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インターセルを用いた NHEK（NB）との共培養による NHDF（NB）の増殖への影響

１． 目的
ファイブロブラストをケラチノサイトと共培養することによってファイブロブラストの増殖性および遺伝子発現の変化を調べる。インターセル TP を使用することで両細胞は非接触状態で培養することが可能となり、両細胞における液性因子のみの影響を調べることができる。

２． 材料と方法
細胞：

NHDF（NB）（新生児包皮由来） （Cat No. KF-4009、Strain No. 05882）
NHEK(NB)（新生児包皮由来） （Cat No. KK-4009、Strain No. 09186）

培地：①ファイブロブラスト培養用無血清増殖培地：FibroLife Comp kit（Cat No. LL-0001）②ケラチノサイト培養用無血清増殖培地：Humedia-KG2（Cat No. KK-2150S）

共培養用培養器： インターセル TP（透視タイプ、24 穴マルチプレート用、膜孔径 0.45µm）

培地①および②を使ってファイブロブラストおよびケラチノサイトをそれぞれ前培養し、各細胞をトリプシン処理によって回収した。回収したファイブロブラストは 24 穴マルチプレートに 4,000 個（700µl）/ウエルで播種、ケラチノサイトはコラーゲン I-A をコートしたインターセル TP に 15,000 個（200µl）/インターセルで播種した。播種翌日にファイブロブラストが播種された 24 穴マルチプレートにケラチノサイトを播種した
インターセル TP を配置し（Fig.1）、ウエルおよびインターセルの培地を培地①および②の各培地で培地交換した。その後培地交換は 1 または２日おきに行い、3 日目および 6 日目にファイブロブラストの様子を写真撮影するとともに、細胞の増殖性を確認した。
細胞の増殖性の確認には、Cell Counting Kit-8（CCK-8, 同仁化学）を使用した。マルチプレート内の培地を除き、CCK-8 原液を培地①で 10 倍に希釈した溶液を 700µl/ウエルで添加、37℃で 2 時間インキ
ュベート後、マイクロプレートリーダーで 450nm の吸光度を測定し、各条件での増殖性を比較した。
遺伝子発現解析に使用した total RNA は QuickGene Auto12S システム（クラボウ）と RNA 抽出プロトコールによって分離した。定量と純度検査は吸光度測定により行い、品質検査はキャピラリー電気泳動シス
テム（アジレントテクノロジー、Bioanalyzer2100）を使用した。発現解析には DNA マイクロアレイ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、Clariom S Human Array, cat. 902927）を使用し、トータル RNA100ng を開始サンプルとしてメーカーのプロトコールに従って実施した。SST-RMA アルゴリズムにより算出したシグナルの比率を算定しサンプル間の発現量の相対比較を行った。

Fig. 1 共培養の模式図
プレートウェル内にファイブロブラスト（黄色）を播種し、インターセル TP 内にケラチノサイト（緑色）を播種して共培養した。

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３． 結果
３－１．増殖性の変化ファイブロブラストとケラチノサイトを共培養して 3 日目および 6 日目のいずれにおいても、ファイブロブラストはケラチノサイトと共培養することでその増殖が促進されることが確認された（Fig.2）。6 日目では単独の場合と比較してケラチノサイト共存の場合にファイブロブラストは約 5 倍の細胞数となった。顕微鏡像でも細胞が非常に密な状態が観察された。
Fig. 2 ファイブロブラストの増殖性
培養 3 日目および 6 日目の生細胞数を CCK-8
アッセイで評価した。各培養日数でファイブロブ
ラスト単独培養の場合を 100 とした。

3 日目
NHEK(-)

6 日目
NHEK(+)NHEK(-)NHEK(+)

Fig. 3 ファイブロブラストの顕微鏡画像
ケラチノサイトと共培養せず単独で培養した場合は 3 日目から 6 日目までの増殖が緩やかであるのに対して、インターセル TP を介してケラチノサイトと共培養を行うと増殖が促進された。

