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浦上財団研究報告書

Vol.21（2014）＜平成 24 年度助成＞

質量分析イメージングによる生体組織内における機能性食品因子の局在解析
立花宏

文（九州大学大学院農学研究院生命機能科学部門）

緒言Ionization）法を基盤とした質量分析イメージング法（Mass Spectrometry Imaging, MSI）は、近（ – ）-Epigallocatechin-3- O -gallate（EGCG、年タンパク質、ペプチド、脂質など生体高分子のC 22H 18O 11、精密質量 : 458.08489）は緑茶（Camellia

局所変動を非標識で捉える in situ 生体分子マッ

sinensis L.）以外での植物では見出されていない特ピング法であり、新たな分子イメージング法とし殊な成分であり、その生理活性が他のカテキン類て注目を集めいている分子イメージング技術であと比べて強い。その生理活性には抗酸化作用、抗る 3 - 5）。イオン化は、サンプルとマトリックスと腫瘍作用、発ガン抑制作用、抗菌作用、抗ウイル呼ばれる有機低分子化合物の混合物にレーザー光ス作用、血圧上昇抑制作用、血糖低下作用、心疾を照射することで起こる。その詳細なメカニズム

患抑制作用等が報告されている 1, 2）。このようなは未だ明らかになっていないが、マトリックスが多彩な生理作用が報告されている EGCG の生理

レーザー光を吸収し、エネルギー仲介物質となる

活性発現のメカニズム解明には、EGCG 自身の厳と考えられている。また、得られるマススペクト

密な組織内空間分布の把握が必要不可欠である。

ルはサンプルとマトリックスの混晶の状態に大きしかしながら、現状では、低分子である EGCGく左右されることが知られている。しかしながら、の組織内における空間分布情報は明らかにされてMALDI 法自体が持つ欠点（定量性・再現性の悪いない。これは EGCG の局在を簡単に測定できさ・マトリックスイオンによる妨害）のため、細る分子イメージング技術の欠如が原因の一つであ

胞膜脂質や骨格タンパク質など、組織中に圧倒的る。

多量に存在し、かつ分子量が比較的大きな分子群

現在、分子イメージング、つまり、生体内での分子プロセスの可視化に関する基礎的・臨床的研の定性的な分布観察のみにその適用が制限されていた。

究および開発された可視化手法を利用する応用

これに対して、我々は MALDI - MS を用いて研究が盛んに行われている。その中でも、細胞・薬剤や食品因子の新たな表現型解析を可能に組織レベルでの分子イメージングでは、Greenし、既存の常識を覆す生体内代謝物の超高感度Fluorescent Protein（GFP）などの蛍光タンパク（attomole レベル）測定法および微量細胞からの質や他の蛍光色素を利用した光学イメージングが非標的型代謝物検出法、ならびに細胞内代謝動主に用いられている。しかしながら、生体内低分態の秒スケール追跡法の開発に成功した。さらに、子化合物の組織微小領域での可視化は非常に難し

上記技術を応用することで、単一細胞レベルの検いのが現状である。

出感度で多彩な代謝物を二次元可視化できる超一方、マトリックス支援レーザー脱離イオン

高感度 MS イメージング法を開発し、生体組織微化（MALDI ; Matrix Assisted Laser Desorption/

小領域における代謝ダイナミクスを明らかにして

質量分析イメージングによる生体組織内における機能性食品因子の局在解析

いる 6 - 8）。
そこで本研究では、非標識で低分子化合物を可視化できる MALDI - MS I を開発し、これまで追跡不可能であった EGCG の組織内における分布情55

た後、MALDI - TOF- MS に供し、各スポットでの強度を測定した。
1-3. マウス組織切片上における EGCG スポットの可視化検討
EGCG（5, 50, 500μM）を マ ウ ス 肝 臓、 腎 臓、報の可視化を試みた。
実験 1. MALDI- TOF- MS による EGCG イオン化に向けたマトリックスの探索

