−報3文−

変異導入による抗体の交叉反応性改善
武松藤葉隆

悠＊ 1
雄＊ 1

Improving the Cross−Reactivity of an Antibody Using Site-Directed Mutagenesis

Yu MUTO
Takao MATSUBA

Isolation of monoclonal antibodies with high affinity and specificity is difficult. Therefore, we have established atechnology to obtain high performance rabbit monoclonal antibodies. With this technology, we can acquire highly
functional antibodies, but the selection from numerous candidate antibodies is laborious and time-consuming. In thepresent study, we have devised a novel method to isolate high performance monoclonal antibodies by introducing
amino acid mutation to an antibody that has high affinity but does not have sufficient specificity for diagnostic use.
We performed alanine-scanning on CDR3 of an immunoglobulin heavy chain to determine the amino acids that were
not involved in antigen recognition. After introducing the mutation to the amino acids that did not relate to binding,cross-reactivity of the antibody was improved without decreasing its affinity.   By using this technique, specificity ofthe monoclonal anti-triiodothyronine antibody (UT2AY-5), which has cross-reactivity to metabolites of diclofenac (anon-steroidal anti-inflammatory drug),

was improved. Thus, this technique is expected to be useful for making highperformance monoclonal antibodies in a short period of time.

1．緒は、膨大な数の候補抗体の中から選別する必要があり、言

この工程に多くの時間と労力が必要であった。そこで、モノクローナル抗体は標的抗原に特異的かつ高親和親和性は高いが特異性の改善が必要な抗体へアミノ酸性に結合することから、ELISA，ウエスタンブロット

変異を導入することで、高親和性と高特異性を兼ね備などの実験用試薬としてだけではなく、癌・自己免疫えた抗体に改変する検討を行った。

疾患などの治療薬、免疫診断薬の中核材料として広く

抗 体 の 抗 原 認 識 能 は、 相 補 性 決 定 領 域

利用されている。これらの用途で使用する抗体は特に（complementarity determining region：CDR） と 呼 ば高い親和性と特異性が要求されるが、それらを兼ね備れる、抗原と直接接触する 5 ～ 10 残基程度のアミノえた抗体を単離するのは難しく、特に低分子抗原を高酸領域により決定される。この CDR のアミノ酸にい特異性で認識する抗体の単離は非常に困難である。

変異を導入することで抗体の機能を改変する研究は、これは低分子抗原では、抗体と相互作用することのでファージディスプレイ 2，3）という手法を用いて広く行きる部分が限られること、さらに類似の構造をもつ化われている。ファージディスプレイでは、CDR へラ合物が多く存在することに起因する。

ンダム変異を導入した組換 Fab 断片をファージ上に表

我々はこれまでに、高性能抗体の取得技術としてウサギモノクローナル抗体創製技術

1）示させ、パニング法により目的抗体のスクリーニングを確立し、低分子を行う。しかし、パニング法を用いたスクリーニング抗原に対して高い特異性と親和性で結合できる抗体をでは抗体の濃度の影響を無視できず、ライブラリー中単離した。しかし、特異性と親和性の両方が高い抗体に微量にしか存在しない高機能抗体の単離は原理的に＊1不可能であった。このため、より系統的な方法を用いバイオサイエンス事業部

開発部

技術開発 GTOSOH Research & Technology Review Vol.56（2012）

4た抗体機能改変技術が必要とされていた。

［4］AIA 装置上での親和性の評価

今回我々は、抗体の抗原結合に最も寄与が大きいと競合法の測定原理上、抗体の親和性が高いほど、下いわれる CDR3 領域に着目し、系統的なアミノ酸変異

記に示す B ／ B0 の値が小さくなり、競合がかかりやを導入することで、抗体の親和性を低減させずに、特すい 6）。つまり B ／ B0 の値を測定することで抗体の親異性を改善する技術の構築に成功した。この論文で和性を相対的に比較することができる。そこで、アミは、ジクロフェナク代謝物に対して交叉反応性を示すノ酸変異を導入した抗 T 3 ウサギモノクローナル抗体

