研究助成業績報告集

第 29 回（2021 年度）バイエル循環器病研究助成『心不全における慢性腎臓病』

公益財団法人循環器病研究振興財団

No

研

1

＊

目

次

究

課

題

＊

研 究 者

頁

ケトン体が結ぶ心腎連関機構の解明

有馬 勇一郎1

2

心筋梗塞で動員される新規ミエロイド細胞
サブセットが慢性腎臓病病態形成に与える影響

尾花 理徳

7

3

慢性腎臓病を合併した心不全における「腎－脳－心連関」の
機序解明

篠原 啓介

10

4

心不全時の造血幹細胞のエピゲノム変化が引き起こす慢性
腎臓病

中山 幸輝

13

ケトン体が結ぶ心腎連関機構の解明

熊本大学 国際先端医学研究機構 特任准教授

有馬

勇一郎

Ⅰ．緒 言
心腎連関は代表的な臓器連関であり、心不全において腎機能障害が増悪因子となることはよく知られている。そのため、健康長寿社会の実現のためには、双方向で作用する臓器連関の分子実態を明らかにし、両臓器の保護を目指した予防・治療戦略の設定が必要である。
ケトン体は古くから空腹時のエネルギー源として知られてきたが、エネルギー基質以外にも多彩な作用があることがか明らかとなってきた。ケトン体代謝のKetogenesis( Production)

特徴として、ケトン体を賛成する臓器と消費する臓器が明確にわかれているという点があるが(図 1)、これらの違いは律速段階酵素の発現により制御されていKetolysis( Consum ption)

図２ ケトン体代謝
ケトン体代謝はケトン体を合成する Ketogenesis と、ケトン体をる(図２)。

消費する Ketolysis に分かれる。この中で、Ketogenesis はHmgcs2,
Ketolysis は Scot がそれぞれの反応の律速段階酵素であり、これらの酵素発現によりケトン体合成・消費臓器の違いが区別される。

Heart
Ketolytic

Brain
Ketolytic

Liver
Ketogenic

KidneyKetogenic
図3

図1

ケトン体合成によるミトコンドリア保護

ケトン体合成不全状態では、基質となるアセチル CoA が蓄積し、ミケトン体合成臓器と消費臓器

ケトン体を合成する臓器の代表として肝臓・腎臓、消費する臓器としトコンドリアタンパクに過剰なアセチル化を加えることで、クエンては心臓・脳が代表的である。

酸サイクルの機能が低下する。(Arima et. al., Nature Metabolism
2021)

研究代表者はケトン体合成の律速段階酵素である

我々はこの現象を新生児期の肝臓において見出し

HMG-CoA synthase2(Hmgcs2)のノックアウトマウ

たが、腎臓においてもケトン合成は盛んに行われていスを独自に樹立し、ケトン体合成にミトコンドリアタ

ることを確認しており、同様の機序が機能している可ンパクの過剰なアセチル化を緩和し、機能を保護作用

能性が示唆される。また、糖尿病性腎症を用いたモデがあることを初めて発見した(図 3:Arima et. al.,

ルマウスにおいても、ケトン体が mTOR 活性の抑制

Nature Metabolism 2021)1)。

を通じて腎保護作用を示すことが報告され（Tomita1et. al., Cell Metabolism 2020）2)、ヒトにおいても１変化するかを検証した。

細胞核シーケンスの解析において糖尿病性腎症患者

続いて、内因性のケトン体が心不全・腎不全にどのの腎臓では Hmgcs2 の mRNA 発現が低下している

ように影響するかを検証するため、有馬は Hmgcs2

ことが確認された（図 4:Wilson et al, PNAS 2019）flox マウスと Alb-cre マウスを用いて、肝臓特異的な3)。

ケトン体合成不全マウスを作成して検証した。研究分
担者の内村は、Hmgcs2 flox マウスと NDRG-1CreERT2 マウスを用いて、近位尿細管特異的なケトン体合成不全マウスを作成し、急性腎障害モデル(AKI)から慢性腎臓病(CKD)へ進展する過程(AKI to
CKD)において、近位尿細管におけるケトン体合成不全が病態のどのように影響するのか検証した。
一細胞核シーケンス(左)Ⅲ．結 果

健常腎（中央）と比較して糖尿病性腎症患者の腎臓(右)において高脂肪食負荷と高血圧処置の併用により病的心肥大

Hmgcs2 の発現が低下している(赤ドット)。

が生じる

心臓は代表的なケトン体消費臓器であり、申請者はHFpEF 病 態 を 再 現 す る た め 既 報 に 則 り

ヒトの心臓で消費されるケトン体を実測し、心臓を通(Schiattarella et. al., Nature 2019)、８週齢の野生型

過する過程で３〜４割のケトン体が利用される

マウスに対して 60%高脂肪食と 0.5g/L γ-nitro-L-(Arime et. al., JACC 2019)4)。また、心不全病態におarginine methyl ester (L-NAME)を 15 週間負荷した

いても、血中ケトン体濃度の上昇とともにケトン体の(2-Hit model)。15 週後の時点において、対照群であ利用率が上昇することが報告されている(Murashige

る通常食・通常飲水マウスと比較して、2-Hit modelet. al., Science 2020)5)。

を加えたマウスは有意に体重増加・血圧上昇を認めた

一連の研究結果は、ケトン体代謝が心・腎ともに(図 5)。

保護的に作用する可能性を示しており、慢性腎臓病を合併した心不全において、負のサイクルを断ち切る因

Body Weight

Systolic BP子として作用しうる可能性を秘めている。しかしなが

60

200

ら現時点において、①心不全に伴うケトン体代謝の変化は腎機能に影響を及ぼすのか？②腎臓におけるケ

150

mmHg

トン体合成は、心臓に影響しうるのか？といった心腎連関に関わる分子メカニズムは不明である。そこで本

40

100

研究提案では、腎臓内科を専門とする山梨大学の内村P<0.0001

P=0.011g
20

50

幸平先生との共同研究により、様々な臓器・時期特異

図5

E
A
M
-N

C

A

FD

+L

N

+L
-

H

FD

きをもち、疾病進展の予防に有用であるかを検証した。

Ⅱ．対象・方法

M
E

TR
L
C

ける慢性腎臓病の中で、ケトン体代謝がどのような働

TR
L

0

0

的なケトン体合成不全マウスを駆使して、心不全におH

図42-Hit model

通常飼育群(CTRL)と比較して、60%高脂肪食と 0.5g/L L-NAME

本研究計画では申請者の樹立した、Hmgcs2 のノッ

含有水を投与した 2-Hit モデルでは、有意な血圧上昇と体重増加をクアウトマウスおよびコンディショナルノックアウ
トマウスを駆使して実験を進めた。まずは、心不全病

