総説

鯉淵研報 32 3-15（2022）

α-ガラクトシダーゼの構造と機能 II小林 秀行 11

鯉淵学園農業栄養専門学校 食品栄養科

キーワード：ガラクトマンノオリゴ糖，基質特異性，立体構造，相互作用

α-ガラクトシダーゼ（αGal）は微生物，植物，動

Ⅰ

緒

言

物に広く存在し，それらのいくつかは精製され，性質が解明されている 3）。Dey らは αGal が，その基質α-ガラクトシダーゼ（αGal）は，ガラクトオリ

特異性に基づいて 2 つのグループに分類されること

ゴ糖，例えばラフィノースとスタキオースを加水分を示した。1 つのグループは，pNPGal（p-ニトロフェ

解してガラクトースとスクロースを生成し，糖脂質，

ニル-α-D-ガラクトシド）やラフィノースファミリー

例えばグロボトリアオシルセラミドに作用して，ガ（メリビオース，スタキオース）などの低分子ガラク

ラクトースとラクトシルセラミドを生成する酵素でトシドに特異的に作用し，他のグループの αGal はあり，高分子ガラクトマンナンから α-1,6-ガラクト多糖であるガラクトマンナンに作用するとともに低シル残基を加水分解する酵素である。

分子基質を様々な程度に加水分解する 4）。

ヒト α-ガラクトシダーゼ A（αGal A）は，糖脂

今回，Penicillium purpurogenum, Mortierella vinacea,

質および糖タンパク質から末端の α-ガラクトシル

そしてイネ αGal の基質特異性を含む構造機能の研究

残基を切断するリソゾーマルエキソグリコシダーゼ

を通じて，新たな αGal の分類について知見を得たのである。αGalA 遺伝子の変異は，糖脂質の不完全でまとめてみたい。

な分解を引き起こし，ファブリー病（糖脂質代謝異常）を引き起こす 1）。組換え αGal A は，この疾患

Ⅱ

CAZy データベースの治療のために開発されている。
血液型は赤血球の表面に存在する糖鎖構造の違い

グリコシルヒドロラーゼ（糖質加水分解酵素）は，によって決定されるが，O 抗原と B 抗原の違いでそれらのアミノ酸配列の相同性（疎水性コアパター

ある α 結合した末端ガラクトースを αGal が除去すン）
に従って CAZy データベースで 171 の異なるファることができるため，植物由来の αGal が，B 型血ミリーに分類されている 5）。また，グリコシダーゼ

液から O 型血液を得るために開発されている 2）。

はグリコシド性ヒドロキシル基の α，β-アノマー保さらに，αGal は，多くのバイオテクノロジー関持及びアノマー反転の 2 つの触媒機構に分けられて連の用途に利用されている。甜菜中のラフィノース

いる。保持型グリコシダーゼは二重変位触媒機構をの含有量は，貯蔵中に徐々に増加するため，甜菜

介して基質のアノマー立体構造を保つが，反転グリ糖業界では，ラフィノースは甜菜糖の結晶化の障

コシダーゼはワンステップ反応でアノマーの反転を害として知られている。6 〜 10 ％存在する甜菜糖誘導する。それらのほとんどは，基質のグリコシド

蜜中のラフィノースを除去できれば，甜菜糖の結酸素を囲む 2 つのカルボキシレート（グルタミン酸

晶化効率を向上させることができる。そのために，

またはアスパラギン酸）を有し，そのうちの 1 つはMortierella vinacea αGal は，甜菜糖製造プロセスでプロトンドナーとして作用し，もう 1 つは求核剤と使用されてきた。

（表 1）。
して作用すると言われている 6）
多くの真核生物の α-ガラクトシダーゼ（αGal）

1〒 319-0323 茨城県水戸市鯉淵町 5965

は，グリコシルヒドロラーゼファミリー 27（GH27）
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表 1．グリコシドヒドロラーゼファミリー 27 の特徴

Glycoside Hydrolase Family 27
Known Activities

α-galactosidase (EC 3.2.1.22),
α-N-acetylgalactosaminidase (EC 3.2.1.49)
isomalto-dextranase (EC 3.2.1.94)

Mechanism
Catalytic Nucleophile（求核剤）
Catalytic Proton Donor（プロトンドナー）

Retaining
Asp
Asp

3D Structure Satus

Available (β/α) 8 Fold

Clan*

GH-D

* : タンパク質の構造をもとにした分類で，ファミリーの上位の分類。

に分類される。このファミリー内のすべての酵素

ガラクトオリゴ糖（メリビオース，ラフィノース，はアノマー保持機構を有し，2 つのアスパラギン

スタキオース）およびガラクトマンナンが通常使用

酸が触媒残基である。αGal は，同じファミリー 27

されるが，今回はガラクトマンナンの β-マンナナーに属する α-N-アセチルガラクトサミニダーゼ（ECゼによる加水分解産物であるガラクトマンノオリゴ

3.2.1.49），およびイソマルトデキストラナーゼ（EC糖も基質として使用した。ホワイトコプラミールの3.2.1.94）と高い一次構造上の類似性を有する。細放線菌 β-マンナナーゼ消化物からガラクトマンノ

