Stable Isotopes for

Biomolecular NMR

大陽日酸株式会社
メディカル事業本部 SI事業部〒142-8558 東京都品川区小山1-3-26 東洋Bldg.
TEL.03-5788-8550 FAX.03-5788-8710
E-mail:Isotope.TNS@tn-sanso.co.jp
http://stableisotope.tn-sanso.co.jp/

MJ-45(15.06)0.6K.TI

http://stableisotope.tn-sanso.co.jp

安定同位体標識技術が拓くBiomolecular NMR

平素より、大陽日酸の安定同位体をご愛顧いただき、厚くお礼申し上げます。

タンパク質の立体構造、動態あるいは相互作用などを原子レベルで解析可能な N M R 法は、生命科学、医学

このたび、Biomolecular NMR 専門の安定同位体カタログを発行することとなりました。

および薬学などへの学術的意義に留まらず、医薬品、食品および環境関連分野を含む幅広い産業分野におい

近年、生命科学分野において、核磁気共鳴法（NMR）
は、生体分子の構造や相互作用を解析する手法として発展して不可欠な基盤技術へと発展してきました。特に最近では、創薬ターゲットとして膜タンパク質、抗体、糖タてきました。特に、生体分子試料を安定同位体標識する技術の高度化で、NMRのアプリケーションはさらに広がり

ンパク質、核酸およびそれらの複合体などの重要性が高まっており、これらを対象とした N M R 測定・解析がを見せています。

盛んに行われております。しかしながら、これらの解析対象は、分子量の大きさに起因する N M R シグナルの本カタログでは、日本を代表する先端研究者の皆様に、Biomolecular NMR 研究における安定同位体利用技術‥についてご寄稿いただきました。これにあわせて、各種安定同位体（アミノ酸、
ケト酸、
核酸、
培地等）
やタンパク質‥合成キットをご紹介しております。本カタログが、Biomolecular NMR 研究にたずさわる皆様の一助になることを確信しております。この場をお借りして、ご寄稿いただきました先端研究者の皆様に深く感謝いたします。

広幅化や縮重などの問題に加えてサンプルの調製自体も難しく、解析に資するNMR スペクトルを得る事が困難な場合が多いのが現状です。
タンパク質の高分子量化に伴う広幅化や縮重に対する解決法として、高分子量タンパク質中のメチル基を観測対象としたMethyl-TROSY 法が広く利用されております。このMethyl-TROSY 法では、タンパク質中の特大陽日酸は、無細胞タンパク質合成キット「無細胞くん」をはじめとして、SAILテクノロジーズ製「SAILアミノ酸」、

定のメチル基のみを観測可能にするメチル基選択的な安定同位体標識タンパク質を測定サンプルとして使用

ISOTEC® 製「D、C、N 標識化合物」等の幅広い品ぞろえで、Biomolecular NMR 研究に貢献してまいります。今後します。この技術では、安定同位体標識されたアミノ酸前駆体を大腸菌発現系などの培地に添加することにとも、大陽日酸の安定同位体をご愛顧いただきますよう、よろしくお願いいたします。

より、アミノ酸生合成経路を利用して系中においてメチル標識イソロイシン、ロイシン、バリンを合成し、こ13

安定同位体標識技術が拓く
Biomolecular NMR

ご挨拶

ご挨拶

15

れらの合成されたメチル標識アミノ酸がタンパク質合成に利用されることによりメチル選択的安定同位体標識タンパク質試料が調製されます。最近では化学合成された立体選択的メチル標識バリンやロイシンなどの2015 年 6月
大陽日酸株式会社

遊離アミノ酸を各数十 mg/L 程度培地に添加することにより、タンパク質中のバリン残基のγ1、γ2 あるいはメディカル事業本部

ロイシン残基のδ1、δ2 のメチル基を立体選択的に標識する技術も開発されました。またアラニン、メチオ

SI事業部

ニン、トレオニンなどのアミノ酸においても同様に、それらのメチル基を安定同位体標識したアミノ酸を用いることにより、これらのアミノ酸残基側鎖のメチル基を同位体標識したタンパク質の調製が可能です。
NMR 用の安定同位体標識タンパク質調製技術としては、無細胞タンパク質合成法が大腸菌発現系と並んで目次
ご挨拶‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ P1
安定同位体標識技術が拓くBiomolecular NMR‥ ‥‥‥ P2
巻頭言 荒田洋治‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ P3■ 無細胞タンパク質合成を用いる安定同位体標識‥‥‥ P5
木川隆則（理化学研究所）■ タンパク質合成キット「無細胞くん」
		 ● 無細胞くん‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ P8
		 ● 無細胞くん用安定同位体標識アミノ酸‥‥‥‥‥ P8
		 ● 特徴‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ P9■ アミノ酸‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ P11■ SAIL 法により拡がるタンパク質 NMRの未来‥‥‥‥ P14
甲斐荘正恒（東京都立大学）
SAIL アミノ酸‥ ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ P18■ メチル標識アミノ酸, 芳香族標識アミノ酸‥ ‥‥‥ P19■■ 糖タンパク質の安定同位体標識‥ ‥‥‥‥‥‥‥‥ P25
加藤晃一（自然科学研究機構）■ 培地
		 ● 標識培地 ISOGRO®‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ P27
		 ● 標識培地用試薬‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ P27■ 糖‥ ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ P28■ 安定同位体標識核酸を用いたNMR 解析‥ ‥‥‥‥‥ P29
河合剛太（千葉工業大学）
核酸
		 ● DNA‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ P31
		 ● RNA‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ P31
		 ● 安定同位体標識 DNA/RNA 受託合成‥ ‥‥‥‥‥ P31■■ タンパク質とタンパク質や核酸等との相互作用‥ ‥ P32
西村善文（横浜市立大学）
各種安定同位体標識試薬		 ■ FMOCアミノ酸‥ ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ P35
		 ■ BOC アミノ酸‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ P36
		 ■ Water-17O‥ ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ P36
		 ■ バッファー, 界面活性剤, 還元剤 他‥ ‥‥‥‥‥ P37
		 ■ ユビキチン‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ P37
		 ■ ファージ‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ P37■■ 膜タンパク質機能解明における安定同位体の利用‥ P21
幸福裕、嶋田一夫（東京大学）
α- ケト酸		 ● 2-Ketobutyric acid‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ P23
		 ● 2-Keto-3-methylbutyric acid‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥ P24■＜記号説明＞

01

広く利用されるようになってきました。無細胞タンパク質合成系は、大腸菌系では発現が困難な細胞毒性を有す
るタンパク質の調製が可能であるという利点に加え、少量の標識アミノ酸を代謝拡散させずに目的のタンパ
ク質に組み込こませることも可能なため、メチル標識技術をはじめSAIL（ Stereo-Array Isotope Labelling；立体整列同位体標識）法などの特定のアミノ酸残基側鎖の位置・立体選択的安定同位体標識に最適なタンパク質合成法としても利用されております。
一方、核酸や糖タンパク質などは、解析対象としての重要性は理解されているものの、無細胞系や大腸菌系を用いた方法では安定同位体標識サンプルを調製することは困難な為、現在まで様々な安定同位体標識技術の研究が進められてきました。核酸の安定同位体標識においては、酵素合成法や安定同位体標識アミダイト
ユニットを用いた化学合成法による安定同位体標識技術が報告されており、これらに使用する様々な安定同位体標識核酸が市販されております。また糖タンパク質においては、動物細胞、昆虫細胞、酵母など様々な
真核細胞発現系を利用した代謝標識技術が極めて有効であり、これらに使用する代謝前駆体の安定同位体標識の研究開発や製品化が展開されております。
Biomolecular NMRが今日の発展を遂げた背景には、過去半世紀にわたり積み重ねられたNMR 研究者による多大な安定同位体標識技術の研究成果が大きな基盤となっております。大陽日酸は、このような安定同位体
標識技術の研究成果の普及を通じて、最先端の N M R 研究環境の整備や幅広い N M R 応用研究の支援に努めてまいります。

毒 劇 ・・・・・ 毒物および劇薬取締法に基づく該当品目
労

・・・・・

労働安全衛生法に適用された品目

TAIYO NIPPON SANSO Stable Isotopes for Biomolecular NMR

TAIYO NIPPON SANSO Stable Isotopes for Biomolecular NMR

02

巻頭言

巻頭言

巻頭言
安定同位体と構造生物学

何ごとにも、歴史がある。石器時代があって現代がある。
NMRの石器時代については、2011 年 4 月、
【NMR50 年 Ⅰ-Ⅴ】
をブログに書いた。
http://yojiarata.exblog.jp/12459664/
1960 年、藤原鎭男先生の門を叩く。
ある時、「これを使いなさい」のお言葉と共に、β位の2個の水素原子のうちの1個が選択的に重水素化されているアス

重水中で緑藻を培養中‥（Jardetzky 研究室，1972 年 12 月撮影）

パラギン酸を渡された。例によって、どのように使いなさいとは、一切口にされない。

重水100リットルの巨大なドラム缶（Jardetzky 研究室，1972 年 12 月
撮影）

同じ頃，藤原先生から，「大切に使うように」のお言葉とともに渡された重水１ミリリットル，余りの勿体無さのため，棚に飾ったまま未使用（後日，撮影）.

Jardetzkyのナチス・ドイツに対する怨念は渡米後も消えることがなかった。1986 年、ドイツのTodtmoosで開かれた
小さく細いガラスのチューブに“ アスパラギン酸 ”は入っていた。今にして思えば、これが我が人生の岐路であった。

第 XII 回 ICMRBSの招待講演者から外されたことに対する怒りの手紙を、学会主催者のHausser 教授に送り、それに留
まらず、コピーを多数の研究者にも送った。私もその手紙を受け取ったことから見て、世界中の研究者がこの手紙の“ アスパラギン酸 ”は、次の流れで私の手に渡ったことをあとで知った。

内容を知るところとなったことは間違いない。この件以来、Jardetzkyは世界中のNMR コミュニティーから孤立することになった。私の個人的な感想を言えば、鬼才を “ 失った ” ことは如何にも残念である。タンパク質の選択的重水素藤原鎭男（電気通信大学、当時）←田宮信雄（東京医科歯科大学、当時）←竹西忠男（味の素）←甲斐荘正恒（味の素、当時）化を世界で最初に始めたのもJardetzky。M. Cohen、R. G. Shulmanと共にICMRBS（1964 年 7 月 20-22 日。ボストン）を立ち上げたのもJardetzkyだからである。

藤原研で、アミノ酸の N M R の測定を中心に研究を進めていた頃、アミノ酸どころかタンパク質のスペクトル①が、すJardetzkyは、Harvard 大学医学部の助教授に就任後、独自にタンパク質のNMR 研究を進めたのち、職を辞し（いつも

でに、1957 年のJACSに掲載されていることを知った。このスペクトルを見た私のような凡人の頭には、hopelessといのように、一言多いのが災いしたと聞いた）、メルク社の N M R 部門の所長として、タンパク質の選択的重水素化とう言葉しか浮かばなかった。

いう大プロジェクトを立ち上げた。数年を要したこのプロジェクトの中心にいたのが H a r v a r d 以来の “凸凹コンビ ”‥
Oleg Jardetzky + John Markleyだった。最初の論文が、1968 年のサイエンスに掲載された。培養技術と有機化学の融

しかし、これをhopelessと捉えない人物がいた。Oleg Jardetzkyである。祖国から、ナチス・ドイツの侵攻を逃れて渡合による画期的な成果だった。
（スペクトル②）

米、Minnesota 大学医学部で学位を取得、CaltechのLinus Paulingのポスドクになった。その後、Paulingとの親交は終1971 年 1 月、私は、Stanford University Medical Centerの分子薬理学研究室を主宰するJardetzky教授のポスドクになっ生続くことになる。

た。36歳のポスドクは気の毒だといって、教授会で、私を“ 客員助教授 ”に推挙してくれた。給与も上がり、有難かった。
①②

医学部の ANATOMYの看板が、S T R U C T U R A L B I O L O G Y と書き換えられたのが丁度その頃だったと記憶している。
Lubert StryerがYaleから招かれ、1976 年、構造生物学センターの初代所長に就任した。
注目する特定の水素、炭素、窒素原子にピントを合わせ、“ 生きた ” 生体高分子を生きたまま見る。これは、N M R にしかできないことである。
現在では、この冊子に記述されているように、レベルの高い研究が日本でも活発に行われている。

Saunders, M., Wishnia, A., Kirkwood, J. G. The nuclear magnetic
resonance spectrum of ribonuclease. J. Am. Chem. Soc.,79,3289-3290, (1957)

John Markley 博士の博士論文より引用. Staphylococcus Aureus の生産するヌク
レアーゼの芳香族領域の100MHz 1H NMRスペクトル, フェニルアラニンは全重水素化されている. ヒスチジンのイミダゾール環の4 位 , チロシンのフェノール環の3 位および4 位は重水素化されている.

