日本食品微生物学会雑誌
226
日食微誌 Vol. 28 Jpn.
No. J.
4 Food2011 Microbiol., 28(4), 226‒231, 2011

＝原著＝蛍光消光現象を利用した Duplex RT-LAMP 法によるノロウイルス遺伝子グループ I および II の同時検出および識別
山 田 裕 子 *1, ・桑 山勝・重 本 直 樹 *1・谷 澤 由 枝 *1
松 尾
健 *1・福 田 伸 治 *1†（*1 広島県立総合技術研究所保健環境センター，*2 広島県西部畜産事務所）（受付： 平成 23 年 8 月 16 日）（受理： 平成 23 年 10 月 21 日）

Simultaneous Detection and Visual Identiﬁcation of Norovirus
Genogroups I and II by Duplex Reverse Transcription-Loop-Mediated
Isothermal Ampliﬁcation Assay with Fluorescent
Quenching-Based System
Hiroko Yamada*1, † , Masaru Kuwayama*2, Naoki Shigemoto*1
Yukie Tanizawa*1, Takeshi Matsuo*1 and Shinji Fukuda*1(*1 Center for Public Health and Environment, Hiroshima Prefectural Technology Research Institute,
Minami-machi, Minami-ku, Hiroshima 734‒0007; † Corresponding author)(*2 Hiroshima Prefectural Western Oﬃce of Livestock Industry,
Saijogojo-cho, Higashihiroshima, Hiroshima 739‒0013)
We have developed a duplex reverse transcription-loop-mediated isothermal ampliﬁcation(RT-LAMP) assay with a ﬂuorescent quenching-based system for the simultaneous and rapid
detection of norovirus (NoV) genogroup I (GI) and genogroup II (GII) genomes in a single tube.

After amplifying, NoV genomes could be identiﬁed visually in a tube by adding only quencherlabeled oligonucleotides, which have complementary sequences to the ﬂuorescence-labeled
primers. This assay requires no further tests such as electrophoresis or hybridization. In theevaluation tests with 70 NoV RT-PCR-positive fecal specimens, the green and red colors for
GI and GII, respectively, and sometimes with yellow color for NoV GI and GII mixture, could
be identiﬁed easily by the naked eye under UV light. The detection limits for NoV GI and GII
genomes by duplex RT-LAMP were estimated to be between 103 and 104 copies/tube. Our
duplex RT-LAMP assay allows for rapid, simple and simultaneous detection and supports
genogroup-screening test of NoV GI and GII genomes from fecal specimens in most laboratories.
Furthermore, this ﬂuorescent quenching-based system is potentially useful for all gene ampliﬁcation assays in a wide range of gene-related ﬁelds due to its simple principle.
Key words:
detection†

連絡先NoV, Duplex RT-LAMP assay, Fluorescent quenching-based system, Simultaneous*1 〠 734‒0007 広島市南区皆実町 1 丁目 6‒29
*2 〠 739‒0013 広島県東広島市西条御条町 1‒15

227

緒

ン酸マグネシウムが生成され，白濁の有無により視覚言的に陽性・陰性を判定できる特徴があることから，イ

ノロウイルス (NoV) は，厚生労働省の食中毒統計

ンフルエンザウイルス 14)，ウエストナイルウイルス 13)，に

SARS コロナウイルス 19) など，種々の微生物の迅速遺伝

おいて病因物質別事件数，患者数ともに毎年上位に位置

子検査に用いられている．反面，RT-LAMP 法は対象としており，また，乳幼児，小児のウイルス性下痢症の原している単一遺伝子を検出するのみで，遺伝子の多重検(http://www.mhlw.go.jp/topics/syokuchu/04.html)

