技術紹介

東ソー株式会社

アフィニティクロマト法による抗体医薬品の構造および活性分析田 中

1 は じ め に
抗体医薬品は標的細胞への特異的な吸着性と患者自身の免疫機能を利用することを特長とする医薬品であり，2000 年頃よりガンや自己免疫疾患などの治療薬として実用化され，17 兆円（2020 年，世界）を超える巨大市場を形成している．2022 年現在においても 6000 件を超える治験が実施されており，今後も年率 10 ％ を超える高成長率での市場拡大が見込まれている．一方で，軽鎖 2 本および重鎖 2 本から成る分子量約 15 万の抗体

亨，村 中

和 昭，井 出輝 彦

ン細胞などの標的細胞に強く引き付けることができる．
抗体医薬品の大部分を占める IgG 型抗体に結合する Fc

受 容 体 と し て は FcγRI，FcγRIIa，FcγRIIb，FcγRIIc，FcγRIIIa および FcγRIIIb が知られているが，特に重要な Fc 受容体はナチュラルキラー細胞（NK 細胞）の表（b）），抗体医層に発現している FcγRIIIa であり（図 1
薬品の活性を一定に保つためには本受容体と抗体医薬品の相互作用を一定にコントロールする必要がある．
一般に抗体医薬品は CHO 細胞などの培養細胞で生産されるが，その糖鎖構造は不均一であり，かつ 1 分子（a）），生産される分子は非常に複雑な構造であり（図 1に 2 か所の修飾を受けることから非常に多様な分子種抗体医薬品の品質を担保するための分析が欠かせない．の混合物となっている．さらに，生産細胞株の種類はも

特に，抗体医薬品の Fc 領域に付加される糖鎖の構造がとより，pH や通気量，栄養源濃度などの各種培養条件

抗体医薬品の薬効，物理化学的安定性，免疫原性，血中も糖鎖構造に影響する5）．そのため，医薬品製造時の品半減期など，重要な物性に影響することが報告されてお質のバラつきを抑制し，糖鎖構造の組成比を一定に制御

り1）～3），生産ロットごとに詳細かつ多方面からの分析をするための生産技術や品質管理技術が求められる．

行う必要がある．

抗体医薬品と Fc 受容体の相互作用解析は ELISA 法

抗体糖鎖が薬効に関与する機序については，抗体のや表面プラズモン共鳴（SPR）法が用いられている．しFc 領域と免疫反応にかかわるエフェクター細胞の表層かしながら，これらの解析法は構造的に不均一な抗体混に発現する Fc 受容体との相互作用が変化するためと考4）

えられている ．すなわち，薬効が高い抗体分子は Fc受容体と強く結合し，結果としてエフェクター細胞をガ合物の平均値を与えるに過ぎず，成分組成に関する情報は得られない．また，糖鎖構造については酵素で切断後に蛍光標識し LC-MS で分析する手法が用いられているが，先述したとおり抗体分子は 2 か所の糖鎖修飾を受けているため，インタクト抗体の組成比そのものではないことに注意が必要である．この様な既存法における制限を解消可能な分析技術として，筆者らは FcγRIIIa を充填剤に固定化した HPLC 用分析カラム TSKgel® FcRIIIA-NPR を作製し，アフィニティクロマト法による抗体医薬品の成分分析技術を開発した．本法によれば，抗体医薬品を前処理なしに直接分析でき，糖鎖構造とFcγRIIIa への親和性に基づく組成比の情報が得られる．
本稿では，本分析カラムの仕様や基本的性質，医薬品分析への応用例を紹介する．