今や、最新鋭のNMR 分光計が揃った。若者よ、あとは実行あるのみだ！
平成 27 年 5 月 31 日
東京大学名誉教授

03

TAIYO NIPPON SANSO Stable Isotopes for Biomolecular NMR

TAIYO NIPPON SANSO Stable Isotopes for Biomolecular NMR

04

タンパク質の安定同位体（stable isotope、以下 SI）標

β - 位において軽水素（1H ）による重水素希釈が起こる

識は、C F 反応液中の対象アミノ酸を S I 標識したものとために、大腸菌細胞抽出液をはじめとするすべての試薬

木川隆則

置き換えることにより行う。一般に C F では、効率的なを、重水（2H 2O ）を用いて調製する必要があった。一方、理化学研究所生命システム研究センター
チームリーダー

翻訳のためにカリウムイオンが必要であり、通常、カリアミノ酸における軽水素との交換は、ピリドキサール

ウムイオン源として L- グルタミン酸カリウムが使用さ5'-リン酸（PLP）
要求性酵素により触媒されることが報告れる（Kigawaら、1995）。しかし、高濃度のSI 標識されてされている。これに着目し、PLP 要求性酵素の阻害剤をいない L- グルタミン酸カリウムの存在は S I 標識率を著加えることにより、均一重水素標識アミノ酸を用いて、しく低下させることとなる。そこで、高いSI 標識率を維反応溶液に軽水を用いた C F によって、均一重水素標識

持したうえ、生産性の高いCFを実現するために、カリウタンパク質を調製、95a t o m % 以上の重水素標識率を達

翻訳の基質を含む外部溶液（外液）に対して透析する。

ムイオン源としてD- グルタミン酸カリウムを用いるCF

成した（Yokoyamaら、2011）。

synthesis system、以下 CF）の技術の進展により、様々

反応時間は数時間から一晩程度であり、CAT タンパク質（D-Glu 系）が開発された（Matsudaら、2007）。理化学研

な真核生物および原核生物のタンパク質を大量に生産の実施例では、10 時間反応で反応混合物 1m L あたりタ

究所では、このD-Glu 系を用いて、ヒト、マウスおよびシすることが可能となった。大腸菌、ウサギおよびコムギ

ンパク質 7mgを超える生産となった（Kigawaら、2007）。

ロイヌナズナなどの高等真核生物由来の 1,000 を超える

アミノ酸選択的 S I 標識は、N M R 低感度およびスペク

胚芽細胞抽出液を C F 反応液として用いる従来の系に加1mL 内液 /10mL 外液から9mL 内液 /90mL 外液までの反13

C / N - 均一標識タンパク質が調製されている。これら

トル重複という問題を解決するために広く用いられてえ、真核細胞抽出液を用いる新しい系が開発されるな

応スケールにおいて、反応液量に対する透析膜表面積のタンパク質のNMR スペクトルは、高いSI 標識率で、こおり、さらに、高分子量タンパク質とそれらの複合体をど、多様な発現環境でタンパク質を得ることが可能との比率を最適化することで、反応液当たりの生産性をれまでにない質を有していた。また、N M R 分光法にお解析するために不可欠なものとなっている。一般の C Fなっている。一方、今世紀に入り、ヒトゲノムの解析が同等に維持できる。

ける分子サイズの限界を広げることが期待される立体

では、アスパラギン酸、アスパラギン、セリンおよびア

CFでは、PCRにより増幅された直鎖状 DNA断片を鋳型

整列同位体標識（Stereo-Array Isotope Labeling、SAIL）
法

ラニンなどの特定のアミノ酸を除くほとんどすべての析に科学的興味が注がれ、膨大な数のタンパク質試料としてタンパク質を生産できる。そのため、遺伝子クロー（Kainoshoら、2006）
は、CFによる「均一」SI 標識の応用

種類のアミノ酸の選択的標識を可能にするが、わずかを効率的かつ迅速に調製する必要性が高まった。CFは、ニングが不要であることが大きなメリットの一つとなっのひとつとして注目される。

な同位体スクランブリングおよび希釈を伴う（Kigawa

自動化やハイ・スループット発現に容易に適用できるている。理化学研究所は、大腸菌細胞の培養温度をやや通常、均一 S I 標識には、単離されたSI標識 アミノ酸‥

ら、1995）。C F の内在性代謝反応を、それらの化学阻害ため、そのような必要性に応える最適な技術として、構低い範囲（20 〜 34℃）にする細胞抽出液調製プロトコー

1〜 20種類が用いられるが、そのコストは高額となるこ剤であるアミノオキシ酢酸、D- リンゴ酸、L- メチオニン

造ゲノミクスおよびプロテオミクス・プロジェクトでルにより、細胞抽出液中の直鎖状 D N A 分解活性を大幅とが多い（ K i g a w a ら、2010）。このコストを低減するた

スルホキシイミン、S - メチル - L- システインスルホキシ

利用され（Yokoyamaら、2003）、最も有用なタンパク質に抑制することを見出し、それにより、透析系を用いる

めには、それらを用いる代わりに、S I 標識藻類由来タン

イミン、6- ジアゾ -5- オキソ - L- ノルロイシン、および 5-発現方法のひとつとして広く認められるようになった。

大スケールの生産であっても、PCR 増幅鋳型を用いて十パク質バイオマスの酸加水分解物から生産される、より

ジアゾ -4- オキソ - L- ノルバリンを用いて抑制すること

現在、理化学研究所の構造生物学研究では、大腸菌細胞

分な生産性を実現することに成功した（Sekiら、2008）。

安価なSI 標識藻類加水分解アミノ酸混合物（algal amino

で、正確かつ完全なアミノ酸選択的標識が実現された

acid mixture、AAAM）
を使用することが推奨される。し（Yokoyamaら、2011）。SI 標識の正確さと完全性が、新かしながら、加水分解アミノ酸混合物（アミノ酸16種類）

しく開発されたSI 標識戦略にとって有用であるため、こ前述のように、C Fは自動化やハイ・スループット発現には含まれておらず、はるかに高価なS I標識アスパラギの、スクランブリングおよび標識の希釈の起こらない S Iに容易に適用できる。そのメリットを最大限に活用す

ン、グルタミン、システインおよびトリプトファンが必

標識技術は、大きく複雑な生体系の N M R 解析に大きくるため、全自動 CF 装置が様々な機関で開発されている。

要となる（Kigawaら、1999）。そのため、CFを用いるSI 標

貢献するであろう。アミノ酸代謝の抑制もまた標識効

理化学研究所では、1）タンパク質の発現確認を768 試料

識のコストはこの4 つの酸分解アミノ酸に大きく依存す率を高める一因となり、SI 標識のコスト低減に貢献する

当初、C F ではタンパク質を大量生産できないという

同時に 9 時間以内で実施する装置（鋳型作成のためのる。そこで、内在性代謝による変換をうまく利用するこことが期待される。

問題があった。しかしこれは、C F の技術革新である連PCR 反応（Yabukiら、2007）、バッチ式 CF反応（30 μ L）、とにより、CF反応の際にSI 標識 AAAM、SI標識インドー

イソロイシン、ロイシンおよびバリン残基のメチル基続交換法の開発（ S p i r i n ら、1988）や反応条件の最適化

GFP 融合産物の蛍光測定（Kigawaら、2007）、等の機能を

ルおよび硫化ナトリウムなどの安価な原材料からこれの選択的プロトン化もまた、N M R 分光法における分子（Yabukiら、1998）等により解決された。現在では、大腸有する）、2）タンパク質を96 種類大量に半日で調製するらの4 つのアミノ酸を生成する（Yokoyamaら、2010）
こ

量限界を高めた（TugarinovおよびKay、2003）。近年我々

菌細胞抽出液を C F 反応液として用いた連続交換法に装置（透析式 C （F 内液 1mL）、アフィニティ精製、等の機とにより、単離された SI 標識アミノ酸 20 種類を使用す

は、CFにより調製された、メチル基を選択的にプロトン

よって容易にタンパク質を大量生産することが可能と能を有する（Aokiら、2009））、を開発した。約 20,000 種類

る従来の場合と比べて、コストが大幅に削減された。

化した試料を用いて、約 400 残基のタンパク質の構造決■ 緒言
近年、無細胞タンパク質合成系（ C e l l - F r e e p r o t e i n

完了した結果、その機能としてのタンパク質の網羅的解アミノ酸類やヌクレオチド三リン酸などの転写および抽出液に基づく転写 - 翻訳共役 C F が標準的なタンパク質発現方法の一つとなっており、タンパク質およびタン
パク質ドメインの1,300 を超えるNMR 構造と250 を超えるＸ線結晶解析構造が決定されている。
■ タンパク質の大量生産

■ 自動化

15

なっている。連続交換法すなわち透析式 C F は、小量生のタンパク質試料を、P C R 増幅直鎖状 D N A 鋳型を用い一般に、均一重水素（ H）標識は、より分子量の大きな産から大量生産まで最も普及している反応様式である

る透析法 CFにより調製し、それらのNMR スペクトルのタンパク質の解析に利用されている。生細胞を用いた従（K i g a w a ら、2007）。透析膜内部の C F 反応液
（内液）
を、
‥

測定に成功した（Kigawaら、2007）。

来のタンパク質生産では困難な均一重水素標識が、均

本文は「ISOTEC® Stable Isotopes in vitro Protein Expression Kit (iPE)」への寄稿文を翻訳したものです。

05を用いる従来のCFでは、特定のアミノ酸のα - 位および■ 均一安定同位体標識

TAIYO NIPPON SANSO Stable Isotopes for Biomolecular NMR

2■ アミノ酸選択的安定同位体標識

無細胞タンパク質合成を用いる安定同位体標識

無細胞タンパク質合成を用いる安定同位体標識

無細胞タンパク質合成を用いる安定同位体標識定に成功している。
■ 部位特異的安定同位体標識

一重水素化標識アミノ酸を用いるCFにより実現された

部位特異的 S I 標識は、関心部位のある特定のアミノ（Etezady-Esfarjaniら、2007）。ただし、反応液に軽水
（1H2O）

酸残基の観測およびシグナル帰属を大幅に簡素化する

TAIYO NIPPON SANSO Stable Isotopes for Biomolecular NMR

06

ため、巨大タンパク質の局所構造およびタンパク質間として評価されている（Shimonoら、2009、Sobhanifarら、

理化学研究所の高度な無細胞タンパク質合成技術をキット化いたしました。大腸菌抽出液を用いており、高い同位体標識

相互作用の解析等において有用である。アンバー（コ2010、Nguyenら、2010）。毒性およびタンパク質分解の回

ドン U A G ）サプレッションを用いる C F により、非天然避などのCFの一般的な利点に加え、膜タンパク質は、機

アミノ酸の部位特異的取り込みが行われた（ N o r e n ら、能的フォールディングのために共翻訳的に膜内に直接■ 無細胞くん1989）。我々は、ほぼ同じ方法を用いることにより、SI 標

組み入れることが可能である。

タンパク質合成キット「無細胞くん Quick」

効率で迅速・簡便にNMR 測定に充分な量の安定同位体標識タンパク質を合成できます。

識チロシンのRas タンパク質への部位特異的（Tyr ）導入
32（Yabukiとその1H-15N HSQCスペクトルの測定に成功した■ 今後の展望ら、1998）。チロシン以外の S I 標識アミノ酸の部位特異タンパク質の高度化されたSI 標識を実現するために、的な取り込みも、アミノアシル化されたサプレッサー

C F にはまだ変更および改良の余地がある。新たなN M R

tRNAの利用により可能である。

法と組み合わせて、生体分子 N M R の可能性をさらに広げることが期待される。

■ 膜タンパク質

製品名

数量

A29-0058

無細胞くんQuick 注1

1キット

■ 特徴
タンパク質発現確認用キットです。クイック液には非標識アミノ酸を‥はじめ、必要な成分がすべて含まれておりますので、テンプレート
D N A を添加して1 時間インキュベートするだけで、簡便にタンパク質を合成できます（CATタンパク質最大合成量 800μg/mL）。

■ キット内容● 無細胞くんQuick クイック液
1mL × 1 本‥		
（50μL 反応×20 回相当分）● コントロールDNA（pUC-CAT）注 2 50μL×1本

現在、CFは、従来のin vivo生産の主要な制限を克服す
安定同位体標識タンパク質合成キット「無細胞くん SI」

るための、構造解析用膜タンパク質の生産に適切な方法

製品番号1）Yokoyama, S. (2003) Protein expression systems for structural
genomics and proteomics. Curr. Opin. Chem. Biol., 7. 39-43.
2）Yabuki, T., Kigawa, T., Dohmae, N., Takio,K., Terada, T., Ito,Y.,
Laue, E., Cooper, J., Kainosho, M.and Yokoyama, S. (1998) Dualamino acid-selective and site-directed stable-isotope labelingof the human c-Ha-Ras protein by cell-free syntesis. J. Biomol.
NMR, 11, 295-306.
3）Spirin, A. S., Baranov, V. I., Ryabova, L. A., Ovodov, S. Y. andAlakhov, Y. B. (1988) A Continuous Cell-Free Translation
System Capable of Producing Polypeptides in High Yield.
Science, 242, 1162-1164.
4）Kigawa, T., Matsuda, T., Yabuki, T. and Yokoyama, S. (2007) In
Spirin, A. S. and Swartz, J. R. (eds.), Cell-free Protein Synthesis
Methods and Protocols. Wiley-VCH, Weinheim, pp. 83-97.
5）Seki, E., Matsuda, N., Yokoyama, S. and Kigawa, T. (2008)
Cell-free protein synthesis system from Escherichia coli cells
cultured at decreased temperatures improves productivity bydecreasing DNA template degradation. Anal. Biochem., 377,
156-161.
6）Yabuki, T., Motoda, Y., Hanada, K., Nunokawa, E., Saito, M., Seki,
E., Inoue, M., Kigawa, T. and Yokoyama, S. (2007) A robust
two-step PCR method of template DNA production for highthroughput cell-free protein synthesis. J. Struct. Funct.‥
Genomics, 8, 173-191.
7）Aoki, M., Matsuda, T., Tomo, Y., Miyata, Y., Inoue, M., Kigawa,T. and Yokoyama, S. (2009) Automated system for highthroughput protein production using the dialysis cell-freemethod. Protein Expr. Purif., 68, 128-136.
8）Kigawa, T., Inoue, M., Aoki, M., Matsuda, T., Yabuki, T., Seki,E.,
Harada, T., Watanabe, S. and Yokoyama, S. (2007) In Spirin, A.
S. and Swartz, J. R. (eds.), Cell-free Protein Synthesis Methods
and Protocols.Wiley-VCH, Weinheim, pp. 99-109.
9）Kigawa, T., Muto, Y. and Yokoyama, S. (1995) Cell-freesynthesis  and amino acid-selective stable isotope labeling ofproteins for NMR analysis. J. Biomol. NMR, 6, 129-134.
10）
Matsuda, T., Koshiba, S., Tochio, N., Seki, E., Iwasaki, N., Yabuki,T., Inoue, M., Yokoyama, S. and Kigawa, T. (2007) Improving
cell-free protein synthesis for stable-isotope labeling. J.
Biomol. NMR, 37, 225-229.
11）
Kainosho, M., Torizawa, T., Iwashita, Y., Terauchi, T., Mei Ono,
A. and Guntert, P. (2006) Optimal isotope labelling for NMR
protein structure determinations. Nature, 440, 52-57.

