京都市産業技術研究所

熟成年数の異なる市販清酒の成分比較及びHSSPMEGC/MSによる熟成清酒の微量香気成分分析
バイオ系チーム

要

清野珠美，廣岡青央

旨清酒の熟成による成分変化を明らかにするため，長期保管している製造年度の異なる清酒の分析を行った。香味成分について，糖や有機酸には熟成年数に伴う一定の増減傾向は見られなかったが，一部のアミノ酸で，熟成年数が長いほど濃度が高くなる傾向が見られた。また，ヘッド スペース固相マイクロ抽出ガスクロマトグラフィー質量分析装置（HSSPMEGC/MS）
による熟成清酒中の微量香気成分の定性分析を行った。通常のHS法では10種類程度の検出しかできないところ，この装置により60から70種類のピークを検出し，成分を推定することができた。新酒との比較を行ったところ，新酒では華やかな果実様香を持つ多種の脂肪酸エステルが検出されたが，これらは熟成清酒では検出されなかった。一方で，熟成清酒ではフルフラールなどのメイラード 反応生成物や，コハク酸ジエチルなどの有機酸エチルエステルが顕著に検出され，他に多種のアルコールやアルデヒド ，エステル類も検出された。

1．はじめに現在，製造された清酒の熟成の適否は，製造者の官能

国内の清酒製造量は年々減少傾向にあり，平成18か的判断にゆだねられている。この熟成の適否を判断す

ら26酒造年度の 9年間では全体で16%減少している1)。

る指標を確立できれば，より高度に品質管理された熟しかし近年，消費者の間では，華やかな香りが特徴の成清酒製造が行える可能性があり，清酒業界に対する高精白米を使用した吟醸酒や，原料が米と米麹のみの大きな技術支援になると考えられる。

純米酒といった特定名称酒の人気が高まっている。特そこでまず，長期熟成清酒の香味成分を分析し，熟定名称酒の製造量は，清酒全体とは逆に前出の 9年間成による成分経過を明らかにすることを目的として，で15%増加，中でも平成22年からの 5年間で37%も増

当チームで長期保管している市販清酒の糖，アミノ酸，1)加している 。このように，清酒業界の中で高付加価有機酸及び清酒の基本的な香気成分を分析した。更に，値製品の需要が高まっている。

微量の香気成分を分析するため，平成27年度に導入し更に和食のユネスコ無形文化遺産登録に伴い，海外たヘッド スペース固相マイクロ抽出ガスクロマトグでの清酒需要も高まっており，特定名称酒を中心に，ラフィー質量分析装置（HSSPMEGC/MS）を用いて，海外への輸出が盛んになっている。一方で，ワイン・新酒と熟成清酒の香気成分を定性分析し，その比較をウイスキー圏である西欧では，酒を「熟成」するとい行ったので，本報にて報告する。

う文化があり，熟成するほど，その価値も高いという
2．実験方法認識がある。日本人の価値観のみでなく，このような
2． 1 分析試料

外国人の価値観を考慮した清酒を提供することで，海外での清酒の認知拡大を後押しできる可能性がある。

分析に使用した熟成清酒は，製造年の異なる市販清ゆえに，今後の清酒市場の高付加価値製品分野を拡大

酒 5点である。試料の詳細を表 1に示す。No
.
1は製造するためには，「熟成」という考え方が重要になると考年月日が不明瞭であったため表のように判断した。No
.
2は製品ラベルがなく，製造年のみの情報しかなかっえられる。
しかし，国内の熟成清酒製造への意識はそれほど高たため表のように不明とした。また，定性分析に使用いとは言えないのが現状である。それは，清酒に含ました新酒は，平成27酒造年度に製造・火入れ処理されれる多種多様な成分が，熟成の間に複雑に変化するたたものである。

め，熟成させる前の段階では，熟成後の味や香りの品質を予測判断することが困難であるためと考えられる。

－55－

研究報告 №６（２０１６）
表 1 分析に使用した清酒試料詳細

所製ソフトウェアGC solutionのシミラリテ ィ検索を

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表 2 HSSPMEGC/MS分析条件+6630(৖્શෞ৪ෞ৪পᆹᅿ

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2． 2 糖，アミノ酸及び有機酸分析૥મ৳ആആ২ৎ৑٦ীྴলৎ৑ী൓ାৎ৑ীਞ৲஼ആ২٦

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糖 分 析 は，Honda
ら に よ る3
Methyl
1ph
enyl
5pyr
azolon（ePMP）
プレ ラベル化法による逆相液体クロ3．結果と考察2)

