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マイクロ流体デバイスによる連続的密度勾配遠心分離の研究

Author(s)浮田, 芳昭Citation

科学研究費助成事業研究成果報告書: 1‑5

Issue Date

2013‑05‑03

TypeResearch Paper

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URL

http://hdl.handle.net/10119/11391

RightsDescription

研究種目：若手研究（Ｂ）, 研究期間：2011〜2012,
課題番号：23760150, 研究者番号：40578100, 研究分
野：マイクロ流体工学, 科研費の分科・細目：機械工学、流体工学

Japan Advanced Institute of Science and Technology

様式Ｆ-１９	 	 	 科学研究費助成事業（学術研究助成基金助成金）研究成果報告書	 	 
平成２５年	  ５月	  ３日現在
機関番号：13302	 
研究種目：若手研究（Ｂ）	 
研究期間：2011～2012	 
課題番号：23760150	 
研究課題名（和文）	  マイクロ流体デバイスによる連続的密度勾配遠心分離の研究	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	 研 究 課 題 名 （ 英 文 ） 	  Study	  on	  continuous	  density-gradient	  centrifugation	  using	 microfluidics	 	 研究代表者	 浮田	  芳昭（UKITA	 YOSHIAKI）	 
北陸先端科学技術大学院大学・マテリアルサイエンス研究科・助教	 
研究者番号：40578100	 
研究成果の概要（和文）：本課題では、密度勾配遠心法を連続的かつ自動的に実行する流体デバ
イスを開発した。遠心ディスク上に流路を形成し、この中で多層の流れを形成することに成功した。これを用いて、密度勾配遠心法を実施した結果、血液と密度媒体の界面に蛍光ビーズを選択的に濃縮しつつ、血球をこれらから分離して回収するできることが判った。この実験に於ける蛍光ビーズ除去率は 100%であり、希少細胞抽出技術として有望な技術であると言える。
研究成果の概要（英文）：The	 new	 device	 for	 automated	 and	 continuous	 density	 gradient	 
centrifugation	 was	 developed.	 Stable	 multilaminar	 flow	 was	 successfully	 patterned	 on	 a	 microfluidics.	 The	 device	 was	 applied	 to	 continuous	 mode	 density-gradient	 centrifugation	 to	 demonstrate	 separation	 of	 micro	 resin	 particle	 and	 blood	 cells.	 As	 the	 result,	 the	 resin	 beads	 were	 removed	 from	 the	 mixture	 with	 performance	 of	 100	 %	 of	 removal.

交付決定額	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  （金額単位：円）	 
直接経費	 
間接経費	 
合	  計	 交付決定額	 3,600,000	 
1,080,000	 
4,680,000	 
研究分野：マイクロ流体工学
科研費の分科・細目：機械工学、流体工学
キーワード：細胞分離、マイクロフルイディクス

１．研究開始当初の背景	  今後実用化が期待される先進医療には、一細胞診断や再生医療等の細胞を活用するものが多く存在し、安価な装置で簡便に細胞の選別が出来る方法の開発が急務である。
２．研究の目的	 	  密度勾配遠心法は血液等からの細胞抽出に広く活用されている方法である。その方法
は、遠心チューブ内に Percoll 等の密度媒体とサンプルを積層し遠心する。遠心するとサンプルに懸濁した細胞が密度に応じて沈降、または上昇する。このとき、目的細胞の密度を挟み込む密度に媒体の密度を調整しておくと、目的細胞がこれらの界面に濃縮出来る。

一方、液体同士をチューブ内に積み重ねる作業や密度媒体界面に濃縮したサンプルを回収する工程が極めて煩雑である点が問題である。本稿では、これらの煩雑な工程を自動化する事を目的とした、遠心型のマイクロ流体デバイスの開発について報告する。
３．研究の方法(1)連続密度勾配遠心法の原理	 原理を示す。回転するディスク上に Fig.	 1に示すような流路を作製する。流路はディスクの円周に沿うような形をしており、入り口と出口を分岐させておく。ディスクを回転すると入り口からサンプルと密度媒体が流入し、これらが合流する事で階段状密度	 Center of rotation
Spinning direction
SampleFlow velocityDensity media

Centrifugal forceCentrifugal forceCentrifugal force

微粒子や細胞であるため、CCD に顕微鏡を取り付けて使用出来るようにもした。	 	 
４．研究成果	 (1)可視化装置の評価	 
0 m/s(0 rpm)

Suspended particlesHigher density
media

Lower densitymedia

勾配が連続的に形成される。遠心する事で細胞を分離するための重力を得る事が出来、密度勾配に応じて細胞が密度媒体界面に濃縮されると言うものである。	 
(2)可視化装置の開発	 
5Trigger signals
7Image transfer

CCD

StrobeComputerCompact disk device
4Periodic signals

Image grabber

Strobedriver

6Trigger signals

Control boxPICServo motor

Image grabberapplication
Spin controlprogram

3Control signals

Motor controller

Encoder
1Motor control signal

11.5 m/s(2000 rpm)

17.27 m/s
(3000 rpm)

Purified and enriched particlesFig. 1 Schematic illustration of continuous
density gradient centrifugation.

