重症野菜・果物アレルギーのコンポーネント解析―Gibberellin-regulated protein 検出・検査系の確立―

49＜平成 30 年度助成＞

重症野菜・果物アレルギーのコンポーネント解析―Gibberellin-regulated protein 検出・検査系の確立―
近藤康人（藤田医科大学 医学部 小児科）多い（6 対）ため、大腸菌発現系では正しい立体構はじめに造の産物を得られない可能性が高く、酵母（Pichia
ここ数年果物アレルギーは増加してきている。食pastoris）の分泌経路に乗せる発現系の確立を行う必物アレルギー新規発症の原因食品として果物は 4 ～要があると考えた。最後に、これらの基礎的解析の6 歳においては 1 番多く、7 ～ 19 歳においては 2成果をもとに、様々な果物や、関連性が指摘されて番目に多い 。果物アレルギーには口腔に限局した

いるヒノキ科花粉 4) であるスギ花粉に対するアレル症状を主とする口腔症状群と、全身症状からアナギー患者における GRP の関与について解析を行った。

1)

フィラキシーに発展しうる重症タイプの全身症状群がある。平成 26 年に研究代表者として立ち上げた

方法

多施設共同果物アレルギーコンポーネント研究会
で、全国からリンゴとモモ（特定原材料に準ずる食品）のアレルギー患者の血清を収集し解析した結果、１．天然モモ GRP とリコンビナントモモ GRPの調製と ELISA

我が国のモモ、リンゴの全身症状群に係る原因抗原

天然モモ GRP（nPru p 7）はモモ GRP に特異的なは、 欧 米 に お け る 原 因 抗 原 の 代 表 で あ る Lipid

モノクローナル抗体を用いた抗体カラムにより純化transfer protein（LTP）とは異なり、むしろ新規にした。また、モモ GRP の遺伝子配列を基にして PCR報告された Gibberellin-regulated protein（GRP）でにより cDNA を合成後、大腸菌でクローニングし、あることを確認し報告した 2)。またこのタンパク質

大腸菌と酵母において GRP を発現させた。どちらもは抗菌作用を有することから、モモやリンゴに限ら上述の抗体カラムにより純化した。これらの抗原をず、種々の果物や野菜に存在してアレルゲンになりELISA プレートに固相化し（1μg/ml）、洗浄、ブロッうると考えられ、我々はモモアレルギー患者が GRPキング後、10 倍希釈した血清を 4℃で一晩反応させを介してオレンジアナフィラキシーを発症したと思た。翌日プレートを洗浄後、二次抗体としてビオチわれる数症例をまとめて報告した 。

ン標識マウス抗ヒト IgE 抗体を反応させた後、スト

3)

しかし GRP に関するアレルゲンの評価系が未確立

レ プ ト ア ビ ジ ン ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ で 発 色 さ せ、の状況であるため、果物や野菜のアレルゲン食品に450nm の吸光度を測定した。正常コントロール（アよる重症アレルギー報告例は後を絶たない。今後、

