2.5 次元培養用パターニングプレートの開発
今久門牧泉
野田田豪
純
健裕＊ 1士＊ 1
平＊ 1
一＊ 1

Development of Patterning Plates for 2.5-dimensional Culture.

Yu IMAIZUMI
Goshi KUNO
Junpei KADOTA

Kenichi MAKITA

We focused on a "2.5-dimensional culture," which combines the advantages of an adhesive culture (2-dimensional)
and a floating culture (3-dimensional), and developed a patterning plate for a 2.5-dimensional culture. We found alarge number of cell masses were easily formed with good size uniformity on this patterning plate. We cultured iPScells on this plate in an adherent state, with 279 ± 23 µm diameter and approximately 24,000 pieces on a plate. With
keeping an adherent state, we succeeded to differentiate the cell masses into nerve cells, cardiomyocytes according
to the each protocols.
We expect this newly-developed plate will have great value in practical use for regenerative medicine and drug
screening, due to the uniformity in the size of masses, the ease of handling, and the stability of efficiency in thedifferentiation induction.のモデル組織としての応用が期待されている。これま1． はじめに

でに、再生医療では 2018 年に iPS 細胞由来ドパミン

我々は、再生医療や創薬スクリーニング等への iPS産生神経細胞を移植する医師主導治験が開始され細胞応用を後押しするために、従来培養法における課た 1）。また、創薬スクリーニングでは 2019 年に筋萎題の解決を目指し、当社独自のパターニングプレート

縮性側索硬化症（ALS）を対象に iPS 細胞由来神経細を開発した。

胞で有効性を示す化合物を見出し、人への治験が開始
される 2）等、iPS 細胞の応用が急速に進展している。
今後、これらの iPS 細胞を用いた再生医療、創薬ス2．背景

クリーニングを実用化するためには、iPS 細胞由来分iPS 細胞や ES 細胞などの多能性幹細胞は、様々な化細胞を高品質かつ大量に作製する技術が重要になる組織や臓器の細胞に分化する能力を持つことから、再と考える。また、現状では、再生医療で用いられる生医療における移植細胞の原料や創薬スクリーニング

iPS 細胞由来分化細胞は細胞培養加工施設（CPC）内＊1

ファンクショナルポリマー研究所環境バイオグループ

で人の手作業によって作製しているが、作業者の手技による細胞品質のばらつきや、人件費等の費用の面が39

TOSOH Research & Technology Review Vol.66（2022）

これらの方法では胚様体が浮遊しているため、培地交換や培養容器を運搬する際に慎重な取り扱いが必要であり、操作が煩雑なことも課題である。
そこで我々は、培養プレートの底面に細胞接着領域と細胞非接着領域を設けることによって、簡便な操作で均一なサイズの胚様体を大量に形成可能な当社独自のパターニングプレート（以後、開発品）を開発した。この開発品で形成する胚様体は接着した状態で立体的な構造になり、本開発品での培養法を平面培養の

縦 × 横［mm］約 85× 約 130

2 次元培養と浮遊培養の 3 次元培養の特徴を併せ持つ

6well プレート

図１

ことから 2.5 次元培養と呼ぶ。本稿では、細胞接着領開発品の外観域と細胞非接着領域を有するパターニングプレートの設計、iPS 細胞を対象とした 2.5 次元培養、および 2.5普及のハードルになると考える。これらの課題解決を次元培養による分化誘導評価について報告する。

目指した自動培養装置の開発も進歩しており、今後はなお本開発品は、再生医療や創薬スクリーニングの自動培養装置への組み込みを考慮した iPS 細胞由来分

現場で iPS 細胞を産業応用する上での課題に対して、化細胞の作製方法の開発も重要になる 3）。

簡便な操作で iPS 細胞由来分化細胞を高品質かつ大量iPS 細胞を分化誘導する方法の１つとして、iPS 細胞を凝集させて胚様体（embryoid body；EB）というに作製できる技術を提供することで、iPS 細胞の産業応用への貢献を目指す。

疑似的な胚を形成させた後、低分子化合物やタンパク質を添加した培地内で培養し、神経細胞や心筋細胞を作製する方法が報告されている 4）、5）。
従来の胚様体形成方法を図２に示す。培養容器とし

3．実験方法［1］開発品の設計て容器底面が U 字の形状になった U 字ボトムプレー

開発品の細胞接着領域を観察するため、iMatrix −トを用いた場合、U 字型のウェルの中で 1 つ 1 つ細胞511（ニッピ製、892011）に対して、タンパク質標識キッが凝集するため、１つのウェルに１つの胚様体を形成

