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クルクミン食併用による新たな抗癌剤治療プロトコール開発に向けた安全性研究＜平成 22 年度助成＞

クルクミン食併用による新たな抗癌剤治療
プロトコール開発に向けた安全性研究
中

川

貴

之

（東京大学農学生命科学研究科獣医外科学研究室）

1.

はじめに

東南アジア、中国などでは生薬、漢方薬などとして利用されてきた 8）。クルクミンは IKK を阻害す

犬の乳腺腫瘍は避妊していない雌で最も発生のることによって NF-κB 活性を抑制する効果があ多い腫瘍であり、特に大型犬で発生する乳腺腫瘍

ることが示され 9）、クルクミンによる NF-κB 活の約半数は悪性でそのうち約半数が予後不良であ性化の抑制によって腫瘍細胞の増殖や転移が抑制

る1, 2）。リンパ節浸潤、遠隔転移のある症例ではされたとの報告もされている 10, 11）。

化学療法が必要となるが、犬乳腺腫瘍に対する化

我々の研究室ではこれまでに悪性度の異なる学療法の科学的根拠や実験的評価はほとんどなく

犬乳腺腫瘍由来クローン株を作成し 12）、それら

人乳癌の外挿や一般的に抗腫瘍効果が高い抗癌剤の cDNA マイクロアレイ解析から NF-κB 関連遺を使用しているのが現状である3）。

伝子が有意に変化していることを見出した。犬乳NF-κB（Nuclear Factor-kappa B）は二量体を腺腫瘍自然発症例の組織サンプルを免疫染色し検形成し転写因子として働くタンパク質複合体であ証したところ、乳癌組織では良性組織と比較してる。外的ストレス、サイトカインや増殖刺激など

NF-κB の核内移行が有意に多く見られた 13）。そに反応して NF-κB は活性化される。古典的経路

こで、クルクミンによる NF-κB 活性の抑制効果

では刺激により IKK（IκB Kinase complex）が活に着目し、犬乳腺腫瘍細胞株を用いた移植マウス

性化されると、IκBα（Inhibitor κBα）がプロテモデルにおいてその抗腫瘍効果を検討したとこ

アソームによる分解を受け、核内に移行した NF-

ろ、NF-κB 選択的阻害剤 BAY11-7082 を用いた

κB が DNA に結合し標的遺伝子の転写活性化を抗腫瘍効果 14）と比較して効果は低いものの、経行う。非古典的経路では刺激により NIK（NF-κB

口クルクミン投与による腫瘍組織での NF-κB 核

Inducing Kinase）が活性化され p100-RelB 複合体

内移行の抑制と抗腫瘍効果がみられ、また明らかが限定分解されることで産生された p52-RelB がな副作用も見られなかったことから、単剤として

DNA に結合し転写活性を示す 4, 5）。NF-κB の活

ではなく併用薬としての有用性が期待できると考性化は、炎症、細胞増殖・分化、細胞の生存やアえられた。

ポトーシスなどに関与していることが知られ、まそこで本研究では犬乳腺腫瘍症例に対する経口

た NF-κB によって調節される標的遺伝子の多く

クルクミン投与と化学療法との併用、すなわちクが癌化や腫瘍の進行に関連することから、腫瘍に

ルクミン食と抗癌剤投与を組み合わせた新たな化

おいて NF-κB が非常に重要な因子であると考え

学療法プロトコールの確立に向けた基礎的研究と

られている

6, 7）

。

して、犬乳腺腫瘍の化学療法薬として最もよく選

ポリフェノールの一種であるクルクミンはウコ

択される薬剤のひとつであるカルボプラチンとクンに含まれる黄色色素であり、古来よりインドやルクミンの併用による抗腫瘍効果の検討と犬にお48

浦上財団研究報告書

ける長期クルクミン投与による安全性の評価を行うこととした。
材料と方法

2.
2-1.

移植細胞株

Vol.20（2013）2-4.