マトグラフィー（RPHPLC）を改変して行った。試料

3． 1 市販熟成清酒の香味成分の比較20μLに，40μLの0.
3mol/
L NaOH及び0.
5mol/
L PMPメ

表 3に市販熟成清酒 5点の糖，有機酸，香気成分のタノール溶液を加え，70℃で30分，糖の誘導体化反応

分析結果を示す。糖，有機酸及び国税庁所定法で分析を行った。反応後，120μLの0.
1mol/
L HClを加えて中できる香気成分には，熟成年度に伴う一定の増減変動和し，そこに200μLのクロロホルムを 加えて過剰のは見られなかった。

PMPをクロロホルム層に移行させた後，クロロホルム層を除去して水層を回収した。クロロホルムを添加・

表 3 熟成清酒の糖，有機酸，香気成分分析結果除去する操作は計 2回繰り返した。水層はHPLCに用ヨᩱ No./〇㐀㓇㐀ᖺᗘ (ᖹᡂ)

いる溶媒で適宜希釈し，0.
45μmフィルターでろ過後，123425 or 2623231821021241622

分析に供した。分析カラムはUnisonUKC18（3x150⢾mm,3µm,インタクト）を用い，カラム温度は40℃とࢢࣝࢥ࣮ࢫ5(mg/mL)࢖ࢯ࣐ࣝࢺ࣮ࢫ

3.9

1.2

3.01.34.0した。溶出は，移動相A:
0.
1%ギ酸，B:
0.
1%ギ酸80%ア᭷ᶵ㓟ங㓟

427531606507404

セトニトリルを用い，流速0.
6mL/分で行った。溶出グ(mg/mL)

ࢥࣁࢡ㓟

473

756

999

882

710

ࣜࣥࢦ㓟235

323

362

517

344

ࢡ࢚ࣥ㓟4563586162

㤶Ẽᡂศ㓑㓟࢚ࢳࣝ1746522119(ppm)㓑㓟࢖ࢯ࢔࣑ࣝ

0.3

1.0

1.00.30.4

࢖ࢯ࢔࣑ࣝ࢔ࣝࢥ࣮ࣝ

109

174184206152࢝ࣉࣟࣥ㓟࢚ࢳࣝ0.80.90.80.50.8

ラジエントは 0-3分でB 1015%，316分でB 2528%，
1621分で100%，2130分で10%とし，溶出液を254nmでモニタリングした。また，アミノ酸3)及び有機酸分析4)は，既報に準じて行った。
2． 3 香気成分分析
各熟成清酒の酢酸エチル，イソアミルアルコール，市販熟成清酒 5点の遊離アミノ酸分析により，熟成酢酸イソアミル，カプロン酸エチルについては，国税年数が長いほど高くなる傾向が見られたのがアスパラ庁所定分析法に準じてGCによる定量分析を行った。

ギン酸，アラニン，バリン，ロイシン，イソロイシン，セリン，スレオニン，フェニルアラニン，チロシン，HSSPMEGC/
MSに よ る定性分析には，（株）島津製
作所製AOC6000搭載GCMSTQ8040を使用し，熟成清メチオニン，ヒスチジンの11種類，逆に低くなる傾向

酒No.
4と，平成27酒造年度製造の新酒（火入れ処理が見られたのがグルタミン，トリプトファンの 2種類済）10mLを試料として用いた。SPMEにはPAL SPMEであった。これらのグラフを図 1に示す。その他のアAc
rylateFiber
（Polyacrylate,85µm,CTC Analytics）をミノ酸では，熟成年数による一定の増減変動は見られ用いた。分析条件は表 2に示す。分離された各ピークなかった。また，同じ純米大吟醸酒で精米歩合も近いのマススペクトルからの成分推定には，（株）島津製作

No.
1とNo.
5に着目すると，グルタミン，トリプトファ－56－京都市産業技術研究所

SSPSSP॔५ঃছॠথ෷SSP॔ছॽথSSPংজথ

SSPটॖ३থSSPSSP७জথ५ঞड़ॽথ
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図1 市販熟成清酒の遊離アミノ酸濃度
グラフ横軸の数値は表1の試料No.
を示す。

ン，アルギニンを除いた17種類のアミノ酸が熟成年数

素的反応によるピログルタミン酸への変化が減少の一の長いNo.
5で高かった。

因であると思われる。トリプトファンは，貯蔵中にア

清酒中のアミノ酸は，熟成中に分解して，アルデヒ

セト アルデヒド と反応し，苦み成分である1methyl-

ド やピルビン酸になるといわれている5) 。他にも糖と

1,2,3,4tetrahydroβcarboline3carboxylic acid

反応して着色物質や香気成分を生成するメイラード 反（MTCA）に変化する。実際に火入れ・活性炭処理清酒応にも関与する。そのため，清酒中のアミノ酸は熟成の貯蔵により，MTCAの増加とトリプトファンの減少中に減少すると考えられているが，今回分析に用いたが確認されており7)，減少の一因であると考えられる。

