第七版：2021.8

Cat. No. A183-0242

はじめにこのたびは、タンパク質合成キット「無細胞くん Start」
をお買い上げいただき、まことにありがとうございます。
国立研究開発法人理化学研究所からライセンスを受け、その高度な無細胞タンパク 質合成技術をキット化いたしました。
「無細胞くんStart」は、大腸菌細胞抽出液によるタンパク質合成系であり、T7RNAポリメラーゼでmRNAを転写できる環状DNAまたは直鎖状DNAをテンプレートDNAとして加えるだけで、タンパク質を簡単に効率よく合成できるキットです。本キットで6回の反応［100 µL、収量0.5 mg/反応（CATタンパク質の場合）］が可能です。弊社「無細胞くん」
製品による大量合成前の発現量確認にも最適です。
ご使用の前に、本書をよくお読みいただき、正しいお取り扱い方法を十分にご理解ください。

安全上のご注意● ご使用にあたっては必ず本書をお読みください。

● 本書は、ご使用になるまでいつでも取り出せる場所に大切に保管してください。

- 本書の著作権は弊社に帰属するものです。本書の一部、または全部を弊社に無断で転載、複製、改変することを禁止します。
- 本書に記載された仕様、デザイン、文面等は改良のため、予告することなしに変更することがあります。
- 本書を作成するにあたり万全を期しておりますが、万一ご不明な点、記載漏れ等お気づきの点がございましたら、下記連絡先にお問い合わせください。

以下の点につきましては特にご留意ください。
● 本キットは試験研究用です。
本キットおよび本キットにより得られたタンパク質等の成分を、人・動物の医療・臨床診断へ使用することおよび飲料品・食品へ添加することを禁止します。
● 一般的な生化学実験経験者およびマイクロピペット操作に慣れた方を対象としています。それ以外の方のご使用はご遠慮ください。
● ご使用にあたっては安全ゴーグル、手袋、白衣等、適切な保護具を着用してください。万一、溶液などが眼や皮膚に付着した場合には、清浄な流水で洗浄してください。炎症が見られる場合には、医師の診察を受けてください。
● 本書に記載されていないご使用方法により発生した安全上の問題については、弊社は責任を負いかねますので予めご了承ください。
● 安全にご使用いただくために、特にご注意をいただきたい内容に下記注意マークを表示しております。本マークに併記される注意事項は必ずお守りください。

！ 注意 取り扱いを誤った場合に、軽傷を負う恐れがあります。

キット内容● 無細胞くん Start 内液● 無細胞くん Start 外液● 無細胞くん 非標識アミノ酸混合物水溶液● コントロールDNA pUC-CAT†● 透析ユニット

180 µL（1.5 mLチューブ）
1.8 mL（2 mLチューブ）
0.6 mL（1.5 mLチューブ）
50 µL（1.5 mLチューブ）（2 mLチューブ入り）† 大腸菌由来クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)を発現します。
†† 2反応/1本 合計6反応分

！ 注意

3本††
3本††
1本
1本
6個

本キットを素手で扱わないでください。
-80℃になっておりますので凍傷の危険性があります。

保存方法● -80±2℃で保存してください。
● -80℃を大きく逸脱した温度で保存するとタンパク質合成性能が低下します。
● 運搬や一時保存は、ドライアイスを入れた発泡スチロール等の容器で行ってください。

● 一度解凍した無細胞くんStart 内液は、氷上で速やかに必要量小分けした上で、液体窒素で凍結し、-80℃で保存してください。その他の溶液は、同様に小分けし、-30℃以下で保存してください。小分け保存した液は、次回ご使用の際、使い切ってください。
凍結融解を繰り返すとタンパク質合成性能が低下します。

キット構成液主要成分
無細胞くん Start 内液

必要な器具・試薬類
ご使用の前に以下のものをご準備ください。
1）無細胞くん Start 内液
無細胞くん Start 外液■ サンプル数に応じた本数をご用意ください。
（1本あたり2反応分）

