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食嗜好性を高めるうま味・甘味増強作用の分子メカニズムの解明＜平成 26 年度助成＞

食嗜好性を高めるうま味・甘味増強作用の分子メカニズムの解明

山下敦子・安井典久（岡山大学大学院 医歯薬学総合研究科）

うま味および甘味は、ヒトも含め多くの生物が高ヘテロ二量体 LBD のアロステリック部位に結合するい嗜好性を示す味である。これらの味では、昆布とイノシン酸によって相乗的に増強する作用であるこ鰹節の合わせだしを日本人が好むように、ある味物とが報告されている 2)。また、このような相乗効果質に対する味覚を別の味物質が増強することで、よは長らく T1r1/T1r3 ヘテロ二量体に特徴的な機能とり嗜好性が高まる現象が存在することが知られてい考えられてきたが、近年、甘味受容体 T1r1/T1r3 ヘる。この味増強作用は、さまざまな食物の組み合わテロ二量体にも同様に甘味物質結合を相乗的に増強せから、より食味のよい料理を生むなど、私たちのする作用を示す化合物が存在することが報告されて食生活をより豊かなものにしてくれる。

おり 3)、T1r ヘテロ二量体が共通して有する機能的グルタミン酸やショ糖などのうま味や甘味を呈す特徴と考えられる。

る化学物質は、口腔内の味感覚器である味蕾を構成

クラス C 型 GPCR の LBD は、Venus-flytrap module

する味細胞に存在する、うま味受容体や甘味受容（VFTM）と呼ばれる立体構造をとっていることが体によって感知される 。これらの受容体は、クラ知られている。これまでに結晶構造が解明されて

ス C 型 G タンパク質共役型受容体ファミリーであいる代謝型グルタミン酸受容体 LBD4) や GABA 受容

る、T1r タンパク質で構成されている。具体的には、

体 B-LBD5) の構造から、これらの受容体のアゴニス

T1r1 と T1r3 のヘテロ二量体がうま味受容体、T1r2

トは、VFTM に存在する２つのサブドメインであると T1r3 のヘテロ二量体が甘味受容体として機能しLB1 と LB2 の間の隙間（クレフト部）に結合するこており、これらは脊椎動物で保存されている。クラとが報告されており、この結合によって引き起こさス C 型 GPCR は、細胞外に存在する 500 アミノ酸れる LBD の構造変化が受容体活性化を誘起すると考残基程度あるリガンド結合ドメイン（LBD）が、細えられている。このことから、甘味とうま味の受容胞内へのシグナル伝達を引き起こすアゴニストの結体についても、同じ隙間に味物質が結合することで、合部位となっている。甘味とうま味の受容体の場合、味物質感知の情報が味細胞内に伝達される受容体作T1r3 が両受容体共通の構成要素となっていること用の起点になると推測されてきた。一方、アロステもあり、グルタミン酸やショ糖など主要なうま味物リック制御因子に関しては、これまでの他のクラス質や甘味物質の結合部位は、それぞれ T1r1 およびC 型 GPCR の構造研究では、LBD に結合する因子のT1r2 の LBD であると考えられている。一方、味増結合部位や作用メカニズムなどの情報は乏しい。う強物質の一部には、これらの味覚受容体の味物質のま味受容体・甘味受容体についても、味増強物質の結合部位とは異なる部位に結合し、味物質の結合を変異体実験による結合部位探索への試みはあるものアロステリックに制御するものが存在する。例えばの、部位同定や作用メカニズムの解明は途上にある。

先に挙げた「昆布と鰹節の合わせだし」のおいしさ

T1r 味覚受容体の構造研究は、LBD のみにおいては、うま味受容体である T1r1/T1r3 ヘテロ二量体

も、タンパク質の組換え発現が極めて困難であっLBD へのグルタミン酸の結合が、同じく T1r1/T1r3たため、大きく遅れていた。しかし、筆者らの研

1)

