研究助成業績報告集

2022 年度 公募自由課題研究助成

山内進循環器病研究助成

公益財団法人循環器病研究振興財団

No

研

＊

目

次 ＊

究

課

題

研 究 者

頁

1

心血管疾患リスクを早期に予測可能なコレステロール引き抜き能測定法の開発と評価

大川 龍之介1

2

中胚葉において循環器形成細胞が誘導される分子基盤解明

橋本 寿之

13

3

心臓弁形成を制御する「血流ベクトル」を認識した力学応答原理
の解明

福井 一

18

心血管疾患リスクを早期に予測可能なコレステロール引
き抜き能測定法の開発と評価―ビリルビンによる正誤差の影響回避，分析装置に実装可能な新たな測定法の開発および臨床評価―＞ ３行あける．
＞＞

東京医科歯科大学大学院医歯学総合研究科
先端分析検査学分野・教授

大川
＞

龍之介

２行あける．

＞

Ⅰ．緒 言

抜き能を評価し，それぞれのトランスポーターを介し虚血性心疾患，脳卒中は世界の死因の第一位，第二たコレステロール引き抜きの割合（ABCA1（34%），

位を占め（WHO 2019），その死亡者数は増加の一途

SR-B1（20%），ABCG1 やそれ以外の 46%）を示し

を辿っている．これらの疾患の主な原因の一つとしてた（１）．Khera らは，同様の細胞を用いた CEC 評

脂質異常症が知られており，生活習慣の改善により大価法にて，CEC が冠動脈疾患の進行度と逆相関する

きな予防効果が認められることから，早期の病態把握ことを示した（２）．さらに Rohatgi らは，2,924 名が肝要である．高比重リポタンパク（high-densityの患者を対象として CEC を評価し，CEC 高値群がlipoprotein；HDL）は多数の抗粥状動脈硬化機能を有

CEC 低値群よりも CVD のリスクが 67%減少しておすることから，粥状動脈硬化症が引き起こす心血管疾り，さらに HDL-C とは独立したリスクファクターに患の発症リスクの予測として，HDL の量を反映するなり得ることを報告した（３）．その後心血管疾患とHDL コレステロール濃度（HDL-cholesterol；HDL-

CEC との関連が次々と報告されている（４，５，６）．

C）の定量がなされてきた．しかしながら，近年，HDL-

したがって，CEC 測定の臨床応用が世界中から期待

C が必ずしも実際の心血管疾患発症リスクを反映しされているが，従来の CEC 測定法は，前述のようにないとの報告がなされている．この原因は，HDL が細胞や放射性同位元素標識コレステロールを用いる

単一の粒子から成るのではなくタンパクや脂質組成ため，操作の煩雑さ，安全性など種々の課題が残されの異なるヘテロジニアスな粒子の集合であり，それぞおり，未だ普及していない．2018 年に当研究室では，れのサブクラスの持つ抗粥状動脈硬化機能が異なっ細胞や放射性同位体を用いない新しい CEC 評価法でているからである．したがって，HDL の“量”だけある固相化リポソーム結合ゲルビーズ（immobilized

でなく“質”を評価する方法が模索されてきた．近年，liposome-bound gel beads ；ILG）法を開発した（７）．

HDL の抗粥状動脈硬化機能のうちコレステロール引

この方法では細胞のかわりにコレステロールを含む

き抜き能（cholesterol efflux capacity；CEC）が注目

リポソームを固相化したゲルビーズを，放射性標識コを浴びている．CEC は粥状動脈硬化の原因となる泡

レステロールのかわりに蛍光標識コレステロールを沫細胞からコレステロールを受け取り，プラークの縮用いる．無細胞系の方法にもかかわらず，ILG 法によ小に寄与する能力である．HDL の主要なタンパクでる CEC は従来の細胞を用いた従来法と良く相関した．

あるアポリポタンパク A-I（apolipoprotein A-I；apoA-

また，
超遠心で時間をかけて分離するHDL ではなく，

I や HDL が泡沫細胞からコレステロールを引き抜く

ポリエチレングリコールを用いてアポリポプロテイには主に３つの経路を介することが知られている．

ン B 含有リポタンパクを沈殿させた後の上清である

apoA-I は泡沫細胞上に発現するATP 結合カセット輸

BDS（apolipoprotein B-depleted serum）
を用いるが，

送体（ATP-binding cassette transporter；ABC）A1

ILG 法では BDS が血清中の HDL をよく反映していを介して，HDL は ABCG1 や scavenger receptor

ることを示した（８）．また，細胞を用いないため，簡class B type 1（SR-B1）を介して行う．Adorni らは，便で短時間で測定でき，精度は細胞法（CV10%以上）

細胞に放射性標識コレステロールを取り込ませ泡沫

よりもはるかに優れている（本法，CV 3%以下）こと

細胞化した細胞に血清を添加し，コレステロール引きを実証している（９）．

1一方，ILG 法を臨床に応用するにはいくつかの解決

ンパク除去血清（apoB-depleted serum; BDS）の作

すべき課題がある．一つはビリルビンの影響である．

製

血清にビリルビンを添加して CEC を ILG 法による沈殿法はZimettiらの方法を参考に行った（１１）．

に測定すると，ビリルビン濃度依存的に CEC が増加

20%ポリエチレングリコール溶液（200 mM glycine

することが認められた（１０）．また，臨床応用するた

buffer; pH 7.4）を血清に対し 100 : 40 の割合で添加

めには自動化が望ましいが，ILG 法は測定の過程で遠し，室温で 20 分間インキュベーションしたのち，4℃，

心操作が必要で自動分析装置への搭載が困難であっ10,000 rpm，30 分間の遠心を行い，上清を BDS とた．そこで，本研究室では上記の ILG 法に用いたゲ

して回収した．

ルビーズのかわりに磁気ビーズを用いた遠心操作不要な新たな CEC 評価法を開発した（”新規のコレス

Ⅱ-1(d) 固相化リポソーム結合ゲルビーズ（ILG）のテロール引き抜き能測定法” 特願 2021-94456）．し作製

かしながら，この新しい測定法の妥当性確認が不十分

レシチン 10.6 mg とコレステロール 2.3 mg をクロであった．さらに，ILG 法は従来法と良く相関するもロホルムに溶解した後，0.5 mM の蛍光標識コレステのの，実際の患者検体を用いた検証は十分に行われてロールである BODIPY-C を 30 µL 添加した．窒素ガ

いないことや，前述の細胞の各種トランスポーターをスでクロロホルムを蒸発させ，さらにジエチルエーテ介したコレステロール引き抜きに関して，本法がどのルを加え蒸発させる操作を 2 回行い，BODIPY-C 含

トランスポーターを介したコレステロール引き抜き

有リポソームを作製した．作製したリポソームをを反映するかも検証が必要である．

BufferA 14 mL に溶解し，Sephacryl S-300 ゲルビー

したがって本研究では，本法の臨床への実装を目指

ズを 0.70 g 加え，室温で 30 分静置した．その後，-すべく，ビリルビンの影響の回避，磁気ビーズを用い

80℃にて凍結，室温にて融解の操作を 7 回繰り返し，た 新 た な 方 法 （ immobilized liposome-bound

リポソームをゲルビーズに固相化した．融解後，上清

magnetic beads assay，ILM 法）のさらなる検証，おを捨てゲルビーズにBufferA を加え，
室温，
3,000 rpm，

よび臨床検体を用いた評価，細胞法（各種トランスポ

5 分間の遠心による洗浄を 5 回行った．洗浄後，ーター）との比較を目的とした．

BufferA を 10 mL 加え，ILG 混濁液を作製し，4℃，＞１行あける．

遮光下で保存した．

Ⅱ．対象・方法
Ⅱ-1(e) CEC の測定

Ⅱ-1 ビリルビン影響の回避の検討

ILG 混濁液 100 µL に希釈した BDS を 150 µL 添

Ⅱ-1(a) 対象試料
血液試料は本学で書面で同意を得られた健常者ボ加し，最終血清濃度 0.25%，0.5%，1%，2%になるよ

ランティアより採取した．全血試料を採血管に採取後，うにした．遮光条件下で室温にて 16 時間インキュベ

室温で 15 分静置して血液を凝固させた．凝固後，血ーションしたのち，上清を 75 µL 回収し蛍光強度を

清を 2,000g，15 分の条件で遠心分離し，血清を別のFLUOROSKAN

チューブに移し，-80℃で凍結保存した．尚，本研究はSCIENTIFIC）で測定した．測定毎に被検血清とは異

本学医学部倫理委員会の承認の下，行った（承認番号：

なる血清（reference 血清）を測定し，reference 血清

M2015-546）．

の蛍光強度に対する被検検体の蛍光強度の比を CEC

ASCENT （ Thermo

Fisherとした．
Ⅱ-1(b) ビリルビン添加血清の作製
Ⅱ-1(f) BODIPY-C とビリルビンの 3 次元蛍光スペク

得られた血清に干渉チェック・A プラス（シスメックス）のビリルビン F（遊離ビリルビン）およびビリトルの測定

ルビン C（抱合型ビリルビン）を添加し，ビリルビン

150 mM NaCl，1 mM EDTA-2Na 含有 10 mM

濃度がそれぞれ，遊離ビリルビン：0.0，2.5，5.0，10.0

Tris-HCl （pH 7.4）
（BufferA）に溶解した BODIPY-

mg/dL，抱合型ビリルビン：0.0，2.4，4.8，9.7 mg/dL

C 含有リポソームと，BufferA に溶解した干渉チェッとなるように調整した．

ク・A プラス（シスメックス）のビリルビン F の蛍光スペクトルを Spectra Max iD5（モレキュラーデバイ

Ⅱ-1(c) 沈殿法によるアポリポタンパク B 含有リポタ

スジャパン）で測定した．励起波長 455 nm から 500

2

nm における，600 nm までの蛍光波長のスペクトル2.45 g 加え，室温で 30 分静置した．その後，-80℃にを測定した．蛍光波長のスペクトルを励起波長の順にて凍結，室温にて融解の操作を一定数繰り返し，リポ

