[食品・臨床栄養 e2011_1-8]

報文
プロテアーゼ処理挽き割り納豆からの ACE 阻害物質の精製・同定と高血圧自然発症ラットにおける納豆の血圧上昇抑制作用

嶋影 逸 1 ＊ ，新保 守 1 ，山田清繁 1 , Ardiansyah 2 ，白川 仁 2
駒井三千夫 2 , 樋渡一之 2,3 ，戸松 誠 3 ，高橋砂織 3(投稿日：2011.8.17、受理日：2011.12.16)
血圧上昇抑制作用は，納豆の機能性の一つとして知られている。納豆はレニン -アンジオテンシン系の鍵酵素アンジオテンシン変換酵素（ ACE）を阻害することで，血圧上昇抑制作用を発揮していると推察されている。納豆の血圧上昇抑制作用に関しては，これまでいくつかの研究報告がなされているが，納豆由来の血圧 上昇抑制物質については知見がほとんどない。
我々は，ACE 阻害活性が通常の挽き割り納豆よりも約 1.4 倍高いプロテアーゼ処理挽き割り
納豆より，ACE 阻害物質を精製・同定した。その結果同定された ACE 阻害物質には，新規な ACE 阻害ペプチド Ile-Ile，Ile-Asp，Ile-Phe-Tyr，Leu-Phe-Tyr 及び Leu-Tyr-Tyr が含まれることが判った。更にプロテアーゼ処理挽き割り納豆より粗抽出物を調製し，脳卒中易発性高血圧自然発症ラットに経口投与（抽出物の投与量はラットの体重 1kg あたり 80mg）すると，有意な収縮期血圧降下を確認することができた。

キーワード：納豆，レニン-アンジオテンシン系，アンジオテンシン変換酵素(ACE)，
ACE 阻害ペプチド

はじめに納豆や味噌など大豆食品の生理機能の一つに，血圧上昇抑制作用がある。これまで，高等動物において普遍的な血圧調節系レニン-アンジオテンシン系の鍵酵
素アンジオテンシン変換酵素(Angiotensin-converting enzyme: ACE)を阻

害する植物由来の血圧上昇抑制物質として，ニコチアナミンが醤油 1)やモロヘイ
ヤ 2) ，アシタバ 3)，ハヤトウリ 4) ，大豆煮汁 5) などから精製・同定されている。
更にニコチアナミンの他にも，ACE 阻
害活性を有するペプチドが存在しており，具体的にはワカメ 6) ，ブロッコリー 7) ，イワシ 8) ，カゼイン 9) ，ニワトリ 10)11) ，ローヤルゼリー 12) などから単離された ACE 阻
害ペプチドがこれまでに報告されている。
これら食品由来の ACE 阻害ペプチドの研究は，牛乳由来のカゼインドデカペプ
チドの発見 13) にその端を発しており，現在までに血圧上昇抑制作用を謳った特定保健用食品（トクホ）の関与成分となっ

1.

1

株式会社ヤマダフーズ(〒013-1901 秋田県仙北郡美郷町野荒町字街道の上 279)2
東北大学大学院農学研究科栄養学分野 (〒981-8555 仙台市青葉区堤通雨宮町 1-1)
3
秋田県総合食品研究センター (〒010-1623 秋田市新屋町字砂奴寄 4-26）＊著者連絡先 E-mail:shimakage@yamadafoods.co.jp

1[食品・臨床栄養 e2011_1-8]ているものも存在する。具体的にはカルピス酸乳より見出されたラクトトリペプ
チド Val-Pro-Pro，Ile-Pro-Pro 14) ，イワシすり身を酵素分解して得られるイワシペプ
チド Val-Tyr 8)15) などを挙げることができる。
納豆の ACE 阻害活性に着目した研究では，Okamoto ら 16)，伊部ら 17) などによる報告がこれまでになされている。しかし ACE 阻害物質の詳細についての報告は殆どない。
本研究では，納豆由来 ACE 阻害物質の精製・同定を目的とした。まず極小粒納豆と挽き割り納豆の ACE 阻害活性を比較した。次に納豆製造時のプロテアーゼ製剤添加効果を検討した。さらに，酵素処理挽き割り納豆より， ACE 阻害活性ペプチドを精製しその構造を決定した。
この他，酵素処理挽き割り納豆抽出物を脳卒中易発性高血圧自然発症ラット（SHRSP）に経口投与し，血圧降下作用を検証した。

