魚病診断マニュアル

コイ春ウイルス血症（SVC）の診断
分離ウイルスをテンプレートとした RT-PCR 法による診断（平成 20 年 8 月

独立行政法人養殖研究所改訂版）

水産総合研究センター
魚病診断・研修センター

1. 診断にあたっての注意
・ 生のウイルス培養液を材料とするので，核酸抽出試薬と混合するまでは，無菌室内で作業を行う。
・ 試料のクロスコンタミネーションを防ぐため，検体ごとにチップ，ピペットを換える。
・ エチジウムブロミドは強力な発ガン物質なので，取り扱い時には必ず手袋を着用する。粉末と溶液が市販されているが，吸引などの危険性から溶液を購入するのがよい。また，廃液は活性炭で吸着後焼却処分をする。
2.必要な実験装置と試薬類
1）試薬・実験器具＜核酸抽出用試薬＞
・ TRIzolR LS Reagent（ｲﾝﾋﾞﾄﾛｼﾞｪﾝ）・ クロロホルム（特級）・ ２-プロパノール（特級）・ dDW (DNAse・RNAse free)（ｲﾝﾋﾞﾄﾛｼﾞｪﾝ）・ 75%エタノール（特級を dDW で希釈）＜PCR 用試薬＞・ SuperScriptTM Ⅲ One-Step RT-PCR
with PlatinumR Tag （ ｲ ﾝ ﾋ ﾞ ﾄ ﾛ ｼ ﾞ ｪ ﾝ ,Cat.No.12574-026）
・ Takara EX Taq HS（タカラ）＜電気泳動用試薬＞
・ 電気泳動用アガロース HS（ニッポンジーン）
・ 電気泳動用バッファー（TBE，Takara）：粉末を DW に溶解し使用する。
・ 臭化エチジウム溶液（10mg／mL，ニッポンジーン）：本液の 20 倍希釈液をアガロース 100mL に対し 20μL 添加する（最終濃度 0.1μg／mL）。臭化エチジウムは発ガン物質であるため，取り扱い時には手袋を着用する。
・ マイクロチューブ（0.5 mL，1.5 mL 用高圧滅菌済みのもの）・ PCR 用マイクロチューブ（PCR 用 0.2 mL 等，高圧滅菌済みのもの）・ DNA 分子量マーカー（フナコシなど）

1

＜核酸抽出用器具＞
・ ディスポーザルピペット（5mL，1mL）・ フィルター付きチップ(1,000μL，200μL など)
・ オートピペッター（1,000μL，200μL）
・ チューブ立て・ パウダーフリー・ディスポーザブル手袋＜RT-PCR 用器具＞
・ フィルター付きチップ(1,000μL，200μL，20μL，10μL など)
・ オートピペッター（1,000μL，200μL，20μL，10μL）
・ チューブ立て
RT-PCR プライマー・反応液
・ RT-PCR プライマー：下表の配列のものをメーカーに合成依頼する。通常合成されたプライマーは，乾燥状態で納品されるので dDW 等で溶解し使用する（ストック液は 10pmol/μL に調製し小分けして冷凍保存する）。
診断用プライマーの配列
プライマー名配列

SVCV F15’-TCT TGG AGC CAA ATA GCT CAR＊ R*TC-3’

SVCV R25’-AGA TGG TAT GGA CCC CAA TAC ATH* ACN＊ CAY＊-3’

ストック液は 10pmol/μL に調製＊R:A又はG

H:A又はC又はT

N:A又はC又はG又はT

Y:C又はT・ RT-PCR反応液：SuperScriptTM Ⅲ One-Step RT-PCR with PlatinumR Taq を用いて，使用する直前に所定の濃度になるよう調製する。
RT-PCR 反応液の調製
試薬（1 検体分）2×Reaction Mix（キット）25μL

dDW（滅菌超純水）

8μL

SVCV F1 primer(10pmol/μL)

5μL

SVCV R2 primer(10pmol/μL)

5μL

RT PlatinumR Taq Mix（キット）

2μL
合計

245μL

2）実験装置
・ 冷却微量高速遠心機
・ オートクレーブ・ PCR サーマルサイクラー
・ ミニゲル電気泳動装置・ トランスイルミネーター
・ 写真撮影装置あるいは CCD カメラ撮影装置
・ 攪拌機
3.

