第24回日本遺伝子細胞治療学会
24th JSGCT Meeting

腫瘍溶解性ウイルスの品質･安全性評価
Current Issues on Quality and Safetyof Oncolytic Virus Products
金沢工業大学・加齢医工学先端技術研究所・所長
日本薬科大学・客員教授
山口照英
28/7/2018多様な腫瘍溶解性ウイルスの開発とその作用機構
腫瘍溶解性ウイルスの製法開発と品質評価
非臨床安全性
ウイルス排出と第三者への伝播の防止

腫瘍溶解性ウイルス： 正常細胞内では増殖できず、標的とするがん細胞内で選択的に増殖可能な制限増殖型ウイルス
がん遺伝子治療ベクター

感染した細胞のみ溶解• 野生型ウイルス• 自然弱毒変異株• 遺伝子改変ウイルス• 正常細胞におけるウイルス増殖に必要な遺伝子の欠失• 腫瘍細胞に特異的なプロモータの組み込み

腫瘍溶解性ウイルス(ベクター） 周辺のがん細胞や遠隔転移したがん細胞も溶解• 細胞親和性や細胞への侵入過程に関与するウイルス遺伝子の変異• ウイルスへの遺伝子導入：受容体蛋白，サイトカインなど••••

増殖性を持つウイルスベクターを利用することにより高い薬効が期待
がん細胞の溶解による免疫活性化(バイスタンダード効果）
免疫活性化を支援するArmed Oncolytic Virus
がん遺伝子治療（e.g.プロドラッグの改変酵素遺伝子を搭載）

国内開発中の腫瘍溶解性ウイルスの例
区

分 実施施設ウイルスの種類

名古屋大学

変異単純ヘルペス
ウイルス

三重大学

臨床研究
東京大学

治験

変異単純ヘルペスウイルス
遺伝子組換え単純ヘルペスウイルス1型(HSV‐1)

岡山大学

遺伝子組換えアデノウイルスオンコリス
バイオファーマ

遺伝子組換えアデノウイルス

タカラバイオ株式会社

変異単純ヘルペス
ウイルス

開発名
HF10

特徴

対象疾患

実施状況

再発性乳がん(皮膚転移)2003年 終了

再発性頸頭部がん

2004年 終了

進行性膵がん2013年 開始

固形がん

2012年 開始

進行性膠芽腫2009年 開始

前立腺癌

2012年 開始

進行性嗅神経芽細胞腫

2013年 開始

hTERTプロモーター

頭頸部がん、肺がん、食道がん

2012年 開始

hTERTプロモーター

各種進行性固形がん

米国でphaseⅠ終了
メラノーマでPhaseⅡ

頭頸部がん

米国でPhaseⅠ/Ⅱ

悪性黒色腫

米国でPhaseⅡ
実施中 (2014‐)

悪性黒色腫、皮膚の扁平上皮癌等

国内Phase I(2015‐)

弱毒型自然変異株

HF10

弱毒型自然変異株

G47Δ

第三世代
遺伝子組換えHSV‐1

Telomelysin
Telomelysin

HF10

弱毒型自然変異株

東京大学

遺伝子組換え単純ヘルペスウイルス1型(HSV‐1)

G47Δ

第三世代
遺伝子組換えHSV‐1

進行性膠芽腫

先駆け指定

鹿児島大学

遺伝子組換えアデノウイルス

Surv.m‐CRA‐1

サバイビン
プロモーター

骨軟部悪性腫瘍2016年～

アステラスアムジェン

HSV-1

talimogene
laherparepvec

GM-CSF

悪性黒色腫

2017年～

http://www.nihs.go.jp/mtgt/section‐1/150924‐oncolytic‐virus.pdf

多様な腫瘍溶解性ウイルス（OV）が開発されようとしてる
非組換えOV、組換えOVに加え、武装化（armed‐OV）や特定遺伝子を搭載したOVの開発が進められている
Mode of Action (MOA)の多様化： 特性解析や出荷規格においてMOAをどのように評価していくか

