3−報文−

高親和性ウサギモノクローナル抗体の創製（高感度エストラジオール測定系への応用）
松三
田井葉苫中上隆惠
千益雄
民代男

Preparation of Super−High Affinity Rabbit Monoclonal Antibodies Against Estradiol.
: Application to Highly Sensitive Estradiol Measurement.
Takao MATSUBA
Yasutami MITOMA
Chiyo TANAKA
Masuo INOUE

High−affinity monoclonal antibodies with high specificity against low−molecular compounds, e.g. steroid
hormones, have been known to be very difficult to prepare. We have devised a novel method to isolate rabbitanti−estradiol monoclonal antibody that comprises antigen immunization to rabbits, lymphocyte fusion withmouse myeloma cells containing rabbit genes, rapid selection of hetero hybridoma cells prior to the gene loss,
rapid isolation of the antibody gene, and expression in animal cells. A rabbit monoclonal antibody (U16A−14) was
thus prepared successfully, and it showed extremely high affinity (KD: 2.1 x 10−14 M) and specificity.
A proto−type immunoassay reagent, prepared using the antibody U16A−14, was shown to have a sensitivity andspecificity superior to the commercially available immunoassay reagent AIA−PACK E2 (Tosoh Corporation,marketed for the fully automated enzyme immunoassay instruments including AIA−360, AIA−600II, AIA−1800
and AIA−2000).
The method described here is expected to be quite useful as a preparation process for high−performancemonoclonal antibodies, which were hardly to be isolated by the conventional methods.

1．緒

今回我々は、女性ホルモンの一種で卵巣機能の観察

言の目的などで測定されており、高感度化が要求されてモノクローナル抗体はその特異性と親和性の高さかいるエストラジオール（E2）に着目した。E2は分子ら、ある特定の物質を検出するための実験用試薬とし量272.39の低分子ホルモンであるため競合法で測定さてだけではなく、がん治療用医薬品、免疫診断薬の中れている。現在東ソー株式会社が上市している体外診核材料として広く利用されている。免疫診断薬に関し断薬（AIA−PACK E2：ポリクローナル抗体を使用）ては、近年高感度化が要求されており、免疫診断薬のと同等以上の性能を得るためには、少なくとも10−11M中核材料としてのモノクローナル抗体の高親和性化がから10−12M 以上の解離定数（KD）を持つモノクロー要求されている。

ナル抗体が必要であると計算された。しかし、このよ（ 3 ）4TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.52（2008）

うな高親和性を持つモノクローナル抗体は、たんぱくとを融合させヘテロハイブリドーマを作製後、ヘテロ質抗原を含めても報告例が非常に少ない。さらに免疫ハイブリドーマが抗体を産生しているうちに抗体遺伝診断薬用の抗体として考えた場合、エストラジオール子を単離し、遺伝子組み換え抗体として発現させるこには類似体が多いことから高い特異性も要求される。とを試み、遺伝子組み換えウサギモノクローナル抗体

当初マウスおよびラットを用いて高親和性抗E2抗の発現に成功した。さらに得られたウサギモノクロー体の単離を試みた。モノクローナル抗体単離におけるナル抗体の性能は極めて高く、その抗体を用いること各種要因（動物の系統、週齢、性別、免疫場所、固体で高感度なE2測定試薬を構築できたので、以下に報差、免疫量、キャリアータンパク質、アジュバント、告する。

免疫回数など）を最適化することで、一匹の動物から単離される抗体数は最適化前の100倍以上に増加し、得られる抗体の親和性も向上した。しかし、目標とす

2．実験

る親和性を持つモノクローナル抗体は得られなかっ［1］免疫抗原の作製と動物への免疫た。

（1）免疫抗原およびスクリーニング抗原の作製

われわれは、当時入手可能であった各種モノクローE2−BSA（Sigma社製）を免疫抗原として使用した。

ナル抗体およびポリクローナル抗体に関する評価を行

またELISAでのスクリーニング用抗原は、 E2の6位をった結果、①動物の体が大きくなるに従いポリクローN−ヒドロキシスクシイミドで活性化した活性エステ

ナル抗体の性能が向上し、それらの動物から得られるルとBCP（Blue Carrier Protein: Pierce社製）を反応さモノクローナル抗体の親和性も高いこと。②抗体の親せてE2−BCPを作製し使用した。

