信州医誌，61⑸：289〜342，2013

信州大学において審査された医学博士論文要旨
氏
名(所属講座)

学位授与
番
号

授与年月日

博

士

論

文

名

学位審査委員
主査

副査

島田健太郎 甲第923号
（臓器発生
制御医学）

24. 3.31 Hemodialysis‑Induced P‑Wave Signal‑Aver- 山 田 充 彦 西 澤
天野
aged Electrocardiogram Alterations Are

橋 本 幸 始 甲第924号（代謝制御学）24. 3.31 PPARα activation protects against anti‑ 田 中 榮 司 西 澤理
菅野祐幸
Thy1 nephritis bysuppressing glomerular NF‑
κB signaling（ペルオキシソーム増殖剤活性化
受容体 α型の活性化は，糸球体内の NF‑κB
経路を抑制することにより抗 Thy1腎炎に対し保護効果を発揮する）

町田香津子 甲第925号（加齢生物学）25. 3.31 Postmortem ﬁndings in a patient with cere- 樋 口 京 一 天 野 直 二
本郷一博
bral amyloid angiopathy actively treatedwith corticosteroid（積極的な副腎皮質ステロ
イド治療を行った脳アミロイドアンギオパチー
患者の剖検所見）野竹
剛 甲第926号（外科学⑴）

24. 3.31 Diﬀerential requirements for IRF‑2 in gener- 奥 山 隆 平 中 山淳
駒津光久
ation of CD1d‑independent T cells bearing
NK cell receptors（NK レセプターを発現する CD1d 非依存性Ｔ細胞の発生に IRF‑2は重要な役割を担っている）

江口
尚 甲第927号
（衛生学公
衆衛生学）

25. 3.31 The Eﬀects of Workplace Occupational 福 嶋 義 光 天 野 直 二
浅村英樹
M ental Health and related Activities on
Psychological Distress among Workers: A
M ultilevel Cross‑sectional Analysis（職場のメンタルヘルス活動が労働者の心理的ストレスに与える影響について：マルチレベル分析を用いた横断研究）

河 村 理 恵 甲第928号（遺伝医学･
予防医学）

24. 3.31 Visualization of the spatial positioning of 中 山桂
安 萍 甲第929号（外科学⑴）

24. 9.30 Impaired degradation followed by enhanced 谷口俊一郎 鎌 田徹
塩沢丹里
recycling of epidermal growth factor receptor caused by hypo‑phosphorylation oftyrosine 1045 in RBE cells（胆管癌細胞 RBEにおける，Y1045低リン酸化による EGFR の再循環増強と分解抑制）

No. 5, 2013

理純

Indicative of Vulnerability to Atrial Arrhythmias（血液透析療法の催上室性不整脈性―Ｐ波加算平均心電図による検討―）

the SNRPN, UBE3A, and GABRB3 genes in
the normal human nucleus by three‑color
3D ‑ﬂuorescence in situ hybridization（３ 色
3D‑FISH 法による正常人細胞核の SNRPN，
UBE3A，GABRB3遺伝子の空間配置の解析）

淳 本田孝行樋口京一

289

審査学位論文要旨

AL ‑ KZAYER 甲第930号
LIKAʼ
AFASIHYAQOUB（小児医学）

25. 3.31 Genetic Evaluation of Childhood Acute 菅 野 祐 幸 宇佐美真一
田中榮司
Lymphoblastic Leukemia in Iraq Using FTA
Cards（FTA カードを用いたイラク国内発症
小児急性リンパ性白血病の遺伝子解析）

柴 﨑 利 英 甲第931号（分子薬理学）24. 3.31 KGA‑2727, a novel selective inhibitor of a 駒 津 光 久 青 山 俊 文
大森栄high‑aﬃnity sodium glucose cotransporter(SGLT1), exhibits antidiabetic eﬃcacy inrodent models（高親和性ナトリウム・グルコー
ス共輸送体（SGLT1）の選択的阻害薬である
KGA‑2727は動物モデルにおいて抗糖尿病効
果を示す）

木 下 久 慈 甲第932号（精神医学）

25. 3.31 Not only body weight perception but also 天 野 直 二 池 田 修 一
野見山哲生
body mass index is relevant to suicidal ideation and self‑harming behavior in Japaneseadolescents（日本の青少年では，体型への認知のみならず，BMI（body mass index）も希
死念慮・自傷行為と関連する）

吉 沢 隆 浩 甲第933号（循環病態学）25. 3.31 Novel Regulation of Cardiac Metabolism and 樋 口 京 一 中 山
大森Homeostasis by the Adrenomedullin‑Rece‑
ptor Activity Modifying Protein 2 System（心臓におけるアドレノメデュリン‑RAMP2系
による代謝及び恒常性維持の新規制御機構）

吉江
進 甲第934号（組織発生学）25. 3.31 Establishment of novel detection system for 青 山 俊 文 田 中 榮 司
大森栄embryonic stem cell‑derived hepatocyte‑likecells based on nongenetic manipulation withindocyanine green（インドシアニングリーン
を用いた胚性幹細胞由来肝細胞の新規検出シス
テムの開発）

小 山 晃 英 甲第935号（循環病態学）25. 3.31 Vascular endothelial adrenomedullin‑RAMP2 樋 口 京 一 福 嶋 義 光中山淳
system is essential for vascular integrity
and organ homeostasis（血管内皮細胞における adrenomedullin‑RAMP2システムは血管統合性と組織恒常性維持に必須である）

武 井 真 大 甲第936号（内科学⑷）

24. 3.31 A new experimental model of ATP‑sensitive 山 田 充 彦 大 橋 俊 夫
佐々木克典
K＋ channel ‑independent insulinotropic
action of glucose:a permissive role of cAM P
for triggering of insulin release from rat
pancreatic β‑cells（グルコースによる ATP
感受性カリウムチャネル非依存性インスリン分泌刺激作用の新規実験モデル：ラット膵 β細胞からのインスリン分泌惹起における cAMP の寛容的役割）

茂木亜希海 甲第937号（組織発生学）24. 3.31 The method of mouse embryoid body estab- 山 田 充 彦 森 泉 哲 次
竹下敏一
lishment aﬀects structure and developmental
gene expression（マウス胚様体形成の方法はその構造と発生上の遺伝子発現に影響する）

家 里 康 弘 甲第938号（循環病態学）25. 3.31 Adrenomedullin‑RAMP2 system is crucially 樋 口 京 一 谷口俊一郎
菅野祐幸
involved in retinal angiogenesis（アドレノメ
デュリン‑RAMP2系の網膜血管新生における
重要性）

290

淳
栄

信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨

立 石 一 成 甲第939号（内科学⑴）

24. 3.31 Clinical Outcomes in Elderly Patients Ad- 久 保 惠 嗣 宮 川 眞 一
塩沢丹里
ministered Geﬁtinib as First‑line Treatment
in Epidermal Growth Factor Receptor‑
mutated Non‑small Cell Lung Cancer:Retrospective Analysis in a Nagano Lung Cancer
Research Group Study（高齢者 EGFR 遺伝子
変異陽性非小細胞肺癌における一次治療としての Geﬁtinib 治療の臨床的解析：長野県肺癌研究グループにおける後方視的解析）

杉 山 大 介 甲第940号（麻酔蘇生学）24. 3.31 In vivo patch ‑clamp recording from locus 大 橋 俊 夫 山 田 充 彦
田渕克彦
coeruleus neurones in the rat brainstem（ラット脳幹青斑核神経細胞からの in vivo パッチク
ランプ記録）

君塚康一郎 甲第941号
（器官制御
生理学）

25. 3.31 Sphingosine 1‑phosphate (S1P) induces S1P2 加 藤 博 之 佐々木克典
田渕克彦
receptor‑dependent tonic contraction in murine iliac lymph vessels（S1P によるマウス腸管リンパ管における S1P2受容体を介した収縮反応の機能特性）楊磊 甲第942号（循環病態学）25. 3.31 Endogenous CGRP protects against neointimal 樋 口 京 一 谷口俊一郎
菅野祐幸
hyperplasia following wire‑induced vascular
injury（内因性CGRPは，血管傷害による新生内膜形成を抑制する）

劉茜 甲第943号（神経可塑性学）

24. 3.31 Speciﬁc interaction of postsynaptic densities 田 渕 克 彦 谷口俊一郎
樋口京一
with membrane rafts isolated from synaptic
plasma membranes（精製シナプス後肥厚部と膜ラフトの特異的相互作用）

篠 山 大 明 甲第944号（精神医学）

25. 3.31 Increased cerebrospinal ﬂuid interleukin‑6 池 田 修 一 駒 津 光 久
鈴木龍雄
levels in patients with schizophrenia and（統合失those with major depressive disorder
調症患者および大うつ病性障害患者における髄液中インターロイキン‑6濃度の上昇）

境 澤 香 里 甲第945号（皮膚科学）

25. 3.31 M utation analysis of BRAF and KIT in 谷口俊一郎 本 田 孝 行
小泉知展
circulating melanoma cells at the single celllevel（血液循環メラノーマ細胞のシングルセ
ルレベルでの BRAF と KIT の遺伝子解析）丸 山 雅 史 甲第946号（内科学⑵）

24. 3.31 Periductal Induction of High Endothelial 本 田 孝 行 菅 野 祐 幸
森泉哲次
Venule‑Like Vessels in Type 1 Autoimmune（１型自己免疫性膵炎における高Pancreatitis
内皮細静脈様血管の出現に関する検討）

大彌
歩 甲第947号（分子病理学）25. 3.31 Lymphocyte recruitment via high endothelial 角 谷 眞 澄 宇佐美真一
栗田浩
venules in lymphoid stroma of Warthinʼstumour（ワルチン腫瘍のリンパ様間質における高内皮細静脈からのリンパ球ホーミング）肖鉄 朋 甲第948号
（歯科口腔
外科学）

25. 3.31 Vital staining with iodine solution in oral 菅 野 祐 幸 宇佐美真一
谷口俊一郎
cancer:iodine inﬁltration, cell proliferation,and glucose transporter 1（口腔がんにおけるヨード生体染色機序の解明：ヨードの浸透，細胞増殖とグルコース トランスポーター１）

No. 5, 2013291

審査学位論文要旨

氏
(所

名
属)

学位授与
番
号

授与年月日

博

士

論

文

名

学位審査委員主査

副査

赤 羽 貴 行 甲第１号
（保健学専攻
医療生命
科学分野
医療生命
科学領域）

24. 3.20 A Case of Wound Dual Infection with Pas- 奥 村 伸 生 市 川 元 基
川上由行
teurella dagmatis and Pasteurella canis Resulting from a Dog Bite ―Limitations of Vitek‑2

春日恵理子 甲第２号
（保健学専攻
医療生命
科学分野
医療生命
科学領域）

24. 3.20 Bactericidal activities of woven cotton and 奥 村 伸 生 寺 田克
川上由行
nonwoven polypropylene fabrics coated withhydroxyapatite‑binding silver/titanium dioxide ceramic nanocomposite “
Earth‑plus”（アースプラス（酸化チタン，ハイドロキシア
パタイト，銀）加工の施された綿織布とポリプ
ロピレン不織布の医療関連感染起因性病原菌に対する殺菌活性）

久保田聖子 甲第３号
（保健学専攻
医療生命
科学分野
医療生命
科学領域）

24. 3.20 Pathophysiological Investigation of the Gas- 奥 村 伸 生 日 髙 宏 哉
太田浩良
tric Surface Mucous Gel Layer of Patients青木幹昌（保健学専攻
生涯保健
学分野成
人保健学
領域）

甲第４号

25. 3.20 A descriptive study investigating the feasibil- 木 村 貞 治 百 瀬 公 人
ゴウ アーチェン
ity and selectivity of Current Perception
Threshold in the objective assessment ofpost‑
operative sub‑acute knee pain（手術後の亜急性膝痛の客観的な評価における電流知覚閾値の実現可能性と選択性を調査した記述的研究）

中西康祐（保健学専攻
生涯保健
学分野老
年保健学
領域）

甲第５号

25. 3.20 Evaluating the quality of life of people with 小 林 正 義 上 村 智 子
横川吉晴
dementia in residential care facilities（施設に入所している認知症高齢者の生活の質の評価）

務台
均（保健学専攻
生涯保健
学分野老
年保健学
領域）

甲第６号

25. 3.20 Factors associated with functional recovery 上 村 智 子 本 郷実
小林正義
and home discharge in stroke patients admitted to a convalescent rehabilitation ward（回復期リハビリテーション病棟に入院した脳卒中患者における機能回復および在宅復帰に寄与する因子の検討）292

System in Exact Identiﬁcation of Pasteurella（イヌ咬傷から分離されたPasteurella
Species―dagmatisとPasteurella canis創部重複感染症の１例―Vitek‑2システムによる Pasteurella属の正確な同定の限界―）

with Helicobacter pylori Infection by Using
Immunoassays for Trefoil Factor Family 2and Gastric Gland M ucous Cell‑Type Mucin
in Gastric Juice（胃液における TFF2と胃腺
粘液細胞型ムチンのイムノアッセイを用いた
Helicobacter pylori 感染患者の胃表層粘液ゲル
層の病態生理学的研究）

信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨

Hemodialysis‑induced P‑wave Signal‑averaged Electrocardiogram Alterations are Indicative ofVulnerability to Atrial Arrhythmias（血液透析療法の催上室性不整脈性―Ｐ波加算平均心電図による検討―）
島田

健太郎（論文の内容の要旨）

66.7±12.6歳，男性23人）を対 象 と し た。透 析 前 ・【目的】発作性心房細動等の上室性不整脈は，血液透中・後の PWD はそれぞれ135.5±14.2，144.6±15.9，

析中に高頻度に出現する。上室性不整脈は循環動態の139.5±14.1ms で，透析前と比変化を惹起し，しばしば血液透析の妨げとなりうる。

に延長していた（p＜0.05）。また RM S20はそれぞれまた，心房細動自体が透析患者の予後不良を予測する

5.51±3.87，3.05±1.87，5.29±5.17μV であり，透との報告もあり，透析中に生じる上室性不整脈の抑制

析前と比は維持透析症例の管理における重要な主題である。上

透析後は有意差が消失していた。これらの結果は，血室性不整脈に対する受攻性の定量的且つ非侵襲的な評

液透析の開始に伴い P‑SAECG の変化が生じると共価方法として，Ｐ波加算平均心電図（P‑SAECG）がに，血液透析の終了に伴い P‑SAECG が回復するこある。P‑SAECG の主な計測値として P wave dura-とを示唆した。次いで，P‑SAECG の変化と関連すtion（PWD）と root mean square voltages for theる因子を調べるために，透析中‑透析前の間の変化量

last 20ms of the P wave（RM S20）の２項目があり，を Δと定義した上で，ΔP‑SAECG と対象症例の固有PWD の延長と RMS20の短縮は将来的な心房細動の因子・透析条件・生化学的検査所見の関係を検討した。

発症を予測するとされている。しかしながら，血液透具体的にはピアソンの相関分析で検討し相関因子を抽析中の P‑SAECG 所見を調査した研究はこれまで成出した上で，重回帰分析を用いてより相関関係の強いされていない。そのため今回我々は，血液透析の催不因子を選択した。その結果，ΔPWD は透析期間及び整脈性を電気生理学的に評価するため，透析の最中を除水率と，ΔRM S20は透析期間及び ΔBUN と，それ含めて透析時の P‑SAECG を計測し，その関連因子

ぞれ有意な相関を認めた（p＜0.05）。これらのデーについて検討した。

タから，透析期間の長さや血液透析の強度によるΔP‑【方法】2008年６月から2009年７月にかけて，当院をSAECG への影響が示された。

含めた３つの関連病院において維持透析を施行してい【結 論】今 回 の 報 告 は，血 液 透 析 に よ り 劇 的 な P‑

る症例を対象とした。ただし，基本的に正常洞調律症

SAECG の変化が生じることを示した初めての研究で例を対象とし，加えて急性冠症候群発症直後・周術期ある。こうした変化は，透析中に上室性不整脈への受症例・重症感染症等の催不整脈要因を合併した症例は攻性が増大していることを示している。そして，血液除外した。また noise level は0.3μV 未満に設定した。

透析中の上室性不整脈の抑制には透析条件の厳密なコ登録された症例は全例で週２‑３回の透析療法を行っントロールが重要と考えられた。

ていた。透析前後のそれぞれ30分を含むようにしてして透析中に有意して透析中は有意に短縮し（p＜0.05），（論文審査の結果の要旨）

Digital Holter ECG を装着し，Synescope software

維持透析症例において，しばしば透析中に発作性不を 用 い て Digital data か ら 透 析 前 ・ 中 ・ 後 の P ‑整脈が生じる。不整脈を評価する場合，Holter ECG

SAECG を再構築した。P‑SAECG については最もで期外収縮を調べるのが一般的であるが，期外収縮はnoise level が 低 い も の を 採 択 し た。並 行 し て 透 析

時間差・個人差が激しく，比 が困難という欠点があ

前・中・後の３相で血液検体を採取し，血液検査項目

る。一方で定量的な評価方法として，心筋の遅延伝導についても調査した。統計処理は JM P software をを測定する加算平均心電図という手法がある。加算平使用した。処理方法については，連続変数に対しては

均心電図は Total の波長を示す PWD と，最後20ms

分散分析を，変数間の相関関係に対してはピアソンの部の面積を示す RMS20の２項目を評価する。PWD

相関分析及び重回帰分析を，それぞれ適用した。

の延長や，RM S20の短縮は心房細動の発症を予測す【結果】57症例を登録した上で，基準に従い24症例をるとの報告がある。また，透析症例ではＰ波加算平均

除 外 し，最 終 的 に33人 の 維 持 透 析 患 者（平 均 年 齢

心電図の異常が生じやすく，また透析後には PWD のNo. 5, 2013293

審査学位論文要旨

延長や RMS20の短縮が生じるとされている。しかし除水に伴い右心系内圧の低下が報告されており，まながら，Ｐ波加算平均心電図を透析中に応用した研究

た心内圧の低下に伴う心筋の遅延伝導の増悪が観察さは成されていない。そのため，今回我々は透析中のＰれている。BUN の低下に関しては膠質浸透圧の変化

波加算平均心電図を測定し，増悪因子の検索を行った。

により，細胞浮腫による機能障害が生じうるとされて方法に関しては，研究の協力施設に於いて，維持透いる。また，透析はレニン‑アンジオテンシン‑アルド析中の連続33症例を登録した。計測機器を透析前後のステロン系を代表とした神経体液性因子を賦活化し，30分を含め装着することで，透析前・透析中・透析後長期の曝露にて心筋を傷害させると報告されている。

のＰ波加算平均心電図を測定した。また，症例の既往

そうした要因が，Ｐ波加算平均心電図の増悪に関与し歴・採血データ・透析条件を調べ，関連因子を抽出したものと推定された。

た。

今回の研究において，透析中のＰ波の遅延伝導の増その結果，島田は次の結論を得た。

悪が検出されており，透析という治療行為自体が催不１．透析中，PWD は有意に延長し，RM S20は有意整脈性を有するものと考えられた。また，透析強度にに短縮した。それらの変化は透析終了後に回復する

比例してＰ波加算平均心電図の変化は増大しているこ傾向を示した。

とから，不整脈抑制における透析強度コントロールの２．透析中と透析前の数値の変化量を Δと定義した場

重要性が示唆された。臨床上重要な知見であり，主査，

合，重回帰分析において，ΔPWD は除水率・透析

副査は一致して本論文を学位論文として価値があるも期間と，ΔRM S20は ΔBUN ・透析期間と，それぞのと認めた。

れ有意な相関を示した。

PPARα activation protects against anti‑Thy1 nephritis by suppressing glomerular NF‑κB signaling（ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体 α型の活性化は，糸球体内の NF‑κB 経路を抑制する
ことにより抗 Thy1腎炎に対し保護効果を発揮する）
橋

本

幸

始

（論文の内容の要旨）

炎が惹起されやすくなることも報告した。これらの【背景と目的】慢性腎臓病（CKD）は心血管病や末期知見から，PPARα作動薬による PPARα活性化は腎不全，死亡の重大な危険因子であり，その対応は重M sPGN の治療に有益である可能性が考えられた。

要である。

ラット抗 Thy1腎炎は，抗 Thy1抗体がメサンギウ

メサンギウム増殖性腎炎（MsPGN）は CKD の主ム細胞表面の抗原に結合することにより高度の糸球体要原因の一つであり，レニン・アンジオテンシン系抑炎が惹起される，最も確立した MsPGN 動物実験モ

制薬や免疫抑制薬が治療薬として用いられているが，デルである。過去の報告では抗 Thy1腎炎発症の過程

活動性の高い場合，治療抵抗性の症例も存在する。

においても，ヒト M sPGN と同様に NF‑κB の活性

MsPGN 患者では腎内の NF‑κB 炎症経路の活性化化が起きることが報告されている。

が指摘されており，その抑制が活動性腎炎の新たな治療手段となる可能性がある。
ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体 α型（PPARα）

本研究は PPARα作動薬であるクロフィブラート
による PPARα活性化が，NF‑κB 経路を抑制し抗Thy1腎炎の疾患活動性を軽減することができるか検はリガンド依存性に転写調節を行う核内受容体の一つ証することを目的とした。

であり，脂質・糖質代謝調節，NF‑κB 経路の抑制に【材料及び方法】８週齢の雄 Wistar ラットを以下のよる抗炎症作用など様々な生理活性をもつ。近年我々３群に分け，５日間のクロフィブラート前投与の後には，活性化メサンギウム細胞では細胞の形質転換が起マウス抗 Thy1モノクローナル抗体の単回投与によりきることにより PPARαの発現が認められるように

抗 Thy1腎炎を誘導した。Fib（−）群：実験期間中なること，PPARα作動薬が活性化メサンギウム細胞

普通食を投与（n＝24），0.02％ Fib 群：0.02％のクの NF‑κB 経 路 を 抑 制 し 抗 炎 症 作 用 を 発 揮 す る こ

ロフ ィ ブ ラ ー ト 食 を 投 与（n＝12），0.1％ Fib 群：とを報告した。また，PPARα遺伝子の欠損により腎0.1％クロフィブラート食を投与（n＝24）

294

信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨

解析のため，day０，４，７，14にラットを屠殺，

将来的には，尿細管毒性がなく腎障害時でも使用可

検体を採取し，腎機能評価，病理学的評価，糸球体内能な薬物動態の安定した PPARα作動薬の開発が望PPARα活性の評価，糸球体内 NF‑κB 活性の評価をまれる。

組織学的及び生化学的手法を用いて行った。
【結果】（論文審査の結果の要旨）
慢性腎臓病（CKD）は心血管病や末期腎不全の重・抗 Thy1腎炎を惹起後，全ての群で尿蛋白の急速な大な危険因子であり，その対策が急務である。メサン

増加を認めたが，Fib 群では用量依存的に尿蛋白がギウム増殖性腎炎（MsPGN）は CKD の主要原因の減少した。

一つであり，NF‑κB 炎症経路の活性化が腎炎形成過・抗 Thy1腎炎を惹起後，全ての群で高度な腎炎所見程において重要であることが知られている。

（メサンギウム増殖，メサンギウム融解，糸球体血ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体 α型（PPARα）

管瘤形成，管外増殖）が認められたが，Fib 群でははリガンド依存性に転写調節を行う核内受容体の一用量依存的に病理学的腎炎所見が抑制された。

つであり，脂質・糖質代謝調節，NF‑κB 経路の抑・Fib（−）群では，抗Thy1腎炎惹起に伴い，PPARα制による抗炎症作用などの生理活性をもつ。近年，の PPRE 結合能低下および PPARα標的遺伝子のPPARα作動薬がメサンギウム細胞の NF‑κB 経路を

発現低下を認めた。一方，Fib 群では，用量依存的抑制し抗炎症作用を発揮すること，また PPARα遺に PPARα活性が強化され，抗 Thy1腎炎が惹起さ伝子欠損により腎炎が惹起されやすくなることが報告れても，PPARαの PPRE 結合能・ PPARα標的されている。これらの知見から，PPARα作動薬によ遺伝子発現が保たれた。PPARα作動薬は，腎炎進る PPARα活性化は MsPGN 治療に有益である可能

行過程における PPARαの機能劣化を防いだと考性が考えられた。

えられた。

今回，橋本幸始らは，MsPGNのモデルであるラッ・ Fib（−）群では，抗 Thy1腎炎が惹起されるに伴ト抗 Thy1腎炎を用いて，代表的な PPARα作動薬でい，NF‑κBの DNA結合能が亢進し，NF‑κBの標あるクロフィブラートが，PPARαの活性化を通じて的遺伝子である COX2，TNFα，ICAM 1の mRNA

NF‑κB 経路を抑制し抗 Thy1腎炎の疾患活動性を軽発現が増加した。一方，Fib 群では，PPARα活性減しうるか検証した。

化と同調し IκBαが誘導され NF‑κB 経路が抑制された。

８週齢の雄 Wistar ラットをクロフィブラート非投与群（Fib（−）），0.02％クロフィブラート投 与 群【結 論】本 研 究 は，MsPGN 動 物 モ デ ル に お い て（0.02％ Fib）
，0.1％クロフィブラート投与群（0.1PPARα作動薬が尿蛋白を減少させ腎炎の活動性病変％ Fib）の ３ 群 に 分 け，５ 日 間 の 前 投 与 の 後 に 抗を改善させうることを示した。PPARα作動薬は，腎

Thy1腎炎を誘導した。採取した尿や血液，腎組織を炎進展の過程において生じる PPARαの発現低下を用いて解析を行った。

防ぎ，糸球体内の PPARαを活性化させた。

その結果，橋本幸始は次の結論を得た。

過去の報告では，PPARα活性化は IκBαの発現

１．抗 Thy1腎炎を惹起後，全ての群で尿蛋白の増加を亢進させ NF‑κB 経路を抑制する可能性が示されと病理学的活動性腎炎所見が認められたが，Fib 投ているが，抗 Thy1腎炎においても PPARαの活性化

与群では用量依存的に尿蛋白が減少し病理学的腎炎

が NF‑κB 経路を抑制し糸球体内炎症を軽減する可活動性所見が抑制された。

能性が考えられた。この結果は PPARαの活性化を介した MsPGN 治療の可能性を示唆している。

２．抗 Thy1腎 炎 惹 起 後，Fib（−）群 で は PPARα
発現量が低下し PPARαの機能劣化が起きたが，本研究では PPARα活性化の知見の多いクロフィ

Fib 投与群では，用量依存的に PPARα活性が亢

ブラートを用い腎への悪影響を生じることなく抗腎炎

進 し，抗 Thy1腎 炎 惹 起 後 も PPARα機 能 が 保 た効果を示した。しかし，腎機能障害時にはフィブラー

れた。PPARα作動薬は，腎炎進行過程におけるト血中濃度上昇により尿細管毒性が起きる可能性が指PPARαの機能劣化を防いだと考えられた。

摘されているため，フィブラート製剤を腎炎治療に応

３．Fib（−）群では，抗Thy1腎炎惹起に伴い，NF‑

用する際には適切な用量管理と注意深い経過観察が必κB 経 路 が 著 明 に 活 性 化 し た が，Fib 群 で は，要である。

PPARα活性と同調し用量依存的に IκBαが誘導

No. 5, 2013295

審査学位論文要旨

され NF‑κB 経路が抑制された。

性が示唆された。本研究成果は，CKD 患者における本研究は，MsPGN 動物モデルにおいて，PPARα

新たな治療法を模索する上で有用な情報を提示するも作動薬が腎炎進展過程において生じる PPARαの発現低下を防ぎ NF‑κB 経路を抑制することで，腎炎の活動性病変を改善させうることを示した。この結果のと思われた。
よって，主査，副査は一致して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

から，PPARα活性化を介した M sPGN 治療の可能

Postmortem ﬁ
ndings in a patient with cerebral amyloid angiopathyactivelytreated with corticosteroid（積極的な副腎皮質ステロイド治療を行った脳アミロイドアンギオパチー患者の剖検所見）
町

田

香津子

（論文の内容の要旨）

４段階のアミロイド沈着スコアに分類し，面積当たり【背景】脳アミロイドアンギオパチー（Cerebral amy-のスコアを計算した（アミロイド沈着スコア０；なし，

loid angiopathy；CAA）は脳血管へのアミロイド沈

１；少量，２；中等量，３；大量。生検標本面積7.60

着症であり，高齢者やアルツハイマー型認知症患者で。さらに，剖検脳のmm 。剖検標本面積67.83mm ）しばしば認められ，脳出血や白質脳症などの原因とな

髄膜血管から Aβアミロイドを分離・精製して，そのる。CAA はアミロイド蛋白の種類とそれに対応する

蛋白量を蟻酸処理した LC/MS mass spectrometry

臨床病型により６つに分類される。Aβ型 CAA は髄で解析し，対照として，未治療の CAA 関連脳出血の膜と皮質血管への Aβアミロイドの沈着（Aβ1‑40が

剖検84歳女性から分離した CAA 含有髄膜組織とで比主体）を特徴とする。CAA 自体に対する治療は現在をした。

ないが，アルツハイマー型認知症に対する Aβワクチ【結果】生検では髄膜と皮質血管の全てに Congo red

ン療法の臨床試験の報告では，脳実質のアミロイド沈

強陽性かつ偏光を呈する Aβアミロイド沈着（congo-

着は除去されるが，血管壁に沈着し CAA 及び CAA

philic angiopathy）がみられ，血管周囲には炎症細胞

関連微小出血が増加することや，免疫を介する Aβア

浸潤もみられた。剖検脳では半球全体でごく少数の血

ミロイドの血管壁からの除去が CAA 血管の脆弱化や管にcongophilic angiopathyが観察されたのみであっ炎症をもたらし出血を誘発する可能性がある。一方，

たが，Aβ免疫反応性物質は多数の血管外膜に限局す

白質脳症の病像を呈する CAA 関連血管炎では副腎皮る形でみられ，血管周囲には炎症細胞はみられなかっ質ステロイドや免疫抑制剤が有効であったという報告た。アミロイド沈着スコアでは，Congo red 染色ではが多数ある。今回，我々は白質脳症の臨床像を呈した

生検時7.10/mm →剖検時0.18/mm ，免疫染色ではCAA 患者に，治療として積極的に副腎皮質ステロイ

生検時9.47/mm →剖検時2.76/mm といずれも大きドを投与し，生検と剖検での脳血管へのアミロイド沈

く減少した。

着の変化について病理組織学的および生化学的に検討

生化学的評価として，LC/MS mass spectrometryをした。

および immunoblotting では髄膜血管から抽出した【方法】対象は67歳時に左前頭葉皮質下出血の既往のAβ関連蛋白は対照例では多量であったが，本患者である69歳の女性。亜急性に認知機能低下と右不全片麻は微量であった。

痺を呈し，くも膜下出血と交通性水頭症のためＶ‑Ｐ【考察】本患者において，副腎皮質ステロイド投与にシャント手術と脳生検が施行され，CAA 関連血管炎

より脳血管アミロイドが退縮したと考えられ，作用機と診断された患者。治療は副腎皮質ステロイドを投与

序として Aβの産生抑制，排泄促進が推察される。本し，１年間で漸減中止をした。脳出血の再発はなく，研究では，この副腎皮質ステロイドを一定期間少量持1.5年後に感染症からの敗血症で死亡し，剖検が施行

続的に使用することで脳血管 Aβアミロイド沈着を寛された。生検と剖検で CAA 病変の程度を光学顕微鏡

解させる可能性が示唆された。しかし，脳血管 Aβアおよび電子顕微鏡で病理組織学像を比し，また，標ミロイド沈着を減らす機序については免疫学的機序が本面積をコンピューターソフトを用い測定し，各種染推察されるが，確固たる機序は不明であり，解明にあ

色方法で染色されたアミロイド沈着血管をカウントし，たり更なる研究が必要と考えられた。

296

信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨（論文審査の結果の要旨）

療の CAA 関連脳出血の剖検84歳女性から分離した

脳アミロイドアンギオパチー（Cerebral amyloid

CAA 含有髄膜組織と比 した。

angiopathy；CAA）は脳血管へのアミロイド沈着症

生 検 で は 髄 膜 と 皮 質 血 管 の 全 て に Congo red強であり，高齢者やアルツハイマー型認知症患者でしば陽性かつ偏光を呈する Aβアミロイド沈着（congo-

しば認められ，脳出血や白質脳症などの原因となる。

philic angiopathy）がみられ，血管周囲には炎症細胞

CAA 自体に対する治療は現在ない。白質脳症の病像

浸潤もみられた。剖検脳では半球全体でごく少数の血を呈する CAA 関連血管炎では副腎皮質ステロイドや管にcongophilic angiopathyが観察されたのみであっ

免疫抑制剤が有効であったという報告が多数ある。今

たが，Aβ免疫反応性物質は多数の血管外膜に限局す

回，くも膜下出血および白質脳症の臨床像を呈したる形でみられ，血管周囲には炎症細胞浸潤はみられな

CAA 患者に，治療として副腎皮質ステロイドを積極かった。アミロイド沈着スコアは，Congo red 染色で的に投与し，生検と剖検で脳血管へのアミロイド沈着

は生検時7.10→剖検時0.18/mm ，免疫染色では生検の変化について病理組織学的および生化学的に検討を時9.47→剖検時2.76/mm といずれも大きく減少した。

した。

生化学的評価として，LC/MS M S および immunob-

対象は67歳時に左前頭葉皮質下出血の既往のある69

lotting では髄膜血管から抽出した Aβ関連蛋白が対歳の女性。亜急性に認知機能低下と右不全片麻痺を呈照例では多量であったが本患者では微量であった。本し，くも膜下出血と交通性水頭症のためＶ‑Ｐシャン

患者において，副腎皮質ステロイド投与により脳血管ト手術と脳生検が施行され，CAA 関連血管炎と診断

アミロイドが退縮したと考えられ，作用機序としてされた。治療は副腎皮質ステロイドを投与し，１年間Aβの産生抑制，排泄促進が推察される。本研究では，で漸減中止をした。脳出血の再発はなかった。1.5年

この副腎皮質ステロイドを一定期間少量持続的に使用後に敗血症で死亡。生検と剖検で CAA 病変の程度をすることで脳血管 Aβアミロイド沈着を寛解させる可

病理組織学的に比 検討した。また，各標本面積を測能性が示唆された。しかし，脳血管 Aβアミロイド沈

定し，各種染色方法で染色されたアミロイド沈着血管着を減らす機序については免疫学的機序が推察されるをカウントし，４段階のアミロイド沈着スコアに分類が，明確な機序は不明であり，解明にあたり更なる研し，面積当たりのスコアを算出した。さらに，剖検脳究が必要と考えられた。

の髄膜血管から Aβアミロイドを分離・精製して，その蛋白量を LC/M S M S で解析し，対照として未治以上の結果より，主査，副査は一致して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

Diﬀerential requirements for IRF‑2 in generation of CD1d‑independent T cells bearing NK cell
receptor（s NK レセプターを発現する CD1d 非依存性Ｔ細胞の発生に IRF‑2は重要な役割を担っ
ている）
野

竹

剛

（論文の内容の要旨）胞）の機能，分化については近年盛んに研究が行われ【背景と目的】NK レセプター（NKR）とは，特異的ている。iNKT 細胞以外にも NKR を発現するＴ細胞

なリガンドと結合することにより NK 細胞の機能お（NKR Ｔ細胞）は存在し，表現型として CD44 のメ

よび増殖を調節するシグナルを伝達する分子であり，モリー型を有するものの中に NKR を同時に発現してNK1.1や NKG 2D，Ly49な ど す で に 多 く の レ セ プ

いるものが存在することがすでに報告されている。こターの存在が示されている。このように，NKR とはのような NKR Ｔ細胞はマウスのみならずヒトにおNK 細胞の機能制御に重要な分子として発見されたもいても存在が確認されており，様々な疾患の病態に関のだが，NK 細胞以外の細胞群においても発現してい与している可能性が示唆されている。しかしその発生ることが知られている。例えばＴ細胞の一部の集団に機序や具体的な機能に関しては，詳細は明らかになっ

