ビタミン B2 定量法の検討― Hakuryo method の確立 ―函館大学付属柏稜高等学校 理科研究部
Hakodate Univ. HAKURYO High School Science Club

３年
１年

市原 裕也
木戸 博哉
大江 拓人

齋藤星澤稔之翼【はじめに】
柏稜高校理科研究部は、身近な食品や飲料が研究の対象にならないかと考え、食品成分分析について文献を調べた。その過程で、紫外線を照射すると蛍光を示すという特殊な性質を持つビタミン B2 (リボフラビン C17H20N4O6)の存在を知り、興味を持った。ビタミン B2 は、リボフラビンと呼ばれ、橙黄色の結晶として得られる化合物であり、その構造はイソアロキサジン核の 10 位の N にリビトールが結合したものOである (図 1) 。水溶性ビタミンに分類される生理活性物質で、正常な皮膚・粘膜・ CH3NNH成長に必要となる栄養素である。発育ビタミンや美容ビタミンともいわれ、体内のエネルギー代謝に関与している物質であり、私達が口にする様々な食品中に含まれ CH3ONNていることがわかった。その後、身近な食品や飲料中にビタミン B2 がどれだけ含まOHれているか調査できないかと考えたが、高校実験室レベルにおいてその手段が無いOHため定量法の検討を始めた。
HO
そこで本研究部が着目したのは薄層クロマトグラフィー (TLC) とオープンソース
OH(ImageJ) である。薄層クロマトグラフィー (thin layer chromatography：TLC)
は、ガラスやアルミニウムシートにシリカゲルを薄く塗布したプレートを用いて
図 1. リボフラビンの構造式行うクロマトグラフィーである。試料をスポットし展開溶媒に下部を浸すことで、シリカゲルへの吸着能の差により混合物を分離同定する方法である。物質の同定は移動率 (rate of flow) Rf 値で行い、以下のように求めることができる (図 2) 。
スポット
Rf 値 ＝a(原点から試料スポットまでの距離) cmb(原点から溶媒前線までの距離) cmba

また、ImageJ はアメリカ国立衛生研究所 (NIH) で開発されたオープンソースで原点
画像加工に加えて RGB 分解や 2 値化後、様々な画像解析ができる。主に、医用や×生化学の分野で活用されている。http://imagej.nih.gov/ij/よりダウンロードすることができる。
図 2. TLC の a,b について
本研究部は昨年度、TLC と ImageJ を用いた方法で 125～500 ng の範囲におけるビタミン B2 標準検量線を得ることに成功した 1)。本研究では、成分が表記されている飲料を試料として用いた実験を行うことで、この検量線の精度を再検証し、高校実験室レベルにおいても可能な食品及び飲料中に含まれるビタミン B2 定量法 (Hakuryo method) の確立を目指した。

【実験方法】
Ⅰ.ビタミン B2 標準検量線の作成
標準検量線の作成は、昨年度発表した TLC とオープンソース (ImageJ) のグレー値を用いる方法で行った。
(1) アセトン:メタノール＝1:1 の混合溶液を展開溶媒とし TLC を行った。展開槽として用いたデシケーターの内部は、展開溶媒の蒸気で十分に飽和させた。
(2) 実験に用いた TLC プレートは広領域紫外線 (λ＝250～400 nm) の照射により、有色スポットとして観測されるため、紫外線監別器を改造しデジタルカメラで撮影できるようにした。さらに市販のガラス用 UV カットフ
ィルムを用いてクリアな画像が得られるように工夫した。TLC の展開終了後、暗幕で覆い外光の影響を受けない環境で速やかに撮影を行った。その後、TLC プレートの a,b cm を測定し、Rf 値を求めた。

(3) ImageJ で撮影した画像ファイルをグレースケールにした後 (図 3) 、Image＞Adjust＞Threshold で画像調整し、解析できる環境を整えた (図 4) 。
(4)スポットを選択し、Analyze＞Measure でグレー値を解析した。昨年度の研究より Min Gray Level(最小グレー値) の解析が最も有効であることがわかっており、得られた 125～500 ng の範囲におけるビタミン B2 標準検量線を定量時に用いた (図 5) 。
なお、TLC に関しては、実験時の温度や湿度などの外的要因が結果に影響を与えることが考えられるため、実験を 10 回繰り返し平均化したデータを数値として用いた (n=10) 。
190.00Min Gray Level

185.00180.00175.00170.00y = 0.0209x + 167.45
R² = 0.9998

165.00160.00

0125

250

375

500625リボフラビン (ng)

図 3. グレースケール画像(リボフラビン 250 ng)

図 4. 調整した画像(リボフラビン 250 ng)

図 5. Min Gray Level とリボフラビンの関係
によるビタミン B2 標準検量線 (n=10)(125～500 ng)

