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哺乳類細胞の継代培養のための準備
注記：Clonetics™とPoietics™のヒト初代細胞と動物細胞には適しません。

細胞培養では、しばしば細胞を継代培養する必要が生じます。継代することによって、細胞数を増やす、または用途に応じた培養容器に細胞を移すことができます。細胞を1つの培養容器から取り除き、別の容器に移すには数多くの方法があります。細胞は以下の方法によって、付着している表面から剥離させることができます。
–

機械的な手段（スクレーピング）–

キレート剤、エチレンジアミン四酢酸［EDTA］–

酵素（トリプシン、プロナーゼ、コラゲナーゼ）

トリプシン処理の手順
細胞培養は、コンフルエントまたはそれに近い状態になると、通常継代培養されます。原則として、最初にコンフルエントになってから継代培養されるまでの時間が長くなればなるほど、トリプシンが作用するまでの時間が長くなります。

1.

培養容器から培地を別の容器へ移します。血清はトリプシン活性を阻害するため、血清を含む培地は完全に除去する必要があります。

2.

トリプシン/Versene®（カタログNo.17-161）を添加する前に、細胞の層をカルシウムやマグネシウムを含まない BSS ですすぎます。単層を BSS で完全に覆ってください。このすすぎはすぐに終わりますが、最長 4はブタ膵臓の含水粗細胞抽出物です。トリプシンは、細胞時間まで細胞層上に BSS を残しておいてもかまいまを表面や無傷組織から取り除くために使用される最も一般せん。

的な方法です。トリプシン組成にはトリプシンに加えて他のプロテアーゼ、リパーゼ、カルボヒドラーゼが含まれる

3.

Versene®は、各容器に以下のように添加します。

ため、トリプシンという名称は少し誤っています。膵臓が75 cm2フラスコ
150 cm2フラスコ
850 cm2ローラー瓶

産生する数多くの消化酵素が、トリプシン組成にも含まれると考えられます。純粋な結晶トリプシンを使用することも可能ですが、これは粗トリプシンよりも高価で、特に細胞を無傷組織から調製した場合は、粗トリプシンほど働かすすぎに使用した培地を洗い流します。トリプシン /4.

2.5 ml〜5.0 ml
5.0 ml〜10.0 ml
10.0 ml〜20.0 ml

培地, 試薬, 血清酵素およびキレート剤はしばしば併用されます。トリプシン単層はトリプシン /Versene® で完全に覆ってください。トリプシン /Versene® のロットが異なると、強度ない場合が多くあります。
トリプシン活性の最適条件は pH 7.6〜7.8、温度37℃です。

が異なる場合があるため、最初の30秒間、室温でトリトリプシンの効果は、細胞同士または基質表面に結合するプシン処理をモニターすることが推奨されます。これ細胞内基質を分解することです。

によって、トリプシン処理が過剰な速度で進んでいなトリプシン活性に対する化学的基準はありません。ロンザか確認することができます。

はトリプシンの品質保証試験を実施しており、標準時間内に、損傷を引き起こすことなく、どれだけ基質表面から細5.

胞を剥離するかを測定しています。これは滅菌用通常試験に 並 行 し て 実 施 さ れ ま す 。 通 常 ト リ プ シ ン は 、 0.05% 〜0.25%濃度で使用されます。ただし用途によっては、この範囲 以 外 の 濃 度 が 必 要 に な る こ と も あ り ま す 。 Versene®
（EDTA）は、トリプシン活性を高めるため効率的な細胞剥離に必要なトリプシン濃度を下げることができます。
濃縮トリプシン（2.5%、カタログNo.17-160）は、カルシウ

その後、細胞容器を手のひらで軽く叩いて細胞が剥離するか確認します。容器を垂直に明かりの下にかかげて、容器面から剥がれ落ちている細胞層を探します。
単層全体が剥離したら、手順#6に進みます。そうでない場合は37℃でインキュベートし、1分毎に容器を観察して剥離状態を確認します。培養容器を再度手のひらで叩いて、すべての細胞が剥離したことを確認します。培養容器をインキュベーターから取り出します。

ムやマグネシウムを含まない平衡塩溶液（ BSS ）（ハンクBSS、カタログNo.10-543、またはダルベッコリン酸緩衝生
理食塩水、カタログNo.17-512）で希釈してください。溶液が低張となって細胞に損傷を与えるため、水による希釈は推奨されません。生理食塩水単独による希釈も細胞に損傷を与えます。

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続き

6.