認め、高血圧と肥満を合併したモデルとして妥当であることが示さ態を再現するマウスモデルとして、高脂肪食負荷と高れた。

2-Hit model により病的心筋肥大が生じる

血圧処理を併用した収縮保持性心不全(Heart failure
with preserved ejection fraction; HFpEF)の作出を試

2-Hit model を 15 週間加えた時点において、心臓みた(Schiattarella et. al., Nature 2019)6)。その上で、超音波検査を実施すると、負荷群において有意な心室
中隔壁肥厚を認めた(図 6)。

心不全形成過程においてケトン体代謝がどのように加えて、採取した心臓組織を用いて免疫組織染色を2実施した結果、2-Hit model においては有意に心筋断し、ケトン体合成が亢進することが明らかとなった。

面積が拡大しており(図 7)、心筋肥大が生じているこHeart_βOHB

Blood_βOHBとが明らかになった。加えて血管密度の測定では 2-

6

Hit model において血管密度の減少を認め、生理的心0.8

P=0.0002

肥大ではなく病的心肥大が生じていることが確認さ

0.6
4

a.u.

mmol/l

れた。

2

0.0

C

IVSTd

EF
80

1.2

P=0.15

mm

%

3.5

T

H

-N
+L
FD

AM

60

図8 2-Hit model では血中ケトン体濃度が亢進する

P=0.003

0.8

hmgcs2

Liver_hmgcs2

Total Protein
5

0.4
C

+L
-N
AM

E
AM

CTRL

H

FD

2

HFD+L-NAME

0
T

H

3

1

FD

+L
-N

C

AM
E

C

+L
-N
FD

a.u.

40

E

2.5

P=0.049

4

TR
L

0.6

TR
L

50

TR
L

3.0

W

H

E

1.0

70

4.0

D+

W

E

P=0.11

HF

L-

M
NA

E

FD

+L

-N

A
M

4.5

mm

L
TR

HFD+L-NAME

LVDd

0.4
0.2

0

CTRL

P=0.04H

図6 2-Hit model は心室中隔壁の肥厚を生じる

図9 2-Hit model では肝臓でのケトン体合成が亢進する
DAPIWGAIB4CTRL

肝臓特異的なケトン体合成不全マウスの作成

HFD+L-NAME

一連の実験結果から2-Hitモデルではケトン体合成が亢進することが明らかとなった。Hmgcs2 は肝臓だ
けでなく、腎臓や腸の幹細胞などでも発現しており、肝外性のケトン体合成と肝臓におけるケトン体合成の作用を区別するため、肝臓特異的なケトン体合成不全マウスの作成を試みた。
Cross Sectional Area

我々が独自に樹立した Hmgcs2 flox マウスと、

800

Albumin Cre マウス(Alb-cre マウス)を交配し、p<0.001

a.u.

600

Hepatocyte 特異的なケトン体合成不全マウスを作成400した(図 10 Hepatic Keto-less model; hKL)。

200
0
CTRL

HFD+L-NAME

Alb-CRE

図7 2-Hit model は心筋細胞の肥大を生じる

2-Hit model ではケトン体合成が亢進する
病的心筋肥大が生じることが明らかとなった 2-Hit

Hepatic
Keto-lessmodel

図10 肝臓特異的なケトン体合成不全マウス

モデルにおいて、血中・組織中のβヒドロキシ酪酸濃

hKL マウスは全身のケトン体合成不全マウスと同度を測定すると、有意な上昇を認めた(図 8)。また採様、致死的な表現型は示さず、成獣まで生存可能であ

取した肝臓を用いて Hmgcs2 のタンパク量の発現をった。成獣組織の肝臓・心臓・腎臓を用いて免疫組織確認した結果、有意な上昇を認めた(図 9)。以上より、染色を実施すると、hKL マウスでは肝臓の Hmgcs22-Hit モデルでは肝臓におけるHmgcs2 の発現が亢進の発現が消失する一方で、腎臓における発現は維持さ

3

認め、心筋肥大が増悪することが確認された（図 14）。

れていることが確認された。また心臓ではコントロー
ルマウス(Hmgcs2 flox/flox)でも Hmgcs2 タンパクの

50
Liver

Heart

systolic BP

Body weight

発現は確認されなかった(図 11)。

P=0.53

P=0.63Kidney

150

gram

WT

mmHg

45
40

100

50

35
hKL

0

30

WT

染色)

