「挿入遺伝子と RCA の確認」
1.

アデノウイルスの増幅
組換えアデノウイルスは、通常の方法により増幅して下さい。
「別冊実験医学

ザ・プロトコールシリーズ

遺伝子導入＆発現解析実験法羊土社」参照

1.

RCA 検査のための感染実験
作業手順「RCA 検査のための感染細胞の調製」参照

2.

DNA 抽出作業手順書「アデノウイルス感染細胞からの全 DNA 抽出」参照

3.

DNA の確認と PCR
4-1.「染色体 DNA を含むアデノウイルスゲノム DNA の制限酵素切断」参照
4-2.「PCR 法による挿入遺伝子の確認」参照
4-3.「PCR 法による RCA の確認」参照

注釈
1.

PCR プライマーは、脱保護グレードのもので十分である。

2.

プライマーセットの選択について、
pAxCAwt（RDB No. 1678）によって作製された組換えアデノウイルスは、プライマーセット（PAXCAF1, PAXCAR1）により検出する。また、pAXCALNLw によって作製された組換えアデノウイルスは、プライマーセット（PAXCALNLF1, PAXCAR1）により検出する。

3.

PCR 反応は、30 サイクル以上は行わないで下さい。プライマーダイマーが形成される可能性があるため。

4.

E1 遺伝子検出のためのポジティブコントロールとしては、293 細胞を用いて下さい。

「RCA 検査のための感染細胞の調製」

１．-80℃で保存されているウイルス液を取り出す。
（当バンクでは継代により力価を上げたウイルス液を使用している。）
２．37℃ water bath で溶かす。
Virus が凝集しているので、十分にボルテックスを行う。
３．5% FCS-DMEM 500μlにウイルス液 10μlを加えたものを準備する。
４．あらかじめ HeLa 細胞を 24 穴プレートで 500μl の 10% FCS-DMEM
液中で培養し、ほぼ 80% confluent になっていることを確認する。
５．培養上清を取り除く。
６．細胞に操作３の液をすべて(約 510μl/well )加える。
７．CO 2 incubator で 3-5 日まで培養する。
この間、１日毎に顕微鏡で細胞を観察する。RCA の混在する組換えアデノウイルスにおいては、細胞の形態に変化が現れる。
８．培養上清を取り除く。このとき細胞ははがれやすくなっているので静かに操作すること。
９．細胞をはがさないように PBS(-) 500μl/wellで細胞を wash する。
１０． 0.02% EDTA-PBS(-) 200μl/well を加える。
37℃で 10 分間ほど置く（細胞が丸くなるのを顕微鏡下で確認する）。
１１． さらに PBS(-) 500μl/wellを加えてピペッテイングして細胞をはがし、1.5 mlマイクロチューブに回収する。
１２． 14,000 rpm, 4℃, 1 min で遠心する。
１３． 上清を取り除く。
１４． 回収した感染細胞(cell pack)から DNA を抽出する。
（「アデノウイルス感染細胞からの全 DNA の抽出」の項目を参照）

アデノウイルス感染細胞からの全 D N A 抽出

1. 1ml の死細胞を、1.5 ml のチューブに 500 µl ずつ分注する。
2. 14,000 rpm, 1 min, 4˚C で遠心する。
3. 上清を取り除く。
4. それぞれのチューブに、以下の混合溶液を加える。

TNE*

500 µl10 mg/ml proteinase K

5 µl

10% SDS

5 µl*TNE:50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 10 mM EDTA (pH 7.5)

5. よく混ぜる。
6. 50˚C、1 時間反応させる（37˚C、一晩でもよい）。
7. フェノール抽出を、1 回行う。
（このとき、十分にボルテックスを行うこと）。
8. クロロフォルム抽出を、1 回行う（このとき、十分にボルテックスを行うこと）。
9. （オプション）1/10 量の 3M NaOAc (pH 5.2) を加える。
10. 等量の 99.5 % EtOH を加える。
11. 15,000 rpm, 10 min, 4˚C で遠心する。
12. 上清を除去し、沈殿を 99.5% EtOH で、リンスする。
13. 乾燥する（乾燥しすぎると DNA が溶けなくなるので、キムワイプでこよりを作成し、余分な EtOH を吸い取る）。
14. 100 µl の TE+10 µg/ml RNase を加える。

染色体 DNA を含むアデノウイルスゲノム DNA の制限酵素切断

1.

