ISSN 2433-5819

研

究

年

令和 3 年度
第5号

ANNUAL REPORTOFOSAKA INSTITUTE OF PUBLIC HEALTH

No.5(2021)報

2020
1
2020
11
2019

2020
18

CRE

2015

2020
25

32

41

48

55
2019
59
2020
66
2020
73
2,2,4

1,3

2,2,4

1,3
80
2
90

Sung-mok JUNG
Yichi Yang,Baoyin Yuan, Andrey R. Akhmetzhanov, Natalie M. Linton
RS
i

98

98
2016
99
Enterococcus saigonensis VE80T
99

100
mcr-5

Salmonella Albany
100

H. Marcotte

L. Hammarstom
101

101

102

102
,
103
2

SFTS

SFTS

103
Capnocytophaga felis
104
blaIMP-1

blaGES-5

mcr-9

Enterobacter roggenkampii

104

105

ii

105

106

106
on-chip

O157:H7
107

LC-MS/MS

6
107
P450

2’-, 3’-, 4’-

OVitchan Kim

Donghak Kim

F Peter. GuengerichAspa/Hcn1

108

NMDA
108
P450

2’-,3’-,4’-,6Vitchan Kim

Donghak Kim

F Peter. Guengerich

109

109

110
4

Gal d 1–4

LC-MS/MS
110

PET
111
FTIR
111

112

iii

HPLC

112

113

113

114

114
115

115

116
LSR

LKB1-AMPK119

ANNUAL REPORT OF OSAKA INSTITUTE OF PUBLIC HEALTHCONTENTS
Original Articles
Surveillance of infectious diseases in 2020 in Osaka prefecture (in Japanese)
Y. SATSUKI, K. MOTOMURA, Y. NISHIDA, K. KAKIMOTO, T. NISHIO, T.
MIYAMA, N. IRITANI and K. KOBAYASHI

1

Epidemic Situation and molecular-epidemiological analysis of enterovirus infection in Osaka Prefecture(Fiscal 2020 Report) (in Japanese)
K. NAKATA, Y. YAMANAKA and K. MOTOMURA

11

Epidemic and molecular epidemiological analysis of norovirus outbreaks in case of food poisoning in Osaka
Prefecture (Fiscal 2019 2020 Report) (in Japanese)
T. SHIRAI, N. SAKON, R. TAKADA and K. MOTOMURA

18iv

Surveillance of carbapenem-resistant Enterobacterales (CRE) infections in Osaka city, 2015-2020 (inJapanese)
K. UMEDA, A. AKIYOSHI, S. SHIBAKAWA, Y. HIRAI, H. NAKAMURA, A.
SETSUDA and H. YOSHIDA

25

Analysis of sugar and sugar alcohol in commercially available vegetable and fruit juices (in Japanese)
M. KI, A. KUDO, S. TERATANI, T. YAMASAKI, Y. KAKIMOTO and M. SHINYA

32

Moisture content analysis of food products for nutrition-labeling compliance test (in Japanese)
T. YAMASAKI, Y. KAKIMOTO, M. KI, T. HAGIWARA and M. SHINYA

41

Validation study for analytical method of veterinary products due to the renewal of analytical instruments (inJapanese)
M. YAMAGUCHI, K. AWAZU, I. SHIRAKAWA, H. NAGAYOSHI, C. NOMURA,
N. FUKUI and M. SHINYA

48

Validation study for analytical method of tetracyclines antibiotics due to the renewal of analytical
instruments (in Japanese)
M. YAMAGUCHI, K. AWAZU, I. SHIRAKAWA, H. NAGAYOSHI, C. NOMURA,
N. FUKUI and M. SHINYA

55

Results of external quality control on the analytical methods for sodium in tap water, performed in 2019 in
Osaka Prefecture (in Japanese)
J. YOSHIDA and F. ADACHI

59

Elucidation of factors affecting quantitative accuracy for bromate in water quality measurements, performed
in 2020 in Osaka Prefecture (in Japanese)
J. YOSHIDA, T. NAKAJIMA, Y. HASEGAWA and Y. KOIZUMI

66

Elucidation of factors affecting quantitative accuracy for formaldehyde in water quality measurements,
performed in 2020 in Osaka Prefecture (in Japanese)
Y. HASEGAWA, J. YOSHIDA and Y. KOIZUMI

73

Analytical method for urinary metabolites of 2,2,4-trimethyl-1,3-pentanediolmonoisobutyrate and2,2,4-trimethyl-1,3-pentanedioldiisobutyrate in the general population (in Japanese)
T. YOSHIDA

80

Survey of environmental and food radioactivity in Osaka PrefectureFiscal 2020 Report (in Japanese)
T. HIZUKA, M. OHYAMA, Y. KOIZUMI, M. KOIKE and N. YAMAGUCHI90

Abstracts
Estimation of the asymptomatic ratio of novel coronavirus infections (COVID-19)
H. NISHIURA, T. KOBAYASHI, T. MIYAMA, A. SUZUKI, SM. JUNG, K.
HAYASHI, R. KINOSHITA, Y. YANG, B. YUAN, AR. AKHMETZHANOV and
NM. LINTON

98

Seasonal shift in epidemics of respiratory syncytial virus infection in Japan
T. MIYAMA, N. IRITANI, T. NISHIO, T. UKAI, Y. SATSUKI, H. MIYATA, A.
SHINTANI, S. HIROI, K. MOTOMURA and K. KOBAYASHI

98

A measles outbreak in Kansai International Airport, Japan, 2016: Analysis of the quantitative difference andinfectivity of measles virus between patients who are immunologically naive versus those with secondary
vaccine failure
T. KURATA, S. P. YAMAMOTO, H. NISHIMURA, T. YUMISASHI, K.
MOTOMURA and M. KINOSHITA

99

Detection of genetic elements carrying vanA in vancomycin-resistant Enterococcus saigonensis VE80T
isolated from retail chicken meat
T. HARADA, D. MOTOOKA, S. NAKAMURA, Y, YAMAMOTO, T.

99v

YAMAGUCHI, R. KAWAHARA and K. KAWATSU
The first report of macrolide-resistant Bordetella pertussis isolation in Japan
T. YAMAGUCHI, Y. KAWASAKI, C. KATSUKAWA, R. KAWAHARA and K.
KAWATSU100

Isolation and plasmid characterisation of Salmonella enterica serovar Albany harbouring mcr-5 from retailchicken meat in Japan
Y. WAKABAYASHI, T. SEKIZUKA, T. YAMAGUCHI, A. FUKUDA, M. SUZUKI,
R. KAWAHARA, M. TAGUCHI, M. KURODA, K. SEMBA, H. SHINOMIYA and K.
KAWATSU100

A heterodimer antibody fragment for the passive immunotherapy against norovirus infection
Y. YUKI, S. KUROKAWA, S. SATO, A. SASOU, N. MATSUMOTO, A. SUZUKI,
N. SAKON, Y. GODA, N. TAKEYAMA, T. MIYOSHI, H. MARCOTTE, T.
TANAKA, L. HAMMARSTROM and H. KIYONO

101

Development of Antibody-Fragment–Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus
A. SASOU, Y. YUKI, S. KUROKAWA, S. SATO, Y. GODA, M. UCHIDA, N.
MATSUMOTO, H. SAGARA, Y. WATANABE, M. KURODA, N. SAKON, K.
SUGIURA, R. NAKAHASHI-OUCHIDA, H. USHIJIMA, K. FUJIHASHI and H.
KIYONO

101

Overview of norovirus from an international perspective and future challenges (in Japanese)
N. SAKON, T. SHIRAI and M. UEMA102

Foodborne viral diseases-up date of norovirus - (in Japanese)
N. SAKON, T. SHIRAI and K. MOTOMURA

102

Tick-borne infectious diseases (in Japanese)
T.YUMISASHI

103

Two Different Strains of Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus (SFTSV) in North andSouth Osaka by Phylogenetic Analysis of Evolutionary Lineage: Evidence for Independent SFTSVTransmission
R. IKEMORI, I. AOYAMA, T. SASAKI, H. TAKABAYASHI, K. MORISADA, M.
KINOSHITA, K. IKUTA, T. YUMISASHI and k. MOTOMURA

103

Capnocytophaga felis sp. nov. isolated from the feline oral cavity
M. SUZUKI, K. UMEDA, M. KIMURA, K. IMAOKA, S. MORIKAWA and K.
MAEDA

104

Genomic characterization of clinical Enterobacter roggenkampii co-harboring blaIMP-1- andblaGES-5-encoding IncP6 and mcr-9-encoding IncHI2 plasmids isolated in Japan.
K. UMEDA, H. NAKAMURA, A. FUKUDA, Y. MATSUMOTO, D. MOTOOKA, S.
NAKAMURA, Y. YASUI, H. YOSHIDA and R. KAWAHARA

104

Molecular identification and prevalence of Anisakis larvae in Japanese sardine Sardinops melanostictus fromJapanese waters (in Japanese)
T. BABA

105

Contaminated fungi on botanical specimens by water hazard of flood (in Japanese)
N. HAMADA, T. BABA and D. SAKUMA

105

Gekko japonicus (Schlegel’s Japanese Gekko). Diet
K. AKITA, H. MATSUOKA and K. YAMAZAKI

106

vi

Nomenclature and identification method of non-permitted dyes of Patent Blue Group (in Japanese)
M. SHINYA, M. Ki and Y. YAMAGUCHI106

Rapid quantification of Escherichia coli O157:H7 in lettuce and beef using an on-chip staining microfluidic
deviceY. TOKUNAGA and N. YAMAGUCHI107

Development of an LC-MS/MS-based rapid and simple analytical method for six fungicides (in Japanese)
M. YOSHIMITSU, R. UENO, H. MATSUI, M. OSAKADA, K. UCHIDA, N. FUKUI,K. AKUTSU and N. KAKUTANI

107

Preference for O-demethylation reactions in the oxidation of 2′-, 3′-, and 4′-methoxyflavones by human
cytochrome P450 enzymes
H. NAGAYOSHI, N. MURAYAMA, M. TSUJINO, S. TAKENAKA, J. KATAHIRA,
V. KIM, D. KIM, M. KOMORI, H. YAMAZAKI, F P. GUENGERICH
and T. SHIMADA

108

Involvement of NMDA receptors in tremor expression in Aspa/Hcn1 double-knockout rats
A. NISHITANI, H. NAGAYOSHI, S. TAKENAKA, M. ASANO, S. SHIMIZU, Y.
OHNO and T. KURAMOTO

108

Liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis of oxidation of 2′-, 3′-, 4′- and6-hydroxyflavanones by human cytochrome P450 enzymes
T. SHIMADA, H. NAGAYOSHI, N. MURAYAMA, S. TAKENAKA, J. KATAHIRA,
V. KIM, D. KIM, M. KOMORI, H. YAMAZAKI and F P. GUENGERICHf

109

Determination of various constituent elements of polyethylene terephthalate bottles used for beverages inJapan
E. KISHI, A. OZAKI, T. OOSHIMA, Y. ABE, M. MUTSUGA, Y. YAMAGUCHI and
T. YAMANO

109

Mechanism of aggregation and amyloid fibril formation of apolipoprotein on lipid membrane environment(in Japanese)
C. MIZUGUCHI, T. OHGITA and H. SAITO

110

Development of a liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for simultaneous quantificationof hen’s egg white allergens Gal d 1–4 in fresh and processed eggs
K. KIYOTA, M. YOSHIMITSU, K. UCHIDA and K. KAJIMURA

110

Determination of formaldehyde and acetaldehyde levels in poly(ethylene terephthalate) (PET) bottled
mineral water using a simple and rapid analytical method
Y. ABE, N. KOBAYASHI, M. YAMAGUCHI, M. MUTSUGA, A. OZAKI, E. KISHI,
K. SATO

111

Trial and subjects of microplastics analysis by FTIR microscopy (in Japanese)
S. NAKAO, K. AKITA, K. MASUMOTO, A. OZAKI and T. OKUDA

111

Evaluation of carboxamide-type synthetic cannabinoids on the functional activities at cannabinoid receptors
and biological effects via inhalation exposure test
A. TAKEDA, T. DOI, A. ASADA, T. SUZUKI, K. YUZAWA, H. ANDO, Y. KUBO,
A. NAGASAWA, F. KAIHOKO, Y. HASEGAWA, K. TANAKA, K. IGARASHI, T.
MAENO, A. SUZUKI, S. SHIMIZU, N. UEMURA, J. NAKAJIMA, J. SUZUKI and T.
TAGAMI112

Studies on KAKI CALYX (in Japanese)
R. ISHIHARA, K. ARIMOTO, M. ITO, K. IMURA, I. OI, M. OKASAKA, A.
KAWABATA, E. SAKAI, H. SHIMADA, Y. SHIMADA, T. TAGAMI, E.

112

vii

TSUJIMOTO, K. NISHIO, R. NOMURA, H. MATSUDA, T. MATSUMOTO, Y.
YAMAMOTO and T. YOKOKURA
Rapid on-site monitoring of bacteria in freshwater environments using a portable microfluidic counting
systemN. YAMAGUCHI and Y. FUJII

113

Intakes of phthalates by Japanese children and the contribution of indoor air quality in their residences
T. YOSHIDA, M. MIMURA and N. SAKON

113

Lowest observed adverse effect level of pulmonary pathological alterations due to nitrous acid exposure inguinea pigs
M. OHYAMA, H. NISHIMURA, K. AZUMA, C. MINEJIMA, N. TAKENAKA, and
S. ADACHI

114

Time series analysis of climate and air pollution factors associated with atmospheric nitrogen dioxide
concentration in Japan
T. MIYAMA, H. MATSUI, K. AZUMA, C. MINEJIMA, Y. ITANO, N. TAKENAKA,
and M. OHYAMA

114

Verification survey with Johkasou after defining standards (in Japanese)
F. ADACHI, J. YOSHIDA, R. TAKATSUKA, A. MITSUDA, A. NAGAO and M.
TSUCHIYA

115

Examination of analytical method for methanol, trichloroethylene, and tetrachloroethylene to revise theofficial methods based on “Act on the Control of Household Products Containing Harmful Substances”(inJapanese)
T. KAWAKAMI, N. SUGAYA, M. TAHARA, T. OOSHIMA, I. NISHI, H.
UEMURA, H. SHIODA, I. SUZUKI, K. TABATA and Y. IKARASHI

115

Thesis summary
Problem-oriented field epidemiological study in dairy production medicine using a causal inference approach
T. MIYAMA116

LSR promotes epithelial ovarian cancer cell survival under energy stress through the LKB1-AMPK pathway
Y. TAKAHASHI

119

viii

報

文

地方独立行政法人大阪健康安全基盤研究所研究年報 Ann.Rep.Osaka.Inst.Pub.Health, 5, 1-10 (2021)

大阪府における 2020 年感染症発生動向

皐月由香 a，本村和嗣 b，西田陽子 a，柿本健作 a，西尾孝之 a，三山豪士 c、入谷展弘 a，小林和夫 d2020 年、新型コロナウイルスの感染が世界中に拡大し、その感染拡大防止のため人々は行動変容を求められた。感染症発生動向調査に基づき収集した感染症情報を分析し、2020 年と過去 5 年の感染症発生数を比較することにより、2020 年の感染症発生に対する新型コロナウイルス感染症の感染予防対策等の影響について考察を行った。その結果、飛沫・接触・経口感染する感染症及び輸入感染症は、2020 年の報告数が減少しており、新型コロナウイルス感染症の影響を受けたと考えられた。新型コロナウイルス感染症の感染予防対策であるマスク着用や身体的距離の確保等による飛沫感染防止や手洗い・手指の消毒等による接触・経口
感染防止は飛沫・接触・経口により感染する感染症に有効であったと考えられた。

キーワード：感染症発生動向調査、新型コロナウイルス感染症、感染症対策、2020 年

感染症発生動向調査は、1999 年（平成 11 年）4 月に施行された「感染症の予防及び感染症の患者に対する医療に関する法律」（感染症法）に基づく調査である。その目的は、感染症の発生情報を把握、分る必要がない場合である 1)。これらは、国が定める届出基準に基づいて、診断した医師等から保健所に届けられる。保健所が届け出内容を感染症発生動向調査システム(National Epidemiological Surveillance of析し、その結果を国民や医療関係者へ迅速に提供・公開することにより、感染症に対する有効かつ的確な予防・診断・治療に係る対策を図り、多様な感染症の発生及びまん延を防止するとともに、病原体情報を収集、分析することで、流行している病原体の検出状況及び特性を確認し、適切な感染症対策を立

Infectious Disease :NESID)に登録することにより、都道府県を通じて厚生労働省に報告される。
新型コロナウイルス感染症（Coronavirus disease
2019:COVID-19）は、2019 年 12 月に中華人民共和国湖北省武漢市において確認され、その後世界中に感染が拡大した。世界保健機関（ World Health

案することである。
同調査における感染症の発生情報については、感染症発生動向調査事業実施要綱により対象とする感染症が定められており、全数を把握する感染症（全数把握感染症）と指定された医療機関（定点医療機関）からの報告数を把握する感染症（定点把握

Organization:WHO）は、2020 年 1 月 30 日に「国際的に懸念される公衆衛生上の緊急事態」を宣言し、
3 月 11 日には「パンデミック（世界的な大流行）の状態にある」と表明した。COVID-19 は飛沫や接触により感染するため、その感染拡大防止策として、
日本ではマスクの着用、身体的距離の確保、手洗い・感染症）がある。全数把握感染症は、周囲への感染拡大防止を図ることが必要な場合及び発生数が希少な場合であり、定点把握感染症は発生動向の把握が必要なもののうち、患者数が多数で全数を把握す

手指の消毒、3 密（密閉、密集、密接）を避けるな
どの「新しい生活様式」の実践が求められた。また、渡航制限や緊急事態宣言を発出することにより人の流れを抑制する対策が取られた。

a 大阪健康安全基盤研究所公衆衛生部健康危機管理課
b 大阪府感染症情報センター
c 大阪健康安全基盤研究所公衆衛生部疫学解析研究課
d 大阪健康安全基盤研究所公衆衛生部-1-

COVID-19 が世界各地で大流行する一方で、COVID-19 以外の感染症は減少したとの報告があり
2-5)、大阪府においても COVID-19 以外の感染症の発生に、例年と異なる傾向が認められた。そこで、2020
年の大阪府における感染症発生状況を把握し、過去調査期間は 2015 年から 2020 年までとした。対象疾患は感染症発生動向調査実施要綱に定める定点把握感染症及び全数把握感染症のうち 3～5 類感染症を対象とした（表 1）。ただし、全数把握感染症のうち全国における 2015 年から 2019 年までの年平均

5 年間の発生状況と比較して、COVID-19 によるその他の感染症の発生への影響について検討した。

累積報告数が 12 例以下の感染症、潜伏期間が長い
感染症、感染経路又は病原体が明確ではない感染症、創傷により感染する感染症、土壌や水などの環境中に存在する病原体から感染する感染症は、報告数が少ないため比較が困難、COVID-19 に関係しないことが明らか等の理由により対象外とした（表 2）。

調 査 方 法1.調査期間と対象疾患
表 1 対象とした感染症
分類

感染症

小児科定点・

インフルエンザ、RS ウイルス感染症、咽頭結膜熱、A 群溶血性レンサ球菌咽頭炎、感インフルエンザ定点

染性胃腸炎、水痘、手足口病、伝染性紅斑、突発性発しん、ヘルパンギーナ、流行性
耳下腺炎

定
点
把
握
感
染
症

眼科定点

急性出血性結膜炎、流行性角結膜炎

基幹定点

細菌性髄膜炎、無菌性髄膜炎、マイコプラズマ肺炎、クラミジア肺炎（オウム病を除く）、感染性胃腸炎（ロタウイルス）性感染症定点
基幹定点

性器クラミジア、性器ヘルペス、尖圭コンジローマ、淋菌
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌感染症、ペニシリン耐性肺炎球菌感染症、薬剤耐性緑
膿菌感染症

全
数
把
握
感
染
症

3類

細菌性赤痢、腸管出血性大腸菌感染症、腸チフス、パラチフス

4類

E 型肝炎、A 型肝炎、重症熱性血小板減少症候群、チクングニア熱、つつが虫病、デング熱、日本紅斑熱、マラリア、ライム病

5類

アメーバ赤痢、カルバペネム耐性腸内細菌科細菌感染症、クリプトスポリジウム症、
後天性免疫不全症候群、ジアルジア症、侵襲性インフルエンザ菌感染症、侵襲性髄膜炎菌感染症、侵襲性肺炎球菌感染症、水痘（入院例）、梅毒、バンコマイシン耐性腸球菌感染症、百日咳、風しん、麻しん、薬剤耐性アシネトバクター感染症

表 2 対象外とした感染症
分類

全
数
把
握
対
象
感
染
症

感染症

3類

コレラ

4類

ウエストナイル熱、エキノコックス症、黄熱、オウム病、オムスク出血熱、回帰熱、キャサヌル森林病、Q 熱、狂犬病、コクシジオイデス症、サル痘、ジカウイルス感染症、腎症候性出血熱、西部ウマ脳炎、
ダニ媒介脳炎、炭疽、東部ウマ脳炎、鳥インフルエンザ（H5N1 を除く）
、ニパウイルス感染症、日本
脳炎、ハンタウイルス肺症候群、B ウイルス病、鼻疽、ブルセラ症、ベネズエラウマ脳炎、ヘンドラウ
イルス感染症、発疹チフス、ボツリヌス症、野兎病、リッサウイルス感染症、リフトバレー熱、類鼻疽、
レジオネラ症、レプトスピラ症、ロッキー山紅斑熱、5類

ウイルス性肝炎、急性弛緩性麻痺、急性脳炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、劇症型溶血性レンサ球菌
感染症、先天性風しん症候群、播種性クリプトコックス症、破傷風、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球
菌感染症

-2-

表 3 2020 年の累積報告数と平年との比較表現
2020 年の累積報告数

平年との比較

平年平均*1＋2SD*2 以上

かなり多い

平年平均＋SD 以上
平年平均＋2SD 未満

多い

平年平均－SD 以上
平年平均＋SD 未満

平年並み

平年平均－2SD 以上
平年平均－SD 未満

少ない

平年平均－2SD 未満

かなり少ない

基幹定点では、感染性胃腸炎（ロタウイルス）の定点あたり報告数が平年よりかなり少なく、細菌性
髄膜炎、無菌性髄膜炎、ペニシリン耐性肺炎球菌感染症、薬剤耐性緑膿菌感染症は平年より少なかった。
それ以外の感染症は平年並みであった（表 4）。
性感染症定点では、性器クラミジアは定点あたり報告数が平年よりかなり多かったが、それ以外の感染症は、平年並みであった（表 4）。
2.全数把握感染症（3 類感染症）
大阪府の報告数で比較することができたのは腸*12015 年から 2019 年までの累積報告数の平均*22015 年から 2019 年までの累積報告数の標準偏差

管出血性大腸菌感染症のみであり、平年より少なかった。全国の報告数で比較した腸チフス、パラチフ
スの報告数は平年よりかなり少なく、細菌性赤痢の報告数は、平年より少なかった（表 5）。

2.方法
NESID より大阪府及び全国における各年の感染症報告数を収集し、定点把握感染症については大阪
府の定点あたり累積報告数（定点あたり報告数）を、全数把握感染症については大阪府及び全国の累積報告数を用いた。過去 5 年間（平年）を 2015 年から 2019 年までとし、各感染症における過去 5 年間の累積報告数の平均（平年平均値）及び標準偏差（SD）を算出した。2020 年の累積報告数と平年平均値を比較して、表 3 の通り分類し（かなり多い、多い、平年並み、少ない、かなり多い）、COVID-19の影響について検討した。大阪府内での年平均累積報告数が 12 例以下の全数把握感染症は比較困難であるため、全国の累積報告数を用いて比較した。
結 果

3.全数把握感染症（4 類感染症）
大阪府の報告数で比較することができたのは、A型肝炎、デング熱であり、共に報告数は平年より少なかった。なお、2020 年のデング熱は 2015 年以降
で最も少ない報告数であった。全国の報告数で比較し、報告数が平年よりかなり少なかったのは、マラリアであった。報告数が平年よりかなり多かったのは、日本紅斑熱、つつが虫病及びライム病であった。
それ以外の感染症は平年並みであった（表 5）。
4.全数把握感染症（5 類感染症）
大阪府の報告数で比較することができた 11 感染症のうち 4 感染症（アメーバ赤痢、侵襲性肺炎球菌
感染症、水痘（入院例）、百日咳）の報告数は平年よりかなり少なく、後天性免疫不全症候群は平年より少なかった。それ以外の感染症は平年並みであった。
全国の報告数で比較した 4 感染症（クリプトスポリ
ジウム症、ジアルジア症、侵襲性髄膜炎菌感染症、
薬剤耐性アシネトバクター感染症）の報告数は平年

大阪府における定点把握対象感染症の定点あたり報告数（2020 年）及び平年との比較を表 4 に、全数把握対象感染症の累積報告数（2020 年）及び平年との比較を表 5 に示した。
1.定点把握感染症
2020 年の大阪府における小児科定点・インフルエ
ンザ定点・眼科定点に指定された医療機関（小児科・インフルエンザ・眼科定点）からの報告数の総計は76,096 例であり、平年（183,538 例）と比較し 58.5％
減少していた。伝染性紅斑、流行性耳下腺炎は定点あたり報告数が平年並みであったが、手足口病、突発性発しんは平年より少なく、それ以外の感染症は平年よりかなり少なかった（表 4）。

よりかなり少なかった（表 5）。
考 察
1.定点把握感染症
定点把握感染症の小児科定点・インフルエンザ定
点・眼科定点及び基幹定点からの報告が平年よりかなり少なくなった感染症は、飛沫・接触・経口によ-3-

表 4 大阪府における定点把握感染症の定点あたり報告数及び平年との比較

小
児
科
定
点
・
イ
ン
フ
ル
エ
ン
ザ
定
点

平年平均値 標準偏差 平年との比較*1

感染症

2020年

インフルエンザ

143.69272.7060.49

かなり少ないRSウイルス感染症

5.76

53.87

7.81

かなり少ない

咽頭結膜熱

10.45

25.66

1.31

かなり少ないA群溶血性レンサ球菌咽頭炎

47.89

110.893.93

かなり少ない感染性胃腸炎120.88304.2442.55

かなり少ない

水痘

9.06

21.10

4.16

かなり少ない

手足口病

3.17

78.84

55.87

少ない

伝染性紅斑

3.85

16.57

13.67

平年並み

突発性発しん

19.43

23.43

2.87

少ない

ヘルパンギーナ

7.93

29.87

7.42

かなり少ない

流行性耳下腺炎

2.85

25.39

27.73

平年並み

急性出血性結膜炎

0.22

0.71

0.19

かなり少ない

流行性角結膜炎

7.04

22.57

4.38

かなり少ない細菌性髄膜炎

0.63

1.18

0.31

少ない

無菌性髄膜炎

0.94

2.35

0.76

少ない

マイコプラズマ肺炎

5.81

27.76

23.80

平年並み

クラミジア肺炎（オウム病を除く）

0.06

0.23

0.18

平年並み

感染性胃腸炎（ロタウイルス）

0.38

18.76

4.82

かなり少ないメチシリン耐性黄色ブドウ球菌感染症

49.53

46.05

4.33

平年並み

ペニシリン耐性肺炎球菌感染症

3.88

4.76

0.61

少ない

薬剤耐性緑膿菌感染症

0.18

0.51

0.31

少ない

性器クラミジア

40.59

37.32

1.36

かなり多い

性器ヘルペス

13.95

13.88

1.85

平年並み

尖圭コンジローマ

9.43

9.50

1.04

平年並み

淋菌

13.24

11.84

2.07

平年並み

眼科定点

基
幹
定
点

性
感
染
症
定
点
*1

平年との比較は、2020年の定点あたり累積報告数と平年平均値の偏差に基づいて平年と比較した。

-4-

表 5 全数把握対象感染症の累積報告数及び平年との比較
大阪府
感染症

主な感染経路等

腸管出血性大腸菌感染症

経口感染

147

233

細菌性赤痢

輸入感染

1

腸チフス

輸入感染

パラチフス

全国
平年との
比較 *1

2020年

平年
標準偏差
平均値

82

少ない

3,092

3,744

138

かなり少ない

6

3

-

87

165

59

少ない

1

3

1

-

21

40

7

かなり少ない

輸入感染

0

1

1

-

7

22

7

かなり少ない

デング熱

輸入感染

5

30

15

少ない

45

308

100

かなり少ない

マラリア

輸入感染

3

3

2

-

21

52

8

かなり少ないチクングニア熱

輸入感染

0

2

1

-

3

18

18

平年並み

節足動物
媒介感染
節足動物
媒介感染
節足動物
媒介感染
節足動物
媒介感染

11

6

3

-

421

290

47

かなり多い

0

1

1

-

536

447

38

かなり多い

0

0

0

-

27

13

5

かなり多い

0

0

1

-

78

78

18

平年並み

Ｅ型肝炎

経口感染

4

6

3

-

454

362

112

平年並み

Ａ型肝炎

経口感染

7

26

14

少ない

120

430

286

少ない

アメーバ赤痢

経口感染

49

102

23

かなり少ない

613

1,009

149

かなり少ないクリプトスポリジウム症

経口感染

1

1

1

-

6

18

4

かなり少ないジアルジア症

経口感染

6

7

3

-

28

67

11

かなり少ない

2

4

2

-

14

37

9

かなり少ない

116

242

47

かなり少ない

1,655

3,003

417

かなり少ない11

26

5

かなり少ない

362

380

91

平年並み

侵襲性インフルエンザ菌
感染症

飛沫・
接触感染
飛沫・
接触感染
飛沫・
接触感染
飛沫・
接触感染

25

41

18

平年並み

253

393

121

少ない

後天性免疫不全症候群

性感染症

115

175

32

少ない

1,096

1,360

91

かなり少ない

梅毒

性感染症

902

809

358

平年並み

5,871

5,348

1,755

平年並み

飛沫・
接触感染
飛沫・
接触感染
飛沫・
接触感染
薬剤耐性菌
感染症
薬剤耐性菌
感染症
薬剤耐性菌
感染症

111

949

165

かなり少ない

2,947

14,4803,345

かなり少ない

7

57

63

平年並み

102

1,124

1,384

平年並み

1

45

61

平年並み

12

282

273

平年並み

22

20

12

平年並み

136

74

10

かなり多い

157

172

31

平年並み

1,952

1,905

373

平年並み

2

1

1

-

10

29

6

かなり少ない

2020年

平年
標準偏差
平均値

平年との
比較 *1

3類

日本紅斑熱
4類

つつが虫病
ライム病
重症熱性血小板減少症候群

侵襲性髄膜炎菌感染症
侵襲性肺炎球菌感染症
水痘（入院例）

5類

百日咳

*1

風しん
麻しん
バンコマイシン耐性腸球菌
感染症
カルバペネム耐性腸内細菌科細菌感染症
薬剤耐性アシネトバクター
感染症*1

平年との比較は、2020年の累積報告数と平均値の偏差に基づいて平年と比較した。

*2

百日咳は2018年から全数把握感染症となったため、平均値は2018～2019年とした。

り感染する感染症であり、同じ感染経路である
COVID-19 の予防対策による影響を受けたと考えられた。手足口病、伝染性紅斑、流行性耳下腺炎も飛沫・接触により感染するが、平年並みか、平年より少なかった。他の小児科定点の感染症は毎年ほぼ一定以上の報告数があるが（図 1-1）
、手足口病、伝染性紅斑、流行性耳下腺炎には流行の周期があり、非流行年の定点あたり報告数が 10 例以下と少なかっ-5-

たためと考えられた（図 1-2）
。しかし、2020 年の手足口病と流行性耳下腺炎の定点あたり報告数は過去 5 年間で最も少なく、伝染性紅斑は 2 番目に少なかったことから、これらの感染症も COVID-19 の予防対策による影響を受けたと考えられた。突発性発が報告数の減少に影響したと考えられた。
日本紅斑熱、つつが虫病、ライム病及び重症熱性
血小板減少症候群は節足動物媒介感染症である。これらの感染症については 2020 年の報告数に減少が認められず、日本紅斑熱、つつが虫病及びライム病

しんについては、好発年齢が 0～1 歳であり、0 歳児
人口の減少とともに報告数は年々減少している 6)。
また、突発性発しんの感染経路は既感染成人からの唾液による水平感染と考えられており、COVID-19による予防対策の影響を受けにくかったと考えられた。細菌性髄膜炎、無菌性髄膜炎、マイコプラズの報告数は平年よりかなり多くなっている。
COVID-19 が流行している中で人との接触を避ける
ためキャンプ等の野外活動をする機会が増えた 11)
ことが理由の一つと考えられた。

マ肺炎、クラミジア肺炎（オウム病を除く）は 300
床以上の基幹定点医療機関からの報告であり、年間報告数が少ないため、今回は COVID-19 による影響について判断することはできなかった。
2.全数把握感染症（3 類感染症及び 4 類感染症）

飛沫・接触により感染すると考えられる侵襲性髄膜炎菌感染症、侵襲性肺炎球菌感染症、水痘（入院例）、百日咳の報告数が平年よりかなり少なく、
COVID-19 による予防対策の影響を受けたと考えられた。大阪府で平年並み、全国で平年より少なかった侵襲性インフルエンザ菌感染症も飛沫感染する

腸管出血性大腸菌感染症、E 型肝炎、A 型肝炎の
主な感染経路は経口感染と考えられる。腸管出血性
大腸菌感染症の報告数は、大阪府で平年より少なく、全国でかなり少なかった。手洗い、手指消毒の徹底
により、人から人への感染が減少したことに加え、経口感染の機会が減少したと考えられた。食中毒統感染症であり、大阪府における 2020 年の報告数は
過去 5 年間で最も少なかった。また全国では 2015
年以降年々増加傾向にあったが、2020 年の報告数は2019 年より半減しており、COVID-19 の予防対策による影響を受けたと考えられた。飛沫あるいは飛沫
核感染により感染する風しん及び麻しんの報告数

計資料によると、家庭での食中毒事件件数に変化はあまりないが、飲食店における食中毒事件件数も減少しており 7)、外出自粛に伴う外食の機会の減少も影響したと考えられた。全国での報告数が平年並みであった E 型肝炎は、食品の加熱調理が感染予防に重要であり 8)、COVID-19 による影響を受けなかっは、大阪府、全国とも平年並みであった。風しんは、
厚生労働省の報道発表資料 12)によると、全国的に2018 年第 30 週頃から増加し、2019 年も報告数が多くなっていたが、2019 年 37 週以降は 20 例を下回
る報告数となっている。風しんは国外発生事例もあり、2020 年の報告数は平年の約 10 分の 1 であり、たと考えられた。A 型肝炎は、経口感染の他に同性間性的接触による感染も報告されているが 9)、手洗いの徹底や外食の機会の減少などによる影響で平年より少なくなった可能性がある。
腸チフス、パラチフス、デング熱及びマラリアは輸入感染症であり、渡航制限により 2020 年の訪日

COVID-19 による影響があったことが示唆された。
麻しんは過去において大きな流行があり、その後も散発的な発生が認められたが 13)、2020 年第 24 週以降発生はなかった。麻しんは、海外で感染し国内に持ち込まれることが多く、渡航制限による影響があったのではないかと考えられた。経口感染するアメ

外国人旅行者数及び日本人出国者数が減少しており 10)、それに伴い報告数が減少したと考えられた。
チクングニア熱も輸入感染症であるが、全国でも年間総数が 10 例未満の年があり、今回は比較が困難であった。細菌性赤痢の報告には、国内発生例と国外発生例があり、渡航制限による国外発生例の減少

ーバ赤痢、クリプトスポリジウム症及びジアルジア症は海外での感染事例も報告されていることから
14）、手洗い・手指消毒や渡航制限によって報告数が減少したと考えられた。

-6-

3.全数把握感染症（5 類感染症）

図 1-1 大阪府における 2015 年～2020 年の定点把握感染症定点あたり報告数（手足口病、伝染性紅斑、流行性耳下腺炎を除く）

図 1-2 手足口病、伝染性紅斑、流行性耳下腺炎の大阪府における 2015 年～2020 年の定点把握感染症定点あたり報告数4.性感染症
後天性免疫不全症候群の報告数は年々減少傾向にあったことに加え、HIV（ヒト免疫不全ウイルス）の検査数が大きく減少したとの報告 13)もあり、
COVID-19 の影響について判断することはできなか

性器クラミジアは全国において年々増加傾向 16)であり、COVID-19 の影響について判断することはできなかった。

った。梅毒、性器ヘルペス、尖圭コンジローマ及び
淋菌については 2020 年の報告数が平年並みであり、COVID-19 の予防対策による影響はなかったと考えられた。一方で平年よりかなり多い報告数となった

薬剤耐性菌であるカルバペネム耐性腸内細菌科
細菌感染症、薬剤耐性アシネトバクター感染症及び定点把握感染症のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌、ペニシリン耐性肺炎球菌感染症、薬剤耐性緑-7-5.薬剤耐性菌感染症

Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) Mitigation Strategies
on Seasonal Respiratory Viruses: A Tale of Two
Large Metropolitan Centers in the United States. Clin

膿菌感染症は、大阪府及び全国の平年との比較において、平年よりかなり少ない感染症から平年よりかなり多い感染症までばらつきが大きく、今回は COVID-19 による影響について判断することはできなかった。

Infect Dis 2020; 72: 154-157
3) Yeoh DK，Foley DA，Minney-Smith CA， Martin
AC，Mace AO，Sikazwe CT，Le H，Levy A，Blyth CC，Moore H. Impact of Coronavirus Disease2019 Public Health Measures on Detections ofInfluenza and Respiratory Syncytial Virus inChildren During the 2020 Australian Winter.

ま と め
COVID-19と同様に飛沫・接触感染する感染症や経口感染する感染症は、COVID-19の感染予防対策であるマスク着用等の咳エチケット、手洗い・手Clin.Infect.Dis 2021; 72: 2199-2202
4) Sakamoto H，Ishikane M，Ueda P. Seasonal
Influenza Activity During the SARS-CoV-2

指の消毒、身体的距離の確保等が感染予防に有効であることが示唆された。また、COVID-19の対策である渡航制限は輸入感染症を減少させた。
一方、3密（密閉、密集、密接）を避けるために増加したと考えられる野外活動は、節足動物媒介感染症の発生に影響したようである。性感染症のOutbreak in Japan. JAMA 2020; 323: 1969-1971
5) Matthew A. Crane,Aleksandra Popovic, Rohan
Panaparambil,, Andrew I. Stolbach,, John A.
Romley,, Khalil G. Ghanem, Reporting of Infectious
Diseases in the United States During the COVID-19
Pandemic Clin.Infect.Dis 2021;
https://doi.org/10.1093/cid/ciab529

多くは平年並みの報告数でCOVID-19の予防対策は
影響しなかったと考えられた。これらの感染症については、特有の感染予防対策が必要である。
2021年は、10歳未満の小児においてCOVID-19の流行中もライノウイルスの検出率が上昇したとの報告17)やRSウイルスによる感染症が増加している

6) 国立感染症研究所. 突発性発疹 2000～2020 年.
IASR 2020; 41: 211-212
7) 厚生労働省. 食中毒統計資料.
https://www.mhlw.go.jp/stf/seisakunitsuite/bunya/kenkou_iryou/shokuhin/syokuchu/04.htmlとの報告18)がある。今後もCOVID-19以外の感染症の発生動向に注意し、COVID-19の流行による他の感染症への影響について検討していく。

8) 国立感染症研究所. 人獣共通感染症としての E
型肝炎. IASR 2014; 35: 4-5
9) 国立感染症研究所. A 型肝炎 2015～2019 年 3月現在. IASR 2019; 40: 147-148

謝 辞
大阪府感染症発生動向調査事業にご協力いただきました医療機関の方々及び関係機関の方々に深謝します。

10).国土交通省 訪日外国人旅行者数・出国日本人
数
https://www.mlit.go.jp/kankocho/siryou/toukei/in_ou
t.html

利 益 相 反11) やまとごころ.jp. インバウンドニュース
https://www.yamatogokoro.jp/inboundnews/pickup/42274/

開示すべき利益相反はない。

12) 厚生労働省. 風しん対策（抗体検査）の実施率の向上策について.
https://www.mhlw.go.jp/stf/newpage_09247.html

文 献1) 厚生労働省. 感染症発生動向調査について.
https://www.mhlw.go.jp/stf/seisakunitsuite/bunya/00

13) 国立感染症研究所 麻疹 2020 年 2 月現在.
IASR 2020; 41: 53-55

00115283.html

14) 国立感染症研究所. 日本の輸入感染症例の動向について 2021 年 1 月 19 日更新版.
https://www.niid.go.jp/niid/images/epi/imported/PDF/202101_WebupImportedIDs_final.pdf

2) Sherman AC，Babiker A，Sieben AJ，Pyden A，
Steinberg J，Kraft CS，Koelle K，Kanjilal S. The
Effect of Severe Acute Respiratory Syndrome-8-15) 厚生労働省. 第 155 回エイズ動向委員会（令和2 年 第 1・第 2 四半期） エイズ動向委員会 委
員長コメント. https://apinet.jfap.or.jp/status/japan/data/2020/2009/20200915_
coment.pdf
16) 国立感染症研究所. 性器クラミジア感染症の発生動向. 2019 年
https://www.niid.go.jp/niid/ja/chlamydia-stdm/chlamydia-std-idwrs/10202-chlamydia-21jan.html
17) Takashita E，Kawakami C，Momoki T，Saikusa
M，Shimizu K，Ozawa H，Kumazaki M，Usuku
S，Tanaka N，Okubo I，Morita H，Nagata S，Watanabe S，Hasegawa H，Kawaoka Y. Increased
risk of rhinovirus infection in children during thecoronavirus disease-19 pandemic. Influenza Other
Respi Viruses. 2021; 15: 488-494
18) 大阪府感染症情報センター. 大阪府感染症発生動向調査週報（速報）2021 年 第 21 週 5 月 24
日～5 月 30 日.
http://www.iph.pref.osaka.jp/infection/surv21/topics2
1.pdf
WEB サイトの内容は 2021 年 6 月 21 日に確認した。

-9-Annual Report of Osaka Institute of Public Health, 5, 2021

Surveillance of infectious diseases in 2020 in Osaka Prefecture

Yuka SATSUKI, Kazushi MOTOMURA, Yoko NISHIDA, Kensaku KAKIMOTO, Takayuki NISHIO,
Takeshi MIYAMA, Nobuhiro IRITANI and Kazuo KOBAYASHISARS-CoV-2 has spread around the world in 2020. It had people change the behavior to prevent the spread of infection.
We investigated surveillance data of infectious diseases based on National Epidemiological Surveillance of Infectious
Diseases. We compared the number of reported infectious diseases in 2020 with that of 5 previous years to consider the
impact of infection prevention measures for coronavirus disease 2019 (COVID-19). The number of infectious diseases
reported for droplet, contact, oral transmissions and imported cases have decreased 2020 as compared with that of 5previous years. Our findings suggest that prevention measures against COVID-19 (e.g. physical distancing, wearing amask, washing hand, hygiene hands, avoiding the 3 Cs (i.e., crowded places, close-contact settings, and closed spaces)
are effective against droplet, contact and oral transmissions.

Key words : surveillance of infectious diseases, coronavirus disease 2019, infection prevention measures,2020

Osaka Institute of Public Health- 10 -

報

文

地方独立行政法人大阪健康安全基盤研究所研究年報 Ann. Rep. Osaka. Inst. Pub. Health, 5, 11-17 (2021)

大阪府におけるエンテロウイルス感染症の流行状況と分子疫学的解析（2020 年度）

中田恵子 a，山中靖貴 a，本村和嗣 b2020 年度の無菌性髄膜炎、手足口病またはヘルパンギーナ患者から検出されたエンテロウイルスはそれ
ぞれ、エコーウイルス 9 型（1 名）とエコーウイルス 14 型（1 名）、コクサッキーウイルス A4 型（2 名）、同じくコクサッキーウイルス A4 型（2 名）であった。コクサッキーウイルス A4 型の分離株の Viral Protein
1 領域を用いた系統樹解析の結果、2020 年度の 4 株全てが同じクラスターに分類された。また、2020 年度の株は、2018 年の中国の株が最も近縁であった。新型コロナウイルス感染症（COVID-19）流行下で国内外の人流が制限され、既知の感染症患者が非常に少なく推移したシーズンでさえ、エンテロウイルス感染症では前シーズンの主流とは異なるウイルス型が主となり、系統樹解析では国外からのウイルスの流入が疑われた。今後も引き続きエンテロウイルス感染症の動向を調査する必要がある。

キーワード：無菌性髄膜炎、手足口病、ヘルパンギーナ、エンテロウイルス

毎年夏季に小児の患者数が増加するエンテロウ

調 査 方 法イルス（Enterovirus ; EV）感染症の中で、無菌性髄膜炎、手足口病およびヘルパンギーナは「感染症の予防及び感染症の患者に対する医療に関する法律」（以下、感染症法）において 5 類感染症の定点把握疾患に指定されている。各疾患の原因となるウイル
スの型は年毎に変動があり、患者から検出されるウ

1. 検体及び情報収集
2020 年 4 月 1 日から 2021 年 3 月 31 日の期間に、大阪府内（ただし大阪市および堺市を除く）の定点医療機関から当所に搬入された無菌性髄膜炎、手足口病またはヘルパンギーナと診断された 18

イルスは疾患ごとに特徴がある 1）。また、ウイルス型によっては中枢神経症状を引き起こす等、重症化との関連が疑われる 2）ことや、流行するウイルス型
が一定の周期で繰り返す傾向が認められるため 3）、
流行を予測する観点から毎年の流行解析は重要である。本稿では、2020 年 4 月 1 日から 2021 年 3 月

名から採取された 33 検体を対象とした。検体種別の内訳は髄液が 8 検体、咽頭ぬぐい液（鼻汁含む）
が 15 検体、便（腸内容物含む）が 6 検体、その他が 4 検体（血清が 1 検体、尿が 2 検体、水疱内容物が 1 検体）であった。患者情報（患者の年齢、性別、診断名、体温、発症日）は感染症法に基づく

31 日の間に無菌性髄膜炎、手足口病またはヘルパン
ギーナと診断された患者検体から検出されたウイルスと患者の疫学情報を集約し、EV の流行状況とウイルスの分子疫学的解析を実施したので報告する。

感染症発生動向調査事業によって得られた調査票より収集した。
2. 培養細胞によるウイルス分離
培養細胞によるウイルス分離には 10％FBS を添加したイーグルＭEM 培地（日水製薬株式会社）で培養し、48 ウェルプレートに播種したRD-A、
VeroE6、
FL、Caco-2 細胞を用いた。咽頭ぬぐい液は、綿棒でa 大阪健康安全基盤研究所微生物部ウイルス課
b 大阪健康安全基盤研究所公衆衛生部- 11 -

咽頭を擦過後、検体輸送用培地に浸漬した溶液（検体溶液）を、髄液は無処理でそれぞれ 100 μL ずつを各細胞に接種した。便（腸内容物含む）は、緩衝液（ラクトアルブミン水解物溶解液）で 10% 懸濁液（便乳剤）を作製し、15,000 rpm で 5 分間遠心分名であった。手足口病と診断された患者は 7 名で、年齢の中央値が 1 歳 9 か月（1 歳-4 歳 5 か月）、性
別は男性 1 名、女性 6 名であった。ヘルパンギーナと診断された患者は 3 名で、年齢の中央値は 2 歳 5か月（1 歳 7 か月-2 歳 5 か月）、性別は男性 1 名、離後、その上清を同緩衝液で 10 倍希釈し、0.45 μm
シリンジフィルターでろ過した溶液から 100 μL を各細胞に接種した。各細胞への検体接種後、CO2 濃
度 5％、37℃のインキュベーターで 1 週間培養し、細胞変性効果（cytopathic effect; CPE）を観察した。
CPE が出現した場合に陽性と判定し、培養上清を

女性 2 名であった。
無菌性髄膜炎、手足口病あるいはヘルパンギーナと診断された合計 18 名分、33 検体のうち 6 名分、6 検体で EV が陽性となった。無菌性髄膜炎患者の8 名中 2 名から EV の遺伝子が検出され、それぞれエコーウイルス 9 型（Echovirus9 ; E9）と E14 であ回収した。なお、3 代盲継代を繰り返し、CPE が出
現しなかった場合を陰性と判定した。

った。両名ともに便検体でのみ陽性であった。手足口病では 7 名中 2 名から、ヘルパンギーナでは 3 名
中 2 名から EV の遺伝子が検出され、全てコクサッ
キーウイルス A4 型（Coxsackievirus A4 ; CV-A4）と型別された。CV-A4 陽性検体では、遺伝子検出および培養細胞（RD-A 細胞でのみ）によるウイルス分

3. 検体および培養上清からのウイルス遺伝子検出
および系統樹解析
便乳剤の遠心上清およびその他の全ての検体からそれぞれ 200 μL を採取し、ウイルス RNA 抽出用検体とした。ウイルス RNA 抽出は、Magtration®MagaZorb RNA Common Kit（PSS 社）を用いて、全自動核酸抽出装置 Magtration® System 6GC または12GC（PSS 社）で行った。EV の Viral Protein （VP）
4–2 領域に対する seminested RT-PCR4)を実施後、増離検査の双方で陽性となった（表 1、2、3）。

幅産物のダイレクトシークエンスを実施し、BLAST
解析にて遺伝子型を決定した。また、培養細胞によるウイルス分離の結果、CPE が認められた場合は、培養上清から 200 μL を採取し、上述の方法でウイ
ルス RNA を抽出した。培養上清から抽出したウイ
ルス RNA を用いて EV の VP1 領域に対する RT-

月から 11 月までであった（図 2）。

PCR5)を実施した。得られた増幅産物に対し、ダイレ
クトシークエンスを行ない、BLAST 解析により遺伝子型別を行うとともに、近隣結合法を用いた系統
樹解析を実施した。

株の 4 株は同じクラスターを形成し、2018 年の中国株に最も近縁であった。また、2020 年度株は、過去の当センター分離株とは独立したクラスターを形成し、当センター分離株では 2018 年度株よりも2016 年度株が近縁であった（図 3）。

2. 疾患別月別の検出 EV の遺伝子型
無菌性髄膜炎患者からは 9 月に E14 が、1 月に E9が検出された（図 1）。手足口病とヘルパンギーナ患者からは CV-A4 のみが検出されたが、検出時期は 9

3. CV-A4 の VP1 領域に対する系統樹解析
CV-A4 の分離株 4 株について、ウイルス抗原決定領域である VP1 領域（解析が可能であった 661 塩基）の系統樹解析を実施した。その結果、2020 年度

4. 本研究は、
地方独立行政法人大阪健康安全基盤研
究所倫理審査委員会の承認を得て（承認番号 131005-5）、「人を対象とする医学系研究に関する倫理指針」を順守して実施したものである。
結 果
1.

