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米の食味と機能性の向上をめざした日本晴変異体米の作出と物性発現機構＜平成 21 年度助成＞

米の食味と機能性の向上をめざした日本晴変異体米の作出と物性発現機構
阿久澤

さゆり

（東京農業大学 応用生物科学部）

1.

緒

返されてクラスター構造が形成されているポリグ

言ルカンである。この、クラスターを構成している

澱粉は、植物による光合成の最終産物であり、ポリグルカンの分岐数、分岐の位置、それぞれのそれは植物が成長し、さらに種として次世代を残構成鎖長とその割合などが、植物ごとに、合成酵すシステムによる産物でもある。私たちは、植物素の発現時期によって制御されて、澱粉が合成さが合成・蓄積した種や根茎を採取・収穫し、栄養（炭れていると考えられている。イネの胚乳澱粉を合水化物）源として摂取するのみではなく工業製品成するためには、基質供給酵素（AGPase）、枝つとしても古くから利用している。

くり酵素（Starch Branching Enzymes;BE）、直鎖

日本の 1 年間の澱粉の需要量は、約 260 万トン伸長酵素（Soluble Starch Synthases;SS）、枝切り（平成 22 年、農林水産省調べ）であるが、大部分酵素（Starch Debranching Enzymes;DBE）など多が異性化糖や水あめなどの糖化製品とし利用さくの酵素が関与しており、澱粉合成の過程を知るれ、供給量の大部分はトウモロコシ澱粉が占めてためには、特定のアイソザイム 1 つを欠失させ、いる。また、各澱粉の特性を利用して食品に利用合成された澱粉構造の変化から、欠失したアイソされているものは、経験によって植物の種類が選ザイムの機能を推測することが出来る 4）。また、

択 1, 2) されているため、目的としている澱粉の特このような澱粉合成酵素を欠損させて作出した変性（糊化・老化特性、糊液の物性）が、どのよう異体米は、野生型とは異なるユニークな澱粉構造な分子構造の違いによって発現しているのかは、を示す変異体が多く、澱粉糊液の物性と澱粉構造いまだに明らかにされていない。の関係を知るためにも興味深い対象である。さら私たちの主食である米は、澱粉がイネ胚乳成分に、遺伝子組み換えではないため、野外での大量の約 80％を占めており、澱粉の特性が、炊飯米な栽培が可能であり、試料の収集やその後の実用の食味や形状、米粉の加工特性に大きく影響を及化には有利な点もある。

ぼしている。そのため、食味の改善および利用拡

私たちは、澱粉の構造とレオロジー特性の相大を目的とした品種改良や、新しい特性を持つ米互関係を明らかにし、澱粉性食材および澱粉のの開発をめざして、イネ胚乳澱粉の生合成に関与利用性の向上をめざして研究を行っている。そする酵素を欠損させた変異体の作出により、米おの中でも、本研究では、澱粉合成に重要な役割をよび米澱粉の構造を変化させ、それらの物性に関担う Starch synthase アイソザイムの 1 つである

3）する研究が行われ報告されている 。

SSIIIa が欠損した変異体を作出し、その胚乳澱粉

澱粉は、約 80％を占めるアミロペクチンを主成を分離・精製して、澱粉の分子構造および糊液の分とし、直鎖を形成するα 1, 4 グルコシド結合と、粘弾性を検討し、米の新しい機能性の付与とその分岐構造を形成するα 1, 6 グルコシド結合が繰り米粒および澱粉の利用性について検討した結果を

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浦上財団研究報告書

報告する。
2.

試料および実験方法

2.1

試料

日本晴（野生型）と日本晴にレトロトランスポゾン Tos17 が挿入され SSIIIa 活性が完全に欠損

Vol.18（2011）として 30 分間膨潤させた。50 ～ 95℃まで昇温（6℃ /min）して 95℃で 5 分間保持した後、再び 50℃まで降温（6℃ /min）して粘度曲線を得た。解析 ソ フ ト は Themocline for Windows（Newport
Scientific Pty.Lid. 製）を用い、粘度上昇開始温度、最高粘度、最低粘度、最終粘度を求めた。

したイネ（SSIIIa 変異体）を作出した。脱穀し精示差走査熱量計（DSC：SII 社製 DSC6100）によ白した後、UDY サイクロンサンプルミル（株式会る熱特性は、70 μ l 容銀容器に 30%濃度（w/w 無社ニレコ社製）を用いて粉砕して精白米粉を得た。

