公益財団法人 寺岡記念育英会
2021 年度 研究活動費助成事業 研究活動報告書一覧
小胞体ストレス応答による脂質メディエーター産生制御機構の解明とがん治療への応用
川崎医科大学 薬理学 生物系薬学
助教 北風圭介

・・・ 1

肺癌幹細胞と腫瘍微小環境を標的とした革新的腫瘍免疫療法の開発
岡山大学病院 呼吸器・アレルギー内科 胸部悪性腫瘍研究准教授 大橋圭明

・・・ ５

人工知能（AI）による敵対的生成ネットワークを用い難治性大腸癌の治療標的となる
AI バイオマーカーを探索する
川崎医科大学 臨床腫瘍学 消化器癌
助教 矢野修也

・・・ ９

小児脳腫瘍腫瘍診断困難例に対するマルチオミクス解析を駆使した
precision medicine の確立
岡山大学 脳神経外科 脳腫瘍、小児疾患
助教 石田穣治

・・・ 14

ゲノム編集を用いた腎臓病の病態解明と治療法の開発
重井医学研究所 分子遺伝部門 分子生物学副主任 難波真澄

・・・ 17

非アルコール性脂肪肝炎にサルコペニアを併発する際の腸内細菌叢の変化
岡山大学 学術研究院保健学域 病態検査学
助教 山元修成・・・ 21

マルチオミクス解析によるヒト肢芽形成の理解
岡山大学 医歯薬学総合研究科 バイオインフォマティクス
助教 大曽根達則※対象者の所属・職位は、本助成事業への応募当時のものです。

・・・ 27

小胞体ストレス応答による脂質メディエーター産生制御機構の解明とがん治療への応用
川崎医科大学 薬理学教室
北風圭介（研究成果の概要）
小胞体ストレス応答（UPR）は細胞の適応応答機構であり、がん細胞では UPR が恒常的に活性化し、がんの悪性化に関与している。一方でリゾホスファチジン酸や環状ホスファチジン酸は、がんの悪性化に関与する脂質
メディエーターである。本研究では脂質メディエーター産生酵素であるグリセロホスホジエステラーゼ GDE4および GDE7 と UPR との関連を解析した。また、乳がん細胞株において GDE7 が産生した環状ホスファチジン
酸は PPARγ 経路を抑制していたことから、乳がんの悪性化に関与することが示唆された。
（本文）

cPA による PPARγ抑制は乳がんの悪性化に関与す

１．研究開始当初の背景

る可能性がある。

小胞体ストレス応答（unfolded protein response;

近年、グリセロホスホジエステラーゼ（GDE）フ

UPR）は細胞の恒常性を維持する適応応答機構であァミリーのメンバーである GDE4 と GDE7 は小胞体る。がん細胞では UPR が恒常的に活性化し、低酸膜に局在するリゾ PLD 型酵素であり、ATX と同様

素・低栄養ながん微小環境下における生存を促進すに LPA を産生することが報告された。さらに細胞内ることでがんの悪性化に関与することが知られていにおいて cPA を生合成する可能性も示唆されている。

る。UPR はがん化シグナルや一部の分子標的薬によ以上の背景から、GDE4 あるいは GDE7 は細胞スっても活性化されることから、創薬標的としても注

トレスに応答して cPA レベルを上昇させ、PPARγ

目されている。

を抑制し、がんの進行を促進する可能性があると考一方で、脂質メディエーターは細胞の情報伝達をえられる（図 1）。本研究では、GDE4 あるいは GDE7

担う脂質分子の総称であり、様々な疾患の発症・進が(i) UPR により制御されるか、(ii) cPA を細胞内で展に関与することから、その受容体や代謝酵素は創産生するか、(iii) 産生された cPA が脂質メディエー

薬標的として期待されている。リゾホスファチジン

ターとして機能するかについて検討を行った。

酸（LPA）と環状ホスファチジン酸（cPA）は、真核生物の組織や血漿に存在する脂質メディエーターである。LPA は G タンパク質共役型受容体を介して、発生、生理機能、病態進行などを制御している。LPA
は主に血中のオートタキシン（ATX）によってリゾ
ホスファチジルコリン（LPC）等から産生される。
一方、cPA は、ATX 阻害を介してがんの浸潤と転移を阻害し、LPA 受容体の活性化を通じてヒアルロン酸の生合成を促進する。また、ペルオキシソーム増
殖剤活性化受容体 γ（PPARγ）のアンタゴニストとしても作用する。PPARγの活性化は、悪性乳がんの増殖と進行を抑制することが報告されていることから、-1-

図 1. 本研究の概要

２．研究の目的

μM オルトバナジン酸ナトリウムを含む50 mM Tris-

本研究では、小胞体膜上に局在するリゾホスホリパ

HCl（pH7.4）中で、25 μM [14C]LPC（20,000 cpm、5ーゼ D 型酵素である GDE4 および GDE7 に着目し、μL のエタノールに溶解）と膜画分を 37℃で 30 分間

これらの脂質メディエーター産生酵素と UPR とのインキュベートした。クロロホルム/メタノール/1 M

関連および、がんの悪性化に GDE がどのように関クエン酸（8:4:1）およびクロロホルム/メタノール

与するかについて明らかにすることを目的とした。

（17:3）で脂質を抽出し、薄層クロマトグラフィーで展開した（クロロホルム/メタノール/28%アンモニ

３．研究の方法

ア水=60/35/8）。画像の取得は Cytiva 社の Typhoon(i) 小胞体ストレスによる GDE4/GDE7 発現の亢進9400 で行った。

内在性 GDE4 の発現が高いヒト前立腺がん細胞株

細胞内の LPA および cPA は細胞ペレットから BlighLNCaP を用い、小胞体ストレス誘導剤であるタプシ& Dyer 法により抽出し、Applied Biosystems の 4000

ガルギンを 200 nM, 2 時間あるいは 6 時間処理した。

Q TRAP および 1100 liquid chromatography system を

その後、TRIzol 試薬を用いて RNA を単離し、逆転用いた LC-MS/MS により定量した。

写酵素（PrimeScript RT reagent kit, TaKaRa Bio）により cDNA を合成した。その後、TB Green Premix Ex(iii) GDE7 が産生する cPA の PPARγ 抑制活性

Taq II (TaKaRa Bio) を用いた qPCR により UPR 関連

MCF-7 の野生型、GDE7 ノックアウトおよびレスキ

因子およびGDE4、
GDE7 の遺伝子発現を定量した。

ュー細胞株を用い、それぞれの細胞株を 0.2％ウシ血

次に、
UPR の主要な 3 経路である PERK, IRE1α, ATF6

清アルブミン（fatty acid-free）を含む無血清培地で 20に対する阻害薬（1 μM GSK2606414, 100 μM STF-

時間培養した。その後、(i)と同様に RNA を単離し、083010, 2 μM PF-429242）をそれぞれ LNCaP に処理

cDNA 合成および qPCR により PPARγ および下流因し、同様に qPCR で UPR 関連因子および GDE4、子の遺伝子発現を定量した。

GDE7 の遺伝子発現を定量した。
４．研究成果(ii) LPA および cPA 生成活性測定(i) 小胞体ストレスによる GDE4/GDE7 発現の亢進

組み換え GDE4 あるいは GDE7 による LPA および

小胞体ストレス誘導剤であるタプシガルギン処理に

cPA 生成活性の測定には、ヒト GDE4、ヒト GDE7より代表的な UPR 関連因子である XBP1s, DDIT3,あるいはマウス GDE7 をレンチウイルスベクターに

HSPA5 等の発現が顕著に増加した。この時、GDE4

より過剰発現させた COS-7 細胞株を用いた。また、および GDE7 の発現レベルも経時的に増加していた

内在性 GDE7 による cPA 生成活性の測定には GDE7

（図 2）
。また、タプシガルギンと同時に PERK 阻害

発現が高いヒト乳がん細胞株 MCF-7 を用い、薬を加えると DDIT3 発現が抑制され、IRE1α阻害

CRISPR-Cas9 系で GDE7 ノックアウト細胞株（KO）薬あるいは ATF6 阻害薬を加えると HSPA5 発現が有を樹立し、野生型（WT）と比較検討した。また、KO意に抑制されることを確認した。
GDE4 および GDE7株にマウス GDE7 を強制発現させたレスキュー細胞の発現レベルは PERK 阻害薬を加えた場合にのみ抑株（RE）についても評価した。各細胞をスクレーパ

制されたことから、PERK 経路の転写因子によりーで剥離した後、50 mM Tris-HCl 緩衝液（pH 7.4）中GDE4 および GDE7 の発現レベルが制御されている

で 3 秒間ずつ 3 回超音波処理した。その後、105,000

ことが示唆された。

× g、4℃で 1 時間超遠心して得られた膜画分を酵素源とした。酵素アッセイは、2 mM CaCl2 および 100-2-図 3. マウスあるいはヒト GDE7 による LPA およびcPA の産生（主な発表論文 1 より引用・図改変）

図 2. 小胞体ストレス誘導剤の処理により GDE4 お
よび GDE7 の発現レベルが亢進する(ii) LPA および cPA 生成活性測定
組み換え GDE4 あるいは GDE7 を酵素源とした場
合、ヒト GDE7 およびマウス GDE7 は LPA および
cPA を産生することが明らかとなった。一方でヒト
GDE4 は LPA のみを産生した。また、内在性 GDE7を酵素源とした場合、MCF-7 の野生型に比べ、GDE7
KO では cPA の産生が低下した。また、マウス GDE7のレスキューにより cPA 産生は回復した。これらの結果より、GDE4 は主に LPA を産生するのに対し、

図 4. 組み換えあるいは内在性ヒト GDE7 による

GDE7 は LPA と cPA の両方を産生することが明らか

LPA および cPA の細胞内産生（主な発表論文 1 よとなった（図 3）。

り引用・図改変）

次に細胞内の LPA および cPA を定量した結果、ヒト GDE7 の過剰発現により LPA および cPA が増加(iii) GDE7 が産生する cPA の PPARγ 抑制活性した。また、MCF-7 の野生型に比べ、GDE7 KO で

GDE7 が産生する cPA が PPARγを抑制する脂質メは LPA および cPA 量が低下しており、これはマウディエーターとして機能するかどうか検討した。

ス GDE7 のレスキューにより回復した（図 4）。

PPARγの下流因子である CD36 と CYP27A1 の-3-

mRNA 発現量を MCF-7 細胞で調べた。その結果、

4. グリセロホスホジエステラーゼ 7 は小胞体内腔

これらの発現レベルは、野生型と比較して GDE7 KOにおける環状ホスファチジン酸の産生酵素でではともに増加しており、KO における mGDE7 のある . 北風圭介, 坪井一人, Hanif Ali, 木本来希,発現によって有意に抑制された。

竹之内康広, 石丸浩靖, 山下純, 上田夏生, 田中保, 岡本安雄. 第 95 回日本生化学会大会
2022 年 11 月 11 日

以上の結果より、GDE7 は小胞体ストレスによって誘導され、細胞内で PPARγを抑制する脂質メディエーターとしての cPA を産生することが明らかとなった。このことから GDE7-cPA 経路は乳がんの新規治療標的としても期待される。

