信州医誌，57⑵：Duchenne 型筋ジストロフィー症
における exon‑skipping 療法
信州大学医学部小児医学講座

樋口司

Duchenne型筋ジストロフィー症（ DMD）は４歳頃に発症し，進行性に筋力が低下して10代で自立歩行が不可能となり，20代には呼吸不全または心不全で死に至るＸ連鎖劣性遺伝疾患である。原因はジストロフィン遺伝子の変異のために筋細胞内のジストロフィン蛋白が欠損していることによって，筋細胞そのものが壊れていくことによる。常に機械的なストレスに曝されている筋細胞膜（筋鞘膜と呼ばれる）は外側に基底膜，内側にアクチン網を形成することで，保護されている。ジストロフィン蛋白はＮ末にアクチン結合ドメインを，Ｃ末にジストログリカン結合ドメインをもっていて，Ｎ末で細胞内アクチンに結合し，Ｃ末ではジストログリカンを介して細胞膜および基底膜と連絡し（図１），機械的なストレスからこれらを守る働きをしている。そのためジストロフ ィ ン の 欠 損 し て い る
DM D では筋鞘膜が脆弱となるため機械的ストレスによって筋壊死を起こしやすくなる。
ジストロフィン遺伝子はヒトの遺伝子の中でも最大のものの一つであり，トータル14kb，79exon がＸ染色体短腕のおよそ2.3Mb の範囲に存在している。
本症の３分の２の患者ではジストロフィン遺伝子の単数または複数の exon の欠損が認められる。近年開発された MLPA 法という exon 欠失／重複を検出する検査法は本症の診断において最も有効であり，DMDは以前に比べて簡便に診断できるよう に な っ た。
DM D の軽症型とされるのが Becker 型筋 ジ ス ト ロフィー症（BM D）であり，同じジストロフィン遺伝子の異常によって生じるが，寿命はほぼ平均なみと著明な違いがある。DM D ではジストロフィン蛋白がほとんど発現されていないのに対し，BMD では不完全ながらジストロフィン蛋白の発現を認める。また BMD
患者の85%においてジストロフィン遺伝子にやはりexon 単位の欠失を認める。多少の例外はあるものの，両者の違いはジストロフィン遺伝子が non‑sense 変異になるか，missense 変異になるかの違いであると言われている（in‑ﬂame 仮説）。つまり，BMD では欠失した全 exon の合計塩基数が３の倍数のために（in‑ﬂame 変異：図２Ａ），欠失してもその exon 以降のコドンの読み枠はずれないので翻訳は最後まで進み短縮型ジストロフィン蛋白が産生されることになる。
No. 2, 2009

〜

，2009

その結果アクチンと細胞膜を繫ぐというジストロフィ
ン本来の働きは最低限果たせるため，筋収縮が保たれ筋細胞の破壊も激烈ではない。これに対し DMD では欠失した exon の合計塩基数が３の倍数でないために，ジストロフィン mRNA の途中に stop コドンが生じて（out of ﬂame 変異：図２Ｂ），蛋白のＣ末端（ジストログリカン結合ドメイン）が形成されずアクチンと細胞膜とを繫ぐことができない。その結果，筋鞘膜が脆弱となり最終的には筋細胞の破壊が生じる。
そこで，最近ではアンチセンスオリゴヌクレオチド（AON）を筋細胞に導入して欠失している exon の隣接exon を不活化することで，mRNA に含まれない exonの合計塩基数を３の倍数に調節（DMD の out‑of‑ﬂame 変異を in‑ﬂame に変換）して，表現型を BMDにして治療しようとする試みがなされ，これを exon‑skipping 療法と呼んでいる 。図２Ｂでは exon 3の欠失のために exon 4に stop コドンが生じているが，図２Ｃのように AON を投与して exon 4を不活化すると，両 exon での欠失塩基数は３の倍数となり，exon5以降は in‑ﬂame になる。欠失している exon が複数の場合でも最終的に欠失塩基数を３の倍数に調節しさえすれば in‑ﬂame にできる。これをジストロフィン遺伝子で行うことで，３ʼ末端まで stop コドンなしに翻訳されて短縮型ジストロフィンが産生されるので，臨床的には BMD となって筋力をある程度保ったまま長期生存することが可能になる。
実際に AON をヒトに投与した報告では，筋細胞内のジストロフィン蛋白が産生され，筋力も回復することが確認されている。また AON の投与方法も検討されてきており，筋注だけでなくphospholothioate
AON や morpholino (phosphorodiamidate) AON などの開発によってウイルスベクターなどを用いない静脈内投与でも，筋細胞内で十分に効力を発揮することが確かめられている 。さらに DMD 患者の exon 欠失の約60%が集中しているとされる exon 45‑55の間

