再生医療及び遺伝子治療製品の品質・安全性評価
2019 年3月20日
山口照英
金沢工業大学
日本薬科大学

金沢工大曙文庫

本日の話題• 再生医療等製品（遺伝子治療製品）に関する基準や指針• 再生医療等製品の製法確立と特性解析– ウイルス安全性／再生医療等製品の原材料の安全性– 製造工程での評価– 製品の特性解析– 最終製品の規格／試験法• 遺伝子治療製品の製法確立・品質・安全性

細胞・組織加工医薬品等の製造に係る品質・安全性確保⚫ 「細胞・組織を利用した医療機器又は医薬品の品質及び安全性の確保について」平
成11 年7 月30 日付け医薬発第906 号（平成21 年5 月18 日付け薬食発第0518001号
にて一部改正）⚫ 「ヒト又は動物由来成分を原料として製造される医薬品等の品質及び安全性確保について」平成12 年12 月26 日付け医薬発第1314 号⚫ 「ヒト（自己）由来細胞や組織を加工した医薬品又は医療機器の品質及び安全性の確保について」平成20 年2 月8 日付け薬食発第0208003 号⚫ 「ヒト（自己）由来細胞・組織加工医薬品等の品質及び安全性の確保に関する指針に係るQ&A について」平成20 年3 月12 日付け事務連絡⚫ 「ヒト（同種）由来細胞や組織を加工した医薬品又は医療機器の品質及び安全性の確保について」平成20 年9 月12 日付け薬食発第0912006 号⚫ 「ヒト（同種）由来細胞・組織加工医薬品等の品質及び安全性の確保に関する指針に係るQ&A について」平成20 年10 月3 日付け事務連絡⚫ 「ヒト（同種）体性幹細胞加工医薬品等の品質及び安全性の確保に関する指針」薬食発 0907第3号 平成24年9月7日⚫ 「ヒト（自己）iPS（様）細胞加工医薬品等の品質及び安全性の確保に関する指針」薬食発0907第4号 平成24年9月7日⚫ 「ヒト（同種）iPS（様）細胞加工医薬品等の品質及び安全性の確保に関する指針」薬食発0907第5号 平成24年9月7日⚫ 「ヒトES細胞加工医薬品等の品質及び安全性の確保に関する指針」 薬食発0907第6号 平成24年9月7日

生物由来原料基準• ヒト細胞組織加工製品原料基準– ヒト細胞組織原料等を採取するに当たって、それらの利用の目的に応じ、問診、検診、検査等により、細菌、真菌、ウイルス等の感染が否定されていること– ウイルス等の検査項目、検査手法の適切性– ウイルスの検査ではウインドウ期を考慮した検査の実施– ドナーの適格性：輸血や移植医療を受けたものの排除• 細胞の培養や加工に用いる試薬等– 動物由来原料基準（培養細胞由来サイトカインやヒト血液由来増殖因子）– 反芻動物由来原料基準(ウシ血清）– 血漿分画製剤総則(アルブミン等）– ストローマ細胞

欧米：先端医療製品のRaw-Material Control

再生医療等製品に関連する他の指針
異種動物由来細胞・組織を用いる場合●「異種移植の実施に伴う公衆衛生上の感染症問題に関する指針について」平成14
年7 月9 日付け医政研発第0709001 号●「異種移植の実施に伴う公衆衛生上の感染症問題に関する指針」に基づく3T3J2
株及び3T3NIH 株をフィーダー細胞として利用する上皮系の再生医療への指針について」平成16 年7 月2 日付け医政研発第0702001 号

細胞に遺伝子工学的改変を加える場合●「遺伝子治療用医薬品の品質及び安全性の確保に関する指針について」平成7 年
11 月15 日付け薬発第1062 号●「遺伝子治療用医薬品の品質及び安全性の確保に関する指針の改正について」
平成14 年3 月29 日付け医薬発第0329004 号●「遺伝子治療用医薬品の品質及び安全性の確保に関する指針の一部改正について」平成16 年12 月28 日付け薬食発第1228004 号
製造管理・品質管理●「ヒト（自己）由来細胞・組織加工医薬品等の製造管理・品質管理の考え方について」平成20 年3 月27 日付け薬食監麻発第0327025 号●「治験薬の製造管理、品質管理等に関する基準（治験薬GMP）について」平成20
年7 月9 日付け薬食発第0709002 号

次世代医療機器評価指標• 「関節軟膏再生に関する評価指標」 薬食機発1215第1号（別添1）平成22年12月
15日• 「角膜内皮細胞シートに関する評価指標」 薬食機発0118第1号（別添1）平成22年
１月１8日• 「角膜上皮細胞シートに関する評価指標」薬食機発0528第1号（別添1）平成22年5月28日• 「重症心不全細胞治療用細胞シートに関する評価指標、角膜上皮細胞シートに関する評価指標」 薬食機発0118第1号別添3及び4 平成22年1月18日• 「自己iPS細胞由来網膜色素上皮細胞に関する評価指標」 薬食機発0118第1号
平成25年5月29日• 「歯周組織治療用細胞シートに関する評価指標」 薬食機発1207第1号 平成2３
年１２月７日• 「ヒト軟骨細胞または体性肝加工製品を用いた関節軟骨再生に関する評価指標」
薬食機発0630第1号 平成２８年６月３０日• 他
本評価指標は申請内容に関して拘束力を有するものではなく、個々の細胞・組織
加工医薬品等についての試験の実施や評価に際しては、その時点の学問の進歩を反映した合理的根拠に基づき、ケース・バイ・ケースで柔軟に対応することが必要である。

日本の遺伝子治療関連指針◼ 臨床研究遺伝子治療臨床研究に関する指針
2002年3月27日文部科学省・厚生労働省告示第1号
2004年12月28日文部科学省・厚生労働省告示第2号（全部改正）
2015年指針の改正
2019年2月ゲノム編集を取り入れた指針の告示 4月施行

◼ 薬事承認に向けた開発（治験）
遺伝子治療用医薬品の品質及び安全性の確保に関する指針
1995年11月15日厚生省薬務局長通知 薬発第1062号
2013年7月1日医薬食品局審査管理課長通知：確認申請制度の廃止に伴う改正
2015 「遺伝子治療用製品等の品質及び安全性の確保に関する指針」（案）を厚生労働省に提出（小野寺班）
ICH見解
生殖細胞への遺伝子治療用ベクターの意図しない組み 込みリスクに対応するための基本的な考え方

事務連絡2015.6.23

ウイルスとベクターの排出に関する基本的な考え方

事務連絡2015.6.23

腫瘍溶解性ウイルス事務連絡2015.6.23

遺伝子治療の法規制の変化⚫ 薬事法の改正
医薬品、医療機器等の品質、有効性及び安全性の確保等に関する法律（医薬品
医療機器等法/薬機法）（平成25年11月27日公布、26年11月25日施行）✓ 「医薬品」「医療機器」とは別に「再生医療等製品」という区分を新たに定義✓ 「遺伝子治療を目的として、人の細胞に導入して使用するもの」は「再生医療等製品」に分類（遺伝子治療用医薬品ではなく遺伝子治療用製品）✓ 「再生医療等製品」の条件・期限付承認制度の創設による早期実用化⚫ 再生医療等の安全性の確保等に関する法律（ 26年11月25日施行）✓ ex vivo遺伝子治療は遺伝子導入細胞を用いた臨床研究となり、再生医療新法の「高リスク」第一種再生医療等として特定認定再生医療等委員会により審査を受ける（ex vivoとin vivo遺伝子治療が異なる組織で審査を受ける）✓ 「遺伝子治療臨床研究に関する指針」の一部改正について：ex vivo遺伝
子治療の除外と薬事法の名称変更に伴う改正

