どうやって培養するの？
1

増殖培地の準備2

凍結バイアル溶解3

遠心/凍結培地除去

4MSC
編

継代？

？
MSC が 〜 90% コ ン フ

ルエンシーになる前に継代する。培地を除き
D-PBS(Ca+Mg フリー )で 培 地 成 分を 洗 浄する。トリプシン処理後、完全培地で中和し、遠心回 (600 x g 5 分 ) して複 数 枚のディッシュに播種複数枚のディッシュに播種する。

D-PBS

凍結バイアルトリプシン/EDTA(Cat# CC-3232)

プレインキュベート済み
完全培地

基本培地
完全培地
添加因子セット

5 ml 完全培地

MSC GM Bullet Kit (PT-3001) の構成品を混和して完全培地を調整する。
使用期限：冷蔵保存 /1 ヶ月以内

応用例

同量の完全培地を加え中和

1-2 分以内
37℃ウォーターバス(Single Quote)

遠心回収し播種継代

500 x g で 5 分間遠心して凍結保存培地を除去し、予めプレインキュベーションしてお いた 5 ml
完 全 培地に対し、ウォーターバスで 1 分程 度溶解した細胞溶液を加える。

回収された細胞を予めプレインキュベーションして い た 培 地 へ 播 種 密 度 5,000-6,000 cells /cm2となるよう播種する。播種 3-4 日後に培地交換を実施する。

播種密度：5,000-6,000 viable cells/cm2

分化誘導
骨芽細胞への分化誘導

軟骨細胞への分化誘導

脂肪細胞への分化誘導

hMSC – BulletKit™【 骨芽細胞分化用 】(Cat# PT-3002) を

hMSC – BulletKit™【 軟骨細胞分化用 】(Cat# PT-3003 ) を調整した不完全培地及び TGF- β 3( 別売) を添加した完全培地をそれぞれ調整

hMSC – BulletKit™【 脂肪細胞分化用 】(Cat# PT-3004) に含まれる下記 2 種調整

分化誘導培地分化誘導培地
増殖培地で1 日培養

分化誘導培地で2-3 週間分化誘導

コラ ー ゲ ンコ ート培 養 皿 に 播 種 密 度：hMSC 3.1 x 103
cell/ cm2 となるよう増 殖 培 地 (MSCGM) を 添 加し、24時間培養したら、分化誘導培地へ培地交換し、3 〜 4 日に一度、培地交換しながら 2 〜 3 週間分化誘導する。コントロールとして、未分化の hMSC を、増殖培地 (MSCGM)で培養し比較する。の培地を調整

不完全培地
不完全培地

3 日間

3 サイクル完全培地(TGF- β含 )
完全培地

静置培養

15 ml 容量のポリプロピレンチューブで 2.5 x 105 個の hMSC を不完全培
地で 2 回洗浄し、その後 0.5 ml 完全培地 (TGF- β 3 添加 ) を加え遠心し、培地は取り除かずそのまま細胞ペレットを 24 時間インキュベーターで静置培養する。2-3 日に 1 回の頻度で培地交換する。

維持培地

1-3 日間100% コンフルエンシー の 状 態 で、誘 導 培地で 3 日、次いで維 持 培地で1-3 日培養する。この培養サイクルを 3 回繰り返し、脂肪細胞へ分化誘導する。コントロールとして、未分化の hMSC を、維持培地で培養し比較する。
アッセイ試薬：AdipoRed™ assay reagent 5 x 4.0 ml (PT-7009)

ロンザ ヒト間葉系幹細胞 (hMSC) の特徴

国際細胞治療学会 (ISCT) の品質試験標準項目

ロンザの hMSC は 継代数の低い第 2 継代段階で凍結保存された製品で、再生医療の応用に向けて国際細胞治療学会 (ISCT) の標準とされているマーカー項目や分化能に順守しています。

陽性：CD73, CD90, CD29, CD105, CD166, CD44 確認済
陰性：CD14, CD19, CD34, CD45, HLA-DR 確認済
分化能：骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞確認済み

0.50.40.30.20.10
Donor 1

Donor 2

Fluorescence Intensity (RFU)