Ⅱ.試料の検討
昨年度の研究で得られたビタミン B2 標準検量線の範囲は 125～500 ng であった。よって、TLC のスポット量として適当な 2～10 μL 中に 125～500 ng のビタミン B2 を含む食品のリストアップを行った。その結果、多くのビタミン群を含み栄養補給を目的としているタイプの飲料が候補に挙がり、オロナミン C (大塚製薬)、リポビタン D (大正製薬)、アスパラドリンク (田辺製薬)、グロンサン内服液 (ライオン)、アリナミン V (武田薬品工業)の 5 種に関して TLC を行うことにした。当初、我々は食品において含まれるビタミン B2 は全てリボフラビン単体で含まれていると考えていたが、リポビタン D、アスパラドリンク、グロンサン内服液はリボフラビンをリン酸化させた後、含有させていることがわかった。TLC におけるスポットを観察したところ、拡散しテーリングも見られていたため、純粋なリボフラビンを抽出しなければ定量化ができないと判断し試料候補から除いた。また、オロナミン C は炭酸飲料のため気泡が毛細管現象を妨げ、開封後すぐにキャピラリーを用いたスポッティングができなかった。炭酸を抜くために放置する必要があり、その間に成分が変化してしまう可能性が考えられたため、これも同様に除いた。
これらの結果より、純粋なリボフラビンを含み、良好なスポットが観測されるアリナミン V を試料とすることにした。アリナミン V に含まれるリボフラビンは 2 mg/50 mL であり、希釈等の操作をせずに実験に用いることができる。スポッティングは 5,10 μL のキャピラリーで行った (リボフラビンの質量は、200,400 ng） 。

【実験結果】
Ⅰ.TLC による Rf 値測定
リボフラビン標準試薬とアリナミン V に含まれるリボフラビンを同量の 200 ng にして TLC を行った (図 6) 。
測定した a,b cm と算出した Rf 値の結果を示した (表 1) 。表には AVE:平均値、SD:標準偏差、CV:変動係数の計算結果も合わせて示した。AVE に関する CV が a,b cm、Rf 値全て 2.5％以内という安定したデータが得られた。

表 1. リボフラビンとアリナミン V の Rf 値比較 (n=10)(リボフラビン 200 ng)

図 6. 紫外線照射での画像(左リボフラビン,右アリナミン V リボフラビン 200 ng)

a (cm)b (cm)

Rf

リボフラビン

5.25

8.02

0.65

アリナミンV

5.02

7.96

0.63

AVE

5.14

7.99

0.64

SD

0.12

0.03

0.01

CV (％)

2.24

0.38

1.56

Ⅱ.ImageJ での画像解析
アリナミン V のスポットに含まれる Min Gray Level を解析した。200,400 ng ともに、AVE に関する CV が 0.8％以内という安定したデータが得られた (表 2,3) 。

表 2. アリナミン V の Min Gray Level 表 3. アリナミン V の Min Gray Level(リボフラビン 200 ng)(リボフラビン 400 ng)
アリナミンVMin

アリナミンVMin

A

172

A'

176

B

172

B'

175

C

171

C'

177

D

172

D'

175

E

171

E'

177

F

171

F'174

G172

G'174

H

171

H'175

I

172

I'174

J

172

J'178

AVE

171.60AVE

175.50SD0.49SD

1.36

CV (％)

0.29

CV (％)

0.78

Min Gray Level

190.00185.00180.00175.00170.00y = 0.0209x + 167.45
165.00160.00
0125

250

375

500625リボフラビン (ng)

図 7. 標準検量線とアリナミン V の Min Gray Level(リボフラビン 200,400 ng)
表 4. アリナミン V の Min Gray Level と理論値比較 (n=10)(リボフラビン 200,400 ng)(リボフラビン 200 ng)
200 ng
400 ng

アリナミンV

171.60175.50

理論値

171.63175.81

AVE

171.62

175.66

SD0.020.16

CV (％)

0.01

0.09【考察】TLC より求めた Rf 値から、アセトン:メタノール＝1:1 の展開溶媒はアリナミン V に関しても有効であり、成分中のリボフラビンを安定的に測定できることがわかった。これをもとに、ImageJ でアリナミン V のスポットに含まれる Min Gray Level を解析し (表 2,3) 、結果をビタミン B2 標準検量線上にプロットした (図 7) 。合わせて標準検量線の近似直線 y＝0.0209x＋167.45 に x=200,400 を代入することで Min Gray Level の理論値を算出し、解析値と比較した (表 4) 。その結果、200,400 ng の AVE に関する CV は、それぞれ 0.01,0.09％という極めて小さい値が得られ、アリナミン V から求められた解析値と理論値が非常に近い値であることを示している。
このことから、実際に市販されている飲料に関しても、本研究部のビタミン B2 標準検量線を用いた定量化は十分可能であり、一定の精度を保証することができたと判断できる。よって、TLC と ImageJ のグレー値を用いた定量化は、高校実験室レベルにおいても可能な食品及び飲料中に含まれるビタミン B2 定量法 (Hakuryo method) になると考えられる。

【結論】
・アセトン:メタノール＝1:1 の展開溶媒は市販されている飲料 (アリナミン V) に関しても有効であり、成分中のリボフラビンを安定的に測定できる。
・TLC と ImageJ のグレー値を用いた定量化は、食品及び飲料中に含まれるビタミン B2 定量法 (Hakuryo method)になる。

【参考文献】
1)第 50 回全道高等学校理科研究発表大会 (2011) TLC とオープンソースを用いたビタミン B2 の定量化
2)及川 剛司 (2005) Umu 試験における Plasmid pSK1002 数とβ-Galactosidase 活性3)綿抜 邦彦 (2003) 分析化学[新訂版] , サイエンス社
4)露木 英男・田島 眞 (2002) 食品学 –栄養機能から加工まで- , 共立出版5)立屋敷 哲 (2003) 生命科学・食品学・栄養学を学ぶための有機化学 基礎の基礎 , 丸善
6)科学技術庁資源調査会編 (2000) 五訂 日本食品標準成分表(2000)【受賞にあたって】
この度は化学系学協会北海道支部奨励賞という名誉ある賞を頂くことができ、部員一同大変嬉しく思っております。今後もこの受賞を励みに、なお一層研究に邁進していきたいと考えております。有難うございました。