2009.12.14

DNA チップによる病原体の検出方法
養殖研

病害防除部

釜石 隆

DNA チップとは、様々な既知配列の DNA を基板に貼り付け、標識した試料の DNA とハイ
ブリダイゼーションを行い、基板上のどこが陽性となるかを調べるものである。病原体の検出の場合、様々な病原体に特異的な DNA 配列を基板に貼り付け、病魚組織や分離された病原体の核酸を標識してハイブリさせ、どこが陽性反応を示すかによって、病原体の推測ができる。特徴として、既知の病原体を網羅的に検索できるということがある。当然のことながら未知の病原体には基本的に対処できない。
これまでに３種類のチップを検討した。一つは細菌類の種を推定する「16S チップ」と、次にビブリオ類の種を推定する「ビブリオチップ」、最後にウイルス類の種を推定する「ウイルスチップ」の３種類である。
16S チップは真正細菌類に共通した領域に設定したプライマーによって、16S rRNA の部
分領域を PCR で増幅および標識する。これを、様々な既知細菌類の特異配列を貼り付けたチップとハイブリさせ、どのスポットが陽性反応を示したかによって、試料の細菌種を推定する。
ビブリオチップも同様に、ビブリオ類に共通の領域にプライマーを設定し、PCR で増幅
および標識する。これを、既知ビブリオ類の特異配列を貼り付けたチップとハイブリさせ、試料がどのビブリオ類の何の種かを推定する。
一方、ウイルスチップは上記の２つとは異なっている。というのも、各種魚病ウイルスに共通した核酸領域はないため、基本的に各々のウイルスに特異的なプライマーを用意し、それらをまとめて PCR で増幅と標識を行う（マルチプレックス PCR）。次に何が増幅されてきたかを調べるために、ウイルスチップとハイブリダイゼーションを行う。ウイルスチッ
プには各種ウイルス特異的なオリゴ DNA が貼り付けてある。ただし、あまり多くのプライ
マーを混在させると、PCR が阻害されることがあるので、ここでは、淡水魚用のウイルス
プライマーセット、海水魚用のウイルスプライマーセットにわけてある。ウイルスには RNA
ウイルスト DNA ウイルスがあるので、RT-PCR を行い増幅と標識を行う。これを、種々のウ
イルスの特異配列を貼り付けたチップとハイブリさせて種の推定を行う。

DNA チップによる病原体の検出

１

チップの作製

スポット方法（随時変更あり）

オリゴ DNA (50mer ) を発注し、100μM (100 pmol /μl ，1.5 pg /μl) に調整する。この溶液を 1/250-1,000 に TE で希釈する。
↓
0.5μl ずつナイロン膜（プラスチャージ膜）にスポットする。0.1% BPB(w/v DW) 溶液を少量加えておくと（青色が分かる程度），スポットした場所が分かり易い。BPB 溶液はハイ
ブリには影響しない。
↓
UV (254nm，120 mJ /cm2)を照射する。プラスチャージのナイロン膜であっても、ベーキン
グよりも UV クロスリンクの方が感度が良くなった。
↓
ナイロン膜は室温で長期保存可能。

２

核酸抽出

●

魚の腎臓や脾臓などの組織からの DNA 抽出

キアゲン社などから市販されている DNA 抽出キットを用いる。たいていの場合は，市販のキットで抽出が可能である。ただし，植物や無脊椎動物のように多糖類（ねばねばした物質）が多く含まれたサンプルから DNA を抽出する場合は，普通の抽出キットでは対応しきれない場合が多いので，植物用のキットなどを試す。海産無脊椎動物は，それでも困難な場合が多い。
無脊椎動物から抽出された DNA は、1/10, 1/100 に希釈して PCR を行う。希釈することによって、PCR を阻害している物質も希釈されるので、PCR が上手く行くことがある。PCRのサイクル数は標準的な 30 サイクルではなく、40-50 サイクルとする。

●

分離されている菌からの DNA 抽出

平板上で分離されている菌を用いる場合は、非常に簡便な熱水抽出で良い。コロニーをピペットで突いて，100μl ほどの TE バッファーに懸濁させる。懸濁した菌が目視できる程度の量があれば十分である。100℃で約 10 分温めて菌体を壊す。遠心して，菌の残滓を落とし，上清 1μl を PCR の鋳型として用いる。
（腎臓や脾臓などの魚体組織からの熱水抽
出は，うまく行かないことが多いので，市販の DNA 抽出キットを用いる。）●

