（１）磁気的免疫検査システムの開発(a) 磁気的免疫検査法
免疫検査とは、血液中に存在する疾患由来の蛋白質や食品中の病原菌等のバイオ物質を検出する検査法であり、医療・バイオ分野における診断・検査法として広く用いられています。これらのバイオ物質は抗原と総称されており、その検出にはバイオ物質に特異的に結合する抗体が用いられます。この抗原―抗体の結合反応を検出するため、抗体にはマーカーが付加されており、このマーカーからの信号を検出します。現在は光学マーカーが一般的に用いられており、検出は光センサを用いて行われています。
本研究では、光学マーカーに代わり磁気マーカーを用いて、抗原―抗体の結合反応を磁気的に検出するシステムを開発しています。この磁気的手法には光学的手法にはない、(1)高感度検出、(2)迅速検出、(3)広いダイナミックレンジ、等の特徴があり、新しい免疫検査法として期待されています。

磁気ナノマーカーを用いた免疫検査
磁気ナノマーカーを用いた免疫検査

磁気信号

磁気センサ

磁気マーカー
検出抗体
バイオ物質
(抗原)
固定抗体

蛋白質
病原菌
がん細胞
環境有害物質DNA

磁気的検査法の利点
1. 迅速検査 （洗い工程によるBF分離の省略）
2. 高感度 （アトモルレベルの微量検出）
3. 広いダイナミックレンジ （4桁の検出範囲）(b) 液相免疫検査法
免疫検査では、B/F(Bound/Free)分離といわれる洗浄工程を用いた固相法が一般に用いられています。マーカーで標識された検査抗体を投入すると、一部は抗原に結合しますが、他は未結合のまま残ります。前者を結合(Bound)、後者を未結合(Free)マーカーと呼び、未結合マーカーは“洗い”と呼ばれる洗浄工程により取り除かれます。この洗浄工程を BF 分離と呼びます。この BF 分離工程は手間と時間がかかるため、検査の迅速化を阻害する大きな要因となっています。
磁気マーカーを用いますと、この BF 分離の工程を省くことが出来、液相検査による検査の迅速化が可能となります。すなわち、磁気マーカーの溶液中のブラウン緩和現象を利用することにより、結合マーカーと未結合マーカーが混在した状態でも結合マーカーのみを検出することが可能となります。これは、磁気的手法の大きな特長の一つです。
なお、液相検査の方法としては、固定用基板を用いる方法と固定用の高分子ビーズを用いる方法があります。
信号
結合マーカー
結合マーカー
信号

信号

未結合マーカー(ブラウン運動）磁気信号ゼロ結合(a) BF分離を用いた固相法

未結合高分子ビーズ(b) 基板を用いた液相法(c) 高分子ビーズを用いた液相法(c)高分子ビーズを用いた液相検査
高分子ビーズを用いた BF 分離なしでの液相検査法の原理について簡単に紹介します。
磁気マーカーはその大きさが 100 nm 程度ですので、熱雑音の影響のため溶液中ではランダムに移動・回転しています。この運動はブラウンの並進・回転運動と呼ばれています。免疫検査には、磁気マーカーのブラウン回転運動を用います。
磁気マーカーは磁気モーメント m を持っています。この磁気モーメントは大きさと方向を持ったベクトル量となります。従って、磁気マーカーがランダムに回転しますと、磁気モーメントもランダムとなり、磁気マーカーの集合体の磁化 M は時間とともにexp(-t/τ)のように指数関数的に減衰することになります。この緩和現象はブラウンの磁気緩和と呼ばれており、その緩和時間 τ は磁気マーカーの体積に比例します。
未結合マーカーの粒子直径は dpF=120 nm であり、緩和時間はτBF=0.65 ms となります。
一方、高分子ビーズに固定された結合マーカーのブラウン回転は高分子の直径 dpB=6.7µm で決まり、τpB=110 s となります。このように、両者のブラウン緩和時間には非常に大きな違いがあります。この違いを利用することにより、両者を磁気的に識別することが可能となります。
両者の識別法としては、時間領域での測定では印加磁界を切ったあとの磁気緩和の違いを用います。図に示すように未結合マーカーからの信号は時間とともに急激に減衰し、短時間でゼロとなります。一方、結合マーカーからの信号は長時間保持されることになります。従って、測定時間を適切に選べば、結合マーカーのみを検出することが出来ます。
また、周波数領域での測定では、交流磁化率（実部χʼ、虚部χ”）の周波数依存性を用います。図に示すように、未結合マーカーは高い周波数まで応答できるため、その磁化率は高周波にまで及びます。これに対して、結合マーカーは低周波でのみ大きな値を示し、高周波数ではゼロとなります。従って、測定周波数を適切に選べば、未結合マーカーのみを検出することが出来ます。なお、図で磁化率の虚部はある周波数でピーク値を持ちますが、この周波数はブラウン緩和時間により f=1/2πτと与えられます。

