公益財団法人 寺岡記念育英会
2019 年度 研究活動費助成事業 研究活動報告書一覧
海外輸入された Ready-to-Eat 食品における薬剤耐性菌を用いた分子疫学解析
岡山大学 医歯薬学総合研究科 臨床感染症 准教授 萩谷英大

・・・ 1

精原細胞ニッチの再構築を用いた新規移植法によるマウス精巣内異種移植の試み
川崎医科大学 解剖学 講師 横西哲広・・・ ４

高転移臓器における前転移 niche の性質の検討
岡山大学 医歯薬学総合研究科 口腔病理学分野 助教 河合穂高

・・・ 10

うつ発症予防を目指した香り分子吸入の研究
川崎医療福祉大学 医療技術学部 臨床検査学科 講師 上野浩司

・・・14

制御性 T 細胞におけるユビキチンリガーゼ RNF146 の役割についての研究
岡山大学大学院 医歯薬学総合研究科 腎・免疫・内分泌代謝内科学 助教 勝山隆行

・・・18

炎症性骨破壊におけるアンジオテンシン II が及ぼす骨細胞における役割の検討
川崎医科大学 リウマチ・膠原病学 大学院生 赤木貴彦
※対象者の所属・職位は、本助成事業への応募当時のものです。

・・・22

海外輸入された Ready-to-Eat 食品における薬剤耐性菌を用いた分子疫学解析

岡山大学大学院医歯薬学総合研究科 瀬戸内（まるがめ）総合診療医学講座
萩谷 英大（研究成果の概要）
本研究では、薬剤耐性菌の国内流入ルートの一つの可能性として海外輸入食品を疑い、特にカルバペネム耐性腸内細菌科細菌（CRE）を対象に特殊スクリーニング培地を用いた調査を実施した。合計 54 の食品サンプルを調査し、スクリーニング培地陽性が 1 サンプルで認められたが、菌種同定・薬剤感受性検査の結果、CRE は検出されなかった。本調査では、海外輸入食品が薬剤耐性菌の国内流入ルートであるという証拠を示すことはできなかったが、サンプル数が少ないことからその可能性を否定できるものではない。国際化が進む中、薬剤耐性菌対策は今後も医療現場内外で考えていく必要があり、今後も調査を継続してその可能性を検討していく必
要がある。

（本文）

よび近郊地域で生活排水を中心とした環境調査を実【研究背景】

施した結果、
220 サンプルのうち 8.4%から NDM 型

薬剤耐性菌（Antimicrobial Resistance, AMR）は主体の CRE が検出されたことを発表した（1）。ま

世界的な規模で医療上および公衆衛生上の脅威となた、ヤンゴンの生鮮市場で売買されている食料品にりつつある。有効な対策が為されない場合、2050 年

おける CPE 検出率を調査したところ、93 サンプルには AMR 関連死亡数は世界中で 1,000 万人以上にから 15 株(16.1%)を検出し、日常的に流通する食材

上ると試算されており、主要先進国首脳会議でもがCPE で汚染されている現状を明らかにした（2）。

AMR 問題が主要議題として取り上げられ、「世界経

私たちの研究により、CRE は患者臨床検体のみな済・移民問題・テロ対策などと並ぶ世界的な課題とらず、東南アジアを中心としたインフラ整備が不十して、AMR 問題について各国が協調して取り組ん

分な地域で、環境水・食肉・野菜などからも広く拡でいく」ことが強調されている。中でも薬剤耐性菌

散しうることが明らかとなった。このことから日常時代における Last-Resort としての位置づけである

生活の中で食事摂取を通して潜在的に CRE を保菌

カルバペネム系抗菌薬に耐性化したカルバペネム耐するリスクが広がっていることが推測される。

性腸内細菌科細菌(CRE, Carbapenem-ResistantEnterobacteriaceae)が、世界中の臨床現場に驚異的なスピードで拡散している。
本研究に先立ち、感染症研究国際展開戦略プログ
ラム（J-GRID）を通して、タイにおける AMR 疫学
調査体制の基盤づくりに従事する傍ら、2015 年 7 月
よりミャンマーの国営研究機関である国立医学研究所(Department of Medical Research)との国際共同研究を立ち上げ、ミャンマー国内における CRE 疫学調査を開始した。これまでに、ヤンゴン都市部お－1－EnteroBase (http://enterobase.warwick.ac.uk/) お

【目的】

よ び

本研究は、
日本国内での食の安全という観点から、

Institute

Pasteur’s

MLST

database

海外由来の小売・ネット通販されている Ready-to-(http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html)

Eat 食品を対象に CRE の保菌状況を調査する目的に照会のうえ判定する。さらに網羅的に薬剤耐性遺で実施した。CRE 用選択培地を用いて食品スクリー

伝子を検出するために、得られたシークエンスデー

ニングを行い、検出された CRE 株に対してゲノムタ解析を行い既存データベースと比較することで、食(https://cge.cbs.dtu.dk//services/ResFinder/) で 解

品由来株の薬剤耐性遺伝子のタイピング・ルーツな析することとした。

をResFinder

database

どを明らかにするとともに、ヒト由来株との相違点③ リスク分類を模索する。

食品ごとの薬剤耐性菌保有リスクを算出するため【方法】に、輸入元や食品の種類などのカテゴリー別に汚染① 食料品の回収率を算出する。
（なお、データ発表にあたっては、個研究対象である Ready-to-Eat 食品は、小売販売・人の業者などが特定されないように配慮する。
）

ネット販売の形で一般流通している海外輸入食料品とする。購入後に火を通して食すものは除外し、野【結果】

菜・果物・加工食品などのうち入手したままの状態

研究期間中に 54 サンプルの海外輸入商品を調査で摂取することを前提とした食品とした。

した。輸入元国はミャンマー34 件、バングラディッ
シュ 1 件、パキスタン 9 件、タイ 4 件、ベトナム 6② 薬剤耐性菌のスクリーニング件であった。図１に調査した食品サンプル写真の一本研究で対象とするのは、カルバペネム耐性腸内部を例として提示する。

細菌科細菌（CRE）および基質拡張型 β ラクタマー

クロモアガーKPC/ESBL 分画培地でスクリーニン

ゼ(ESBL)産生腸内細菌科細菌とする。この両者を同グした結果、CRE を疑うコロニーは 1 サンプル（ミ時スクリーニングするために、メーカー市販のャンマー由来）から得られた。しかし、菌種は感受ESBL・CRE 選択培地を用いる（クロモアガー

性良好な Vibrio 属であり、CRE は検出されなかった

KPC/ESBL 分画培地, 関東化学）。

ことから遺伝子型タイピング・薬剤耐性メカニズムの同定までは実施しなかった。

③菌種・薬剤感受性・タイピング・薬剤耐性メカニ
ズムの同定

図１．調査したサンプル

上記手法により得られた薬剤耐性菌を疑う菌株については、菌種同定（質量分析法： MALDI-TOFMS, Bruker ）、 薬 剤 感 受 性 試 験 （ MicroScan
WalkAway 96 Plus; Beckman Coulter, Brea, CA
およびドライプレート栄研; Eiken Chemical Co.,Tokyo, Japan）、さらに責任遺伝子を同定するためのシークエンス検査を行うこととした。
具体的には、
PowerSoil DNA isolation kit (Qiagen, Valencia, CA,USA)を用いて DNA を抽出した後、MinION シー
ク エ ン サ ー (Nanopore) を 用 い て 解 析 す る 。
Multilocus sequence typing (MLST) の 判 別 は－2－

（ミャンマーからの輸入食品）【結語】
本調査は途中段階だが、現時点においては輸入商品
が ESBL 産生菌／CRE で汚染されているエビデンスは得られなかった。引き続き調査を継続して、正確な実態を把握していきたい。

【文献】
1) Sugawara Y, Akeda Y, Hagiya H, Sakamoto N,
Takeuchi D, Shanmugakani RK, Motooka D,
Nishi I, Zin KN, Aye MM, Myint T, Tomono K,
HamadaS.

Spreading

Patterns

of

NDM-

Producing Enterobacteriaceae in ClinicalandEnvironmental

Settings

inYangon,Myanmar.Antimicrob Agents Chemother. 2019Feb 26;63(3):e01924-18.
2) Sugawara Y, Hagiya H, Akeda Y, Aye MM, Myo
Win

HP,

SakamotoN,

Shanmugakani

RK,

Takeuchi D, Nishi I, Ueda A, Htun MM, Tomono
K,

HamadaS.

Disseminationofcarbapenemase-producing Enterobacteriaceae
harbouring blaNDM or blaIMI in local market
foods of Yangon, Myanmar. Sci Rep. 2019 Oct
8;9(1):14455.