製品名

A29-0059

参考文献

07

製品番号

タンパク質合成キット「無細胞くん」

無細胞タンパク質合成を用いる安定同位体標識

タンパク質合成キット「無細胞くん」

12）Kigawa, T. (2010) Cell-free protein production system with
the E. coli crude extract for determination of protein folds.
Methods Mol, Biol., 607, 101-111.
13）Kigawa, T., Yabuki, T., Yoshida, Y., Tsutsui, M., Ito, Y., Shibata,T. and Yokoyama, S. (1999) Cell-free production andstableisotope labeling of milligram quantities of proteins.
FEBS Lett., 442, 15-19.
14）Yokoyama, J., Matsuda, T., Koshiba, S. and Kigawa, T. (2010)
An economical method for producing stable-isotope labeledproteins by the E. coli cell-free system. J. Biomol. NMR, 48,
193-201.
15）Etezady-Esfarjani, T., Hiller, S., Villalba, C. and Wüthrich, K.
(2007) Cell-free protein synthesis of perdeuterated proteinsfor NMR studies. J. Biomol. NMR, 39, 229-238.
16）Yokoyama, J., Matsuda, T., Koshiba, S., Tochio, N. and Kigawa,T. (2011) A practical method for cell-free protein synthesis to
avoid stable isotope scrambling and dilution. Anal. Biochem,
411, 223-229.
17）Tugarinov, V. and Kay, L. E. (2003) Ile, Leu, and Val methyl
assignments of the 723-residue malate synthase G using a
new labeling strategy and novel NMR methods. J. Am. Chem.
Soc., 125, 13868-13878.
18）Noren, C. J., Anthony-Cahill, S. J., Griffith, M. C. and Schultz, P.
G. (1989) A General Method of Site-Specific Incorporation ofUnnatural Amino Acids into Proteins. Science, 244, 182-188.
19）Shimono, K., Goto, M., Kikukawa, T., Miyauchi, S., Shirouzu, M.,
Kamo, N. and Yokoyama, S. (2009) Production of functional
bacteriorhodopsin by an Escherichia coli cell-free protein
synthesis system supplemented with steroid detergent andlipid. Protein Sci., 18,2160-2171.
20）Sobhanifar, S., Reckel, S., Junge, F., Schwarz, D., Kai, L.,
Karbyshev, M., Lohr, F., Bernhard, F. and Dotsch, V. (2010)
Cellfree expression and stable isotope labelling strategies formembrane proteins. J. Biomol. NMR, 46, 33-43.
21）Nguyen, T. A., Lieu, S. S. and Chang, G. (2010) An Escherichia
coli-based cell-free system for large-scale production offunctional mammalian membrane proteins suitable for X-ray
crystallography. J Mol Microbiol Biotechnol, 18, 85-91.

TAIYO NIPPON SANSO Stable Isotopes for Biomolecular NMR■ キット内容● 無細胞くんSI 内液● 無細胞くんSI 外液
注2● コントロールDNA（pUC-CAT）● 非標識アミノ酸混合物水溶液● 透析カップ

無細胞くんSI

数量
注1

1キット

■ 特徴
安定同位体標識タンパク質合成用キットです（ C ATタンパク質最大
合成量 5mg/mL）。より大量のタンパク質が必要な場合には、複数のキットをまとめてスケールアップしてご使用ください。

1mL ×1 本（1回分）
10mL ×1 本（1回分）
50μL×1本‥
1mL ×1 本
1個（1 回分）

安定同位体標識タンパク質合成キット「無細胞くん SI SS」
製品番号

SS

製品名

A89-0126

無細胞くんSI SS

数量
注1

1キット

■ 特徴
SS 結合を持つ低分子化抗体やサイトカインなどの分泌系タンパク質
合成用キットです。安定同位体標識タンパク質の合成に最適です。
■ キット内容● 無細胞くんSISS 内液
685μL ×1 本
● 無細胞くんSISS 外液
7.25mL ×1 本
● 50mM 酸化型グルタチオン（GSSG） 1.2mL ×1 本
● 50mM 還元型グルタチオン（GSH） 1.2mL ×1 本
注3
● コントロールDNA（pUC-BAP）
50μL ×1 本● 非標識アミノ酸混合物水溶液
1mL ×1 本● 透析カップ
1個（1 回分）
注 1：本キットに含まれるアミノ酸は安定同位体標識されておりません。
注 2：クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT ）を発現します。
注 3：アルカリホスファターゼ（BAP）を発現します。

■ 無細胞くん用 安定同位体標識アミノ酸
製品番号

製品名

数量

製品番号

製品名

数量

A107-0144

アミノ酸混合物水溶液 -UL-d

1mL

A42-0075

アミノ酸混合物水溶液 -UL-13C,15N,d1mL

A39-0072

アミノ酸混合物水溶液 -UL-15N

1mL

A91-0128

アミノ酸混合物水溶液 -Lys,Arg-UL-13C,15N

1mL

15

A41-0074

アミノ酸混合物水溶液 -UL- N,d1mL

A92-0129

アミノ酸混合物水溶液 -Lys,Leu-UL-13C,15N

1mL

A40-0073

アミノ酸混合物水溶液 -UL-13C,15N

1mL

A108-0145

アミノ酸混合物水溶液 -SeMet

1mL

アミノ酸にはDTTが含まれております。
「無細胞くんSI SS」にご利用の際には別途お問合せください。
※本製品は科学技術振興機構「産学共同シーズイノベーション化事業」の支援を受け、開発された製品です。
※本製品に関する詳細情報は「無細胞くん」カタログ（別冊）
をご参照ください。

TAIYO NIPPON SANSO Stable Isotopes for Biomolecular NMR

08

タンパク質合成キット「無細胞くん」（2）高い安定同位体標識率を実現（1）プロトコール

無細胞タンパク質合成におけるアミノ酸代謝を大幅に低減しました。

迅速・簡便にタンパク質を合成できます。

厳密なアミノ酸選択標識が可能です。

分注します

Asp

Asn

Glu

Gln

3 4μLの鋳型DNAをそれぞれ（pUC-CAT）
をクイック液を分注した
サンプルチューブに加えます55

2 4μLのコントロールDNA

クイック液を分注した
サンプルチューブに加えます60

1 46μLのクイック液をサンプルチューブにコントロールDNA（pUC-CAT）50μL

65

4 37℃で1時間インキュベートします13C (ppm)

クイック液 1mL50

高い重水素標識率のタンパク質を合成可能です。

70

5 反応終了後アイスバスに移して、反応を終了させます75

タンパク質合成キット「無細胞くん」■ 特徴

6 反応液を遠心分離することで、上清に発現した可溶性タンパク質を得ます

8

6

4

1H (ppm)20

1H-13C-HSQC spectrum of uniformly13C/15N/D labelled UBA domain

内液 1mL外液 10mL

非標識アミノ酸
混合物水溶液1mL

15N (ppm)

Model protein

透析カップ
MWCO; 15kDa

コントロールDNA（pUC-CAT）
50μL

1

1 非標識アミノ酸混合物水溶液を外液と内液に加えます2 37μLの鋳型DNAを

3 内液を透析カップに内液に加えます4 透析カップを外液に移します

MW: 7.5 kDa
PDB ID: 2DAG

Isopeptidase UBA domain

1H (ppm)

H-15N-HSQC spectra of amino acid selective 15N-labeled UBA domain

5 軽く撹拌しながら30℃で4～16時間

いれ、ふたをしますインキュベートします

840μL

6 外液から透析カップを抜き取り、無細胞くん

84μL

内液を新しいチューブに回収します

7 内液を回収したチューブを氷上に置いて、（鋳型DNA）

反応を停止させます※安定同位体標識する場合は別売の「無細胞くん用
安定同位体標識アミノ酸混合物水溶液」を加えます

8 チューブを遠心分離（4℃で12,000 rpm、
5分間）
することで、上清に目的の可溶性
タンパク質を含む溶液を得ます（3）「無細胞くんSI SS」によるジスルフィド結合をもつタンパク質合成例
NMR 測定に充分なタンパク質を合成できます。

BPTI プロテアーゼインヒビター
Source: Bovine
Serine protease inhibitor• Approx. Mw: 6.5 kDa• Disulfide bond: 3
•

36

•

His-tag TEV

C

40

C

C

49

65

C

73

C

86

1H-15N HSQC spectrum

[ppm]

93

C

105

90

G12

110
15N

R39

外液 7.25mL

非標識アミノ酸
混合物水溶液1mL

コントロールDNA（pUC-BAP）50μL

酸化型グルタチオン（GSSG）1.2mL

還元型グルタチオン（GSH）1.2mL

透析カップ
MWCO ; 15kDa

還元型グルタチオンを混合します

酸化還元条件
50mM GSH
50mM GSSG
合計（μL）

1

2

3

4

5

0

240

600

960

1200

1200

960

600

240

0

A16

T11
Y35

130

1200

1200

1200

1200

1200

MR1-1 抗変異型EGF受容体一本鎖抗体
酸化・還元型
グルタチオン
混合液

50mM
GSSG

※酸化還元条件は目的タンパク質によって異なります。予めP11の微量透析法でご確認ください

50mM
GSH

•

[ppm]

2 外液と内液それぞれに非標識アミノ酸混合物水溶液、グルタチオン混合液、Milli-Q® 水を加えます

Source: Mouse
Single chain antibody• Approx. Mw: 27 kDa• Disulfide bond: 2•

1
His-tag TEV

10グルタチオン混合液

Milli-Q® 水

外液

750μL

1mL

1mL

内液

75μL

100μL

100μL

C

VH

22

C
96

119

1

Linker

C
23

VL

C
88

107

Source: Human
Serine proteaseApprox. Mw: 35 kDa• Disulfide bond: 6•••

1H-15N TROSY-HSQC spectrum

5 透析カップを外液にいれ、ふたをします

1

H

A58

8

7

6

[ppm]

161

431

C K I C C C
His-tag TEV 168
178179 209 217 225

C C

288 299

C

313

C

345

C C C

361 372 382

C

400

106

15N

111

120

15N

内液
130

4 内液を透析カップに移します

9

R20

1H-15N HSQC spectrum

[ppm]
101

110

外液

3 内液に40μLの鋳型DNAを加えます

I18
I19

Urokinase プロテアーゼ

100

非標識アミノ酸
混合物水溶液

C38
A40

K41

C14

11

1 酸化型グルタチオンと

R17

125

内液 685μL

K15

R42
E49

F33

120

SS

G36

115

6 軽く撹拌しながら30℃で4～16時間インキュベートします

116
121
126

12

11

10

7 外液から透析カップを抜き取り、カップ内の内液を新しいチューブに回収します

9

1

8

7

6

131

[ppm]

H

11

10

9

1

H

8

7

6

5 [ppm]

ご提供：理化学研究所生命分子システム基盤研究領域  NMR パイプライン高度化研究チーム殿

8 内液を回収したチューブを氷上に置いて、反応を停止させます
9 チューブを遠心分離（4℃で12,000rpm、5分間）することで、上清に目的の可溶性タンパク質を含む溶液を得ます

09

TAIYO NIPPON SANSO Stable Isotopes for Biomolecular NMR

商標についてMilli-Q®はメルクミリポア社の商標です。
無細胞くん®は大陽日酸株式会社の商標です。

TAIYO NIPPON SANSO Stable Isotopes for Biomolecular NMR

10

製品番号

製品名

濃縮度

製品番号

製品名

濃縮度

製品番号

製品名

濃縮度

製品番号

製品名

濃縮度

49,287-6

L-Alanine-12C3

99.9 atom % 	12C

60,783-5

L-Aspartic Acid-13C4,15N (95% CP)

29,932-4

Glycine-2-13C,15N

L-Lysine-4,4,5,5-d4･HCl (98% CP)

98 atom % 	 D

L-Alanine-1-13C

99 atom % 	13C

99 atom % 	13C98 atom % 	15N

61,619-2

48,986-7

98 atom % 	13C98 atom % 	15N

57,251-9

L-Aspartic-15N,2,3,3-d3 Acid

98 atom % D
98 atom % 	15N

48,952-2

Glycine-13C2,15N

99 atom % 	13C98 atom % 	15N

48,677-9

13

13

L-Alanine-2- C

99 atom % 	 C

13

13

48,994-8

L-Alanine-3- C

99 atom % 	 C

60,010-5

L-Cystine- N2 (98% CP)

