83●全自動デヒドロエピアンドロステロン−サルフェイト測定試薬の開発
バイオサイエンス事業部 開発部 試薬開発G
バイオサイエンス事業部 企画開発室

堀田
新谷
永田
井上秀樹
晃司
喜彦
益男

DHEA−S誘導体とが、凍結乾燥体として試薬カップに1．はじめに封入されている。試薬カップに含まれるウサギポリク

デヒドロエピアンドロステロン‐サルフェイト

ローナル抗体はDHEA−Sを特異的に認識し、検体中の（DHEA−S、Dehydroepiandrosterone sulfate）は主にDHEA−Sもしくはアルカリ性ホスファターゼ標識副腎皮質から分泌される副腎アンドロゲンである。

DHEA−S誘導体と結合する（図１）。測定は、試薬カ

DHEA−Sはすべての年齢層において、男性が女性よップに抗原を含む検体を分注することにより、凍結乾り高値を示す。男女ともに20歳代で最も高く、その後、燥体が溶解し抗原抗体反応が開始する。37℃、10分間

１）〜３）の反応後、未反応の成分をB/F分離により洗浄除去し、加齢とともに減少していく。

DHEA−Sは各種副腎皮質疾患の診断、特にクッシン酵素基質である4−メチルウンベリフェリルりん酸グ症候群の副腎病変の鑑別診断及び先天性副腎過形成（4MUP）を分注後、経時的に蛍光強度を測定し単位における酵素障害部位の鑑別診断上有用とされてい時間あたりの4−メチルウンベリフェロン（4MU）のる。また女性の多嚢胞性卵巣症候群や多毛症の疾患の生成量を測定する。基質の蛍光強度は固定化された酵場合に高くなることが報告されている。

４）〜８）

素量に依存し、さらにDHEA−S抗原量に反比例する。

現在、国内において販売されている全自動のしたがって、あらかじめ既知濃度のDHEA−Sを含む標

DHEA−S測定用試薬は2キットだけで、測定結果が出準品を用いその蛍光強度とDHEA−S濃度による標準曲るまでの時間はそれぞれ29分と35分程度である。今回、線を作成し、DHEA−S濃度未知の患者検体の蛍光強度

我々はDHEA−S測定試薬の開発を進め、全自動エンザに相当するDHEA−S濃度を標準曲線より算出すること

イムイムノアッセイ装置AIAシリーズを用いた短時間によりDHEA−Sの定量が可能である。測定の際、検体（18分）、高感度かつ特異性の高い測定試薬を構築したのカップへの分注、一定時間下での抗原抗体反応、ので報告する。

B/F分離、基質分注、蛍光強度の測定は全自動エンザ
イムイムノアッセイ装置により自動で行われ、各試薬ともに測定開始から約18分後に結果が得られる。（試2．測定原理と材料

薬の主な仕様を表１に、全自動エンザイムイムノアッ

本試薬の測定原理は1ステップ競合蛍光酵素免疫測定法であり、磁性ビーズに固定化されたウサギポリク

セイ装置AIA−1800を使用したときに得られる検量線の例を図２に示す。
）

ローナル抗体と、アルカリ性ホスファターゼ標識

Free

抗体固定化磁性ビーズ
酵素標識DHEA−S誘導体

Bound

検体（抗原（DHEA−S））
酵素基質（4MUP）

検体分注

B／F分離

（抗原抗体反応）

図１

基質分注
（洗浄）

酵素反応生成物（4MU）（蛍光測定）

DHEA−S測定の免疫複合体模式図

84

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.54（2010）

表１

DHEA−S測定試薬の主な仕様

測定項目
測定原理
反応関与成分

血中デヒドロエピアンドロステロン−サルフェイト
1ステップ競合蛍光酵素免疫測定法
抗DHEA−Sウサギポリクローナル抗体
アルカリ性ホスファターゼ標識DHEA−S誘導体
測定装置
自動エンザイムイムノアッセイ装置（AIA−1200シリーズおよびAIA−600は除く）
免疫反応温度・時間 37℃・10分
酵素反応温度・時間 37℃・5分
測定対象検体血清または血漿（ヘパリン・EDTA）
測定範囲
2.0〜1,000μg／dL
検体量／分注水量10μL／140μL
標準品形状
液状品
標準品濃度
0、5、12、60、300、1200μg／dL（6点）
濃度単位μg／dL

