大量培養用温度応答性細胞培養基材の開発
慈
今
平
根
陳
伊

道
富
床
津
孫
藤

裕 美 子＊ 1
伸
哉＊ 1
聖
也＊ 1
友
祐＊ 1
詩
蒙＊ 2
博
之＊ 1

Temperature-Responsive Cell Cultureware for Mass Culture

Yumiko JIDO
Shinya IMATOMI
Shoya HIRATOKO
Yusuke NEZU
Shimou CHINSON
Hiroyuki ITOH

Cellular medicines, which are a type of biologics manufactured using cells, are pharmaceuticals that administer
cells themselves to patients for treatment. The market size of cellular medicines is expected to expand because
it is effective for diseases that have been difficult to treat. On the other hand, the current cellular medicines are
manufactured on a small scale, so the cost is high, and the quality of cells deteriorates due to the use of proteolytic
enzymes during cell recovery process. Therefore, the technique that can culture high-quality cells at low cost isnecessary.
We have developed a temperature-responsive cell cultureware which is coated with a unique temperatureresponsive polymer consisting of three components, a hydrophilic block, a hydrophobic block, and a temperatureresponsive block. Since the developed cell cultureware has excellent temperature responsiveness due to the effectof the hydrophilic block, the cell recovery rate was 98%, which was 1.5 times that of the conventional temperatureresponsive cultureware. It was confirmed that the cultured cells could be efficiently recovered. In addition, since thetemperature-responsive cell cultureware can recover cells only by cooling treatment, it does not require complicatedoperations as compared with the method using proteolytic enzymes, and the proteins on the cell surface are notdecomposed. Human mesenchymal stem cells cultured using developed cell cultureware had more than twice theexpression level of CD29, a protein involved in cell adhesion, compared to enzyme-treated cells. Furthermore, thetissue factor activity involved in thrombus formation during administration to patients was suppressed to about
30%, and it is confirmed that the deterioration of cell quality could be suppressed. Moreover, since our uniquetemperature-responsive block copolymer can be coated regardless of the material and shape, it can be expected tobe applied to a large cell cultureware for mass culture.
As mentioned above, the developed temperature-responsive cell cultureware can contribute to reduction of the
manufacturing cost and improvement of the cell quality for cellular medicines.
＊1＊2

ライフサイエンス研究所
ライフサイエンス研究所

バイオマテリアルグループ
バイオプロセスグループ

41

TOSOH Research & Technology Review Vol.65（2021）

1．背景

応答 性 細 胞 培 養 基 材 を 用 い た 冷 却 処 理 法 が 挙 げ られる 4）。温度応答性細胞培養基材とは、スピンコート

再生医療は、機能障害や機能不全に陥った生体組織法やグラフト法 5） により基材表面に温度応答性ポリや臓器に対して細胞を用いて機能を再生する医療を指マーを固定化して作製され、温度変化に伴う基材表面し、従来は治療が困難であった疾患に対する新たな医の温度応答性ポリマーの親水性と疎水性の変化を利用療として注目を集めている 1）。世界各地で再生医療にして細胞接着性を制御可能な基材を指す。細胞は、適使用する再生医療等製品の開発が進められており、そ度な疎水性を示す基材に接着して増殖しやすく、親の世界市場は 2020 年の約 1500 億円から、2030 年に水性を示す基材には接着しにくい性質を持つ。従っは約 3.4 兆円にまで急速に拡大すると予測されていて、細胞を培養する温度である 37℃では疎水性を示

2）

る 。再生医療等製品は培養軟骨や培養皮膚のようなし、20℃以下に冷却すると親水性を示す温度応答性

細胞加工製品と、細胞そのものを患者に投与する細胞

細胞培養基材を用いることで、冷却処理するだけで医薬品に大別される。患者への移植手術が必要な細胞培養した細胞の剥離が可能である。従来の温度応答加工製品と比較して、患者に投与するだけで治療が可性細胞培養基材として、温度応答性成分のみを基材

