C18以外のHPLCカラム、どう選ぶ？どう使う？
逆相セカンドカラム の決定版
から、 HILICの活用 まで

液クロ玉手箱ChromaNik㈱クロマニックテクノロジーズ
カラムコンシェルジュ
小山 隆次
koyama@chromanik.co.jp

ChromaNik

C18で“困った時”の 別種カラムの選択
1. 分離できない
C18 column

2. 保持できない▲,●O
O SiO

2nd RP column
OO Si
O

疎水的極性基HILIC column
・ イオンペア法
・ 誘導体化法
・ MIXモード、他親水的極性基

O

Si O
O

異なる逆相カラム 又はHILICカラムの選択など
2

ChromaNik

本日ご紹介するテーマ
1. セカンド逆相カラムと 活用のコツ
F

①PFPF

OO SiO③FPhenylO
O SiO

BiphenylO
O SiO

FFF

②PFP&C18FOO SiOO
O Si
O

F

④F
F

2. HILICカラムと 活用のコツ
O
OO

Si

H
N

R
O

（R︓親⽔基）⑥ HILIC
DiolHOOOOHO⑤ HILIC
AmideSiO

3ChromaNik①PFP： ユニークな保持・分離機構
F
O
O SiO

PFP

F

F

結合基：Pentafluorophenylpropyl

F(カラム名称： PFPP, F5, Fluorophenylなど)

F フッ素の電子吸引性に基づく双極子間相互作用
 「フェニル」とは、真逆の静電ポテンシャル配置
δ-

F
F

F
δ+

F
δ+

パーフルオロベンゼンの静電ポテンシャルマップ（左図）と、ベンゼンの静電ポテンシャルマップ（右図）

H

H
δ-F
F

H

H

δF

H

F
F

F

F

H

δ-

δ-

芳香環に対する特異な親和性が 類縁分離を生む。
4

ChromaNik①PFP： クレゾール位置異性体の分離
参考： キシレン位置異性体等の分離

3SunShell C18CH3電子の局在状態を認識

1,2CH3H3C

H3C
H3C

CH3CH3HOOHFHOCH3H3C

32C30

41FF

H3C

H3COH

2 31H3C

SunShell PFP
PFP基Retention time/min

FF

Column size: 2.6 µm 150 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=40/60
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 25 ºC
Detection: UV@250 nm
Sample:1 = p-Cresol
2 = m-Cresol
3 = o-Cresol

3,4C182
13,4PFP

21Sample:
1 = Ethylbenzene
2 = o-Xylene
3 = m-Xylene
4 = p-Xylene

PFPでは 「極性基」の位置異性体の分離が良好
5

ChromaNik②PFP&C18： PFPの選択性＋疎水性
F
FPFP&C18FOO SiOOO SiO

FFF
F

結合基：PFP + C18： アルキル鎖

FFF

図：より実際的な固定相構造のイメージ

 PFPの選択性を活かしつつ、疎水性保持を強化
 疎水性付与に伴う安定化で、耐久性は3倍に向上
120%

ピングの一環で導入

耐久性テスト条件
Column: Sunniest 5 µm , 2.1m x 150mm
Mobile phase: CH3OH/20mM Phosphatebuffer (pH 7.0) = 70/30
Flow rate: 0.2 mL/min Temperature: 40 ºC

測定条件（結果は右図）• 高い疎水性保持力＋ 理論段数
Mobile phase: CH OH/H O=70/30（PFP&C18）
3

安定性強化型 PFP

2CH3OH/H2O=60/40（PFP）
Flow rate: 0.2 mL/min Temperature: 40 ºC
Sample: Acenaphthene

相対理論段数維持率• C18をエンドキャッ100%
80%
60%
40%
20%
0%

0100200300400500600

通液時間（ｈ）

逆相HPLCでの汎用性を重視 C18ライクなPFP
6ChromaNik②PFP&C18： フルオロベンゼンの分離
Column:1,2SunShell 2.6 μm, 4.6 x 150 mm

3C18Mobile phase: CH3OH/H2O=60/40

4Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Detection: UV@250 nm

1.

