（参考資料９）

DNA 分析によるおうとう品種の識別
山形県農業総合研究センター

農業生産技術試験場

１．はじめに日本国内におけるおうとう（P.avium L.）生産量は約２万ｔあり、このうちの約 7 割強が山形県（14,000ｔ、72%、H15 年度）で生産されている。一方、おうとうの輸入は平成
15 年度 13,978ｔあり、99%以上がアメリカ産で品種は「ビング」が大部分を占める。山形県で栽培されているおうとう品種の栽培面積を表１に示す。
「佐藤錦」、「ナポレオン」で 80%以上を占めるが、「佐藤錦」を補完する品種として近年、山形県育成の登録品種である、「紅秀峰」、「紅さやか」及び「紅てまり」などの新品種の作付けが増加している。近年問題となっている品種偽装表示や登録品種の海外流出は、おうとうの産地に大きな影響をおよぼす問題である。そこで、消費者に対する食の安全・安心と産地保護のために、DNA マーカーを利用し果実 1 粒からでも品種識別できる技術を開発した。本技術を用いることで、国内品種及び海外から輸入されるおうとうについても品種識別が可能である。

表１ H15年度おうとう品種別栽培面積
品種
佐藤錦
ナポレオン
紅秀峰
高砂
紅さやか
香夏錦
南陽
正光錦
ジャボレー
紅てまり
その他
合計

栽培面積(ha) 比率(%)
2050.0
74.0%
350.0
12.6%
167.0
6.0%
72.3
2.6%
40.3
1.5%
20.6
0.7%
20.0
0.7%
14.4
0.5%
12.4
0.4%
12.0
0.4%
12.9
0.5%
2771.9100%（平成 15 年度特産果樹生産動態等調査より）
２．おうとう品種識別の留意点（１）遺伝的背景
おうとうを含むばら科果樹は、品種の増殖を接ぎ木で行う栄養繁殖性作物である。よって種子繁殖性植物とは異なり、同一品種の異なる個体は全てクローンであるため、同一品種の個体・果実の遺伝的バックグラウンドは全てのサンプルで等しいと考えられる。

参９－１

（２）標準試料
おうとうの品種識別を行うに当たっては、調査品種について信頼のおける個体をその品種の標準サンプルとし、標準サンプルと調査品種の遺伝子型を比較する必要がある。また、調査品種以外についても、可能な限り各品種がどのような遺伝子型を示すかデータを蓄積し、同一の遺伝子型を示す品種が存在しないことを提示することが望ましい。
当試験場では、本県育成品種である「紅さやか」、「紅秀峰」、「紅てまり」については、原木を標準試料とし、その他の品種については、場内で保存する遺伝資源を標準試料とし、各 DNA マーカーの遺伝子型データを収集した。
（３）サンプルの採取部位
おうとうは果実として流通しているため、おうとうの果肉部位もしくは軸より DNA を抽出し、DNA マーカーの遺伝子型を判定する必要がある。この場合、どの部位から抽出したサンプルでも同様の結果を出せること、標準試料のサンプル（葉）より抽出した DNA サンプルと同じ結果が得られることを確認する必要がある。
３．SSR（Simple Sequence Repeat）マーカーによるおうとうの品種識別（１）はじめに上記の留意点を踏まえ、当試験場では、SSR マーカーによるおうとうの品種識別法の開発を行った。SSR マーカーは、ももを中心とする核果類（もも、アーモンド、すもも等）において、既に多くマーカーが開発されている。これらのマーカーは、ばら科果樹の異なる樹種間においても相互に利用可能である。今回、当試験場において品種識別に利用した
SSR マーカーは、（独）農業・生物系特定産業技術研究機構果樹研究所より分譲頂いたもも及び酸果おうとう由来 SSR マーカーである。
（２）識別の原理
SSR マーカーでは、ゲノム DNA 上に存在する単純反復配列を含む領域を特異的に増幅するプライマーを用い、PCR 法で DNA 断片を増幅し、その長さの違いを利用して品種識別を行う。
①

