研究助成業績報告集

第 20 回（2012 年度）バイエル循環器病研究助成『日本人における血栓止血の特異性』

公益財団法人 循環器病研究振興財団

No

研

＊

目

次 ＊

究

課

題

研 究 者

頁

1

脳梗塞病態における酸化ストレスによる血液凝固反応亢進機構の
解明

吾郷 哲朗

1

2

「日本人は血栓ができにくいのか？」
新規開発の血栓形成能診断システムによる検証

伊藤 隆史

3

3

新規抗凝固薬による出血合併症の減少を目的としたモニタリング手法の開発

大森

司

7

4

モデルマウスを利用した日本人の静脈血栓症の遺伝的特異性の
解明

坂野 史明

15

脳梗塞病態における酸化ストレスによる血液凝固反応亢進機構の解明
九州大学病院・腎高血圧脳血管内科・助教

吾郷
Ⅰ．緒 言

哲朗

という点に注目して検討を行った．

脳梗塞は日本人にとっての国民病である．欧米人

Ⅱ．対象・方法

では冠動脈疾患の比率が脳血管疾患よりも高いが，日本人ではこの比率が逆転する．日本人は欧米人に

ヒト培養脳微小血管内皮細胞 (Cell Systems

比べ，脳梗塞３大病型の一つであるラクナ梗塞，おCorporation)を購入し，通常培養ならびに低酸素下よび，脳出血の発生頻度が高い．つまり，欧米人に(1% O2)での培養を行った．
アデノウイルスを用いて比し，日本人は穿通枝(=細小動脈)血管が障害されや

Nox4 を脳血管内皮細胞に過剰発現させ，遺伝子発現変化を microarray により網羅的に解析した．本すい民族であるといえる．
穿通枝血管を障害する代表的な危険因子が高血研究では，とくに血液凝固関連分子に注目し，これ

圧・糖尿病であることに異論の余地はない．これら

らの分子の発現変化については，real-time PCR，の因子を有することで脳血管障害発症の危険度は有Western blot などによる検討を加えた．

意に増加する．一方で，脳梗塞発症時に血圧や血糖マウス中大脳動脈永久閉塞脳梗塞モデル(MCAO)のコントロールが悪い症例では，神経機能が増悪しを用いて，脳における Nox4 の発現変化を免疫組織

やすく，機能予後も不良となりやすいことを我々は染色により検討した．また，我々が作製した血管内報告した(1).つまり，高血圧・糖尿病は，脳梗塞発

皮細胞特異的 Nox4 過剰発現マウス(Tg-EC-Nox4,症のリスクであると同時に，脳梗塞発症後の増悪因

Tie2 プロモーターを使用)を用いて，MCAO におけ子でもある，と考えることができる．

る表現型変化について検討した．

高血圧・糖尿病などの生活習慣病が長期に持続しⅢ．結 果

た状況では，血管壁における酸化ストレスが亢進していることが知られている．
酸化ストレスの亢進は，まず，ヒト培養脳微小血管内皮細胞において，活性酸素種の産生増加もしくは活性酸素種消去系酵NADPH oxidase family タンパク質(Nox1〜Nox5)素の発現・機能低下によってもたらされる．生理的のうち，Nox4 が特異的に発現していることを確認

条件下における主たる活性酸素種産生源はミトコンにした．

ドリア呼吸鎖であると考えられているが，病的状況

Nox4 による活性酸素種産生量はその発現量に依下においては，活性酸素種産生酵素 NADPH

存することが知られており，Nox4 の発現に影響をoxidase の役割が近年注目されている(2)．我々は，及ぼす因子について，Ang II (10-5−10-7 M)負荷，高血管壁細胞とくに血管内皮細胞において NADPH

血糖負荷 (500 mg/dl)，低酸素負荷 (1% O2)などを

oxidase family タンパク質の一つである Nox4 が高行い検討した．Nox4 の発現変化に有意な影響(=増度に発現し，主たる活性酸素種産生源として作用し加)を及ぼしたのは，調べた限りにおいては低酸素負ていることを明らかにした(3)．また，Nox4 の発現

荷のみであった．そこで，低酸素負荷によって活性は脳血管において高いことも報告している(4)．

化される代表的転写因子である Hypoxia-inducible

本研究課題では，血管壁内皮細胞における Nox4

factor-1(HIF-1)とNox4 の関連について調べた．

の発現がどのように制御され，これを介した酸化ス

siRNA を用いて HIF-1のノックダウンを行った上トレスの亢進が,血液凝固反応にどのような影響をで，低酸素負荷を行ったが Nox4 の発現上昇は抑制及ぼすか，また，脳梗塞の病態悪化に関連しうるかされなかった．逆に Nox4 を過剰発現させると，

1

HIF-1タンパク質の発現が増加した．つまり Nox4

Nox4 の発現が上昇し，凝固促進タンパク質の発現は低酸素負荷により，HIF-1非依存性に発現が上上昇ならびに凝固抑制因子の発現抑制を誘導されて昇し，HIF-1を安定化することによって，低酸素

おり，凝固反応が亢進する可能性がある．これらに応答を増強させる可能性が示唆された．

より，脳虚血時の微小循環障害は益々助長されるも次に，アデノウイルスを用いて Nox4 を脳血管内のと思われ，このような病態下では，脳梗塞が悪化

皮細胞に過剰発現させ，遺伝子発現変化をマイクロする可能性がある．Tg-EC-Nox4 において脳梗塞巣

アレイにより網羅的に解析した．興味深いことに，が拡大した理由の一つとして，Nox4 を介した血管

様々な分子の発現変化が生じていた．中でも，炎症内皮細胞の酸化ストレス増加とそれに引き続く血液性サイトカインや血管栄養因子，解糖系酵素など，

凝固反応亢進が関与している可能性が示唆された．

低酸素や HIF-1によって制御されていることが知Ⅴ．結 論

られている分子群の発現が有意に増加していた．さらに，血液凝固に関連するタンパク質に注目すると，脳血管内皮細胞における Nox4 を介した酸化スト

Tissue factor, plasminogen activator-1(PAI-1)の有

レスの亢進は，血液凝固反応を亢進させることによ

意な発現上昇，ならびに，抗凝固タンパク質 Protein

り，脳梗塞の発症，さらには脳梗塞病態の悪化と関C の内皮細胞受容体 endothelial protein C receptor

連する可能性がある．Nox4 を介した酸化ストレスの有意な発現低下を認めた．すなわち，Nox4 の発亢進の是正は，急性期脳梗塞の治療ターゲットにな現が上昇した内皮細胞では血液凝固反応を促進するる可能性があると考えられる．

ように作用する可能性が示唆された．
最後に，脳における Nox4 の発現について蛍光免

Ⅵ．研究協力者

疫組織染色を用いて検討した．正常マウス脳組織に

鴨打正浩・九州大学病院脳血管内科・講師

おいて，Nox4 は弱いながらも血管内皮細胞に発現

黒田淳哉・九州大学病院脳血管内科・助教していた．MCAO により脳梗塞を生じさせると，

松尾龍・九州大学病院脳血管内科・医員

脳梗塞巣ならびにその周囲領域の微小血管内皮細胞，

牧原典子・九州大学病院脳血管内科・大学院生

周皮細胞において Nox4 の発現が有意に増加してい有村公一・九州大学病院脳血管内科・大学院生

た．さらに，脳組織 homogenate を用いた定量 PCR

中村麻子・九州大学病院脳血管内科・大学院生

により，対側・非虚血組織と比較して虚血組織にお西村中・九州大学病院脳血管内科・大学院生

ける Nox4 の有意な発現増加を認めた．
最後に Tg-EC-Nox4 マウスの MCAO における表

Ⅶ．参考文献現型変化について検討した．
Tg-EC-Nox4 マウスは，

1) Kamouchi M, Matsuki T, Hata J, et al.:Stroke 2011; 42: 2788-2794

正常マウスに比し，脳梗塞サイズが有意に拡大して

2) Ago T, Kuroda J, Kamouchi M, et al.:いた．

Circulation Journal 2011; 75: 1791-1800
3) Ago T, Kitazono T, Ooboshi H, et al.:Ⅳ．考 察
Nox4 を介した酸化ストレスの増加は，細小血管C

irculation 2004; 109: 227-233
4) Ago T, Kitazono T, Kuroda J, et al.: Stroke

レベルの内皮細胞において強いようである．その理由として，1) Nox4 の発現量そのものは低酸素によ2005; 36: 1040-1046って最も制御をうけていること，および，2) 末梢細小血管は正常状態においてもそもそも酸素分圧が低
いこと，などが考えられる．故に，微小血管が豊富に存在する脳においては，Nox4 の発現が高いと考えられる．虚血領域の微小血管の血管壁ではさらにNox4 の発現が増加する．微小循環における酸化ス
トレスの発生においては，Nox4 が重要な役割を担っている可能性がある．
我々の検討から考察すると，脳梗塞などの虚血病態では，内皮細胞における2

