度な技術、あるいは高価な装置を必要とするものが多宗芳和

Yoshikazu SO

宮澤

極性をもった薄いりん脂質が二重になった膜でく、研究者の負担が大きいといった課題がある。そこ

EVsはエクソソームをはじめ、細胞から分泌されるで、弊社は迅速・簡便な検査手法の一つである「イム

様々な小胞体の総称である。100〜1000nm程度のノクロマトグラフィー（Immunochromatography；

大きさを有するマイクロベシクル、1〜5µmのアポトー

IC）法」に着目し、EVsを検出できるICキットの開発を

シス小胞などが存在する（表2）。
アポトーシス小胞は行った。本報では、EVsの構造や研究事例に関する解細胞死により分泌されるが、エクソソームやマイクロベ説をはじめ、IC用の標識材として弊社にて開発した青

シクルは生きている細胞から分泌される。エクソソー

色粒子「金ナノプレート（図2）」を使用した、
イムノクロ

ムは細胞の内部で産生され、マイクロベシクルは細胞マトキットについて解説する。

膜の陥没により産生される3) 。国際細胞外小胞学会（International Society for Extracellular Vesicles：

雄太

Yuta MIYAZAWA

ISEV）において、EVsの分類方法が示されているが、産生や分泌の機構について未解明な部分が多く、識１． はじめに

表1

がん（悪性腫瘍）は1981年以降日本人の死因のトップであり、2021年時点で死因の26.5%を占めている 。
1)

一方でがん疾患の詳細なメカニズムは解明されておらず、寿命の高齢化に伴い、がん患者数が増加傾向にあるなか、革新的ながん予防、診断、治療法の開発が求められている。
がん細胞は分裂速度が正常な細胞と比べて速く、進行度（ステージ）が進むにつれて生存率が低くなるため、早期にがんを発見することががん治療の成功率を高めるカギとなる。
がんの発見には、従来、生体組織を体内から採取する検査手法（組織生検）が用いられてきた。
このような手法
は検査精度に優れるものの、患者の身体的・精神的な負担が大きく、がんの早期検査のスクリーニングには不向

組織生検

画像検査

侵襲性

低い（採血、採尿など）

高い（手術）

低い（撮像）

検査費用

比較的安い

高い

高い

細胞外小胞の種類

検査精度※検査対象による高い※装置による

サイズ（目安）表2

来する①cfDNA（cell free DNA）、②細胞、③細胞外ージ初期のがん細胞からも分泌されるため、がん早期発見のマーカーとして利用できる可能性が高く、研究が盛んに行われている。特に近年研究は著しく活発化しており、論文投稿の件数は2010年以降で指数関数的に増加している（図1）。

が採用されており、直径1cm以下の小さながんの可視化も可能である。
しかし、コストや時間的、地理的な制限があり、早期検査技術としての利用は困難である。
したがって、安価で侵襲性が低く、高度な医療施設・技術を必

マイクロベシクル

50〜150nm

100〜1000nm

1〜5µm

産生機構

細胞からの開口分泌

細胞膜からの出芽細胞死による分泌マーカー

CD9, CD63, CD81など 各細胞特異的マーカー Histone, Annexin V

構成成分

タンパク質、RNA、miRNA、脂質

EVs 論文検索結果出する点ではIC法と同様であるが、ELISA法で脂質二重膜を4回貫通するタンパク質である。

ソームはヒトの恒常性やがんなどの疾患の進行におは試験紙でなく、溶液中で反応を行う。
プレート

CD9、CD63、CD81はエクソソーム検出に利用いて重要な役割を果たしている。さらに、エクソソームにエクソソームマーカーに対する抗体を固定化されるマーカータンパク質として知られている。

は、(i) 低い細胞毒性、(ii) 制御された免疫原性、(iii)

し、エクソソームを捕捉した後、酵素標識した抗細胞間コミュニケーションの効果的な利用などの薬体を用いて蛍光や化学発光により検出する。

③ インテグリン鎖2)標識材の一つである貴金属ナノ粒子は、自由電子のる。一例として、銀ナノプレートのアスペクト比が及ぼ

標識材として使用する場合、貴金属ナノ粒子の分散液を検出する際のターゲット物質にすることができる。本

吸水パッドとメンブレンとの接触を保持するため部分には、それぞれ抗体が固定化されている。Test

局在表面プラズモン共鳴（Localized Surface Plasmon

す色調への影響を示す（図8）。色調の異なる粒子をと標識用抗体Bを含む溶液とを混合することにより、疎キットはEVsを定量することを考慮し、EVs表面に広くに貼付するフィルムである。

Lineには検体と結合する抗体が固定化されており、Resonance：LSPR）に由来する光吸収特性を有し、標識材に使用することにより、IC試験におけるマルチ

水性相互作用による物理吸着を介して標識することが分布するCD9をターゲット物質として選定した。本また、メンブレンが傷つかないように保護する目

Control Lineには試験が正常に行われていることを鮮やかな発色を呈するためICキットに広く使用されてカラーでの多検体同時検出が可能になる
（図9）。

できる。

キットの開発においては、
メンブレンへの抗体の固定チェックするための抗体が固定化されている。

いる。一般的には、化学的安定性の高い金を材質とす

る情報を含んでいる。

したエクソソームを投与することで、顕著にがんの増により検出する。

主要組織適合遺伝子複合体（major histocom
patibility complex；MHC）という。膜表面に存在

2.3.3 ExoScreen を使用した循環細胞外小胞の超高感度リキッドバイオプシー9),10)①、②がエクソソームのタンパク測定を目的とするのに対し、③は粒子数のカウントを目的としている。

できるマーカーとしては、CD9、CD63、CD81などが多細胞生物では、離れた細胞間の情報伝達は単予め抗体に固定化された光増感剤ビーズによって検ローサイトメーターで個々の粒子の蛍光を測定す知られている。以下にEVsの一例として、エクソソーム

一分子、またはEVsを介して構成される信号の送受出する手法であるため、精製を行うことなくがん由来ることで、粒子の大きさや、蛍光を発している粒子の構造2)について説明する（図3）。

信によって行われている。がんの進行と転移においてのEVsを検出できる。本法により、結腸直腸がん患者の数を測定する手法であり、細胞の解析方法とし

2.1 細胞外小胞についても、がん細胞由来のエクソソームを媒介するタンパクから採血した血液では「CD147」を含むEVsが多く検て使用されてきた。
しかし、数µmもある細胞とは質が関与していることが示唆された。がん細胞から出されることが報告されている。

異なり、100nm程度とサイズの小さいエクソソー

1983年にJohnstoneらによって、脂質二重膜構造分泌されるエクソソームは、膜表面に存在するインテ

ムを直 接 検出することは困 難であるため、予めを有する100nmほどのEVsが発見され、1987年にグリン（インテグリン末端のフィブロネクチンという部

ビーズに固定化したエクソソームに蛍光色素結合「エクソソーム」と命名された。発見当初、エクソソーム位）を介して細胞の指向性・運動性を促進すること

は細胞内や細胞膜に含まれる余分なタンパク質を細ができる。さらに、血管透過性を誘発することによっ

胞外に排出するためのごみ袋として考えられていたて、周囲のみでなく離れた非腫瘍細胞の細胞生理機が、1996年にはRaposoらによって細胞間のコミュニ

能を変化させ、がん細胞の播種および増殖を可能に

ケーションツールとして機能していることが明らかとなすることができる。

し、ウイルスなどの抗原と結合することで免疫を活性化する。

同定と定量化は依然として困難である。

３． 細胞外小胞の検出手法

4 フローサイトメトリー（FCM）2)

IC法は、妊娠検査やインフルエンザウイルス、新型コ
ロナウイルスの検査キットなどに適用されている検査手法である。イムノクロマト試験紙に固定化された抗体IC法を用いた検査は多くの場合、疾病にり患していメンブレンに展開した溶液を吸い上げる駆動力

るかどうかを簡易的に判断するための定性検査を目となる材料である。

的として使用される。唾液や尿などの液状物質をイム

吸水パッドに吸水できる水分量は、おおむね吸ノクロマト試験紙の上流側（図6の左端）に接触させる

水パッドの厚みに比例する。

ことにより検査できる。

4 バッキングシート

・標識用抗体B捕捉用抗体
メンブレンのControl Line上に固定化される抗体でいる標識材、検体用抗体A、標識用抗体B、標識用抗体である。バッキングシートはポリスチレン、
ポリエ

体B捕捉用抗体について、以下説明する。

例えば、標識用抗体Bとして、
マウスIgG抗体を使用する場合、標識用抗体B捕捉用抗体には抗マウスIgG抗体を使用できる。
メンブレンのTest Line及びControl Line上にそれぞと、標識材に固定化された抗体を用い、試験紙上で検れ抗体を固定化させた後、ウシ血清アルブミン（BSA）

体（ウイルスやタンパク質など）をサンドイッチすることやカゼインを含むブロッキング試薬を用いてメンブレ

で検査対象物を検出する仕組みとなっている。ハーフ

ン全体をコーティングし、意図しない反応（非特異検ストリップと呼ばれる形式のイムノクロマト試験紙の模出）やバックグラウンドの着色を抑制する。

式図を示す
（図5）。
また、図6にイムノクロマト試験紙のり患している（検体が存在する）場合、Test Lineに固

写真を示す
（図6）。

EVsをターゲットとしたリキッドバイオプシーの研究
は、直近10年の間に拡大しており、EVsの検出手法に

図8

銀ナノプレートのアスペクト比と色調ついても様々な手法が開発されている。現在一般的に標識物）が検体と反応することにより、Test Lineに標識材が集積する。
また、Test Lineに捕捉された検体と反使用されている、代表的なEVs検出手法を以下に示す。

化方法やブロッキング条件の最適化、ならびに金ナノプレートへの抗体の標識方法などを工夫した。
説明する（図10）。

図10(a) EVsを含む検体溶液を試験紙に展開すると、試験紙

験では、Test LineとControl Lineの2か所に標識材由来の着色が認められる。

には金ナノプレート（AuPL）に標識した抗体と結合する抗体（抗体捕捉用抗体）が固定化されている。
(b) 金ナノプレートを標識した抗体溶液を展開すると、(a)のステップで試験紙上に固定化されたEVsと結合する。
(c) EVsが捕捉された部分に金ナノプレート標識抗体が集積することで、青色のラインが目視確認できる。
3.2.3 Exorapid-qICの内容物

イムノクロマト試験紙は下記1〜4の部材で構成される。

図7

IC法の陽性・陰性試験（模式図）

認められる。
図9 マルチカラーでの多検体同時検出

検査時間

短（0.75時間）

短〜中
（3時間）

長
（5〜8時間）

短
（1時間）

短
（1時間）

操作性

◎

○

△

○

○

スループット性

○

◎

○

△

△

検出感度

○

○〜◎

○

◎

○〜◎

Exorapid-qICには下記の内容物が含まれている（図11）。

①

②

④

③

○

○

△

（やや高価）（やや高価）

（高価）

（高価）

不要
─

必要
（やや高価）

必要（やや高価）

必要
（高価）

必要
（高価）

Exorapid-qICはEVsを含む検体溶液の展開ス

TestとControlの2本のラインが出現する。試験時間

結乾燥保存したものである。

テップ（①）と、EVs表面抗原であるCD9を認識する抗は全工程で45分程度であり、迅速な評価が可能であ

純水で溶解することで使用できる。

体を標識した金ナノプレートの展開ステップ（②）の2る。試験後に台紙に試験紙を貼付し、スキャナーやプ

段階でEVsを検出する（図12）。EVsを含まない場合

リンタなどで保存した画像を、Image J（アメリカ国立

CD9のリコンビナントタンパク質を凍結乾燥保存し（試験例A）
では、試験紙上にControlのラインのみが衛生研究所の開発したフリーソフト）で解析することたものである。

出現し、EVsを含む場合（試験例B）
では、試験紙上ににより簡易的な定量ができる。

② 標準物質[凍結乾燥]

培養上清（75μL）

図13

ある。

④ 洗浄液

⑤ イムノクロマト試験紙
Test Line、Control Lineにあらかじめ抗体が塗布された試験紙である。
⑥ 96well プレート

図11 Exorapid-qICの内容物

Exorapid-qICにより迅速・簡便にEVsを検出するこjinkou/geppo/nengai21/dl/kekka.pdf）とができるため、EVs関連研究の推進・発展への寄

2）落谷孝広, 吉岡祐亮「医療を変えるエクソソーム-与が期待される。
また、将来的には早期のがん診断

生体機能から疾患メカニズム、臨床応用まで」技術への応用も期待される。

（化学同人, 第1版第1刷, 2018年8月25日発行）される。
また、直近では美容・健康の分野でも利用さ血清量（μL）

Evs分泌時間（時間）②の希釈や、検体の希釈に使用するための溶液でである。

（https://www.mhlw.go.jp/toukei/saikin/hw/

れるようになり「エクソソーム」という用語の認知度

培養上清（75μL）

分泌促進剤（+）となり、今後の技術発展に貢献することを期待している。

3）Borges FT, Reis LA, Schor N. Braz J Med Biol
Res, 46(10), 824-30(2013)4）門田 宰 他2名「日薬理誌（Folia Pharmacol. Jpn.）」
149, 119〜122（2017）5）高桑 雄一「綜 説(Review Article)：膜(MEMBRANE)」
20(2), 92-102(1995)
6）Mercedes Tkach, Clotilde Théry, Cell 164,
March 10(2016)7）中瀬生彦「生物物理」62（1），13-18（2022）
8）Sushrut Kamerkar et al., Nature volume 546,
498‒503 (2017)9）Yusuke Yoshioka et al.,NATURE COMMUNICATIONS, 5, article number:3591(2014)

量線を作成できる。

試 験 紙 への 溶 液 の 展 開を行うためのプレート

ト（弊社製品名：Exorapid-qIC）について解説した。

シーによるがんの早期検査の材料として大いに期待

純水で溶解し、希釈系列ごとに試験することで検試験紙の洗浄に使用する溶液である。検体の展開⑥

年計（概数）の概況

E Vs 、
とりわけエクソソームは、
リキッドバイオプ

EVs数（×108個）

1）厚生労働省 令和３年(2021)人口動態統計月報

プレート」を標識材として使用したイムノクロマトキッが高まっているなか、Exorapid-qICが研究の一助

後、および標識抗体の展開後に使用する。

⑤

△

（安価）

③ 検体希釈液定された検体用抗体Aと抗体標識物が結合せず、標識
は、Control Lineの1か所のみに標識材由来の着色が④FCM[凍結乾燥]

Test LineにはEVsと結合する抗体が、Control Line

Lineで検体の捕捉が行われないため、Test Lineに固材が集積しない。
そのため、検体を含まない陰性試験で① 金ナノプレート標識抗体

弊社製の金ナノプレートにCD9抗体を標識し、凍一方、り患していない（検体が存在しない）場合、Test

図6 イムノクロマト試験紙

③NTA

検出機器

上に固定化された抗体によってEVsが捕捉される。

された抗体と結合する。
したがって、検体を含む陽性試

図5 イムノクロマト試験紙（模式図）

イムノクロマトグラフィーへの適用

EVs検出の仕組み

例Bについては、市販の血清を使用して評価した。
EVsの構造や研究事例、弊社の青色粒子「金ナノ

②WB

図12

Exorapid-qICを用いた試験の概要

35

参考文献

4． おわりに培養し、培養上清から回収したEVsを評価した。試験

検査手法の比較（弊社調べ）①ELISA◎DNTコーティング技報 No.23
解説­3
迅速・簡便な研究用試薬「細胞外小胞用イムノクロマトキット」

なお、試験例A,C,Dについては、がん由来の細胞を紹介する（図13）。

Exorapid-qIC

初期費用

Exorapid-qICによるEVsの検出の仕組みについて応しなかった標識用抗体BはControl Lineに固定化

3.2 細胞外小胞の検出方法としての速・簡便に検出できる「細胞外小胞用イムノクロマト

定化された検体用抗体Aと検体が反応する。
その際、あらかじめ標識材に固定化された標識用抗体B（抗体

抗体結合させてフローサイトメーターで検出する

今般、弊社の貴金属ナノ粒子を活用し、EVsを迅

表3あり、標識用抗体Bと結合する抗体が用いられる。

以下、IC法の試験例を示す（図7）。図7に記載されてメンブレンと吸水パッドを固定化するための支持

また、標識用抗体Bは、検体や後述する標識用抗体B
捕捉用抗体と反応する抗体が用いられる。

手法がとられている。
3.1 細胞外小胞の一般的な検出手法

検体と反応する抗体が用いられる。

メンブレンのTest Line、Control Lineと呼ばれる

い、酵素標識した抗体を用いて蛍光や化学発光

エクソソームなどの粒 子に励 起 光を当てて、フを機にEVsに関連した研究が活発となった 。

ど、抗体と結合可能なタンパク質が存在しており、EVs

遺伝子変異）に作用するshort hairpin RNAを内包「ExoScreen法」はEVsを2種類の抗体で捕捉し、

図3 エクソソームの構造

標識材を固定化する抗体である。貴金属ナノ粒子をエクソソーム内に存在し、分泌元の細胞に由来す

2.3.1 細胞外小胞による情報伝達とがんの転移6)2)ト比などを調整することにより色調をコントロールでき

後、ゲルから微多孔膜へのパターンの転写を行して活発に取り上げられている。エクソソームを識別２．細胞外小胞とは検討が進められている。

ん細胞に対して、K-Rasの変異体（がん細胞における2.3 エクソソーム研究事例

達物質として非常に有用であることから、研究対象とで説明したようにEVsは表面にCD9、CD63、CD81な量の違い）から、検体中のタンパク質を分離した

予め遠心分離などで精製しておくことが好ましい。

EVsの中でも特に、エクソソームは細胞間の情報伝・標識用抗体B（細胞の取り込み機構の1つ）を誘導している膵臓が3 ナノトラッキング解析（NTA）2),13)④と比較し、専用の検出機器を必要とせず、操作が簡形状の貴金属ナノ粒子については、
それらのアスペク能する部位である。

殖が抑制されることを示した。

検査薬などで広く使用されているIC法を用いた。2.2などが使用されており、診断薬メーカー各社で様々な

3 吸水パッド⑤ MHC分子2)Exorapid-qICを使用した試験例について以下に液の展開を補助する役割がある。

出法である。電気泳動による移動度の違い（分子3.2.1 イムノクロマトグラフィー（IC）法とは較した結果を示す（表3）。

存在する。展開速度は、
メンブレン上の抗体と検究チームは生体内において、マクロピノサイトーシス※商品紹介：https://www.dnt.co.jp/technology/new-business/exorapid-qic/