98 atom % 	 N

60,468-2

L-Alanine-2,3-13C2

99 atom % 	13C

A01-0001

L-Cystein-15N･HCl･H2O

95 atom % 	15N

48,987-5

L-Alanine-13C3 (95% CP)

98 atom % 	13C

A02-0002

L-Cystein-13C3,15N･HCl･H2O

33,212-7

L-Alanine-15N (98.7% CP)

98 atom % 	15N

98 atom % 	13C95 atom % 	15N

60,905-615

β -Alanine- N

98 atom % 	 N

48,586-1

L-Alanine-2-d1 (98% CP)

98 atom % D

48,992-1

L-Alanine-3,3,3-d3

99 atom % D

48,584-5

L-Alanine-2,3,3,3-d4

98 atom % D

1599 atom % 	13C98 atom % 	15N

13

1548,585-3

13

15

L-Alanine-2- C, N

99 atom % 	 C
98 atom % 	15N

48,988-3

L-Alanine-13C3,15N

98 atom % 	13C98 atom % 	15N

49,082-2β -Alanine-13C3,15N

99 atom % 	13C98 atom % 	15N

58,672-2

L-Alanine-1-13C,3,3,3-d3

99 atom % 	13C99 atom % D

64,344-0

L-Arginine-13C6･HCl (95% CP)

99 atom % 	13C

60,908-0

L-Arginine-15N2･HCl (guanidineimino-15N2)(98% CP)98 atom % 	15N

B01-0003

L-Arginine-15N4 (97% CP)

95 atom % 	15N

60,803-3

L-Arginine-13C6,15N4･HCl (97% L-,95% CP)

98 atom % 	13C98 atom % 	15N

60,802-5

57,986-6
58,869-5

L-Alanine-1- C, N

13

L-Asparagine-4-13C･H2O

99 atom % 	13C

13

L-Asparagine- C4･H2O (95% CP)
15

15

13

98 atom % 	 C
15

48,589-6

L-Asparagine- N･H2O (amide- N)

98 atom % 	 N

48,996-4

L-Asparagine-15N･H2O (amine-15N)

98 atom % 	15N

64,196-0

L-Asparagine-15N2 (98% CP)

98 atom % 	15N

48,591-8

L-Asparagine-15N2･H2O (98% CP)

98 atom % 	15N

64,195-2

L-Asparagine-13C4,15N2 (95% CP)

98 atom % 	13C98 atom % 	15N

60,815-7

L-Asparagine-13C4,15N2･H2O (95% CP)

98 atom % 	13C98 atom % 	15N

63,667-3

L-Asparagine-15N2,d8 (98% CP)

57,074-5

15

63,659-2

L-Asparagine- N2,d8･D2O
L-Asparagine-13C4,15N2,d8 (95% CP)

98 atom % 	15N98 atom % D
1598 atom % 	 N
98 atom % D
98 atom % 	13C98 atom % 	15N98 atom % D

A03-0021
A04-0022

15

15

L-Cystein-15N,d8･DCl･D2O

95 atom % 	15N95 atom % D

L-Cystein-13C3,15N,d7･DCl･D2O

98 atom % 	13C98 atom % 	15N98 atom % D

60,496-8

L-Glutamic Acid-1-13C (98% CP)

99 atom % 	13C

60,512-3

L-Glutamic-2-13C Acid

99 atom % 	13C

49,001-6

L-Glutamic-3-13C Acid

99 atom % 	13C

58,767-2

L-Glutamic-4-13C Acid

99 atom % 	13C

13

15

60,766-5

L-Lysine-6-13C,ε-15N･HCl (98% CP)

60,677-4

Glycine-12C2,14N (13C,15N-depleted)

99.9 atom % 	12C99.9 atom % 	14N

99 atom % 	13C98 atom % 	15N

49,008-3

L-Methionine-1-13C

99 atom % 	13C

60,807-6

13

Glycine-1- C,2,2-d2

59,261-7

Glycine-15N,d5

B03-0005

L-Histidine-15N3

60,922-6

15

B07-0009

13

99 atom % 	 C
98 atom % D
98 atom % 	 D
98 atom % 	15N95 atom % 	15N15

L-Histidine-2- N (α-amine- N) (98% CP)
13

15

L-Histidine- C6, N3

15

98 atom % 	 N

29,915-4

L-Methionine-(methyl-13C,d3)

99 atom % 	13C99 atom % 	 D

60,814-9

L-Methionine-1-13C,methyl-d3

99 atom % 	13C99 atom % 	 D

49,009-1

L-Phenylalanine-1-13C

99 atom % 	13C

98 atom % 	15N

60,809-2

L-Isoleucine-13C6,15N (95% CP)

98 atom % 	13C98 atom % 	15N

Q36872

L-Isoleucine-2,3,4,4-d4,13C6,15N

49,005-9

L-Leucine-1-13C

99 atom % 	13C

48,681-7

L-Leucine-2-13C

99 atom % 	13C

60,501-8

L-Glutamine-1-13C (98% CP)

60,508-5

L-Glutamine-2-13C

60,494-1

L-Glutamine-3-13C

60,469-0

13

13

L-Glutamine-5- C (amide- C)

60,490-9

13

99 atom % 	 C

L-Leucine-1,2-13C2

99 atom % 	13C

60,504-2

L-Phenyl-1- C-alanine

99 atom % 	13C

99 atom % 	13C

34,096-0

L-Leucine-15N

98 atom % 	15N

60,487-9

L-Phenyl-13C6-alanine

99 atom % 	13C

99 atom % 	13C

61,607-9

L-Leucine-3-d1

99 atom % 	 D

99 atom % 	13C

61,597-8

L-Leucine-4-d1

99 atom % 	 D

48,682-5

L-Leucine-5,5,5-d3

99 atom % 	 D

13

99 atom % 	 C

L-Leucine-d10

98 atom % 	 D

61,598-6

L-Leucine-d7 (isopropyl-d7) (98% CP)

98 atom % 	 D

49,014-8

L-Phenyl-d5-alanine-2,3,3-d3

98 atom % D

49,002-4

L-Glutamine-15N (amide-15N)

98 atom % 	15N

L-Phenylalanine-13C9,15N (95% CP)

48,680-9

L-Glutamine-15N (amine-15N)

98 atom % 	15N

98 atom % 	13C98 atom % 	15N

B02-0004

15

L-Glutamine- N2

95 atom % 	15N

61,630-3

L-Glutamine-2,3,3,4,4-d5 (98% CP)

98 atom % D

60,812-2

L-Glutamine-2-13C,15N (amine-15N)

99 atom % 	13C98 atom % 	15N

60,806-8

49,006-7

L-Leucine-1- C, N

99 atom % 	 C
98 atom % 	15N

60,801-7

60,765-7

L-Leucine-2-13C,15N

99 atom % 	13C98 atom % 	15N

Q36880

L-Phenylalanine-2,3,3-d3, Phenyl-3,5-d2,13C9,15N

60,817-3

L-Leucine-3-13C,15N

99 atom % 	13C98 atom % 	15N

Q36899

L-Phenylalanine-2,3,3-d3, Phenyl-2,4,6-d3,13C9,15N

58,949-7

L-Proline-1-13C

13

15

L-Leucine-13C6,15N (95% CP)

1360,899-8

L-Proline- N (98% CP)

98 atom % 	15N

60,811-4

13

L-Proline- C5, N (95% CP)

98 atom % 	13C98 atom % 	15N

49,015-6

L-Serine-1-13C

99 atom % 	13C

60,471-2

L-Serine-2-13C

99 atom % 	13C

B06-0008

L-Glutamine-13C5,15N2

97 atom % 	13C95 atom % 	15N

59,627-2

L-Leucine-13C6,15N (99% chiral purity basis)

57,073-7

L-Glutamine-15N2,d10

98 atom % 	15N98 atom % D

98 atom % 	13C98 atom % 	15N

60,794-0

L-Leucine-13C6,d10

63,508-1

L-Glutamine-13C5,15N,d10 (95% CP)

98 atom % 	13C98 atom % 	15N96 atom % D

99 atom % 	13C98 atom % D

Q36813

L-Leucine-2,3,3,4-d4,13C6,15N

Q36902

L-Leucine-2,3,3,4,5,5,5-d7, 4-Methyl-13C,15N

Glycine-1-13C

99 atom % 	13C

60,470-4

L-Lysine-1-13C･HCl (98% CP)

99 atom % 	13C

60,485-2

L-Aspartic Acid-13C4

98 atom % 	13C

27,943-9

Glycine-2-13C

99 atom % 	13C

58,932-2

L-Lysine-2-13C･HCl (95% CP)

99 atom % 	13C

33,213-5

L-Aspartic-15N Acid

98 atom % 	15N

28,382-7

Glycine-13C2

99 atom % 	13C

64,203-7

L-Lysine-6-13C･2HCl (98% CP)

99 atom % 	13C

60,910-2

L-Aspartic-15N Acid, β -Benzylester Derivative

98 atom % 	15N

29,929-4

Glycine-15N

98 atom % 	15N

58,936-5

L-Lysine-6-13C･HCl (98% CP)

99 atom % 	13C

60,770-3

15

L-Aspartic-2- C, N Acid

33,645-9

Glycine-2,2-d2

98 atom % 	 D

64,345-9

13

L-Lysine- C6･HCl (95% CP)
1599 atom % 	13C

Glycine-d5

98 atom % 	 D

59,290-0

L-Lysine-2- N･2HCl (98% CP)

98 atom % 	 N

33,133-3

Glycine-N,N,O-d3

98 atom % 	 D

60,896-3

L-Lysine-2-15N･HCl

98 atom % 	15N

29,934-0

13

99 atom % 	 C
98 atom % 	15NTAIYO NIPPON SANSO Stable Isotopes for Biomolecular NMR

15

Glycine-1- C, N

13

99 atom % 	 C
98 atom % 	15N

15

1560,472-0

L-Serine-3- C

99 atom % 	13C

58,960-8

13

99 atom % 	13C

13

99 atom % 	13C

60,517-4
60,488-7

13

L-Serine-1,2- C2
L-Serine-2,3- C2
13

L-Serine- C3 (95% CP)

60,897-1

L-Lysine-ε-15N･HCl

98 atom % 	15N

60,902-1

L-Lysine-15N2･HCl (98% CP)

98 atom % 	15N

98 atom % 	13C

60,900-5

L-Serine-15N (98% CP)

98 atom % 	15N

48,598-5

L-Serine-2-13C,15N

99 atom % 	13C98 atom % 	15N

B09-0011

L-Serine-13C3,15N

98 atom % 	13C98 atom % 	15N

60,503-4

L-Threonine-1-13C (97% CP)

99 atom % 	13C

B04-0006

15

98 atom % 	15N

15

17,583-8

13

99 atom % 	13C

98 atom % 	13C98 atom % 	15N

27,942-0

13

98 atom % 	 D

49,294-9

99 atom % 	13C

99 atom % 	 C‥98 atom % 	15N

98 atom % 	 D

L-Phenyl-d5-alanine

99 atom % 	 C

L-Aspartic Acid-3,4-13C2

L-Aspartic Acid-1- C, N

98 atom % 	 D

98 atom % 	13C

58,616-1

58,628-5

L-Phenylalanine-2-d1
L-Phenylalanine-3,3-d2

L-Glutamine-13C5 (95% CP)

99 atom % 	13C

1358,943-8
61,588-9

L-Glutamine-1,2- C2

L-Aspartic Acid-1,2-13C2

98 atom % D

98 atom % 	15N

60,516-6

57,979-3

15

L-Phenylalanine- N

49,010-5

1560,522-0

13

99 atom % 	13C

13

13

61,587-0

13

L-Aspartic Acid-1-13C

L-Aspartic-2,3,3-d3 Acid, N-Acetyl Derivative

99 atom % 	13C

L-Phenylalanine-3- C

98 atom % 	13C

48,997-2

61,606-0

49,012-1

99 atom % 	13C

13

L-Phenylalanine-2- C

L-Leucine-13C6 (95% CP)

99 atom % 	13C

98 atom % D

49,011-3

13

60,523-9

L-Aspartic-4-13C Acid

L-Aspartic-2,3,3-d3 Acid

98 atom % 	 D

99 atom % 	13C98 atom % 	 D

L-Glutamic-15N Acid

98 atom % 	15N98 atom % D

98 atom % 	15N

L-Methionine-2-d1

L-Methionine-(methyl-13C,d)33,214-3

L-Glutamic Acid-15N,d9

L-Methionine-15N, N-Acetyl Derivative

58,980-2

65,140-0

99 atom % 	13C98 atom % 	15N

64,387-4

58,983-7

98 atom % 	13C98 atom % 	15N

L-Isoleucine-1-13C (98% CP)

L-Leucine-3- C

98 atom % 	15N

L-Methionine-13C5,15N (95% CP)

99 atom % 	13C98 atom % 	15N

60,482-8

L-Methionine- N (98% CP)

60,810-6

L-Histidine-13C6,2-15N (α-amine-15N)

13

60,924-2

99 atom % 	13C98 atom % 	15N

60,808-4

L-Isoleucine-15N (98% CP)

99 atom % 	13C98 atom % 	15N98 atom % D

99 atom % 	13C

98 atom % 	 D

60,901-3

L-Glutamic Acid-13C5,15N,d9

15

L-Methionine-(methyl-d3)

