21

抗体精製用疎水クロマトグラフィー新規TOYOPEARL
グレードの開発
﨑橋三間本苫恵佳惠美巳
民Development of a New TOYOPEARL Hydrophobic Interaction
Chromatographic Resin for Antibody Purification
Emi SAKIMAYoshimi HASHIMOTO
Yasutami MITOMA

In view of ever expanding demand for therapeutic antibodies in medical market, we may expect thatthe chromatographic resins for use in the manufacture and purification of antibodies would also go on
increasing in market demand. We have now developed a new grade Toyopearl hydrophobic interaction
chromatographic (HIC) resin (TOYOPEARL PPG-600M) good for the use at intermediate stage ofantibodies manufacturing process.
The new resin was designed to possess an optimal pore size for antibody molecules and a moderatehydrophobicity that was intermediate between the ether and pheny-based ligands. Compared with thecurrent Tosoh's HIC resins and competitors'products, this resin exhibited not only higher binding
capacity and more efficient recovery but also better selectivity in removing impurities from the antibodies
of ascites samples.

中間精製、最終精製を適用するのが一般的である。中1．はじめに間精 製 以 降 の ス テ ッ プ で は 疎 水 ク ロ マ ト グ ラ フィ

近年、抗体の医薬品としての需要は過去20年間にわー 2),3)、イオン交換クロマトグラフィーなどが使用さたって増加を続けており、現在、数種類の抗体がれるが、その担体には不純物との良好な分離性能と共FDAにより医薬品として認可されている1）。代表的なに抗体に対する吸着容量が高いことが要求される。

ものとしては転移性乳癌治療薬のハーセプチン、再狭TOYOPEARLは親水性のビニルポリマーを基剤とし窄予防薬のレオプロ等があり、それぞれ全世界で年間た半硬質多孔性球状のクロマトグラフィー担体で、そ約400億円の売り上げがある。抗体医薬の市場は今後の優れた耐圧性と化学的安定性から、ラボスケールかも伸びることが考えられ、2010年には総額約500億ドらプラントスケールの大量精製まで適用が可能であルに達するとの予想もある。

り、医薬品、食品精製等様々な分野で広く利用されて抗体医薬の製造では、抗体を発現する細胞を培養、いる。

膜による前処理を行った後、純度を上げるために３ス

これまでに、我々は目的精製物に合わせてテップあるいはそれ以上のクロマトグラフィーで精製TOYOPEARL細孔径の最適化4)〜6)を行うことで吸着容を行うことが多い。精製プロセスとしては、粗精製、量を向上させる技術を検討してきた。その技術を応用（ 21 ）

22

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.47（2003）

した例としては、2002年４月に上市したインスリン粗清に残った未吸着のサンプル量から吸着したサンプル

精製用イオン交換クロマトグラフィー担体

量 を 算 出 し た 。 サ ン プ ル は human γ -globulins

TOYOPEARL MagaCap SP-550ECがある。

（Sigma社製、G-4386）を用いた。タンパク質の濃度

今回、我々は抗体の中間精製用にターゲットを絞り、決定には分光光度計（島津製作所製、UV-160A）を用

この細孔径最適化技術の適用と新規リガンドの検討にいた。

より、良好な吸着容量と不純物との優れた分離選択性（４）モノクローナル抗体（Anti-LH IgG）動的吸着容量の両立を目標とした疎水クロマトグラフィー新規

7.8mmI.D.*200mmステンレスカラムに担体を充填し、0.8M硫酸ナトリウムを含む0.1Mリン酸バッファ

TOYOPEARLグレードの開発を行った。
本稿では、疎水クロマトグラフィー新規（pH7.0）で30分間平衡化した後、サンプル（モノクTOYOPEARLグレードの開発の概要と基本的性質、特ローナル抗体、Anti-LH IgG、濃度1mg/mL）を流速