レルギー歴のない健常者）血清の示した吸光度の平

果物や野菜の摂取による重篤なアレルギー発症を減

均 +10SD 標準偏差以上を陽性と定義し、天然モモらすためにも重症アレルギーのマーカーである GRP

GRP と各方法で得られたリコンビナント GRP に対の存在量を明らかにすることは急務であると考えする患者血清の反応性を比較した。

る。また、抗原をより安定的に大量調整するためには遺伝子組み換えによるリコンビナント GRP の作製

２．サンドイッチ ELISA とリアルタイム PCRが必須であるが、GRP は低分子量ながら S-S 結合が固相抗体としてモモ以外の果物 GRP にも反応する

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浦上財団研究報告書

モノクローナル抗体、二次抗体としてペルオキシVol.28（2021）

４．スギ患者における GRP 陽性率の検討

ダーゼ標識したモモ GRP 特異的モノクローナル抗体

当院に通院中のスギ花粉症患者および、その家族を用いてサンドイッチ ELISA を構築し、品種間比較から採血とアンケートの同意が得られた者から血清と部位別に濃度測定を行った。新鮮な果物から RNAを収集した。また、正常コントロールとして成人で画分を調製し、各果物の GRP 遺伝子配列に基づいてアレルギー歴のない患者、陽性コントロールとして重合成した 2 種のプライマーを用いてリアルタイム篤なモモアレルギー患者 3 名を選んだ。これらの血PCR（RT-PCR）解析を行った。増幅のサイクル数は清、純化モモ GRP を用いて、上述した ELISA を行っ増幅速度の変化率の最も大きい時点で決定し、RNAた。正常コントロール（アレルギー歴のない健常者）

試料の 8 倍希釈が 3 サイクルのずれになることで増血清の示した吸光度の平均 +3SD 標準偏差以上を陽幅の正常性のチェックとした。なお、内部標準とし性と定義した。てアクチンを用い、アクチンの発現量に対する比で発現量を示した。

結３．病歴からアレルゲン近縁種を推定し、その１．リコンビナント GRP の作製とその評価

果食品とモモのアレルギー症状を比較検討

大腸菌、酵母で発現された GRP はどちらもモモ

果物アレルギーコンポーネント研究会で得られたGRP 特異的モノクローナル抗体を用いたウエスタン

アンケートからモモアレルギーを来した患者 70 名解析で陽性であった。また、N 末端配列はどちらもを口腔限局症状群と全身症状群に分け、アレルギー

構築した遺伝子配列から予想される正しい配列を示を生じた食品から頻度の多いものを抽出し、その食した。モモから精製した nPru p 7 と酵母で発現させ品に対する詳細な病歴からモモアレルギー症状と該た prPru p 7 の陽性率に有意差は認められなかった

当食品に対するアレルギー症状との関連性についてが、大腸菌で発現させた erPru p 7 は、nPru p 7、比較検討した。

prPru p 7 に比して陽性率が低く有意差を認めた（P< 0.05）。（図 1）

図1

モモ抽出 GRP（nGRP）および、リコンビナントで得られた GRP（大腸菌 erGRP および酵母 prGRP）に対するモモアレルギー患者（アナフィラキシー、運動誘発アナフィラキシー）と健常者における血清 IgE 反応の比較
大腸菌で発現させた erPru p 7 は、nPru p 7, prPru p 7 に比して陽性率が有意に低かった
文献 2 から引用改変

重症野菜・果物アレルギーのコンポーネント解析

図2

サンドイッチ ELISA によるモモ GRP 量の品種間比較
品種間によって濃度が大きく異なっていた

２．GRP の存在量と発現量の解析―Gibberellin-regulated protein 検出・検査系の確立―

図351

モモ部位別 GRP 定量
モモは下部（萼から遠い）ほど濃度が濃く、また、表面が緑色から赤色に熟している部位で濃度が濃くなるによって、遺伝子配列のわかっているモモ以外の果

サンドイッチ ELISA の結果、品種によっては 10物・野菜の GRP 発現量すなわち存在量を推定するこ倍ほども濃度が異なる（図 2）こと、モモ GRP は熟とが可能となる。リアルタイム PCR の結果、モモですにつれて濃度が増加すること、また部位別ではモの発現量が一番高く、以下ブドウ、ウメ、ナシ、イモの下部が高濃度であることが分かった（図 3）。同

チゴ、リンゴ、トマトの順に低くなることが判明し様の結果は PT-PCR でも確認でき、存在量と発現量た。ただし、上述したように用いた品種、個体、部が相関することが判明した。今回用いたサンドイッ位などによるばらつきが考えられ、今後の検討が必

チ ELISA はモモ特異的であるため、モモ GRP の評要である。（図 4）

価しかできない。しかし、RT-PCR を導入すること

図4

リアルタイム PCR による種類別完熟果肉あたりの GRP 量の比較
モモでの発現量が一番高く、以下ブドウ、ウメ、ナシ、イチゴ、リンゴ、トマトの順に低くなることが判明した（Actin を 1 としたときの発現量比）

