鳥取大学 新技術説明会（令和５年３月７日）

ストロビルリンXによる細胞増殖抑制作用
鳥取大学 農学部 共同獣医学科
菌類きのこ遺伝資源研究センター
新機能開発研究部門
准教授 高橋 賢次
1

菌類きのこ遺伝資源研究センター
きのこ由来生理活性物質の探索
遺伝資源
多様性研究部門

遺伝資源
評価保存研究部門

有用きのこ栽培研究部門

きのこ資源の提供

物質活用研究部門

抽出物ライブラリーの調製・提供

新機能開発研究部門

抽出物ライブラリーの機能評価

有用資源の情報還元2

菌類きのこ遺伝資源研究センター
液体窒素気相タンク（-170℃）
TUFC菌株コレクション• 保有株
９、０９７株のきのこ類菌株を液体窒素で凍結保存• ＤＮＡシーケンスによる同定確認実施• 品質確認済みの菌株を公開・分譲• 菌株データベースを公開

凍結標品の作製

菌株を保存する凍結チューブ
3

物質活用研究部門

きのこ抽出物ライブラリーの概要
１０００種の菌株の中から属の異なる４００株を選抜
多様な菌類

菌糸体

液体培養物

培養ろ液抽出物
菌糸体抽出物子実体
子実体の発生栽培子実体抽出物

天然子実体の採集

天然子実体抽出物
44

抽出物の作製(菌糸体の場合）
保存菌株

200 mL (500 mL フラスコ）x 10 / １系統

物質活用研究部門

植菌
培養

液体培養物

培養室 ２〜３ヶ月

菌糸体と培養液の分離 ろ過菌体

ろ液
凍結乾燥 凍結乾燥機

有機溶媒分配抽出粉砕

脱水

有機溶媒抽出遠心分離 遠心分離機
濃縮

濃縮抽出物

遠心エバポレーター

抽出物 100 mg / １系統 程度 フリーザー 集約して管理、データベースの整備
5

抽出物の作製(子実体の場合）物質活用研究部門
子実体
乾燥粉砕
有機溶媒抽出遠心分離 遠心分離機
濃縮

遠心エバポレーター

抽出物 100 mg / １系統 程度 フリーザー

集約して管理、データベースの整備
6

きのこ抽出物ライブラリーの利点
多様なきのこの抽出物
類似のライブラリーと比較して大規模、非食用きのこも含む。

効率の良いスクリーニング
培養、抽出、濃縮といった長い時間と大きな労力のかかるステップを回避して、ユニークなアッセイ系との橋渡しができる。

菌糸体、培養ろ液、子実体の抽出物が使用可能
培養条件によって生産される化合物が全く異なる。

大量培養や化合物の分画、精製が可能
菌株、培養条件はっきりしている。近縁種を調べることもできる。
7きのこ抽出物ライブラリー進捗状況
２０１４年２月スタート
きのこセンターから分譲していただいた系統
抽出物作成終了 ２，１７３サンプル

8

抽出物ライブラリーの細胞増殖抑制活性探索抽出物ライブラリー

増殖活性測定（WST法）

培養細胞
・HL60－白血病由来（ヒト）・A549－肺がん由来（ヒト）・G361－悪性黒色腫由来（ヒト）・NB1RGB－正常皮膚由来（ヒト）・WI-38－正常肺由来（ヒト）

増殖活性測定・抽出物適用： 24 – 72 hrs・活性測定 ： WST-8

・有用菌株と近縁種による比較検討
・抽出物に含まれる有用物質の同定・機能解析

9抽出物ライブラリー（菌糸体）の細胞増殖抑制活性探索50 μg/mL、24 hrs

1.0

ヒト
正常線維芽細胞G361

NB1RGDNB1RGB**0.80.6

**

0.4
0.2
0.0

＃1
＃2
＃3
＃4
＃5
＃6
＃7
＃8
＃9
＃10
＃11
＃12
＃13
＃14
＃15
＃16
＃17
＃18
＃19
＃20
＃21
＃22
＃23
＃24
＃25
＃26
＃27
＃28
＃29
＃30
＃31