RNA の抽出

市販のキットを用いる。トリゾルやアイソジェン、マスターピュアなどの試薬を用いると、DNA も同時に採ることが出来る。トリゾルが安い。

３

PCR および標識（随時変更あり）

細菌の検出（16S チップ、ビブリオチップ）
分離菌などから抽出した DNA、魚類などから抽出した DNA など、比較的増幅されやす
い核酸を鋳型に用いる場合は、下記の２回目の PCR から始める。
ただし、無脊椎動物から抽出した DNA のように、増幅困難な DAN を用いる場合は、２回の PCR を行うと良い場合がある。両方の PCR で用いるプライマーは、真正細菌ユニバーサ
ルプライマーである。一回目では通常の増幅を行い，二回目は，PCR 産物を 100 倍以上に希釈したものを鋳型とする。ここでは，DIG が入った基質を用いて PCR をして，増幅と同時に標識を行う。
PCR が終わったら、1/3 量くらいを泳動する。ここで細菌の増幅バンドが見られる。何もバンドがないようなら、ハイブリのステップには進まない。ウイルスの場合は見えないときもある。

nested PCR の１回目
DNA 溶液1
10×buffer
1
dNTP(2.5mM)
0.4
終濃度 100μM
primer(100μM) 0.1, 0.1
終濃度
1μM (10pmol/10μl)
10% Tween20
1
Taq (5u/μl)
0.05
DW
6.35
--------------------------------------------------------------total
10.0

通常の PCR（nested PCR の２回目）・・・ 増幅と標識を行う。
DNA 溶液1(1st PCR 産物を 1/100 以下に希釈)
10×buffer1
DIG-dNTP(2mM)*0.5
終濃度 100μM
primer(100μM) 0.1, 0.1
終濃度
1μM (10pmol/10μl)
10% Tween20
1
Taq (5u/μl)
0.05
DW
6.25
--------------------------------------------------------------total
10.0* ロシュ(株) の PCR DIG ラベリングミックス (Cat. No. 1 585 550) を用いる。

無脊椎動物などのように PCR で増幅しにくい試料からの増幅を行う場合は、島津社のAmpdirect（241-08800-97 16,500 円）を用いると良い。Ampdirect は Taq バッファーの代わりに用い、PCR を阻害する物質の影響を少なくさせる試薬である。もし nested PCR をするのなら、１回目の PCR 反応の時に入れる。２回目の PCR では、希釈によって阻害物質の量が少なくなっているので、Ampdirect を入れる必要ない。
DNA チップ以外にも、余裕があるのなら、PCR には常に Ampdirect を用いることが望ましい。終濃度 1%の Tween20 も反応を改善する場合があるので、常に入れる。

サンプル(鋳型 DNA)1
Ampdirect (5×)
2
(島津 Ampdirect 粗精製 DNA 用)
DIG-dNTP(2mM)*
0.5
プライマー (100μM) 0.1, 0.1
10% Tween20
1
Taq ポリメラーゼ
0.05(タカラ Ex-Taq hot start version)
DW
5.25------------------------------------------------------------------10μl

サイクルの条件は，以下を基本とする。
94℃

2分（ホットスタート用の Taq を用いた場合は 4 分）

↓
94℃
55℃
72℃

30 秒
30 秒
1分

┐
│ 30〜50 サイクル
┘

↓
72℃

☆

7分

最後に 4℃にする必要はない。

16S チップのプライマーセット

nested PCR の１回目
EubB (20F)
5'EubA5'(1500R
5'-

agagtttgatcmtggctcag -3'
aaggaggtgatccanccrca -3'
ggttaccttgttacgactt -3')

通常の PCR （nested PCR の２回目）
EubB (20F)
5'- agagtttgatcmtggctcag -3'
E360r
5'- attcyybactgcwgccyyccgtag -3'

