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遺伝子発現に重要なベクターの要素
はじめに■ プロモーター強度
ご使用のプロモーターは目的の細胞型に適したものです

ロンザの技術サポートチームには、よく次のような質問か？

が寄せられます。「さまざまなベクターバックボーンを使表1では、ロンザがAmaxa™最適化プロトコルを有する多様な細胞のCMVプロモーター強度の相対パーセン用した場合同じ遺伝子発現レベルが得られないのはなぜ

トとして、プロモーター強度が示されています。CMVプか？」1つのベクターに対し、遺伝子発現レベルに影響を与ロモーターの活性度は、参考文献の CAT アッセイ値をもえる可能性のある成分が数多く存在します。以下は、ベクとに 100% に設定されています。 CMV は多くの哺乳動物

タ ー に 着 目 し た 場 合 に 考 慮 す べ き 10 の 最 も 重 要 な 要 素

細胞において強力なプロモーターですが、使用する細胞です。

で、別のプロモーターがさらに強力な発現を惹起する場

適切な発現ベクターを選択することは効率的な遺伝子発現合があります（例： BHK-21 細胞におけるプロモーターSV40）。

ロンザは、異なるバックボーンと発現カセットで同一のルシフェラーゼを発現する10の異なるベクターを試み、極め■ イントロンて変化に富む発現レベルを得ました。

多くの研究者は、構造的に接合されたイントロンが最適な遺伝子発現には不可欠であると考えています。しかしこの考えは常に正しいとは限りません。イントロンの位遺伝子導入を行うのに非常に重要です。図1をご覧ください。

置と強度は、転写、mRNAの核外輸送およびポリアデニル化に影響を与える可能性があります。このように、その位置によってはイントロンが遺伝子発現を弱めることさえあります。

Relative luciferase-expression % of
[pGL3-CMV at 24 h]

A
1600
1400
12001000
800
600
4002000

Control

Programonly

pGL3control

pGL3-CMV

pmax
Cloning™

pSG5

pcDNA3.1

pFP

pIRESMCS B

pcDNA4
HisMaxpCMVbetapCMV-TNTControl

Programonly

pGL3control

pGL3-CMV

pmax
Cloning™

pSG5

pcDNA3.1

pFP

pIRESMCS B

pcDNA4
HisMaxpCMVbeta

pCMV-TNT

Relative luciferase-expression % of
[pGL3-CMV at 24 h]

B
2000
1500
1000
500
0

4 hours

24 hours

48 hours

図1. Luciferase expression levels depend on vector backbones. We looked at luciferase expression at 4, 24 and 48 hours in THP-1 and HUVEC cells.
The amount of DNA was held at equimolar amounts based on plasmid size. For THP-1, the DNA amount ranged from 0.3 – 0.5 µg per reaction (A). For HUVECs,
we used 2.5 – 4.4 µg of plasmid (B).

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続き

表1：細胞型別プロモーター強度
細胞源

SV40

RSV

CMV

参考文献

293

ヒト胚腎臓

5%

EF1a

74%

100%

4, 6

BHK-21

ハムスター腎臓

200%

200%

C6

ラット神経膠腫

44%

CHO-K1

チャイニーズハムスター卵巣

16%

Cos-7

アフリカミドリザル腎臓

7%

15%

HeLa

ヒト子宮頸がん43%

N2A (Neuro-2A)

マウス神経芽腫

50%

NIH-3T3

マウス線維芽細胞

67%

100%

4100%

511%100%

2, 4, 57%

100%

1, 2, 4, 5, 873%

29%

100%

2, 3, 4, 5, 6, 8100%

5143%

107%

100%

2, 3, 7, 8

■ IRES プラスミド

IRESプラスミドによって、プロモーターは2つの遺伝子

ルは、IRES配列のないプラスミドと比較した場合は通常発現を惹起します。これらは複製される遺伝子（通常見られるよりも低くなります。目的のタンパク質と GFP

は 上 流 遺 伝 子 ） と GF P タ ン パ ク 質 を コ ー ド す る レ

は、両タンパク質の結合、 2 つの発現カセットを含むポーター遺伝子（下流遺伝子）です。IRESプラスミドかコンストラクト、または共遺伝子導入によって、等量ずmRNAは2シストロン性のメッセージです。
つまり、両遺伝子とも同じmRNA分子上に出現します。
各遺伝子のコード mRNA は等量ずつ母集団に出現します。しかし、2つの遺伝子の翻訳開始効率は大きく異なっつ取得できます。