標準品はベースとして、ヒト血清を使用することで、DHEA−Sの3位にあるスルホン酸エステルの加水分解が液状状態でも起こらないようにした。
その結果、他社キットと同様の基本性能を確保し、B／B0＝測定対象の蛍光量／DHEA−Sゼロ濃度の蛍光量×100

短時間、高感度かつ特異性の高い測定試薬を開発することができたので、評価結果を以下に報告する。

4．基本性能評価（1）感度
DHEA−S濃度0濃度の標準品を5重（連続）測定し、得られた蛍光量より最小検出限界を求めた結果、0濃
図２

DHEA−S測定試薬の検量線例

度試料の平均値−2倍標準偏差（SD）を最小検出限界値としたときの濃度は0.135μg/dLであった。DHEA−
S濃度0濃度の標準品および低濃度血清検体をDHEA−S

3．AIA試薬の開発

濃度0濃度の標準品を用い14段階に希釈した試料を5日間 2重 測 定 し 、 得 ら れ た 変 動 係 数 （ coefficient of

DHEA−Sの測定試薬として、固定化用抗体に関してvariation：CV）が10または20％以内の理論値を実効

は、DHEA−Sに対して特異性の高いウサギポリクロー

感度として算出したときの濃度はそれぞれ2.37μg／dL

ナル抗体を選定した。と0.90μg／dLとなり、良好な結果が得られた（図３）。

酵素標識抗原に関しては、DHEA−Sの誘導体から有機合成的手法により、酵素（アルカリ性ホスファター80.0ゼ）に結合させた。

70.060.0

固定化量と酵素標識抗原のDHEA−S誘導体量の使用量50.0等を最適化し、短時間で十分な感度を得られるようにした。

CV％

この固定化用抗体と酵素標識抗原を使用して、抗体

40.0
30.0
20.0

免疫反応液組成について、検体中に含まれる可能性10.0のある異好性抗体（Heterophilic Antibodies）との非0.0特異的反応を抑えるためにブロッキング剤を添加し、CV20％ 0.90μg／dL
CV10％ 2.37μg／dL−1.02.03.0

また、検体中のアルブミンなどの結合蛋白質の影響を緩和するため、結合阻害剤の濃度を最適化した。

4.0

DHEA−S濃度（μg／dL）

図３

実効感度5.06.0東ソー研究・技術報告 第54巻（2010）85（4）共存物質および抗凝固剤の影響（2）再現性
測定内再現性、測定間再現性試験を濃度の異なる3

検体中に含まれる可能性のある各物質を高濃度でプ種のプール血清およびプール血漿（ヘパリン）を用いール血清およびプール血漿（ヘパリン）へ添加し、測て行った。使用した3種（Low、Middle、High）は1定値への影響を確認した。共存物質としてはヘモグロ回の測定分を小分け分注し使用まで凍結保存した。5

ビン、遊離型ビリルビン、抱合型ビリルビン、脂質、重同時測定による測定内再現性試験の結果、各試料のヒト血清アルブミン、アスコルビン酸を、抗凝固剤と測定値のCVは0.6〜3.9％であった。1日2回各2重測定

してはクエン酸、ヘパリン、EDTAを各々表３に記載し、試薬、装置を変えずに20回繰り返して行った測定の濃度まで添加し測定した結果、未添加に対して測定間再現性試験の結果（検量線作成後99日間）、各試料値はいずれも±10％以内であり、これら物質による影の測定値のCVは1.8〜2.9％であった（表２）。

