29●高吸着型精製用担体 TOYOPEARL GigaCap シリーズの開発
バイオサイエンス事業部

1．背開発部

セパレーションセンター

久保中村
中谷雄二
孝司
茂

疎水性相互作用クロマトグラフィー用担体、高吸着型

景ミックスモードクロマトグラフィー用担体等の新規高

近年、組み換え DNA 技術や細胞培養技術の急速な性能担体を製品化してきた。この中で、特に汎用性の進歩に伴い、微量な生体タンパク質を多量に生産可能高い高吸着型イオン交換体 TOYOPEARL GigaCap シとなり、タンパク質などバイオ医薬品の市場規模は大リーズ担体については、スルホン酸基やカルボキシル1）きく拡大した 。バイオ医薬品には、成長著しい免疫基を有する強、弱カチオン交換体、4 級アンモニウム

グロブリン G（IgG）を中心とした抗体医薬の他、酵基を有する強アニオン交換体を製品化してきた 8）。本素、インスリン等のホルモン、血液凝固因子、ワクチン、稿では、新たに開発したジエチルアミノエチル基をエリスロポエチン、サイトカイン、インターフェロン

官能基として有する弱アニオン交換体 TOYOPEARLなどが挙げられる。これらバイオ医薬品の実用化に伴GigaCap DEAE − 650M、また粒子サイズを小さくする

い、培養工程で製造されたタンパク質を液体クロマトことで分離能を更に改善した TOYOPEARL GigaCap

グラフィーの原理に基づいて精製する分離精製用担体シリーズ S グレードの基本的性能について報告する。の需要も大きく伸び、その市場規模は全世界で 500 億円程度と推定されている。また、生産性向上のため培養工程における発現量が増加しており、同時に精製工程においても分離性能・生産性・コストパフォーマン

2．実験項［1］試薬、充填剤スに優れた新しい分離精製用担体の開発が必要とされガンマグロブリン（ポリクローナルヒト IgG）及てきている。この問題点を解決する一つの効果的な方

び牛血清アルブミン、インスリン、トランスフェリ法が、精製用担体の高吸着容量化であり、この技術にン、オブアルブミン、トリプシンインヒビター、リボより、一度に精製可能な培養液処理量が多くなるため、ヌクレアーゼ A、チトクローム C、リゾチーム等のタ精製工程での生産性を著しく改良することが可能となンパク質や酢酸、酢酸ナトリウム、トリスヒドロキシる2 − 5）

。また、精製用担体の使用量の削減やカラムサ

メチルアミノメタン、NaCl、NaOH などの試薬は和イズの縮小、吸脱着溶媒、洗浄溶媒の削減などコスト

光純薬㈱から購入した。Capto DEAE、SP Sepharose6）

HP、Capto SP ImpRes、Q Sepharose HP、Capto Q

ダウンも可能となる 。
タンパク質の液体クロマトグラフィーは、分離モー

ImpRes は GE Healthcare 社 ㈱ 製 の 製 品 を 用 い た。

ドによって主に以下の 5 種類に大別される。即ち、タFractogel EMD DEAE は Merck 社㈱製の製品を用いンパク質を、そのサイズによって分離するサイズ排除た。TOYOPEARL は東ソー㈱製の製品を用いた。

クロマトグラフィー、抗体精製用 Protein A に代表されるアフィニティークロマトグラフィー、多くのタン［2］動的吸着量の測定

パク質の精製に広く使用されるイオン交換クロマト

各種精製用担体を、それぞれ 6 mm I.D. × 40 mm

グラフィー、疎水性リガンドを固定化した疎水性相のステンレス製カラムに充填し用いた。吸着緩衝液に互作用クロマトグラフィー、複数の相互作用を合わせは、カチオン交換体の場合、0.05 mol ／ L 酢酸ナトリ6）,7）。

ウム（pH4.7）を用い、アニオン交換体の場合、0.05

当 事 業 部 で は、 こ れ ら の 分 離 モ ー ド 用 担 体 と し て

mol ／ L トリス塩酸（pH8.5）を用いた。タンパク質とTOYOPEARL 及び TSKgel を製品化している。さらにして、カチオン交換体の場合はガンマグロブリンを用は近年、高吸着型 Protein A 担体、高吸着型イオン交い、アニオン交換体の場合はウシ血清アルブミンを用

換体 TOYOPEARL GigaCap シリーズ担体、高吸着型

いて、上記の吸着緩衝液へ溶解し 1 mg ／ mL の濃度へ持つミックスモードクロマトグラフィーである

30TOSOH Research & Technology Review Vol.57（2013）調整した。充填したカラムへ送液ポンプと UV 検出器を、それぞれ 6 mm I.D. × 40 mm のステンレス製カ（280 nm）を接続し、調整したタンパク質溶液を線速ラムに充填し用いた。タンパク質として牛血清アルブ

