植物培養細胞の超低温保存

国⽴研究開発法⼈理化学研究所
バイオリソース研究センター
実験植物開発室⼩林 俊弘
2022年9⽉12⽇

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植物培養細胞リソースについて
超低温保存の原理と技術問題点と将来

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植物培養細胞リソースについて超低温保存の原理と技術問題点と将来

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実験植物開発室のリソース
実験植物種⼦130,889系統

4℃保存

711,240クローン−80℃保存72細胞株

継代による維持

シロイヌナズナ
ミナトカモジグサ

植物DNA
シロイヌナズナ
ミナトカモジグサ
ポプラ
キャッサバ
ストライガ
ヒメツリガネゴケ

植物培養細胞2020年度実績

リソースリスト：https://epd.brc.riken.jp/ja/resource/list01

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植物培養細胞リソース
細胞⽣物学の研究に使⽤脱分化した細胞 — 再分化能を失った細胞株
モデル細胞株
タバコ BY-2
100 µm

モデル植物の細胞株
シロイヌナズナ T87

物質⽣産株
ヨウシュヤマゴボウ PAR

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Plant species

Cell line

BY-2BY-2H— Transgenic line
BY-TIPG
BY-YTRF3 *
GF11
GT16
GV7
OsmotinPro:RFP *TBY2-31/41 *TBY2-31/ST *TBY2-31/ST(E) *TBY2-41/ST *TBY2-AtRER1B
TBY2-G31 *TBY2-R31 *TBY2-RER/31 *topless3-GFP *Arabidopsis thaliana
At tomDeep *
Deep-rapid *gnom
MM2d *
MM2d-LS *T87
YG1
Brachypodium distachyon Embryogenic callus
BRC525 *Glycine max
DG330
Lotus japonicus
Lj
Lj A
Ljm A
Nicotiana tabacum
3n-3
ATR-r
NaCl-r* Not released** Not available
Nicotiana tabacum

Plant species

Cell line

Plant species

Cell line

Nicotiana tabacum

NI
T91 *
T91H *Xan-1
XD6S2 *XD6S21 *
Oc
OS-1
GCR26
GCR237
Sly-1
H440
CRA
CrB *
V208
Cba-1
TA416
Cj
156-S
Cl
Dm
SB489
GlV
GlW
Ak-1
Ge
M18-1
OM
Lcy-1 **
LcyD6
LcyD7
Mar-1
T-13
Pb

Phyllostachys nigra
Phytolacca americana

Pn
PAP
PAR
PAW
Co460
P468
ToF
VR
VW
Asp-86 **
A.pas
A.per
A.plo
AY-01
BsLs
C38 **L46 *L63 *Cr-AH *
kurodagosun
NC *
G89
PSB
PSGPSW
Spi-12F
Spi-I-1
Spi-WT
Cp *
Vma-1
YU-1
ZE3

Oryza sativa
Solanum lycopersicum

Amaranthus sp.
Catharanthus roseus

Citrullus battich
Commelina communis
Coptic japonica
Curcuma longa
Duboisia myoporoides
Fragaria × ananassa
Glehnia littoralis
Glycyrrhiza echinata
Lithospermum erythrorhizon
Luffa cylindrica

Mentha arvensis
Nicotiana tabacum
Phyllostachys bambusoides

Prunus × yedoensis
Prunus persica
Taraxacum officinale
Vitis sp.
Asparagus officinalis
Asparagus pastorianus
Asparagus persicus
Asparagus plocamoides
Athyrium yokoscense
Bruguiera sexangula

Ceratopteris richardii
Daucus carota
Nicotiana glauca
Sesamum indicum

Spinacia oleracea

Triticum vulgare
Vinca major
Vitis vinifera
Zinia elegans

6維持の特徴
⽣細胞を植継ぎで維持
凍結保存は⾮常に難しい
寄託以前に10年以上植継ぎで維持されている

強い選択圧のもとで維持
特定の培地‧培養環境で盛んに増殖する細胞
視覚による選抜n カルスの形態
n ⾊素⽣産変異が⼊り放題ではないと考えられる

品質管理
DNA検査による植物種‧細胞株の判別
⼀時的な状態の変化（環境に敏感）≫ 遺伝的変化

7

継代による維持の問題点
コスト‧スペース培地
培養環境

細胞株の損失微⽣物の汚染
事故‧天災
特性の変化
細胞増殖能

問題解決の唯⼀の⽅法
液体窒素中の超低温保存8植物培養細胞リソースについて
超低温保存の原理と技術問題点と将来9

植物細胞を凍結すると…
植物細胞結晶冷却細胞内凍結

細胞内構造の破壊

加温

By User:127.0.0.l
File:SiO2 - Quarz - 2D.png
CC BY-SA 3.0

https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=568470

細胞死

イオンの流出pHの変化
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細胞内凍結を回避するには…
ガラス化