nseted PCR をする際、１回目の PCR では，EubB と EubA のプライマーを用いる。これで増幅されない時もあるので，その時は EubA を 1500R に変える。ただし、ほとんどの場合、ネ
スティッド PCR は必要ない。
通常の検出（もしくは nested PCR の 2 回目）では，EubB と E360r を用いる。20F は EubBと同じ配列なので，名前を統一しておいても良い。EubB と E360r の間にある２カ所の変異領域の違いをハイブリで検出する。
ここで用いるプライマーは全て真正細菌 16SrRNA ユニバーサルであることを目指している。
というのも，これらのプライマーで増幅できない細菌は、検出系からもれてしまうからである。そのため，よりユニバーサルなプライマーがあれば，すぐに変更する予定である。
16S rRNA 領域（＝は変異領域）
EubB (20F と同じ)→
5' ┝━＝━＝━━━━＝━━━＝━━━＝━━━━━━━＝━━┥ 3'
←
← ←
E360r
1500R EubAPCR を行った後，ハイブリダイゼーションを行う前に，アガロースゲル電気泳動して増幅産物の有無とサイズ（約 360bp 種によって異なる）を確認する。増幅産物が見られない場
合は，鋳型 DNA を 1/10, 1/100, 1/1000 に希釈して PCR を行う。鋳型 DNA を希釈する理由
は，PCR 反応を妨げている物質の濃度を薄くするためである。サイクルについては，30〜
50 の間で増減させる。

☆

ビブリオチップのプライマーセット
VITSF
VITSR

5'5'-

wrctctttaacaatttgga -3'
cgstkagycacttaaccata -3'

ビブリオチップのプライマーは、F が ITS に、R が 23S の 5'側に設定されている。基本的にビブリオしか増幅されないようになっている。
5' -16S rRNA --- tRNA --- 非翻訳領域(ITS) --- 23S rRNA
→
←
VITSF
VITSR

-

3'

PCR 産物の大きさは、200-300bp であるが、シマアジ分離菌の増幅産物は 450bp となるなど、ビブリオの種によってかなり異なる。

--------------------------------------------PCR の試薬類は，鋳型 DNA 以外を混合し，PCR 用のチューブに分注して凍結しておく。必要に応じて解凍し，鋳型 DNA を入れて使用すると，PCR 溶液の調整に掛かる時間を節約できて便利である。
PCR 反応の総量が 10μl なので、プライマーは 0.1μl、Taq は 0.05μl を採らない。しかし、実際にピペットで採れる溶液量は、0.3μl くらいが限度なので、ピペットで採るのは不可能である。そこで、サンプル(鋳型 DNA)以外を調合した溶液をまとめて作る。10 本をまとめて作ると、プライマーは 1μl、Taq は 0.5μl となって、十分にピペッティングが可能となる。こうして作った PCR 反応液を 9μl ずつ PCR 反応チューブに分注し、使わなかった残りは冷凍して保存する。これらの反応液入りのチューブを冷凍庫から出してサンプ
ルを１μl 加えれば、すぐに PCR 反応を行うことが可能である。このように PCR 反応液を分注して冷凍保存することにより、試薬調整の時間が節約できるため、迅速な対応が可能となる。試薬調整にともなうコンタミネーションの危険性も下がる。
こちらでは、日常的に用いるプライマーセットごとに、PCR 反応液を分注して凍結している。経験的に、1-2 年は凍結保存していても大丈夫だが、陽性対照を入れて反応をさせる。
PCR チューブについては，自分の機械と「相性の良い」チューブを使用する。PCR チューブは，ブロックとの密着性が製品によって異なる。PCR の結果が機械によって左右される場
合，機械の性能というよりもブロックとチューブの密着性の問題であることがほとんどである。密着性が悪い場合は，ブロックにミネラルオイルを滴下しておくと良い。
試薬や DNA 試料などが入ったマイクロチューブを開ける前には，必ず遠心機（ミリポア社
チビタン，トミー社カプセルなど）でスピンダウンをする。チューブを手で振って液を落とすのは良くない。かえって溶液がフタに付くことになる。習慣的にスピンダウンを行う
ようにして，コンタミが起きる確率を少しでも減らすようにする。

ウイルスの検出（ウイルスチップ）
ウイルスチップは、各々のウイルスの特異プライマーを混合して増幅し、何が増幅されたかをハイブリダイゼーションで検出する。ウイルスは配列の特異性が高いため、細菌のような共通プライマーを用いた増幅ができないためである。
ただし、複数のプライマーセットを混合するとPCR (RT-PCR) の増幅効率が下がる。ここでは、便宜的に、淡水魚用 (FW16) と海水魚用 (SW18) の２つに分けてあり、目的に応じて使い分ける。プライマーは、100μMの原液を等量ずつ混ぜてあり、RT-PCRの際には、1μl 使用する。
核酸抽出は、RNA ウイルスと DNA ウイルスが存在するため、両方が一度に抽出できるものが望ましい。エアブラウン MasterPure Complete DNA and RNA Purification kit もあるが、一般に RNA 抽出に用いるトリゾルなどでも両方が抽出できる。

