組換えタンパク質発現用ベクター

Expression Vector
pLEAD DNA, pre-digested
マニュアル (第 4 版)

Code No. 315-06801
Code No. 312-06811

NIPPON GENE CO., LTD.

目 次
Ⅰ 製品説明 ······················································································································································· 2【Expression Vector pLEAD DNA の発現システムについて】 ······················································································· 2【Expression Vector pLEAD DNA における第 1 ORF 及び第 2 ORF の構造模式図】 ·········································· 3【第 1 ORF 終止コドンと第 2 ORF 開始コドンのオーバーラップ部位】 ······································································· 3【Expression Vector pLEAD DNA, pre-digested のクローニングサイト周辺配列情報】 ········································· 4

Ⅱ キット内容 ······················································································································································ 5
Ⅲ 保存 ································································································································································ 5
Ⅳ 使用上の注意 ·············································································································································· 5Ⅴ プロトコル ······················································································································································ 6【本品以外に必要な試薬、培地、機器など】 ····················································································································· 6【ベクターの選択】 ····································································································································································· 7【インサート DNA の調製】 ······················································································································································ 7[ リーダーORF 及びタンパク質 N 末端近傍の発現模式図 ］ ·········································································· 7【遺伝子クローニング】 ··························································································································································· 11[ 2×Ligation Mix と Competent E.coli JM109 を用いたプロトコル例 ］ ······················································· 13【タンパク質発現確認】 ·························································································································································· 14【タンパク質発現】 ··································································································································································· 14
Ⅵ データ集 ······················································································································································ 15
Ⅶ トラブルシューティング ····························································································································· 16
Ⅷ 参考文献 ····················································································································································· 17

1pLEAD Manual (ver.4) 1808

Ⅰ 製品説明
Expression Vector pLEAD DNA は、大腸菌を用いてタンパク質を生産するための組換えタンパク質発現用ベクターです。
転写された mRNA から効率良く翻訳が行われるように改変された配列を有し、大腸菌での発現が難しいとされる好熱菌や放線菌などの GC 含有率の高い遺伝子からのタンパク質発現に特に有効です。タグ配列を付加せず、また融合タンパク質としないため、タンパク質本来のアミノ酸配列を反映した発現が可能です。
Expression Vector pLEAD DNA, pre-digested はあらかじめクローニングに用いる制限酵素で消化済みであるため、簡便に実験を開始できます。

【Expression Vector pLEAD DNA の発現システムについて】
発現用ベクターを用いて大腸菌に異種タンパク質を発現させる手法は、タンパク質の研究や産業応用において不可欠な技術とされています。大腸菌は取り扱いが簡便で成育が早く、異種タンパク質の生産に最適な宿主として広く用いられていますが、遺伝子の配列によっては大腸菌に対し致死的に作用する場合や、不溶化などにより極めて少量のタンパク質しか得られない場合が少なくありません。
この問題を解決するために、GC 含有率の高い遺伝子からのタンパク質発現効率が良い発現用ベクタークローンのスク
リーニング(1)の結果に基づき、Expression Vector pLEAD4 DNA 及び Expression Vector pLEAD5 DNA が構築されました(2)。
この発現効率の上昇は、目的遺伝子の直前に挿入された短い ORF (Open Reading Frame) に起因しています。スクリーニ
ングにより得られた高発現クローンでは、この短い ORF (リーダーORF) の終止コドンと目的遺伝子の開始コドンに塩基の重複が見出されました(1、3、4)。
一般に大腸菌に用いる発現用プラスミド DNA は、ベクター上のプロモーター下流に目的遺伝子を挿入して構築されます。しかしながら、実際に発現するかどうかは使用するプロモーターと発現させたいタンパク質をコードする遺伝子の N 末
端付近の配列に依存すると考えられており、安定な発現系の構築までには試行錯誤が必要となります。特に GC 含有率の高い遺伝子は大腸菌での発現が困難となる場合があり、原因はその翻訳開始効率の低さにあると考えられています(5)。
この ORF の重複を利用して組換えタンパク質を効率良く翻訳させることを目的に構築されたのが Expression Vector
pLEAD4 DNA 及び Expression Vector pLEAD5 DNA です(2)。Expression Vector pLEAD DNA は AT 含有率の高い遺伝子の発現に対しても有効であることが示されており(6)、通常のタンパク質発現だけでなく、従来の発現用ベクターでは発現が難しかった遺伝子からのタンパク質発現における効果が期待できます。