度 212 cm ／ h の流速で負荷させた。得られた吸着破過ミンを用いた場合、上記［2］記載の方法と同一の方曲線から、充填剤の動的吸着容量（Dynamic binding法で動的吸着容量を測定した。一方、タンパク質としcapacity：DBC）を算出した。吸着させたタンパク質てガンマグロブリンを用いた場合は、吸着緩衝液にはは脱着し、その回収液の UV 吸光度から、タンパク質0.015 mol ／ L トリス塩酸緩衝液（pH8.7）を用い同様の回収率を計算した。

な方法で測定した。

［3］静的吸着量の測定［6］充填剤の使用耐久性の測定

カチオン交換体はゲル 1 mL、アニオン交換体はゲ6 mm I.D. × 40 mm のステンレス製カラムに各精製

ル 3 mL を計量し、300 mL 三角フラスコへ投入し用用担体を充填し、ガンマグロブリンまたは牛血清アルいた。吸着緩衝液およびタンパク質は、上記［2］記ブミンの動的吸着容量を測定した。動的吸着容量は、載の物質と同じものを用いた。それぞれ、タンパク質上記［2］記載の方法と同じ方法で測定した。吸着タ

負荷溶液濃度が 10 mg ／ mL、全タンパク質負荷量 210

ンパク質を脱着させ、その後、アルカリ洗浄液で洗浄

mg ／ mL − gel となるように、上記三角フラスコ中へタした。アルカリ洗浄条件は、0.5 mol ／ L NaOH 溶液をンパク質と吸着緩衝液を投入した。得られた反応スラ洗浄液として用い、流速 0.5 ml ／ min. で 1 時間洗浄しリーを室温で 3 時間撹拌後、上清中に含まれる未吸着た。次いで吸着緩衝液を用い 30 分洗浄した。これをタンパク質量を UV 吸光光度計で定量し、その数値か洗浄 1 サイクルとし、所定の回数洗浄後、再度吸着容ら静的吸着容量（Static binding capacity：SBC）を計量の測定を繰り返した。洗浄回数は 100 回実施した。

算した。
［4］タンパク質分離選択性の測定
各種精製用担体を、それぞれ 7.5 mm I.D. × 75 mmのステンレス製カラムに充填し用いた。溶離液には、

3．結果と考察［1］TOYOPEARL GigaCap シリーズ精製用担体の新グレードの製品化

カチオン交換体の場合、緩衝液 A として 0.02 mol ／ L

タンパク質等バイオ医薬品の製造プロセスは、初期リン酸緩衝液（pH7.0）を用い、緩衝液 B として 1.0の培養工程とその後の精製工程に大別される。精製工

mol ／ L の塩化ナトリウムを含む 0.02 mol ／ L リン酸緩程では、医薬品中への不純物の混入を避けるため、高衝液（pH7.0）を用いて、A 液 100％から B 液 100％ま純度での精製が要求されている。そのため精製工程は、で 60 分リニア―グラジエントのグラジエント勾配でキャプチャー工程、中間精製工程、最終精製工程の 3

タンパク質を分離した。アニオン交換体の場合、緩衝工程で実施することが一般的に推奨されている 9）。こ液 A として 0.05 mol ／ L トリス塩酸緩衝液（pH8.5）をれら精製工程では、各種精製用担体を数十～数百リッ用い、緩衝液 B として 1.0 mol ／ L の塩化ナトリウムをトルの大型カラムへ充填し、液体クロマトグラフィー含む 0.05 mol ／ L トリス塩酸緩衝液（pH8.5）を用いて、の原理によって不純物と目的成分の分離が行われる。

A 液 100 ％から B 液 100 ％まで 120 分リニア―グラジ

我々は、この精製工程の生産性や製造コストの削エントのグラジエント勾配でタンパク質を分離した。

減 が 可 能 と な る 高 吸 着 型 精 製 用 担 体 TOYOPEARL

タンパク質として、カチオン交換体の場合、リボヌク

GigaCap シリーズの製品化を行ってきたが、新たにレアーゼ A、チトクローム C、リゾチームを用い分離官能基としてジエチルアミノ基を有する弱アニオン選択性を測定した。アニオン交換体の場合、トランス