並べることによって，BODIPY-C とビリルビンの 3ソームを磁気ビーズに固相化した．融解後，上清を捨

次元蛍光スペクトルを得た．

てゲルビーズに BufferA を加え，室温，3,000 rpm，
5 分間の遠心による洗浄を 5 回行った．洗浄後，Ⅱ-1(g) ビリルビンオキシダーゼ含有 BufferA の作製

BufferA を 10 mL 加え，上記の固相化磁気ビーズ混およびビリルビン酸化の確認

濁液を作製し，4℃，遮光下で保存した．

ビリルビン含有血清（遊離ビリルビン：10.0 mg/dL，固相化された磁気ビーズの安定性を確認するため抱合型ビリルビン：9.7 mg/dL）からそれぞれ BDS をに，暗所 4℃にて最大 60 日間保管し，その後，上清作製した後，BDS をビリルビンオキシダーゼ含有（旭の蛍光強度を測定した．

化成，25 μg/L）および非含有 BufferA で希釈した．
この際，BDS は血清で 3.3%になるように調整した．

Ⅱ-2(b) 磁気ビーズを用いた CEC 測定における条件希釈した BDS を 16 時間室温でインキュベーションの検討，妥当性確認

した後，350～1,000 nm の波長で島津 UV-1280 を用作製した磁気ビーズを用いて，健常者から得られた

いて吸収スペクトルを確認した．さらに，同様に処理

BDS（2%，3%，4％）の CEC をⅡ-1(e)と同様の方法

した試料を 450 nm および 675 nm の波長の吸光度をで測定した．
この際のインキュベーション温度を4℃，

20 分おきに 16 時間計測し，ビリルビンがビリルビン

30℃，37℃に変化させ，CEC の違いを調べた．

オキシダーゼによりビリベルジンへと変化すること

3 種類の血清から得られた BDS を用いて，磁気ビを確認した．上記のビリルビンオキシダーゼ処理後のーズを用いた CEC 測定をそれぞれ 20 重測定し，併BDS の蛍光強度（励起波長：485 nm，蛍光波長：538

行精度を確認した．次に希釈によって濃度の異なるnm）を測定した．

HDL（0.6～9.0 mg/dL）および BDS（0.2～5.0%）を作製，それぞれの CEC を測定し，その直線性を確認

Ⅱ-1(g) HDL の精製した．さらに，15 名の健常者血清から得られた BDSの CEC を測定し，HDL-C 濃度および ILG 法による健常者より得られた血清を用いて，既報の方法（１２）を用いて超遠心によって HDL（1.063 < d < 1.210

CEC と比較した．

g/mL）を分離した．得られた HDL は PBS を用いて4 ℃で 24 時間透析した後，4 ℃で保存した．

Ⅱ-3 患者検体を用いた CEC 測定の臨床的意義の評
価

Ⅱ-1(h) ビリルビンオキシダーゼによる HDL の粒子

当院で同意を得られた心臓カテーテル検査を受けた 113 名の患者の静脈血を収集し，得られた血清か構造へ与える影響の確認
ビリルビンオキシダーゼがHDL の粒子構造に影響

ら，BDS を分離，ILG 法による CEC を測定した．そのないことを確認するために，ビリルビンオキシダーの う ち ， 光 干 渉 断 層 法 （ optical coherence

ゼにより処理したHDL の構造を非変性ポリアクリル

tomography；OCT）が実施できた 78 名の患者のう

アミドゲル電気泳動にて確認した．ゲルは 8%に調整

ち，30%以上の狭窄が認められた 61 名に関して，臨し，CBB 染色にて視覚化した．ポジティブコントロ

床的背景，
OCT や他の血清学的検査の結果と CEC をールとして，TritonX-100 で処理した HDL を同様に比較解析した．なお，本研究は本学医学部倫理委員会

分析した．

の承認の下，行った（M2018-266）．

Ⅱ-2 自動分析装置への実装を目指した CEC 測定法

Ⅳ 統計解析
統計解析には SPSS ver.25（IBM）を用いた．2 群の差の検定には student の t 検定（片側検定），3 群以上のデータには一元配置分散分析を行った．相関の解析は Pearson により求めた．p < 0.05 を有意であるとした．＞１行あけるの開発
Ⅱ-2(a) 磁気ビーズへの BODIPY-C の固相化の確認
Ⅱ-1(d)の方法と同様にして，BODIPY-C 含有リポ
ソームをゲルビーズのかわりに多孔性磁気ビーズに固相化した．すなわち，作製した BODIPY-C 含有リ
ポソームを BufferA 14 mL に溶解し，磁気ビーズを3

Ⅲ．結 果Ⅲ-1 ビリルビンによる正誤差の影響回避の検討
Ⅲ-1(a) BODIPY-C とビリルビンの 3 次元蛍光スペク
トルの比較
ILG 法によるCEC 測定の際のビリルビンによる偽陽性の原因を確認するために，BODIPY-C とビリルビンの 3 次元蛍光スペクトルを比較した．BODIPYC は 520～540 nm で励起し，480～520 nm で蛍光を発することが観察された（図 1A）．ビリルビンの蛍光スペクトルは遊離型，抱合型共に広範囲に観察され，500～550 nm で励起，450～470 nm で特に蛍光を発した（図 1B，1C）．このようにビリルビンの蛍光スペ
クトルは BODIPY-C のそれと重複しており，ILG 法の際の BODIPY-C の蛍光検出の際に，ビリルビンの蛍光様波長を測り込むことが示唆された．

C

図２．波長変更後のビリルビンによる正誤差の影響
従来波長および改良波長にてビリルビン添加血清（A：遊離型ビ
リルビン，B：抱合型ビリルビン）の CEC を測定，正誤差の割合を比較した（C）．* p < 0.05．n.s: 有意差なしの濃度依存的に，CEC の値は増加する傾向にあった（図 2C）．
Ⅲ-1(c) ビリルビンオキシダーゼによるビリルビンの
図１．BODIPY 標識コレステロール，遊離型および抱合型ビリルビンの 3 次元蛍光スペクトル

影響回避
波長変更では，ビリルビンの影響は完全には回避できないため，次に，ビリルビンオキシダーゼ含有

Ⅲ-1(b) 波長変更によるビリルビン偽陽性影響回避の

BufferA を用いて，影響の回避を試みた．初めに，濃効果

度の異なるビリルビンオキシダーゼ（2.5，5.0，8.0，

ビリルビンの影響を回避するために，3 次元蛍光ス

13.3，25，40 µg/L）をビリルビンに作用させ，後述のペクトルの結果に基づいて励起波長を 485 nm から

吸光および蛍光スペクトルを確認し，ビリルビンオキ

498 nm へ変更した．初めに，ビリルビン非含有血清

シダーゼの濃度を 25 μg/L に決定した．

を用いて上記の条件で CEC を測定し，励起波長の変25 μg/L のビリルビンオキシダーゼを用いてビリ

更によって CEC の値に影響がないことを確認した

ルビンのビリベルジンへの変化を確認した．ビリルビ（図 2A，2B）．次にビリルビン含有血清を用いて同ン含有血清から分離された BDS 中には 450 nm に強様に CEC を測定した．
その結果，波長の変更により，い吸収が認められたが，ビリルビンオキシダーゼ含有

遊離型ビリルビン（10 mg/dL）の CEC への影響を

BufferA で処理することにより，450 nm の吸収帯は70%，抱合型ビリルビン（9.7 mg/dL）の影響を 78%

消失し，ビリベルジンのスペクトルである 350 nm～

回避することが明らかになった（図 2A，2B）．回避が550 nm および 550 nm～750 nm の吸収帯へと変化認められた一方で，上記の変更によってもビリルビン

4

することが確認された（図 3A，3B）．このビリルビン

6 時間で消失し，ILG 法における 16 時間は十分な時オキシダーゼによるビリルビンの酸化が ILG 法にお間であることが明らかになった（図 3A，3B）．また，