徴について述べる。

2.39mL/min（線速300cm/h）でカラムにアプライし2．実た。280nmの吸光度をモニターし、元の濃度の10％の験サンプルがカラムから漏れだした時間を測定し、動的［1］試作担体の調整吸着容量を求めた。その後、未吸着のサンプルを親水性ビニルポリマーである既存のTOYOPEARLと1.1M硫酸アンモニウムを含む0.1M リン酸バッファ同様の基材を用いて、様々な細孔径を持つベースゲル（pH7.0）で洗い流した後、吸着されたサンプルをを調整した。その後、ゲル表面修飾反応において各リ

0.1M リン酸バッファ（pH7.0）で溶出させ、溶出回収ガンドを導入した担体を作成した。中間精製用を想定量、回収率を求めた。サンプルはモノクローナル抗体し、粒子径は40〜90μmに設定した。ベースゲル細孔（Anti-LH IgG、東ソー東京研究所より）を用いた。

径調整、リガンド導入反応、粒子径制御は常法に従い行った。
［2］試作充填剤の物性評価

3．結果と考察［1］ベースゲル細孔径の最適化（１）細孔特性

Fig.1に示したように、ベースゲルの細孔径を小さ細孔特性は排除限界分子量で測定した。10.7mm

くした場合、表面積は大きくなり、分子量の小さなタ

I.D.*150mmステンレスカラムに担体を充填し、純水ンパク質に対しては吸着に有効な表面積が大きくなるを流速0.47mL/min（線速30cm/h）で通液しサンプルが、細孔に入れないような分子量の大きなタンパク質を溶出した。標準試料はプルラン（昭和電工製、に対しては吸着に有効な表面積が小さくなる。反対に、STANDARD P-82） を 用 い た 。 測 定 装 置 は HLC-

細孔径を大きくした場合、分子量の小さなタンパク質8120GPC（東ソー製）を使用し、検出はRIで行った。

に対しては吸着に有効な表面積は小さくなるが、分子（２）タンパク質溶出挙動

量の大きなタンパク質に対しては吸着に有効な表面積7.5mmI.D.*75mmステンレスカラムに担体を充填し、1.8M硫酸アンモニウムを含む0.1Mリン酸バッフは大きくなる。上記の考えに基づき、抗体（IgG）吸着に対して最適なベースゲル細孔径を検討した。

ァ（pH7.0）から0.1Mリン酸バッファ（pH7.0）への様々な大きさの細孔径を持つベースゲルにポリエー

リニアーグラジエントでサンプルの溶出を行った。サテルをリガンドとして導入した試作担体について、

ンプルはBSA（Sigma社製、A-8022）、モノクローナルIgGが主成分であるhuman γ-globulinsの静的吸着容抗体（Anti-LH IgG、東ソー東京研究所より）、マウス量を調べた。また、細孔特性を表すパラメータとして腹水（Anti-IgE IgG、東ソー東京研究所より）を用い排除限界分子量測定を行った。排除限界分子量とγ-た。測定装置はポンプ（東ソー製CCPM-Ⅱ）、オートglobulins吸着容量の関係をFig.２に示した。排除限界

サンプラー（東ソー製AS-8020）、カラムオーブン（東分子量80万前後で吸着容量が最も高く、これはソー製CO-8020）、検出器（東ソー製UV-8020、検出波

TOYOPEARL既存グレードと比較するとHW-65とHW-長:280nm）により構成した。またシステムのコント55の中間の細孔径に相当した。
Fig.３に示したように、吸着容量で最適な結果が得ロール、データ処理には東ソー製スーパーシステムコ
ントローラSC-8020を用いた。

られた担体の細孔特性（較正曲線）の中心分子量を長（３）human γ-globulins静的吸着容量さに換算する7）と、排除限界分子量80万の場合、中心0.8M硫酸アンモニウムを含む0.1Mリン酸バッファ