2 Fc 受容体によるアフィニティ分析技術の開発
2･1 安定化 FcγRIIIa リガンドの開発

抗体医薬品の薬効にかかわるヒト FcγRIIIa は細胞外図 1 抗体医薬品の構造（a）と作用模式図（b）
ぶんせき 2022 11

ドメインと膜貫通領域，細胞内領域から構成される．ア465

表1

標準使用条件図 2 FcγRIIIa リガンドの耐久性比較
酸処理条件：pH3，25 ℃

製品名

TSKgel FcR-IIIA-NPR

基

非多孔性親水性ポリマー（5 μm）

材

リガンド改変型ヒト FcγRIIIa

カ ラ ム

4.6 mm I.D.×7.5 cm，PEEK 製

出荷溶媒0.025 ％ ProClin 300＋0.65 mM ク エ ン酸＋9.35 mM ク エ ン 酸 三 ナ ト リ ウ ム（pH6.5）

溶離液 A

50 mM クエン酸緩衝液（pH6.5）

溶離液 B

50 mM クエン酸緩衝液（pH4.5）

流

1.0 mL/min

速グラジェント図 3 開発カラムの外観（a）と充填剤の構造（b）

フィニティクロマトに用いるリガンドの構造設計に際して，抗体に結合する細胞外ドメインのみを組換えタンパク質として調製した．得られた天然型 FcγRIIIa リガン

開発分析カラムの諸元表

0─2 分 B0 ％，2─20 分 B0 → 100 ％（リニア），20─25 分 B100 ％，25─30 分 B0 ％

図 4 抗体医薬品 A の分析例
分析温度 25 ℃，その他条件は表 1 に記載

溶 液 組 成 を 種 々 検 討 し た 結 果，0.65 mM ク エ ン 酸，9.35 mM クエン酸三ナトリウム（pH6.5）に防腐剤として 0.025 ％ ProClin300 を添加した水溶液を保存溶液

ドは大腸菌などの微生物発現系で生産可能であり，かつ（出荷溶媒）として使用することとし，保管温度は冷蔵抗体への結合性を確認した．しかしながら，クロマト用（2～8 ℃）とした．

充填剤への利用を考慮した際には安定性が十分ではな
く，繰り返しクロマトグラフィーを行うと徐々に結合性が損なわれることが判明した．そこで，エラープローン
PCR による変異体ライブラリ作製とスクリーニングを繰り返す進化工学的手法によりリガンドの安定性改良を行い，顕著に安定性が向上した改変型 FcγRIIIa リガン
ドを創製した（図 2）．

2･2

FcγRIIIa 固定化ゲル，HPLC カラムの開発

改変型 FcγRIIIa リガンドをクロマト用充填剤に共有

本製品は東ソー株式会社より TSKgel FcR-IIIA-NPRとして販売している（表 1）．

3 抗体医薬品の分析
多くの抗体は中性付近（pH6.0～7.5）で FcγRIIIa に吸着し，酸性条件下（pH4.0～5.0）で脱着するため，
TSKgel FcR-IIIA-NPR によるアフィニティ分析は pH の異なる 2 液による pH グラジェント溶出法で行う．溶離液には種々の緩衝液が使用できるが，幅広い pH 範囲で緩衝能を有するクエン酸ナトリウム緩衝液が好適であ結合で固定し，FcγRIIIa 固定化ゲルを調製した．固相る．また，LC-MS 分析を行う場合には揮発性の酢酸アには分離性能やロット間差を考慮して非多孔性の親水性ンモニウムを用いた緩衝液も用いることができる．

ポリマー（5 μm）を採用した．また，カラムサイズは

TSKgel FcR-IIIA-NPR を用いて pH グラジェント法に4.6 mm I.D.×7.5 cm と し， 部 材 は バ イ オ イ ナ ー ト なよる抗体医薬品 A のアフィニティ分析を試みた結果，本カラムの長期的な保存安定性に関してはリガンドに細解析を行うために各ピーク成分を単離して各種解析を依るところが大きい．リガンドの安定性を考慮した保存行った．先ず，改変型 FcγRIIIa リガンドに対する親和PEEK を選択した（図 3）．

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．そこで，さらなる詳三つのピークを検出した（図 4）

ぶんせき 2022 11

図 7 各種モノクローナル抗体の分析例
分析温度 25 ℃，その他条件は表 1 に記載
図 5 抗体医薬品 A 分離成分の解析（a）FcγRIIIa 親和性，（b）ADCC 活性：抗体濃度 4.1 ng/mL，反応時間 6 時間

図 6 抗体の糖鎖構造とカラム保持力の関連性単糖を示すシンボルマークは図 1 参照

性を表面プラズモン共鳴装置にて解析したところ，カラムから早く溶出した抗体は中性条件（pH7.4）において（a））．すなわち，も親和性が弱いことが判明した（図 5

図 8 IgG4 抗体の分析例
上段：分析条件は表 1 に記載，下段：溶離液 A を 20 mM クエン酸緩衝液（pH6.5）に変更，その他は表 1 と同一，ともに分析温度 25 ℃