５．主な発表論文等①雑誌論文（1 件）
1. GDE7 produces cyclic phosphatidic acid in the ER
lumen functioning as a lysophospholipid mediator.
Kitakaze K, Ali H, Kimoto R, Takenouchi Y,
Ishimaru H, Yamashita A, Ueda N, Tanaka T,
Okamoto Y, Tsuboi K. Communications Biology 6
524 2023 年 5 月②学会発表（4 件）
1. 前立腺がん細胞において小胞体ストレス応答
はリゾリン脂質メディエーター産生酵素の発現を亢進する. 北風圭介, 鵜飼悠, 高峯大典,
Jirapat Namkaew, 濱田良真, 竹之内康広, 坪井
一人, 親泊政一, 岡本安雄. 第 96 回日本生化学会大会 2023 年 10 月 31 日
2. グリセロホスホジエステラーゼ 7 が産生する環状ホスファチジン酸は PPARγを抑制する脂質
メディエーターとして機能する. 北風圭介, 坪
井一人, Hanif Ali, 木本来希, 竹之内康広, 石丸
浩靖, 山下純, 上田夏生, 田中保, 岡本安雄. 第64 回日本生化学会中国・四国支部例会 2023 年
5 月 28 日
3. グリセロホスホジエステラーゼ 7 による環状リン脂質メディエーターの細胞内産生. 北風圭介,
Hanif Ali, 木本来希, 竹之内康広, 石丸浩靖, 山
下純, 上田夏生, 田中保, 岡本安雄, 坪井一人.
第 96 回日本薬理学会年会 2022 年 12 月 1 日-4-

（表 題）
肺癌幹細胞と腫瘍微小環境を標的とした革新的腫瘍免疫療法の開発（所 属）岡山大学病院 呼吸器・アレルギー内科 准教授（氏 名）大橋 圭明（研究成果の概要）
EGFR 変異を有する肺癌(EGFR 肺癌)は、日本人の非喫煙者に発生する肺癌の半数以上を占める重要な疾患であるが、薬物療法では根治できない。その難治性に癌幹細胞が重要な役割を果たすとされるが、EGFR 肺癌の癌幹細胞の存在は十分確立しておらず、また癌幹細胞マウスモデルも樹立されていない。本研究は、マウス 2 型肺胞上皮細胞に Egfr 遺伝子を特異的に発現させた EGFR 肺癌マウスから、癌幹細胞を抽出し、in vivo 癌幹細胞モデ
ルの樹立、また治療標的を探索する（本文）

胞との相互関係についても未解明である(図 2)。

１．研究開始当初の背景
進行期肺癌は癌死亡数が最も多い難治癌の代表である。その中で,上皮成長因子受容体（EGFR）
遺伝子変異を有する肺癌（EGFR 肺癌）は,日本人の非喫煙者に発生する肺腺癌の半数以上を占める
非常に重要な疾患である(図 1)。EGFR チロシンキ
ナーゼ阻害薬(TKI)は,発癌の原因である EGFR シグ
ナルを阻害し,EGFR 肺癌を一過性に制御するが,耐性化は避けられない(Ohashi PNAS 2012, Ohashi

２．研究の目的J Clin Oncol 2012)。また EGFR 肺癌に対し,抗 PD-

CSCs に対する革新的治療法の開発に向けた基礎デ1 抗体など免疫チェックポイント阻害薬の効果は乏ータを確立するため,下記 1-3 を「本研究の目的」としい。
そのため,根治的な効果をもたらす新規治療戦する。

略の開発が強く求められている。

1. 免疫能が保持された C57/BL6 に生着するシンジェニック CSCs マウスモデルを樹立する
2. CSCs と TME の相互作用を含めた病態の解明,新規
治療標的の同定を行う
3. CSCs と TME の双方を標的とした革新的な治療戦略を CSCs マウスモデルで検証する
３．研究の方法

多剤薬剤耐性能をもつ癌幹細胞 (cancer stem

本研究のためマウス 2 型肺胞上皮（AT2）細cells: CSCs) が根治の障壁として重要な役割を担胞へ特異的に Egfr 変異を発現させた肺癌マウっていると考えられているが, CSCs の病態は確立

スモデル(C57BL/6 Egfr ex19del Ohashi Cacner

していない。また,CSCs の in vivo モデルは確立し

Sci 2008)及び皮下移植により継代可能なシンて お ら ず ,CSCs と 腫 瘍 微 小 環 境

ジェニック肺癌マウスモデル(Higo Lung(tumormicroenvironment:TME)に存在する間質細胞,免疫細Cancer 2019)を樹立した(図 3)。CSCs 分離のた-5-

め幹細胞のマスター転写因子の一つであるcell(sc) RNA シーケンスライブラリ ー を 作 成

Oct4 に着目し,Oct4 発現を GFP で標識した遺伝子改

す る Chromium Controller が稼働している。GeoMx

変マウス(RBRC00821,C57BL/6 Oct4-GFP)

による CSCs とＴＭＥの空間情報を保持した状態でを RIKEN バイオリソースセンターより導入した。

の遺伝子、蛋白発現プロファイリングと scRNA シー

C57BL/6 Egfr ex19del と交配し、新たに C57BL/6
Egfr/Oct4-GFP を作成した。

ケンスによる１細胞レベルでの包括的な遺伝子発現解析を行う(図 5)。
2-1.Oct4+CSCs をターゲットとした新規治療標的候
このマウス肺腫瘍を皮下移植し,継代できるシンジ

補の探索: Oct4+癌細胞と Oct4-癌細胞の比ェニックマウスを作製し、以下の解析を行う。

較解析を行い,CSCs と TME に特徴的な発現プロファ

１．シンジェニック CSCs マウスモデルの確立

イル,治療標的を同定する。

セルソーティングを行い, Oct4+癌細胞を分離

2-2.Oct4+CSCs および間質細胞がどのような協調関し,in vivo で癌幹細胞の特徴(自己複製能,多分係にあるか？: 空間的解析により CSCs 及び周囲 TME化能,転移能,多剤薬剤耐性)を検証する(図 4)。

の「どの細胞(CSCs or 免疫細胞・間質細胞)」に「ど1-1 生着能：100-1,000 個など少ない細胞数ののような分子(腫瘍生存シグナルに関与する分子 or

植え付けでの生着能を検証する。
（親株モデルは安定

免疫チェックポイント分子)」が発現しているのか？

した移植に数十万個程度の細胞数が必要）を評価する。2-1,2-2 で同定された分子は,免疫染1-2. 多分化能: Oct4+癌細胞から Oct4

色,フローサイトメトリーで確認する。

-癌細胞が発生するか? を検証する。

2-3. 同定された標的の阻害効果: 抗腫瘍効果,抗腫1-3. 転移能: Oct4+癌細胞の転移能を検証する。(親瘍免疫の活性化を in vivo で検証する。

株モデルは遠隔転移能を有さない)
1-4. 薬剤耐性能：肺癌で承認されている抗がん剤

４．研究成果への多剤耐性能を検証すｒ。

C57BL/6 Egfr/Oct4-GFP から樹立した皮下移植腫瘍

1-5. 表面 CSCs マーカーによるソーティング：Oct4を用い、FACSaria によるセルソーティングを行った。

のみで CSCs の形質が完全でない場合,CD44

GPF 陽性細胞と陰性細胞を選別するゲーティングのなど別の表面マーカーを用い、さらに細胞集団を絞設定を調整し（図６）、マウスの皮下へ GFP 陽性細り込み,CSCs の形質を確立する。

胞、陰性細胞をそれぞれ 500, 5000, 50000 個植え
付け生着能を比較した（図７）。GFP 陽性細胞の生着能が高い傾向を認めた。また本来は奏功するはずのEGFR-TKI に耐性の傾向をしました。しかし結果にはばらつきがあり、ゲーティングのより厳密な調整、また CD44 など他の表面マーカーを追加した Oct4 単

２．CSCs モデルを用いた新規治療標的の同定とその独ではないゲーティングの設定などさらなる調整を阻害効果の検証行っている。

岡山大学ゲノム医療総合推進センターで空間的発現解析器である GeoMX シ ス テ ム 及 び single-6-抗腫瘍免疫の誘導が確認できた場合, 進行期肺癌に今後、安定して CSCs 様の細胞が分離され、生着能な対する革新的な治療戦略開発の基盤となり,肺癌治

ど CSCs としての形質が確認できれば、研究計画の療全体に大きな波及効果が期待できる。

２を行う予定であり、資材の準備など並行して行っている。

５．主な発表論文等① 雑誌論文EGFR 肺癌における CSCs の病態は十分解明されてお1. Nakasuka T, Ohashi K, Nishii K, Hirabae A,

らず,CSCs を根絶する治療戦略は確立していない。

Okawa S, Tomonobu N, Takada K, Ando C,

現在,CSCs と TME の間質細胞・免疫細胞がどのよう

Watanabe H, Makimoto G, Ninomiya K, Fujiiに協調しているかを評価することができるシンジェ

M, Kubo T, Ichihara E, Hotta K, Tabata M,

ニック CSCs モデルは樹立されていない。そのた

Kumon H, Maeda Y, Kiura K.PD-1 blockade

め,CSCs が TME とどのように協調,どのように薬剤や

augments CD8+ T cell dependent antitumor

抗腫瘍免疫から逃避しているか？については,未解immunity triggered by Ad-SGE-REIC in Egfr-

明である。シンジェニック CSCs モデルの樹立

mutant lung cancer. Lung Cancer. 2023

は,CSCs の病態を再定義し,新たな治療標的, 治療

Apr;178:1-10.

アプローチの創造に繋がる。TME との相互作用つま2. Nishii K, Ohashi K, Tomida S, Nakasuka T,

り CSCs の生存に重要な間質細胞・免疫細胞およびHirabae A, Okawa S, Nishimura J, Higo H,

成長因子・ケモカインを同定できれば,CSCs を直接

Watanabe H, Kano H, Ando C, Makimoto G,

傷害する治療標的のみならず,間接的に CSCs を傷害

Ninomiya K, Kato Y, Kubo T, Ichihara E,

する治療標的が新たに同定される。さらに,CSCs がHotta K, Tabata M, Toyooka S, Udono H, Maeda

腫瘍免疫から逃避する機構を有しているとすれば,Y, Kiura K. CD8+ T-cell Responses Are

CSCs および TME に発現する免疫チェックポイント分

Boosted by Dual PD-1/VEGFR2 Blockade after

子を探索することで,CSCs に対する抗腫瘍免疫を活EGFR性化させる治療標的を同定できる可能性がある。つInhibition

Cancer.Cancer

まり,CSCs を抗腫瘍免疫で根絶するという新しい治

inEgfr-Mutant

Lung

Res.

Sep

Immunol2022

1;10(9):1111-1126.