99 atom % 	 C

64,456-0

L-Methionine-(methyl- C)

99 atom % 	13C

L-Methionine-2-13C,15N

98 atom % 	13C

98 atom % 	13C98 atom % 	15N

13

30,061-6

L-Glutamic Acid-13C5 (95% CP)

98 atom % D

29,914-6

L-Methionine-2- C (98% CP)

58,982-9

L-Glutamic-5- C Acid

L-Glutamic-2,3,3,4,4-d5 Acid

58,977-2

13

97 atom % 	 C
95 atom % 	15N

13

60,486-0

L-Glutamic Acid-13C5,15N (95% CP)

99 atom % 	13C99 atom % 	15N

99 atom % 	 C
98 atom % 	15N

49,292-2

61,628-1

98 atom % 	 D

Glycine- C2, N Ethyl Ester･HCl

60,477-1

60,785-1

L-Lysine-3,3,4,4,5,5,6,6-d8･HCl
L-Lysine-13C6,15N2･HCl (95% CP)

60,816-5

13

13

61,621-4
60,804-1

13

48,999-9

48,998-0

11

アミノ酸

アミノ酸

アミノ酸

60,777-0

L-Threonine- N
13

15

L-Threonine- C4, N

98 atom % 	13C98 atom % 	15NTAIYO NIPPON SANSO Stable Isotopes for Biomolecular NMR

12

製品番号

製品名

濃縮度

製品番号

製品名

濃縮度

B10-0012

L-Threonine-13C4,15N

97 atom % 	13C95 atom % 	15N

48,582-9

L-Tyrosine-(phenyl-2,6-d2)

98 atom % 	 D

60,483-6

L-Tryptophan-1-13C (98% CP)

99 atom % 	13C

48,980-8

L-Tyrosine-(phenyl-d4)

98 atom % 	 D

60,484-4

L-Tryptophan-2-13C (Indole Ring-13C) (96% CP) 98 atom % 	13C

59,098-3

L-Tyrosine-2-13C,15N

99 atom % 	13C98 atom % 	15N

60,799-1

L-Tyrosine-13C9,15N (95% CP)

98 atom % 	13C98 atom % 	15N

60,984-6

L-Tyrosine-(4-hydroxy-17O)

40 atom % 	17O

15

15

15

60,906-4

L-Tryptophan- N (α-amino- N)

99 atom % 	 N

B05-0007

L-Tryptophan-15N2

95 atom % 	15N

61,586-2

L-Tryptophan-2',4',5',6',7'-d5 (Indole-d5)

97 atom % 	 D

B11-0013

L-Tryptophan-13C11,15N2

97 atom % 	13C95 atom % 	15N

15

15

B13-0020

L-Tryptophan- N2,d8

95 atom % 	 N
95 atom % 	 D

B12-0014

L-Tryptophan-13C11,15N2,d8

97 atom % 	13C95 atom % 	15N95 atom % 	 D

48,982-4

13

L-Tyrosine-1- C ‥(4-Hydroxyphenylalanine-carboxy-13C)

60,991-918

東京都立大学名誉教授

95 atom % 	18O

L-Tyrosine-(4-hydroxy- O)
13

99 atom % 	13C

60,491-7

13

L-Valine-2- C

99 atom % 	13C

49,017-2

L-Valine-15N

98 atom % 	15N

48,602-7

L-Valine-d8

98 atom % 	 D

X 線結晶構造解析に代表されるタンパク質の立体構

60,014-8

L-Valine-13C5,15N (95% CP)

98 atom % 	13C98 atom % 	15N

造決定手法は急速な発展を遂げ、以前は想像もできな

Q36848

L-Valine-2,3-d2,13C5,15N

49,016-4

L-Valine-1- C

13

99 atom % 	 C

甲斐荘正恒

ンパク質複合体の生物機能に迫る N M R 技術として今後■ はじめにかったような巨大、且つ複雑なタンパク質複合体の精■ タンパク質NMR研究における安定同位体利用技術

60,510-7

L-Tyrosine-2- C

97 atom % 	 C

Q36821

L-Valine-2,3,4,4,4-d5,3-Methyl- C, N

密な立体構造が次々と解明されている。しかしながら、タンパク質の主要な構成元素、水素、炭素、窒素、酸

48,985-9

L-Tyrosine-3-13C

99 atom % 	13C

42,619-9

Algal Amino Acid Mixture-13C

98 atom % 	13C

結晶中で整然と静止した状態における立体構造情報の素のうちで高分解能 N M R シグナルが観測できる安定

60,509-3

L-Tyrosine-(phenyl-4-13C)

99 atom % 	13C

60,894-7

Algal Amino Acid Mixture-15N

98 atom % 	15N

58,784-2

L-Tyrosine-1,2,3-13C3

99 atom % 	13C

48,791-0

Algal Amino Acid Mixture-13C,15N

15
N の 3 種類である。水素（1H ）を除き同位元素は 1H、13C、

48,979-4

L-Tyrosine-(phenyl-13C6)

99 atom % 	13C

98 atom % 	13C98 atom % 	15N

みでは、実際に生物機能を果たすタンパク質の真の姿を理解するには十分ではない。タンパク質の立体構造とこれらの元素は天然に存在する割合（天然存在比）が低49,286-8

L-Tyrosine-13C9 (95% CP)

98 atom % 	13C

59,690-6

Algal Amino Acid Mixture-15N,d

98 atom % 	15N97 atom % 	 D

生物機能の関連をより深く理解するためには、生体内いために N M R 観測には高濃度の同位体標識が必要とな

33,215-1

15

L-Tyrosine- N

98 atom % 	 Nにおいて各タンパク質が存在する環境にできる限り近る。低分子化合物ならば、1H - N M R スペクトルから必要

48,984-0

L-Tyrosine-(phenyl-3,3-d2)

98 atom % 	 Dい状態で、それらの立体構造・動態・相互作用を総合的十分な構造情報が得られるが、20 種類のアミノ酸残基に解明する手段が不可欠となる。数々の困難にもかかのみから構成されるタンパク質の N M R スペクトルで状

わらず、タンパク質の N M R 研究が人々をひきつける理況は大きく異なる。即ち、タンパク質の 1H - N M R スペク

由がここにある。半世紀に渡るたゆみない努力の結果、

トルでは、近接した化学シフトを持つ膨大な 1H - シグナ

TROSY（Transverse Relaxation Optimized SpectroscopY）

ルが重なり合い、更に 1H - 1H 間の双極子相互作用による法をはじめとして様々な技術が続々と開発され、N M R

線幅の拡がりも加わるため、それらの解析には多大な困法の最大の弱点とされてきた分子量限界の大幅な拡張難が伴う。多次元 N M R 法に代表されるタンパク質構造が実現しつつある。

解析技術の発展の基盤は、このような困難を軽減するた

13

13

15

60,764-9

13

13

15

15

Algal Amino Acid Mixture- C, N,d13

98 atom % 	 C
98 atom % 	15N97 atom % 	 D

ここで紹介するSAIL（Stereo-Array Isotope Labeling;
立体整列同位体標識）法もそのような成果の一つである

TAIYO NIPPON SANSO Stable Isotopes for Biomolecular NMR

めに追求された、安定同位体標識技術の高度化に向けた膨大な努力から形成されている 2 ）。

が、他の手法にはみられない際立った特徴がある。即安定同位体標識法は、立体構造や生物機能への影響

ち、従来の技術開発では、高分子量タンパク質の主鎖アを最小限に抑えつつ、タンパク質 N M R スペクトル上のやIle、Leu、Val 等のメチル基（13C1H3）
等の一ミド ( N1H）

特性を大きく変えることができる手法である。例えば、握りの N M R 情報を入手するために、他の原子団に由来

天然に存在する炭素と窒素の殆どは同位元素 12C、14N でする N M R 情報の取得を犠牲にすることを前提としてきあるが、前者は核スピンを持たないため N M R 測定にかた。我々の開発したSAIL 法は、安定同位体標識パターン

からず、後者は核スピンが 1 のために高分解能 N M R 測を徹底的に最適化したアミノ酸（ S A I L アミノ酸）を合成

定には不向きである。しかしながら、これらの元素をし、それらで標識したタンパク質（ S A I L タンパク質）を

核スピン 1/ 2 を持つ安定同位体 13C、15N に置換すること用いることにより、あらゆる原子団由来の N M R シグナ

により、タンパク質の骨格元素である炭素、窒素を溶液

ルを余すことなく観測しようとする技術である。S A I L

NMR 法に組み込むことが可能となる。その結果、1H, 13C,

標識した高分子量タンパク質の N M R スペクトルは著し

15

く簡略化される一方、測定感度も大きく改善される。究量タンパク質の N M R スペクトル解析は著しく容易とな

極的なT R O S Y 法とも云えるSAIL 法は、これまで入手すでタンパクる。更に、水素の同位元素である重水素（2H）

ることが困難とされてきた原子団に関する様々な立体質を標識すれば、1H - N M R スペクトルは大幅に簡略化さ構造や動態に関する新たな情報を通じて、高分子量タれると同時に、1H - 密度の低下に伴い重水素置換されず

1513の発展が期待される1 ）。

SAIL法により拡がるタンパク質NMRの未来

アミノ酸

SAIL法により拡がるタンパク質NMRの未来

Nを含めた多核種多次元 NMR 測定法が成立し、高分子

TAIYO NIPPON SANSO Stable Isotopes for Biomolecular NMR

14

量限界を大幅に拡張できると考えた。これが、S A I L 法

以上の原則に従った同位体標識パターンを持つタンドタンパク質は、422 残基のアミノ酸からなり、その N

狭まり、延いては測定感度の著しい増加という恩恵がもの基本的な発想である 。このために、下記に列挙したパク質を構成する 20 種類のアミノ酸を “ 第一世代 ” の

末端側および C 末端側の 2 ヶ所に構造ドメインを持つ。

たらされる。この結果、 C / N - 二重標識試料を用いた原則に従い、タンパク質 N M R 解析に適した同位体標識

SAIL アミノ酸と呼んでいるが、それらの合成が完了する

両ドメインともRNA 結合能を持つが、C 末端側ドメイン

手法では、構造決定が可能な分子量上限が 25 k D a 程度

パターンを持つアミノ酸を合成した。図 1 に示した標識には10 年余の歳月を要した。SAIL アミノ酸はプロキラ（C-terminal domain; CTD）
は、タンパク質の二量化形成であったものが、2H /13C /15N - 三重標識試料の利用によるパターンは、SAIL 法の開発当初のもの（“ 第一世代 ” SAIL

ルなメチレン、メチル基は立体選択的に同位体標識されの役割も担う。そのため、本研究の共同研究先の台湾

更なる分子量上限の拡張が可能となる。しかしながら、

アミノ酸）であるが、その後現在に至るまで多種多様なているために、N M R による構造精度に大きく影響する

中央研究院においてはSARS-CoV CTD の立体構造解明

三重標識試料を用いて、タンパク質中の必要な部位の改良型 S A I L アミノ酸が開発され、様々な構造・動態情立体帰属に関する不確実性は全く存在しないため、重が重要な緊急課題となっていた。しかしながら、シグナ

H - N M R 情報を得るためには、その部分の重水素化だけ

報の取得に利用されている。

水素化により失われる情報量の減少を補って余りある

ルの縮重、及び線幅の拡がりに阻まれ、従来の N M R 手は選択的に避ける必要がある。試料調製の簡便さから、（1）
アミノ酸に含まれる全てのメチレン基上のプロキラ

情報の質的向上が得られる。もう一つの S A I L 法の特記

法ではトポロジー構造の決定に留まっていた。S A I L 法

適当な重水素濃度に調整した重水中（例えば、60- 80%

ル水素のうち、一方のみを立体選択的に重水素化

すべき特徴は、S A I L アミノ酸のみから構成されるタンを用いた共同研究が持ちかけられたのはこのような事程度）
で、“ランダム” 重水素化を施した三重標識試料を

する。

13

15

1

1）

パク質 ( S A I L タンパク質）
は、 C , N - 二重標識タンパク情による。SARS-CoV CTD の構造決定は数週間で完了

用い “ 残余 1H ” を観測する手法が試みられた。しかしな（2）
アミノ酸に含まれるメチル基を 13C H D 2 標識する。

質と比較して、タンパク質全体の水素密度は 50- 60% 近

したが、S A I L 法の適用によりもたらされた最も大きながら、このような手法では重水素化の位置や濃度を制御

また、L e u、Va l のプロキラルメチル基のうち、一く減少するにも関わらず、重水素化部位以外の水素（残NMR スペクトル上の改善点は、芳香族領域のNMR スペ

できないために、無数の同位体異性体（isotopomer）
が（現
方を立体選択的に C D 3、他方を C H D 2 とする余水素）は完全に保存される点である。従って、重水素

クトルの劇的な向上にあった。図 2- a に示すように、通混在することは避けられない。このような根本的な欠在は経済性を考えて C H D 2 の代わりに C H 3 とす化の位置・立体化学を制御できないランダム重水素化

常の[U-13C,15N]- 標識体では、芳香環領域の 1H-13C HSQC

陥のために、現在ではほとんど利用されていない。

るパターンを主に利用）。

法では問題となる、同じ標識パターンを持つ分子が理スペクトルは複雑なスピン系のために、有用な構造情（4）
芳香族アミノ酸、Phe、Tyr、Trp の芳香環において論的には存在し得ないほど無数に存在する同位体異性

