生命科学用の場としての水和イオン液体
Perspective of Hydrated Ionic Liquids in Life Science

藤 田 恭子Kyoko Fujita

東京薬科大学 薬学部(講師)Tokyo University of Pharmacy and Life Sciences (Senior Assistant Professor)

自由水

束縛水01

はじめにイオン構造

構造形成

水和イオン液体

02

細胞内はタンパク質や種々の高分子が高濃度溶解している混み合いの状況（分子クラウディング環境）であるとの考え方が広水和イオン液体はイオン液体にわずかな水を添加したものでく認識されている。また近年、細胞内相分離現象をはじめ、細胞あり、自由水として振る舞う水分子はほぼ存在しないものと定義

内における生体分子、その他の高分子による時空間的なドラスして検討を行ってきた（図1）。そのため、水和イオン液体は開放ティックな変化が多彩な機能発現や反応の進行に大きく関与し系で室温放置していても、ほとんど蒸発せず、長期間安定な液体ていることが多数報告されている 。このような細胞内の機能発として取り扱える。これまでに様々なイオン構造からなるイオン現や諸反応のいずれにも深く関与している水分子は、通常の試液体について、水の添加量を変化させて水分活性測定を行った。

験管内で用いる希薄溶液（自由水）
ではなく細胞内の混み合いに水と混和する親水性のイオン液体は構成イオンの大きさや極性より周囲から様々な影響を受けた束縛水として存在すると考えに関わらず1イオンペアに対して水7分子程度までは、自由水はられる。試験管内実験においても細胞内環境を再現するようなほぼ存在しない結果を得ている8)。イオン液体は添加する水の量水分子を含む場の制御が望まれるが、その方法は未だ確立されを制御することで1イオンペアに対する水分子数を連続的に制ていない。

御でき、さらに自由水/束縛水比も調整可能になる。また、1イオ1)

一方、融点の低い塩であるイオン液体は構造を選択することンペアに対する水分子数の数が同じであっても、水和イオン液体で溶媒特性をチューニング可能である。水や有機溶媒では実現の構成イオンによって水分子の特性は変化する。例えば、後述すできない特性を持つ溶媒として注目され、基礎研究や社会実装るような生体分子の高次構造を保持した状態で直接溶解し、さらまで幅広い分野で発展してきた2)。バイオ関連では酵素反応3)や抽出場4)、医薬品有効成分の溶解性改善5)や輸送技術6)、薬物のイオン液体化7)などがイオン液体としての特性を活かした展開だろう。一方、水溶液中にイオン液体を添加したり、低濃度で用いる
報告はイオン液体としての特性は期待できないものの、水溶液中で有機塩が生体分子に及ぼす影響も非常に興味深い。本解説
ではイオン液体に添加した水分子が束縛水として存在する混み合い環境ともいえる“水和イオン液体”を場として観測される「生体分子の挙動」
について紹介したい。

図1 水和イオン液体の概念図

2

THE CHEMICAL TIMESに安定性の向上を示すイオン液体中では、束縛水の中でも「中間しかし、構成イオンによる影響は大きく、水の構造形成能が高い水」と呼ばれるような水が存在する解析結果が得られている。中コスモトロピックなイオンを構成イオンにした水和イオン液体

間水は生体親和性材料の表面に存在し、材料と弱く相互作用すの場合、タンパク質や酵素の溶解が可能になるが、そうでないる水に分類される 。中間水が存在するような材料はタンパク質

場合の多くはわずかな水分子の添加では生体分子は溶解しな

9)の吸着などが抑制され、中間水のない材料に比べて血栓の発生い。これまでに各種タンパク質や酵素、グアニン四重鎖（G4）構など抑えられることが報告されている。中間水の有無に関する評造を形成する核酸などの高次構造を保持したまま溶解するイオ

価法として示差走査熱量測定（DSC）が知られている。これまでン液体として、コリニウムカチオン（[ch]）とリン酸二水素アニオンに様々なイオン構造のイオン液体について、含水率を変化させ（[dhp]）
からなるイオン液体を用いて、様々な報告をしてきた。

ながらこの中間水の有無についてDSC測定で検討を行ってきたこのイオンの組み合わせはリン脂質膜の親水部の構造に一致し。中間水が存在するイオン液体は水の構造形成能の高いコスており、生命の進化の過程で選ばれてきた組み合わせが示す生モトロピックなイオンで構成される場合が多く、中間水の存在を体分子との親和性の高さには説得力がある。水和[ch][dhp]に示す水の低温結晶形成に由来する発熱挙動が観測される水分高次構造を保持したまま溶解したタンパク質や核酸は熱安定性