ト（同仁化学研究所製、LK14）を使用して、蛍光色する。比較的球形でサイズ均一性が高い胚様体が形成

素でラベリングした iMatrix − 511 を作製した。蛍光ラされるものの、1 ウェルあたり 1 つの胚様体の形成でベリングした iMatrix − 511 を PBS（−）（富士フィルムあるため、胚様体の数に制限があり、大量形成には不和光純薬製、166 − 23555）で希釈し、0.3 µg ／ cm2 とな向きである。また、胚様体の形成数を多くするため、るように開発品のウェル内に添加した。37℃で 1 時間

細胞低接着シャーレやバイオリアクターで培養する方静置した後、蛍光顕微鏡（キーエンス製、BZ − X810）

法もあるが、1 度の細胞播種で、多くの胚様体を形成で撮像し、細胞接着領域への iMatrix − 511 の吸着を観できるものの、細胞の自己凝集がランダムに生じるた察した。

め胚様体の大きさや形状の均一性に乏しい。さらに、

U 字ボトムプレート

細胞低接着シャーレ

胚様体
ウェルサイズ7.0［mm］

縦 × 横［mm］約 85× 約 130
96well プレート形成する
胚様体サイズ0.3［mm］

図２40

形成する
胚様体サイズ0.3～1［mm］
Φ約 100［mm］

従来の胚様体形成方法

東ソー研究・技術報告第 66 巻（2022）［2］iPS 細胞培養評価

液に StemFit®AK02N、足場材に iMatrix511 を 1.5 µg ／（1）立体構造の形成

cm2 で添加して 1 日間未分化培養した後、分化誘導培開発品に iPS 細胞（201B7 株）を 1.35 × 105 cells 播養を開始した。分化誘導培地成分は文献６を参考にし種し、37℃、CO2 濃度 5％の条件下で 7 日間培養した。

た。培養開始後 5 日目に形成した胚様体をトリプシン®

培養液は StemFit AK02N（味の素ヘルシーサプライ製、処理によってシングルセル状態にし、2.5 次元培養でRCAK02N）、 足 場 材 は iMatrix − 511 を 0.3 µg ／ cm2 では開発品に 1.35 × 105 cells 播種した。一方で、従来培養液に添加して使用した。顕微鏡観察には倒立顕微法の 3 次元培養では細胞低接着シャーレ（住友ベーク鏡（OLYMPUS 製、IX73）を使用し、蛍光画像は蛍光ライト製、MS − 90350）に 2 × 105 cells 播種し、それ顕微鏡（キーエンス 製、BZ − X810）を使用して撮像

ぞれ 19 日目まで培養した。その後、胚様体を再度シした。

ングルセル状にして、ポリ L −オルニチン溶液（富士（2）従来法との比較

フィルム和光純薬製、163 − 27421）および Matrigel®

従来法として、U 字ボトムプレート（住友ベーク（Corning 製、354277） を コ ー ト し た 汎 用 シ ャ ー レ

ラ イ ト 製、MS − 9096U） に iPS 細 胞 を 1 ウ ェ ル あ た（Corning 製、430165） に 1.9 × 106 cells 播 種 し、33

り 200 cells 播種した。開発品は前述と同様の条件で

日 目 ま で 2 次 元 培 養 し た 後、 免 疫 染 色 お よ び RT −細胞を播種し、開発品および U 字ボトムプレートでqPCR を行った。免疫染色については、4％パラホルそれぞれ 5 日間培養した胚様体を免疫染色し、蛍光画ムアルデヒド・りん酸緩衝液（富士フィルム和光純薬

像解析により形成する胚様体の数およびサイズを評製、161 − 20141）で細胞を固定し、運動神経細胞マー価した。iPS 細胞の未分化マーカータンパク質であるカーである HB9 およびβⅢ− tubulin、細胞核を DAPI®

SSEA4 の免疫染色には、AlexaFluor 488 anti − humanで免疫染色した。HB9、βⅢ− tubulin の免疫染色にはSSEA4（Biolegend 製、330412）を使用した。蛍光画

