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ワサビ成分の神経細胞分化促進活性に関する研究

ワサ ビ成 分 の神 経細 胞 分化促 進 活性 に関 す る研 究

福家洋子(都 立短期大学健康栄養学科教授)

るが ワサ ビの あのツー ン とくる辛 み成分 の主成 分
1.はじめにではな い。
日本 独特 の香辛料 で あるワサ ビの辛み 成分が,また,ワ サ ビ と同 じアブ ラナ科 の ブロ ッコリー

微生物 の生育 抑制効 果 をもつ ことか らこの成分 でか らは,メ チ ル基が2分 子少 ない同族体 のス ルフ

あ るア リル イ ソチ オ シ アナ ー ト(AIT,CH2=ォラ フ ァン[4‑(メ チル スル フィニ ル)ブ タ ンイ

CH‑CH、=N=C=S)を利 用 した食 品 の保 存法

ソチ オ シアナ ー ト](4‑MITCと略)が 単 離 ・同等が開 発 されてい る。著者 らは,ワ サ ビ成分の抗定 され てい る4)。Zhangら は,4‑MITCが菌 性以 外の生 理的活 性 に関 す る研 究 を進 めて きた。

第 二相解 毒酵素 であ るキノ ンレダ クターゼ誘導 活

肝臓 のそ の過 程 で,ワ サ ビ の水 抽 出画 分 を95℃以 上10性 を もち,ラ ッ トでの乳 ガ ンの重量減 少や遅延 効

min加 熱 した試料 中 に強 い抗腫 瘍 活性 を もつ成果 を報 告 して いる5)。著 者 ら もワサ ビの6‑MITC分が 存在 す るこ とを見い 出 した1)。活 性成 分検 索も また キ ノンレダ クターゼ誘 導活性 を もつ こと をの タ ー ゲ ッ ト細胞 と して ヒ ト胃癌 細胞 由 来 の発 表 し6),マ ウスで の実験 腫瘍 転移 系 を使 い,超MKN‑28細微 小転 移の段 階で肺 におけ る増 幅遺伝 子 を検 出す

胞 を用 い て,ワ サ ビ に存 在 す る抗腫瘍成 分の1つ を同定 し,そ の構 造 を決定 した2)。

る という転移検 出系 によ って,ワ サ ビの6‑MITC

Fig.1に 示す よ うに分子 量205の6一 メチ ルスル フが転移 を抑制 する ことを報告 してい る7・8)。

ィニル ヘ キ シル イ ソチ オ シア ナ ー ト(6‑MITCと略)一で あった。 この成 分は,沢 ワサ ビ特有 の香

このよ うにワサ ビ成 分(6‑MITC)の種々 の培

養細胞 への影響 を検討 す る過 程で,未 分化芽 球でりを構 成す る成分 の1つ であ るこ とが報 告 されてあ るK‑562細い る3)。また この成分 は,多 少 の辛 みを有 してい

6‑MITCが胞が形態 的変化 を示 した こ とか ら,細 胞 の分 化誘 導 に何 らか の影 響 を及ぼす と推察 され,本 研 究 を開始 した。

実験方法
1.細胞 系お よび培 養

K‑562細 胞:慢 性骨 髄 【生ヒ ト白血病 細胞 。未分化芽 球 で,穎 粒 球 ・赤 血 球 ・マ ク ロフ ァー ジ ・巨核球 な どへ分化誘 導可能 な多能性 幹細胞 であ る。
培 養 は,RPMI1640培

地(シ グマ 社)にFBS(牛胎 児血 清:コ スモバ イオ)を10%濃し,37℃,5%CO,イFig.1ワ

サ ビ ・ブ ロ ッ コ リー の 活 性 成 分度 で添加

ンキ ュベ ー ター内で 行 った。

PC‑12細 胞:ラ ット副 腎髄質 褐色細 胞か らクロ

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浦上 財 団研 究報 告 書Vol.7(1999)