清酒 5点全体の結果では，アミノ酸20種類のうち11種類が熟成年数とともに高くなる傾向であった。酒類総3． 2 HSSPMEGC/
MSによる新酒と熟成清酒の微6)

合研究所の磯谷ら は，自所で製造・貯蔵している清量香気成分の比較
HSSPME法は，試料を封入した容器を加温しながら，酒の分析を行っているが，12種類のアミノ酸が熟成年数とともに増加する傾向を示していた。そのうち 9種

表面に吸着剤が塗布された針状のファイバーを容器の類が本報で示したアミノ酸と一致していた。熟成中にヘッド スペース部分に差し込むことで，加温により試アミノ酸が増加する原因の 1つとして，残存していた料から揮発した微量成分を効率的に吸着剤へ濃縮させペプチド の分解が考えられるが，清酒の殺菌工程である方法である。通常のHS法によるGC分析では10種類

る火入れ処理により分解酵素は失活しているため，酵ほどしか香気成分を検出できないが，今回HSSPME法

素以外の要因で分解が起きている可能性がある。一方，を導入することでGCクロマトグラム上での検出ピ ー減少した 2つのアミノ酸について，グルタミンは非酵

ク数は格段に増加し，各ピークのマススペクトルを用－57－

研究報告 №６（２０１６）
いたシミラリティ検索によって60から70の種類の香気HSSPMEGC/MSによる清酒の微量香気成分分析に成分を推定することができた。新酒と熟成清酒のGCクより，新酒のみで検出された多種の脂肪酸エステルは，ロマトグラムを比較し，新酒のみ，あるいは熟成清酒熟成清酒では検出されず，また熟成清酒の吟醸香成分のみで検出された成分，そして新酒と比較して熟成清は新酒と比較して大きく減少していた。一方で，熟成酒でピーク面積が 2倍以上増加している成分を表 4に

清酒では メイラード 反応生成物や多種のアルコール，まとめた。新酒のみで検出された成分はほとんどが華アルデヒド ，エステル類が検出された。加えて有機酸やかな果物様香を持つ脂肪酸エステルであった。一方のエチルエステルが顕著に増加していた。メイラードで，熟成清酒のみで検出された成分はアルコールやエ反応生成物や有機酸エチルエステルは華やかな香りとステル等様々であったが，メイラード 反応生成物であは異なり，カラメルやナッツに似た甘く重厚な香りをるフルフラール（アーモンド 様香）やフェニル酢酸エ持つ。以上のことから，新酒の華やかな香りに寄与すチル （蜂蜜様香）が顕著に検出された。

る多種の脂肪酸エステルが熟成により減少または消失し，代わりにメイラード 反応生成物や有機酸のエチルエステルが増加するため，清酒は熟成が進むと，華や表 4 HSSPMEGC/
MS定性分析による新酒と熟成清酒の比較

かな香りから甘く重厚な香りに変化することが示唆さৗඣ‫ڀ‬࿃ਛ஬ඣद೅ਰ঱ੜਸग़ॺय़३ॸॺছ঄ॻটইছথ‫؜‬ॖ९ঈॳঝ॔ঝ॥‫ش‬ঝ‫؜‬ॖ९॔঑ঝ॔ঝ॥‫ش‬ঝ‫؜‬ওॳঝঌথॱঀ‫ش‬ঝ‫؜‬໚෷ग़ॳঝ‫؜‬ग़ॺय़३উটঃঀ‫ش‬ঝ‫؜‬উটআঝঌথॱঀ‫ش‬ঝ‫؜‬঄ॻটय़३ዽ෷ग़ॳঝ‫؜‬ঋথ६॔ঝॹ঄ॻ‫؜‬ड़ॡॱঀ‫ش‬ঝ‫؜‬ॖ९উটএय़३ঈॱঀ‫ش‬ঝ‫̤؜‬ঈॳটছॡॺথ‫؜‬॥ঁॡ෷४ग़ॳঝ‫؜‬ঈॱথ४ड़‫ش‬ঝれる。
成分が高橋ら 8)によって同定されている。また磯谷ら 6)ৗඣभाਫ਼লሌ෷উॳঝ‫ൃ୺؜‬෷ग़ॳঝ‫؜‬উটআड़থ෷ॖ९॔঑ঝ‫؜‬ሌ෷षय़३ঝ‫؜‬ढ़উটথ෷উটআঝ‫؜‬ঊউॱথ෷ग़ॳঝ‫؜‬ሌ෷ঊউॳঝ‫ঀॼঀ؜‬থ‫؜‬ढ़উটথ෷ঈॳঝ‫؜‬ड़ॡॱথ෷উটআঝ‫ ؜‬ওॳঝॳड़ উটঃঀ‫ش‬ঝ‫؜‬ढ़উজথ෷ॖ९ঈॳঝ‫؜‬঑জ५ॳথ෷ग़ॳঝ‫؜‬ढ़উটথ෷ইख़ॽঝग़ॳঝ‫؜‬ड़ॡॱথ෷ইख़ॽঝग़ॳঝ‫؜‬জঀঞথ෷ग़ॳঝ࿃ਛ஬ඣभाਫ਼লॖ९ংঞঝ॔ঝॹ঄ॻ४ग़ॳঝ॔७ॱ‫ش‬ঝ‫̣؜‬ग़ॺय़३ग़ॱঀ‫ش‬ঝ‫؜‬আঝঅথ෷ग़ॳঝ‫॔؜‬७ॺ‫ش‬ঝ‫شॼॼঀ؜‬ঝ‫؜‬঄ॻটय़३ওॳঝዽ෷ग़ॳঝ‫؜‬ইঝইছ‫ش‬ঝ‫شঀॼঀ؜‬ঝ‫؜‬঄ॻটय़३ढ़উটথ෷ग़ॳঝ‫؜‬໚෷ॖ९॔঑ঝ‫؜‬উটঃথ४ड़‫ش‬ঝ‫؜‬ইख़ॽঝሌ෷ग़ॳঝ‫؜‬ছक़জথ෷ওॳঝ‫؜‬

