日本食品微生物学会雑誌＝原Jpn. J. Food Microbiol., 29(1), 11‒17, 201211

著＝

蛍光 RT-multiplex PCR 法を用いた
食中毒起因微生物の包括的検出
重 本 直 樹 *1, †・谷 澤 由 枝 *1・山 田 裕 子 *1
健 *1・福 田 伸 治 *1
大 原 祥 子 *2・松 尾（*1 広島県立総合技術研究所保健環境センター，*2 広島県食肉衛生検査所）（受付： 平成 23 年 5 月 2 日）
（受理： 平成 24 年 2 月 15 日）

Comprehensive Detection of Food-Borne Pathogens from
Fecal Specimens Using a Reverse Transcription Multiplex
PCR with Fluorescent Dye-Labeled Primers
Naoki Shigemoto*1, † , Yukie Tanizawa*1, Hiroko Yamada*1,
Sachiko Ohara*2, Takeshi Matsuo*1 and Shinji Fukuda*1（*1 Center for Public Health and Environment, Hiroshima Prefectural Technology Research Institute,
Minami-machi, Minami-ku, Hiroshima-shi, Hiroshima 734‒0007; † Coresponding author）（*2 Hiroshima Prefectural Meat Inspection Oﬃce, Awaya-machi, Miyoshi-shi, Hiroshima 728‒0025）
We have developed a reverse transcription（RT）-multiplex PCR assay with ﬂuorescent dyelabeled primers for detection of 12 pathogens, including 9 bacteria and 3 viruses, that are highly
associated with food-borne gastroenteritis outbreaks. This assay has a great advantage of comprehensive detection of bacterial DNAs and viral RNAs. PCR products of pathogens are easily
discriminated by ﬂuorescent color and fragment size visualized under ultraviolet light without
staining, after electrophoresis. Simultaneous extraction of bacterial DNAs and viral RNAs wereachieved using a commercial viral RNA extraction kit with some modiﬁcation. After RT reaction, multiplex PCR was carried out with 3 primer sets（A, B, and C）labeled with 3 to 4 diﬀerent colors of ﬂuorescent dyes. Primer set A was designed for diarrheagenic.
Primer set B was for
spp.,
and
and
. Primer set C was for, Norovirus, Sapovirus, and Astrovirus.
Upon analysis of 45 food-borne gastroenteritis outbreaks and 15 sporadic cases, this assay had
nearly corresponding sensitivity and speciﬁcity compared with conventional methods, such asbacterial cultivation and monoplex PCR. This assay can be completed within 6 to 7 hours and isconsidered eﬀective for rapid screening of food-borne bacteria and viruses.
Key words: food-borne pathogens, comprehensive detection, reverse transcription-multiplex
PCR, ﬂuorescent dye
緒

言

物を原因として発生している．平成 20 年から 22 年の食中毒発生状況は細菌を原因とするものが 536〜778 件

厚 生 労 働 省 の 食 中 毒 統 計（http://www.mhlw.go.jp/（患者数 6,700〜10,331 名），ウイルスを原因とするもの

topics/syokuchu/）によると，食中毒は多くの病原微生が 304〜403 件（患者数 10,953〜14,700 名）で減少傾向は†

連絡先*1 〠 734‒0007 広島県広島市南区皆実町 1‒6‒29*2 〠 728‒0025 広島県三次市粟屋町 1911‒1

認められていない．食中毒発生時には迅速な病因物質（微生物）の検出がその拡大防止には非常に重要である．
一般的には，病原微生物に応じた個別の検査が実施され

12

日食微誌

Vol. 29 No. 1 2012

るが，多くの時間と労力を要している．

核酸を− 20℃あるいは− 70℃で保存した．

近年では PCR 機器および試薬の低価格化により，小

3.

逆転写反応

規模の検査室においても比較的容易に遺伝子検査を実施

PrimeScript RT reagent kit（タカラバイオ）を用いすることが可能となった．また，試薬などの充実によりて逆転写反応を行った．逆転写反応組成は 5 × Prime-

高感度に遺伝子を検出することが可能となっているた

Script buﬀer 4 μ , PrimeScript RT enzyme mix 1 μ ,め，Multiplex PCR 法による多種の細菌あるいはウイル
スの同時検出に関する研究が数多く見られるが 14, 19, 21〜23），細菌およびウイルスを同時に包括的ある

Oligo dT primer （50 μM） 1 μ , Random 6 mers （100μM）1 μ , RNase free dH2O 3 μ および抽出核酸 10 μ の計 20 μ で，30℃ 10 分間，42℃ 60 分間，99℃ 5 分間実施し，その後氷冷した．

いは網羅的に検出しようとする研究は見られない．
食中毒の原因微生物は過去の様相とは異なり，ウイル

4.