菌由来の他の αGal は，主にファミリー 36 に分類

オリゴ糖混合物を調製し，混合物からされ，両ファミリー（27 と 36）は，ファミリー 31

ラクトシル残基を有するガラクトマンノオリゴ糖（Gal3Man4）と末端 α-ガラクトシル残基

7）と共に，Clan GH-D に分類される 。

側鎖 α-ガを有するガラクトマンノオリゴ糖（Gal3Man3）を活性

Ⅲ

基質特異性

炭カラムにより分離した。これらのガラクトマンノ
オリゴ糖の構造を図 1 に示した。

α-ガラクトシダーゼの基質特異性を調べるために

図 1．ガラクトマンノオリゴ糖の構造4

小林：α-ガラクトシダーゼの構造と機能 II

Ⅳ α -ガラクトシダーゼ（αGal）の精製，1 次構造，基質特異性

Trichoderma reesei10），
Saccharomyces calsbergensis11），
M.
vinacea12,13），コーヒー 14），およびヒト 15）αGal のアミノ酸配列と P. purpurogenum αGal のアミノ酸配列の1 ．Penicillium purpurogenum α-ガラクトシダーゼ比較をしたところ，P. purpurogenum αGal は，これら（1）精製の酵素と相同性を示し，特に T. reesei αGal（AGL1）

 Penicillium purpurogenum を，ブラウンコプラミールとはこれらの中で最も高い値を示した（57％）
。

8）を含む培地で培養し ，得られた培養ろ液を粗酵素液（3）発現とした。粗酵素液を限外ろ過により濃縮し，DEAE-

P. purpurogenum αGal cDNA を，GAL10 プ ロ モ ー

セルロースおよび SE-セルロースカラムに供した。こターの制御下で S. cerevisiae を用いて発現させた。

れらの手順により，酵素は 76％の収率で，約 450 倍

組換え αGal は培地に分泌され，活性は 216 時間でに精製された。精製された酵素（天然型 αGal）は，

約 63U/mL に達した（精製酵素 0.21g/L 培地に相当）。

SDS-PAGE（Sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel

本酵素（組換え P. purpurogenum αGal）は，3 つのelectrophoresis）で均一であると判断され，精製されクロマトグラフィーステップで均一に精製され，た酵素の分子量は，67kDa であった。PVDF（polyvi-

100mL の培地から，6.75mg の精製 αGal が 33 ％のnylidene diﬂuoride）メンブレンにブロッティングした回収率で得られた。

後，N 末端アミノ酸配列をエドマン分解により同定（4）基質特異性

し た と こ ろ，L-I-L-P-D-D-V-G-X-L-P-A-L-G-X-N-S-

図 2 から明らかなように P. purpurogenum αGal は天

X-X-A-（X は未決定アミノ酸を示す）の配列が決定

然型，組換え型共に末端ガラクトースを持つ Gal3Man3

9）

された 。

には作用せず，側鎖ガラクトースを持つ Gal3Man4 に（2）1 次構造作用した。また，データは示していないが，本酵素はP. purpurogenum αGal を コ ー ド す る cDNA を ク

多糖であるガラクトマンナンには作用しなかった。

ローニングし，その塩基配列を決定した。本酵素

2 ．Mortierella vinacea  α-ガラクトシダーゼ

は，19 アミノ酸のシグナル配列と 420 アミノ酸の成
熟 αGal で 構 成され，分 子量は 46.3kDa であった。

（1）M. vinacea αGal I

配列中に 9 つの N 型糖鎖結合部位（N-X-S/T）が存

1）精製

在し，これは天然型 αGal が 67kDa であることと，

 M. vinacea を 30 ℃で 3 日間培養し，α-ガラクト

コンカナバリン A と反応することと一致している。

シダーゼ I（αGal I）を鈴木ら 16）の方法に従って(a) Gal3Man3Gal

Gal3Man4(b)

Gal3Man3

Gal3man4

0 1 3 9 Gal 0 1 3 9
Gal 0 1 3 9
Gal 0 1 3 9
M 0.5 2 6 24
M 0.5 2 6 24
M 0.5 2 6 24
M 0.5 2 6 24
purpurogenum αGal のガラクトマンノオリゴ糖に対する特異性
図 2．P. 時間（ｈ）
時間（ｈ）(a) 天然型 P. purpurogenum αGal, (b) 組換え P. purpurogenum αGal
Gal: ガラクトース，M: マンノース，マンノビオース，マンノトリオース，マンノテトラオース，マンノペンタオース

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精製した。最終標品は SDS-PAGE で分子量 52kDa

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2022（2）M. vinacea αGal IIの単一のタンパク質バンドを示した。Con A（コ1）精製

ンカナバリン A）との反応性から，この酵素分子 M. vinacea の培養ろ液から，新規 αGal を単離内に N 型糖鎖が存在することが示唆された。M.