一次抗体に Polyclonal Anti − MNX1 Antibody（ATLAS

像は蛍光顕微鏡（キーエンス製、BZ − X810）を使用

ANTIBODIES 製、HPA071717）、Monoclonal Anti −して撮像した。また、胚様体の数およびサイズは画像

beta − Tubulin Ⅲ（Sigma − Aldrich 製、T8660） を 使 用®

解析ソフト Image − Pro （MEDIA CYBERNETICS 製、し、二次抗体に、Goat anti − Rabbit IgG（H+L）Highly100 − 002）を使用して評価した。

Cross − Adsorbed Secondary Antibody, Alexa FluorTM
488（ThermoFisher 製、A11034）、Goat anti − Mouse［3］未分化性維持評価

IgG (H+L) Cross − Adsorbed Secondary Antibody, Alexa

iPS 細 胞 の 未 分 化 性 を 維 持 す る 一 般 的 な 培 養 法FluorTM 555（ThermoFisher 製、A21422）を使用した。

で あ る 2 次 元 培 養 を す る た め、 ポ リ ス チ レ ン 製 のまた、DAPI の免疫染色には ProLong® Gold Antifade

汎 用 シ ャ ー レ（Corning 製、430165） に iPS 細 胞

Reagent with DAPI（Cell Signaling TECHNOLOGY 製、を 3600 cells 播種した。開発品は前述と同様の条件8961S）を使用した。RT − qPCR については、運動神で細胞を播種し、開発品および汎用シャーレでそれ経細胞マーカーである ISL1 遺伝子を評価した。プ

ぞ れ 7 日 間 培 養 し た。 そ の 後、 そ れ ぞ れ 培 養 し た

ラ イ マ ー は Integrated DNA Technologies 製 を、RT −TM

細 胞 を TrypLE Select Enzyme（ × 1), no phenol redqPCR 装 置 は QuantStudio3（ThermoFisher 製 ） を そ（ThermoFisher 製、12563011）を使用したトリプシン

れぞれ使用した。

処理によってシングルセル状態にし、4％パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液（富士フィルム和光純薬製、（2）心筋細胞分化誘導161−20141）で細胞を固定した。iPS 細胞の未分化性は、iPS 細胞を開発品に 1.35 × 105 cells 播種し、培養

SSEA4 タンパク質が発現する細胞割合をフローサイト

液 は StemFit®AK02N、 足 場 材 は iMatrix511 を 1.5 µgメーター（日本ベクトンデッキンソン製、Accuri C6／ cm2 で培養液に添加して 2 日間未分化培養した。そplus）にて測定した。SSEA4 タンパク質の免疫染色にの 後、 培 養 液 に STEMdiff Ventricular Cardiomyocyte®

は AlexaFluor 488 anti − human SSEA4（Biolegend 製、Differentiation Kit（STEMCELL Technologies 製、ST −330412）を使用した。

05010）を用いてキット推奨の方法に従い、16 日目まで心筋細胞への分化誘導を行った。その後、分化誘導［4］分化誘導した心筋細胞の形態を観察するために胚様体をトリプ（1）運動神経細胞分化誘導

シン処理によってシングルセル状態にして、ポリスチ

iPS 細胞を開発品に 1.35 × 105 cells 播種し、培養レン製の汎用プレート（Corning 製、3526）に播種した。
41

TOSOH Research & Technology Review Vol.66（2022）

胚様体形成方法の課題解決を目指した。

7 日間の 2 次元培養終了後、4％パラホルムアルデヒ
ド・りん酸緩衝液（富士フィルム和光純薬製、161 −まず初めに、図３に示すように培養容器上の細胞が20141）で細胞を固定し、心筋細胞マーカーである心接着する領域を制限し、接着した細胞の増殖を通常の筋トロポニン T（cTnT）を免疫染色した。cTnT の免

水平方向から垂直方向に向けることによって接着した

疫 染 色 に は Cardiac TroponinT Monoclonal Antibody

状態で立体的な胚様体の形成ができないかと仮説を立（13 − 11）（ThermoFisher 製、MA5 − 12960）およびてた。
上記コンセプトを満たす培養容器を実現するため、Goat anti − Mouse IgG（H ＋ L）Cross − Adsorbed
TM

Secondary Antibody，Alexa Fluor 555（ThermoFisher

図４に示すセルカルチャー処理を施した細胞接着領域

製、A21422）を使用した。と細胞非接着ポリマーが被覆された細胞非接着領域を設けたパターニングプレートを開発した。
細胞接着領域および細胞非接着領域が形成されて4．結果と考察

