報文

鯉淵研報 33 7-10（2023）

カボチャ種子糖質関連酵素の活性に及ぼす発芽処理の影響
高崎 瑞穂 1，田中 友加里 1，原田 カレン 1，小林 秀行 1
1

鯉淵学園農業栄養専門学校

食品栄養科（受付：2022 年 12 月 6 日／受理：2022 年 12 月 26 日）

摘要：西洋カボチャ種子の各種グリコシダーゼにおける発芽前後の活性変化について検討した。休眠種子には
β-D-galactosidase 活性，α-D-galactosidase 活性が検出された。一方，発芽処理により β-D-galactosidase の活性は約 2 倍に増大したが，β-D-fucosidase と β-D-glucosidase 活性は 20 倍以上に増大した。また，粗酵素液のイオン交換クロマトグラフィーの結果，β-D-fucosidase 活性と β-D-glucosidase 活性，β-D-galactosidase 活性のピークが一致し，その画分の SDS-PAGE の結果からこの画分は 66 kDa の大きさを持つ単一のタンパク質であることが示唆された。このことから，タイローズウッド種子の β-D-fucosidase/β-D-glucosidase と類似の酵素がカボチャ種子の発芽処理により活性化されたと考えられる。
キーワード：β-D-glucosidase，糖質関連酵素，カボチャ種子，発芽向にあった器官の代謝機能が，発芽時には分解の方Ⅰ

緒言向に転換することであり，貯蔵物質の分解と利用に関わる酵素群が活性化される 2）。

カボチャは緑黄色野菜であり，可食部 100 g 当た

β-D-glucosidase（β-D-glucopyranoside glucohydrolase）

り水分 76.2 g，炭水化物 20.6 g，タンパク質 1.9 g，は，配糖体やオリゴ糖から非還元末端のグルコース脂質 0.3 g，カリウム 450 mg，ビタミン C 43 mg，残基を遊離する酵素であり，生物全般に存在し，いβ-カロテン 4 mg 程度などを含んでおり，野菜の中ろいろな機能を示す。微生物によるバイオマス変でも丈夫で栽培しやすい。収穫後は，サツマイモや換，動物における糖脂質の分解，植物における細胞栗などと同様に貯蔵あるいはゆっくり加熱すること壁オリゴ糖の代謝，防御などである 3）。

によって甘みが増す。

種子の β-D-glucosidase については，タイローズ

一方，カボチャ種子には可食部 100 g 当たり水ウッドの種子 4）やカボチャ種子 5）に β-D-glucosidase

分 4.5 g，脂質 51.8 g，タンパク質 26.5 g，炭水化物活性が存在し，精製酵素の性質について報告されて12 g（食物繊維 7.3 g），ビタミン B2 0.19 mg，カルいる。

シウム 44 mg，マグネシウム 530 mg を含んでいる。

本研究では，カボチャ種子の β-D-glucosidase をまた，ポリフェノールの 1 種であるリグナンが含ま含む種々の糖質関連酵素群の発芽処理前後におけるれており，抗酸化作用や炎症を抑える作用があると活性の質的・量的変化について検討を加えた。

言われている。リグナン類には頻尿などの排尿障害を軽減する効果が期待できる他，女性ホルモンのバⅡ材料と方法ランスを整える作用があり，骨粗鬆症の予防にも効果的と言われている 1）。

1 ．種子及び発芽処理

発芽とは，低水分含量のために休眠状態であった本校の作物園芸農場で生産された西洋カボチャ

胚の各器官での細胞の原形質が水和により再活性化（栗カボチャ）を用いた。種子を採取し水洗いし，する過程であるとされ，種子形成時に合成・蓄積方乾燥させた。発芽処理は，シャーレに脱脂綿を敷いて水を加え，暗所で 27 ℃，5 日間行った。

1〒 319-0323 茨城県水戸市鯉淵町 5965

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鯉淵研報

2 ．粗酵素液の調製

第 33 号

2023

5 ．SDS-PAGE

発芽処理前後で種子から殻を取り除き，種子重量SDS-PAGE は Laemli の方法 6）に従い，アクリルアミ（pH 5.0）を加え，に対して 6 倍量の 0.05 M 酢酸緩衝液