－3－精原細胞ニッチの再構築を用いた新規移植法によるマウス精巣内異種移植の試み（所 属）
川崎医科大学 解剖学
（氏 名）
横西 哲広
申請者は、ベンザルコニウム塩化物によってセルトリ細胞を除去したマウスの精巣に、別個のマウスの精巣細胞を精細管内移植することで、宿主の精巣内にドナー由来の精巣を再構築することに成功した。この研究成果は若年性男性がん患者の妊孕性の温存法への応用が期待されるが、ドナーの細胞の定着効率を改善させる必要がある。本研究では、ベンザルコニウム塩化物の精巣内注入にブスルファンの腹腔投与を加えることで、同種移植の効率を改善できることが示唆された。
背景

性未成熟な精巣組織や精原細胞の分化誘導法として、

米国 NIH の報告によると、2014 年から 2018 年まで

培養法があげられる。精巣の細胞培養による精子産の全人種の男女における、がん患者全体に占める 20

生の試みは、過去多くの報告があるが、機能性を有歳未満の罹患者は、およそ 1.0%と推定されている。

する精子の産生は未だ達成されていない。精巣の組

近年の医療技術の発展によって、これらの治療成績

織培養も一世紀以上前から試みられ、2011 年に小川は向上し、5 年生存率は 85%を超えるほどになった。

らによってマウスの精巣組織の培養が成功した(5)。

このような背景もあり、2019 年 1 月時点での米国のこの方法を用いて、新生仔マウスの精巣組織片をガ

がん治療後の生存者は、およそ人口の 5%を占めるよ

ラス化凍結保存し、解凍後に培養し、機能的な精子うになった。小児期にがん治療を受けた約 3 割の患を得ることができた(6)。
この気層液層境界培養法に者で、性差なく不妊症を発症すると報告されており、

マイクロ流体システムを導入し、培養期間を延長さ

がん完治後の大きな問題となっている。

せることが可能となったことから、精子形成期間の性成熟した男性がん患者の妊孕能の温存法としては長い大型動物にも応用されることが期待された(7)。

精液の凍結保存が確立している。しかし、精子まで

このように、培養系の開発がなされているが、齧歯の分化はおよそ 13〜14 歳と推定されているため、類での精子形成の報告にとどまっており、ヒトへの

これ以前の年齢の患児には精液凍結保存は適応とな応用は困難であることが予想される。

らない。この場合、研究段階であるが、がん治療前

培養法以外の分化誘導法として、精細管内移植法との精巣組織の凍結保存が推奨されている(1)。
実際に、精巣組織移植法があげられる。精細管内移植法は、ASCO（American Society of Clinical Oncology）

精子の幹細胞である精原細胞または精原細胞を含むは、性未成熟ながん患者の場合、臨床医は、生殖腺

精巣細胞懸濁液を、精細管内に逆行性に注入する方

毒性を説明し、生殖腺の組織凍結保存法を提示し、法である(8, 9)。この精細管内移植法はマウスやラ適切な専門医へ紹介することを推奨している(2)。

ットをはじめ、サルにも応用できることが知られて2004 年にホジキン病の治療前に採取し凍結保存しいる(10)。また、凍結保存した検体でも、精細管内た卵巣組織を、治療後に自身に移植して自然分娩が移植法によって精子まで分化することが証明されて成功した報告から(3)、
現在までに凍結卵巣組織を用いる(11)。精巣組織移植とは、精巣組織片を宿主のいた挙児は 140 例を超えている(4)。しかし、凍結保

背部皮下組織または精巣白膜下に移植する方法であ存した未熟な精巣組織の解凍後の分化誘導法が確立

り、齧歯類からサルまで成功している(12)。これら

していないことが問題である。

の移植法は宿主によって、自身の生体に移植する自－4－

家移植と、別の種の体内へ移植する異種移植に分類

トリ細胞除去後のマウスの精巣に、別個のマウスのされる。がん患者の治療前の検体を自家移植するこ

精巣細胞懸濁液を注入したところ、宿主マウスのセとにおいて、最も懸念すべき問題がある。それは、ルトリ細胞だけでなく、生殖細胞や間質に存在する自家移植する組織または細胞の中に、がん細胞が混筋様細胞やライディッヒ細胞も置換され、宿主精巣入している可能性を否定できない点である。白血病の中でドナー由来の精巣を再構築でき、ドナーの精

ラットの精巣から得た細胞懸濁液を別のラットの精子形成を認めた(16)。この方法を用いた異種移植は巣に移植したところ、わずか 20 個の白血病細胞のヒトの妊孕性の温存法に応用できると考えられた。

混入によって宿主ラットに白血病を発症させた。こしかし、本手法では、ドナー細胞の定着率が低いこのため、自家移植よりも異種移植の方が安全面におとが問題である。

いて優れていると考えられる(13)。
安全性以外の異種移植における精巣組織移植の利点

目的は、自身の精子形成の場である精細管の管腔構造や、

ブスルファンは宿主の精原細胞を死滅させる作用を

ライディッヒ細胞や筋様細胞などの間質構造を保持持つことから、精細管内移植法の前処置として用いしたまま精巣組織を移植できることである。
しかし、られてきた(8)。本研究では、ベンザルコニウム塩化

ヒト精巣組織を免疫不全マウスに異種移植した報告

物注入に加えて、アルキル化剤であるブスルファン

では、ヒト精原細胞は生存を認めたものの精子形成を投与することで、より多くのセルトリ細胞を除去はおこらず、移植後 10 週ほどでヒトの精巣組織はでき、移植効率を向上できるか試みた。

萎縮し線維化をきたした(14)。この原因として、移材料と方法植した組織の精細管が盲端となり、生理状態では存在する精細管内フローが失われていること、宿主か【動物】

らの栄養、酸素や老廃物などの代謝に必要な循環回

本実験は、生後 7 週齢以上 12 週齢以下の雄路が無いことがあげられる。

C57BL/6JJcl マウス（日本クレア）を用いた。飼育

一方、ヒトの精巣細胞を免疫不全マウスに異種精細中、マウスは実験動物用飼料と水道水を自由に摂取

管内移植した結果、ヒト精原細胞はマウスの精細管させた。本研究は、川崎医科大学動物実験委員会の内で長期間生存し、増殖するものの、精巣組織移植

定めるガイドラインに従って実施した（川崎医科大と同様に、ヒト精子形成は進まなかった(15)。この学動物実験委員会承認番号：20－139）。

原因として、マウスの精巣体細胞はヒトの精子形成【ブスルファンの投与法】

を支持する能力がないと考えられる。そこで、精原ブスルファンを N、N-ジメチルアセトアミド、ポリ細胞だけでなく、精子形成を支持する精原細胞ニッ

エチレングリコールで溶解させ、水で希釈した溶液

チを構成する体細胞も含めて精細管内に移植し、宿を 3 日間、隔日で腹腔に 8.75mg/kg/day 投与した。

主精巣内でヒトの精巣が再構築できればヒトの精子コントロールには、何も溶解させていない同量の N、形成が進むと期待された。

N-ジメチルアセトアミド、ポリエチレングリコール

陽イオン界面活性剤あるベンザルコニウム塩化物は、を水に溶き腹腔に注入した。

点眼薬の防腐剤として使用されている一方で、長期【ベンザルコニウム塩化物の準備】的な使用によって角膜上皮細胞傷害を引き起こすこ

ベンザルコニウム塩化物（ACROS ORGANICS、21541-とが報告されている。ベンザルコニウム塩化物によ0010）を 0.02%〜0.06%に PBS で希釈した。

る上皮細胞損傷に着目し、0.02%ベンザルコニウム塩【ベンザルコニウム塩化物の精細管内注入法】

化物をマウスの精細管内に注入すると、精巣上皮細セボフルラン（濃度 4-5%，気流量 0.5L/min）を充満胞であるセルトリ細胞を選択的に除去することがでさせた飼育箱の中にマウスをいれて麻酔し、処置中きた。さらに、ベンザルコニウム塩化物によるセルでは吸入マスクにて麻酔を持続させた。

－5－

（LSM-700、Zeiss）で撮影した。

マウスを開腹し精巣を体表面に引き出し、ガラス管を精巣網に刺し、0.02%ブロモフェノールを加えた

一 次 抗 体 は Cy3-conjugated anti-α-Smooth

PBS またはベンザルコニウム塩化物を注入した。術Muscle Actin 抗体（Sigma、C-6198）、抗 SOX9 抗体

後は速やかにバイクリルで腹膜と皮膚を縫合して閉（Millipore、AB5535）、抗 TRA98(GCNA1)抗体（Abcam、腹した。

Ab82527）、抗 GFP 抗体（Aves、GFP-1020）、抗 3βHSD【ドナー細胞の準備】

抗体（TransGenic Inc、KO607）、抗 MVH/DDX4 抗体

10 日齢の CAG-EGFP マウス（日本クレア）の精巣を（Abcam、
ab13840）と抗 TRA98 抗体（Abcam、
ab82527）

摘出し、PBS で洗浄後に、0.25%トリプシンで 37 度を用いた。

10 分間反応させた。10%FBS in DMEM で酵素反応を止め、40μm のフィルターを通し、精巣細胞懸濁液

結果を集めた。1x107 細胞/ml となるように 10%FBS in

まず始めに、精細管内ベンザルコニウム塩化物

DMEM で再希釈した。

(Benzalkonium Chloride;BC)注入によるセルトリ細【精細管内移植法】

胞の除去の再現性を検証した。C57BL/6JJcl マウス

吸入麻酔し、麻酔深度を確認した後に処置を開始しの精細管内にコントロールとして PBS、0.02%、0.04%

た。マウスを開腹し精巣を体表面に引き出し、ガラと 0.06%BC を注入したところ、各濃度でセルトリ細ス管を精巣網に刺し、0.02%トリパンブルーを加えた胞の除去効果は見られた。しかし、0.02%BC 注入群