脳組織切片上に各 0.2μL ずつアプライした。サ

材料と方法

mL acetone）をスプレーコーティング法により1-1. 384 well MALDI サ ン プ ル プ レ ー ト 上 における検討

約 500μL 塗布した。そのステンレスプレートを100μM EGCG と 各 種 の マ ト リ ッ ク ス 溶 液で固定した後に MALDI - TOF- MS に供した。サ（10 mg/mL 100 % methanol, acetone 若 し く はンプルのサイズに合わせて測定サイズを調節し、acetonitrile）を そ れ ぞ れ 等 量 混 合 し、384 well

レーザーを照射した。また、各スポットにおいてMALDI サンプルプレートに 1μL アプライした10 回のレーザーショットを積算したスペクトル（n = 5）。 ま た、 コ ン ト ロ ー ル 群 と し て 各 溶 媒の平均値を、それぞれのスポットの強度とした。とマトリックスをそれぞれ等量混合したものも得られたデータを Biomap で解析することで、イ同様にアプライした。プレート上のサンプルをメージング画像を得た。

風 乾 さ せ た 後 に、MALDI - TOF- MS（AXIMA結ンプルを風乾させた後、1, 5 - DAN 溶液（10 mg/MALDI イメージング用プレートに導電性テープ

果Performance, Shimazu, Japan）に 供 し、positive

質量分析における選択性と検出感度を決定づけ

ion mode 若しくは negative ion mode それぞれる最大の要因は対象物質のイオン化効率にあり、のサンプルを測定した。データ解析はマトリック

特に MALDI - MS ではマトリックスと呼ばれる物

スと EGCG との混合サンプルで得られた強度か質のイオン化を促進する化合物（イオン化助剤 ）らコントロールとして用いたマトリックスと溶媒が標的物質のイオン化の成否を決定づけている。の混合サンプルの強度を引いた値を強度として

しかしながら、現状では EGCG のような微量低扱った。

分子化合物をイオン化できる有用なマトリックス

1-2. マウス肝臓組織切片上における検討情報はほとんど無い。そこで、EGCG のイオン化

C57BL/6J（雄性、6 週）マウスに頸椎脱臼処置を施し、頭部を液体窒素により瞬間凍結した。そに最適なマトリックスの探索とその最適な条件を検討した。の後即座に、氷上においたスチールトレーの上でまず、2, 5 - dihydroxybenzoic acid（ DHB ）,肝臓を摘出し、組織は O CT Compound で埋包し、α- cyano - 4 - hydroxycinnamic acid（ CHCA ）,- 80 ℃で凍結保存した。後日、クライオスタット

sinapic acid（SA）, 9 - aminoacridine（9 - AA）な どを用いて 10μm の薄片を作成し、ステンレスプ

MALDI - MS へ最も汎用されているマトリックスレートに張り付けた。そのステンレスプレートをを含む 41 種類の化合物を用いて、EGCG のイオ

MALDI イメージング用プレートに導電性テープン化に最適なマトリックスを検討した。その結で固定した。サンプルは、100μM EGCG と各マ

果、1, 5 - diaminonaphtalene（DAN）, Ferulic acid,トリックス溶液（10 mg/mL acetone）をそれぞれHarmine, Norharmane, Harmane が EGCG に 対等量混合した。それを組織上に 1μL アプライしする高い検出能（pmol オーダー）を示した。また、

56

浦上財団研究報告書

Vol.21（2014）

このような差は negative ion mode の場合にのみacid, Harmine, Norharmane, Harmane, Harmine

見られた。Positive ion mode の場合には、今回は著しくその強度が弱くなった。組織上において用いた全ての候補分子については大変強度が弱は、組織そのものの共雑物が非常に多くイオンく、EGCG を検出できなかった。このことより化が起きにくい状態であると考えられる。また、

MALDI 法において、今回用いたマトリックス候

Ferulic acid はサンプルプレート上では比較的強補化合物に対しては、EGCG は負に帯電しやすくい強度を示していたが、今回の組織上における検なると考えられる（ 表 1）。

討では、全く EGCG を検出することができなかっEGCG を高感度に検出できた 5 種類のマトリッた。一方、1, 5 - DAN のみにおいてはその強度はクスについて、マトリックスを溶かす溶媒の影響組織上においても強い強度を示し、EGCG を高感について検討した。その結果、それぞれのマト度に検出することができた（ 図 1B）。