水物換算）になるように純水を入れて膨潤させた。

さらに、精白米粉を 0.1%水酸化ナトリウム溶液

リファレンスに純水を用いて、25 ～ 150℃の温度に懸濁させ、冷アルカリ法で澱粉を分離精製して、範囲を昇温速度 2℃ /min で測定し、得られた吸日本晴および SSIIIa ともに、①米粒、②精白米粉、熱曲線から糊化開始温度（To）、糊化ピーク温度③分離澱粉を測定用試料とした。

（Tp）、糊化終了温度（Tc）を求め、この 3 点で囲精白米（生）および炊飯米の形態観察と破断特性

まれた面積を吸熱エンタルピー（Δ H mJ/mg）と精白米および炊飯米の米粒の長さ、幅、厚さをノギスで測定した。炊飯方法は、米粒を純水で 42.4 イオン交換―パルスアンペロメトリー法によるアミロペクチンの単位鎖長分布の測定～ 5 回洗浄し、米粒重量の 1.5 倍量の水を加えて分離澱粉 30mg を Pseudomonas イソアミラー30 分間浸積した。その後、炊飯釜を用いて通電ゼ（林原生物科学研究所製）で 18 時間以上枝きり開始から終了までを 25 分とし、通電終了後 15 分反応を行い、Dionex 社製 DX-500 を用いてアミ放置して破断測定用試料とした。

ロペクチンの鎖長分布を測定した。

2.2した。

破 断 測 定 は、 山 電 ㈱ 製 RheonerII 33005S で、分離カラムは Dionex Carbopack PA‐1、検出冶具は楔形プランジャー No.49 を用いて垂直方向器は ED - 40 を用いて、150mM 水酸化ナトリウムに等速圧縮破断を行った。容器中央から炊飯米と酢酸ナトリウムを移動相として得られた溶出曲を一粒取り出し、測定台に横向きに置いて高さ線から各鎖長割合を算出 5 , 6 ）した。

を測定後、圧縮スピード 1mm/sec、接触面積：2.522mm 、格納ピッチ：0.02、98％圧縮により得ら分離澱粉糊液の動的粘弾性測定による周波数依存性れた応力―歪曲線から破断荷重（N）、破断歪率（%）

澱 粉 糊 液（ ４ ％ w/w 無 水 物 換 算 ）を 調 製 し、を算出した。なお、明確な破断点を示さない破断Rheostress RS1（HAAKE 社製）で、動的粘弾性曲線については、延性破断とし、曲線が平衡になを測定した。冶具は C60/1-Ti を用い、ギャップった点を破断荷重とした。

サイズ 0.052mm、応力 0.2Pa、測定温度 50℃、周2.3

精白米粉および分離精製澱粉のペースト特性と熱特性

ラピッドビスコアナライザー（New port scientific波数 0.01 ～ 50Hz の条件で周波数依存性を測定した。
2.6

α- アミラーゼによる生澱粉の消化性

Pty. Ltd. 製、Rapid Visco Analyzer：RVA）を用

分離澱粉を 0.1M リン酸緩衝液（pH6.9）に懸濁いて、精白米粉および分離澱粉のペースト特性をさせ、ブタ膵臓 α- アミラーゼ（porcine pancease測定した。全量 26g、6%（w/w 無水物換算）濃度

α- amylase, SIGMA Chemical CO., EC 3.2.1.1）を

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米の食味と機能性の向上をめざした日本晴変異体米の作出と物性発現機構

261U 加え、5 時間および 24 時間反応後、反応停

日本晴に見られるように、通常の胚乳が形成され止液を加え、遠心分離（3000rpm、10min）を行った。ていることが示された。

上澄みと沈殿を分離し、上澄み中の生成糖を測定して消化率を算出した。また、沈殿部分は未分解澱粉であるため、エタノールで再結晶させ、風乾して消化澱粉試料とした。

日本晴

SSIIIa

図 1 日本晴（野生型）と変異体米（SSIIIa）の精白米

X 解回折による分離澱粉および消化澱粉の結晶性の比較

また、炊飯した米の形状を比較すると、生米に比分離澱粉および上記 2.6 で調製した消化澱粉のべて、日本晴は長さが 1.57 倍、幅は 1.31 倍に膨結晶性を測定した。測定機器は XRD-6100（島津張しており、一方、SSIIIa は長さが 1.82 倍、幅は製作所製）を用いて、走査範囲 4.0 ～ 50.0 °、走1.01 倍になっており、日本晴に比べて縦長の炊飯査ステップ 2.0 °、走査速度 2.0 °/min、計数時間米であることが分かった。

