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新規鎮痛作用機序を有する香辛料成分の探索＜平成 23 年度助成＞

新規鎮痛作用機序を有する香辛料成分の探索前田武彦（新潟薬科大学薬学部薬効薬理学）

緒機序を検索した。その結果、損傷部位の脂肪組織

言に炎症性マクロファージが集積し、それに伴い脂神経障害性疼痛は、神経の形態および機能的異肪細胞が肥大する形態変化を見いだした。さらに、常がもたらす慢性疼痛の一つであり、麻薬性鎮痛

脂肪細胞由来のレプチン 6 ) 、ならびにマクロファー薬が奏功しない場合もあるなど、疼痛緩和に難渋

ジ由来の炎症性サイトカインおよびケモカイン 7)するケースがある。現在、神経障害性疼痛への適が、疼痛の発現に関わることを明らかにした。こ応拡大など、既存医薬品を中心とする鎮痛薬およれらの知見は脂肪細胞と免疫細胞が、疼痛の誘導・びその補助薬としての可能性が模索されている。

維持過程に必須である可能性を示唆する。本研究

病態生理学的研究から、神経炎症とそれに付随すの目的は、香辛料成分の標的分子 TRP ファミリる免疫系の活性化が、神経障害性疼痛の誘導と維ーによる脂肪細胞および免疫細胞の機能調節が慢1)持に関係すると考えられている 。
Transient receptor potential（TRP1）ファミリーに属する TRPV1（TRP vanilloid 1）は、小型の後根神経節細胞に発現し、熱や酸ならびに炎症性メディエーターにより生じる様々な侵害刺激を統合する非選択的陽イオンチャネルである 2 ) 。

性疼痛を緩和する可能性とその分子機構を明らかにし、香辛料成分による疼痛治療の可能性を探求することである。
方法

1.

実験動物

TRPV1 の活性化は、炎症組織における痛覚過敏

5 週齢雄性の TRPV1 ノックアウトマウス（KO マの発現に必須とされ、炎症性疼痛の治療薬創製を

ウス ; B6.129S4-Trpv1tm1Jul/J; Jackson Laboratory,

目指した TRPV1 拮抗薬の開発が行われてきたが、Bar Harbor, Maine, USA）および、そのコンジェ

副作用などの問題があり、臨床応用には至っていニ ッ ク 化 の た め に 使 用 し た C57BL/6J マ ウ スない 3 ) 。一方、天然バニロイドであるカプサイシン（WT マウス；紀和実験動物、和歌山）を実験に（cap）は TRPV1 のアゴニストであり、それによ供した。また、免疫組織化学的検討のためにグる TRPV1 の活性化は初期の興奮効果に続き、長リーンマウス（EGFP マウス , C57BL/6-Tg（CAG-4)期に及ぶ脱感作を誘発する 。この脱感作機構にEGFP）1 Osb/J; Jackson Laboratory）を使用した。

よる感覚神経興奮応答の遮断を作用機序とする5 ) 、

温度 23-24℃、湿度 60-70 ％、照明時間を 8-20 時

TRPV1 アゴニストの鎮痛薬としての可能性が模とする環境にて飼育し（5 匹 /1 ケージ）、固形試

索され、cap 軟膏が糖尿病性有痛神経障害などの料（MF、オリエンタルイースト、東京）および飲3)

神経障害性疼痛に利用されている 。
申請者は最近、末梢神経損傷に基づく神経障害性疼痛のモデル動物を用いて、疼痛成立の新たな料水を自由に摂取させた。
2.

神経障害性疼痛モデルマウス
Seltzer ら 8 ) の方法に従い、坐骨神経部分結紮

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浦上財団研究報告書

Vol.20（2013）（PSL; partial sciatic nerve ligation）による神経Frey フィラメントを用いて 6 秒間、マウスの後障害性疼痛モデルマウスを作製した。すなわち、肢足底を刺激した時の逃避反応を観察した。デー

ペントバルビタール（80 mg/kg, i.p.）麻酔下で、マタは試行回数に対する逃避反応率として表した。

ウス右大腿上部の坐骨神経（SCN）を露出し、そ熱痛覚過敏反応は、Hargreaves 法により PSL 後の 1/2 から 1/3 を絹糸で結紮した。また sham（対21 日目のみ評価した。マウスを透明な強化ガラ照）群として、坐骨神経の露出のみを行った。

ス板上に置き、透明な容器で伏せた後、約 2 時間

3.