＊ () 中の数字は参考文献番号に対応しています。参考文献に関しては、17 ページを参照して下さい。

2
pLEAD Manual (ver.4) 1808

【Expression Vector pLEAD DNA における第 1 ORF 及び第 2 ORF の構造模式図】
1 つの転写単位の中に 2 つの翻訳単位を配置することにより、第 1 ORF (リーダーORF) の翻訳と第 2 ORF (目的遺伝子) の翻訳を同時に行います。

DNA
転写

ATG

mRNA

ATG

翻訳

NH 2

COOH

第 1 ORF(リーダーORF)

タンパク質
NH2

COOH

第 2 ORF(目的遺伝子)【第 1 ORF 終止コドンと第 2 ORF 開始コドンのオーバーラップ部位】
下図の RBS は、遺伝子にコードされる mRNA 上の Ribosome Binding Sequence に対応しています。
Expression Vector pLEAD4 DNA： 4 bp overlap
終止コドン5’----AGGAGGATTTACGTATGANNNNNNNN----3’
RBS

開始コドン

Expression Vector pLEAD5 DNA： 1 bp overlap
終止コドン5’----AGGAGGATCACGTGATGNNNNNNNN----3’
RBS

開始コドン

3
pLEAD Manual (ver.4) 1808

【Expression Vector pLEAD DNA, pre-digested のクローニングサイト周辺配列情報】
下図の RBS は、遺伝子にコードされる mRNA 上の Ribosome Binding Sequence に対応しています。各
ベクターの配列は GenBank （NCBI; National Center for Biotechnology Information） を参照して下さい。
Accession number
Expression Vector pLEAD4 DNA： AB049968
Expression Vector pLEAD5 DNA： AB049969

Expression Vector pLEAD4 DNA, pre-digested
EcoR IRBS

Nde I

EcoR V

Sac I

RBS

5’-GAATTCAGGAGGATTATCATATGACCATGATTGATATCAGGAGGATTTAC
3’-CTTAAGTCCTCCTAATAGTATACTGGTACTAACTATAGTCCTCCTAAATG
平滑末端

Kpn I

Stu I

BamH I Hind III

CGGTACCTAGGCCTGGATCCAAGCTT-3’
TCGAGCCATGGATCCGGACCTAGGTTCGAA-5’
突出末端

Expression Vector pLEAD5 DNA, pre-digested
EcoR IRBS

Nde I

EcoR V

Sac I

RBS

5’-GAATTCAGGAGGATTATCATATGACCATGATTACTGATATCAGGAGGATCAC
3’-CTTAAGTCCTCCTAATAGTATACTGGTACTAATGACTATAGTCCTCCTAGTG
平滑末端

Ptac

Kpn I

Stu I

BamH I Hind III

CGGTACCTAGGCCTGGATCCAAGCTT-3’
TCGAGCCATGGATCCGGACCTAGGTTCGAA-5’
突出末端

Trrn

pLEAD4/pLEAD5
2,657 bp/2,659 bp

Ampr
Ori

Ptac: tac プロモーター
TrrnB： rrnB ターミネーター
Ampr： アンピシリン耐性遺伝子 (ß-ラクタマーゼ遺伝子)
Ori： Origin (複製起点)
4pLEAD Manual (ver.4) 1808

