−報文−

新規卵巣明細胞癌マーカー TFPI2 の臨床的有用性
大明新荒平
宮竹庭谷川野城則昇晃憲悦

久＊ 1平＊ 1司＊ 2
昭＊ 3久＊ 3子＊ 4Clinical Significance of Tissue Factor Pathway Inhibitor 2, a Novel Serum
Biomarker for Diagnosis of Ovarian Clear Cell Carcinoma
Norihisa OHTAKE
Shohei MYOBA
Koji SHINTANI
Noriaki ARAKAWA
Hisashi HIRANO
Etsuko MIYAGIOvarian clear cell carcinoma (OCCC) is intrinsically resistance to conventional taxane-platinum combination
chemotherapy, and a highly lethal histological subtype in epithelial ovarian cancer (EOC). We identified tissue factor
pathway inhibitor 2 (TFPI2) as a novel specific serum biomarker candidate for OCCC by a proteome-based approach.
Furthermore, we measured serum TFPI2 levels in a retrospective training set (n=268) and a prospective validation
set (n=156) consisting of patients with benign and borderline ovarian tumors, EOC subtypes, and uterine diseases.
Serum TFPI2 levels were specifically elevated only in OCCC patients, consistent with the mRNA expression
pattern in tumor tissues. Our results revealed that TFPI2 is useful for preoperative clinical diagnosis of OCCC andmonitoring of malignant transformation from endometriosis to OCCC in the future.

1．背景［1］卵巣癌の現状

巣癌は漿液性、類内膜、粘液性、そして明細胞と主に４つの組織型に分類される。その中でも、明細胞癌は①他の組織型と比べて抗癌剤が効きにくく予後不良例

本邦における卵巣癌の罹患数・死亡数は共に増加傾が多く 1）、②日本における明細胞癌の発生頻度は欧米向にあり、国立がん研究センターの 2015 年がん統計に比べて有意に高く（欧米：約 5％、日本：約 23％）、予測では罹患数 10,400 人、死亡数 4,800 人とされ、婦③明細胞癌は子宮内膜症を母地として高頻度に発生す人科悪性腫瘍の中で最も死亡数が多い疾患である。卵る 2）ことが報告されており、本邦主導で卵巣明細胞癌＊1＊2＊3＊4

バイオサイエンス事業部 第一開発部 技術グループ
バイオサイエンス事業部 第一開発部
横浜市立大学 先端医科学研究センター
横浜市立大学 大学院医学研究科 産婦人科学

診断／治療法の改善に向けた検討が進んでいる 3,4）。

23

TOSOH Research & Technology Review Vol.62（2018）［2］卵巣癌の診断され、FDA に認可された卵巣癌検査方法 OVA1 テス

卵巣腫瘍は術前に血液検査や画像診断による精密検トの対象タンパク質であるβ2 －マイクログロブリン、査にて悪性度を推定するが、良性・境界悪性・悪性のアポリポプロテイン A1 およびセロトランスフェリン

組織学的分類は術後の病理検査で初めて確定される。

もいずれかの群に含まれていることが明らかとなっ代表的な卵巣癌マーカーである CA125 は、卵巣癌全た。そこで、新規卵巣明細胞癌マーカー候補として明般の検出には優れるものの、①組織型の鑑別性能を有細胞癌特異的な 148 種のタンパク質に焦点を当てた。

していない、②明細胞癌の陽性率が低い、③良性腫瘍である子宮内膜症で高値となり内膜症からの明細胞癌

CCC common (891)

発症を正確に診断することができないといった問題が

TFPI2
MUC16(CA125)
KRT19(CYFA21-1)
β2-miroglobulin(OVA1*)ある。その結果、明細胞癌症例の対応の遅れや疾患の148