マウス移植モデルと治療プロトコール

ヌードマウスは実験前に施設内で一週間順化さ
せ、移植 2 日前に 4 Gray の全身照射を行った。
移植細胞株は 1 x 10 8 cells/ml の濃度で滅菌 PBSに懸濁し、ヌードマウスの右乳腺部へと 27G 注射

実験には自然発症の犬乳腺腫瘍症例から樹立

針を用いて 1 匹あたり 1 x 10 7 cells を注入した。

された親株 CHMp 株 15）か ら ク ロ ー ニ ン グ さ れ

犬乳腺腫瘍細胞株を移植したマウスは以下の 6

た 悪 性 度 が 高 い 細 胞 株 CHMp - 5b 株 12）を 用 い群（各 6 匹ずつ）に群分けした。無治療群（control

た。犬乳腺腫瘍細胞株の培養には L - グルタミン群）、カルボプラチン治療群（CBDCA 群）、2 %加 RPMI-1640 液体培地に 1 0 % 非働化（56 ℃ 30 分

クルクミン含有食食餌群（cur-fed 群）、2 %クルク加温）牛胎仔血清（FBS ; Invitrogen 社 , Carlsbad,

ミン含有食食餌＋カルボプラチン治療群（cur-fed

CA, U.S.A.）、50 mg/L ゲ ン タ マ イ シ ン（Sigma

CBDCA 群）、400 mg/kg クルクミン経カテーテ

Chemical 社 , St. Louis, MO, U.S.A.）を添加したもル投与群（cur-cat 群）、400 mg/kg クルクミン経のを用い、37 ℃、5 % CO 2 条件のインキュベーター

カテーテル投与＋カルボプラチン治療群（cur-cat

内で維持した。

C B D CA 群 ）。control 群、C B D CA 群、cur-cat

実験動物群、cur-cat CBDCA 群では放射線滅菌飼料（CL-2 ;2-2.

マウス移植モデルには 5 週齢の雌ヌードマウ

日 本 Clea 社 , Tokyo, Japan）を、cur-fed 群、cur-ス（KSN Slc; 日本 SLC 社 , Tokyo, Japan）を用い

fed CBDCA 群では先行研究と同様に同 CL-2 飼

た。ヌードマウスは無菌アイソレーター（ ICM

料に 2 %クルクミンを含有させたものを使用した。

社 , Ibaragi, Japan）内 で 温 度 24±1 ℃、 湿 度 4 0 -全ての群で食餌と水は自由給仕とした。それぞれ

70 %、12 時間の明暗期サイクル条件で維持した。

の群の食餌量は 5 日ごとに消費量を計量し算出し犬に対する長期投与実験には健常ビーグル犬 4 頭た。カルプロフェンの投与群（CBDCA 群、cur-（Nisseiken 社 , Yamanashi, Japan）を用いた。こfed CBDCA 群、cur-cat CBDCA 群）では、移植れらの動物を用いた全ての実験は東京大学農学生

後第 5、15日に生理食塩水に希釈したカルボプラチ

命科学研究科の動物実験委員会に動物実験申請を

ン 200μl（100 mg/kg）を腹腔内投与した。クルク行い、同委員会の承認のもと動物実験倫理に則っミン経カテーテル投与群ではセサミオイルに溶解て行われた。

したクルクミン 400 mg/head を第 5 日から第 20

試薬日の間、毎日一回食道カテーテルを用いて経口投

2-3.

クルクミン粉末（1, 7 - Bis（4 - hydroxy-3-methoxy-

与した。

phenyl）-1, 6-heptadiene-3, 5-dionem）は Alfa Aesar

臨床徴候は毎日確認し、体重は 5 日ごとに測社（Ward Hill, MA. U.S.A.）から購入した。化学定した。移植部位における腫瘍体積は以下の計

療法薬には犬乳腺腫瘍症例に対する化学療法で多算式を用いて計測した。腫瘍体積 V（mm 3）= 1/2

用される薬剤のひとつであるカルボプラチン 2, 7）2。平均腫瘍増殖抑制率
長径（mm）x 短径 （mm）

（cis-diammine （1, 1-cyclobutanedicarboxylato）（MGI ; Mean Tumor Growth Inhibition rate）はplatinum（II）（C B D CA）; 日 医 工 社 , Toyama,（治療群の増殖率）/（非治療群の増殖率）の割合でJapan）を用いた。

