Vol.３０ No.１，２０１１

11１
センターニュース

分析機器解説シリーズ（111）◆迅速スクリーニング手法（GC/MS＋NAGINATA）を用いた農薬・化学物質測定 ……… P1
新川電機株式会社

分析カスタマセンター

東房健一

トピックス

◆大気圧走査電子顕微鏡ClairScopeの紹介 …………………………………… P6
日本電子株式会社

開発部

西山英利

分析機器解説シリーズ（111）

迅速スクリーニング手法（GC/MS＋NAGINATA）を用いた農薬・化学物質測定
1

はじめに分析カスタマセンター

2

GC（ガスクロマトグラフ）

新川電機株式会社

1

はじめに

東房健一

近年、食品中農薬や飲料水の水質項目に代表されるように、各種の固体または液体を固定相として、その一端に置いた多くの化学物質や農薬の分析を行う必要性が増加している。

試料混合物を適当な移動相で移動させ、各成分の吸着性や分2GC（ガスクロマトグラフ）
これらの分析を行うには、主にGC/MSを使用して行われる

3

GC/MS（ガスクロマトグラフ質量分析計）
配係数の差異に基づく移動速度の差を利用して、これを相互が、測定を行う前に測定しようとする物質を確定し、条件の分離する技術の総称をクロマトグラフィ－とよび、その中で設定、標準品を用いた検量線の作成を行い、対象試料を測定

ガスクロマトグラフィ－は、固体に対する気体の吸着性の差34することが必要となってくる。また、緊急性を要する調査でGC/MS（ガスクロマトグラフ質量分析計）

異を利用したものをガスクロマトグラフィ－とよばれている。
迅速スクリーニング手法

は、早期安全性確認の為に多成分を短時間に測定することがまた、相互分離するための装置のことをガスクロマトグラ必要となってくる。

4

しかしながら、これらの分析には多くの時間と労力を要し、迅速スクリーニング手法

物質数が多くなるほど困難となる。解決手段として、我々は、

フとよび、ガスクロマトグラフには、ボンベ、注入口（試料5気化室）、カラム（分離管）
おわ り に 、検出器が接続されており、不活GC/MSと多成分の化学物質を網羅的に短時間で分析することが可能なスクリーニング手法（NAGINATA）を開発し、実サ5おわりにンプルへの適応を試みて評価してきた。今回は、GC/MSの基礎とこの手法の仕組み及び実試料への適用を解説する。

図 1 ガスクロマトグラフのシステム（）分析機器解説シリーズ（111）
性なキャリアガス（N2、H2、He、Ar 等）が一定量流れている。

電子イオン化法は、イオン源に取り付けられたフィラメン注入口から導入した試料は、加熱されて瞬時に気化し、キャトに電流を流し、イオン化室に向けて熱電子を放出する。こ1

リアガスに押し流されてカラムへ送られる。試料成分はカラはじめにの熱電子と試料成分が衝突すると、次のようなイオン化反応

ム内で分配（固定相への溶解と気化）を繰り返し、親和性のが起こる。

違いから各成分ごとに異なった速さで移動していく。分離さ2れた成分は次々とカラムから溶出し、検出器に捕らえられてGC（ガスクロマトグラフ）

ピ－クとして出力され、これをクロマトグラムとよんでいる。

CH3COCH3 ＋�� �
e － → CH3COCH3 ＋ ＋ 2e －イオン化反応により生成した正イオンは、フラグメンテーション（開裂）を起こる。

3GC/MS（ガスクロマトグラフ質量分析計）

CH3COCH3 ＋ .�����
→����
CH3CO ＋ ＋ CH3・GC/MSは、前記したガスクロマトグラフの検出器にMSをCH3 ＋ ＋ CH3CO・装備したものである。

