ヒト iPS/ES 細胞用凍結保存液 「CP-5E」 プロトコル集【プロトコル一覧】
1. 一般的な細胞株の凍結保存・解凍方法
2. フィーダレスシングルセルフラット培養したヒト iPS 細胞の凍結保存・解凍方法
3. オンフィーダー培養したヒト iPS 細胞の凍結保存・解凍方法【プロトコル】
1. 一般的な細胞株の凍結保存・解凍方法※ 対数増殖期にある細胞で凍結保存を行うことを推奨します。
■ 凍結保存
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培養中の細胞数を計数する。
遠心（190×g, 5 分, 室温）後、上清を除去する。
凍結する細胞に応じて適切な細胞密度になるように CP-5E を加える。
（通常は 1x106 cells/mL 程度）
ピペッティングにて均一に懸濁する。
1 mL ずつ凍結用バイアルに分注する。
凍結処理容器（例：BICELL）に入れ、-80℃のディープフリーザーで緩慢凍結する。
24 時間経過後、凍結用バイアルを液体窒素または-150℃ディープフリーザーへ移す。

■解凍（1 バイアルを処理する場合）

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凍結していたバイアルを 37℃の温浴で解凍する。
8 割程度まで溶けたら全量を、培地 9 mL を入れた 15 mL 遠心管へ加える。
遠心（190×g, 5 分, 室温）後、上清を除去する。
適量の培地を加え懸濁し、細胞数を計数する。
常法にて細胞を培養容器に播種し培養する。

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CP-5E プロトコル 3 版 2021/06/03

2.フィーダーレスシングルセルフラット培養したヒト iPS 細胞の凍結保存・解凍方法※ 対数増殖期にある細胞で凍結保存を行うことを推奨します。
注意点
・翌日の初期接着率は、細胞株や培地, ECM 処理などの条件によって異なります。
ご自身の培養環境における条件設定を行ってからご使用ください。
・凍結前の培養条件がクランプ培養であっても、シングルセル状態にすることで凍結保存が可能です。
また、解凍の際にシングルセルフラット状態で培養することが可能です。

■ 凍結保存（6 ウェルプレート 1 ウェルを処理する場合）1.
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培地を吸引除去し、PBS（-）2 mL で洗浄する。
あらかじめ 37℃に温めた Pronase/EDTA for Stem を 1 mL 加える。
インキュベーター内で 2～5 分間静置し、細胞を剥離・分散する。
培地を加え、ピペッティングにて細胞をシングル化し、細胞数を計数する。
細胞縣濁液を遠心チューブに回収し、遠心（400×g, 3 分, 4℃）後、上清を除去する。
あらかじめ氷冷した CP-5E を加えて、2×106 cells 以上/mL になるように均一に縣濁する。
0.5 mL ずつ凍結用バイアルに分注する。
凍結処理容器（例：BICELL）に入れ、-80℃で緩慢凍結する。
24 時間経過後、液体窒素または-150℃ディープフリーザーへ移す。

■ 解凍（1 バイアルを処理する場合）
1. あらかじめ ECM コートした 6-well プレートを準備する。
2. 培地 5 mL を遠心チューブに分注し、室温に戻す。
3. 凍結していたバイアルを 37℃の温浴で解凍する。
4. 8 割程度溶けたら解凍全量を培地 5 mL へ加え、遠心（400×g, 3 分, 4℃）する。
5. 上清を除去し、ROCK 阻害剤添加培地を加えて再懸濁する。
6. 細胞数を計数する。
7. あらかじめ ECM コートしたプレートへ 0.5～1.0 x 106 cells/well になるように播種する。
(最終容量 2 mL/well)
8. 翌日、ROCK 阻害剤非添加の培地に交換し、その後、毎日培地交換を行う。