⾮晶質

ガラス：
液体を急速にガラス転移温度以下に冷却することによって形成される⾮晶質の固体

By User:127.0.0.l
File:SiO2 - Glas - 2D.png
CC BY-SA 3.0

https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=568452

11ガラス化の誘導
誘導条件
溶質濃度の増加
急速冷却

加温条件
急速加温
⸺ 昇温による再結晶化を抑制

平井泰 (2001) 北海道⽴中央農業試験場報告 第99号
p 3, Fig II-2を元に作成
http://agriknowledge.affrc.go.jp/RN/2010630232.pdf

12超低温保存の⼿順
前培養
前処理

脱⽔

脱⽔耐性の付与馴化（低温‧浸透圧）

細胞質の濃縮⽔分含量の減少

凍結脱⽔（緩速予備凍結法）
浸透脱⽔（ガラス化法）
⾵乾

急速冷却

ガラス化の誘導（乾燥法）

液体窒素に投⼊13

緩速予備凍結法
凍結脱⽔

ガラス化法
浸透脱⽔
⾼濃度のガラス化液を⽤いて、浸透差によって脱⽔

複雑な構造の器官には不向き

培養茎頂
⽑状根
Embryogenic cells

プログラム
フリーザー

浸透圧ストレス

乾燥法
⾵乾⾃然乾燥
シリカゲル乾燥

乾燥の調整が困難

処理の最適化が⾯倒

通常のフリーザーを使⽤する簡易法が確⽴されている
14

凍結脱⽔
凍害防御剤液冷却 0.5〜2.0℃/min
細胞外凍結

急速冷却 液体窒素
凍結
ガラス化 (細胞内)15ビーズ簡易予備凍結法

https://epd.brc.riken.jp/ja/wp-content/uploads/plant_cell_lines/cryopreservation_protocol.pdf

16植物培養細胞の保存成績
細胞株 a

前処理 予備凍結(分)(時間)

細胞⽣存率(%) b

再増殖率 培養⽇数 d(%) c

BY-2602.063.1 ± 6.5100<7T87 e403.055 〜 60100< 14ColL23-275

1.036.0 ± 4.1100< 14ColL23-360

1.54.6

LerL601.059.5 ± 4.6

WsL

60

2.03.3

WsL2375

1.565.0 ± 11.9100< 14WsL4560

1.550.6 ± 4.9100< 140100< 140

ビーズ簡易予備凍結法で保存 (凍害防御剤液：2 M glycerol、0.4 M sucrose)
培養1⽇⽬の細胞⽣存率［BY-2：エバンスブルー排除法、BY-2以外：TTC還元法 (無処理に対する相対%)］c30バイアル (ColL23-3とWsLは5バイアル) を⽤いた場合の懸濁培養誘導の成功率
abd 継代可能になるまでに要した⽇数

e 川原‧菅原‧⼩林(正) (未発表)

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参考⽂献
Sakai A, Kobayashi S, Oiyama I (1991) Cryopreservation of nucellar cells of navel orange (Citrussinensis Osb.) by simple freezing method. Plant Science 74: 243–248.
DOI: 10.1016/0168-94 52(91)90052-A
Menges M, Murray JAH (2004) Cryopreservation of transformed and wild-type Arabidopsis and tobacco cell suspension cultures. Plant Journal 37: 635–644.
DOI: 10.1046/j.1365-313X.200 3.01980.x
Kobayashi T, Niino T, Kobayashi M (2005) Simple cryopreservation protocol with an encapsulation
technique for tobacco BY-2 suspension cell cultures. Plant Biotechnology 22: 105–112.
DOI: 10.5511/plantbiotechnology.22.105
Kobayashi T, Niino T, Kobayashi M (2006) Cryopreservation of tobacco BY-2 suspension cell cultures by vitrification with encapsulation. Plant Biotechnology 23: 333–338.
DOI: 10.5511/plantbiotechnology.23.333
Ogawa Y, Suzuki H, Sakurai N, Aoki K, Saito K, Shibata D (2008) Cryopreservation and metabolic
profiling analysis of Arabidopsis T87 suspension-cultured cells. Cryo-Letters 29: 427–436.
https://www.ingentaconnect.com/content/cryo/cryo/2008/00000029/00000005/art00008
Ogawa Y, Sakurai N, Oikawa A, Kai K, Morishita Y, Mori K, Moriya K, Fujii F, Aoki K, Suzuki H,Ohta D, Saito K, Shibata D (2012) High-throughput cryopreservation of plant cell cultures
for functional genomics. Plant and Cell Physiology 53: 943–952.
DOI: 10.1093/pcp/pcs038