2.70.6 s、管電圧 40.0 KV、管電流 30.0 mA で行った。
2.8GPC-MALLS による平均分子量測定

炊飯米の破断特性では、破断荷重は 0.8N で、ほぼ同じ値であったが、日本晴は明確な破断点分離澱粉および上記 2.6 で調製した消化澱粉をを示さない平衡破断を示し、SSIIIa は明確な破ジメチルスルホキシド（DMSO）で分散させた後、断点を示す脆い炊飯米であった。表面の付着性エタノールを加えて DMSO を除去し、純水に再は、SSIIIa は日本晴に比べて著しく低い値であり、分散させて試料溶液とした。

SSIIIa の炊飯米の特性は、細長い形状でありもろ各試料溶液を高速液体クロマトグラフ

く表面の付着性が低い特性を示すことが明らかと（ShodexGPC-11）に示差屈折計（RI）と多角度レーなった。

ザ ー 光 散 乱 計（MALLS：Wyaat Technology 社

3.2.

製）を検出器として測定し、Berry プロットにより平均分子量を算出した。分析条件は、移動相RVA によるペースト特性

図２に日本晴と SSIIIa の精白米粉の RVA 曲線を示した。に 25mM 臭化リチウム溶液（和光純薬社製、Cat.

精白米粉のペースト特性は、SSIIIa は日本晴にNo.125 ‐ 01122）を 用 い、 流 速 1.0ml/min、 測 定比べ最高粘度、最終粘度が著しく低い曲線を示し

温度 55℃、カラムは Shodex OH Pack SB-806Mた。また、粘度上昇開始温度は、日本晴 71.7℃に

HQ と Shodex OH Pack SB-804M HQ を連結して比べ、SSIIa は 88.4℃と顕著に高い値であった。

用いた。
3.

結果および考察3.1

米粒の形状観察及び炊飯米の破断特性

精白米の写真を図 1 に示した。
日本晴（野生型）の長さは平均 5.1mm、幅 2.8mmで、変異体米（SSIIIa）の長さは 5 . 5mm、幅 3 . 0mmでほぼ同じ大きさであった。千粒の重量は日本晴
20.0g、SSIIIa は 21.5g であり、SSIIIa では、米粒の形状および密度ともに日本晴と同程度であり、

図2

日本晴および SSIIIa の 6％精白米粉の RVA 曲線

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浦上財団研究報告書Vol.18（2011）

澱粉のペースト曲線は、精白米粉の曲線に比べ位鎖長分布を示し、鎖長ごとの比較では、SSIIIaて、SSIIIa、日本晴ともに高い粘度曲線であった。

は日本晴に比べ DP6-9 が減少し、DP10-15 が増加

しかし、精白米粉の粘度曲線で得られた傾向と同していた。

様に、SSIIIa は日本晴に比べて最高粘度、最終粘3.5

GPC-MALLS による平均分子量測定度共に著しく低いことが示された。精白米粉のペ図 ４に SSIIIa の ShodexGPC-11―MALLS シスースト特性は、澱粉の特性が大きく反映されるこテムによる溶出曲線を示した。澱粉からアミロペとから、SSIIIa の澱粉は、日本晴とはまったく異クチンを分離していないため、アミロペクチンとなる特性を持つことが示された。

アミロースの 2 つのピークが観察された。各ピー

3.3

DSC による熱特性

クの散乱強度は、第 1 ピークが著しく大きく、こ精白米粉の吸熱曲線には日本晴、SSIIIa とものピークがアミロペクチンの溶出ピークであるたに 65℃と 97℃付近に 2 つのピークが確認された。

め、第１ピークの平均分子量を算出した。第 1 ピ

低温側のピーク 1 は、糊化開始温度が SSIIIa はークの平均分子量は、SSIIIa は日本晴に比べて約57.3℃、日本晴 59.8℃と SSIIIa が低値を示したが、2 ／ 3 程度の小さい分子量を示し、慣性半径も減ピーク温度、糊化終了温度は日本晴に比べ 1 ～ 2少していた。