和性が高くなるに従い、高感度な測定系が構築できる（2）動物と抗原免疫方法等の知見を得た。さらに現在のAIA試薬ではウサギの免疫動物はウサギ（日本白色種）の12週齢メスを使ポリクローナル抗体を使用していることから、ウサギ用した。初回免疫はフロイント完全アジュバント、2モノクローナル抗体を単離できれば、目的親和性に到次免疫以降はフロイントの不完全アジュバントを用達できると判断し、ウサギモノクローナル抗体の開発い、抗原と等量混合後エマルジョンを作製した後に2に着手した。

週間間隔で免疫した。免疫抗原量は初回500マイクロ

マウスモノクローナル抗体は次の方法で作製されている。まず、抗原を免疫したマウスの脾臓細胞（抗体グラムで2次免疫以降は250マイクログラムを免疫に使用した。

産生細胞）をマウスミエローマ細胞（骨髄腫細胞）と細胞融合することで、無限増殖能を持ち目的抗体を産［2］細胞融合とスクリーニング

生するハイブリドーマを作製する。その後、本細胞を（1）細胞融合培養することで分泌する抗体を精製する。しかし、ウELISAで抗体価を測定し、十分な抗体価の上昇を確

サギモノクローナル抗体は同様な方法では作製できな認した後に脾臓を摘出し、定法に従って脾臓細胞を調1）い。それは、ウサギミエローマ細胞 が一般には流通製した。今回ウサギ脾臓細胞と細胞融合するのに用いしていないからである。また、ウサギ脾臓細胞をマウた細胞（2−3A）は、ミエローマ細胞の遺伝子にウサスミエローマ細胞と融合することも考えられるが、異ギの染色体が一部組み込まれており5）、ウサギ脾臓細種動物間の融合であるため融合効率が低く、ハイブリ胞と融合させた場合、ハイブリドーマの出現率が通常ドーマが得られても、細胞が不安定なため短期間のうのマウスミエローマ細胞よりも高い細胞である。細胞ちに抗体を発現しなくなることはよく知られてい融合方法は定法（PEG法）に従い、2−3Aとウサギ脾る2，3）。また、ウサギ血清存在下で培養すると抗体生臓細胞を融合させた。融合後の細胞浮遊液は10％産能が維持できるとの報告もあるが、生産されたモノ

FCS、1×HAT、を含むGIT培地（日水製薬社製）でクローナル抗体の精製が困難になることや、長期間の懸濁し、マイクロタイタープレートで培養した。

4）

抗体生産性については不明である 。以上のことから、（2）ELISA

ウサギモノクローナル抗体は、ウサギミエローマ細胞

培養上清中の抗E2抗体は下記の方法で検出した。

を有した特定の機関でのみ取り扱うことが可能な材料

E2−BCP（0.5 ug／ml）をELISAプレートに固定化しであった。

た後、1％スキムミルクでブロッキングした。その後、

今回我々は、ウサギの遺伝子が含まれた特殊なマウ細胞融合後の培養上清を反応させた。E2に結合した

スミエローマ細胞5）と抗原を免疫したウサギ脾臓細胞

抗E2ウサギモノクローナル抗体は、アルカリホスフ（ 4 ）東ソー研究・技術報告 第52巻（2008）

RNA extractionHybridoma

Reverse transcription

cDNA

Total RNAH chain
PCR

5Expression vector（pECEdhfr）

H chain expression vector

L chain
PCR Fragment
L chain expression vector

Fig.１

A scheme of the expression vector construction

ァターゼ標識抗ウサギIgGを結合させ、未反応の酵素

MCS

SV−40P

poly A標識抗体をB／F分離後、酵素基質である4―メチルウンベリフェリルリン酸（4−MUP）を分注し、蛍光強dhfr度を測定することで検出した。
また、抗E2抗体の競合性能は、上記測定系で培養

pECEdhfr

上清を反応させる際に、E2（500 pg／ml）を共存させSV−40Pる実験をおこなった。
特異性は、培養上清を反応させる際に各種ステロイ

Ampド（エストロン：E1、エストリオール：E3、エチニ
ルE2：EtE2、テストステロン：TS、各500 pg/ml）をFig.２共存させておくことで評価した。

Plasmid vector, pECEdhfr, used for theproduction of antibody

MCS, multi cloning site; SV−40P, virus promoter; dhfr,
dihydrofolate reductase; poly A, polyadenylate attachment
signal; Amp, β−lactamase［3］遺伝子組み換え抗体の発現（1）抗体遺伝子の単離と発現ベクターの作製
抗体遺伝子の単離から発現ベクター作製までの一連の流れは図１に示した。