品種間に違いのある SSR 領域について、蛍光プライマーを用いて特異的に増幅する。

②

増幅産物を DNA シーケンサーでジーンスキャンし、増幅された DNA 断片の長さを特定する。
③

あらかじめ、品種ごとに特定しているパターンと照合し、品種を特定する。

（３）おうとう品種識別用 SSR マーカーセットの特徴
これまでに約 150 種の SSR マーカーについて検討を行い、85 品種 49 マーカーについて

参９－２各遺伝子型のデータを蓄積した。品種識別には 49 マーカーのうち、比較的対立遺伝子数が多く、品種識別に適した 12 マーカーを利用する。表２に山形県の作付面積上位 10 品種並びに「天香錦」、「ビング」及び「レーニア」の遺伝子型を示した。表２では、「佐藤錦」と同じ遺伝子型を示すマーカーを黄色に網掛けした。またこれら 12 品種は、最小３マーカー（５,６,７）で品種識別可能である。
品種識別にあたっては、まず No.５,６,７の 3 マーカーについて判定を行い、表２の登録品種（「紅秀峰」、「紅さやか」、「紅てまり」等）に一致した場合、マーカー数を 12 種類に増やし、日本の品種と一致するかどうか判定することが望ましい。
表２

おうとう主要品種における１２SSRマーカーの遺伝子型
1

佐藤錦456789101112BPPCT0 BPPCT0 BPPCT0MA007a MA013a MA020aPMS30
PMS3 PceGA25 PMS40 pchgms1 PS12A02023739115/139 220/228 157/161 181/183 142/146 134/134 142/172 189/189 161/194 95/97 137/183 162/162

ナポレオン

115/139 220/228 157/169 181/183 140/146 134/138 142/176 189/189 161/190

95/97

139/183 162/166

紅秀峰

115/115 220/228 157/161 181/183 142/142 134/134 142/142 189/189 194/194

95/97

137/137 162/162

品 種

23

高砂

103/109 219/219 165/169 179/183 142/146 134/150 155/176 189/201 161/194

95/99

137/137 162/166

紅さやか

109/115 220/228 161/169 181/181 142/146 134/134 160/172 189/201 161/194

97/97

137/137 162/162

南陽

103/115 220/220 161/161 181/185 142/146 134/138 142/176 189/191 161/194

97/97

137/139 166/166香夏錦

109/115 219/228 165/169 179/181 142/146 134/150 142/155 189/201 161/194

97/99

137/183 162/162

紅てまり

103/139 219/220 157/159 183/185 136/142 134/134 142/176 189/189 161/194

95/107

137/183 162/166

正光錦

109/115 219/228 165/169 179/181 142/146 134/134 142/155 189/201 161/194

97/99

137/183 162/162

ジャボレー

109/109 220/220 157/157 181/185 140/140 134/134 153/162 189/204 190/198

95/97

137/141 162/162

天香錦

115/139 220/228 161/169 181/183 140/142 134/138 142/172 189/189 190/194

95/97

137/183 160/162

ビング

115/139 220/228 161/169 181/183 140/142 138/148 132/176 189/189 161/194

95/97

139/183 166/166

レーニア115/139 220/228 161/165 181/183 140/142 146/148 132/176 189/189 161/194

95/95

139/183 166/178（４）DNA 分析上の注意①

サンプルの採取・ DNA 抽出には新鮮な果実を用いる。
・ 果実の果肉部分および軸のどちらからも抽出可能
・ 腐敗した組織、かびの生えた組織の使用は避ける。
②

DNA の抽出・ サンプル間の交互汚染に注意する。
・ サンプル DNA 中にタンパク質や多糖類が多量に含まれていると PCR 反応が阻害されるので、できるだけ夾雑物は除去する。
・ 抽出した DNA の濃度を定量し、一定量の DNA を PCR に供する。
③