リックスについて各種溶媒で検出強度に大きな差

次に、実際の測定条件を想定して、1, 5 - DANが見られた。これらの中で、特に、1, 5 - DAN をのマウス組織切片上に EGCG のみをスポットし、acetone へ溶かした場合顕著に EGCG に対する高そこにマトリックスを塗布してイメージング解い検出能を示した（ 図 1A）。

析を行った。その結果、マウス肝臓と腎臓ではマトリックスのさらなるスクリーニングを行う

5 pmol/spot から、脳では 50 pmol/spot の EGCG

ため、実際の標的組織である肝臓組織切片上でのを検出し、二次元イメージング化することができ検討を行った。サンプルには EGCG とマトリック

た（ 図 2）。

スの混合液を用いた。その結果、MALDI サンプ以上のことから、1, 5 -DAN が EGCG のイオン化にルプレート上では強い強度を示していた Ferulic最適なマトリックスであることが明らかとなった。

表 1. MALDI-MS を用いた各種マトリックスによる EGCG イオンの検出強度
Chemicals

Intensity
Negative

Positive

Chemicals

Intensity
Negative

Positive

DHB

580Acridine

25,2330CHCA

009-AA

160SA

51203,6-AD

00HPA

1,007

03-AQ

537

05-ASA

006-AQ

5,0720

Salicylamide

29304-AP

250DHAP

26204-NA

620

THAP

9,716

01,5-DAN

75,808,52900

HABA

1,4670DMAN0Caﬀeic acid

10,58102-NSA

00Ferulic acid

50,736,46805-FU

25

163

Anthranilic acid00MTX

1,83102-AB

208,205

0

NFR

00IAA

216,4310RB

02,672Dithranol

890

Diamond00

Norharmane

48,008,145

0Silver

00Harmane

22,721,4740

Colloidal

00Harmol

1,8980TiO 200

Harmaline00

SiO 2 TiO 200BaTiO 3 StTiO 300

Harmalol

43,2600Harmine

25,206,0890質量分析イメージングによる生体組織内における機能性食品因子の局在解析

57

図 1.

MALDI-MS による EGCG イオン化に向けた最適な条件の検討（A）各マトリックスにおける EGCG イオン検出強度に及ぼす溶媒の影響。10 mg/mL となるように100 %methanol、acetone、acetonitrile それぞれに溶かした各マトリックスと100μM
EGCG 混合物 1μL を MALDI サンプルプレートにアプライし、MALDI-TOF-MS によ
図 1. MALDI-MSによる EGCG イオン化に向けた最適な条件の検討 (A) 各マトリ
り negative ion mode で測定した（mean ± S.D., n = 5）。
（B）MALDI サンプルプレー
ックスにおけるトとマウス肝臓組織切片におけるEGCG イオン検出強度に及ぼす溶媒の影響。10mg/mL
EGCG イオン検出における影響。100μM
EGCG となるようと各マトリックス溶液（10 mg/mL in acetone）をそれぞれ等量混合し、MALDI サンに 100% methanol、acetone、acetonitrile それぞれに溶かした各マトリックスと 100
プルプレート若しくはマウス肝臓組織切片上にアプライし、MALDI-TOF-MS によりnegativeで測定した。
µM EGCG 混合物
1µLionをmode
MALDI
サンプルプレートにアプライし、MALDI-TOF-MSにより negative ion mode で測定した (mean±S.D., n=5)。(B) MALDI サンプルプ

レートとマウス肝臓組織における EGCG イオン検出における影響。100 µM EGCGと各マトリックス溶液 (10 mg/mL in acetone) をそれぞれ等量混合し、MALDI サン
プルプレート若しくはマウス肝臓組織切片上にアプライし、MALDI-TOF-MS によりnegative ion mode で測定した。

図 2.