ら発現する遺伝子導入細胞株

ロンザは、IRESの多重クローニング部位（MCS）の上流（コンストラクトA）またはIRESの下流（コンストラクトB、図2）いずれかで複製されたレポーター（GFP）を有ています。上流遺伝子の開始領域に対するリボソーム結する、pIRES発現ベクター（Clontech）に着目しました。

合は非常に効率的ですが、 IRES は下流遺伝子のリボ

図2Bは、GFPがIRESの下流に位置する場合にGFP発現がソーム結合と翻訳開始をしばしば著しく低レベルにしま著しく減少することを示しています。この研究は GFPレす。下流遺伝子は通常 GFP であるため、 GFP の発現レベポーター遺伝子について示されているものですが、ルシA
pmaxGFP™ Vector:

CMV*

pmaxGFP™ Vector

Construct A:

CMV*

pmaxGFP™ Vector

IRES

MCS B empty

Construct B:

CMV*MCS B empty

IRES

pmaxGFP™ Vector

Expression in Huvec
HUVECにおける発現
Mean fluorescence (% of pmaxGFP™ vector)

Mean fluorescence (% of pmaxGFP™ vector)

B
Expression in HL-60
HL-60 における発現120100806040200pmaxGFP™ Vector

Construct A

Construct B

120100806040200pmaxGFP™ Vector

Construct AConstruct B

図2. Reporter gene expression is dependent on the position in an IRES expression vector. HL-60 and HUVEC cells were transfected by Nucleofection™ witheither pmaxGFP™ Vector or pIRES variants containing maxGFP™ Reporter Protein cloned in either the Multiple Cloning Site (MCS) upstream (constructA) or downstream of the IRES sequence (construct B; 2A). Figure (2B) shows reduced GFP expression using IRES plasmids especially if GFP is locateddownstream of the IRES sequence.

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遺伝子発現に重要なベクターの要素
続きフェラーゼを用いても行われ、同様の結果が得られていロンザの研究所では、4〜7 kb のプラスミドが日常的にます。

使用されており、Nucleofection™可能なプラスミドは最ご使用のプラスミドには IRES 配列が含まれています

大で約 20 kb に達する場合もあります。これより大きな

2シストロプラスミドを使用すると遺伝子導入効率が低下する可能

ン性mRNAの安定性は、挿入された遺伝子のいずれかに性が非常に高くなります。原則として、プラスミドが大よって影響される可能性があります。第一および第二遺きくなるほど細胞内への導入が難しくなります。これはか？ その場合、どこで使用していますか？

エレクトロポレーションまたは脂質媒介型遺伝子導入の両方にあてはまります。それでもなお、Nucleofection™

能性があります。結果的に、プラスミドの真の効率は使を用いたいくつかの結果において、遺伝子導入効率は低用するレポーターの低い発現レベルにより、過小評価さいもののBACベクターでも同様に導入されることが示される場合があります。 IRES の下流にあるレポーター遺れています。9、10

伝子については、高感度の検出方法を使用するようにしてください。

■ レポーターどのような種類のレポーターを使用していますか？

■ LTR（ウィルス性長末端反復）
発現プラスミドの中には、レトロウイルスの長末端反復とが必要です。使用するレポーターは、細胞によって内配列（LTR）から得られるプロモーターやエンハンサー

生的に高レベルで発現するものではなく、カスタマーのを利用するものがあります。またこれらの発現プラスミ

下流アッセイにおいて十分に機能するものを選択しま

ドが特定の細胞に遺伝子導入される場合、複製される遺す。レポーターを変更する場合、または遺伝子導入方法

伝子の発現がその細胞によって抑制される可能性がありを変更する場合、現行の遺伝子導入方法を用いたそのレます。抑制のメカニズムは完全には明らかになっていま

ポーターの発現動態を評価し、最適な時点で分析を行う

せんが、レトロウイルスのLTRに由来するプロモーター必要があります。例えばルシフェラーゼは、遺伝子導入またはエンハンサーを含むプラスミドが、初代細胞や特がNucleofection™（遺伝子導入後6〜16時間で最大の発定の細胞株で十分に機能しない可能性は高いといえま現）によってなされるか、または脂質媒介型遺伝子導入す。Nucleofection™が初代細胞における唯一の効果的な（遺伝子導入後 24 時間で最大の発現）によってなされ方法であることも多いため、このような抑制効果がるかによって、大きく異なる発現カイネティクスをもちNucleofection™においてより頻繁に観察される場合があます。ロンザは、ルシフェラーゼの発現カイネティクス

