ゲノム編集技術を用いた画期的な遺伝子治療開発と課題
2019年9月14日
山口照英
金沢工業大学
日本薬科大学

金沢工大曙文庫

本日の話題• 遺伝子治療について• 遺伝子治療の光と影• ゲノム編集技術により遺伝子治療開発への期待• ゲノム編集の安全性

遺伝子治療遺伝子を外から補充・付加する治療法
体内（In vivo）遺伝子治療（遺伝子を組み込んだベクターの投与）
ベクターの例直接投与

 ウイルスベクター

体外（ex vivo）遺伝子治療（遺伝子導入細胞の投与）
標的細胞を取り出す(自己、同種)

造血幹細胞
T細胞 等
培養、増幅
ベクターによる遺伝子導入レトロウイルス アデノウイルス AAV 等
レンチウイルス プラスミドベクター

プラスミドDNA

リポフェクション

 腫瘍溶解性ウイルス

腫瘍内、筋肉内、眼内、肝臓内、脳内、
皮内 等

培養、増幅

投与
遺伝子導入細胞遺伝子の変異が原因の病気では、正常な遺伝子を補充することで治療効果
がんなどの難病に対しても開発が進んでいる
欧米では既に計８品目が上市、日本は2品目承認

遺伝子治療の対象疾患
心血管 神経疾患 疾患
2%
7%
感染症
7%

単一遺伝子疾患11% がん（メラノーマ、B細胞性白血病）、前立腺癌、肺癌、脳腫瘍、頭頸部癌など

眼疾患 その他
7%1%

 単一遺伝子疾患：先天性免疫不全症（ADA欠損症）、レーバー病、 LPL欠損症、 血友病、βサラセミア、副腎白質ジストロフィーなど
がん65% ウイルス感染症：HIV/AIDS、B型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスなど
 心血管疾患：閉塞性動脈硬化症、狭心症、心筋梗塞等*J Gene Medicine 2017.11 data 神経疾患：パーキンソン病、アルツハイマー病、ALSなど
 眼疾患：網膜色素変性、加齢黄斑変性など

遺伝子疾患だけでなく様々な疾患を対象として開発研究が行われている
初期には重篤な疾患を対象としたためにがん疾患の比率が高い

遺伝子治療の歴史
創世期

停滞期

再興期

実用化

 1970年代：組換えDNA技術の発展
 1990年：世界で初めての遺伝子治療実施(米）：ADA欠損症
 1995年：日本で初めての遺伝子治療実施：ADA欠損症
 1999年：アデノウイルスベクターの大量投与による死亡事故(米）
 2000年： X-SCID遺伝子治療で初めての成功例が報告される（仏） 2002年：X-SCID遺伝子治療の副作用で白血病発症(仏） 2008年頃から単一遺伝子疾患を中心に成功例の報告が相次ぐ
 2012年：ASGCTがTarget 10（5-7年以内に実用化が期待される遺伝子治療対象疾患）を発表
 2012年：先進国で初めての遺伝子治療製品（AAV)が欧州で承認
 2015年：欧米で初めての腫瘍溶解性ウイルス製品（HSV)が欧米で承認
 2016年：欧州で遺伝子導入細胞製品2品目承認（ADA欠損症、GVHD予防）
 2017年：米国でCAR-T細胞製品2品目、遺伝子治療製品（レーバー病）1品目承認
 2019年：日本でCAR-T細胞製品とHGFプラスミド製品の承認

5

欧米で承認された遺伝子治療用製品
製品名 （社名）

製品の種類

導入遺伝子適応症

承認国

Glybera（UniQure）

AAV1

ﾘﾎﾟ蛋白質ﾘﾊﾟｰｾﾞ（S447Xバリアント）

LPL欠損症

欧州 2012（2017承認整理）

Imlygic（Amgen）

腫瘍溶解性HSV1

GM-CSFメラノーマ

米・欧 2015

Strimvelis（GSK）

レトロ-造血幹細胞

ADA

ADA欠損症

欧州 2016

Zalmoxis（MolMed）

レトロ-T細胞HSV-TK Mut2
/ΔLNGFR

ハプロHSC移植のGVHD予防

欧州・条件付承認
2016

Kymriah (Novartis)

レンチ-T細胞（CART細胞)

抗CD19
キメラ抗原受容体

B細胞性急性リン
パ芽球性白血病

米国2017
日本2019

Yescarta(Kite Pharma)
Luxturna（SparkTherapeutics)

レトロ-T細胞（CAR-T細胞)