患者情報およびウイルスの検出状況
検体が採取された患者のうち、無菌性髄膜炎と診断されたのは 8 名で、年齢の中央値は 2 か月（範囲：0 か月-14 歳 2 か月）、性別は男性 6 名、女性 2

考 察2020 年度の EV 感染症の流行状況は非常に低調であった。季節性に毎年流行する他のウイルス感染症の流行が非常に低調であったのと同様に、
COVID-19 の世界的な感染拡大の影響による人々の行動変容、受診抑制、マスクや手洗いなどのウイル
ス感染防止策を実行したことが要因として考えられる。また、緊急事態宣言の発令に従い、人流が抑制され、休園や休校措置により EV 感染症の好発年- 12 -

表 1．無菌性髄膜炎患者由来検体におけるウイルス検出結果
咽頭ぬぐい液（鼻汁含む）（n=5）

便（腸内容物含む）（n=6）

遺伝子検査

分離培養

遺伝子検査

分離培養

髄液（n=8)

その他（n=3)

遺伝子検査 分離培養

遺伝子検査 分離培養

E9

0

0

1

0

0

0

0

0

E14

0

0

1

0

0

0

0

0

合計（％）

0

0

2（33）

0

0

0

0

0

その他：血清1，尿2

表 2. 手足口病患者由来検体におけるウイルス検出結果

咽頭ぬぐい液（n=7）

その他（n=1)

遺伝子検査

分離培養

遺伝子検査 分離培養

CV-A4

2

2

0

0

合計（％）

2（29）

2（29）

0

0

その他：水疱内容物表 3. ヘルパンギーナ患者由来検体におけるウイルス検出結果

咽頭ぬぐい液（n=3）
遺伝子検査

分離培養

CV-A4

2

2

合計（％）

2（67）

2（67）

2

患
者
数

E9

E14

10

11

1

（人）

0
4

5

6

7

8

9

2020年

12

1

2

2021年

図 1. 無菌性髄膜炎患者から検出された月別検出ウイルス遺伝子型- 13 -

3

2

CV-A4（手足口病患者由来）

患者
数

CV-A4（ヘルパンギーナ患者由来）

1

（人）

0
4

5

6

7

8

9

10

11

2020年

12

1

2

3

2021年

図 2. 手足口病およびヘルパンギーナ患者から検出された月別検出ウイルス遺伝子型

BrCr-EV71
MK388479China2016
LC626199China2020

995

MK388498China2017
MN964110China2018
20201012
20201011

950

819

20200024
20200020
MH086036China2015

994

KY978566China2014
MK388456China2013
2801462801692801731000

1000

2810692801652801402801812801872020年度株：赤2018年度株：緑2016年度株：黄2014年度株：青2012年度株：紫2801222810412801202801211000

280211281034
LT719044MAD2011

976

280194260161
1000

260084260069999

KY271949USA2015
MH111020AUS2016
2601191000

261038260105
LC438279VNM2012

0.02

241061300167
CA4_High_point_ref

図 3. CV-A4 の VP1 領域に対する系統樹解析（661 塩基）- 14 -

齢である乳幼児や学童幼児の接触が減少したことも大きく関与していると考えられる。
このような状況下においても無菌性髄膜炎患者
からは E9 と E14 が検出された。E9 は 2013 年度以降、E14 は近年 10 年間、当センター搬入の無菌性

外からの人流は大きく抑制された。しかし、無菌性髄膜炎、手足口病、ヘルパンギーナの疑い患者からは 2019 年度とは異なる型の EV が検出され、CV-A4に関しては系統樹解析の結果から国外からのウイ
ルスの流入が強く疑われた。EV は、不明熱をはじ

髄膜炎疑い患者検体からは検出されていない 6-11)。
無菌性髄膜炎は症候群として診断されるため一定の疫学パターンをとらないが、ウイルスが原因となる場合は、EV の占める割合が高いことから、基本的な発生動向は EV の流行状況を反映するとされている 12)。
無菌性髄膜炎の全国規模の流行は、1983 年、めとする軽症事例や不顕性感染を引き起こすことが広く知られている。完全な人流抑制が不可能である場合は、国外からウイルスの侵入をコントロール
することは困難であると考えられた。
COVID-19 感染防止対策下で EV 感染症の患者は少なく抑えられたシーズンでも、国外からのウイル

1989-1991 年、1997-1998 年に発生した E30 によるものが知られているが、その後は E9、E13、E30 などによる集団発生事例が地域的に報告されている
13）。国内では長期間、EV による無菌性髄膜炎の大規模な流行は発生していないため、無菌性髄膜炎の原因となる EV に対する抗体を保有していない感受スの流入が示唆された。EV 感染症は、流行するウ
イルスの型によって症状や疫学的動向も異なり、抗体保有状況によっては大規模な流行も懸念される。
今後も引き続き、国内の流行解析に加えて世界的なEV 感染症の動向を注視する必要があると考えられた。また、流行状況に合わせた検査情報を発信し、性者の増加による大規模な流行が懸念される。引き続き、患者から検出されるウイルスの動向を注視す
る必要がある。
手足口病およびヘルパンギーナの患者からはCV-A4 が検出された。
CV-A4 が検出された全ての検体から分離株が得られ、VP1 領域の分子系統樹解析

流行予測および流行拡大の防止のための啓発に役立てる必要があると考えられた。

が実施可能であった。当センターでは、2012 年度以降隔年で CV-A4 が分離されている。例年、手足口病やヘルパンギーナ患者からは初夏から盛夏に EVの検出が目立つが、2020 年度の CV-A4 の検出は 9月からと、秋以降となった。2020 年度は検体数が非常に少なかったため、この現象の原因の詳細は不明にご協力いただいた医療機関の先生方に深謝いた
します。

謝 辞
感染症発生動向調査事業に基づき、患者検体採取

利 益 相 反開示すべき利益相反はない。

だが、COVID-19 の感染拡大に伴う、好発の年齢層の接触機会の変化が影響している可能性が推測される。CV-A4 の系統樹解析の結果では、2020 年度の分離株は全て同じクラスターに分類され、過去の当センター分離株のクラスターとは独立していた。
また、2020 年度 CV-A4 の分離株は 2018 年の中国株

1) Heinz Z, Hans-Peter G. Clinical virology manual third
edition-Enteroviruses.
AmericanSocietyforMicrobiology, Wasington, D. C 2000; 252-69.

（MN964110 China2018）と最も近縁関係にあり、2016、2017、2020 年の中国株が過去の当センター分
離株より近縁であった。国内では、CV-A4 が分離されていなかった年度には CV-A6 等の他の EV が主流となっていたことからも、毎年の主流 EV は夏季を中心としたシーズンで一旦終結し、次のシーズン

2) Jones E, Pillay TD, Liu F, Luo L, Bazo-Alvarez JC,
Yuan C, Zhao S, Chen Q, Li Y, Liao Q, Yu H, Rogier
van Doorn H, Sabanathan S. Outcomes following
severe hand foot and mouth disease: A systematic
review and meta-analysis. Eur J Paediatr Neurol 2018
doi: 10.1016/j.ejpn.2018.04.007.

には中国などの近隣アジア諸国から国内に流入した株が関与して広がる可能性が示唆された。
2020 年度は COVID-19 感染拡大防止のため、国3) Abedi GR, Watson JT, Nix WA, Oberste MS, Gerber SI.
Enterovirus and Parechovirus Surveillance - UnitedStates, 2014-2016. MMWR Morb Mortal Wkly Rep

文 献2018; 67(18): 515-518.

- 15 -

4) 石古博昭，島田康司，輿那覇麻理，栄賢司. 遺伝
子系統解析によるエンテロウイルスの同定. 臨床とウイルス 1999; 27(4): 283-93.
5) Oberste MS, Maher K, Kilpatrick DR, Pallansch MA.
Molecular evolution of the human enteroviruses:
correlation of serotype with VP1 sequence andapplication to picornavirus classification. J Virol 1999;
73(3): 1941-8.
6) 中田恵子，山崎謙治，左近直美，駒野淳，加瀬哲
男. 大阪府におけるエンテロウイルスおよびヒト
パレコウイルス感染症の流行状況と分子疫学的解析（2014 年度）. 大阪府立公衆衛生研究所研究報
告（平成 27 年度）.2015; 7-14.
7) 中田恵子，左近直美，弓指孝博，加瀬哲男. 大阪
府におけるエンテロウイルス感染症の流行状況と
分子疫学的解析（2015 年度）. 大阪府立公衆衛生研究所研究報告（平成 28 年度）. 2016; 9-16.
8) 中田恵子，弓指孝博，久米田裕子. 大阪府におけるエンテロウイルスおよびヒトパレコウイルス感染症の流行状況と分子疫学的解析（2016 年度）. 大
阪健康安全基盤研究所研究年報（平成 29 年度).
2017; 1-8.
9) 中田恵子，弓指孝博. 大阪府におけるエンテロウ
イルス感染症の流行状況と分子疫学的解析（2017年度）. 大阪健康安全基盤研究所研究年報（平成 30
年度）. 2018; 1-8.
10) 中田恵子，本村和嗣. 大阪府におけるエンテロ
ウイルスおよびパレコウイルス A 感染症の流行
状況と分子疫学的解析 （2018 年度）大阪健康安全基盤研究所研究年報（令和元年度） 2019; 9-16.
11) 中田恵子，本村和嗣. 大阪府におけるエンテロ
ウイルス感染症の流行状況と分子疫学的解析（2019 年度）. 大阪健康安全基盤研究所研究年報（令和 2 年度）. 2020; 1-8.
12) 国 立 感 染 症 研 究 所 . 無 菌 性 髄 膜 炎 と は .
https://www.niid.go.jp/niid/ja/kansennohanashi/520viral-megingitis.html
13) 国立感染症研究所. IASR Vol.39p89-90:2018 年 6
月 号 . https://www.niid.go.jp/niid/ja/viral-megingitism/viral-megingitis-iasrtpc/8085-460t.html

WEB サイトの内容は 2021 年 8 月 4 日に確認した。

- 16 -

Annual Report of Osaka Institute of Public Health, 5, 2021

Epidemic Situation and molecular-epidemiological analysis of enterovirus infection in Osaka Prefecture (Fiscal
2020 Report)

Keiko NAKATA, Yasutaka YAMANAKA and Kazushi MOTOMURA

From April 2020 to March 2021, multiple type enteroviruses were detected and obtained from specimens of aseptic
meningitis, hand-foot-and-mouth disease, and herpangina patients. The types of viruses detected were Echovirus9 andEchovirus14 from each one patient with aseptic meningitis, and CV-A4 was detected from two patients with hand-footand-mouth disease and herpangina, respectively. The phylogenetic trees constructed by using partial sequences at the viralprotein 1 region showed that the CV-A4 isolates of the 2020 epidemic formed a single cluster. Also, the 2020 epidemicstrains of CV-A4 were most closely related to the 2018 China strain. In 2020 season, the domestic and international
movement was severely restricted to prevent the spread of coronavirus disease 2019 (COVID-19) infection outbreak.
Nevertheless, as a result of phylogenetic tree analysis of CV-A4, it was suspected that viruses were imported inflamed
overseas. It is necessary to continue the pathogen surveillance.

Key words：Aseptic meningitis, Hand-foot-and-mouth disease, Herpangina, Enterovirus

Osaka Institute of Public Health- 17 -

報 文

地方独立行政法人大阪健康安全基盤研究所研究年報 Ann. Rep. Osaka. Inst. Pub. Health, 5, 18-24 (2021)

大阪府の食中毒事例で検出されたノロウイルス流行状況と分子疫学的解析（2019・2020 年度）

白井達哉 a，左近直美 a，高田利香 b，本村和嗣 c2019 年度、当課で検査した食中毒事例 51 事例中 21 事例（41.2％）からノロウイルスを検出した。2020
年度は 32 事例中 3 事例（9.4％）であり、ノロウイルス陽性事例数は 2019 年度比 85.7％の減少であった。ノロウイルス陽性事例から数検体を選択し、ORF1 の RdRp コード領域と ORF2 の VP1 コード領域の部分遺伝
子解析を行い、遺伝子型を決定した。2019 年度には 8 種類が検出され、そのうち最も多く検出された遺伝子型は GII.4[P31]（7 事例、33.3%）、次いで GII.2[P16]（5 事例、23.8%）であった。2020 年度は GII.2[P16]（2事例、66.7%）及び GII.17（P-Type 不明、1 事例、33.3%）の 2 種類に留まり、2002 年度以降毎年検出されてきた GII.4 は検出されなかった。
2019 年度の GII.4[P31]及び GII.4[P16]について VP1 コード領域（1623 塩基）を解析した。アミノ酸配列
を過去の GII.4 variant と比較したところ、1995 年以降のパンデミックに影響したと推察されるアミノ酸 5 箇
所全てにおいて、2012 年に出現した GII.4 Sydney 2012 variant と一致していた。

キーワード：ノロウイルス、食中毒、遺伝子型、VP1

ノロウイルスは冬季を中心に嘔吐や下痢などを引き起こす感染性胃腸炎の起因ウイルスである 1)。
例年世界中の 5 歳以下の小児の約 7 万人が死亡し、社会経済的損失は 6 兆円に達すると推計される 2)。
食中毒の原因として最も多く患者を出す病原体で端に位置する RdRp コード領域のアミノ酸配列に基づき、VP1 同様に P-group に分けられ（RdRptyping）、60 以上の P-type に分類される。ORF1 とORF2 の間では遺伝子組換えが起こることが知られており、これが大きな流行につながると考えらあり 3)、流行状況の把握は食品衛生管理において重要である。
ノロウイルスはカリシウイルス科に分類され、エンベロープはなく、
約 7.5kb のプラス一本鎖 RNA
ゲノムを持つ。ゲノムは 3 つの ORF（Open-ReadingFrame）
で構成されており、
ORF1 は RNA-dependent-

れている 4,5)ため、 Genotype と P-type 両方の解析（Dual-typing）が推奨されている 6)。
パンデミックと呼ばれる世界的な流行を何度も起こしてきた遺伝子型である GII.4 だが 7)、2012 年の GII.4 Sydney 2012 variant（GII.4[P31]）によるもの以降は起きていない。2016 年には GII.4 Sydney

RNA-polymerase（RdRp）などの非構造タンパク、
ORF2 及び ORF3 はそれぞれ構造タンパク VP1 及び VP2 をコードする。ノロウイルスは VP1 のアミノ酸配列により大きく 10 種（GI-GX）の遺伝子群（Genogroup）に分類され（VP1 typing）、さらに 48以上の Genotype に分類される。人に感染する主な2012 variant が ORF1/2 間での組換えを起こした
GII.4[P16]が世界各地で検出されたが、パンデミッ
クと呼べるほどの拡大には至らなかった。
GII.4 の VP1 コード領域に関しては、モノクロー
ナル抗体を用いたエピトープマッピングで得られたエピトープ（Motif/Antigenic site A、C、D、E 及

Genogroup は GI と GII である。また、ORF1 の 3’
a 大阪健康安全基盤研究所微生物部ウイルス課
b 大阪府茨木保健所
c 大阪健康安全基盤研究所公衆衛生部

び G）の中から、HBGA blockade assay や分子疫学- 18 -

的解析を通じて、過去の GII.4 variant による世界での感染拡大に関わる 5 つのアミノ酸部位が推定されており、それが VP1 アミノ酸配列の 352、355、357、368 及び 378 番目（以下、
5 amino acid residues）とされている 8,9)。これらについて、GII.4 Sydney

pf/typingtool/norovirus/）により遺伝子型を決定した。
2012 年度から 2018 年度の食中毒のノロウイルス
陽性事例については、VP1 typing 領域のデータを用いた。
3. ノロウイルス GII.4 の VP1 コード領域のアミノ

2012 variant に 関 し て は GII.4[P31] （ Accession
number（ACN）：JX459908）と GII.4[P16]（ACN：LC175468）に差異は認められていない。
2019 年度及び 2020 年度の食中毒事例において検出されたノロウイルスについて、Dual-typing による遺伝子型別及び VP1 コード領域のアミノ酸配酸配列解析
2019 年度にノロウイルス GII.4 が検出された検体の一部について、COG2F/TX30SXN のプライマー
11)を用いて PCR を行い、前述と同様にダイレクトシークエンス法により VP1 コード領域の全塩基配列（今回解析した検体について 1623 塩基）を決定し

列解析の結果とその特徴について報告する。

た（図 1）。アミノ酸配列に変換したのちに、過去のGII.4 variant と比較した 8,9,12)。
比較対象となる variantには表 2 の代表株を用い、GII.4 Sydney 2012 variantについては GII.4[P31]と GII.4[P16]の両方の代表株を用いた。

調 査 方 法
1. 検査材料
2019 年度に当課で検査した食中毒事例（疑い、有症苦情、他府県依頼分を含む）51 事例のうちノロウイルス遺伝子が検出された 21 事例、及び 2020
年度の 32 事例のうちノロウイルス遺伝子が検出された 3 事例を対象とした。遺伝子の検出は、国立感染症研究所の病原体検出マニュアル 10)に準拠
したリアルタイム PCR により実施した。
また、2012 年度から 2018 年度にかけて発生した食中毒事例について当課で検査し、ノロウイル
スが検出された計 363 事例を比較対象とした。

図 1 ノロウイルスゲノム構造と解析領域

2. ノロウイルスの遺伝子解析
各ノロウイルス陽性事例から数検体を選択し、遺4. 本研究は、
地方独立行政法人大阪健康安全基盤研
究所倫理審査委員会の承認を得て（承認番号 071003-4）、「人を対象とする医学系研究に関する倫理指伝子解析を行った。Dual-typing による遺伝子解析のために、
ORF1 の RdRp コード領域及び ORF2 の VP1
コード領域に対し、
ノロウイルス GI は Mon432/G1SKR、ノロウイルス GII は Mon431/G2-SKR のプラ
イマーを用いて RdRp/VP1 typing 領域を増幅した 10)。
検体のコピー数が少なく Dual-typing が適用できな針」を遵守して実施したものである。

かった事例については、ノロウイルス GI は G1SKF/G1-SKR、
ノロウイルス GII は G2-SKF/G2-SKRのプライマーを用いた conventional PCR もしくは
semi-nested PCR により VP1 typing 領域を増幅した
10)
（図 1）
。目的とする PCR 増幅産物は電気泳動で確認した後、ゲルを切り出して遠心しその上清を精子型別月別の検出状況を表 1 に示す。2019 年度に確認された遺伝子型は Genotype 不明であったものを除いて 8 種類あり、GII.4[P31]が 7 事例（33.3%）、
GII.2[P16]が 5 事例（23.8%）、GII.17[P17]、GI.4[P4]及び GII（Genotype 及び P-Type 不明）がそれぞれ 2事例（9.5%）、GII.4[P16]、GII.6[P7]、GI.2（P-type 不製水で希釈して用いた。BigDye Terminator v1.1 Cycle
Sequencing Kit（Applied biosystems）を用いたダイレ
クトシークエンス法により塩基配列を決定し、Norovirus Typing Tool Version 2（http://www.rivm.nl./m

明）及び GI.7（P-type 不明）
がそれぞれ1 事例（4.8％）であった。GII.17[P17]と GI.2（P-type 不明）が検出された事例のうちの 1 つは混合事例（同一事例において複数の遺伝子型を検出）であり、1 検体のみの

結 果
1. ノロウイルスの検出状況
食中毒事例から検出されたノロウイルスの遺伝- 19 -

検査で 2 種類が検出された。
2019 年度は、2020 年 3 月に最も事例数が多く、
2019 年 12 月から 2020 年 3 月までに事例の 61.9％が発生した。月別にみると、2019 年 4 月から 11 月まではGII.4[P31]の検出は1 事例に留まったが、
2019

3. ノロウイルス GII.4 の VP1 コード領域のアミノ酸配列解析
2019 年度に検出された GII.4[P31]の 3 株及びGII.4[P16]の 1 株のアミノ酸配列（540 塩基）を解析した。また、そのエピトープのアミノ酸配列（31 残年 12 月以降 6 事例確認され、主に冬春季に検出された。GII.4[P31]は 2019 年 12 月から 2020 年 3 月の事例の 46.2%を占めた。これに対し、GII.2[P16]は2019 年 4 月、5 月、11 月及び 2020 年 3 月に検出されており、明確な季節性が見られなかった。
2020 年度に確認された遺伝子型は 2 種類に留ま基）を過去の GII.4 variant と比較し、表 2 に示した。
GII.4[P31]の 3 株の VP1 アミノ酸配列相同性は99.8～100%であり、比較した全てのエピトープのアミノ酸配列が一致した。GII.4[P31]と GII.4[P16]の相
同性は 97.4～97.6%であり、エピトープの比較ではエピトープ G で配列が一致したが、エピトープ Aり、GII.2[P16]が 2 事例（66.7%）、GII.17（P-type 不明）が 1 事例（33.3%）であった。前年度に陽性事例数が最も多かった GII.4[P31]は検出されなかった。
2020 年 4 月から 2020 年 11 月まで検出はなく、2020
年 12 月、2021 年 2 月と 3 月にそれぞれ 1 事例で検出された。

の 297、372 及び 373 番目、エピトープ C の 377 番
目、エピトープ D の 393 番目及びエピトープ E の414 番目で差異が見られた。
GII.4[P31]は過去のvariantと比較してGII.4 Sydney
2012 variant(GII.4[P31])との相同性が 98.1～98.3%と最も高く、エピトープ領域ではエピトープ A の 297、

2. ノロウイルス陽性事例数と検出された Genotypeの変化（2012 年度～2020 年度）
2012 年度以降 2020 年度までの、ノロウイルスが検出された事例数の変動及び Genotype の内訳を図2 に示した。対象期間のノロウイルス陽性事例数は372 及び 373 番目、エピトープ E の 414 番目で差異が見られた。また、GII.4[P16]は過去の variant の中で GII.4 Sydney 2012 variant の リ コ ン ビナ ン ト(GII.4[P16])との相同性が 99.6%と最も高く、エピトープ領域ではエピトープ C の 377 番目のみ差異が見られた。

387 事例で、最も多く検出された Genotype は GII.4
で 129 事例（33.3%、混合事例を除く。
）であった。
GII.4 に次いで GII.17 が 64 事例（16.5%）、GII.2 が50 事例（12.9%）の順に多かった。GII については、
前述の 3 つの他に 8 つの Genotype（GII.1、GII.3、GII.6、GII.7、GII.11、GII.12、GII.13 及び GII.14）が2019 年に検出された株の 5 amino acid residues は、
GII.4[P31]と GII.4[P16]のいずれも GII.4 Sydney 2012variant と完全に一致した（表 2）。

検出され、Genotype が確認されていない事例（GIIND: Not Defined）が 69 事例あった。一方、GI については 2013 年度の 7 事例が最多となり、2012 年以降に 9 つの Genotype（GI.2、GI.3、GI.4、GI.5、GI.6、
GI.7、GI.11 及び GI.14）が検出された。図 2 に各年度の GII.4、GII.17、GII.2、GII その他、GII ND、GI

2019 年度及び 2020 年度に食中毒事例から検出されたノロウイルスの遺伝子型を解析した。
2019 年度は GII.4[P31]が多かったが、2020 年度には GII.4 は検出されなかった。これは 2002 年度以降、当課の食中毒事例の遺伝子解析において初めてのことであった 13)。

及び混合事例の内訳を示した。
2014 年度は GII.17 が41.3%（26/63 事例）、2016 年度、 2018 年度及び 2020
年度は GII.2 がそれぞれ 44.2%（23/52 事例）、34.4%（10/29 事例）及び 66.7%（2/3 事例）となり最も多い Genotype であったが、その他の年度は GII.4 が最も多く検出され、2019 年度まで毎年検出された。ノノロウイルスは ORF1/2 間の遺伝子組み換えなどをきっかけとした、VP1 コード領域の変異が大きな流行の一要因と考えられている 5)。GII.4 については
VP1 エピトープ上のアミノ酸変異の研究が進められ、5 amino acid residues の変異が過去の GII.4 variantの世界的な感染拡大に関わったと推察されている 8)。

ロウイルス陽性事例数は減少傾向であり、2019 年度
は 2012 年度以降で 2020 年度に次いで 2 番目に少なく、最も少なかった 2020 年度は 3 事例で前年度（21事例）に対して 85.7%減少した（図 2）。

2019 年度に検出した GII.4[P31]及び GII.4[P16]を比較すると、エピトープ A、C、D 及び E のアミノ酸配列に差異が見られた。RdRp の違いがこのような違いを生み出している可能性があり、Dual-typing

考 察- 20 -

表 1 月別ノロウイルス遺伝子型検出状況（2019 年度及び 2020 年度）

図 2 ノロウイルス陽性事例数と検出された Genotype（2012 年度～2020 年度）の重要性を示唆している。一方で 5 amino acidresidues は一致しており、GII.4 Sydney 2012 variant と比較しても差異はなかった（表 2）。これらのことか

residues のうち 4 箇所が GII.4 Sydney 2012 variant と異なっていた 9)。現状 GII.4 Hong Kong variant による日本での感染拡大は確認されていないが、VP1 ア

ら今回検出した株は感染拡大につながる変異は起
こしていないと推察される。海外においては、新規の GII.4 Hong Kong variant が 2017 年以降にアジアやヨーロッパ圏で報告されており、これは 5 amino acid

ミノ酸配列解析を通じて新しい変異株の侵入を早期に捉える必要がある。GII.4 Sydney 2012 variant は2012 年度に世界に感染拡大し 14)、大阪府や全国でのノロウイルス陽性事例数も増加した 15,16)。しかし- 21 -

表 2 GII.4 の VP1 各エピトープのアミノ酸配列比較

注：白抜き数字(Amino acid position)は特に重要とされる 5 つのアミノ酸残基を表す。

2012 年度以降、GII.4 は引き続き検出されてはいる
ものの、検出数が減少傾向にある。この点には 5数の顕著な減少が報告されており、2020 年度（29 件）
は 2019 年度（183 件）に比べて 84.2%減少していた

amino acid residues に変異が見られていないことが関連している可能性がある。GII.4 は当課でも 2002
年 度 以 降 2019 年 度 ま で 毎 年 検 出 さ れ て き た
Genotype であり 13)、ノロウイルス陽性事例数の変化に与える影響も大きい。そのため GII.4 陽性事例数の減少がノロウイルス陽性事例全体の減少に影響

3)していると推察される（図 2）。エピトープの変異と流行の関連については GII.17 についても示唆されており 17)、GII.17 や GII.2 に関しても同様の解析を進めていきたい。
一方で、2007年に検出されたGII.4 Osaka 2007
variantや2017年のGII.4 Hong Kong variantのように5向上によりノロウイルス流行は 2020 年度に大きく抑えられたと推察された。しかし、新型コロナウイ
ルス流行が終息し社会活動が活発になった後、流行
規模の拡大や、これまで流行期とされていなかった
季節での流行が懸念される。加えて新たな変異株の出現には注意が必要であり、ORF1/2 間の遺伝子組

amino acid residuesに変異が複数見られたにも関わらず（表2）、世界的な感染拡大には至っていないGII.4
variantも存在する。例えば、ウイルスゲノムの変異により、細胞内でのウイルスRNA複製や粒子形成などにも変化が起きる可能性がある。エピトープの変異だけでなくウイルスの感染及び増殖機構、公衆衛

換えを探知するための Dual-typing や VP1 アミノ酸配列の情報を集積し、その変化や動向をいち早く捉えることが引き続き重要である。

。これは当課でのノロウイルス陽性事例数の減少と同程度であった。
GII.4 において流行に関わるとされる VP1 コード
領域の変異が起こっていないことに加え、新型コロ
ナウイルス対策に伴う飲食店の休業あるいは時短
営業、個々人の手洗いやマスクなど衛生対策意識の利 益 相 反生を含めた包括的な研究が必要である。
ノロウイルスが検出された事例数が 2020 年度に顕著に減少したのは、新型コロナウイルス対策として大阪府に緊急事態宣言が発令され（1 回目：2020
年 4 月 7 日~5 月 21 日、2 回目：2021 年 1 月 13 日
~2 月 28 日）、飲食店の休業あるいは時短営業が実開示すべき利益相反はない。

1) R Green KY. (eds. Knipe DM, Howley PM, Griffin
DE, Lamb RA, Martin MA, Roizman B and Straus

施されたこと、加えて緊急事態宣言がノロウイルス
流行期に相当していたことが大きく影響したと考えられた。厚生労働省から発表されている全国の食中毒発生状況においてもノロウイルス食中毒事例

SE). Caliciviridae: The Noroviruses. Fields Virology,
5th ed. Lippincott Williams & Wilkins; 2007. 949979.
2) Bartsch SM, Lopman BA, Ozawa S, Hall AJ, Lee BY.

文 献- 22 -

Global Economic Burden of Norovirus
Gastroenteritis. PLoS One 2016; 11(4): e0151219.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0151219
3) 厚生労働省 4.食中毒統計資料.
http://www.mhlw.go.jp/stf/seisakunitsuite/bunya/ken

genomewide tracing of evolutionary history. J Virol
2008; 82(22): 11247-11262.
12) Mallory ML, Lindesmith LC, Graham RL, Baric RS.
GII.4 Human Norovirus: Surveying the Antigenic
Landscape. Viruses 2019; 11(2).

kou_iryou/shokuhin/syokuchu/04.html
4) Bull RA, Hansman GS, Clancy LE, Tanaka MM,
Rawlinson WD, White PA. Norovirus recombinationin ORF1/ORF2 overlap. Emerg Infect Dis 2005;
11(7): 1079-1085.
5) Eden JS, Tanaka MM, Boni MF, Rawlinson WD,

https://doi.org/10.3390/v11020177
13) Sakon N, Yamazaki K, Nakata K, Kanbayashi D,
Yoda T, Mantani M, Kase T, Takahashi K, Komano J.
Impact of genotype-specific herd immunity on thecirculatory dynamism of norovirus: a 10-year
longitudinal study of viral acute gastroenteritis. J

White PA. Recombination within the pandemic
norovirus GII.4 lineage. J Virol 2013; 87(11): 62706282.
6) Chhabra P, de Graaf M, Parra GI, Chan MC, Green K,
Martella V, Wang Q, White PA, Katayama K,
Vennema H, Koopmans MPG, Vinje J. Updated

Infect Dis 2015; 211(6): 879-888
14) 国立感染症研究所. ノロウイルス遺伝子型GII.4
変異型の急速な拡大. IASR Vol.34 p45,48: 2013年
2月号 https://www.niid.go.jp/niid/ja/norovirusm/norovirus-iasrf/3180-fr3964.html
15) 髙田利香，左近直美，中田恵子，本村和嗣，classification of norovirus genogroups andgenotypes. J Gen Virol 2019; 100(10): 1393-1406.
7) Parra GI. Emergence of norovirus strains: A tale oftwo genes. Virus Evol 2019, 5(2):vez048
https://doi.org/10.1093/ve/vez048
8) Tohma K, Lepore CJ, Gao Y, Ford-Siltz LA, Parra GI.

弓指孝博．大阪府における食中毒事例から検出されたノロウイルスの流行状況と分子疫学的解析（2016 年度）. 大阪健康安全基盤研究所研究
年報 平成 29 年度 2017; 1: 10-19.
16) 髙田利香，左近直美，中田恵子，本村和嗣，
弓指孝博．大阪府における食中毒事例から検出

Population Genomics of GII.4 Noroviruses Reveal
Complex Diversification and New Antigenic Sites
Involved in the Emergence of Pandemic Strains.
mBio 2019; 10(5).
https://doi.org/10.1128/mBio.02202-19
9) Chan MC, Roy S, Bonifacio J, Zhang LY, Chhabra P,

されたノロウイルスの流行状況と分子疫学的解析（2017 年度）. 大阪健康安全基盤研究所研究
年報 平成 30 年度 2018; 1: 10-16.
17) Yi Y, Wang X, Wang S, Xiong P, Liu Q, Zhang C,
Yin F, Huang Z. Identification of a blockade epitopeof human norovirus GII.17. Emerg Microbes InfectChan JCM, Celma C, Igoy MA, Lau SL,
Mohammad KN, Vinje J, Vennema H, Breuer J,
Koopmans M, de Graaf M, for Noropatrol. Detectionof Norovirus Variant GII.4 Hong Kong in Asia andEurope, 2017-2019. Emerg Infect Dis 2021; 27(1):289-293.

2021; 10(1): 954-963.
WEB サイトの内容は 2021 年 5 月 25 日に確認した。

10) 国立感染症研究所. 病原体検出マニュアル ノロウイルス（第 1 版）令和元年 6 月
https://www.niid.go.jp/niid/images/labmanual/Norovirus20190611.pdf11) Motomura K, Oka T, Yokoyama M, Nakamura H,
Mori H, Ode H, Hansman GS, Katayama K, Kanda
T, Tanaka T, Takeda N, Sato H, Norovirus
Surveillance Group of Japan. Identification ofmonomorphic and divergent haplotypes in the 20062007 norovirus GII/4 epidemic population by- 23 -

Annual Report of Osaka Institute of Public Health, 5, 2021

Epidemic and molecular epidemiological analysis of norovirus outbreaks in case of food poisoning in Osaka
Prefecture (Fiscal 2019・2020 report)

Tatsuya SHIRAIa, Naomi SAKONa, Rika TAKADAb and Kazushi MOTOMURAa

Norovirus is a leading cause of acute gastroenteritis in the world. In 21 out of 51 suspected foodborne outbreaks,
noroviruses were detected in our tests during the 2019 season（April 2019 to March 2020）. We detected noroviruses in
3 out of 32 cases during the 2020 season, and norovirus-detected cases decreased by 85.7% compared to the previous
season. We conducted comprehensive genome analysis to perform a molecular epidemiological study. A dual-typing(Genotype and P-type) system is proposed for GI and GII noroviruses using partial regions of the ORF1 RdRp encoding
region and ORF2 VP1 encoding region. In the 2019 season, GII.4[P31] (7/21, 33.3%) and GII.2[P16] (5/21, 23.8%) were
found to be prevalent. On the one hand, only two genotypes, GII.2[P16] and GII.17 were detected and GII.4 viruses were
not detected in the 2020 season. Four strains of GII.4 detected in the 2019 season (3 of GII.4[P31] and one of GII.4[P16])
were analyzed sequences of the full-length VP1 region(540aa). A recent large-scale sequence analysis and antibody
blockage confirmation study proposed a set of 5 amino acid residues on VP1 that are influential in the emergence andreplacement of pandemic GII.4. Norovirus GII.4 Sydney 2012 variant, has been circulated from 2012 in the world. We
observed that all 5 residues on GII.4[P31]and GII.4[P16] strains analyzed in this study have no substitution comparedwith GII.4 Sydney 2012 variant.

Key words：norovirus, food poisoning, genotype, VP1

a Osaka Institute of Public Healthb Ibaraki Public Health Center, Osaka- 24 -

報 文

地方独立行政法人大阪健康安全基盤研究所研究年報 Ann. Rep. Osaka. Inst. Pub. Health, 5, 25-31 (2021)

大阪市におけるカルバペネム耐性腸内細菌科細菌（CRE）感染症
サーベイランス（2015 年～2020 年）

梅田 薫 a，秋吉充子 a，柴川紗恵子 a，平井佑治 a，中村寛海 a，説田 景 b，吉田英樹 b

カルバペネム耐性腸内細菌科細菌（CRE）は多様な感染症を引き起こし、5 類感染症に指定されている。
中でもカルバペネマーゼ産生菌は治療が困難な上に院内感染の原因となりうる。2015 年～2020 年に大阪市保健所に届出された CRE 感染症の内、54 医療機関由来の分離菌株 262 株について、疫学情報集約や耐性遺伝子検出等によるサーベイランスを行った。CRE 患者は高齢者に多く、菌株数は 2018 年より増加傾向にあった。262 株中カルバペネマーゼ産生菌は 76 株（29％）であった。Klebsiella pneumoniae および Escherichia
coli ではカルバペネマーゼ産生菌の割合が 60％以上であったのに対して、Enterobacter cloacae、Klebsiellaaerogenes、Serratia marcescens では 10％未満であった。カルバペネマーゼ遺伝子は近畿地方で多く検出される IMP-6 が多数を占め、大阪市内での長期的な流行と多菌種への拡散が示唆された。他に IMP-1 の持続した検出、KHM-1 や IMP-1 と GES-5 の同時保有株といった稀なカルバペネマーゼ遺伝子の検出が認められた。また、メロペネムに耐性を示すことがカルバペネマーゼ産生菌の鑑別に有効なことが分かった。

キーワード：薬剤耐性菌、カルバペネム耐性腸内細菌科細菌（CRE）、カルバペネマーゼ産生菌、IMP 型

薬剤耐性菌が世界中に拡大し、問題となっている。
このまま対策が行われなければ、2050 年には耐性菌によって亡くなる人の数が世界で年間 1000 万人に達するとの試算がある 1)。国際的には 2015 年にWHO 総会で薬剤耐性（AMR）に関するグローバル

多く、プラスミド上に存在するカルバペネマーゼ遺伝子は水平伝達により別の菌種にまで拡散されることから、臨床上の問題となっている 2)。
カルバペネマーゼ遺伝子にはいくつかの種類があり、国内で多く検出される IMP 型、海外で広がアクションプランが採択され、国内でも 2016 年にAMR 対策アクションプランが策定された 1)。重要項目の 1 つとして耐性菌サーベイランスの強化が挙げられている。
カルバペネム耐性腸内細菌科細菌（CRE）は、グ
ラム陰性菌による感染症の治療において最も重要っている NDM 型、KPC 型、OXA-48 型などが知られている 2)。その分布には地域特異性が見られることから、地域での流行状況を把握して医療機関等に情報を還元することが求められている。2017 年 3月には、CRE 感染症の届出があった際には、地方衛生研究所等において分離菌株のカルバペネマーゼ

な抗菌薬であるカルバペネム系抗菌薬および広域
β-ラクタム剤に対して耐性を示し、しばしば、院内感染の原因となる 2)。2014 年 9 月には、CRE 感染症が感染症法に基づく感染症発生動向調査の 5 類
全数把握疾患に追加された 3)。CRE の中でも、カルバペネム分解酵素であるカルバペネマーゼを産生

産生性の確認や耐性遺伝子検出等の試験検査を実施する旨が厚生労働省より通知された 4)。
大阪市では本通知に先駆けて、2015 年より市内医療機関で発生した CRE 感染症の分離菌株を収集し、疫学情報の集約および各種試験検査によるサーベ
イランスを実施してきた。本稿では、2015 年～2020する菌は、複数の系統の薬剤に汎耐性を示すことが年の 6 年間にわたるサーベイランスにより得られ

a 大阪健康安全基盤研究所 微生物部 微生物課
b 大阪市保健所- 25 -

た結果として、CRE 感染症届出状況、CRE 菌株数およびカルバペネマーゼ産生菌株数の年次推移、菌種内訳、カルバペネマーゼ遺伝子検出状況等について報告する。

5. 倫理に関する声明
本研究は、地方独立行政法人大阪健康安全基盤研
究所倫理審査委員会の承認を得て（承認番号 160203-2）、「人を対象とする医学系研究に関する倫理指針」を遵守して実施したものである。

材 料 と 方 法
結 果
1． 供試菌株
2015 年 4 月から 2020 年 12 月までに、感染症法に基づき大阪市保健所に届出がなされた CRE 感染
症例のうち、54 か所の医療機関より提供された
CRE 菌株 262 株を供試した。発生届に記載された情報を基に、主な症状（診断名）、分離検体、年代、
性別および、耐性の判定に用いた薬剤について集計した。
2. 菌種同定およびカルバペネマーゼ産生スクリ

1.

CRE 感染症の届出情報
CRE 菌株 262 株について、届出情報を図１に集計した。主な症状（診断名）は、尿路感染症が最も多く、次いで敗血症/菌血症、肺炎、胆嚢炎/胆管炎、腹膜炎等であった。その他には、手術後の創部感染症、膿瘍、潰瘍、骨髄炎、副鼻腔炎等が含まれた（図１A）。分離検体は、尿が最も多く、次いで血液、喀
痰、胆汁、膿等であった。その他には、ドレーン廃液、創部浸出液、胃粘膜、膿瘍等が含まれた。通常ーニング試験
菌種同定には、菌種同定キット API 20E (ビオメリュー)を用いた。スクリーニング試験は、各種カ
ルバペネマーゼに特異的な阻害剤を用いて実施した。メタロ-β-ラクタマーゼ（IMP 型、KHM 型、NDM型等）は、メルカプト酢酸ナトリウム（SMA）ディ

無菌とされる検体（血液、胆汁、腹水、胸水）が、全体の 40％近くを占めた（図１B）。患者の性別は、
男性が 148 例（57％）
、女性が 114 例（43％）であった。患者の年代は 20 代～90 代と幅広かったが、60 代以上が全体の 90％近くを占めた（図１C）。

スク（栄研化学）、セリン-β-ラクタマーゼ（KPC 型等）は、3-アミノフェニルボロン酸をそれぞれ用いて、病原体検出マニュアルに記載された方法 5)に従って行った。

2.

3. カルバペネマーゼ産生性の確認試験
CarbaNP テストあるいは、modified Carbapenem
Inactivation Method (mCIM)により実施した 5)。
4. カルバペネマーゼ遺伝子の検出および型別
6 種類のカルバペネマーゼ遺伝子（IMP 型、NDM
型、KPC 型、OXA-48 型、VIM 型、GES 型）を検

CRE 菌株およびカルバペネマーゼ産生菌の検出状況および年次推移
CRE 菌株 262 株の内、カルバペネマーゼ産生菌
は 76 株（29％）であった。CRE 菌株数およびカル
バペネマーゼ産生菌株数の年次推移を図２に示す。
CRE 菌株数は 2015 年～2017 年には年間 30 株程度であったのが、2018 年に年間 55 株まで増加した後、2020 年まで年間 50 株以上で推移した。カルバペネ
マーゼ産生菌株数は毎年 10 株～19 株の間で推移したが、CRE 菌株数に占める割合は年度により異なっており、2015 年が 44％、2016 年が 40％、2017 年
が 34％、2018 年が 18%、2019 年が 16％、2020 年

出するためのマルチプレックス PCR 法 6)を実施した。IMP-1 と IMP-6 の識別には、Kayama らの PCR法を用いた 7)。KHM 型の検出および型別は、単独
PCR 法を行った後、得られた産物のシーケンス解
析により実施した 5)。GES 型および、IMP-1、IMP6 以外の IMP 型の型別には、単独 PCR 法を行ったが 37%であった。

後、得られた産物のシーケンス解析を行った 5)。カルバペネマーゼ産生性試験陽性かつ、カルバペネマーゼ遺伝子が検出された場合をカルバペネマーゼ
産生菌と判定した。

いで、Klebsiella pneumoniae、Klebsiella aerogenes、
Escherichia coli 、Serratia marcescens、以上の 5 菌種
で全体の 92％を占めた。以下、Citrobacter koseri、
Citrobacter freundii、Citrobacter braakii、Enterobacter

3.

菌種の内訳
CRE 菌株およびカルバペネマーゼ産生菌株の菌種内訳を図３に示す。CRE 菌株は、Enterobactercloacae が最も多く、全体の 30％近くを占めた。次- 26 -

asburiae、Klebsiella oxytoca、Providensia rettgeri、Proteus milabilis、Morganella morganii の計 13 菌種であった。カルバペネマーゼ産生菌の割合は菌種によって著しく異なり、E. cloacae が 9％、K. pneumoniae
が 69％、K. aerogenes が 2％、E. coli が 63％、Serratia

が 1 株であった（表１）。検出された医療機関数はIMP-6 が 34 か所、IMP-1 が 7 か所、KHM-1 が 1 か所であった。年度別の検出数から、IMP-6 は毎年 9
株～13 株、IMP-1 は毎年 1 株～4 株が検出された。
その他の遺伝子は散発的な検出であった。IMP-6 陽

marcescens が 4％、C. freundii が 75％、E. asburiae
が 50％、K. oxytoca が 50％、P. rettgeri が 50％であった。

性株は 6 菌種の内、K. pneumoniae と E. coli が大半を占めた。IMP-1 陽性株は 6 菌種の内、E. cloacaeと K. pneumoniae が各 3 株、その他の菌種は各 1 株であった。KHM-1 陽性株は C. freundii が 2 株、E.
cloacae が 1 株であった。IMP-11 陽性株、E. IMP-1
および GES-5 を同時保有する株は E. cloacae であ4.