熟成清酒に特有の焦臭成分として，ソトロンというにより，ジクロロメタン抽出法による熟成清酒中ソトロンの定量分析が行われ， 6年以上貯蔵された清酒には検知閾値の 2μg/Lを大きく上回る量のソトロンが含まれており，ソトロンが清酒の熟成香に大きく寄与*&067,&ॡটঐॺॢছ঒भআ‫ش‬ॡએ஋भૻຎपेॊ‫؛‬すると考察している。そこで今回のHSSPMEGC/MS
また，新酒と比較して熟成清酒で 2倍以上増加して分析条件により，他成分と同時にソトロンの分析が可いる成分は表 4に示すようにアルコール類が多かった

能か検討した結果，検出感度とピーク形状が非常に悪が，他に乳酸エチル（弱いナッツまたは乳製品様香）く，定性分析は不可能であった。今回GCカラムとしては約13倍，ベンズアルデヒド （アーモンド 様香）は約用いた高極性のDBWAXでは，ピークの溶出時間も遅95倍，コハク酸ジエチル (果実様香)は約105倍と大きく，ピーク形状が大きく広がってしまったため，極性く増加していた（図 2）。更に，データは示していないの異なるカラムを用いた分析を今後検討している。

が，清酒の吟醸香の主成分である酢酸イソアミル (バナナ様香)やカプロン酸エチル (リンゴ様香)は，熟成4．まとめ

清酒では新酒の約 1/10と大きく減少していた。

今回分析に用いた試料は，すべて異なる酒蔵で製造されており，使用された米や酵母の種類も様々である*&06ীෲपेॊআ‫ش‬ॡએ஋க(ৗඣと予想されるため，熟成による清酒成分変化の考察と࿃ਛ஬ඣしては十分ではない可能性がある。しかし，その中で(

も製造条件の近いNo.
1とNo.
5の比較により，一部のアミノ酸の増加が確認できた。さらに，本報で使用し(たHSSPME法による分析は，通常のHS法では検出できないフルフラールやコハク酸ジエチルなど，熟成によ(り増加する微量香気成分の検出を可能とすることが分(໚෷ग़ॳঝঋথ६॔ঝॹ঄ॻかった。糖，有機酸，アミノ酸分析と合わせることで，熟॥ঁॡ෷४ग़ॳঝ

成による多種多様な成分の変化及びそれらの関連性を

図 2 HSSPMEGC/MSによる新酒および 熟成清酒中の乳酸エチル，ベンズアルデヒド ，コハク酸ジエチルのピーク面積値の比較調べることができると考えられる。今後は，清酒の熟成による成分変化について，より正確に把握するため－5
8－京都市産業技術研究所に，同一ロットあるいは製造条件が同じで，熟成年数の異なる清酒を入手し，熟成に伴う成分変化の分析を検討している。
文献1）国税庁:
平成22～26
酒造年度における清酒の製造状況等について.
2）S.Honda.他:Anal.Biochem.
,180,351(1989).
3）清野珠美:酒研会報,No.
55,p.
20(2016).
4）高 阪 千 尋 他:
京 都 市 産 業 技 術 研 究 所 研 究 報 告,No.
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5）高橋康次郎:
日本醸造協会誌,72,839(1977).
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日本醸造協会誌,99,374(2004).
7）近藤洋大 他:
日本醸造協会誌,91,64(1996).
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,40,325(1976)－59－