再現性の確認・ 同じロットから数果実を独立に検証し、同じ遺伝子型が得られることを確認する。
・ 比較対照品種を設け、必ずＤＮＡ抽出段階から同時に分析を行うことが望ましい。

参９－３

（５）識別フロー

オウトウサンプルの入手

DNA 抽出

PCR

ジーンスキャン

・果実（果肉・軸）：半日

2 日～3 日4 時間

サンプル 1 点 30 分程度24 点 12 時間（ABI310 使用時）

解析・判定

48 点 24 時間

図1

BPPCT037 における 3 品種の遺伝子型

図2

BPPCT039 における 3 品種の遺伝子型

参９－４

（５）SSR マーカーによる品種識別の方法①

DNA の抽出その１（QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit を用いた果肉からの抽出）準備するもの・ QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit
・ 不溶性ポリビニルピロリドン
・ メルカプトエタノール
・ 液体窒素・ 滅菌済乳鉢・乳棒
手順

１．２ml マイクロチューブにキット付属の AP1 液 400μl、キット付属の RNaseA ４μl、メルカプトエタノール８μl、不溶性ポリビニルピロリドン４mg を入れ、あらかじめ 65℃に温める。
２．果肉 0.5g を小さな乳鉢に取り、液体窒素中で粉砕し、解凍する前に１のチューブに入れる。
３．撹拌機（Vortex）等で混合し、65℃で 15 分保温。途中数回反転混和する。
４．キット付属の AP2 液 130μl を加え、軽く混ぜた後、氷上で５分冷却。
５．室温で 14000rpm、５分遠心。
６．上澄み液をキット付属の QIAshredder spin column に加え、室温で 14000rpm、２分遠心し、溶出液を２ml のマイクロチューブに移す。
７．上澄み液の 1.5 倍量の AP3（キット付属）＋エタノール混合液（0.5vol AP3+1.0vol EtOH）を加え、10 秒間ボルテックスする。
８．得られた混合液を 500μl ずつ、キット付属の Mini Spin column に通し、室温で14000rpm、２分遠心し、混合液がなくなるまでこれを繰り返す。
９．カラムにキット付属の AW 液 500μl を加え、室温で 14000rpm、5 分遠心しリンスする。さらにもう１回 500μl 加え、同じ条件で 15 分遠心しエタノールを完全に除く。
10．Mini Spin カラムを新しいチューブにセットし、温めておいた滅菌ミリ Q 水 50μl を加え、５分放置し、14000rpm で１分遠心し、DNA を溶出する。これを２回繰り返し、得られた溶液を DNA 試料の原液とする。

参９－５

②DNA 抽出その２（簡易 CTAB 法による軸からの抽出）準備するもの
・ 2×CTAB

Buffer (100ml)

２%CTAB２g

0.1M Tris-HCl

10ml (1M Tris-HCl pH9.5)

20mM EDTA

4ml (0.5M EDTA pH8.0)

