●抗体医薬品用アフィニティ分析カラム「TSKgel® FcR − IIIA − NPR」の開発
バイオサイエンス事業部

第二開発部

セパレーションＧ

ライフサイエンス研究所 バイオプロセスＧ
ライフサイエンス研究所

田中村中寺尾井出亨
和昭陽介
輝彦た 4）。本稿では、これらの技術を利用して商品化した

1．はじめに抗体医薬品向けアフィニティ分析カラム TSKgel FcR −近年、ガンや自己免疫疾患の治療薬として抗体医

IIIA − NPR の基本的特性と応用例について述べる。

薬品（図 1）が広く利用されており、世界で 11 兆円

なお、本商品は抗体医薬品の品質管理や品質向上にもの市場を形成するとともに、年率 10％以上の高い資するものであり、SDGs が定める国際目標の内、保成長率で拡大している（2017 年度）1）。一方で、分子健の項目（健康・長寿の達成）への貢献が期待できる。

量 15 万の巨大分子である抗体医薬品は様々な修飾反応を経て多様な分子構造をとっていることが判明しており、医薬品の品質管理の観点からリスク因子と考えられるようになっている。特に Fc 領域に付加した糖2）

2．基本原理抗体医薬品でガン等を治療する際には、抗体分子が鎖が薬効に大きく影響することが知られており 、糖ターゲット細胞上の抗原に結合するだけでなく、細胞鎖構造が高度に制御された抗体医薬品が求められてい障害活性を有するエフェクター細胞を引き寄せる力がる。しかしながら、動物細胞培養により生産される抗重要と考えられている。その際にキーとなる反応がエ体医薬品は基本的に多様な糖鎖構造の混合物となる上フェクター細胞上の FcR と抗体の Fc 部分の結合であに、多くの製造工程パラメータが糖鎖構造に影響すり、特にナチュラルキラー細胞（NK 細胞）上の Fcγる 3）。また、多項目の品質分析が必要とされるため、RIIIa が抗体依存性細胞障害活性（ADCC 活性）の発製造や品質管理に高度な技術と時間が必要とされてい現に重要とされている（図 2）5）。そして、Fc 部分にる。

結合した糖鎖の構造が本結合性に影響し、薬効にも影

この様な背景の下、当社では抗体医薬品の活性に関わるキー分子である Fc レセプター（FcR）に着目し、響を与えることが近年の数多くの報告によって明らかとなっている 6），7）。

クロマトグラフィー用リガンドとして実用化するためこの様な作用機序を基に、新規な抗体医薬品分析手に安定化分子の創生や生産技術の構築を推進してき法として FcR を利用したアフィニティクロマト法を開発した。すなわち、FcγRIIIa を担体の表面に固定したクロマトゲル（図 3）を調製してカラムに充填し、抗体分子を親和性の違いによって分離することで、抗体医薬品の活性に基づいた成分分析が可能となる。

Fab領域

糖鎖

糖鎖

通常、抗体医薬品の糖鎖構造や活性分析には、煩雑

NK 細胞

抗体

ガン細胞

Fc領域
：N-アセチルグルコサミン：ガラクトース：マンノース
：フコース
：シアル酸

図１

抗体医薬品の構造

FcγRIIIa

図２

抗体医薬品の作用（ADCC 活性）模式図77

TOSOH Research & Technology Review Vol.63（2019）

た、Fc 融合タンパク質の分析も可能である。
［2］標準的分離条件
多くの抗体は中性付近（pH 6.0 ～ 7.5）で FcγRIIIa
クロマトグラフィー用担体

図３リガンドに吸着し、酸性条件下（pH 4.0 ～ 5.0）で溶

FcγRIIIaリガンド出するため、TSKgel FcR − IIIA − NPR による抗体の分

FcγRIIIa 固定化ゲルの構造

離には、通常、pH の異なる 2 液による pH グラジェ
ント溶出法を用いる。

な前処理、高価な分析装置や高度な技能が必要とされ溶離液として種々の緩衝液が使用できるが、上記

るが、TSKgel FcR − IIIA − NPR を用いたアフィニティの pH 範囲で幅広い緩衝能を有するクエン酸緩衝液がクロマトグラフィー分析法は迅速性、簡便性、コスト好適である。一般的な CHO 細胞で作製したヒト IgG1など、多くの部分で優位性がある。

