平成17年フォーラム富山「創薬」第15回研
究会

平成17年

施設紹介

2005/02/03

フォーラム富山「創薬」第15回研究会

細菌部の業務概要−健康とくらしの安全を科学する−

1.

−細菌部の取組み、ゲノムから細菌を見る
2.
3.

4.

5.
富山県衛生研究所・細菌部
1
副主幹研究員 綿引 正則

伝染病・食中毒の発生にともなう行政的検査① 原因病原体の究明② 感染源・感染経路の追及③ 保菌者検索による流行拡大防止
食品・医薬品・飲料水等の依頼検査
伝染病・食中毒予防のための調査研究① 微生物生態学的調査研究② 病原性の本体の究明
研修・指導① 厚生センター・医療機関検査担当者② 製薬会社・食品製造業の製造管理担当者
情報の収集・還元① 病原細菌情報の収集と還元② 国内・国外の学会情報・文献の収集と紹介
2

1998年大腸菌O157感染症広域散発事件の概要

細菌検査

日付

重要なスキル１．ターゲット細菌を効率的に分離すること
２．迅速、正確に細菌を鑑別すること

細菌ゲノム解析の進展

生化学性状・ファージ型別・血清型別
抗生物質感受性試験
問題点
１．菌の長時間培養
２．病原性とは直接関係のない代謝産物が対象
３．発現状況の変化・突然変異

Genotyping（遺伝子型別）
プラスミドプロフィール解析法・PCR法・PFGE法

膨大な細菌ゲノム配列情報を細菌検査や公衆衛生に活かしたい！

細菌部に保管されている臨床、環境株を用いた細菌の比較ゲノ
ム学的手法を用いた調査研究

O157発生（B寿司店疑い）

6月11日

小学生O157発生（C寿司店疑い）

6月14日①小学校検便（600名）⇒2名陽性②イクラを疑う③DNAパターン一致

6月16日

北海道に調査依頼

6月17日①事件を公表②３寿司店営業停止処
分①患者5人イクラ寿司を喫食と発表②北海道に調査依頼

6月18日①北海道・製造業者名公表

寿司店等12,940施設に立入り、調査・回収
指導（23日）イクラからO157検
出、患者由来株とDNAパターン一致

3

製造業者立入り調査など

千葉県（29日)イクラからO157検出①イクラ出荷状況調
査②イクラ醤油漬製品自主回収指示①千葉県：寿司店営業停止処分②北海道に調査依頼(20日)イクラからO157検出(23日)DNAパターン一致

単一暴露による集団感染

患者数

患者分離株
東京県

患者数

イクラ分離株富山県

北海道（30日以降）山梨、横浜市、茨城県
DNAパターン一致①営業自粛指示②全国各自治体に調査依頼(20日)イクラ醤油漬
回収命令(22日)営業停止命
4
令以後、調査継続

diffuse outbreakとは？

イクラ醤油漬事件分離株のPFGEパターン
患者分離株

その他の府県
千葉、山梨

富山県の発表を受け、イクラ調査開始

O157発生（A寿司店疑い）

20日以降

問題点
１．染色体DNAへの外来遺伝子の取り込み
２．検査コスト神奈川
O157発生6月3日

塩基配列決定DNA同定法 （遺伝子型を指標とした検査）
１．DNAプローブ法とPCR法
２．病原因子等の特異的な遺伝子を検出する
３．細菌の一般的な同定分類への利用

東京都
O157発生（寿司屋調査）5月26日

新しい検査法の予感

Phenotyping（表現型別）

富山県

5月

diffuse outbreak

暴露暴露5富山県衛生研究所

時間時間61

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2005/02/03

細菌ゲノム解析状況
解析終了

ゲノム配列情報の利用

進行中

215 （Jan 14, 2005）

271 （Jan 14, 2005）

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/MICROBES/Complete.html

1. 迅速・正確に同定するためのターゲット遺伝子の探索

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/MICROBES/InProgress.html

細菌部で関連が深い菌株（終了）

細菌部で関連が深い菌株（進行中）z

Bacillus anthracis str. 'Ames Ancestor'
Bacillus anthracis str. A2012

Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi str. CT18 Aeromonas hydrophila
Salmonella typhimurium LT2
Aeromonas salmonicida

Bacillus anthracis str. Ames

Shigella flexneri 2a str. 2457TBacillus anthracis str. SterneBacillus cereus ATCC 10987

Shigella flexneri 2a str. 301
Staphylococcus aureus subsp. aureus COL

Bacillus anthracis str. Australia 94
Bacillus anthracis str. CNEVA-9066

Salmonella enterica subsp. arizonae serovar 62:z4,z23:-Salmonella enterica subsp. diarizonae

