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微生物の迅速検査を可能にする人工シデロフォア修飾蛍光材料の開発＜令和 3 年度助成＞

微生物の迅速検査を可能にする

人工シデロフォア修飾蛍光材料の開発
猪股智彦（名古屋工業大学大学院 工学研究科工学専攻 生命・応用化学系プログラム）

緒術の開発に取り組んでいる 1~3)。微生物がレセプター

言で認識可能な人工シデロフォアの構造が異なるた
近年、HACCP（Hazard Analysis and Critical ControlPoints）導入により、微生物の迅速な検出に対するめ、人工シデロフォアの構造をチューニングすることで選択的に微生物を検出可能となる。

ニーズが高まっている。微生物を高感度に検出する

本研究では、図 1 に示したように人工シデロフォためには微生物自身、あるいは PCR 法による DNA

ア分子に蛍光を発する材料を結合することで、培養等の増殖が必要であり、検出結果が出るまでに時間操作を必要としない、視覚的に微生物を選択的に検がかかる。シデロフォアとは微生物が必須金属イオ出可能な技術の開発を目指す。人工シデロフォアのンである鉄イオンを捕捉し細胞内に取り込むために構造の違いにより、それを取り込むことのできる微産出するキレート分子である。微生物から放出され生物が異なるため、微生物を選択的に検出することたシデロフォアは環境中に存在する鉄イオンと選択が可能な技術となる。本報告書では、人工シデロフォ的に結合して複合体を形成する。形成された複合体

アおよびその鉄錯体の合成と諸性質の測定、蛍光材は微生物の細胞膜上にあるレセプターと呼ばれる膜料と結合した人工シデロフォアおよびその鉄錯体のタンパク質で認識され、細胞内へと取り込まれる。

合成とその蛍光測定、蛍光材料と結合した人工シデ

人工シデロフォアは天然のシデロフォアの機能を模ロフォア鉄錯体を用いた微生物の培養実験および蛍倣した人工的に合成された化合物であるが、我々は光材料による可視化について報告する。

人工シデロフォアを利用した微生物の選択的検出技

図1

蛍光材料を結合した人工シデロフォア鉄錯体による微生物の検出110

浦上財団研究報告書

Vol.31（2024）

規に合成したハイブリッド型人工シデロフォアであ結果と考察る。各人工シデロフォアは FT-IR、1HNMR、および・人工シデロフォアおよびそれらの鉄錯体のESI-MS、それらの鉄錯体は UV/vis スペクトルおよ合成

び元素分析によって同定された。微生物（E. coli, B.

本研究では微生物に選択的に取り込まれる人工シsubtills, M. flavescens, P. putida, R. rhodochrous など）

デロフォア鉄錯体として図 2 に示した末端に NH2-を用いて合成された人工シデロフォア鉄錯体の取込基を有する 4 種類の人工シデロフォアおよびそれら能を評価し、これらの人工シデロフォアが選択的にの鉄錯体を合成した 。このうち LC2H1 および LC1H2

微生物に取り込まれることを確認した。

4)

は既報

1, 2)

である LC3 および LH3 の合成法をもとに新

図2

図3

本研究で合成した人工シデロフォア鉄錯体の構造

蛍光材料を結合した人工シデロフォア分子およびその鉄錯体の合成法

微生物の迅速検査を可能にする人工シデロフォア修飾蛍光材料の開発

・蛍光材料が結合した人工シデロフォアおよ111

れた電荷移動吸収（K3[FeLC3] では 499 nm に観測 2)）

びその鉄錯体の合成が overlap したためと考えられる。この結果から鉄イ

上記で合成された人工シデロフォアのうち、一般オンとの錯形成反応は問題なく進行しているものと判的な微生物である E. coli にもっとも選択的に取り込断できる。また両者の差スペクトルでは、K3[FeLC3-FITC]

まれる K3[FeLC3] に一般的蛍光色素であるフルオレセ由来の電荷移動吸収がほぼ同じ位置に観測されたたイン（FITC）を結合した人工シデロフォア（LC3-FITC）

め、FITC の結合による錯体の構造への影響はほとんおよび人工シデロフォア錯体（K3[FeLC3-FITC]）を図 3どないことが示唆された。に示した方法により新規に合成した。LC3-FITC は FT-IR

図 4b に励起波長 490 nm で観測された LC3-FITC およおよび HNMR、K3[FeLC3-FITC] は FT-IR および UV/vis

び K3[FeLC3-FITC] の蛍光スペクトルを示した。LC3-FITCスペクトルにより同定した。LC3 と FITC との結合はの蛍光スペクトル強度に比較して、錯形成反応によLC3 の末端にある NH2- 基と FITC の NCS- 基との縮合り鉄イオンが導入された K3[FeLC3-FITC] では、その蛍反応により行った。我々が合成した人工シデロフォ

光スペクトル強度は大きく減少することが判明し

アは各種材料の表面などに結合するためにいずれもた。これは配位した鉄イオンによる消光過程が存在すNH2- 基を末端に導入しており、今回の合成により蛍るためと考えられる。 図 4c に示したのは濃度 0.02

光材料への結合も比較的容易に行えることが判明しM に調整した LC3-FITC および K3[FeLC3-FITC] の水溶液のた。また LC3 に対して同程度の大きさを有する FITC写真であり、この濃度では鉄イオンが導入されたを導入できたことから、立体障害などによる合成へ

K 3[FeLC3-FITC] による蛍光が減衰していることがわの影響もほとんど観測されず、NH2- 基に結合する官かる。このような鉄イオンの導入による消光を防ぐ能基であればどのような蛍光材料にも導入可能であためには、 LC3 と FITC の間の距離を離すためにリンることが示唆された。

カー分子の導入などが必要と考えられる。

・K 3[FeLC3-FITC] の UV/vis および蛍光スペクトル・K 3 [FeL C3-FITC ] による E. coli の培養実験

1

図 4a に合成された LC3-FITC および K3[FeLC3-FITC] の濁度測定による K3[FeLC3-FITC] の E. coli への取込実

UV/vis スペクトルを示した。LC3-FITC のスペクトルに験を行った。図 5 に鉄制限培地中で培養された E.