交 換 体 TOYOPEARL GigaCap DEAE − 650M、 及 び

フェリン、オブアルブミン、トリプシンインヒビター

粒子サイズを小さくすることで分離能を更に改善しを用いて分離選択性を測定した。またインスリン、モた TOYOPEARL GigaCap シリーズ S グレードを製品

ノクローナル抗体のアニオン交換体による分離では、化した。DEAE タイプについては、既存製品であるトリス塩酸緩衝液を用いてリニア―グラジエント条件

TOYOPEARL DEAE − 650M が FactorVIII 等 の 中 間 精で測定した。

製に用いられているが、処理能力が不十分であったた
め、今回、高吸着型の担体を新たに製品化した。S グ［5］タンパク質サイズの動的吸着容量への影響測定
各種アニオン交換クロマトグラフィー精製用担体

レードに関しては、最終精製工程などでの不純物の分離能改善を目的として、より高純度に精製可能な高吸東ソー研究・技術報告

着型のグレードとして新たに製品化した。

第 57 巻（2013）31［3］タンパク質の分離選択性
それぞれの新規製品の各種モデルタンパク質に対する分離選択性を評価した。結果を Fig. １、Fig. ２、［2］タンパク質の吸着容量
それぞれの新規製品の各種タンパク質に対する吸着

Fig. ３、Fig. ４に示した。Fig. １、Fig. ２では DEAE容量を評価した。結果を Table １、Table ２、Table ３

タイプの分離選択性を評価したが、DEAE タイプは、に示した。いずれの製品も既存製品にくらべ高い吸着既に製品化されている Q タイプとは分離選択性が異容量を有していることを確認した。

なり、顧客の用途に応じた選択肢の広がりが期待でき

Table 1Comparison of dynamic binding capacitya for bovine serum albumin on weak anion exchanger

Particle Ion exchange Dynamic binding
Static binding
Recoverybcapacityb
sizecapacityc
capacity［%］ ［mg ／ mL−gel］［μm］ ［meq ／ mL］ ［mg ／ mL−gel］
0.23
165
100179TOYOPEARL GigaCap DEAE−650M 50−100
0.1125973040−90
TOYOPEARL DEAE−650M
0.29−0.35
14096
14390
Capto DEAE−−−5240−90
Fractogel EMD DEAE (M)ResinaDynamic binding capacities were determined at 10% breakthrough curve. Column size:6 mm I.D.×40mm height.
Sample: bovine serum albumin 1 mg/mL. Flow velocity: 212 cm/hr. Detection: UV at 280 nm.
b Binding buffer: 0.05 mol/L Tris-HCl buffer, pH 8.5.
Elution buffer: 0.05 mol/L Tris-HCl buffer, pH 8.5, 0.5 mol/L sodium chloride.
c Binding buffer: 0.05 mol/L Tris-HCl buffer, pH 8.5.

Table２Comparison of dynamic binding capacitya for gamma-globulin on cation exchange resin

TOYOPEARL GigaCap S−650S
TOYOPEARL SP−650S
TOYOPEARL GigaCap S−650M
TOYOPEARL GigaCap CM−650MParticle Ion exchange Dynamic binding
Static binding
Recoveryb
capacityb
size
capacityc
capacity［μm］ ［meq ／ mL］ ［mg ／ mL−gel］［%］ ［mg ／ mL−gel］
20−500.24
16499
1770.1647d20−50−−0.1650−100
145
98
156
0.24
50−10010097120

SP Sepharose HP
Capto SP ImpRes

24−4436−44

Resin

0.15
0.12

65
27100
10010589a

Dynamic binding capacities were determined at 10% breakthrough curve. Column size: 6 mm I.D.×40mm height.
Sample: gamma-globulin 1 mg/mL. Flow velocity: 212 cm/hr. Detection: UV at 280 nm.
bBinding buffer: 0.05 mol/L sodium acetate buffer, pH 4.7.
Elution buffer: 0.05 mol/L sodium acetate buffer, pH 4.7, 0.5 mol/L sodium chloride.
cSample: gamma-globulin. Binding buffer: 0.05 mol/L sodium acetate buffer, pH 4.7.
dSample: Lysozyme. Binding buffer: 0.02 mol/L phosphate buffer, pH 6.0.