おいても NKR の発現が認められており，特に，CD1ていない。本研究では，NKR Ｔ細胞（特に Ly49 Ｔ

d 拘束性を有しＴ細胞受容体として Vα14Jα18（ヒト細胞）の発生メカニズムを解明する事を目的とした。

では Vα24）をもつ invariant NKT 細胞（iNKT 細【方法】遺伝子改変マウスを用いて実験を行った。

No. 5, 2013297

審査学位論文要旨

CD1d 拘束性 iNKT 細胞を除外して検討するため，

IRF‑2は 型インターフェロン（IFN）受容体からのコントロールとして CD1d 欠損マウスを用いた。これ

シグナルを負に制御する分子である。つまり IRF‑2

を IRF‑2欠損マウスと掛け合わせて double mutant

欠損マウスの細胞内では IFN 受容体からのシグナル

mice を作成し，CD1d 非依存性 NKR Ｔ細胞の発生が亢進している。NKR Ｔ細胞の減少と過剰な IFN

におけるIRF‑2の必要性について検討を行った。これ

受容体シグナルの関連について検討した。IFN 受容らマウスの脾臓や骨髄，肝臓からリンパ球を単離し，体からのシグナルを排除するために，インターフェロ

各種細胞表面マーカーで多重染色を行い，ﬂow cyto-

ン α/β受容体 α鎖（IFNAR1）欠損マウスと IRF‑2

metryによりＴ細胞の表現型について解析を行った。

欠損マウスを掛 け 合 わ せ て double mutant mice

またＸ線照射キメラマウスを作成し，遺伝子改変の影（IRF‑2 AR1 ）を 作 成 し た。す る と，IRF ‑2

響がＴ細胞内因性のものか否かを検討した。さらに，

AR1 でも IRF‑2単独欠損マウスと同様に（またはIL‑2培養系を用いて，in vitro における NKR Ｔ細胞

それ以上に）NKR Ｔ細胞が減少していた。このことの発生メカニズムに関しても解析を行った。

から，NKR Ｔ細胞の分化において，IRF‑2はインター【結果】IRF‑2欠損マウスではコントロールに比べて，フェロン受容体からのシグナル調節とは独立した経路

NK1.1，NKG2D や Ly49といった NKR を発現するで作用していることが示された。

Ｔ細胞集団が有意に減少していた。NKR の中でも，【結論】以上の結果から，転写因子IRF‑2は，インター

特に Ly49 Ｔ細胞が最も強く影響を受けていた。Ｔ細フェロン受容体からのシグナル調節とは独立した経路

胞を IL‑2存在下で培養すると NKR Ｔ細胞が増加す

で，Ｔ細胞に内因性に作用し，NK レセプターを発現ることが知られている。コントロールとは異なり，するＴ細胞，特に Ly49 Ｔ細胞，の分化に重要な役割

IRF‑2欠損マウスから採取したリンパ球を同様に培養を果たしていることが示された。IRF‑2が制御していすると，NK1.1や Ly49を発現するＴ細胞は増加しなるNKR Ｔ細胞が生体内で担っている機能や役割に関かったが，NKG2D を発現するＴ細胞はコントロール

して詳細は未だ不明であり，今後のさらなる研究に期同様に増加した。このことから，発現する NKR の種待がもたれる。

類によって，NKR Ｔ細胞の分化に対する IRF‑2の（論文審査の結果の要旨）

役割が異なることが示された。続いて，Ｘ線キメラマ

NK レセプター（NKR）とは，特異的なリガンドウスを作成し，NKR Ｔ細胞の発生における IRF‑2と結合することにより NK 細胞の機能および増殖をの作用がＴ細胞自体に直接働いているのか，または環調節するシグナルを伝達する分子である。このように，境や他の細胞への作用が間接的にＴ細胞に影響していNKR とは NK 細胞の機能制御に重要な分子として発るのかを検討した。コントロールに移植した IRF‑2

見されたものだが，NK 細胞以外の細胞群においても欠損マウス由来の骨髄からは NKR Ｔ細胞は出現し発現していることが知られている。例えばＴ細胞のなかった。さらに，コントロール由来と IRF‑2欠損

一部の集団においても NKRの発現が認められておマウス由来の骨髄を mix してコントロールマウスにり，特に CD1d 拘束性を有する invariant NKT 細胞

移植し作成した混合キメラを用いた実験でも，IRF‑2（iNKT 細胞）の機能，分化については近年盛んに研欠損マウス由来の骨髄からは NKR Ｔ細胞は出現し究が行われている。iNKT 細胞以外にも，NKR を発なかった。このことから，IRF‑2はＴ細胞に内因性に現するＴ細胞（NKR Ｔ細胞）が存在することがすで作用していることが示された。NKR Ｔ細胞はメモに報告されている。このような NKR Ｔ細胞はマウ

リー細胞としての表現型を示すＴ細胞（Ｔ細胞）のスのみならずヒトにおいても存在することが確認されサブセットの一つであることがすでに知られている。

ており，様々な疾患の病態に関与している可能性が示

興味深いことに IRF‑2欠損マウスでは，Ｔ細胞の唆されている。しかしその発生機序や具体的な機能に内で NKR のサブセットは著しく減少しているが，関して，詳細は明らかになっていない。本研究では，

反対 に NKR の サ ブ セ ッ ト は コ ン ト ロ ー ル に 比 べ

遺伝子改変マウスを用い，これらの脾臓や骨髄，肝臓

Ｔ細胞全体に対する割合だけでなく絶対数においてからリンパ球を単離し，各種細胞表面マーカーで多重も多い結果となった。IRF‑2はＴ細胞が最終的に染色を行い，ﬂow cytometryによりＴ細胞の表現型

NKR になるか NKR に分化するかという運命の決について解析を行った。CD1d 拘束性 iNKT 細胞を定に，重要な役割を果たしていることが示された。

除外して検討するため，コントロールとして CD1d 欠

298

信州医誌 Vol. 61

信州医誌，61⑸：289〜342，2013

信州大学において審査された医学博士論文要旨
氏
名(所属講座)

学位授与
番
号

授与年月日

博

士

論

文

名

学位審査委員
主査

副査

島田健太郎 甲第923号
（臓器発生
制御医学）

24. 3.31 Hemodialysis‑Induced P‑Wave Signal‑Aver- 山 田 充 彦 西 澤
天野
aged Electrocardiogram Alterations Are

橋 本 幸 始 甲第924号（代謝制御学）24. 3.31 PPARα activation protects against anti‑ 田 中 榮 司 西 澤理
菅野祐幸
Thy1 nephritis bysuppressing glomerular NF‑
κB signaling（ペルオキシソーム増殖剤活性化
受容体 α型の活性化は，糸球体内の NF‑κB
経路を抑制することにより抗 Thy1腎炎に対し保護効果を発揮する）

町田香津子 甲第925号（加齢生物学）25. 3.31 Postmortem ﬁndings in a patient with cere- 樋 口 京 一 天 野 直 二
本郷一博
bral amyloid angiopathy actively treatedwith corticosteroid（積極的な副腎皮質ステロ
イド治療を行った脳アミロイドアンギオパチー
患者の剖検所見）野竹
剛 甲第926号（外科学⑴）

24. 3.31 Diﬀerential requirements for IRF‑2 in gener- 奥 山 隆 平 中 山淳
駒津光久
ation of CD1d‑independent T cells bearing
NK cell receptors（NK レセプターを発現する CD1d 非依存性Ｔ細胞の発生に IRF‑2は重要な役割を担っている）

江口
尚 甲第927号
（衛生学公
衆衛生学）

25. 3.31 The Eﬀects of Workplace Occupational 福 嶋 義 光 天 野 直 二
浅村英樹
M ental Health and related Activities on
Psychological Distress among Workers: A
M ultilevel Cross‑sectional Analysis（職場のメンタルヘルス活動が労働者の心理的ストレスに与える影響について：マルチレベル分析を用いた横断研究）

河 村 理 恵 甲第928号（遺伝医学･
予防医学）

24. 3.31 Visualization of the spatial positioning of 中 山桂
安 萍 甲第929号（外科学⑴）

24. 9.30 Impaired degradation followed by enhanced 谷口俊一郎 鎌 田徹
塩沢丹里
recycling of epidermal growth factor receptor caused by hypo‑phosphorylation oftyrosine 1045 in RBE cells（胆管癌細胞 RBEにおける，Y1045低リン酸化による EGFR の再循環増強と分解抑制）

No. 5, 2013

理純

Indicative of Vulnerability to Atrial Arrhythmias（血液透析療法の催上室性不整脈性―Ｐ波加算平均心電図による検討―）

the SNRPN, UBE3A, and GABRB3 genes in
the normal human nucleus by three‑color
3D ‑ﬂuorescence in situ hybridization（３ 色
3D‑FISH 法による正常人細胞核の SNRPN，
UBE3A，GABRB3遺伝子の空間配置の解析）

淳 本田孝行樋口京一

289

審査学位論文要旨

AL ‑ KZAYER 甲第930号
LIKAʼ
AFASIHYAQOUB（小児医学）

25. 3.31 Genetic Evaluation of Childhood Acute 菅 野 祐 幸 宇佐美真一
田中榮司
Lymphoblastic Leukemia in Iraq Using FTA
Cards（FTA カードを用いたイラク国内発症
小児急性リンパ性白血病の遺伝子解析）

柴 﨑 利 英 甲第931号（分子薬理学）24. 3.31 KGA‑2727, a novel selective inhibitor of a 駒 津 光 久 青 山 俊 文
大森栄high‑aﬃnity sodium glucose cotransporter(SGLT1), exhibits antidiabetic eﬃcacy inrodent models（高親和性ナトリウム・グルコー
ス共輸送体（SGLT1）の選択的阻害薬である
KGA‑2727は動物モデルにおいて抗糖尿病効
果を示す）

木 下 久 慈 甲第932号（精神医学）

25. 3.31 Not only body weight perception but also 天 野 直 二 池 田 修 一
野見山哲生
body mass index is relevant to suicidal ideation and self‑harming behavior in Japaneseadolescents（日本の青少年では，体型への認知のみならず，BMI（body mass index）も希
死念慮・自傷行為と関連する）

吉 沢 隆 浩 甲第933号（循環病態学）25. 3.31 Novel Regulation of Cardiac Metabolism and 樋 口 京 一 中 山
大森Homeostasis by the Adrenomedullin‑Rece‑
ptor Activity Modifying Protein 2 System（心臓におけるアドレノメデュリン‑RAMP2系
による代謝及び恒常性維持の新規制御機構）

吉江
進 甲第934号（組織発生学）25. 3.31 Establishment of novel detection system for 青 山 俊 文 田 中 榮 司
大森栄embryonic stem cell‑derived hepatocyte‑likecells based on nongenetic manipulation withindocyanine green（インドシアニングリーン
を用いた胚性幹細胞由来肝細胞の新規検出シス
テムの開発）

小 山 晃 英 甲第935号（循環病態学）25. 3.31 Vascular endothelial adrenomedullin‑RAMP2 樋 口 京 一 福 嶋 義 光中山淳
system is essential for vascular integrity
and organ homeostasis（血管内皮細胞における adrenomedullin‑RAMP2システムは血管統合性と組織恒常性維持に必須である）

武 井 真 大 甲第936号（内科学⑷）

24. 3.31 A new experimental model of ATP‑sensitive 山 田 充 彦 大 橋 俊 夫
佐々木克典
K＋ channel ‑independent insulinotropic
action of glucose:a permissive role of cAM P
for triggering of insulin release from rat
pancreatic β‑cells（グルコースによる ATP
感受性カリウムチャネル非依存性インスリン分泌刺激作用の新規実験モデル：ラット膵 β細胞からのインスリン分泌惹起における cAMP の寛容的役割）

茂木亜希海 甲第937号（組織発生学）24. 3.31 The method of mouse embryoid body estab- 山 田 充 彦 森 泉 哲 次
竹下敏一
lishment aﬀects structure and developmental
gene expression（マウス胚様体形成の方法はその構造と発生上の遺伝子発現に影響する）

家 里 康 弘 甲第938号（循環病態学）25. 3.31 Adrenomedullin‑RAMP2 system is crucially 樋 口 京 一 谷口俊一郎
菅野祐幸
involved in retinal angiogenesis（アドレノメ
デュリン‑RAMP2系の網膜血管新生における
重要性）

290

淳
栄

信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨

立 石 一 成 甲第939号（内科学⑴）

24. 3.31 Clinical Outcomes in Elderly Patients Ad- 久 保 惠 嗣 宮 川 眞 一
塩沢丹里
ministered Geﬁtinib as First‑line Treatment
in Epidermal Growth Factor Receptor‑
mutated Non‑small Cell Lung Cancer:Retrospective Analysis in a Nagano Lung Cancer
Research Group Study（高齢者 EGFR 遺伝子
変異陽性非小細胞肺癌における一次治療としての Geﬁtinib 治療の臨床的解析：長野県肺癌研究グループにおける後方視的解析）

杉 山 大 介 甲第940号（麻酔蘇生学）24. 3.31 In vivo patch ‑clamp recording from locus 大 橋 俊 夫 山 田 充 彦
田渕克彦
coeruleus neurones in the rat brainstem（ラット脳幹青斑核神経細胞からの in vivo パッチク
ランプ記録）

君塚康一郎 甲第941号
（器官制御
生理学）

25. 3.31 Sphingosine 1‑phosphate (S1P) induces S1P2 加 藤 博 之 佐々木克典
田渕克彦
receptor‑dependent tonic contraction in murine iliac lymph vessels（S1P によるマウス腸管リンパ管における S1P2受容体を介した収縮反応の機能特性）楊磊 甲第942号（循環病態学）25. 3.31 Endogenous CGRP protects against neointimal 樋 口 京 一 谷口俊一郎
菅野祐幸
hyperplasia following wire‑induced vascular
injury（内因性CGRPは，血管傷害による新生内膜形成を抑制する）

劉茜 甲第943号（神経可塑性学）

24. 3.31 Speciﬁc interaction of postsynaptic densities 田 渕 克 彦 谷口俊一郎
樋口京一
with membrane rafts isolated from synaptic
plasma membranes（精製シナプス後肥厚部と膜ラフトの特異的相互作用）

篠 山 大 明 甲第944号（精神医学）

25. 3.31 Increased cerebrospinal ﬂuid interleukin‑6 池 田 修 一 駒 津 光 久
鈴木龍雄
levels in patients with schizophrenia and（統合失those with major depressive disorder
調症患者および大うつ病性障害患者における髄液中インターロイキン‑6濃度の上昇）

境 澤 香 里 甲第945号（皮膚科学）

25. 3.31 M utation analysis of BRAF and KIT in 谷口俊一郎 本 田 孝 行
小泉知展
circulating melanoma cells at the single celllevel（血液循環メラノーマ細胞のシングルセ
ルレベルでの BRAF と KIT の遺伝子解析）丸 山 雅 史 甲第946号（内科学⑵）

24. 3.31 Periductal Induction of High Endothelial 本 田 孝 行 菅 野 祐 幸
森泉哲次
Venule‑Like Vessels in Type 1 Autoimmune（１型自己免疫性膵炎における高Pancreatitis
内皮細静脈様血管の出現に関する検討）

大彌
歩 甲第947号（分子病理学）25. 3.31 Lymphocyte recruitment via high endothelial 角 谷 眞 澄 宇佐美真一
栗田浩
venules in lymphoid stroma of Warthinʼstumour（ワルチン腫瘍のリンパ様間質における高内皮細静脈からのリンパ球ホーミング）肖鉄 朋 甲第948号
（歯科口腔
外科学）

25. 3.31 Vital staining with iodine solution in oral 菅 野 祐 幸 宇佐美真一
谷口俊一郎
cancer:iodine inﬁltration, cell proliferation,and glucose transporter 1（口腔がんにおけるヨード生体染色機序の解明：ヨードの浸透，細胞増殖とグルコース トランスポーター１）

No. 5, 2013291

審査学位論文要旨

氏
(所

名
属)

学位授与
番
号

授与年月日

博

士

論

文

名

学位審査委員主査

副査

赤 羽 貴 行 甲第１号
（保健学専攻
医療生命
科学分野
医療生命
科学領域）

24. 3.20 A Case of Wound Dual Infection with Pas- 奥 村 伸 生 市 川 元 基
川上由行
teurella dagmatis and Pasteurella canis Resulting from a Dog Bite ―Limitations of Vitek‑2

春日恵理子 甲第２号
（保健学専攻
医療生命
科学分野
医療生命
科学領域）

24. 3.20 Bactericidal activities of woven cotton and 奥 村 伸 生 寺 田克
川上由行
nonwoven polypropylene fabrics coated withhydroxyapatite‑binding silver/titanium dioxide ceramic nanocomposite “
Earth‑plus”（アースプラス（酸化チタン，ハイドロキシア
パタイト，銀）加工の施された綿織布とポリプ
ロピレン不織布の医療関連感染起因性病原菌に対する殺菌活性）

久保田聖子 甲第３号
（保健学専攻
医療生命
科学分野
医療生命
科学領域）

24. 3.20 Pathophysiological Investigation of the Gas- 奥 村 伸 生 日 髙 宏 哉
太田浩良
tric Surface Mucous Gel Layer of Patients青木幹昌（保健学専攻
生涯保健
学分野成
人保健学
領域）

甲第４号

25. 3.20 A descriptive study investigating the feasibil- 木 村 貞 治 百 瀬 公 人
ゴウ アーチェン
ity and selectivity of Current Perception
Threshold in the objective assessment ofpost‑
operative sub‑acute knee pain（手術後の亜急性膝痛の客観的な評価における電流知覚閾値の実現可能性と選択性を調査した記述的研究）

中西康祐（保健学専攻
生涯保健
学分野老
年保健学
領域）

甲第５号

25. 3.20 Evaluating the quality of life of people with 小 林 正 義 上 村 智 子
横川吉晴
dementia in residential care facilities（施設に入所している認知症高齢者の生活の質の評価）

務台
均（保健学専攻
生涯保健
学分野老
年保健学
領域）

甲第６号

25. 3.20 Factors associated with functional recovery 上 村 智 子 本 郷実
小林正義
and home discharge in stroke patients admitted to a convalescent rehabilitation ward（回復期リハビリテーション病棟に入院した脳卒中患者における機能回復および在宅復帰に寄与する因子の検討）292

System in Exact Identiﬁcation of Pasteurella（イヌ咬傷から分離されたPasteurella
Species―dagmatisとPasteurella canis創部重複感染症の１例―Vitek‑2システムによる Pasteurella属の正確な同定の限界―）

with Helicobacter pylori Infection by Using
Immunoassays for Trefoil Factor Family 2and Gastric Gland M ucous Cell‑Type Mucin
in Gastric Juice（胃液における TFF2と胃腺
粘液細胞型ムチンのイムノアッセイを用いた
Helicobacter pylori 感染患者の胃表層粘液ゲル
層の病態生理学的研究）

信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨

Hemodialysis‑induced P‑wave Signal‑averaged Electrocardiogram Alterations are Indicative ofVulnerability to Atrial Arrhythmias（血液透析療法の催上室性不整脈性―Ｐ波加算平均心電図による検討―）
島田

健太郎（論文の内容の要旨）

66.7±12.6歳，男性23人）を対 象 と し た。透 析 前 ・【目的】発作性心房細動等の上室性不整脈は，血液透中・後の PWD はそれぞれ135.5±14.2，144.6±15.9，

析中に高頻度に出現する。上室性不整脈は循環動態の139.5±14.1ms で，透析前と比変化を惹起し，しばしば血液透析の妨げとなりうる。

に延長していた（p＜0.05）。また RM S20はそれぞれまた，心房細動自体が透析患者の予後不良を予測する

5.51±3.87，3.05±1.87，5.29±5.17μV であり，透との報告もあり，透析中に生じる上室性不整脈の抑制

析前と比は維持透析症例の管理における重要な主題である。上

透析後は有意差が消失していた。これらの結果は，血室性不整脈に対する受攻性の定量的且つ非侵襲的な評

液透析の開始に伴い P‑SAECG の変化が生じると共価方法として，Ｐ波加算平均心電図（P‑SAECG）がに，血液透析の終了に伴い P‑SAECG が回復するこある。P‑SAECG の主な計測値として P wave dura-とを示唆した。次いで，P‑SAECG の変化と関連すtion（PWD）と root mean square voltages for theる因子を調べるために，透析中‑透析前の間の変化量

last 20ms of the P wave（RM S20）の２項目があり，を Δと定義した上で，ΔP‑SAECG と対象症例の固有PWD の延長と RMS20の短縮は将来的な心房細動の因子・透析条件・生化学的検査所見の関係を検討した。

発症を予測するとされている。しかしながら，血液透具体的にはピアソンの相関分析で検討し相関因子を抽析中の P‑SAECG 所見を調査した研究はこれまで成出した上で，重回帰分析を用いてより相関関係の強いされていない。そのため今回我々は，血液透析の催不因子を選択した。その結果，ΔPWD は透析期間及び整脈性を電気生理学的に評価するため，透析の最中を除水率と，ΔRM S20は透析期間及び ΔBUN と，それ含めて透析時の P‑SAECG を計測し，その関連因子

ぞれ有意な相関を認めた（p＜0.05）。これらのデーについて検討した。

タから，透析期間の長さや血液透析の強度によるΔP‑【方法】2008年６月から2009年７月にかけて，当院をSAECG への影響が示された。

含めた３つの関連病院において維持透析を施行してい【結 論】今 回 の 報 告 は，血 液 透 析 に よ り 劇 的 な P‑

る症例を対象とした。ただし，基本的に正常洞調律症

SAECG の変化が生じることを示した初めての研究で例を対象とし，加えて急性冠症候群発症直後・周術期ある。こうした変化は，透析中に上室性不整脈への受症例・重症感染症等の催不整脈要因を合併した症例は攻性が増大していることを示している。そして，血液除外した。また noise level は0.3μV 未満に設定した。

透析中の上室性不整脈の抑制には透析条件の厳密なコ登録された症例は全例で週２‑３回の透析療法を行っントロールが重要と考えられた。

ていた。透析前後のそれぞれ30分を含むようにしてして透析中に有意して透析中は有意に短縮し（p＜0.05），（論文審査の結果の要旨）

Digital Holter ECG を装着し，Synescope software

維持透析症例において，しばしば透析中に発作性不を 用 い て Digital data か ら 透 析 前 ・ 中 ・ 後 の P ‑整脈が生じる。不整脈を評価する場合，Holter ECG

SAECG を再構築した。P‑SAECG については最もで期外収縮を調べるのが一般的であるが，期外収縮はnoise level が 低 い も の を 採 択 し た。並 行 し て 透 析

時間差・個人差が激しく，比 が困難という欠点があ

前・中・後の３相で血液検体を採取し，血液検査項目

る。一方で定量的な評価方法として，心筋の遅延伝導についても調査した。統計処理は JM P software をを測定する加算平均心電図という手法がある。加算平使用した。処理方法については，連続変数に対しては

均心電図は Total の波長を示す PWD と，最後20ms

分散分析を，変数間の相関関係に対してはピアソンの部の面積を示す RMS20の２項目を評価する。PWD

相関分析及び重回帰分析を，それぞれ適用した。

の延長や，RM S20の短縮は心房細動の発症を予測す【結果】57症例を登録した上で，基準に従い24症例をるとの報告がある。また，透析症例ではＰ波加算平均

除 外 し，最 終 的 に33人 の 維 持 透 析 患 者（平 均 年 齢

心電図の異常が生じやすく，また透析後には PWD のNo. 5, 2013293

審査学位論文要旨

延長や RMS20の短縮が生じるとされている。しかし除水に伴い右心系内圧の低下が報告されており，まながら，Ｐ波加算平均心電図を透析中に応用した研究

た心内圧の低下に伴う心筋の遅延伝導の増悪が観察さは成されていない。そのため，今回我々は透析中のＰれている。BUN の低下に関しては膠質浸透圧の変化

波加算平均心電図を測定し，増悪因子の検索を行った。

により，細胞浮腫による機能障害が生じうるとされて方法に関しては，研究の協力施設に於いて，維持透いる。また，透析はレニン‑アンジオテンシン‑アルド析中の連続33症例を登録した。計測機器を透析前後のステロン系を代表とした神経体液性因子を賦活化し，30分を含め装着することで，透析前・透析中・透析後長期の曝露にて心筋を傷害させると報告されている。

のＰ波加算平均心電図を測定した。また，症例の既往

そうした要因が，Ｐ波加算平均心電図の増悪に関与し歴・採血データ・透析条件を調べ，関連因子を抽出したものと推定された。

た。

今回の研究において，透析中のＰ波の遅延伝導の増その結果，島田は次の結論を得た。

悪が検出されており，透析という治療行為自体が催不１．透析中，PWD は有意に延長し，RM S20は有意整脈性を有するものと考えられた。また，透析強度にに短縮した。それらの変化は透析終了後に回復する

比例してＰ波加算平均心電図の変化は増大しているこ傾向を示した。

とから，不整脈抑制における透析強度コントロールの２．透析中と透析前の数値の変化量を Δと定義した場

重要性が示唆された。臨床上重要な知見であり，主査，

合，重回帰分析において，ΔPWD は除水率・透析

副査は一致して本論文を学位論文として価値があるも期間と，ΔRM S20は ΔBUN ・透析期間と，それぞのと認めた。

れ有意な相関を示した。

PPARα activation protects against anti‑Thy1 nephritis by suppressing glomerular NF‑κB signaling（ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体 α型の活性化は，糸球体内の NF‑κB 経路を抑制する
ことにより抗 Thy1腎炎に対し保護効果を発揮する）
橋

本

幸

始

（論文の内容の要旨）

炎が惹起されやすくなることも報告した。これらの【背景と目的】慢性腎臓病（CKD）は心血管病や末期知見から，PPARα作動薬による PPARα活性化は腎不全，死亡の重大な危険因子であり，その対応は重M sPGN の治療に有益である可能性が考えられた。

要である。

ラット抗 Thy1腎炎は，抗 Thy1抗体がメサンギウ

メサンギウム増殖性腎炎（MsPGN）は CKD の主ム細胞表面の抗原に結合することにより高度の糸球体要原因の一つであり，レニン・アンジオテンシン系抑炎が惹起される，最も確立した MsPGN 動物実験モ

制薬や免疫抑制薬が治療薬として用いられているが，デルである。過去の報告では抗 Thy1腎炎発症の過程

活動性の高い場合，治療抵抗性の症例も存在する。

においても，ヒト M sPGN と同様に NF‑κB の活性

MsPGN 患者では腎内の NF‑κB 炎症経路の活性化化が起きることが報告されている。

が指摘されており，その抑制が活動性腎炎の新たな治療手段となる可能性がある。
ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体 α型（PPARα）

本研究は PPARα作動薬であるクロフィブラート
による PPARα活性化が，NF‑κB 経路を抑制し抗Thy1腎炎の疾患活動性を軽減することができるか検はリガンド依存性に転写調節を行う核内受容体の一つ証することを目的とした。

であり，脂質・糖質代謝調節，NF‑κB 経路の抑制に【材料及び方法】８週齢の雄 Wistar ラットを以下のよる抗炎症作用など様々な生理活性をもつ。近年我々３群に分け，５日間のクロフィブラート前投与の後には，活性化メサンギウム細胞では細胞の形質転換が起マウス抗 Thy1モノクローナル抗体の単回投与によりきることにより PPARαの発現が認められるように

抗 Thy1腎炎を誘導した。Fib（−）群：実験期間中なること，PPARα作動薬が活性化メサンギウム細胞

普通食を投与（n＝24），0.02％ Fib 群：0.02％のクの NF‑κB 経 路 を 抑 制 し 抗 炎 症 作 用 を 発 揮 す る こ

ロフ ィ ブ ラ ー ト 食 を 投 与（n＝12），0.1％ Fib 群：とを報告した。また，PPARα遺伝子の欠損により腎0.1％クロフィブラート食を投与（n＝24）

294

信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨

解析のため，day０，４，７，14にラットを屠殺，

将来的には，尿細管毒性がなく腎障害時でも使用可

検体を採取し，腎機能評価，病理学的評価，糸球体内能な薬物動態の安定した PPARα作動薬の開発が望PPARα活性の評価，糸球体内 NF‑κB 活性の評価をまれる。

組織学的及び生化学的手法を用いて行った。
【結果】（論文審査の結果の要旨）
慢性腎臓病（CKD）は心血管病や末期腎不全の重・抗 Thy1腎炎を惹起後，全ての群で尿蛋白の急速な大な危険因子であり，その対策が急務である。メサン

増加を認めたが，Fib 群では用量依存的に尿蛋白がギウム増殖性腎炎（MsPGN）は CKD の主要原因の減少した。

一つであり，NF‑κB 炎症経路の活性化が腎炎形成過・抗 Thy1腎炎を惹起後，全ての群で高度な腎炎所見程において重要であることが知られている。

（メサンギウム増殖，メサンギウム融解，糸球体血ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体 α型（PPARα）

管瘤形成，管外増殖）が認められたが，Fib 群でははリガンド依存性に転写調節を行う核内受容体の一用量依存的に病理学的腎炎所見が抑制された。

つであり，脂質・糖質代謝調節，NF‑κB 経路の抑・Fib（−）群では，抗Thy1腎炎惹起に伴い，PPARα制による抗炎症作用などの生理活性をもつ。近年，の PPRE 結合能低下および PPARα標的遺伝子のPPARα作動薬がメサンギウム細胞の NF‑κB 経路を

発現低下を認めた。一方，Fib 群では，用量依存的抑制し抗炎症作用を発揮すること，また PPARα遺に PPARα活性が強化され，抗 Thy1腎炎が惹起さ伝子欠損により腎炎が惹起されやすくなることが報告れても，PPARαの PPRE 結合能・ PPARα標的されている。これらの知見から，PPARα作動薬によ遺伝子発現が保たれた。PPARα作動薬は，腎炎進る PPARα活性化は MsPGN 治療に有益である可能

行過程における PPARαの機能劣化を防いだと考性が考えられた。

えられた。

今回，橋本幸始らは，MsPGNのモデルであるラッ・ Fib（−）群では，抗 Thy1腎炎が惹起されるに伴ト抗 Thy1腎炎を用いて，代表的な PPARα作動薬でい，NF‑κBの DNA結合能が亢進し，NF‑κBの標あるクロフィブラートが，PPARαの活性化を通じて的遺伝子である COX2，TNFα，ICAM 1の mRNA

NF‑κB 経路を抑制し抗 Thy1腎炎の疾患活動性を軽発現が増加した。一方，Fib 群では，PPARα活性減しうるか検証した。

化と同調し IκBαが誘導され NF‑κB 経路が抑制された。

８週齢の雄 Wistar ラットをクロフィブラート非投与群（Fib（−）），0.02％クロフィブラート投 与 群【結 論】本 研 究 は，MsPGN 動 物 モ デ ル に お い て（0.02％ Fib）
，0.1％クロフィブラート投与群（0.1PPARα作動薬が尿蛋白を減少させ腎炎の活動性病変％ Fib）の ３ 群 に 分 け，５ 日 間 の 前 投 与 の 後 に 抗を改善させうることを示した。PPARα作動薬は，腎

Thy1腎炎を誘導した。採取した尿や血液，腎組織を炎進展の過程において生じる PPARαの発現低下を用いて解析を行った。

防ぎ，糸球体内の PPARαを活性化させた。

その結果，橋本幸始は次の結論を得た。

過去の報告では，PPARα活性化は IκBαの発現

１．抗 Thy1腎炎を惹起後，全ての群で尿蛋白の増加を亢進させ NF‑κB 経路を抑制する可能性が示されと病理学的活動性腎炎所見が認められたが，Fib 投ているが，抗 Thy1腎炎においても PPARαの活性化

与群では用量依存的に尿蛋白が減少し病理学的腎炎

が NF‑κB 経路を抑制し糸球体内炎症を軽減する可活動性所見が抑制された。

能性が考えられた。この結果は PPARαの活性化を介した MsPGN 治療の可能性を示唆している。

２．抗 Thy1腎 炎 惹 起 後，Fib（−）群 で は PPARα
発現量が低下し PPARαの機能劣化が起きたが，本研究では PPARα活性化の知見の多いクロフィ

Fib 投与群では，用量依存的に PPARα活性が亢

ブラートを用い腎への悪影響を生じることなく抗腎炎

進 し，抗 Thy1腎 炎 惹 起 後 も PPARα機 能 が 保 た効果を示した。しかし，腎機能障害時にはフィブラー

れた。PPARα作動薬は，腎炎進行過程におけるト血中濃度上昇により尿細管毒性が起きる可能性が指PPARαの機能劣化を防いだと考えられた。

摘されているため，フィブラート製剤を腎炎治療に応

３．Fib（−）群では，抗Thy1腎炎惹起に伴い，NF‑

用する際には適切な用量管理と注意深い経過観察が必κB 経 路 が 著 明 に 活 性 化 し た が，Fib 群 で は，要である。

PPARα活性と同調し用量依存的に IκBαが誘導

No. 5, 2013295

審査学位論文要旨

され NF‑κB 経路が抑制された。

性が示唆された。本研究成果は，CKD 患者における本研究は，MsPGN 動物モデルにおいて，PPARα

新たな治療法を模索する上で有用な情報を提示するも作動薬が腎炎進展過程において生じる PPARαの発現低下を防ぎ NF‑κB 経路を抑制することで，腎炎の活動性病変を改善させうることを示した。この結果のと思われた。
よって，主査，副査は一致して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

から，PPARα活性化を介した M sPGN 治療の可能

Postmortem ﬁ
ndings in a patient with cerebral amyloid angiopathyactivelytreated with corticosteroid（積極的な副腎皮質ステロイド治療を行った脳アミロイドアンギオパチー患者の剖検所見）
町

田

香津子

（論文の内容の要旨）

４段階のアミロイド沈着スコアに分類し，面積当たり【背景】脳アミロイドアンギオパチー（Cerebral amy-のスコアを計算した（アミロイド沈着スコア０；なし，

loid angiopathy；CAA）は脳血管へのアミロイド沈

１；少量，２；中等量，３；大量。生検標本面積7.60

着症であり，高齢者やアルツハイマー型認知症患者で。さらに，剖検脳のmm 。剖検標本面積67.83mm ）しばしば認められ，脳出血や白質脳症などの原因とな

髄膜血管から Aβアミロイドを分離・精製して，そのる。CAA はアミロイド蛋白の種類とそれに対応する

蛋白量を蟻酸処理した LC/MS mass spectrometry

臨床病型により６つに分類される。Aβ型 CAA は髄で解析し，対照として，未治療の CAA 関連脳出血の膜と皮質血管への Aβアミロイドの沈着（Aβ1‑40が

剖検84歳女性から分離した CAA 含有髄膜組織とで比主体）を特徴とする。CAA 自体に対する治療は現在をした。

ないが，アルツハイマー型認知症に対する Aβワクチ【結果】生検では髄膜と皮質血管の全てに Congo red

ン療法の臨床試験の報告では，脳実質のアミロイド沈

強陽性かつ偏光を呈する Aβアミロイド沈着（congo-

着は除去されるが，血管壁に沈着し CAA 及び CAA

philic angiopathy）がみられ，血管周囲には炎症細胞

関連微小出血が増加することや，免疫を介する Aβア

浸潤もみられた。剖検脳では半球全体でごく少数の血

ミロイドの血管壁からの除去が CAA 血管の脆弱化や管にcongophilic angiopathyが観察されたのみであっ炎症をもたらし出血を誘発する可能性がある。一方，

たが，Aβ免疫反応性物質は多数の血管外膜に限局す

白質脳症の病像を呈する CAA 関連血管炎では副腎皮る形でみられ，血管周囲には炎症細胞はみられなかっ質ステロイドや免疫抑制剤が有効であったという報告た。アミロイド沈着スコアでは，Congo red 染色ではが多数ある。今回，我々は白質脳症の臨床像を呈した