2.
FF

1. Benzene

FFFF

Sample:FFFFFF

2PFP

1

2. Fluorobenzene

34PFP基CH33. Toluene

PFP&C18234F1FF

疎水性・大4. α,α,α-Trifluorotoluene

051015Retention time/min

PFPの選択性はそのままに 疎水性保持力を強化
7ChromaNik■PFP系固定相の相違点：カチオン保持PFP&C18

固定相表面の模式図

Column: 5 μm, 150 x 4.6 mm

1Sunniest PFP&C18（%C: 14%）

Temperature: 25 ºC⊖C18TMS

Ammonium Formate(pH3)
Flow rate: 1.0 mL/min

PFP⊖

Detection: UV@260 nm⊖▲

OMobile phase: 12.5 mM

PFP&C18Sample:

抑制された
カチオン保持1 = Epinephrine
2 = Levodopa

2次反応工程の差

疎水性の層２⊖

FFFF⊖

FFFF

1Sunniest PFP

F（%C: 10%）

F1

⊖

+1PFP

▲

顕在化したカチオン保持±0Ａｐｐ．No.１143

at pH 3.0（>99%*）(log D : -2.95)
at pH 3.0 （>95%*）(log D : -1.81)

02468

PFPは （PFP&C18より） カチオン保持が強い。
8ChromaNik■逆相固定相１３種の比較

C/カチオン保持指標
pH 7.0pH 2.8PFP系固定相4種

⊖ ●⊖

⊖

●

C/カチオン保持指標

C/カチオン保持指標⊖●

H/疎水性指標

エンドキャッピング様式の違い⊖ ⊖ ⊖⊖⊖

Sunniest PFPSunShell PFP
Sunniest PFP&C18
SunShell PFP&C18

その他固定相9種

PFP
PFP&C18

Sunniest PhE
Sunniest Biphenyl
Sunniest C8
Sunniest RP-AQUA
SunShell Biphenyl
SunShell Phenyl
SunShell C8
SunShell RP-AQUA
SunShell C18

H/疎水性指標

固定相の性質上、高度不活性化法の適用が困難

PFP系：TMS end-capping

一般的な不活性化法

他：Sunniest end-capping

高温＆高度不活性化法

⊖F

F
F

FF

⊖ ⊖
PFP&C18も 中性条件ではカチオン保持が働く。
(データ引用元) HPLC Columns, Column Selectivity Database, https://www.hplccolumns.org/database/

PFP&C189

ChromaNik■PFP系固定相34種の比較⊖●⊖ ⊖ ⊖⊖⊖

C/カチオン保持指標⊖ ●⊖C/カチオン保持指標⊖●

C/カチオン保持指標
pH 7.0pH 2.8H/疎水性指標<PFP(F5)系カラム34種> （左列より、H値に基づき昇順に整列）
Ultra PFP
XSelect CSH Fluoro-Phenyl
Venusil PFP
YMC-Triart PFPXselect HSS PFP
Sunniest PFP
Viva PFP Propyl
Hypersil GOLD PFP

Ultra PFP Propyl
Poroshell 120 PFPSvea PFP
Ultimate PFP
Pinnacle DB PFP Propyl
Pursuit PFPSunShell PFP
Ultra II PFP Propyl

H/疎水性指標

Fluophase PFP
Discovery HS F5
Selectra PFPP
Kinetex PFP 100A
Shim-pack Velox PFPP
Curosil-PFP
Fluophase RP
HALO PFP
Halo 5 PFP

Ascentis Express 5 F5Nucleodur PFP
Ascentis Express F5Kinetex F5Accucore PFPLuna PFP(2)Allure PFP Propyl
Sunniest PFP&C18
SunShell PFP&C18

2次相互作用（カチオン保持）差異が PFPの多様性(データ引用元) HPLC Columns, Column Selectivity Database, https://www.hplccolumns.org/database/10

ChromaNik③Phenyl： 多様なPhenyl系固定相
PhenylOO SiO

結合基：Ｐｈｅｎｙｌhexyl（一例）

 C18とは異なる選択性（π相互作用が働く）
 多種多様なPhenyl系固定相のバリエーション
USP L11登録固定相(Phenyl)の一例

ＰｈｅｎｙlＰｈｅｎｙethyl

Ｐｈｅｎｙｌpropyl

Ｐｈｅｎｙｌhexyl

Biｈｅｎｙｌ

主にアルキル鎖長とフェニル基のバランスの違い。
11

ChromaNik③Phenyl： Ca拮抗剤の分離
Column: SunShell C18, Phenyl 2.6 µm, 150 x 4.6 mm
Mobile phase: Methanol:10 mM ammonium acetate pH6.8=70:30
Flow rate: 1.0 mL / min, Temperature: 40 oC, Detection: UV@230 nm