海水魚用プライマーミックス SW18
(9ペア18コ)-----------------------------------------------------------------RSIV _MCP
イリドウイルス RSIV-1, RSIV-2, TRBIV, ISKNV を増幅
GIV _MCP
グルーパーイリドウイルス
LCDV _MCP
リンホシスティスウイルス LCDV-1, LCDV-2 を増幅
FHV
ヒラメ表皮増生症ウイルス
HGRV _N
ホシガレイラブド
HIRV _N
ヒラメラブドVNN _R2
VNNの７つの遺伝子型を増幅
Birna_VP2
IPNV (2タイプ), YAV, VDV を増幅
VHS _G
ウイルス性出血性敗血症------------------------------------------------------------------

淡水魚用プライマーミックス FW16
(8ペア16コ）-----------------------------------------------------------------EHNV_MCP
流行性造血器壊死症ウイルス
KHV_TK
コイヘルペスOMV_ORF61 サケ科魚類のヘルペスウイルス病
IHNV_G
伝染性造血器壊死症
SVC_G
コイの春ウイルス血症
PFR_G
パイクフライラブド
Birna_VP2 IPNV (2タイプ), YAV, VDV を増幅
VHS_G
ウイルス性出血性敗血症-------------------------------------------------------------------

RT-PCRの反応液組成例
OneStep RT-PCRキットを用いた場合
ちなみに、この反応条件では、キアゲン OneStep RT-PCRキット 25回分 (210210 \20,500-)の場合で、このプロトコールでは200回分使える。
Sample0.5
5×buffer2
DIG dNTP
1primer1
enzyme0.25
DW
5.25---------------------total
10 μl

上記の組成のうち酵素以外の全てを入れたら、98℃（沸騰水）10分間加熱して、氷冷する。
こうして２本鎖RNAウイルスのゲノムを１本鎖にする。この間、反応チューブから結構蒸発するので、適量のDWを足しておく。酵素を0.25μl入れて、RT-PCR反応開始。

50℃ 30 min （逆転写反応）
95℃ 15 min （Taqの活性化）↓
94℃ 30 sec ┐50℃ 30 sec │50サイクル
72℃ 1 min ┘↓72℃ 7 min

PCRのあとに、アガロースゲル電気泳動で増幅産物を確認しようとしても、プライマーのダイマーなどの影響で、バンドが見えない場合がある。

４

ハイブリダイゼーション

ナイロン膜は素手では触ると非特異反応の原因となる。基本的にメンブレン用のピンセッ
トを用いる。ナイロン膜の表裏と上下方向がわかるようにしておく。例えば、左上の一画を非対称に切り取ったり、鉛筆でサンプルの記載をしておく。鉛筆は B くらいの柔らかい芯が良い。油性のペンでは，ハイブリ液等に含まれる界面活性剤で文字が消えてしまう。
（プレハイブリダイゼーション）＊このステップは省略可能であるので、次のハイブリから始める。
ナイロン膜とハイブリ溶液を馴染ませるステップである。ナイロン膜をプラスチックバッ
ク（ハイブリバック）に入れ，ハイブリ溶液を入れてシールし，42℃で 5 分以上プレハイ
ブリダイゼーションをする。プレハイの時間は長くても問題ない。ハイブリ液はナイロン膜に十分に行き渡る位の液量を入れる。ナイロン膜の気泡を抜くようにしてハイブリ溶液をよく馴染ませる。
↓（ハイブリダイゼーション）
標識 DNA 2μl/0.5-1ml ハイブリ溶液，の標識 DNA 濃度を目安に，ハイブリ溶液を用意する。この濃度から１桁ほど前後しても，判定可能な結果が得られる。ただし、発色の場合は若干感度が下がり、シグナルが薄くなることがあるため、標識 DNA 1μl/100μl ハイブ
リ溶液とするなどにして下さい。PCR の後の泳動でバンドが薄い場合は残りの反応液をす
べてハイブリに用いる。ハイブリ溶液の量は、ナイロン膜に十分に液が行き渡り、ハイブ
リバック内で液が動くようであれば良い。ビブリオチップの場合で、600μl くらいである。
98℃で 5-10 分間、DNA を熱変成させ、氷に漬けて急冷する。この溶液をハイブリバックに入れてシールする。シールしたら、ナイロン膜の気泡を抜くようにして、ハイブリ溶液をナイロン膜によく馴染ませる。42℃のインキュベータに入れて、適当な時間が経ったらハ
イブリ液を動かしてナイロン膜に馴染ませる。振盪機能のあるインキュベータが便利であるが、なくても良い。ハイブリの時間は，1-２時間あれば判定が可能となるが，一晩など，長い時間ハイブリダイゼーションをすると最大の効率が得られる。
--------------------------------------------熱シーラーでシールするとき、熱をかけ終わった後、2-3 秒間、取手を押しつけたままにしてから、取手を離すときれいにシールできる。熱をかけ終わってすぐに取手を離すと、ビニールが溶けてシールが不完全になるときがある。

