日補綴会誌 Ann Jpn Prosthodont Soc 6 : 44-46, 2014

依 頼 論 文◆特集：臨床イノベーションのための若手研究者の挑戦：治療，検査法の新たな展開

間葉系幹細胞を用いてインプラント周囲における上皮封鎖性は改善出来るか？
熱田生

The effect of Systemically-administered Mesenchymal Stem Cells
with Peri-implant Mucosa
Ikiru Atsuta, DDS, PhD
抄録
歯科用チタンインプラントにおいて，歯肉貫通部での上皮封鎖は，細菌などの侵入を防ぐなどの働きから治療成功への重要な鍵と考えられている．しかし同部位における低封鎖性も報告されており，特に長期症例で生じるトラブルを防ぐためその改善が望まれている．一方近年になって，間葉系幹細胞はその高い増殖能と幅広い分化能から再生治療における細胞の供給源となる一方，炎症を調整する制御能から自己免疫疾患などの治療法として歯科領域でも注目されている．本研究ではこの幹細胞をインプラント周囲に応用し，上皮封鎖性の向上に有効かを明らかとする．

和文キーワード
インプラント，間葉系幹細胞，上皮細胞，上皮封鎖性，細胞治療

Ⅰ．背実である．そこで本実験では，間葉系幹細胞（MSC）によりインプラント治療の長期機能維持を目指すこととした．
MSC はオッセオインテグレーションが提唱された時期とほぼ同じ 1960 年代に同定された細胞で，優れた多分化能と増殖能を有する幹細胞の一種である8）．特に分化の幅は広く，骨芽細胞，軟骨細胞，脂肪細胞など様々であり9），組織再生に有効な選択肢である10）．2000 年代になると顎骨骨折や歯周病由来の骨欠損，顎補綴時など口腔領域での再生治療として用いられるようになった．
現在では，幹細胞の新たな投与効果として免疫細胞の制御能が明らかとなった．これによりリューマチや膠原病など自己免疫疾患，大腸性ポリープなどの炎症，さらには乳癌など悪性腫瘍の治療にも効果的とされている11–13）．このような MSC の特徴的な働きはインプラント周囲軟組織の封鎖性向上にも活用出来ないものであろう
か．以下の実験でその有効性を明らかにする．

景

歯科インプラント治療は歯牙欠損患者に対する最も有効な補綴治療の選択肢となっている．1960 年代にBrånemark 博士らによって「オッセオインテグレーション」というチタン−骨の結合に関する概念が提唱されて以来 1），多くの研究が重ねられ現在のインプラント治療は確固たる地位を獲得している．しかし長期経過症例に目を向けたとき依然解決されるべき問題が残されているようにも思える．
その中で最も注目すべきはインプラント周囲軟組織の存在であろう．インプラント周囲における軟組織は天然歯と類似した封鎖構造を有するにも関わらず明らかに脆弱である2, 3）．インプラント周囲粘膜は感染リスクの高さに加え，生じた炎症は天然歯周囲と比較して容易に骨へと波及しインプラントの支持骨を吸収させる4）．そのため細菌性の感染に対する局所防御の改善こそが周囲炎や粘膜退縮を防止し長期にわたるインプラント治療の成功に貢献出来るかもしれない．
今までもインプラント周囲における軟組織封鎖性の向上を目指した研究は数多くなされてきた5–7）．ただコスト面や安全性の点で臨床応用まで多少の距離があるのも事Ⅱ．方法1）動物実験：全身投与される MSC は 4 週齢の雄性Wistar ラット骨髄から採取された．また 6 週齢実験モデ
ルは，上顎右側第一臼歯を抜歯後，即時に純チタン製イ

九州大学大学院歯学研究院口腔機能修復学講座インプラント・義歯補綴科
Section of Implant and Rehabilitative Dentistry, Division of Oral Rehabilitation, Faculty of Dental Science Kyushu
University44

間葉系幹細胞を用いてインプラント周囲における上皮封鎖性は改善出来るか？

図 1 Photograph of the experimental implants (left panel). Photographof the implant in the rat oral cavity(right panel).
実験用インプラント（左）およびインプラントモデルラット口腔内写真（右）．

図 3 Light micrographs of the PIE around the experimental implants with MSC injection after HRP penetration. In the case of
MSC injected group, a strong DAB reaction based on HRP was only
seen in the upper PIE. Bar = 100 μm. *P<0.05 versus Con.
HRP 浸透実験．歯肉溝またはインプラント周囲溝へ滴下された HRP
は無処理群では結合組織付近まで，MSC 処理群では歯冠側に限局して観察された．
（図中下向き矢印：上部から滴下された HRP の浸透深さを示す）．

ンプラント（図 1）を埋入され，その 24 時間後に MSCが尾静脈より全身投与された．そして埋入 4 週後に軟組織の免疫組織化学的に観察した．さらにその封鎖性は
西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP；分子量約 41,000）をインプラント周囲溝に 30 分間持続投与し，その浸透深さを組織上で観察することで評価した．また図 4 で示す実験では GFP 遺伝子導入ラットを用いた．
2）培養実験：出生 4 日齢の Wistar ラット口腔粘膜より採取した上皮組織から上皮細胞（OECs）を単離した．その後 3 日間だけ単独で培養し，同数の MSC など各種指定条件で共培養した．そして OECs が MSC から受ける影響についてアポトーシス（Apoptosis marker/FACs），細胞増殖能（Brd-U assay），接着能（Adhesionassay）などで評価した．

