第15回バイオロジクスフｫーラム
２０１８‐１‐１０ 文京区シビックホール

規制の視点から‐CAR T 細胞療法の品質・安全性等について金沢工業大学
日本薬科大学
国立医薬品食品衛生研究所
山口照英

CAR T細胞療法製剤の開発• FDA 2017年に2つの抗CD19 CARを発現する自己CTL細胞を承認• Novartis社のCART製品KymriahがFDAから承認.小児・若年r/r B‐ALL適応．2017年10月9日• 米Kite Pharma社のCART製品であるYescarta （axicabtagene ciloleucel）がFDAから承認．2種以上の全身療法でも有効性が得られなかった再発/難治性の大細胞型B細胞性リンパ腫の成人患者．
2017年10月18日

抗原特異的CTLの遺伝子導入(1)‐様々な導入法が存在• Retrovirus• FDAの承認を受けたKite社のCARTや三重大学でのTCR‐CTLの作製に利用• Lentivirus• FDAの承認を受けたNovartis社のCART作製に用いられている• Gene editing (CRISPR/CAS9やTALEN)• ゲノム編集によりTCRやHLAの細胞膜移行に必要なβ2microglobulinのKOを同時行うことが可能 （Liu et al (201&) CRISPR‐Cas9‐mediated multiplex gene editing in CAR‐T cells. Cell Research)• Transposon• トランスポゾンを用いることによりplasmidを用いて高いTCR導入を実現（Peng et al/ (2012) Efficient nonviral Sleeping Beauty
transposon‐based TCR gene transfer to peripheral blood
lymphocytes confers antigen‐specific antitumor reactivity)

抗原特異的CTLの遺伝子導入(２)‐想定されるリスク• Retrovirusはlentivirus• CART作製では高い遺伝子導入効率が得られるが、挿入変異のリスクは最も高い• ゲノム編集• 同時に複数の遺伝子改変が可能であるが、遺伝子を切るという特性から染色体の切断といった新たなリスクやオフターゲット効果などの評価が必ずしも合意の得られている手法が確立していない．

• Transposon• CART遺伝子が組込まれるリスクに加えて、トラスポザーゼ遺伝子そのものが染色体への組込まれるリスクがあり、その場合長期にわたる遺伝子変異のリスクがでてくる．

CARTの高い奏功率と同時に重篤な副作用の出現も
CARTの治験では重篤な副作用が頻発している

2016‐3‐16 FDAはCAR T細胞療法の安全性確保のためにINDの新規データベースを提案
2016‐7‐7 FDAはJuno社のCARTの治験（JCAR015)に対してClinical‐hold2016‐7‐12 改正したJCAR015のClinical‐holdをとかれる
2017‐9‐6 同種由来CD123をターゲットとするCAR T細胞療法の患者死亡を受けClinical‐holdBioTodayより********************
死亡例発生によりCellectis社の出来合いCAR-T製品のPh1試験をFDAが差し止め
2017-09-06• FDA 致死性サイトカイン放出（CRS）と毛細血管漏出症候群の発生により、Cellectis社の同種CAR-T製品UCART123の第1相試験の差し止め• UCART123の対象疾患：芽球型形質細胞様樹状細胞腫瘍（BPDCN）を対象にしたPh1試験と急性骨髄性白血病（AML）を対象にした両Ph1試験の差し止め• 死亡例：BPDCN試験の際の被験者。
• UCART123：同種CTLによる移植片対宿主病（GVHD）は発症せず。
• 発症経緯：•••前処置；30mg/m2/day フルダラビン、4日間、1g/m2/day シクロホスファミド、3日間の投与．Day 0に、6.25ｘ105 cells/kg UCART123を投与．Day5、Grade2のCRS、
Grade3 Infection in Lung.肺感染症は広域スペクトラム抗菌薬の静注開始後に速やかに改善した。
Day 8,Grade 5 CRS、Grade 4の毛細血管漏出症候群
Day 9, 死亡• データ安全性監視委員会の勧告：投与用量を6.25ｘ104個/kgに減量．前処置をシクロホスファミド、3日間、計4gまでに変更
投与量の設定が最もCRSや致死性脳症の発症に関与する？

Cellectis社： Clinical‐holdを解くために治験プロトコールの改定をFDAと合意• 投与量を 6.25x104 UCART123 cells/kgとする• リンパ球の低減化するためのcyclophosphamideの3日間の投与量を 750 mg/m²/day とし、一日の最高用量を1.33 gとする;• 患者登録条件として、UCART123投与時に制御不能な感染症を発症していないこと、臓器不全などの認められないことを適格性条件とすること;• 新たな3例の登録では65歳以下の患者とすること;• acute myeloid leukemia (AML) and blastic plasmacytoid
dendritic cell neoplasm (BPDCN)の新規患者登録は28日経過してから新たな患者登録を行うこと

ウイルスベクターの考慮事項• ウイルスベクターの力価の評価• ウイルスベクターとしての規格試験• 増殖性ウイルス試験（RCR/RCL）• ベクター作製用細胞バンクの特性解析と試験

