報文鯉淵研報26 ３２～₄３（2010）

毒性アオコの検出とミクロシスチン合成遺伝子群の保存性について
野 口

Ⅰ

はじめに

貴 彦＊

Ⅱ

毒性アオコの発生とその被害

世界中の湖沼などにおいて富栄養化が進み，アオ

近年，世界各地において家庭や工場からの排水がコ（青粉，水の華）が発生し大きな環境問題となって増え，また土壌からは過剰施肥などによる肥料成分

いる。特に深刻なのは毒性アオコの発生である。

（窒素，リン）の流出もあり，水環境を汚染する物

アオコの原因生物であるシアノバクテリアには，質の流出は増え続け，富栄養化した湖沼，河川，ダ

糸 状 性 の Nostocalaes に 分 類 さ れ る Anabaena，ムなどが増加している。そしてアオコが大量発生し，Aphanizomenon お よ び Nodularia，Oscillatoriales にその湖水を飲んだ野生動物や家畜の死亡被害が多分類される Planktothrix，Oscillatoria，また球状の数報告されるようになった。アオコの毒性について

Chroococcales に 分 類 さ れ る Microcystis が あ り，は，1878 年に出された報告が最初であり 3），我が国

日本に発生するアオコを構成するシアノバクテリア

では Watanabe らにより 1977 年に諏訪湖から採取の優占種としては，Microcystis が最もよく観察されした M. aeruginosa よりなるアオコに毒性があるこる。シアノバクテリアには，カビ臭（ジオスミン），とが初めて報告された 4）。1990 年にはオーストラリ

肝毒素（ミクロシスチン，ノジュラリン，シリンド

アのニューサウスウエールズを流れるダーリング川

ロパーモプシン），神経毒（アナトキシン，サキシ流域で 1,200km にわたってアオコが大発生し，そトキシン）などの有毒物質を生産する株があり，それによって数百頭もの家畜が死亡した例が報告されの中で最も問題となるのが肝毒素ミクロシスチン

た 5）。日本におても 1995 年に発生した新池（兵庫（microcystin）である。ミクロシスチンは細胞内毒

県西宮市）における野鳥の変死の原因がミクロシス

素であり，細胞の破壊・溶解により環境中に放出さチンであることが報告され 6），これが日本におけるれる。これまでにミクロシスチンは，Microcystis，

ミクロシスチンによる野生動物への被害として最初

Anabaena，Planktothrix，Oscillatoria などが生産すの報告である。ヒトへの被害については，1996 年

ることが明らかとなっている。さらに近年，ミクロに南米のブラジルにおいて，病院で有毒アオコが発シスチン合成遺伝子（mcy）クラスターの構造が明生した水を人工透析に使ったため，透析患者 50 人

らかとなったことから，その遺伝子情報を用いて環あまりが死亡し，その原因はミクロシスチンである

境中から毒性株の検出や mcy クラスター構造の詳ことが報告された 7）。そのため世界保健機構（WHO）

細な検討が可能となってきた。ここでは，毒性アオ

ではミクロシスチンのヒトへの健康被害を未然に防コの問題，遺伝情報を用いた毒性アオコの検出，ミ

ぐ た め，1998 年 に 初 め て 飲 料 水 中 の microcystin-

クロシスチン合成遺伝子クラスターの構造と多様

LR の暫定ガイドラインを 0.001 mg/L と設定した 8）。

性，そしてミクロシスチンの生合成について得た知この様に水源において毒性アオコが発生した場

見について述べる。

1）2）

合，ヒトの健康への被害が憂慮されることから，毒性アオコの発生防除と除去対策が求められている。
アオコを構成するシアノバクテリアの多くの種はミ
クロシスチンを生産し，その生産性は株特異的であ＊鯉淵学園農業栄養専門学校 生活栄養科学科

32

り，ミクロシスチンは 89 種にのぼる。シアノバク

毒性アオコの検出とミクロシスチン合成遺伝子群の保存性について

テリアはどの様にしてミクロシスチン生産能を獲得保存されている領域からプライマーをデザインし，したのか（あるいは失ったのか），また，ミクロシ

PCR 法を基盤とした手法を用いて，霞ヶ浦より分

スチン合成遺伝子はシアノバクテリア間で伝播して離した M. aeruginosa K-139 よりミクロシスチン合

いるのかなど，遺伝生態学的な解明が大きな課題と成遺伝子をクローニングし，その遺伝子構造を世界なっている。

で最初に明らかにした 12）13）。ミクロシスチン合成
遺伝子は，10 個の遺伝子からなり，転写方向が逆Ⅲミ クロシスチン合成遺伝子と生合成機向きの mcyABC と mcyDEFGHIJ の 2 つのクラスター

