■ TechTalk

今回のTechTalkでは、ご使用の 4D-Nucleofector™ X ユニットにおけるNucleofection™ の実験条件を最適化するためのガイドラインと、ご使用いただく際によくいただくご質問を Q&A 形式でご紹介します。

Q.
A.

4D-Nucleofector™ Xユニットを使用する際、Nucleofection™ の実
験条件の最適化はどんな場合に行う必要がありますか？

Nucleofectionを成功させるためには、個々の細胞に適した最適条件を使用することが重要です。この最適化は、ご使用になる細Q.
A.

最適化にはどんな基質が使用出来ますか？

最適化には、使用する基質（プラスミド、siRNA、タンパク質もしくは化合物）に関係なく、常にpmaxGFP ™ ベクターをご使用いただ

胞に適した4D-Nucleofector™ XユニットのLonza社の推奨プロトコルがなくことをお勧めします。まずはpmaxGFP™ ベクターを用いてNucleofection™

い場合に必要となります。最適化されたプロトコルが利用できるかどうの実験条件を確立すれば、その後はお好みの基質をご使用になれま

かは、 Lonza のウェブサイトもしくは細胞遺伝子導入データベースす。pmaxGFP™ ベクターを最適化に用いることで、基質調製の質や分析の（www.lonza.com/celldatabase）をご覧いただくか、技術サポートチームタイミングといったさまざまな変数をなくすことができます。にご連絡下さい。
なお、96-well Shuttle™ システムでの実験条件は、4D-Nucleofector™ を用いたNucleocuvette™ ストリップ中での20 µL反応と同等です。従って、

4D-Nucleofector™ Xユニットと96-well Shuttle™ システムの実験条件は、どちらのデバイスでもご使用いただけます。

Q.
A.

Nucleofector™ I または II の実験条件は、 4D-Nucleofector™ Xユニットに対応していますか？

4D-Nucleofector™ システムはNucleofector™ テクノロジーをアップグレードしており、導入用試薬およびプログラムの互換性はありません。4D-Nucleofector™ システムでの主な改善点は下記の通りです。

- 2種類のNucleofection™ キュベットをご使用になれます。キュベットの種類としては、多数の細胞数へ対応可能な100 µL Nucleocuvette™（2×105〜2×107個）と少数の細胞数へ対応している20 µL Nucleocuvette™ ストリップ（2×104〜106個）をが使用可能です。Nucleofection の実験
条件は、これら2種類のキュベット間で共通です。
- Nucleocuvette™ にはアルミニウムではなく導電性ポリマーを使用しているため、Nucleofection 後の細胞生存率が改善されました。
- 効率化された 4D-Nucleofector™ 試薬では、ご使用の細胞に適したNucleofector™ 試薬を簡単に見つけることができます。
- より幅のあるプログラム条件の設定により、最適化の幅が広がりました。
これらの違いにより、Nucleofector™ I または II デバイスに推奨されている導入試薬およびプログラムは4D-Nucleofector™ システムに対応しません。しかしながら、4D-Nucleofector™ X ユニットを用いて最適化を行うことにより、Nucleofection™ の結果を更に改善する可能性があります。

Q.
A.

Q.
A.

最適化のためには、どのNucleofection™ フォーマットを用いればよいか？

4D-Nucleofector™ Xユニットは最適化のステップを簡略化できるようデザインされています。より少ない細胞で最適化を行うために、20 µL Nucleocuvette™ ストリップをご使用になることをお勧めします。当社の初代細胞（Primary Cell）もしくは細胞株（Cell Line）の最適化Nucleofector™ キットはこのフォーマットに対応しています。いったん最適な実験条件を決定すると、同じ溶液と同じプログラムを使用し細胞数と基質量を5倍にすると、簡単に100 µL Nucleocuvette™ に切り替えることができます。