Cell viability

1.2

ヒト
メラノーマ

10ヌメリツバタケモドキ
学名：Mucidula mucida var. venosolamellata
グループ（門）：担子菌門（basidiomycota）
科：タマバリタケ科（physalacriaceae）

属：ヌメリツバタケ属（mucidula）
特徴：子実体は白色で軟らかい。ひだはヌメリツバタケ（Mucidula mucida）と異なりしわがある。
可食きのこ。
11

ブナシメジ
学名：Hypsizygus marmoreus
グループ（門）：担子菌門（basidiomycota）
科：シメジ科（lyophyllaceae）

ホクト株式会社属：シロタモギタケ属（hypsizigus）

特徴：人工栽培され「シメジ」として販売されている可食きのこ。
12

ヌメリツバタケモドキ抽出物からの化合物の分離

ヌメリツバタケモドキ抽出物
Purification by silica gel chromatography（acetone-hexane）

0%10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% MeOH
Purification by silica gel chromatography（ethyl acetate-hexane）

0%①～10%②

10%②

10%③

20%① 20%② 20%③ 30%①~30%② 30%③～MeOH

Fractionation by HPLC)（Acetonitrile-H2O）

Fractionation by HPLC)（Acetonitrile-H2O）

Compound 1

Compound 213

ヌメリツバタケモドキ由来化合物の細胞毒性
ヒトメラノーマ
48 hrsEZE

Compound 1: Strobilurin A(MW: 258)

ヒト正常線維芽細胞

NB1RGBEZE

Compound 2: Strobilurin X(MW: 288)

14

ストロビルリンXの細胞毒性

48 hrs ヒト肺がん細胞

Cell viability

1.2

A549

0.81.2ヒト子宮がん細胞HeLa

0.80.41.2

ヒト正常線維芽細胞
WI38

**
**

75

0.80.4100

IC5050(μM)

0.4

25000

-7 -6 -5 -4 -3-7 -6 -5 -4 -3-7 -6 -5 -4 -3[Strobilurin X] Log(mol/L)[Strobilurin X] Log(mol/L)[Strobilurin X] Log(mol/L)

0A549

A549

HeLa

HeLa

WI38

WI38

15

ストロビルリンXのアポトーシス誘発作用
ヒト肺がん細胞（A549）－24 hrs
Strobilurin X(21.7 μM)

6.9%

6.4%

32.0%

PIVehicle

Strobilurin X(10.9 μM)

Annexin V - FITCAutophagy

6 hrStrobilurin X(21.7 μM)

G361

- +NBB1
RGB- +ER stress

A549 HeLa

G361- +- + - +LC3-I
LC3-II

GRP78

BeclinActin

NBB1
RGB- +

A549 HeLa- + - +16

ストロビルリンXの呼吸鎖抑制と細胞毒性の関係

StrobilurincompoundComplex IV

Complex I
Complex II

Cyt c

Complex III

IC50=399.5±69.5 nM

高い抗菌活性0.80.40.01.210080
60
402000.80.4
0.0-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3[Strobilurin X] Log (mol/L)[Antimycin A] Log (mol/L)

10.0

Lactate (mM)

ストロビルリン系農薬

1.21008060
40200

Wood and Hollomon, Pest Manag Sci, 2003, 59: 499

IC50=13 nM

48 hrs

8.0

A549

6.0

G361

HeLa

4.0

WI-38

2.00.0Cell viability (⚫, )

Mitochondrial respiratory chain

Complex III activity (%, , )

A549

NB1RGB
VehVehicle

X1.56

5.4 μM Strobilurin X

17

ストロビルリンXの呼吸鎖抑制と細胞毒性の関係

ピリミジン合成経路

Boukalova et al., BBA-MolecularBasisofDisease, 2020, 1866: 165759

18

ストロビルリンX誘発細胞毒性に対するウリジンの効果

A549□ Vehicle■ Strobilurin X (21.7 μM)

48 hr
1.2

Uridine (50 μg/mL)

**

*

*

025 50 100 200

1.00.8Cell viability

Cell viability

1.0

0.6

0.4Vehicle

0.2

0.8
0.6
0.4
0.2

0.0

0.0

-7-6-5-4-3[Strobilurin X] Log (mol/L)