構の解明から構成されていた（図 2）。その特徴は，NRPS
遺 伝 子 と ポ リ ケ チ ド 合 成 酵 素（PKS：polyketide

ミクロシスチンは，1985 年に Botes らにより M.

synthase）遺伝子が融合した 2 つの遺伝子（mcyE，

aeruginosa の生産する肝毒素が単離され構造が決mcyG）を有することである。これらの Mcy のミ

定された 。ミクロシスチンは 7 つのアミノ酸か

クロシスチン生合成における役割を図 3 に示した。

ら な る 環 状 ヘ プ タ ペ プ チ ド で，［cyclo-D-Ala-X-β-

一般的にペプチド生合成遺伝子のモジュールの配

MeAsp（β-erythro-methyl-D-Asp）-Z-Adda（3-amino-

列は，ペプチドを構成するアミノ酸配列と一致し9-metoxy-2,6,8-trimethyl-10-phenyl-4,6-decadienoicている。mcyA → mcyB → mcyC は，Mdha-Ala-Leu-

9）

acid）
-D-Glu-Mdha（N-methyldehydroalanine）］の

MeAsp-Arg の 合 成 に 関 与 し 12）13）14），McyC の C

共通構造を有し，X と Z の位置の L 型アミノ酸は末端には，生合成の最終段階である NRPS からペミクロシスチンにより変化する（図 1）。ミクロシ

プチドの遊離と環状化に関与するチオエステラーゼ

スチンの命名は，X の位置がロイシン（Leu，L）で，ドメインがある。これらのことからミクロシスチ

Z がアルギニン（Arg，R）の場合，microcystin-LRンの生合成は Adda の合成から開始されると推定さとよばれる。これまでに 89 種の構造の異なるミクれている。そして Adda は，McyG，McyD および

ロシスチンが報告されている。ミクロシスチン

McyE により合成されると推定される。合成されたの分子構造が決定されたことから，次の課題はミ

Adda は，McyE により Glu と縮合し，Adda-Glu のクロシスチン合成遺伝子（mcy）構造の解明であっジペプチドが合成され，次のステップへと進むと考た。ミクロシスチンは，その分子構造から非リボ

え ら れ る。McyF は Asp/Glu の ラ セ ミ 化 に 15）16），

ソーム型ペプチド合成酵素（NRPS：nonribosomal

McyI は 2-hydroxy-acid dehydrogenase で， ミ ク ロ

peptide synthetase）複合体により合成されると推

シスチン分子の 3 位の D-MeAsp の合成に関わって定され，西澤らは NRPS においてアミノ酸の活いることが報告されている 17）。McyJ は，Adda 分性化を触媒するアデニレーションドメインに共通に子の O- メチル化の役割を担っていることが示され

10）

11）

図 1 ．Microcystin-LR の構造
Adda, 3-amino-9-methoxy-10-phenyl-2,6,8-trimethyl-deca-4,6-dienoic acid; D-MeAsp,
D-erythro-β-methylaspartic acid; Mdha, methyldehydroalanine; M.W., molecular weight.

33

鯉 淵

研 報

第 26 号

2010

図２．シアノバクテリアのミクロシスチン合成遺伝子構造

mcyｰ: ミクロシスチン合成遺伝子構造非保有株（非生産株）
Nodularia：肝毒素ノジュラリン合成遺伝子（nda）［ ］に対応するmcyを示した

図３．ミクロシスチン生合成におけるMcyの機能ている 18）。また McyH は ABC トランスポーター

や毒性株の検出が積極的に行われている。ミクロと相同性を持つ遺伝子で，mcyH を破壊することにシスチン合成遺伝子が解明される以前は，HPLC

よりミクロシスチンを生産しなくなることが報告さ

や LC/MS/MS などを用いた機器分析法，モノク

れている

ロナール抗体を用いた ELISA 20），プロテインホス。

19）

ファターゼ阻害測定法などが用いられてきた 4）。湖Ⅳ

環 境中における毒性株の検出とその動

水などのミクロシスチン濃度は様々な環境要因に

態解析

より変化すること，あるいは 89 種ものミクロシスチンがあることなどから，これらの方法だけでは環毒性アオコの発生が世界的に深刻な環境問題と境中におけるミクロシスチンの動態を調べるにはなったことから，その環境中における毒性アオコ

不十分であった。そこで，遺伝学的指標を基にしの動態解析のために，毒性アオコのモニタリング

た毒性株の分類・同定が試みられた。毒性および34

毒性アオコの検出とミクロシスチン合成遺伝子群の保存性について

非 毒 性 Microcystis 株 の 16S rRNA 遺 伝 子，16S-23Sが出されている。PCR 法の問題点としては，ミクinternal transcribed spacer region（16S-23S ITS

