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浦上財団研究報告書

Vol.15（2007）〈平成17年度〉

熱帯植物由来味覚修飾タンパク質ネオクリンの味覚修飾活性評価系の開発
三坂巧（東京大学大学院農学生命科学研究科）

1.

諸れた数十種類の分子で，それぞれ受容されるこ言とが明らかにされた。T1R・T2Rは共にGタンパ

西マレーシア原産の熱帯植物であるクルクリ

ク質共役型受容体であり，味受容器官内においてゴ（Curculigo latifolia）の果実を口に含んだ後に異なる細胞に発現することにより，末梢レベルでレモン等の酸味を呈するものを摂取すると，非常味質が区別されて認識されていることが示されてに甘く感じるという不思議な現象が存在する。こいる３）。甘味を受容する甘味受容体はT1Rファミの酸味を甘味へと変換する効果を味覚修飾活性とリーに属するT1R2とT1R3のヘテロマーで構成さ呼び，クルクリゴ果実に含まれるある種のタンパれており，１種類の受容体で非常に広範な多種の１）ク質がその活性の本体である 。我々は最近，活甘味物質を受容しうることが，培養細胞発現系を性タンパク質の単離・精製を行い，アミノ酸配列用いた実験より示されている４,５）。

解析・糖鎖解析・cDNAクローニングにより全配前述したように，ネオクリンはそれ自身が甘味列を決定した２）。ネオクリンと命名したこのタンを呈するのみならず，クエン酸等の酸によってそパク質は２つのサブユニット（酸性サブユニットの甘味が著しく増加する。しかしながら，これまNAS，塩基性サブユニットNBS）から構成されでネオクリンの甘味および味覚修飾活性は人間のており，ジスルフィド結合によりヘテロダイマー官能検査によってのみ判断されており，客観的なを構成していた。ネオクリンはそれ自身が甘味を評価を行う評価系は存在しなかった。本研究では有する甘味タンパク質であるだけでなく，同時にネオクリンの甘味や味覚修飾活性を，ヒト甘味受味覚修飾活性をも有するというユニークなタンパ容体（hT1R2＋hT1R3）を発現させた細胞を用いク質であり，非常に興味深い研究対象である。

たin vitroの実験系にて評価することを目的とし一方，我々が食品を摂取する際に感じられる味て研究を行った。最終的に酸性条件下での機能解のうち基本味については，それらを受容するいわ析が予想されるため，細胞外液の変化に対して丈

ゆる「味覚受容体」の実体がほぼ明らかとされた３）。

夫な細胞であるアフリカツメガエル卵母細胞をヒ哺乳類由来の味覚受容体についてこれまでの知見

ト甘味受容体の発現系として最初に選択した。次をまとめると，甘味・旨味は細胞外領域が非常ににすでに甘味受容体の機能解析が行われている哺

大きく，代謝型グルタミン酸受容体やカルシウム乳類培養細胞を用いた解析を行った。

受容体等と同じグループに属するT1Rファミリー

2.

実験方法

は光受容体であるロドプシンや嗅覚受容体等と同

2. 1

ネオクリンタンパク質の精製

じグループに分類されるT2Rファミリーと命名さリガンドとして用いるネオクリンは，クルクリと命名された３種類の分子の組み合わせで，苦味熱帯植物由来味覚修飾タンパク質ネオクリンの味覚修飾活性評価系の開発

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ゴ（Curculigo latifolia）の果実より抽出し，粗精養細胞（HEK293T）に受容体（hT1R2＋hT1R3）

製した画分を用いた２）。SDS電気泳動によりほぼとキメラGタンパク質を遺伝子導入した。遺伝単一となっていることを確認している。

子導入後２日目の細胞に蛍光カルシウム指示薬

2. 2

味覚受容体および使用する遺伝子のクFura-2AMを負荷し，細胞に取り込ませた。細胞

ローニング

内カルシウム濃度変化を測定するためには以下のヒトT1R2・T1R3 cDNAはカリフォルニア大ようなカルシウムイメージングを行った。Fura-学サンディエゴ校のCharles S. Zuker教授より供2AMを負荷した細胞を340nmと380nmで励起し，与いただいた。ラットGタンパク質共役型内向整510nmにおいて観察される蛍光画像を蛍光顕微