子数はイオン構造によって変化した。また、イオン液体の場合、報や経時的安定性が水溶液中に比べて飛躍的に向上した13)。また、告されている生体適合性高分子と異なり発熱挙動はごく限られ存在する水分子数を調整することで、水和[ch][dhp]中での酵素た水分子数でのみ観測された（図2）。水和イオン液体でも生体反応の進行も確認されている14)。さらに、東京農工大学

分子との親和性を評価するうえで、中間水の有無は大きな指標

典先生との共同研究でG4構造を形成する核酸アプタマーを用

10)池袋一となることを示した。また、
この中間水が存在するか否かを判断いた検討では、水和[ch][dhp]中で水溶液中と類似構造を形成する方法としてNMR測定も有効な手段といえる結果が得られてするが、水分子数のわずかな変化でG4構造のトポロジーが変化

いる11)。中間水が観測される水和イオン液体中の水分子ピークすることを分光学的に観測している。さらにトポロジーが異なるは自由水に比べて低磁場側にシフトして観測された。

ことで、標的分子との相互作用が水溶液中に比べて強くなった15)。
結果も得られている（図3）

図2 イオン液体の1イオンペアに対する水分子数を変化させ示差走査熱量測定を行った結果

図3 1イオンペアに対する水分子数を変化させた水和[ch][dhp]中に溶解した核酸アプタマーのCD測定結果 ref15、Fig.3を改編

生体分子の溶解03

膜タンパク質

イオン液体への生体分子の直接溶解は困難である。無理に溶最近、大阪大学 溝端栄一先生と名古屋工業大学 古谷祐詞先解すると高次構造は変化してしまう。イオン液体と親和性の高い生との共同研究により、水和イオン液体の膜タンパク質の安定高分子などを生体分子の表面に化学修飾することで直接溶解は化溶媒としての可能性について検討を進めている。膜タンパクし可能となり、溶解後は安定性の向上などが確認されている12)。

質は細胞膜に存在し、細胞膜内外の物質輸送や細胞間の相互作かし、化学修飾は煩雑な操作が必要であり、また、制御も難しい。

用などに関与している。
しかし、その取扱いの難しさから水溶性

そこで提案したのがイオン液体にわずかな水分子を混合した水タンパク質に比べて研究が遅れている。創薬研究ではターゲット

和イオン液体である。の6割が膜タンパク質と言われ、膜タンパク質の不安定さや調整の困難さを克服する技術が望まれている。検討では、
モデルタン

水溶性タンパク質、核酸パク質として、構造解析がされているαヘリックス貫通型膜タン

水和イオン液体中には自由水は存在しないが、水分子の存在パク質2種を用いた。アニオントランスポーターで10回膜貫通により水素結合を形成して生体分子の溶解促進が期待できる。

型膜タンパク質であるTehAと光駆動プロトンポンプである7回3

特集

イオン液体

膜貫通型膜タンパク質のバクテリオロドプシン
（bR）
を用いた
（図た白色固体を1イオンペアに水3分子になるよう調整した各種水4）。様々な構成イオンからなる水和イオン液体を調整して膜タン和イオン液体中に混合し、遠心分離後の上清について蛍光測定

パク質を混合すると、いくつかの水和イオン液体中で二次構造をにより溶解性を評価した。また、リコンビナントタンパク質凝集体保持した溶解が確認された。イオン構造や水分子数による影響

として大腸菌で発現したセルラーゼ6A（CcCel6A）
凝集体は大は水溶性タンパク質や後述の凝集体の溶解とは少し異なった。

腸菌破砕後に遠心分離によって回収し、Con Aと同様、調整した

TehA のCD測定ではαヘリックス構造とその含有量が水溶液中各種水和イオン液体と混合した。凝集体の溶解を検討するイオと類似であることが確認され、さらにbRでは7本のαヘリックス

ン液体にはアルキル鎖長の異なるホスホニウムカチオン、アンモ構造の内部に存在する発光団レチナールが水和イオン液体中にニウムカチオンや、環構造の効果の有無についてイミダゾリウム