算 出 し、 併 用 指 数（C I ; Combination Index）は、（期待される増殖抑制率）/（測定された増殖抑制

クルクミン食併用による新たな抗癌剤治療プロトコール開発に向けた安全性研究

49率）から算出した。薬剤 A と薬剤 B の併用指数を（GE Healthcare 社 , Buckinghamshire, UK）と 室

計算する場合、期待される増殖率は、（薬剤 A 単温 1 時間で振盪させながら反応させた後、再度剤による MGI ）/（薬剤 B 単剤による MGI ）で算

TBS-T に て 洗 い enhanced chemiluminescence

出される。併用指数が 1 以上の場合には相乗効果、（ECL）detection system（GE Healthcare 社）に

1 の場合は相加効果があると判定した。MGI、C I

よってタンパク発現を検出した。

は第 20 日のデータから算出した。

2-6.

免疫染色

移植されたヌードマウスは移植後第 20 日に安免疫染色にはホルマリン固定パラフィン包埋の楽死とした。移植部位の原発腫瘍組織は組織サン

腫瘍組織から薄切した 2 mm 厚の連続切片を用い

プルおよびタンパク質抽出用に採材し、肺、肝臓、た。抗原の賦活化はクエン酸バッファー（pH 6.0）

腎臓、脾臓も病理組織学的検索のために採材した。

による 120 ℃ 10 分間のオートクレーブで行い、病理組織学的検索用の組織は 10 %中性ホルマリ

内因性ペルオキシダーゼ活性の阻害は 3% H 2 O 2ン固定しパラフィン包埋したのち常法に従って薄に よ り、 非 特 異 的 反 応 の ブ ロ ッ キ ン グ は 10 %切、H&E（hematoxylin and eosin）染色を行った。

正常ヤギ血清（Dako cytomation 社）により行っ

2-5.

ウェスタンブロット法

た。一次抗体は、anti - NF-κB（BD Transduction

原発組織における IκBα、p-IκBα、Bcl-2、β-actin

Laboratories 社 , Lexington, KY, U.S.A.）、anti-の発現はウェスタンブロット法にて評価した。

Ki - 67（Dako Cytomation 社 ）、anti - IκBα（Cell

約 1 mg の 腫 瘍 組 織 か ら Complete Mini（Roche

Signaling Technology 社）を用い、希釈倍率はそApplied Science 社 , Indianapolis, IN, U.S.A.）加

れぞれ、1 : 5 0、1 : 7 5、1 : 5 0 であった。これら一次

RIPA バッファー（Sigma Chemicals 社）にてタン

抗体とメンブレンを 4 ℃、overnight により反応

パク質を溶解抽出し、溶解液は 15,000 rpm、4 ℃

さ せ TBS-T バ ッ フ ァ ー に て 洗 浄 し た 後、HRP

30 分の条件で遠心分離した。回収した上清のタン

標識ポリマー試薬と室温 1 時間で反応させ DAB

パク濃度は BCA protein assay reagent（Thermo

試 薬（3, 3’- diaminobenzidine（DAB）/ hydrogen

Fisher Scientific 社 , Rockfor, IL, U.S.A.）を 用 い

peroxidase solution）によって可視化し、Mayer’sて測定し標準化した後、2 x サンプルバッファー

hematoxylin 染色液により核染を行った。また一と混和し 5 分間の煮沸変性した。サンプル処理

次抗体を除いたものを陰性対象とした。

をしたタンパクは 1 0 %アクリルアミド含有 SDS PAGE ゲルを用いて電気泳動を行い、分離され2-7.

