（様式 20）成果報告書

TSUBAME 共同利用 平成 26 年度 学術利用 成果報告書

ＡＴＰ加水分解によって惹き起こされるミオシン分子モーターの偏った揺らぎ運動に関する分子動力学シミュレーション
Molecular dynamics simulations of biased fluctuations of myosin molecular motor
due to the ATP hydrolysis

川久保 達之Tatsuyuki KAWAKUBO
桐蔭横浜大学
Toin University of Yokohama
tatsu@toin.ac.jp
筋肉の収縮はそれを構成するミオシンフィラメントとアクチンフィラメント間の相対的滑り込み運動によるものであり、それを惹き起こすミオシン頭部の方向性のあるゆらぎ運動がアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の加水分解によって誘発されていることが知られているが、そのプロセスは分かっていない。本研究では、ＡＴＰ加水分解の放出するエネルギーがミオシン頭部の各原子の熱振動にどのような変調を惹き起こすか、１００ns の分子動力学シミュレーションを行った結果、頭部は本来的に一体となって尾部との接合領域を蝶番とする偏角振動をしていること、さらにＡＴＰの加水分解による摂動はその偏角振動の平均角度の方角をシフトさせる傾向があることがわかった。
Muscle contraction is caused by unidirectional relative movement between myosin head and actin
filament. This movement is triggered by ATP hydrolysis within the myosin head, but its mechanism
remains unknown. We carried out 100 ns all-atom molecular dynamics simulations at threetemperatures to investigate the effect of ATP hydrolysis upon thermal vibrations of atoms in themyosin head. The results suggested that pivoting vibrations of the myosin head are biased in one
direction by the perturbation of ATP hydrolysis.

Keywords: Muscle contraction, Myosin, ATP hydrolysis, Biased thermal vibration
１．背景と目的
本研究はＴＳＵＢＡＭＥ共同利用の平成２４年度エネルギーを機械的エネルギーに変換する熱機関と学術利用に採択された「ＡＴＰ加水分解によって惹は異なっている。熱機関の場合、作業物質は高温のき起こされるミオシン分子モーターの変形運動に関気体分子であって、その速度分布は本来当方的であする分子動力学シミュレーション」において計算をるが、それを閉じ込めているシリンダーの内壁やピ実施し、一応の成果が得られたものであるが、計算ストンに気体分子を衝突させることによって方向性終了後、対象に用いたタンパク質であるミオシンののある力を発現させている。

分子構造の欠損部分を補綴する段階で、主鎖の一部それに引き換え、生体運動を司る筋肉は図１に示が元々の構造と若干異なる構造になっていたことにすような階層構造をもっていて、その収縮は、生体気づき、公開論文をまとめるために修正した初期構系に共通なエネルギー供給物質であるアデノシン三造を使ってのシミュレーションを再度行い、完璧をリン酸（ＡＴＰ）の加水分解によって駆動される筋期したものである。

肉中のミオシンフィラメントとアクチンフィラメン

前回と多少重複するが、研究の背景と目的は次のト間の相対的な滑り込み運動によるものであることようなことである。生物が生きている証しの一つでが１９５７年 Huxley によって明らかにされた。アある“自ら動く”という現象のメカニズムは化学的

クチンフィラメントは２本の数珠玉状分子の鎖を捩（様式 20）成果報告書じり合わせたような構造をしており、一方のミオシシン分子がガラスに固定したアクチンフィラメントに接触させることによってフィラメントに沿って運動する様子を直接観測することに成功した。それによって、ミオシン分子とアクチンフィラメントの相対的な運動は１回のＡＴＰ加水分解によって一定の距離だけ進むのではなく、常に小刻みにランダムな運動をしながら、ときおり確率的に一方向に進み、ときには後戻りすることが明らかになった。
柳田グループはその実験結果から、アクチンフィラメントを突きうごかしているのはミオシン頭部の熱運動のエネルギーであってその運動はランダムであるが、相対運動に対して確率的にせよ方向を与えているのがＡＴＰの加水分解であるとしている。しかしミオシン分子内の各原子の熱振動を直接観測する実験的手段はない。 そこでわれわれは数年前から、分子動力学シミュレーション専用のＰＣを使って１回のＡＴＰ加水分解が放出するエネルギーがミオシン頭部の各原子の熱振動にどのような変調をもたらすかについての計算機シミュレーションを行ってきた。
その結果、ＡＴＰ加水分解による摂動が各原子の熱振動にある方向に偏った非対称性をもたらすことが分かったが、全体の run time が１０ns と短く、Ｘ線解析から予想される構造変化とつき合わせるには不図 1（a）筋肉の階層構造 （b）ＡＴＰの加水分解によるミオシンとアクチンの相対運動の結果起こる筋収縮 柳田敏雄著「生物分子モーター」より十分であった。
本プロジェクトでは、run time を１００ns まで伸ばし、計算の対象をミオシンの頭部だけでなく軽鎖を含む尾部の一部まで広げ、さらに環境温度を２５０