2,3C1854Sample: 12

1Nifedipine

3Nitredipine

35Phenyl⋅ HCl42
1

Verapamil Hydrochloride
4024681012

⋅ HCl

H

δ-HH

Diltiazem Hydrochloride

ベンゼンの静電ポテンシャルマップ
5

δH
δ+

14H
HOO SiO

疎水基極性基⋅ HClNicardipine Hydrochloride

疎水性相互作用の他に π電子的相互作用が働く。
12

ChromaNik④Biphenyl： π相互作用を最大化
Biphenyl

OO SiO

結合基：Biphexyl（回転） アルキル鎖を介さない 二連のPhenyl基固定相
 ユニークな分離特性 π相互作用に基づく選択性
ＣＨ-π相互作用

H
H C R

π-π相互作用HH
T字型配置

ずれた平行配置

他のπ相互作用 カチオン-π相互作用，ハロゲン-π相互作用，π水素結合（NH-π相互作用，OH-π相互作用） 等

特に CH/π相互作用に基づく選択性が際立つ
13

ChromaNik④Biphenyl： イソロイシン、ロイシン分離
33PFP

1

Rs2,3 =1.32

2

1RP-AQUA

Rs2,3 =1.37

218.0 MPa17.6 MPa

PFP&C18

1

31Biphenyl

3

Rs2,3 =1.51

Rs2,3 = 2.95

2216.6 MPa

17.4 MPa★
0123450

1Retention time/min

Detection: UV@205nm

Flow rate: 1.0 mL/min

Sample: 1 = L-Valine345Retention time/min

Column: SunShell RP-AQUA , PFP , PFP&C18 , Biphenyl 2.6 µm, 150 x 4.6 mm
Mobile phase: 0.1% formic acid

2123H3CTemperature: 40 ºC

2 = L-Isoleucine

3 = L-Leucine

CH3

分岐位置の異なる構造異性体同士を 良好に分離
14

ChromaNik●Phenyl系固定相の選択性の違い
pC18Column: SunShell 2.6µm 100 x 2.1mm
Mobile phase: 2-Propanol / 20 mM
Ammonium acetate (pH 6.8) = 3/97
Flow rate: 0.4 mL/min Temperature: 40 ℃
Detection: UV@230 nmm

Sample: o-, m-, p-Methylhippuric acidOOHNHpPhenyl＊フェニルへキシル基

O

疎水性相互作用CH3mo -メチル⾺尿酸
Oπ相互作用OHNHOCH3m -メチル⾺尿酸

BiphenylanalytempOOHNHOH 3Cp - メチル⾺尿酸＊相互作用のイメージ

012345疎水基とフェニル基のバランスが 選択性を生む。
15

ChromaNik●Biphenyl: CH3基に対する強い認識
Column:SunShell 2.6 µm150 x 4.6 mm
Flow rate : 1.0 mL/min
Temperature: 40 ℃
Detection: UV@250 nm
Mobile phase: shown below
Sample: shown below

C18123k3=0.60
α3/4=0.19

k3=1.154k3=0.72

4

14

α3/4=0.26

24 k =5.19
3Methanol/Buffer*=30/70

α3/4=0.40

1.
Theobromine

3＊20 mM Ammonium Acetate Buffer(pH 4.7)

3212Acetonitrile/Buffer*=20.5/79.5

41 20Biphenyl60

α3/4=1.48

246

3.
Caffeine

2.
Theophylline

CH3H3C

H3C

CH383104.
PhenolCH3

メタノール移動相下で 各種π相互作用が強まる。
16ChromaNik●Biphenyl: CH3基の結合状態を認識
Column: SunShell 2.6 µm, 150 x 4.6 mm
Mobile phase:NO22-propanol : Methanol : Water = 25:40:35
oTemperature: 40 C
Detection: UV@360 nm