報が全く得られなかった。一方、S A I L- 標識体の同じ芳は、観測対象とする炭素と水素のみ H - C とし、体は、S A I L タンパク質では只一種類の同位体異性体に

香環領域では、極めて良質の 1H-13C HSQC スペクトルが他は 12CDとする。

13

12

13

13

■ SAIL- 立体整列同位体標識法の誕生

131

我々は、このような状況を根本的に解決するには、重1315集約される。このような全く新しい概念の安定同位体

容易に得られた（図 2-b）。この芳香族領域のNMRスペク

水素化を含めた安定同位体標識技術をその限界まで高（5）水素を持つ炭素は全て 13C、窒素は全て15Nとするこ標識技術を立体整列同位体標識（Stereo-array isotope

トルの質的改善がSARS-CoV CTD の迅速な精密構造決め、立体選択性を含めて標識位置を完全に制御したタとにより、 C - C、 C - N スピン結合を経由し側鎖

labeling；SAIL）法と名付けた理由がここにある。SAIL定の決め手となった。

ンパク質試料を調製できるならば、得られる構造情報‥

原子団の帰属を可能とする。

アミノ酸には合成が困難なものが幾つも含まれており、

S A R S - C o V C T D は、4 本鎖から構成される逆平行従ってこのような貴重なアミノ酸の効率的利用が S A I L

β シ ー ト 上 に、α へ リ ッ クス が 位 置 す る い わ ゆ る法の実用化にとっての鍵となる。このためには、S A I L“domain-swapped dimer” 構造を形成しており（図 2-c）、

アミノ酸の安定同位体標識パターンを保ったまま目的

この N M R 構造は後に決定された結晶構造とも良く一致とするタンパク質に効率良く取り込ませることのできした。S A I L タンパク質を用いた核酸滴定実験等の相互る大腸菌無細胞合成システムが最も有効である。この作用解析も実施し、S A R S の薬剤開発に重要な基礎的知ようにしてSAIL アミノ酸のみからなるSAIL タンパク質

幸いなことに、S A R S は終息後、現在に見が得られた 3 ）。

の調製が実現した。S A I L タンパク質においては、全て至るまで大きな流行が報告されていない。

13

13

13

15

の精度を犠牲にせず、長い間の懸案事項であった分子SAIL法により拡がるタンパク質NMRの未来

SAIL法により拡がるタンパク質NMRの未来に残った 1H - シグナルの N M R シグナルの線幅は大幅にのプロキラル基の一方が立体特異的に重水素化されているため、観測されるプロキラル基の立体帰属は全て■ SAIL法の展望確定している。このために、従来の立体帰属が不確実

本稿ではSAIL 法の原理とNMR 構造決定への応用に関な場合に利用せざるを得ない擬原子（pseudoatom）近して簡単に解説したが、現在も高分子量タンパク質へ似が不要となるために、遥かに高精度（precise）、且つ正の応用、タンパク質動態の研究手法の開発等に向けSAIL。
以下に、その一法の応用分野の開発が活発に進められている。S A I L ア

例として S A R S コロナウィルス C 末側 R N A 結合ドメイ

ミノ酸合成に関連した不斉有機合成技術の高度化、及ンの溶液構造決定を紹介する 。

び標識アミノ酸を用いて効率良く目的タンパク質を標確（accurate）
な立体構造が得られる

1,2）

3）

識する無細胞系・細胞系発現技術は過去数年間で大き図 1 	タンパク質を構成する20 種類の“ 第一世代 ”SAIL アミノ酸の化学構造 . 1Hとして残した側鎖水素はベージュ, 重水素化したものは灰色で表示 . その他、窒素は青, 炭素は黒, 酸素は赤 , 硫黄は黄色で表示してある. また, 1Hの結合した炭素は全て 13C, 窒素
は全て15Nで標識してある.（グラフィックスはKimmo Pääkkönen 博士作成）

15

TAIYO NIPPON SANSO Stable Isotopes for Biomolecular NMR■ SAIL法によるSARS コロナウィルス C 末側ドメインのく発展し、新たな N M R 研究技術の開発基盤を提供して

立体構造決定いる。革新的安定同位体利用 NMR 技術であるSAIL 法の数年前、世界を震撼とさせた重症呼吸器性症候群

更なる開発と普及は、生体系 N M R 研究の活性化に大き（SARS）の発症原因となるコロナウィルス（SARS-CoV）く寄与するだけではなく、我が国の生命科学基盤技術

は、ヌクレオキャプシドと呼ばれるタンパク質とRNAかへの国際貢献という点からも重要な課題であろう。

らなる集合体を形成している。S A R S - C o V のキャプシ

TAIYO NIPPON SANSO Stable Isotopes for Biomolecular NMR

16

(a)

(c)
構造式

構造式

Ala

Lys

H

13

13

C

Arg

(b)

H
15

15

H2 N

13

C

15

NH

15

13
13

C

H

H215NO13C

13

13

C

1）“Optimal Isotope Labelling for NMR Protein Structure
Determinations”, M. Kainosho, T. Torizawa, Y. Iwashita, T.
Terauchi, A. M. Ono, and P. Guentert, Nature,440, 52-57 (2006);“SAIL- Stereo-array isotope labeling”, M. and P. Güntert,
Quarterly Reviews of Biophysics, 42, 247-300 (2009).
2）“Recent Developments in Stable-Isotope-Aided Methods
for Protein NMR Spectroscopy”, S.-y. Ohki and M. Kainosho,
Modern Magnetic Resonance, 211-218 (2006); “Stable Isotope
Labeling Methods for Protein NMR Spectroscopy”, S.-y. Ohki
and M. Kainosho, Progress in Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy, 53, 208-226 (2008).

HS3）“Solution Structure of the C-terminal Dimerization Domain of
SARS Coronavirus Nucleocapsid Protein Solved by the SAILNMR Method”, M. Takeda, C.-k.Chang, T.Ikeya, P. Güntert, Y.-h.
Chang, Y.-l. Hsu, T.-h. Huang, and M. Kainosho, J. Mol Biol., 380,608-622 (2008).

13

13

C

C

H

参考文献

13

13

13

C

D

NH2

CO2H
15

13

Glu

D
13

HO213C

C

H H
13

C

C

D

H H

13

13

C

H

C

15

H

13

N

13

C
15

15

NH2

15

NH2

13

C

Leu

D

H H

13

13

C

HD213C
13

D312C

C

C

H

13

13

13

C

C

NH2

CO2H
15

NH2

H
H

C

H

C
13

CO2H

13

15

13

13

C

C

H

13

N 13
13

15

NH2

CO2H
15

NH2

H
C

H

13

C

13

C

C

13

C

D

CO2H
15

NH2

H

H
H
13

H

C

D
13

C

C

Val
12

D3 C

13

13

HD213C

13

13

C

CO2H
15

NH2

H

H

13

13

C

C

H
C

D

D
CO2H

NH2

CD2H

C

13

13

NH2

CO2H
15

H

C

HO

CO2H

13

C

D

CD2H

H H
13

15

H

15

D

13

D

TAIYO NIPPON SANSO Stable Isotopes for Biomolecular NMR

C

H

HD213C

C

H

CO2H

13

C

13

13

C

C

13

Trp
13

13

13

13

D

H
Ile

H

13

Thr

CO2H

H
13

CO2H

13

HO

C

N

N

D

H
C

15

C

CO2H

Tyr

His

C

C

D
13

H

H

13

13

D

13

C

Ser

D

13

C

D
H 13

Gly

H215N

NH2

D

D
Pro

D

H

15

H

13

C

13

D

H

H

13

13

13

D 13

NH2 ・HCl

13

H H
C

CO2H

H

13

C

NH2

15

C

C

C

D

C

HO

H215NO13C

13

13

D

13

CO2H

D

13

H

H
13

D

H

Gln

H

S

Phe

NH2

CO2H
15

C

H

D

H
C

HD213C

H

H
13

C

Met

D

Asp

13

15

D

H
13

H

HO2 C

C

H
C

13

D

C

D D

Asn

図 2 	芳香環領域の 1H-13C HSQC スペクトル（a）:[U-13C,15N]-SARS CoV CTD,（b）SAIL SARS-CoV CTD.（c）SARS-CoV のNMR 構造のリ
ボン図. SAIL 法ではCTDドメインに含まれる7 残基 Pheの6 残基の 13Cε-1Hεのシグナルが明瞭に観測された. なお, F275 は芳香環の反転速度が遅いためにε1, ε2 が分裂して観測され , F 287 のε- シグナルは反転によるシグナルの広幅化により観測されな
い. このような芳香環の反転速度に関する情報はSAIL法がタンパク質動態の研究に有用であることを示している.

13

H
13

C

H215N

NH2

13

C

H

13

D H 13CO2H

H

N

D

CO2H

HD213C

Cys

17

SAILアミノ酸

SAIL法により拡がるタンパク質NMRの未来

SAILアミノ酸

CO2H

15

NH2

H

CO2H
15

NH2

H

TAIYO NIPPON SANSO Stable Isotopes for Biomolecular NMR

18

製品番号

製品名

A-006a

L-Alanine-2-d,3-13C,15N

Q36872

濃縮度

構造式

D

CO2H

H313C

15

D

D D 13CO2H

L-Isoleucine-2,3,4,4-d4,13C6,15N

L-Isoleucine-2,3,4,4-d4,3-methyl,5-13C2,15N

C

13

C

D

15

D D

C

13

C

D3C

L-Methionine-(methyl-13C)

D

L-Methionine-(methyl-13C,d)

H

F-023

L-Methionine-(methyl-13C,d3)

99 atom%13C
99 atom% D

CO2H

D

D

H

H H

TAIYO NIPPON SANSO Stable Isotopes for Biomolecular NMR

13

C

D

13

Y-023

C

C
C

13

C

13

C

13

C

D

H

13

D

D

NH2

D

CO2H
NH2

D

D
D

13

C

CO2H

C

15

T-006

D

L-Threonine-2,3-d2,4-13C,15N

D

15

NH2

D
Q36848CO2H

Q36821

C

13

L-Valine-2,3,4,4,4-d5,3-methyl-13C,15N

C

D3C
H3 C
V-003

L-Valine-2,3, γ2-methyl-d5, γ1-methyl-13C,15N

NH2

CO2H
15

NH2

D
D

D3C
H313C

15

D

D

H

CO2H

13

13

NH2

CH3
D

NH2

CO2H

13

L-Valine-2,3-d2,13C5,15N

H313C

NH2

D

CO2H

HO

H3 C

H

15

D

H
HO

H

S

C

C

D

13

H H

D 13CO2H

13

C

L-Tyrosine-2,3,3-d3,Phenyl-2,6-d2,Phenyl-3,5-13C2,15N

NH2

S

NH2

15

H

CO2H

H H

15

D

D

H

S

C

13

13

CO2H

H H

D 13CO2H

D
H

NH2

H

19

H

D

S

H

D313C

C

D

H
29,915-4

C

13

L-Phenylalaine-2,3,3-d3,Phenyl-2,3,5,6-d4,Phenyl-4-13C,15N

NH2

H

DH213C13

15

98 atom% D

99 atom%13C
98 atom% D

C

13

13

13

D

H
65,140-0

13

H
D

NH2

CO2H

D D

99 atom%13C

D3C

C

L-Phenylalaine-2,3,3-d3,Phenyl-2,4,6-d3,13C9,15N

NH2

H
L-Methionine-(methyl-d3)

C

H

13

30,061-6

13

C

15

H313C

H3 C

NH2

D

13

13

Q36899

CO2H
15

D

D3C

29,914-6

D D

D
H

NH2

15

D D

H

S

L-Phenylalaine-2,3,3-d3,Phenyl-3,5-d2,13C9,15N

D

D
L-Leucine-2,3,3,4, δ1-methyl-d7, δ2-methyl-13C,15N

Q36880

13

C

NH2

D
H313C

NH2

CO2H

H313C

L-003

S

L-Methionine-2,3,3,4,4-d5,methyl-13C,15N

CH3

D
L-Leucine-2,3,3,4,5,5,5-d7,4-methyl-13C,15N

M-003

13

13

Q36902

D3C

H

D D 13CO2H

H313C

H H 13CO2H

H

D

15

H313C

構造式

CH3

D
L-Leucine-2,3,3,4-d4,13C6,15N

99 atom%13C
99 atom% D

13

H313C

Q36813

濃縮度

L-Methionine-1-13C,methyl-d3

13

C

D
I-003

製品名

60,814-9

NH2

13

H313C

製品番号

メチル標識アミノ酸, 芳香族標識アミノ酸

メチル標識アミノ酸, 芳香族標識アミノ酸

メチル標識アミノ酸, 芳香族標識アミノ酸

CO2H
15

NH2

D

TAIYO NIPPON SANSO Stable Isotopes for Biomolecular NMR

20

■ β2 アドレナリン受容体の動的構造の解析によるシグナル伝達機構の解明
は、
GPCRの一種であるβ2 アドレナリン受容体（β2 AR）
気管支拡張などの生理応答に関与するが、β2 A R を介しにおける活性化構造の割合により β2 ARのシグナル伝達