ロシスチンを生産する可能性のある株を検出していregion）あるいはフィコシアニン遺伝子を用いた系るものであり，必ずしも生産株を検出してはいない

統樹解析が行われた

21）22）23）。しかし，これら遺伝ことである。西澤らはミクロシスチン合成遺伝子を子による系統学的解析から毒性株を特異的に検出す保有しているが，ミクロシスチンは生産しない株

ることは困難であることが示唆された。

（mcy-containing non-toxic strain） が あ る こ と を 明

ミクロシスチン合成遺伝子の構造が明らかとなっらかにしている 12）13）。またミクロシスチン生産能たことから，遺伝情報を用いた毒性株（mcy+）のは生産株により異なること，また生産性は環境要因

検 出 法 が 検 討 さ れ た。Tillett ら は mcyA か ら デ ザに大きく影響されることから，mcy 株の割合は必インしたプライマーを用いた PCR 法により毒性株

ずしも環境中のミクロシスチン量を示すものではなを検出し，16S rRNA 遺伝子とフィコシアニンオペ

いことに留意する必要がある。よってアオコ中の毒ロンの系統樹との比較検討を行った。また Pan性株の動態解析には遺伝学的解析，化学的分析や免らは，mcyB よりデザインしたプライマーを用い疫学的手法による解析も併用する必要がある。しかて PCR 法によるミクロシスチン生産株の検出を報し遺伝子工学的検出法はアオコ毒性株の動態を解析告した。 さ ら に 定 量 的 PCR（Quantitative real-

するためには，極めて有効な方法であり，特に定量

time PCR, qRT-PCR）法による環境中の毒性株の的 PCR 法により，毒性株の割合の解析が可能となっ

定 量 的 計 測 へ と 発 展 し た。Kurmayer ら は， ド イ

たことは，環境中の毒性アオコのモニタリングに大ツの Wannsee 湖で mcyB を標的とし，フィコシア

きく貢献するものといえる。

22）

24）

+

ニンオペロンを構成する遺伝子間の増幅と比較することにより，Microcystis 中での毒性株（mcy ）の+測定が可能であることを報告した 25）。Vaitomaa らⅤ湖沼に発生したアオコの毒性と mcy + の
分離は，フィンランドの Tuusulanjärvi 湖などで mcyEを 標 的 と し た 定 量 的 PCR 法 を 用 い て mcyE の コ

筆者らは，湖沼における mcy+ 株の動態と mcy 構

ピー数を導きだし，その値と湖水中のミクロシスチ

造を明らかにするため，塘路湖（北海道標茶町），

ン濃度と相関関係があることからモニタリング方

諏訪湖（長野県），阿木川ダム（岐阜県恵那市），昆

法として有効な手段であると報告している。ま

陽池（兵庫県伊丹市，採取場所の違いを「昆陽池

た，Rantala らはフィンランドの 70 ヶ所の湖にお2」，「昆陽池 3」と示した）の地域や環境の異なる

いて，mcyE を標的として PCR 解析を行ったとこ

4 つの湖沼を対象とし（図 4），アオコの毒性調査とろ，ミクロシスチンを生産する可能性のある株はmcy を指標に mcy+ 株の分離を試みた。塘路湖は釧

Microcystis，Planktothrix，Anabaena spp. で は そ れ

路川水系 3 湖沼の一つで，その周辺は釧路湿原国立ぞれ 70 ％，63 ％，37 ％であり，富栄養化が進ん公園の特別地域であり，2000 年以前からアオコのだ湖においてミクロシスチン合成遺伝子を保持した発生が認められている。諏訪湖は 1960 年代からア株の割合が高くなっていることを報告している

27）。

オコが発生し，我が国において霞ヶ浦，三方湖など

日本においても，吉田らは，福井県の三方湖と新月

ともにアオコに関する研究が最も活発に行われてい湖に発生したシアノバクテリアについて，mcyA をる湖である 30）。阿木川ダムは近隣市町村や愛知県標的とした Competitive PCR 法を用いてミクロシの用水として利用されている多目的ダムで，1999

スチン合成遺伝子を持つ株の湖沼中における菌体数

年頃からアオコの発生が観察されている。昆陽池はの推定が可能であること報告した。古川らも茨都市部に位置する昆陽池公園にあり，地下水を水源

城県の霞ヶ浦と北浦で発生したシアノバクテリアにとしている。富栄養化によるアオコが大発生し，大ついて mcyA を標的とした定量的 PCR 法を用いてきな問題となっている。2002 年にそれぞれ採取しミクロシスチン合成遺伝子を持つ株の湖沼中におけたアオコでは，PCR 法を用いた mcyG-mcyH 領域のる菌体数の測定が可能であると報告した 29）。これ