抗CD19
キメラ抗原受容体

B細胞性リンパ腫

米国2017

AAV2

RPE65

レーバー
先天性黒内障米国2017AMG0001

HGF-プラスミド

HGF

下肢動脈梗塞
バージャー病日本2019

scAAV9SMN1

脊髄性筋萎縮症

米国2019Zolgensma(Novartis)

実用化が期待される遺伝子治療対象疾患Target 10
January 6, 2012
From: the American Society of Gene & Cell Therapy and all the Society’s past Presidents
To: NIH Director, Francis S Collins
2012年に発表されたTarget 10中4品目が2018までに承認“Target 10” group of disease and disorders
1. レーバー先天性黒内障⇒ Spark
2. ADA-SCID⇒

米国で承認（2017）

GSK 欧州で承認2016

3. 血友病B⇒ Baxter、Sparks

Phase I/II

4. X-SCID（Phase I/II）
5. パーキンソン病（Phase I)

6. 加齢黄斑変性⇒ Sanofi-Genzyme (Phase I)
7. 副腎白質ジストロフィー⇒ Bluebird Bio (Phase II/III)
8. サラセミア(溶血性貧血）⇒

Bluebird Bio (Phase II/III)

9. リンパ腫⇒Novartis, Kite Pharma米国で承認（2017）
10. メラノーマ⇒

Amgen 欧米で承認 2015
7

本日の話題• 遺伝子治療について• 遺伝子治療の光と影• ゲノム編集技術により遺伝子治療開発への期待• ゲノム編集の安全性

遺伝子治療の成功例と副作用
成功例
 アデノシンデアミナーゼ欠損症（ADA-SCID）
 X連鎖重症複合免疫不全症（X-SCID）
 慢性肉芽腫症（CGD）
 パーキンソン病
 レーバー先天性黒内障(LCA)
10名全員が視力（光感受性）回復（2009) 副腎白質ジストロフィー(ALD)
2名とも症状の進行停止(2009)

無菌室でしか生きられないXSCID患児が普通の生活を βサラセミア(2010)

重篤な副作用 アデノウイルスベクターの投与による異常免疫反応により死亡 （米・1999年）
 X-SCID遺伝子治療でレトロウイルスベクターによる遺伝子の染色体挿入により、20名中5名にT細胞白血病様症状発症 (仏英・2002年～）

単一遺伝子疾患では目覚ましい成果が得られているが、がんなどの非遺伝的疾患に対する効果は限定的 (特定のがんに対して著効を示す事例がでてきた）
予想外の重篤な副作用も生じるなど、遺伝子治療はまだ医療として克服すべき点が多いが、安全性・有効性を高めるための研究が進められている

X-SCID免疫不全症
X-SCIDはX染色体に位置するγc鎖遺伝子の異常で起る先天性疾患。γc鎖は、リンパ球の発生・分化・機能を制御するインターロイキン-2（IL-2）、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15、IL-21の細胞膜受容体
X-SCID患児は抗体産生やがん細胞を破壊するNK細胞などのリンパ球の成熟不全により感染症を繰返す治療法：抗体（ガンマグロブリン）の投与．骨髄移植（無治療では無菌室での生活）リスク要因： 感染症発祥 ⇒ 骨髄移植でのリスク
適合ドナーの存在

From 原発性免疫不全症候群情報サイトe-免疫.com

主な遺伝子治療用ベクターの構造(例）
レトロウイルスベクターアデノウイルスベクター

カプシド

エンベロープウイルスゲノム

エンベロープタンパク質

ウイルスゲノムの構造
LTR

ψ

非増殖性
LTR
レトロウイルスベクター

ψ野生性
レトロウイルスgagpolenv

LTR

非増殖性
アデノウイルスベクター

LTR
ﾌﾟﾛﾓｰﾀｰ

ITR

野生型
アデノウイルス

約36ｋｂ

E1 領域

ITR

∆E3

∆E1

ITR

E3 領域

ITR

目的遺伝子
ﾌﾟﾛﾓｰﾀｰ 目的遺伝子

LTR: Long Terminal Repeat
ψ：パッケージングシグナル
ITR: Inverted Terminal Repeat

アデノ随伴ウイルス（AAV)ベクター
プラスミドベクター
複製起点

ITR
野生型AAV

ITR
Rep

ITR

選択マーカー
遺伝子

ﾌﾟﾛﾓｰﾀｰ

目的遺伝子
約4.7ｋｂ

プラスミドDNA
目的遺伝子

ITR

AAVベクタープロモーターpoly A
付加シグナルレトロウイルスベクターの挿入変異によるがん化
X-SCID遺伝子治療:造血幹細胞を使用した理想的な遺伝子治療
CD34陽性細胞

retroviral vector

After his gene therapy, he was running around at home(science, 2000)- He is a normal little boy now LMO-2遺伝子座への挿入による白血病の発症
LTR

