CRISPR/Cas システムを用いたゲノム編集に遺伝子導入装置 Nucleofector™

Target sequence
Genomic DNA■ 核内への遺伝子導入能力→高効率のゲノム編集を実現■ 多様なドナー DNA（ssODN、dsDNA）によるゲノム編集事例■ Cas Nuclease を導入可能。オフターゲット効果を低減■ iPS 細胞や免疫細胞における多数の報告■ DNA、RNA、タンパク質、RNP 等多様な基質を共導入可能

Cas9

文献紹介

Highly efficient RNA-guided genome editing inhuman cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins
Sojung Kim,1,2 Daesik Kim,1,2 Seung Woo Cho,1,2 Jungeun Kim,1,2 and Jin-Soo Kim1,2,3
1

Department of Chemistry, Seoul National University, Seoul 151-747, South Korea; 2Center for Genome Engineering, Institutefor Basic Science, Seoul 151-747, South Korea

要約

Cas9 タンパク質を利用したゲノム編集の問題点として、標的遺伝子で４D-Nucleofector により導入された組換え Cas9 タンパク質とガイドは無い遺伝子配列の改変（オフターゲット効果）や、プラスミドに起因RNA は、種々のヒト細胞に高効率で導入された。導入された Cas9 タ

する DNA 断片がランダムにゲノムに挿入されることがあげられる。このンパク質は、速やかにゲノム修復を行った後、細胞内で分解されること問題を解決するために、本研究では、従来プラスミド DNA の形で導入により、従来法と比較してオフターゲット効果が減少し、高効率にゲノされていた Cas9 を、精製組換えタンパク質として導入した。

ム修復を行うことが可能となった。

【Nucleofection 条件】細胞数：2 × 105cells/ 20 µL sample | Cas9 タンパク質：4.5 〜 45 µg または、Cas9 プラスミド (1 µg または 2.4µg)| sgRNA:6-60 µg
細胞種

K562

H9 （human ES 細胞）

導入試薬

SF Cell line nucleofector solution

P3 Primary cell nucleofector solution

プログラム

FF-120CB-150DT-130

引用元：Genome Res 24:1012.1019

CRISPR/Cas によるゲノム編集文献一覧

BJ

http://genome.cshlp.org/content/24/6/1012.short* 他も多数実績有り

Authors
Byrne et al.
Byrne et al.
Chan et al.
Chang et al.
Chavez et al.
Dalvai et al.

Citation
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Nucleofector™ Platform
4D-Nucleofector™ System
4D-Nucleofector™ System
4D-Nucleofector™ System
Nucleofector™ II/2b Device
4D-Nucleofector™ System
4D-Nucleofector™ System
Nucleofector™ II/2b Device,
4D-Nucleofector™ System
4D-Nucleofector™ System
Nucleofector™ II/2b Device
4D-Nucleofector™ System
4D-Nucleofector™ System
4D-Nucleofector™ System
4D-Nucleofector™ System
4D-Nucleofector™ System
Nucleofector™ II/2b Device,
4D-Nucleofector™ System
4D-Nucleofector™ System
4D-Nucleofector™ System
96-well Shuttle™ Add-on
4D-Nucleofector™ System
4D-Nucleofector™ System
96-well Shuttle™ Add-on
96-well Shuttle™ Add-On
4D-Nucleofector™ System
4D-Nucleofector™ System
Nucleofector™ II/2b Device
Nucleofector™ II/2b Device
4D-Nucleofector™ System
4D-Nucleofector™ System

Cell Type
Human iPSC
Human iPSC
CHO suspension
Human iPSC
Human iPSC
K562

Substrates
plasmid
plasmid
plasmid
plasmid
plasmid
plasmid

Human CD34

protein (Cas9 RNP)

CD34, K562
Human iPSC
U2OS
U2OS, K562
Plasmodium falciparum
Human iPSC
HCT116, HeLa

protein (Cas9 RNP)
plasmid
plasmid
plasmid
plasmid (linearized)
plasmid
plasmid
plasmid, mRNA,protein (Cas9 RNP)
plasmid
plasmid
protein (Cas9 RNP)
ribonucleoprotein
plasmid
plasmid, mRNAribonucleoprotein
protein (Cas9 RNP)
plasmid
plasmid
plasmid
plasmid
plasmid, ssODN