けるインキュベーション時間である 16 時間以内に終ビリルビンオキシダーゼを反応させた後の，遊離型ビ了することを確認するために，上記の反応のタイムコ

リルビンおよび抱合型ビリルビンの 3 次元蛍光スペースを観察したところ，遊離型は 10 時間，抱合型はクトルを分析した．図１B，C で観察された遊離型および抱合型ビリルビンの蛍光スペクトルは消失していた（図 3C，3D）．
Ⅲ-1(c) ビリルビンオキシダーゼの HDL の粒子構造への影響
TritonX-100 で処理した HDL を非変性ゲル電気泳動で分析すると，HDL 粒子よりも小さいサイズである 8.2 nm 以下の粒子サイズにバンドが観察されたのに対し（図 4，矢印），ビリルビンオキシダーゼで処理した HDL では同様の小粒子は観察されず，BufferAのみを添加したHDL と同様のプロファイルを示した（図４）．したがって，ビリルビンオキシダーゼは
HDL の構造には影響を与えていないことが明らかになった．

図４．ビリルビンオキシダーゼ含有 BufferA による
HDL の粒子構造へ与える影響の確認

Ⅲ-1(d) ビリルビンオキシダーゼ含有 BufferA を用いたビリルビンによる偽陽性回避の確認
ビリルビンオキシダーゼによるビリルビンの蛍光の消失が確認できたため，ビリルビンオキシダーゼ含
図３．ビリルビンオキシダーゼによるビリルビンからビリ
ベルジンの産生の確認および蛍光スペクトルの変化
BufferA および BO 含有 BufferA による遊離型ビリルビン（A，C）および抱合型ビリルビン（B，D）の吸収スペクト
ル・450 nm における吸光度（A，B）および蛍光（C，D）
スペクトルの変化．
BO；ビリルビンオキシダーゼ

有 BufferA を用いてビリルビン含有血清から得られ
た BDS を測定し，CEC への偽陽性回避の効果を確認した．その結果，遊離型ビリルビン（10 mg/dL）の
CEC への影響は 88%，
抱合型ビリルビン（9.7 mg/dL）の影響は 80%回避された（図 5A，5B，5C）．

5Ⅲ-1(e) 健常者血清を用いた従来のILG法と改良ILG法による比較
5 名の健常者から血清を採取し，従来法および改良法にて CEC を測定した．その結果，改良法による
CEC は従来法による CEC よりも有意に低値であり，ビリルビンによる偽陽性の回避が健常者でも確認できた（図 6）．
Ⅲ-2 自動分析装置への搭載を目的とした CEC 測
定法の改良
Ⅲ-2(a) 磁気ビーズへの BODIPY-C の固相化の確認
BODIPY-C 含有リポソームを磁気ビーズに添加し，凍結融解処理を繰り返した．処理した磁気ビーズを蛍光顕微鏡下で観察したところ，緑色の蛍光が点状に観察され磁気ビーズの多孔にリポソームが入り込み，固相化されていることが確認できた（図 7）．

図５．ビリルビンオキシダーゼ添加によるビリルビンの正誤差の影響
従来波長および改良波長にてビリルビン添加血清（A：遊離型ビリルビン，B：抱合型ビリルビン）の CEC を測定，正誤差の割合を比較した（C）．* p < 0.05．n.s: 有意差なし

図７．磁気ビーズへの蛍光標識リポソーム固相化の確認作製した BODIPY-C 含有リポソームを固相化処理
した磁気ビーズを蛍光顕微鏡にて観察した（励起波長フィルター：460–480 GFP, 蛍光波長フィルター：495–540 GFP）．
＊特許申請時資料

また，固相化の際の凍結融解の回数を 3 回，5 回，
7 回，9 回に変化させた後，処理後の上清の蛍光強度を測定した．添加前のリポソーム溶液の蛍光強度から
上清の蛍光強度を差し引いた値を磁気ビーズ内への固相化量として，凍結融解回数による固相化の効果を調べた．その結果，凍結融解回数 3 回から 7 回までは回数依存的に取り込み量は増加したが 7 回と 9 回で図６．健常者血清から得られた BDS を用いた従来法および改良法の比較
5 名の健常者血清から得られたBDS を用いて BuffeA を用いる従来法とビリルビンオキシダーゼ含有 BufferA を用いた改良法で CEC を測定し比較した．
BO；ビリルビンオキシダーゼ

は有意な差は認められなかった（図 8）．また，凍結融
解回数 5 回の磁気ビーズ内への蛍光物質の取り込み量をILG 法におけるゲルビーズ（凍結融解回数7 回）と比較したところ，同等であることが確認された．

6

表１．ILM 法による CEC 測定の併行精度の確認

図８．凍結融解回数の違いによる磁気ビーズへの蛍光標識リ
ポソーム固相化量の検討

Ⅲ-2(b) 磁気ビーズを用いた CEC 測定における条

日内併行精度日差併行精度

CEC

CV

CEC

CV

1

0.756 ± 0.044

5.8

40.806 ± 0.063

7.7

2

0.839 ± 0.051

6.1

50.873 ± 0.080

9.2

3

0.952 ± 0.063

6.6

6

0.872 ± 0.080

9.2

CEC（平均±2SD），CV（％）で示す．１～６は異なる健常者由来の血清件の検討，妥当性確認
作製した磁気ビーズを用いて，健常者から得られた
BDS（2%，3%，4％）の CEC をⅡ-1(e)と同様の方法で測定した．
この際のインキュベーション温度を4℃，
30℃，37℃に変化させ，CEC の違いを調べた．4℃の条件では上清の蛍光強度はどの BDS 濃度においてもほとんど上昇しなかった（図 9A）．また，30℃および37℃では蛍光強度が有意に増加し，蛍光標識コレステ
ロールの引き抜きを確認できた．算出した CEC では
30℃と 37℃に違いはなかったため（図 9B），以降の
CEC 測定には ILG 法に近い 30℃の条件で行った．

図９．インキュベーション温度の違いによる CEC の比較
BDS（2%，3%，4%）の CEC を異なる温度条件（4℃，30℃，37℃）によって磁気ビーズ法にて測定し，上清の蛍光強度および CEC を比較した．

次に，3 種類の血清から得られた BDS を用いて，
磁気ビーズを用いた CEC 測定をそれぞれ 20 重測定
し，併行精度を確認した．また，同様に濃度の異なる
BDS 試料を 20 日間測定し，日差の再現性を調べた．
その結果，日内併行精度は CV7%以内，日差併行精度
は 10%以内に収まった（表 1）．
図１０．濃度の異なる HDL および BDS を用いた直線性の確認． 健常者血清の CEC の測定．
希釈により様々な濃度の HDL（0.6-9.0 mg cholesterol/dL）を作製し，CEC を測定した（A）．同様に，BDS（0.2-5.0%）についても CEC の直線性を確認した（B）．同じ試料を用いて，ILG 法によっても測定し，ILM 法との CEC の相関性を確認した（C：HDL，D：BDS）．

7

次に HDL および BDS を希釈し，濃度の異なる

かった．

HDL（0.6～9.0 mg/dL）および BDS（0.2～5.0%）をapoE 含有 HDL コレステロールと正の相関性が認調整し，それぞれ CEC を測定して直線性を確認した．

められたため，全HDLコレステロールあたりのapoE

HDL においては，1.2～7.8 mg cholesterol/dL の範囲

含有 HDL コレステロールの割合（apoE-HDL％）をで，BDS では 1.0～5.0%範囲で直線性が認められた

求めた．61 名の患者をこの apoE-HDL％の平均値（図１10A，10B）．また，これらの直線性が認められ（9.0 ± 1.1（％））で 2 群に分け，apoE-HDL％低値

た濃度範囲の HDL および BDS 試料を用いて，ILG

群と高値群の CEC を比較した．その結果，両群には法との相関性を確認した．その結果，ILM 法による有意な差（p < 0.001）が認められ，apoE-HDL%低値

CEC は，HDL，BDS ともに ILG 法と良好な相関性群よりも，apoE-HDL%高値群において，CEC は有が認められた（図 10C，10D）．

意に高い値を示した（図 12）．

さらに，15 名の健常者血清から得られた BDS の表２．
患者の背景および脂質検査の結果および CEC との相関関係

CEC を測定し，HDL-C 濃度および ILG 法によるCEC と比較した．CEC は HDL-C 濃度と有意な正の

項目

平均±SD
（範囲）

CEC とのCEC が大きく異なる検体も見受けられた（図 11A）．

年齢，年

68 (59 - 75.5)-0.2880.024

また，
ILG 法とでは良好な相関性を示した（図 11B）．

性別，（％）

男（83.6）

身長，cm

165.5 ± 7.5-0.062

0.633

体重，kg

69 (62.7 - 77.3)

0.191

0.139

BMI，kg/m2

25.6 ± 4

0.241

0.061

CEC

0.753 ± 0.078

FC，mg/dL

40.6 ± 8.1

0.288

0.025

sdLDL，mg/dL

19.2 (13.4 - 26.9)