３－２．遺伝子発現の変化
培養 3 日と 6 日のケラチノサイトとの共培養なし（-）または、あり（+）のフィブロブラストから total RNA を抽出した。それらの収量と純度、品質は下表の通りで、DNA マイクロアレイ解析を行うために十分なものが得られた。
表１．ファイブロブラストから抽出した total RNA の定量および品質検査の結果
サンプル

収量(µg)

純度 A260/A280

純度 A260/A230

品質(RIN)

Day3 (-)

1.4

2.13

1.11

10.0

Day3 (+)

4.5

2.17

1.53

10.0

Day6 (-)

3.6

2.10

1.68

8.0

Day6 (+)

9.3

2.10

2.03

10.0

チャート

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Fig. 4 マイクロアレイのシグナル散布図
ケラチノサイトとの共培養 3 日および6 日のファイブロブラスト由来 total RNA
に関する Clariom S アレイ解析を行い、共培養がない場合の蛍光シグナルを横軸、ある場合を縦軸にプロットした。シグナル値は Log2 換算値であり、図中の緑、黄、赤の実線はそれぞれ発現量が 2 倍、4 倍、8 倍の境界を示す。

6 日あり

3 日あり

上記 4 つの total RNA に関してマイクロアレイ解析を実施し、各サンプルで約 2 万の遺伝子発現シグナルのデータを取得した。Fig.4 に 3 日目と 6 日目のシグナル散布図を示した。いずれの培養日数においても、著しく発現量が上昇または減少している遺伝子が認められた。

6 日なし

3 日なし

各日で発現変動が大きかった上位 20 個の遺伝子リストを表 2 に記した。培養 3 日では多様なケモカインリガンドの遺伝子発現が上昇していた。さらにインターロイキン 6 の上昇が見られ、これらの事象は既報と（Front. Immunol., Volume 11, 06 May 2020）合致する。

表 2. 発現変動の大きかった上位 20 遺伝子●3日目にケラチノサイト共存下で発現上昇したファイブロブラスト遺伝子上位20個
遺伝子名●6日目にケラチノサイト共存下で発現上昇したファイブロブラスト遺伝子上位20個
倍率 (Log2)

遺伝子名

倍率 (Log2)

chemokine (C-X-C motif) ligand 5 (CXCL5), mRNA.

9.1

superoxide dismutase 2, mitochondrial (SOD2), transcript variant 1, mRNA.

5.6

chemokine (C-X-C motif) ligand 1 (melanoma growth stimulating activity, alpha) (CXCL1), transcript variant 1, mRNA.

8.1

chemokine (C-X-C motif) ligand 5 (CXCL5), mRNA.

4.9

chemokine (C-C motif) ligand 2 (CCL2), mRNA.

7.3

chemokine (C-X-C motif) ligand 1 (melanoma growth stimulating activity, alpha) (CXCL1), transcript variant 1, mRNA.

3.9

matrix metallopeptidase 3 (MMP3), mRNA.

6.4

tetratricopeptide repeat and ankyrin repeat containing 1 (TRANK1), mRNA.

3.8

colony stimulating factor 3 (granulocyte) (CSF3), transcript variant 1, mRNA.

6.4

complement component 3 (C3), mRNA.

3.7

chemokine (C-X-C motif) ligand 6 (CXCL6), mRNA.

6.0

prostaglandin F receptor (FP) (PTGFR), transcript variant 1, mRNA.

3.7

chemokine (C-X-C motif) ligand 8 (CXCL8), mRNA.

5.8prolyl 3-hydroxylase 2 (P3H2), transcript variant 2, mRNA.

3.6

interleukin 1, beta (IL1B), mRNA.

4.9

collagen and calcium binding EGF domains 1 (CCBE1), mRNA.

