評価報告書

皮膚感作性試験代替法

ADRA:ア
アミノ酸誘導体結合性試験

皮膚感作性試験資料編纂委員会

令和 5 年（2023 年）12 月 12 日

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皮膚感作性試験資料編纂委員会
福 山 朋 季 （委員長：麻布大学）
安 達 玲 子 （国立医薬品食品衛生研究所）
大 竹 利 幸 （株式会社資生堂）
小 島 幸 一 （一般財団法人
小島

食品薬品安全センター）

肇 （国立医薬品食品衛生研究所）

瀬 崎 拓 人 （三井化学株式会社）
武 吉 正 博 （一般財団法人

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化学物質評価研究機構）

要旨
皮膚感作性初期段階の反応であるタンパク質と化学物質の結合反応を対象とした代替法であるペプチド結合性試験（Direct Peptide Reactivity Assay：DPRA）は、システインあるいはリジンを含むペプチドと化学物質の結合反応を機器分析によって評価する簡単な手法であり、2015 年に OECD 試験法ガイドライン（Test Guidelien：TG）に収載された。しかし、DPRA
は、反応液中での被験物質の析出や共溶出が起こりやすく、且つ混合物の感作性評価ができない等の課題があった。日本で開発されたアミノ酸誘導体結合性試験（Amino acid Derivative
Reactivity Assay：ADRA）は、DPRA と同じ原理であるが、求核試薬としてナフタレン環を導入したシステインあるいはリジンを用い、被験物質と混合・反応させた後、紫外線（Ultra
Violet：UV）検出器および蛍光（Fluorescence：FL）検出器を搭載した高速液体クロマトグラフ
ィー（High Performance Liquid Chromatography：HPLC）で分析することで、これらの課題を克服することができる。ADRA の使用方法は、被験物質の情報や状態によって異なる。分子量が既知の被験物質については、4 mM に調製した被験物質溶液を用いた ADRA（4 mM）、混合物のような分子量が未知の被験物質については、0.5 mg/mL に調製した被験物質溶液を用いた ADRA（0.5 mg/mL）を使用する。共溶出が認められる場合は、FL 検出器を用いた ADRAFL 法が使用できる。
ADRA は、最初、1 mM に調製した被験物質溶液を用いた ADRA（1 mM）が、2019 年にOECD の TG に収載された。その後、混合物の感作性評価を可能にするための ADRA（0.5mg/mL）、求核試薬を蛍光検出する ADRA-FL 法および偽陰性物質の数を減らすために開発された ADRA（4 mM）が盛り込まれた OECD TG 改定版が 2022 年に発出された。
ADRA（0.5 mg/mL）および ADRA（4 mM）のバリデーション研究は、5 施設において、10 化合物および 8 化合物の習熟度確認物質を対象に、施設内および施設間再現性試験が実施された。なお、HPLC による求核試薬の測定は、UV 検出器と FL 検出器の両方で実施し、ADRAUV 法と ADRA-FL 法の同一性についても検証が行われた。ADRA（0.5 mg/mL）および ADRA
（4 mM）の施設内再現性は、ADRA-UV 法あるいは ADRA-FL 法のどちらで測定しても 100％であり、施設間再現性も、ADRA-UV 法あるいは ADRA-FL 法のどちらで測定しても 100％であり、達成基準（85％）を満たした。また、接触皮膚炎のリスクを動物で予測する試験法として知られているマウスを用いる局所リンパ節試験（Local Lymph Node Assay: LLNA）の試験結果を参照し、ADRA（0.5 mg/mL）および ADRA（4 mM）における正確度（Accuracy）、感度（Sensitivity）および特異度（Specificity）はいずれも 100％と報告されている。
ADRA は感作性発現機序における初期の重要な事象であるタンパク質と化学物質の結合反応を検出しており、化学物質の感作性を判断する上で重要な情報を与えてくれる。また、
ADRA は、LLNA の 1/20 程度、DPRA の 1/2 の経費で実施可能であり、動物を用いない inchemico 試験法であることから、有用性は高い。しかしながら、本法は代謝系を欠く化学的試験法であり、活性化に代謝系や非生物的活性化を必要とする感作性物質、弱い感作性物質
や金属塩などは正しくその感作性が検出されない可能性がある。以上の事実を踏まえ、本資料編纂委員会は、他の Key Event（KE）を対象とした代替法やコンピューターを用いた定量的構造活性相関（Quantitative Structure-Activity Relationship: QSAR）等の in silico 手法と組み合わせた評価を推奨する。