溶解後も水溶液中と類似状態で存在していることが分光学的にカチオンやピロリジニウムカチオンを用いた。アニオンはブロマ確認できた。さらに、光照射に伴うレチナールの異性化とそれにイドかクロライドに統一することで、カチオンの影響について検続くプロトン輸送に伴う構造変化も水和イオン液体中でも同様討した（図5）。その結果、カチオンのアルキル鎖の総炭素鎖数とに観測された。また、TehA、bRのいずれも水和イオン液体中に凝集体の溶解性に興味深い相関が得られた。凝集体は一般的に溶解することで、水溶液中に比べて熱変性温度が２０℃以上向上タンパク質内部の疎水性残基が表面に現れ、疎水性部分同士がし、bRに関しては連続した光照射による光退色も抑制されること集合して水溶液中で固体を形成している。そのため、疎水性環境が確認されている。の方が溶解性が上がると想像できるが、場の疎水性が高ければ高いほど溶解性が上がるわけではなく、疎水性が高くなりすぎると溶解度は下がる結果となった。溶解性に効果的であったのはアンモニウムやホスホニウムカチオンでアルキル鎖の総炭素数が16)16付近のものであった 。カチオンの環構造による顕著な影響は確認されず、水溶性タンパク質の高次構造を保持した溶解に有効であったコリニウムカチオンも溶解性は低かった。一方、アニオンの影響としてブロマイド、クロライドアニオンをコスモトロ
図4 TehA (a)およびbR (b)の立体構造（PDBエントリー：3M71、5B35）ピックな[dhp] アニオンに交換した結果、溶解性は向上した。さらに含水量の影響として、1イオンペアに対する水分子数が増えると溶解度は低下する結果がいずれの水和イオン液体でも得られた。このような凝集体の溶解に関する傾向は熱変性タンパク

タンパク質凝集体
次にタンパク質凝集体の溶解について紹介する。タンパク質質凝集体でも大腸菌を宿主として得られたリコンビナントタンパク質凝集体でも同様であった17)。タンパク質凝集体の溶解には、は熱や化学的な因子により容易に変性、凝集する。また、大腸菌

水溶性タンパク質や膜タンパク質とはまた異なる視点からのイなどを宿主としたリコンビナントタンパク質の発現は汎用技術でオン構造の選択が有効であった。

あるが、高い確率で凝集体を形成する。このような凝集体はタンパク質本来の構造を失っているため不活性である。このような凝集体の活性の再生は一般的に高濃度変性剤を用いた可溶化後、長時間の希釈・透析により変性剤を取り除きながらリフォールディングを行うが、再生が難しい場合も多い。このような再生過程は希薄水溶液中（自由水中）で進められる。一方、細胞内ではタンパク質の再生環境は全く異なり、疎水的環境であるシャペロン内部で進行する。水和イオン液体は構成イオンと混合する水分子数の調整により、自由水が存在しない疎水的環境でありながら、水素結合を形成する疑似シャペロン環境を実現する場になると期待される。実際に、熱凝集タンパク質やリコンビナントタンパク質凝集体を変性剤を使用することなく直接溶解し、溶解後にはリフォールディング挙動の誘起を観測している。ここでは凝集タンパク質の溶解について紹介し、その後のリフォールディング挙動については次章に記載したい。
糖鎖認識タンパク質であるコンカナバリンA（Con A）の熱凝集体はCon Aを水溶液に溶解して70 ℃で10分間インキュベートすることで白色固体として得られる。遠心分離によって回収し4

図5 凝集体溶解の検討で用いたイオン液体の構造
ref16、Fig.1を改編

THE CHEMICAL TIMES

04を選択した水和イオン液体に高濃度に溶解する（12 mg/mL）。

前章では水和イオン液体を用いた溶解の中でタンパク質凝集リコを測定した結果、結合強度の回復が確認されている16)。また、体の溶解について紹介した。本章では水和イオン液体に溶解後ンビナント凝集CcCel6Aを用いて、水和イオン液体に溶解後ののリフォールディング挙動について記載するが、その前に凝集体構造について蛍光スペクトル測定を行った。蛍光スペクトルではではないが凍結乾燥サンプルを用いたリフォールディングの検スペクトルのピーク位置によって溶解状態が予測でき、335nm討結果について紹介する。凍結乾燥は長期間保存が可能な汎用付近がネイティブ類似状態、長波長シフトはアンフォールド状況、リフォールディング挙動