増幅の結果から，全ての採取場所においてミクロシ

までに mcyA，mcyB および mcyE などを増幅領域とスチン合成遺伝子（mcyG，mcyH）を持つシアノバ

した定量的 PCR 法を用いた毒性株動態解析の報告

クテリアの存在が示唆され，HPLC および MALDI-

26）

28）

35

鯉 淵

研 報

第 26 号

2010

図 4 ．本研究の対象とした湖沼・ダム湖
日付は採取日を示した

表 1．アオコの毒性

TOF/MS 解析により，昆陽池 3 を除いて，いずれの試料からもミクロシスチンが検出された（表 1）。

Microcystin の検出

採取地

PCR
(mcyG-H)

HPLC

MALDI-TOF/MS， 昆 陽 池 3 に 存 在 し た mcy+ 株

昆陽池 2

＋＋

MCYST-LR,-RR

MCYST-LR, -RR

は，ミクロシスチンの生産量が極めて低かったと考

昆陽池 3

＋＋

阿木川ダム

＋

諏訪湖

＋＋＋

MCYST-LR,-RR

MCYST-LR,-RR

唐路湖

＋＋

MCYST-RR

MCYST-LR,-RR

昆陽池 3 からはミクロシスチン生産菌が分離されていることから

31）えられた。阿木川ダムのアオコからは，ごく微量のmicrocystin-LR が検出された。よって阿木川ダム
ではアオコ中に毒性株は存在するが，その割合は非常に少ないと考えられた。このことは mcy 株の分+

MCYST-LR＋ , PCR バンドの強度を示す。
－ , 検出なし

離結果とも一致していた 31）。
2002 年に昆陽池，阿木川ダム，諏訪湖及び塘路が mcy 株であった。阿木川ダムに発生したアオコ湖より採取したアオコから分離された株について，から分離した 20 株からは mcy 株は検出されなかっmcyA プローブと mcyG プローブを用いたゲノミッ

た。諏訪湖から分離した 30 株のうち 4 株（13 ％）が，ク・サザン解析により mcy プローブに陽性を示し

塘 路 湖から分 離した 19 株 のうち 2 株（11 ％）がた株を mcy 株とした。また，塘路湖から分離した

mcy+ 株であった（表 2）。これらの結果より昆陽池

19 株 に つ い て， さ ら に PCR 法 で mcyG-mcyH 間，

では，他の湖沼に比べ mcy+ 株の割合が高いことが

mcyA-mcyD 間を増幅し，アガロースゲル電気泳動で示された 31）。Matsunaga らは 1995 年に昆陽池に発増幅断片を確認することにより mcy+ 株の検定を行っ生したアオコから高い濃度のミクロシスチンを検出た。その結果，2002 年に採取したアオコについて，しており，特に毒性の強い microcystin-LR の濃度が昆陽池 2 から分離した 30 株のうち 7 株（23 ％）が，高く，アオコ乾燥菌体の LD50 が 41 mg/kg- マウスと，

また昆陽池 3 から分離した 26 株のうち 7 株（27 ％）

毒性が極めて強いことを報告している 6）。さらに

+

36

+

+

毒性アオコの検出とミクロシスチン合成遺伝子群の保存性について

表 2．アオコから mcy + 株の分離
採取地

分離株（mcy+）

2002 年

mcy+/ 総分離数

昆陽池 2

K2-18, K2-19, K2-22, K2-23, K2-26, K2-28, K2-30

7/30

昆陽池 3

K3-9, K3-15, K3-17, K3-20, K3-23, K3-27, K3-26

7/26

阿木川ダム

none

0/20

諏訪湖

S-11, S-14, S-26, S-24

4/30

唐路湖

T-3, T-14

2/19

TF-1, TF-3, TF-4, TF-5, TF-7, TF-8, TF-9, TF-10, TF-14, TF-21, TM-28

11/16

2004 年

唐路湖

Rantala らは 2002 年夏季にフィンランドの 70 ヶ所の湖で，富栄養化が進んだ湖においては mcy 株の+割合が高くなることを報告している 27）。よって面Ⅵ

 icrocystis 分離株のミクロシスチン合M
成遺伝子構造の解析積が 1.5 ha と小さく，富栄養化が進んでいる昆陽
池では毒性株の割合が高くなっているのかもしれな

これまでミクロシスチン合成遺伝子の構造は，い。このことからも昆陽池でのアオコの発生には注Microcystis 属，Anabaena 属 お よ び Planktothrix 属