ドナー細胞の懸濁液を注入した。精巣を腹腔内に戻では、切片あたりのセルトリ細胞が除去された精細し、速やかにバイクリルで腹膜と皮膚を縫合して閉管の割合は 2.7%と極めて少腹した。

なかった（図 1）。一方で、【蛍光免疫染色】0.04%BC 注入群では一切片精巣を摘出し、室温で 30 分振盪した後に、水平段

あたり、17.8%の精細管でセに割を入れてさらに 30 分振盪させて 4%パラホルム

ルトリ細胞が除去され、アルデヒド（paraformaldehyde：PFA）で固定、また

0.06%BC 注入群では27.9%のは 4℃で一晩、4%PFA で浸漬固定し、翌日に水平段に精細管でセルトリ細胞が除割を入れた。PBS で洗浄後、スクロース溶液上昇系

去され、前回の報告とほぼ列（5%、10%、20%および 50% in PBS）で処理して、同様だった（図 1）。

OCT コンパウンド（Sakura Finetek）で凍結包埋し次に、0.04%と 0.06%BC 注入群における、BC に影響を受けたと考えられる精細た。サンプルは 12µm で凍結切片を作成した。
多重蛍光免疫染色では、サンプル上の OCT コンパ

管内に残存するセルトリ細ウンドを PBS で除去し、0.2%PBT（PBS＋Triton-X）

胞を、抗 SOX9 抗体を用いてを室温で 5 分間を 3 回繰り返し、膜透過処理を行っ数えた。その結果、コントロ

た。次いで、ブロッキング液（10%FBS＋3%BSA inールではセルトリ細胞が 45

0.2％PBT）で、室温で 1 時間ブロッキング反応を行個であったのに対し、0.04%

った。
その後、
一次抗体をブロッキング液で希釈し、と 0.06%BC 注入群では、そ4℃で一晩または室温で 1 時間反応させた。0.2%PBT

れぞれ 7 個と 1 個であったで 10 分間３回洗浄した後、0.2%PBT で希釈した蛍光

（図 2）
。

標識二次抗体を、室温で 1 時間遮光して反応させた。

同様に、0.04%と 0.06% BC 注入群における、BC に影

この時、同時に核を Hoechst で対比染色した。PBS で響を受けたと考えられる精細管内周囲の筋様細胞と10 分間 3 回洗浄した後、ポリビニルアルコールで封ライディッヒ細胞を、抗 SMA 抗体と抗 3βHSD 抗体

入した。完成した標本は、共焦点レーザー顕微鏡で免疫染色して数えた。その結果、各群ともコント－6－

ロールと比較して、明らかな違いは認めなかった。

め、ブスルファン群、0.06%BC 群と BBC 群における以上から 0.06%BC が C57BL/6JJcl マウス精巣のセル

同種移植効率を検討した。8 週齢の B6 マウスを、前トリ細胞除去に効果を有し、間質細胞への影響がな

述と同様に 3 群に分けて前処置を行った。ドナーにいことがわかった。

は、全身の細胞に GFP を発現する同系統の CAG-GFP

次に、ブスルファンを腹腔投与し、4 週間後に精巣マウス新生仔の精巣細胞を用いた。移植 8 週後に各内に PBS を注入した群を観察すると、生殖細胞は除群の宿主精巣を固定し、免疫染色でドナー由来(GFP

去されたが、セルトリ細胞数はコントロールと変わ陽性)の精原細胞ニッチの再構築を評価した。
移植はらず精細管内に生存することを確認した。

3 回に分けておこなった。3 回のうち、2 回の移植実

N、N-ジメチルアセトアミド、ポリエチレングリコー

験で得られたドナー細胞懸濁液を、抗 TRA98 抗体まル溶液をコントロールとして腹腔内投与し、4 週後

たは抗 VASA 抗体を用いて精原細胞を、抗 SOX9 抗体のマウス精巣に 0.06%BC を注入した群(0.06%BC 群)

を用いてセルトリ細胞を、抗 3βHSD 抗体を用いてと、ブスルファン投与 4 週間後に 0.06%BC を精巣内

ライディッヒ細胞を染色した。ドナー細胞懸濁液にに注入群(BBC 群)に分けてセルトリ細胞除去率を比おける各種細胞のポピュレーションは、精原細胞が較した。その結果、BBC 群と 0.06%BC 群間において58%(585/1015 細胞)、セルトリ細胞は 16%（294/1815

有意差は認められなかったが、ブスルファン群と比細胞）、
ライディッヒ細胞は 10%(103/1017 細胞)であ較して BBC 群ではセルトリ細胞数は減少し（図 3）、った。

生殖細胞が残存する精細管の率も低下した（図 4）。

ブスルファン群（n=5）
における各種ドナーの定着は、精原細胞が 4 検体（80%）
、セルトリ細胞が 3 検体にわずかに認め（60%）
、間質細胞の定着は認めなかった。
ドナー由来の精子形成は 4 検体
（80%）
であった。
BC 群（n=7）では、精原細胞の定着は 3 検体（43%）

コントロールと比較し、ブスルファン群、BBC 群と0.06%BC 群の筋様細胞とライディッヒ細胞の数に大き な 差 は 見 ら れ な か っ た （ 図 5 ）。

と低く、セルトリ細胞の定着を 3 検体（43%）
、間質細胞の定着を 2 検体（29%）に認め、ドナー由来の精子形成は 3 検体（43%）で認めた。BBC 群（n=6）においては、ドナー精原細胞の定着は 6 検体すべてに認め（100%）、精原細胞とともに定着した SOX9 陽性のセルトリ細胞を 5 検体に認めた（83%）
。3βHSD 陽
性のライディッヒ細胞の定着は同定できなかったが、SMA 陽性の筋様細胞の定着を 2 検体であった（33%）
。
BBC 群では、移植した全ての宿主でドナー由来の精子形成を認めた（図 6）。以上、3 群の中でのドナー

BBC 群において、BC 群よりもセルトリ細胞の除去率

細胞の定着は精原細胞、セルトリ細胞、間質細胞とが向上すると期待されたが、その効果は認めなかっもに BBC 群で最も多かった。

た。しかしながら、生殖細胞の除去効果を認めたた－7－

Preservation

研究成果

in

Women.

N

Engl

J

Med.

BBC 群では BC 群と比較してセルトリ細胞除去効率に

2017;377(17):1657-65.

有意差を認めないものの、精細管内移植の定着効率

5.

は優れていた。BBC 群において、ドナーのセルトリ

Ogonuki N, Ogura A, et al. In vitro production of

細胞はドナー精原細胞と同一の精細管に定着していfunctional sperm in cultured neonatal mouse testes.

たが、ライディッヒ細胞の定着を認めなかった。ドNature. 2011;471(7339):504-7.

ナー細胞内のライディッヒ細胞が占める割合は約6.

10%と低く、今後は細胞懸濁液の精製を調整や、精細Kubota Y, Nakabayashi K, et al. Offspring

管内移植と間質細胞移植の 2 段階移植法を試みるな

production with sperm grown in vitro from

どの工夫が必要と考えられる。移植は、BC 注入後にcryopreserved

セルトリ細胞と精原細胞が消失し、空の精細管が得2014;5:4320.

られた時機に合わせて、注入 4 日後に行った。以前

7.

の報告では、0.02%BC 注入後 7 日目に全精巣細胞を

Yokonishi T, Sato T, Kojima K, et al. Long-term ex

移植していた。0.06%BC 注入後の炎症が間質細胞に

vivo maintenance of testis tissues producing fertile

影響を与えると仮定すれば、BC 注入後の炎症を経時

sperm in a microfluidic device. Sci Rep. 2016;6:21472.

的に数値化し、BC 注入から移植までの期間を改めて8.

精査する必要があると考える。
また全実験について、Spermatogenesis

追加検証を行う予定である。

transplantation. Proc Natl Acad Sci U S A.

Sato T, Katagiri K, Gohbara A, Inoue K,

Yokonishi T, Sato T, Komeya M, Katagiri K,

testistissues.

Nat

Commun.

Komeya M, Kimura H, Nakamura H,

Brinster

RL,

Zimmermann

following

male

JW.

germ-cell

1994;91(24):11298-302.
9.

主な発表論文等

Ogawa T, Aréchaga JM, Avarbock MR,

新学術領域研究「配偶子インテグリティ」第 3 回

Brinster RL. Transplantation of testis germinal cells

若手・公募班研究集会（７月５日、７月６日オンラ

into mouse seminiferous tubules. Int J Dev Biol.

イン開催）「マウス精巣内異種精巣の構築」横西1997;41(1):111-22.

哲広

10.

Hermann BP, Sukhwani M, Winkler F,

Pascarella JN, Peters KA, Sheng Y, et al.
1.

Spermatogonial stem cell transplantation into

Oktay K, Harvey BE, Partridge AH, Quinn

GP, Reinecke J, Taylor HS, et al. Fertility

rhesusPreservation in Patients With Cancer: ASCO

producing functional sperm. Cell Stem Cell.

Clinical Practice Guideline Update. J Clin Oncol.