りで 14 時間とした。納豆は極小粒と挽き割り共に，発酵終了日（0 日目）から 5℃で一晩保存した後，翌日（1 日目）からは 10℃で保存した。なお酵素処理挽き割
り納豆の作製は，煮豆に自社株を接種する際に食品添加物扱いのプロテアーゼ製剤（天野エンザイム株式会社製）を煮豆に対して 0.5%(w/w) 添加した以外は，通常の挽き割り納豆と同様の手順で行なった。プロテアーゼ製剤には，大豆タンパク質からペプチドを得るためにエンド型活性を持つと共に，蒸煮直後の熱い煮豆に納豆菌液と共に添加するために耐熱性を有し，かつ納豆の風味に影響を与えないために増量剤にデキストリンが使用されている製剤を使用した。

2. 実験方法
2-1 納豆の調製
極小粒及び挽き割りの原料大豆を，それぞれ製造工程よりサンプリングした。
原料大豆としては極小粒納豆と挽き割り納豆共に，カナダ産大豆を使用した。な
お挽き割り納豆用の原料大豆については，
本研究の途中にヤマダフーズ本社工場において大豆品種の切り替えがあり，酵素処理挽き割り納豆の作製時ではそれまで使用した SO3W4 と異なる品種 KG41 を使用した。また極小粒納豆と挽き割り納豆の作製に使用した納豆菌には，いずれもヤマダフーズ自社株 (本研究所にて以前単離された納豆菌)を用いた。極小粒と挽き割りの原料大豆をそれぞれ 15℃で 18時間及び 4 時間浸漬した後，ザルに移して水を切った。得られた浸漬大豆を，オートクレーブ(株式会社平山製作所製)にて極小粒は 123℃，30 分，挽き割りは114℃，8 分の条件でそれぞ れ 蒸煮 し た。
蒸煮後，煮豆に前述の納豆菌の胞子縣濁液を接種して，40℃のプログラム低温恒温器(ヤマト科学株式会社製)で発酵させた。発酵時間は極小粒で 15 時間，挽き割22-2 納豆の熱水抽出液の調製
納豆に 10 倍量（w/v）の蒸留水を加えて，オートクレーブにて 121℃，15 分の条件で熱水抽出を行なった。熱水抽出液を水冷した後，市販のジューサーミキサーで均質化して懸濁液にした。これを4000×g，10 分間の遠心分離を行い，得られた上清を ACE 阻害活性測定の試料とした。
2-3 試料のタンパク質量の測定 18)
2-2 で得た試料を蒸留水で適宜希釈し，280nm における吸光度(A280)を測定して求めた。
2-4 試料の ACE 阻害活性の測定
試料の ACE 阻害活性測定は，Friedlandらの方法 19)に従って行なった。2-2 で得た試料を蒸留水で適宜希釈した溶液を，1.5ml マイクロチューブに 5μl ずつ分取した。これらに 10mU/ml のウサギ肺由来
ACE (Sigma 製)10μl を加えた後，2.29mMの基質 Bz-Gly-His-Leu (株式会社ペプチド研究所製)溶液 35μl を加え，37℃で 30分間反応させた。反応後に 50μl の 0.1NNaOH を加えて反応を停止させた。1.0%(w/v)オルトフタルアルデヒド(OPA)溶液
10μl を加えて室温で 10 分間反応を行い，基質分解物を蛍光誘導体化させた。反応後に 140μl の 0.1N HCl を加え，励起波長355nm，蛍光波長 460nm で各検体の蛍光強度を測定した。標準物質として His-Leu[食品・臨床栄養 e2011_1-8]を用いた。測定結果より各試料の希釈液毎に ACE の相対活性を算出し，ACE を50%阻害するタンパク質濃度(IC 50 )を求めた。各納豆の ACE 阻害活性については，算出した IC 50 を基に「IC 50 と同量のタンパク質量」を 1 阻害 U と定義して求めた。

ACE 阻害活性を示すピークをポリブレン処理したガラスフィルターにスポットし，Protein Sequencer (株式会社島津製作所製，PPSQ-10)にてアミノ酸配列を決定した。同定した配列と一致する大豆タン
パク質の検索には BLAST i)を使用した。