本日の話題• 再生医療等製品に関する基準や指針• 再生医療等製品の製法確立と特性解析– ウイルス安全性／再生医療等製品の原材料の安全性– 製造工程での評価– 製品の特性解析– 最終製品の規格／試験法• 遺伝子治療製品の製法確立・品質・安全性

再生医療等製品の開発
細胞原料• 患者の前処置（例：末梢血CD34陽性細胞採取のためのG-CSF投与）• 細胞組織の採取･加工・選別･分離• 採取施設要件• 細胞受入れ試験
細胞種• 自己由来細胞• 同種由来細胞– iPS細胞– ES細胞– 骨髄間葉系幹細胞

製法の確立
培養、工程管理
培養打ち切り条件(培養期間）
製品の特性解析
品質規格／出荷判
定ドナー適格性と細胞の試験ドナーとしての適格性（同種製品）
•
•
•
•

•
•
•
•

病歴（がんや腫瘍、神経疾患等）
輸血や臓器移植を受けたことのないもの(未知の感染症の排除）
海外滞在歴（輸入感染症やBSE)
ウイルス検査（HIV、HCV、HBV、HTLV-1/2、パルボウイルスB19）；
NAT検査、血清学的検査、問診、サイトメガロウイルス感染、EB ウ
イルス感染及びウエストナイルウイルス感染については必要に応
じて検査
梅毒トレポネーマ、クラミジア、淋菌、結核菌等の細菌による感染症
重篤な代謝及び内分泌疾患
肝疾患
特定の遺伝性疾患や家族歴

ウイルス安全性に関してウインドウ期によるウイルス汚染リスクを排除するために再試験の実施を考慮すること

細胞／組織の採取と細胞組織可能製品の製造工程への受け入れ
ドナーの適格性
• 検査
• 問診
• 病歴等

組織の採取

工程管理と
工程内試験
培養工程

製品

細菌・真菌・ウイルス等の不活化、除去法
限定的な不活化処理
例えば組織片のア
ルコール洗浄等

細胞の分散・選別• 酵素処理• 遠心操作• FACS• マグネティックソーティング
細胞の受け入れ試験・ウ
イルス検査・無菌試験等

細胞の受け入れ試験• 無菌試験
– 試験結果が受け入れ時の後に得られるケースも– 必ずしも適用できない（口腔内細胞、角膜細胞）• 抗生物質を用いた培養の必要性• ウイルス試験• マイコプラズマ試験

血清等を用いたスクリーニング
検査と異なる結果もありえる*– 無菌試験同様に適用できない場合もある• 表面抗原の発現試験*: Ferri C et al: Parvovirus B19 infection of bone marrow in systemic sclerosis patients. ClinExpRheumatol.
17, 718-720, 1999 ; Lundqvista,A et al. High frequency of parvovirus B19 DNA in bone marrow samples
from rheumatic patients. J. Clin. Virol. 33, 71–74, 2005

生きた細胞を用いる再生医療製品では、ウイルス等の不活化工程を導入することが不可能で有り、かつウイルス検査のみではウイルス安全性を担保することには限界がある。ウイルス安
全性は再生医療等製品の重要な柱ES細胞やiPS細胞由来製品• 最適な細胞を選別後、均一な細胞集団としてバンク化やストック化される：ストック時の試験• 目的とする機能細胞へ分化させた後、必要な特性解析や規格試験を実施• さらに増幅後患者へ投与：出荷規格

京都大学及び成育医療センターからの医療用ES細胞の作製計画を了承【厚生労働省部会】•••

厚生労働省厚生科学審議会再生医療等評価部会（2017年6月7日）
京都大学ウイルス・再生医科学研究所の末盛博文准教授らのチームが申請した再生医療用の胚性幹細胞（ES細胞）の作製計画を了承。文部科学省の特定胚等研究専門委員会は5月に計画を大筋で了承
厚労・文科両大臣が認可する見通し。認可されれば、国内初の臨床用ES細胞の作製が始まる。

•

計画では、医療機関から不妊治療で使われなかった余剰胚の提供を受け、臨床応用が可能なES細胞を20種類作製。年度内にも、国立成育医療研究センターなど
再生医療を用いた治療を行う医療機関や研究機関に提供を開始。

•

厚労省によると、部会に先立ち開かれた審査委員会では、受精卵提供者からのインフォームド・コンセントを慎重に取得すべきとの意見が出たという。
国立成育医療研究センターもES細胞を用いた難病治療を目指す研究を予定しており、近日中に作製計画を両省に申請するとみられる。

•• 成育医療研究センターからの樹立申請 2017年9月6日に承認

iPS細胞由来再生医療等製品• 京都大学：iPS細胞由来ドパミン神経前駆細胞を用いた医師主導治験を平成30年6月4日付で独立行政法人医薬品医療機器総合機構(PMDA)に提出、平成30年8月1日より治験を開始• iPS細胞：再生医療用iPS細胞ストックプロジェクトでは、HLA型を、 免疫拒絶反応が起きにくいホモ接合体で持つドナーから医療用のiPS細胞を作製

iPS作製

作製したiPS細胞のストック化

臍帯血臨床研究としての開発（厚生労働省・再生医療等評価部会での承認）• iPS由来心筋細胞シートを用いた重症心不全治療臨床研究• iPS由来網膜色素上皮細胞を用いた加齢性黄斑変性症臨床研究• IPS由来神経細胞を用いた脊髄損傷治療臨床研究• iPS由来角膜上皮細胞シートを用いたSJ症候群等の臨床研究

iPS細胞由来心筋シートによる虚血性心筋症治療臨床研究
京都大学が樹立したiPS細胞より大量に心筋シート作製法の開発
患者の手術日に合せて心筋シートを作製
重症心不全患者3名を対象とした
安全性評価

iPS細胞から誘導した心筋シート

大阪大学ホームページより

心筋シートから産生される因子によりリモデリングや血管誘導により治療効果が発揮されると想定

iPS細胞やES細胞由来細胞を用いた再生医療等製品
iPS細胞やES細胞の受入れ試験• iPS細胞を樹立し、ストック（バンクに相当）を作製した時点で徹底的な解析
• ウイルス汚染：ICH Q5A（バイオ医薬品のウイルス安全性）を参考に評価• 無菌試験
• ゲノム変異（がん遺伝子等）や染色体解析により造腫瘍性リ
スクの評価本日の話題• 再生医療等製品に関する基準や指針• 再生医療等製品の製法確立と特性解析– ウイルス安全性／再生医療等製品の原材料の安全性– 製造工程での評価– 製品の特性解析– 最終製品の規格／試験法• 遺伝子治療製品の製法確立・品質・安全性