した。抗原結合能が確認された抗体遺伝子ペアは、スケールアップして一過性発現を行なった。その後、定細胞からのRNAの抽出には、Ambion社のTM

MagMax −96 Total RNA Isolation kitを、逆転写反応法に従い得られた培養上清からProtein Gカラムで抗E2抗体を精製した。

はGE Healthcare社のReady−To−Go You−Prime First−
Strand Beadsを用いた。その後ウサギ抗体遺伝子に特［4］発現抗体の親和性測定

異的なプライマー（H鎖およびL鎖用）を用いPhusion

BIAcore T−100（ビアコア株式会社製）を用いて、High−Fidelity DNA polymerase（第一化学薬品社製）

マウス由来モノクローナル抗体（4種類：M−01、M−で、抗体遺伝子を増幅させた。得られたそれぞれの02、M−03、M−04）、ラット由来モノクローナル抗体

6）（１種類：F1−33）、ヒツジ由来モノクローナル抗体（pECEdhfr：図２）に導入し、H鎖、L鎖用の発現ベ（１種類：5A11）、今回単離したウサギ由来モノクロクターを調製した。

ーナル抗体（3種類：U12−2、U16A−2、U16A−14）の（2）遺伝子組み換え抗体の発現（COS細胞による一全9種類の抗体の親和性を下記に示す方法で測定した。

PCRフラグメントは、動物細胞用発現ベクター

過性発現）と精製

E2誘導体（E2の6位にアミノ基を導入したもの）を

COS細胞での遺伝子組み換え抗体の生産をおこなっ

アミンカップリング法で、センサーチップ（CM5）7，8）。96ウエルプレート上で対数増殖期にあるCOS上に固定化し、ランニング緩衝液：HBS−EP、反応温

細胞に、H鎖発現ベクターとL鎖発現ベクター各200

度：25℃、流速30 ul／min、結合時間：1分、解離時ngを、リポフェクトアミン2000（インビトロジェン

間：10分の条件で抗体の結合と解離を測定した。また社）で導入した。遺伝子導入時の培地は、Opti−MEM

得られたデーターは、解析ソフト（BIAcore T100（インビトロジェン社）を使用した。遺伝子導入から3

Evaluation Software, version. 1.1）を用い、bivalentモ

日後に培養上清を回収し、ELISAで抗体の存在を確認

デルで解析し、ka（M−1s−1）、kd（s−1）、KD（M）のた（ 5 ）6TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.52（2008）の遺伝子が組み込まれていることが確認されており5）、値を算出した。

その遺伝子の影響で細胞融合効率が向上していると推［5］AIA試薬形態でのモノクローナル抗体の評価測される。

精製したウサギ由来モノクローナル抗体（U16A−14）

スクリーニングの結果、ウサギモノクローナル抗体を用いて、プロトタイプ形のAIA用の免疫診断薬を作を安定に生産し続けるハイブリドーマも得ることは出製し、現在上市されている免疫診断薬（AIA−PACK

来たが、ほとんどのハイブリドーマは培養を継続する

E2）と性能を比較した。と抗体産生能が消失した。高性能抗体を単離するためには、数多くの候補抗体の中から優れた抗体を絞り込む必要がある。そこで、今回はヘテロハイブリドーマ

3．結果および考察の抗体産生能が消失する前に、高性能抗体を生産して［1］単離目標の抗体の親和性の見積もりいるハイブリドーマを探し出し、その細胞から抗体遺モノクローナル抗体の親和性の違いによる競合法の検量線形状を理論的に計算した結果を図３に示した。

伝子を単離し、遺伝子組み換え抗体として発現させる方法をとった。

グラフ中細線は、モノクローナル抗体の親和性が変化したときの検量線を示し、太線は現在のAIA試薬の［3］抗体遺伝子を単離する細胞のスクリーニング検量線を示す。このグラフから、現在のAIA試薬より数百から数千種類の細胞から抗体遺伝子を単離し、高感度な測定系を構築するためには（検量線が左側に遺伝子組み換え細胞を樹立し、抗体性能を評価するこシフトするほど高感度測定系）、少なくとも1 x 10−11Mとは、現実的に不可能である。つまり、何らかの方法以上の解離定数を持つ抗体が必要であることがわかっで高性能な抗体を発現しているハイブリドーマを選別−9た。マウスモノクローナル抗体の解離定数は1 x 10 M−10する必要がある。今回は、反応性、特異性、競合特性から1 x 10 M程度のものが多いが、少なくとも10倍の３つの要因についてELISAで一度に評価する系を構から100倍高い親和性が必要なことがわかった。

