Growth inhibitory effect of an injectablehyaluronic acid-tyramine hydrogels incorporating
human natural interferon-α and sorafenib on
renal cell carcinoma cells
腎細胞癌細胞における天然型IFN-α含有ヒアルロン酸-チラミンハイドロゲルとsorafenibを用いた増殖抑制効果について植田浩介

【Background】

 IFN-aを含む免疫療法は転移性腎細胞癌の治療に用いられているが,奏効率は15-20％程度と言われている。
 しかし、肺転移のみの症例、特に日本人においては有効であることも示されており、分子標的時代においても治療オプションの一つとなっている。

 IFNは不安定で血中半減期は3～8時間と短く、24時間後には検出感度以下となるため、頻回の注射を必要とする。そのため、患者のQOLやコンプライアンスの低下を引き起こしやすい。また、IFN血中濃度の上昇・下降を繰り返すため発熱・悪寒・頭痛・倦怠感などの副作用をきたしやすい。

 現在、本邦で腎癌治療においては天然型(natural type)IFN-aである
Sumiferonのみが承認されている。
 遺伝子組換え型(recombinant)IFNはPEG化は可能であるが、天然型IFNのPEG化は困難と言われている。

Hyaluronic acid-Tyramine (HA-Tyr) hydrogelFig. 1A

Hyaluronic acid-tyramine(HA-Tyr) hydrogel ハイドロゲルは触媒としてホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)および過酸化水素水(H2O2)の存在下で、フェノール含有ポリマーから、例えばHA-Tyr結合体から形成される。
 ゲル化速度はHRPの濃度により調節され、メッシュサイズ(架橋密度・硬度)はH2O2の濃度を変化させることにより調節することができる。

これらの濃度を調節することによりハイドロゲルからの薬物放出速度・率を調節することができる。

Half-life of OIF alone in plasma injected to humans
subcutaneously vs HA-Tyr-OIF hydrogels in plasma of nude mice ：5.7 hours vs 18.6 hours
Medical-supplies interview form, Otsuka Pharma Co. Ltd.
Yano H, et al. unpublished data
3500

Concentration of OIFin Plasma（IU/mL）

3000
2500

2000

Concentration of OIF in plasma of nude mice treatedwith the mixture solution of HA-Tyr conjugate, HRP,
H2O2 (0.5%) and OIF (1.0×106 IU/mL).

1500
1000
500
00 6 12 24

487296 120 144

Time （h）

 以前のOIFを用いた検討ではHA-Tyr hydrogelを用いることで約3倍の血中半減期の延長を認めた。

Treatment with the HA-Tyr-soft-IFN hydrogel reduced the tumor size
more than IFN-α2a alone on a HCC cell line.
Keming, X. et al. J Control Rel. 166: 203-210, 2013.

 H2O2 の濃度を変化させた2種類の硬度のHA-Tyr hydrogelを用いた検討では、 437μMのH2O2 を使用した
soft hydrogelにおいて腫瘍へ到達するIFN濃度も高く、より強い抗腫瘍効果を呈することが示された。

Anti-tumor effect of Sorafenib (Nexavar®)Phase II trial showing thecombination of Sorafenib puls IFNa2b has substantial activity inpatients with metastatic renal cell
carcinoma
Gollob, GA, et al. J Clin Oncol 25: 2007.

Mechanism of SynergisticAntitumor Effect of Sorafenib andInterferon-α on Treatment ofRenal cell carcinoma
Takeuchi, A, et al. J Urol 184: 2010.

Multi-kinase inhibitor これまでの様々な検討においてIFN-aとsorafenibの併用効果が示されている。

【Aims】

 腎細胞癌細胞における天然型IFN-α (Sumiferon)含有
HA-Tyr hydrogelsの抗腫瘍効果につき検討する。

 さらに、天然型IFN-α (Sumiferon)含有HA-Tyrhydrogelsとsorafenibの併用による効果につき検討する。

Experimental design to examine anticancer effects of
IFN-α-incorporated HA-Tyr hydrogels on human RCC cells
in vivo
RCC cell line
(ACHN): 5 X 106 cells

Nude mice(n=8/ Group)
Subcutaneousinjection

Group A: Control
Group B: HA-Tyr hydrogels (0.3%H2O2) alone
Group C: s.c.IFN-α (4,000 IU x twice a week) alone
Group D: IFN-α (4,000 IU x twice a week)-incorporated HA-Tyr hydrogels
Day 1Day 4

Day 8

Day 11

Day 15
Sacrifice？
IFN-α (Sumiferon®)Anticancer effect of IFN-α-incorporated HA-Tyr hydrogels
on tumor xenografted in nude mice.