ウイルス検査• 自己細胞と同種細胞での試験要件の違い– 自己細胞の場合にはスクリーニング試験としての必要性
は必須とはされていない：但し、製造工程の汚染や製造従事者の安全性確保の観点が求められる• 同種細胞の場合は献血時の試験項目– 問診：患者の健康状態、過去の病歴(輸血歴等）– 海外渡航歴– 血清学的試験• HCV：抗体検査• HBV：抗HBe抗原検査、抗HBc抗体検査• HIV：抗体検査• HTLV-1/2：抗体検査– 核酸増幅検査（NAT検査）

血清学的試験とNATを組み合わせることが有用• HBV、HCV、HIV• 感度･精度･頑健性の設定
Chudy,M et al.: Risk Minimization Measures for Blood Screening HIV-1 Nucleic Acid Amplification Technique
Assays in Germany. Transfus Med Hemother 41, 45-51, 2014

製法においてストックを構成する細胞- 細胞バンクを含む
ドナーの適格性
• 検査
• 問診
• 病歴等

Yamanaka4
因子の導入

組織の採取
iPS細胞

再検査によるウインドウ期の否定

製品

ウイルス試験

工程管理と
工程内試験

細胞ストックとしての試験（ICH Q5A）
ウイルス安全性

培養工程

目的細胞への分化誘導

細胞の受け
入れ試験

同種ヒト細胞を原材料として多数の患者に投与するためにバンクを構成する場合
ICH Q5A 細胞バンクレベルで一度は実施すべきウイルス試験
ＭＣＢ

ＷＣＢ

ＣＡＬ

＋

－

＋

＋
＋＊１
適宜実施

－
－
－

＋
＋＊１
適宜実施

－＊２
－＊２
－
－

＋
＋
－
－

レトロウイルス及び内在性ウイルス試験
感染性試験
電子顕微鏡観察
逆転写酵素活性その他細胞種特異ｳｲﾙｽ試験

非内在性ウイルスまたは外来性ウイルス試験
in vitro試験＋
in vivo試験＋
抗体産生試験
＋＊３
その他細胞種特異ｳｲﾙｽ試験
適宜実施*1:レトロウイルス感染性試験が陽性のときは不要*2:ＣＡＬ（イン・ビトロ細胞齢の上限の細胞）で試験が実施されるときは不要*3:例えばマウス，ラット，ハムスターでの抗体産生試験，通常，げっ歯類由来の細胞に対し適用する．

原材料（Raw Materials）受け入れ• 培養添加物– ウシ胎児血清– ヒトトランスフェリン– ヒト繊維芽細胞増殖因子（FGF）– インターロイキン：e.g. IL-2、IL-４• 培養マトリックス– フィブロネクチン– マトリゲル• 細胞加工– ブタトリプシン– コラゲナーゼ• 安定化剤

ウシ血清
米国連邦規制基準9CFR 113.53– BVDV、B. adenovirus type、 Bovine
parvovirus、Bluetongue virus、Bovine
respiratory syncytial virus、Rabies
virus、Reovirus type 3– 細胞変性性病原体– 赤血球吸着性病原体– マイコプラズマ– 無菌試験

USP：GC BFS– 細胞増殖試験– ウイルス不活化工程– γ線照射(25-35Gr)：３０Gr 以上では細胞の増殖促進効果が減衰– UV照射：十分な不活化効果がえられるか？

– ヒトアルブミン

原料としての品質管理とウイルス等の汚染を排除した安全性確保

本日の話題• 再生医療等製品に関する基準や指針• 再生医療等製品の製法確立と特性解析– ウイルス安全性/再生医療等製品の原材料の安
全性– 製造工程での評価– 製品の特性解析– 最終製品の規格／試験法• 遺伝子治療製品の製法確立・品質・安全性

製造管理• 細胞の選別、ソーティング– FACS、磁気ビーズ、接着細胞の選別• 培養条件– 培地組成：血清、増殖因子、– 培養基質（フィブロネクチン、コラーゲン）– 温度、ｐH、酸素濃度– 播種細胞濃度– 細胞の生存性– 培養期間（継代数、細胞倍加数）• 培養打ち切り条件– 培養以上件を超えた細胞での試験

製法開発における考慮事項• 目的とする細胞の分離と増幅加工– Homologous Use とNon-homologous Use• 皮膚由来繊維芽細胞を拡大培養して用いる（HU)• MSCを神経細胞の前駆細胞として用いる(non-HU)– 純度の高い細胞；拡大培養– 特定細胞のみを増幅；分離操作

生きている細胞を用いるという特性：• 培養工程の中での選別：MSCのトリプシンを用いない継代
刻一刻と変化する• 培養条件と培養期間– 多くの細胞がin vitro培養で特性が変化していく• 増殖能の低下• 細胞特性の変化･消失– 工程評価• 細胞培養の期間の設定• 細胞品質特性の恒常性を担保する培養期間の設定

血管内皮前駆細胞の開発例
•
•
Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

種々の条件での増幅・誘導CD34/AC133陽性細胞
末梢血単核球

特性解析結果から目的とする
再生医療製品の最適な培養方法開発へのフォードバック

Y細胞表面、マーカー等による特性解析と細胞の分離
血管内皮細胞誘導能の解析
血管内皮前駆細胞

CD31

Tie2

KDR/Flk-1

効率よく目的細胞を誘導できる
条件の確立

eNOS
Flt-3/Flk-2
Von Willebrand Factor
Ve-cadherin
Tie1
Tie2
CD11b

目的とする血管内皮前駆細胞の品質特性を目指し、採用した製造方法がその目的にかなうことを示す必要がある

FDAの品質特性確保の取り組み
MSC consortium：
MSCを用いた細胞治療の増加に対応するために• FDA’s perspective:
First of all, agency noted the lack of consensus
in MSC field:• Although not an FDA requirement,
stakeholder efforts toward generatingconsensus on MSC definitions would be auseful development for the field, which would
allow comparison across multiple studies andcould facilitate potential clinical use.

FDA MSC Consortium‐ MSCの免疫抑制機能を予測する指標の開発

経時的に細胞の形態変化をおっていくことにより、細胞の機能分化能を予測することを開発。

Klinker et al (2017) Morphological features of IFN-γ–stimulated mesenchymal stromal cells predict overall immunosuppressive capacity.
PNAS .

FDA MSC Consortium‐ Development of strategies to improve cell therapy product characterization

FDAはMSC Consortiumを立ち上げ開発が進むMSCの品質特性解析を進めている。
その一つとして、MSCの分化機能を予測する指標を開発

MSCを用いた再生医療の開発が進むが、培養条件、培養経緯、由来等を含めてMSCと総称できる均一な機能を持つ細胞ではない

Marklein et al (2016) Size and shape of human mesenchymal stem cells may predict future biochemical
behavior potentially linked to supporting bone growth, Stem cells, 34:935–947

テムセル：JCR 造血幹細胞移植後の急性移植片対宿主病（GVHD）
造血幹細胞移植における急性GVHDを効能とする。
MSCが免疫抑制機能を持つことは広く知られているが、投与された全ての細胞が同じ機能を持つのかという課題
例えば将来的に製法変更をした時に、MOAを担う細胞が製法変更前後で同等であるか。

FDA MSC Consortium MSCの特性指標：
Cell Surface Marker Characterization Proposed in MSC-Based Product INDs
Table 1MSC-Based Product Phenotypic Marker Expression Proposed in MSC-Based Product INDs
% Usage
Av. Min. % ± SD
Usage
Common ProductRange Described% with Range
RANKMarker Name
RANK
Described