手技1）核酸の抽出①

倒立顕微鏡により，培養細胞の細胞変性効果（CPE）が完全に出現し細胞がほとんど全て浮き上がっていること確認する。

②

ピペットを用いて，培養フラスコ内の組織培養液を遠沈管に移す。
使用済み培養フラスコおよびピペットは滅菌缶に捨てる。

③

遠沈管に回収した組織培養液を4℃で 3,000 rpm・5 分間，遠心分離する。

④

ピペットを用いて，遠心した上清250μL を 1.5 mL チューブに移す。
使用済み遠沈管およびピペットは滅菌缶に捨てる。

3⑤1,000μL オートピペッターを用いて，TRIzol LS 750μL をチューブに加える(TRIzol(LS)にはフェノールが含まれているので手袋を着用)。

⑥

十分撹拌した後，室温で５分間放置する。

⑦

クロロフォルム 200μL を加え，15秒間激しく撹拌し，その後，室温で 5 分間放置する。

⑧４℃で 12,000ｇ・10 分間，遠心分離する。

⑨

透明上層（水相），白色中間層（DNA相），赤色下層（ﾌｪﾉｰﾙ相）の 3 層に分離されていることを確認する。分離されていなければ，再度遠心分離する。

⑩

白色中間層を吸わないように，水相(500–600μl)のみを別の 1.5mLチューブに移入する。全ての水層をとる必要はない。

4⑪500μL の 2-プロパノール（原液）を入れ，軽く混合する。室温で 10分間放置する。作業、⑩と⑪は逆でもよい。先に新しいチューブに2-プロパノールを入れておき、それに⑨の水相を加える。

⑫

４℃で 12,000ｇ・10 分間，遠心沈澱する。ペレットは確認できないことが多い。

⑬

上清をピペット等で吸い取り除去した後，75％エタノール 1,000μLを入れて，軽く撹拌機で混ぜる。

⑭

４℃で 7,500ｇ・５分間，遠心する。

⑮

上清をピペットで除去し，遠沈管を乾燥させる（過剰乾固を避けるため，吸引器は用いない）。

⑯

サ ン プ ル に dDW （ DNAse ・ RNAsefree）100μL を加える。

⑰

1.5mL チューブを指で弾いて，よく溶かす。RNA は分解されやすいので，溶解後は速やかに氷冷する。
保存する場合は，-80℃で行う。

⑱

ウイルスに汚染した器具等は滅菌缶に入れオートクレーブ処理する。

52）RT-PCR 反応①

SuperScriptTM Ⅲ One-Step RT-PCRwith PlatimumR Taq

キット中のx2

Reaction Bufferと 10pmol/μLに調整したプライマーを解凍し、氷冷する。
Taqは直接氷冷する。
②

オートクレーブ処理した PCR チュー
ブにサンプルの番号を記入し準備する。陽性・陰性対照用チューブ（計２本）も加えて準備する（ポジコンにバンドが出ない，あるいはネガコンにバンドが出たら，やり直し）。