療アプローチを検証できる。
幹細胞様の機能がある AT2 細胞を起源とするシンジ② 学会発表ェニック EGFR 肺癌マウスモデルは世界で我々のみ

1. 西井和也, 大橋圭明, 冨田秀太, 中須賀崇匡,

保有している。ヒト型でなくマウス型 Egfr 変異を

平生敦子, 大川祥, 西村淳, 安東千裕, 槇本剛,

導入しているため,ヒト型 EGFR 蛋白に対するマウス

二宮貴一朗, 加藤有加, 久保寿夫, 市原英基,の免疫応答を考慮する必要がない強みもある。本申堀田勝幸, 田端雅弘, 豊岡伸一, 鵜殿平一郎,

請は EGGR 肺癌マウスモデルの希少性,独自性もあり,

前田嘉信, 木浦勝行

類似の研究が全く行われていない非常に挑戦的な研EGFR 阻害が誘導する

Egfr 肺癌に対する抗腫瘍 免疫を逐次的究と考える。CSCs マウスモデルの確立, 新規治療標

VEGFR-2/PD-1 阻害が増強する 第 63 回日本肺的のスクリーニング, また CSCs に対する根治的な癌学会学術集会, 2022 口演-7-

2. 中須賀崇匡，大橋圭明, 西井和也，平生敦子，
大川祥，髙田健二，西村淳，栗林忠弘，安東千裕，
西達也，森田絢子，槇本剛，二宮貴一朗，藤井昌
学，市原英基，堀田勝幸，田端雅弘，前田嘉信，
木浦勝行 Egfr 変異陽性肺癌に対する Ad-SGEREIC と抗 PD-1 抗体併用による抗腫瘍免疫賦活
効果 第 63 回日本肺癌学会学術集会, 2022
3. 大川祥, 大橋圭明, 中須賀崇匡, 平生敦子, 高
田健二, 西村淳, 栗林忠弘, 安東千裕, 西達也,
森田絢子, 二宮貴一朗, 槇本剛, 藤井昌学, 市
原英基, 堀田勝幸, 田端雅弘, 前田嘉信, 木浦
勝行 osimertinib が誘導する抗腫瘍免疫は M2
マクロ ファージの抑制により増強される 第 63回日本肺癌学会学術集会, 2022 口演
4. 西村淳, 大橋圭明, 栗林忠弘, 森田絢子, 西達也, 大川祥, 高田健二, 安東千裕, 中須賀崇匡,
西井和也, 平生敦子, 二宮貴一朗, 槇本剛, 藤井昌学, 市原英基, 堀田勝幸, 田端雅弘, 前田
嘉信, 木浦勝行. CD8 陽性細胞抵抗性 Egfr 肺癌に対する STING agonist による抗腫瘍免疫の誘
導 第 63 回日本肺癌学会学術集会,2022-8-

（表 題）
人工知能(AI)による敵対的生成ネットワークを用い難治性大腸癌の治療標的となる
AI バイオマーカーを探索する（所 属）川崎医科大学 臨床腫瘍学（氏 名）矢野修也（研究成果の概要）
The Cancer Genome Atlas (TCGA)によると、大腸癌の発症は 5 つのシステムの異常に基づく。治療薬の選択において、RAS/RAF の遺伝子変異と MSI-H の有無からなる遺伝子変異分類が使用される。さらに、分子生物学的には mRNA による遺伝子発現分類も定義された。これらの分類は煩雑なため、我々は、高・中分化型、粘液型、低分化
型に、間質の量も癌を構成する成分と定義すると、これら遺伝子情報分類と病理分類を統合出来ることを見出した。この分類は患者の予後とも関連があることを確認した。深層学習を使用して病理画像の特徴を抽出し、Semantic
Segmentation を行うことで、精密な病理組織の評価が可能となった。遺伝子情報との関連性を評価するため、遺伝子発現やシグナルパスウェイのクラスター分析を行ったところ、AI による病理分類と一致する結果が得られた。これらの分析から、予後不良群に特有のシグナルパスウェイが明らかとなり、新しい治療戦略の開発の可能性が示された。
背景

トウェア EIRL aneurysm、肺結節検出プログラムなど AI

人工知能は医療にとって必要なツールになる

画像認識技術が開発中で、早期癌の診断は早晩人間

2023 年は、技術革命の中心に AI が位置していた年から AI に置き換わる。がん以外にも、COVID19 肺炎と言える。特に、chatGPT などの生成型 AI の登場はあ

画像認識プログラムなど、画像に関しては AI が全てを

らゆる産業を根本的に変える可能性を秘めている。

診断出来る日が迫っている。

1.

また、AI による画像認識技術の普及も著しい。この技術は、2D から 3D までの画像解析を可能とし、出入国2.

の際の顔認証や、車の運転支援など、多くの場面でのPrecision Medicine は分子サブタイプに応じた適切な分実用化が進められている。

子標的薬の使用である。The Cancer Genome Atlas が全医療分野でも、AI の影響は大きく、その進化は驚異

遺伝子解析の結果、大腸癌は 5 つのシステムの異常に的である。電子カルテの導入や、MRI や CT などの医より発生し、各システムの強弱でサブタイプが決まるこ

療画像のデジタル化により、AI による診断の効率化やとを報告した(図１; TCGA, Nature, 2012). 包括的遺伝

精度向上が実現されようとしている。さらに、病理画像
もデジタル化され、バーチャルスライドとして保存・分析することができるようになったことも AI 化を後押ししている。例えば、前立腺癌では PANDA challenge という画像認識を応用した AI 病理診断が、早期癌を診断し、Gleason スコアと呼ばれる悪性度までをも診断出来るよ
うになった (Nat. Med, 2022)。そのため米国 FDA は前立腺癌の AI 病理診断を認可した。さらに早期乳がんを発見するマンモグラフィでの AI 診断(Nat. Med., 2021)が可能になった。また、我が国でも、内視鏡画像診断
支援ソフトウェア EndoBRAIN、医用画像画像解析ソフ-9-

大腸癌分類に AI をどのように活用するか？

子パネル検査(CGP)もこのシステム異常で起こる遺伝

材料と方法

子変異に基づいている。臨床では、治療薬の適応から、(1) パブリックデータベース

これらを単純化した RAS/RAF 遺伝子変異の有無とThe Cancer Genome Atlas (TCGA)のデータベースから、MSI-H の有無からなる遺伝子変異分類が頻用される

597 人分の H.E.染色画像 1960 枚、遺伝子変異、遺伝(図２)。さらに、分子生物学的には mRNA による遺伝子

子発現分類(CMS1-4)、を入手した。the Human Protein発現分類(CMS 分類) も 定義さ れ た (Guinney, Nat.

atlas から 19760 種類の遺伝子発現データを入手した。

Med. ,2015 図３)。この網羅的遺伝子発現の解析で、遺UCSB Xena から 1800 種類のシグナルパスウェイデータを入手した。
(2) 深層学習を用いた人工知能による画像検出
H.E.染色画像から高中分化腺癌・低分化腺癌・粘液
癌、間質、筋組織、脂肪組織の各々224*224 ピクセル
を計 15000 枚用意した(図)。また、これら画像ごと

伝子変異分類にはない、予後不良な間葉型(CMS4)とに色付け＝mask 画像を用意した(図)。深層学習プロ

いうサブタイプが定義された。

グラムは、Python を用い VGG19 をベースとした。

このシステム異常分類に遺伝子変異分類も遺伝子発学習用コンピュータは、CPU はインテル社製 Core i9

現分類も包括されるが、病理分類との関係を調べた報12900、GPU は NVIDIA RTX3090 ti 24GB モデルで構告はない。私たちは、従来の病理組織分類である高・成されたものを用いた中分化型、粘液型、低分化型に、間質の量も癌を構成(3) 機械学習を用いた遺伝子情報の解析する成分と定義すると、分子生物学的分類と病理分類

深層学習を用いた AI 大腸癌分類に従い、遺伝子発を統合出来、予後とも相関することを見出した(図４)。

現、シグナルパスウェイを、JMP17 を用いてクラス
ター解析を行った。
結果(1) 大腸癌病理画像を VGG19 を用いて深層学習させ、Semantic segmentation の基盤作りを行う
まず、H.E.染色画像から高中分化腺癌・低分化腺癌・粘液癌、間質、筋組織、脂肪組織の各々224*224 ピク
セル 700 枚を、それぞれの領域ごとに色付けを行い、そこで、図４の項目ごとの病理画像の特徴を抽出、深mask 画像を作成した。VGG19 を用いて HE 画像と層学習により AI 遺伝子病理画像分類を構築し、さらにマスク画像を深層学習させた(図５、図６)。

構成する成分を 1 ピクセル毎に Semantic Segmentation
して定量化すれば、AI で詳細な大腸癌分類が可能になると予想した。
目的
大腸癌病理組織像に対し AI が画像分類可能になる分類方法を構築し、AI 画像分類に分子生物学的な意味づけを行い、AI 遺伝子画像検出モデルを構築する。さらに、分類ごとに遺伝子情報をフィードバックすることで組織別バイオマーカー群を構築する。

-10-

Accuracy にばらつきを認めたため、7000 枚、14000

これらの分類で TCGA に収載されている 597 例の生存枚と画像を増やし深層学習を行なった。Accuracy は

曲線は図９となる。高分化型が最もよく、低分化型が最82%でプラトーとなった(図６)。

も予後不良で、間質型は中間であった。

(2) 大腸癌病理画像を Semantic segmentation する
14000 枚学習させた重み付けされた AI 病理画像プ
ログラムを用いて、HE 画像を Semantic segmentation
させると図７のようになる。粘液癌の H.E.画像であり、(4) A I 大腸癌分類はクラスター解析をより分かりやす
くする

粘液を裏打ちする癌細胞は分化型と分類した。後述するように、粘液癌には分化型癌が粘液を産生するタイ

the Human Protein Atlas に収載されている 16000 種

プと、未分化癌の一部が粘液を産生するタイプがある。

類の mRNA のクラスター解析を行うと、図１０左に

このように、AIはすべての領域に対して分類、検出してなる。クラスター解析は、発現の高低を機械的に分くれるので非常に有用であることが示された。

けただけである。図１０左だけでは、どのような群にまた、同時にピクセル数をカウントするだけで領域の面なっているかは判断できない。
図１０右にあるように AI

積が算出されるので、どの組織型が優位なのか、また病理分類ごとに当てはめてみると、AI 病理分類とクラス

先進部はどの組織型なのか、など任意の場所での分ター解析は相関していた。発現の高低を機械的に分類が瞬時に可能となる。

けた分類と、AI 病理分類が一致するということは、
遺伝子発現＝AI 病理分類となるので、遺伝子発現の(3) A I 大腸癌分類

結果が病理組織像になるのではないか、という仮説

同様に、分化型腺癌、間質、粘液型癌、低分化腺癌がここに証明された。

の代表的な Semantic Segmentation の例を示す(図８)。
以下の分類は、最も有意に多い構成成分を採用することとした。

さらに簡略化すると、図１１左のようになる。そしてこれを元に、系統樹を描くと(図１１右)、まず分化型と間質型・低分化型に分かれて、次に、間質型と低分化型に分かれる。遺伝子発現を機械学習させたクラスター分類と、深層学習による AI 病理画像分-11-