1.4M NaCl

8.16g

・ メルカプトエタノール

・ 不溶性ポリビニルピロリドン

・ クロロホルム・ イソプロパノール（－20℃保存）・ 70％エタノール

・ 1／10ＴＥ・ 滅菌乳鉢、乳棒または滅菌ペッスル

・ 液体窒素手buffer順

１．軸 1 本を剃刀でスライスし２ml のマイクロチューブに入れ、液体窒素で凍結し、－80℃で保存する。
２．抽出液を作り（0.9ml CTAB Buffer＋4.5μl ﾒﾙｶﾌﾟﾄｴﾀﾉｰﾙ+30mg 不溶性ﾎﾟﾘﾋﾞﾆﾙﾋﾟﾛﾘﾄﾞﾝ）、２ml のチューブに入れておく。
３．液体窒素で凍結した軸を、滅菌した乳鉢または滅菌済ペッスルを用いて、粉砕する。
４．粉砕後、直ちに抽出液を入れたチューブに移し、よく撹拌する。
５．65℃で 30 分インキュベートする（10 分でも可）。
６．20 回程度、上下反転混和する。
７．12000rpm、５分遠心する（室温で可）。
８．上澄み液を新しい２ml のチューブへ移す。
９．クロロホルム 0.8ml を加え、10 分振とうする。
10．12000rpm、５分遠心する（室温で可）。
11．上澄み液を新しい 1.5ml のチューブへ移す。
12．－20℃の冷イソプロパノールを取った液体と等量加え、ゆっくり混ぜる。
13．12000rpm、５分、４℃で、遠心する。
14．上澄みを捨てる。
15．70%エタノールを 1ml 加え、沈殿をリンスする。
16．12000rpm、５分、４℃で、遠心する。上澄みを捨てる。
17．ペーパータオルを敷いた上に、逆さに立て、数分放置し乾かす。
18．チューブに 1/10TE を 100μl 加え、沈殿物を溶かす。
19．DNA 濃度を電気泳動で確認し、－20℃で保存。使用時には所定の濃度に希釈する。

参９－６

PCR

②

果実より抽出した DNA 試料は、原液を PCR 用の作業液として用いる。軸より抽出したDNA は、濃度を確認し濃いようならば滅菌ミリ Q 水で数倍に希釈し（10ng/μl 程度）、PCR用作業液とする。
PCR 反応液および増幅プログラムは以下のとおりとする。
PCR 反応液

増幅プログラム

滅菌ミリ Q 水

11.9 μl

94℃

３分

10X ExTaq buffer

2.0 μl

94℃

１分

dNTPs

2.0 μl55℃

１分

SSR プライマー＊

1.0 μl72℃

２分

サンプル DNA

3.0 μl72℃

５分

Ex Taq polymerase

0.1 μl４℃∞

計

20.0 μl

35 回＊：蛍光ラベルされたフォワード、リバースプライマーを各 10pmol／μl 含む＜プライマー情報＞

③No.

Name

Forward primer (5'-3')

Reverse primer (5'-3')１MA007a

GTGCATCGTTAGGAACTGCC

GCCCCTGAGATACAACTGCA

２MA013a

CACACTCCAAAAACTCCTATCACAAAGAGAGGTGAACAAC

３MA020a

CTTGCCCATTTATGTACTGATATATCGCATAATCACGGTC

４BPPCT002

TCGACAGCTTGATCTTGACCCAATGCCTACGGAGATAAAAGAC

５BPPCT037

CATGGAAGAGGATCAAGTGC

CTTGAAGGTAGTGCCAAAGC

６BPPCT039

ATTACGTACCCTAAAGCTTCTGC

GATGTCATGAAGATTGGAGAGG

７PMS30CTGTCGAAAGTTTGCCTATGCATGAATGCTGTGTACATGAGGC

８PMS3TGGACTTCACTCATTTCAGAGA

ACTGCAGAGAATTTCACAACCA

９PceGA25

GCAATTCGAGCTGTATTTCAGATG

CAGTTGGCGGCTATCATGTCTTAC

10PMS40

TCACTTTCGTCCATTTTCCC

TCATTTTGGTCTTTGAGCTCG

11pchgms1

GGGTAAATATGCCCATTGTGCAATC GGATCATTGAACTACGTCAATCCTC

12PS12A02

GCCACCAATGGTTCTTCC

AGCACCAGATGCACCTGA

ジーンスキャンによる DNA 多型の検出（DNA Sequencer ABI310 使用の場合）

PCR 反応液１～２μl を取り、滅菌水で 20～50 倍に希釈する。この希釈溶液１μl とサイズマーカーを含む HiDi ホルムアミド 12.5μl を混和し、94℃５分－４℃10 分の熱変性後、ジーンスキャンに供試する。各サンプルのマーカーごとの波形ピークを検出し、そのピークの示す長さを対立遺伝子型とした。例として「佐藤錦」、「高砂」、「ビング」の波形を図