Av. Max. %
± SD

1
2
3
4
5

CD45
CD105
CD90
CD73
CD34

91
73
61
52
48

2
1
3
4
7

58
67
36
29
21

0±0
88 ± 7.54
87 ± 7.17
86 ± 7.240±0

7 ± 6.84
100 ± 0100 ± 0100 ± 09 ± 6.56

6
7

CD14
HLA Class II

47
44

6
5

24
27

0±0
0±0

7 ± 7.00
9 ± 7.15

89CD44
HLA Class I

30
26

—
10

—
14

—
74 ± 18.60—
100 ± 0

10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20

CD29
CD106
CD19
CD80
CD86
CD166
CD10
CD146
CD40
CD11b
CD200

24
23
21
21
21
20
18
15
15
14
12

—
—
—
—
—
8
—
9
—
—
—

—
—
—
—
—
18
—
15
—
—
—

—
—
—
—
—
92 ± 4.52

—
—
—
—
—
100 ± 067 ± 4.83———

100 ± 0———

自家培養皮膚ジェイス（JACE）• 米国グリーン教授の方法に準じて製造された自家培養表皮• 適用疾患：自家植皮のための恵皮面積が確保できない重篤な広範囲熱傷。体表面積の30％以上の熱傷を適応対象。先天性巨大色素性母斑• 採取皮膚組織：最低1cm2以上• 移植された自家培養表皮は、通常、1週間程度で生着し、 3～4週で基底膜が完成、移植してから1年後には真皮と表皮の境界に緩やかな波状の表皮突起が形成されと考えられている細胞をばらばらに培養移植した細胞シートから幹細胞が増幅してきている可能性 ⇒ 長期の生着に寄与しているのでは患者皮膚長期生着に寄与する細胞の特性解析の必要性

Feeder
拡大培養

取り出した細胞シート

酵素処理 Confluent-cell
細胞シート

From J-TEC

ヒト（自己）骨格筋由来 細胞シート（ハートシート）
虚血性心疾患による重症心不全患者を対象とした再生医療製品
患者自身の大腿部から骨格筋芽細胞（骨格筋のもとになる幹細胞）を採取し、試験管ないで培養増幅させる（細胞を増やす）。
できた細胞をシート状にして患者の心筋の表面に貼り付ける
貼り付けた細胞シートが心筋細胞になるわけではない（分泌された因子が心不全を回復させると考えている）
再生医療に用いる細胞は、患者自身の細胞を用いる自家細胞製品と他人の細胞を用いる他家細胞製品に分類することができる。自家細胞製品は拒絶反応がないという反面、完全オーダーメイド製品なので高コストになると予想され、また疾病を持つ患者さんからの細胞を摂取するために身体的負担が掛かる。さらに製造している間に感受の病状が進行することもある

骨格筋芽細胞シート

患者の心筋に貼り付ける
From Terumo Co.

本日の話題• 再生医療等製品に関する基準や指針• 再生医療等製品の製法確立と特性解析– ウイルス安全性– 再生医療等製品の原材料の安全性– 製造工程での評価– 製品の特性解析– 最終製品の規格／試験法• 遺伝子治療製品の製法確立・品質・安全性

培養期間を超えて培養した細胞の確認
iPS/ES細胞由来製品では造腫瘍性や染色体異常などの評価を製品や培養期間を超えた細胞で実施する

細胞特性
の確認

製品

設定された培養期間
培養期間を超えた製造

造腫瘍性試験• 造腫瘍性リスクのある場合– 特性の幹細胞由来の細胞バンク、遺伝子改変細胞、長期に亘って培養した細胞• 造腫瘍能の試験系– 軟寒天コロニー形成試験、フォーカス形成試験、成長因子非依存性増殖の有無(クローナリティー）、ヌードマウスへの皮下移植による造腫瘍性試験（WHO TRS878）• 臨床投与を類似した部位への投与（FDA)– 必ずしも適切とは言えないかもしれない(眼内投与：被検量限界）• 試験動物の選択、投与量、陽性コントロール– ヌードマウスを用いるより、さらに高感度な方法としてNOGマウス、
NSGマウスを用いる系が考えられるが標準化されてはないない– 全ての腫瘍細胞が陽性となるわけではない– ワクチン製造での評価などと異なり投与量、投与部位、観察期間などについてコンセンサスが得られているわけではない

iPS細胞／ES細胞の造腫瘍性試験• iPS細胞やES細胞は奇形腫を形成する細胞– iPSやES細胞を用いた再生医療製品を開発する際に作製されたiPS細胞やES細胞ストックでの造腫瘍性試験と機能分化をさせた最終製品での造腫瘍性試験の意味は異なる• 樹立したiPS細胞／ES細胞ストックでの試験• ゲノム変異の解析– 核型（G-バンド解析）、及び全エクソンの塩基配列の異常を解析– 既知発がん遺伝子における異常；がんゲノム変異データベース– iPS細胞では誘導に用いた遺伝子の染色体への挿入の有無– ゲノムの不安定性– 必要であればホールゲノム配列の確認• iPS細胞／ES細胞由来細胞組織加工製品の試験– 最終製品の試験では少量しか含まれない未分化細胞を検出できることを評価する必要– 最終製品を未分化多能性幹細胞培養条件に戻して培養してiPS 細胞等のコロニーが出現しないことの確認– 軟寒天コロニー形成試験、フォーカス形成試験、成長因子非依存性増殖アッセ
イ、ヌードマウスへの皮下移植（感度の十分性の評価が必要）

PMDA科学委員会：iPS 細胞等をもとに製造される細胞組織加工製品の造腫瘍性に関する議論のまとめ

製造工程を通じた細胞特性の安定性• 遺伝的安定性

Gバンド解析

– G-バンド解析– Q-バンド解析– m-FISH– Comparative Genomic
Hybridization CGH– SNP変異解析– 全ゲノム解析

マルチカラーFISH

CGH

本日の話題• 再生医療等製品に関する基準や指針• 再生医療等製品の製法確立と特性解析– ウイルス安全性／再生医療等製品の原材料の安全性– 製造工程での評価– 製品の特性解析– 最終製品の規格／試験法• 遺伝子治療製品の製法確立・品質・安全性