能な細胞医薬品は市場が急速に拡大すると予想されてに固定化したものが市販されているが、温度応答性

3）

いる 。しかし、現在の細胞医薬品は小規模製造が中が不十分であることから細胞の剥離が緩やかに起こ心であるため製造コストが高く、結果として治療費がり、操作に時間を要する点および細胞の回収率が低

約 1500 万円／回と高額となっている。また、培養細い点が課題であった。そこで我々は、親水性を有す

胞の回収工程でタンパク質分解酵素を使用しているたる 2 − methoxyethyl acrylate（MEA）、疎水性を有する

め、細胞表面のタンパク質が分解されて細胞の品質が

n − butyl acrylate（BA）、32℃付近に下限臨界溶液温低下する点も課題であり、将来の市場規模の拡大に対度（LCST：Lower Critical Solution Temperature） を応した細胞の大量培養技術や、治療費の削減および品有する N − isopropylacrylamide（IPAAm）の 3 成分か質向上を目的とした、高品質な細胞を大量に低コストらなる温度応答性ブロック共重合体を独自開発し、細で培養できる技術が求められている。

胞培養基材にコーティングすることで従来品を上回る

生 体 内 で は、 血 球 系 細 胞 以 外 の 細 胞 の 多 く は コ

高い細胞回収率を有する温度応答性細胞培養基材を開ラーゲンなどの細胞外マトリックス（ECM：Extra

発した。本稿では、温度応答性ブロック共重合体の設Cellular Matrices）を自ら産生し、ECM に接着した状計、温度応答性細胞培養基材の物性、および細胞医薬態で増殖する。細胞医薬品の原料となる細胞は生体外品の原料細胞の一種であるヒト骨髄由来間葉系幹細で増殖させる必要があり、その場合は ECM に対して胞（hbMSC：human bone marrow mesenchymal stem

接着性を有するポリスチレン（PS）製シャーレなど

cell）を用いた開発品の細胞培養性能について報告すの細胞培養基材を使用して培養する。培養して増殖しる。

た細胞は、トリプシンなどのタンパク質分解酵素で処

なお本開発品は、細胞医薬品の治療費が高額なため、理することにより、ECM を分解して培養基材から剥難治性疾患の治療が広範囲に普及しないといった社会

離させて回収し、回収した細胞を再び新しい細胞培養課題に対し、簡便な操作で高品質な細胞を高効率に生基材へ移し、培養して増殖させる操作（継代操作）を産できる技術を提供することで、細胞医薬品の製造コ

繰り返すことで、患者への投与に必要な細胞数を確保

スト低減と高品質化に貢献することを目指す。

する。酵素処理による細胞剥離は一般的に用いられる方法であるものの、細胞表面のタンパク質なども同時に分解してしまうため細胞に与えるダメージが大きく、結果として細胞医薬品の品質が低下する可能性が

2．方法［1］温度応答性ブロック共重合体の合成高い。また、傷ついた細胞を細胞医薬品の原料として

温度応答性ブロック共重合体は、リビングラジカル

用いることで、患者に投与した際に血栓を引き起こす重合の一種である可逆的付加−開裂連鎖移動重合法 6）懸念も指摘されている。さらに、酵素を除くためには（RAFT：Reversible Addition − Fragmentation Chain

細胞を洗浄する操作や遠心分離などを行う必要がある

Transfer Polymerization） を 用 い た。RAFT 重 合 法 はため、大量の細胞を得る方法としては操作が煩雑であ目的の分子量で分子量分布の狭いポリマーを得られる

り、工程数が多いという点が課題である。

手法であるため再現性に優れ、品質の安定した温度応

酵素処理を用いない細胞の剥離方法として、温度
42

答性ブロック共重合体を得られることから選択した。

東ソー研究・技術報告第 65 巻（2021）

RAFT 剤 と し て cyanomethyl dodecyl trithiocarbonate

表面に気泡を接触させる三態系法により測定した。

（CMDT、Sigma − Aldrich 製、723029）、開始剤として
2,2’− azobis(isobutyronytrile)（AIBN、 富 士 フ イ ル ム［3］細胞培養