Tibial Length

Heart Weight

続いて、空腹時の血中濃度を測定すると、hKL マウ

180
160

P=0.39P=0.037
9

140

18.0
17.5

120

8
7
6

17.0

5

16.5

100

Blood_βOHB

10

18.5

mm

mg

を認めた(図 12)。

HW/TL

19.5

P=0.09619.0

スでは有意な血中べーたヒドロキシ酪酸濃度の低下

8hKL

図12 15 週負荷時点の体重・血圧mg/mm

図 11 肝臓特異的なケトン体合成不全マウス(Hmgcs2 の免疫組織

WT

hKL

WT

WT hKLWT hKLhKL

図13 hKL マウスは心臓重量が増加する

P=0.007DAPIWGAIB4
CSA
P=0.0017
600um^2

mmol/l

6

400
200

4

0

WT

WT

2

hKL

hKL

図14 hKL マウスは心筋断面積が増加する

これらの変化がどの時期から確認されるかを検証

0
WTするため、負荷期間を変えて表現型を検討した結果、

hKL

５週負荷後の時点において、理学所見上の差は認めな
図11 hKL マウスモデルでは血中ケトン体濃度が低下する

いものの、心筋断面積にはすでに変化が生じているこ

興味深いことに、肝臓特異的なケトン体合成不全マとが確認された。

ウスにおける血中ケトン体濃度は、全身のケトン体合

DAPIWGAIB4

CSA

成不全モデルとほぼ変わりなく、血中のケトン体濃度

800

P<0.0001

600

um^2

はほぼ肝臓でのケトン体合成により供給されていることが今回の研究で明らかとなった。

400
200

hKL マウスでは 2-Hit model による心筋肥大が増悪

0
WT

hKL

する
WT

hKL マウスを用いて、高脂肪食+L-NAME 飲水負hKL

荷を 15 週間加えた。体重やテイルカフにて測定した

図 15 hKL マウスによる心筋肥大の増加は 5 週間負荷でも確認さ血圧については、コントロールマウスと hKL マウスれる。

で明らかな差は認めなかった(図 12)。一方で、心臓重2-Hit model における形態的に明らかな腎障害は認め

量は hKL マウスで増大する傾向を示し、脛骨長で補られない

正すると有意な上昇を認めた(図 13)。

2-Hit モデルが腎機能に与える影響を確認するため、そこで、免疫組織染色法により心筋断面積を計測し15 週負荷後の腎臓組織についても切片による組織的た結果、hKL マウスでは有意な心筋断面積の増加を検討を行った。しかしながら、組織所見上明らかな腎4図17 hKL マウスでは Fgf16 の発現が低下する

障害所見は認められなかった。
2-Hit model における遺伝子発現変化の検討

同様の現象は負荷後 15 週目の時点においても確認

一連の解析により、
hKL マウスでは 2-Hit model にされ、ケトン体合成不全状態が Fgf16 の発現を転写レ

よる心筋肥大が増悪すること、負荷後 5 週の時点で心ベルで抑制することが確認された。

筋肥大の所見が確認されることを見出した。どのよう

βヒドロキシ酪酸投与によりFGF16 の発現が上昇すな遺伝子発現の変化がケトン体合成不全によりもたる

らされるかを確認するため、負荷後５週の心臓組織を続いて、FGF16 の発現変化がケトン体による直接

用いて、RNA-sequencing 解析を実施した。

的なものであるかを検証するため、単離心筋細胞を用

Hmgcs2 flox/flox の対照群(Ctrl)、Alb-cre;Hmgcs2

いた検討を行った。生後 2 日目の野生型ラットより心flox/flox の hKL マウスそれぞれ 3 検体を用いて、イ筋細胞を単離し、βヒドロキシ酪酸の存在・非存在下

ルミナ社性 Nextseq500 による RNA sequencing 解

でフェニレフリン負荷刺激を行った(図 18)。

析を実施した。解析により 21 種の Defferentiallyphenylephrine

expressed genes (DEGs)が同定されたが、これらの中

48hr

RT-PCR

で異なるサンプルセット及び 15 週負荷のサンプルでw/wo βOHBも同様の傾向を認める遺伝子を RT-PCR により確認

Rat neonatal
cardiomyocyte

し、最終的に 5 種の遺伝子が hKL マウスにおいて顕著に変化することを確認した(図 16)。

図18 Rat 由来心筋細胞を用いた心筋肥大誘導

RNA-sequencing (IMEG; Ctrl n=3 vs hKL n=3)

負荷後 48 時間の時点で RNA を回収し、RT-PCR
法により遺伝子発現を比較した結果、FGF16 の発現

Pick up DEGs (Ctrl > hKL; 19 genes, Ctrl < hKL; 3 genes)

が 5mM のβヒドロキシ酪酸との共培養により上昇することが確認された。

Validation by RT-PCR (Ctrl n=5 vs hKL n=5)

fgf16
2.5

Validated genes (n=5)

2.0

Ratio

図16 RNA-sequencing 解析を用いて変動遺伝子の同定

この中で、今回の心臓と腎臓をつなぐ鍵因子の同定

1.5
1.0
0.5

という目的を達成するため、分泌型の因子に注目して

b5
m

20
uM
20
uM

+b
h

PE

M
C
R
N

した。

M

0.0

検討を行った結果、FGF16 を候補遺伝子として同定

PE

FGF16 の発現は hKL マウスにおいて低下する
FGF16 は FGF ファミリーの一つであり、心筋細胞

図 19 βヒドロキシ酪酸(bhb)の刺激により Fgf16 の発現は増加すより分泌されて心臓保護的に作用することが知られるて い る (Khosravi et. al., Frontiers in Cell andDevelopmental Biology 20217), Fujiu and Nagai,
JMCC 20148))。

どのような機序でケトン体合成はン体濃度を測定すると、我々は 5 週間負荷を加えた 2-Hit モデルにおいて、近位尿細管特異的なケトン体合成不全マウスの作成

心臓における Fgf16 の発現が hKL マウスで有意に低心腎連間の腎臓側のケトン体合成の意義を明らか

Fgf16
2.0

にするため、本研究では近位尿細管特異的なケトン体

0.0123

合成不全マウスの作成も進めている。研究代表者の樹

Ratio

1.5

立した Hmgcs2 flox マウスの精子を研究分担者であ1.0

る内村幸平先生の所属する山梨大学へ送り、SPF グ

0.5

レードのマウス作成を進めている。現在 Hmgcs2 flox

0.0
WT

マウスのホモ接合体の樹立と、NDRG-1-CreERT2 マ

hKL

下することを確認した(図 17)。

ウスとの交配による近位尿細管特異的なケトン体合5成不全マウスの樹立を進めている。

内村幸平・山梨大学腎臓内科・助教

Ⅳ．考 察

Ⅶ．参考文献1)

一連の検討により、ケトン体合成不全状態では心筋

Arima Y, Nakagawa Y, Takeo T, et al. Murine

肥大が増悪することが確認された。この現象は肝臓特neonatal ketogenesis preserves mitochondrial

異的なケトン体合成不全マウスで確認され、近位尿細energetics

管で Hmgcs2 の発現が残った状態でも全身の血中濃hyperacetylation. Nat Metab. 2021;3:196-210.
2)

度低下は明らかであったことから、腎臓から産生されbypreventing

proteinTomita I, Kume S, Sugahara S, et al. SGLT2るケトンが心保護に作用する可能性は否定的な結果

Inhibition Mediates Protection from Diabetic

であった。

Kidney Disease by Promoting Ketone BodyInduced mTORC1 Inhibition. Cell Metab.

