3−報文−

酵素トルエンモノオキシゲナーゼを利用した選択的酸化反応技術の開発
飯
丸
小
柿

田
山
林
谷

高
秀

寛
廣
峰
均

Selective Oxidation of Organic Compounds by Utilizing Toluene Monooxygenases
Hiroshi IIDA
Takahiro MARUYAMA
Hidetaka KOBAYASHI
Hitoshi KAKIDANI

Toluene monooxygenases are known to oxidize toluene and other hydrocarbons in the environment. In thiswork, toluene 2-monooxygenase (T2MO) from gram-negative bacterium Burkholderia cepacia G4 was chosen toinvestigate its applicability as biocatalyst.

Recombinant Escherichia coli strains harboring the gene for TM2O

were found to perform the enantioselective epoxidation of terminal olefins besides the regioselectivehydroxylation of toluene and naphthalene.

Lowering reaction temperature led to an increase inenantioselectivity. Of several trichloroethylene (TCE)-degrading bacteria, Janibacter brevis showed higher
oxidation activity and enhanced enantioselectivity in the epoxidation of 1-butene as compared with the T2MO
recombinant E. coli strains. In addition, J. brevis exhibited a unique oxidation profile, suggesting its potential as
an attractive source for novel monooxygenases.

題がクリアされず、実用化には至らなかった。その後

１．はじめに微生物を用いた直接空気酸化によってオレフィンから酸化反応は工業的に重要な化学反応であるが、長年エポキシドを生産する技術や直鎖状の炭化水素からジの技術開発を経た現在においてもプロセスの環境負荷

カルボン酸を生産する技術などが1980年代に開発されや反応の選択性において課題が残されている。一方生

たが、総じて生体触媒を用いた酸化反応で実用化され体触媒（酵素あるいは酵素を含有する微生物）は自然

たものは数少ない。

界において常温常圧の穏やかな反応条件下で選択性のところが近年これらとはまったく別の観点から新た高い反応を行っていることから、生体触媒を酸化反応な技術シーズが生み出されている。それはトリクロロに用いることは古くから試みられてきた。1970年代にエチレン（TCE）やダイオキシンなど環境中に蓄積さ開発されたいわゆるCetusプロセスは、２種類の酵素

れた難分解性有機化合物を分解する新規な酸化酵素とを用いてグルコースとプロピレンからエピクロロヒド

強い酸化活性を有する微生物である。我々はそれらのリン／プロピレンオキシドを生産させる壮大な試みで中でトルエンモノオキゲナーゼに注目した。環境中にあったが、併産されるフルクトースの用途と価格の問おけるトルエンの代謝分解にはいくつもの経路のある

（ 3 ）

4

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.49（2005）

B. cepacia G4

OH

OH

T2MO

C23O
OH

T2MO

O
COOH
OH

P. Picketti PKO1

OH
CHO
COOH
CO2

OH

B. sp. JS150

＋

OH

OH

H2O
OH
H

P. putida F1

OH
OH
H
CH2OH

OH

O
COOH

OH

OH

CHO

COOH

P. putida mt-2

Fig.１

Catabolic pathways of toluene by various environmental microorganisms

B. cepacia G4 grows on toluene as sole carbon and energy source. Initial catabolic process is hydroxylationof benzene ring by T2MO at ortho position, followed by another hydroxylation by T2MO. Subsequent oxidative
ring opening is catalyzed by C23O.

ことが知られている（Fig. 1）。グラム陰性細菌であ1)子を還元して水にする。副生物が水だけというシンプ

るBurkholderia cepacia G4 はTCE分解菌として単離

ルで究極の環境調和型反応であるが、その分子機構はされたが、環境中のトルエンを単一の炭素源、エネル

非常に複雑であり、まだ解明されていないところが多ギー源として生育できる。この代謝の初発反応はトルい。Fig.2にT2MOの遺伝子、酵素を構成するタンパ

エンのオルト位の水酸化であり、この反応を触媒する

ク質、酸素酸化に共役した還元力の供給過程を模式的酵素がtoluene 2-monooxygenase（T2MO）である。

に表した。この中でヒドロキシラーゼ・コンポーネン

T2MOは生じたo-クレゾールをさらに水酸化して3-メトのα-サブユニットに存在する非ヘム２核鉄が酸素

チルカテコールにする。この化合物に作用してベンゼ

酸化の触媒活性を担っている。またBタンパク質とン 環 を 酸 化 的 に 開 裂 さ せ る 酵 素 は catechol 2,3-

NADH-オキシドレダクターゼはNADHに由来する還

dioxygenase（C23O）であり、一連の酸化反応によっ

元力をα-サブユニットに伝達する働きをしている。

て水溶性の増した化合物は容易に代謝されて分解し、遺伝子 tomA0 に相当するORF（open reading frame）

一部はバイオマス（菌体）に固定される。T2MOはトの機能は明らかにされていない。

ルエン以外の芳香族化合物にも働き、ナフタレンの場
合には1-ナフトールを生成する 2)。またTCEの酸化的な分解活性やオレフィンのエポキシ化活性3)も有する
極めて興味深い酵素である。我々はT2MOのエポキシ