和光純薬製、019 − 04932）を用いて、tert − butanol（富hbMSC（Lonza 製、PT − 2501）を直径 60 mm のシャー

士フイルム和光純薬製、028 − 03386）中で反応を行っ

レ 1 枚 に 対 し 1.0 × 105 cells 播 種 し、37 ℃、CO2 濃

た。polyMEA ブロックを形成した後、polyBA ブロッ

度 5％の条件下で培養した。培養液にはウシ胎児血ク、polyIPAAm ブロックの順に形成し、温度応答性

清（BioWest 製、S1810）を 10 vol％含むダルベッコ・

ブロック共重合体 poly（MEA − b − BA − b − IPAAm）をフォークト変法イーグル最小必須培地（10 vol％ FBS

1

合成した（Fig. １）。ブロック共重合体の組成は H −／ DMEM）を用いた。培養終了後の細胞数と細胞生存

NMR（日本電子製、
JNM − ECZ400S ／ L1）により解析し、率は、
自動セルカウンター（Thermo Fisher Scientific 製、

分子量および分子量分布は GPC（東ソー製、HLC −Countess® Ⅱ）を用いて測定した。

8320GPC）により解析した。
［4］細胞回収［2］温度応答性細胞培養基材の作製（1）冷却処理上記［1］で合成した温度応答性ブロック共重合体をhbMSC の培養終了後、培養液を除去し、新たに 4℃

2 − butanol（関東化学製、04461 − 05）に溶解して、固に冷却した培養液を加え、室温で 10 分間冷却した。

形分濃度が 0.28 wt％である温度応答性細胞培養基材

10 分後、数回のピペッティングを行い、剥離した細胞作製用ポリマーコート剤を調製した。調製したポリを回収した。また、冷却処理による細胞回収率は以下

マーコート剤を、市販の直径 60 mm 組織培養用 PS 製の計算式により算出した。
細胞回収率［％］＝（［冷却処理による回収細胞数］

シャーレ（AGC テクノグラス製、3010 − 060）に 100／［全細胞数］）× 100µL 滴下し、3000 rpm で 60 秒間スピンコートすること
で温度応答性細胞培養基材（TSA − 111）を作製した。

ここで、［冷却処理による回収細胞数］は上述の操ポリマーコート膜厚は顕微分光膜厚計（大塚電子製、作により回収した細胞数であり、［全細胞数］は、冷OPTM − A1）により測定し、温度応答性の挙動は接触却処理による回収細胞数と、培養基材に残存する細胞

角計（協和界面科学製、DMs − 401）により測定した。

を後述する酵素処理により回収した細胞数を足し合わ

接触角は、細胞培養環境に近い条件で評価するために、せた数である。

温度を調節した水中に測定対象の基材を設置し、その

O

O

O

NH

x
O

CMDT, AIBNin tert－butanol

O

O

RAFT polymerization
62℃, 24 hOOBA, AIBN
in tert－butanol

IPAAm, AIBNin tert－butanol

RAFT polymerization
62℃, 48 h

RAFT polymerization
62℃, 48 h

polyMEA

MEA

x
O

O

block

O

y
O

block

O

z

O

NH

O

poly(MEA－b－BA－b－IPAAm)

Fig.１

Synthesis of temperature－responsive block copolymer, poly(MEA－b－BA－b－IPAAm)

43

TOSOH Research & Technology Review Vol.65（2021）

AK09F）を用いて、脂肪を赤色に染色した。

（2）酵素処理hbMSC の培養終了後、培養液を除去し、リン酸緩（2）骨芽細胞衝生理食塩水（PBS（− ）：phosphate − buffered saline、