し αGal II と 名 付 け た。 精 製 さ れ た αGal II は，vinacea αGal I のタンパク質部分のサイズを推定す

SDS-PAGE で単一のタンパク質バンドを示 し，るために，エンド-β-グリコシダーゼ F で処理しαGal II の分子量は，SDS-PAGE で 51 〜 62kDa，た後，酵素を SDS-PAGE に供した。タンパク質

Superdex 200HR 10/30 カラムを用いたゲルろ過でバンド（50，46，および 43kDa）を検出し，Con

60kDa と算出され，本酵素が溶液中では単量体でA は， 分 子 量 50 および 46kDa のタンパク質バ

存在していることが示唆された。

ンドと 52 kDa の成熟酵素と反応したが，43kDa2）一次構造のバンドとは反応しなかった事から，M. vinacea

 精製された αGal II，およびリジルエンドペプチ

αGal I は 43 kDa のタンパク質部分と，8 〜 9kDa

ダーゼで消化した酵素たんぱく質を SDS-PAGEのオリゴ糖鎖からなると考えられた。また，本で分離し，PVDF メンブレンにブロッティングし酵素のゲルろ過の結果（精製酵素の分子量は 160

た後，精製酵素とフラグメントの N 末端アミノ〜 200kDa）から，本酵素は溶液中で 4 量体とし酸配列を同定した。それぞれ I-I-D-P-S-L-A-T-P-て存在していると考えられた。

Q-M-G-W-N-S-W-N-K- お よ び N-V-S-R-P-Y-F-F-

 精製した αGal I と V8 プロテイナーゼで消化しS-L- と決定した。

た酵素を SDS-PAGE に供し，PVDF メンブレン

 本酵素 cDNA をクローニングし，そのヌクレオにブロッティングした後，それぞれの N 末端アチド配列（1240bp）を決定した。エドマン分解

ミノ酸配列を分析したところ，それぞれ S-N-N-

によって同定された αGal II の N 末端および内部

G-L-A-I-T-P-Q-M-G-X-N-T-X-N-K-Y-G-X-N-I-Q-

アミノ酸配列が推定アミノ酸配列中に見出され

L-I-L-D-A-A-K-A-I-V-S-S-G-L と I-I-M-N-D-E-V-

た。本酵素は 20 アミノ酸残基からなるシグナル

I-A-V-N-Q-D-S-S-Y-S-P-A-V と同定された。

配列を含む 396 アミノ酸残基を有し，成熟酵素は

2）一次構造376 アミノ酸残基で，その分子の大きさは 41kDa

Mortierella vinacea αGal I をコードする遺伝子であった。推定されたアミノ酸配列は，他の起源

を RT-PCR 法によりクローニングし，ヌクレオチの αGal の配列と 31-49％の相同性を示した 13）。

ド配列を決定した結果，エドマン分解によって同定された αGal I の N 末端および内部アミノ酸配列が本酵素のアミノ酸配列中に存在した。この酵（3）基質特異性
αGal I と αGal II の基質特異性をガラクトオリゴ
糖，ガラクトマンノオリゴ糖を用いて検討した。

素は，20 アミノ酸のシグナル配列と 397 アミノ

図 3 に示すように，αGal II はメリビオース，ラ酸の成熟 αGal の 417 アミノ酸残基で構成されてフィノース，スタキオース，および Gal3Man3 や

44kDa と計算され，いた。成熟 αGal I のサイズは，

Gal3Man4 などのガラクトマンノオリゴ糖を加水分

脱グリコシル化された αGal I のサイズ（43kDa）

解したが，αGal I は Gal3Man4 を加水分解できなかっとほぼ一致した。シークエンス内に 5 つの推定 Nた 18）。αGal II はさらに高分子であるガラクトマン型糖鎖結合部位（N-X-S/T）が確認され，これはナンにも効果的に作用した（図 4 a）。

ConA との反応性と一致している。

これらの結果から αGal は，ガラクトマンノオリ

 M. vinacea αGal I の ア ミ ノ 酸 配 列 と， 酵 母

ゴ糖に対する特異性から 3 つのグループに分けるこ（Saccharomyces cerevisiae）由 来 の αGal， グ ア ーとができる。即ち 1 つ目のグループは P. purpuroge-

7）（Cyamopsis tetragonoloba）由来の αGal 1 および
15）

num αGal のように側鎖ガラクトースのみに作用すのアミノ酸配列の比較を行ったとる αGal，2 つ目のグループは M. vinacea αGal I のよころ，相同性は，それぞれ 47 ％，43 ％，および

うに末端ガラクトースのみに作用する αGal，3 つ

34％であった。

目のグループは M. vinacea αGal II のように両方のヒト αGal A

ガラクトースに作用する αGal である。
グアーガムとローカストビーンガムは，食品業界
6

小林：α-ガラクトシダーゼの構造と機能 II

図 3．M. vinacea αGal I and αGal II のガラクトオリゴ糖及びガラクトマンノオリゴ糖に対する特異性

I: M.vinacea αGal I, II: M. vinacea αGal II
Gal: ガラクトース， Mel: メリビオース，Raf: ラフィノース， Sta: スタキオース，Gal3Man3: 63-a-D-ガラクトマンノト
リオース，Gal3Man4: 63-a-D-ガラクトマンノペンタオース，M1-M5: マンノース，マンノビオース，マンノトリオース，
マンノテトラオース，マンノペンタオース

図 4．ガラクトマンナンに対する M. vinacea αGal II の作用 (a) 及びキサンタンガムのゲル化に対する酵素処理の影
響 (b)(a) ガラクトマンナンに M. vinacea αGal II を作用させた時のガラクトースの遊離率の経時的変化
矢印：沈殿が生成した時点(b) キサンタンガムにそれぞれの時間酵素処理したグアーガムを加えた時のゲル化の状態
GG: グアーガム（無処理），2h: 2h 処理，7.5h: 7.5h 処理，15h: 15h 処理，24h: 24h 処理，LBG: ローカストビーンガム（無処理）で増粘剤として広く使用されている。ローカスト