２．材料及び方法［1］細Escherichia coli JM109およびEscherichia coli BL21

化活性に注目し、エナンチオ選択的なエポキシ化反応に利用することを目標として研究を進めた。

菌（DE3）はタカラバイオ（株）より購入した。また以下

T2MOなどモノオキシゲナーゼは一般に分子状酸素の菌株は各微生物保存機関より入手した。

の１つの酸素原子を基質に添加し、もう１つの酸素原

Escherichia coli C600（ATCC23724）（ 4 ）東ソー研究・技術報告 第49巻（2005）

5

T2MO gene cluster

tomA0

tomA1

tomA2

tomA3

tomA4

tomA5

DNA
short ORF
long ORF

74aa
orhydroxylase

97aa

CO2 ＋ H2O

unknown function
B protein

NADH-oxidoreductase
NAD＋

e−

＋ H＋
O

Ｒ
＋ O2

NADH

R
＋H2O

carbon source（glucose, lactate, etc.）

Fig.２

Epoxidation of olefin by toluene 2-monooxygenase working in living microorganism

Toluene 2-monooxygenase (T2MO) from Burkholderia cepacia G4 is encoded by 4.6-kb operon tomA012345 4) andis a three-component enzyme consisting of a 211-kDa hydroxylase (from tomA1A3A4 ) with two catalytic oxygen-bridged
binuclear iron centers, a 40-kDa NADH-oxidoreductase (from tomA5 ), and a 10.4-kDa protein also called B protein (fromtomA2 ) involved in electron transfer between hydroxylase and NADH-oxidoreductase 5). An ORF encoded by tomA0 is
a hypothetical protein with unknown function (74aa for short ORF, 97aa for long ORF ).

Burkholderia cepacia E1（MBIC3837）6)

ーニングを行なった。発現ベクターとしてpTrc99A

Burkholderia cepacia G4（DSM11737）（Amersham Biosciences社製）を用い、マルチクロー
7)

Burkholderia kururiensis KP23（JCM10599）

ニングサイトのEcoRI-KpnI部位に組み込んだ。より具8)

Burkholderia sp. JS150（DSM8530）

体的にはタグ配列としてEcoRI部位を有する上流側プ

Comamonas testosteroni R5（MBIC3841）9)

ライマーを用いたPCR（polymerase chain reaction）

Janibacter brevis（DSM13953）10)を行い、tomA0とtomA1の途中までの増幅産物を得た。
11-12)

Pseudomonas stutzeri OX1（ATCC BAA-172）

これを Eco RI- Sal I消化し、 Sal I部位からC23O中の

13)

Ralstonia eutropha JMP134（DSM4058）

KpnI部位までのDNA断片とpTrc99AのEcoRI-KpnI消化物とを合わせた3-fragment ligationにより目的の組換［2］T2MO発現大腸菌の作製

え体を作製した。ここでtomA0は機能未知の配列領域

B. cepacia G4の培養物から常法に従って全DNAをであり、配列の読み取り枠であるORFが97アミノ酸残調製した。これを制限酵素EcoRIで完全消化し、アガ基（long ORF）であるか74アミノ酸残基（short ORF）

ロース電気泳動で9-12KbのEcoRI断片を分離、回収しであるかは明らかでなかったため（Fig. 2）、両者にた後、プラスミドベクターpUC18のEcoRI部位に組み対応する組換え体を設計し、さらにORFが必要でない

込んで大腸菌（Escherichia coli）JM109に導入するこ可能性も考慮して合計3種の組換えプラスミドとによって部分ライブラリーを構築した。次にC23O

pT2MO11、pT2MO12、pT2MO13を作製して比較検（Fig. 1）の活性を指標としたスクリーニングを寒天討した。

プレート上で行うことにより、約500の組換え大腸菌
コロニーから１つを選抜した。この菌を培養したとこ［3］菌の培養方法

ろ、同時に微弱なナフタレン水酸化活性を有していた（1）TCE分解菌の培養
TCE分解菌は、1.6％トリプトンペプトン、１％酵

ことから、T2MO遺伝子を含むことが確定された（JM109/pT2MO1、Fig. 3）。

母エキス、0.5％NaCl、5 mM NaOHからなる培地

pT2MO1からT2MOの遺伝子領域のみを取り出し、（2×YT培地）あるいは、Yeagerらの方法14)で調製し同時に酵素活性を増強させることを意図してサブクロ

たBasal Salts Medium（以下ではBSMと呼ぶ）にそれ

（ 5 ）

6

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.49（2005）

BamHI

BamHI

Eco RI
Kpn I

BgI II

BamHI

tomA0

Pst I
tomA1
Hin dIII

tomA2

pT2MO1

pUC18

Hin dIII

tomA3

12.96 kb

BamHI

tomA4
tomA5

BgI II
Pst I

C23O Ferredoxin

Eco RI
BgI II
Hin dIII
Kpn I

Fig.３

Pst I

Kpn I

Restriction map of plasmid pT2MO1

Plasmid pT2MO1 contains T2MO gene cluster (tomA012345 ), ferredoxin gene, and C23O
gene from B . cepacia G4.

