DEHP の化審法優先化学物質（一次）リスク評価 I において、最小有害性評価値の根拠論文となった Zhang et al (2015)が、（一次）リスク評価 II におけるキースタディに選定される場合の化審法における問題点を考察する評価書（一次）リスク評価において、最小有害評価値の根拠論文となった Zhang et al (2015)1)では、雌 CD-1 マウスの交尾後 0.5 日―18.5 日（膣栓発見日＝交尾後 0.5 日）に 0.1%の DMSOを含む生理食塩水に溶解した DEHP 40 g/kg 体重/日を経口投与して実験を行っている。交尾後 12.5 日に妊娠マウス（F0）の血清エストラジオールレベルを測定した。妊娠 F0 マウスは自然分娩させ、F1 児マウスを得た。選抜した F1 マウスは DEHP 非投与の雄マウスと交配させ、F2 児マウスを得た。生後 21 日の F1 及び F2 雌児卵巣の卵胞形成を調べた。さらに、F0 及び F1 マウスを交尾後 13.5 日にと殺し、雌生殖細胞のバイサルファイトシーケンシングを行った。DEHP 投与群において、F0 マウスのエストラジオールレベルは低下し、F1 マウス胎児における雌生殖細胞の減数分裂進行が遅れ、未成熟の細糸期及び合糸期染色体の割合が増加し、より進行した厚糸期及び複糸期染色体の割合が減少していた。交尾後13.5 日には、減数分裂特異遺伝子（Stra8）及びタンパクレベルが低下し、よりメチル化していた。生後 21 日の F1 雌児の卵巣の病理組織学的検査では卵胞形成の変化、数少ない卵胞及び広範な生殖細胞嚢胞、がみられた。生後 21 日の F1 及び F2 マウス卵巣の原始卵胞の割合が低下し、二次卵胞の割合が上昇していた。DEHP 投与により卵胞形成関連遺伝子（Cx43, Egr3, Tff1, Ptgs2）発現がみられた。これらの結果から、DEHP は卵胞形成障害を引き起こすと結論している。
Zhang et al (2015)1)の論文には、母体血清中のエストラジオールレベル測定結果に n=5 との記載があるだけで、対照群及び DEHP 投与群における使用動物数及び各検査に用いた標本数が記載されていない。生殖発生試験の各種ガイドラインでの使用動物の最小数は、生殖/発生毒性スクリーニング試験（TG421）、反復投与試験と生殖発生毒性スクリーニング試験の併合試験（TG422）における一群当たり最小 10 例である 2)。また、発生毒性試験においては通常の毒性試験とは異なり、母体に被験物質を投与して直接投与されていない次世代以降の児を検査するので、試験成績のばらつきは大きくなる。Zhang ら(2015)1)における一群当たりの動物数が 5 例であるとしても十分な動物数を用いたとはいえない。Kimmel(2006)3)は少数の使用度物を用いた動物実験によるデータからは不十分な情報しか得られないと述べている。児の生後観察を行う場合、母体の栄養状態の影響を排除するために、一母体当たりの児数（通常一母体当たり 8-10 匹）を調整する 4)。生殖発生毒性試験においては同一母体の個々の胎児または児は完全に独立して化学物質に反応するのではなく母体の化学物質に対する状態に影響されるので、統計処理においては母体ごとの児の検査結果の平均値を統計単位として用いる（すなわち、母体ごとの児検査値を平均し、この平均値が群の値となる）5)。しかしながら、本論文においては、児数の調整及び児検査結果の集計・統計方法についての記載はない。また、母体の影響（litter effect）を避けるために児の検査を行う場合には同一母体の児のみを検査するのではなく、群内の母体から均等に選抜した児を用いて検査を行う必要があるが、このことについての記載もない。また、
DEHP の用量が極めて少量であるので、通常（経口ゾンデを用いる強制経口投与、餌・飲水に混じて与える等）の経口投与方法とは異なると考えられるが、投与方法の詳細についての記載がない。また、母体の一般状態や生殖発生毒性指標に関する記載もない。母体血清エストラジオールレベルの低下はそれに関連した生殖指標についての記述がないので、生物学的な意義が不明である 6)。卵巣の卵胞数には個々の卵巣及び切片、測定者による大きな変動があり、卵胞数の変化と明確な生殖毒性との因果関係を示す報告はほとんどない