2012;11(5):715-26.

2018;36(19):1994-2001.

11.

2.

Loren AW, Mangu PB, Beck LN, Brennan

Reconstitution of spermatogenesis from frozen

L, Magdalinski AJ, Partridge AH, et al. Fertility

spermatogonial stem cells. Nat Med. 1996;2(6):693-6.

preservation for patients with cancer: American

12.

Society of Clinical Oncology clinical practice

Pulaski H, Shetty G, Meistrich ML, et al. Autologous

guideline update. J Clin Oncol. 2013;31(19):2500-10.

grafting of cryopreserved prepubertal rhesus testis

3.

produces

Donnez J, Dolmans MM, Demylle D,

testesregenerates

spermatogenesis

Avarbock MR, Brinster CJ, Brinster RL.

Fayomi AP, Peters K, Sukhwani M, Valli-

sperm

and

offspring.

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－9－

（表 題）高転移臓器における前転移 niche の性質の検討（所 属）岡山大学 医歯薬学総合研究科 口腔病理学分野（氏 名）河合穂高（研究成果の概要）
近年の研究では、腫瘍細胞が遠隔臓器に転移を起こす際に、腫瘍細胞の転移に先立って、前転移 niche と呼称される微小環境が形成され、その微小環境を足がかりとして転移が成立することが明らかとなっている。本
研究では、腫瘍間質細胞の産生する CCL2 が高転移臓器である肺に CCR2 陽性 MDSC が集簇し、前転移 niche 形成に関与する可能性が示唆された。CCL2-CCR2 axis が高転移臓器の肺に CCR2 陽性 MDSC を集簇させ、転移を促進している可能性が考えられた。

（本文）(PDS: Patient Derived Stromal Cells)と口腔癌細

１：研究開始当初の背景

胞株(HSC2)をヌードマウスに共接種し、高転移臓器

腫瘍が遠隔臓器に転移する際、臓器によって転移での微小環境の変化について検討を行なった。

のしやすさは異なる。近年、この違いには「前転移niche」と呼ばれる微小環境が関係していることがわ

２：研究の目的

かってきた。
「前転移 niche」とは、腫瘍の影響によ腫瘍間質細胞は様々な因子を放出し、腫瘍細胞やり遠隔臓器で形成される微小環境のことであり、同周囲組織に影響を与えている。本研究では、２名の微小環境を足掛かりにして、腫瘍の転移が成立する。

口腔扁平上皮癌患者から採取した PDS と、初代培養

前転移 niche 形成には骨髄由来免疫抑制細胞された成人のヒト皮膚線維芽細胞(HDF: Human（myeloid derived suppressor cell: MDSC）が大きな役

Dermal Fibroblast)をマイクロアレイ解析を用いて割を果たしている。MDSC は、癌免疫に重要な樹状mRNA の発現を比較し、遠隔臓器の前転移 niche の形細胞や M1 マクロファージなどの抗腫瘍免疫応答を成に関与する因子を検討する。

抑制する。特に arginase1 陽性 MDSC は、T 細胞などの免疫応答を抑制しながら前転移 niche を形成し、３：材料と方法

腫瘍が転移しやすい環境をつくっているという報告a) PDS の採取がある。現在、口腔癌と前転移 niche の関係性につ２名の口腔扁平上皮癌患者の手術検体の腫瘍部分

いては不明な点が多く、口腔癌における前転移から、1x1 mm 大の組織片を採取した。採取した組織

niche 形成メカニズムの解明は、口腔癌における遠片は PBS で洗浄後裁断し、1mg/ml のコラゲナーゼと隔臓器への転移を理解するうえで重要である。

ディスパーゼ混合溶液に 37 度 3 時間振盪させた。

また、近年、腫瘍組織を構成する腫瘍間質は、腫その後、10cm シャーレに組織を播種し、10%FBS α-

瘍細胞との密接な相互作用をし、浸潤や転移、免疫MEM で 5%CO2 インキュベーター37 度で 7 日間培養し抑制など、腫瘍促進的に働くことが多数報告されてた。細胞がコンフェレントになったのを確認してかいる。それ以上に、間質の性質が腫瘍組織の性格全ら、アキュターゼを反応させ、細胞接着性の違いを体を変えてしまうほど、大きなインパクトを持つこ

利用して、PDS のみ採取した。
採取された PDS を 10cmとを我々のグループは発表してきた（Takabatake K,

シ ャ ー レ に 播 種 し 、 10%

Kawai H, et al. Int J Mole Sci. 2020）。

antibiotic/antimyotic,α-MEM で CO2 インキュベー

FBS,

1%

ター(CO2 濃度 5%)にて 37 度でさらに培養継代し、本研究課題では、患者より得られた癌間質細胞－10－

スト（RS 102895）を 3.0mg / kg の濃度で隔日に腹継代数 15 までの細胞を、実験に使用した。

腔内注射しました。
。 対照として、3％DMSO の腹腔b) 細胞

内注射を行った。 1 週間後、マウスを屠殺し、分析使用した細胞は、ヒト由来口腔扁平上皮癌細胞株のために標本を作成した。

(HSC2)及び、ヒト成人皮膚線維芽細胞の初代培養細胞（HDF）を用いた。これらは、JCRB Cell Bank とe) 標本作製・染色

Lonza Walkersville から購入した。細胞は 10cm シ

検体は 10％中性緩衝ホルマリンにて固定した後、

ャ ー レ に 播 種 し 、 10%1%

常法に従いパラフィン包埋し、ブロック作製のうえ

antibiotic/antimyotic,α-MEM で CO2 インキュベー

3μｍの連続切片を作製した。切片はヘマトキシリ

ター(CO2 濃度 5%)にて 37 度で培養を行った。

ン・エオジン染色、免疫組織化学的染色を行い組織FBS,

化学的に観察した。
c) マイクロアレイ解析
免疫組織化学染色HDF および PDS1/2 細胞を 3 日間培養し、RNeasy Mini
Kit（QIAGEN）を使用して培養細胞からトータル RNA

一次抗体は以下のものを使用した。

を単離した。全 RNA の濃度と品質（A260 / 280）は、

一次抗体

メーカー

免疫動物

希釈倍率

Bioanalyzer（Agilent 2100）によって測定した。低

CD11b

Abcam

rabbit×1000

入力クイックアンプラベリングキット（Agilent

Gr1

Abcam

rat

×200

Technologies）
を使用して 0.1μg のトータル RNA か

Arginase1 Abcam

rabbit×200

ら cDNA を合成し、Agilent Technologies マイクロ

CCL2

Abcam

rabbit×500

アレイ（SurePrint G3 Human 8x60K Ver.3.0）のプ

CCR2

Abcam

rabbit×500

ローブにハイブリダイズさせた。HDF と PDS1/2 の遺DAB による発色、および核はヘマトキシリン染色を

伝子発現を比較し、さらに分析するために 3SD を超行い、光学顕微鏡で標本を観察した。

える発現する遺伝子を選択した。弁図は、Venny2.1を使用して作成した。「細胞走化性に関連する遺伝

蛍光免疫多重染色子」を、DAVID Bioinformatics Resources6.8 を使MDSC 検出には、OPAL7 色マニュアル IHC キットを用して選択した。HDF と PDS1/2 の DEG の棒グラフと使用した。手技はマニュアルに従い染色を行った

ヒートマップの表示は、MicrosoftExcel を使用し作（https://www.perkinelmer.com）。切片を DAPI で対成した。

比染色し、ZEISS LSM 700 共焦点顕微鏡を使用して切片を観察した。

d) 動物実験
HSC-2 および HDF 共移植群（HSC-2 + HDF）
、HSC-2f) 陽性細胞の評価および PDS 共移植群（HSC-2 + PDS1 および HSC-2 +各臓器について、抗体ごとに 5 枚ずつランダムに写

PDS2）の 3 種類の腫瘍モデル（それぞれ N=5）を作

真を撮影した。画像処理ソフトウェアである image

成 し た 。 腫 瘍 細 胞 は 、 HBSS （ Gibco 、 Lifej を用いて CD11b、Gr1 陽性細胞数を計測し、対照

6Technologies、Carlsbad、CA、USA）に 1.0 x 10 HSC-

群、1 週目の腫瘍マウス、2 週目の腫瘍マウスで陽2/0.2ml および 3.0x106 間質細胞/ 0.2ml の濃度で懸性細胞数を比較した。また、arginase1 陽性細胞に濁した。これらの細胞を、頭部皮下にシリンジにてついては、組織内での偏在性を検討した。また、陽移植した。 また、CCR2 を遮断するために、腫瘍移性細胞が顕著であった臓器を代表とし、クラスター

植の 3 週間後、HSC-2 + HDF、HSC-2 + PDS1、および数を計測したHSC-2 + PDS2 に、DMSO に溶解した CCR2 アンタゴニ－11－Cells）と考えられた。

３：研究成果a) PDS 群における CCL2 の発現上昇
PDS1 と HDF、および PDS2 と HDF では、それぞれ249 個と 231 個の遺伝子発現が上昇しており、
176 個と 189 個の遺伝子発現が減少していた。
また、
PDS1,2両方で上昇している遺伝子は 122 個で、減少している遺伝子は 71 個であった。これらのうち、「細胞走化性に関連する遺伝子」に絞り込んで検索を行うと、15 個の遺伝子が候補に挙げられた。このうち、発現レベルが高い遺伝子として CCL2 が見出された。

