茨城県工業技術センタ−研究報告第 19 号

大根のポリフェノ−ルオキシダ−ゼ活性
橋本 俊郎＊
大根の塩蔵中に生ずる褐変は，ニ次加工品の品質評価に大きな影響を与える 1）。この褐変防止のために貯蔵中の塩漬大根と外気（酸素）との遮断，低温貯蔵，清液へのアスコルビン酸の添加などが行われ，ある程度の効果をあげている。しかし，褐変の原因や機構は明かでなく，未解決の問題として残っている 2）。おそらく複数の要因が相乗的に作用した結果であろうと言われ，そのひとつに大根ポリフエノール類の酵素による酸化褐変説 2）がある。これに関する酵素として生大根で 3，4−ジヒドロキシフエニルアラニン（DOPA）を基質とするポリフエノールオキシダーゼ（PPO．E.C.1.14.18.1）1）3）とピロガロールなどのトリヒドロキシベンゼンを基質とするＰＰ０4）の存在が報告されている。
ＰＰ０は分子状酸素を利用してフエノール性物質を酸化するので，その活性測定法として，褐変生成物による吸光度の増加を測る吸光度法 5）より，基質の酸化に消費された酸素濃度の減少を測る検圧法や酸素電極法 6）のほうが直接的で優れている。
本試験においては大根根部から調製した粗酵素画分について，ＰＰ０活性を酸素電極法で測定し，各種基質についてその作用を調べた結果，ＰＰ０活性は認められなかったので大根根部にＰＰ０は存在しないと推察した。

1．実験方法
1．1 アセトンパウダー及ぴ粗酵素の調製細切した生大根（青首と白秋大根を使用．）100ｇに 6 倍量の冷アセトン（−25゜Ｃ）を加えて磨砕後，ろ過した。アセトン不溶部を 5 倍量の冷アセトンで洗浄後，氷冷下でアセトン臭がなくなるまで減圧乾燥し，アセトンバウダーとした。100ｇの生大根から 1．8ｇのアセトンパウダーが得られた。
5ｇのアセトンパウダーに対し，2．5ｇの不溶性ポリビニルピロリドンと 1000ｍｌの 0．ｌＭリン酸緩衝液（ｐＨ6．8）を加えて室温下で 15 分間穏やかに撹拌後，遠心分離（10，000Ｇ×20ｍｉｎ．）して不溶物を除去し，得られた上清に硫安を加えて 0．2〜0．9 飽和で沈澱する蛋白画分を集めた。沈澱物は少量の緩衝液に溶かして透析チュープに入れ，外液を 0．0ｌＭリン酸緩衝液（ＰＨ6．8）として 48 時間透析（冷蔵庫内）した。
不溶物を遠心分離で除き，上清を粗酵素液（約 20ｍｌ）とした。
なお，比較のために生ゴボウからも同様の操作で粗酵素を調製した。
1．2ＰＰＯ活性の測定法 6）酸素電極法の場合は，東亜電波工業（株）製の記録計ＣＤＲ12Ａに隔膜ガルバニ式酸素電極 0Ｅ−201 を接続し，酵素添加後の反応液中の溶存酸素濃度の減少を 5 分間測定記録して，1 分間当たりの酸素減少＊食品加工部−94−茨城県工業技術センター研究報告第 19 号

量を PPO 活性として示した。反応容器として 15ml 容のガラス製秤量瓶（内径 28mm，深さ 28mm）を用い，反応液総量を 10ｍ3 として室温下で測定した。酵素源としてアセトンパウダーを使用する場合は，基質溶液10ml に対し 100mg のパウダーを加えた。基質としてピロガロール，カテコール，フロログリシン，クロロゲン酸及び L‑DOPA を用い，それぞれ，0.ｌM リン酸緩衝液(pH6.8)に 10mM となるように溶かした。 吸光度法による場合は，自記分光光度計（日立，U‑3200）の Time Scan 機能を用い，3ml の 10mM 基質溶液に 0.2ml の酵素液を加え，420nm の吸光度の変化を 5 分間記録し，1 分間における吸光度の増加量で活性を示した。測定は 250℃下で行い，対照セルには基質溶液と熱失活させた酵素液を入れた。