価であり，安定的に供給可能なため，α-ガラクトシ

ビーンガム（Gal/Man = 1/4）は，カラギーナンやダーゼによりガラクトース部分を除去してローカス

キサンタンガムなどの多糖類と混合することによトビーンガム様の修飾ガラクトマンナンを調製する

3）

り，ゲルを形成するが ，グアーガム（Gal/Man =ことができれば，ゲル化能を有する多糖を得ること

1/2）はゲル化多糖類と混合してもゲルができない。

ができる。

グアーガムはローカストビーングガムよりかなり安

コーヒー，グアー，および P. ochlochloron からの
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αGal は，ガラクトマンナンからガラクトースを除リコシル化の阻害は，インベルターゼの細胞内蓄積

去することが報告されているが，これらの酵素を使をもたらし 21），この結果は，オリゴ糖鎖が組換え用するためには共存する β-マンナナーゼ活性を除αGal の分泌に重要であることを示唆している。

く必要がある。β-マンナナーゼ活性が存在すること

溶 液 中 の 組 換 え αGal II は，Superdex 200HR カ

は，マンナン主鎖の水解によりガラクトマンナンのラ ム で 200kDa，SDS-PAGE で 150-200kDa の 分 子

粘性を低下させ，かつゲル化能を失うことにつながサイズを示し，糖鎖含量は 73-80% であり，酵素はる。

単量体（モノマー）として存在した。一方，αGalM. vinacea の αGal 活性はラクトースの添加によ19）

I は Superdex 200HR カラムで 240kDa，SDS-PAGE，β-マンナナーゼ活性のないで 58-67kDa であり，糖鎖含量は 24-34% であった。

αGal 画分は，簡単な精製ステップによって培養ろ

SDS-PAGE でのサイズの増大は，付加された N 型液から得られた。αGal I はガラクトマンナンにほと糖鎖のサイズによっており，タンパク質の分泌が糖んど作用せず，αGal II はガラクトマンナンを効果

鎖含量に影響されていることを示している（表 2）。

的に加水分解し，ポリマーのガラクトース含有量を組換え αGal の基質特異性を，Gal3Man3，Gal3Man4。キサンタンガムと混効果的に減少させた（図 4a）を用いて調べた 22）。組換え αGal I は Gal3Man3 の合し，ゲル化能を検討したところ無処理のグアーガ

み を 切 断 し， 組 換 え αGal II は Gal3Man3 お よ び

ムはゲル化しなかったが，M. vinacea αGal II で 15

Gal3Man4 の両方を加水分解した。即ち，組換え酵

ｈ以上処理したグアーガムはローカストビーンガム

素がガラクトマンノオリゴ糖に対して天然酵素と同の場合と同等のゲル化能が確認できた（図 4b）。

じ特異性を示すことが確認された。

り誘導されるため（4）組換え αGal I と αGal II
M. vinacea αGal I と αGal II の cDNA を GAL10 プ

3．イ ネ（Oryza sativa L. Nipponbare）α-ガラク
トシダーゼ

ロモーターの制御下で S. cerevisiae で発現させた。
組換え αGal I は，初めは主にペリプラズムに局在し，（1）精製

200 時間の培養後にペリプラズムと同じ濃度で培地

イネ α-ガラクトシダーゼ（イネ αGal I）を，イに分泌された。対照的に，組換え αGal II は培養初

ネ細胞の培養ろ液から精製した。図 5 に示すよう期から主に培地に分泌され，総活性は αGal I の 3に，精製された αGal I は SDS-PAGE で均一であり，〜 4 倍であった。これらの事実は，αGal I および II

酵素の分子量は，SDS-PAGE で 41 kDa，Sephacrylの局在がこれらのタンパク質の構造特性によって決S-200 でのゲルろ過で 40 kDa と推定され，酵素

定されていることを示している。

が溶液中にモノマーの形で存在することを示していS. cerevisiae のインベルターゼは 2 つの状態で存る。また，ConA との反応性がない（データは示し在する。1 つは 50％（w/w）の炭水化物を含むグリていない）ため N 型糖鎖を含まない酵素であるとコシル化された細胞外部に分泌される形態であり，考えられる。

もう 1 つはグリコシル化されていない細胞内部に（2）一次構造

存在する形態である

20）。ツニカマイシンによるグ

 イネ αGal I cDNA をクローニグし，その塩基配表 2．組換え M. vinacea αGal I and αGal II の性質

Molecular mass (kDa) SDS-PAGE*

I

II

58 〜 67

150 〜 200

Optimum pH（至適 pH）

4.0

4.0

Optimum temperature（至適温度）

60℃

60℃

pH stability（pH 安定性）

6.0 〜

2.0 〜 7.0

Heat stability（熱安定性）〜 50℃〜 50℃ (native 〜 30 ℃ )Gal3Man3＋＋

Gal3Man4−＋

Substrate speciﬁcity（基質特異性）*SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate-Poly Acrylamide Gel Eletrophoresis

