鳥取県産業技術センター研究報告 No.21 (2018)

鳥取県内の生乳から分離した乳酸菌を使用したカマンベールチーズの製造
Production of Camembert Cheese Using Lactic Acid Bacteria
Isolated from Raw Milk in Tottori Prefecture

西垣ひろ美・西尾 昭
Hiromi Nishigaki and Akira Nishio
電子・有機素材研究所

発酵生産科

鳥取県内で生産された牛生乳、ヤギ生乳から乳酸菌の分離を試み、ヤギ生乳から分離した乳酸菌が、同定試験および発酵試験の結果よりチーズ製造に使用できる乳酸菌であると考えられた。分離株を使用してカマンベールチーズの製造を行った結果、市販乳酸菌スターターを使用した場合と遜色のないチーズができることを確認した。

1.

はじめに発を目標に、鳥取県内の生乳から新たに天然乳酸菌をスクリーニングし、分離した乳酸菌を使用してチ発酵乳製品であるチーズは、日本国民１人当たりの消費量（2016 年）において年間 2.7 ㎏（1 位デンーズを試作したので報告する。

マーク 28.1 ㎏）とまだ少ないが、近年増加傾向にあり、今後さらに伸びていくことが期待される１）。
チーズはワインと相性の良い食べ物とされ、どのチーズにはどのワインを合わせるといった、相性の

2.

実験方法

2.1

原材料

乳酸菌の分離源として、牛生乳（鳥取県畜産農協）、良い組み合わせ（マリアージュ）の原則が示されてヤギ生乳（メイちゃん農場）を用いた。

２）いる 。一方、日本酒とチーズの相性はこれまでほ乳酸菌の培養には、スキムミルク（雪印メグミル

とんど考えられてこなかったが、2015 年ミラノ国際ク）を蒸留水で 10％（w/v）に調製し、105℃，7 分

博覧会において多くの日本酒とチーズのマリアージ間オートクレーブ殺菌した 10％還元スキムミルク

ュが提案され大好評であったとのこと２）で、ワイン液を使用した。
チーズ試作には、牛生乳（畜産試験場）を用い、と同じようにマリアージュは十分に期待できる。
現在、鳥取県にチーズ製造企業は数社しかなく、63℃，30 分間殺菌し、使用した。
2.2 試薬美味しいチーズを造るための製造技術、特徴ある製品開発が課題となっている。チーズ製造には乳酸菌

乳 酸 菌 分 離 用 培 地 は 、 Lactobacilli MRS Brothによる乳酸発酵が必要なものが多く、発酵はチーズ（Difco）を使用した。寒天培地には炭酸カルシウムの味、香り、テクスチャー等を決定する重要な役割1％、寒天 1.6％を加えてオートクレーブ滅菌し、プを担う。
地域の特徴を持ったチーズ開発のためには、レートを作製した。

地域の自然に存在する乳酸菌を用いることが有効なチーズ製造に用いる凝乳酵素レンネットは、発酵生産キモシン CHY-MAX（クリスチャンハンセン，方法と考えられる。
本研究では、日本酒に合う鳥取県独自のチーズ開デンマーク）を使用した。

23

体に、3％過酸化水素水を 1mL 添加し、発泡の有無2.3 菌株を観察した。発泡がなければ、カタラーゼ陰性。乳

培養試験およびチーズ製造の対照乳酸菌として市販乳酸菌スターターCHN-11（クリスチャンハンセ酸菌はカタラーゼ陰性である。

ン）を使用した。また、チーズ製造に、白カビ PCA1

2.5.3

ガス生成

（Penicillium candidum, クリスチャンハンセン）、ジMRS 液体培地 8ml の入ったダーラム管入りの試

オトリカム GE0 CD1（Geotrichum candidum, クリス験管に、最終の培養菌液を 10μL 採取し、30℃で 3チャンハンセン）を使用した。

日間培養した。ダーラム管に気体がたまっていれば

2.4

ガス生成ありでヘテロ発酵、たまっていなければガ乳酸菌の分離

乳酸菌の分離は、Tulini ら３）および、鈴木４）の方ス生成なしでホモ発酵をする乳酸菌と推定できる。
2.5.4法を基に一部改変して行なった。すなわち、Tulini
らの方法では、0.1％Pepton Water で原料乳を 10～10