冷却処理もしくは酵素処理により回収した hbMSC

富 士 フ イ ル ム 和 光 純 薬 製、166 − 23555） で 洗 浄 しを、フィブロネクチンをコートした組織培養用 24 ウェ

た。0.25 ％ ト リ プ シ ン − EDTA 溶 液（Thermo Fisher

ルプレート（Corning 製、3526）に 3.0 × 104 cells 播

Scientific 製、25200056）を加え 37℃で 5 分間静置した種 し、 間 葉 系 幹 細 胞 骨 芽 細 胞 分 化 培 地（PromoCell

後、新たに培養液を加えてピペッティングを行い剥離製、C − 28013）を用いて骨芽細胞に分化誘導培養しした細胞を回収した。回収した細胞を含む液を遠心分た。分化誘導終了後、− 20℃のメタノールを加え、4℃

離し上清を除去した後、細胞を培養液に懸濁させて回で 20 分間固定し石灰化染色キット（コスモバイオ製、収した。

AK21F）を用いて、カルシウム沈着をアリザリンレッ
ド S で赤色に染色した。

［5］表面マーカータンパク質測定（3）軟骨細胞冷却処理もしくは酵素処理により回収した hbMSC

冷却処理もしくは酵素処理により回収した hbMSCの性質を調べるために、細胞表面のマーカータンパ

を 超 低 接 着 表 面 96 ウ ェ ル プ レ ー ト（Corning 製、®

ク質をフローサイトメーター（Luminex 製、Guava

4515）に 1.0 × 105 cells 播種し、間葉系幹細胞軟骨細easyCyteTM）を用いて測定した。細胞の接着性に関

胞分化培地（PromoCell 製、C − 28012）を用いて軟骨与するタンパク質である CD29 タンパク質の測定に細胞に分化誘導培養した。分化誘導終了後、得られたは Anti − Integrin β1 Antibody, clone 12G10（Merck

細胞凝集塊を 4％パラホルムアルデヒド／ PBS（− ）で製、MAB2247 − I）を用いた。また、ヒト間葉系幹細固定し、アルシアンブルー染色し、染色陽性の軟骨組胞（hMSC：human mesenchymal stem cell） の 陽 性織の直径を測定した。

マーカータンパク質である CD90 抗原、CD105 抗原、
CD73 抗 原 の 測 定 に は、 そ れ ぞ れ FITC Mouse Anti［7］適用細胞種の拡大検討− Human CD90（BD 製、561969）、PE Mouse anti −（1）歯髄幹細胞

Human CD105（BD 製、560839）、APC Mouse anti −ヒ ト 歯 髄 幹 細 胞（DPSC：dental pulp stem cell、
Lonza 製、PT − 5025）を直径 60 mm のシャーレ 1 枚

Human CD73（BD 製、560847）を用いた。
冷却処理もしくは酵素処理により回収した hbMSC

に対し 1.0 × 105 cells 播種し、37℃、CO2 濃度 5％のの 血 栓 生 成 能 を 評 価 す る た め に、 組 織 因 子（TF：

条件下で培養した。培養液には DPSC SingleQuots™

Tissue Factor） 活 性 を 測 定 し た。 具 体 的 に は、 回

添 加 因 子 セ ッ ト（Lonza 製、PT − 4516） を 添 加 し た

収した hbMSC から抽出したタンパク質溶液を調製

DPSC 基本培地（Lonza 製、PT − 3927）を用いた。

し、Pierce™ BCA Protein Assay Kit（Thermo Fisher（2）脂肪由来幹細胞

Scientific 製、23225）でタンパク質濃度を測定した後、ヒト脂肪由来幹細胞（ADSC：adipose derived stem

Human Tissue Factor（TF）Chromogenic AssaySense

cell、Lonza 製、PT − 5006） を 直 径 60 mm の シ ャ ーActivity Assay Kit（AssayPro 製、CT1002b） を 用 い て