10%血清を添加した培地を入れた容器に剥離したすべ

12. 連続的に継代しつづけると最終的にその株は失われまての細胞を直ぐに移します。培地と細胞をピペットですが、可用性が失われるわけではありません。なぜな

吸引して容器に移し、残りの細胞をすべて取り除きまら凍結アンプルはほぼすべての代で取得でき、のべです。ばらばらに分離した細胞を得るために、小さなボ最大約50分裂回数まで連続継代を再開するために細胞アピペットを使用して可能な限り完全にこの吸引を行株を復元できるからです。この手順を繰り返すことにうことが重要です。細胞が分離していない場合、新しよって、取得可能な細胞数はあらゆる実際的目的のたい培養液に数多くの微小コロニーができる場合がありめにほぼ無限大となります。

ます。容器に移した細胞は、スターラーバーを使って渦が発生しない速度（約 100 〜 200 rpm）で攪拌する

13. ヒト胚2倍体細胞株は、in vitro でおよそ 50 回の 1:2 継代培養または細胞分裂寿命持ちます。寿命がくると、か、手動で攪拌します。この時点で、使用されるトリプシン/Versene® 量の少なくとも10倍の血清を含む培地を追加することが大切です。これによって、消化酵細胞は分割を停止し、最終的には死に至ります。

14. 1:2 よりも高い分割比を使用すると、特定の細胞密度または培養容器数を得るのに必要な操作を最小化でき素が阻害されます。

7.て、その総量が 2 つの培養容器底面を覆うようにします。各容器の底面積は、最初の培養容器と同じになるようにします（または最初の容器の 2 倍の底面積を持つ単一の培養容器を使用します）。分割比は 1:2 になります。増殖の盛んな細胞集団に対しては、別の分割比を適用してもよいでしょう。

8.

を行います。分裂停止の条件を知るために、終了した1つ（または複数）の培養容器を37℃でインキュベートします。

9.

細胞分裂回数を記録すること重要です。

培地, 試薬, 血清るという利点があります。ヒト胚 2 倍体細胞株は、 invitroで細胞分裂を有限回数行うため、終了した分裂回数を記録する必要があります。 1:2 の分割比では、単純に 1 を各分割に足します。なぜならこの比率によって、 1 集団が倍加されるからです。より大きな分割比も使用できます。例えば、1:4の分割比は1:4分割毎に2倍化を行います。1:8分割比は1:8分割毎に3倍化

ピペットで吸引した懸濁液に新鮮な培地を十分追加し15. ヒト2倍体細胞は分裂によって増殖するため、母集団

1:2 分割を行う際、ヒト 2 倍体細胞の継代培養は 3 〜4日のスケジュールを厳守してください。この間にコン数の増加は、以下のように細胞毎に発現する可能性がフルエントな細胞層ができます。余分な細胞は凍結

10あります。

し、液体窒素で保存できます。

214283164… 細胞数… 母集団培化レベル

10. 無制限に培養の可能な母集団は、コンフルエントな状態になる度に連続的に継代培養できます。培養細胞

参考文献

が、有限倍化能力をもつ2倍体集団である場合、各1:2

1. Hayflick, L. and Moorhead, P.S. (1961) The serial cultivation ofhuman diploid cell strains. Exp. Cell Research 25:585.

継代培養（分割）において、集団倍化レベル（PDL）数を1つずつ増やします。

11. 繰り返し1:2分割（週に2回）を行うことにより、培養容器の数が幾何学的（ 1 、 2 、 4 、 8 、 16 、 32 、 64 など）に増大します。これは短期間で達成でき、さまざまな用途で大量の培養を行うことができます。

2. Hayflick, L. (1970) Aging under glass. Exp. Geront. 5:291.
3. Hayflick, L. (1965) The limited in vitro lifetime of human diploidcell strains. Exp. Cell Res. 37:614.
4. Hayflick, L. (1968) Human cells and aging. Scientific American
218:32.
5.	Hayflick, L. (1973) Subculturing human diploid fibroblast cultures.
Methods and Applications of Tissue Culture Eds. Patterson, M.K.
and Kruse, P.F., Academic Press, N.Y.
6.	 Freshney, R.I. (1983) Culture of Animal Cells: A Manual of BasicTechnique. Alan R. Liss, Inc., New York.

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