2018年 日本核酸医薬品学会第4回年会

mRNA製品の品質・安全性評価について
Quality and safety issues on mRNA medicinalproducts

金沢工業大学／日本薬科大学
山口照英
国立医薬品食品衛生研究所
内田恵理子

mRNA医薬品• mRNA医薬品（iｎ vivo投与）– タンパク質一過性発現／ワクチン／がんワクチン
mRNA単独投与 vs. DDS• Ex vivo mRNA導入細胞

再生医療製品– がんワクチン(樹状細胞）– 再生医療等製品（分化/増殖誘導、血管新生等）• ゲノム編集– CRISPR/CAS9– iｎ vivo vs. in vitro

遺伝子治療製品

mRNA医薬品（タンパク質一過性発現）
in vivo投与による一過性タンパク質発現による疾患
治療– Vasopressin-mRNA尿崩壊（多尿症））– Erythropoietin-mRNA（貧血）– VEGFA-mRNA（心筋梗塞における血管新生）– 間葉系幹細胞でのNotch発現による神経細胞誘導
特徴：遺伝子治療と比較して迅速なタンパク質発現が可能.
容易に多様なmRNA候補品をデザインすることが可能／プロモータ等による発現制御ができない

ex-vivo 投与

再生医療等製品– 樹状細胞へのIL-4 mRNA投与（自己免疫性糖尿病）– PBリンパ球 へのCAR mRNA投与（白血病）mRNA製品の投与• 投与形態– mRNA単独投与– mRNA + Protein（protamine）– mRNA + PEI– mRNA + Liposome• 局所投与（投与部位）– 皮内– 皮下– 筋肉内– リンパ節

• 全身投与（静脈内）

 mRNAの細胞内への取込を促進する製剤化が実施しれているmRNAワクチンを用いた臨床プロトロール数(NIH Clinical-Trials）
 多くのがんワクチン臨床試験は抗原提示細胞への導入によるex-vivo細胞療法
 一方、感染症予防ワクチンはmRNAのin vivo直接投与
 がんワクチンではin vivoでもex vivoでも複数のmRNAを用いた多抗原刺激によるがん免疫誘導を目指した臨床試験が実施されている

がんワクチン

感染症予防ワクチン12710685643422100mRNA alone mRNA tailer-made mRNA MultimRNA導入DCmRNA

DC with mRNA

 Multi-target mRNAが使用される場合には、品質特性解析等によりどのような発現制御がなされているのかの評価が必要（確認試験や力価設定）

mRNA 感染症予防ワクチン• mRNAのin vivo投与が主• 液性免疫と細胞性免疫の両方を刺激• PDマーカー– 液性免疫• 中和抗体産生試験（血清中の中和抗体量）– 細胞性免疫• 抗原特異的CD4+及びCD8+T細胞反応• IFN-g産生CD4+細胞• in vivo評価法– チャレンジ試験（フェレット等を用いた高病原性インフルエンザウイルスの感染防御能の測定）

mRNAがんワクチン• 多くがex vivo細胞治療として実施• 樹状細胞（DC）へmRNAを導入することにより、標的抗原の提示• 液性免疫と細胞性免疫の両方を刺激– 液性免疫
• 代替マーカーとしての抗体産生– 細胞性免疫• 抗原特異的CD4+及びCD8+T細胞反応• IFN-g産生CD4+細胞• テトラマーアッセイ複数のmRNAを用いる製品
A、B、C、D、EのmRNAの混合• 特性解析：– 物理化学的解析• A～EのmRNAの構成比(電気泳動、qRT-PCR）– 生物活性• 各mRNAが設計通りの発現をしていること• 抗体誘導活性• 規格試験：– 各構成mRNAの確認試験、含量設定