レ 1 枚 に 対 し 1.0 × 105 cells 播 種 し、37 ℃、CO2

タンパク質 1 µg 当たりの TF 活性を測定した。

濃 度 5 ％ の 条 件 下 で 培 養 し た。 培 養 液 に は ADSC −SingleQuots™ 添加因子セット（Lonza 製、PT − 4503）［6］分化誘導培養を添加した ADSC 基本培地（Lonza 製、PT − 3273）を（1）脂肪細胞用いた。

冷却処理もしくは酵素処理により回収した hbMSCを、フィブロネクチンをコートした組織培養用 24 ウェ
4（3）iPS 細胞
ヒ ト 人 工 多 能 性 幹 細 胞（hiPSC：human induced

ルプレート（Corning 製、3526）に 3.0 × 10 cells 播

pluripotent stem cell）の 201B7 株を iMatrix − 511（ニッ

種し、間葉系幹細胞脂肪細胞分化培地 2（PromoCell

ピ製、892011）をコートした直径 60 mm のシャーレ

製、C − 28016）を用いて脂肪細胞に分化誘導培養し1 枚に対し 1.0 × 105 cells 播種し、37℃、CO2 濃度 5％た。分化誘導終了後、10％中性緩衝ホルマリン液で細の条件下で培養した。培養液には StemFit® AK02N（味胞を固定しリピットアッセイキット（コスモバイオ製、の素ヘルシーサプライ製）を用いた。

44

東ソー研究・技術報告第 65 巻（2021）

150

Contact angle［degree］

3．結果と考察［1］温度応答性ブロック共重合体の合成
1H − NMR により MEA ／ BA ／ IPAAm の存在を確認し、また GPC チャートは単峰性を示したことから、生成物が MEA、BA、IPAAm の 3 成分からなる温度応答性
ブロック共重合体であることを確認した。生成物の組成比は MEA ／ BA ／ IPAAm ＝ 5 ／ 30 ／ 65［mol％］
、数平

145
40℃

135
130
125
120

均分子量は 11 万、分子量分布は 1.5 であった。

TSA－111

Conventional
TR－dish

合成した温度応答性ブロック共重合体に含まれる polyMEA ブ ロ ッ ク は、 わ ず か に 存 在 す る こ と で

15℃

140

Fig.２

polyIPAAm の相転移を促進する役割を持つ。相転移

PS cultureware

Contact angle dependence on temperature（TR－dish：temperature－responsive dish）を促進することで冷却処理の時間を短縮することができ、作業時間の短縮のみならず細胞へのダメージを最シャーレと比較して顕著な接触角変化を示した。以上

小限に抑えることが可能である。polyBA ブロックはより、polyMEA ブロックを導入した優位性を確認した。

基材へのコート性を付与し、基材との疎水性相互作
用によりポリマーの溶出を防ぐ役割を持つ。そして、［3］細胞増殖性と細胞生存率
我 々 が 開 発 し た 温 度 応 答 性 細 胞 培 養 基 材（TSA −polyIPAAm ブロックは 32℃付近で相転移し、細胞の7）脱着を制御する役割を持つ 。高温では polyIPAAm ブ

111）を用いて培養した hbMSC の増殖性と細胞生存

ロックが脱水和することで疎水性を示し、低温では水率を、温度応答性ブロック共重合体をコートしていな

和することで親水性に変化する。

い未コート PS 製シャーレと比較した。それぞれの細胞培養基材に hbMSC を播種後、96 時間まで 24 時間
毎の細胞数と、168 時間後の細胞数および細胞生存率［2］温度応答性細胞培養基材の物性
スピンコート法を用いて PS 製シャーレに温度応答の測定結果を Fig. ３に示す。播種後 168 時間までの増性ブロック共重合体をコーティングした温度応答性細殖性は未コート PS 製シャーレと同等であった。また、