3.5

serpin peptidase inhibitor, clade B (ovalbumin), member 2 (SERPINB2), transcript variant 1, mRNA.

4.7

anillin actin binding protein (ANLN), transcript variant 2, mRNA.

3.5

chemokine (C-X-C motif) ligand 3 (CXCL3), mRNA.

4.1

tumor necrosis factor, alpha-induced protein 3 (TNFAIP3), transcript variant 2, mRNA.

3.4

chemokine (C-C motif) ligand 20 (CCL20), transcript variant 2, mRNA.

4.0

mannan-binding lectin serine peptidase 1 (C4/C2 activating component of Ra-reactive factor) (MASP1), transcript variant 3, mRNA.

3.3

zinc finger CCCH-type containing 12A (ZC3H12A), mRNA.

3.7

histone cluster 1, H2bm (HIST1H2BM), mRNA.

3.3

interleukin 6 (IL6), mRNA.

3.7

interleukin-1 receptor-associated kinase 3 (IRAK3), transcript variant 2, mRNA.

3.2

complement component 3 (C3), mRNA.

3.7

phospholipase D1, phosphatidylcholine-specific (PLD1), transcript variant 2, mRNA.

3.2

superoxide dismutase 2, mitochondrial (SOD2), transcript variant 1, mRNA.

3.6

chemokine (C-X-C motif) ligand 6 (CXCL6), mRNA.

3.2

tumor necrosis factor, alpha-induced protein 3 (TNFAIP3), transcript variant 2, mRNA.

3.5

ring finger protein 144B (RNF144B), mRNA.

3.1

SCL/TAL1 interrupting locus (STIL), transcript variant 1, mRNA.

3.5

chemokine (C-C motif) ligand 2 (CCL2), mRNA.

3.1

transmembrane protein 154 (TMEM154), mRNA.

3.2

centrosomal protein 128kDa (CEP128), mRNA.

3.1

ribonucleotide reductase M2 (RRM2), transcript variant 2, mRNA.

3.2

cytochrome P450, family 7, subfamily B, polypeptide 1 (CYP7B1), mRNA.

3.0

neuregulin 1 (NRG1), transcript variant HRG-beta1c, mRNA.

3.1

solute carrier family 9, subfamily A (NHE9, cation proton antiporter 9), member 9 (SLC9A9), mRNA.

3.0●3日目にケラチノサイト共存下で発現低下したファイブロブラスト遺伝子上位20個
遺伝子名●6日目にケラチノサイト共存下で発現低下したファイブロブラスト遺伝子上位20個
倍率 (Log2)

遺伝子名

倍率 (Log2)

microfibrillar-associated protein 4 (MFAP4), transcript variant 1, mRNA.

-6.6

insulin-like growth factor binding protein 3 (IGFBP3), transcript variant 2, mRNA.

-7.2

insulin-like growth factor binding protein 3 (IGFBP3), transcript variant 2, mRNA.

-6.1

proenkephalin (PENK), mRNA.

-5.8

collagen, type XIV, alpha 1 (COL14A1), mRNA.

-6.1

transforming growth factor, beta-induced, 68kDa (TGFBI), mRNA.

-5.6

early growth response 2 (EGR2), transcript variant 1, mRNA.

-5.3

early growth response 2 (EGR2), transcript variant 1, mRNA.

-5.3

elastin (ELN), transcript variant 1, mRNA.

-5.3

elastin (ELN), transcript variant 1, mRNA.

-5.2

transforming growth factor, beta-induced, 68kDa (TGFBI), mRNA.

-4.7

sparc/osteonectin, cwcv and kazal-like domains proteoglycan (testican) 1 (SPOCK1), mRNA.

-5.1

sulfotransferase family 1E, estrogen-preferring, member 1 (SULT1E1), mRNA.

-4.5

LON peptidase N-terminal domain and ring finger 2 (LONRF2), mRNA.

-4.7

osteoglycin (OGN), transcript variant 3, mRNA.