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図5Vol.28（2021）

詳細な病歴に基づいたモモアレルギー患者の臨床病型別の内訳

３．病歴から推定し た近縁種 食品に おけるモモアレルギー症状との比較
モモアレルギーの全身症状群と口腔限局症状群の果物アレルギー全身症状群でも 5) モモの場合はリンゴ、サクランボと種々の野菜に対するアレルギーの合併が多くみられた 6)（図 6）。

症例数のチャートを図 5 に示す。また、これら両群

次に、モモ全身症状群に合併したアレルギーを来間に年齢および鼻炎の合併率には差はみられなかっ

した単独食品として最も頻度が高かったリンゴに着た。唯一の違いはカバノキ科花粉症の合併率が有意目し、リンゴに対する詳細な病歴からモモとのアレ差をもって口腔限局症状群に多かったのみである。

ルギー症状の関連性について比較した。モモ全身症

口腔限局症状群にはバラ科食物を中心とした複数の状群では、リンゴアレルギーを有する者は約 4 割で、果物にアレルギーを合併する症例が多かったのに対リンゴの病型の内訳は口腔限局症状と全身症状がし、従来、単独感作の割合が高いと報告されている半々であった（図 7）。更にモモアナフィラキシー症

図6

病歴に基づいたモモアレルギー各症状群に合併した果物によるアレルギー
口腔限局症状群にはバラ科食物を中心とした複数の果物にアレルギーを合併する症例が多かったのに対し、果物アレルギー全身症状群ではリンゴもしくは野菜アレルギーの合併が多くみられた重症野菜・果物アレルギーのコンポーネント解析

図7―Gibberellin-regulated protein 検出・検査系の確立―

モモアレルギー全身症状群に合併したリンゴアレルギーの病型

図853

モモアナフィラキシーに合併したリンゴアレルギーの病型状に合併するリンゴの症状について着目した結果

これらが 6 対の SS 結合で繋がっている。したがって、も、リンゴ摂取時に半数は症状を有さず、症状を有

今回我々が本研究で使用したモモ GRP に特異的なモしても大半がより軽症の口腔限局症状で、残りのノクローナル抗体を用いたサンドイッチ ELISA にお20％がアナフィラキシーであったが、アナフィラキいても還元した GRP を認識しなかったことから、

シー症状の半数は運動をしなければ症状を有さない

GRP はかなり強固で特徴的な高次構造を形成してい（図 8）
運動誘発アナフィラキシーであった 。

ることが予想される。本研究で得られた患者 IgE と6)GRP の反応性が erPru p 7 ＜ nPru p 7 ＝ prPru p 7

４．スギ花粉症患者における GRP 陽性率の検討であったという結果は、「大腸菌発現系では発現タスギ花粉症患者の内訳は小児から成人の軽症からンパク質がインクリュージョンボディへの蓄積によ中等症の花粉症患者 52 名で、患者群の 20％がモモり正しい SS 結合による天然の高次構造を構築しにGRP に陽性反応を示した。これら患者にモモアレル

くいのに対し、酵母系では分泌タンパク質として発ギー症状について問診したところ多くは摂取ができ現させているので天然の高次構造を取りやすい」とていたが、中には口腔症状を訴える患者や、他の多いう予想と一致した。今後、リコンビナント抗原のくのバラ科果物に口腔症状を主体としたアレルギー作製にあたって重要な知見と考えられる。ただし、を起こしている結果から、果物を一切除去している