骨髄移植馴化させた。ガラス板下側から熱刺激装置により、

KO マウスに致死量の放射線（10 Gy）を照射し、マウス後肢足底に輻射熱を照射し、逃避反応を示

ドナーマウスの骨髄細胞 1.0 × 10 6 個を尾静注しすまでの時間（ latency）を測定した。組織損傷をた。ドナーの骨髄細胞は、頸椎脱臼させたマウ防ぐため、Cut - off 時間を 15 秒とした。これを 5スの大腿骨から調製した。ドナーとして用いた回繰り返し、その平均値を算出した。

マウスは、WT マウス、KO マウスおよび EGFP

6.

薬物投与マウスを使用した。それぞれのドナーマウスを手術の 7 日後に、ペントバルビタール麻酔下で、WT- KO マウス、KO - KO マウスおよび EGFP-KO

坐骨神経周囲にカプサイシン（cap, 0.1% , 10μL）

マウスと以下に表記した。

を投与した。対照群として溶媒（10％エタノール

免疫組織化学的染色および 10 ％ Tween 80 を含む生理食塩水）を同様骨髄移植 6 週間後の EGFP-KO マウスに PSLに投与した。

4.

を行い、PSL21 日目にペントバルビタール麻酔

7.

カルシウム蛍光実験

下でリン酸緩衝食塩水（PBS , 20 ml）を経心的にマウスより採取した腹腔マクロファージを灌流することにより脱血し、その後 4 %パラホ

RPMI/10 % FBS/1 % ペ ニ シ リ ン・ ス ト レ プ ト

ルムアルデヒド（PFA , 20 ml）を用いて灌流固定

マイシンの 培 養 液 を 満 た し た 96 well-plate に、を行った。SCN を採取し、凍結組織切片（ 厚さ

4 x 1 0 5cells/100μL の 細 胞 密 度 で 播 種 し た。 播15μm）を作製した。また、naive の WT マウス

種 24 時 間 後、 培 地 を 除 去 し、PBS に て 洗 浄 しより腹腔マクロファージを採取し、4 % PFA 液た後、Recoridng medium（20 mmol/l HEPES,にて固定した。4 %ウシ血清アルブミンを含む

115 mmol/l NaCl, 5.4 mmol/l KCl , 0.8 mmol/l

0.1 % TritonX-100/PBS 液 に よ り ブ ロ ッ キ ン グ

MgCl 2 , 1.8 mmol/l CaCl 2 , 13.8 mmol/l glucose,処理を行った後、一次抗体として抗 TRPV1 抗体

pH7.4）に 5μＭ Fura 2 AM DMSO solution（Neuromics, Edina, MN, USA）あるいは抗 F4/80

loading buffer（Dojindo）を含む loading buffer を抗体（Cederlane, Ontario, Canada）を 4 ℃で一晩100μL/well を添加し、37 ℃で 1 時間インキュベー反応させた。洗浄後、蛍光標識 2 次抗体（Alexaトする。loading buffer 除去後、PBS にて洗浄し、Flour 594-conjugated antibody, Molecular Probes,100μL recording medium/well を加え、マイク

Eugene, OR, USA）を室温で 2 時間、反応させた。

ロプレートリーダー（Infinite F200 Pro-FL-ABS ,Perma Fluor（ Thermo, Pittsburgh, PA, USA）でTECAN）にて励起波長 340 nm/380 nm および蛍封入し、共焦点顕微鏡で観察した。

光波長 510 nm にて蛍光強度比を算出した。薬物

5.

行動実験
疼痛行動は PSL21 日目に観察した。触アロディ

ニ ア 反 応 を 評 価 す る た め に、0.16 g 強 度 の vonはインジェクター（IJ1, TECAN）を用いて 20μLを添加した。

新規鎮痛作用機序を有する香辛料成分の探索

結果

2.