ぞれの菌の資化性に応じた炭素源を加えた培地で培養［4］酵素活性の測定した。BSMを用いた場合の炭素源は、P. stutzeri OX1

上記の培養方法に従って調製した菌体を、組換え大については20 mMリンゴ酸ナトリウム、J. brevisにつ腸菌の場合は1％グルコース含有50 mMリン酸カリウ

いては2.5 mM 乳糖、その他のTCE分解菌については

ム緩衝液（pH7.4）、B. cepacia G4、B. cepacia E1は2020 mM L-乳酸を用いた。培養温度は B. kururiensis

mM L-乳酸含有50 mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）、

KP23では37 ℃、その他のTCE分解菌では30 ℃とした。

J. brevis は20 mM酢酸ナトリウム含有50 mMリン酸カ

酵素活性は菌を回収する4時間前と2時間前に、0.2 M

リウム緩衝液（pH7.0あるいはpH7.5）、その他についフェノールを培地の1/100倍容加えて誘導した。トルては20 mM L-乳酸含有50 mMリン酸カリウム緩衝液

エンを用いて酵素活性を誘導する場合には最終濃度が（pH7.5）でそれぞれ2回菌体を洗浄したのち、菌密度2 mMになるようにトルエンを直接培養液に加えた。

がOD600の値で1から10の範囲の値になるように懸濁液を調製した。

（2）組換え大腸菌の培養

その他の反応は125 ml容量のアルミシールバイアル

反応に用いる組換え大腸菌はBSMにチアミン塩酸に菌体懸濁液10 ml（Fig. 5）、15 ml （Table 3、Table

塩、グルコース、カルベニシリンナトリウムをそれぞ

4、Table 5）あるいは20 ml（Table 2）を入れたのち、れ10μg/ml、2 mg/ml、50μg/mlになるように加え基質（あるいはエタノールに溶解した基質）を添加した培地中37 ℃で一晩培養したのち、新鮮な培地に植て30 ℃あるいは37 ℃で振とうしながら行った。基質

え継いで、適当な菌体密度（OD600＝0.6〜１）になる

がガスの場合にはバイアルを密閉した後、ガスタイトまで培養した。その後1 mM isopropyl-1-thio-β-D-

シリンジで所定量のガスを注入した。プロピレンは、

galactoside（IPTG）を添加し、引き続き2時間培養を0.19 mmol（Table 2、Fig. 5）あるいは0.37 mmol

継続して酵素活性を誘導した。

（Table 5）、１-ブテンは、0.42 mmol（Table 3、活性測定以外の目的での培養には1％トリプトンペ

Table 4、Table 5）を添加した。

プトン、0.5％酵母エキス、1％NaCl、5 mM NaOHか反応液はガスタイトシリンジを用いて経時的にサンらなる培地（LB培地）あるいは2×YT培地を用いた。

プリングしたのち、等容の酢酸エチルあるいはクロロ（ 6 ）東ソー研究・技術報告 第49巻（2005）

7

ホルムで抽出してGC（Hewlett Packard HP5890、カは検出されなかったが、 o- クレゾール（1.4 mM）を

ラムHP-5）で分析した。

基質にしてJM109/pT2MO11とJM109/pT2MO12の反またTCE分解菌のナフタレン水酸化活性の分析は、応性を調べたところ、反応の初速度（mM/h/OD600）

0.1 ｍMナフタレンを基質にして反応を行った。生成はそれぞれ0.24、0.17であったことから、組換え大腸した1-ナフトールは酢酸エチルで抽出したのちFast

菌においてもトルエンはo-クレゾールを経て3-メチル

Blue B（o-dianisidine, tetrazotized Zn salt）を用いた

カテコールになっているものと考えられる。

比色法により定量した15)。
Table１［5］光学純度の測定

Toluene hydroxylation activity of the recombinant
E. coli strains

反応生成物の光学純度を測定する場合には、反応液を1/5倍容の酢酸エチル、ジエチルエーテルあるいはE. coli

ORF

Initial reaction rate
［mM/h/OD600］

クロロホルムで抽出した後モレキュラーシーブス3A

JM109/pT2MO11

long

0.074

で脱水し、キラル分析用キャピラリーカラムを接続しJM109/pT2MO12

short

0.042

たGC（上述）を用いて分析した。プロピレンオキシ

JM109/pT2MO13

absent0.007

ドにはChiraldex A-TA、その他のエポキシドにはChiraldex G-TA（いずれもASTEC社製）をそれぞれキThirty micromole of toluene was added to 20 ml cell suspension(OD600=5). 3-Methylcatechol was the sole detectable product.

