漬物用乳酸菌スターターの開発
加工食品部

1. はじめに橋本俊郎＊

風発酵白菜キムチの３種類を入手して用いた。
いずれも食品加工における微生物の利用は古くから行われ，酒，ビール，ワイン，味噌・醤油，納豆など多くの発酵食品漬け込み後，１〜２週間のものである。
2.2 微生物試験法及び乳酸の光学異性体の判別法が生まれた。
乳酸菌は酵母と並んで古くから利用されて乳酸菌の分離及び計数には MRS ブロス（ Difco）におり，人々はその食品に適した乳酸菌を自然界から分離寒天及び炭酸カルシウムを加えた培地を用いた。生理し，純粋培養した後，培養液そのまま，濃縮液状品，凍試験用の液体培養には GYP 培地を用いた。即ち，グ結品あるいは凍結乾燥品などの形状でスターターとしルコース 1g，酵母エキス 1g，ペプトン 0.5g，酢酸ナて利用している１）。乳酸菌の菌種として，ヨーグルトはトリウム 0.2g，塩類溶液（ 1ml あたり硫酸マグネシウ

Lactobacillus

Streptococcus

ム 40mg，硫酸マンガン 2mg，硫酸鉄 2mg，食塩 2mg

thermophilus，味噌の醸造には耐塩性の Pediococcusが含まれる。）0.5ml 及びツイーン 80 溶液(50mg／ml

halophilus というように各食品に適した種類の乳酸菌水溶液)1ml を蒸留水 100ml に溶かした。同定試験はが使用される。

乳酸菌実験マニュアル 2)に従った。発酵乳酸の異性体

bulgaricusと一方，野菜漬物では特有の風味の形成に乳酸菌が作用の判別は，大塚ら 3) の方法に従い HPLC 分析によった。

していると考えられているが，未だに自然の乳酸菌，即生育条件の比較として L.plantarum

ち，環境由来や野菜付着の乳酸菌が発酵の主役となってIFO-15891 ,L.sakei IFO-15893 ,E.coli IFO-3972 をいる。そのため，保存性や風味などが乳酸菌の種類や増用いた。この場合，E.coli は酢酸塩で生育が阻害され殖度に影響され，品質的に安定を欠いている。また，近るので酢酸ナトリウムを除いた GYP 培地を用いた。

年の低塩漬物の拍車化によって非加熱漬物における大2.3 野菜の食塩浸出液での生育試験法

腸菌群等の食中毒菌の増殖が危惧され，乳酸菌による大(1) HS-1 生育増強成分の調査腸菌群の抑制が提唱されている。
乳酸発酵を漬物製造工

細切りしたハクサイあるいはダイコンに野菜重量の程の一部に取り込むことにより，安全で健康に良く風味5%の食塩を加えて重石を乗せ，冷蔵庫で５日間放置しの優れた漬物の開発が期待される。
この場合に漬物用乳て食塩浸出液（下漬液）を得た。メンブランフィルター

酸菌スターターとしては，食塩耐性を有する植物性乳酸で除菌した浸出液の食塩分は 5.4〜5.5%であった。これ

菌で発酵温度は室温または室温以下の中温性もしくはに滅菌蒸留水を加えて２倍に希釈したものを培地とし低温性乳酸菌が望ましく，ガス発生を伴わないホモ発酵て用いた。GYP 培地に比べ生育が劣ったのでグルコー乳酸菌が適すると考えられる。

ス(1%)，酵母エキス(1%)，ペプトン(0.5%)，塩類溶液

これらの条件を満たす乳酸菌として，キムチより(0.5%)，ツイーン 80 溶液(1%)及び酢酸ナトリウム

Lactobacillus sakei HS-1 を発見し，スターターとして(0.2%)のそれぞれを加えた場合の生育への影響を調べ検討した結果，優れた性質を有することが明らかになった。

たので報告する。

(2)

ダイコンの食塩浸出液と麹エキス混合液における培養温度の生育への影響
2. 実験方法

酵母エキスの代替として麹エキスを使用した。
ダイコ

2.1 材料ン 500g に水 250g，食塩 37.5g，酢酸 1.5ml を加えて重乳酸菌の分離源として，近在で味が良いと評判の韓国石を乗せ，３日間漬けた。濾過して 490ml の下漬け液が得られたので，５分間煮沸し，続けて水酸化ナトリウ*加工食品部