8
1,5-DAN を用いた MALDI-MS によるマウス各組織切片におけるEGCG イオンの可視化。EGCG（5, 50, 500μM）をマウス組織切片上に各 0.2μL ずつアプライした後、1,5-DAN 溶液（10 mg/mL acetone）を塗布し、MALDI-TOF-MS により negativeion mode で測定した。得られたデータを Biomap で解析することで、m/z 457 イオンイメージング画像を得た。

図 2．1,5-DAN を用いた MALDI-MS によるマウス各組織切片における EGCG イオンの可視化。EGCG (5, 50, 500 µM)をマウス組織切片上に各 0.2 µL ずつアプライした後、1,5-DAN 溶液 (10 mg/mL acetone) を塗布し、MALDI-TOF-MS によりnegative ion mode で測定した。得られたデータを Biomap で解析することで、m/z

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浦上財団研究報告書

実験 2. EGCG を経口投与したマウス組織における EGCG の質量分析イメージング
材料と方法
2-1. EGCG の経口投与とサンプルの調整
C57BL/6J（雄性、6 週齢）マウスを 6 時間の絶食後、EGCG を 2000 mg/kg body weight となるように強制経口投与した。Control 群として、生理食塩水を投与した。EGCG 投与 1 時間後、マウス肝臓、腎臓、脳を摘出し、各組織内の EGCGレベルを測定するため、一部の組織は解析まで- 80 ℃で凍結保存した。
2-2. LC- IT- TOF- MS を用いた各組織におけるEGCG レベルの測定
凍結組織を約 50 mg 切り出し、ホモジナイズ用チューブにビーズとともに入れた。そこにアスコルビン酸を 50 mg/200μL となるように添加 し た。4,800 rpm, 30 秒 間 の 条 件 で 2 回（ イ ンターバルは 30 秒間）ホモジナイズした。その後、
4 ℃, 15,000 x g, 30 分間遠心分離した。その上清100μL をエッペンに回収した。そのエッペンに等 量（100μL）の 酢 酸 エ チ ル を 添 加 し た。N 2 ガス下でドライアップし、10 % acetonitrile 100μLに再溶解した。検量線を引くため EGCG 標品も各濃度となるよう調製した。各サンプルを注入
量 3μL で LCMS - IT- TOF- MS（Shimadzu）に供し、測定を行った。移動相は（A）100 % 超純水、0.05 % Formic acid、（B）100 % Methanol、0.05 %Formic acid としグラジエント溶出を行った。流
速 は 0.1 mL/min で、B buffer 濃 度 が、0 - 2 min,5% ; 2 - 7.5 min, 5 - 60%, 7.5 - 17 min , 60 - 100 % ; 1723 min, 100 % ; 23 -24 min, 100 - 5 % ; 24 - 30 min,5%の条件でグラジエントをかけた。カラムはLuna 5u C18（2）100A（Phenomenex）を用いた。
UV ス ペ ク ト ル は 210 nm、280 nm で 検 出 し た。
Electrospray ionization（ESI）によりイオン化を行い、negative ion mode でデータを得た。

Vol.21（2014）

2-3. 1,5-DAN を 用 い た MALDI-MS イ メ ー ジ ン
グによる組織切片での EGCG 分布の可視化
OCT Compound で埋包した組織サンプルをク
ライオスタットを用いて薄片を作成し、ステンレスプレートに張り付けた。組織上には positivecontrol として 250μM の EGCG 0.2μL をスポットした（50 pmol/spot）。サンプルを風乾させた
後、1, 5 - DAN 溶 液（10 mg/mL acetone）を ス プ
レーコーティング法により塗布した。ステンレス
プレートを MALDI イメージング用プレートに導電性テープで固定した後に MALDI - TOF- MS に供しレーザーを照射した。また、各スポットにおいて 10 回のレーザーショットを積算したスペク
トルの平均値を、それぞれのスポットの強度とした。得られたデータを Biomap で解析することで、イメージング画像を得た。
2-4. 1,5-DAN を用いた MALDI- FT- ICR- MS によるイメージ画像の同定
組織切片上から得られたピークイメージの同定
は超高分解能フーリエ変換イオンサイクロトン共
鳴 質 量 分 析 装 置（MALDI - FT- ICR- MS, Bruker
Daltonk GmbH）にて行った。具体的には、OCT
Compound で埋包した組織サンプルをクライオスタットを用いて薄片を作成し、ステンレスプレートに張り付けた。組織上には positive control として 250μM の EGCG 0.2μL をスポットした（50pmol/spot）。サンプルを風乾させた後、1, 5 - DAN溶液（10 mg/mL 80 % acetone）をスプレーコーティング法により約 500μL 塗布した。ステンレ
スプレートを MALDI イメージング用プレートに導電性テープで固定した後、MALDI - FT- ICRMS に供した。実際、サンプルから得られたピークのデータとタゲット分子の同位体（CHONPS 要素）の天然存在比から算出された理論ピークを比較することで、ピークの同定を行った。