16S リボソーム DNA 配列

分離株の 16S リボソーム DNA 配列解析は、外部6倍に希釈し、各希釈液を MRS 寒天培地上に 100μL機関（テクノスルガ・ラボ）に委託した。

塗布し、30℃で 3～4 日間培養した。
鈴木の方法では、

2.6

培養特性

原料乳を 0.85％滅菌食塩水で 10～10 倍に希釈し、分離株を用いてカマンベールチーズを試作する

それぞれの希釈液をシャーレに 100μL 滴下し、そのため、濱岡ら５）の方法を参考に乳酸菌の培養特性を上から 45℃に冷ました MRS 寒天培地を流し入れ、次のように解析した。

6

寒天培地が固まった後 30℃で 3 日間培養した。培養

培養は 10％（w/v）スキムミルク液での静置培養には、嫌気ジャーを用い、シャーレとともに脱酸素とした。分離株は冷凍保存ストックから、対照であ剤（アネロパック）を封入した。培養後、周囲の炭る CHN-11 は乾燥菌体から 30℃で 16～18 時間培養

酸カルシウムが溶解している単一コロニー（酸生成）し、これをマザースターターとした。次いで、新しを滅菌楊枝で穿刺し、MRS 液体培地に植菌し 5 日間い培地にマザースターターを 5％（v/v）加えて 30℃程培養した。MRS 液体培地で繁殖した菌は 2 回目ので 16～18 時間培養し、これをバルクスターターとし分離を行った。2 回目以降の分離は、0.85％滅菌食塩た。さらに新しい培地にバルクスターターを 5％

水で培養菌液を 10～10 倍に希釈し、それぞれの濃（v/v）加えた被験区をそれぞれ 22、30、37℃で培度の希釈液 100μL を MRS 寒天培地に塗布し、脱酸養し一定時間ごとに pH、酸度を測定した。

6素剤（アネロパック）とともに嫌気ジャーに封入しそれぞれの測定は次のとおり行った。pH はガラスて、生育状況を確認しながら 30℃で 2～6 日間培養電極を用いて直接測定し、酸度は被験試料を 9.0ｇ秤した。その後、上記操作を 2 回繰り返し、計 4 回の量し、蒸留水 20mL を加えて懸濁し、0.1mol/L 水酸分離を行った。

化ナトリウム液で pH が 8.4 になるまで滴定して終点2.5を確認し、中和に消費した水酸化ナトリウム液の容

乳酸菌の同定乳酸菌の同定は、鈴木４）の方法に従い、以下の項量から算出した。
分離株については、生育温度が 20～30℃位の中温目について行った。

2.5.1

グラム染色菌と思われたが、確認のため一部の菌株については被験区 41℃でも上記同様の試験を実施した。

フェイバーG「ニッスイ」（日水製薬）を使用して2.7行った。青く染色すればグラム陽性、赤ければグラチーズの試作は、濱岡ら５）、Ricki Carroll６）、Jim

ム陰性。乳酸菌はグラム陽性である。

2.5.2

カマンベールチーズの試作

Law７）を参考に一部改変して以下の工程で行なった。

カタラーゼ試験

最終の培養菌液を遠心して上清を捨て、残った菌24

環境温度を 16℃に下げ、庫内ファンを稼働させ、

2.7.1 凝乳

チーズ表面の乾燥を開始した。乾燥の間チーズを 1殺菌した原料乳の温度が 37℃になったことを確認し、乳酸菌スターターを添加し 3 分間撹拌、続い日 1～2 回反転させた。て白カビ PCA1 とジオトリカム GE0 CD1 を添加し 22.7.6

一次熟成分間撹拌した。各原料の添加量は、分離株はスキム

表面が乾燥したら、チーズをフタ付の熟成ボック

ミルク液でバルクスターターを作成したうえで、原スへ移動し、湿度を高く保つため、水を入れた小型料乳の 5％（v/v）に相当する量とし、市販乳酸菌ビーカーも併せて入れ、環境温度を 7℃に下げた。

