電気化学的手法を用いたタンパク質化学修飾法
東京工業大学

科学技術創成研究院
教授 中村 浩之
2021年11月2日

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標的タンパク質のラベル化
一般的なラベリング
GFP fusion tag

Small-moleculeAntibody

OOH

遺伝子組換えが必要
タグ分子が大きいON
N

N

O

Small chemical tag
H
N

生細胞内での標的タンパク質のラベル化

OO
N
S
O

Post-translational modification(Chemical modification)

クロストーク機能ダイナミクス

局在2

従来のタンパク質ラベル化法
一般的なタンパク質ラベル化法は、求核的なアミノ酸残基であるcysteine あるいは lysineへの求電子剤との反応が多い
Reductive
amination
還元的アミノ化法

スルホンアミド法

ジスルフィド法

活性エステル法

ハロアシル法マレイミド法 イソシアニド法

3従来技術：システイン残基ラベル化法とその問題点
既に実用化されているものには、マレイミドを用いた共役付加反応法等がある。
レトロ付加反応に起因する脱離が起こる反応溶液のpHの上昇により選択性が低下
フリーのSH基がタンパク質内に少ない等の問題があり、使用するには制限が多い。
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従来技術：リジン残基ラベル化法とその問題点
既に実用化されているものには、Nーヒドロキシスクシンイミドを用いた活性化エステル法等がある。
プロテアーゼに起因する加水分解が起こる
ラベル化に伴うタンパク質表面電荷の変化
ラベル化数、部位選択性の制御が困難等の問題があり、使用するには制限が多い。
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新技術：チロシン残基ラベル化法① Heminを用いたチロシン残基ラベル化法② 電気化学的手法による修飾タンパク質の製造方法③ 高反応性試薬によるチロシン残基ラベル化法6

新技術①：Heminを用いたチロシン残基ラベル化法
特許第6598286号（特許権者：国立大学法人東京工業大学）
2019年10月11日特許登録

in situ activation✔ 高効率✔ 高いチロシン残基選択性✔ 求電子的修飾法との直交性

タンパク質

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ルミノール反応のメカニズム
light-N2??
Luminolsolution

H2O2solutionTyr
ウキペディアより犯罪捜査などで用いられる血液検出法

cyclic diazodicarbonyl
PTAD

Tyr 選択的修飾
Tyr
Lys

PTAD : 不安定
Ban, H., Gavrilyuk, J., Barbas, C. F. III, Proc. J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 1523. Ban, H., Nagano, M., Gavrilyuk,J., Hakamata, W., Inokuma, T., Barbas, C. F. III, Bioconjugate Chem. 2013, 24, 520.

8

ルミノール反応のメカニズム
light??
Luminolsolution

H2O2solution

Tyr
React with tyrosine residues
ウキペディアより犯罪捜査などで用いられる血液検出法

ルミノール誘導体の構造最適化

S. Sato, K. Nakamura, H. Nakamura, ACS Chem. Biol. 10, 2633-2640 (2015)9新技術の実施例➢ Streptavidin の部位特異的ラベル化➢ Trastuzumab の部位特異的ラベル化

Tyr83のみラベル化（溶媒接触度に依存）

抗体のCDR領域のTyrに特異的

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新技術の実施例➢ 薬物抗体複合体（ADC）への応用
Hydrophobic Interaction Chromatography(Trastuzumab)
ハーセプチン
結合数01 2 3 4 5 6 7Ly s M o d ifica tio n o n R a n d o m Site s
平均薬剤結合数 = 3 . 5( １ 抗体あたり 0 〜7 個結合)

カドサイラ
カドサイラ

平均薬剤結合数 ≒ 2

我々のADC
SK-BR-3 (HER2+) cell based ELISA assay
150.

Trastuzumab
Kadcyla112.5

DM-1-mod. Trastuzumaba.u.

75.

37.5

0.
0-37.510concentration (nM)

1000

Kd = 2.37 nM
4.78 nM
7.61 nM
HER2 陽性細胞の腫瘍

新技術の実施例➢ 細胞免疫染色法への応用
1)

hemin, H2O2
r.t. 1 hr

2)
抗tubulin抗体

37 ℃ 1 hr

ラベル化抗体DBCO- fluor 488

HeLa cells

通常の免疫染色(抗tubulin抗体+ FITC-二次抗体)

Blue : DAPIGreen : ラベル化
抗体 (tubulin)12➢ 従来法：ペルオキダーゼによるTyrラベル化機構
・+

チラミド法

tyramide
H2O2

Heme

Horseradish
Peroxidase (HRP)✓ ラベル化剤同士で反応✓ ラベル化効率は低い

tyramidetyrosine+· (tyrosyl radical)
oxidizedtyramidetyramidetyramidedimer or trimer

Tyr

チラミド多量体の生成13

新技術②：電気化学的手法による修飾タンパク質の製造方法
特願2018-124834（出願人：国立大学法人東京工業大学）
2018年6月29日出願
タンパク質eY-click14新技術の実施例➢ Trastuzumab のラベル化の比較➢ HRPよりややラベル化効率が下がる➢ 酸化剤（H2O2）が不要➢ 加える試薬が不要（GMP対応可能）

S. Sato, M. Matsumura, T. Kadonosono, S. Abe, T. Ueno, H. Ueda, H. Nakamura, Bioconjugate Chem. 31, 1417-1424 (2020)15

新技術③：高反応性試薬によるチロシン残基修飾
出願人：東京工業大学、特願2020-80345、出願日 : 2020年4月30日

タンパク質

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新技術の実施例➢ 使用直前にラベル化剤の活性化
試薬100 uM Angiotensin II in 50 mM Tris (pH 7.4), r.t. 20 min➢ 安定・保存可能➢ 高いラベル化効率