ターゲット分子 分子量• Melan-A
20-24kDa• MAGE-A348kDa• MAGE-A1
46kDa• Survivin
16kDa• GP100
70kDa• Tyrosinase 70-84kDa• GM-CSF
17kDa

mRNAの製造方法
 mRNA医薬品の生産に関していくつかの製法が利用されている
 製法に依存して評価すべき品質特性項目や管理項目が異なってくるmRNA医薬品の製造• mRNAの構造設計– CAP構造– 3’-UTRs構造– コドンの最適化– ポリA Tail• in vitro転写システムによる製造• Template– 直鎖プラスミド– PCR Product• mRNA合成酵素– T7 RNA ポリメラーゼ– SP6 RNAポリメラーゼ

New England Bio-Labs

 工程由来不純物• 酵素や修飾核酸原料
 目的関連物質＋目的関連不純物• ポリＡの長さの違い

mRNA医薬品及びmRNAを利用した細胞製品の特性解析と規格•

mRNA医薬品

mRNAで加工した細胞製品特性解析試験– 物理化学的• 特性解析試験

• Agarose 電気泳動

– 配列解析
– 生物活性– 目的タンパク質の生産性– 抗体誘導活性（ワクチン）•規格試験––––––確認試験
示性値
純度試験
感染因子含量試験
生物活性

感染予防ワクチン／がんワクチン、たんぱく質の一過性発現等– 目的タンパク質の発現– 細胞特性（膜抗原）– 生物活性– クロスプレゼンテーション• 規格試験
– 確認試験
– 純度試験（目的外細胞）– 感染因子– 生細胞数– 含量試験（目的細胞含量）– 生物活性（抗原提示）がんワクチン等

mRNA医薬品及びmRNAを利用した細胞製品の特性解析と規格•

mRNA医薬品

mRNAで加工した細胞製品

特性解析試験
– 物理化学的• 特性解析試験

• Agarose 電気泳動

– 配列解析

•– 生物活性– 目的タンパク質の生産性– 抗体誘導活性（ワクチン）
規格試験– 確認試験
– 示性値– 純度試験
– 感染因子– 含量試験
– 生物活性感染予防ワクチン／がんワクチン、たんぱく質の一過性発現等– 目的タンパク質の発現– 細胞特性（膜抗原）– 生物活性mRNAは細胞加工の– クロスプレゼンテーション
ためのMaterial．製品• 規格試験は細胞．用いるmRNAについて詳細な品質– 確認試験
特性解析が必要では– 純度試験（目的外細胞）– 感染因子– 生細胞数– 含量試験（目的細胞含量）– 生物活性（抗原提示）がんワクチン等どのような品質管理が必要か？ （荒戸先生の課題への提案）
品質の試験（出荷試験）：核酸医薬品⇔mRNA医薬品⇔遺伝子治療
修飾の有無

参考となる指針・事例など
性状確認試験
カウンターイオン純度試験

核酸医薬品（原薬）

mRNA医薬品

遺伝子治療（プラスミドの場合）

非修飾、修飾非修飾・修飾（CAPなど）

非修飾（天然）

ヌシネルセン審査報告書

遺伝子治療用製品の品質及び安全性の確保に関する指針 改訂案○
MS、液クロ、LC-MS○・オリゴヌクレオチド
類縁物質
・残留溶媒・元素不純物

••

○

○

電気泳動、RT-PCR

制限酵素マップ、塩基配列、サイズ等－－

目的物由来不純物＋ 目的物質関連物
質 （類縁物質）
工程由来不純物

・目的物由来不純物（OC体、LN体）
・宿主由来タンパク質、DNA、RNA・工程由来不純物（培地成分、添加物、溶菌剤、溶媒等）

エンドトキシン

○

○

○

感染性因子

微生物限度

微生物限度(工程）

微生物限度(工程）定量法（含量）LC-MS

RNA含量等

DNA含量（260nm吸光度）等－In vitro発現試験

生物活性（遺伝子発現、タンパク質機能等）

生物学的活性試験
その他

プラスミド均一性試験

非臨床試験
• Biodistribution（血中動態や排出は不要）• 薬理試験
• 安全性薬理試験• 一般毒性試験（単回／反復投与毒性試験）• 遺伝毒性試験• 生殖発生毒性試験• がん原性試験• 免疫毒性試験