胞培養基材（TSA − 111）の膜厚を測定した結果、約 10

168 時間後の細胞生存率は温度応答性細胞培養基材、nm のポリマー膜が形成されていることがわかった。

未コート PS 製シャーレにおいていずれも 95％であり、また、接触角計を用いて温度変化による表面の親水性

未コート PS 製シャーレと同等の細胞生存率であった。

と疎水性の変化を測定した結果、Fig. ２に示すように

以上より、温度応答性ブロック共重合体をコートした

40℃では疎水性を示し、15℃では親水性へと変化する

場合に細胞増殖性と細胞生存率に影響を与えないことことを確認した。さらに開発品は、従来の温度応答性を確認した。

9.0

Cell counts［×105 cells］

Cell viability rate

TSA－1118.0

95%

PS cultureware

7.0

95%

6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
0.0
0

24

48

72

96

168

Culture times［h］

Fig.３

Cell proliferation and cell viability rate of hbMSC cultured bytemperature-responsive cultureware or PS cultureware

45

TOSOH Research & Technology Review Vol.65（2021）

将来の細胞医薬品製造においては、作業の標準化、［4］細胞回収
冷却処理と酵素処理による細胞回収工程の比較を

低コスト化、汚染防止の観点から自動化に移行するとFig. ４に示す。冷却処理では、（1）培地除去、（2）冷却予測され、既に自動培養装置が開発されている 8）。開培地添加、（3）細胞回収の 3 工程で細胞が回収可能で発した温度応答性細胞培養基材は操作が簡便な冷却処あるが、酵素処理では 8 工程が必要である。

理で細胞回収できる点と、機械的操作に対応可能な優開発品（TSA − 111）を用いて hbMSC を培養した後、増殖した hbMSC は冷却処理により剥離して回収した。

れた冷却剥離性を発現できる点から、自動培養装置への用途展開も可能であると考えられる。

Fig. ５に示すように、4℃に冷却した培養液を添加して 10 分間静置すると hbMSC が基材から剥離する様子［5］表面マーカータンパク質測定が観察できた。その後、数回のピペッティングにより開発品（TSA − 111）を用いて培養し、冷却処理に

hbMSC は基材から容易に剥離し、回収が可能であっより回収した hbMSC と、未コート PS 製シャーレをた。また、開発品と従来の温度応答性シャーレを用い用いて培養し、酵素処理により回収した hbMSC につて同様の冷却処理により hbMSC を回収した結果、従いて、CD29 タンパク質の発現量を比較した。なお、来品の細胞回収率は 65％であったのに対して開発品は

CD29 タンパク質は細胞− 基材間の接着性に関与する

98％であり、従来品に比べて高効率に hbMSC を回収

インテグリンの内、インテグリンα1 〜α8 とαV サ

できることが判明した。さらに、データは示さないが、ブユニットと結合する抗原タンパク質である。Fig. ６

前述したピペッティング以外の方法として、振盪機をに示すように、冷却処理により回収した hbMSC の利用した機械的操作でも、高効率に hbMSC が回収でCD29 タンパク質の発現量は酵素処理により回収した

きることも確認済みである。

hbMSC の 2 倍以上であり、細胞へのダメージが低減

Cell culture

Passage

Cell recovery

Cooling treatment(1) Medium
removal(2) Cooled medium (3) Cell
additionrecoveryEnzyme treatment

Fig.４(1) Medium removal(2) PBS wash
(3) PBS removal(4) Enzyme addition(5) Keep 37℃ few minutes(6) Centrifugation(7) Enzyme removal(8) Cell recovery

(1)

(5)

(2)

(3)

(4)

(6)

(7)

(8)

Cell recovery process of cooling treatment and enzyme treatment

Cooling for 10 min

Before cooling

After pipetting

TSA－111

Recovery rate: 98％

Conventional
TR－dish200µm

Recovery rate: 65％

200µm

Fig.５

46

200µm

200µm

200µm

Images of cell recovery by cooling treatment（TR－dish : temperature－responsive dish）

200µm

東ソー研究・技術報告第 65 巻（2021）

されていることが明らかになった。酵素処理では細胞等であり、hMSC としての性質が維持されていること− 基材間の接着に関与するタンパク質を分解して細胞が明らかになった。