0.173

0.181

3.7 ± 1.1

0.780

<0.001

HDL3-C，mg/dL

16.4 ± 2.9

0.746<0.001

TC，mg/dL

140.6 ± 28

0.392

0.002

HDL-C，mg/dL

40.4 ± 8.5

0.766<0.001LDL-C，mg/dL

75.2 ± 25.7

0.138

0.290

TG，mg/dL

98 (79 - 153.5)-0.0210.875

相関性を示したが，同程度の HDL-C 濃度においてもApoE-HDL-C，
mg/dL
図１１．健常者血清の CEC の測定および ILG 法との相関性の確認
15 名の健常者血清の CEC を ILM 法で測定し，HDL-C との相関性を確認した（A）．また，同様に ILG 法によっても測定し，ILM 法における CEC との相関性を確認した．

P値

相関係数

FC: 遊離型コレステロール，sdLDL：small dense LDL，ApoEHDL：アポリポプロテイン E 含有 HDL，TC：総コレステロール

Ⅲ-3 患者検体を用いた CEC 測定の臨床的意義の評
価
OCT により狭窄が見られた 61 名の患者血清中のCEC を測定し，各パラメータと比較した．患者の背景および脂質検査の結果および CEC との相関関係を
表２に示す．
CEC は年齢と負の相関性を示し，加齢とともに低下した．また予想通り，CEC は総コレステロール，
遊離型コレステロール，HDL コレステロールと正の相関性を示した．興味深いことに，apoE 含有 HDL コ
レステロールや小型HDL であるHDL3 コレステロー

図１２．apoE-HDL 低値群と高値群の CEC の比較

ルとも正の相関性を示した（r = 0.780, p < 0.001，r =0.746，
p < 0.001）．
一方，
LDL コレステロールや small
dense LDL コレステロールとの相関性は認められな

8

OCT により求めた脂質性プラークの長さおよび角さらに一歩，臨床応用へ近づいたと言える．上記以外

度から，脂質に富むプラーク（Large lipid-rich plaque，にも，細胞法（各種トランスポーター）との比較や本

角度 ＞ 180，長さ ＞ 5 mm）を定義すると，61 名

法の意義を裏付けるためのコレステロール引き抜きのうち 26 名が脂質に富むプラークを有していた．こ能に及ぼす因子の解析なども実施したがこちらはまの脂質に富むプラークの有無で２群に分け，各パラメ

だ進行中であるため，それ以外について報告させていータを比較したところ（表３），HDL-C は有意差が認ただいた．以下に結果に対する考察を述べる．

められなかった（p = 0.105）のに対し，CEC では有意な差が認められ（p = 0.029），脂質に富むプラーク

Ⅳ-1 ビリルビンによる正誤差の影響回避の検討を有している群の方が CEC が 5.7％低値であった．

初めに BODIPY-C とビリルビンの 3 次元蛍光スペ

また，apoE 含有 HDL も同様に有意な差があり（p <クトルを測定した．その結果，ビリルビンにも広範囲

0.013），脂質に富むプラーク有している群では 7.4%な蛍光スペクトルが認められ，その一部は BODIPY-

低値を示した．また，LDL コレステロールや中性脂

C のスペクトルと重なっていた．ビリルビンの蛍光に肪に関しては 2 群で差は認められなかった．

関しては報告がないが，ビリルビンの化学構造を考えると蛍光を発する可能性は十分に考えられる．ビリル

表３．脂質に富むプラークの有無による各種パラメータの比較
項目

Large lipid-rich

ビンはビリベルジンが還元されることによって生じ，
ビリベルジンはヘムを構成するプロトポルフィリン

Large lipid-richp-valueから生じる物質であり，このプロトポルフィリンは蛍

plaque (-)

plaque (+)

n

35

26

年齢

61 (56.5 - 73.5)

71 (66 - 78)

0.021

フィリンが蛍光を発するのは炭素間単結合と二重結男性（％）

29 (82.9)

22 (84.6)

1.000

合の繰り返しである共役構造が存在することによる

BMI

26.1 ± 3.9

24.9 ± 4.00.232と考えられる．共役構造をもつ物質では基底状態と最糖尿病

17 (48.6)

7 (26.9)0.115

低励起状態のエネルギー差が小さく，可視光によって高血圧

22 (62.9)

22 (84.6)

0.085

励起されやすいことが知られている．最低励起状態に

喫煙歴

22 (62.9)

15 (57.5)0.793

おいて分子構造や周囲の環境の変化によりエネルギ

CEC

0.771 ± 0.08

0.727 ± 0.07

0.029

HDL-C

41.9 ± 8.1

38.3 ± 8.8

0.105

%apoE

9.5 (8.8 - 10.0)

8.8 (7.9 - 9.4)

0.013

%HDL3

42.9 (39.8 - 44.5)

光を発することが知られている（１３）．プロトポルー変化が起こると，最低励起状態から基底状態に戻る
際に励起光より長波長の光を蛍光として放出する．プロトポルフィリンから生じる物質であるビリルビンにも同様に共役構造が見られるため，可視光によって41.9 (38.4 -

励起され，蛍光を発する可能性は十分に考えられる．

0.620
44.6)

LDL-C

79.6 ± 23.6

69.31 ± 27.6

0.188

TG

101 (86.5 - 165)

94 (78 - 138)

0.314

これが BODIPY-C を検出する際に測り込まれるため正誤差になると考えられた．BODIPY-C はわれわれの無細胞系の測定だけではなく，細胞を用いた従来法%apoE：apoE 含有 HDL 割合（％），%HDL3：HDL3 割合（％）にも用いられている（３，１４）．したがって，このビ
リルビンの影響を回避することは，コレステロール引
き抜き能測定の改良に広く貢献することと考えられ

Ⅳ．考 察

る．

今回，われわれは開発した無細胞系のコレステロー

初めに，ビリルビンの蛍光が比較的弱く，かつル引き抜き能評価法の社会実装を目指すべく，課題でBODIPY-C の蛍光が十分検出できる波長への変更をあったビリルビンの影響の回避，自動分析装置への搭

試みた．その結果，ビリルビンの測り込みを避けるこ載を見据えた磁気ビーズを用いた新たな測定方法とができ，影響を小さくすることができた．他の材料（ILM 法）のさらなる検証，患者検体の臨床評価を実を必要とせずに，波長の変更だけであるため簡便な改施した．その結果，ビリルビンの影響を大幅に取り除良である一方，高濃度のビリルビンではまだ有意な差くことに成功し，また ILM 法に関しても良好な成績が認められた．

を得た．さらに，臨床評価に関しても HDL コレステ

したがって，次にビリルビンオキシダーゼによるビロールよりも優れた結果を示した項目もあり，本法がリルビンの消去を試みた．ビリルビンの酸化によって

9変化したビリベルジンは，ほとんど蛍光を発しないたは下回った．今後，再現性をさらに改善するには，含め，BODIPY-C 測定の際の測り込みの回避には有用有する BODIPY-C の量を増やす，磁気ビーズ間の固であることが予想された．実際，ビリルビンを添加し相化の均一化などの工夫が必要である．測定範囲に関

た血清において，80%以上のビリルビンによる正誤差

しては，実試料中の HDL-C 濃度で 1.2–7.8 mg/dL のの回避に成功した．コレステロール引き抜き能測定の範囲で測定可能であった．本法は血清から BDS 作製

目的はHDL-Cでは発見することができない残余リス

後，希釈して測定する．3.5%の BDS（今回の最適なクを検出することであり，また，将来，健診などで利濃度）で測定した場合，上記の直線性の結果は，血清用されることを想定している．したがって，今回添加中の HDL-C 濃度に換算すると 34-223 mg/dL まで直したビリルビンの最大濃度である 10 mg/dL ほどの高線性を示すことになり，ILM 法は健常者から患者検

ビリルビン血症の検体を測定する機会は稀である．そ

体まで広い範囲で測定できることが確認できた．15の一方，ビリルビンは健常者にも存在し，この測り込

名の健常者血清の測定では，CEC は HDL 濃度と正みがコレステロール引き抜き能の値にばらつきを与の相関性を示したが，大変興味深いことに，
HDL-C がえていることも間違いない．実際に，健常者の血清を66 mg/dL，67 mg/dL と同程度の 2 名の健常者血清に用いて，ビリルビンの消去の有無によるコレステロー

おいて，CEC は 0.93 と 1.11 となり，19%の差が認

ル引き抜き能の値を比較すると，有意な差が認められめられた．これは，検査によって同程度の HDL におた．したがって，より正確なコレステロール引き抜き

いても，その機能に大きな差があることを示唆し，コ能を測定するには，健常者であってもビリルビンの消レステロール引き抜き能が残余リスクの発見に利用去が必要であると考えられる．

