魚病診断マニュアル

アユの Edwardsiella ictaluri 感染症の診断
病魚からの検出（平成 20 年 7 月

独立行政法人養殖研究所暫定版）

水産総合研究センター
魚病診断・研修センター

１．注意事項
・ 生の魚体組織試料を扱う場合には、何らかの病原体がいる可能性を常に考え、検査後、殺菌・消毒できる場所で行う。
・ サンプルは症状を示す病魚または瀕死魚とする。死亡魚はできるだけ使用しない（生魚が入手できない場合にはできるだけ新鮮な死亡魚を選択する）。試料到着後、速やかに検査を行う。やむを得ず、後日検査する場合には、-80℃に凍結保存する。
・ 特定疾病が疑われる試料では、検査方法、供試細胞、検査組織・部位などは、各疾病のマニュアルに従う。
・ 試料のクロスコンタミネーションを防ぐため、検体ごとにチップ、ピペット類を換える。
・ 検査を始める前には、アルコール綿等を用いて机上のほこりをよく拭き取る。
・ 試験管、シャーレ等の蓋を開ける際には、アルコールランプ（あるいはガスバーナー）付近で行い、出来るだけ空中落下菌の混入を避ける。
２．必要な実験装置と試薬類
１）試薬・実験器具
・ 解剖器具・ 火炎滅菌用アルコールランプ（またはガスバーナー）・ アルコール綿・ 魚体重測定用電子天秤・ 白金耳、白金線
・ トリプトソイ寒天培地；TS 寒天培地（あるいはトリプトソイ液体培地＋細菌培養用寒天）・ 滅菌シャーレ
・ スライドグラス

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・ チトクローム・オキシダーゼ試験棒（または試験紙）
・ 3％KOH 溶液

・ SIM 培地・ コバック試薬・ 小試験管
・ 白金線

PCR 関連試薬・器具一式
・ 酵素（TaKaRa EX Taq Hot Start Version 等）
・ プライマーセット（線毛遺伝子上流部位）
・ E. ictaluri 陽性対照（養殖研より配布）
その他、PCR 関連器具

２）実験機器・装置
・ インキュベータ
・ 遠心機または、高速微量遠心機
・ PCR 関連機器・装置
・ ブロックインキュベータ
・ オートクレーブ

2３．手技（１）菌分離①

解剖器具、菌の分離培養に用いるTS 寒天培地、白金耳、アルコールランプ（あるいはガスバーナー）、アルコール綿等を準備する。

②

解剖器具は火炎滅菌する。

③

病魚の体長・体重を測定・記録した後、症状を観察する。血液の混じった腹水に起因する腹部膨満等がアユの E. ictaluri 感染魚の症状の一つである。

④

きつく絞ったアルコール綿で体表を拭き、病魚の体表を殺菌する。

⑤

消化管を傷つけないように、肛門前方からハサミを入れ、側線にそって鰓蓋付近まで腹腔壁を切開し、開腹する。腹水が溜まっている場合は、きつく絞ったアルコー
ル綿で腹水を拭う。

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⑥腎臓（体腎：背鰭基部後端の下方に位置する背骨の腹側に張り付いている）を露出させ、火炎滅菌した白金耳を挿入する。予め、白金線で腎臓表面の膜に孔を開けておくと白金耳を挿入しやすい。

⑦

トリプトソイ（ＴＳ）寒天培地に画線塗布する。

⑧25℃で 48 時間培養する。48 時間後の培養コロニーは半透明の白色を示し、粘着性が無いのが特徴である。特徴的なコロニーが単一に多数形成していることを確認し、それらを以下の性状検査や遺伝子検査に用いる。

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（２）性状検査
１）菌のグラム鑑別試験（劉の方法）①

3％KOH 溶液を準備し、スライドグラス上に 1 滴滴下する。

②48 時間培養した菌のコロニー数個を白金耳で掻き取り、スライドグラス上で KOH と混合する。

③

グラム陰性菌であれば、菌体が粘性を示し、白金耳を上下すると糸を引く。逆にグラム陽性菌は粘性を示さない。（E. ictaluri は、グラム陰性）

２）チトクローム・オキシダーゼ試験①

チトクローム・オキシダーゼ綿棒に寒天上の 48 時間培養菌のコロニーを付着する。
試験紙タイプのものを使用する場
合には、試験紙を少量の蒸留水で湿らせ、その上に滅菌楊子等で掻き取ったコロニーを塗布する。

