技術情報

Nucleofection™を使ったsiRNA実験のデザイン
Amaxa™ Nucleofector™ テクノロジーは、初代細胞と遺伝子導入の難しい細胞株への siRNA や shRNA ベクターの遺伝子導入に最適です。

siRNAの選択

細胞型と遺伝子導入プロトコルの選択■ 標的遺伝子を選択■ 実験結果の生理学的関連性を高めるための細胞型を選択■ コントロールsiRNAを選択■ Amaxa™ 最適化Nucleofection™プロトコルを入手–

Non-Targeting Control*■ 遺伝子導入コントロールを選択

ポジティブコントロールsiRNA –例：siGENOME®

–

未処理細胞 (siRNAなし、もしくは遺伝子導入なし)–

Mock-transfection (siRNAなし、 遺伝子導入あり)

GAPDH siRNA*

siRNA導入の確認

遺伝子導入–

at www.lonza.com/cell-database

ネガティブコントロールsiRNA –例：siGENOME®

■ siRNAの導入効率の確認:–––

蛍光標識siRNA

検出法の選択または■ 検出法の選択;

蛍光発現プラスミド (例：pmaxGFP™ベクター)
または–mRNA ̶ branched-DNA, RT-PCR

pmaxGFP™ベクターおよびmaxGFP™レポータータン
パク質siRNA–タンパク質 ̶ ELISA, ウェスタン, FACS解析–

表現型 ̶ 生存率, アポトーシス

または–ハウスキーピング遺伝子を標的としたsiRNA検出法の調整標的のノックダウンの最適化■ 特定のシステムに応じて検出法を最適化■ 最適なsiRNA濃度の決定––Nucleofector™ 装置 ➞ 0.2 – 200 pmol (2 nM – 2 µM)–

96-well Shuttle™ 装置 ➞ 0.04 – 40 pmol (2 nM – 2 µM)

一回あたりの検出範囲に応じた最適な細胞密度の決定–

複数の検出法からの結果の相関付け

検出条件の最適化–

タイムコースでの検出もしくは複数の検出法を試す–mRNA ➞ 12 – 72 時間–Protein ➞ 24 – 96 時間

サイレンシングの特異性の確認■ 異なるsiRNA試薬でノックダウンの結果を確認–siGENOME® SMARTpool® siRNA Reagents*を使用した場合、 ON-TARGETplus® SMARTpool®
siRNA Reagents*を使って同じ遺伝子のノックダウンを確認する–siGENOME® siRNA*を使用した場合, 同じ遺伝子を標的とした複数のsiRNAを使用する■ 可能であれば、レスキュー実験をする*Thermo Fisher Scientific, Dharmacon Products

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pmaxGFP™ベクターで、Nucleofection™条件を確立/検■ 未処理の遺伝子導入コントロール
未処理のコントロールサンプルはsiRNAで処理されず、証します。
特定の細胞型に対する最適なNucleofection™条件は、DNAまたは RNA のどちらを遺伝子導入するかに関わらず同一となります。カスタマーの細胞に最適なNucleofector™溶液およびプログラムを確立 / 検証するために pmaxGFP™ ベクター

遺伝子導入プロセスにも関連しない細胞から構成されています。このコントロールは、他のすべての条件と比較して基準となる細胞活性自体の指標として使用できます。
■ 偽処理コントロール（各キットに含まれるポジティブコントロールプラスミ

偽処理のコントロールサンプルは、siRNAを含まずに遺ド）で予備実験を行うよう推奨されます。条件を決定した伝子導入を行った細胞です。Nucleofection™の場合、細胞はNucleofector™溶液と混合され、siRNAを含まない状時に）遺伝子導入するかに関わらず、その条件が適用され態でNucleofection™操作を行います。偽処理細胞の分析

ます 。

によって、遺伝子導入プロセス自体が細胞毒性またはその他の非特異的効果を示すかどうかが分かります。

適切な実験コントロールを特定します。

siRNAの実験から導き出される結果が正確であるようにする

精密に調整された特異的siRNA 配列/濃度ため、適切な実験コントロールを設定する必要がありま

同一のNucleofection™条件を使用すれば、siRNAを予備実験す。各 RNAi 実験において、少なくとも 4 種類の実験コントで使用されるpmaxGFP™ベクターに置き換えることができまロールを設定するよう推奨されます。複数の条件下での複す。（独立した平行サンプル、またはsiRNAを用いた
N u c l e o fe c t i o n ™ に よ る 共 遺 伝 子 導 入 の い ず れ か で ）pmaxGFP™ ベクターを実験間での相対的遺伝子導入効率を数コントロールを使った平行試験は96-wellShuttle™システ