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植物培養細胞リソースについて
超低温保存の原理と技術問題点と将来19現状の問題
運⽤できていない技術の習熟が必要（技術員）
常に提供している

適⽤できる細胞株が少ない
タバコ BY-2
シロイヌナズナ
ニンジン NC× 物質⽣産株

形質転換BY-2の超低温保存
寄託が増えている
提供数は少ない
評価しやすい20

超低温保存による性質の変化

超低温保存
半永久的に保存できる
液体窒素保存⾃体は変異を誘発しない

選抜による顕在化

不均⼀性
回避するには … ⾼い細胞⽣存率
細胞分裂能の維持

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保存する材料の重要性
材料の質は⾮常に重要
健康状態 ≫ 厳密な操作

保存しやすい細胞
⼩さい細胞‧meristematicな細胞細胞質に富む ＝ 液胞が⼩さい
増殖が速い

材料の特性
どの細胞がどのくらい⽣き残ればいいか
脱⽔‧低温感受性
耐性の誘導◼ 低温馴化
◼ 浸透圧処理◼ ABA

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保存する材料と⽅法
材料
培養細胞

保存法
懸濁硬いカルス

培養茎頂⽑状根
Embryogeniccells

緩速予備
凍結法

⽣存部位 回復
多くの細胞細胞

ガラス化法
ガラス化法
ガラス化法
緩速予備
凍結法

成⻑点

再分化する
細胞

⼀細胞でも⽣き残れば回復する可能性（時間がかかる、技術が必要）

⼀外植⽚
⼀植物体
増殖が遅い
再分化しない液胞化した細胞は⽣き残りにくい23

技術開発の⽅向性
簡便さ
誰でも技術の習熟が不要

すぐに条件検討が不要

何でも材料の種類‧質に依らない

周辺技術
培養技術
ビーズカプセル化
マイクロカルチャー
移植技術（動物）
凍害防御剤
低毒性
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Cryo-plate法

Niino et al. (2014) Plant Biotechnology 31: 281–287
https://doi.org/10.5511/plantbiotechnology.14.0624a

超急速冷却‧加温によるガラス化の促進
⼩さい試料をアルギン酸ゲルでアルミニウムプレートに固定し、液体窒素に直接投⼊© ⼀般社団法⼈⽇本植物バイオテクノロジー学会
2014
CC BY 4.0

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装置

器具

液体窒素凍結保存容器

デュワー瓶

n キャニスターn バイアルボックス

プログラムフリーザー（必須ではない）
https://planer.com/

バイオメディカルフリーザ

ケーン
https://www.thermofisher.com/jp/ja/home.html

クライオバイアル（外蓋の⽅がコンタミしにくい）
https://shop.gbo.com/ja/japan/products/bioscience/

クライオプレート関連（必須ではない）

振とう機‧ローテーター
ウォーターバス

試薬（凍害防御剤）
GlycerolSucroseDimethyl sulfoxide（ガラス化法）
Ehylene glycol（ガラス化法）

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参考
実験植物開発室https://epd.brc.riken.jp/ja/

植物培養細胞ラボマニュアル
https://epd.brc.riken.jp/ja/manual/cell

技術研修https://ja.brc.riken.jp/consulting/kensyu_plant27.shtml

基礎⽣物学研究所 IBBPセンター
https://www.nibb.ac.jp/ibbp/

⽣物遺伝資源新規保存技術開発共同利⽤研究
http://www.nibb.ac.jp/collabo/invite/invite.html

Cryopreservation Conference (2014〜)
https://ibbp.nibb.ac.jp/cryoconf2019/

農研機構 遺伝資源センター

https://www.naro.go.jp/laboratory/ngrc/index.html

低温⽣物⼯学会

http://square.umin.ac.jp/jscc/jp/index.html

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