「日本人は血栓ができにくいのか？」
新規開発の血栓形成能診断システムによる検証

鹿児島大学大学院医歯学総合研究科・特任講師

伊藤隆史
Ⅰ．緒 言
これにより、血流下で血小板と凝固因子が活性化さ
これまでの臨床的観察により、アフリカ系人種はれる生理的な血栓形成過程を総合的かつ定量的に評

急性冠症候群の高リスク群であり、逆に日本人を含価することが可能となった[1]。我々はこの T-TAS

めたアジア系人種は抗血栓療法による出血の高リを用い、健常人とアスピリン内服患者の血栓形成パ

スク群であることが明らかになっている。これには、ターンを解析した結果、健常人では 10 分間の検査

血小板の接着因子、凝固因子、リポタンパク質、薬時間の間に全例が 60 kPa に達して流路が閉塞した

物代謝酵素の遺伝子多型といった先天的要因、食生のに対し、アスピリン内服患者では 75%の症例で流活、肥満のような後天的要因、さらには治療法やそ路の閉塞が抑制され、薬効が示されていることを確の質などの社会的要因が関係する。このため、「血認した[2]。しかしながら、残りの 25%の症例はアス栓のできやすさに人種差はあるか？」という疑問にピリンを内服していない健常人と同程度の血栓形成

対して、疫学的検討のみによって明確な答えを出す

能を認め、アスピリン抵抗性患者だと考えられた（図ことは困難であり、検査医学的検討が求められてい２）。

た。しかしながら、現今の検査医学的手法は出血傾向の診断には有用だが、血栓傾向を定量的に診断することにはほとんど無力であった。
我々はこの数年、JST の支援を受け、血栓傾向を科学的、定量的に診断する方法の開発に取り組み、
この度、マイクロチップ式血栓形成能解析システム（T-TAS）を完成させた（JST プレスリリース
http://www.jst.go.jp/pr/info/info862/index.html ）。
本システムでは、キャピラリーに細動脈でのずり応

図 2 T-TAS によるアスピリンの薬効モニタリング

力に相当する速度で血液を流し、血栓が形成されてキャピラリーが閉塞していく過程を、圧力センサー

本システムは、個々人の総合的な血栓形成能を可視で定量的に評価するとともに、マイクロカメラで視化するとともに定量的に診断することができる優れ覚的に評価する（図１）。

た検査法であり、多施設での応用展開が可能なシステムである。現在、健常人を対象として、血栓形成能の個人差を検証中であるが、本申請課題においては、この計画を日本だけでなく、オランダでも同時に展開することによって、血栓形成能の人種差を検定する。また、高血圧や脂質異常症などの生活習慣病は、動脈硬化を促進することによって、血栓症のリスクを高めていると考えられているが、これらの
生活習慣病が血液の血栓形成能を高めている可能性

図 1 T-TAS によるリアルタイム血栓モニタリングについても、動物モデルを用いて検討する。

3

ともに凝固因子が活性化され、血小板とフⅡ．対象・方法

ィブリンの混合血栓が形成される。本研究【被験者選択基準】

では、
PLチップでは1000, 1500, 2000 sec-1

（1）
（2）
（3）

同意取得時の年齢が 20 歳以上 45 歳以下ののズリ速度で血液を流し、AR チップでは者

240, 600 sec-1 のズリ速度で血液を流し、X担当医師が、本研究に適格な健康成人と判軸に時間（分）、Y 軸にキャピラリー内圧

断した者（kPa）をプロットした際の曲線下面積を本研究への参加にあたり十分な説明を受け解析する。

た後、十分な理解の上、本人の自由意思に

Ⅲ．結 果

よる文書同意が得られた者

日本人 119 名（28.6±6.7 歳、男性 71%）とオラ【被験者除外基準】（1）（2）

本研究の採血日前 4 箇月以内に他の臨床試

ンダ人 23 名（34.2±6.6 歳、男性 48%）が本研究に験又は治験に参加し被験薬の投与を受けた

エントリーされた。まず、日本人の健常人データを者解析すると、T-TAS での曲線下面積を指標として血本研究の採血日前に献血（1箇月以内に200

栓形成能を評価した場合、被験者の年齢による差異

mL 以上、3 箇月以内に 400 mL 以上）をは認められなかった（図３）
。

行った者
（3）

本研究の採血日前 1 ヵ月以内に医療用医薬品・一般用医薬品を使用した者（4）

本研究の採血日前 7 日以内に栄養補助食品（サプリメント）を使用した者（5）

担当医師により本研究への参加が不適当と判断された者【目標被験者数】(1)

日本人 120 名(2)

オランダ人（Caucasian）20 名

【方法】
(1)

文書による同意を取得した被験者に対して担当医師が診察（問診、視診、聴打診、触診）を行い、選択基準・除外基準により被験者が適格であるかを確認する。

(2)

適格と判定された被験者に対し、6 時間以上の絶食下、採血し、T-TAS による血栓形
成能測定を実施する。

(3)

T-TAS では、PL チップを用いた血小板機

図 3 T-TAS での曲線下面積と被験者の年齢（日本人）

能評価と、AR チップを用いた血小板およ
び凝固系機能評価を施行する。PL チップ

次に、性差を検討したところ、日本人では男性ののキャピラリーにはコラーゲンコーティン

方が PL チップでの血栓形成能が高く、女性と比べグ部位があり、ヒルジンで抗凝固した血液て血小板機能が高い人が多いと考えられた（図４上）。

を流すことで、同部位で血小板が粘着、凝一方、AR チップで解析すると、日本人では女性の集して血栓が形成される。AR チップのキ方が血栓形成能が高く、PL チップで男性優位だっャピラリーにはコラーゲンと組織因子をコた結果と合わせて考えると、女性の方が凝固系が亢ーティングした部位があり、コーントリプ

進しているか、もしくは凝固系と血小板系の相互作

シンインヒビターで処理した血液を流すこ用が発達している人が多いと考えられた（図４下）。

とで、同部位で血小板が粘着、凝集すると次に、オランダ人の健常人データを解析したところ、4

男性 11 名、女性 12 名と被験者数は少ないが、PL

また、この人種差は男性においても女性においてもチップ、AR チップともに性差は認められなかった。

同様で、オランダ人の方が有意に血栓系性能が高かった（図６）。

図 6 T-TAS での曲線下面積と性差と人種差 水平線：平均値

一方、
AR チップにおいては、ズリ速度 240、600 sec-1
ともに、人種差は認められなかった（図７）。

図 4 T-TAS での曲線下面積と性差（日本人） 水平線：平均値

次に、日本人とオランダ人の血栓形成能を比較したところ、PL チップにおいては、ズリ速度 1000 な
らびに 1500 sec-1 では、人種差は認められなかったが、2000 sec-1 の高ズリ速度環境下では、オランダ人の方が有意に血栓形成能が高かった（図５）。
図 7 T-TAS AR チップでの曲線下面積と人種差 水平線：平均値

次に、生活習慣病が血液の血栓形成能を高めている可能性について、動物モデルを用いて検討した。
通常の餌を摂取したマウスと比較して、高脂肪食を摂取したマウスは、AR チップでの血栓形成が有意に亢進していた（図８）。

図 5 T-TAS での曲線下面積と人種差 水平線：平均値
図 8 高脂肪食による血栓傾向（マウス）5また、高血圧自然発症ラット（spontaneously

だけでなく、血液の血栓形成能を高めることで、血hypertensive rats: SHR）も、正常対照群のラット

栓症のリスクを高めている可能性が示唆された。今と比較して、AR チップでの血栓形成が有意に亢進後は、ヒトにおいても同様の現象が認められるか、していた（図９）。

検討していく必要がると考えられる。

Ⅴ．結 論
血栓傾向の科学的、定量的評価を目的に開発したマイクロチップ式血流下血栓形成能解析システム（T-TAS）を用いて、血栓形成能の人種差を検定し
図 9 高血圧による血栓傾向（ラット）たところ、高ズリ速度環境下では、日本人と比べてオランダ人の方が有意に血小板血栓形成能が高かっⅣ．考 察

た。動物モデルにおいては、高脂肪食摂取や高血圧

血流下で形成される血栓と、静的環境下で形成さによって、血栓形成能が亢進した。

れる血栓とでは、血栓の質が大きく異なる。速い血
流下での血栓形成には、ズリ応力依存性のフォンウ

Ⅵ．研究協力者ィルブラント因子（VWF）の伸展と血小板の粘着が丸山征郎・鹿児島大学・特任教授

重要な役割を担っているのに対し、静的環境下では、

細川和也・鹿児島大学・客員准教授

血液凝固系の活性化に伴うフィブリン形成の重要度

深瀬広幸・シーピーシー治験病院・院長が増す。急性冠症候群の場合、速い血流下で血栓がJoost Meijers・University of Amsterdam・Prof.