ド濃度 10 % を用いた。タンパク質は CBB R-250 染色

氷冷下ホモジナイズし，4 ℃で 10,000 rpm，10 minで検出した。分子量マーカーは Amersham Bioscienses

遠心分離し，得られた上澄み液を 0.05 M の酢酸緩の LMW calibration Kit［Phosphorylase b（97 kDa），

衝液（pH 5.0）に対して透析し，粗酵素液とした。

Albumin（66 kDa），Ovalbumin（45 kDa），Carbonicanhydrase（30 kDa）
，Trypsin inhibitor（20 kDa）
，α-Lact-3 ．グリコシダーゼ活性測定

albumin（14 kDa）］を用いた。

活性測定のための各種基質 pNP-グリコシド（p-ni-trophenylglycoside）は，Sigma 社製を用いた。各種Ⅲ

結果と考察

pNP-グリコシドを基質とし，以下のようにグリコ1 ．発芽処理による酵素活性の変化

シダーゼ活性を測定した。

10 mM の 各 種 pNP- グ リ コ シ ド 溶 液 100 μL に，Table 1 に示すように，カボチャの休眠種子には強800 μL の 0.05 M 酢 酸 緩 衝 液（pH5.0） と 粗 酵 素 液

力な β-D-galactopyranoside 分解活性（0.705 unit/mL）

100 μL を加え，25 ℃で 30 min 反応させ，0.2 M Na2CO3（0.137が存在し，加えて α-D-galactopyanoside 分解活性を 1 mL 加えて反応を停止した。408 nm の吸光度をunit/mL）と若干の β -D-fucopyranoside 分解活性（0.059測定し，上記条件で 408 nm の吸光度を 1 上昇させunit/mL），β-D-glucopyranoside 分 解 活 性（0.058 unit/る酵素量を 1 unit とした。

mL）が存在した。
一方，発芽処理によって β-D-galactopyranoside 分

4 ．酵素の精製，α-D-galactopyrano解活性は 2 倍に（1.340 unit/mL）

イオン交換クロマトグラフィーは SE-cellulose カside 分解活性も 2 倍（0.330 unit/mL）に増加したが，ラム（1.5x10 cm）を 0.05 M 酢酸緩衝液（pH 5.0）

β-D-fucopyranoside 分解活性と β -D-glucopyranoside 分

で 平 衡 化 し， 同 緩 衝 液 に 対 し て 透 析 し た 粗 酵 素

解活性は 20 倍以上（1.360 unit/mL と 1.340 unit/mL）液（30 mL）をアプライした。同緩衝液で洗浄後，に上昇した。また，α-L-arabinopyranoside 分解活性は0.5 M NaCl を含む同緩衝液で酵素を溶出した。タ

20 倍以上（0.193 unit/mL）に，β-D-cellobioside 分解

ンパク質濃度は，280 nm での吸光度 1 をタンパク活性は 10 倍以上（0.200 unit/mL）に上昇した。一方，質 1 mg/mL とした。

他 の 基 質（pNP-α-L-arabinofuranoside，pNP-α-L-fuco-

pyranoside，pNP-N-acetyl-β-D-galactosaminide，pNPα-D-glucopyranoside，pNP-N-acetyl-α-D-glucosaminide，

Table 1．カボチャ種子の発芽前後のグリコシダーゼ活性の変化

Activity ofresting seed
(unit/mL, A)

Activity ofgerminated seed
(unit/mL, B)

B-A(unit/mL)