2）無細胞くん アミノ酸混合物水溶液 (0.6 mL)3）テンプレートDNA

1本■ 1反応あたり環状DNAでは50 ng/µLで10 µL以上、直鎖状DNAでは100 ng/µLで10 µL以上ご用意ください。
■ lacオペレーターを含むテンプレートDNAをご使用の際は終濃度で0.5から1.0 mmol/LのIPTGを添加することで合成量が増加する場合があります。

4）滅菌蒸留水
5）任意のタンパク質精製用buﬀer等
6) 透析ユニット（付属品、MWCO: 12-14 kDa）
7）0.2 mL チューブ8) 1.5 mL チューブ9）マイクロピペット
10）卓上遠心機
11）恒温振とう機（30℃）
12）水浴（30℃）
13）氷浴

タンパク質合成操作
安全ゴーグル、手袋、白衣等の保護具を着用して操作してください。

！ 注意 キット溶液が眼や皮膚に付着すると炎症の原因になる場合があります。

大腸菌抽出液Creatine kinase
T7 RNA polymerase
tRNADTTNTP
HEPES (pH7.5)
Polyethylene glycol
D-Glutamate
0.05% NaN3

Folinic acid
Ammonium acetate
Magnesium acetate
Creatine phosphatecAMPNTP
Ammonium acetate
D-Glutamate
0.05% NaN3

無細胞くん Start 外液
Folinic acid
Polyethylene glycol
Creatine phosphatecAMP

HEPES (pH7.5)
Magnesium acetate
DTT
Potassium acetate＊ 毒物及び劇物取締法における毒物指定物質のアジ化ナトリウム(NaN3)を0.05%含みます。
含有量が0.1%以下であることから上記法適用外となりますが、お取扱いおよび廃棄には十分ご留意ください。

準備

恒温振とう機を30℃にあたためておきます。

合成反応

テンプレートDNAの純度や濃度およびタグの種類等により、タンパク質発現量が異なる場合があります。
詳しい情報は下記Webページをご参照ください。
https://stableisotope.tn-sanso.co.jp/Stableisotope_Products/Stableisotope/BiomolecularNMR/
cell-free/cell-free-tech.html① 本キットを開封し、無細胞くん Start 外液と無細胞くん アミノ酸混合物水溶液を取り出します。それぞれ30℃の水浴中で約10分間および、3分間で解凍し、室温に置きます。
② 予め調製したテンプレートDNAおよびコントロールDNAを解凍し、氷上に置きます。
＊ 開封時に、ふたの緩みや容器の破損が無いことをご確認ください。
＊ 記載されている解凍時間は目安ですので、適宜調整してください。

③ 外液を調製します。1.5 mLチューブに解凍した無細胞くん Start 外液を825 µL、充分けん濁させた無細胞くん アミノ酸混合物水溶液を75 µL、滅菌蒸留水100 µLを分注後よく攪拌し、30℃恒温振とう機内に静置します。

③⑤＊無細胞くん アミノ酸混合物水溶液中に一部のアミノ酸が完全に溶解せず沈殿が見られますが異常ではありません。

試薬
無細胞くん Start 外液
無細胞くん アミノ酸混合物水溶液
滅菌蒸留水
合計

分注量(µL)
82575100

終濃度
82.5% v/v
1.5 mM each amino acid1,000

④ 無細胞くん Start 内液を、30℃の水浴中に3分間入れて解凍し、卓上遠心機でスピンダウンした後、氷上に置きます。
＊解凍時間は目安ですので、適宜調整してください。解凍後は氷上に置き、直ちに使用してください。長時間放置するとタンパク質合成性能が低下します。
＊ 残った内液を再度使用する場合はすみやかに冷凍してください。