流性カリウムチャネル（GIRK1，GIRK2）・ラッ鏡ならびにCCDカメラを用いて4秒おきに取得しトGαi2をコードするcDNAはラット脳より，ラッた。２画像の比率（F340/F380）から各細胞におトGgust・ラットGα15をコードするcDNAはラッける細胞内カルシウム濃度を算出した。リガンドト舌上皮より，ヒトGα16をコードするcDNAはを投与する前後において比率（F340/F380）の差

ヒト脾臓より，それぞれ作成した１本鎖cDNAをが0.15を超えたときにその細胞を応答細胞と判断テンプレートとし，PCRにより取得した。ラット

し，取得画像の視野中における応答細胞数を測定

Gα15やヒトGα16のC末端部分をラットGαi3やし，解析を行った。

Ggustに入れ替えたキメラGタンパク質（G15Gi3,
G16Gust25, G16Gust44）はPCRにより作製した。
これらのcDNA断片はアフリカツメガエル卵母細胞発現用ベクターおよび哺乳類細胞発現用ベクターに挿入し，以下の実験に使用した。
2. 3

3.

実験結果

3. 1

アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いたヒト甘味受容体の発現

まずアフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いアフリカツメガエル卵母細胞発現系を用て，ヒト甘味受容体の機能解析を試みた。受容いたヒト甘味受容体の機能解析体と共にGi系Gタンパク質ならびにGタンパク質

作製した発現プラスミドよりT7 RNA Polymerase共役型内向整流性カリウムチャネル（GIRKチャを用いてcRNAを合成した。作製したcRNA溶液ネル）を共発現させることにより，リガンドをを適当な割合にて希釈・混合した後，コラゲナー投与した際の受容体の活性化をGIRKチャネルをゼにより単離したアフリカツメガエル卵母細胞に流れる電流として検出することが一般的に行わ

ガラス針を用いて１細胞当たり50nlづつ微少注入れている。本研究では受容体としてヒト甘味受容した。17℃で培養し，cRNA注入後２〜４日経過

体（hT1R2＋hT1R3）を，Gタンパク質として味した卵母細胞を実験に使用した。受容体・Gαi2受容器官にて発現しているGαi2もしくはGgust（あるいはGgust）・GIRK1・GIRK2を共発現させを選択した。全ての組み合わせでGIRKチャネルた卵母細胞を−80mVに電位固定し，リガンドをと共に卵母細胞に発現させた。−80mVに電位固投与した際に流れるGIRKに由来する内向き電流定した卵母細胞に，リガンドとしてヒト甘味受容値を時間と共に記録した。

体が受容することが知られている５）アセスルファ

2. 4

哺乳類培養細胞発現系を用いたヒト甘味ムK・アスパルテーム・サッカリンをそれぞれ適受容体の機能解析当な濃度で投与し，内向き電流値を時間と共に記

ヒト甘味受容体の機能解析のため，哺乳類培録した。cRNA注入後２および４日経った卵母細124

浦上財団研究報告書

Vol.15（2007）

胞について検討を行ったが，リガンドに対する応条件下でネオクリンを投与した。20μMのネオク答はいずれも観察できず（結果未掲載），この系リンを投与したところ，細胞内カルシウム濃度変においてヒト甘味受容体が機能的に発現していな化を起こす細胞が観察された（図１）。この応答いと判断した。