Ex.1

LTR

γc cDNA

γc cDNASASASDSD

LMO-2LTR(science 302, 415, 2003)

Pt 4LTR

Pt 5

Ex.2

（がん原遺伝子）

急性T細胞白血病の原因遺伝子であるTAL-1のコファクターとして機能し、TAL-1と同時にLMO-2が発現するとT細胞白血病を発症する。さらにTAL-1とLMOファミリーはGATA3のコファクターとして働き、その下流の転写活性化因子として機能する
現在より安全とされるレンチウイルスを用いた臨床試験で好成績が得られている

先端医療技術のコストの課題と普遍化
遺伝子改変したCART-19による画期的な効果
Emma Whitehead は2010年に急性白血病になり、抗がん剤治療も効かず余命半年と宣告されCART療法に最後の望みを託す。CART療法では重篤な副作用も出たが白血病細胞が駆除され、現在もALLサバイバーとして元気に生活している。

CAR T細胞療法製剤の開発

Emma Whitehead は2010年に急性白血病になり、抗がん剤治療も効かず余命半年と宣告。CART療法では重篤な副作用も出たが白血病細胞が駆除された• FDA 2017年に2つの抗CD19 CARを発現する自己CTL細胞を承認• Novartis社のCART製品KymriahがFDAから承認.小児・若年r/r B-ALL適応．2017年10月9日• 米Kite Pharma社のCART製品であるYescarta (axicabtagene ciloleucel)がFDAから承認．2種以上の全身療法でも有効性が得られなかった再発/難治性の大細胞型B細胞性リンパ腫の成人患者．2017年10月18日• 2019年2月20日Kymriah：再生医療等製品・生物由来技術部会が製造販売を承認
CD19

今後CART019 以外のCTL製品がでてくるか：
固形がん
ユニバーサルドナー細胞技術の実用化：患者ではなくドナー由来のCAR-T細胞の利用
高額な医療費の課題

B細胞白血病CART19T細胞

CAR T細胞療法製剤の開発• FDA 2017年に2つの抗CD19 CARを発現する自己CTL細胞を承認• Novartis社のCART製品KymriahがFDAから承認.小児・若年
r/r B-ALL適応．2017年10月9日• 米Kite Pharma社のCART製品であるYescarta (axicabtageneciloleucel)がFDAから承認．2種以上の全身療法でも有効性が得られなかった再発/難治性の大細胞型B細胞性リンパ腫の成人患者．2017年10月18日• がん治療を受けた患者ではCARTの製造（増幅）が困難な場合がある• ユニバーサルCART製品の開発（FDAが同種由来CARTの治験を承認.2018） ⇒ ゲノム編集への期待• サイトカインストーム症、毛細管漏出症、致死的脳症などの重篤な副作用をどのように制御していくかが課題

本日の話題• 遺伝子治療について• 遺伝子治療の光と影• ゲノム編集技術により遺伝子治療開発への期待• ゲノム編集の安全性

遺伝子治療とゲノム編集による治療の違い
ゲノム編集による遺伝子治療

従来の遺伝子治療
染色体異常遺伝子

遺伝子導入

染色体
レトロ、レンチ

ゲノム編集による切断
AAV

染色体外異常遺伝子

異常遺伝子

正常遺伝子
本来とは異なる場所

 遺伝子を補充・付加する治療法
 異常遺伝子は残る

非相同末端
連結修復
Ｘ
遺伝子の機能消失

ドナーベクター

相同組換え

異常遺伝子の修復

 異常遺伝子や特定の遺伝子の機能消失（優性遺伝病の治療）

 正常遺伝子の組み込み部位は制御不能➡がん化の可能性

 異常遺伝子の変異を修復（究極の遺伝子治療）

 導入遺伝子の発現調節は困難

 遺伝子の発現調節も可能

 がん化を生じない安全な部位への遺伝子導入

従来の遺伝子治療では実現できない治療が可能
しかし開発が進むにつれて課題も明らかに

ZFN/TALEN/CRISPRによるゲノム編集
2010年～

1996年～

Zinc finger nucleases (ZFNs)
FokI nuclease

Zinc finger binding motifs

2012年～

TALE nucleases (TALENs)

