新奇有用微生物の分離とプロバイオティクスへの応用検討（第1報）－Bacillus属細菌の分離方法の確立－
山下 聡子*1

水城 英一*1

齋藤 浩之*1

Isolation of Novel Beneficial Bacteria and Application to Probiotics (I)- Screening Methods for the isolation of useful Bacillus species Satoko Yamashita, Eiichi Mizuki and Hiroyuki Saitoh
Bacillus属細菌は，熱や乾燥に安定な芽胞を形成することから，流通や取扱いが容易であるという利点がある。
このうちB. coagulansは，炭素源からL-乳酸を産生する特徴を有しており，プロバイオティクスとしての利用事例があるが，分離の報告は多くない。本研究では，B. coagulansの収集及びプロバイオティクスとしての利用の可能性を検討すること目的に，様々な分離源から効率的に分離する方法の確立を試みた。その結果，351株の菌株を分離することができた。また，この分離手法を応用し，B. subtilis, B. amyloliquefaciensの分離も可能となった。

2-2

1 はじめにBacillus 属細菌の分離源（試料）

有用微生物を利用したプロバイオティクス素材は整当研究所敷地内及び周辺地域の土壌，植物，地域農腸作用が期待されて おり，ヒトや 家畜用の製品展 開産物，及び福岡県農林業総合試験場より提供を受けたニーズが高まっている。代表的なプロバイオティクス

家畜糞を分離源（試料）とした。

として，腸内常在細菌であるビフィズス菌や乳酸菌の2-3 Bacillus 属細菌の分離方法利用が知られているが，腸内常在細菌ではない

2-3-1 B. coagulans 候補菌の分離

Bacillus属細菌についてもいくつか利用例がある。

試料に10倍量の滅菌水を加え，よく懸濁した後，水Bacillus属細菌は，休眠状況下では芽胞を形成する層を98 ℃で5分，又は65 ℃で30分熱処理し，中條らことが知られており，この芽胞は熱や乾燥に安定であの報告 1) を参考としたpH 4.6の分離用寒天培地に接ることから，保存や流通に優れているという利点があ

種，55 ℃で約3日間培養して生育する菌を取得した。

る。このうち，B. coagulansはL-乳酸を産生すること

上記の方法で分離が困難であった試料は，pH 4.6又から「有胞子性乳酸菌」とも呼ばれているが，効率的は pH 7.0 に 調 製 し た 分 離 用 液 体 培 地 を 適 量 加 え ，な分離方法が確立されておらず，国内での利用株はわ

37 ℃又は55 ℃で約7日間予備培養を行った後，培養ずかである。

液を65 ℃で30分熱処理し，pH 4.6の分離用寒天培地

本研究では，有用微生物B. coagulansを効率的に分に接種，55 ℃の条件下で生育する菌を分離した。

離する方法の確立を試みたので報告する。また，この分離した菌は，滅菌した爪楊枝を用い0.5 % の炭酸過程でB. subtilis, B. amyloliquefaciensも効率的カルシウムを添加したpH 7.0の分離用寒天培地に穿刺に分離することができたので併せて報告する。

し，55 ℃で培養して，菌周辺の炭酸カルシウムの溶解（ハロー）を確認した。
最終的に，顕微鏡観察でB. coagulansの特徴的形態

2 研究，実験方法
2-1 供試菌株

並びに芽胞の形成が確認されたもの，及び炭酸カルシ

本研究で分離した各 Bacillus 属細菌（候補菌），当ウムの溶解能が認められたものをB. coagulans候補菌

T

研 究 所 が 保 有 す る B. coagulans NBRC12583 株 ， B.とした。

subtilis natto （高橋菌）， B. amyloliquefaciens

2-3-2 B. subtilis , B. amyloliquefaciens 候補菌の分離

B1144株（分離菌株）を用いた。

37 ℃で予備培養を行った試料について，pH 4.6の分離用寒天培地に接種，37 ℃の条件下で生育する菌のうち，粘性物質の生産が認められ，かつ，顕微鏡観察でB. subtilis, B. amyloliquefaciens両菌種の特*1 生物食品研究所- 9 -徴的形態並びに芽胞の形成が確認されたものを候補菌

