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納豆によるメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の制御法の開発＜平成 29 年度助成＞

納豆によるメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の制御法の開発
千葉明生（東京慈恵会医科大学 細菌学講座）

背景

医療の現場では、さまざまな薬剤耐性菌が問題となっている。特に、抗菌薬の一つであるメチシリン

方法

納豆からのグラム陽性桿菌の分離培養と抗菌活性の観察に耐性化した黄色ブドウ球菌 : Methicillin Resistance

29 種類の市販されていた納豆から一粒を無菌的

Staphylococcus aureus （MRSA）は、ペニシリン系に取り出し、マンニット食塩培地に擦りつけ、画線抗菌薬だけでなく多くの抗菌薬に耐性化しているた培養を行った。37℃で一晩培養し、得られた孤立コ

め、感染症を起こすと治療に難渋する。また、黄色ロ ニ ー を Brain Heart Infusion（BHI） 液 体 培 地 でブドウ球菌はそのバイオフィルム形成能のため血管37℃で一晩培養した。培養物を数 µL をスライドガ内留置カテーテルや人工関節、心臓の人工弁などのラス上で乾燥させ、グラム染色を行いグラム陽性桿生体内人工物に感染しやすく、院内感染の原因菌と菌であることを確認し、-80℃で保存した。

して問題となっているだけでなく、市中における黄色ブドウ球菌は、東京慈恵会医科大学で得られMRSA の拡大も懸念されている。MRSA 感染症に対た MRSA の臨床分離株 MR10 株を用いた。MR10 株

する治療薬としては、バンコマイシンが第一選択薬の BHI 液体培地での一晩培養物を、新鮮な BHI 液体として使用されているが、2002 年に耐性菌が米国培地で 100 倍に希釈し、滅菌綿棒で固形培地に塗布で報告された。幸いにして、本邦では報告がされてした。この培地上に、グラム陽性桿菌の 10 µL の培おらず、世界的にも稀な感染症と考えられているが、養液を滴下し、37℃で一晩静置培養し、黄色ブドウ昨今の抗菌薬耐性菌の蔓延を鑑みると、今後問題に球菌に対する抗菌活性を観察した。最も抗菌活性がなる可能性は否定できない。このため、新しい抗強かった株を GPR-K0 株とした。また、同株の一晩MRSA 薬の開発を継続する必要があると考えられる。

培養物を新鮮な BHI 液体培地で希釈し、マンニットペニシリンをはじめとする抗生物質は、微生物の食塩培地で継代培養した。K0 株と異なったコロニー生存戦略の一つとして産生された物質を利用したも形態の細菌をさらに BHI 液体培地で培養し、その抗のである。自然界に広く存在する Bacillus 属の細菌菌活性がなかった株を GPR-K2 株とした。また、抗は、抗生物質の産生についていくつかの報告がなさ菌物質を分離するために、GPR-K0 株の培養物を遠れてきた。本研究では、Bacillus subtilis の一種であ心分離し、上清を径 0.2 µm のフィルターでろ過した。

る納豆菌の持つ抗 MRSA 活性に焦点をあて、新たな感染症治療法の可能性を見いだした。

次世代シーケンサー（NGS）による解析
BHI 液体培地で培養した GPR-K0 株と K2 株を遠心 分 離 で 集 菌 し、 ペ レ ッ ト か ら Wizard Genomic
DNA Purification Kit（Promega）を用いて、ゲノムDNA を抽出した。得られたゲノムをテンプレートと

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浦上財団研究報告書

Vol.27（2020）

し、16s rRNA 領域全長を PCR で増幅し、DNA シーの 配 列 を PCR で 増 幅 し、 増 幅 配 列 を Splicing byケンスにより枯草菌であることを確認した。さらに、

overhang extension PCR で 結 合 し た。 こ の 配 列 を抽出したゲノム DNA を illumina Hiseq により 100

BP clonase により pKOR1 挿入もしくは GeneArt にpair end の条件で、ユーロフィンジェノミクスへのより pIMAY に結合させ、大腸菌 DH5α株に形質転外部委託によりシーケンスを行った。得られたデー換し、プラスミドの抽出をした。プラスミドは黄色

