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浦上財団研究報告書

Vol.25（2018）＜平成 27 年度助成＞

果物・野菜のアレルゲンコンポーネント解析－代表的なアレルゲン LTP と新規アレルゲン GRP を中心に－
岡﨑史子（龍谷大学 農学部食品栄養学科）

これまで食物アレルギーは、卵、牛乳といった原諸言

因食品名で表現されてきたが、実際にアレルギーを近年、食物アレルギー患者は増加傾向にあり、我々誘発するのはその食品中のタンパク質である。そこにとって身近であるにもかかわらず、謎の多い疾病で、アレルゲンをタンパク質レベルで解析・診断すである。未だに根治療法が確立されておらず、原因る component-resolved diagnosis (CRD) が提唱され、食品を食べない「除去」が第一の治療となっている。

アレルゲンタンパク質の同定が注目されるように果物・野菜のアレルギーは一般にあまり知られてなった。その中でも、Lipid Transfer Protein（LTP）

いないが、「平成 23 年即時型食物アレルギー全国モは重篤な症状を誘発するうえに、あらゆる植物に相ニタリング調査」によると、原因食品のうち 4％を同性高く保存されているため、交差反応しやすい「汎果物類が占めている１）。果物アレルギーに多い特徴アレルゲン」として論文が多数報告されてきた。我々として、①成長してから発症する、②発症する果物

はモモ LTP の研究過程で、LTP 画分中に Gibberellinが増えていく、③花粉症を合併していることが多い、Regulated Protein（GRP）というアナフィラキシーという 3 点があげられる。乳児・幼児期早期の食物を引き起こす新たなアレルゲンが混在していること

アレルギーは、消化機能や免疫機能の発達と共に 8を発見した２）。GRP は LTP 同様に低分子量ながらシ～ 9 割が治る一方で、成長してから発症する食物アステインが多い塩基性のタンパク質である（Fig. 1）。

レルギーは完治が難しいため、果物も注意すべきアそれゆえに、通常のタンパク質精製方法で完全に両レルゲンである。また、近年、少しずつではあるが者を分離することが困難であった。本研究では、モ野菜アレルギーの報告も増えてきている。

ノクローナル抗体（mAb）を用いたアフィニティク

Lipid Transfer Protein

Gibberellin Regulated Protein

Fig.1）LTP、GRP のアミノ酸配列

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ロマトグラフィーを使ってモモ LTP、GRP を完全にそのままを試料溶液とした。

純化し、両者を比較しながら解析を進めることで、
モモ GRP の特質を明らかにするとともに、GRP が果物・野菜の汎アレルゲンである可能性を探ることを目的とした。

３．サンドイッチ ELISA
抗モモ GRP mAb を 5µg/mL 固相化したプレートに、モモ GRP（0 ～ 1000 ng/mL）を標準溶液として 50µL ずつ添加し、37℃で１時間放置した。試料

実験方法

溶液も適宜希釈後、同様に反応させた。なお、変性剤の影響を調べるために、モモ GRP を 0.1 M 亜硫

１．モモ LTP、GRP の精製酸ナトリウム、0.6% SDS、それぞれもしくは両者のモモ（山梨白鳳）の種を除き、2 mmol/L エチレ存在下で 5 分加熱処理した後、20 倍希釈して ELISA

ンジアミン四酢酸二ナトリウム、10mmol/L ジエチに供した。その後、ペルオキシダーゼ標識抗モモ

ルジチオカルバミン酸ナトリウム、3 mmol/L アジ

GRP mAb を 50µL ずつ添加し、37℃で 1 時間放置後、化ナトリウムを含む抽出溶媒（モモ：溶媒＝ 1：1

ELISA POD 基質 TMB キット（ナカライテスク）を（W/V））および 2% ポリビニルポリピロリドンを加用いて発色させ、主波長 450 nm、副波長 595 nm

え、ミキサーにより粉砕抽出を行った。その後、ガーにおける吸光度をマイクロプレートリーダーによりゼでろ過し、遠心分離（10,000 × g、4℃、10 分間）測定した。LTP についても同様に、抗モモ LTP mAbにより上清を回収した。上清画分にトヨパール CMを用いてサンドイッチ ELISA を行った。

樹脂（TOYOPEARL CM 650M、東ソー）を加え、4℃で一晩撹拌吸着させた後、遠心分離（10,000 × g、結果・考察4℃、10 分間）により樹脂を回収し、カラムに詰め、20 mmol/L リン酸緩衝液 pH 5 により樹脂を洗浄し１．サンドイッチ ELISA の構築た。その後、0.5 mol/L NaCl/20 mmol/L 、リン酸

先行研究にて取得済みの LTP、GRP に対する mAb

緩衝液 pH 5 により吸着画分を溶出させた（CM 吸を用いて、それぞれサンドイッチ ELISA を構築した着画分）。

ところ、どちらも 1ng/mL 程度から検出可能であっ既 得 の 抗 LTP mAb、 抗 GRP mAb を そ れ ぞ れ リ

た。また、LTP、GRP ともに 100℃、20 分間の加熱

ガンド固定化用カップリングカラム（HiTrap NHS-によっても定量値が大きく低下することはなく、非activated HP Columns、GE Healthcare）に結合させ、常に熱安定性の高いタンパク質であることが明らか

