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体内に発現する苦味受容体の機能解析＜令和 2 年度助成＞

体内に発現する苦味受容体の機能解析加藤英介（北海道大学大学院 農学研究院）

1．目的

2．マウス体内組織における Tas2r の発現解析「味」は食品の機能の一つであり、甘味、うま味、雄性の C57BL/6J マウスより白色脂肪組織および苦味、酸味、塩味が基本味と呼ばれている。動物は、

肝 臓 を 採 取 し、qPCR 法 に よ る Tas2r 発 現 解 析 をそれぞれの味を感知することで自身の体に必要な栄行ったところ、肝臓では発現量が低く有意な結果が養素を含むか判断している。基本味のうち苦味は、得られなかったが、白色脂肪組織では Tas2r108, 126,一般に忌避する味であるため有害な食品を感知する135, 137, 143 を定量可能なレベルで発現していた。

ための感覚だと言われている。近年、苦味成分を感これら Tas2r の発現量が変動するか、1）組織採取

知する苦味受容体（TAS2R）が口腔以外の様々な組前の絶食、および 2）組織採取後の苦味化合物によ織にも発現していることが明らかとなり、それらのる刺激、の二点について検討したところ、いずれの機能に関心が集まっている。気道や消化管などの上条件でも Tas2r108, 137 の発現が有意に上昇した皮性組織では、TAS2R が細菌や寄生虫を感知して免（図 1）。また、マウス白色脂肪細胞のモデルである疫反応を惹起するなど、免疫機能に関わることが明3T3-L1 脂肪細胞と肝細胞モデルである NCTC1469

らかとされている細胞においても、苦味化合物刺激により Tas2r の発。

1, 2)

一方で、肝臓、筋肉、脂肪、精巣、脳など非上皮現量が変動することを確認した（図 2）。

性組織でも TAS2R 遺伝子の発現は見られる 。それ

次 に、Tas2r の 一 部 ア ミ ノ 酸 配 列 を 抗 原 と し て

ら非上皮性組織で発現する TAS2R の働きは、ほとん

Tas2r 抗体を作製し、3T3-L1 脂肪細胞および Hepa

どわかっていないが、TAS2R の遺伝的変異が男性の1-6 肝細胞モデル株において Tas2r108, 126, 135,不妊 、糖尿病 、肥満にリスクと相関するとい137, 143 をタンパク質として発現しているかウェスう報告がある。こうした報告は、TAS2R が非上皮性タンブロッティング法により解析した。いずれの抗組織においても機能しており、かつ、その機能が免体でも多数のバンドが検出されたが、3T3-L1 細胞疫にとどまらないことを示唆している。

では Tas2r108, 126、Hepa1-6 細胞では Tas2r126 の3)

4)

5)

6)

このようなことから、非上皮性組織における TAS2R機能を解析することで、食と健康のつながりを考え分子量に相当するバンドが検出され、これらタンパク質の発現が示唆された。

るための視点をもたらすことが期待できる。そこで

以上より、白色脂肪組織、肝臓における Tas2r 発

本研究では、特に TAS2R の遺伝子変異と糖尿病や肥現を確定させるには追加の検討が必要であるが、各満リスクとの相関に注目し、非上皮性組織のうち脂組織の細胞は一部の Tas2r を発現しており、苦味化肪組織と肝臓における TAS2R の機能解析を目的と合物を認識していることが推定された。

した。

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浦上財団研究報告書

図1

図2

Vol.31（2024）

絶食（左）および苦味化合物刺激によるマウス白色脂肪組織の Tas2r 発現変化。
eWAT：精巣上体脂肪組織、iWAT：鼠径部脂肪組織、*p<0.05 to control

3T3-L1 脂肪細胞（左）および NCTC1469 細胞（右）の苦味化合物刺激による Tas2r 発現変化。*p<0.05 to control

3．3T3-L1 細 胞 を 用 い た 脂 肪 細 胞 に お け る
Tas2r 機能の推定

seq 解析により遺伝子発現変化を網羅的に解析した。
発現量が変化した遺伝子をもとに、遺伝子オントロジーエンリッチメント解析（GO 解析）により関係

脂 肪 細 胞 に お け る Tas2r 機 能 を 推 定 す る た め、する細胞機能を探索した結果、Tas2r126 のリガン

3T3-L1 脂肪細胞を Tas2r108 と 126 のリガンドでド刺激が脂肪細胞分化に影響する遺伝子発現変化を刺激することで Tas2r が活性化する状態にし、RNA-起こすことがわかった（図 3）。

図3

Tas2r126 リガンドで刺激した 3T3-L1 脂肪細胞において発現が上昇した遺伝子の GO 解析結果（上位５項目）

体内に発現する苦味受容体の機能解析

図437

3T3-L1 脂肪細胞への Tas2r126 リガンド刺激による転写因子の遺伝子発現変化（左）と Tas2r を過剰発現させた 3T3-L1 細胞の分化後脂肪蓄積量への影響。Tas2r108/126 OE：Tas2r 過剰発現細胞。*p<0.05 to control (t-test), alphabet (Tukey, p<0.05)

さらに個別の遺伝子発現変化の解析から、脂肪細胞分化への影響には Egr2、Nr4a1-3 といった転写因4．Hepa1-6 細 胞 を 用 い た 肝 細 胞 に お け る
Tas2r 機能の推定子が関与している可能性が示された。この RNA-seqによる結果は、qPCR 法でも再確認されたため（図肝細胞おける Tas2r 機能を推定するため、Hepa4 左）、Tas2r126 は 3T3-L1 細胞の脂肪細胞への分1-6 細胞をモデルとした解析を行った。まず、Hepa化を調節する機能があると推定した。