因の大部分を占めている

7, 12, 18)．さらに，NoV は世界各

出には不向きである．

地において急性胃腸炎の主要な原因物質であり，冬季をわれわれは先に，RT-LAMP 法による NoV の簡易検中心に，高齢者施設や病院，学校などで集団感染事例

出法 5) と，蛍光標識プライマーを用いた RT-LAMP 法にが多発している1, 2, 7, 8, 10, 17)．NoV に起因する食中毒など

より NoV GI および GII の同時遺伝子増幅を行い，増幅の集団感染事例の大部分は遺伝子グループ II (GII) を原

産物を電気泳動することにより，泳動バンドの蛍光色か因としているが，二枚貝を原因とする食中毒では遺伝

ら遺伝子グループを鑑別する方法 3) を報告した．本報で子グループ I (GI) が同時に検出されることも少なくな

は，この発展系として，電気泳動を必要とせず，遺伝子

い 6, 15)．NoV の検出のみを目的とする場合には遺伝子グ増幅後，蛍光物質とクエンチャーが近接することによりループを識別する必要はないが，集団感染事例では感染起こる蛍光消光現象を利用して，反応後直ちに，チュー

経路の解明も大きな目的となるため，遺伝子グループな

ブの蛍光色から NoV GI および GII を簡便に検出・識別どの，より詳細な情報の把握を求められることが多い．

する方法を確立し，糞便からの NoV 検出に応用した．

その際，NoV GI と GII は遺伝子配列が異なっているた

材料および方法

め，PCR 法などによる遺伝子増幅は，通常遺伝子グルー
1.

プごとに実施されている．

供試検体

NoV の 検 出 の み を 目 的 と す る 場 合 は， 簡 易 遺 伝 子

RT-PCR 法 で NoV 陽 性 で あ っ た 食 中 毒 ま た は 感 染

検 出 法 で あ る Reverse transcription-loop mediated性胃腸炎患者由来の糞便 70 検体を用いた．糞便からisothermal ampliﬁcation (RT-LAMP) 法，Nucleic acidの NoV RNA の 抽 出 は，QIAamp Viral RNA Mini Kit

sequence-based ampliﬁcation (NASBA) 法，Transcrip-(QIAGEN) を用い，マニュアルに従って実施した．
Duplex RT-LAMP 法

tion reverse transcription concerted reaction（ TRC）

2.

法が有用であり，NoV 検出キットとして市販されてい遺 伝 子 増 幅 は，NoV GI お よ び GII の 二 つ の 遺 伝 子る．このうち，RT-LAMP 法は，増幅反応過程でピロリ

グループを 1 本のチューブで同時増幅する Duplex RT-

Table 1.
Primer name
G1F3
G1B3
G1FIP1G1FIP2
G1BIP1G1BIP2
G1BIP3
G1LF1
G1LF2
G1LF3
G2F3
G2B3
G2FIP1G2FIP2G2FIP3
G2FIP4
G2FIP5
G2BIP1G2BIP2G2BIP3
G2BIP4
G2LF1
G2LF2
G2LF3
G2LF4

Primer sets for genogroups I and II for detection of noroviruses
Sequence (5′‒3′)

CCRGGNTGGCARGCNATGTTCCAACCCARCCATTRTACACATTTACGAATTCGGGCAGGTTTTCGCTGGATGCGNTTCCATGA
CATTTACAAAATCGGGCAGGTTTTCGCTGGATGCGNTTCCATGAGATGGCGTCTAAGGACGCTTTTAGCTGTRTTTGCCTCTGGWAC
GATGGCGTCTAAGGACGCTTTTAGCWGTATTAACCTCCGGYACGATGGCGTCTAAGGACGCTTTTAGCTGYAYTAACCTCTGGAACAGATYGCGATCYCCTGTCCA
AGATTGCGATCTCCTGCCCA
AGCTCGCGGTCTCCTGTCCA
GGNMTGGANTTTTAYGTGCCMAG
CCRCCNGCATRHCCRTTRTACATGGGAGCMAGATTGCGATCGCTTTTGAGBCNATGTTYAGRTGGATGGGAGCMAGATTGCGATCGCTTTTGAGCCCATGTTCAGRTGGATGGGAGCGAGATTGCGATCGCTTTTGAGTCAATGTTYAGGTGGATGGGAGCGAGATTGCGATCGCTTTTGAGCCYATGTTYAGGTGGATGGGAGCMAGATTGCGATCGCTTTTGAACCWATGTTYAGGTGGATTGTGAATGAAGATGGCGTCGTTTTCTCATTRTTRVTCTCTGGBACGAGTGTGAATGAAGATGGCGTCGTTTTCTCATTRTTGCYCTCTGGYACGAGTGTGAATGAAGATGGCGTCGTTTTCTCATTGTTGAYCTCTGGKACGAGTGTGAATGAAGATGGCGTCGTTTTCTCATTRTTACTTTCTGGCACGAGGTGCTCARATCWGARAACCTCGTGCTGAGGTCWGARAATCTCGTGCTCAAATCTGAGAATCTCGTGCTCAAGTCTGAGAAYCTCLabeled dye