細胞特性解析：サイトカインや増殖因子産生能
血管内皮前駆細胞が放出するサイトカインの解析
TNF

GM-CSF

G-CSF

10

10

10

8

8

8

6

6

6

4

4

4

2

2

2

0

pg/ml

Bright Pos Bright Pos
Peripheral

0

Peripheral

Cord Blood

VEGF

200

1600

150

1200

100

800

50

400

0

Bright Pos Bright Pos
Peripheral

Cord Blood

Bright Pos Bright Pos

00

Peripheral

Cord Blood

MCP-1

Bright Pos Bright Pos

30000

Cord Blood

IL-8• 有効性及び安全性の面から評価をする必要がある• 細胞の産生能は刻一刻と変化している• 有効成分と考えられる場合には出荷規格として設定

25000
20000
15000
10000
5000
Bright Pos Bright Pos
Peripheral

Cord Blood0

Bright Pos Bright Pos
Peripheral

Cord Blood• 血管内皮前駆細胞が産生する血管内皮細胞により血管形成を促進する可能性• 細胞が分泌するサイトカインや増殖因子の役割

細胞特性解析：特定遺伝子発現

2R32（管腔形成能 高）
1.E+01

遺伝子発現比較結果

1.E+00

MMP1

1.E-01

1.E-02OECS222 （管腔形成能 中）

CASP1
OCLN

1.E-03

1.E+01
1.E-04
1.E+00
1.E-05

MMP1

1.E-01

1.E-06OEC

HUVEC

1.E+01• 管腔形成に関わる遺伝子の探索• 製法開発における培養条件の最適化

1.E+00

1.E-01MMP1

1.E-02OEC

1.E+01

1.E+00

1.E-01

1.E-02

1.E-03

1.E-04

1.E-05

1.E-06S3（管腔形成能 低）

1.E-03OCLN

1.E-04CASP1

1.E-05

1.E-06

1.E+01

1.E+00

1.E-01

1.E-02

1.E-03

1.E-04

1.E-05

1.E-06

HUVEC

開発対症である細胞に求めるその機能に関連する品質特性、生物活性を、表現系をあきらかする

1.E+01

1.E-06

1.E+00

1.E-05

1.E-01

1.E-02

1.E-03

HUVEC

OCLN
CASP1

1.E-04

1.E-04

1.E-03

1.E-05

1.E-06

1.E-02

最終製品の品質管理(1) 細胞数並びに生存率(2) 確認試験(3) 細胞の純度試験(4) 細胞由来の目的外生理活性物質の試験(5) 製造工程由来不純物試験(6) 無菌試験及びマイコプラズマ否定試験(7) エンドトキシン試験(8） ウイルス試験⚫ 全ての品質管理項目の実施を求めて(9) 効能試験
いない(10)力価試験⚫ 恒常性が担保されていれば最終製品ごとの試験が不要の場合も(11) 力学的適合性試験⚫

中間工程試験で品質・安全性を担保できれば最終製品での試験は不要

想定される細菌感染症
米国の病院での汚染菌のサーベイ結果• コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（31％)、黄色ブドウ球菌（20%）、エンテロコッカス属菌(9％)、カンジダ属菌(5％)、E.coli(3％)、 クレブシエラ属菌(2％)、緑膿菌(2％)
The Pew Charitable Trust. Report on US．Illness and death associated with compounded medicines. September 06, 2014

2006～2016年：輸血後細菌感染症の発症状況 (日赤 医薬品情報）• Staphylococcus aureus（黄色ブドウ球菌）（3件）, Streptococcus dysgalactiae ssp.
equisimilis（G群溶血性レンサ球菌）（3件）, Streptococcus agalactiae（Ｂ群レンサ球菌）,• Staphylococcus pyogenes（A群溶血性レンサ球菌）, Serratia marcescens（セラチア）• Escherichia coli（大腸菌）, Citrobacter koseri

各種迅速試験法の特徴 －測定原理、検出限界等
代表的な検出法

技術要件

検出限界（cfu/ml）

解析に要する時間

サンプルサイ
ズ（ml）

長所と欠点

グラム染色

クラシカルな染色104～10530分

0.1

バクトアラート

呼吸法（CO2 測定）

1-10

ON～7日間5-10

高価、生細菌測定

ScanRDI システ
ム

固相サイトメトリー

1-10

2-3 時間

1-500

特殊機器

Milliflex迅速系

ATP検出法1-10

5-7 日間1-500

FACS 解析

フローサオトメトリー解析

10-100

6-8 時間

0.1-2

汎用機器

PCR（多数の核
酸増幅法）

核酸増幅法

1-100

2-4 時間

0.2-2

迅速、高感度、儀陽性、汚染リスク

TAM V

マイクロカロリーメトリー

1-10

2-7 日間1

特殊機器

マイコプラズマ試験法改正の背景＿日局17
2014年6月に公表*・パブコメ、2016年3月7日厚生労働省告示第64号◼主な改正点：C法（PCR法）の全面改正
C. 核酸増幅法（NAT)◼16局：特定のプライマーを用いたPCR法の例示⇒NATのバリデーション法の提示(様々な手法が利用可能）◼C法の位置づけを改正：「培養法 (A法)」と「指標細胞を用いたDNA蛍光染色法 (B法) 」 による試験を実施する。ただし、適切なバリデーションを実施することにより、C法をA法やB法の代替法として用いることができる。
◼欧米薬局方との国際調和、生物学的製剤基準との調和◼同等性試験を実施し、NATとA法又はB法の検出感度を比較
NATをA法、B法の代替法とする場合
A法を代替する場合：
7種のマイコプラズマ全てについて10 CFU/mLを検出可能なことを示す
B法を代替する場合：
7種のマイコプラズマ全てについて100 CFU/mLを検出可能なことを示す*http://www.pmda.go.jp/public/pubcome_201406_2/file/029-1406.pdf
日本薬局方フォーラム23 (2)，145-149 (2014)

細胞及び測定市販キットの比較
細胞
Vero細胞（JCRB細胞バンクJCRB0111）
Mesenchymal stem cell（MSC； Lonza）
CHO-DG44細胞（Life Technologies）
マイコプラズマ測定市販製品
MycoTOOL PCR Mycoplasma Detection Prep Kit (Roche Diagnostics)
MycoTOOL Mycoplasma Real-Time PCR Kit (Roche Diagnostics)
MycoSEQ Mycoplasma Detection Kit (Life Technologies)
キット名
会社
特化

MycoTOOL (realtime PCR)
Roche Diagnostics
CHO-DG44

MycoTOOL (PCR)

MycoSEQ

Life Technologies
特にない
マイコプラズマゲノム
1E+05 cells/ml以下の場合、沈殿媒体の使
沈殿媒体
DNAを結合できる磁石用が推奨(オプション）
ビーズ(常備)
1 ml
推奨検体量
10 ml
抽出
1E+06 cells
1E+06 cells以上
細胞濃度上
5E+06 cells/ml
2E+08 cells以下の場
限合、細胞を取り除き上
清を使用
ターゲット
16S rRNA
16S rRNA
非公開
配列
公開
非公開
非公開
核酸増幅
real-time
インターカレータ－法
probe法PCR原理
SYBR Green I 46
公表検出下限< 10 CFU/ml< 10 CFU/ml< 10 CFU/mlM
5E+02 cells/ml

5E+03 cells/ml

5E+04 cells/ml

5E+05 cells/ml

5E+06 cells/ml

PC Mo 1 pg

PC Mh 1 pg

PC 10 copy

negative control

細胞変更によるマイコプラズマ検出への影響__ヒトMSCの場合

キャリアーDNAを添加

M. hyorhinis

target 464bp
PC 360bp

100 CFU/ml

target 464bp
PC 360bp

10 CFU/ml

まとめ• 新法の制定により再生医療等製品は医薬品とは別枠の製品とされたが品質や安全性に対する考え方が変ったわけではない• 生きていいる細胞という非常に不安定で刻一刻と変化する細胞を一定の品質を担保して製造するための製法管理の重要性• 特にウイルス等の感染因子に対する安全性確保の重要性• 通常の医薬品と異なり、製造後の有効期間の短い再生医療等製品の出荷試験については合理的な考え方を適用することが望ましい：そのための基礎的データを取得しておくことの重要性• 迅速試験法の適用による安全性確認の有用性．迅速試験
で投与の判断を行った場合に、通常の試験による無菌性の確認が望ましい本日の話題• 再生医療等製品（遺伝子治療製品）に関する基準や指針• 再生医療等製品の製法確立と特性解析– ウイルス安全性／再生医療等製品の原材料の安全性– 製造工程での評価– 製品の特性解析– 最終製品の規格／試験法• 遺伝子治療製品の製法確立・品質・安全性

遺伝子治療用製品の種類と遺伝子治療の方法
遺伝子治療用ベクター製品(in vivo遺伝子治療)

遺伝子導入細胞製品(ex vivo遺伝子治療)

ベクターの
直接投与

ベクターの例

標的細胞を取り出す(自己、同種)◆ ウイルスベクター

造血幹細胞
T細胞 等

培養、増幅
遺伝子導入

Retrovirus
Lentivirus Adenovirus

AAV
etc.