形成されるため、そのリスクを評価するには、ズリ
応力依存性の血小板機能を解析しうる検査方法が望Ⅶ．参考文献ましい。我々は新規開発のマイクロチップ式血流下1. Hosokawa K, Ohnishi T, Kondo T, et al: A

血栓形成能解析システム（T-TAS）を用い、健康なnovel automated microchip flow-chamber

日本人とオランダ人の血栓形成能を比較したところ、

system to quantitatively evaluate thrombus

ズリ速度 240 ならびに 600 sec-1 での AR チップ、

formation and antithrombotic agents under1000 ならびに1500 sec-1 での PL チップでは人種差

blood flow conditions. J Thromb Haemostは認められなかったが、2000 sec-1 という高ズリ速

2011, 9(10):2029-2037.

度環境下ではオランダ人の方が有意に血栓形成能が2. Hosokawa K, Ohnishi T, Sameshima H,

高かった。2000 sec-1 というズリ速度は、健康な血

Miura N, Ito T, Koide T, Maruyama I:

管では見られず、高度狭窄部位や血栓形成部位でのAnalysing responses to aspirin and clopidogrelみ見られる病的高ズリ速度環境であり、冠動脈のプ

by measuring platelet thrombus formation

ラークが破裂して閉塞性の血栓が形成されるような

under arterial flow conditions. Thrombosis

状況においては、オランダ人の方が完全閉塞に至りand Haemostasis 2013, 109(1):102-111.
3. Sakuma M, Konno Y, Shirato K ：Increasing

やすい可能性が考えられた。
T-TAS での血栓形成能を男女別に見てみると、オmortality from pulmonary embolism in Japan,
1951-2000. Circ J 2002, 66：1144-1149.

ランダ人では性差がほとんど認められないのに対し、日本人では男性の方が血小板機能が高く、女性の方が凝固機能が高い傾向にあった。欧米と異なり、日本では女性の方が静脈血栓塞栓症のリスクが高いとの報告もあり[3]、今回の T-TAS のデータはそれを裏付けるものかもしれない。
高血圧や脂質異常症などの生活習慣病モデル動物
は、正常対照群と比べて、AR チップでの血栓形成が有意に亢進していた。このことより、高血圧や脂質異常症などの生活習慣病は、動脈硬化を促進する

6

新規抗凝固薬による出血合併症の減少を目的としたモニタリング手法の開発
自治医科大学分子病態治療研究センター分子病態研究部・講師

大森 司
Ⅰ．緒 言

われる患者を対象とする臨床研究を予定した．
まず，

従来用いられてきたヘパリンやワルファリンに変

抗凝固療法を行わない整形外科手術患者における出わる薬剤として経口の抗トロンビン薬や活性化血液血予測因子の評価を行った．本臨床研究では，本報

凝固第 X 因子(FXa)阻害薬が臨床の場で使用され始告書作製の段階で 122 症例がエントリーされ，抗凝めている．これらの薬剤は１）薬剤相互作用や食事固療法を行わない患者群での出血リスク因子の同定による影響を受けにくい，２）比較的薬剤の作用がを中間解析として試みた．さらに，経口抗 FXa 阻害

予測できモニタリングが不要，等の利点が挙げられ薬であるエドキサバンの抗 FXa 阻害効果を自動分る．大規模臨床試験の結果から，これら新規抗凝固析器にて効率的に直接測定することが可能となった．

薬の抗血栓効果はワルファリンと同等以上の効果を血漿への in vitro での薬剤添加実験から，臨床におしめすが，出血合併症，特に脳出血に関しては有意ける薬剤モニタリングのための検査項目の意義・重に発症率が低いと報告された[1-3]．この結果を受け要性についての考察が得られた．これらの結果をもて国内でもワルファリンからダビガトラン（プラザとに，倫理委員会の承認を得て，エドキサバンを投キサ®）への変更が一時的に広がったが，致死的な出与する患者群での出血リスクを同定のための臨床試血を来した症例が報告されており，その使用につい験を計画し，
現在患者のエントリーを開始している．

て注意が促されている．従来，日本人においては脳
卒中でも脳出血の頻度が高いことが報告されており，Ⅱ．対象・方法

またその人種や体格の違いから薬剤用量が欧米人の1.

それでよいかどうかという点は常に問題になる．薬効を臨床検査にてモニタリングを行いその効果を推

1-1 抗凝固療法を行わない手術患者における出血リ
スクの同定察することができれば，出血合併症が減少し，新規

対象：自治医科大学附属病院整形外科で変形性脊椎抗凝固薬をさらに効果的に使用することができるか症，等で椎弓切除術を行う患者（エントリー中，現もしれない．

段階で 122 例での中間解析）．

ヒトを対象とした臨床試験の計画と実施

本研究では，現在臨床で用いられている新規抗凝固薬を，臨床の場で，より安全，かつ効果的に使用

方法：術当日朝に空腹時採血を行い血漿・血清を得出来るためのモニタリング手法の開発を最終目標とた．術中及び術後のドレーンからの出血量を定量しして検討を開始した．非弁膜症性心房細動患者でのた．

重大な出血合併症の比率は，これまでの大規模臨床試験の結果からも，2%前後のため[1-3]，出血合併症

評価項目：血小板機能検査（PA-200，興和，東京），と血液検査値との関係を観察するには，数千人規模

PT, APTT，アンチトロンビン（AT）,プロテイン C，での検討が必要と推測される．一方，観血的処置患

PAI-1，D-dimer，FDP，E-セレクチン，可溶性フ者を対象とすれば，術中・術後の出血量，ヘモグロィブリン (SF), α2-プラスミンインヒビター (α２ビン（Hb）の変動を評価することで，より少数の患PI)，プラスミノゲン（表 2）．

者を対象とした検討においても，出血傾向・出血量を定量することで出血傾向の評価が可能となる．以

統計学的解析：上記の検査値と共に，患者背景，一上より，本研究目的の達成ために，外科的処置が行

般生化学検査などから，術中，術後の出血量を規定7

する因子について統計学的に評価を行った．単相関

APTT を用いた（シスメックス株式会社）．エドキ

は Pearson の相関分析を用い，多変量解析は重回帰

サバンの抗 FXa 活性は，ヘパリン測定試薬（ヒーモ解析を行った．

スアイエル ヘパリン リキッド；三菱化学メディ
エンス株式会社）を用いて，ACLTOP にて測定を

1-2 エドキサバン投与中の出血量解析おこなった．抗 FXa 活性はヘパリンの抗 FXa 活性

本研究計画が循環器病研究振興財団への研究助成にに換算する形で算出した．

受理された後に，自治医科大学と山梨県立中央病院との共同研究として，研究計画を立案し，各施設のⅢ．結 果

倫理委員会への申請を行った．修正の後，平成 241.

年 10 月 9 日に自治医科大学（A12-57 号），平成 24

1-1 患者背景 – 抗凝固療法や抗血小板療法を術

年 12 月 1 日に山梨県立中央病院（臨床 24-15）の倫後に行わない脊椎手術患者を対象に研究を開始した．

理委員会からの承認を得た．現在は患者のリクルー

現段階でエントリーされた集団の主な特徴を表 1 にトを開始した段階であり，データ解析は行なってい示す．

周術期の出血量規定因子の同定ない．
表 1 対象患者背景 連続変数は平均 ± 標準偏差で表す．BMI =対象：山梨県立中央病院，自治医科大学附属病院でbody mass index; RA = rheumatoid arthritis; OPLL =整形外科手術を行い，深部静脈血栓症 (DVT)予防に

ossification of the posterior longitudinal ligament.