Q.
A.

Nucleofection™ の実験条件を4D-Nucleofector™ X ユニットでどのように最適化すればよいですか？
ご使用の細胞に推奨されるプロトコルがない場合は、下記の3つの選択肢をお試し下さい。（Decision Guiding Schemeをご覧ください。）- 推奨されるプロトコルがない場合は、第一段階として基本最適化プロトコルを使用します。このステップでは、 5つの Nucleofector™ 試薬（P1からP5は初代細胞用、SE、SF、SGは細胞株用）を15の異なるプログラムをテストします。（参考文献2）- 細胞が特定の種類（線維芽、内皮、上皮、神経、幹細胞、等）に分類可能な場合には、4D-Nucleofector™ Xユニットのそれぞれの細胞種の基本最適化プロトコルによる最適化を行います。細胞種ごとの基本最適化プロトコルは、6〜7個のプログラムを1つもしくは2つのどのパラメーターを最適化することができますか？

Nucleofection™ の最適化において最も重要なパラメーターはNucleofector™ 試薬（Nucleofector™ キットに付属）とプログラム（Nucleofector ™ 装置から伝達される電気パルス）です。初めて実験を行う場合は、 20 µLのNucleofection™ 反応において 200,000 個の細胞および0.4 µgのプラスミドをご使用になることをお勧めします。細胞数および基質量はさらに最適化が可能です。（参考文献1）

Nucleofector™ 試薬を使用します。
- 多くの 細胞について は、 Nucleofector™ 実績デ ータベー ス に、4D-Nucleofector™ X ユニット用として実験条件とデータが記述されています。これらのデータには、ユーザーからのフィードバックいただいたデータも含まれており、更に条件検討が必要なものもあります。これらについては、まず記述された条件をテストする、または先に述べた初めの2つのオプションをお試しいただくことことが考えられます。

TechTalk ■Q.
A.

Nucleofection™ 最適化のためには、どの解決への図解ような情報が必要ですか？

使用する細胞は、4D- Nucleofector ™ の実験条件を最適化を必要とするか？

Nucleofection™ 後、24時間および必要なタイムポイントで導入効率と細胞の生存率を記録してください。導入効率は、蛍光顕微鏡または FACS分析による、GFPを発現している生存細胞の割合で表されます。用途

使用する細胞に合ったLonza社の最適プロトコルはありますか？
Lonza社のウェブサイトまたは細胞遺伝子導入データベースを検索するか、サイエンスサポートチームにご連絡ください。

によっては、 FACS解析ではGFPシグナルの強い。細胞生存率はトリパンブルーの取り込みい。また、電気プログラムに依存しないバックHUVEC細胞などご使用の細胞タイプごとに、利用可能な最適化済み

4D-Nucleofector™ プロトコルをお使いください。

No

度をX-平均（X-mean）として記録してくださなどの細胞生存率アッセイで測定してくださ

Yes

使用する初代細胞に合ったLonza社の基本プロトコルはありますか？
細胞株をお使いの場合は、このポイントをスキップして直接4D-Nucleofection™ の実験条件へお進みください。

グランドとしての細胞生存率を得るために、Nucleofector™ 溶液ごとに電気パルスなしのQ.
A.

4D-Nucleofector™
Recommended kit for
Basic Protocol
4D-Nucleofector™ X Unit
Endothelial
P5
Epithelial
P1 or P3
Fibroblasts
P2 or P3
Neurons/glial
P3
Smooth muscles
P1
Human stem cells
P3 or P4
Basic protocols refer to a limited number (6–7)
of preselected pulses.

Primary Mammalian Cells

コントロールテストすることをお勧めします。

Nucleofection™ の実験条件をさらに改善するにはどうすればよいか？
いったん最適化の第1段階でNuceofection™ の結果が得られたら、その結果をe-mailで<bioscience.technicalsupport.