CP-5E プロトコル 3 版 2021/06/03

3.オンフィーダー培養したヒト iPS 細胞の凍結保存・解凍方法※ 対数増殖期にある細胞で凍結保存を行うことを推奨します。

注意点・本法は SNL フィーダー細胞上で培養したヒト iPS/ES 細胞の凍結保存に最適化されております。

・CP-5E を使用して SNL フィーダー上で培養したヒト iPS/ES 細胞を凍結保存する場合には、Pronase/EDTA for Stem（別売品）を使用して細胞の回収を行ってください。その他の分散液を使用した場合、期待する性能が得られない可能性があります。
・MEF フィーダー細胞上で培養したヒト iPS/ES 細胞を本品で凍結保存する場合には、適切な分散液を選択し、ヒト iPS/ES 細胞の回収を行ってください。
・翌日の初期接着率は、細胞株や培地, ECM 処理などの条件によって異なります。
ご自身の培養環境における条件設定を行ってからご使用ください。

■ 凍結保存（6 ウェルプレート 1 ウェルを処理する場合）
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あらかじめ必要量の CP-5E を氷上などで冷やしておく。
細胞の状態を確認し、必要に応じて分化したコロニーを除去する。
培養容器からアスピレーターを用いて培地を除去する。
PBS(-)で細胞を緩やかに 1 回洗浄します。
温浴で温めた Pronase/EDTA for Stem を 1 mL/well 添加し、37℃の CO2 インキュベーター内で 2～5 分程度静置する（Point①）。
6. 浮遊してきた SNL フィーダー細胞をアスピレーターで除去する。
7. 新しい培地 1 mL/well を緩やかに添加し、細胞を 1 回洗浄する（Point②）。
8. 新しい培地 2 mL/well を添加し、ピペッティングにてヒト iPS/ES 細胞コロニーを培養容器から剥がす。
9. 細胞を遠心チューブに回収し、細胞数を計数する（Point③）。
10. 遠心（300 x g，3 分間，4℃）後、上清を除去する。
11. 4x104 ～ cells/mL になるように、氷上で冷却している CP-5E を添加して均一に懸濁する。
12. 細胞懸濁液を凍結用バイアルへ 500 μL ずつ分注する（Point④）。
13. 凍結処理容器（例：BICELL）に入れ、-80℃のディープフリーザーで緩慢凍結する。
14. 24 時間経過後、凍結用バイアルを液体窒素または-150℃以下のディープフリーザーに移す。
Point!
① この処理が長すぎると細胞のロス、生存率の低下などの原因となります。フィーダー細胞の状態やヒトiPS/ES 細胞の株によって剥離のスピードは異なりますので、適宜、確認してください（図 1）。
② 洗浄は、PBS(-)ではなく培地で行ってください。コロニーが細分化しているため、ヒト iPS/ES 細胞が剥がれやすくなっています。
③ 回収した細胞懸濁液から一部を抜き取り、ピペッティングにてシングルセル化します。その後、トリパン
ブルー染色法により細胞数を計数してください。
④ 液量が多くなると生存率が低下します。

図 1. Pronase/EDTA for Stem 処理による細胞剥離の様子
先に、SNL フィーダー細胞が剥離、浮遊し、続いて時間差でヒト iPS細胞(201B7)のコロニーに適度にひびが入る。
（Scale bar； 500 μm）
CP-5E プロトコル 3 版 2021/06/03

■ 解凍（1 バイアル(2 x 104 cells)を 10 cm ディッシュに播種する場合）
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凍結していたバイアルを 37℃温浴で解凍する。
8 割程度まで溶けたら全量を、培地 5 mL 程度に添加する。
遠心（300 x g，3 分間，4℃）後、上清をアスピレーターで注意深く除去する。
ROCK 阻害剤添加培地を 12 mL 添加し、懸濁する。
10 cm ディッシュへ播種する（注）。
48 時間後、ROCK 阻害剤非添加の培地に交換する。
3 日後以降は、適宜培地を交換する。
適度なサイズのコロニーになるまで 6～10 日程度培養を続ける。

Point!
バイアル 1 本（2 x 104 cells）を 10 cm ディッシュに播種した場合、6～10 日程度培養すると適度な密度となります。

図 2. 操作方法の概略【問い合わせ先】
極東製薬工業株式会社 営業学術部〒103-0024 東京都中央区日本橋小舟町 7-8 電話 03-5645-5664

FAX 03-5645-5703

CP-5E プロトコル 3 版 2021/06/03