抗 T 3 抗体
（抗トリヨードサイロニン抗体 : U T 2AY − 5）の親和性の相対評価は、全自動エンザイムイムノアッの交叉反応性の低減に関して報告する。

セイ装置 AIA 600II（東ソー株式会社製）を用いて下記の方法で行った。まず変異抗体を使用した AIA600II2．実用の試薬（以下 AIA 試薬と省略）を作製し、T 3 を含験まない血清（cal1）と既知濃度（35 pg ／ mL）の T 3 を［1］抗 T3 ウサギモノクローナル抗体の単離含む血清（cal6）を測定した。その後 B／B0 の値を、（cal6高親和性を示す抗 T 3 ウサギモノクローナル抗体は、／ cal1）× 100 の計算式で算出した。得られた値と変BSA － T 3 を免疫したウサギ（日本白色種）から脾臓

異導入前の抗体の B ／ B0 とを下記に示す計算式で比較を摘出し、定法に従って脾臓細胞を調整した後、ウサした。

ギモノクローナル抗体創製技術 1）を用いて単離した。

変異型（100−B ／ B0）
親和性（％）＝
×100
野生型（100−B ／ B0）［2］変異導入抗体の発現とスクリーニング（1）抗体遺伝子への変異導入［5］AIA 装置上での交叉反応性の評価

抗体遺伝子への変異導入は、変異配列を導入した

ジクロフェナク代謝物に対する交叉反応性評価は、

PCR プライマーを作製し、KOD − Plus − Mutagenesis

下記の方法で行なった。まず評価したい抗体で AIA 試

Kit（東洋紡績株式会社製）を用いて行った。

薬を作製し、ジクロフェナク服用前および服用 2 時間（2）変異導入抗体の発現（COS 細胞による一過性発現）後のヒト血清を測定した。AIA600II で得られる蛍光強COS 細胞で、変異を導入した遺伝子組み換え抗体度の値（服用前 : rate 0、服用後 : rate 1）の比をとり、4, 5）。96 ウェルプレート上で対数増殖変化割合を下記の式で比較することで行った。

期にある COS 細胞に、変異を導入したＨ鎖発現ベク（1−rate1 ／ rate0）変異型
交叉反応率（％）＝×100（1−rate1 ／ rate0）野生型の生産を行った

ター（8 ng）とＬ鎖発現ベクター（16 ng）を、リポフェ
クトアミン 2000（ライフテクノロジー社製）を用いて導入した。遺伝子導入時の培地は、Opti − MEM（ライフテクノロジー社製）を使用した。遺伝子導入から［6］変異導入抗体の親和性測定
BIAcore T − 100（GE ヘ ル ス ケ ア 社 製 ） を 用 い て、3 日後に培養上清を回収し、発現抗体を評価した。

変異導入前後のウサギモノクローナル抗体（UT2AY −（3）ELISA

5, U T 2AY − 5mu2）の親和性を下記に示す方法で測定

培養上清中の抗 T 3 抗体は下記の方法で検出した。

した。T 3 をアミンカップリング法で、センサーチッ

α Rabbit − IgG (0.5 μ g ／ mL) を ELISA プレートにプ（CM5）上に固定化し、ランニング緩衝液：HBS固定化した後、1％スキムミルクでブロッキングした。

− EP、 反 応 温 度：25 ℃、 流 速 30μ L ／ min、 結 合 時

その後、アルカリフォスファターゼ（ALP）標識 T 3

間：1 min、解離時間 10 min の条件で抗体の結合と解存在下で、遺伝子導入後の細胞培養上清を ELISA プ離を測定した。また得られたデータは、解析ソフトレート上で 1 時間反応させた。未反応の ALP 標識 T 3（BIAcore T100 Evaluation Software, version. 1.1.1） をを B／F 分離後、酵素基質である 4−メチルウンベリフェ用い、bivalent モデルで解析し、ka（M − 1s − 1）、kd（s − 1）、リルリン酸（4 − MUP）を分注し、蛍光強度を測定すKD（M）の値を算出した。

ることで検出した。
［3］変異導入配列の確認
抗体遺伝子の塩基配列は、ABI PRISM 310 GeneticAnalyzer（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて解析した。