を剥離し回収するのに対し、冷却処理では基材表面のさ ら に、 開 発 品 か ら 冷 却 処 理 に よ り 回 収 し た

親水性と疎水性の変化によって細胞を剥離するため、

hbMSC の TF 活性について、未コート PS 製シャーレ

細胞表面のタンパク質を保持したまま細胞が回収されから酵素処理により回収した hbMSC と比較した。TF

た結果、CD29 タンパク質の発現量が高くなったと考は血液凝固カスケードの開始因子であり、TF 活性のえられる。CD29 タンパク質を保持していることで、高い細胞は血管内に投与後血栓を形成するリスクが高

継代操作時に速やかに細胞が培養基材に接着するた

くなることから、細胞医薬品に用いる細胞は低 TF 活

め、温度応答性細胞培養基材で継代操作を続けた場合性であることが好ましい。Fig. ８に示すように、冷却は、通常の酵素処理で継代した場合と比較して細胞増処理により回収した hbMSC の TF 活性は酵素処理に殖性が向上し、より多くの細胞を得ることができる。

より回収した hbMSC の 1 ／ 3 程度に抑えられているこ

ま た、hbMSC の 性 質 が 維 持 さ れ て い る こ と をとが判明し、細胞医薬品としての品質が向上している

hMSC の陽性マーカータンパク質測定によって評価しことが明らかとなった。

た。国際細胞治療学会では hMSC を定義するための基準として、CD90 抗原、CD105 抗原、CD73 抗原が陽［6］分化誘導培養性であることを提案している 9）。Fig. ７に示すように、

ヒト間葉系幹細胞は、骨、血管、脂肪、筋肉、心筋、開発品から冷却処理により回収した hbMSC は、CD90

軟骨などの細胞に分化する能力を持つことから、開発

抗 原（Thy − 1）
、CD105 抗 原（Endoglin）、CD73 抗 原品（TSA − 111）から冷却処理により回収した hbMSC（5’− nucleotidase）の陽性率がいずれも未コート PS 製を各種分化誘導培地中で培養し、脂肪細胞（Adipocyte）、

シャーレで培養し、酵素処理により回収した場合と同骨芽細胞（Osteoblast）、軟骨細胞（Chondrocyte）への分化能を評価した。Fig. ９に分化能評価結果を示す。
未コート PS 製シャーレから酵素処理により回収した

Expression rate of CD29

2.5

hbMSC と分化能を比較したところ、脂肪細胞、骨芽2.0細胞においてはいずれの方法で回収した hbMSC も目

1.5的の細胞へと分化することを確認した。一方、軟骨細胞においては冷却剥離により回収した hbMSC の方が1.0

大きな軟骨細胞を形成することが判明した。従って、0.5

hbMSC を軟骨細胞に分化誘導する場合は、酵素処理で回収するよりも冷却処理で回収する方が優れること

0.0
Cooling treatmentが明らかとなった。

Expression rate of CD29 of hbMSC recovered bycooling treatment or enzyme treatment

CD90
100
Positive rate［％］Fig.６

Enzyme treatment

Cooling
treatment

CD105
Enzymetreatment

Cooling
treatment

CD73

Enzymetreatment

Cooling
treatment

Enzymetreatment

95
90
85
80
75
70

2

6

8 10 2Fig.７

6

8 10 26

8 10 2 6
Passage

8 10 26

8 10 26

8 10

CD90, CD105, and CD73 positive rate of hbMSC
recovered by cooling treatment or enzyme treatment

47

TOSOH Research & Technology Review Vol.65（2021）

回収も可能であることを確認した。さらに、ヒト間葉

TF activity［pM/μg protein］

6.0

系幹細胞以外の再生医療に用いられる細胞種としてヒ5.0

ト iPS 細胞への適用を検討した結果、開発品を用いた増殖と冷却処理による細胞の剥離回収が可能であるこ4.0とを確認した。各細胞の、未コート PS 製シャーレに3.0対する増殖性および細胞回収率を Table １に示す。
Table １に記載の幹細胞の他に、研究用途等で多用2.0