い る こ と を 確 認 す る た め、 蛍 光 ラ ベ ル で 標 識 し た
iMatrix − 511 を用い、タンパク質吸着試験を実施した。

［1］開発品の設計
iPS 細胞はランダムな増殖や自己凝集をするため、図５に示す蛍光画像から、細胞接着領域にのみ蛍光が均一な胚様体を形成するには、胚様体の大きさや形状観察され、細胞非接着領域には吸着が見られないことを制御することが重要であると考えた。また、前述のから、設計通りに細胞接着領域および細胞非接着領域

U 字ボトムプレートでの培養方法は 1 つのウェル毎にの形成ができていることを確認した。

細胞を播種する操作や培地交換時に胚様体を吸引しないための慎重な操作が必要である。これらの煩雑な操［2］iPS 細胞培養評価

作は、細胞塊が浮遊していることに原因があると考え（1）立体構造の形成た。以上のことから、開発品のコンセプトとして、①開発品を用いて、iPS 細胞が接着した状態で立体的胚様体形状を制御する仕組みを取り入れること、②少な構造を形成するか調べた。図６に結果を示す。iPSない培養操作で大量の胚様体を形成可能とすること、細胞の培養は、細胞接着領域にのみに細胞が接着し、③胚様体を接着状態で形成することを設定し、従来の培養 3 日後には細胞が増殖して細胞接着領域を埋め尽

接着領域

増殖
方向

非接着細胞増殖増殖方向

接着領域細胞増殖

増殖
方向

非接着増殖
方向
赤：iMatrix－511

図３

開発品のコンセプトイメージ

パターニングプレート

0.4［mm］

0.4［mm］

細胞接着領域：
約 5500［個／ well］
細胞接着領域：
セルカルチャー処理

Φ0.2［mm］

COOH OH

細胞非接着領域：
細胞非接着ポリマー被覆

図４42

パターニングプレートの設計イメージ

図５

タンパク質吸着試験結果

東ソー研究・技術報告第 66 巻（2022）

くす状態が観察された。培養 7 日目の胚様体の厚みを1 プレートあたり 96 個の胚様体を形成し、サイズは評価したところ 3 つの胚様体平均で 73 µm であり、通279 ± 56 µm であったため、開発品の方が均一な胚様常の iPS 細胞の 2 次元培養ではこのような厚みをもっ体を形成可能であることが判明した。
また、胚様体が接着していることから 2 次元培養とた胚様体は形成されないことから、設計通りに接着状同様に接着面から剥がれることなく、容易に培地交換態で立体構造が形成されることが判明した。

を行うことができた。
以上より、開発品では、簡便な操作でサイズ均一性（2）従来法との比較が高い胚様体を大量に形成できることがわかった。

開発品で形成した胚様体の形成数およびサイズ（胚様体の直径）を U 字ボトムプレートと比較した。胚様体のサイズを画像解析ソフトで評価した結果を図［3］未分化性維持評価

７、表１に示す。開発品では 1 つのウェルあたり、胚iPS 細胞は、一般的に未分化維持培地を使用して 2様体を 4,210 個形成できており、胚様体サイズは 279次元培養することで、未分化性を維持しながら培養± 23 µm であった。一方、U 字ボトムプレートではする。開発品で形成した胚様体が 2 次元培養と同様

〈上面図〉

〈側面図〉

開発品で形成した胚様体の様子

胚様体形成数［個］

図６8006004002000100

図７150200 250300 350
胚様体サイズ［μm］400

開発品で形成した胚様体の様子およびサイズ評価結果

表１

従来の胚様体形成方法との培養結果比較

胚様体サイズ［μm］形成する胚様体数［個／プレート］
培地交換

2.5 次元培養
開発品
6well プレート

3 次元培養U 字ボトムプレート
96well プレート

279±23279±56

約 24,00096

2 次元培養と同様に簡便
全量交換

操作が煩雑
半量ずつ交換43

TOSOH Research & Technology Review Vol.66（2022）

表２（1）運動神経細胞分化誘導

開発品の未分化性維持評価結果

従来法である U 字ボトムプレートで胚様体を形成

SSEA4 を発現する細胞割合
開発品
汎用シャーレ
2.5 次元培養
2 次元培養99％99％

させた 3 次元培養（3D）と比較して 2.5 次元培養（2.5D）による運動神経細胞への分化誘導を免疫染色およびRT − qPCR にて評価した。
分化誘導過程のスキームを図８、評価結果を図９にに未分化性を維持できるか調べた。開発品および汎用示す。免疫染色から運動神経細胞特異的なマーカーでシャーレで iPS 細胞を 7 日間培養した後、SSEA4 タン