Ⅱ キット内容

Code No. 315-06801
Expression Vector pLEAD4 DNA, pre-digested

5.0 µgExpression Vector pLEAD4 DNA, pre-digested (0.5 µg/µl)

10 µl

マニュアル

1部

Code No. 312-06811
Expression Vector pLEAD5 DNA, pre-digested

5.0 µgExpression Vector pLEAD5 DNA, pre-digested (0.5 µg/µl)

10 µl

マニュアル

1部

Ⅲ 保存
Expression Vector pLEAD DNA, pre-digested は-20℃で保存して下さい。

Ⅳ 使用上の注意
・

本品は試験研究用試薬ですので、医薬品、その他の目的にはご使用になれません。

・

試薬についての基本的な知識のある方以外は取り扱わないでください。

・

本品のお取り扱いは、マニュアル記載内容通りに行ってください。

・

マニュアル記載内容と異なったお取り扱いによるトラブルにつきましては、株式会社ニッポンジーン
では責任を負いかねます。

5
pLEAD Manual (ver.4) 1808

Ⅴ プロトコル【本品以外に必要な試薬、培地、機器など】
・ マイクロピペット
・ ピペットチップ
・ マイクロチューブ
・ インキュベーター
・ マイクロ遠心機
・ LB 培地 (液体・寒天)・ アンピシリン
・ IPTG・ 滅菌蒸留水・ EDTA・ Tris-HCｌ (pH8.0)
・ NaCl・ Tween 20
・ Phenylmethylsulfonyl fluoride・ 2-mercaptoethanol
・ Glycerol
・ Bromo Phenol Blue・ T4 Polynucleotide Kinase： リン酸化プライマーを調製する場合
・ SDS
・ 制限酵素： インサート DNA を制限酵素により調製する場合
・ Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1)： インサート DNA を制限酵素により調製する場合
・ 99.5 %エタノール： インサート DNA を制限酵素により調製する場合
・ 70 %エタノール： インサート DNA を制限酵素により調製する場合
・ 5 M Ammonium Acetate： インサート DNA を制限酵素により調製する場合
・ SOC medium・ ライゲーション用試薬（ニッポンジーン製 Ligation-Convenience Kit 等)
・ 大腸菌 Lac リプレッサー (LacIq 遺伝子) 高発現株 (JM109、XL1-Blue 等)

ニッポンジーンでは、バッファーや酵素などを取り扱っております。詳しくはお問い合わせ下さい。

www.nippongene.com

6
pLEAD Manual (ver.4) 1808

【ベクターの選択】
Expression Vector pLEAD4 DNA では、目的遺伝子の 2 アミノ酸目に対応するコドンの 1 塩基目が Aに限定されます。従って、2 番目のアミノ酸はイソロイシン、メチオニン、スレオニン、アスパラギン、リジン、セリン、アルギニンのいずれかに制限されます。
発現させるタンパク質の N 末端側より 2 アミノ酸目に対応するコドンの 1 塩基目が A である場合或いは
A に置換可能である場合 (2 アミノ酸目がセリン或いはアルギニンの場合) は、Expression Vector
pLEAD4 DNA、Expression Vector pLEAD5 DNA ともに使用可能です。
発現させるタンパク質の N 末端側より 2 アミノ酸目に対応するコドンの 1 塩基目が A 以外であり、A には置換できない場合には、Expression Vector pLEAD5 DNA をご使用下さい。
【インサート DNA の調製】
各ベクターには、下記のインサート DNA をあらかじめ準備する必要があります。
インサート DNA の配列にはいくつかの制限がありますので、以下の方法に従ってインサートを作製して下さい。
[ リーダーORF 及びタンパク質 N 末端近傍の発現模式図 ]下図では、アミノ酸を一文字表記にて表示しており、ter は終止コドンを示しています。

Expression Vector pLEAD4 DNA
リーダーORFM T M I D I

R R I

Y V ter5’----CATATGACCATGATTGATATCAGGAGGATTTACGTATGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN----3’
M N N N N N
目的遺伝子