℃程度高値を示した。吸熱エンタルピーは日本晴、SSIIIa ともに近似した値であり、糊化に必要なエンタルピーは同程度であることが示された。しかし、高温側の第 2 ピークでは、SSIIIa の吸熱エンタルピーが日本晴に比べて約 3 倍であり、SSIIIaは高温で糊化する構造が日本晴より多く存在していることが示された。
3.4

HPAEC によるアミロペクチンの単位鎖長分布の測定
図4

HPAEC で測定した日本晴分離澱粉のアミロペクチンの単位鎖長分布測定結果から算出した各鎖長の割合を図 3 に示した。
日本晴、SSIIIa ともに DP12 にピークを持つ単

ShodexGPC-11―MALLS システムによる溶出曲線

HPAEC で得られたアミロペクチンの構成鎖長分布がどのように配置で分岐して、アミロペクチン分子を構成しているのかということは継続して検討する必要があるが、SSIIIa が示した極めて低い粘度を発現する要因として、アミロペクチンの分子量の減少によるものではないかと考えられた。
3.6

動的粘弾性による周波数依存性

図 5 に４％分離澱粉糊液の動的粘弾性による周波数依存性で得られた周波数 1.0Hz における貯蔵弾性率（G’）、損失弾性率（G”）の値を示した。
動的粘弾性特性では、日本晴および SSIIIa ともに、G ’が G ”より高値を示しゲルを形成してい図3

日本晴分離澱粉のアミロペクチンの鎖長分布ることが示された。1.0Hz における G ’は日本晴

米の食味と機能性の向上をめざした日本晴変異体米の作出と物性発現機構

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顕著な違いは認められなかった。
また、図 6 に未消化、5 時間および 24 時間消化澱粉の X 線回折図形を示した。結晶性は全ての試料で A 型図形を示し、結晶化度は約 10%であった。日本晴、SSIIIa ともに消化時間の増加に伴い、5a のピークがわずかに強くなる傾向を示したが、結晶性は顕著な変化は認められなかった。
ブタ膵臓α - アミラーゼ消化澱粉の DSC 特性では、生および消化後の澱粉も日本晴より SSIIIa
図5４％分離澱粉糊液の動的粘弾性特性値の方がやや糊化開始温度が低いものの、ピーク粘度及び吸熱エンタルピーは同値であった。一が 11Pa、SSIIIa は 4.6Pa で あ り、SSIIIa が 日 本

方、酵素消化後では、第１ピークの吸熱エンタル

晴に比べ顕著に低値を示しており、RVA の結果

ピーが日本晴れ約 13mJ/mg に比べ、SSIIIa は約と同様に SSIIIa は日本晴よりゲルの粘弾性が低11.5mJ/mg と小さく、さらに、第２ピークが明確いことが示された。になり、吸熱エンタルピーも約 4mJ/mg と増加

さらに、G’と G ”の比で表される tan δ は日本していた。第 2 ピークはアミロースと内部脂肪酸

晴れ 0.32、SSIIIa0.28 となり、SSIIIa が形成するのへリックスの融解であるといわれており、真のゲルは日本晴に比べ粘性部分が発現している割合

アミロース含量が日本晴 15.0%、SSIIIa20% 3）とが少ない糊液であることが示された。

SSIIIa が日本晴れに比べ高いことからも、消化率

ブタ膵臓α - アミラーゼによる消化性および消化澱粉の X 線および DSC 特性が同様な値であっても、SSIIIa は高温で融解するブタ膵臓α - アミラーゼを生澱粉に 5 時間おいることが示され、難消化性澱粉としての構造を3.7

よび 24 時間作用させた後、フェノール硫酸法とSomogyi-Nelson 法を用いて糖量を測定し、消化率を算出した。日本晴は、5 時間で約 34％、24時間では約 47％であり、SSIIIa もほぼ同程度で、図6構造、または消化されにくい構造が多く残存して形成しているのではないかと考えられた。
4．ま と め以上の結果から、SSIIIa（変異体米）の特性は、SSIIIa ブタ膵臓α - アミラーゼ消化澱粉の X 線回折図形

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浦上財団研究報告書

Vol.18（2011）

日本晴（野生型）と比較して、澱粉蓄積量は同程

文度であり、その炊飯米はもろく表面の付着性が低

1) Akuzawa S, Kawabata A (2003) Relationship amongstarch from different origins classified according to their
physicochemical properties. J. Appl. Glycosci. 50: 11-16.