Microschope

5.8 m/s(1000 rpm)

DA converter

2Control signals

Fig. 2 Schematic illustration of micro strobe
scope.

本研究を実施する上で問題となるのが、回転するディスク上での現象を如何に観察するかということで有る。本研究の実施にあたり、まず観察装置を独自に開発した。Fig.	 2 はこの装置の概略図を示している。ディスク型デバイスを取り付ける軸の角度をエンコーダーにより読み取り、ディスクが特定の角度に成った時にトリガー信号を出力する。この信号を PIC マイコンにより 2 つのトリガー信号に分岐させ一方を数 10	 μs 程度遅延させる。
先に出力したトリガーは CCD カメラの撮影開始トリガーとなり、CCD の撮影を開始する。
このとき露光時間は 1/15000	 s であり、通常の室内では明瞭な像が得られない。後から、発信されたトリガーシグナルはストロボ発光シグナルとなり CCD 撮影開始後数 10	 μs後に発光する。今回使用したストロボの発光時間は 0.8	 μs 程度（半値幅）である。このため、ストロボの発光中にディスクの撮影対象部位が移動する距離は数 10	 μm 以下と成るため、撮影した瞬間の静止画像のようなスナップショットが撮影出来る。この撮影を一回転毎に行う事で、回転する CD 上の同一位置の変化を一回転毎に捉える事が出来、あたかも静止している対象を観察しているかのように観察することが可能と成る。本研究では、特に観察対象がマイクロ流路内を流れる

25 µm L&S
(x20)

50 µm L&S(x4)

Rotational direction

Fig. 3 Observed test patterns using
microstrobe scope.

顕微ストロボスコープの評価結果について述べる。Fig.	 3 は顕微ストロボスコープにより撮影したテストパターンの写真である。ディスクの中心軸から 55	 mm 離れた位置を顕微鏡を取り付けた CCD で撮影した。ディスクを静止した状態と回転させた状態を比較し、回転数は 1000	 ~	 3000	 rpm の間で変化させた。
3000	 rpm に於ける観察対象の線速度は 17.27	 m/s であり、このスピードに於いても 25	 μmのラインアンドスペースの像が捉えられており、細胞の挙動を観察するのにも十分な分解能を有していることが判った。さらに、ス
トロボの発光スペクトルが、蛍光色素の励起波長を多く含んでいる事に着目し、蛍光観察の検討を行った。	 
0.3 m/s(60 rpm)

5.8 m/s(1000 rpm)

11.5 m/s(2000 rpm)

17.27 m/s
(3000 rpm)

4.5 µm

10 µm

20 µm

Fig. 4 Observed fluorescence microparticle
using fluorescence micro strobescope.

Fig.	 4 はディスク上に固定した蛍光ビーズを観察したものである。使用したビーズのサイズは 4.5	 μm~20	 μm であり、回転数は 1000	 rpm~	 3000	 rpm である。ビーズのサイズが小さいと蛍光強度も弱まるが、2000	 rpm までは一つ一つのビーズの形状が確認出来、細胞程度のサイズの粒子の挙動を可視化できることが判った。本技術開発に関しては現在原著論文執筆中である。	 
(2)遠心フルイディクス上での多層流形成	 
①コリオリの力に由来する 2 次流れの発生と制御	 

調は中間色である紫色に成るはずであるが、本実験ではそうはなっていないことに興味を持ち更に詳細に調べた。	 

Center of rotation
Sample inlet

Inlet
1000 rpmFlow direction

1500 rpm

R1

Rotation direction

Resistivity control

2000 rpm

R = 55 mm

Centrifugal force

L1

2500 rpm

Samplecollection

3000 rpm

OutletPattern in the center cross section

Fig. 7 Simulated secondary flow behavior.
R2

L2Fig.	 7 は有限要素解析により本系を再現したものである。通常のナヴィエストークス式による解析に外力としてコリオリの力を適用して解析した。実験結果と同様に、入り口側と出口側とでは、色が反転する挙動が得られており、さらにこの挙動はコリオリの力に由来する 2 次流れが引き起こすものである事が判った。コリオリの力は回転ベクトルと物体の運動ベクトルとのベクトル積に比例する物理量であり、数値解析により回転数と 2 次流れパターンが相関する結果が得られていることは、これと整合する。流速条件を変更してもパターンの変化は得られなかったが、流速が速くなる事で、サンプルの滞在時間が短くなりその分 2 次流れがパターンを撹拌する影響が小さくなり、パターンの釣り合いが保たれるためと考えられる。一方、流速と回転数と色素の撹拌挙動との相関を実験的に確認した。	 

Confluent microchannel

Fig. 5 Schematic illustration of microfluidic
channels.

