土壌 DNA 抽出キット

ISOILマニュアル（第 3 版）

Code No.316-06211

NIPPON GENE CO., LTD.

ISOIL マニュアル（第 3 版）
040817MO:1805

目 次Ⅰ

製品説明

1Ⅱキット内容

1

Ⅲ保存2Ⅳ

使用上の注意2Ⅴプロトコル

2

Ⅵ＜本品以外に必要な試薬、機器など＞

2＜標準プロトコル＞

3＜スケールアップについて＞

45

データ集
１．各種土壌サンプルからの DNA 抽出

5２．土壌 DNA のサイズ

5３．PCR による系統群の検出

6４．土壌 DNA の制限酵素消化6５．65℃インキュベート中の撹拌と土壌 DNA の収量

7６．土壌 DNA の PCR-DGGE 解析

7

Ⅶ

トラブルシューティング

8

Ⅷ

関連製品

10

ISOIL マニュアル（第 3 版）
040817MO:1805

Ⅰ 製品説明ISOIL は土壌サンプルから DNA を抽出するためのキットです。
特別な組成の抽出液により、非火山灰土壌はもちろん、これまで困難とされてきた火山
灰土壌からも DNA の抽出が可能です。
ISOIL では DNA の抽出方法として界面活性剤存在下での加熱抽出法を採用しています。
物理的な力を加えることなく土壌中の DNA を抽出するため、高分子の DNA を得ることができます。したがって、ISOIL で抽出した土壌 DNA は、メタゲノムライブラリーの構築等、遺伝子資源としての利用に適しています。
ただし、強固な細胞壁を持つ微生物等は破砕されない可能性がありますので、あらかじ
めご了承ください。
PCR-DGGE 解析等を用いた土壌微生物の群集構造解析および土壌 DNA の定量による土壌バイオマスの推定等には、ビーズ破砕法による ISOIL for Beads Beating をご使用ください。

Ⅱ キット内容
Lysis Solution HE

50 ml × 1 本＊

1.25 ml × 2 本

Lysis Solution 20S＊

Purification Solution

20 ml × 1 本

Precipitation Solution

40 ml × 1 本

Wash Solution

50 ml × 1 本TE（pH8.0）

5 ml × 1 本

Ethachinmate

100μl × 1 本

マニュアル

1部

＊： Lysis Solution 20S および Purification Solution 中に結晶が析出する場合がありますが、品質、性能に問題はありません。このような場合には、容器ごと 65℃程度でインキュベートし（ときおり混和する）、結晶を完全に溶解させてからご使用ください。

-1-

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Ⅲ 保存
ISOIL に含まれる試薬はすべて室温保存が可能です。
ただし、Precipitation Solution、Wash Solution、Ethachinmate については、使用時のコンタミネーション（カビや雑菌等の混入）に十分注意し、開封後は低温（2～10℃）で保存することをお奨めします。

Ⅳ 使用上の注意
・

本品は試験研究用試薬ですので、医薬品、その他の目的にはご使用になれません。

・

試薬についての基本的な知識のある方以外は取り扱わないでください。

・

本品のお取り扱いは、マニュアル記載内容通りに行ってください。

・

マニュアル記載内容と異なったお取り扱いによるトラブルにつきましては、弊社では責任を負いかねます。

・本品は、東京大学 TLO が所有する特許のライセンスを受けて製造販売しております。

Ⅴ プロトコル＜本品以外に必要な試薬、機器など＞
・70%エタノール・クロロホルム
・マイクロピペット
・ピペットチップ・2ml マイクロチューブ
・インキュベーター
・マイクロ遠心機
・ボルテックスミキサー-2-ISOIL マニュアル（第 3 版）
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＜標準プロトコル＞①

0.5 g の土壌サンプルを 2 ml チューブに入れる。

② 950μl の Lysis Solution HE と 50μl の Lysis Solution 20S を添加し、転倒混和にて十分に混合した後、65℃で 1 時間インキュベートする（注１）。
③