実験犬におけるクルクミン長期投与プロト
コール

たタンパクは polyvinilylidene（PVDF）メンブレ

実験犬に対するクルクミン長期経口投与にはン（Bio-rad 社 , Hercules, CA, U.S.A.）に 転 写 し た。

移 植 マ ウ ス 実 験 と 同 じ 投 与 量（400 mg/kg/1 日

メ ン ブ レ ン は 5 % ス キ ム ミ ル ク 加 TBS-T バ ッ1 回）を用いた。クルクミンは市販の犬用フード

ファーにてブロッキングを行った後、振盪させ缶（PRESCRIPTION DIET a/d. ; Hill’s-Colgate 社,

な が ら 4 ℃ overnight で そ れ ぞ れ の 一 次 抗 体 とTokyo, Japan）1/4 量に投与直前に混ぜ込み、毎反 応 さ せ た。 一 次 抗 体 に は、anti - IκBα（Santa

夕定刻に経口投与した。経口投与開始前日（第 0Cruz Biotechnology 社, CA, U.S.A.）、anti-p-IκBα日）から開始後第 28 日までを実験観察期間とし、（Cell Signaling Technology 社 , Beverly, MA,

毎日クルクミンの経口投与を行った。実験期間

U.S.A.）を用いた。メンブレンを TBS-T にて洗中、毎日、下痢、嘔吐をはじめとする臨床徴候のい horseradish peroxidase（HRP）標 識 二 次 抗 体有無を観察し、第 0、1、2、3、4、5、6、7、10、

50

浦上財団研究報告書

Vol.20（2013）14、17、21、24、28 日に体重測定と採血を行っレアチニン（Cre ; mg/dl）、血糖（Glu ; mg/dl）、中た。採血はクルクミン経口投与から 1 時間後に頸性 脂 肪（TG ; mg/dl）、総 コレステロール（T-Cho ;静脈から 23G 注射針を用いて全血 2 ml を採取し、mg/dl）、C 反応性蛋白（CRP ; mg/dl）である。

うち 1 ml は全血球算定（CBC）用に EDTA を、残2-9.

りの 1 ml は生化学検査用にヘパリンを用いて抗凝統計解析

抗腫瘍効果の評価には Turkey Kramer 検定と固処理を行った。

ANOVA（one way analysis of variance）検 定 を、

血液検査

NF-κBとKi - 67 核内陽性率の評価には Bonferroni-

2-8.

CBC には pocH-100iV Diﬀ（SYSMEX 社 , Hyogo,
Japan）を用いた。計測した項目は、以下の通り。
白 血 球 数（WBC; cells/μl ）、 赤 血 球 数（R B C ;x10 4cells /μl）、血 色 素 量 (Hgb; g/dl）、ヘマトク

Mann-Whitney U 検定とKruskal Wallis H 検定を用い、p <0.05 を有意差ありとした。
結

3.

果

移植マウスモデル

リット値（Hct ; %）、平均赤血球容積（M C V; fL）、

3-1.

平均赤血球血色素量（MCH ; pg ）、平均赤血球血3-1-1. 臨床徴候と食餌量

4

色素濃度（MCHC ; %）、血小板数（x10 cells/μl ）。

実験観察期間中、全ての群で明らかな臨床症状

生 化 学 検 査 に は DRI-CHEM 7000V（FUJIFILMを示すマウスはいなかったが、cur-cat C BDCA

Medical 社 , Tokyo, Japan）を用いた。計測した項

群で 2 匹が死亡しその原因は不明であった。食餌

目は、総タンパク（TP ; g/dl）、アルブミン（Alb; g/

量は control 群、C B D CA 群、cur-fed 群では明らdl）、グルタメート・ピルベート・トランスアミナー

かな変化は見られなかったが、cur-fed C BDCA

ゼ（GPT（ALT）; U/L）、アルカリフォスファターゼ

群と cur-cat C B D CA 群では第 10 日から第 15 日

（ALP ; U/L）、血 中 尿 素 窒 素（BUN ; mg/dl）、ク

および第 15 Fig.
日から第2 cur-cat CBDCA20
3 日で食餌量の減少が見ら&* % (A) 9#:0

Fig. 1  (







)

( (B)
!



.