生検時7.10/mm →剖検時0.18/mm ，免疫染色ではCAA 患者に，治療として積極的に副腎皮質ステロイ

生検時9.47/mm →剖検時2.76/mm といずれも大きドを投与し，生検と剖検での脳血管へのアミロイド沈

く減少した。

着の変化について病理組織学的および生化学的に検討

生化学的評価として，LC/MS mass spectrometryをした。

および immunoblotting では髄膜血管から抽出した【方法】対象は67歳時に左前頭葉皮質下出血の既往のAβ関連蛋白は対照例では多量であったが，本患者である69歳の女性。亜急性に認知機能低下と右不全片麻は微量であった。

痺を呈し，くも膜下出血と交通性水頭症のためＶ‑Ｐ【考察】本患者において，副腎皮質ステロイド投与にシャント手術と脳生検が施行され，CAA 関連血管炎

より脳血管アミロイドが退縮したと考えられ，作用機と診断された患者。治療は副腎皮質ステロイドを投与

序として Aβの産生抑制，排泄促進が推察される。本し，１年間で漸減中止をした。脳出血の再発はなく，研究では，この副腎皮質ステロイドを一定期間少量持1.5年後に感染症からの敗血症で死亡し，剖検が施行

続的に使用することで脳血管 Aβアミロイド沈着を寛された。生検と剖検で CAA 病変の程度を光学顕微鏡

解させる可能性が示唆された。しかし，脳血管 Aβアおよび電子顕微鏡で病理組織学像を比し，また，標ミロイド沈着を減らす機序については免疫学的機序が本面積をコンピューターソフトを用い測定し，各種染推察されるが，確固たる機序は不明であり，解明にあ

色方法で染色されたアミロイド沈着血管をカウントし，たり更なる研究が必要と考えられた。

296

信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨（論文審査の結果の要旨）

療の CAA 関連脳出血の剖検84歳女性から分離した

脳アミロイドアンギオパチー（Cerebral amyloid

CAA 含有髄膜組織と比 した。

angiopathy；CAA）は脳血管へのアミロイド沈着症

生 検 で は 髄 膜 と 皮 質 血 管 の 全 て に Congo red強であり，高齢者やアルツハイマー型認知症患者でしば陽性かつ偏光を呈する Aβアミロイド沈着（congo-

しば認められ，脳出血や白質脳症などの原因となる。

philic angiopathy）がみられ，血管周囲には炎症細胞

CAA 自体に対する治療は現在ない。白質脳症の病像

浸潤もみられた。剖検脳では半球全体でごく少数の血を呈する CAA 関連血管炎では副腎皮質ステロイドや管にcongophilic angiopathyが観察されたのみであっ

免疫抑制剤が有効であったという報告が多数ある。今

たが，Aβ免疫反応性物質は多数の血管外膜に限局す

回，くも膜下出血および白質脳症の臨床像を呈したる形でみられ，血管周囲には炎症細胞浸潤はみられな

CAA 患者に，治療として副腎皮質ステロイドを積極かった。アミロイド沈着スコアは，Congo red 染色で的に投与し，生検と剖検で脳血管へのアミロイド沈着

は生検時7.10→剖検時0.18/mm ，免疫染色では生検の変化について病理組織学的および生化学的に検討を時9.47→剖検時2.76/mm といずれも大きく減少した。

した。

生化学的評価として，LC/MS M S および immunob-

対象は67歳時に左前頭葉皮質下出血の既往のある69

lotting では髄膜血管から抽出した Aβ関連蛋白が対歳の女性。亜急性に認知機能低下と右不全片麻痺を呈照例では多量であったが本患者では微量であった。本し，くも膜下出血と交通性水頭症のためＶ‑Ｐシャン

患者において，副腎皮質ステロイド投与により脳血管ト手術と脳生検が施行され，CAA 関連血管炎と診断

アミロイドが退縮したと考えられ，作用機序としてされた。治療は副腎皮質ステロイドを投与し，１年間Aβの産生抑制，排泄促進が推察される。本研究では，で漸減中止をした。脳出血の再発はなかった。1.5年

この副腎皮質ステロイドを一定期間少量持続的に使用後に敗血症で死亡。生検と剖検で CAA 病変の程度をすることで脳血管 Aβアミロイド沈着を寛解させる可

病理組織学的に比 検討した。また，各標本面積を測能性が示唆された。しかし，脳血管 Aβアミロイド沈

定し，各種染色方法で染色されたアミロイド沈着血管着を減らす機序については免疫学的機序が推察されるをカウントし，４段階のアミロイド沈着スコアに分類が，明確な機序は不明であり，解明にあたり更なる研し，面積当たりのスコアを算出した。さらに，剖検脳究が必要と考えられた。

の髄膜血管から Aβアミロイドを分離・精製して，その蛋白量を LC/M S M S で解析し，対照として未治以上の結果より，主査，副査は一致して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

Diﬀerential requirements for IRF‑2 in generation of CD1d‑independent T cells bearing NK cell
receptor（s NK レセプターを発現する CD1d 非依存性Ｔ細胞の発生に IRF‑2は重要な役割を担っ
ている）
野

竹

剛

（論文の内容の要旨）胞）の機能，分化については近年盛んに研究が行われ【背景と目的】NK レセプター（NKR）とは，特異的ている。iNKT 細胞以外にも NKR を発現するＴ細胞

なリガンドと結合することにより NK 細胞の機能お（NKR Ｔ細胞）は存在し，表現型として CD44 のメ

よび増殖を調節するシグナルを伝達する分子であり，モリー型を有するものの中に NKR を同時に発現してNK1.1や NKG 2D，Ly49な ど す で に 多 く の レ セ プ

いるものが存在することがすでに報告されている。こターの存在が示されている。このように，NKR とはのような NKR Ｔ細胞はマウスのみならずヒトにおNK 細胞の機能制御に重要な分子として発見されたもいても存在が確認されており，様々な疾患の病態に関のだが，NK 細胞以外の細胞群においても発現してい与している可能性が示唆されている。しかしその発生ることが知られている。例えばＴ細胞の一部の集団に機序や具体的な機能に関しては，詳細は明らかになっ

おいても NKR の発現が認められており，特に，CD1ていない。本研究では，NKR Ｔ細胞（特に Ly49 Ｔ

d 拘束性を有しＴ細胞受容体として Vα14Jα18（ヒト細胞）の発生メカニズムを解明する事を目的とした。

では Vα24）をもつ invariant NKT 細胞（iNKT 細【方法】遺伝子改変マウスを用いて実験を行った。

No. 5, 2013297

審査学位論文要旨

CD1d 拘束性 iNKT 細胞を除外して検討するため，

IRF‑2は 型インターフェロン（IFN）受容体からのコントロールとして CD1d 欠損マウスを用いた。これ

シグナルを負に制御する分子である。つまり IRF‑2

を IRF‑2欠損マウスと掛け合わせて double mutant

欠損マウスの細胞内では IFN 受容体からのシグナル

mice を作成し，CD1d 非依存性 NKR Ｔ細胞の発生が亢進している。NKR Ｔ細胞の減少と過剰な IFN

におけるIRF‑2の必要性について検討を行った。これ

受容体シグナルの関連について検討した。IFN 受容らマウスの脾臓や骨髄，肝臓からリンパ球を単離し，体からのシグナルを排除するために，インターフェロ

各種細胞表面マーカーで多重染色を行い，ﬂow cyto-

ン α/β受容体 α鎖（IFNAR1）欠損マウスと IRF‑2

metryによりＴ細胞の表現型について解析を行った。

欠損マウスを掛 け 合 わ せ て double mutant mice

またＸ線照射キメラマウスを作成し，遺伝子改変の影（IRF‑2 AR1 ）を 作 成 し た。す る と，IRF ‑2

響がＴ細胞内因性のものか否かを検討した。さらに，

AR1 でも IRF‑2単独欠損マウスと同様に（またはIL‑2培養系を用いて，in vitro における NKR Ｔ細胞

それ以上に）NKR Ｔ細胞が減少していた。このことの発生メカニズムに関しても解析を行った。

から，NKR Ｔ細胞の分化において，IRF‑2はインター【結果】IRF‑2欠損マウスではコントロールに比べて，フェロン受容体からのシグナル調節とは独立した経路

NK1.1，NKG2D や Ly49といった NKR を発現するで作用していることが示された。

Ｔ細胞集団が有意に減少していた。NKR の中でも，【結論】以上の結果から，転写因子IRF‑2は，インター

特に Ly49 Ｔ細胞が最も強く影響を受けていた。Ｔ細フェロン受容体からのシグナル調節とは独立した経路

胞を IL‑2存在下で培養すると NKR Ｔ細胞が増加す

で，Ｔ細胞に内因性に作用し，NK レセプターを発現ることが知られている。コントロールとは異なり，するＴ細胞，特に Ly49 Ｔ細胞，の分化に重要な役割

IRF‑2欠損マウスから採取したリンパ球を同様に培養を果たしていることが示された。IRF‑2が制御していすると，NK1.1や Ly49を発現するＴ細胞は増加しなるNKR Ｔ細胞が生体内で担っている機能や役割に関かったが，NKG2D を発現するＴ細胞はコントロール

して詳細は未だ不明であり，今後のさらなる研究に期同様に増加した。このことから，発現する NKR の種待がもたれる。

類によって，NKR Ｔ細胞の分化に対する IRF‑2の（論文審査の結果の要旨）

役割が異なることが示された。続いて，Ｘ線キメラマ

NK レセプター（NKR）とは，特異的なリガンドウスを作成し，NKR Ｔ細胞の発生における IRF‑2と結合することにより NK 細胞の機能および増殖をの作用がＴ細胞自体に直接働いているのか，または環調節するシグナルを伝達する分子である。このように，境や他の細胞への作用が間接的にＴ細胞に影響していNKR とは NK 細胞の機能制御に重要な分子として発るのかを検討した。コントロールに移植した IRF‑2

見されたものだが，NK 細胞以外の細胞群においても欠損マウス由来の骨髄からは NKR Ｔ細胞は出現し発現していることが知られている。例えばＴ細胞のなかった。さらに，コントロール由来と IRF‑2欠損

一部の集団においても NKRの発現が認められておマウス由来の骨髄を mix してコントロールマウスにり，特に CD1d 拘束性を有する invariant NKT 細胞

移植し作成した混合キメラを用いた実験でも，IRF‑2（iNKT 細胞）の機能，分化については近年盛んに研欠損マウス由来の骨髄からは NKR Ｔ細胞は出現し究が行われている。iNKT 細胞以外にも，NKR を発なかった。このことから，IRF‑2はＴ細胞に内因性に現するＴ細胞（NKR Ｔ細胞）が存在することがすで作用していることが示された。NKR Ｔ細胞はメモに報告されている。このような NKR Ｔ細胞はマウ

リー細胞としての表現型を示すＴ細胞（Ｔ細胞）のスのみならずヒトにおいても存在することが確認されサブセットの一つであることがすでに知られている。

ており，様々な疾患の病態に関与している可能性が示

興味深いことに IRF‑2欠損マウスでは，Ｔ細胞の唆されている。しかしその発生機序や具体的な機能に内で NKR のサブセットは著しく減少しているが，関して，詳細は明らかになっていない。本研究では，

反対 に NKR の サ ブ セ ッ ト は コ ン ト ロ ー ル に 比 べ

遺伝子改変マウスを用い，これらの脾臓や骨髄，肝臓

Ｔ細胞全体に対する割合だけでなく絶対数においてからリンパ球を単離し，各種細胞表面マーカーで多重も多い結果となった。IRF‑2はＴ細胞が最終的に染色を行い，ﬂow cytometryによりＴ細胞の表現型

NKR になるか NKR に分化するかという運命の決について解析を行った。CD1d 拘束性 iNKT 細胞を定に，重要な役割を果たしていることが示された。

除外して検討するため，コントロールとして CD1d 欠

298

信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨

損マウスを用いた。これを IRF‑2欠損マウスと掛け髄からは NKR Ｔ細胞は出現しなかった。

合わせて double mutant mice を作成し，CD1d 非依

４．IRF‑2欠損マウスでは，メモリー細胞としての表存性 NKR Ｔ細胞の発生における IRF‑2の必要性に現型を示すＴ細胞の内で NKR のサブセットは著ついて検討を行った。またＸ線照射キメラマウスを作しく減少しているが，反対に NKR のサブセット

成し，遺伝子改変の影響がＴ細胞内因性のものか否か

はコントロールマウスに比べＴ細胞全体に対する割を検討した。さらに，IL‑2培養系を用いて，in vitro

合だけでなく絶対数においても多かった。

における NKR Ｔ細胞の発生メカニズムに関しても解析を行った。

５．インターフェロン α/β受容体 α鎖（IFNAR1）と IRF‑2をともに欠損した double mutant mice

その結果，野竹剛は今回の実験で次の結果を得た。
１．IRF‑2欠損マウスではコントロールに比べて，（IRF ‑2 AR1 ）を 用 い た 解 析 で，IRF ‑2
AR1 でも IRF‑2単独欠損マウスと同様に（またNK1.1，NKG2D や Ly49といった NKR を発現すはそれ以上に）NKR Ｔ細胞が減少していた。

るＴ細胞集団が有意に減少していた。NKR の中で以上の結果から，転写因子IRF‑2は，インターフェ

も，特に Ly49 Ｔ細胞が最も強く影響を受けていた。

ロン受容体からのシグナル調節とは独立した経路で，２．IRF‑2欠損マウスから採取したリンパ球を同様にＴ細胞に内因性に作用し，NK レセプターを発現する

培養すると，NK1.1や Ly49を発現するＴ細胞は増Ｔ細胞，特に Ly49 Ｔ細胞の分化に重要な役割を果た

加しなかったが，NKG2D を発現するＴ細胞はコンしているという結論を得た。本論文は，これまでまっ

トロールと同様に増加した。

たく不明であった NKR Ｔ細胞の発生・分化に関す

３．Ｘ線照射キメラマウスの解析で，コントロールマ

る遺伝子制御を初めて明らかにし，NKR Ｔ細胞が生ウスに移植した IRF‑2欠損マウス由来の骨髄から体内で担っている生理機能解明の研究へ応用される可は NKR Ｔ細胞は出現しなかった。さらに混合キ能性を有するものであり，主査，副査は一致して本論メラを用いた実験でも，IRF‑2欠損マウス由来の骨文を学位論文として価値があるものと認めた。

The eﬀects ofWorkplace Occupational Mental Health and related Activities on Psychological Distressamong Workers:A MultilevelCross‑sectionalAnalysis（職場のメンタルヘルス活動が労働者の心
理的ストレスに与える影響について：マルチレベル分析を用いた横断研究）
江口尚（論文の内容の要旨）

集団における個人の行動を検討するには，個人レベル【背景】これまでの研究では，管理職に対するメンタ

変数と集団レベル変数の両方を考慮するマルチレベル

ルヘルス教育などの一次予防，質問票によるうつ病の分析を行うことが求められており，公衆衛生学分野でスクリーニングなどの二次予防，復職支援などの三次も重要な手法として注目されている。このマルチレベ

予防は，企業におけるメンタルヘルス対策として，労ル分析を用いて，事業所レベルの要因と，従業員レベ

働者の心理的ストレス反応を軽減することに効果があ

ルの要因の関係について調査したメンタルヘルス研究ることが確認されている。我が国おいても，他の先進は少ない。そこで，本研究では，中小企業を対象にし諸国と同様に，産業保健において労働者のメンタルヘて，マルチレベル分析を用いて，以下の仮説の検証を

ルスへの関心が高まっている。しかし，多くの研究は，行った。

大企業で行われており，我が国の労働人口の80％を仮説①事業所レベルで実施しているメンタルヘルス対しめる中小企業を対象にしたメンタルヘルス対策の有策が，従業員の心理的ストレス反応を直接軽減

効性について調査した研究は少ない。従来の重回帰分する。

析は，標本間の独立を仮定しているのに対して，マル仮説②事業所レベルで実施しているメンタルヘルス対

チレベル分析は，組織から得られた標本は，この独立策が，心理社会的要因と心理的ストレス反応の性が成立しないと仮定している。そのため，従来の重関係を弱める。

回帰分析よりも，マルチレベル分析は，より現実に近【方法】対象は，諏訪労働基準協会に加盟する長野県

い形にモデル化した分析手法である。そのため，近年，

岡谷市内の357事業所とその従業員を対象とし，事業No. 5, 2013299

審査学位論文要旨

所調査と従業員調査の２段階の調査を行った。事業所ことが原因としては考えられた。今後，概念をより明

調査は，257事業所（回収率72.0％）から回答を得た。

確にした上で，事業所レベルのメンタルヘルス対策と，事業所調査に協力をいただいた事業所のうち，121事

従業員レベルの心理的ストレスの関係について，調査業所から従業員調査への同意を得た。従業員調査は，を行う必要があると考えられた。本研究では，仮説②

4,786人に質問票を配布し，3,540人（回収率74.0％）については支持されなかった。このことは，事業所レから回答を得た。マルチレベル分析を行う上で，デーベルの集団効力感や職場のサポートの緩衝作用や劣化

タの信頼性をより高めるために，回答者が20名未満の作用と，従業員レベルの心理的ストレスの間に関連を事 業 所 は 解 析 対 象 か ら 外 し，最 終 的 に32事 業 所，認めている先行研究とは一致しなかった。これらの結

2,123名を解析対象とした。従業員の心理的ストレス

果から，事業所レベルのメンタルヘルス対策は，間接反応と心理社会的要因の測定には，職業性ストレス簡的と言うよりも，より直接的に，従業員レベルの心理

易調査票を用いた。従業員の属性は，性別と年齢を用的ストレスと関連していることが示唆された。

いた。事業所のメンタルヘルス対策については，事業【結論】事業所レベルのコミュニケーションの促進は，所の安全衛生担当者に対して，「あなたの事業所では，従業員レベルの心理的ストレス反応を軽減した。さら現在，何らかのメンタルヘルス対策が行われていますに，事業所レベルのメンタルヘルス対策は，従業員レ

か」「あなたの事業所ではメンタルヘルスに関する情

ベルの心理的ストレス反応を軽減する可能性が示唆さ

報を手に入れることができますか」「あなたの事業所れた。

ではコミュニケーションを促進するために，何か取り（論文審査の結果の要旨）組みを行っていますか」について質問を行った。事業

本研究では，事業所レベルで実施されているメンタ

所属性として規模と業種を用いた。解析方法は，事業ルヘルス活動が，その事業所で働く労働者レベルの心所レベルと従業員レベルによるマルチレベル分析を用

理的ストレス反応に与える影響について検討を行った。

いた。

本研究の目的は，個人を取り巻くグループや部署，事【結果】事業所レベルでのコミュニケーションの促進

業所といった集団レベルのメンタルヘルス活動や事業は，従業員レベルの心理社会的要因を調整した上で，所規模等の要因が，個人レベルの健康状態（アウトカ従業員レベルの心理的ストレス反応と有意に負の相関

ム）と関連するかを明らかにすることである。そのたがあった（p＜0.01）。また，事業所レベルでのメン

めに，性，年齢といった個人レベルの要因のアウトカ

タルヘルス対策の実施は，従業員レベルの心理社会的

ムとの関連も調整する必要があることから，集団レベ要因を調整した上で，従業員レベルの心理的ストレス

ルと個人レベルの２つの要因レベルを２層（マルチレ反応と負の関連性を認める傾向にあった（p＝0.06）。

ベル）に分けて，アウトカムとの関連を分析する手法

事業所レベルでのメンタルヘルスに関する情報の入手である「マルチレベル分析」を用いた調査計画を立案

については，有意な相関を認めなかった（p＝0.72）。

した。また，マルチレベル分析を行うためには，集団以上から，仮説①は支持された。しかし，今回の調査

レベルにおいて十分なばらつき（バリエーション）がでは，仮説②については，支持されなかった。

必要となる。そのため，本研究では，岡谷市全域の事【考察】本研究では，仮説①については支持された。

業所を調査対象とすることで，マルチレベル分析を行事業所レベルのコミュニケーションの促進が，従業員うことができる十分なばらつきを得られる調査モデル

レベルの心理的ストレスと負の相関を認めたことは，となるよう計画した。

職場内のコミュニケーションを改善することが，仕事本研究では，岡谷市内の中小事業所を対象に，個人

上のストレスを軽減するという先行研究と一致した。

レベルで労働者に対する質問票調査を行い，心理的ス

事業所レベルのメンタルヘルス対策が，仕事上のストトレス反応，職業性ストレス要因といったアウトカム

レスを軽減するという先行研究があるにも関わらず，とそれに関連する可能性のある労働者の要因を調べ，本研究で，明らかな有意差を認めなかった。その理由

また，集団レベルで事業所別にアウトカムに関連するとしては，メンタルヘルス対策の中に，管理職教育，と考えられる事業所のメンタルヘルス活動の実態

健康診断時のストレスチェック，カウンセリングルー（「コミュニケーションの促進」，「メンタルヘルス対策

ムの設置，メンタルヘルスに関するパンフレットの配の実施」，「メンタルヘルスに関する情報の入手」）に布，従業員教育，が含まれ，曖昧な概念となっていた

関して質問票調査で調べた。

300

信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨

事業所レベルで実施されているメンタルヘルス活動

ンを促進することは，労働者レベルの心理的ストレス

が，労働者レベルの心理的ストレス反応を軽減する

反応を軽減することが示唆された。また，事業所レベ（仮説１），労働者レベルの職業性ストレス要因を緩和

ルでメンタルヘルス対策を実施することは，労働者レさせる（仮説２），か否かについて，マルチレベル分

ベルの心理的ストレス反応を軽減する可能性が示唆さ析を用いて検証した。

れた。

その結果，江口は次の結論を得た。

本論文のように，ある地域を広くとり，更に中小事

１．仮説１ 事業所レベルの「コミュニケーションの業所を対象とし，マルチレベル分析を試みた研究は少促進」は，労働者レベルの心理的ストレス反応と有ない。そのため，本論文の結果は，限られた対象に実

意に負の相関があった（p＜0.01）。また，事業所施していた従来のメンタルヘルス活動に関する研究とレベルの「メンタルヘルス対策の実施」は，労働者比べて，より一般化することができる結果を得ること

レベルの心理的ストレス反応と負の関連性を認めるができたと考えられる。

傾向にあった（p＝0.06）。

この内容に対して，主査，副査は一致して本論文を

２．仮説２ 関連を認めなかった（p＞0.10）。

学位論文として価値があるものと認めた。

上記の結果より，事業所レベルでコミュニケーショ

Visualization of the spatial positioning of the SNRPN, UBE3A, and GABRB3 genes in the normal
human nucleus bythree‑color 3D‑ﬂuorescencein situ hybridization（３色3D‑FISH 法による正常人
細胞核の SNRPN，UBE3A，GABRB3 遺伝子の空間配置の解析）
河

村

理

恵

（論文の内容の要旨）

た単核球細胞（PB），EB virus により形質変換・樹【背景と目的】近年，核内ゲノムの空間配置は遺伝子

立したＢリンパ芽球様細胞株（LCL），および皮膚切発現状態と関連し，細胞機能に重要な役割を持つと考片より樹立した線維芽細胞株（FB）を用いてそれぞえられるようになってきた（Egecioglu D et al.（2011）

れ3D‑FISH 用に立体構造を維持したまま固定した。

。しかし，クロマ
Curr Opin Cell Biol 23：338‑345）

培養細胞については細胞周期による核内配置への影響

チンレベルでの遺伝子空間配置と遺伝子発現制御とのを考慮し，固定前に末梢血細胞と DNA 量が同じ G1関係についての詳細はまだ明らかにされておらず，そ期の細胞が優位となるよう同調処理をした。DNA プの詳細を調べる方法として，3D‑ﬂuorescence in situ

ローブとして SNRPN ，UBE3A，GABRB3 をそれ

hybridization（3D‑FISH）法を用いた single cell レ

ぞれに含む BAC クローンを準備し，それぞれ異なる

ベルでの個々のアレルごとの遺伝子空間配置の解析が蛍光色素（緑，赤，赤外）を用いて標識し，立体構造考慮される。

を維持した細胞核標本にハイブリダイズした。共焦点

本研究では，「発現パターンが親由来アレルで異なレーザースキャン顕微鏡を用いて３領域の画像スタッるインプリンティング領域の空間配置は，アレル間でクを取得し，各細胞種につき50細胞ずつ，3D 画像解異なる」という，ゲノム配置とゲノム機能に関連する

析ソフトウェア IMARIS（Carl Zeiss）を用いて，ア仮説の検証を目的として解析を行った。具体的には，

レルごとに３遺伝子の遺伝子間距離を計測，空間配置

ヒトにおいて片親性発現を示す遺伝子のクラスターをについて解析した。

形成している領域のひとつである15番染色体 q11.2‑【結果】３遺伝子は，用いた３細胞種のいずれも解析

q12バンド領域に座位する，発現パターンの異なる３

したほとんどの細胞において，非直線状の空間配置

つの遺伝子，SNRPN （父性発現），UBE3A（組織特をとっていた。一次構造上は，SNRPN ，UBE3A，

異的母性発現），GABRB3 （両親性発現）を対象遺伝

GABRB3 の順に位置しているが，三次元ではGABRB3

子とし，正常同一個人由来の３種類の細胞を材料としはUBE3AよりもSNRPN の近くに位置していた。また，て，３色3D‑FISH 法による遺伝子空間配置の解析を３遺伝子間の三次元距離を比行った。

UBE3A（SU）と UBE3A〜GABRB3 （UG）領域間【対象と方法】正常同一個人由来の末梢血から分離しの距離はアレル間で異なっており，特に SU比（長いNo. 5, 2013

した結果，SNRPN 〜

301

審査学位論文要旨

SU距 離 ／ 短 い SU 距 離）は UG 比（長 い UG 距 離 ／関連するエビデンスはまだ十分ではない。我々は，短い UG 距離）より大きかった。すなわち，SU 距離「インプリンティング領域の空間配置は，片親性発現は２つのアレルで距離の差が大きい結果であった。さに伴い，父方アレルと母方アレルで異なる」という仮らに，一次構造上約0.45M b 離れている SU と約1.3説を立て，三次元配置の詳細を single cell レベルでMb離れている UG領域間の比は SU： UG＝0.35：１

個々のアレルごとに調べることができる3D‑FISH 法

であるが，３細胞種とも，三次元上では片方のアレルを用いた解析を行い，ゲノム機能と空間配置に関するの SU 領域間距離比は0.35に近かったのに対し，もう仮説の検証を試みた。

片方のアレルは0.35より大きい値であった。

具体的には，片親性発現を示す遺伝子クラスターを３遺伝子の遺伝子間距離は細胞種により異なる傾向

形成しているインプリンティング領域のひとつであるも確認され，特に PB における３遺伝子間距離は，

ヒトの15番染色体q11.2‑q12バンド領域に座位する，発LCL，FB に比べて長かった。

現パターンの異なる SNRPN （父性発現），UBE3A【考察】本研究により，⑴ SNRPN ，UBE3A，GABRB3（組織特異的母性発現），GABRB3 （両親性発現）の遺伝子領域が細胞核内で非直線上に規則性のある核

３つの遺伝子をターゲットにした３色3D‑FISH 法を

内配置をとっており，⑵ 父性発現の SNRPN 遺伝子

用いた遺伝子空間配置の解析を，正常同一個人由来のを含む領域の三次元距離は，相同染色体間および領域

Ｂリンパ芽球様細胞株（LCL），末梢血から分離した間で異なる傾向がある，という知見を得た。ゲノムの単核球細胞（PB），および皮膚線維芽細胞株（FB）

一次構造は同じであるにも関わらず，父親由来染色体を対象に行った。

のみ遺伝子発現を有する SNRPN 遺伝子のエピジェ

その結果，河村らは次の結論を得た。

ネティックなメカニズムが核内三次元遺伝子間距離の１．３つの遺伝子は非直線状に配置しており，三次元違いに影響を与えている可能性が考えられた。また，

では一次構造上の並びとは異なり，GABRB3 は遺伝子間距離はクロマチン凝縮に大きく影響されていUBE3A よりも SNRPN の近くに位置していた。

ると考えられるため，相同染色体間での遺伝子発現の２．領域特異的な遺伝子間距離が見られ，SNRPN

違いはクロマチン凝縮に関連していることも推測され，〜UBE3A 距離はアレル間での差が大きく，同一染

父性発現 SNRPN を含む SU 領域は，片方のアレル

色体上の UBE3A〜GABRB3 距離間比と比の凝縮が緩んでいることを示唆していると考えられた。

と，片方のアレルが緩んでいると考えられた。

本研究結果は核内配置と遺伝子発現とを関連づける新今回，異なる３つの細胞種（LCL，PB，FB）で解たなエピジェネティックエビデンスである可能性が示

析し，３遺伝子の空間配置の規則性については，同様唆された。また，遺伝子間距離を比 する際は，同じの傾向を示すことを確認した。ただし，遺伝子間距離

細胞種を用いる必要があることも示された。

は細胞種により異なる傾向を示したので，遺伝子間距する

今後，SU 距離の違いと染色体の親由来の関連を確

離を比 する際は，同じ細胞種を用いる必要がある。

認し，遺伝子間距離と遺伝子発現についての直接的検以上の結果より，ゲノムの一次構造は同じであるに証をめざしたい。遺伝子発現と三次元核内配置の関連も関わらず，父性発現を有する SNRPN 遺伝子のエが証明できれば，責任遺伝子が同定されていながら，

ピジェネティックなメカニズムが，アレル間の核内三遺伝子変異のみつかっていない患者の新たな診断法の次元遺伝子間距離の違いに影響を与えている可能性が確立や，核内ゲノムの空間配置という視点から新しい考えられた。また，遺伝子間距離はクロマチン凝縮に疾患発症機序の提案ができる可能性，また未だに原因

大きく影響されていると考えられるため，相同染色体が明らかにされていない遺伝性疾患の病態解明に繫が間での遺伝子発現の違いはクロマチン凝縮に関連してる可能性などが期待できる。

いることも推測され，本研究結果は核内配置と遺伝子（論文審査の結果の要旨）
核内ゲノムの空間配置は，遺伝子発現状態と関連し，発現とを関連づける新たなエピジェネティックエビデ
ンスに繫がる結果であると評価した。よって，主査，

細胞機能に重要な役割を持つことを示唆する研究が近副査は一致して本論文を学位論文として価値があるも年改めて注目されているが，ゲノム機能と核内配置にのと認めた。

302

信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨

Impaired degradation followed by enhanced recycling of epidermal growth factor receptor caused byhypo‑phosphorylation oftyrosine1045 in RBE cells（胆管癌細胞 RBE における，Ｙ1045低リン酸化による EGFR の再循環増強と分解抑制）
桂安萍（論文の内容の要旨）

2 ± 0.3 vs. 2.6 ± 0.4 folds of pY1068/total EGFR

Background : Cholangiocarcinoma is the secondand 2.9 ± 0.5 vs.0.8 ± 0.0 folds of p‑p44/42 MAPK/

most primary malignancy of the liver with poor

total p44/42MAPK of RBE cells before EGF stimu-

prognosis. For inoperable cholangiocarcinoma, sys-

lation, p＜0.05, n＝3). In RBE cells, the process oftemic chemotherapy has been applied. Nowadays,

EGFR sorting for lysosomal degradation was block-anti‑Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR)

ed at the early endosome stage (early endosome

therapy consisting of EGFR antibody (cetuximab)

marker EEA‑1 colocalizing EGFR after 1hr ofand anti‑tyrosine kinase small molecular inhibitor

stimulation : 14.4 ± 2.0 % vs. 1.2 ± 0.2% total(Geﬁtinib)is under wide study because EGFR over‑

EGFR, p＜0.01, n＝10), and non‑degradated EGFR

activation is related with poor prognosis.However,

was recycled to the cell surface (cell surface EGFR

further understanding of the mechanisms of aber-

expression of RBE cells after 1hr of EGF stimula-rant EGFR signaling in cholangiocarcinoma is need-tion :15.1 ± 0.8% vs. 28.3 ± 1.8% control with or

ed to reﬁne EGFR‑targeted therapy due to thewithout monensin treatment, p＜0.05, n＝4). A

limited response rate to the therapy today. Our

disrupted association between EGFR and E3 ubi-

study put emphasis on EGFR degradation and recy-

quitin ligase c‑Cbl,as well as hypo‑phosphorylationcling in cholangiocarcinoma cells.

of EGFR at tyrosine 1045, was observed in RBE

Methods: EGFR expression and signaling were

cells. No mutation of EGFR was identiﬁed in RBE

compared between chlangiocarcinoma cell line RBE

cells.Exogenous wild type EGFR was not sorted tocells and immortalized cholangiocyte cell line

lysosome neither in RBE cells.

MM NK‑1 cells (normal)by immunoblotting ;EGFR

Conclusion :In RBE cells,over‑activation of EGFR

colocalization with early endosome or late en-signaling is related with defective down‑regulation

dosome/lysosome was evaluated by immunoﬂuores-of EGFR. Up‑regulation of EGFR Tyr1045 phos-cence;cell surface EGFR expression was studied byphorylation is a potentially useful molecular altera-

ﬂuorescence‑activated cell sorting (FACS); EGFR

tion to EGFR‑targeted therapy in cholangiocar-

ubiquitination and its association with Cbl werecinoma cell types resembling RBE cells.

studied by immunoprecipitation ; Monensin treat-（論文審査の結果の要旨）

ment was adopted for inhibition of EGFR recycling.

Cholangiocarcinoma is the second most primary

Rab11a depletion was also adopted in RBE cells.

malignancy of the liver with poor prognosis. For

Myc‑tagged wild type EGFR was transfected into

inoperable cholangiocarcinoma, systemic chemo-

RBE cells to examine lysosome‑sorting process andtherapy has been applied. Nowadays, anti‑Epider-

EGFR degradation of exogenous wild type EGFR.

mal Growth Factor Receptor (EGFR) therapy con-

Results: Ligand‑induced EGFR degradation was

sisting of EGFR antibody (cetuximab) and anti‑

impaired (remaining EGFR ratio after 2 hr of stimu-

tyrosine kinase small molecular inhibitor (Geﬁtinib)

lation :68.2 ± 9.2 vs. 11.1 ± 1.4%, p＜0.05, n＝4);

is under wide study because EGFR over‑activation

the expression of phopho‑tyrosine1068and phospho‑

is related with poor prognosis. However, further

p44/42 MAPK were sustained in RBE cells as

understanding of the mechanisms of aberrant EGFR

compared with M MNK‑1 cells (pY1068 and p‑p44/

signaling in cholangiocarcinoma is needed to reﬁne

42 M APK expression after 2 hr of stimulation :7.

EGFR‑targeted therapy due to the limited response

No. 5, 2013303

審査学位論文要旨

rate to the therapy today. Our study put emphasis

RBE cells.

on EGFR degradation and recycling in cholan-

３．EGFR was recycled back plasma membrane

giocarcinoma cells.EGFR expression and signaling

through endocytic recycling compartment after

were compared between RBE cells and immortal-

traﬃcking delay at early endosome in RBE cells.

ized cholangiocyte cell line MM NK‑1 cells (normal)

４．Recycling inhibition did not facilitate EGFR

by immnoblotting ;EGFR colocalization with early

degradation in RBE cells.

endosome or late endosome/lysosome was evaluat-

５．Poor EGFR ubiquitination and EGFR‑Cbl asso-

ed by immunoﬂuorescence; cell surface EGFR

ciation might be the mechanism of impaired

expression was studied byﬂurescence‑activated cell

EGFR degradation in RBE cells.

sorting (FACS);EGFR ubiquitination and its associ-６．Hypo‑phosphorylation of tyrosine 1045 ofation with Cbl were studied by immunoprecipita-

EGFR might be the reason of poor EGFR‑Cbl

tion ; Monensin treatment was adopted for inhibi-

association in RBE cells.

tion of EGFR recycling. Rab11a protein depletion

According to the results listed above, in RBE

was also adopted in RBE cells. Myc‑tagged wild

cells, over‑activation of EGFR signaling is related

type EGFR was transfected into RBE cells to examwith defective down‑regulation of EGFR. Up‑

lysosome‑sorting process and EGFR degradation ofregulating EGFR Tyr1045 phosphorylation and ac-

exogenous wild type EGFR.

celerating EGFR degradation may be potentially

その結果，桂安萍は今回の実験で次の結果を得た。

useful molecular alteration to EGFR‑targeted ther-

１．EGFR degradation was impaired and its down‑

apy consisting of EGFR antibody and anti‑tyrosine

stream M APK signaling was sustained in RBE

kinase small molecular inhibitor in cholangiocar-

cells.

cinoma cell types resembling RBE cells.