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浦上財団研究報告書

Vol.25（2018）

究グループでは、脊椎動物のモデル生物であるメ化前に添加してインキュベーションする、あるいはダカの T1r2a の LBD と T1r3 の LBD のヘテロ二量PD-10（GE Healthcare）を用いて化合物をあらかじ体（T1r2a/3LBD）であれば、良好な組換え発現タめ添加したバッファーに置換する、のいずれかの手ンパク質が生産できることを見出し 6)、本研究開始

法を用いて、タンパク質試料に対し結合させた。

時には、その結晶構造を明らかにすることに世界に結晶化は、PEG400 と PEG1500 を沈殿剤に用い先駆けて成功していた 。さらに、この受容体にアて、シッティングドロップ蒸気拡散法により 20˚Cゴニストとして作用する L- グルタミンが、これまで行った。得られた結晶はグリセロールを凍結保護で推測されていたように T1r2a のクレフト部に結剤として液体窒素中で凍結した。

7)

合していることも確認していた。そこで、このメダ
カ T1r2a/3LBD をプローブとして用いて、T1r に存

結晶構造解析

在する味増強作用、すなわち味物質結合のアロステ

X 線回折強度データ収集は SPring-8 のビームラリック制御の分子メカニズムを解明することを目的

イン BL41XU にて、検出器 PILATUS 6M を用いてに、研究を実施した。

実施した。Se 含有化合物、S 含有化合物、Yb3+ の異常分散データ収集の際はそれぞれ波長 0.979 Å, 1.9Å, 1.385 Å の X 線を用いて、それ以外の場合は波長実験方法

1Å のデータを用いてデータ収集を行った。得られたデータは HKL2000 にて処理し、CCP4 を用いた

実験材料
Selenomethyl-N-acetylglucosamine（SeMeNAG）

アロステリック制御因子非結合構造の情報 7) を分子

お よ び Selenoethyl-sialic acid（SeEtSIA） は 岐 阜 大

置換法で構造を決定して、CCP4 にて構造の精密化

学応用生物科学部・安藤弘宗准教授（研究当時、現を行った。

教授）よりご供与いただいたものを実験に用いた。

変異体解析
T1r2a/3LBD とアロステリック制御因子候補

T1r3LBD 変異体は常法により作製し、単独およびT1r2aLBD の共存下で一過性発現を行って、ウェス化合物の結晶化結晶化のためのタンパク質試料は、ショウジョタンブロッティングによる発現量解析、多色蛍光検

ウバエ S2 細胞による組換え発現で生産した 。C

出クロマトグラフィー 8) による折りたたみ状態と多末側に Factor Xa 認識配列と FLAG タグを融合した量体形成の解析を行った。

7)

T1r2aLBD と T1r3LBD を恒常的に共発現する S2 細胞安定発現株を構築し、細胞培養を行って、分泌等温滴定カロリメトリーによる相互作用解析

画 分 を 回 収 し た。 こ の 画 分 に 対 し、 抗 FLAG タ グ

T1r2a/3LBD は、上記「T1r2a/3LBD とアロステ抗体レジンを用いたアフィニティークロマトグラ

リック制御因子候補化合物の結晶化」の項と同様に

フィー、Factor Xa 分解反応による FLAG タグ切除、アフィニティークロマトグラフィー精製し、iTC200

Endo H 分解反応による糖鎖切除を行ったのち、結（GE Healthcare）を用いてアロステリック制御因子晶化に必要な抗 T1r2a 抗体 Fab 断片をタンパク質に候補化合物との相互作用解析を行った。

結合させ、さらにゲルろ過クロマトグラフィー精製を行って、結晶化に用いる試料を調製した。各種の実験結果

アロステリック制御因子候補化合物（具体的な化合物は「実験結果」の項に記載）は、上述のように調製した T1r2a/3LBD に対して、種々の濃度で、結晶アロステリック結合部位の探索
本研究では、筆者らが構造解析に成功しているメ食嗜好性を高めるうま味・甘味増強作用の分子メカニズムの解明