◆ プラスミドベクター

Naked DNA

Lipofection

腫瘍内、筋
肉内眼内、
脳内
皮内 等

培養、増幅

輸
注

◆ 腫瘍溶解性ウイルス
Herpesvirus
Adenovirus etc.

◆ 増殖性細菌ベクター
Listeria
Clostridium etc.

遺伝子治療の代表的な対象
疾患と導入遺伝子の例◆ 遺伝性疾患：欠損遺伝子◆ がん：キメラ抗原受容体（CAR)
抗原特異的T細胞受容体
がん抗原、サイトカイン 等

遺伝子導入
細胞
TALENやCRISPR-Cas等のゲノム編集技術を用いたより安全性の高い治療が期待されている

遺伝子治療ベクターと臨床適用• 遺伝子治療ベクターとして用いられるもの– ウイルスベクター• 非増殖性• 増殖性ベクター（腫瘍溶解性ウイルス等）– プラスミド– 細菌ベクター（腫瘍溶解性組換え細菌）– mRNAやタンパク質＋ガイドRNA（CRISPR/CAS9）：遺伝子を用いない遺伝子改変が可能に• ベクターとしての特徴– 染色体への挿入（インテグラーゼ活性をもつ）– 核内での遺伝子発現（アデノウイルスベクター、プラスミド）– 核外での遺伝子発現（センダイウイルスベクター）

Ex vivo遺伝子導入 ⇔ ヒトへの直接投与

主な遺伝子治療用ベクターの構造例
レトロウイルスベクター

アデノウイルスベクター

カプシド

エンベロープウイルスゲノム

エンベロープタンパク質

ウイルスゲノムの構造
野生性
レトロウイルス

LTR

非増殖性
LTR
レトロウイルスベクター

ψ

gag

pol

env

ψ

LTR

野生型
アデノウイルス

ﾌﾟﾛﾓｰﾀｰ

E3 領域

ITR

非増殖性
アデノウイルスベクター

LTR

約36ｋｂ

E1 領域

ITR
DE3

DE1
ITR

ITR

目的遺伝子
ﾌﾟﾛﾓｰﾀｰ 目的遺伝子

LTR: Long Terminal Repeat
ψ：パッケージングシグナル
ITR: Inverted Terminal Repeat

アデノ随伴ウイルス（AAV)ベクター
プラスミドベクター
複製起点

ITR

ITR
野生型AAV

Rep

ITR

選択マーカー
遺伝子

ﾌﾟﾛﾓｰﾀｰ

目的遺伝子
約4.7ｋｂ

プラスミドDNA
目的遺伝子

ITR

AAVベクタープロモーターpoly A
付加シグナル

ウイルスベクターの製造スキーム AAVやAdV
Promotor

ITR

CMV

Gene of Interest

hGH polyA

Rep

CAP

ITR

Promotor

E2A

E4

VA RNAsITR

ds DNA

Co-transfection
293 cells
ITR
Rep
E2A

E4

CMV

Gene of Interest

hGH polyA

CAP

ss DNAVA RNAsmRNA
Viral proteins

Packaging of single-strand DNA
Production of viral vector

遺伝子治療用ベクターの遺伝子構造を明らかにすると共に、ベクター製造工程を明らかにする必要がある。ベクターの安全性や有効性は製造方法に依存している。

レトロウイルスベクターの製造スキーム
gag

LTR
ψ
pGP

Recombinant
retrovirus vector
plasmidpol

LTR
hHCV promotor

pE-ecoCo-transfection
LTR

生産培養
遺伝子治療用ベクターの遺伝子構造を明らかにすると共に、ベクター製造工程を明らかにする必要がある。ベクターの安全性や有効性は製造方法に依存している。

Retoro ウイルスベクターの製造スキーム
gag

LTR
ψ
Recombinant
retrovirus vector
plasmid

pGP

pol

LTR
hHCV promotor
製造工程において遺伝的変異が起きる可能性 ⇒ ベクターの遺伝子配列解析
製造に用いる生産細胞がウイルスに汚染されている可能性
製造工程中に外来性ウイルスが迷入する可能性
pE-eco⇒ ウイルス試験
Co-transfection⇒ 増殖性ウイルスベクターを用いる場合には目的とするウイルスベクター
がウイルス試験を妨害する可能性⇒ 目的ウイルスに対する中和抗体を使用
LTR
してウイルス試験を実施
相同組換えにより増殖性ウイルスが出現する可能性⇒ 増殖性ウイルス試験

生産培養
遺伝子治療用ベクターの遺伝子構造を明らかにすると共に、ベクター製造工程を明らかにする必要がある。ベクターの安全性や有効性は製造方法に依存している。

生産したベクターのウイルス安全性等• バンク化した生産細胞のICH Q5Aを参考としてウイル
ス試験• 培養後のバルクハーベストでの迷入ウイルス試験– インビトロウイルス試験• 例えばヒト細胞を用いる場合、MRC-5、Vero細胞、HEK293細胞などを用いて細胞傷害性（CPE）や赤血球凝集反応などを指標として感染性ウイルスの検査– 特に懸念されるウイルスについてNATによる検査– 感染性の検出ではウイルスベクターとの競合が起こる可能性がある• バルクハーベストでの増殖性ウイルス否定試験• ウイルスベクターの製造工程由来不純物の試験

RCAの検出法：CPE 法とInfectivity PCR法
＜Conventional Cell Culture / CPE Method＞
RCA＜Infectivity PCR＞

AdV
Infection
1～9 Days

Cell Pellet

HeLa Cell

DNA Extraction by
Glass Beads

7 Days

1~2 Days

4 Wks

Quantification of E1 DNA
by Quantitative PCR

Cell Lysate

A549 Cell
14 DaysSensitivity : 1 pfu in Starting Materials
7 DaysCytopathic Effect (CPE)➢Long Term Needed➢Semi-quantitativeRapidSensitive
Quantitative