迅速スクリーニング手法
4MSとはmassspectrometry（質量分析）の略称で、試料分

1

は じ め に C2H3 ＋ ＋ OCH3・子をイオン源で分解・イオン化し、マスフィルターで質量／各イオンは、マスフィルターでふるい分けられた後、検出電荷（m/z）毎にイオンをふるいわけ、さらに各イオンの量に器に到達し、検出器で電気信号の強度質量／電荷ごとに記録5比例するシグナルを出力する。MSは、主に、次の3つの部分おわりに2され、図2のようなマススペクトルが得られる。
GC（ガスクロマトグラフ）で構成される。

このマススペクトルは化合物ごとに固有なパターンを示す。

①���������イオン源

マススペクトルはある法則にしたがって生成し、この生成し 試料分子をイオン化し、マスフィルターの方向へ加速������������������������をさせる。

3たフラグメントイオンを解析することによって、測定試料のGC/MS（ガスクロマトグラフ質量分析計）構造を知ることができる。

②��������
�������
マスフィルター イオン源で生成したイオンを質量／電荷（m／z）によ�������������������������り、ふるいわけする。
③����
���
検出器
 ����������������
HEDとEMから構成されている。

4

迅速スクリーニング手法

4. 1 NAGINATA の考え方と仕組み◦HEDはイオンを高エネルギ－の電子に変換する。
������������������������お わのりに的 な 考 え 方 は、 保 持 時 間（Retention5NAGINATA
基本◦EMは電子を増倍し、電気信号として出力する。
�����������������������Time、RT）および検出器応答（Response Factor、RF）を化

◆ 原��
理
�

学種ごとに固定化・データベース化して、一般的な検量線に代えて使用することである。RT ならびにRFは化学種ごとにGC/MS でのイオン化の方法は数種類あり、これらを試料に特徴的である一方で流動的でもあり、測定に使用する装置ああった方法を選択して使用する。各種イオン化の種類を以下

るいは測定日などが異なると、変動するのが通例となっていに示したが、一般的には、操作が簡単で、データベースが充る。このため、日常的に標準物質測定に基づいた化合物情報実して解析が容易な電子イオン化（EI）法が多く使用される。の把握あるいは、検量線更新などのメソッド調整などが必要◦電子イオン化法（EI）となり、多成分分析の煩雑さならびに制約の主な原因の一つ◦化学イオン化法（CI）になっている。これに対して、NAGINATA ではこれらの操作◦高速電子衝撃法（FAB）を不要とするので、多成分分析に付随する問題を大きく改善◦エレクトロスプレーイオン化法（ESI）できると考えられる。

図 2 マススペクトルの例
Parent Peak（分子イオンピーク）：分
 子量を示すピーク。電子を一つ失っている。
Base Peak（基準ピーク）：最大強度を示すピーク
Fragment ion（フラグメントイオン）：分子イオンが一つ以上結合開裂して生成したイオン。
Mass/Charge：質量／電荷（）分析機器解説シリーズ（111）RT の固定化にはリテンションタイムロッキング（RetentionRRFに影響を与えるもう一つの要因としてGC/MSシステ

Time Locking、RTL）を用いた。RTLは数年前に Agilent 社にムの状態が挙げられる。システムの劣化による影響の受け方

より実用化された技術で、装置あるいは測定日が異なってもは化学種により差があるだけでなく、システムの劣化箇所に実用上問題ないレベルでRT を一致させることができるとされよって影響を受ける化学種は異なる。例えば、図4はGC 注ている。その作動原理は、GC 条件を固定した上で適当な基準入口の状態に起因するクロマトグラムの差を示しているが、化合物のRTとカラムヘッド圧の関係を用いてカラムヘッド圧ある種の化合物（カプタホル、イソキサチオン）では汚染にを調整することにより、意図した時間にRT をコントロールすより大きく感度が低下しているのに対して、フタル酸エステるものである。RTL の一例として、図3に40あまりの農薬にル（フタル酸ブチルベンジル）ではほとんど影響が認められついて5 機関で得られたRT の最大値と最小値の差分を示す。