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ダカ T1rLBD を用いることで、味物質結合をアロスについては応答を示さないとの報告がある。一方、テリックに制御する因子の結合部位を同定し、構造これらの物質がアロステリック制御因子として機能と機能の両面から分子メカニズムの理解に重要な情する可能性を考え、L- グルタミンと共存させた状態報を得る、との研究戦略をとった。一方、アロステで結晶化を行った。このとき、結晶構造解析によるリック制御因子については、イノシン酸など私たち物質の結合の同定を確実かつ容易に行うため、糖のヒト T1r に対し味増強作用を示す物質は知られていO 原子を S または Se 原子に置換した糖誘導体であるものの、メダカ受容体に対して作用するものはまる、1-thio-ϐ-D-glucose, 1-thio-ϐ-D-galactose, isopryopyl

だ明らかになっていない。そこでまず、食物に含まϐ-D-1-thiogalacoside, SeMeNAG, SeEtSIA を結晶化に用れている可能性の高い、(1) 核酸および関連化合物、いた。これらの結晶について、それぞれ S および Se(2) 糖および関連化合物、(3) アミノ酸および関連化の特性吸収端波長近傍である 1.9 Å および 0.979 Å合物、(4) イオンについて、候補化合物を添加してにて X 線回折強度データ収集を行い、化合物の電子T1r2a/3LBD の結晶構造解析を行い、T1r2a に存在密度の確認に加え、S 原子または Se 原子由来の異常する味物質結合部位とは異なるアロステリックな部分散ピークの確認も試みた。しかしながら、得られ位に結合がみられるかどうかの確認を行った。そのたデータから、これらの化合物に該当するとみられ結果、後述するように、(1) 核酸・(2) 糖およびそれる電子密度や異常分散ピークを確認することはできらの関連化合物については、有意な結合が確認できなかった。このことから、今回試した条件においてなかったものの、(3) アミノ酸および (4) イオンを用は、T1r2/3LBD に対して、これらの化合物の有意ないて、アロステリック結合部位を見出すことに成功結合はみられなかったと考えられる。

した。

(3) アミノ酸および関連化合物(1) 核酸および関連化合物

魚類の味覚応答は、ベタインによって増強される

ヒト T1r1/T1r3 において呈味作用・味増強作用との報告がある 9)。そこで、ベタインが T1r2a/T1r3がみられるイノシン酸（IMP）、グアニル酸（GMP）のアロステリック増強因子となる可能性を考え、ベや、同じくプリン塩基を有するアデノシン三リン酸タイン関連化合物であるサルコシン（メチルグリシ（ATP）について、メダカ T1r2a/3LBD のアゴニスン）、ジメチルグリシン、ベタイン（トリメチルグ

トである L- グルタミンと共存させた状態で結晶化リシン）について、アゴニスト L- グルタミンと共存し、得られた結晶の構造解析を行った。しかしながさせた状態で結晶化を行った。しかしながら、結晶

ら、結晶構造において、これら化合物に該当すると構造において、これら化合物に該当するとみられるみられる電子密度は確認できなかった。このことか電子密度は確認できなかった。このことから、今回

ら、今回試した条件においては、T1r2/3LBD に対し試した条件においては、T1r2/3LBD に対して、これて、これらの化合物の有意な結合はみられなかったらの化合物の有意な結合はみられなかったと考えらと考えられる。なお、他にグアノシン、アデニン、れる。

チミンとの結晶化も試みたが、これらについては良好な結晶が得られなかった。

次に、L- アミノ酸そのものの結合を確認するため、メチオニンの S 原子が Se 原子に置換されているセレノメチオニンを T1r2a/3LBD に結合させ、Se の特(2) 糖および関連化合物性吸収端波長近傍である 0.979 Å にて X 線回折強度