Exorapid-qICは3.1に記載のEVs検出手法①〜

いる。
プレート状やロッド状といった、異方性を有する細胞どうしのコミュニケーションツールとして機細胞外小胞用イムノクロマトキット

EVsを迅速かつ簡便に検出する手法として、市販のノ粒子、または着色したセルロースナノファイバー粒子

的もある。

図4

メンブレンのTest Line上に固定化される抗体であり、ドとメンブレンを接触させ、毛細管現象による溶ウェスタンブロッティングは、
タンパク質の免疫検④ 核酸（mRNA, miRNAなど）2)

3.3 Exorapid-qICを使用した試験例

く、溶液の展開速度の異なる複数のグレードがの次世代キャリアとして期待されている。Kalluriの研34

便で検査時間が短い特長がある。他の検出手法と比弊社では様々な色調の貴金属ナノ粒子を開発して受容体である。

33

DNTコーティング技報 No.23
解説­3
迅速・簡便な研究用試薬「細胞外小胞用イムノクロマトキット」

3.2.4 Exorapid-qICの特長

標識材には貴金属ナノ粒子、着色したラテックスナ

2 トップフィルム

32

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迅速・簡便な研究用試薬「細胞外小胞用イムノクロマトキット」

3.2.2 EVs検出用イムノクロマトキットの開発

着剤を貼り合わせた構成になっている。吸水パッる赤色の球状金ナノ粒子が使用されている。

31

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・検体用抗体A

ニトロセルロース素材で構成されるタイプが多体との反応性を大きく左右する。

2 ウェスタンブロッティング（WB）2),12)

その他の生体成分も多いことから、がん由来のEVsの金ナノプレート分散液

会社島津製作所」と共同で開発した。

30

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・標識材

学的利点から、治療用分子を細胞内に送達するためンパクの凝集塊を見分けることは不可能なため、

図2

キット（弊社製品名：Exorapid-qIC、図4）」を「株式

29

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ステル、塩化ビニルなどのプラスチックシートに粘

1 メンブレン2量体の膜貫通型の構造をもつ、糖タンパク質

ど）には健康な細胞に由来するEVsも多く存在し、また細胞に由来する物質を含むことが明らかとなり、
これ
図1

クソソームにカプセル化されており、分泌されたエクソ② テトラスパニン鎖（表面抗原）ことができる。エクソソームと同程度の大きさのタった。
さらに、2007年には、エクソソームが分泌元の要としない、血液検査や尿検査などの方法によるがん早アポトーシス小胞の一つ。抗体と抗原（マーカー）の結合により検2)において有望ではあるが、臨床サンプル（血液や尿な

小胞（Extracellular Vesicles：EVs）などが挙げられる。
とりわけ、③は進行したがん細胞のみでなく、ステエクソソームエクソソームの膜上のタンパク質を解析する方法

マイクロRNAや酵素などの「メッセージ」分子はエあり、細胞膜の基本構造とほぼ同じである。

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1 ELISA法2),11)粒子のブラウン運動より解析し粒子数を算出するの対象物質（マーカー）として、血液に含まれる循環物
質が注目されている。
この循環物質としては、腫瘍に由

細胞外小胞の種類

膵臓がんの抑制7),8)28

がん細胞が分泌するEVsの検出は、がん早期診断

近年、がん発見を目的としたリキッドバイオプシー（Magnetic Resonance Imaging）などの画像検査技術「リキッドバイオプシー（Liquid Biopsy）」という。

で明確に区別、単離することは困難である4)。

リキッドバイオプシーきである。
また、侵襲性の低い手法として近年ではMRI

このような検査手法を
期検査技術が求められている2)。

別するマーカーも十分に定まっていないため、現時点

がんの検査手法

2.3.2. エクソソームを介した薬物送達による① 脂質二重膜5)2.2 細胞外小胞の種類と構造

27

DNTコーティング技報 No.23
解説­3
迅速・簡便な研究用試薬「細胞外小胞用イムノクロマトキット」

検出強度（輝度解析）

しかしながら、EVsの検出手法には煩雑な工程や高Development of a Quick and Easy Research Reagent Set"Immunochromatographic Kit for Extracellular Vesicles"

スペシャリティ事業部門
スペシャリティ事業部
機能材開発グループ
Speciality Business Div.
Speciality Business Dept.
Functional Materials Development Group26

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検出強度（輝度解析）

迅速・簡便な研究用試薬「細胞外小胞用イムノクロマトキット」

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検出強度（mAbs）

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検出強度（輝度解析）

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EVs分泌時間（時間）Exorapid-qICを使用した試験例

A）EVsの定量

C）EVs量のモニタリング

Test Lineに捕捉されるEVs量に応じて金ナノプレート

細胞培養上清（ウシ胎児血清（FBS）非含有）を直接標識抗体の集積量が変動するため、Test Lineの色濃

試験紙に展開することにより、EVsの検出が可能であ度を測定することによりEVsの定量が可能である。乳る。細胞培養によるEVs放出量をモニタリングすること

がん細胞MCF-7由来EVsを用いた試験において、ナノにより、培 養 の 管 理などに使 用できる。
（ 細 胞 株：トラッキング装置で解析したEVs数と高い相関性が得

MCF7）られることを確認した。

D）薬剤によるEVs分泌促進評価

B）血清中のEVs検出

培養細胞のEVs分泌促進剤や抑制剤の効果を簡便

血清を直接試験紙に展開することにより、EVsの検出に 評 価 す る こと が 可 能 で あ る 。本 試 験 で はが可能である。展開する血清の量に依存して検出強Cucurbitacin Bによる分泌促進の効果を評価した。

度が増大した。
キットに付属の標準物質を用いて検量（細胞株：HCT116）線を作成することにより、血清中のEVs量を間接的に定量することが可能である。

10）吉岡 祐亮, 落谷 孝広, Cytometry Research26（1）：1 〜 6，2016
11）Mariantonia Logozzi et al., PLoS One. 4(4):e5219(2009)
12）Biji T. Kurien et al., Methods Mol Biol.; 1312:
17‒30.(2015)13）Christina Coughlan et al., Curr Protoc Cell
Biol. September ; 88(1): e110.(2020)

度な技術、あるいは高価な装置を必要とするものが多宗芳和

Yoshikazu SO

宮澤

極性をもった薄いりん脂質が二重になった膜でく、研究者の負担が大きいといった課題がある。そこ

EVsはエクソソームをはじめ、細胞から分泌されるで、弊社は迅速・簡便な検査手法の一つである「イム

様々な小胞体の総称である。100〜1000nm程度のノクロマトグラフィー（Immunochromatography；

大きさを有するマイクロベシクル、1〜5µmのアポトー

IC）法」に着目し、EVsを検出できるICキットの開発を

シス小胞などが存在する（表2）。
アポトーシス小胞は行った。本報では、EVsの構造や研究事例に関する解細胞死により分泌されるが、エクソソームやマイクロベ説をはじめ、IC用の標識材として弊社にて開発した青

シクルは生きている細胞から分泌される。エクソソー

色粒子「金ナノプレート（図2）」を使用した、
イムノクロ

ムは細胞の内部で産生され、マイクロベシクルは細胞マトキットについて解説する。

膜の陥没により産生される3) 。国際細胞外小胞学会（International Society for Extracellular Vesicles：

雄太

Yuta MIYAZAWA

ISEV）において、EVsの分類方法が示されているが、産生や分泌の機構について未解明な部分が多く、識１． はじめに

表1

がん（悪性腫瘍）は1981年以降日本人の死因のトップであり、2021年時点で死因の26.5%を占めている 。
1)

一方でがん疾患の詳細なメカニズムは解明されておらず、寿命の高齢化に伴い、がん患者数が増加傾向にあるなか、革新的ながん予防、診断、治療法の開発が求められている。
がん細胞は分裂速度が正常な細胞と比べて速く、進行度（ステージ）が進むにつれて生存率が低くなるため、早期にがんを発見することががん治療の成功率を高めるカギとなる。
がんの発見には、従来、生体組織を体内から採取する検査手法（組織生検）が用いられてきた。
このような手法
は検査精度に優れるものの、患者の身体的・精神的な負担が大きく、がんの早期検査のスクリーニングには不向

組織生検

画像検査

侵襲性

低い（採血、採尿など）

高い（手術）

低い（撮像）

検査費用

比較的安い

高い

高い

細胞外小胞の種類

検査精度※検査対象による高い※装置による

サイズ（目安）表2

来する①cfDNA（cell free DNA）、②細胞、③細胞外ージ初期のがん細胞からも分泌されるため、がん早期発見のマーカーとして利用できる可能性が高く、研究が盛んに行われている。特に近年研究は著しく活発化しており、論文投稿の件数は2010年以降で指数関数的に増加している（図1）。

が採用されており、直径1cm以下の小さながんの可視化も可能である。
しかし、コストや時間的、地理的な制限があり、早期検査技術としての利用は困難である。
したがって、安価で侵襲性が低く、高度な医療施設・技術を必

マイクロベシクル

50〜150nm

100〜1000nm

1〜5µm

産生機構

細胞からの開口分泌

細胞膜からの出芽細胞死による分泌マーカー

CD9, CD63, CD81など 各細胞特異的マーカー Histone, Annexin V

構成成分

タンパク質、RNA、miRNA、脂質

EVs 論文検索結果出する点ではIC法と同様であるが、ELISA法で脂質二重膜を4回貫通するタンパク質である。

ソームはヒトの恒常性やがんなどの疾患の進行におは試験紙でなく、溶液中で反応を行う。
プレート

CD9、CD63、CD81はエクソソーム検出に利用いて重要な役割を果たしている。さらに、エクソソームにエクソソームマーカーに対する抗体を固定化されるマーカータンパク質として知られている。

は、(i) 低い細胞毒性、(ii) 制御された免疫原性、(iii)

し、エクソソームを捕捉した後、酵素標識した抗細胞間コミュニケーションの効果的な利用などの薬体を用いて蛍光や化学発光により検出する。

③ インテグリン鎖2)標識材の一つである貴金属ナノ粒子は、自由電子のる。一例として、銀ナノプレートのアスペクト比が及ぼ

標識材として使用する場合、貴金属ナノ粒子の分散液を検出する際のターゲット物質にすることができる。本

吸水パッドとメンブレンとの接触を保持するため部分には、それぞれ抗体が固定化されている。Test

局在表面プラズモン共鳴（Localized Surface Plasmon

す色調への影響を示す（図8）。色調の異なる粒子をと標識用抗体Bを含む溶液とを混合することにより、疎キットはEVsを定量することを考慮し、EVs表面に広くに貼付するフィルムである。

Lineには検体と結合する抗体が固定化されており、Resonance：LSPR）に由来する光吸収特性を有し、標識材に使用することにより、IC試験におけるマルチ

水性相互作用による物理吸着を介して標識することが分布するCD9をターゲット物質として選定した。本また、メンブレンが傷つかないように保護する目

Control Lineには試験が正常に行われていることを鮮やかな発色を呈するためICキットに広く使用されてカラーでの多検体同時検出が可能になる
（図9）。

できる。

キットの開発においては、
メンブレンへの抗体の固定チェックするための抗体が固定化されている。

いる。一般的には、化学的安定性の高い金を材質とす

る情報を含んでいる。

したエクソソームを投与することで、顕著にがんの増により検出する。

主要組織適合遺伝子複合体（major histocom
patibility complex；MHC）という。膜表面に存在

2.3.3 ExoScreen を使用した循環細胞外小胞の超高感度リキッドバイオプシー9),10)①、②がエクソソームのタンパク測定を目的とするのに対し、③は粒子数のカウントを目的としている。

できるマーカーとしては、CD9、CD63、CD81などが多細胞生物では、離れた細胞間の情報伝達は単予め抗体に固定化された光増感剤ビーズによって検ローサイトメーターで個々の粒子の蛍光を測定す知られている。以下にEVsの一例として、エクソソーム

一分子、またはEVsを介して構成される信号の送受出する手法であるため、精製を行うことなくがん由来ることで、粒子の大きさや、蛍光を発している粒子の構造2)について説明する（図3）。

信によって行われている。がんの進行と転移においてのEVsを検出できる。本法により、結腸直腸がん患者の数を測定する手法であり、細胞の解析方法とし

2.1 細胞外小胞についても、がん細胞由来のエクソソームを媒介するタンパクから採血した血液では「CD147」を含むEVsが多く検て使用されてきた。
しかし、数µmもある細胞とは質が関与していることが示唆された。がん細胞から出されることが報告されている。

異なり、100nm程度とサイズの小さいエクソソー

1983年にJohnstoneらによって、脂質二重膜構造分泌されるエクソソームは、膜表面に存在するインテ

ムを直 接 検出することは困 難であるため、予めを有する100nmほどのEVsが発見され、1987年にグリン（インテグリン末端のフィブロネクチンという部

ビーズに固定化したエクソソームに蛍光色素結合「エクソソーム」と命名された。発見当初、エクソソーム位）を介して細胞の指向性・運動性を促進すること

は細胞内や細胞膜に含まれる余分なタンパク質を細ができる。さらに、血管透過性を誘発することによっ

胞外に排出するためのごみ袋として考えられていたて、周囲のみでなく離れた非腫瘍細胞の細胞生理機が、1996年にはRaposoらによって細胞間のコミュニ

能を変化させ、がん細胞の播種および増殖を可能に

ケーションツールとして機能していることが明らかとなすることができる。

し、ウイルスなどの抗原と結合することで免疫を活性化する。

同定と定量化は依然として困難である。

３． 細胞外小胞の検出手法

4 フローサイトメトリー（FCM）2)

IC法は、妊娠検査やインフルエンザウイルス、新型コ
ロナウイルスの検査キットなどに適用されている検査手法である。イムノクロマト試験紙に固定化された抗体IC法を用いた検査は多くの場合、疾病にり患していメンブレンに展開した溶液を吸い上げる駆動力

るかどうかを簡易的に判断するための定性検査を目となる材料である。

的として使用される。唾液や尿などの液状物質をイム

吸水パッドに吸水できる水分量は、おおむね吸ノクロマト試験紙の上流側（図6の左端）に接触させる

水パッドの厚みに比例する。

ことにより検査できる。

4 バッキングシート

・標識用抗体B捕捉用抗体
メンブレンのControl Line上に固定化される抗体でいる標識材、検体用抗体A、標識用抗体B、標識用抗体である。バッキングシートはポリスチレン、
ポリエ

体B捕捉用抗体について、以下説明する。

例えば、標識用抗体Bとして、
マウスIgG抗体を使用する場合、標識用抗体B捕捉用抗体には抗マウスIgG抗体を使用できる。
メンブレンのTest Line及びControl Line上にそれぞと、標識材に固定化された抗体を用い、試験紙上で検れ抗体を固定化させた後、ウシ血清アルブミン（BSA）

体（ウイルスやタンパク質など）をサンドイッチすることやカゼインを含むブロッキング試薬を用いてメンブレ

で検査対象物を検出する仕組みとなっている。ハーフ

ン全体をコーティングし、意図しない反応（非特異検ストリップと呼ばれる形式のイムノクロマト試験紙の模出）やバックグラウンドの着色を抑制する。

式図を示す
（図5）。
また、図6にイムノクロマト試験紙のり患している（検体が存在する）場合、Test Lineに固

写真を示す
（図6）。

EVsをターゲットとしたリキッドバイオプシーの研究
は、直近10年の間に拡大しており、EVsの検出手法に

図8

銀ナノプレートのアスペクト比と色調ついても様々な手法が開発されている。現在一般的に標識物）が検体と反応することにより、Test Lineに標識材が集積する。
また、Test Lineに捕捉された検体と反使用されている、代表的なEVs検出手法を以下に示す。

化方法やブロッキング条件の最適化、ならびに金ナノプレートへの抗体の標識方法などを工夫した。
説明する（図10）。

図10(a) EVsを含む検体溶液を試験紙に展開すると、試験紙

験では、Test LineとControl Lineの2か所に標識材由来の着色が認められる。

には金ナノプレート（AuPL）に標識した抗体と結合する抗体（抗体捕捉用抗体）が固定化されている。
(b) 金ナノプレートを標識した抗体溶液を展開すると、(a)のステップで試験紙上に固定化されたEVsと結合する。
(c) EVsが捕捉された部分に金ナノプレート標識抗体が集積することで、青色のラインが目視確認できる。
3.2.3 Exorapid-qICの内容物

イムノクロマト試験紙は下記1〜4の部材で構成される。

図7

IC法の陽性・陰性試験（模式図）

認められる。
図9 マルチカラーでの多検体同時検出

検査時間

短（0.75時間）

短〜中
（3時間）

長
（5〜8時間）

短
（1時間）

短
（1時間）

操作性

◎

○

△

○

○

スループット性

○

◎

○

△

△

検出感度

○

○〜◎

○

◎

○〜◎

Exorapid-qICには下記の内容物が含まれている（図11）。

①

②

④

③

○

○

△

（やや高価）（やや高価）

（高価）

（高価）

不要
─

必要
（やや高価）

必要（やや高価）

必要
（高価）

必要
（高価）

Exorapid-qICはEVsを含む検体溶液の展開ス

TestとControlの2本のラインが出現する。試験時間

結乾燥保存したものである。

テップ（①）と、EVs表面抗原であるCD9を認識する抗は全工程で45分程度であり、迅速な評価が可能であ

純水で溶解することで使用できる。

体を標識した金ナノプレートの展開ステップ（②）の2る。試験後に台紙に試験紙を貼付し、スキャナーやプ

段階でEVsを検出する（図12）。EVsを含まない場合

リンタなどで保存した画像を、Image J（アメリカ国立

CD9のリコンビナントタンパク質を凍結乾燥保存し（試験例A）
では、試験紙上にControlのラインのみが衛生研究所の開発したフリーソフト）で解析することたものである。

出現し、EVsを含む場合（試験例B）
では、試験紙上ににより簡易的な定量ができる。

② 標準物質[凍結乾燥]