ラルカラムとして選択した。
次にプロピレンを基質にしてプロピレンオキシドの３．結生成を調べた。その結果、ORFがないJM109/

果

pT2MO13ではプロピレンオキシドは検出されなかっ［1］T2MO組換え大腸菌の活性測定

たが、反応の初速度（以下ではこれを活性と表記する）

T2MOを構成する各サブユニットタンパク質の遺伝を見ると、この場合にもJM109/pT2MO11は子はtomA1、tomA2、tomA3、tomA4であることが知JM109/pT2MO12と比べて1.5倍の値を示した（Table

られているが（Fig. 2）、それらを大腸菌に組み込ん2）。また宿主大腸菌をJM109からBL21（ DE3）に変えで機能させた場合に、ゲノムDNAのすぐ上流にあるて宿主の影響を調べたところ、pT2MO11とpT2MO12

tomA0遺伝子の有無がT2MO活性にどのような影響をのいずれについてもJM109よりもBL21（ DE3）の活性与えるかは明らかにされていない。tomA0遺伝子の塩が高く、BL21（DE3）/pT2MO11の活性はBL21（DE3）/

基配列からは97アミノ酸残基（long ORF）と74アミ

pT2MO12の約1.2倍、B. cepacia G4の1.6倍であった。

ノ酸残基（short ORF）という２通りのORFの可能性

以上の結果より、ORFはトルエンのヒドロキシル化が考えられたことから、T2MO遺伝子の上流にlong活性およびプロピレンのエポキシ化活性を高める作用

ORFあるいはshort ORFをもつプラスミドおよびORFを有することがわかった。

をもたないプラスミドの3者を作製し、それぞれを組み込んだ大腸菌についてトルエンの水酸化活性を分析

Table２

Propylene epoxidation activity of the bacteria

した。その結果、longあるいはshortのORFを含んだ大腸菌からは3-メチルカテコールが検出され、ORFをORF

Initial reaction rate
［mM/h/OD600］

JM109/pT2MO11

long

0.31

Strain含まないものに比べて明らかに活性が高かった（Table 1）。B. cepacia G4においてはトルエンはo-クレゾールから3-メチルカテコールへと順次水酸化された

E. coli a
JM109/pT2MO12

short

0.21

のち代謝されてしまうため、生成物は検出されなかっJM109/pT2MO13

absent0.00

た（データ示さず）５)。トルエンから3-メチルカテコ

BL21(DE3)/pT2MO11

long

0.57

ールへの反応は一段階の反応ではないが、見かけ上のBL21(DE3)/pT2MO12

short

0.47

(native)

0.35b

初 速 度 は long ORFを も つ 組 換 え 大 腸 菌 JM109/

B. cepacia G4

pT2MO11が、short ORFをもつJM109/pT2MO12と比Enzyme activity of each strain was induced by a IPTG
or b phenol. Propylene (0.19 mmol) was added to 19 ml
cell suspension (OD600=10). Propylene oxide wasmeasured by GC.

べて1.5倍、ORFがないJM109/pT2MO13と比べて11倍高かった。いずれの菌を用いた場合にもo-クレゾール

（ 7 ）

8

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.49（2005）［2］ORFがエポキシ化反応のエナンチオ選択性に与した（Table 3）。BL21（ DE3）/pT2MO11の活性はえる影響

BL21（ DE3）/pT2MO12の約1.2倍、BL21（ DE3）/

次にORFがオレフィンのエポキシ化反応で生じる生

pT2MO13の約14倍、また、B. cepacia G4の約0.7〜0.8

成物の光学純度に影響しているのかどうかを調べた。

倍であり、1-ブテンを基質にした場合にもORFの有無

上述したプロピレンを基質にした実験ではで活性に差が現れた。しかしながら生じた1,2-エポキ

JM109/pT2MO13にプロピレンのエポキシ化活性が検

シブタンの光学純度（46〜48％ e.e.）の違いは誤差範

出されなかったことから、BL21（DE3）を宿主に用い、囲であり、差は認められなかった。また同時にこの値

また1-ブテンを基質として反応性の有無を含めて検討

はB. cepacia G4を用いた場合とも変わらなかった。

した。その結果、BL21（DE3）を宿主に用いた組換え以上の結果から、ORFは生成物の光学純度に対しては体はいずれも1-ブテンから1,2-エポキシブタンを生成影響しないことがわかった。

Table３

1-Butene epoxidation activity of the bacteria

ORF

Initial reaction rate
［mM/h/OD600］

Optical purityof the product［％e.e.］(R/S )BL21(DE3)/pT2MO11

long

0.31

48.3(R )BL21(DE3)/pT2MO12

short

0.25

48.3(R )BL21(DE3)/pT2MO13

absent0.02

45.9(R )b(native)0.4246.8(R )B. cepacia G4 c(native)

0.38

46.9(R )StrainE. coli a

B. cepacia G4

Enzyme activity of each strain was induced by a IPTG , b phenol, or c toluene.
1-Butene (0.42 mmol) was added to 15 ml cell suspension (OD600=5).
1,2-Epoxybutane was measured by GC.
A)

B)
15

25
BL21(DE3)/ C600/
pT2MO11pT2MO12

20

4℃

15

20 ℃

10

30 ℃

5

Epichlorohydrin［mM］

Propylene oxide［mM］

30

20 ℃
30 ℃

5

0

0
0

10
20
Reaction time［h］

0

30

C)

10
20
Reaction time［h］

30

D)
1.0

90

0.8

85
Substrate BL21(DE3)/ C600/
pT2MO11 pT2MO12

0.6

Propylene
Allyl chloride

0.4
0.2

％ e.e. of productInitial reaction rate［mM/h/OD600］

BL21(DE3)/ C600/
pT2MO11pT2MO121080BL21(DE3)/ C600/
Product pT2MO11 pT2MO12

75

PO
ECH

70
65
60

0.0
0

10
20
Temperature［℃］

Fig.４

30

0

10
20
Temperature［℃］30

Effect of temperature on the reaction rate and enantioselectivity(A) Production of propylene oxide. (B) Production of epichlorohydrin. (C) Initial reaction rate. (D) Optical purity of the epoxides. Propylene (0.45 mmol)
or allyl chloride (0.15 mmol) was added to 15 ml cell suspension (OD600=3.5) at zero hour. The same amount of each substrate was added at 3 h (reaction at
30 ℃) or 5 h (reaction at 20 ℃). PO; propylene oxide. ECH; epichlorohydrin.