⑤ 内液を調製します。0.2 mLチューブに無細胞くん Start 内液 77.5 µL、無細胞くん アミノ酸混合物水溶液 7.5 µL、滅菌蒸留水 5 µL、テンプレート
DNA 10 µLを分注後、マイクロピペットで均一になるまで泡立てないよう静かに攪拌します。
試薬
無細胞くん Start 内液
無細胞くん アミノ酸混合物水溶液
滅菌蒸留水
テンプレートDNA 環状DNA 50 ng/µL
直鎖状DNA 100 ng/µL（合計

分注量(µL)77.57.5510）

100

終濃度77.5% v/v
1.5 mM each amino acid

（環状DNA 5 ng/µL
直鎖状DNA 10 ng/µL）⑥ 外液を恒温槽から取り出し、透析ユニットの外側（青矢印）にマイクロピペットで静かに入れます。

⑦ ⑤内液を透析ユニットの導入口（赤矢印）にマイクロピペットでゆっくりと入れます。この際、出来るだけ泡が立たないように注意してください。
⑧ 透析ユニットの入ったチューブのふたを閉めます。

廃棄方法！ 注意

本キットの溶液および溶液が付着した容器・器具等の廃棄は、必ずオートクレーブ等で不活化処理した後、５項の構成液主要成分およびSDSをご参照の上、地域の条例等で指定された方法に従って行ってください。キット内に大腸菌（遺伝子組み換えでない）が残存している可能性があります。

保証● 使用期限は外箱に記載されておりますので、使用期限内にご使用ください。
● ドライアイス冷凍で配送されます。
到着時、配送ボックス内にドライアイスが残っていなかった場合や、容器の破損、液漏れが確認された場合は、品質が低下している可能性がありますのでお問い合わせください。無償で交換いたします。

● 保証期間内であっても以下のような場合には免責とさせていただきます。

1）誤った保存方法およびご使用方法による不具合
2）本キットの性能によらない不具合● タンパク質の発現は、キットの性能以外の様々な要因により低下する可能性があります。
そのため、タンパク質の発現を保証するものではありません。
● 本キットの不具合による逸失利益、また本キットを使用して得られた生成物による損害等について、弊社では一切責任を負いかねますので予めご了承ください。

安定同位体標識アミノ酸

無細胞くん 安定同位体標識アミノ酸を別売しております。本キットとともにご利用いただくことで、安定同位体標識タンパク質も合成可能です。
品名

A39-0072

アミノ酸混合物水溶液-UL-15N

A41-0074

アミノ酸混合物水溶液-UL-15N,

A40-0073

A42-0075

外液導入箇所⑨ 30℃に設定した恒温振とう機内に⑧を設置し、振とうしながら16 (4~16)
時間反応を行います。
＊ 回転振とう例
振幅 2 mmの場合 300 rpm
振幅 25-30 mmの場合 80 rpm＊ 不安定なタンパク質には短時間の反応が適する場合があります。

⑩ 無細胞くん Start 内液をマイクロピペットで適切なチューブに回収します。
透析ユニット内に残った反応液は、100 µL精製用buﬀer等で洗浄後、回収してください。
⑪ 回収した無細胞くん Start 内液を、氷上に5分置いて反応を停止させます。不溶性画分を含む全画分が必要な場合は、このままご使用ください。

⑫ 可溶性画分が必要な場合は、内液を4℃で15,000×g、1分間遠心分離し、上清（可溶性画分）をご使用ください。
＊ 反応終了後、氷上で長時間放置しますと、発現したタンパク質が沈殿したり、分解するなどの可能性がありますので、直ちにご使用頂くか、適切な方法で精製してください。
＊ アフィニティ樹脂等で精製する場合、回収した反応液を平衡化用緩衝液で5倍程度に希釈してください。希釈しないで用いると、 樹脂への目的タンパク質の吸着効率が低下することがあります。