ブラウン緩和時間 τ =結合

未結合

磁気モーメント

高分子
ビーズ
ターゲット

測定時間

1B ou ndχ', χ"M0.80.60χ′ =

χ’
Bound

Free

20 40 60 80 10 0t (m s)
磁気緩和

χ”

0-4-3-2-1012310 10 10 10 10 10 10 10f (Hz)
交流磁化率

χ01 + (ωτ )2χ ′′ = j

0.40.20 .01

測定周波数

1.21F ree

2k BT

未結合マーカー
粒子直径：dpF=120 nm
緩和時間：τBF=0.65ms
結合マーカー粒子直径： dpB=6.7 mm
緩和時間： τBP=110sm0.1πη d 3pχ 0ωτ
1 + (ωτ )2(d) 測定例
磁気緩和測定と交流磁化率測定を用いた液相での免疫検査実験の例を示します。最初に磁気緩和測定法を用いた IgE と呼ばれる蛋白質の検出結果を示します。なお、IgE はアレルギー疾患に関連した蛋白質です。図に示すように、従来の BF 分離を用いた固相法と、固定用高分子ビーズを用いた液相法による検出を行い、両者を比較しました。図に示すように、両者はよく一致しており、BF 分離なしでの液相検査が正確に行われていることがわかります。また、アトモルレベルの微量な IgE を高感度に検出できることも分かります。さらに、図に示すように、検出時間は 5 分程度で充分であり、迅速検査が可能なことが分かります。

markersignalIgEPolymerbeads
液相固相350LiquidSolid21040010011030sΦ (mΦ )signal Φs (mΦ0)

102010-110010110210310weight (atto-mol)
IgEの量と磁気信号の関係

41000.5 123 5 7.5 10t (min)反応時間と磁気信号の関係

次に交流磁化率測定による検出結果を示します。この場合は、高分子ビーズに固定したビオチンと呼ばれる蛋白質を検出しています。結合マーカーと未結合マーカーが混在した試料の交流磁化率の実部の周波数依存性を図に示します。図で Np は高分子ビーズの数、即ちビオチンの数を表します。図に示すように、Np の増加に伴って、試料の磁化率が減少しています。これは、結合マーカーが増加し、未結合マーカーが減少していることに対応します。従って、磁化率の減少分∆χʼが結合マーカーの量を表すことになります。図に示すように、減少分∆χʼは Np 即ちビオチンの数に比例しており、液相検査が正確に行われていることを示しています。

1N =0p4100

1.7x1080

10.2x10460
400.8

3.4x104

0.6∆χ'χ' (arb. unit)120∆χ’30Hz
90 Hz
150Hz

0.4
0.220
0210f (Hz)
交流磁化率の実部の変化

310(a)

0051 10
Np51.5 10(a)磁化率の減少分と結合マーカー量の関係

磁気的免疫検査の詳細については以下をご覧下さい。
磁気的免疫検査（ファイル）

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