類を組み合わせるだけで、予後も加味された図１１右は過学習をしてしまい逆に正答率が下がってしまう現のような分類が可能になった。

象がある。しかし、この教師画像を用意するには試行錯誤しかないため、build and scrap で応じるしかない。
そのため、分類方法にも工夫が必要である。我々は、臨床で汎用されている RAS/RAF/MS status、4000
例の次世代シーケンサーによる大規模な遺伝子発現分類(CMS 分類)も結局は、病理組織分類と大腸癌を引き起こす 5 つのシステム異常の組み合わせで説明できることを見出した。CMS 分類の一番の意義は間質の多いタイプ＝間質型(mesenchymal type もしくは
EMT 型)を創出したことである。我々はこの点に着目し、間質も大腸癌を構成する成分になる、と考え(5) A I 大腸癌分類とシグナルパスウェイは一致する

た。こうすることで、遺伝子情報と病理分類を統合

さらに、シグナルパスウェイのクラスター分類を AIできる分類法(図４)となり、分類法ごとの教師用病理病理分類で説明できるかを試みた。遺伝子発現のク画像も用意できることを見出した。

ラスター分類よりも、シグナルパスウェイのクラス

世にある AI 画像分類、検出は 10 億枚、少なくとター分類の方が病理組織を説明可能であった。すなも数百万枚で学習されたプログラムである。今回はわち、分化型癌では、細胞周期、DNA/RNA 合成が畳み込み(Convolution)のみでの VGG19 の AI プログ

亢進し、また c-Myc 系も亢進していた。一方、間質ラムを使用したため、1 万数千枚の教師画像で GPU

型は、TGFb シグナル、FGF シグナル、matrix metallo

メモリを全て消費した。しかし、VGG19 での正確度

protease (MMP)シグナルが亢進し、また血管新生シは 84%程度とされるが、今回我々の教師画像では正グナルも亢進していた。低分化型・粘液型癌では、確度は 82%であったので、VGG19 の精度で AI プロ

TNF-α、Fas signal、また代謝にかかるシグナルが亢

グラムの構築は完成とみる。さらに精度を高めるた

進していた。

めには、より多くの教師用画像を用い、さらに精度の良い deepLab V3 plus での深層学習が必要かも知れない。

考察
我々は深層学習を使用して、大腸癌の病理組織像

がんのバイオマーカーとは、サブタイプ特異的なに対する Semantic Segmentation を実現するプログラ

遺伝子変異、遺伝子発現、タンパク質などを見つけムを開発した。このプログラムにより、各ピクセルることである。クラスター解析とは、関係の強い数に分類ラベルが割り当てられる。
病理組織の範囲は、字をまとめ、グループ化することに他ならない。こピクセルカウントを基に定量的に評価することがでのグループごとの特徴を見出すのが困難である。今きる。この AI 病理分類法を用いて、組織像が分化

回我々は、クラスター解析での群と AI 病理分類の型、間質型、粘液型、または低分化型のどれである群が一致していることを見出した。これこそが、遺かを自動的に判別することが可能となった。

伝子変異、発現の結果が病理組織を創り出す証左とTCGA の 597 例を基に、Kaplan-Meier 法で描かれた言える。さらに、シグナルパスウェイのクラスター

予後曲線は、この AI 病理分類法との間で強い相関解析を行ったところ同様であった。つまり、シグナを示していた。

ルとは 5 つのシステム異常に相当するので、この 5

さらに、遺伝子発現とシグナルパスウェイのクラ

つのシステム異常の強弱で病理組織が決定するといスター解析により判明したサブタイプは、AI による

うことである。我々の施設でのコホートを用いて遺病理分類で明確に区分されることが確認された。

伝子発現、シグナルパスウェイでも同様のことが再現できるか現在準備中である。

深層学習による画像分類を行うには、AI が判断しや
すい教師画像を用意する必要がある。AI が分類するた

今回、深層学習による AI 大腸癌病理画像分類法

めに特徴的な所見を必要とするからである。ただし、この構築、Semantic segmentation による大腸癌病理自動こで過学習に注意する必要がある。一つの分類に多く

検出法の確立と、機械学習による遺伝子発現、シグの特徴を詰め込んだ多彩な教師画像を用意すると、AIナルパスウェイのクラスター解析により、大腸癌新-12-

分類を構築した。他のコホートでの再現性を行い、バイオマーカーの構築にさらに研究を続けて行きたい。
主な業績
論文発表：0 (投稿中:1)
学会発表：3 件
1. 矢野修也 重安邦俊 母里淑子 岸本浩行 永坂
岳司 高度進行大腸癌に対する骨盤内臓全摘術
は KRAS 野生型かつ分化型腺癌のみに効果的である 第 60 回日本癌治療学会学術集会 臓器別ワークショップ 神戸 2022 年
2. 矢野修也 重安邦俊 母里淑子 岸本浩行 永坂
岳司 さらなる大腸癌 Precision Medicine を目指した深層学習による画像分類と機械学習による遺伝
子発現分類に基づいた AI 大腸癌分類 第 123 回
日本外科学会定期学術集会 ワークショップ 東京
2023 年
3. 矢野修也 重安邦俊 母里淑子 岸本浩行 永坂
岳司 深層学習による画像分類と機械学習による遺伝子発現分類に基づいた難治性消化器癌のAI 分類 第 78 回日本消化器外科学会定期学術集会 シンポジウム 函館 2023 年-13-

（表 題）
小児脳腫瘍腫瘍診断困難例に対するマルチオミクス解析を駆使した precision medicine の確立（所 属）
岡山大学学術研究院 医歯薬学域 脳神経外科

（氏 名）
石田 穣治
（研究成果の概要）
小児脳腫瘍は死亡率が高い難治疾患であるものの、日本の現状では保険診療範囲内での診断は困難であるため、手術後の治療方針の決定に悩むことが多い。本研究では、DNA メチル化パターンから腫瘍型を同定する手法を用いて小児脳腫瘍の診断解析を行った。さらに診断に応じた個別化治療を目指すため、小児悪性グリオー
マから樹立した初代培養細胞に対する新規治療薬による治療実験を行い、一定の効果が示された。

（本文）

う必要がある。
2021 年に当院で小児を含む脳腫瘍に対してゲノ背景
原発性脳腫瘍は約 130 種類以上の診断名が存在す

ムワイドメチル化解析を行った病理診断困難例のうること、希少がんであることも相まって、診断が困ち、約 7 割は既存のゲノムワイドメチル化解析リフ

難な症例を経験する。その中でも小児例は特に希少ァレンスデータを用いて診断に至らなかった。このであるため、診断困難に行き当たることが少なくなようにゲノムワイドメチル化解析によっても診断困い。悪性脳腫瘍は小児がんのうち死亡率が最も高い

難例も存在するため、これらに対してはマルチオミ

難治疾患であり、治療成績の改善が喫緊の課題であクス解析を追加する必要がある。
また小児脳腫瘍の中でも paediatric-type diffuse

る。
近年、DNA メチル化というエピゲノムの状態を網

high-grade gliomas に属する diffuse midline glioma, H3

羅的に解析することで、特定のパターンから腫瘍型

K27-altered で、脳幹（橋）発生のものは DIPG (diffuseを同定するゲノムワイドメチル化解析による診断技

intrinsic pontine glioma)と呼ばれ、非常に悪性度の高術の開発が進んでいる。2021 年 CNS 腫瘍 WHO 分

い脳腫瘍である。現在までのところ、有効とされる類第 5 版の改訂後、半数以上の疾患でゲノムワイド

化学療法は存在しないが、近年の網羅的ゲノム解析

メチル化解析が必須もしくは推奨となり、診断に基により基礎研究では効果を示す薬剤が報告されておづく治療が求められる (Pickles JC et al., Lancet Child

り、今後の臨床応用への発展が期待されている。

Adolesc Health, 2020)。しかしながら本邦ではゲノム
ワイドメチル化解析が保険償還されていないために、目的
1）
小児脳腫瘍の臨床症例に対してゲノムワイドメ

臨床研究としてメチル化解析を実施して個別診断行-14-

チル化解析を行い、診断精度を高める。

結果

2)有効な化学療法がない小児グリオーマに対する

1) 小児脳腫瘍のうち、病理診断可能例と病理診断

新規治療薬を模索する。個々の腫瘍に対するターゲ

困難例に対してゲノムワイドメチル化解析を 2

ット薬剤の効果および機序を検証することで、例に対して行った。

precision medicine（精密医療）の確立を目指す（要旨

症例1: 頭痛で発見された10歳代の視床腫瘍。手図）。

術摘出にて低悪性度グリオーマであるpilocytic
astrocytoma, WHO grade 1と病理診断が確定した。
Infinium MethylationEPIC arrays [Illumina, Inc., San
Diego, CA, USA] を用いてゲノムワイドメチル化解析を追加し、Molecular Neuropathology Classifier(MNP, https://www.molecularneuropathology.org/msp/)
version 12.5にて、スコア0.88824でpilocytic
astrocytomaにマッチし、統合診断でもpilocytic
astrocyrtoma, WHO grade 1と確定した。ROS1遺伝子座を示す6q22染色体領域の欠失が示された (図1A,

方法

B)。ROS1変異を示す低悪性度グリオーマは過去の

1) 病理診断困難例に対するゲノムワイドメチル化

大規模データから0.4%の頻度と稀であるが (Ryall S
et al., Cancer Cell, 2020)、本解析により将来的にター

解析
当院で解析を行った症例を Web ベースのリファ

ゲット治療薬の対象となる可能性が示唆された。

レンスデータ(2800 例以上)と比較し、t-SNE やUMAP

症例 2: 頭痛で発見された 10 歳代の側頭葉腫瘍。

等の次元削減法を用いて診断する。この方法では診

手術摘出にて high-grade glioma, NOS, WHO grade 4 相断が行えなかった症例に対しても、既存のリファレ当と診断された。症例 1 と同様にゲノムワイドメチ

ンスデータに依存しない解析を追加することで、更ル化解析を追加して行ったが、スコア 0.15683 と解に詳細に細分類を行った。

析可能範囲の疾患にマッチしなかった (図 1C, D)。
Cancer gene panel 診断により、FGFR::TACC3 fusion
が判明した。統合診断は glioblastoma, IDH-wild type,2) 患者由来脳腫瘍細胞株に対する治療標的の探索と precision medicine の確立

NEC, WHO grade 4 となった。ゲノムワイドメチル化

小児を含む若年世代の脳腫瘍は、成人に一般的な解析だけでなく、マルチモダリティによる解析が小driver 遺伝子とは異なる遺伝子変異を有しているこ

児脳腫瘍の診断と治療に貢献する可能性が示唆されとが多く、治療標的となる変異が発見されることもた。

多い。このため、①で得られたデータを元に、論文あるいは Web 上のデータベースからターゲット薬剤を検索し、患者由来脳腫瘍細胞株に対する治療効
果を in vitro で検討した。
治療効果は 96 well プレートを用い、治療濃度別に
cell viability assay を行い、治療効果解析した。複数の治療標的薬に対して、数学的相乗効果解析アプリケーション(SynergyFinder; https://synergyfinder.fimm.fi)を用いて薬剤相乗効果について検討した。

-15-

2) 患者由来脳腫瘍細胞株に対する薬剤スクリーニ
ングと数学的相乗効果解析

主な発表論文など
雑誌論文: 2 報

研究期間中に患者由来小児脳腫瘍細胞株として適切な症例が無かったため、すでに樹立されている小1. Otani Y, Satomi K, Suruga Y, Ishida J et al. Utility of

児 DIPG 患者由来細胞株を用いて in vitro で薬剤治療

genome‑wide DNA methylation profiling for

実験を行った。

pediatric‑type diffuse gliomas. Brain Tumor Pathol.