ない。この種の問題に対してはシステム評価のための試料（クほとんどの成分で差分が 0.05 分以下と良好に一致している。

ライテリアサンプル）を策定した。

RFに つ い ては 絶 対RF の 固 定 化 が 困 難と考 え ることか

GC/MSにおいて試料が通過する箇所は、注入口、カラムおら、適当な内部標準物質との相対強度（Relative Response

よび検出器（イオン源）に大別されるが、クライテリアサンプ

Factor、RRF）の固定化を試みた。RRF の固定化に際しては、ルにはこれらの各箇所の劣化に対して鋭敏な化学種が含まれ測定に使用するMSから得られるマススペクトルパターンをている。クライテリアサンプルとその評価システムの活用によ一定にする必要がある。これは、化合物間（内部標準物質とり、測定に使用するシステムを適用可能な状態レベルに保つ測定対象成分）で定量に用いるイオンが異なるためである。

ことができる。表2にクライテリアサンプルに含まれる主な化

従って本検討では通常のオートチューンに代えて、より厳密学種と評価部位ならびに基準の一例を示す。基準には評価箇にマススペクトルパターンを調整できるEPA625メソッド準所に応じて、評価用化合物の検出量、テーリング度および特拠のDFTPP チューニングアルゴリズムを採用した。表1に10定イオンの強度比率などを設定した。なお、クライテリアサン台の装置によるDFTPP チューニング結果を示す。ベースイオプル成分の選定は国内での入手のし易さも考慮して選定した。

ン（m/z 69）に対する各イオンの比率の相対標準偏差は概ね5％前後と良好であった。

図 3 5 機関の装置で得られた RT の最大値と最小値の差分（分）表 1 10 台の装置による DFTPP チューニング結果

図4

システム状態による測定結果の差の一例（注入口）

表 2 クライテリアサンプルと評価基準の一例（）分析機器解説シリーズ（111）

4. 2 データベースの構築と専用ソフトウエアの構成システムを最適化した上で行った。
結果を図6に示したが、標準液（アセトン溶液）中でのク

4. 1�������������������������
������������������������で述べた仕組みに基づき、約800の化学種についてロロタロニルの分解が原因と思われる減衰傾向が認められるそれぞれ、① RT、② RRF、および③マススペクトルの3種類

ものの、ほとんどの農薬の測定値が調整濃度付近に集中し、のデータベースを構築した。マススペクトルについては従来測定回数間の変動も小さく、約8 割の農薬が調整濃度の±のものと同様であるが、チューニングにマススペクトルパター30％の範囲内で再現されるという結果が得られた。これは、ンに関する規定を設けたことにより、MS間におけるデータの異なる日時や装置状態であっても、システム状態を最適化す整合性の向上が期待される。また、このデータベースを活用ることにより、比較的正確かつ精度よく測定出来ることが確するための専用の GC/MS 用ソフトウエアも合わせて作成し認され、この手法が十分に有用であることが評価できた。

た。ソフトウエアの主な機能としては、データベースによる自動定量（Quant Screener）、クライテリアサンプル測定結果

4. 4 化学物質定量の実際の自動評価（Setup Captain）ならびにクロマトグラムマニュ① 河川環境モニタリングへの適応アル解析画面（NAGINATA Browser）などが挙げられる。表 �������������������������
福岡県内の河川（山間部の二級河川）の定点において、3にデータベース構築ならびに測定に用いたGC/MS 条件を、6月11日から週1回の頻度で採取した河川水をGC/MS＋図5にデータベースを含めた本システムの構成を示した。

NAGINATA 法で測定した結果、約30種類の物質が検出された。このうち、検出された農薬と濃度を降雨量と共に図4. 3 再現性の評価例

7に示した。水田や畑作農薬であるプレチラクロールやピNAGINATA から得られる測定結果の再現性を確認する目的

リブチカルブ等の農薬7 種類が 0.003mg/L 以下の極低濃で、内部標準溶液を添加した農薬混合溶液 0.5ppmを測定した。農薬混合溶液の測定は、調整した標準溶液を1週間毎に3回実施し、それぞれ装置起動から測定
表 3 GC/MS 測定条件