蛍光 RT-multiplex PCR 反応

スによるものも多く報告され，細菌およびウイルスを同逆転写反応後，Table 1 に示した 3 プライマーセットご

時に検出する意義は非常に大きくなっている．また，通とに，蛍光標識プライマーを用いた Multiplex PCR（蛍常 行 わ れ る Multiplex PCR 法 で は 電 気 泳 動 法 に よ り，

光 RT-multiplex PCR）法を実施した．A セットは Diar-

PCR 産物の大きさを指標として微生物の検出を行うた

rheagenic

め，PCR 産物の大きさが近似すると鑑別が困難となる．

およびを，B セットはとspp.,
を，C セットは, Norovirus, Sapovirus および Astrovirus

先に，われわれはこれらの欠点を補う方法として，蛍光標識プライマーを用いた Multiplex PCR 法を確立し，下を検出対象とした．また，Multiplex PCR 反応は Multi-痢症ウイルス 16) あるいは下痢原性大腸菌病原因子 7) の同

plex PCR assay キット（タカラバイオ）を用いて，Mul-

時検出法を報告した．

tiplex PCR mix2 25 μ , Multiplex PCR mix1 0.25 μ およ

本研究では，食中毒の原因となる率の高い細菌およびび Table 1 に示す最終濃度のプライマーを含む反応液にウイルスについて，一般に広く用いられる PCR 法によ逆転写反応液を 2 または 5 μ 加え，計 50 μ で実施した．

り多種の微生物を同時に検出することを目的に，蛍光標

反 応 条 件 は 94 ℃ 60 秒 間 の 熱 変 性 後，94 ℃ 30 秒 間，識プライマーを用いた遺伝子検出法を検討し，PCR 産

57 ℃ 90 秒 間 お よ び 72 ℃ 90 秒 間 を 40 サ イ ク ル 行 い，物の大きさおよび PCR 産物の蛍光色の違いにより対象

72℃ 10 分間の最終伸長を行った．
5.

微生物を識別する包括的検査法を確立した．
材料および方法
1.

ミネータで 312 nm の光を照射し泳動像および蛍光色を

対象微生物および検出用プライマー

対象微生物は Diarrheagenic

電気泳動

2.0％アガロースゲルにて電気泳動後，トランスイル
確認すると同時に，紫外線吸収フィルター（SC46, フジ［腸管出フィルム）を用いデジタルカメラで撮影した．なお，サ

血性大腸菌（EHEC）, 腸管侵入性大腸菌（EIEC）, 毒素原

イズマーカーは 100 bp ラダー（GE Healthcare） 1 μ に，性大腸菌（ETEC）, 腸管凝集性大腸菌（EAEC）および
腸 管 病 原 性 大 腸 菌（EPEC）］，,

および等量の EzVISION（Amresco）を混合して用いた．
6.

spp.,
,

, Norovirus（genogroup I およ

スタンダード DNA の作製

Diarrheagenic

を除く個々の微生物について，Table 1 に示すプライマーで増幅した PCR 産物を QIA-

び II），Sapovirus（genogroup I, II, IV および V）およびGEN PCR Cloning Kit（QIAGEN）を用いて pDrive clon-

Astrovirus（genotype I〜VIII）の 12 種とした．ターゲッ

ing vector（QIAGEN）に挿入し，トとした病原因子，プライマー配列および標識蛍光物

した．そして，質 13）を Table 1 に示した．

ト III（GL Sciences）を 用 い て プ ラ ス ミ ド DNA を 精 製

2.

糞便からの細菌 DNA およびウイルス RNA の同時抽出

QIAamp viral RNA mini kit（QIAGEN）を用い，キッ
ト添付のプロトコールを一部改変して糞便から細菌およDH5 α に保持から MonoFas プラスミド抽出キッ

後，コピー数を算出した．
7.

