〈第 28 回３山﨑賞〉

分解者のキチナーゼ活性に関する研究

1. はじめに夏にはいろいろなところでセミの抜け殻を見つけることができる。しかし、夏以降になると発見できなくなる。
「何がぬけがらを分解しているのだろう。」これが先輩が疑問に思ったことであり、この研究の始まりだった。文献を調べ、セミの抜け殻のキチン質を分解しているのは放線菌であると予想を立て、１年目の研究を始めた。
2．キチンについて① セミの抜け殻はキチンという物質でできている。
② 甲殻類、貝類及び昆虫類の殻、酵母、椎茸などの真菌類等、自然界に広く分布している。
③ 地球上での生産量はセルロースに次いで多く、年間約１千億トンと推測されている。
④ キチンから生成されるキトサンは医療素材、衣類、化粧品、食品などに広く利用できる。
⑤ キトサンの生成に大量のアルカリ廃液が発生するため、現在は数千トンしか使われておらず、そのため世界最大の未使用バイオマスともいわれている。
本研究で探索しているキチナーゼの酵素活性をもつ分解者は、キチンのバイオマスとしての安全利用につながる可能性も持っている。
3．１年目の研究の要約
抜け殻の分解をしているのは放線菌であると予想し、その培養を試みた。温浴の温度や抗生物質の代わりの界面活性剤の添加、植え付け方法等を変えて、高校の実験室で行うことのできる培養条件を探った。その結果、胞子の状態でいるものを目覚めさせるため温浴を行い、洗剤を添加した方が一般細菌のコロニーの数が減り、放線菌などの菌類が観察しやすくなることがわかった。
放線菌の同定に当たっては国立沼津高等工業専門学校の蓮實文彦教授にご協力いただいた。培地は菌類用の Yeast-Starch-Agar 培地を用いた。培地の組成は表 1 に示す。
表１ Yeast-Starch-Agar 培地組成表

・酵母エキス1g

・可溶性デンプン 5g

・蒸留水 500mℓ

・寒天7.5g

Ph7.3 120℃で 15 分間滅菌

4．２年目の研究の要約
2 年目はまず培地の改良を行った。Yeast-Starch-Agar 培地では養分が多すぎることを教えていただき、腐食酸培地を用いることとした。腐食酸培地の組成を表 2 に示す。腐食酸としてフミン酸を加えている。腐食酸培地の方が Yeast-Starch-Agar 培地よりも細菌が少なく放線菌の観察がしやすいことがわかった。次に、放線菌は常に土の中に多く存在するわけではないと考え、放線菌を増やすために学校の裏に実験区をつくり、図１の A にすり潰した抜け殻を撒き、土の中にキチンが多い状態を作り、B には何も撒かなかった。Ａ区の土を 35℃、100℃で温浴したものから、それぞれ放線菌を培養することができた。このことから実験区に抜け殻を撒くという方法で土の中の放線菌を増やせることがわかった。

- 66 -

図１ 実験区の様子

表２ 腐食酸培地組成Ph7.3 120℃で 15 分間滅菌
・CaCO3 0.04g・FeSO4・7H2O 0.02g ・KCl 3.42g

・MgSO4・7H2O 0.1g ・Na2HPO4 1.0g
・蒸留水 2ℓ ・寒天 36g・ フミン酸 2.0g
・アリナミン 10mℓ
5．今年の研究の目的
昨年までの研究から浮かび上がってきた『放線菌以外にもキチンを分解できる分解者がいるの昨年までの研究から浮かび上がってきた『放線菌以外にもキチンを分解できる分解者がいるのではないか』という疑問から、放線菌に限らず抜け殻に付着する分解者を探すこととした。また、という疑問から、放線菌に限らず抜け殻に付着する分解者を探すこととした。また、『培養された放線菌は本当にキチンを分解しているのか培養された放線菌は本当にキチンを分解しているのか』という疑問についてについては、培養された分解者のキチナーゼ活性の強さを調べることとした。
6．実験Ⅰ 土の中に生息している分解者の培養(1)目的 放線菌に限らず、抜け殻に付着する分解者を探す。
抜け殻に付着する分解者を探す。
(2)方法ア

学校裏の松林に抜け殻を埋め、土の中の分解者に抜け殻を分解させる。

埋めた場所は 4 か所で、常緑樹の下で薄暗く、地面は一面落ち葉が覆っているところの 2地点を A，B 地点（図２２））、松の下で日当たりがよく、草がたくさん生えているところの 2地点を C，D 地点（図３）とした。
）とした。
イ

２週間後、抜け殻を掘り出す
抜け殻を掘り出す（図４）。

ウ胞子の状態でいるものを目覚めさせるため、胞子の状態でいるものを目覚めさせるため、抜け殻の温浴を行う。

エ

培地に植えつける。

「培養という方法は、その培「培養という方法は、その培地で生育できる微生物しか得られない」という指摘をいただいできる微生物しか得られない」という指摘をいただいたので、多くの微生物を得るため、多くの微生物を得るため、1 年目に使用した Yeast-Starch-Agar
Agar 培地と 2 年目に使用した腐食培地の２種類の培地を用いた。
腐食培地の２種類の培地を用いた。
オ