一 ン化 。NGF(神Table16‑MITCに経 成長 因 子)の 添加 によ り数

よ るK‑562細胞 の 形 態 変化

日で肥大 し,扁 平 とな り長 い神 経線維 を伸 ばす。
神経 細胞 に類似 した形態 を とる。副 腎髄 質 のク ロ
ム親 和性細 胞 は,発 生段 階の細 胞分 化の系譜 か らす れば,末 梢神 経系の仲 間 と考 え られ,種 々の性質 を備 えてい る9}。
培 養 は,RPMI1640培

地 に非働化 した10%HS(馬血 清:コ スモ バ イオ)お よび5%FBSを添加 し,培 養 した。
なお 分化 誘 導実 験 で は,RPMI1640培
織 培養 用添加 剤RD‑1(極地 に組東)を 加 え,無 血 清培

地 を使用 した。
2.試料 お よび試薬

沢 ワ サ ビ の抗 腫 瘍 成 分 で あ る6‑(methylsul‑finy1)hexylisothiocyanate(6‑MITC)および

プ ロ コ リー に見 出 さ れ た4‑(methylsulfinyl)
butylisothiocyanate(4‑MITC)は,化学 合成品

RPMI培

地+FBS5%

RPMI培

地+FBS5%(白鳥 製薬)を 使用 した。な おCH3‑SO‑(CH2)n‑NCSの基本 構造 は,同 じで ある がメ チル 基 の長 さが細 胞の変 化 に影 響 を与 え るので はないか と考 え,メ チ ル基 の長 さ(n=2,8)につ いて も合成 し,一 部 実験 に用 い た。つ まり,n=2,4,6,8の イ ソチオ シアナ ー トが準備 され た。神経 成長因 子(NGF)は,ChemiconInternationalInc.
製 マ ウス顎 下腺 由来2,5Sを使用 した。 コラー ゲンは,新 田ゼ ラチ ン㈱ 生物化 学研究 所製組 織培養+6‑MITC(2μg/m!)

用 コ ラーゲ ンタイ プ1‑Aを 使 用 した。
結果 および考 察
1.K‑562細Fig.2K‑562細胞 の形 態 変 化

化 をFig.2に 示 したが,試 料 添 加細 胞 で は,細胞の形 態変化 に及 ぼす影響

回収 され た細 胞 を1.0×105/mlに胞 が明 らか に長 形に なった。 この細長 い細 胞は,調 製 し,96

膜 染色,核 染色 に よって生細 胞で ある ことを確か

ウエル マイ クロ プレー トに100μ1ず っ播種 し,1めて い る。分化 誘 導剤 で あ るハー ビマ イ シンA

時 間 後 に各試 料 を添 加 した。FBSのに よる細 胞の変 化 と類 似 していた。 また核 染色 に

量 は,5%に減 じて培 養 し24,48時 間培 養後 の影響 を調べ た。
Table1にK‑562細胞の48時 間後 の顕微 鏡写真

か ら算 出 した形 態変化 の結果 を示 した。形 態的変よ って核 の大 き さを比較 したが,お お きな差 は見られ なかった。
形態変 化の程 度 は表 下 に示 す ように3段 階 とし

ワサビ成分の神経細胞分化促進活性に関する研究99

た。試料 濃度 が高 くな ると強 い細胞 毒性 によ り細て 表 した(Fig.4)。50,100ng/mlで胞 は,死 滅す るが,濃 度 を下 げて ゆ くと細胞 の分の 伸展 は,顕 著 で あっ た。100μmま で の長 さ で化 を促進 す るもの と考 え られた。 メチル基 の長 さは,NGFのに よる 影響 を見 る と,n=4,6,8ので あ った。6‑MITCの中 で は,細添加量 が50ng/m!のの神 経線維

方 が高い くらい影 響 を調 べ る実験 では,

胞 毒性 の 強 さ に比 例 した結 果 とな った。n=2でNGF量は,24時 間の時 点で,わ ず かなが ら形態変化 が観な いが,細 胞数 は,神 経線 維数 と反比例 した。