意が必要であると考えられた。一方，阿木川ダムでで明らかにされている（図 2）。M. aeruginosa では+は検出されたミクロシスチンは，ごく微量で mcy

mcy クラスターは，10 個の遺伝子からなり，転写株も分離できなかった。しかし，ごく微量でもミク方向が逆向きの mcyABC と mcyDEFGHIJ の 2 つのロシスチンが検出されたことから，阿木川ダムにおクラスターから構成されていた。P. agardhii の mcy

ける毒性株の割合が今後どう変化するのか興味が持クラスターの構成をみると，mcyT を除いて全て同たれた。

じ転写方向に配置され，mcyD → mcyE → mcyG の塘路湖は最も緯度が高い地域の湖沼であり，ここ

配列順序は Microcystis 属と同じであった。しかしに生息している Microcystis の群体は大きく，フラ

mcyF と mcyI は，クラスター内に存在せず，ゲノ

スコ壁面に付着するなどの特徴が観察された。そムの別の位置に存在すると推定されている 18）。まこで 2004 年にも塘路湖よりアオコを採取して単藻た，Anabaena strain 90 の mcy クラスターの構成を株（16 株）を分離し，mcyG-mcyH と mcyA-mcyD 間

みると，Microcystis 属と同じ 2 つのクラスターからの PCR 増幅することで mcy 株の検定を行った。分

構成されているが，「Adda-Glu」の合成に関わるク

析の結果，分離した 16 株のうち 11 株（69 ％）がラスターは生合成過程における順序と同じになるよ

mcy 株であった（表 2）。塘路湖では，2002 年に比うに mcyG → mcyD → mcyE の順序で配置しており，

べると，mcy 株の割合が約 6 倍に増加していた

31）。

mcyF → mcyH → mcyI → mcyJ の配置は Microcystis

白井らは霞ヶ浦において 1998 年の 7 ～ 9 月までの属とは異なっていた 34）。このように，mcy 構造に

3 ヶ月間のアオコ中の毒性株（マウス毒性）の割合

は属間で多様性が認められる。もし，シアノバクテ

は，6 ～ 47 ％であったことを報告している。まリアの共通祖先に mcy が存在していたとしたら 35），

た Saker ら は， ポ ル ト ガ ル の Tamega 川 で，1999

進化の過程で分岐するときに遺伝子の再編が起こっ年の 8 月採取の 14 株は全て microcystin-LR 生産株

たか，あるいは特定の属で遺伝子の再構成が行われ（100 ％）であったのに対し，9 月採取の 12 株ではたとも考えられる。Nodularia のノジュラリン合成

microcystin-LR 生 産 株 は 2 株（16.7 ％） に 大 き く

遺伝子（nda）クラスターは（図 2），mcy から 2 つ

減少したと報告している。塘路湖における毒性の NRPS 遺伝子が欠失して生じたと考えられ，遺株の変化が，一時的な増加であるのか，それとも増伝子の再構成が行われたと推定される 35）。また，

加傾向を示しているのか断定はできない。ミクロシ

Microcystis に お い て は，M. aeruginosa K-139，M.

スチン毒性株の環境中における動態を明らかにする

aeruginosa PCC7806，M. aeruginosa NIES-843 のため，今後も継続的に分子生物学的手法を用いた生

mcy の全構造が明らかとなり，いずれも 2 つのクラ

態学的解析が必要であると考えられた。

スターからなる mcy が dnaN と uma1 の間に位置し

+

+

+

32）

33）

37

鯉 淵

研 報

ていた。西澤らは PCR 法を用いて，Microcystis 保

第 26 号2010

生産していないと判断された 31）。

存株における mcy 構造の保存性を調べた結果，保2．mcy + 株における mcy 構造の解析

存株において mcy クラスター構造は保存されているものの，遺伝子‐遺伝子間への挿入配列が観察されたことから，mcy の多様性を指摘した

分離株の mcy 構造は，構造解析用に設計された。これま

隣接した二つの遺伝子間を増幅させるためのプラで mcy 構造の解析は，各湖沼から分離された保存

イマー（図 5）を用いて，PCR 法により解析した。

株を用いて解析されており，特定の湖沼などに発生解析の対照として mcy 構造がすでに決定されていしたアオコを構成する mcy 株の mcy 構造を比較解る M. aeruginosa K-139 の mcy を用いた。2002 年に析した報告例はない。ここでは，mcy 構造の保存性

昆陽池（8 株），諏訪湖（4 株），塘路湖（1 株）かを解析することにより，環境中におけるミクロシス

ら分離した 13 株と，2004 年に塘路湖から分離した+

チン合成遺伝子保有（mcy ）株の動態を明らかにし，

8 株について解析を行った。その結果，全ての株にさらに昆陽池，諏訪湖，塘路湖の三つの湖沼から分おいて全領域で増幅断片が検出されたことから（表離された mcy 株の遺伝子構造について述べる。