47

)'12,"8 (200 )(A)% (<-)(B)

$

!;6

/5 (+-)8

Fig. 2 cur-cat CBDCA 群においてFig. 1 平均食餌量と体重（矢印はカルボプラチン投与日を示す）

治療中に死亡したマウス（A）と観察期間終了まで生存したマウス（B）の肝臓の病理組織学的所見 （200 倍 )。（A）では中心静脈を中心とした広範
1な壊死（黒矢印）が、（B）では二核の細胞 （白矢印）が見られる。

クルクミン食併用による新たな抗癌剤治療プロトコール開発に向けた安全性研究

51

れた（Fig. 1（A））。体重は全ての群で同様であっるなど肝臓の再生像が見られた（Fig. 2（B））。

たが、クルクミンを投与した群では一回目のカ

3-1-2. 腫瘍体積

ルボプラチン投与後に一時的に体重減少が見られ原発腫瘍の体積は第 10 日までは全ての群で同たものの徐々に回復し、二回目のカルボプラチン様であったが、第 20 日には cur-fed C B D CA 群が投与後には影響は見られなかった（Fig. 1（B））。

最も低い腫瘍体積を示し、control 群、cur-fed 群、

cur-cat CBDCA 群では治療開始後に急死するマ

cur-cat C B D CA 群 と 比 較 し て 有 意 に（ p <0.05）

ウスが見られたが、死因は明らかにできなかっ

低 い 腫 瘍 体 積 で あ っ た（Fig. 3）。C B D CA 群 はた。それらのマウスでは病理組織学的検索では肝control 群、cur-fed 群 と 比 較 し て 有 意 に 低 い 腫

臓に中心静脈を中心とした重度の壊死が見られた

瘍体積を、クルクミンを投与した群では cur-cat（Fig. 2（A））
。また、実験観察期間中生存した同群が cur-fed 群よりも有意に低い腫瘍体積を示

Fig. 3   (  群のマウスの肝臓においては二核の細胞が見られ

Fig. 3 



 (





)
し
た （ p <0.05）。 ま た Table 1 に 平 均 腫 瘍 増 殖
)Fig. 3 平均腫瘍体積（矢印はカルボプラチン投与日を示す）
Table 1 各群における平均腫瘍増殖抑制率 (MGI) 併用指数 (CI)

Treatment1
MGI（%）

CBDCA

42.5%
1

Cur-fed

Expected（%）

CI

41.4%

2.157

27.0%

0.788

97.5%

Cur-fed CBDCA

19.2%

Cur-cat63.5%

Cur-cat CBDCA

34.3%

52

浦上財団研究報告書

抑制効果と併用指数の結果を示したが、cur-fed

Vol.20（2013）

3-1-5. ウェスタンブロット法

CBDCA 群では有意な相乗効果（CI=2.157）が示

原発腫瘍組織におけるタンパク発現の結果はされた一方で、cur-cat C B D CA 群では有意な相Fig. 4 に示した。cur-cat 群、cur-cat C B DCA 群

加ないし相乗効果は見られなかった。

Fig. 4 では
control  (A)CBDCA
 (B)
IκBαの発現減少が見られた。Bcl-2
発現は3-1-3. 遠隔転移

cur-fed  (C)cur-fed CBDCA  (D)cur-cat  (E)cur-cat CBDCA  (F)全ての群間で明らかな差異は見られなかった。


肺転移はそれぞれのマウスにつき 5 スライスの切片において鏡検レベルでの転移結節を評価したが、全ての群間で有意な差異は見られなかった（data not shown）。
3-1-4. 免疫染色（NF-κB、Ki - 67）
核内に NF-κB の発現が見られたものを核内
陽 性 と し、 そ の 陽 性 率 を 評 価 し た（Table 2）。

Fig. 4 原発腫瘍組織におけるタンパク発現。control 群 (A)、CBDCA 群 (B)、cur-fed 群 (C)、cur-fed CBDCA 群 (D)、cur-cat 群 (E)、cur-cat CBDCA 群 (F) の結果を示す。

CBDCA 群 は、control 群、cur-fed 群、cur-cat

実験犬への長期経口投与

CBDCA 群と比較して有意に高い NF-κB 核内陽3-2.