T‐細胞の考慮事項• 製造でのT細胞の分離・製造（選択方法、抗体）• 細胞サブセットの機能解析（CD4/CD8/CD34/CD65)• T細胞の増幅方法（サイトカイン、血清（ヒトor FBS）
• 製造に用いる生物由来原料

CARTの安全性の考慮事項• 最終製品への製造工程由来不純物の残存（増殖因子や細胞選択用ビーズ）• 細胞へのウイルスベクターの導入コピー数（FDA：5コピー/細胞以下（根拠？））• オフターゲット（毛細血管漏出症）とオンターゲット反応（抗体産生の低下）• 無菌試験（培養法と迅速法の組合せ）

力価に関する評価• 生理作用と密接に関連する力価の設定（目的とするT細胞の用量？）• 力価試験
• 力価はMode‐of‐Actionを反映したものであること• 生物活性に密接に関連するT細胞の機能（殺細胞効果やサイトカイン産生能）• 力価を指標に安定性評価

YESCARTA（Kite)のFDAの審査
YESCARTAの規格試験設定根拠
性状

外観目視

無色、淡黄色、オレンジ確認試験

svFv重鎖・CD28配列の検出

投与量生細胞／抗CD19CAR発現細胞 抗CD19 CAR T細胞、最大投与量2x108 cells

力価

生細胞数、抗CD19CAR発現

純度

Gentamicin、Endotoxin

微生物試験

レトロウイルス試験

Mycoplasma
無菌試験

陰性RCR（2つの方法）

陰性

YESCARTAの規格試験設定根拠• Dose• 投与量は抗CD19 CAR陽性T細胞の生細胞数．
• 適切な投与量が可能な濃度になるように製造調製を行う• 最大投与量は2x108抗CD19 CAR T細胞に設定• 計算された細胞数を68mlにしてバックに封入• 力価• CD19 CAR発現の設定根拠：Phase1/2に用いられたlotのデータ及びZUMA‐1試験に用いたlotのデータ• 安定性• ‐150℃以下、12月間の安定性評価

YESCARTAの非臨床試験• 薬理試験
• 抗マウスCD‐19 CAR T‐細胞を用いて同系マウスリンフォーマモデルでの試験• 安全性薬理試験：実施せず• 生体内分布（PK）：実施せず．ただ同系マウスを用いた論文が出されおり、CD8+/CD4+ CAR T細胞の脾臓への集積が8日目までみとめられる（被検組織が脾臓に限定されておりヒトへの外挿性は？）• 毒性試験：製品を用いた毒性試験は実施していないが、同系マウスを用いた坦
がんモデルでの検討で209日までのデータが得られている．その結果では明らかな毒性は認められないが、B細胞の低下が確認されており、製剤を用いた臨床データと合致• 遺伝毒性：実施せず• がん原性／造腫瘍性試験：申請者が引用しているマウスでの変異やクローナル増殖性の公表文献からリスクを評価．ガンマレトロウイルスによるマウスのがん化は造血幹細胞においてのみ認められていること．T細胞でのベクターによる造腫瘍性のリスクは認められない．臨床的にもがん化はWAS、CGD、X‐SCIDにおいてのみ認められている．

Kymriahの出荷規格試験法
試験

試験法、規格試験対象

外観

無色ないしは淡黄色(cell‐clump）

バック封入前確認試験

qPCRによるCARの発現

ハーベスト後生T細胞率(viable CD3+CD45+ cells/total WBC)

最終製品

CARの導入効率qPCRにより導入効率

生細胞率

最終製品

残存粒子

顕微鏡観察（抗CD3/CD28 beads)

生CD19陽性細胞とB細胞

Flow‐cytometry（CD19+CD45+ cells）

最終製品

全細胞数mlあたりの数値を記載

最終製品

投与量

0.2‐5.0x106 T‐cells/kg (<50kg）
0.1‐2.5x106 T‐cells/kg (>50kg)

CARの発現率(力価）

Flow‐cytometry (抗idiotype antibody)

IFN‐ 産生能CD19発現細胞への応答

エンドトキシン最終製品

最終製品

無菌試験

陰性

マイコプラズマ

陰性

VSV‐G DNAqPCR

バック封入前Kymriahの規格試験法の設定• CAR陽性細胞の比率と臨床効果との間には相関関係は認められていない．
• 臨床投与量は遺伝子導入されたT細胞量による• IFN‐ 産生能はCAR導入T細胞あたりの培養上清の量．CD19陽性細胞に応答してIFN‐ 産生能とCRS発症との相関性は認められず、 IFN‐ 産生能は製法の恒常性評価の一環としての位置づけ• 製造においてCD3/CD28‐coated beadsを用いていることから、beadsの残存性を工程由来不純物として試験自己由来CAR T細胞からユニバーサル（同種）CAR T細胞• 自己由来CAR T細胞では十分な増幅が得られず製品の製造ができないリスクがある• 同種由来のユニバーサルCAR T細胞を用いた治療への期待：既に有効性を示唆する結果も得られている• ユニバーサルCAR T細胞の実用化では内在性TCRのノックアウトの必要性• 特異的、効率的なTCRのノックアウトにゲノム編集技術に期待が集まっているCAR T療法の有効性とTCR• マウスを用いて同種ALLモデルでのCAR T による治療効果の検討．CD8+CART細胞はTCRが活性化す
るとアポトーシスを起こし効果が消滅するが、CD4+CART細胞はそのようなことは無い• Yong et al. TCR engagement negatively affects CD8 but not CD4 CAR T cell expansion
and leukemic clearance. Science Translational Medicine 22 Nov 2017:9, Issue 417,
eaag1209• 細胞療法の最適化としてCD4+CART細胞の選択を行うデザインも考えられる• CART細胞のTCRをKOすることによる有効性確保
ゲノム編集を利用した複数遺伝子の同時改変