B/A(fold)pNP-α-L-arabinopyranoside

0.0080.193

0.185

24.1

pNP-β-L-arabinopyranoside

0.015

0.075

0.060

5.0

pNP-β-D-cellobioside

0.021

0.200

0.179

9.52

pNP-β-D-fucopyranoside

0.059

1.360

1.301

23.1

pNP-α-D-galactopyranoside

0.137

0.330

0.193

2.41

pNP-β-D-galactopyranoside

0.705

1.340

0.635

1.90

pNP-β-D-galacturonide

0.016

0.091

0.075

5.69

pNP-β-D-glucopyranoside

0.058

1.340

1.282

23.1

pNP-β-D-mannopyranoside

0.035

0.029

-0.0060.83

SubstratepNP-α-L-arabinofuranoside, pNP-α-L-fucopyranoside, pNP-N-acetyl-β-D-galactosaminide, pNP-α-D-glucopyranoside, pNPN-acetyl-α-D-glucosaminide, pNP-N-acetyl-β-D-glucosaminide, pNP-β-D-glucuronide, pNP-β-D-lactopyranoside に 関 し ては殆ど活性が見られなかった。

8高崎ら：カボチャ種子糖質関連酵素の活性に及ぼす発芽処理の影響

pNP-N-acetyl-β-D-glucosaminide，pNP-β-D-glucuronide，活性が検出された。β-D-glucosidase 活性と β-D-fuco-

pNP-β-D-lactopyranoside）については，発芽前・後とsidase 活性はほぼ同レベルであり，β-D-galactosidase

もにそれらの分解活性は殆ど検出されなかった。

活性は 1/3 程度であった。いくつかの β-D-glucosi-

発 芽 時 の β-D-fucopyranoside 分 解 活 性 と β-D-

glucopyranoside 分 解 活 性 の 活 性 比 率 は，1.360

dase が，β-D-fucosidase 活性，β-D-galactosidase 活性を示すことは知られている 7）。

unit/1.340 unit で あ り， ほ ぼ 1.0 で あ っ た。β-D-

精 製 酵 素 は SDS-PAGE（Fig. 2） に 示 し た よ う

glucopyranosidase は，細胞壁を構成するセルロースに，2 種類の酵素活性がほぼ等量存在すると考えらを含む β-グルカン対して作用し発芽時のエネルギーれる画分が 1 つのタンパク質バンドを示し，そのサを得ていると考えられるが，β-D-fucopyranosidase

イズは 66 kDa であった。もし違う酵素だとすればの活性に相当すると考えられる基質は報告されてい2 本のバンドが検出される可能性が高く，ゲル中のない。

唯一のタンパク質バンドの分子量（66 kDa）はタイ

α-L-arabinopyranosidase 活性についても，発芽前ローズウッド種子の酵素（β-D-fucosidase/β-D-gluco-後で 20 倍以上の活性の上昇が見られるが（Table 1），sidase）とほぼ同一であることから，タイローズウッ

β-D-glucosidase が α-L-arabinopyranosidase 活性を示

ドの酵素と類似の酵素の存在が示唆される 8）。

すことは，知られていることであり 7），タイローズ

一方，カボチャ休眠種子の精製 β-D-glucosidase

ウッドの酵素の場合，α-L-arabinosidase/β-D-glucosi-に つ い て は， ゲ ル 濾 過 に よ る 分 子 量 が 48 kDa，dase 活性比は 0.05 であり，カボチャの酵素の 0.14

SDS-PAGE の結果 2 量体構造をとっており，S-S 結という値と似た傾向にあると考えられる。

合を持たない 28.0 kDa と 20.1 kDa の 2 つのサブユニットからなっており 5），本研究における発芽処理

2 ．酵素の精製によって生成する β-D-glucosidase とは別のものと発芽後の種子のホモジナイズを SE-cellulose カラ思われる。
，
精 製 酵 素 が β-D-glucosidase 活 性（8.30 unit/mL）。0.05 M の酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5.0），
（Fig. 1），β-D-galactosidase
β-D-fucosidase 活性（9.40 unit/mL）に対して透析したホモジナイズを，同緩衝液で平衡活性（2.70 unit/mL）を示したことから，カボチャ化した SE-cellulose カラムにアプライし，0.5 M NaCl

種子の β-D-fucosidase/β-D-glucosidase 活性比は 1.13，を含む同緩衝液で溶出した。溶出画分には，β-D-glu-β-D-galactosidase/β-D-glucosidase 比 は 0.33 と な り，

cosidase 活 性，β-D-fucosidase 活 性，β-D-galactosidase

タイローズウッド種子の β-D-fucosidase/β-D-glucosi-

10.000Protein

9.000

Protein (mg/mL)

