第36回⽇本動物実験代替法学会

千葉⼤学
2023年11⽉[シンポジウム4]
医療機器分野における動物実験代替法の開発状況と今後の展望

動物実験代替法にも利⽤可能な感作性試験⽤陽性対照材料の開発
国⽴医薬品⾷品衛⽣研究所 医療機器部︓〇野村祐介、岡本悠佑、⻑⾕川千恵、蓜島由⼆、⼭本栄⼀
⼀般財団法⼈化学物質評価研究機構︓⼩林俊夫、森岡久⼦
花王株式会社︓⽔町秀之
テルモ株式会社︓猪俣依⼦、⾦⽊淳史、岡⽥真幸

国立医薬品食品衛生研究所 医療機器部

1

筆頭発表者のCOI開示
筆頭発表者氏名：野村祐介

な し＊本講演の内容は規制当局等の正式見解ではありません

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本⽇の講演内容• 感作性試験の陽性対照材料の作製• In vivo感作性試験での性能検証• In vitro感作性試験での性能検証
• まとめ

3

本⽇の講演内容• 感作性試験の陽性対照材料の作製• In vivo感作性試験での性能検証• In vitro感作性試験での性能検証
• まとめ

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⽣物学的安全性評価の標準材料
医療機器の⽣物学的安全性評価
⽣体と接触する医療機器の薬事申請の際には、ISO10993シリーズに基づき、⽣物学的安全性に関わる⾮臨床試験データを取得する必要がある• 材料の極性/⾮極性溶媒抽出物が被検物質として⽤いられる例が多いことが特徴的である• ⼀⽅で、⼤部分の試験法において、該当する毒性を発揮する化合物を陽性対照物質として⽤いている⇒抽出過程（抽出効率等）が考慮されておらず、陽性対照として不⼗分である⇒数種類の陽性対照材料は国⽴衛研を中⼼に開発され、⽇本から世界に頒布されている。
•

第1部
第2部
第3部
第4部
第5部
第6部
第7部
第8部

細胞毒性試験
感作性試験
遺伝毒性試験
埋植試験
刺激性試験
全⾝毒性試験
発熱性物質試験
⾎液適合性試験

 感作性試験の確度向上を⽬標に、極性/⾮極性溶媒抽出物が陽性となる対照材料を開発し、頒布体制を構築すると共に、国際標準化を⽬指す。

感作性試験⽤陽性対象材料作製
現⾏の細胞毒性試験⽤陽性対照材料（ZDBC/ZDEC含有PUフィルム）を参考

基材︓ポリウレタン（PU）
作成⽅法︓キャスト法

 各種試験法の陽性対象としてDNCBが記載されている
 感作性化合物としては安定性が⾼いと共に、揮発しにくいCl
NO2NO22,4-dinitrochlorobenzene（DNCB）

1 w/w% DNCB-PU sheet
皮膚感作性試験用陽性対照材料としての性能を評価

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分析評価による事前検証

抽出溶媒
メタノール
アセトン
⽣理⾷塩⽔
ゴマ油
抽出溶媒
メタノール
アセトン
⽣理⾷塩⽔
ゴマ油

試料/溶媒⽐抽出温度

抽出時間

陽性対照材料使⽤量

0.1g/1mL

25℃

72h（溶媒交換3回）

約0.1g

6cm2/1mL

37℃

72h

約8cm2

抽出時間

1% DNCBシート
抽出液中DNCB濃度（µg/mL）

試料/溶媒⽐ 抽出温度
0.1g/1mL

6cm2/1mL

25℃

37℃

72h
（溶媒交換3回、4回分をプール）
72h

分析⽅法︓Q Exactive GCの⾼分解能SIM

Confidential1)平均±標準偏差

DNCBの抽出効率は、
メタノール︓80%程度
アセトン︓80%程度
⽣理⾷塩⽔︓2%程度
ゴマ油︓90%程度

ISO 10993-12 及 び 国 内 ガ イ ダ ン ス の 抽 出 条 件 に よ り 抽 出 液 を 調 製 後 、DNCB(logP=2.0)の極性に準じた抽出が確認された。
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本⽇の講演内容• 感作性試験の陽性対照材料の作製• In vivo感作性試験での性能検証• In vitro感作性試験での性能検証
• まとめ