本検討では連続密度勾配遠心法の要と成る多層流の形成を検討した。検討には fig.	 5に示すような流路構造を使用した。入り口側に色の異なるインクを注入し、これを回転する事で、流路内に多層流が形成されるかをス
トロボスコープにより確認した。	 

1.00.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.10.0Victoria0blue0(Blue)
Safranine (Red)AbsorbanceAbsorbance1.00.90.80.70.60.50.40.30.20.10.0400500600

700800

Wave length [nm]Safranine (Red)0.1% Safranin
0.1% Victoria blue

500600700800

Wave length [nm]Victoria0blue0(Blue)

400500600

700800

Wave length [nm]Fig. 6 Observed multilaminar flow patterns.

観察結果を Fig.	 6 に示す。最上段の写真が回転中に於ける多層流パターンであり、中段は静止座標系において同じ流量のサンプルを流した結果を示している。回転数は 1500	 
rpm で流量は 14	 μL/s と見積もられた。回転
していない座標系では色素が全く混じらずに明瞭な多層パターンを形成して流れている。典型的なマイクロ流体の挙動と言える。
一方、最上段に示した写真では、入り口側では赤色の色素が内周を流れているが、流路を進むにつれてやがて界面は不明瞭になり、出口側では青色の色素が内周を流れている様子が明らかである。単なるミキシングにより色素が混じりあっている場合には色素の色

Flow rate [µl/s]

Safranine (Red)Absorbance



1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0

12.75
3.27
1.81
1.23
0.89

3000$rpm

9.43
2.35
1.30
0.86
0.63

2500$rpm

5.50
1.51
0.81
0.54
0.40

2000$rpm

Victoria0blue0(Blue)

400

3.56
0.87
0.47
0.32
0.22

1500$rpm

1.47
0.38
0.20
0.140.101000$rpm

0102030405060

708090100

Content of sample [%]Fig. 8 Effect of spinning speed and flow rateon the magnitude of mixing.

Fig.	 8 に結果を示す。回転数、及び流速共に撹拌に対して影響するファクターであることが判った。回転数の影響に関しては数値解
析の結果と整合するものであると言えるが、流速依存性が生じる原因に関しては現在のところ不明である。流速を 0.1	 μl 以下、回Fig. 9 Focused microparicles on theboundary of non-continuous density
gradient.

結果を Fig.	 9 に示す。流路の合流部ではポリスチレンラテックスビーズが溶媒中に分散している様子が確認出来るが、流路を進むにつれてビーズが界面に収束しており、密度勾配遠心法の原理が確認出来た。次に、ビーズ懸濁液と血球細胞を混合したサンプルを用いて実験を行った。血液サンプルにはニワトリ保存血を使用した。また、本実験で使用した流路では、上記実験で使用した流路の出口分岐部を３本に分岐する事で界面に収束した成分を選択して分離できる設計にしてある。	 
分離の様子を可視化したものを Fig.	 10 に示す。流路合流部（左上）に於いて、血球細胞は溶媒全体に分散している様子であるが、流路を流れて行くにつれて（左中）遠心力により沈降し、界面を通り抜けて Percoll に侵入して行く。	 	 	 Percoll



Fig. 10 Observed density gradientcentrifugation.

一方、本実験を蛍光視野により観察した場合には、蛍光ビーズが Percoll 内に侵入せずに密度勾配が障壁になり血球細胞のみがPercoll に侵入していることがわかる。出口20200087.5#

606402003.25

4.42

38.6

38.2

4200880

[106/ml]43.252.75
23.5
12.4

80

[106/ml]

406



6063.75
34.2

40200812.7

414.6520

 [106/ml]!

860 [106/ml]

!

77.3

80 [106/ml](3)連続的密度勾配遠心法の検討	 	  密度勾配遠心の基礎検討としてポリスチ
レンラテックスビーズの収束実験を実施した。事前の実験により、ポリスチレンラテッ
クスの密度はおよそ 1.065	 g/cc 程度である事がわかった。よって Percoll を 1.075	 g/ccに調製し、PBS(1.01	 g/cc)にポリスチレンラテックスビーズを懸濁して実験を行った。使用した流路は上記実験と同じ形状のものである。

側に回収されたサンプルをカウントして評価した結果を Fig.	 11 に示す。右と示すもの
は分岐部最下部の流路であり、この流路へのポリスチレンビーズの流入は無いことがわかる。即ち、完全にビーズを除去出来ている。
現在、以上の成果をもとに更に研究を進め、希少細胞抽出技術の開発に取り組んでいる。	 	 
3000#rpm
2000#rpm
1500#rpm
	 	 	 	 	    	 