い特性を持つことが分かった。また、精白米粉のペースト特性では、著しく粘度が低い米粉ペーストであり、澱粉糊液の粘弾性特性においても、著しく粘度の低い特性を持つことが明らかとなった。SSIIIa は米粒および精白米粉、分離澱粉は、低付着性、低粘度特性および難消化性成分を有する国内産米として利用できると考えられた。
謝辞
本研究を遂行するにあたり、多大な研究助成を賜りました財団法人浦上食品・食文化振興財団ならびに関係者各位に心より感謝を申し上げますとともに、貴財団の益々のご発展をお祈り申し上げます。また、共同研究者として、精力的に研究を遂行してくださいました秋田県立大学
氏、鹿児島大学ます。

花城藤田直子

勲氏に深く感謝いたし

献2) Ikeda M, Mastumori S, Akuzawa S. (2008) Effect of heatMoisture Treatment on the Digestibility and Viscous
Characteristics of Hard Wheat Flour and Separated WheatStarch, Food Pre. Science, 34:203-208.
3) Fujita N, Yoshida M, Kondo T, Saito K, Utsumi Y, Tokunaga
T, Nishi A, Satoh, H, Park J-H, Jane J-L, Miyao A, Hirochika
H, Nakamura Y (2007) Characterization of SSIIIa-deficientmutants of rice (Oryza sativa L.); the fucntion of SSIIIaand pleiotropic effects by SSIIIa deficiency in the riceendosperm. Plant Physiol 144: 2009-2023.
4) Nakamura Y, (2002) Toward a better understanding of themetabolic system for amylopectin biosynthesis in plants:
Rice rndosperm as a model tissue; Plant Cell Physiol. 43:718-725
5) Hanashiro I,Abe J, Hizukuri S, (1996) A periodic
distribution of the chain length of amylopectin as revealedby high-performance anion-exchange chromatography;
Carbihydrate research; 283: 151-159.
6) Koizumi K, Kubota Y, Tanimoto T, Okada Y, (1989)
Anion-exchange chromatography of homogeneous
D-gluco-oligosaccharides and D-gluco-polysaccharides(polymerization degree greater than or equal to 50) withpulsed amperometric detedtion;J. Chromatography 464,365-373.

Rheological properties of SSIIIa-deficient mutants of rice grain and the starch

Rheological properties of SSIIIa-deficient mutants ofrice grain and the starch
Sayuri Akuzawa
Department of Nutritional Science, Faculty of Applied Bioscience
Tokyo University of Agriculture
Starch is one of the most important natural polymers available to humans. In addition
to being a food material, starch is also used as an adhesive and texture modifier in industrial
processes such as papermaking. Starch is known to display distinct physicochemical
properties depending on its botanical origin.
The biosynthesis of starch is catalyzed by at least four enzymes; ADP glucose
pyrophosphorylase (AGPase), starch synthase (SS), starch branching enzyme (BE) andstarch debranching enzyme (DBE). Analysis of various mutants has given important
clues to our understanding the function of each isozyme. Indeed, some of these mutants
have been shown to produce novel starches with great potential as new foodstuffs and/orfor industrial applications. Starch synthase IIIa (SSIIIa)-deficient rice mutant, that wascompletely absent in SSIIIa activity, and the parental Nihonbare were characterized toreveal the relationship between the structure of the endosperm starches and the rheologicalproperties of the corresponding starch pastes.
The length and width of the raw rice grains of SSIIIa and Nihonbare were similar, but
the cooked rice grains of SSIIIa became longer than those of Nihonbare. The characteristic
force-strain curve of the cooked rice grain of SSIIIa displayed brittleness. The RVA
viscogram of SSIIIa showed low values for all the pasting characteristics, which weremarkedly different from those of Nihonbare. In terms of the dynamic viscoelasticity
parameters, the storage modulus G’ of SSIIIa was lower than that of Nihonbare. The
proportion of short chains with DP 6 to 9 and DP 16-19 decreased while chains with DP 10
to 15 and DP 20 to 25 increased in the chain-length distribution patterns of amylopectin.
The average of molecular weight of SSIIIa was smaller than that of Nihonbare. Changes
in the pasting and rheological peoperties of SSIIIa were mainly caused by variations in thestructure of amylopectin. We believe that the rice grains and the divided starch from SSIIIa
constitute a promising food material.

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