ンフィラメントは頭部と尾部からなる沢山の分子をＫ、３００Ｋ、３５０Ｋに選んだ場合の違い、非線形系尻尾の部分で束ねたような構造をしていて、両者ののランダム運動で考慮する必要がある初期値の違滑り込み運動はミオシン頭部がその中に取り込んだいによる効果などの検討も行った。その結果、各原ＡＴＰの加水分解をトリガーとして、ボートのオー子はそれぞれ熱振動をしているが、頭部は全体としルが水を掻くように振れてアクチンを引き込み、筋てそれに繋がる頸部（あるいは尾部）との接合部分肉全体の収縮を惹き起こすことが分かったが、そのを蝶番とする偏角振動（首振り運動）をしており、ATP詳細なメカニズムは謎のままであった。の加水分解による摂動はその偏角振動の平均角の方向をシフトさせる傾向のあることが分かった。

１９９０年代の後半になり、阪大の柳田敏雄博士のグループが蛍光顕微鏡を使って、ＡＴＰの水溶液２．概要中で、ガラスに固定した１個のミオシン分子がそれ具体的には、図２に示すようなホタテガイのミオシと接触するアクチンフィラメントを運動させる様子

ン分子Ｓ１（モーター部位、軽鎖および軽鎖結合部位や、逆に屈曲可能な細い針状結晶の先に付けたミオの全原子を含む）の構造解析データ（ＰＤＢ；1kk7）を（様式 20）成果報告書用いた。計算を実施するｘ、ｙ、ｚの座標は図２に直らに１００ ns の間、各原子の軌道計算を続け線で示した直交座標であり、ｘ座標は軽鎖（赤と白）る。に取り巻かれた尾部に沿ってとり、ｙ軸はミオシンがII) ＡＴＰ分子１個が加水分解によって放出するエネ

筋原繊維内にあるときのアクチンフィラメントの軸にルギー 8.60×10-20 J をＡＴＰがミオシンに結平行にとった。

合する際のγリン酸の位置から半径１０Å以内にある８０個の主鎖原子（図２において黄色で示した部分）に運動エネルギーとして分配する。分配の仕方は熱平衡の状態でのある時点を選び、その時点で各原子が持っている速度に比例す

yる大きさの付加速度をそれぞれの原子に与える方法をとった。このようにして摂動を与えた時
x点からさらに１００ ns の間各原子の軌道計算を行う。
I) と II）によって得られた各原子の軌道の違いがＡＴ
Ｐ加水分解の効果である。この効果が実際のアクトミオシン系ではどんな運動を惹き起こすことになるかを知るためには主鎖のうちでミオシンを束ねる端に近い複数の原子の位置を ATP がない場合の位置にPrimary binding site

重なるように他の全原子の時々刻々の位置を変換

Terminus of SH1 helix

すればよい。こうして得られた結果から、ＡＴＰ加水Cardiomyopathy
loop

Loop 2x分解によってミオシン頭部が全体としてどんな動きをするか、またアクチンとの接触の可能性がある部分で、どこがどのように変形するかを明らかにするこzとができる。
分子動力学シミュレーションと呼ばれるこの計算では温度が重要な役割をもっているので、常温の３００

図２ ホタテガイのミオシン分子Ｓ１の構造

K だけでなく、２５０K と３５０K の場合についてもシミュレーションを行いその違いを調べた。また、原子の青い鎖が主鎖であり、その一部黄色い部分はＡＴＰ

熱運動という確率現象では時々刻々の原子の位置の加水分解によって放出されたエネルギーを各原子ではなく、長時間にわたるその分布に意味があり、しに運動エネルギーとして分配した部分