F i g . 11 R e s u l t o f d e n s i t y - g r a d i e n t	 centrifugation.	 
５．主な発表論文等	 
（研究代表者、研究分担者及び連携研究者には下線）	 

[106/ml]

転数を 1000	 rpm 以下という条件では明瞭な界面が維持出来る条件である事が判った。以上 の 結 果 を ま と め た 原 著 論 文 はMicrofluidics	 and	 Nanofluidics に受理されている。	 

0〔雑誌論文〕（計 1 件）	 1. Yoshiaki	  Ukita,	  Yuzuru	  Takamura,	 Control	  of	  secondary	  flow	  in	 
concentrically	  traveling	  flow	  on	 
centrifugal	 
microfluidics,	 
Microfluidics	 and	 Nanofluidics,査読あり，	 
2013,	 DOI	 10.1007/s10404-013-1194-9	 	 
〔学会発表〕（計 7 件）	 1. Yoshiaki	  Ukita,	  Yuzuru	  Takamura,	 Formation	  of	  stable	  multilaminar	 flow	  on	  centrifugal	  microfluidic	 
device	  and	  application	  to	  density	 
gradient	  separation, International	 Joint	  Symposium	  on	  Single-Cell	 Analysis	  (The	  6th	  International	 
Workshop	 on	 Approaches	 to	 Single-Cell	 Analysis	  &	  The	  8th	  International	 
Forum	 on	 Post-Genome	 
Technologies), 2012.11.27-28,	 Kyoto	 Research	 Park	 	 2. Takayuki	  Oguro,	  Yoshiaki	  Ukita,	 Yuzuru	 Takamura, Continuous	 density	 
gradient	  centrifugation	  using	  a	 centrifugal	 
microfluidic	 
device, 25th	 
International	 
Microprocesses	  and	  Nanotechnology	 
Conference	 (MNC2012),	 
2012.10.30-11.02, Kobe	 Meriken	 Park	 
Oriental	 Hotel	 	 
3. Yoshiaki	  Ukita,	  Yuzuru	  Takamura,	 Switching	 of	 secondary	 flow	 behavior	 
on	 cetrifugal	 microfluidics,	 The	 16th	 
International	 Conference	 on	 

Miniaturized	  Systems	  for	  Chemistry	 and	  Life	  Sciences	  (MicroTAS	  2012),
2012.10.28-11.1	 ,OKINAWA,	 	 
4.	 
5.	 
6.	 
7.

Yoshiaki	  Ukita,	  Takayuki	  Oguro,	 Masaki	 Ishizawa,	 Hiroki	 Nose,	 Yuichi	 
Utsumi,	 Yuzuru	 Takamura, Visualization	 
of	 Biological	  Fluid	  Behaviour	  on	 Spinning	  Centrifugal	  Microfluidics	 
using	 Coaxial	 
Micro-Stroboscope, 38th	 International	 Conference	 on	 Micro	 and	 
Nano	 Engineering	 
(MNE2012), 	 
2012.9.16-20,	 Toulouse	 France	 
小黒	 崇之，浮田	 芳昭，高村	  禅、 遠心送液型マイクロ流体デバイスを用いた血球分離挙動の可視化、 2012 年秋季	 
第 73 回	 応用物理学会学術講演会、
2012.9.11-14、愛媛大学・松山大学	 
Yoshiaki	  Ukita,	  Takayuki	  Oguro,	 Yuzuru	 Takamura, Study	 on	 secondary	 flow	  behavior	  in	  centrifugal	 
microfluidics, JAIST	 ISEN(International	 Seminar	 on	 
Emerging	  Nanotechnology)	  2012,	 
2012.3.28,	 Ishikawa	 	 浮田	 芳昭，小黒	 崇之，高村	 禅、 遠心
送液型マイクロフルイディスク内の２次流れ挙動、 2012 年春季第 59 回応用物理学関係連合講演会、2012.03.15-18、早稲田大学	 	 〔図書〕（計 0 件）	 	 
〔産業財産権〕	 
○出願状況（計 1 件）	 名称：送液方法	 
発明者：浮田芳昭，小黒崇之，高村禅	 
権利者：国立大学法人北陸先端科学技術大学
院大学	 
種類：出願	 番号：特願	  2012-119476	 
出願年月日：2012 年 9 月 11 日	 
国内外の別：国内	 	 ○取得状況（計 0 件）	 	 
〔その他〕	 ホームページ等	 	 
６．研究組織	 (1)研究代表者	 	  浮田	  芳昭（UKITA	 YOSHIAKI）	 

北陸先端科学技術大学院大学・マテリアル
サイエンス研究科・助教	 
研究者番号：40578100