Lin らの報告から、DIPG 細胞に効果を示す可能性

2023 Apr;40(2):56-65.（4 番目/7 人）の高い薬剤を抽出した (Lin et al., Sci Transl Med,

2. Makino K, Otani Y, Fujii K, Ishida J et al. Utility of2019)。細胞株 DG-A および DG-B に対して、

Comprehensive Genomic Profiling for Precise

topoisomerase II 阻害薬を投薬し、cell viability assay を

Diagnosis of Pediatric-Type Diffuse High-Grade

行ったところ、それぞれ 0.023 μM、0.027 μM と低い

Glioma. Acta Med Okayama. 2023 Jun;77(3):323-

IC50 を示した (図 2A, B)。さらに薬剤 a, b, c を用い

330.（4 番目/12 人）て濃度勾配別に薬剤を併用し、SynergyFinder アプリ
ケ ー シ ョ ン に て 解 析 し た 。 ZIP (zero interaction

学会発表

potency) analysis により、いずれもピーク値 15 を超石田穣治ら、当院における小児グリオーマ診療につえ る 高 い 相 乗 効 果 を 示 し た ( 図 2C) 。

いて －がんゲノム医療時代における変遷－ 第 51回日本小児神経外科学会 (2023.6)
図書:なし
産業財産権:なし

研究成果
小児脳腫瘍は希少かつ難治性疾患であるが、近年のゲノム解析による病態の解明により、precision
medicine に関する期待の高い疾患といえる。実臨床に成果を得るまでに依然多くのステップを要し、継続して研究行う必要がある。今回少数のみでの研究であるが、本研究によりゲノムワイドメチル化解析が確定診断に寄与し、分子標的治療等の候補薬剤選択の可能性につながる成果を得ることができた。今後、国内外の臨床および基礎研究と連携して継続することで、疾患病態の解明と新規治療へつながることが期待できる。

-16-

（表 題）ゲノム編集を用いた腎臓病の病態解明と治療法の開発（所 属）重井医学研究所 分子遺伝部門（氏 名）難波 真澄（研究成果の概要）
アルポート症候群は、糸球体基底膜の異常を特徴とする進行性遺伝性腎疾患である。本疾患は、Col4α3、Col4

α4、または Col4α5 の変異により発症する。本研究では、rGONAD 法を用いて Col4α5 を欠損させたラットを作製し、新規のアルポート症候群モデルラットを作製した。Col4α5 欠損ラットのヘミ変異体雄は、血尿、蛋白尿、高濃度 BUN、Cre を示し、18-28 週齢で死亡した。腎臓切片を顕微鏡下で観察すると、糸球体・尿細管の線維化、基底膜の菲薄化や緻密板の分裂・断片化など、異常が認められた。以上のことから、Col4α5 欠損ラットは、
アルポート症候群の病態を再現しており、アルポート症候群モデルラットとして有用であることが示唆された。

（本文）

Acids Delivery）法(図 1)を使ってノックアウトラ

１． 研究開始当初の背景

ットを作製した。rGONAD 法は、Cas9 タンパク、ガイ

アルポート症候群(Alport syndrome)は予後不良

ド RNA、一本鎖 DNA（ssDNA）を含む溶液を卵管に直の進行性遺伝性腎疾患である。その病態の原因は、

接注入し、その後、エレクトロポレーションを行う

IV 型コラーゲンの異常である。アルポート症候群はことでノックアウトラットを作製する。rGONAD 法を

X 染色体連鎖型と常染色体型に分類され、その約 8処置された母親ラットを利用すれば、妊娠から出産、割が X 染色体連鎖型で最も多く、X 染色体を 1 本しそして育児まで、通常通りの飼育方法で繁殖させるか持たない男性の場合、病態は重篤なもので 10 代ことが可能である。

後半から 20 代前半で末期腎不全へと進行する。
実験用ラット(Rattus norvegicus）は、哺乳類の中でよく使用される実験モデル動物であり、例えば
Wistar Kyoto (WKY) ラット系統は、腎炎感受性があることが知られている。

図 1. rGONAD 法

ラットはマウスと比較して、体が大きく、尿量も多いなど、実験を行う上で取り扱いが容易であり利

２．研究の目的点が多い。しかし、遺伝子改変技術という点におい本研究では、腎炎感受性のある WKY ラット系統にては、マウスより作製が困難で、近年までノックア

おいて、rGONAD 法を用いて Col4α5 欠損ラットを作

ウトラットの作製は積極的に行われてこなかった。

製し、アルポート症候群モデルとして有用となりう

CRISPR/Cas9 の登場により、ノックアウトラットのるか検討した。モデルラットが作製できれば、病態作製は以前に比べれば格段に容易になったが、そのの進行メカニズムを解明する手がかりとなり、また敷居は未だに高く、胚操作や生体外でのマニピュレ

投薬などの治療法探索にも有力な候補となりうる。

ーションなど、高価な装置や高度な技術を要することが大きな障壁となっていた。

３．研究の方法

そこで今回は、負担のかかる実験ステップを省略

1

実験動物

し、
かつ高効率にノックアウトラットを作製できる、WKY ラットを Charles River 社から購入した。

rGONAD(Genome-editing via Oviductal Nucleic

12:12h の明暗時間で、自由飲水・自由給餌で飼育し

-17-

た。

した。クレアチニンクリアランスは、(尿クレアチニ
ン［mg/dl］×尿量［dl］）／血清クレアチニン［mg/dl］

2Col4α5 欠損ラットの作製で算出した。測定はすべて、メーカー推奨のプロト

CRISPR/Cas9 溶液を、
Alt-RTM CRISPR-Cas9 system

コールに従って実施した。

(IDT 社)の取扱説明書に従って作製した。
ガイド RNAの 配 列 をCHOPCHOP

ホ ー ム ペ ー ジ

5 免疫染色(https://chopchop.cbu.uib.no/)のアルゴリズムをラット腎臓を OCT コンパウンドに浸し，液体窒素

利用して作製した(図 2)。

中で凍結させた。その後，5 μm の厚さで凍結切片

交配後 0.75 日の雌ラットの卵管に、調整したを作製した。アセトンで固定後、5 %ロバ血清を用い

CRISPR/Cas9 溶液を注入し、NEPA21（ネッパジーンて室温でブロッキングし、その後一次抗体と反応さ社）を使用してエレクトロポレーションを行った。

せた。PBS で洗浄後、二次抗体と室温で 1 時間反応させた。共焦点顕微鏡（オリンパス、FV1200）を用
いて観察・撮影を行った。
４．研究成果rGONAD 法で、Col4α5 欠損ラットを作製した。作製した Col4α5 欠損ラットは通常繁殖が可能で、その産子はメンデルの法則に従って産まれることが確認できた。しかし、生存週齢において、ラットは通常

図 2. Col4α5 欠損ラットのゲノム編集

2‐3 年生存するのに対し、X 染色体を 1 本しか持たないヘミ変異体雄は 18 週齢から 28 週齢で死亡した

3 ＰＣＲによる遺伝子判別（n=58）。また、ヘテロ変異体雌は 35 週齢から 100

ラットの耳または尻尾から DNA を単離し、PCR と週齢で死亡し、100 週を超えても生存している雌はシーケンスにより遺伝子変異を確認した。ジェノタ

全体の約 30%にとどまった。
（n=33）。Col4α5 欠損ラ

イピングでは、以下のプライマーを使用した：rCol4

ットは寿命が正常ラットより短く、特に X 染色体をα5-fw、（5'-GCTCTTCCCAATAACCCCT-3'）、rCol4α5-

1 本しか持たないヘミ変異体雄では短命となること

rv、（5'-CAATTTTGACTTCCCTGGCCA-3'）。

がわかった(図 3a)。
次に、腎機能を評価するため、Col4α5 欠損ラッ

4 尿および血清による腎機能評価

トの尿を検討した。ヘミ変異体雄では生後 21 日か

尿は、ラットを個別に代謝ケージに入れ、16 時間

ら血尿となり、6 週齢までに尿蛋白が認められた(約畜尿を行うことで回収した。尿蛋白は、3％スルホサ

6.0 mg/16 時間）。また、ヘテロ変異体雌では生後 4リチル酸を用いて吸光度を測定し、蛋白量を計算し週から血尿が認められた。12 週齢以降はヘミ変異体

た。

雄の全て（n=35）で、16 週齢ではヘテロ変異体雌の血清は、ラット尾静脈から血液を採取し、3000rpm

62%（n=28/45）で尿蛋白量が 20.0 mg/16 時間以上にで 5 分間遠心分離したのち上清を回収することで得増加した。一方、正常ラットでは、雄雌に関わらず、た。

いずれの週齢でも血尿・蛋白尿は検出されなかった

血清中の血中尿素窒素（BUN）は Colorimetric（図 3b）。

Detection Kit (Arbor Assays 社)を用いて測定し続いて、体重変動と尿量変化について検討した。

た。血清または尿中のクレアチニン（Cre）濃度は、

ヘミ変異体雄は、正常な雄と比べ、体重が減少し、Jaffe 法（富士フイルム和光純薬社）を用いて測定

尿量が増加した（図 3c,d）。血中尿素窒素(BUN）お-18-

よび血清クレアチニン(Cre）濃度は、ヘミ変異体雄で 20 週齢になると顕著に上昇した（図 3e,f）。ヘミ
変異体雄の蛋白／クレアチニン比はで 8 週齢から高値となり、クレアチニンクリアランスは 20 週齢までに有意に低下した（図 3g,h）。

図 4. 免疫染色
正常ラット雄と Col4α5 欠損ラット雄の腎臓における COL4α3 から COL4α5 の発現本研究で作製した Col4α5 欠損ラット雄は 18 週
齢から 28 週齢で死亡し、約 95 %の個体が 20 週齢から 26 週齢の間に死亡した。今後は、この Col4α5 欠損ラットに対し、薬剤治療や給餌などが寿命にどのように影響するか検討していく予定である。
図 3. Col4α5 欠損ラットは早期より尿蛋白・血尿

またラットは血圧測定が可能であり、その数値はが認められる

マウスに比べて信頼性も高いことが知られている。

(a)生存率 (b)尿蛋白 (c)体重 (d)尿量 (e)血中尿

よって、この Col4α5 欠損ラットはアルポートモデ

素窒素(BUN)濃度 (f)血清クレアチニン(Cre)濃度

ルラットとして、アルポート症候群のような腎疾患(g)蛋白／クレアチニン比 (h)クレアチニンクリアと血圧関連疾患との関係性を研究する上でも、新たランスな知見をもたらすことが期待される。
以上のことから、Col4α5 欠損ラットは、腎疾患