2-5 酵素処理納豆からの ACE 阻害ペプチ
ドの精製
酵素処理納豆 100 g に蒸留水 800 ml を加え 121 ℃，15 分間オートクレーブして冷却後，市販のジューサーミキサーで破砕した。破砕液を 10000×g，30 分間遠心分離し，上清(800 ml)を回収した。上清(200 ml)を SepPak C18 35cc カラムに添加し，蒸留水で十分洗浄後，吸着物質を 100ml のメタノールで溶出した。この操作を4 回繰り返した。メタノール溶出液(400ml)を減圧乾燥後，25 ml の 10% エタノー
ルに溶解し，同じく 10% エタノールで平衡化した Biogel P-4 カラム(φ5×65 cm)に添加した。流速は 60 ml/時とし，15 mlずつ分画した。各分画の 280 nm の吸光度及び ACE 阻害活性を測定した。ACE 阻害活性は 6 画分（A-F）に溶出された。得られた 6 画分を凍結乾燥後，それぞれさらに蒸留水で平衡化したオクタデシルシリカカラム(10×300mm，Waters，Sep-Pak C 18Innate Open column)に添加した。流速は2.0ml/min とし，0-100%メタノールのリニアグラジエント(60 分）によりペプチド類を溶出した。溶出液の 280 nm 及び 215 nmの吸光度と ACE 阻害活性を測定した。次
いで，阻害活性と吸光度のピークが一致する画分が得られたＤ及びＦから分画した 2 画分について，それぞれ RESOURCE
RPC 1ml カラム(GE ヘルスケア製，φ0.64×3cm)を用いた逆相クロマトグラフィーシステム(GE ヘルスケア製，ÄKTAexplorer 100)で分画した。溶出は水−50％アセトニトリルのリニアグラジエント(20 分間)，流速は 1 ml/min，測定波長は 280nm および 210nm で行った。0.5 mlずつ分取し ACE 阻害活性を測定した。この分画において，阻害活性と吸光度のピークが一致する 11 画分が得られた。

2-7 動物実験
動物投与に投与する粗抽出物は，上記と同様の方法で調製した。すなわち，酵
素処理納豆に蒸留水を加えて加熱・破砕した溶液の遠心上清を SepPak C18 35cc
カラムに添加，吸着された物質をメタノールで溶出した。この溶出物を減圧乾固したものを粗抽出物とし，40mg /ml となるように蒸留水に溶解したものを試料溶液とした。
実験動物として脳卒中易発性高血圧自然発症ラット SHRSP/Izumo (12 週齢，雄，日本エスエルシー株式会社)を用いた。ラットは温度 23±2℃，湿度 50±10％，1 日
12 時間人工照明に調節した動物飼育室内に設置したステンレス製金網ケージで個別飼育し，AIN-93M 組成の飼料と飲水を自由摂取させた。12 匹のラットを馴化のため 1 週間予備飼育した後，試料群(6 匹)，対照群(6 匹）に分けた。試料群には試料溶液，対照群には蒸留水をラット用金属製胃ゾンデで強制経口投与した。投与量は、納豆粗抽出物および市販の血圧降下作用を有する飲料の ACE 阻害活性を比較する予備検討を行い，その結果から invivo における十分な血圧降下作用を推定できる量であるラット体重 1kg 当たり2ml (粗抽出物としてラット体重 1kg 当たり 80mg)とした。試料溶液は投与までの間-20℃で保存し，投与前に室温で解凍，室温に戻った溶液を十分撹拌した後に投与した。血圧測定は，経口投与直前および投与 1, 2, 4, 6 時間後にマウス・ラット用無加温型非観血式血圧計 MK-2000(室町機械株式会社製)を用いたテイルカフ法で行った。本動物実験は，「東北大学大学院農学研究科実験動物委員会」の承認(承認番号 07-07B)のもと実施した。
2-8 統計処理
全ての測定値は平均値±標準誤差で示2-6 ACE 阻害ペプチドのシーケンス分析
3[食品・臨床栄養 e2011_1-8]