7)ので、卵胞数の変化はリスク評価の単独のエンドポイントとして用いるべきではなく、他の生殖発生毒性の指標を含めて総合的に毒性を判断すべきである 8)が、Zhang ら(2015)1)では生殖発生毒性指標についての記載はない。Zhang ら(2015)1)においては各卵胞の百分率を示しているが、各種卵胞の測定実数は示されていないので、他の報告結果との比較ができない。卵巣毒性検出には卵巣の病理組織学的検査が重要である 7)が、Zhang ら(2015)1)においては卵巣の病理組織学的検査結果は Supplemental Figure 1 として組織学的切片像が 1 例
示 さ れ て い る だ け で あ る 。 生 殖 細 胞 嚢 胞 は 対 照 群 で 17.501.41%、DEHP 投 与 群 で20.203.64%とわずかな差であった。投与物質による影響の用量―反応関係を明らかにすることは毒性を惹起する要因を確認するための重要な基準である 3)が、本報告は 40
g/kg/day の一用量のみの実験であるので用量―反応関係が不明である。Zhang ら(2015)1)の結果から、LOAEL(無毒性量)を 40 g/kg/day として規制値を設定することには疑問がある。
化学物質の有害性評価及びリスク評価においては、動物実験のデータの信頼性（Reliability：実験方法は標準的方法に基づいているか、結果は明解で、実験方法から導かれた結果として妥当か）を評価し、信頼性の高いデータを採用する。一般的に、国際的に採用されている試験方法に従って実験が実施され、優良試験所基準（GLP、GoodLaboratory Practice）に準拠した実験である場合、そのデータは信頼性があるとみなす。有害性評価に用いる動物実験データの信頼性に関しては、クリミッシュのコードを参考にし、以下の 4 つの信頼性コードに分類する 9)。
コード 1：信頼性あり（国際的に認知された試験ガイドラインに従って実施された実験から得られたデータ。GLP 下の実験が望ましい）。
コード 2：制限付き信頼性あり（試験ガイドラインに完全には一致していないが、科学的に許容できる実験から得られたデータ）。
コード 3：信頼性なし（コード 1 及びコード 2 以外の実験から得られたデータ。測定系と被験物質との間に干渉がある、非生理的な曝露経路である、実験方法が適切でない、記述が不十分である等の報告から得られたデータ）。
コード 4：評価できない（記述が十分でない短い要約又は書籍、レビュー等の二次資料に挙げられているだけの実験から得られたデータ）。
定量的な有害性評価には信頼性コード 1 及び 2 のデータを用い、信頼性コード 3 及び 4のデータは用いない。
上記のようにデータの信頼性を確認したのちに化学物質の健康影響評価を行うことは、OECD 化学物質共同評価プログラム 10)、有害大気汚染物質の健康リスク評価 11)、化審法における人健康影響に関する有害性データの評価 12)でも行われている。Zhang et al (2015)1)は、試験動物数（各試験の標本数）、児の試験結果につぃての統計処理方法、卵巣の病理

組織学的所見及び経口投与方法の詳細、母動物の一般状態や生殖発生毒性指標、各種卵胞の測定実数などに関する記述が不十分であり、単一用量投与による試験で用量―反応関係が不明であることなどにより信頼性は低いと考えられ、規制値を設定するためのキースタディとするのは適切ではない。
DEHP の卵胞形成に対する影響を検討した結果（表―1）を下記に示した。
Hannon ら（2014）13)は、雌 CD-1 マウス 10 日間 20 g, 200 g, 20 mg, 200mg または 750mg/kg/day、または 20 日間 20 g, 200 g, 20 mg または 200 mg/kg/day の DEHP を経口投与し、投与後の発情期の雌マウスをと殺して検査した。10 日間投与後の 20 及び 200mg/kg/day で原始卵胞の割合が低下し、20 及び 200 g/kg/day で一次卵胞の割合が上昇した。30 日間投与では 200 g/kg/day 及び 20 mg/kg/day で一次卵胞の割合の上昇がみられた。しかしながら、用量－反応関係は明確ではなく、10 日間及び 20 日間投与で一貫した傾向はみられなかった．