質量分析イメージングによる生体組織内における機能性食品因子の局在解析

結59

分 布 の 可 視 化 を 1, 5 - DAN を 用 い た 質 量 分 析 イ

果EGCG を経口投与したマウス肝臓、腎臓、脳でメージングを行った結果、両臓器で EGCG と思の EGCG のイメージングを試みた。そのために、

われる m / z 457 のイメージ画像が EGCG 投与群

まず、EGCG を投与したマウス組織内の EGCGのみに認められた（ 図 4A）。

レベルを LC - IT-TOF-MS を用いて測定した。そ次に、m / z 457 ピークのイメージ画像が本当にの 結 果、EGCG を 2,000 mg/kg body weight 投

EGCG であることを確かめるためピークの同定を与したマウスの肝臓と腎臓組織には EGCG と思行った。一般的に、検出されたピークを同定する

われる m / z 457 マススペクトルピークが見られには標品の MS/MS 情報が必要不可欠である。した。このサンプルに対して MS/MS 解析を行った

かし、生体内で観察されるピークの多くは標品がところ、EGCG 標品と同様のマススペクトルピーなく、また、微量レベルであるため、たとえ標品クが見られた（ 図 3A）。これより、EGCG を投与があったとしても MS/MS でのピーク同定が困難したマウス肝臓 (149.55 ± 37.51 nmol/g Liver）とな場合が多い。そこで、我々は今回用いた TOF -腎臓（11.17 ± 1.82 nmol/g Kidney）組織中には、MS のような従来の装置よりも極めて高い質量分インタクトな状態の EGCG が存在していること解能（> 100,000）と質量精度（< 1ppm）での高感がわかった（ 図 3B）。

度測定が可能である MALDI - FT- ICR- MS を用

そこで、これらの二つの組織における EGCG

図 3.

いて 9）、m / z 457 ピークの同定を試みた。EGCG

EGCG を経口投与したマウス組織における EGCG の同定と定量化。（A）EGCG を投与したマウス肝臓と腎臓抽出物における LC-MS を用いた m/z 457 ピークの同定（B）LC-MS を用いた各組織における EGCG のレベル検討（mean ± S.D., n = 6）。

図 3. EGCG を経口投与したマウス組織における EGCG の同定と定量化。
(A) EGCGを投与したマウス肝臓と腎臓抽出物における LC-MS を用いた m/z 457 ピークの同定(B) LC-MS を用いた各組織における EGCG のレベル検討 (mean±S.D., n=6)。

60

浦上財団研究報告書を投与したマウスの肝臓と腎臓組織切片から得られたピークと同位体の天然存在比から算出された

Vol.21（2014）

結論

EGCG の理論ピークを比較した結果、第二同位体多彩な生理作用が報告されている緑茶カテキまで理論ピークと同様のピークが得られたことか

ン EGCG の生体組織内における局在情報を可視

ら、肝臓と腎臓組織切片から得られた m / z 457 イ化するため、MALDI - MS イメージング法を基盤

メージ画像は確かに EGCG であることが示されとした質量分析イメージング法の開発を行った。

た（ 図 4B）。また、興味深いことは EGCG の分EGCG をイオン化させるため、40 種類以上のマ布は肝臓では一様なのに対し、腎臓における分布トリックス候補化合物から MALDI サンプルプは部位により異なることが初めて明らかになった

レート上、肝臓組織切片上におけるスクリーニン（ 図 4A）。

グを行うことで、EGCG を高感度に検出できる

図 4.

