アブラナ科植物における揮発性物質を用いた新規環境・病害ストレス耐性誘導技術の基盤構築

55＜平成 26 年度助成＞

アブラナ科植物における揮発性物質を用いた新規環境・病害ストレス耐性誘導技術の基盤構築
木下奈都子（筑波大学 生命環境系）

背景ることを目的とする。具体的には、アブラナ科モデ
ル植物を用いて、1）非コード RNA を介した環境ス

アブラナ科は世界中の食文化に深く関わり、特にトレス応答メカニズムと、2）生物ストレス応答に香辛料としては西洋ワサビ、マスタード、ルッコラおいて中心的な役割を果たす植物ホルモンについてなどが存在する。和食を代表する香辛料であるワサの生物ストレス応答機構の可視化と、メカニズム解ビもアブラナ科である。

明のための基盤研究を行った。モデル植物において、しかし栽培農場では、軟腐病やモンシロチョウ、コナガのような特異的な害虫から、ハスモンヨトウストレス応答機構を解明することで、直接ワサビを含むアブラナ科に応用することができる。

やアブラムシ類など病害虫の被害が著しい中で、ワサビの適用農薬は非常に少ないのが現状である。こ結果のような背景から、農薬の適用拡大が要望されている。しかし現時点でほとんどのワサビは水耕で栽培

１．アブラナ科植物におけるモデル植物を 用されているため、水系への影響の懸念からこの取りいた新規環境ストレス応答機構の探索組みは難航している。さらに、ワサビ栽培には冷涼lincRNA とは通常（1）200 塩基以上、（2）100 アな温度管理と豊富な水資源が不可欠であるが、温暖ミノ酸以上をコードする ORF を含まない、（3）既知化や水資源の不足から、今後ワサビの栽培適地の減の遺伝子から少なくとも 500 塩基以上離れていると少が予測される。この現状の突破口として、分子育定義される。我々の研究グループは、塩・乾燥など種や新規な栽培法・生物的防御法によるアブラナ科の環境ストレス下で機能する lincRNA を同定するこ

香辛料作物の生産安定化に期待が寄せられる。とを目的とし、研究室内外のデータベースをスクリー

一方で、近年の DNA シークエンス技術と転写産ニングし、塩ストレスで誘導される lincRNA である

物解析の進歩に伴い、バックグラウンド「ノイズ」

NPC60（NON PROTEIN CODING 60）に焦点を当てた。

だと考えられてきた非コード RNA（long intergenic

まず、ノザン解析で期待される長さの RNA が検出

non coding RNA; lincRNA）が真核生物の転写制御にされることを確認した（図 1A）。塩ストレスは、高おいて重要な役割を担っていることが明らかになっ浸透圧ストレスや水ストレスホルモンであるアブシた。例えば哺乳類においては、lincRNA がヒトの疾ジ ン 酸（ABA） の 経 路 と 重 な っ て い る こ と か ら、患や病態生理に関する原因遺伝子として単離されてABA や高浸透圧ストレスにおける NPC60 レベルのいる。

変化を解析した。その結果、NPC60 の RNA レベル

本研究では、生物ストレスと環境ストレスに抵抗は塩・高浸透圧ストレスおよび ABA に応答して急上性のあるアブラナ科の栽培法・生物的防除法の開発

昇 す る こ と を 確 認 し た（ 図 1B）。 こ の 結 果 か らを目的として、長鎖非コード RNA によるアブシジン

NPC60 は、塩・高浸透圧ストレスおよび ABA に共酸とジャスモン酸を介した病害抵抗性反応を解明す

通 し て 応 答 す る lincRNA だ と 考 え ら れ た。 次 に

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Vol.27（2020）

図 1 NPC60 RNA の発現レベルは ABA や高浸透圧ストレスにも応答して上昇し、登熟種子で高発現している
A, 葉、花芽組織由来の RNA を使用したノザン解析による NPC60 RNA の検出。B, ABA、NaCl、高浸透圧ストレス（0.3M Mannitol）処理によるNPC60 RNA のレベルの変化を RT-qPCR によって解析した。C-F, NPC60 のプロモーター下流のβGUS 活性による NPC60 発現部位の解析。C、全個体レベル（Bar=1cm）; D, 花芽 ; E-F、葉における NPC60 発現組織。矢印：排水構造（塩腺）。Bar=5mm. 右、花芽組織における発現部位。
Bar=1mm.