図 5 NAGINATA の構成

図 6 NAGINATA 再現性（）分析機器解説シリーズ（111）度で検出され、フェノブカルブも同様な傾向を示していた
ものの、7月9日のみに環境基準要監視項目指針値の約1/3の濃度である0.01mg/L の濃度が検出された。
② 降下ばいじんへの応用 ������������������������
福岡市内の弊社屋上に、デポジット採取器（開口部：180mm）を設置し、平成17 年10月から1ヶ月毎に降下ばいじんを採取した。採取した降下ばいじん試料からは、検出物質としては、アルカン類21種類やPAHs10 種類が認めはじめに1られ、その他の化学物質として、フェノールや2－ジニトロフェノールなど7 種類が検出された。このうち、4－tert－オクチルフェノールは11月から2月に比較的高く、特に溶図 7 農薬検出状況と降雨量GC（ガスクロマトグラフ）
2存態での濃度が高い傾向を示していた。

 �������������������������
また、迅速スクリーニング手法で検出されたPAHsとGC/MS（SIM）法で定量した値を比較した結果を図10にGC/MS（ガスクロマトグラフ質量分析計）
3示したが、粒子態と溶存態とも迅速スクリーニング手法
はGC/MS（SIM）法に比べ約2割高い傾向を示しているものの、双方とも良好な相関（0.908，0.974）を有してお4り、迅速スクリーニング手法が降下ばいじん主成分である
迅速スクリーニング手法
PAHs の分析に十分に適応できることが確認された。

5

おわりに

この GC/MS＋NAGINATA 手法を用いることにより、標準品を必要とせず、測定する物質を限定せずに農薬を含めた化学物質を網羅的に定量・定性することが可能となり、迅速性

図 8 PAHs の検出状況が要求される調査などのスクリーニングとして十分に活用できると考えられる。

引用文献
1）門上ら：Development of A Novel GC/MS Database for Rapid
Comprehensive Analysis，日中環境化学連合シンポジウム，2004．
2）東房ら：第13回日環協・環境セミナー全国大会要旨集，63－66（2005）3）山上ら：第10回第10回日本水環境学会シンポジウム，110－111（2007）4）宮 崎 ら：第16回 環 境 化 学 討 論 会 講 演 要 旨 集，632－633（2007）
5）東房ら：第17回日環協・環境セミナー全国大会要旨集，115－118（2009）

図 9 その他の化学物質の検出状況

図 10 迅速スクリーニング法と GC/MS(SIM) との比較

（）

トピックス

大気圧走査電子顕微鏡 ClairScope の紹介
日本電子株式会社開発部

西山英利

1．は じ め に
電子顕微鏡（電顕）は光学顕微鏡（光顕）よりも高い分解能を持つため、各分野で必須のツールとなっている。しかし、通常の電顕では試料を実環境とは異なる真空中におく必要があり、アプリケーションに限界があった。このようなことから、大気圧下で試料を観察できる大気圧走査電子顕微鏡（Atmospheric ScanningElectron Microscope：ASEM），ClairScope［1－3］ を 開発した。この装置を用いれば、溶液に浸したままの試料も容易に観察できる。

2．�����
装　　　置
本装置は通常の SEM を倒立させ、その上端には窒化シリコン（SiN）薄膜窓を備えた薄膜ディッシュをセットできるようになっている（図1）。ディッシュ薄膜は厚みが 100nm であり、電子線を透過する。一方、この薄膜は一気圧を支えることで、ASEM 内部を真空に保つ。試料を載せた薄膜ディッシュを ASEM にセットし、下方から薄膜を通って試料に電子線を照射し、試料からの反射電子を検出することで SEM 観察ができる。また、薄膜の上方に光顕も配置され、同一視野を光顕と ASEM で交互に観察できる。これにより、光と電子線の情報を相関させる Correlative Microscopy を1台の装置で実現できる。薄膜ディッシュ上部は開放されており、試料は一気圧の大気圧下に保持されるため、これまで不可能であった観察が可能になる。生物分野においては、電顕観察に際して従来必須であった脱水や蒸着等の試料前処理は必要が無くなり、この前処理に費やされた時間（一日～数日）も不要となったばかりでなく、実環境下に近い状態の試料が観察できる。材料分野においては、試薬中に浸すなど外部環境を変化させて観ることができ、蒸発など試料の体積が変化する過程の観察もできる。