熱凝集Con Aについては、前述のように構成イオンと含水量溶解後のCon Aについて、緩衝液で希釈後にマンノース結合能技術であり、タンパク質の凍結乾燥品の販売もある。
しかし、タ短波長シフトは凝集状況を示唆する。図７に溶解後CcCel6Aのンパク質を凍結乾燥させる過程で活性が低下するようなダメー構造が構成イオンによって大きく異なること示すスペクトルを示ジを受ける可能性は否めない。例えば、凍結乾燥したCon Aはした。凝集CcCel6Aの高い溶解性を示したテトラブチルアンモ緩衝液に溶解してグルコースが担持されたカラムを通すと吸着ニウムブロマイド（[N4444][Br]）は、溶解後も凝集体様の状態せず溶出してしまう成分が確認できる。Con Aはマンノースとグであることがスペクトルから示唆された。これに対して、[dhp]アルコースを選択的に吸着するが、その結合係数はマンノースのニオンからなるイオン液体の場合、溶解後にネイティブ（water-方が3倍程度高い。グルコース担持カラムに吸着しなかった成分soluble）と類似構造へリフォールディングを示唆するスペクトルと、カラムに吸着後にマンノース溶出液で溶出・回収した成分にが得られた。水素結合を形成しやすい[dhp]をアニオンとするこ

ついて、同濃度でマンノース結合強度を比較すると前者は後者とで、溶解後のリフォールディングが誘起されたと考えられる。同の半分以下であった。それぞれの成分を水和イオン液体に溶解様に水和イオン液体中に溶解後、リフォールディングが示唆されし、その後、マンノース結合強度を測定した結果、いずれの成分たCcCel6Aの活性回復について検討するため、疎水性カラムをも結合強度が増加し、さらに両成分ともに同程度の結合強度と用いてCcCel6Aを緩衝液中に溶出した。回収したCcCel6Aのなった（図6）。これは糖鎖認識能が低下していた凍結乾燥Con A

セルラーゼ活性について検討を行ったところ、ばらつきがあるもを水和イオン液体中に溶解することでリフォールディングが誘ののネイティブと比較しても高い活性が得られた17)。以上のよう起され、糖鎖認識能が向上したためと示唆される。また、興味深に、構成イオンを選択した水和イオン液体を用いることで凝集タいことに水和イオン液体の含水率によって糖鎖認識能の増加程

ンパク質の溶解とリフォールディングが可能になる結果を得てい度が異なった。1イオンペアに対して水3、7、15分子となるようる。従来法とは異なるメカニズムによる凝集タンパク質の再生法

調整した水和イオン液体に溶解したマンノース結合能は緩衝液の発展に寄与できればと期待する。に直接溶解したものに比べてそれぞれ約2、1、0.5倍となった。
水和イオン液体中の水分子数が多くなり自由水が存在し始めるとリフォールディングの効果はなくなることが結果から示唆された18)。

図7 リコンビナント凝集CcCel6Aを各種水和イオン液体溶解後の蛍光スペクトル
Ref17、Fig.2を改編

おわりに
図6 水和イオン液体で処理前後のマンノース結合センサーグラム（黒ライン処理前、赤ライン処理後）(a) グルコースカラムに吸着しなかったConA、(b) グルコースカラムに吸着したConA
Ref18、Fig.4を改編

05

生命科学研究用の“場”として水和イオン液体を用いる可能性について紹介した。水溶性タンパク質だけでなく膜タンパク質や核酸の構造を保持した溶解が可能であり、溶解後にはリフォー
ルディング挙動や安定性の向上などが観測されている。また、

5特集

イオン液体

水和イオン液体中の水分子の数を制御することで、DNAアプタ

参考文献

マーのトポロジー変化や分子間相互作用が変化する結果も得ら

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れている。さらに今回は割愛したが、イオン構造のデザインにより親・疎水性を調整することで温度によって水と二相分離挙動を示すイオン液体が知られているが、生体分子と高い親和性を示す水和イオン液体でもこのような挙動を示すものがある。水分子数や温度のわずかな変化により引き起こされる液液相形成などの環境の変化は、時空間的にドラスティックに変化する細胞内を連想させる。水和イオン液体を制御することで細胞内の状況をシンプルに模倣するような場の形成ができないだろうか。水和イオン液体を生命科学研究用の場として、生体分子の反応や構造に大きく影響を及ぼす水分子の振る舞いを制御しながら得られる結果について理解を進めることで、細胞内の挙動理解につながることを期待したい。

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