これらのことから、患者由来腫瘍間質は CCL2 を分泌し、腫瘍組織に CCR2 陽性 MDSC の遊走を促進している可能性が示唆された。
c) CCR2 抑制剤による CCR2 陽性 MDSC の減少
それぞれの腫瘍移植マウスに CCR2 阻害剤を投与したところ、腫瘍間質に浸潤する CCR2 陽性 MDSC の数が PDS 群のみ優位に減少した。
単球走化性タンパク質（MCP-1）としても知られる
CCL2（C-C モチーフケモカインリガンド 2）、およびCCR2（CCL2 受容体）は、MDSC の移動に重要な役割を果たす。 CCL2 は、前立腺がん、乳がん、悪性神経
膠腫、結腸直腸がん、肺がんなどの腫瘍から分泌され、 CCL2/CCR2 axis は、MDSC の動員を減らし、癌治療を改善するための潜在的なターゲットとして注目されている分子である。
b) CCR2 陽性 MDSC の浸潤
頭部に移植した腫瘍組織を組織学的に検討すると、免疫組織化学染色により CCL2 の発現が PDS 群で優位に上昇していることが確認された。また、腫瘍組
織間質には、CCR2 陽性の血球系細胞の有意な増加が認められた。増加した CCR2 陽性血球系細胞は、Arginase-1, Gr-1, CD11b を発現しており、骨髄由
これらのことから、PDS が分泌する CCL2 が CCR2 陽来免疫抑制細胞（MDSC：Myeloid Derived Suppressor－12－学会発表：２件

性 MDSC の遊走に関与している可能性が示された。

1. 河合穂高, メイワトウ, 高畠清文, 大森悠加, 中野敬介, 長塚仁. CCL2-CCR2 axis を介した癌関連線d) 高転移臓器における CCR2 陽性細胞

維芽細胞による骨髄由来細胞の動員. 第 110 回日本

高転移臓器である肺において、PDS 群で CCR2 陽性
血球細胞が優位に増加していることが明らかとなり、病理学会総会, 東京（Web）, 2021 年 4 月.

CCR2 陽性 MDSC が肺の前転移 niche 形成に関与している可能性が示唆された。また、CCR2 阻害剤を投与

2. 河合穂高, メイ ワト ウ, 髙畠清文, 伏見滋子,

すると、肺での CCR2 陽性細胞が優位に減少した。こ稲田靖則, 中野敬介, 長塚仁. 口腔扁平上皮癌におれらの結果から、CCR2 阻害剤は肺の前転移 niche 形

ける間質細胞が与える骨髄由来細胞の動員への影響.

成を阻害する可能性が示唆された。

第３１回日本臨床口腔病理学会(Web), 2020 年 9 月．

４：今後の展望遠隔臓器への腫瘍の転移は患者の予後を著しく悪図書：０件化させる。本研究課題で明らかとなった、前転移

産業財産権：０件

niche の形成に関与する CCR2 陽性細胞の更なるプロファイルが明らかとなれば、阻害剤を事前に投与することで、腫瘍の転移を抑制する治療の開発につながる可能性がある。
５：主な発表論文など
雑誌論文：３件
1. Kawai H*, Oo MW, Tsujigiwa H, Nakano K,
Takabatake K, Sukegawa S, Nagatsuka H. Potential role ofmyeloid-derived suppressor cells in transition fromreaction to repair phase of bone healing process.
International Journal of Medical Science. 2021; 18(8):1824-1830.
2. Takabatake K, Kawai H*, Omori H, Qiusheng S, Oo
MW, Sukegawa S, Nakano K, Tsujigiwa H, Nagatsuka H.
Impact of the Stroma on the Biological Characteristics of
the Parenchyma in Oral Squamous Cell Carcinoma.
International Journal of Molecular Science. 2020; 21(20):7714.
3. Omori H, Shan Q, Takabatake K, Nakano K, Kawai H,
Sukegawa S, Tsujigiwa H, Nagatsuka H. The origin ofstroma innfulence the biological characterristics of oral
squamous cell carcinoma. Cancers. 2021; 13: 3491.

－13－

学術大会,愛知

（表 題）うつ発症予防を目指した香り分子吸入の研究（所 属）川崎医療福祉大学 医療技術学部 臨床検査学科（氏 名）上野 浩司（研究成果の概要）
シトラールは様々な芳香性植物種の精油に含まれている 1 つのモノテルペンです。シトラール吸入によって生じる中枢神経系への生理的影響は不明瞭なままである。我々はシトラール吸入によってマウスの行動に与える影響について調べた。生後 9 週齢のマウスに一定時間のシトラールを吸入させた後，一連の行動実験(高架式十字迷路試験，オープンフィールド試験，Y 迷路試験，テールサスペンション試験，強制水泳試験など)を実施した。シトラールを吸入した生後 9 週齢のマウスはオープンフィールド試験において不安様行動の増加を示した。シトラールを吸入したマウスは中枢性鎮痛効果，筋力低下を引き起こした。これらの結果は，シトラー
ルは吸入によって，マウスの中枢神経系に作用し，行動を変化させることを示している。

１．研究開始当初の背景

申請者らは以前より植物に含まれる香気成分の中か現代の日本はストレス社会と言われているように，

ら生理的作用のもつ化学物質を探索し，その成果を精神疾患患者の増加という大きな社会問題を抱えて精神疾患の治療薬として開発しようと研究を進めている。特にうつ病の社会的損失は 2005 年の時点で 2きた。その結果，我々は薔薇の香り成分である 2-フ兆円と推定されており，近年は軽くこの損失額を越ェニルエタノールには抗うつ作用のあることを明らえていると考えられる。他の先進国と同様，日本にかにして大きな話題となった。しかし，香りはヒト

おけるうつ病から生じる社会的損失は莫大である。

の場合は好き嫌いが激しく，好まない香りを嗅ぐ場

しかし，うつ病に対しての根本的な対策方法は存在

合はストレスとなってしまう場合がある。
そのため，しないのが実情であり，早急な対策が望まれている。

ヒトに対してうつ病の予防のために香味成分を摂取

抗うつ薬の使用は口渇や肥満や性機能障害，2 型させる場合には多種類の抗うつ効果のある香気成分

糖尿病の増加，攻撃性の増加など様々な副作用が併を発見しておく必要がある。
そこで本研究では，我々存している。副作用に関するデータは過小評価されのもつ香り成分による作用を調べる実験方法を駆使ており，利益よりも害のほうが大きいことが指摘さし，フルーツの各種香気成分からリラックス作用のれている。そのため，効果的に副作用のない抗うつある成分を明らかにすることを行った。

薬の開発が望まれている。また，既存の抗うつ薬は発症後に処方されるものであり，予防のために服用

２．研究の目的する抗ストレス効果のあるものは未だ存在しない。

ストレス社会において大きな問題となっているう

うつ病の予防目的に摂取できる薬が開発されれば現つ病の増加を少しでも阻止すべく抗うつ効果のある代の日本へのニーズは非常に高いことが容易に推測

香気成分を発見することで，ストレス社会を生き抜される。

く新たな予防方法やうつ病の治療薬開発といった臨

古来より植物由来のエッセンシャルオイルには抗床研究に繋げる。

うつ効果や抗ストレス効果，リラックス効果などがフルーツの香気成分の中にはベンゼン環をもつ化あるとされてきたがその科学的根拠は乏しかった。

学物質が多くあり，
心理的作用をもつ可能性が高い。

－14－抗うつ効果意外にもリラックス効果，さらには認知機能向上効果，記憶力増強効果，抗不安作用効果などをもつ香気成分が見つかることが期待される。
３．研究の方法
実験動物
9 週齢の雄マウス(C57BL/6)を 2 つのグループに分けました。香り分子吸入群(n = 10)および吸入なしのコントロール群(n = 10)。マウスは日本チャール
ズ・リバー株式会社(神奈川県)から購入しました。
12/12 時間の明暗サイクル，室温 23〜26°C の範囲
で食物と水を自由に摂取できるケージ内でマウスを0.3°C に加熱した板の上に置き，最初の足の反応飼育しました。これらの実験は，米国国立衛生研究(足を上げる，舐める等)までの潜時を記録しました。

所(NIH)の実験動物の管理と使用に関するガイド

組織損傷を防ぐためのカットオフ時間は 30 秒とし(1996 年改訂)に準拠しており，川崎医科大学の動物ました。

実験委員会によって承認を受けた後実施しました。

握力試験

香料の吸入

前肢の握力を評価するために，グリップ強度計を

シトラールは東京化成工業株式会社(L0047，
東京，使用しました。前肢がワイヤーグリッドをつかむこ日本)から購入しました。
生理食塩水をコントロールとができるように，マウスを尾で持ち上げて保持しとして使用しました。
吸入は密閉容器で行いました。