メ ダ カ T1r2a/T1r3 は、L- ア ラ ニ ン や L- グ ル タ

データ収集を行った。セレノメチオニンの結合方法

ミンなどに対して応答を示し、哺乳類などの T1r2/について、インキュベーション、バッファー置換なT1r3 ヘテロ二量体が応答を示す糖などの甘味物質

ど種々の条件を用いたものを結晶化してデータ収集

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浦上財団研究報告書（A）

図１Vol.25（2018）（B）

結晶構造解析により見つかったアロステリック因子結合候補部位 . （Ａ）T1r2a/3LBD- セレノメチオニン複合体結晶の Se の異常分散ピーク .
（Ｂ）T1r2a/3LBD-Yb3+ 複合体結晶の Yb3+ の異常分散ピーク . Ａ , Ｂとも 3.5 σの異常分散電子密度図を赤色で示す。

を行ったところ、PD-10 にてバッファー置換を行い、(4) イオン

L- グルタミンを除去してセレノメチオニンに置換しクラス C 型 GPCR の代謝型グルタミン酸受容体でた結晶について、セレノメチオニンに該当するとみは、Ca2+ などの陽イオンがアゴニストへの応答や結られる電子密度および Se 由来の異常分散ピークを合を増強するとの報告がある 10,11)。そこで、同様の確認することができた。

作用が T1r2a/3LBD にも見られるかどうかを検証す

セレノメチオニンの結合は、アゴニストであるるため、X 線結晶構造解析により異常分散ピークのL- グルタミンの結合部位としてこれまで同定できて確認が可能な Yb3+ や Ho3+ などのランタノイドイオ

いた T1r2a のクレフト部で、L- グルタミン結合部ンを L- グルタミンと共存させた状態で結晶化を行っ位と全く同じ部位に確認された。さらにこの位置のた。両者より結晶が得られ、より良質の結晶が得ら結合に加え、これまで予想されていなかった、T1r3れた Yb3+ 結合結晶について、Yb の特性吸収端波長のクレフト部の該当する部位にもみられることが明近傍である 1.385 Å にて X 線回折強度データ収集をらかになった（図 1A）。

行った。その結果、L- グルタミンの結合部位とは異セレノメチオニンの T1r2a/3LBD への結合を検なる複数の部位に、Yb3+ の結合を示す異常分散ピー証するため、等温滴定カロリメトリーによる結合実ク が 確 認 さ れ た（ 図 1B）。 具 体 的 に は、T1r2a と験を行った。結合実験はメチオニンを用いて実施しT1r3 の相互作用面近傍や、T1r3 のクレフト部で、たところ、T1r2a/3LBD 溶液へのメチオニン添加に上述したアミノ酸結合部位とは異なる開口部近傍な伴い発熱反応が観測され、結合定数 K a 値が 5.97 ±どの部位に、比較的高いピークが検出された。これ

5.71 × 10 M （K d 値 16.8µM）と求められた。ならの結果から、陽イオンも含めたアロステリック制

お、同じ条件でアゴニストである L- グルタミンにつ御因子の結合部位として、複数の候補部位の存在がいて結合定数を求めたところ、K a 値は 2.74 ± 0.363示唆された。

4-1× 10 M （K d 値 3.65µM）であった。このことから、
5-1メチオニンが確かに T1r2a/3LBD に結合することがT1r3LBD に 存 在 す る ア ロ ス テ リ ッ ク 結 合 部確認でき、極めて類似した物理化学的性質を持つセ位の意義の検証

レノメチオニンも同様の結合をしていること示唆する結果を得た。

X 線結晶構造解析による結果から、T1r2a/3LBDについて、複数のアロステリック制御因子結合部位候補を見出すことができた。特に、これまで味物質

食嗜好性を高めるうま味・甘味増強作用の分子メカニズムの解明

（A）

図2（B）

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（C）

T1r3 変異体発現解析 . （Ａ）Western blotting による発現量比較解析 . （Ｂ , Ｃ）T1r2/3LBD の多色蛍光検出ゲルろ過クロマトグラフィー
による T1r3LBD の凝集・会合状態解析 . 黒矢印は T1r 二量体の溶出位置を示す . （Ｂ）T1r2a/T1r3 野生型 LBD,（Ｃ）T1r2a/T1r3-S300E
変異体 LBD.