Yes

ご使用の細胞タイプに合った基本プロトコルと 4D-Nucleofection™
キットをお使いください。

Yes

これらの実験条件でNucleofection™
を行ってください。

Nojp@lonza.com>に送信していただくと、より良い結果が得られると思われるプログラムについてご連絡いたします。（フィードバックを使用する細胞タイプに合った4D-Nucleofection™ の実験条件は細胞遺伝子導入データベースにありますか？

リクエストすることが可能です。）

No

図のDecision Guiding Schemeに示されている
微調整表は基本最適化プロトコルの実験結果から、微調整を行うために使用することが出最適化の第1段階を開始してください。

来ます。（参考文献2）- 最もよい結果の得られる初期プログラム（DN-100など）を微調整表からお選びください。最適化の第1段階に述べられている15のプログラムは表の中央に垂直に並んでいます。

Solution
Primary Cell
P1
P2orP3P4P5

15 Electrical Pulses

Cell LineSE
SF withSGA
B
C
D
E
F
GH

- 細胞生存率を上げるためには、選択したプログラムの左側にあるプログラムをお使い

1
CA-137
CM-138
CM-137
CM-150
DN-100DS-138
DS-137
DS-1302
DS-150DS-120
EH-100
EO-100EN-138
EN-150
EW-113ControlYes

よりよい結果が必要ですか？

ください（DH-100など）。導入効率を上げるためには、初期プログラムから右のプログラムをお使いください（ER-100など）。
はじめに選択したプログラムからさらに左もしくは右に行くほど、それぞれ生存率もしくは導入効率がさらに改善される可能性が高まります。

微調整（任意）1．第1段階から最適な溶液と電気パルスをお選びください。
2．Nucleofection™ 効率または細胞生存率を上げるために、下記のチャー
トを水平方向に試して電気パルスの微調整を行ってください。
3．第1段階からの最適な溶液および微調整電気パルスを適用してください。

参考文献
1. Optimization of adult sensory neuron
electropor-ation to study mechanisms ofneurite growth. McCall J, Nicholson L, Weidner
N and Blesch A. 2012. Frontiers in Molecular
Neurosciences, Volume 5, Article 11.
2. Optimization of mouse neural stem/progenitor cell (NSC) transfection with the4D-Nucleofector™ System. Bertram B, vonHolst A and Muster G. 2011. Lonza Application
Notes & Toss Sheets, CD-SP001.

Increasing Viability
CA-113
CL-138
CL-135
CL-120
CY-100
DG-138
DG-135
DG-130
DG-120
DG-120
DG-113
CM-100
DZ-135
DZ-120
DZ-113

CA-123
CM-113
CL-137
CL-150DA-100
DS-113
DG-137
DS-128
DG-150DS-106
DS-112CV-100
DZ-137
DZ-150
EH-112

CA-132
CM-119CM-134
CM-116
DH-100
DS-119DS-134
DS-107
DS-116
DS-103
DS-109
DG-100
EH-134
EH-116
EH-109

Increasing Efficiency

Best
Program(s)CA-139CM-132
CM-135
CM-120DI-100DS-132
DS-135
DS-118
DS-120
DS-111
DS-104DR-100
EH-135
EH-120
EH-104CA-137
CM-138
CM-137
CM-150
DN-100DS-138
DS-137
DS-130DS-150DS-120
EH-100
EO-100EN-138
EN-150
EW-113

不十分な場合は?

CA-158
CM-134
CM-158
CM-198
DP-100DS-134
DS-158
DS-155
DS-198
DS-141
DS-123
DT-100
EH-158
EH-198
EH-123

CA-189CM-167
CM-189CM-156
EH-100DS-167
DS-189DS-139DS-156
DS-142
DS-118
DU-100
EH-189
EH-156
EH-118

CA-167
CU-138
CU-137
CU-150ER-100DT-138DT-137
DT-130DT-150DT-120DT-113ED-100
ER-137
ER-150ER-113

CA-201
DG-138
DG-137
DG-150FA-100ED-138
ED-137
ED-130ED-150ED-120ED-113EN-100FA-137
FA-150FA-113

弊社の技術サポート<bioscience.
technicalsupport.jp@lonza.com>にメールをお送りください。