カルバペネマーゼ遺伝子検出状況
カルバペネマーゼ産生菌 76 株のうち、カルバペ

ネマーゼ遺伝子検出数は IMP-6 が 61 株と最も多く、次いで IMP-1 が 10 株、KHM-1 が 3 株、IMP11 が 1 株、IMP-1 および GES-5 を同時保有する株った。

図 1 CRE 菌株 262 株における A 患者の主な症状 B 分離検体内訳 C 患者年代

図 2 CRE 菌株数の年次推移（内、カルバペネマーゼ産生菌株数）- 27 -

図３．CRE 菌株の菌種内訳（内、カルバペネマーゼ産生菌株）
表 1 カルバペネマーゼ遺伝子検出数と菌種内訳
カルバペネ
マーゼ
遺伝子

検出数/年
2015 2016 2017 2018 2019 2020

合計

IMP-6

13

9

9

9

8

13

61

IMP-1

2

1

1

1

1

4

10

KHM-1
IMP-11
IMP-1＋GES-5*

2

1

3
1
1

1
1

菌種(菌株数）K. pneumoniae (32), E. coli (24), E. cloacae (1),
K. aerogenes (1), S. marcescens (1), C. koseri (1),K. oxytoca (1)E. cloacae (3), K. pneumoniae (3), C. koseri (1),
C. freundii (1), E. asbriae (1), P. rettgeri (1)C. freundii (2), E. cloacae (1)E. cloacae
E. cloacae* IMP-1遺伝子およびGES-5遺伝子を同時保有

表 2 カルバペネマーゼ遺伝子検出数と菌種内訳
薬剤*

CRE菌株数

メロペネム
イミペネム＋セフメタゾール
不明

116
143
3

カルバペネマーゼ
産生菌株数（％）

75 (64.7)
1 (0.7)0 (0.0)*耐性の判定に必要な検査所見 3)
メロペネムの基準：メロペネムの MIC 値 2μg/ml 以上またはメロペネム感受性ディスク阻止円直径 22mm 以下
イミペネムかつセフメタゾールの基準：イミペネムの MIC 値 2μg/ml 以上またはイミペネム感受性ディスク阻止円直径
22mm 以下かつ、セフメタゾールの MIC 値 64μg/ml 以上またはセフメタゾール感受性ディスク阻止円直径 12mm 以下

5.

耐性の判定に用いた薬剤とカルバペネマーゼ
産生
CRE 感染症届出時に、医療機関において分離菌株の耐性を確認した薬剤は、メロペネムが 116 株、

イミペネムとセフメタゾールが 143 株、不明が 3 株であった。両方の基準で確認した場合は、メロペネ
ムとして集計した。その内、カルバペネマーゼ産生菌株数とその割合は、メロペネムの基準で判定され- 28 -

た株では 75 株（65％）の一方、イミペネムとセフ
メタゾールの基準で判定された株では 1 株のみ（0.7％）と著しく異なった（表２）
。
考 察

（表１）
。菌種は、K. pueumoniae が最も多く、次いで E. coli となっており、この傾向も近畿地方で共通している 12)。しかし、それ以外の５菌種からもIMP-6 遺伝子が検出され、耐性プラスミドを介した
IMP-6 遺伝子の菌種を超えた拡散が推察される。過CRE は主に感染防御機能の低下した患者や外科手術後の患者、抗菌薬を長期にわたって使用している患者などに感染症を引き起こす 2)。大阪市における CRE 感染症の患者は 60 代以上の高齢者が多く、主に尿路感染症、敗血症/菌血症、肺炎の原因菌とし去には大阪市内の医療機関で IMP-6 産生菌の長期間にわたる院内伝播が発生し 9)、また、IMP-6 産生菌が市中で拡散している可能性も否定できない 13)
ことから、今後も監視が必要である。
IMP-1 陽性株は少数だが毎年検出された。多菌種から IMP-1 遺伝子が検出されたため、IMP-6 遺伝子て検出されていた（図１）。カルバペネム耐性は、
各種カルバペネマーゼの産生以外に、AmpC 型 β-ラクタマーゼや基質特異性拡張型 β-ラクタマーゼ（ESBL）などのカルバペネム分解性の弱い β-ラクタマーゼの産生と細胞膜の透過性低下の組み合わせにより獲得されることが多い 9)。カルバペネマーと同様、耐性プラスミドを介した IMP-1 遺伝子の拡散が示唆される。KHM-1 陽性株および、IMP-1 とGES-5 の同時保有株は、国内のみならず国際的にも稀なタイプであったことから、耐性プラスミドの次世代シーケンス解析を実施した 14, 15)。KHM-1 陽性
株では、耐性プラスミドに多数の耐性遺伝子の集積

ゼ産生菌とその他の菌とは院内感染対策上も治療上も区別が必要と考えられている 2)。大阪市内のCRE 患者届出数は 2018 年以降増加した一方で、カルバペネマーゼ遺伝子検出株の割合は減少した（図２）。同様の傾向は国内全域のサーベイランスにおいても報告されている 2)。しかしカルバペネマーゼが見られ、IMP-1 と GES-5 の同時保有株では、IS26を介した IMP-1 遺伝子の挿入および、耐性プラス
ミドを複数個持つことによるコリスチン耐性遺伝
子の獲得が認められた。両株ともに医療機関において高度耐性化が進んでいることが推定される特徴を示しており、今後の流行状況を注視する必要があ

産生菌は毎年 10 株以上が検出され、2020 年には増加していることから、持続した流行下にあると言える。
カルバペネマーゼ産生菌の割合は菌種により大きく異なっていた（図３）。K. pueumoniae および E.
coli においては、カルバペネマーゼ産生菌の割合がる。
CRE 感染症届出時には、医療機関において分離
株のカルバペネム耐性を判定することが求められている 3)。カルバペネマーゼ産生菌の検出にはメロ
ペネムが感度・特異度ともに優れているが、臨床現場では最初に市販されたイミペネムの薬剤感受性

60 ％以上であったのに対して、 E. cloacae、 K.
aerogenes、S. marcescens 等においては 10%未満であった。これらの菌種は染色体性の AmpC 型 β-ラクタマーゼを保有することが多く、その作用でカルバ
ペネム耐性を示したものと推察された 10, 11)。国内全域のサーベイランスより、カルバペネマーゼ産生菌の方が広く測定されていたことから、イミペネム・
セフメタゾールの 2 剤が届出基準に加えられている 9, 10)。両基準でカルバペネマーゼ産生菌の割合が著しく異なった（表２）ことからも、医療機関でCRE が検出された際にカルバペネマーゼ産生菌かどうかを推察するには、メロペネムに耐性を示すこの菌種は、関東地方では E. cloacae が多く、近畿地方では K. pneumoniae、E. coli が多い 12)とされており、大阪市内においても近畿地方に特有の傾向が認められた。
国内で多くみられる IMP 型カルバペネマーゼには、アミノ酸配列の違いにより多くの型が存在する。

とが鑑別に有用であることが分かった。
2015 年～2020 年の 6 年間にわたる CRE 感染症
分離菌株のサーベイランス調査の結果、大阪市内のCRE 感染症届出数の増加傾向とカルバペネマーゼ
産生菌の持続した流行が明らかになった。また、
IMP-6 陽性株が多数を占める中、IMP-1 陽性株や稀中でも IMP-6 は、近畿地方から中国地方で多く分離され、IMP-1 はそれ以外の地域を中心に全国から幅広く分離されている 10, 12)。大阪市内においてもIMP-6 がカルバペネマーゼ遺伝子の大半を占めたなカルバペネマーゼ遺伝子陽性株も検出された。各医療機関における耐性菌対策が功を奏し、この期間に大阪市内で大規模な院内感染は発生せず、国内での検出数が年々増加して定着が危惧されている海- 29 -

外型カルバペネマーゼ遺伝子（主に NDM 型や KPC型）2)の検出も認められなかった。今後も、必要に応じて CRE 保菌者分離菌株の解析や耐性プラスミドの解析等を加味しながら、CRE 感染症の分離菌株サーベイランスにおいてその動向を注視すると

7) Kayama S, Shigemoto N, Kuwahara R, Onodera M,
Yokozaki M, Ohge H, et al. Rapid detection of blaIMP6 by amplification refractory mutation system. J

ともに、得られた情報を還元し、院内感染はもとより、市中における蔓延を防止していきたい。

aerogenes Hormaeche and Edwards 1960 (Approved
Lists 1980) and Klebsiella mobilis Bascomb et al.
1971 (Approved Lists 1980) share the same
nomenclatural type (ATCC 13048) on the approved
lists and are homotypic synonyms, with consequences
for the name Klebsiella mobilis Bascomb et al. 1971

Microbiol Methods 2012; 88: 182-184.
8) Tindall B, Sutton G, Garrity G. Enterobacter

謝 辞
本研究において、菌株収集、情報提供、諸連絡、技術指導、検査補助等に携わって頂きました、大阪
市保健所、大阪市各保健福祉センター、医療機関、
国立感染症研究所薬剤研究センター、大阪健康安全基盤研究所微生物部の皆様に深謝いたします。
利 益 相 反開示すべき利益相反はない。
文 献1) 大曲貴夫. 薬剤耐性（AMR）対策アクションプ
ラン 2016-2020 の背景. 臨床と微生物 2017; 44:
291-295.
2) 国立感染症研究所. ＜特集＞カルバペネム腸内細菌科細菌（CRE）感染症. 病原微生物検出情報
2019; 40: 17-30.
3) 厚生労働省. 感染症法に基づく医師の届出のお願い ３ カルバペネム耐性腸内細菌科細菌感染症. https://wwwmhlwgojp/bunya/kenkou/kekkakukansenshou11/01-05-140912-1html.
4) 厚生労働省. 平成 29 年 3 月 28 日付け健感発0328
第 4 号厚生労働省健康局結核感染症課長通知「カ
ルバペネム耐性腸内細菌科細菌（CRE）感染症等に係る試験検査の実施について」. 2017.
5) 国立感染症研究所. 病原体検出マニュアル 薬剤 耐 性 菌 令 和 2 年 6 月 改 訂 版 Ver2.0.
https://wwwniidgojp/niid/images/labmanual/ResistantBacteria20200604pdf. 2020.
6) Watahiki M, Kawahara R, Suzuki M, Aoki M, Uchida(Approved Lists 1980). Int J Syst Evol Microbiol
2017; 67: 502-504.
9) 国立感染症研究所. ＜特集＞カルバペネム耐性
腸内細菌科細菌感染症. 病原微生物検出情報
2014; 35: 281-291.
10) 鈴木里和. カルバペネム耐性腸内細菌科細菌の疫学. 化学療法の領域 2016; 32: 2023-2029.
11) 中村明子, 海住博之. 薬剤耐性菌検出のために
臨床検査室が実施すべき検査法. The ChemicalTimes 2016; 239: 10-14.
12) 国立感染症研究所. カルバペネム耐性腸内細菌科細菌（carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,
CRE）病原体サーベイランス, 2018 年. 病原微生物検出情報 2019; 40: 157-158.
13) Yamamoto N, Asada R, Kawahara R, Hagiya H,
Akeda Y, Shanmugakani R, et al. Prevalence of, andrisk factors for, carriage of carbapenem-resistantEnterobacteriaceae among hospitalized patients inJapan. J Hosp Infect 2017; 97: 212-217.
14) Umeda K, Nakamura H, Fukuda A, Yamaguchi T,
Matsumoto Y, Motooka D, et al. Molecularcharacterization of blaKHM-1 encoding plasmid in anEnterobacter hormaechei subsp. hoffmannii isolate
from blood culture. PLoS One 2020; 15: e0227605.
15) Umeda K, Nakamura H, Fukuda A, Matsumoto Y,
Motooka D, Nakamura S, et al. Genomic
characterizationofclinicalEnterobacter
roggenkampii co-harbouring blaIMP-1- and blaGES-5encoding IncP6 and mcr-9-encoding IncHI2 plasmids

K, Matsumoto Y, et al. Single-tube multiplex
polymerase chain reaction for the detection of genes
encoding Enterobacteriaceae carbapenemase. Jpn J
Infect Dis 2020; 73: 166-172.
- 30 -

isolated in Japan. J Glob Antimicrob Resist 2021; 24:
220-227.
WEBサイトの内容は2021年5月14日に確認した。

Annual Report of Osaka Institute of Public Health, 5, 2021

Surveillance of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae (CRE) infections in Osaka city, 2015-2020

Kaoru UMEDAa, Atsuko AKIYOSHIa, Saeko SIBAKAWAa, Yuji HIRAIa, Hiromi NAKAMURAa,
Aogu SETSUDAb, and Hideki YOSHIDAb

Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae (CRE) cause a wide variety of infections and have been designated as acategory V infectious disease. Among them, carbapenemase-producing bacteria are difficult to treat and can cause
nosocomial infections. In this study, 262 isolates of CRE infections from 54 hospitals reported to Osaka city from 2015
to 2020 were collected, and surveillance were conducted by epidemiological information and resistance genes detection.
CRE infectious patients were predominantly elderly, and CRE isolates have increased since 2018. Of the 262 isolates,
76 isolates (29%) produced carbapenemase. The proportion of carbapenemase-producing bacteria was more than 60%
in Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli, whereas it was less than 10% in Enterobacter cloacae, Klebsiellaaerogenes, and Serratia marcescens. The most common carbapenemase gene was IMP-6, which is frequently detectedin the Kinki region, suggesting a long-term epidemic in Osaka city and the spread of carbapenemase genes to multiple
species. IMP-1 genes were detected persistently, and rare carbapenemase genes of KHM-1 or co-harboring IMP-1 and
GES-5 were observed. Meropenem resistance was found to be useful in differentiating carbapenemase-producing
bacteria in medical facilities.

Key words：Antimicrobial-resistant bacteria, Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae (CRE),
Carbapanemase-producing Enterobacteriaceae, IMP typea Osaka Institute of Public Healthb Osaka City Public Health Office- 31 -

報

文

地方独立行政法人大阪健康安全基盤研究所研究年報 Ann. Rep. Osaka. Inst. Pub. Health, 5, 32-40 (2021)

野菜・果実飲料における糖類および糖アルコール分析

紀 雅美 a，工藤鮎子 b，寺谷清香 b，山﨑朋美 a，柿本 葉 a，新矢将尚 a

野菜・果実飲料の糖分析を目的とし、単糖類・二糖類および糖アルコールの計 10 種について液体クロマ
トグラフ-示差屈折率検出器を用いた測定条件を検討した。分析に用いたのはポリマー系親水性相互作用ク
ロマトグラフィー用カラムで、感度、ピーク分離および分析時間を考慮し、移動相には 75%アセトニトリル
を用いて分析することとした。陰性であることを確認した野菜飲料に糖を添加し 1 日に 5 併行で 3 日間の妥当性の評価を行い、真度および精度が良好であることを確認した。確立した分析法を用い市販の野菜・果実
飲料を分析した結果、糖類を含まない旨の表示がある野菜飲料 2 種類からは分析対象とした糖は検出されなかった。糖質を含む表示があった飲料から検出された単糖類はフルクトース、グルコース、二糖類はスクロースで、果実を含む飲料からは微量のソルビトールも検出された。フルクトース、グルコース、スクロースの合計値で求めた糖類含有量は表示値に対して−14～−4%となり、食品表示基準で示されている許容差の範囲である±20%に収まった。

キーワード：糖類、糖アルコール、栄養成分、食品表示法、示差屈折率検出器

昨今、血糖値のコントロールやダイエットを目的たもの」、糖質は「炭水化物から食物繊維を引いたとした炭水化物や糖質の摂取量を制限する食事法
である糖質制限やロカボなどの言葉をよく耳にする。また、スーパーやコンビニエンスストアなどでは、シュガーレス、無糖、低糖、糖質オフ、糖類オ
フ、糖質ゼロ、糖類ゼロ、砂糖不使用など糖を意識した食品が多く販売され、糖摂取に対する世間の関もの」、糖類は「単糖類、二糖類であって糖アルコー
ルではないもの」と定義されている 2)。このうち最も効率的なエネルギー源となるのが糖類であり、血糖値を急激に上昇させるために注意が必要なのも糖類である。また、炭水化物、糖質、糖類の 3 つの分類の中で栄養成分表示欄とは別に、含まない旨、心の高さがうかがえる。糖を示す言葉も、糖含有量の程度を意味する言葉も様々であるが、現在、栄養成分の量及び熱量等に関する表示は食品表示法 1)と同法に基づく食品表示基準 2)において定められている。食品表示法は、消費者の自主的かつ合理的な食品選択の機会の確保を目的とし、食品衛生法、日本

低い旨、低減の強調表示について表示基準が定められているのも糖類である 2)。そこで、既に行政検査として実施している遺伝子組換え食品やアレルギ
ー物質の検査と同様、今後、栄養成分表示についても検査を行うことを想定し、なかでも関心が高く表示が多い糖類の検査法を確立することを目的とし農林規格等に関する法律および健康増進法の食品の表示に関する規定を一元化して 2015 年に施行された法であり 1)、安全性審査済みの遺伝子組換え食品やアレルゲンを含む食品の表示に関する事項と並んで栄養成分表示についても規定されている 1, 2)。
食品表示基準において、炭水化物は「当該食品の質た。
国や地方公共団体が行う栄養成分の検査は、食品
表示基準の「別添 栄養成分等の分析方法等」（以3)
下、別添の分析法） に従う必要がある。食品中の糖類の分析法を確立するにあたり、別添の分析法を参考にして、前処理が容易かつ市販されている種類

量から、たんぱく質、脂質、灰分及び水分量を除いが多く、糖類の表示がある試料として野菜・果実飲a 大阪健康安全基盤研究所衛生化学部食品化学 1 課
b 大阪健康安全基盤研究所衛生化学部食品化学 2 課- 32 -

料を選択した。一方、別添の分析法において測定対象となる単糖類と二糖類は具体的に規定されていないため、文部科学省の日本食品標準成分表 2020年版（八訂）（以下、食品成分表）4) および食品成分
表炭水化物成分表編 5) において記載のある糖類を調 査 方 法1. 試料2020 年 10 月から 2021 年 3 月にかけて、大阪府下で入手した野菜・果実飲料 6 種類 8 試料を検査対対象にした。利用可能炭水化物として収載されている単糖類のグルコース、フルクトース、ガラクトー
ス、二糖類のスクロース、マルトース、ラクトース、
トレハロースと備考欄に記載されている二糖類のイソマルトースの 8 種類である。糖アルコールは糖類には含まれないが、糖類と同時に分析が可能であ象とした。一覧を表 1 に示す。栄養成分表示欄の糖類含有量が 0 g/100 g または 0 g/100 mL である飲料が 2 試料（No.1 および No.2）あり、いずれも糖質ゼロまたは無糖といった糖類を含まない旨の強調表示があった。これらは 2 ロットずつ分析を行った。
No.3～6 は糖質含有量が 6.2～9.0 g/100 mL の試料で、るため、食品成分表に記載されているソルビトール
及びマンニトールについても測定対象とした 5)。最
初に、対象成分 10 種類について分析条件の検討を行い、確立した条件で野菜・果実飲料を対象とした妥当性確認を行った。その後、市販の野菜・果実飲料について分析を行い、糖類含有量を求め表示値とうち 3 試料には砂糖不使用の任意表示があった。

の比較を行ったので報告する。

-マルトース一水和物（特級）、D（−）-ソルビトール（一級）、D（−）-マンニトール（特級）：富士フイ

2. 標準品および標準液
D（−）-フルクトース（特級）、D（＋）-ガラクトース（特級）、D（＋）-グルコース（特級）
、スクロー
ス（特級）
、ラクトース一水和物（特級）、D（＋）

表 1 本研究に用いた試料
No.
1
2

原材料

*1

野菜（大麦若葉、ケール）、抹茶、食物繊維、大麦若葉粉末、亜鉛酵母、寒天/ビタミンC
野菜（大麦若葉、ケール）、大麦若葉粉末、抹茶、亜鉛酵母/増粘多糖類、
ビタミンE

糖類表示値

糖に関する

分析に用いたg/100mL

強調表示等

ロット数

*2

糖質ゼロ

2

0

無糖

2

6.2

―

1

0

野菜（にんじん、トマト、むらさきいも、赤ピーマン、いんげんまめ、モロ
ヘイヤ、めキャベツの葉、レタス、ケール、ピーマン、だいこん、はくさい、アスパラガス、グリーンピース、セロリ、しそ、ブロッコリー、かぼ
3

ちゃ、あしたば、こまつな、ごぼう、にがうり、しょうが、ブロッコリー（芽ばえ）、パセリ、クレソン、キャベツ、はつかだいこん、ほうれんそう、みつば）、レモン果汁、海藻カルシウム、ライスマグネシウム/ビタミ
ンC
野菜（にんじん、こまつな、ケール、ブロッコリー、ピーマン、ほうれんそう、アスパラガス、赤じそ、だいこん、はくさい、セロリ、めキャベツ（プ4チヴェール）、紫キャベツ、ビーツ、たまねぎ、レタス、キャベツ、パセ

6.7

リ、クレソン、かぼちゃ）、果実（りんご、オレンジ、レモン）/クエン

砂糖・甘味料
不使用

1

酸、香料、ビタミンC
野菜（にんじん、ケール、ほうれんそう、アスパラガス、クレソン、パセ
リ、かぼちゃ、レタス、キャベツ、ビーツ、だいこん、はくさい、たまね
5ぎ、セロリ）、果実（りんご、レモン、ブルーベリー、クランベリー）、食8.9

物繊維、殺菌発酵豆乳、はっ酵乳、寒天、アサイーエキス、植物性乳酸菌

砂糖・甘味料無添加

1（殺菌）／香料、安定剤（ペクチン）、クエン酸、ピロリン酸第二鉄、野菜（にんじん、ピーマン、こまつな、ケール、ほうれんそう、アスパラガ
ス、クレソン、パセリ、かぼちゃ、レタス、キャベツ、ビーツ、だいこん、6

はくさい、たまねぎ、セロリ）、果実（りんご、ぶどう、レモン、キウイフ

9.0

ルーツ、バナナ）、食物繊維/香料、クエン酸、ビタミンC、ベニバナ黄色素、クチナシ青色素*1 原材料の野菜名および果実名は日本食品標準成分表2020年版（八訂）の食品名表記を参考にした。
*2 表示値の単位は g/100g- 33 -

砂糖・甘味料
無添加

1

ルム和光純薬、D（＋）-トレハロース二水和物（ >98.0%）、イソマルトース（＞97.0%）：東京化成
工業、いずれも 60℃、5 時間減圧乾燥したものを使用した。
100 mg/mL 標準原液：標準品は無水物に換算して移して水で定容した。50 mL 遠沈管に移して遠心分離（3000 回転/分、1 分間）した。上清 1 mL を採取し、等量のアセトニトリルと混合し、メンブランフ
ィルター（0.45 µm）にかけたものを試験溶液とした。

1.000 g をはかり取り、水に溶解して 10 mL に定容した。
10 mg/mL 混合標準液：①フルクトース、ガラクト
ース、グルコース、スクロース、ラクトース、マル
トースについて、100 mg/mL 標準原液から 1 mL ず
つ採り、10 mL に水で定容した。②ソルビトール、

6. 糖分析
高速液体クロマトグラフィーを用いて、以下の条件で行った。
移動相：75%、77.5%、80%アセトニトリル
流速：0.8 mL/min
注入量：10 µL

マンニトール、トレハロース、イソマルトースについて、100 mg/mL 標準原液から 1 mL ずつ採り、10mL に水で定容した。
検量線用標準溶液：10 mg/mL混合標準液をもとに、最終50%アセトニトリル溶液となるように0.1～5
mg/mLの検量線用標準溶液を調製した。

カラム：昭和電工 Shodex Asahipak NH2P-50
4E（内径 4.6 ㎜、長さ 250 ㎜）
カラム温度：30℃
検出器：示差屈折率検出器
検出器光学系温度：30℃
検量線用標準溶液を装置にインジェクションし、単一糖標準溶液：糖類または糖アルコールそれぞれ
において、最終50%アセトニトリル溶液となるように0.1、1、5 mg/mLの標準溶液を調製した。

糖または糖アルコール濃度に対してピーク高さをプロットし検量線を作成した。試験溶液のクロマトグラムから、標準溶液と同じ保持時間にあるピークの高さを求め、検量線を用いて試料中の糖類または糖アルコール濃度を算出した。

3. 試薬および試液
水酸化ナトリウム（特級）およびアセトニトリル（LCMS 用）：富士フイルム和光純薬
水：超純水製造装置で 18.2 MΩ・cm まで精製したもの。
10 w/v%水酸化ナトリウム溶液：水酸化ナトリウム10 g を水に溶かし 100 mL とした。

7. LC 分析の条件検討
移動相のアセトニトリルを 75%、77.5%、80%の3 濃度について検量線用標準溶液をインジェクショ
ンして、保持時間、ピーク分離、感度および検量線

4. 装置・器具
超純水製造装置：メルクミリポア Milli-Q IQ 7003
遠心分離機：KUBOTA 4000
液体クロマトグラフ：Agilent 1290 Infinity II LC シス
テム
示差屈折率検出器：Agilent 1260 Infinity

8. ピーク高さ比較
検量線用標準溶液の 0.1、1、5 mg/mL、および単一糖標準溶液 0.1、1、5 mg/mL について、移動相に75%アセトニトリルを用いて分析した。検量線用標
準溶液については 3 回、単一糖標準溶液は 2 回ずつ
インジェクションを行った。糖類または糖アルコー

カラム：昭和電工 Shodex Asahipak NH2P-50 4E（内径 4.6 ㎜、長さ 250 ㎜)
15 mL、50 mL 遠沈管：Watson 製

ルごとに、検量線用標準溶液のピーク高さ平均を単
一糖標準溶液のピーク高さ平均で除してピーク比を求めた。

5. 前処理別添の分析法 3)を一部変更し、前処理を行った。

9. 妥当性評価
陰性試料 5 mL に 50 mg の対象成分を添加し（n=5）
、

50 mL 遠沈管によく混合した試料 5 mL を採取し、5 mL の水を加え、液性が酸性の場合には 10 w/v%
水酸化ナトリウム溶液で pH 5～7 に調整した。30 分
間超音波処理した後、全量を 25 mL メスフラスコに

3 日間分析を行った。添加回収率により真度を、添加回収率の一元配置分散分析により精度を確認した。

の比較を行った。

- 34 -

1. LC 分析における移動相の検討
示差屈折率検出器は紫外吸収が少ない成分の検出に用いられ、光の屈折率の違いにより測定する検ときに、アセトニトリル 75%ではラクトース 14.0 分
トレハロース 14.4 分およびマルトース 14.7 分、77.5%ではトレハロース 18.7 分とマルトース 18.9 分、80%ではマルトース 29.0 分とトレハロース 29.0 分となり、移動相に用いるアセトニトリル濃度により出器である。ベースラインの安定性が重要であり、溶媒の比率を変化させるグラジェント条件分析を用いることができないため、ピークの重なりを避けるために分析対象を①②の 2 グループに分けて分析した。
移動相のアセトニトリル濃度 75%、77.5%、80%

トレハロースとラクトースやマルトースを分離するのは困難であることが示された。トレハロースは天然の食品ではきのこ類に含まれているが、最近では食品添加物として使用されている食品も多く、今後、異なる分析カラムの使用など更なる検討が必要である。

の 3 濃度において、5 mg/mL 検量線用標準溶液を分析したときのクロマトグラムを図 1 に示す。分析に用いたカラムは、糖類の分析に適したカラムで、移動相に水-アセトニトリル混液を用いて糖分析する
場合、水の比率が高いほど早く溶出し、また基本的に分子量が小さいものから溶出する 6)。①では単糖

次に 0.1～5 mg/mL の検量線用標準溶液を 2 回ずつ分析し、糖類または糖アルコール濃度に対してピーク高さをプロットし検量線を作成した（図 2）。移動相のアセトニトリル濃度が高くなるほど、感度は下がるため、検量線の傾きは小さくなった。検量線
は移動相のアセトニトリル濃度に関係なく全ての類であるフルクトース、ガラクトース、グルコース、②ではグルコースが還元されたソルビトールおよびマンニトールが先に溶出し、次いで二糖類が溶出した。アセトニトリル濃度が高くなるほど分析に要する時間が長くなり、保持時間の差は大きくなるが、ピーク高さ、すなわち感度は低くなることが分かる。

糖類または糖アルコールにおいて 0.1～5 mg/mL の範囲で良好な直線性を示した（決定係数 R2 > 0.99）。
しかしながら低濃度領域において、検量線用標準溶液について検量線の回帰直線から算出した濃度と理論値の乖離が大きいため、検量線として使用した
範囲はフルクトースで 0.5～5 mg/mL、その他の糖類①②の検量線用標準溶液の保持時間平均を比べたおよび糖アルコールにおいては 0.2～5 mg/mL とし

結 果 お よ び 考 察

1.フルクトース

2.ガラクトース

3.グルコース

4.スクロース

5.ラクトース

6.マルトース

7.ソルビトール8.マンニトール

9.トレハロース

10.イソマルトース

アセトニトリル75％
アセトニトリル77.5％

図 1 移動相におけるアセトニトリル濃度の影響

アセトニトリル80％

グループ①：1.フルクトース、2.ガラクトース、3.グルコース、

図 2 アセトニトリル濃度の検量線への影響

4.スクロース、5.ラクトース、6.マルトース

横軸：糖濃度(mg/mL)、1 目盛りは 1 mg/mL に相当

グループ②：7.ソルビトール、8.マンニトール、

縦軸：ピーク高さ(nRIU)、1 目盛りは 10000nRIU に相当

9.トレハロース、10.イソマルトース
75％、77.5％、80％：移動相のアセトニトリル濃度- 35 -

表 2 単一糖標準溶液および検量線用標準溶液におけるピーク高さ比較
ピーク高さ比*1濃度（mg/mL)
フルクトース ガラクトース

グルコース

スクロース

ラクトース

マルトース ソルビトール マン二トール トレハロース

イソマルトース

0.5

0.90

0.96

0.96

0.91

0.98

0.97

0.97

0.98

0.96

1.02

1

0.90

0.99

0.96

0.92

0.95

0.93

1.03

1.01

0.96

0.96

5

1.10

1.17

1.13

1.11

1.14

1.15

1.01

1.04

1.02

0.99

*1 検量線用標準溶液におけるピーク高さの平均値÷単一糖標準溶液のピーク高さ平均値

表 3 妥当性評価
フルクトース ガラクトース グルコース スクロース ラクトース マルトース ソルビトール マン二トール トレハロース

イソマルトース

総平均（%）

98.0

96.3

97.0

98.6

98.3

97.8

100.8

99.9

100.5

100.1

併行精度（RSD，%）

2.2

2.1

2.2

2.1

2.1

2.2

4.6

4.7

4.9

5.0

室内精度（RSD，%）

5.7

2.9

2.6

2.1

2.1

3.2

5.1

4.9

6.4

5.8

た。したがって、試料中の定量下限はフルクトース

した陰性飲料 5 mL に 50 mg の対象成分を添加し（5で 0.5 g/100 mL、その他の糖類および糖アルコールにおいては 0.2 g/100 mL、検出限界は検量線用標準溶液で最も低い濃度 0.1 mg/mL から試料中濃度に換
算して 0.1 g/100 mL とした。
本研究の調査試料は原材料からフルクトース、グ
ルコース、スクロース中心の分析になることが推定

併行、3 日間）、前処理を行い移動相アセトニトリル
濃度 75%で分析を行った。添加量は試料換算すると各対象成分 1 g/100 mL となり、糖類含有量として 8
g/100 mL、野菜・果実飲料を構成する主要な糖類であるフルクトース、グルコース、スクロースの 3 糖類の合計値は 3 g/100 mL となる。回収率（%）を求されるため、分析時間が短く、感度が良い 75%アセ
トニトリルを用いることにしたが、ガラクトースとグルコース、ラクトースとマルトース、ソルビトー
ルとマンニトールのピークは完全に分離していな
いため、定量性の確認を行った。75%アセトニトリ
ルを用いて分析した単一糖標準溶液のピーク高さ

め、回収率（%）の総平均により真度の評価を、回収率を一元配置分散分析にて求めた併行精度（%）
および室内精度（%）により、精度の評価を行った。
結果を表 3 に示す。総平均 96.3～100. 8%、併行精度
2.1～5.0%、室内精度 2.1～6.4%となり、分析法として妥当であることが確認された。

に対する混合標準溶液である検量線用標準溶液のピーク高さの比を求め表 2 に示した。混合標準溶液
中で単一のピークとして存在しているフルクトー
ス、スクロース、トレハロース、イソマルトースのピーク比が 0.5 mg/mL では 0.90～1.02、1 mg/mL では 0.90～0.96、5 mg/mL では 0.99～1.11 であるのに

3. 市販の野菜・果実飲料の分析
市販の野菜・果実飲料について試料あたり 3 併行

対し、ピーク分離が不十分であるガラクトース、グ
ルコース、ラクトース、マルトース、ソルビトール、
マンニトールは 0.5 mg/mL では 0.96～0.98、1 mg/mL
では 0.93～1.03、5 mg/mL では 1.01～1.17 と同等のピーク比を示し、ピーク分離が不十分な糖類または糖アルコールと、単一ピークとして存在する糖類は

No.1

No.3

1

No.2

1

4
3

No.4

1
3

3

4

7

図 3 野菜・果実飲料のクロマトグラム

同等の定量性があると考えられた。

No.1 および No.2 は糖類ゼロ表示のある飲料で縦軸（nRIU）
は No.3 および No.4 の 20 分の 1 である。

2. 妥当性評価
予め測定対象成分が含まれていないことを確認

1.フルクトース、3.グルコース、4.スクロース、7.ソルビト-ル- 36 -

で前処理を行い分析した。クロマトグラムの一部を
図 3 に、検出限界を超えて検出された糖について結果を表 4 に示す。糖類を含まない旨の表示があった
No.1 において、ロットに関係なくピークは確認されなかった。なお、No.1 の糖類含有量表示は重量あた

料水等にあたっては 100 mL あたり）0.5 g 未満と定められている 2)。国や地方公共団体が行う検査において、別添の分析方法に従って得られた分析値の表
示値に対する割合が許容差の範囲外であった場合、
食品表示基準違反の疑いがある。本調査は別添の分りで示されていたが、糖は検出されなかったので他の試料と同等 100 mL あたりの表示値として結果を示した。同じく糖類を含まない旨の表示があった
No.2 においては、両ロットともにフルクトースとグ
ルコースの小さいピークが確認できたが、検出限界未満であった。No.3～6 からはフルクトース、グル析法に従った分析を実施し、その結果、糖類を含まない旨の表示があった No.1 および No.2 からは糖類は検出されず、また No.3～6 について分析値は表示
値の-4～-14%と表示値に対して分析値が低めではあったが、分析値は許容差の範囲内にあり、表示値は妥当であると考えられた。しかしながら今後、糖コース、スクロースのピークが確認された。原材料の種類が多く、糖の組成や含有量に大きく寄与する原材料は特定できないが、食品成分表炭水化物成分
表編の本表データ 7)によると、
にんじんやかぼちゃ、果実などの糖類含量の影響が大きいと推察された。
またNo.4～6 は糖アルコールであるソルビトールが類を含まない旨または低い旨の表示がある食品など調査対象食品を広げていくにあたり、現状の定量
下限付近の精確な分析が要求されることが予想される。そのため、フルクトース、ガラクトース、グ
ルコース、スクロース、ラクトース、マルトース、
ソルビトール、マンニトールを対象とし、低濃度領検出されたが、No.6 は定量下限に満たなかったため
表 4 には Tr で示した。ソルビトールはりんご、梨、
プルーンに多く含まれることが知られている。今回、調査した試料の原材料のうち食品成分表に記載がある原材料でソルビトールを含む食品はりんごのみであった 7)。したがって、検出されたソルビトー

域の分析を検討した。すなわち、検量線の範囲を
0.05～1 mg/mL とし、陰性試料 5 mL に妥当性評価の 10 分の 1 である 5 mg を添加し添加回収試験を実施したところ、
検量線および回収率（99.6～111.5%）で良好な結果が得られた。今後、データの蓄積を行ったうえで低濃度領域の分析が可能となる。

ルはりんご由来である可能性が高いと考えられた。
No.5 には原材料中に野菜・果実以外に豆乳やはっ酵乳が含まれる。食品成分表によると調整豆乳にはマルトースが 0.3 g/100 g、はっ酵乳にはラクトースが3.6 g/100 g 含まれるが 7)、今回の分析でマルトース
およびラクトースの明確なピークは得られなかっ

さらに No.１および No.2 では糖類を含まない旨、
No.4～6 では砂糖不使用の表示があった。糖類を含まない旨の表示基準は飲用に供する液状の食品 100
mL 当たり 0.5 g 未満である 2)。この値は栄養成分表
示欄に糖類含有量をゼロと表示することができる
基準と同じであり、分析の結果、表示とも矛盾がなた。原材料中の豆乳およびはっ酵乳の割合が低かったものと考えられる。
4. 表示値との比較
食品表示基準において糖類は「単糖類、二糖類であって糖アルコールではないもの」と定義されていいことが確認された。また、砂糖不使用の表示は、①いかなる糖類も添加していないこと、 ②糖類に代わる原材料又は添加物を使用していないこと、③酵素分解その他何らかの方法により、当該食品の糖類含有量が原材料及び添加物に含まれていた量を超えていないこと、④当該食品の 100 g 若しくはるため、検出された単糖類フルクトース、グルコー
ス、二糖類スクロース含有量を合計し糖類含有量を算出し、表示値との比較を行った（表 5）。なお糖類としての定量下限は、検出されている糖の中で高い定量下限である 0.5 g/100 mL とした。食品表示基準において栄養成分の表示値は、原材料における栄養100 mL 又は一食分、一包装その他の一単位当たりの糖類の含有量を表示しているという基準をクリアした食品に表示が認められている 2)。砂糖不使用の表示がある食品は、原材料由来のスクロースをはじめとする糖類は含んでおり、それらが原材料由来
であるかどうかは分析では判別できないため、砂糖

成分含有量のばらつきや加工の影響などを考慮し成分ごとに許容値の範囲やゼロと表示できる量が定められており、糖類の許容値の範囲は±20%、ゼロ
表示をすることができる量は 100 g あたり（清涼飲

不使用の表示がある試料の検査についても、分析値が表示値の許容差の範囲内に収まるかを確認するに留まった。また本調査では糖類および糖アルコー
ルの分析法確立を目的としているため甘味料分析- 37 -

表 4 野菜・果実飲料から検出された糖類および糖アルコールNo.

フルクトース

グルコース

スクロース

ソルビトール(g/100mL)(g/100mL)(g/100mL)(g/100mL)

1

ND

ND

ND

ND

2

ND

ND

ND

ND

1

ND

ND

ND

ND

2

ND

ND

ND

ND

Lot

1

2
ND

3

-

1.3

±

0.0

1.2

±

0.0

2.8

±

0.0

4

-

2.6

±

0.1

1.4

±

0.0

2.5

±

0.0

0.2

±

0.0

5

-

4.2

±

0.1

2.0

±

0.0

2.1

±

0.0

0.3

±

0.2

6

-

3.6

±

0.1

2.6

±

0.0

1.7

±

0.0

Tr

検出限界

0.1

0.1

0.1

0.1

定量下限

0.5

0.2

0.2

0.2

平均±標準偏差
ND；検出限界未満
Tr；検出限界以上、定量下限未満

表 5 野菜・果実飲料における糖類含有量と表示値との比較
No.

Lot
1

表示値

分析値

(g/100mL)(g/100mL)

0

1

*2

*1

RSD%

対表示
(%)

ND

-

-

許容差の範囲

*2

2

0

ND

-

-

0.5ｇ/100mL

1

0

ND

-

-

未満

2

0

ND

-

-

3

-

6.2

5.3 ± 0.1

1.0

-14

4

-

6.7

6.4 ± 0.1

1.8

-4

5

-

8.9

8.2 ± 0.2

2.0

-7

6

-

9.0

7.9 ± 0.2

2.2

-13

2

±20％

平均±標準偏差
ND；定量下限未満、定量下限0.5g/100mL*1 対表示（%）=分析値÷表示値×100-100*2 表示値の単位はg/100g- 38 -

は実施していないが、砂糖不使用表示の検証のためには、今後、甘味料の分析も必要である。さらに、
示差屈折率検出器による分析はピーク同定の手段
が保持時間のみであり定性の情報が少なく、ピークが重なった場合の同定も困難であることから、液体クロマトグラフィータンデム質量分析装置（LCMS/MS）を用いた糖の定性分析について検討を行う
予定である。
食品表示基準の別添の分析法に基づいて市販の野菜・果実飲料の糖分析を行った結果、分析値は食品表示基準に定められている許容差の範囲以内であり、また糖類を含まない旨や砂糖不使用の表示とも矛盾がなかった。今回、調査した試料は前処理が容易な野菜・果実飲料であったが、糖類に関する表示がある食品は炭酸飲料やアルコール飲料、菓子類など多く流通しているため、分析対象を広げていく
可能性を考慮して検査体制を拡充する必要がある。

参 考 文 献1) 食品表示法（平成 25 年法律第 70 号）
2) 食品表示基準（平成 27 年内閣府令第 10 号）
3) 消費者庁：食品表示基準 別添 栄養成分等の分
析方法等https://www.caa.go.jp/policies/policy/food_labeling/fo
od_labeling_act/pdf/food_labeling_cms101_200327_1
1.pdf
4) 文部科学省：日本食品標準成分表 2020 年版（八訂）https://www.mext.go.jp/a_menu/syokuhinseibun/mext_01110.html
5) 文部科学省：日本食品標準成分表 2020 年版（八訂）炭水化物成分表編 －利用可能炭水化物、糖アルコール、食物繊維 及び有機酸－
https://www.mext.go.jp/content/20201225mxt_kagsei-mext_01110_041.pdf

謝 辞
本調査にあたり、大阪府健康医療部生活衛生室食の安全推進課のご協力を受けたことを記し、深謝申し上げます。

6) 昭和電工：HILIC モードによる単糖、二糖、三糖の分析 (1) (NH2P-50 4E)
https://www.shodex.com/ja/dc/03/02/12.html
7）文部科学省：日本食品標準成分表 2020 年版（八訂）炭水化物成分表編 －利用可能炭水化物、糖アルコール、食物繊維 及び有機酸－、第2 章本表（データ）
https://www.mext.go.jp/content/20201225mxt_kagsei-mext_01110_042.xlsx

利 益 相 反本事例の調査にあたって開示すべき利益相反はない。

WEB サイトの内容は2021 年6 月21 日に確認した。

- 39 -

Annual Report of Osaka Institute of Public Health, 5, 2021

Analysis of sugar and sugar alcohol in commercially available vegetable and fruit juices

Masami KIa, Ayuko KUDOb, Sayaka TERATANIb, Tomomi YAMASAKIa, Yo KAKIMOTOa and Masanao SHINYAa

To analyze sugars in commercially available vegetables and fruits juices, the measurement conditions for 3
monosaccharide, 5 disaccharide and 2 sugar alcohol, by liquid chromatography with polymer-based columns forhydrophilic interaction chromatography and refractive index detector, were examined. Considering sensitivity, peakseparation and total run time, we decided isocratic analysis with 75% acetonitrile for mobile phase. For validation study,
50mg each sugars were spiked 5mL sugar free vegetable juice and were analyzed for 3 days with 5 points. As a result of
the validation study in 10 sugars, the trueness, repeatability and within-laboratory reproducibility were 96.3～100.8%,
less than 5.0 and 6.4%, respectively.
Each sugar was not detected in 2 vegetable juice expressed sugar content zero in nutrition information. Fructose, glucose
and sucrose were detected in 4 vegetable and fruit juices, and sorbitol was detected juices included fruits. Sugar contents
obtained by sum of fructose, glucose and sucrose were −14～−4% of expressed sugar content in nutrition information.