エドキサバン等の抗凝固薬を投与する患者．
Variables

イベント設定：術後 2 週間までの出血，または，術Age, years

66.54 ± 11.12

後 1 年間までの症候性深部静脈血栓症、または肺塞Men, n (%)

75 (61.5)

栓症の発症，死亡．

BMI, kg/m2

24.3 ± 4.536

Current NSAIDs, n (%)

46 (37.7)

評価項目：PT, APTT, フィブリノゲン, 抗 FXa 活性

Hypertension, n (%)

56 (45.9)

測定, AT, プラスミノゲン, α２PI, PAI-1, FDP,

Diabetes mellitus, n (%)

19 (15.6)

D-dimer, SF, PIC, プロテインＣ, プロテインＳ活

Dialysis, n (%)

6 (4.9）性, これらのデータについ以下の術後 2 週間まで合RA, n (%)

6 (4.9)計 5 ポイントでの採血を行い，出血量・血栓症合併

OPLL, n (%)

28 (23.0)

例との解析を行う（1 度は内服後 2−3 時間後に検査

Operation time, min

165.0 ± 57.81

で薬剤血中濃度のピーク値を測定する）．

Bleeding for operation, ml

104.7 ± 131.2

Drain bleeding, ml

526.6 ± 318.42.

新規経口抗凝固薬の in vitro における薬効評
価：臨床試験で主に用いるエドキサバンをジメチルスル

抗凝固療法や抗血小板療法を行なっていない段階

ホキシド (DMSO)で溶解後に，様々な濃度で正常プでの出血リスクを検討するため，術当日に採血を行ール血漿に添加して，様々な凝固マーカーの測定をい，血小板機能と様々な凝固・線溶因子関連検査を行った．同様に正常血漿をオーレンベロナール緩衝

測定した（表 2）．

液にて一定の割合で希釈して同様の測定を行った．
プロトロンビン時間(PT)や活性化部分トロンボプラ
スチン時間(APTT)は血液凝固自動分析装置である
ACLTOP300 (以下，ACLTOP)（三菱化学メディエンス株式会社，東京），または CA500（シスメックス株式会社，神戸）を用いて測定した．それぞれ PT
試薬と APTT はヒーモスアイエル PT・ APTT（三菱化学メディエンス），またはトロンボチェックPT・8

表 2 対象患者の検査測定値 連続変数は平均 ± 標準偏差で表す．

表 3 術中出血と相関する患者背景・検査値（pearson 相関係数）

WBC = white blood cell; ESR = erythrocyte sedimentation rate;

PA = platelet aggregation; PAR-1 = protease activated

PA = platelet aggregation; Coll = collagen; PAR-1 =receptor-1 agonist.

protease-activated receptor-1 agonist; PAI-1 = plasminogenactivator inhibitor-1; PIC = plasmin2-PI complex.

Variables

Variables

R (P value)

GPT

0.2987(0.0064)

PT (%)-0.3793(0.0005)

WBC, ×103/mm36.209±1.748

Operation time

0.3715 (0.0006)

Hemoglobin, g/dl

13.36±1.484

PA PAR1-0.2245(0.0426)

Platelets, ×104/mm3

22.14±6.018-PI-0.2248(0.0423)

APTT, sec

33.17 ±7.352

PT, %96.77 ±13.16

ESR, mm/hr

17.29 ±16.76

表 4 術後ドレーン出血と相関する患者背景・検査値（pearson 相CRP, mg/dl

0.2219 ±0.5029

関係数）BMI = body mass index; PA = platelet aggregation; Coll

Total protein, g/dl

7.317 ±1.286= collagen; PIC = plasmin-2-PI complex.

Creatinine, mg/dl

0.9695 ±1.515

GOT, U/l

24.19 ±13.4

Variables

R (P value)

Cholesterol, mg/dl

200.1 ±36.17

Operation time

0.304 (0.0055)

PA ADP 2 µM, %42.49±20.75

BMI, kg/m2

0.3082(0.0048)

PA ADP 5 µM, %62.52±17.79

Platelets-0.3 (0.0283)

PA Coll 1 µg/ml, %59.4 ±25.39

PT (%)-0.2319 (0.0372)

PA Coll 3 µg/ml, %79.4±11.37

PAADP 2 µM

-0.2253 (0.0418)

PA PAR1 20 µ M, %43.87 ±27.73

PAADP 5 µM

-0.2934 (0.0075)

PAI-1, ng/ml

28.68±13.78

PA Coll 1 µg/ml-0.26615(0.0157)

E-selectin, ng/ml

19.09±9.14

PA Coll 3 µg/ml-0.359 (0.0011)

D-dimer, µg/ml

0.911 ±1.146

Antithrombin-0.244 (0.0272)

FDP, µg/ml

4.625 ±5.267

PIC-0.2419 (0.0285)

Antithrombin, %84.04±12.61

Soluble fibrin-0.2883(0.0086)

2-PI, %83.24±13.73

Plasminogen, %84.04±12.61

PIC, µg/ml

0.9168±0.3476

1-3 出血リスクの評価（多変量解析）− 上記の単

Soluble fibrin, µg/ml

6.002 ±0.3476

相関にて相関が認められた変数を用いて，多変量解析を行った．術中出血には PT 活性（t = −2.65, P =1-2 出血リスクの評価（単相関）− 母集団の中か

0.0097），手術時間（t = 2.95, P = 0.0042），およびら，現段階で症例数の多い頚椎手術患者 82 名を選

PAR-1 血小板凝集能（t = -2.56, P = 0.0125）が有意定し，Pearson の相関係数を用いて，種々の測定値・であった．ドレーンからの出血では PT 活性（t =患者背景と出血量との関係を検討した．
術中出血は，-2.78, P = 0.0071），可溶性フィブリン（t = -2.68, P

手術時間とGPTと正の相関，
PT活性，
α2-PI，
PAR-1= 0.0091），3 µg/ml 刺激時のコラーゲン凝集能（t =血小板凝集能と負の相関を認めた（表 3）．術後のド-2.15, P = 0.035）が有意であった．

レーンからの出血量は BMI，手術時間と正相関し，血小板数，PT 活性，ADP 凝集能，コラーゲン血小1-4 術前 PT 測定値の意義 − 以上より，血小板

板凝集能，アンチトロンビン，可溶性フィブリン，凝集能の低下，及び PT 活性の低下が抗凝固療法を

PIC と負の相関を認めた（表 4）．

行なわない手術患者での出血リスクとなる可能性が9

ある．対象患者群での術前 PT, APTT 値をプロットすると（図 1）
，ほぼ全例が正常値であるものの，特anti-FXa activity

anti-FXa activity (U/ml of low dose heparin)に %PT の 個 人 差 が 認 め ら れ る （ PT (%):
96.77±13.16; APTT (sec) 33.17±7.352）．

PTPT (%)

150

100

50

0

PT (%)

5

4

3

2

1

0

0

200 400 600 800 1000
Edoxaban (ng/ml)

APTT
図2 エドキサバンによる抗FXa 活性の測定. 正常血漿にエ80

APTT (sec)

ドキサバンを種々の濃度で添加し，抗 FXa 活性をヘパリン
60

リキッド試薬を用いて測定した．データは平均 ± 標準偏差(n = 3-7)．

40

2-2 PT, APTT への影響 – 同様にヒトプール血漿20にエドキサバンを添加し，最も用いられる凝固検査0である PT, APTT の測定を行った（図 3）
．実際の測

APTT

定は以下の 2 種類を検討した．1) 測定装置：シスメ
図１ 術前 PT，APTT の分布図. 母集団の PT（％）(上)，ックス社の CA500，
試薬：トロンボチェック APTT，および APTT（秒）（下）をそれぞれプロットした．

PT，2) 測定装置：三菱化学メディエンス社のACLTOP，試薬はヒーモスアイエル APTT・PT．

新規経口抗凝固薬の in vitro における薬効評価

図 3 に示すように，PT，APTT 共にエドキサバンの2-1 抗 FXa 活性の測定 – 臨床試験の開始に先立ち，濃度依存性に延長した．また，トロンボチェック PT,

薬剤による抗 FXa 活性の測定ができるか検討した．

APTT 試薬の方が，エドキサバンによる凝固時間延正常ヒトプール血漿に DMSO で溶解した新規経口

長効果が強かった．

2.