抗体を分析する場合、吸着用溶離液（溶離液 A）として 50 mM クエン酸緩衝液（pH 6.5）、溶出用溶離液（溶離液 B）として 50 mM クエン酸緩衝液（pH 4.5）が3．基本的性質適している。また、それぞれの溶離液に無機塩を添加してイオン強度を向上させることで、非特異的な吸着［1］充塡剤の性質
TSKgel FcR − IIIA − NPR は、非多孔性の親水性ポリの抑制が可能である。

マー基材に、遺伝子組換えヒト FcγRIIIa の細胞外領

図 4 に同一の抗体を FcR アフィニティクロマト、域をリガンドとして導入した充塡剤を PEEK 製カラム

サイズ排除クロマト（SEC）および陽イオン交換クロに充塡した HPLC 用カラムである。FcγRIIIa リガンマトによりそれぞれ分析したクロマトグラムを示す。

ドは、天然型のアミノ酸配列に対して複数のアミノ酸一般的にサイズ排除クロマトは凝集体やフラグメント置換を施して物理化学的安定性を向上させた分子を設の分析に、イオン交換クロマトはチャージバリアント計後、遺伝子組換え大腸菌により製造した。本カラムの分析に汎用されているが、FcR アフィニティクロマの仕様を表 1 に示す。HPLC 装置に関しては各社より

トは従来の手法とは全く異なる分析が可能である。

販売されている 2 液グラジェントが可能なシステムでまた、本カラムは抗体を選択的に吸着・分離するこあれば使用できるが、本分析はカラム温度が保持力にとが可能であるため、不純物を多量に含む抗体溶液影響するため、カラムオーブンによる温調下（指定温（例えば、CHO 細胞の培養上清など）を直接分析でき度：15℃～ 25℃）で測定する。

る（図 5）。この様な分析を行う場合には非特異的な

FcγRIIIa リガンドはヒト抗体の Fc 領域に特異的に吸着を抑制するために 150 mM 程度の NaCl を溶離液吸着するため、抗体医薬品として一般的なヒト抗体、に添加するとともに、不純物を素通りさせる十分な洗ヒト化抗体およびキメラ抗体の分析に使用できる。ま浄時間を設ける必要がある。図 5 に示す通り、不純物

表１品番0023513

基充塡剤カラム

使用条件

材

非多孔性親水性ポリマー

平均粒子径5μm

リ ガ ン ド改変型ヒト FcγRIIIa（大腸菌生産）

サズ

4.6 mm I.D. × 7.5 cm

質PEEKイ材

出 荷 溶 媒

0.025％ ProClin 300＋0.65 mM クエン酸＋9.35
mM クエン酸三ナトリウム（pH6.5）

p H 範 囲pH4.0～pH8.0（短期）、pH5.0～pH7.0（長期）温度

15℃～25℃

適 正 流 速1.0 mL/min

最大圧力損失9.0 MPa

保管条件

78

TSKgel FcR-IIIA-NPR の仕様

出荷溶媒に置換し、冷蔵（2℃～8℃）

第 63 巻（2019）（B）サイズ排除クロマト（C）陽イオン交換クロマト

12603010502584020642UV 280 nm（A）FcR アフィニティクロマト

UV 280 nm

UV 280 nm

東ソー研究・技術報告30201015105000－2－10－505101520051015051015

Retention time [min]Retention time [min]Retention time [min]カラム：TSKgel FcR-IIIA-NPR
溶離液 A：50 mM クエン酸緩衝液（pH6.5）
溶離液 B：50 mM クエン酸緩衝液（pH4.5）
グラジェント：B0％（0-2 min）
B0→100％（2-20 min）
流 速：1.0 mL/min
検 出：UV 280 nm
温 度：25℃
試 料：ヒト化モノクローナル抗体，10μg

カラム：TSKgel G3000SWXL
溶離液：100 mM リン酸緩衝液＋100 mMNa2SO4（pH6.7）
流 速：1.0 mL/min
検 出：UV 280 nm
温 度：室温試 料：ヒト化モノクローナル抗体，10μg

カラム：TSKgel CM-STAT（4.6 mm I.D.×10 cm）
溶離液 A：20 mMMES 緩衝液（pH6.0）
溶離液 B：20 mMMES 緩衝液＋0.5 M
NaCl（pH4.5）
グラジェント：B10％→30％（0-15 min）
流 速：1.0 mL/min
検 出：UV 280 nm
温 度：25℃
試 料：ヒト化モノクローナル抗体，10μg

図４FcR アフィニティクロマトと一般的なクロマト分析法の比較かった。これらの試験結果より、200 回以上の使用耐久性を確認できた。
また、長期保存安定性試験に関しては、所定の保存UV 280 nm