タはトリミングを行い、DDBJ Pipeline を利用してブ ド ウ 球 菌 RN4220 株 を 介 し、MRSA 臨 床 分 離 株

contig を作成した。得られた contig のうち、300 塩

MR10 株へ形質転換し、相同組換えにより遺伝子欠基以下の配列を除去し、アノテーションパイプライ損株を得た。

ン DFAST でアノテーションを付与したものをドラフ
トゲノムとした。

結果・考察

発現量解析を行うため、BHI 液体培地で培養した
GPR-K0 株と K2 株を遠心分離で集菌した。ペレット

納豆菌による黄色ブドウ球菌に対する発育阻から RNeasy Maxi Kit（Qiagen）を用いて total RNA

害効果を抽出し、illumina HiSeq により 100 bp paired end

納 豆 か ら 得 ら れ た グ ラ ム 陽 性 桿 菌 の 培 養 液 を、の条件で、北海道システム・サイエンスへの外部委

MRSA が塗布された固形培地に滴下した。一晩の静託によりシーケンスを行った。得られたデータをト置培養により、納豆菌のコロニー周辺に MRSA に対リ ミ ン グ し、 全 ゲ ノ ム が 公 開 さ れ て い る 納 豆 菌する発育阻止円がみられた。複数の納豆から細菌をBEST195 株（NC_017196）にマッピングし、cufflinks抽出し、最も阻止円が大きい株を GPR-K0 株としたにより発現量解析を行った。

（図 1 左）。納豆菌は、ファージやトランスポゾンなどによる遺伝子発現の変化により、納豆製造過程で納 豆 を 産 生 で き な く な る こ と が あ る。 そ こ で、in vivo での抗菌活性
九州大学遺伝子資源開発研究センターより分譲された、5 齢の S30 × xe5 系統のカイコ幼虫 を使用

GPR-K0 株 を 継 代 培 養 す る こ と で 抗 菌 活 性 が な い
GPR-K2 株を得た（図 1 右）。

した。MR10 株を BHI 液体培地で一晩培養した菌液

納豆菌による発育阻止効果の機序を検討するためを遠心分離し、ペレットを培養液と同量の 0.6％塩に、いくつかの MR10 株の遺伝子変異株に対する抗化ナトリウム溶液に懸濁した後、再度遠心分離した。

菌活性を調べた。その結果、atl 欠損株でその効果がペレットを元の培養液の 1/2 量の 0.6％塩化ナトリ減弱した。Atl は autolysin と呼ばれ、細胞分裂時にウ ム 溶 液 で 懸 濁 し、 試 験 菌 液 と し た。4 × 106

重要な酵素であり、その活性は界面活性剤の存在下

CFU/50 µL の試験菌液をカイコの背脈管より投与で上昇する。このことより、納豆菌の産生する界面し、餌を与えず 25℃で 90 時間を観察した。また、納豆菌抽出液を DDW で 1/5 に希釈し、試験菌液もしくは 0.6 % 塩化ナトリウム溶液と混合した後、カイコに投与した。

遺伝子変異株の作製
相同組換えによる遺伝子欠損株を作成するため、プラスミド pKOR1 もしくは pIMAY を用いた。黄色ブドウ球菌から抽出したゲノム DNA をテンプレー
トとし、欠損させる遺伝子の上流、下流の 500 塩基

図 1 納豆菌による阻止円
MR10 株の培養液を希釈し、固形培地に塗布後、GPR-K0 株（左）とGPR-K2 株（右）の培養液を滴下し 37℃で一晩培養した。

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納豆によるメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の制御法の開発

表1野生株

atl欠損株

tarO欠損株

ドラフトゲノムの比較

GPR-K0GPR-K2

全塩基（bp）

4,069,935

4,066,498

シーケンス数9794

GC 含有率（%）

43.343.3

N50102,931102,934

CDS 数4,3134,307

ANI（%）*99.978799.9991

図 2 MRSA 変異株への効果
MR10 株の遺伝子変異株を固形培地に接種後、GPR-K0 株の培養物を滴下し、37℃で一晩培養した。

活性を持つ物質がその抗菌活性に重要であることが*Bacillus subtilis Best195 をリファレンスとして fastANI を用いて算出した。

示唆された。一方、βラクタム薬などの細胞壁合成阻害剤は、壁タイコ酸合成遺伝子である tarO の欠ある。GPR-K0 株と K2 株のドラフトゲノムを作製し、損によりその効果が増強される。しかし、tarO 欠損

納豆菌 BEST195 株との比較を FastANI で行い、ANI株に対しては発育阻止効果に変化がないため、細胞値を算出した（表 1）。その結果、いずれも納豆菌と壁合成阻害剤とは異なる機序であることが示唆され判断できた。

た（図 2）。

次に、RNA シーケンスによる遺伝子発現量の変化を網羅的に解析した。その結果、GPR-K0 株は芽胞

納豆菌の保有する遺伝子の解析

形成、GPR-K2 は運動性に関連する遺伝子の発現量

GPR-K0 株、GPR-K2 株は 16s rRNA の配列から枯が増加していた（図 3）。以上から、納豆菌の黄色ブ草菌と同定した。納豆菌は枯草菌の一種とされていドウ球菌に対する発育阻止効果は、芽胞形成に関連るが、ゲノムの比較では納豆菌に存在する遺伝子のするタンパク質の発現が重要であることが示唆され約 15％が、納豆菌にのみ存在すると報告されている。