一方、ケトン体合成不全により複数の遺伝子群が心2020;32:404-419.

臓において転写レベルで発現変化を示すことが明らかとなった。この中でも FGF16 は心保護的に作用す3)

Wilson PC, Wu H, Kirita Y, et al. The single-cell

るタンパクとして知られ、心筋細胞より分泌されるこtranscriptomic landscape of early humanとが知られている。既報では FGF2 を介したシグナ

diabetic nephropathy. Proc Natl Acad Sci.

ルを部分的に抑制することで心保護的に作用するこ2019;116:19619-19625.

とが示されているが、今回用いた 2-Hit モデルにおい

4)

Arima Y, Izumiya Y, Ishida T, et al. Myocardialて FGF16 がどのような機序で肥大を抑制しているのIschemia Suppresses Ketone Body Utilization.

かは明らかでない。現在、FGF16 がもたらす下流のJ Am Coll Cardiol. 2019;73:246-247.
5)

シグナル伝達の変化と、FGF16 の発現が変化する上Murashige D, Jang C, Neinast M, et al.

流の転写制御機構について解析を進めている。特に転Comprehensive quantification of fuel use by

写制御機構については、ケトン体が内因性の HDAC

the failing and nonfailing human heart.

阻害作用を示すことや(Shimazu et. al., Science

Science. 2020;370:364-368.

2013)9)、直接的なヒストン修飾をもたらすことが報告6)

されており（Xie et. al., Molecular Cell 2016）10)、今

Schiattarella GG, Altamirano F, Tong D, et al.
Nitrosative stress drives heart failure with

後 Chip-qPCR や Chip-sequencing 解析を進めて、ケ

preserved ejection fraction. 2019;568:351-356.
7)

トン体による転写制御機構を明らかにしたいと考え

Khosravi F, Ahmadvand N, Bellusci S, et. al.
The Multifunctional Contribution of FGFている。
また、研究当初は 2-Hit モデルにより腎臓においてSignalingto

CardiacDevelopment,

も障害が確認されることを予測していたが、15 週負Homeostasis, Disease and Repair. Front Cell

荷の本モデルでは明らかな形態的な変化は確認でき

Dev Biol. 2021;9:672935.
8)なかった。原因として、心臓の表現型も既報と比較す

Fujiu K and Nagai R. Fibroblast-mediatedると軽度であることから、腎障害をもたらすには負荷

pathways in cardiac hypertrophy. J Mol Cell

が軽すぎる可能性が考えられる。現在腎臓でのケトン

Cardiol. 2014;70:64-73.
9)体合成不全マウスの作成を進めているが、2-Hit モデ

Shimazu T, Hirschey M, Newman J, et. al.

ルに合わせて AKI を合併させるモデルなどを加える

Suppression of Oxidative Stress by β-

ことで、より心腎連関をつなぐ働きを明らかにしたい

Hydroxybutyrate, an Endogenous Histoneと考えている。

Deacetylase Inhibitor. Science. 2013;339:211214.
10) Xie Z, Zhang D, Chung D, et. al. Metabolic

Ⅴ．結 論

Regulation of Gene Expression by Histone

ケトン体合成不全は、心肥大の進行を促進する。

Lysineb-Hydroxybutyrylation.

2016;62:194-206.

Ⅵ．研究協力者
山田敏寛・熊本大学循環器内科・大学院生
徐宇卿・熊本大学循環器内科・大学院生
辻田賢一・熊本大学循環器内科・教授

6

Mol

Cell.

心筋梗塞で動員される新規ミエロイド細胞サブセットが慢性腎臓病病態形成に与える影響

大阪大学大学院薬学研究科・准教授

尾花

Ⅰ．緒 言

理徳

検討

我が国では、社会の高齢化に伴い心不全患者が急増

マウス MI モデルは、C57BL/6J マウスの左冠動脈をしており、心不全パンデミックとも称されている。他

結紮することで作製した 6。糖尿病性腎臓病モデルは、方、慢性腎臓病（CKD）は、我が国の成人の 1,330 万

C57BL/6J マウスに、クエン酸バッファーに溶解した人が罹患していると言われ、新たな国民病と言われてストレプトゾシン（STZ）を 50mg/kg/day の用量で 5いる。言わずもがな、心腎連関と言われるように、心日間連続腹腔内投与した。STZ 投与 4 週間後、解析に不全病態と CKD 病態は、互いの病態進展に影響を与供した。ミエロイド細胞特異的 GARP または TGFβ3

えているが 1 2、その機序は十分に明らかにされてい欠損マウスは、LysM プロモーター下 Cre 発現マウス

ない。

と GARP flox または TGFβ3 flox マウスを交配させて作製した（それぞれ GARP cKO、TGFβ3 cKO）。

心筋梗塞（MI）後心不全発症に至る過程（心筋リモデリング）では、好中球やマクロファージなどから成るミエロイド細胞が炎症を制御していることが知ら(2) 心機能の評価れている 3。申請者は、ミエロイド細胞における心筋

心機能の評価は心エコー法を用いて行った。

リモデリング制御機構を、より詳細に理解するため、MI 後に心筋組織内に浸潤するミエロイド細胞に対し(3) 組織学的評価てシングルセルRNA シーケンスを行った。
その結果、心筋線維化はマッソントリクローム染色により評価