3），これらの株の mcy は染色体上の dnaN と uma1

23）

+

+

の間に位置し，mcyABC と mcyDEFGHIJ の二つの
1．mcy + 株のミクロシスチン生産性解析

クラスターからなることが示された 31）。しかし，

昆陽池，諏訪湖，塘路湖から分離された mcy+ 株

数株において M. aeruginosa K-139 とは異なるサイ（13 株）は，HPLC 及び LC/MS/MS による分析のズの増幅断片が認められた領域があり，それらの塩結 果，K2-26，K3-15，K3-17，K3-20，K3-26 株 を

基配列を決定した。諏訪湖から分離した 2 株（S-14，

除いて，いずれの株からもミクロシスチンが検出

S-24）は dnaN-mcyJ 遺伝子間にトランスポザーゼ遺された（表 3）。生産株の多くは，microcystin-LR，伝子（trp1）の挿入があり（図 6），この挿入配列は-RR の desmethyl 体を生産していた。昆陽池 2 からISMae4（IS5 family）と相同であった。面白いことに，分離した K2-26 株と昆陽池 3 から分離した K3-15，

1987 年 に 霞 ヶ 浦 か ら 分 離 し た M. aeruginosa B-47

K3-17，K3-20，K3-26 株については，さらに質量分株の dnaN-mcyJ 間にも同様の挿入が認められた。

析計による解析を行ったがミクロシスチン類に相当

このことは，
諏訪湖と霞ヶ浦という全く異なる地域，

するピークを得ることはできず，ミクロシスチンを異なる時期から同じ挿入配列を同じ部位にもつ株が表 3 ．Microcystis 分離株のPCRによるmcy 構造解析とミクロシスチン生産性
株名PCR 増幅領域

ミクロシスチン生産

NJ

IJ

HI

GH

FG

EF

DE

AD

AB

BC

CU

K-139

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

［Dha7］MCYST-LR,［D-Asp3,Dha7］MCYST-LR

T-14

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

Desmethyl MCYST-RR

S-11

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

Desmethyl MCYST-LR

S-14

＋*

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

Desmethyl MCYST-LR

S-24

＋*

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

Desmethyl MCYST-LR

S-26

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

Desmethyl MCYST-LR, -RR, -YR,
Didesmethyl MCYST-RR

K2-23

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋*

＋

＋

＋*

Desmethyl MCYST-LR

K2-26

＋*

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋*

none

K2-28

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋*

＋

＋

＋*

Desmethyl MCYST-LR, -RR

K3-9

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋*

＋

＋

＋*

Desmethyl MCYST-LR

K3-15

＋

＋*

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

none

K3-17

＋

＋*

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

none

K3-20

＋

＋*

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

none

K3-26

＋

＋*

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

none

＋ , positive; ＋ *, positive and long size; MCYST, microcystin.

38

毒性アオコの検出とミクロシスチン合成遺伝子群の保存性について

図 5 ．ミクロシスチン合成遺伝子間増幅用プライマーセット

図 6 ．Microcystis 分離株のmcy 構造比較
分離されたことになり，何らかの原因でこの株が湖れていなかった。しかし，これらの挿入断片の幾つ沼を移動したか，あるいはこの位置がこの挿入配列

かは，塩基配列を解析した結果，霞ヶ浦や河口湖のホットスポットであることを示すと考えられた。

から異なる時期に分離された株にも存在すること一 方， 昆 陽 池 か ら 分 離 し た 3 株（K2-23，K2-28，が示された 31）。また，塘路湖から分離した 9 株は，

K3-9） は mcyA-mcyD 遺 伝 子 間 お よ び mcyC-uma1対照とした M. aeruginosa K-139 と全て同じ増幅パ

遺伝子間に，1 株（K2-16）は dnaN-mcyJ 遺伝子間ターンを示した。これまで報告された mcy 構造に

および mcyC-uma1 遺伝子間に，それぞれ DNA 断

ついての結果を併せて考察すると，dnaN-mcyJ と片の挿入が認められた。また 4 株（K3-15，K3-17，

mcyA-mcyD は遺伝子の挿入が起こりやすいホット

K3-20，K3-26）は，何れも mcyI の構造遺伝子内にスポットであり，また転位因子によるものと思われ

mcyI 破壊株
103 bp の挿入断片が認められ，（Δ mcyI）

る挿入配列が mcy 遺伝子の多様性に関わっているであった（図 6）。これまで Microcystis では，mcyIと考えられた。そして，これまで mcyC-uma1 間の変異株の報告はなく，これが初めての報告となっ保存性は非常に高いとされていたが，4 株（K2-23，