培養上清（75μL）

図13

ある。

④ 洗浄液

⑤ イムノクロマト試験紙
Test Line、Control Lineにあらかじめ抗体が塗布された試験紙である。
⑥ 96well プレート

図11 Exorapid-qICの内容物

Exorapid-qICにより迅速・簡便にEVsを検出するこjinkou/geppo/nengai21/dl/kekka.pdf）とができるため、EVs関連研究の推進・発展への寄

2）落谷孝広, 吉岡祐亮「医療を変えるエクソソーム-与が期待される。
また、将来的には早期のがん診断

生体機能から疾患メカニズム、臨床応用まで」技術への応用も期待される。

（化学同人, 第1版第1刷, 2018年8月25日発行）される。
また、直近では美容・健康の分野でも利用さ血清量（μL）

Evs分泌時間（時間）②の希釈や、検体の希釈に使用するための溶液でである。

（https://www.mhlw.go.jp/toukei/saikin/hw/

れるようになり「エクソソーム」という用語の認知度

培養上清（75μL）

分泌促進剤（+）となり、今後の技術発展に貢献することを期待している。

3）Borges FT, Reis LA, Schor N. Braz J Med Biol
Res, 46(10), 824-30(2013)4）門田 宰 他2名「日薬理誌（Folia Pharmacol. Jpn.）」
149, 119〜122（2017）5）高桑 雄一「綜 説(Review Article)：膜(MEMBRANE)」
20(2), 92-102(1995)
6）Mercedes Tkach, Clotilde Théry, Cell 164,
March 10(2016)7）中瀬生彦「生物物理」62（1），13-18（2022）
8）Sushrut Kamerkar et al., Nature volume 546,
498‒503 (2017)9）Yusuke Yoshioka et al.,NATURE COMMUNICATIONS, 5, article number:3591(2014)

量線を作成できる。

試 験 紙 への 溶 液 の 展 開を行うためのプレート

ト（弊社製品名：Exorapid-qIC）について解説した。

シーによるがんの早期検査の材料として大いに期待

純水で溶解し、希釈系列ごとに試験することで検試験紙の洗浄に使用する溶液である。検体の展開⑥

年計（概数）の概況

E Vs 、
とりわけエクソソームは、
リキッドバイオプ

EVs数（×108個）

1）厚生労働省 令和３年(2021)人口動態統計月報

プレート」を標識材として使用したイムノクロマトキッが高まっているなか、Exorapid-qICが研究の一助

後、および標識抗体の展開後に使用する。

⑤

△

（安価）

③ 検体希釈液定された検体用抗体Aと抗体標識物が結合せず、標識
は、Control Lineの1か所のみに標識材由来の着色が④FCM[凍結乾燥]

Test LineにはEVsと結合する抗体が、Control Line

Lineで検体の捕捉が行われないため、Test Lineに固材が集積しない。
そのため、検体を含まない陰性試験で① 金ナノプレート標識抗体

弊社製の金ナノプレートにCD9抗体を標識し、凍一方、り患していない（検体が存在しない）場合、Test

図6 イムノクロマト試験紙

③NTA

検出機器

上に固定化された抗体によってEVsが捕捉される。

された抗体と結合する。
したがって、検体を含む陽性試

図5 イムノクロマト試験紙（模式図）

イムノクロマトグラフィーへの適用

EVs検出の仕組み

例Bについては、市販の血清を使用して評価した。
EVsの構造や研究事例、弊社の青色粒子「金ナノ

②WB

図12

Exorapid-qICを用いた試験の概要

35

参考文献

4． おわりに培養し、培養上清から回収したEVsを評価した。試験

検査手法の比較（弊社調べ）①ELISA◎DNTコーティング技報 No.23
解説­3
迅速・簡便な研究用試薬「細胞外小胞用イムノクロマトキット」

なお、試験例A,C,Dについては、がん由来の細胞を紹介する（図13）。

Exorapid-qIC

初期費用

Exorapid-qICによるEVsの検出の仕組みについて応しなかった標識用抗体BはControl Lineに固定化

3.2 細胞外小胞の検出方法としての速・簡便に検出できる「細胞外小胞用イムノクロマト

定化された検体用抗体Aと検体が反応する。
その際、あらかじめ標識材に固定化された標識用抗体B（抗体

抗体結合させてフローサイトメーターで検出する

今般、弊社の貴金属ナノ粒子を活用し、EVsを迅

表3あり、標識用抗体Bと結合する抗体が用いられる。

以下、IC法の試験例を示す（図7）。図7に記載されてメンブレンと吸水パッドを固定化するための支持

また、標識用抗体Bは、検体や後述する標識用抗体B
捕捉用抗体と反応する抗体が用いられる。

手法がとられている。
3.1 細胞外小胞の一般的な検出手法

検体と反応する抗体が用いられる。

メンブレンのTest Line、Control Lineと呼ばれる

い、酵素標識した抗体を用いて蛍光や化学発光

エクソソームなどの粒 子に励 起 光を当てて、フを機にEVsに関連した研究が活発となった 。

ど、抗体と結合可能なタンパク質が存在しており、EVs

遺伝子変異）に作用するshort hairpin RNAを内包「ExoScreen法」はEVsを2種類の抗体で捕捉し、

図3 エクソソームの構造

標識材を固定化する抗体である。貴金属ナノ粒子をエクソソーム内に存在し、分泌元の細胞に由来す

2.3.1 細胞外小胞による情報伝達とがんの転移6)2)ト比などを調整することにより色調をコントロールでき

後、ゲルから微多孔膜へのパターンの転写を行して活発に取り上げられている。エクソソームを識別２．細胞外小胞とは検討が進められている。

ん細胞に対して、K-Rasの変異体（がん細胞における2.3 エクソソーム研究事例

達物質として非常に有用であることから、研究対象とで説明したようにEVsは表面にCD9、CD63、CD81な量の違い）から、検体中のタンパク質を分離した

予め遠心分離などで精製しておくことが好ましい。

EVsの中でも特に、エクソソームは細胞間の情報伝・標識用抗体B（細胞の取り込み機構の1つ）を誘導している膵臓が3 ナノトラッキング解析（NTA）2),13)④と比較し、専用の検出機器を必要とせず、操作が簡形状の貴金属ナノ粒子については、
それらのアスペク能する部位である。

殖が抑制されることを示した。

検査薬などで広く使用されているIC法を用いた。2.2などが使用されており、診断薬メーカー各社で様々な

3 吸水パッド⑤ MHC分子2)Exorapid-qICを使用した試験例について以下に液の展開を補助する役割がある。

出法である。電気泳動による移動度の違い（分子3.2.1 イムノクロマトグラフィー（IC）法とは較した結果を示す（表3）。

存在する。展開速度は、
メンブレン上の抗体と検究チームは生体内において、マクロピノサイトーシス※商品紹介：https://www.dnt.co.jp/technology/new-business/exorapid-qic/

Exorapid-qICは3.1に記載のEVs検出手法①〜

いる。
プレート状やロッド状といった、異方性を有する細胞どうしのコミュニケーションツールとして機細胞外小胞用イムノクロマトキット

EVsを迅速かつ簡便に検出する手法として、市販のノ粒子、または着色したセルロースナノファイバー粒子

的もある。

図4

メンブレンのTest Line上に固定化される抗体であり、ドとメンブレンを接触させ、毛細管現象による溶ウェスタンブロッティングは、
タンパク質の免疫検④ 核酸（mRNA, miRNAなど）2)

3.3 Exorapid-qICを使用した試験例

く、溶液の展開速度の異なる複数のグレードがの次世代キャリアとして期待されている。Kalluriの研34

便で検査時間が短い特長がある。他の検出手法と比弊社では様々な色調の貴金属ナノ粒子を開発して受容体である。

33

DNTコーティング技報 No.23
解説­3
迅速・簡便な研究用試薬「細胞外小胞用イムノクロマトキット」

3.2.4 Exorapid-qICの特長

標識材には貴金属ナノ粒子、着色したラテックスナ

2 トップフィルム

32

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迅速・簡便な研究用試薬「細胞外小胞用イムノクロマトキット」

3.2.2 EVs検出用イムノクロマトキットの開発

着剤を貼り合わせた構成になっている。吸水パッる赤色の球状金ナノ粒子が使用されている。

31

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・検体用抗体A

ニトロセルロース素材で構成されるタイプが多体との反応性を大きく左右する。

2 ウェスタンブロッティング（WB）2),12)

その他の生体成分も多いことから、がん由来のEVsの金ナノプレート分散液

会社島津製作所」と共同で開発した。

30

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・標識材

学的利点から、治療用分子を細胞内に送達するためンパクの凝集塊を見分けることは不可能なため、

図2

キット（弊社製品名：Exorapid-qIC、図4）」を「株式

29

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ステル、塩化ビニルなどのプラスチックシートに粘

1 メンブレン2量体の膜貫通型の構造をもつ、糖タンパク質

ど）には健康な細胞に由来するEVsも多く存在し、また細胞に由来する物質を含むことが明らかとなり、
これ
図1

クソソームにカプセル化されており、分泌されたエクソ② テトラスパニン鎖（表面抗原）ことができる。エクソソームと同程度の大きさのタった。
さらに、2007年には、エクソソームが分泌元の要としない、血液検査や尿検査などの方法によるがん早アポトーシス小胞の一つ。抗体と抗原（マーカー）の結合により検2)において有望ではあるが、臨床サンプル（血液や尿な

小胞（Extracellular Vesicles：EVs）などが挙げられる。
とりわけ、③は進行したがん細胞のみでなく、ステエクソソームエクソソームの膜上のタンパク質を解析する方法

マイクロRNAや酵素などの「メッセージ」分子はエあり、細胞膜の基本構造とほぼ同じである。

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1 ELISA法2),11)粒子のブラウン運動より解析し粒子数を算出するの対象物質（マーカー）として、血液に含まれる循環物
質が注目されている。
この循環物質としては、腫瘍に由

細胞外小胞の種類

膵臓がんの抑制7),8)28

がん細胞が分泌するEVsの検出は、がん早期診断

近年、がん発見を目的としたリキッドバイオプシー（Magnetic Resonance Imaging）などの画像検査技術「リキッドバイオプシー（Liquid Biopsy）」という。

で明確に区別、単離することは困難である4)。

リキッドバイオプシーきである。
また、侵襲性の低い手法として近年ではMRI

このような検査手法を
期検査技術が求められている2)。

別するマーカーも十分に定まっていないため、現時点

がんの検査手法

2.3.2. エクソソームを介した薬物送達による① 脂質二重膜5)2.2 細胞外小胞の種類と構造

27

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検出強度（輝度解析）

しかしながら、EVsの検出手法には煩雑な工程や高Development of a Quick and Easy Research Reagent Set"Immunochromatographic Kit for Extracellular Vesicles"

スペシャリティ事業部門
スペシャリティ事業部
機能材開発グループ
Speciality Business Div.
Speciality Business Dept.
Functional Materials Development Group26

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検出強度（輝度解析）

迅速・簡便な研究用試薬「細胞外小胞用イムノクロマトキット」

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検出強度（mAbs）

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検出強度（輝度解析）

24

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EVs分泌時間（時間）Exorapid-qICを使用した試験例

A）EVsの定量

C）EVs量のモニタリング

Test Lineに捕捉されるEVs量に応じて金ナノプレート

細胞培養上清（ウシ胎児血清（FBS）非含有）を直接標識抗体の集積量が変動するため、Test Lineの色濃

試験紙に展開することにより、EVsの検出が可能であ度を測定することによりEVsの定量が可能である。乳る。細胞培養によるEVs放出量をモニタリングすること

がん細胞MCF-7由来EVsを用いた試験において、ナノにより、培 養 の 管 理などに使 用できる。
（ 細 胞 株：トラッキング装置で解析したEVs数と高い相関性が得

MCF7）られることを確認した。

D）薬剤によるEVs分泌促進評価

B）血清中のEVs検出

培養細胞のEVs分泌促進剤や抑制剤の効果を簡便

血清を直接試験紙に展開することにより、EVsの検出に 評 価 す る こと が 可 能 で あ る 。本 試 験 で はが可能である。展開する血清の量に依存して検出強Cucurbitacin Bによる分泌促進の効果を評価した。

度が増大した。
キットに付属の標準物質を用いて検量（細胞株：HCT116）線を作成することにより、血清中のEVs量を間接的に定量することが可能である。

10）吉岡 祐亮, 落谷 孝広, Cytometry Research26（1）：1 〜 6，2016
11）Mariantonia Logozzi et al., PLoS One. 4(4):e5219(2009)
12）Biji T. Kurien et al., Methods Mol Biol.; 1312:
17‒30.(2015)13）Christina Coughlan et al., Curr Protoc Cell
Biol. September ; 88(1): e110.(2020)

度な技術、あるいは高価な装置を必要とするものが多宗芳和

Yoshikazu SO

宮澤

極性をもった薄いりん脂質が二重になった膜でく、研究者の負担が大きいといった課題がある。そこ

EVsはエクソソームをはじめ、細胞から分泌されるで、弊社は迅速・簡便な検査手法の一つである「イム

様々な小胞体の総称である。100〜1000nm程度のノクロマトグラフィー（Immunochromatography；

大きさを有するマイクロベシクル、1〜5µmのアポトー

IC）法」に着目し、EVsを検出できるICキットの開発を

シス小胞などが存在する（表2）。
アポトーシス小胞は行った。本報では、EVsの構造や研究事例に関する解細胞死により分泌されるが、エクソソームやマイクロベ説をはじめ、IC用の標識材として弊社にて開発した青

シクルは生きている細胞から分泌される。エクソソー

色粒子「金ナノプレート（図2）」を使用した、
イムノクロ

ムは細胞の内部で産生され、マイクロベシクルは細胞マトキットについて解説する。

膜の陥没により産生される3) 。国際細胞外小胞学会（International Society for Extracellular Vesicles：

雄太

Yuta MIYAZAWA

ISEV）において、EVsの分類方法が示されているが、産生や分泌の機構について未解明な部分が多く、識１． はじめに

表1

がん（悪性腫瘍）は1981年以降日本人の死因のトップであり、2021年時点で死因の26.5%を占めている 。
1)

一方でがん疾患の詳細なメカニズムは解明されておらず、寿命の高齢化に伴い、がん患者数が増加傾向にあるなか、革新的ながん予防、診断、治療法の開発が求められている。
がん細胞は分裂速度が正常な細胞と比べて速く、進行度（ステージ）が進むにつれて生存率が低くなるため、早期にがんを発見することががん治療の成功率を高めるカギとなる。
がんの発見には、従来、生体組織を体内から採取する検査手法（組織生検）が用いられてきた。
このような手法
は検査精度に優れるものの、患者の身体的・精神的な負担が大きく、がんの早期検査のスクリーニングには不向

組織生検

画像検査

侵襲性

低い（採血、採尿など）

高い（手術）

低い（撮像）

検査費用

比較的安い

高い

高い

細胞外小胞の種類

検査精度※検査対象による高い※装置による

サイズ（目安）表2

来する①cfDNA（cell free DNA）、②細胞、③細胞外ージ初期のがん細胞からも分泌されるため、がん早期発見のマーカーとして利用できる可能性が高く、研究が盛んに行われている。特に近年研究は著しく活発化しており、論文投稿の件数は2010年以降で指数関数的に増加している（図1）。

が採用されており、直径1cm以下の小さながんの可視化も可能である。
しかし、コストや時間的、地理的な制限があり、早期検査技術としての利用は困難である。
したがって、安価で侵襲性が低く、高度な医療施設・技術を必

マイクロベシクル

50〜150nm

100〜1000nm

1〜5µm

産生機構

細胞からの開口分泌

細胞膜からの出芽細胞死による分泌マーカー

CD9, CD63, CD81など 各細胞特異的マーカー Histone, Annexin V

構成成分

タンパク質、RNA、miRNA、脂質

EVs 論文検索結果出する点ではIC法と同様であるが、ELISA法で脂質二重膜を4回貫通するタンパク質である。

ソームはヒトの恒常性やがんなどの疾患の進行におは試験紙でなく、溶液中で反応を行う。
プレート

CD9、CD63、CD81はエクソソーム検出に利用いて重要な役割を果たしている。さらに、エクソソームにエクソソームマーカーに対する抗体を固定化されるマーカータンパク質として知られている。

は、(i) 低い細胞毒性、(ii) 制御された免疫原性、(iii)

し、エクソソームを捕捉した後、酵素標識した抗細胞間コミュニケーションの効果的な利用などの薬体を用いて蛍光や化学発光により検出する。

③ インテグリン鎖2)標識材の一つである貴金属ナノ粒子は、自由電子のる。一例として、銀ナノプレートのアスペクト比が及ぼ

標識材として使用する場合、貴金属ナノ粒子の分散液を検出する際のターゲット物質にすることができる。本

吸水パッドとメンブレンとの接触を保持するため部分には、それぞれ抗体が固定化されている。Test

局在表面プラズモン共鳴（Localized Surface Plasmon

す色調への影響を示す（図8）。色調の異なる粒子をと標識用抗体Bを含む溶液とを混合することにより、疎キットはEVsを定量することを考慮し、EVs表面に広くに貼付するフィルムである。

Lineには検体と結合する抗体が固定化されており、Resonance：LSPR）に由来する光吸収特性を有し、標識材に使用することにより、IC試験におけるマルチ

水性相互作用による物理吸着を介して標識することが分布するCD9をターゲット物質として選定した。本また、メンブレンが傷つかないように保護する目

Control Lineには試験が正常に行われていることを鮮やかな発色を呈するためICキットに広く使用されてカラーでの多検体同時検出が可能になる
（図9）。

できる。

キットの開発においては、
メンブレンへの抗体の固定チェックするための抗体が固定化されている。

いる。一般的には、化学的安定性の高い金を材質とす

る情報を含んでいる。

したエクソソームを投与することで、顕著にがんの増により検出する。

主要組織適合遺伝子複合体（major histocom
patibility complex；MHC）という。膜表面に存在

2.3.3 ExoScreen を使用した循環細胞外小胞の超高感度リキッドバイオプシー9),10)①、②がエクソソームのタンパク測定を目的とするのに対し、③は粒子数のカウントを目的としている。

できるマーカーとしては、CD9、CD63、CD81などが多細胞生物では、離れた細胞間の情報伝達は単予め抗体に固定化された光増感剤ビーズによって検ローサイトメーターで個々の粒子の蛍光を測定す知られている。以下にEVsの一例として、エクソソーム