検出限界の測定（1） 下痢原性大腸菌
分離株の菌数（cfu）を測定後，抽出した DNA を 10 倍びウイルス核酸（DNA および RNA）の同時抽出を行っ

段階希釈し検出限界（cfu/反応）を測定した．

た． ま ず，PBS に よ り 作 製 し た 10％糞 便 乳 剤 を ボ ル（2） 下痢原性大腸菌以外の細菌

テックスミキサーで 30 秒間激しく撹拌した後，室温で 1

スタンダード DNA を用いて，リアルタイム PCR 法に分間静置した．そして，上清 160 μ を Buﬀer AVL 640

より分離株から抽出した DNA のコピー数を算出し，10

μ に加え，15 秒間ボルテックス後室温に 10 分間静置した．6,000×g で 3 分間遠心分離した上清 700 μ を用い，倍段階希釈して検出限界（コピー数/反応）を測定した．

以降キット添付のプロトコールに従って核酸を抽出しウイルス含有糞便に含まれる RNA から逆転写反応にた．なお，直ちに次の操作を実施しない場合は抽出したより得た cDNA のコピー数をスタンダード DNA を用い（3） ウイルス

AC1ʼ
AC230
CPE697F
CPE892R

CapsidEnterotoxin

Astrovirus

SV-F21
SV-R2

CapsidG2SKF
G2SKR
G2ALSKR

Sapovirus

Polymerase, capsid

Norovirus genogroup II

G1SKF
G1SKR

CC18F
CC519R

Aspartokinase

＋
−

＋
−

＋
−

＋
−
−

＋
−

＋
−

＋
−

＋
＋
−

VPT346tdhF
VPT346trhF
VPT508R
CJ166F
C4m

＋
−

＋
−

INVA-1
INVA-2eaeA-F
eaeA-Rr＋−

aggR-F
aggR-Rg

Oxidoreductase

Polymerase, capsid

spp.

Norovirus genogroup I

Primer set C

Primer set B

Enteropathogenic（EPEC）＋−

EAST-1Sg
EAST-1AS＋−

STX2-F
STX2-RgEnteroaggregative（EAEC）＋−

STX1-F
STX1-RgEnterohemorrhagic（EHEC）＋−＋−

STh̲FrJW7
ipaH-F
ipaH-Ro＋−PolarityLT̲tF
LT̲tRoPrimername

CCTTGGACTCAAAAGCTTAATTTACGAACATATTGTCCAGCATCTAAGATGGCTAGCAAGTCTGACAAG
GGTTTTGGTCCTGTGACACCANTAGTGTTTGARATGGAGGG
GWGGGRTCAACMCCWGGTGG

CNTGGGAGGGCGATCGCAACCRCCNGCATRHCCRTTRTACATCCACCAGCATATGAATTGTACATCTGCCCGAATTYGTAAATGACCAACCCARCCATTRTACAGGTATGATTTCTACAAAGCGAATAAAAGACTATCGTCGCGTG

AACTTACGCATTCGCATCAAG
CCATAAGCACTAGCTAGCTGATATTCTGCTGTGTTCGTAAAATCAGYTTCWACGGTCTTCACAAAATCAG
CCACTACCGCTCTCATATGCYTCACAGTGCTCGTTTACGACCTGAATAGACGACTGGTACTGATCGATAATATGCTTAGTGCTGGTTTAGG
GTCCGGGGACATTTTAGTCACCTAAAGGATGCCCTGATGATGCTGCTTTGCTCATTCTTG