NPC60 がどの組織で発現しているのかを調べるため能しているという仮説を立て、発現レベルの異なるに、NPC60 のプロモーター下でβ-グルクロニダー

NPC60 形質転換系統を用いて表現型を解析した。そゼ（GUS）を発現する形質転換植物を作出し、GUSの結果、通常生育条件下ではどの系統も同様に発芽活性を検出した。その結果、NPC60 は葉と花芽で発するのにもかかわらず、NPC60 ノックアウトおよび現し、葉では維管束の先にある排水構造（hydathode）

RNAi によるノックダウン株は野生株に比べて ABAでプロモーター活性が検出された（図 1C-F）。

依存的チェックポイントに過剰に応答し、過剰発現発芽は植物のライフサイクルの中で最も乾燥に弱系統は非感受性を示した。よって NPC60 はチェッい時期の一つである。そこでは、まわりの水分環境クポイントに関する負の因子であることが分かったが発芽に適しているかどうかを判断するチェックポ（図 2A, B）。これは我々の知る限り、低分子 RNA にイントが存在する。仮に乾燥ストレスが感知された直接作用しない lincRNA としては、植物で先駆的に場合、植物は ABA 依存的に生長を停止する。この生表現型レベルで機能が確認された数少ない例の一つ

長停止状態の芽生えは高いストレス耐性を保持する。

で あ る。 次 に こ の 表 現 型 を 利 用 し て、 果 た し て

我々はまず、NPC60 がこのチェックポイントに機NPC60 は RNA として機能しているのか、それとも

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図 2 NPC60 は ABA 依存的な発芽時の水分チェックポイントを負に制御している
A, ABA 依存的な生長停止に関する応答を野生型、過剰発現系統（OX）、ノックダウン（RNAi）、ノックアウト（KO）ラインにおいて解析した。
写真は播種後７日後に撮影された。Bar: 0.5 mm. B, 発芽時チェックポイントの表現型の定量化。Ｃ，NPC60 ノックアウト系統に野生型と変異型（Met->Val）NPC60 を誘導型プロモーター制御下で発現し、相補実験を行った。上、野生型と変異型 NPC60 で相補したノックアウト系統の ABA依存的な発芽率。＋、−はβエストラジオールによる発現誘導のあり・なし。

短 い ペ プ チ ド と し て 機 能 し て い る の か、 変 異 型

因子は ABI5 である。このため NPC60 とは対称的でNPC60 （Met->Val）を用いた相補実験を行った。そある。すなわち ABI5 ノックアウト系統は発芽時のの結果、変異型 NPC60 と野生型 NPC60 では優位なチェックポイントに関して ABA に非感受性で、過剰差が認められなかったので、NPC60 は RNA として発現系統は野生型よりも過敏に反応する。ABI5 の機能していることが示唆できた（図 2D）。

mRNA レベルは NPC60 と同様に、塩・乾燥またはこれらの結果から、NPC60 は種子発芽期の水ストABA によって誘導される。NPC60 と ABI5 の発現パレス下で、登熟種子と同様の乾燥ストレス耐性に関ターンを詳細に解析するために、登熟段階別と発芽するプログラムを制御していることが分かったの時における発現パターンを比較した。種子登熟段階

で、実際に種子登熟期の発現パターンを解析した。

においては、NPC60 レベルが減少する S4 期（受粉NPC60 の RNA レ ベ ル は S3 期（ 受 粉 後 11-15 日 ）後 16-20 日）に ABI5 のレベルがピークに達していにピークに達し、その後減少していた（図 3A）。

た（図 3A）。発芽時では両遺伝子の発現レベルは一方、発芽時のチェックポイントにおける正の鍵ABA によって上昇する。しかし登熟期では、NPC60

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図 3 NPC60 と ABI5 の発現レベルは負の相関を示す
A, 胚発生時における NPC60 および ABI5 RNA レベルの変化。F, 花芽 . S1, 受粉後 1-5 日（DPA; days post anthesis）. S2, 6-10 DPA. S3, 11-15 DPA.
S4, 16-20 DPA. B, RT-qPCR による発芽時における ABA 処理後の NPC60 と ABI5 RNA レベルの経時的変化。Ctl, コントロール、0 uM ABA; ABA,3uM ABA. C, RT-qPCR を利用した NPC60 過剰発現系統における胚発生段階における ABI5 mRNA 蓄積量の解析。COL.0, 野生型コントロール；
OE1, NPC60 過剰発現系統 1; OE7, NPC60 過剰発現系統 7. D、核局在性 RNA の in vivo 検出メソッドに用いるツール。E、上、NPC60 に結合している MS2 RNA 配列に親和性を持つ MSCP は NES（nuclear exporting signal）を付与した GFP に結合しているので MS2 配列が存在しない場合は核外に局在し、GFP で検出できる。中、MS2-NPC60 を発現している細胞は mCherry で識別できるとともに mCherry は NLS（Nuclear LocalizingSignal）を付与しているので核のマーカーでもある。下，MSCP-GFP と MS2-NPC60 が共発現されると GFP シグナルは核で検出されるので、NPC60 RNA は核に局在すると考えられる。