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現⾏のin vivo試験における性能検証

LLNA : BrdU-ELISA（OECD TG442B︓In vivo マウス局所リンパ節試験）

GPMT（ISO10993-10︓In vivo モルモットマキシマイゼーション法）

動物実験代替法に利用するとしても、現行の試験で意図した性能を示す必要がある

9LLNAによる検証
Evaluation
Group

Test group(Saline)
50%抽出液において、陽性判定基準を満たすが、SI値の標準偏差及び100%抽出液のSI値(1.3)から総合的に判断し、陰性判定。

Test group(Sesame oil)
陽性判定

Test group(Acetone)
陽性判定

Dose level
negative
controlsolvent
control
25%
50%
100%
positive
controlnegative
controlsolvent
control
25%
50%
100%
positive
controlnegative
controlsolvent
control
2.5%
5.0%
10%
positive
controlnWeight oflymph nodes
(mg)

BrdU
labeling index

SIConfidential

 LLNAにおいて DNCBｰPU シートはゴマ油及びアセトン抽出条件下で陽性
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GPMTによる検証
Group

Solvent control group(Saline)Solvent control group(Sesame oil)

Test group(Saline)
陽性判定

Test group(Sesame oil)
陽性判定

0.1 w/v% DNCB solution(olive oil)

Dose levelnnegative
control

525%

550%

5100%

5

negative
control

525%

550%

5100%

5

negative
control

1025%

1050%

10100%

10

negative
control

1025%

1050%

10100%

10

positive
control

5

Observation time(h)
2448
24
48
2448
24
48
2448
2448
24
48
2448
2448
2448
2448
2448
2448
2448
24
48
2448
24
48

Evaluation
Positive rate (%)

Score

Confidential DNCBｰPU シートは⽣理⾷塩⽔及びゴマ油の両抽出条件下で陽性
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現⾏のin vivo試験における性能検証

LLNA : BrdU-ELISA（OECD TG442B︓In vivo マウス局所リンパ節試験）

ゴマ油及びアセトンで抽出液陽性
GPMT（ISO10993-10︓In vivo モルモットマキシマイゼーション法）

⽣理⾷塩⽔及びゴマ油抽出液で陽性
陽性対照材料はいずれの試験においても陽性を示す。
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本⽇の講演内容• 感作性試験の陽性対照材料の作製• In vivo感作性試験での性能検証• In vitro感作性試験での性能検証• まとめ13

動物実験代替法での適⽤有害性発現経路（AOP）に基づいた皮膚感作性試験
ChemicalMolecular
initiating event

Cellular response

Key event 1

Key event 2

Covalent binding
to skin proteins

Keratinocyte
response

ADRA, DPRA

Organresponse

Organism
response

EpiSensA, KeratinoSensTM, LuSens,
SENS-IS, IL-18 RhE Assay, SenCee Tox
Key event 3

Key event 4

Activation ofdendritic cells

T-cellproliferationh-CLAT, U-SENSTM,
IL-8 Luc Assay, GARDTM

GPMT

LLNA

Key event 1︓化学物質とタンパク質のシステイン残基またはリジン残基との共有結合
Key event 2︓ケラチノサイトにおける炎症応答とARE依存的経路による抗酸化遺伝⼦発現
Key event 3︓樹状細胞の活性化 (特異的細胞表⾯マーカーの発現、ケモカインやサイトカインの産⽣）
Key event 4︓リンパ節におけるT細胞増殖

動物実験代替法としてADRA、EpiSensA、h-CLATを選定

動物実験代替法での適⽤

 医療機器評価⽤に検体は材料からの溶媒抽出液とした
 陽性対照材料はDNCB-PUシートとした 動物実験と異なり、ポリエチレン(PE)シート及びポリプロピレン(PP)シートを陰性対象材料とした
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ADRAによる検証

Material

Depletion (%)

Extraction
NAC

DNCB-PU sheet
Water
Acetonitrile
陽性判定
PE sheet
Water
Acetonitrile
PP sheet
Water
Acetonitrile