Alexa Fluor 488
Alexa Fluor 488
Alexa Fluor 488

Alexa Fluor 594
Alexa Fluor 594
Alexa Fluor 594
Alexa Fluor 594

Final concentration(μM)

Reference

0.2
0.2
1.6
0.8
1.6
0.8
0.8
0.8
0.8
0.8
0.2
0.2
1.6
0.8
0.8
0.8
0.8
1.6
0.8
0.8
0.8
0.8
0.8
0.8
0.8

5
5
5
5
5
5
3
5
5
5
5
5
5
5
5
3
3
5
5
5
5
5
5
5
5

Mixed bases in degenerate primers are as follows: K, T or G; M, A or C; R, A or G; W, A or T; Y, C or T; B, not A; H, not G; V, not
T; N, any.

228

日食微誌

Vol. 28 No. 4 2011

LAMP 法 と し て 実 施 し た．RT-LAMP 反 応 は，Table

ら の 報 告 8) お よ び 現 在 広 く 使 用 さ れ て い る 型 別 法

1 に 示 し た と お り， 一 部 を Alexa Fluor488（緑） ま（ Capsid N/S region に基づく遺伝子型，http://idsc.nih.

た は Alexa Fluor594（赤） で 蛍 光 標 識 し た Fukuda

go.jp/pathogen/refer/norokaisetu1.html）に従って遺伝

ら 3, 5) のプライマーおよび RNA 増幅試薬キット（栄研子型別を行った．

化学）を用いて，63℃，90 分間行った．反応終了後，RT-LAMP 法 の 陽 性 反 応 で あ る ピ ロ リ ン 酸 マ グ ネ シ

結果

ウムの白濁が認められた場合は，室温にて 100 pmol/

NoV 陽性の糞便 70 検体の遺伝子型は，GI 単独陽性がμ 濃 度 の 3′-BHQ-1 標 識 オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド (G1LF̲
R; TGGRCAGGRGAYCGCRAKCT) お よ び 100 pmol/
μ 濃度の 3′-BHQ-2 標識オリゴヌクレオチド (G2LF̲R;
GAGRTTYTCWGAYYTSAGCAC) を そ れ ぞ れ 5 μ 加

GI.1（ 2 検体），GI.4 (8), GI.8 (6) および GI 未型別 (1) のえた．その後，直ちに UV トランスイルミネーターによ計 17 検体，GII 単独陽性が GII.1 (2), GII.2 (7), GII.3 (5),GII.4 (9), GII.5 (5), GII.6 (2), GII.7 (1), GII.12 (2), GII.13(3), GII.14 (2), GII.16 (1) および GII.19 (2) の計 41 検体，
GI および GII の両方が陽性（以降 GI および GII 混合とすり 312 nm の紫外線を反応チューブに照射し蛍光色を観る）が GI.1, GII.2 (1), GI.1, GII.3 (2), GI.2, GII.2 (1), GI.2,

察した．

GII.12 (1), GI.2, GII.14 (1), GI.4, GII.5 (1), GI.4, GII.14

3.

リアルタイム PCR 法による遺伝子コピー数の定量(1), GI.7, GII.12 (1), GI.8, GII.2 (1), GI.8, GII.12 (1), GI.14,
GII.5 (1) の計 12 検体であった．

LightCycler 480 シ ス テ ム お よ び LightCycler 480

これらのうち，NoV GI または GII 単独陽性検体につProbes Master (Roche Diagnostics) を用いて，TaqMan

いて，Duplex RT-LAMP 法による NoV の検出結果とリプローブ法により糞便中に含まれる遺伝子コピー数を算

アルタイム PCR 法により定量した反応当たりの遺伝子定した 3)．リアルタイム PCR 反応は 95℃で 5 分間酵素活

コピー数との関係を遺伝子グループごとに Fig. 1 に示し性化後，95℃で 10 秒間，56℃で 20 秒間を 50 サイクル行

た．NoV GI 陽性 17 検体のコピー数は 1 反応チューブ当

い，50℃で 10 秒間クーリングした．

たり 102 から 107 オーダー（最小値： 5.5 × 102，最大値：

4.

