安定かつ⻑期的にタンパク質を⽣産可能な細胞
東京理科⼤学 薬学部 ⽣命創薬科学科
准教授 草森 浩輔
2023年11⽉9⽇（⽊）
1背景︓タンパク質の⽣産
タンパク質は、⼀般的には⼈体の⽣命活動に必須とされる炭⽔化物や脂質と並ぶエネルギー産⽣栄養素の⼀つであるが、その特性や機能は多岐に渡り、疾患治療を⽬的とした医薬品に限らず、産業⽤酵素や⾷品⽤酵素、バイオエネルギーとしても幅広く応⽤される。これらタンパク質を⽣産するプロセスのうち、細胞を利⽤したタンパク質⽣産プロセスにおいては、⽬的タンパク質を産⽣する遺伝⼦改変細胞（宿主細胞）を利⽤し、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）などが汎⽤されている。
抗体など

フラスコまたはバイオリアクター等

宿主細胞
2

課題︓タンパク質の⽣産における課題
これまでに、宿主細胞を利⽤して様々なタンパク質が⽣産されてきた⼀⽅で、その⼯程においては多くの課題が残されている。中でも、「得られるタンパク質の純度」はタンパク質⽣産プロセスにおいて重要な課題である。従来のタンパク質⽣産プロセスにおいては、⽬的タンパク質を産⽣する宿主細胞が培養期間中に疲弊することが報告されており、培養初期と培養後期では産⽣されるタンパク質の純度が著しく低下することが知られている。本課題を解決しようとする取り組みや技術開発は多数報告されており、その市場ニーズは⾼いと考えられるものの、未だ具体的な解決策はないのが現状である。
⻑期培養
フラスコまたはバイオリアクター等

細胞疲弊

⽬的以外のタンパク質が混⼊する
3

仮説︓技術開発の必要性
したがって、タンパク質を産⽣する宿主細胞の疲弊を回避し、純度の⾼いタンパク質を⻑期的に産⽣することができれば、半永久的な⽬的タンパク質の⼤量⽣産が可能となる。
また、タンパク質⽣産プロセスにおける⽣産効率とコストを著しく低下させるとともに、省エネに⼤きく貢献し、プロセスの効率化によるCO2削減も期待できる。

⻑期培養
フラスコまたはバイオリアクター等

細胞の状態維持⽬的のタンパク質を⼤量に回収可能

4着眼点︓従来のタンパク質⽣産⽅法
従来のタンパク質⽣産⽅法は、宿主細胞を培養開始後は、継代等を実施せずに⼀定期間培養を継続する⽅法が主流である。⼀⽅で、培養時間とともに細胞は増殖し続けるため、⼀定期間以降は細胞密度が過密状態になる（図）。実際、タンパク質を⽣産する宿主細胞の増殖に関する報告を確認すると、その多くが培養後期で細胞を過密状態で培養を継続している。
細胞の密度
細胞密度

⼀般に、過密状態の細胞は機能が低下することが知られており、これにより、産⽣するタンパク質の変異が起こる可能性がある。したがって、細胞を過密状態にせず、⼀定の細胞数を維持すれば、⾼純度なタンパク質を⻑期的に産⽣できると考えた。

過密状態で細胞は増殖しない

培養時間
5これまでに開発した技術︓⾃殺遺伝⼦を利⽤した細胞増殖制御
⾃殺遺伝⼦は、特定の薬物を代謝することで、細胞のアポトーシスを誘導する代謝物を産⽣する酵素をコードする遺伝⼦である。これまでに我々は、⾃殺遺伝⼦を発現する細胞に特定の薬物や化合物を添加することで、選択的にアポトーシスが誘導できることを報告し、その濃度を調整することで細胞の増殖を⼀定に維持することに成功した。
⾃殺遺伝⼦発現細胞の細胞死メカニズムの例*tk遺伝⼦を発現するインスリン産⽣細胞を使⽤

Cell number (% of initial)

40001000**100*
1010tk: 単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ遺伝⼦, ⾃殺遺伝⼦の⼀種
GCV: ガンシクロビル, tl遺伝⼦発現細胞を特異的に死滅させる化合物

*

*

*

*
*

*

● No treatment● GCV 0.25 μg/mL■ GCV 1.25 μg/mL■ GCV 2.5 μg/mL*

4128Time (day)**16*p<0.05; vs No treatment.

Tsujimura et al, J Control Release 275: 78-84 (2018).