は甘味受容体の阻害剤であるラクチゾール存在下

3. 2

哺乳類培養細胞発現系を用いたネオクリでは観察されず，またネオクリンに応答した細胞ンの甘味評価系の構築においては，アスパルテームやサッカリンといっ次に，甘味受容体が機能的に発現することがた他の甘味物質に対しても応答することを確認し示されている ４,５） 哺乳類培養細胞発現系を用いた（図１）。様々な濃度のネオクリンを投与したた解析を行った。この系においては受容体とと際に観察される応答を，細胞内カルシウム濃度変もにラットGα15やヒトGα16といったGqファミ化を起こした細胞数で計測したところ，20μMまリーに属するGタンパク質のキメラタンパク質での範囲において濃度依存的な応答を示すことが（G15Gi3, G16Gust25, G16Gust44） を 発 現 さ せ，判明した（図２）。以上の結果より，ネオクリン受容体の活性化を細胞内情報伝達経路の下流で起が中性条件下においてヒト甘味受容体により受容きる細胞内カルシウム濃度上昇として検出する。

されうることが判明し，ヒト甘味受容体を発現し検出の方法としては細胞に蛍光カルシウム指示薬た哺乳類培養細胞を用いてネオクリンの甘味を評を取り込ませ，蛍光イメージングを用いる方法が価することができたと判断した。

広く行われている。

3. 3

まずこの検出系にてネオクリンが呈する甘味哺乳類培養細胞発現系を用いたネオクリンの味覚修飾活性評価系の構築を 計 測 で き る か ど う か 検 討 し た。 ヒ ト 甘 味 受

次に同様の発現系を用いて，ネオクリンの味覚容 体（hT1R2＋hT1R3） を キ メ ラGタ ン パ ク 質

修飾活性を評価することを試みた。ネオクリンは（G16Gust25）とともに発現させ，中性（pH7.4）

それ自身が甘味を呈するのみならず，クエン酸等

図１

ヒト甘味受容体（hT1R2＋hT1R3）発現細胞におけるネオクリンの応答
ヒト甘味受容体（hT1R2＋hT1R3）とキメラGタンパク質（G16Gust25）をHEK293T細胞に共発現させ，リガンド投与における細胞内カルシウム濃度変化を蛍光カルシウム指示薬（Fura-2）の蛍光強度比によって表示した。ある１個の細胞における結果を図に示した。リガンドは還流により投与し，リガンドを投与後，バッファーにて洗浄する操作を繰り返した。投与したリガンドは10mMグルタミン酸ナトリウム（MSG），20mMネオクリン（NCL），2.5mMラクチゾールを含む20mMネオクリン（NCL＋Lac），10mMアスパルテーム（Asp），10mMサッカリン（Sac）である。

図２

ヒト甘味受容体に対するネオクリンの濃度応答相関様 々 な 濃 度 の ネ オ ク リ ン を， ヒ ト 甘 味 受 容 体（hT1R2＋hT1R3）とキメラGタンパク質（G16Gust25）を共発現させたHEK293T細胞に投与し，応答細胞数を計測した。20μM
ネオクリンを投与した際の応答細胞数で正規化した数値を図に示した。

熱帯植物由来味覚修飾タンパク質ネオクリンの味覚修飾活性評価系の開発

125の酸によってその甘味が著しく増加する。従ってなかったのに対し，pH依存的な差はリガンドと酸性条件下において，中性条件下よりもヒト甘味してネオクリンを用い，G15Gi3を共発現させた受容体に対して強い応答性を示すことが期待され場合についてのみ観察された（図４）。尚，このる。これを哺乳類培養細胞発現系により示すこと場合について観察される応答性の差は弱アルカリができるかについて検討した。