た。その後，グリッドを解放するまでゆっくり後ろ

2 mL の香り物質(または生理食塩水)を吸収させたに引き戻しました。前肢によって加えられるピーク

コットン(4×4 cm)を，穴の開いた蓋を持つステンレ

力は，ニュートン(cN)で記録されました。

ス鋼容器(60×60×35 mm)に入れました。マウスが高架式十字迷路試験

コットンをなめたり触ったりすることは出来ない状

高架式十字迷路を使用して不安様行動を調べまし況にしました。ステンレス鋼容器を新しい飼育ケー

た。実験装置は 2 つのオープンアーム(8×25 cm)とジ(235×325×170 mm)内に置き，このケージをさら同じサイズの高さ 30 cm の透明な壁のある 2 つのクに大きな 2 つケージ(292×440×200 mm)で囲いましローズドアームで構成されている。アームは白いプた。コットンを配置して約 20 分後，マウスを 30 分

ラスチック板で構成され，床から高さ 40 cm であっ間内部のケージに入れた。30 分間吸入させた後行動た。同じタイプのアームは互いに反対側に位置して実験を行いました。

いました。マウスは最初にクローズドアームに直面

行動実験
すべての行動実験は明期(9:00〜16:00)の間に実施しました。各行動実験は 1 日につき 1 テ
ストのみとした。マウスはランダムな順序でテストしました。各試験の終了後，70％エタノールと次亜塩素酸を含む水で実験装置を洗浄し，嗅覚刺激によるバイアスの発生を防止しました。
ホットプレート試験
ホットプレートテストはマウスの温度感受性を評価するために用いました。マウスを 55.0±－15－

の迷路の周りに配置しました。
ANY-MAZE ソフトウェアを使用して総移動距離(m)，アームへの進
入回数，および交互の数を分析しました。
テールサスペンション試験
テールサスペンション試験に
よってマウスのうつ様行動を調べました。各マウスは粘着テープを尾の先端から 1 cm 未満の位置に貼り，白いプラスチック製の箱の床から高さ 60 cm の位置に吊り下げられました。吊り下げられた
マウスの行動を 6 分間記録しました。ビデオカメラで画像を撮影してマウスの不動時間を測定しました。ANY-MAZE ソフトウェアを使して迷路の中央に置き， 6 分間自由に移動させました。マウスの行動はビデオで記録し，ビデオトラッ

用してデータの分析を行いました。

キングソフトウェア(ANY-MAZE, Stoelting Co.,

強制水泳試験

Wood Dale. IL. USA)を使用して，アーム進入回数，

Porsolt 強制水泳試験を使用してマウスのうつ様

移動距離(m)，およびオープンアームで費やした時間

行動を調べました。実験装置はアクリル樹脂製のシを分析しました。

リンダー(高さ 20 cm×直径 10 cm)で構成されていオープンフィールド試験ました。シリンダーに深さ 7.5 cm まで水(23°C)をオープンフィールド試験によってマウスの探索様入れました。マウスをシリンダー内に 6 分間置き，行動，不安様行動，および一般的な活動量を調べま

その行動を記録しました。テールサスペンション試した。各マウスは壁(45×45×40 cm)に囲まれた正験と同様に不動時間は ANY-MAZE ソフトウェアを使

方形の装置の中央に配置しました。
総移動距離(m)と用して評価しました。

中央エリアで費やされた時間を記録しました。中央

統計解析

エリアは箱の中央の 20×20 cm の部分として定義しデータは，一元配置分散分析(ANOVA)，反復測定分ました。実験装置は 100 lux で照らしました。マウ散分析を使用して分析しました。 p 値が 0.05 よりスの行動は 30 分間にわたって記録し，下回った場合に統計的に有意とみなした。データはANY-MAZE ソフトウェアを使用してデータ分析を行いました。
Y 迷路試験
Y 迷路試験装置(各アームの長さ：40 cm，アームの下部の幅：3 cm，アームの上部の幅：10 cm，アームの壁の高さ：12 cm)を使用して空間作業記憶を調べました。マウ
スを Y 迷路の中心に最初に置き，6 分間自由に行動させまし。視覚的な合図は実験室－16－

箱ひげ図として表示しました。
４．研究成果本研究において，我々はシトラールの吸入は中枢性鎮痛効果，筋力低下，不安様行動の増加，活動量の増加を引き起こすことを明らかにした。
シトラールには抗侵害受容作用がある
ことが報告されており，
5-HT2A セロトニン受容体の有意な活性化を伴うことが見出されている。本研究においても，シトラー
ルの吸入は抗侵害受容作用をホットプレ
ートテストにおいて示した。この結果はシトラールの吸入は腹腔内投与と同様の作用を発揮することを示している。以前の研究においてシトラールのマウスへの腹腔内投与によって鎮静作用と運動弛緩作用ある。

があることが示されている。さらには，シトラールには高用量の投与によって不安惹起作用があること

本研究では，シトラールの吸入によって，どういも報告さている。シトラールを吸入する時間を変化った経路でシトラールがマウスの中枢神経系に作用させることでマウスの行動も変化するのか明らかにして行動を変化させたのかは調べていない。また，する研究が必要である。

マウスと同様にヒトでもシトラールの吸入によってシトラールの吸入はマウスに対して前肢の握力低行動が変化するかは不明である。シトラールによる下を生じさせた。先行研究においても，シトラール

中枢神経系への作用メカニズム，分子メカニズムをの腹腔内投与による実験において，ロタロッド試験

明らかにするにはさらなる研究が必要である。
本研究はシトラールを含むエッセンシャルオイル

でマウスの筋弛緩が報告されている。
本研究は，高架式十字迷路試験ではシトラールのや様々な製品において，シトラールを吸入すること

吸入はマウスに不安様行動を増加させなかったが，で脳神経に影響を与えるという科学的根拠の一端をオープンフィールド試験においてマウスは不安様行示した。

動を増加させることを示した。高架式十字迷路ではシトラールの腹腔内投与によってマウスのオープン

５．主な発表論文等

アームへの侵入数が減少することが示されている。

①雑誌論文：1 件

本研究は過去の研究と同様にシトラールの吸入はマ

1.

上野 浩司.ヘキサナール吸入による神経心理学 的 影 響 .AROMA RESEARCH. 22(1), 11-13.

ウスに不安様行動を増加させることを示している。

2021.

マウスの場合と同様にヒトでも，シトラールを含むフレグランスの吸入やシトラールが使用された生活用品の使用によってこれらの神経心理的作用があ②学会発表：0 件

るかは不明であるが，類似の神経回路構造を所持す③図書：0 件ることより同様の効果がある可能性がある。
詳細は，④産業財産権：0 件

ヒトを対象に効果を確認するさらなる研究が必要で－17－

（表 題）制御性 T 細胞におけるユビキチンリガーゼ RNF146 の役割についての研究（所 属）岡山大学大学院 医歯薬学総合研究科 腎・免疫・内分泌代謝内科学（氏 名）勝山 隆行（研究成果の概要）
近年自己免疫疾患の病態におけるユビキチン修飾の重要性が注目されている。本研究では、ユビキチン E3 リガーゼの 1 つである RNF146 が T 細胞の生存や活性化、制御性 T 細胞分化や機能に与える影響について検討を行い自己免疫疾患における RNF146 の役割を明らかにすることを目的とした。RNF146 を選択的にノックアウトした T 細胞を用いて様々な解析を行うことにより、T 細胞機能における RNF146 の役割を解明する。

（本文）

ーゼの 1 つであり、標的タンパク質である AXIN の

1. 研究開始当初の背景

ユビキチン化を介して Wnt-β カテニンシグナルを制自己免疫疾患の病態には自然免疫、獲得免疫の両御する(Zhang Y, et al. Nat Cell Biol, 2011)。癌細胞株を者に関わる様々な免疫担当細胞が重要な役割を果た

用いた in vitro での検討では、RNF146 が LKB1 のユ

すことが知られているが、近年 T 細胞が果たす役割

ビキチン化を促進し AMPK シグナルを制御するこが改めて注目されている。制御性 T 細胞は免疫抑制とが報告されている(Li N, et al. Nat Commun, 2019)。

を司る役割を持った細胞分画であり、そのマスター

また、破骨細胞や骨芽細胞においては 3BP2 を介し遺伝子が Foxp3 であることが知られている。がん免てその分化や機能に重要な役割を果たすことも明ら

疫においては種々の抗腫瘍免疫応答を抑制することかとなっている(Matsumoto Y, et al. J Clin Invest 2016)。

により免疫逃避機構に関与するが、自己免疫疾患に一方で、RNF146 やその標的分子、下流シグナルがおいては過剰な自己免疫を抑制し病態制御の役割を制御性 T 細胞を含む免疫担当細胞においてどのよう果たす。自己免疫疾患の病態においては、な役割を果たすかはこれまで検討されていない。

Th1/Th2/Th17 細胞などのエフェクターT 細胞への分

筆者はこれまで全身性エリテマトーデスなどの全化異常や異常活性化に加えて、制御性 T 細胞の機能

身性自己免疫疾患における T 細胞の役割について研低下も重要な役割を担うことが報告されている。

究を行なってきた。今回、T 細胞、特に制御性 T 細ユビキチン修飾系は代表的な翻訳後修飾系であり、胞の機能と RNF146 の関連を明らかにすることで、免疫担当細胞内のシグナル伝達のあらゆるレベルでこれまで知られていなかった RNF146 ならびにその

ユビキチン化が関与していることが明らかとなって下流分子が免疫担当細胞で果たす役割について解明きたため、近年自己免疫疾患の病態における重要性することを目的として本研究を計画した。将来的にが注目されている。ユビキチン修飾酵素である A20

は自己免疫疾患の病態に RNF146 が果たす役割を解は NFκB を制御しその変異は関節リウマチや全身性

明し、新規治療標的開発の端緒となることが期待さ

エリテマトーデスのリスクとなる(Cicacci C, et al.