Ⅲ．結果

1）動物実験：埋入 4 週後のモデルで，インプラント−周囲上皮界面における接着の指標としてラミニン-332の局在を観察した（図 2）．背景でも記した通りインプラント周囲上皮の接着構造は根尖側 2/3 に限局していたが，MSC 投与によりインプラント体界面全体に観察された．また上皮封鎖能を直接評価する HRP の浸漬実験でも，MSC 投与群における HRP の侵入阻害能が上昇していた（図 3）．

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図 2 Ln-332 distribution during the formation of peri-implant epithelium (PIE)
following MSC injection. After 4 weeks,
the PIE was completely formed in bothgroups. Ln was scarcely expressed along
the upper portion of the implant-PIE interface. Ln was weakly expressed along
the BM. Hematoxylin staining. Bar =100 μm.
ラミニン-332 の局在．ラミニンは天然歯および MSC 処理群においては上皮組織界面全体に発現を認めたが，無処理インプラントでは根尖側 1/3 に限局した局在を観察した．
（ES：エナメル質が存在していたスペース，JE：付着上皮，OSE：歯肉溝上皮，
IS：インプラントの存在していたスペース，
PIE：インプラント周囲上皮，PISE：インプラント周囲溝上皮，OE：口腔上皮）．

MSC 全身投与によるインプラント周囲上皮の封鎖性改善は，投与された GFP 陽性 MSC がインプラント周囲上皮と結合組織界面付近に集積することで説明出来る（図4）．ただしこの集積も 1 週間を過ぎると観察されない．
2）培養実験：OECs の単独培養（Cont），MSC との共培養（Co-cul），さらに共培養時に Trans-well Ⓡを使用し，MSC との細胞接触を遮断して共培養（Trans-well）の 3 群を作製した．Cont 群と比較して Trans-well 群では OECs の生存性が上昇した．また増殖性および接着性でも有意な増加が認められた（図 5）．

Ⅳ．考察1）動物実験：インプラントと周囲上皮界面におけるラミニン-322 の発現量増加や HRP の侵入抑制を示した
実験結果は，MSC の全身投与がインプラント周囲での封鎖性を局所的に上昇させたことを示す．この機序としてMSC の集積がある（図 3）．実際，腫瘤や創傷部位へのMSC 集積に加えサイトカインなどの分泌による治癒促進効果が報告されている14, 15）．本研究でもインプラント埋入という行為が炎症を惹起させ，MSC の集積を促したのかもしれない．ただしその集積が 1 週間と比較的短期間であるにも関わらず，埋入 4 週間後でも上皮封鎖性を高く維持していた．MSC が消失しても尚なぜ効果は持続したのだろうか？
2）一つの可能性として投与 MSC が宿主側の MSC の性質を変えた事である16）．病的な状況下にある MSC は病態を悪化させる病的性質を有する事も知られており17），
本研究のように全身的な MSC 投与はインプラント体周囲の病的な MSC に対し炎症抑制や治癒促進を促す一方，上皮細胞には MSC が発現するサイトカインの効果で接着性向上などの直接的影響を及ぼしているのかもしれない18）．

Ⅴ．結論

全身投与された MSC はインプラント周囲の上皮細胞に対して直接作用し，封鎖性を向上することが示唆され

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図 4 Accumulation of GFP-transgenic injected MSCs after toothextraction or implantation. Around the experimental implants, injected MSCs selectively accumulated at the extraction site or periimplant tissue. However, no double-positive MSCs (GFP+/CD90+)
were observed in gingival mucosa. Bar = 100 μm.
全身投与された MSC の集積．GFP で緑に蛍光ラベリングされた
MSC はインプラント埋入一日後，またはそれに相当する日程で尾静脈より投与された．結果としてインプラント周囲上皮組織と結合組織の境界付近に限局して MSC が GFP および MSC マーカー CD90 陽性細胞として観察された．またこの集積は一時的で 1 週間後にはほぼ認められなくなった．

た．このような MSC による細胞治療はインプラント周囲組織における外部刺激への抵抗性を保ち，インプラント体の口腔内での長期安定化に貢献するかもしれない．

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3）Ikeda H, Yamaza T, Yoshinari M, Ohsaki Y, Ayukawa Y, Kido
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6 巻 1 号（2014）

図 5 Relationship between MSCs and OECs in co-culture (A)Apoptosis analysis by FACS. Apoptosis of OECs was detected andquantified by FACS after annexin V and 7AAD staining. (B) The
rate of adhesion of OECs as determined by adhesion assay. (C)Rate of proliferation as determined by Brd-U assay. Each data point
represents the mean ± SD of two parallel experiments. *; P < 0.05
versus Cont.
MSC が上皮細胞に与える影響．上皮細胞の単独培養（Cont），MSCと上皮細胞の直接的共培養（Co-cul），Trans-well Ⓡを使用し MSC と上皮細胞との直接的接触を阻害した間接的共培養（Trans-well）．結果，Co-cul 群では上皮細胞のアポトーシスが促進されるが，Transwell 群では Cont よりも有意に接着性，増殖性，生存性の上昇が認め
MSC 上皮活性の促進効果が示された．
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著者連絡先：熱田 生〒 812-8582 福岡市東区馬出 3-1-1
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