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骨髄由来細胞における TRPV1 の発現
EGFP マウスをドナーとする骨髄移植を受けた

マクロファージ細胞内カルシウムに及ぼす
TRPV1 アゴニストの影響

KO マ ウ ス（EGFP-KO マ ウ ス ）SCN の 免 疫 染 色

二波長励起による Fura 2 蛍光測光により、腹TRPV1 抗体免疫反応陽性を示した（Fig. 2a and腔内マクロファージの細胞内カルシウム濃度を測2b)。腹腔内マクロファージについて、抗 F4/80

定 し た。Recording medium 添 加 は、340 nm 励（マクロファージ膜抗原）抗体で免疫染色を行い、起と 380 nm 励起による蛍光強度比（F340/F380）

TRPV-1 に対する抗体との二重染色を行った結に影響を及ぼさなかった（Fig. 1）。1μM カプサ

果、F4/80 免疫反応陽性細胞の一部が抗 TRPV1

イシンの適用は F340/F380 を著しく上昇した。

抗体免疫反応陽性を示した（Fig. 2c and 2d）。

1.

を行った結果、EGFP 蛍光を示す細胞の一部は抗すなわち、細胞内カルシウム濃度の有意な上昇がみとめられた。一方、同濃度の 6 - gingerol および6-shogaol は F340/F380 を上昇したが、カプサイシンよりは低値であった。

Figure 2. Immunohistochemistry for TRPV1 in SCN (a and b) andperitoneal macropharges (c and d). Six weeks after
bone marrow transplantation, an EGFP-KO mouse wassubjected to PSL, after which 3 weeks it underwent
transcardial perfusion fixation with paraformaldehyde.
A section of dissected SCN was immunostainedusing antibody against TRPV1, and an image for
TRPV1-immunoreactive cells (a) and EGFP-positivecells (b) was taken from its section. The peritoneal
macrophages were collected from a naive WT mouseand double-immunostained with both antibody for
TRPV1 (c) and antibody for F4/80 (d). The same cells
are indicated by the same type of symbols in a and b
and in c and d.

Figure 1. Effect of TRPV1 agonists on cytosolic free-Ca 2+ inperitoneal macrophages. a) Time-course of intracellular
Ca 2+ fluorometry. Representative time course showing
F340/F380 in responses to TRPV1 agonists. b) The
magnitude of effect of TRPV1 agonists on [Ca 2+]i. Area
under the curve in time-course of Ca 2+ fluorometry is
calculated for evaluation of increase in [Ca 2+]i. n=5.
**P<0.01 and ***P<0.001 vs. control, determined byDunnet multiple comparison test.

3. カプサイシン鎮痛効果に及ぼす骨髄移植の影響
KO-KO 溶媒投与群において、PSL により触刺激誘発逃避行動発生率の有意な増加が見られた（Fig. 3a）。つまり、触アロディニアが発現したことを示す。cap 投与は、KO-KO 溶媒投与群で形成された触アロディニアに対して有意な影響を74

浦上財団研究報告書Vol.20（2013）

及ぼさなかった。WT-KO 溶媒投与群において、ウム濃度上昇応答を指標に、腹腔マクロファージ

PSL に よ り 触 ア ロ デ ィ ニ ア が 形 成 さ れ た。capの TRPV1 刺激効果の強さを評価した。その結果、投与は、統計的に有意な差はみられなかったが、カプサイシンが最も強くカルシウム濃度を上昇しWT-KO 溶媒投与群における触アロディニア形成たことから、本物質の神経障害性疼痛への影響をを減弱する傾向を示した。また、sham 処置にお検討することを決定した。次に、TRPV1 発現細ける反応率に対して、cap 投与は有意な影響を胞の同定を試みた。EGFP-KO マウスの PSL によ及ぼさなかった。熱刺激誘発逃避反応について、

り、PSL 側 SCN に TRPV1 を発現する骨髄由来細PSL は KO-KO 溶媒投与群および WT-KO 溶媒投胞が集積することが示された（Fig. 2a and 2b）。