Table３Comparison of dynamic binding capacitya for bovine serum albumin on anion exchanger
Resin

TOYOPEARL GigaCap Q−650S
TOYOPEARL GigaCap Q−650M
Q Sepharose HP
Capto Q ImpResaParticle Ion exchange Dynamic binding
Static binding
Recoveryb
capacityb
size
capacityc
capacity［μm］ ［meq ／ mL］ ［mg ／ mL−gel］［%］ ［mg ／ mL−gel］
20−500.20
19199
2000.1717297
191
50−1000.15
8199
114
24−44
36−440.124010092

Dynamic binding capacities were determined at 10% breakthrough curve. Column size: 6 mm I.D.×40mm height.
Sample: bovine serum albumin 1 mg/mL. Flow velocity: 212 cm/hr. Detection: UV at 280 nm.
bBinding buffer: 0.05 mol/L Tris-HCl buffer, pH 8.5.
Elution buffer: 0.05 mol/L Tris-HCl buffer, pH 8.5, 0.5 mol/L sodium chloride.
c
Binding buffer: 0.05 mol/L Tris-HCl buffer, pH 8.5.

TOSOH Research & Technology Review Vol.57（2013）32

る。S グレードのカチオン交換及びアニオン交換タイ

ンパク質サイズによらず、種々のタンパク質の精製にプの評価結果を Fig. ３、Fig. ４に示したが、M グレー利用可能であると考えられる。

ドに比べ溶出ピークは、よりシャープ化されており、微量不純物の分離能が改善されている。最終精製工程［5］充填剤の使用耐久性
一般的にタンパク質の精製に使用されたカラムは、での精密分離用途での利用が期待される。

タンパク質の吸着・脱着操作の後、カラムの殺菌のため、NaOH による洗浄操作（CIP 操作：Cleaning in［4］タンパク質サイズの動的吸着容量への影響
各種アニオン交換体のタンパク質サイズの動的吸着place）が行われ、再利用される 10）。この時、NaOH容量への影響を測定した。結果を Table ４に示したが、に対する安定性が低いと、充填剤の選択性や吸着能がTOYOPEARL GigaCap シリーズ担体は、サイズの大低下し、その結果充填剤の交換頻度が高くなるため、きいタンパク質を用いても既存製品にくらべ十分に高タンパク質医薬品の製造コストが高くなる。ここでは、

い吸着容量を有することを確認した。これにより、タ

アルカリ性洗浄液として、0.5 mol ／ L NaOH を使用し120100280mV

TOYOPEARL GigaCap DEAE−650M

16034020Capto DEAE
TOYOPEARL GigaCap Q−650M

0−200102030405060

Retention time［min.］Fig.１

Protein selectivity of TOYOPEARL GigaCap DEAE−650M
Column size: 7.5mm I.D.×75 mm height. Buffer A: 0.05 mol/L Tris−HCl, pH 8.5. Buffer B: 0.05 mol/LTris−HCl, pH 8.5, 1.0 mol/L sodium chloride. Gradient: 120 min. linear gradient from buffer A 100% tobuffer B 100%. Flow rate: 1.0 mL/min. Detection: UV at 280 nm. Sample: 1. transferrin 2.9 mg/mL, 2.
ovalbumin 6.5 mg/mL, 3. trypsin inhibitor 10.0 mg/mL. Injection volume : 100μL.

160140120mV

100
8060
TOYOPEARL GigaCap DEAE−650M Mab

40TOYOPEARL GigaCap Q−650M Mab

20TOYOPEARL GigaCap DEAE−650M InsulinTOYOPEARL GigaCap Q−650M Insulin
Capto DEAE Insulin

0−200102030405060Retention time［min.］Fig.２Protein selectivity of various proteins on TOYOPEARL GigaCap DEAE-650M
Column size: 7.5mm I.D.×75 mm height. Insulin separation : Buffer A 0.05 mol/L Tris-HCl, pH 8.5. Buffer B 0.05 mol/L
Tris-HCl, pH 8.5, 1.0 mol/L sodium chloride. Gradient 60min. linear gradient from buffer A 100% to buffer B 100%. Flowrate 1.0 mL/min. Detection UV at 280 nm. Sample Insulin 4.9 mg/mL. Injection volume 100 μL.. Monoclonal antibody
separation : Buffer A 0.015 mol/L Tris-HCl, pH 8.7. Buffer B 0.015 mol/L Tris-HCl, pH 8.7, 0.5 mol/L sodium chloride.
Gradient 60min. linear gradient from buffer A 100% to buffer B 100%. Flow rate 1.0 mL/min. Detection UV at 280 nm.
Sample monoclonal antibody 4.5 mg/mL. Injection volume 100 μL.