抗 FXa 阻害薬エドキサバン[4]を添加し，抗 FXa 活
性をヘパリンキリッド試薬により測定した．健常人を対象とした試験では，薬剤 30 mg 内服時の薬剤血中濃度のピークは 1-2 時間後であり，200 ng/ml 程度と報告されている（医薬品インタビューフォーム
より）．
本試薬をもちいた検討でも薬剤濃度依存的に抗 FXa 活性がほぼ直線的に測定できた（図 2）．本
手法により，
内服時の抗 FXa 活性が測定可能と考え
られる．

10

PT

Diluted anti-FXa activity
CA500

40

PT (sec)

anti-FXa activity (U/ml of low dose heparin)

50

ACLTOP

30

20

10

0
0

200 400 600 800 1000
Edoxaban (ng/ml)
APTT

1.5

100%
66%
50%
33%

1.0

0.5

0.0

CA500

50 100 150 200
Edoxaban (ng/ml)

ACLTOP

図 4 希釈血漿に対するエドキサバンの抗 FXa 阻害効果.

100

0

250

APTT (sec)80

正常血漿 (100%)，をオーレンベロナール緩衝液で 66％，

60

50％，30％となるように希釈し，エドキサバンを種々の濃度40で添加し，抗 FXa 阻害活性を測定した．データは平均 ± 標
準偏差 (n = 6)．

200

一方で PT, APTT の測定値は，薬剤添加がなくと
0200 400 600 800 1000
Edoxaban (ng/ml)

も測定値が希釈に依存して延長し，特にヒーモスア
イエル APTT・PT (ACLTOP)で顕著であった（図 5，

図３ エドキサバンによる PT, APTT への影響. 正常血漿

図 6）
．薬剤添加により，PT，APTT は延長したが，にエドキサバンを種々の濃度で添加し，PT（上），APTT（下）薬剤添加による直線の傾き（薬剤感受性）は 50％希を自動分析器である CA500，または ACLTOP で測定した．

釈（正常血漿の 50%の凝固因子）程度までは大きく

データは平均 ± 標準偏差 (n = 3-6)．

変化しなかった（図 5，図 6）．

2-3 希釈検体への影響 – 日常臨床では，様々な基礎疾患をもつ患者が存在し，各凝固因子の予備能も異なることが予測される．凝固因子の予備能低下状
態を in vitro で再現するために，一定の割合で正常血漿を緩衝液で希釈し PT，APTT，及び抗 FXa 活性を測定した．正常血漿を段階的に希釈しても，血漿中の抗 FXa 活性は影響を受けなかった（図 4）．

11

Diluted PT (ACLTOP)

Diluted APTT (ACLTOP)

60
120

50

33%

33%
APTT(sec)

PT (sec)

100

40

30

50%

80
50%
60
66%
100%

66%

20

40

100%
10
0

50
100
150
Edoxaban (ng/ml)

0

200

50
100
150
Edoxaban (ng/ml)

200

Diluted APTT (CA500)

Diluted PT (CA500)
60
120

50
APTT (sec)PT(sec)

100

33%

40

30
50%
66%

20

60

100%

50
100
150
Edoxaban (ng/ml)

50%
66%
100%

40

10
0

33%
80

0

200

50
100
150
Edoxaban (ng/ml)

200

図 5 希釈血漿に対するエドキサバンの PT に対する効果.

図6 希釈血漿に対するエドキサバンのAPTTに対する効果.

正常血漿 (100%)，をオーレンベロナール緩衝液で 66％，

正常血漿 (100%)，をオーレンベロナール緩衝液で 66％，

50％，30％となるように希釈し，エドキサバンを種々の濃度

50％，30％となるように希釈し，エドキサバンを種々の濃度で添加し，PT 活性を測定した（上，ACLTOP; 下，CA500）．

で添加し，
APTT 活性を測定した（上，
ACLTOP; 下，
CA500）．

データは平均 ± 標準偏差 (n = 6)．

データは平均 ± 標準偏差 (n = 6)．

Ⅳ．考 察
最近の血栓止血学領域における大きな進歩として，
新規経口抗凝固薬の登場があげられる．2011 年に直接トロンビン阻害薬であるダビガトラン，また整形外科領域で抗FXa薬としてのエドキサバンが，2012
年からは，FXa 阻害薬であるリバーロキサバンとア
ピキサバンが相次いで承認された．従来は経口抗凝固薬としてワルファリンしか選択肢がなく，これらの薬剤の開発により，臨床の場での抗凝固療法の選択肢が格段に広がっている．

12新規経口抗凝固薬と従来のワルファリンとの違いの活性阻害を直接測定する手法が優れていると考えは大きく 2 つに分けられる．1 つはその作用機序でられる．

ある．ワルファリンがビタミン K 依存性凝固因子の一方，これらの特異的検査も血中濃度を間接的に総量を調節して“凝固因子の出来高“を制御するのに評価しているのみであり，この検査値を持って実臨

対して，新規抗凝固薬は直接活性型凝固因子の酵素

床での出血合併症の予測は困難である．特異的なア活性を阻害する[5]．もう 1 つは，薬剤血中濃度の変ッセイでは薬剤の血中濃度を反映するものの，患者動である．ワルファリンは半減期が長く，時間的に自身の他の凝固因子量が反映されないため，高齢者

均一な抗凝固作用を示すのに対し，新規抗凝固薬はなど凝固因子産生の予備能が低下している患者にお内服後 1−3 時間のピークを持ち，次回内服前には血いて薬剤の安全性を推定，つまり出血合併症の予見

中濃度は，内服前値近くまで低下する[5]．非弁膜症には優れていない可能性がある．抗凝固療法を行な性心房細動を対象とした臨床試験では，何れの薬剤っていない患者でも，実際の術前 PT 活性には正常も脳血栓塞栓症の予防効果はワルファリンと同等，値であっても個人差が生じており，
事実，
今回の我々

もしくはそれを上回る結果である[1-3]．特筆すべきの検討でも PT 活性値が術中や術後の出血量と多変は，脳出血の合併例が明らかに少ないことである．

量解析において関連した．新規経口抗凝固薬を使用

一方で，実診療においては，出血合併症の増加も懸する患者では，FXa 阻害活性と同時に，PT，また念されており，事前に出血合併症のリスクが高い患は APTT の測定により，凝固因子予備能を合わせて者群を何らかの手法で見出す必要がある．

評価することで出血合併症の予見が可能となるかも

日常臨床で一般的に用いられる凝固関連検査にはしれない．ただし，各試薬の薬剤感受性が異なるこプロトロンビン時間(PT)，活性化部分トロンボプラとから，試薬の標準化や各施設毎の検討が必要であ

スチン時間(APTT)がある．本研究では，経口抗 FXaる．また，抗凝固療法を行なっていない患者におい薬であるエドキサバンの添加をおこない，PT,APTTて，血小板機能も術中や術後出血に関与することかの変化を観察した．既報通り[6, 7]，PT, APTT 共にら，
抗 FXa 阻害薬投与を行う患者では非ステロイド

薬剤の濃度依存性に延長した．今回は異なる 2 種の性抗炎症薬 (NSAIDs)などの抗血小板作用をもつ

PT,APTT 試薬を用いたが，試薬による薬剤の感受薬剤の使用は可能な限り避けた方が無難であろう．

性が異なった．また有効薬剤血中濃度と思われる濃現在，進行中の抗凝固薬投与患者を対象とした臨床度の範囲内（〜200 ng/ml）では PT, APTT の延長研究において，これらの点を明らかにしたい．

は軽度にとどまった．さらに，PT や APTT は凝固

さらに，本研究で注目すべきは，同一条件での比因子希釈による影響を受け，さらに抗凝固薬を使用

較ではないものの，エドキサバンの治療域とされてしていない患者群の PT の値もある程度の個人差をいるピーク値の抗 FXa 阻害効果が，ヘパリンや低分

みとめた．以上より，PT や APTT の測定値のみで，子量ヘパリンの一般的な投与による血中濃度よりも各個人の抗凝固療法の効果をモニタリングすること明らかに高いことである．低分子量ヘパリンであるは困難と思われる．一方で，直接抗 FXa 因子の阻害

エノキサパリンを治療量である 2,000 単位を成人男

活性を測定する検査（本研究の場合はヘパリンリキ

子に単回投与した時にそのピーク抗 FXa 活性はッド試薬）は血漿希釈の影響を受けないため，正確0.25 ± 0.03 U/ml である．
また，
ダルテパリンを DIC