N---terExpression Vector pLEAD5 DNA
リーダーORFM T M I T D

I R R

I T ter5’----CATATGACCATGATTACTGATATCAGGAGGATCACGTGATGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN----3’
M N N N N N---ter
目的遺伝子

7pLEAD Manual (ver.4) 1808

方法 1： PCR 法を用いた制限酵素認識配列の付加及び 5’末端のリン酸化
下記に従ってプライマーを設計し、PCR 法により C 末端側に制限酵素 Sac I 認識配列を付加します。
目的遺伝子に Sac I の認識配列が含まれる場合は、代わりに Kpn I、Stu I、BamH I、Hind III のいずれかの認識配列を付加し、pLEAD pre-digested も同一の制限酵素にて消化して下さい。
PCR 法により得られた DNA 断片は Klenow Fragment により平滑化注１し、続いて 5'末端をリン酸化注２してから C 末端側に付加した制限酵素認識配列をその制限酵素で消化して下さい。
非特異的な増幅産物が認められる場合には、ライゲーションの前にアガロースゲルからの切り出しを行
い、DNA 断片の精製を行って下さい。
注１

3'-5' exonuclease 活性を有する DNA Polymerase を PCR 法に用いた場合、DNA 断片の平滑化は不要です。

注 2 あらかじめ化学合成或いは T4 Polynucleotide Kinase により 5'末端にリン酸基を付加したプライマーを使用する
場合、5’末端のリン酸化は不要です。

Expression Vector pLEAD4 DNA
PCR プライマー
N 末端側：

5'-GTATGA + NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'＊ ATG (下線部) は目的遺伝子の開始コドンに対応

C 末端側：

5'-NNNNN GAGCTC TTA + NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
5'-NNNNN GAGCTC TA + NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
5'-NNNNN GAGCTC A + NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'＊ TTA、CTA、TCA (下線部) は目的遺伝子の終止コドンに対応

使用する制限酵素
GAGCT|C: Sac I
Expression Vector pLEAD5 DNA
PCR プライマー
N 末端側：

5'-GTGATG + NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
5'-CTGATG + NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'＊ ATG (下線部) は目的遺伝子の開始コドンに対応

C 末端側：

5'-NNNNN GAGCTC TTA + NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
5'-NNNNN GAGCTC TA + NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
5'-NNNNN GAGCTC A + NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'＊ TTA、CTA、TCA (下線部) は目的遺伝子の終止コドンに対応

使用する制限酵素
GAGCT|C: Sac I

8pLEAD Manual (ver.4) 1808

［リン酸化プライマー調製プロトコル］①

下記の組成の反応溶液を作製する。
100 µM オリゴヌクレオチド

50 µl

10×Kinase Buffer A 注 3

10 µl

100 mM rATP

1 µl

T4 Polynucleotide Kinase

5 µl(100 units)

H2O

34 µl

/Total

注3

100 µl

10×Kinase Buffer A 組成
500 mM Tris-HCl (pH 7.6)
100 mM MgCl2
50 mM DTT
1 mM Spermidine
1 mM EDTA②

37℃で 1 時間静置する。

③

Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) 100 µl を添加し、ボルテックスにより十分に撹拌した後、12,000 rpm、5 分間、25℃にて遠心する。

④

上清 100 µl を新しいチューブに移し、5 M Ammonium Acetate 100 µl と 99.5 %エタノール 400 µl を添加してボルテックスにより十分に撹拌した後、-80℃に 15 分間或いは-20℃に 1 時間静置する。