図１ ジストロフィンおよび関連蛋白の細胞内構造（文献５より引用，一部改変）
α‑DG : α‑dystroglycan, β‑DG : β‑dystroglycan,
DBN :dystrobrevin, α:α‑sarcoglycan, β:β‑sarcoglycan, γ: γ‑sarcoglycan, δ: δ‑sarcoglycan, Cav‑3:
caveolin‑3, Syn :syntrophinトピックス

図２ In‑ﬂame 仮説の模式図欠失する exon が複数個でも原理は同じである。
Ａ 欠失した exon 2の塩基数⑹は３の倍数であるためにexon 3以降の読み枠は元のままである。
Ｂ 欠失した exon 3の塩基数⑸は３の倍数でないために，exon 4以降の読み枠がずれて，stop コドンが生じている。
Ｃ アンチセンスオリゴヌクレオチドで exon 4を不活化
すると，exon 3，4の両 exon の合計塩基数 は３の倍数であるために，exon 5以降の読み枠が元に戻っている。

では２種類の AON を使い分けるまたは同時投与することで，この間に生じる全ての exon 欠失に対応できるようなことも考えられている 。
現在は exon 欠失に対応しての exon‑skipping 療法が始められているが，上記のような好発部位以外の欠失では AON がオーダーメイドになるため，コストがかかると思われる。また DM D の約３分の１を占めると考えられる点変異症例でも同様に変異 exon と，もし変異 exon が in‑ﬂame でなければその隣接 exon をも標的とした exon‑skipping を行えば短縮型ジストロフィンが産生できることになり，表現型を BMD に文することが可能である。ただしこの場合は点変異を見つけるために全 exon のシークエンスが必要となり，もちろん AON はオーダーメイドになるため，労力とコストがかかる難点がある。
従来はウイルスベクターなどを用いた遺伝子導入などが盛んに検討されていたが，ジストロフィンが巨大遺伝子という点で困難があった。今後症例を重ねて安全性や有効性，長期効果について検討していく必要が
あ る が，exon‑skipping 療 法 は 治 療 法 の な か っ た
DM D において，画期的かつ有望な治療法であると言える。
献1） van Deutekom JC,Janson AA,Ginjaar IB,Frankhuizen WS,Aartsma‑Rus A,Bremmer‑Bout M ,den Dunnen JT,Koop K,van der Kooi AJ,Goemans NM,de Kimpe SJ,Ekhart PF,Venneker EH,Platenburg GJ,Verschuuren JJ,
van Ommen GJ :Local dystrophin restoration with antisense oligonucleotide PRO051.N Eng J M ed 357:2677‑2686,
20072） Alter J, Lou F, Rabinowitz A, Yin H, Rosenfeld J, Wilton SD, Partridge TA, Lu QL : Systemic delivery ofmorpholino oligonucleotide restores dystrophin expression bodywide and improves dystrophin pathology.Nat Med12:175‑177, 20063） Takeshima Y, Yagi M , Wada H, Ishibashi K, Nishiyama A, Kakumoto M , Sakaeda T, Saura R, Okumura K,M atsuo M :Intravenous infusion of an antisense oligonucleotide results in exon skipping in muscle dystrophin
mRNA of Duchenne muscular dystrophy. Pediatr Res 59 :690‑694, 20064） Beroud C,Tuﬀery‑Giraud S, Matsuo M , Hamroun D,Humbertclaude V,M onnier N,M oizard M ‑P,Voelckel M ‑A,Calemard LM ,Bouisseau P,Blayau M,Philippe C,Cossee M ,Pages M ,Rivier F,Danos O,Garcia L,Claustres
M :M ultiexon skipping leading to an artiﬁcial DM D protein lacking amino acids from exons 45 through 55 could
rescue up to 63% of patients with Duchenne muscular dystrophy. Hum M utation 28:196‑202, 20075） 沖永剛志：肢帯型筋ジストロフィー. 小児内科 35増刊号 小児疾患診療のための病態生理 ２：908‑912, 2003

信州医誌 Vol. 57