65 ℃で30分熱処理し，芽胞を形成するBacillus属細とした。

菌以外の大半の微生物を排除すること，次にpH 4.6,2-4 特定遺伝子の検出による種の判定

55 ℃の酸性かつ高温条件下で培養することで 1) ，こBacillus 属 細 菌 の 各 種 に 特 異 的 な 遺 伝 子 を 基 にの条件下では生育できない多くのBacillus属細菌を排primerを設計し，リアルタイムPCRで遺伝子の有無を除することにより，効率よく分離することができた。

検出，種を判定した。各種遺伝子の検索等は，一方，植物等の試料では，滅菌水に懸濁したのみのNational Center for Biotechnology Information

溶液からはB. coagulans候補菌は分離できなかった。

(NCBI) のwebサイトが提供する検索ツールを利用した。

植物等からのB. coagulansの分離報告は多くはないこ

B. coagulans に つ い て は ， 遠 田 ら が 報 告 し たとからも，試料中の存在量は極めて少ないのではない

ITS領 域 2 ) 及びL-乳酸脱水素酵素遺伝子（ L-ldh ）をかと考えられたため，分離用培地を用いた予備培養の標的とした。B. subtilis, B. amyloliquefaciensに工 程 を 加 え る こ と と し た 。 予 備 培 養 は ， 酸 性 （ pH

ついてはリン酸レギュロンのphoR遺伝子にprimerを設4.6），中 性（pH 7.0），並 びに高温 （55 ℃），中 温定した。更に， B. subtilis と判定された菌株につい（37 ℃）の条件を組み合わせて行った。予備培養後て は ビ オ チ ン 生 合 成 酵 素 に か か わ る オ ペ ロ ン （ bioの試料溶液をpH 4.6の分離用寒天培地に接種，55 ℃operon）のbioF遺伝子の欠損の有無を確認し，bioF遺の条件下で生育する菌を分離した結果，B. coagulans

伝子が欠損した株を納豆菌と判定した。検出に用いた候補菌が分離された。

primerと増幅サイズは表1に示す（配列は非公開）。

3-1-2 B. coagulans 候補菌の顕微鏡観察及び性状確認

2-5 B. coagulans 分離菌株の16S rRNA遺伝子配列決定

B. coagulans候補菌について，顕微鏡観察を行い，B. coagulans と 判 定 し た 菌 株 の 一 部 に つ い て ，芽 胞 形 成 の 有 無 を 確 認 し た 。 ま た ， Bergey'sに準じて16S rRNA遺伝子の配列を調べた。遺mannual5) に記載の， B. coagulans に特徴的な形態を伝子の増幅には10F, 1500R primer対4) ，シーケンスに確認した（図1）。菌体の長さや大きさは，菌株によっは10F, 及びr1L, r2L primer3) を用いた。菌種の同定て差が認められた（データ未掲載）。

定法3)にはEZ Bio Cloudのwebサイトを使用した。

分離した菌株の増殖能については，いずれも55 ℃
では良好であったが，37 ℃で培養した場合は増殖の3 結果と考察3-1速度に差が認められた。芽胞形成能は菌株によって大B. coagulans の効率的分離方法の確立きな差があり，一部，形成率が極めて低い菌株も存在した。B. coagulansについては，基準株：NBRC12583T

3-1-1 B. coagulans 候補菌の分離

B. coagulans 候補菌の分離は，土壌 や家畜糞等 B.

株に代表されるように芽胞形成率が低い菌株があるこ

coagulans の分離報告があり，一定量含まれることがとが知られており，試験結果はその知見を裏付けるも期待される試料については，滅菌水に懸濁した溶液をのであった。

表1
菌

Bacillus 属細菌の種特異的遺伝子検出用 primer
種

B. coagulans

B. subtilis,
B. subtilis natto

標的遺伝子（サイズ (bp)）

Primer の名称

配列

ITS 16S-23S rDNA
(164, 166)

F: 101-22F
R: 264-21R

文献 2)

L-ldh (124)

F: P4-102B ldh F
R: P4-102B ldh R

非公開

phoR (134)