２．Impaired EGFR degradation was caused by
defective sorting into late endosome/lysosome in

主査，副査は一致して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

Genetic Evaluation of Childhood Acute Lymphoblastic Leukemia in Iraq Using FTA Cards（FTA
カードを用いたイラク国内発症小児急性リンパ性白血病の遺伝子解析）
Likaʼa Fasih Yaqoub Al‑Kzayer（論文の内容の要旨）

chaotropic agent that denatures infectious agents,

Background : Genetic examination of childhoodand thus samples are no longer considered a bioh-

leukemia has not been available in Iraq. The pres-azard. Because of the small size of the FTA cards,

ence of speciﬁc chromosomal aberrations can bethey are convenient for storage in a limited spaceused to stratify patients,decide treatment protocol,and transport of specimens. We examined the fre-

and reveal prognosis.The common risk‑stratifying

quency of TEL‑AML1,E2A‑PBX1,M LL‑AF4,andtranslocations of pediatric ALL include t(12; 21)

BCR‑ABL chimeric transcripts in 264 Iraqi children(p13;q22), t(1;19)(q23;p13), t(4;11)(q21;q23),and

newly diagnosed with acute lymphoblastic leukemiat(9 ; 22)(q34; q11). These translocations encode(ALL), using FTA cards impregnated with bone

fusion transcripts of TEL‑AML1 (also termedmarrow aspirate or whole blood.

ETV6‑RUNX1), E2A‑PBX1 (also termed TCF3‑

M ethods:Five hospitals participated in this study:

PBX1), M LL‑AF4, and BCR‑ABL (p190), respec-

the Childrenʼ
s Welfare Teaching Hospital (CWTH)

tively. In the present study,we used Flinders Tech-in Baghdad (a major referral center for childhood

nology Associates (FTA) ﬁlter papers for genetic

cancers in the country), Central Teaching Hospital

analysis of Iraqi children with ALL.The ﬁlter paper

for Children (CTH) in Baghdad, Basra Childrenʼsmatrix of the FTA card is impregnated with

Specialty Hospital (BCSH)in Basra,Ibn Al Atheer304

信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨

Hospital for Children (IAH) in Mosul, and Nana‑

AML1 chimeric transcript product was found in 32

Kali Hospital for Hemato‑Oncology (NKH) in(12.1%) of 264 ALL patients. Eleven (4.2%)

Erbil. BM and/or peripheral blood (PB) samples

patients, 4 (1.5%) patients, and 11 (4.2%) patientswere collected from 269 Iraqi patients aged15

had E2A‑PBX1 mRNA, MLL‑AF4 mRNA, andyears (the peak was at 3 years), newly diagnosed

BCR‑ABL mRNA, respectively. One patient hadwith ALL from October 2009 to June 2011.Of a total

both TEL‑AML1 and E2A‑PBX1 fusion genes.Theof 269 patients, 132 cases were from CWTH, 69

incidence of TEL‑AML1 in Iraqi ALL children

cases from CTH, 31 cases from BCSH, 28 cases

appears to be similar to or slightlyhigher than thosefrom IAH, and 9 cases from NKH. Since 5 casesof Jordan (12%)and Kuwait (7%).M ore than 90%

were excluded because of diﬃculty in proving theof cases with TEL‑AML1 rearrangement in Iraq

diagnosis owing to the poor quality of their slides,

belonged to a favorable age group, with 71.9 % of

264 patients were enrolled in the study.The diagno-

these cases diagnosed in patients aged between 2

sis of ALL was made according to standard French‑and 6 years.The prevalence and clinical ﬁndings ofAmerican‑British morphologic criteria. Based on

ALL patients with either E2A‑PBX1 or BCR‑ABL

the results of storage temperature and duration,

were comparable to the data reported elsewhere.

most of the FTA samples were preserved at 4 ℃ for

Conclusion : The use of FTA chemically treated

up to 6 weeks in 5 Iraqi hospitals and then transfer-paper may be an attractive alternative to the collec-

red to Japan for molecular analysis.Nested reversetion of blood in tubes for obtaining genetic informa-transcription‑polymerase chain reaction was adopt-tion of hematologic malignancies in the under-

ed for the analysis.All Iraqi BM and/or PB samples

developed countries, where international collabora-

on FTA ﬁlter papers were analyzed and reevaluatedtion via FTA is helpful. In developed countries, it

at least once, together with REH cell line for t(12;has been demonstrated that patients with TEL‑

21)/TEL‑AM L1, RCH‑ACV cell line for t(1; 19)/

AML1 translocation have a superior clinical out-

E2A‑PBX1, MV4‑11 cell line for t(4; 11)/M LL‑

come, with relapse‑free survival rates approaching

AF4, or TOM ‑1 cell line for t(9 ;22)/BCR‑ABL as

90% upon testing a variety of drug regimens.Thus,

positive control cells, and normal healthy PB cells

disclosure of Iraqi ALL children with TEL‑AM L1

were used as negative controls.

may provide important information to persuade theResults:Since it has been demonstrated that FTA

patients not to abandon treatment and to undergocards provide an easy way to prepare total RNA

chemotherapy with suﬃciently assorted eﬀectivefrom a variety of samples stored in the short term

medicines.

at room temperature and in the longer term at（論文審査の結果の要旨）‑20 ℃ or ‑80 ℃,we conceived of using the cards for

The common risk‑stratifying translocations ofgenetic analysis of Iraqi children with ALL. First,

pediatric acute lymphoblastic leukemia (ALL)we examined storage temperature and duration by

include t(12;21)(p13;q22),t(1;19)(q23;p13),t(4;11)

which extraction of RNA was possible from REH(q21;q23), and t(9 ;22)(q34;q11). These transloca-

cells carrying TEL‑AM L1 fusion mRNA that weretions encode fusion transcripts of TEL‑AML1,E2A‑

inﬁltrated into the FTA matrix. GAPDH mRNA

PBX1, M LL‑AF4, and BCR‑ABL (p190), respec-

was detectable when at least 500 cells per μl were

tively.Flinders Technology Associates (FTA)cards

inﬁltrated into the FTA matrix and kept at either

are convenient for samples storage and transfer as‑30 ℃ or 4 ℃ for up to 6 weeks.On the other hand,well as nucleic acids protection for further genetic

37 ℃ was not suitable for RNA storage.

analysis. In the present study we examined theInterestingly,the TEL‑AML1 transcript,as well as

frequency of TEL‑AML1, E2A‑PBX1, M LL‑AF4,

GAPDH mRNA, was detectable in the FTA sam-and BCR‑ABL chimeric transcripts in 264 Iraqi

ples that were kept at 4 ℃ for up to 40 weeks.TEL‑

children newly diagnosed with acute lymphoblastic

No. 5, 2013305

審査学位論文要旨

leukemia, using FTA cards impregnated with bone

was found in 11 (4.2%)patients.
５．Lower TEL‑AM L1 frequency in Iraqi child-marrow aspirate or whole blood.
We found as follow:

hood ALL was comparable to Arab countries

１．GAPDH mRNA was detectable when at least

close to Iraq such as Jordan and Kuwait as well

500 REH cells/μl or 2.5% of REH mixture withas to other Asian countries such as Japan andnormal peripheral blood were inﬁltrated into the

Korea. Many studies reported a signiﬁcant

FTA matrix and kept at either ‑30 ℃ or 4 ℃ for

diﬀerence in the frequencyof t(12;21)in pediatric

up to 6 weeks.

B‑precursor ALL between Western countries and２．TEL‑AM L1 was detectable by nested RT‑PCR

Asian countries.

from all the 4 diﬀerent cell concentrations and 4

In conclusion :The use of FTA chemically treateddiﬀerent percentages of REH cells that were

paper may be an attractive alternative to the collec-

saved at either ‑30 ℃ or 4 ℃ for up to 6 weeks.

tion of blood in tubes for obtaining genetic informa-

３．TEL‑AM L1 and BCR‑ABL chimeric tran-tion of hematologic malignancies in low‑income

scripts were detectable bynested RT‑PCR from 4

and underdeveloped countries. In developed coun-

Japanese patients: 2 harbored t(12; 21) and 2

tries, it has been demonstrated that patients with

were positive for t(9 ;22)diagnosed by FISH andthis translocation have a superior clinical outcome.

G‑banding previously, respectively.

Thus, disclosure of Iraqi ALL children with TEL‑

４．GAPDH mRNA was successfully ampliﬁed

AML1 may provide important information to per-from all 264 samples. Four chromosomal fusion

suade the patients not to abandon treatment and totranscripts were detectable by RT‑PCR from theundergo chemotherapy with suﬃciently assorted

examined cohort of cases, with a frequency com-eﬀective medicines.

parable to others except for TEL‑AML1 which

FTA カードを用いてイラクの小児急性リンパ性白was lower than frequencies reported in Western

血病患者の初発時の遺伝子異常を国際協力により明ら

countries. TEL‑AML1 mRNA was found in 32

かにした本研究は，開発途上国における悪性腫瘍患者(12.1%)patients.FISH study in 4 cases conﬁrmedの診断と治療の向上に大きく役立つことから，主査，

our results.E2A‑PBX1 mRNA was detected in 11

副査は一致して本論文を学位論文として価値があるも(4.2%) patients. M LL‑AF4 mRNA was detectedのと認めた。

in 4 (1.5%) patients. BCR‑ABL mRNA (190 bp)

KGA‑2727, a novel selective inhibitor of a high‑aﬃnity sodium glucose cotransporter (SGLT1),
exhibits antidiabetic eﬃcacy in rodent models（高親和性ナトリウム・グルコース共輸送体（SGLT1）の選択的阻害薬である KGA‑2727は動物モデルにおいて抗糖尿病効果を示す）
柴崎（論文の内容の要旨）

利

英方，SGLT1は糖尿病モデルラット及び糖尿病患者に近年，糖尿病治療薬の新しいターゲットとしてナト

おいて小腸 SGLT1の発現量が亢進していることが報

リウム依存性グルコース共輸送体（以下，SGLT）阻

告されており，これが食後過血糖を助長する１つの要因

害薬の開発が進んでいる。SGLT には主に消化管にとも考えられている。したがって，SGLT1阻害は食後発現してグルコース吸収を担っている SGLT1と，腎過血糖の是正につながると考えられるが，SGLT1を選臓の尿細管に発現して尿からのグルコース再吸収を担っ択的に阻害する化合物は報告されていない。そこで，ている SGLT2が知られている。開発が進んでいる多我 々 は SGLT 1を 選 択 的 に 阻 害 す る 化 合 物 KGA ‑くの SGLT 阻害薬は過剰な糖を尿排泄することによ2727を創製し，動物実験モデルを用いて糖尿病治療薬

り高血糖を是正するメカニズムを有しており，その主としての効果を評価した。

なターゲットは尿細管に発現する SGLT2である。一306

まず，SGLT1または SGLT2を発現させた培養細信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨

胞を用いて糖取込み阻害実験を行った。その結果，（論文審査の結果の要旨）

KGA‑2727が SGLT1による糖取込みを強く阻害し，糖尿病治療において，合併症の進展を抑制するためその阻害は SGLT1に対して高い選択性を有していた。

には，血糖値の厳格なコントロールが必要であり，臨次に，ラット小腸 in situ ループ法を用いた糖吸収実

床研究の結果などから，食後高血糖の是正も重要であ験を行った結果，KGA‑2727はフルクトース吸収を阻ると考えられている。体内への糖質吸収には消化管に害せずにグルコース吸収のみを阻害した。消化管にお発現する SGLT1が重要な役割を担っており，糖尿病

けるフルクトース吸収は GLUT5が担っていることか

患者の小腸において SGLT1の発現量が増加している

ら，KGA‑2727が GLUT5を阻害せずに SGLT1の みとの報告も存在することから，消化管の SGLT1阻害を阻害した結果であると考えられた。消化管からの炭は，食後高血糖を抑制するのに有効なアプローチの一

水化物の吸収を抑制する薬として αグルコシダーゼ阻つであると考え，本研究が進められた。

害薬が知られているが，これは消化管での炭水化物の腎臓尿細管に発現する SGLT2を阻害して尿糖排泄分解を阻害することにより，その吸収を抑制・遅延さを促進することにより高血糖を是正する SGLT2阻害せる糖尿病治療薬である。そこで， αグルコシダーゼ薬が数多く開発されている一方，SGLT1を選択的に阻害薬の一つであるアカルボースと KGA‑2727の作阻害する化合物は知られておらず，本論文の KGA‑

用を比 する実験を行った。スターチ経口負荷後の消2727は SGLT1選択的阻害薬という点で，新規性のあ化管内に残存する炭水化物の量を評価した結果，アカる化合物である。この新規 SGLT1阻害薬 KGA‑2727

ルボース及び KGA‑2727処置群において消化管内にを用いて各種動物実験を行い，消化管の SGLT1阻害

残存する炭水化物量の増加が認められた。アカルボー

が消化管からの糖吸収を抑制した結果，糖尿病病態のス処置群において残存炭水化物のほとんどが多糖とし悪化が抑制されており，その糖尿病治療薬としての可て存在するのに対し，KGA‑2727処置群において，そ能性を本論文で示している。論文の概要は以下に示すのほとんどが単糖のグルコースとして存在していた。

通りである。

これらの違いは，アカルボースが多糖の分解を抑制し・ KGA‑2727は新規 SGLT1阻害薬である。

ているのに対し，KGA‑2727はグルコースの吸収を抑・ SGLT 発現培養細胞を用いた検討において，KGA制しているという作用メカニズムの違いによるものと‑2727は SGLT1に対して高い阻害活性及び高い選考えられた。

択性を示した。

次に，ストレプトゾトシン誘発糖尿病モデルラット

・消化管からの糖吸収実験において，KGA‑2727はフにおいて，グルコース経口負荷後の血糖値上昇に対す

ルクトース吸収を抑制せずに，グルコース吸収のみる効果を検討した。KGA‑2727は用量依存的にグルを抑制した。

コース経口負荷後の血糖値上昇を抑制しており，KGA‑・ KGA‑2727は消化管内にグルコースをとどめ，吸2727が食後高血糖を抑制すると考えられた。さらに，収抑制されたグルコースが消化管下部へ移行してい肥満２型糖尿病モデルラットである ZDF ラットを用た。

いて KGA‑2727長期投与の効果を検討した。48日間混餌による投与を行った結果，KGA‑2727は用量依存・ KGA‑2727は，グルコース負荷後の血糖値上昇を抑制した。

的に血糖値および糖化ヘモグロビン値の上昇を抑制し・ ZDF ラットを用いた長期投与試験においては，た。また KGA‑2727処置群において，膵臓インスリ

KGA‑2727が血糖値の上昇及び糖化ヘモグロビン値

ン分泌の保護，尿量及び尿糖増加の抑制作用が確認さの上昇を抑制しており，膵臓 β細胞の保護作用，尿れた。これらの結果から，KGA‑2727が糖尿病の悪化

糖排泄量及び尿量増加の抑制を示すなど，糖尿病病を抑制することが示された。さらに，処置後の門脈血態の進展を抑制した。

中 GLP‑1濃度の上昇が確認されており，KGA‑2727

・ KGA‑2727処置によって血中 GLP‑1濃度が上昇しの抗糖尿病作用の一部に GLP‑1が関与している可能ており，その抗糖尿病作用の一部に GLP‑1が関与性が示された。

している可能性が考えられた。

これらの結果か ら，SGLT1選 択 的 阻 害 薬 で あ る・上記の実験結果より，新規 SGLT1選択的阻害薬

KGA‑2727が糖尿病治療薬の候補となりうると考えら

KGA‑2727は糖尿病治療薬としての可能性を有してれた。

いると結論づけた。

No. 5, 2013307

審査学位論文要旨

主査，副査は一致して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

Not only body weight perception but also body mass index is relevant to suicidal ideation and self‑harming behavior in Japanese adolescents（日本の青少年では，体型への認知のみならず，BMI（body mass index）も希死念慮・自傷行為と関連する）
木

下

久

慈

（論文の内容の要旨）① BMI（Table２）；回 答 か ら 得 た 身 長 と 体 重 よ り【背景と目的】2010年の日本人口動態統計によると，

BM I を算出し，BMI パーセンタイルより５つに分類

自殺は15歳〜19歳の死因の第一位，10歳〜14歳の死因した。② BWP（Table３）； 現在の体重についてどの第３位である。青少年の自殺のリスクファクターとう感じていますか

して，うつ病などの精神障害・薬物乱用・友人関係な

死念慮；希死念慮に関しては， 現在，「生きていてもどが報告されている。さらに近年，low body mass

仕方がない」と考えていますか

index（BMI）が希死念慮と関連しているという研究に関しては， この１年以内に自分で自分を故意に傷結果が複数報告されている。例えば，Kaplan らによつけてしまったことはありましたかる 大 規 模 疫 学 研 究 で は，BMIが ５kg /m 減 少 す る④ 薬物使用の有無，性別，年齢。⑤ the 12‑item Gen-ごとに自殺のリスクは男性で18％，女性で24％上昇；健康な人にeral Health Questionnaire（GHQ‑12）

す る こ と が 分 か っ た。し か し，青 少 年 の BMIと 希

おける，精神症状をスクリーニングするための自記式

死念慮や自傷行為の関係では，体型への認知（body評価尺度であり，特に不安とうつ症状を評価するのにweight perception；BWP）が影響することが示唆さ優れている。

れている。例えば，Orbach らによって行われた研究と質問した。③ 自傷行為と希と問い，自傷行為と質問した。

解析は重回帰分析によって行われた。

では，自傷行為の既往がある青年はそうでない者に比【結果・考察】日本の青少年において，BM I が希死念

べて，自分の体に対してより否定的な態度を示すこと

慮や自傷行為と独立に関連するリスクファクターであが報告された。また Eaton らはアメリカの高校生にることが，本研究で示された。すなわち，性別・年

おける，BWP ・ BMI と希死念慮や自傷行為との関

齢・薬物の乱用・精神的苦痛・ BWP を交絡因子とし連について調べ，体型と希死念慮・自傷行為との関係てコントロールした後にも，low BM I と希死念慮やには BWP が影響していることを報告した。つまり現自傷行為との間には有意な関連が認められた。

在のところ，青少年において，痩せていること自体がアメリカで行 わ れ た 先 行 研 究 で は，BMIと 希 死

希死念慮や自傷行為と直接関連しているかどうかは，念慮・自傷行為との関係に BWPが影響を与えていいまだに結論が得られていない。そこで本研究では，ることが示唆された。しかし，本研究では，BMI と日本の青少年において，BWP などの交絡因子の影響

BWP の両者が，独立に希死念慮や自傷行為と関連しを取り除いた場合，BM I と希死念慮や自傷行為とのていることが明らかになった。BMI の分布の相違関連が見られるかどうかを調べることを目的とした。

（日本における low BMI の割合は15％以上だが，ア【方法】本研究は，日本の青少年における精神病様体

メリカにおいては10％以下）や文化の差異が影響し験と精神衛生の関係について調査した研究の一環として，このような違いが出現している可能性もあり，さて行われた。2008年から2009年の間，三重県津市の公らなる検討が必要と思われる。low BMI と希死念立中学校45校，高知県の高校28校の生徒18,104人に対慮・自傷行為との関連に関しては，血清コレステロー

して調査を行った。自記式の質問票を先生から生徒にルの低下（先行研究により自殺企図との相関が示唆さ配布し，無記名で回答を得た。その際，調査への参加

れている）や，低栄養状態（被刺激性を亢進させるこは任意であり，調査結果等のデータは，匿名化されたとが示唆されている）が媒介因子となっている可能性

まま保管され，個人情報は外部に漏れないよう厳重にもある。

管理されることを先生から生徒に伝えるようにした。

本研究のリミテーションとして以下の５つが挙げら

本研究では，質問票中の以下の５項目に関して解析れる。まず，本研究は横断研究であり，実際の因果関

した。
308

係を説明することは困難である。第２に本研究では，
信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨

希死念慮より自殺企図の方が自殺の重要な予測因子で調べた。その際，交絡因子として，BWP ・薬物の使あるにも関わらず，自殺企図に関しては評価していな用の有無・性別・年齢・ the 12‑item General Healthい。第３に，本研究は学校で行われた調査であるため，Questionnaire（GHQ‑12；健康な人における，精神欠席者からは回答が得られなかった。第４に本研究は，症状をスクリーニングするための自記式評価尺度であ

日本人の青少年における精神病様体験と精神衛生とのり，特に不安とうつ症状を評価するのに優れている）

関係について調べた調査の２次解析であるため，体重などの影響を除去した。

コントロールを行うための方法や友人関係などの重要な交絡因子についても調査することができていない。

その結果，木下は次の結論を得た。
１．low BM I は，自傷行為・希死念慮と有意に関連

第５に，体型の認知を評価するための質問の信頼性と妥当性は確立されていない。

している。
２．太りすぎているとの体型への認知は，自傷行為・（論文審査の結果の要旨）

希死念慮と有意に関連している。

体型への認知（body weight perception；BWP）

３．交絡因子の影響を除去しても，上記の関連は有意が青少年の自殺のリスクファクターの一つであるこであった。

とが，多くの研究で示されている。さらに近年，low

これらの結果より，日本の青少年において，BM I

body mass index（BM I）が自殺企図や自傷行為と関が希死念慮や自傷行為と独立に関連するリスクファク

連しているという研究結果が報告されている。しかしターであることが，示された。すなわち，性別・年

現在のところ，青少年において，痩せていること自体

齢・薬物の使用・精神的苦痛・ BWP を交絡因子としが希死念慮や自傷行為と直接関連しているかどうかは，てコントロールした後にも，low BM I と希死念慮やいまだにはっきりした結論が得られていない。そこで自傷行為との間には有意な関連が認められた。痩せて本研究では，日本の青少年において，BWP などの交いること自体が，自傷行為・希死念慮と関連している

絡因子の影響を取り除いた場合，BMI と希死念慮・と考えられ，BM I 18.5の青少年に対しては，保健

自傷行為との間に関連が認められるかどうかを調べた。

室での早期介入やスクールカウンセラー・精神科医の日本の公立中学・高校の生徒18,104人に対して調査介入などが必要であることを示唆している。よって，を行った。自記式の質問票を先生から生徒に配布し，主査，副査は一致して本論文を学位論文として価値が無記名で回 答 を 得 た。得 ら れ た 回 答 を 解 析 し て，あるものと認めた。

BM I ・ BWP と自傷行為・希死念慮の関係について

Novel Regulation of Cardiac Metabolism and Homeostasis bytheAdrenomedullin‑Receptor Activity‑
Modifying Protein 2 System（心臓におけるアドレノメデュリン‑RAMP2系による代謝及び恒常性維持の新規制御機構）
吉沢（論文の内容の要旨）

隆浩

AM 遺伝子ホモ接合体欠損マウス（AM）は，胎【背景と目的】アドレノメデュリン（AM ）は，全身

生中期に心血管系の発生異常により致死となるが，の様々な臓器で産生・分泌される生理活性ペプチドで

RAM P の各アイソフォームの遺伝子欠損マウスの中あり，血管拡張や降圧，臓器保護など多彩な生理活性で，AMを有することが知られている。また，高血圧や心不全と伝子ホモ接合体欠損マウス（RAMP2 ）のみであっ

いった病態では，血中 AM 濃度が上昇することから，た。このことから，AM ‑RAMP2系の心血管系にお循環器疾患における AM の重要性が示唆されている。

ける重要性が示唆された。AM 及び RAM P2は心臓

AM の受容体はＧタンパク共役型受容体である CLRにおいても高発現を認めるが，これらの遺伝子欠損マであるが，CLR に受容体調節タンパク RAMP2又はウスは胎生致死となるために，成体における AM ‑RAM P3が結合することで，受容体の機能及び特異性

RAM P2系の機能解析にはこれまで限界があった。そが規定される。我々はこれまでに，AM や RAMP のこで 我 々 は，成 体 の 心 臓 に お け る AM ‑RAMP2系

遺伝子改変マウスを樹立・解析し，報告してきた。

の病態生理学的意義を解 明 す る た め に，薬 剤 誘 導No. 5, 2013と同様に胎生致死となるのは，RAMP2遺309

審査学位論文要旨型 心 筋 細 胞 特 異 的 RAM P2遺 伝 子 欠 損 マ ウ ス（C‑臓における RAM P2遺伝子欠損が，心筋細胞のミトコ

RAM P2 ）を樹立し，解析を行った。

ンドリア機能の低下を誘発することが明らかになっ【材料及び方法】αMHC‑M erCreMer Tg マウスとた。このことから，AM ‑RAMP2系は酸化ストレス

RAM P2 ﬂox マウスを交配させ，C‑RAMP2 を樹抑制だけでなく ATP 産生や脂質代謝などのミトコン

立し，薬剤誘導型 Cre‑loxP システムを用い，心筋細ドリア機能の制御・維持を介して，心臓における恒常

胞特異的に RAM P2遺伝子を欠損誘導し，各種解析を性維持に重要な役割を果たすことが示された。

行った。

（論文審査の結果の要旨）【結果】C‑RAMP2 では，心機能低下や心室の拡大

アドレノメデュリン（AM ）は，血管拡張や抗酸化を認め，拡張型心筋症様所見の自然発症を認めた。ま

ストレス作用等の様々な生理活性を有する。AM 受

た C‑RAMP2 の心臓では，酸化ストレスの亢進を容体システムは，Ｇタンパク共役型受容体 CLR と受認めた。そこで，C‑RAM P2 に対して抗酸化剤で容体活性調節タンパク RAM P2又は RAMP3が結合すある TEMPOL の投与を行ったところ，酸化ストレることで，その機能と特異性が規定される。AM やスは軽減し，心臓リモデリングは抑制されるものの，

RAM P2のホモ接合体遺伝子欠損マウスでは，心血管心不全改善には至らなかった。このことから，酸化系の発生異常により胎生致死となることから AM ‑ストレスの他にも心不全発症に重要な因子の関与が示

RAM P2系の重要性が示唆されるが，成体における唆された。そこで，心不全発症の原因を探索するため解析には限界があった。そこで吉沢隆浩は，薬剤誘に，C‑RAMP2 の 心 臓 の メ タ ボ ロ ー ム 解 析 を 行

導型心筋細胞特異的 RAMP2遺伝子欠損マウス（C‑い，代謝物 の 包 括 的 解 析 を 行 っ た。そ の 結 果，C‑RAM P2 ）を新たに樹立し，解析を行った。

RAM P2 の心臓では，ミトコンドリア内膜特異的脂その結果，吉沢隆浩は次の結論を得た。

質であり，ミトコンドリア機能に重要であるカルジオ

１．C‑RAMP2 では，心室の拡大や心機能低下とリピンの含有量低下が特異的に認められた。さらに，

いった拡張型心筋症様症状の自然発症を認めた。

電子顕微鏡でもミトコンドリアの構造異常が認められ

２．心機能低下は RAM P2遺伝子欠損誘導後７日目かた。遺伝子発現を定量的 RT‑PCR 法で検討したとこ

ら28日目まで持続して観察された。

ろ，ミトコンドリア制御因子である PGC‑1をはじめ，

３．C‑RAM P2 の心室組織では酸化ストレス亢進

様々なミトコンドリア関連因子の遺伝子発現低下が認が認められ，抗酸化剤である TEMPOL による治められた。さらに，心不全発症までの遺伝子発現を経療効果を検討したが，酸化ストレスの軽減だけでは

時的に解析したところ，ミトコンドリア制御因子であ心不全の改善には至らなかった。

る PGC‑1αの遺伝子発現の変動が，その他の遺伝子

４．脂質メタボローム解析では，C‑RAMP2 の心の変動に先行して認められることから，ミトコンドリ室においてミトコンドリア特異的脂質であるカルジ

ア機能障害が，心不全のプライマリーな原因であるとオリピンの含有量低下が認められた。

考えられた。初代培養心筋細胞における検討では，C‑５．遺伝子発現の変動を経時的に検討したところ，心RAM P2 でミトコンドリア膜電位低下や，ミトコ

不全関連因子の変動に先行して，ミトコンドリア制

ンドリア由来活性酸素種産生亢進が確認された。C‑

御因子の変動が認められた。

RAM P2 では，PGC‑1の制御因子の１つであり，

６．C‑RAMP2 ではミトコンドリア構造の異常や，

Ｇタンパク共役型受容体による制御を受けることが知ミトコンドリア関連因子の遺伝子発現の低下が認められている CREB の活性化低下が認められた。そこられた。

で，アデニル酸シクラーゼの活性化を介して cAMP

７．C‑RAMP2 の初代培養心筋細胞では，ミトコ

産生を亢進させ，CREB を活性化することが知られンドリア膜電位低下や，ミトコンドリア由来活性酸ているフォルスコリンを C‑RAMP2 に投与したと素種の産生亢進が認められ，ミトコンドリア機能低ころ，ミトコンドリア関連因子の遺伝子発現の回復と下が示唆された。

心不全の改善が見られた。

８．C‑RAMP2 ではミトコンドリア制御因子PGC‑【結論】従来，AM は NADPH オキシダーゼからの1の上流因子である CREB の活性化の低下が認めら

活性酸素種産生を抑制することで臓器保護作用を発揮れた。

すると考えられていたが，今回の我々の研究から，心310

９．C‑RAM P2 の初代培養心筋細胞で CREB を活信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨

性化すると，ミトコンドリア膜電位の回復を認めた。

ミトコンドリア機能の制御・維持を介して，心臓にお10．C‑RAM P2 マウスにおいて CREB を活性化す

ける代謝や恒常性維持に重要な役割を果たす事を初めると，ミトコンドリア関連因子の遺伝子発現が回復て明らかとした。よって，主査，副査は一致して本論し，心不全の改善傾向が認められた。

文を学位論文として価値があるものと認めた。

以上の結果より，吉沢隆浩は，AM ‑RAM P2系がEstablishment of novel detection system for embryonic stem cell‑derived hepatocyte‑like cells basedon nongenetic manipulation with indocyanine green（インドシアニングリーンを用いた胚性幹細胞
由来肝細胞の新規検出システムの開発）
吉江進（論文の内容の要旨）発するレーザーとその蛍光を検出できるフィルターを【背景】現在，重症肝不全及び各種代謝性肝疾患の根搭載したフローサイトメーターを開発し，まずは，初治療法は肝臓移植であるが，我国においては慢性的な代肝細胞を用いて染色時における ICG の適切な染色ドナー不足を抱え苦慮しているため，臓器移植の代替濃度から検討した。その結果，高濃度で染色するととなる新しい治療方法の開発が急務とされている。まICG が大量に肝細胞に取り込まれ，細胞内で ICG がた，現在の創薬開発過程における動物実験の問題とし凝集することでその吸収スペクトルが変化し，僅かなて，ヒトの生体内反応を予測した，新規開発物質の薬細胞しか検出することができなかった。また，染色時

物動態評価・薬効薬理評価を充分におこなうことが間を長くすると肝細胞以外の細胞も非特異的な取り込できていない。これらの解決策の一つとして，ヒト

みや細胞膜表面に付着する等が原因で検出されてしま

ES/iPS 細胞を用いて肝細胞を誘導させそれらを用いうため，非肝細胞では検出せず，肝細胞においては検ることで，新規移植治療法の開発や，創薬開発過程に出できるような最適な染色条件を検討した。その結果，おける代替試験法が可能になると考えられる。しかし，染色濃度５μg/ml，染色時間30min において，初代

これまでに報告されている肝細胞分化誘導方法は肝細肝細胞では90％以上の ICG 陽性細胞を検出すること

胞以外の多種多様な細胞も誘導されてしまい，目的とが可能となり，この条件で非肝細胞では ICG 陽性とする肝細胞を効率よく分化誘導させるまでには至ってはならなかった。次に，マウス ES 細胞から肝細胞へいない。そのため，肝細胞をレポーター遺伝子で標識誘導させ（参考論文），検討した至適な染色条件下ですることや肝細胞膜表面に存在する複数の抗原を捉え解析を行った。培養の時間経過と共に肝細胞マーカー

ることで，セルソーターを用いて肝細胞を分離していである AFP や ALB の発現量が増加し，それに伴い，る。しかしながら，遺伝子操作は操作が煩雑であり且ICG 陽性細胞を検出することができた。さらには，つ細胞の安全性が懸念され，また，抗体は高価であり

ICG 陽性細胞が AFP ，ALB 陽性細胞と同程度の割

活性もロットにより異なるなど結果に安定性を欠く欠合であることが確認され，また，肝細胞の分化段階に点がある。さらには，肝細胞で発現している遺伝子は

よって ICG の取り込み能力が異なり，蛍光強度に差

他の組織の細胞でも発現しているため，肝細胞に特異が生じることも明らかになった。

性の高いマーカーが欠如しているのが現状である。

【結論】以上の結果から，ICG を用いて肝細胞を安全【研究内容，結果】そこで，本研究では安価で安全性

且つ簡便に検出し，分離できることが示唆された。さが高く，簡便な肝細胞特異的な細胞検出・分離システ

らに，肝細胞へ分化した細胞数の定量や，これまでにムを開発するために，肝機能検査の一つとして使用さ困難であった分化した肝細胞の成熟度を解析するためれていた ICG（インドシアニングリーン）に着目しの迅速で簡便な新規評価方法になることも明らかにた。コスト的にも安価な ICG は緑色を呈する無害ななった。

色素であり，特定波長で励起させると長波長付近に蛍（論文審査の結果の要旨）

光を発する特性を持っている。さらに，培養上清中に

ES 細胞をはじめとする多能性幹細胞から作製した

添加し，短時間の染色をするだけで肝細胞に選択的に肝細胞を，新規細胞移植治療方法の開発や創薬開発過取り込まれる。これらの性質を利用して，特定波長を程において利用するために，本研究では多能性幹細胞

No. 5, 2013311

審査学位論文要旨

から分化誘導させた肝細胞を検出・分離するためのシ② ICG の染色時間を30min〜24hr の範囲で検討し，ステムを開発した。本研究で注目した ICG は緑色を30min の染色時間が最適であることがわかった。

呈する無害な色素であり，特定波長で励起させると長③ ①，②で得られた染色条件をもとに，ES 細胞か波長付近に蛍光を発する特性を持っている。さらに，

ら分化誘導させた細胞を解析した結果，10％前後

培養上清中に添加し，短時間の染色をするだけで肝細の ICG 陽性細胞が検出され，これらは肝細胞マー胞に選択的に取り込まれる。これらの性質を利用して，カーである AFP ，ALB 陽性細胞の割合と同程度

特定波長を発するレーザーとその蛍光を検出できるフであることがわかった。また，①で得られた初代肝ィルターを搭載したフローサイトメーターを開発し，細胞と比 すると分化させた細胞では10倍程蛍光強以下の検討をおこなった。

度が低かった。

① ICG 陽性細胞を検出することを目的に初代肝細④ 高濃度での ICG 染色を行い，ICG を取り込んだ胞を用いて染色時における ICG の濃度を検討した。

細胞を可視化させた結果，ICG で陽性になった細② 非肝細胞系の細胞を用いて ICG の取り込みの特胞は数時間後に ICG を排泄し，さらには PAS 陽性

異性を解析すると共に，染色時間を検討した。

細胞であることを確認した。また，ICG‑positive③ ①，②で得られた結果をもとに ES 細胞から分化

cluster は肝細胞マーカーの AFP ，ALB などの発誘導させた肝細胞において染色を行い，同様な解析

現が確認されたが，成熟マーカーの発現はほとんどをおこなった。

確認されなかった。一方，ICG‑negative cluster に④ 本研究で開発したフローサイトメーターは細胞をおいては肝細胞マーカーの発現はほとんど認められ分採するためのソーティングモードがないため，なかった。