偽陽性判定による良性疾患の過剰治療、それに伴う患

185

72

者の QOL の低下が喫緊の問題となっている。

486

新規卵巣癌マーカータンパク質として数多くの論文

290が報告されている中、HE4 5）と Ova1 test 6）が FDA 承認

266
124を受けて米国で臨床応用されている。しかし、これら

Serous (1085)のマーカーは卵巣腫瘍における卵巣癌全般の検出精度

Mucinous(948)
KLK6
Apolipoprotein A1(OVA1*)
Serotransferin(OVA1*)

向上や卵巣癌のリスク判定を目的としており、卵巣癌組織型を鑑別するものではない。従って、卵巣明細胞癌の診断、治療効果および経過観察を的確に管理する

Fig.１

ために、特異度の高い卵巣明細胞癌マーカーの開発が必要とされている。これまで、我々は卵巣癌細胞株のVenn diagrams show overlap between the 891 proteinscommon to CCC cell lines and the set of proteins
identified in serous- and mucinous-type ECC cell lines.
Asterisks (＊) indicate the biomarker used in theOVA1 test.

培養上清を起点にプロテオーム解析（タンパク質）およびトランスクリプトーム解析（遺伝子）により新規［2］トランスクリプトーム解析

卵巣明細胞癌マーカー候補を探索し、組織因子経路イ

次に、遺伝子発現情報による絞り込みを目的として、

ンヒビター 2（TFPI2）を候補タンパク質として見出し、

RCAI RefDIC デ ー タ ベ ー ス（http://refdic.rcai.riken.

自動免疫診断試薬（AIA）にて臨床評価を実施してきjp）により 148 種の卵巣明細胞癌マーカー候補遺伝子た7）8）。これまでの研究経緯と今後の展望を報告する。の Gene Ontology（GO） 分 類 に て「 分 泌 ／ 細 胞 外 」に分類される 30 種のタンパク質遺伝子に絞り込んだ。

2．卵巣明細胞癌マーカー探索［1］プロテオーム解析

さらに、主要臓器における遺伝子発現データ、並びに、卵巣癌細胞株（8 種）および卵巣組織（正常、良性および悪性腫瘍、計 14 種類）の遺伝子発現量を real −本研究では血液診断用の新規マーカー探索を目的と

time RT − PCR にて解析し、卵巣明細胞癌のみで遺伝して、癌細胞株から培養上清中に分泌または放出され子発現が上昇する TFPI2 を有力な卵巣明細胞癌マーるタンパク質（セクレトーム）に焦点を当て、プロテカー候補として選定した（Fig. ２）。

OVMANA および OVSAYO）、卵巣漿液性癌細胞株 2種類（OVSAHO および OVKATE）および卵巣粘液性癌 2 種類（RMUG − S および MCAS）を無血清培地で培養後、培養上清中のタンパク質を脱塩・濃縮し、還元アルキル化およびトリプシン消化後に LC − MS ／ MS解析を実施した。
LC − MS ／ MS 解析により卵巣明細胞癌群（891 種）、卵巣漿液性癌群（1085 種）、卵巣粘液性癌群（948 種）のタンパク質が同定された。3 群を統合した結果（Fig.
１）
、CA125 は 3 群に共通するタンパク質として分類
241009080706050403020100

Tissue samples

12Control

345

Benign678 9 10 11 12 13 14
non-CCC
CCC
Malignant

OVMANA

卵 巣 明 細 胞 癌 細 胞 株 4 種 類（OVTOKO, OVISE,

Relative TFPI2 mRNA levels (％)

オミクスによる網羅的比較解析を行った。

Fig.２ TFPI2 mRNA levels in various ovarian tissue samples
were evaluated by real-time PCR. Data were normalizedagainst β-actin mRNA levels.