比べて K3[FeLC3-FITC] のスペクトルでは全体的に吸収coli の生長曲線を示した。何も加えない（鉄イオンの上昇が見られたが、これは人工シデロフォア部位源がない）場合は E. coli の増殖は見られなかったが、が鉄イオンと錯形成をしたことにより新たに観測さK3[FeLC3-FITC] を加えた場合は、蛍光材料を結合して

図4LC3-FITC（点線）および K3[FeLC3-FITC]（実線）の a) UV/vis 吸収スペクトル、b) 蛍光スペクトル、c) UV ランプ照射時の写真（サンプル濃度：0.02 mM phosphate buffer (pH 7.0)、励起波長 490 nm）

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浦上財団研究報告書

Vol.31（2024）

いない人工シデロフォア鉄錯体である K3[FeLC3] と同程度の E. coli の増殖が観測された。これは加えた
K3[FeLC3-FITC] が鉄イオン源として E. coli 内部へ取り込まれたことで増殖したものと考えられる。これは当初の目的どおり、蛍光材料を結合した人工シデロフォア鉄錯体が微生物の細胞膜上のレセプタータンパク質によって認識され微生物細胞内に取り込まれていることを示している。現状では先にも述べたと
おり K3[FeLC3-FITC] は鉄イオンの導入による消光過程が存在し、十分な発光強度が出ていない。そのため現時点では K3[FeLC3-FITC] により E. coli の蛍光によるラベル化ができているかを判断することはできなかった。今後リンカー分子の導入による蛍光強度減図5衰の抑制や他の蛍光材料（蛍光を発する半導体微粒子や GFP タンパク質など）と結合した人工シデロフォア分子の開発を進める予定である。

謝

鉄イオン源なし（破線）、K3[FeLC3]（点線）および
K3[FeLC3-FITC]（実線）添加時の E. coli の生長曲線

辞
本研究の遂行にあたり、研究助成を賜りました公益財団法人 浦上食品・食文化振興財団に厚く御礼を結言

本研究では、その構造の違いにより選択的に微生物に取り込まれる人工シデロフォア鉄錯体に蛍光材料を結合し、視覚的に微生物の検出などが行える材料の開発を行った。そのため 4 種類の人工シデロフォア分子を設計・合成し、それらの鉄錯体の複数の微生物に対する取込能力を検討した。E. coli に対して選択的な取込能力を示す K3[FeLC3] に対して蛍光色素である FITC を結合した新規人工シデロフォアである LC3-FITC およびその鉄錯体である K3[FeLC3-FITC] を設計・合成し、その蛍光特性について評価した。また
実際に E. coli を用いた培養実験を行い、K3[FeLC3-FITC]が E. coli 細胞内へ取り込まれることを確認した。

申し上げます。
参考文献

1) T. Inomata, H. Eguchi, Y. Funahashi, T. Ozawa, H.
Masuda, Langmuir , 2012, 28 , 1611-1617.
2) T. Inomata, H. Tanabashi, Y. Funahashi, T. Ozawa, H.
Masuda, Dalton Trans., 2013, 42 , 16043-16048.
3). T. Inomata, T. Murase, H. Ido, T. Ozawa, H. Masuda,
Chem. Lett. , 2014, 43 , 1146-1148.
4). T. Inomata, S. Endo, H. Ido, R. Mori, Y. Iwai, T. Ozawa,H. Masuda, Inorg. Chem ., 2023, 62 , 16362-16377.

Development of fluorescence material-modified artificial siderophores for rapid detection of microorganisms 113

Development of fluorescence material-modified artificialsiderophores for rapid detection of microorganisms
Tomohiko INOMATA
Graduate School of Engineering, Nagoya Institute of Technology
The rapid and high-sensitivity detection of microorganisms is one of thecritical problems for food safety and public health. We have focused on the ironuptake system by microorganisms using siderophore molecules to develop new
rapid, sensitive, and selective microbial detection methods. Siderophores aresmall Fe ion chelating molecules for iron uptake. The siderophores form stablecomplexes with Fe ions, while the receptor proteins on the surface ofmicroorganisms recognize the complexes, which permeate into the interior ofthe cells. Artificial siderophores are functional model compounds for nativesiderophores. We have developed techniques for the selective adsorption ofmicroorganisms using artificial siderophore-Fe complex-modified substrates. In
this study, we succeeded in the synthesis of an artificial siderophore connected
to a fluorescent material (L C3-FITC ) and its Fe ion complex ([FeL C3-FITC ] 3– ). Thesemolecules emitted fluorescence in an aqueous solut ion. Biolog ical curvemeasurement using E. coli indicated the permeation of [FeL C3-FITC ] 3– into the E.
coli cell interior. This result indicates that [FeL C3-FITC ] 3– permeates into E. coli ,and possesses a good ability for the selective detection of microorganisms
using fluorescence.