細孔直径は140Å前後と推定された。IgG分子の大き（pH7.0）中でサンプルを50分間担体に吸着させ、上さ（約100×150Å）8）と考え合わせると妥当な結果と（ 22 ）

東ソー研究・技術報告 第47巻（2003）a)b)

Hydrophobic groups

Hydrophobic groups

Proteins

Fig.１

Proteins

Eluent flow

Eluent flow

Porousmaterial

Porousmaterial

Relationship between pore size and effective surface area for binding to proteins.
a）small size poreb）large size pore

30.0

9.0

25.0

8.0

20.0

7.0
6.0

15.0

logMW

Binding Capacity for γ−Globulins（mg/mL−gel）

2310.0HW−55

5.0

5.04.0HW−65

3.0
0.01.0E＋05

1.0E＋06

2.0

1.0E＋07

1.0

Exclusion limit（Log Mw of Pullulan）

Kd＝00.0
4.0

Fig.２

Relationship between γ−globulins binding capacityand exclusion limit.
Resin：Polyether bonded TOYOPEARL（All reseach sample）
Sample：human γ−globulins

Kd＝0.5
6.0

8.0

Kd＝1
10.0

12.0

Elution volume（mL）

Fig.３

考えられる。
［2］リガンドの選択
これまでに、当社既存品の疎水クロマトグラフィー
担体としてはEther-650M、Phenyl-650M、Butyl-650M等がある。Fig.4に示したように、マウス腹水の分離

Calibration curve of optimized material for antibodybinding.
Conditions：
Column size；10.7 mmI.D.*150 mm
Eluent；H2O
Flow rate；0.47 mL/min（linear velocity：30 cm/h）
Detection；RI
Sample；Pullulan, ethylene glycol
Injection；40 μL

において、Ether-650MではアルブミンとIgGの良好な分離が得られているが、Phenyl-650M、Butyl-650Mでと予想される新規リガンドのポリエーテル基を導入しはやや分離選択性が劣っていた。一方、Ether-650Mた担体を試作し、物性を比較した。Fig.5にマウス腹では吸着容量は低いがPhenyl-650M、Butyl-650Mでは水（Anti-IgE IgGを含む）のクロマトグラム測定結果吸着容量に優れている 。分離選択性と吸着容量の両を示した。Phenyl基、Butyl基を導入した充填剤では方に優れた充填剤が求められる中間精製ステップでのアルブミンとIgGの溶出ピークが重なっていたのに対使用を想定した場合、リガンドの疎水性はEtherとし、新規リガンドのポリエーテルを導入した担体ではPhenylの中間となるものが適当と考えた。そこで、共Etherを導入した担体と同様にマウス腹水に含まれる通のベースゲルに既存品と同様のEther、Phenyl、夾雑物であるアルブミンとIgGの良好な分離が確認さButyl、およびEtherとPhenylの中間の疎水性を有する

れた。

9）

（ 23 ）

24

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.47（2003）

600

450
400

1Albumin350

3
TOYOPEARL new resin

500300TOYOPEARL Ether-650M

TOYOPEARL Ether-650M

250
200

Peak height（mV）

Peak height（mV）

2IgG

TOYOPEARL Phenyl-650M

150100TOYOPEARL Butyl-650M

500050100

Retention time（min）

Fig.４

Separation of mouse ascites fluid on some HICmaterials.
Conditions：
Column size；7.5 mmI.D.*75 mm
Eluent；a）0.1 M Phosphate buffer containing 1.8 M
ammonium sulfate（pH 7.0）b）0.1 M Phosphate buffer（pH 7.0）
Gradient；a）to b）30 min linear
Flow rate；1mL/min（linear velocity：136 cm/h）
Detection；UV（280 nm）
Sample；Monoclonal IgG1（Anti human IgE）in mouse
ascites fluid（diluted four times）
Injection；100 μL