５ナイロン膜の洗浄と免疫学的検出

発色による検出では省略

ハイブリバックからナイロン膜を取り出す。ハイブリ液中の標識 DNA は，数回の再利用が可能なので，必要ならハイブリ液を回収して保存する（常温でも 1-2 年は大丈夫である）。
↓
2×SSC 0.1% SDS の洗浄溶液にナイロン膜を入れる。 5 分×2 回
液はナイロン膜が動くだけの量があれば良い。容器はパラフィルムを折って作る。
↓
0.1×SSC 0.1% SDS 5 分×2 回↓
buffer 1 0.3%(W/V) Tween20 添加洗浄液
2分↓
buffer 2 20 分 ブロッキング
ロシュのバッファーセットに 10×Buffer2 があるので、1×Buffer1 で希釈する。
↓
アルカリフォスファターゼ(AP)標識抗 DIG 抗体 buffer 2
20 分
1/5,000 に希釈する。ただし抗体はピペットで採る限界以下の容量となるときは、少々濃くても構わない。抗体溶液とナイロン膜を良くなじませるため強くこする。
↓
buffer 1 0.3% Tween20 5 分×3 回
ロッシュのバッファーセットに 10×溶液が入っているので DW で希釈して用いる。
↓
buffer 3 2 分↓
ATTOGLOW などの発光基質液をナイロン膜に行き渡る量（約 10μl/cm2）サランラップに滴下し，DNA が付いている面を下にして，発光液上にナイロン膜を載せる。ナイロ
ン膜を上げ下げして発光液をナイロン膜全体に行き渡らせる。
↓
ナイロン膜を DNA が付いている面を上にしてポラロイドのホルダーに載せて，サラン
ラップでくるむ。CCD カメラでも同様。
↓
最初は 20 分ほど露光する。CCD カメラの場合は自動露光。
↓
様子を見て露光時間を調整する。シグナルは数時間，発光する。
↓
さらに、シグナルを発色させることもできる。
↓
ロッシュの発色試薬(NBT/BCIP ストック溶液)を 20μl/ml buffer3 に調整し、ナイロン膜とハイブリバックの中に入れ、暗所に静置する。
↓
30 分ほどしたら様子を見て、シグナルの濃さが十分になるまで放置する。長くてオーバー
ナイトくらいであるが、それ以上長く置いても、バックグランドが上がるだけの場合が多い。

↓TE バッファーで洗浄し、乾燥させる。乾燥したナイロン膜はハイブリバックなどに保存する。
＊

洗いのステップの時間は厳密ではない。

＊ シグナルが出ていないナイロン膜は TE 溶液に保存して冷蔵しておけば、次回の検出にも使用できる。標識 DNA（ハイブリ液）は，数回の再利用可能である。
＊ CDP-star が代表的であるが、ATTOGLOW（フナコシ）の方が、露光時間が短くて光りも強いので、ATTOGLOW を使用する。
＊ 現在、ポラロイドフィルムの入手が困難であるが、再発売されるらしい。発光による検出の方が、早く検出できる場合が多い。保存状態によっては、ポラロイドフィルムは年月が経つと退色する場合があるので、スキャナーなどでパソコンに取り込んでおくと良い。
＊ シグナルが染色されたナイロン膜は、放置しておくとバックグランドが上がって、全体が青っぽくなり、シグナルが目立たなくなる。染色してシグナルが出たら、その日のう
ちに、スキャナーでパソコンに取り込んだ方が良い。

●

試薬

DNA 抽出キット
キアゲン

市販品の例
DNeasy tissue kit (Cat.No. 69504)

RNA と DNA 抽出キット 市販品の例
エアブラウン MasterPure Complete DNA and RNA Purification kit
Cat No. 89010 ¥8,000インビトロジェン トリゾル 100ml \21,600- Cat. No. 15596026(10 回)