2
ム溶液で pH6.8 に中和後，麹エキス（定法による）
200ml

無作為に１コロニーづつ選択してダーラム管入りと水を加えて 1,000ml として，オートクレーブ処理しGYP 液体培地に接種，培養した。ヘテロ発酵菌は膨た。HS-1 を含む３種類の乳酸菌を接種して５〜30℃でれなどの原因となるのでガス発生を示したコロニー培養し，生育への影響を調べた。

は除いた。残った細菌の形状を顕微鏡で観察し，桿菌

2.4 HS-1 を用いたハクサイ発酵試験をスターターの候補として選んだ。これらの桿菌はい

下漬ハクサイに HS-1 を添加して，発酵させた場合のずれもグラム染色陽性で，カタラーゼ−，グルコース性状を調べた。下漬法は通常と異なり，高食塩濃度で迅から乳酸のみを生成する乳酸菌であった。最後に，ハ速に漬ける方法とした。即ち，ハクサイ２個(4.3Kg)にクサイの食塩浸出液に接種し，生育の良好なコロニー最終濃度で食塩 30%，酢酸 0.5%及び差し水 4.3L を加から順に番号を付与した。

え，6 時間漬けた。3.5Kg となった下漬ハクサイに差し

表１に分離した乳酸桿菌 R-1 の生理的性質を示し

水 5%，食塩 1%，酢酸ナトリウム 0.5%，酵母エキスた。分離したコロニーはいずれも R-1 と同様な性質を0.1%及び HS-1 を 1.6×105 CFU/g を添加し，重石を示し，比較に用いた L. plantarum IFO-15891 とはい

加えて 15℃で発酵させた。

くつかの点で異なっていた。ペプチドグリカンのタイ
プが非 DAP であること，ラフィノース，マンニトー

3. 実験結果及び考察

ル，ソルビトールを資化しないこと，酢酸塩の存在下

3.1 漬物からの乳酸菌の分離と同定

で生成乳酸の異性体タイプが DL 型から L 型に変化す

仕込み後 1〜2 週間のキムチをストマッカー処理し，ることが主な相違点であった。特に異性体タイプの変グラム陰性菌や真菌を抑制するためアジ化ナトリウ化は L. sakei のみに観察されていることから，この乳ムとシクロヘキシミドを添加した白亜 MRS 培地で分酸菌 R-1 は L. sakei と同定した。
以降，R-1 は L. sakei

離培養した。培養して酸生成を示したコロニー群から

HS-1 または HS-1 と称する。

表 １白 菜 キ ム チ か ら 分 離 し た 乳 酸 桿 菌 の 性 質
１５℃での生育４５℃での生育
発酵形式
生成乳酸異性体タイプ
酢酸存在下での乳酸異性体タイプ
ペプチドグリカンの型
糖類発酵性
アラビノース
リボース
キシロース
フラクトースマンノース
ラクトース
シュクローストレハロースラフィノースマンニトールソルビトール
グルコン酸ナトリウム
マルトース
ガラクトースメリビオース
6.5％食塩存在下での生育
同定菌種名＋ ：陽 性 ，− ：陰 性

R-1＋−ホモDLL
非DAP

L.plantarum *＋−ホモDLDLDAP＋＋−＋＋＋＋＋−−−＋＋＋＋＋
Lactobacillus sakei＋＋−＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋*IFO-15891

3L. sakei は，名前の由来通り酒のもろみから発見され育できなかった（表４）。従って，HS-1 の乳酸発酵でたが，これまで日本の漬物から分離された報告はみあた

pH が低下した場合，大腸菌の生育は抑制されると考えらない。著者 4)は，先に市販浅漬から分離しており，こられる。の乳酸菌種は漬物に普遍的に存在して漬け込み初期に表４ E.coliの増殖に対する乳酸(0.5%)の影響有用な働きをしていると考えている。
3.2 GYP 培地における生育条件の比較
なお，分離の際に棄却したヘテロ乳酸菌(Leuconostoc
mesenteroides と思われた｡ )で発酵させたハクサイ漬

HS1pH4.5+pH5.0+
培地：GYP(酢酸Naを除く）
培養期間：30℃，6日間
pHは水酸化ﾅﾄﾘｳﾑで調整

E.coli+は，香りが悪く，スターターとして不適当と思われた。
(3) 食塩耐性(1) 生育温度
HS-1 は ， タ イ プ カ ル チ ャ ー で あ る L. sakei