4 分析条件に関する検討
種々の検討から，FcγRIIIa リガンドと抗体の親和性

クロマトグラムの保持時間と FcγRIIIa への親和性が正は pH だけでなく，温度やイオン強度の影響を受けるこの相関を示すことが明らかとなった．続いて，各ピークとが判明している．そのため，本アフィニティ分析を実成分の抗体依存性細胞傷害活性（ADCC 活性）を測定施する際には，溶離液の調製を厳密に行うこと，およびしたところ，クロマトグラムの保持時間と ADCC 活性

カラムオーブンを利用して恒温条件で分析を行うことがも正の相関を示すことが判明し，FcγRIIIa への結合性が肝要である．また，抗体培養液などのクルードサンプル（b））．最高い程，活性が高くなる結果が得られた（図 5を直接分析する場合においては，夾雑成分が非特異的に後に，各ピーク成分の糖鎖構造を解析した結果，カラムカラムに吸着して抗体成分の保持力が徐々に低下する可きょうざつ保持力が強くなる構造と弱くなる構造が明らかとなった能性がある．この様なケースにおいては，溶離液に．抗体医薬品の Fc 領域には N- 結合型糖鎖が付与（図 6）

150 mM 程度の NaCl を添加するなど，高イオン強度条されるが，糖鎖末端部に位置するガラクトース残基の有件下で分析することで非特異的な吸着を抑制でき，安定無が FcγRIIIa への親和性に影響することが判明した．

した分析を繰り返し実施できる．一方で，イオン強度を開発したアフィニティクロマト法を用いて種々のモノクローナル抗体を分析した結果，糖鎖構造の組成比に基上げるとカラム保持力が低下する傾向があるため，保持時間のシフトに注意する必要がある．

づいて様々な分離パターンを示した（図 7）．本法は抗この様な特性を上手く利用することで，様々な抗体医体医薬品を特別な前処理なく直接分析可能な点に特長が薬品の分析が可能となる．一例として，ヒト IgG4 抗体あり，医薬品のロット間差など糖鎖構造のバラつきを評の分析事例を紹介する．一般に IgG4 抗体は FcγRIIIa

価可能であることが示唆された．

に対する親和性が低く，ADCC 活性も低いことが知られている6）7）．実際に IgG1 抗体向けの分析条件で IgG4を分析すると，カラム保持力が十分でないため分析が困

ぶんせき 2022 11

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表2

開発分析カラムの諸元表

製品名

TSKgel FcR-IIIA-5PW

基

多孔性親水性ポリマー（l0 μm）

材

リガンド

改変型ヒト FcγRIIIa

カ ラ ム

7.8 mm I.D.×7.5 cm，PEEK 製

出荷溶媒0.025 ％ ProClin 300＋0.65 mM ク エ ン酸＋9.35 mM ク エ ン 酸 三 ナ ト リ ウ ム（pH6.5）

標準使用条件

溶離液 A

50 mM クエン酸緩衝液（pH6.0）

溶離液 B

50 mM クエン酸緩衝液（pH4.0）

流

0.3 mL/min

速0─10 分 B0 ％，10─130 分 B0 → 100 ％グラジェント （ リ ニ ア ），130─150 分 B100 ％，150─
180 分 B0 ％

図 9 FcR-IIIA-5PW によるモノクローナル抗体の分離例
抗体量 5 mg，温度 25 ℃，分離条件は表 3 に記載

術は簡便で迅速な抗体糖鎖の分析を可能とし，抗体医薬品の品質向上の一助になると期待している．また，本法難であるが，低イオン強度条件で保持力を増大させるこは抗体医薬品の品質管理だけでなく，抗体生産細胞株のとで分析が可能であった（図 8）．

スクリーニングや培養生産中の糖鎖構造モニタリングなど，製薬企業における研究開発や製造工程管理において5 分取クロマト用製品への展開も応用が可能である．

TSKgel FcR-IIIA-NPR は表面積の比較的少ない非多本分析法に関して，現在までに複数の研究機関から技孔性ベースゲルを用いているため高い分離能が得られる術論文が報告されており9）～14），今後，本格的な社会実が，一方で，一度のクロマト操作で分離できる抗体量が装が期待される．是非，これらの論文も参照されたい．