ICH Consideration: Oncolytic virus
開発されてくるOVをどのように評価していくべきかについてのtentativeな見解を提供

Ungerechts et al: Moving oncolytic viruses into the clinic: clinical‐grade production,

purification, and characterization of diverse oncolytic viruses. Mol. Therapy 3: 16108 (2016)

開発中の多様な腫瘍溶解性ウイルス
野生型ウイルス／弱毒化ウイルス• 麻疹ウイルス（Measles virus）• 水胞性口内炎ウイルス(VSV)• レオウイルス（Reovirus)• ニューキャッスル病ウイルス（NDV)• 単純ヘルペスウイルス(HSV‐1)

組換えウイルス•••••

アデノウイルスAdV
ポックスウイルス（Pox virus）
ワクシニアウイルス
センダイウイルス（SeV）
HSV‐1

Armed virus••

GM‐CSF HSV‐1
IL‐12 HSV‐1

組換えウイルスと非組換えウイルスで品質評価における差異
野性型／弱毒型OV：非均一性（長期培養による不均一性の変化）
組換えOV：•搭載遺伝子の特徴：腫瘍溶解に関連する遺伝子、免疫誘導、遺伝子治療、マーカー遺伝子
評価法
ゲノム解析、細胞指向性
MOA

腫瘍溶解性ウイルスの作用機構
遺伝子治療とは疾病の治療や予防を目的として遺伝子又は遺伝子を導入した細胞を人の体内に投与すること（遺伝子治療等臨床研究に関する指針の定義）

原発腫瘍
 OV：腫瘍溶解性
ウイルスベクター直接投与
腫瘍内で増幅したOVが遠隔転移した腫瘍に感染
転移腫瘍• バイスタンダー効果：腫瘍溶解に伴い抗腫瘍免疫系の活性化が抗ガン効果に重要 ⇒ Oncolytic Immunotherapy (がん腫瘍免疫の評価の重要性）• 転移腫瘍への効果：OVの遠隔感染ではないのでは• バイスタンダー効果の評価：抗腫瘍免疫の活性化、TILの評価

FDA：メラノーマの治療に対し、初めて腫瘍溶解性ウイル
ス療法薬talimogene laherparepvecを承認 (2015‐11‐7）
腫瘍溶解性ウイルスの臨
床有効性の概念の変更：
腫瘍溶解によるバイスタ
ンダー効果の重要性

Oncolytic virotherapy
oncolytic immunotherapy

遅延型の有効性：免疫応答が認められるまで時間を要する

がんを効率的に死滅させる機能以上に宿主免疫応答に重要な役割が期待多様な腫瘍溶解性ウイルスの開発とその作用機構
腫瘍溶解性ウイルスの製法開発と品質評価
非臨床安全性
ウイルス排出と第三者への伝播の防止

細胞バンクの樹立と生産における恒常性評価
十分に特性が評価され、一定の品質が担保された細胞を用いて生産することにより、目的製品(OV)の恒常性を担保できる
セル・バンク・システム
細胞基材↓
マスター・セル・バンク（MCB）↓
ワーキング・セル・バンク（WCB）↓
製造上限まで培養した細胞（CAL)

細胞の無血清化や浮遊培養化を行い，高生産可能な細胞を樹立
MCBにおいて十分な細胞特性及び安全性の解析を実施

実生産工程を通じて製品の恒常性が担保されていることを確認

細胞バンク及びウイルスバンクの特性解析• ICH Q5Dガイドライン：「生物薬品（バイオテクノロジー応用医薬品／生物起源由来医品）製造用細胞基剤の由来、調製及び特性解析」を参考にバンクの作製及びその解析を実施• 腫瘍溶解性ウイルスを製造した時の生産能や製品の特性、ゲノム安定性（感染価、粒子数、感染価/粒子数）• 細胞特性解析（形態学的特徴、増殖特性、生化学的指標）• 作製した細胞バンクのウイルス安全性に関しては、ICH
Q5Aガイドラインのバンク試験を参考に評価を実施• 迷入ウイルスの試験に際して、OVそのものの細胞変性効果があるためOVを中和できる抗体の開発が有用とされている• 別の評価方法として並行して培養した生産細胞のウイルス安全性評価も代替案としてあり製法開発と製造スケールの拡大
初期開発でのスケールアップ