築することで、高性能抗体を発現しているハイブリドーマを選別することが可能となった。
図４は、各クローンの競合特性（縦軸）、特異性［2］細胞融合とヘテロハイブリドーマの安定性
マウスミエローマ細胞とウサギ脾臓細胞とを融合し（横軸）、反応性（プロットの大きさ）を一枚の図で示て得られるハイブリドーマ数は、マウス脾臓細胞と融したものである。この図中黒丸の細胞が生産する抗体合して得られるハイブリドーマ数の約10〜20分の1であったが、今回使用した2−3Aは、マウスミエローマ
Inhibition by E2 : B/B0［％］

細胞をマウス脾臓細胞と融合して得られるハイブリド

B／B0［％］ーマ数と同程度であった。本細胞は染色体上にウサギ

100

Dissociation constant
KD［M］

80

10−8M

60

10−9M

10−13M40

100

10−10M10−12M

50002010 M

01

Fig.３

10100
1000
E2［pg／ml］

50100

Inhibition by E1, E3, TS and EtE2 : B/B0［％］−11Fig.４

10000

Theoretical competitive inhibition calibration curveand AIA reagent calibration curve

Thick line shows the calibration curve of current AIA reagent.
Theoretical calibration curves of competitive inhibition assay (thinlines) were drown follows condition. (Estradiol alkaline-phosphataseconjugate : 2 nM, anti-E2 antibody : 0.2 nM).
The value in the figure showa the dissociation constant of monoclonal
antibody.

Typical screening result of anti−E2 monoclonal
antibodies.

The circle size show the maximum amount of the E2−ALP conjugatethat the antibody can bind in the absence of free E2 (B0). Horizontal
and Vertical ％B/B0 (％ Bound / Maximum Bound) were calculated
in the following equations. Horizontal: rate of the ELISA value (500pg/ml of free E1:Estrone, E3:Estriol, TS:teststeron and EtE2:EthynylEstradiol) to that of maximum binding(B0). Vertical: rate of the ELISAvalue (500 pg/ml of free E2) to that of maximum binding(B0). Blackcircle monoclonal antibodies have high reactivity, high inhibition
performance and high specificity. Antibody genes were isolated form
these clones.

（ 6 ）東ソー研究・技術報告 第52巻（2008）

730

Response［RU］

201000200400600

Time［s］

Fig.５

Representative Biacore sensorgrams obtained for the binding ofmonoclonal antibody.

For association, rabbit monoclonal antibody (16A−14) were injected at 5 different concentrations(12.5, 6.25, 3.13, 1.56 and 0.78 nM; top to bottom ) between t ＝ 0 and 60s.

は、競合特性も高く、特異性が高く、反応性も高いク

由来：4種類、ラット由来：１種類、ヒツジ由来：1種

ローンであることがわかる。このグラフは約4,000ク類）と今回単離したウサギ由来モノクローナル抗体

ローンの培養上清の評価結果をまとめたものである（3種類）の親和性をBIAcore T−100で解析した。図５が、本スクリーニング方法により、高性能の抗体を生は、代表例としてU16A−14を解析した際のセンサーグ産しているハイブリドーマの選別が可能となった。次ラムを示し、このグラフからka（M−1s−1）、kd（s−1）、に、本スクリーニング方法で選んだ細胞から抗体遺伝KD（M）値を計算した。９種類の抗体を解析し、縦子を単離した。

軸kd（s−1）、横軸ka（M−1s−1）でプロットした結果を図６に示した。なお図６中の、左下がりの座標軸は［4］抗体遺伝子の単離と遺伝子組み換え抗体の発現KD（M）値を示す。このグラフから、今回単離した

今回は遺伝子抽出に使用できる細胞数が少ないこと

ウサギモノクローナル抗体の親和性は通常のマウスモが予想されたため、少ない細胞から効率よくRNAをノクローナル抗体と比較して極めて高親和性であるこ抽出できるキットを使用した。また抗体遺伝をPCRでとがわかる。また、抗体の解離定数（KD）に与える増幅させる際に変異が入らないように正確性の高い影響は、kaの値よりもkdの値の寄与が大きいことがDNA ポリメラーゼを選択した。
ウサギ抗体の場合、H遺伝子は80％以上がVH1遺伝−710−2子を、L遺伝子はほとんどがκ鎖であることが報告されている−81010。抗体遺伝子を増幅する場合、可変領域

