Nucleofector
Voice of Customers®

ー 遺伝子導入実験におけるお客様ご評価 ー
Nucleofector® は2001年にAmaxa Nucleofector 装置として日本国内で発売以来、数々のモデルチェンジやアプリケーションの拡充を経ながら、革新的な遺伝子導入装置としてお客様から高い評価をいただいてまいりました。このたび、Nucleofector® Voice of Customersと称しまして、お客様のNucleofector® を使用した研究内容とご評価例をご紹介させていただきます。今後も最先端のライフサイエンス研究をサポートするべく、Nucleofector® の技術向上に取り組んでまいります。

実績紹介 01
抗腫瘍効果を高めるT-cellの遺伝子探索
データ提供：
慶應義塾大学 微生物免疫制御学教室

要約
がん組織に集積するT細胞の多くは、何度も抗原刺激を受けること

吉村 昭彦 教授

で複数の免疫チェックポイント分子を高度に発現し『疲弊』する。本

三瀬 節子 助教

研究では、ロンザ社 4D-Nucleofector® Xユニットを用いて、疲弊化誘導遺伝子特異的な sgRNAとCas9タンパク質の複合体をマウス

CD8+ T 細胞、およびヒトCD3+ CAR-T細胞に導入し、その遺伝子をノッUser ʼs Voice 導入効率が大変良い。レトロウイルス導入後にもエレクトロポレーションを行うことができるため、CAR-T 細胞での遺伝子のノックアウトに有効。

クアウトすることで抗腫瘍効果を高めることに成功した。

細胞試薬キット
プログラム
細胞数/キュベットサイズ

マウス CD8 T-Cell

ヒト CAR-T細胞

P4（V4XP-4032）

P2（V4XP-2032）+CM-150

EH-1001×106 cells
20 ul Strip Well

1×106 cells
20 ul Strip Well

Cas9 RNP
sgRNA：450 pmol
* 180 pmol
Cas9 Protein：

導入基質* 西増教授、濡木教授（東京大学）作成

ノックアウト効率

50% - 90%

マウスprimary CD8 T細胞へのヒトCD3+CAR-T細胞への

Cas9/RNPの導入

Cas9/RNPの導入

Fig：マウスCD8T細胞を抗CD3/CD28抗体で刺激し、2日後にエレクトロポレーションを行った。更に5日後にウェスタンブロットにてtargetの発現を調べた。

Fig：CARを導入したヒトpanT細胞にtargetのsgRNAを導入し、ウェスタンブロットでtargetの発現を調べた。

実績紹介 02
腎障害回復期のTregに発現する
GATA3遺伝子の有益性

データ提供：

要約

吉村 昭彦 教授

慶應義塾大学 微生物免疫制御学教室

組織に局在する制御性T細胞（組織Treg）のうち、腎障害の回復期に博士課程 酒井 亮太 様発現するGATA3遺伝子が大きな役割を果たすことが示唆されている。
本研究では、腎炎モデルマウスに移植して評価する目的として、GA-TA3遺伝子欠損Tregの作成に、ロンザ社4D-Nucleofector® Xユニッ
トでターゲット遺伝子の導入/疾患モデルマウスへの移植後の評価（現、埼玉医科大学 助教）

User ʼs Voice 初心者でも使いやすくて、編集効率も高く、様々な遺伝子を編集してみたい衝動に駆られた。

を行った。
Gated on live CD45.2+CD4+ cells

マウス 脾臓 CD4+T-Cell

試薬キット

P4（V4XP-4024）

プログラム

CM-137, CV-137, DS-158（要条件検討）

細胞数/キュベットサイズ

導入基質

Kidney5×106 cells
100 ul CuvetteCas9 RNP 15 ul
crRNA-tracrRNA duplex：180 pmol
* 10 ng
Cas9 Protein：* 西増教授、濡木教授（東京大学）作成

編集効率

50% - 60%

GATA3+Treg in kideny
80
60

FoxP3-APC細胞+ Gata3 KD-Treg% GATA3++FoxP3+ T cells
in CD4% GATA3+Treg+ Control-Treg*4020