8小林：α-ガラクトシダーゼの構造と機能 II

列 か ら ア ミ ノ 酸 配 列 を 推 定 し た。BLAST（URL:

を用いて発現させた。イネ αGal I は，ラフィノー

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/） を 使 用 し てス > メリビオース > スタキオースの順に加水分解

タンパク質および核酸データベースで利用可能なした。更に Gal3Man3 と Gal3Man4 は，M. veinacea

配列と比較した結果，最も類似性の高いコーヒー

αGal II 13）と同様にイネ αGal I（図 5）によっても加αGal（C. arabica αGal）は，アミノ酸配列全体でイ

水分解された。前述のように，αGal はガラクトマ

ネ αGal I と 73 ％の相同性を示した。N 末端から中

ンノオリゴ糖への特異性に応じて 3 つのグループに央部にかけて相同領域がいくつか存在するが，C 末

分類でき，ガラクトマンノオリゴ糖で得られた結果

端部分はこれらの酵素の類似性が低かった。イネから，イネの αGal I が αGal の 3 番目のカテゴリー

αGal I には N 型糖鎖結合部位（N-X-S/T）が認めらに分類されることを示した。このカテゴリーに属す

れず，ConA との反応性の欠如の結果と一致している酵素は高分子基質にも作用した 24）。

る。

 イネ αGal I によるローカストビーンガムとグアー

 イネ αGal I には 7 つの Cys 残基があり，そのうちガムからのガラクトース除去の上限は，それぞれファミリー 27 αGal 間で共通に保存されている N 末

32％と 24％であった。植物 αGal は，ガラクトマン

端領域には 5 つの Cys 残基がある。一部の αGal は，ナンにさまざまな程度で作用することが報告されてpCMB（p-chloromercuribenzoate）などの SH 試 薬にいる 25, 26）。イネの αGal I は，他の植物，微生物のよって阻害されることが報告されているが，1mM酵素で報告されているようにグアーガムよりもロー

pCMB で 30 ℃，30 分間処理するとイネ αGal I は完

カストビーンガムに速く作用した 27）。

。このことから，
全に不活化された（対照の 2％未満）
本酵素にも基質結合部位近傍に遊離 Cys が存在し，

pCMB や Hg によって修飾され，基質結合が阻害2+されると考えられる

23）。

4 ．αGal のアミノ酸配列の比較（図 6）
P. purpurogenum αGal と T. reesei αGal（AGL1）は，高い相同性を示した（57 ％）が，P. purpurogenum（3）基質特異性

αGal の残基 150 から 183 間にユニークな 34 アミノ

 イネ αGal I cDNA を大腸菌 origami と pET-32a（+）

酸の挿入があり，T. reesei αGal（AGL1）の配列でも確認された。これらの 2 つの酵素には，N 末端領
域に αGal に共通な 4 つの Cys が存在し，挿入領域と C 末端領域にそれぞれ 2 つの Cys 残基を含むな
ど，同一の位置に 9 つの Cys 残基を保持していた。
この事はこれらの酵素の三次構造がかなり類似している事を示唆している 24）。
M. vinacea αGal I と酵母の αGal には，9 つのシステイン残基が含まれている。9 つの残基のうち 5 つのシステイン残基（21，53，101，131，および 166
番目の残基）は N 末端ドメインにあり，これらのシステイン残基がすべての酵素間でよく保存されていることは各 αGal の三次構造を構築するためにこれらが重要であることを意味する。
M. vinacea αGal I には 196-215 付近に 20 アミノ酸の挿入ループが存在し , S. cerevisiae αGal にも同様の挿入ループが存在した。M. vinacea αGal I のこのループに位置する 4 つのシステイン残基は，S. cerevisiae αGal や S. carlsbergensis αGal にも存在し 11），2

図 5．天 然型 (a) と組換え (b) イネ αGal I の SDSPAGE，ゲルろ過 (c)，とガラクトマンノオリゴ
糖に対する組換えイネ αGal I の基質特異性

つの S-S 架橋がこれらの酵素の安定性と関わっていると考えられる。
M. vinacea αGal II には挿入ループ配列は確認され
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図 6．種々起源 αGal のアミノ酸配列の相同性

各 αGal のアミノ酸配列を Multialin (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) を用いて類似性が最大となるようにアライメントをとった。 触媒残基はアステリスク＊によって示した。10 配列中 8 配列が同一である場合 consensus とした。 Ca, Coffea arabica (coﬀee) αGal (CAI47559);
Ct, Cyamopsis tetragonoloba (guar) αGal (CAA32772); OsI, Oryza sativa (rice) αGal I (BAB12570); OsII, Oryza sativa αGal II; OsIII, Oryza sativa αGal III (BAC79549); Mv II, Mortierella vinacea αGal II (BAA33931); Mv I, Mortierella vinacea αGal I (AAB35252); Sc, Saccharomyces
cerevisiae αGal (AAA34700);Pp, Penicillium purpurpgenum αGal (BAA22992);Tr, Trichoderma reesei αGal (CAA93244).