遺伝子発現パターンから、ミエロイド細胞は 3 つの細した。またアポトーシスは TUNEL 染色により、マク胞集団に分類され、それらは好中球、マクロファージ

ロファージは抗 F4/80 抗体を用いた免疫染色によりの細胞集団に加え、未知の細胞集団（クラスターX）検出した。

から成ることが明らかとなった。このクラスターX の細胞集団は Transforming Growth Factor-β（TGF-β）(4) 培養マクロファージ

3 4やマウスの骨髄細胞を単離し、マクロファージコロニー

TGF-β の活性化を担う膜結合型タンパク

Glycoprotein A repetitions predominant （GARP）

刺激因子によりマクロファージに分化させた。分化後、5 を高発現する。
興味深いことに、
MI 後の末梢血中に、リコンビナ ント TGF-β3 を作用させ、cleaved

クラスターX の細胞集団が、CD11b 陽性ミエロイド

caspase3 発現をウェスタンブロットにより検出する

細胞中 36.2±5.2%存在することが明らかとなり、これことでアポトーシスを評価した。

らは心臓に限らず他臓器へも何らかの影響を及ぼすと考えられる。そこで本研究では、心腎症候群の新た(5) タンパク発現解析

なメカニズムを追究するべく、MI 後に生体内で発現

GARP タンパクの発現は、フローサイトメトリーまた上昇する新規ミエロイド細胞群が、心筋リモデリングはウェスタンブロッティングにより解析した。

及び CKD 病態に与える影響を検討する。
(6) 統計解析

Ⅱ．対象・方法

2 群間の比較は Student’s t-test、多群間は多重比較検(1) 病態モデルマウス及び遺伝子改変マウスを用いた定により解析し、P<0.05 を有意差ありと判断した。

7

Ⅲ．結 果(1) ミエロイド細胞発現 GARP が心筋リモデリングに与える影響の検討
ミエロイド細胞で発現する GARP が心筋リモデリン

図 3：MI4 日目おいて、TGF-β3 中和抗体はマクロファージのアポグに与える影響を検討するため、GARP cKO マウス

トーシスを抑制する。

を作製した。本マウスに MI を施し、心筋線維化を評価した。マッソントリクローム染色及び心エコーの結果、GARP-cKO において心筋線維化が抑制され、心機能の低下が抑制されていた（data not shown）。現在、本実験結果の再現性の評価を実施している。
図 4：リコンビナント TGF-β3 により骨髄由来マクロファージの(2) TGF-β3 flox が心筋リモデリングに与える影響の

cleaved caspase3 発現が上昇する。

検討
クラスターX で特異性高く発現する TGF-β3 が心筋

加えて、ミエロイド細胞特異的ジフテリア毒素受容体

リモデリングに与える影響を検討するため、MI 後マ-GFP 融合タンパク発現マウスを作製した。今後、ウスに TGF-β3 中和抗体を投与した。経時的な心エ

TRECK 法によりクラスターX を破壊したマウスをコー解析の結果、TGF-β3 中和抗体投与マウスにおい作製し、当該細胞の心疾患病態生理学的意義を追究すて心機能の低下が抑制された（図 1）。また MI14 日

る。

後において、マッソントリクローム染色の結果、抗TGF-β3 抗体投与群で心筋線維化の抑制が認められ(3) 心腎症候群における GARP 陽性ミエロイド細胞た（図 2）。また、心臓組織を用いた TUNEL 染色及の関与

び免疫染色の結果、マクロファージのアポトーシスが心腎症候群における GARP 陽性ミエロイド細胞の関TGF-β3中和抗体投与群で減少していることが明らか与を探るため、MI4 日後、腎組織中の GARP 陽性ミとなった。さらに、培養マクロファージにおいて、リ

エロイド細胞割合をフローサイトメトリーで評価しコンビナント TGF-β3 がアポトーシスを惹起させた。

た。その結果、MI 群の腎組織中の GARP 陽性ミエロ

加えて、TGF-β3 cKO マウスを作製し、現在、ミエロ

イド細胞割合は、正常時の心臓と同程度であった

イド細胞特異的な TGF-β3 の心筋リモデリングにお（data not shown）。GARP 陽性ミエロイド細胞は傷ける役割を評価している。

害領域に遊走、浸潤することが示唆されたため、腎障
害を誘発させるべく STZ 誘発糖尿病性腎臓病モデルを作製し、このマウスに MI を施した。腎組織中GARP 発現をウェスタンブロット法により評価した
ところ、MI 群や糖尿病腎で GARP の発現上昇が認められた。一方、糖尿病に MI を付加しても腎組織中
GARP 発現の有意な変動は認められなかった。

図1：マウス MI モデルにおいて、TGF-β3 中和抗体は心機能の低下を抑制する。LVIDs; left ventricular end-systolic diameter

図5：MI4 日の腎臓や糖尿病モデルマウスの腎臓で GARP タンパクの発現増加が認められた。
図2：マウス MI モデルにおいて、TGF-β3 中和抗体は心筋線維化を

Ⅳ．考 察

抑制する。

本研究から、新規サブセットと考えられるミエロイ

8

ド細胞群が発現する GARP 及び TGF-β3 が心筋リモ
デリング進展に寄与している可能性が示された。

Ⅵ．研究協力者

TGF-β3はマクロファージの細胞死に関与することを

藤尾 慈・大阪大学大学院薬学研究科・教授

見出しつつあるが、GARP 及び TGF-β3 の心筋リモ

冨松 聖史・大阪大学大学院薬学研究科・大学院生

デリング進展メカニズムについて、今後より詳細な検坂井 響・大阪大学薬学部・大学生討が必要である。また、現状はミエロイド細胞に存在する分子の機能解析に留まっており、新規ミエロイド

Ⅶ．参考文献細胞サブセットとしての病態生理学的意義は不明で1.

ある。我々はこれまでにミエロイド細胞特異的ジフテ

Chang TI, et al. American Heart Association

リア毒素受容体-GFP 融合タンパク発現マウスを作製

Council on the Kidney in Cardiovascular D and

してきた。
また、
GARP 陽性ミエロイド細胞について、Council on Clinical C. Cardiorenal Syndrome:

より広範な網羅的解析を実施している。
GARP またはClassification, Pathophysiology, Diagnosis, and本サブセットをより特徴づける遺伝子のプロモータ

Treatment Strategies: A Scientific Statement Fromー下に Cre を有するマウスとミエロイド細胞特異的

the American Heart Association. Circulation.