ムを使用することで簡単に実行できます。

比較もしくは遺伝子導入される細胞を選択するための手段■ siRNAポジティブコントロール
サイクロフィリンB（PPIBとしても知られる）、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）、ラミンなどのハウスキーピング遺伝子を標的とするsiRNAプールまたは単体の siRNAを使用します。十分に発現するものの非必須の遺伝子を標的とする良好なポジティブコントロールは生細胞率に影響しない実験パラとして取り入れることができます。 DNA を用いた遺伝子導入効率は通常siRNAと比較してかなり低くなります。蛍光でラベリングしたオリゴヌクレオチドの使用に興味があれば、まずこの文書中補注部分を一読するか、ロンザの技術サポートチームにお問い合わせください。
■ 最適なsiRNA 配列の選択メータを設定するのに役立ちます。またこれは、研究対あらかじめ特性が明らかになっていないsiRNA配列を使象に関連する特定の経路と無関係なネガティブコント用している場合は、慎重に配列の選択をするように推奨ロールとして使用することもできます（目的遺伝子に対されます。siRNAを提供している会社の多くは、オリゴするアッセイでは表現型が観察されない）。

ヌクレオチドの最適化サービスを提供しています。しかし、遺伝子特異的なsiRNAオリゴヌクレオチドをいくつ■ siRNAネガティブコントロール

siRNAネガティブコントロールは、選択される細胞型において既知の標的にならないよう生物情報学的に設計、検証されています。これらの試薬は、siRNAの細胞への導入に関連する配列非依存性効果と配列固有のサイレンシングを区別するのに重要です。このような配列非依存かテストして、標的となる遺伝子を効率的にダウンレギュレートするsiRNAオリゴヌクレオチドの同定が必要となる場合もまだ珍しくありません。
■ 最適な有効siRNA濃度の決定性効果の例として、核酸導入に関連する遺伝子導入のプ

siRNA媒介性ノックダウン実験を実行する際、用量反応（濃度）解析によって、mRNA、タンパク質または機能ロセスまたは二本鎖RNAの導入に対する過敏性に起因すレベルに対して十分なターゲットのノックダウンに必要る毒性があります。ネガティブコントロールが観察可能なsiRNAの最小濃度を決定するよう推奨されます。

で、標的とは無関係の意図しない効果を引き起こさないことを実験的に確認するために、各実験システムにおいNucleofection™では、最適なsiRNA濃度は 2 nM 以下から2 µMの間です。最適な濃度は細胞型やmRNAおよび/まて複数の候補を試験するよう推奨されます。このたたはターゲット遺伝子のタンパク質の半減期など複数のめ、 Thermo Fisher Scientificは複数のネガティブコン要因によって異なります。研究対象の細胞型やターゲッ

ト ロ ー ル の 製 品 群 を 取 り 揃 え て い ま す 。 例 え ば ON-トに最適な濃度を決定するために siRNA 濃度の初期滴

TARGETplus®Non-Targeting Controlsがありますが、これはマイクロアレイ解析によって、 HeLa 細胞において標（Nucleofector™装置：0.2〜200 pmol / 100 µl、96-well

的とは無関係の効果をわずかしか又は全く示さないことが確認されています。

遺伝子導入

ら、基質としてDNAまたはRNAのどちらを（あるいは両方同定を 2 nM 〜 2 µM の間で実行するよう推奨されます

Shuttle™装置0.04〜40 pmol / 20 µl）。最小濃度決定には
30および300 nMを使用してください。使用するsiRNAの濃度は脂質媒介型の方法より高いように見えますが、

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表1：低濃度siRNAを用いたNucleofection™
siRNA濃度

細胞型

標的/解析法

ノックダウン

参考文献

2 nM (0.2 pmol*)

COS-7 (サル腎臓線維芽細胞)

Bruton's チロシンキナーゼ / FACS

96%

5

7 nM (0.7 pmol*)

THP-1 (ヒト単球白血病)

インターフェロン調節因子 (IRF5) / RT-PCR»強く抑制«

6

1 nM (0.1 pmol*)

HUVEC (ヒト臍帯静脈内皮細胞)

インターフェロンインテグリン 1 / 3および
Akt / ウェスタンブロット>90%7* Per cuvette (100 µl volume)

サンプル当たりではNucleofection™は5x〜25x少ない量

96ウェルリポフェクションでは100 µl、標準Nucleofector™
装置では100 µl、6ウェルリポフェクションでは1〜2.5 ml）。

siRNA特異性の検証
siRNA濃度を可能な限り低く保つことで非特異的効果の最小化に役立ちますが、すべての実験に適切なコントロールを3 mRNAおよびタンパク質レベルにお使用すること大切です。