参９－７

１及び図２に示す。
④

品種の識別
３マーカー（No.５,６,７）について、比較対照品種（「佐藤錦」、「紅秀峰」など）とサンプルのピークを比較し、各サンプルの遺伝子型を決定する。これを表２のようにタイピングし、３つのマーカーの遺伝子型が一致する品種を探す。一致するものが無ければ、上記以外の品種と判断する。一致した場合、その品種である可能性と偶然一致する未知の品種である可能性が考えられるため、次に、表２の 12 マーカーについて検定を行う。12 マーカ
ー全てにおいて遺伝子型が一致した場合、その品種であると同定する。

４．まとめ
ばら科果樹において SSR マーカーを用いた品種識別、系統樹作成、親子判定は、複数の報告が学会・論文等でなされており、既に信頼できる手法となっている。今回、オウトウ生産量の９割以上を占める上位 10 品種及び輸入おうとう２品種について、最少３マーカーを用いることで識別が可能となった。
DNA 品種識別技術の信頼性を確保するためには、流通する可能性のある全ての品種の遺伝子型をカタログ化する必要がある。また、未知の供試体の品種識別には、カタログ化された遺伝子型の比較と統計学的な手法の併用が重要である。当試験場では、既に 85 品種・系統（表３）について 49 マーカーの遺伝子型データを得ており、このうちのほとんどの品種がこの３マーカーで識別できることを確認した。例えば、本試験場が育成した紅秀峰と同じパターンを示す品種はこの 85 品種・系統中にはなく、「紅秀峰」と未知の品種のパターンが偶然一致する確率は、この 85 品種・系統を母集団とし３マーカーを用いた場合は6.43％、12 マーカーを用いた場合は 0.0000034％である。
今後は、入手可能な未検討品種を中心に解析を進め、より多くの品種について遺伝子型のデータを蓄積していく予定である。また、おうとう加工品（缶詰など）からの DNA 抽出の検討を現在進めており、将来的には、加工品の品種識別も可能になる技術に発展させていく。

参９－８

表３ 85品種リスト
No. 品種・系統名
No. 品種・系統名
1 佐藤錦
26 八興錦
2 ナポレオン
27 秀雅錦
3 紅秀峰
28 富士山4 高砂
29 マドンナ
紅さやか
530 マドンナの瞳
6 南陽
31 芳玉
7 香夏錦
32 佳紅
紅てまり
833 C3
9 正光錦
34 C3-5
10 ジャボレー
35 C3-91
11 ビング
36 C612 レーニア
37 C7
大富一号
1338 C814 月山錦
39 C915 北光
40 C10黄玉
1641 Adriana
17 ｸﾞﾛﾘｱｽ･ｽﾀｰｸ･ｺﾞｰﾙﾄﾞ 42 Alpha
18 紅灯
43 Bada19 紅蜜
44 Bell Agatha
20 寿錦
45 Burlat
蔵王錦2146 Compact Ｓｔｅｌｌａ
22 さおり47 Celesta 123 ジャンボ錦48 Copas White
大将錦2449 Du Righi
25 天香錦
50 Emperor Francis

No. 品種・系統名
No. 品種・系統名
51 Giorgia
76 Velvet
52 Hedelfingen
77 Victor
53 Hederfinger Riesen
78 Victoria
54 Inge
79 Vitoria
Korkovanyi
Csersznye
55
80 White Elton
56 Late Amber
81 Yellow Spanish
57 Merton Glory
82 11w-26-50
Moreau58
83 11w-26-58
59 Norwegian
84 13s-39-51
60 Peggy Rivers
85 13s-41-55
61 Red Glory
86
62 Rodmershaw Seedling87
Rustina
63
88
64 Sapikisa
89
65 Seneca
90
Spaulding
66
91
67 Starking
92
68 Sue93
69 Sweet Heart
94
70 Uta Gaiant
95
V66161
71
96
72 V690620
97
73 V69068
98Van7499
75 Vega100

参９－９