⑤

15,000 rpm、15 分間、4℃にて遠心し、上清を除去する。

⑥

70 %エタノール 1 ml を添加して穏やかにチューブを転倒させた後、15,000 rpm、5 分間、4℃にて遠心し、上清を除去する。

⑦

キャップを開けたまま 15 分間程度静置し、沈澱を風乾する。

⑧

滅菌蒸留水に溶解し、濃度を 10 µM 程度に調整して PCR 法に用いる。

9pLEAD Manual (ver.4) 1808

方法 2： PCR 法を用いた制限酵素認識配列の付加
下記に従ってプライマーを設計し、PCR 法により両末端に制限酵素認識配列を付加します。目的遺伝
子に Sac I の認識配列が含まれる場合は、代わりに Kpn I、Stu I、BamH I、Hind III のいずれかの認識配列を C 末端側に付加し、pLEAD pre-digested も同一の制限酵素にて消化して下さい。
非特異的な増幅産物が認められる場合には、ライゲーションの前にアガロースゲルからの切り出しを行
い、DNA 断片の精製を行って下さい。
Expression Vector pLEAD4 DNA
PCR プライマー
N 末端側：

5'-NNNNN TACGTA TGA + NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'＊ ATG (下線部) は目的遺伝子の開始コドンに対応

C 末端側：

5'-NNNNN GAGCTC TTA + NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
5'-NNNNN GAGCTC TA + NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
5'-NNNNN GAGCTC A + NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'＊ TTA、CTA、TCA (下線部) は目的遺伝子の終止コドンに対応

使用する制限酵素
TAC|GTA: SnaB I、Eco105 I
GAGCT|C: Sac I
Expression Vector pLEAD5 DNA
PCR プライマー
N 末端側：

5'-NNNNN CACGTG ATG + NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
5'-NNNNN CAGCTG ATG + NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'＊ ATG (下線部) は目的遺伝子の開始コドンに対応

C 末端側：

5'-NNNNN GAGCTC TTA + NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
5'-NNNNN GAGCTC TA + NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'
5'-NNNNN GAGCTC A + NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'＊ TTA、CTA、TCA (下線部) は目的遺伝子の終止コドンに対応

使用する制限酵素
CAC|GTG: PmaC I、Pml I、BbrP I、Eco72 I
CAG|CTG: Pvu II (インサート DNA は切り出せなくなります)
GAGCT|C: Sac I

10pLEAD Manual (ver.4) 1808

【遺伝子クローニング】
目的遺伝子に Sac I が含まれない場合①

滅菌蒸留水を用いて Expression Vector pLEAD DNA, pre-digested を 0.1 µg/µl に希釈する。

②

インサート DNA を準備し、ライゲーション、形質転換注 4 を行う。ライゲーションにおけるベクター：インサート比に関しては下記を参照する。

③ コロニーPCR 注 5 によりインサート DNA の挿入を確認する。
④

必要に応じてプラスミド DNA を抽出してシークエンシングにより内部配列を確認する。

目的遺伝子に Sac I が含まれる場合
目的遺伝子に Sac I が含まれる場合は Expression Vector pLEAD DNA, pre-digested を Kpn I、Stu I、

BamH I、Hind III のいずれかの制限酵素でさらに消化する必要があります。
① Kpn I、Stu I、BamH I、Hind III の中から目的遺伝子に含まれない制限酵素認識配列を選択し、100µl の反応系にて Expression Vector pLEAD DNA, pre-digested 及びインサート DNA をそれぞれ消化する。
② Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) 100 µl を添加し、ボルテックスにより十分に撹拌した後、12,000 rpm、5 分間、25℃にて遠心する。
③

上清 100 µl を新しいチューブに移し、5 M Ammonium Acetate 100 µl と 99.5 %エタノール 400 µl を添加してボルテックスにより十分に撹拌した後、-80℃に 15 分間或いは-20℃に 1 時間静置する。