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1. 緒言皮膚感作性を評価することは化学物質の安全性評価において重要である。化学物質の皮膚での接触皮膚炎のリスクを動物で予測する経済協力開発機構（Organisation for Economic
Co-operation and Development：OECD）TG としてモルモットを用いる皮膚感作性試験（OECDTG 406）やマウスを用いる局所リンパ節試験（Local Lymph Node Assay: LLNA）がある。LLNAには放射性化合物（Radioisotope：RI）の取込量を測定する LLNA-RI 法（OECD TG 4291)）のほか、RI を用いず Adenosine triphosphate（ATP）量を測定する LLNA: DA 法（OECD TG 442A2)）
や Bromodeoxyuridine（BrdU）量を測定する LLNA: BrdU-ELISA 法および LLNA: BrdU-FCM
法（OECD TG 442B3)）がある。
EU に お け る 欧 州 化 学 品 規 則 （ Registration, Evaluation, Authorization and Restriction ofChemicals：REACH）では、安全性評価はコンピューターを用いた QSAR モデルや in vitro 試
験等による代替法が推奨されており、動物実験により安全性が評価された成分を含んだ化
粧品の輸入および販売が禁止された（2013 年 3 月全面施行）。そのため、化学物質の皮膚感
作性を評価する代替法の開発が進み、動物を用いない多くの代替法が OECD TG として承認されてきている。
皮膚感作性に伴う化学的および生物学的機序に関する最新の知見は、有害性発現経路（Adverse Outcome Pathway：AOP）として提示されている。皮膚感作性は、その AOP に基づ
く 4 つの Key Event（KE）を経て成立し、下記のように、KE1～KE3 には動物を使わない代替法が開発され、OECD TG 化されている。
KE1: 化学物質とタンパク質の共有結合、DPRA、ADRA および kDPRA（OECD TG 442C）4)
KE2: 角化細胞活性化に関連する ARE Nrf2 依存性ルシフェラーゼの発現、KeratinoSensTM
および LuSens（OECD TG 442D）5)KE3: 特異的細胞表面マーカーの発現およびケモカインやサイトカインの産生、皮膚感作性関連遺伝子群の発現プロファイルを指標とした樹状細胞の活性化、h-CLAT、USENSTM、IL-8 Luc assay および GARDTM skin（OECD TG 442E）6)
KE4: リンパ節における T 細胞の増殖、LLNA（OECD TG 4291)、TG 442A2)および TG 442B3））DPRA は、求核試薬としてシステイン含有ペプチド（Ac-RFAACAA-COOH）とリジン含有ペプチド（Ac-RFAAKAA-COOH）を用い、それぞれを被験物質と混合・反応させ、24 時間後における未反応のペプチド量を基に被験物質の反応性を分類する手法であり、HPLC 分析が可能な施設であれば容易に実施することができる 4, 7, 8)。しかし、DPRA で用いる求核試薬のペプチドは、特異的な UV 吸収や FL がなく、ペプチドの検出波長として 220 nm を用いる
ため、DPRA の被験物質の調製濃度は、100 mM と高濃度となる。DPRA は反応液中での被験物質の析出 9)、HPLC の検出時における被験物質と求核試薬の共溶出 10)、システイン含有
ペプチド二量体の多発など試験精度に影響を及ぼす事例 11)や重量濃度で調製された被験物
質溶液や混合物の感作性評価ができないなどの限界があった。
そこで、求核試薬の測定における検出感度を上げるために、求核試薬として、システイン
およびリジンに検出部位として高い UV 吸収率を持ち、かつ特定波長の光照射によって強い FL を発するナフタレン環を導入した N-(2-(1-naphthyl)acetyl)-L-cysteine（NAC）および αN-(2-(1-naphthyl)acetyl)-L-lysine（NAL）を用いた ADRA が開発された（図 1）12, 13)。NAC（N-8Acetyl Cystein）および NAL の検出部位であるナフタレン環は 281 nm と比較的長波長側に極大吸収波長をもつため、220 nm で検出している DPRA と比較して検出特異性が高く、被験物質由来の夾雑ピーク（吸収）の影響を受けにくいだけでなく、FL 検出器による特異的な検出・定量が可能である 14, 15)。
ADRA は、最初、1 mM に調製した被験物質溶液を用いた ADRA（1 mM）のバリデーショ
ン研究が始まり、Japanese Center for the Validation of Alternative Methods（JaCVAM）による第三者評価（ピアレビュー）を経て 16-18）、OECD 専門家会議で議論された後、2019 年に OECDの TG に収載された。その後、混合物の感作性評価を可能にするために、0.5 mg/mL の被験物質溶液を用いた ADRA（0.5 mg/mL）19)、求核試薬を FL 検出する ADRA-FL 法 14, 15）、偽陰性物質の数を減らすために開発された ADRA（4 mM）20)が、2022 年に OECD TG に盛り込まれ、改定された（Annex 1 参照）。
JaCVAM 皮膚感作性試験資料編纂委員会（以下、委員会）が ADRA の皮膚感作性試験代替法としての科学的妥当性について、現在までに公開されている情報をもとに評価したので、その結果を報告する。
2．
．試験法の原理と方法
OECD TG 442C に収載されている ADRA と DPRA は、KE1 の『化学物質とタンパク質の共有結合』に対応した動物および細胞を用いない in chemico 試験である。
多くの感作性物質は、タンパク質のシステインまたはリジンに結合することから、ADRA
は、図 1 に示すように、システインおよびリジンの検出部位として高い UV 吸収や FL を持つナフタレン環を導入した NAC および NAL の 2 種類を使用する。被験物質とそれぞれの求核試薬を混合し、反応させ、24 時間後における未反応の求核試薬量を HPLC で分離定量する（詳細は Annex 2 参照）。ADRA では NAC 二量体を HPLC で定量することができるた
め、NAC のクオリティチェックに利用できるだけでなく、酸化促進作用のある被験物質による NAC 二量体の生成についても予測することができる。求核試薬を検出する HPLC シス
テムには、UV 検出器と FL 検出器を直列につなぐことにより、同時検出することができる。
これにより、もし UV 検出器で共溶出が認められた場合でも、FL 検出器で測定した値を採用することができる。ただし、NAC 二量体は、UV 吸収を持つが、FL は消失するため、原
則的に UV 検出器で得られた値を採用する。

図1

ADRA の概要

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3．
．精度
ADRA（1 mM）は、4 施設に技術移転を実施し、その後に施設内再現性（Phase Ⅰ）および施設間再現性（Phase Ⅱ）の試験が実施されている。詳細な結果は Annex 3（表 S3-1～S3-5）に示す。
3-1. ADRA（1 mM）の技術移転性
基本的な実験設備と HPLC 技術を持つ参加施設に、リード施設（富士フイルム）から 1 日のトレーニングで技術移転は可能であった。プレトレーニング試験として、代表的な感作性
物質 4 化合物および非感作性物質 1 化合物、計 5 化合物の評価が行われ（表 S3-1）、4 施設とも 5 化合物の評価はすべて、リード施設の結果と一致した（表 S3-2）。
プレトレーニング試験を終了した参加施設には、トレーニング試験が実施された。トレー
ニング試験の化合物は、NAC および NAL（以下、NAC/NAL）の減少率の平均値が、閾値に近い化合物を含む 6 化合物の感作性物質と 4 化合物の非感作性物質から成る 10 化合物のデータセットが選択され（表 S3-3）、4 施設の施設内再現性は、それぞれ 100％、90％、100％および 100％、施設間再現性は、80％となり、それぞれ達成基準（70％）を満たした（表 S3-4）。
なお、プレトレーニング試験およびトレーニング試験では、減少率の閾値は、5.05 が使われた。これらの試験の後、NAC の二量体の増加を防ぐため、反応液に EDTA を添加することが決まったため、この条件で 82 化合物の ADRA を再実施し、得られた減少値から閾値を計算したところ、閾値が 4.9 に変更になった。従って、バリデーション研究以降の減少率の閾
値は、4.9 が使用された。
3-2. ADRA（1 mM）の施設内再現性および施設間再現性試験 16-18)
ADRA（1 mM）のバリデーション研究は、4 施設において、10 化合物を対象に施設内再現性試験が実施され、これらの 10 化合物のデータを含む 40 化合物を対象に施設間再現性試
験が実施された。4 施設の施設間再現性の結果は、100％（10/10）、100％（10/10）、100％（7/7）、90％（9/10）であった。40 化合物の施設間再現性（3 施設換算）は 91.9％であり、達成基準（80％）
を満たした（表 1 および表 S3-5）。なお、ADRA の 4 施設におけるバリデーション研究で検証された 40 種類の化合物の LLNA の結果に対する本試験法の正確度は 86.9％（139/160）、
感度は 81.5％（88/108）、特異度は 98.1％（51/52）であった。
Dihydroeugenol は、参加施設間で結果がバラついたが、これは、Dihydroeugenol がプレハ
プテンであり、一部の施設で試験中に酸化して反応性が増加したためと考えられた。Citral
および Hydroxycitronellal も参加施設間で結果がバラついたが、これは NAC/NAL の減少率の平均値が閾値付近であったためと考えられた。Dextran も 1 施設のみが陽性の判定であったが、化学構造上は、NAC や NAL と反応する部位がなく、基本的に非反応性であると考えられる。しかしながら、グルコースなどの還元糖の 1 位のアルデヒド基は、それらの 5 位の水酸基と反応して環状構造を形成し、水溶液中では一部が開環し、部分的にアルデヒド基を生成することが知られており 21)、このアルデヒド基と求核試薬の NAC が反応し、Sciff-baseを形成する可能性がある。同様に、Dextran も水溶液中で末端に存在する環状構造の一部が開環して生じたアルデヒド基と NAC が結合し、減少率がわずかに上昇したことが一部の施設で偽陽性が生じた原因と推察される。しかし、改定された TG では、ポリマーは 0.5 mg/mL