した。図１における a) ，b)それぞれのグ
ラフ内での比較は，分散分析(one-wayANOVA)および Tukey ポストテストを用いた。図 2 における比較では，分散分析(two-way ANOVA)および Bonferroni ポス
トテストを用いた。図 3 における比較では，分散分析(two-way repeated measures
ANOVA)および Bonferroni ポストテストを用いた。すべての解析で有意水準は両側検定で 5%以下とした。統計処理には ，GraphPad Prism5.0-J (Graphpad Software 社製)を用いた。となり，挽き割り納豆の方が上昇度合いの大きいことが判った。また粒納豆と挽き割り納豆の ACE 阻害活性を比較すると，保存期間全体を通じて挽き割り納豆の方が大きく，その差は最大で約 2.5 倍となった。
挽き割り納豆の ACE 阻害活性が粒納豆よりも大きくなる理由として，丸粒大豆と違い脱皮しており，かつ挽き割られ表面積が大きい原料大豆を製造に使用していることが考えられる。丸粒大豆が脱皮され挽き割られることで豆の内部がむき出しになり，納豆菌の作用をより受け易くなる分 ACE 阻害物質の生成量が多くなると推察された。

3. 実験結果および考察
3-1 各種納豆の ACE 阻害活性の経時変動
極小粒納豆と挽き割り納豆の ACE 阻
害活性の経時変動を図 1 に示した。図 1より粒納豆と挽き割り納豆共に，保存日数の経過と共に ACE 阻害活性が有意に上昇した後，6 日目以降ほぼ一定になることが判った。ただし 6 日目におけるACE 阻害活性は，初発日(極小粒納豆は 1日目，挽き割り納豆は 0 日目)を基準にした場合，粒納豆では約 1.7 倍上昇(図 1a)，挽き割り納豆では約 3.0 倍の上昇(図 1b)3-2 酵素処理挽き割り納豆の ACE 阻害活性
酵素処理挽き割り納豆と通常の挽き割り納豆の ACE 阻害活性の経時変動を図 2に示した。図 2 より酵素処理挽き割り納
豆の ACE 阻害活性は，保存期間を通じて挽き割り納豆よりも有意に高く，11 日目においても 41%大きくなることが判った。
その一方で 11 日目における ACE 阻害活

200200

ACE 阻害活性 (阻害 U/g)

a150b))

ccd6911bcb100

cb0cd150

10050daa50

1368010a024

保 存 日 数

保 存 日 数
01(days)(days)
図 1 各種納豆のACE 阻害活性の経時変動a)，極小粒納豆 ； b)，挽き割り納豆．データは平均値±標準誤差で示した (n=3)．異なる
文字は統計的に有意な差があることを示す(p<0.05)．
4[食品・臨床栄養 e2011_1-8]

性は 1 日目を基準とした場合，酵素処理挽き割り納豆と通常の挽き割り納豆でそれぞれ約 1.1 倍，約 2.4 倍と有意に上昇し，後者の方が上昇度合いの大きいことが判った。これは，通常の挽き割り納豆では発酵終了後の冷蔵保存中に納豆菌の働きで ACE 阻害物質が生成していくのに対し，酵素処理挽き割り納豆では発酵前に添加したプロテアーゼ製剤により，発酵中に ACE 阻害物質が生成することによるものであると推察した。また酵素処理挽き割り納豆の作製にはプロテアーゼ製剤を使用していること，酵素処理挽き割り納豆の ACE 阻害活性が保存期間を通じて挽き割り納豆よりも高い事実より，前者に含まれる ACE 阻害物質は後者とは異なる可能性が推察された。
3-3 酵素処理納豆からの ACE 阻害物質の精製・同定
表 1 に酵素処理挽き割り納豆から同定された ACE 阻害ペプチド 11 種類の詳細を示した。これら 11 ペプチドの配列と一致する配列は，いずれも大豆タンパク質データベースに登録されていた。従って，これらの ACE 阻害ペプチドは全て，大豆タンパク質の分解によって生成したものであると考えられた。また，これらのペプチド 11 種類のうち 5 種類は，これまで報告のない新規 ACE 阻害ペプチドであった。

ACE 阻害活性（阻害 U/g）

400edd300cb200a100016
保 存 日 数3-4 動物実験による血圧降下作用の確認
強制経口投与後のラットの外見的状態，行動に異常は認められなかった。試験期
間中の血圧の変化を図 3 に示した。対照群は投与後もほとんど血圧は変化しなかった。これに対し，試料群は投与1 時間後から対照群に対して有意な低値(18.4％低下)を示し，最終測定である
6 時間後まで継続して血圧が有意に低11

