「様式３－A」

課題番号 20

LC-MS/MS によるプラズマローゲンの新規定量法の開発:
アルツハイマー病患者血液のプラズマローゲンの精密定量［１］組織
代表者：山下慎司(帯広畜産大学食品科学研究部門)
対応者：荒井啓行 (東北大学加齢医学研究所)
古川勝敏 (東北大学加齢医学研究所)
分担者：木下幹朗 (帯広畜産大学食品科学)
仲川清隆 (東北大学大学院農学研究科)
宮澤陽夫 (東北大学未来科学技術共同研究センター)
研究費：物件費 45 万円，旅費 0 万円

こういった背景から、
Pls を分子種レベルで精密分析することにより、詳細な AD 情報が得られることが期待される。しかしながら、生体内の Pls は分子種が多様かつ微量で分析が困難であるため、臨床へのバイオマーカーとしての応用はほとんどなされていない。我々はこれまで、Pls を分子種レベルで分析できる方法の開発に取り組み、高速液体クロマトグ
ラフィー-蒸発光散乱検出（HPLC-ELSD）や HPLCタンデム質量分析（LC-MS/MS）による方法を考案してきた。また、最近 MS/MS において PlsEtn と［２］研究経過
高齢化社会の現代、アルツハイマー病（AD）の急

PlsChoがアルカリ金属存在下で特異なプロダクトイ増に伴い、AD の早期発見が急務となっている。ADは本法を応用することで、生体サンプル中の PlsEtnの新規バイオマーカーの最も有力な候補としてプラと PlsCho を精密に定量する方法を確立できると考ズマローゲン（Pls）が注目されている。Pls とは神えた。本研究では、血漿中 Pls を分子種レベルで精経細胞膜を構成する主要なリン脂質であり、sn-1 位密定量する方法を確立し、Pls のバイオマーカーへのに特徴的なビニルエーテル結合を有する。Pls には、応用性を評価することを目指した。まず Pls の分析

極性基にエタノールアミンもしくはコリンを有する法および血漿からの抽出法の確立を行い、次に、臨エタノールアミン型 Pls（PlsEtn）とコリン型 Pls

床サンプルへと応用するために、加齢研の荒井教授、（PlsCho）がある。さらに sn-1 と sn-2 位にはそれぞ

古川准教授とメールおよび以下の日程で打ち合わせれ異なる脂肪酸を持つため、その分子種は極めて多を行い、分析対象とする AD 患者の年齢・性別・ス様である。これまで Pls には神経保護作用や抗酸化テージを決定した。

作用、細胞膜の流動性に重要であることが報告されオンを生じることを見いだした（図 2）。そこで、我々2015 年 11 月 28 日 荒井・宮澤・山下（出雲）ている。さらに AD を初めとする神経疾患患者の脳や血液においてこれらの低値が示唆されている（図1）。

図 1）AD 患者脳における Pls の減少

図 2）Pls の MS スペクトル（プロダクトイオンスキャン）

［３］成果（３－１）研究成果
本年度は、以下に示す研究成果を得た。第１に、PlsEtn（PE-18:0p/18:1、18:0p/20:4、18:0p/22:6）と PlsCho（PC-18:0p/18:1、18:0p/20:4、18:0p/22:6）を精密に定量する LC-MS/MS 分析法を確立した。LC-MS/MSの条件にはアルカリ金属としてナトリウムを用いることで、Pls を特異的かつ高精度に分析することができた。第 2 に、人の血漿からの Pls 抽出方法を確立した。本法は従来の方法と比較して非常に簡便かつ安定してPlsをほぼ100%抽出できる画期的な方法である。最後に、これらの方法を用いて今まで知り得なかった AD 患者の血漿中 Pls 分子種とその絶対量を明らかにすることに成功した。
（３－２）波及効果と発展性など
PlsEtn とPlsCho を分子種レベルで精密に定量できる方法は、世界の多くの研究者が取り組んでいるものの、達成されていなかった。今年度確立した PlsEtnと PlsCho の精密定量法は、Pls の生理学的な機能を明らかにする最も有力な方法であると申請者らは確信している。引続き加齢研の荒井教授、古川准教授にご協力いただき、対象とする AD ステージと血漿サンプル数の規模を拡大させ、Pls 定量値を明らかにすることで、バイオマーカーとしての応用性を精査する。本研究を遂行することで、AD 患者の血液中Pls 量の増減を明らかにすることができる。いずれかのPls 分子種がAD のバイオマーカーになり得れば、早期発見と予防法解明の進展につながる。
そのため、本研究の社会的意義は極めて大きいと言える。
また、現在 Pls は神経系疾患のみならず、様々な疾病への関与が示唆されている。その注目度は究めて高く、本年度開発した Pls 分子種分析法を基盤とした共同研究へと発展している。具体的には鬱病患者、動脈硬化症患者、急性膵炎患者、small vessel
disease 患者の血漿を分析することとなっている。これらの発展により、Pls の生理学的な機能を明らかにするだけでなく、そのバイオーカーとしての可能性が広がることとなる。
［４］成果資料〔原著論文〕
1. 山下慎司、木下幹朗、仲川清隆、アルツハイマ
ー型認知症におけるプラズマローゲンの意義.
プラズマローゲン分子種のバイオマーカーとしての可能性．化学と生物、in press (2016)
2. S. Yamashita, S. Kanno, A. Honjo, Y. Otoki, K.
Nakagawa, M. Kinoshita and T. Miyazawa,
Analysis of plasmalogen species in foodstuffs, Lipids,51, 199-210 (2016)
3. S. Yamashita, T. Kiko, H. Fujiwara, M. Hashimoto,