東ソー研究・技術報告

3．TFPI2 免疫測定試薬の構築
患者血液を簡便かつ高精度に解析するために、抗体

第 62 巻（2018）

4．臨床評価［1］欧米人検体による評価を用いた酵素免疫測定法（イムノアッセイ）の構築を健常人 n ＝ 30、子宮内膜症 n ＝ 30 および卵巣明細試みた。一般的な抗体作製方法は大腸菌等の宿主を用

胞癌 n ＝ 50 の欧米人購入検体（IVT 社製、IC 取得済）いた組換えタンパク質、また当該タンパク質の部分領を対象に、TFPI2 免疫測定試薬にて血中 TFPI2 を測定域からなるオリゴペプチドを免疫源として用いる。しした。その結果、血中 TFPI2 濃度は健常者や子宮内かし、TFPI2 は複数のジスルフィド結合を介した複雑膜症と比べて明細胞癌にて有意に高く、適切なカットな高次構造を取っており、生体内の TFPI2 の立体構オフ値を設定することで CA125 陰性（35 U ／ mL 未満）

造を反映しないオリゴペプチド、あるいは、調製過程の卵巣明細胞癌症例においても高頻度に陽性と検出可で立体構造が変化したタンパク質を免疫源として使用能なことを見出した（Fig. ３）。

した場合、得られた抗体が生体内の TFPI2 に対してたプラスミド DNA 免疫法による抗 TFPI2 モノクローナル抗体作製を行った。60 種以上の抗 TFPI2 モノク

A

p=0.0022

10000

NS100
10CONT
n=30

しない 10 種類の抗 TFPI2 モノクローナル抗体を選抜

分間の反応後、未反応の検体成分と未反応の酵素標識

CA125 (U/mL)

CONT
n=300/1312/1310010cut off

EMS
n=30

CCC
n=501000

cut off

1

ビーズに固定化した抗 TFPI2 抗体とアルカリ性ホス

燥試薬が溶解され免疫反応が開始される。37℃、10110

TFPI2 (Intensity)たサンドイッチ酵素免疫測定法（EIA）である。磁性

Fig.３

p=0.0006

10CCC
n=50100

TFPI2 免疫測定試薬は 2 種類の抗 TFPI2 抗体を用いこの試薬カップに検体と分注水を注入すると、凍結乾

EMS
n=30Cした。

液が、凍結乾燥体として試薬カップに封入されている。

p＜0.0001

1000.1

1

中に豊富に含まれる TFPI1（いわゆる TFPI）と交叉

p＜0.0001
10001000

ローナル抗体を得た後、TFPI2 の構造類縁体であり血ファターゼ標識された抗 TFPI2 抗体を含む免疫反応溶

B

p=0.0023
100000TFPI2 (Intensity)る。そこで本研究では、DNA ワクチン手法を応用しCA125 (U/mL)

高い特異性や結合力を有していない可能性が類推され

1CA125

TFPI2Serum levels of CA125 (A) and TFPI2 (B) were
measured in 50 CCC patients, 30 endometriosis
patiens (EMS), and 30 healthy controls (CONT.).
Statistical analysis was perfmed by nonparametricMann-Whitney U test. (C) TFPI2 levels in sera from
13 CCC patients with normal CA125 levels (＜35 U/mL)

抗体を B ／ F 分離により洗浄除去する。蛍光基質である 4 −メチルウンベリフェリルりん酸（4MUP）を分注［2］日本人検体による評価

後、経時的に蛍光強度を測定し単位時間あたりの 4 −横浜市立大学および奈良県立医科大にて収集したメチルウンベリフェロン（4MU）の生成量を測定する。

卵巣腫瘍および子宮腫瘍含む婦人科腫瘍患者術前血既知濃度の TFPI2 タンパク質を含む標準品を用いて、清（Training set：保管検体 n ＝ 268、Validation set：

各種 TFPI2 濃度の蛍光強度から検量線を作成するこ

前向き収集検体 n ＝ 156、計 424 症例、Table. １）をとで、患者検体中の TFPI2 濃度の定量が可能となる。

対 象 に、TFPI2 お よ び CA125 を 測 定 し た（UMIN:測定の際、検体のカップへの分注、一定時間下での免000007501）。

疫反応、B ／ F 分離、基質分注、蛍光強度の測定は自社 自 動 免 疫 測 定 装 置（AIA − 2000、AIA − 1800、AIA −900、AIA − 600II、AIA − 360）にて自動で行われ、測定開始から約 20 分後に測定結果が得られる。