たシグナル伝達強度が決まる機構は不明である。高分強度が決定されていることが明らかになった（図 5）3，4）。

幸福裕

嶋田一夫

子量膜タンパク質であるβ2 ARの高感度 NMR 解析には、

東京大学
助教

東京大学
教授

メチル基の選択的 13C 標識や、その周囲の 2H 標識が必須

A）2H 標識なしである。一方で、活性を保持したβ2 AR の大量発現に必B）2H 標識あり

要な昆虫細胞発現系では、大腸菌や酵母で一般的な重水やアミノ酸前駆体を用いた標識法が適用できない。
そこで、我々は、昆虫細胞発現系において、標識アミノ■ 転移交差飽和法を用いたケモカインMIP-1α とその受容体CCR5との相互作用解析
G タンパク質共役型受容体（GPCR）の一種であるケモM I P - 1α のイソロイシン・ロイシン・バリン残基メチル酸を適切な量とタイミングで添加することにより、メチカイン受容体 C C R5 と、そのリガンド M I P -1α は、様々基を選択的に C 標識し、それ以外を H グルコース、重オニン残基メチル基を選択的に 13C 標識し、その周囲をな免疫応答や H I V 感染に関与しており、その相互作用様

水を用いて高度に 2H 標識した。これらの試料を用いて、2式の解明が望まれている。一方で、C C R 5 の収量や安定我々が開発した転移交差飽和（ T C S ）法 1）により相互作

得た
（図 4）
。これにより、rHDLの脂質二重膜中における性が低いために、十分な測定感度にて、N M R による相用解析を行った（図 2）。その結果、M I P -1α上のV59・V63

β2 ARのNMR シグナルを、高感度に観測することに初め互作用解析をおこなうことは困難であった。そこで、を含む領域が C C R 5 と近接することを新たに同定した‥て成功した。様々なリガンドが結合した β2 ARのNMR シ

C C R 5 の安定化のために、界面活性剤の代わりに、より（図 3）。この結果により、MIP-1αE57の変異がHIV感染にグナルの解析から、β2 ARが2 種類の不活性化構造と1 種

生理的条件に近い再構成高密度リポタンパク質（rHDL）

影響する機構として、変異が C C R5 との相互作用に直接の中にCCR5 を埋め込みNMR 試料とした
（図 1）
。さらに

影響を与えることが示された2）。

13

2

H 標識する方法を新たに開発し、約 5 倍の感度向上を

N M R 測定の高感度化のために、大腸菌発現系により、

A

B

100
構造を保持したCCR5の割合
（％）

脂質二重膜

アポリポタンパク質変異体

85.4

M82U 構造

弱い部分作動薬

弱い部分作動薬

Y316
M82

40

W286

M82A 構造

Y316
M82
W286

Y316
M82

500 s-1
W286(200-800 s-1)

6.7
界面
活性剤

弱い部分作動薬(500-800 s-1)

2500 s-1

20

<4%
rHDL

MIP-1α28 (28-37) %71 (59-72) %図 5 安定同位体標識 β2 ARのN M R 解析から明らかになった動的構造平衡. 弱い部分作動薬が結合した状態における ,‥各構造の割合とその間の交換速度を示す.

参考文献

シグナル
強度減少

図 2 TCS法の模式図 . CCR5を選択的に飽和すると, その飽和は空間的に近接したMIP-1αにも伝播する. MIP-1α が結合状態と遊離状態を交換している場
合には, 遊離状態のMIP-1αのCCR5相互作用界面に対応する残基のNMR シ
グナル強度が選択的に減少する.

M82D 構造60

図 1 CCR5のrHDLへの再構成 （A）.
rHDL 中のCCR5の模式図 （B）.
界面活性剤中および rHDL 中で4 ℃にて
24 時間静置後に構造を保持しているCCR5 の割合.

rHDL
再構成
CCR5

活性化状態
（Gタンパク質と結合可能）a) rHDL800

MIP-1α

図 4 2H 標識による β2 ARのNMRシグナルの感度向上 （A）.
メチオニンメチル基を13C 標識したrHDL再構成 β2 ARの1H-13C相関スペクトル.（B）メチオニンメチ
ル基を13C 標識し, さらにその周囲を2H標識したrHDL再構成 β2 ARの1H-13C
相関スペクトル. 点線部分の切り出しを各スペクトル上部に示す.

不活性化状態

CCR521類の活性化構造の間の動的構造平衡にあること、平衡膜タンパク質機能解明における安定同位体の利用

膜タンパク質機能解明における安定同位体の利用

膜タンパク質機能解明における安定同位体の利用

図 3 TCS 法による解析結果. TCSの結果 , 強度減少した残基をMIP-1α の構造上に橙で, それ以外の残基を緑で示す. V59・V63を含む領域が CCR5 に近接することが明らかとなった.

TAIYO NIPPON SANSO Stable Isotopes for Biomolecular NMR

1）Ueda, T., Takeuchi, K., Nishida, N., Stampoulis, P., Kofuku, Y.,
Osawa, M., & Shimada, I. Cross-saturation and transferredcross-saturation experiments. Q. Rev. Biophys., (2014), 47, 143187.
2）Yoshiura, C., Kofuku, Y., Ueda, T., Mase, Y., Yokogawa, M.,
Osawa, M., Terashima, Y., Matsushima, K., & Shimada, I. NMR
analyses of the interaction between CCR5 and its ligand using
functional reconstitution of CCR5 in lipid bilayers. J. Am. Chem.
Soc., (2010), 132, 6768-6777.

3）Kofuku, Y., Ueda, T., Okude, J., Shiraishi, Y., Kondo, K., Maeda,
M., Tsujishita, H., & Shimada, I. Efficacy of the β2 - adrenergic
receptor is determined by conformational equilibrium in thetransmembrane region. Nature Communications, (2012), 3,
1045.
4）Kofuku, Y., Ueda, T., Okude, J., Shiraishi, Y., Kondo, K., Mizumura,T., Suzuki, S., & Shimada, I. Functional dynamics of deuterated
β2 -adrenergic receptor in lipid bilayers revealed by NMR
spectroscopy. Angew. Chem. Int. Ed., (2014), 53, 13376-13379.

TAIYO NIPPON SANSO Stable Isotopes for Biomolecular NMR

22

α-ケト酸

α-ケト酸

α-ケト酸
安定同位体標識されたα - ケト酸を培地に添加することにより、メチル選択的安定同位体標識タンパク質

ことにより、生細胞のアミノ酸生合成経路を利用したを作成することができます。大陽日酸は、各種α-ケト酸

メチル標識イソロイシン、ロイシン、バリンが合成され、をラインナップしております。

O
OH

これらの標識アミノ酸が、タンパク質に取り込まれる

3

2

1

4

O

O
4

O

O

NH2

2-Ketobutyric acid

Isoleucine

2

1

ONa

Valine
O

O

OH

ONa

3

NH2

2-Keto-3-methylbutyric acidOH
NH2
Leucine■ 2-Ketobutyric acid23

■ 2-Keto-3-methylbutyric acid

製品番号

製品名

濃縮度

71,715-0

2-Ketobutyric acid-3,3-d2 sodium salt hydrate(97% CP)

57,134-2

構造式

製品番号

製品名

濃縮度

97 atom % D

57,133-4

2-Keto-3-(methyl- 13C)-butyric acid-4- 13C sodium salt
(97% CP)99 atom % 13C

2-Ketobutyric acid-4- 13C sodium salt hydrate(97% CP)99 atom % 13C

63,437-9

2-Keto-3-(methyl- 13C,d2)-butyric acid-4- 13C, d2 sodium salt

98 atom % 13C
98 atom % D

63,783-1

2-Ketobutyric acid-4- 13C,4-d1 sodium salt hydrate(98% CP)99 atom % 13C
97 atom % D

58,906-3

2-Keto-3-(methyl- 13C)-butyric acid-4- 13C, 3-d1 sodium salt
(97% CP)99 atom % 13C
98 atom % D

63,472-7

2-Ketobutyric acid-4- 13C,4,4-d2 sodium salt hydrate(98% CP)99 atom % 13C
98 atom % D

59,490-3

2-Keto-3-(methyl-d3 )-butyric acid-4- 13C sodium salt

99 atom % 13C
98 atom % D

58,927-6

2-Ketobutyric acid-4- 13C,3,3-d2 sodium salt hydrate(98% CP)99 atom % 13C
98 atom % D

69,188-7

2-Keto-3-(methyl-d3)-butyric acid-4- 13C,3 -d1 sodium salt
(97% CP)99 atom % 13C
97 atom % D

60,753-3

2-Ketobutyric acid-4- 13C,3,3,4,4,4-d5 sodium salt hydrate(98% CP)99 atom % 13C
50-70 atom % D (13CD3)
97 atom %	 D (CD2)59,641-8

2-Keto-3-(methyl-d3)-butyric acid-1,2,3,4- 13C4 sodium salt

99 atom % 13C
98 atom % D

60,754-1

2-Ketobutyric acid- 13C4,3,3-d2 sodium salt hydrate(98% CP)99 atom % 13C
98 atom % D

63,785-8

2-Keto-3-(methyl-13C,d3)-butyric acid-1,2,3,4- 13C4, 3-d1 sodium salt
(98% CP)99 atom % 13C
98 atom % D

66,398-0

2-Keto-3-methylbutyric acid- 13C5 sodium salt

99 atom % 13C

60,756-8

2-Keto-3-methylbutyric acid- 13C5, 3-d1 sodium salt

99 atom % 13C
98 atom % D

71,716-9

2-Keto-3-methylbutyric-3-d acid, sodium salt hydrate(98% CP)98 atom % D

TAIYO NIPPON SANSO Stable Isotopes for Biomolecular NMR

構造式

TAIYO NIPPON SANSO Stable Isotopes for Biomolecular NMR

24

5）
。
鎖医工学研究センター千葉靖典先生らとの共同研究）

また、トランスジェニックタバコを硝酸カリウム、硝酸

め、その構造を自由自在にコントロールすることはこれ

アンモニウムを主な窒素源として水耕栽培することにからの課題だが、糖鎖の生合成に関わる遺伝子の導入加藤晃一

よって 15N 標識した抗体を生産しNMR 計測を実施していや発現制御などを通じてタンパク質の糖鎖構造をテー

自然科学研究機構
岡崎統合バイオサイエンスセンター
教授

る（産業技術総合研究所 北海道センター松村健先生ら

ラーメードなかたちで生産しようという試みも着実にとの共同研究）。ごく最近、生きたカイコにバキュロウ

進展しつつある。構造生物学がこれまで積極的に取りイルスを感染させるシステムを利用して安定同位体標

扱ってこなかった糖タンパク質も N M R 解析として益々7）識した抗体を発現し、そのN M R 解析に成功している 。

身近なものとなるに違いない。こうした技術は基礎研

これは同位体標識した酵母から抽出したタンパク質を究のみならずバイオ医薬品の設計・開発や高度化をは

6）

タンパク質の多くは裸の状態ではなく糖鎖という衣糖鎖の存在を無視して解析を行うということが往々に含む人工飼料を大陽日酸と共同で開発することによっじめとする産業界のニーズに応えることにもつながる装を身に纏って働いている。自然界に存在するタンパ

して行われてきた。
（ちなみに、このような状況は構造てはじめて実現されたものである。

であろう。

ク質全種類の実に半数以上は糖鎖による修飾をうけて生物学に限らず生体分子研究に広くみられてきた風潮

いるものと見積もられている。糖鎖は、タンパク質の溶で、glycophobics と言い表されるほどである。
）NMRは解性や熱安定性といった物理化学的性質を規定してい糖タンパク質のような動的不均一系の構造解析を可能るばかりでなく、タンパク質機能部位の構造構築に積極とする潜在的能力を持っているが、その有用性を十分に的に関わり、レクチンと総称されるタンパク質との相互発揮するためには試料に安定同位体標識を施すことが作用を通じて、様々な生命現象を媒介している。例えば、

必要不可欠である。

糖鎖は細胞の顔としてその表層を覆い、細胞同士のコ

現在のところ糖タンパク質の安定同位体標識に最もミュニケーションにおける言語としての役割を演じて有効な方法は真核細胞を利用したタンパク質発現系をおり、その一方でウイルスが感染する際の標的にもなっ利用することである。動物細胞、昆虫細胞、酵母など様々ている。タンパク質の細胞内外における運命もそれらな真核細胞発現系を利用した標識技術がこれまでに報が担う糖鎖とレクチンとの相互作用を通じて決定され

告されている2）。私たちは、大陽日酸の支援のもとで哺ている。特に最近は、創薬の分野で糖鎖の存在が注目さ

乳動物細胞発現系を用いた糖タンパク質の代謝標識技れている。主要なバイオ医薬は糖タンパク質であり、そ術の開発と応用に取り組んできた。例えば、バイオ医の性状と性能に糖鎖の構造が深く関わっていることが薬品の生産に広く用いられているチャイニーズハムス

明らかになってきているからである。例えば、代表的な

ター卵巣（CHO）細胞を代謝前駆体（アミノ酸、グルコー

バイオ医薬である抗体においては、その F c 領域に結合

ス、ピルビン酸、コハク酸）をすべて安定同位体標識体

している糖鎖の構造のわずかな違いによってがん細胞で置き換えた無血清培地中で培養することによって、を殺傷する能力が 100 倍近くも変わってくることが知均一に13Cおよび15N 標識した抗体を調製することができられている。

に関してる 3）。ヒト抗体 IgGのFc 領域（分子質量 53kDa）

近年の構造生物学の進展によってタンパク質の立体は最近、主鎖シグナルの帰属を公開した4）。こうした情構造情報は爆発的な勢いで蓄積されてきている。しか報を利用することによって糖鎖改変やアミノ酸残基置しながら、プロテインデータバンクに登録されているタ換あるいは長期保存などに伴う抗体の構造変化を細やンパク質 3 次元構造データ約 10 万件のうち糖タンパク