HS-1 は L.plantarum と同様に食塩濃度 8%まで生育

IFO-15893 より広い５℃から 40℃の温度範囲で生育をを示した（表５）。しかし，生育菌数を調べると食塩 5%示した。また，大腸菌は 10℃から 45℃の範囲で増殖が以上で増殖度（生菌数）は劣ることがわかった。

可能であった（表２）。

表２ 各微生物の生育温度
培養温度(℃) HS1L.plantarum L.sake
IFO15891 IFO15893
5+10+++15+++40++45培地：
GYP(酢酸Naを除く）培養期間：５日間- : <0.1 at abs.660nm

表５ 各微生物の耐塩性

E.coli
IFO3972++++食塩濃度(%)

HS1L.plantarum L.sake
E.coli
IFO15891 IFO15893 IFO3972
６++++７+++８++９培地：GYP(酢酸Naを除く）
培養期間：30℃，５日間- : <0.1 at abs.660nm

HS-1 の食塩耐性からは，食塩 4%以下の低塩漬物に(2) 生育に対する pH の影響，発酵最終 pH
培地 pH が生育に及ぼす影響を表３に示した。HS-1適すると思われる。
(4) 酢酸塩添加による L-乳酸生成比率の上昇

は 大 腸 菌 と 同 様 の pH ４ で 生 育 が 抑 制 さ れ た 。

乳酸は光学異性体としてＤ型とＬ型があり，人間はL.plantarum は pH3.5 まで生育可能であった。HS-1L-乳酸だけを生成する。幼児や高齢者は健康のため D-の発酵最終 pH は 3.9 であり，L.plantarum に比べて酸乳酸の大量摂取を避けるべきであるという勧告が，味が強すぎないレベルで発酵が終了した。

FAO と WHO の合同委員会から出されている。微生物
は，D-乳酸を主に生産する D 型菌種，L-乳酸を主に生

表３ 初発pHの増殖への影響
HS1
E.coliL.plantarum
IFO3972 IFO15891
pH3.5+
pH4.0+
pH4.5+++
pH5.0+++
培地：GYP(酢酸Naを除く）培養期間：30℃，6日間pHの調整：塩酸と水酸化ﾅﾄﾘｳﾑ- : <0.1 at abs.660nm
大腸菌は HS-1 と同様に pH4.5 の GYP 培地で生育可能であり，共存した場合に pH による抑制が難しいと思われたが，pH の調整を乳酸で行った場合は pH4.5 で生産する L 型菌種及び D-乳酸と L -乳酸のいずれも同時に生産する DL 型菌種があり，同定上の重要な性質となっている。L.sakei は，通常の培地では DL 型であるが，酢酸塩が存在する場合は L 乳酸を生成する。
図１に酢酸ナトリウム濃度と L 乳酸生成比率の関係を示した。培地中の L-乳酸比率は，酢酸ナトリウム濃度が 0.6%以上の場合に，ほぼ 100%となった。

4ある。

100806040200E.coli

00.10.20.3 0.4 0.5 0.6 0.7
酢酸ナトリウム濃度(%)

0.80.9

図１ L-乳酸比率に対する酢酸Naの影響

以上のことより，HS-1 は低温で生育が可能で，pHを過度に低下させず，食塩濃度 4%までは充分な生育を示し，条件により L-乳酸だけをつくることが判明した。

濁度（Abs660nm)

生成比率(%)

菌増殖の危険が少ない低温で発酵させることが可能で

HS1L.plantarum

L.sake10.90.80.70.60.50.40.3
0.2
0.105℃,6日 10℃,5日15℃,2日20℃,1日25℃,1日30℃,1日

図2 大根培地における各温度生育度

しかし，漬物用スターターとして塩漬野菜で生育が良好であるかどうかは不明であるので，次に野菜の食塩浸出液を用いて生育状況を調べた。

3.4 HS-1 添加による大腸菌の増殖抑制
HS-1 と大腸菌の競合について，先に述べた麹エキス

3.3 野菜の食塩浸出液での生育とダイコン浸出液培地を用いて検討した。
表６に示したハクサイまたはダイコンの食塩浸出液で HS-1 を培通り，大腸菌を単独に接種した場合，15℃で充分な生養した場合，pH は低下するものの生育菌数は GYP 培