Fig. 3: Time-course changes in estimatedtumor volumes of subcutaneously xenografted
human renal cell carcinoma tumors treatedwith IFN-α-incorporated HA-Tyr hydrogels innude mice. Tumor regression study of ACHN
inoculated BALB/c nude mice treated with saline(control), HA-Tyr hydrogels alone, IFN-α alone
or IFN-α-incorporated HA-Tyr hydrogels (n=8,mean ± SD of the mean).

 HA-Tyr hydrogel単独では抗腫瘍効果は認められなかった。
 IFN-α含有HA-Tyr hydrogels群においては最も高い抗腫瘍効果が示された。

Experimental design to examine anticancer effects ofIFN-α-incorporated HA-Tyr hydrogels + sorafenib on human
RCC cells in vivo
RCC cell line
(ACHN): 5 X 106 cells

Nude mice(n=8/ Group)
Subcutaneousinjection

Group A: Control
Group B: s.c.IFN-α (4,000 IU x twice a week) alone
Group C: sorafenib (200µg/day × everyday) alone
Group D: s.c.IFN-α (4,000 IU x twice a week) + sorafenib (200µg/day × everyday)
Group E: IFN-α (4,000 IU x twice a week)-incorporated HA-Tyr hydrogels +sorafenib (200µg/day × everyday)

Day 1

Day 4

IFN-α (Sumiferon®)

Day 8

Day 11

Sorafenib

Day 15
Sacrifice？

Anticancer effect of IFNα-incorporated HA-Tyr hydrogels+ sorafenib on tumor xenografted in nude mice.

Fig. 4A: Time-course changes in estimatedtumor volumes of subcutaneously xenografted
human renal cell carcinoma tumors treatedwith IFN-α-incorporated HA-Tyr hydrogels +sorafenib in nude mice. Tumor regression
study of ACHN inoculated BALB/c nude micetreated with saline (control), IFN-α alone,sorafenib alone, IFN-α + sorafenib, or IFN-αincorporated HA-Tyr hydrogels + sorafenib (n=8,mean ± standard error of the mean).

 IFN-α含有HA-Tyr hydrogels + sorafenib群において最も高い抗腫瘍効果を認めた。
* しかし、sorafeniba単独群、IFN-a + sorafenib群とIFN-α含有HA-Tyr hydrogels + sorafenib群においては有意な差は見られなかった。

The ratio of apoptotic cells and Ki-67 positive cells in human RCC
tumors subcutaneously transplanted in nude mice.
The ratio of apoptotic cells in nude mice

The ratio of Ki-67 positive cells in nude mice.

TUNELKi67

Fig. 6: The ratio ofapoptotic cells and Ki-67
positive cells in human RCC
tumorssubcutaneouslytransplanted in nude mice.
The number of apoptotic
cells and Ki-67 positive cells
was counted 5 random fields(x200) in a blinded manner.
Each bar represents the“apoptosis index” and “Ki-67
labeling index”, expressed asmean ± SD.

 IFN-α含有HA-Tyr hydrogels + sorafenib群においては、他の群と比較し、アポトーシスを起こした細胞が多くみられ、Ki67陽性を呈する細胞が減少していた。

 これらの結果はIFN-α含有HA-Tyr hydrogels + sorafenib群は最も強くアポトーシスを誘導し、増殖を抑制していることを示している。

The ratio of the microvessel number in human RCC tumors
subcutaneously transplanted in nude mice.
The microvessel number in nude mice

CD31Fig. 7: Microvessel number in human RCC
tumors subcutaneously transplanted in nude
mice. Microvessel numbers of tumor sections
were counted at high power field (x200). The
microvessel number was apparently small innumber in the tumors of mice treated withIFN-α-incorporated
HA-Tyrhydrogels+sorafenib. Each bar represents the average
microvessel number for each group, expressed
as mean ± SD.

 IFN-α含有HA-Tyr hydrogels + sorafenib群において最も強く、血管新生が抑制されていた。

【 Summary 】

 IFN-α含有HA-Tyr hydrogels + sorafenib群はヒト腎細胞癌細胞株移植マウスにおいて、最も高い抗腫瘍効果を認めた。
 IFN-α含有HA-Tyr hydrogels + sorafenibはアポトーシスを誘導し、血管新生を抑制することで腫瘍の増殖を抑制していると考えられる。

【 Conclusion 】
 Our results suggest a possibility that HA-Tyr hydrogel
drug delivery system prolongs the biological half-life ofnatural human IFN-α and enhances its anticancer
effects on human RCC cells.

HA-Tyr hydrogel drug delivery systemは、天然型IFN-αの生物学的半減期を延長させ、腎細胞癌における抗腫瘍効果を増強させる可能性がある。