される細胞についても開発品の適用可能性を検討した

1.0
0.0

Fig.８

結果、Table ２に示す細胞について増殖と冷却処理に
Cooling treatment

よる細胞の剥離回収が可能であることを確認しておEnzyme treatment

り、開発品は幅広い種類の接着細胞の培養に利用可能

TF activity of hbMSC recovered by cooling treatment
or enzyme treatment

であることが示された。
Table１［7］適用細胞種の拡大
ヒト間葉系幹細胞は骨髄以外に、比較的入手が容易

Cell proliferation and recovery rate bycooling treatment of various stem cells

Cell

Proliferation rate［/PS cultureware］

Recovery rate［％］

ト脂肪由来幹細胞（ADSC）として採取可能である。

DPSC

0.7

100

これらのヒト間葉系幹細胞も hbMSC と同様に開発品

ADSC

1.1

77

hiPSC

0.9

98

な歯髄や脂肪組織からヒト歯髄幹細胞（DPSC）やヒ（TSA − 111）で増殖可能であり、冷却処理による剥離

Cooling treatment

200μm

200μm

200μm

200μm

Fig.９

(c) Chondrocyte

Volume : 2.78 mm3Volume : 0.97 mm3Images of differentiated cells (a) adipocyte, (b) osteoblast,(c) chondrocyte

Table２Type
human stem cells

human somatic cells
human cancer cells
other animal－derived cells

48(b) Osteoblast

Enzyme treatment(a) Adipocyte

Applicable cells of TSA－111
Cell
bmMSC（bone marrow mesenchymal stem cell）
DPSC（dental pulp stem cell）
ADSC（adipose derived stem cell）
iPSC（induced pluripotent stem cell）
TIG－3（human normal diploid fibroblast）
HEK293（human embryonic kidney cell）
HepG2（human hepatoma cell）
PC9（human lung cancer cell）
A549（human lung adenocarcinoma cell）
3T3（mouse fibroblast）
CHO（chinese hamster ovary cell）

東ソー研究・技術報告第 65 巻（2021）

5．まとめ
以上のように、親水性ブロック、疎水性ブロック、
温度応答性ブロックの 3 成分からなる独自の温度応答性ブロック共重合体を既存の細胞培養基材にコーティングした温度応答性細胞培養基材を開発した。温度応答性ブロック共重合体への親水性ブロック導入により、開発品は温度応答性に優れるため、従来の温度応
答性細胞培養基材よりも高効率で細胞を回収できた。
また、一般的な酵素処理と比較して、冷却処理では細胞の回収に必要な工程数が削減できた。開発品から冷却処理により回収した細胞は、細胞表面のタンパク質が分解されずに基材から剥離するため低ダメージである点や、血栓を引き起こす要因となる TF 活性を低く抑えられる点において優位であった。
本開発品は温度応答性ブロック共重合体を細胞培養基材にコーティングして得られることから、本稿で紹介したシャーレ以外の多様な基材への適用も期待できる。例えば、ポリエチレン製フィルムなどにコーティ
ングすることで、大型の細胞培養バッグの製造が可能であり、また、PS 製微粒子などにコーティングする
ことで、大型リアクターでの培養が可能な細胞培養マ
イクロキャリアの製造が可能である。細胞医薬品の製造において、我々が開発した温度応答性ブロック共重合体を大型の細胞培養基材に展開することで、細胞医薬品の原料となる細胞の製造の効率化、低コスト化への寄与が期待される。

引用文献
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場の最新動向と将来性 2019（2019）４） 秋 山 義 勝、 岡 野 光 夫、 高 分 子 論 文 集、75（2）、174（2018）
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６）John Chiefari, et al., Macromolecules , 31（16）,5559（1998）
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