F: B. sub- phoR F
R: B. sub- phoR R

非公開

bioF

F: B. sub- bioF F
R1: B. sub- bioF R
R2: B. sub- bioF R (del)非公開

F: B. amy- phoR F
R: B. amy- phoR R

非公開(F-R1/ WT:171, del:117)(F-R2/ WT:81, del:-)B. amyloliquefaciens

phoR (115)- 10 -

coagulansを取得することができた（表2）。
B. coagulans 分離菌株の16S rRNA遺伝子配列決3-1-4
定

分 離 し た 候 補 菌 の う ち 任 意 の 18 株 に つ い て ， 16S
rRNA遺伝子の前半約500 bpの配列を決定しsimilarity
を調べたところ，B. coagulans基準株とのsimilarityが98.4-99.8 %，次に挙がったB. acidiproducens基準
図1

株とのsimilarityが93.3-93.9 %であったことから，オオシマザクラから分離した分離した候補菌は B. coagulans であると示唆された

B. coagulans 候補菌（データ未掲載）。このことから， 本研究で確立した

B. coagulansの特徴の一つとして，炭素源からのL-分離方法でB. coagulansを効率よく分離できるものと乳酸の産生が挙げられる。そこで，B. coagulans候補考えられた。

菌を炭酸カルシウム，グルコースを添加したpH 7.0の3-2分離用寒天培地に接種し，55 ℃で培養して，菌周辺の確立の炭酸カルシウムの溶解（ハロー）をもって酸生成能

3-2-1 B. subtilis 又はその類縁種の候補菌の分離，顕微を確認した（図2）。

鏡観察及び性状確認

B. subtilis, B. amyloliquefaciensの効率的分離方法

3-1-1 に記載した，B. coagulans候補菌の分離目的で行った予備培養において，中温（37 ℃）で予備培養した試料をpH 4.6の分離用寒天培地に接種し，同じく37 ℃で培養したところ，生育した菌のなかに粘性物質を産生するものが認められた。この特徴を有する菌はB. subutilis又はその類縁種であると推測された。
図2

B. coagulans 候補菌の酸生成確認

B. subutilisや類縁種のB. amyloliquefaciensはプロ寒天培地中の炭酸カルシウムの溶解バイオティクスとしての利用事例があることから，こ左：候補菌接種，右：対照れらについても分離を行うこととした。

B. subtilis 又はその類縁候補菌について顕微鏡観3-1-3 B. coagulansの特異的遺伝子の検出察を行い，芽胞形成の有無を確認するとともに，これBergey's mannual5) を参照すると，Bacillus属細菌らの菌種に特徴的な形態を確認した（データ未掲載）。にはB. coagulans以外にも高温，酸性で生育可能な種，B. subtilis又はその類縁候補菌の37 ℃での増殖能，及びB. coagulansと類似の形態を示す種が存在する。

芽胞形成能はいずれも良好であった。

このた め，3-1-1，並びに3-1-2の方法 で分 離した B.

3-2-2

coagulans 候補菌に別の種が存在する可能性は否定での検出きない。そこで，取得したB. coagulans候補菌全てに

B. subtilis, B. amyloliquefaciens の特異的遺伝子収集したB. subtilis又はその類縁候補菌について，ついて，B. coagulansに特異的な遺伝子を検出するこB. subtilis及びB. amyloliquefaciensの判定を試みととし た。 標的 遺伝 子は ，既 報 1) のITSのほ か， L-

た。Guoらの論文 6) のAbstractに，リン酸レギュロ ン

ldh 遺伝子にPCR用primerを設計し，NBRCのBLAST検索の phoR 遺伝子が B. subtilis とその類縁種の分類学的にてB. coagulansに特異的であることを確認した。まマーカーになり得るとの記載があり，この情報を基にた，基準株：NBRC12583T 株に対しリアルタイムPCRをB. subtilisとB. amyloliquefaciensの各phoR遺伝子行い，この2つの遺伝子の存在を確認した。以上の検を標的にPCR用primerを設計し，BLAST検索で各種に特討を基に，B. coagulans候補菌の分離過程の最後にリ異的であることを確認した。次にB. subtilis natto

アルタイムPCRを実施し，両遺伝子とも陽性であった（高橋菌），B. amyloliquefaciens B1144株に対しリ菌株をB. coagulansと判定した。最終的に，351株のB.