東ソー研究・技術報告

第 57 巻（2013）

33328012230180mV

TOYOPEARL SP−650S
130
Capto SP ImpRes
80SP Sepharose HP
30

TOYOPEARL GigaCap S−650M

TOYOPEARL GigaCap S−650S−200Fig.３

1020Retention time［min.］

3040Protein selectivity of TOYOPEARL GigaCap S-650SColumn size: 7.5 mm I.D.×75 mm height. Buffer A: 0.02 mol/L phosphate buffer, pH 7.0.
Buffer B: 0.02 mol/L phosphate buffer, pH 7.0, 1.0 mol/L sodium chloride. Gradient: 60 min.
linear gradient from buffer A 100% to buffer B 100%. Flow rate: 1.0 mL/min. Detection: UV at
280 nm. Sample: 1. ribonuclease A 9.8 mg/mL, 2. cytchrome C 3.6 mg/mL, 3. lysoyzme 6.4mg/mL. Injection volume : 20 μL.
2440

TOYOPEARL DEAE−650S

39013340290

TOYOPEARL Super Q−650SmV240190140

Capto Q ImpRes

90

TOYOPEARL GigaCap Q−650M
TOYOPEARL GigaCap Q−650S

40−100102030405060

Retention time［min.］Fig.４

Protein selectivity of TOYOPEARL GigaCap Q-650S
Column size: 7.5 mm I.D.×75 mm height. Buffer A: 0.05 mol/L Tris-HCl, pH 8.5. Buffer B: 0.05 mol/L
Tris-HCl, pH 8.5, 1.0 mol/L sodium chloride. Gradient: 120 min. linear gradient from buffer A 100% tobuffer B 100%. Flow rate: 1.0 mL/min. Detection: UV at 280 nm. Sample: 1. transferrin 2.9 mg/mL, 2.
ovalbumin 6.5 mg/mL, 3. trypsin inhibitor 10.0 mg/mL. Injection volume : 100 μL.

TOSOH Research & Technology Review Vol.57（2013）34

Effect of protein size on dynamic binding capacitya of anion exchanger

Table４ResinTOYOPEARL GigaCap DEAE−650M
TOYOPEARL GigaCap Q−650S
TOYOPEARL GigaCap Q−650M

Dynamic binding capacity（g/L）
BSAb
gamma−globulinc
66kDa
160kDa
170
103
181
92
173
104
108
145
29
25

TOYOPEARL Q−600C AR
TOYOPEARL Super Q−650MTOYOPEARL QAE−550C
TOYOPEARL DEAE−650M

90133251a

Dynamic binding capacities were determined at 10% breakthrough curve.
Column size: 6 mm I.D. × 40 mm height. Flow velocity: 212 cm/hr.
Detection: UV at 280 nm.
bSample: bovine serum albumin 1 mg/mL. Binding buffer: 0.05 mol/L Tris-HClbuffer, pH 8.5.
c
Sample: gamma-globulin 1 mg/mL. Binding buffer: 0.015 mol/L Tris-HCl buffer,
pH 8.7.

200
180160

DBC［g／L］

1401201008060TOYOPEARL GigaCap DEAE−650M

40TOYOPEARL GigaCap S−650S20TOYOPEARL GigaCap Q−650S0020406080100CIP cycle［times］

Fig.５

Cleaning in place stability test
CIP conditions; Alkaline washing solution: 0.5 mol/L sodium hydroxyde. Washingflow rate: 0.5 ml/min. Alkaline washing time: 1h. DBC conditions; Column size: 6mm I.D.×40 mm height. Sample: gamma-globulin 1 mg/mL for cation exchanger.
BSA 1 mg/mL for anion exchanger. Binding buffer: 0.05 mol/L sodium acetate
buffer pH4.7 for cation exchanger. 0.05 mol/L Tris-HCl pH 8.5 for anion exchanger.
Flow linear velocity: 212 cm/hr. Detection: UV at 280 nm.て、その繰り返し使用耐久性を評価した。結果を Fig.

ミノエチル基を有する新規高吸着型イオン交換体であ５に示した。タンパク質動的吸着容量の変化を確認しり、 一 方、TOYOPEARL GigaCap シ リ ー ズ S グ レ ー

たが、100 回の洗浄操作の後でも吸着能の変化は認め

ドは、粒子サイズを小さくすることにより更なる高分られなかった。

離能化を達成した高吸着型イオン交換体である。タン
パク質等バイオ医薬品の生産性の向上及び製造コスト

4．まとめ
本稿では、タンパク質等バイオ医薬品の精製効率化 に 有 効 な TOYOPEARL GigaCap シ リ ー ズ 精 製 用削減、精製純度の改善に寄与することが期待される。

引用文献

担体の新製品の性能を紹介した。弱アニオン交換体

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57 − 70（2012）８）久保雄二，分離技術，38，4，16 − 19（2008）９）石原尚，バイオプロダクション，151 − 156（2006）10）S. Ahuja，Handbook of Bioseparations（2000）

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