また Col4α5 欠損ラットの腎臓において蛍光染色のメカニズムを解明し、治療標的を特定するためのを行ったところ、
8-20 週齢のヘミ変異体雄では COL4

アルポート症候群モデルラットとして、有力な候補

α5 の発現が消失し、ヘテロ変異体雌ではモザイクとなりうる。

パターンとなった。また、COL4α3、COL4α4 の発現もヘミ変異体雄では見られず、ヘテロ変異体雌では５．主な発表論文等

モザイクパターンとなった。以上の結果から、Col4〈雑誌論文：1 件〉

α5 欠損ラットにおいて、IV 型コラーゲンα3/α4/

1. Creation of X-linked Alport syndrome rat
with

Col4a5α5 のらせん構造が消失していることが示唆された

model

deficiency(Namba

M,

（図 4）
。

Kobayashi T, Kohno M, Koyano T, Hirose T,
Fukushima M, Matsuyama M.)Sci Rep. 2021
〈学会発表：1 件〉
1. Namba Masumi, Kobayashi Tomoe, Kohno Mayumi,
Koyano Takayuki, Matsuyama MakotorGONAD: a new method for germline genomeediting in rats and the creation of rat models-19-

of underlying renal diseases
第 8 回

日本ゲノム編集学会(タワーホール船堀),2023 年 6 月 6 日(火)～6 月 8 日(木)-20-

非アルコール性脂肪肝炎にサルコペニアを併発する際の腸内細菌叢の変化
岡山大学学術研究院保健学域
山元

修成

（概要）
非アルコール性脂肪肝炎 (NASH) に，骨格筋が萎縮するサルコペニアが併発することが明らかになった。併発機序はいくつか報告されているが，いまだ有効性が示された報告はなく，未解明の機序の存在が示唆されている。近年，腸内細菌叢が，疾患の発症に関与していることが明らかになり注目されている。本研究では，筆者らが確立した世界的にも珍しい NASH－サルコペニア併発モデルを用い，併発時の腸内細菌叢の変化を解析した。

1．研究開始当初の背景

在 まで に有 効な 治療 方法 は確 立さ れて いな い

ヒトをはじめとする哺乳類の腸内には，多種多様(Eksted M et al., 2015; Targher G et al., 2016)。このな細菌が共生している。これら細菌からなる生態系

NAFLD/NASH の予後に，加齢や肥満，インスリン抵

は腸内細菌叢と呼ばれ，宿主の免疫系構築・成熟に

抗性とは独立して，骨格筋が萎縮するサルコペニア

影響することが知られてる。免疫系により適切に制が影響することが近年報告された (Lee YH et al.,

御された腸内細菌叢は，糖質や脂質のエネルギー代

2015; Koo BK et al., 2017)。

謝や病原細菌の定着抑制など，宿主にとって有益な

サルコペニアは元来，加齢に伴い筋肉量が減少し，作用を発揮する (Sysbiosis)。しかし，抗生物質の投筋力や歩行速度の低下を伴う疾患と定義されていた与や生活習慣の変化，環境要因や遺伝的素因により，(Rosenberg IH, 1989)。しかし現在では，加齢以外の要

こ の相 互関 係は 破綻 する こと が知 られ てい る

因，悪液質 (カヘキシア) や糖尿病，慢性腎疾患など(Dysbiosis)。この Dysbiosis の状態は，代謝性疾患 (糖の諸疾患や寝たきりになることでもサルコペニアを尿病など) や消化器疾患 (炎症性腸疾患や大腸がん

発症することが明らかにされ，これらを二次性サルなど)，神経疾患 (パーキンソン病など) など，種々

コペニア，加齢に伴うものを一次性サルコペニアとの疾患の原因になることが報告されている

区別している (Bauer J et al., 2019)。サルコペニアが(Clemente JC et al., 2012; Hsiao EY et al., 2013; Sharon G

進行すると，転倒や活動度低下が生じやすく，フレ

et al., 2014)。

イル (虚弱。生理的予備能が低下することで，スト

近年，世界的に患者数が増加し注目を集めているレスに対する脆弱性が亢進し，機能障害や要介護状

非アルコール性脂肪性肝疾患 (NAFLD) でも，腸内態，死亡など不幸な転機に陥りやすい状態) が進行

細菌叢の変化が報告されている。NAFLD は，飲酒量し，生命予後等を低下させることになるため問題視が乏しいにもかかわらず脂肪肝を呈する慢性肝疾患

されている。

で，脂肪肝のみを呈する非アルコール性脂肪肝

NAFLD/NASH にサルコペニアを併発する機序と(NAFL) と，脂肪肝に加え炎症細胞の浸潤および肝しては，たんぱくエネルギー低栄養などが考えられ線維化を伴う非アルコール性脂肪肝炎 (NASH) にているが，未解明の機序の存在も示唆されている。

二 分 さ れ る (Rinella ME, 2015; Nd AM, 2019) 。

このような疾患の機序解明や予防・治療方法の研究

NAFLD/NASH は肝硬変や肝がんへ移行するだけでには有用なモデル動物が必要になるが，これまでヒなく，心血管疾患の発症・死亡率も増加することがトの病態に類似した NAFLD/NASH 併発性サルコペ

明らかにされており，盛んに研究されているが，現ニアモデルは報告されていなかった。筆者らは，-21-

NAFLD/NASH モデル動物であるSHRSP5/Dmcr ラッ24.0%，粗繊維 1.5%，粗灰分 2.3%，水分 3.7%，炭水トが，高脂肪・高コレステロール (HFC) 食負荷によ化物 26.9%，
パーム油 25.0%，
コレステロール 5.0%，って NAFLD/NASH にサルコペニアを併発すること

コール酸 2.0% (Kitamori K et al., 2012)。

を見出した。本ラットは，ヒトの病態と共通して，

ラットは，最初の一週間は水と SP 食を自由摂取

肝線維化の進行に伴いサルコペニアを併発するといさせて馴化を行った。10 週齢開始時に，摂食量，体う特徴がある (Yamamoto S et al., 2023)。

重，四肢筋力に有意差が生じないよう，SP 食給餌群と HFC 食給餌群の 2 群に群分けし，20 週間の食餌

2．研究の目的負荷を行った (各群 n = 5)。

既述のように，NAFLD/NASH 患者で腸内細菌叢
3.2. 生理学的解析の変化が起こっていることはすでにいくつかの報告がある (Zhu L et al., 2013; Raman M et al., 2013;

最終週齢 (30 週齢) 時に，一晩絶食させたラット

Mouzaki M et al., 2013)。また，腸内細菌叢の変化は加をペントバルビタールナトリウム (48.6 mg/kg) で齢によっても起こるため，サルコペニアをはじめと麻酔し，長趾伸筋 (EDL; 速筋) およびヒラメ筋

する様々な筋消耗性疾患への関与が示唆されている(SOL; 遅筋) それぞれの筋収縮力を測定した。測定(Siddharth J et al., 2017; Kang L et al., 2021; Ren X et al.,は MP100 ， AcqKnowlege ， ト ラ ン ス デ ュ ー サ2021; Wang Y et al., 2022)。しかし，NAFLD/NASH に

TSD125D，アンプ DA100C，双極鉤電極 UM2-5050，

おける腸内細菌叢の変化が骨格筋にもたらす影響に

刺激反応用モジュール STM100C，
刺激アイソレーシ

ついては，いまだ検証されていない。

ョンアダプタ STMISOC (すべて BIO PAC Systems,

そこで本研究では，筆者らが確立した

Inc., CA, USA) を用いて行った。刺激電圧は 5V/2 sec，

NAFLD/NASH 併発性サルコペニアモデルである

サンプリング周波数は 2000Hz で記録した。
各筋肉，

SHRSP5/Dmcr ラットを用いて，サルコペニア併発時それぞれ 10 回分の筋収縮力を測定し，ランダムに 3の腸内細菌叢の変化を明らかにする。

回分の測定値を抽出し，平均を取得して比較した(Yamamoto S et al., 2023)。

3．研究の方法
3.1. 実験動物

3.3. 病理学的解析

動物実験は，環境省が公表した「実験動物の飼養

筋収縮力測定後，全採血による安楽死を行い，解及び管理並びに苦痛の軽減に関する基準 (2006 年)」

剖を実施した。採血後，肺を摘出し，リン酸緩衝生の勧告に厳格に従って実施した。本研究では，すべ理食塩水を灌流させた。その後，肝臓と EDL，SOLてのラットを温度 (24℃±2℃)，湿度 (55%±2%)，を摘出し，病理組織学的解析のために切片化した。

12 時間の明暗サイクルがコントロールされている

EDL および SOL は，筋線維の走行に対して垂直に本学動物資源部門の施設内で管理した。本実験は，切片化し，10%中性緩衝ホルマリンで 48 時間振盪固

岡山大学動物実験委員会の承認を得て行っている

定し，断面が観察できるようパラフィン包埋を行っ(承認番号 OKU-2021672)。

た。肝臓に関しても，同様の手順でパラフィン包埋

雄性の SHRSP5/Dmcr ラット (n = 10) は，9 週齢を行った。EDL と SOL は，それぞれ速筋線維で SHR 等疾患モデル共同研究会 (京都，日本) から[Myosin (FAST) clone MY-32; Sigma-Aldrich, St. Louis,購入した。普通 (SP) 食および HFC 食は，フナバシ

MO, USA] と遅筋線維 [Myosin (Skeletal Slow) clone

ファーム (千葉，日本) から購入した。食餌の組成は

NOQ7.5.4D; Sigma-Aldrich] を免疫組織化学染色で次の通りである。SP 食：粗たんぱく質 20.8%，粗脂

染め分け，線維断面積の解析を行った。肝臓は，質 4.8%，粗繊維 3.2%，粗灰分 5.0%，水分 8.0%，炭Hematoxylin-Eosin (HE) 染色と Masson-Trichrome 染

水化物 58.2%，HFC 食：粗たんぱく質 9.6%，粗脂質

色を岡山大学の共同研究室に依頼した。画像は，蛍-22-

光顕微鏡 (BZ-X700，KEYENCE，大阪，日本) を用加したが，SOL の筋線維 (遅筋線維) は両群に差はいて撮影した。解析は Image J Fiji (Image J 1.53u, Java,

認められなかった (図 1C, D)。以上のように，筋重1.8.0_322; National Institutes of Health, Bethesda, MD,

量および筋力の低下が認められたことから，HFC 食USA) を用いた。

を 20 週間給餌した SHRSP5/Dmcr ラットはサルコペ肝臓においては HE 染色像を用いて，NASH の判A)定に用いられる NAFLD 活性スコア (NAS) を算出40した。NAS は，高脂肪食負荷ラットに適用された

30

NASH Clinical Research Network スコアリングシステ

EDL収縮力 (g換算)B) SOL収縮力 (g換算)
20

*

15

20

10

2005; Elias J et al., 2009)。肝脂肪症，炎症，細胞の浸105潤および肝細胞バルーニングそれぞれの評点の合計

0

ムに従って推定されたものである (Kleiner DE et al.,,

SP5+SP

20weeks
SP食群

が 5 点以上のものを NASH と判定する。

SP5+HFC

N.S.