一分子、またはEVsを介して構成される信号の送受出する手法であるため、精製を行うことなくがん由来ることで、粒子の大きさや、蛍光を発している粒子の構造2)について説明する（図3）。

信によって行われている。がんの進行と転移においてのEVsを検出できる。本法により、結腸直腸がん患者の数を測定する手法であり、細胞の解析方法とし

2.1 細胞外小胞についても、がん細胞由来のエクソソームを媒介するタンパクから採血した血液では「CD147」を含むEVsが多く検て使用されてきた。
しかし、数µmもある細胞とは質が関与していることが示唆された。がん細胞から出されることが報告されている。

異なり、100nm程度とサイズの小さいエクソソー

1983年にJohnstoneらによって、脂質二重膜構造分泌されるエクソソームは、膜表面に存在するインテ

ムを直 接 検出することは困 難であるため、予めを有する100nmほどのEVsが発見され、1987年にグリン（インテグリン末端のフィブロネクチンという部

ビーズに固定化したエクソソームに蛍光色素結合「エクソソーム」と命名された。発見当初、エクソソーム位）を介して細胞の指向性・運動性を促進すること

は細胞内や細胞膜に含まれる余分なタンパク質を細ができる。さらに、血管透過性を誘発することによっ

胞外に排出するためのごみ袋として考えられていたて、周囲のみでなく離れた非腫瘍細胞の細胞生理機が、1996年にはRaposoらによって細胞間のコミュニ

能を変化させ、がん細胞の播種および増殖を可能に

ケーションツールとして機能していることが明らかとなすることができる。

し、ウイルスなどの抗原と結合することで免疫を活性化する。

同定と定量化は依然として困難である。

３． 細胞外小胞の検出手法

4 フローサイトメトリー（FCM）2)

IC法は、妊娠検査やインフルエンザウイルス、新型コ
ロナウイルスの検査キットなどに適用されている検査手法である。イムノクロマト試験紙に固定化された抗体IC法を用いた検査は多くの場合、疾病にり患していメンブレンに展開した溶液を吸い上げる駆動力

るかどうかを簡易的に判断するための定性検査を目となる材料である。

的として使用される。唾液や尿などの液状物質をイム

吸水パッドに吸水できる水分量は、おおむね吸ノクロマト試験紙の上流側（図6の左端）に接触させる

水パッドの厚みに比例する。

ことにより検査できる。

4 バッキングシート

・標識用抗体B捕捉用抗体
メンブレンのControl Line上に固定化される抗体でいる標識材、検体用抗体A、標識用抗体B、標識用抗体である。バッキングシートはポリスチレン、
ポリエ

体B捕捉用抗体について、以下説明する。

例えば、標識用抗体Bとして、
マウスIgG抗体を使用する場合、標識用抗体B捕捉用抗体には抗マウスIgG抗体を使用できる。
メンブレンのTest Line及びControl Line上にそれぞと、標識材に固定化された抗体を用い、試験紙上で検れ抗体を固定化させた後、ウシ血清アルブミン（BSA）

体（ウイルスやタンパク質など）をサンドイッチすることやカゼインを含むブロッキング試薬を用いてメンブレ

で検査対象物を検出する仕組みとなっている。ハーフ

ン全体をコーティングし、意図しない反応（非特異検ストリップと呼ばれる形式のイムノクロマト試験紙の模出）やバックグラウンドの着色を抑制する。

式図を示す
（図5）。
また、
イムノクロマト試験紙の写真

り患している（検体が存在する）場合、Test Lineに固

を示す
（図6）。

EVsをターゲットとしたリキッドバイオプシーの研究
は、直近10年の間に拡大しており、EVsの検出手法に

図8

銀ナノプレートのアスペクト比と色調ついても様々な手法が開発されている。現在一般的に標識物）が検体と反応することにより、Test Lineに標識材が集積する。
また、Test Lineに捕捉された検体と反使用されている、代表的なEVs検出手法を以下に示す。

化方法やブロッキング条件の最適化、ならびに金ナノプレートへの抗体の標識方法などを工夫した。
説明する（図10）。

図10(a) EVsを含む検体溶液を試験紙に展開すると、試験紙

験では、Test LineとControl Lineの2か所に標識材由来の着色が認められる。

には金ナノプレート（AuPL）に標識した抗体と結合する抗体（抗体捕捉用抗体）が固定化されている。
(b) 金ナノプレートを標識した抗体溶液を展開すると、(a)のステップで試験紙上に固定化されたEVsと結合する。
(c) EVsが捕捉された部分に金ナノプレート標識抗体が集積することで、青色のラインが目視確認できる。
3.2.3 Exorapid-qICの内容物

イムノクロマト試験紙は下記1〜4の部材で構成される。

図7

IC法の陽性・陰性試験（模式図）

認められる。
図9 マルチカラーでの多検体同時検出

検査時間

短（0.75時間）

短〜中
（3時間）

長
（5〜8時間）

短
（1時間）

短
（1時間）

操作性

◎

○

△

○

○

スループット性

○

◎

○

△

△

検出感度

○

○〜◎

○

◎

○〜◎

Exorapid-qICには下記の内容物が含まれている（図11）。

①

②

④

③

○

○

△

（やや高価）（やや高価）

（高価）

（高価）

不要
─

必要
（やや高価）

必要（やや高価）

必要
（高価）

必要
（高価）

Exorapid-qICはEVsを含む検体溶液の展開ス

TestとControlの2本のラインが出現する。試験時間

結乾燥保存したものである。

テップ（①）と、EVs表面抗原であるCD9を認識する抗は全工程で45分程度であり、迅速な評価が可能であ

純水で溶解することで使用できる。

体を標識した金ナノプレートの展開ステップ（②）の2る。試験後に台紙に試験紙を貼付し、スキャナーやプ

段階でEVsを検出する（図12）。EVsを含まない場合

リンタなどで保存した画像を、Image J（アメリカ国立

CD9のリコンビナントタンパク質を凍結乾燥保存し（試験例A）
では、試験紙上にControlのラインのみが衛生研究所の開発したフリーソフト）で解析することたものである。

出現し、EVsを含む場合（試験例B）
では、試験紙上ににより簡易的な定量ができる。

② 標準物質[凍結乾燥]

培養上清（75μL）

図13

ある。

④ 洗浄液

⑤ イムノクロマト試験紙
Test Line、Control Lineにあらかじめ抗体が塗布された試験紙である。
⑥ 96well プレート

図11 Exorapid-qICの内容物

Exorapid-qICにより迅速・簡便にEVsを検出するこjinkou/geppo/nengai21/dl/kekka.pdf）とができるため、EVs関連研究の推進・発展への寄

2）落谷孝広, 吉岡祐亮「医療を変えるエクソソーム-与が期待される。
また、将来的には早期のがん診断

生体機能から疾患メカニズム、臨床応用まで」技術への応用も期待される。

（化学同人, 第1版第1刷, 2018年8月25日発行）される。
また、直近では美容・健康の分野でも利用さ血清量（μL）

Evs分泌時間（時間）②の希釈や、検体の希釈に使用するための溶液でである。

（https://www.mhlw.go.jp/toukei/saikin/hw/

れるようになり「エクソソーム」という用語の認知度

培養上清（75μL）

分泌促進剤（+）となり、今後の技術発展に貢献することを期待している。

3）Borges FT, Reis LA, Schor N. Braz J Med Biol
Res, 46(10), 824-30(2013)4）門田 宰 他2名「日薬理誌（Folia Pharmacol. Jpn.）」
149, 119〜122（2017）5）高桑 雄一「綜 説(Review Article)：膜(MEMBRANE)」
20(2), 92-102(1995)
6）Mercedes Tkach, Clotilde Théry, Cell 164,
March 10(2016)7）中瀬生彦「生物物理」62（1），13-18（2022）
8）Sushrut Kamerkar et al., Nature volume 546,
498‒503 (2017)9）Yusuke Yoshioka et al.,NATURE COMMUNICATIONS, 5, article number:3591(2014)

量線を作成できる。

試 験 紙 への 溶 液 の 展 開を行うためのプレート

ト（弊社製品名：Exorapid-qIC）について解説した。

シーによるがんの早期検査の材料として大いに期待

純水で溶解し、希釈系列ごとに試験することで検試験紙の洗浄に使用する溶液である。検体の展開⑥

年計（概数）の概況

E Vs 、
とりわけエクソソームは、
リキッドバイオプ

EVs数（×108個）

1）厚生労働省 令和３年(2021)人口動態統計月報

プレート」を標識材として使用したイムノクロマトキッが高まっているなか、Exorapid-qICが研究の一助

後、および標識抗体の展開後に使用する。

⑤

△

（安価）

③ 検体希釈液定された検体用抗体Aと抗体標識物が結合せず、標識
は、Control Lineの1か所のみに標識材由来の着色が④FCM[凍結乾燥]

Test LineにはEVsと結合する抗体が、Control Line

Lineで検体の捕捉が行われないため、Test Lineに固材が集積しない。
そのため、検体を含まない陰性試験で① 金ナノプレート標識抗体

弊社製の金ナノプレートにCD9抗体を標識し、凍一方、り患していない（検体が存在しない）場合、Test

図6 イムノクロマト試験紙

③NTA

検出機器

上に固定化された抗体によってEVsが捕捉される。

された抗体と結合する。
したがって、検体を含む陽性試

図5 イムノクロマト試験紙（模式図）

イムノクロマトグラフィーへの適用

EVs検出の仕組み

例Bについては、市販の血清を使用して評価した。
EVsの構造や研究事例、弊社の青色粒子「金ナノ

②WB

図12

Exorapid-qICを用いた試験の概要

35

参考文献

4． おわりに培養し、培養上清から回収したEVsを評価した。試験

検査手法の比較（弊社調べ）①ELISA◎DNTコーティング技報 No.23
解説­3
迅速・簡便な研究用試薬「細胞外小胞用イムノクロマトキット」

なお、試験例A,C,Dについては、がん由来の細胞を紹介する（図13）。

Exorapid-qIC

初期費用

Exorapid-qICによるEVsの検出の仕組みについて応しなかった標識用抗体BはControl Lineに固定化

3.2 細胞外小胞の検出方法としての速・簡便に検出できる「細胞外小胞用イムノクロマト

定化された検体用抗体Aと検体が反応する。
その際、あらかじめ標識材に固定化された標識用抗体B（抗体

抗体結合させてフローサイトメーターで検出する

今般、弊社の貴金属ナノ粒子を活用し、EVsを迅

表3あり、標識用抗体Bと結合する抗体が用いられる。

以下、IC法の試験例を示す（図7）。図7に記載されてメンブレンと吸水パッドを固定化するための支持

また、標識用抗体Bは、検体や後述する標識用抗体B
捕捉用抗体と反応する抗体が用いられる。

手法がとられている。
3.1 細胞外小胞の一般的な検出手法

検体と反応する抗体が用いられる。

メンブレンのTest Line、Control Lineと呼ばれる

い、酵素標識した抗体を用いて蛍光や化学発光

エクソソームなどの粒 子に励 起 光を当てて、フを機にEVsに関連した研究が活発となった 。

ど、抗体と結合可能なタンパク質が存在しており、EVs

遺伝子変異）に作用するshort hairpin RNAを内包「ExoScreen法」はEVsを2種類の抗体で捕捉し、

図3 エクソソームの構造

標識材を固定化する抗体である。貴金属ナノ粒子をエクソソーム内に存在し、分泌元の細胞に由来す

2.3.1 細胞外小胞による情報伝達とがんの転移6)2)ト比などを調整することにより色調をコントロールでき

後、ゲルから微多孔膜へのパターンの転写を行して活発に取り上げられている。エクソソームを識別２．細胞外小胞とは検討が進められている。

ん細胞に対して、K-Rasの変異体（がん細胞における2.3 エクソソーム研究事例

達物質として非常に有用であることから、研究対象とで説明したようにEVsは表面にCD9、CD63、CD81な量の違い）から、検体中のタンパク質を分離した

予め遠心分離などで精製しておくことが好ましい。

EVsの中でも特に、エクソソームは細胞間の情報伝・標識用抗体B（細胞の取り込み機構の1つ）を誘導している膵臓が3 ナノトラッキング解析（NTA）2),13)④と比較し、専用の検出機器を必要とせず、操作が簡形状の貴金属ナノ粒子については、
それらのアスペク能する部位である。

殖が抑制されることを示した。

検査薬などで広く使用されているIC法を用いた。2.2などが使用されており、診断薬メーカー各社で様々な

3 吸水パッド⑤ MHC分子2)Exorapid-qICを使用した試験例について以下に液の展開を補助する役割がある。

出法である。電気泳動による移動度の違い（分子3.2.1 イムノクロマトグラフィー（IC）法とは較した結果を示す（表3）。

存在する。展開速度は、
メンブレン上の抗体と検究チームは生体内において、マクロピノサイトーシス※商品紹介：https://www.dnt.co.jp/technology/new-business/exorapid-qic/

Exorapid-qICは3.1に記載のEVs検出手法①〜

いる。
プレート状やロッド状といった、異方性を有する細胞どうしのコミュニケーションツールとして機細胞外小胞用イムノクロマトキット

EVsを迅速かつ簡便に検出する手法として、市販のノ粒子、または着色したセルロースナノファイバー粒子

的もある。

図4

メンブレンのTest Line上に固定化される抗体であり、ドとメンブレンを接触させ、毛細管現象による溶ウェスタンブロッティングは、
タンパク質の免疫検④ 核酸（mRNA, miRNAなど）2)

3.3 Exorapid-qICを使用した試験例

く、溶液の展開速度の異なる複数のグレードがの次世代キャリアとして期待されている。Kalluriの研34

便で検査時間が短い特長がある。他の検出手法と比弊社では様々な色調の貴金属ナノ粒子を開発して受容体である。

33

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解説­3
迅速・簡便な研究用試薬「細胞外小胞用イムノクロマトキット」

3.2.4 Exorapid-qICの特長

標識材には貴金属ナノ粒子、着色したラテックスナ

2 トップフィルム

32

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3.2.2 EVs検出用イムノクロマトキットの開発

着剤を貼り合わせた構成になっている。吸水パッる赤色の球状金ナノ粒子が使用されている。

31

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・検体用抗体A

ニトロセルロース素材で構成されるタイプが多体との反応性を大きく左右する。

2 ウェスタンブロッティング（WB）2),12)

その他の生体成分も多いことから、がん由来のEVsの金ナノプレート分散液

会社島津製作所」と共同で開発した。

30

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・標識材

学的利点から、治療用分子を細胞内に送達するためンパクの凝集塊を見分けることは不可能なため、

図2

キット（弊社製品名：Exorapid-qIC、図4）」を「株式

29

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ステル、塩化ビニルなどのプラスチックシートに粘

1 メンブレン2量体の膜貫通型の構造をもつ、糖タンパク質

ど）には健康な細胞に由来するEVsも多く存在し、また細胞に由来する物質を含むことが明らかとなり、
これ
図1

クソソームにカプセル化されており、分泌されたエクソ② テトラスパニン鎖（表面抗原）ことができる。エクソソームと同程度の大きさのタった。
さらに、2007年には、エクソソームが分泌元の要としない、血液検査や尿検査などの方法によるがん早アポトーシス小胞の一つ。抗体と抗原（マーカー）の結合により検2)において有望ではあるが、臨床サンプル（血液や尿な

小胞（Extracellular Vesicles：EVs）などが挙げられる。
とりわけ、③は進行したがん細胞のみでなく、ステエクソソームエクソソームの膜上のタンパク質を解析する方法

マイクロRNAや酵素などの「メッセージ」分子はエあり、細胞膜の基本構造とほぼ同じである。

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1 ELISA法2),11)粒子のブラウン運動より解析し粒子数を算出するの対象物質（マーカー）として、血液に含まれる循環物
質が注目されている。
この循環物質としては、腫瘍に由

細胞外小胞の種類

膵臓がんの抑制7),8)28

がん細胞が分泌するEVsの検出は、がん早期診断

近年、がん発見を目的としたリキッドバイオプシー（Magnetic Resonance Imaging）などの画像検査技術「リキッドバイオプシー（Liquid Biopsy）」という。

で明確に区別、単離することは困難である4)。

リキッドバイオプシーきである。
また、侵襲性の低い手法として近年ではMRI

このような検査手法を
期検査技術が求められている2)。

別するマーカーも十分に定まっていないため、現時点

がんの検査手法

2.3.2. エクソソームを介した薬物送達による① 脂質二重膜5)2.2 細胞外小胞の種類と構造

27

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検出強度（輝度解析）

しかしながら、EVsの検出手法には煩雑な工程や高Development of a Quick and Easy Research Reagent Set"Immunochromatographic Kit for Extracellular Vesicles"

スペシャリティ事業部門
スペシャリティ事業部
機能材開発グループ
Speciality Business Div.
Speciality Business Dept.
Functional Materials Development Group26

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検出強度（輝度解析）

迅速・簡便な研究用試薬「細胞外小胞用イムノクロマトキット」

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検出強度（mAbs）

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検出強度（輝度解析）

24

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EVs分泌時間（時間）Exorapid-qICを使用した試験例

A）EVsの定量

C）EVs量のモニタリング

Test Lineに捕捉されるEVs量に応じて金ナノプレート

細胞培養上清（ウシ胎児血清（FBS）非含有）を直接標識抗体の集積量が変動するため、Test Lineの色濃

試験紙に展開することにより、EVsの検出が可能であ度を測定することによりEVsの定量が可能である。乳る。細胞培養によるEVs放出量をモニタリングすること

がん細胞MCF-7由来EVsを用いた試験において、ナノにより、培 養 の 管 理などに使 用できる。
（ 細 胞 株：トラッキング装置で解析したEVs数と高い相関性が得

MCF7）られることを確認した。

D）薬剤によるEVs分泌促進評価

B）血清中のEVs検出

培養細胞のEVs分泌促進剤や抑制剤の効果を簡便

血清を直接試験紙に展開することにより、EVsの検出に 評 価 す る こと が 可 能 で あ る 。本 試 験 で はが可能である。展開する血清の量に依存して検出強Cucurbitacin Bによる分泌促進の効果を評価した。

度が増大した。
キットに付属の標準物質を用いて検量（細胞株：HCT116）線を作成することにより、血清中のEVs量を間接的に定量することが可能である。

10）吉岡 祐亮, 落谷 孝広, Cytometry Research26（1）：1 〜 6，2016
11）Mariantonia Logozzi et al., PLoS One. 4(4):e5219(2009)
12）Biji T. Kurien et al., Methods Mol Biol.; 1312:
17‒30.(2015)13）Christina Coughlan et al., Curr Protoc Cell
Biol. September ; 88(1): e110.(2020)

