistry,AichiMedicalUniversitySchoolofMedicine)

Effectsofnaturallyoccurringpolyphenolicsincludingspiceingredientsonthe
humanlowdensitylipoproteinwereanalyzed.Mostflavonoidsaspolyphenolicswith
catecholmoietyintheBringsuchasquercetin,kaempferol,galangin,myricetin,taxifolinandcatechininhibitedLDLoxidation,butshowedaprooxidantactionwhen
addedatlagphaseoftheoxidation.Alkylestersofgallicacidwithpolyphenolicstruc‑turealsoshowedaprooxidanteffectbystimulatingthecopper‑mediatedLDLoxida‑
tion,andbyDNAstrandscissionandtheformationof8‑hydroxy‑2'‑deoxyguanosine
theDNAbaseadduct.Theseprooxidanteffectsofgallateestersweredependingontheiralkylchainlength,andclosely‑correlatedwiththecopper‑dependentoxidationactivity.
Themostpotentprooxidantwasgallicacidfollowedbyethyl‑,propyl‑andbutylgal‑
latesinthisorder,andoctyl‑andlaurylgallatesdidnotshowanyprooxidanteffect.
Somepolyphenolicswiththemethoxygroupsuchascapsaicin,eugenol,gingerol
andcurcuminasthespiceingredientsshowedonlyantioxidanteffectwithoutproox‑
idantactionontheLDLoxidation.Structuresofthesecompoundsresemblesthatofbutylhydroxyanisolethesyntheticandpotentantioxidant.Antioxidantactionofspiceasthefoodadditivescanbeexplainedbythemethoxylatedpolyphenolicstructureofits
ingredients.