ジフテリア毒素受容体-GFP 融合タンパク発現マウス

2019;139:e840-e878.

を交配させることで、当該サブセット欠失マウスを作2.

製し、その病態生理学的意義を追究していく。

Siligato R, et al. Cardiorenal Syndrome: New

Rangaswami J, Bhalla V, Blair JEA,

Gembillo G, Visconti L, Giusti MA,

Pathways and Novel Biomarkers. Biomolecules.

心腎症候群における当該サブセットの病態への関与は未だ不明である。我々のこれまでの検討から、MI

2021;11.

後 2~4 日と比較的早期に当該サブセットのミエロイ

3.

ド細胞が動員されていることから、急性傷害に反応性

Honda H, et al. Myeloid cell-derived LRGが高いと考えられる。そこで、まず急性腎障害におけattenuates adverse cardiac remodelling after

る当該サブセットの関与を検討する。急性腎障害におmyocardial

ける当該サブセットの病態的意義が明らかになれば、

2016;109:272-282.

心筋梗塞後心不全病態下における急性腎障害に与え4.

る影響を検討していく。他方、MI4 日後の腎臓ではIwasakiGARP 陽性ミエロイド細胞の割合は高くないものの、

CD4+CD25(-)LAG3+ regulatory T cells control

MI4 日後や糖尿病モデルマウスの腎臓で GARP タン

humoral

パク発現の増加傾向が認められている。このことは、

2015;6:6329.

MI 後や糖尿病時に腎実質細胞で GARP が発現上昇

5.

している可能性を示唆する。
GARP はヒト糸球体に特Glycoprotein A repetitions predominant (GARP)

徴的に発現していることが知られている 7。
実際、
我々

positively regulates transforming growth factor

もマウス糸球体、特にポドサイト（血液濾過における(TGF)

最終障壁を担う細胞）に GARP が発現していること

palatogenesis. J Biol Chem. 2017;292:18091-18097.

を見出しているが、その機能は不明である。今後、心6.

腎症候群における腎実質細胞の GARP の役割にも注

A, et al. Therapeutic activation of signal transducer

目していく。

and activator of transcription 3 by interleukin-11

Kumagai S, Nakayama H, Fujimoto M,

infarction.

Cardiovasc

Res.

Okamura T, Sumitomo S, Morita K,Y,etimmuneal.

TGF-beta3-expressing

responses.

Nat Commun.

Wu BX, Li A, Lei L, Kaneko S,et al.

beta3

and

is

essential

for

mouse

Obana M, Maeda M, Takeda K, Hayama

ameliorates cardiac fibrosis after myocardial
infarction. Circulation. 2010;121:684-691.

Ⅴ．結 論
ミエロイド細胞に発現する GARP や TGF-β3 が心7.

Nystrom J, Fierlbeck W, Granqvist A,

筋リモデリング進展に影響を与えることが明らかとKulak SC, et al. A human glomerular SAGEなった。今後、その詳細なメカニズムを追究するととtranscriptome database. BMC Nephrol. 2009;10:13.

もに、GARP や TGF-β3 発現新規ミエロイド細胞サ
ブセットの心・腎疾患や心腎症候群における役割などを解明していく。

9慢性腎臓病を合併した心不全における「腎-脳-心連関」の機序解明

九州大学病院 ARO 次世代医療センター/循環器内科・特任助教

篠原 啓介
Ⅰ．緒 言

ーロンは延髄の頭側腹外側野（RVLM）に伝わり、同心-腎連関と交感神経系

部位の神経興奮によって最終的に交感神経活動が規心臓病と腎臓病が互いに関連しあう「心-腎連関」と定される（図 1）。したがって、腎交感神経求心路からいう現象はよく知られているが、両臓器間の連携機序の入力を受けて交感神経活動を制御する脳内機序とはいまだ不明な点が多い。心臓や腎臓のコントロール

して、PVN のバソプレシン産生増加を介した交感神を含む循環調節には交感神経系が重要である。慢性的

経調節ニューロンの神経興奮が関与する可能性があな交感神経活動の亢進は、心臓のリモデリング（心肥る。

大や左室収縮能・拡張能の低下）や腎障害の進行、また腎臓からのレニン分泌増加を介したレニン・アンジ

バソ プレシン
視床下部

オテンシン系の亢進などを引き起こし、心不全の病態

延髄を進展させる。
「腎→脳」を連携する腎交感神経求心路

交感神経活動

腎交感神経
求心路

交感神経系の調節において中心的な役割を果たす

心臓交感神経腎交感神経
遠心路のは脳である。脳は末梢からの様々な入力を受け、その情報を統合・調節し交感神経活動を規定している。
腎臓交感神経は遠心路と求心路から成り、脳から出力

レニン分泌↑

された交感神経活動は腎神経遠心路を介して腎臓に

心臓リ モデリ ング

図1 「腎→脳→心」の臓器連携伝わる。一方、腎臓には感覚神経終末が存在し、感覚神経の神経活動は腎神経求心路を介して脳に入力さ研究の目的れる（図 1）。腎交感神経求心路が腎障害により活性化

慢性腎障害を伴う心不全モデル動物において、以下することや、同求心路の急性刺激により、脳から末梢を明らかにする。

へ出力される交感神経活動が増加することが示唆さ(1）腎交感神経求心路の選択的除神経により、全身のれている。そこで我々は、「慢性腎臓病を合併する心交感神経活動が低下し心不全が改善するか（＝腎交感不全において、腎交感神経求心路を介したさらなる交神経求心路の心不全病態への寄与）