度な技術、あるいは高価な装置を必要とするものが多宗芳和

Yoshikazu SO

宮澤

極性をもった薄いりん脂質が二重になった膜でく、研究者の負担が大きいといった課題がある。そこ

EVsはエクソソームをはじめ、細胞から分泌されるで、弊社は迅速・簡便な検査手法の一つである「イム

様々な小胞体の総称である。100〜1000nm程度のノクロマトグラフィー（Immunochromatography；

大きさを有するマイクロベシクル、1〜5µmのアポトー

IC）法」に着目し、EVsを検出できるICキットの開発を

シス小胞などが存在する（表2）。
アポトーシス小胞は行った。本報では、EVsの構造や研究事例に関する解細胞死により分泌されるが、エクソソームやマイクロベ説をはじめ、IC用の標識材として弊社にて開発した青

シクルは生きている細胞から分泌される。エクソソー

色粒子「金ナノプレート（図2）」を使用した、
イムノクロ

ムは細胞の内部で産生され、マイクロベシクルは細胞マトキットについて解説する。

膜の陥没により産生される3) 。国際細胞外小胞学会（International Society for Extracellular Vesicles：

雄太

Yuta MIYAZAWA

ISEV）において、EVsの分類方法が示されているが、産生や分泌の機構について未解明な部分が多く、識１． はじめに

表1

がん（悪性腫瘍）は1981年以降日本人の死因のトップであり、2021年時点で死因の26.5%を占めている 。
1)

一方でがん疾患の詳細なメカニズムは解明されておらず、寿命の高齢化に伴い、がん患者数が増加傾向にあるなか、革新的ながん予防、診断、治療法の開発が求められている。
がん細胞は分裂速度が正常な細胞と比べて速く、進行度（ステージ）が進むにつれて生存率が低くなるため、早期にがんを発見することががん治療の成功率を高めるカギとなる。
がんの発見には、従来、生体組織を体内から採取する検査手法（組織生検）が用いられてきた。
このような手法
は検査精度に優れるものの、患者の身体的・精神的な負担が大きく、がんの早期検査のスクリーニングには不向

組織生検

画像検査

侵襲性

低い（採血、採尿など）

高い（手術）

低い（撮像）

検査費用

比較的安い

高い

高い

細胞外小胞の種類

検査精度※検査対象による高い※装置による

サイズ（目安）表2

来する①cfDNA（cell free DNA）、②細胞、③細胞外ージ初期のがん細胞からも分泌されるため、がん早期発見のマーカーとして利用できる可能性が高く、研究が盛んに行われている。特に近年研究は著しく活発化しており、論文投稿の件数は2010年以降で指数関数的に増加している（図1）。

が採用されており、直径1cm以下の小さながんの可視化も可能である。
しかし、コストや時間的、地理的な制限があり、早期検査技術としての利用は困難である。
したがって、安価で侵襲性が低く、高度な医療施設・技術を必

マイクロベシクル

50〜150nm

100〜1000nm

1〜5µm

産生機構

細胞からの開口分泌

細胞膜からの出芽細胞死による分泌マーカー

CD9, CD63, CD81など 各細胞特異的マーカー Histone, Annexin V

構成成分

タンパク質、RNA、miRNA、脂質

EVs 論文検索結果出する点ではIC法と同様であるが、ELISA法で脂質二重膜を4回貫通するタンパク質である。

ソームはヒトの恒常性やがんなどの疾患の進行におは試験紙でなく、溶液中で反応を行う。
プレート

CD9、CD63、CD81はエクソソーム検出に利用いて重要な役割を果たしている。さらに、エクソソームにエクソソームマーカーに対する抗体を固定化されるマーカータンパク質として知られている。

は、(i) 低い細胞毒性、(ii) 制御された免疫原性、(iii)

し、エクソソームを捕捉した後、酵素標識した抗細胞間コミュニケーションの効果的な利用などの薬体を用いて蛍光や化学発光により検出する。

③ インテグリン鎖2)標識材の一つである貴金属ナノ粒子は、自由電子のる。一例として、銀ナノプレートのアスペクト比が及ぼ

標識材として使用する場合、貴金属ナノ粒子の分散液を検出する際のターゲット物質にすることができる。本

吸水パッドとメンブレンとの接触を保持するため部分には、それぞれ抗体が固定化されている。Test

局在表面プラズモン共鳴（Localized Surface Plasmon

す色調への影響を示す（図8）。色調の異なる粒子をと標識用抗体Bを含む溶液とを混合することにより、疎キットはEVsを定量することを考慮し、EVs表面に広くに貼付するフィルムである。

Lineには検体と結合する抗体が固定化されており、Resonance：LSPR）に由来する光吸収特性を有し、標識材に使用することにより、IC試験におけるマルチ

水性相互作用による物理吸着を介して標識することが分布するCD9をターゲット物質として選定した。本また、メンブレンが傷つかないように保護する目

Control Lineには試験が正常に行われていることを鮮やかな発色を呈するためICキットに広く使用されてカラーでの多検体同時検出が可能になる
（図9）。

できる。

キットの開発においては、
メンブレンへの抗体の固定チェックするための抗体が固定化されている。

いる。一般的には、化学的安定性の高い金を材質とす

る情報を含んでいる。

したエクソソームを投与することで、顕著にがんの増により検出する。

主要組織適合遺伝子複合体（major histocom
patibility complex；MHC）という。膜表面に存在

2.3.3 ExoScreen を使用した循環細胞外小胞の超高感度リキッドバイオプシー9),10)①、②がエクソソームのタンパク測定を目的とするのに対し、③は粒子数のカウントを目的としている。

できるマーカーとしては、CD9、CD63、CD81などが多細胞生物では、離れた細胞間の情報伝達は単予め抗体に固定化された光増感剤ビーズによって検ローサイトメーターで個々の粒子の蛍光を測定す知られている。以下にEVsの一例として、エクソソーム

一分子、またはEVsを介して構成される信号の送受出する手法であるため、精製を行うことなくがん由来ることで、粒子の大きさや、蛍光を発している粒子の構造2)について説明する（図3）。

信によって行われている。がんの進行と転移においてのEVsを検出できる。本法により、結腸直腸がん患者の数を測定する手法であり、細胞の解析方法とし

2.1 細胞外小胞についても、がん細胞由来のエクソソームを媒介するタンパクから採血した血液では「CD147」を含むEVsが多く検て使用されてきた。
しかし、数µmもある細胞とは質が関与していることが示唆された。がん細胞から出されることが報告されている。

異なり、100nm程度とサイズの小さいエクソソー

1983年にJohnstoneらによって、脂質二重膜構造分泌されるエクソソームは、膜表面に存在するインテ

ムを直 接 検出することは困 難であるため、予めを有する100nmほどのEVsが発見され、1987年にグリン（インテグリン末端のフィブロネクチンという部

ビーズに固定化したエクソソームに蛍光色素結合「エクソソーム」と命名された。発見当初、エクソソーム位）を介して細胞の指向性・運動性を促進すること

は細胞内や細胞膜に含まれる余分なタンパク質を細ができる。さらに、血管透過性を誘発することによっ

胞外に排出するためのごみ袋として考えられていたて、周囲のみでなく離れた非腫瘍細胞の細胞生理機が、1996年にはRaposoらによって細胞間のコミュニ

能を変化させ、がん細胞の播種および増殖を可能に

ケーションツールとして機能していることが明らかとなすることができる。

し、ウイルスなどの抗原と結合することで免疫を活性化する。

同定と定量化は依然として困難である。

３． 細胞外小胞の検出手法

4 フローサイトメトリー（FCM）2)

IC法は、妊娠検査やインフルエンザウイルス、新型コ
ロナウイルスの検査キットなどに適用されている検査手法である。イムノクロマト試験紙に固定化された抗体IC法を用いた検査は多くの場合、疾病にり患していメンブレンに展開した溶液を吸い上げる駆動力

るかどうかを簡易的に判断するための定性検査を目となる材料である。

的として使用される。唾液や尿などの液状物質をイム

吸水パッドに吸水できる水分量は、おおむね吸ノクロマト試験紙の上流側（図6の左端）に接触させる

水パッドの厚みに比例する。

ことにより検査できる。

4 バッキングシート

・標識用抗体B捕捉用抗体
メンブレンのControl Line上に固定化される抗体でいる標識材、検体用抗体A、標識用抗体B、標識用抗体である。バッキングシートはポリスチレン、
ポリエ

体B捕捉用抗体について、以下説明する。

例えば、標識用抗体Bとして、
マウスIgG抗体を使用する場合、標識用抗体B捕捉用抗体には抗マウスIgG抗体を使用できる。
メンブレンのTest Line及びControl Line上にそれぞと、標識材に固定化された抗体を用い、試験紙上で検れ抗体を固定化させた後、ウシ血清アルブミン（BSA）

体（ウイルスやタンパク質など）をサンドイッチすることやカゼインを含むブロッキング試薬を用いてメンブレ

で検査対象物を検出する仕組みとなっている。ハーフ

ン全体をコーティングし、意図しない反応（非特異検ストリップと呼ばれる形式のイムノクロマト試験紙の模出）やバックグラウンドの着色を抑制する。

式図を示す
（図5）。
また、図6にイムノクロマト試験紙のり患している（検体が存在する）場合、Test Lineに固

写真を示す
（図6）。

EVsをターゲットとしたリキッドバイオプシーの研究
は、直近10年の間に拡大しており、EVsの検出手法に

図8

銀ナノプレートのアスペクト比と色調ついても様々な手法が開発されている。現在一般的に標識物）が検体と反応することにより、Test Lineに標識材が集積する。
また、Test Lineに捕捉された検体と反使用されている、代表的なEVs検出手法を以下に示す。

化方法やブロッキング条件の最適化、ならびに金ナノプレートへの抗体の標識方法などを工夫した。
説明する（図10）。

図10(a) EVsを含む検体溶液を試験紙に展開すると、試験紙

験では、Test LineとControl Lineの2か所に標識材由来の着色が認められる。

には金ナノプレート（AuPL）に標識した抗体と結合する抗体（抗体捕捉用抗体）が固定化されている。
(b) 金ナノプレートを標識した抗体溶液を展開すると、(a)のステップで試験紙上に固定化されたEVsと結合する。
(c) EVsが捕捉された部分に金ナノプレート標識抗体が集積することで、青色のラインが目視確認できる。
3.2.3 Exorapid-qICの内容物

イムノクロマト試験紙は下記1〜4の部材で構成される。

図7

IC法の陽性・陰性試験（模式図）

認められる。
図9 マルチカラーでの多検体同時検出

検査時間

短（0.75時間）

短〜中
（3時間）

長
（5〜8時間）

短
（1時間）

短
（1時間）

操作性

◎

○

△

○

○

スループット性

○

◎

○

△

△

検出感度

○

○〜◎

○

◎

○〜◎

Exorapid-qICには下記の内容物が含まれている（図11）。

①

②

④

③

○

○

△

（やや高価）（やや高価）

（高価）

（高価）

不要
─

必要
（やや高価）

必要（やや高価）

必要
（高価）

必要
（高価）

Exorapid-qICはEVsを含む検体溶液の展開ス

TestとControlの2本のラインが出現する。試験時間

結乾燥保存したものである。

テップ（①）と、EVs表面抗原であるCD9を認識する抗は全工程で45分程度であり、迅速な評価が可能であ

純水で溶解することで使用できる。

体を標識した金ナノプレートの展開ステップ（②）の2る。試験後に台紙に試験紙を貼付し、スキャナーやプ

段階でEVsを検出する（図12）。EVsを含まない場合

リンタなどで保存した画像を、Image J（アメリカ国立

CD9のリコンビナントタンパク質を凍結乾燥保存し（試験例A）
では、試験紙上にControlのラインのみが衛生研究所の開発したフリーソフト）で解析することたものである。

出現し、EVsを含む場合（試験例B）
では、試験紙上ににより簡易的な定量ができる。

② 標準物質[凍結乾燥]

培養上清（75μL）

図13

ある。

④ 洗浄液

⑤ イムノクロマト試験紙
Test Line、Control Lineにあらかじめ抗体が塗布された試験紙である。
⑥ 96well プレート

図11 Exorapid-qICの内容物

Exorapid-qICにより迅速・簡便にEVsを検出するこjinkou/geppo/nengai21/dl/kekka.pdf）とができるため、EVs関連研究の推進・発展への寄

2）落谷孝広, 吉岡祐亮「医療を変えるエクソソーム-与が期待される。
また、将来的には早期のがん診断

生体機能から疾患メカニズム、臨床応用まで」技術への応用も期待される。

（化学同人, 第1版第1刷, 2018年8月25日発行）される。
また、直近では美容・健康の分野でも利用さ血清量（μL）

Evs分泌時間（時間）②の希釈や、検体の希釈に使用するための溶液でである。

（https://www.mhlw.go.jp/toukei/saikin/hw/

れるようになり「エクソソーム」という用語の認知度

培養上清（75μL）

分泌促進剤（+）となり、今後の技術発展に貢献することを期待している。

3）Borges FT, Reis LA, Schor N. Braz J Med Biol
Res, 46(10), 824-30(2013)4）門田 宰 他2名「日薬理誌（Folia Pharmacol. Jpn.）」
149, 119〜122（2017）5）高桑 雄一「綜 説(Review Article)：膜(MEMBRANE)」
20(2), 92-102(1995)
6）Mercedes Tkach, Clotilde Théry, Cell 164,
March 10(2016)7）中瀬生彦「生物物理」62（1），13-18（2022）
8）Sushrut Kamerkar et al., Nature volume 546,
498‒503 (2017)9）Yusuke Yoshioka et al.,NATURE COMMUNICATIONS, 5, article number:3591(2014)

量線を作成できる。

試 験 紙 への 溶 液 の 展 開を行うためのプレート

ト（弊社製品名：Exorapid-qIC）について解説した。

シーによるがんの早期検査の材料として大いに期待

純水で溶解し、希釈系列ごとに試験することで検試験紙の洗浄に使用する溶液である。検体の展開⑥

年計（概数）の概況

E Vs 、
とりわけエクソソームは、
リキッドバイオプ

EVs数（×108個）

1）厚生労働省 令和３年(2021)人口動態統計月報

プレート」を標識材として使用したイムノクロマトキッが高まっているなか、Exorapid-qICが研究の一助

後、および標識抗体の展開後に使用する。

⑤

△

（安価）

③ 検体希釈液定された検体用抗体Aと抗体標識物が結合せず、標識
は、Control Lineの1か所のみに標識材由来の着色が④FCM[凍結乾燥]

Test LineにはEVsと結合する抗体が、Control Line

Lineで検体の捕捉が行われないため、Test Lineに固材が集積しない。
そのため、検体を含まない陰性試験で① 金ナノプレート標識抗体

弊社製の金ナノプレートにCD9抗体を標識し、凍一方、り患していない（検体が存在しない）場合、Test

図6 イムノクロマト試験紙

③NTA

検出機器

上に固定化された抗体によってEVsが捕捉される。

された抗体と結合する。
したがって、検体を含む陽性試

図5 イムノクロマト試験紙（模式図）

イムノクロマトグラフィーへの適用

EVs検出の仕組み

例Bについては、市販の血清を使用して評価した。
EVsの構造や研究事例、弊社の青色粒子「金ナノ

②WB

図12

Exorapid-qICを用いた試験の概要

35

参考文献

4． おわりに培養し、培養上清から回収したEVsを評価した。試験

検査手法の比較（弊社調べ）①ELISA◎DNTコーティング技報 No.23
解説­3
迅速・簡便な研究用試薬「細胞外小胞用イムノクロマトキット」

なお、試験例A,C,Dについては、がん由来の細胞を紹介する（図13）。

Exorapid-qIC

初期費用

Exorapid-qICによるEVsの検出の仕組みについて応しなかった標識用抗体BはControl Lineに固定化

3.2 細胞外小胞の検出方法としての速・簡便に検出できる「細胞外小胞用イムノクロマト

定化された検体用抗体Aと検体が反応する。
その際、あらかじめ標識材に固定化された標識用抗体B（抗体

抗体結合させてフローサイトメーターで検出する

今般、弊社の貴金属ナノ粒子を活用し、EVsを迅

表3あり、標識用抗体Bと結合する抗体が用いられる。

以下、IC法の試験例を示す（図7）。図7に記載されてメンブレンと吸水パッドを固定化するための支持

また、標識用抗体Bは、検体や後述する標識用抗体B
捕捉用抗体と反応する抗体が用いられる。

手法がとられている。
3.1 細胞外小胞の一般的な検出手法

検体と反応する抗体が用いられる。

メンブレンのTest Line、Control Lineと呼ばれる

い、酵素標識した抗体を用いて蛍光や化学発光

エクソソームなどの粒 子に励 起 光を当てて、フを機にEVsに関連した研究が活発となった 。

ど、抗体と結合可能なタンパク質が存在しており、EVs

遺伝子変異）に作用するshort hairpin RNAを内包「ExoScreen法」はEVsを2種類の抗体で捕捉し、

図3 エクソソームの構造

標識材を固定化する抗体である。貴金属ナノ粒子をエクソソーム内に存在し、分泌元の細胞に由来す

2.3.1 細胞外小胞による情報伝達とがんの転移6)2)ト比などを調整することにより色調をコントロールでき

後、ゲルから微多孔膜へのパターンの転写を行して活発に取り上げられている。エクソソームを識別２．細胞外小胞とは検討が進められている。

ん細胞に対して、K-Rasの変異体（がん細胞における2.3 エクソソーム研究事例

達物質として非常に有用であることから、研究対象とで説明したようにEVsは表面にCD9、CD63、CD81な量の違い）から、検体中のタンパク質を分離した

予め遠心分離などで精製しておくことが好ましい。

EVsの中でも特に、エクソソームは細胞間の情報伝・標識用抗体B（細胞の取り込み機構の1つ）を誘導している膵臓が3 ナノトラッキング解析（NTA）2),13)④と比較し、専用の検出機器を必要とせず、操作が簡形状の貴金属ナノ粒子については、
それらのアスペク能する部位である。