③

総サンプル分の RT-PCR 反応液を調製する。

④

PCR 反応液 45μL を PCR チューブに分注する。

⑤

抽出核酸サンプル液 5μL を PCR チューブに入れた RT-PCR 反応液に移入する。

6⑥チューブのキャップをしっかりと閉める。

⑦サーマルサイクラーのプログラムを開始し，50℃に達したところでポーズして止める。PCR チューブをセットし，蓋を閉め，再スタートさせる。
プログラム
50℃

30 分

94℃

2分

94℃

15 秒

55℃

30 秒

68℃

１分

68℃

７分, ４℃保冷

35 サイクル3）RT-PCR 増幅産物の電気泳動と判定
電気泳動による RT-PCR 増幅産物の確認と判定は，「魚類組織をテンプレートとした RT-PCR 法による診断」に準ずる。
・２nd PCR を予定している場合には，反応が終わった PCR チューブには直接電気泳動用ローディングバッファーを入れず，パラフィルム上で，増幅産物 9μL と電気泳動用ローディングバッフ
ァー1μL をピペッティングにより混合する。これを電気泳動用試料とする。

7・判定： 714bp の増幅産物を確認し，陽性と判定する。

4.付録―2nd PCR（nested-PCR）
最初の RT-PCR では SVCV の他に近縁種の PFRV(Pike Fry Rhabdovirus)の遺伝子も増幅する可能性がある。SVCV と PFRV の宿主は共通することがある。OIE では、シークエンスすることを勧めているが、ここでは、nested-PCR で SVCV と PFRVに分ける。nested-PCR は感度が高いため、テンプレートのコンタミに注意する。
１）必要な試薬類
・ テンプレートの準備(RT-PCR

1/50)：RT-PCR 反応液 1.0μL に dDW を 49μL加えて混ぜる。コンタミしないように注意する。もし、RT-PCR でバンドが認められなくても同様な処理でテンプレートとして用いてよい。
・ ２nd(nested)-PCR プライマー(SVCV 用)：下表の配列のものをメーカーに合成依頼する。通常合成されたプライマーは，乾燥状態で納品されるので dDW 等で溶解し使用する（ストック液は 10pmol/μL に調製し小分けし冷凍保存する）。
SVCV Nested-PCR プライマーの配列
プライマー名配列

SVCV nest F

5’-TGA AGA Y*TG TGT CAA TCA AGT C-3’

SVCV nest R

5’-GCG AR*T GCA GAG AAA AAG TG-3’

ストック液は 10pmol/μL に調製＊

Y:C又はT

R:A又はG8・ ２nd(nested)-PCR プライマー(PFRV 用)：PFRV Nested-PCR プライマーの配列
プライマー名配列

PFRV nest F

5’-GTG CY*C TCA CAC AS*C GTA AA-3’

PFRV nest R

5’-GGA GGA GAG TGT AAT GCT CC-3’

ストック液は 10pmol/μL に調製＊

Y:C又はT

S:C又はG・ Nested-PCR 反応液：Takara EX Taq HS を用いて，使用する直前に所定の濃度になるよう調製する。
２nd-PCR 反応液の調製
試薬（1 検体分）10x EX Taq buffer

5.0μL

2.5mM dNTP mixture

4.0μL

dDW（滅菌超純水）34.75μL

nest F primer(10pmol/μL)

2.5μL

nest R primer(10pmol/μL)

2.5μL

Takara EX Taq HS

0.25μL
合計49μL

２）手技① オートクレーブ処理した PCR チューブにサンプルの番号を記入し，準備する。
② Takara Ex Taq Hot Start Version を使用し，総サンプル分の PCR 反応液を調整する。
③ PCR 反応液 49μL を PCR チューブに分注する。
④ 希釈した RT-PCR 反応液(1/50)の 1μL を PCR チューブに加える。ポジコンとネガコンを必ず作ること。ポジコンにバンドが出ない，あるいはネガコンにバンドが出たら，やり直し。
⑤ チューブのキャップをしっかりと閉める。
⑥ サーマルサイクラーのプログラムを開始し，94℃に達したところでポーズして止める。PCR チューブをセットし，蓋を閉め，再スタートさせる。SVCV とPFRV は同じプログラムを使用する。