抗体含有細胞培養液

緩衝液でカラム内を置換後、保管温度 10℃条件下で実施した。評価項目として FcγRIIIa リガンドの結合活性を示す抗体保持力検査を行い、経時変化を追跡し精製抗体
分析 1 回目
1020
Retention time [min]カラム：TSKgel FcR-IIIA-NPR
溶離液 A：50 mM クエン酸緩衝液＋0.15 M NaCl（pH6.5）
溶離液 B：50 mM クエン酸緩衝液＋0.15 M NaCl（pH4.5）
グラジェント：B0％（0-7 min），B0→100％（7-25 min）
流 速：1.0 mL/min
検 出：UV 280 nm
温 度：20℃
試 料：抗体含有細胞培養液，精製抗体

図５

分析 20 回目

30

分析 40 回目
分析 60 回目
UV 280 nm

0分析 80 回目
分析 100 回目
分析 120 回目
分析 140 回目
分析 160 回目

細胞培養液中の抗体分析

分析 180 回目
分析 200 回目を含んでいても分離度を低下させることなく抗体の分析が可能であった。
［3］耐久性と保存安定性
TSKgel FcR − IIIA − NPR の耐久性を評価するため、モノクローナル抗体を含む CHO 細胞培養上清を試料として 200 回の連続分析試験を実施した（図 6）。分析 20 回毎にクロマトグラムを抽出し解析を行った結果、抗体保持時間や分離度に顕著な変化は観察されな

01020Retention time [min]30カラム：TSKgel FcR-IIIA-NPR
溶離液 A：50 mM クエン酸緩衝液＋0.15 M NaCl（pH6.5）
溶離液 B：50 mM クエン酸緩衝液＋0.15 M NaCl（pH4.0）
グラジェント：B0％（0-7 min），B0→100％（7-25 min）
B100％（25-30 min），B0％（30-35 min）
流 速：1.0 mL/min
検 出：UV 280 nm
温 度：20℃
試 料：抗体含有細胞培養液

図６

TSKgel FcR-IIIA-NPR の使用耐久性

79

TOSOH Research & Technology Review Vol.63（2019）た（図 7）。その結果、12 ヵ月以上経過しても抗体結ターンの僅かな違いを検出した（図 10）。この結果は合活性が保持されていることを確認した。

市販の抗体医薬品にも糖鎖構造や活性にバラつきがあることを示唆しており、本カラムは抗体医薬品の品質管理に使用できるものと考えられる。

［4］製造再現性
製造プロセスの再現性を評価するため、量産スケー
ルにて 3 ロットの FcγRIIIa 固定化ゲル試作を行い、そ れ ぞ れ カ ラ ム に 充 填 し て TSKgel FcR − IIIA − NPR［2］抗体糖鎖構造と保持力の相関
CHO 細胞で調製したモノクローナル抗体分析時にを作製した。つづいて、機能を比較するためにヒト
IgG1 を分析し、得られたクロマトグラムを解析した（図 8）。その結果、各ロットともに同様のピーク分離度と保持時間を示し、優れた製造再現性を確認した。
UV 280 nm

Lot.A

4．応用例

Lot.B

［1］抗体の分析例
TSKgel FcR − IIIA − NPR を用いて様々な抗体を分析

Lot.Cした（図 9）。CHO 細胞にて調製した標準的なモノクローナル抗体では多くの場合 3 つのメインピークを与05えるが、サンプルによってピーク面積比が大きく異なることがわかる。また、フコース付加型と脱フコース

1015
Retention time [min]20

カラム：TSKgel FcR-IIIA-NPR
溶離液 A：50 mM クエン酸緩衝液（pH6.5）
溶離液 B：50 mM クエン酸緩衝液（pH4.5）
グラジェント：B0％（0-2 min），B0→100％（2-20 min）
流 速：1.0 mL/min
検 出：UV 280 nm
温 度：25℃
試 料：ヒト IgG1（シグマ－アルドリッチ社製），10μg型のハーセプチン・バイオシミラーの分析例を見ると、脱フコース型の方が長保持時間となる傾向が観察された。一般的に、脱フコース型糖鎖を有する抗体は強い
ADCC 活性を有していることが報告されており 8），9）、