Key words：sugar，sugar alcohol，nutrition information，Food Labeling Act，refractive index detectora Osaka Institute of Public Health Division Hygienic Chemistry Food Chemistry Section 1b Osaka Institute of Public Health Division Hygienic Chemistry Food Chemistry Section 2- 40 -

報 文

地方独立行政法人大阪健康安全基盤研究所研究年報 Ann. Rep. Osaka. Inst. Pub. Health, 5, 41-47 (2021)

栄養成分検査にかかる水分分析条件の検討

山﨑朋美，柿本 葉，紀 雅美，萩原拓幸，新矢将尚

菓子類、野菜・果物加工品、大豆加工品及びチーズについて、加熱乾燥法による水分分析の乾燥条件の検討を行った。菓子類は、135 °C では水分以外の成分の変化や揮発が顕著であり、100 °C または減圧・100 °Cの条件が適切と考えられた。野菜・果物加工品は、135 °C や 100 °C では水分以外の成分の変化や揮発が顕著であり、減圧・70 °C または減圧・60 °C の条件が適切と考えられた。大豆加工品及びチーズは、それぞれ検討した 2 つの条件が適用できた。また、炭水化物が 10 g/100 g 以下と少ない試料では、乾燥条件の違いによる水分分析値の差が小さい場合でも、炭水化物に換算すると大きな差となった。

キーワード：栄養成分分析、栄養成分表示、食品表示法、加熱乾燥法

食品表示法が 2015 年 4 月 1 日に施行され、2020
年 4 月 1 日より原則すべての一般用加工食品に栄養成分表示が義務化された。それに伴い大阪府では流通食品の栄養成分表示の真正性を確認するための検査の実施を検討している。当所においても大阪府

い。また、「加熱乾燥後の試料の色が変わったり、焦げ等が発生している場合は、加熱温度を下げる又は減圧加熱乾燥を採用する等、乾燥条件の検討が必要」と記載されており、様々な加工食品について最適な乾燥条件を設定するためには、データや経験の蓄積と連携して検査体制の構築にあたることとなった。
栄養成分表示の真正性の確認を目的とする場合、食品表示基準で規定されている成分の測定及び算出
は、消費者庁次長通知「食品表示基準について（平成 27 年 3 月 30 日消食表第 139 号）別添 栄養成分等の分析方法等（以下、公定法）」1)に定められた分が必要である。
本報告では、実際の栄養成分検査で搬入される可能性がある加工食品について、複数の乾燥条件による水分分析を行い、得られた定量値や恒量が得られるまでの時間、焦げなどの有無を比較した。それにより、実際の検査の際の条件設定に寄与するデータ

析法に従い実施する必要がある。
水分は、炭水化物の量を計算するために分析する必要があり、水分分析の公定法として、試料の加熱乾燥による減量を水分量とする方法（乾燥助剤法、
減圧加熱乾燥法、常圧加熱乾燥法、プラスチックフィルム法）またはカールフィッシャー法が定められの蓄積を目的とした。また、水分分析における乾燥条件の違いが、炭水化物の計算値へどのように影響するか考察した。

ている。前者の加熱乾燥による方法は、簡便かつ多くの食品に適用でき、また、国内で実施された技能試験 2, 3)においてほぼ全ての参加機関が採用している。加熱乾燥による方法は、水分のみを蒸発させ、かつ水分以外の食品成分の変化を最小限に抑えられるように、原材料等を考慮し最適な乾燥温度と時

1. 試料
2019 年 10 月から 2021 年 3 月に大阪府内で流通している市販の栄養機能食品または栄養成分の量について訴求する表示があり、かつ合理的な推定により得られた値を示す文言の表示がない食品を対象とした。菓子類を 6 種類、野菜・果実加工品を 4間を設定する必要がある。しかし公定法には、代表的な食品の乾燥条件は記載されているが、様々な原材料から成る加工食品については記載されていな
大阪健康安全基盤研究所衛生化学部食品化学 1 課

種類、大豆加工品及びチーズを 4 種類、合計 14 種
類の加工食品を使用した。菓子類としてシリアル A、
シリアル B（乾燥果実を含むもの）、栄養調整食品方 法- 41 -A（小麦粉を主成分として成形後、焼成したもの）、
栄養調整食品 B（小麦粉を主成分として成形後、アーモンドをトッピングし焼成したもの）、スナック
菓子（小麦粉を主成分として成形後、小さくカット
し煎ったもの）、クリームサンドビスケットを使用

法）により計算した。計算に用いるたんぱく質、脂質、及び灰分は、公定法に準じて分析した。

した。野菜・果実加工品として、コーン缶、果物ジ
ュース（果汁 25%）
、スムージーA（野菜及び果物を主原料とするもの）、スムージーB（野菜及び果物を主原料とし豆乳及びヨーグルトを含むもの）を使用した。大豆加工品及びチーズとして大豆ミート（脱脂大豆を高温・高圧乾燥したもの）、無調整豆乳、イ

1. 菓子類について
公定法を含む 4 つの文献 1, 4-6)からシリアル、栄養
調整食品、スナック菓子、クリームサンドビスケッ
トに適用可能な乾燥条件例を抽出し、表 1 の菓子類の欄にまとめた。公定法には、穀粒、乾めん、せん
べい類の乾燥条件例として 135 °C・3 時間のみが記

ンスタントみそ汁、プロセスチーズを使用した。

載されているが、他の文献にはクッキーなどの焼菓
子類の乾燥条件例として 100 °C・恒量などが記載されている。これらの例を参考に 3 種類の乾燥条件で分析を行った結果を表 2 の菓子類の欄に示した。全ての試料において、水分分析値は 135 °C で他の条件より高い値となった。また、135 °C では、全ての

2. 水分の分析方法
試料を必要に応じてミル等で粉砕・均質化し、公定法に示される水分の常圧加熱乾燥法、減圧加熱乾燥法及び乾燥助剤法に準じて行った。乾燥による質量の変化量が、水分（%）として 0.1%以内になったときを恒量とみなした。
3. 炭水化物の計算方法
公定法に示される炭水化物の計算方法（差し引き結 果 及 び 考 察

菓子類の試料に焼き色がついた。各条件につき n=2で行った水分分析値の相対標準偏差（RSD）は 0.047～8.4%だった。また、乾燥条件の違いによる水分分
析値のばらつきは、5.0～40%だった。今回使用した菓子類はいずれも水分含量が 100 g 当たり 10 g 以下

表 1 使用した試料に該当し得る食品の乾燥条件例
乾燥条件例
食品の種類

乾燥温度 a食品

穀粒、乾めん、せんべい類
あられ、せんべい類
菓子類
クッキーなどの焼菓子類
クッキーなどの焼菓子類
クッキーなどの焼菓子類
野菜、果実及びその加工品
野菜・果物 野菜類、果実類、乾燥野菜類
加工品
果実飲料
缶・びん詰類（野菜類）
きな粉、脱脂大豆
油あげ、豆腐、納豆
大豆加工品
豆腐類
みそ
チーズ
チーズ
チーズ類
チーズ
a
Vは減圧加熱乾燥を示す。

- 42 -

・ 時間

135 °C ・ 3時間
135 °C ・ 3時間
100 °C ・ 恒量
V 100 °C ・ 恒量
V 90～100 °C ・ 5時間
V 70 °C ・ 5時間
V 70 °C ・ 5時間
V 70 °C ・ 5時間
V 70 °C ・ 5時間
130 °C ・ 1時間
100 °C ・ 5時間
105 °C ・ 2時間
V 70 °C ・ 5時間
105 °C ・ 5時間
105 °C ・ 4時間
105 °C ・ 4～5時間

文献
1, 6)
4, 5)
4)
5)
6)
1)
6)
4, 5)
4)
1, 4-6）
1)
4, 5)
1, 4-6）
1)
4, 5)
6)

表 2 各乾燥条件における水分分析値および炭水化物計算値
乾燥条件
分類

試料

シリアルA

シリアルB（乾燥果実を含むもの）栄養調整食品A（小麦粉を主成分として成形後焼成したもの）
菓子類

栄養調整食品B（小麦粉を主成分として成形後アーモンドをトッピングし焼成したもの）
スナック菓子（小麦粉を主成分として成形後、小さくカットし煎ったもの）
クリームサンドビスケット

コーン缶

果物ジュース（果汁25％）
野菜・果物
加工品

スムージーA（野菜及び果物を主原料とするもの）
スムージーB（野菜及び果物を主原料とし豆乳及びヨーグルトを含むもの）
大豆ミート（脱脂大豆を高温・高圧乾燥したもの）

大豆加工品

無調整豆乳
インスタントみそ汁

チーズ

プロセスチーズ

温度
(℃)a

水分

時間

乾燥
助剤

分析値(RSD)b

135
100
V 100
135
100
V 70
135
100
V 100
135
100
V 100
135
100
V 100
135
100
V 100
135
100
V 70
135
100
V 70
135
100
V 70
V 60

3
5
5
3
5
5
3
5
5
3
5
5
3
5
5
3
5
5
3
5
5
3
5
5
3
5
5
5

なし
なし
なし
なし
なし
なし
なし
なし
なし
なし
なし
なし
なし
なし
なし
なし
なし
なし
なし
なし
海砂
なし
なし
海砂
海砂
海砂
海砂
海砂

3.2 (2.2 )
2.6 (0.047)
2.6 (0.10 )8.0 (3.6 )5.0 (1.5 )
3.6 (2.2 )
9.3 (1.1 )
8.5 (0.76 )
8.3 (1.0 )
3.5 (1.0 )
2.4 (1.9 )2.7 -e3.5 (2.3 )
1.5 (2.1 )
1.8 (1.2 )
2.9 (0.49 )
1.6 (8.4 )
2.2 (1.5 )82.2 (0.36 )81.5 (0.50 )80.9 (0.10 )93.7 (0.19 )92.1 (0.026)
87.8 (0.016)
95.6 (0.15 )93.6 (0.042)
92.5 (0.23 )91.3 (0.16 )

V 70

5

海砂

90.3 (0.16 )

V 60

5

海砂

91.0 (0.026)

135
130
100
V 70
V 70
V 60
105
100

1
1
3
3
3
5
4
4

なし
なし
海砂
海砂
海砂
海砂
なし
なし

8.4 (0.63 )
8.1 (0.067)
92.1 (0.025)
91.3 (0.42 )51.7 (0.19 )52.8 (0.071)
46.9 (0.13 )46.7 (0.13 )a

Vは減圧加熱乾燥を示す。
n=2またはn=3で行った平均値(g/100 gまたはg/100 ml)及び相対標準偏差(%)
c
各条件での分析値または計算値の相対標準偏差(%)
d
炭水化物の平均値(g/100 gまたはg/100 ml)en=2で行ったが片方のデータのみ得られたのでRSDを計算できなかった。

b- 43 -

炭水化物
乾燥条件の
違いによる
ばらつきc

9.9

33

5.0

16

40

23

0.69

2.7

1.7

0.35
1.7
0.43
1.1
0.15

乾燥条件の

計算値 d 違いによる
ばらつきc

82.3
83.0
82.9
70.6
73.6
75.0
53.1
53.9
54.1
58.1
59.3
59.0
65.2
67.2
66.9
73.0
74.2
73.7
12.9
13.6
14.2
5.8
7.4
11.7
3.3
5.4
6.5
7.7
8.8
8.2
34.5
34.7
0.6
1.4
21.4
20.3
4.5
4.7

0.34

2.5

0.81

0.81

1.3

0.70

4.2

30

28

3.8
0.40
41
2.8
1.6

と少なく炭水化物含量が 100 g 当たり 50～80 g 程度と多い試料のため、これらのばらつきは炭水化物の計算値の違いにほとんど影響しなかった。
水分の分析は恒量をもって終点とするが、シリア
ル A を除く全ての菓子類の試料は、135 °C で繰り

菜・果物加工品の欄に示した。いずれの試料でも、135 °C 及び 100 °C による水分分析値は、減圧 70 °C
または減圧 60 °C による値よりわずかに高かった。
また、135 °C で乾燥した際、コーン缶で試料の一部が黒変し、それ以外の野菜・果物加工品の試料で焼返し加熱を行う度に重量が減少し恒量を得られなかった。シリアル A、シリアル B、栄養調整食品 B、
クリームサンドビスケットの加熱による重量変化を図１の(a)～(d) に示した（栄養調整食品 A、スナ
ック菓子については省略）。加熱による減量は、水分の蒸発以外にもアルコール類や揮発性有機酸のき色がついた。各条件につき n=2 または n=3 で行った水分分析値の RSD は0.016～0.50%だった。
また、乾燥条件の違いによる水分分析値のばらつきは、
0.35～2.7%だった。今回使用した野菜・果物加工品
はいずれも水分含量が 100 g 当たり 80～90 g 程度と多く、炭水化物含量が 100 g 当たり 10 g 以下と少な

揮発、加熱による成分変化の影響が含まれる。
135 °C の場合、焼き色が付いたことから、メイラー
ド反応などにより試料中の成分が変化し、水分以外の成分の揮発がより顕著だったと考えられる。これらのことから、菓子類の乾燥条件として 135 °C は
適さない場合が多いと考えられた。シリアル B を除い試料のため、これらのばらつきは炭水化物の計算値の違いに大きく影響した。
スムージー及び果物ジュースは、135 °C、100 °Cの乾燥では恒量を得られず、減圧 70 °C 及び減圧
60 °C で恒量を得られた。代表としてスムージーAの加熱乾燥による試料重量の変化を図 1(e)に示した。

く菓子類の試料はいずれも、100 °C または減圧・
100 °C の条件において 2～3 回の加熱で恒量を得られたため、どちらかの条件で得られた値を採用する
ことが適切と考えられた。シリアル B は 100 °C での乾燥で恒量は得られず、減圧・70 °C の加熱により恒量が得られたため、後者の条件で得られた値を

野菜・果物加工品は加熱により変化しやすいため、今回の試料においても 135 °C や 100 °C の加熱で試料中の成分が変化し、水分以外の成分の揮発がより著しかったと考えられた。図には示さなかったが、コーン缶については 135 °C では恒量が得られず、
100 °C、減圧 70 °C で恒量が得られた。これらのこ

採用することが適切と考えられた。シリアル B は乾燥果実が含まれており、100 °C の加熱では試料中の成分が変化し、水分以外の成分の揮発がより著しかったと考えられた。
竹林らが行った技能試験の報告 3)では、水分分析
値が不適切な結果となった原因の一つとして、恒量とから、野菜・果物加工品の水分分析における乾燥
条件は、4 つの文献で例示された減圧 70 °C が適切であると確認できた。また、減圧 60 °C による分析値を採用することも可能であると考えられた。

の基準に適合するため必要以上に乾燥を繰り返すことが挙げられている。今回の検討においても、
135 °C の加熱では恒量が得られにくかったが、このような場合は値を採用せず温度を下げて再度実施
する等、採用基準を明確にする必要があると考えられた。

公定法を含む 4 つの文献から大豆ミート、無調整
豆乳、インスタントみそ汁、プロセスチーズに適用
可能な乾燥条件例を抽出し、表 1 の大豆加工品及びチーズの欄にまとめた。大豆ミートは、形態の近い
脱脂大豆の 130 °C・1 時間、インスタントみそ汁はみその減圧 70 °C・5 時間、プロセスチーズはチーズ

2. 野菜・果実加工品について
公定法を含む 4 つの文献から果物ジュース、スムージー、コーン缶に適用可能な乾燥条件例を抽出し、
表 1 の野菜・果物加工品の欄にまとめた。野菜、果物は加熱によって変化しやすい食品のため、公定法の 105 °C・4～5 時間の乾燥条件がそれぞれ適用可能と考えられた。そこでこれらの試料については、乾燥条件の違いによる水分分析値の比較及びデー
タの蓄積を目的とし、それぞれの試料に適用可能と考えられた条件を含めた 2 つの条件で水分分析を行った。一方、無調整豆乳は、成分組成が近い豆腐を含む 4 つの文献で減圧 70 °C・5 時間と例示されている。乾燥条件の違いによる水分分析値の比較及びデータの蓄積を目的とし、減圧 70 °C・5 時間を含めた複数の乾燥条件で分析を行い、結果を表 2 の野の 100 °C、及び、水分を多く含む食品に適用される
減圧 70 °C の 2 つの条件で水分分析を行った。結果
を表 2 の大豆加工品及びチーズの欄に示した。イン
スタントみそ汁以外の試料において、乾燥温度が高3. 大豆加工品及びチーズについて- 44 -

図 1 加熱乾燥による試料重量の変化(a)：シリアル A、(b)：シリアル B、(c)：栄養調整食品 B、(d)：クリームサンドビスケット、(e)：スムージーA、(f)：大豆ミート、(g)：無調整豆乳、(h)：インスタントみそ汁、(i)：プロセスチーズ- 45 -

い条件での水分分析値が高くなった。乾燥条件の違いによる水分分析値のばらつきは、0.43～1.7%と少なかった。また、大豆ミート及びプロセスチーズの各条件でわずかに焼き色が付いた。乾燥条件の違い
による炭水化物の計算値の違いは無調整豆乳がた。特に、炭水化物が 10 g/100 g 以下と少ない試料
では、水分分析値の差が小さい場合でも、炭水化物に換算すると大きな差になった。そのため、表示の根拠となった値の測定時に用いた分析条件と異なる条件で水分分析を行うと、炭水化物の計算値が表41%と大きかった。大豆加工品及びチーズでは、図1 の(f)～(i)に示すように、プロセスチーズの 100 °C
以外の乾燥条件において、2～3 回の加熱で恒量を得られた。プロセスチーズの 100 °C では、恒量が得られるまでに 6 回加熱を繰り返す必要があった。今回、大豆加工品及びチーズでは 2 つの条件で乾燥を行

示値から大きくずれることが示唆された。今回得られた結果は、検査の際の条件設定に役立つものとなった。

ったが、どちらの結果を採用しても良いと考えられた。ただし、プロセスチーズは加熱を繰り返す回数の少ない 105 °C で行った方が効率的である。
また、無調整豆乳のように炭水化物含量が少ない食品の場合、乾燥条件の違いによる水分分析値の差が小さ
くても、炭水化物に換算すると差が大きくなる可能

本研究は大阪府健康医療部生活衛生室食の安全推進課の事業の一環として実施されたものであり、関係した皆様に深謝致します。

性がある。そのため、表示の根拠となった値の測定時に用いた乾燥条件と異なる条件で水分分析を行うと、炭水化物の計算値が表示値から大きくずれる可能性がある。そのため、今回の無調整豆乳の様に炭水化物の表示値が 10 g/100 g 以下、かつ、文献な
どに乾燥条件例が記載されていない食品の場合、採謝 辞

利 益 相 反開示すべき利益相反はない。
文 献1) 食品表示基準について（平成 27 年 3 月 30 日消
食表第139 号）「別添 栄養成分等の分析方法等」

今回使用した試料では、菓子類は 100 °C または

2) 竹林純，松本輝樹，石見佳子. 栄養成分表示値の信頼性確保─主要栄養成分に関する分析技能試
験の試み─. 栄養学雑誌 2017; 75(1): 3-18.
3) 竹林純，高坂典子，鈴木一平，中阪聡亮，平林尚之，石見佳子，梅垣敬三，千葉剛，渡辺卓穂. 食
品中の栄養成分検査の技能試験（2017–2018）. 食

減圧・100 °C の条件の適用が望ましかった。ただし、乾燥果実が使用されている場合は、減圧・70 °C の条件で適切な結果が得られると考えられた。菓子類
は水分含量が少ないため、乾燥条件の違いによる水分分析値の差が 40%程度ある場合でも、炭水化物の値にはほとんど影響しなかった。野菜・果物加工品

品衛生学雑誌 2020; 61(2): 63-71.
4) 日本食品衛生協会. 食品衛生検査指針 理化学編
2015. 日本食品衛生協会; 2015. 20-32.
5) 安井明美，渡邊智子，中里孝史，渕上賢一. 日本
食品標準成分表 2015 年版（七訂）分析マニュア
ル・解説. 建帛社; 2016. 11-24.

は、減圧・70 °C または減圧・60 °C の条件で適切な結果が得られた。大豆加工品及びチーズではそれぞれ 2 つの条件で乾燥を行った結果、どちらを適用しても良いと考えられた。乾燥条件の違いによる水分分析値の差は、菓子類が 5.0～40%、野菜・果物加工品が 0.35～2.7%、大豆加工品及びチーズが 0.15～

6) 日本薬学会. 衛生試験法・注解 2020. 金原出版;
2020, 197-199.

用されうる複数の乾燥条件で水分分析を行うことが望ましいと考えられた。
ま と め

1.7%であり、水分含量の少ない検体で大きくなる傾向にあった。一方、これらの差を炭水化物に換算す
ると、菓子類が 0.34～2.5%、野菜・果物加工品が 3.8～30%、大豆加工品及びチーズが 0.40～41%となっ- 46 -

Annual Report of Osaka Institute of Public Health, 5, 2021

Moisture content analysis of food products for nutrition-labeling compliance test

Tomomi YAMASAKI, Yo KAKIMOTO, Masami KI, Takuyuki HAGIWARA and Masanao SHINYA

Moisture contents of confectionery products, vegetable and fruit products, soybean products and cheese were determinedby drying method at various temperatures at normal pressure or reduced pressure. When confectionery products weredried at 135 °C, changes and volatilization of components other than water were remarkable. For drying of confectionery
products, 100 °C at normal or reduced pressure were considered appropriate. When vegetable and fruit products weredried at 135 °C and 100 °C, changes and volatilization of components other than water were remarkable. For drying ofvegetable and fruit products, 70 °C at reduced pressure or 60 °C at reduced pressure were considered appropriate. For
soybean products and cheese, the two conditions examined were applicable. In the sample with a small amount ofcarbohydrates, even if the difference in water analysis value due to the difference in drying conditions was as small as afew percent, there was a large difference in terms of carbohydrates.

Key words：nutrition analysis, nutrition labeling, Food Labeling Act, drying method

Osaka Institute of Public Health- 47 -

報 文

地方独立行政法人大阪健康安全基盤研究所研究年報 Ann. Rep. Osaka. Inst. Pub. Health, 5, 48-54 (2021)

分析機器更新による動物用医薬品一斉分析法の妥当性評価

山口瑞香, 粟津 薫, 白川育子, 野村千枝, 永吉晴奈, 福井直樹, 新矢将尚

食品中の残留動物用医薬品の一斉分析法の妥当性評価を行った。LC-MS/MS の更新に伴い、検出感度が向上したため、方法の一部を見直した。48 成分の動物用医薬品を用いて添加回収試験を実施した結果、
一部を除き、妥当性評価ガイドラインの目標値を満たした。

キーワード：液体クロマトグラフ-タンデム質量分析計(LC-MS/MS)、合成抗菌剤、駆虫剤、妥当性評価

当所では以前より食肉、魚介類、牛乳および鶏卵中の動物用医薬品の分析を行っており、サ
ルファ剤、キノロン系抗菌剤、葉酸拮抗剤および駆虫薬を対象とした一斉分析法を用いてきた。
既報 1)では、前処理の過程で遠心エバポレータ
ーによる濃縮操作を行なっていた。しかし、機器の更新により検出感度が向上したため、濃縮が不要となった。この方法を用いて、動物用医薬品の妥当性評価を行なったので報告する。
実 験 方 法1. 試料および試薬等(1) 試料：市販の鶏卵、牛乳、鶏肉、牛肉、豚肉、サケ、エビおよびハマチを用いた。
(2) 標準品：混合標準溶液は、富士フィルム和光純薬(株)製動物用医薬品混合標準液サルファ剤＋葉酸拮抗剤およびキノロン剤を用いた。
駆虫薬の Albendazole sulfone、Oxibendazole、Thiabendazole、5-OH Thiabendazole、Praziquantel、Flubendazole、Levamisole は富士フィルム和光純
薬(株)製、2-Amono flubendazole は Sigma-Ardrich
社製、Parbendazole は USP 製を用いた。
(3) 試薬等：アミノプロピル基を結合した固相
抽出遠心カラムは GL Science 社製 MonoSpin L
NH2、メンブランフィルターはアドバンテック
東洋(株)製 DISMIC(親水性 PTFE, 13 mmφ, 0.2µm)、残留農薬試験用ヘキサンおよび無水硫酸ナトリウム、LC/MS 用アセトニトリル、メタノ
大阪健康安全基盤研究所衛生化学部食品化学 1 課

ールおよびぎ酸、試薬特級ぎ酸は富士フィルム
和光純薬(株)製を使用した。水は富士フィルム
和 光 純 薬 ( 株 ) 製 LC/MS 用 超 純 水 ま た は
Merckmillipore 社製 Milli-Q Integral3 により精製して用いた。
2. 装置および測定条件(1) 装置：高速ホモジナイザーはポリトロン
PT3100(KINEMATICA 社 製 ) 、 遠 心 分 離 器 は
himac CF7D2 (日立工機(株)製)、高速振とう機は
CM−1000(東京理化器械(株)製)、LC-MS/MS はAQUITY UPLC I-Class-Xevo TQ-XS(Waters 社製)を使用した。
(2) LC-MS/MS 測定条件
分 析 カ ラ ム ： Waters CORTECS UPLC C18(100×2.1 mm i.d., 1.6 µm)、カラム温度：50ºC、
流速：0.2 mL/min、注入量：1 µL、移動相：A
液；0.1%ぎ酸水溶液 B 液；0.1%ぎ酸メタノー
ル 、 グ ラ ジ エ ン ト 条 件 ； B%:10%(0-5 min),
10-74% (5-17 min), 95% (17.1-22 min)、イオン化
モード：ESI(+/-)、測定モード：SRM、イオン源
温度：150℃、コーンガス(窒素)流量：200L/h、
脱溶媒ガス(窒素)温度および流量：600℃および1000 L/h。物質ごとの条件は表 1 に示した。
3. 試験溶液の調製(1) 抽出:筋肉試料は細切均一化し、鶏卵は複数個を割り均一化した。牛乳はそのまま試験に供した。試料 2 g を 50 mL 遠沈管に計り採り、1%- 48 -

ぎ酸含有ヘキサン飽和アセトニトリル 15 mL お
よび無水硫酸ナトリウム 5 g を加え、高速ホモジナイザーで混合粉砕した。3,000 rpm で 5 分間
遠心分離した後、上清を新しい 50 mL 遠沈管に分取した。残渣に 1%ぎ酸含有ヘキサン飽和ア
セトニトリル 15 mL を加えて高速振とう器で 5
分間振とうし、同様に遠心分離後、上清を合わ
せ、1%ぎ酸含有ヘキサン飽和アセトニトリルで30 mL に定容した。ここにヘキサン 10(a)Intensity
mL を加えて高速振とう器で約 5 分間振
50000
45000
とう後、3,000 rpm で 5 分間遠心分離した
40000
35000
下層を抽出液とした。
30000
25000
(2) 精製: 15 mL 遠沈管に MonoSpin L
20000
15000
NH2 を付け、抽出液 750 µL を負荷して
10000
5000
3,000 rpm で約 5 分間遠心分離した。ここ
08.5に 1%ぎ酸含有ヘキサン飽和アセトニト
リル 200 µL を加え、同様に遠心分離した。
MonoSpin L NH2 を外して水を加えて 1 mL とした。これをさらに水で 5 倍に希釈し、メンブラ
ンフィルターでろ過したものを試験溶液とした。
4. 検量線の作成
マトリックス入り標準溶液は各試料の種類に応じて調製した。添加試料と同様に抽出および精製を行なったブランク溶液に標準溶液を添加し、0.05〜2 ng/mL となるように調製した。
5. 妥当性評価「食品中に残留する農薬等に関する試験法の妥当性評価ガイドライン」2)に基づき、鶏卵、牛乳、豚肉およびサケについて妥当性評価試験(分析者 5 名、2 併行×1 日間)を行なった。牛肉、鶏肉、エビおよびハマチについては併行精度評
価(6 併行)のみを行なった。各試料に 0.01、0.1µg/g となるよう標準溶液を添加し、上記方法にて試験を行なった。
結 果 及 び 考 察
1. LC-MS/MS の最適化
2020 年に質量分析計を Waters 社製の Xevo
TQ-S から Xevo TQ-XS に更新した。測定条件の最適化のため、動物用医薬品の標準溶液を測定した。しかし、キノロン剤の一部ではピーク形状が不良となった(図 1a)。キノロン系抗菌剤は、カルボニル基を有する化学構造の為、金属とキレートを作りやすい物質としても知られている。
今回のピーク形状の不良はこのためであると考えられた。そこで、装置や分析カラムの金属部分を不活化させることにより、ピーク形状を良好にすることができた(図 1b)。これらの検討の結果、Xevo TQ-S より検出感度が向上し、定量下限を下げることができた。
(b)
Intensity
500000450000400000350000300000250000200000150000100000
50000
0
9

9.5

min

10

10.5

8.5

9

9.5

10

10.5

min


図 11 DanofloxacinDanofloxacin のクロマトグラム(a)
(b)
(a)最適化前、(b)最適化後

2. 試験法の検討
LC-MS/MS の移動相の初期条件は 0.1%ぎ酸含有 10%メタノール溶液であり、試験溶液がこの組成に近い溶媒でない場合に、保持時間のズレや、ピーク形状の異常が認められた。そのため従来は、試験溶液を初期条件の組成を近づけるため濃縮して 10%メタノール溶液に再溶解していた。しかし、LC-MS/MS の更新に伴って検出感度が向上したため、遠心エバポレーターでアセトニトリルを除去して溶媒を置換する必要がなくなった。そこで、MonoSpin L NH2 からの溶出液を水で希釈して初期条件に近い 20%アセトニトリル水溶液にすることとした。濃縮操作が不要となり、前処理時間を短縮することができた。
3. マトリックス効果の検証
マトリックス添加標準溶液と溶媒標準で検量線を作成し、検量線の傾きを比較することにより、各試料のマトリックス効果について検証した。鶏卵、牛乳、豚肉およびサケについて 0.05
〜2 ng/mL の範囲で作成した検量線を比較した
結果、マトリックス添加標準溶液と溶媒標準の検量線の傾き比は、85〜120%であった(表 2)。
概ねマトリックスの影響はなく、溶媒標準の検量線でも定量できると考えられた。しかし、実際の定量結果では、牛乳のキノロン剤の一部で、- 49 -

溶媒標準で定量した場合のみ目標値 2)を満たさないものがあった。そのため、マトリックス検量線での定量を行うこととした。

果は、概ね妥当性評価ガイドラインを満たすものであり日常の検査に利用できると考えられた。
利 益 相 反4. 妥当性評価結果
上記方法にて妥当性評価を実施した結果を表3 に示した。下線で示した一部試料の駆虫剤の代謝物については真度が 70%未満であったため
妥当性評価ガイドラインの目標値を満たさなかった。その他の物質は、真度が 70〜117%、併行精度が 11%以下、室内精度が 14%以下であり、概ね良好な結果であった。
ま と め

開示すべき利益相反はない。
文 献1) 山口瑞香，𠮷田優子，永吉晴奈，柿本健作，
白川育子，北川陽子，梶村計志. 畜水産物
中の動物用医薬品の一斉分析法の妥当性評
価 地方独立行政法人大阪健康安全基盤研
究所年報 2018; 2: 53- 59.
2）平成 22 年厚生労働省食安発 1224 第 1 号 1

LC-MS/MS を使用した畜水産物中の動物用医薬品一斉分析法を確立した。添加回収試験の結Compound

表 1LC-MS/MS
LC-MS/MS 測定条
件 posi/nega Precursor ion Product ion1 Product ion2 Retention time

Enrofloxacin
Ciprofloxacin
Ofloxacin
Orbifloxacin
Sarafloxacin
Difloxacin
Danofloxacin
Norfloxacin
Marbofloxacin
Oxolinic acid
Nalidixic acid
Flumequine
Piromidic acidSulfaethoxypyridazine
Sulfaquinoxaline
Sulfachlorpyridazine
Sulfadiazine
Sulfadimidine
Sulfadimethoxine
Sulfacetamide
Sulfathiazole
Sulfadoxine
Sulfatroxazole
SulfanitranSulfapyridine
Sulfabromomethazine sodium
Sulfabenzamide
Sulfamethoxazole
Sulfamethoxypyridazine
Sulfamerazine
Sulfamonomethoxine
Sulfisozole
Sulfisomidine
Sulfametoxydiazine
Sulfisoxazole
Ormetoprim
Diaveridine
Trimethoprim
Pyrimethamine
Albendazole metabolite
Oxibendazole
Thiabendazole
5-OH-Thiabendazole
Parbendazole
Praziquantel
Flubendazole
2-Aminoflubendazole
Levamisole

+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
−
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+

(m/z )
360
332
362
396
386
400
358
320
363
262
233
262
289
295
301
285
251
279
311
215
256
311
268
334
250
357
277
254
281
265
281
240
279
281
268
275
261
291
249
240
250
202
218
248
313
314
256
205

(m/z )
316
231
318
295
342
356
340
233
72
244
215
202
271
156
156
156
156
186
156
156
156
156
92
136
156
92
156
156
92
92
156
156
124
92
156
123
245
230
177
133
218
175
147
216
203
123
123
178

(m/z )
245
314
261
352
299
299
314
276
320
216
187
244
243
92
92
92
92
92
92
92
92
92
156
270
92
156
92
92
156
156
92
92
186
156
92
259
123
123
233
198
176
131
191
145
83
282
95
91

(min)
9.0
8.5
8.0
9.3
9.5
9.4
8.9
8.1
6.9
11.5
13.2
13.6
15.1
10.5
11.6
8.5
2.8
7.9
11.3
2.1
3.4
9.6
9.1
13.3
4.1
13.5
10.0
8.8
8.1
4.9
8.9
4.9
2.9
7.0
9.5
8.3
5.3
7.1
11.2
4.4
12.2
6.9
4.7
14.4
16.4
14.7
11.2
3.4

- 50 -

表 2 検量線の傾き比2 (%)
salmon
pork
egg
(%)

Enrofloxacin
Ciprofloxacin
Ofloxacin
Orbifloxacin
Sarafloxacin
Difloxacin
Danofloxacin
Norfloxacin
Marbofloxacin
Oxolinic acid
Nalidixic acid
Flumequine
Piromidic acidSulfaethoxypyridazine
Sulfaquinoxaline
Sulfachlorpyridazine
Sulfadiazine
Sulfadimidine
Sulfadimethoxine
Sulfacetamide
Sulfathiazole
Sulfadoxine
Sulfatroxazole
SulfanitranSulfapyridine
Sulfabromomethazine sodium
Sulfabenzamide
Sulfamethoxazole
Sulfamethoxypyridazine
Sulfamerazine
Sulfamonomethoxine
Sulfisozole
Sulfisomidine
Sulfamethoxydiazine
Sulfisoxazole
Ormetoprim
Diaveridine
Trimethoprim
Pyrimethamine
Albendazole metabolite
Oxibendazole
Thiabendazole
5-OH-Thiabendazole
Praziquantel
Parbendazole
Flubendazole
2-Aminoflubendazole
Levamisole

97
102
99
93
97
101
96
99
100
93
94
95
98
91
89
91
92
91
92
91
92
91
93
92
91
91
91
94
92
91
91
90
92
93
91
94
95
95
95
95
96
97
97
90
96
93
98
97

95
97
95
88
95
95
94
95
91
96
94
93
93
87
85
87
89
86
87
87
87
87
87
91
87
86
87
88
88
87
89
88
88
88
88
91
92
90
91
91
91
94
94
83
92
87
94
93

106
104
99
99
98
102
101
101
106
99
99
100
101
92
91
93
93
92
93
93
91
93
93
92
92
89
93
92
91
93
93
95
93
92
92
96
99
98
98
98
98
98
99
94
98
95
99
98

milk
107
115
99
100
105
107
110
107
104
98
102
106
99
105
105
111
110
110
103
109
111
108
110
120
110
101
114
109
110
111
108
110
106
110
108
96
96
98
96
107
95
98
96
105
93
94
104
97

hen egg
CompoundEnrofloxacin
Ciprofloxacin
Ofloxacin
Orbifloxacin
Sarafloxacin
Difloxacin
Danofloxacin
Norfloxacin
Marbofloxacin
Oxolinic acid
Nalidixic acid
Flumequine
Piromidic acidSulfaethoxypyridazine
Sulfaquinoxaline
Sulfachlorpyridazine
Sulfadiazine
Sulfadimidine
Sulfadimethoxine
Sulfacetamide
Sulfathiazole
Sulfadoxine
Sulfatroxazole
SulfanitranSulfapyridine
Sulfabromomethazine sodium
Sulfabenzamide
Sulfamethoxazole
Sulfamethoxypyridazine
Sulfamerazine
Sulfamonomethoxine
Sulfisozole
Sulfisomidine
Sulfamethoxydiazine
Sulfisoxazole
Ormetoprim
Diaveridine
Trimethoprim
Pyrimethamine
Albendazole metabolite
Oxibendazole
Thiabendazole
5-OH-Thiabendazole
Parbendazole
Praziquantel
Flubendazole
2-Aminoflubendazole
Levamisole

Spiked level: 0.01 µg/g
recrepeatInter.Pre
109
3.2
4.6
97
3.9
8.2
109
5.3
5.3
110
2.3
3.2
107
3.5
4.5
109
2.4
3.2
108
1.9
2.6
95
6.3
10.2
109
3.7
3.7
101
4.2
4.3
104
2.4
5.6
105
3.0
3.3
106
6.8
6.8
88
5.0
5.0
90
5.6
5.8
87
6.1
6.4
89
4.0
4.0
90
5.6
5.6
92
6.4
6.4
91
4.6
4.6
86
4.4
4.4
92
4.7
4.7
91
6.8
6.8
101
5.2
5.5
89
5.3
5.3
95
4.9
4.9
92
4.2
4.7
91
6.2
6.2
88
5.7
5.7
91
5.2
5.2
91
5.0
5.3
92
5.1
5.1
88
4.5
4.5
90
4.2
4.2
90
4.6
4.6
95
2.8
2.8
94
2.8
2.8
96
3.6
3.6
102
3.1
3.1
84
2.9
3.2
101
3.3
3.7
99
3.7
4.3
94
4.6
5.4
108
2.9
2.9
107
2.9
2.9
107
3.0
3.7
93
3.5
3.5
100
5.3
5.3

表 3 妥当性評価結3 
果
Spiked level: 0.1 µg/g
recrepeatInter.Pre
105
1.1
2.7
96
3.3
4.2
100
2.6
2.6
111
1.2
1.8
101
2.6
3.1
106
2.6
2.6
104
1.3
1.6
94
2.3
2.5
103
1.0
3.6
103
3.2
3.2
104
1.2
1.8
105
1.4
1.4
104
4.0
7.7
92
2.9
3.8
93
2.5
3.5
92
1.4
3.0
92
2.4
3.4
92
2.8
3.7
94
2.6
3.5
94
2.4
3.2
89
3.2
3.8
94
2.9
3.7
93
3.0
4.6
101
1.5
1.9
91
3.1
3.5
96
2.2
4.2
94
2.1
3.5
94
1.9
4.0
91
2.5
4.0
92
2.6
3.8
93
2.7
4.5
94
2.1
3.8
89
2.8
3.0
93
2.7
3.8
93
3.0
3.9
95
1.9
2.7
93
1.3
1.6
94
1.2
1.3
97
1.3
2.2
83
1.4
1.5
101
1.1
1.3
98
2.1
2.8
92
2.7
2.9
108
0.9
1.0
109
1.9
1.9
107
1.7
2.5
87
2.0
2.0
99
1.1
2.2

- 51 -

bovine milk
Spiked level: 0.01 µg/g
Spiked level: 0.1 µg/g
recrepeatInter.Prerec
repeatInter.Pre
111
2.4
4.2
105
2.0
4.7
104
5.4
5.4
102
3.4
3.4
112
1.9
2.4
102
2.8
3.5
114
1.2
2.8
113
1.6
2.9
109
6.5
6.5
104
1.5
3.5
113
2.5
3.2
108
1.3
3.9
113
3.2
5.0
106
1.4
3.5
106
3.0
5.6
100
2.1
2.8
112
2.8
2.9
105
2.9
3.5
106
3.3
4.3
107
2.6
3.4
106
5.3
5.6
103
1.3
1.6
106
1.9
4.0
106
2.0
2.9
109
6.2
6.2
111
1.6
5.3
93
0.7
2.5
94
1.7
2.3
96
2.0
3.1
95
1.3
2.4
93
1.2
1.4
94
1.7
1.7
93
1.0
3.0
94
1.2
2.3
93
2.3
2.7
94
2.0
3.0
94
2.7
3.0
96
0.9
2.1
94
0.9
1.9
95
1.5
2.2
93
1.3
2.4
93
1.4
2.5
94
0.6
2.5
94
1.8
2.7
96
3.6
4.9
95
2.2
2.4
102
6.6
6.6
100
1.9
2.3
93
1.2
2.4
93
1.4
2.0
100
1.2
1.6
97
1.3
2.1
93
1.6
2.2
95
1.7
2.2
97
2.9
4.3
95
1.9
1.9
91
3.0
3.3
93
1.9
3.3
94
1.9
2.9
94
1.7
2.1
94
2.3
3.8
94
2.0
2.6
95
1.7
3.7
95
1.7
2.3
92
0.9
2.5
91
1.4
2.1
95
2.0
3.2
94
1.5
2.3
95
1.9
4.0
94
1.3
2.3
97
1.3
2.6
96
1.9
2.3
97
1.3
2.9
94
1.6
1.9
96
2.0
3.8
95
1.3
1.9
103
1.5
2.9
98
2.0
2.0
91
2.3
3.1
88
1.5
2.1
103
1.2
3.1
100
1.6
2.5
100
7.1
7.7
98
2.0
2.4
98
1.8
3.5
94
2.4
3.0
107
2.7
2.7
107
1.0
1.9
110
3.1
4.0
112
1.7
4.0
108
2.4
2.8
108
1.3
2.1
102
1.9
2.7
95
1.4
1.9
100
1.2
2.3
96
2.4
2.8

pork
CompoundEnrofloxacin
Ciprofloxacin
Ofloxacin
Orbifloxacin
Sarafloxacin
Difloxacin
Danofloxacin
Norfloxacin
Marbofloxacin
Oxolinic acid
Nalidixic acid
Flumequine
Piromidic acidSulfaethoxypyridazine
Sulfaquinoxaline
Sulfachlorpyridazine
Sulfadiazine
Sulfadimidine
Sulfadimethoxine
Sulfacetamide
Sulfathiazole
Sulfadoxine
Sulfatroxazole
SulfanitranSulfapyridine
Sulfabromomethazine sodium
Sulfabenzamide
Sulfamethoxazole
Sulfamethoxypyridazine
Sulfamerazine
Sulfamonomethoxine
Sulfisozole
Sulfisomidine
Sulfamethoxydiazine
Sulfisoxazole
Ormetoprim
Diaveridine
Trimethoprim
Pyrimethamine
Albendazole metabolite
Oxibendazole
Thiabendazole
5-OH-Thiabendazole
Parbendazole
Praziquantel
Flubendazole
2-Aminoflubendazole
Levamisole

salmonSpiked level: 0.01 µg/g
recrepeatInter.Pre

rec

108
92
104
106
101
110
108
90
109
102
101
102
107
92
92
94
93
92
95
95
90
94
93
99
92
96
94
94
93
94
94
95
89
94
94
92
90
92
98
78
100
94
69
102
109
103
89
98

100
89
96
103
97
101
99
87
106
101
99
102
105
92
92
93
92
93
94
93
90
93
93
96
92
93
93
93
91
93
92
94
88
93
92
90
88
88
93
77
96
93
64
101
105
102
82
95

2.3
0.6
3.0
3.1
3.7
1.9
2.6
3.8
3.2
2.4
3.0
1.4
3.6
1.0
1.5
3.7
1.7
1.8
1.7
1.8
1.3
1.8
3.9
4.6
2.3
4.7
1.5
2.7
3.1
1.8
2.3
2.1
2.1
2.0
4.0
2.9
1.4
1.8
2.9
3.0
1.2
3.2
3.2
2.1
1.3
1.3
2.1
1.5

3.0
3.9
3.1
4.9
5.2
3.9
4.2
10.0
4.2
3.9
6.0
3.4
4.7
4.8
5.0
6.9
5.6
6.3
2.4
5.5
4.7
4.8
6.5
8.3
5.5
6.3
4.4
5.8
6.4
5.3
6.4
4.7
5.7
5.6
5.8
4.8
3.7
2.5
4.2
5.2
2.3
5.5
9.0
4.3
4.0
3.0
4.3
3.4

Spiked level: 0.1 µg/g
repeatInter.Pre
2.9
1.5
1.7
2.3
1.2
1.6
0.7
3.4
2.8
3.0
1.0
1.5
1.8
1.3
1.6
0.8
1.3
1.6
1.4
1.4
1.4
1.3
2.1
3.1
1.1
1.0
1.4
1.5
1.7
1.5
2.1
1.2
1.0
0.9
2.3
1.8
0.9
1.3
1.7
1.2
1.0
3.1
1.9
1.9
1.4
1.3
0.9
2.2

4.3
3.2
2.5
4.3
2.2
4.2
4.8
4.9
5.6
4.8
3.4
3.6
3.2
3.5
2.5
4.4
2.7
2.7
2.1
3.3
3.6
2.5
3.0
4.0
3.5
3.1
3.7
3.4
4.2
3.6
2.4
2.8
3.6
3.3
3.3
3.2
2.7
3.4
3.0
4.5
4.1
3.2
10.7
3.3
5.0
3.2
5.0
3.9

- 52 -

Spiked level: 0.01 µg/g
recrepeatInter.Pre

rec

106
90
101
98
98
106
104
82
105
98
101
99
102
88
88
89
89
88
89
90
86
90
87
96
88
90
89
88
87
90
90
93
85
90
90
89
87
89
94
74
96
92
80
96
101
97
84
96

96
86
93
94
93
96
95
86
97
98
95
98
99
88
89
89
89
89
89
90
86
90
90
93
88
90
89
89
88
89
90
92
85
89
89
87
85
85
90
73
92
90
78
95
97
94
77
92

4.5
4.2
5.0
4.3
7.8
6.2
2.9
7.8
4.2
2.3
4.0
3.2
2.3
2.9
3.2
2.6
3.3
2.3
3.0
2.7
3.2
3.2
5.2
8.0
3.1
6.6
3.7
3.9
1.9
2.6
3.3
4.1
3.2
3.4
4.8
3.8
2.9
2.6
2.3
3.7
2.8
5.0
3.3
3.3
2.3
2.5
2.0
2.4

8.0
5.1
5.0
4.7
7.8
7.4
3.7
9.0
5.0
4.4
7.0
4.9
6.3
5.1
5.3
5.7
6.0
5.3
5.0
5.5
5.1
4.7
6.6
14.1
5.2
6.6
5.7
5.5
5.3
5.8
5.3
5.5
5.7
5.5
6.8
4.6
4.7
4.2
4.7
7.0
3.9
5.0
6.8
4.3
4.6
3.3
4.3
4.7

Spiked level: 0.1 µg/g
repeatInter.Pre
3.9
1.8
2.5
2.9
1.7
1.7
2.6
3.9
2.0
4.3
1.9
2.8
2.7
2.1
2.3
2.1
1.8
2.1
2.5
2.0
1.8
1.5
2.6
2.6
2.0
1.4
2.5
2.7
1.5
2.7
2.7
2.1
1.7
2.1
1.7
2.2
2.1
1.9
2.2
1.7
2.5
2.9
2.5
2.6
2.2
2.8
1.5
3.0

5.2
5.0
4.0
4.5
3.2
4.8
5.5
6.7
4.6
6.0
5.0
5.9
4.9
4.7
5.5
4.5
4.5
4.3
5.1
4.8
4.9
5.0
4.9
5.4
5.1
4.7
5.2
5.2
4.3
4.9
5.0
5.6
4.9
5.3
5.0
5.3
5.0
4.7
5.1
6.1
5.7
6.0
6.8
5.2
5.0
5.5
5.4
5.4

beef
Spiked level: 0.01 µg/g
Spiked level: 0.1 µg/g
recrepeatrec
repeatEnrofloxacin
98
6.0
85
3.8
Ciprofloxacin
79
6.6
73
4.1
Ofloxacin
91
4.3
81
4.2
Orbifloxacin
91
4.9
91
3.3
Sarafloxacin
89
6.8
80
2.6
Difloxacin
101
1.8
91
3.2
Danofloxacin
95
2.9
82
4.6
Norfloxacin
77
3.7
71
3.6
Marbofloxacin
100
5.8
94
3.5
Oxolinic acid
86
3.2
82
3.8
Nalidixic acid
84
3.9
84
2.5
Flumequine
84
2.9
87
2.3
Piromidic acid
91
3.2
94
3.0
Sulfaethoxypyridazine
77
3.6
76
2.9
Sulfaquinoxaline
76
5.0
76
3.3
Sulfachlorpyridazine
78
3.1
75
3.1
Sulfadiazine
78
4.2
77
2.5
Sulfadimidine
78
3.3
76
2.0
Sulfadimethoxine
78
4.0
78
2.8
Sulfacetamide
77
3.3
76
2.4
Sulfathiazole
72
4.7
73
3.6
Sulfadoxine
80
2.9
78
2.6
Sulfatroxazole
79
3.6
79
1.5
Sulfanitran
77
5.7
80
3.1
Sulfapyridine
78
3.2
76
2.8
Sulfabromomethazine sodium
78
4.8
79
4.3
Sulfabenzamide
77
4.9
75
3.8
Sulfamethoxazole
81
3.5
77
2.4
Sulfamethoxypyridazine
78
4.0
76
3.7
Sulfamerazine
78
2.3
77
2.6
Sulfamonomethoxine
76
3.5
77
3.6
Sulfisozole
78
3.7
77
2.0
Sulfisomidine
73
3.4
73
3.1
Sulfamethoxydiazine
78
5.2
76
2.7
Sulfisoxazole
77
5.8
76
2.8
Ormetoprim
74
2.8
73
3.4
Diaveridine
74
2.5
71
3.3
Trimethoprim
74
3.3
72
3.3
Pyrimethamine
81
2.7
77
3.3
Albendazole metabolite
61
4.8
63
4.4
Oxibendazole
84
2.1
83
2.1
Thiabendazole
80
3.5
81
2.8
5-OH-Thiabendazole
56
6.7
47
3.0
Parbendazole
90
2.4
89
2.7
Praziquantel
96
2.8
95
2.3
Flubendazole
91
3.0
94
2.6
2-Aminoflubendazole
74
10.6
70
3.0
Levamisole
83
1.8
79
2.6
CompoundchickenSpiked level: 0.01 µg/g
Spiked level: 0.1 µg/g
recrepeatrec
repeat
91
5.1
80
3.6
72
3.0
73
2.6
88
1.2
75
3.9
90
4.4
85
3.1
91
3.9
76
3.9
99
5.5
83
3.3
93
5.3
79
3.3
77
7.9
74
5.1
100
4.2
86
4.6
84
5.0
80
3.5
83
3.9
80
3.2
82
4.1
83
2.9
86
5.6
86
3.7
76
3.5
74
2.5
77
4.4
75
3.0
77
4.1
74
2.4
76
2.7
75
2.7
76
3.4
74
2.2
77
3.6
74
2.7
76
2.7
75
2.7
71
3.5
72
3.1
77
3.4
75
2.1
77
3.4
75
3.6
80
4.8
77
3.6
76
2.7
74
2.6
78
3.8
76
3.2
79
3.8
74
3.1
79
4.6
76
2.4
75
3.1
74
3.2
77
3.8
74
2.2
81
5.6
74
3.9
77
3.7
75
3.0
71
2.2
70
3.1
78
3.6
75
3.0
77
4.4
76
2.9
73
4.1
70
3.7
71
2.5
71
3.1
72
5.2
71
2.8
81
3.8
74
3.3
60
2.9
59
4.2
82
4.6
79
3.4
80
2.5
75
3.6
72
3.3
67
3.6
89
4.2
82
3.3
92
3.7
87
3.7
87
3.7
83
2.5
74
3.6
70
3.6
81
4.1
76
4.0

rec; recovery (%)
repeat; repeatability (%)
Inter.Pre; intermeditate precision (%)- 53 -

prawn
Spiked level: 0.01 µg/g
Spiked level: 0.1 µg/g
recrepeatrec
repeat
96
6.1
97
3.2
90
5.2
87
5.9
103
3.5
93
2.4
96
3.1
94
3.8
94
5.8
96
4.2
106
5.4
96
4.0
103
3.7
96
3.4
84
6.9
87
5.1
103
7.2
99
3.6
96
2.5
99
2.8
95
5.2
96
2.3
95
2.2
98
3.3
97
3.4
102
3.2
90
2.3
91
2.4
90
4.4
91
2.3
90
5.5
92
2.4
92
2.3
92
2.0
91
2.9
93
2.3
93
2.3
93
2.4
90
2.6
92
2.4
88
2.9
90
2.4
90
2.5
92
2.1
92
3.9
93
2.9
88
11.4
94
2.7
90
3.0
91
2.4
92
4.7
93
2.1
91
2.8
92
2.1
89
3.4
92
2.5
90
3.9
92
3.2
91
0.9
91
2.2
95
4.0
92
2.7
92
3.9
92
2.9
86
3.1
88
2.9
92
2.7
92
2.3
89
5.9
92
2.9
89
2.6
88
2.4
87
3.0
86
3.2
87
2.4
87
3.0
95
2.8
91
2.8
79
2.4
76
3.8
93
3.1
94
2.9
92
2.8
93
3.9
85
2.4
86
4.2
94
3.0
96
2.9
101
3.2
102
2.9
95
3.0
99
3.0
84
3.5
82
4.5
94
2.7
92
2.0

yellowtail
Spiked level: 0.01 µg/g
Spiked level: 0.1 µg/g
recrepeatrec
repeat
117
2.5
100
2.6
92
3.0
90
4.6
109
3.4
99
3.1
103
2.9
100
2.6
104
2.8
98
2.7
115
2.7
105
3.0
104
3.6
98
2.5
92
8.2
90
4.8
108
5.3
103
3.6
103
2.7
106
3.1
105
5.0
101
3.6
107
1.8
105
3.9
108
2.7
104
2.5
91
1.9
96
2.1
94
3.3
95
2.5
91
4.1
94
2.6
94
1.5
97
2.7
92
3.0
98
1.9
94
1.3
97
2.6
95
2.1
100
2.7
89
2.5
94
2.6
95
2.5
98
2.3
95
2.4
98
3.9
104
7.4
99
3.7
91
2.4
97
2.5
93
5.0
97
2.0
93
1.8
97
2.8
91
3.6
99
3.0
90
1.8
95
2.8
92
2.6
97
2.3
95
3.7
96
2.4
94
2.6
98
2.7
87
2.0
91
2.6
95
2.6
97
2.5
96
2.6
96
3.5
92
3.6
93
2.7
90
1.2
89
2.7
91
2.6
90
2.0
99
1.5
96
2.8
75
3.5
78
3.0
101
1.8
98
2.3
99
3.2
97
3.6
66
6.1
52
15.6
98
3.7
101
2.6
109
2.2
105
2.5
107
1.4
105
2.2
86
2.1
82
2.4
101
2.6
99
3.1

Annual Report of Osaka Institute of Public Health, 5, 2021

Validation study for analytical method of veterinary products due to the renewal of analytical
instruments

Mizuka YAMAGUCHI, Kaoru AWAZU, Ikuko SHIRAKAWA, Haruna NAGAYOSHI, Chie NOMURA, Naoki
FUKUI and Masanao SHINYA

The method for simultaneous analysis for residual veterinary drugs in food were validated. Since the detection
sensitivity was improved with the update of LC-MS/MS, a part of the method was reviewed. As a result ofrecovery test using 48 components of veterinary drugs, the target values of the validity evaluation guidelines
were satisfied except for some cases.