④

15,000 rpm、15 分間、4℃にて遠心し、上清を除去する。

⑤

70 %エタノール 1 ml を添加して穏やかにチューブを転倒させた後、15,000 rpm、5 分間、4℃にて遠心し、上清を除去する。

⑥

キャップを開けたまま 37℃のエアーインキュベーター内に静置し、沈澱を風乾する。

⑦

滅菌蒸留水に沈殿を溶解し、Expression Vector pLEAD DNA, pre-digested の DNA 濃度を 0.1µg/µl に調整する。

⑧

上記と同様に調製されたインサート DNA とライゲーションし、形質転換注 4 を行う。ライゲーションにおけるベクター：インサート比に関しては下記を参照する。

⑨

コロニーPCR 注 5 によりインサート DNA の挿入を確認する。

⑩

必要に応じてプラスミド DNA を抽出してシークエンシングにより内部配列を確認する。

ベクター：インサート比
ベクター：インサートのモル比はライゲーションの効率に大きく影響しますので、下記の表を参考にベク
ター：インサート比を設定して下さい。
インサート長200 bp600 bp1,000 bp3,000 bp

ベクター

1.0

1.0

1.0

1.0

インサート

5.0

5.0

2.0-10.0

0.5-2.011pLEAD Manual (ver.4) 1808

注 4 宿主とする大腸菌には、JM109、XL1-Blue 等、Lac リプレッサー (LacIq 遺伝子) 高発現株を選択して下さい。

Lac リプレッサーを発現していない大腸菌では、形質転換効率が低下する場合があります。

注5

コロニーPCR には、プライマーが別途必要です。
下記配列 のプ ライマー が使 用可能です。 各ベクター の配列は GenBank （NCBI; National Center for
Biotechnology Information） を参照して下さい。

Accession number
Expression Vector pLEAD4 DNA： AB049968
Expression Vector pLEAD5 DNA： AB049969

プライマー配列
pLEAD-Forward： 5’-ACAATTAATCATCGGCTCG-3’
pLEAD-Reverse： 5’-CAGACCGCTTCTGCGTTCTG-3’

Expression Vector pLEAD4 DNA

5’-TGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTT
CACACAGGAAACAGAATTCAGGAGGATTATCATATGACCATGATTGATATCAGGAGGATTTAC----------AGCTCGGTACCTAGGCCTGGATCCAAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCCTGATACAGATTAAATCAGAACGCAGAAGCGGTCTGATAAA-3’

Expression Vector pLEAD5 DNA

5’-TGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTT
CACACAGGAAACAGAATTCAGGAGGATTATCATATGACCATGATTACTGATATCAGGAGG
ATCAC---------AGCTCGGTACCTAGGCCTGGATCCAAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCCTGATACAGATTAAATCAGAACGCAGAAGCGGTCTGATAAA-3’

部分はベクター由来の配列を示す。

12
pLEAD Manual (ver.4) 1808

［2×Ligation Mix と Competent E.coli JM109 を用いたプロトコル例］
以下は、ニッポンジーンの 2×Ligation Mix（Ligation-Convenience Kit）と Competent E.coli JM109 を用いて遺伝子クローニングを行った場合のプロトコル例です。
①

インサート DNA を準備する。

②

Expression Vector pLEAD DNA, pre-digested (0.1 µg/µl) 1 µl にインサート DNA と滅菌蒸留水を添加して 5 µl とする。ライゲーションにおけるベクター：インサート比に関しては下記を参照する。

③

2×Ligation Mix 5 µl を添加してピペッティングにより混和する。

④

16℃で 15 分間静置する。

⑤

Competent E.coli JM109 90 µl を添加してピペッティングにより混和する。

⑥

氷上或いは 4℃にて 30 分間静置する。

⑦

ヒートブロック或いはウォーターバスを用いて 42℃、45 秒間熱処理した後、速やかに氷上或いは 4℃に移し 5 分間静置する。

⑧

SOC medium 900 µl を添加し、チューブを転倒させて混和した後 37℃に 1 時間静置する。

⑨

6,000 rpm、5 分間、4℃で遠心し、上清 900 µl を除去する。

⑩

ピペッティングにより Competent E.coli JM109 の沈澱を懸濁し、50 µg/ml のアンピシリンを含む LB
寒天培地に塗布する。

⑪

37℃にて一晩倒置培養する。

⑫

コロニーPCR によりインサート DNA の挿入を確認する。

⑬

必要に応じてプラスミド DNA を抽出してシークエンシングにより内部配列を確認する。

ベクター：インサート比
ベクター：インサートのモル比はライゲーションの効率に大きく影響しますので、下記の表を参考にベク
ター：インサート比を設定して下さい。
インサート長200 bp600 bp1,000 bp3,000 bp