3．結果および考察［1］変異導入前の抗 T3 抗体の性能
ウサギモノクローナル抗体創製技術を用いて数種の抗 T 3 モノクローナル抗体を単離した。単離抗体を用

東ソー研究・技術報告第 56 巻（2012）5

いて AIA 試薬を作製し、検量線を作成した結果を図１

10 番目を特徴的なアミノ酸であると判断した。番号 5に示す。単離した抗体の中で、U T2AY − 5 は最も親和は単純な骨格のアラニンに対して極性アミノ酸のアス性の高い抗体であるが、ジクロフェナク代謝物に対しパラギン、番号 8 はグリシンに対して酸性アミノ酸のて交叉反応性を示していた。今回、この抗体を特異性

アスパラギン酸、番号 10 は欠損に対して塩基性アミ改変の材料として選択した。

ノ酸のアルギニンという組み合わせになっている。そB／B0［％］

こで、これら 3 箇所のアミノ酸に対してランダムにア100

ミノ酸置換を行った。

80［3］変異導入抗体の親和性と交叉反応性の評価
U T 2AY − 5 のアミノ酸番号 5, 8, 10 の位置にランダ

60

ムにアミノ酸置換を行った各抗体（表１；5 − X, 8 − X,10 − X）の親和性を、AIA 600II で評価した。その結果、

40

アミノ酸番号 8 の位置の置換抗体では親和性が大きく低下してしまうことがわかった。また、アミノ酸番号205 の位置の置換抗体では、Arg および His への変異は親和性の低下は少なかったが、それ以外では大きく低0110100

T 3 conc.［pg／mL］できず、より詳細な考察を行うには X 線結晶構造解析

Calibration curves of T 3 measured with the AIA reagent using● ; UT 2AY−5, ○ ; U T2AY−4, ■ ; UT1D−5, □ ; UT6AY−10 areshown. B0 means the value of the calibrator without T3 and B
means the value of the calibrator containing T3.

Fig. 1

下してしまった。この現象がどこに起因するかは推測

Comparison of calibration curve of the AIA reagentsusing isolated antibodiesなどを用いて、タンパクの立体情報を得る必要がある。
アミノ酸番号 10 の位置を置換した抗体では親和性の変化はなかった（図２）。これは 10 の位置のアミノ酸が T 3 の認識に関与していないためだと考えられる。
親和性の変化がなかったアミノ酸番号 10 の位置の変異型抗体に対して交叉反応性を評価した。結果を［2］アミノ酸変異導入位置の決定
H 鎖の CDR3 配列は抗原との結合に最も寄与が大

図３に示す。アミノ酸番号 10 の Arg を Lys に置換しきいことが知られている 7）。まず、配列中の特徴的なた変異型抗体では交叉反応性の改善は見られないが、アミノ酸が交叉反応に関与するアミノ酸であると考Gly に置換した変異型抗体（10G）は wild − type と比え、同一のウサギ個体から得られた 2 種の抗 T 3 抗体

較して、交叉反応性を 40％まで低減できた。これらのＨ鎖 CDR3 領域の配列を比較した ( 表１；U T 2AY −の結果から、アミノ酸番号 10 の位置の塩基性アミノ

4, U T 2AY − 5)。その結果、U T 2AY − 5 において、5、8、酸側鎖がジクロフェナク代謝物との交叉反応に関与しTable１Antibody
U T2AY−4
U T2AY−55−X
8−X
10−X
10G
4A10G
6A10G
7A10G
9A10G
10G11A
10G12A
9X10GU T2AY−5mu2

12Arg Ala
− −CDR−H3 sequences of anti−T 3 antibodies

amino acid sequense number910 11 12783456Ser Arg Ala Tyr Ile Gly Phe − Asn Leu− Arg Asn Phe Leu Asp Val Arg Asn Leu
XX
X
Gly
Gly
Ala
Gly
Ala
Ala
Gly
Ala Gly
Gly Ala
Gly
Ala
X Gly
Trp Gly− dash）（：delated position.（blank）：blank position represents a same amino acid toU T2AY−5. X：X represents rardom mutated position.