K562, human T cells, CD34
Plasmodium falciparum
Rhesus iPSC
Human T cells
K562, BJ fibroblasts
U2OS
C6, Neuro2A
293T, NHDF, hESC
H9 hESCU2OS
Human T cells, CD34
Human iPSC
Human iPSC
Human iPSC

文献紹介

Optimization of scarless human stem cell
Luhan Yang1,2, Marc Guell1, Susan Byrne1, Joyce L. Yang1,2, Alejandro De Los Angeles3, Prashant Mali1, John Aach1, Caroline Kim-Kiselak2,Adrian W Briggs1, Xavier Rios1, Po-Yi Huang1,4, George Daley3 and George Church1,5,*1

Department of Genetics, Harvard Medical School, Boston, 02115 MA, USA, 2Biological and Biomedical Sciences Program, Harvard Medical School, Boston,
02115 MA, USA, 3Children’s Hospital, Boston, 02115 MA, USA, 4Chemistry and Chemical Biology program, Harvard, 02138 Cambridge, MA, USA and 5Wyss
Institute for Biologically Inspired Engineering, Harvard University, Cambridge, 02138 MA, USA要約

ヒト iPS 細胞等の幹細胞を標的としたゲノム編集では、ゲノムに痕跡をえが reTALEs を使用した場合より 7-8 倍高くみられ、ssODN と共導入残さずに高効率に行うことが重要である。本報告では、レンチウイルした相同的組換えによる修復効果は若干高い傾向がみられた。これら

スでも使 用可能 な TALE（reTALEs）を作 製し、Cas9-gRNA のそれぞの系を使用することにより、ヒト iPS 細胞からおよそ 3 週間でゲノム編れを 4D-Nucleofector™ によりヒト iPS 細胞に導入し、種々の比較を行っ集により遺伝子改変を行った単一 細胞からなるクローンを得ることがた。reTALEs を用いたゲノム編集では、Cas9-gRNA では非相同的組換可能となった。

【Nucleofection 条件】PGP1 iPSC | 細胞数：2 × 106 cells/ 20 µL | 導入試薬：P3 Primary cell nucleofector solution | プログラム：CB-150| 基質：① Re-TALENs plasmid：1 µg、gRNA：1 µg、ssODN(100 µM)：2 µL② Cas9: 1 µg、gRNA：1 µg、ssODN(100 µM)：2 µL
引用元：Nucleic Acids Res 41:9049-9061

http://oxfordjournals.org/our_journals/nar/top_articles_genomics.html

Authors
Park et al.
Petit CS et al.
Pires et al.
Pogson et al.
Poon et al.
Ran FA et al.
Ran FA et al.*Richardson et al.
Ruan et al.
Rupp et al.
Smith et al.
Srikanth et al.
Su et al.
van Agtmaalet al.
van Overbecket al.
Walter et al.
Wang J et al.
Wang et alCitation
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Nucleofector™ Platform
4D-Nucleofector™ System
Nucleofector™ II/2b Device
4D-Nucleofector™ System
4D-Nucleofector™ System
4D-Nucleofector™ System
4D-Nucleofector™ System
4D-Nucleofector™ System
4D-Nucleofector™ System
4D-Nucleofector™ System
4D-Nucleofector™ System
4D-Nucleofector™ System
4D-Nucleofector™ System
Nucleofector™ II/2b Device

Substrates
protein (Cas9 RNP)
plasmid, ssODN
plasmid, ssODN
plasmid
plasmid
plasmid, PCR cassette
plasmid, PCR cassette
protein (Cas9 RNP)
plasmid
protein (Cas9 RNP)
plasmid
plasmid
plasmid

4D-Nucleofector™ System

Cell Type
Human T cells
HeLa
Human iPSC
Hybridoma cell lines
Human iPSCHUES62
HUES9, HEK293
HEK293
293FT
Human T cells
Human iPSC
Human iPSC
Human T cells
Human immortalized
myoblasts

Mol Ther 25(1): 24-43 (2017)
Mol Cell 63:633–646 (2016)

4D-Nucleofector™ System

HEK293, HCT116, K562

protein (Cas9 RNP)

eLife 5: e11418 (2016)
PNAS 111(36):13157–13162 (2014)
Nat Protocols (1):88-103 (2017)

4D-Nucleofector™ System
Nucleofector™ II/2b Device
Nucleofector™ II/2b Device

plasmid
plasmid
plasmidWu et al.