れる。

Immunol Res, 2019)。RNF146 はユビキチン E3 リガ本研究では、既存の RNF146flox/flox マウスに新たに－18－

Lck Cre マウスを交配することで T 細胞選択的における Treg 数についてフローサイトメトリーでRNF146 ノックアウトマウス(KO)を作製する。これ確認する。マスター転写因子である Foxp3 の発現レまで検討されていない同マウスを用いることで制御ベルについては平均蛍光強度(MFI)でも評価を行う

性 T 細胞の分化や機能に RNF146 が果たす役割につこととした。

いて明らかにすることができる。

In vitro の解析では、活性化マーカーの発現やサイトカイン産生、増殖能などの T 細胞機能評価をフロ

2. 研究の目的

ーサイトメトリーで行った。さらに、RNF146 欠損 T

本研究では、T 細胞選択的 RNF146 ノックアウトマ

細胞でのシグナル異常について、Syk や NFκB など

ウスを用いて RNF146 が T 細胞の生存や機能に与えの下流シグナルや mTOR pathway の活性化についてる影響を明らかにする。さらに、制御性 T 細胞に着もウエスタンブロット法で評価し、3BP2 や LKB1 な

目してその分化、増殖、抑制能に RNF146 が果たす

どの既知の標的タンパク質の発現量やユビキチン化

役割について解明することでこれまで知られていなも確認した。また、制御性 T 細胞への分化実験を行かった RNF146 の免疫担当細胞における役割を明ら

い、Foxp3 発現の制御に RNF146 が果たす役割を明かにする。

らかにすることとした。具体的には、脾臓から分離

また、将来的には自己免疫疾患における当該分子のキ ッ ト を 用 い て naïve CD4 T 細 胞 を 分 離 し 、果たす役割を解明したいと考えている。そのため、

CD3/CD28 抗体の刺激下で IL-2、TGF-β とともに 72

自己免疫疾患モデルマウスとの交配も開始し、時間培養を行うことで Treg へと分化誘導されるこRNF146 をノックアウトすることが病勢や臓器障害とが知られている。コントロールならびに KO マウにどのような影響を与えるかを明らかにすることもスから分離した naïve CD4 T 細胞を比較することで、目的とした。

RNF146 が Treg 分化に果たす役割を明らかにすることができる。転写因子発現の制御に関しては免疫沈3. 研究の方法

降や質量解析法などにより RNF146 の新規標的タン

本研究は、まず T 細胞特異的ノックアウトマウス

パク質の発見も含めて解析を行うことで RNF146 やを用いて in vivo で全身性の自己免疫性疾患様病態発

ユビキチン修飾の未知の役割を明らかにすることと症にユビキチンリガーゼが果たす役割について検討した。

すると同時に、制御性 T 細胞(Treg)の発生・維持へのさらに、RNF146 欠損 Treg の抑制能について評価

影響を検討する。続いて、in vitro の解析で Treg の機するため、in vitro Treg suppression assay を行う。具体

能や分化の評価、細胞内シグナルやユビキチン化標的には、フローサイトメトリーを用いて Treg

的分子の検討を行うこととした。

(CD4+CD25+CD127-)と non-Treg (CD4+CD25-)をソー

具体的には、免疫担当細胞に広く発現する E3 ユビ

ティングし、CD3/CD28 抗体の刺激下で様々な比率

キチンリガーゼの 1 つである RNF146 に着目し、で共培養を行う。CFSE 染色を用いて non-Treg の増University of Toronto, Prof. Robert Rottapel と共同で作殖を確認することで Treg による抑制能を評価でき製した RNF146flox/flox マウスと Lck Cre マウスと交配る。コントロールと KO マウス由来の Treg で抑制能することで T 細胞特異的 RNF146 KO マウスを作製を比較することにより、RNF146 欠損が Treg 抑制能する。In vivo の解析では、生存期間、体重変化、尿に与える影響を明らかにすることができる。

蛋白、自己抗体産生などにより自己免疫疾患様病態

さらに、全身性エリテマトーデス疾患モデルマウ

について評価する。また、肺、腎臓、腸管などの主スである B6/lpr マウスとの交配も行い、自己免疫疾

要臓器障害について組織学的な評価を行う。各臓器患における当該分子の役割について in vivo での検での細胞浸潤については免疫組織染色、フローサイ

討を行うこととした。全身性エリテマトーデスの病

トメトリーを用いて評価する。続いて、胸腺や脾臓態において T 細胞で RNF146 がどのように機能する－19－

かを明らかにすることにより病態解明や新たな治療

続いて、ウエスタンブロット法により KO マウスの標的の開発に寄与できると考えた。

T 細胞における蛋白発現の評価を行った。まず、WT

4. 研究成果

マウス・KO マウスの脾臓細胞から磁気ビーズを用

まずは University of Toronto, Prof. Robert Rottapel といて T 細胞を分離した。分離された T 細胞における共同で作製した RNF146flox/flox マウスと Lck Cre マウ

RNF146 の発現を確認したところ、図 2 の通り

スと交配することで T 細胞特異的 RNF146 KO マウ

RNF146 の発現が抑制されていることが確認できた。

スを作製した。マウス作出に時間を要したが、最終WT

的に T 細胞選択的 RNF146 ノックアウトマウス(RNF146flox/flox LCK Cre+マウス, KO マウス)の安定的

KO

RNF146な作出が可能となった。
この KO マウスと野生型マウス(WT マウス)の比較Actinを行った。生後 12 週までの比較では、生存率に差は(図 2)なく明らかな皮膚炎・関節炎といった視診上確認できる異常所見は認められなかった。また、体重にも差はみられなかった。脾臓重量についても有意差は

さらに、RNF146 の下流シグナルについて検討を行認めていない。各臓器の組織学的な評価についてはった。RNF146 の標的基質となる既知の複数の分子

現在検討中である。

について検討を行ったところ、Factor X の発現が KO

続いて、同ノックアウトマウスを用いて脾臓細胞

細胞 T 細胞で著明に増加していることが明らかとなの解析をフローサイトメトリーで行った。T 細胞分った。一方でその他の因子(Factor Y など)については

画・B 細胞分画の割合については WT マウス・KO マ

WT T 細胞と KO T 細胞の両者で差はみられなかっ

ウス間で有意差は認めなかった。一部の活性化マーた(図 3)。これらの標的のユビキチン化についての評

カー、エフェクター細胞分画が KO マウスで増加す

価ならびに T 細胞活性化に関与する細胞内シグナルる傾向を認めており、更なる検討を進めている。

についての検討を進めており、RNF146 が T 細胞機

制御性 T 細胞についても検討を行った。マスター

能に果たす役割について解明していく。

転写因子である Foxp3 の発現については顕著な差は認められなかった。一般的な制御性 T 細胞の分画と

WT

KO

WT

されている CD4+CD25+Foxp3+細胞の割合についても、明確な差は認められなかった(図 1)。Naïve CD4

Factor X

Factor Y

Actin

Actin

KO

T 細胞からの制御性 T 細胞分化(induced-Treg)について現在検討を行っている。また、制御性 T 細胞の抑制能の評価も in vitro, in vivo で確認する予定である。

WT

(図 3)
(得られた成果の位置づけ)

KO

RNF146 に関連したシグナル経路については、これまで骨芽細胞・破骨細胞を中心に研究が進められFoxp3てきた。本研究では、自己免疫疾患にユビキチン化修飾が重要な役割を果たすことに着目し、RNF146
が T 細胞機能にどのような影響を与えるかについて

CD25

検討を行った。T 細胞機能についての詳細な解明については現在検討を続けているが、本研究を通じて

(図 1)
－20－

RNF146 の未知の役割を明らかにすることにより、全身性エリテマトーデスをはじめとする種々の自己免疫疾患の病態解明、新たな治療戦略の確立に寄与できる可能性があると考えられる。
(今後の展望)現時点では制御性 T 細胞の機能に RNF146 が果たす役割については検討できていない。今後は、抑制能の評価を in vitro, in vivo の両者で検討するとともに、制御性 T 細胞の機能に関与することが知られている各分子の発現についてもフローサイトメトリー
で検討する。さらに、RNF146 の下流シグナルについてより詳細な検討を進めることで治療標的となる細胞内経路の同定を試みる。
さらに、疾患モデルマウスでも同様の検討を行う
ことにより、自己免疫疾患における RNF146 の役割を明らかにする。
マウスから得られた知見をもとに、将来的にはヒト患者検体でも同様の傾向がみられるかを確認し、臨床応用の可能性について検討を進める。
5. 主な発表論文など
現時点では当該研究については雑誌論文並びに学会発表は行なっていない。