響は添加量上限まで認められないと判断した。

（3）希釈直線性（5）交叉反応性試験

希釈直線性試験を濃度の異なる3種の血清検体およ血中に存在する種々のステロイドとの交叉反応性をびヘパリン血漿検体を用い4重測定にて行った。各々評価するために、血清検体に各ステロイドを表４に示の検体を専用希釈液で5段階の希釈系列を作製し測定す濃度となるように添加して測定した。評価したすべした結果、血清検体、ヘパリン血漿検体ともに原点にてのステロイドで交叉率が1％以下を示したことから、収束する良好な希釈直線性性能を有していることが認

DHEA−Sに対して高い特異性を有していると判断できめられた（図５）
。

た。

表２

測定内および測定間再現性

DHEA−S濃度［μg／dL］
Pooled serum
Pooled heparinized plasma
Low
MiddleHighLowMiddle
High
測定内再現性（n＝5）
mean
SD
CV［％］

51.7
1.0
2.0309.4
4.9
1.6

517.0
19.9
3.9

104.9
0.6
0.6

252.0
3.9
1.6

489.2
12.72.6

測定間再現性（n＝20）
mean
SD
CV［％］

53.6
1.0
1.8

298.7
6.5
2.2

531.6
14.5
2.7

103.3
3.0
2.9

244.8
5.1
2.1

484.2
14.2
2.9（b）ヘパリン血漿検体（a）血清検体
600
血清−A y＝511.0x＋0.3，r＝1.00
血清−B y＝292.1x＋0.2，r＝1.00
血清−C y＝51.2x＋0.7，r＝1.00

500

血漿−A y＝476.2x＋0.3，r＝1.00
血漿−B y＝247.6x−1.9，r＝1.00
血漿−C y＝102.3x−0.3，r＝1.00

500
DHEA−S濃度［μg／dL］

DHEA−S濃度［μg／dL］

600

400300200100400300200100000.00.30.50.81.00.00.3

希釈率

図４

希釈直線性：（a）血清検体、（b）ヘパリン血漿検体

0.5
希釈率

0.81.086

TOSOH Research ＆ Technology Review Vol.54（2010）

共存物質および抗凝固剤影響

プール血清［mg／dL］
ヘモグロビン440
遊離型ビリルビン ［mg／dL］
17
抱合型ビリルビン ［mg／dL］
19
脂質
1,600［mg／dL］
ヒト血清アルブミン ［g／dL］
2
アスコルビン酸 ［mg／dL］
20
クエン酸
20［mg／dL］
ヘパリン
100［U／mL］
EDTA
10［mg／mL］800

プール血漿440
17191,600
2202010010

EテストTOSOHⅡ（DHEA−S）［μg／dL］

表３700

y＝0.952x＋11
r＝0.990
n＝91

600
500
400
300
200
10000

表４200

添加濃度 交叉反応性（μg／dL） （mol％）
DHEA
N.D.
4000
DHEA glucuronide
0.09
5000
Aldosterone
0.04
5000
Androstenedione
0.17
1000
Androsterone
0.03
2000
Androsterone glucuronide
5000
0.10
Androsterone sulfate
5000
0.30
Cortisol
10000
0.03
5a−dihydrotestosterone
5000
0.01
Estradiol5000
N.D.
β−estradiol−3−sulfate−17−glucuronide
5000
N.D.
Estriol
5000
0.02
Estrone5000
N.D.
Estrone−3−sulfate50000.09
19−hydroxyandrostenedione
50000.05
Progesterone
50000.05
Testosterone
20000.18＊N.D.：検出不能

600

800

他社A法［μg／dL］

種々のステロイドとの交叉反応性添加物質（ステロイド）

400

図５

DHEA−S測定試薬と他社キットとの相関性（図５）、他社A法に対して相関係数（r）0.990、回帰係数0.952、y切片11と良好な相関性が認められた。
（8）血清検体と血漿検体の相関性試験
DHEA−Sの定量は他項目と組み合わせて定量することによって、下垂体−副腎皮質−性腺系などの指標として有用と考えられている。そのため血清以外にEDTA血漿、ヘパリン血漿で測定できることが要求されている。
そこで、血漿検体（ヘパリン血漿、EDTA・2Na）へ対応可能であるか検討した。同一人物から同時に採取した血清とヘパリン処理採血から得られた血漿との相関性試験を行った結果（血清（x）、ヘパリン血漿（y））、49例での相関係数（r）0.998、回帰係数0.993、y（6）健常者の濃度分布切片0.8、また、同一人物から同様に採取した血清と健常者275例について、血清中のDHEA−S濃度を測