ず，5 つのシステイン残基と 9 つの推定 N 型糖鎖結タンパク質溶液を 5μl のリザーバー溶液（5％ D-ガ

合部位が配列中に存在した。

ラクトース，5 ％イソプロパノール，0.1M 硫酸ア

イネ αGal I には M. vinacea αGal II と同様に挿入

ンモニウム，0.1M 酢酸緩衝液 pH4.5）と混合 し，

ループ配列は確認されず，7 つのシステイン残基が20℃，2 週間で得られた。

確認されたが，N 型糖鎖結合部位（N-X-S/T）は確（1）イネ αGal I の全体構造

認されなかった。

イネ αGal I の結晶構造は，水銀および金誘導体を使用した MIR（Multiple Isomorphous Replacement，多重Ⅴ

基質認識，特性と高次構造

同形置換）法により 1.5Å の分解能で決定された。イネ αGal I は触媒（N 末端）ドメイン（1 〜 278）と C

1 ．イネ α-ガラクトシダーゼ I（イネ αGal I）

末端ドメイン（279 〜 362）を持つ 362 アミノ酸でエキソグリコシダーゼの構造と機能の関係をより構成されていた。触媒ドメインは（β/α）8 バレル

よく理解するために，イネ αGal I を精製し，ハンで構成されていたが，これはトリオースリン酸イソ

ギングドロップ蒸気拡散法による単結晶調製を行っメラーゼ 28）で以前に観察され，現在では多くのグた。イネ αGal の結晶は，15mg/ml の濃度の 5μl のリコシド加水分解酵素の共通のモチーフとなってい10

小林：α-ガラクトシダーゼの構造と機能 IIる。結晶化中に添加された D-ガラクトース分子が存在した。別の触媒残基である Asp-185 は，α-ア結合リガンドとして同定され，活性部位ポケットはノマー O1 ヒドロキシルおよび O2 ヒドロキシル酸

触媒ドメインの中央 β バレルの C 末端側に見られ素原子に水素結合していた。この酵素による触媒た。2 つのジスルフィド結合が触媒ポケットの近く

作用は二重置換メカニズムであると考えられ，イネにあり，C 末端ドメインは，8 本の β ストランドでαGal I では，Asp185 はプロトンドナーとして機能構成されていた。N 末端，C 末端 2 つのドメイン間し，Asp130 はガラクトースのアノマー炭素 C1 原のインターフェースは，主に疎水性相互作用であっ子（2.5Å）の近くにあるため，求核剤として機能す29）

た （図 7）。

る。Asp185 は α-アノマーヒドロキシル O1 原子の（2）活性部位と基質近くにあり，これは基質への α-1,6-グリコシド結合

イネ αGal I の結晶構造は D-ガラクトースとの複の酸素原子に対応する。

合体として解かれたが，1.5Å 分解能での電子密度

触 媒 残 基 に 加 え て， 周 り の 他 の 残 基 は リ ガ ン

図により，糖環の立体配座とヒドロキシル基の配向ドに対して親水性および疎水性相互作用を示し，が明確に識別された。アノマー C1 炭素では，α-ア

Arg181，Trp164，Cys162， お よ び Asp185 は， ガ ラ クノマーと β-アノマーの両方の O1 ヒドロキシル基にトースの O2 酸素原子と水素結合を形成していた。

対応するマルチコンフォメーション電子密度が明確

Lys128 は，2 つのヒドロキシル酸素 O3 および O4に観察され，D-ガラクトース分子が 2 つのアノマー

原子に水素結合し，Asp51 はヒドロキシル酸素 O4形態の混合物として結合したことを示している。密原 子に水 素 結 合し，Asp52 は O6 原 子に水 素 結 合

度の強さから，α-アノマーと β-アノマーはそれぞ

し て い た。 さ ら に， 残 基 Trp16，Cys101， お よ び

れ 0.3 と 0.7 の比率で存在すると推定された。これ

Met217 で疎水性相互作用が観察された。ガラクトー

は，ガラクトピラノースの溶液状態の天然存在比

ス結合タンパク質とレクチン 30） の間でみられるよ0.36 /0.64 と類似している。α-アノマーヒドロキシ

うに Trp16 の芳香族インドール環は糖環に面しておル基は外側に突き出ていたが，β-アノマーヒドロキ

らず，結合したガラクトースの O3，C3，C4，C5，

シル基はアクティブポケットの側面を指していた。

C6，および O6 原子によって形成される一種の平らイネ αGal I に見られる触媒残基は，図 6 中＊でな表面に面していた。Cys101 は，2 つのジスルフィ

示したようにストランド 4 の末端にある Asp130 とド架橋のうちの 1 つを Cys132 と形成した。合計 10

ストランド 6 の後の Asp185 である。Asp130 は β-残基がガラクトース結合に関与していた。

アノマー O1 ヒドロキシル酸素に水素結合し，ガラ

pCMB と 反 応 す る 活 性 部 位 近 傍 の Cys 残 基 はクトース分子の O5 原子と水素結合できる距離内に

Cys162 と考えられ，その側鎖の向きも活性中心に向かっているため，pCMB と反応すると立体障害により基質が近づけなくなり活性が失われると考え

C 末端
ドメイン

られる。
（3）ガラクトマンノオリゴ糖に対する特異性

N 末端
ドメイン

ファミリー 27 酵素のアラインメント（図 6）とイネ αGal I の三次構造から，黒矢印の挿入と白矢印の挿入が活性部位のすぐ隣にあることがわかる（図 7）。挿入のないグループ（イネ αGal）は末端ガラクトースと側鎖ガラクトースの両方に作用し，黒矢印の挿入のあるグループは側鎖ガラクトースに作用できず，白矢印の挿入のあるグループは末端ガラクトースに作用できない。このような性質から挿図 7．イネ（O. sativa）αGal I の単量体構造と挿入ルー
プの位置
M. vinacea αGal I の 196-215 の挿入ループと P. purpurogenum
αGal の 150-183 の挿入ループの位置をそれぞれ黒矢印と白矢印で示した。