育を示した。しかし，HS-1 を共存させることにより添地に比べてかなり劣った。しかし，表６に示したように，酵母エキスやペプトンを添加することでかなりの生育改善が認められた。

表 5 ダイコンの食塩浸漬液での生育
培地の種類
濁度(660nm)
GYP
1.82
ダイコン
0.14
ダイコン＋グルコース
0.1
ダイコン＋酵母エキス
0.71
ダイコン＋ペプトン
0.33
ダイコン＋塩溶液
0.09
ダイコン＋Tween 80
0.13
ダイコン＋酢酸Na
0.23
30℃，２日間培養加した大腸菌は完全に死滅した。
表６ HS-1による大腸菌の増殖抑制
培養条件
添加菌数
発酵後菌数 発酵後pH
E.coli単独
1.1E+04
1.2E+05
5.4
HS-1単独
4.0E+04
1.4E+08
3.9
E.coli+HS-1 E.coli
1.1E+040
3.8
HS-1
4.0E+048.0E+07
培地：大根エキス＋麹汁
発酵：15℃，２週間現実のハクサイやダイコンから大腸菌が検出されることはまれであるが，HS-1 の添加は野菜に存在する大腸菌群の増殖を抑制する。
大腸菌群は塩漬中に亜硝酸を生成し，漬物の亜硝酸は，発ガン物質であるニトロソアミン生成の一要因と疑われている。HS-1 を添加するこ

アミの塩辛や魚醤が添加されているキムチで生育が良好なことから蛋白分解物や微量成分を必要とするととにより亜硝酸の生成を抑制することができた 5) 。
3.4 HS-1 添加によるハクサイの発酵思われる。天然物では麹エキスも酵母エキスに劣らず

表７に 15℃で貯蔵した場合の性状を示した。乳酸菌

HS-1 の生育に有効であったので，麹エキスを添加したは 5 日で，ほぼ最大に増殖し，pH4 台に低下した。7

大根の食塩浸出液を用いて各微生物の成育に対する温日目では大腸菌群及びグラム陰性菌が不検出となった。

度の影響を調べた。

このようにしてつくられたハクサイ漬は，やや褐変する

HS-1 の 各 温 度 に お け る 生 育 は ， 20 ℃ 以 下 でL.plantarum より優れていた（図 2）。従って，食中毒が香り，味とも自然な風味で好評であった。

5

表7 HS-1添加ハクサイ漬の性状
2日後
5日後
7日後
pH
pH5.6
pH4.3
酸度(ml)
314
大腸菌群(cfu/g)
80ｸﾞﾗﾑ陰性菌(cfu/g)
610<10乳酸菌(cfu/g)
2.7E+07
7.3E+08
1.0E+09
L-乳酸比率92%
下漬ハクサイに対し,食塩1%,酢酸ナトリウム0.5%,酵母エキス0.1%15℃で発酵
なお，本乳酸菌 HS-1 を用いた漬物の製造方法は平成11 年に特許（第 3091196 号）として登録された。
4要

約

漬物用乳酸菌スターターとして，発酵ハクサイキムチより新しい乳酸菌を分離した。Lactobacillus sakei に属する乳酸菌種で HS-1 と命名した。HS-1 の生育可能温度は５〜40℃であり，20℃以下では Lactobacillus
plantarum より生育が良好であった。発酵後の最終 pHは４付近であり，L. plantarum より耐酸性は低かった。
耐塩性は８％まであるが，5％以上で生育が劣った。酢酸ナトリウムが 0.6%以上存在した場合，発 酵乳酸の異性体タイプはほとんどがＬ型になった。GYP 培地に比べてダイコンやハクサイの食塩浸出液での生育は劣ったが，酵母エキスや麹エキスの添加で回復した。また，同濃度の大腸菌と混在させた場合，完全に大腸菌の生育を抑制した。

5 参考文献1)森地敏樹：ニューフードインダストリー,28,2(1986)2)内村泰・岡田早苗，乳酸菌実験マニュアル，小崎道雄監修，（朝倉書店，東京）(1992)
3)大塚正盛・岡田早苗・内村泰・駒形和男：生物工学
会誌,72,81(1994)
4)橋本俊郎：日本食品科学工学会誌， 45,368(1998)
5)橋本俊郎：日本食品科学工学会誌， 48,409(2001)