イムノアフィニティーカラムを作製した。これを用になった（Fig. 2）。これらの定量系は食品中のアレいて、モモ CM 吸着画分より LTP、GRP をそれぞれルゲンを定量することを想定している。そこで、現純化し、SDS-PAGE、ウェスタンブロッティングにて在市販されている特定原材料のアレルゲン検査で用確認した（データ省略）。

いられている条件に合わせて、亜硫酸ナトリウムと SDS 存在下で定量したところ、ほとんど測定でき２．定量用試料溶液の調製なかった３）。変性剤のうちどちらが影響しているか

加工食品固形試料は、4 倍量（W/V）の PBS を加調べた結果、SDS の影響は少ないが、亜硫酸 Na のえて均質化し、モモ果実は皮と可食部に分けてそれ存在により測定できなくなっていることが分かった

ぞれに２倍量 (W/V) の既出の抽出溶媒と 2％ PVPP

（Fig. 3）。この理由としては、亜硫酸ナトリウムのを加え均質化した。それらを遠心分離（3,000 × g、還元作用の影響が想定される。LTP、GRP ともに、4℃、20 分間）したのち上清を回収し、ろ過（No.2、分子量が小さいにもかかわらずジスルフィド結合がAdvantec）したろ液を試料溶液とした。液体試料は多い（LTP：約 9kD、4 対、GRP：約 7kDa、6 対）（Fig. 1）。

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Fig.2）加熱が定量値に与える影響

Fig.3）変性剤が定量値に与える影響

そのため、熱変性しにくい強固な立体構造を保って実においても皮に圧倒的に多く存在していることがいるが、亜硫酸 Na により還元されジスルフィド結確認できた。一方で、GRP は可食部に多かった。モ合が切れると立体構造が大きく崩れるため、高次構

モ使用加工食品では、果汁 1％の飲料や缶詰のシロッ

造認識の抗体が反応できなくなっていると考えられ

プでも LTP、GRP ともに定量可能であり、現在の通る。亜硫酸 Na は食品添加物として汎用されている知法の条件とは異なるが、モモ使用量の評価に応用ため、この現象を応用することで LTP、GRP のアレできるものであることが示された。また、民間療法

ルゲン性を低減できる可能性も示唆された。

で使用されることのあるモモの葉に、特に LTP が高濃度で存在することが明らかになった。近年、食物２．モモ使用加工品中 LTP・GRP の定量アレルギーの感作経路として「経皮感作」が注目さ構築したモモ LTP、GRP の定量系を用いて、モモれている。そこで、モモの葉エキスを使用した化粧果実やモモ使用加工食品、モモ葉の LTP、GRP の定品等の定量を行った（Fig. 5）。その結果、モモの葉量を行った（Fig. 4）。LTP は植物の表層組織で生体エキス含有化粧品の 6 商品中 4 商品から、0.11ng/ml

防御に関わっていることが知られており、モモの果～ 2.58ng/ml の LTP が 検 出 さ れ た。 自 家 製 化 粧果物・野菜のアレルゲンコンポーネント解析－代表的なアレルゲン LTP と新規アレルゲン GRP を中心に－ 103

Fig.4）モモ使用食品中 LTP、GRP の定量

Fig.5）モモの葉エキス配合化粧品中 LTP、GRP の定量品作製用に販売されていた桃の葉エキスの原液でも測定したところ、皮の LTP 量も、過熟、病気・虫は、LTP：0.3ng/ml、GRP：0.08ng/ml が 検 出 さ れ食いのサンプルで多かった。モモの果実は、熟したた。自家製桃の葉エキス作製用に販売されていた乾後、過熟状態になるまでの期間が短いため傷病との燥モモの葉を添付書類にしたがって煎じた液では、区別は難しいが、LTP、GRP ともに熟すとともに多357ng/ml の LTP が検出された。いずれも低濃度でくなることは明らかになった。

はあるが、モモの葉エキスは、皮膚バリアが低下しそこで糖度との関連を調べるために、完熟に分類ているときに使用されることが多いため、注意が必したモモ 4 個の可食部を細かく切り分けてそれぞれ要であると考える。

抽出し、糖度と GRP の量の関連を調べた（Fig. 8）。
LTP は皮に圧倒的に多く、可食部には少ないので検３．モモの状態別 LTP・GRP の定量討しなかった。個体間で糖度と GRP 量の関連はみLTP は植物の感染特異タンパク質（pathogenesis-られなかったが、個体内では、GRP 量が比較的多い

related protein）として知られており、植物の生体30、31 では、糖度と GRP の量に高い正の相関がみ防御に関わっている。GRP についての統一された見られた。植物の生長や果実の成熟には、日照、気候、解はないが、植物にとっての生体防御タンパク質で物理的刺激、微生物感染、収穫後の保存状態など、あるという報告や、植物の成長、果実の成熟に関わっあらゆる因子が影響するために条件をそろえることているという報告があるため、モモ果実を、未熟、が難しく、この結果から糖度と GRP 量の関連につい完熟、過熟、病気・虫食いに分類してそれぞれ定量て述べることはできないが、果実の成熟との関連がを行った（Fig. 6，7）示唆された。