1010−3−11部位を増幅するミックスプライマーよりも、定常領域

10−4RNAの量が限られるため、ウサギ抗体遺伝子に特異10kd［s−1］は高い。今回は、出発細胞数が少なく鋳型となる

M−01
M−02
M−03
M−04
F1−33
5A11U12−2
U16A−2U16A−14−109，10）に特異的に結合するプライマーセットの方が増幅効率−910−121010−5−131010−6−1410的なプライマーセットで抗体遺伝子を増幅させる方法を取った。先行論文11−14）およびGeneBankデーターベ

10−7ースを参考に、ウサギ抗体遺伝子のH鎖およびL鎖の10−8105全長を増幅できるようにプライマーを設計した。

−1510KD

106107［M］

108−1 −1ka［M s ］

その結果、スクリーニングで選別した細胞から、Fig.６80％以上の確率で抗体遺伝子を増幅できた。
［5］単離した抗体の親和性と性能の比較
各種動物由来の抗E2モノクローナル抗体（マウス

Kinetic interaction between Estradiol and nine monoclonal
antibodies from four kinds of animals

Horizontal and vertical axis show the association rate constant (ka) anddissociation rate constant (kd), respectively. KD ＝ kd ／ ka : dissociation
constant. Mouse monoclonal antibodies: M−01, M−02, M−03, M−04,
Rat monoclonal antibody : F1−33, sheep monoclonal antibody : 5A11,Rabbit monoclonal antibodies: U12−2, U16A−2, U16A−14.

（ 7 ）8TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.52（2008）

が構築できることが明らかとなった（ポリクローナルわかる。
また、解離定数（KD）を横軸に、縦軸に競合性能をとると、親和性の高い抗体ほど競合性能も高く、高抗体を使用した現行AIA試薬：25.2 pg／ml、U16A−14を用いたAIA試薬：22.4 pg／ml）。

感度な測定系を構築できることがわかる（図７）。M−

また、E1（エストロン）およびE3（エストリオー02およびF1−33もマウスおよびラット由来の抗体としル）といった、類似ステロイドへの交差反応性（10ては高親和性であるが、ウサギモノクローナル抗体のng／ml）を測定したところ、どちらのステロイド類に親和性には及ばないため、高感度測定系を構築するこ対する交差反応性も大幅に改善されていた。とが出来ないことがわかる。
［6］AIAでの評価結果AIA試薬

U16A−14E14.77％

0.92％

E34.19％0.28％。

今回単離したU16A−14を用いたAIA試薬と現在のAIA試薬の検量線を図８に示した。このグラフからもまた、145種類の実検体を用いて両測定系の相関性明らかなように、従来のAIA試薬より高感度な測定系を見た結果を図９に示した。相関係数r＝0.998というきわめて高い相関性を示した。

100

M−02
F1−33
5A11U12−2
U16A−14B／B0［％］

804．結論本研究により、一連の技術パッケージとして、高性60能なウサギモノクローナル抗体の取得技術を確立し40た。今回構築した技術には2つのメリットがある。
まず第一点目は、同一性能のモノクローナル抗体を20限の材料であり、現在と同等の性能のポリクローナル
10−9Fig.７

10−1010−1110−12KD［M］

10−1310−14抗体が得られる保証は無い。しかし、モノクローナル抗体化することで、その問題を完全に回避できる。

Five monoclonal antibodies correlation between
dissociation constant (KD) and competitive
inhibition assay performance

第二点目は、従来の抗体では検出できなかった微量成分の検出の可能性が期待できることである。今回単KD ＝ kd ／ ka : dissociation constant. B0(Maximum binding): maximum
amount of the E2−ALP conjugate that the antibody can bind in theabsence of free E2. ％B／B0: (％ Bound ／ Maximum Bound): rate of theELISA value (1050 pg／ml of free E2) to that of maximum binding. Mouse
monoclonal antibody: M−02, Rat monoclonal antibody: F1−33, sheep
monoclonal antibody: 5A11, Rabbit monoclonal antibodies: U12−2,U16A−14.