20-bp target sequence

Transcription Activator-Like Effectors

FokI nuclease5’-TAGCCATCAGGTTTTATGTGATGGAACACCTGAGGGACCACTATTACGTA-3’
3’-ATCGGTAGTCCAAAATACACTACCTTGTGGACTCCCTGGTGATAATGCAT-5’
Zinc finger binding motifs

CRISPR/Cas9

FokI nuclease

FokI nuclease

Transcription Activator-Like Effector

TTTCCAGGATTATGTAATAGPAM
GT
GGT
G
ACAGT
AGGGA
TGTCA G UUUCCAGGAUUACGUAAUAG
TCCCTGAGCAC
AAAGGTCCTAATACATTATCG UAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAUU AAU AUUUU GUGAAA
U A
Cas9
U C G
U A
G C
A A UG
U A
GA
guide GG CC
A C
G GC GC ARNAUA UGA
GAAA

二本鎖切断(DSB)

non-homologous end joining(NHEJ)

遺伝 子X
homologous recombination
(HR)
GFP

遺伝indel子X

ノックアウト（破壊）遺伝 GFP子X

ノックイン（挿入）遺伝子暗号はATGCの4つの塩基からなり、ヒト染色体は30億塩基からなる目的遺伝子を確実にとらえるには特異的な遺伝子配列を認識する設計が必要⇔in silico

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの改良の取り組み
dead Cas9 (dCas9)
 切断しないCas9（dead Cas9）が開発されている。
 dead Cas9は、リプレッサードメイン又はアクチベータードメインを結合させたCas9が、遺伝子発現を調節するプロモーター領域等に結合し、遺伝子の発現を抑える（CRISPRi）、又は遺伝子の発現を上げる（CRISPRa）ものや、緑色蛍光タンパク（GFP）を結合して狙った遺伝子を光らせたり、メチラーゼ、デメチラー
ゼを結合させてメチル化、脱メチル化したりするものもある。

ゲノム編集遺伝子治療の定義と適用範囲
ゲノム編集による遺伝子切断
配列認識モジュールヌクレアーゼDNA二本鎖切断

A T G C T G
I

I

I

I

I

欠失／挿入
相同組換え

I

T A C G A C
切断しないゲノム編集
エフェクター
脱アミノ化

NH2

ATGCTGATCTA

ATGCTGATUTATACGACTAGATTACGACTAAAT

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

エフェクター
脱メチル化

Me

ATGCTGATCTA

ATGCTGATCTATACGACTAGATTACGACTAGAT

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

I

III

I

I

I

I

I

脱アミノ化（デアミナーゼ）
リコンビナーゼDNAメチル化/脱メチル化
ゲノム以外の修飾

点変異

遺伝子改変に該当

組換え
DNAの特異的修飾は遺伝子治療の範囲

遺伝子発現制御
現時点では含めないが今後の検討課題

ゲノム編集治療の臨床試験登録件数（ClinicalTrials.gov, 2019.6)
件数

海外ではすでに50件以上のプロトコールが臨床試験に入っている

25

20

15

TALENの開発
10

CRISPR/Cas9の開発

50

2009

2010

2011

2012

2013
2014
CRISPR
TALEN

2015
ZFN

2016

2017

2018

2019

年

日本ではまだ実施されていないが、海外ではゲノム編集の臨床試験が急増
20

Clinicaltrial.govに登録済のゲノム編集臨床試験
受理
年
2009

対象疾患

状況

ゲノム編集の種類、導入法

HIV

終了

ZFN

アデノex vivo

標的細胞・組織・臓器T細胞

2010

HIV

終了

ZFN

アデノex vivo

201020122014
2015

HIV
HIV
HIV
HIV

終了
実施中
実施中
リクルート中

ZFN
ZFN
ZFN
ZFN

アデノ
アデノ
mRNA
mRNA

ex vivoex vivoex vivoex vivo

2015

HIV

リクルート中

ZFN

mRNA

2016
2016

血友病B
ムコ多糖症1型

リクルート中
未実施

ZFN
ZFN

2016

ALL、CML

リクルート中

TALEN

AAV
AAV
mRNA
（CARはレンチ）

2016

非小細胞肺がん実施中

CRISPR

未実施

ZFN

リクルート中

TALEN

膀胱がん
未実施
腎細胞がん
未実施
前立腺がん
未実施
ムコ多糖症2型
未実施
EBｳｲﾙｽ性腫瘍
未実施
ﾊﾟﾋﾟﾛｰﾏｳｲﾙｽ性子宮頚2017
未実施
部上皮内部腫瘍
2017
食道がん
リクルート中CRISPRCRISPRCRISPRZFNCRISPRTALEN,CRISPRCRISPR