Bacillus anthracis str. Kruger B

Salmonella enterica subsp. enterica serovar Choleraesuis

Campylobacter jejuni
NCTCBacillus anthracis
str. A1055 11168
Clostridium perfringens str. 13

Bacillus cereus ATCC 14579

Staphylococcus aureus subsp. aureus MRSA252

Bacillus cereus ZK
Campylobacter jejuni RM1221

Staphylococcus aureus subsp. aureus MSSA476
Staphylococcus aureus subsp. aureus MW2

Campylobacter jejuni subsp. jejuni NCTC 11168

Staphylococcus aureus subsp. aureus Mu50

Clostridium perfringens str. 13

Staphylococcus aureus subsp. aureus N315

Bacillus anthracis str. Vollum
Escherichia coli
O157:H7Bacillus anthracis str. Western North America USA6153
Bacillus cereus G9241

Escherichia coli O157:H7
EDL933Campylobacter coli RM2228

Clostridium tetani E88
Escherichia coli O157:H7

Mycobacterium tuberculosis 210
Pseudomonas aeruginosa UCBPP-PA14
Salmonella bongori 12149

Salmonella enterica subsp. enterica serovar Dublin
Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis str.

Streptococcus pyogenes M1 GASStreptococcus pyogenes MGAS10394

Campylobacter fetus

Salmonella typhimurium DT104
Salmonella typhimurium SL1344

Streptococcus pyogenes MGAS315

Campylobacter upsaliensis RM3195

Salmonella typhimurium TR7095

Legionella pneumophila str. Lens
Legionella pneumophila str. Paris

Streptococcus pyogenes MGAS8232
Streptococcus pyogenes SSI-1

Clostridium
botulinumA
Shigella flexneri
2astr.
301
Clostridium difficile 630

Legionella pneumophila subsp. pneumophila str. Philadelphia 1 Vibrio cholerae O1 biovar eltor str. N16961

Clostridium perfringens M
ATCC 13124
Streptococcus pyogenes
GAS

Listeria monocytogenes EGD-e
Listeria monocytogenes str. 4b F2365

3. 16S rDNA配列データベースを利用した細菌の分類同定

Shigella sonnei 53G

Clostridium perfringens SM101

Mycobacterium tuberculosis CDC1551

Listeria monocytogenes str. 1/2a F6854
Vibrio choleraeListeria
O1N16961
Vibrio vulnificus YJ016
monocytogenes str. 4b H7858

Mycobacterium tuberculosis H37Rv
Pseudomonas aeruginosa PAO1

Yersinia pestis CO92
Yersinia pestis KIM

Staphylococcus aureus RF122
Staphylococcus aureus subsp. aureus NCTC 8325

Mycobacterium bovis BCG

Streptococcus pyogenes M49 591

Mycobacterium microti

Yersinia enterocolitica (type 0:8)

Staphylococcus epidermidis RP62Az

Vibrio parahaemolyticus
2210633 Streptococcus pyogenes Manfredo
MycobacteriumRIMDmarinum M

Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Ty2

Yersinia pseudotuberculosis IP 32953

塩基配列多型に基づいた遺伝子型別：Multilocus
Sequence Typing (MLST)
ゲノム上の病原性起因領域の比較による病原性に関する研究zSerratia marcescens subsp. marcescens Db11
Shigella dysenteriae M131649

Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633
Vibrio vulnificus CMCP6

Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratypi A str. Yersinia pestis biovar Medievalis str. 91001

z

Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi B str.
Salmonella enterica subsp. enterica serovar PullorumEscherichia coli O157:H7 EDL933

Shigella flexneriCampylobacter2a str.
lari RM21002457T

毒素遺伝子、病原因子遺伝子、その他

2. 比較ゲノム学的手法を用いた分離株、保存株の配列解析と比較

環境分離株（深層水、名水）の分類同定

7Mycobacterium smegmatis str. MC2 155

8

赤痢菌の迅速な確定検査法の開発

調査研究課題の紹介

赤痢菌；Enterobacteriaceae科Shigella属

1. 赤痢菌の迅速確定法の開発
2. カンピロバクターのMultilocus sequencetyping (MLST)による型別

１９９９年 新感染症法により2類感染症として位置付けられる

3. 腸炎ビブリオ分離株の比較ゲノム学的解析

１８９８年 赤痢の原因菌として分離

輸入感染症・国内散発/集団発生事例
赤痢菌誤同定・耐性菌の問題
分類学的には大腸菌（Escherichia coli）の生物型のひとつであるが2類感染症として鑑別が必要