可能であることを示唆した．
このように，われわれは簡便で高精度であり，自動Ⅳ-2 自動分析装置への搭載を目的とした CEC 測定

分析装置に搭載可能なコレステロール引き抜き能測法の改良定法を実現した．その一方で，細胞法との違いも確認

ILG 法では，コレステロール引き抜き後の上清の分している．以前，ILG 法において，HDL の亜分画で離のために遠心操作を行ってゲルビーズを沈殿させある HDL2 と HDL3 を CEC を測定した場合，その値る必要がある．したがって，この方法をそのまま自動は細胞法と同様で HDL の性質をよく反映していた化することは困難であった．そこで，広く免疫学的測（９）．しかしながら，特殊な HDL である apoE 含有定法に用いられる磁気ビーズに着目した．また，リポ

HDL では異なる挙動を示した．細胞法では apoE 含

ソームを固相化できるように多孔性の磁気ビーズを

有 HDL と apoE 非含有 HDL の CEC に差が認めら

選び，ゲルビーズのかわりにコレステロール引き抜きれなかったのに対し，ILG 法では apoE 含有 HDL のを行う方法を勘案した．期待通り，ゲルビーズと同様

CECはapoE非含有HDLよりも低値に測定された．

に BODIPY-C を含むリポソームを磁気ビーズに添加

われわれは以前，THP-1 マクロファージを用いたして，凍結融解を繰り返すと磁気ビーズの多孔質の中CEC 測定において，apoE-HDL は通常の HDL と異に蛍光標識リポソームが入り込んでいることが観察なり ABCG1 経路ではなく，ABCA1 経路を介してコできた．予備実験では，この磁気ビーズを用いた ILM

レステロールの引き抜きが行われることを報告して法においても HDL 濃度依存的な CEC が見られ，従いる（１５）．通常，ABCA1 を介したコレステロール

来の ILG 法とも相関性が認められた．したがって，引き抜きは主に apoA-I によって行われる．ILG 法で今回，さらに ILM 法の性能を確認するために，凍結は apoA-I による引き抜きはほとんど反映されないた融解回数と固相化量の比較，固相化効率の従来法

め（９），同様に ABCA1 を介する apoE 含有 HDL の（ILG 法）との比較，引き抜き時のインキュベーショ

CEC も本法では反映されていない可能性がある．循

ン温度の影響，本法における CEC の再現性，濃度の環血液中では，遊離の apoA-I はすぐに腎臓から尿へ

異なる HDL や BDS を用いた直線性，健常者血清のと排泄されるため，血清中には遊離の apoA-I はわず

評価を行った．ビーズへの固相化の検討では，ゲルビ

かしか含まれていない．また，apoE 含有 HDL は全

ーズが 7 回の凍結融解が必要であるのに対し，今回用HDL 中の 10%以下であり，上記の細胞法との差は，いた磁気ビーズでは 5 回の凍結融解で同等の量のリ

大きな影響はないと考えられる．
その一方で，
apoE 含ポソームが取り込まれることが明らかになった．測定

有 HDL の CEC が生体内の抗粥状動脈硬化能として精度に関して，ILG 法には劣るものの（９），CV10%

重要であるという報告もあり，本法においても臨床検

10

Ⅴ．結 論体を用いた実際の評価が必要であると考えられた．また，前述のように，本法におけるコレステロール引き本研究により，測定法の改良に成功し，大きな問題

抜きが，細胞表面のどのトランスポーターを経由した点であったビリルビンによる正誤差の問題を解決しコレステロールの引き抜きを反映するかに関しては，た．また，自動分析装置に実装可能なコレステロール

今後さらに詳細に解析する必要がある．

引き抜き能評価法を確立し，さらには，実際の患者検体で有用な結果も得られた．今後は，本法を自動分析

Ⅳ-3 患者検体を用いた CEC 測定の臨床的意義の評装置に搭載し，より多くの臨床検体を評価することで，価本法の有用性をさらに示すとともに，残余リスクを発前述の背景の下，本法における臨床的有用性を明ら見し，より多くの粥状動脈硬化症に伴う虚血性心疾患

かにするために，本学病院循環器内科との共同研究にや脳卒中に対する医療に貢献していきたい．

よって，カテーテル検査時に採血された 113 名の患者

本助成により，非常に多くの有用な成果を得ること

血清の CEC を評価した．OCT による解析の結果，冠ができた．公益財団法人 循環器病研究振興財団に厚動脈に狭窄が見られた 61 名の患者の各種パラメータ

く御礼申し上げたい．

と CEC の結果を比較したところ，
apoE 含有 HDL に関して矛盾した結果が得られた．前述した以前われわ

本研究成果の一部（ILM 法の確立と基礎性能の確れが行った apoE 含有 HDL の CEC の研究では，認）を Bioscience Reports 誌に報告した．
（Mutsuda

apoE 含有 HDL はセファロースカラムを用いて分離

Y., Miyakoshi T., Horiuchi Y. et al. Development and

した試料であった．今回の apoE 含有 HDL コレステ

validation of novel automatable assay for cholesterol

ロールは，株式会社デンカが製造している試薬によっ

efflux capacity. Bioscience Reports 2023; 43 (2):て測定されたものであり，その原理は，界面活性剤に

BSR20221519）．また，ビリルビン回避の検討に関しより，他の apoE 非含有と区別してコレステロールをては，現在，投稿中であり，循環器疾患のデータに関酵素によって酸化する方法である．この apoE 含有

しては投稿準備中である．

HDL の選別の違いによって，このような矛盾が生じた可能性がある．あるいは，前者の試料は健常者からⅥ．研究協力者

採取し，分離した apoE 含有 HDL であるが，今回は米津 太志・東京医科歯科大学病院 循環器内科・准教

患者血清のみの結果であることも原因の一つである

授かもしれない．いずれにしても，本法におけるコレス

亀田 貴寛・東京医科歯科大学 大学院医歯学総合研究

テロール引き抜き能が apoE 含有 HDL と関連性があ科先端分析検査学分野・助教（2023 年 4 月より帝京

るかについては，基礎研究も含めたさらなる解析が必大学・医療技術学部・講師）

要である．

陸田 優芽・東京医科歯科大学 大学院医歯学総合研究

OCT による結果との比較により，脂質に富むプラ科先端分析検査学分野・大学院生

ークとの関連が認められた．繊維性プラークなどの他

宮腰 恒広・東京医科歯科大学 大学院医歯学総合研究のプラークと比較して，脂質に富むプラークは不安定

科先端分析検査学分野・大学院生

であり，その性質を把握することはイベント発症のリスク予測に繋がる可能性があり重要である．今回，本Ⅶ．参考文献法における CEC がわずかではあるが HDL-C よりも

1)

Adorni, M.P., Zimetti, F., Billheimer, J.T. et al.

有意にプラークの性質を検出できたことは重要な発2007; The roles of different pathways in the

見であると考えている．また，コレステロール引き抜

release of cholesterol from macrophages. J.

き能という観点から，CEC が低い＝脂質に富むプラ

Lipid Res. 48, 2453–2462,

ークの増加，も理にかなっていると言える．今回のデhttps://doi.org/10.1194/jlr.M700274-JLR200
2)ータをさらに解析するとともに，今後はさらに多数のKhera, A.V., Cuchel, M., de la Llera-Moya, M.

患者検体を測定や CEC と粥状動脈硬化の進展や治療et al. Cholesterol efflux capacity, high-densityの効果など時系列を解析することが必要である．

lipoprotein function, and atherosclerosis. N.
Engl. J. Med 2011; 364, 127–135.
https://doi.org/10.1056/NEJMoa1001689

11

3)

4)

5)

Rohatgi, A., Khera, A., Berry, J.D. et al. HDL

lesterol efflux assay using immobilized lipos

cholesterol efflux capacity and incident

ome-bound gel beads: Confirmation and im

cardiovascular events. N. Engl. J. Med 2014;

provement for application in clinical laborat

371, 2383–2393,

ory. Ann Clin Biochem. 2022; 59(2):134-143.

https://doi.org/10.1056/NEJMoa1409065

doi: 10.1177/00045632211054406.

Khera A.V., Demler O.V., Adelman S.J. et al.

11) Zimetti F., Weible G.K., Duong M. et al. M

Cholesterol Efflux Capacity, High-Density

easurement of cholesterol bidirectional flux

Lipoprotein Particle Number, and Incident

between cells and lipoproteins. J Lipid Res.

Cardiovascular Events: An Analysis From the2006; 47: 605-613. doi: 10.1194/jlr.M500466

JUPITER Trial (Justification for the Use of-JLR200.

Statins in Prevention: An Intervention Trial

12) Havel R.J., Eder H.A., Bragdon J.H. The d

Evaluating Rosuvastatin). Circulation 2017;

istribution and chemical composition of ultr

135(25): 2494-2504. doi:

acentrifugally separated lipoproteins in hu

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Saleheen D., Scott R., Javad S. et al.

353, 10.1172/JCI103182. doi: 10.1172/JCI10

Association of HDL cholesterol efflux capacity3182.

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X in human serum. 2007; 27(5): 995-998.