殖が抑制されることを示した。

検査薬などで広く使用されているIC法を用いた。2.2などが使用されており、診断薬メーカー各社で様々な

3 吸水パッド⑤ MHC分子2)Exorapid-qICを使用した試験例について以下に液の展開を補助する役割がある。

出法である。電気泳動による移動度の違い（分子3.2.1 イムノクロマトグラフィー（IC）法とは較した結果を示す（表3）。

存在する。展開速度は、
メンブレン上の抗体と検究チームは生体内において、マクロピノサイトーシス※商品紹介：https://www.dnt.co.jp/technology/new-business/exorapid-qic/

Exorapid-qICは3.1に記載のEVs検出手法①〜

いる。
プレート状やロッド状といった、異方性を有する細胞どうしのコミュニケーションツールとして機細胞外小胞用イムノクロマトキット

EVsを迅速かつ簡便に検出する手法として、市販のノ粒子、または着色したセルロースナノファイバー粒子

的もある。

図4

メンブレンのTest Line上に固定化される抗体であり、ドとメンブレンを接触させ、毛細管現象による溶ウェスタンブロッティングは、
タンパク質の免疫検④ 核酸（mRNA, miRNAなど）2)

3.3 Exorapid-qICを使用した試験例

く、溶液の展開速度の異なる複数のグレードがの次世代キャリアとして期待されている。Kalluriの研34

便で検査時間が短い特長がある。他の検出手法と比弊社では様々な色調の貴金属ナノ粒子を開発して受容体である。

33

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解説­3
迅速・簡便な研究用試薬「細胞外小胞用イムノクロマトキット」

3.2.4 Exorapid-qICの特長

標識材には貴金属ナノ粒子、着色したラテックスナ

2 トップフィルム

32

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3.2.2 EVs検出用イムノクロマトキットの開発

着剤を貼り合わせた構成になっている。吸水パッる赤色の球状金ナノ粒子が使用されている。

31

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・検体用抗体A

ニトロセルロース素材で構成されるタイプが多体との反応性を大きく左右する。

2 ウェスタンブロッティング（WB）2),12)

その他の生体成分も多いことから、がん由来のEVsの金ナノプレート分散液

会社島津製作所」と共同で開発した。

30

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・標識材

学的利点から、治療用分子を細胞内に送達するためンパクの凝集塊を見分けることは不可能なため、

図2

キット（弊社製品名：Exorapid-qIC、図4）」を「株式

29

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ステル、塩化ビニルなどのプラスチックシートに粘

1 メンブレン2量体の膜貫通型の構造をもつ、糖タンパク質

ど）には健康な細胞に由来するEVsも多く存在し、また細胞に由来する物質を含むことが明らかとなり、
これ
図1

クソソームにカプセル化されており、分泌されたエクソ② テトラスパニン鎖（表面抗原）ことができる。エクソソームと同程度の大きさのタった。
さらに、2007年には、エクソソームが分泌元の要としない、血液検査や尿検査などの方法によるがん早アポトーシス小胞の一つ。抗体と抗原（マーカー）の結合により検2)において有望ではあるが、臨床サンプル（血液や尿な

小胞（Extracellular Vesicles：EVs）などが挙げられる。
とりわけ、③は進行したがん細胞のみでなく、ステエクソソームエクソソームの膜上のタンパク質を解析する方法

マイクロRNAや酵素などの「メッセージ」分子はエあり、細胞膜の基本構造とほぼ同じである。

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1 ELISA法2),11)粒子のブラウン運動より解析し粒子数を算出するの対象物質（マーカー）として、血液に含まれる循環物
質が注目されている。
この循環物質としては、腫瘍に由

細胞外小胞の種類

膵臓がんの抑制7),8)28

がん細胞が分泌するEVsの検出は、がん早期診断

近年、がん発見を目的としたリキッドバイオプシー（Magnetic Resonance Imaging）などの画像検査技術「リキッドバイオプシー（Liquid Biopsy）」という。

で明確に区別、単離することは困難である4)。

リキッドバイオプシーきである。
また、侵襲性の低い手法として近年ではMRI

このような検査手法を
期検査技術が求められている2)。

別するマーカーも十分に定まっていないため、現時点

がんの検査手法

2.3.2. エクソソームを介した薬物送達による① 脂質二重膜5)2.2 細胞外小胞の種類と構造

27

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検出強度（輝度解析）

しかしながら、EVsの検出手法には煩雑な工程や高Development of a Quick and Easy Research Reagent Set"Immunochromatographic Kit for Extracellular Vesicles"

スペシャリティ事業部門
スペシャリティ事業部
機能材開発グループ
Speciality Business Div.
Speciality Business Dept.
Functional Materials Development Group26

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検出強度（輝度解析）

迅速・簡便な研究用試薬「細胞外小胞用イムノクロマトキット」

25

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検出強度（mAbs）

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検出強度（輝度解析）

24

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EVs分泌時間（時間）Exorapid-qICを使用した試験例

A）EVsの定量

C）EVs量のモニタリング

Test Lineに捕捉されるEVs量に応じて金ナノプレート

細胞培養上清（ウシ胎児血清（FBS）非含有）を直接標識抗体の集積量が変動するため、Test Lineの色濃

試験紙に展開することにより、EVsの検出が可能であ度を測定することによりEVsの定量が可能である。乳る。細胞培養によるEVs放出量をモニタリングすること

がん細胞MCF-7由来EVsを用いた試験において、ナノにより、培 養 の 管 理などに使 用できる。
（ 細 胞 株：トラッキング装置で解析したEVs数と高い相関性が得

MCF7）られることを確認した。

D）薬剤によるEVs分泌促進評価

B）血清中のEVs検出

培養細胞のEVs分泌促進剤や抑制剤の効果を簡便

血清を直接試験紙に展開することにより、EVsの検出に 評 価 す る こと が 可 能 で あ る 。本 試 験 で はが可能である。展開する血清の量に依存して検出強Cucurbitacin Bによる分泌促進の効果を評価した。

度が増大した。
キットに付属の標準物質を用いて検量（細胞株：HCT116）線を作成することにより、血清中のEVs量を間接的に定量することが可能である。

10）吉岡 祐亮, 落谷 孝広, Cytometry Research26（1）：1 〜 6，2016
11）Mariantonia Logozzi et al., PLoS One. 4(4):e5219(2009)
12）Biji T. Kurien et al., Methods Mol Biol.; 1312:
17‒30.(2015)13）Christina Coughlan et al., Curr Protoc Cell
Biol. September ; 88(1): e110.(2020)

度な技術、あるいは高価な装置を必要とするものが多宗芳和

Yoshikazu SO

宮澤

極性をもった薄いりん脂質が二重になった膜でく、研究者の負担が大きいといった課題がある。そこ

EVsはエクソソームをはじめ、細胞から分泌されるで、弊社は迅速・簡便な検査手法の一つである「イム

様々な小胞体の総称である。100〜1000nm程度のノクロマトグラフィー（Immunochromatography；

大きさを有するマイクロベシクル、1〜5µmのアポトー

IC）法」に着目し、EVsを検出できるICキットの開発を

シス小胞などが存在する（表2）。
アポトーシス小胞は行った。本報では、EVsの構造や研究事例に関する解細胞死により分泌されるが、エクソソームやマイクロベ説をはじめ、IC用の標識材として弊社にて開発した青

シクルは生きている細胞から分泌される。エクソソー

色粒子「金ナノプレート（図2）」を使用した、
イムノクロ

ムは細胞の内部で産生され、マイクロベシクルは細胞マトキットについて解説する。

膜の陥没により産生される3) 。国際細胞外小胞学会（International Society for Extracellular Vesicles：

雄太

Yuta MIYAZAWA

ISEV）において、EVsの分類方法が示されているが、産生や分泌の機構について未解明な部分が多く、識１． はじめに

表1

がん（悪性腫瘍）は1981年以降日本人の死因のトップであり、2021年時点で死因の26.5%を占めている 。
1)

一方でがん疾患の詳細なメカニズムは解明されておらず、寿命の高齢化に伴い、がん患者数が増加傾向にあるなか、革新的ながん予防、診断、治療法の開発が求められている。
がん細胞は分裂速度が正常な細胞と比べて速く、進行度（ステージ）が進むにつれて生存率が低くなるため、早期にがんを発見することががん治療の成功率を高めるカギとなる。
がんの発見には、従来、生体組織を体内から採取する検査手法（組織生検）が用いられてきた。
このような手法
は検査精度に優れるものの、患者の身体的・精神的な負担が大きく、がんの早期検査のスクリーニングには不向

組織生検

画像検査

侵襲性

低い（採血、採尿など）

高い（手術）

低い（撮像）

検査費用

比較的安い

高い

高い

細胞外小胞の種類

検査精度※検査対象による高い※装置による

サイズ（目安）表2

来する①cfDNA（cell free DNA）、②細胞、③細胞外ージ初期のがん細胞からも分泌されるため、がん早期発見のマーカーとして利用できる可能性が高く、研究が盛んに行われている。特に近年研究は著しく活発化しており、論文投稿の件数は2010年以降で指数関数的に増加している（図1）。

が採用されており、直径1cm以下の小さながんの可視化も可能である。
しかし、コストや時間的、地理的な制限があり、早期検査技術としての利用は困難である。
したがって、安価で侵襲性が低く、高度な医療施設・技術を必

マイクロベシクル

50〜150nm

100〜1000nm

1〜5µm

産生機構

細胞からの開口分泌

細胞膜からの出芽細胞死による分泌マーカー

CD9, CD63, CD81など 各細胞特異的マーカー Histone, Annexin V

構成成分

タンパク質、RNA、miRNA、脂質

EVs 論文検索結果出する点ではIC法と同様であるが、ELISA法で脂質二重膜を4回貫通するタンパク質である。

ソームはヒトの恒常性やがんなどの疾患の進行におは試験紙でなく、溶液中で反応を行う。
プレート

CD9、CD63、CD81はエクソソーム検出に利用いて重要な役割を果たしている。さらに、エクソソームにエクソソームマーカーに対する抗体を固定化されるマーカータンパク質として知られている。

は、(i) 低い細胞毒性、(ii) 制御された免疫原性、(iii)

し、エクソソームを捕捉した後、酵素標識した抗細胞間コミュニケーションの効果的な利用などの薬体を用いて蛍光や化学発光により検出する。

③ インテグリン鎖2)標識材の一つである貴金属ナノ粒子は、自由電子のる。一例として、銀ナノプレートのアスペクト比が及ぼ

標識材として使用する場合、貴金属ナノ粒子の分散液を検出する際のターゲット物質にすることができる。本

吸水パッドとメンブレンとの接触を保持するため部分には、それぞれ抗体が固定化されている。Test

局在表面プラズモン共鳴（Localized Surface Plasmon

す色調への影響を示す（図8）。色調の異なる粒子をと標識用抗体Bを含む溶液とを混合することにより、疎キットはEVsを定量することを考慮し、EVs表面に広くに貼付するフィルムである。

Lineには検体と結合する抗体が固定化されており、Resonance：LSPR）に由来する光吸収特性を有し、標識材に使用することにより、IC試験におけるマルチ

水性相互作用による物理吸着を介して標識することが分布するCD9をターゲット物質として選定した。本また、メンブレンが傷つかないように保護する目

Control Lineには試験が正常に行われていることを鮮やかな発色を呈するためICキットに広く使用されてカラーでの多検体同時検出が可能になる
（図9）。

できる。

キットの開発においては、
メンブレンへの抗体の固定チェックするための抗体が固定化されている。

いる。一般的には、化学的安定性の高い金を材質とす

る情報を含んでいる。

したエクソソームを投与することで、顕著にがんの増により検出する。

主要組織適合遺伝子複合体（major histocom
patibility complex；MHC）という。膜表面に存在

2.3.3 ExoScreen を使用した循環細胞外小胞の超高感度リキッドバイオプシー9),10)①、②がエクソソームのタンパク測定を目的とするのに対し、③は粒子数のカウントを目的としている。

できるマーカーとしては、CD9、CD63、CD81などが多細胞生物では、離れた細胞間の情報伝達は単予め抗体に固定化された光増感剤ビーズによって検ローサイトメーターで個々の粒子の蛍光を測定す知られている。以下にEVsの一例として、エクソソーム

一分子、またはEVsを介して構成される信号の送受出する手法であるため、精製を行うことなくがん由来ることで、粒子の大きさや、蛍光を発している粒子の構造2)について説明する（図3）。

信によって行われている。がんの進行と転移においてのEVsを検出できる。本法により、結腸直腸がん患者の数を測定する手法であり、細胞の解析方法とし

2.1 細胞外小胞についても、がん細胞由来のエクソソームを媒介するタンパクから採血した血液では「CD147」を含むEVsが多く検て使用されてきた。
しかし、数µmもある細胞とは質が関与していることが示唆された。がん細胞から出されることが報告されている。

異なり、100nm程度とサイズの小さいエクソソー

1983年にJohnstoneらによって、脂質二重膜構造分泌されるエクソソームは、膜表面に存在するインテ

ムを直 接 検出することは困 難であるため、予めを有する100nmほどのEVsが発見され、1987年にグリン（インテグリン末端のフィブロネクチンという部

ビーズに固定化したエクソソームに蛍光色素結合「エクソソーム」と命名された。発見当初、エクソソーム位）を介して細胞の指向性・運動性を促進すること

は細胞内や細胞膜に含まれる余分なタンパク質を細ができる。さらに、血管透過性を誘発することによっ

胞外に排出するためのごみ袋として考えられていたて、周囲のみでなく離れた非腫瘍細胞の細胞生理機が、1996年にはRaposoらによって細胞間のコミュニ

能を変化させ、がん細胞の播種および増殖を可能に

ケーションツールとして機能していることが明らかとなすることができる。

し、ウイルスなどの抗原と結合することで免疫を活性化する。

同定と定量化は依然として困難である。

３． 細胞外小胞の検出手法

4 フローサイトメトリー（FCM）2)

IC法は、妊娠検査やインフルエンザウイルス、新型コ
ロナウイルスの検査キットなどに適用されている検査手法である。イムノクロマト試験紙に固定化された抗体IC法を用いた検査は多くの場合、疾病にり患していメンブレンに展開した溶液を吸い上げる駆動力

るかどうかを簡易的に判断するための定性検査を目となる材料である。

的として使用される。唾液や尿などの液状物質をイム

吸水パッドに吸水できる水分量は、おおむね吸ノクロマト試験紙の上流側（図6の左端）に接触させる

水パッドの厚みに比例する。

ことにより検査できる。

4 バッキングシート

・標識用抗体B捕捉用抗体
メンブレンのControl Line上に固定化される抗体でいる標識材、検体用抗体A、標識用抗体B、標識用抗体である。バッキングシートはポリスチレン、
ポリエ

体B捕捉用抗体について、以下説明する。

例えば、標識用抗体Bとして、
マウスIgG抗体を使用する場合、標識用抗体B捕捉用抗体には抗マウスIgG抗体を使用できる。
メンブレンのTest Line及びControl Line上にそれぞと、標識材に固定化された抗体を用い、試験紙上で検れ抗体を固定化させた後、ウシ血清アルブミン（BSA）

体（ウイルスやタンパク質など）をサンドイッチすることやカゼインを含むブロッキング試薬を用いてメンブレ

で検査対象物を検出する仕組みとなっている。ハーフ

ン全体をコーティングし、意図しない反応（非特異検ストリップと呼ばれる形式のイムノクロマト試験紙の模出）やバックグラウンドの着色を抑制する。

式図を示す
（図5）。
また、図6にイムノクロマト試験紙のり患している（検体が存在する）場合、Test Lineに固

写真を示す
（図6）。

EVsをターゲットとしたリキッドバイオプシーの研究
は、直近10年の間に拡大しており、EVsの検出手法に

図8

銀ナノプレートのアスペクト比と色調ついても様々な手法が開発されている。現在一般的に標識物）が検体と反応することにより、Test Lineに標識材が集積する。
また、Test Lineに捕捉された検体と反使用されている、代表的なEVs検出手法を以下に示す。

化方法やブロッキング条件の最適化、ならびに金ナノプレートへの抗体の標識方法などを工夫した。
説明する（図10）。

図10(a) EVsを含む検体溶液を試験紙に展開すると、試験紙

験では、Test LineとControl Lineの2か所に標識材由来の着色が認められる。

には金ナノプレート（AuPL）に標識した抗体と結合する抗体（抗体捕捉用抗体）が固定化されている。
(b) 金ナノプレートを標識した抗体溶液を展開すると、(a)のステップで試験紙上に固定化されたEVsと結合する。
(c) EVsが捕捉された部分に金ナノプレート標識抗体が集積することで、青色のラインが目視確認できる。
3.2.3 Exorapid-qICの内容物

イムノクロマト試験紙は下記1〜4の部材で構成される。

図7

IC法の陽性・陰性試験（模式図）

認められる。
図9 マルチカラーでの多検体同時検出

検査時間

短（0.75時間）

短〜中
（3時間）

長
（5〜8時間）

短
（1時間）

短
（1時間）

操作性

◎

○

△

○

○

スループット性

○

◎

○

△

△

検出感度

○

○〜◎

○

◎

○〜◎

Exorapid-qICには下記の内容物が含まれている（図11）。

①

②

④

③

○

○

△

（やや高価）（やや高価）

（高価）

（高価）

不要
─

必要
（やや高価）

必要（やや高価）

必要
（高価）

必要
（高価）

Exorapid-qICはEVsを含む検体溶液の展開ス

TestとControlの2本のラインが出現する。試験時間

結乾燥保存したものである。

テップ（①）と、EVs表面抗原であるCD9を認識する抗は全工程で45分程度であり、迅速な評価が可能であ

純水で溶解することで使用できる。

体を標識した金ナノプレートの展開ステップ（②）の2る。試験後に台紙に試験紙を貼付し、スキャナーやプ

段階でEVsを検出する（図12）。EVsを含まない場合

リンタなどで保存した画像を、Image J（アメリカ国立

CD9のリコンビナントタンパク質を凍結乾燥保存し（試験例A）
では、試験紙上にControlのラインのみが衛生研究所の開発したフリーソフト）で解析することたものである。

出現し、EVsを含む場合（試験例B）
では、試験紙上ににより簡易的な定量ができる。

② 標準物質[凍結乾燥]