たK2-28，K3-9，K2-16）において DNA 断片の挿入が。昆陽池から分離した 8 株の mcy 株は全て遺31）+

伝子間に何らかの DNA 断片の挿入があり，これら認められたことは，初めての報告となった 31）。

の挿入断片にはトランスポザーゼ遺伝子はコードさ

39

鯉 淵

Ⅶ

研 報

第 26 号

2010

昆 陽池より分離したミクロシスチン生告している 17）。そこで，K3-15 株のΔ McyIK3-15 と産性変異株の解析

K-139 株の McyIK-139 のアミノ酸配列を比較したところ，Δ McyIK3-15 では，核酸結合ドメインの一部と，昆陽池より分離した K3-15 株は mcyI 構造内に，C 末端側の基質結合ドメインと調節ドメインが完全

K2-26 株 に は dnaN-mcyJ と mcyC-uma1 間 に そ れ ぞに欠損していることが示された 31）。Δ McyIK3-15 でれ DNA 断片の挿入が認められた。そして K3-15，はこの欠損によって活性を失い，そのため MeAsp

K2-26 株は，ともにミクロシスチンを生産していなが合成できず，ミクロシスチンが合成できなくなっかった。ここでは，mcy 株でありながらミクロシたと考えられた。

+

スチンを生産しない K3-15，K2-26 株の解析について述べる。

2．K2-26 株における mcy の転写発現
K2-26 株 は，mcyABC，mcyDEFGHIJ ク ラ ス タ ー

1．K3-15 株における mcy の転写発現とΔ McyI の構造は保持しているが，ミクロシスチン生産性は失oxidoreductase 活性の解析われていた。そこで dnaN-mcyJ と mcyC-uma1 間へ

K3-15 株は，mcyI 構造内に DNA 断片が挿入したの DNA 断片の挿入が転写へ影響しているかを調べことにより，C- 末端側の欠失したΔ McyI が合成される mcyI 変異株（ΔmcyI）である。Pearson らは，McyI は 2-hydroxy-acid dehydrogenase で， ミ ク ロ
シスチン分子の 3 位の D-MeAsp のプレカーサー分
子 で あ る 3-Methylozaloacetate の 3-Methylmalateからの変換に関わっていることを報告している 17）。
K3-15 株はミクロシスチンを生産しないことから，
DNA 断片の挿入による mcyI の変異がその生産能を失わせたと推察された。mcy は光誘導的に発現し，mcyABC クラスターはポリシストロニックに，
mcyDEFGHIJ はポリシストロニックとモノシストロ
ニックに転写される 12）36）37）。そこで光連続照射下に培養した K3-15 細胞から RNA を抽出し，mcyA，
mcyD，mcyH，mcyI および mcyJ，それぞれの発現について調べたところ，mcyI を含め，いずれの遺伝子も発現していることが認められた（図 7）。次にΔ McyI の oxidoreductase 活性を調べるために，
M. aeruginosa K-139 株 と K3-15 株 の ゲ ノ ム DNA
から PCR 増幅した mcyI と ΔmcyI コード領域を発

図 7 ．ミクロシスチン合成遺伝子の転写解析
G：genome (positive control)
C：cDNA
N：DNA-free total RNA (negative control)
M：pUC119/HinfI

現 ベ ク タ ー（pQE-60） に ク ロ ー ニ ン グ し， 大 腸菌 M15 株で発現させ，精製した組換えタンパクのMcyIK-139 と Δ McyIK3-15 を 得 た。SDS-PAGE で 分 子
量サイズを分析したところ，予想される 40 kDa と
29 kDa のタンパクとして確認できた（図 8）。これらの組換えタンパクを用いて，reductase 活性を測定したところ，Δ McyI K3-15 では明らかに活性は認められなかった（図 8）。Pearson らは，McyI の推定される構造は，N 末端側と C 末端側に基質結合ドメインがあり，その間に核酸結合ドメインが，そして C 末端領域にある調節ドメインからなると報40

図 8 ．McylタンパクのReductase活性の測定(A) SDS-PAGE解析(B) Reductase活性M;分子量マーカー 1；ΔMcyIK3-15
2；McyIK-139
McyIK-139の活性を100%として表示

毒性アオコの検出とミクロシスチン合成遺伝子群の保存性についてた。その結果，mcyA と mcyD の発現が確認された（図Microcystis に お け る mcy の 構 造 は，M. aeruginosa7）。西澤らは，mcyABC，mcyDEFGHIJ クラスター

K-139 株 を Type I と す る と，DNA 断 片 の 挿 入 位

構造は保持しているが，ミクロシスチンを生産しな置の違いから 7 つのタイプに分けられた（図 9）。

い株があることを報告している。これらの株でMicrocystis の mcy は，2 つのクラスターからなり，は構造遺伝子に点突然変異などの変異が起こった結dnaN と uma1 の間に位置しその構造は極めて保存