培養条件は、抜け殻の埋めないもの・埋めたもの、温浴の温度は温浴なし・温浴の温度は温浴なし・50℃・100℃、培養温度 37℃とし、恒温器で培養した。
℃とし、恒温器で培養した。埋めた場所周辺の土も同じ条件で培養した。
埋めた場所周辺の土も同じ条件で培養した。
カ 対照実験として、何も植えつけていない培地も 37℃に保った。

図２ A,B 地点

図３ C,D 地点

図４ 掘り出した様子

(3)結果
ア

掘り出した抜け殻の状態
B 地点の抜け殻を掘り出したところ、地点の抜け殻を掘り出した
抜け殻は形を残しておらず、形を残しておらず、黒っぽくなっていた。

C 地点の抜け殻は白っぽっぽくなっており、形は残っていたがもろく、ピンセットで、形は残っていたがもろく、ピンセットで摘むとすぐに崩れた。
イ

腐食酸培地で培養されたコロニーの数培養されたコロニーの数培養されたカビ、細菌
培養されたカビ、細菌、放線菌のコロニー数の一例を表3 に示す。コロニーとして数をコロニーとして数を数えられなかったものは数えられなかったものは、広がりの大きさを+の数で示した。Ａ，Ｂ地点は近いため、土の数で示した。Ａ，Ｂ地点は近いため、土- 67 -

はＢ地点で採集したものを培養した。Ｃ，Ｄ地点は埋めた抜け殻を見つけられなかったた
め結果の記載がない。
埋めてない抜け殻は、カビが埋めてない抜け殻は、カビが+++と多かったが、細菌・放線菌は培養できなかった。埋と多かったが、細菌・放線菌は培養できなかった。埋めた抜け殻からは主にカビと放線菌が培養され、細菌はほとんど培養されなかった。
「温浴なし」の条件では、放線菌のコロニーは「土に埋めた抜け殻」のＡ地点でのＡ地点 12 個、Ｂ地点で 11 個、、「土」で 12 個培養されたが、カビは培養されないか、＋だった。
「「100℃温浴」の条件では、放線菌はＡ地点で 5 個、他では培養されなかったが、カビは++、+++個、他では培養されなかったが、カビはと多かった。このように、放線菌は温浴しないほうが多く得られ、 カビは 100℃温浴のほうが多く得られた。
表３ 腐食酸培地で培養した分解者のコロニーの数（８月
腐食酸培地で培養した分解者のコロニーの数
27 日植え付け９月 16 日観察）
培養したもの123456温度

放線菌

カビ

細菌

放線菌

なし

＋-

12-＋

1150℃

＋＋＋--＋＋-

10100℃--

5＋＋--なし-＋

12100℃＋＋＋＋-なし

土カビ

細菌

放線菌＋＋＋--

B 地点

細菌

抜け殻

抜け殻

A 地点
カビ

埋めていない土に埋めた

培養されたもの温浴のウ B 地点の培養後の培地の様子（図後の培地の様子（図５，６，７，８）。
図５の矢印で示した白くて粉っぽいコロニーが放線菌のコロニーである。
白くて粉っぽいコロニーが放線菌のコロニーである。
白くて粉っぽいコロニーが放線菌のコロニーである。図６は腐食酸培地で培養されたカビであり、抜け殻培地で培養されたカビであり、抜け殻の上や周辺に広がっているのがよく分かるよく分かる。図７、８は Yeast-Starch-Agar 培地で培養されたもので、図７の円で囲まれたもののように、培地で培養されたものでの円で囲まれたもののように、カビも培養することができた。図８８の抜け殻の周りにある乳白色で、光沢のあるものものが細菌である。
以上のように、腐食酸培地では腐食酸培地では主に放線菌・カビが培養され、Yeast-StarchStarch-Agar 培地では細菌・カビが培養された。

図６腐食酸培地のカビの様子

図５ 放線菌の様子

図７ カビの様子

図８ 細菌の様子- 68 -

(4)考察「温浴なし」では、抜け殻、土ともにカビは発生せず、放線菌が多く培養できたが、「「100℃温浴」ではカビが多く発生し、放線菌は見られなかった。 年目の研究では「100℃温浴」で温浴」ではカビが多く発生し、放線菌は見られなかった。2年目の研究でも放線菌が培養でき、異なる結果となった。
これは培養したものの違いによると考えられる。 年目は抜け殻を撒いた実験区の土を温これは培養したものの違いによると考えられる。2は抜け殻を撒いた実験区の土を温浴し、その上澄みを培養した。上澄みの中の放線菌は胞子の状態であり、「「100℃温浴」によって発芽が促されたため培養って発芽が促されたため培養できた。
一方、今年は松林の土に埋めた抜け殻そのものを培養した。放線菌は菌糸の状態で抜け殻を分解中であり「した。放線菌は菌糸の状態で抜け殻を分解中であり「100℃温浴」では破壊されてしまい培養破壊されてしまい培養できなかった。つまり、放線菌は抜け殻を分解してかった。つまり、放線菌は抜け殻を分解していたと考えられる。
また、カビの胞子は熱に強く、は熱に強く、完全に死滅させるには 200℃の乾熱滅菌が用いられる。カ
乾熱滅菌が用いられる。カビは胞子の状態のものがあり、温浴によって発芽が促されて、「「100℃温浴」で多くなったと℃温浴」で多くなったと考えられる。
7. 実験Ⅱ 分解者のキチナーゼ活性の測定(1)目的 培養された分解者のキチナーゼ活性の強さを調べる。
(2)方法
ア