－21－

炎症性骨破壊におけるアンジオテンシン II が及ぼす骨細胞における役割の検討
川崎医科大学 リウマチ・膠原病学
赤木 貴彦
研究成果の概要
近年、レニン・アンジオテンシン系（RAS）が骨代謝に関与していることが報告されている。本研究では、アンジオテンシンⅡ(AngⅡ)が関節リウマチなどの炎症性骨破壊に及ぼす影響について検討を行い、過剰な AngⅡ存在下では骨破壊が増強していることを見出した。慢性腎臓病や肥満などによる RAS 系活性化状態を合併した
関節リウマチでは、RAS 活性化が骨びらんを増強している可能性があり、RAS 系阻害薬が骨破壊を軽減する可能性が示唆された。

関節リウマチは、炎症性骨破壊を呈する代表的な

1.研究開始当初の背景
アンジオテンシンⅡ(AngⅡ)は、レニン・アンジオ疾患であり、その病態として関節内で破骨細胞の活テンシン系(RAS)の最終代謝産物であり、血管収縮に性化による骨破壊が起こっていることが既に知られよる血圧の恒常性維持や、体液量の調節を行っていている。関節リウマチ患者や関節炎ラットの滑膜やる。近年、AngⅡを含めた RAS が、全身への作用とは滑液において、AngⅡや AngⅡタイプ１受容体(AT1R)

別に、組織局所で AngⅡが産生され、auto/para-の発現が亢進していることが報告されている

crine 的に作用する局所的な RAS が存在し、臓器自(Arthritis Rheum. 2007;56:441-7.)。

体の機能調節に寄与していることが報告されている
2.研究の目的（Physiol Rev. 2006;86:747-803）。また、臓器の機能調節とは別に、炎症や線維化による病的な組織リ

関節リウマチにおいて、関節局所に RAS の構成要

モデリングにも働いていることが報告されており、素である AngⅡや AT1R の発現の亢進が、関節リウマ

AngⅡ変換酵素阻害薬や AngⅡ受容体阻害薬が疾患

チを代表する炎症性骨破壊に及ぼす役割については

進展抑制目的に使用されている(Ann Rev Pharmacol

解明されていない。そこで、関節炎による炎症性骨Toxicol. 2010;50:439-65.)。

破壊を自然発症するマウスにおいて、AngⅡが骨破壊

AngⅡによる組織局所での作用の１つとして、骨代に及ぼす影響を明らかにすることを目的とした。本謝に関与していることが知られている。
AngⅡは骨芽研究により、炎症性骨破壊における RAS の関与が明細胞の RANKL 発現誘導を介して破骨細胞分化を亢進

らかとなれば、アンジオテンシン II 及びその下流させ、AngⅡの持続投与は全身の骨量低下を引き起このシグナルを標的とした新規治療戦略の開発へと展すことが報告され (FASEB J. 2008;22:2465-75.)、

開できるものと考える。

RAS が亢進した高血圧マウスは骨量低下の表現系を3.研究の方法

呈すことが報告されている(J Bone Miner Res.
2009;24:241-50.)。また、コホート研究において、

まず、関節炎を自然発症するヒト TNF トランスジ

アンジオテンシン変換酵素阻害薬の使用が骨折リス

ェニック(TNFtg)マウスの足関節における AT1R の発クを下げることが報告されている(J Hypertens.

現を、定量 PCR とウエスタンブロット法、免疫組織

2006;24:581-9.)。

染色で評価を行った。次に、12 週齢の野生型及び－22－

TNFtg マウスに浸透圧ポンプを用いて AngⅡ(1.44

ES/BS や N.Oc/BS において、AngⅡ投与により WT とmg/kg/day)を 4 週間持続皮下投与し、16 週齢時に体比較して TNFtg マウスで骨びらん・破骨細胞形成が重、関節炎スコア(関節腫脹)を評価した。その後、増悪する傾向を認めた。
AngⅡ投与による全身の骨へマイクロ CT で足関節(距骨)の骨びらん、ならびにの影響として、海綿骨(第 5 腰椎・脛骨骨端幹)と皮全身骨への影響を評価するため、海綿骨(第 5 腰椎・質骨(脛骨中央骨幹)の解析を行った。対照群におい脛骨骨幹端)と皮質骨(脛骨中央骨幹)を撮影した。
骨て WT と比べて、TNFtg マウスでは脛骨中央骨幹でのびらんは、BV(Bone volume：骨量)と Ev/Rpv(Eroded

皮質骨幅が有意に低下していたが、その他の部位でvolume per repaired volume：骨びらん体積)で、海は変化は見られなかった。また、AngⅡ投与は WT や綿骨骨量は BV/TV(Bone volume per total volume)、

TNFtg マウスの全身骨に対して影響を及ぼさなかっ

皮質骨骨量はCt.Th(Cortical thickness：皮質骨幅)た。

で評価した。距骨の骨びらんは組織学的にも評価を次に、二重変異(TNFtg/AT1R−/−)マウスを用いて、行った(HE 染色：炎症細胞浸潤、Safranin O 染色：

AT1R 欠損が骨びらんを改善するか検証するために、軟骨破壊、TRAP 染色：破骨細胞形成をそれぞれ評価)。

TNFtg 群と TNFtg/AT1R−/−群の比較を前述の方法と評価は ES/BS(Eroded surface per bone surface：

同様の方法で行った。その結果、関節炎スコアや組

骨びらん面積)と N.Oc/BS(number of osteoclasts

織学的解析、骨びらん(図 2)において有意な差は認per bone surface：骨表面における破骨細胞数)で行

めず、骨破壊の改善は認めなかった。また、全身骨った。

(海綿骨や皮質骨)の評価においても同様に有意な差は認めなかった。

次に、TNFtg マウスと AT1R 欠損(AT1R−/−)マウス
を交配させ二重変異(TNFtg/AT1R−/−)マウスを作成
し、AT1R 欠損が TNFtg マウスの炎症性骨破壊ならびに全身骨に与える影響について上記と同様の方法で評価した。
4.研究の成果
TNFtg マウスの足関節で、AT1R 遺伝子とタンパクの有意な発現亢進を認めた。TNFtg マウスへの Ang
Ⅱ投与群と対照群(H2O 投与)の比較では、体重や関節炎スコア、組織学的な炎症細胞浸潤や軟骨破壊の関節炎を自然発症する TNFtg マウスを用いて、Ang程度に差は認めなかった。距骨の骨びらんは、AngⅡ

Ⅱが炎症性骨破壊に与える影響を検討した。その結投与により、野生型(WT)と比較して、TNFtg マウス

果、
AngⅡ投与下では関節炎の悪化は認めなかったが、で有意に悪化した(図 1)。組織学的な解析では、

骨びらんは増強した。つまり、AngⅡが炎症とは独立した機序で、TNF を介した炎症性骨破壊を増強させた可能性が考えられた。過去の既報より、AngⅡが骨芽細胞などの間葉系細胞に作用し RANKL 発現を亢進させることで、破骨細胞分化を促進することが報告されている。また、TNF などの炎症性サイトカイン
が滑膜細胞での RANKL 発現を増加させ、破骨細胞分化や成熟を促進させることが知られている(FASEB J.
2008;22:2465-75.)。これらの報告より、TNF によるRANKL 発現亢進を AngⅡが増強し、その結果、破骨細－23－

④ 産業財産権：0 件

胞分化を促進し、骨破壊を増強するという機序が考えられた。
AngⅡ投与下では関節炎に伴う骨びらんは増強したが、AT1R 欠損では軽減しなかった。すなわち、関節リウマチなどの炎症性骨破壊をきたす関節炎では、AngⅡが異常高値となると、骨破壊が増強する可能性が考えられた。腎血管性高血圧症、慢性腎臓病や肥満などによる RAS 活性化状態を合併した関節リウマチ患者では、RAS 活性化が骨びらんを増強している可能性があり、RAS 系阻害薬が骨破壊を軽減する可能性が示唆された。
5.主な発表論文等① 雑誌論文：1 件
Akagi T, Mukai T, Mito T, Kawahara K, Tsuji S,
Fujita S, Uchida HA, Morita Y. Effect ofAngiotensin II on Bone Erosion and Systemic
Bone Loss in Mice with Tumor Necrosis FactorMediated Arthritis
Int J Mol Sci. 2020; 21(11): 4145.
② 学会発表：3 件
Akagi T, Mukai T, Mito T, Kawahara K, Tsuji S,
Fujita S, Uchida HA, Morita Y. Excessive
Angiotensin II exacerbates bone erosion in amurine tumor necrosis factor-mediated arthritis
model. 第 65 回日本リウマチ学会総会・学術集会.
2021/4/26 WEB 開催.
Akagi T, Mukai T, Mito T, Kawahara K, Tsuji S,
Fujita S, Uchida HA, Morita Y. Effect ofAngiotensin II on Bone Erosion and Systemic
Bone Loss in Mice with Tumor Necrosis FactorMediated Arthritis. The 22nd Asia Pacific
League of Associations for Rheumatology (APLAR
2020) 2020/10/24 Virtual congress
赤木貴彦, 向井知之, 河原恭子, 守田吉孝. 炎症性骨破壊におけるアンジオテンシンⅡの役割の検討.
第 40 回日本骨形態計測学会 2020/06/18 WEB 開催.
③ 図書：0 件－24－