アルタイムPCRを行い，設計したprimer対が両種を区- 11 -

し，B. subtilis及びB. amyloliquefaciensの分離，別可能であることを確認した。
実際の分類に あたって は，まず ，候補菌 に対し B.

判定法も確立することができた。なお,B.

subtilis の phoR 遺 伝 子 が 陽 性 で あ っ た 菌 株 を B.

amyloliquefaciensについては近年B. velezensisに再subtilis と判定した。次に， B. subtilis の phoR 遺伝

分類される菌株があることから 9) ，分離菌株の菌種判子が陰性であった菌株でB. amyloliquefaciensのphoR定には今後精査が必要である。

遺伝子が陽性であった菌株をB. amyloliquefaciensと判定した。

5 謝辞

更に， B. subtilis と判定された菌株のうち，いわ分離に用いた家畜糞については，福岡県農林業総合ゆる納豆菌（B. subtilis natto）と推定される菌株試験場より提供を受けました。

を確認するため，納豆菌の特徴の一つであるビオチン要求性に関係すると言われるbio operonのbioF遺伝子の欠損を標的とし

7,8)

6 参考文献，欠損があれば増幅サイズが小1) 中條均紀，森山裕子：日本食品工業学会誌，41巻，さくなるprimer対（B. sub- bioF F / B. sub- bioF

第4号，pp. 281-286 (1994)

R），又は増幅されない（B. sub- bioF F / B. sub-2) 遠田昌人，田口憲人：東洋食品工業短大・東洋食

bioF R (del)）primer対を設定（表1），B. subtilis

品研究所 研究報告書，27巻，pp. 77-83 (2009)

natto（高橋菌）を比較対象とし，PCR産物の電気泳動，

3) 鈴木健一朗，平石明，横田明 編：微生物の分類・又はリアルタイムPCRで確認した。これらのprimer対同定実験法，pp. 48-64，シュプリンガー・ジャパを用いることで， B. subtilis 候補菌の中から，納豆ン (2001)

菌の遺伝的特徴を有した菌株を選別することが可能と

4) 第十六改正日本薬局方 (平成23年3月24日厚生労働なった（データ未掲載）。

省告示第65号)，pp. 2029-2031

最終的に， B. subtilis と判定された菌株：99株

5) Rogan NA, De Vos P.: Bergey's mannual of（うち，納豆 菌に見ら れる bioF 遺伝子欠損の特徴 をSystematics of Archaea and Bacteria, Bacillus,持った菌株：9株），B. amyloliquefaciensと判定されOnline. John Wiley & Sons, Inc. (2015)

た菌株：160株を取得することができた（表2）。

6) Guo Q, et al.： Can. J. Microbiol.，Vol. 58,
No. 11, p. 1295-1305 (2012)

4 まとめ7) Kubo Y, et al.: Appl. Environ. Microbiol., Vol.

B. coagulansの分離・収集を目的として，培地，培77, No. 18, p. 6463-6469 (2011)

養温度，基本性状確認等を組み合わせ，候補菌を効率

8) Sasaki M, et al.: Biosci. Biotechnol. Biochem.,

よく分離する方法を確立した。また，予備培養を行う

Vol. 68, No. 3, p. 739-742 (2004)

ことで，含有量が少ないと考えられる分離源からの分

9) Dunlap CA, et al.: Int. J. Syst. Evol.

離も可能となった。更に，特異的遺伝子の検出により，Microbiol., Vol. 66, No. 3, p. 1212-1217 (2016)

16S rRNA遺伝子の配列決定を行わずに，B. coagulansを判定することが可能となった。この分離方法を応用
表2

様々な環境からの有用微生物（Bacillus 属細菌）の分離
分離菌株数B. subtilis

分離源B. coagulans

土 壌植 物
農産物

212850- a)
93 (9)
6 (0)

- a)
7919

家畜糞450 b)

62 b)

計351

99 (9)

160（うち，納豆菌の特徴を有する菌株）

B. amyloliquefaciensa) 候補菌の分離を行っていない。b) 一部の分離源について分離を実施。
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