グリコールキチンがコンゴーレッドでどの程度染色
リコールキチンがコンゴーレッドでどの程度染色されるのかを確かめるためグリコールキチン 0.05％、0.01％、寒天のみの培地を作％、寒天のみの培地を作り、コンゴーレッド 0.1%溶液で染色した（図９）（図９）。グリコールキチンはキチンを水溶性にした物質であり、培地に混ぜることができる。
図９ 染色の様子イ

グリコールキチンを滅菌水に溶かしグリコールキチンを滅菌水に溶かし（図10）、グリコールキチンをグリコールキチンを 0.01％濃度で含む

Yeast-Starch-Agar 培地を作る。
ウ培養された分解者をディスポループですくい取り、作成した培地上に塗布する（図 11）
培養された分解者をディスポループですくい取り、。

エ37℃で１日培養する。保温期間終了時には、細菌のコロニーができる℃で１日培養する。保温期間終了時には、細菌のコロニーができる℃で１日培養する。保温期間終了時には、細菌のコロニーができる（図12）。

オ

培地をコンゴーレッドの 0.1%溶液で 15 分染色し、0.1％塩化ナトリウム水溶液で洗い塩化ナトリウム水溶液で洗い流す。

カコロニー周辺のハローを探す。
ハローを探す。細菌の作ったキチナーゼが培地のキチンを分解
細菌の作ったキチナーゼが培地のキチンを分解すると、そこは染色されず色が薄くなる。この色の薄い所をハローとそこは染色されず色が薄くなる。この色の薄い所をハローという。ハローの大きさを測ハローの大きさを測定し、キチナーゼ活性の強さを定し、キチナーゼ活性の強さを測る。

図 10 グリコールキチン水溶液

図 11 コロニーから塗布する様子- 69 -図 12 １日培養後(3)結果図 13 は C 地点に埋めた抜け殻から得られた細菌であり、細菌のコロニーを縁取るように色が薄くなっており、ハローがよく分かる。図 14 は A 地点と図 15 は D 地点に埋めた抜け殻から培養された細菌で、やはりハローが観察できる。 濃く染まっているところが細菌のコロニーである。
図 13 染色した培地の様子

図 14 A 地点

図 15 D 地点細菌

ハロー

(4)考察
今回培養によって得られた細菌と放線菌は、いずれもキチナーゼ活性を持っていることが確認できた。
8. まとめ(1)抜け殻は、室内に置いておいたときは、その形を保っているが、土に埋めるとやわらかくぼろぼろになった。このことから、抜け殻がなくなるのは単なる風化ではなく土の中の分解者によると予想された。
(2)土に埋めた抜け殻から腐食酸培地では放線菌とカビが、Yeast-Starch-Agar 培地では細菌とカビが培養され、放線菌以外にも抜け殻に付着する分解者を発見することができた。
(3)「温浴なし」で放線菌が多く培養され、逆に「100℃温浴」では放線菌が少なかったことか
ら、放線菌は菌糸の状態で活動中であり、抜け殻を分解していると考えられる。
(4)コンゴーレッドによる染色でハローを見つけることで、培養できた分解者のキチナーゼ活性を調べられることが分かった。この方法により、培養された放線菌と細菌はキチナーゼ活性をもつことを確認した。
(5)以上のことから抜け殻に付着している放線菌や細菌は抜け殻を実際に分解していることが確かめられた。
9. 今後の課題
キチナーゼ活性を示す細菌、放線菌を発見することができたので、さらに一つ一つ分離したコロニーを作成し、ハローの大きさからキチナーゼ活性の強さを比較したい。また、今回調べたカビはキチナーゼ活性を持っていなかったので他のカビについてもキチナーゼ活性を持つのか調べたい。さらに乳酸菌、酵母菌等、他の細菌類についても調べていきたい。
10. 謝辞放線菌の同定に当たっては国立沼津高等工業専門学校の蓮實文彦教授にご協力いただいた。改めてお礼申し上げます。
11. 参考文献
1,飯村研-放線菌- http://www.ab11.yamanashi.ac.jp/ABF/NO1/index a.html
2,日本キチン・キトサン学会 http://www.jicc.jp/index.html
3.キチナーゼをコードするＤＮＡ及びキチナーゼの製造方法 味の素株式会社- 70 -