3．実験結果及び考察
3．1Ｐｍ活性測定における吸光度法と酸素電極法の比較表 1 に 2 つの方法による大根のＰＰ0 活性の測定結果を示した。

試験した基質物質の中でピロガロール，カテコール，フロログリシンは大根酵素の添加により黄色〜淡褐色に変色し，大根酵素によって酸化されたようにみえる。吸光度法によれば，大根にはこれらの物質に対するＰＰＯ活性があるとみることができる。しかし，クロロゲン酸及びＬ−ＤＯＰＡに対しては，酵素添化後も反応液の 420ｎｍの吸光度を増加させることなく，酸化しないちのと思われる。表に示してないが，コーヒー酸，Ｐ−クマール酸，フエルラ酸及びシナピン酸のヒドロキシ桂皮酸類に対する吸光度の増加は認められなかった。
反応中の酸素濃度の変化を調べる酸素電極法によって酸素濃度の減少が認められた物質はフロログリシンのみで，カテコ−ル，ピロガロールのいずれも酸素濃度に変化は認められなかった。従って，ＰＰ0 の定義
から大根酵素はフロログリシン酸化活性を有するが，試験した他のフエノール類に対する酸化活性はなく，ｏ−ジフエノール化合物を酸化するＰＰ0 は存在しないものと思われる。
3．2 ゴボウのＰＰＯとの比較
大根に用いた酵素の調製法でＰＰＯが失活しないことを確認するために，ゴボウから大根と同じ調製法−95−

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で酵素を調製した。表 2 にアセトンパウダーを用いてＰＰ0 活性を測定した結果を示した。

ゴボウは試験したフエノール化合物に強いＰＰ0 活性を示し，特にｏ−ジフエノール化合物に対して高い酸素吸収を示した。しかし，大根はフロログリシンに弱い活性を示したのみで，ｏ−ジフエノール酸化活性は認められなかった。ゴボウァセトンパウダーから調製した透析粗酵素は各基質に対し，アセトンパウダーと同様の作用を示した。従って，用いた酵素調製法でゴボウＰＰＯが失活せずに抽出されることから，大根の場合も，もしＰＰ0 が存在するならば失活せずに抽出されると考えられる。また，大根のＰＰＯ活性を抑制し，外観上，活性が無いように作用するアスコルビン酸 3）やフエノール性物質 7）は，用いた調製法で除かれることから大根にはＰＰ0 は全く存在しない，または，少なくとも大根の品質に影響を及ぼす程度のＰＰ0 は存在しないと考えた方が妥当である。
大根の粗酵素のフロログリシン酸化活性に関して，試験に用いた粗酵素はグアヤコールを基質として強いパーオキシダーゼ活性を示した。藤田ら 4）は精製したカブのフロログリシン酸化酵素がパーオキシダーゼ活性を恃つことを示している。植物体に広く存在するパーオキシダーゼが過酸化水素なしにＩＡＡ，ＮＡＤＨ及びＤ0ＰＡなどを酸化する活性を有することが知られている 8），9）。従って，大根の粗酵素で認められたフロログリシン酸化活性はパーオキシダーゼに由来する可能性が高く，ＰＰ0 によるものでないと考察される。

4．要約
大根根部よりアセトンパウダーを調製し，更にパウダーから緩衝液で抽出，硫安分画及び透析して粗酵素画分を得たっピロガロール，カテコール，フロログリシン，クロロゲン酸及びＬ−Ｄ0ＰＡを基質として，酸素電極法によりポリフエノールオキシダーゼ活性を測定したところ，フロログリシンのみに活性を示した。
ゴボウ粗酵素との比較及びパーオキシダーゼ活性の検出から大根根部にはポリフエノールオキシダーゼは存在しないと推察した。

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参考文献
1）小川敏雄：漬物製造学ｐ113（株）光琳（1989）
2）前田安彦：月刊食品 322 号ｐ11（1984）
3）石黒伊三雄・篠原力雄・青山方子：栄養と食糧 23，13（1970）4）藤田修二・東野哲三：農化 54，429（1980）
5）中林敏郎：日食工誌 15，199（1968）
6）農林水産技術会議事務局編：昭和 48 年度食品分析研究会報告書Ｐ278（1974）
7）藤田修二・東野哲三：農化 53，233（1979）8）Ａ．ＳｉｇｎｏｒｅｔａｎｄＪ．Ｃｒｏｕｚｅｔ：Ａｇｒｉｃ．，Ｂｉ01．，Ｃｈｅｍ．，42，1871（1978）
9）0．Ｐ．ＳｒｉｖａｓｔａｖａａｎｄＲ．Ｂ．ＶａｎＨｕｙｓｔｅｅ：Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，16，1527（1977）−97−