PCR 用試薬
Taq ポリメラーゼ，Taq 用 10×buffer, dNTP
dNTP(DIG 標識用 ロッシュ \45,400- Cat. No. 1585550)
各種プライマーAmpdirect (島津 ¥16,500 商品番号 241-08800-97)
アガロースゲル泳動用試薬
アガロース（ゲル強度の強いものが扱いやすい）
10×TBE 溶液 Tris 108g, ホウ酸 55g, EDTA-2Na 9.3g を 1 リットルの DW に溶解。
臭化エチジウム溶液（0.5mg/ml ストック溶液） このストック溶液を 20μl/100mlとなるようにアガロースゲルに溶かして使用する。
AP 標識 抗 DIG 抗体
発色試薬

ロシュ

\18,800- (Cat. No. 1093274)

ロッシュ NBT/BCIP ストック溶液 8ml\13,200- (Cat. No. 1681450)

化学発光用の試薬（化学発光が撮影できるカメラがあれば購入する）
フナコシ ATTOGLOW-450 50ml \15,000- (商品コード SAP450101E)（アマシャム CDP-star Cat.No. RPN3682 でも代用可能。）
ハイブリ用試薬（ロシュのバッファーセットを購入すると良い）
ハイブリ溶液（20% ホルムアミド）
5×SSC（20×SSC を 1/4 容量）， 0.02%(w/v) SDS,
1%(w/v) ブロッキング剤（or ロシュ 10×Buffer 2 を 1/10 容量），0.1%(w/v) N-Lauroylsarcosine (ナカライ 20116-22 25g \1,500-),
ホルムアミド以外を溶かした溶液(1.25×)をオートクレーブし、冷ます。
20%(v/v)となるように、ホルムアミド(ナカライ 02020-64 100ml \3,000-)と混合して、4℃で保存する。
Buffer 1

0.1M マレイン酸，0.15M NaCl (pH7.5, 20℃)
ただしマレイン酸バッファーを作製する時は大量の NaOH を必要とする。

10×buffer1 を 1 リットル作る時（マレイン酸 116.07g, NaCl 87.66g）に，pH 調整には約 83g の NaOH が必要で面倒である。
Buffer 1 は，0.1M Tris-HCl, 0.15M NaCl (pH7.5, 20℃) でも良い。これは作るのが簡単である。
Buffer 2

1%(W/V)となるようにブロッキング剤を buffer 1 に溶かしたもの。
1×Buffer2 は分注して冷蔵、長期保存用なら冷凍しておく。

Buffer 3

0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl (pH 9.5, 20℃)
MgCl2 を入れるプロトコールがあるが、入れなくても問題はない。
Buffer3 の組成は単純なので簡単に調整できる。

上記の Buffer 1, 2, 3 はロッシュのバッファーセットを購入すると良い。
DIG 洗浄およびブロックバッファーセット

ロシュ\27,800- (Cat. No. 1585762)

ハイブリ液のブロッキング剤も、バッファーセットの 10×buffer2 を用いる。ブロッキン
グ剤粉末（ロシュ 50g \11,700- Cat. No. 1096176）は溶け難く、10×Buffer2 を作るのは大変なので、バッファーセットは便利である。
1×Buffer1 はバッファーセットの 10×Buffer1 を DW で 10 倍に希釈してオートクレーブする。1×Buffer2 は、バッファーセットの 10×Buffer2 を 1×Buffer1 で 10 倍に希釈してオートクレーブする。1×Buffer３は、バッファーセットの 10×Buffer3 を DW で希釈してオートクレーブする。
他の試薬は自分で調合し、オートクレーブする。
20×SSC

3M NaCl, 0.3M クエン酸ナトリウム (pH 7.0, 20℃ 塩酸で調整)

10% SDS

w/v SDS(ラウリル硫酸ナトリウム)TE

10mM Tris-HCl, 1mM EDTA (pH 8.0, 20℃)

2×SSC 0.1% SDS
0.1×SSC 0.1% SDS

●

機材

機材は基本的に他の用途にも使用できるような汎用性の高いものを選んでください。
・ピペットマン・電気泳動槽（ミューピッド，コスモバイオ i-MyRun）
・サーマルサイクラー(PCR)
・ヒートシーラー（ハイブリバックのシールに用いる）
・インキュベーター（42℃が維持できるものなら何でも良い）・シェイカー・ポラロイドカメラ（アマシャム ECL ミニカメラ Cat.No. RPN2069 など）→ ポラロイドフィルムの生産終了により製造中止。残念！
・ブロックインキュベータ（アステック社製など）
・高速遠心機（核酸抽出用）
・卓上小型遠心機（マイクロチューブのスピンダウン用
日本ジェネティクス NS-060 が一番安い）●