0
SP5+SP

20weeks
HFC食群

20weeks
SP食群

SP5+HFC

20weeks
HFC食群

C)

3.4. 16SrRNA 解析
解剖時に，直腸に滞留している糞便をコレクショ
ンチューブに採取し，凍結保存した。全個体の解剖終了後，凍結糞便を生物技研 (神奈川，日本) に送付
し，16SrRNA V3/V4 領域を対象とした解析を依頼しD)た。解析結果は，データベース (SILVA) を使用して菌種を同定した。
得られた SP 食群（n = 5）および HFC 食群（n =5）の計 10 個体の 16SrRNA 菌叢解析データをもとに，各個体の α 多様性を示す Shannon index と Faith's

SP食群

Phylogenetic Diversity を 調 べ た 。 検 定 は Mann-

HFC食群

E)

Whitney-U で検定した。また，SP 食群および HFC 食
群間での腸内細菌組成の多様性の差 (β 多様性指数)

F)を示す Unifrac 距離を，Unifrac weighted 距離の 2 軸

NAS

10

主成分分析 (PCoA)，Unifrac unweighted 距離から生成された有意性プロットを用いて評価した。Unifrac
SP食群

unweighted 距離の統計検定には PREMANOVA を使
用した。

5

0

SP long

HFC long

SP食群 HFC食群(SHRSP5)(SHRSP5)

4．研究成果4.1. NAFLD/NASH－サルコペニア併発の確認
HFC食群

骨格筋重量は，EDL・SOL ともに HFC 食群で有図1. 生理学・病理学的データ
A: 長趾伸筋 (EDL) の収縮力，B: ヒラメ筋
(SOL) の収縮力，C: EDLの免疫組織化学染色
像 (速筋線維を染色, Scale bar=100 μm)，D:
SOLの免疫組織化学染色像 (遅筋線維を染色,
Scale bar=100 μm)，E: 肝臓のMassonTrichrome染色像 (Scale bar=50 μm)，F:NAS (5点以上をNASHと判定)

意に低値となった。筋収縮力は，速筋である EDL では HFC 食群で有意に低値となったが，遅筋である
SOL では両群に差は認められなかった (図 1A, B)。
筋線維断面積も同様の傾向があり，EDL の筋線維
(速筋線維) は HFC 食群で萎縮した線維の割合が増-23-

ニアを発症していることが示唆される。一方，肝臓た有意性プロット (PREMANOVA 検定) で示しの病態は，HFC 食群で脂肪肝および肝線維化が増悪た。SP 食群と HFC 食群において，Unifrac weighted

し，NAS も 5 点以上となり，NASH を発症している

距離の 2 軸主成分分析は偏りを示した (図 2O)。

ことが確認できた (図 1E, F)。

また，SP 食群と HFC 食群において，Unifrac
unweighted 距離は腸内細菌組成の分類学的な距離を示し，2 群間で有意差を示した (図 2P, Q)。

4.2. α 多様性

Shannon index (図 2A) および Faith's Phylogenetic
Diversity (図 2B) の α 多様性指数は，SP 食群と比4.5. 総括

較して HFC 食群で有意に低下していた (Mann-

ヒトの場合，筋肉重量の減少および筋力の低下を

Whitney-U-test，p < 0.05)。これらの結果は，HFC共に示した場合を，サルコペニアと判断している。

食給餌群において，腸内細菌叢の多様性が減少し筆者らは以前の研究で，SHRSP5/Dmcr ラットが，ていることを示している。

NAFLD/NASH の肝線維化進行に伴いサルコペニアを発症することを明らかにしている (Yamamoto S et4.3. 腸内細菌叢の変化

al., 2023)。本実験でも，HFC 食を 20 週間給餌した
SHRSP5/Dmcr ラットで，NASH とサルコペニアを併本研究では，腸内細菌叢を形成する細菌として
9 門，65 科，127 属が同定された (図 2C, D)。全発していることが示された (図 1)。

サンプルにおいて，腸内細菌叢は主に Firmicutes(25.2%) ，が報告されている。NAFLD/NASH もその一つで，肝Verrucomicrobia 門 (12.2%) ， Proteobacteria 門

線維化が進行すると，Bacteroides 属や Ruminococus(2.3%)，Actinobacteria 門 (1.5%)，Tenericutes 門属が増加することが報告されている (Boursier J et al.,

(0.2%) によって支配されていた。その中でも，

2016)。これは，本研究結果とも一致するものである。

Firmicutes 門は，SP 食群と比較して HFC 食群で有また，Loomba らは，高度線維化症例で Proteobacteria

意に減少した (68.3% vs. 48.2%)。

門が増加し，
Firmicutes 門が減少することを明らかに門(58.3%) ， Bacteroidetes 門

腸内細菌叢と疾患の関係は，現在盛んに研究成果

科レベルでは，SP 食群と比較して HFC 食群で
Akkermansiaceae

科 ， Bacteroidaceae

しているが，こちらも本研究成果と一致している

科 ，(Loomba R et al., 2017)。また，重篤な肝疾患患者では，

Tannerellaceae 科が有意に増加した (図 2E-G)。そ腸内細菌叢の多様性減少と肝機能悪化との間に因果れに対し，SP 食群と比較して HFC 食群で関係が示唆されており (Perlin CM et al., 2023)，本研

Ruminococcaceae 科，
Lactobacillaceae 科が有意に減

究でも腸内細菌の多様性減少が示されている。肝機少した (図 2H, I)。

能の悪化は，以前の研究で報告済みである属レベルでは，SP 食群と比較して HFC 食群で(Yamamoto S et al., 2023)。

Akkermansia 属，Bacteroides 属，Ruminococcus 属，一方，サルコペニアと腸内細菌叢の関係も近年にParabacteroides 属が有意に増加した (図 2J-M)。そなり注目を集めている。主に加齢に伴うサルコペニ

れに対し，Lactobacillus 属は有意に減少した (図ア患者の解析となるが，サルコペニア患者で多様性2N)。

の低下やBacteroides 属がサルコペニアの重症度と関係しているという報告がある (Park CH et al., 2022;

4.4. β 多様性

Wang Y et al., 2022)。NASH がさらに重症化すると肝SP 食群および HFC 食群における腸内細菌組成

硬変となるが，肝硬変患者における筋力低下患者のの違いは，β 多様性指数を用いて示した。この組

腸内細菌叢の調査も行われている。この研究では，

成の違いは，Unifrac weighted 距離の 2 軸主成分分

Bacteroides 属 の 3 種 の ほ か ， Escherichia 属 や析 (PCoA)，Unifrac unweighted 距離から生成されClostridium 属などの菌種が増加していたと報告され-24-ている (Ponziani FR et al., 2021; Ren X et al., 2021)。本
研究でも，HFC 食群で多様性は減少し，Bacteroides

5．主な発表論文等

属が有意に増加した。SHRSP5/Dmcr ラットは，サル【雑誌論文】なし（投稿中：1）

コペニア併発以前にも，NASH 病態で Bacteroides 属【学会発表】が SP 食群より高値となる結果を筆者らは確認して

山元修成，福岡威人，後藤和義，中山日菜子，いる (未発表)。このことから，NAFLD/NASH の発

桐原空，藤井萌，渡辺彰吾．疾患併発性サルコ症・進行に伴い Bacteroides 属が増加し，それによりペニアモデル SHRSP5/Dmcr ラットにおける腸サルコペニアを併発している可能性が示唆される。

内細菌叢の変化．第 10 回 日本サルコペニア・

Lactobacillus 属は，整腸作用など生体にとって良フレイル学会大会，2023 年 11 月 2-3 日，東京．

い作用を発揮する共生菌として有名である。近年，マウスモデルを用いた検討で，Lactobacillus 属を投与することで NAFLD 病態を改善し，肝線維化改善作用を有することが報告された (Velayudham A et al.,2009; Yu JS et al., 2021)。つまり，Lactobacillus 属は
NAFLD/NASH の発症を抑制する働きを有している。
本研究では，Lactobacillaceae 科および Lactobacillus
属の菌群は HFC 食群で顕著に減少しており，
NAFLD/NASH が発症・進展しやすくなっていることが考えられる。
Tannerellaceae 科や Parabacteroides 属は，両疾患と腸内細菌叢に関するこれまでの報告には見られな
いものであった。これらは，二疾患を併発した場合に認められる変化の可能性もあり，注目される。一方，善玉菌とされる Akkermansiaceae 科，Akkermansia
属が HFC 食群で著増した。これらは，痩せに関する菌群で，NAFLD/NASH 患者では正常者より減少することが確認されている。しかし，これら報告は肥満患者における解析結果である。
本モデルラットは，
アジア圏で問題となっている痩せ型 NASH のモデル動物である。痩せ型 NASH 患者に関する腸内細菌の報告は見られず，肥満を呈さない NASH 患者でも同様の結果が得られることが考えられる。しかし，筆者らはなぜこの菌群が増加するのかに対する答えは得られておらず，今後の追究課題となった。
結論として，腸内細菌叢の多様性低下は NASH 病
態およびサルコペニア病態にも影響を及ぼし得ることが示唆された。特に，NASH およびサルコペニア
患者の腸内細菌叢に関する報告の共通項である
Bacteroides 属は，NAFLD/NASH にサルコペニアを併発する仲介因子になっている可能性がある。

-25-

100%

Relative count of family

90%
80%
70%
60%

50%
40%
30%
20%

E)

D)

100%
90%

70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%

0%

0%

HFC食群

SP食群

F)

Akkermansiaceae

HFC食群

G)

Bacteroidaceae

*

H)

80%

10%

SP食群

*

Faith PD*

Relative count of genus

C)

B)

Shannon index

A)

Tannerellaceae

*

*

I)

Ruminococcaceae

J)

Lactobacillaceae

Akkermansia

*
*
*
K)

L)

Bacteroides*

N)

Lactobacillus

Parabacteroides

*

*

O)

P)

0.2

(7.349%)

Q)

*

0.1

*

M)

Ruminococcus

*

0
-0.1
-0.2
-0.5

0

0.5

(78.96%)

図2. 腸内細菌叢解析結果
A: Shannon index，B: Faith’s Phylogenetic Diversity，C: 腸内細菌叢の科レベルの分布，D: 腸内細菌叢の属レベルの分布，E-I: 各科の分布量，J-N: 各属の分布量，O: Unifrac weighted距離の2軸
主成分分析 (PCoA)，P: Unifrac unweighted距離から生成された有意性プロット (HFC食群との腸内細菌組成の分類学的な距離を表す)，Q: Unifrac unweighted距離から生成された有意性プロット(SP食群との腸内細菌叢の分類学的な距離を表す)-26-マルチオミクス解析によるヒト肢芽形成の理解
岡山大学 学術研究院 医歯薬学域（医学系） 組織機能修復学分野
大曽根 達則（研究成果の概要）
本研究では人工ヒト多能性幹細胞から軟骨前駆細胞へと分化する過程において RNA 発現量・オープンクロマ
チン領域・ヒストン修飾の変化に関して、どのような経時的な変動が起こっているのかを明らかにすることを目的として研究を行った。結果、軟骨前駆細胞へと分化する過程における転写因子のネットワークの候補が明らかになった。また、codingRNA における発現変動相関ネットワークが示され、そのネットワーク上で 9 つのクラスタが存在することが明らかになった。