離したウサギモノクローナル抗体の一つは2.1 x 10−14Mという解離定数（KD）を示した。この値は非共有結合の中で一番親和性が高いビオチン・アビジンの結合

3000

120Current AIA reagent
New AIA reagent

B／B0［％］

10080
60
4020Current AIA reagent; E2［pg／ml］

0

安定に供給できる点にある。ポリクローナル抗体は有02000

1000

010

Fig.８

100
1000
E2［pg／ml］

010000Fig.９

Comparison of calibration curve of the current AIAreagent and new developed AIA reagent using
U16A−141000
2000
3000
New AIA reagent ; E2［pg／ml］

Correlation between current AIA reagent and new
developed AIA reagent using U16A−14

Horizontal and vertical axis show the new developed AIA reagent andcurrent AIA reagent, respectively.
Slope, 0.924; intercept, −2.387, r＝0.998

Current and new AIA reagent functional sensitivity were calculated
25.2 pg／ml, 22.4 pg／ml, respectively.

（ 8 ）東ソー研究・技術報告 第52巻（2008）（KD： 1 x 10−15M）に匹敵する値である。このように

３）M. C. Weiss, H. Green, Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, 58, 1104（1967）

超高親和性抗体を測定系に使用することで、測定系の高感度化、あるいはこれまでは検出できなかった微量

４）T. J. G. Raybould, M. Takahashi, Science, 240,

成分の検出の可能性が広がり、あらたな領域への展開も期待される。

91788（1988）
５）増渕晴美、橋本真、公開特許公報、特開平10−

今後は本技術を適用することで、現在抗血清を使用

262657

している測定項目のモノクローナル抗体化を推進し、

６）K. Yasukawa, T. Saito, T. Fukunaga, Y. Sekimori,

AIA試薬性能向上、抗体供給の不安定性を解消してゆY. Koishihara, H. Fukui, Y. Ohsugi, T. Matsuda,

く予定である。

H. Yawata, T. Hirano, T. Taga,

T. Kishimoto,

J. Biochem., 108, 673（1990）

5．謝７）Y. Iba, T. Kaneko, T. Ekida, K. Miyata, K.

辞Inouye, Y. Kurosawa, K. Yasukawa, Biotechnol.

Lett., 17, 135（1995）

本論文の中で使用した細胞（2−3A）は，栄研化学株式会社の増渕晴美様，橋本真様により樹立されたも

８）K. Takagi, K. Yasukawa, Y. Iba, Y. Isobe, Y.

ので，栄研化学株式会社の好意により譲渡して頂いた

Suketa, R. Kannagi, K. Kohda, M. Takagi, T.

ものである。厚く御礼申し上げます。また、抗体遺伝

Imanaka, J. Ferm. Bioeng., 79, 405（1995）

子増幅用のPCRプライマー設計などの助言を頂いた、

９）C. Raman, H. Spieker−Polet, P. Yam, K. L.
Knight, J. Immunol., 152, 3935（1994）

藤田保健衛生大学総合医科学研究所黒澤良和教授、伊庭善孝助手に感謝いたします。また本研究を行うに当

10）M. Popkov, R. G. Mage, C. B. Alexander, S.

たり種々の実験でお世話になった、宮内ゆかさん、保Thundivalappil, C. F. Barbas III, C. Rader, J. Mol.

田涼子さん、津田歩美さん、春田千晶さん、相馬麗さBiol., 325, 325（2003）

ん、池野佳恵さんに感謝いたします。

11）J. S. Babcook, K. B. Leslie, O. A. Olsen, R. A.
Salmon, J. W. Scheader, Proc. Natl. Acad. Sci.

文USA, 93, 7843（1996）

献12）R. Ridder, R. Schmitz, F. Legay, H. Gram,Biotechnol., 13, 255（1995）

１）H. Spieker−Polet, P. Sethupathi, P. Yam, K. L.
Knight, Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 92, 9348

13）B. Mariame, M. Akimenko, F. Rougeon, Nucl.

Acids. Res., 15, 6171（1987）（1995）
２）M. C. Weiss, B. Ephrussi, Genetics, 54, 1095

14）O. Heidmann, F. Rougeon, Nucl. Acids. Res., 10,（1966）

著

1535（1982）

者

氏名 松 葉 隆 雄Takao MATSUBA

氏名 三 苫 惠 民

氏名 田 中 千 代

氏名 井 上 益 男

Chiyo TANAKA

Masuo INOUE

Yasutomi MITOMA

入社 昭和61年 4 月 1 日

入社 昭和59年 4 月 1 日

入社 昭和62年 3 月16日

入社 昭和59年 9 月16日

所属 バイオサイエンス事業部

所属 バイオサイエンス事業部

所属 バイオサイエンス事業部

所属 バイオサイエンス事業部

開発部

開発部

開発部

開発部

技術開発グループ

技術開発G

AIA試薬開発グループ開発部長

グループリーダー（ 9 ）