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6)14) Ferraz-Amaro I., Delgado-Frias E., Hernan

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Cholesterol Mass Efflux Capacity, Incident

lux capacity and lipid profile in patients wi

Cardiovascular Disease, and Progression ofth systemic sclerosis. Arthritis Res Ther 20

Carotid Plaque. Arterioscler Thromb Vasc

21; 23, 62, doi: 10.1186/s13075-021-02443-9

Biol. 2019; 39(1):89-96. doi:
7)15) Horiuchi Y., Ohkawa R., Lai S.J. et al. Ch

10.1161/ATVBAHA.118.311366.

aracterization of the cholesterol efflux of ap

Horiuchi Y, Lai S..J, Yamazaki A. et al. Va

olipoprotein E-containing high-density lipop

lidation and application of a novel cholester

rotein in THP-1 cells. BiolChem. 2019; 400ol efflux assay using immobilized liposomes(2):209-218. doi: 10.1515/hsz-2018-0284.

as a substitute for cultured cells. Biosci R
ep. 2018; 38(2). pii: BSR20180144, doi: 10.1
042/BSR20180144.
8)

Horiuchi Y., Ohkawa R., Lai S.J., et al. Us
efulness of apolipoprotein B-depleted serumin cholesterol efflux capacity assays using
immobilized liposome-bound gel beads. Biosci Rep. 2019; 39(4). pii: BSR20180144, doi:
10.1042/BSR20180144.

9)

Horiuchi Y., Lai S.J., Kameda T. Comparis
on of a novel cholesterol efflux assay using
immobilized liposome-bound gel beads withthe conventional method. Biosci Rep. 2020;40(8). BSR20201495, DOI: 10.1042/BSR202
01495.

10) Horiuchi Y., Lai S.J., Kameda T. Novel cho

12

中胚葉において循環器形成細胞が誘導される
分子基盤解明慶應義塾大学医学部・特任講師

橋

Ⅰ．緒 言

本

寿 之

を作製した。その結果、Zfp281KO-ES 細胞では心近年、心臓発生に重要な複数の転写因子(Gata4,筋細胞への分化が観られず、Zfp281KO マウスも胎

Mef2c, Tbx5)を強制発現させることにより線維芽細

生致死であることが確認された。しかし器官形成期

胞を心筋様細胞( iCM)に直接分化転換できることがの胎仔シングルセル解析の結果、Zfp281 は個体にお報告された 1。我々は約 1000 個のヒト ORF ライブ

いて遍在的に発現しているため、我々は次にラリーを用いて無作為なスクリーニングを行った結Zfp281flox マウスを作製し、中胚葉特異的に Cre リ

果、多能性幹細胞の分化に関わる転写因子 Zinc

コンビナーゼを発現する Mesp1-Cre マウスと交配

Finger Protein 281(Zfp281/ZNF281)に非常に強いして中胚葉特異的 Zfp281cKO マウスを作製した。

心筋分化転換誘導作用がある事を見出した 2。
また、

その結果、このマウスは胎生致死で、観察すると心我々はマルチオミクス解析を用いたエピゲノム解析

奇形を認めた(図 2)。

の結果、in vitro 心筋分化転換と in vivo 心臓発生の転写制御機構には多くの共通点がある事を見出した
3（図 1；文献 3 より引用改変）。

図 2 中胚葉特異的 Zfp281cKO 胎仔マウス・Zfp281cKO マウスに心奇形を認める

よって、本研究ではこの Zfp281 と心臓発生の予
想外な関連性を基に、様々な遺伝子改変マウス及び遺伝子発現・エピゲノム解析を用いて、遍在的に発図 1 心臓と iCM のエピゲノム解析比較・両者には共通する活性現する幹細胞因子 Zfp281 が胎生期にどのように循

化エンハンサーが多く存在する

環器形成細胞特異的に情報を伝達し、転写制御に寄このような知見から、今度は逆に分化転換の研究与しているかを明らかにする。そして、最終的には成果を参考にして、心臓発生を司る新たな転写制御

研究成果を心疾患の新たな分子機序解明や心臓再生機構を解明することができるのではないかと考え、技術の開発へと発展させることを目指す。

我々は Zfp281 に着目した。
次に、心臓発生における Zfp281 の機能を解析す

Ⅱ．対象・方法

るために、我々は CRISPR/Cas9 システムを用いて本研究では幹細胞因子 Zfp281 に着目し、生体にZfp281KO 多能性幹(ES)細胞及び遺伝子改変マウス

おいて循環器形成細胞が誘導される新たな転写制御

13

機構を解明するために以下の実験を行った。

Ⅲ．結 果
1)Zfp281 が心臓形成に寄与する時期及び組織の解1)Zfp281 は心臓発生において心臓中胚葉期に必須

明の因子である1-1)Zfp281 組織特異的欠損(cKO)マウスの作成・

心 臓 中 胚 葉 (Mesp1-Cre) 、 心 筋 前 駆 細 胞(Nkx2-5-Cre)、心筋細胞(Myh6-Cre)という心臓発生

遺伝子型解析
器官形成期の胎仔シングルセル解析の結果、過程の各分化段階特異的に Zfp281 を欠損したマウZfp281 は個体において遍在的に発現しているため、スを作製した。その結果、心臓中胚葉特異的にCre リコンビナーゼを心臓中胚葉(Mesp1-Cre)、心Zfp281 を欠損したマウスは胎生致死であったが、心筋前駆細胞(Nkx2-5-Cre)、心筋細胞(Myh6-Cre)特異筋前駆細胞、心筋細胞特異的に欠損したマウスは出的に発現するマウスと Zfp281flox マウスを交配し、生し、成獣期まで生存した（図 4）。

各発生段階の Zfp281cKO マウスを作製した 4 (図3；文献 4 より引用改変)。これらマウス産仔の遺伝
子型を解析することにより、心臓中胚葉から心筋細胞へと分化するどの発生過程において Zfp281 が必須であるかを検証した。
図 4

産仔マウスのジェノタイピング解析・心臓中胚葉

Zfp281cKO は確認できず、胎生致死であることが確認できた

また、心筋前駆細胞、心筋細胞特異的 Zfp281cKO

図 3 マウス原腸形成期のシングルセル解析・原腸形成期に
Zfp281 は遍在的に発現する

マウスにおいては心臓の形態や機能に特記すべき異常を認めなかった。よって、Zfp281 は心臓中胚葉か1-2)Zfp281cKO マウス心臓の形態・組織解析

ら心筋前駆細胞に分化するタイミングで必須の因子

次に、各 Zfp281cKO マウスの心臓の形態や組であることが明らかになった（図 5）。

織学的解析を行った。これらの解析により、Zfp281
欠損が循環器形成細胞において構造的、機能的にどのような影響を与えるかを検証した。
2)Zfp281 が寄与する心臓形成転写ネットワークの解明
2-1)Zfp281cKO マウス心臓の遺伝子発現解析

図 5 30 週齢 Zfp281cKO マウスの心臓組織解析・心筋前駆細胞、心臓形成における Zfp281 の機能を解析するため

心筋細胞特異的 Zfp281cKO 心臓に構造異常を認めなかったに、心臓に表現型が観察された Zfp281cKO マウス
系統の心臓サンプルを用いて異なるステージにて次に、心臓中胚葉 Zfp281cKO マウスの表現型をRNA-seq 解析を行った。この解析により、Zfp281

解析するために、各発生段階での胎仔マウスの心臓欠損により変動する遺伝子群・パスウェイを明らかを解析した。その結果、Zfp281cKO マウスはにした。

E8.5-9.5 の段階から発達遅延や胎仔奇形を認め、2-2)マルチオミクス解析による Zfp281 標的遺伝

Zfp281flox マウスとの鑑別が可能であった。そしてE12.5 以降は心臓の自律拍動を認めず、胎生致死で子の解明
上記 RNA-seq と我々の先行研究のエピゲノム解あった（図 6）。

析のデータを統合し、Zfp281 が直接的に転写制御する遺伝子群を検討した。この変動遺伝子群と既知の心臓転写ネットワークを比較解析し、Zfp281 がどのような心臓関連遺伝子群を制御しているか検討した。

14

生に寄与するかを明らかにするため、E9.5 の心臓中胚葉 Zfp281cKO と Zfp281flox マウスの心臓を用いてトランスクリプトーム解析を行った（図 9）。

図 6 心臓中胚葉 Zfp281cKO マウスの表現型解析・E8.5 から発達遅延や奇形を認めた

さらに、心臓中胚葉 Zfp281cKO 胎仔の心臓を詳細に観察すると、右室流出路系の低形成や心筋の菲

図 9 E9.5 心臓中胚葉 Zfp281cKO と Zfp281flox 心臓の遺伝子発薄化等を認めた（図 7）。

現解析

その結果、Zfp281 を欠損したマウスにおいては心臓や心筋に関連した遺伝子群の発現低下を認めた。
しかし、より興味深い事に、中胚葉由来臓器である心臓には本来発現していないはずの内胚葉や非心臓領域の運命決定に重要な遺伝子群の異所性発現上昇を認めた（図 10・表１）。
図 7 心臓中胚葉 Zfp281cKO マウス心臓の表現型解析・右室流出路の低形成を認めた