1,5-DAN を用いた MALDI-MS による EGCG を投与したマウス各組織切片におけるEGCG イオンの可視化と MALDI-FT-ICR-MS によるそのピークの同定。（A）2,000mg/kg body weight と な る よ う に EGCG を 経 口 投 与 し た マ ウ ス 肝 臓 と 腎 臓 組 織
切 片 へ 1,5-DAN 溶 液（10 mg/mL acetone）を 塗 布 し、MALDI-TOF-MS に よ り
negative ion mode で測定した。得られたデータを Biomap で解析することで、m/z457 イオンイメージング画像を得た。（B）（A）のサンプルを MALDI-FT-ICR-MS に供し、得られたピークイメージの同定を行った。

図 4. 1,5-DAN を用いた MALDI-MS による EGCG を投与したマウス各組織切片
おける EGCG イオンの可視化と MALDI-FT-ICR-MS によるそのピークの同定。
2,000 mg/kg body weight となるように EGCG を経口投与したマウス肝臓と腎臓織切片へ 1,5-DAN 溶液 (10 mg/mL acetone) を塗布し、MALDI-TOF-MS によ質量分析イメージングによる生体組織内における機能性食品因子の局在解析

マトリックス 1, 5 - DAN を見出した。さらに、本マトリックスを用いることで EGCG を投与した
マウス肝臓と腎臓組織切片において、EGCG の生体組織内分布情報を非標識で可視化に世界に先駆けて成功した。今後、標的組織中の緑茶カテキン
EGCG の詳細な作用機構の解明につながることが期待される。
謝辞
本研究は（公財）浦上食品・食文化振興財団の研究助成により遂行することができました。貴財団の多大なご支援に対し心より感謝いたします。
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Anal Chem 2010; 82: 4278-4282.
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Anal Chem 2010; 82: 9789-9796.
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resonance mass spectrometry based on isotopic peak ratio.
Anal Chem 2010; 82: 5887-5891.

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浦上財団研究報告書

Vol.21（2014）

In situ label-free imaging of functional food factors inmammalian tissues by mass spectrometry imaging
Hirofumi Tachibana
Division of Applied Biological Chemistry, Department of Bioscience and Biotechnology
Faculty of Agriculture, Kyushu University
Introduction: The spatial distribution of bioactive small molecules from dietarycompound is indispensable information for elucidating their biological effects. However,there has been no analytical technique that can easily detect the localization in mammaliantissues. Therefore, in this study we present a novel in situ label-free imaging technique forvisualizing the localization of EGCG, a major green tea polyphenol, within mammaliantissue after oral dosing by establishing a matrix-assisted laser desorption/ionization-mass
spectrometry imaging (MALDI-MSI) technique.
Methods: To effectively ionize the EGCG for MALDI-MS, the optimum matrix needs
to be determined. For screening candidate matrix of EGCG, mixtures of EGCG and eachchemical compound solution were directly spotted onto a stainless MALDI sample plate.
These spots were measured by using MALDI-TOF-MS (AXIMA performance, Shimadzu).
To examine EGCG in the tissue section, normal or EGCG-administrated C57BL/6J mousetissues (liver and kidney) were sliced with cryostat and, then, thaw-mounted onto an ITOcoated glass slide. A 1,5-DAN solution as matrix was sprayed using an airbrush. Data wereacquired in negative ionization mode with 50μm spatial resolution (10 laser shots/datapoint). To identify EGCG and its metabolites in tissues, an isotopic fine structure analysis
was performed by ultrahigh-resolution Fourier-transform ion cyclotron resonance (FTICR)-MS.
Results and Discussion: Among 41 chemicals as the potential matrix, β-carboline
derivatives, CHCA analogues, and 1,5-DAN could effectively ionize EGCG on MALDI
sample plate in negative ionization mode. Among such matrix candidates, only 1,5-DAN
was able to visualize EGCG directly spotted onto liver and kidney sections. Furthermore,by using 1,5-DAN-based MALDI-MS, EGCG was visualized within liver and kidney
sections of EGCG-administrated mouse. In addition, combination of this label-free
MALDI-TOF-MSI technique and an isotopic fine structure analysis using ultrahighresolution MALDI-FT-ICR-MS also visualized spatially-resolved biotransformation basedon simultaneous mapping of EGCG.
Conclusion: In conclusion, we demonstrated for the first time that MALDI-MSI could
visualize an orally dosed bioactive polyphenol of green tea, EGCG in mammalian tissues
without any labeling.