SDS-PAGE前処理のためのアセトン沈殿＊ 無細胞くん Start 内液をそのまま電気泳動にかけますと、ポリエチレングリコールによりバンドが乱れることがあります。SDS-PAGEで反応産物をご確認頂く場合は以下の方法に従ってアセトン沈殿処理を行ってください。
1) 24 µL の蒸留水に、⑩反応後の無細胞くん Start 内液 6 µLを加える（全画分）。
2) 無細胞くんStart 内液を15,000×g で1分間遠心し、24 µLの蒸留水に、上清6 µL を加える（可溶性画分）。
3) それぞれに 60 µL の冷アセトンを加えてよく混合し10分間氷冷する。
4) 15,000×g、1 分間、4℃で遠心分離する。
5) 上清を除き、ペレットを60℃で20分間乾燥させる。
6) ペレットを30 µL の 1× SDS-PAGE サンプルバッファーに溶解させる。
7) 熱変性後、SDS-PAGE用ゲルに 1ウェル当り5-10 µL アプライする。
8) 電気泳動で分離後、ゲルをクマシーブリリアントブルー等で染色する。

参考文献本キットで得られたタンパク質等の生成物の廃棄はお客様の責任で行ってください。

製品番号

内液導入口

容量 製品番号
1 mL

A107-0144

アミノ酸混合物水溶液-UL-13C,15N

1 mL

A91-0128

アミノ酸混合物水溶液-UL-13C,15N, d

1 mL

A108-0145

1 mL

A92-0129

品名

アミノ酸混合物水溶液-UL-dアミノ酸混合物水溶液-Lys, Arg-UL-13C,15N
アミノ酸混合物水溶液-Lys, Leu-UL-13C,15N
アミノ酸混合物水溶液-SeMet■ Kigawa T. et al., Cell-free Protein Synthesis Methods and Protocols(Spirin, A. S. & Swartz, J. R., eds.), 83-97, 2007
■ Matsuda T. et al., J. Biomol. NMR., 37 (3), 225-229, 2007
■ Yabuki T. et al., J. Struct. Funct. Genomics, 8 (4), 173-191, 2007
■ Seki E. et al., Anal. Biochem., 377, 156-161, 2008

トラブルシューティング

タンパク質が発現しない、または発現量が少ないなどの場合には、下記およびWebページのFAQ等ご参照ください。
その他ご不明な点は、お問い合わせ窓口までお願い致します。
① 使用期限内であることをご確認ください。

キット性能の低下 ② 適正な温度で保管されていたかご確認ください。

③ 使用期限内で適正に保管されていた場合は、弊社までお問い合わせください。

① テンプレートDNAの配列および濃度が適切かご確認ください。
DNAは定量方法によって値が異なる場合があります。
アガロースゲル電気泳動でバンドに問題がないことをご確認ください。低分子の不純物、ゲノムDNAの混入により、UV定量値より実際のテンプレートDNAの濃度が少ない場合があります。
環状DNAでは、終濃度が1-10 ng/μL、直鎖状DNAは、5-20 ng/µLになるよう添加してください。
② フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿による再精製で発現量が改善する場合があります。

テンプレートDNA③ N末端側に精製用タグを導入することで発現量が改善される場合がありによる問題ます。最適なタグの検討はPCRによる直鎖状DNAを用いることをお勧めします。詳細は参考文献（Yabuki et al.）の方法をご参照ください。

④ プラスミドはpUC等ハイコピータイプを推奨します。pET等コピー数の少ないプラスミドでは、精製時の不純物が相対的に多くなり、発現量が少なくなる場合があります。

⑤ lacオペレーターを含むテンプレートDNAをご使用の際はIPTGを終濃度で0.5から1.0 mmol/L になるように添加すると発現量が改善する場合があります。

タンパク質の性質 タンパク質によっては反応中に分解、沈殿してしまう傾向のものがあります。
による問題
4時間程度の短時間反応や、界面活性剤等の添加をご検討ください。

容量

1 mL

1 mL

1 mL

1 mL

東京都品川区小山1-3-26
E-mail : Isotope.TNS@tn-sanso.co.jp
U R L : https://stableisotope.tn-sanso.co.jp