結合に直接関わらないと考えられてきた T1r3 のク造が不安定化していることを示している。これらのレフト部に、アミノ酸およびランタノイドイオンの結果から、T1r3 に存在するアロステリック部位は、複数の候補因子の結合がみられたことから、この何らかの物質を結合することで、T1r3LBD の構造を部位に対するアロステリック因子の結合の意義に安定化し、その結果として T1r2a/3 ヘテロ二量体の興味を持った。そこで、この部位に変異を導入し、膜移行を促進し、また細胞膜に提示されている受容T1r2a/3LBD にどのような影響があらわれるか確認

体構造を安定化することで、受容体の味物質に対すを行った。

る応答性を高める方向に機能する可能性が示唆されメダカ T1r3 のクレフト部には Ser300 のアミノた。

酸残基が存在するが、メダカ以外の多くの動物種では、該当する部位がグルタミン酸になっているもの考察がみられる。そこで、このアミノ酸をグルタミン酸に変異すると、立体構造には大きな影響を与えず、本研究では、T1r3 に対する物質結合を見出し、そアロステリック因子の結合に何らかの影響が与えらの結合が受容体構造安定化や膜移行の効率に寄与しれることを期待し、T1r3 に S300E 変異を導入し、ている可能性を明らかにした。これまでに得られてT1r2a/3LBD ヘテロ二量体の発現解析を行った。

いる T1r3LBD の結晶構造では、全てこの部位に何

その結果、T1r3-S300E-LBD 変異体は、正常に膜らかの物質が結合しており、クレフト部を閉じたコ移行できているものについては T1r2aLBD とヘテンフォメーションで観察されている。このことから、

ロ二量体形成を行うことができるものの、正常に膜この部位への物質結合は、T1r3LBD のコンフォメー移行する分子自体が減少しており、結果としてヘテションを、構造安定化に有利な閉じた形に安定化すロ二量体の膜移行しているものの発現量が減少してる役割を持つ可能性が考えられる。T1r 味覚受容体いることが明らかとなった。さらに、蛍光検出ゲルにおける T1r3 の機能的役割はこれまで明確ではな

ろ過クロマトグラフィーの結果から、T1r3-S300E-かったが、本研究は、T1r3 が T1r2 同様リガンド結LBD 変異体は野生型に比べ凝集している分子が多く合能を持つことを明らかにしたものである。T1r3 に存在することが判明した（図 2）。この結果は、変対するリガンド結合の機能的意義として、本研究で異体では野生型に比べ分子の生理的な折りたたみ構示された受容体安定化に対する寄与に加え、味物質

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浦上財団研究報告書

感知に関わるその他の受容体機能への関与にも興味

Vol.25（2018）

謝辞が持たれる。今後は、この部位への物質結合が、受本研究の遂行にあたり、研究助成を賜りました公

容体応答反応に対して何らかの影響を与えているか

益財団法人 浦上食品・食文化振興財団ならびに関係についても、詳しく解析してく必要があるだろう。

者の皆様に、心から感謝申し上げます。また X 線回

また、今回イオン結合実験で用いたランタノイド

折強度データ収集および結合解析では、公益財団法

イオンは、Ca とイオン半径が近似しているため、

人 高輝度光科学研究センターの長谷川和也博士、奥生理学的に重要なイオンである Ca の結合と何らか村英夫博士、岡山大学薬学部 渥美菜奈子氏、変異体の関係がある可能性がある。加えてランタノイドイ

実験では岡山大学医歯薬学総合研究科 細谷麻以子

オンは、高い分極率を持ち、HSAB 則における「柔氏、薬学部 平澤輝一氏のご協力を得ました。本研究らかい酸（soft acid）」に該当する。この soft acid のにご協力いただいた方々に御礼申し上げます。