NAL

Confidential

Prediction
Mean

NAC/NAL NAC-only
Positive Positive
Positive Positive
Negative Negative
Negative Negative
Negative Negative
Negative Negative PEシート及びPPシート由来抽出液はNAC/NAL予測モデル及びNAC単独予測モデル共に陰性判定が得られた。
 DNCB-PUシートでは、⽔及びアセトニトリル（ACN）の両抽出溶液においてNAC減少率 ≧ 5.6%（⽔:41%, ACN:97%）、NAC及びNALの減少率の平均値≧ 4.9%（⽔:21%, ACN:53%）を満たし両予測モデルで陽性判定が得られた。
 GPMTと同傾向の結果であった。

16EpiSensAによる検証
Imax
ATF3
GCLM DNAJB4
IL-8(15-fold) (2-fold) (2-fold) (4-fold)

EC (w/v%)
GCLM
DNAJB4EC2EC2Cellviability Prediction(%)

Run setNo.

GroupExtraction

Dose level(%)

Saline12.5-100

Negative

Sesame oil

12.5-100
positive
control
positive
control
12.5-100

Positive

1

DNCB-PU sheet
陽性判定
0.78 w/v% Clotrimazole/ AOO solution
0.1 w/v% 4-NBB/ AOO solution
PE sheet

20.78 w/v% Clotrimazole/ AOO solution
0.1 w/v% 4-NBB/ AOO solution
PP sheet

30.78 w/v% Clotrimazole/ AOO solution
0.1 w/v% 4-NBB/ AOO solution

SalineSesame oil
SalineSesame oil-12.5-100
positive
control
positive
control
12.5-100
12.5-100
positive
control
positive
control

ATF3
EC15IL-8
EC4

Positive
Positive
Negative
Negative

Confidential

Positive
Positive
Negative
Negative
Positive
Positive＊陽性対照物質を⽤いた試験から成⽴判定 DNCB-PUシート⽣理⾷塩⽔抽出液は全ての感作性マーカーで陰性
 DNCB-PUシートゴマ油抽出液でATF3(72-fold)、GCLM(5.0-fold)、DNAJB4(9.7-fold)において各Cut-Off値を超える遺伝⼦発現の亢進が認められた（陽性） 陰性対照材料であるPEシート及びPPシートにおいて、⽣理⾷塩⽔及びゴマ油の両抽出液で全ての感作性マーカーはCut-off値を下回り陰性とみなされた。
 LLNAの結果（⽣理⾷塩⽔は陰性、ゴマ油は陽性）に対して正しい予測となっている。
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h-CLATによる検証
DNCB-PU sheet 陽性判定

Confidential

PE sheet

Confidential

PP sheet

Confidential

溶媒対照（SC）: THP-1細胞の維持培地、抽出溶媒（10%FBS培地）
陽性対照（PC）: DNCB 4 µg/mL
媒体対照（VC）: DMSO添加溶媒対照（終濃度0.2%）

 THP-1細胞の細胞表⾯マーカー（CD86及びCD54）を指標
 DNCB-PUシートにおいて10%FBS培地抽
出液は3回の測定でいずれも陽性（細胞⽣存率75%以上の添加濃度条件）
 ⼀⽅、PE及びPPシートにおける同抽出液群
では3回全てにおいて陰性判定
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本⽇の講演内容• 感作性試験の陽性対照材料の作製• In vivo感作性試験での性能検証• In vitro感作性試験での性能検証• まとめ19

陽性対照材料の適⽤範囲
現行のin vivo 感作性試験
LLNA

GPMT

（生理食塩水, ゴマ油、アセトン ）（生理食塩水, ゴマ油）

陽性

陽性

動物実験代替法パッケージ候補
Key event 1

Key event 2

Key event 3

ADRA

EpiSensA

h-CLAT（水, ACN ）(生理食塩水, ゴマ油)

(10% FBS培地)

陽性

陽性

陽性

 DNCB-PUシートは⽪膚感作性試験⽤陽性対照材料として公定法のin vivo試験並びにin vitro動物実験代替法に利⽤可能である。
 PE,PPシートは動物実験代替法の陰性対象材料として利⽤可能である。
 ADRA、EpiSensA、h-CLATは動物実験代替法として有⽤である。
 今後は上記3試験を中⼼に動物実験代替法パッケージとして評価を進める。

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終わりにご静聴ありがとうございました

国立医薬品食品衛生研究所 医療機器部
野村 祐介
nomura@nihs.go.jp21