与群の反応潜時に対して有意な影響を示さなかっ

さらに、マクロファージ膜抗原である F4/80 にた（Fig. 3b）。

対する免疫組織化学的二重染色により、腹腔マクロファージの一部は TRPV1 を発現することが明らかになった（Fig. 2c）。これらの結果は、骨髄から PSL 部位に集積するマクロファージは TRPV1を発現する可能性を示唆する。神経障害性疼痛の形成および維持機構には様々な炎症性メディエーターが重要な役割を果たす。これら炎症性メディエーターの供給源として神経損傷部位に集積したマクロファージなどの免疫細胞が報告され、これらの免疫細胞や神経細胞によるサイトカインネットワークの重要性が明らかになっている

1, 5 )。著者はこれまでに、PSL により SCN に集積するマクロファージと SCN 上膜に分布する脂肪細胞のクロストークにより両細胞が炎症性フェノタイプに転化し、神経障害性疼痛様行動の成立に寄与することを示した 9 )。さらに、本研究では PSL 誘発
神経障害性疼痛様行動はカプサイシンの SCN 周囲投与により抑制されること、また、その鎮痛効
Figure 3. Effect of capsaicin on PSL-induced tactile allodynia
and thermal hyperalgesia in KO-KO mice and WT-KO
mice. Six weeks after bone marrow transplantation,
mice were subjected to PSL, and subsequently
received a single perineural administration of capsaicin(cap; 0.1%, 10µl) or vehicle (veh) to SCN on day 7 ofPSL. Tactile allodynia (a) and thermal hyperalgesia (b)were evaluated on day 21 of PSL. *p<0.05.

考察

果は TRPV1-KO マウスにおいては、生じないことが明らかとなった。そこで、PSL により集積するマクロファージにおける TRPV1 の機能的重要性を調べる目的で、TRPV1-KO マウスに WT マウス骨髄を移植することにより、マクロファージにおける TRPV1 機能を回復させたマウス（WTKO マウス）における神経障害性疼痛に及ぼすカTRPV1 を標的とする香辛料成分として、唐辛プサイシンの影響を調べた。KO-KO 溶媒投与群

子、生姜由来のカプサイシン、ショーガオール、において、PSL により触アロディニアが発現した。

ジンジャオールに注目し、これらの細胞内カルシ

一方、WT-KO 溶媒投与群においても同様の結果

新規鎮痛作用機序を有する香辛料成分の探索75が得られた（Fig. 3）。これらの成果は、骨髄移植究結果は、TRPV1 発現マクロファージがカプサの処置そのものは、TRPV1-KO マウスにおけるイシンの標的細胞になりうることを明らかにし、PSL 誘発触アロディニア形成に影響を及ぼさない神経障害性疼痛の病態解明に新たな知見を提示すことを示唆する。カプサイシンの SCN 周囲投与

る重要な成果といえる。

による触アロディニア減弱効果は、KO-KO マウスでは見られなかったが、WT-KO マウスでは減謝辞弱傾向が見られた（Fig. 3）。一方、熱痛覚過敏に本研究課題を遂行するにあたり、多大な研究助

ついては KO-KO ならびに WT-KO の両マウスで成を賜りました（公財）浦上食品・食文化振興財は生じなかったという結果は、一次知覚神経線維団に厚く御礼申し上げます。の TRPV1 欠損マウスでは熱感受性が減弱していることと一致する 2 )。以上の行動学的検討結果は、

文

TRPV1-KO マウス S CN に浸潤する骨髄由来細胞

1) Scholz J, Woolf CJ (2007) The neuropathic pain triad:neurons, immune cells and glia. Nat Neurosci 10:1361-1368.

における TRPV1 機能の骨髄移植による獲得は、カプサイシン鎮痛効果を回復させることを示す。
さらに、免疫組織化学的検討の結果も考慮すると、PSL により SCN に浸潤する TRPV1 発現マクロファージは、少なくともカプサイシン標的細胞の一つである可能性が示唆される。この可能性に対し、マクロファージ細胞株 RAW246.7 には TRPV1 が発現せず、マクロファージに対するカプサイシンの抗炎症効果は TRPV1 を介さないという報告がある 10 )。著者も、RAW246.71 には TRPV1 が発現されなかったことを確認しているが、一方で、他のマクロファージ細胞株である J774A.1 およびマウス腹腔マクロファージのいずれにおいてもmRNA を検出した（data not shown）。個体から採取した標本であることならびに細胞株の種類の違いもあるが、本研究結果（Fig. 1）と合わせて考慮すると、本研究条件下で観察したマクロファージに TRPV1 が発現している可能性は高いと考えられる。
要 約 す る と、S CN 傷 害 後、 集 積 す る マ ク ロ
ファージが TRPV1 を発現しており、カプサイシン投与はその TRPV1 刺激を介して、炎症性サイトカイン産生を抑制することが示唆される。本研