培養上清（75μL）

図13

ある。

④ 洗浄液

⑤ イムノクロマト試験紙
Test Line、Control Lineにあらかじめ抗体が塗布された試験紙である。
⑥ 96well プレート

図11 Exorapid-qICの内容物

Exorapid-qICにより迅速・簡便にEVsを検出するこjinkou/geppo/nengai21/dl/kekka.pdf）とができるため、EVs関連研究の推進・発展への寄

2）落谷孝広, 吉岡祐亮「医療を変えるエクソソーム-与が期待される。
また、将来的には早期のがん診断

生体機能から疾患メカニズム、臨床応用まで」技術への応用も期待される。

（化学同人, 第1版第1刷, 2018年8月25日発行）される。
また、直近では美容・健康の分野でも利用さ血清量（μL）

Evs分泌時間（時間）②の希釈や、検体の希釈に使用するための溶液でである。

（https://www.mhlw.go.jp/toukei/saikin/hw/

れるようになり「エクソソーム」という用語の認知度

培養上清（75μL）

分泌促進剤（+）となり、今後の技術発展に貢献することを期待している。

3）Borges FT, Reis LA, Schor N. Braz J Med Biol
Res, 46(10), 824-30(2013)4）門田 宰 他2名「日薬理誌（Folia Pharmacol. Jpn.）」
149, 119〜122（2017）5）高桑 雄一「綜 説(Review Article)：膜(MEMBRANE)」
20(2), 92-102(1995)
6）Mercedes Tkach, Clotilde Théry, Cell 164,
March 10(2016)7）中瀬生彦「生物物理」62（1），13-18（2022）
8）Sushrut Kamerkar et al., Nature volume 546,
498‒503 (2017)9）Yusuke Yoshioka et al.,NATURE COMMUNICATIONS, 5, article number:3591(2014)

量線を作成できる。

試 験 紙 への 溶 液 の 展 開を行うためのプレート

ト（弊社製品名：Exorapid-qIC）について解説した。

シーによるがんの早期検査の材料として大いに期待

純水で溶解し、希釈系列ごとに試験することで検試験紙の洗浄に使用する溶液である。検体の展開⑥

年計（概数）の概況

E Vs 、
とりわけエクソソームは、
リキッドバイオプ

EVs数（×108個）

1）厚生労働省 令和３年(2021)人口動態統計月報

プレート」を標識材として使用したイムノクロマトキッが高まっているなか、Exorapid-qICが研究の一助

後、および標識抗体の展開後に使用する。

⑤

△

（安価）

③ 検体希釈液定された検体用抗体Aと抗体標識物が結合せず、標識
は、Control Lineの1か所のみに標識材由来の着色が④FCM[凍結乾燥]

Test LineにはEVsと結合する抗体が、Control Line

Lineで検体の捕捉が行われないため、Test Lineに固材が集積しない。
そのため、検体を含まない陰性試験で① 金ナノプレート標識抗体

弊社製の金ナノプレートにCD9抗体を標識し、凍一方、り患していない（検体が存在しない）場合、Test

図6 イムノクロマト試験紙

③NTA

検出機器

上に固定化された抗体によってEVsが捕捉される。

された抗体と結合する。
したがって、検体を含む陽性試

図5 イムノクロマト試験紙（模式図）

イムノクロマトグラフィーへの適用

EVs検出の仕組み

例Bについては、市販の血清を使用して評価した。
EVsの構造や研究事例、弊社の青色粒子「金ナノ

②WB

図12

Exorapid-qICを用いた試験の概要

35

参考文献

4． おわりに培養し、培養上清から回収したEVsを評価した。試験

検査手法の比較（弊社調べ）①ELISA◎DNTコーティング技報 No.23
解説­3
迅速・簡便な研究用試薬「細胞外小胞用イムノクロマトキット」

なお、試験例A,C,Dについては、がん由来の細胞を紹介する（図13）。

Exorapid-qIC

初期費用

Exorapid-qICによるEVsの検出の仕組みについて応しなかった標識用抗体BはControl Lineに固定化

3.2 細胞外小胞の検出方法としての速・簡便に検出できる「細胞外小胞用イムノクロマト

定化された検体用抗体Aと検体が反応する。
その際、あらかじめ標識材に固定化された標識用抗体B（抗体

抗体結合させてフローサイトメーターで検出する

今般、弊社の貴金属ナノ粒子を活用し、EVsを迅

表3あり、標識用抗体Bと結合する抗体が用いられる。

以下、IC法の試験例を示す（図7）。図7に記載されてメンブレンと吸水パッドを固定化するための支持

また、標識用抗体Bは、検体や後述する標識用抗体B
捕捉用抗体と反応する抗体が用いられる。

手法がとられている。
3.1 細胞外小胞の一般的な検出手法

検体と反応する抗体が用いられる。

メンブレンのTest Line、Control Lineと呼ばれる

い、酵素標識した抗体を用いて蛍光や化学発光

エクソソームなどの粒 子に励 起 光を当てて、フを機にEVsに関連した研究が活発となった 。

ど、抗体と結合可能なタンパク質が存在しており、EVs

遺伝子変異）に作用するshort hairpin RNAを内包「ExoScreen法」はEVsを2種類の抗体で捕捉し、

図3 エクソソームの構造

標識材を固定化する抗体である。貴金属ナノ粒子をエクソソーム内に存在し、分泌元の細胞に由来す

2.3.1 細胞外小胞による情報伝達とがんの転移6)2)ト比などを調整することにより色調をコントロールでき

後、ゲルから微多孔膜へのパターンの転写を行して活発に取り上げられている。エクソソームを識別２．細胞外小胞とは検討が進められている。

ん細胞に対して、K-Rasの変異体（がん細胞における2.3 エクソソーム研究事例

達物質として非常に有用であることから、研究対象とで説明したようにEVsは表面にCD9、CD63、CD81な量の違い）から、検体中のタンパク質を分離した

予め遠心分離などで精製しておくことが好ましい。

EVsの中でも特に、エクソソームは細胞間の情報伝・標識用抗体B（細胞の取り込み機構の1つ）を誘導している膵臓が3 ナノトラッキング解析（NTA）2),13)④と比較し、専用の検出機器を必要とせず、操作が簡形状の貴金属ナノ粒子については、
それらのアスペク能する部位である。

殖が抑制されることを示した。

検査薬などで広く使用されているIC法を用いた。2.2などが使用されており、診断薬メーカー各社で様々な

3 吸水パッド⑤ MHC分子2)Exorapid-qICを使用した試験例について以下に液の展開を補助する役割がある。

出法である。電気泳動による移動度の違い（分子3.2.1 イムノクロマトグラフィー（IC）法とは較した結果を示す（表3）。

存在する。展開速度は、
メンブレン上の抗体と検究チームは生体内において、マクロピノサイトーシス※商品紹介：https://www.dnt.co.jp/technology/new-business/exorapid-qic/

Exorapid-qICは3.1に記載のEVs検出手法①〜

いる。
プレート状やロッド状といった、異方性を有する細胞どうしのコミュニケーションツールとして機細胞外小胞用イムノクロマトキット

EVsを迅速かつ簡便に検出する手法として、市販のノ粒子、または着色したセルロースナノファイバー粒子

的もある。

図4

メンブレンのTest Line上に固定化される抗体であり、ドとメンブレンを接触させ、毛細管現象による溶ウェスタンブロッティングは、
タンパク質の免疫検④ 核酸（mRNA, miRNAなど）2)

3.3 Exorapid-qICを使用した試験例

く、溶液の展開速度の異なる複数のグレードがの次世代キャリアとして期待されている。Kalluriの研34

便で検査時間が短い特長がある。他の検出手法と比弊社では様々な色調の貴金属ナノ粒子を開発して受容体である。

33

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3.2.4 Exorapid-qICの特長

標識材には貴金属ナノ粒子、着色したラテックスナ

2 トップフィルム

32

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3.2.2 EVs検出用イムノクロマトキットの開発

着剤を貼り合わせた構成になっている。吸水パッる赤色の球状金ナノ粒子が使用されている。

31

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・検体用抗体A

ニトロセルロース素材で構成されるタイプが多体との反応性を大きく左右する。

2 ウェスタンブロッティング（WB）2),12)

その他の生体成分も多いことから、がん由来のEVsの金ナノプレート分散液

会社島津製作所」と共同で開発した。

30

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・標識材

学的利点から、治療用分子を細胞内に送達するためンパクの凝集塊を見分けることは不可能なため、

図2

キット（弊社製品名：Exorapid-qIC、図4）」を「株式

29

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ステル、塩化ビニルなどのプラスチックシートに粘

1 メンブレン2量体の膜貫通型の構造をもつ、糖タンパク質

ど）には健康な細胞に由来するEVsも多く存在し、また細胞に由来する物質を含むことが明らかとなり、
これ
図1

クソソームにカプセル化されており、分泌されたエクソ② テトラスパニン鎖（表面抗原）ことができる。エクソソームと同程度の大きさのタった。
さらに、2007年には、エクソソームが分泌元の要としない、血液検査や尿検査などの方法によるがん早アポトーシス小胞の一つ。抗体と抗原（マーカー）の結合により検2)において有望ではあるが、臨床サンプル（血液や尿な

小胞（Extracellular Vesicles：EVs）などが挙げられる。
とりわけ、③は進行したがん細胞のみでなく、ステエクソソームエクソソームの膜上のタンパク質を解析する方法

マイクロRNAや酵素などの「メッセージ」分子はエあり、細胞膜の基本構造とほぼ同じである。

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1 ELISA法2),11)粒子のブラウン運動より解析し粒子数を算出するの対象物質（マーカー）として、血液に含まれる循環物
質が注目されている。
この循環物質としては、腫瘍に由

細胞外小胞の種類

膵臓がんの抑制7),8)28

がん細胞が分泌するEVsの検出は、がん早期診断

近年、がん発見を目的としたリキッドバイオプシー（Magnetic Resonance Imaging）などの画像検査技術「リキッドバイオプシー（Liquid Biopsy）」という。

で明確に区別、単離することは困難である4)。

リキッドバイオプシーきである。
また、侵襲性の低い手法として近年ではMRI

このような検査手法を
期検査技術が求められている2)。

別するマーカーも十分に定まっていないため、現時点

がんの検査手法

2.3.2. エクソソームを介した薬物送達による① 脂質二重膜5)2.2 細胞外小胞の種類と構造

27

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検出強度（輝度解析）

しかしながら、EVsの検出手法には煩雑な工程や高Development of a Quick and Easy Research Reagent Set"Immunochromatographic Kit for Extracellular Vesicles"

スペシャリティ事業部門
スペシャリティ事業部
機能材開発グループ
Speciality Business Div.
Speciality Business Dept.
Functional Materials Development Group26

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検出強度（輝度解析）

迅速・簡便な研究用試薬「細胞外小胞用イムノクロマトキット」

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検出強度（mAbs）

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検出強度（輝度解析）

24

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EVs分泌時間（時間）Exorapid-qICを使用した試験例

A）EVsの定量

C）EVs量のモニタリング

Test Lineに捕捉されるEVs量に応じて金ナノプレート

細胞培養上清（ウシ胎児血清（FBS）非含有）を直接標識抗体の集積量が変動するため、Test Lineの色濃

試験紙に展開することにより、EVsの検出が可能であ度を測定することによりEVsの定量が可能である。乳る。細胞培養によるEVs放出量をモニタリングすること

がん細胞MCF-7由来EVsを用いた試験において、ナノにより、培 養 の 管 理などに使 用できる。
（ 細 胞 株：トラッキング装置で解析したEVs数と高い相関性が得

MCF7）られることを確認した。

D）薬剤によるEVs分泌促進評価

B）血清中のEVs検出

培養細胞のEVs分泌促進剤や抑制剤の効果を簡便

血清を直接試験紙に展開することにより、EVsの検出に 評 価 す る こと が 可 能 で あ る 。本 試 験 で はが可能である。展開する血清の量に依存して検出強Cucurbitacin Bによる分泌促進の効果を評価した。

度が増大した。
キットに付属の標準物質を用いて検量（細胞株：HCT116）線を作成することにより、血清中のEVs量を間接的に定量することが可能である。

10）吉岡 祐亮, 落谷 孝広, Cytometry Research26（1）：1 〜 6，2016
11）Mariantonia Logozzi et al., PLoS One. 4(4):e5219(2009)
12）Biji T. Kurien et al., Methods Mol Biol.; 1312:
17‒30.(2015)13）Christina Coughlan et al., Curr Protoc Cell
Biol. September ; 88(1): e110.(2020)

度な技術、あるいは高価な装置を必要とするものが多宗芳和

Yoshikazu SO

宮澤

極性をもった薄いりん脂質が二重になった膜でく、研究者の負担が大きいといった課題がある。そこ

EVsはエクソソームをはじめ、細胞から分泌されるで、弊社は迅速・簡便な検査手法の一つである「イム

様々な小胞体の総称である。100〜1000nm程度のノクロマトグラフィー（Immunochromatography；

大きさを有するマイクロベシクル、1〜5µmのアポトー

IC）法」に着目し、EVsを検出できるICキットの開発を

シス小胞などが存在する（表2）。
アポトーシス小胞は行った。本報では、EVsの構造や研究事例に関する解細胞死により分泌されるが、エクソソームやマイクロベ説をはじめ、IC用の標識材として弊社にて開発した青

シクルは生きている細胞から分泌される。エクソソー

色粒子「金ナノプレート（図2）」を使用した、
イムノクロ

ムは細胞の内部で産生され、マイクロベシクルは細胞マトキットについて解説する。

膜の陥没により産生される3) 。国際細胞外小胞学会（International Society for Extracellular Vesicles：

雄太

Yuta MIYAZAWA

ISEV）において、EVsの分類方法が示されているが、産生や分泌の機構について未解明な部分が多く、識１． はじめに

表1

がん（悪性腫瘍）は1981年以降日本人の死因のトップであり、2021年時点で死因の26.5%を占めている 。
1)

一方でがん疾患の詳細なメカニズムは解明されておらず、寿命の高齢化に伴い、がん患者数が増加傾向にあるなか、革新的ながん予防、診断、治療法の開発が求められている。
がん細胞は分裂速度が正常な細胞と比べて速く、進行度（ステージ）が進むにつれて生存率が低くなるため、早期にがんを発見することががん治療の成功率を高めるカギとなる。
がんの発見には、従来、生体組織を体内から採取する検査手法（組織生検）が用いられてきた。
このような手法
は検査精度に優れるものの、患者の身体的・精神的な負担が大きく、がんの早期検査のスクリーニングには不向

組織生検

画像検査

侵襲性

低い（採血、採尿など）

高い（手術）

低い（撮像）

検査費用

比較的安い

高い

高い

細胞外小胞の種類

検査精度※検査対象による高い※装置による

サイズ（目安）表2

来する①cfDNA（cell free DNA）、②細胞、③細胞外ージ初期のがん細胞からも分泌されるため、がん早期発見のマーカーとして利用できる可能性が高く、研究が盛んに行われている。特に近年研究は著しく活発化しており、論文投稿の件数は2010年以降で指数関数的に増加している（図1）。

が採用されており、直径1cm以下の小さながんの可視化も可能である。
しかし、コストや時間的、地理的な制限があり、早期検査技術としての利用は困難である。
したがって、安価で侵襲性が低く、高度な医療施設・技術を必

マイクロベシクル

50〜150nm

100〜1000nm

1〜5µm

産生機構

細胞からの開口分泌

細胞膜からの出芽細胞死による分泌マーカー

CD9, CD63, CD81など 各細胞特異的マーカー Histone, Annexin V

構成成分

タンパク質、RNA、miRNA、脂質

EVs 論文検索結果出する点ではIC法と同様であるが、ELISA法で脂質二重膜を4回貫通するタンパク質である。

ソームはヒトの恒常性やがんなどの疾患の進行におは試験紙でなく、溶液中で反応を行う。
プレート

CD9、CD63、CD81はエクソソーム検出に利用いて重要な役割を果たしている。さらに、エクソソームにエクソソームマーカーに対する抗体を固定化されるマーカータンパク質として知られている。

は、(i) 低い細胞毒性、(ii) 制御された免疫原性、(iii)

し、エクソソームを捕捉した後、酵素標識した抗細胞間コミュニケーションの効果的な利用などの薬体を用いて蛍光や化学発光により検出する。

③ インテグリン鎖2)標識材の一つである貴金属ナノ粒子は、自由電子のる。一例として、銀ナノプレートのアスペクト比が及ぼ

標識材として使用する場合、貴金属ナノ粒子の分散液を検出する際のターゲット物質にすることができる。本

吸水パッドとメンブレンとの接触を保持するため部分には、それぞれ抗体が固定化されている。Test

局在表面プラズモン共鳴（Localized Surface Plasmon

す色調への影響を示す（図8）。色調の異なる粒子をと標識用抗体Bを含む溶液とを混合することにより、疎キットはEVsを定量することを考慮し、EVs表面に広くに貼付するフィルムである。

Lineには検体と結合する抗体が固定化されており、Resonance：LSPR）に由来する光吸収特性を有し、標識材に使用することにより、IC試験におけるマルチ

水性相互作用による物理吸着を介して標識することが分布するCD9をターゲット物質として選定した。本また、メンブレンが傷つかないように保護する目

Control Lineには試験が正常に行われていることを鮮やかな発色を呈するためICキットに広く使用されてカラーでの多検体同時検出が可能になる
（図9）。

できる。

キットの開発においては、
メンブレンへの抗体の固定チェックするための抗体が固定化されている。

いる。一般的には、化学的安定性の高い金を材質とす

る情報を含んでいる。

したエクソソームを投与することで、顕著にがんの増により検出する。

主要組織適合遺伝子複合体（major histocom
patibility complex；MHC）という。膜表面に存在

2.3.3 ExoScreen を使用した循環細胞外小胞の超高感度リキッドバイオプシー9),10)①、②がエクソソームのタンパク測定を目的とするのに対し、③は粒子数のカウントを目的としている。

できるマーカーとしては、CD9、CD63、CD81などが多細胞生物では、離れた細胞間の情報伝達は単予め抗体に固定化された光増感剤ビーズによって検ローサイトメーターで個々の粒子の蛍光を測定す知られている。以下にEVsの一例として、エクソソーム

一分子、またはEVsを介して構成される信号の送受出する手法であるため、精製を行うことなくがん由来ることで、粒子の大きさや、蛍光を発している粒子の構造2)について説明する（図3）。