性率を示した（ p <0.05）。また、cur-fed 群は cur-

3-2-1. 臨床徴候

cat 群と比較して有意に低い核内陽性率であった

クルクミン長期投与実験に用いた実験犬は、ビ（ p <0.05）。 同 様 に、Ki - 67 核 内 陽 性 率 を Table

ーグル犬計 4 頭であった。性別は雄 2 頭、雌 2

3 に 示 し た。C B D CA 群 は control 群、cur-fed

頭であり、年齢は 1 歳齢、導入時の体重は 9.9 ±群、cur-cat CB D CA 群 と 比 較 し て 有 意 に 高 い

0.2 kg であった。第 28 日までの実験観察期間中、

Ki-67 核内陽性率を示し、Cur-fed 群は control 群、全ての実験犬において、下痢、嘔吐、発熱など明

cur-cat 群と比較して有意に低い陽性率であった

らかな臨床徴候は見られなかった。体重は第 0、（ p <0.05）。

1、2、3、4、5、6、7、10、14、17、21、24、28 日 に 測Table 2 各群における NF-κB 核内陽性率。異なるアルファベット定したが、1 頭で 1 0 % を超す変動が一過性に見ら間に有意差あり（P<0.05）

れたが、2 0 % 以上の重度の肥満や削痩を示した犬GroupsMean ± S.E. (% )Control

30.2 ± 2.60 %

bd

CBDCA

42.1 ± 2.82 %cd

Cur-fed19.7 ± 2.63 %a

全 て の 実 験 犬 か ら1第 0、1、2、3、4、5、6、7、Cur-fed CBDCA

35.1 ± 2.48 %ad

10、14、17、21、24、28 日に、採血と C B C と生化

Cur-cat32.9 ± 0.95 %dCur-cat CBDCA

26.2 ± 2.51 %ad

学検査を行った。C B C の評価項目では、一過性Table 3 各群における Ki - 67 核内陽性率。異なるアルファベット間に有意差あり（P<0.05）

はいなかった（Fig. 5）。
3-2-2. 血液検査結果の軽度 W B C 上昇（1 頭）が見られた（Fig. 6）。
また生化学検査においても、一過性の C R P 上
昇（2 頭）が見られたが臨床徴候を示すような大きGroupsMean ± S.E. (% )Control

40.7 ± 17.5 %

a

CBDCA

43.6 ± 17.8 %abCur-fed40.6 ± 16.6 %bCur-fed CBDCA

25.3 ± 10.3 %abCur-cat36.5 ± 14.9 %abCur-cat CBDCA

45.0 ± 22.5 %abな炎症性疾患は見られなかった。他の生化学検査
項目では、G P Tと A L P が変動はあるものの長期的に減少傾向を示した（Fig. 7）。

クルクミン食併用による新たな抗癌剤治療プロトコール開発に向けた安全性研究
Fig. 5 
12.5
12.0

BW (kg)

11.5
11.0

dog 1
dog 2

10.5

dog 3

10.0

dog 4
9.5
9.0
0

1

2

3

4

5

6

7

10 14 17 21 24 28

Day

Fig. 5 体重の変動

1

Fig. 6 CBC 検査項目の変動

53

54

浦上財団研究報告書

Vol.20（2013）

Fig. 7 生化学検査項目の変動

4

考

察

よる抗腫瘍効果の評価と臨床応用に向けた犬に対するクルクミン長期投与時の安全性の評価を行っ

本研究では犬乳腺腫瘍に対するクルクミン食併た。原発腫瘍体積の評価による腫瘍増殖抑制効果

用による新たな抗癌剤治療プロトコール、すなわ

は cur-fed C B D CA 群で最も高く、またこの群でちクルクミン経口投与と従来の抗癌剤との併用にはクルクミンとカルボプラチンとの相乗効果がクルクミン食併用による新たな抗癌剤治療プロトコール開発に向けた安全性研究55示された。ウェスタンブロットの結果では、cur-ては NF-κB 活性抑制効果が犬乳腺腫瘍細胞株のfed CBDCA 群 と cur-cat 群、cur-cat C B D CA

Ki - 67 で検出される細胞増殖活性に対しては十分群で p-IκBαの発現が明らかに低く、これらのな抑制効果を持っていないことも考えられた。ク

群では IκBαのリン酸化が抑制されていることがルクミンとカルボプラチン併用による相乗効果の分かった。また cur-fed 群では NF-κB 核内陽性メカニズムに関してはさらなる研究が必要であ率も control 群よりも有意に低く、クルクミン併ろう。