2016 子宮頚部前がん病変
2016
2016
2016
2016
2017
2017

小児ALL

plasmidmRNA(CARはレンチ）

AAV
plasmid

標的遺伝子 ゲノム編集目的

治験段階

CCR5KO

Phase 1T細胞

CCR5KO

Phase 1

CCR5
CCR5
CCR5
CCR5

KO
KO
KO
KO

Phase 1/2
Phase 1/2
Phase 1/2
Phase 1

ex vivo

T細胞
T細胞
T細胞
造血幹細胞
T細胞

CCR5

KO

Phase 1in vivoin vivo

肝臓
肝臓

アルブミン座アルブミン座

遺伝子導入
遺伝子導入

Phase 1
Phase 1

ex vivo

T細胞

TCR, CD52

KO （UCART19)

Phase 1

ex vivo

T細胞

PD-1

KO

Phase 1in vivo

子宮頚部

HPV

KO

Phase 1

ex vivo

T細胞

TCR, CD52

KO (UCART19)

Phase 1

ex vivoex vivoex vivoin vivoex vivo

T細胞
T細胞
T細胞
肝臓T細胞

KOKO
KO
遺伝子導入
KO

Phase 1
Phase 1
Phase 1
Phase 1
Phase 1in vivo

子宮頚部

KO

Phase 1

ex vivo

T細胞

PD-1
PD-1
PD-1
アルブミン座PD-1
HPV16,
HPV18 E7
PD-1

KOPhase 2

CCR5を改変してHIVに感染しないようにする
HIV感染するリスクの高い人のなかで感染しない人がいることが発見
HIVが感染するリンパ球のCCR5に変異があることがわかる
CCR5に変異を入れるとHIVに感染しなくなり、HIV陽性患者のCCR5を改変することにより治療が可能では

HIVはCCR5を介してCD4+リンパ球に感染
CCR5

CD4陽性リンパ球

CCR5への結合を阻害するHIV治療薬が開発中David Cyranoski & Heidi Ledford: Genome-edited baby claim provokesinternational outcry. - The startling announcement by a Chinese scientistrepresents a controversial leap in the use of genome editing. Nature NEWS26 NOVEMBER 2018 563, 607-608 (2018)

ヒト胚をゲノム編集することのリスク
香港大学で開催された国際ヒトゲノム編集サミットで中国の科学者がヒト受精卵のゲノム編集を行い既に二人の子供が生まれていると報告（2018．11）
中国の南方科技大学の賀建奎副教授がHIVに感染しないようにヒト胚にゲノム編集を行い2人の女児が生まれたと報告

The Guardianの記事より

血友病AAV遺伝子治療
効率的な産生遺伝子コドンの最適化
CpG含量

十分な効果を得ることが難しい
いかに効率よく発現させるか

F-VIIIやF-IXに対する中和抗体
AAVベクターの結成型の選択
空ベクター
最適な製造

AAVに対する中和抗体
Doshi & Arruda : Gene therapy for hemophilia:
what does the future hold? Ther Adv Hematol
2018, Vol. 9(9) 273–293

血友病治療薬開発と患者の延命効果
血液製剤やバイオ医薬品開発の努力により現在では健常人に近い人生が送れるようになってきている

我が国では血漿由来製品と組換えDNA製品の２つが承認

血友病治療：インヒビターとの戦い
高用量のF-VIII、F-IXの投与
ヘモフィリアA/B（F-VIII, F-IX欠損）
バイパス製剤先天性疾患では補充するFVIIIやF-IXは異種タンパク質として認識され中和抗体（インヒビター）ができてしまう。製剤量やバイパス製剤を活用しながら出血を制御する必要がある。

バイパス製剤としては、血液凝固第Ⅹ(10)因子加活性化第Ⅶ（7）因子（FⅦa/FX）、血液凝固因子抗体迂回活性複合体（aPCC）、遺伝子組換え活性化第Ⅶ（7）因子（rFⅦa）などが用いられる
化血研、業務停止処分へ
2015/12/25 日本経済新聞「薬事制度揺るがす」