Key words : LC-MS/MS, synthetic antibacterial drug, anthelmintic agent, validation study

Osaka Institute of Public Health- 54 -

報 文

地方独立行政法人大阪健康安全基盤研究所研究年報 Ann. Rep. Osaka. Inst. Pub. Health, 5, 55-58 (2021)

分析機器更新によるテトラサイクリン系抗生物質分析法の妥当性評価

山口瑞香, 粟津 薫, 白川育子, 野村千枝, 永吉晴奈, 福井直樹, 新矢将尚

食品中のテトラサイクリン系抗生物質分析法の妥当性評価を行った。LC-MS/MS の更新に伴い、検出感度が向上したため、最終液を希釈して測定した。添加回収試験を実施した結果、妥当性評価ガイドラインの目標値を満たした。

キーワード：液体クロマトグラフ-タンデム質量分析計(LC-MS/MS)、テトラサイクリン系抗生物質、妥当性評価

当所では以前より魚介類および牛乳中のテトラサイクリン系抗生物質の検査を行ってきた。機器の更新により検出感度が向上したため、既報 1)の試
験溶液をさらに希釈して測定する方法を検討した。
この方法について、妥当性評価を行なったので報告する。

ム塩二水和物(EDTA)は(株)同仁化学研究所製を用いた。水は富士フイルム和光純薬(株) 製 LC/MS
用 超 純 水 ま た は Merckmillipore 社 製 Milli-Q
Integral3 により精製して用いた。ガラスビーズは
直径 1 mm のものをシラン処理して使用した。
2. 装置および測定条件(1) 装置：遠心分離器は 6200 (久保田商事(株)製)、
高速振とう機は CM−1000(東京理化器械(株)製)、
LC-MS/MS は AQUITY UPLC I-Class-Xevo TQ-XS(Waters 社製)を使用した。
(2) LC-MS/MS 測定条件
分析カラム：Waters CORTECS UPLC C18 (100×2.1
mm i.d., 1.6 µm)、カラム温度：30℃、流速：0.2
mL/min、注入量：1 µL、移動相：A 液；0.1%ぎ酸
水溶液 B 液；アセトニトリル、グラジエント条
件:B%；10-30%(0-10 min), 30-90% (10-12 min)、イ
オン化モード：ESI(+)、測定モード：SRM、イオ
ン源温度：150℃、コーンガス(窒素)流量：200 L/h、
脱溶媒ガス(窒素)温度および流量：600℃および1000 L/h。物質ごとの条件は表 1 に示した。

実 験 方 法1. 試料および試薬等(1) 試料：市販の牛乳、サケ、エビ、ハマチおよび牛肉を用いた。
(2) 標準品：オキシテトラサイクリン塩酸塩、テトラサイクリン塩酸塩、クロルテトラサイクリン
塩酸塩およびドキシサイクリンヒクラートは富士
フイルム和光純薬(株)、オキシテトラサイクリン-13C,d3 は林純薬工業(株)を用いた。
(3) 試薬等：固相抽出カラムは Waters 社製 Oasis
HLB(60 mg/3 mL,30 µm)、メンブランフィルターはア ド バ ン テ ッ ク 東 洋 ( 株 ) 製 DISMIC( 親 水 性PTFE,13 mmφ,0.2 µm)、アセトニトリル、メタノ
ールおよびぎ酸は富士フイルム和光純薬(株)製LC/MS 用、クエン酸およびリン酸二ナトリウムは富士Compoundフイルム和光純薬(株)製試
Oxytetracycline
薬特級を使用した。エチレン
Chlortetracycline
ジアミン四酢酸二ナトリウ Tetracycline

表 1 LC-MS/MS 測定条
LC-MS/MS
件
Precursor ion Product ion1 Product ion2 Retention time

Doxycycline
Oxytetracycline-13 C,d3

大阪健康安全基盤研究所衛生化学部食品化学 1 課- 55 -(m/z )
461
479
445
445
465

(m/z )
426
444
410
428
430

(m/z )
443
462
427
154
447

(min)
3.7
6.8
4.3
7.7
3.7

3. 試験溶液の調製(1) 抽出:魚介類および牛の筋肉は細切均一化し、牛乳はそのまま試験に供した。試料 2 g を 50 mL
遠沈管に量り取り、内部標準物質を添加した。ここに、EDTA 含有クエン酸緩衝液を 20 mL と約 1.5
g のガラスビーズを加え、高速振とう器を用いて1,500 rpm で 10 分振とう粉砕し均質化した後、5,000 rpm で 10 分間遠心分離を行った。この上清を抽出液とした。
(2) 精製: メタノール 3 mL と水 3 mL で前処理した固相抽出カラムに抽出液を 10 mL 負荷した。次に、4%メタノール溶液 2 mL で固相カラムを洗浄し、50%アセトニトリル溶液 1 mL で溶出した。溶出液に 0.1%ぎ酸水溶液を加え 2 mL に定容して試験液とした。機器の測定感度に合わせて試験液を0.1%ぎ酸水溶液で希釈し、メンブランフィルターでろ過して測定した。

に示した。
真度は 73〜116%、
併行精度は 6%以下、室内精度は 6%以下であった。
概ね良好な結果であり、食品中に残留する農薬等に関する試験法の妥
当性評価ガイドライン」2)の目標値を満たした。

(a)Intensity
40000
35000
30000
25000
20000
15000
10000
5000
0

(b)

3

4

5

6

min

7

8

7

8

9

Intensity
1400000
1200000
1000000
8000006000004000002000004. 検量線の作成
標準溶液に内部標準物質を添加し、0.002〜0.1
μg/mL となるように調製した。これを測定濃度に合わせ、0.1%ぎ酸水溶液で希釈して使用した。
5. 妥当性評価
牛乳、エビおよびサケについて妥当性評価試験(分析者 5 名、2 併行×1 日間)を行なった。牛肉およびハマチについては併行精度評価(6 併行)のみを行なった。各試料に 0.01 および 0.1 µg/g となる
よう標準溶液を添加し、上記方法にて試験を行なった。試験液を 10 倍に希釈して測定した。

0
3

4

5

  

6

min




9

 

 



1 テトラサイクリン類のクロマトグラム
1図
(a) TQ-S
0.125
ng/mL
TQ-XS0.1ng/mL
0.1ng/mL(a)TQ-S
0.125
ng/mL(b)(b)TQ-XS

ま と め
LC-MS/MS を使用した畜水産物中のテトラサイク
リン系抗生物質分析法を確立した。添加回収試験の結果は、概ね妥当性評価ガイドラインを満たすものであり日常の検査に利用できると考えられた。

結 果 及 び 考 察
利 益 相 反1. 試験法の検討
2020 年に質量分析計を Waters 社製の Xevo TQ-S
から Xevo TQ-XS に更新した。これに伴いテトラサ
イクリン系抗生物質の測定感度が向上した(図 1)。従来の濃度で検量線を測定した際に検量線の直線性が低下したため、測定濃度を下げることとした。測定
溶液の希釈率を 4 倍から 10 倍に変更して測定を行ったところ、検量線の直線性は良好であり、定量下限のS/N は 10 以上であった。

開示すべき利益相反はない。
文 献1） 藤田瑞香，柿本健作，田口修三，田中之雄.
LC/MS/MS による食品中のテトラサイクリン系抗生物質の分析法の検討.大阪府立公衆衛生研究所研究報告 2007; 45: 53- 59.
2） 平成 22 年厚生労働省食安発 1224 第 1 号

2. 妥当性評価結果
上記方法にて妥当性評価を実施した結果を表 2- 56 -

表 2 妥当性評価結果
2

Spiked level: 0.01 µg/g
CompoundOxytetracycline
Chlortetracycline
Tetracycline
Doxycycline
CompoundOxytetracycline
Chlortetracycline
Tetracycline
Doxycycline
CompoundOxytetracycline
Chlortetracycline
Tetracycline
Doxycycline

Spiked level: 0.1 µg/g

Spiked level: 0.01 µg/g

Salmonrec

repeatInter.Prerec

repeatInter.Pre

103
80
103
73

1.3
3.0
1.8
2.6

1.3
4.1
1.8
2.6

103
92
104
88

1.4
0.8
0.9
5.0

1.7
2.5
1.7
5.0

rec

repeatBovine milkInter.Prerec

repeatInter.Pre

104
94
101
96

3.5
2.1
1.0
2.7

1.1
1.6
1.4
1.9

1.2
2.2
1.4
4.2

4.1
2.8
1.2
3.4

100
94
99
96

Prawn
rec

repeatInter.Prerec

repeatInter.Pre

106
80
116
75

1.9
1.5
1.4
3.9

1.9
2.2
1.7
3.9

107
96
119
90

2.1
4.3
3.3
6.2

2.2
4.8
3.3
6.3

- 57 -

CompoundOxytetracycline
Chlortetracycline
Tetracycline
Doxycycline
CompoundOxytetracycline
Chlortetracycline
Tetracycline
Doxycycline

Spiked level: 0.1 µg/g
Beef

rec
95
85
96
81

repeat
1.6
4.4
1.5
2.7

rec
102
88
101
78

repeat
1.5
2.4
2.5
4.7

rec

repeat

94
81
91
84

rec

repeat

1.5
1.4
2.4
3.6

102
83
98
85

0.6
6.4
2.1
4.6

Yellowtail

rec; recovery (%)
repeat; repeatability (%)
Inter.Pre; intermeditate precision (%)

Annual Report of Osaka Institute of Public Health, 5, 2021

Validation study for analytical method of tetracyclines antibiotics due to the renewal of analytical instruments

Mizuka YAMAGUCHI, Kaoru AWAZU, Ikuko SHIRAKAWA, Haruna NAGAYOSHI, Chie NOMURA, Naoki
FUKUI and Masanao SHINYA

The validity of the tetracycline antibiotic analysis method in food was evaluated. Since the detection sensitivity
improved with the renewal of LC-MS/MS, the final solution was diluted and measured. As a result of recovery test, thetarget value of the validity evaluation guideline was satisfied.

Key words : LC-MS/MS, tetracyclines antibiotics, validation study

Osaka Institute of Public Health- 58 -

報

文

地方独立行政法人大阪健康安全基盤研究所研究年報 Ann. Rep. Osaka. Inst. Pub. Health, 5, 59-65 (2021)

水質検査における外部精度管理（2019 年度）―ナトリウム及びその化合物―

吉田仁，安達史恵水道水質検査精度の向上を図ることを目的とし、大阪府内水道事業者、保健所および公的研究機関（水道事業者等）を対象に外部精度管理を実施した。水道事業者等に水質検査用模擬試料を配付し、各機関が水道水質検査法に従って測定した検査結果を回収した。各機関の検査値を解析した結果、24 検
査値中 2 検査値が、真値に対する誤差率および Z スコアの許容範囲を超過した。外れ値と評価された
これらの機関を対象に定量精度に関するフォローアップ調査を行ったところ、前処理操作におけるナトリウムの汚染が定量値に影響を及ぼした可能性が示唆された。

キーワード：水道水、ナトリウム及びその化合物、水道水質検査、定量精度、外部精度管理（地独）大阪健康安全基盤研究所では、大阪府
健康医療部生活衛生室環境衛生課と協力して、水道水質検査精度の向上を図ることを目的に、水質検査を実施している大阪府内水道事業者、保健所
および公的研究機関（水道事業者等）を対象に外部精度管理を実施している 1-10）。

の評価値 200 mg/L が味覚の観点から現在も維持されている 11)。

2019 年度の対象項目は、無機項目として「ナトリウム及びその化合物」を選定した。水道水中のナトリウムの多くは、自然由来によるものである
が、海水、顔料・染色・パルプ工場排水などの混入や苛性ソーダによる pH 調整、次亜塩素酸ナト
リウムによる塩素処理等の浄水処理に由来することがある 11, 12）。
ナトリウムはヒトにおいて重要な元素ではあるが、食塩過剰摂取による急性影響として、けいれん、筋硬直、肺浮腫などある 12)。ただし、一般
的な飲料水中のナトリウムは 1 日のナトリウム
総摂取量のわずかにしか寄与していない。現在までに飲料水中のナトリウムとそれに関係する疾病との関係は明確になっておらず、健康影響に関する指針値は設定されていない 11)。ナトリウムの水質基準については、1992 年以降、新たに追加するべき知見がないことから 1992 年の専門委員会

本研究に参加した水道事業者等は、24 機関であった。その内訳は水道事業者 21 機関、保健所
1 機関および公的研究機関 2 機関であった。

方法

1. 参加機関2. 実施方法(1)精度管理試料の調製方法
2019 年 9 月 24 日に水道水約 30 L をポリタンクに採水し、精度管理試料とした。採水した水道
水の水質分析結果を表 1 に示す。500 mL ポリエ
チレン瓶に満水になるよう分注して冷暗所保管
した後、9 月 26 日に（地独）大阪健康安全基盤研
究所の上水試験室において各検査実施機関に配付した。
(2)試料の検査方法
検査方法は「水質基準に関する省令の規定に基づき厚生労働大臣が定める方法」（告示法）のフ
レームレス－原子吸光光度計による一斉分析法

大阪健康安全基盤研究所衛生化学部生活環境課- 59 -

表 1. 精度管理試料の水質分析結果

化合物の変動係数の目標が 10%であるためである 16）。なお、変動係数、誤差率および Z スコア
については、検査値を計算過程で丸めずに算出した。そして「外れ値」に該当した機関に対してフォローアップ調査を実施した。
結（FLAA 法）、フレーム－原子吸光光度計による一斉分析法（AAS 法）、誘導結合プラズマ発光分
光分析装置による一斉分析法（ICP-AES 法）、誘導結合プラズマ質量分析装置による一斉分析法（ICP-MS 法）およびイオンクロマトグラフ（陽イオン）による一斉分析法（IC 法）とした 13）。
配付試料については前処理を含めて 5 回の測定を実施し、測定結果を有効数字 3 桁で「外部精度管理結果報告書」に記入し、5 つの測定結果の平均値を検査値とした。また、各検査機関が実施した分析法の分析条件等を「外部精度管理結果報告書」に記入し、検査に使用した機器の測定データ
やチャート等と合わせて提出することとした。
(3)評価の検証方法およびフォローアップ
各検査実施機関から送付された「外部精度管理
結果報告書」を取りまとめた後、検査結果および検査方法等に関する評価を実施した。
はじめに、各機関内で測定された精度管理試料の 5 つの測定値の変動係数が 10%を超過した機関は評価対象外とした。
検査結果は、「真値」に対する誤差率（誤差率）
および Z スコアで評価を行い、両方の評価方法において許容範囲を超過した検査値を「外れ値」とした。
「真値」は、各機関からの検査値を用いて、有意水準を 5%として Grubbs の棄却検定 14）を行い、棄却された検査値を除いた検査値から平均を求め、これを「真値」とした。誤差率は、（1）の式から算出し、±10%以内を許容範囲とした。
誤差率（%）＝（[各機関の検査値]－[真値]）/ [真値] ×100 ……（1）Z スコアは四分位数法で算出し 15）、Z スコアの絶対値 3 未満を許容範囲とした。誤差率および変動係数の許容範囲を 10%とした根拠は、水質基準項目の測定精度におけるナトリウム及びその

果 お

よ び 考

察

1. 精度管理試料の均一性および安定性
精度管理試料の均一性を確認するために、2019
年 9 月 24 日に試料を分注順に等間隔で 5 本抜き取り、試料 1 本につき 2 回測定した。そして、得られた測定結果を基に一元配置分散分析を行った。その結果、試料間の変動は有意とならなかったため（p=0.64）、均一性に問題がないことを確認した。また、配付日、配付 1、4、7 および 14 日
後に試料を測定した結果を図 1 に示す。近似直線の傾きはほぼ 0 で、精度管理試料の安定性に問題はないと判断した。

図 1 精度管理試料に含まれるナトリウムの分析値の安定性（n = 5、平均±標準偏差）2. 検査方法
参加機関が用いた検査方法を表 2 に示す。
表 2. 参加機関の検査方法およびデータ数
検査方法
フレームレス－原子吸光光度計による一斉分析法（FLAA法）
フレーム－原子吸光光度計による一斉分析法（AAS法）
誘導結合プラズマ発光分光分析装置による一斉分析法（ICP-AES法）
誘導結合プラズマ質量分析装置による一斉分析法（ICP-MS法）
イオンクロマトグラフ（陽イオン）による一斉分析法（IC法）
計

データ数
1
1
0
2
20
24

本研究においては、IC 法でナトリウム及びその化合物の検査を実施する機関が最も多く、次いで ICP-MS 法、FLAA 法および AAS 法と続いた。
ICP-AES 法を使用した機関はなかった。

- 60 -

3. 検査結果の検証(1)誤差率、Z スコア及び「外れ値」
水道事業者等 24 機関から報告された 24 の検
査値、
変動係数、
誤差率および Z スコアを表 3 に、各機関の検査値のヒストグラムを図 2 に示す。
表 3. 外部精度管理試験における検査値の概要
機関番号

検査方法

検査値
(平均値)
(mg/L)
16.6
17.1
17.1
17.1
17.2
17.3
17.3
17.4
17.4
17.4
17.4
17.4
17.4
17.5
17.5
17.5
17.6
17.7
17.8
17.9
18.0
18.2
19.4
20.1
17.6
20.1
16.6
0.72
4.1
24

変動係数
(%)

真値に対する
誤差率
(%)
-4.61
-2.08
-1.97
-1.74
-1.51
-0.94
-0.82
-0.25
-0.25
-0.25
-0.25
-0.25
-0.02
0.21
0.32
0.44
0.67
1.47
1.81
2.39
3.07
4.57
11.0
15.0

A‐1
ICP-MS
1.78
A‐2
IC
0.26
A‐3
IC
0.92
A‐4
IC
0.32
A‐5
IC
0.26
A‐6
IC
0.86
A‐7
IC
0.00
A‐8
IC
0.57
A‐9
IC
0.00
A‐10
IC
0.00
A‐11
IC
0.00
A‐12
IC
0.00
A‐13
IC
0.31
A‐14
ICP-MS
1.24
A‐15
IC
1.62
A‐16
IC
0.26
A‐17
IC
0.51
A‐18
IC
0.00
A‐19
IC
0.85
A‐20
IC
0.31
A‐21
IC
1.49
A‐22
IC
0.30
A‐23*
AAS
0.94
A‐24*
FLAA
4.80
平均値
最大値
最小値
標準偏差
変動係数(%)
n
真値：17.4 mg/L
*真値に対する誤差率が±10%を超え、Zスコアの絶対値が3以上の機関

Zスコア
-2.51
-1.09
-1.03
-0.90
-0.77
-0.45
-0.39
-0.06
-0.06
-0.06
-0.06
-0.06
0.06
0.19
0.26
0.32
0.45
0.90
1.09
1.41
1.80
2.63
6.23
8.48

図 2. 検査法別の検査値のヒストグラム（*：外れ値）
機関内変動係数が 10%を超過した検査値は存在しなかったため、すべての検査値を評価対象とした。
はじめに、「真値」を算出するため、検査値を有意水準 5%で Grubbs の棄却検定を行った。その結果、2 検査値（A-23 および A-24）が棄却され、残りの 22 検査値を平均した 17.4 mg/L を「真値」とした。誤差率の許容範囲を超えたのは 2 機関
（A-23 および A-24）であり、誤差率はそれぞれ、
誤差率と Z スコアとの両方の許容範囲を超えた検査値を「外れ値」と評価したが、この「外れ値」に該当する機関は 2 機関（A-23 および A-24）であった。
外れ値の存在率は 8.3%（2/24）であった。
「外れ値」となった機関 A-23 および A-24 に対してフォローアップ調査を行った。
(2)フォローアップ調査
機関 A-23 は、AAS 法を用いており、検査値は19.4 mg/L、Z スコアは 6.23 および誤差率は 11.0%であった。提出された資料から告示に逸脱する点等は見られなかった。機関 A-23 の検査担当者に問い合わせたところ、空試験の結果が検量線の下限値未満であったが、普段の検査結果より 2 倍程度高かったことが明らかになった。検査担当者は、
精度管理試料の希釈等に使用した精製水を入れた洗瓶にナトリウムが混入していたのではないかと回答した。空試験の結果を減算して再計算をした結果、検査値は 17.1 mg/L となり誤差率は1.9%となった。そこで、機関 A-23 の検査担当者に前処理時にナトリウムの汚染に留意するよう助言した。具体的には、検査に使用する精製水は使用直前に用意すること、洗瓶については分析毎に精製水を入れ替えること、使用する器具は使用直前に精製水でリンスして乾燥させることを助言した。その後、機関 A-23 の検査担当者は、再試験を実施した。再試験の際、検査担当者は、我々の助言に加え前処理時の汚染を低減させるために加熱時間をこれまでの 2 時間から 1 時間～1.5
時間程度に短くした。その結果、検量線の下限値に対する空試験の吸光度の比が 0.258 から 0.225に改善された。そして、検査値は 17.4 mg/L とな
り、当所が測定した再調製試料の検査値 16.7
mg/L に対して誤差率 4.56%と良好な結果を得る
ことができた。ナトリウムは一般環境中に広く存在する物質であるため、汚染が発生しやすい検査
項目と考えられる。特に、IC 法以外の方法の内、AAS 法および FLAA 法は加熱操作に加え希釈操作が必要となるため、前処理中の雰囲気からの汚染に注意が必要である。そのため、今回の事例の様に空試験が普段の値より高値を示した場合は、検査値の精度が低下している可能性があるため、留意する必要があることが明らかになった。

- 61 -

機関 A-24 は、FLAA 法を用いており、検査値
は 20.1 mg/L、Z スコアは 8.48、「真値」に対する誤差率は 15.0%であった。提出された資料から、
機関 A-24 では、測定波長が 330.2 nm で告示法の589 nm とは異なっていた。また、告示法で定められている加熱操作を実施していなかった。さらに、分析装置の動作不良により 2 週間以内の検査が実施できなかった。機関 A-24 の検査担当者に問い合わせたところ、測定波長が告示法と異なった理由として、告示法通りの測定波長ではナトリ
ウムの吸光度が高すぎるため、感度を低下させるために波長を変更していたことがわかった。また、
現在使用している原子吸光光度計について、機器メーカーによる修理は実施したものの装置の完ことを確認することとなっている 13)。本研究ではすべての機関が空試験を実施しており、検量線の下限値を下回ることを確認していた。
② 前処理および標準液
告示法では前処理の際、元素の濃度範囲に収まるように適宜濃縮または希釈を行うように記載されている 13)。本研究では、前処理操作においてAAS 法もしくは FLAA 法で検査した 2 機関が 10～100 倍の範囲で希釈操作を実施していた。
告示法では、IC 法において孔径 0.2 µm のフィ
ルターろ過処理を行うこととなっているが機関
A-2 および A-5 では、ろ過処理を行っていなかったため、SOP の修正が必要であった。また、AAS
法、FLAA 法、ICP-AES 法および ICP-MS 法では全な復旧とはならず、機器メーカー担当者より装置の経年劣化が指摘されていたことが明らかになった。以上の結果より、告示を遵守した標準作
業手順書（SOP）を制定するとともに、検査に使用する機器は保守点検等により常に性能を維持する必要があることが明らかになった。なお、機関 A-24 では次年度に ICP-MS を新たに購入し、ナトリウムを含め FLAA 法で実施していた検査をすべて ICP-MS による検査に移行する予定であったため、今回のフォローアップでは、告示法からの逸脱部分についての助言のみを行った。
(3)全体的な留意点

加熱操作を行うこととされているが、機関 A-24
において加熱操作は行われておらず、また SOP にも加熱操作の記載がなかったため、SOP の修正が必要であった。
告示法では、標準原液、標準液または混合標準
液は原体から自己調製したもの、もしくは計量法（平成 4 年法律第 51 号）
第 136 条もしくは第 144条の規定に基づく証明書又はこれらに相当する証明書が添付され、かつ、告示法の標準原液と同濃度のもの又は告示法の標準液もしくは混合標
準液と同濃度のものの使用が認められている 13)。
また、告示法の標準液もしくは混合標準液と同濃① 検量線および空試験
告示法では別表に記載された濃度範囲内で濃度 0 mg/L を含めない 4 段階以上の標準液を用いて検量線を作成するように記載されている 13)。
すべての機関において検量点を 4 点以上用いて検量線を作成していた。一方、機関 A-14 では、検量線の点に 0 mg/L を用いていた。告示法および妥当性ガイドラインにおいては原則、検量線の点に 0 mg/L を用いないこととなっている 13,17)ため、SOP の修正が必要であった。
告示法では測定法別に元素ごとの濃度範囲を提示し、検量線はその範囲を超えてはならないとされている 13)。FLAA 法、AAS 法、ICP-AES 法、
ICP-MS 法および IC 法の上限はそれぞれ 0.2、0.6、20、200 および 200 mg/L となっている。機関 A24 では、最も高い検量点が告示の範囲を超えていたため、SOP の修正が必要であった。
告示法では空試験の判定の際、空試験の濃度が各検査機関が作成した検量線の下限値を下回る

度のものは開封後速やかに使用することとし、開封後保存したものを使用してはならない 13)。
ただし、ICP-AES 法および ICP-MS 法では、告示に定められた方法に従えば開封後保存したものについても使用できる 13)。本研究においては、すべての機関で市販の標準原液もしくは混合標準液を使用していたが、4 機関（機関 A-9、A-17、A-21
および A-22）では認証付きの製品を使用していなかった。これらの機関は認証付きの製品を使用する必要がある。標準原液もしくは混合標準液の開封時期については、すべての機関が 1 年未満であり、検量線作成用標準液は用時調製していた。
③ 妥当性試験2012 年 9 月 6 日付で厚生労働省より水道水質検査における妥当性ガイドラインについて通知
され、告示法においても妥当性試験を行うことが求められている 17）。妥当性試験とは、水道水質検査を行う検査機関が自らの SOP に示す検査方法の妥当性を評価するための手段である。妥当性- 62 -

ガイドラインは、検量線の評価と添加試料の評価が示されている。検量線の評価では、最高濃度の標準試料を測定した直後のブランク試料中の濃度が検量線の下限値を下回ることを確認するキャリーオーバーの評価、標準試料を繰り返し測定
し、定量した濃度の平均値がいずれの濃度点においても定められた目標内に収まることを確認す
る真度の評価、および標準試料を繰り返して測定した際の精度が目標内に収まることを確認する
精度の評価を実施する。添加試料の評価では、定量を妨害するピークがないことを確認する選択性の評価、添加試料を複数回測定し、得られた回収率の平均値が目標以内であることを確認する
真度の評価、および回収率の併行精度が目標内に能を維持すること。性能が維持できない場合は、機器を更新する必要がある。
(3)ナトリウムの測定では汚染の可能性がある。
とくに空試験の結果が普段の検査結果に比べて高い値になったときは、分析時に汚染が発生した可能性が懸念されるため、留意する必要がある。
謝

本研究は「令和元年度大阪府水道水質検査外部
精度管理事業」により実施された。研究実施にあたり協力していただいた大阪府健康医療部生活衛生室環境衛生課の各位に感謝いたします。

収まることを確認する併行精度の評価を実施する。本研究では機関 A-2 および A-22 を除く機関がキャリーオーバーの評価を実施していた。なお、
機関 A-22 では分析機器が 2019 年 9 月 6 日に納入されたため、外部精度管理実施時においては妥
当性試験を行っている最中であった。検量線の真度および精度の評価を、それぞれ 88%（21/24）および 83%（20/24）の機関が実施していた。添加試
料の真度および精度の評価については、いずれも83%（20/24）の機関が実施していた。多くの機関
では妥当性試験の重要性を認識し実施していたが、一部未実施の機関がみられたため、これらの機関は早急に妥当性試験を実施することが望ま
しい。
ま と め
大阪府の水道水質検査外部精度管理事業として、ナトリウム及びその化合物の検査結果を誤差率±10%と Z スコアの絶対値 3 未満を許容範囲とする 2 つの方法で評価を行った。報告された 24機関の内、5 つの測定値の変動係数が 10%を超えた機関は存在しなかった。24 機関の内、誤差率±10%を超えたのは 2 機関であった。また、Z スコ
アの絶対値が 3 以上であったのは 2 機関であった。両方法で許容範囲を超えた検査値を「外れ値」と評価したが、この「外れ値」に該当したのは 2機関であった。｢外れ値｣の存在率は、8.3% （2/24）であった。そして、検証の結果、検査精度を向上するためには、以下の留意点が考えられた。
(1)告示に基づいた SOP を作成すること。
(2)分析機器については、保守点検を行いその性

辞

利

益 相

反

開示すべき利益相反はない。
文献1） 田中榮次, 安達史恵, 小川有理, 吉田直志,
木村直昭, 足立伸一. 大阪府水道水質検査外部精度管理-蒸発残留物(平成 21 年度)-. 水道協会雑誌 2011; 80: 12-22.
2） 小泉義彦, 宮野啓一, 足立伸一. 大阪府水道水質検査外部精度管理結果と分析の留意点シス-1,2-ジクロロエチレン及びトランス1,2-ジクロロエチレン(平成 21 年度)-. 大阪
府立公衆衛生研究所研究報告 2011; 49: 6172.
3） 小泉義彦, 足立伸一. 大阪府水道水質検査外部精度管理結果と分析の留意点 -1,4- ジオ
キサン(平成 23 年度)-. 大阪府立公衆衛生研
究所研究報告 2014; 52: 49-52.
4） 小泉義彦, 足立伸一. 大阪府水道水質検査外部精度管理結果と分析の留意点-全有機炭素(TOC)の量(平成 24 年度)-. 大阪府立公衆衛生研究所研究報告 2014; 52: 53-57.
5） 小泉義彦, 足立伸一. 大阪府水道水質検査外部精度管理結果と分析の留意点-ハロ酢酸(平成 26 年度)-. 大阪府立公衆衛生研究所研究報告 2016; 54: 50-58.
6） 小泉義彦, 木村明生. 大阪府水道水質検査外部精度管理結果と分析の留意点-ジクロロメ- 63 -

タン(平成 27 年度)-. 大阪府立公衆衛生研究
所研究報告 2016; 54: 59-63.
7） 吉田仁, 木村明生. 水質検査における外部精度管理(2015 年度)-銅及びその化合物- . 大阪
健康安全基盤研究所研究年報 2017; 1: 15-33.
8） 吉田仁, 小泉義彦. 水質検査における外部精度管理(2016 年度)-フェノール類-. 大阪健康安全基盤研究所研究年報 2018; 2: 74-82.
9） 吉田仁, 中島孝江. 水質検査における外部精度管理（2017 年度）-鉛及びその化合物-. 大
阪健康安全基盤研究所研究年報 2019; 3: 8388.
10）吉田仁, 中島孝江. 水質検査における外部精度管理（2018 年度）-鉄及びその化合物-. 大

WEB サイトの内容は 2021 年 5 月 6 日に確認した

阪健康安全基盤研究所研究年報 2020; 4: 9399.
11）厚生労働省. 水質基準の見直しにおける検討概要.
https://www.mhlw.go.jp/topics/bukyoku/kenkou/suido/kijun/dl/k37.pdf
12）真柄秦基. 水道水質ハンドブック. 日本水道新聞社; 1994. 56.
13）厚生労働省. 厚生労働省告示第 261 号「水質基準に関する省令の規定に基づき厚生労働大臣が定める方法」.
https://www.mhlw.go.jp/content/10900000/000
615898.pdf
14）日本工業標準調査会. JIS Z8402-2: 測定方法
及び測定結果の精確さ(真度及び精度-第 2
部: 標準測定方法の併行精度及び再現性を求めるための基本的方法 ). 日本規格協会;
1999. 309-310.
15）藤井賢三. 試験所認定制度における技能試験(1). 環境と測定技術 2000; 27: 51-56.
16）厚生労働省. 建水発第 1010001 号「水質基準に関する省令の制定及び水道法施行規則の一部改正等並びに水道水質管理における留意事項について」.
https://www.mhlw.go.jp/content/10900000/000
763260.pdf
17）厚生労働省. 建水発 0906 第 4 号「水道水質検査方法の妥当性評価ガイドラインについて」.
https://www.mhlw.go.jp/topics/bukyoku/kenkou/suido/hourei/jimuren/dl/120906-4.pdf- 64 -

Annual Report of Osaka Institute of Public Health, 5, 2021

Results of external quality control on the analytical methods for sodium in tap water, performed in 2019
in Osaka Prefecture

Jin YOSHIDA and Fumie ADACHIIn order to improve the accuracy of water quality measurements, we implemented the external quality control
on analytical methods for sodium in tap waters, with water supply corporations, public health centers and publicresearch institutes in Osaka Prefecture. As a result, two of 24 examination values were evaluated as outliers.
We executed the follow up survey for these facilities. The survey showed that the examination value wassuggested to be influenced by the sodium contamination in the process of the preparation step of the measurement.

Key words : tap water, sodium, water quality measurements, accuracy, external quality control

Osaka Institute of Public Health- 65 -

報

文

地方独立行政法人大阪健康安全基盤研究所研究年報 Ann. Rep. Osaka. Inst. Pub. Health, 5, 66-72 (2021)

水質検査における定量精度に影響を及ぼす因子の解明（2020 年度）―大阪府建築物飲料水水質検査業（臭素酸）―

吉田 仁，中島孝江，長谷川有紀，小泉義彦

水道水質検査における定量精度に影響を与える因子を抽出し、分析法改良の提案を行うことを目的に、建築物飲料水水質検査業の大阪府知事登録を受けている事業所を対象に外部精度管理を実施した。
臭素酸を添加した水質検査用模擬試料を配付し、各機関が水道水質検査法に従って測定した検査結果を回収した。各機関の検査値を解析した結果、14 機関中 3 機関が、真値に対する誤差率および Z スコ
アの許容範囲を超過した。これらの機関を対象に定量精度に関するフォローアップ調査を行ったとこ
ろ、検量点数の不足、不適切な検量線濃度範囲および標準液調製操作の不備が定量値に影響を及ぼす要因となることが明らかになった。

キーワード：水道水、臭素酸、水道水質検査、定量精度、建築物飲料水水質検査業（地独）大阪健康安全基盤研究所では、2015 年
度から（一社）大阪ビルメンテナンス協会からの受託研究として、水道水質検査における定量精度に影響を与える因子を抽出し、分析法改良の提案を行うことを目的に、「建築物における衛生的環

でオゾン処理時においてはオゾン注入率や pH を制御することにより生成を抑制することが重要である 5)。
ヒトの健康影響について、International Agency
for Research Cancer では、臭素酸カリウムは実験境の確保に関する法律」第 12 条の 2 第 1 項に規定の建築物飲料水水質検査業の大阪府知事登録を受けている事業所（以下、登録水質検査業者）を対象に外部精度管理を実施している 1-4）。
2020 年度の対象項目は、無機項目である「臭素酸」を選定した。臭素酸（臭素酸イオン、BrO3-）の多くは塩として存在し、一般的な形態としては、
臭素酸カリウム、臭素酸ナトリウムとして存在している。臭素酸カリウムは小麦粉改良剤として、臭素酸ナトリウムは分析用試薬や毛髪のコール
ドウェーブ用薬品等として使用されている。さらに臭素酸は、水道水の消毒に用いる次亜塩素酸ナトリウムの不純物として含まれる可能性があり、また浄水処理工程の 1 つであるオゾン処理時に水に含まれる臭素が酸化され生成することが知られている 5)。一方で臭素酸は凝集沈殿処理やエアレーションでは除去することが困難であるの動物の発がん性に関して十分な証拠があるとして Group2B（ヒトでの発がんの可能性あり）に分類されている 6)。臭素酸は遺伝毒性を示す発がん性物質として考えられているため、動物実験の結果からリスク計算を行い、最終的にその基準値は0.01 mg/L に設定された 7)。
方法

1. 参加機関
本研究に参加した登録水質検査業者は、14 機関であった。
2. 実施方法(1)水質検査用模擬試料の調製方法
2020 年 9 月 28 日に精製水約 15 L をポリタンクに採水した。臭素酸標準液（富士フイルム和大阪健康安全基盤研究所衛生化学部生活環境課- 66 -

光純薬：2000 mg/L、保証期限 2021 年 1 月、ロッ
ト番号 KCR4333）1.0 mL を精製水で 100 mL に
メスアップして 20 mg/L 標準液を調製した。この標準液 3.75 mL をポリタンクに添加した後に撹拌し、250 mL のポリエチレン製容器に分注したもの（設定濃度：0.005 mg/L）を水質検査用模擬試料とした。なお、標準液添加前の精製水に存在する臭素酸は 0.001 mg/L 未満であり、試料調製用の精製水として問題ないと判断した。9 月 29日に各登録水質検査業者にチルド便にて送付した。
(2)試料の検査方法
検査方法は「水質基準に関する省令の規定に基づき厚生労働大臣が定める方法」（平成 15 年
7 月 22 日付け厚生労働省告示第 261 号〔最終改正 令和 2 年 3 月 25 日付け厚生労働省告示第 95号〕（告示法）のイオンクロマトグラフ―ポスト
カラム吸光光度法（IC 法）（別表第 18）および
液体クロマトグラフ―質量分析法（LC/MS/MS 法）（別表 18 の 2）とした 8）。配付試料については前処理を含めて 5 回の測定を実施し、測定結果
を有効数字 3 桁で「外部精度管理結果報告書」に記入し、5 つの測定結果の平均値を検査値とした。
また、各検査機関が実施した分析法の分析条件
等を「外部精度管理結果報告書」に記入し、検査に使用した機器の測定データやチャート等と合わせて提出することとした。
(3)評価の検証方法およびフォローアップ
各参加機関から返送された「外部精度管理結果報告書」を取りまとめた後、検査結果および検査方法等に関する評価を実施した。
評価の実施に先立って、各機関内で測定された精度管理試料の 5 つの測定値の変動係数が10%を超過した機関は評価対象外とした。
検査結果は、「真値」に対する誤差率および Z
スコアで評価を行い、両方の評価方法において許容範囲を超過した検査値を「外れ値」とした。
「真値」は、各機関からの検査値を用いて、有意水準を 5%として Grubbs の棄却検定 9）を行い、棄却された検査値を除いた検査値から平均を求め、これを「真値」とした。誤差率は、（1）の式から算出し、±10%以内を許容範囲とした。
誤差率（%）＝（[各機関の検査値]－[真値]）/ [真値] ×100……（1）

Z スコアは四分位数法で算出し 10）、Z スコアの絶対値 3 未満を許容範囲とした。誤差率および変動係数の許容範囲は、水道基準項目の測定精度における臭素酸の変動係数の目標値を根拠に 10%とした 11）。なお、変動係数、誤差率および Z スコアについては、検査値を計算過程で丸めずに算出した。その後、「外れ値」に該当した機関に対してフォローアップ調査を実施した。
結

果

お

よ

び

考

察

1. 水質検査用模擬試料の均一性および安定性
精度管理試料の均一性を確認するために、
2020 年 9 月 28 日に試料を分注順に等間隔で 5 本
抜き取り、試料 1 本につき、2 回測定した。その後、得られた測定結果を基に一元配置分散分析を行った。その結果、試料間の変動は有意とならなかったため（p=0.55）、均一性に問題がないことを確認した。また、試料の安定性を確認するた
めに、配付日、配付 1、2、5、７、12 および 14
日 後 に試 料 を測 定し た結 果 を 図 1 に 示す 。

図 1 水質検査用模擬試料に含まれる臭素酸の分析値の安定性（n = 5、平均±標準偏差）
近似直線の傾きはほぼ 0 で、水質検査用模擬試料の安定性に問題はないと判断した。
2. 検査方法
本研究においては、14 機関中 13 機関が IC 法
で臭素酸の検査を実施し、残り 1 機関がLC/MS/MS 法により実施していた。
大半の登録水質検査業者は臭素酸の測定を IC 法により測定していることがわかった。
3. 検査結果の検証- 67 -

(1)誤差率、Z スコア及び「外れ値」
参加機関 14 機関から報告された 14 の検査値、変動係数、誤差率および Z スコアを表に示す。
さらに、各機関の検査値のヒストグラムを図 2 に示す。
表. 各参加機関から報告された検査値の概要
検査値

変動係数

(mg/L)(%)(%)

A-01⁺*

0.00357

1.31

—26.6

—7.78

IC法

A-02⁺*

0.00403

1.44

—17.4

—5.03

IC法

A-03

0.00471

2.2

—3.22

—0.85

IC法

A-04

0.00473

4.05

—2.86

—0.74

LC/MS/MS法

A-05

0.00479

3.35

—1.75

—0.41

IC法

A-06

0.00481

0.97

—1.17

—0.24

IC法

A-07

0.00482

0.85

—1.01

—0.19

IC法

A-08

0.00489

1.14

0.31

0.19

IC法

A-09

0.00489

1.7

0.43

0.23

IC法

A-10

0.00491

1.23

0.72

0.32

IC法

A-11

0.00499

1.18

2.4

0.81

IC法

A-12

0.005

0.85

2.65

0.89

IC法

A-13

0.00504

4.47

3.51

1.14

IC法

A-14⁺*

0.00545

6.04

11.8

3.61

IC法

平均値

0.00476

最大値

0.00545

最小値

0.00357

標準偏差
変動係数
（%）

0.00045

機関番号

n

誤差率

Zスコア 検査方法

9.5
14

真値：0.00487 mg/L（Grubbsの棄却検定で棄却された機関を除いた平均）

⁺：Grubbsの棄却検定で棄却された機関*：真値に対する誤差率が±10％を超え、かつZスコアの絶対値が3以上の機関（外れ値）

図 2. 検査法別の検査値のヒストグラム（*：外れ値）
機関内変動係数が 10%を超過した検査値は存在しなかったため、すべての検査値を評価対象とした。
「真値」を算出するため、検査値を有意水準 5%で Grubbs の棄却検定を行った。その結果、3 機関（A-01、A-02 および A-14）が棄却され、残りの 11 検査値を平均した 0.00487 mg/L を「真値」とした。誤差率の許容範囲を超えたのは 3 機関