ある HB9 および神経マーカーのβⅢ− tubulin 陽性をパク質が発現する細胞割合を比較した。表２に結果を確認した。また、RT − qPCR 結果から運動神経細胞マー示す。開発品において、SSEA4 を発現する細胞割合はカーの ISL1 遺伝子の発現が確認され、発現量が従来99％であり、一般的な 2 次元培養で培養した結果と同の 3 次元培養と同等以上であることも判明した。

等であることが判明した。
以上より、開発品を用いた iPS 細胞の 2.5 次元培養

（2）心筋細胞分化誘導においても未分化性を維持したまま培養できることが分化誘導中の培養過程の様子、および胚様体を分散、わかった。

再播種した細胞に対しての免疫染色結果を図 10 に示す。培養 10 日目から胚様体が一定の間隔で拍動する様子を確認できた。また、シングルセルにして再播種［4］分化誘導
iPS 細胞は外胚葉、中胚葉、内胚葉に分化する能力

した細胞からは心筋マーカーである cTnT の陽性が確を持つ。再生医療や創薬スクリーニングでの応用が期認できたことから、2.5 次元培養における心筋細胞へ待される外胚葉の運動神経細胞および中胚葉の心筋細の分化誘導を確認した。

胞への分化誘導が開発品を用いてできるかを調べた。

未分化培養（day0～day1）

開発品

以上から 2.5 次元培養によって胚様体を形成させた

分化誘導①（day1～day5）

分化誘導②（day5～day19）

胚様体分散
再播種

胚様体分散
再播種

胚様体分散
再播種

2.5D 培養

2.5D 培養

2D 培養

開発品

分化誘導③（day19～day33）

汎用シャーレ（非パターニング）

開発品

胚様体分散
再播種

胚様体分散
再播種

3D 培養

2D 培養
細胞非接着シャーレ

運動神経細胞への分化誘導スキーム

Relative expression level

図８

汎用シャーレ（非パターニング）

2.4

ISL12.01.6
1.20.80.40.03D2.5D

day 33

図９44運動神経細胞への分化誘導結果

東ソー研究・技術報告

未分化培養（day0～day2）

分化誘導（day2～day16）

開発品

開発品

第 66 巻（2022）

胚様体分散
再播種
2D 培養

汎用プレート（非パターニング）

図 10

心筋細胞への分化誘導結果

後、運動神経細胞および心筋細胞への分化誘導ができることを確認した。

引用文献
１）D. Doi et.al., Nat. Commun ., 11, 3369（2020）

5．おわりに

２）K. Imamura et al., Sci Transl Med ., 9, 391（2017）３）（株）北隆館、BIO Clinica、34（13）、45 − 51（2019）

我々は、従来の培養方法における３つの課題（①サ４）K. Watanabe., Nat Neurosci ., （8 3）288 − 296（2005）

イズ均一性、②大量形成数、③操作性）の解決を目指

５）（公社）日本薬理学会、日本薬理学雑誌、141、32 −し、細胞接着領域と細胞非接着領域を設けた当社独自のパターニングプレートを開発した。細胞接着領域が厳密に制御された開発品では、iPS 細胞の培養におい36（2013）６）K. Fujimori., Stem Cell Rep ., 9（5）1675 − 1691
（2017）て水平方向への増殖が制限され垂直方向に増殖させるによって、プレートに接着したまま半球状の胚様体を均一なサイズで形成することができた。任意に細胞接着領域を設けることができるため、１つのプレートで大量の胚様体を形成することも可能である。また、プレートに胚様体が接着しているために培地交換において 3 次元培養の時のような慎重な操作が不要となり、操作性の面からも優れている。さらに、本開発品を使用し iPS 細胞から形成した胚様体は高い未分化維持率を有すること、各種プロトコルに沿って運動神経細胞や心筋細胞等に分化誘導可能であることも見出した。
本開発品を使用することによって、サイズ均一性良く、大量に胚様体を形成でき、その胚様体を分化誘導した場合にロット間での分化誘導効率が安定化し、細胞品質の良好な細胞を確保できる。さらに、培地交換やプレート運搬時の操作を簡便かつ安定化することができるため、本開発品が今後、再生医療や創薬スクリーニングの実用化に向けて大いに貢献できると期待している。

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