GATA3-PE

0+ Gata3 KD+CtrlKO-Treg
Control- GATA3KOTreg
Treg
Treg

Fig：遺伝子編集した脾臓Treg（CD45.2陽性）をFoxP3を発現しないTconv（conventionalT）細胞（CD45.1陽性）と共移入してマウス腎炎を誘導した。腎炎回復期の腎臓におけるlive
CD45.2陽性CD45.1陰性CD4陽性細胞をゲートしたフローサイトメトリー解析とTregあたりのGATA3陽性細胞の割合を示す。

論文情報：Kidney GATA3+ regulatory T cells play roles in the convalescence stage after antibody-mediated renal injury Cellular & Molecular Immunology. Published online: 11 Sep.2020
引用論文：Brain regulatory T cells suppress astrogliosis and potentiate neurological recovery. Nature volume 565, pages246–250(2019)実績紹介 03
ヒト臍帯血由来CD34陽性造血幹細胞のゲノム編集について

データ提供：
東海国立大学機構 名古屋大学 環境医学研究所 発生遺伝分野

要約RIKEN BRCより購入した健常人由来CD34陽性造血幹細胞に対して、
CRISPR-Cas9法によるゲノム編集を実施した。ADH5（alcohol dehydrogenase 5）を標的遺伝子とし、リボヌクレオ蛋白質（RNP）複合体をロンザ社 4D-Nucleofector® を用いて導入した。2箇所のgRNA配列に対するゲノム編集効率を、CD34陽性造血幹細胞からDNAを荻 朋男 教授
岡 泰由 講師

User ʼs Voice RNP 導入効率・使い勝手ともに期待以上でした。

抽出し、サンガーシーケンス法にてゲノム編集効率を確認した。そ20

gRNA-1157.1

6

4.65.5

3.5

2.6

2.5

305

ヒトCD34（HSPCs）

1816.4

10% of sequences

きていることを確認した。
細胞25の結果、両配列共に80%以上の効率でゲノム編集（indel変異）が起

Cas9 RNP
gRNA：27 pmol
* 9 pmol* 入手元：IDT社
Cas9：

導入基質
導入効率およびゲノム編集効率（KO）

510insertion-->
35.4

40

EH-10030gRNA-2

20

5×104 cells
20 ul Strip Well0<--deletion% of sequences

細胞数/キュベットサイズ-510.2

10

プログラム-10P3（V4XP-3032）

10.2

8.5
5.3

2.6

3.1

0

試薬キット

-10-50510insertion--><--deletion

Fig：TIDEによるCD34陽性造血幹細胞のゲノム編集効率の確認

80% 以上
論文情報：Oka et al. Science Advances 6: eabd7197 (2020)

実績紹介 04

PiggyBac Transposonシステムによるデータ提供：

多発性骨髄腫細胞株への遺伝子導入

京都大学 ウイルス・再生医科学研究所
幹細胞遺伝学教室

要約
ロンザ社 Cell Line Optimization 4D-Nucleofector® X Kitを用いて、遊佐 宏介 教授

4D-Nucleofector® による多発性骨髄腫細胞株MM1Sへの遺伝子導（SE, SF, SG）
入条件の最適化を行った。
プロトコルに従って3種の試薬それぞれに15種のプログラムを試した結果、SF試薬／プログラム
DN-100 が最適であった。この最適化条件を用いて、PiggyBac
TransposonシステムによるMM1S細胞への遺伝子導入を行った。
Vector サイズは約 10kbであったが、容易に安定発現細胞を得る

青木 一成 助教

ことができた。

a120

60
40SF（V4XC-2012）20プログラム

DN-1000

導入基質
安定発現株の構築効率

5×105cells
20ul Strip well
Transposase発現ベクター ：500 ng/sample
目的遺伝子・GFP発現ベクター：100 ng/sample
約0.4%

関連文献：K. Yusa et al., “A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.” Proc Natl
Acad Sci U S A. 2011 Jan 25;108(4):1531-60.5
Transposase (+)