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59のピークは ABI5 のピークに先行して 1 日目にピー

２．生物ストレス応答において中心的な役 割クに達し、その後 NPC60 の mRNA レベルが減少する。

を 果 た す 植 物 ホ ル モ ン、 ジ ャ ス モ ン 酸 と追随して ABI5 mRNA レベルが上昇し、そのピーク

サ リ チ ル 酸 に つ い て、 個 体 内 と 個 体 間 をは 4 日目に達するという現象が観察された（図 3B）。

介した生物ストレス応答機構の可視化とこれらの結果から、（1）ABI5 が正の制御因子とメカニズム解明のための基盤研究して機能する発芽時のチェックポイントに関してジャスモン酸、サリチル酸、それぞれの発現調節は、遺伝解析から NPC60 が負の制御因子として機領域によって制御される蛍光タンパク質が導入され能していること、（2）この正と負の因子は共に ABAたシロイヌナズナ（筑波大学・別役氏）を用い、コによって誘導されるものの、ABI5 mRNA レベルのナガの食害に対する応答を解析した。その結果、食上昇は NPC60 の RNA レベルの減少とともに起こる害に応答して食害部位とその周辺の細胞で蛍光シグことが明らかになった。そこで我々は、NPC60 がナルが検出された。この結果を受けて、傷害ストレABI5 mRNA 蓄積量を負に制御することによって負スと害虫からの唾液などに応答した特異的な反応をの因子として機能しているのではないかという仮説調べるために、ハスモンヨトウの唾液を単離し、唾液を立て、NPC60 過剰発現系統における ABI5 mRNA応答反応と傷害ストレスを切り離して解析できる実レベルを解析した。その結果、過剰発現系統では、験系を確立した（図 4）。その結果、サリチル酸経路

ABI5 mRNA レベルが著しく減少していることが分がジャスモン経路より先行して反応するが、24 時間かった（図 3B-C）。つまり、NPC60 は ABI5 mRNA

後にはジャスモン酸経路が強力に応答していることを負に制御し、その結果チェックポイントで負の因が、タイムラプス実験から明らかになった（Kinoshita

子として機能していると考えられた。さらに両遺伝

and Betsuyaku, 2018; Kinoshita et al., 2019）。

子は別々の染色体上に存在し明確な相同性もないこ

さらに、揮発性物質を介した生物ストレス耐性誘とから、NPC60 は ABI5 にトランスに作用している導型栽培法の技術基盤として、揮発型のサリチル酸と推測される。ABI5 は転写因子として自己の転写を（メチルサリチル酸）とジャスモン酸（メチルサリチポジティブにフィードバックしているので、NPC60ル酸）に対するそれぞれの組み替え植物の応答を解はクロマチンレベル、または RNA、タンパク質レベ析した。その結果、低濃度の揮発性植物ホルモンにルで ABI5 を制御していることが示唆された。

対して、特異的に反応していることが分かった（図 5）。

これらの結果を受けて、我々は NPC60 RNA の細胞内局在性を解析した。方法としては、既存する細胞 質 局 在 性 の in vivo RNA 可 視 化 法（Schonbergeret al., 2012）を改変して、高感度な解析法を考案した。この改変型メソッドを利用した場合、NPC60 のRNA は核で検出された。よって NPC60 にコードされる RNA の核局在性は、下流で作用する転写因子

ABI5 と同様であることが明らかになった（Kinoshitaet al., 2018）。これは両遺伝子の関係とも合致する（図 3D-E）。

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図 4 ハスモンヨトウ吐き出し液に対するシロイヌナズナのジャスモン経路とサリチル酸経路の活性化
A、ハスモンヨトウの吐き出し液を用いた生物ストレス実験系の模式図
B、上）ジャスモン酸応答経路の活性化に応答して蛍光を発する形質転換植物を用いたハスモンヨトウ吐く戻し液に対する応答中）吐き戻し液区画の拡大図下）傷害ストレスのみの対照実験区の拡大

図 5 モニター植物を用いた揮発性物質の感知
ジャスモン酸に応答して蛍光（Yellow Fluorescent Protein）を発する形質転換植物を用いた上）溶媒のみの対象区、中）ジャスモン酸メチル、下）サリチル酸メチル
左）白色光、中）蛍光シグナル、右）自家蛍光アブラナ科植物における揮発性物質を用いた新規環境・病害ストレス耐性誘導技術の基盤構築