Sample:1. Acetaldehyde-DNPH
2. Propionaldehyde-DNPH
3. iso-Butyraldehyde-DNPH
4. n-Butyraldehyde-DNPH
5. iso-Valeraldehyde-DNPH
6. n-Valeraldehyde-DNPH

NO2HN

HN

N

N

O2N

O2N

3. iso-Butyraldehyde-DNPH

4. n-Butyraldehyde-DNPH

13,42

1C18046

Retention Time (min)8103

Biphenyl

5 62212014 24681012451461618

Retention Time (min)

分岐鎖・直鎖構造異性体を分離 (MeOH＋IPA)
17

ChromaNik● CH/π選択性モデル

Phenyl

C18p-m-p-m-OOHNHO
H 3Cp - メチル⾺尿酸

OHOHNH
O相互作用のイメージ

H C

CH3

Polar groupm -メチル⾺尿酸

H

パラ位HColumn:
2.6 µm (Core-Shell) 150 x 4.6 mm
Flow rate: 1.0 mL/min Temperature: 40 oC
Mobile phase:
2-Propanol/25 mM Phosphate buffer ( pH 3.0 )Detection: UV@230 nm
Sample: o-, m-, p-Methylhippuric acid

Biphenylの （）H C
H

分析種の （）Polar group

メタ位

干渉

CH/π相互作用と 分子内相互作用との綱引き
18ChromaNik●Biphenyl 4種比較 ： 塩基性化合物
シラノール高度不活性法の適用によって、水素結合性が減少し、疎水性保持が増大

α(C/P)

塩基性化合物の吸着性試験

水素結合性 = α(Caffeine/Phenol)
A Biphenyl
B Biphenyl
C Biphenyl

SunShell(1.82)※

2 3※( )内は、α(C/P)

4CH 3

1NCH 3k4=2.90
1A324 = Amitriptyline4(2.69)

SunShellBiphenyl

疎水性保持= kA

k4=7.24

疎水選択= α(A/B)

B(2.52)

2124

3k4=12.59

OOSi OHC

Si

Si OH(3.07)

OOOO

143k4=13.11

SiO

形状認識 = α(T/o)

048121620Retention time/min

図.Biphenyl固定相4種（SunShell,A,B,C）の選択性比較
各種パラメータの最高値を100%とした場合の相対比較チャート

Column: Biphenyl 2.6 µm or 2.7 µm
150 x 4.6 mm
Flow rate: 1.0 mL/min,
Temperature: 40 ºC

Mobile phase:
CH3CN/10 mM Ammonium
acetate pH 6.8 = 40/60
Detection: UV@250 nm

Sample: 1=Uracil, 2=Propranolol, 3=Nortriptyline, 4=Amitriptyline

高度不活性処理で 塩基性化合物の吸着を抑制
19

ChromaNik

汎用HPLC向け 決定版カラム & カラム管
有機不活性管

プロミナート（2022年）
Prominer推奨pH範囲
1 – 12(C18)
1 - 10(Biphenyl)

ワイドなpHレンジ
高耐久型エンドキャッピング法
3.5 µm
高効率粒子

実質
メタル
フリー

（2023年）

有機不活性化層

焼結フィルター

カラム内壁

Stainless SteelOO SiOOO SiO

更なる分離向上に

接続良好

高吸着性化合物に20

ChromaNik

充填剤 汎用HPLCの可能性を拡張 素管
有機不活性管プロミナート

セミオーダー対応（通常品価格+25,000円）
12D company C18 (ハイブリッド型シリカ)
3.5 μmN:理論段数，k:保持係数7531418.0 MPa
k6 =7.1
N6=20,000

62（詳細条件は、Prominert
カタログp.2に掲載）

Prominert C18
3.5 μm
57034613.0 MPa
k6 =9.2
N6=28,000

0.2

0.4

0.6

0.8

Column: SunShell C18 2.6 µm, 100 x 2.1 mm i.d. SS / PS inert
Mobile phase: Acetonitrile : 0.1% formic acid in Water = 1 : 99
Detection: UV@254 nm
Flow rate: 0.45 mL/min

Column Temperature: 40 ℃
Instrument: LC2060C MT(Shimadzu)