10

に調製した被験物質溶液を用いることとなり、Dextran の場合、本実験条件の 1/8000 程度の濃度となるため、偽陽性になることはないと思われる。
なお、DPRA のバリデーション研究は、ADRA と試験デザインや化合物の種類が違うため
直接の比較はできないが、3 施設の施設内再現性試験の正確度は、66.7％、3 施設の施設間再現性の正確度は 82％と報告されている 22)。従って、ADRA の施設内および施設間再現性
はそれらを上回ることが示されている。
表 1 ADRA の施設内および施設間再現性値

3-3. ADRA（0.5 mg/mL）の施設内再現性および施設間再現性試験 23)
ADRA（0.5 mg/mL）のバリデーション研究は、ADRA（1 mM）のバリデーション研究に参加した 4 施設にリード施設を加えた 5 施設で実施された。また、通常の UV 検出器を用いた測定の他に、同じサンプルで FL 検出器を用いた測定も実施し、ADRA-UV 法と ADRA-FL
法の同一性についても相関解析による検証が行われた。ADRA（0.5 mg/mL）の技術移転試験
は、被験物質溶液の濃度を 1 mM から 0.5 mg/mL に変更しただけなので、実施されなかった。また、FL 検出器による検出法の技術移転は、UV 検出器の代わりに FL 検出器を使用しただけなので、各施設で NAC および NAL の検量線の測定が正常にできるかどうかの確認のみが実施された。5 施設のうち、1 施設は、2 種類の HPLC システムを用意できなかったために、この施設については、FL 検出器のみ使用された。0.5 mg/mL の被験物質溶液を用いた ADRA-FL 法は、5 施設により 10 種類の習熟度確認物質について施設内および施設間再現性試験が実施され、施設内再現性は 5 施設すべてで 100％ 、施設間再現性もすべてで100％であった（表 S3-6-1、S3-6-2 および S3-6-3）。また、0.5 mg/mL の被験物質溶液を用いた ADRA-UV 法は、4 施設により 10 種類の習熟度確認物質について施設内および施設間再現性試験が実施され、施設内再現性は 4 施設すべてで 100％ 、施設間再現性もすべてで100％であった。0.5 mg/mL 溶液を用いた ADRA-UV 法と ADRA-FL 法における NAC/NALの減少率の平均値の相関係数は r = 0.99（p < 0.001）であり極めて強い相関が確認されたことから、両試験法の結果が同等であることが示された。
3-4. ADRA（4 mM）の施設内再現性および施設間再現性試験 24)
ADRA（4 mM）のバリデーション研究も、ADRA（0.5 mg/mL）のバリデーション研究と同様に ADRA（1 mM）に参加した 4 施設にリード施設を加えた 5 施設で実施された。試験デザイ

11ン等は、ADRA（0.5 mg/mL）のバリデーション研究と同じであるが、このバリデーション研
究との違いは、FL 検出器と UV 検出器を HPLC システムに直列につないで同時検出している点であった。4 mM の被験物質溶液を用いた ADRA-FL 法および ADRA-UV 法は、5 施設
により 8 種類の習熟度確認物質について施設内および施設間再現性試験が実施され、施設内再現性試験は両測定法とも 5 施設すべてで 100％、5 施設による施設間再現性もすべてで100％であった（表 S3-7-1 および S3-7-2）。図 2 は、Farnesal を除く 8 種類の習熟度確認物質と、ADRA（4 mM）および ADRA（1 mM）で結果の違う 4 種類の化合物と 2 種類の陽性対照に対して、ADRA（4 mM）を実施したときの ADRA-UV 法と ADRA-FL 法の相関図である。
NAC/NAL の減少率の相関係数は、いずれも r = 1.00（p < 0.001）であり極めて強い相関が確認されたことから、両試験法の結果が同等であることが示された。

NAC depletion

図2

NAL depletion

ADRA（4 mM）バリデーション研究における FL 検出と UV 検出の NAC/NAL 減少率の同等性の検証 24)

4．
．正確度、感度および特異度
ADRA（1 mM）、ADRA（0.5 mg/mL）および ADRA（4 mM）のバリデーション研究の結果は、
表 2 に示した。
ADRA（1 mM）の 4 施設におけるバリデーション研究で検証されたコード化された 40 種類の化合物の LLNA の結果に対する本試験法の正確度は 86.9％（139/160）、感度は 81.5％（88/108）、特異度は 98.1％（51/52）であった 18)。なお、DPRA のバリデーション研究は ADRAと試験デザインや化合物の種類が異なるので直接の比較はできないが、3 施設の LLNA の結果に対する本試験法の正確度は 77.8％、感度は 70.8％、特異度は 91.7％であったことから 22)、ADRA の正確度、感度および特異度は、感作性を予測する上で十分であることが示された。
ADRA（0.5 mg/mL）の 5 施設における 10 種類の習熟度確認物質のバリデーション研究では、UV 検出の正確度は 100％（40/40）、感度は 100％（24/24）、特異度は 100％（16/16）、また、
FL 検出の正確度は 100％（50/50）、感度は 100％（30/30）、特異度は 100％（20/20）であった 23)。
なお、この試験の化合物のコード化は実施されていなかった。