入部の基質特異性に及ぼす機能の 1 つは基質結合の妨害であると考えられる。

11

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淵

研

2 ．M. vinacea α-ガラクトシダーゼ I（1）構造解析報第 32 号

2022

プロトンドナーとしてそれぞれ作用する 2 つの触媒残基，Asp129 および Asp189 は，触媒ポケットの構造解析は，イネ α-ガラクトシダーゼの構造モ上部と下部に 6.3Å の距離で配置されていた。触媒

デル（PDB, Protein Data Bank，タンパク質データ

ポケット内のほとんどのアミノ酸は，イネの αGal

バンクコード 1UAS，39％の相同性）を検索モデル

I のアミノ酸と同一であった。イネの αGal I の構として使用し，プログラム MOLREP を使用した分造に基づいて，Trp16 とジスルフィド架橋 Cys101-30）。解析はプログラム

Cys131 はポケットの疎水性表面を形成しており，

Refmac5 を使用してシミュレーテッドアニーリング

Cys166，Trp168，および Arg185 はガラクトース分法を用い，モデル構築は自動モデリングプログラム

子の C-2 ヒドロキシル基を認識していた。

子置換法によって実行した

ARP / wARP を使用して行った

31,32）。

（2）サブユニット構造（3）4 量体構造
化学的な分析により，M. vinacea αGal I は 4 量体

M. vinacea αGal I の結晶構造は 2.0Å の分解能で構造を形成していると考えられ 10），その予備的な決定され，各ユニットには，397 アミノ酸残基の 1

結晶学的研究もこの仮説を支持した 33）。4 量体構造つのペプチド鎖，3 個の N 型糖鎖，556 個の水分子，は平らな円筒形で，100Å の直径で，厚さは 75Å でおよび 1 個の Tris と 4 個の PEG400 分子が含まれある。4 量体界面は主に隣接する分子の触媒ドメイていた。酵素は分泌真菌タンパク質として産生されン間に位置し，ファンデルワールス相互作用，9 つたため，N 結合型糖鎖をもつ糖タンパク質であった。

の水素結合相互作用，および水媒介相互作用によっ

4 つ の ジ ス ル フ ィ ド 架 橋（Cys21-Cys53，Cys101-て構成されていた。Asn155 に結合した N 型糖鎖とCys131，Cys201-Cys215， お よ び Cys203-Cys208）

隣接するタンパク質分子との間に 3 つの水素結合がが触媒ドメインに存在した。

見られた。

挿入領域の Cys 残基が偶数であることは興味深い。

 触媒ポケットは 4 量体の接触面に埋もれており，

たとえば，P. purpurogenum αGal の残基 147〜180（T.

触媒ポケットを構成している Trp168 の側鎖は，隣reesei の 146〜180）には 2 つの Cys 残基が含まれ，接する分子の Lys230 の 4.5Å の位置にあり 4 量体

酵母 αGal の残基 198 〜 219 および M. vinacea αGal形成に関与していた。触媒ポケットの近くに，挿入

I の残基 196 〜 215 には 4 つの Cys 残基が含まれる。

されたペプチド 196-215（挿入 2）があり，そこか

これらの Cys 残基は，分子内に S-S ブリッジを形成

ら 9 つのアミノ酸残基が 4 量体接触面の形成に関与することにより，これらの酵素の安定性を維持するしていた。図 8 に示すように，この挿入は 4（fold

役割を果たしていると考えられる。

axis）倍軸の周りに集まり，隣接する分子と相互作

モノマー構造は，既知の GH27αGal の構造と類用して，4 量体界面を形成した。同様に，他の 2 つ似していた。イネの αGal と比較して，触媒ドメイの挿入も 4 量体界面に存在していた。したがって，

ンと C 末端ドメインの基本的な二次構造はよく保これらの挿入は，この酵素の安定した 4 量体を形成存されていた。M. vinacea αGal I には 3 つの注目すする上で重要な役割を果たしていると考えられる。

べき挿入ペプチドがあった。すなわち，ペプチド

 レ イロらは，Gal4Man4 の 構 造 をもとに S. cerevi-137-141（挿入 1）と 196-215（挿入 2）は（β/α）8siae αGal を用いて，ドッキングシミュレーションを

バレルのアクティブな裂け目の周りにあり，ペプチ

行い，20 アミノ酸の挿入が末端ガラクトースを持つ

ド 346-351（挿入 3）は C 末端ドメインに位置してGal4Man4 を基質認識部位にフィットさせ，Gal 部分

いた。（β/α）8 バレルの 6 番目の β シートの後に位が活性部位に深く入り込んでいることを確認した 34）。

置する最大のペプチド 196-215 は，20 個のアミノ

この結果は，M. vinacea αGal I が Gal3Man3 に対して酸で構成され，ねじれたペプチドの中に 2 つのジス

効果的に作用することを説明できる。

ルフィド架橋を含んでおり，（Cys201-Cys215 およ M. vinacea αGal I 分子の N 型糖鎖が結合しているび Cys203- Cys208），触媒ポケットの前に位置する