-4.3

sushi domain containing 2 (SUSD2), mRNA.

-4.7

sparc/osteonectin, cwcv and kazal-like domains proteoglycan (testican) 1 (SPOCK1), mRNA.

-4.3

cholinergic receptor, nicotinic, alpha 1 (muscle) (CHRNA1), transcript variant 2, mRNA.

-4.6

corin, serine peptidase (CORIN), transcript variant 2, mRNA.

-4.3

insulin-like growth factor binding protein 2, 36kDa (IGFBP2), transcript variant 1, mRNA.

-4.5

dermatopontin (DPT), mRNA.

-4.3

peptidase inhibitor 15 (PI15), mRNA.

-4.5

activating transcription factor 3 (ATF3), transcript variant 3, mRNA.

-4.2

gamma-aminobutyric acid (GABA) A receptor, rho 1 (GABRR1), transcript variant 2, mRNA.

-4.4

heme oxygenase 1 (HMOX1), mRNA.

-4.0

collagen, type XIV, alpha 1 (COL14A1), mRNA.

-4.0

periostin, osteoblast specific factor (POSTN), transcript variant 2, mRNA.

-4.0

microfibrillar-associated protein 4 (MFAP4), transcript variant 1, mRNA.

-4.0

sushi domain containing 2 (SUSD2), mRNA.

-4.0

uridine phosphorylase 1 (UPP1), transcript variant 3, mRNA.

-3.8

sushi, nidogen and EGF-like domains 1 (SNED1), mRNA.

-4.0

egl-9 family hypoxia-inducible factor 3 (EGLN3), transcript variant 2, mRNA.

-3.8

regulator of G-protein signaling 4 (RGS4), transcript variant 1, mRNA.

-4.0

proteoglycan 4 (PRG4), transcript variant B, mRNA.

-3.7

neurofilament, medium polypeptide (NEFM), transcript variant 2, mRNA.

-3.8

solute carrier family 5 (sodium/myo-inositol cotransporter), member 3 (SLC5A3), mRNA.

-3.7

insulin-like growth factor binding protein 2, 36kDa (IGFBP2), transcript variant 1, mRNA.

-3.7

ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 9 (ADAMTS9), mRNA.

-3.7

platelet derived growth factor D (PDGFD), transcript variant 1, mRNA.

-3.7

matrix Gla protein (MGP), transcript variant 2, mRNA.

-3.7

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3 日および 6 日の発現変動遺伝子群の機能分類を Gene Ontology Biological process のエンリッチメ
ント解析により行った。ケラチノサイトとの共培養の有無によりファイブロブラストで 4 倍以上の発現上昇あるいは低下のあった遺伝子数は、3 日上昇 189／低下 132、6 日上昇 111／低下 140 であった。エンリッチメント解析の結果を表 3 に示した。
培養 3 日目の発現上昇遺伝子には細胞分裂や細胞周期、DNA 複製に関連するものが、また発現が低下した遺伝子には接着や細胞外マトリクス形成に関連するものが有意に含まれていた。
一方、培養 6 日目では「微小管」や「有糸分裂紡錘体」に関連する遺伝子が上昇し、亜鉛や銅イオンへの応答遺伝子の低下が見られた。
表 3. 発現変動遺伝子群の機能分類エンリッチメント解析
培養 3 日および 6 日にケラチノサイトとの共培養によって発現量が変動したファイブロブラストの遺伝子群を GeneOntology によって機能分類した。データ分析は David Bioinformatics Resources (https://david.ncifcrf.gov/)で実施した。

製品情報
自動核酸分離システム QuickGene-Auto12S https://www.kurabo.co.jp/bio/nucleic/product/qg/a12s/■対応サンプル
DNA：全血、動物組織、植物組織、培養細胞、大腸菌（プラスミド DNA）、FFPE
RNA：血球細胞、動物組織、植物組織、培養細胞、ウイルス

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