最後に、実際に食害を受けた植物から放散される揮発性物質に応答し、隣接する植物の免疫応答が活性化することを独自に開発したシステムで示すことができた。この系では、目視で確認するのが困難な微細な食害に反応することが分かった。このことか
ら、早期な害虫被害を発見して予防型の農業を可能にする技術でもあることが分かった。早期に被害を検知することで省農薬を可能にする持続型農業に貢献するだけでなく、自動的に微細な害虫被害を検知することができるため、超高齢化している日本の農業 現 場 に も 対 応 で き る 技 術 で あ る（ 特 願 2017205564; 国際特許出願 ; PCT/JP2018/180576）。
謝辞

本研究を進めるにあたり、公益財団法人 浦上食品・食文化振興財団から多大な助成金を賜りました。厚
く感謝を申し上げます。

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参考文献

Kinoshita, N., Arenas-Huertero, C., and Chua NH.
"Visualizing nuclear-localized RNA using transient
expression system in plants” G¯enes Cells 23, 105–111(2018)
Kinoshita N., and Betsuyaku, S. "The effects of
Lepidopteran oral secretion on plant wounds: A casestudy on the interaction between Spodoptera litura andArabidopsis thaliana ” Plant Biotechnology 35, 237–242(2018)
Kinoshita, N., Sugita, A., Lustig, B., Betsuyaku S., FujikawaT., Morishita T. ”Automating measurements of fluorescentsignals in freely moving plant leaf specimens” Plant
Biotechnology 36, 7–11 (2019)
木下奈都子「画像処理装置、画像処理システム及び画像処理プログラム」特許出願 2017-205564 2017 年 10月 国際特許出願 PCT/JP2018/180576 2018 年 10 月

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Developing Novel Environmental andBiological Stress Tolerance Inducing TechnologyNatsuko KINOSHITA
Faculty of Life and Environmental Sciences, University of TsukubaBrassicaceae, which is also known as the mustard family, is an important
genus for food culture. In addition to mustard, this family contains whitemustard and horseradish, as well as wasabi, which is one of the most important
spices in Japanese food culture.
Despite a large loss of wasabi produce due to biological threats such as
pathogens and insects, very few pesticides are currently available for use inprotecting this valuable crop. In particular, wasabi plants are farmed using
running water systems, and wasabi farming requires an abundance of cold
water. However, due to global warming and a lack of fresh water resource, wepredict a significant reduction in wasabi yields in the near future. Accordingly,
to develop new molecular breeding technolog ies that enable more stablesupplies of Brassicaceae spices and other vegetables (1) we invest ig atedenvironmental stress responses mediated by a new category of transcript, longnon-coding RNA (lncRNA). In addition, (2) we also expanded the development of
our toolbox towards biological stress response using transgenic plants that
express fluorescent signals in re sp onse to bi ol og i cal str ess and vol at ile
compounds emitted by crops under biological stress caused by pathogens andpest insects.
(1) lncRNAs are transcriptome products with regulatory importance. HumanlncRNA has been associated with diseases (Gupta, et al ., 2010; Hu, et al .,2011; Zhu, et al ., 2011; Cabianca, et al ., 2012). However, it has beendifficult to assess lncRNA function using phenotypes at the whole organism
level in mammalian systems. Here, we explored whole plant level
phenotypes and undertook a characterization of possible downstreammechanisms regarding a salt stress induced lncRNA (Kinoshita et al., 2018).
(2) Using transgenic plants that expose fluorescent signals in response to theactivation of major phytohormone pathways, we clarified the local andsystemic cellular responses with two-dimensional resolution. In addition,
we also analyzed the specificity of the transgenic responses to volatilecompounds that are emitted by damaged plants (Kinoshita and Betsuyaku,
2018; Kinoshita et al., 2019). Finally, we were to demonstrate that thetransgenic plants responded to nearby plants that were infested withinsects. We were able to detect early stages of the infestation (Kinoshita,2017; Kinoshita, 2018). The results indicate their potential to be employed
as monitor plants for early detection and preventative agriculture, for
Brassicaceae species and other economically important crops.

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References
Kinoshita, N., Arenas-Huertero, C., and Chua NH. "Visualizing nuclear-localized
RNA using transient expression system in plants” Ḡenes Cells 23, 105–111(2018)
Kinoshita N., and Betsuyaku, S. "The effects of Lepidopteran oral secretion onplant wounds: A case study on the interaction between Spodoptera litura andArabidopsis thaliana ” Plant Biotechnology 35, 237–242 (2018)
Kinoshita, N., Sugita, A., Lustig, B., Betsuyaku S.,Fujikawa T., Morishita T.
”Automating measurements of fluorescent signals in freely moving plant leaf
specimens” Plant Biotechnology 36, 7–11 (2019)
Kinoshita, Natsuko「画像処理装置、画像処理システム及び画像処理プログラム」特許出願 2017-205564 2017 年 10 月 国際特許出願 PCT/JP2018/180576 2018年 10 月Acknowledgement
This research was supported with generous funding by the Urakami Foundation
for Food and Food Culture Promotion.