約 50 μg 程度に制限される．そのため，各ピーク成分を分離精製した上での詳細解析が困難であった．特に，
FcγRIIIa によるアフィニティクロマト分析法を医薬品の品質管理に適用するためには分析法バリデーション

8）に基づいた検証が求められ，規格値策定には各ピーク成分の構造や機能についての詳細データが不可欠である．
一般に抗体医薬品の親和性解析や活性測定に必要な抗体量は少量であるが，糖鎖構造の詳細解析には約 1 mg の謝辞

本研究開発の推進に多大なるご尽力とご協力を賜りました東京大学大学院工学系研究科の津本浩平教授，Jose M. M.

Caaveiro 博士（現，九州大学薬学研究院准教授），木吉真人博士（現，国立医薬品食品衛生研究所生物薬品部），長門石暁博士（現，東京大学医科学研究所特任准教授）に心から感謝申し上げます．また，本研究開発の一部は AMED（課題番号 JP17ae0101003）支援の下，次世代バイオ医薬品製造技術研究組合で行われました．

抗体を要する．そのため，mg オーダーでの成分分取が可能な分取用カラムを開発した．
具体的には，ベースゲルを多孔質化して表面積を増大させることで抗体吸着量の向上を図るとともに，分取用クロマト装置での使用を想定して圧力損失が小さい粒子
径 10 μm 品を選択した．また，カラムサイズを 7.8 mm

I.D. ×7.5 cm（3.6 mL 容）に拡大し，結果として分離可能な抗体量を FcR-IIIA-NPR 比で 100 倍量となる 5mg/回まで向上させることに成功した．

本製品は TSKgel FcR-IIIA-5PW として販売している（表 2，図 9）．

6 ま と め近年，抗体医薬品における糖鎖構造の重要性が広く認知され，製薬企業各社では様々な製造技術による糖鎖構造と品質のコントロールが為されている．しかしながら，培養生産中の糖鎖修飾反応は細胞内で段階的に進行し，かつ厳格な制御機構がないことから，糖鎖構造の完全な均一化は困難である．この様な背景のもと，今回開発した FcγRIIIa を用いたアフィニティクロマト分析技
468

文献

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ぶんせき 2022 1111）H. Kosuge, S. Nagatoishi, M. Kiyoshi, A. Ishii-Watabe,T. Tanaka, Y. Terao, S. Oe, T. Ide, K. Tsumoto : Biotechnol.
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14）A. Chakrabarti, J. Kervinen, E. Mueller, T. Tanaka, K. Muranaka :“Monoclonal Antibodies”, Chapter 4, p81（2021）（IntechOpen,,London）.
●●田中亨（Toru Tanaka）

東ソー株式会社ライフサイエンス研究所（〒252─1123 神奈川県綾瀬市早川 2743─

1）．東京農工大学大学院工学府（修士）．
《現在の研究テーマ》改変タンパク質を用いたアフィニティクロマト用充填剤の開発．《 趣 味 》 ラ ン ニ ン グ， サ ッ カ ー， ス

村中和昭（Kazuaki Muranaka）
東ソー株式会社バイオサイエンス事業部
第二開発部（〒746─8501 山口県周南市開成町 4560）．茨城大学理学部化学科（学士）．《趣味》家庭菜園，釣り．
E─mail : kazuaki-muranaka-xf@tosoh.co.jp

井出輝彦（Teruhiko Ide）
東ソー株式会社執行役員ライフサイエンス研究所長兼東京研究センター長（〒252─1123 神奈川県綾瀬市早川 2743─1）．
千葉大学大学院園芸学研究科農芸化学専
攻（理学博士）．《主な著書》“コンビナトリアル・バイオエンジニアリング”．（化学同人）．
E─mail : teruhiko-ide-zj@tosoh.co.jp

ノーボード．
E─mail : tooru-tanaka-pb@tosoh.co.jp

会社ホームページ URL：
https://www.tosoh.co.jp/

関連製品ページ URL：

https://www.separations.asia.tosohbioscience.com/

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