1-6 細胞が Tas2r126 を発現していることを明確に次に、脂肪細胞における Tas2r126 の推定機能にすることとした。Tas2r126 抗体を用いたウェスタ

ついて検証するため、3T3-L1 細胞にプラスミドベ

ンブロッティングでは、Tas2r126 に分子量が相当クターを導入して Tas2r108 および Tas2r126 を過するバンドは見られたが、他にも多数のバンドが検剰発現させた。この Tas2r 過剰発現細胞を脂肪細胞出され確定できていなかった。そこで、CRISPR-Cas9へと分化させたところ、分化誘導後の脂質蓄積量が法を用いて Tas2r126 ノックアウト細胞を作製した。

有意に減少したことから、Tas2r には脂肪細胞の分作製したノックアウト細胞と野生型を、Tas2r126化調節機能があることが示された（図 4 右）。また、抗体を用いたウェスタンブロッティングで比較した

これら Tas2r 過剰発現細胞に Tas2r126 のリガンド

結果、ノックアウト細胞でバンドが消失し、Hepa1-6を添加するとさらに脂質蓄積量が減少したが、コン細胞が Tas2r126 を発現していることを確定させる

トロール細胞にリガンドを添加した場合でも脂質蓄ことができた（図 5）。

積量の有意な減少が観察されたため、リガンドがTas2r126 を 刺 激 し た 結 果 で あ る か は 判 別 で き な
かった。なお、細胞の形態観察から、これら脂質蓄積量の減少は、脂肪細胞への分化が抑制されたものと推定されているが、分化マーカーなどの詳細な解析を行い、細胞分化が抑制されているのか、それとも脂質の合成や代謝への影響も含まれるのか確認の必要があると考えている。

図 5 Hepa1-6 細胞の Tas2r126 発現解析
Con：野生型 KO：ノックアウト

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浦上財団研究報告書

図6Vol.31（2024）

Tas2r126 リガンドで刺激した Hepa1-6 脂肪細胞において発現が上昇した遺伝子の GO 解析結果

次に、Tas2r126 の機能推定のため、Hepa1-6 細謝

辞胞を Tas2r126 リガンドで刺激した際の遺伝子発現

本研究を行うにあたりご支援いただきました公益

変化の網羅的解析を行った。前項の 3T3-L1 脂肪細財団法人 浦上食品・食文化振興財団に感謝申し上げ

胞の解析においては、Tas2r リガンドで刺激した際ます。の遺伝子発現変化が少なかった。そこで Hepa1-6 細胞では、変化を顕著にするため Tas2r126 を過剰発

参考文献現させた細胞を用いることとした。プラスミドベク

1) Luo, X.-C. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 116, 5564–5569 (2019).
2) Shaik, F. A. et al. Int. J. Biochem. Cell Biol. 77, 197–204 (2016).
3) Expression Atlas. https://www.ebi.ac.uk/gxa/home(2022).
4) Gentiluomo, M. et al. Hum. Reprod. 32, 2324–2331(2017).
5) Dotson, C. D. et al. PLoS One 3, e3974 (2008).
6) Ortega, F. J. et al. Mol. Nutr. Food Res. 60, 1673–1683 (2016).

ターを用いて Hepa1-6 細胞に Tas2r126 を過剰発現させ、Tas2r126 リガンドで刺激した際の遺伝子発現変化を網羅的に解析した。発現量が変化した遺伝子をもとに、GO 解析により関係する細胞機能を探索した結果、脂質の代謝や分子輸送に関わる機能への影響が推定された（図 6）。個別の遺伝子発現を解析すると糖や脂質の輸送タンパク質の発現量の変動が見られ、肝細胞において Tas2r はこれらの輸送を制御する機能を有していることが推定された。

5．総括
本研究では、脂肪細胞と肝細胞に Tas2r が発現しており、その機能が細胞分化や物質輸送に関わることを見出した。本研究ではモデル細胞株を用いているため、生物の組織、個体レベルでも同様の機能を有しているか今後研究を発展させ示していきたいと考えている。

Functional analysis of bitter taste receptors expressed in internal organs

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Functional analysis of bitter taste receptors expressed
in internal organs
Eisuke KATO
Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University
Taste 2 receptors (TAS2Rs) are responsible for the perception of bitter taste
in the oral cavity, but have also been reported to be expressed in extra-oral
tissues. Among extra-oral TAS2Rs, those expressed in epithelial tissues such as
the respiratory and digestive tracts are reported to have immune-relatedfunctions. However, the functions of TAS2Rs in other tissues have not been
substantially clarified. This study aimed to reveal the functions of TAS2Rsexpressed in white adipose tissue and the liver. A study using mouse white
adipose tissue showed that five Tas2r are expressed in this tissue, and that theexpression level increases in response to fasting or direct stimulation withTas2r ligands. Detection of Tas2r proteins in 3T3-L1 adipocyte model cells andHepa1-6 hepatocyte model cells suggested the presence of two Tas2r proteinsin 3T3-L1 cells and one Tas2r protein in Hepa1-6 cells. An RNA-seq analysis of
3T3-L1 adipocytes stimulated with a Tas2r ligand following a gene ontologyenrichment analysis identified fat cell differentiation as the relevant term.
Overexpression of Tas2r in 3T3-L1 cells following differentiation of the cells
resulted in decreased lipid accumulation, suggesting that the Tas2r of adipocyte
functions to regulate differentiation. An RNA-seq analysis of Tas2r
overexpressing Hepa1-6 cells stimulated by a Tas2r ligand, followed by a gene
ontology enrichment analysis identified transmembrane transport and lipid
metabolism as the relevant term, indicating that the Tas2r in hepatocytes mayregulate these processes. In summary, the Tas2r in adipocytes and hepatocytes
were studied, and their suggested functions were revealed in this study.