性〜酸性領域においてpH変化に依存的であるこ3.2のようにヒト甘味受容体（hT1R2＋hT1R3）とも確認された（結果未掲載）。

をGgustと の キ メ ラGタ ン パ ク 質（G16Gust25もしくはG16Gust44）とともに共発現させた場合，中性（pH7.2）もしくは酸性（pH5.5）条件下で比較的濃い濃度のネオクリンに対する応答性に違いが見られなかった（図３・左列）。視野中において細胞内カルシウム濃度上昇を起こした細胞（灰白色で示されている）の数はほぼ同じ程度であった。一方，ヒト甘味受容体と共発現させるキメラGタンパク質としてG15Gi3を用いた場合，異なるpH条件下において応答性が異なっていた（図３・右列）。中性条件下ではネオクリン投与により応答する細胞数が少ないのに対し，酸性条件下では応答細胞数が多かった。さらに投与するリガンドとして合成甘味料であるアスパルテームを用いた
場合には，細胞外液のpHや共発現させるキメラG
タンパク質の種類によって応答性に差がほとんど

図４

図３

異なるGタンパク質を用いた際のヒト甘味受容体のネオクリンに対する応答
ヒト甘味受容体（hT1R2＋hT1R3）を異なるキメラGタンパク質（G16Gust44もしくはG15Gi3）とともにHEK293T細胞に共発現し，中性（pH7.2）もしくは酸性（pH5.5）条件下でネオクリンに対する応答を観察した。13.3μMのネオクリンを投与した後の蛍光カルシウム指示薬（Fura-2）の蛍光強度比をグレースケールにて図に示した。

異なるGタンパク質を用いた際のヒト甘味受容体の応答
ヒト甘味受容体（hT1R2＋hT1R3）を異なるキメラGタンパク質（G16Gust44もしくはG15Gi3）とともにHEK293T細胞に共発現し，中性（pH7.2）もしくは酸性（pH5.5）条件下でアスパルテームもしくはネオクリンに対する応答を観察した。Gタンパク質として
G15Gi3を用い，酸性（pH5.5）条件下で13.3μMネオクリンを投与した際の応答細胞数で正規化した数値を図に示した。

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浦上財団研究報告書

Vol.15（2007）

以上の結果より培養細胞発現系においては，ヒ麹菌により発現させた野生型ネオクリンはヘテロ

ト甘味受容体は共発現するGタンパク質により性ダイマーを形成しており，味覚修飾活性を有して質が異なること，またある種のキメラGタンパクいることを官能検査により確認している７）。本研質（G15Gi3）と共発現させた場合においてはネ

究により構築したネオクリンの味覚修飾活性評価

オクリンの味覚修飾活性を評価しうる系となると系を用いることにより，リコンビナントネオクリ判断した。

ンの味覚修飾活性が天然のものと同様であるかど

4.

考

うかを評価することが課題として挙げられる。ま察

た麹菌によるネオクリンの発現は発現プラスミド

本研究において味覚修飾タンパク質ネオクリンの導入により行われるため，ネオクリンの変異体の味覚修飾活性評価系を構築するため，ヒト甘味をコードするcDNAを作製することにより変異体受容体を２種類の発現系を用いて発現させ，機能タンパク質を発現生産させることも可能である。

解析を行った。

複数の変異体を用いることにより，ネオクリンの一般にアフリカツメガエル卵母細胞を受容体タ持つ味覚修飾活性が何に由来するのかを検討してンパク質の発現系として用いる利点として，①こ行く予定である。その際にも，本研究により構築の発現系が外来膜タンパク質の発現に非常に適しした培養細胞を用いた味覚修飾活性評価系は強力ていること，②卵母細胞にcRNAを直接注入するなツールとして機能することが期待される。

ため，複数遺伝子の同時発現が容易であること，③電気生理学的な記録は感度が良く，リアルタイ

謝辞

ムの記録が可能であること，④卵母細胞が非常に本研究を遂行するにあたり，多大な助成を賜り丈夫なため，培養細胞では困難な強い刺激（高濃ました浦上食品・食文化振興財団に厚く御礼申し度刺激，低温度刺激等）の適用が可能であること，上げます。

等が挙げられる。しかしヒト甘味受容体については機能的に発現させることができず，ネオクリンの評価系として使用することはできなかった。
一方，哺乳類培養細胞発現系を用いた場合，ヒト甘味受容体は機能的に発現させることが可能で
５）