3．生物分野への応用
薄膜ディッシュは、細胞培養を行うために十分な量（数 ml）の培養液を保持でき、装置から取り外すことが可能である。そのため、CO2 インキュベータ内での長期間細胞培養もできる。今回、薄膜上で COS7 細胞を培養した後、グルタールアルデヒドで固定した。光（）図 1 ClairScope の構造図．
倒立 SEM（大気圧走査電子顕微鏡，ASEM）と対向して光学顕微鏡を配置し，間に薄膜ディッシュを備える．薄膜ディッシュは SiN薄膜窓を底面に持つ．この薄膜は，電子線を透過するほど薄いが大気圧と真空の圧力差に耐えられる．薄膜を通って試料に電子線を照射させ，試料からの反射電子を検出することにより ASEM 像を高分解能で取得できる．また，光学顕微鏡により同じ視野を交互に観察できる．

顕用に蛍光色素で小胞体を染色し、さらに ASEM 用には重金属の染色を行った。ASEM 用の前処理は、溶液を入れ替えるだけで簡便であり、待ち時間も10 分程度と短い。光顕の蛍光像で小胞体の位置を確認し（図2a）、それと同じ視野を ASEM で観察することができる（図 2b）。光顕では倍率1,000 倍程度が限界であるが、ASEM では 20,000 倍（図 2d）であっても明瞭な像が得られる。この結果は、ASEM によって光顕では観察困難な細胞内小器官を溶液中で高速に観察可能で

トピックス

図 2 細胞観察．
a）蛍光染色した小胞体を光顕で位置確認し，b）ASEM により同視野観察（x1,000, scale bar 10μm）を行った．c）b の四角内を拡大（x5,000, scale bar 5μm），d）c の四角内を拡大（x20000, scale bar 1μm）した．
試料ご提供：（独）産業技術総合研究所

佐藤主税先生あることを示すものである［4 －5］。
また、免疫電子顕微鏡としても利用することができる。試料は常に水溶液中に浸しておくことができるので、抗原性が保存され、従来の蛍光顕微鏡法でラベリングに用いられてきた抗体が幅広く使用できる。これを利用して、細胞内におけるタンパク質の局在を光顕を超える高い分解能で決定できる。光顕と電顕の両方で見ることができるラベルを用いて、癌の転移に関係するタンパク質（CD44）の位置を調べ、薬の投入によってその分布が変わることを示した研究もなされている［6］。
菌の観察においても、光顕と同程度の前処理時間、手間により光顕では観察困難な一万倍程度の撮像に成功している［7］。これにより大腸菌（図 3a）の繊毛やレジオネラ菌（図 3b）の内部構造を詳細に観察できる可能性があると考えている。
他の重要な特徴として、試料室が開放されており外部からの試料操作が可能であることが挙げられる。例
えば、細胞に試薬の投与を行い、その反応を光顕でモ

図 4 シリカ粒子（直径 1 μ m）のブラウン運動．
2000倍でのASEM観察で、a）0秒，b）6秒後，10,000倍観察で、c）0秒，d）5秒後、5,000倍観察及び塩水滴下、e）0秒，f）16秒後．