化血研は処分期間中、医薬品の出荷ができなくなる。
ただ、代替がきかない一部の血液製剤やワクチンなどは患者への影響が大きいため処分対象から外す

患者ごとに製剤特性に合わせた治療が行われており、異なるF-VIII製品
では出血コントロールが難しい

血友病A及びBを対象とした遺伝子治療薬の開発
血友病
第8因子は肝臓で生産され、血中に一定量の維持されなければ出血傾向等の有害事象が発症する
歯茎からの出血や関節での出血も頻発し、特に関節での出血により変形性関節症を引き起こす
遺伝子治療での課題
 十分な量の第8因子や第9因子の供給が必要十分な第8因子の供給が可能な
AAVベクターを開発

Hemophilia A
Pfizer/Sangamo: SB-525 is a gene therapy that uses an AAV vector to deliver a new
therapeutic copy of the Factor VIII gene to the patient’s liver cells, designed to enable theliver to produce and secrete functionally active Factor VIII protein into the bloodstream.
遺伝子治療によるヘモフィリア治療の長所と欠点
 新しい技術であり、長期に亘る有効性や安全性が課題
 挿入変異のリスク
 継続した第8因子や第9因子の産生が期待され1回の投与により何年にも亘って効果が持続 単回での薬剤費は高いと想定されるが生涯にわたる医療費は抑制可能 幼少期（乳児期）に投与することにより免疫応答が抑えられインヒビター発生が抑制

血友病AAV遺伝子治療

Ohmori et al: CRISPR/Cas9-mediated genome editing via postnatal administration of AAVvector cures haemophilia B. Scientific Reportsvolume 7, Article number: 4159 (2017) |体内ゲノム編集の臨床試験
 血友病B：血液凝固第9因子の遺伝子変異により、出血が止まらなくなる遺伝性疾患
 ムコ多糖症１型、２型：代謝酵素の欠損により、様々な臓器障害、脳の障害が進行する遺伝性疾患
 現在の治療法は不足している血液凝固因子/欠損酵素の注射（週１、２回、一生涯）

体内ゲノム編集（2017投与開始）
AAV2/6ベクターにゲノム編集コンポーネントを搭載

ZFN1, ZFN2
治療用正常遺伝子

肝臓のアルブミン遺伝子座に正常遺伝子が組み込まれる
Sangamo社資料より

1回の投与で、肝臓から長期間、治療用タンパク29質が産生

体内ゲノム編集の臨床試験
 血友病B：血液凝固第9因子の遺伝子変異により、出血が止まらなくなる遺伝性疾患
 ムコ多糖症１型、２型：代謝酵素の欠損により、様々な臓器障害、脳の障害が進行する遺伝性疾患
 現在の治療法は不足している血液凝固因子/欠損酵素の注射（週１、２回、一生涯）
従来の遺伝子導入型ベクターによる遺伝子治療とゲノム編集を体内ゲノム編集（2017投与開始）用いた血友病治療法の開発が進む。
必ずしもどちらの方が優れているかいう問題ではなく、その疾病
ZFN1, ZFN2
AAV2/6ベクターにゲの特徴にあった治療法が開発されてくることが望ましい
ノム編集コンポーネ
治療用正常遺伝子ントを搭載 このような遺伝子治療は単回投与では非常に高額ではあるが一回の投与により生涯にわたる効果が得られればむしろ医療費の低減化に寄与する肝臓のアルブミン遺伝子座に正常遺伝子が組み込まれる
Sangamo社資料より

1回の投与で、肝臓から長期間、治療用タンパク30質が産生

鎌形赤血球症• アフリカ、地中海沿岸、中近東、インド北部に高発現する遺伝的疾患• 赤血球の酸素運搬を担うβヘモグロビンの遺伝子(11番染色体）の6番目の遺伝子がグルタミンからバリンに変っているために起こる先天性疾患• 毛細血管内でヘモグロビンが重合し三日月のように変形して詰まらせる。
同時に溶血も起こり重度の貧血を起こす
鎌型赤血球症の患者はマラリアに抵抗性があったために熱帯マラリア蔓延地域で選択圧がかからなかったと想定される正常型遺伝子 3'-GGA CTC CTC-5‘
アミノ酸配列-Pro Glu Glu
鎌型赤血球症 3'-GGA CAC CTC-5‘
アミノ酸配列-Pro Val Glu
ヘモグロビンの6番目の遺伝子をCACからCTCに戻すことができれば治療効果が期待できる
ただし赤血球の元になる造血幹細胞を全て改変するのは至難