EDTA・2Na処理採血から得られた血漿との相関性試定した結果を表５に示す。男性が女性より高値を示し、験を行った結果（血清（x）、EDTA・2Na血漿（y））、また男女ともに20歳代で最も高く、その後、加齢とと49例での相関係数（r）0.999、回帰係数1.04、y切片2.1もに減少していくことが確認できた。といずれの結果も良好な相関性が認められた（図６）。
したがって、本DHEA−S測定試薬は血清、血漿のマト（7）他社キットとの相関性リックスの違いによる測定値の差は認められず、いず91例の血清検体を使用し本DHEA−S測定試薬（y）と他社A法（x）で測定し、測定値の比較を行った結果

表５

年齢20〜2930〜3940〜4950〜59n47325428

健常者の濃度分布

男性μg／dL
123〜727106〜44566〜48877〜365n7518138

女性μg／dL
65〜51471〜20834〜303
41〜222れの検体種にも同等な測定値を与える試薬であることが明らかとなった。

5．ま と め今回、DHEA−S測定試薬を開発し、基本性能を確認した。
感度は測定下限値2.37μg／dLでCV＝10％であった。
測定内、測定間再現性は4％以内で、検体の希釈直線性も良好であった。検体中の共存物質や抗凝固剤は測東ソー研究・技術報告 第54巻（2010）

400
y＝0.993x＋0.8
r＝0.998
n＝49300

EDTA・2Na血漿［μg／dL］

ヘパリン血漿［μg／dL］

400872001000

y＝1.04x＋2.1
r＝0.999
n＝49300

200100001002003004000血清［μg／dL］

100200300

血清［μg／dL］

図６

血清検体と血漿検体の相関性定系に影響を及ぼさないことが確認できた。交叉反応５）矢内原巧、HORMONE FRONTIER IN性試験結果から本試薬はDHEA−Sに対する特異性が非GYNECOLOGY、8（2）、35−42（2001）

常に高く、他のステロイドに対する交叉反応をほとんど示さなかった。血清、血漿（ヘパリン，EDTA・2Na）両検体を同等に測定可能なことが確認された。
他社キットとの相関性試験においても他社法と良好な以上から、本DHEA−S測定試薬は、下垂体−副腎皮質−性腺系などの疾患の鑑別診断に使用する際の試薬として有用であることが示された。また近年、
DHEA−Sは年齢によって血中濃度が増減することから、アンチエイジングのマーカーとしても注目を浴びており、今後の有用性が期待される。

辞本開発において臨床的有用性の確認に対してご協力していただいた各先生方に厚く御礼申し上げます。
北海道大学病院検査・輸血部副部長 ：清水力 先生

北海道大学病院検査・輸血部副技師長：渋谷斉 先生

北海道大学病院検査・輸血部

文６）T. Yamaji, et al, J Clin Endocrinol Metab, 59（6）,1164−1168（1984）７）W. Meikle, Endocrinol Metab Clin North Am, 20（2）, 381−400（1991）
８）R. Jeffrey Chang, American Journal of obstetrics

相関性を示した。

7．謝400：椹

わか菜先生

献１）蘆田健二、他、Modern Physician、27（8）、1049−1052（2007−8）２）PD. Kroboth, et al, Clin Pharmocol, 39, 327−348（1999）
３）JE. Nestler, et al, J Steroid Biochem Mol Biol, 40（4−6）, 599−605（1991）
４）橋本浩三、治療、78、1325−1327（1996）

and Gynecology, 191, 713−717（2004）