ES 細胞由来 ICG 陽細胞の性質を確認するために高⑤ ICG‑positive cell と ICG‑negative cell を目視で濃度での ICG 染色で細胞を可視化させ，その後，

pick up し，RNA 抽出後，リアルタイム PCR で解PAS 染色や RT‑PCR で解析した。

析を行った。その結果，ICG‑positive cell は ICG‑

⑤ ICG 陽性細胞の機能性を調べるために CYP の発

negative cell に比べて薬物代謝に関わる遺伝子群

現をリアルタイム PCR で検討した。

の発現が高く，それらの発現は胎児期（Ｅ13.5）の得られた結果は以下のとおりである。

肝臓と同程度の発現量を示した。

① ICGの染色濃度を検討した結果，高濃度（１mg/以上より，ICG を用いて多能性幹細胞由来の肝細ml）で染色をすると ICG が大量に取り込まれ，細胞を安全且つ簡便に検出し，分離できることが示唆さ

胞内で ICG が凝集することでその吸収スペクトルれた。さらに，肝細胞へ分化した細胞数の定量や，こが変化し，フローサイトメーターでは僅かな細胞しれまでに困難であった分化した肝細胞の成熟度を解析

か検出することができなかったが，５ug/ml で添するための迅速で簡便な新規評価方法になることも明加した際に90％以上の肝細胞を検出できることをらかになった。よって，主査，副査は一致して本論文確認した。

を学位論文として価値があるものと認めた。

Vascular endothelial adrenomedullin‑RAMP2 system is essential for vascular integrity and organ
homeostasis（血管内皮細胞における adrenomedullin‑RAMP2システムは血管統合性と組織恒常性維持に必須である）
小山（論文の内容の要旨）

晃

英に必須であることを報告してきた。

アドレノメデュリン（AM ）は，血管拡張作用をは

本研究では，血管の AM ‑RAMP2系の病態生理学

じめ，多様な作用を有する内因性生理活性ペプチドで的意義を解明するために，① 血管内皮細胞特異 的ある。我々は，AM ，およびその受容体活性調節タン

RAM P2コンディショナルノックアウトマウス（E‑パクの一つである RAM P2のノックアウトマウスが，

RAM P2 ）ライン，② 血管内皮細胞特異的 AM コ

共に，血管の構造異常により，浮腫や出血を来して胎ンディショナルノックアウトマウス（E‑AM

生致死となることから，AM ‑RAM P2系が血管新生

イン，③ 成体においてオンデマンドに血管特異的に

312

）ラ

信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨

RAM P2を欠損させる薬剤誘導性血管内皮細胞特異的臓器障害や動脈硬化に抵抗性を示すことが報告されてRAM P2コンディショナルノックアウトマウス（DI‑いる。さらに，高血圧，心不全，腎不全などで血中濃E‑RAM P2 ）ラインを樹立し，解析を行った。

度が上昇することから，各疾患への関与も示唆されてE‑RAMP2 のほとんどは出生前後に致死であり，きた。しかし，生理活性分子そのものは血中半減期が血管内皮細胞の構造異常と全身性の浮腫を認めた。一

短いため，慢性疾患の治療薬として応用するには制約

方で，血管の RAMP2発現が２割程度残存する一部がある。これに対し，受容体側の調節因子である膜タの E‑RAMP2 では，成体が得られた。成体の E‑

ンパク RAM P を標的とすれば半減期の問題はなく，RAM P2 では，血管壁の形態異常に加え，主要臓器慢性疾患への応用に道が拓ける。

の血管周囲の著明な炎症細胞浸潤を認めた。さらに加以前に，小山らのグループは，AM ，およびその受齢に伴い，酸化ストレスの亢進と臓器内線維化の進展

容体活性調節タンパクの一つである RAMP2のノッを認め，肝硬変様の所見や，水腎症，糸球体硬化症なクアウトマウスが，共に，血管の構造異常により，浮どの自然発症を認めた。一方，E‑AM

腫や出血を来して胎生致死となることから，AM ‑は成体が得られた。E‑RAMP2 同様，成体の E‑AMは，血RAM P2系が血管新生に必須であることを報告してき

管周囲の炎症細胞浸潤や糸球体硬化症の自然発症を認た。本研究では，血管の AM ‑RAMP2システムの病めた。

態生理学的意義を検討した。

E‑RAMP2 では得られる成体数が限られるため，以下の三種類のノックアウトマウスを樹立し，解析

次に成体になってから RAM P2欠損を可能とする DI‑を行った。

E‑RAM P2 を用いた解析を行った。RAMP2欠損誘① 血管内皮細胞特異的 RAMP2コンディショナル

導後早期から，血管透過性亢進に伴う全身性浮腫の発症が認められた。このときの血管内皮細胞は，細胞骨格を担うアクチンが重合不全を起こしており，cor-

ノックアウトマウスライン② 血管内皮細胞特異的 AM コンディショナルノッ
クアウトマウスライン

tical actin ring の形態異常が認められた。アクチン重③ 成体においてオンデマンドに血管特異的に合を制御する Rho ファミリーの活性を検討したとこ

RAMP2を欠損させる薬剤誘導性血管内皮細胞特異ろ，DI‑E‑RAMP2 の血管内皮細胞では，Rac1の的 RAMP2コンディショナルノックアウトマウス

活性が低下しており，RhoA の活性が亢進していた。

（DI‑E‑RAMP2 ）ライン

一方，血管内皮細胞に AM を添加すると，cortical

その結果，小山晃英は次の結果を得た。

actin ring は増強し，その作用は Rac1阻害剤により抑制された。

１．AM の発生における血管新生作用は，血管内皮細胞の RAMP2によって規定されていた。

DI‑E‑RAM P2 では，虚血時の血管新生や，血管２．AM ‑RAMP2システムは，Rac1，RhoA の活性傷害に対する応答性の異常が確認された。そこで，下調節により，血管内皮細胞のアクチン重合を制御し肢虚血処置を行った DI‑E‑RAMP2 の大腿部にマていた。

ウス RAMP2を遺伝子導入し，RAMP2による治療実

３．RAMP2欠損によるアクチン重合の不全は，血管験を行った。RAM P2を導入した DI‑E‑RAM P2 で透過性を亢進し，血管炎症の自然発症を引き起こしは，虚血時の血管新生が促進されており，間質の浮腫た。

が軽減されていた。
以上から，AM ‑RAM P2系が，発生における血管新生だけでなく，成体の血管恒常性維持にも必須であることが初めて示された。RAM P2は慢性炎症や臓器保護に対する新たな治療標的分子として期待される。
（論文審査の結果の要旨）

４．RAMP2の慢性欠損により，血管内皮細胞の恒常性が破綻し，血管の老化が亢進し，最終的に全身の臓器不全が引き起こされた。
５．RAMP2遺伝子導入により，下肢虚血時の DI‑E‑
RAMP2 の血管新生が促進された。
これらの結果より，AM ‑RAM P2システムが，発生

生体内生理活性分子は，多彩な生理活性を有し，生における血管新生だけでなく，成体の血管恒常性維持

体内恒常性維持において重要な役割を有する。生理活にも必須であることが示された。RAMP2は慢性炎症性分子の一つであるアドレノメデュリン（AM ）は，や臓器保護に対する新たな治療標的分子となる可能性

血管新生作用，抗炎症作用，抗酸化作用などを有し，がある。

No. 5, 2013313

審査学位論文要旨

以上の結果に対して，主査，副査は一致して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

A newexperimental model ofATP‑sensitive K channel independent insulinotropicaction ofglucose:a permissive role of cAMP for triggering of insulin release from rat pancreaticβ‑cells（グルコースによる ATP 感受性カリウムチャネル非依存性インスリン分泌刺激作用の新規実験モデル：ラット膵 β細胞からのインスリン分泌惹起における cAMP の寛容的役割）
武

井

真

大

（論文の内容の要旨）を開放させ，ニフェジピン（10μM ）により LVDCC【背景】内分泌細胞や神経内分泌細胞における細胞内を抑制した。また，フォルスコリン（10μM ）を使用

遊離カルシウム濃度（［Ca ］）上昇は，ホルモンまして細胞内 cAMP を上昇させた。インスリンはラジ

たは神経伝達物質のエクソサイトーシスにおいて重要

オイムノアッセイで測定した。
［Ca ］測定では，膵な役割を担っている（興奮分泌連関）。膵 β細胞からβ細胞を Fura‑2AM 蛍光プローブで１時間インキュのインスリン分泌においても［Ca ］上昇が重要であ

ベートし，340nm/380nm 励起蛍光強度比を測定しると考えられている。生理的に重要なインスリン分泌た。

刺激物質であるグルコースは膵 β細胞内で代謝を受け，【結 果】い ず れ の 実 験 で も2.8mM グ ル コ ー ス 刺 激

細胞内 ATP/ADP 比を上昇し，ATP 感受性カリウ（低グルコース刺激）によるインスリン分泌量を基準

ムチャネル（Kとし比チャネル）を閉鎖し，膵 β細胞膜した。22mM グルコース刺激（高グルコーを脱分極させる。脱分極により電位依存性Ｌ型カルシス刺激）により，30分間で10倍のインスリン分泌増加

ウムチャネル（LVDCC）が活性化し，細胞外のカルを認めた。フォルスコリン存在下での22mM グルコー

シウムイオンが細胞内へ流入し［Ca ］が上昇する。

ス刺激インスリン分泌量は22mM グルコース 単 独［Ca ］が上昇することにより，最終的にインスリン

刺激の２倍であった。ジアゾキシド，ニフェジピン存分泌顆粒が細胞膜へ癒合し，インスリンの開口放出に在下では，22mM グルコースによるインスリン分泌至る。この経路は一般に K

チャネル依存性 経 路増加を認めなかったが，フォルスコリン存在下では約（惹起経路）と呼ばれている。グルコースはこの惹起５倍に増加した。しかし，バッファー液中のカルシウ

経路をさらに増強させるシグナル経路も有している。

ム濃度を低下させると，フォルスコリン存在下でも細この経路はジアゾキシドにより K

胞外カルシウム濃度依存性にインスリン分泌は低下しチャネルを開放した状態でもインスリンを分泌することから，Kた。灌流実験でインスリン分泌のタイムコースを検討

チャネル非依存性経路（増幅経路）と呼ばれている。

するとジアゾキシド，ニフェジピン，フォルスコリン

また，インクレチンによるインスリン分泌作用のセカ存在下での22mM グルコース刺激インスリン分泌は，

ンドメッセンジャーである cAM P がこのグルコース

２分後に上昇開始し，６分後にピークを認めた。そのによる増幅経路をさらに増強することでグルコース濃後は緩徐に上昇した。同様の条件下での［Ca ］は３度依存性にインスリン分泌を増加させることを我々の分以内に低下し，その後は緩徐に上昇した。ジアゾキ

教室がすでに報告している。本研究では，強制的にシド，ニフェジピン，フォルスコリン存在下で，アミチャネルを開放し，かつ，Ｌ型カルシウムチャ

ノ酸代謝中間体である αKIC はグルコース刺激時のネルを抑制した条件下において，cAM P の細胞内濃７割程度のインスリン分泌増加を再現した。一方，ミ度を上昇させた場合，グルコースによるインスリン分

トコンドリア呼吸鎖を阻害するアジ化ナトリウムはこK

泌が惹起されるか否かを検討した。

の条件下のインスリン分泌を抑制した。タンパク質ア【方法】オスのウイスターラットから膵を摘出し，コシル化阻害剤であるセルレニンは濃度依存性にこの条

ラゲナーゼ法により光学顕微鏡下で膵島を単離した。

件下のインスリン分泌を抑制した。

単離膵島を用いてインスリン分泌実験（培養実験，灌【結論】K流 実 験）を 行 っ た。KRBH バ ッ フ ァ ー で 30分 間 プ

せた条件下でも，cAMP 存在下では膵 β細胞からのレインキュベーション後，インスリン分泌実験を施行

グルコースによる急峻なインスリン分泌を認めたことした。ジアゾキシド（250μM ）により K

から，K

314

チャネル

チャネルを開放させ，LVDCC を閉鎖さ

チャネル／LVDCC を介した［Ca ］上昇
信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨には依存しないインスリン分泌惹起経路の存在を示す

コース単独刺激の２倍であった。ジアゾキシド，ニ

新たな実験モデルを提唱した。また，同様のインスリ

フェジピン存在下では，高グルコースによるインス

ン分泌を αKIC で再現できたことやアジ化ナトリウ

リン分泌増加を認めなかったが，フォルスコリン存

ム，セルレニンがインスリン分泌を抑制したことから，

在下では約５倍に増加した。

ここで示したグルコースによるインスリン分泌機構に

２．バッファー液中のカルシウム濃度を低下させると，はミトコンドリア代謝やタンパク質のアシル化が関与

フォルスコリン存在下でも細胞外カルシウム濃度依している可能性が示唆された。

存性にインスリン分泌は低下した。

（論文審査の結果の要旨）

３．インスリン分泌のタイムコースを検討すると，高内分泌細胞や神経内分泌細胞における細胞内遊離カ

グルコース刺激にインスリン分泌は，２分後に上昇

ルシウム濃度（［Ca ］）上昇は，ホルモンまたは神開始し，６分後にピークを認めた。その後は緩徐に経伝達物質のエクソサイトーシスにおいて重要な役割上昇した。

を担っている。グルコースは，膵 β細胞内で代謝を受け，ATP 感受性カリウムチャネル（Kチャネル）

４．この実験条件下での膵 β細胞の［Ca ］は，３分以内に低下し，その後は緩徐に上昇した。

を閉鎖し細胞膜を脱分極させ，電位依存性Ｌ型カルシ

５．αKIC は，この実験条件下でのグルコース刺激時

ウムチャネル（LVDCC）を介した［Ca ］上昇によの７割程度のインスリン分泌増加を再現した。

り，インスリンの開口放出に至る。この経路は一般に６．アジ化ナトリウムは，この実験条件下でのインス

K

チャネル依存性経路（惹起経路）と呼ばれている。グルコースはこの惹起経路をさらに増強させるシグナル経路，K

チャネル非依存性経路（増幅経路）も有している。
本研究では，強制的に K

リン分泌を抑した。
７．セルレニンは，薬剤濃度依存性にこの条件下でのインスリン分泌を抑制した。
以上の結果より，cAMP 存在下で K

チャネル／

チャネルを開放し，かLVDCC を介した［Ca ］上昇に依存しないインスリ

つ，Ｌ型カルシウムチャネルを抑制した条件下においン分泌惹起経路の存在を示唆する新しい実験モデルをて，cAM Pの細胞内濃度を上昇させた場合，グルコー提唱した。また，ここで示したグルコースによるインスによるインスリン分泌が惹起されるか否かを，インスリン分泌機構にはミトコンドリア代謝やタンパク質

スリン分泌実験（培養実験，灌流実験）を行い検討しのアシル化が関与している可能性が示唆された。本論た。また，単離膵 β細胞を Fura‑2AM 蛍光プローブ

文で提唱された実験モデルは今後の「インスリン分泌でインキュベートし，［Ca ］を測定した。

機構の解明」にむかった新たな研究に充分に寄与する

その結果，武井らは次の結論を得た。

と考えられる。

１．高グルコース刺激により，30分間で10倍のインス
リン分泌増加を認めた。フォルスコリン存在下でのよって，主査，副査は一致して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

高グルコース刺激によるインスリン分泌量は高グルThe method of mouse embryoid body establishment aﬀects structure and developmental gene expression（マウス胚様体形成の方法はその構造と発生上の遺伝子発現に影響する）
茂

木

亜希海

（論文の内容の要旨）

造学的視点から検討した。同時に EB の作製方法とし【目 的】EB（embryoid body：胚 様 体）形 成 は，ESて，ハンギングドロップ法と静置浮遊培養法とを比細胞の分化を行うために重要なステップである。また検討した。ハンギングドロップ法はマウス胚様体形成

EB は外胚葉，中胚葉，内胚葉の三葉構造からなるこで確立された一般的な方法であるが，操作が煩雑でそとから，形態学的にはマウス発生過程の初期段階を再の作製過程には技術を要する。一方静置浮遊培養法は現しているとみなされている。しかし EB 形成過程に操作が単純であり，また高度な技術を有しなくてもおける微細構造の詳細はわかっていない。本研究ではEB 作製ができる新しい方法として本研究で開発を目

EB 形成のプロセスを，遺伝子発現解析に加え微細構指したものである。ここではハンギングドロップ法とNo. 5, 2013315

審査学位論文要旨

静置浮遊培養法で作製されたそれぞれの EB について，胚葉，筋肉や軟骨に分化する中胚葉，消化管などに分分化傾向とその微細構造の特徴を明らかにし，同時に化する内胚葉の三胚葉いずれにも分化できる多能性を

静置浮遊培養法を新しい EB 形成方法として確立する持つことが挙げられる。

ことを目的とした。

ES 細胞の分化を行うために重要なステップが EB【方法】ハンギングドロップ法は，マウス ES 細胞コ（embryoid body：胚様体）形成である。胚様体は外ロニーを酵素処理によって単細胞に分散し，その細胞

胚葉，中胚葉，内胚葉の三葉構造からなることから，

懸濁液（1000cells/50μl drop）を培養ディッシュ蓋

形態学的にはマウス発生過程の初期段階に類似してい部の内側に等間隔で撒く。蓋を裏返しにして水滴をつると考えられている。しかし EB 形成過程における形

りさげ，重力により細胞が水滴の底部に沈むことを利態学的変化，特に微細構造の詳細はわかっていない。

用して細胞を凝集させ，胚様体を形成する。一方，静そこで本研究では，EB 形成のプロセスを RT ‑PCR

置浮遊培養法は，ES 細胞コロニーをスクレーパーでによる遺伝子発現解析に加え，電子顕微鏡による微細物理的に剥離した後，細胞非接着性ディッシュにその構造学的視点から検討した。また EB を作製するためまま浮遊させて胚様体を形成させる。これらの方法でに，ハンギングドロップ法と静置浮遊培養法の二種類

それぞれ１週間，EB 形成を行った。EB 形成開始後，で実施し比 検討した。ハンギングドロップ法はマウ

７日間毎日サンプルを回収し，遺伝子発現を RT ‑ス胚様体形成で確立された一般的な方法であるが，操PCR で，超微細構造については電子顕微鏡で解析し作が煩雑でその作製過程には技術を要し，ヒト ES 細た。

胞に応用することが出来ない。一方静置浮遊培養法は【結果及び考察】RT ‑PCRによる解析では，どちら操作が単純であり，また高度な技術を有しなくてもの EB も早期に三胚葉マーカーを発現したが，Bra-

EB 作製ができ，ヒト ES 細胞でも応用出来る新しいchyury遺伝子（中胚葉指標）のみ，ハンギングドロッ

方法として本研究で開発を目指したものである。ここ

プ法で作製した EB において５日目で見られた。形態

ではハンギングドロップ法と静置浮遊培養法で作製さ学的解析では，EB 形成がすすむにつれて，細胞骨れたそれぞれの EB について，分化傾向とその微細構

格，接着構造の変化および微絨毛の発達，細胞間開離造の特徴を明らかにすると同時に静置浮遊培養法を新などの大きな変化が見られた。特にハンギングドロップ

しい EB 形成方法として確立することを目的とし評価法で作成した EBでは，微細構造の変化と Brachyuryを行った。

の発現時期とが深く関係していることが認められた。
しかし静置浮遊培養法による EB 形成過程でも，ハンギングドロップ法と比その結果，以下の結論を得た。
１．RT‑PCR による遺伝子発現解析：ハンギングド

し多少発現が遅い傾向にはロップ法 EB，静置浮遊培養法 EB ともに早期に三あったが，微細形態学的には類似の構造を見いだすこ胚 葉 マ ー カ ー を 発 現 し た が，Brachyury遺 伝 子とができた。以上の結果から，静置培養法で作成した（中胚葉指標）のみ，ハンギングドロップ法で作製

EB は従来のハンギングドロップ法で作成した EB とした EB において５日目で見られた。

比 し，変化はやや遅いものの，同様の分化傾向を示

２．形態学的解析：EB 形成がすすむにつれて，細胞すことがわかった。静置培養法でみられる分化傾向の骨格，接着構造の変化および微絨毛の発達，細胞間遅れは，この方法を応用する際，留意する必要はある。

開離などの大きな変化が見られた。特にハンギング

しかし分化傾向が緩徐にすすむことは，分化過程の途

ドロップ法で作成した EB では，微細構造の変化と中経過を詳細に観察・解析できる利点もあり，静置培Brachyuryの発現時期とが深く関係していることが養法はハンギングドロップ法と同様，EB 形成の一つ認められた。しかし静置浮遊培養法による EB 形成の手段として，また初期胚発生過程の解明ツールとし過程でも，ハンギングドロップ法と比 し微細構造て，有用であると考えられる。

の変化は多少発現が遅い傾向にはあったが，類似の（論文審査の結果の要旨）
ES 細胞とは，マウスの場合受精後3.5日目の胚盤構造を見いだすことができた。
本研究の結果より，静置浮遊培養法で作成した EB

胞から内部細胞塊を取り出して樹立されたものである。

は従来のハンギングドロップ法で作成した EB と比その特徴として① ほとんど無限に増殖するという高し，変化はやや遅いものの，同様の分化傾向を示すこい増殖能力を持つこと，② 神経や上皮に分化する外とがわかった。静置浮遊培養法でみられる分化傾向の316

信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨

遅れは，ES 細胞から EB を作成する過程での細胞剥置培養法はハンギングドロップ法と同様，EB 形成の離法の違いによるものであると推測される。従ってこ

一つの手段として，また初期胚発生過程の解明ツールの方法を応用する際には，その点を留意する必要はあとして，有用であると考えられる。よって主査，副査る。しかし分化傾向が緩徐にすすむことは，分化過程は一致して本論文を学位論文として価値があるものとの途中経過を詳細に観察・解析できる利点もあり，静認めた。

Adrenomedullin‑RAMP2 system is crucially involved in retinal angiogenesis（アドレノメデュリン‑
RAMP2系の網膜血管新生における重要性）
家

里

康

弘

（論文の内容の要旨）

17において，定量的 RT‑PCR にて VEGF，eNOS の【背景と目的】アドレノメデュリン（AM ）は，血管遺伝子発現低下を，Western blotting で VEGF 発現

拡張作用をはじめ，多様な生理作用を有する内因性生の低下，p‑eNOS/eNOS 比の低下を認めた。一方，

理活性ペプチドであり，その受容体活性調節蛋白の１

RAM P2 でも無血管野と低酸素領域の減少を認めた。

つである RAMP2と共に，AM ‑RAM P2系が血管新血管内皮細胞における解析では，脈絡膜血管内皮様生に必須であることが知られている。一方，眼内にお細胞ラインである RF/6A135細胞において，AM 添

いても AM の発現が認められるが，その病態生理学

加は濃度依存的に遊走・増殖を増強することが確認さ的意義の詳細は不明である。AM の発現は低酸素にれた。RAMP2を過剰発現させた血管内皮細胞では，おいて誘導されることから，低酸素により眼内の血管

AM 添加時にコントロールの血管内皮細胞に比新生をきたす未熟児網膜症や糖尿病網膜症などの疾患て細胞遊走・増殖が増加していた。またヒト網膜血管において，AM ‑RAM P2系が重要な役割を果たして

内皮細胞においても AM によって内皮細胞の遊走・いることが予想される。

増殖の増強が確認された。

【材料及び方法】① AM ，RAM P2ヘテロノックアウ
トマウス

しDI‑E‑RAMP2 では，Ｐ6で網膜血管伸長の低下を用いた酸素誘導網膜症（OIR）モデルと伸長血管先端部の過剰な血管網といった網膜血管発における real time PCR，Western blotting，網膜標達の異常パターンを認めた。一方，Ｐ10とＰ11では網本の Isolectin 染色，Hypoxyprobe 染色，HE 染色に膜中間部の血管網分岐の減少と血管内皮細胞増殖の低よる解析，② 網（脈絡）膜血管内皮細胞（RF/6A135，下を認めた。

HRMEC）や RAMP2を過剰発現させた血管内皮細最後に AM をターゲットにした治療応用を検討す

胞（EAhy926）を用いた，AM ‑RAM P2系の Scratch

るため，OIR モデルに対して抗 AM 抗体の眼内投与

assayによる血管内皮細胞遊走・増殖作用の解析，③を行ったところ，網膜の病的新生血管が抑制された。

薬剤誘導性血管内皮細胞特異的 RAMP2コンディショ【結論】AM ‑RAMP2系が，網膜の低酸素による病的ナルノックアウトマウス（DI‑E‑RAM P2 ）ライン

血管新生や，発達段階における生理的血管新生においを用いた網膜血管の発達段階における網膜標本のて重要な役割を果たしていることが初めて示された。

Isolectin 染色，Ki‑67染色，TUNEL 染色による生理AM は低酸素による眼内の病的血管新生に対する新的網膜血管新生の解析，④ 抗 AM 抗体の眼内投与

たな治療標的分子として期待される。

（OIR モデル）を行った網膜標本の Isolectin 染色による解析を行った。

（論文審査の結果の要旨）
アドレノメデュリン（AM ）は，多様な生理作用【結 果】OIR モ デ ル に お い て，
（ 相 対 的）低 酸 素 環を有する内因性生理活性ペプチドであり，その受容境（生後（Ｐ）13‑17日）で AM の遺伝子発現の亢進体活性調節蛋白の１つである RAMP2と共に，AM ‑が確認された。高酸素環境から大気下環境に戻され

RAM P2系が血管新生に必須であることが知られていた直後（Ｐ12）には，野生型マウス（WT），AM，る。一方で眼内における AM ‑RAMP2系の病態生理

RAM P2 で網膜血管網密度に違いは見られなかった学的意義は不明である。そこで家里康弘は，AM ，が，Ｐ17において AM

RAM P2ヘテロノックアウトマウス

で網膜の病的新生血管，無血管野，低酸素領域のいずれも減少していた。またＰ
No. 5, 2013

を用いて酸素誘導網膜症（OIR）モデルにおける解析，各種血管内317

審査学位論文要旨

皮細胞を用いて AM 添加による遊走・増殖作用の解細胞では濃度依存的に，ヒト網膜血管内皮細胞で析，薬剤誘導性血管内皮細胞特異的 RAMP2コンディ

も AM 添加で遊走・増殖の 増 強 が 確 認 さ れ た。

ショナルノックアウトマウス（DI‑E‑RAMP2 ）を

RAMP2を過剰発現させた血管内皮細胞では，AM用いた発達段階における 網 膜 血 管 新 生 の 解 析，抗添加下で RAM P2過剰発現細胞は遊走・増殖が亢進AM 抗 体 の 眼 内 投 与 を 行 っ た OIR モ デ ル の 解 析 を

していた。

行った。

６．DI‑E‑RAMP2 では，発達初期で網膜血管伸長

その結果，家里康弘は次の結論を得た。

の低下と伸長先端部の過剰な血管網といった網膜血

１．OIR モデルにおいて，低酸素状態で AM の遺伝

管発達の異常を認めた。一方，発達中期では網膜中子発現の亢進が確認された。

間部の血管網分岐の減少と血管内皮細胞増殖の低下

２．高酸素下から，大気環境下に戻された直後では，野生型マウス（WT），AM，RAM P2 で網膜血管に違いはなかったが，Ｐ17では AMを認めた。
７．WT マウスの OIR モデルに抗 AM 抗体の眼内投で病的与を行ったところ，病的新生血管が減少し，無血管

新生血管，無血管野，低酸素領域のいずれも減少し野には影響しなかった。

ていた。

以上の結果から，家里康弘は，AM ‑RAMP2系が，３．Ｐ17で，AMでは定量的 RT‑PCR にて VEGF，

網膜の低酸素による病的血管新生や，発達段階におけ

eNOS の遺伝子 発 現 の 低 下 を，Western blotting

る生理的血管新生において重要な役割を果たしているで VEGF 蛋白発現の低下，p‑eNOS/eNOS 比の低こと，AM が，網膜の病的血管新生に対する新たな下を認めた。

治療標的となる可能性を初めて示した。よって，主査，

４．RAM P2 でも無血管野と低酸素領域の減少を認めた。

副査は一致して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

５．網脈絡膜血管内皮様細胞ラインである RF/6A135

Clinical Outcomes in Elderly Patients Administered Geﬁtinib as First‑line Treatment in Epidermal
Growth Factor Receptor‑mutated Non‑small Cell Lung Cancer:Retrospective Analysis in a Nagano
Lung Cancer Research Group Study（高齢者 EGFR 遺伝子変異陽性非小細胞肺癌における一次治療としての Geﬁ
tinib 治療の臨床的解析：長野県肺癌研究グループにおける後方視的解析）
立

石

一

成

（論文の内容の要旨）したが，75歳以上の高齢者での geﬁtinib 治療の臨床【背景と目的】肺癌患者の高齢化が進み，肺癌患者の的有用性の報告は未だ少ない。そのため本試験では長内で75歳以上の患者が約半数を占める。高齢者に対す

野県内の関連施設の協力を得て，geﬁtinib 高感受性のる殺細胞性の化学療法は若年者と比べ毒性が強く認

EGFR 遺伝子変異をもつ高齢者進行非小細胞肺癌患

められ，高齢者手術不能進行非小細胞肺癌に対する者の臨床的有用性を後方視的に解析した。

化学療法の適応には慎重を要する。一方，epidermal【対象及び方法】長野県内関連施設における EGFR 遺

growth factor receptor（以 下 EGFR）tyrosine

伝子変異陽性の75歳以上未治療非小細胞肺癌患者で一kinase inhibitor（以下 TKI）の一つである geﬁtinib

次治療として geﬁtinib 投与が行われた患者を対象とは非小細胞肺癌に対する分子標的治療薬で，腫瘍細胞した。気管支鏡検査等の検体採取時に PNA‑LNAの EGFR 遺伝子変異の存在が高い奏効率に関与してPCR clamp 法を用いて EGFR 遺伝子変異を検索し，いる。75歳以下 EGFR 遺伝子変異陽性患者を対象と感受性遺伝子変異はexon 19delation mutationもしくした比試験で，一次治療における geﬁtinib 治療は，はL858Rとした。Performancestatus（PS）はEasterm

殺細胞性化学療法より有意に高い奏効率および奏功期

Cooperative Oncology Group（ECOG）分類を用い間を示した。我々は，17例の75歳以上高齢者手術不能

た。Geﬁtinib は一日一回250mg を投与した。治療効

進行非小細胞肺癌で EGFR 遺伝子変異陽性患者を対果は RECIST version 1.0を用いて評価し，奏効率，象に前向き研究を行い，高い奏効率を示すことを報告

病勢コントロール率，無増悪生存期間，全生存期間

318

信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨を求めた。有害事象は the Common Terminology
Criteria for Adverse Events（CTCAE）Version 4.0を用いて評価した。

療に成り得る。
（論文審査の結果の要旨）
肺癌患者の高齢化が進み，肺癌患者の内で75歳以上【結果】2007年４月から2012年７月に治療を受けた55の患者が約半数を占める。高齢者への殺細胞性化学

人を解析した。男性16名，女性39名，年齢中央値は

療法は若年者と比べ毒性が強く，高齢者進行非小細81.1歳であった。PS 0‑1の患者が83.7％，全例が腺胞肺癌に対する化学療法の適応には慎重を要する。

癌であった。病期は， Ａ期３例， Ａ期２例， Ｂ

Geﬁtinib は非小細胞肺癌に対する分子標的治療薬で，期４例，期40例，術後再発６例だった。EGFR 遺腫瘍細胞の epidermal growth factor receptor（以下

伝子変異は exon 19 delation mutation 31例，L858

EGFR）遺伝子変異の存在が高い奏効率に関与していR 24例であった。奏効率は72.7％（95％信頼区間：る。75歳以下 EGFR 遺伝子変異陽性患者の比

59.5％‑82.9％），病勢コントロール率は92.7％（95で，一次治療における geﬁtinib 治療は殺細胞性化学％ 信 頼 区 間 ： 82.0％ ‑97.6％）で あ っ た。無 増 悪療法より高い奏効率・無増悪生存期間を示した。75歳

生 存 期 間 中 央 値 は13.8カ 月（95％ 信 頼 区 間：9.9‑

以上の高齢者での geﬁtinib 治療の臨床的有用性は報18.8カ月），全生存期間は29.1カ月（95％信頼区間：

告は少ない。本試験では長野県内の geﬁtinib 感受性22.4カ月‑），２年生存率は，59.5％（95％信頼区間：

EGFR 遺伝子変異をもつ高齢者進行非小細胞肺癌患

41.0％‑78.8％）であった。主な有害事象は皮疹41.8

者の臨床的有用性を後方視的に解析した。

試験％，AST ・ ALT 上昇20.0％であり，Grade3以上の長野県内施設における EGFR 遺伝子変異陽性75歳

毒性の際にはgeﬁtinibの隔日投与を行い，23.6％の患

以上非小細胞肺癌患者で一次治療として geﬁtinib 投者で隔日投与が行われた。肺障害を３例に認めたが，与が行われた患者を対象とした。検体採取時にPNA‑

geﬁtinib の中止あるいは副腎皮質ステロイドで改善し

LNA PCR clamp 法を用いて EGFR 遺伝子変異を検た。

索し，感受性遺伝子変異は exon 19 delation muta-【考察】本試験の解析から，EGFR 遺伝子変異を有す

tion と L858R と し た。Geﬁtinib は 一 日 一 回250mg

る高齢者非小細胞肺癌の患者に対して geﬁtinib 一次を投与した。治療効果は RECIST version 1.0にて評治療は高い奏効率と生存期間の延長を示すことが確

価し，奏効率，病勢コントロール率，無増悪生存期間，認された。今回の奏効率72.7％およ び 無 増 悪 生 存

全生存期間を求めた。有害事象は CTCAE Version

期間中央値13.8カ月，２年生存率59.5％の結果は，4.0で評価した。

EGFR 遺伝子変異陽性の75歳以下の肺癌患者を対象

その結果，立石は次の結論を得た。

に一次治療として geﬁtinib 治療が行われた試験の結１．2007年４月から2012年７月に治療を受けた55人を果と比 し，ほぼ同様ないしはやや優れた結果を示し解析した。男性16名，女性39名，年齢中央値は81.1ている。また高齢者に対する毒性の頻度および重症度

歳，PS 0‑1の患者が83.7％，全例が腺癌で，病期ともに75歳以下と同等だった。本解析の対象患者は，は Ａ期３例， Ａ期２例， Ｂ期４例， 期40例，高齢者特有の他疾患の合併症を有する患者や，PS2以術後再発６例であり，EGFR 遺伝子変異は exon 19

上患者も16.3％に認めていることから，一次治療とdelation mutation 31例，L858R 24例であった。

しての geﬁtinib 治療は良好な選択肢であると考えら

２．奏効率72.7％（95％CI：59.5％‑82.9％），病勢れた。実際 geﬁtinib 治療耐性後，24.1％の患者しかコントロール率92.7％（95％CI：82.0％‑97.6％）