2+2+結合部位は、他のタンパク質において、アミノ基など有機化合物中の塩基性官能基の結合部位となっているケースがみられる。今回みられた結合部位の１つは、上述した T1r3 クレフト部で、アミノ酸結合部とは異なる開口部に近い部分であり、この部位への結合も、T1r3LBD の閉じた構造の安定化に寄与することが考えられ、上述した T1r3 に対するリガンド結合と同様の機能的意義を持つと推測される。さらに、クラス C 型 GPCR のシグナル伝達では、二量体相互作用変化がみられることが報告されており 12)、二量体相互作用面近傍の結合部位は、相互作用様式に何らかの影響を与える可能性が考えられる。これらのことから、今回ランタノイドイオン結合で明らかとなったアロステリック因子結合候補部位は、実際に受容体応答に何らかの影響を与える可能性がある。本研究で得られた情報を足がかりに、アロステリック制御因子の結合と作用について、今後さらに研究を進めていきたい。

参考文献

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Elucidation of molecular mechanisms of umami and sweet taste enhancemen

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Elucidation of molecular mechanisms of umami andsweet taste enhancement
Atsuko Yamashita, Norihisa Yasui
Graduate School of Medicine, Dentistry and Pharmaceutical Sciences,
Okayama University
Umami and sweet taste enhancement phenomena, such as that found withJapanese soup stock made from dried kelp broth along with dried bonito, areat least partly explained by taste receptor functions. Umami and sweet taste
substances are perceived by members of class C GPCR, T1r proteins, which areconserved among vertebrates. Specifically, one heterodimer of T1r1 and T1r3serves as the umami taste receptor, while another of T1r2 and T1r3 serves as thesweet taste receptor. T1r receptors possess a large ligand binding domain (LBD) atthe extracellular side, and major taste substances are considered to bind to the LBDof the unique subunit of the T1r receptors (i.e. , either T1r1 or T1r2). In addition,some taste enhancers, such as inosine monophosphate, an ingredient of bonito, are
known to bind to the allosteric site in T1rLBD, and enhance the binding of tastesubstances, such as monosodium glutamate, an ingredient of kelp. However, due tothe limited structural information regarding T1rLBD, the molecular mechanisms of
the allosteric modulation of taste substance perception by T1r receptors have notcompletely been elucidated. Further, a structural analysis of the T1r receptors has
been hampered by difficulties in recombinant sample protein preparation.
Recently, our group found that a heterodimer of T1r2a and T1r3 LBD frommedaka fish, a model organism of vertebrates, exhibits proper recombinantexpression. We successfully solved the crystal structure of T1r2/3LBD with anagonist L-glutamine bound at the cleft between two subdomains, LB1 and LB2,
in T1r2a. In this study, we attempted to elucidate the molecular mechanisms oftaste enhancement, with a particular focus on the allosteric modulation of taste
perception, by utilizing medaka fish T1r2a/3LBD as a structural and functional
probe of T1r proteins.
We first searched for allosteric ligands and their binding sites at T1r2a/3LBD,
testing various compounds among possible ingredients in foods, including
nucleotides, sugars, amino acids, ions, and their derivatives, and analyzed theirbinding via X-ray crystallography. We found that some amino acids and cations
bind at the cleft between LB1 and LB2 in T1r3. In order to assess the effect ofligand binding at the site, we introduced a mutation into T1r3, so as to perturb
ligand binding at that site. The mutant exhibited a lower level of membranetrafficking and more aggregation fractions, compared to the wild type protein.
These results suggest that binding of the ligand at the allosteric site found in T1r3improves the protein’s stability, resulting in a higher level of membrane trafficking
as well as higher receptor stability at the plasma membrane, thus contributing toan enhanced level of taste perception by the receptor. We also identified several
additional candidate sites for allosteric modulator binding.