Cell Res 25(1):67-79 (2015)

Nucleofector™ II/2b Device

Xiang et al.
Yang et al.
Yang L et al.
Young et al.
Zah et al.
Zhang et al.
Zhang et al.
Zhang et al.

EMBO Mol Med 8(9):992-1004 (2016)
Nat Commun 5:5507 (2014)
Nucleic Acids Res 41:9049-9061 (2013)
Cell Stem Cell 18:1–8 (2016)
Cancer Immunol Res 4(6):498-508 (2016)
PLoS ONE 10(3): e0120396 (2015)
Stem Cell Research 17:151–153 (2016)
Sci Adv 12;3(4): e1602814 (2017)

4D-Nucleofector™ System
4D-Nucleofector™ System
4D-Nucleofector™ System4D-Nucleofector™ System
Nucleofector™ II/2b Device
Nucleofector™ II/2b Device
4D-Nucleofector™ System
4D-Nucleofector™ System

J1 ES cells
Raji
Human iPSC
Mouse spermatogonial stemcells
Murine microglia cell line N9
Human iPSC
Human iPSC
Human iPSC
Raji
Mouse ES
Human iPSC
Human iPSC

plasmid

plasmid
plasmid
plasmid
plasmid
plasmid
plasmid
plasmid
plasmid
plasmid

4D-Nucleofector™ 各装置の特徴
CRISPR/Cas9 について報告されている基質量の範囲
Cas911ガイドRNA

242X ユニット

320 uL Strip
0.4〜1 μg

Cas9 Nuclease

Y ユニット4100 uL Cuvette
2〜5 μg
110 μg (60 pmol) *50 μg (300 pmol)

1ガイドRNA

120〜180 pmol *600〜900 pmol

ガイドRNAプラスミド

0.4〜1 μg

2〜5 μgdsDNA(lin)0.4〜2 μg

5〜10 μg

50 pmol *250 pmol

2ドナー

31 コアユニット基質

Cas9プラスミド

ssODN

12 μg (100-mer) *3 60 μg (100-mer)*1 J. Exp. Med. 2018 Vol. 215 No. 3 985–997*2 弊社技術資料より*3 SCIENTIFIC Reports (2018) 8:310 Ishida et al.

LV ユニット

AAF - 1002B（4D-Nucleofector™ コアユニット）*①
品番（品名）

定価

AAF - 1002X

AAF - 1002Y

AAF-1002L（4D-Nucleofector™ X ユニット）*②（4D-Nucleofector™ Y ユニット）*③（4D-Nucleofector™ LV ユニット）*④2,800,000円

3,100,000円

お問い合わせください

コアユニット : 1,200,000円

構成

X ユニット : 1,600,000円

コアユニット : 1,200,000円

構成

Y ユニット : 1,900,000円

コアユニット : 1,200,000円

構成

LV ユニット : お問い合わせ

キュベット

細胞数

100 µl キュベット

16-wellストリップ

2 × 102 × 105〜

2 × 10

7

1〜2

サンプル数

4〜

1 × 1024ウェルプレート用電極

1 ml カートリッジ

LV カートリッジ

プロトコルに依存

1 × 101 × 109

6

1〜16

1〜24

電極材

用

1

導電性ポリマー

導入形態
用

8

浮遊接着浮遊途

高効率遺伝子導入

接着状態の遺伝子導入

同一バッチによる大量導入

途

P3初代細胞キット（iPS細胞、免疫細胞）
20 μL容量：V4XP-3032
100 μL容量：V4XP-3012,3024

基本神経細胞ADキット

P3初代細胞キット（iPS細胞、免疫細胞）
1 mL容量：V4LP-3002
20 mL容量：V4LP-3020, 3520

V4YP - 1A24

Nucleofector™2b 装置の特徴
品番(品名)

AAB - 1001
（Nucleofector™ 2b デバイス）

反応容量

電極材

細胞数

サンプル数

導入形態

100 µL

アルミニウム2 × 105 〜
2 × 107

1浮遊定価

1,500,000円

RES-LF2104-01-PNT