殺細胞性化学療法を受けていないことからも，高感受であった。

性 EGFR 遺 伝 子 変 異 を 有 す る 高 齢 者 で は EGFR ‑３．無増悪生存期間中央値13.8カ月（95％ CI：9.9‑

TKI の一次治療が有用な治療法に成り得ると考えら

18.8カ 月），全 生 存 期 間29.1カ 月（95％ CI：22.4

れる。さらに日常診療上 EGFR 遺伝子変異を検索し，カ月‑），２年生存率59.5％（95％CI：41.0％‑78.8

陽性患者の抽出の重要性が再確認され，さらにその陽％）であった。

性者では EGFR‑TKI 治療を受ける機会を逸しないよ４．主な有害事象は皮疹41.8％，AST ・ ALT 上昇

う注意すべきである。

20.0％，肺障害を３例に認めたが，内服の中止，【結論】一次治療の geﬁtinib 治療は EGFR 遺伝子変

副腎皮質ステロイドで改善した。

異陽性の75歳以上進行非小細胞肺癌に対する有用な治これらの結果より，EGFR 遺伝子変異陽性の75歳

No. 5, 2013319

審査学位論文要旨

以下肺癌患者に一次治療として geﬁtinib 治療が行わことから，高感受性 EGFR 遺伝子変異を有する高齢れた試験と比 し同様ないしはやや優れた結果と考え者では EGFR‑TKI 治療を受ける機会を逸しないようた。高齢者に対する毒性の頻度・重症度ともに75歳以注意すべきであることが示された。よって，主査，副下と同等で，一次治療として geﬁtinib 治療は良好な査は一致して本論文を学位論文として価値があるもの

選択肢であることが示された。geﬁtinib 治療耐性後，と認めた。

24.1％の患者しか殺細胞性化学療法を受けていない

In vivo patch‑clamp recording from locus coeruleus neurones in the rat brainstem（ラット脳幹青斑
核神経細胞からの in vivo パッチクランプ記録）
杉

山

大

介

（論文の内容の要旨）

い二相性の反応を示した。電位固定した状態でピンチ【目的】青斑核は脳幹に位置する生体内で最大のノル刺激を加えても，興奮性シナプス後電流（EPSC）のアドレナリン（NA）作動性ニューロン群である。こ

増加は認められず，単相性の内向き電流が観察されれらの NA 作動性ニューロンは痛みや意識など多くた。パッチ電極内液をセシウム含有のものに変えて記の生体の恒常性に寄与している。青斑核細胞は青斑核録を行ったところ，EPSC と抑制性シナプス後電流自体や青斑核周囲の細胞からの興奮性と抑制性入力を（IPSC）をそれぞれ単離して記録することができた。

受けて活動性が調節されている。青斑核細胞の活動電【考察】in vivoラット脳幹の青斑核からホールセルパッ

位閾値下のシナプス入力については，スライスや培養

チクランプ記録に成功した。ピンチ刺激による活動電細胞を使用した従来の方法ではシナプスが切断されて位の二相性の反応には脱分極や過分極，また EPSC

おり，得られる知見については限界があった。これらの増加も伴わず，内向き電流が観察されたことは，Ｇを解決するためには in vivo 記録が必要である。これ

蛋白活性化経路などの間接的な経路が関与しているこまで in vivo パッチクランプ記録による解析は脊髄やとを示唆する。また侵害刺激で活動電位が増加したが，小脳，大脳皮質聴覚野などでは報告されていたが，脳青斑核細胞はギャップ結合により細胞同士が結合して幹 で の 手 法 は 確 立 さ れ て い な か っ た。そ こ で，inいるとされ，この結合を介したシナプス入力が関与しvivo 標本を用いて青斑核細胞からホールセルパッチている可能性が示唆された。

クランプ記録法を開発し確立することで，生体で青斑【結語】in vivo ラットの脳幹青斑核細胞からホールセ

核細胞の活動がどのようなシナプス入力を受けてコン

ルパッチクランプ記録に成功し，青斑核細胞の侵害刺トロールされているのかを調べることを目的として本激に対するシナプス入力の一部を明らかにした。この研究を実施した。

記録法を用いることにより生理条件下に近い状態で脳【方法】４週齢から６週齢の SD ラットをウレタンの幹の細胞膜の電気的性質やシナプス電流を調べること

腹腔内投与にて麻酔状態を得たのちに，気管切開・気ができ，薬理学的研究も行うことが可能になる。

管挿管を施行し人工呼吸にて呼吸管理を行った。ラッ（論文審査の結果の要旨）

トの頭部を定位固定装置で固定し，小脳直上にて開頭

青斑核は脳幹に位置するノルアドレナリン作動性をおこない，小脳は一部摘除し脳幹部を露出した。露ニューロン群で，痛みや意識の調節に関与している。

出した脳幹部は Krebs 液にて灌流し，顕微鏡下に脳青斑核細胞は青斑核自体や青斑核周囲の細胞から興奮

幹青斑核の部位を直視しながら，パッチクランプ電極性と抑制性入力を受けているが，その詳細は不明であを青斑核へと刺入し，ブラインドパッチクランプ法をる。スライス標本や培養細胞を使用した方法ではシナ用いて in vivo パッチクランプ記録を行った。

プスが切断されており，得られる知見については限界【結果】In vivo 標本を用いて63の青斑核細胞からホーがある。青斑核へのシナプス入力を明らかにするため

ルセルパッチクランプ記録を行った。青斑核細胞の静には，in vivo パッチクランプ記録を行う必要がある。

止膜電位は‑55.4±8.3mV であった。全ての細胞で

これまで in vivo パッチクランプ記録による解析は脊の自発性活動電位（6.0±2.7Hz）を認めた。電流固髄や小脳，大脳皮質聴覚野などでは報告されていたが，定した状態で侵害刺激により脱分極も過分極も伴わな脳の深部に位置する脳幹での手法は確立されていな

320

信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨

かった。そこで，in vivo 標本を用いて青斑核細胞かかな内向き電流が観察された。この結果から，侵害らホールセルパッチクランプ記録法を開発し確立する刺激に際して青斑核細胞ではＧタンパク質を介することで，生体で青斑核細胞の活動がどのようなシナプなどのシグナル伝達が存在する可能性が示唆された。

ス入力を受けてコントロールされているのかを調べることを目的として本研究を実施した。

４．電位固定下に自発性の EPSC と抑制性シナプス
後電流（IPSC）をそれぞれ単離して記録することその結果，杉山は以下の結論を得た。

ができた。自発性 EPSC は AMPA 受容体のア ン

１．青斑核細胞より in vivo パッチクランプ記録を行

タゴニストである CNQX の投与により抑制されたうために，⑴ 固定法や麻酔深度を調節することでことより AM PA を介したシナプス入力であること

記録部位の不動化を行った，⑵ 小脳を一部摘除すが示唆された。自発性 IPSC は GABA 受容体のアることで径の太いパッチクランプ電極が青斑核へとンタゴニストである Bicuculline の投与により抑制

直接アプローチできるようにした，⑶ 手術手技にされたことより，GABA を介したシナプス入力でよる出血を最小限にし，かつ補液を行うことで標本あることが示唆された。

が安定した状態で生命維持できるようにした。これ

今回の研究は，in vivo ラットの脳幹青斑核細胞からの結果，脳幹青斑核細胞からの in vivo ホールセ

らホールセルパッチクランプ記録の実験手法を確立しルパッチクランプ記録に成功し確立することができたものである。その手法を用い，青斑核細胞の侵害刺た。

激に対するシナプス入力の一部を明らかにした。この

２．In vivo 標本を用いて63の青斑核細胞からホール

記録法を用いることにより，これまでは不可能であっセルパッチクランプ記録を行った。青斑核細胞の静た生理条件下に近いシナプスが保たれた状態で，脳幹

止膜電位は‑55.4±8.3mV であった。全ての細胞の細胞膜の電気的性質やシナプス電流を調べることがでの自発性活動電位（6.0±2.7Hz）を認めた。

でき，薬理学的研究も行うことが可能になる。本法に

３．電流固定した状態で，侵害刺激により脱分極も過よって，意識のメカニズムや生体内の鎮痛機構のメカ

分極も伴わず活動電位の頻度のみが増加した後に抑ニズムの解明，将来的には新たな鎮静薬や鎮痛薬の開制されるという二相性の反応を示した。電位固定し発にもつながると考えられる。以上より，主査，副査た状態で侵害刺激を加えても，興奮性シナプス後電は一致して本論文を学位論文として価値があるものと流（EPSC）の増加は認められず，単相性のゆるや認めた。

Sphingosine 1‑phosphate（S1P）induces S1P2 receptor‑dependent tonic contraction in murine iliac
lymph vessels（S1P によるマウス腸管リンパ管における S1P2受容体を介した収縮反応の機能
特性）
君

塚

康一郎

（論文の内容の要旨）されてきていない。そこで今回我々は，マウスより摘【目的】S1P はＧ結合型タンパク質である S1P1〜５出した腸骨集合リンパ管に対して S1P がどのような受容体を介して血管やリンパ管に作用しさまざまな反反応を引き起こすかを詳細に解析し，リンパ管の自発応を引き起こすリン脂質のケミカルメディエーターで性収縮への影響やリンパ管平滑筋の収縮反応におけるあることが知られている。その作用は主に抵抗血管のCa の由来とその受容体解析を免疫組織化学の手法

血管抵抗調整を担っておりその収縮を引き起こすといを用いて検討した。

う報告や，S1P はリンパや組織間𨻶に存在し，Ｔ細【方法】ddY マウス（雄・６〜９週齢）をペントバル

胞およびＢ細胞ならびにデントリック細胞の動員を調ビタールで麻酔後脱血，屠殺し，腸骨リンパ管を摘出整しているという報告がみられる。最近では自己免疫

し，両端をガラス製マイクロピペットに挿入し，臓器疾患である多発性硬化症の治療に FTY720という薬槽に装着し灌流標本を作製した。標本内腔に４cmH剤が臨床応用されている。このように末梢循環や免疫O の内圧を負荷し，標本外腔側にクレブス液（pH7.4，

学的な作用がわかっている一方で，リンパ平滑筋に対37℃）に0.2％のウシ胎児アルブミンを付加したもの

する S1P の直接反応については今までにあきらかにを５ml/min で連続的に灌流しながらリンパ管の直径

No. 5, 2013321

審査学位論文要旨

変化を経時的に計測した。まず始めに，リンパ管の自の S1P 収縮反応は有意に抑制された。また，同濃発性収縮を観察するにあたり，適当なリンパ管内圧は度での inactive U‑73122前処理では５×10 M のいくらであるのかを再検討するために，内圧を変化さ

S1P 収縮反応は有意に抑制されなかった。

せたことによるリンパ管自発性収縮の頻度と収縮力に７．10 M xetosponginC前処理によって，５×10 M

対する影響を調べ た。次 に リ ン パ 管 に 対 す る S 1PのS1P収縮反応は有意に抑制された。また，10 Mの時間依存ならびに用量 依 存 反 応 を 調 べ た。次 に

nifedipine 前処理では５×10 M の S1P 収縮反 応

S1P のリンパ管内皮細胞への影響を調べるために L‑は有意に抑制されなかった。

NAME，aspirin 処理による S1P の収縮反応に及ぼ

８．high‑K 溶液で細胞膜を完全に脱分極させた条件

す影響を調べた。次に S1P による収縮反応の細胞内でも，５×10 M の S1P は収縮反応を誘起した。

シグナル伝達機構ならびに収縮反応に関与する Ca

さらに，１mM EGTA Caの由来を調べるために，JTE013（S1P2受容体阻害下においても，５×10 M のS1Pは収縮反応を誘起剤），VPC23019（S1P1および３受容体阻害剤），U‑

した。

free high‑K 溶液環境

73122（PLC阻害剤），xetosponginC（１，４，５‑ IP【結論】以上より，S1P の収縮反応は，内因性 NO や受容体阻害剤），nifedipine（Ｌ型 Ca チャネル阻害プロスタグランジンによるものではなく，主に S1P2剤）処理による S1P の収縮反応に及ぼす影響を比受容体および１，４，５‑ IP 受容体を介した細胞内検討した。また摘出したリンパ管に存在する S1P 受

貯蔵部位の Ca を利用していることが証明された。

容体の特性と存在部位を確認するために，S1P2受容（論文審査の結果の要旨）

体，S1P1・S1P3受容体，Actin，核（DAPI），リンパS1P はＧ結合型タンパク質である S1P1〜５受容体

管内皮細胞（LYVE‑1）の marker を用いて免疫織組

を介して血管やリンパ管に作用し主に末梢循環および学に検討した。

免疫学的な調整をになうリン脂質ケミカルメディエー

最後に，high‑K 溶液，１mM EGTA 溶液処理下ターであることが知られている。その一方で，リンパの Ca free＋high‑K 溶液を用いて S1P の収縮反応

平滑筋に対する S1P の直接反応については今までにの発生機序を詳細に解析した。

明らかにされてきていない。そこで君塚らは，マウス【結果】

腸骨集合リンパ管に対する S1P の自発性収縮への影

１．リンパ管の自発性収縮の頻度と収縮力は継時的に響やリンパ管平滑筋の収縮反応における Ca の由来

内圧を変化させた場合，４cmH O の条件で規則正とその受容体解析を検討した。さらに，免疫組織化学

しく自発性収縮を引き起こした。また，４cmH Oの手法を用いて機能的にも受容体の存在も検討した。

で自発性収縮しているリンパ管に10 M の S1P を投与した場合，その収縮力と頻度には有意な変化をもたらさなかった。

以下に研究結果を示す。
１．リンパ管の自発性収縮の頻度と収縮力は継時的に内圧を変化させた場合，４cmH O の条件で規則正２．S1P は90分間隔で投与すれば，反応の減弱化はしく自発性収縮を引き起こした。また，４cmH O

生じないことを確認した。10 ‑８〜10 の範囲におで自発性収縮しているリンパ管に10 M の S1P をいては，用量依存的な収縮反応を誘起した。

投与した場合，その収縮力と頻度には有意な変化を

３．10 M L‑NAM E，および10 M aspirin 前処理
よって５×10 M のS1P収縮反応は抑制されなかった。
４．10 M JTE013前処理によって５×10 M の S1P

もたらさなかった。
２．S1P は90分間隔で投与すれば，反応の減弱化は生じないことを確認した。10 ‑８〜10 の範囲においては，用量依存的な収縮反応を誘起した。

収縮反応は有意に抑制された。10 M VPC23019前

３．10 M L‑NAME，および10 M aspirin 前処理

処理によって５×10 M の S1P 収縮反応は抑制さ

よって５×10 M のS1P収縮反応は抑制されなかっ

れなかった。

た。

５．actin の周囲に S1P2受容体が染色され，リンパ４．10 M JTE013前処理によって５×10 M の S1P

管平滑筋表面に S1P2受容体が存在することが確認

収縮反応は有意に抑制された。10 M VPC23019前された。

処理によって５×10 M の S1P 収縮反応は抑制さ

６．５×10 M U‑73122前処理によって，５×10 M
322

れなかった。
信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨

５．actin の周囲に S1P2受容体が染色され，リンパでも，５×10 M の S1P は収縮反応を誘起した。

管平滑筋表面に S1P2受容体が存在することが確認

さらに，１mM EGTA Caされた。

下においても，５×10 M の S1P は収縮反応を誘

６．５×10 M U‑73122前処理によって，５×10 M

free high‑K 溶液環境起した。

の S1P 収縮反応は有意に抑制された。また，同濃以上の結果から，S1P はマウス腸骨リンパ管平滑度での inactive U‑73122前処理では５×10 M の筋に作用し，内因性 NO やプロスタグランジンによS1P 収縮反応は有意に抑制されなかった。

るものではなく，主にS1P2受容体および１，４，５‑

７．10 M xetosponginC前処理によって，５×10 M

IP 受容体を介した細胞内貯蔵部位の Ca 放出によっのS1P収縮反応は有意に抑制された。また，10 Mてリンパ管平滑筋細胞収縮を誘起していることが証明

nifedipine 前処理では５×10 M の S1P 収縮反 応された。

は有意に抑制されなかった。

主査，副査は一致して本論文を学位論文として価値

８．high‑K 溶液で細胞膜を完全に脱分極させた条件があるものと認めた。

Endogenous CGRP protects against neointimalhyperplasiafollowing wire‑induced vascular injury（内因性 CGRP は，血管傷害による新生内膜形成を抑制する）
楊磊

（論文の内容の要旨）

ウスでは，血管傷害部位の新生内膜や外膜においてマ【背 景 と 目 的】カ ル シ ト ニ ン 遺 伝 子 関 連 ペ プ チ ド

クロファージの浸潤や，酸化ストレスレベルが亢進し（CGRP）は，カルシトニン遺伝子の alternative spli-ていること示された。一方で，腹腔マクロファージに

cingによって作られる37個のアミノ酸残基からなるペおける検討では，WT，CGRP

プチドであり，神経系，消化器系，血管などに発現が性サイトカイン発現量に有意な差を認めなかったため，認められ，強力な血管拡張作用のほか，細胞増殖調節

マクロファージにおける CGRP 欠損自体が，新生内など多彩な生理活性を有するペプチドである。我々

膜形成の主因ではないと考えられた。これに対し，は CGRP のファミリー因子であるアドレノメデュリ

CGRPン（adrenomedullin：AM ）について，その血管保護

PCNA 陽性平滑筋細胞が有意に増加しており，平滑作用を報告してきたが，CGRP にも AM と同様の作筋細胞の増殖亢進が，新生内膜形成亢進の主因と考え用があるのか，詳細は不明である。

られた。

我々は，カルシトニン‑CGRP 遺伝子配列のうち，マウスともに，炎症

マ ウ ス の 新 生 内 膜 で は，細 胞 増 殖 を 示 す

血管傷害後の新生内膜形成には，骨髄由来細胞の関CGRP に特異的なエクソン５のみを欠損させること与が報告されている。そこで，CGRP

で，カルシトニンは正常に保たれ，CGRP のみ欠損

ける新生内膜形成に骨髄由来細胞が関与しているか明するノックアウトマウス（CGRP

らかとするため，CGRPした。本研究では，CGRP

マウス）を樹立

マウスを用いて，血管マウスにおあるいは WT マウスの骨髄を，放射線照射したWTマウスに移植し，血管傷害

傷害モデルを作製し，血管傷害後の新生内膜形成におを加えて新生内膜形成を検討した。その結果，CGRP ，ける CGRP の役割を検討した。

WT マウスの骨髄細胞のどちらを移植しても，新生【結果】マウス大腿動脈にワイヤーを挿入し血管内腔内膜形成に差を認めないことから，CGRP

を擦過処理することで，血管に傷害を加えた。血管傷における新生内膜形成亢進は，骨髄由来細胞の関与に

害後，野生型（WT）マウス，CGRP

よるものではなく，傷害部位局所の平滑筋細胞増殖がマウス共に新生内膜形成を認めたが，傷害後４週間後の新生内膜厚は，CGRP

マウスで有意に亢進していた。血管傷

害部位の再内皮化には，WT と CGRP

マウス

原因であることが示唆された。
次に，in vitro の系において，CGRP が，平滑筋細に有意な差胞増殖，遊走に及ぼす影響を検討した。ラット平滑筋

マウスでは，新生内膜

細 胞 増 殖 を，BrdU 取 り 込 み 法 を 用 い て 検 討 し たにおいて αSMA 陽性細胞数が有意に増加していた。

ところ，CGRP 添加は，濃度および時間依存性に平遺伝子発現や免疫組織染色の結果から，CGRP

滑筋増殖を抑制することが示された。また Scratch‑を認めなかったが，CGRP

No. 5, 2013マ323

審査学位論文要旨

Wound アッセイにより，平滑筋細胞遊走能を検討したところ，CGRP 添加により，細胞遊走が抑制されその結果，楊磊は次の結論を得た。
１．CGRP

マウスでは，野生型マウスに比して，ることが示された。マウス由来平滑筋細胞でも同様の血管傷害４週間後の新生内膜形成が有意に亢進して結果であった。一方，CGRP

マウス由来平滑筋細おり，内膜/中膜（I/M ）比が有意に高値であった。

胞は，WTマウス由来平滑筋細胞に比 して，PDGF‑

このことから，内因性 CGRP は，血管傷害時におBB 刺激下の細胞増殖が亢進していることが示された。

ける新生内膜形成を抑制し，血管保護に働いている

最後に，CGRPによる平滑筋細胞増殖抑制のメカニズ

ことが示された。

ムを検討した。ウェスタンブロットの検討では，平滑筋

２．CGRP

マウスでは，傷害血管部位において，細胞に CGRP を添加することにより，extracellular

酸 化 ス ト レ ス レ ベ ル の 増 強 を 認 め，eNOS の 発

signal regulated kinase（ERK）１/２の活性が抑制

現が有意に低下し，NADPH サブユニットであるされる事が示された。

P47phox の有意な上昇と，p67phox の上昇傾向が【結論】以上の結果から，内因性 CGRP は，酸化スト認められた。このことから，内因性 CGRP は，酸レスと血管平滑筋細胞の増殖を制御することにより，化ストレスを抑制し，血管傷害を抑制すると考えら

新生内膜形成を抑制し，動脈硬化の進展を抑制していれた。

ると考えられる。CGRP による血管保護作用は，動３．CGRP

脈硬化症の新たな治療標的となる可能性が示唆される。
（論文審査の結果の要旨）

マウスの骨髄細胞を野生型マウスに移植したマウスでは，新生内膜形成には有意な変化を認めなかった。CGRP は，培養血管平滑筋細胞のカルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）は，カ

増殖，遊走を抑制した。一方で，CGRP

由来のルシトニン遺伝子の alternative splicing によって作

血管平滑筋細胞は，野生型マウス由来の平滑筋細胞られる37個のアミノ酸残基からなるペプチドであり，に比べて，増殖が亢進していた。また CGRP は平神経系，消化器系，血管などに発現が認められ，強滑筋細胞において，細胞増殖，遊走に関わるタンパ

力な血管拡張作用のほか，細胞増殖調節など多彩な

ク質キナーゼである ERK１/２活性を抑制した。こ

生理活性を有するペプチドである。CGRP のファミの こ と か ら，CGRP は，血 管 平 滑 筋 細 胞 の ERKリー因子であるアドレノメデュリン（adrenomedullin：

１/２活性を抑制し，平滑筋細胞の増殖，遊走を抑AM ）については，これまで，その血管保護作用が報制し，新生内膜形成を抑制することが示された。一告されてきたが，CGRP にも AM と同様の作用があ方，骨髄由来細胞への影響は少ないと考えられた。

るのか，詳細は不明である。

以上の結果から，楊磊は，内因性 CGRP は，酸化楊磊は，カルシトニン‑CGRP 遺伝子配列のうち，ストレスと血管平滑筋細胞の増殖を制御することによ

CGRP に特異的なエクソン５のみを欠損させること

り，新生内膜形成を抑制し，動脈硬化の進展を抑制しで，カルシトニンは正常に保たれ，CGRP のみ欠損ていること，更に，CGRP による血管保護作用は，するノックアウトマウス（CGRP

マウス）を用い

動脈硬化症の新たな治療標的となる可能性を初めて示て，血管傷害モデルを作製し，血管傷害後の新生内膜した。よって，主査，副査は一致して本論文を学位論形成における内因性 CGRP の役割を検討した。

文として価値があるものと認めた。

Speciﬁc interaction of postsynaptic densities with membrane rafts isolated from synaptic plasma
membranes（精製シナプス後肥厚部と膜ラフトの特異的相互作用）
劉茜（論文の内容の要旨）

プス後部においてもこの膜ラフトが存在していて，シ【背景と目的】細胞膜上には，膜ラフトと呼ばれるコナプス形成と維持，神経細胞の可塑性などに関わってレステロールとスフィンゴ脂質に富む微小膜領域が存いると考えられている。しかし，シナプス後部の膜ラ在している。この膜ラフトは細胞内情報伝達，細胞接

フトについて詳細に検討した報告はほとんどない。シ着，タンパク質ソーティングなどの様々な細胞機能に

ナプス後部にはもう一つの重要な細胞内情報処理に関おいて重要な役割を演じることが知られている。シナ

わる場，シナプス後肥厚部（Postsynaptic density，324

信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨

PSD）が古くから知られているが，現在では，シナプ

胞由来 DRM に比べて有意に多くの PSD タンパク質

ス後部膜ラフトと PSD の関係を明らかにすることがが結合することが明らかになった。またシナプス膜由

今後の重要な研究課題と考えられている。我々は2011

来 DRM には PSD 構造が結合していることが電子顕年の論文（Suzuki et al，2011，119：64‑77．学位申微鏡を用いた観察で明らかになった。この様に本実験

請参考論文）で，シナプス膜から界面活性剤不溶性浮では，in vitro で PSD とシナプス後部膜ラフトが特遊画分（Detergent‑resistant membrane，DRM ）を異的に結合することが明らかになった。以上の結果は，単離し，そのタンパク質成分をプロテオミクス解析に

PSD とシナプス後部膜ラフトとが in vivo においてより同定するとともに，PSD 構成タンパク質成分とも相互作用することを強く示唆している。また，今後，比 した。その結果，両方の細胞内構造に共通して存PSD とシナプス後部膜ラフトの結合の仕組みや，結在している分子が数多く存在していることを明らかに合に介在する分子を明らかにして行く上で，本実験でした。さらに，シナプス膜を0.15％ Triton X‑100で用いたアッセイシステムが有用な系として利用可能で処理して得られた DRM 画分中に PSD‑ラフト複合体あると考えられた。

が存在していることを電子顕微鏡で同定した。これら（論文審査の結果の要旨）の結果から，PSD とシナプス後部膜ラフトが相互作

細胞膜上には，膜ラフトと呼ばれるコレステロール用している可能性が示唆された。本研究では，精製とスフィンゴ脂質に富む微小膜領域が存在している。

PSD とシナプス後部膜ラフトを用いて，in vitro でこの膜ラフトは細胞内情報伝達，細胞接着，タンパク

この二つのシナプスドメインの結合を解析した。

質ソーティングなどの様々な細胞機能において重要な【実験方法】PSD とシナプス後部膜ラフトの精製：６

役割を演じることが知られている。シナプス後部にお週齢ラットの前脳から調製したシナプス膜を種々の濃いてもこの膜ラフトが存在していて，シナプス形成と度の Triton X‑100またはオクチルグルコシド（OG）

維持，神経細胞の可塑性などに関わっていると考えらで処理した後，ショ糖密度勾配遠心（SDG）を行い，れている。しかし，シナプス後部の膜ラフトについて12画分を分離・回収した。各画分のタンパク質および詳細に検討した報告はほとんどない。シナプス後部にGM 1ガングリオシドの分布は電気泳動（銀染色）おはもう一つの重要な細胞内情報処理に関わる場，シナ

よびドットブロットで調べた。また，質量分析，ウエ

プス後肥厚部（Postsynaptic density，PSD）が古く

スタンブロッティングにてタンパク質を同定した。

から知られているが，現在では，シナプス後部膜ラ

PSD とシナプス後部膜ラフトの in vitro 結合実験：

フトと PSD の関係を明らかにすることが今後の重要精製した PSD（OG 処理フラクション12）とシナプな研究課題と考えられている。我々は2011年の論文

ス後部膜ラフト（OG 処理フラクション４）を混合し，（Suzuki et al，2011，119：64‑77．学位申請参考論

４℃で４時間インキュベートした後，再び SDG にか文）で，シナプス膜から界面活性剤不溶性浮遊画分けた。SDG 後，タンパク質の分布と分画内に含まれ（Detergent‑resistant membrane，DRM ）を単離し，る構造を電気泳動，質量分析，ウエスタンブロッティ

そのタンパク質成分をプロテオミクス解析により同定

ングおよび電子顕微鏡で解析した。精製ラフト画分するとともに，PSD 構成タンパク質成分と比（DRM ）への PSD タンパク質の結合は31‑kDa PSD

その結果，両方の細胞内構造に共通して存在している

タンパク質の結合量で定量した。コントロールとして分子が数多く存在していることを明らかにした。さらは，肝細胞膜から調製した DRM を用いた。

に，シナプス膜を0.15％ Triton X‑100で処理して得【結果と考察】OG と Triton X‑100とでは PSD とシられた DRM 画分中に PSD‑ラフト複合体が存在してナプス後部膜ラフト（DRM ）の分離のされ方に大きいることを電子顕微鏡で同定した。これらの結果から，な違いが観察された。すなわち，Triton X‑100ではPSD とシナプス後部膜ラフトが相互作用している可PSDとラフトの分離作用が弱く，一定条件下でPSD‑能性が示唆された。本研究では，精製 PSD とシナプ

ラフト複合体が保存されたのに対して，OGでは PSD

ス後部膜ラフトを用いて，in vitro でこの二つのシナとラフトの分離は完全で，調べた限りのどの様な OG

プスドメインの結合を解析した。

した。

濃度においても PSD‑ラフト複合体の存在は観察され

PSD とシナプス後部膜ラフトの精製：６週齢ラッなかった。次に，精製 DRM と PSDを用いた in vitro

トの前脳から調製したシ ナ プ ス 膜 を 種々の 濃 度 ので結合実験において，シナプス膜由来 DRM には肝細Triton X‑100またはオクチルグルコシド（OG）で処

No. 5, 2013325

審査学位論文要旨

理した後，ショ糖密度勾配遠心（SDG）を行い，12OG 濃度においても PSD‑ラフト複合体の存在は観画分を分離・回収した。各画分のタンパク質および察されなかった。

GM 1ガングリオシドの分布は電気泳動（銀染色）お２．次に，精製 DRM と PSD を用いた in vitro で結よびドットブロットで調べた。また，質量分析，ウエ合実験において，シナプス膜由来 DRM には肝細胞

スタンブロッティングにてタンパク質を同定した。

由来 DRM に比べて有意に多くの PSD タンパク質

PSD とシナプス後部膜ラフトの in vitro 結合実験：が結合することが明らかになった。またシナプス膜

精製した PSD（OG 処理フラクション12）とシナプ

由来 DRM には PSD 構造が結合していることが電ス後部膜ラフト（OG 処理フラクション４）を混合し，子顕微鏡を用いた観察で明らかになった。この様に４℃で４時間インキュベートした後，再び SDG にか

本実験では，in vitro で PSD とシナプス後部膜ラ

けた。SDG 後，タンパク質の分布と分画内に含まれフトが特異的に結合することが明らかになった。

る構造を電気泳動，質量分析，ウエスタンブロッティ

以上の結果は，PSD とシナプス後部膜ラフトとがングおよび電子顕微鏡で解析した。

in vivo においても相互作用することを強く示唆してその結果，劉茜は次の結論を得た。

いる。また，今後，PSD とシナプス後部膜ラフトの１．OG と Triton X‑100とでは PSD とシナプス後部結合の仕組みや，結合に介在する分子を明らかにして膜ラフト（DRM ）の分離のされ方に大きな違いが行く上で，本実験で用いたアッセイシステムが有用な観察された。すなわち，Triton X‑100では PSD と系として利用可能であると考えられた。よって，主査，

ラフトの分離作用が弱く，一定条件下で PSD‑ラフ

副査は一致して本論文を学位論文として価値があるもト複合体が保存されたのに対して，OG では PSDのと認めた。

とラフトの分離は完全で，調べた限りのどの様なIncreased cerebrospinal ﬂuid interleukin‑6 levels in patients with schizophrenia and those with major
depressive disorder（統合失調症患者および大うつ病性障害患者における髄液中インターロイキ
ン‑6濃度の上昇）
篠

山

大

明

（論文の内容の要旨）

髄液中と末梢血中の IL‑6濃度の相関を調べるために，【背景】統合失調症およびうつ病の病態生理には脳へ

対象者のうち患者群全例および健常者32名においては，の過剰なインターロイキン‑6（IL‑6）シグナルの関髄液検査施行時に採取した血清中の IL‑6濃度も測定与していることが多くの研究で示唆されている。統合した。髄液中および血清中 IL‑6濃度はサンドウィッ

失調症患者と大うつ病性障害の患者では健常者と比チ ELISA 法を用いて測定した。統合失調症および大して血清中の IL‑6濃度が高値であることが知られてうつ病性障害の重症度の評価にはそれぞれ陽性・陰性

いるが，髄液中の IL‑6濃度を調べた研究は少ない。

症状評価尺度（PANSS）およびハミルトンうつ病評

中枢感染症や低酸素状態では中枢神経由来の IL‑6が価尺度21項目版（HAM D‑21）を用いた。抗精神病薬

上昇することが知られており，さらに，髄液中と末梢および抗うつ薬の１日服用量はそれぞれクロルプロマ

血中の IL‑6濃度には相関を認めないとする報告があジン換算値およびイミプラミン換算値を用いて計算しる。従って，統合失調症およびうつ病における中枢神

た。本研究は国立精神・神経医療研究センター倫理委

経由来の IL‑6の病態への関与を解明するためには，員会の承認を得ており，対象者には研究の内容を説明

中枢神経の変化を反映する髄液中の濃度を測定する必した上で文書にて同意を得た。

要がある。本研究では，統合失調症患者，大うつ病性【結果】健常対照群と比患者，健常者における髄液中の IL‑6濃度を比IL‑6濃度が高かった（統合失調症：

した。

して患者群で有意に髄液中＝0.0027，大【方法】統合失調症患者32名（平均年齢40.8±8.8，女

うつ病性障害： ＝0.012）。髄液中 IL‑6濃度は血清性12名），大うつ病性患者30名（平均年齢42.7±8.2，

中 IL‑6濃度より有意に高く，両者間の相関は有意で女性11名），健常者35名（平均年齢41.3±16.4，女性はなかった。統合失調症患者において，PANSS の陽14名）より採取した髄液中の IL‑6濃度を測定した。

性症状および陰性症状の得点はいずれも髄液中 IL‑6326

信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨

濃度と有意な相関は示さず，抗精神病薬の１日服用量て，今回，統合失調症患者，大うつ病性患者，健常者

も髄液中 IL‑6濃度と有意な相関を示さなかった。同における髄液中の IL‑6濃度を比 した。

様に，大うつ病性患者において，HAM D‑21の得点は統合失調症患者32名（平均年齢40.8±8.8，女性12

髄液中 IL‑6濃度と有意な相関を示さず，抗うつ薬の名），大うつ病性患者30名（平均年齢42.7±8.2，女性

１日服用量も髄液中 IL‑6濃度と有意な相関は示さな

11名），健常者35名（平均年齢41.3±16.4，女性14名）

かった。

より採取した髄液中の IL‑6濃度を測定した。髄液中【結論】髄液中の IL‑6が末梢血中より高い濃度であると血清中の IL‑6濃度の相関を調べるために，対象者ことから，統合失調症患者および大うつ病性障害患者のうち患者群全例および健常者32名においては，髄液で上昇がみられる髄液中のIL‑6は，末梢組織由来IL‑

検査施行時に採取した血清中の IL‑6濃度も測定した。

6の受動的な拡散によるものではなく，中枢神経にて統合失調症および大うつ病性障害の重症度の評価には産生されたものであることが示唆される。すでに多く

それぞれ陽性・陰性症状評価尺度（PANSS）およびの研究で統合失調症患者および大うつ病性患者の血清

ハミルトンうつ病評価尺度21項目版（HAMD‑21）を中の IL‑6濃度が健常者と比して高値であることが用いた。抗精神病薬および抗うつ薬の１日服用量はそ報告されているが，今回，髄液中でも同様に濃度が高

れぞれクロルプロマジン換算値およびイミプラミン換いことを示すことで，統合失調症および大うつ病性障算値を用いて計算した。

害の病態に IL‑6が関与している可能性をさらに裏付ける結果が得られた。

その結果，篠山大明は次の結論を得た。
１．健常対照群と比 して患者群で有意に髄液中 IL‑（論文審査の結果の要旨）

6濃度が高かった。

中枢神経系は内分泌系や自律神経系を介して免疫系

２．髄液中 IL‑6濃度は血清中 IL‑6濃度より有意に高に影響を及ぼす一方で，免疫系はサイトカインを介して脳への情報伝達を行っている。インターロイキン‑

く，両者間の相関は有意ではなかった。
３．髄液中 IL‑6濃度と重症度との間には有意な相関

6（IL‑6）などの炎症性サイトカインは，うつ症状や統合失調症の症状に類似した精神症状を引き起こすこを認めなかった
４．髄液中 IL‑6濃度と向精神薬の１日服用量との間とが知られており，すでに多くの研究で統合失調症患には有意な相関を認めなかった者と大うつ病性障害の患者では健常者と比 して血清