同等性評価

精製工程

実生産に向けてのスケールアップ
生産培養

カラムＡ

カラムＢ

新鮮培地

スケールアップ

原薬

ウイルス不活化工程
培養槽

製法変更に伴う同等性評価• 遺伝子治療製品の開発では様々な製法変更が実施される。また開発の最終ステージで、スケールアップや生産方法/精製方法の変更が行われることもある ⇒ 旧製法との同等性評価が重要• 同等性評価が十分に立証できない場合には旧製法で実施した非臨床試験などの再実施が必要になる可能性も• OV遺伝子コンストラクトのベクターデザインの変更• 安全性の向上のためのプロモータの改変や搭載遺伝
子のコドンの最適化

Reflection Paper on design modifications of gene therapy medicinal products during
development. EMA/CAT/GTWP/44236/2009

腫瘍細胞特異的に増殖しCPEを引き起こす
腫瘍特異的にCPEを引き起こすことを種々の細胞パネルを用いて検証する必要がある(ICH見解：腫瘍溶解性ウイルス)
用いる細胞は プライマリー細胞と株化細胞
 正常細胞パネルの取得とその範囲
 バイレミアを起こすウイルスか否か（遠隔転移への効果）
正常細胞
表皮eEPC

腫瘍細胞
MSC

神経芽細胞腫

上皮がん

血管内皮甲状腺がんメラノーマ

 入手可能な正常細胞には限界がある ウイルス特性を考慮して選択 培養株での効果は必ずしも生体内での効果と一致しない

In vitro Oncolytic Activity
MOI = Mock
0.001

0.01

0.1

Borad et al; Phase I Trial of Intratumoral Injection of VSV.

1.0

MAYOCLINIC

腫瘍溶解性ウイルスの作用機構• 腫瘍溶解機構• がん細胞の増殖活性をターゲット• がん細胞の特異的受容体• Armed OV• GM‐CSF（e.g.T‐vec）、IL12• 腫瘍溶解＋抗腫瘍遺伝子発現• 抗腫瘍血管因子• miRNA• ProDrugの活性化酵素

腫瘍溶解活性の生物活性評価• がん細胞で特異的に発現しているプロモータ、増殖シグナル、テロメラーゼをターゲット• RAS、hTERT、Wnt/β‐catenin、Survivin• がん細胞で高発現している抗原のターゲット• PSA、FGFR、VSIV、HA/NA、CD46• 正常細胞への影響：増殖性の高い正常細胞に対して影響の懸念• 腫瘍特異性の評価 ⇒ ヒト正常細胞パネル及びがん細胞パネル• Primary細胞での評価が有用とされるが入手が困難• 正常細胞への影響の評価法：RASなどのMOAに関与する因子の高発現細胞の影響• RASやテロメラーゼ KO 腫瘍細胞

腫瘍溶解性ウイルス製品の特性解析• ゲノム解析（組換えOV）• 挿入遺伝子• フランキング領域• 制限酵素切断パターン• 全ゲノム解析• 細胞指向性（正常細胞、腫瘍細胞）• 感染性（感染価/ウイルス粒子比）• ウイルス粒子／ウイルスゲノム量コピー数• 純度試験
• 類縁物質（目的物質関連物質、目的物質由来不純物）• 工程由来不純物• 生産細胞由来タンパク質• 生産細胞由来DNA• 生物活性（遺伝子発現活性；GM‐CSF、IL‐12）

腫瘍溶解性ウイルス製品の規格試験例• 一般特性• 確認試験
• 溶状• pH• 示性値（感染価／ウイルス粒子比）• 純度試験

• 類縁物質（目的物質関連物質、目的物質由来不純物）• 工程由来不純物• 生産細胞由来タンパク質• 生産細胞由来DNA• 無菌試験
• マイコプラズマ否定試験• エンドトキシン• 含量試験（ウイルス粒子数、ウイルスゲノム含量）• 力価（生物活性）腫瘍溶解性ウイルスの品質特性評価• 非組換え腫瘍溶解性ウイルス• 単一クローンでない可能性• 製造を通じての恒常性の確認（MVBとCALのウイルス特性の比較）• 粒子当たりの感染価（比活性）の評価と製造を通じての恒常性• 組換え腫瘍溶解性ウイルス• ゲノム解析技術の進展⇒殆どケースで全ゲノム解析が行われてきている• 製造を通じてのゲノムレベルでの恒常性を確認