（1）Training set（保管検体）
Training set（n ＝ 156） に お い て、CA125 は 卵 巣子宮内膜症および卵巣癌全般で高値傾向を示した

選抜した 10 種類の抗 TFPI2 抗体を用いて、測定（Fig. ４A）。CA125 は卵巣がんマーカーとして非常にシグナル強度（力価）、再現性、安定性等を指標にサ有用なものの、卵巣子宮内膜症でも高値を示す例がンドイッチ EIA に最適な抗体ペアを選定し、免疫反散見された。一方、TFPI2 は卵巣明細胞群において応溶液組成の最適化（pH および添加剤等）を行い、のみ特異的な高値傾向を示すことが明らかとなった

TFPI2 免疫測定試薬を構築した。

（Fig. ４B）。

25

TOSOH Research & Technology Review Vol.62（2018）

Sources of samples

Table.１

Serum Samples
Histology

Training Set
YCU
NMU56

Benign ovanan tumor

Valldation Set
YCU

5840

Non-EMS

43EMS

1358

71154266

38

Bordertine ovarian tumor
Ovarian cancer

2317

CCC

11187Serous

101717

Endometrioid

7214

Mucinous

534

Other

97638

Uterine disease58

Utenne tibroids

517

Ceevical cancer

1815

Endometnal cancer

1526

Other disease

5Total

143

125

156

Abbreviatiors : YCU. Yokohama City University, NMU, Nara Medical University ;EMS, endometriosis（2）卵巣明細胞癌鑑別性能の検証

A
P=0.005
P=0.001

卵巣癌疑い時の術前精密検査（卵巣明細胞癌、卵巣P=0.001

境界悪性腫瘍および卵巣明細胞癌を除く卵巣悪性腫

10000瘍）、または卵巣子宮内膜症からの卵巣明細胞癌発症

100

診断（卵巣明細胞癌および卵巣子宮内膜症）を想定し、

10

TFPI2 と CA125 の卵巣明細胞癌鑑別性能を ROC 解析

1にて比較した。CA125 は卵巣境界悪性腫瘍含む卵巣悪Benign

EMD(n=28)
Mucinius
(n=8)
Other
(n=16)
UF(n=2)
Cervical(n=16)
Endometrial(n=14)1000

EMS(n=71)
non-EMS(n=43)
Boderline(n=8)
CCC(n=29)
Serous(n=27)

CA125 (U/mL)

100000P=0.005

non-CCCEOC

TFPI2 (pg/mL)

P=0.0001

14000
10000
6000
2000
2000

（AUC 0.700，Fig. ５B 点線）のいずれにおいても、卵巣明細胞癌の鑑別性能は比較的低い結果を示した。一B
ns性腫瘍（AUC 0.636, Fig. ５A 点線）、卵巣子宮内膜症

方、TFPI2 は卵巣境界悪性腫瘍含む卵巣悪性腫瘍にお

P=0.0001

いて高い卵巣明細胞癌鑑別性能を有し（AUC：0.854，P=0.0001

Fig. ５A 実線）、卵巣子宮内膜症と卵巣明細胞癌の鑑別性能も非常に高いことが示された（AUC 0.924，

1500

Fig. ５B 実線）。

1000

Fig.４

26

non-CCC

100

EOC

80

Ut disease

Distribution of CA125 (A) and TFPI2 (B) levels inserum samples from patients with CCC and othergynecological diseases (retrospective training set,n = 268).
Abbreviations: EMS, endometriosis; Ut, Uterin tumor;
UF, uterine fibroids. Box plots display 5th, 25th, 50th
(median, middle horizontal line), 75th, and 95th,percentiles. Statistical analysis was performed bynonparametric Mann-Whitney U test.