TOSOH Research & Technology Review Vol.56（2012）

6120

Affinity［％］

10080604020W5−XLeu
HisTyrVal
Lysr

lyGSeAsnGlu
HisSerGlylu
TrpSerGlyGgisHild−tArype08−X10−X

The amino acid of the x-axis represents the residue of X position in the CDR3 of heavy chain.

Fig. 2Comparison of affinity of wild−type and single mutation antibodies

120

Cross−reactivity［％］

1008060
40
200

Wild−typeSerGlyValLysLeu

HisTyrThe amino acid of the x−axis represents the residue of X position

Fig. 3Comparison of cross−reactivity of wild−type and single mutation antibodies（10−X）ていたことが考えられ、この位置の側鎖を削ったことべることで、置換位置の活性への寄与を評価する方法で交叉反応性が改善できたと推測される。

である 8）。アラニン置換抗体（表１；4A10G, 6A10G,

以上、U T 2AY − 5 へのアミノ酸変異を導入し、得ら

7A10G, 9A10G, 10G11A, 10G12A） を 作 製 し、 親 和 性れた変異抗体の親和性と特異性を解析することで以下の変化を評価した（図４）。結果から、配列番号 9 ののことが示唆された。

位置をアラニンに置換した抗体（9A10G）で親和性が①抗原結合に関与しているアミノ酸への変異導入によ低下しないことがわかった。そこで配列番号 9 の位置

り抗体の親和性は低下するへランダムにアミノ酸変異を導入して、特異性の改善②抗原結合に直接関与しないアミノ酸への変異導入でを試みた。アミノ酸置換を行って得られた変異型抗体

親和性を低下させずに交叉反応性の改善が可能の親和性の変化、交叉反応性の変化を図５、図６にそれぞれ示す。図５の結果から、配列番号 9 の位置にア［4］アラニンスキャニングによる変異導入位置の決定

ミノ酸変異を導入しても親和性が低下しないことがわ［3］で得られた、アミノ酸番号 10 を Gly に置換しかった。このことから配列番号 9 のアミノ酸は抗原認た変異型抗体（10G）の交叉反応性を更に改善するた識に直接関与しないアミノ酸であったと考えられる。

め、抗原結合に直接関与しない CDR3 のアミノ酸をさらに図６の結果から、アミノ酸番号 9 の位置を Trpアラニンスキャニング法により決定した。アラニンスに置換した抗体（U T 2AY − 5mu2）で交叉反応性が最キャニング法は、対象のアミノ酸を物理的・化学的にも改善できることがわかった。これは、嵩高い芳香族中性なアラニンに置換し、タンパク質の活性変化を調側鎖を持つ Trp への変異により交叉物質の反応ポケッ東ソー研究・技術報告第 56 巻（2012）

7120

Affinity［％］

10080
6040200

Wild−typeFig. 4

4A10G

6A10G

7A10G

9A10G

10G11A

10G12A

Comparison of affinity of wild−type and alanine mutation antibodies

120

Affinity［％］

10080
6040200
Wild−type

Pro

Trp

His

Ile

Ser

Arg

Gly

Ala

The amino acid of the x−axis represents the residue of X position

Fig.５

Comparison of affinity of wild−type and double mutation antibodies（9X10G）

120

Cross−reactivity［％］

100806040200

Wild−type 10GPro

Trp

His

IleSer

Arg

Gly

Ala

9X10G
The amino acid of the x−axis represents the residue of X position

Fig.６

Comparison of cross−reactivity of wild−type and mutation antibodies（10G, 9X10G）

トが塞がれたためだと推測できる。

た結果を図７（B）に示す。結果から、U T 2AY − 5mu2
は UT2AY − 5 と同等の検量線を描くことが分かり、T3［5］AIA 試薬形態での変異型抗体の評価結果に対する親和性は変化していないと考えられる。また、変異導入前の抗体（U T2AY − 5）と変異導入後の抗ジクロフェナク服用検体を測定した際、U T 2AY − 5 を体（U T 2AY − 5mu2）を AIA 試薬形態で検量線を比較用いた測定試薬では交叉反応により偽高値を示すが、した結果を図７（A）に示す。また 2 つの抗体を用いて、