遠心（12,000×g , 1 分間 , 室温）する。

④

上清 600 μl を新しいチューブに移し、400μl の Purification Solution を添加し、十分に混合する。

⑤600μl のクロロホルムを添加し、15 秒間ボルテックスした後、遠心（12,000×g, 15 分間,室温）する。

⑥

中間層を入れないように注意しながら水層 800μl を新しいチューブに移し、800μl のPrecipitation Solution を添加して十分に混合し、遠心（20,000×g, 15 分間, 4℃）する（注２）。

⑦

上清を捨て、1ml の Wash Solution を加えて数回転倒混和し、遠心（20,000×g, 10 分間,4℃）する（注２）、（注３）。

⑧

上清を捨て、1ml の 70%エタノールと 2μl の Ethachinmate を加えてボルテックスした後、遠心（20,000×g, 5 分間, 4℃）する（注２）、（注４）。

⑨

上清を捨て、風乾した後、沈殿を 100μl の TE（pH8.0）に溶解する。

（注1） 途中で転倒混和することで、土壌 DNA の収量が増加します（データ集 5 参照）。
ローテーター等が準備できる場合には、穏やかに回転させながらインキュベートすることをお奨めします。
（注2） ご使用の遠心機の最大遠心力が 20,000×g よりも小さい場合は、遠心機の最大遠心力（だたし 12,000×g 以上）で遠心してください。
（注3） できるだけ上清を取り除いて下さい。上清に含まれる着色物質（腐植物質）は PCRを阻害することが知られています。また、腐植物質のコンタミネーションが少ない場合（クロロホルム処理後の水層の着色が少ない場合）は、⑦の操作を省略しても構いません。
（注4） 70%エタノールに Ethachinmate を加えることで、土壌 DNA を安定して回収することができます。ただし、何らかの理由で Ethachinmate を添加されない場合は、ボルテックスを避け、転倒混和によって穏やかに沈殿を洗浄してください。

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＜スケールアップについて＞
ISOIL での土壌 DNA 抽出はスケールアップが容易です。クローニングやライブラリーの構築等、高分子の土壌 DNA が大量に必要な場合には、スケールアップして抽出することをお奨めします。スケールアップの際には以下の点に注意してください。
1. Lysis Solution HE と Lysis Solution 20S の比は必ず 95：5 にする。
2. 標準プロトコル④の遠心上清と Purification Solution の比は必ず 6：4 にする。
3. クロロホルムの添加量は標準プロトコル④の遠心上清と等量にする。
4. Precipitation Solution の添加量はクロロホルム処理後に回収した水層の量と等量にする。

スケールアップ例：土壌 5g からの DNA 抽出（10 倍スケール）①

5g の土壌サンプルを 50ml 遠心チューブに入れる。

②

9.5ml の Lysis Solution HE と 0.5ml の Lysis Solution 20S を添加し、転倒混和にて十分に混合した後、穏やかに振とうしながら 65℃で 1 時間インキュベートする。

③

遠心（5,000×g, 10 分間, 25℃）する。

④

上清 6ml を新しいチューブに移し、4ml の Purification Solution を添加し、十分に混合する。

⑤6ml のクロロホルムを添加し、転倒混和にて均一になるまで十分に混合した後、遠心（5,000×g, 15 分間, 4℃）する。

⑥

中間層を入れないように注意しながら水層 8ml を新しいチューブに移し、8ml のPrecipitation Solution を十分に混合し、遠心（9,000×g, 30 分間, 4℃）する。

⑦

上清を捨て、10ml の Wash Solution を加えて数回転倒混和し、遠心（9,000×g, 10 分間,4℃）する。

⑧

上清を捨て、10ml の 70%エタノールと 10μl の Ethachinmate を加えて転倒混和した後、遠心（9,000×g, 10 分間, 4℃）する（注１）。

⑨上清を捨て、風乾した後、沈殿を 500μl の TE（pH8.0）に溶解する。

（注1） Ethachinmate は最終溶液 100μl に対して 1～2μl で十分です。Ethachinmate を添加しすぎると溶液の粘度が増し、以後の操作に支障をきたす場合があります。

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Ⅵ データ集

１．各種土壌サンプルからの DNA 抽出
本キットを用いて 3 種類の土壌から DNA 抽出を行った結果、いずれの土壌からも DNAを抽出することができた。
1234
Lane 1. OneSTEP Marker 1（λ/ HindⅢ digest）
Lane 2. 東大弥生圃場対照区土壌（アロフェン質黒ボク土 / 火山灰土壌）
Lane 3. 埼玉農試畑土壌