NH2-DRVYIHPF-COOH
just after
preparation

double mod. (Y)after 3 h r.t.

after 16 h r.t.

single mod. (Y)17新技術の実施例➢ Quench-bodyへの展開

試薬、DMF

S. Sato, M. Matsumura, H. Ueda, H. Nakamura, ChemComm. 57, 9760-9763 (2021).

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新技術④：チロシンホスファターゼ及びチロシンキナーゼ活性の測定方法
出願人：東京工業大学、特許登録番号：第67707550号 、登録日 : 2020年9月30日
チロシンホスファターゼ（PTP）
ペプチド基質認識能PTP

チロシンラベル化反応

PTP
PTP

標的PTP

脱リン酸化

検出

標的PTP基質ペプチド19

新技術の実施例➢ チロシンホスファターゼ活性の測定方法
ADP

ATPKinasePP

脱リ ン 酸化反応の定量
チロ シ ン ホスフ ァ タ ーゼ
活性検出の新⼿法

Tyrdetectable tag

Tyr

Tyr
TyrPhosphataseP

従来法

本技術

• リ ン 酸化チロ シン ミ ミ ッ ク を 基質にする ⼿法〇⽣体の夾雑物の存在下で基質ペプ チド の脱リ ン 化状態を 観測でき る
e.g .

p-nitrophenyl phoshate(pNPP)

標的の基質ペプ チド を プ レ ート に固定化

Abs. 405 nm• マラ カ イ ト グリ ーン によ る
無機リ ン 酸 P の定量
×⽣体の夾雑物と も 反応し てし ま う（ 精製酵素での使⽤に限定）

TyrP

Ce ll Ly sa te

脱リ ン 酸化さ れた
チロ シ ン 残基のラ ベリ ン グ・ 検出

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新技術：チロシン残基ラベル化法の特徴・従来技術との比較• 従来のラベル化技術は、生体内での特に酵素に対する安定性に課題があったが、本技術のチロシン残基ラベル化により炭素ー炭素結合でラベル化できることから、代謝安定性が担保できる。 （技術１〜３）• 従来技術のリジン残基のラベル化では、問題点であった、タンパク質の表面電荷の変化をチロシン残基ラベル化で、回避することに成功。
（技術１〜３）21

新技術：チロシン残基ラベル化法の特徴・従来技術との比較• 特異的ラベル化が困難であり、生成物は混合物であったが、溶媒接触度による特異性が向上したため、品質が担保可能となった。
（技術１〜３）• 従来技術の問題点であった、酸化剤の添加によるタンパク質の酸化を回避することに成功。
（技術２）
22

新技術：チロシン残基ラベル化法の特徴・従来技術との比較• 従来技術のマラカイトグリーンによるホスファターゼ反応で生成する無機リン酸の検出限界
は500 pmolであったが、本技術で非リン酸化ペプチドを 100 pmol のスケールで検出可能。
（技術１、３、４）• 従来技術では、精製酵素での使用に限定されていたが、生体の夾雑物の存在下での標的の基質ペプチドによる検出が可能。（技術４）23想定される用途• 電気化学的手法によるラベル化では、加える試薬が不要であるため、密閉形でのフロープロセスが可能となり、医薬品（GMP基準）製造といった用途に展開することも可能 。したがって、核医学の分野での放射性同位体の導入技術への応用が考えられる。（技術２）24想定される用途• 従来技術の問題点であった、ラベル化剤の不安定性を克服し、ラベル化剤を使用直前に活性化できる本技術は、生化学的実験試薬への用途に展開することも可能。 （技術３）• チロシンホスファターゼ関連の疾患の診断技術、阻害剤スクリーニング法への展開。
（技術４）
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実用化に向けた課題• 現在、電気化学的ラベル化技術についてマイクロリットルスケールでのプロセスが可能なところまで開発済み。しかし、ラベル化効率の向上の点が未解決である。
• 今後、溶媒接触度の小さいチロシン残基の場合について、ラベル化可能な条件条件設定を行っていくことで、対象タンパク質の範囲を広げていく。。
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企業への期待• 核医学の分野での放射性同位体の導入技術を持つ、企業との共同研究を希望。
• また、薬物抗体複合体（ADC）を開発中の企業、医療分野への展開を考えている企業には、本技術の導入が有効と思われる。
• さらに、抗体センサーの開発を考えている企業には、本技術の導入が有効と思われる。

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本技術①に関する知的財産権• 発明の名称• 特許番号• 出願人• 発明者：チロシンの修飾方法：第6598286号：東京工業大学：佐藤伸一、中村浩之

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本技術②に関する知的財産権• 発明の名称 ：電気化学的手法による修飾
タンパク質の製造方法• 出願番号：特願2018-124834• 出願人：東京工業大学• 発明者：佐藤伸一、中村浩之

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本技術③に関する知的財産権• 発明の名称 ：高反応性試薬によるチロシン残基修飾• 出願番号：特願2020-80345• 出願人：東京工業大学• 発明者：佐藤伸一、中村浩之

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本技術④に関する知的財産権• 発明の名称 ：チロシンホスファターゼ及びチロシンキナーゼ活性の測定方法• 特許番号：第67707550号• 出願人：東京工業大学• 発明者：佐藤伸一、中村浩之、中野洋文

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お問い合わせ先
東京工業大学
研究・産学連携本部
ＴＥＬ ０３－５７３４－２４４５
ＦＡＸ ０３－５７３４－２４８２
e-mail sangaku@sangaku.titech.ac.jp32