U T 2AY − 5mu2 では交叉反応が回避され、正確な T 3

ジクロフェナク服用前後の検体中の T 3 濃度を測定し濃度を測定することが可能となった。

TOSOH Research & Technology Review Vol.56（2012）

8（B）

120

6100

580

T3 conc.［pg／mL］

B／B0［％］（A）U T2AY−5mu2（double mutation antibody）

60
40

101

32U T2AY−5（wild−type）

20

4

10

1000

UT 2AY−5（Wild−type）

T3 conc.［pg／mL］

UT 2AY−5mu2（double mutation antibody）（A）Solid line shows the calibration curve of wild-type antibody. Broken line shows the calibration curve of double mutation antibody.
（B）■：sera of non−taken Diclofenac □：sera of taken Diclofenac

Fig.７ （A）Standard curve for the T3 immunoenzymetric assay on AIA−system（B）T3 concentrations in the sera of patientsしい 9）。今回の抗体では、変異導入前後で、静的パラ［6］変異型抗体の親和性
変異導入前後の抗体の親和性を BIAcore T − 100 でメーターである KD も、動的パラメーターである ka、解析した。図８は、代表例として U T 2AY − 5 を解析しkd もほぼ同等の値を示すことから、抗体の親和性にた際のセンサーグラムを示し、このグラフから ka影響を与えずに、変異導入が行えていると言える。

−1 −1−1（M s ）、kd（s ）、KD（M）値を計算した。
ka（M − 1s − 1） kd（s − 1） KD（M）

4．結論

U T 2AY − 51.1 × 106

3.2 × 10 − 6

2.8 × 10 − 12

U T 2AY − 5mu2

1.5 × 106

1.7 × 10 − 61.1 × 10 − 12

本研究により、抗体の親和性を低下させずに交叉反免疫アッセイによる物質定量の実践においては、反応性を改善する技術を確立した。この技術は、まずア応時間が限定されるため、多くの場合、反応は平衡にラニンスキャングにより CDR 領域で抗原認識に関与達していない。したがって、実践における抗原抗体しないアミノ酸を選定し、次にそのアミノ酸に対し反応の評価は、静的なパラメーターの解離定数（KD）てランダムに置換を行うことで達成される。本技術はでなく、動的なパラメーターの会合速度定数（ka）お他のモノクローナル抗体に対しても適用可能であり、よび解離速度定数（kd）によって評価することが好ま

EE2（エチニルエストラジオール）に対して交叉反応

Response［RU］

30020010000200400600

Time［s］
UT2AY−5 was injected 6 different concentrations（25, 12.5, 6.25, 3.13, 1.56 and 0.78 nM ;top to bottom) between = 0 and 60 s.

Fig.８

Concentration series for capture of UT2AY−5 to immobilized T3

東ソー研究・技術報告を示す抗 E2（エストラジオール）モノクローナル抗体に適用し、交叉反応性を改善している。
これまでのファージディスプレイを用いた CDR へのランダム変異による抗体機能の改変は、パニング法よるスクリーニングを行うため抗体濃度の影響を無視できなかった。今回の交叉反応性改善技術は、アラニンスキャニングを行い、変異導入箇所を限定することで評価対象の変異型抗体を絞り込み、パニング法によらないスクリーニングが可能となった。
今回の報告では、抗原との結合に最も寄与が大きいことが知られているＨ鎖の CDR3 にのみ変異導入を行っているが、他の CDR に対しても同様の方法を適用可能である。他の CDR へ変異導入を行うことで、さらに高機能な抗体の単離が期待される。
この技術を適応することで、高親和性と高特異性を有した抗体を短期間に効率よく取得することができる。今後、本技術を適用することで高特異性のモノクローナル抗体を単離し、AIA 試薬性能の向上を行っていく予定である。

5．謝辞

本研究を行うに当たり種々の実験でお世話になった相馬麗さん、池野佳恵さんに感謝いたします。

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