アデノウイルスゲノム DNA を切断する酵素の中で認識配列に CG を含む酵素（例えばXhoI, ClaI, SnaBI）で切断し、アガロースゲル電気泳動を行う。

DNA

8 µl

10×buffer

1 µl

Enzyme

1 µl

Total

10 µl

2.

少なくとも 2 時間、37℃で反応する。

3.

10×Loading buffer を 1µl加える。

4.

全量を使用し、アガロースゲル電気泳動を行う。

注釈 1：切断パターンは、塩基配列をもとにあらかじめ調べておく。細胞の染色体 DNA には、CG があまり含まれないので細胞の染色体 DNA は、ほとんど切れない。
注釈 2：uncut DNA も電気泳動を行う。

PCR 法による挿入遺伝子の確認
作業日：
クローン名：担当者：

1.

鋳型 DNA を滅菌水を使用し、50 倍希釈する。

2.

以下の反応液を調製する。
50×Template

1.0 µl

10×Buffer (KOD Plus)

2.0 µl

10 µM forward primer

0.2 µl

10 µM reverse primer

0.2 µl

H2O

13.6 µl

25 mM MgSO4

0.8 µl2 mM dNTP

2.0 µlKOD Plus

0.2 µlTotal

20.0 µl

Primer sets 1:PAXCAF1, PAXCAR1
Primer sets 2:PAXCALNLF1, PAXCAR1
3.

以下の条件で反応を行う。
PCR 反応96℃

5 min1 cycle

96℃

30”

60℃

15”

68℃min/kb
30 cycles

filelink file

4.

10

PCR 産物 10 µlをアガロースゲル電気泳動し、増幅産物と挿入遺伝子の大きさと比較する。

PCR 法による RCA の確認

作業日：
クローン名：担当者：

1.

鋳型 DNA を滅菌水を使用し、50 倍希釈する。

2.

以下の反応液を調製する。
50×Template

1.0 µl

10×Buffer (KOD Plus)

2.0 µl

10 µM forward primer

0.2 µl

10 µM reverse primer

0.2 µl

H2O

13.6 µl

25 mM MgSO40.8 µl

2 mM dNTP

2.0 µlKOD Plus

0.2 µlTotal

20.0 µl

Primer set 1:E1AF1, E1AR2
Primer set 2:E1BF2, E1BR2
3.

以下の条件で反応を行う。
PCR 反応96℃

5 min
1 cycle96℃30”

60℃

15”

68℃

2 min/kb
30 cycles

filelink file

4.

10

PCR 産物 10 µlをアガロースゲル電気泳動し、増幅産物と挿入遺伝子の大きさと比較する。
相当するバンドが存在すれば、RCA 混入の可能性が高い。

表 . アデノウイルス検出用プライマー
Name

Position

Sequence

E1AF1560-595

5'-ATGAGACATATTATCTGCCACGGAGGTGTTATTAC-3'

in this study

E1AF2626-661

5'-CTGATCGAAGAGGTACTGGCTGATAATCTTCCACC-3'

in this study

E1AR21545-1511

5'-TTATGGCCTGGGGCGTTTACAGCTCAAGTCCAAAG-3'in this study

E1BF12002-2035

5'-AGTTTTATAAAGGATAAATGGAGCGAAGAAACCC-3'in this study

E1BF22097-2131

5'-ACACAAGAATCGCCTGCTACTGTTGTCTTCCGTCC-3'in this study

E1BR12495-2462

5'-AGTGGTCAGCTGCTCTATGGAATACTTCTGCGCC-3'in this study

E1BR23156-3122

5'-TGCGAGAGTGGCTGGCTACGTGAATGGTCTTCAGC-3'in this study

E1BR33285-3251

5'-TGCTCTCGGGCTCAAGCAATATCTTAGTGTGACTC-3'in this study

jpz1 (E1A)