Hannon ら（2016）14)は、雌 CD-1 マウスに 10 日間 20 g, 200 g, 20 mg, 200mg または500 mg/kg/day の DEHP を経口投与し、投与後 9 か月の発情休止期の雌マウスをと殺して検査した。200 及び 500 mg/kg/day で卵胞総数が減少し、20, 200 及び 500 mg/kg/day で原始卵胞数が減少した。500 mg/kg/day で一次卵胞数が減少し、原始卵胞の割合の低下、胞状卵胞の割合及び閉鎖胞状卵胞の割合の上昇がみられた。黄体数に変化はみられなかった。
低用量域における卵胞形成に対する影響は観察されなかった。
Chang ら（2020a）15)は、雌 CD-1 マウスに 10 日間 20 g, 200 g, 20 mg または 200mg/kg/day の DEHP を経口投与し、投与直後、投与後 6 及び 9 か月の発情休止期に雌マウスをと殺して検査した。投与後 9 か月において 20 及び 200 mg/kg/day で前胞状卵胞の割合の上昇がみられたが、投与直後及び投与後 6 か月の原始卵胞、一次卵胞、前胞状卵胞及び胞状卵胞の割合に投与の影響はみられず、投与後 9 か月の原始卵胞、一次卵胞及び胞状卵胞の割合に投与の影響はみられなかった。低用量域における卵胞形成に対する影響は観察されなかった。投与後 9 か月にみられた前胞状卵胞の割合の上昇には用量－反応関係はみられなかった。本報告では、5 匹のマウスが死亡または安楽死させられた。致死量よりはるかに低い量を投与されていたにもかかわらず死亡等が認められたことは、動物取扱または動物飼育環境に問題があったことを示唆しており、実験が適切に行われなかった可能性が懸念される。
Chang ら（2020b）16)は、雌 CD-1 マウスに 10 日間 20 g, 200 g, 20 mg または 200mg/kg/day の DEHP を経口投与し、投与後 12, 15 及び 18 か月に雌マウスをと殺して検査した。12 か月において 200 mg/kg/day で不健全卵胞の割合が低下し、20 mg/kg/day で一次卵胞数が減少した。15 か月では 200 g/kg/day で前胞状卵胞数の増加及び胞状卵胞の割合の低下がみられた。18 か月では卵胞形成への影響は観察されなかった。卵胞形成に対する影響に用量－反応関係はみられなかった。
Cha ら（2018）17)雌雄の CD-1 マウスに 133 g/L または 1330 g/L の DEHP を含む飲水を10 週間（雌では交配前 2 週間、交配中 2 週間、妊娠及び授乳中 6 週間）与えた。1330 g/L群において一次卵胞数、二次卵胞数及び三次卵胞数の増加がみられた。マウスの体重及び飲水量のデータは示されていない（因みに、既存の報告 18）における妊娠及び授乳中の飲水量から計算すると、DEHP 摂取量は 133 g/L 群で 32-132 g/kg/day、1330 g/L 群で 3151325 g/kg/day となる）。
Niermann ら （2015） 19)は、CD-1 マウスの妊娠 11 日―分娩日に 20 g, 200 g, 200 mg,500 mg または 750 mg/kg/day を経口投与し、雌 F1 児の生後 8 及び 21 日に卵巣検査を行った。生後 8 日の原始卵胞数、一次卵胞及び前胞状卵胞数に DEHP 投与の影響はみられなかった。生後 21 日の卵巣では 200 g, 500 mg で前胞状卵胞数が増加していたが、用量―反応関係は認められなかった。
Mirihagalle ら（2019）20)は、CD-1 マウスの交尾後 10.5 日―交尾後 18.5 日に 20 g/kg/dayを経口投与し、雌 F1 児の生後 8 日及び 21 日に卵巣検査を行った。生後 8 日及び 21 日の卵巣検査の結果、原始卵胞、一次卵胞及び前胞状卵胞の数及び割合、総卵胞数に投与の影響はみられなかった。
以上に示したように、雌マウスに DEHP を投与した結果では低用量域での DEHP の影響はみられなかったかまたは影響がみられても用量―反応関係が認められなかった。高用量での卵胞形成に対する影響にも用量―反応関係は認められなかった。妊娠マウスに DEHPを投与し、その雌児 F1 の卵胞形成に対する影響が認められることもあるが、用量―反応関係は認められていない。このようなことから、卵胞形成の変化はリスク評価の単独のエンドポイントとして用いることは適切ではないと考えられる。