これらの結果より，統合失調症患者および大うつ病

中の IL‑6濃度が高値であることが報告されている。

性障害患者で上昇がみられる髄液中の IL‑6は，末梢一方で，統合失調症および大うつ病性患者の髄液を用

血由来 IL‑6の受動的な拡散によるものではなく，中いて中枢神経内の IL‑6濃度を調べた研究は少数存在

枢神経内にて産生されたものであることが示唆された。

するのみで，結果も一貫していない。髄液中と血清中

中枢神経由来の IL‑6が統合失調症および大うつ病性の IL‑6濃度には相関を認めないとする報告があり，障害の病態生理に関与している可能性を示す結果であ統合失調症およびうつ病における中枢神経由来の IL‑り，主査，副査は一致して本論文を学位論文として価6の病態への関与を解明するためには，中枢組織の変値があるものと認めた。

化を反映する髄液中の濃度を測定する必要がある。従っMutation analysis of BRAF and KIT in circulating melanoma cells at the single cell level（血液循環メラノーマ細胞のシングルセルレベルでの BRAF と KIT の遺伝子解析）
境

澤

香

里

（論文の内容の要旨）

vemurafenib は臨床治験が開始された。また，肢端【背景と目的】近年，分子標的薬による治療は様々な型・粘膜型のメラノーマでは KIT 変異が20％近くに癌に対して行われており，進行期メラノーマに対して認められ，KIT 阻害剤である imatinib が有効だった

は BRAF や KIT を標的にした治療が有用と考えられと報告されている。個々の患者にこれらの治療を開始ている。メラノーマの原発巣の60％に BRAF 変異がするためには腫瘍の遺伝子変異の解析が不可欠である認められたと報告されており，BRAF 阻害剤であるが，原発巣と転移巣の変異の有無は必ずしも一致しな

No. 5, 2013327

審査学位論文要旨

い。また，実際に腫瘍の切除検体が入手できない場合

atin などの上皮系の特異抗原が用いられてきた。メもある。Circulating tumour cells（CTC）は癌の患ラノーマでは CTC の分離に有用な抗体がなかったた者の末梢血中を循環する腫瘍細胞で，CTC を得るた

め，CTC は PCR 法を基本とした mRNA レベルの解めには採血が必要だが，腫瘍の切除と比べはるかに低析が行われてきた。しかし，近年メラノーマ細胞の細侵襲である。繰り返し検体を得ることも可能で，CTC胞膜に発現している HM W ‑MAA に対する特異抗体

からリアルタイムの情報を得て，腫瘍の再発や転移のを用いた CTC の分離が報告されるようになった。従指標となりうる。本研究ではこの CTC を分離し，

来の HM W ‑MAA 抗体を用いた magnetic beads に個々の細胞の BRAF と KIT の遺伝子変異の有無をよる CTC 分離では依然として血球細胞の混在を認め解析し，原発巣と転移巣と比 し，分子標的治療におたが，我々が行った複数のステップを介した手技ではけるバイオマーカーとして利用可能かを検討した。

HMW ‑MAA ，CD45 ，M ART ‑1/GP100 の特徴を【材料及び方法】＜細胞株＞888mel，928mel，MMG1持つ細胞を分離することが可能となり，この特徴をを用いて予備実験を行い，magnetic beads を用いたもった細胞を CTC と判定した。このようにしてメラメラノーマ細胞分離の効率を検討した。＜臨床検体＞

ノーマ患者の末梢血から得られた CTC の BRAF の坦癌状態の stage IIIC から IV のメラノーマ患者11名

genotype は原発巣のそれと一致する傾向がみられたより CTC を分離し，患者の原発巣と転移巣の切除検が，異なる例も存在した。KIT の genotype に至っ

体と CTC の三者について BRAF ，KIT の変異の有ては原発巣，転移巣，CTC の間で変異の一致はみら無を比検討した。＜方法＞５ml の患者末梢血を使れなかった。これらの結果はメラノーマの腫瘍が必ず用 し，抗 HMW ‑M AA 抗 体 を 標 識 し た magnetic

しもモノクローナルな細胞で構成されているわけでは

beads によりメラノーマ細胞を分離した。さらに抗ないことを示していた。さらに，原発巣を切除した時CD45抗体を標識したmagnetic beadsを用いて白血球点と CTC が得られた時点では変異を持つ腫瘍細胞のを完全に除去した。得られた検体をM ART‑1とgp100

割合が変化している可能性も考えられた。以上より，

で免疫染色し，陽性細胞を１つ１つずつ laser micro-

将来，分子標的治療を行う上で非常に重要となる変異

dissection により分離した。その後，nested PCR との同定に，切除検体に含まれる多くのメラノーマ細胞

シークエンスを行った。

を一塊にして解析するとともに，１つ１つの CTC を【結果】培養細胞を用いた予備実験では健常人の末梢解析することが有用であることが明らかとなった。

血 に 混 じ た 細 胞 の う ち １ ％ か ら 24％ を beads処 理（論文審査の結果の要旨）により分離 し た。11名 の メ ラ ノ ー マ 患 者 の 末 梢 血

進行期メラノーマに対する有効な治療法は確立され５ml からは１〜20個の CTC を分離した。11例中，ていない。しかし近年BRAFやKITを標的にした分子

原 発 巣 の BRAF

変 異 を も つ 症 例 が ３ 例，転 移標的治療が有力と考えられている。メラノーマの原発巣

変 異 を 持 つ 症 例 が ２ 例 あ り，そ のの60％に変異が認められたと報告されている BRAF

巣 の BRAF

うち原発巣と転移巣両方で共通して BRAF

変異に対しては，BRAF阻害剤であるvemurafenibが臨床であった症例は１例のみ だ っ た。原 発 巣 ・ 転 移 巣

治験中である。また，肢端型・粘膜型メラノーマの20％のいずれかの検体で BRAF

変異があった４例で近くに変異がある KIT に対 し て は KIT 阻 害 剤 で あ

CTCでも同じ変異があったのは３例で，そのうち１例

るimatinibが有効だったと報告されている。個々の患は CTCで BRAF

者にこれらの治療を開始するためには腫瘍の遺伝子

BRAF

変異のほか，BRAF

変異とが見出された。切除検体ではBRAF

変 異 だ っ た が，CTCで は BRAF

変異の解析が不可欠だが，臨床の場では原発巣が得らだった例がれないこともあり，また原発巣と転移巣で変異の有無

１例あ っ た。KIT の 解 析 で は，原 発 巣 ・ 転 移 巣 いは必ずしも一致しない。そこで境澤らは癌患者の末ずれかの切除検体で KIT の変異があった症例は３例

梢血中を循環する腫瘍細胞である circulating tumor

あったが，いずれの例でも CTC で同じ変異は示され

cells（CTC）をメラノーマ患者の末梢血から分離し，なかった。原発巣でKIT

CTC1個単位で BRAF と KIT の遺伝子変異を解析

KITだったものの，CTCでを示した症例が１例あった。

【結論】様々な癌で CTC の分離が行われているが，多くは上皮系の腫瘍で EpCAM や BerEP4，cytoker328

した。
その結果，境澤は次の結果を得た。
１．抗 HMW ‑MAA 抗体を一次抗体とした磁気ビー
信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨

ズを用い，さらに抗 CD45抗体と結合した磁気ビー

６．原発巣でKITだったものの，CTCでKIT

ズを使用し混じた白血球を完全に除去し，メラノーを示した症例が１例あった。

マ患者からの CTC の分離を従来と比メ ラ ノ ー マ 患 者 の 末 梢 血 か ら 得 ら れ た CTC のしより効率よく行った。

BRAF の genotype は原発巣のそれと異なる例が存

２．Stage IIIC〜IV のメラノーマ患者11例の末梢血在した。KIT の genotype に至っては，原発巣・転５ml から１〜20個の CTC の分離に成功した。

移巣・ CTC で変異の一致は見られなかった。これら

３．11例中，原発巣の BRAF
３例，転移巣の BRAF

変異を持つ症例がを持つ症例が２例あり，の結果はメラノーマの腫瘍が必ずしもモノクローナルな細胞で構成されているのではないことを示していた。

そのうち原発巣と転移巣両方で共通の BRAF

さらに，原発巣を切除した時点と CTC が得られた時変異のあった症例は１例のみだった。

点では変異を持つ腫瘍細胞の割合が変化している可能４．原発巣・転移巣のいずれかの検体で BRAF

性も考えられた。本研究はメラノーマ患者に分子標的変異があった４例で CTC でも同じ変異があったの治療を行う上で非常に重要となる変異の同定に CTCは３例で，そのうち１例は CTC で BRAFをシングルセルで解析することが有用である可能性をか，BRAF

変異と BRAFのほが見出された。

５．KIT の解析では原発巣・転移巣いずれかの検体
でKIT の変異があった３例で，CTCにおいて同じ

具体的に示したものであり，その臨床的意義は大きい。
よって，主査，副査は一致して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

変異は示されなかった。

Periductal Induction of High Endothelial Venule‑Like Vessels in Type 1 Autoimmune Pancreatitis（１型自己免疫性膵炎における高内皮細静脈様血管の出現に関する検討）
丸

山

雅

史

（論文の内容の要旨）

本研究の目的は，リンパ球の誘導に関与する高内皮【背景と目的】１型自己免疫性膵炎は膵管周囲におけ細静脈様血管（high endothelial venule‑like vessel）

る著明なリンパ球と形質細胞浸潤を組織学的特徴とすの出現ならびに M ECA‑79陽性高内皮細静脈様血管とる。生体内において組織へのリンパ球の誘導はリンパM AdCAM ‑1陽性高内皮細静脈様血管の出現を評価す

球ホーミング機序の変化により引き起こされているとることで１型自己免疫性膵炎の組織学的特徴を明らか考えられている。

にすることである。

血液中のリンパ球は末梢リンパ組織内に存在する高【材料及び方法】１型自己免疫性膵炎，腫瘍関連慢性内皮細静脈（High endothelial venule：HEV）の血膵炎，正常膵の手術標本組織を用いて各抗体を用いた管壁を通り抜けることで目的組織中に誘導される。リ

組織免疫染色を行った。MECA‑79抗体，MAdCAM ‑ンパ球はその後，輸出リンパ管から胸管をへて再び血1抗体，そしてすべての細血管に発現する CD34抗体

液中に戻ることにより体内を再循環している。それがを用いて MECA‑79陽性高内皮細静脈様血管と CD34

組織へのリンパ球ホーミングと呼ばれる機序である。

陽性細血管の比，MAdCAM ‑1陽性高内皮細静脈様血

消化管組織内におけるリンパ球の誘導については管と CD34陽性細血管の比を各組織において比HEV の血管内皮にリンパ球が接着する機序が最初の【結果】膵管周囲における M ECA‑79陽性高内皮細静段階で認められ，その接着機構として L‑selectin を脈様血管の発現は腫瘍関連慢性膵炎に比し１型自己リガンドとする糖鎖6‑sulfo sialyl Lewis X 構造を有免疫性膵炎で有意に増加していた。それに対し MAd-

する糖蛋白質があり，それは mouse endothelial cell

CAM ‑1陽性高内皮細静脈様血管の発現は両者においantigen 79（MECA‑79）陽性血管として認識される。

て差は認めなかった。また，M ECA‑79陽性高内皮静また，α4β7 integrin をリガンドとする粘膜細胞接着

細脈様血管は膵組織のみならず，１型自己免疫性膵炎分子である mucosal addressin cell adhesion mole-における膵外病変である硬化性唾液腺炎の組織においcule 1（M AdCAM ‑1）も同様に接着分子として確認ても腺管周囲に多数発現していた。また，正常膵管，

されている。

唾液腺管上皮にも MECA‑79陽性細胞が出現しており

No. 5, 2013

した。

329

審査学位論文要旨

6‑sulfo‑sialyl Lewis X が発現していることが判明しれる。また，α4β7integrinをリガンドとするmucosal

た。

addressin cell adhesion molecule 1（MA d CAM ‑1）【結論】膵管周囲の MECA79陽性高内皮細静脈様血管も同様に高内皮細静脈の血管内皮に発現している。

の発現増加は１型自己免疫性膵炎の組織学的特徴であ

今回，手術により摘出された１型自己免疫性膵炎，り，腺管上皮，唾液腺管の上皮にも M ECA‑79によっ腫瘍関連慢性膵炎，正常膵，及び IgG4関連硬化性唾

て認識される糖鎖である6‑sulfo‑sialyl Lewis X が発

液腺炎の組織検体を用い，CD34陽性細静脈，MECA‑現していた。１型自己免疫性膵炎または IgG4関連疾

79陽性高内皮細静脈様血管，及び MAdCAM ‑1陽性

患では L‑selectin と6‑sulfo‑sialyl Lewis X を持つ糖

高内皮細静脈様血管の出現を評価した。

蛋白質が発症メカニズムと関与している可能性がある。
（論文審査の結果の要旨）

その結果，丸山は次の結論を得た
１．１型自己免疫性膵炎においても全例で MECA‑79

１型自己免疫性膵炎は膵管周囲における著明なリン陽性高内皮細静脈様血管が出現していた。さらには

パ球と形質細胞浸潤を組織学的特徴とする。一方，生IgG4関連硬化性唾液腺炎でも出現が確認された。

体内において２次リンパ装置へのリンパ球誘導はリン２．膵管上皮と唾液腺管上皮では MECA‑79陽性の糖パ球ホーミングにより引き起こされる。１型自己免疫鎖が出現しており，病態との関連が示唆された。

性膵炎におけるリンパ球浸潤の分子機構については解３．１型自己免疫性膵炎では MECA‑79陽性高内皮細明されていない点が多い。今回，組織標本を用いたリ静脈様血管が高頻度で出現しており，L‑selectin とンパ球ホーミングに関与する高内皮細静脈様血管

6‑sulfo sialyl Lewis X 構造を有する糖鎖の結合を（high endothelial venule‑like vessel）とその細胞発介したリンパ球ホーミングが起こっている可能性が現分子について解析した。

示された。

リンパ球ホーミングについては組織中に存在する高これらの結果より，M ECA‑79陽性高内皮細静脈様内皮細静脈の血管内皮にリンパ球が接着する機序が最血管と１型自己免疫性膵炎の関連が示唆され，１型自初の段階で認められ，その相互作用機構として L‑

己免疫性膵炎における病態解明の一端となる可能性がselectin のリガンド糖鎖である6‑sulfo sialyl Lewis X示された。

構造を有する糖蛋白質が高内皮細静脈の血管内皮細胞に発現しており，この細胞は mouse endothelial cell

よって，主査，副査は一致して本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

antigen 79（MECA‑79）による免疫染色により同定さLymphocyte recruitment via high endothelial venules in lymphoid stroma of Warthinʼs tumor（ワルチン腫瘍のリンパ様間質における高内皮細静脈からのリンパ球ホーミング）大彌歩（論文の内容の要旨）上に発現する糖鎖である６硫酸化シアリルルイスＸと【背景と目的】ワルチン腫瘍は，腺腔形成を示す上皮

結合し，リンパ球ホーミングの最初の段階に至る。

細胞とリンパ様間質から構成される。リンパ様間質は

M ALTでは，他のリガンドであるmucosal addressin

リンパ節に類似した特徴を有するため，ワルチン腫瘍

cell adhesion molecule 1（M AdCAM ‑1）が高内皮細は胎生期に耳下腺内または周囲のリンパ節内に取り込

静脈内皮上に特異的に発現している。今回，ワルチン

まれた異所性の唾液腺組織から発生すると考えられて腫瘍のリンパ様間質の特徴を明らかにすることを目的きた。しかし，ワルチン腫瘍の上皮成分とリンパ濾胞として，リンパ様間質中の高内皮細静脈内皮上に発現との位置関係，上皮成分がIgAを分泌すること，DC‑する糖鎖発現形式を免疫組織学的に調べた。

SIGH 陽性樹状細胞の分布が粘膜組織と類似している【材料および方法】信州大学医学部附属病院でワルチ

点から，リンパ様間質はmucosa‑associated lymphoid

ン腫瘍と診断された10例を対象とした。これらホルマ

tissue（M ALT）に類似していることが示唆されてい

リン固定パラフィン包埋切片に対して，抗 CD34抗体，

る。一方，リンパ球の表面上に発現する L‑セレクチ

抗 MAdCAM ‑1抗体，6‑sulfo sialyl LacNAc 抗原をンは，二次リンパ組織内に存在する高内皮細静脈内皮認識する S1抗体および S2抗体，MECA‑79抗体を用

330

信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨

いた免疫染色を行った。次に，L‑selectin ・ IgM キ

molecule 1（MAdCAM ‑1）が高内皮細静脈内皮上にメラを用いて，組織切片中で L‑selectin のリガンド

特異的に発現している。今回，WT のリンパ様間質との結合実験を行った。最後に，ワルチン腫瘍のリンの特徴を明らかにすることを目的として，リンパ様間

パ様間質内の高内皮細静脈内皮に接着しているＴ細質中の高内皮細静脈内皮上に発現する糖鎖発現形式を胞とＢ細胞数を計測するため，MECA‑79抗体，抗免疫組織学的に調べた。

CD20抗体と抗 CD79α抗体の混合抗体，抗 CD3抗体

信州大学医学部附属病院で WT と診断された10例による３重染色を行い，１個あたりの高内皮細静脈にを対象とした。これらホルマリン固定パラフィン包埋

接着する平均のＴ細胞とＢ細胞数をそれぞれ計測した。

切片に対して，抗 CD34抗体，抗 MAdCAM ‑1抗体，【結果】ワルチン腫瘍のリンパ様間質における高内皮

6‑sulfo sialyl LacNAc 抗原を認識する S1抗体および細静脈内皮は，M ECA‑79抗 原，6‑sulfo sialyl Lac

S2抗体，MECA‑79抗体を用いた免疫染色を行った。

NAc抗原を表出していた。10例中２例で MAdCAM ‑次に，L‑selectin ・ IgM キメラを用いて，組織切片

1抗原の発現が認められた。また，L‑selectin ・ IgM

中で L‑selectin のリガンドとの結合実験を行った。

キメラはいずれも高内皮細静脈内皮に Ca 依存性に

最後に，WT のリンパ様間質内の高内皮細静脈内皮結合した。高内皮細静脈内皮には，Ｔ細胞がＢ細胞にに接着しているＴ細胞とＢ細胞数を計測するため，比べ有意に接着していた（

M ECA‑79抗 体，抗 CD20抗 体 と 抗 CD79α抗 体 の 混＝0.0003）。

【結論】ワルチン腫瘍のリンパ様間質は，二次リンパ合抗体，抗 CD3抗体による３重染色を行い，１個あ

組織，特に M ALT と類似する機構により高内皮細静たりの高内皮細静脈に接着する平均のＴ細胞とＢ細胞

脈を介してリンパ球がホーミングすることで，発達す数をそれぞれ計測した。

ると考えられた。

その結果，大彌は次の結論を得た。

（論文審査の結果の要旨）

１．WT のリンパ様間質における高内皮細静脈内皮

ワルチン腫瘍（WT）のリンパ様間質はリンパ節にには，MECA‑79抗原，6‑sulfo sialyl LacNAc 抗

類似した特徴を有するため，WT は胎生期に耳下腺
内または周囲のリンパ節内に取り込まれた異所性の唾

原を表出していた。
２．WT のリンパ様間質における高内皮細静脈内皮

液腺組織から発生すると考えられてきた。しかし，には MAdCAM ‑1抗原の発現が認められた。

WT の上皮成分とリンパ濾胞との位置関係，上皮成３．L‑selectin ・ IgM キメラは組織切片上，いずれ分が IgA を分泌すること，DC‑SIGN 陽性樹状細胞

も高内皮細静脈内皮に Ca 依存性に結合した。

の分布が粘膜組織と類似している点から，リンパ様間４．高内皮細静脈内皮には，Ｔ細胞がＢ細胞に比べ有質は mucosa‑associated lymphoid tissue（MALT）

意に接着していた（ ＝0.0003）に類似していることが示唆されている。一方，リンパこれらの結果より，WT のリンパ様間質は，二次球の表面上に発現する L‑セレクチンは，二次リンパリンパ組織，特に MALT と類似する機構により高内組織内に存在する高内皮細静脈内皮上に発現する糖鎖皮細静脈を介してリンパ球がホーミングすることで，である６硫酸化シアリルルイスＸと結合し，リンパ球

発達すると考えられた。よって，主査，副査は一致しホーミングの最初の段階に至る。MALT では，他のて本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

リガンドである mucosal addressin cell adhesion

Vital staining with iodine solution in oral cancer: iodine inﬁltration, cell proliferation, and glucose
transporter 1（口腔がんにおけるヨード生体染色機序の解明：ヨードの浸透，細胞増殖とグルコーストランスポーター１）
肖鉄朋（論文の内容の要旨）することは術後の局所再発，リンパ転移，生存率と【背景と目的】口腔扁平上皮癌は世界的にもっとも多QOL の向上などの非常に重要である。しかし，病変い10の悪性腫瘍の中の一つであり，顎顔面領域での主範囲の判定は視診，触診，医師の経験などに影響され，要な悪性腫瘍の一つである。正確に病変範囲を判断

簡単，正確，そして客観的に癌病変の境界を判断でき

No. 5, 2013331

審査学位論文要旨

る方法は非常に有意義だと考えている。ヨード溶液生できなかった。一方 PAS 染色では，ヨード染色域

体染色は，上消化管および婦人科領域で癌の範囲の診の上皮の Superﬁcial layer は PAS 陽性を示したが，断に広く臨床応用されている。口腔外科領域では，ヨー

不染域では PAS 陽性部位は見られなかった。染色

ドグリセリン液を用いた生体染色が，口腔咽頭粘膜病域の上皮 Superﬁcial layer を３層に分けてヨード

変或いは口腔咽頭扁平上皮癌の範囲の診断に有用であの浸透率を見ると，上１/３で100％，中間１/３でると報告された。

60.0％，下 １/３ で13.3％ で あ っ た。一 方，PAS

一般的にヨード生体染色は，ヨードと上皮細胞中の陽性率は Superﬁcial layer の上１/３で100％，中グリコーゲンが反応し，発色することにより病変の染間１/３で93.0％，下１/３で60.0％であった。

め分けを行っていると考えられている（正常粘膜上皮

３．GLUT ‑1と Ｐ 53の 標 識 率 は 上 皮 全 層 に お い て細胞はグリコーゲンを保有する vs 異型性上皮はグリヨード不染域が染色域よりも有意に高かった。また，

コーゲンを欠き発色しない）。しかし，実際に⑴ ヨー

Ki67に関しては，表層においてヨード不染域で標ドは上皮内どこまでに染みこんでいるのか ⑵ ヨー

識率が有意に高かった。
（Wilcoxon 符号付順位検

ドが染みこんだ場所には何があるのか

定，p＜0.05）。

など，染色機序に関しては十分な検討が行われていない。そこで今【結語】

回われわれは，口腔粘膜におけるヨード呈色反応の場

１．口腔扁平上皮癌周囲の異形成性上皮の広がりを正と糖の取り込みに関連するグルコーストランスポーター

確に診断することは，治療結果を左右する重要な因１（GLUT ‑1），癌抑制遺伝子変異（Ｐ53），細胞増子である。われわれは，ヨード溶液を用いた生体染殖能（Ki67）との関連について検討した。

色を口腔粘膜に応用し，扁平上皮癌およびその周囲【対象と方法】2009年10月から2011年12月の期間に，の異形成性上皮の広がりの診断に有用であることを

原発口腔扁平上皮癌と診断され当科で手術を行った31

確認した。

例のうち，ヨード染色による腫瘍マージンを鑑別され２．ヨードの浸透部位と PAS 陽性部位とは一致してた15例を対象とした。年齢は30〜85歳であった。性別

おり，ヨードと上皮内のグリコーゲンとは何らかの

は，男性11例，女性４例，部位は舌７例，口底１例，反応を起こしている可能性が示唆された。ヨードは歯肉４例，臼後三角１例，頰部１例，軟口蓋１例であっSuperﬁcial layerまで確実に浸透しており，ヨード呈た。

色反応の場は Superﬁcial layer（特に上部１/３〜

１．標本採集および処理：手術より切除された摘出物１/２）であると考えられた。

の粘膜を洗浄，軽く乾燥された後，病変部位および３．上皮表層において，ヨード不染域と染色域の間で周囲粘膜にヨード液綿球にて10〜20秒塗布し，１〜Ki67の発現に有意差があり，ヨード染色機序に細２分後，非染色域の範囲を確認し，染色域と非染色胞分裂能が関連している可能性が示唆された。

域の各５mm 組織を含めて切取り，速やかに切除４．がん細胞は好気条件下でもグルコースを大量に取組織を凍結させ，‑80℃で保存した。

り込み，解糖系を利用して ATP を得る現象は，提２．生体組織の凍結切片を作製し，光顕下にヨードの唱者の名前から「ワールブルグ効果（ワーバーグ効

呈色反応範囲（染みこんだ範囲）を観察した。同じ

果）」と呼ばれる。ヨード不染域と染色域の間で標本 の Ｈ ‑Ｅ 染 色，PAS 染 色 及 び Ki‑67，Ｐ53，

GLUT ‑1の発現に差が見られた。この結果は，癌

GLUT ‑1染色を行い，陽性細胞の分布とヨードの細胞における糖代謝の促進（糖の取り込みの増加）

呈色反応範囲との関係について分析した。

を意味し，癌細胞ではグリコーゲンの消費，消失が【結果】おこり，そのためヨード染色不染となる可能性が示

１．ヨード染色では，不染域として認められた異常上された。

皮のうち，Hyperplasia１例（6.7％），中等度異型性（論文審査の結果の要旨）

上皮５例（33.3％），高度異型性上皮２例（13.3％），

口腔扁平上皮癌に関して正確に病変範囲を判断する

上皮内癌３例（20％），扁平上皮癌４例（26.7％）

ことは術後の局所再発，リンパ転移，生存率と QOLであった。

の向上などの非常に重要である。ヨード生体染色は，２．ヨードは，染色域の上皮で Superﬁcial layer に

口腔粘膜扁平上皮癌および異型性上皮を不染域として，浸透していた。非染色域では上皮内のヨードは確認

正常非角化粘膜を染色域として染め分けることができ

332

信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨る。そのため，上記疾患の病変範囲の描出に有用な方

そこで，上皮内のグリコーゲン存在率を PAS 染色法であり，この方法を用いて病変を診断し，切除を行で 調 べ る と，Superﬁcial layer 上 １/３ で100％，

えば局所再発率を低減できることが報告されている。

中間１/３で93.3％，下１/３で60％であった。ヨーヨード生体染色は，ヨードと上皮細胞中のグリコー

ドの浸透する部位に確実にグリコーゲンは存在してゲンが反応し，発色することにより病変の染め分けをおり，Superﬁcial layer の上１/３〜１/２がヨード行っていると考えられている。しかし，実際に⑴ ヨー

生体染色の反応の場として矛盾しない。

ドは上皮内どこまでに染みこんでいるのか ⑵ ヨー

５．GLUT ‑1と Ｐ 53の 標 識 率 は 上 皮 全 層 に お い て

ドが染みこんだ場所には何があるのか，起こっている

ヨード不染域が染色域よりも有意に高かった。こののかなど，染色機序に関しては十分な検討が行われことは，ヨード不染粘膜上皮では上皮全層に渡っていない。そこで，口腔粘膜におけるヨード呈色反応て糖の取り込み増加と癌抑制遺伝子の変異が生じの場とその染色機序を解明すべく，口腔扁平上皮癌切ていることを示している。また，Ki67に関しては，

除標本を用いて，病理組織学的検討を行った。

Superﬁcial layer においてヨード不染域で標識率がその結果，肖は次の結論を得た。

有意に高かった。これらの結果から，ヨード不染粘１．ヨード不染粘膜はほぼ中等度異型性上皮以上であ膜では全体的に糖の取り込みが増加しており，特にり，染色粘膜は正常非角化粘膜および軽度異型性上Superﬁcial layer では細胞分裂の増加に伴い糖の代皮であった。この結果からヨード生体染色は，中等

謝・消費の亢進が顕著で，そのためグリコーゲンの度以上の異型性上皮，癌上皮を不染域として描出し消費・消失がおこり，ヨード染色反応（ヨード‑グている。

リコーゲン反応）が消失しているものと推察された。

２．ヨード染色域と不染域を含めた組織を，染色後に今回の研究は，ヨードが実際に上皮に染みこんでいすぐに採取し凍結切片を作製すると，ヨード溶液がることを確認し，また，どの層まで染みこんでいるか

浸透している部位，つまりここが ヨード染色のを確認できたことは，ヨード生体染色の機序を解明す

場と考えられる，を観察することができた。

るための第一歩として非常に価値のある研究である。

３．染色域ではヨードは上皮内に観察できたが，非染

また，ヨードが染みこんでいる部位では，細胞分裂能

色域では上皮内に染みこんでいなかった。染まったが亢進していることや，糖の代謝（グルコースの細胞上皮の Superﬁcial layer でヨードの浸透率を見る

内への取り込み）が亢進していることが確認された。

と，上１/３で100％，中間１/３で60.0％，下１/

これらの所見はヨード生体染色反応の機序を解明する

３で13.3％であり，Superﬁcial layer 上１/３に確だけではなく，癌細胞にみられる糖代謝異常を解明す

実にヨードが浸透しており， ヨード生体染色の場るためにも重要な知見である。以上より，主査，副査はこの部分であると考えられた。

は一致して本論文を学位論文として価値があるものと４．一般的にヨード生体染色反応は，ヨードと上皮内認めた。

のグリコーゲンとの反応であると考えられている。

No. 5, 2013333

審査学位論文要旨

A Case of Wound Dual Infection with Pasteurella dagmatis and Pasteurella canis Resulting from a
Dog Bite ―Limitations of Vitek‑2 System in Exact Identiﬁcation of Pasteurella Species―（イヌ咬傷から分離された Pasteurella dagmatis と Pasteurella canis 創部重複感染症の１例―Vitek‑2シス
テムによる Pasteurella 属の正確な同定の限界―）
赤羽（論文の内容の要旨）

貴行検査装置では P. pnuemotropica と誤同定され，このPasteurella 属菌は多くの野生動物や家畜等の口腔が含ま
Vitek2システムのデータベースにʻ
P. dagmatisʼ

内や消化管の常在する菌として知られ，人畜共通感染れていないことに起因していた。また，P. canis と最症の病原菌としても重要であり，Pasteurella 属菌に終的に同定された菌株Ｂや菌株Ｃでは，Vitek2自動よるヒトへの感染症としては，多くの場合，動物の咬細菌検査装置では遺伝学的手法と同様な結果が得られ傷によって引き起こされるケースが多い。今回我々は，たのに対し，ID‑Test HN‑20では P. multocida と誤

健康な25歳女性がイヌ咬傷に よ っ て 異 な る ２ 種 の同定された。このことから，P. dagmatis の分離頻度

Pasteurella 属菌による同時感染した稀な重複感染症の低さや，本菌種に起因する感染症例の稀少さは，同例に遭遇した。患者のイヌ咬傷部位の開放性膿と咬ん定機器やキット製品の同定精度の問題に起因しているだイヌの唾液の両者の細菌検査を実施したところ，チョ

可能性が推測された。Vitek2自動細菌検査装置は多コレート寒天培地とヒツジ血液寒天培地に形態学的くの医療施設の臨床微生物検査の現場で普及・稼働しに酷似した灰白色Ｓ型の滑らかなコロニーと光沢のあている機器の１種であるため，Pasteurella 属，特にる灰白色のコロニーの発育を認めた。これらの発育コ

P. dagmatis の Vitek2自動細菌検査装置よる正確な同

ロニーに対して，グラム染色，GN カードを用いた定の限界を認識することは，臨床微生物学検査を行う

Vitek2自動細菌検査装置による同定，簡易同定キッ

現場では重要なことであり，Vitek2システムのさらトである ID‑Test HN‑20による同定，さらに Taq

なる改善の余地があることも判明した。

DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing/3100（論文審査の結果の要旨）

DNA sequencer 機器による16S rRNA 解析による同本学位論文は，イヌ咬傷部位の感染巣より Pasteu-

定を行った。イヌ咬傷により患者から分離された菌種

rella dagmatis と Pasteurella canis の Pasteurella 属

は，培養検査による形態学的特徴，同定検査による生菌２菌種を同時に分離同定した重複感染症例の研究報

化学的性質，16S rRNA 遺伝子配列による遺伝学的告である。本研究の特徴は，菌種の正確な同定のため

解 析 成 績 か ら，最 終 的 に Pasteurella canis と Pas-に複数の同定機器・装置及び同定キットパネルを用い

teurella dagmatis と同定された。この両菌種とも多くると同時に，16S リボゾーム RNA の塩基配列解析をの抗菌薬に高い感受性があり，患者はセファロスポリ

行い生化学的性状と合わせて最終的に菌種名を同定しン系第一世代である cefazolin（セファゾリン；商品たことである。

名セフマゾン）と，セファロスポリン系第三世代の本論文の重要性は大きく以下の２点である。第一に，cefcapene pivoxil（セフカペンピボキシル；商品名

稀少症例であることである。臨床細菌検査室の日常検

フロモックス）の投与により完治した。イヌの唾液か査で分離同定されることが極めて稀な２菌種による感ら分離された菌株は，患者から分離された株と同一菌染症例であり，特に P. dagmatis によるヒトヘの感染種である P. canis と同定された。

事例の論文としては国内第一例目（学会報告が過去１

今回の症例は，我々の知る限り1988年のP.dagmatisと P. multocida による第１例目の重複感染症に続き，例）であること，さらに P. dagmatis と P. canis のによる重複感染は世界で第一例目であった。

イヌ咬傷が原因である P. dagmatis と P. canis によっ

第二に，国内・外の臨床細菌検査室で広く普及してて引き起こされた Pasteurella 属菌の第２例目の重複いる菌種同定装置である Vitek‑2において P. dag-

感染症であった。今回，P. dagmatis と最終的に同定

matis の同定が正しく行われなかったことと，また，された菌株Ａは，ID‑Test HN‑20では遺伝学的手法

我が国において汎用されている菌種同定キットであると同様な結果が得られたのに対し，Vitek2自動細菌

ID‑Test HN‑20において P. canis の同定が正しく行334

信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨

われなかったことである。

Table に示されている項目は，日頃臨床細菌検査の担特に後者に関して本論文が提唱していることは次の当者や感染症を専門とする研究者のみならず，同定装点である。日常検査で分離同定されることが比 的ま

置や同定キットを市販している製造・販売に関わる企

れな菌種の同定検査を市販の菌種同定装置や同定キッ

業に対して極めて重要な情報であり，本論文で明らかトを用いて行う場合には，同定機器・装置やキットパにされた問題点を，感染症学分野，臨床細菌学分野へ

ネルで示された結果が正しくない可能性があることを投げかけた意味には大きいものがある。

常に念頭におき，必ず複数の同定装置や同定キットを

公開学位論文審査は平成24年１月19日（保健学科使用して相互に確認することが肝要である。さらに，

331教室）18時から，主査，副査を含めた別紙の参加

それらの結果が不一致であった場合には16S リボゾー者名簿に示した10名の関係各位同席の中で開催された。

ム RNA の塩基配列解析などの分子遺伝学的検査を併

本審査会での冒頭，申請者である「赤羽貴行」に本研用することが重要である。

究の概略を述べさせたのち，主査，副査からの質疑を

本論文の最後に，「P. dagmatis による感染事例が行ったが，質疑に対しては別紙様式第８号のようなや稀であると言うことが，同定機器装置による誤同定にり取りが行われ，質問に対する応答は概ね適切である

起因している可能性がある」と記されている一文のもことを確認し，本研究の遂行に十分な学力を有していつ意味は極めて重い。また，稀な P. dagmatis が疑わるものと評価した。よって主査，副査は一致して本論れる症例に遭遇した際に識別に有用と考えられる生化

文を学位論文としての価値を充分に有するものと認め学的性状を整理して提示しているが，この鑑別性状た。

Bactericidalactivities ofwoven cotton and nonwoven polypropylenefabrics coatedwithhydroxyapatite‑binding silver/titanium dioxide ceramic nanocomposite“
Earth‑Plus”（アースプラス（酸化チタン，
ハイドロキシアパタイト，銀）加工の施された綿織布とポリプロピレン不織布の医療関連感染
起因性病原菌に対する殺菌活性）
春

日

恵理子

（論文の内容の要旨）

本研究では，アースプラスの抗菌効果の評価を行う【はじめに】医療施設では適切な感染管理が必要であために抗菌効果定量法，操作型電子顕微鏡を用いた菌り，医療関連感染を防ぐことは安全面ばかりではなく体の観察および銀溶出試験を行った。尚，抗菌効果定

経済面においても重要な事象である。医療関連感染の量法は JIS L1902に準じて行い，アースプラスは織布

感染経路の多くは，汚染された医療従事者の手指や環および不織布に加工して検討に用いた。

境，医療器具を介する接触感染によるものである。接供試菌株は３菌種（Staphylococcus aureus ３株，

触感染防止のために，Standard precautions や M ax-

Escherichia coli ３株，Pseudomonas aeruginosa ３

imal barrier precautions などの手法が用いられてい株）計９株を用いた。９株の詳細は，標準菌株３株

るが，感染の発生率を減らすためにはこれらの方法だ（ATCC29213 S. aureus，ATCC25922 E. coli，

けでは不十分であり，医療環境から病原微生物を減少

ATCC9027 P. aeruginosa），臨床分離株６株（Meth-

させることが接触感染防止策の一つと考えられている。

，Methicillin
icillin resistant S. aureus（MRSA）

医療環境から菌を減少させるために，銀イオン等を用，Extended Spectrum
sensitive S. aureus（M SSA）

いた種々の抗菌材が利用されているが，用途や使用環

β‑lactamase（ESBL）産生E.coli，ESBL非産生E.coli，

境によってその効果は左右される。

M etallo β‑lactamase（M BL）産生 P. aeruginosa，【材料・方法】

M BL 非産生 P. aeruguinosa）である。

㈱信州セラミックスから earth‑plus（アースプラ【結果】ス）と呼ばれるセラミックス複合材が開発された。アー

（抗菌効果定量法）アースプラス加工織布および不織スプラスは酸化チタン，ハイドロキシアパタイト，銀布では，いずれの株においても経過時間とともに生菌の３つの成分からなり，そのうち酸化チタンが殺菌の数の減少が認められたが，対照として用いた未加工のメカニズムの本体を担っている。

織布と不織布では生菌数の減少は認められなかった。

No. 5, 2013335

審査学位論文要旨

菌種別にみると，S. aureus は６時間接触後には‑２る。

log CFU/ml 未満まで生菌数が減少し，18時間接触（論文審査の結果の要旨）

後では検出感度以下となった。同様に，E. coli にお

本研究において春日は，酸化チタン，ハイドロキシ

いても６時間接触後には‑２log CFU/ml 未満まで生

アパタイト，銀の３成分からなるセラミックス複合材

菌数が減少し，18時間接触後では検出感度以下となっ「Earth‑plus」を織布および不織布に加工した際に抗た。P. aeruginosa においては，６時間接触後には検菌効果が得られるか評価を行った。Earth‑plus は，

出感度以下まで減少したが，ATCC 株と MBL 非産

ハイドロキシアパタイトが細菌を吸着し，銀の触媒作

生株では18時間接触後に菌の再増殖が認められた。

用を利用し酸化チタンから発生するラジカルが細菌を（電子顕微鏡）アースプラス加工の施された織布に６分解する。

時間菌体を接触させた結果，S. aureus では大きな変

検討内容は定量法を用いた抗菌効果の評価，走査型

形は認められなかったが，E. coli と P. aeruginosa に電子顕微鏡を用いた細菌の形態観察，Earth‑plus か

おいては表面が陥没している部分が認められた。しからの銀溶出試験を行った。尚，検討には Staphylococ-

し，菌体が潰れるなどの明らかな変化は認められな

cus aureus，Escherichia coli，Pseudomonas aer-

かった。

uginosa の３菌種について，標準株（ATCC 株）１株，（銀溶出試験）アースプラス加工の施された織布と不臨床分離株（薬剤感性株，薬剤耐性株）２株，計３菌

織布から溶出された銀イオンの濃度は約0.2ppbで種９株を用いた。

あった。これは銀イオンが抗菌効果を示す50ppb よ

その結果，抗菌効果の評価において効果が現れるま

りもはるかに低い値であった。

でには，菌種，布の種類によって数時間の差は認めら【考察】アースプラスは即効性には劣るがいずれの株れたが，いずれの株において抗菌効果が認められた。

においても抗菌効果が認められた。また，医療関連感

その効果を菌種別に見た場合ではグラム陽性菌よりグ染で問題となる薬剤耐性菌においても十分な効果が得

ラム陰性菌で効果が早く現れ，布別に見た場合では不られた。

織布よりも織布でその効果が早く現れた。また，P.