図８

本知見と一致する分析結果が得られた。

量産試作品 3 ロットのクロマトグラム比較

続いて、市販されている抗体医薬品を 2 ロット入手して FcR アフィニティ分析を行ったところ、分離パ

100
市販抗体医薬品 A80

モノクローナル抗体 2
ハーセプチンバイオシミラー（フコース付加型）

60
Lot.A
40

Lot.B

ハーセプチンバイオシミラー（脱フコース型）

20024681012

保管期間［月］〈抗体保持力検査法〉
カラム：TSKgel FcR-IIIA-NPR
溶離液：50 mM クエン酸緩衝液（pH5.1）
流 速：0.3 mL/min
検 出：UV 280 nm
温 度：25℃
試 料：ヒトガンマグロブリン，20μg※第 3 ピークの保持時間を比較

図７

長期保存安定性

1440200051015
Retention time [min]20カラム：TSKgel FcR-IIIA-NPR
溶離液 A：50 mM クエン酸緩衝液（pH6.5）
溶離液 B：50 mM クエン酸緩衝液（pH4.5）
グラジェント：B0％（0-2 min），B0→100％（2-20 min）
流 速：1.0 mL/min
検 出：UV 280 nm
温 度：25℃
試 料：ヒト IgG1（シグマ－アルドリッチ社製），10μg

図９抗体の分析例

25B％（破線）

60

Lot.C

8080

モノクローナル抗体 1

100
UV 280 nm

抗体保持時間維持率［％］120東ソー研究・技術報告

表２
糖鎖構造

第 63 巻（2019）

抗体医薬品の糖鎖構造と保持力の相関

略号

保持力G0F

糖鎖構造略号

保持力低い

Man5低い

G1F高い

SG2F高いG1F

低いS2G2F高いG2F高い（α1，6）（α1，3）：N- アセチルグルコサミン：ガラクトース：フコース：シアル酸

いて分離していることを確認した。特に糖鎖末端に付12加したガラクトースの有無が親和性に大きく影響して

10

面積比
Lot.A
Peak 1: 42%
Peak 2: 36%
Peak 3: 22%

8
UV 280 nm：マンノース

64いることが明らかとなった。また、TSKgel FcR − IIIA− NPR への保持力と ADCC 活性の相関に関しては、高保持力画分ほど高活性であることを確認している 10），11）。

Lot.B
Peak 1: 36%
Peak 2: 39%
Peak 3: 25%

20

5．おわりに－20510
15Retention time [min]20

カラム：TSKgel FcR-IIIA-NPR
溶離液 A：50 mM クエン酸緩衝液（pH6.5）
溶離液 B：50 mM クエン酸緩衝液（pH4.5）
グラジェント：B0％（0-2 min），B0→100％（2-20 min）
流 速：1.0 mL/min
検 出：UV 280 nm
温 度：25℃
試 料：抗体医薬品 A，10μg

図 10

市販抗体医薬品 2 ロットの比較

本稿では、抗体医薬品向け新規アフィニティ分析
カラムである TSKgel FcR − IIIA − NPR の基本性能と応用例について報告した。従来、抗体医薬品の糖鎖構造解析や活性解析には高価な装置や煩雑な作業が必要であったが、本カラムを用いた新規分析法は、非常に簡便かつ短時間で再現性の良い結果を得ることができる。また、本カラムは抗体医薬品の品質管理用途だけでなく、生産用細胞株のスクリーニングや細胞培養液組成の最適化、培養工程の工程解析などにも利用可能

現れる 3 つのピークについて成分解析を行うため、大型の FcγRIIIa カラムを試作して抗体成分の分離を行い、それぞれ 80％以上の純度で単離した。得られた抗体の糖鎖を N −グリカナーゼで切り出した後、ピリジルアミノ化により蛍光標識し、逆相 HPLC により糖鎖構造を分析した。得られた結果を解析したところ、G0F 型糖鎖などを含む抗体は低保持力画分に多く溶出していた一方で、G2F 型糖鎖などを含む抗体は高保持力画分に多く含まれていることが判明した。解析結果を表 2 に示す。この結果より、TSKgel FcR − IIIA− NPR が抗体の糖鎖の違いを認識し、その構造に基づと考えられ、抗体医薬品生産の高度化の一助となることを期待したい。
なお、本研究開発の一部は、経済産業省の「平成25 年度個別化医療に向けた次世代医薬品創出基盤技術開発（国際基準に適合した次世代抗体医薬等製造技術）」及び「平成 26 年度次世代医療・診断実現のための創薬基盤技術開発事業（国際基準に適合した次世代抗体医薬等製造技術）」、及び国立研究開発法人日本医療研究開発機構（AMED）の「次世代医療・診断実現のための創薬基盤技術開発事業」の課題番号（JP17ae0101003）の支援によって行われた。

81

TOSOH Research & Technology Review Vol.63（2019）

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