2P020

温度数 K における一分子分光のための高開口数対物レンズの開発（東工大・物理）稲川博敬, 丸尾美奈子, 藤芳暁, 松下道雄

An objective with a high numerical aperture for single-molecule spectroscopy at a few kelvins(Department of Physics, Tokyo Institute of Technology)
Hironori Inagawa, Minako Maruo, Satoru Fujiyoshi, Michio Matsushita【序】2007 年に、我々は低温中で回折限界性能で動作する反射対物レY

でのタンパク質 1

球面 S 1ンズの開発に成功した[1]。これを用いて、温度分子の蛍光分光に成功した[2-3]。しかし、反射対物レンズの開口数

反射対物レンズ

平面 S 2で、空気中での NA の原理限界 1 と比べるとまだ向上の余地を残しており、測定系の応用範囲が限られている。図 1 に示した反射対Z物レンズの 2 枚の球面鏡のみで NA を上げようとすると、球面収差がO
球面鏡１原因で集光性能が下がる。そこで、この反射対物レンズに加えて半球レンズを用いることで、外径Φはレンズ厚 L半球レンズに向上することに成功したので報告する。

球面鏡２

図 1. レンズペアの配置【レンズデザイン】図 1 に対物レンズ・半球レンズペアの配置を示す。

λ /6.4る。対物レンズに入射した平行光は 2 枚の球面鏡で反射され、球面波となる。球面波は半球レンズの球面 S1 (曲率半径)から入射して、平面 S2 に集光される。測定分子はこの平面 S2 にスピンコートする。

集光性能

半球レンズの曲率中心 O を対物レンズの焦点と一致するように配置す

λ/8 λ/4
λ/2
球面 S1の面精度 (P-V)

【公差設定】以下に、製作にあたり考慮した公差について示す。光学計算には光学設計ソフトウェア ZEMAX を用いた。半球レンズで高い

図 2. 球面 の面精度に対する集光性能。
計算波長 は。青く塗りつぶしたのが設定した許容精度(以下)。赤線で示したのが完成品の検査値。

加工精度が要求されるのが球面 S1 と、レンズ厚 である。まずは S1 の加工精度について議論する。図 2 に S1 の球面精度(P-V 値)に対する集光性能の計算値を示す。図の縦軸に示す集光性能は、図 1 の原点 O か-0.01 mm)に放射される球面波の全エネルギーのうち、反射対物集光性能ら全立体角(λレンズに捕集されて結像レンズによって結ばれた像の第一暗環内に集められるエネルギーの割合と定義する。図 2 から、球面精度が以下ならば集光性能の低下は 3%未満に抑えられるので、これを球面精-0.2度の公差に指定した。実際に完成した半球レンズの球面精度の検査値であり、集光性能の低下は 2%未満に抑えられる。
次に、レンズ厚 について議論する。図 3 に、 の設計値(からのずれに対する集光性能の計算値を示す。図 3 をみるとでの集光性能の低下分は+0.1+0.2程度であり、 に高い加工精度を要求しなくても集光性能の著しい低下は起こらない。一方、球面 S1 の場合とは異なり、 のずれは軸上色収差と倍率色収差を生じるので、これらについても考慮する必要がある。図 4 に波長を基準にしたときの波長に対する軸上色収差の計算値を示す。グラフ a が、グラフ c がの場合で、がら離れるほど軸上色収差が顕著に大きくなる。
（波長かの場合、の波長領域では軸上色収差は最大
れはレンズペアの焦点深度0.0ΔL / mm

図 3. 半球レンズの厚 の設計値()からのずれ に対する集光性能。計算波長は。青く塗りつぶした範囲が設定公差()。

)

軸上色収差 Z /μ m（λ= 700 n m 基準）は-0.1である。こ）よりも十分小さい値

0.150.100.05cba0.00
400450500 550 600波長 / nm

図 4. 軸上色収差。
(b)、（実際の検査値）の場合(c)。

650 700(a)、なので、測定には問題ない。よって、レンズ厚の公差をと指定した。次に、倍率色収差について、表 1 に波長を基準にしたときの計算値を示す。

が設計値(a)、設定公差(c)、実際のレンズの値(b)それぞれの場合について示したが、設定した公差範囲内では全く影響しない。なお、が倍率色収差にはの波長領域では、倍率