用による NF-κB 活性の抑制効果がこの相乗効果

ビーグル犬を用いたクルクミン長期経口投与でに関与しているものと考えられた。抗癌剤投与

は、抗癌剤併用の前段階としてクルクミン単剤でによるストレスで NF-κB 活性化が誘発されるこの安全性を評価した。本研究でのクルクミンの

16）、またそれに対するクルクミンの抑制効果

投与量は、移植マウス実験における cur-cat/cur-が in vitro、in vivo においてこれまでの人乳癌やcat C B D CA 群と同様の 400 mg/kg/1 日 1 回経口他の腫瘍 17, 18）で報告されている。本研究におい投与とした。クルクミンの投与量はマウスモデルても CBDCA 群が最も高い NF-κB 核内陽性率をにおいて 1 - 2 %含有食食餌、マウスやラットへの示し、control 群、cur-fed 群、cur-cat 群と比較し経口単回投与として 100 - 500 mg/kg などが報告て有意差が見られた。cur-fed C B D CA 群の NF-κ

されている 21, 22）。今回の実験ビーグル犬に対するB核内陽性率は C B D CA 群より低値であり、cur-

400 mg/kg/1 日 1 回の長期経口投与では明らか

cat CBDCA 群では C B D CA 群よりも有意に低いな臨床徴候や重篤な体重減少なども見られなかっ値であった。これらのことから、併用時のクルクた。また血液学的検査を行い C B C および生化学

ミンの抗腫瘍効果は単剤での抗腫瘍効果だけで検査項目のスクリーニングを行ったが、WB C、なく、カルボプラチン投与により引き起こされた

CRPで一過性に正常値を超えることがあった

NF-κB 活性化を抑制することで相乗的に抗腫瘍ものの長期に悪化傾向を示す項目はなかった。

効果を示している可能性が示唆された。またクルG P T、A L P は長期に良化傾向を示し、これはク

クミンによる抗腫瘍効果は NF-κB 経路を介する

ルクミンの肝庇護効果によるものと考えられた。

ものだけでないため、他の腫瘍増殖因子を阻害し人において 8000 mg/1 日 1 回の投与を 4 週 23）、3 ヶていたことも十分に考えられる。

月 24）続けた報告があるが、大きな副作用は報告と細胞増殖活性の指標の一つである Ki - 67 の免されていない。本研究では組織学的な検索は行っ

疫 染 色 で は、cur-fed 群 が control 群 と 比 較 し てていないため病理組織学的な変化は不明ではある

有意に低い結果となり、これは先行研究 14）と同が、400 mg/kg/1 日 1 回は犬に対して安全に投与様の結果であった。一方で、他の Ki - 67 の結果はできるものと考えられた。

NF-κB 核内陽性率の結果とは必ずしも一致せず、

本 研 究 で は 移 植 マ ウ ス モ デ ル の cur-cat

C B D CA 群と他の群の間で Ki - 67 核内陽性率は有C B D CA 群において、原因不明の急死が見られた。

意な差異は見られなかった。また原発腫瘍の腫瘍死亡したマウスの肝臓において中心静脈を中心と体積とも相関は見られなかった。これは腫瘍の増した重度の壊死が見られたこと、実験観察期間を殖活性以上に殺細胞を薬剤が示している可能性が生存した同群のマウスの肝臓において組織再生像考えられた。またクルクミンによる細胞増殖活性が見られたことから、これらの群では肝障害が起抑制効果は in vitro、in vivo ともに人乳癌や他のきていた可能性がある。クルクミンを用いた多く腫瘍で報告されているが 11, 19, 20）、本研究においの研究で肝毒性が見られたという報告はないが、