CHN-11 は乳量 1,000L 当たり 100U 相当量とした。

この間も 1 日 1 回反転させた。

白カビは仕込量 1,000L に対して 4-5U、ジオトリカ

2.7.7 包装

ムは仕込量 1,000L に対して 1-2U とした。上記原料

数日後、表面にうっすらと白カビが生えそろった

すべてを添加後 90 分静置したのち、レンネットのを確認したら、白カビの過剰繁殖を抑制するため、CHY-MAX を 0.002％（w/v）添加し 5 分間撹拌し、チーズをクッキングシートで包んだ。

45 分静置した。

2.7.8

2.7.2

二次熟成

チーズを包んだ日を起点に 4～6 週間熟成させ、カッティング

凝乳した原料乳（カード）にパレットナイフを刺

チーズの中心部にカードの芯がなく、内部全体がクし、澄んだホエイがしみ出るような適度な強度であリーム状に変質しているのを確認し完成とした。完ることを確認したら、カードを 2.5cm 程度のサイコ成までの間、最初の 1 週間は 1 日 1 回、その後は 3ロ状にカットし、そのまま 15 分静置した。カードの～4 日おきに反転を継続した。

体積が減り、大量に排出されたホエイは、カードと2.8試作した 2 種類のチーズ（分離株、市販乳酸菌）同レベルの高さまで排除した。
2.7.3

官能評価

については、その風味について 20 名のボランティア

型詰め・ホエイ排除

直径 7.5cm（容量約 480mL）の穴あきのチーズ型

評価者による官能評価を行った。官能評価は、色、にカードをすくい移し、型が一杯になるまで詰め、匂い、味、食感について、良い 1 点・普通 2 点・悪ホエイを漏出させた。型の中のホエイがある程度排い 3 点で評価し、チーズの好みについては選択方式、出され、カードの体積が減り、型の反転が可能となその他全般については記述式のコメントを得た。

った時点で 1 回目の反転を行った。反転は、チーズ型の上に小型の簀の子（すのこ）を置き、手のひら

3.

結果と考察でしっかり押さえ、端からチーズがこぼれないよう、3.1

乳酸菌の分離もう一方の手で素早く反転させた。その後、20℃の牛生乳、ヤギ生乳ともに乳酸菌の分離を 4 回行い、環境に移動し、1 時間おきに 4 回反転させホエイの最終的に牛生乳からは 4 株、ヤギ生乳からは 1 株を漏出を促進させた。

分離することができた。

2.7.4 加塩3.2

乳酸菌の同定翌日、型からはずし、それぞれのチーズの重量を牛生乳から分離した 4 株（Cow1～4）と、ヤギ生測定し、1.4％（w/w）相当の塩をカードの両面に施乳から分離した 1 株（G1）についてグラム染色を行した。具体的には、まず片面に 1.4％（w/w）の半量ったところ、いずれもグラム陽性であった。同じく、にあたる塩をすりつけ、4 時間程度静置して塩の浸カタラーゼ試験を行ったところ、いずれも発泡はな透を待ち、その後、反対面に同様の操作を行った。

く、カタラーゼ陰性であった。以上の結果より、こ2.7.5 乾燥

れらは乳酸菌であると推定された（表 1）。

25表 1 分離した乳酸菌の簡易同定試験結果

ａCow2

Cow3

Cow4

G1

分離源

牛生乳

牛生乳

牛生乳

牛生乳

ヤギ生乳グラム染色陽性陽性陽性陽性陽性

カタラーゼ試験

陰性陰性陰性陰性

陰性

ガス生成

有無有有無乳酸発酵型

ヘテロ

ホモ

ヘテロ

ヘテロ

ホモ細胞形態

球菌

球菌

球菌

球菌

球菌

pH

Cow16.46.05.65.24.84.44.0

培養温度

22℃： 30℃： 37℃

0 1 2.5 4 5 6 7 8 910

24

培養時間（ｈ）

また、ガス生成試験を行ったところ、牛生乳からｂ分離した 4 株のうち、3 株ではガス生成が観察され、培養温度

22℃： 30℃： 37℃

培養温度

30℃： 37℃：＊41℃

残る 1 株ではガス生成は観察されなかった。よって、ガス生成が観察された 3 株はヘテロ発酵をする乳酸菌であり、残る 1 株はホモ発酵菌であることがわかった。ヤギ乳から分離した 1 株については、ガス生成は観察されず、ホモ発酵菌であることがわかった（表 1）。
分離した乳酸菌 5 株の 16S リボソーム DNA の部