12

ADRA（4 mM）の 5 施設におけるコード化された 8 種類の習熟度確認物質のバリデーショ
ン研究では、正確度、感度、特異度はいずれも 100％（40/40）であった 24)。
なお、ADRA（4 mM）は、被験物質を従来の 1 mM から 4 mM に濃度を高くすることで、ADRA（1 mM）で偽陰性と判定される化合物の数を減らす効果があることが報告されている 20)。
リード施設だけでなく、他施設でもこの効果が再現するかを確認するために、ADRA（1 mM）
において偽陰性化合物と判定される 4 化合物について、ADRA（4 mM）のバリデーション研
究の中で検証された 24)。ADRA（1 mM）で偽陰性、ADRA（4 mM）で LLNA の結果と一致して
陽 性 と 判 定 さ れ る 4 化 合 物 （ m-Aminophenol 、 3-Propylidenephthalide 、 Ethyleneglycol
dimethacrylate および n-Butyl glycidyl ether）について、5 施設において、3 回の試験が実施され、1 施設において、m-Aminophenol が 1 回の試験だけ陰性判定になった。そのため、正確
度は、98.3％（59/60）であったが、その効果が複数の施設でも確認された（表 S3-8-1 および
表 S3-8-2）。
これらのバリデーション以外にも、リード施設で 136 化合物のデータセット（バリデーシ
ョン化合物を含む）についても、ADRA（1 mM）、ADRA（0.5 mg/mL）および ADRA（4 mM）が実施され、それぞれの予測結果についてまとめられた（Annex 5、表 S5-1 および S5-2）。
表 2 ADRA（1 mM）、ADRA（0.5 mg/mL）および ADRA（4 mM）のバリデーション研究のまとめ

5．
．ADRA を用いた皮膚感作性評価手順
ADRA を用いた感作性評価フローを、図 3 に示した。被験物質が、分子量既知の単一化
学物質の場合は、4 mM 被験物質溶液を調製し、ADRA（4 mM）を実施する。また、組成が既知の混合物および多成分構成物質は、それぞれの構成成分の分子量および濃度から見かけの分子量を算出し、その分子量を用いて 4 mM の被験物質溶液を調製し、ADRA（4 mM）を実施する。見かけの分子量の算出方法の例は Annex 4 に示した。分子量不明の単一化合物、組成が不明の混合物および多成分構成物質、ポリマーは、0.5 mg/mL の被験物質溶液を調製し、ADRA（0.5 mg/mL）を実施する。固体の混合物の場合は、適切な溶媒を選択し、0.5 mg/mL
被験物質溶液を調製する。液体の混合物の場合は、溶媒に溶解している混合物の重量濃度を基にして、TG に規定されている溶媒で 0.5 mg/mL に調製する。なお、液体混合物において、混合物の成分が溶解している溶媒が ADRA の TG に記載されていない場合は、その溶媒が、ADRA 試験系に影響がないことを示す必要がある。被験物質溶液と求核試薬を反応させ、反応停止液を添加したサンプルは、UV 検出器を用いた ADRA-UV 法で測定し、その値をADRA の測定値とする。もし、ADRA-UV 法で共溶出が生じた場合は、ADRA-FL 法で測定13

した値を採用してもよい。また、あらかじめ UV および FL 検出器を装備した HPLC システ
ムで UV 値と FL 値を同時測定することも可能である。ただし、その場合には、上記のような理由がない限り、ADRA-UV 法で測定した値を採用する。混合物の感作性評価について、OECD は、KE1 の代替法については、なるべくモル濃度で被験物質を調製することを推奨している 4)。分子量が分からない混合物についても、大部分を占める成分の分子量が分かれば、その分子量を使用して被験物質溶液の調製が可能であることが記載されている（OECDTG442C

図3

Appendix Ⅱ、ADRA、段落 16）。

ADRA を用いた皮膚感作性評価フロー

6．
．評価可能な物質の範囲
136 物質を対象に ADRA を実施した評価では、Annex 5、表 S5-1 および S5-2 に示す通り、様々な化学物質の皮膚感作性の予測が可能であることが示されている 20)。
LLNA で陽性と判定される 98 物質は、4 mM に調製した被験物質溶液を用いた ADRA
（4 mM）では 23 物質、ADRA（1 mM）では 34 物質、および ADRA（0.5 mg/mL）では 24 物質が偽陰性と判定された。偽陰性と判定された物質のうち、Strong sensitizer に分類されるのはHexyl salicylate のみであり、多くは LLNA で moderate あるいは weak に分類される化合物であることから、DPRA と同様に感作性ポテンシャルの弱い物質の一部に偽陰性判定が生じる可能性があることに留意する必要がある。
一部のプレハプテンは正しく判定されるが、プロハプテンおよびプレハプテンは、DPRAと同様に原理的に適用範囲外と考えられる。また、本法は主にシステイン基やリジン基と反14

応する化学物質を対象としており、非共有結合により複合体を形成する Nickel（II）sulfate な
どの化合物は、DPRA と同様に評価可能な物質の範囲から外れる。
7．
．有用性と限界
本法は汎用 HPLC およびその技術を保有する施設で容易に実施可能である。また、本法は動物を用いない in chemico の手法であり、「動物の愛護および管理に関する法律」および
3Rs の精神と合致している。さらに 1 化合物あたりの試験消耗品費用を試算したところ、
DPRA では約 1 万円であるのに対し、 ADRA では約 5 千円と半分の経費であった。一方、
LLNA は 1 化合物当たりの消耗品費は約 10 万円である。被験物質の必要量が DPRA に比して少量（1/25）で済み、その秤量から反応開始までの時間（DPRA の約半分）や、用いる反応容器が DPRA ではガラス製オートサンプラー用バイアルであるのに対して ADRA では 96 穴
マイクロタイタープレートであることなど、操作性にも勝り簡便である。また、TG 442D お
よび 442E に収載されている in vitro の試験法は、細胞の前培養なども含めると複数週の時間が必要である。これに対して、ADRA の試験期間は 2 日から 3 日で実施可能であり、試験法として簡便性、経済性や迅速性などの面から有用と考えられる。
本法は水系での反応を必要とするため、被験物質は少なくとも適切な溶媒（Water、
Acetonitrile、Acetone および 5％ DMSO 含有 Acetonitrile）に 4 mM あるいは 0.5 mg/mL の濃度で溶解する必要がある。また、本法の正確度は、約 75％であり、1/4 の化合物の判定が誤って評価される可能性があるため、この試験法単独で皮膚感作性の代替法として考えるのは難しい。特に下記の化合物の類似化合物が陰性判定となった場合、偽陰性の可能性がある
ため、試験結果の解釈には注意が必要と考えられる。
1）LLNA で moderate または weak にあたる弱い感作性物質 19)
LLNA で weak sensitizer に分類される 12 物質（α-Hexylcinnamaldehyde、α-Amylcinnamaldehyde、Oxalic acid、Benzyl benzoate、Benzyl cinnamate、N,N-Dibutylaniline、Phenyl benzoate、Cinnamyl
alcohol、Benzocaine、Linalool、d,l-Citronellol および Aniline）と Moderate sensitizer に分類される 10 物質（Ethylenediamine、Methyl pyruvate、Benzyl salicylate、Diethyl sulfate、Tropolone、
4-Chloroaniline、10-Undecenal、12-Bromo-1-dodecanol、dl-α-Tocopherol および 5-Methyl-2phenyl-4H-pyrazol-3-one）は、ADRA では陰性となるため、これらの化合物の類似物が陰性判定の場合、注意が必要である。
2）プロハプテン、プレハプテン
本試験系は代謝系を有さない化学反応を検出する試験系であることから、感作性の獲得に代謝的あるいは非代謝的活性化を必要とするプロハプテンあるいはプレハプテン（例：Ethylenediamine、Cinnamyl alcohol、Benzocaine など）は偽陰性と評価される可能性がある。
3）金属塩
本試験系は、KE1 すなわちタンパク質と共有結合する可能性のある化合物を検出する試
験系であり、金属塩は、共有結合以外の機序によりタンパク質と反応することが知られているため、本試験法は適用外となる。ただし、一部の金属塩（塩化コバルトなど）は本試験系において陽性になることが確認されている。
4）疎水性の高い物質等