感神経活性化が心不全の悪循環の病態形成に寄与す(2）腎交感神経求心路を介した脳への入力が、視床下る」という仮説を立てた。

部バソプレシン産生を介して交感神経出力を調節するか（＝「腎→脳→心」の連携における脳内機序：視交感神経系調節の脳内機序

床下部バソプレシン産生の寄与）

腎交感神経求心路からの神経活動は、視床下部の室傍核（PVN）に入力される[1]。腎交感神経求心路の刺Ⅱ．対象・方法

激により PVN のバソプレシン産生ニューロンが興奮(1) 腎障害を伴う心不全モデルにおける腎交感神経すること[2]、PVN のバソプレシン産生増加により同求心路の心不全病態への寄与の検証

神経核に存在する交感神経調節ニューロンが興奮す

Dahl 食塩感受性ラットは、腎障害を伴う高血圧性ること[3]が示されている。PVN の交感神経調節ニュ

10

心疾患による心不全モデルとして広く用いられていこれらの結果より、腎障害合併の高血圧性心不全モる。Dahl 食塩感受性ラットに 6 週齢より高食塩負荷

デルラットにおいて、ARDN による心不全改善効果（high salt: HS）を行い、血圧上昇や心肥大、腎障害が示唆された。さらに、ARDN と TRDN の心不全改を来している 9 週齢時に、腎神経遠心路・求心路とも善効果が同等であったことから、TRDN による効果に除神経する total RDN（HS-TRDN 群）、腎神経求の機序として、腎交感神経求心路の除神経の寄与が大心路を選択的に除神経する afferent RDN（HS-部分を占めることが示唆された。

ARDN 群）、または sham 手術（HS-sham 群）を行う。対照群は低塩食（low salt: LS）を与え sham 手術を行う（LS 群）。
血圧、心機能（心エコー）を経時的に測定し、左室収縮能の低下を伴う心不全期にあたる 16 週齢時に、心不全の表現型の評価を行う。
(2)「腎→脳→心」の連携に関わる交感神経系の脳内制御機構の解明：視床下部バソプレシンの寄与の検証

図 2 収縮期血圧の推移

上記(1)でARDN により心不全の改善が得られる場合においても、心不全の改善の結果として視床下部のバソプレシン産生や交感神経調節ニューロンの興奮が抑制されるのか、腎交感神経求心路を介した交感神経活動亢進の原因として視床下部のバソプレシン産
生ニューロンの活性化が寄与するのか、は不明のままである。そこで、まだ心不全を呈していない心肥大期である 12 週齢時に、対照群（低塩食＋sham 手術）、
sham 群（高塩食＋sham 手術）、ARDN 群（高塩食

図3 左室重量と肺重量の変化＋ARDN 手術）の 3 群で評価を行い、腎交感神経求心路－視床下部－交感神経出力の連携を明らかにする。特に、脳組織を用いて、交感神経出力に重要な神経核であるPVNとRVLMにおける神経興奮と、
PVNのバソプレシン産生ニューロンの活性を評価する。

図4 16 週齢時の心エコー（左室 M モード）

Ⅲ．結 果(2) 腎求心性神経入力を介した交感神経活動亢進に(1) 心不全進展における ARDN の効果

おける視床下部バソプレシン産生ニューロンの関連

高食塩負荷により血圧は上昇し、ARDN ならびに心肥大期の 12 週齢時に、心臓と神経体液性因子、

TRDN による降圧効果は見られなかった（図 2）。左脳の評価を行った。心エコーでは、LS 群と比較し、

室重量および肺重量は高食塩負荷により増加したが、HS-sham 群、HS-ARDN 群ともに左室壁厚は増加し

ARDN、TRDN により肺重量は同等に抑制された（図た。左室内径短縮率は、HS-sham 群と HS-ARDN 群

3）。左室の ANP mRNA の発現は、高食塩負荷で増とで有意差はなかった。血漿ノルエピネフリンは、LS

加し、ARDN で有意に抑制された。心エコーでは、群と比較し、HS-sham 群で有意に増加したが、HS-

LS 群と比較し、HS-sham 群、HS-ARDN 群、HS-

ARDN 群では有意な増加を認めなかった。血清浸透TRDN 群ともに左室壁厚（左室中隔＋後壁）は増加し

圧は高食塩負荷により HS-sham 群、HS-ARDN 群とた。左室内径短縮率で表される左室収縮能は、高食塩もに増加した。高食塩負荷により、PVN のバソプレ負荷により低下したが、ARDN ならびに TRDN で同シン産生ニューロンは著明に活性化したが、ARDN等に低下が抑制された（図 4）。組織学的評価による左により有意に活性化が抑制された（図 5）。PVN の交室の線維化は、高食塩負荷により有意に増加したが、感神経調節ニューロンも、高食塩負荷により活性化し

ARDN、TRDN ともに同等に抑制された。

たが、ARDN により有意に活性化が抑制された。PVN

11

の交感神経調節ニューロンからの入力を受ける

れたバソプレシンは、軸索輸送によって下垂体後葉に

RVLM においても、高食塩負荷により神経活性が亢運ばれ、血中に分泌される。軸索輸送されるバソプレ

進し、ARDN により活性化が抑制された。

シンは、同じく PVN に存在する交感神経調節ニューこれらの結果より、腎障害合併の高血圧性心不全モ

ロンに発現するバソプレシン受容体に作用し、同ニュ

デルラットにおいて、心不全を呈する前の心肥大期にーロンを興奮させ交感神経活性化を引き起こす[3]。
本

交感神経活性化が起こっていることが示唆され、その研究では、腎交感神経求心路を介した PVN バソプレ

活性化機序に腎交感神経求心路－視床下部 PVN のバ

シン産生ニューロンの活性化が、PVN の交感神経調

ソプレシン産生ニューロンが寄与している可能性が

節ニューロンの活性化と関連することを示したが、実示唆された。

際にバソプレシン受容体を介して交感神経調節ニューロンの活性化が起きたかは明らかにできていない。
今後のさらなる研究でこの点を明らかにしていきた
い。

Ⅴ．結 論
慢性腎臓病合併の高血圧性心不全において、腎交感
神経求心路の活性化は、脳からの交感神経出力を亢進させ心不全の病態進展に寄与する。さらに、腎交感神
図 5 PVN のバソプレシン産生ニューロン活性経求心路の入力先であるPVN でのバソプレシン産生