図 2 各種挽き割り納豆の ACE 阻害活性の経時変動の比較□ ，挽き割り納豆 ；，酵素処理挽き割り納
豆．データは平均値±標準誤差で示した (n=3)．
異なる文字は統計的に有意な差があることを示す(p<0.05)．

表1 ACE阻害ペプチドのアミノ酸配列
配列

由来する大豆タンパク質*

β―アミラーゼ

Ile-IleIle-Asp*

サイクリン

Ile-Phe-Tyr*

他

他

ユビキチン特異的プロテアーゼ 12 他

Leu-Phe-Tyr*
Leu-Tyr-Tyr*RNA-結合タンパク質他

リポオキシゲナーゼ他20)21)

フラボノイド 3', 5'-ヒドロキシラーゼ22)

NADH デヒドロゲナーゼスブユニット 7 他

Ile-PheLeu-Ile23)

Leu-Pheペルオキシダーゼ

Leu-Ile-Tyr21)

逆転写酵素

Ile-Ile-Tyr24)

フィトールキナーゼ

Trp-Gly-Pro25)

他

他

他
他

プロテインジスルフィドファミリー*：ACE 阻害ペプチドとして新規配列

5他

収縮期血圧（mmHg）[食品・臨床栄養 e2011_1-8]220対照群

200

試料群

180###
160
140****
*

120
0*

1****
***
*

**
*

*

*

*

2

3456*
投与後の経過時間（h）

図 3 納豆抽出物の経口投与による SHRSPの収縮期血圧の変化
データは平均値±標準誤差で示した（n=6）．
*は対照群に対して、各経過時間の時点で統計的に有意な差があることを示す（**:p<0.01，*** : p<0.001，**** : p<0.0001）．#は対照群と試料群それぞれの血圧の変化に統計的に有意な差があることを示す（### :p<0.001）．

くなっていた。さらに分散分析の結果、対照群と試料群それぞれの血圧の変化に統計的に有意な差があることが認められた。以上のことから，in vitro で ACE 阻害
活性を有する挽き割り納豆の熱水抽出液は，in vivo においても血圧降下作用を示すことが明らかとなり，その作用は前述の ACE 阻害ペプチドによることが示唆された。
なお本研究の一部は，文部科学省「都市エリア事業」補助金により行われました。
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[食品・臨床栄養 e2011_1-8]

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Purification and Identification of ACE Inhibitory Substance from Protease-treated Hikiwari-natto and Anti-hypertensive Effect of Natto on Spontaneously
Hypertensive Rats
Atsushi Shimakage1*, Mamoru Shinpo1, Seihan Yamada1, Ardiansyah2, Hitoshi Shirakawa2,Michio Komai2, Kazuyuki Hiwatashi2,3, Makoto Tomatsu3 and Saori Takahashi3
1

Yamadafoods.Co.Ltd. , 279 Aza-kaidounoue Noaramachi, Misato-cho, Senboku-gun, Akita
019-1301
2
Laboratory of Nutrition, Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University, 1-1
Tsutsumidori- Amamiyamachi, Aoba-ku, Sendai, Miyagi 981-8555
3
Akita Research Institute of Food and Brewing (ARIF), 4-26 Sanuki, Araya-machi, Akita
City, Akita 010-1623
Received Aug 17, 2011; Accepted Dec 16,2011
Anti-hypertensive effect has been known as one of the functionalities of natto. It is deduced
that natto shows anti-hypertensive effect by inhibiting angiotensin-converting enzyme (ACE),
the key enzyme of renin-angiotensin system. Some research results about anti-hypertensive
effect of natto have been reported so far, but there are almost no findings about ACE
inhibitory substance derived from natto. We purified and identified the substances fromprotease-treated hikiwari-natto, whoese ACE inhibitory activity was about 1.4 times higher
than that of protease-untreated hikiwari-natto. As a result, it was found that ACE inhibitory
substances included novel ACE inhibitory peptides such as Ile-Ile, Ile-Asp, Ile-Phe-Tyr,Leu-Phe-Tyr and Leu-Tyr-Tyr. In addition, the extracts of protease-treated hikiwari-natto
showed significant reduction in systolic blood pressure when they were orally administered tostroke prone spontaneously hypertensive rats in a single dose (80mg/kg of rat weight).
Key words：natto, renin-angiotensin system, angiotensin-converting enzyme (ACE), ACE
inhibitory peptide(責任編集委員：赤桐里美)

8