CRISPR/Casを用いた鎌形赤血球の臨床試験
A CRISPR Approach to Treating Sickle Cell
Posted on April 2nd, 2019 by Dr. Francis Collins

鎌形赤血球患者のヘモグロビン遺伝子をCRISPR/Casで破壊し、胎児型ヘモグロビン（HbF)を誘導
One particularly exciting approach involves using gene editing to increase levels of fetal
hemoglobin (HbF) in the red blood cells of people with SCD. Shortly after birth, babies
usually stop producing HbF, and switch over to the adult form of hemoglobin. But rare
胎盤 お母さんの赤血球はヘモグロビンA（HbA)
individuals continue to make high levelsof HbF throughout their lives. This is referred to as臍帯 胎児の赤血球はヘモグロビンF（HbF)
hereditary persistence of fetal hemoglobin (HPFH). (My own postdoctoral research in theHbFはHbAより酸素のへの親和性が高いために
early 1980s discovered some of the羊水
naturallyoccurring DNA mutations that lead to this
卵膜 HbAの酸素を効率よく受け取れるcondition.)
Gene therapy targets sickle-cell disease - The research is promising, but a true cure for thispainful condition could be years away.. Anna Nowogrodzki Nature (2018)

CRISPR/Casを用いた鎌形赤血球の臨床試験
A CRISPR Approach to Treating Sickle Cell
Posted on April 2nd, 2019 by Dr. Francis Collins

鎌形赤血球患者のヘモグロビン遺伝子をCRISPR/Casで破壊し、従来の遺伝子導入型遺伝子治療で鎌形赤血球の治療を行
胎児型ヘモグロビン（HbF)を誘導
うには殆ど造血幹細胞のヘモグロビンを正常型ヘモグロビン遺伝子に変換する必要があり、現実的には困難（遺伝子One particularly
exciting approach involves using gene editing to increase levels of fetalを導入しただけでは異常ヘモグロビン遺伝子は残ったまま）
hemoglobin (HbF)
in the red blood cells of people with SCD. Shortly after birth, babies
ゲノム編集を用いた成人型ヘモグロビンをノックアウト（遺伝usually stop producingHbF, and switch over to the adult form of hemoglobin. But rare
子を破壊）するのは遺伝子導入よりも比較的効率よくおこな
胎盤 お母さんの赤血球はヘモグロビンA（HbA)
individuals continue
to make high levelsof HbF throughout their lives. This is referred to as
うことが可能臍帯 胎児の赤血球はヘモグロビンF（HbF)
hereditary persistence of fetal hemoglobin (HPFH). (My own postdoctoral research in theHbFはHbAより酸素のへの親和性が高いために
early 1980s discovered some of the羊水
naturallyoccurring DNA mutations that lead to this
卵膜 HbAの酸素を効率よく受け取れるcondition.)
Gene therapy targets sickle-cell disease - The research is promising, but a true cure for thispainful condition could be years away.. Anna Nowogrodzki Nature (2018)

本日の話題• 遺伝子治療について• 遺伝子治療の光と影• ゲノム編集技術により遺伝子治療開発への期待• ゲノム編集の安全性

安全性：オフターゲット効果の評価法
 In silicoでオフターゲット候補部位を予測し、PCR増幅後次世代シーケンサーによりディープシーケンスする方法
検出感度 0.1%以下?
全てのoff-target siteを予測できる保証はない

 全ゲノムシーケンスにより検出する方法
 検出感度 ～1%？
 クローニングした細胞株では培養により自然変異が入る可能性(Tsai SQ et al. Nat.Rev. Genet 17, 300,2016)オフターゲット変異のgenome-wide検出法
BLESS (2013)

Guide-seq (2015)

HTGTS(2015)

Digenome-seq (2015)

High-throughput genome-wide
translocation sequencing
DSB部位にbiotinラベルアダプターを結合させ、avidinで選択後、次世代シークエンス
検出感度 ～1%
Breaks labelling, enrichment on streptavidin
and next-generation sequencing (BLESS)DSBによりNHEJが起こる際にdsODNを取り込ませ、特異的プライマーを用いたLAM-PCR
後、次世代シークエンス
検出限界 ～0.1%

DSBによる転座部位を、特異的プライマーを用いたLAMPCR、次世代シークエンスで検出
検出限界 ～0.1%

 各方法にはそれぞれ得意、不得意あり
 これらの方法を用いてもあくまで予測でしかない
 実際に投与する細胞の変異を見ることはできない(Tsai SQ et al. Nat.Rev. Genet 17, 300,2016)