0.4%GFP+

多発性骨髄腫細胞株MM1S

SF DN 100

80

試薬キット

細胞数/キュベットサイズb

Negative control

100
Viability (%)

細胞

User ʼs Voice 遺伝子導入の難しい細胞株であっても、効率よく遺伝子導入を行うことが可能。

0.30.2
Transposase (-)

0.10020406080
Efficiency (%GFP+)

100

169Days after transfection

Fig：Nucleofector® を用いたMM1S細胞への遺伝子導入。(a) 多発性骨髄腫細胞株MM1Sにおける4D-Nucleofetor® の最適条件を検討、SF試薬／プログラムDN-100が最適（図中赤点）であることが明らかになった。(b) (a)の最適化条件でMM1S細胞に目的遺伝子とGFPを発現するPiggyBac transposon vectorおよびTransposase 発現Vectorを同時に遺伝子導入したところ、導入後9日を経てもGFPの安定発現が観察され、目的とする安定発現細胞が得られたことが示された。

Nucleofector™ による核内への遺伝子導入実績
ヌクレオフェクションは電気パルスにより細胞膜に瞬時に細孔を形成する技術です。Nucleofector™ プログラムと細胞種ごとに最適化された専用試薬の開発による総合的な手法を採用し、細胞質へはもちろん、さらに核膜を通して核内への遺伝子の導入を実現しました。
これにより、細胞種によっては99%という高導入効率と細胞増殖に依存しない遺伝子導入の実現が可能になりました。
核内へDNAを直接導入
ABC

D
Fig：正常ヒト皮膚線維芽細胞（新生児）に 2.5µ g のeGFP（高感度GFP）をコードするTMR標識したプラスミドDNAを導入。導入2時間後、細胞は 3.5 ％ PFA により固定され、共焦点顕微鏡で観察された。導入プラスミド（TMR標識）〔A〕、導入、発現されたGFP〔B〕、核（DAPI染色）〔C〕、以上3つを重ね合わせたもの〔D〕を示した。

Nucleofector® は免疫細胞をはじめとした困難な導入を強力にサポートします
独自のパルスパラメーターとユニークな試薬の組合せで構成されるシス

Nucleofector®では有機化合物から各種核酸、ペプチド、たんぱく質などテムは免疫細胞にも安定した高い遺伝子導入効率を実現。
導電性ポリマー

あらゆるサイズ、あらゆる種類の基質の導入・共導入が可能です。そのたを電極材として採用することで、従来のエレクトロポレーション機器と比め急速に発展するゲノム編集技術に登場する多様なシステムにも柔軟に較して、細胞生存性を飛躍的に向上しました。

対応します。導入が困難な核酸タイプのssODNの導入もNucleofector®
でならスムーズです。

その他 免疫/血球細胞への遺伝子導入データ
導入効率

100

細胞生存率

83%

79%

％ 導入効率

80

70%

62%
60

54%
45%

38%

40

ガイド

RNA

CD34+ cell

B cellNatural Killer

T cell, Unstimulated
ドナー

100％ 導入効率

806059%Cas9プラスミド

0.4〜1 μg

2〜5 μg

10 μg (60 pmol) *150 μg (300 pmol)

ガイドRNA

120〜180 pmol *1

600〜900 pmol

ガイドRNAプラスミド

0.4〜1 μg

2〜5 μgdsDNA(lin)0.4〜2 μg

5〜10 μg

ssODN

250 pmol

50 pmol *2
12 μg (100-mer) *360 μg (100-mer)*1 J. Exp. Med. 2018 Vol. 215 No. 3 985–997*2 弊社技術資料より*3 SCIENTIFIC Reports (2018) 8:310 Ishida et al.

69%

64%

100 uL CuvetteCas9 Nuclease

84%

77%
70%

20 uL Strip

基質Cas952%

200CRISPR/Cas9について報告されている基質量の範囲

60%42%40200

T cell, Stimulated

Monocyte

Macrophage

Dendritic cell

柔軟な拡張性機器ラインナップ

基礎研究に最適な20 µL／100 µL 系のＸユニットから、ご研究の進展に合わせて、スクリーニングなどの大量検体の処理に適したハイスループッ
ト拡張、CAR-T細胞の大量調製などの細胞療法に適した大容量拡張など、柔軟な拡張性を実現。
これらのNucleofector® デバイス間で使用する実LVユニットデバイス

験条件には互換性があり、シームレスな機器の移行が可能です。

VolumeX ユニットデバイス
96-well ユニットデバイス

検体数：1検体
容量：1〜20 mL

HT Nucleofector™ システム
検体数：〜16 well
容量：20 μL /100 μL
検体数：〜96 well
容量：20 μL

検体数：〜384 well
容量：10〜20 μL

Throughput

RES-LF2109-01