遺伝子型別

5.9 × 107）であり，Duplex RT-LAMP 法によりすべて

平 成 15 年 11 月 5 日 付け 食 安監 発 第 1105001 号，厚 生
9)Alexa Fluor 488 の緑色蛍光が検出され，陽性と判定さ労働省医薬食品局食品安全部監視安全課長通知法 に準れた．また，NoV GII 陽性の 41 検体のうち，37 検体で，拠して遺伝子増幅を行い，DNA gel extraction kit (Mil-Duplex RT-LAMP 法により陽性反応である Alexa Fluor

lipore) を用いて 1.5% アガロースゲルから PCR 増幅産物

594 の赤色蛍光が検出され，1 反応チューブ当たりのコを精製後，SequiTherm EXCEL II DNA sequencing kit

ピー数は 103 から 107 オーダー（最小値： 2.1 × 103，最大LC for 25- and 41-cm gels (EPICENTRE Technologies)

値： 9.7 × 107） で あ っ た．Duplex RT-LAMP 法 で 陰 性および LI-COR4200 series sequencer (LI-COR) を用いを示した残り 4 検体の遺伝子型は GII.2 (1), GII.4 (1) おてダイレクトシーケンスを行った．そして，Kageyama

よび GII.5 (2) で，これらの 1 反応チューブ当たりの遺伝

Fig. 1.

Detection of norovirus genomes by duplex RT-LAMP with ﬂuorescent quenching-based system from fecal specimens containing a single genogroup I or II and number of genome copies per reaction.
● , positive; ○ , negative.

229

Fig. 2.

Colors indicated in co-infection of norovirus
genogroups I and II by duplex RT-LAMP withfluorescent quenching-based system and number of genome copies per reaction in fecal specimens.
G, green; R, red; Y, yellow.

子コピー数は 103 オーダーおよび 101 オーダーであった．
1 反応チューブ当たりのコピー数が 103 オーダーであった 7 検体のうち，Duplex RT-LAMP 法により 4 検体が陽性，3 検体が陰性を示した．
次に，NoV GI および GII 混合陽性の 12 検体について，
Duplex RT-LAMP 法による NoV の検出結果と糞便中に含まれていた NoV GI および GII の遺伝子コピー数との関係を Fig. 2 に示した．12 検体のうち，緑色と赤色の混色である黄色蛍光が検出されたものは GI.1 および GII.2
混合と GI.2 および GII.2 混合の 2 検体で，1 反応チューブ
当たりのコピー数はそれぞれ 3.7 × 105 および 2.5 × 105,
1.0 × 106 お よ び 7.7 × 104 で あ っ た． ま た，GI.1 お よ び

Fig. 3.

Positive reaction indicated in duplex RT-LAMP
with fluorescent quenching-based system. (A),White precipitate as positive reaction in RTLAMP; (B), Fluorescent colors under UV light at
312 nm before adding quencher-labeled oligonucleotides; (C), Fluorescent colors under UV lightat 312 nm after adding quencher-labeled oligonucleotides into RT-LAMP-positive tubes.
1, negative control; 2, genogroup I; 3 and 4,
genogroup II; 5 and 6, genogroups I and II mixture.

GII.3 混合の 2 検体と GI.2 および GII.14 混合の計 3 検体はGI の蛍光色である緑色を示し，その他の 7 検体は GII の蛍光色である赤色を示した．コピー数の多い遺伝子グループの蛍光色が優勢に示される検体も存在したが，必ずしもその傾向が認められるとは限らなかった．

(data not shown)．
考察

NoV は食中毒および感染症対策上重要な病原ウイル

クエンチャーによる蛍光消光現象を利用した Duplex

スであり，その迅速検出が求められている．今回われRT-LAMP 法の例を Fig. 3 に示した．RT-LAMP 反応後，われは，NoV GI および GII の同時遺伝子増幅を行い，