15水系での反応を必要とする本法では、被験物質が反応液中で析出した場合、陽性の結果であれば、その判定を受け入れることは可能であるが、陰性の結果の場合、被験物質が十分に反応していない可能性があるので、陰性結果をそのまま受け入れることはできず、十分な考察が必要である。ADRA は、反応に必要な被験物質溶液の濃度が 4 mM（または 0.5 mg/mL）
であり、DPRA の 100 mM と比較すると 1/10 以下と低い濃度のため、反応液中で被験物質が析出することは稀である。白濁した場合も析出した場合と同様に、陽性結果であれば、その判定を受け入れることは可能であるが、陰性結果はそのまま受け入れることはできず、十分な考察が必要である 9)。
以上のことから、DPRA を含む他の代替法と同様に、ADRA により感作性陰性と判断された場合は、その物性等により偽陰性となる可能性を考慮し、必要に応じて補完し得る他の KEを対象にした代替法等により確認する必要がある。ADRA により陽性と判断された場合は、感作性陽性と判断することは可能と考えるが、希に偽陽性の結果が生じる可能性があることにも留意する必要がある。ADRA は感作性発現機序における初期の重要な事象であるタンパ
ク質と化学物質の結合反応を検出しており、化学物質の感作性を判断する上で重要な情報を与えることから、証拠の重み付けや他の代替法と組み合わせでの評価を推奨する 25-27)。
8．
．結論
ADRA は、簡便性・経済性の面から有用な動物実験代替法である。ADRA は、当初、1 mMに調製した被験物質を用いた試験法のバリデーション研究が、40 化合物を対象にして実施された。DPRA のバリデーション研究と ADRA のバリデーション研究は、施設数、化合物の種類および化合物数が異なるため、直接比較することはできないが、ADRA の施設内および施設間再現性は、90～100％および 91.9％であり、DPRA（施設内：87～100％、施設間：75％）よりも高い。実際に、本試験に使用する濃度である 4 mM あるいは 0.5 mg/mL に調製した被験物質溶液を用いた ADRA のバリデーション研究は、1 mM の ADRA で施設内および施設間の再現性が十分に検証された後に、10 化合物あるいは 8 化合物の習熟度確認物質
を対象に実施されており、両濃度とも施設内および施設間再現性は 100％であった。
本試験法（被験物質溶液濃度：4 mM および 0.5 mg/mL）のバリデーション研究における感度、特異度および正確度はすべて 100％であるが、化合物数が少ないので、リード施設が実施した 136 化合物の試験データに注目すると、LLNA の結果に対する ADRA（4 mM）の感度、特異度および正確度は、76％、79％および 76％であり、ADRA（0.5 mg/mL）の感度、特異度
および正確度は、74％、79％および 76％であった。また、ヒトの結果に対する ADRA（4 mM）の感度、特異度および正確度は、83％、86％および 84％であり、ADRA（0.5 mg/mL）の感度、特異度および正確度は、81％、86％および 83％であった（Annex 5、表 S5-1）。このように、
LLNA の結果に対する ADRA（4 mM）および ADRA（0.5 mg/mL）の正確度、感度および特異度は約 75％、ヒトの結果に対する ADRA（4 mM）および ADRA（0.5 mg/mL）の正確度、感度および特異度は、約 85％である。
ADRA は感作性発現機序における初期の重要な KE であるタンパク質と化学物質の結合反応を検出しており、化学物質の感作性を判断する上で重要な情報を与えてくれる。ADRAの 1 化合物あたりの消耗品の費用は、LLNA の 1/20 程度、DPRA の 1/2 の経費で、短期間で16実施可能であり、動物を用いない in chemico 試験法であることから、有用性は高い。しかしながら、本法は代謝系を欠く化学的試験法であり、活性化に代謝系や非生物的活性化を必要とする感作性物質、弱い感作性物質や金属塩、疎水性の高い物質などは正しくその感作性が検出されない可能性がある。以上の事実を踏まえ、委員会は、必要に応じて、細胞を用いる
他の KE を対象にした代替法や QSAR 等の in silico 手法と組み合わせでの評価を推奨する。
謝辞
JaCVAM 皮膚感作性試験資料編纂委員会において、この ADRA の皮膚感作性試験評価報
告書を作成するにあたって、ADRA の開発、評価等を主導した富士フイルム株式会社の笠原利彦氏には、具体的かつ詳細な情報の提供に多大なるご協力をいただいた。ここに深く感謝申し上げます。
9.

参考文献

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Assay (LLNA), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. Available at:https://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-429-skin-sensitisation_9789264071100-en
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17) OECD (2019), Amino acid Derivative Reactivity Assay (ADRA) – Report of the Peer Review
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20) Imamura M et al. (2021) Improving predictive capacity of the Amino acid Derivative Reactivity
Assay test method for skin sensitization potential with an optimal molar concentration of test
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21) Satyanarayana U and Chakrapani U (2014) Biochemistry 4th edition, Elsevier Health Sciences.
22) OECD (2012) Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) ECVAM Validation Study Report18

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Results of the study for reproducibility confirmation implemented in five participating laboratories.
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24) Fujita M et al. (2022) The within- and between-laboratories reproducibility and predictive capacityof Amino acid Derivative Reactivity Assay using 4 mM test chemical solution: Results of ring
study implemented at five participating laboratories. Journal of Applied Toxicology, 42: 318-333.
25) Yamamoto Y et al. (2019) Applicability of amino acid derivative reactivity assay for predictionof skin sensitization by combining multiple alternative methods to evaluate key events. Journal ofApplied Toxicology, 44: 585-600.
26) Imamura M et al. (2022) Applicability of ADRA (4 mM) for the prediction of skin sensitizationby combining multiple alternative methods to evaluate key events Journal of Applied Toxicology,
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27) OECD (2021) OECD Guideline No. 497. Defined Approaches on Skin Sensitisation.
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879a4-en28) ADRA protocol: JaCVAM Statements. Available at: http://www.jacvam.jp/en_effort/effort02.
html
29) Akimoto M et al. (2020) Oxidation of a cysteine-derived nucleophilic reagent by dimethyl
sulfoxide in the amino acid derivative reactivity assay. Journal of Applied Toxicology, 40: 843854.