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②30 秒以内に菌の塗布部分が青色に変色するか否かを判定する。本菌の場合、青色に変色しない（E.
ictaluri は、チトクローム・オキシダーゼ陰性）。

（３）PCR 法による菌種の同定
１）テンプレートの準備①

TS 寒天培地上で 48 時間培養した菌の 1 コロニーを白金耳あるいは滅菌楊子で軽く触れ、1.5 ml マイ
クロチューブ内の蒸留水（遺伝子実験用）100μL に懸濁する。

②

ブロックインキュベータを用いて、100℃で 5 分間加熱する（DNAの熱抽出）③

10,000 rpm、5 分間遠心し、その上清を PCR 用のテンプレートとする。

6２）PCR・PCR反応液の組成について、プライマー＊以外はKHV病診断のPCR法に準じる。
・反応プログラムは表の通り。
④

増幅産物の電気泳動像。分子量470 bp に陽性バンドが出現する。

＊

E. ictaluri検出用プライマーセット（線毛遺伝子上流に設計）
EDi-F：5'-CAG-ATG-AGC-GGA-TTT-CAC-AG-3'
EDi-R：5'-CGC-GCA-ATT-AAC-ATA-GAG-CC-3'

表PCR 反応プログラム（TaKaRa ExTaq の場合）
反応温度

反応時間

反応回数

酵素活性*

94℃

3分

ｘ1

熱変性

94℃

30 秒

ｘ40

アニーリング

65℃

30 秒

伸長

72℃

1分

最終伸長*

72℃

5分

*

使用するTaqのマニュアルに従う

7ｘ1参照：SIM 培地を用いた性状試験
本試験は腸内細菌属の性状試験として常用される試験であり、本菌と性状が近似する Edwardsiella tarda との簡易鑑別にも有用である。
①SIM 培地を指示書に従い、小試験管内に作製する。あるいは市販の生培地を購入する。

②白金線（先端がループ状でないこと）を用いて、48 時間培養菌の数コロニーを掻き取り、培地の中央部に挿入し、試験管底から 1 cm 上方までせん刺する。

③25℃で 48 時間培養後、培地の色および濁りを観察する。硫化水素産生がある場合には、培地全体ある
いはせん刺部位が黒変する。運動性陽性の場合には、せん刺部位以外の部分でも、培地の濁りを示す。

④

次にコバック試薬を数滴試験管内に滴下し、試薬と接した培地面が赤変するか否かを観察する。赤変すればインドール陽性。写真左側が E. tarda、右側が E. ictaluri。

表．SIM 培地を用いた Edwardsiella ictaluri と Edwardsiella tarda の鑑別
Edwardsiella ictaluri

Edwardsiella tarda

硫化水素産生能（S）±＊＋＊＊

インドール産生能（I）－＋＋（W）＊＊＊＋

運動性（M）

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＊：48 時間以内に判定した場合、陰性＊＊：海水魚に感染するEdwardsiella tardaの中には、硫化水素を産生しない型もある。

＊＊＊：せん刺部位より拡がって培地の濁りが観察される（培地全体の濁りには至らない）。

9４．検査後の器具・機材の処理①

細菌に汚染した器具、培養液等は滅菌缶に入れ、オートクレーブ処理する。オートクレーブできない器具や実験台はアルコール消毒する。

②

検査後の検体（魚）は焼却処分する。

10参考：改良前（2008 年 4 月版）の PCR・PCR反応液の組成について、プライマー＊以外はKHV病診断のPCR法に準じる。
・反応プログラムは表の通り。
増幅産物の電気泳動像。分子量 305 bpに陽性バンドが出現する。

＊

E. ictaluri検出用プライマーセット（線毛遺伝子上流に設計）
EI-F：5’-TCA-ACA-TCC-ACC-AAA-TGG-3’
EI-R：5’-CTA-TTA-CAG-ACA-ATC-AAG-3’

表 PCR 反応プログラム
反応温度

反応時間

反応回数

酵素活性94℃

3分

ｘ1

熱変性

94℃

30 秒

ｘ40

アニーリング

52℃

30 秒

伸長72℃

30 秒

最終伸長

72℃

5分

11ｘ1