K. Nakagawa, M. Kinoshita, K. Furukawa, H.
Arai, and T. Miyazawa, Alterations in the levels ofamyloid-beta, phospholipid hydroperoxide, andplasmalogen in the blood of patients with
Alzheimer’s disease: possible interactions between
amyloid-beta and these lipids, J. Alzheimers Dis., 50,527-537 (2015)
4. Y. Otoki, K. Nakagawa, S. Kato, T. Miyazawa,
MS/MS and LC-MS/MS analysis ofcholine/ethanolamine plasmalogens via promotion ofalkali metal adduct formation, J. Chromatogr., B,
1004, 85-92 (2015)
5. S. Yamashita, S. Kanno, K. Nakagawa, M.
Kinoshita and T. Miyazawa, Extrinsic
plasmalogens suppress neuronal apoptosis in mouseneuroblastoma Neuro-2A cells: importance ofplasmalogen molecular species. RSC Adv., 5,61012-61020 (2015)〔学会発表〕
1. 乙木百合香、仲川清隆、加藤俊治、荒井敬行、古川勝敏、宮澤陽夫、LC-MS/MS によるコリン型及びエタノールアミン型プラズマローゲンの精密定量．日本農芸化学会東北支部第 150 回大会（2015 年 10 月、仙台）
2. 山下慎司、菅野範、本庄亜矢子、仲川清隆、木下幹朗、宮澤 陽夫、食品中に含まれるプラズマローゲン分子種の定量とその神経保護効果．日
本油化学会第 54 回年会（2015 年 9 月、名古屋）
3. 乙木百合香、仲川清隆、加藤俊治、木村ふみ子、宮澤陽夫、LC-MS/MS によるコリン型及びエタノールアミン型プラズマローゲンの精密定量．
日本油化学会第 54 回年会（2015 年 9 月、名古屋）
4. 山下慎司、喜古健敬、仲川清隆、古川勝敏、荒井敬行、宮澤陽夫、アルツハイマー型認知症患者の血液中でのリン脂質量の変化-アミロイドβとリン脂質の相互作用．日本過酸化脂質・抗酸化物質学会第 23 回年会（2015 年 8 月、仙台）
5. 山下慎司、山田有紗、乙木百合香、仲川清隆、木下幹朗、宮澤陽夫、畜産物由来プラズマロー
ゲンの詳細分析．平成 27 年度日本農芸化学会
北海道支部講演会（2015 年 8 月、帯広）
6. 乙木百合香、加藤俊治、仲川清隆、宮澤陽夫、LC-MS/MS によるエタノールアミン型、コリン型プラズマローゲンの精密定量法の確立．第 57回日本脂質生化学会（2015 年 5 月、東京）
7. Y. Otoki, S. Kato, K. Nakagawa, T. Miyazawa,
LC-MS/MS analysis of choline/ethanolamine
plasmalogens via promotion of alkali metals
adduct. 12th Asian Congress of Nutrition (May,2015, Yokohama)
8. Y. Otoki, S. Kato, K. Nakagawa, T. Miyazawa,
LC-MS/MS analysis of choline/ethanolamine
plasmalogens via promotion of alkali metal
adduct formation. 106th AOCS Annual
Meeting & Industry Showcases (May, 2015,Orlando, Florida, USA)