Cell-freeでDSB後、全ゲノムシークエンスし、同一5’末端として検出
検出感度 0.1%以下

ゲノム編集の医療応用の問題点
１．従来の遺伝子治療の問題• （主に）ベクターの免疫原性、細胞毒性• ベクターの挿入変異による造腫瘍性等（レトロウイルス、レンチウイルス）
遺伝子治療の研究 ＝ delivery, 安全性, 免疫の研究
２．ゲノム編集に固有の問題• 人工制限酵素（細菌由来！）の免疫原性、細胞毒性• 人工制限酵素の遺伝毒性（オフターゲット変異）• がん関連遺伝子の変異リスク• 染色体切断による転座や欠失• 遺伝子ノックイン時のP53の変異

問題その１：人工制限酵素の免疫原性• 人工制限酵素の免疫原性
 65%に抗spCas9抗体、79%に抗SaCas9抗体、46%に抗SaCas9(Charlesworth et al., BioRxiv, 2018)T細胞
 2.5%に抗spCas9抗体、10%に抗SaCas9抗体（ELISA）(Simhadri et al., Mol Ther Methods Clin Dev, 2018)

 AAV-CRISPRのマウス骨格筋投与後、Cas9に対する液性・(Chew et al., Nature Methods, 2016)
細胞性免疫応答 免疫原性の決定因子：ベクターの血清型、投与経路、投与量、プロモーター特異性、宿主、etc.
 ex vivo vs. in vivo、タンパクで導入 患者スクリーニング• 免疫抑制？
• 本当に遺伝子付加治療よりも有利か？
• 遺伝子（付加）治療も大型動物への移行が困難だった

問題その２: オフターゲット以外のDNA変異
頻度

変異/バリアント
細胞あたりの頻度
酵素の<0.001 (0.1%)?
オフターゲット変異
ドナーDNAのランダ~0.05 (5%)?
ム部位への組み込み>10DNA 複製エラー(1→108 細胞として)
個人間の>106
DNAバリアント• 検出法• 転座、large deletion?
• 相同組換え修復• 検出困難 ・dsDNA• iPS細胞• オフターゲット変異との区別• 外来DNAが残らない → 変異を見つけにくい• in vivo法： オフターゲット変異の蓄積
使用する動物とヒトゲノムとの違い→ オフターゲット配列が予測不可能

変異は必ず生じる → がん化に関係する変異かが重要.多くの変異は細胞死をまねく

問題その３:ゲノム編集の安全性評価：染色体転座リスク

Chen et al:Targeted Chromosomal Translocations and Essential Gene
Knockout Using CRISPR/Cas9 Technology in Caenorhabditis elegans.
Genome Research 2017

がんキメラ融合遺伝子

Ferguson & Frederick :DNA double strand break repair andchromosomal translocation: Lessons
from animal models. Oncogene 20: 5572 (2001)

Torres et al: Engineering human tumour-associatedchromosomal translocations with the RNA-guided
CRISPR–Cas9 system. Nature Communications 2014

問題その４: CRISPR・CAS9によるHDRゲノム編集はp53変異のある細胞で起きやすい

P53：がん抑制遺伝子

CRIPSPR/Cas9によるゲノム編集をがん抑制遺伝子であるp53KOヒト網膜細胞に適用すると効率よくゲノム編集できるが、正常細胞ではクリスパーに対抗してがん抑制遺伝子が働き、編集に失敗しやすいことを報告。P53の影響で細胞が死んだり、増殖が停止するという。著者らは、結果としてがん化の恐れが高い細胞が多く残る可能性があると指摘
Haapaniemi et al: CRISPR/Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response. Nat. Med. 2018
Ihry et al: p53 inhibits CRISPR-Cas9 engineering in human pluripotent stem cells Nat. Med. 2018

まとめ
• 従来の遺伝子治療は遺伝子導入（ノックイン）技術．
特定の部位に挿入することはできない• 遺伝子導入による遺伝子治療で画期的な治療効果が認められるようになったが発がんリスクなど克服すべき課題がある• ゲノム編集技術は従来の遺伝子治療の欠点を克服できる可能性のある技術であり、究極の遺伝子治療になる可能性をもつと期待されている• ゲノム編集は技術的には未完成の部分が多く、克服すべき課題は多い• 従来型の遺伝子治療とゲノム編集を比較してどちらが優れているという問題ではない。それぞれ特徴を生かした開発が進められる必要がある