（A-01、A-02 および A-14）であり、誤差率はそ
れぞれ、-26.6、-17.4 および 11.8%であった。
次に、14 検査値を用いて Z スコアを求めた結果、
Z スコアの範囲は-7.78～3.61 となり、Z スコアが許容範囲を超えたのは 3 機関（A-01、A-02 および A-14）であり、Z スコアはそれぞれ、-7.78、-5.03 および 3.61 となった。誤差率と Z スコアとの両方の許容範囲を超えた検査値を「外れ値」と評価したが、この「外れ値」に該当する機関は 3機関（A-01、A-02 および A-14）であった。外れ
値の存在率は 21%（3/14）であった。「外れ値」となった機関 A-01、A-02 および A-14 に対してフォローアップ調査を行った。
(2)フォローアップ調査
機関 A-01 は、IC 法を用いており、検査値は0.00357 mg/L、「真値」に対する誤差率は-26.6%、
Z スコアは-7.78 であった。
機関 A-01 の検査担当者は、外れ値となった原因として標準液の調製ミスが推測されると回答した。その理由として、普段の標準系列のピーク
面積に比べて今回の標準系列のピーク面積が高かったためとのことであった。機関 A-01 では、原体を用いて標準原液を調製していた。機関 A01 の SOP における標準原液の調製方法は、臭素
酸カリウム 1.31 g を精製水に溶かして 1 L としていた（1000 mg/L）。この調製方法は、告示法の調製方法、すなわち臭素酸カリウム 2.63 g を精製水に溶かして 1 L とする（2000 mg/L）とは臭素酸カリウムの量が異なっていた。担当者は
機関 A-01 の SOP に従って標準原液および標準系列を測定当日に調製していた。そのため、担当者が標準液の調製をどの箇所で間違えたか明ら
かにすることはできなかった。その後、担当者は市販の標準原液を購入して標準系列を調製し精度管理試料を再測定した結果、標準系列のピーク面積が普段の検査と近い値となり、検査値は0.00491 mg/L、真値に対する誤差率は 0.76%、Z
スコアは 0.15 と共に許容範囲に収まり改善された。以上より、検査精度を維持するためには標準溶液を正確に調製すること。さらに、日頃から測定対象物質の検出感度を確認し、異なる場合はその原因を追究することが重要であることがわ
かった。
機関 A-02 は、IC 法を用いており、検査値は0.00403 mg/L、「真値」に対する誤差率は-17.4%、- 68 -

Z スコアは-5.03 であった。
機関 A-02 の検査担当者は、検量点数が少ない
不適切な検量線を使用したことが原因として推測されるとのことであった。機関 A-02 の検量点
は 0.001、0.01、0.02 mg/L であった。
機関 A-14 は、IC 法を用いており、検査値は0.00545 mg/L、「真値」に対する誤差率は 11.8%、
Z スコアは 3.61 であった。
機関 A-14 の検査担当者は、検量点数が少ない
不適切な検量線を使用したこと、およびメンブ
レンフィルターを使用しなかったことが原因として推測されるとのことであった。機関 A-14 の検量点は、0、0.0015、0.006、0.015 mg/L であり
0 を除くと 3 点で検量線を作成していた。

SOP に従えば検査担当者全員が検査可能となるものを整備する必要がある。
2012 年 9 月 6 日付で厚生労働省より水道水質検査における妥当性評価ガイドラインについて通知され、告示法においても妥当性試験を行う
ことが求められている 12）。妥当性試験とは、水道水質検査を行う検査機関が自らの SOP に示す検査方法の妥当性を評価するための手段である。
妥当性評価ガイドラインは、検量線の評価と添加試料の評価が示されている。検量線の評価では、最高濃度の標準試料を測定した直後のブランク試料中の濃度が検量線の下限値を下回ることを確認するキャリーオーバーの評価、標準試料を繰り返し測定し、定量した濃度の平均値がA-02 および A-14 はいずれも検量点数が少ない不適切な検量線を使用したことが外れ値の原因と考えられた。本研究において、検量点数が 4点未満であった機関は 2 機関であったが、そのいずれも外れ値となった。このように、定量精度に影響を及ぼす因子として検量点数は重要であり、検査精度を向上させるためには、検量点数は4 点以上、告示法に準拠した検量線濃度範囲など
適切な検量線を作成する必要があると考えられた。さらに、両機関に対して検量点数は 4 点以上必要であること、公比は 4 以内であることが望ましいことを助言した。その後、A-02 に対して

いずれの濃度点においても定められた目標内に収まることを確認する真度の評価および標準試料を繰り返して測定した際の精度が目標内に収まることを確認する精度の評価を実施する。添
加試料の評価では、定量を妨害するピークがな
いことを確認する選択性の評価、添加試料を複数回測定し、得られた回収率の平均値が目標を満たすことを確認する真度の評価および回収率の併行精度が目標内に収まることを確認する併行精度の評価を実施する。SOP に従って行う妥
当性評価は自社の検査法の精度を客観的に評価できるものであり、検査結果の信頼性に繋がる

水質検査用模擬試料を再送付し、検量点を 4 点（0.001、0.002、0.005、0.01 mg/L）に増やした検量線で再測定を実施した。その結果、A-02 の検査値が 0.00484 mg/L となり当所で測定した結果（0.00497 mg/L）に対する誤差率が-2.54%と良好な結果を得ることができた。
(3)全体的な留意点①標準手順作業書と妥当性試験
標準手順作業書（SOP）について、フロー図のみで SOP の体をなしておらず、未整備と分類した機関が 2 機関あった。標準液の具体的な調製方法および検量線の濃度と点数については、すべての機関が記載していた。一方、精製水を含む
試薬類および器具・装置の規格をすべて記載した機関は 2 機関であった。SOP へ記載されていなかった項目として、空試験の実施方法、連続測定を実施する場合の措置、試料の採取および保存、試験開始までの時間等があった。SOP は、精度良く検査を実施するために必要なものであり、ものである。検量線の妥当性評価を実施していた機関は 9 機関、添加試料の妥当性評価を実施していた機関は 8 機関であった。登録建築物飲料水水質検査業においては妥当性評価の重要性を認識する必要があると考えられた。
②検査開始までの時間
告示法では検査開始までの時間は 2 週間以内と定められているが、すべての機関が 2 週間以内に検査を開始しており、問題はなかった。
③前処理
告示法では、前処理として検水をメンブラン
フィルターろ過装置でろ過することと記載されている 8)。また使用するメンブランフィルターの孔径は約 0.2 µm と規定されている。
メンブランフィルターでろ過していない機関が 3 機関存在した。また、メンブランフィルターの孔径が 0.45 µm のものを使用していた機関が 1機関あった。検査に使用する器具、試薬などは告示を遵守した SOP に定められた規格のものを使- 69 -

用する必要がある。
④検量線および空試験
告示法では別表に記載された濃度範囲内で濃度 0 mg/L を含めない 4 段階以上の標準液を用いて検量線を作成するように記載されている 8)。また、測定法別に元素ごとの濃度範囲を提示し、検量線はその範囲を超えてはならないとされている 8)。IC 法では 0.001～0.02 mg/L、LC/MS/MS 法
では 0.0005～0.02 mg/L である。本研究において、検量線が濃度範囲を逸脱した機関、原点を強制的に通過させた機関、検量線の範囲外で測定した機関はなかった。一方、0 mg/L を検量点としていた機関は 1 機関、0 mg/L を除いた検量点数
が 4 点未満だった機関が 2 機関であった。
なお、

線作成用標準液は用時調製していた。

2 機関の内 1 機関はフォローアップ調査により改善されている。
告示法では精製水を検水と同様に前処理し、空試験を実施することになっており、その値が検量線の濃度範囲の下限値（基準値の 1/10 以下）
を下回ることを確認する必要がある。今回、空試
験が未実施の機関は無かったが、検量点の最小濃度が基準値の 1/10 より高いため、判定値を下回ることを確認できない機関が 1 機関存在した。
検量線の下限値は基準値の 1/10 以下に設定することが必要である。
⑤標準液｢外れ値｣の存在率は、21% （3/14）であった。検証の結果、検査精度を向上するためには、以下の留意点が考えられた。
(1) 告示法に準拠した SOP を整備する。
(2) 分析操作は告示法を遵守し、SOP から逸脱しないようにする。
(3) 検量点数は 4 点以上、告示法に準拠した検量
線濃度範囲など適切な検量線を作成する。
(4) 標準液を正確に調製する。
(5) 日頃から測定対象物質の検出感度を確認し、異なる場合はその原因を追究する。

告示法では、標準原液、標準液または混合標準
液は原体から自己調製したもの、もしくは計量法（平成 4 年法律第 51 号）第 136 条若しくは第144 条の規定に基づく証明書又はこれらに相当する証明書が添付され、かつ、告示法の標準原液と同濃度のもの又は告示法の標準液若しくは混合標準液と同濃度のものの使用が認められている 8)。また、告示法の標準液若しくは混合標準液と同濃度のものは開封後速やかに使用することとし、開封後保存したものを使用してはならな
い 8)。本研究においては、原体から標準原液を調製した機関が 2 機関、市販の標準原液を使用した機関が 12 機関であった。原体から標準原液を調製した 2 機関のうち、1 機関の標準原液が告示（2000 mg/L）と異なり 1000 mg/L となっていた
ため SOP の改善が必要であった。市販の標準原液を使用した機関のうち、1 機関の標準原液濃度が告示（2000 mg/L）と異なっていたため改善が必要であった。一方、すべての機関において検量

ま

と

め

大阪府の登録建築物飲料水水質検査業を対象に、臭素酸の検査結果を誤差率±10%と Z スコアの絶対値 3 未満を許容範囲とする 2 つの方法で評価を行った。報告された 14 機関の内、5 つの測定値の変動係数が 10%を超えた機関は存在しなかった。14 機関の内、誤差率±10%を超えたのは 3 機関であった。また、Z スコアの絶対値が 3以上であったのは 3 機関であった。両方法で許容範囲を超えた検査値を「外れ値」と評価したが、この「外れ値」に該当したのは 3 機関であった。

謝辞

本研究は「建築物飲料水水質検査における定量精度に影響を及ぼす因子の解明ならびに改良
分析法の提案に関する研究」により実施された。
研究実施にあたり協力していただいた大阪府
健康医療部生活衛生室環境衛生課ならびに（一社）大阪ビルメンテナンス協会の各位に感謝い
たします。
利

益

相

反

開示すべき利益相反はない。
文献1） 吉田仁, 木村明生. 水質検査における外部精度管理(2015 年度)-銅及びその化合物- . 大
阪健康安全基盤研究所研究年報 2017; 1: 73-- 70 -

79.
2） 中島孝江, 安達史恵, 小泉義彦. 水質検査における外部精度管理(2017 年度)-大阪府建築物飲料水水質検査業-. 大阪健康安全基盤研
究所研究年報 2018; 2: 91-99.
3） 中島孝江, 安達史恵, 小泉義彦. 水質検査における定量精度に影響を及ぼす因子の解明（2018 年度）-大阪府建築物飲料水水質検査業 -. 大 阪 健 康 安 全 基 盤 研 究 所 研 究 年 報
2019; 3: 96-105.
4） 中島孝江, 安達史恵, 小泉義彦. 水質検査における定量精度に影響を及ぼす因子の解明（2019 年度）-大阪府建築物飲料水水質検査業 -. 大 阪 健 康 安 全 基 盤 研 究 所 研 究 年 報

https://www.mhlw.go.jp/topics/bukyoku/kenko
u/suido/hourei/jimuren/dl/120906-4.pdf
WEB サイトの内容は 2021 年 5 月 6 日に確認した

2020; 4: 100-109.
5） 厚生労働省. 水質基準の見直しにおける検討概要. https://www.mhlw.go.jp/topics/
bukyoku/kenkou/suido/kijun/konkyo0303.html
6） International Agency for Research Cancer. IARC
monographs on theidentification ofcarcinogenic
hazardstohumans.
https://monographs.iarc.fr/list-of-classifications7） 真柄秦基. 水道水質ハンドブック. 日本水道新聞社; 1994. 56.
8） 厚生労働省. 厚生労働省告示第 261 号「水質基準に関する省令の規定に基づき厚生労働大臣が定める方法」.
https://www.mhlw.go.jp/content/10900000/000
615898.pdf9） 日本工業標準調査会. JIS Z8402-2: 測定方法
及び測定結果の精確さ(真度及び精度-第 2
部: 標準測定方法の併行精度及び再現性を求めるための基本的方法).日本規格協会;
1999. 309-310.
10）藤井賢三. 試験所認定制度における技能試
験(1). 環境と測定技術 2000; 27: 51-56.
11）厚生労働省. 建水発第 1010001 号「水質基準に関する省令の制定及び水道法施行規則の一部改正等並びに水道水質管理における留意事項について」.
https://www.mhlw.go.jp/content/10900000/000
763260.pdf
12）厚生労働省. 建水発 0906 第 4 号「水道水質検査方法の妥当性評価ガイドラインについて」.

- 71 -

Annual Report of Osaka Institute of Public Health, 5, 2021

Elucidation of factors affecting quantitative accuracy for bromate in water quality measurements,
performed in 2020 in Osaka Prefecture

Jin YOSHIDA, Takae NAKAJIMA, Yuki HASEGAWA and Yoshihiko KOIZUMIIn order to elucidate the factors that affect the quantitative accuracy and improve the water quality measurements,
we implemented the external quality control on analytical methods for bromate in tap waters, with building
inspection contractors in Osaka Prefecture. As a result, 3 from 14 examination values was evaluated as an
outlier. We executed the follow up survey for these facilities. From this survey, the examination value wassuggested to be influenced by the inappropriate calibration points and calibration curve concentration range,
inadequate standard solution preparation and sensitivity fluctuation of analytical instrument.

Key words : tap water, bromate, water quality measurements, accuracy, external quality control

Osaka Institute of Public Health- 72 -

報

文

地方独立行政法人大阪健康安全基盤研究所研究年報 Ann. Rep. Osaka. Inst. Pub. Health, 5, 73-79 (2021)

水質検査における定量精度に影響を及ぼす因子の解明（2020 年度）―大阪府建築物飲料水水質検査業（ホルムアルデヒド）―

長谷川有紀，吉田 仁，小泉義彦

地方独立行政法人 大阪健康安全基盤研究所では、一般社団法人 大阪ビルメンテナンス協会からの受託研究として、2015 年度より外部精度管理を実施している。この外部精度管理は、水道水質検査における定量精度に影響を与える因子を抽出し、分析法改良の提案を行うことを目的として実施している。2020 年度は、ホ
ルムアルデヒドを選定し、大阪府の登録建築物飲料水水質検査業の 17 機関が参加した。各参加機関のホルムアルデヒドの検査値を「真値」に対する誤差率（誤差率）と Z スコアの 2 つの方法で評価した。
「外れ値」に該当した 1 機関に対してフォローアップ調査を行った。外れ値となった原因は、使用した精製水にホ
ルムアルデヒドが含まれていたからであった。したがって、使用する精製水に含まれるホルムアルデヒドの濃度が定量精度に影響を与えないことを確認してから、検査を行うことが重要であると分かった。

キーワード：水道水、ホルムアルデヒド、外部精度管理、建築物飲料水水質検査業

2015 年度より地方独立行政法人 大阪健康安全基盤研究所では、一般社団法人 大阪ビルメンテナン
ス協会からの受託研究として、外部精度管理を実施しており 1-4)、水道水質検査における定量精度に影

毒性について、ホルムアルデヒドは International
Agency for Research Cancer により、Group1（ヒトに対する発がん性がある）に分類されているが、経口では明らかな発がん性はないとされている 6)。しか響を与える因子を抽出し、分析法改良の提案を行うことを目的としている。対象は、「建築物における衛生的環境の確保に関する法律」第 12 条の 2 第 1項に規定の「建築物飲料水水質検査業」の大阪府知事登録を受けている事業者である。
2020 年度は「ホルムアルデヒド」を選定した。
ホルムアルデヒドは、石炭酸系、尿素系、メラミ
ン系合成樹脂原料、ポリアセタール樹脂原料、界面活性剤、ヘキサメチレンテトラミン、農薬、消毒剤、その他一般防腐剤等に用いられている 5)。
水道水中のホルムアルデヒドは、浄水過程において塩素およびオゾン処理の際にアミン等の有機物
質と反応して生成される 5)。ホルムアルデヒドは活性炭処理により除去が可能であり、ホルムアル
デヒド前駆物質は通常処理においての凝集沈殿＋ろ過、活性炭処理による除去性があり、塩素注入
点を変更することでホルムアルデヒドの生成を低減することができる 5)。
大阪健康安全基盤研究所衛生化学部生活環境課

し、吸入暴露による影響を考慮し、TDI 値 15µg/kg/day から水質基準値は 0.08 mg/L 以下と定められている 5)。
方 法
1.参加機関本外部精度管理に参加した建築物飲料水水質検査業の機関は、17 機関であった。
2.実施方法(1)精度管理試料の調製方法
2020 年 9 月 25 日に精製水約 20 L をステンレス製タンクに採水した。2020 年 9 月 28 日に精製水約20 L に対して、ホルムアルデヒド標準液（富士フイルム和光純薬：1009 mg/L、保証期限 2021 年 3 月末、
ロット番号 ESN0912）を 0.4 mL、マイクロピペッ
トを用いて添加後、十分に撹拌し、500 mL ガラス- 73 -

製瓶に分注した（設定濃度：0.0202 mg/L）。なお、
標準液添加前の精製水に含まれるホルムアルデヒ
ドは基準値の 1/10 である 0.008 mg/L 未満であった。
よって、試料調製用の精製水として問題ないと判断した。
2020 年 9 月 29 日（火）に各参加機関にチルド便にて送付した。
また、精度管理試料の均一性および安定性を確認するため、試料を分注順に等間隔で 5 本抜き取り、試料 1 本につき 2 回測定を行った。測定方法は、「水質基準に関する省令の規定に基づき厚生労働大臣が定める方法」（平成 15 年 7 月 22 日厚生労働省告示第 261 号〔最終改正令和 2 年 3 月 25 日厚生労働省告示第 95 号〕（告示法）誘導体化―液体クロマト

トグラフ―質量分析法（LC/MS/MS 法）（別表第 19の 3）とした。5 回測定した値を平均し、有効数字 3桁にしたものを検査値とした。検査値および測定条
件等を「外部精度管理検査結果報告書」に記入し、標準作業手順書（SOP）、分析チャート、検量線、分析に係るメモ等の資料も合わせて報告を依頼した。

グラフ―質量分析法（LC/MS/MS 法）（別表第 19 の3）とした 7）。
得られた測定結果を基に一元配置分散分析を行ったところ、試料間の変動は有意とならず（p=0.0547）、試料水中のホルムアルデヒドの均一性に問題がないことを確認した。また、配付日、配付 1、2、5 および 7 日後に試料を測定した結果を図1 に示す。図 1 中に示した一次直線式（y=-3E05x+00.0157）の傾きが概ね 0 に近いことから、7 日間の経日変化がほぼないことを確認した。

スコアの 2 つの方法で評価した。真値の求め方は、参加機関の検査値を用いて有意水準を 5％としてGrubbs の棄却検定 8)を行った。それにより、棄却された検査値を除いた検査値から平均を求め、これを「真値」とした。
誤差率は、(1)の式から算出し、真値に対して±20%以内を許容範囲とした。

0.0200

誤差率（％）＝｛（各機関の検査値－真値）/ 真値
×100｝・・・(1)
Z スコアは四分位数法で算出し 9)、絶対値 3 未満

y = -3E-05x + 0.0157

0.0160濃度(mg/L)(3)評価の検証方法およびフォローアップ
我々は、各参加機関から送付された「外部精度管理結果報告書」を取りまとめ、検査値の評価を行った。参加機関が報告した測定値（n=5）の変動係数
は、20％を許容範囲とし、20％を超えた機関については外部精度管理の評価の対象外とした。次に、検査値は「真値」に対する誤差率（誤差率）および Zを許容範囲とした。
これら 2 つの方法で許容範囲を超えた検査値のみを「外れ値」と評価し、報告書および分析チャート等を確認し、原因等について検証した。評価において、「外れ値」に該当した機関に対してフォロー
アップ調査を実施した。

0.01200.00800.00400.0000024
配付後日数(日)68

結 果 お よ び 考 察
図 1 精度管理試料に含まれるホルムアルデヒドの安定性（n=5、平均±標準偏差）
また、各試料の平均値の変動係数は 2.74%で安定性にも問題がないことを確認した。
(2)試料の検査方法
検査方法は、告示法 7)の溶媒抽出―誘導体化―ガ
スクロマトグラフ―質量分析法（GC/MS 法）
（別表
第 19）
、誘導体化―高速液体クロマトグラフ法（LC法）（別表第 19 の 2）および誘導体化―液体クロマ

1.参加機関の分析方法
11 機関は GC/MS 法を、6 機関は LC 法を用いており、LC/MS/MS 法を用いている機関はなかった。
2.検査結果の検証(1)誤差率、Z スコア及び「外れ値」
17 機関から報告された検査値、変動係数、誤差率および Z スコアを表 1 に示す。また、各機関の検査値の分布を図 2 に示す。5 つの測定値の変動係数
が 20%を超えた機関は存在しなかったため、全て- 74 -

GC/MS105＊00.0100≦x＜0.0150 0.0150≦x＜0.0200 0.0200≦x＜0.0250 0.0250≦x＜0.0300
検査値（mg/L）

検査値（mg/L）

変動
係数
（%）

真値に
対する
誤差率

＊：外れ値

図 2 検査法別による検査値の分布

表 1 参加機関の検査値、変動係数、誤差率
および Z スコア

機関番号

LC

15

機関数

の検査値を用いて評価を行った。真値は、Grubbs の棄却検定で棄却された 1 つの検査値を除いて、
16 機関の検査値を平均した 0.0216 mg/L となった。誤差率は検査値を丸めずに算出した。誤差率の範囲は49.25～16.88％となり、許容範囲を超えたのは 1 機
関（B-01）であった。一方、17 検査値を用いて Z ス
コアを求めた結果、Z スコアの範囲は-5.65～2.18 となり、Z スコアが許容範囲を超えたのは 1 機関（B-

Z スコア

（%）

01）であった。
以上の結果より、誤差率および Z スコアの両方の許容範囲を超えた「外れ値」に該当する機関は 1 機関であった。
「外れ値」となった機関 B-01 に対してはフォローアップ調査を行った。

B-01⁺*

0.01103.63-49.25

-5.65

B-02

0.01886.88-12.76-1.33(2)フォローアップ調査

B-03

0.0192

3.26-11.00

-1.12

B-04

0.0199

1.45

-8.03

-0.77

B-05

0.0202

4.68

-6.55

-0.59

B-06

0.0202

6.59

-6.37

-0.57

B-07

0.0207

8.76

-3.96

-0.29

B-08

0.0209

2.47

-3.13

-0.19

B-09

0.0213

1.47

-1.55

0.00

B-10

0.0217

1.20

0.67

0.26

B-11

0.0218

5.30

0.76

0.27

B-12

0.0224

0.40

3.91

0.65

B-13

0.0226

2.11

4.84

0.76

B-14

0.0234

3.04

8.17

1.15

機関 B-01 は、GC/MS 法を用いており、検査値は0.0110 mg/L、誤差率は-49.25 %、Z スコアは-5.65 であった。分析チャートを確認すると、ホルムアルデ
ヒドのピークが空試験において検出されていた。空試験の面積比（0.15）は、告示法通り検量線最小濃度の面積比（0.22）を下回っていたが、両者にはほとんど差がみられなかった。このことから、測定に使用した精製水にホルムアルデヒドが含まれていた可能性が考えられた。そこで、図 3 に機関 B-01
が従来使用していた精製水（検量線 A
y=13.558x+0.1013）および我々の提供した精製水（検量線 B y=14.077X+0.0145）を示した。

B-15

0.0235

3.24

9.01

1.25

B-16

0.0236

2.00

9.10

1.26

B-17

0.0252

0.66

16.88

2.18

平均値

0.0210

最大値

0.0252

最小値

0.0110標準偏差0.00310

0.5
0.3

14.78

0.0

変動係数
（％）
N

検量線A

検量線B

2.0

y = 13.558x + 0.1013

面積比

1.5
1.0

y = 14.077x + 0.0145

017

真値：0.0216mg/L（Grubbs の棄却検定で棄却された機関を除いた平均）
⁺：Grubbs の棄却検定で棄却された機関*：真値に対する誤差率が±20％を超え、かつ Z ス
コアの絶対値が 3 以上の機関（外れ値）

0.02280.05濃度（mg/L）0.1

図 3 機関 B-01 による検量線 A および検量線 B
その結果、検量線 A の切片が 0.1013、検量線 Bの切片が 0.0145 となり、A の切片のほうが B の切
片よりも高くなった。そこで、機関 B-01 が精度管- 75 -

理試料を測定したときの面積比（0.34…）を用いて、検量線 B で試料濃度を算出した。その結果、0.0228
mg/L となり、真値に対する誤差率が 5.56%に改善された。このことから、検量線 A で用いた精製水にホルムアルデヒドが含まれていたため、ホルムアル
デヒドが定量に影響を及ぼさない濃度の精製水から作成した検量線よりも切片が高くなったことにより、定量値が低く算出されたと考えられた。したがって、外れ値の原因は検量線に使用した精製水にホルムアルデヒドが含まれていたことであった。ホ
ルムアルデヒドを測定する際、ホルムアルデヒドが定量に影響をなるべく与えない精製水を用いることが重要であることがわかった。

始までの時間を明記し、それに従って検査する必要
がある。
④検量線
告示法では別表に記載された検水の濃度範囲内
で 4 段階以上の標準液を用いて、検量線を作成するように定められている 7)。濃度範囲は検査方法によって異なり、GC/MS 法では 0.001～0.1 mg/L、LC法及び LC/MS/MS 法では 0.005～0.1 mg/L である。
検量点に 0 mg/L を使用している機関が 2 機関、検量線を強制的に原点通過させている機関が 1 機関、検量点数が告示法と異なる（4 点未満）機関が 2 機関、溶媒ブランクを測定していない機関が 13 機関あり、改善が必要である。
⑤前処理(3)全体的な留意点①SOP の整備状況
SOP を未提出の機関が 1 機関、フロー図のみ等
で SOP の体をなしていない SOP 未整備の機関が 1機関あった。また、使用器具や試薬の規格等、必要な記載が欠けて不十分とした機関が 14 機関であった。SOP は精度よく検査を実施するために必要なものであり、検査担当者全員が SOP 通りに検査を行
えば、誰でも検査できるものを整備する必要がある。
②妥当性評価検量線の妥当性評価を実施していた機関は 9 機
関、添加試料の妥当性評価を実施していた機関は 8

告示法では、GC/MS 法による測定では「検水 50mL（検水に含まれるホルムアルデヒドの濃度が 0.1
mg/Ｌを超える場合には、0.001～0.1 mg/Ｌとなるよ
うに精製水を加えて 50 mL に調製したもの）を採り、ペンタフルオロベンジルヒドロキシルアミン溶液 3 mL を加えて混合する。2 時間静置後、硫酸（1＋1）0.8 mL および塩化ナトリウム 20 g を加えて混合する。次に、内部標準添加ヘキサン 5 mL を加えて 5 分間激しく振り混ぜ、数分間静置後、ヘキサン層を分取し、無水硫酸ナトリウムを少量加える。この溶液を一定量採り、試験溶液とする。」と記載されている 7)。検水を 50 mL 分注していない機関が 1機関であった。妥当性評価は、SOP 通りに行った検査で得られた結果が、水質検査の目的とする濃度レベルに適合していることを確認するためのものである 10,11)。これは、検査法の精度を客観的に評価できるものであり、検査結果の信頼性に繋がるものである。登録建築物飲料水水質検査業において、妥当性評価の重要性を認識する必要があると考えられた。もし、機関 B-01 が妥当性評価を実施していれ
ば、精製水に含まれたホルムアルデヒドが精度に影響を与えていることに気づいた可能性がある。
③検査開始までの時間
告示法では検査開始までの時間は 72 時間以内と定められている 7)が、5 機関が 72 時間以内に検査を開始していなかった。精度管理試料の配付日が決められていたため、通常業務の都合により、72 時間以内に開始できなかった機関もあった可能性が考えられた。しかし通常の検査において、速やかに分析できない場合、試料水を冷蔵保存し、72 時間以内に前処理しなければならない。また、SOP にも検査開機関存在した。また、誘導体化試薬および硫酸（1＋1）の添加量が告示法と異なっている機関、塩化ナ
トリウム及び無水硫酸ナトリウムを添加していな
い機関が各々1 機関あった。ヘキサン抽出時と同時に内部標準液を添加していない機関が 3 機関存在した。検水量、試薬の添加の有無、試薬の添加量および試薬を添加する手順は、告示法を遵守した上で検査をする必要がある。
LC 法では、告示法において「検水 10 mL（検水に含まれるホルムアルデヒドの濃度が 0.1 mg/Ｌを超える場合には、
0.005～0.1 mg/Ｌとなるように精製水を加えて 10 mL に調製したもの）を採り、リン酸（1＋4）0.2 mL および DNPH 溶液 0.5 mL を加えて混合する。20 分間静置後、この溶液を一定量採り、試験溶液とする。
」と記載されている 7)。LC 法を用いた機関において、告示法と異なる前処理をした機関は存在しなかった。
⑥空試験
空試験は、告示法で精製水を検水と同様に前処理- 76 -

する試験のこととされており、検量線の下限値を下回ることを確認する必要がある 7)。空試験を実施していない機関は 1 機関存在した。一方、空試験のエ
リア面積が、検量線の濃度範囲の下限値のエリア面
積より高かった機関は無かった。空試験は、告示法において必要であるため、今後の検査において必ず実施する必要がある。
⑦標準液
告示法では、標準原液、標準液または混合標準液
は原体から自己調製したもの、もしくは計量法（平成 4 年法律第 51 号）第 136 条若しくは第 144条の規定に基づく証明書又はこれらに相当する証明書が添付され、かつ、告示法の標準原液と同濃度のもの又は告示の標準液若しくは混合標準液と同

ま と め
大阪府の登録建築物飲料水水質検査業の機関のうち参加した 17 機関を対象に、ホルムアルデヒドの検査結果を「真値」に対する誤差率と Z スコアの 2 つの方法で評価した。報告された 17 検査値のうち、変動係数が 20％を超えた機関は存在せず、全て評価対象とした。Grubbs の棄却検定で 1 機関が棄却され、棄却された 1 機関を除いた 16 検査値を平均した 0.0216 mg/L を
「真値」
とした。
誤差率±20％を超えたのは 1 機関、Z スコアの絶対値が 3 以上であった機関は 1 機関であった。以上の結果より、「外れ値」に該当する機関は 1 機関であった。
なお、濃度のものの使用が認められている 7)。なお、告示
法の標準液若しくは混合標準液と同濃度のものは開封後速やかに使用することとし、開封後保存したものを使用してはならない 7)。参加した全機関が、市販品の標準原液を使用していた。そのうちの 1 機
関は、市販の購入日が不明、かつ、市販の保証期限が過ぎているものを使用していた。また、標準液の調製方法が告示法と異なる機関は 6 機関、標準液が用時調製されていない機関は 1 機関、標準液を希釈する時の試薬名が不明の機関が 1 機関存在した。これらの機関は、告示法に遵守し、標準液を用時調製する必要がある。

「外れ値」等の原因を検証した結果、検査精度を向上する上で、次の留意点が考えられた。
1) 予め使用する精製水に含まれる対象物質の濃度を確認する。
2) 告示法に準拠した SOP を整備する。
3) 分析操作は告示法を遵守し、SOP から逸脱しないようにする。
4) 分析は告示法通り 72 時間以内に開始する。
5) 妥当性評価の試験を実施する。

⑧内部標準液GC/MS 法では内部標準液を用いてホルムアルデ
ヒドを測定することとなっている。告示法では、「内部標準原液は、1-クロロデカン 0.100 g をヘキサン
60 mL を入れたメスフラスコに採り、ヘキサンを加えて 100 mL としたもの。この溶液 1 mL は、1-クロロデカン 1 mg を含む。この溶液は、調製後直ちに10 mL ずつをねじ口バイアルに入れて冷凍保存する。
」と記載されている 7)。また、内部標準添加ヘキ
サンについては、「内部標準原液をヘキサンで 2000
倍に薄めたもの。この溶液 1 mL は、1-クロロデカ
ン 0.0005 mg を含む。この溶液は、使用の都度調製する。
」と告示法において記載されている 7)。内部標
準物質を使用していない機関は 1 機関、内部標準原
液調製後、冷凍保存していない機関が 1 機関、内部
標準添加ヘキサンを都度調製していない機関が 2機関、内部標準液の調製方法が告示法と異なる機関が 3 機関存在した。これらの機関は、告示法通りに
内部標準物質を使用する必要がある。

本研究は「建築物飲料水水質検査における定量精度に影響を及ぼす因子の解明ならびに改良分析法の提案に関する研究」により実施された。
研究実施にあたり協力していただいた大阪府健康医療部生活衛生室環境衛生課ならびに（一社）大阪ビルメンテナンス協会の各位に感謝いたします。

謝 辞

利 益 相 反開示すべき利益相反はない。
文 献
1)

2)

- 77 -

吉田仁, 木村明生. 水質検査における外部精度管理(2015 年度)-銅及びその化合物- .
大阪健康安全基盤研究所研究年報 2017; 1:
73-79.
中島孝江, 安達史恵, 小泉義彦. 水質検査における外部精度管理（2017 年度）―大阪

3)
4)

5)

6)

7)

8)

9)

府建築物飲料水水質検査業―. 大阪健康安
全基盤研究所研究年報 2018; 2: 91-99.
中島孝江, 安達史恵, 小泉義彦. 水質検査における定量精度に影響を及ぼす因子の解明（2018 年度）-大阪府建築物飲料水水質検査業-. 大阪健康安全基盤研究所研究年
報 2019; 3: 96-105.
中島孝江, 安達史恵, 小泉義彦. 水質検査における定量精度に影響を及ぼす因子の解明（2019 年度）-大阪府建築物飲料水水質検査業-. 大阪健康安全基盤研究所研究年
報 2020; 4: 100-109.
厚生労働省. 水質基準の見直しにおける検討概要. https://www.mhlw.go.jp/topics/buk
yoku/kenkou/suido/kijun/konkyo0303.html
International Agency for Research Cancer. List ofClassifications. Agents classified by the IARC
Monographs, Volumes 1–129. https://monographs.iarc.who.int/list-of-classifications/
厚生労働省. 水質基準に関する省令の規定に基づき厚生労働大臣が定める方法（平成 15 年
厚生労働告示第 261 号）. https://www.mhlw.
go.jp/content/10900000/000615898.pdf
日本工業標準調査会. JIS Z8402-2: 測定方法及び測定結果の精確さ(真度及び精度-第 2 部: 標
準測定方法の併行精度及び再現性を求めるた

めの基本的方法).日本規格協会; 1999. 309-310.
10) 藤井賢三. 試験所認定制度における技能試験(1). 環境と測定技術 2000; 27: 51-56.
11) 厚生労働省. 健水発 0906 第 1~4 号「水道水質検査方法の妥当性評価ガイドラインについて」. https://www.mhlw.go.jp/topics/bukyoku/ken
kou/suido/hourei/jimuren/dl/120906-4.pdf
12) 厚生労働省. 水道水質検査方法の妥当性評価
ガイドライン. https://www.mhlw.go.jp/file/06Seisakujouhou-10900000-Kenkoukyoku/000018
1618_2.pdf
WEB サイトの内容は 2021 年 5 月 24 日に確認した。

- 78 -

Annual Report of Osaka Institute of Public Health, 5, 2021

Elucidation of factors affecting quantitative accuracy for formaldehyde in water quality measurements,
performed in 2020 in Osaka Prefecture

Yuki HASEGAWA, Jin YOSHIDA and Yoshihiko KOIZUMIWe have been conducted external quality control as a commissioned research from the Osaka Building Maintenance
Association. This external quality control was carried out for the purpose of suggesting improvement of analyticalmethod and extracting factors that affect the quantitative accuracy in water quality measurements. In 2020, formaldehyde
was selected as the object substance of an organic compound and 17 institutions of the building inspection contractor
participated in Osaka Prefecture. The formaldehyde test values of each participating institution were evaluated by two
methods: the error rate and the Z score. The only institution B-01 exceeded the error rate of ±20%, and was out of Zscore range(≧3). As a result, B-01 corresponded to outlier because the purified water to prepare the standard solution
was contaminated with formaldehyde. Therefore, it is important to confirm that formaldehyde contained in purified water
did not affect the quantitative accuracy before conducting the water quality measurements.

Key words：tap water, formaldehyde, external quality control

Osaka Institute of Public Health- 79 -

報 文

地方独立行政法人大阪健康安全基盤研究所研究年報 Ann. Rep. Osaka. Inst. Pub. Health, 5, 80-89 (2021)

住民における 2,2,4-トリメチル-1,3-ペンタンジオールモノイソブチレート
および 2,2,4-トリメチル-1,3-ペンタンジオールジイソブチレートの尿中代謝物の分析法

吉田俊明

厚生労働省により住宅等室内における空気中濃度指針値の策定が検討されている 2,2,4-トリメチル-1,3-ペン
タンジオールモノイソブチレート (TMB) および 2,2,4-トリメチル-1,3-ペンタンジオールジイソブチレート(TDB) への住民の曝露量を把握することを目的として、今回、TMB の主要な尿中代謝物を検索し、TMB お
よび TDB の尿中代謝物の分析方法を確立した。TMB を腹腔内投与 (300 mg/kg) したラットの尿中より、これまでに知られている TDB の尿中代謝物と同じ 2 種の代謝物 (2,2,4-トリメチル-1,3-ペンタンジオールおよび 3-ヒドロキシ-2,2,4-トリメチル吉草酸) が検出された。これらの代謝物を酵素で加水分解したのち尿中よりトルエンで抽出し、トリメチルシリル化した後ガスクロマトグラフィー/質量分析により定量した。各
代謝物の検量線の直線性は良好であり、尿中濃度 300 μg/L 以下の代謝物を正確かつ再現性よく定量することが可能であることが示唆された (検出下限濃度：0.2 - 0.3 μg/L)。また、採取した尿試料は、一ヶ月間冷凍庫で保存が可能であった。著者から一週間連続的に採取した尿試料に本法を適用したところ、両代謝物の尿中濃度の間に有意な相関性が見られた。本法は、TMB および TDB の曝露のモニタリング手法として、今後の調査や研究に有用であると考えられた。

キーワード：テキサノール、TXIB、曝露指標、ガスクロマトグラフィー/質量分析

2,2,4-トリメチル-1,3-ペンタンジオールモノイソとなる可能性の高い化学物質を選定し、トルエン

ブチレート (CAS No.: 25265-77-4、
以下 TMB と略、
代表的商品名テキサノール) および 2,2,4-トリメチ
ル-1,3-ペンタンジオールジイソブチレート (CASNo.: 6846-50-0、以下 TDB と略、代表的商品名 TXIB)
は、主に水性塗料や水性接着剤の造膜助剤 (塗料や接着剤表面のコーティングを促進させるための添(油性塗料の溶剤などとして使用) やフタル酸ジ-nブチル (主に可塑剤として使用) 等これまでに 13
物質の室内空気中濃度指針値を策定してきた 2 – 5)。

加剤) および可塑剤 (主にプラスチックなど樹脂製品に柔軟性を与えるための添加剤) として建材や家庭用品等に使用される 1)。ともに 2,2,4-トリメチ
ル-1,3-ペンタンジオール (TMPD) のエステル化合物であり、TMB は 2 種の異性体の混合物として市販されている (図 1)。建材中の化学物質による室内空気汚染が主原因となるシックハウス症候群が社会的問題となり、厚生労働省では室内で健康上問題

O

O

O

HO
OH

O

O

O

O

TMB (2種異性体の混合物)

O

TDB

図 1. 2,2,4-トリメチル-1,3-ペンタンジオールモノイ
ソブチレート(TMB)及び 2,2,4-トリメチル-1,3-ペン
タンジオールジイソブチレート(TDB)の化学構造式

大阪健康安全基盤研究所衛生化学部生活環境課- 80 -

その結果、これらの規制対象化学物質が原因となる
シックハウス症候群の発症事例は減少し、大きな成果が得られたものと考えられる。しかし一方で、規制されたこれら化学物質の代わりに建材等へ使用された TMB 等の代替化学物質による健康被害事例

まえながら、指針値について再検討することになった 8)。
海外においても TMB および TDB とシックハウス症候群との関連性が報告されている 9, 10)。また、
TMB および TDB による室内空気汚染の実態は国内
外ともにほとんど把握されていないが、これまでの限定的な調査でのこれらの室内空気中からの検出率は高く 11, 12)、一般住民におけるこれらの体内汚染(体内摂取) は広範に及んでいる可能性が高い。現在
世界的流行となっている新型コロナウイルスの感染防止対策を契機として住民の在宅時間が増長すると考えられ、住宅の建材等から放散されるこれら化学物質の体内摂取量は今後さらに増加すると推測される。TMB および TDB は喘息等アレルギー性疾患を悪化させるとの報告があり 13-15)、近年増加している子どものアトピー性皮膚炎等アレルギー性疾患との関連性も懸念される。これらのことから、住民における TMB および TDB による健康被害の防止を目指し、これらへの曝露に関する知見を得る
ことは非常に重要と考えられるが、日常生活環境下での住人における毎日の曝露量 (吸収量) について
は国内外を通じて全く知られていない。一般に、化学物質の曝露量は尿中に排泄される化学物質の代謝物量を指標として把握される。経口的に TDB を投与したラットの尿中から TMPD および 3-ヒドロ
キシ-2,2,4-トリメチル吉草酸 (HTMV) (図2) が排泄されることがこれまでに知られている 16)。一方、
TMB の尿中代謝物に関する知見は見当たらない。

HO
OH

TMPD

が、北海道の小学校で発生した事例 6) をはじめ全国的に散発している。厚生労働省では、このような状況を鑑み、2017 年に開催された「シックハウス（室内空気汚染）問題に関する検討会」7) において TMB
および TDB の室内濃度指針値 (それぞれ 240 μg/m3
および 100 μg/m3) を新たに提案した。しかし、翌年に開催された同検討会において、関係者が対策を講ずるに当たり、科学的知見のさらなる収集が必要であり、また技術的観点から実効性に疑義のある値が提案されている可能性があるとのパブリックコメ
ント等の意見を踏まえ、ヒトへの安全性に係る情報や代替物の情報等を引き続き集積し、国際動向も踏

O

HO

OH

HTMV

図 2. 2,2,4-トリメチル-1,3-ペンタンジオール(TMP
D)及び 3-ヒドロキシ-2,2,4-トリメチル吉草酸(HTMV)の化学構造式

本研究では、住民における TMB および TDB の
曝露量を把握することを目的として、今回、TMB の主要な尿中代謝物を明らかにするとともに、TMB
および TDB の尿中代謝物の分析方法を確立したので報告する。
方 法
1. 試薬および材料
標準用試薬 TMPD (純度 98.3%) および HTMV (同97%) は そ れ ぞ れ 東 京 化 成 工 業 お よ び Toronto
Research Chemicals より、内部標準物質 (IS) n-オク
チル-d17 アルコール (純度 99.0%) は CDN Isotopes
より入手した。TMB (2,2,4-トリメチル-1,3-ペンタン
ジオール-1-モノイソブチレート (61.4%) と 2,2,4トリメチル-1,3-ペンタンジオール-3-モノイソブチ
レートとの混合物) は東京化成工業より入手した。
他の試薬はすべて富士フイルム和光純薬製または
東京化成工業製を使用した。アセトンおよびトルエ
ンは残留農薬・PCB 試験用、無水硫酸ナトリウムは
PCB・フタル酸エステル試験用、1-トリメチルシリ
ルイミダゾールおよび N,O-ビス(トリメチルシリル)アセトアミドはガスクロマトグラフ用を使用した。
スルファターゼ (Helix pomatia 由来、Type H-1、
活性 >10,000 units/g (pH 5.0)、β-グルクロニダーゼ活性 >300 units/mg) はシグマ-アルドリッチより、ラット (SD 系、雄、8 週令) は日本エスエルシーより入手した。
2. TMB の尿中代謝物の定性(1) ラットへの TMB の投与と採尿
入荷後施設の環境で一週間飼育したラット 2 匹- 81 -

(体重 325 g および 340 g) の腹腔内に、オリーブ油に溶かした TMB (100 mg/mL) を 300 mg/kg 投与した。代謝ケージ (日本クレア製 CT-10S 型) を用いて投与後 21 時間内に排泄される尿を全て採取して試料尿とした。TMB を含有しないオリーブ油を別

5 ℃/min – 120 ℃ – 9 ℃/min – 280 ℃ (5 分保持)、イ
ンターフェイス温度：260 ℃、イオン化方式：電子イオン化 (EI)、イオン源温度：200 ℃、イオン化電
圧：70 eV、分析モード：SCAN (m/z：50～360)。

のラット 2 匹 (体重 310 g および 330 g) に 3 mL/kg
投与後同様に採尿し、ブランク尿とした。採取した尿は分析までの期間冷凍庫に保存した。
なお、動物実験は地方独立行政法人大阪健康安全基盤研究所動物実験委員会に承認された動物実験
計画書に沿って適切に実施した (承認番号 D-R2-1)。

(3) TMB 代謝物の同定
試料尿およびブランク尿の分析結果から尿中への排泄が推定された TMB 代謝物のうちその化合物が市販されているものを標準物質として入手した。
標準物質をトルエン 1 mL に溶解し、上記「2. (2) 試料の分析」の方法に従って誘導体化試薬と反応させ(2) 試料の分析
ピレスロイド系殺虫剤 17) やフタル酸系可塑剤 18)の尿中代謝物の定量法としてこれまでに確立した方法を一部改変して試料尿およびブランク尿を分析した。

た後、同様に処理して分析した。試料尿中の TMB
代謝物と推定されるピークの保持時間及びマスス
ペクトルを標準物質のそれらと比較してそれぞれ同定した。
3. TMB の尿中代謝物の定量

解凍した尿を遠心分離 (3000 回転 × 10 分) し、その上清 10 mL を分取した。2M-酢酸緩衝液 (pH5.0) 0.75 mL、スルファターゼ 7 mg を加えて 22 時
間 37 ℃で反応させ、抱合体を加水分解した。濃塩
酸 0.5 mL および硫酸アンモニウム 9 g を加えた後トルエン 2 mL で代謝物を 2 回抽出した。抽出液を本定量法の確立のために使用する尿は全て著者
から採取した。
(1) 保存用混合標準原液および保存用内部標準液の調製
上記「2. TMB の尿中代謝物の定性」
において TMBの尿中代謝物として同定された TMPD および合わせて無水硫酸ナトリウム 1 g を加えて脱水した。
無水硫酸ナトリウムをトルエン 1 mL で洗い、抽出液に合わせた後窒素気流下 60 ℃にて 1 mL に濃縮した。この液にトリメチルクロロシラン、N,O-ビス(トリメチルシリル)アセトアミドおよび 1-トリメチ
ルシリルイミダゾールを各 30 μL 添加後、90 ℃で

HTMV の標準用試薬をそれぞれ別々にアセトンで褐色高気密ビンに溶解し、保存用標準原液 (10mg/mL) を調製した。さらに各標準原液を別の褐色
高気密ビンに等量ずつ混合し、アセトンで希釈して保存用混合標準原液 (各化学物質濃度：100 μg/mL)を調製した。

30 分間反応させ、各代謝物のトリメチルシリル化誘導体を形成した。水 1 mL で 2 回洗浄した後、無水
硫酸ナトリウム 0.5 g を加えて脱水した。さらに、
無水硫酸ナトリウムをトルエン 1 mL で洗い、脱水液に合わせて試料溶液とした。試料溶液をトルエン
で適宜希釈した後、ガスクロマトグラフィー/質量

IS をアセトンで希釈して 150 μg/mL の濃度に褐
色高気密ビンに調製し、保存用内部標準液とした。

分析法 (GC/MS) により測定した。
装置には島津製作所製AOC-20 型オートサンプラ
ーを装着した GCMS-QP2010 型ガスクロマトグラ
フ質量分析計を使用し、以下の条件のもと分析を行った。分析カラム：アジレント製 J&W DB-5MS (長さ 30 m、内径 0.25 mm、膜厚 0.25 μm)、注入量：1.0

理して、試料溶液を調製した。ただし、尿の遠心分離により得た上清 10 mL に保存用内部標準液 3 μL
を添加した後尿中の抱合体を加水分解した。また、各代謝物のトリメチルシリル化誘導体形成後、水洗、脱水した溶液は、60 ℃で 0.15 mL に濃縮した後、試料溶液とした。

μL、注入モード：スプリットレス (サンプリング 2.0
分)、キャリアーガス：ヘリウム、制御モード：圧力(定圧)、キャリアーガス圧力：89.7 kPa、注入口温度：
260 ℃、カラムオーブン温度：90 ℃ (2 分保持) –(3) 検量線作成のための標準尿溶液の調製
複数回採取した尿のうち、あらかじめ測定対象とする代謝物 TMPD および HTMV の含有量が低レベ(2) 試料溶液の調製
採取後分析までの期間–20 ℃にて保存した尿を解凍し、上記「2. (2) 試料の分析」の方法により処- 82 -

ルであることが確認された尿を混合してプール尿とし、–20 ℃にて保存した。試料の分析に際し、プール尿を解凍し、その 10 mL (n = 7) にアセトンで希釈した保存用混合標準原液の一定量を添加して、各代謝物の尿中添加濃度 0、1、3.3、10、33、100 お

率 R (%) を算出した。

よび 333 μg/L の尿を調製した。上記「3. (2) 試料溶液の調製」の方法に従って処理し、標準尿溶液とした。
(4) ガスクロマトグラフィー/質量分析
調製された試料溶液および標準尿溶液を、上記「2.