また、心臓中胚葉 Zfp281cKO では胎仔心不全を示唆する心嚢液貯留や卵黄嚢血管網の萎縮を認めた（図 8）。

図 10 発現変動遺伝子群のパスウェイ解析・心臓に関連する遺伝
子群の発現低下及び非心臓関連遺伝子群の発現上昇を認める

図 8 心臓中胚葉 Zfp281cKO マウスの観察・胎仔心不全を示唆す

表１ E9.5 心臓中胚葉 Zfp281cKO 心臓で発現上昇している代表

る表現型を認めた的な非心臓領域の運命決定遺伝子群

以上より、心臓中胚葉 Zfp281cKO は E12.5 までに胎生致死となる事が明らかとなり、その原因として右室流出路系の形成不全による胎仔心不全が示唆された。
2)Zfp281 は心臓中胚葉において運命決定因子の発現を調節する次に Zfp281 がどのような遺伝子群を操り心臓発

15

Ⅳ．考 察我々はこの発現変動遺伝子群の中から、22q11.2
欠失症候群/DiGeorge 症候群の関連遺伝子として報我々は先行研究の成果を基に、心筋分化転換誘導

告されている Tbx1 に着目した。22q11.2 欠失症候

因子 Zfp281 には心臓発生においても重要な働きが群には様々な心奇形が合併する事が報告されている。

あると推測して研究を開始した。そして、本研究成

その中に今回のモデルマウスで観察された流出路の果では当初の予測通り、遺伝子可変モデルマウスを異常も挙げられ、動物モデルでは Tbx1 の発現低下、用いて Zfp281 が心臓中胚葉から心臓が形成される

上昇の両方で心臓流出路に異常を認め、Tbx1 の発際に必須の因子であることを明らかにした。
しかし、現量制御が病態に深く関わっている事が示唆されて意外にも Zfp281 は心筋細胞の分化誘導に必須ではいる 5。今回、心臓中胚葉 Zfp281cKO マウスの心臓ない事が判明した。また、驚くべきことに Zfp281

では Tbx1 の発現上昇を認めたため、我々は Zfp281

は右室流出路の形成に必須であった。線維芽細胞かが Tbx1 の発現を直接抑制して心臓形成に寄与して

ら心筋様細胞を分化転換誘導する Zfp281 が心筋細いると考えた。

胞の分化誘導ではなく特定の心臓領域の形成に必須

よって、我々は過去に報告されている Tbx1 の発であることは興味深い知見である。

現を制御する心臓特異的な Tbx1 エンハンサー領域

我々の研究成果から Zfp281 は心臓領域においてを解析した 6（図 11）。その結果、同領域に Zfp281

特定の心臓形成因子の発現を誘導したり、非心臓領の結合モチーフを認めた。

域の誘導因子の異所性発現を抑制することにより、心臓形成に寄与していることが明らかになった。一方、Zfp281 は原腸形成期に遍在的に発現しているため、種々の転写調節共役因子の存在が示唆される。
今まで心臓発生における転写制御の研究においては、心臓で顕著に発現している転写因子(Mef2c,
Gata4 等)に着目して解析する研究手法が主流であ図 11 心臓特異的 Tbx1 エンハンサー領域解析・種を超えて保存った。しかし、このような心臓マスター因子の遺伝されている Zfp281 の結合モチーフを認めた

子異常を原因とする先天性心疾患の表現形は多種多様である。今後は本研究成果を基に、心臓形成に寄このエンハンサー領域をクローニングして、ルシ与する新たな転写制御機構を解明し、先天性心疾患

フェラーゼを用いたレポーターアッセイを行った結等の病態解明に応用することも検討している。

果、Zfp281 には同領域の転写抑制作用がある事が判明した（図 12）。

Ⅴ．結 論
心臓中胚葉において Zfp281 を欠損するマウスは胎生致死であり、右室流出路を中心とした様々な心奇形を認めた。よって、心筋分化転換誘導因子
Zfp281 は心臓発生に必須の因子であることが明らかとなった。

Ⅵ．研究協力者
小室仁・慶應義塾大学・助教
図 12 心臓特異的 Tbx1 エンハンサー領域を用いたレポーターア

中村貴裕・慶應義塾大学・助教

ッセイ解析・Zfp281 はエンハンサー活性を抑制した

Ⅶ．参考文献以上より、心臓中胚葉 Zfp281cKO マウスの心臓

1） Ieda, M., Fu, J. D., Delgado-Olguin, P. et al.

流出路発生異常の原因の一つとして、Zfp281 によるDirect reprogramming of fibroblasts into

Tbx1 転写抑制作用の欠如に起因する、心臓におけfunctional cardiomyocytes by defined factors.

る Tbx1 発現上昇が考えられた。

Cell 2010; 142: 375-386.
2） Zhou, H., Morales, M. G., Hashimoto, H. et

16

al.

ZNF281enhances

cardiac

reprogramming by modulating cardiac andinflammatory gene expression. Genes Dev
2017; 31: 1770-1783.
3） Hashimoto, H., Wang, Z., Garry, G. A. et al.
Cardiac

Reprogramming

Synergistically

Activate

Factors
Genome-wide

Cardiogenic Stage-Specific Enhancers. Cell
Stem Cell 2019; 25: 69-86 e65.
4） Pijuan-Sala, B., Griffiths, J. A., Guibentif, C.

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organogenesis.

Nature 2019; 566: 490-495.
5） Xu, H., Morishima, M., Wylie, J. N. et al.
Tbx1 has a dual role in the morphogenesis of
the cardiac outflow tract. Development 2004;
131: 3217-3227.
6） Maeda, J., Yamagishi, H., McAnally, J.,
Yamagishi, C. & Srivastava, D. Tbx1 isregulated by forkhead proteins in thesecondary heart field. Dev Dyn 2006; 235:
701-710.

17心臓弁形成を制御する「血流ベクトル」を認識した力学
応答原理の解明＞＞＞

３行あける。

国立循環器病研究センター研究所・細胞生物学部室長

福井 一＞

２行あける。

＞
Evident/Olympus）を用いて観察・撮影した。

Ⅰ．緒 言
心拍動・血流の開始後、心臓管腔を構成する心内

カベオラ形成を阻害するための検討では、カベオ

膜内皮細胞は恒常的に高値の物理的ストレスを受け

リン１（Cav1）を標的とした guide RNA を作成し、る。本申請者らはゼブラフィッシュ胚を用いた研究

Cas9/CRISPR システムによる変異体作製を行った。

から、弁形成時期に特異的かつ心臓弁領域の心内膜

磁性流体の検討では、ゼブラフィッシュ 3 日胚心臓内皮細胞に限局した「力」に直接応答する生体化学

管腔内へ Femtojet（Eppendorf）を用い任意量の磁機構（Ca2+-Nfat シグナル活性化）が存在し、弁形性流体を注入した。磁性体の操作に用いる磁気プロ成を制御することを見出した（1）。しかしながら拍

ーブは、銅線を巻き付け先端を旋盤で鋭利に研磨し動・血流が常に生じる心臓で、いかにして弁形成時たものに可変電圧機が繋がる電磁石を用い、倒立型の弁領域に限って力学応答 Ca2+-Nfat シグナルが規蛍光顕微鏡（Eclipse Ti2, Nikon）で 20 frame/sec

定されるのかは未だに不明である。

の速度で撮影した。胚観察、胚操作の際はトリカイ

本課題研究は、物理情報が心内膜内皮細胞に作用

ン溶液による麻酔下条件で、1％低融点アガロース

して心臓弁組織形成に至る力学応答シグナル作動原中に仰向けにして包埋した。

理の詳細解明を目指すものである。本課題では目的＞１行あける。

の達成に向け、血流から生じる「どの」情報が心内Ⅲ．結 果

膜内皮細胞の力学応答性 Ca2+-Nfat シグナルを制御

まず房室弁領域の血流情報と Ca2+-Nfat シグナルし、心臓弁形成をするのか明らかにする検討を行っの各パラメーター変動相関に着目した。心臓弁形成た。さらに、「どのような」機構が血流ベクトルの差

早期は弁葉形態が構築されておらず、弁領域で「双異を認識するのか実証するための手法を開発してい方向性」ベクトルの血流が認められる（2, 3）。そのる。以上をふまえた成果を報告する。

後、機能的弁形成の進行に伴い「順方向性」の血流＞１行あける。

ベクトルへと変化するが、この時期と相関して、心Ⅱ．対象・方法

内膜内皮細胞の Ca2+-Nfat シグナル活性が低下・消検討にはゼブラフィッシュ胚を用い、心内膜内皮失する。観察結果を踏まえた仮説として、『血流ベク細胞を可視化するトランスジェニック系統：