Uridine (μg/mL)19

ストロビルリンXの活性酸素種生成能

A549
A549

G361

HeLa

NB1RGB

1.2

StrobilurinX(21.7 μM)

Count

MFI:536

MFI:673

MFI:412

MFI:209

MFI:721

MFI:223

MFI:262

Cell viabilityVehicle

Count1 hr

48 hr□ Vehicle■ Strobilurin X (21.7 μM)

0.8

0.4

MFI:205
0.0Veh1mM NAC

DCF

20

ストロビルリンXのミトコンドリア障害作用G361, 12 hr
VehicleStrobilurin X(21.7 μM)

91.4%

87.3%

JC-10 Red

92.1%

Strobilurin X(10.9 μM)

JC-10 Green21

細胞増殖関連分子に対するストロビルリンXの作用
Strobilurin X NBB1RGB A549 HeLa
(21.7 μM)
- + - + - +phosphoErk

NB1
RGB A549 HeLa
pS473
pS308
TotalErk
phosphop38
p38
phosphoJNK
JNK
phosphocRaf- +- + - +Akt

phospho-PTEN
phospho-PDK-1
phospho-GSK-3ββ-Actin

A549

Cell viability

PD: PD98509 (10 μM), MEK inhibitor
U01: U0126 (10 μM), MEK inhibitor
SB: SB203580 (10 μM), p38 MAPK inhibitor
JNKi: JNK inhibitor (10 μM)
LY: LY294002 (10 μM), PI3K inhibitor

1.2□■Vehicle
Strobilurin X (21.7 μM)

0.8

0.40Veh
10PD 10U126 10SBVehicle
PD U01
SB

5JNKi

JNKi

5LY

LY

22

ストロビルリンXの細胞周期調節作用

Count

24 hr
A549

HeLa

WI38Vehicle

VehicleVehicle

G1
SubG
1A549

HeLa

WI38

SubG1100S100100757550502525G2/M75G1

10.9 μM Strobilurin X

10.9 μM Strobilurin X% 5025Count

10.9 μM Strobilurin X

0Strobilurin X(10.9 μM)

SG2/MVehicle-

03.12 μg/mL+

Vehicle-03.12 μg/mL+

Vehicle-3.12 μg/mL+PI

23

ストロビルリンXのタンパク質合成阻害作用
がん細胞

30 minA549

ヒト正常線維芽細胞

HeLa

NB1RGBWI38Vehicle
50 μm

Strobilurin X(21.7 μM)24

総 括・ヌメリツバタケモドキ菌糸体及び培養ろ液抽出物からストロビルリンXの単離に成功し、がん細胞に対して強力な細胞毒性作用があることを明らかにした（「癌細胞増殖抑制剤」特開2022-090502）。
・ストロビルリンXは、ミトコンドリア呼吸鎖電子伝達系complex IIIを阻害することで細胞毒性を引き起こしたが、それ以外のメカニズムによる細胞毒性の可能性を新たに発見した。
・ストロビルリンXは、活性酸素種の生成を誘発するものの、細胞株に依存し、細胞毒性作用との関連性は見られなかった。
Strobilurin X・ストロビルリンXは、細胞増殖シグナル伝達経路への関与は見られなかった。
・ストロビルリンXは、細胞周期の停止を誘発した。
・ストロビルリンXは、タンパク質合成阻害作用を示した。
・ストロビルリンXを含むストロビルリン系化合物には新たな腫瘍細胞特異的な増殖阻害作用があることが明らかとなった。

ROS

Cell cycle
Polypeptide

RibosomemRN chainA

Cancer cells
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本技術に関する知的財産権• 発明の名称：癌細胞増殖抑制剤• 出願番号：特願2020-202938• 公開番号：特開2022-090502• 出願人：国立大学法人鳥取大学• 発明者：高橋賢次、石原亨、井上裕貴26

お問い合わせ先
国立大学法人鳥取大学
研究推進機構ＴＥＬ 0857‐31‐5546
ＦＡＸ 0857‐31‐5571
e-mail sangakucd＠ml.cjrd.tottori-u.ac.jp
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