消耗品

・チップ，チューブ
・チューブラック（1.5ml, 0.5ml・・・バイオビック TS-36）（0.2ml・・・日本ジェネティクス 21521）（0.2ml・・・ABI MicroAmp Base N801-0531 9,300 円/10 個 おすすめ）・アイスラック （1.5ml, 0.5ml・・・ イウチ IR-1）（0.2ml・・・イウチ IR-2）
・ハイブリダイゼーションバッグ（コスモバイオの製品がベスト！ Cat.No. S-1021 ）・ポラロイドフィルム（3200B）＊

実験の待ち時間には，いろいろなカタログを見て，良さそうな製品を物色することを普段から心懸ける(^^;。

16S チップ（070703）
1 イサキからの分離菌 Francisella sp. 260r
2 メガイアワビ分離菌 Francisella sp. 230r (各種アワビから分離)
3 ピシリケッチア Piscirikettsia salmonis EM90 250r
4 細菌性腎臓病(BKD) Renibacterium salmoninarum 240r
5 Streptococcus dysgalactiae 110r
6 Streptococcus dysgalactiae 240r
7 Lactococcus garvieae 110r
8 Lactococcus garvieae 240r
9 Streptococcus iniae 110r
10 Streptococcus iniae 240r
11 Streptococcus parauberis 110r
12 Streptococcus parauberis 240r
13 Streptococcus agalactiae 250r
14 カラムナリス病 Flavobacterium columnare 1 250r
15 カラムナリス病 Flavobacterium columnare 2 250r
16 カラムナリス病 Flavobacterium columnare 3 250r
17 冷水病菌 Flavobacterium psychrophilum 250r
18 細菌性鰓病(BGD) Flavobacterium branchiophilum 250r
19 細菌性溶血性黄疸の原因細菌 250r
20 滑走細菌 Tenacibaculum maritimum 250r
（ブリの血管内にいる菌も同様の配列である。）
21 Mycobacterium marinum (sp.) 250r
22 ノカルジア症原因菌 Nocardia seriolae 250r
23 Vibrio anguillarum 110r
24 Vibrio anguillarum 250r
25 類結菌 Photobacterium damselae 110r
26 類結菌 Photobacterium damselae 250r
27 日栽協シマアジ(2003.12) Vibrio sp. 110r
28 Pseudomonas anguilliseptica 250r
29 Pseudomonas plecoglossicida 250r
30 米国のアワビ筋萎縮症原因菌 CXC 250r
31 Edwardsiella tarda -E22 110r
32 Edwardsiella tarda -E22 250r
33 レッドマウス病(ERM) Yersinia ruckeri 110r
34 レッドマウス病(ERM) Yersinia ruckeri 250r
35 Aeromonas hydrophila 250r
36 Aeromonas salmonicida 250r
* は明確な病原性が確認されていない菌の配列。

スポットは 36 種類。1 は赤色のオレンジＧを混合(BPB と混じって緑色になってしまった)。
他は BPB の青色に着色。ほぼ正方形なので、向きがわかるように鉛筆(B くらいの柔らかさが良い)で試料名などを書き込む。

1
7
13
19
25
31

１

2
8
14
20
26
32

3
9
15
21
27
33

4
10
16
22
28
34

5
11
17
23
29
35

２

５
１
２
３
４
５
６
７
８

6
12
18
24
30
36

３

６
Streptococcus agalactiae
Streptococcus dysgalactiae
Streptococcus parauberis
Aeromonas salmonicida
Pseudomonas anguilliseptica
Vibrio anguillarum
Aeromonas hydrophila
Piscirickettsia salmonis

４

７

８

ビブリオチップ（070702）
A
1 V.alginolyticus
2 V.anguillarum
3 V.carcariae
4 V.cholerae
5 V.fluvialis
6 V.harveyi
7 V.ichthyoenteri
8 V.nigripulchritudo
9 V.ordalii
10 V.parahaemolyticus
11 V.pelagius
12 V.penaeicida
13 V.salmonicida
14 V.splendidus
15 V.tapetis
16 V.tubiashii
17 V.vulnificus
18 P.damsela
19 シマアジ由来菌
20 ポジティブコントロール