ｃ分塩基配列約 500bp を決定し、国際塩基配列データ
ベ ー ス （ DDBJ/ENA(EMBL)/GenBank ） に 対 し て
BLAST 相同性検索を行った結果、高い相同率で表 2のとおり種属が推定された。牛生乳から分離した 3株（Cow1,3,4）は塩基配列が同じであったため同じ乳酸菌であると判断した。
3.3

培養特性

牛生乳から分離したヘテロ株 Cow1、ホモ株 Cow2ｄと、ヤギ生乳から分離した株 G1、対照として市販乳培養温度

酸菌 CHN-11 について、培養特性試験を実施した。

22℃： 30℃：

37℃：＊41℃

10％（w/v）スキムミルク液にバルクスターターを 5％（v/v）加えた被験区を、CHN-11 と Cow1

表 2 分離した乳酸菌の DNA 塩基配列解析

検体名

推定種属相同率Cow1Leuconostoc mesenteroides

498/498（100％）

Cow2

Lactococcus sp.

504/506（99.6％）

Cow3

Leuconostoc mesenteroides

498/498（100％）ｂ：牛乳より分離した乳酸菌 Cow1

Cow4

Leuconostoc mesenteroides

498/498（100％）ｄ：ヤギ乳より分離した乳酸菌 G1

G1

Lactococcus lactis subsp. lactis

498/498（100％）26

図１ 乳酸菌を添加したスキムミルク液の pH 低下曲線
ａ：市販乳酸菌 CHN-11（対照）ｃ：牛乳より分離した乳酸菌 Cow2

は 22、30、37℃で、Cow2 は 30、37、41℃で、G1

塩の量については、明確に記載されている文献がでは 22、30、37、41℃で培養した。温度特性が不明なく、当初は市販のカマンベールチーズのパッケーであったため、牛生乳から分離した 2 株についてはジに記載されている塩分濃度（2％）
を参考にしたが、被験区をずらして実施した。対照である CHN-11 は非常に塩味の強いチーズが出来上がったため、塩量中温菌なので 41℃の被験区培養は行わなかった。そを検討した結果 1.4％（w/w）が適当と判断した。チの結果、CHN-11 では 30℃と 37℃の培養温度で、開ーズ内部の塩分濃度を塩分濃度計で測定した結果、

始 2～7 時間の pH 低下が同程度に顕著であり、242％（w/w）の塩を施したチーズの塩分濃度は 1％程

時間後にはすべての温度帯で pH が 4.4 前後となった

度、1.4％（w/w）の塩を施したチーズは 0.6％程度で（図 1a）。Cow1 株、Cow2 株ともにすべての被験区あった。

において顕著な変化はみられず、G1 株では 37℃で3.5

官能評価の pH 低下が顕著であった（図 1b～d）。酸度に関し試作品の風味について健常成人 20 名のボランテても pH 同様、CHN-11 では 30、37℃で、G1 株ではィア評価者による官能評価を行った。その結果、G137℃での酸生成能が高かったが、Cow1 株、Cow2株のチーズは、色 1.1、匂い 1.7、味 1.6、食感 1.3

株ともにほとんど変化は見られなかった（データ非であり、対照の CHN-11 チーズの、色 1.7、匂い 1.6、掲載）。これは、Cow1 株については 16S リボソーム

味 1.4、食感 1.4 という結果と比べても遜色ない良好

DNA 配列で判明した菌種が、ほとんど酸生成しないなものであった。また、好みについては、G1 株チーことと合致している。また、Cow2ズを好んだ評価者が 9 名、CHN-11 チーズを好んだ