900

Peak height（mV）

TOYOPEARL Butyl-650M

300

200

Phenyl Sepharose
6FF（low sub）
Phenyl Sepharose
6FF（high sub）

100

Butyl Sepharose 4FF
Octyl Sepharose 4FF050

100Retention time（min）

Fig.６ Separation of standard proteins.
Conditions：Column Size；7.5 mmI.D.*75 mm
Eluent；a）0.1M Phosphate buffer containing 1.8 M
ammonium sulfate（pH 7.0）b）0.1M Phosphate buffer（pH 7.0）
Gradient：a）to b）60min linear
Flow rate；1mL/min（linear velocity：136 cm/h）
Detection；UV（280 nm）
Sample；RNase A（1）,Lysogyme（2）,α−Chymotripsinogen A（3）1 mg/mL
Injection；100 μL

Ether bonded TP700

TOYOPEARL Phenyl-650M0IgG

Albumin800

400600Polyether bonded TP500400

た。本開発担体は既存品Ether-650MとPhenyl-650MのPhenyl bonded TP

300

中間の疎水性を持つことが分かる。

200（２）マウス腹水の分離性能

Butyl bonded TP100

実サンプルに近いと考えられるマウス腹水（中程度00102030405060の疎水性を有するモノクローナル抗体Anti-IgEを含Retention time（min）

む）を用いて様々な疎水クロマトグラフィー担体で分離の比較を行った。Fig.7にその結果を示した。他社

Fig.５

Separation of mouse ascites fluid on some HIC
materials.
Conditions：
Column size；7.5 mmI.D.*75 mm
Eluent；a）0.1 M Phosphate buffer containing 1.8 M
ammonium sulfate（pH 7.0）b）0.1 M Phosphate buffer（pH 7.0）
Gradient；a）to b）30min linear
Flow rate；1mL/min（linear velocity：136 cm/h）
Detection；UV（280 nm）
Sample；Monoclonal IgG1（Anti human IgE）in mouse
ascites fluid（diluted four times）
Injection；100 μL

競合品である疎水基導入アガロース系ゲルではいずれもマウス腹水に含まれるアルブミンのピークがIgGピークと重なっており、夾雑物（アルブミン）と目的物の分離が確認されなかった。これに対し、本開発担体
ではアルブミンとIgGがよく分離していることがわかる。
（３）抗体とアルブミンの分離性能医薬品として製造される抗体は多岐に渡り、様々な疎水性を持つと考えられる。そこで、比較的疎水性の［3］開発担体の基本的性質高い抗体（モノクローナル抗体（Anti-LH IgG））と夾以上の検討から抗体精製に最適化した細孔特性を持雑物とのモデルサンプルを作成し、分離を他社競合品

つベースゲルにポリエーテル基を導入した担体を調製であるPhenyl Sepharose 6FF（high sub）と比較した。

し、基本的性質を調べた。

Fig.８にその結果を示した。他社競合品ではBSAピー（１）標準タンパク質の分離性能

クがかなりブロードとなっており、抗体のピークは確

Fig.6に市販の標準タンパク質3種類の分離例を示し認されなかった。これに対して、本開発担体では２つ（ 24 ）

東ソー研究・技術報告 第47巻（2003）

80

1000

Peak height（mV）

Albumin

TOYOPEARL new resin

800
TOYOPEARL Ether-650M
700
Peak height（mV）

BSA

IgG

900

TOYOPEARL Phenyl-650M

600

2560
TOYOPEARL new resin
40BSA
Phenyl Sepharose
6FF（high sub）

20500

0

TOYOPEARL Butyl-650M

050400200

Phenyl Sepharose 6FF（high sub）

100

Butyl Sepharose 4FF

Fig.８ Separation of IgG and BSA.
Conditions：
Column Size；7.5 mmI.D.*75 mm
Eluent；a）0.1M Phosphate buffer containing 1.8 M
ammonium sulfate（pH 7.0）b）0.1 M Phosphate buffer（pH 7.0）
Gradient：a）to b）60 min linear
Flow rate；1mL/min（linear velocity：136 cm/h）
Detection；UV（280 nm）
Sample；BSA 3 mg/nL, monoclonal IgG1（Anti- LH）
1 mg/mL
Injection；100 μL