（灰色低地土 / 非火山灰土壌）

Lane 4. 兵庫農試森林土壌（褐色森林土 / 非火山灰土壌）

0.5g の土壌から抽出した DNA の 1 / 10 量を 1% Agarose S で電気泳動した。

２．土壌 DNA のサイズ
本キットを用いて抽出した土壌 DNA を 0.5% Agarose H で電気泳動した。その結果、抽出された土壌 DNA は 50kb 以上であった。
12
Lane 1. Marker 7GT（166, 50, 42, 23, 21, 18, 10, 1.3 kb）
Lane 2. 東大弥生圃場対照区土壌から抽出した DNA-5-

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040817MO:1805

３．PCR による系統群の検出
系統群検出用プライマーを用いて、本キットで抽出した土壌 DNA の PCR 解析を行った
結果、様々な系統群由来の DNA 断片が検出された。
12345671234567123456

東大弥生圃場対照区土壌

埼玉農試畑土壌

兵庫農試森林土壌

アロフェン質黒ボク土

灰色低地土

褐色森林土

7

Lane 1. OneSTEP Ladder 100
Lane 2. Bacteria（723 bp）
Lane 3. Bacillus species and relatives（600 bp）
Lane 4. High-G+C gram-positive bacteria（542 bp）
Lane 5. Streptomyces species and related taxa（1,243 bp）
Lane 6. Fungi, protists, and green algae（555 bp）
Lane 7. Plants（597 bp）
PCR 産物の一部を 2% Agarose S で電気泳動。
プライマー参考文献：
Small-Scale DNA Sample Preparation Method for Field PCR Detection of Microbial Cells andSpores in Soil.
Kuske CR, Banton KL, Adorada DL, Stark PC, Hill KK, Jackson PJ.
Appl Environ Microbiol. 1998 Jul 1;64(7):2463-72.

４．土壌 DNA の制限酵素消化
本キットで抽出した土壌 DNA を制限酵素 EcoRⅠで消化した。
1234567Lane 1. OneSTEP Marker 1（λ/ HindⅢ digest）
Lane 2. 東大弥生圃場対照区土壌 DNA intact
Lane 3. 東大弥生圃場対照区土壌 DNA / EcoRⅠ
Lane 4. 埼玉農試畑土壌 DNA intact
Lane 5. 埼玉農試畑土壌 DNA / EcoRⅠ
Lane 6. 兵庫農試森林土壌 DNA intact
Lane 7. 兵庫農試森林土壌 DNA / EcoRⅠ-6-ISOIL マニュアル（第 3 版）
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５．65℃インキュベート中の撹拌と土壌 DNA の収量
65℃インキュベート中の撹拌と土壌 DNA の収量について検討した結果、インキュベート中に転倒混和することで DNA の収量が上がることがわかった。
1234

5
Lane 1. OneSTEP Marker 1（λ/ HindⅢ digest）
Lane 2. 60 分間静置
Lane 3. 30 分間隔で転倒混和
Lane 4. 20 分間隔で転倒混和
Lane 5. 10 分間隔で転倒混和

６．土壌 DNA の PCR-DGGE 解析
本キットで抽出した土壌 DNA を用いて PCR-DGGE 解析を行った。
123456
Lane 1. 東大弥生圃場対照区土壌
Lane 2. 東大田無農場牧草地土壌
Lane 3. 千葉農試森林土壌
Lane 4. 草地試験場永年採草地土壌
Lane 5. 埼玉農試畑土壌
Lane 6. 兵庫農試森林土壌

データ提供：
東京大学大学院 農学生命科学研究科 応用生命化学専攻-7-

頼泰樹 博士ISOIL マニュアル（第 3 版）
040817MO:1805

Ⅶ トラブルシューティング

問題考えられる原因考えられる対策
できるだけ新鮮な土壌を使用してください。

土 壌 微 生 物 が 少 また、65℃でのインキュベートの際に、10 分間ない。

隔で溶液を転倒混和することで DNA 収量が増す
場合があります（データ集 5 参照）。
プロトコルステップ⑧では DNA の沈殿が剥がれやすい状態になっています。70%エタノールと共土壌 DNA の収量が DNA の沈殿が流 に付属の Ethachinmate を使用してください。ま少ない。