UndifferentiatedDonor 3

Donor 48 Days

10 Days

Donor 5

Donor 615 Days

22 Days

2.5
2.0

1.5

1.0

0.50.0
Donor 1

Donor 2

UndifferentiatedDonor 3

Donor 48 Days

14 Days

Donor 5

Donor 620 Days

Figure 2. Chondrogenic Differentiation hMSC weredifferentiated with the hMSC Differentiation BulletKit™ –chondrogenic (Lonza, PT-3003) in the presence orabsence (undifferentiated control) of 10ng/ml TGF-ß3(Lonza, PT-4124). Chondrogenic differentiation wasmonitored on the indicated days using Alcian blue 8GX
staining (Sigma, A3157). Absorption was measured with
the FLUOstar Omega (BMG Labtech) at 610 nm [data isexpressed as mean ± SD for 3 replicates]. All lots
underwent chondrogenic differentiation as measured byglycosaminoglycan production compared toundi f f er en tia te d c o n tr o l s . L o t-to - l o t d ep end en t
variability was observed.
F ig ur e 3. O s te o g enic Di f f er en tia tio n hM S C w er edifferentiated with the hMSC differentiation BulletKit™ –osteogenic (Lonza, PT-3002) according to manufacturers instructions with exception of the seeding density[1,85E+03 cells/cm2]. Osteogenic differentiation wasmonitored on the indicated days with the OsteoImage™
Mineralization Assay (Lonza, PA-1503). Fluorescenceintensity was measured with the Fluoroskan Ascent[Labsystems; excitation 485 nm/emission: 520 nm; 293data points/well; data is expressed as mean ± SD for 1 –3 r e p l i c a te s]. A l l d o n o r s u n d e r w e n t o s te o g e n i cd i f f e r e n t i a t i o n a s m e a s u r e d b y h y d r o x y a p a t i tedeposition of cells. Lot-to-lot dependent variability wasobserved with respect to total amounts of depositedhydroxyapatite per well as well as the time required for
detectable hydroxyapatite deposition.

Fluorescence Intensity (RFU)

A.
10864

20
Donor 1

Donor 2

UndifferentiatedDonor 38 DaysB.

Donor 4

Donor 514 Days

18 DaysDonor 6F ig ur e 4. A d ip o g eni c D i f f er en tia ti o n hM S C w er edifferentiated with the hMSC Differentiation BulletKit™ –adipogenic (Lonza, PT-3004) according to manufacturers instructions. Cell differentiation was monitored on theindicated days with the AdipoRed™ Assay (Lonza, PT7009) containing the hydrophilic stain Nile Red.
A) Fluorescence intensity was measured with theFluoroskan Ascent [Labsysstems; excitation 485nm/emi s s io n : 5 38nm ; 2 93 da ta p o in t s / w ell ; da ta i s
expressed as mean ± SD for 1 – 3 replicates].
B) Exemplary fluorescence microscopy overlay. Nile Red
stained intracellular triglyceride droplets are shown inred. Hoechst 33342 stained nuclei are shown in blue.
Scale bar: 200 µm. All hMSC lots underwent adipogenic
differentiation as measured by the accumulation ofi n t r a c e l l u l a r l i p i d d r o p l e t s w i t h i n t h e c e l l s . Th e
percentage of differentiated cells and/or the total lipid
content per cell varied between different lots.

細胞間葉系OD 610nm

hMSC 分化能の確認
カタログ番号PT-2501

製品名

hMSC 間葉系幹細胞

製品情報
正常成人(単一)サイズ

定価≥7.5 x 105

98,000円

基本培地および添加因子

26,000円

440 ml

18,000円

1セット

19,000円

基本培地および添加因子

39,000円

MSCGM-CD™ Mesenchymal Stem Cell Basal Medium –Chemically-Defined

500 ml

21,000円

MSCGM-CD™ Mesenchymal Stem Cell Growth Medium
SingleQuots™ Supplements and Growth Factors

1セット

25,000円

培地：PT-3924
添加因子：PT-4120

基本培地および添加因子

36,000円

培地：PT-3925
添加因子：PT-4121

基本培地および添加因子

59,000円

2 µg

58,000円

基本培地および添加因子41,000円

hMSC – Human Mesenchymal Stem Cells

培地

PT-3001
PT-3238
PT-4105

MSCGM BulletKit™

MSCGM™ Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit™

MSCBM™ 基本培地

MSCGM™ Mesenchymal Stem Cell Basal Medium

MSCGM™ SingleQuots™ 添加因子セット

MSCGM™ Mesenchymal Stem Cell Growth Medium SingleQuots™
Supplements and Growth Factors

既知組成培地00190632
00190620
00192125

MSCGM-CD™ 間葉系幹細胞 BulletKit™

MSCGM-CD™ Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit™

既知組成

MSCBM-CD™ 間葉系幹細胞基本培地

MSCGM-CD™ 間葉系幹細胞 SingleQuots™ 添加因子セット

分化キット

PT-3002
PT-3003PT-4124

hMSC BulletKit™【 骨芽分化用 】

hMSC – Human Mesenchymal Stem Cell Osteogenic
Differentiation Medium BulletKit™

hMSC BulletKit™【 軟骨分化用 】

hMSC – Human Mesenchymal Stem Cell Chondrogenic
Differentiation Medium BulletKit™

hMSC 用 rhTGF- β 3 添加因子【 軟骨分化用 】

rhTGF-β3 for hMSC Chondrogenic Differentiation Medium
Supplement

hMSC – BulletKit™【 脂肪細胞分化用 】
PT-3004

hMSC – Human Mesenchymal Stem Cell Adipogenic
Differentiation Medium BulletKit™

培地：PT-3102A 、PT-3102B

添加因子：PT-4122、PT-4135

RES-LF1523C
データ引用：Monitoring of Human Mesenchymal Stem Cell Differentiation with Histo- or Biochemical Assays and miRNA Expression Analysis (Lonza CD-PO045 02/14)