アスパラギンは，Asn155，Asn276，および Asn371

小さな球状ドメインを形成した。

であった。これらの中の 2 つ（Asn155 と Asn276）

酵素の触媒ポケットは，触媒ドメインの中央の βバレルの C 末端側に位置していた。求核剤および12は触媒ドメインにあり，Asn371 は C 末端ドメインに存在した。

小林：α-ガラクトシダーゼの構造と機能 II

Asn155 に結合した糖鎖の糖鎖部分が 3 本の鎖のⅥ

まとめ

中で最もよく観察され，糖鎖の構造は高マンノース型であると判断された。Asn155 に結合した糖鎖は，（β/α）8 バレルの触媒部位の裏側に位置し，隣接する単量体分子まで伸びており，3 つの水素結合相互1 ．基質特異性による分類
α-ガラクトシダーゼは，表 3 のように 3 つのグ
ループに分けることができる。

作用を介して四量体形成に関与していた。Asn276

ガラクトマンノオリゴ糖の側鎖状に結合したガおよび Asn371 に結合した糖鎖は溶媒領域に伸びてラクトースのみに作用する A グループと，末端にいた。

結合したガラクトースのみに作用する B グループ， グリコシル化は，その不均一性と柔軟性のためそして側鎖，末端関係なく作用する特異性の広い Cに，タンパク質の結晶化を妨げることがあるが，グループである。

M. vinacea αGal I は容易に結晶化した。これは，M.

A グループの酵素は，溶液中でモノマー（単量体）

vinacea αGal I が，結晶パッキングに適用できる 4として存在し，150 番目前後に約 30 アミノ酸残基

回対称の安定した 4 量体構造を持っているためと考の挿入を持っているのが特徴である。この挿入は活えられる。さらに，M. vinacea αGal I の 4 量体化は，性部位周辺に存在し，挿入部分には S-S 結合が存在

その基質特異性を変化させ，安定性を高めているとし，A グループ独特のループ構造を示しており，こ考えられる。M. vinacea αGal I の 4 量体化の生物学

れらの酵素の基質特異性と関わっていると考えられ的意味については今後の検討課題である。

る。

B グループの酵素は，溶液中でテトラマー（4 量体）として存在し，200 番前後に 20 アミノ酸残基の挿入ループを持つ。このループは Gal3Man3 に対して効果的に作用することに加え 34），Gal3Man4 の基質結合を妨げるように作用すると思われる。また，B グループ の酵素については，挿入部分が多量体化と密接な関係があることが示唆されており，活性部位を中心に 4 量体が形成されているため，高分子基質は活性部位に接触することができない。一方で，A グループの酵素は単量体であるが，高分子
基質には作用できない。この点については詳細な検討が必要である。

C グループの酵素については，多糖を含むすべての基質に作用する広い基質特異性を示す。溶液中で

図 8．M. vinacea αGal I の 4 量体構造

黒矢印は 196-215 の挿入ループを示し，白矢は N- 結合型糖鎖を示す。挿入ループと Asn155 に結合した糖鎖は，他のサ
ブユニットと相互作用することにより 4 量体形成に需要な役割を果たしている。

はモノマーとして存在し，A，B グループの酵素と比べて，挿入がないために基質を選ばない広い特異性を示しているのであろう。ポリマーに対して効率

表 3．種々起源 α-ガラクトシダーゼの基質特異性と構造的特徴

Group

起源

基質

挿入

高次
構造

活性部位（Asp, Asp）

N型
糖鎖

A

P. purpurogenum(T. reesei)

Gal3Man4

34 a.a.

単量体

D134 (Nnucleophile)D228 (Proton donor)

9個
（9 個）

B

M. vinacea I(S. cerevisiae)

Gal3Man3

20 a.a.

4 量体

D129 (Nnucleophile)
D189 (Proton donor)

5個
（9 個）

C

M. vinacea II
O. sativa

Gal3Man3
Gal3Man4
polymernone

単量体

D130 (Nnucleophile)
D185 (Proton donor)

9個
0個

13

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報

第 32 号

2022

的に作用するこのグループの酵素の性質は食品素材

and cDNA cloning of a novel α -galactosidase fromの高付加価値化ともつながる可能性が考えられる。

Morteerella vinacea. Biosci. Biotech. Biochem. 61: 592-

グアーガムとローカストビーンガムは前述のように増粘剤として食品業界で広く使用されている。
ローカストビーンガムは，カラギーナンやキサンタ
ンガムなどの酸性多糖類と混合するとゲル化する
が，グアーガムにはゲル化能は認められない。グアーガムはローカストビーンガムより容易かつ安定して入手可能であり，はるかに安価であるため，M.
vinacea αGal II や植物酵素によるグアーガムの脱ガ
ラクトシル化による優れた機能特性を備えた修飾ガ
ラクトマンナン製造への利用の可能性に期待したい。

598.
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