GRP が感染防御タンパク質としての機能を有してい患者が存在していた。

るためか、発現量が少なく、産生クローンも不安定という印象があり、今後の改良が待たれる。また、考察

通常アレルゲン解析における抗原同定のために行われるウエスタンブロッティングも非還元で行う必要

１．リコンビナント GRP の作製とその評価性が示唆された。

GRP は約 80 個のアミノ酸からなる低分子タンパク

リコンビナント技術により品種、季節などに関係質であるにも関わらず、12 個のシステインを持ち、なく均質な抗原を安定して供給可能となることか

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Vol.28（2021）

ら、天然に近い構造をもったリコンビナント抗原がした患者では病歴摂取時にその傾向が強いと感じグローバルスタンダードとして利用されることを期た。また他の食品と比べて果物は避けていても栄養待している。

的な問題を起こさないことも影響していると考えられる。その他に GRP のエピトープの相違による可能

２．GRP の存在量と発現量の解析
現在、食物アレルギーの診断には患者ファクター性も考え、今後はその点に焦点をあてた解析を予定している。

として特異的 IgE の濃度が用いられているが、食品次に、リンゴアレルギー症状との関連性の比較で、ファクターとしてアレルゲンの量の把握も重要であ

モモが全身症状であるにもかかわらずリンゴを摂取る。卵・乳などの主要アレルギー食品ではコンポーできるのが半数あり、しかも摂取時に口腔症状に限ネントの組成がほぼ揃っているうえ主要タンパク質局する例が半数に認められたのも、リンゴの GRP がであることが多いので、アレルゲンの摂取量の把握モモに比して少ないことが原因と考えられた。更に、が容易であり、プリックテストにおいて試料の個体モモアナフィラキシー群に絞って検討した結果で差は生じにくい。しかし本研究で明らかにされたも、リンゴ摂取時に半数は無症状で、アナフィラキ

GRPは、品種差が大きく、熟度に依存し、部位で違う、シー症状を有する例は 2 割あるが、その半数は運動など個体差が大きい。このようなアレルゲンでは、負荷をかけなければ症状を有さない運動誘発アナ摂取量が不明なうえにプリックテストの結果に大きフィラキシーであったことも、モモに比してリンゴなばらつきが生じることが予想される。従って、重の GRP 濃度が低いことに起因すると考えられた。

要なコンポーネントに関しては適正なアレルゲン定量系の確立、特に植物抗原では個々の植物特異的な４．スギ花粉症患者における GRP 陽性率の検討

定量系と交差反応性を考慮した定量系の確立が必要

日本人口の 1/3 ～ 1/2 が罹患しているとされるスとなるであろう。また、果物・野菜アレルギーのプギ花粉症の約 2 割が、モモ GRP にも感作を有するリックテストは標準抗原を用いて行うことが必要とことは意外であった。今回は正常コントロールの平思われる。

均 +3SD 以上を陽性基準としていたことから、改めて陽性者に病歴を確認したところ、+10SD 以上を除

３．病歴から推定し た近縁種 食品に おけるモモアレルギー症状との比較

くほとんどの患者は摂取ができていた。しかし、我々の以前の研究では +3SD を超える例で運動負荷時にモモアレルギー口腔限局症状群にはバラ科食物をアナフィラキシーを有していた例も存在しており、中心とした複数の果物にアレルギーを合併する症例

そのようなリスクを回避するためにも、GRP 測定はが多かった。この背景として Bet v 1 ホモログやプ有用であると考える。

ロフィリンの関与が考えられた。一方、果物アレル
ギー全身症状群ではリンゴやサクランボの合併が多結論くみられた。全身症状の群には GRP の関与が考えられるが図 4 での GRP 量の結果と相同しないところ今回の研究においてアレルギーが疑われる患者だがある。この理由については、果物側の要因としてけでなく花粉症患者における GRP 抗体測定の意義を季節を問わず入手可能なリンゴが上位に来た可能性明らかにすることができた。また、今後の食物アレがある。また患者側の要因として嗜好の問題があげ

ルギーの診断・治療・予防には従来の患者側の要因られる。例えば、或る果物でアレルギー症状が出る（IgE 量）だけではなく、抗原側の要因（安定供給、と、患者は果物全般を避ける傾向がある。特にアナ交差性、存在量など）も考慮する必要があることをフィラキシーのような重度のアレルギー症状を起こ示すことができた。