究極の遺伝子治療としてのゲノム編集への期待
Gene therapy using gene-editing

Traditional gene therapy

Chromosome Target gene (abnormal gene)

Chromosome Target gene (abnormal gene)

Gene transfer

Retro-, lentivirus

Gene cutting by CRISPR/CAS9AAV

Out-ofChromosomeTarget gene(abnormal gene)

Normal geneNot-target gene locus

Nonhomologous
repairＸ
Knock-outof abnormalgene

Donor DNAhomologous
recombination

Repairing abnormal gene

 Gene addition or complement

 Repair the abnormal gene or knock-out

 No change of abnormal gene（for congenital gene disease）

 Difficult to control the insertion

 異常遺伝子の変異を修復（究極の遺伝子治療）➡Risk of tumor

 がん化を生じない安全な部位への遺伝子導入

 Difficult to control the expression of gene

 遺伝子の発現調節も可能

従来の遺伝子治療では実現できない治療が可能
染色体切断に伴う副作用の可能性

「遺伝子治療等臨床研究に関する指針」の問題点
第一章 総則第二 用語の定義
一 この指針において「遺伝子治療等」とは、疾病の治療や予防を目的として遺伝子又は遺伝子を導入した細胞を人の体内に投与することをいう。
指針Q&A 9: 核酸医薬（合成オリゴDNA/RNA)の導入は対象外
10: mRNAの導入は対象外
 ウイルスベクターやプラスミドを用いるゲノム編集
 外来遺伝子を導入するゲノム編集
 ゲノム編集用酵素をタンパク質やmRNAで導入
 ガイドRNAにオリゴRNA、塩基の書換えにオリゴDNAを用いたゲノム編集

遺伝子治療

現行指針・Q&A
では対象外

指針に基づく審査が行われない

ゲノム編集の遺伝子治療としての定義及び遺伝子治療の範囲
ゲノム編集による遺伝子切断
配列認識モジュールヌクレアーゼDNA二本鎖切断

A T G C T GIIIII

欠失／挿入
相同組換えIT A C G A C切断しないゲノム編集
エフェクター
脱アミノ化

NH2

ATGCTGATCTA

ATGCTGATUTA

I

I

I

I

I

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I

I

I

I

I

I

TACGACTAGAT

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

TACGACTAAAT

エフェクター

ATGCTGATCTA

ATGCTGATCTA

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

TACGACTAGAT

I

点変異
組換え

遺伝子改変に該当
DNAメチル化/
脱メチル化

脱メチル化

Me

脱アミノ化
（デアミナーゼ）
リコンビナーゼ

I

I

I

I

I

I

I

I

I

TACGACTAGAT

転写制御因子
ヒストン修飾遺伝子発現制御西田敬二：染色体の切断を伴いないゲノム編集ツール開発．（実験医学Vol 34 p35(2016)） より改変

ゲノム編集の安全性評価：染色体転座リスク

Chen et al:Targeted Chromosomal Translocations and Essential Gene
Knockout Using CRISPR/Cas9 Technology in Caenorhabditis elegans.
Genome Research 2017

Ferguson & Frederick :DNA double strand break repair andchromosomal translocation: Lessons
from animal models. Oncogene 20: 5572 (2001)

Torres et al: Engineering human tumour‐associatedchromosomal translocations with the RNA‐guided
CRISPR–Cas9 system. Nature Communications 2014

CARTやTCR‐CTL遺伝子治療における挿入変異やがん化の評価• リスクはO ではない
• T細胞を用いた治療においてがん化が認められたケースはない（分化した細胞故に腫瘍化する前に細胞が死滅？）• 対象疾患を考えたときに造腫瘍性に関する試験を求める必要性は低い• 但し、モニタリングは必要• 用いる技術(ベクター）によりリスクは変わる• ゲノム編集ではオフターゲット効果のみならず転座のリスクもありえる

がん抗原T細胞療法• 有効性やMOAに関連する力価の設定• 投与量の設定は有効性のみならず安全性確保の観点• 生物由来原料や感染性試験• レトロウイルスやレンチウイルスによる挿入変異のリスク⇒造血幹細胞に比較して低い• CAR導入にどのようなベクターを用いるかにより品質や安全性評価が異なる

ご静聴ありがとうございました
ご質問があれば