非臨床試験
核酸医薬品（化学合成医薬品）

mRNA医薬品

遺伝子治療製品（プラスミド）ADME

Biodistribution

Biodistribution

POC（有効性）検証・効果効能裏付試験

POC（有効性）検証・効果効能裏付試験

POC（有効性）検証・
効果効能裏付試験

一般毒性試験

一般毒性試験

一般毒性試験

遺伝毒性試験

遺伝毒性試験

生殖発生毒性試験

生殖発生毒性試験

がん原性試験

がん原性試験

（免疫毒性試験）（免疫毒性試験）

生殖細胞の染色体への組込みリスクの評価

Biodistribution（BD）• mRNAのin vivo投与後の動物で体内分布の解析：
目的及び目的外の細胞/組織への分布とその持続性の解析• 主な検出手法– qRT PCR、TMA、DNA-branch法などの核酸増幅法（NAT）、タンパク質発現（IHCなど）• 目的– mRNAの体内分布とその持続性から薬理学的効果を評価– 目的外細胞/組織への分布は安全性データの解釈に利用– 持続性がない場合、毒性試験の省略や簡略化を検討

mRNA医薬品の非臨床安全性評価• mRNA医薬品：細胞/組織内でタンパク質発現により薬理作用を示す– 天然型mRNA• 通常のmRNAと同様の作用によりタンパク質発現• 発現したタンパク質は ICH S6 (バイオテクノロジー応用医薬品の安全性ガイドライン）に沿ってオンターゲット毒性を評価– 非天然型mRNA• 細胞内で通常のmRNAと同様の作用によりタンパク質発現• 新規性の高い修飾の場合、ICH M3ガイドラインに沿って、新規化学物質として安全性を評価– DDS(リポソーム等)を用いる場合• 新規性等を考慮してICH M3ガイドラインの適用を考慮

安全性薬理試験• コアバッテリー臓器（心血管系、呼吸系および中枢神経系）への影響を評価– 天然型mRNA• 発現するタンパク質に注目して、 ICH S6ガイドライン沿って評価（一般毒性試験の中で評価可能）• hERG試験は、通常必須ではない– 非天然型mRNA• 発現するタンパク質に注目して、天然型と同様に評価• 新規性の高い修飾の場合、 ICH S7A及びS7B（安全性薬理試
験ガイドライン）に沿って、新規化学物質として安全性を評価• 安全性薬理試験の評価にあたっては、臨床試験での用法・用量を踏まえて検討することが必要

免疫毒性• 反復投与毒性試験等で、意図しない免疫毒性が示唆された場合、免疫毒性試験の実施を考慮する• mRNAに対するTRL活性化の可能性がある– 既存情報を活用して、 TLR活性化の有無について構造をデザイン
例• 感染症予防ワクチン・がんワクチン： TLR活性化 あり• ワクチン以外：
TLR活性化 なし

他の非臨床安全性試験• 遺伝毒性試験– 天然型• 不要– 非天然型
• 新規性の高い修飾の場合、ICH M2（遺伝毒性試験ガイドライン）に沿って評価• 生殖発生毒性
ヒトで全身性の曝露リスクがある場合には試験実施を検討– 天然型– 非天然型• ICH S5（生殖発生毒性試験ガイドライン）に沿って評価• がん原性試験
ヒトで長期曝露リスクがある場合には試験実施を検討– 天然型• ICH S6ガイドラインを踏まえて、原則として不要• 非天然型• 新規性の高い修飾の場合、ICH S1（がん原性試験ガイドライン）に沿って実施