ベクター

1.0

1.0

1.0

1.0

インサート

5.0

5.0

2.0-10.0

0.5-2.013
pLEAD Manual (ver.4) 1808

【タンパク質発現確認】①

プラスミド DNA を保持した菌体を 50 µg/ml アンピシリンを含む LB 液体培地 1～5 ml に植菌し、37℃
にて 20 時間程度振盪培養する。

②

培養液をマイクロチューブに移し、12,000 rpm、1 分間、4℃で集菌し、上清を除去する。

③

集菌した菌体に破砕バッファー注 6 100 µl と 2×サンプルバッファー注 7 100 µl を添加し、90℃で 2 分間処理する。

④

5～10 µl を SDS-PAGE により分離し、タンパク質の発現を確認する。
注6

破砕バッファー組成
20 mM Tris-HCl (pH 8.0)
1 mM EDTA (pH 8.0)
200 mM NaCl
1 % Tween 20
30 µg/ml Phenylmethylsulfonyl fluoride
2 mM 2-mercaptoethanol

注7

2×サンプルバッファー組成
40 mM Tris-HCl (pH 6.8)
4 % SDS
20 % Glycerol
0.02 % Bromo Phenol Blue
5 mM 2-Mercaptoethanol【タンパク質発現】①

前培養：プラスミド DNA を保持した菌体を 50 µg/ml アンピシリンを含む LB 液体培地 (本培養の1/100 倍量) に植菌し、37℃にて 20 時間程度振盪培養する。

②

本培養：培養液を 100 倍量の LB 液体培地に植え継ぎ、37℃にて 20 時間程度振盪培養する。

③

適した容量の容器に培養液を移し、遠心により集菌する。

④

タンパク質の精製を行う。すぐに使用しない場合は-80℃に保存する。
LB 液体培地中において基底レベルで十分な発現量が得られるため、原則として IPTG による強制発

現誘導は不要です。
LB 液体培地で発現量が少ない場合には、IPTG による発現誘導が必要である場合があります。その場
合は 0.1 mM 程度の IPTG を添加して発現コントロールを行って下さい。IPTG 過多の条件下では発現量(発現菌体量) が著しく低下する場合がありますのでご注意下さい。

14
pLEAD Manual (ver.4) 1808

Ⅵ データ集【実験例１】 Expression Vector pLEAD5 DNA による耐熱性 DNA ポリメラーゼの発現
耐熱性 DNA ポリメラーゼを発現させた大腸菌を超音波破砕し、可溶性画分を SDS-PAGE により分離した。
Expression Vector pLEAD5 では、IPTG による強制的な発現誘導を行うことなく、従来の発現用ベクター (vector A) よりも効率良く耐熱性 DNA ポリメラーゼが豊富に発現した。

＜発現条件＞
Lane 1: pLEAD5 (E.coli JM109/37℃)
Lane 2: vector A (E.coli JM109/37℃、1 mM IPTG)

1

2【実験例２】 Expression Vector pLEAD5 DNA で発現したタンパク質の熱安定性試験
上記実験例１で得た耐熱性DNAポリメラーゼを精製し、熱処理後の活性を評価した。
Expression Vector pLEAD5で発現した耐熱性DNAポリメラーゼは、70℃で80分間の熱処理を施した後も活性を維持しており、従来の発現ベクター (vector A) を用いてIPTG誘導により強制発現させたタンパ
ク質と比較して熱安定性において優れていた。
vector A

pLEAD5
2

3

1

100.0

Relative activity (%)