（本文）を取り扱う行動科学分野などが挙げられる。その１．研究開始当初の背景

ような分野においては、現象を数学的、物理・化

細胞内の様々な生物学的挙動が明らかになって学的に再現するのではなく、モデルそのものを別きた今、効率的に in vitro 実験を行うためには、の形で近似することでシミュレーションを行って予めシミュレーションが行えると望ましい。しかいる。そのためヒト細胞においても、ブラックボ

しながら、現実的には細胞シミュレーションの作ックスである細胞内挙動をそのまま再現するので成は困難である。その理由としては、膨大な数のはなく別の形で近似することが出来れば、それは分子が存在すること、それらの相互作用が複雑で細胞シミュレーションになりうるのではないか、あること、それらの分子全ての機能が明らかになと考えられる。

っているわけではないこと、が挙げられる。ヒト

報告者は現象をそのまま再現するのではなく、細胞シミュレーションに向けた研究に関して、国マイクロ RNA 配列とその発現量から疾患モデルを内ではミトコンドリア、シグナル伝達など機能ご構築する研究をこれまで行ってきた。本研究ではとに開発を行い後で統合する E-Cell プロジェク

実用的な速度でのシミュレーションが可能となる

ト、国外では今年初めに報告された約 7000 分子

ように、伝令 RNA-非翻訳性 RNA ネットワークの経からなる細胞を細胞周期の 20 分間をシミュレー

時変化という、別の形で近似する。これは従来のションした研究が挙げられる。前者は Version４

研究とは異なる新しいアプローチである。

まで開発が進んでいるものの、全ての機能ごとにモデルが完成しているわけではなく、後者は並列２．研究の目的計算に特化したコンピュータを使用して 10 時間

本研究では、最終的な目的である「細胞分化にかかっている。従って生化学的に厳密なヒト細胞

おける細胞内挙動の近似モデルを作成する」ため

シミュレーションを作成するのは現時点では非常に、人工ヒト多能性幹細胞から軟骨前駆細胞へとに困難であると言わざるを得ない。

分化する過程において RNA 発現量・オープンクロ

一方、
シミュレーションという観点から見ると、マチン領域・ヒストン修飾の変化に関して、どの他分野でのシミュレーションでは必ずしも対象にような経時的な変動が起こっているのかを明らかおける挙動を科学的に厳密に再現することを試みにすることを目的とする。

ているとは限らない。例えば、人の心理のように現時点では数学的に記述することが出来ない分野-27-

３．研究の方法

ルネットワーク解析などで用いられるエッジベ

３−１．細胞の分化誘導ースの手法であるコミュニティ検出のうち、用いた細胞株および分化誘導の手順は、申請

Louvain 法を用いて相関関係にある遺伝子のク者が所属する研究室が出した論文 [D. Yamada,

ラスタ分類を行った。

et al., Nat. Biomed. Eng., 2021] に全て則ATAC-Seq および CUT&Tag の解析においては、って行った。

fastp で品質管理を行い、
bowtie2 でマッピング

３−２．マルチオミクス解析した。その後フラグメント長分布もしくはマッ

ヒト人工多能性幹細胞 (day0; D0) 、D0 からピングされた断片長分布の評価を行った。シグ

中期原始線条への分化誘導 (MPS)、MPS から側ナル分布の可視化のため、deepTools を用いた。

板中胚葉への分化誘導(day2; D2; LPM)、LPM かまたピーク検出には gopeaks を用いた。ピーク

ら肢芽間葉系幹細胞への分化誘導(day4; D4;の可視化には IGV を利用した。

LBM)、軟骨前駆細胞(ExpLBM)の各段階においてbulkRNA-Seq 解析、ATAC-Seq 解析、CUT&Tag 解４．研究成果析を行った。
なお当初の予定では ChIP-Seq 解析

４−１．bulkRNASeq 解析を行う予定であったが、ChIP-Seq 法の改良版で

D0、MPS、LPM、LBM、ExpLBM の各段階におけあり細胞数が少量でも行うことが可能なるマーカー遺伝子の発現量を確認した。D0 でCUT&Tag 法へと変更した。

は NANOG をはじめとした多能性を示すマーカ

bulkRNA-Seq に お い て は 、 RNeasy Kits

ー遺伝子が、ExpLBM では軟骨前駆細胞のマー(QIAGEN 社)で RNA 抽出を行い、 KAPA RNA

カー遺伝子である PRRX1 が多く発現している

HyperPrep Kit with RiboErase (Roche 社)でラなど、各分化段階においてそれぞれのマーカ

イブラリ作成を行った。

ー遺伝子が見られることが確認できた（図１）。

ATAC-Seq においては、NexteraDNA Sample
Prep Kit (illumina 社)でオープンクロマチン
領域を抽出し、Nextera Index Kit (illumine社)でライブラリ作成を行った。
CUT&Tag においては、CUT&TAG-IT Assay kit(Active Motif社)で取得したいヒストン修飾部位を抽出し、Nextera Index Kit (illumine 社)
でライブラリ作成を行った。
各手順はキットのプロトコル準拠である。塩基配列の読み出しは外注した。
３−３．データ解析
取得した塩基配列は不老 Type II (名古屋大学)で解析を行った。
bulkRNA-Seq 解析においては、
fastp で品質管理を行い、kallisto で擬似マッピングした。正規化には GeTMM 法を用いた。差次的発現解析は
NOISeq で行い、濃縮解析には GSEA を用いた。

図１

相関解析では WGCNA と同じ SCAN 法では実行速分化誘導の各段階における度の点から現実的ではなかったため、ソーシャ

マーカー遺伝子の発現量-28-４−２．ATAC-Seq 解析, CUT&Tag 解析

伝子ネットワークに着目したものを報告する。

ATAC-Seq によってオープンクロマチン領

図３で示したように、オープンクロマチン

域を、CUT&Tag によって H3K9me3、H3K27me3、領域に関しては D0・MPS・LPM では PRRX1 のプ

H3K9ac、H3K27ac の各ヒストン修飾が存在す

ロモータ領域はあまり開いておらず、LBM やる領域を取得した。各分化段階のマーカー遺ExpLBM で開いていく。またヒストン修飾とい伝子に対して、どの領域が開いているのか、う観点でも、D0・MPS・LPM では非活性化を示

どの領域にどのようなヒストン修飾がされてすトリメチル化されているのに対し。ExpLBM

いるのかを IGV で確認した。そのうちの一つ

で特に活性化を示すアセチル化されている。

として、PRRX1 を示す（図２）。PRRX1 では LBM

転写を活性化・非活性化したい領域にメチルや ExpLBM でクロマチンが開いていることが化・アセチル化酵素が引き寄せられるメカニ示された。またヒストン修飾においては、プ

ズムは分かっていないが、メチル化に関して

ロモータの非活性化を示す H3K27me3 のピー

は転写が活性化していない部分がメチル化さクが PRRX1 のプロモータ領域において day0,

れるという仮説がある [Yiran Guo, et al.,

MPS, LPM で立っていた。一方、プロモータ領

Trends Genet., 2021]。そこで本研究ではヒ域の活性化を示す H3K9ac や H3K27ac のピー

ストン修飾ではなく転写因子によるネットワ

クが立っていた。前述したように、PRRX1 はークに着目し、LBM への分化誘導の前後で軟骨前駆細胞のマーカー遺伝子であるため、

PRRX1 の転写に関わる転写因子ネットワーク

ATAC-Seq 解析および CUT&Tag 解析においてもがどのように変化しているのかについて調べ

PRRX1 の転写が活性化していることが示された。

た。

PRRX1 の転写制御に関して、次の可能性が考えられる。
1.

LPM まではエンハンサ領域が不活性化しており、LBM 以降では活性化する

2.

LPM まではリプレッサによって転写が抑制されており、LBM 以降ではサイレンサ
領域が不活性化することにより転写が活性化する
前者においては、genecards より PRRX1 のエンハンサ領域を取得し各領域をIGV にて確認したところ次の条件を満たす領域は見つ

図２
PRRX1 がコードされている領域のけられなかった。

オープンクロマチン領域および

LPM までは当領域において

H3K9me3、H3K27me3、H3K9ac、H3K27ac の

クロマチンが閉じている

各ヒストン修飾が存在する領域



メチル化されたヒストンがある

アセチル化されたヒストンがあまり見られない４−３．統合解析軟骨前駆細胞の前後では PRRX1 の発現量がLBM 以降では当領域において大きく異なることが知られている。ゆえにこ

クロマチンが開いている

こでは PRRX1 が LPM 以前と LBM・ExpLBM 以降



メチル化されたヒストンがあまり見られないで PRRX1 の発現が変動する機構に関与する遺

-29-



アセチル化されたヒストンがあるとなった。これらの転写因子が軟骨への分化

後者においては、SilencerDB より PRRX1 のにおいて本当に重要なのか、どのような機序

サイレンサ領域を取得した。実験で確かめら

で分化へと関与しているのかを、今後の研究れたサイレンサ領域は登録されておらず、で研究する予定である。

253 の予測される領域が得られた。各領域をIGV にて確認したところ、８箇所の候補が以４−４．経時的変動解析

下の条件を満たす領域として抽出された。


LPM までは当領域においていが、前準備として D0 から ExpLBM までの各



クロマチンが開いている段階における RNA の発現変動に対して相関解

メチル化されたヒストンがあまり析を行った。報告時点では非翻訳性 RNA を含

見られない

んだ RNA 全体では行えておらず、codingRNA

アセチル化されたヒストンがあるのみでの解析である。codingRNA の相関解析



報告時においては、本解析は完了していな

LBM 以降では当領域においてにより相関関係にある遺伝子ネットワークが

クロマチンが閉じている

得られた（図３）。それにより、9 個のクラス



メチル化されたヒストンがある

タに分けられることが明らかになった。



アセチル化されたヒストンがあまり見られないそれぞれの領域に結合しうる転写因子をJASPAR で予測した。その結果、714 の転写因子もしくはその複合体が見つかった。転写因子の種類としては 669 種類であった。それらの転写因子のうち、LPM 以前と LBM 以降を比較した時に LPM 以前で発現が２倍以上有意に上昇していた転写因子は 10 あった。さらに
その 10 の転写因子のうち、D0 と LPM では有図３

意に発現量が変動しておらず、かつ LBM と分化の経時変動に対する

ExpLBM でも有意に発現量が変動していない

RNA 発現量の相関ネットワーク

転写因子はなかった。また、同転写因子のう

４−５．今後の展望

ち、D0 から ExpLBM にかけて発現が減少して報告時においては、当初の目標であった経

いく転写因子は４つ、D0 で十分発現していな

時的変動解析までは行えていない。従って、

い転写因子は５つであった。D0 と LPM では有どのように転写物ネットワークが分化に従い意な変動は見せなかったが、LBM から ExpLBM

変動するのか、そしてそれを数理モデル化すにかけて有意に減少した転写因子が１つでることが可能かの検討を行う。

あった。これらの転写因子に重複は見られなかった。D0 で十分発現していなかった転写因

５．主な発表論文等

子を除く５転写因子について文献調査をし現時点では当該研究については雑誌論文並びにたところ、いずれも発生初期段階で見られる

学会発表は行っていない。

転写因子や椎骨・尾の形成に重要な転写因子など軟骨の発生においても重要であることが示唆される転写因子であることが明らか-30-