化審法における 人健康影響に関する有害性データの信頼性評価等について（改訂第 2 版）
では、有害性データの評価は Klimisch ら（ 1997）9)に従って信頼性を評価し、コード 1及び 2 のデータを有害性評価に用いるとしている。また、化学物質の有害性に係る既存知見のうち、既に専門家によりレビューされ、信頼性が評価されている情報源や有害性データを最大限活用し、それらについては基本的に新たな信頼性評価は行わないとしている。
しかしながら、データの正確性を担保するためにできる限り元論文を用いてデータの評価を行う必要がある。優勢順位 1 に分類されている ATSDR: Toxicological profile for di(2ethylhexyl)phthalate (DEHP)（2022）6)において、Zhang et al (2015)1)は MRL（最小リスクレベル）のワークシートで Principal study として掲載されている（Appendix A, A13-A-16）。しかしながら、Zhang ら（ 2015）1)の論文には信頼性に問題があり、当論文の結果である卵胞形成に対する影響を生殖発生毒性のエンドポイントとすることは不適切である。
12)

引用文献
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全性情報、http://www.nihs.go.jp/hse/chem-info/oecdindex.html (2022. 7.14 確認)
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5) Holson JF, Nemec MD, Stump DG, Kaufman LE, Lindstrom P, Varsho BJ (2006) Significance,reliability, and interpretation of developmental and reproductive toxicity study findings, inDevelopmental and Reproductive Toxicology, 2nd edition (Edited by Hood RD), pp. 329-424,
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12) 経済産業省 (2019) 化審法における 人健康影響に関する有害性データの信頼性評価等について（改訂第２版）、https://www.neti.go.jp/policy/chemical_management/kashinho/files/information/r/a/reliability_cri
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18) 雑賀 絢、多田幸恵、中村麻里、北条 幹、生嶋清美、前野 愛、湯澤勝廣、長澤明
道、久保善一、安藤 弘、田中知良、鈴木 仁、猪又明子、守安貴子（2020）ネオニコ
チノイド系農薬ジノテフランの CD-１マウスによる次世代影響試験、東京健安研セ年報、
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19) Niermann S, Rattan S, Brehm E, Flaws JA (2015) Prenatal exposure to di-(2-ethylhexyl) phthalate(DEHP) affects reproductive outcomes in female mice. Reprod Toxicol 53, 23-32.

20) Mirihagalle S, You T, Suh L, Patel C, Gao L, Rattan S, Qiao H (2019) Prenatal exposure to di-(2ethylhexyl) phthalate and high-fat diet synergistically disrupts mouse fetal oogenesis and affects
folliculogenesis. Biol Reprod, 100, 1561-1570.

2022 年 8 月 26 日
江馬 眞