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プログラム
94℃

30 秒

94℃

30 秒

55℃

30 秒

72℃

30 秒

72℃

７分, ４℃保冷

25 サイクル3) 2nd-PCR 増幅産物の電気泳動と判定
RT-PCR の方法に準ずる。目的増幅産物は SVCV で 369bp、PFRV で 410bp である。
また，増幅産物と電気泳動ローディングバッファーを混合する際，ローディングバッファー6μL を直接，反応終了後の PCR チューブに入れてもよい。
SVCV

PVRV

(369bp) (410bp)

SVCV（左）369bp および PFRV（右）410bpの核酸の増幅バンド。

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5．付録－2nd-PCR（Semi-nested PCR）
この 2nd-PCR は RT-PCR で陽性バンドが得られなかった時にのみ実施する。
１）必要な試薬類
・ ２nd(Semi-nested)-PCR プライマー：下表の配列のものをメーカーに合成依頼する。通常合成されたプライマーは，乾燥状態で納品されるので dDW 等で溶解し使用する（ストック液は 10pmol/μL に調製し小分けし冷凍保存する）。
Nested-PCR プライマーの配列
プライマー名配列

SVCV F15’-TCT TGG AGC CAA ATA GCT CAR＊ R*TC-3’

SVCV R45’-CTG GGG TTT CCN* CCT CAA AGY* TGY*-3’

ストック液は 10pmol/μL に調製・ Nested-PCR 反応液：Takara EX Taq HS を用いて，使用する直前に所定の濃度になるよう調製する。
２nd-PCR 反応液の調製
試薬（1 検体分）

10x EX Taq buffer

5.0μL

2.5mM dNTP mixture

4.0μL

dDW（滅菌超純水）

28.25μL

SVCV F1 primer(10pmol/μL)

5.0μL

SVCV R4 primer(10pmol/μL)

5.0μL

Takara EX Taq HS

0.25μL
合計47.5μL２）手技① オートクレーブ処理した PCR チューブにサンプルの番号を記入し，準備する。
② Takara Ex Taq Hot Start Version を使用し，総サンプル分の PCR 反応液を調整する。
③ PCR 反応液 47.5μL を PCR チューブに分注する。
④ ここにサンプル(RT-PCR 反応液)2.5μL を PCR チューブに加える。ポジコンとネガコンを必ず作ること。ポジコンにバンドが出ない，あるいはネガコンにバンドが出たら，やり直し。

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⑤ チューブのキャップをしっかりと閉める。
⑥ サーマルサイクラーのプログラムを開始し，94℃に達したところでポーズして止める。PCR チューブをセットし，蓋を閉め，再スタートさせる。
プログラム
94℃

30 秒

94℃

30 秒

55℃

30 秒

72℃

１分

72℃

７分, ４℃保冷

35 サイクル３) 2nd-PCR 増幅産物の電気泳動と判定
RT-PCR の方法に準ずる。目的増幅産物は 606bp である。また，増幅産物と電気泳動ローディングバッファーを混合する際，ローディングバッファー6μL を直接，反応終了後の PCR チューブに入れてもよい。
1st RT-PCR(714bp)2nd PCR(606bp)

RT-PCR（左）および２nd-PCR（右）による SVCV 核酸の増幅バンド。
判定：606bp の増幅産物を確認し，陽性と判定する。

６． 参考資料
1) バイオ実験イラストレイテッド③本当に増える PCR,秀潤社
2) Molecular Cloning(third edition) ,CSHL PRESS
3) Protocol for the proposed new confirmatory test for spring viraemia ofcarp, OIE 2004 proposal
4) The glycoprotein genes and gene junctions of the fish rhabdoviruses,
spring viremia of carp virus and hirame rhabdovirus: analysis ofrelationships with other rhabdoviruses (1996) Bjorklund H.V. et al.
Virus Res., 42, 65-80.

125) Nucleotide sequence analysis of the glycoprotein gene of putative springviraemia of carp viruses and pike fry rhabdovirus isolates reveals four
distinct piscine vesiculovirus genogroups (2002) Stone D.M. et al. Dis.
Aquat. Org., 53, 203-210.

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