トルに依存した弁領域の流体特性が、弁形成を制御

Tg(fli1a:mCherry) 、 血 球 を 可 視 化 す る 系 統 ：Tg(gata1a:dsRed)、力学依存性 Nfat レポーター系
統：Tg(4xnfbr:d2EGFP)、心内膜内皮細胞質内またする心内膜内皮細胞の時空間特異的シグナルを司る』

は細胞膜にて Ca2+蛍光センサーを発現する系統：そに誘導した結果、心内膜内皮細胞の Ca2+-Nfat シグ

れ ぞ れ Tg(fli1a:galff);(uas:GCaMP7a) 、 ま た はナル活性が再開することを見出した。この際、血球Tg(fli1a:galff);(uas:myr-GCaMP7a)を用いた。拍動を蛍光可視化することで、血流方向性が変化する領する心臓の血流と、心内膜内皮細胞の Ca2+流入変化

域と Ca2+応答活性化に相関が認められることを明について、正立型スピニングディスク共焦点顕微鏡確にした。

を考えた。Ca2+-Nfat シグナル活性が消失する機能的弁形成後に「双方向性」の血流ベクトルを人為的（Dragonfly, Andor）を用いて 100 frame/sec の時

続いて高速イメージングを活用した弁領域の精密間分解能でデータ取得を行った。力学応答レポータ

な血流測定と血流操作から、「どの」力学情報が心内ー発現は正立型共焦点レーザー顕微鏡（FV3000,

膜内皮細胞の頑健な力学応答性 Ca2+-Nfat シグナル18

活性に関わるのか検討した。細胞は全領域で外部か結果を基に、磁力誘導の開始と停止に応答した磁性らの力学刺激を感知している。これまで得ている力

流体変形から非拍動条件下の心室心管腔内で方向性

学刺激に対する細胞質内の Ca2+流入変化では、どのをもつ人為的な血流を誘導する系を確立中である。

領域の力に対する応答か明らかでなかった。
そこで、そして血流方向による力学応答シグナル作用の検証

心内膜内皮細胞の細胞膜に局在する Ca2+センサーを行い、定量的解析から力作用の切り分けと生体機を作製し、細胞膜上の変化を検証した。100

構の解明をすすめている。

frame/sec で拍動心臓のイメージングを行った結果、心臓管腔面に位置する膜を起点として Ca2+流入が開始し、その後全体へと伝播することが明らかとなった (図 1)。

図1拍動心臓における弁領域に着目し、細胞膜局在 Ca2+

図2

心管腔内に留置した磁性流体の操作・胚体外に設置しセンサー活性の経時的変化・拍動心臓の同一焦点面を経時的に観た磁気プローブ/電磁石により心管腔内へ留置した磁性流体の操作察した結果、心内膜内皮細胞（赤）では、心管腔に面する細胞膜を試みた。磁力に応じて磁性流体が変形し（白矢印方向への変形）、

で Ca2+流入（緑、矢印）が開始し、１秒以内に細胞全体へと伝搬

管腔内では血液が押し出されることで人為的な流れを作り出した。

した。黄色点線は心管腔輪郭、白色点線は矢印で示す心内膜内皮

黄色点線は心管腔輪郭を示す。20 frame/sec で撮影。

細胞の輪郭を示す。100 frame/sec で撮影。

細胞膜は力に応じてひずみ変形を引き起こす。

続いて、血流ベクトルの差異を認識する物理情報

我々は膜張力が低下する II 型ミオシンの阻害剤での処理機構を明らかにするための実験系開発に取りあるブレビスタチンの添加胚では Ca2+流入が減弱組んだ。細胞内部の力学情報解析を専門とする横浜

する先行結果を得ている。心管腔の力学シグナル活市立大学理学研究科の谷本博一准教授の協力を仰ぎ、性の起点は管腔に面する細胞膜であるため、続く検

ゼブラフィッシュ胚心臓内部での人為的血流操作法

討では細胞膜構造に着目した。膜脂質の密度が高くを新たに考案した。管腔面に作用する血流作用を評

丸底フラスコ様の構造をとるカベオラは、構成成分、価するため、心臓管腔内へ磁性流体を注入し、胚体形態ともに特殊な細胞膜ドメインであり、細胞外か外より磁気プローブで操作する手法を新たに開発しらの力感知の場として重要である（4）。我々はカベた。磁性流体は直径 10 nm 程度の界面活性成分で被オラ形成因子である Cav1（カベオリン 1）を標的と膜化された酸化鉄などの磁性金属（マグネタイト）

する guideRNA を用いて、CRISPR/Cas9 システムが分散したコロイド溶液であり、磁力作用により変で発現を抑制すると、心内膜内皮細胞弁領域におけ形する特徴を持つ。注入した磁性流体は、サイズにる力学応答シグナル活性が抑制されることを見出し依存して磁気ビーズと同様に心管腔内に留まり、血た（図 3）。

流を介して心管腔内を移動した。また心房腔内に留まる磁性流体に対して、心室側の胚体外より磁力を与えることで磁性流体の変形に成功した(図 2)。本19

開発され（6）、生体組織の構築でも心内膜が類似の
生体メカニズムを構築・保有する可能性が考えられる。血管内皮細胞では大動脈湾曲部などの血流方向が変化する領域において、細胞応答が異なることが知られ（7）、乱流発生領域では動脈硬化の要因となる。しかしながら、未だに細胞調節機構による説明はできない。圧力刺激に応答する代表的な因子として Piezo 分子が知られるが（8）、我々が観察しているCa2+-Nfatシグナル応答はPiezoに依存しない（1）。
今後も血流から生じるせん断応力の極性を認識する機構の解明に近づく研究を継続する。
本研究では生体化学情報である Ca2+流入に着目している。常に拍動する心臓では多様な力学情報がCav1 発現抑制による力学応答レポーター活性抑制・発生しており、他の生体シグナルによるアウトプッ

心内膜内皮細胞（赤）の弁領域でみられる力学応答シグナル（シトも十分に考えられる。例えば、心筋や心線維芽細アン）が cav1 発現抑制（右側）により抑制される。パネル上部は胞では拍動に依存する伸展張力を介した Hippo シ

心臓全体像、下部は弁領域拡大像を示す。

グナルの活性調節機構が報告されている（9）。各力

図3

学情報を切り分け、各自の応答を検討することで全本結果は心管腔面のカベオラ近傍に「双方向血流から生じる力」を認識する因子が存在することを示

容理解に向かうと期待される。

唆する。本結果を基に、力を感知する実体の同定に＞１行あける。

向けて近位依存性ビオチン化酵素を活用した検討をⅤ．結 論開始した。心内膜内皮細胞のカベオラを可視化する

力学レポーターを活用したゼブラフィッシュ胚イ

個体：Tg(fli1a:cav1-EGFP)と、過酸化水素存在下でメージングより、心内膜内皮細胞は心臓管腔形成時

ビオチン標識する APEX2 と GFP 結合タンパク質に生じる双方向血流を特異的に認識する力学応答機（GFP-binding protein, GBP）複合体が全身で発現構が存在することを見出した。本研究期間中、我々する個体：Tg(beta-act:APEX2-GBP)を樹立し、心は新たに個体管腔内の磁性流体操作から心管腔内で内膜内皮細胞のカベオラ近傍に局在するタンパク質

せん断応力を操作する方法を開発した。本手法は心を網羅的にビオチン標識する検討をすすめている。

管腔内で発生する力学作用を切り分けて定量的に理今後はプロテオミクス解析を行い、血流応答因子の解し、生体シグナル機構を実証する系へと進展する候補に迫る計画である。

ことが期待できる。また細胞レベルで力学応答機構を捉える検討では、細胞膜のカベオラ構造が力学応＞１行あける。

答に重要であることが明らかとなり、力覚センサー

Ⅳ．考 察の探索・同定に向かう有用な知見が得られた。本結心内膜内皮細胞では、心内腔で発生する双方向性

果を基にすることで、力に応答する生体原理の解明の血流を認識して力学応答シグナルが活性化するこ

へ向かうことが期待できる。

とが明らかになった。双方向血流は早期弁形成時に＞１行あける。

おきる力学的特性である。
弁石灰化や弁閉鎖不全時、Ⅵ．研究協力者

異常な血流が生じて心内膜で異常シグナルが認めら

谷本 博一（TANIMOTO Hirokazu）

れることが知られる（5）。適切な部位と時期で物理

横浜市立大学理学部・准教授

学情報に応答する本力学シグナルは正確な形態調節

折井 良太（ORII Ryota）に必須である可能性が考えられる。また本結果を基横浜市立大学理学部・博士院生にすると、心内膜内皮細胞膜自体または力覚センサ＞１行あける。

ーが力の極性変化を認識する機構により、力学応答

Ⅶ．参考文献性 Ca2+-Nfat シグナルが調節されると示唆される。

1)

ソフトマター研究では、力の極性を区別する材料がFukui H, Chow RW, Xie J, et al. Bioelectric
signaling and the control of cardiac cell

20

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21