どのような安全確認が必要か？ （荒戸先生の宿題への回答案）
非臨床安全性試験：核酸医薬品⇔mRNA医薬品⇔遺伝子治療
核酸医薬品
修飾の有無

非修飾、修飾参考となる指針など

ICH S6対応研究班による医薬品医療機器RS誌への投稿論文

毒性評価の考え方・オンターゲット毒性
・狭義のオフターゲット毒性
・広義のオフターゲット毒性（クラスエフェクト：自然免疫活性化など）

一般毒性試験

動物種：2種

遺伝毒性試験

遺伝子治療（プラスミド）

mRNA医薬品
修飾（CAPなど）

非修飾

ICH S6

ICH S6＋M３

遺伝子治療用製品の品質及び安全性の確保に関する指針（改正案）

・発現タンパク質の毒性・発現タンパク質の毒性＋・修飾核酸やその代謝産物の毒性・ベクターによる毒性・発現タンパク質による毒性（免疫原性など）

適切であれば1種で2種1種で十分な場合がある○－○－生殖発生毒性試験

○△

△

△

がん原性試験

○－安全性薬理試験○－その他

サロゲートの利用

非修飾

相同遺伝子の利用△○

遺伝子組込み評価－相同遺伝子の利用

ex-vivoでmRNAを導入した細胞• mRNA– 細胞製造における重要な原材料として評価– mRNA単独での非臨床安全性評価は原則不要• 導入したmRNAの発現産物– 安全性上の懸念があれば、ICHS6ガイドラインに沿って、毒性試験を検討• ex-vivoでmRNAを導入した細胞– 最終製品を細胞加工製品として安全性評価

まとめ
• 特徴
一過性のタンパク質発現をin vivo, ex vivoで迅速に誘導可能• 品質特性評価– プラスミド製品との類似した評価が可能であるが、新たな解析手法も必要– 修飾mRNAの解析では、不均一性についても評価• 非臨床安全性評価＜In vivoで導入＞– 天然型• 発現するタンパク質に注目して、バイオ医薬品を参考に安全性を評価– 非天然型• 発現するタンパク質に注目して、天然型と同様に評価• 新規性の高い修飾の場合、化学合成医薬品を参考に安全性を評価＜Ex vivoで導入＞– mRNAは細胞加工に用いる原料とみなす– 最終製品を細胞加工製品として安全性を評価

ご静聴ありがとうございました
謝辞： 非臨床試験につきましては医薬品
医療機器総合機構・真木一茂先生の意
見を参考にさせていただきました予備mRNA利用医製品

In vivo投与

遺伝子改変無再生医療等製品*
ワクチン
がんワクチン

遺伝子改変有ゲノム編集

遺伝子治療等製品

ex vivo細胞改変

遺伝子改変無ゲノム編集
遺伝子改変有再生医療等製品

遺伝子治療等製品

製品の本質

mRNA＋αmRNA＋α細胞製品*：mRNAによる一過性タンパク質発現を行い製品も再生医療等製品に分類されるDDS化されたmRNA医薬品• Liposomeの物理化学的特性• 脂質2重構造（Uni-lamellar、Multi-lamellar)• 表面構造• ゼータ電位（表面荷電）
• 粘度
• 粒子径
• リポソームの相転移温度
ブロック共重合体ミセル医薬品の開発に関する厚生労働省／欧州医薬品庁の共同リ
フレクションペーパー.薬食審査発0110第1号 平成26年1月10日
Liposome Drug Products Chemistry, Manufacturing, and Control; Human
Pharmacokinetics and Bioavailability; and Labeling Documentation. US FDA Guidancefor Industry April 2018

POC（有効性）検証・効果効能裏付試験• in vitroヒト細胞での目的mRNAからのタンパ
ク質発現– 目的とする細胞内分布；膜タンパク質、分化誘導や増殖活性• in vivo モデル動物でのタンパク質発現– 必要に応じてモデル動物の相同タンパク質をコードするmRNAの導入– 腫瘍免疫の誘導• テトラマーアッセイ、ELISPOTアッセイ、抗体産生、DHL、

ゲノム編集技術の種類
第一世代: ZFN 1996～(Zinc Finger Nuclease)
はさみ（人工ヌクレアーゼ：タンパク質）2種類を標的配列毎に作製して認識・切断