GCCATCAACACAGTATATCCGAGTGACGGCTTTGTAGTCC

AGGCGCGTTTTGACCATCTTCTKGATGCATCTCTGGTCATTTGAACTGGGGAAGGTTGAGTGCGCACTGAGAAGAAGAGA

ACCATGCTCGCAGAGAAACTCAGTCTCACGCATCACCTGT

CTCAGGATGCTAAACCAGCACCCGGTACARGCAGGATTACCGGTATTACAGAAATCTG
CTGTTATATATGTCAACCTC

Sequence（5′‒3′）

Alexa Fluor 546

Alexa Fluor 350

Alexa Fluor 532

Alexa Fluor 594

Alexa Fluor 488

Alexa Fluor 594

Alexa Fluor 488

Alexa Fluor 532

Alexa Fluor 594

Alexa Fluor 594

Alexa Fluor 488

Alexa Fluor 488

Alexa Fluor 488

Alexa Fluor 488

Alexa Fluor 546

Alexa Fluor 594

Alexa Fluor 546

5′-Fluorescentdye

OrangeBlue

Yellow

Red

Green

Red

Green

Yellow

Red

Red

Green

Green

Green

Green

OrangeRed

Orange

Color

196

230

435

344

330

502

196

163

244

390

406

106

285

482

337

157

263

Product size（bp）

Speciﬁc primer sets used in RT-multiplex PCR assay with ﬂuorescent dye-labeled primersEnteroinversive（EIEC）

Enterotoxigenic（ETEC）

Primer set A

PathogenTable 1.

Target
gene

0.4
0.4

0.2
0.2

0.2
0.2

0.4
0.4
0.2

0.4
0.4

0.4
0.4

0.2
0.2

0.2
0.2
0.2

0.2
0.2

0.2
0.2

0.2
0.2

0.08
0.08

0.1
0.1

0.2
0.2

0.1
0.1

0.2
0.2

0.2
0.2

Final concentration（μ M）

This study

15

12

11

6

6

8

This study
20（slightly modiﬁed）

This study

1

7

7

24

7

7

7

7（slightly modiﬁed）
17

7（slightly modiﬁed）

Reference

13

14

日食微誌

Vol. 29 No. 1 2012

Fig. 1.

Detection and identiﬁcation of pathogens by ﬂuorescent colors and size of PCR products（A) and application to gastroenteritis outbreaks and sporadic cases（B）.
Lanes; 1,
O157 : H7（
, and
）; 2,
O26 : H11（
and
）; 3,
O111 : HNM
（
and
）; 4,
O63 : H6（ ）; 5,
O142 : H6（ ）; 6,
O44 : H18（
and
）; 7,
O28 : HNM（）; 8,
O124 : HNM（）; 9,
O148 : H28（
and）; 10,
O25 : HNM（ ）; 11,
O6 : H16（, and）; 12,（ ）; 13,
（ ）;
14,
; 15,
; 16,
Enteritidis; 17, Norovirus genogroup I; 18, Norovirus genogroup
II; 19, Sapovirus; 20, Astrovirus; 21,; 22, EAEC（）in primer set A; 23, Norovirus genogroup II in primer set C; 24,
spp. in primer set B; 25,
andin primer set B; 26, Negativein primer set B; 27, Norovirus genogroup II in primer set C; 28, Norovirus genogroups I and II in primer set C; 29,
Astrovirus in primer set C; 30,
in primer set C; 31, Astrovirus in primer set C.

てリアルタイム PCR 法により算出し，10 倍段階希釈し結て検出限界（コピー数 /反応）を測定した．
8.

食中毒等集団感染事例および散発事例への応用

平成 21 年から 22 年に発生した食中毒等集団感染 45 事
例 お よ び 散 発 15 事 例 の 患 者 糞 便 に 蛍 光 RT-multiplex

果

蛍光 RT-multiplex PCR 法による病原微生物の検1.

出種々の病原因子を保有する Diarrheagenic

PCR 法を適用し，常法（培養法あるいは monoplex PCR

血 清 型，

法）と比較した．なお，蛍光 RT-multiplex PCR 法には

,

11

あるいは

陽性

,

Enteritidis, Norovirus geno-,

常法による検査後，冷凍または冷蔵保存されていた患者

group I, Norovirus genogroup II, Sapovirus, Astrovirus

糞便を用いた．

およびの計 21 種について，蛍光 RT-mul-

tiplex PCR 法による検出状況を Fig. 1A に示した．プラ
イマーセットごとに，それぞれの病原微生物の標的とした遺伝子が目的とした増幅産物の大きさおよび蛍光色として検出された．また，Diarrheagenic

は複数の

15
Table 2.

Detection limits in RT-multiplex PCR with ﬂuorescent dye-labeled primers

Primer set
A

PathogenDetection limit per reaction
101 to 104 cfu

Diarrheagenic

B

104 copies
104 copies
104 copies
101 copies

C

102 copies
102 copies
102 copies
102 copies
102 copies

spp.