れている。

た、Ethachinmate により沈殿は可視化されますので、沈殿を流してしまわないように目で確認しながら注意深く上清を取り除いてください。

微生物が十分に破砕されていない。
ピペット操作やDNA がせん断され 撹 拌 時 に 物 理 的ている。

せん断が起きている。

Beads Beating による物理的な菌体破砕を採用している ISOIL for Beads Beating をご使用ください。ただし、物理的なせん断を受けるため、抽出される土壌 DNA は～23 kb 程度となります。
ピペットチップの先端をカットしてください。また、溶液を撹拌する際はボルテックスの使用を避け、転倒混和で十分に混合してください。

Lysis Solution 20S 低 温 に よ っ て 試 37～65℃程度でインキュベートし、結晶を完全に中に白い結晶が折 薬 が 析 出 し て い 溶解させてからご使用ください。品質、性能には出している。

る。

問題ありません。

Purification Solution 低 温 に よ っ て 試 37～65℃程度でインキュベートし、結晶を完全に中に白い結晶が析 薬 が 析 出 し て い 溶解させてからご使用ください。品質、性能には出している。

る。

問題ありません。
新しいキットをご購入ください。

Precipitation
Solution 中に浮遊物が見られる。

カビ等のコンタミが起きている。

本溶液はカビ等が繁殖しやすい溶液組成となっていますので、使用時のコンタミネーションには十分な注意が必要です。開封後は低温（2～10℃）で保存することをお奨めします。

ISOIL マニュアル（第 3 版）
040817MO:1805-8-

問題考えられる原因考えられる対策
新しいキットをご購入ください。
ただし、腐植物質のコンタミネーションが少ない場合はプロトコルステップ⑧は省略しても構Wash Solution 中に カ ビ 等 の コ ン タ浮遊物が見られる。 ミが起きている。

いませんので、その場合には Wash Solution は必要ありません。
また、本溶液はカビ等が繁殖しやすい溶液組成となっていますので、使用時のコンタミネーションには十分な注意が必要です。開封後は低温（2～10℃）で保存することをお奨めします。
新しい Ethachinmate をご購入ください。

Ethachinmate 中 に カ ビ 等 の コ ン タ また、使用時のコンタミネーションには十分注浮遊物が見られる。 ミが起きている。 意し、開封後は低温（2～10℃）で保存することをお奨めします。

土壌は様々な鉱物、粘土などの無機物、様々な植物および植物遺体、腐植物質をはじめとする土壌有機物、そしてそこに生息する多様な微生物から成り立っています。そのため、一つとして同じ土壌はないと言えます。
本キットは現在までの試験の結果、日本の数十種類の様々なタイプの土壌から DNA が抽出できることを確認していますが、土壌は極めて多様なサンプルであることから、土壌の種類や状態によっては収量が上がらない可能性があります。
本キットで抽出した土壌 DNA の収量が少ない場合、試薬や操作上の問題だけでなく、土壌サンプルが他にはない特異な性質を有している可能性も考慮してください。

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040817MO:1805

Ⅷ 関連製品

コード No.

製品名

包装単位

319-06201

ISOIL for Beads Beating

50 回用

312-06791

ISOIL Large for Beads ver.2

8 回用

318-06271

ISOFECAL

50 回用

315-06281

ISOFECAL for Beads Beating

50 回用

312-01791

Ethachinmate

0.2 ml

315-03981

Marker 7 GT（T4 GT7+T4 GT7/BglⅠ）

10 μg

310-05251

OneSTEP Marker 1（λ/ HindⅢ digest）

1,500 μl

313-05241OneSTEP Ladder 100（0.1-2.0 kbp）

312-01193

Agarose S100 g

319-01201

Agarose H

10 g

318-03231

Gene Taq NT

500 μl

250 units

マニュアル記載内容や製品仕様、価格に関しては予告なしに変更する場合があります。

お問い合わせ先株式会社ニッポンジーン
研究試薬部 学術営業課

TEL 076 - 451 - 6548
www.nippongene.com
お問い合わせは、お電話もしくは WEB フォームより承っております

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