を50ng/m1と 設 定 した。結果 を示 して い察 されて いた。

2.36‑MITCに

2.PC‑12細胞 の分化誘 導に及 ぼす6‑MITCの進効果

胞 に対す る細胞増 殖抑制 活性NGF(50ng/ml)お影響

PC‑12細2.1PC‑12細ワサ ビの6‑MITCは,抗よるPC‑12細 胞 の分化 誘 導促

胞 を無 血 清 培 養 し,24時
よ び6‑MITCを間 後 に

添 加 し培 養腫瘍 成 分 と して研 究を行 った。 なお,培 養4日 ご とに培 地お よび添加され た もので あ り,強 い細胞毒 性 を有 して いる。

試 料 は,交 換 され た。培 養12日 目 の 測 定 値 を分化 誘導 実験 を行 うにあた り,試 料濃 度 を決 定すFig.5に 示 した。結果 は,NGF50ng・NGF+6るため にPC‑12細‑MITC(2μM)・NGF十6‑MITC(5胞 に対 す る細胞 増殖 抑 制活 性を調 べた 。生細 胞数 の測定 は,MTTアッセー1°)に よ り行 った。結 果 をFig.3に 示 した。 この結 果MITC(5μM)がよ り,6‑MITCを10μM以数 が 高 くな った。6‑MITCが2μMで上 に設 定 す る と細 胞の死滅 す る割合 が高 まる ことか ら,本 実験で は,,uM)の3実 験 を比 較 した も の で あ る。NGFおよ び6‑

存 在 す る実験 区 が,神 経線 維
は,差 が見 られず さらに添加量 の検討 が必要 であ る。 また2.0お よび5.0μMの 条 件 とした。
2.2NGF添

加 量 と神 経線維 数の変化

48ウ エ ルプ レー トをコラー ゲン コー トした後,PC‑12細 胞 を2×104/mlに調 製 し,各 ウ エル に0.5mlず つ 分注 し培 養 し た。24時 間後 にNGF
を0・50・100ng/mlにな る よ う に添加 した。 培

養12日 目 に神 経様樹 状突起 の変化 を撮影 し,顕 微鏡写真 か ら神 経線維 の長 さを測定 し3段 階 に分 け
Fig.4NGF添

Fig.36‑MITCの細胞増殖抑制率

Fig.56‑MITCの加量 と神経線維伸展

神経線維伸展に及ぼす影響

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写 真を割 愛 した が,培 養6日 目の神 経線 維の 伸展とを期待 させ るもので ある。

が始 まる時点 では,両 者の差 が さらに顕著 であ った。
なぜ,6‑MITCを終わ りに臨 みま して,本 研究 に多大 な研究 助成
加 える とNGF存在下 で神経樹状 突起 の伸 展が,促 進 されるの か?そ のメカ ニズムの検 討の ため に,さ らに この研 究 を続 けた い感 謝申 しあげ ます。
また ワサ ビとい う日本独特 の香辛料 が素材 で あった こ とで海 外の研究 者 に追 われず にすん でい ると願 ってい る ところであ る。
ワサ ビの6‑MITCのをいた だき ました浦上 ・食文化 振興財 団に心 より抗腫 瘍 活性 の研 究 で は,こ とも幸 い してい ます。

他機関 との研 究 によ って その メカニズ ムが推定 で
きそ うな段階 に ある。 この抗腫瘍 活性 の成果が,細胞 の分化促 進の メカニ ズム解 明の ヒン トになる

文献1)福家 洋 子,大石 芳 江,岩下 恵 子,小野 晴 寛,篠原 和 毅:原 和 毅:日本食品 科

日本 食 品 科 学 工 学 会,41,709(1994)

ので は と期待 してい るところで ある。
PC‑12細 胞 をNGF存2)小在 下で培 養 した際 にっ いて,先 述 した形態 的変化 とともに機能 的変化 も詳
し く調べ られ てい る9)。オルニ チ ン脱 炭酸 酵素 の野 晴 寛,足立 恵 子,福家 洋 子,篠学 工 学 会43,1092‑1097(1996)
3)H.Etoh.A.1̀ishimura,R.Takasawa,A。Yagi,K.
Saito,K.Sakata,1.KishimaandKIna:Agi7c.Biol.
Chern.54,1587‑1589(1990)