Norovirus genogroup I
Norovirus genogroup II
Sapovirus
Astrovirus

coli contains ETEC, EIEC, EHEC, EAEC, and EPEC.

Diarrheagenic

病原因子を保有する株を用いたが，それぞれの株が保有

Table 3.

するそれぞれの病原因子が検出され，多重検出が可能であった．
2.

蛍光 RT-multiplex PCR 法の検出限界

各病原微生物遺伝子の検出限界を Table 2 に示した．
Diarrheagenic

9 血清型を用いて測定した Primer

set A の病原因子の検出限界は 101 から 104 cfu/ 反応で，が 約 101 cfu/ 反 応 と 最 も 低 く，が 103 か ら 104

cfu/反応で最も高かった．Primer set B ではの検出限界が約 101 コピー/反応で，その他の病原微生物は約 104 コピー/反応であった．また，Prim-

Relationship between conventional and new
methods
Conventional

MethodPositive
New
Negative（This study）
Total

Positive

Negative

Total

27
2
29

2
29
31

29
31
60

New method: RT-multiplex PCR with ﬂuorescent dye-labeled primers.
Conventional method: bacterial cultivation and monoplex
PCR.

er set C での検出限界はすべての病原微生物で約 102 コ

multiplex PCR 法で陰性の事例がそれぞれ 1 例ずつ認め

ピー/反応であった．

られた．

3.

蛍光 RT-multiplex PCR 法による食中毒等集団感
染事例および散発事例からの病原微生物の検出状況

考察

蛍光 RT-multiplex PCR 法による患者糞便からの病原

食中毒等集団感染事例発生時には原因の究明，拡大防

微生物検出の全工程に必要な検査時間は 6〜7 時間で止のため，迅速な病因物質の特定が必要となる．近年のあった．Fig. 1B には，食中毒等集団感染事例および散食中毒集団発生事例の病因物質は発事例の患者糞便からの検出例を示した．レーン 25 でNorovirus が大部分を占めていることからわかるよう

およびは二つの病原微生物が同時に検出され，レーン 28 ではに，原因細菌およびウイルスが同時にしかも迅速にスク増幅産物の大きさが非常に近似している場合でも増幅産リーニングできることは行政対応上，非常に重要である

物の大きさと蛍光色により複数の病原微生物を識別可能と考えられる．一般的に，糞便および食品を材料としたであり，レーン 29 から 31 に見られるように，増幅産物

遺伝子検査の場合には，検査対象とする細菌あるいはウが近似している場合でも蛍光色により容易に識別可能でイルスの DNA あるいは RNA を個別に抽出し，遺伝子あった．

増幅反応も個別に実施しているが，煩雑であり，食中毒常法である培養法あるいは monoplex PCR 法と蛍光発生時に簡易に導入することは困難である．

RT-multiplex PCR 法による検出結果を Table 3 に示し

今回われわれが開発した方法では，市販されているウ

た．検出感度は 93.1％, 特異度は 93.5％および一致率はイルス RNA 抽出キットを利用して細菌とウイルスの核93.3％で あ り， 常 法 と の 有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た

酸 を 同 時 抽 出 し， 逆 転 写 反 応 後 に 蛍 光 RT-multiplex（McNemar test,＝1.00）．夏季でウイルスを想定した

PCR 法を実施している．DNA と RNA を同時に抽出す

検 査 が な さ れ て い な か っ た た め， 蛍 光 RT-multiplex

るキットも市販されているが，時間や特別な装置を必要

PCR 法で Norovirus を検出した事例が 1 事例あり，抗生とするケースが多い．しかし，今回は市販のウイルス物質が投与された後に患者糞便が採取された 1 事例では

RNA 抽出キットのプロトコールを一部変更することで，細 菌 培 養 陰 性 に 対 し， 蛍 光 RT-multiplex PCR 法 で

簡易に短時間で細菌とウイルスの核酸の同時抽出が可能が 検 出 さ れ た． ま た， 細 菌 培 養 法 でであった．また，蛍光 RT-multiplex PCR 法では 3 セッ

陽 性， 蛍 光 RT-multiplex PCR 法 で 陰 性トのプライマーセットで 12 種の食中毒起因微生物とその事例と monoplex PCR で Norovirus GII 陽性，蛍光 RT-の病原因子を電気泳動後に核酸染色を行うことなしに，