19

Annex 1.

ADRA を用いた皮膚感作性評価における試験法の変遷

ADRA では、さまざまな濃度の被験物質溶液を使用して、その感作性について評価されてきた。ADRA は、DPRA と同じ原理に基づく試験方法として開発されたため、当初、感作性評価は、DPRA と同じ 100 mM の被験物質溶液を使って評価された 12)。しかしながら、求核試薬の検出感度が高いため、100 mM の被験物質溶液を用いる ADRA では、反応後のサンプルを希釈してから HPLC にかける必要があった。100 mM の被験物質溶液の濃度では、難溶解性被験物質を評価する際に、反応液中で被験物質析出が危惧されるだけでなく、HPLC 測定毎に希釈作業を要する。そのため、適切な被験物質の濃度を決めるために、DPRA法を確立するために使用された 82 化合物のデータセット 7)を用いて検討したところ、1 mMの被験物質溶液を用いる ADRA（1 mM）法が DPRA と同等の予測精度を示したため、ADRA（1 mM）を標準法とした 13)。これにより、被験物質溶液および求核試薬の濃度は、当初の 1/100に減少し、反応溶液中の被験物質の析出頻度 9)や HPLC 分析における共溶出 10)の頻度を著しく低減することができた。2016 年に、この ADRA（1 mM）を OECD TG に収載するためのバリデーション研究を始めるために、バリデーション参加施設に技術移転試験を実施した
ところ、ほとんどの参加施設で求核試薬 NAC の二量体の増加が認められた。その原因を探索したところ、洗浄したガラス器具に残留した成分が NAC の二量体化を促進したことが疑われたため、実験に使用するすべての器具をディスポーザブルの製品（ポリプロピレン製）に変えた。その後も、一部の施設で NAC の二量体の増加が発生し、検討の結果、精製水中の銅イオンの増加が関わっていることが明らかになった。それゆえ、金属キレートであるエ
チレンジアミン四酢酸（EthyleneDiamineteTraacetic Acid：EDTA）が 0.25 μM 含まれる条件は、
0.01 ppm 銅イオンによる NAC の二量体化を抑制し、EDTA 自体が ADRA の反応に影響を与えないことが確認された 11)。この条件（被験物質濃度；1 mM、0.25 μM EDTA）がバリデーシ
ョン研究に採用され、2019 年に OECD TG に収載された。
2019 年に発行された TG 442C（段落 3、Appendix 1（DPRA））には、DPRA で混合物の感作性評価を可能にするためには、重量濃度で調製した被験物質溶液による試験法の開発が必要であると記載されていた。そのため、ADRA において、重量濃度で調製した被験物質溶液
を用いた重量濃度法を確立するために、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/mL の濃度で被験物質溶液を調製し、上記 82 化合物を用いて ADRA を実施し、DPRA と ADRA（1 mM）の結果を比較した 19)、被験物質の濃度を 0.05 mg/mL から 0.5 mg/mL に上げるにしたがって、偽陰性の頻度が減少し（偽陽性の頻度は若干増加）、感作性予測精度は、被験物質溶液の濃度が 0.5 mg/mLの時に ADRA（1 mM）よりも数％高く、DPRA と同程度であった 19)。これにより、ADRA を
重量濃度で実施する場合の被験物質溶液の最適濃度は、0.5 mg/mL であることが示された。
しかし、この検討結果は、すでに TG 化された ADRA（1 mM）の被験物質濃度が最適ではないという疑念を生じさせた。その後実施した、プレ/プロハプテンを含む 136 種類の化学物
質を含むデータセットでは、ADRA（1 mM）の予測精度は DPRA よりも低く 19)、その原因を解析したところ、NAC/NAL の減少率が、閾値よりわずかに低く、偽陰性と判定される化学物質が多いことが、原因であることが判明した。ADRA（0.5 mg/mL）の結果からも分かるよ
うに、ADRA を実施する被験物質溶液の濃度は、1 mM より高い方が、偽陰性化合物の数が減少し、予測精度も高くなると予想された。したがって、ADRA の被験物質溶液の最適モル20

濃度を決定するために、ADRA（1 mM）で偽陰性と誤って判定された 8 化合物について、2、3、4 および 5 mM の被験物質溶液を用いて、ADRA を実施したところ、4 mM 以上ですべての化合物が正しく陽性と判定された。そこで、4 mM に調製した被験物質溶液を用いて、136
化合物について感作性評価を実施したところ、予測精度が向上することが確認された 20)。
また、ADRA は従来の UV 検出の他に FL 検出が可能であり、NAC/NAL を特異的に検出することができることから、被験物質由来の成分と共溶出することがほとんどない 14,15)。これ
らの結果から、分子量既知の単一化合物については 4 mM の被験物質溶液を用い、分子量不明の単一物質および混合物については、0.5 mg/mL に調製した被験物質溶液および ADRAFL 法を用いることが提案され、2019 年から 10 種類の習熟度確認物質について、リード施設を含む 5 施設で、施設内・施設間の再現性を評価するバリデーション研究が実施された。
このバリデーション結果については、OECD の感作性専門家会議で審査され、コメンティン
グラウンドを経て、2022 年 4 月に、2 つの濃度の被験物質溶液（4 mM および 0.5 mg/mL）および FL 検出器を用いた ADRA-FL 法を含む改定案が、OECD 会議において議論され、6 月に承認・公表された。

21

Annex 2.