ウイルスベクターによる細胞の遺伝子改変

Transfection

Target Cells
非増殖性LTR
レトロウイルスベクター

ψLTR
ﾌﾟﾛﾓｰﾀｰ

LTR

目的遺伝子

逆転写酵素によるDNA合成
LTR

Integration

Replicated DNA

mRNA

Protein of Interest

遺伝子治療としての効果発現

遺伝子治療ベクターの品質特性評価
感染効率
目的遺伝子の発現効率
遺伝子発現の持続性
ウイルス粒子数（電顕やqPCR）••••••

目的遺伝子の発現
ウイルスベクターに混入した宿主遺伝子断片等
電顕観察によりウイルス遺伝子をもつ粒子とカラの粒子の評価
感染可能な細胞の評価（ウイルスベクターの細胞指向性）
レーザ回折・散乱法粒子径分布測定による粒子径分布の測定
増殖性ウイルスの測定 RCAはウイルス粒子3 x 1010に1個以下

•
•
•
•

迷入ウイルス
無菌試験
マイコプラズマ否定試験
エンドトキシン製造に用いたプラスミド（）や宿主遺伝子断片（

感染性/粒子数（感染性のない
ウイルス粒子の評価））の混入

ウイルスベクターにより挿入変異による造腫瘍性リスク
免疫不全マウスを用いた造腫瘍性試験

X-SCIDでの発ガンには3-5年以上の年月を要している

長期フォローアップの重要性

レトロウイルスベクターの挿入変異によるがん化
X-SCID遺伝子治療:造血幹細胞を使用した理想的な遺伝子治療
CD34陽性細胞

retroviral vector

After his gene therapy, he was running around at home(science, 2000)- He is a normal little boy now LMO-2遺伝子座への挿入による白血病の発症

LTR

Ex.1

LTR

gc cDNA

gc cDNASASA（がん原遺伝子）

SD

SD

LMO-2

LTR

(science 302, 415, 2003)

Pt 4

LTR

Pt 5

Ex.2

慢性肉芽腫症に対する造血幹細胞を標的とした遺伝子治療臨床研究でのMDS発症(2017年7月）• 我が国で実施されている慢性肉芽腫症（CGD)の遺伝子治療において骨髄異形成症候群（MDS）の発症が認められた。
• レトロウイルスベクターを用いた造血幹細胞をターゲットとし遺伝子治療• 海外でもレトロウイルスベクターを用いたCGD遺伝子治療においてMDSの発症が報告されていた• 海外のCGD遺伝子治療においてもMDS発症が認められていたが、今回用いられているレトロウイルスベクターは、これまで
MDSの発症が認められていないベクターであった• レトロウイルスベクターががん遺伝子であるEVI1をコードする
MECOM( MDS1 and EVI1 complex locus )<3q26.2> ）に挿入されている細胞のクローナルな増殖が認められた
発ガンは造血幹細胞を対象としたレトロウイルスベクターを用いたex-vivo遺伝子治療でのみ起こっている（体細胞遺伝子治療では造腫瘍性は知られていない）

体性幹細胞を対象としたレトロウイルス遺伝
子治療の挿入変異やがん化の評価• 間葉系幹細胞や脂肪幹細胞のレトロウイルスベクター（インテグラーゼ活性を持つベクター）の挿入変異のリスク
Retrovirus Vectorを用いた遺伝子治療
25
20
15
10

5
0

CART等のCTL遺伝子治療において最も多くレトロウイルスベクターが使用されている。
一方で先天性希少疾患の治療において造血幹細胞を含めた体性幹細胞治療にもレト
ロウイルスベクターが使用されている（挿入変異の評価や長期フォローアップが必要。

FDAの遺伝子治療長期フォローアップGL•••

ベクターごとのリスクに応じたフォローアップ対策
基本的なフォローアップ期間としては１５年。最初の５年間は毎年の検査を実施し、残り１０年間は定期的な問診を行う
長期に渡る遅発性有害事象に関しては、全ての遺伝子治療薬が同じリスクを持つ
わけではない•極めて予後の悪い患者、病状の重い患者、発ガン性のある治療薬を投与されている患者などに同様のフォローアップを適用することは困難•

それぞれの遺伝子治療薬の特性に応じたフォローアップを行う必要がある•

遅発性有害事象のリスクが極めて低いケースでは長期フォローアップを求めない

モニタリング対象

他局の対応⚫ レトロウイルスベクターによる発癌• 有害事象の長期フォローアップに関して
は、各極ごとにモニタリング体制が求められている⚫ De novo 由来がんの発症の有無⚫ 神経疾患の発症の有無⚫ リウマチ性疾患の発症の有無⚫ 免疫性疾患／血液疾患の発症の有無
等を含める• 他の地域（EUで開発されている遺伝子治療薬をFDAに）への治験申請する場合も想定され、議論の継続により基本原則の調和が達成されることが望ましい

究極の遺伝子治療としてのゲノム編集への期待
Gene therapy using gene-editing

Traditional gene therapy

Chromosome Target gene (abnormal gene)

Chromosome Target gene (abnormal gene)

Gene transfer

Retro-, lentivirus

Gene cutting by CRISPR/CAS9AAV

Out-ofChromosome
Target gene(abnormal gene)

Normal geneNot-target gene locus

Nonhomologous
repairＸ

Knock-outof abnormal
gene

Donor DNAhomologous
recombination

Repairing abnormal gene

⚫ Gene addition or complement⚫ Repair the abnormal gene or knock-out⚫ No change of abnormal gene（for congenital gene disease）⚫ Difficult to control the insertion⚫ 異常遺伝子の変異を修復（究極の遺伝子治療）➡Risk of tumor⚫ がん化を生じない安全な部位への遺伝子導入⚫ Difficult to control the expression of gene

⚫ 遺伝子の発現調節も可能

従来の遺伝子治療では実現できない治療が可能
染色体切断に伴う副作用の可能性

「遺伝子治療等臨床研究に関する指針」の問題点
第一章 総則第二 用語の定義
一 この指針において「遺伝子治療等」とは、疾病の治療や予防を目的として遺伝子又は遺伝子を導入した細胞を人の体内に投与することをいう。
⚫ ウイルスベクターやプラスミドを用いるゲノム編集⚫ 外来遺伝子を導入するゲノム編集⚫ ゲノム編集用酵素をタンパク質やmRNAで導入⚫ ガイドRNAにオリゴRNA、塩基の書換えにオリゴDNAを用いたゲノム編集

遺伝子治療

現行指針・Q&A
では対象外
指針に基づく審査が行われない医薬品医療機器総合機構（PMDA）科学委員会
ゲノム編集に関する専門部会を設置
2019年度内にゲノム編集についてのコンセプトペーパーの作成

Clinicaltrial.govに登録済のゲノム編集臨床試験
受理
年
2009

対象疾患

状況

ゲノム編集の種類、導入法

HIV

終了

ZFN

アデノ

ex vivo

標的細胞・
組織・臓器
T細胞

2010

HIV

終了

ZFN

アデノ

ex vivo

2010
2012
2014
2015

HIV
HIV
HIV
HIV

終了
実施中
実施中
リクルート中

ZFN
ZFN
ZFN
ZFN

アデノ
アデノ
mRNA
mRNA

ex vivoex vivoex vivoex vivo

2015

HIV

リクルート中

ZFN

mRNA

2016
2016

血友病B
ムコ多糖症1型

リクルート中
未実施

ZFN
ZFN

2016

ALL、CML

リクルート中

TALEN

AAV
AAV
mRNA
（CARはレンチ）

2016

非小細胞肺がん実施中

CRISPR

未実施

ZFN

リクルート中

TALEN

膀胱がん
未実施
腎細胞がん
未実施
前立腺がん
未実施
ムコ多糖症2型
未実施
EBｳｲﾙｽ性腫瘍
未実施
ﾊﾟﾋﾟﾛｰﾏｳｲﾙｽ性子宮頚2017
未実施
部上皮内部腫瘍
2017
食道がん
リクルート中CRISPRCRISPRCRISPRZFNCRISPRTALEN,CRISPRCRISPR