Retention time / min

低圧力で高理論段数吸着抑制にて強度向上
21

ChromaNik【新製品】 SunShell Peptide C18（2024年）

SunShell Peptide C18

Wide poreコアシェル粒子

低吸着・不活性技術

1st injection&一般 C18カラム

1st injection
2nd injection

一般Ｃ１８カラムの場合、ギ酸条件下でペプチドピーク形状が崩れやすく安定化にも時間を要する。

WP

16 nm

Column: SunShell Peptide C18 , general C18
Column dimension: 2.1 x 50 mm, 2.6 µm
Mobile phase:
Acetonitrile/0.1% formic acid in water=15/85
Flow rate: 0.3 mL/min,Temperature: 40 ºC, Detection: UV@210 nm
Sample: Angiotensin II

イオンペア効果を有するTFAを添加すればペプチドピークは改善するが、LC/MSにてイオン化抑制が生じるなどの問題がある。
05101520Retention time / min

ギ酸条件下で 優れたピーク強度 LC/MSに最適
22

ChromaNik【予告】 ウルトラハイブリッドカラム （2025年）
Ultra Hybrid(仮称) C18
Ultra Hybrid
C1820th120(prototype)
相対理論段数/ %100

D company hybrid C18

8060

Silicagel
C1840

A company hybrid C18
B company hybrid C18
C company hybrid C18

表面改質型

全調製型

部分ハイブリッド

フルハイブリッド

20
050

100

150200250

通液時間/ hour
耐久性試験条件

測定試験条件

Column: Ultra Hybrid(仮) C18, D company hybrid C18, A company hybrid C18,B company hybrid C18, C company hybrid C18, 150 x 4.6 mm
Mobile phase: Methanol/50mM potassium phosphate pH 11.5 = 10/90
Flow rate: 1.0 mL/min, Temperature: 40 ºC

Mobile phase: CH3CN/H2O=70/30
Flow rate: 1.0 mL/min Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Butylbenzene

当社史上最安定 異次元の耐久性を有した充填剤
23

ChromaNik◆逆相LCで、そもそも保持できない場合（例）


高極性化合物

糖

水溶性が極めて高く 疎水性相互作用が殆ど働かない。


アミノ酸

酸・塩基の双性イオンを持つため pHを一方に振っても極性は高いままとなり、疎水性相互作用が殆ど働かない。
対策：
配位子交換(糖・糖アルコール)、イオン交換(アミノ酸)、誘導体化逆相分析、又はイオン対クロマトグラフィー等
C18 (ODS)

親水性化合物を狙って保持する分析モードの活用
24ChromaNik

親水性相互作用クロマトグラフィー(HILIC)
シリカゲル固定相表面の、親水性相互作用のイメージ

1 = 疎水性化合物 2 = 極性化合物

移動相（水、アセトニトリルなど）

固定相

無修飾 Silica（HILIC）

2（Silicaなど）

2ODS silica（RP-LC）

実質的な固定相（固定相＋水和層）

逆相とは 溶出順が「逆」固定相の担持した水和層が 分配固定相として機能
25

ChromaNik◆親水性保持と、有機溶媒比率との関係
160%

Column：Silica 1, 4.6x150mm

22Mobile phase: Acetonitrile/10mM
phosphate (pH4.5) = (60:40),(65:35), (70:30), (75:25), (80:20),(85:15)165%

22

Flow rate: 1.0 mL/min

170%

Temperature: 30 ℃

22Detection: UV@220nm
175%Sample:1 = Uracil

2logP= -1.07
180%

22
185%

2 = Urea

22logP= -2.11
01

アセトニトリル比率

234TIME (min)

有機溶媒の比率が高いほど 親水性保持力も向上
26

ChromaNik⑤HILIC Amide ： 高活性型HILIC固定相
SunShell HILIC-Amide

OOO

SiH
N

R

（for HPLC）

O（R︓親⽔基） アミド系親水基の活性による高い親水性保持力
 塩濃度のコントロール等で 選択性が一部変化

塩の種類・濃度制御が HILIC-Amide活用のコツ
27

ChromaNik◆平衡化時間と、保持挙動

SunShell HILIC Amide
OO SiO

Nucleobases
351264152

1回目（0分）

576

不安定6O

437123R40 mM

20 mM4NH

1回目

7

2回目（30分）

安定

2回目

345126

3回目（90分）

07510Time (min)15HILICモードは 塩濃度が重要因子
0510Time (min)1520Column: SunShell HILIC-Amide 2.6 µm, 150 x 4.6 mm, Mobile phase: CH3CN/X mM Ammonium acetate buffer(pH 4.7)=90/10, Flow rate:1.0 mL/min,
Temperature: 40 ºC, Detection: UV@250nm, Sample: 1.Thymine, 2.Uracil, 3.Adenine, 4.Hypoxanthine, 5.Cytosine, 6.Guanine, 7.Xanthine