かも同じ温度で同じ摂動を与えるならば、その分布の変化が摂動を与える寸前の初期条件によらずにミオシン分子全体を多数の水分子からなる直方体

常に同じ傾向をもたなければ生体としての機能をもの箱に浸けて、総数約１８万個の原子の集団とし、先つことにならない。そこで、まず２５０K, ３００K, ３５０

ず、５０ ns かけて３００ K の温度で熱平衡化する。

K の各温度に対して５０ ns かけて熱平衡化した後、計算は周期的境界条件法により、ソフトはＡＭＢＥＲ

時間をずらして各原子が違う位置と速度を持つ３つ

11 の GPU 版 pmemd モデュールを用い、時間刻みの時点での状態を初期状態として、３つの初期条件

は 2 fs とした。熱平衡化した後、次の二つの条件でから出発して、ＡＴＰの摂動なし、ＡＴＰの摂動ありのシミュレーションを行った。

場合について、それぞれ１００ ns の間計算するシミI ) 何も摂動を加えず温度も３００K に保ったまま、さュレーションを行い、両者の比較を行った。

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さらに、実際の筋原繊維ではミオシンフィラメントのそれぞれ一つずつ例を示した。図中、ATP ありの場

幹の部分は動かずに頭部が揺れ動くことによってア合の z の値が ATP なしの場合のｚの値より大きい場クチンと相互作用することが分かっている。そこで計合は赤色、逆の場合は青色で表示してある。この図

算結果の解析では、対象としたミオシン分子中でフィの場合、どの温度でも、ATP 加水分解の影響として、ラメントである幹に近い部位にある残基番号８０６～ミオシン頭部の原子を –z 方向へずらす傾向（青が８３１の２５個の原子について、ATP がない場合の各多い）が見られるが、他の初期条件では＋ｚ方向に原子の位置に ATP の効果を入れた場合の位置がなシフトする場合も多く見られる。

るべく重なるようにする(superimpose)。具体的には

ただ、ここに示していない別の初期条件から出発し位置の差の二乗平均が最小になるように２５個の原た場合も含めて共通して云えることは、子のＡＴＰありの場合の位置を決め、それに準じて他

ａ） 残基番号８００辺りを蝶番として、頭部は全体のすべての原子位置を変換して、その時間変化がどが同じ時刻では同じ方向へシフトする。残基番号

うなるかを調べた。

が大きな Essential Light Chain も実際の位置は図２の赤い線で示されているように頭部をと取り巻３．結果および考察
３．１ ATP 加水分解によって惹き起こされる各原子の変位
ＭＤシミュレーションの対象としたホタテガイのミオ
シン分子の構造(PDB:1kk7) は主鎖として１１３５個のα炭素を含むが、このうち残基番号が３５０～４４０いていて、頭部と同じ方向へシフトしている。
ｂ）ミオシン自体の温度が低い場合にくらべて、高い場合の方がＡＴＰの摂動効果が大きく出る。
ｃ）ＡＴＰの摂動効果がもたらす振動分布のシフトは、Actin-binding sites の領域が大きい。などである。と５１５～６００の Actin-binding sites （図３ 下部に表示した赤色の領域） にはそれぞれ Cardiomyopathy
loop、Primary binding site と呼ばれ、ミオシン頭部

３．２ ＡＴＰ加水分解によって惹き起こされる構造ゆらぎの全体像の先端近くにあって、実際の筋肉中ではアクチンフィ３次元的に配列する原子集団が揺らいでいる状況ラメントに接触する部位があり、これらの熱運動がを２次元の図面で表現するのは難しいので、ミオシ

ATP の加水分解によってどんな変調を受けるかを知

ン分子の主鎖を一続きの緑色の紐で表わし、その紐ることが重要である。

が５ ns 毎にどう変形するかを描くことによって構造

Ⅹ線溶液散乱法によるミオシンの構造変化の解析ゆらぎを表わしたのが図４である。温度は ２５０K,によると、頭部は尾部との接合部を蝶番とする横揺

３００K, ３５０K で、初期条件は図３の場合とそれぞれ（ｚ方向）運動をする傾向のあることが知られていれ同じ初期条件から出発した例である。見ている方る。そこで、本報告ではシミュレーションで得られた

向は各温度とも上段が +z 方向から、中段が –x膨大なデータの中から 1135 個のα炭素原子の５ns方向から、下段が +y 方向からであり、左コラムは毎のｚ座標の値について、ATP 加水分解の摂動があ“ＡＴＰなし”、右コラムは“ＡＴＰあり”の図である。図

る場合の値と ATP の摂動がない場合の値の差中にある黒い太線は“ＡＴＰなし”の平均構造を表わ

Δｚ＝ｚ（ATP の摂動あり）－ｚ（ATP の摂動なし）

す線で、同じ線を対応する右側の“ＡＴＰあり”の図中を求め、それを縦軸に、α炭素原子の残基番号を横にも記入して、ＡＴＰの加水分解によって本来の構造軸にとったグラフを５ ns 毎に並べる図を掲載する。