果，ミクロシスチン生産能が失われたと推定された。

性が高いことが示された。さらに，mcy の多様性は

よって，K2-26 株も mcy 構造遺伝子内の変異により，「組換え」，「遺伝子の挿入」の要因が大きく関与しミクロシスチン生産能を失ったと考えられたていることが示された。そして，これまで保存性が

23）

。

31）

高いとされていた mcyC-uma1 間に DNA 断片の挿

Ⅷ

おわりに

入が認められたことから，それぞれのクラスターの両端である dnaN-mcyJ，mcyAD，mcyC-uma1 間は，

日本の 4 つの湖沼において，mcy 株の分離およDNA 断片の挿入などが起こりやすいホット・スポッ

び分離株の mcy 構造の解析を行い，湖沼環境におトであると考えられた。しかし，Microcystis では

けるミクロシスチン生産株の動態を明らかにしよう

mcy 遺伝子の再編は観察されていないが，もし原始とする試みについて述べた。これまでに得られたシアノバクテリアが mcy 遺伝子を保有していたの+

図 9 ．Microcystis におけるミクロシスチン合成遺伝子構造

41

鯉 淵

研 報

と仮説が正しいなら，mcy 遺伝子非保有株では，転第 26 号

2010

新光社，東京．

移因子様遺伝子あるいは組換えにより脱落が起こっ

６ ）H. Matsunaga et al. (1999) Possible cause of

た可能性が考えられた。また，Microcystis においてunnatural mass death of wild birds in a pond in

初めて遺伝子内への挿入断片による mcyI 変異株がnishinomiya, Japan: sudden appearance of toxic

分離された。その解析の結果，McyI タンパクは，

cyanobacteia. Nat. Toxins 7: 81-84.

ミクロシスチン生合成に必須である可能性が示唆さ₇ ）E. M. Jochimsen et al. (1998) Liver failure andれた。この分離株は，ミクロシスチン生合成機構のdeath after exposure to micorcystins at a hemo-

詳細な解析に貢献すると考えられる。この様に mcy

dialysis center in Brazil, The New England J.

構造の解析により，挿入する多様な断片により mcy

Med. 338: 873-878.

の多様性が増すことが示唆され，また湖沼ごとに₈ ）I. Chorus and J. Bar tram (ed.) (1999) Toxic

mcy へ挿入される断片が特徴を持つことが確かめら

cyanobacteria in water. E & FN Spon, London,

れた。これらの研究により，mcy 遺伝子構造解析のU.K., Published on behalf of WHO.

重要性を示唆するとともに，その解析技術も確立さ

₉ ）D.P. Botes et al. (1985) Structure studies on

れてきた。今後は，それぞれの湖沼に発生したアオ

cyanoginosins-LR, -YR, -YA, and -YM, peptide

コから mcy 遺伝子を指標に Micorcystis 株を分離し，toxins form Micocystis aeruginosa. J. Chem. Soc.

その毒素生産性を解析し，分離株の mcy 遺伝子構

Perkin Trans. 1: 2747-2748.

造を解析することにより，さらに遺伝子の多様性が10）A. Tooming-Klunderud et al. (2008) The mosa-明らかになり，遺伝子の脱落や水平伝播が起こって

ic structure of the mcyABC operon in Microcystis.

いるかなどの情報を得られると思われ，それぞれのMicrobiology 154: 1886-1899.

湖沼における mcy 株の特徴が明らかとなることが+期待される。
世界中の多くの湖沼においてミクロシスチン毒性

11）B. A. Neilan et al. (1999) Nonribosomal peptide synthesis and toxigenicity of cyanobacteria.
J. Bacteriol. 181: 4089-4097.

株の増加が問題となっている。湖沼におけるミクロ

12）T. Nishizawa et al. (1999) Genetic analysis of

シスチン毒性株の動態解析とともに，分離株を用い

the peptide synthetase genes for a cyclic hep-

た研究室レベルでの毒性アオコの発生機構の解明に

tapeptide microcystin in Microcystis spp. J. Bio-より，発生の防除も可能になると思われる。日本でchem. 126: 520-529.

も近年になり，諫早湾（長崎県）など多くの湖沼で

13）T. Nishizawa et al. (2000) Polyketide synthase

アオコの発生が問題となってきており，これらの研gene coupled to the peptide synthetase module

究が湖沼におけるミクロシスチン生産株の動態解析

involved in the biosynthesis of the cyclic hepta-に貢献することを期待したい。

peptide microcystin. J. Biochem. 127: 779-789.
14）D. Tillett et al. (2000) Structure organization

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毒性アオコの検出とミクロシスチン合成遺伝子群の保存性について

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