早期の平衡化には 「塩濃度高め」での調製が有効
28

ChromaNik⑥HILIC Diol ： 高安定型HILIC固定相
HOSunShell HILIC DiolHOOOOSiO（for HPLC, LC/MS）

 ジオール基による シンプルな親水性相互作用
 平衡化が迅速。低塩濃度で 安定な分析が可能
10 mM5,6471

保持力が弱い一方 安定化も早い。

32

1回目
475,6Column: SunShell HILIC Diol 2.6 µm, 150 x 4.6 mm

312Mobile phase: CH3CN/10 mM Ammonium acetate buffer(pH 4.7) = 90/10

2回目

Flow rate: 1.0 mL/min, Temperature: 40 ºC, Detection: UV@250nm
Sample: 1.Thymine, 2.Uracil, 3.Adenine, 4.Hypoxanthine, 5.Cytosine,

0Time (min)56.Guanine, 7.Xanthine

低い塩濃度で扱える事から LC/MSと相性が良い。
29ChromaNik

塩濃度を変化させた場合の挙動

ThymineOO SiO

2Uracil

HOSunShell HILIC Diol

4O5,6710 mM

1HONucleobases
1Sample:3Column: SunShell HILIC Diol 2.6 µm, 150 x 4.6 mm
Mobile phase: A)CH3CN / B) X mM Ammonium

2NH23Adenine

4Hypoxanthine

5Cytosineacetate buffer(pH 4.7), A/B = 90/10, Flow rate: 1.0mL/min, Temperature: 40 ºC, Detection: UV@250nm
7 420 mM

135 62← R5,6=1.04
1435

712

R : 分離度, α : 分離係数4380 mM（α=1.04）

56← R5,6=1.75（α=1.08）
6H 2N

Guanine1748

0Time (min)5107Xanthine

塩濃度を上げることで 選択性が一部変化する。
30

ChromaNik◆両HILIC固定相の親水性保持力の対比
移動相使用履歴の影響（メモリー効果）
1k4 = 9.37

342Amide

リン酸緩衝液未使用

リン酸緩衝液
使用後

1614

0510

1520Column: SunShell HILIC Diol or HILIC-Amide 2.6 µm, 150 x 4.6 mm
Mobile phase:
Acetonitrile: 20 mM Ammonium acetate buffer(pH 4.7) = 90:10
Flow rate: 1.0 mL/min
Column: SunShell HILIC- Amide 2.6 mm : 150 x 4.6 mm,

Temperature: 40 ºC , Detection: UV@250nm, Sample: shown below

Mobile phase:
Acetonitrile : 20 mM Ammonium acetate(pH6.8) = 85:15

4

Flow rate: 0.8 mL/min

3Temperature: ambient

Detection: UV@250 nm , Sample: shown below

Diol

21k4 = 0.65
NH2162105

明白な保持・選択性の差

32

14
H 2N

AdenineHypoxanthine

GuanineXanthine

Amide: 保持が強い反面 メモリー効果にも注意
31

ChromaNik

まとめ （ご聴講ありがとうございました。）
1. セカンド逆相カラム• PFPは 極性置換基を有した芳香族化合物の分離が得意• PFP&C18は 疎水基の安定性を付与したPFP系固定相• Phenylは C18とは異なる保持機構（π相互作用）が働く• Biphenylでは π相互作用が最大化。類縁体分離に有用• SunShell Peptideは、ギ酸系でペプチドを良好に検出
2. HILICカラム• Amideは 高活性が特徴。塩濃度コントロールの重要性大• Diolは 低塩濃度での高安定性が特徴。LC/MSにも最適32