NoV GI または GII 陽性検体のチューブ内の反応液は白クエンチャーによる蛍光消光現象を利用して，反応後濁し［ Fig. 3(A)］，これに紫外線を照射すると，すべてのチューブの蛍光色から NoV GI および GII を簡便に検同一の蛍光色（黄色）が確認された［ Fig. 3(B)］．しか出・識別する Duplex RT-LAMP 法を確立し，1 チュー

し，クエンチャー標識オリゴヌクレオチドを加えると，ブでの迅速検出を可能にした．NoV GI または GII 陽性

NoV GI は緑色，NoV GII は赤色，GI および GII 混合はの反応チューブはそれぞれ，緑色，赤色の蛍光色を示

黄色の蛍光色を呈した［ Fig. 3(C)］．このとき，緑色蛍

し，容易に識別が可能であった．複数の標的遺伝子の同光は 1 種であったが，赤色蛍光および黄色蛍光はわずか

時検出には，一般的にマルチプレックス PCR 法などがに異なる 2 種がそれぞれ認められた．なお，緑色と赤用いられるが，通常，遺伝子増幅後に電気泳動あるいは色の混色である黄色蛍光にカチオン性ポリマーである

ハイブリダイゼーションなどの追加操作により，どの遺2.5% ポリエチレンイミンを 1 μ 加えると，緑色蛍光が伝子が増幅したかを確認する必要があり，先に報告した

消光して赤色蛍光を呈し，混色であることが確認された

RT-LAMP 法も同様である 3)．一方，Duplex RT-LAMP

230

日食微誌

Vol. 28 No. 4 2011

法に利用した蛍光消光現象による標的遺伝子の検出・識

その後の調査などに結びつけることが可能であり，簡便

別方法は，蛍光標識したプライマーを用いて遺伝子増幅であるという特性を最大限に発揮できるものと考えられを行った後，これらのプライマーと相補配列を有するク

る．なお，われわれが Duplex RT-LAMP 法に用いたプエンチャー標識オリゴヌクレオチドを加えるのみで，増ライマーは，先に報告した RT-LAMP 法と同じものであ幅した複数の遺伝子を視覚的に，迅速かつ簡易に，同時り，これらの特異性は確認されている 3)．

に検出・識別することが可能である．この原理を次に示

また，緑色と赤色の混色である黄色蛍光を呈した場

す．クエンチャー標識オリゴヌクレオチドは，遺伝子合，その反応液にカチオン性ポリマーであるポリエチレ増幅に用いられなかった蛍光標識プライマーとハイブ

ンイミンを加えることで緑色蛍光が消光し，結果としてリダイズし，プライマーの標識蛍光物質がオリゴヌクレ

赤色蛍光が残り，混色が確認できることを明らかにしオチドのクエンチャーと近接するため消光する．一方，た．これまでに，蛍光標識したオリゴヌクレオチドを含遺伝子増幅に利用された蛍光標識プライマーは，2 本鎖

む LAMP 法の増幅産物にポリエチレンイミンを加える

DNA を形成しており，クエンチャー標識オリゴヌクレ

ことにより沈殿を生じさせ，その蛍光色から増幅した遺オチドがハイブリダイズしないため，発光したままであ伝子を検出・識別する方法が報告されているが 11)，ポリる．その結果，増幅された遺伝子に対応するプライマー

エチレンイミンによる緑色蛍光の消光は新しい知見であの蛍光色のみが発光し，識別が可能となる．なお，蛍光る．このメカニズムは明らかではないが，黄色を含む複標識プライマーとクエンチャー標識オリゴヌクレオチド

数の蛍光色を利用して遺伝子を同時増幅する方法に拡張のハイブリダイズは室温のため直ちに起こり，反応時間する場合に，黄色蛍光が単独遺伝子の増幅によるものでを必要としない．

あるか，あるいはそれぞれ緑色と赤色を呈する複数の遺NoV 陽 性 検 体 を 用 い て Duplex RT-LAMP 法 を 検 証したところ，NoV GI および GII ともに，1 反応チュー
34

伝子の増幅によるものであるかの識別に応用できる．
Duplex RT-LAMP 法は，特別な機器を必要としない

ブ当たりの遺伝子コピー数が 10 から 10 以上で陽性をため，小規模の検査機関においても，糞便あるいは嘔吐示した．患者糞便中に含まれる NoV コピー数 /g は，中物検体から NoV GI および GII を迅速かつ簡便に検出・