重症野菜・果物アレルギーのコンポーネント解析

謝―Gibberellin-regulated protein 検出・検査系の確立―

辞本研究の遂行にあたり、貴重な研究助成を賜りました公益財団法人 浦上食品・食文化振興財団およびその関係者の皆さまに心より感謝致します。また、本研究の遂行にあたり多大なご協力をいただいた、学校法人大和学園 京都栄養医療専門学校 管理栄養士科の成田宏史先生に深く感謝を申し上げます。
参 考文 献1) 日本小児アレルギー学会．食物アレルギー診療ガイドライン 2016．協和企画．2018.
2) Mori Y, Okazaki F, Inuo C, Yamaguchi Y, Masuda S,
Sugiura S, Fukuie T, Nagao M, Tsuge I, Yosikawa T,
Yagami A, Matsunaga K, Fujisawa T, Ito K, Narita H,
Kondo Y. Evaluation of serum IgE in peach-allergic
patients with systemic reaction by using
recombinant Pru p 7(gibberellin-regulated protein).
Allergol Immunopathol (Madr). 2018; 46: 482-90.

553) 高松伸枝，近藤康人，高田聡，成田宏史，岡崎史子，森雄司，伊藤浩明，徳田玲子，柘植郁哉，宇理須厚雄．
柑橘類による食物依存性運動誘発アナフィラキシー
患者のモモ交差反応性．日本小児アレルギー学会誌
2016; 30: 453.
4) Tuppo L, Alessandri C, Giangrieco I, Ciancamerla M,
Rafaiani C, Tamburrini M, et al. Isolation of cypress
gibberellin-regulated protein: Analysis of its
structural features and IgE binding competition withhomologous allergens. Mol Immunol 2019; 114:189-95.
5) 加藤泰輔，田嶋直哉，北村勝誠，高里良宏，田島巌，小野学，田上和憲，酒井一徳，古田朋子，杉浦至郎，
伊藤浩明．小児果物アレルギー患者の口腔症状と全身 症 状 に 関 す る 検 討． ア レ ル ギ ー 2018; 67: 129138.
6) 森雄司，岡本薫，川井学，山脇一夫，中島陽一，柘
植郁哉，近藤康人．モモアレルギー患児における、臨 床 像 と 合 併 す る 原 因 食 品 の 関 係． ア レ ル ギ ー
2018; 67: 579.

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浦上財団研究報告書

Vol.28（2021）

Establishment of GRP detection and preparation of ameasurement system for anti – GRP antibody,to provide protection from severe vegetable and fruit allergies
Yasuto KONDO
Department of Pediatrics, Fujita Health University School of Medicine
The incidence of fruit and vegetable allergies have been increasing in recentyears. In a previous study, we confirmed that the causative allergen associatedwith severe symptoms for peach in Japan was a newly-reported gibberellinregulated protein (GRP), rather than lipid-transfer protein (LTP), which is known
to be the main causative allergen in the Mediterranean region. The purpose ofthis study is to clarify the abundance of GRP in various foods, and to prepare ameasurement system for the anti-GRP antibody, to assist in the detection ofpatients who are at risk for severe allergies.
Based on our results, it was found that P. pastoris is superior to E. coli as anexpression system for the production of large quantities of soluble, biologicallyactive GRP. It was also found that GRP content displays large differences among
various foods, depending on both maturity and sections of a plant. Since there
are many cases of apple allergies among peach allergy patients, we compared theallergy symptoms between the two. As a result, it was found that apple allergy
symptoms were mild or asymptomatic compared to those of peach, which wasconsistent with the fact that the GRP content in apples, as determined by realtime PCR or sandwich ELISA, was less than that in peaches. Finally, it wasrevealed that peach GRP sensitization was observed in about one fifth of thosewith Japanese cedar pollinosis.
We believe that the measurement of GRP-IgE antibody is meaningful to avoid
the risk of developing allergies.