ニターし、タイミングを計り固定、ASEM 用の染色を行えば高分解能撮像ができる［4］。

4．材料分野への応用
4–1．ブラウン運動
溶液中のシリカ粒子（直径 1μm）を試料に用いると、ブラウン運動をリアルタイムに ASEM 観察することができる。図 4a，b は 2,000 倍でブラウン運動を撮像した動画から切り出したものである。また、倍率を上げ、電子線量を増加させることによってシリカ粒子が集合し規則的な配列を取る擬結晶化が起こる（図 4c，d）。この規則化配列の過程は電子線の照射量を変えると変化する。さらに、この装置は外部から細いチューブを試料上まで挿入し、ASEM で観察しながら試薬を滴下することができる。ここでは試薬として NaCl 溶液を用いた。これを滴下するとブラウン運動が停止し（図 4e）、その後シリカ粒子の凝集が起こる。図 4f はその開始する瞬間を観察している。
4–2．蒸発過程

図3a）大腸菌（x30,000, scale bar 0.5μm），b）レジオネラ菌のASEM 像（x15,000, scale bar 1μm）
試料ご提供：（独）産業技術総合研究所

島村政基先生（b）

NaCl を 含 む 水 溶 液 を 数 μl 薄 膜 上 に 滴 下 し、ASEM で観察した。試料の水分が蒸発し、析出を観察することができた（図 5a － c）
。また電子線量を（）トピックス

図 6 溶液中における硫酸銅結晶の成長．
図 5 ASEM で撮像した溶液から固体が析出する様子．
a）0 秒，b）2 秒後，c）60 秒後，d）c の四角内の拡大．

積極的に増加すると、試料中に黒く丸い領域が発生する様子を捉えることができた（図 5d）。強い電子線の照射により析出物の中に残留していた水分が蒸発した結果であると推測している。このように、本装置を用いると、体積が変化する蒸発過程なども観察することができる。
4–3．析���　　�
出純水 5ml を 45℃程度に温め、硫酸銅1.5g を溶かした。その硫酸銅水溶液を薄膜ディッシュに10μl滴下し、自然蒸発により硫酸銅の結晶が成長する様子を観察することができた（図 6）。

a）0秒（x5,000, scale bar 5μm），b）290秒（x4,000, scalebar5μm），c）480秒（x2,000, scale bar 10μm）．

利用した製造装置としての可能性もある。さらに薄膜ディッシュを工夫すれば、様々な可能性が広がる。例
えば、試作品ではあるが、薄膜上に電極を成膜して電極間に電圧を印加することによる電気化学反応、試料近傍にヒーターを設けることによる加熱過程による変化の観察ができている［8］。
注）本 装置は2010年12月、「低炭素社会基盤材料構築に向けた次世代燃料電池触媒開発研究拠点」（http://lowcarbon.cstm.kyushu-u.ac.jp）（伊都キャンパス）に導入されました。

参考文献［1］http://www.jeol.co.jp/products/product/jasm-6200/index.htm

5．�����
ま　と め
ClairScope の開発により、溶液中においた試料の大気圧 SEM 観察が容易になった。生物分野では、培養した細胞を、溶液を入れ替えるのみの簡単な前処理で、溶液に浸したまま蛍光像と ASEM 像の同視野観察ができる。これにより、光顕で観察困難であった細胞の微細構造が ASEM で観察可能になった。材料分野では、外部からの試薬投与や物質の出入りを伴う反応の insitu 観察が可能になった。また、電子線による反応を［2］H. Nishiyama et al ., Microscopy and Microanalysis
15, 938-939 (2009).
［3］M. Suga et al ., Microscopy and Microanalysis 15,924-925 (2009).
［4］H. Nishiyama et al ., J Struct Biol 169, 438-449(2010).
［5］西山英利 他, 顕微鏡 44, 262-267 (2009).
［6］T. Murai el al ., J Biol Chem 286, 1999-2007 (2010).
［7］K. Teramoto et al., JEOL News 45, 38-41 (2010).
［8］M. Suga et al ., Microscopy and Microanalysis 16,330-331 (2010).

九州大学中央分析センターニュース
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ホームページアドレス

（）

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平成23年1月31日発行

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http://www.bunseki.cstm.kyushu-u.ac.jp