0050

100

Retention time（min）

Phenyl Sepharose 6FF（low sub）

300IgG

100

Retention time（min）

Fig.７ Separation of mouse ascites fluid.
Conditions：
Column Size；7.5 mmI.D.*75 mmEluent；a）0.1 M Phosphate Buffer containing 1.8 M
ammonium sulfate（pH 7.0）b）0.1 M Phosphate Buffer（pH 7.0）
Gradient：a）to b）60 min linear
Flow rate；1mL/min（linear velocity：136 cm/h）
Detection；UV（280 nm）
Sample；Monoclonal IgG1（Anti human IgE）in mouse
ascites fluid（diluted four times）
Injection；100 μL

れた。
（５）抗体動的吸着容量
実際の抗体精製での使用を想定し、抗体（モノクローナル抗体、Anti-LH IgG）溶液を連続フィードして動的吸着容量の測定を行った。比較のため、当社既存品であるPhenyl-650M、および他社競合品であるPhenylの良好なピークが確認された。

基導入アガロース系ゲルについても同時に測定を行っ（４）human γ-globulins静的吸着容量た。Fig.9に結果を示した。既存のTOYOPEARL

Table１にhuman γ-globulins静的吸着容量測定結果を示した。競合品のPhenyl Sepharose 6FF（highPhenyl-650Mと比較して本開発担体は高い吸着容量を示した。

sub）で最も高い吸着容量が得られた。また既存品

連続フィード後、洗浄液で未吸着のサンプルを洗いButyl-650Mでも高い吸着容量が得られた。これらの担離選択性に優れた担体の中では良好な吸着容量が得らTable１ Static binding capacity of some HIC resins forhuman γ-globulins
HIC resin

γ-Globulins binding
capacity（mg/mL-gel）

TOYOPEARL new resin
Butyl-650M
Phenyl-650M
Fractogel EMD Phenyl（S）
Phenyl Sepharose 6FF（high sub）
Butyl Sepharose 4FF
Octyl Sepharose 4FF25342617412717Absorbance（280 nm）

体に対し、本開発担体は吸着容量では劣るものの、分0.02
0.018
0.016
0.014
0.012
0.01
0.008
0.006
0.004
0.002
010％Leakage

TOYOPEARL
Phenyl-650M

0TOYOPEARL
new Resin

204060
Supplied IgG（mg/mL-gel）Phenyl-Sepherose
6FF（high sub）

80

Fig.９ Comparison of breakthrough curves.
Conditions：Column size；7.8 mmI.D.*20 cm
Flow rate；2.39 mL/min（linear velocity：300 cm/h）
Detection；UV（280 nm）
Feed；monoclonal IgG1（Anti-LH）1 mg/mL
in 0.1M Phosphate buffer containing 0.8 M
ammonium sulfate（pH 7.0）

Adsorption Buffer；0.1 M phosphate buffer containig
0.8 M ammonium sulfate（pH7.0）（ 25 ）

26

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.47（2003）

Table２ Dynamis binding capacity for monoclonal IgG1（Anti- LH）
HIC Resin

Dynamic binding capacity
Eluted amount（mg/mL-gel, 10％leakage） （mg/mL-gel,）

TOYOPERL New ResinTOYOPERL Phenyl-650M
Phenyl Sepharose 6FF（high sub）

383065392959

Recovery1（％）
10095891

Absorbance（UV 280 nm）

Recovery：（Eluted amount/dynamic binding capacity）×100達成した。また、疎水クロマトグラフィーではサンプ1ルの特性に応じて適切な疎水性を持つ担体を選択する
0.8TOYOPEARL
Phenyl-650M