な薬剤血中濃度の推測ができる．ダビガトランに関

患者に 3,900 単位/日で持続投与した時の血中抗しても，直接プロトロンビンを活性化させるヘビ毒

FXa 活性は 0.09 - 0.11 U/ml である．未分画ヘパリ

エカリンを用いた凝固時間法（エカリン凝固時間）

ンを 50 単位/kg を 3 時間で投与（24 時間，体重 50kg

や希釈患者検体と正常血漿を混合しトロンビンを直で 20,000 単位/日）で 0.35 ± 0.09 U/ml となる（各，接添加し凝固時間を測定するトロンビン時間法を用

薬剤インタビューフォームより引用）．実臨床では，

いた方が薬剤の治療効果判定の面では優れていると添付文書上のエドキサバン 30 mg を用いると，術後報告されている[8]．以上より，これらの単一の凝固の出血合併症が増加するため（研究協力者の私見），

因子活性阻害を標的とした新規薬剤の血中濃度，お研究協力者の施設では主に 15 mg の減量投与を行よび治療判定の推測には，患者凝固因子活性の影響なっている．15 mg 投与においても，最高血中濃度を受けないように，トロンビン，または FXa と混合が 100 ng/ml と推測すると，それでもピークの抗した上で，それぞれの特異的な合成基質を用いてそFXa 阻害活性はエノキサパリンよりも高い．もちろ

13ん，新規経口抗凝固薬はアンチトロンビンを必要と

Dabigatran versus warfarin in patients with

せず，その作用機序が異なるが，各薬剤の阻害効果

atrial fibrillation. The New England journal ofをモニタリングしながら過剰量の薬剤を投与するこ

medicine 2009; 361: 1139-51.

とを避けること，また薬剤間のモニタリング値と臨

4. Camm AJ, Bounameaux H. Edoxaban: a new

床所見・治療効果の比較による新たな治療量の設定

oral direct factor xa inhibitor. Drugs 2011; 71:

を行うことが今後は肝要と思われる．

1503-26.
5. Turpie AG. New oral anticoagulants in atrial
fibrillation. European heart journal 2008; 29:

Ⅴ．結 論

155-65.

本研究では，日本人において新規抗凝固薬である
経口抗トロンビン薬や FXa 阻害薬を効果的，かつ安

6. Hillarp A, Baghaei F, Fagerberg Blixter I, et al.

全に使用できるための基礎的な検討を行った．従来

Effects of the oral, direct factor Xa inhibitor

用いられる PT や APTT では抗凝固療法の治療域をrivaroxaban on commonly used coagulation

確認することは困難である．一方で，患者凝固因子

assays. Journal of thrombosis and haemostasis :予備能も考慮した上記の検査は治療の安全域を担保

JTH 2011; 9: 133-9.

する可能性がある．現在，実際に新規抗凝固薬を投7. Lindahl TL, Baghaei F, Blixter IF, et al. Effects

与されている患者を対象とした臨床試験を進行させof the oral, direct thrombin inhibitor dabigatranており，安全かつ，効果的な薬剤の投与手法の開発

on five common coagulation assays. Thrombosisを目指したい．過去に出血合併症の発症抑制を目的

and haemostasis 2011; 105: 371-8.

として様々なモニタリング測定を行い比較した報告

8. van Ryn J, Stangier J, Haertter S, et al.

はなく，本研究は日本人の抗血栓療法に対して新た

Dabigatran etexilate--a novel, reversible, oral

なデータを提供すると考えられる．

direct thrombin inhibitor: interpretation of
coagulation assays and reversal of anticoagulant

Ⅵ．研究協力者

activity. Thrombosis and haemostasis 2010; 103:

木村 敦・自治医科大学整形外科学講座・講師

1116-27.

坂田飛鳥・自治医科大学分子病態治療研究センター
分子病態研究部 / 内科学講座循環器内科部門・大学
院生
岩瀬弘明・山梨県立中央病院整形外科・医長
窓岩清治・自治医科大学分子病態治療研究センター
分子病態研究部・講師
笹沼秀幸・自治医科大学整形外科学講座・助教
関矢 仁・自治医科大学整形外科学講座・准教授
苅尾七臣・自治医科大学内科学講座循環器内科部
門・教授

Ⅶ．参考文献1. Granger CB, Alexander JH, McMurray JJ, etal. Apixaban versus warfarin in patients withatrial fibrillation. The New England journal of
medicine 2011; 365: 981-92.
2. Patel MR, Mahaffey KW, Garg J, et al.
Rivaroxaban versus warfarin in nonvalvularatrial fibrillation. The New England journal of

medicine 2011; 365: 883-91.
3. Connolly SJ, Ezekowitz MD, Yusuf S, et al.

14

モデルマウスを利用した日本人の静脈血栓症の遺伝的特異性の解明
国立循環器病研究センター

分子病態部・研究員

坂

野 史 明

PS−K196E 変異および Plg−A620T 変異は、日本

Ⅰ．緒 言

人に特有かつ高頻度な血栓性遺伝子変異であり、白血液凝固、線溶やその制御に関わる因子の先天的人には見られない。このため、本邦で独自に両変異

異常は血栓症のリスクとなるが、原因となる遺伝子の影響を確立する必要がある。本研究では、PS−

変異は人種間で大きく異なる。白人では凝固第 V 因K196E 変異および Plg−A622T 変異をもつ遺伝子改子（FV）R506Q 変異（マウスでは R504Q 変異）

変マウスを用いて日本人の血栓症の遺伝的特徴、特が血栓症の遺伝的背景となっており、変異を保有すに欧米との違いを明確化し、これらのマウスを日本るモデルマウスも確立されているが 1)、この変異は人に適した選択的抗血栓療法を開発する上での動物

日本人には存在しない 2)。当研究室では、日本人静モデルとして確立することを目的とした。
このため、脈血栓症患者の遺伝的背景として凝固制御因子プロ

静脈血栓症モデル、脳虚血再灌流モデルおよび皮膚テイン S（PS）の K196E 変異を同定した 3)。静脈創傷モデルを用いて PS−K196E および Plg−A622T

血栓症発症に対してオッズ比 4.7〜5.6 を示す。本変

マウスの応答を白人型血栓症モデルである FV−

異は日本人の約 55 人に 1 人に認められ、約 1 万人

R504Q マウスと比較解析した。

がホモ接合体であると推計される。PS は活性化プ
ロテイン C（APC）の補酵素として機能する約Ⅱ．対象・方法

75kDa の血漿タンパク質であり、リン脂質膜上でAPC と複合体を形成して、活性化 FV および活性化【実験動物】

凝固第 VIII 因子の分解、不活性化を促進する。

野生型マウス、PS−K196E 変異ヘテロ接合体マウ

K196E 変異は、PS の APC 補酵素活性を低下させス（PS+/E ）、PS−K196E 変異ホモ接合体マウス

るため 4)、凝固亢進傾向をもたらすと考えられる。

（PSE/E）、PS 欠損ヘテロ接合体マウス（PS+/−）、Plg−A622T 変異ホモ接合体マウス（PlgT/T）および、

また、日本人には線溶因子プラスミノーゲン（Plg）の A620T 変異（マウスでは A622T 変異）も広く存

FV−R504Q 変異ホモ接合体マウス（FVQ/Q）1) の合在し、当研究室にて一般住民を対象に行った検討で

計 6 系統を解析対象とした。

もアレル頻度 2％（約 25 人に 1 人がヘテロ接合体）

PS−K196E 変異マウスは Pros1 遺伝子のエキソと高頻度に認められた 5)。全国で約 5 万人がホモ接ン 6 に一塩基置換 c.586A>G を導入したターゲティ