文

献

１）Yamashita, H., Theerasilp, S., Aiuchi, T., Nakaya, K.,
Nakamura, Y., and Kurihara, Y. Puriﬁcation and completeamino acid sequence of a new type of sweet protein tastemodifying activity, curculin. J. Biol. Chem., 265, 15770-15775

あることはすでに報告されている 。この系をリ（1990）

ガンドとしてネオクリンを用いたところ，共発現２）Shirasuka, Y., Nakajima, K., Asakura, T., Yamashita, H.,させるGタンパク質を変えることによって，ネオクリンの持つ甘味と味覚修飾活性の両方を評価することができると判断した。共発現させるGタン
パク質により受容体の性質が変化する例は他の受容体でも知られており６），ヒト甘味受容体についてもその点については同様であるといえよう。
我々はすでに麹菌を宿主としてリコンビナントネオクリンを発現生産することに成功している７）。

Yamamoto, A., Hata, S., Nagata, S., Abo, M., Sorimachi,H., and Abe, K. Neoculin as a new taste-modifying
protein occurring in the fruit of Curculigo latifolia. Biosci.
Biotechnol. Biochem., 68, 1403-1407（2004）
３）Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J., and Zuker,
C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature,444, 288-294（2006）４）Nelson, G., Hoon, M. A., Chandrashekar, J., Zhang, Y.,
Ryba, N. J., and Zuker, C. S. Mammalian sweet taste
receptors. Cell, 106, 381-390（2001）

熱帯植物由来味覚修飾タンパク質ネオクリンの味覚修飾活性評価系の開発
５）Li, X., Staszewski, L., Xu, H., Durick, K., Zoller, M., andAdler, E. Human receptors for sweet and umami taste.
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 99, 4692-4696（2002）

127of odorants. J. Biol. Chem., 280, 11807-11815（2005）
７）Nakajima, K., Asakura, T., Maruyama, J., Morita, Y.,Oike, H., Shimizu-Ibuka, A., Misaka, T., Sorimachi, H., Arai,

６）Shirokova, E., Schmiedeberg, K., Bedner, P., Niessen, H.,

S., Kitamoto, K., and Abe, K. Extracellular production ofWillecke, K., Raguse, J. D., Meyerhof, W., and Krautwurst,

neoculin, a sweet-tasting heterodimeric protein with taste-D. Identiﬁcation of speciﬁc ligands for orphan olfactory

modifying activity, by Aspergillus oryzae. Appl. Environ.

receptors. G protein-dependent agonism and antagonism

Microbiol., 72, 3716-3723（2006）

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URAKAMI FOUNDATION MEMOIRS

Vol.15（2007）

Construction of the assay system evaluating the taste-modiﬁng activity of
neoculin derived from a tropical fruit（Curculigo latifolia）
Takumi Misaka（Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo）

Neoculin, a sweet protein occurring in Curculigo latifolia, is unique in that it also has tastemodifying activity capable of converting sourness to sweetness. We here tried to construct
the in vitro assay system evaluating both the sweetness and the taste-modifying activity ofneoculin.
Calcium imaging analysis with HEK cells, which were expressing the human sweet taste
receptor（hT1R2+T1R3）and a chimeric G protein（G16Gust25）, demonstrated that theintracellular calcium concentration（[Ca2+]i）increased following the addition of 20 μM NCL
at the neutral pH. The use of lactisole, a blocker of the sweet receptor, inhibited the [Ca2+]i
increase almost completely. These results indicate that neoculin is actually received by thehuman sweet receptor and the reception can be monitored using the expression systemusing the mammalian cultured cells. On the other hand, when human sweet taste receptor
was coexpressed with another G protein（G15Gi3）, the cell response to neoculin wasobserved in a pH-dependent manner. The number of the responding cells at the acidic pH
was higher than that at the neutral pH.
Our results obtained here suggest that we can evaluate both the sweetness and the tastemodifying activity of neoculin by the use of the mammalian cultured cells expressing thehuman sweet taste receptor.