Glycosidase activity (unit/mL)

ムを用いてイオン交換クロマトグラフィーを行った

8.000

pNP-β-D-galactopyranoside

7.000

pNP-β-D-fucopyranoside

6.000

pNP-β-D-glucopyranoside

5.000
4.000
3.000
2.000
1.000
0.000
0510

15

Fraction Number (5mL)
Fig. 1. 粗酵素液のカチオン交換クロマトグラフィー

9鯉淵

研報

第 33 号

Ⅳ2023

引用文献kDa1 ）久野憲康，土屋欣也，中島成生（1999），新しい抗老96

化化粧品原料−ゴマ発芽中のリグナン配糖体−．J.
Soc. Cosmet. Chem. Japan, 33（3）: 245-253.
2 ）南川隆雄（1984），種子発芽の生化学．化学と生物，
22（2）: 84-92.

66453 ）Ketudat Cairns j. R., Esen A. (2010) β-Glucosidases.
Cell.Mol.Life Sci., 67: 3389-3405.
4 ）Srisomsap C., Svasti J., Surarit R., ChampattanachaiV., Sawangareetrakul P., Boonpuan K., Subhasitanont

30

P., and Chokchaichamnankit D. (1996) Isolation andCharacterization of an Enzyme with β-Glucosidase andβ-fucosidase Activities from Dalbergia cochinchinensis

Pierre. J. Biochem., 119 (3): 585-590.
5 ）Kim E.Y., Kwon C.W., Chang P.-S. (2021) Purification

20and characterization of a novel acid-tolerant and heterodimeric β-glucosidase from pumpkin (Cucurbita moschata)
seed. J.Biosci.Bioeng., 132 (2): 125-131.

146 ）Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of Structural Proteins

ABFig. 2. 精製酵素の SDS-PAGE
A：分子量マーカー，B：精製酵素（画分 11，Fig.1）

dase 活性比の 1.24，β-D-galactosidase/β-D-glucosidase
比の 0.09 とは差はある8）が，似た傾向を示していると考えられる。
また，タイローズウッドの種子には，イソフラボンの仲間である Dalcochinin glucoside が 3 % 以上含まれており，β-D-fucosidase/β-D-glucosidase の天然の基質であるとの報告がある 4，9）。
β-D-glucosidase は多糖やオリゴ糖，配糖体などか

during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4.
Nature, 227: 680-685.
7 ）β -Glucosidase EC 3.2.1.21, https://www.brenda-enzymes.org/（参照 2022-10-29）．
8 ）Svasti M.R.J., Srisomsap C., Surarit R., Techasakul
S., and Ketudat-Cairns J. (1997) Characterization of a
Novel Rotenoid-β-Glucosidase Enzyme and its Natural
Substrate from Thai Rosewood. International Conference
on Biodiversity and Bioresourses: Conservation andUtilization, 23-27 Novemver 1997, Phuket, Thailand.
URL:http://www.iupac.org/symposia/proceedings/
phuket97/svasti.html（参照 2022-10-29）．
9 ）Cairns J.R.K., Champattanachai V., Srisomsap C.,
Wittman-Liebold B., Thiede B., Svasti J. (2000)
Sequence and Expression of Thai Rosewood β-Glucosi-

ら β-D-glucose を遊離するが，カボチャ種子ではフェdase/β-Fucosidase, a Family 1 glycosyl Hydrolase glycoprotein. J. Biochem., 128: 999-1008.

ノール配糖体（ククルビトシド）が報告されてい10）Koide K., Li W., Liu L., Hata E., and Nikaido T. (2005)

10）

る 。しかし，種子の発芽との関係で議論されている研究はなく，これらが β-D-glucosidase の基質となり得るかどうか興味が持たれる。

10New Phenolic glycosides from the Seeds of Cucurbita
moschata. Chem. Pham. Bull., 53 (2): 225-228.