880-8995'-GGGTCCGGTTTCTATGCCAA-3'Hum. Gene Ther. 10, 113-121. (1999)

jpz2 (E1A)

1099-1077

5'-GCCACAGGTCCTCATATAGCAAA-3'

Hum. Gene Ther. 10, 113-121. (1999)

jpz3 (E1B)

2392-2413

5'-CCAGACACCGTCCTGAGTGTAT-3'Hum. Gene Ther. 10, 113-121. (1999)

jpz4 (E1B)

2628-2607

5'-CGTTCCCAGAAATGTAGCAACA-3'

Hum. Gene Ther. 10, 113-121. (1999)

jpz5 (pIX)3473-3494

5'-CGCTGAGTTTGGCTCTAGCGAT-3'

Hum. Gene Ther. 10, 113-121. (1999)

jpz6 (pIX)3698-3679

5'-CATCACATTCTGACGCACCC-3'

Hum. Gene Ther. 10, 113-121. (1999)

Ad5fiberF131001-31035

5'-GTTCCTGTCCATCCGCACCCACTATCTTCATGTTG-3'in this study

Ad5fiberR131596-31562

5'-AGTGGCAGTAGTTAGAGGGGGTGAGGCAGTGATAG-3'in this study

PAXCAF11601 - 1619

5'-GGCTTCTGGCGTGTGACCGGC-3'in this study

PAXCAR11865 - 1843

5'-CAGAGGGAAAAAGATCTCAGTGG-3'

in this study

Table. PCR primer sets for detection of Replication competent adenovirus and recombiant adenovirus
Name
Sequence
Detection
Size
E1AF15'-ATGAGACATATTATCTGCCACGGAGGTGTTATTAC-3'E1A985 bp
E1AR25'-TTATGGCCTGGGGCGTTTACAGCTCAAGTCCAAAG-3'
E1BF2E1BR25'-ACACAAGAATCGCCTGCTACTGTTGTCTTCCGTCC-3'5'-TGCGAGAGTGGCTGGCTACGTGAATGGTCTTCAGC-3'

E1B

PAXCAF1PAXCALNLF1PAXCAR15'-GGCTTCTGGCGTGTGACCGGC-3'5'-CACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCC-3'5'-CAGAGGGAAAAAGATCTCAGTGG-3'

Insert DNA

1,059 bp

RCA に関する参考文献

1.

FALLAUX, F.J., BOUT, A., VAN DER VELDE, I., VAN DEN WOLLENBERG, D.J., HEHIR,K.M., KEEGAN, J., AUGER, C., CRAMER, S.J., VAN ORMONDT, H., VAN DER EB, A.J.,
VALERIO, D., and HOEBEN, R.C. (1998). New helper cells and matched early region 1deleted adenovirus vectors prevent generation of replication-competent adenoviruses. HumGene Ther 9, 1909-1917.

2.

FALLAUX, F.J., KRANENBURG, O., CRAMER, S.J., HOUWELING, A., VAN ORMONDT, H.,
HOEBEN, R.C., and VAN DER EB, A.J. (1996). Characterization of 911: a new helper cell line
for the titration and propagation of early region 1-deleted adenoviral vectors. Hum GeneTher 7, 215-222.

3.

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4.

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WHITE, G.A., COUTURE, L.A., EVERTON, M.B., KEEGAN, J., MARTIN, J.M., PRATT, D.A.,
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their occurrence. J Virol 70, 8459-8467.

5.

LOCHMULLER, H., JANI, A., HUARD, J., PRESCOTT, S., SIMONEAU, M., MASSIE, B.,
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6.

ZHU, J., GRACE, M., CASALE, J., CHANG, A.T., MUSCO, M.L., BORDENS, R., GREENBERG,R., SCHAEFER, E., and INDELICATO, S.R. (1999). Characterization of replication-competentadenovirus isolates from large-scale production of a recombinant adenoviral vector. HumGene Ther 10, 113-121.