B

C

A

1

11

2

12

3

13

4

14

5

15

6

16

7

17

8

18

9

19

1

20

B

C

１種類のビブリオにつき、A, B, C の３カ所の特異領域を選択し、オリゴ DNA プローブを作製した。右下３つのポジコンはオレンジ色、他は青色のスポットである。

タイプストレインによるハイブリ結果-1

V.alginolyticus

V.harveyi

V.anguillarum

V.carcariae

V.cholerae

V.fluvialis

V.ichthyoenteri

V.nigripulchritudo

V.ordalii

V.parahaemolyticus

タイプストレインによるハイブリ結果-2

V.pelagius

V.penaecida

V.salmonicida

V.splendidus

V.tubiashi

V.vulnificus

P.damsela

シマアジ菌

V.tapetis

ウイルスチップ1

IHNV（061124）
2

G-689r
10
19
28

EHNV

G-917r
11956r

VHSV (I)VP2 1060r
38

VHSV (IV)LCDV 1
RSIV 147

R2 476r

VHSV (IV)48

56 LCDV 1
MCP 950r
65

RSIV 1SVCV (欧州) 18

MCP 1320r

G1-962r

G1-1200r

G-1079r

G23-962r

G23-1200r

MCP 800r
74 ISKNV75

VNN C1R292

R2 586r

VHSV (I)VHSV (IV)LCDV 1
RSIV 1
ISKNV
MCP

84

586r

VNN C2T

31
40
49
58

93

PFRV (V76)

G2-483r

G3-186r
YAV-VDVVP2 956r

VP2 1060r

VP2 1119r

VP2 956r

VHSV (II)HIRV
LCDV 2RSIV 2HGRV
VNN C21

R2 476r

R2 586r

VNN C2H

94 VNN C2H

R2 476r

R2 586r

No. 1 と No. 91 はオレンジ色のスポット。あとは青色。

25

IPNV-Ja DRT 34

41

VHSV (II)42

G4-539r
50

HIRV

59

LCDV 251

RSIV 2

60

HGRV

69

VNN C2278

VNN C3R2 514r

LCDV 2

61

35

27

YAV-VDV44

VHSV (III)36

YAV-VDVVP2 1119r

45

G2-539r
53

PFRV (V76)
G3-483r

VP2 1060r

RSIV 2
HGRV

87

VNN C2270

VNN C3R2 586r

62

VHSV (III)G2-623r

54

TRBIV

79

FHV

71

VNN C23
R2 476r

97

63

TRBIV

80

FHV

72

VNN C23TRBIV
MCP 850r

81

150r
89

GIV
MCP 1310r

MCP 800r

80r
88

GIV
MCP 1230r

MCP 730r

R2 586r
96

GIV
MCP 1180r

N 1250r

R2 476r
95

52

MCP 850r

N 1150r
86

HIRV

VHSV (III)PFRV (V76)

61 840r

G3-366r

G2-477r

MCP 1000r

MCP 800r
77

43

26

OMV

N 1100r

MCP 950r
68

VHSV (II)G4-623r

N 1050r

N 1050r
85

PFRV (F4)

IPNV-Ja DRT 33

MCP 730r

850r

24

IPNV-Ja DRT 32

MCP 700r
67

PFRV (F4)
G2-366r

N 1000r

76

VNN C21

23

G4-477r

MCP 850r

MCP 800r
83

IPNV-Sp N1

MCP 1000r
66

9SVCV (欧州) 17

G3-623r
57

OMV

SVCV (共通) 16

G1-623r

G3-539r

R2 476r
VNN C2T

39

8

SVCV (ｱｼﾞｱ) 15

13

VP2 1119r

G1-539r

MCP 730r
VNN C1

VHSV (I)OMV

SVCV (ｱｼﾞｱ) 14

EHNV

G2-186r30

761 780r

G1-483r

IPNV-Sp N1

KHV

61 660r

G1-366r
29

6

TK 720r

G1-186r
IPNV-Sp N1

1260r

KHV
TK 660r

PFRV (F4)73 ISKNV

91

12

5

TK 600r

PFRV (一般) 22

MCP 730r

82

G-971rKHV

PFRV (一般) 21

MCP 700r
64

4

PFRV (一般) 20

G3-477r
55

EHNV

IHNV

MCP

G1-477r
46

3

MCP 1200r

VP2
37

IHNV

FHV
230r

90

R2 586r
98 λ110r99

λ230r