（ 8 ）東ソー研究・技術報告 第49巻（2005）［3］反応温度がエポキシ化反応のエナンチオ選択性

91.2
brevis

長らく酵素のエナンチオ選択性は反応基質ごとに固有の値を持つように思われていたが、最近反応媒体や反応温度を変えることによって変化することがリパー
ゼなどを用いた研究で報告されている16-19）。ここでは菌体を用いた反応であるため媒体を変えることはでき
ないが、限られた範囲であっても温度を変えることは

Initial reaction rateof propylene oxide production［mM/h/OD600］に与える影響可能である。そこで30 ℃、20 ℃および4 ℃での反応を行って、反応速度と生成物の光学純度を測定した

1.0
0.8

R5

0.6
G4
G4(T)

0.4

E1
OX1
JS150
JMP134
KP23

0.2
0.0
0.00

（Fig. 4）。反応基質としてはプロピレンおよびアリル

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

Initial reaction rateof 1-naphthol production［mM/h/OD600］

クロライドを用いた。その結果、Fig. 4 A）, C）に示すようにプロピレンのエポキシ化においては温度を低下させることで反応性が低下したものの、Fig. 4 D）

Fig.５に示すように光学純度が上昇する傾向が見出された。

Oxidation of naphthalene and propylene by
TCE-degrading bacteria

Enzyme activity of each strain was induced by phenol. Additionallyinduction of B. cepacia G4 enzyme activity was performed by toluene(denoted G4(T) ). Naphthalene (0.1 μmol) was added to 1 ml cellsuspension (OD600=1). Propylene (0.19 mmol) was added to 10 ml cellsuspension (OD600=10) . Each reaction was performed at 30 ℃ except
for B. kururiensis KP23 at 37 ℃. ●, ▲, B. cepacia G4; ×, B. cepacia
E1; ＋, B . sp. JS150; ◇, B. kururiensis KP23; ＊, C. testosteroni R5; ○,J. brevis ; □, P. stutzeri OX1; △, R. eutropha JMP134.

一方アリルクロライドのエポキシ化においては20℃の方が反応終点におけるエピクロロヒドリンの濃度が高かったが（Fig. 4 B）、初速度は30℃の方が高く（Fig.
4 C）、生成したエピクロロヒドリン（S体過剰）の光
学純度は20℃の方が高い値を示した（Fig. 4 D）。
以上の結果より反応温度、反応性、生成物の光学純度の間に明瞭な関係が見出され、T2MOは反応温度をTable４

1-Butene epoxidation activity of the TCE-degrading
bacteria低下させることでエナンチオ選択性が上昇する酵素であると解釈される。

Strain［4］TCE分解菌の活性測定

Initial reaction rate
［mM/h/OD600］

Optical purityof the product［％e.e.］(R/S )B. cepacia E1

0.26

40(R )

B. sp. JS150

0.1447(R )

cepacia G4のT2MOが持っている特性について多くの

R. eutropha JMP134

0.42

56(R )

情報が得られた。組換え大腸菌はプロピレン、アリル

C. testosteroni R5

0.54

57(R )

J. brevis

0.98

61(R )

これまでの組換え大腸菌を用いた実験により B.

クロライド、1-ブテンに対して比較的高いエポキシ化活性を示したが、エナンチオ選択性は当初期待したほどは高くなかった。そこでT2MOと類縁の酵素（トル1-Butene epoxidation reaction was performed as described inTable 3. Enzyme activity of each strain was induced by phenol.

エンモノオキシゲナーゼあるいはフェノールヒドロキシラーゼ）を有すると推測されるTCE分解菌を各種微J. brevisはB. cepacia G4と同様にフェノールによっ

生物保存機関から取り寄せ、ナフタレンの水酸化活性てTCE分解活性が誘導される特徴を有するが、用いたとプロピレンのエポキシ化活性を指標にして評価を行中では唯一のグラム陽性細菌である（現在はJ. terrae

った。その結果、B. cepacia G4以外にも７種類のTCEと同種に分類されている）。現在までグラム陽性細菌

分解菌にナフタレン水酸化活性が見出され、いずれもからT2MO類縁の酵素が見出された報告はないため、

プロピレンのエポキシ化活性を有することがわかった

観察された酸化活性が新規な酵素によるものである可（Fig. 5）
。その中でもJ.brevisに高い活性が認められた。

能性も考えられる。そこでいくつかの化合物を基質といくつかの菌株について1-ブテンのエポキシ化活性

してJ. brevisの反応性を解析した（Table 5）。プロピを調べたところ、J. brevisが最も高い活性を示し、生

レンと1-ブテンに対する反応性は高かったものの、1-成した1,2-エポキシブタン（ R 体過剰）の光学純度ブテンよりも炭素数がひとつ増えた1-ペンテンに対し（61％ e.e.）は、Table 4に示した他の菌やTable３にてはほとんど反応しなかった。1,3-ブタジエンからブ示したB. cepacia G4あるいはT2MO組換え大腸菌（46