ります。効果的な代替手段として挙げられるのは、研究が遺伝子導入方法に関連しており、ベクターのバック対象の遺伝子を CMV （例： pmaxCloning™Vector ）、ボーンや使用される細胞型には関係しないことを発見し

EF1aまたはSV-40などの従来型プロモーターを使用するました。レポーターの発現動態はmRNAやタンパク質の別の発現プラスミドに、再クローニングすることです。

安定性にも依存するため、ロンザはNucleofection™後のルシフェラーゼの発現カイネティクスを、ß–galと比較■ ベクターのサイズ
Kinetics of Luciferase Expression in HUVEC
HUVEC におけるルシフェラーゼ発現のカイネティクス(Protein/Well, 24 hours value = 100%)（タンパク質/ウェル、24時間の値 =100%）
300
250200150100
6 – 16 hours
500010HUVEC
ß-gal
発現のカイネティクス
Kinetics ofにおける
ß-gal Expressionin HUVEC(Protein/Well, 24 hours value = 100%)（タンパク質/ウェル、24時間の値=100%）
Relative expression per cell (% of 24 hours value)

Relative expression per cell (% of 24 hours value)

安

全で再現性があり、定量的で、かつ感度が良好であるこ

遺伝子導入

伝子で発現されるタンパク質のレベルは特定できません。またこれによって、分析や解釈に問題が生じる可

20300
250200150
10010 – 48 hours
50304050
Time post-transfection (hours)

00

1020304050
Time post-transfection (hours)

図3. Expression kinetics are reporter gene dependent. HUVEC cells were transfected by Nucleofection™ with either a luciferase or a ß-gal expression
vector. While luciferase expression shows a maximum 6 – 16 hours post-transfection, ß-gal expression is sustained for several days after transfection.

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遺伝子発現に重要なベクターの要素続きしました（図3）。これらのデータは、ルシフェラーゼ■ 融合ベクターvs.共遺伝子導入

ベクターおよびß–galベクターを用いた、HUVEC細胞の融合タンパク質の発現は、融合タンパク質の折り畳みや共遺伝子導入から取得したものです。

安定性だけでなく、タンパク質の局在化、転写と翻訳に両レポーターとも、非常に高レベルでは過小評価されるも依存します。

可能性があります。しかし、各レポーターの発現カイネ発現を改善するには、タンパク質が融合する末端を変更ティクスは大きく異なります。ルシフェラーゼは、遺伝することが望ましい場合があります。融合ベクターの代子導入後16時間に発現が非常に顕著に低下します。

わりに、共遺伝子導入を使用することもできます。

しかしß–galの発現は遺伝子導入の10時間後に最大に達し、その後一定に保たれます。例えば 24 時間といった1 つ目のプラスミドにはレポーター遺伝子（すなわちGFP ）が含まれ、 2 つ目のプラスミドに発現する遺伝子1点が選択される場合、ルシフェラーゼの最大発現は観が含まれます。プロモーターの強度やベクターの大きさに応じて2つのベクターの比率を最適化する必要がありがあります。

ます。

結論として、ロンザは Nucleofection™ の6〜16時間後にルシフェラーゼ解析を行うようお勧めします。一方 ß–galまたはGFPの発現は、Nucleofection™の10〜48時間後が最適な解析のタイミングとなります。

■ 遺伝子産物におけるヘアピン構造

RNAにおいて形成されるヘアピン構造は遺伝子の翻訳に影響を与える可能性があります。例えば、発現させる遺遺伝子導入察されず、ベクターの導入効率は過小評価される可能性

伝子に変異を導入する場合にはこの点を考慮する必要が■ 検出方法あります。

検出方法はレポーターごとに規定されています。レポー
ターの中には、複数の方法で測定できるものがあります。例えばGFPは、蛍光顕微鏡、フローサイトメーター、蛍光プレートリーダーによる読み取りが可能です。定性的画像が1つ必要なだけなら、蛍光顕微鏡が費用対効果の高い選択肢となります。定量的データが必要な場合はフローサイトメーターまたは蛍光プレートリーダーによって、より正確なデータが得られます。

■ コザック配列
コザック配列はリボソームによるスキャニング速度を低下させる場合があります。またATG開始コドンでの翻訳開始を認識することによって、その確率を高める可能性があります。コザック配列がATG開始コドンから連続している場合、目的遺伝子の翻訳と全体的発現効率を著しく増大させる可能性があります。

参考文献

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Cheng et al., (1995) Int J Radiat Biol 67(3): 261-267

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