表 1. 倍率色収差(を 1 倍とする）(a) Δ L =(b) Δ L =(c) Δ L =波長λ0.0000 mm -0.0062 mm -0.0100 mm
700 nm 1.0000
1.00001.0000633 nm 0.9988
0.99880.9988532 nm 0.9962
0.99630.9964473 nm 0.9940
0.99410.9941
405 nm 0.9902
0.99020.9903

色収差が 1%未満に抑えられている。光軸から離れた励起光
蛍光位置にある分子の測定では(実際の測定ではこの程度離れた位置で使用できれば十分である)、1%の倍率の違いはの位置ずれに対応する。集光領域を波長第一暗環半径内に固定して波長えることを想定した場合、マルチモードファイバー

f150でのロングパスフィルターでの測定に切り替の位置ずれによって生じ

f100

f100

APD
試料箱

反射対物レンズる集光量の損失は 11%である。この程度の損失は測定に差試料し支えない。

可変 ND
フィルター
λ= 633 nm【レンズペアの評価】対物レンズと半球レンズペアの評価を一分子測定によっておこなった。試料には濃度電動レンズ

図 5. 共焦点顕微鏡システムの Alexa Fluor 647 色素(Alexa)溶液を用い、それを合成石英基板にコートする従来の方法と、A1.5た。

1.01.0）は可変

す。励起光のレーザー（波長ND フィルターを用いて、試料上の励起光強度がとなるように調整した。この励起光をロングパスフィルターで反射し、レーザー走査のための 2 枚の0.50.0-0.5-1.0-1.5子からの蛍光は励起光と逆の経路を通し、2 枚のロングパスフィルターを透過させた後、Intensity

対物レンズによって試料に集光させた。試料分測定結果
理論値

0.50.0のマルチモードファイバーにカップルし、APD(Avalanche PhotoDiode)によってその光子数を計測した。試料の光退色やブリンキングを-0.5-1.0r1st = 0.57μ m

1.0のアクロマートレンズでコア径0.0-1.5-1.00.01.0
X Position / μ m

アクロマー

トレンズ（一方は電動、他方は固定）を通してB

0.5Intensity

図 5 に評価に用いた共焦点顕微システムを示

Y Position / µm1.5Y Position / µ m

半球レンズにコートする今回の方法とを比較し-1.00.01.0
X Position /μ m

-1.00.01.0
X Position /μ m

1.00.50.0r1st = 0.40μ m
測定結果
理論値

-1.00.01.0
X Position /μ m

図 6.合成石英基板を用いた場合(A)と半球レンズを用いた場合(B)の Alexa1 分子の蛍光画像(上段)とその強度断面(下段）。強度断面は赤の実線が測定結果で黒の破線が計算値。 は測定結果を理論曲線にフィッティングすることで求めた第一暗環半径。

抑えるため、試料箱内はアルゴンでパージして測定した。

3530合(B)における Alexa 1 分子の蛍光画像およびその強度断面を示25す。第一暗環半径
論値

は合成石英基板を用いた場合が（理）であるのに対して、半球レンズを用いると（理論値）となり倍になった。半球レンズを用いることによる NA の向上(倍)に応じて、顕微鏡の空間分解

Occurrence

図 6 に合成石英基板を用いた場合(A)と半球レンズを用いた場

15100

集光量を比較するため、広い領域でイメージングをして取得(B)における輝点のピーク強度分布をヒストグラムで示す。半球レンズを用いることで、分布が強度の強い側へシフトしている。
蛍光強度の和平均は半球レンズを用いない場合のとなり、倍（理論値に対倍）に増加した。NA 向上に見合った集光性能の向上を確認した。
【参考文献】[1] M. Fujiwara et al, J. Opt. Soc. Am. B, 26, 1395 (2009).
[2] S. Fujiyoshi et al, Phys. Rev. Lett. , 100, 168101 (2008).
[3] S. Fujiyoshi et al, Phys. Rev. Lett. , 106, 078101 (2011).

050020Occurrence

図 7 に半球レンズを用いない場合(A)と半球レンズを用いた場合し、半球レンズを用いると205能が上がったことを確認した。
された全ての 1 分子の輝点について、ピーク強度を計算した。

A

1000 1500 2000
Intensity / s-12500

B

1510500500

1000 1500 2000
Intensity / s-12500

図 7. 1 分子蛍光の強度分布。A が合成石
英基板を用いた場合で、計測した分子の総数は 、平均蛍光強度は。B が半球レンズを用いた場合で、分子の総数は 、平均蛍光強度は。励起光強度はいずれもm 。