た。

そこで、納豆から得られたグラム陽性桿菌が納豆菌であることを確認するため、ANI（Average Nucleotidein vivo モデルでの評価の類似性をコンピュータ上で算出し、95% 以上であ物モデルとして用いて評価した。カイコは無脊椎動れば同種、95% 未満であれば別種と判定する基準で物であるため倫理的制約がなく、かつ非常に安価で86420-2-4-6-8

No_01
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納豆菌の定着による宿主への影響を、カイコを動K2に対するK0の発現量の比Identity）値を算出した。ANI 値は、2 つ株のゲノム

図 3 RNA シーケンスによるトランスクリプトーム解析
Bacillus subtilis BEST195 株をリファレンスとし、GPR-K0 株と GPR-K2 株の遺伝子の発現量を比較した。4 倍以上の差があった遺伝子に任意の番号をつけ、緑色が芽胞形成、橙色が運動性に関連するものとして示している。

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浦上財団研究報告書ある。また、細菌や各種化合物の投与による影響は、

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結語マウスへの影響との相関がある。GPR-K0 株を、脊本研究期間中には、納豆から分離した細菌が納豆椎動物の脈管系に相当する背脈管と腸管に投与した菌であることを遺伝学的に確認したことに加え、納が、 カ イ コ の 生 存 性 に 影 響 し な か っ た（data not

豆菌が抗菌物質を産生し、その産生条件を特定するshown）。このことは同株の病原性は弱いことを示唆ことができた。また、in vivo の実験で納豆菌は病原している。また、MR10 株と納豆抽出物を混合した性が低いこと、抗菌活性物質にはカイコに対する毒ものを、カイコの背脈管から投与すると、生存期間性がなく MRSA に対し抗菌活性があることを明らかが有意に延長した（図 4）。これは、抽出物中に抗菌にした。今後、抗菌物質の同定とその発現に関わる活性物質が含まれていることを示唆している。

遺伝子を明らかにすることで、新規の抗菌物質を発見できる可能性がある。また、納豆菌自体の病原性

対照抽出物のみ

生存率 (%)

1.00.8用いた納豆菌の定着による MRSA の排除の可能性を検討する。

細菌のみ0.6がほぼないことが確認されたので、in vivo モデルを細菌+抽出物

0.4

謝0.20.002040

時間6080

図 4 カイコに対する病原性
各 群 10 頭 の カ イ コ 幼 虫 に、0.6% NaCI（ 対 照 ）、GPR-K0 抽 出 物、MR10 培養液、培養液と抽出物の混合物を投与し、室温、無給餌で90 時間観察した。細菌単独投与群と細菌・抽出物の混合物投与群では統計学的有意差があった（P<0.01）。

辞本研究を行うにあたり、ご支援を頂きました公益財団法人 浦上食品・食文化振興財団に深く御礼を申し上げます。また、本研究の立ち上げを支援してくださった水之江義充先生、研究に関しアドバイスをして頂いた金城雄樹先生をはじめ、東京慈恵会医科大学 細菌学講座の皆様には深謝いたします。

Development of control measures against methicillin resistant Staphylococcus aureus using natto.

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Development of control measures against methicillin resistant
Staphylococcus aureus using natto.
Akio CHIBA
Department of Bacteriology, The Jikei University School of Medicine
In recent years, antibiotic-resistant bacteria have spread throughout theworld. Methicillin resistance Staphylococcus aureus (MRSA) is one of the mostimportant pathogens in clinical settings, due to its antibiotics resistance andbiofilm formation ability. However, therapeutic agents for MRSA are limited.
Due to the current spread of antibiotic-resistant bacteria, it is necessary tocontinue the development of anti-MRSA drugs. Several articles have reported
that Bacillus subtilis possesses antibacterial activity. In the current study, wefocused on the anti-MRSA activity of B. subtilis natto, a subtype of B. subtilisthat produces natto.
After investigating commercially available natto, we found that some strains
display anti-MRSA activity, while other derivatives do not. Differences in theanti-MRSA activity of several genetic mutants of MRSA suggested surfactant
activity to be involved in its antibacterial activity. In addition, these bacteria
were genetically confirmed as Bacillus subtilis natto via comparative genomics.
RNA sequencing suggested that the anti-MRSA activity was related to theincreased expression of proteins associated with sporulation. On the otherhand, the expression of several genes associated with motility decreased. In invivo experiments in silkworms, we showed that the bacteria itself was lesspathogenic, and that the crude anti-MRSA substance extracted from B. subtilis
natto not only displayed no toxicity, but also displayed antibacterial activity
against MRSA.
In the future, new anti-MRSA substances can be discovered via theidentification of antibacterial substances, along with the genes involved in theirexpression. Moreover, we will investigate the elimination of MRSA through B.
subtilis natto colonization.