2016 子宮頚部前がん病変
2016
2016
2016
2016
2017
2017

小児ALL

plasmidmRNA(CARはレンチ）

AAV
plasmid

標的遺伝子 ゲノム編集目的

治験段階

CCR5

KO

Phase 1

T細胞

CCR5

KO

Phase 1

CCR5
CCR5
CCR5
CCR5

KO
KO
KO
KO

Phase 1/2
Phase 1/2
Phase 1/2
Phase 1

ex vivo

T細胞
T細胞
T細胞
造血幹細胞
T細胞

CCR5

KO

Phase 1in vivoin vivo

肝臓
肝臓

アルブミン座アルブミン座

遺伝子導入
遺伝子導入

Phase 1
Phase 1

ex vivo

T細胞

TCR, CD52

KO （UCART19)

Phase 1

ex vivo

T細胞

PD-1

KO

Phase 1in vivo

子宮頚部

HPV

KO

Phase 1

ex vivo

T細胞

TCR, CD52

KO (UCART19)

Phase 1

ex vivoex vivoex vivoin vivoex vivo

T細胞
T細胞
T細胞
肝臓
T細胞

KO
KO
KO
遺伝子導入
KO

Phase 1
Phase 1
Phase 1
Phase 1
Phase 1in vivo

子宮頚部

KO

Phase 1

ex vivo

T細胞

PD-1
PD-1
PD-1
アルブミン座PD-1
HPV16,
HPV18 E7
PD-1

KO

Phase 2

ゲノム編集の遺伝子治療としての定義及び遺伝子治療の範囲
ゲノム編集による遺伝子切断
配列認識モジュールヌクレアーゼDNA二本鎖切断

A T G C T G
I

I

I

I

I

欠失／挿入
相同組換え

I

T A C G A C
切断しないゲノム編集
エフェクター
脱アミノ化
NH2

ATGCTGATCTA

ATGCTGATUTA

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

TACGACTAGAT

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

TACGACTAAAT

エフェクター

ATGCTGATCTA

ATGCTGATCTA

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

TACGACTAGAT

I

点変異
組換え

遺伝子改変
に該当
DNAメチル化/
脱メチル化

脱メチル化

Me

脱アミノ化
（デアミナーゼ）
リコンビナーゼ

I

I

I

I

I

I

I

I

I

TACGACTAGAT

転写制御因子
ヒストン修飾遺伝子発現制御西田敬二：染色体の切断を伴いないゲノム編集ツール開発．（実験医学Vol 34 p35(2016)） より改変

ゲノム編集の安全性評価：染色体転座リスク

Chen et al:Targeted Chromosomal Translocations and Essential Gene
Knockout Using CRISPR/Cas9 Technology in Caenorhabditis elegans.
Genome Research 2017

Ferguson & Frederick :DNA double strand break repair andchromosomal translocation: Lessons
from animal models. Oncogene 20: 5572 (2001)

Torres et al: Engineering human tumour-associatedchromosomal translocations with the RNA-guided
CRISPR–Cas9 system. Nature Communications 2014

先端医療技術のコストの課題と普遍化
遺伝子改変したCART019による画期的な効果
Emma Whitehead は2010年に急性白血病になり、抗がん剤治療も効かず余命半年と宣告されCART療法に最後の望みを託す。CART療法では重篤な副作用も出たが白血病細胞が駆除され、現在もALLサバイバーとして元気に生活している。

CAR T細胞療法製剤の開発• FDA 2017年に2つの抗CD19 CARを発現する自己CTL細胞を承認• Novartis社のCART製品KymriahがFDAから承認.小児・若年r/r B-ALL適応．2017年10月9日• 米Kite Pharma社のCART製品であるYescarta (axicabtagene ciloleucel)がFDAから承認．2種
以上の全身療法でも有効性が得られなかった再発/難治性の大細胞型B細胞性リンパ腫の成人患者．2017年10月18日• がん治療を受けた患者ではCARTの製造が困難なことが多い• ユニバーサルCART製品の開発（FDAが同種由来CARTの治験を承認.2018）• サイトカインストーム症、毛細管漏出症、脳症などの致死的副作用• 2019年2月20日Kymriah：再生医療等製品・生物由来技術部会が製造販売を承認
今後CART019 以外のCTL製品がでてくるか：固形がん
ユニバーサルドナー細胞技術の実用化
高額な医療費の課題

CAR T細胞療法製剤の開発• FDA 2017年に2つの抗CD19 CARを発現する自己CTL細胞を承認• Novartis社のCART製品KymriahがFDAから承認.小児・若年
r/r B-ALL適応．2017年10月9日• 米Kite Pharma社のCART製品であるYescarta (axicabtagene
ciloleucel)がFDAから承認．2種以上の全身療法でも有効性が得られなかった再発/難治性の大細胞型B細胞性リンパ腫の成人患者．2017年10月18日• がん治療を受けた患者ではCARTの製造（増幅）が困難なことが多い ⇒ ゲノム編集を用いたユニバーサル化• ユニバーサルCART製品の開発（FDAが同種由来CARTの治験を承認.2018） ⇒ 高額治療費の課題への対応• サイトカインストーム症はIL-6R抗体により対処可能だが、毛細管漏出症、致死的脳症などの重篤な副作用をどのように制御していくかが課題

CART開発とバイオ医薬品

Giaridis: CAR T-cell-induced cytokine release syndrome ismediated by macrophage and abated by IL-1 blocked.
Natutre . 2018

抗IL-1受容体アンタゴニスト(Anakinra)が致死的脳症に効果がある可能性
CARTのような先端医薬品の実用化がバイオ医薬品によって支えられている⇒ バイオ医薬品の新たな領域

FDA：メラノーマの治療に対し、初めて腫瘍溶解性ウイル
ス療法薬talimogene laherparepvecを承認 (2015-11-7）
腫瘍溶解性ウイルスの臨
床有効性の概念の変更：
腫瘍溶解によるバイスタ
ンダー効果の重要性

Oncolytic virotherapy
oncolytic immunotherapy

遅延型の有効性：免疫応答が認められるまで時間を要する

がん効率的に死滅させる機能以上に宿主免
疫応答に重要な役割が期待

まとめ• 非常に多様な遺伝子治療製品の開発が進んでいる．
• 初期に想定していなかった増殖性ウイルスを用いた治療やバイスタンダード効果を期待する製品も多くなっている• 遺伝子治療製品の品質・安全性に関しては製造においてどのようなプラスミドが用いられたか、遺伝的安定性･変異などの評価が重要• 進歩の激しい遺伝子治療用製品の開発を促進させる
ために、最新の科学的レベルに基づく評価を積極的に取り入れることが重要• ゲノム編集技術は技術的要件も含めて従来の遺伝子
導入型遺伝子治療と異なる評価が必要ご静聴ありがとうございました
ご質問がございましたら