試験手順／判定 28)

2-1. 使用する求核試薬および陽性対照の調製・NAC 含有リン酸緩衝溶液（pH 8.0）
NAC（純度：98％以上）は、リン酸緩衝液（pH 8.0）に 6.667 µM の濃度になるように溶解させる。
・NAL 含有リン酸緩衝溶液（pH 10.2）
NAL（純度：98％以上）は、リン酸緩衝液（pH 10.2）に 6.667 µM の濃度になるように溶解させる。
・陽性対照：
Phenylacetaldehyde（PADH、CAS No:122-78-1、純度≧ 90％）
PADH を、アセトニトリルに 4 mM の濃度で溶解させる。
Scuaric acid diethyl ester（SADE、CAS No:5231-87-8、純度≧95％）
SADE を、アセトニトリルに 4 mM の濃度で溶解させる。
※陽性対照物質は、PADH と SADE のどちらかを実施すればよい。ただし、PADH はア
ルデヒドのため化合物の安定性が良くない。そのため、NAC/NAL の減少率の値が管理幅に入らなくなることがあるので、注意が必要である。被験物質を重量濃度で調製する
場合も、陽性対照物質は 4 mM に調製して使用する。
2-2. 各反応液の調製および反応手順
各被験物質、陽性対照物質、および各種クオリティチェック用コントロールは、下記のように調製する。
NAC：被験物質 or 陽性対照物質=1:200

NAL：被験物質 or 陽性対照物質=1:200

5 μM NAC，4 mM 被験物質（or 0.5 mg/mL）

5 μM NAL，4 mM 被験物質（or 0.5 mg/mL）

or 4 mM 陽性対照物質

or 4 mM 陽性対照物質※※■150 μL NAC 溶液■150 μL NAL 溶液■50 μL 被験物質溶液 or 陽性対照物質溶液■50 μL 被験物質溶液 or 陽性対照物質溶液

反応液中の被験物質の濃度； ADRA （4 mM）：1 mM、ADRA （0.5 mg/mL）：0.125 mg/mL※

クオリティチェック用コントロール【共溶出コントロール】
NAC 用

NAL 用

■150 μL リン酸緩衝液（pH 8.0）■150 μL リン酸緩衝液（pH 10.2）■50 μL 被験物質溶液■50 μL 被験物質溶液【参照コントロール A および B】
NAC 用

22

NAL 用

■150 μL NAC 溶液■150 μL NAL 溶液■50 μL アセトニトリル■50 μL アセトニトリル

【参照コントロール C】
NAC 用

*

NAL 用

■150 μL NAC 溶液■150 μL NAL 溶液■50 μL アセトニトリルおよび被験物質■50 μL アセトニトリルおよび被験物質のの溶解に用いた溶媒*溶解に用いた溶媒*：被験物質の溶解に用いた溶媒がアセトニトリルの場合は、アセトニトリルのみで良い。
以下のフローチャートに従い、実施する。

*分析条件（推奨）推奨カラム：コアシェルタイプシリカゲル（2.5 - 2.7 µm、3.0 mm×150 mm）等例）Wakopak Core C18 ADRA（φ3.0 × 150 mm、富士フイルム和光純薬）
カラム温度：40℃
サンプル温度：25℃（冷却機能がある場合、4℃にすることを推奨）
検出波長： 吸光度：281 nm、 蛍光（Excitation / Emission）：284/333 nm
流速：0.3 mL/min
注入量：10～20 μL（装置によって変更可能、ピーク形に応じて変更可能）
移動相： A 液：0.1％ （v/v） TFA（トリフルオロ酢酸）水溶液
B 液：0.1％ （v/v） TFA 含有アセトニトリル溶液

23

HPLC 条件
時間

NAC 溶出条件

NAL 溶出条件（分）

A 液（％）

B 液（％）

A 液（％）

B 液（％）

0

70

30

80

20

9.5

45

55

55

45

10

0

100

0

100

13

0

100

0

100

13.5

70

30

80

20

20

終了

終了

2-3. 試験成立の条件 4)
試験成立には、以下の条件を満たさなければならない。
1) NAC/NAL のそれぞれを用いて、0.156 ~ 5.0 μM の範囲の 6 濃度にて標準曲線の作成を行い、その寄与率が 0.990 より大きい。
2) 被験物質の NAC/NAL（n=3）の減少率の標準偏差が、10％未満である。
3) 陽性対照である PADH または SADE の NAC/NAL の n=3 の減少率の平均値および標準偏差は下記の条件を満たす必要がある。
・NAC 減少率（n=3 の平均値）
PADH : 30 - 80％、SADE: 30 - 80％
・NAL 減少率（n=3 の平均値）
PADH : 70 - 100％、SADE: 70 - 100％・減少率の標準偏差（SD）
PADH の NAC/NAL ともに、10％未満
SADE の NAC/NAL ともに、10％未満
4) NAC/NAL のそれぞれに 3 種類の参照コントロール（A、B、C）を設け、以下を確認する。
参照コントロール A（n=3）：分析前の HPLC システム適合性参照コントロール B（n=6）：分析時間中の参照コントロールの安定性
参照コントロール C（n=3）：使用された溶媒が NAC/NAL の減少に影響しないこと
・参照コントロール A および C の NAC/NAL の平均濃度が、3.2～4.4 μM※の範囲に入っていること。
溶媒に 5％ DMSO/アセトニトリルを使用した場合は、DMSO による NAC の※SH 基の酸化により、NAC 二量体が産生され、NAC 濃度が減少することが知られているので、参照コントロール C の NAC の濃度の平均値は、2.8 ～ 4.0
μM であること 29)。
・参照コントロール B（n=6）とアセトニトリルで調製した参照コントロール C（n=3）を合わせた 9 回について、NAC/NAL の平均ピーク面積、SD および CV（変動係数）を計算し、CV は、10％未満であること。
24

・各溶媒における参照コントロール C（n=3）の NAC/NAL ピーク面積の CV は、
10％未満であること。
2-4.

評価

被験物質の反応性は、測定ごとの NAC/NAL の減少率を算出し、NAC/NAL の減少率の平均値が、閾値である 4.9％を基準に感作性および非感作性を判定する（表 S2-1）。基本的には、試験成立基準を満たしており、信頼性に影響を与える事象がなければ、1 回の測定で最終判定をすることができる。ただし、NAC/NAL の減少率の平均値が、閾値に近い場合は、判定
結果が正しくない可能性があることから、確認試験を実施して判定結果の是非を確認する。
つまり、NAC/NAL の減少率の平均値が、「3％ ≤ NAC/NAL の減少率の平均値 ≤ 10％」となった場合は、2 回目の試験を実施する。1 回目と 2 回目の判定結果が同じ場合は、その判定
が最終判定となる。しかし、1 回目と 2 回目の判定結果が異なった場合は、さらに 3 回目の試験を実施し、3 回の判定結果の多数決により判定する。
ADRA は、検出波長が 281 nm のため、DPRA と比較して NAC あるいは NAL と被験物質の溶出時間が重なる共溶出が起こりにくい。また、FL 検出器により、NAC および NAL の特異的な検出ができることから、共溶出が起こることは極めて稀である。しかし、NAC の共溶出が、UV 検出器および FL 検出器の両方で認められた場合は感作性を評価できないが、NAL のみで共溶出が認められた場合は、NAC 単独モデルで評価が可能である。NAC 単独
モデルは、NAC の減少率が、NAC 単独モデルの閾値である 5.6 を基準に感作性および非感作性を判定する（表 S2-2）。ただし、NAC の減少率の平均値が、閾値に近い場合は、判定結果が正しくない可能性があることから、確認試験を実施して判定結果の是非を確認する。つまり、NAC の減少率の平均値が、「4％ ≤ NAC の減少値 ≤ 11％」に適合する場合は、2 回目の試験を実施する。1 回目と 2 回目の判定結果が同じ場合は、その判定が最終判定となる。
しかし、1 回目と 2 回目の判定結果が異なった場合は、3 回目の試験を実施し、3 回の判定
結果の多数決により判定する。
表 S2-1ADRA 感作性予測モデル