B

CCC (n=29)
vs BD + non-CCC EOC (n=87)

80

60
40

TFPI2 0.854
CA125 0.636

200

CCC (n=29)
vs EMS (n=71)

1000Fig.５

2040
60
80
100% - Specificity%

100

Sengitiyity%

Ovarian diseaseA

Sengitiyity%

BenignEMD(n=28)
Mucinius(n=8)
Other(n=16)
UF(n=5)
Cervical(n=18)
Endometrial(n=15)

0EMS(n=71)
non-EMS(n=43)
Boderline(n=8)
CCC(n=29)
Serous(n=27)

500

6040
TFPI2 0.924
CA125 0.700

2000204060
80
100% - Specificity%

100

ROC and AUC values for serum CA125 and TFPI2
levels in discrimination of CCC from other ovariandiseases (borderline and non-CCCEOCs) (A), CCC
versus EMS (B). Line: TFPI2, Dotted line: CA125.

東ソー研究・技術報告第 62 巻（2018）（3）Validation set（前向き収集）

20000

Early(T)4/18
Early(V)0/4
Late(T)1/11
Late(V)0/3

卵巣癌疑い時の術前精密検査（卵巣明細胞癌、卵巣Early(T)9/18
Early(V)2/4
Late(T)10/11
Late(V)3/3

境界悪性腫瘍および卵巣明細胞癌を除く卵巣悪性腫
TFPI2(pg/mL)瘍）時の TFPI2 カットオフ値を Youden Index（感度−（100 −特異度））最大値から設定した。横浜市立大学にて新たに前向き収集された Validation set（卵巣腫瘍検体（n ＝ 156）を用いて、設定したカットオフ値の妥

2000

280pg/mL

200

当性を検証したところ、高い卵巣明細胞癌鑑別性能（感Early(T)4/18
Early(V)1/4

度 71.4％、特異度 85.7％、AUC 0.797）が再現された。

20

5

Early(T)4/18
Late(V)1/4

35U/mL

50500

5000

CA125(U/mL)（4）早期癌の診断性能と CA125 との相補性

EMS(T)EMS(V)

早期卵巣明細胞癌（FIGO Ⅰ／Ⅱ）／後期卵巣明細胞 癌（FIGO Ⅲ／ Ⅳ ） お よ び 卵 巣 子 宮 内 膜 症 を 対 象に、CA125 と TFPI2 の卵巣明細胞癌診断性能と相補

Fig.７性、Training set と Validation set の連続性を検証した。
CA125 においては早期卵巣明細胞癌と卵巣子宮内膜

Early CCC(T)
Early CCC(V)

Late CCC(T)
Late CCC(V)

Correlation of serum TFPI2 levels vs. serum CA125levels in CCC and EMS patients. Two-dimensional
scatter graphs show serum levels vs. TFPI2 andCA125 in patients with CCC or EMS in the training(T) and validation (V) sets.

症の間に統計的な有意差が認められなかった（Fig. ６A）。一方、TFPI2 は早期卵巣明細胞癌と卵巣子宮内膜症に顕著な有意差が認められた（p<0.0001，Fig. ６B）。

5．総括

本結果は、TFPI2 が卵巣子宮内膜症からの卵巣明細胞TFPI2 は胎盤タンパク質５（PP5）と同一分子であり、癌発症の早期発見に有用な可能性を示唆するものであ

共著者である横浜市立大学産婦人科学 宮城悦子らにる。

より分泌型セリンプロテアーゼインヒビターとして報CA125 と TFPI2 の相関分析の結果、両マーカー値告されている９）。胎盤および妊婦血清で発現亢進するの間には強い相関関係は認められなかった（スピアことから、周産期における血液凝固系への関与が考察

マン相関係数 r ＝ 0.26（training），0.61（Validation），されている分子である 10、11）。癌との関連に関してはFig. ７）。また、早期明細胞癌の陽性率を比較すると、浸潤転移を抑制するがん抑制遺伝子と考えられている

CA125 および TFPI2 はいずれも単独では 50％の陽性が 12）、多くの癌種で TFPI2 DNA プロモーターにメチ率となった。しかし、CA125 と TFPI2 を組み合わせル化修飾を受けていることが明らかとなり、メチル化ることで、陽性率は約 90％（20 ／ 22）に向上すること