16

日食微誌

Vol. 29 No. 1 2012

PCR 産物の大きさとその蛍光色を指標として包括的に菌 9 種およびウイルス 3 種）の包括的検出に，蛍光標識

検 出・ 識 別 で き る 簡 便 性 が あ る． 蛍 光 RT-multiplex

プライマーを用いた RT-multiplex PCR 法を適用した．

PCR 法の検出限界は病原微生物により差異が認められ，本法は，細菌 DNA およびウイルス RNA を包括的に検検出限界は 101 から 104 コピー/反応であったが，食中毒出できる特徴があり，電気泳動後の染色を必要とせず等事例患者糞便を用いた適用試験結果から実用上迅速ス

PCR 産物の蛍光色と大きさの違いから病原微生物を容クリーニング検査法として問題ないことが確認された．

易に識別することが可能である．

食中毒起因微生物検査では微生物の血清型，毒素型，遺患者糞便から細菌 DNA およびウイルス RNA を市販

伝子型なども疫学調査上重要な要素であり，われわれののウイルス RNA 抽出キットを用いて同時抽出し，逆転

蛍光 RT-multiplex PCR 法により病原因子などを特定し写反応後に逆転写反応物を鋳型にして multiplex PCR 法

たうえで，検出された病原微生物を中心に血清型などのを実施した．12 種の病原微生物を三つのグループに区検査を進めることにより効率的な原因究明が可能である

分し，A セットは Diarrheagenicと考えられる．遺伝子学的方法は培養法に比較して迅速性が大きな特徴であるが，抗生物質などの投与により培

spp.,

を，B セットは,を，C セットはおよび, Norovirus, Sapo-

養陰性で菌が分離できなかった事例からも病原微生物のvirus および Astrovirus を対象としたプライマーセット

遺伝子を検出することが可能となる．

とした．食中毒等集団感染 45 事例と散発 15 事例に本法キャピラリー型のリアルタイム PCR 装置を使用し，時を適用した結果，常法である培養法あるいは monoplex

間短縮を図った食中毒細菌の網羅的検出法に関する研

PCR 法と有意差はなく，ほぼ同等の感度と特異度が得

究 2）あるいはリアルタイム PCR 法装置を用いた細菌の網られた．

羅的検出試薬も販売されているが，リアルタイム PCR 法

本法は核酸抽出から遺伝子検出までを 6〜7 時間で完

ではその特性から 1 本のチューブ中で多数の微生物を検了できることから，食中毒原因微生物の迅速スクリーニ

出することは困難な場合が多い．融解曲線分析による識ング検査法として有効であることが確認された．

別・同定では，検出対象微生物の増幅産物のm 値が近似している場合や，Norovirus などのように非常に多くの遺伝子型が存在する 5）とm 値が一定せず，

m 値のみ

で各病原微生物を区別することが困難になる．また，蛍光標識 TaqMan プローブを用いた方法でも対象微生物ごとに波長の異なった標識蛍光物質を選択する必要がある
ため，1 本の反応チューブで複数の蛍光物質を用いることには限界がある．他方，蛍光マイクロビーズアレイシ
ステムを用いて 19 種の呼吸器ウイルスを一度に包括的・網羅的に検出する方法も開発されている 9, 18）が，高額な専用機器が必要となる．われわれの蛍光 RT-multiplex
PCR 法は，全工程 6〜7 時間を要するが，特別な機器を必要とせず 1 本のチューブで 3 種類以上の病原微生物または病原因子の検査・同定が可能であり，簡易に実施できる．
包括的あるいは網羅的検出法の意義は食中毒等感染症
発生時に複数の微生物を同時に検出できることにある．
実際に複数のウイルスが同時に検出される事例 10）あるいはウイルスと細菌が同時に検出された事例 3, 4）も報告されており，われわれの蛍光 RT-multiplex PCR 法はこれらの事例にも非常に有効である．食中毒起因微生物は今回対象とした 12 種以外にも多数存在するが，われわ
れの蛍光 RT-multiplex PCR 法は他の微生物の検出にも拡大可能で，必要に応じて検査対象とする病原微生物または病原因子のプライマーセットを追加することが可能
である．
要

約

食中毒の原因の上位を占める 12 種の病原微生物（細文

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