NAC/NAL の減少率の平均

判定< 4.9％

非感作性物質4.9％ ≦

感作性物質

表 S2-2ADRA NAC 感作性単独予測モデル
NAC の 減少率

判定

< 5.6％

非感作性物質5.6％ ≦

感作性物質25

Annex 3.
表 S3-1

バリデーション結果
ADRA（1 mM）のプレトレーニング試験の試験計画の概要：Sensitizer

表 S3-2：Non-sensitizer

ADRA（1 mM）のプレトレーニング試験の試験結果

減少率：感作性物質≧5.05

非感作性物質＜5.05（プレトレーニング試験およびトレーニング試験では閾値として 5.05 が用いられた。表 S3-5 以降のバリデーション試験では閾値が 4.9 に変更された。
）：Sensitizer

26：：Non-sensitizer表 S3-3

ADRA（1 mM）のトレーニング試験の試験計画の概要：Sensitizer

表 S3-4：：Non-sensitizer

ADRA（1 mM）トレーニング試験の施設内および施設間再現性試験の結果

減少率：感作性物質≧5.05

非感作性物質＜5.05（プレトレーニング試験およびトレーニング試験では閾値

として 5.05 が用いられた。表 S3-5 以降のバリデーション試験では閾値が 4.9 に変更された。）：Sensitizer：Non-sensitizer27

表 S3-5

ADRA（1 mM）の施設内および施設間再現性試験の結果：Sensitizer：Non-sensitizer

減少率：感作性物質 ≧ 4.9

非感作性物質 ＜ 4.9

Phase Ⅱにおいて、NAC/NAL の減少率の平均値が閾値付近（3.0 -10.0）となった化合物について、追加試験を実施したため、複数の値が記載されている。
Lab.C で「－」の表記は、欠測データ（陽性対照物質の減少率が試験成立条件を満たしていなかったにも関わらず、再試験を実施しなかったため。
a)28

Dextran は高分子であり、100 mM の被験物質溶液が調製できないため、DPRA では評価不能

表 S3-6-1

UV 検出および FL 検出による ADRA（0.5 mg/mL）バリデーション研究（NAC 減少率）

表 S3-6-2

UV 検出および FL 検出による ADRA（0.5 mg/mL）バリデーション研究（NAL 減少率）

表 S3-6-3

UV 検出および FL 検出による ADRA（0.5 mg/mL）バリデーション研究（NAC/NAL 平均値）

減少率：感作性物質 ≧ 4.9

非感作性物質 ＜ 4.9:Sensitizer 減少率 ≧4.9

: Non-sensitizer 減少率 <4.929

表 S3-7-1

UV 検出による ADRA（4 mM）バリデーション研究：Sensitizer：減少率 ≧4.9

表 S3-7-2： co-elution

FL 検出による ADRA（4 mM）バリデーション研究：Sensitizer : 減少率≧4.9

表 S3-8-1：Non-sensitizer：減少率 < 4.9：Non-sensitizer：減少率 < 4.9

ADRA（1 mM）と ADRA（4 mM）で判定結果が異なる化合物の ADRA（4 mM）による評価（UV 検出器）：Sensitizer : 減少率≧4.9

表 S3-8-2：Non-sensitizer：減少率 < 4.9

ADRA（1 mM）と ADRA（4 mM）で判定結果が異なる化合物の ADRA（4 mM）による評価（FL 検出器）：Sensitizer : 減少率≧4.930：Non-sensitizer：減少率 < 4.9

Annex 4.

構成成分情報が既知の混合物溶液の見かけの分子量の計算方法

31Annex 5.

ADRA と DPRA の予測性

ADRA は、136 種類の LLNA のデータセットおよび 81 種類のヒトのデータセットに対して、
ADRA（1 mM）、ADRA（4 mM）および ADRA（0.5 mg/mL）が実施され、それぞれの試験法の感度、特異度、正確度および平均正確度（Balanced accuracy）が計算された。なお、平均正確度は、感度と特異度の平均値であり、この指標は、in vivo 陽性と in vivo 陰性の化学物質の数が異なる場合に、有効である。また、参考までに DPRA のデータも掲載した。136 種類の LLNA のデータセットに対して ADRA は、被験物質濃度を 1 mM から 4 mM にすることで、11 種類の偽陰性化合物が、感作性物質と判定された一方、4 種類の非感作性物質が偽陽性と判定されたが、総合的に LLNA と結果が一致する化合物が 7 種類増加した。同様に、被験物質濃度を 1 mM から 0.5 mg/mL にすることで、10 種類の偽陰性化合物が、感作性物質と判定される一方、4 種類の非感作性物質が偽陽性と判定されたが、総合的に LLNA の結果と一致する化合物が 6 種類増加した。81 種類のヒトのデータセットに対して、ADRA は、被験物質濃度を 1 mM から 4 mM にすることで、7 種類の偽陰性化合物が、感作性物質と判定される一方、非感作性物質が偽陽性と判定された化合物はなく、総合的にヒトと結果が一致する化合物が 7 種類増加した。同様に、被験物質濃度を 1 mM から 0.5
mg/mL にすることで、6 種類の偽陰性化合物が、感作性物質と判定される一方、非感作性物質が偽陽性と判定された化合物はなく、総合的にヒトの結果と一致する化合物が 6 種類増加した。このように、被験物質濃度を 4 mM や 0.5 mg/mL に上げることで、1 mM の被験物質濃度では、
NAC/NAL の減少率が閾値よりわずかに低いため非感作性と判定される moderate や weak に分類される感作性物質の一部を陽性として判定できることから、その効果は明らかである。ADRA（4mM）と ADRA（0.5 mg/mL）の平均正確度は ADRA（1 mM）と同等以上であると考えられる。

表 S5-132

ADRA および DPRA の感作性予測結果のまとめ 15)

表 S5-2

ADRA の感作性予測結果 17)

(1/3)

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表 S5-2

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ADRA の感作性予測結果 17) (2/3)

表 S5-2

ADRA の感作性予測結果 17) (3/3)

NC; No Classification, Pos; Positive, Neg; Negative

NC; No Classification, Pos; Positive, Neg; Negative：Sensitizer：Non-sensitizer

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