株についてはホモ発酵菌ではあるものの、16S リボ評価者が 11 名と、大差はなかった。G1 株チーズにソーム DNA 配列で、チーズの乳酸菌として適応かついては、癖がなく食べやすいというポジティブなどうかが不明であったが、培養特性上適応ではないコメントが目立ったが、それ故にか、味が淡泊、特と判明した。G1 株については、pH 、酸度ともに 37℃徴がない、物足りないなどと感じる評価者も目立っでの変化が顕著ではあったが、いずれの被験区におた。CHN-11 チーズについては、お酒やワインに合いても CHN-11 に比べ pH の低下は遅く、酸の生成いそうと感じた評価者が多かった。他には、味が濃能も低かった。

い、塩辛い、アンモニア臭を感じるなどが目立った。

乳酸菌である

3.4８）

チーズの試作培養特性試験で酸生成が確認された G1 株と、対4.

おわりに照の CHN-11 を用いて原料乳各 3L でカマンベール

鳥取県内で生産された牛生乳、ヤギ生乳から乳酸チーズを試作した。当初、一般的なカマンベールチ菌をスクリーニングし、分離した乳酸菌を使用してーズ製造に適温とされている 32℃６）７）での試作をカマンベールチーズを試作した結果、以下の知見が試みたが、G1 株については、その凝固特性のせいか、得られた。

ホエイが排出されているのにもかかわらずチーズが（１）牛生乳から 4 株、ヤギ生乳から 1 株の計 5 株の乳酸菌を分離することができた。

非常にやわらかく、塩をしたのちでも型からはずすと形状を保つことが困難であったため、G1 株の培養

（２）その内ヤギ生乳から分離した乳酸菌が、特性で pH 低下が顕著であった 37℃を試作の適温とLactococcus lactis subsp. lactis と推定され、培養した。CHN-11 についても条件をそろえるために特性試験よりチーズ製造に使用できる乳酸菌で37℃での試作を行った。その結果、G1 株のチーズのあると考えられた。
（３）分離株を使用してカマンベールチーズの試作ゆるさが解消され形状を保つことができる扱いやすを行った結果、市販乳酸菌スターターを使用したい性状となった。

27場合と遜色のない良好なチーズが製造可能であ

乳酸菌スターターの特徴，チーズを科学する，ることを確認した。

株式会社幸書房，p.33

謝辞
快く生乳を提供していただきました、鳥取県畜産農協、メイちゃん農場、鳥取県畜産試験場の皆様に深謝いたします。

文献
1)

農林水産省；平成 29 年度チーズの需給表2)斎藤忠夫；チーズの科学（ブルーバックス），
株式会社講談社，p.75（2016）

3)

Fabricio L Tulini, Nolwenn Hymery, Thomas
Haertle, Gwenaelle Le Blay, and Elaine C P De
Martinis ； Screening

forantimicrobialandproteolytic activities of lactic acid bacteria isolated
from cow, buffalo and goat milk and cheeses
marketed in the southeast region of Brazil, Journalof Dairy Research, 83, p.115-124 (2016)4)鈴木チセ；4.基本的な実験操作 1）食品からの乳酸菌の分離・簡易同定に関する操作，平成 20
年度農林水産省補助事業（食料産業クラスター展開事業）食品機能性評価マニュアル集第 III
集，社団法人日本食品科学工業会，p41-48（2008）5)

濱岡直裕，八十川大輔，奥村幸広，中川良二，田中達大；北海道内で分離した乳酸菌
Streptococcus salivarius ssp. thermophilus を利用
し た モ ッ ツ ァ レ ラ チ ー ズ 製 造 技 術 ， Nippon
Shokuhin Kogaku Kiashi，64(3), p.132-138（2017）

6)

Ricki Carroll；Camembert, Home Cheese Making,recipes for 75 homemade cheeses, Library ofCongress

Cataloging-in-Publication

Data ，p.158-159 (2002)
7)

Jim Law, 翻訳：亀和田俊一，カマンベール，＜職人技がわかる本＞キッチンで始める職人チ ー ズ 造 り， ア ー ル アイ シ ー 出 版株 式 会社
2010，p.144-146（2010）8)

NPO 法人チーズプロフェッショナル協会；3.2.2

28