0.6

TOYOPEARL
new resin

ことが必要であるが、本開発担体は新規リガンドを選

PhenylSepharose 6FF（high sub）択したことで既存品では対応できなかったサンプルに0.4も応用の可能性があると考えられる。本開発担体は

0.2

TOYOPEARL PPG-600Mとして2003年４月に上市した。

00100

200

300 400 500 600
Elution volume（mL）

700

800900

今後、疎水クロマトグラフィーによる抗体精製の分野では、抗体の多様性から様々な選択性を有した担体

Fig.10 Comparison of elution chromatogram.
Conditions：Column Size；7.8 mmI.D.*20 cm
Flow rate；2.39 mL/min（linear velocity：300 cm/h）
Detection；UV（280 nm）
Feed；monoclonal IgG1（Anti-LH）1 mg/mL
in 0.1M Phosphate buffer containing 0.8 M
ammonium sulfate（pH 7.0）
Wash；0.1 M Phosphate buffer containing 1.1 M ammoniumsulfate（pH 7.0）
Elute；0.1 M Phosphate Buffer（pH7.0）
Feed（until 10％leak）⇒Wash（6 min）⇒Elute（Recovered
as shown by arrows）の供給が要求されるものと予想される。これまでに構築した細孔径最適化技術をベースに、新たなリガンド導入技術を検討することで幅広いニーズに対応する担体の開発を継続していく予定である。

参考文献
１）（財）国際医学情報センター機関紙、22(4)、27（2002）
２ ） G.Raspi, M.Spinetti. G.Teri, E.Bramanti,

流した後、溶出液でサンプルを溶出させた。Fig.10、Chromatographia Supplement, 53, 174（2001）

Table 2に結果を示した。本開発担体では最も狭いピ

３）M.P.Smith, M.A.Bulmer, R.Hjorth, N.J.Titchener-ーク幅でサンプルが溶出した。これは不純物との分離

Hooker, J.of Chromatography A, 968, 121（2002）に有効であり、高サンプル濃度での回収、精製時間の４）Y.Hashimoto, K.Shiigi, H.Moriyama, Y.Kato,
ISPPP予稿集, 21, 65（2001）短縮等の利点がある。また、競合品の回収率が89％であるのに対し、本開発担体では100％の回収率が得ら

５）Y.Hashimoto, K.Shiigi,Y.Kato, H.Moriyama,Y.Kato, ISPPP予稿集, 21, 66（2001）

れた。
以上の結果から、本開発担体は抗体の分離精製に対

６）T.Kamichika, Y.Hashimoto, K.Shiigi, E.Sakima,
Y.Mitoma, ISPPP予稿集, 22, 48（2002）

して良好な吸着容量を持ち、かつ回収効率が良く、高７）S.Kuga, J.of Chromatography, 206, 449（1981）

い回収率を持つことがわかる。

８）R.Li, V.Dowd, D.J.Stewart, S.J.Burton, C.R.Lowe,4．ま と めNature Biotechnology, 16, 190（1998）

本検討では、ベースゲル細孔径の最適化と適切なリ

９）R.Hahn, K.Deinhofer, C.Machold, A.Jungbauer,

ガンドを選択することでアルブミン/IgGの優れた分離選択性と良好な抗体吸着容量、高い回収率の両立を（ 26 ）

J.of Chromatography B, 790, 99（2003）

東ソー研究・技術報告 第47巻（2003）

著
氏名 﨑者
間 恵 美

Emi SAKIMA著

者著

氏名 橋 本 佳 巳

者

氏名 三 苫 惠 民

Yoshimi HASHIMOTO

Yasutami MITOMA

入社 平成13年４月１日

入社 昭和62年４月１日

入社 昭和59年４月２日

所属 科学計測事業部

所属 科学計測事業部

所属 科学計測事業部

ゲル製造部

ゲル製造部

ゲル製造部

セパレーションセンター

セパレーションセンター

セパレーションセンター
セパレーションセンター長（ 27 ）27