79央 値 で 10 か ら 10 で あ る こ と か ら

4, 16)，Duplex RT-

識別することが可能であり，多くの検査機関での利用がLAMP 法で十分検出できるレベルにあった．本法は，期待される．さらに，われわれの開発した蛍光標識プラ

RT-LAMP 反応後電気泳動バンドの蛍光色から遺伝子グ

イマーと相補配列を有するクエンチャー標識オリゴヌク

ループを鑑別する，先に報告した方法 3) と同等の検出感

レオチドによる蛍光消光現象は，RT-LAMP 法だけでな度を有していたが，電気泳動などの追加操作を必要とし

く，PCR 法，NASBA 法，TRC 法などのすべての遺伝子ないことから，さらなる操作の簡略化と検査の時間短縮

増幅法に応用でき，また，NoV のみならずすべての生が可能となった．一方，NoV GI および GII の遺伝子が物の遺伝子を対象に適用可能である．われわれは，マル同時増幅された場合，理論上は混色の黄色を呈するが，チプレックス PCR 法による下痢症ウイルスの多重検出，

GI および GII 混合検体のうち，実際に黄色を呈した検体

細菌性嘔吐毒関連遺伝子の多重検出などへも利用可能では一部であった．NoV には，それぞれ GI が 14, GII が 17あることを確認しており (data not shown)，幅広い分野

あるいはそれ以上の遺伝子型が存在している

8, 20)．本法

はこれら多くの遺伝子型を検出対象としてデザインされ5)ているため，遺伝子型による検出感度の差異 は避けられず，検体に含まれる NoV のコピー数の差は必ずしも結果に反映されない．具体的には，プライマーのアニー
リング効率をはじめとした LAMP 法のさまざまな反応への応用が期待される．
なお，本法は，「標的核酸の検出・識別方法」として特許出願中（特願 2011-134800）である．
要約

われわれは，ノロウイルス (NoV) 遺伝子グループ I

プロセスにおける効率の影響を受け，最終的により多く(GI) および遺伝子グループ II (GII) の同時遺伝子増幅を増幅された遺伝子グループの蛍光色が観察されるものと行い，クエンチャーによる蛍光消光現象を利用して，1考えられる．以上の理由から，Duplex RT-LAMP 法に本のチューブで NoV GI および GII を迅速かつ簡便に検より NoV GI および GII 混合検体から両者を同等の効率

出・ 識 別 す る Duplex RT-LAMP 法 を 確 立 し た． 本 法

で増幅することは難しく，また，GI あるいは GII の一方

は，RT-LAMP 反応後に電気泳動あるいはハイブリダイ

が単独で陽性であっても，他方を完全には否定できない

ゼーションなどの追加操作を必要とせず，増幅に使用し場合も存在する．しかしながら，1 反応チューブ当たり

た蛍光標識プライマーと相補配列を有するクエンチャーの遺伝子コピー数が 103 から 104 以上を含む NoV 陽性検

標識オリゴヌクレオチドを反応チューブに加えるのみ

体からは少なくとも GI あるいは GII のいずれかが確実にで，紫外線を反応チューブに照射した際の蛍光色から増検出されており，食中毒・感染症事案などの迅速性と簡幅された遺伝子を視覚的に検出・識別可能である．RT-

便性が重要な局面においては，NoV 遺伝子の検出およPCR 法で NoV 陽性の糞便 70 検体を用いて Duplex RT-び遺伝子グループのスクリーニング試験を迅速に行い，LAMP 法を検証したところ，1 反応チューブ当たりの遺231

伝子コピー数が 103 から 104 以上でそれぞれ NoV GI は
赤色，GII は緑色，GI および GII 混合は一部が混色の黄色の陽性反応を示し，その有用性が確認された．本法

10)は，NoV 食中毒または感染症発生時に，糞便検体からの NoV GI および GII 遺伝子の迅速検出および遺伝子グ
ループのスクリーニング試験法として，多くの検査機関

11)での利用が期待される．さらに，われわれの開発したクエンチャー標識オリゴヌクレオチドによる蛍光消光現象
は，すべての遺伝子増幅法に応用可能であり，幅広い分

12)

野への応用が期待される．
文
1)

2)

3)

4)

5)

6)
7)

8)

9)

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