献2) Caterina MJ, et al. (1997) The capsaicin receptor: a heatactivated ion channel in the pain pathway. Nature 389:816824.
3) Patapoutian A, Tate T, Woolf CJ (2009) Transient receptor
potential channels: targeting pain at the source. Nat Rev
Drug Discov 8:55-68.
4) Numazaki M et al. (2003) Structural determinant of TRPV1
desensitization interacts with calmodulin. Proc Natl Acad
Sci USA 100: 8002-8006.
5) Moalem G, Tracey DJ (2006) Immune and inflammatory
mechanisms in neuropathic pain. Brain Res Rev 51: 240-264.
6) Maeda T, Kiguchi N, Kobayashi Y, Ikuta T, Ozaki M,Kishioka S: Leptin derived from adipocytes in injured
peripheral nerves facilitates development of neuropathic
pain via macrophage stimulation. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA., 106(31), 13076-13081, 2009.
7) Kiguchi N, Maeda T, Kobayashi Y, Fukazawa Y, Kishioka
S: Macrophage inflammatory protein-1α mediates thedevelopment of neuropathic pain following peripheral nerve
injury through interleukin-1β up-regulation. Pain, 149(2),305-315, 2010.
8) Seltzer Z, et al. (1990) A novel behavioral model ofneuropathic pain disorders produced in rats by partial sciatic
nerve injury. Pain 43: 205-218.
9) 前田武彦・慢性疼痛における脂肪細胞の機能的役割とその制御・第 61 回日本薬学会近畿支部大会・2012 年
10 月・神戸
10) Chen CW, et al. (2003) Signal transduction for inhibitionof inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2induction by capsaicin and related analogs in macrophages.
Br J Pharmacol 140:1077-1087.

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浦上財団研究報告書

Vol.20（2013）

Exploration of spice components with novel analgesic mechanism
Takehiko Maeda
Dept. of Pharmacol., Niigata Univ. of Pharm. Appl. Life Sci.

ABSTRACT：Neuropathic pain is triggered by lesions to the somatosensory nervous system thatalter its structure and function so that pain occurs spontaneously and responses to noxious
and innocuous stimuli are pathologically amplified. We have proposed that peripheral
nerve injury induces a cross-talk between perineural adipocyte and recruited macrophages
to prolong and aggravate pain, indicating neuropathic pain. Some of spice components
reportedly have analgesic activity in animal model with conventional mechanism, a manner
mediated by desensitization of TRPV1. Thus, this study explored the analgesics fromspice components with a novel analgesic mechanism. I used fluorometric determination ofcytosolic free Ca 2+ concentration to test effects of some TRPV1 agonists on Ca 2+ response
in peritoneal macrophages of mice. Capsaicin had most highly activity in increments ofthe cytosolic free Ca 2+ concentration. The effects of Capsaicin on the development ofneuropathic pain were tested. Mice were subjected to partial sciatic nerve ligation (PSL)
for neuropathic pain model. Capsaicin was given to perineural SCN on day 7 of PSL.
PSL elicited neuropathic pain including tactile allodynia and thermal hyperalgesia, whichwere reversed by Capsaicin. The Capsaicin -induced attenuation of NP did not occur
in TRPV1-KO mice. To test whether immune cell with TRPV1 is involved in analgesic
effect of Capsaicin, we used bone marrow transplantation to generate TRPV1-KO withmacrophages with wild type genotype. In contrast to TRPV1-KO without bone marrowtransplantation, Capsaicin analgesic effect occurred in TRPV1-KO subjected to bonemarrow transplantation. These results suggest that TRPV1 activation produces analgesic
effects on NP, at least in part, through suppression of inflammatory macrophages. Capsaicin
is potentially useful analgesics through inhibition of inflammatory immune responses.