コントロールおよびブランク中の代謝物の量 (各平均値) である。
② 検出下限いずれの代謝物もプール尿から検出されるためプール尿 (n = 5) を本法に従って分析し、各代謝物の定量値の標準偏差を算出した。また、検量線作成(2) 試料の分析」に示す分析条件のもと GC/MS により測定した。ただし、質量分析計の分析モードはSIM (Selected Ion Monitoring) とし、各分析対象物質の定量イオン・参照イオン (m/z) は、それぞれ
TMPD (145・247)、HTMV (145・261) および IS (204・205) とした。

時の最低添加濃度の標準尿溶液 (1 μg/L, n = 5) を分析し、同様に定量値の標準偏差を算出した。各代謝物について、より高値の標準偏差の値を用いて、その値の 3 倍をそれぞれ尿中検出下限濃度とした 4)。
③ 定量値の正確性および再現性
プール尿 10 ml (n = 5) に、既知量 (2.0 μg) の代謝(5) 定量
尿中代謝物は内部標準法により定量した。各標準
尿溶液を分析した際に得られる検量線 ([各代謝物濃度 (μg/L)] (x) – [各代謝物ピーク面積 / IS ピーク
面積] (y)) の回帰式より、試料溶液中の各代謝物濃物を添加 (保存用混合標準原液 20 μL: 尿中濃度として200 μg/L)し、本法に従って分析した (サンプル)。
一方、代謝物を添加していないプール尿 (n = 2) を同様に分析し、ブランクとした。サンプルの測定値からブランク (2 試料の平均値) の測定値を差し引き、その定量値の平均と標準偏差を算出した (n = 5)。

度を算出した。

R = (Xs – Xb) / (Xc – Xb) x 100
ここで、Xs、Xc および Xb は、それぞれサンプル、(6) 本法の妥当性に関する試験
各尿中代謝物の分析における本法の妥当性について以下のとおり試験した。
① 回収率

定量値の正確性は相対誤差により、定量値の再現性
は変動係数によりそれぞれ評価した。プール尿に各
代謝物 0.2 μg または 0.02 μg (尿中濃度としてそれぞれ 20 μg/L および 2 μg/L) を添加して調製した試料についても、定量値の正確性および再現性を同様に評価した。

分析対象代謝物のグルクロン酸抱合体、硫酸抱合体およびトリメチルシリル化誘導体の標準物質は市販されておらず入手できないため、抱合された代謝物の加水分解反応および代謝物の誘導体化反応の効率を調べることはできない。そのため、代謝物の加水分解のための加温から誘導体化処理の前ま④ 保存に対する安定性
実試料は採取後分析までの期間冷凍庫 (–20℃)
内で保存することを想定し、保存に対する各代謝物の安定性について試験した。プール尿 300 mL に保存用混合標準原液 150 μL を添加した (尿中添加濃度として 50 μg/L) 後、15 mL ずつ 15 本のバイアルでの回収率について試験した。
プール尿 10 mL (n = 5) に、既知量の代謝物を添
加 (保存用混合標準原液 5 μL: 尿中濃度として 50μg/L) し、本法に従って処理した (サンプル)。一方、代謝物を添加していないプール尿 (n = 7) をトルエ
ン抽出物 1 mL に濃縮するまで同様に処理した後、ビンに分注し、分析までの期間冷凍庫内に保存した。
定期的に 3 本ずつ取り出し、本法に従って分析した(サンプル)。一方、各サンプルの分析時、保存用混合標準原液を添加していないプール尿 (n = 1) を同様に分析し、ブランクとした。添加した各代謝物の定量値の保存期間中における変動について評価し5 試料に同量の各代謝物を添加 (コントロール) し、
2 試料には添加せず (ブランク) に、誘導体化処理を行った。サンプル、コントロールおよびブランク
中の各代謝物を測定し、次式に従い各代謝物の回収た。
(7) 分析法の実試料への適用
尿を 1 週間連続的に毎日朝晩 2 回採取し、各尿中- 83 -

代謝物を測定した。朝は起床時 (月曜日から日曜日の 6 時 30 分～8 時) に、勤務日の晩は勤務終了直後(月曜日から木曜日の 18 時 30 分～19 時 30 分) に、
休日の晩は外出先から帰宅直後 (金曜日から日曜
日の 19 時～21 時) においてそれぞれ採尿した (n =化誘導体の分析を試みた。しかし、生成した誘導体のマスフラグメンテーションにおいて高強度の高質量数のフラグメントイオンは生じず、選択性に優れた高感度な分析は困難と判断された。つぎに、各代謝物のトリメチルシリル化誘導体の分析につい14)。2 種の代謝物濃度の相関性、朝・晩における各代謝物濃度の差異について評価した。各代謝物の濃度は、尿の濃淡を考慮し、各尿試料について FolinWu 法 19) により定量されたクレアチニン濃度により補正した。

て検討した。トリメチルクロロシランを触媒として1-トリメチルシリルイミダゾールによる代謝物の誘導体化を試みたが、定量値の再現性が乏しく、誘導体化反応の効率が一定しないことが示唆された。
そのため、最強のシリル化剤の組み合わせとして知られている 21) トリメチルクロロシラン、1-トリメ

結 果 お よ び 考 察

チルシリルイミダゾールおよび N,O-ビス(トリメチ
ルシリル)アセトアミドの等量混合液を使用して生成した TMPD および HTMV のトリメチルシリル化
誘導体を分析することにした。各代謝物の定量には、
マスフラグメンテーションにより生じたフラグメ
ントイオン[(CH3)2CHCHOSi(CH3)3]+ (m/z 145) を用

1. 代謝物の誘導体化試薬の選定
著者らはこれまでに、生活環境下でのピレスロイ
ド系殺虫剤、フタル酸系可塑剤および有機リン剤(殺虫剤および難燃剤) への曝露を評価する目的で、これら各薬剤の尿中代謝物の分析方法を確立した
17, 18, 20)。いずれも、代謝物を tert-ブチルジメチルシリル化した後 GC/MS により測定する方法である。
誘導体化された代謝物は水に対して安定であり、大きな分子を形成するために分析に際して選択性に優れている。今回も、N-(tert-ブチルジメチルシリル)-

いた (図 3)。

N- メチルトリフルオロアセトアミドを用いた
TMPD および HTMV の tert-ブチルジメチルシリル

ラットから得られた結果 (ブランク尿) と比較した
ところ、試料尿から TMB に由来すると考えられる
複数のピークが検出された。これらのうち、保持時
間 9.9 分および 11.2 分に検出されたピークのマスス
ペクトルは、それぞれ市販の TMPD および HTMVを分析した際に得られた保持時間とマススペクト

(I)

%
100

145
73

75
50
103
117

25
0

157

100

247

200

300 (m/z)

(II)
%
100

73
145

75
50

129

25
0

100

217 232 261

200

300

(m/z)

図 3.トリメチルシリル化された TMPD (I) 及び
HTMV (II) のマススペクトル

2. TMB の尿中代謝物の定性
TMB を投与したラットにおける尿 (試料尿) を分析した際に得られたクロマトグラムおよび各ピークのマススペクトルを、TMB を投与していない

ル (図 3) と一致し、それぞれ同定された。試料尿中より投与物質 TMB に由来するピーク (2 種の異性体の保持時間：それぞれ 12.3 分および 13.5 分) も検出されたが、上記 2 種のピークに比較して明らかにその強度は小さく、投与された TMB は尿中には大部分代謝された後に排泄されることが示唆された。同定された 2 種の代謝物はいずれも TDB の尿中代謝物として報告されている 16)。TMB は TMPDのモノエステル化合物、TDB は TMPD のジエステル化合物であることから、体内に吸収された TDBの一部は TMB に加水分解され、その後さらに
TMPD、HTMV に代謝されて尿中に排泄されると推定された。
以下、この 2 種の代謝物 TMPD および HTMV の定量方法について検討した。

- 84 -

3. TMB の尿中代謝物の定量(1) クロマトグラフィー
標準尿溶液を分析した際に得られたクロマトグ
ラムを図 4 に示す。各ピーク強度は定量イオンと参照イオンのシグナルの和である。
IS は 7.0 分、
TMPD
は 9.9 分、HTMV は 11.2 分にそれぞれ検出された。
溶液中にはこれら 3 物質の測定に影響を及ぼす他の化学物質によるピークは検出されなかった。したがって、試料中の各代謝物の分離定量は可能であると考えられた。

I.S.

Intensity(3) 回収率
本法に従って試料を調製した際の各代謝物の回収率を表 1 に示す。TMPD の回収率はほぼ 100%であり、試料の調製過程、すなわち、加水分解のための尿試料の加温、トルエンによる抽出、抽出溶媒の濃縮の過程においてほとんど損失しないと考えられた。一方、HTMV の回収率は TMPD に比較して低く、約 7 割であった。したがって、HTMV を正確に定量するためには、本法のとおり、標準物質を添加したプール尿を試料と同様に処理して調製した標準尿溶液を分析して検量線を作成する必要があ

(I)

TMPD

(2) 検量線
標準尿溶液を分析して検量線を作成した際、その回帰直線の傾きと相関係数の値を表 1 に示す。いずれの代謝物についても、その検量線は 333 μg/L 以下の尿中濃度において良好な直線性を示した。

HTMVると考えられた。
Time (min)(II)(4) 検出下限
いずれの代謝物においても、標準尿溶液 (尿中添加濃度：1 μg/L) を分析した際に得られた定量値の標準偏差は、プール尿を分析した際の標準偏差よりIntensity

I.S.

TMPD

も高値であった。
尿中におけるTMPD およびHTMVの検出下限濃度はそれぞれ 0.2 μg/L、0.3 μg/L であった (表 1)。

HTMVTime (min)図 4. 標準尿溶液 (尿中への添加濃度： (I) 0 μg/L,(5) 定量値の正確性および再現性
一定量の TMPD および HTMV を添加したプール(II) 3.3 μg/L) のトータルイオンクロマトグラム

尿を本法に従い分析し、定量値の相対誤差および変表 1. 本法における各代謝物の検量線、回収率、検出下限および定量値の正確性および再現性
検量線

TMPD
HTMV

傾き

ra

回収率
(%)

0.087
0.047

0.99990.9994

107
72

a

相関係数

b

尿中検出下限濃度 (μg/L)c

代謝物のプール尿への添加濃度d

相対誤差 (%, n = 5)e

変動係数 (%, n = 5)

LOD b

0.2
0.3

正確性及び再現性
20 μg/L

2 μg/L c
R.E. d8.7
6.1- 85 -

C.V. e
5.3
7.8

R.E.
6.7
6.7

200 μg/L
C.V.
4.2
9.7

R.E.
1.5
4.5

C.V.
6.4
5.6

動係数を算出した (表 1)。いずれの添加量においても、各代謝物の定量値の相対誤差、変動係数はそれ
ぞれ 9 %以下、10 %以下であり、TMPD および
HTMV の定量値の正確性、分析における再現性はともに良好であると考えられた。

TDB の曝露量を把握するための指標として、TMPD
および HTMV が妥当であることを支持するものと考えられた。さらに、各代謝物について、朝に採取した試料中と晩に採取した試料中の濃度を比較す
る (t-検定) と、ともに朝に採取した試料中の濃度(6) 保存に対する安定性
一定期間保存後に分析した尿試料中の各代謝物の残存率の経日変化を表 2 に示す。
尿中の TMPD お
よび HTMV の定量値はともに 35 日間の保存期間中ほぼ一定であり、大幅な増減は見られなかった。しの方が有意 (p < 0.05) に高かった。一般に化学物質の代謝物の尿中排泄量は採尿前数時間の曝露を反映していることから、著者においては自宅での睡眠中の TMB または TDB への曝露レベルが、屋外や職場でのそれらへの曝露レベルに比較して高いことが示唆された。

たがって、採取した尿試料は、1 ヶ月間は冷凍庫内で保存可能であると考えられた。
(7) 分析法の実試料への適用
一週間 (毎日朝晩各 2 回) 連続して採取した尿試料中の各代謝物の分析結果を表 3 に示す。TMPD お
よび HTMV はともに全ての尿試料から検出された。
平均濃度は TMPD 3.9 μg/g creatinine、HTMV 1.3 μg/g
creatinine であり、全ての試料において TMPD の濃
度が HTMV の濃度よりも高かった。また、各試料中の両代謝物濃度の間に有意な相関性 (r = 0.54) が認められ、2 つの代謝物の共通の源が存在することが示唆された。すなわち、これらの代謝物の一定量は体内に取り込まれた特定の同じ化学物質から生じたものと推定された。この結果は、TMB または

表 2. 冷凍庫内の尿試料中代謝物の残存率 (%)
保存期間 (日)3915
TMPD 92
90
102
HTMV 104
95
102

24
100
95

これまでに著者らは、厚生労働省の提案する空気
中 TMB および TDB の分析法 4) について検証し、提案された方法は室内空気中のこれら化学物質の分析に十分適用できることを報告した 22)。今回確立した方法と合わせて活用し、住民における TMB お
よび TDB の一日摂取量や住宅室内空気質の摂取量への寄与に関する知見を集積するなど、これら化学物質による健康被害の軽減や防止を目的とした今後の調査や研究のために本法は有用である。
結 論
TMB への曝露において尿中に排泄される代謝物
を、ラットを用いた動物実験により検索したところ、これまでに知られている TDB の尿中代謝物 16) と同じ TMPD および HTMV が検出された。未変化の
TMB の尿中からの検出レベルは 2 種の代謝物に比較して低く、体内に取り込まれた TMB は尿中には大部分代謝された後に排泄されることが示唆された。
一般生活環境下の住民における尿中 TMPD および HTMV の定量に際し、これまでにピレスロイド

35
96
92

表 3. 尿試料中の各代謝物濃度 (μg/g creatinine)

TMPD

朝
晩

月
6.12
1.73

火
3.44
1.73

水
3.64
2.51

木
5.02
2.44

金
5.28
3.08

土
4.38
3.61

日
5.49
6.71

HTMV

朝
晩

1.48
0.85

1.32
0.82

2.30
0.78

1.14
0.79

1.32
1.33

1.24
1.21

1.64
1.49

- 86 -

平均
4.77
3.12
3.94 (全平均)
1.49
1.04
1.27 (全平均)

系殺虫剤 17) やフタル酸系可塑剤 18) の尿中代謝物の定量法として確立した方法の適合性について検証した。代謝物の tert-ブチルジメチルシリル化誘導
体はマスフラグメンテーションにおいて高強度の
高質量数のフラグメントイオンを生じず、既法では(通知). 医薬発 828 号. 2001.
5) 厚生労働省医薬局長. 室内空気中化学物質の室内濃度指針値及び標準的測定方法等について(通知). 医薬発 0207002 号. 2002.
6) 小林 智, 武内伸治, 小島弘幸, 高橋哲夫, 神

選択性に優れた高感度な分析は困難と判断されたため、3 種の誘導体化試薬の混合液との反応により生じた代謝物のトリメチルシリル化誘導体を定量することにした。TMPD および HTMV の検量線はいずれも 333 μg/L 以下の尿中濃度において良好な直線性を示し、それぞれ 0.2 および 0.3 μg/L 以上の和夫, 秋津裕志, 伊佐治信一. 水性塗料成分 1メチル-2-ピロリドン及びテキサノールによる新築小学校の室内空気汚染. 室内環境 2010; 13(1): 39-54.
7) 厚生労働省. 第 21 回シックハウス（室内空気汚染）問題に関する検討会 (2017/4/19) 配付資料.

尿中濃度において検出可能であった。本分析法は、
これらの代謝物を正確かつ再現性よく、また、尿中の他の夾雑成分の影響を受けずに定量することが可能な方法であることが示唆された。さらに、採取した尿試料は、一ヶ月間冷凍庫での保存が可能であると考えられた。本法は、TMP および TDP の曝露

室内空気汚染に係るガイドライン案について－室内濃度に関する指針値案－. 2017.
https://www.mhlw.go.jp/file/05-Shingikai-1112100
0-Iyakushokuhinkyoku-Soumuka/0000166137.pdf
8) 厚生労働省. シックハウス（室内空気汚染）問
題に関する検討会中間報告書－第 23 回までののモニタリング手法として、今後の調査や研究に有用である。

まとめ. 2019.
https://www.mhlw.go.jp/content/000470188.pdf
9) Sahlberg B, Gunnbjörnsdottir M, Soon A, Jogi R,
Gislason T, Wieslander G, Janson C, Norback D.
Airborne molds and bacteria, microbial volatileorganic compounds (MVOC), plasticizers and謝 辞
本研究は、(公財) 大同生命厚生事業団からの助成
金「地域保健福祉研究助成 (医学)」および JSPS 科
研費 (課題番号 21K10431) により実施した。
利 益 相 反開示すべき利益相反はない。

formaldehyde in dwellings in three North European
cities in relation to sick building syndrome (SBS). Sci
Total Environ 2013; 444: 433-440.
10) Metiäinen P, Mussalo-Rauhamaa H, Viinikka M.
TXIB-emission from floor structure as a marker ofincreased risk for some specific symptoms. Indoor

1) 化学工業日報社. 16313 の化学商品. 化学工業日報社; 2013. 562-563.
2) 厚生省生活衛生局長. 室内空気中化学物質の室Air 2002, Proceedings of the 9th International
Conference on Indoor Air Quality and Climate 2002;
2: 108–113.
11) 厚生労働省. 第 21 回シックハウス (室内空気汚染) 問題に関する検討会 (2017/4/19) 配付資料.
新規指針値策定候補となる揮発性有機化合物

内濃度指針値及び標準的測定方法について (通知). 生衛発 1093 号. 2000.
https://www.mhlw.go.jp/web/t_doc?dataId=00ta519
2&dataType=1&pageNo=13) 厚生省生活衛生局長. 室内空気中化学物質の室内濃度指針値及び総揮発性有機化合物の室内の実態調査. 2017.
https://www.mhlw.go.jp/file/05-Shingikai-11121000-Iyakushokuhinkyoku-Soumuka/0000166139.pdf
12) 溝内重和, 市場正良, 宮島 徹, 兒玉宏樹, 高椋利幸, 染谷 孝, 上野大介. 小学校室内環境における未規制 VOCs 濃度の現状把握. 室内環境濃度暫定目標値等について (通知). 生衛発
1852 号. 2000.
4) 厚生労働省医薬局長. 室内空気中化学物質の室内濃度指針値及び標準的測定方法等について

2014; 17 (2): 69-79.
13) Bönisch U, Böhme A, Kohajda T, Mögel I, Schütze N,
von Bergen M, Simon JC, Lehmann I, Polte T.
Volatile organic compounds enhance allergic airway

文 献- 87 -

inflammation in an experimental mouse model.
PLoS One 2012; 7 (7): e39817.
14) Choi H, Schmidbauer N, Sundell J, Hasselgren M,
Spengler J, Bornehag C-G. Common household
chemicals and the allergy risks in pre-school age

as biomarkers for monitoring exposure to phthalates
by gas chromatography/mass spectrometry. Biomed
Chromatogr 2017; 31 (7): e3910.
19) Bonsnes RW, Taussky HH. On the colorimetricdetermination of creatinine by the Jaffe reaction. J

children. PLoS One 2010; 5 (10): e13423.
15) Kim JL, Elfman L, Mi Y, Wieslander G, Smedje G,
Norbäck D. Indoor molds, bacteria, microbial
volatile organic compounds and plasticizers inschools - associations with asthma and respiratory
symptoms in pupils. Indoor Air 2007; 17 (2): 153-

Biol Chem 1945; 158 (3): 581-591.
20) Yoshida T, Yoshida J. Simultaneous analytical method
for urinary metabolites of organophosphorus
compounds and moth repellents in general
population. J Chromatogr B 2012; 880 (1): 66-73.
21) 小川 茂. GC/MS, LC/MS のための誘導体化. ぶ

163.
16) Astill BD, Terhaar CJ, Fassett DW. The toxicology
and fate of 2,2,4-trimethyl-1,3-pentanediol
diisobutyrate. Toxicol Appl Pharmacol 1972; 22 (3):387-399.
17) Yoshida T. Analytical method for pyrethroid

んせき 2008; (7): 332-336.
22) 吉田俊明, 味村真弓, 大嶋智子, 山口進康. 室
内空気中 2,2,4-トリメチル-1,3-ペンタンジオー
ルモノイソブチレート、2,2,4-トリメチル-1,3-ペンタンジオールジイソブチレート及び 2-エチ
ル-1-ヘキサノールの分析法の検討. 大阪健康

metabolites in urine of the non-occupationally
exposed population by gas chromatography/mass
spectrometry. J Chromatogr Sci 2017; 55 (9): 873881.
18) Yoshida T. Analytical method for urinary metabolites

安全基盤研究所研究年報 2019; 3: 89-95.
WEB サイトの内容は 2021 年 5 月 7 日に確認した。

- 88 -

Annual Report of Osaka Institute of Public Health, 5, 2021

Analytical method for urinary metabolites of 2,2,4-trimethyl-1,3-pentanediolmonoisobutyrate and 2,2,4trimethyl-1,3-pentanedioldiisobutyrate in the general population

Toshiaki YOSHIDA

Guideline values of the concentrations in indoor air for two compounds, 2,2,4-trimethyl-1,3-pentanediolmonoisobutyrate(TMB) and 2,2,4-trimethyl-1,3-pentanedioldiisobutyrate (TDB), are presently being deliberated by Ministry of Health,Labour and Welfare in Japan. In order to understand the exposure to these two compounds in the general population, we
identified the major urinary metabolites of TMB and established an analytical method for the urinary metabolites of
TMB and TDB. Two metabolites, 2,2,4-trimethyl-1,3-pentanediol and 3-hydroxy-2,2,4-trimethylvaleric acid, which had
been known as urinary metabolites resulted from TDB, were found in the urine samples collected from rats administeredintraperitoneally with TMB (300 mg/kg). These metabolites were enzymatically hydrolyzed and extracted with toluene.
After transformation to their trimethylsilyl derivatives, they were analyzed by gas chromatography/mass spectrometry.
The calibration curves for the metabolites were linear. They could be determined accurately and reproducibly at urinary
concentrations of up to 300 μg/L (detection limits: 0.2 - 0.3 μg/L). The collected urine samples could be stored for up to
1 month at -20 ℃ in a freezer. The proposed method was applied to determine urine samples collected continuously for
one week from author. There was a significant correlation between the urinary concentrations of both metabolites. The
method was considered to be available for future researches as a monitoring method of the exposures to TMB and TDB
in the general population.

Key words : Texanol, TXIB, biomarker, gas chromatography/mass spectrometry

Osaka Institute of Public Health- 89 -

報 文

地方独立行政法人大阪健康安全基盤研究所研究年報 Ann. Rep. Osaka. Inst. Pub. Health, 5, 90-97 (2021)

大阪府における環境および食品中放射能調査（令和 2 年度報告）

肥塚利江，大山正幸，小泉義彦，小池真生子，山口進康

令和 2 年度の原子力規制庁委託により実施した、大阪府における環境および各種食品中放射能調査
結果を報告する。調査は、降水中の全ベータ放射能測定、環境試料（降下物、大気浮遊じん、上水、海水、土壌、海底土）および食品試料（タマネギ、キャベツ）中のガンマ線放出核種分析および空間放射線量率（モニタリングポスト）について実施した。その結果、令和 2 年度の環境および各種食品中の放射能および放射線のレベルは、過去の値と同様であり、人工放射性物質の環境への新たな放出はなかったことが確認された。

キーワード：環境放射能、全ベータ放射能、核種分析、空間放射線量率

大阪健康安全基盤研究所（当所）では、昭和 35
年（1960 年）度より大阪府における環境および食品中の放射能測定調査を実施している。この調査
は、人工放射性降下物および原子力施設等からの放射性物質の漏洩による環境汚染の有無および

実

験

方

法

試料の採取、処理および測定は、「環境放射能水準調査委託実施計画書（令和 2 年度）」1)に基づいて行った。表 1 に調査項目および試料等を示

そのレベルを明らかにする目的で行っており、原子力規制庁の委託によるものである。
降水については全ベータ放射能測定、その他の環境試料および食品試料についてはガンマ線核種分析［セシウム 134（ 134Cs）、 セシウム 137（137Cs）、ヨウ素 131（131I）、カリウム 40（40K）す。

等］を行い、モニタリングポストによる空間放射
線量率の調査を行った。
ガンマ線核種分析に関しては、測定値の信頼性確保のため、（公財）日本分析センターとの間で、既知量の放射性核種を添加した試料 7 検体について、クロスチェック（標準試料法による相互比cm2）で降水を集めた。毎朝 9 時 30 分に採取し、100 mL（1 mm）以上の降水があった場合には 100mL を測定試料とした。
(2) 測定方法
蒸発皿に試料 100 mL とヨウ素担体（1 mg I-/mL）
1 mL、0.1 mol/L 硝酸銀 1 mL および 10%硝酸 1較分析）を行った。
本報告では、令和 2 年度に実施した上記の放射能調査結果を、過去の測定結果との比較も含め報告する。なお、定時降水、大気浮遊じん、降下物の採取用具および大阪市モニタリングポストの設備は、平成 30 年 10 月に当所の屋上（地上約mL を加えて加熱濃縮させた。濃縮物を直径 25mm のステンレス製試料皿に移して蒸発乾固させ、測定用試料とした。測定は低バックグラウン
ド放射能自動測定装置（日立製作所製 LBC450）で行った。比較試料は、酸化ウラン（U3O8：日本
アイソトープ協会製、35.3 dps）を用いた。測定は20 m）から表 1 の場所に移設された。

試料採取から 6 時間後に行った。測定時間は、比較試料 5 分、降水試料 30 分とした。

1. 全ベータ放射能測定(1) 降水試料当所（大阪市東成区）本館南側屋上（地上約 15m）に設置したデポジットゲージ（表面積 1000

大阪健康安全基盤研究所衛生化学部生活環境課- 90 -

表1

放射能調査項目および試料等

調査項目

試 料 名

種 別

採 取 場 所

採取回数等

全ベータ放射能定時降水
大気浮遊じん
降下物

降水

ガンマ線核種分析

降水・ちり

上 水

原 水
蛇口水

守口市大庭町 大阪府庭窪浄水場
大阪市東成区 当所本館1Ｆ

降水毎
3ヶ月毎
毎月
年1回(令和2年 6月)
年1回(令和2年 6月)

海 水
海底土
土 壌

表面水
表 層
0～5cm

大阪港入口
大阪港入口
大阪市中央区 大阪城公園内

年1回(令和2年 7月)
年1回(令和2年 7月)
年1回(令和2年 8月)

11
1

5～20cm野 菜

タマネギ(生産地)

大阪市中央区 大阪城公園内
大阪府泉南郡熊取町

年1回(令和2年 8月)
年1回(令和2年 6月)

11

大阪府泉南郡熊取町（公財）日本分析センターで調製（公財）日本分析センターで調製

年1回(令和2年12月)
年1回(令和2年 7月)
年1回(令和2年 8月)

111（公財）日本分析センターで調製
大阪市東成区 当所本館北側駐車場

年1回(令和2年 8月)
毎日／年間

5
355

茨木市大住町 茨木保健所
寝屋川市八坂町 寝屋川市保健所

毎日／年間
毎日／年間
毎日／年間

363
361
356

毎日／年間
毎日／年間

359
362

キャベツ(生産地)

相互比較分析試料
（標準試料）

模擬牛乳
模擬土壌
寒天

空間線量率

件数
76
4
12

大阪市東成区 当所本館南側屋上
大阪市東成区 当所本館北側駐車場
大阪市東成区 当所本館南側屋上

モニタリングポスト

東大阪市西岩田東大阪市環境衛生検査センター

富田林市寿町 富田林保健所
泉佐野市羽倉崎 市立佐野中学校

11

2. 核種分析(1) 測定試料① 大気浮遊じん：当所本館北側駐車場に設置し参照）。
④ 食品：野菜類（タマネギおよびキャベツ）の食用部約 4 kg を 65℃の乾燥器（Panasonic 社製、たハイボリウム・エアサンプラー（柴田科学株式
会社製、HV-1000R）を用いて、ろ紙（東洋濾紙、
HE-40T）
上に大気浮遊じんを捕集した。毎月 3 回、午前 10 時から翌日の午前 10 時までの 24 時間捕集を行った。3 ヶ月分のろ紙試料（測定に供した吸引量：約 10000 m3）をカッターで円形（直径 50

MOV-212-PJ）で乾燥させた後に、石英製容器に移し て 電 気 マ ッ フ ル 炉 （ ADVANTEC 社 製 、
FUW263PA）で 450℃、24 時間灰化した。それぞれの灰試料は 0.35 mm メッシュのふるいに通し、
U-8 容器に移して測定用試料とした（試料採取場
所、時期および測定数は表 1 を参照）。

mm）に切り取り、ポリプロピレン製容器（U-8 容器）に詰め測定用試料とした。
② 降下物（雨水・ちり）：当所本館南側屋上（地上約 15 m）に設置した水盤（表面積 5000 cm2）に降下した雨水およびちりを 1 ヶ月間採取し、採取した試料全量を、上水自動濃縮装置（柴田理化⑤ 海水、土壌、海底土：海水は 2 Ｌをマリネリ
ビーカー（2 L 容）に入れ、測定用試料とした。
土壌および海底土は、採取後に 105℃の乾燥器で乾燥させた後、2 mm メッシュのふるいに通して得られた乾燥細土約 100 g を U-8 容器に入れ、測定用試料とした（試料採取場所、時期および測定器械製）を用いて蒸発濃縮させた。濃縮物を蒸発皿に移して蒸発乾固させた後、残留物を U-8 容器に移し測定用試料とした。
③ 上水：原水（淀川河川水）は大阪広域水道企業団 庭窪浄水場（守口市）原水取水口から、蛇口水は当所本館 1 階の実験室内蛇口から採取し数は表 1 を参照）。
⑥ 標準試料法による相互比較分析：（公財）日本
分析センターが数核種を添加して調製した放射能標準容積線源（寒天）（以下「寒天」という）
および放射能標準容積線源（模擬土壌（アルミナ））（以下「模擬土壌」という）ならびに分析比較試

た。採取試料各 100 L を、上水自動濃縮装置を用いて蒸発濃縮させた。濃縮物を蒸発皿に移して蒸発乾固させた後、残留物をそれぞれ U-8 容器に移し測定用試料とした（時期および測定数は表 1 を料（模擬牛乳）（以下「模擬牛乳」という）につ
いて、寒天（U-8 容器：試料高さの違う 5 試料）
および模擬土壌（U-8 容器：1 試料）は U-8 容器のまま、模擬牛乳（1 試料）は全量（2 L）をマリ- 91 -

ネリビーカー（2 L 容）に入れ測定を行った。
測定結果については、（公財）日本分析センタ
ーにおいて基準値（添加値）と比較し評価を行った。評価は、当所（分析機関）の分析値と基準値の拡張不確かさ（U）から En 数を算出し、|En|≦す。
降水中の全ベータ放射能は、76 試料中 17 例から検出されたが、異常値は検出されなかった。
表2

1 を基準値内（基準値と一致）とした。なお、En数は下記の式により求められる。

En 数＝

年

4月
5月
6月
7月
8月
9月
10月
11月
12月
令和3年 1月
2月
3月
令和 2年度(2) 測定方法
あらかじめエネルギーの異なる核種を含んだ
標準線源を用いてエネルギー校正および検出効
率校正を行ったゲルマニウム半導体検出器（キャび 40K 等）の定性定量分析を行った。

月

令和2年

（分析値分析機関－基準値）
U２分析機関＋U２基準値

ンベラ製、GC2018）を用い、試料中の核種より放出されるガンマ線量を測定した。測定時間は原則80000 秒とし、寒天のみ 20000 秒から 80000 秒とした。得られた計測結果をバックグラウンド補正
した後、エネルギー補正および検出効率補正を行ない、測定試料中の核種（134Cs、137Cs、131I およ

降水中全ベータ放射能測定結果
降水量

件数

濃度

月間降下量

mm

（検出数）

Bq/L

MBq/km2

124
104
174
418
109
108
207
48
9
82
47
151
1581

4 (0)
4 (2)
8 (1)
15 (1)
4 (2)
9 (2)
7 (0)
5 (2)
2 (1)
7 (4)
3 (0)
8 (2)
76 (17)ND
ND～0.42
ND～0.42
ND～0.51
ND～0.48
ND～0.36ND
ND～0.43
ND～0.32
ND～0.93ND
ND～1.26
ND～1.26

ND
27.2
1.6
1.4
31.1
1.1
ND
2.0
1.9
4.7
ND
5.6
76.6

1380
1478
1270

75 (33)77 (23)78 (18)ND～1.46
ND～1.63
ND～0.91

147.5
56.9
69.3

過去3年間の値

平成29年度*
平成30年度*
平成31年度*ND：計数値がその計数誤差の3倍を下回るもの*：北朝鮮核実験に伴うモニタリング強化のため、平成29年9月 3日～12日まで休止。

2. 核種分析
環境試料および食品試料中の 134Cs、137Cs、131I

3. 空間放射線量率測定
モニタリングポスト（NaI シンチレーション式、
エネルギー補償型、アロカ製 MAR-22 型）による空間放射線量率の測定は、当所、茨木市、寝屋川および 40K の分析結果を表 3 に示す。
(1) 134Cs および 137Cs：今年度も例年同様、137Cs が土壌および海底土の各試料から検出されたが、そのレベルは過去の値と同程度であった。その他の試料では 137Cs の検出はなかった。134Cs は、どの試料からも検出されなかった。

市、東大阪市、富田林市、泉佐野市に設置した 6基（地上 1m）で連続測定を行った（設置場所は
表 1 を参照）。結果は 1 時間平均値による 1 日の変動をメモリーカードから読み取った。なお、令和 3 年 1 月 18 日から 28 日にかけて、6 基のモニ
タリングポストが更新されたので、それに伴い、(2) 131Ｉ：131Ｉは、上水原水および蛇口水試料か
ら微量（1.1 および 0.68 mBq/L）検出された。他の環境試料および食品試料からは検出されなかった。上水中の 131Ｉについては、原水が平成
元年度から、蛇口水が平成 2 年度から時々検出されており、そのレベルも過去の値（原水：ND ～それぞれ、2 から 10 日間の欠測がある。
モニタリングポスト 6 基の測定結果は、自動測定・配信システムにより 10 分間の平均値が原子
力規制委員会のホームページにリアルタイムで公表されている 2)。

4.9、蛇口水：ND ～ 1.4 mBq/L）3)と同程度であることや他の環境試料等から検出されていない
こと、半減期が 8 日と短いことなどから、既報 4)に述べたように、その起源は医学利用によるものであろうと推定される。
上水中に存在する 131I による府民への健康影響

結

果

お

よ

び

考

察

1. 全ベータ放射能
表 2 に降水中の全ベータ放射能測定結果を示については、既報 4)でも論じたように、そのレベ
ルは飲食物摂取制限の基準 5)（飲料水中の放射性
ヨウ素：300 Bq/kg）の 30 万分の 1 程度の低値であり、問題はないと考えられる。

- 92 -

表3
試料

環境および食品試料中の 134Cs、137Cs、131I および 40K 濃度

採取年月日

単位

134

137

Cs

131

40

Cs

I

K

大気浮遊じん
4月～6月 R2.4.6～R2.6.18

mBq/m3

ND

ND

ND

ND

7月～9月 R2.7.2～R2.9.17

〃

ND

ND

ND

0.13±0.038

10月～12月 R2.10.5～R2.12.17

〃

ND

ND

ND

ND

1月～3月 R3.1.5～R3.3.17

〃

ND

ND

ND

ND

令和2年度

3

mBq/m

ND

ND

ND

ND～0.13

過去3年間の値

mBq/m3ND

ND

ND

ND～0.16

令和2年

令和3年

降下物
令和2年

4月

R2.3.31～R2.4.30

MBq/km2

ND

ND

ND

ND

5月

R2.4.30～R2.6.1

〃

ND

ND

ND

ND

6月

R2.6.1～R2.7.1

〃

ND

ND

ND

ND

7月

R2.7.1～R2.8.3

〃

ND

ND

ND

ND

8月

R2.8.3～R2.9.1

〃

ND

ND

ND

ND

～R2.10.1

〃

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

9月

R2.9.110月

R2.10.1～R2.11.2

〃

ND

11月

R2.11.2～R2.12.1

〃

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND
ND

12月

R2.12.1～R3.1.4〃

ND

1月

R3.1.4～R3.2.1

〃

ND

ND

ND

2月

R3.2.1～R3.3.1

〃

ND

ND

ND

ND

3月

R3.3.1～R3.3.31

〃

ND

ND

ND

0.81±0.20

令和2年度

MBq/km2

ND

ND

ND

ND～0.81

過去3年間の値

MBq/km2

ND

ND

ND

ND～1.4

mBq/L

ND

ND

1.1±0.1264±2.4

mBq/L

ND

ND

ND～3.4

62～79

mBq/L

ND

ND

0.68±0.20

82±2.6

mBq/L

ND

ND

ND～0.66

78～94

Bq/L

ND

ND

ND

4.1±0.37

Bq/L

ND

ND

ND

3.2～5.2

Bq/kg dry

ND

1.5±0.21ND630±11

Bq/kg dryND

1.8～2.4

ND

620～650

Bq/kg dry

ND

1.1±0.21ND680±11

2(ND)(58±11)(ND)(35000±540)

令和3年

上水・原水

R2.6.22

過去3年間の値
上水・蛇口水R2.6.5

過去3年間の値
海水R2.7.30

過去3年間の値
海底土R2.7.30

過去3年間の値
R2.8.7土壌0～5cm層(MBq/km )過去3年間の値

Bq/kg dryND

ND～2.0ND

640～6602(MBq/km )(ND)(ND～110)(ND)(32000～38000)

Bq/kg dry

ND

0.87±0.15ND680±102(MBq/km )(ND)(140±26)(ND)(110000±1700)

Bq/kg dryND

0.8～2.9

ND

680～7102(MBq/km )(ND)(120～490)(ND)(110000～120000）

Bq/kg生ND

ND

ND

53±0.36

Bq/kg生

ND

ND

ND

44～51

Bq/kg生ND

ND

ND

68±0.46

Bq/kg生

ND

ND

ND

63～70

R2.8.7土壌
5～20cm層
過去3年間の値

農産物

タマネギ

R2.6.5

過去3年間の値
農産物

キャベツ

R2.12.11

過去3年間の値
ND：計数値がその計数誤差の3倍を下回るもの- 93 -

表 4 モニタリングポストによる空間放射線量率
表4-1 大阪市 大阪健康安全基盤研究所：地上1 m
モニタリングポスト(nGy/h)
測定回数
測 定 年 月（所在地：大阪市）
最高値 最低値 平均値
30
91
64
66
令和 2年
4月
5月
31
77
65
66
6月
30
105
64
66
7月
31
86
64
66
8月
31
88
64
65
9月
30
84
63
66
10月
31
75
63
66
11月
30
84
65
66
12月
31
92
64
66
1月
21*
72
63
65
令和 3年
2月
28
102
62
64
3月
31
93
61
64
令和 2年度
355*
105
61
66
過去3年間の値
平成29年度 (地上20m)
365
67
40
42
平成30年度 (地上20m)
205
65
40
42
160
99
72
76
(地上1m)*2
366
104
62
71
平成31年度 (地上1m)*2

表4-2 茨木市 茨木保健所：地上1 m
モニタリングポスト(nGy/h)
測定回数
測 定 年 月（所在地：茨木市）
最高値 最低値 平均値
30
69
53
56
令和 2年
4月
5月
31
70
55
57
6月
30
84
53
57
7月
31
72
52
55
8月
31
65
54
57
9月
30
70
55
58
10月
31
64
55
57
11月
30
66
55
57
12月
31
74
55
58
1月
29*
69
53
56
令和 3年
2月
28
75
53
55
3月
31
82
53
55
令和 2年度
363*
84
52
56
過去3年間の値
平成29年度36585
52
56
平成30年度
36586
52
57
平成31年度366
77
52
57* :令和 3年 1月機器更新のため欠測* :令和 3年 1月機器更新のため欠測*2:平成30年10月地上1mに移設

表4-3 寝屋川市 寝屋川市保健所：地上1 m
測

定

年

月

令和 2年

4月
5月
6月
7月
8月
9月
10月
11月
12月
1月
令和 3年
2月
3月
令和 2年度
過去3年間の値
平成29年度
平成30年度
平成31年度

測定回数

30
31
30
31
31
30
31
30
31
27*
28
31
361*

表4-4 東大阪市 東大阪市環境衛生検査センター：地上1 m

モニタリングポスト(nGy/h)（所在地：寝屋川市）
最高値 最低値 平均値
86
64
65
78
64
66
93
64
66
84
63
65
76
64
65
80
63
65
74
63
66
79
64
66
89
64
66
79
64
66
102
64
66
91
64
66
102
63
66

365
365
366

95
98
90

69
68
62

測

定

4月
5月
6月
7月
8月
9月
10月
11月
12月
1月
令和 3年
2月
3月
令和 2年度
過去3年間の値
平成29年度
平成30年度
平成31年度

71
71
67

令和 2年

年

月

4月
5月
6月
7月
8月
9月
10月
11月
12月
1月
令和 3年
2月
3月
令和 2年度
過去3年間の値
平成29年度
平成30年度
平成31年度

30
31
30
31
31
30
31
30
31
22*
28
31
356*

モニタリングポスト(nGy/h)（所在地：東大阪市）
最高値 最低値 平均値
97
74
77
89
75
78
115
74
78
96
73
76
84
75
78
92
75
78
88
75
77
96
75
77
104
75
78
86
74
77
112
74
77
105
74
77
115
73
77

365
365
366

103
108
105

75
72
73

78
77
77

表4-6 泉佐野市 佐野中学校：地上1 m

モニタリングポスト(nGy/h)
測定回数（所在地：富田林市）
最高値 最低値 平均値
30
73
60
62
31
73
61
62
30
75
60
62
31
70
60
61
31
78
61
63
30
73
61
62
31
71
61
62
30
75
61
62
31
91
61
63
25*
67
59
61
28
83
59
60
31
81
59
60
359*
91
59
62
365
365
366

測定回数

* :令和 3年 1月機器更新のため欠測

表4-5 富田林市 富田林保健所：地上1 m
定

月

令和 2年

* :令和 3年 1月機器更新のため欠測

測

年

82
90
85

60
60
60

測

定

令和 2年

年

月

4月
5月
6月
7月
8月
9月
10月
11月
12月
1月
令和 3年
2月
3月
令和 2年度
過去3年間の値
平成29年度
平成30年度
平成31年度

63
62
62* :令和 3年 1月機器更新のため欠測

測定回数

30
31
30
31
31
30
31
30
31
28*
28
31
362*

モニタリングポスト(nGy/h)（所在地：泉佐野市）
最高値 最低値 平均値
72
49
51
74
49
51
85
49
52
72
48
51
60
50
52
69
49
51
62
49
51
65
49
51
67
50
52
73
48
51
72
48
50
98
48
50
98
48
51

365
365
366

* :令和 3年 1月機器更新のため欠測- 94 -

90
91
77

49
48
48

52
51
51

(3) 40K：天然放射性核種である 40K は多くの試料で検出されたが、そのレベルは過去の値と同程度であり、特に異常値は認められなかった。
(4) 標準試料法による相互比較分析：（公財）日本
分析センターの報告書 6)によると、当所の分析結った。また、他の人工放射性核種はいずれの試料からも検出されなかった。空間放射線量率では、大阪市のモニタリングポストでは移設に伴う地上高の影響と思われる僅かな測定値の上昇が継続して認められたが、平常値の範囲内であった。

果は基準値（添加値）とよく一致しており、かつ、En 数の絶対値も「1」以下であり、ガンマ線核種分析の精度は確保されていることが認められた。

また。3 ヶ所のモニタリングポストで過去 3 年間の最高値より若干高い値を観測したが、降雨によるラドン娘核種の降下が原因と推定できた。

3. 空間放射線量率
モニタリングポストによる空間放射線量率調謝

辞

査結果（1 時間平均値に基づく変動範囲を 1 月毎にまとめたもの）を表 4 に示す。
令和 2 年度の大阪市の空間放射線量率値（表 41）の 1 時間平均値は、61～105 nGy/h の範囲であった。この結果は、モニタリングポストの設置場
所が当研究所敷地内の地上 20 m の場所から地上

本調査の遂行にあたり、調査試料の採取にご協
力いただきました大阪城パークセンター、熊取町
役場、大阪広域水道企業団庭窪浄水場の各機関に感謝致します。また調査実施にあたり、ご指導をいただきました原子力規制庁監視情報課放射線環境対策室、日本分析センターの皆様に謝意を表

1m の場所に変更された平成 30 年の 10 月以降（62～104 nGy/h）と類似の範囲であった。
また、表 4-2 から表 4-6 に示したその他の地
上 1m に設置されている 5 ヶ所の空間放射線量率値は、茨木市（表 4-2）が 52～84 nGy/h、寝屋川市（表 4-3）が 63～102 nGy/h、東大阪市（表します。
注：本報告は、電源開発促進対策特別会計法に基づく原子力規制庁からの受託事業として、大阪健康安全基盤研究所が実施した令和 2 年度「環境放射能水準調査」の成果である。

4-4）が 73～115 nGy/h、富田林市（表 4-5）が 59～91 nGy/h および泉佐野市（表 4-6）が 48～98
nGy/h の範囲であった。このうち、寝屋川市、東大阪市および泉佐野市の最高値で過去 3 年間より若干高い値を観測したが、その値は、平成 28
年度に示した最高値（寝屋川市：117、東大阪市：

利

益

相

反

開示すべき利益相反はない。
文

献

7)

124、泉佐野市：133 nGy/h） より低い値であり、また、高値を示した日の降雨の状況 8)およびピー
ク時のスペクトルより、平成 28 年度の高値同様、降雨による天然核種であるラドン娘核種の降下が原因であると推定できた 7)。
また、昨年度大阪市および寝屋川市でみられた周辺環境の変化によるとみられる値の変化 9)は、
本年度はみられなかった。

1）原子力規制庁. 監視情報課放射線環境対策室.
環境放射能水準調査委託実施計画書. 令和 2
年度.
2）原子力規制委員会. 放射線モニタリング情報
全国及び福島県の空間線量測定結果.