Relative activity (%)

1

75.0

50.0

25.0

2

3

100.0

75.0

50.0

25.0

0.0

0.0
1

2

1: 未処理1

3

2: 70℃・40 分間

2

3

3: 70℃・80 分間＊ 未処理の場合の DNA ポリメラーゼ活性を 100 %とする。

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Ⅶ トラブルシューティング
問題

考えられる原因考えられる対策

ベクター：インサート比が適していない
DNA の末端が一致していない

インサート量を増やして再検討して下さい。
末端の配列が正しいかどうか確認して下さい。
宿主とする大腸菌には、JM109、XL1-Blue 等、Lacコロニーが得られない宿主とする大腸菌が Lac リプレッサーを発現していない

リプレッサー (LacIq 遺伝子) 高発現株を選択して下さい。Lac リプレッサーを発現していない大腸菌では、形質転換効率が低下する場合があります。

IPTG 過剰の状態になっている
発現しない

インサートに短い DNA 断片が混入している
フレームが合っていない

IPTG を含む培地中では大腸菌の育成が著しく阻害される場合があります。
アガロースゲルからの切り出しを行って下さい。
フレームが正しく合っているか確認して下さい。
LB 液体 培地 で発 現 量が 少 ない 場合 には 、
IPTG による発現誘導が必要である場合がありま

強制発現誘導が必要である

す。0.1 mM 程度の IPTG を添加して発現コント
ロールを行って下さい。

タンパク質の発現が少ない

目的遺伝子の N 末端周辺の配列は大腸菌の菌
コドンユセージが大腸菌に適し 体内における翻訳効率に影響します。必要な場合は大腸菌のコドンユセージに合わせた塩ていない基への変更を検討して下さい。
上述の IPTG 誘導を検討しても効果が見られな発現が困難なタンパク質である い場合には、培養時間を 20 時間以上に増やして下さい。
タンパク質の発現にはその生物独自の様々な細胞内の要素が関与しています。大腸菌を用いた異種タンパク質の発現はタンパク質研究において有用な技術ですが、全てのタンパク質について均一な発現を行うことは困難です。
目的の遺伝子によっては Expression Vector pLEAD DNA を用いても発現効率が改善しない場合や、従来の発現用ベクターよりも発現量が少なくなる可能性がありますので、タンパク質の性質を考慮した上で、適切なケースで Expression Vector pLEAD DNA を使用して下さい。

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pLEAD Manual (ver.4) 1808

Ⅷ 参考文献

1. Suzuki, T., Tanaka, Y., Ishida, M., Ishizuka, M., Yamagishi, A., Oshima, T. (1997) Screening of amutant plasmid with high expression efficiency of GC-rich leuB gene of an extreme thermophile,

Thermus thermophilus, in Escherichia coli. J. Biochem. 121, 1031-1034
2. Ishida, M., Oshima, T. (2002) Effective Structure of a Leader Open Reading Frame for Enhancing theExpression of GC-Rich Genes. J. Biochem. 132, 63-70
3. Ishida, M., Oshima, T. (1996) A leader open reading frame is essential for the expression in

Escherichia coli of GC-rich leuB gene of an extreme thermophile, Thermus thermophilus. FEMS
Microbiol. Lett. 135, 137-142
4. Ishida, M., Yoshida, M., Oshima, T. (1997) Highly efficient production of enzymes of an extreme
thermophile, Thermus thermophilus: A practical method to overexpress GC-rich genes in

Escherichia coli. Extremophiles. 1, 157-162
5. Ishida, M., Oshima, T. (1994) Overexpression of genes of an extreme thermophile Thermus

thermophilus, in Escherichia coli cells. J. Bacteriol. 176, 2767-2770
6. Ishida, M., Oshima, T., Yutani. K. (2002) Overexpression in Escherichia coli of the AT-rich trpA andtrpB genes from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus. FEMS Microbiol. Lett. 216,
179-183

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