タジエンモノオキシドを生成する活性は比較的高く、〜48％ e.e.）と比べて有意に高かった。

ブタジエンモノオキシドからブタジエンジエポキシド
（ 9 ）

10

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.49（2005）を生成する活性もわずかながら検出された。アリルブ

役した還元力の供給が必要であり、従って生きた微生ロマイドやアリルエチルエーテルは反応しなかった物を用いなくてはならないという制約があるため、合が、アリルクロライドやアリルアルコール、メチルア

成化学的な研究は極めて限られている。我々は近年多クリレート、エチルアクリレート、桂皮酸エチルにはくの新規な酸化酵素や酸化活性の強い微生物が見いだ作用した。また内部オレフィン構造をもつシクロヘキ

され、解析されている状況に注目し、こうした生物機センにも作用した。スチレンに対する反応性は低かっ

能を利用することによって新たな技術構築が可能であたが、スチレンオキシド（R体過剰）の生成が検出さると考えた。本研究ではT2MOを材料として取り上げれた。またこのときにスチレンのベンゼン環の水酸化

たが、他のトルエンモノオキシゲナーゼを含め、オレ物に相当する化合物は検出されなかった。トルエンをフィンのエポキシ化反応を行う酵素はいくつか知られ基質とした場合には一過的にクレゾールが検出されたており、より高い活性や選択性を有する酵素が見出さが、反応生成物の蓄積は認められなかった。クレゾーれる可能性は高い。

ル（o-, m-, p-）を基質とした場合にも基質の減少が確

B. cepacia G4はTCE分解菌として初期に単離された

認されたが、反応生成物は検出されなかった。

細菌であり、またTCE分解活性の本体がT2MOである
ことが明らかになったため、T2MOに関しては比較的

４．考

基礎的な知見が蓄積されている。しかしながら合成化

察

学的な観点で利用する試みはほとんどなく、大腸菌をモノオキシゲナーゼは、通常の化学プロセスでは困宿主とした遺伝子発現についても研究例が少ない。

難な、基質の燃焼を伴わない空気酸化を可能にしてい我々はまず機能未知のORFが酵素生産に与える影響にる興味深い酵素群である。しかしながら酸素酸化に共注目して研究を行い、これが酵素活性を高める働きを

Table５

Substrate

Oxidation activity of J. brevis toward various organic compounds

Product

Initial reaction rate
［mM/h/OD600］

Optical purityof the product［％e.e.］(R/S )Propylene oxide

1.2

70(R )
61(R )

Initial concentrationof substrate［mM］

Propylene
1-Butene

1,2-Epoxybutane

0.94

1,3-Butadiene10

Butadiene monoxide

0.36

Butadiene monoxide

10Butadiene diepoxide

0.09

1-Pentene10

1,2-Epoxypentane

0.01

Allyl alcohol

10Glycidol

0.06

Allyl bromide

10

-

NR a

Allyl chloride

10

Epichlorohydrin

0.56Allyl ethyl ether

10

-

NR a

Methyl acrylate

10

Methyl glycidate

0.31 dEthyl acrylate

10Ethyl glycidate

0.46 dStyrene5

Styrene oxide

0.03

Cyclohexene

5

Cyclohexene oxide

0.29

Toluene5

Cresol c

ND bo- Cresol

5

ND

b

0.42 dm- Cresol

5ND b0.24 dp- Cresol

5

ND

b

0.34 dNaphthalene

1.5

1-Naphthol

Ethyl cinnamate

1.5

ND b

74(R )

38(R )

0.08＞0.15 dEnzyme activity of the bacterium was induced by phenol. Each substrate was added to cell suspension
as follows: 15 ml cell suspension (OD600=5) for propylene (0.37 mmol), 1-butene (0.42 mmol); 20 ml cellsuspension (OD600=5) for 1,3-butadiene, butadiene monoxide, 1-pentene, allyl bromide, methyl acrylate,and ethyl acrylate; 18 ml cell suspension (OD600=10) for allyl chloride, allyl alcohol, styrene, cyclohexene,
toluene, cresols (o-,m-and,p- ), naphthalene, and ethyl cinnamate.
aNR, no reaction. b ND, not determined. c ortho:meta:para =48:3:1. d Initial rate of substrate degradation.