信によって行われている。がんの進行と転移においてのEVsを検出できる。本法により、結腸直腸がん患者の数を測定する手法であり、細胞の解析方法とし

2.1 細胞外小胞についても、がん細胞由来のエクソソームを媒介するタンパクから採血した血液では「CD147」を含むEVsが多く検て使用されてきた。
しかし、数µmもある細胞とは質が関与していることが示唆された。がん細胞から出されることが報告されている。

異なり、100nm程度とサイズの小さいエクソソー

1983年にJohnstoneらによって、脂質二重膜構造分泌されるエクソソームは、膜表面に存在するインテ

ムを直 接 検出することは困 難であるため、予めを有する100nmほどのEVsが発見され、1987年にグリン（インテグリン末端のフィブロネクチンという部

ビーズに固定化したエクソソームに蛍光色素結合「エクソソーム」と命名された。発見当初、エクソソーム位）を介して細胞の指向性・運動性を促進すること

は細胞内や細胞膜に含まれる余分なタンパク質を細ができる。さらに、血管透過性を誘発することによっ

胞外に排出するためのごみ袋として考えられていたて、周囲のみでなく離れた非腫瘍細胞の細胞生理機が、1996年にはRaposoらによって細胞間のコミュニ

能を変化させ、がん細胞の播種および増殖を可能に

ケーションツールとして機能していることが明らかとなすることができる。

し、ウイルスなどの抗原と結合することで免疫を活性化する。

同定と定量化は依然として困難である。

３． 細胞外小胞の検出手法

4 フローサイトメトリー（FCM）2)

IC法は、妊娠検査やインフルエンザウイルス、新型コ
ロナウイルスの検査キットなどに適用されている検査手法である。イムノクロマト試験紙に固定化された抗体IC法を用いた検査は多くの場合、疾病にり患していメンブレンに展開した溶液を吸い上げる駆動力

るかどうかを簡易的に判断するための定性検査を目となる材料である。

的として使用される。唾液や尿などの液状物質をイム

吸水パッドに吸水できる水分量は、おおむね吸ノクロマト試験紙の上流側（図6の左端）に接触させる

水パッドの厚みに比例する。

ことにより検査できる。

4 バッキングシート

・標識用抗体B捕捉用抗体
メンブレンのControl Line上に固定化される抗体でいる標識材、検体用抗体A、標識用抗体B、標識用抗体である。バッキングシートはポリスチレン、
ポリエ

体B捕捉用抗体について、以下説明する。

例えば、標識用抗体Bとして、
マウスIgG抗体を使用する場合、標識用抗体B捕捉用抗体には抗マウスIgG抗体を使用できる。
メンブレンのTest Line及びControl Line上にそれぞと、標識材に固定化された抗体を用い、試験紙上で検れ抗体を固定化させた後、ウシ血清アルブミン（BSA）

体（ウイルスやタンパク質など）をサンドイッチすることやカゼインを含むブロッキング試薬を用いてメンブレ

で検査対象物を検出する仕組みとなっている。ハーフ

ン全体をコーティングし、意図しない反応（非特異検ストリップと呼ばれる形式のイムノクロマト試験紙の模出）やバックグラウンドの着色を抑制する。

式図を示す
（図5）。
また、図6にイムノクロマト試験紙のり患している（検体が存在する）場合、Test Lineに固

写真を示す
（図6）。

EVsをターゲットとしたリキッドバイオプシーの研究
は、直近10年の間に拡大しており、EVsの検出手法に

図8

銀ナノプレートのアスペクト比と色調ついても様々な手法が開発されている。現在一般的に標識物）が検体と反応することにより、Test Lineに標識材が集積する。
また、Test Lineに捕捉された検体と反使用されている、代表的なEVs検出手法を以下に示す。

化方法やブロッキング条件の最適化、ならびに金ナノプレートへの抗体の標識方法などを工夫した。
説明する（図10）。

図10(a) EVsを含む検体溶液を試験紙に展開すると、試験紙

験では、Test LineとControl Lineの2か所に標識材由来の着色が認められる。

には金ナノプレート（AuPL）に標識した抗体と結合する抗体（抗体捕捉用抗体）が固定化されている。
(b) 金ナノプレートを標識した抗体溶液を展開すると、(a)のステップで試験紙上に固定化されたEVsと結合する。
(c) EVsが捕捉された部分に金ナノプレート標識抗体が集積することで、青色のラインが目視確認できる。
3.2.3 Exorapid-qICの内容物

イムノクロマト試験紙は下記1〜4の部材で構成される。

図7

IC法の陽性・陰性試験（模式図）

認められる。
図9 マルチカラーでの多検体同時検出

検査時間

短（0.75時間）

短〜中
（3時間）

長
（5〜8時間）

短
（1時間）

短
（1時間）

操作性

◎

○

△

○

○

スループット性

○

◎

○

△

△

検出感度

○

○〜◎

○

◎

○〜◎

Exorapid-qICには下記の内容物が含まれている（図11）。

①

②

④

③

○

○

△

（やや高価）（やや高価）

（高価）

（高価）

不要
─

必要
（やや高価）

必要（やや高価）

必要
（高価）

必要
（高価）

Exorapid-qICはEVsを含む検体溶液の展開ス

TestとControlの2本のラインが出現する。試験時間

結乾燥保存したものである。

テップ（①）と、EVs表面抗原であるCD9を認識する抗は全工程で45分程度であり、迅速な評価が可能であ

純水で溶解することで使用できる。

体を標識した金ナノプレートの展開ステップ（②）の2る。試験後に台紙に試験紙を貼付し、スキャナーやプ

段階でEVsを検出する（図12）。EVsを含まない場合

リンタなどで保存した画像を、Image J（アメリカ国立

CD9のリコンビナントタンパク質を凍結乾燥保存し（試験例A）
では、試験紙上にControlのラインのみが衛生研究所の開発したフリーソフト）で解析することたものである。

出現し、EVsを含む場合（試験例B）
では、試験紙上ににより簡易的な定量ができる。

② 標準物質[凍結乾燥]

培養上清（75μL）

図13

ある。

④ 洗浄液

⑤ イムノクロマト試験紙
Test Line、Control Lineにあらかじめ抗体が塗布された試験紙である。
⑥ 96well プレート

図11 Exorapid-qICの内容物

Exorapid-qICにより迅速・簡便にEVsを検出するこjinkou/geppo/nengai21/dl/kekka.pdf）とができるため、EVs関連研究の推進・発展への寄

2）落谷孝広, 吉岡祐亮「医療を変えるエクソソーム-与が期待される。
また、将来的には早期のがん診断

生体機能から疾患メカニズム、臨床応用まで」技術への応用も期待される。

（化学同人, 第1版第1刷, 2018年8月25日発行）される。
また、直近では美容・健康の分野でも利用さ血清量（μL）

Evs分泌時間（時間）②の希釈や、検体の希釈に使用するための溶液でである。

（https://www.mhlw.go.jp/toukei/saikin/hw/

れるようになり「エクソソーム」という用語の認知度

培養上清（75μL）

分泌促進剤（+）となり、今後の技術発展に貢献することを期待している。

3）Borges FT, Reis LA, Schor N. Braz J Med Biol
Res, 46(10), 824-30(2013)4）門田 宰 他2名「日薬理誌（Folia Pharmacol. Jpn.）」
149, 119〜122（2017）5）高桑 雄一「綜 説(Review Article)：膜(MEMBRANE)」
20(2), 92-102(1995)
6）Mercedes Tkach, Clotilde Théry, Cell 164,
March 10(2016)7）中瀬生彦「生物物理」62（1），13-18（2022）
8）Sushrut Kamerkar et al., Nature volume 546,
498‒503 (2017)9）Yusuke Yoshioka et al.,NATURE COMMUNICATIONS, 5, article number:3591(2014)

量線を作成できる。

試 験 紙 への 溶 液 の 展 開を行うためのプレート

ト（弊社製品名：Exorapid-qIC）について解説した。

シーによるがんの早期検査の材料として大いに期待

純水で溶解し、希釈系列ごとに試験することで検試験紙の洗浄に使用する溶液である。検体の展開⑥

年計（概数）の概況

E Vs 、
とりわけエクソソームは、
リキッドバイオプ

EVs数（×108個）

1）厚生労働省 令和３年(2021)人口動態統計月報

プレート」を標識材として使用したイムノクロマトキッが高まっているなか、Exorapid-qICが研究の一助

後、および標識抗体の展開後に使用する。

⑤

△

（安価）

③ 検体希釈液定された検体用抗体Aと抗体標識物が結合せず、標識
は、Control Lineの1か所のみに標識材由来の着色が④FCM[凍結乾燥]

Test LineにはEVsと結合する抗体が、Control Line

Lineで検体の捕捉が行われないため、Test Lineに固材が集積しない。
そのため、検体を含まない陰性試験で① 金ナノプレート標識抗体

弊社製の金ナノプレートにCD9抗体を標識し、凍一方、り患していない（検体が存在しない）場合、Test

図6 イムノクロマト試験紙

③NTA

検出機器

上に固定化された抗体によってEVsが捕捉される。

された抗体と結合する。
したがって、検体を含む陽性試

図5 イムノクロマト試験紙（模式図）

イムノクロマトグラフィーへの適用

EVs検出の仕組み

例Bについては、市販の血清を使用して評価した。
EVsの構造や研究事例、弊社の青色粒子「金ナノ

②WB

図12

Exorapid-qICを用いた試験の概要

35

参考文献

4． おわりに培養し、培養上清から回収したEVsを評価した。試験

検査手法の比較（弊社調べ）①ELISA◎DNTコーティング技報 No.23
解説­3
迅速・簡便な研究用試薬「細胞外小胞用イムノクロマトキット」

なお、試験例A,C,Dについては、がん由来の細胞を紹介する（図13）。

Exorapid-qIC

初期費用

Exorapid-qICによるEVsの検出の仕組みについて応しなかった標識用抗体BはControl Lineに固定化

3.2 細胞外小胞の検出方法としての速・簡便に検出できる「細胞外小胞用イムノクロマト

定化された検体用抗体Aと検体が反応する。
その際、あらかじめ標識材に固定化された標識用抗体B（抗体

抗体結合させてフローサイトメーターで検出する

今般、弊社の貴金属ナノ粒子を活用し、EVsを迅

表3あり、標識用抗体Bと結合する抗体が用いられる。

以下、IC法の試験例を示す（図7）。図7に記載されてメンブレンと吸水パッドを固定化するための支持

また、標識用抗体Bは、検体や後述する標識用抗体B
捕捉用抗体と反応する抗体が用いられる。

手法がとられている。
3.1 細胞外小胞の一般的な検出手法

検体と反応する抗体が用いられる。

メンブレンのTest Line、Control Lineと呼ばれる

い、酵素標識した抗体を用いて蛍光や化学発光

エクソソームなどの粒 子に励 起 光を当てて、フを機にEVsに関連した研究が活発となった 。

ど、抗体と結合可能なタンパク質が存在しており、EVs

遺伝子変異）に作用するshort hairpin RNAを内包「ExoScreen法」はEVsを2種類の抗体で捕捉し、

図3 エクソソームの構造

標識材を固定化する抗体である。貴金属ナノ粒子をエクソソーム内に存在し、分泌元の細胞に由来す

2.3.1 細胞外小胞による情報伝達とがんの転移6)2)ト比などを調整することにより色調をコントロールでき

後、ゲルから微多孔膜へのパターンの転写を行して活発に取り上げられている。エクソソームを識別２．細胞外小胞とは検討が進められている。

ん細胞に対して、K-Rasの変異体（がん細胞における2.3 エクソソーム研究事例

達物質として非常に有用であることから、研究対象とで説明したようにEVsは表面にCD9、CD63、CD81な量の違い）から、検体中のタンパク質を分離した

予め遠心分離などで精製しておくことが好ましい。

EVsの中でも特に、エクソソームは細胞間の情報伝・標識用抗体B（細胞の取り込み機構の1つ）を誘導している膵臓が3 ナノトラッキング解析（NTA）2),13)④と比較し、専用の検出機器を必要とせず、操作が簡形状の貴金属ナノ粒子については、
それらのアスペク能する部位である。

殖が抑制されることを示した。

検査薬などで広く使用されているIC法を用いた。2.2などが使用されており、診断薬メーカー各社で様々な

3 吸水パッド⑤ MHC分子2)Exorapid-qICを使用した試験例について以下に液の展開を補助する役割がある。

出法である。電気泳動による移動度の違い（分子3.2.1 イムノクロマトグラフィー（IC）法とは較した結果を示す（表3）。

存在する。展開速度は、
メンブレン上の抗体と検究チームは生体内において、マクロピノサイトーシス※商品紹介：https://www.dnt.co.jp/technology/new-business/exorapid-qic/

Exorapid-qICは3.1に記載のEVs検出手法①〜

いる。
プレート状やロッド状といった、異方性を有する細胞どうしのコミュニケーションツールとして機細胞外小胞用イムノクロマトキット

EVsを迅速かつ簡便に検出する手法として、市販のノ粒子、または着色したセルロースナノファイバー粒子

的もある。

図4

メンブレンのTest Line上に固定化される抗体であり、ドとメンブレンを接触させ、毛細管現象による溶ウェスタンブロッティングは、
タンパク質の免疫検④ 核酸（mRNA, miRNAなど）2)

3.3 Exorapid-qICを使用した試験例

く、溶液の展開速度の異なる複数のグレードがの次世代キャリアとして期待されている。Kalluriの研34

便で検査時間が短い特長がある。他の検出手法と比弊社では様々な色調の貴金属ナノ粒子を開発して受容体である。

33

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3.2.4 Exorapid-qICの特長

標識材には貴金属ナノ粒子、着色したラテックスナ

2 トップフィルム

32

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3.2.2 EVs検出用イムノクロマトキットの開発

着剤を貼り合わせた構成になっている。吸水パッる赤色の球状金ナノ粒子が使用されている。

31

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・検体用抗体A

ニトロセルロース素材で構成されるタイプが多体との反応性を大きく左右する。

2 ウェスタンブロッティング（WB）2),12)

その他の生体成分も多いことから、がん由来のEVsの金ナノプレート分散液

会社島津製作所」と共同で開発した。

30

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・標識材

学的利点から、治療用分子を細胞内に送達するためンパクの凝集塊を見分けることは不可能なため、

図2

キット（弊社製品名：Exorapid-qIC、図4）」を「株式

29

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ステル、塩化ビニルなどのプラスチックシートに粘

1 メンブレン2量体の膜貫通型の構造をもつ、糖タンパク質

ど）には健康な細胞に由来するEVsも多く存在し、また細胞に由来する物質を含むことが明らかとなり、
これ
図1

クソソームにカプセル化されており、分泌されたエクソ② テトラスパニン鎖（表面抗原）ことができる。エクソソームと同程度の大きさのタった。
さらに、2007年には、エクソソームが分泌元の要としない、血液検査や尿検査などの方法によるがん早アポトーシス小胞の一つ。抗体と抗原（マーカー）の結合により検2)において有望ではあるが、臨床サンプル（血液や尿な

小胞（Extracellular Vesicles：EVs）などが挙げられる。
とりわけ、③は進行したがん細胞のみでなく、ステエクソソームエクソソームの膜上のタンパク質を解析する方法

マイクロRNAや酵素などの「メッセージ」分子はエあり、細胞膜の基本構造とほぼ同じである。

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1 ELISA法2),11)粒子のブラウン運動より解析し粒子数を算出するの対象物質（マーカー）として、血液に含まれる循環物
質が注目されている。
この循環物質としては、腫瘍に由

細胞外小胞の種類

膵臓がんの抑制7),8)28

がん細胞が分泌するEVsの検出は、がん早期診断

近年、がん発見を目的としたリキッドバイオプシー（Magnetic Resonance Imaging）などの画像検査技術「リキッドバイオプシー（Liquid Biopsy）」という。

で明確に区別、単離することは困難である4)。

リキッドバイオプシーきである。
また、侵襲性の低い手法として近年ではMRI

このような検査手法を
期検査技術が求められている2)。

別するマーカーも十分に定まっていないため、現時点

がんの検査手法

2.3.2. エクソソームを介した薬物送達による① 脂質二重膜5)2.2 細胞外小胞の種類と構造

27

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検出強度（輝度解析）

しかしながら、EVsの検出手法には煩雑な工程や高Development of a Quick and Easy Research Reagent Set"Immunochromatographic Kit for Extracellular Vesicles"

スペシャリティ事業部門
スペシャリティ事業部
機能材開発グループ
Speciality Business Div.
Speciality Business Dept.
Functional Materials Development Group26

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検出強度（輝度解析）

迅速・簡便な研究用試薬「細胞外小胞用イムノクロマトキット」

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検出強度（mAbs）

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検出強度（輝度解析）

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EVs分泌時間（時間）Exorapid-qICを使用した試験例

A）EVsの定量

C）EVs量のモニタリング

Test Lineに捕捉されるEVs量に応じて金ナノプレート

細胞培養上清（ウシ胎児血清（FBS）非含有）を直接標識抗体の集積量が変動するため、Test Lineの色濃

試験紙に展開することにより、EVsの検出が可能であ度を測定することによりEVsの定量が可能である。乳る。細胞培養によるEVs放出量をモニタリングすること

がん細胞MCF-7由来EVsを用いた試験において、ナノにより、培 養 の 管 理などに使 用できる。
（ 細 胞 株：トラッキング装置で解析したEVs数と高い相関性が得

MCF7）られることを確認した。

D）薬剤によるEVs分泌促進評価

B）血清中のEVs検出

培養細胞のEVs分泌促進剤や抑制剤の効果を簡便

血清を直接試験紙に展開することにより、EVsの検出に 評 価 す る こと が 可 能 で あ る 。本 試 験 で はが可能である。展開する血清の量に依存して検出強Cucurbitacin Bによる分泌促進の効果を評価した。

度が増大した。
キットに付属の標準物質を用いて検量（細胞株：HCT116）線を作成することにより、血清中のEVs量を間接的に定量することが可能である。

10）吉岡 祐亮, 落谷 孝広, Cytometry Research26（1）：1 〜 6，2016
11）Mariantonia Logozzi et al., PLoS One. 4(4):e5219(2009)
12）Biji T. Kurien et al., Methods Mol Biol.; 1312:
17‒30.(2015)13）Christina Coughlan et al., Curr Protoc Cell
Biol. September ; 88(1): e110.(2020)