核種分析により人工放射性核種である 131I およ

http://radioactivity.nsr.go.jp/map/ja/index.html
3）肥塚利江, 東恵美子, 足立伸一. 大阪府における環境および食品中放射能調査（平成 25
年度報告）. 大阪府立公衛研所報 2014; 52:
67-74.
4）田村幸子, 渡辺功, 布浦雅子. 大阪府におけび 137Cs が検出された。医学利用等に由来すると考えられる 131I は上水（原水および蛇口水）に極低レベルで検出された。137Cs は土壌や海底土から例年同様検出されたが、そのレベルは低値である環境および食品中放射能調査 ―平成元年
4 月～平成 2 年 3 月―. 大阪府立公衛研所報
公衆衛生編 1990; 28: 165-170.
5）原子力規制委員会. 原子力災害対策指針（平

ま

と

め

- 95 -

成 24 年 10 月 31 日制定, 平成 30 年 7 月 25
日改正，令和 2 年 10 月 28 日一部改正）
6）公益財団法人日本分析センター. 令和 2 年度
原子力施設等防災対策等委託費（環境放射能水準調査（放射能分析））環境試料の放射能測定における精度管理評価結果
7）肥塚利江, 大山正幸, 木村明生. 大阪府における環境および食品中放射能調査（平成 28
年度報告）. 大阪健康安全基盤研究所年報
2017; 1: 101-110.
8）気象庁．過去の気象データ検索．
https://www.data.jma.go.jp/obd/stats/etrn/index.p
hp9）大山正幸, 肥塚利江, 山口進康. 大阪府における環境および食品中放射能調査（平成 31
年度報告）. 大阪健康安全基盤研究所年報
2020; 4: 123-131
WEB サイトの内容は 2021 年 5 月 6 日に確認した- 96 -

Annual Report of Osaka Institute of Public Health, 5, 2021

Survey of environmental and food radioactivity in Osaka Prefecture（Fiscal 2020 Report)

Toshie HIZUKA, Masayuki OHYAMA, Yoshihiko KOIZUMI, Maoko KOIKE and Nobuyasu YAMAGUCHI

We investigated the radioactivity of environment and foods in Osaka Prefecture by commission from Nuclear
Regulatory Agency in 2020 program year. The gross beta radioactivity in precipitation and the gamma ray radiation
nuclide in various food and environmental samples such as fallout, airborne dust, tap water, sea water, soil and sea
sediment, were measured. In addition, the air radiation dose rates at six sites in Osaka Prefecture were monitored.
An artificial radionuclide, 131I, was detected at extremely low levels in source water and faucet water as in the past.
137
Cs, an artificial radionuclide, was also detected at low levels in soil and sea sediment as in the past. No otherartificial radionuclides were detected in any of the samples.

Key words: environmental radioactivity, gross beta activity, radionuclide analysis, environmental gamma
activity

Osaka Institute of Public Health- 97 -

Estimation of the asymptomatic ratio of novel

Seasonal shift in epidemics of respiratory syncytial virus

coronavirus infections (COVID-19)

infection in Japan

H. NISHIURAa, T. KOBAYASHIa, T. MIYAMAb,aaT. MIYAMAa, N. IRITANIb, T. NISHIOb,aA. SUZUKI , SM. JUNG , K. HAYASHI ,aaT. UKAIa, b, Y. SATSUKIb, H. MIYATAc,

a

R. KINOSHITA , Y. YANG , B. YUAN ,A. SHINTANId, S. HIROIe,aaAR. AKHMETZHANOV and NM. LINTON

K. MOTOMURAe, f and K. KOBAYASHIa

International Journal of Infectious Diseases, 94, 154-155

Epidemiology and Infection, 149, e55(2020)(2021)

doi: 10.1016/j.ijid.2020.03.020

doi: 10.1017/S0950268821000340
RS

+
O

2

+

2

O

O

2

N

O

N1
RS

+

N1
N1

2
30.8% 95%

7.7-53.8% N1

a

a

b

b
c
d
e
f
RS

- 98 -++

2012 2016
9 12
7 10

+

+

+2017 2019O+

A measles outbreak in Kansai International Airport,

Detection of genetic elements carrying vanA in

Japan, 2016: Analysis of the quantitative difference andvancomycin-resistant Enterococcus saigonensis VE80T

infectivity of measles virus between patients who are

isolated from retail chicken meat

immunologically naive versus those with secondary
T. HARADAa, D. MOTOOKAb, S. NAKAMURAb,

vaccine failure

Y, YAMAMOTOc, T. YAMAGUCHIa,
T. KURATAa, b, S. P. YAMAMOTOc,aR. KAWAHARAa and K. KAWATSUaa

H. NISHIMURA , T. YUMISASHI ,K. MOTOMURAa, d and M. KINOSHITAe

Foodborne Pathogens and Disease, 17(12), 772-774(2020)

Journal of Medical Virology 93(6), 3446-3454 (2021)
https://doi.org/10.1002/jmv.26733

2016

NEnterococcus saigonensis
type strain N1

VE80

SVF N

+

2 O
N +

+
vanA

Tn1546pVE80-1

2

O SVF

+

O

O

N

O
+

2

+

N

1
2

O

VRE

+

SVF

+ -

2 O

PCR

O

+
N
2
N SVF

100

+
SVF

N +

N

+
2

2 O
N

a8

5  &'(!2A@GC18ab8

5  &'("2,+bc8

5  &'(!2!18

d8

5  &'(./!2KL8e85$2$*18

KL8cEnterococcus saigonensis VE80T

2016 =%!9:40 6);>7#?AEFH@BM
IBDJ<-3>7#A@
O

O
(VRE)

2
IgG

76kb

+vanS
3

2016

+

+SVF

2

2 2

+

2 +

T

2

- 99 -

The first report of macrolide-resistant Bordetella

Isolation and plasmid characterisation of Salmonella

pertussis isolation in Japan

enterica serovar Albany harbouring mcr-5 from retailchicken meat in Japanab

T. YAMAGUCHI , Y. KAWASAKI ,C. KATSUKAWAc, R. KAWAHARAa

Y. WAKABAYASHIa, T. SEKIZUKAb,

and K. KAWATSUa

T. YAMAGUCHIa, A. FUKUDAc, d, M. SUZUKIe,
R. KAWAHARAa, M. TAGUCHIa, M. KURODAb,
K. SEMBAf, H. SHINOMIYAf and K. KAWATSUa

Japanese Joural of Infectious Diseases, 73, 361-362(2020)

FEMS Microbiology Letters, 367(15), fnaa127 (2020)2

doi: 10.1093/femsle/fnaa127

+

6

N
2

N1

+
2

O

N1 +

+

mcr

Macrolide-resistant Bordetella
pertussis: MRBP
2

N

MRBP

N

+2018

N 2

N 2012

mcr-1~mcr-5
Salmonella Albany

27A-368
MRBP

+

+
mcr-5

256 µg/mL+

MIC

32 µg/mL N1

2

23SrRNA

1+

N

Multilocus Variable Numberof Tandem Repeat Analysis (MLVA)
+

N1 +

N

2

p27A-368++

N1

pSE13-SA01718
N1

mcr-5
+
pCOV27

N+p27A-368

mcr-5

N

+S.

N

p27A-368

O 2

2++pSE13-SA01718
O

2

O

MRBP

N1 +

Single Nucleotide Variants

+ N

MRBP

+27A-368

O

N1

+

N

MRBP

S. Albany

O

N1

O
+

+

+
N

1 O

p27A-368

ESBL(ptxP1/ptxA1/prn1/

fim3A/fhaB3)

115 kbInfantisN(MT-195)

202

+

O

N1

MRBP

mcr-5

mcr

+

MIC

MRBP O

~2016

+

2
N

N +

203

N

MRBP N1

2

N

mcr

N

+

O
+

a
b
c

a

d

b

e

c

f
mcr-5

N
2

O

- 100 -

Salmonella AlbanyA heterodimer antibody fragment for the passive

Development of Antibody-Fragment–Producing Rice

immunotherapy against norovirus infection

for Neutralization of Human Norovirus

Y. YUKIa, S. KUROKAWAa, S. SATOa, b, c, d,abA. SASOUa, Y. YUKIa, b, S. KUROKAWAa,cA. SASOU , N. MATSUMOTO , A. SUZUKI ,S. SATOb, c, d, Y. GODAa, M. UCHIDAe,N. SAKONe, Y. GODAa, N. TAKEYAMAa,

N. MATSUMOTOc, H. SAGARAf, Y. WATANABEf,

T. MIYOSHIf, H. MARCOTTEg, T. TANAKAf,

M. KURODAg, N. SAKONh, K. SUGIURAa,gR. NAKANISHI-OUCHIDAa, b, H. USHIJIMAi,a, h, I, j

L. HAMMARSTROM and H. KIYONO

K. FUJIHASHIj, k and H. KIYONOa, b, l, mJournal of Infectious Diseases, 222, 470-478 (2020)
https://doi.org/10.1093/infdis/jiaa115

Frontiers in Plant Science (2021)
https://doi.org/10.3389/fpls.2021.639953

6

N
20

+

O

2

O GI.1

8500
GII.4
2

VHH 7C6-1E4+

GII.4 O GII.17
2

O
2- +GII.4 O GII.17

MucoRice-VHH 7C6-1E4

7C6 O 1E4 O2++90°C N 20

22
+MucoRice-VHH

VHH

7C6

GII.6+GII.3+GII.4+GII.17+

N

VLP O

O

+

+

GII.4

GII.17ON1+GII.4+1E4O

GII.17
2

VLP

+

VHH

2 +GII.4 O

N1

O

GII.17
VHH
GII.4

+

+

+

GII.17

a
b

N1
O

c

a

d

b

BIKEN

BIKEN

e
f

c

BIKEN
g

d

h

e

i

f

g

j

h
i
j

k
—

l
m

- 101 -

—

O

a

a

b

a

a

, 30, 65-70 (2020), 57, 10-14 (2020)
N

1 +

N

N

O 21

6

a, b

N

8400

O

2

N1

2000

+
O

2

1968

O
+

O

N

+1972

2

N+
O

N1

N1

+
1 2

O
+

O
OO

O

2016

+

N1
O2

2

+

9

2

+

2
+

+

+

2

O+
N

+

O

2

OO
2 2

2

O

O2

N1

a

a

b

b

Overview of norovirus from an international perspective andFoodborne viral diseases-up date of norovirus

future challenges- 102 -

2O

Two Different Strains of Severe Fever with
Thrombocytopenia Syndrome Virus (SFTSV) in Northand South Osaka by Phylogenetic Analysis of
Evolutionary Lineage, 48(12), 635-644 (2020)
N
+

+

O

: Evidence for Independent SFTSV Transmission
R. IKEMORIa, I. AOYAMAa, T. SASAKIa,b,+

H. TAKABAYASHIc, d, K. MORISADAe,

1

M. KINOSHITAf, K. IKUTAa, b, T. YUMISASHIa

2

and K. MOTOMURAa, g

+
+
N1
N

Viruses, 13(2), 1-5 (2021)

N +

2±±

+

https://doi.org/10.3390/v13020177

+

SFTS
+

+

2

2 +

+

2
+

+
2

+
2

SFTS
+

+

N1

N1 ±±

N

+

SFTS

2

SFTSV

+

2

+

N

NGS

+
2018
2

2+2017

2

SFTSV

+
SFTSV

+2017

C5

J1

+2018
O+
C5

N
C5

SFTSV

O

+L O M

C4

+S
+

N1
2 +C5

SFTSV
+

2

2

C5

SFTSV

N

O

O
SFTSV

2 +
N

O

N

+

2

a
Tick-borne infectious diseases

b
c

d

e

f
g
O
SFTS
2

- 103 -

2

SFTS
O

Capnocytophaga felis sp. nov. isolated from the feline

Genomic characterization of clinical Enterobacter

oral cavity

roggenkampii co-harboring blaIMP-1- andblaGES-5-encoding IncP6 and mcr-9-encoding IncHI2

a

b

a

M. SUZUKI , K. UMEDA , M. KIMURA ,plasmids isolated in Japan

K. IMAOKAa, S. MORIKAWAc and K. MAEDAa
K. UMEDAa, H. NAKAMURAa, A. FUKUDAb,
International Journal of Systematic and Evolutionary

Y. MATSUMOTOc, D. MOTOOKAc,

Microbiology, 70(5), 3355-3360 (2020)

S. NAKAMURAc, Y. YASUId, H. YOSHIDAe
and R. KAWAHARAa

Capnocytophaga
Journal of Global Antimicrobial Resistance, 24,+

220-227 (2021)
O
N 2007

2

2011

+

2 +

4

2

blaIMP-1

Capnocytophaga

blaGES-5

2

2 +16SrRNAO+DNA-DNA

mcr-9

+
+

+

N1

Capnocytophaga

40 kbpO+blaGES-5”Capnocytophaga felis”O

C. felisO

blaIMP-1
mcr-9

OInternational Journal of Systematic andEvolutionary Microbiology

IncP6
IS26

IUMS
N1

blaGES-5+blaIMP-1+
2+

272 kbp

IncHI2

blaGES-5+

O

blaIMP-1
O

N1

2
N

IS26
+

a

a

b

b

c

c
Capnocytophaga felis

N1de
blaIMP-1+blaGES-5
Enterobacter roggenkampii- 104 -

+mcr-9

mcr-9

O

O
a

b

,

, 87(1), 52-54 (2021)a,Bulletin of the Osaka Museum of Natural History, 75,
29-34 (2021)

2017

11

2020

3

N
2020

+

O

872

6

sensu stricto

N

+
0.7%
+1

1
simplex s.s.

73Anisakis simplex

0.1%
+2

+
N+

A. pegreffii
0.2%

2 +14

A.

2

+

+Trichoderma N++Fusarium+Penicillium

2

O
N1
O
2

+

+

O

O

+
+

O

1

+

a
Molecular identification and prevalence of Anisakis larvae inbJapanese sardine Sardinops melanostictus from JapaneseContaminated fungi on botanical specimens by water hazard

watersof flood- 105 -

Gekko japonicus (Schlegel’s Japanese Gekko). Diet

O
2

K. AKITAa, H. MATSUOKAb and K. YAMAZAKIc
a, b

a, b

a

Herpetological Review, 51, 578-579 (2020), 61(2), 58-62 (2020)
+

O

N1

+

+

N1

2

+

2
+

V

N1
+
N
O

+

2
1

+

2

N
2

1

2

+

N1
9

O
+TLC+HPLC+LC-MS/MS N
2

O

+

4

+
2
ON

+
N

a

a

2

b

b

1

c
Nomenclature and identification method of non-permitted
dyes of Patent Blue Group- 106 -

+

V+

N
VX+

A

2

O

Rapid quantification of Escherichia coli O157:H7 in

LC-MS/MS

lettuce and beef using an on-chip staining microfluidic

6

device
a
a

b

a

a

Y. TOKUNAGA and N. YAMAGUCHI

a
a

a

a, b

c

Journal of Food Safety, 40(6), e12851 (2020)
https://doi.org/10.1111/jfs.12851, 61(4), 143-147 (2020)

O+

LC-MS/MS

+o

N

O

2

+
N

1 +

6

2

48

N

+

-

O

O

N

O2

+2011

+

N

+

O

2 +

+

O
1 mL

+
2

500 mg

+

2
+

N

O

N

2
O

+

89.7%
N

O

N

O

2
N

5.0%+0.5%2+oN
0.2 mg/kg O

N

E. coli O157:H7

+
2

O

ON

1 mg/kg++

2 N1+2017 2019

+

O

O

+

+
2

4.9%O

+

N

N

+

100.0%++1.5%

E. coli O157:H7

+

6

±+

+

E. coli O157:H7
N +

2N+

+

0.2 µm2+

8 mL N++

Oasis HLB

O+

E. coli O157:H7

1

N

N1 O

a

1

a

b

1

b

on-chip2
O157:H7Oc
Development of an LC-MS/MS-based rapid and simple
analytical method for six fungicides- 107 -

Preference for O-demethylation reactions in the

Involvement of NMDA receptors in tremor expression

oxidation of 2′-, 3′-, and 4′-methoxyflavones by humanin Aspa/Hcn1 double-knockout rats

cytochrome P450 enzymes
A. NISHITANIa, H. NAGAYOSHIb, S. TAKENAKAc,aba

H. NAGAYOSHI , N. MURAYAMA , M. TSUJINO ,M. ASANOa, S. SHIMIZUd, Y. OHNOd

S. TAKENAKAc, J. KATAHIRAd, V. KIMe, D. KIMe,and T. KURAMOTOa, e

M. KOMORId, H. YAMAZAKIb,
F P. GUENGERICHf and T. SHIMADAd

Experimental Animals, 69(4), 388-394 (2020)

Xenobiotica, 50(10), 1158-1169 (2020)
ASPA O
2 '-+3'-+

4'-

MeF

9

1 HCN1P450 P450
CYP

O

O

N

N

+

LC-MS/MS

+

2

N1

+

Aspaem34Kyo /N
CYP1B1.1 O 1B1.3

Hcn1em1Kyo+

F344-Aspa / Hcn1

O

+

+
+

+
O

O

F344-Aspa / Hcn1

+

O

2

in silico
O

N-

N1
O-

+

O CYP1A2

ASPA
NAA

+NAA

N1

N4’-

+2’-+3’-+

N-

-D-

NMDA

O
NAAG

P450

+F344-Aspa / Hcn1

N

NMDA
+
NR2C / NR2D

O+
MeF

+Aspa / Hcn1+

NR2C / NR2D

O
NMDAR

a

1

a

b

b

c

c

d

d

e

e

f

Aspa/Hcn1
P450

2 O2

2’-, 3’-, 4’-

1

NMDA

O-

- 108 -

Liquid chromatography-tandem mass spectrometry

Determination of various constituent elements ofanalysis of oxidation of 2′-, 3′-, 4′- andpolyethylene terephthalate bottles used for beverages

6-hydroxyflavanones by human cytochrome P450

in Japanenzymes
E. KISHIa, A. OZAKIa, T. OOSHIMAb, Y. ABEc,
T. SHIMADAa, H. NAGAYOSHIb,

M. MUTSUGAc, Y. YAMAGUCHIa

N. MURAYAMAc, S. TAKENAKAd, J. KATAHIRAa,eea

and T. YAMANOd

cV. KIM , D. KIM , M. KOMORI , H. YAMAZAKI
and F P. GUENGERICHf

Packaging Technology and Science, 33,
183–193 (2020)

Xenobiotica, 51(2), 139-154 (2021)
PET
N1

2'-

O

2'OHFva +3'OHFva+4'OHFva+
6OHFvaP450
1B1.3+CYP1A1+1A2+1B1.1+

2A6

O

Ge

+PET

β
O 1

LC-MS/MS N+PETNCYP2A6
2

PET
CYP1

+Sb

2

N
+

2

PET

P450

CYP

2

2

N+

34

Li+B+

2
16

2 +

Na+Mg+Al+P+K+Ca+Ti+V+Cr+Mn+Fe+
Co+Ni+Cu+Zn+Ga+Ge+As+Se+Rb+Sr+Zr+

N1 +diOHFva

Mo+Ag+Cd+Sn+Sb+Cs+Ba+W+Pb

diOHFvoUO
ICP-OES
3'OHFvaB
6OHFva4'OHFva

N P450
2

A

+
N

16

O

in silico

2

+

+
5

O

+
Ge

<0.5

50

mg/kg+Ti <1 26 mg/kg+Sb <0.1 279 mg/kg +P <10 48 mg/kg

α

2
PET

a

a

b

1

b

c

c

d

d

e
f
2
2’-,3’-,4’-,6-- 109 -

Co <0.5 53 mg/kg
O

O

+

21
+

P450

ICP-MS
+

O
O

N1

O
2

Development of a liquid chromatography-tandem mass
spectrometry method for simultaneous quantification ofhen’s egg white allergens Gal d 1–4 in fresh andabbprocessed eggs
K. KIYOTAa, M. YOSHIMITSUb,, 46(1), 25-31 (2021)

K. UCHIDAb and K. KAJIMURAc+ Food Chemistry, 345, 128022 (2021)

+
O

2

+

N

N+
N1

+

HDL

+

+
A-I

N1
A-I

HDL

+

+

N +

2 +4

+
A-I

2
+

Gal d 1–4

O
LC-MS/MSON
O

N

N +Gal d 1–4

N

LC-MS/MS N+
Gal d 1–4

2 O

O

2 +

9.77–

N +

39.1 ng/mL+

2

A-I N

68.3–121.3%+

Iowa G26R

+N

1-83

O

1.5–15.7%+2.4–38.1%N1

O
27

+G26R

O

+

+

2

A-I 1-83

N
O

O
+

+
A-I 1-83

2

+

14-22

50-58

+

2
2+

+

+

+

O
Gal d 1–4

N
O

+

+

+

2

N

O
+G26R

2 14-22

N

(

+
)
ON+
N

O

A-I 1-83
O

O
A-I

+
1-83

+
N

a

A-I

2

b

a

2

b

1

c

Mechanism of aggregation and amyloid fibril formation of
apolipoprotein on lipid membrane environmentO
Gal d 1–4

- 110 -

4
LC-MS/MSDetermination of formaldehyde and

FTIR

acetaldehyde levels in poly(ethylene terephthalate)

O(PET) bottled mineral water using a simple andarapid analytical method.

a

,

a

,

,

b

c

,

Y. ABEa, N. KOBAYASHIa, M. YAMAGUCHIa,
M. MUTSUGAa, A. OZAKIb, E. KISHIb, K. SATOa

O

Food Chemistry, 344, 128708 (2021)+, 62, 649-655 (2020)+
FA O

300 350 µm

AA+
FA O AAN+LC

N 2,4-

2

O

1

25°C N 20

+

N1 +

2
2

+

µm

2

+

N

2

LC-MS/MS+2+

150 ng/mL NO

2 O 22

N
20 µm

2

PET

2
2 +

O

2 +

105

N1
PET

FA
+FA
2.6 31.4 ng/mL

O
α

61

+

2

68

5.3 143.5 ng/mL

N

PET

+

FA O AA

+

+

AA

+AA

O

FTIR

1
10

N

+

O

O

2 2 O

α 1
2

2

O

O

+
N

+

N1 O
2

-

+
+
+
N

FTIR

+
O2
1

a
b
PET

2

O

a
2

b
c
Trial and subjects of microplastics analysis by FTIR
microscopy- 111 -

2

Evaluation of carboxamide-type synthetic cannabinoids

2

on the functional activities at cannabinoid receptors and

HPLC

±

biological effects via inhalation exposure testO

A. TAKEDAa, T. DOIa, A. ASADAa, T. SUZUKIb,
K. YUZAWAb, H. ANDOb, Y. KUBOb,aA. NAGASAWAb, F. KAIHOKOb, Y. HASEGAWAb,

a

a

a

a

a

b

K. TANAKA , K. IGARASHI , T. MAENO ,

a

a

a

A. SUZUKIb, S. SHIMIZUb, N. UEMURAb,

a

a, b

a

J. NAKAJIMAb, J. SUZUKIb and T. TAGAMIa

a

a

a

b

c

a

a

a

Forensic Toxicology, 38(2), 455-464 (2020)
https://doi.org/10.1007/s11419-020-00534-x, 75(1), 1-17 (2021)

O

+ ±

+

+

+

+
N

+

+
O

+

+

N1

2

O

26

2

±

2
N

+

-

O

±

27

O

O
29

2

+

2+

N

3

±
5F-MDMB-PICA +5F-EMB-PINACA+AMB-CHMICA

+
2 +

2 +

+HPLC
N
MEAN SD
0.214 0.038 +

+
O

+

±

0.087 0.052 +3N

p 0.01

0.975

O

a

a

b

b

c

Studies on KAKI CALYX- 112 -+
O+

5F-MDMB-PINACA O
2+

0.039 0.015 N1+
5F-MDMB-PICA

N +

+

2
N +

+

+

Rapid on-site monitoring of bacteria in freshwater

Intakes of phthalates by Japanese children and theenvironments using a portable microfluidic counting

contribution of indoor air quality in their residences

system
T. YOSHIDAa, M. MIMURAa and N. SAKONbab

N. YAMAGUCHI and Y. FUJII

Environmental Science and Pollution Research, 27 (16),Biological and Pharmaceutical Bulletin, 43, 87-92

19577–19591 (2020)(2020)

doi.org/10.1007/s11356-020-08397-w
O

+

N1

2

+
O

N1

+

+

2

N

+
O

+

1

N+

2

O

O

2

O +
O

1

+

N

N
(

N
)

O N
O+

: 0.15O(µg/kg/d+

2

)+

SYBR
Green II

-n-

(2-

+
6-carboxyfluoresceindiacetate: 0.42+: 1.1+: 2.2+): 6.3
)

(2-

+

2

O

+
2

β

95

+

+
(RfD

O
O 2
O

2

O

)

+

N1

O

O

+

O
N

(2-

1

N
2

+20 µg/kg/d)+

first screening
+

+

(

+
+

)

(%,

O

)

7.9+

+

4.4+

O
-n0.22+

6.6+

3.2+
(2-

)1.0 N1 +

2 +
O
a

a

b

b
2

2O

O

- 113 -

Lowest observed adverse effect level of pulmonary

Time series analysis of climate and air pollution factors

pathological alterations due to nitrous acid exposure inassociated with atmospheric nitrogen dioxide

guinea pigs

concentration in Japan

M. OHYAMAa, H. NISHIMURAb, K. AZUMAc,

T. MIYAMAa, H. MATSUIb, K. AZUMAc,

C. MINEJIMAd, N. TAKENAKAe, and S. ADACHIf

C. MINEJIMAd, Y. ITANOe, N. TAKENAKAf,
and M. OHYAMAg

Environmental Health and Preventive Medicine, 25, 56(2020)

International Journal of Environmental Research andhttps://doi.org/10.1186/s12199-020-00895-0

Public Health, 17(24), 9507 (2020)
https://doi.org/10.3390/ijerph17249507

3.6 ppm

ppm

HONO

5.8
+
NO2

N
1

O

O

+
N

HONO

+

N

+ NO2

HONO

4

O

NO

+NO2
+

NO2

+

alveolar mean linear intercept
N1
N

O

NO2
α

HONO

2
2009

+
0.0

ON1
4

2017

3

N

O

0.1 ppm

N

N
O

NO2 O
+

N
NO2 O

N

N
2 +NO2
2 O
a

a

b

b

c

c

d

e

e

f

f

g
N
O

- 114 -

+

NO2 O
+

HONO

O

+

O
+

LOAEL

N

2+

2
HONO

N1

2

O

N 0.1, 0.4, 1.7 ppm
NN

1.7 ppm

+
+

ppm

HONO

O +NO

2
+

1 +

N HONO+++ HONO O

NO2 NO H2O 2HONO

+

+

+

NO2
2

NO2

N
+

HONO 0.0, 0.1, 0.4,

1.7 ppm

O

NO2 O

2 O

O 1

5

N

2

HONO
HONO

LOAEL

+

d

HONO

2 2

a

,

a

b

d

e

c

β
a

b

c

, 535, 4-10 (2020)

d

d

e

N

e

f

a

,

JIS A

+

3302-2000
4

a

27

+

1

, 140, 1485-1494 (2020)

N+
2

57

O

4

1

+
2 +

+
29

30

5 w/w%

+

2

O

58

+

O
10

1

+
2

+

O

+

0.1 w/w%+

N 2 2O
2

O

+

β

2 2
2

β

VOCs
+

2

+

29

N

2

28

O
2

1

N+

β

+

3

O
+

+
7

2

N

2

ON+
O

O N

1/10

+

O

+

N1

120%

+

N

RSDr

1 +
2 +
N1

+
2 O

O

2

2+

O

+
+

10%

RSDR

15%

2

β

O

N1

O
__________________________________________+
NO

70 120%

2

a
b
c
d

a

e

b

f

c

Examination of analytical method for methanol,dtrichloroethylene, and tetrachloroethylene to revise the officialemethods based on “Act on the Control of Household Products

Verification survey with Johkasou after defining standards

Containing Harmful Substances”- 115 -

学位論文概要

因果推論を用いた酪農生産獣医療における問題指向型実地疫学的研究

三山豪士

Problem-oriented field epidemiological study in dairy production medicine using a causal inference approach

Takeshi Miyama

Ⅰ 緒言
疫学研究は持続可能な酪農を営む上で、生産獣医療現場の問題解決に有用な手法である。疫学研

大規模農場の密集する研究対象地域の南部に検出された。本研究では、L. Hardjo 感染のリスク因子解
析に統計的アルゴリズムであるステップワイズ法を用いた。交絡の定量的評価には Change-in-estimate

究において、ある暴露因子がアウトカムに及ぼす効果を推定する際、疫学者は観測されたデータを取り扱うことが多くある。観測データでは、暴露群と非暴露群間の条件(背景情報)が異なることが多く、これは交絡を引き起こす。因果効果を推定するためには、この交絡因子を特定し、制御する基準を用いた。

ことが重要となる。本博士論文では、酪農生産獣医療における問題点についてリスク因子解析を実施し、その方法について考察した。日本における農場レベルの牛レプトスピラ症浸潤状況は予測モ
デルを用い、ウガンダにおける東海岸熱(East Coast
Fever, ECF)、乳房炎制御、飼料給与管理について

ニ対策費用等による経済損失のため問題となる。ウ
ガンダ国ムバララ県での本研究による個体レベルの T. parva 感染の有病率は 45.2% (95%CI: 40.4-50.1)、
農場レベルでは 83.3% (95%CI: 64.5-93.7) であった。
リスク因子解析により、高品質の牛保定用枠場は牛体表のダニ浸潤の防御因子であった (OR: 0.32,

は因果推論を用いて解析した。

95%CI: 0.15-0.63, p = 0.001)。質の良い殺ダニ剤保管
庫 (OR: 0.36, 95%CI: 0.17-0.76, p = 0.008) と殺ダニ剤計測用シリンダー (OR: 0.32, 95%CI: 0.11-0.93, p=0.036) は、T. parva 感染の防御因子であった。また、長期間の同系統の殺ダニ剤の使用 (OR: 1.06,
95%CI: 1.01-1.10, p =0.012) と高い使用頻度 (OR:Ⅱ 日本の酪農場における牛レプトスピラ症浸潤
リスク因子
日本の南東北において、Leptospira 血清型 Hardjo
によって引き起こされる牛レプトスピラ症の浸潤状況の詳細な報告はなかった。本横断研究により有病率が 65.1% (95%CI: 56.2-74.1%)と南東北に広く浸潤していることが明らかにされた。また、牛群規模が大きいこと(p = 0.004)及び北海道に滞在歴のある
牛が農場に在籍すること(p < 0.001)が L. Hardjo 感染のリスク因子であることが明らかとなった。L.
Hardjo の陽性農場の集積 (relative risk = 1.87, log
likelihood ratio = 9.93, radius = 13.70 km, p < 0.01) が、
大阪健康安全基盤研究所公衆衛生部疫学解析研究課

Ⅲ ウガンダの酪農場における殺ダニ剤の使用方
法がダニ寄生と Theileria parva 感染へ及ぼす影響
ECF は高い疾病率と致死率、乳生産量の低下、ダ11.70, 95%CI: 1.95-70.13, p =0.007) は T. parva 感染のリスク因子であった。これらの効果は因果推論を用いて定量的に推定された。
Ⅳ ウガンダの酪農場における乳房炎有病率と搾乳方法との関係
酪農において乳房炎は、世界的に最も経済損失の大きい疾病とされている。ウガンダのいくつかの地- 116 -

域においても潜在性乳房炎 (Subclinical mastitis:
SCM)の 高い有病率が報告されているが、酪農集約地域であるムバララ県の SCM の有病率は報告されておらず、また搾乳衛生・手技に関するリスク因子
解析の報告はなかった。本研究により高い個体レベ法は研究の目的により適切に選択されるべきである。酪農生産獣医療における問題解決は継続したプ
ロセスである。持続可能な酪農業を目指し、生産性の向上と人獣共通感染症を防ぐには、適切な記録をとること、記録のモニタリング、情報の記述 (視覚ルの SCM 有病率 (68.8%, 95%CI: 64.9-72.2%) が認
められ、また分離培養検査により伝染性の微生物が優勢であることが明らかにされた。単変数解析において搾乳前の乳頭清拭に一頭一布を利用することと伝染性微生物の検出との間に負の相関が認められた (p = 0.025)。搾乳終盤に牛が落ち着いているこ化)、評価、介入というサイクルを継続的に実施していく必要がある。本博士論文で用いられた手法と構築された根拠は、生産獣医療の多様な問題解決に役立つものと考える。

とは SCM の防御因子であった (OR: 0.20, 95%CI:
0.05-0.79, p = 0.021)。粗造な乳頭口は SCM のリスク因子であった (OR: 1.75, 95%CI: 1.14-2.68, p = 0.011)。
これら効果は因果推論を用いて定量的に推定された。
Ⅴ ウガンダの酪農場における牛群管理が産乳量・潜在性ケトーシスに及ぼす影響
潜在性ケトーシス(Subclinical ketosis: SCK)は産乳性の低下に伴う経済損失を引き起こす。ウガンダの南西部において SCK の有病率と飼料給与管理方法

謝 辞
本研究についてご指導を賜りました酪農学園大学大学院獣医学研究科 蒔田浩平教授、村松康和教
授、及川伸教授に心より感謝申し上げます。本研究にご協力をいただきました国際協力機構ムバララ
県安全な牛乳生産支援プロジェクトの関係者の皆様、山形県農業共済組合の皆様、山形県の酪農家の皆様に深く感謝致します。また、本研究を実施する
に当たりご理解とご協力をいただきました大阪健
康安全基盤研究所公衆衛生部の皆様に厚く御礼申し上げます。

は報告されてこなかった。本研究において、泌乳初
期の牛の SCK 有病率は 17.1% (95%CI: 6.6-33.6%)であった。濃厚飼料を給与した牛は、非給与牛に比べて 1.6 倍高い乳量を示した (95%CI: 1.02-2.34, p =0.041)。輪換放牧を実施した牛は、非実施牛に比べて 1.7 倍高い乳量を示した (95% CI: 1.11-2.51, p =（本稿は、著者が酪農学園大学大学院獣医学研究科
において 2020 年 3 月 31 日に博士（獣医学）の学位を授与された際の論文の概要であり、その詳細は以下に掲載されている。
）

0.017)。これら効果は因果推論を用いて定量的に推定された。

本博士論文は、酪農生産獣医療現場に浸潤してい

1) Miyama T, Watanabe E, Ogata Y, Urushiyama Y,
Kawahara N, Makita K. Herd-level risk factors
associated with Leptospira Hardjo infection in dairy
herds in the southern Tohoku, Japan. Preventive
Veterinary Medicine 2018; 149: 15-20.
2) Miyama T, Byaruhanga J, Okamura I, Nagahata H,

る問題について記述し、それらの問題のリスク因子を明らかにした。これらリスク因子解析を実施する
目的は二つある。一つは、牛レプトスピラ症の研究で認められたように、興味の対象である目的変数を予測し、どの因子が予測に貢献しているかを概念的に理解することである。二つ目は、仮説の検証を目

Murata R, Mwebembezi W, Muramatsu Y, Makita K.
Prevalence of sub-clinical mastitis and its association
with milking practices in an intensive dairy production
region of Uganda. The Journal of Veterinary Medical
Science 2020; 82: 488-493.
3) Miyama T, Byaruhanga J, Okamura I, Uchida L,的とし、暴露因子が目的変数に及ぼす因果効果を、交絡因子を調整することで定量的に推定することである。この方法は ECF、乳房炎制御、飼料給与管理それぞれの研究において採用された。これらの手

Muramatsu Y, Mwebembezi W, Vudriko P, Makita K.
Effect of chemical tick control practices on tickinfestation and Theileria parva infection in an
intensive dairy production region of Uganda. Ticks

Ⅴ まとめ

発表論文

- 117 -

and Tick Borne Diseases 2020; 11: 101438
4) Miyama T, Byaruhanga J, Okamura I, Nakatsuji H,
Nakao T, Oikawa S, Mwebembezi W, Makita K.
Current dairy herd management practices and theirinfluence on milk yield and subclinical ketosis in an
intensive dairy production region of Uganda. Journalof Veterinary Epidemiology 2020; 24: 1-10

- 118 -

学位論文概要

LSR は LKB1-AMPK 経路を介してエネルギーストレス下で上皮性卵巣癌細胞の細胞生存を促進する

髙橋佑介

LSR promotes epithelial ovarian cancer cell survival under energy stress through the LKB1-AMPK pathway

Yusuke Takahashi

I 概要

した。さらに、LSR の発現量は卵巣癌患者の生命予
後に負に相関することから、LSR が進行性卵巣癌の我 々 は 最 近 、 新 規 癌 抗 原 Lipolysis-stimulated
lipoprotein receptor (LSR)の高発現が、卵巣癌の予後不良因子であることを報告した。LSR は接着分子の1 つだが、がんの進行における役割については不明な点が多い。過去の報告で、LSR の knockout で示され たがん形 質は、 AMP-activated protein kinase

予後不良因子であることを報告した。
LSR は初め、主に肝臓に発現するリポプロテイン
レセプターとして同定され、上皮細胞の接着分子
tricellular tight junction protein の 1 つとしても知られている。Czulkies らは結腸癌患者由来の細胞株
CaCo-2 を用いた xenograft マウスモデルで、CaCo-2(AMPK)の代謝調節機能の破綻による、エネルギー
ストレス下での急速な細胞死誘導の結果起こる現象と極めて類似する。AMPK 活性の制御には、接着分子の発現と上流キナーゼ liver kinase B1 (LKB1)の細胞膜への局在が重要な要素であることから、我々
は LKB1-AMPK シグナル経路に着目し、がん形質の LSR 発現停止により腫瘍の成長が著しく抑制されることを報告し、我々も、抗 LSR モノクローナ
ル抗体が xenograft マウスモデルでの LSR 高発現卵
巣癌細胞および胃癌細胞の成長を著しく抑制する
ことを明らかにした。しかし、Czulkies によると invitro では LSR knock out が CaCo-2 の細胞増殖を招を特徴づける LSR の役割について調べた。

卵巣癌は初期の段階では自覚症状に乏しく進行して発見されることが少なくない女性性器悪性腫くことから、LSR は特に in vivo での腫瘍の成長に不可欠な役割を果たしていると考えられる。一般的に、生体内の腫瘍は、旺盛な成長と未熟な血管形成により不十分な栄養飢餓や酸素不足に陥っており、細胞内 ATP レベルが低下したエネルギーストレス
環境に晒されている。これらの現象は、LSR がエネ

瘍で、年間死亡者数は 4700 人に上る。予後不良な
Ⅲ・Ⅳ期の症例に全症例の 40～50%が分布し、Ⅲ・Ⅳ期の 5 年生存率は約 20%と依然低いことから、既存の治療法に代わる新たな分子標的薬の開発が求められている。我々は以前、卵巣癌患者由来の細胞株と正常卵巣上皮細胞株を用いて iTRAQ 試薬をルギーストレス環境下で腫瘍の成長に促進的に働くタンパク質であることを示唆している。
動物細胞は、細胞外環境に適応するため、細胞内ATP レベルの低下時に AMP-activated protein kinase(AMPK)とういうセリンスレオニンキナーゼを活性化させ、異化代謝を亢進させることなどにより細胞用いたプロテオーム解析により新規膜抗原
Lipolysis-stimulated lipoprotein receptor (LSR)を同定

内 ATP レベルを保持し、酸化ストレスを軽減し急速な細胞死を免れる調節機構を備えている。また最II 卵巣癌の新規膜抗原 LSR

大阪健康安全基盤研究所微生物部細菌課- 119 -

学位論文概要

近、接着分子の１つ E-cadherin の発現が AMPK の上流シグナル因子 liver kinase b1 (LKB1)の細胞膜への局在を促進し、下流の AMPK の効率よい活性化に間接的に関与すると報告された。そこで本研究では、LSR が LKB1-AMPK シグナル伝達を介したエ化に正の相関がみられた。
一方で、
OVISE や SKOV3を用いて蛍光免疫細胞染色により細胞内の AMPKの上流因子である LKB1 の細胞内局在を調べたところ、LSR の発現と LKB1 の細胞膜への局在に正の相関がみられた。これらの結果は、卵巣癌細胞にネルギーストレスの軽減に関わり、腫瘍の成長に促進的に働いているという仮説を立て、がんの進行における LSR の役割の一端を明らかにすることとした。

おいて LSR が LKB1 の細胞膜への局在を誘導し、エネルギーストレス下での LKB1-AMPK シグナル伝達を支持し、AMPK の活性化を支持する働きがあることを示唆している。

III LSR と LKB1-AMPK シグナル伝達

IV LSR とエネルギーストレス下での細胞死誘導や細胞増殖活性

卵巣癌でも LSR が生体内での腫瘍の成長に関わることを確かめるため、small hairpin RNA プラスミ
ドベクターを用いて卵巣癌患者由来細胞株 OVISEの LSR 発現抑制クローンを樹立し、ヌードマウス
皮下に接種し経日的な腫瘍体積(mm3)と摘出後の腫AMPK の活性化はエネルギーストレスで誘導される細胞内酸化ストレスを軽減し細胞死を抑制することが知られている。実際、LSR の発現を抑制した OVISE 細胞株では、対照に比べ、グルコース不瘍重量(mg)を計測した(n=5)。対照の腫瘍は接種後28 日に摘出するまで成長を続けた(506.8 ± 113.3
mm3, 267 ± 52 mg)のに対し、2 種類の LSR 発現抑制クローンから形成された腫瘍は一定の大きさ以上には成長せず(114.2 ± 15.9 mm3, 23± 4 mg; 37.0 ±22.4 mm3, 11± 7 mg)、有意に低値を示した(p<0.01)。

含培地交換 48 時間後まで急激な細胞数の減少を示
し、LSR を発現導入した SKOV3 細胞株でも、対照に比べ、グルコース不足による細胞数の急激な低下を軽減する効果が見られた。一方、これらの細胞を用いて栄養豊富な培地での細胞増殖速度を比較したところ、LSR の発現の有無による細胞増殖に差

一方で、in vitro における細胞増殖速度に両者で大きな差は認められなかった。さらに、グルコース不含培地や 1% O2 環境下での細胞生存率を比較すると、特にグルコース飢餓条件下で LSR 発現抑制クローンの生存率が、対照の生存率より短時間で急激に低下した。これらの結果は、LSR が卵巣癌細胞株

はほとんど認められなかった。
さらに、LSR の発現を抑制し、ヌードマウスの皮下に移植して 7 日後に摘出した腫瘍組織を免疫組
織化学染色により解析したところ、対照群(n=3)の腫瘍組織ではリン酸化 AMPK (Thr172)とリン酸化
ACC (Ser79)の発現が増加していたのに対し、LSR

OVISE でも特に生体内でのエネルギーストレス下で腫瘍の成長に促進的に働いていることを示している。
次に、卵巣癌細胞における LSR の発現と AMPK
活性化との関わりを調べるため、グルコース不含培
地で培養時の AMPK シグナル経路の活性化を small発現抑制した群(n=3)の腫瘍組織ではこれらのタン
パク質の増加が見られなかった。連続切片での細胞増殖マーカーKi-67 の発現量も、対照群に比べ、LSR
発現抑制群で低かった。これらの結果は卵巣癌細胞における LSR の発現は、in vitro におけるエネルギ
ーストレス下で誘導された細胞死や、in vivo におけinterference RNA による発現抑制の有無で比較し調べた。OVISE を用いて調べたところ、対照では培地
交換 18 時間後をピークにリン酸化 AMPK (Thr172)とその下流のリン酸化 acetyl-CoA carboxylase (ACC)(Ser79)の発現量が経時的に増加したのに対し、LSRの発現を抑制するとリン酸化 AMPK (Thr172)とリる腫瘍組織での増殖活性を抑制する働きがあることを示している。

ン酸化 ACC (Ser79)の発現量の増加は抑制されていた。また、プラスミドベクターを用いて LSR を発現誘導した SKOV3 細胞株(LSR の発現が低い卵巣癌細胞株)でも LSR の発現と AMPK と ACC の活性

生物学的役割について分子細胞生物学的に解析し、LSR が LKB1-AMPK シグナル伝達を介したエネル
ギーストレス下での細胞死の誘導を抑制し、生体内での腫瘍の成長に貢献することを明らかにした。本

V まとめ
我々は新規膜抗原 LSR の卵巣癌の進行に関わる- 120 -

研究の成果から、LSR が卵巣癌の増殖をもたらす
より詳細な機序と、抗 LSR モノクローナル抗体によるがんの増殖抑制効果の機序解明がさらに進む
ことが期待される。
謝 辞
本研究についてご指導を賜りました大阪大学大学院医学系研究科 免疫・感染制御学講座 仲哲治招
へい教授、高知大学医学部 免疫難病センター 藤本
稔准教授、世良田聡特任准教授、大河原特任助教、大阪大学大学院医学系研究科産科学婦人科学教室
木村正教授、上田豊講師、平松宏祐助教に感謝申し上げます。本研究にご協力をいただきました岐阜大学工学部 化学・生命工学科 竹森洋教授に感謝申し上げます。本研究にご支援いただきました医薬基盤・健康・栄養研究所 免疫シグナルプロジェクト
金澤佑加子様、西理沙様、原田絵美様に感謝申し上げます。本研究や業務についてご理解をいただきました大阪健康安全基盤研究所細菌課の皆様に感謝申し上げます。
（本稿は、著者が大阪大学大学院医学系研究科において令和 3 年 3 月 24 日に博士（医学）の学位を授与された際の論文の概要であり、その詳細は以下に掲載されている。
）
1) Takahashi Y, Serada S, Ohkawara T, Fujimoto M,
Hiramatsu K, Ueda Y, Kimura T, Takemori H, Naka T.
LSR promotes epithelial ovarian cancer cell survival
under energy stress through the LKB1-AMPK
pathway. Biochem Biophys Res Commun. 2021; 537:
92-99.
2) 高橋佑介、平松宏祐、世良田聡、上田豊、木村正、
仲哲治 「LSR はエネルギーストレス環境下で
LKB1 を介した AMPK の活性化を制御し癌細胞の生存に寄与する」 第 73 回日本産科婦人科学会学術講演会 2021 年 4 月 25 日

- 121 -

=M

,D?

78<
3/O 
O L
8@I
.!
P!6 I
9H
JE!*<
( O '
 F
N 
QP = M   J R

K6$
E#
&8O
-+"
5>$
8GA
EO 1
2)
C
B%"
;:0
( O '
/O 4
G#

5

3

ISSN 2433-5819

4

1

1

3

06-6972-1321

69