多様な腫瘍溶解性ウイルスの開発とその作用機構
腫瘍溶解性ウイルスの製法開発と品質評価
非臨床安全性
ウイルス排出と第三者への伝播の防止

動物種の選択• POCや安全性試験における動物種の選択• POCにおいて適切な動物種が存在しない場合• ベクターに被検動物の相同遺伝子を導入した試験も一案• その場合には定量的評価は困難• 安全性試験• 非げっ歯類、げっ歯類の２種の動物を用いることは必須ではない• 投与法による安全性などの評価には適切な大動物が必要な場合もある（脳内投与や心筋内投与）• GLP試験の実施が困難な場合も考えられる（P2対応等）
できるだけGLPに沿うように試験を実施すること→

生体内分布試験• 遺伝子治療用製品の特性として評価• qPCR等(或は発現タンパク質の検出）の手法を用いて解析• 検出感度の妥当性• 分布部位の確認とその持続性の確認• 有効性の評価（ターゲット細胞・組織への分布）• 担がん動物を用いた試験• 安全性評価（生殖細胞への分布、目的外細胞･組織への分布）• 発現タンパク質の生体への影響• コアバッテリー組織への影響• 生体内分布がない組織でも安全性上のターゲットとしなくてよいわけではない多様な腫瘍溶解性ウイルスの開発とその作用機構
腫瘍溶解性ウイルスの製法開発と品質評価
非臨床安全性
ウイルス排出と第三者への伝播の防止

ウイルス排出<In Hospital>
医療従事者
Shedding of Virus
into Patients'
Urine, Feces,Sputum...

Viral Product???
???

???

Patient<Out of Hospital>
近親者<Out of Hospital>

ICH 見解：ウイルスとベクターの排出に関する基本的考え方
ウイルス排出に関するデータは第三者への伝播リスクと環境へのリスクを評価することに使用可能

腫瘍溶解性ウイルスの排出リスク• 腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍内に特異的に分布し、増殖する。7～10日でセカンドピークと呼ばれる腫瘍崩壊に伴う増殖が認められる• ICH見解でもOVはセカンドピークに伴う増幅によりウイルス排出リスクが増加すると指摘
腫瘍溶解性ウイルスは正常細胞での増幅が低く抑えられているために健常な第三者へ伝播しても大きなリスクにはならない
移植を受けた患者や乳児、妊娠中の女性への伝播は大きなリスクになる可能性⇒ 第三者への伝播防止のための適切な対応が求められる

Lee et al; Oncolytic and immunostimulatory efficacy of a targeted oncolytic poxvirus expressing human GM‐CSF
following intravenous administration in a rabbit tumor model. Cancer Gene Therapy 17, 73‐79 (2010)

T‐VECの承認時における環境影響評価
EMA T-VECのERA• Imlygicは野生型HSV-1に比べて神経毒性及び病原性が1/100から1/10000に減弱化• 投与中されたImlygicの環境への暴露の可能性 ⇒ 健常な免疫状態にある第三者の暴露の可能性は低い。しかし、免疫抑制状態の妊娠中の第3者へのImlygicの伝播の可能性は比較的高い
医療従事者や患者への教育プログラム• 提供する教育プログラムにはImlygicの治療に伴う重要なリスク要因について想定されるリスク• 免疫抑制の個人に対してはヘルペス感染症を引き起こす可能性がある点、この免疫不全症には先天的のみならずHIV、白血病、リンフォーマ、さらには一般的な免疫不全症、高濃度ステロイドを処方されている患者などの液性免疫不全症のものが含まれる
Imlygic投与後30日間は血液、体液に触れるリスクを低減化するべき。その方法として次のようなこと避けること
 ラテックスコンドームを用いない避妊 パーティーでのキス 食器類等の共用、歯ブラシ、髭剃りなどの共用

ご静聴ありがとうございました
ご質問がございましたら