ける遺伝子ノックダウンのモニタリングによって、siRNA配注記

1. siRNA濃度の計算：100 µl Nucleocuvette™中 1 pmol siRNAのNucleofection™：1 pmol/100 µl = 20 µl Nucleocuvette™中1 pmol siRNAの10 nM Nucleofection™：1 pmol/20 µl = 50 nM
個別の計算については、ロンザのウェブサイトの siRNA 計算式（www.lonza.com/sirna-calculator）も参照してください。

列がmicroRNAではなく従来のRNAi経由で作用していることが確認されます（標的 mRNA の破壊を目標とするのではな
く、少なくとも部分的にその変換を阻害）。RNAiデータの信頼性を高めるには、目的の RNA 転写産物中の別々の場所をターゲットとする2つ以上のsiRNAを用いて同じの結果に

2. 用量と重量の関係：1 pmol siRNAは、14 ng siRNAに相当します（21 bp siRNA ds-オリゴヌクレオチドの分子量：21×660 g/mol 約14 ng/pmol）。

導きます。最終コントロールとしてのレスキュー実験は、最適な有効siRNA濃度はターゲットおよび細胞型によって異あらゆるRNAi実験で選択されるコントロールは、siRNAではなります。実際、数多くの文献で望ましい遺伝子のノックダウンを導く際に <50 nM siRNA のNucleofection™が観察され、報告されています（表1を参照）。
ユーザーからは 1 µM よりも高い濃度で満足する結果を得たとの報告もあります。しかし効率的なノックダウンと標的とは無関係な効果の最小化とのバランスを保つことが重要です。 siRNA<30nt を保つことよってプロテインキナーゼ（PKR）および2',5'-オリゴアデニル酸シンセターゼ経路の活性化を避けることができますが、siRNAはそれでも非ターゲット遺伝子の刺激や抑制といった非特異的効果をもたらします。1

遺伝子導入で反応を行っています（96-well Shuttle™装置では20 µl、

近年『Nature Cell Biology』3 の論文で示唆されているように、目的遺伝子の発現抑制に効果が無い場合に有効です。通常、1つ以上のサイレントな第3コドンの点変異もしくは標的配列内の非翻訳領域の欠失を利用します。翻訳上の影響は、 3'- 非翻訳領域に対してターゲットとされる siRNA を使用して避けることができます。レスキュー実験では、標的遺伝子のsiRNAとsiRNA耐性型のプラスミドを共遺伝子導入
もしくは標的遺伝子のsiRNA耐性を共発現するshRNAを使用します。
設定したNucleofection™条件を使用してDNAとRNAの両方を遺伝子導入することができるため、Nucleofector™テクノロ
ジーを利用すれば両方の実験を簡便に行うことができます。

最適な解析タイミングの決定

mRNAやその生成タンパク質の安定性と半減期はさまざまで補注あるため、ターゲットのノックダウンを評価するのに最適■ 遺伝子導入効率の測定なタイミングを実験的に決定することが重要です。例え–

蛍光ラベリングされたsiRNAの使用：蛍光ラベリングさば、哺乳動物細胞において、mRNAの半減期は数分から2日

れ た siRNA を 用 い た 実 験 で は 、 い く つ か の 細 胞 型 にとなるのに対し、タンパク質産物の半減期は数分未満からおいて遺伝子導入効率が最大で99%を示します。

2 このことを考慮すると、 siRNA が RISC と結合数日です。

し、mRNA/タンパク質濃度を目的のレベルまで大幅に減少

Nucleofection™後、蛍光ラベルの多くがすぐに消失してしまうため、共焦点顕微鏡またはFACSが使用できない場させるための十分な時間がとれるような実験の設計が必要

合は最初のセットアップ実験において蛍光ラベルしたです。通常、ターゲットmRNAを大幅に減少させるための推奨時間幅は 5 〜 72 時間であり、ターゲットタンパク質を適siRNAの使用は推奨されません。同様に、蛍光細胞を適切に可視化するために必要な蛍光ラベリングsiRNAの量切にノックダウンして表現型の結果を評価するための推奨

は、機能的反応に最適と思われる量よりもずっと多いこ

時間幅は24〜96時間です。とがよくあります。このため、これは高価であまり有益ではない実験となっています。さらに、siRNAが細胞膜

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総量

21 bp siRNA ds-オリゴヌクレオチドの分子量：21×660 g/mol =13860 g/mol =13.86 ng/pmol= 14 ng/pmol