9赤痢菌の迅速な確定検査法の開発

10

赤痢菌の迅速な確定検査法の開発

新規プライマー作成

新規ﾌﾟﾗｲﾏｰgeneX・geneYおよびompＴを用いたPCR

ﾌﾚｷｼﾈﾘ赤痢ｹﾞﾉﾑ
4706 ORFs

１：Shigellasonnei

2：EIEC

3：E.coliM蛋白コード遺伝子3235
機能同定or機能推定
2680

他の細菌にも存在
507
大腸菌
480
Salmonella Mesorhizobium
213

Yersinia
2

gene-X

赤痢菌を鑑別する配列として利用可能？
gene-Y

Pseudomonal Klebsiella Caulobacter Campylobacter Clostridium
1111
1

Listeria1210

a b c a b c a b c
使用ﾌﾟﾗｲﾏｰ a：geneX b：geneY c：ompT

Xylella111

富山県衛生研究所

1057
612392

他に相同遺伝子なし
48

その他の細菌27Vibrio
2

赤痢菌の機能に特異的？

機能未知555

Mbp

IS因子, ファージ, 偽遺伝子
1471

122

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2005/02/03

カンピロバクターMLST

gltA aspA
uncA

tkt

NCTC 11168

１．ゲノムDNA抽出[4]

２．PCRと増幅物の精製

glnA

３．サイクルシークエンス法による塩基配列決定４．解析

13#87 #136

カンピロバクター 分離株のMLST解析
由来

Cj#9Cj#69

glnA

gltA

glyApgm

患者A（平成3年)

21110140

市販鶏肉A

21773

25Cj#70

市販鶏肉A

217125Cj#87

患者B（平成16年)

925

21022Cj#115

市販鶏肉B（平成16年)

217210148

Cj#122

市販鶏肉C（平成16年)

930

22151

Cj#136

市販鶏肉D（平成16年)92521022uncA

tkt65

365

165

16365

185963

MLST解析により、食中毒分離株と同一の遺伝子型を示す株が市販の鶏肉に存在することを検出した。
15腸炎ビブリオ分離株のPCRゲノムスキャニング解析
染色体１aspatase (aspA)

940

83

glutamine synthetase(glnA)

1,304

112

citrate synthase (gltA)

1,111

83

serine hydroxy methyltransferase (glyA)

1,051120

phospho glucomutase(pgm)

1,132

155

ATP synthase α subunit(uncA)

1,194

70

transketorase (tkt)1,258Structure of Gene and PCR and Sequencing

123
14*http://pubmlst.org/campylobacter/

腸炎ビブリオ分離株の比較ゲノム学的解析①腸炎ビブリオのゲノム構造 （Makino,K., et al. Lancet 361:743-749, 2003）

遺伝子型
aspA

SmaI treatment / PFGE

分離株番号

No.of
allele*Target genes

1. ハウスキーピイング遺伝子（７遺伝子）の配列多型解析による型別によるサーベイランスが可能

MLSTの作業工程

1,641,481 bp

Ampliconsize (bps)

MLSTの利点

2. 地域的あるいは全世界的なレベル
で、特定細菌の定量的なクローン解析が可能

glyA
pgm

Campylobacter jejuni

カンピロバクター MLSTのターゲット遺伝子

染色体２つ、食中毒にはｔｄｈあるいはｔｒｈ毒素遺伝子が関与。他の病原性因子については、不明の点が多い。
②VPマリン事業：漁港海水中の腸炎ビブリオ数の定量

腸炎ビブリオ分離保存株
184
ヒト（食中毒）由来
262
魚4
その他
69
合計
519
海水由来

これらの株の病原性因子の比較解析研究は、本菌の病原性に関する研究や、環境中のサーベイ
ランスに有効である。

1970〜2004年

16

細菌部の今後の方向性
ゲノムから細菌を見る、ゲノムから環境を見る、細菌からゲノムを見る、環境からゲノムを見る、そして、最後に細菌からヒトを見る。

（328万塩基対、3080遺伝子）• 調査研究の重要性– 迅速、正確な細菌検査• 新しい検査方法の導入・開発– 細菌ゲノム配列の利用
染色体２（187万塩基対、1752遺伝子）• 細菌の地域における系統解析、データベース化
による情報の利便性向上• 情報のグローバリゼーション– 食品、環境中のモニタリングから流行予測へ• 地震予知とは異なる流行予知は可能か？
• 危機管理に応用
17

富山県衛生研究所

183