（ 10 ）

東ソー研究・技術報告 第49巻（2005）11

していることを見出した。またlong ORFあるいは有している可能性が高い。最近、ダイオキシン分解活

short ORFのみを発現させる組換え大腸菌（宿主BL21性を有する細菌がJanibacter属あるいは近縁の（DE3））を作製してSDS-PAGEで分析したところ、いTerrabacter属から多く報告されている23-24)。ここで分ずれにおいてもshort ORFに相当する大きさのタンパ

析した酸化活性がダイオキシン分解の酵素系と関係しク質が観察された（データ示さず）。従ってshort ORFているかどうかは今後の課題である。

が機能領域である可能性が高いが、 B. cepacia G4で酵素のエナンチオ選択性を上げたい場合に最も多く

short ORFが機能しているかどうかは明らかでない。

とられるアプローチは微生物のランダムスクリーニン

Pseudomonas sp.CF600のフェノールヒドロキシラー

グである。歴史的には多くの成功例があるが、一般にゼにはB. cepacia G4のものとはアミノ酸配列が大きく

その効率は低い。ところでリパーゼに代表されるタフ

異なる機能未知のORFがあり、これがサブユニットのな加水分解酵素は、有機溶媒中で反応させることや反20)会合に関与しているという仮説が提唱されている 。

応温度を極端に低下させることによってエナンチオ選

B. cepacia G4のORFが同様の働きをしているのかどう

択性を上げたという報告がある16-19)。我々は反応温度かは更なる検討が必要である。

を下げてT2MOの反応を行ったところ、プレピレンとT2MO組換え大腸菌はB. cepacia G4と同等以上の酸

アリルクロライドのエポキシ化反応において明瞭なエ化活性を示し、トルエンやナフタレンの水酸化活性、ナンチオ選択性の上昇が観察された。我々は最近アル

プロピレンや1-ブテンのエポキシ化活性とエナンチオ

ケンモノオキシゲナーゼを用いた場合にも同様の効果

選択性、いずれにおいてもB. cepacia G4を用いた結果があることを見出しており（データ示さず）、反応温と近かった。従ってT2MOがB. cepacia G4における主度を低下させることによって多くのモノオキシゲナー

要なモノオキシゲナーゼであると推測された。一方B.

ゼのエナンチオ選択性を上昇させることができるので

sp. JS150やP. stutzeri OX1では２種類以上のモノオキはないかと考えている。
上記のような試みにも関わらずT2MOのエナンチオ

シゲナーゼがトルエンの水酸化に関与しているという
報告があり

8,21)

、B. cepacia G4においても同様の可能選択性を飛躍的に上昇させることはできなかったた性は排除できない。
T2MOのエナンチオ選択性は当初期待していたよりも低かったため、T2MO類縁の酵素を持つ可能性が高
いTCE分解菌から高いエナンチオ選択性を有する酵素
Helix Eを見出すことを試みた。その結果、調べたTCE分解菌の多くにナフタレンの水酸化活性とプロピレンのエポキシ化活性が見出された。その中でもJ. brevisは①両

E197

者の活性がともに高く、②1-ブテンのエポキシ化におH234

いて他のものよりもエナンチオ選択性が高く（61％

Fe2

E231

e.e.、R体過剰）、③グラム陽性細菌である、ことから興味が持たれた。そこで種々の化合物を用いて反応を行い、反応生成物を分析した22)。その結果、T2MOと

O2
E134

O1
Helix F

Fe1

Helix Bはいくつかの点で異なる反応性が観察された。まずプ

E104

H137

ロピレンのエポキシ化反応の初速度を１としたときのHelix C

アリルクロライドに対する初速度の値は、JM109/
pT2MO11では0.86（Fig.4（C）の値より算出）であるのに対して、J. brevisでは0.47（Table４の値より算出）であり、反応性に違いが見られる。またスチレン

Fig.６に 対 す る 反 応 で は 、 組 換 え 大 腸 菌 B L 2 1（ D E 3 ）/pT2MO11がスチレンオキシドのほかに2-ヒドロキシスチレンや2-ヒドロキシスチレンオキシドを生成した（データ示さず）のに対して、 J. brevis はスチレンオ
キシドのみを生成した。こうしたことからJ. brevisはB. cepacia G4由来のT2MOとは異なるタイプの酵素をActive site of ToMO along with a possible binding
mode of allyl chloride

Allyl chloride molecule (represented by stick with a green end, chlorineatom) was docked with X-ray crystal structure of ToMO 25) (PDB entry :1TOQ) by Auto Dock 3.0 26). An output structure of allyl chloride withpreferable position and conformation was selected for display. Six aminoacid residues (Glu104, Glu134, His137, Glu197, Glu231, and His234)
coordinated to two Fe atoms are highlighted. O2, an oxygen atom
derived from molecular oxygen is supposed to attack C=C bond of allyl
chloride in a stereoselective manner. Schematic representation of fourα-helices (Helix B, C, E, and F) surrounding the active site are also shown（ 11 ）12

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.49（2005）

Evol. Microbiol., 50, 743（2000）.

め、我々はアミノ酸残基の置換による酵素の機能改変
を次の技術課題として検討している。エナンチオ選択８ ） G. R. Johnson, R. H. Olsen, Appl. Environ.

Microbiol., 63, 4047（1997）.

性はα-サブユニットにある基質結合ポケットの立体構造によって規定されると考えられることから、基質

９）M. Teramoto, S. Harayama, K. Watanabe, J.

Bacteriol., 183, 4227（2001）.

結合ポケット付近に的を絞ったアミノ酸置換を行えば反応性や選択性が変化するものと推測される。T2MO

10）Y. Imamura, M. Ikeda, S. Yoshida, H. Kuraishi, Int.