増大,ア セチル コ リン受 容体 の増大 とアセ チル コ
リンエ ステ ラ ーゼ の変化,CaやNaチャネ ルの機 能調 節,他 があ る。現 在6‑MITCや4‑MITC

4)Y.Zhang,P.Talalay,C.G.ChoandG.H.Posner;
ProtNat7.Acad.Sci.USA,89,2399‑2403(1992)
5)Y.Zhang,TW,Kensler,C‑GCho,GHPosnerandP.
Talalav:Proc..Natl.Actin.S̀孟USA,91,3147‑によるPC‑12細 胞 の分化促 進効果 を生化 学的 機能
変化 の面 か ら実 験 を進 めて いる。
われわ れ 日本 人が,長 い間 食べ続 けて きた貴重な香辛料 で あるワサ ビに抗菌 性以外 に新 たな生理310(1990
6)Y.Fuke,Y.Haga,H.Ono,T.NomuraandK.
Ryouyama:Cytotechiiologv,25,197‑203(1997)7)福

家 洋 子,芳雄:日活 性が明 らか にな って きた こ とは,大 変興 味あ る
こ とで あ り,世 界 にア ピー ル した い と考 えてい る。
今回の研 究結 果 は,高 濃度 では,が ん細胞 を も死8)沢木 佐 重 子,福雄:日に何 らかの影 響 を与 え るのでは ないか。 とい うこ

家 洋 子,芳木 佐 重 子,野9)畠中10)細p98,朝胞寛:発村 孝 弘,猟山一

村 孝 弘,猟山一

京都
賀 良 子,野本 食 品 科 学 工 学 会,(1998)8月

PC‑12細滅 させ る成分 が,低 濃度で は,神 経 細胞 系の分化

賀 良f,沢

本癌 学 会(1997)9月

札幌生 と 分 化 の モ デ ル ーク ロ ム 親 和 性 細 胞 と胞 一 医 学 の あ ゆ み140,5‑8(1987)
ト キ シ コ ロ ジ ー 試 験 法:日倉 書 店(1991)

本 組 織 培 養 学 会 編,

InductionofdifferentiationinK‑5621eukemiacellsandPC‑12pheochromocytomacellsby
6‑(methylsulfinyl)‑hexylisothiocyanateofwasabi(E〃ノe〃asrcnsabrMaxim.)

InductionofdifferentiationinK‑5621eukemiacellsand
PC‑12pheochromocytomacellsby6‑(methylsulfinyl)‑
hexylisothiocyanateofwasabi(EutremawasabiMaxim.)
YokoFuke(DepartmentofFoodScience&HumanNutritioll,TokyoMetropolitanCoIlege)

Wasabi(EutremawasabiMaxim.)isaverypopularspiceinJapanwhichexhibits
physiologicalattributessuchasanti‑microbialactivityandtheinhibitionofplatelet
aggregation.

Synthetic6‑(methylsulfinyl)hexylisothiocyanate(6‑MITC,apotentantiproliferative
principalfromwasabi)slightlyinhibitedtheinductionofmouseskintumorsinatwo‑
stageprocessofcarcinogenesis,buttheeffectwasnotsignificant.However,6‑MITCdid
significantlyinhibitthemutationofskinresultingfromtopicalapplicationsofthecarcino‑
gens.

Whenamurinehepatomacellline,Hepalclc7,wastreatedwith6‑MITC,itaugment‑
edtheinductionofquinonereductase,aphase2detoxificationenzyme(Cytotechnology,25,197‑203,1997).Alowconcentrationof6‑MITCwasalsofoundtoinducemor‑
phologicalchangesinK‑562humanleukemiacells.

PC‑12ratpheochromocytomacellsarewidelyusedastargetcellsofnervegrowth
factor(NGF)inordertoinducedifferentiationofPC‑12cells.WhenPC‑12cellswere
treatedwith6‑MITC(5,uM)andNGF(50ng/ml),theneuriteswerelongerandmore
numerousthanobtainedfollowingtreatmentwithNGFonly.

Theseresultssuggestedthat6‑MITCmightbeeffectiveforinductingthedifferentiation
ofnervestemcelllinesorthedevelopmentofPC‑12cellsintoneurite‑bearingcells.

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