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浦上財団研究報告書

Vol.20（2013）

中には肝毒性が見られたとする報告もある 25）。ま文

たカルボプラチンの副作用として小腸への傷害が

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ある 26）。クルクミンは腸管から吸収され肝臓で代謝されるが、非常に吸収効率が低いことが知られている 27）。カルボプラチンによって傷害された小腸からクルクミンが直接血中に入ることによりクルクミンの取り込みが促進された可能性もあり、カルボプラチンとの相互作用によって肝毒性が発現されたのかもしれない。今回の研究でカル
ボプラチンとクルクミンの併用によって見られた
突然死に関しては臨床応用を進めていく上でその機序を解明しておく必要がある。
今回の研究から、クルクミン経口投与と並行した抗癌剤投与により、原発腫瘍に対する相乗的な抗腫瘍効果が得られた。また同等の濃度のクルク
ミンの長期経口投与にも実験犬は明らかな臨床症状を示さず大きな副作用はないものと考えられた。しかしながら、本研究に用いたクルクミンとカルボプラチンの投与量では重篤な肝障害を引き起こす可能性があり、これに関してはさらなる検証とその毒性の機序の解明が必要と考えられた。
また、クルクミン経口投与によって抗癌剤の使用量を減らしながら同等の抗腫瘍効果を期待する、
あるいは他の抗癌剤との最適な組み合わせを模索するなど、クルクミン食と抗癌剤治療を組み合わせた新しい治療法の確立に向け、今回の研究をベースにしたさらなる研究は意義のあるものと考え
られた。
謝

辞
本研究の遂行にあたり、研究助成を賜った（公財）浦上食品・食文化振興財団に心より御礼申し上げる。また、本研究の遂行にあたり尽力していた
だいた東京大学農学生命科学研究科高度医療科学
研究室・内山紗也子、高屋淳美、森田希輔、同研究科獣医外科学研究室・佐々木伸雄教授、佐伯亘平、
田中由依子、花房明生、山本博紀に深く感謝する。

献2) Itoh T., Uchida K., Ishikawa K., Kushima K., Kushima E.,
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浦上財団研究報告書

Vol.20（2013）“Evaluation of efficacy and safety of
new combination chemotherapy with curcumin feeding against
canine mammary gland tumors”
Takayuki Nakagawa
Laboratory of Veterinary Surgery
Graduate School of Agricultural and Life Sciences, University of Tokyo
Canine mammary gland tumor (CMGT) is the most common tumor among intact
female dogs. Chemotherapy is needed for advanced CMGTs with lymphatic invasion anddistant metastasis. Our previous studies revealed the relationship between the malignancy
of CMGT and NF-κB activation and showed the anti-tumor potential of the inhibition
of NF-κB activation in the CMGT experimental model. Curcumin, a phenol derivative
included in turmeric, was reported to suppress the activation of NF-κB and suggested tohave therapeutic potential against several tumors such as human breast cancers. In thisstudy, we evaluated the efficacy of combination therapy using curcumin and anti-tumor
drug, carboplatin and the safety of long term feeding of curcumin as preliminary study forthe establishment of new chemotherapy protocol using curcumin feeding.
Highly malignant CMGT cell line, CHMp-5b was used for the xenografted mousemodel. Transplanted mice were received several treatment protocol including 2% curcumin
food, 400mg/kg curcumin feeding, 100mg/kg carboplatin injection and their combinations.
Curcumin and carboplatin combination had higher anti-tumor effect on the primary tumor
volume and 400mg/kg curcumin feeding with carboplatin showed the synergistic effectagainst transplanted CMGT cells. Western blot analysis revealed the decrease of p-IκBαin curcumin groups. In the immunohistochemistry, NF-κB nuclear expression on tumor
tissues of this group was lower significantly than that of carboplatin alone. From theseresults, enhanced anti-tumor effect in curcumin groups was suggested to be related with the
inhibition of NF-κB activation by curcumin.
For the safety evaluation of curcumin feeding, 4 healthy beagle dogs were used andfed 400mg/kg curcumin every day. We evaluated body weights, clinical findings and blood
examinations. There was no severe abnormality in body weights and clinical findings. In
blood examinations, temporary elevation was found in WBC and CRP, and tendency of
decrease in GPT and ALP was observed. Long term feeding with 400mg/kg curcumin was
thought to be safe in healthy dogs.
However, 2 mice which received 400mg/kg curcumin feeding and carboplatin
injection, died within the experimental period with uncertain reason. Histopathologicalexamination suggested the liver damage in these mice. Mechanism of enhancing liver
toxicity of curcumin and/or carboplatin was still unclear. For the establishment of clinicalapplication, further studies are needed to clarify the efficacy and toxicity of combination
therapy using curcumin and anti-tumor drugs.