からどれだけずれるかが分かるようにした。

図３がその図で、上から 250K, 300K, 350K の場合

この図によると、２５０K ではＡＴＰによる摂動を与である。各温度とも、ATP 加水分解の摂動を与えるえた時でも構造ゆらぎの範囲はＡＴＰなしの平均構寸前の初期条件として 3 つの条件から出発して計算造からそれほどずれていないが、３００K では、ＡＴＰを実施したが、ここに示したものは、各温度についてありの場合、頭部の分布が尾部との接合部を蝶番に（様式 20）成果報告書

図３ 各残基番号の炭素原子の位置座標ｚの ATP がある場合とない場合の差Δｚの時間変化

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して –z 方向へ回転する形でずれているのが見られる。さらに高温の３５０K では構造揺らぎは –z お
よび +y 方向へも大きくシフトしＡＴＰなしの場合の平均構造からはみでるほどの分布をしている。
さらにここには提示していない別の初期条件から出発したシミュレーションによって得られた構造揺らぎの結果も含めて一般に云えることは、ミオシン分子は頭部と尾部の間（図２における座標の原点辺り）に屈曲しやすい部分があり、尾部の端を固定するとその部分が蝶番いとなり、頭部は一体となって図２におけるｘ軸にほぼ平行な軸のまわりに首振り運動をする傾向があるが、頭部の中央部にあるＡＴＰポケット(図２の黄色い部分)にＡＴＰ加水分解による僅かなエネルギーを注入すると、その首振り運動の中心軸の向きがシフトすること、さらにそのシフトの大きさは、注入するＡＴＰの加水分解エネルギーは同じでも、ミオシン自体の温度（予め与えた運動エネルギーの平均値）が高いほど大きいことが分かった。
３．３ 考察一般にタンパク質は数ナノから数１０ナノメートルの大きさであり、このサイズでは常に熱ゆらぎにさらされている。そして近年、タンパク質の諸機能の発現はこの揺らぎを排除するのではなく利用することによって発現しているのではないかと考えられるようになったが、そのプロセスは未解決の問題である。
本研究は筋肉の収縮運動を司るミオシン１分子を構成する原子の熱運動がＡＴＰの加水分解によってどのように変調されるかをＭＤシミュレーションによって調べ、ほんの入り口の知見を得たに過ぎないが、それを要約すると次のようになる。
先ず、ミオシンの頭部は本来的に尾部との接合部分を蝶番とする偏角振動をしているが、ＡＴＰの加水分解による刺激はその偏角振動の平均の方角をシフトさせる傾向があり、それは頭部の先端にあってアクチンと接触する部位で大きいことが分かった。しかもそのシフトの大きさは環境温度（予めミオシンの各原子に与えられた運動エネルギーの平均値）が高いほど大きい。これは複雑な構造をしたミオシン分子
図 4 ミオシン分子の構造の揺らぎを構成する各原子はそれぞれ沢山の山や谷からな

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るポテンシャルに支配されて運動しているが、低温では一つの谷に閉じ込められているのが、温度が高いと隣の谷にも移りやすいので、ＡＴＰの加水分解による小さな摂動でも振動のモードが変形するのだと考えられる。これは見方を変えると、ミオシンとアクチンの相対運動惹き起こすエネルギー源は熱エネルギーであって、ＡＴＰの加水分解は運動を惹き起こすトリガーの役目を果たしているに過ぎないのかもしれない。ただ温度が高すぎるとＡＴＰ加水分解の制御が効かなくて、カオス的になる可能性がある。
では具体的に頭部の各原子の揺らぎの中心がシフトする方向はどの方向かというと、図３、図４に示した例では （–z, +y） の方向で、これは図１に示したアクチンのねじれた数珠玉に沿う方向ではあるが、初期条件によっては別の方向にシフトする場合もあって今の段階では確かなことは云えない。
しかしシミュレーションによって得られた膨大なデータはいわば“宝の山”であって、解析を工夫することによって、まだまだ新しい詳細な知見が掘りだせると考えている。
４・今後の課題
ここで得られた結果は膨大な計算データに基づくものであるが、それでもまだ 1 個のミオシン分子の僅か１００ナノ秒間の挙動に過ぎない。実際の現象はアクチンとの相互作用を考えなければならないし、蛍光顕微鏡で観測される事象と照らし合わせるには数百ミリ秒の時間スケールを必要とする。その意味では今後はさらに桁違いに大容量の計算が必要となるであろう。前途遼遠ではあるが、実験的にアクセスできない短い時間・小さい空間内でのメカニズムの解明だからこそ、大型計算機によるシミュレーションが今後ますます重要になると考えられる。