6

⽬的︓⾃殺遺伝⼦を利⽤することで安定かつ⻑期的にタンパク質を⽣産可能な細胞を開発する.
宿主細胞に⾃殺遺伝⼦を導⼊しておくことで、添加する化合物の濃度によって培養中の細胞密度を⾃由に制御可能である。細胞が過密にならない密度で維持することにより、純度の⾼いタンパク質を⻑期的に⽣産できる。
適切な細胞密度tk遺伝⼦発現
宿主細胞細胞密度抗体など

⻑期培養+GCV細胞の状態維持

純度の⾼いタンパク質を⽣産
培養時間

⽬的のタンパク質を⼤量に回収可能
7

従来の技術と今回開発した技術の差異
従来のタンパク質の⽣産プロセス開発
細胞数／
タンパク質の純度現⾏の問題点
×培養時間の経過とともに細胞の機能が低下する.
×細胞の機能低下に応じて、タンパク質の変異が起こり、純度が低下する.
➡培養期間に制限があり、⼤量⽣産が困難.
無駄が多く、コストパフォーマンスが悪いプロセス

培養時間

今回提案するタンパク質の⽣産プロセス開発
機能低下細胞が死滅し、フレッシュな細胞が維持される
細胞数／
タンパク質の純度

薬剤添加

培養時間

⾃殺遺伝⼦発現タンパク質産⽣細胞解決策◯細胞が過密にならない.
◯細胞の常時リニューアル化により、産⽣されるタンパク質の純度が⾼く、⻑期培養も可能➡培養期間が無制限となり、⼤量⽣産が可能.
省エネで、コストパフォーマンスが良いプロセス

8

研究概要︓安定かつ⻑期的にタンパク質を⽣産可能な細胞の開発
tk遺伝⼦を発現するCHL-YN-IgG細胞を樹⽴し、細胞の増殖を制御することで回収できる抗体の純度を維持可能か評価した。

細胞数IgG1産⽣
CHL-YN細胞

GCV

Conﬂuent zone

CHL-YN-IgG細胞
チャイニーズハムスター卵巣（CHO）
細胞と同系統のマウス肺から樹⽴した細胞. Human IgG1抗体を産⽣.
Yamano et al, Sci Rep 10: 17612 (2020).

IgG1産⽣CHL-YN細胞
・細胞の性質変化
・タンパク質の純度低下

tk発現IgG1産⽣CHL-YN細胞・安定した細胞の性質
・純度の⾼いタンパク質産⽣

培養時間
tk発現
IgG1産⽣CHL-YN細胞＊特定のタイミングで、細胞の増殖性を⼀定に維持可能なGCVを含有する培地で培養
9

結果1︓CHL-YN-IgG1細胞の増殖性
CHL-YN-IgG1細胞を125 mLフラスコで培養し、細胞数を経⽇的に測定した.
培地交換は毎⽇実施した.
初期細胞数︓5×10⁴ cells/mL, 培地量︓20 mL

Cell number（×10⁴ cells/mL）

2000• 培養6⽇⽬で細胞数がピークに達し、その後、徐々に細胞数が減少した.
• 培地交換をした場合、細胞数は約1.5×10⁷ cells/mLで維持された.

CHL-YN-IgG1細胞

1500

1000

500005Time (day)10

CHL-YN-IgG1細胞は⻑期培養において過密状態の増殖プロファイルを⽰した.
10

結果2︓CHL-YN-IgG1細胞に遺伝⼦導⼊したプラスミドの情報
pSELECT-zeo-HSV1tk plasmid（市販品）

https://www.invivogen.com/pselect-zeo-hsv1tk

pEBMulti-Neo（市販品︔エピゾーマル）

https://labchem-wako.fujiﬁlm.com/jp/product/detail/W01W01050812.html

pEBMulti-HSVtk plasmidを構築し、薬剤選択によりtk遺伝⼦の安定発現株を樹⽴した.

11

結果3︓CHL-YN-IgG1-tk細胞のGCV感受性
CHL-YN-IgG1細胞とCHL-YN-IgG1-tk細胞（安定発現、以降同様）を6 well plateで培養した. その細胞懸濁液に対し、各種濃度のGCVを添加することで、感受性を評価した.
CHL-YN-IgG1-HSVtk

40

Cell number（×10⁶ cells/mL）

Cell number（×10⁶ cells/mL）

CHL-YN-IgG
5 μg/mL

302010012Time (day)34300 μg/mL
2.5 μg/mL
5 μg/mL

2010012

Time (day)3

CHL-YN-IgG-HSVtk細胞はGCVに応答して死滅した.

412結果4︓CHL-YN-IgG1-tk細胞の増殖制御
各種濃度のガンシクロビルを含有する培地でCHL-YN-IgG-tk細胞を培養し（6 well plate）、細胞数を経時的に評価した. n=3

10000 μg/mL
0.3125 μg/mL

8000.625 μg/mL
1.25 μg/mL

600

2.5 μg/mL
5 μg/mL

400

72時間培養後の細胞数（濃度依存性）
Cell number（×10⁶ cells/mL）

Cell number（×10⁶ cells/mL）

経⽇的な細胞数変化（濃度依存性）

2000400

300

200

100012345601Time (Day)

GCV濃度依存的に細胞が死滅した.