。過熟や病気・虫食いの４〜６）

サンプルで GRP が多い傾向がみられた。同様に LTP

Fig.6）状態別モモ果実中 GRP の定量

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Fig.7）状態別モモ果実中 LTP の定量

Fig.8）モモ果肉の糖度と GRP 量の関係で、今後は、GRP 研究を果物のみならず野菜やイモまとめ、今後の展望類へと拡大していきたい。
近年、GRP の植物における機能に関する報告が増えてきている。あらゆる植物に相同性高く保存され謝辞ていることから考えても、植物にとって重要な働き

本研究の遂行にあたり、貴重な研究助成を賜りまをしているタンパク質であることが予想される。実した公益財団法人 浦上食品・食文化振興財団および際に、GRP の抗微生物活性を利用した遺伝子組みその関係者の皆さまに心より感謝致します。貴財団

換え植物の開発などの報告もある 。従って、GRPの益々のご発展をお祈り申し上げます。引き続き本が遺伝子組み換え食品として商業利用される前に、研究を進め、成果を還元できるよう精進してまいり

GRP のタンパク質としての性質やアレルゲン性を明ます。

７）

らかにしていくことは、重要であると考えている。
また、本研究で用いたモノクローナル抗体カラムがリンゴ、ブドウ、トマト、ジャガイモなどの広範なGRP の純化にも応用できることが判明しているの

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参 考文 献1) 食物アレルギーの診療の手引き 2014、研究代表者
海老澤元宏
2) Inomata N, Okazaki F, Moriyama T, Nomura Y,Yamaguchi Y, Honjoh T, Kawamura Y, Narita H,Aihara M.(2014) Identification of peamaclein asa marker allergen related to systemic reactions inpeach allergy. Ann Allergy Asthma Immunol. 112(2):175-177.
3) アレルギー物質を含む食品に関する表示について ( 平成 25 年 9 月 20 日付け消食表第 257 号 )4) Segura A, Moreno M, Madueño F, Molina A, GarcíaOlmedo F. (1999) Snakin-1, a peptide from potatothat is active against plant pathogens. Mol Plant
Microbe Interact.12(1):16-23.

5) Nahirñak V, Almasia NI, Fernandez PV, Hopp HE,Estevez JM, Carrari F, Vazquez-Rovere C.(2012)
Potato snakin-1 gene silencing affects cell division,
primary metabolism, and cell wall composition.
Plant Physiol.158 (1):252-63.
6) Moyano-Cañete E, Bellido ML, García-Caparrós N,Medina-Puche L, Amil-Ruiz F, González-Reyes JA,
Caballero JL, Muñoz-Blanco J, Blanco-Portales R.
(2012) FaGAST2, a strawberry ripening-related gene,acts together with FaGAST1 to determine cell size ofthe fruit receptacle. Plant Cell Physiol. 54(2):21836.
7) Almasia NI, Bazzini AA, Hopp HE, Vazquez-Rovere C.
(2008) Overexpression of snakin-1 gene enhances
resistance to Rhizoctonia solani and Erwinia
carotovora in transgenic potato plants. Mol Plant
Pathol. 9(3):329-38.

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Allergen component analysis of fruit and vegetables-the representative allergen LTP and the novel allergen GRPFumiko Okazaki
Department of Food and Science and Human Nutrition, Faculty of Agriculture
Ryukoku University
Summary
The number of reports appearing on food allergies concerned withcomponent-resolved diagnosis (CRD) has been increasing. In particular, CRD isuseful for the clinical type classification of plant allergies, as they often havecommon allergens. Recently, we have found that severe symptoms in patientsallergic to peaches were not only related to lipid transfer protein (LTP), butalso to gibberellin-regulated protein (GRP), in Japan. The aim of this study was
to characterize peach GRP via a comparison to peach LTP.
It is quite difficult to separate the LTP and GRP proteins completely usingc o nve n t i o n a l p r o c e d u r e s , d u e t o t h e i r s i m i l a r c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s .
Therefore, LTP and GRP were purified using immunoaffinity column
chromatography, constructed using the respective monoclonal antibodies.
For the determination of peach LTP and GRP, sandwich-type enzyme-linked
immunosorbent assays were also developed using the respective monoclonalantibodies. Both peach LTP and GRP displayed strong heat stability, but wereeasily denatured by reducing agents. While GRP was mainly localized in peachpulp, LTP was localized in the peel. Peach leaves were also rich in LTP, but
contained little GRP. Finally, the concentrations of LTP and GRP in over-ripepeaches were higher than in immature peaches.