1 pmol濃度濃度100 µl用キュベット

20 µl用キュベット

14 ng

1 pmol/100 µl = 10 nmol/l = 10 nM

1 pmol/20 µl = 50 nmol/l = 50 nM

5 pmol69 ng

5 pmol/100 µl = 50 nmol/l = 50 nM

5 pmol/20 µl = 250 nmol/l = 250 nM

10 pmol

140 ng10 pmol/100 µl = 100 nmol/l = 100 nM

10 pmol/20 µl = 500 nmol/l = 500 nM

20 pmol

277 ng20 pmol/100 µl = 200 nmol/l = 200 nM

20 pmol/20 µl = 1000 nmol/l = 1 µM

50 pmol

690 ng50 pmol/100 µl = 500 nmol/l = 500 nM

50 pmol/20 µl = 2500 nmol/l = 2.5 µM

100 pmol

1.4 µg100 pmol/100 µl = 1000 nmol/l = 1 µM

100 pmol/20 µl = 5000 nmol/l = 5 µMに接着し、実際は細胞内に入っていないことに起因する

導プロモーターで操作して、ノックダウン表現型のオン

誤った陽性結果が顕微鏡観察によって導かれる可能性があります。例えば相対的な遺伝子導入効率の推定を行うと オ フ を 切 り 替 え る こ と が で き ま す （ pSuperior 、OligoEngineなど）。DNAを初代細胞（そして他の手段にために、 siRNA と平行して（または同じサンプルとしよる遺伝子導入が難しいか不可能な数多くの細胞株）にて）、pmaxGFP™ベクターをサンプルとして遺伝子導入

遺伝子導入するNucleofector™テクノロジーによって、こするよう推奨されます。それでもなお、siRNA分子の遺れらのベクターを実際にどんな細胞型でも使用すること

伝子導入効率は通常高くなることを考慮してください。

が現在可能となっています。ただし、遺伝子導入効率ラベルしたsiRNAを実験に使用したい場合は、ロンザのは、一般的に DNA プラスミドよりも siRNAオリゴヌクレ技術サポートチームに連絡して、実験がなるべくスムーオチドを用いた場合の方が良好です。

ズに進むよう支援を受けてください。

遺伝子導入

For individual calculation, also refer to our website www.lonza.com/sirna-calculator■ Nucleofector™溶液における二本鎖siRNAの安定性

遺伝子導入細胞を増やす方法の 1 つは、 siRNA を蛍光レ

Nucleofector™溶液はRNAse活性試験済みです。溶液中のRNAを2時間、37℃でインキュベートしたところ、RNAポーターまたは表面マーカーを発現するプラスミドと共の安定性には影響がみられませんでした。詳細について

遺伝子導入し、レポーターを発現する細胞を選択するこは、ロンザの技術サポートチームまでお問い合わせくだとです。このアプローチは、 Wu らによって使用されてさい。

■ 遺伝子導入細胞を増やすにはいます（ 2005 年）4。 shRNA 発現ベクターを使用することによって、共発現される蛍光または抗生物質耐性マー

参考文献

カーを使用し、遺伝子導入された細胞を選択できます

1. Persengiev SP, et al. RNA. 2004 Jan;10(1):12-8（下記参照）。しかし、プラスミド DNAの遺伝子導入効率は、一般的にsiRNA二本鎖よりも低くなっています。
■ 長期的なRNAi効果（二本鎖siRNA vs. shRNA発現ベクター）
化学的に合成される二本鎖 siRNA は、 siRNA 配列を迅速

2. Ross J, 1995, Microbiol Rev 59:423-50
3. Editorial (2003) Wither RNAi. Nat Cell Biol. 5 (6), 489-490.
4. Wu et al. (2005) MCB 25(22):9741-9752
5. Lindvall JM et al. (2005) Immunol Rev 203, 200-215.に知るための手段になります。これは標的遺伝子の効率

6. Schoenemeyer A et al. (2005) J Biol Chem 280, 17005-17012.

的なノックダウンにつながりますが、このダウンレギュ

7. Short SM et al. (2005) J Cell Biol 168, 643-653.

レーションは一過性（通常 2 〜 5 日持続）であり、短期間で標的遺伝子の発現を抑制する目的、または長期間の効果を必要とするその他の用途においては、十分でない可能性があります。siRNAまたはshRNA（ヘアピン構造の小型RNA）の発現を促すための数多くのプラスミドベクターが市販されています。siRNA/shRNAの長期的発現を可能にすることに加え、プラスミドDNAとして増殖、取り扱い、保存できるという利点を有しており、蛍光マーカーまたは抗生物質耐性遺伝子（遺伝子導入細胞の特定や安定的遺伝子導入細胞の選択に利用）を共発現し、誘ロンザジャパン株式会社

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