修飾を指標とした遺伝子診断ターゲットとして様々なが明らかとなった。このことから、TFPI2 は卵巣明細癌種を対象に臨床研究が進められている 13 − 16）。

胞癌マーカーとして高い特異性を有するのみならず、

本研究では卵巣明細胞マーカー探索を目的とし、卵CA125 との同時測定により卵巣明細胞癌検出の感度向巣癌細胞株の培養上清を起点にプロテオーム解析（タ上にも期待できると考えられた。

ンパク質）およびトランスクリプトーム解析（遺伝子）から TFPI2 を見出し、TFPI2 免疫測定試薬を作成

nsAns

B
TFPI2(pg/mL)

CA125(U/mL)

10000

P=0.05

P=0.051000100101T

V

EMS

TV

Early

V
Late

CCC

Fig.６

Tns

して 500 症例を超える血清検体を用いて、TFPI2 の卵

P=0.005

巣明細胞癌血液診断マーカーとしての臨床的有用性を

P=0.001
P=0.005

14000
10000
6000
2000
2000

確認した。卵巣明細胞癌は比較的進行例が少なく（約50％が FIGO I 期で診断）、静脈血栓症の頻度が高いこ

1500
1000とを鑑みると、TFPI2 が卵巣明細胞癌の増殖抑制、並500
0T
EMS

V

TV

T

Early

V
Late

CCC

Distribution of serum CA125(A) and TFPI2(B) levels
in Endometriosis (EMS) and CCC patients at early/late stages.CCC patient groups in training (T) andvalidation (V) sets were divided into early (FIGO I/II)
and late (FIGO III/IV) stages. Statistical analysis was
performed by nonparametric Mann-Whitney U test.

びに、血液凝固系の異常に直接または間接的に関与している可能性が強く示唆される。現在、横浜市大を中心とした複数の国内臨床施設において卵巣明細胞癌とTFPI2 の関係解明に向けた基礎的研究と臨床応用に向けたトランスレーショナルリサーチを遂行している。
TFPI2 免疫測定試薬が卵巣癌診療に臨床応用されれば、血液検査において高い精度で明細胞癌と推察する
27

TOSOH Research & Technology Review Vol.62（2018）

ことが可能となる。その結果、卵巣明細胞癌の早期発見（診断）、治療法選択、並びに、経過観察（治療効果判定／再発）の一助となり、上皮性卵巣腫瘍の診断・治療・経過観察の的確な管理への貢献が期待される。

6．謝辞

本研究は文部科学省イノベーションシステム整備事業「翻訳後修飾プロテオミクス拠点形成」プログラムの研究成果である。また、臨床検体の提供や研究方針策定に多大なご協力をいただいた奈良県立医科大 産
婦人科学 小林浩 教授、神奈川県立がんセンター 臨

床研究部 宮城 洋平 部長、横浜市立大学 臨床統計学
山中 竹春 教授に心より感謝申し上げます。

7．文献［ 1 ］Sugiyama, T., et al., Cancer , 88（11），2584（2000）［ 2 ］Kobayashi, H., et al., Int J Gynecol Cancer , 17（1），37（2007）［ 3 ］Takakura, S., et al., Int J Gynecol Cancer , 20（2），240（2010）［ 4 ］Kashiyama, T., et al., PLoS One , 9（2），e87220（2014）［ 5 ］Fujiwara, H., et al., Tumor Biol , 36（2），1045（2015）［ 6 ］Bristow, R. E., et al., Am J Obstet Gynecol , 209（6），581（2013）［ 7 ］Arakawa, N., et al., J Proteome Res .12（10），4340（2013）［ 8 ］Arakawa, N., et al., PLoS One , 11（10），e0165609（2016）［ 9 ］Miyagi, Y., et al., J Biochem , 116（5），939（1994）［10］Udagawa, K., et al., Placenta , 23（2），145（2002）.
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