３菌種のうちグラム陰性桿菌（E. coli と P. aer-aeruginosa に つ い て は18時 問 後 に 薬 剤 感 性 株 ２ 株

uginosa）がグラム陽性菌（S. aureus）よりも生菌数（ATCC 株，臨床分離株）で僅かに再増殖が認められの減少が著明であった。これは，細胞壁の構造に違いた。これはBioﬁlmが形成されたことによって Earth‑によるもので，細胞壁の構造が厚いグラム陽性菌では

plus の効果が妨げられたと推測された。

効果が現れるまでに，より多くの時間を要したと考えられた。

電子顕微鏡による形態観察においては，菌体が潰れるなどの明らかな形態の変化は認められなかった。こまた，P. aeruginosa においては，薬剤感性株と薬

れは，Earth‑plus から発生するラジカルによって菌剤耐性株でその効果に差が認められた。薬剤耐性株で体が大きなダメージを受けると，Earth‑plus から剥ある M BL 産生株は18時間後でも菌の再増殖は認めらがれ落ちてしまい観察できなかったと推測された。

れなかったが，薬剤感性株である ATCC 株と M BL

銀の溶出試験においては，Earth‑plus から溶出し非産生株においては18時間後に菌の再増殖が認められた銀濃度は殺菌効果を現さない程度であり，Earth‑

た。薬剤感性株ではバイオフィルムが形成されたこと

plus においての銀は，抗菌性金属として作用していによりアースプラスの効果が届き難くなったと考えらないことが明らかになった。

れた。

このように，発表論文は Earth‑plus の構成成分のアースプラスは種々の材質への加工が可能なセラ作用について解説し，Earth‑plus 加工が施された布ミックス複合材であり，さらには病院関連感染で問題において抗菌効果があることを明らかにしているものとなる薬剤耐性菌に対しても確かな効果が認められた。

であり，主査，副査は一致して本論文を学位論文とし今後，感染制御に係る重要なツールとなる可能性があて価値があるものと認めた。

336

信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨

Pathophysiological investigation of the gastric surface mucous gel layer of patients with Helicobacter
pylori infection by using immunoassays for trefoil factor family 2 and gastric gland mucous cell‑typemucin in gastric juice（胃液における TFF2と胃腺粘液細胞型ムチンのイムノアッセイを用いた
Helicobacter pylori 感染患者の胃表層粘液ゲル層の病態生理学的研究）
久保田聖子（論文の内容の要旨）て免疫組織化学的に解析した。組織切片は，形態学的観【研究の背景】研究テーマは，慢性胃炎，胃十二指腸察のため HE染色し，また SMC型ムチンに galactose

潰瘍，胃癌，MALT リンパ腫などの胃疾患の主原因

oxidase‑cold thionine Schiﬀ reaction（GOTS ），となっている H. pylori（HP）感染に対する TFF

腺粘液細胞ムチンに paradoxical Concanavalin Ａ染（trefoil factor family）の挙動を解析することである。

色（PCS）を用いて二重染色した。TFF2と腺粘液細これまで腺粘液細胞ムチンの変動に焦点を当て進めて胞ムチンの分布は，抗ヒト TFF2抗体と抗腺粘液細胞

きた「HP 感染による胃粘膜病変に関する研究」に，

ムチン抗体を用いて酵素免疫増感法により証明した。

新たな知見を加え，HP 感染による胃疾患の病態メカ胃液の検討には，健常人（n＝33）および胃炎（n＝37），

ニズムを解明したいと考えている。胃粘膜では，胃の胃 潰 瘍（GU）（n＝16），十 二 指 腸 潰 瘍 患 者（DU）

表層を覆っている表面粘液細胞（SMCs）が産生する（n＝10）の内視鏡検査時に採取した胃液を用い，胃粘液と胃腺（噴門腺細胞，副細胞，幽門腺細胞）に液中の TFF2と腺粘液細胞ムチンを ELISA で測定しおける腺粘液細胞（GM Cs）由来粘液の２種類の粘た。TFF2の ELISA は，抗ヒト TFF2ポリクローナ

液が産生される。SM Cs と GMCs から分泌される２ル抗体とリコンビナント TFF2抗原を用いて作成した。

種類の粘液は，胃粘膜の表面を覆う表層粘液ゲル層

マトリックスの影響を無視できる程度胃液を希釈し，（SMGL）を形成し，これらの粘液は混じり合うこと

なおかつ感度よく測定するために，抗体を Biotin 標

なく交互に重なって粘膜層を構成している。腺粘液細識して作成した。プレートには1.0μg/mL に希釈し胞ムチンは，正常あるいは非腫瘍性組織の胃粘膜におた抗体を固相し，ブロッキング後，標準物質のリコン

いて GMCs に限局して見出され，これら産生細胞でビナントTFF2抗原あるいは胃液を反応させ，ビオチン

は同時に TFF2が産生・分泌されている。TFF2は腺標識抗体ではさみ，さらに HRP 標識ストレプトアビ

粘液細胞ムチンとともに胃液中に分泌されていること

ジンを反応させ，450nm/650nm で吸光度を測定しが想定されており，luminal surveillance peptide とた。希釈液は0.5％ PBS ‑Tween/0.5％ BSA，洗浄

して，粘膜防御に関与しているペプチドである。胃液は ELISA 専用洗浄液を使用した。またこの抗体を用中の腺粘液細胞ムチンの測定に関して，以前我々は腺いて，胃液中の TFF2の存在様式をウエスタンブロッ

粘液細胞ムチン測定用の ELISA を報告し，その結果

トで確認した。腺粘液細胞ムチンは市販キットで測定

HP 感染患者群では腺粘液細胞ムチンが有意に高値をした。

示した。病理組織学的には腺粘液細胞ムチンには HP【成績・結果】TFF2と腺粘液細胞ムチンは胃の腺粘が棲息していないことが知られており，腺粘液細胞ム

液細胞内および分泌された後も SMGL において共局

チンの自然抗菌機能が証明されたことから，HP 感染

在していることが免疫組織化学的に確 認 さ れ た。

に伴う腺粘液細胞ムチンの分泌量の増加が反映されて

ELISA で用いた抗体と胃液の反応性を確認したとこいると考えた。

ろ，ほとんどの胃液に12kDa と19kDa のバンドが共【目的】本研究では胃粘液ゲル層内の TFF2の局在を通して認められた。19kDa は文献上糖化した TFF2

明らかにし，また TFF2の高感度 ELISA を開発し，であるとの報告があり，胃液によってはそのほか高分HP 感染患者の胃液中の TFF2を腺粘液細胞ムチンと子を含む TFF2が検出された。胃液中の TFF2の不均合わせて測定することにより，粘膜防御機構の解析を

一性の影響を評価するために，様々な分子量が存在す目指した。

る２つの胃液を混合試験したところ，直線性は良好で【方法】胃粘液ゲル層内での TFF2と腺粘液細胞ムチあり，胃液により TFF2の存在様式は様々だが低分子ンの分布は，胃粘液ゲル層を固定した胃粘膜組織を用いも高分子も測定できていることがわかった。健常人おNo. 5, 2013337

審査学位論文要旨

よび胃炎，GU，DU 群の TFF2の平均値（±SE）は反応させ，ビオチン標識抗体ではさみ，さらに HRP

1.9（± 0.4）
，24.8（± 0.7）
，21.3（± 1.2）
，18.4

標識ストレプトアビジンを反応させ，450nm/650nm（±1.5）μg/ml で，健常人に対し疾患群では分泌量で 吸 光 度 を 測 定 し た。検 体 希 釈 液 は0.5％ PBS ‑が有意に増加した（p＜0.05）。HP感染別平均値（±SE）

Tween/0.5％ BSA，洗浄は ELISA 専用洗浄液を使は 陰 性，陽 性 そ れ ぞ れ3.9（±0.4），26.5（±0.7）用した。また，胃液中の TFF2の存在様式をウエスタ。
μg/ml で，感染群は有意に高値を示した（p＜0.001）

ンブロットで確認した。腺粘液細胞ムチンは市販キッ

また，HP の除菌により TFF2濃度の低下がみられた。

トで測定した。

同時に測定した腺粘液細胞ムチンは TFF2と同様の傾【成績・結果】TFF2と腺粘液細胞ムチンは胃の腺粘向を示した。

液細胞内および分泌された後も SMGL において共局【結論】胃粘膜粘液ゲル層内において，TFF2は胃腺在していることが免疫組織化学的に確 認 さ れ た。

粘液ムチンと共局在しており，胃液 TFF2濃度および

ELISA で用いた抗 TFF2抗体と胃液の反応性を確認

腺粘液細胞ムチンは HP 感染症例において亢進してしたところ，ほとんどの胃液に12kDa と19kDa（糖おり，HP 除菌により低下することが証明された。組化した TFF2に相当）のバンドが共通して認められた。

織学的検討から，HP 感染胃粘膜においては胃粘液細胃液によってはその他にも TFF2を含む高分子が検出

胞からの TFF2と腺粘液細胞ムチンの分泌亢進が推測された。TFF2と反応する様々な分子量の高分子が存されており，本研究によりこの亢進が証明された。

在する２つの胃液を混合試験したところ，TFF2測定

TFF2は，上皮の再上皮化（restitution）促進作用に系の直線性は良好であ っ た。健 常 人，胃 炎，GU，加え，粘液ゲルの安定化作用があることから，TFF2（平
DU 群の胃液中 TFF2値はそれぞれ1.9（±0.4）と腺粘液細胞ムチンは胃粘膜防御機構の観点から相乗均 値±SE），24.8（±0.7），21.3（±1.2），18.4（±

効果を発揮しているものと推測される。

1.5）μg/mlで，健常人に対し疾患群では有意に増加し（論文審査の結果の要旨）ていた（p＜0.05）。H. pylori 感染別の胃液中 TFF2

本学位論文は胃粘液ゲル層内の TFF2の局在を明

値は陰性群3.9（±0.4），陽性群26.5（±0.7）μg/ml

らかにし，また TFF2の ELISA を開発し，胃液中ので，感染群は有意に亢進していた（p＜0.001）。また，

TFF2と腺粘液細胞ムチンを合わせて測定することに

H. pylori の除菌により TFF2濃度の低下がみられた。

より，粘膜防御機構の解析を行ったものである。

胃液中の腺粘液細胞ムチンは TFF2と同様の傾向を示【方法】胃粘液ゲル層内での TFF2と腺粘 液 細 胞 ムした。

チンの分布は，胃粘液ゲル層を固定したパラフィン【結論】胃表層粘液ゲル層内で，TFF2は腺粘液細胞

包埋胃粘膜組織から作成した組織切片に HE 染色，

ムチンのゲル層内に貯留されており，TFF2は監視ペ

galactose oxidase ‑cold thionine Schiﬀ reaction

プチド（luminal surveillance peptides）として存在（表層粘液細胞型ムチの染色）― paradoxical Con-

しているものと考える。H. pylori 感染胃粘膜におけ，抗canavalin A 染色（腺粘液細胞ムチンの染色）

る TFF2と腺粘液細胞ムチンの分泌亢進は，H. pylori

TFF2免疫染色と抗腺粘液細胞ムチン免疫染色を行い感染に対する胃粘膜の防御機構を反映しており，可逆解析した。胃液の検討には，健常人（n＝33）および的な変化と考える。TFF2と腺粘液細胞型ムチンはそ

胃 炎（n＝37），胃 潰 瘍（GU）（n＝16），十 二 指 腸 潰

れぞれ固有の作用を持つ他に，相互作用を持つことか瘍 患 者（DU）（ n＝ 10）の 内 視 鏡 検 査 時 に 採 取 しら，胃表層粘液ゲル層内において，TFF2と腺粘液細た 胃 液 を 用 い，胃 液 中 の TFF2と 腺 粘 液 細 胞 ム チ

胞型ムチンは相乗的に作用しているものと考える。

ンを ELISAで測定した。TFF2の ELISAは，抗ヒト

今後，胃粘膜防御因子増強剤の評価法や TFF2産生

TFF2ポリクローナル抗体とリコンビナント TFF2抗腫瘍の分泌物を用いた早期診断法の開発の分野への応原を用いて以下の様に作成した。プレートには1.0用が期待される研究として高く評価し，主査，副査はμg/mL に希釈した抗体を固相し，ブロッキング後，一致して本論文を学位論文として価値があるものと認

標準物質のリコンビナント TFF2抗原あるいは胃液を

めた。

338

信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨

A descriptive studyinvestigating the feasibilityand selectivityofCurrent Perception Threshold in theobjective assessment of post‑operative sub‑acute knee pain（手術後の亜急性膝痛の客観的な評価
における電流知覚閾値の実現可能性と選択性を調査した記述的研究）
青木（論文の内容の要旨）

幹昌VAS と各 CPT とし，独立変数は実験日とした。統臨床場面において，手術後の疼痛は，しばしば患者

計解析は，SPSS 11.0J（SPSS 社）を使用した。

の活動性や意欲を低下させ，運動療法の進行を妨げる【結果】VAS は，TENS 介入後に明らかに減少した。

ことがある。疼痛緩和には，主に消炎鎮痛薬や麻薬性CPT2000Hz は，第２日から第４日で直線的に減少

鎮痛薬が用いられるが，その施行に必要な熟練した医し全期間を通じて低下した。CPT250Hz は，TENS

療者の人手は極めて不足している。そこで，患者本人

介入日で増 加 を 示 し，次 の 非 介 入 日 で 減 少 し た。

が直接操作可能な経皮的電気刺激（Transcutaneous

CPT５Hz は，第３日までわずかに減少したが第５日Electrical Nerve Stimulation：TENS）は，生体にまでほぼ不変であった。

非侵襲なため比的安全な治療法であり，術後の疼痛【考察】本研究では，従来式の TENS で治療された緩和にさらなる利用が期待できる。しかし，鎮痛効

亜急性の術後痛をもつ被験者において，５日間にわた果の判定は，従来から視覚的アナログ尺度（Visual

る VAS と CPT の特徴的な変化パターンを調査した。

Analogue Scale：VAS）に代表される主観的評価法

その結果，CPT2000Hz や CPT250Hz によって Aβが中心であり，客観的な指標に乏しいのが現状である。

線維と Aδ線維の興奮性を選択的に評価できる可能性

近年，電流知覚閾値（Current Perception Thresh-が示唆された。しかし，CPT による C 線維に対する

old：CPT）を指標に用いた報告が増えている。CPT

選択性については明らかではなかった。また，従来式

検査は，皮膚に正弦波形の微弱電流刺激を加え，認知の TENS 治療が亜急性の術後痛を減少させることに可能な最小電流値を測定する方法であり，疼痛を伝達効果的であることを示した。その理由は，TENS がする知覚神経を Aβ線維，Aδ線維，Ｃ線維に分けてAβ線維の感覚閾値を低下させ，同時に Aδ線維の感

それぞれの閾値を計測し，知覚異常の可能性を判定す

覚閾値を上昇させることによって，ゲート機構メカニる方法である。

ズムを賦活させて痛み刺激の伝達を減少させたと考え【目的】本研究の目的は，TENS で治療された亜急性られた。すなわち，本研究で用いた設定の従来式の術後痛を伴った被験者を対象に，CPT 検査を行い知TENS は，緩徐なうずく痛みよりもむしろ鋭い速い

覚神経に対する選択性を評価すること，VAS と比痛みをもつ亜急性の術後痛を減少させるのに効果的として疼痛評価に対する CPT の実現可能性を調査するいえる。しかしながら，本研究は時系列デザインの限ことである。加えて，手術後患者の疼痛管理のために界があり，RCTデザインを使用した将来の研究によっ

TENS の治療効果を，CPT を指標にして明らかにすて，さらに治療効果を明らかにする必要性があると考ることである。

えた。

【被験者と方法】対象は，膝前十字帯再建術を施行（論文審査の結果の要旨）され，臨床研究への参加に同意を得られた17名（男性

本論文は，手術後の亜急性期における膝痛を呈す

11名，女性６名，平均年齢29.2±10.8歳）とした。時る症例を対象として，主観的 な 疼 痛 評 価 法 で あ る

間反転デザイン（Ａ‑Ｂ‑Ａ‑Ｂ‑Ａ）を用い，術後５日

Visual Analogue Scale（VAS）と客観的な評価法で目から連続した５日間にわたり，非介入日（第１，３，ある電流知覚閾値との関連性を指標として，電流知覚５ 日）は TENS の 出 力 ゼ ロ で15分 間 安 静，介 入 日閾値測定の実現可能性と選択性を調査したものである。

（第２，４日）は TENS を15分施 行 後 に，３ 種 類 の対象は，膝前十字靱帯再建術後の17例（男性11例，CPT（2000Hz，250Hz，５Hz）と VASを測定した。

女性６例）で，経皮的電気刺激療法を15分間実施する

CPT 測定は，Neurometer NS3000 （Neurotron 社，

フェーズと実施しないフェーズを交互に繰り返す時間

Baltimore，USA）を用い，TENSは，Trio300（伊藤反転デザイン（Ａ‑Ｂ‑Ａ‑Ｂ‑Ａ）において，主観的な超短波株式会社，東京都）を使用した。従属変数は

疼痛評価法である VAS と客観的な指標である Neur-

No. 5, 2013339

審査学位論文要旨

ometer NS3000を用いた Aβ，Aδ，Ｃ線維の電流知析するための研究デザインにさらなる検討を加え，よ覚閾値を測定した結果，経皮的電気刺激慮法実施フェー

り信頼性のある客観的疼痛評価法についての研究成果

ズにおいては VAS が明らか減少を示し，電流知覚閾

が発表されることを期待したい。

値では，Aβ線維，Aδ線維に関しては選択性が認め

また，審査会や発表会における質疑応答は適切であられたが，Ｃ線維に関しては認められなかったというり，The Journal of Physical Therapy Science にお結果を示した。

いて査読の結果アクセプトされたことから，本研究はわが国の理学療法においては，物理療法の効果を客博士後期課程の学位論文としての価値を有するもので観的な指標に基づいて検討した報告が少ないことから，あるとともに，今後の我が国の理学療法研究としても本研究のような電気生理学的な視点から物理療法の効意義あるものであると，主査，副査の一致した見解が果を検証することは大変意義あるものと考えられる。

示された。

今後は，症例数を増やすとともに，経時的変化を解

Evaluating the qualityof life of people with dementia in residential care facilities（施設に入所している認知症高齢者の生活の質の評価）
中

西

康

祐

（論文の内容の要旨）

施設と特別養護老人ホーム１施設で，１カ月以上施設介【はじめに】高齢化社会の進展にともない，認知症高護を受けている認知症高齢者141名と，その施設に勤務齢者に対するケアの充実が急がれている。認知症疾患

し認知症高齢者のケアに直接従事し心身の状態をよくは慢性進行性の経過をとるため，認知症のケアには生把握しているケアスタッフ74名である。カルテから性活の質＝Quality of Life（QOL）の視点が重要である。

別，年齢，入所期間を調査した。認知機能は MMSE，

QOL は，身体的状態，心理的状態，社会的交流，経認知症重症度は Clinical Dementia Rating（CDR），

済的状態，本人の主観的な全体的 well‑being などが精神症状はNeuropsychiatric Inventory（NPI），日常

含まれる。また QOL 評価には，観察式，自己評価式

生活動作は Barthel Index を用いてそれぞれ評価した。

などさまざまな方法があるが，QOL 評価には自己評

QOL‑AD は認知症高齢者とケアスタッフの双方に実価を重視する必要性がある。これまで，認知症高齢者

施 し た。基 本 情 報，M MSE，CDR，NPI，Barthelの主観的 QOL には関心が向けられていなかった。最Index の二群間の比近になり，在宅や施設入所に関わらず，認知機能障害のＵ検定を行った。主観的 QOL とケアスタッフが評はあっても，多くの認知症高齢者は主観的 QOL の評

価した QOL の比価が可能なことが報告されている。QOL‑AD（Qual-

観的 QOL とケアスタッフが評価した QOL それぞれ

ity of life in Alzheimerʼs disease）は，認知症の中核に影響する因子の検討には，重回帰分析を用いた。

症状である記憶機能を含み，対人関係，生活状況，生【結果】対象となった141名の認知症高齢者うち116名

活動作機能，身体状況，心理状態について項目立てらが主観的 QOL の測定が可能であった。QOL‑AD にれた疾患特異的 QOL 尺度である。QOL‑AD の特徴

回答可能群と回答不能群の間では，MMSE と Barth-

は，同一尺度を用いて患者と代理者（家族介護者，職el Index に 有 意 差 を 認 め た。回 答 で き た116名 は業的介護者）の双方に評価できることである。現在まM MSE の得点は11点以上であった。対象者の主観的で，施設介護を受けている認 知 症 高 齢 者 の 主 観 的

QOL 総得点は28.9点，ケアスタッフが評価した対象については，Mann‑Whitneyには，Pearson の相関行列を，主QOL に関する研究は国際的にも少ない。

者 の QOL 総 得 点 は27.0点 で，両 者 の 相 関 は 低 く【目的】本研究は，施設介護を受けている認知症高齢（r＝0.24）二群間に有意差を認めた。重回帰分析の結者の主観的 QOL と，ケアスタッフからみた認知症高果，認知症高齢者の主観的 QOL は，日常生活動作障

齢者の QOL を同時に評価し，QOL に影響を与える

害（β＝0.207）と NPI のうつ（β＝0.218）と有意に日常生活動作障害，精神症状，認知機能，認知症重症関連した。一方，ケアスタッフが評価した QOL は，度などとの関連を各々検討することである。

，無為無CDR（β＝0.218），NPI の興奮（β−0.193）【対象と方法】対象は，Ｎ県内の介護老人保健施設４関心（β−0.203），脱抑制（β0.254）と有意に関連し340

信州医誌 Vol. 61

審査学位論文要旨た。

の測定に，疾患特異的な尺度である QOL‑AD（Qual-【考 察】認 知 機 能 が 主 観 的 QOLの 測 定 に 強 く 影 響

ity of life in Alzheimerʼs disease）を用いている点がす る こ と が 確 認 さ れ た が，主 観 的 QOL の 測 定 は特徴的である。

MM SE が11点以上あれば可能であることが判る。認認知症高齢者では，認知機能障害を理由に主観的知症高齢者の QOL に対して，認知症高齢者自身とケ

QOL にはほとんど関心が向けられてこなかった可能

アスタッフの捉え方は多くが不一致であり，認知症高性がある。本研究では141名の認知症高齢者のうち116

齢者自身に比べてケアスタッフは得点を低く見積る傾

名（82％）が QOL‑AD に回答しており，M MSE が向が認められた。慢性疾患をもつ人々は自身の QOL

11点以上あれば QOL‑AD に回答可能であることが明を高く見積もるʻが認知症高齢者でdisability paradoxʼ

らかになった。また，認知症高齢者の主観的 QOL はも認められることを本研究は示した。多変量解析の結

日常生活動作障害とうつと関連するのに対し，ケアス

果，認知症高齢者の主観的 QOL は，日常生活動作障

タッフが評価した QOL は認知症重症度，興奮，無為

害とうつと相関することが示された。認知症は慢性進

無関心，脱抑制と関連し，両者の視点が一致しないこ

行性の経過をとり，経過とともに認知機能障害や重症とが判明した。このことは，ケアスタッフの一方的な度は進行する。しかし，先行研究は主観的 QOL に認視点では，対象者本人の QOL を捉えることができな

知機能や疾患重症度は関連しないことを報告している。

いことを示しており，認知症高齢者の生活支援のあり

また，主観的 QOL に影響を与える重要な因子はうつ方を検討するにあたり重要な視点を提供している。

であることを報告している。本研究も同様の結果を確

また，本研究によって施設に入所する認知症高齢者認した。さらに，本研究は日常生活動作障害が施設入にとっては，日常生活動作の障害やうつ状態が QOL

所者の QOL に関連することを示した。日常生活動作に関連することが明らかとなり，施設に入所する認知とうつは QOL の向上に関連する重要な介入目標の可症高齢者の主観的 QOL を向上させるための，日常生能性がある。この研究は施設入所している認知症高齢活動作やうつに対するアプローチの重要性が示唆され者の QOL を総合的に検索した本邦で初めての研究でた。

ある。
（Dementia and Geriatric Cognitive Disorders
32：33‑44，2011）

本研究は施設入所している認知症高齢者の QOL を
総合的に検索した本邦で初めての研究であり，主査，（論文審査の結果の要旨）

副査は一致して本論文を学位論文として価値があるも本研究は，施設 に 入 所 し て い る 認 知 症 高 齢 者 ののと認めた。

QOL を探索した研究で，認知症高齢者の主観的 QOL

Factors associated with functional recovery and home discharge in stroke patients admitted to aconvalescent rehabilitation ward（回復期リハビリテーション病棟に入院した脳卒中患者における機能回復および在宅復帰に寄与する因子の検討）
務

台均（論文の内容の要旨）

脳卒中患者連続例174名（平均年齢：73.0±10.8）で【目的】脳卒中患者の急性期以降のリハビリテーショある。治療効果は，ADL の改善度と自宅退院とし，ンにおいて，本邦では回復期リハビリテーション病棟

ADL 改善度の指標として，退院時の Functional In-

が重要な役割を担っている。回復期のリハビリテーショ

dependence M easure（FIM ）と Montebello rehabil-

ンにおいては，限られた入院期間の中で，いかに効果

itation factor score（MRFS：（discharge FIM ‑的に機能回復を行い，在宅復帰を支援していくかが課

admission FIM ）/（maximum possible FIM ‑admis-

題となる。本研究の目的は，回復期リハビリテーショ）を用いた。ADL の改善度および自宅退sion FIM ）ン病棟に入院した脳卒中患者における，ADL の改善院に寄与する因子の検討には，従来報告のある因子のおよび在宅復帰をアウトカムとし，これに寄与する因うち入院時の患者年齢，性別，家族構成，合併症，発子を検討することである。

症経験，脳卒中のタイプ，発症前の ADL レベル，運【方法】対象は，2006年１月から2008年６月に安曇野

動麻痺の程度，視覚障害，排泄障害，半側空間無視，赤十字病院回復期リハビリテーション病棟に入院した

入院時の Motor および Cognitive FIM を説明変数とNo. 5, 2013341

審査学位論文要旨

して選択し，FIM と M RFS については重回帰分析，

より包括的な介入の必要があり，あわせて介護者の自宅退院の成否については多重ロジスティック回帰分確保に向けた環境調整が重要である。（Geriatrics &析を行った。

Gerontology International. 12：215‑222 2012）【結果】FIM は入院時72.6±27.6点から退院時87.7±（論文審査の結果の要旨）

29.9点に改善した（Ｐ＜0.001）。MRFSは0.30±0.28

本学位論文は，脳卒中患者の回復期におけるリハビであった。自宅退院患者は151名で在宅復帰率が87％

リテーションの阻害要因を縦断研究によって明らかにであった。退院時FIM の阻害因子は，高齢（β＝−0.12，

したものである。

Ｐ＝0.003），脳卒中のタイプが出血性（β＝0.09，Ｐ＝

本研究の特 徴 は，リ ハ ビ リ テ ー シ ョ ン の 帰 結 を

0.005），発症前のADLが介助（β＝0.16，Ｐ＜0.001），

ADL 改善と在宅復帰に分けて，各々の阻害要因を入

半側空間無視（β＝−0.10，Ｐ＝0.001），入院時のmotor

院時の患者属性から検討した点である。回復期病棟に，および入院時のFIM が低値（β＝0.37，Ｐ＜0.001）

入院した174名の患者の退院時の帰結を分析した結果，cognitive FIM が低値（β＝0.46，Ｐ＜0.001）であった。

両者に共通の阻害要因は脳卒中発症前に ADL 介助で，MRFSの阻害因子は，高齢（β＝−0.22，Ｐ＝0.003）

あったこと，認知機能低下，半側空間無視であり，発症前の ADL が介助（β＝0.25，Ｐ＜0.001），入院

ADL 改善固有の阻害要因は運動機能良好，高齢であ時のmotor FIM が高値（β＝−0.28，Ｐ＝0.003），おることを報告した。一方，在宅復帰固有の阻害要因は，

よび入院時の cognitive FIM が低値（β＝0.56，Ｐ＜

一人暮らしと女性であり，在宅復帰には患者の ADL

0.001）であった。自宅退院の阻害因子は，女性（OR＝能力に加えて，社会的要因が影響していることを報告

0.13；95％ CI 0.03‑0.50；Ｐ＝0.003），一人暮らしした。

（OR＝23.25；95％ CI 3.79‑142.56；Ｐ＝0.001），発

脳卒中回復期に集中的にリハビリテーションを行う

症前のADLが介助（OR＝0.09；95％CI 0.02‑0.37；

回復期リハビリテーション病棟は，2000年に新設されＰ＝0.001），半側空間無視（OR＝0.04；95％CI 0.01

た日本独特のシステムであり，大規模に実施され，患‑0.27；Ｐ＝0.002），および入院時のcognitive FIM が者数などの統計が詳細に報告されている。しかし，リ

低値（OR＝1.12；95％CI 1.03‑1.22；Ｐ＝0.010）でハビリテーション・プログラムのあり方を探究するたあった。

めの，因果的説明を可能にする縦断研究はほとんど行【考察】回復期リハビリテーション病棟における脳卒

われていない。ADL 改善や在宅復帰が難しいと考え中患者の在宅復帰率は87％と高く，M RFS で示されられる患者条件が明らかになれば，入院当初から，そるリハビリテーションの効率も海外での報告とほぼ同れに対応したプログラムを構築することができるよう等の数値であった。また，認知機能障害と発症前のになる。本研究は，その患者条件を提言している点にADL が介助であることが，回復期の脳卒中患者の加えて，脳卒中回復期に実施したリハビリテーション

ADL 回復の程度およびリハビリテーションの効率，の帰結を分析する研究手法も新たに提案している点が在宅復帰の共通の阻害因子であることが示された。入評価できる。このことから，本研究は効果的・効率的

院時の認知機能障害は，しばしばリハビリテーション

な回復期リハビリテーション・プログラムの発展に寄プログラムの理解や遂行に支障を来し回復を阻害する，与する研究といえる。

あるいは認知機能障害の背景である中枢神経系の障害

公開学位論文審査は平成25年１月23日（保健学科が，動作学習における神経ネットワークの可塑性にも212教室）16時から，主査，副査を含めた別紙の参加

影響している可能性もある。一方，脳卒中発症前にお者名簿に示した５名の関係各位同席の中で開催された。

ける ADL 障害の存在は老年症候群をはじめとする加本審査会での冒頭，申請者である「務台 均」に本研

齢関連のさまざまな身体機能，精神および認知機能障究の概要を述べさせたのち，主査，副査からの質疑応

害を示唆するものであり，新たに発症した脳卒中によ答を行ったが，質疑に対しては別紙様式第８号のようる障害の回復を阻害し，さらなる機能低下を引き起こなやり取りが行われ，質問に対する応答は概ね適切です過程が推測される。自宅退院の成否には，性別や家あることを確認し，本研究の遂行に十分な学力を有し族構成といった社会的要因が関連しており，自宅退院ているものと評価した。よって主査，副査は一致してには適切な介護者の確保が必要とされる。これら認知

本論文を学位論文として価値があるものと認めた。

機能障害や病前より機能障害のある脳卒中患者には，

342

信州医誌 Vol. 61