合体であると推計される。Plg はフィブリン分解反ングベクターを用いて、PS 欠損マウスは Pros1 遺応の鍵となる酵素プラスミンの前駆体であり、組織

伝子のエキソン 3 を欠失させるベクターを用いて、型やウロキナーゼ型 Plg 活性化因子により、プラス

Plg−A622T 変異マウスは Plg 遺伝子のエキソン 15

ミンに変換され、血栓を溶解する。A620T 変異はプに一塩基置換 c.1864G>A を導入したベクターを用

ラスミン活性を著減させるため 6)、変異保有者ではいて、それぞれ作製した。FV−R504Q 変異マウスは血栓溶解能が低下する。現在まで、本変異と血栓症

ジャクソン研究所から購入した。

との関連は示されておらず、一次的なリスクとはな

動物実験は国立循環器病研究センター動物実験委らないと予想されるが、変異保有者は感染や外傷、員会の承認を得て実施した。

手術等に引き続いて血栓症を発症する例があり、血【血漿 PS 補酵素活性・PS 抗原量測定】

栓形成を助長する要因が重なった場合には、血栓症

野生型、PS+/E、PSE/E、PS+/−マウスから全採血後、が引き起こる可能性がある。

15

1000 x g、10 分間遠心分離して血漿を回収した。マて末梢血血小板数を測定後、実体顕微鏡下に下大静

ウス血漿に段階希釈した組換え体マウス APC を添

脈内血栓を取り出し、その湿重量を測定した（図 2）。

加して 37℃、1 分間反応後、活性化部分トロンボプ
ラスチン時間測定試薬を加えて凝固時間を測定し、APC 添加による凝固時間延長を指標にPS 補酵素活性を群間で比較した 7)。また、抗ヒト PS ポリクローナル抗体を用いた ELISA により、血漿 PS 抗原量を測定した 7)。
【血漿 Plg 活性・Plg 抗原量測定】
野生型および PlgT/T マウス血漿に 0.1N 塩酸を加えて酸性化後、等量の 0.1N NaOH で中和した。この血漿にヒトウロキナーゼを添加して Plg をプラス

図 2 電気分解による DVT モデル

ミンに活性化した後、合成基質（S-2403）切断活性を血漿 Plg 活性として測定した 8)。また、血漿 Plg【三血管閉塞法による局所脳虚血再灌流モデル 12)】

抗原量を Mouse Plasminogen Total Antigen EIA

イソフルレン麻酔下、マウスの頭蓋骨にドリルでKit（Oxford Biomedical Research）を用いて測定穴を開け、左中大脳動脈 M1 末端部を電気焼灼してした。

閉塞した。両側総頸動脈を血管クリップで一過性に閉塞することで、左中大脳動脈支配領域に局所虚血【組織因子誘発肺塞栓モデル 9)】を誘導し、15 分後にクリップを外して再灌流させた。

【無機ポリリン酸誘発肺塞栓モデル 10)】

虚血負荷 24 時間後に神経学的スコアの判定を行っ

マウスに外因系凝固を活性化する組織因子あるいた後、脳を摘出してトリフェニルテトラゾリウムク

は、内在性の内因系凝固促進物質である長鎖無機ポ

ロライド（TTC）による生細胞染色を用いて脳梗塞

リリン酸を下大静脈から投与することで肺塞栓を惹

巣体積、浮腫率を判定した（図 3）。

起し、呼吸停止までの時間を 20 分間測定して生存率を調べた。また、呼吸停止 2 分後に右心室から青色色素 Evans blue を注入し、肺全体の染色像から 5段階の肺血管閉塞スコアを判定した（図 1）。

図 1 肺血管閉塞スコアの判定

図 3 三血管閉塞法による一過性局所脳虚血の誘導【電気分解による下大静脈障害深部静脈血栓症【皮膚創傷モデル 13)】

（DVT）モデル 11)】

トリブロモエタノール麻酔下、マウス背部を剃毛

トリブロモエタノール麻酔下、マウス下大静脈にし、生検トレパンを用いて直径 5 mm の皮膚全層欠ステンレス電極を挿入して 200µA・10 分間通電し損創を一匹あたり 4 ヶ所作製した。各創部の面積をた。電極の電気分解の結果生じるフリーラジカルに

経日的に 2 週間測定し、治癒過程の進行度に違いがより、血管内皮細胞が活性化し、血栓形成が誘発さ見られるかどうか解析した。

れる。生じる血栓が最大となる処置 2 日目に採血し16

肺塞栓を誘発後の生存率は、PS+/E、PSE/E、PS+/–おⅢ．結 果

よび FVQ/Q マウスで、いずれも野生型マウスに比べPS−K196E 変異マウス・PS 欠損マウス
PS−K196E 変異マウスは PS+/E、PSE/E マウス共にて低下した（図 4）。これら 4 系統の遺伝子変異マウ
スでは、肺血管閉塞スコアも野生型マウスに比べて正常に誕生し、繁殖能力も維持していた。少なくと上昇しており（組織因子誘発：野生型 = 1.1 ± 1.4，も通常の SPF 飼育条件下では、野生型マウスと見PS +/E = 2.2 ± 1.7，PS E/E = 2.5 ± 1.5，PS +/– = 2.7 ±1.5，FV Q/Q = 3.7 ± 0.6；無機ポリリン酸誘発：野生型 = 0.1 ± 0.4，PS +/E = 1.5 ± 1.4，PS E/E = 1.4 ± 1.3，
PS +/– = 1.8 ± 1.5，FV Q/Q = 2.7 ± 1.5；平均値 ± SD）、

かけ上の差異は見られなかった。一方、PS 欠損のホモ接合体マウスは既報と同様に胎生致死であり 7)、

PS+/−マウスのみ正常に誕生した。
【血漿 PS 活性・抗原量】

肺塞栓症状の重症化が認められた。

血漿 PS 補酵素活性を測定した結果、３系統の PS【電気分解による DVT モデル】

遺伝子変異マウス群において、いずれも野生型マウ

DVT モデル実験の結果、PSE/E、PS+/–および FVQ/Q

ス群に比べて活性低下が認められた。一方、血漿 PS

マウスでは野生型に比べて、下大静脈障害後に形成

抗原量は、PS+/–マウスでは野生型マウスの約 50％

される血栓重量が増加し（図 5）、消耗性と考えられに低下していたが、PS+/E および PSE/E マウスの抗原

る血小板減少（野生型 = 116 ± 29，PS +/E = 76 ± 34，

量は正常であった。ヒトと同様にマウスにおいてもPS E/E = 47 ± 32，PS +/– = 37 ± 10，FV Q/Q = 34 ± 24
x 104/µL；平均値 ± SD, N=12）も重篤化した。PS+/E

PS−K196E 変異は PS 発現量には影響せず、機能異常をもたらすことが明らかとなった。

マウスの血栓重量は野生型と有意差は見られなかっ【組織因子および無機ポリリン酸誘発肺塞栓モデル】

たが、血小板減少はより亢進していた。以上の結果

組織因子投与および無機ポリリン酸投与により、から、PS−K196E 変異は PS ヘテロ欠損や FV−
R504Q 変異と同様に、マウス静脈系血栓症の増悪要因となることが明らかとなった。

図 5 DVT 誘発 2 日後の下大静脈内血栓重量（平均値 ± SEM,
N = 12, ＊P < 0.01 vs. 野生型）

【局所脳虚血再灌流モデル】
三血管閉塞法による局所脳虚血再灌流障害モデルを用いた検討を行った。虚血負荷 24 時間後の脳梗
塞巣体積は、PS+/E、PSE/E および PS+/–マウスのいずれにおいても野生型マウスと違いは認められなかった（図 6）。脳浮腫率および神経学的スコアも 3 系統

図 4 肺塞栓誘発後の生存曲線 （A）組織因子誘発肺塞栓モデの PS 遺伝子変異マウスと野生型マウスで違いは無ル P < 0.05（野生型 vs. PS+/E），P < 0.005（野生型 vs. PSE/E,
PS+/–, FVQ/Q） （B）長鎖無機ポリリン酸誘発肺塞栓モデル P <0.05（野生型 vs. PS+/E），P < 0.005（野生型 vs. PSE/E, PS+/–,
FVQ/Q）

かった。一方、同じ脳虚血再灌流障害モデルを用いて FV−R504Q 変異マウスを解析した場合、FVQ/Q

17

マウスだけでなくヘテロ接合体マウスでも、野生型

生型マウスの約 20％に低下しており、Plg-A622T

マウスと比べて著明な脳梗塞症状の悪化が認められ変異がマウスでも線溶活性低下を引き起こすことがた 14)。このように PS−K196E 変異と FV−R504Q 変確認された。

異はマウス虚血性脳梗塞に対して異なる症状をもた【肺塞栓・DVT・脳虚血再灌流・皮膚創傷モデル】

らすことが明らかとなった。

肺塞栓モデルおよび DVT モデル実験の結果、PS
遺伝子変異マウスとは異なり、PlgT/T マウスの症状には野生型マウスとの差違は見られなかった。局所
脳虚血再灌流後の脳梗塞症状も PlgT/T マウスで悪化は認められなかったことから、Plg−A620T 変異はこ
れらの血栓性疾患の主病因とはならないと考えられる。
皮膚創傷モデル実験の結果、作製した皮膚創は野
生型マウス、PlgT/T マウスで共に 12〜14 日でほぼ完全に修復された。創面積の経日変化にも、両群間で違いは無く、プラスミノーゲン−A620T 変異は創傷治癒遅延の原因にもならないと考えられた。