2345Time (Day)13結果5︓CHL-YN-IgG1-tk細胞の増殖制御20.625 μg/mLのガンシクロビルを含有する培地でCHL-YN-IgG-tk細胞を培養し（6 well plate）、細胞数を経時的に評価した. n=3.
Cell number（×10⁶ cells/mL）

50040030020010000714Time (Day)0.625 μg/mL GCVにおいて細胞数が⼀定に維持された.
薬剤添加による細胞数の制御に成功した.

14結果6︓CHL-YN-IgG1-tk細胞のタンパク質産⽣量
CHL-YN-IgG細胞、CHL-YN-IgG1-tk細胞を14⽇間培養した. 同様の条件
で、0.625 μg/mLのGCVを含有する培地でCHL-YN-IgG1-tk細胞を培養した. Day 1, 7, 14において細胞を回収し、再播種後24時間培養した. その後、培養上清中のタンパク質量をBCAアッセイにより測定した.

タンパク質量（pg/cell/day）

1.6

1.20.8□ CHL-YN-IgG1細胞■ CHL-YN-IgG1-tk■ CHL-YN-IgG1-tk＋GCV

0.401714Time (Day)

細胞数を制御しない場合、細胞が産⽣するタンパク質量の変化が⼤きかった.

15結果7︓CHL-YN-IgG1-tk細胞のIgG1産⽣量
CHL-YN-IgG細胞、CHL-YN-IgG1-tk細胞を14⽇間培養した. 同様の条件
で、0.625 μg/mLのGCVを含有する培地でCHL-YN-IgG1-tk細胞を培養した. Day 1, 7, 14において細胞を回収し、再播種後24時間培養した.その後、培養上清を回収し、上清中のIgG1量をIgG1 ELISA Kitにより測定した.
IgG産⽣量（pg/cell/day）

1.6

1.20.8□ CHL-YN-IgG1細胞■ CHL-YN-IgG1-tk■ CHL-YN-IgG1-tk＋GCV

0.401714

Time (Day)

細胞数を制御することで、IgGを⻑期的に産⽣できることが⽰された.
構造の完全なIgGが産⽣されている可能性が⾼い.

16

まとめ
• tk遺伝⼦発現CHL-YN-IgG1細胞を樹⽴し、GCVに応答した細胞増殖制御が可能であった.
• 細胞数を制御しない場合、CHL-YN-IgG1細胞から産⽣される細胞あたりのIgG1量は培養時間とともに減少した.
• 細胞数を制御することで、CHL-YN-IgG1細胞から産⽣される細胞あたりのIgG1量を14⽇以上ほぼ⼀定に維持することが可能であった.
17

従来技術とその問題点
既に実⽤化されている技術は、• 培養時間の経過とともに細胞の機能が低下する• 細胞の機能低下に応じて、タンパク質の変異が起こり、純度が低下する等の問題があり、培養期間に制限があり、⼤量⽣産が困難. 無駄が多く、コストパフォーマンスが悪い.
18

新技術の特徴・従来技術との⽐較
今回開発した技術は、• 細胞が過密にならないため、細胞の機能低下が起こらない.
• 細胞の常時リニューアル化により、産⽣されるタンパク質の純度が⾼く、⻑期培養が可能などの特⻑があり、培養期間が無制限となり、⼤量⽣産が可能. 省エネで、コストパフォーマンスが良い.
19

想定される⽤途• バイオ医薬品の⽣産︓抗がん剤等の抗体医薬品、ワクチン、酵素• バイオ新素材の⽣産︓ゴム原料、バイオプラスチック、⾷品添加物や栄養補助⾷品、化粧品⽤途• バイオ燃料20

実⽤化に向けた課題• フラスコを⽤いた低スケールでの実証であることから、バイオリアクター等を⽤いた⼤スケールでの検討が必要である。
• タンパク質産⽣細胞への遺伝⼦導⼊における導⼊箇所や発現量を制御する必要がある。
• 死細胞が混⼊するため、除去する必要があるか検討する必要がある。
21

企業への期待• 共同で遺伝⼦導⼊細胞を開発し、バイオリアクター等を⽤いた⼤スケールでの検討。
• 付加価値の⾼い、国産のタンパク質産⽣細胞の開発。
• ⽣産されたタンパク質の純度や安定性などの詳細な評価。

22

本技術に関する知的財産権• 発明の名称︓形質転換体及び⽬的タンパク質の⽣産⽅法• 出願番号 ︓特願2023-181024• 出願⼈︓東京理科⼤学• 発明者︓草森 浩輔、⻄川元也、尾花 柊、樋上賀⼀、⼩林正樹
23

お問い合わせ先
東京理科⼤学
産学連携機構ＴＥＬ ０３－５２２８ － ７４４０
ＦＡＸ ０３－５２２８ － ７４４２
e-mail ura@admin.tus.ac.jp
24