neurophysin 2： バソプレシン代替マーカー
c-Fos：神経興奮マーカー

ニューロンの活性化が、交感神経調節ニューロンの神経興奮に関連する可能性が示唆された。本研究により、「腎－脳－心連関」の機序の一部が明らかとなった。

Ⅳ．考 察

さらに研究を発展させ、多臓器連関に着目した心不全

本研究により、慢性腎臓病合併の高血圧性心不全モの進展予防・治療法開発につなげたい。

デルにおいて、腎交感神経求心路の活性化が脳からの交感神経出力を亢進させ心不全の病態進展に寄与す

Ⅵ．研究協力者ることが示唆された。さらに、腎交感神経求心路の入なし

力先であるPVN でのバソプレシン産生ニューロンの活性化が、交感神経調節ニューロンの神経興奮に関連

Ⅶ．参考文献する可能性が示唆された。

1.

腎交感神経除神経を行い、心不全における腎交感神

Osborn JW, Foss JD. Renal Nerves and LongTerm Control of Arterial Pressure. Compre

経の役割を示した既報はある。しかし、従来の腎交感

Physiol. 2017;7(2):263-320.

神経除神経では腎神経遠心路と求心路の両方が除神

2.

経されるため、腎神経求心路のみの役割は不明のまま

Ciriello

J.

Afferent

renal

inputstoparaventricular nucleus vasopressin andであった。腎神経遠心路の興奮は、腎臓でのレニン分

oxytocin neurosecretory neurons. Am J

泌増加を介したレニン・アンジオテンシン系の亢進や、尿細管でのNa再吸収、腎血流低下などを引き起こし、

Physiol. 1998;275(6):R1745-1754.
3.

主に体液貯留の病態と関連するため、従来の腎交感神

Son SJ, Filosa JA, Potapenko ES, et al.
Dendritic

経除神経では遠心路の除神経による効果が心不全改

peptideinterpopulation

善に大きく寄与している可能性が高い。すなわち、腎releasemediates

crosstalkbetweenneurosecretory and preautonomic networks.

障害から心不全増悪に至る「腎-心の臓器連関によるNeuron. 2013;78(6):1036-1049.

病態形成機序」に迫ることはできていない。我々は、

4.

近年開発された腎神経求心路を選択的に除神経する

Foss JD, Wainford RD, Engeland WC, et al. A
novel method of selective ablation of afferent

ARDN の手技を用いて[4]、本研究により「腎→脳→renal nerves by periaxonal application of心」の臓器連携機序を明らかにした。

capsaicin. Am J Physiol Regul Integr CompPVN のバソプレシン産生ニューロンにより産生さ

Physiol. 2015;308(2):R112-122.

12心不全時の造血幹細胞のエピゲノム変化が引き起こす慢性腎臓病

東京大学医学部附属病院・循環器内科 助教

中山

幸輝

Ⅰ．緒 言
高齢化に伴って心不全の罹患率は増加し、医療経済を逼迫させている。一度心不全を発症し入院すると、入退院を繰り返し、慢性腎臓病をはじめとする全身合併症を伴って最終的には心不全悪液質の状態となる。神
経内分泌物質を対象とするこれまでの薬物治療に加えた新規の治療標的の同定が望まれている。
図1

左: クラスターに分けた、移植後心臓マクロファージの 1

Ⅱ．対象・方法

細胞発現解析. 右: 細胞起源に分けた表記, 心不全 HSC 由来細胞はマウスの圧負荷心不全モデルを用いて、その骨髄を移

炎症性単球に多くプロットされた植したマウスの心機能を評価したところ、慢性期に心②心不全マウスの骨髄移植後に尿管結紮モデルを作機能が低下し、線維化が進行した。心不全後に骨髄造成すると、コントロールマウスの骨髄移植後と比較し血幹細胞（HSC）のエピゲノムが変化し、間質の免疫て炎症性マクロファージがより多く集まり繊維化が細胞の表現型が変わることで、心筋実質との相互作用進行した。また、レシピエントマウスの心不全モデル

を介した恒常性維持が破綻するのではないかと仮説の腎臓で尿細管障害と線維化マーカー亢進を認めた。

を立てた。①心不全 HSC 由来の心臓マクロファージの分化様式を解析し、心機能低下の分子機序を解明す

Ⅳ．考 察る。②また、腎臓を含めた、心臓以外の臓器における心不全を起こすと HSC のエピゲノムが変化して、末機能解析を行うこととした。

梢血、組織内でのマクロファージ分化においても、表現型が変化する。心不全時の骨髄ニッチを解析するこⅢ．結 果とは心不全の病態解明に繋がる可能性があった。

①心不全マウスの HSC と、コントロールマウスのHSC を移植した場合と比較して、心臓保護的な組織

Ⅴ．結 論

マクロファージへの分化様式 1)が変化するかを解析し心不全に伴う腎臓を始めとする全身合併症の共通基た。１細胞発現解析において、心不全 HSC 由来の心盤として、HSC の表現型が変わることが分かった。

臓マクロファージは、より未分化な領域に集まり、炎症性遺伝子群の発現が亢進した（図 1）。心不全後のⅥ．研究協力者

HSC の発現解析、エピゲノム解析では TGFβシグナ

藤生克仁・東京大学大学院医学系研究科・特任准教授

ルが低下しており、TGFβ阻害薬投与後の HSC の発

小室一成・東京大学大学院医学系研究科・教授

現様式は心不全後の HSC と近似していた。以上のよ
うに、エピゲノムが変化した心不全後の HSC は末梢Ⅶ．参考文献血でミエロイドシフトする一方で、心臓間質において

1) Fujiu K, Shibata M, Nakayama Y, et al. A heart-

は保護的役割を失い、炎症性サイトカインの発現が亢

brain-kidney network controls adaptation to

進することで、心臓線維化を進めることが分かった。

cardiac stress through tissue macrophageactivation. Nat Med. 2017;23:611-622.

13