Ｖ

第二世代: TALEN 2010～(Transcription Activator Like Effector Nuclease)
植物に感染する細菌の転写因子由来
はさみ（人工ヌクレアーゼ：タンパク質）2種類を標的配列毎に作製して認識・切断

第三世代: CRISPR/Cas 2012～(Clustered Regularly Interspaced Short
Palindromic Repeats / CRISPR‐associated protein)（古）細菌の獲得免疫機構を基に開発

はさみはヌクレアーゼ（タンパク質）とガイドRNAの複合体
標的配列毎にガイドRNAを作製して認識・切断Ｖゲノム編集技術の種類
第一世代: ZFN 1996～(Zinc Finger Nuclease)
はさみ（人工ヌクレアーゼ：タンパク質）2種類を標的配列毎に作製して認識・切断

ＶZFN、TALEN、CRISPR/CAS9をコードす
第二世代: TALEN るmRNAを導入することによりプラス
2010～(Transcription Activator Like Effector Nuclease)
ミドやウイルスベクターを用いなくて植物に感染する細菌の転写因子由来
も遺伝子改変が可能に
はさみ（人工ヌクレアーゼ：タンパク質）2種類を標的配列毎に作製して認識・切断

第三世代: CRISPR/Cas 2012～(Clustered Regularly Interspaced Short
Palindromic Repeats / CRISPR‐associated protein)（古）細菌の獲得免疫機構を基に開発

はさみはヌクレアーゼ（タンパク質）とガイドRNAの複合体
標的配列毎にガイドRNAを作製して認識・切断

Ｖ

資料②

ゲノム編集の遺伝子治療としての定義及び遺伝子治療の範囲
ゲノム編集による遺伝子切断
配列認識モジュールヌクレアーゼDNA二本鎖切断

A T G C T GIIIII

欠失／挿入
相同組換えIT A C G A C
切断しないゲノム編集
エフェクター脱アミノ化
NH2

ATGCTGATCTA

ATGCTGATUTA

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

TACGACTAGAT

I

I

I

I

II

I

I

I

I

TACGACTAAAT

脱アミノ化（デアミナーゼ）
リコンビナーゼ

エフェクター
脱メチル化

Me

ATGCTGATCTA

ATGCTGATCTA

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

TACGACTAGAT

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

TACGACTAGATDNAメチル化/脱メチル化
転写制御因子
ヒストン修飾点変異

遺伝子改変に該当

組換え

遺伝子治療の範囲
遺伝子発現制御

現時点では含めないが明確にはせず

資料②

ゲノム編集の遺伝子治療としての定義及び遺伝子治療の範囲
ゲノム編集による遺伝子切断
配列認識モジュール

遺伝子治療臨床研究指針
ヌクレアーゼ第二 用語の定義
欠失／挿入
DNA二本鎖切断
一この指針において「遺伝子治療等」とは、疾病の相同組換え
A T G C T G
治療や予防を目的として遺伝子又は遺伝子を導入
T A C G A Cした細胞を人の体内に投与すること、もしくは種々の方法により人の目的遺伝子を改変/修飾又は目切断しないゲノム編集
的遺伝子を改変／修飾した細胞を人体内に投与す
エフェクターることをいう。
I

I

I

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I

I

脱アミノ化
NH2

ATGCTGATCTA

ATGCTGATUTA

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TACGACTAGAT

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TACGACTAAAT

脱メチル化

ATGCTGATCTA

ATGCTGATCTA

I

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TACGACTAGAT

I

点変異

I

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I

TACGACTAGAT

脱メチル化
転写制御因子
ヒストン修飾遺伝子改変に該当

組換え

遺伝子治療としての審査
DNAメチル化/エフェクター
MeI

脱アミノ化（デアミナーゼ）
リコンビナーゼ

遺伝子治療の範囲

遺伝子発現制御

現時点では含めないが明確にはせず