J. Syst. Evol. Microbiol., 50, 1899（2000）.

の立体構造はまだ明らかにされていないものの、類縁酵素であるtoluene o-xylene monooxygenase （ToMO）

11）S. Chauhan, P. Barbieri, T. K. Wood, Appl.

25)

Environ. Microbiol., 64, 3023 （1998）.

のX線結晶構造が2004年に報告された ことから、このアプローチがにわかに現実味を帯びてきた。我々は

12）D. Ryoo, H. Shim, K. Canada, P. Barbieri, T. K.

X線結晶構造解析によって明らかにされたToMOの活

Wood, Nature Biotechnol., 18, 775（2000）.

性中心にアリルクロライドを計算化学的にドッキング

13）A. R. Harker, Y. Kim, Appl. Environ. Microbiol.,させることによって（Fig. 6）、基質との相互作用に

56, 1179（1990）.

関与する酵素のアミノ酸残基を推定した。今後はこの

14）C. M. Yeager, P. J. Bottomley, D. J. Arp, M. R.

ような手法を組み合わせることによって望ましい特性

Hyman, Appl. Environ. Microbiol., 65, 632（1999）.

を有する酵素を見出したいと考えている。

15）飯田寛、柿谷均、丸山高廣、特開2004-309157
16）V. Kasche, B. Galunsky, A. Nurk, Piotraschke, A.
Rieks, Biotechnol. Lett., 18, 455（1996）.

５．まとめ17）B. Galunsky, S. Ignatova, V. Kasche, Biochem.

Biophys. Acta, 1343, 130（1997）.

〔1〕Burkholdera. cepacia G4由来のT2MOを遺伝子組換えにより大腸菌で生産させることによって、プロピ

18）T. Sakai, I. Kawabata, T. Kishiomto, T. Ema, M.
Utaka, J. Org. Chem., 62, 4906（1997）.

レンやアリルクロライドなどのエポキシ化反応を効率よく行なうことができた。

19）T. Sakai, T. Kishiomto, Y. Tanaka, T. Ema, M.

〔2〕反応温度を低下させることによってエポキシ化反Utaka, Tetrahedron Lett., 39, 7881（1998）.

応のエナンチオ選択性が上昇することを見出した。

20）J. Powlowski, J. Sealy, V. Shingler, E. Cadieux, J.

Biol. Chem., 272, 945（1997）.

〔3〕TCE分解菌であるJanibacter brevisは芳香族化合物の水酸化やオレフィンのエポキシ化活性が高く、ま21）V. Cafaro, V. Izzo, R. Scognamiglio, E. Notomista,

た1-ブテンに対するエナンチオ選択性が高いなど興味

P. Capasso, A. Casbarra, P.Pucci, A. Di Donato,

深い特性を有していた。

Appl. Environ. Microbiol., 70, 2211（2004）.
22）丸山高廣、飯田寛、柿谷均、特開2004-357512

６．文23）H. Nojiri, M. Kamakura, M. Urata, T. Tanaka, J.

献

Chung, T. Takemura, T. Yoshida, H. Habe, T.
Omori, Biochem. Biophys. Res. Commun ., 269,

１）M. J. K. Nelson, S. O. Montgomery, E. J. O Neill,
P. H. Pritchard, Appl. Environ. Microbiol., 52, 383

233（2002）.
24）A. Yamazoe, O. Yagi, H. Oyaizu, Biotechnol. Lett.,（1986）.

26, 479（2004）.

２）L. M. Newman, L. P. Wackett, J. Bacteriol., 179, 9025）M. H. Sazinsky, J Bard, A. Di Donato, S. J. Lippard,（1997）.

J. Biol. Chem., 279, 30600（2004）.

３）K. McClay, B. G. Fox, R. J. Steffan, Appl. Environ.

Microbiol., 66, 1877（2000）.

26）G. M. Morris, D. S. Goodsell, R. S. Halliday, R.

４）M. S. Shields, S. C. Francesconi, U. S. Patent

Huey, W. E. Hart, R. K. Belew, A. J. Olson, J.

Comput. Chem., 19, 1639（1998）.

5,543,317（1996）.
５）L. M. Newman, L. P. Wackett, Biochemistry ,34,14066（1995）.
６）二又裕之、渡辺一也、特開平11-243958
７）H. Zhang, S. Hanada, T. Shigematsu, K. Shibuya,
Y. Kamagata, T. Kanagawa, R. Kurane, Int. J. Syst.
（ 12 ）

東ソー研究・技術報告 第49巻（2005）

著者

氏名 飯 田著
寛Hiroshi IIDA

著

者

者

氏名 小 林 秀 峰

氏名 丸 山 高 廣Takahiro MARUYAMA

Hidetaka KOBAYASHI

13

著

者

氏名 柿 谷均

Hitoshi KAKIDANI入社 昭和63年 4 月 1 日

入社 平成10年 4 月 1 日

入社 平成14年 4 月 1 日

入社 昭和54年10月16日

所属 （財）相模中央化学研究所（出向）所属 東ソー株式会社

所属 東京研究所

所属 （財）相模中央化学研究所

酵素工学グループ

東京研究所

バイオ有機分野

酵素工学グループ

主任研究員

新材料無機分野

副主任研究員（兼）東京研究所
企画管理グループ

副主任研究員

主席研究員（ 13 ）