Ⅳ．考 察
３種類の静脈血栓症モデルを用いた検討の結果、
PS−K196E 変異マウスでは、PS ヘテロ欠損マウス、
FV−R504Q 変異マウスと同様に、野生型マウスに比べて著明な静脈血栓形成亢進が認められた。この結果はヒト観察研究の結果に合致しており 3)、PS−K196E 変異保有者での静脈血栓症リスク上昇が、変異に基づいていることが確認できた。一方、局所脳
虚血再灌流モデル実験では、FV−R504Q マウスでの図 6 局所脳虚血再灌流 24 時間後の脳梗塞巣 （上図）脳切片

み野生型マウスに比して脳梗塞巣の拡大が認められ、の TTC 染色像（白い部分が梗塞巣） （下図）脳梗塞巣体積（N= 10~12，群間に有意差無し）

PS−K196E 変異マウスや PS ヘテロ欠損マウスに症状の悪化は見られなかった。FV−R506Q 変異は白人

Plg−A622T 変異マウスの若年性脳梗塞のリスク要因として報告されている

Plg−A622T マウスはヘテロ、ホモ接合体ともに正が 15)、PS−K196E 変異と脳梗塞との関連を示す報告

常に出生し、発育や生殖能力にも異常は見られなかはない。PS−K196E マウスはこれと矛盾しない表現

った。

型を呈しており、日本人型血栓症の治療応答性を解【血漿 Plg 活性・抗原量】

析するための優れた動物モデルであることが確認できた。

血漿プラスミノーゲン抗原量は、PlgT/T マウスで野生型マウスの約 50％に低下した。ヒト Plg−

Plg−A622T 変異マウスでは、血漿プラスミノーゲ

A620T 変異保有者に明らかな Plg 抗原量低下はみ

ン活性低下が認められ、ホモ接合体マウスの活性はられないため、マウス Plg−A622T 変異に特有の現野生型マウスの約 20％まで低下していた。プラスミ

象かもしれない。測定に使用した ELISA 系では抗ノーゲン欠損マウスでは、成長遅延や寿命の短縮、生殖能の低下などの異常が報告されているが 16)、

マウス Plg モノクローナル抗体を用いているため、変異によって抗体への結合親和性が低下した可能性

Plg−A622T 変異マウスにこうした異常は見られなもあり、結論を得るには別の測定系を用いた再確認

かったことから、本変異による線溶活性低下は胚発が必要である。PlgT/T マウスの血漿 Plg 活性は、野生および個体の成育上の問題とはならないと考えられる。肺塞栓、DVT、脳虚血再灌流モデルを用いた

18

検討において、Plg−A622T 変異マウスに野生型マウ

員スと比べて症状の悪化は見られなかった。日本人を含む東アジア人に広く分布する Plg−A620T 変異はⅦ．参考文献これらの動静脈血栓症を悪化させる主要因とはなら1)ないと推定される。この結果は日本人にとって朗報

Cui J, Eitzman DT, Westrick RJ, et al.:Spontaneous thrombosis in mice carrying

であるが、他の血栓性素因と Plg−A620T 変異が重the factor V Leiden mutation. Blood 2000 ;なることで症状を修飾する可能性が残っており、事96 : 4222-4226

実、本変異と PS−K196E を有する重症静脈血栓症

2)患者が存在する（未発表データ）。今後、Plg−A622T

Fujimura H, Kambayashi J, Monden M, etal.: Coagulation factor V Leiden mutationと PS−K196E の二重変異マウスの解析を通じて、

may have a racial background. Thromb

Plg−A622T 変異が PS−K196E 変異による血栓傾向

Haemost 1995 ; 74 : 1381-1382

を助長するか否か確認したい。

3)

Plg の活性化は血栓溶解だけでなく、細胞外マト

Kimura R, Honda S, Kawasaki T, et al.:Protein S-K196E mutation as a genetic risk

リックスの分解を介した組織の再構築にも寄与して

factor for deep vein thrombosis in Japanese

おり、Plg 欠損マウスでは、皮膚創傷治癒の著しい

patients. Blood 2006 ; 107 : 1737-1738

遅延が認められる 17)。しかし、Plg−A622T 変異マ

4)ウスに同様の皮膚創傷治癒遅延は認められなかった

Hayashi T, Nishioka J, Suzuki K.: Molecularmechanism of the dysfunction of protein S

ことから、プラスミノーゲン−A620T 変異体は創傷(Tokushima)

修復に必要な活性を残存しており、本変異は組織再(Lys155–>Glu)

for

the

regulation of the blood coagulation system.

構築異常にはつながらないと考えられる。

Biochim Biophys Acta 1995 ; 1272 : 159–167
5)

Ⅴ．結 論

Miyata T, Kimura R, Kokubo Y, et al.:Genetic risk factors for deep vein thrombosis

本研究により、PS-K196E 変異マウスが日本人型

among Japanese: importance of protein S

血栓症の適切なモデル動物であることが明らかとな

K196E mutation. Int J Hematol 2006 ; 83 :った。これにより、日本人の静脈血栓症に対する抗217-2236)血栓薬の薬効評価を動物個体レベルで進めることがKimura R, Sakata T, Kokubo Y, et al.:Plasma protein S activity correlates with

可能になった。
Plg−A622T 変異マウスには、肺塞栓、DVT、脳protein S genotype but is not sensitive to

梗塞および創傷治癒の症状悪化は見られないことがidentify K196E mutant carriers. J Thromb判明した。引き続き、PS-K196E 変異との二重変異

Haemost 2006 ; 4 : 2010-20137)

マウスを解析することで、血栓症修飾要因としてのSaller F, Brisset AC, Tchaikovski SN, et al.:作用の有無を検証し、日本人の血栓症における Plg—

Generation and phenotypic analysis of

A620T 変異の位置づけをはっきりさせる必要があ

protein S-deficient mice. Blood 2009 ; 114 :る。

2307-2314
8)

Ploplis VA, Carmeliet P, Vazirzadeh S, et al.:Effects of disruption of the plasminogen gene

Ⅵ．研究協力者

on thrombosis, growth, and health in mice.

宮 田 敏 行

Circulation 1995 ; 92 : 2585-2593

国立循環器病研究センター 分子病態部・部長

9)

Weiss EJ, Hamilton JR, Lease KE, et al.:Protection against thrombosis in mice

小 亀 浩 市lacking PAR3. Blood 2002 ; 100 : 3240-3244

国立循環器病研究センター 分子病態部・室長

10) Müller F, Mutch NJ, Schenk WA, et al.:Platelet田 嶌 優 子polyphosphates

proinflammatory

国立循環器病研究センター 分子病態部・流動研究

19

and

are

procoagulant

mediators in vivo. Cell 2009 ; 139 : 1143-1156
11) Diaz JA, Hawley AE, Alvarado CM, et al.:Thrombogenesis with continuous blood flowin the inferior vena cava. A novel mousemodel. Thromb Haemost 2010 ; 104 :366-375
12) Yanamoto H, Nagata I, Niitsu Y, et al.:Evaluation of MCAO stroke models innormotensive rats: standardized neocortical
infarction by the 3VO technique. Exp Neurol
2003 ; 182 : 261-274
13) Krampert M, Kuenzle S, Thai SN, et al.:ADAMTS1 proteinase is up-regulated inwounded skin and regulates migration offibroblasts and endothelial cells. J Biol Chem
2005 ; 280 : 23844-23852
14) Kita T, Banno F, Yanamoto H, et al.: Large
infarct and high mortality by cerebral
ischemia in mice carrying the factor V
Leiden mutation. J Thromb Haemost 2012 ;10 : 1453-1455
15) Hamedani AG, Cole JW, Mitchell BD, et al.:Meta-analysis of factor V Leiden andischemic stroke in young adults: theimportance of case ascertainment. Stroke2010 ; 41 : 1599-1603
16) Rømer J, Bugge TH, Pyke C, rt al.: Impaired
wound healing in mice with a disrupted
plasminogen gene. Nat Med 1996 ; 2 :287-29217) Bugge TH, Kombrinck KW, Flick MJ, et al.:Loss of fibrinogen rescues mice from thepleiotropic effects of plasminogen deficiency.
Cell 1996 ; 87 : 709-719

20