かに評価することが可能となり、抗体医薬の設計・開質に関するものは全体の4%にも満たず、NMRで決定さ発にも役立つものと期待される。

れたものは 20 例以下（0.02%）に留まっている 。しかも

このように培養動物細胞を利用した糖タンパク質のその大半はわずか糖 1 残基程度の情報を与えているに

安定同位体標識は少しずつ普及してきているが未だ生すぎない。構造生物学研究で広く用いられている大腸

産コストが高いことが懸案材料であろう。私たちは、哺菌発現系や無細胞系で糖タンパク質を発現する方法が

乳類細胞以外の真核生物発現系にも注目して糖タンパ確立していないことがその大きな理由である。また、タク質の安定同位体標識技術を開発することにも取り組

ンパク質を修飾する糖鎖の構造は化学的に不均一であんでいる。例えば、出芽酵母を利用したシステムは、糖るとともに高い柔軟性を有しているがゆえに結晶化が鎖プロセシングに関わる遺伝子をノックアウトするこ困難である。これらも糖鎖の構造生物学研究を阻んでとによって糖タンパク質の糖鎖構造を均一化した状態

きた要因である。それゆえに、これまでの構造生物学はで同位体標識する技術へと発展しつつある
（産総研糖

1）

25

糖鎖の構造はゲノムに直接コードされていないた

TAIYO NIPPON SANSO Stable Isotopes for Biomolecular NMR

糖タンパク質の安定同位体標識

糖タンパク質の安定同位体標識

糖タンパク質の安定同位体標識

図 CHO 細胞（左）およびカイコ（右）を用いて発現した抗体のFc 領域の1H-15N HSQC スペクトル（文献 4 および 7より引用）

参考文献
1）Y. Kamiya, T. Satoh, and K. Kato: Curr Opin Struct Biol, 26, 44-53(2014)
2）K. Kato, Y. Yamaguchi, and Y. Arata: Progress in nuclear
magnetic resonance spectroscopy, 56, 346-359 (2010)3）Y. Yamaguchi, and K. Kato: Methods in enzymology, 478, 305322 (2010)4）H. Yagi, Y. Zhang, M. Yagi-Utsumi, T. Yamaguchi, S. Iida, ‥Y. Yamaguchi, and K. Kato: Biomol. NMR assign., Oct. (2014)
DOI 10.1007/s12104-014-9586-7

5）Y. Kamiya, S. Yamamoto, Y. Chiba, Y. Jigami, and K. Kato: J
Biomol NMR, 50, 397-401 (2011)6）H. Yagi, N. Fukuzawa, Y. Tasaka, K. Matsuo, Y. Zhang, ‥T. Yamaguchi, S. Kondo, S. Nakazawa, N. Hashii, N. Kawasaki, ‥T. Matsumura, and K. Kato: Plant Cell Reports, 34, 959-968(2015)
7）H. Yagi, M. Nakamura, J. Yokoyama, Y. Zhang, T. Yamaguchi, ‥S. Kondo, J. Kobayashi, T. Kato, Y. E. Park, S. Nakazawa, N. Hashii,
N. Kawasaki, and K. Kato: J. Biomol. NMR, in press (2015) ‥DOI 10.1007/s10858-015-9930-y

TAIYO NIPPON SANSO Stable Isotopes for Biomolecular NMR

26

糖標識培地 ISOGRO®, 標識培地用試薬培地

糖■ 標識培地 ISOGRO®
製品番号

製品名

濃縮度

製品番号

製品名

濃縮度

60,686-3

ISOGRO®-¹³C ­Powder­-­Growth­ Medium­99 atom % 	 ¹³C

60,830-0

ISOGRO®-¹⁵N,D ­Powder­-G­ rowth ­Medium­­

98 atom % 	­¹⁵N
97 atom % 	 D

60,687-1

ISOGRO®-¹⁵N ­Powder­-­Growth ­Medium

98 atom % 	­¹⁵N

61,672-9

ISOGRO®-D ­Powder­-­Growth­ Medium­

97-99 atom % 	D

60,683-9

ISOGRO®-¹³C,¹⁵N­ Powder­-­Growth ­Medium

60,829-7

ISOGRO®-¹³C,¹⁵N,D­ Powder­-G­ rowth­ Medium­­99­ atom % 	 ¹³C98 atom % 	­¹⁵N

99­ atom % 	 ¹³C98 atom % 	­¹⁵N
97-99 atom % 	­D

ISOGRO® Powderを用いた大腸菌の培養例
ISOGRO® 培地 100 mL 調製用：
1. ISOGRO® Powder 1gを約 90mLのMilli-Q® 水に溶解します2.	下記濃度の塩類等のストック溶液を作成の上、以下に示した分量を加え
ます

製品番号

製品名

濃縮度

製品番号

製品名

濃縮度

41,555-3

D-Fructose-1-13C

99 atom % 	 13C

60,550-6

D-Glucose-2,5-13C2

99 atom % 	 13C

49,214-0

D-Fructose-2-13C

99 atom % 	 13C

60,546-8

D-Glucose-4,5-13C2

99 atom % 	 13C

60,539-5

D-Fructose-6- C

99 atom % 	 C

38,937-4

D-Glucose- C699 atom % 	 13C

58,761-3

D-Fructose-1,6-13C2

98 atom % 	 13C

60,685-5

D-Glucose-13C675 atom % 	 13C

99 atom % 	 C

31,081-6

D-Glucose-1-d1

98 atom % 	 D

58,762-1

13

13

13

13

D-Fructose- C6

1348,872-0

D-Fructose-6,6-d2

98 atom % 	 D

31,082-4

D-Glucose-2-d1

98 atom % 	 D

41,554-5

D-Galactose-1-13C

99 atom % 	 13C

61,549-8

D-Glucose-3-d1

97 atom % 	 D

13

13

60,537-9

D-Galactose- C698 atom % 	 C

28,265-0

D-Glucose-6,6-d2

98 atom % 	 D

49,507-7

D-Galactose-1-d1

98 atom % 	 D

59,716-3

98 atom % 	 D

30,606-1

Glyce (ol-d3)

99 atom % 	 D

D-Glucose-6,6-d2‥(For clinical investigational use)

48,948-4

13

Glycerol-2- C

99 atom % 	 13C

55,200-3

D-Glucose-C-d7

97 atom %61,633-8

D-Glucose-d12

97 atom % 	 D

55,215-1

D-Glucose-13C6,C-d7

99 atom % 	 13C97 atom % D

60,823-8

D-Glucose-13C6,C-d7

99 atom % 	 13C80 atom % 	 D

60,532-8

D-Lactose-1-13C

99 atom % 	 13C

13

Salt

Conc. of Stock Soln.

Qty/100 mL medium

49,263-9Glycerol-1,3-13C2

99 atom % 	 13CK 2 HPO 4
KH 2 PO 4
MgSO 4CaCl 2 ­･H 2 O

100 g/L
50 g/L
50 g/L
37 g/L

1.8 mL
2.8 mL
2.0 mL30 μL

48,947-6

Glycerol-13C3

99 atom % 	 13C

45,452-4

Glycerol-1,1,2,3,3-d5

98 atom % 	 D

44,749-8Glycerol-d8 (98% CP)

98 atom % 	 D

48,873-9

D-Glucosamine-1-13C･HCl

99 atom % 	 13C

D

3. NaOHでpH7.0 に調整し、Milli-Q® 水で100mLにフィルアップします

60,928-5

D-Glucosamine-15N･HCl

98 atom % 	 D

41,553-7

D-Mannose-1- C

99 atom % 	 13C

4.	0.22μ mのフィルターを通し、オートクレーブ滅菌した振とう用フラスコに‥移します（例：50mL 培地に対して、500mL 容フラスコ）

60,821-1

D-Glucosamine-1-13C,15N･HCl

99 atom % 	 13C98 atom % 	 15N

60,534-4

D-Mannose-2-13C

99 atom % 	 13C

5. 大腸菌のプレートからISOGRO® 液体培地に接種します

図

6. 37℃に設定した培養器で振とう培養します
7. 増殖を吸光度 (OD600) 測定により確認します

大腸菌（cTnC(1-89) pLysS）の増殖曲線（OD600）
赤線は、最少培地にISOGRO®を添加した場合、黒線は、最少培地のみで培養した場合の増殖曲線

49,216-7
29,704-6
31,079-4

上記のISOGRO® Powderを用いた大腸菌の培養例は, ISOTEC®のホームページ記載情報を翻訳したものです.

12

12

D-Glucose- C6 (Dextrose- C6)
13

D-Glucose-1- C
13

D-Glucose-2- C
13

12

99.5 atom % 	 C
13

99 atom % 	 C
13

99 atom % 	 C
13

1360,538-7

D-Mannose-6- C

59,299-4

D-Mannose-13C6
13

99 atom % 	 13C98 atom % 	 13C13

48,918-2

D-Sorbitol-1- C (D-Glucitol-1- C)

99 atom % 	 13C

60,552-2

D-Sorbitol-2-13C

99 atom % 	 13C

60,551-4

D-Sorbitol-13C6

99 atom % 	 13C

60,540-9

D-Glucose-3- C

99 atom % 	 C

31,080-8

D-Glucose-6-13C

99 atom % 	 13C

61,620-6

D-Sorbitol-1,1,6,6-d4

98 atom % 	 D

45,318-8

D-Glucose-1,2-13C2

99 atom % 	 13C

33,110-4

D-Xylose-1-13C

99 atom % 	 13C

45,319-6

D-Glucose-1,6-13C2

99 atom % 	 13C

■ 標識培地用試薬
製品番号29,925-1
59,409-1
48,801-1

27

製品名
労

濃縮度
15

製品番号
15

製品名

濃縮度

Ammonium- N chloride

98 atom % 	 N

44,749-8Glycerol-d8 (98% CP)

98 atom % 	 D

Ammonium-15N,d4 deuteroxide
solution,~3 N in D2O

99 atom % 	15N98 atom % 	 D

49,263-9Glycerol-1,3-13C2

99 atom % 	 13C

48,947-6

Glycerol-13C3

99 atom % 	 13C

15劇 労 Ammonium- N hydroxide solution,~3 N in H2O

98 atom % 	15N

13

99 atom % 	 13C98 atom % 	 D

66,902-4

Glycerol- C3,d8

37,238-2

Sodium Bicarbonate-¹³C

98 atom % 	¹³C

49,073-3

Sodium Pyruvate-3-13C

99 atom % 	 13C

49,071-7

Sodium Pyruvate-¹³C₃­

99 atom % 	¹³C

49,070-9

Sodium­ Pyruvate-1-¹³C‥(Pyruvic acid-1-¹³C Sodium Salt)­

99 atom % 	¹³C

29,928-6

Ammonium-15N2 sulfate

98 atom % 	15N

15,188-2

Deuterium oxide

99.9 atom % 	D

61,738-5

Deuterium oxide

99.8 atom % 	D

43,576-7

Deuterium oxide

99 atom % 	 D

61,342-8

Deuterium oxide

70 atom % 	 D

49,507-7

D-Galactose-1-d₁­

98 atom % 	 D

49,339-2

Sodium Pyruvate-1,2-¹³C₂­

99 atom % 	¹³C

48,873-9

D-Glucosamine-1-¹³C­･HCl

99 atom % 	¹³C

49,072-5

Sodium Pyruvate-2-¹³C­

99 atom % 	¹³C

55,200-3

D-Glucose-C-d7

97 atom % 	 D

48,619-1

Sodium Pyruvate-2,3-¹³C₂­­

99 atom % 	¹³C

61,633-8

D-Glucose-d12

97 atom % 	 D

49,073-3

Sodium Pyruvate-3-¹³C

99 atom % 	¹³C

29,704-6

D-Glucose-1-13C

99 atom % 	 13C

60,848-3

Sodium Pyruvate-3-¹³C3,3,3-d₃

38,937-4

D-Glocose-13C6

99 atom % 	 13C

99 atom % 	¹³C50-60 atom % 	D

55,215-1

D-Glucose-13C6,1,2,3,4,5,6,6,-d7

99 atom % 	 13C97 atom % 	 D

49,197-7

Succinic acid-1,2-¹³C₂‥(Butanedioic acid-1,2-¹³C₂)

99 atom % 	 D

TAIYO NIPPON SANSO Stable Isotopes for Biomolecular NMR

TAIYO NIPPON SANSO Stable Isotopes for Biomolecular NMR

28

リボースのシグナルを関連付けることができ、また、塩基の 15N 核および 13C 核の化学シフトを利用することで分離能を改善することができる。もちろん、残基選択的な標識を行えば、シグナルの帰属の手間は大きく軽減
河合剛太

される。

千葉工業大学教授

R N A の安定同位体標識：RNAの場合、30 残基程度の核酸は古くから知られている分子であるが、特にRNA

短いものについては化学合成が可能であるが、それよは、近年その生物学的な重要性が再認識され、構造生物

り長いものについては、試験管内転写法が用いられる。

学の研究対象として脚光を浴びている。タンパク質がRNAの化学合成場合、リボースの2’ 位の水酸基の保護がさまざまな官能基をもつ 20 種類のアミノ酸からなり、必要となるため、DNAと比べて工程が煩雑であり、長いその N M R シグナルにバラエティがあるのに対して、核R N A の合成は効率が落ちる。それでも、任意の位置を酸は 4 種類のヌクレオチドからなり、さらにいずれも塩標識できるメリットは大きく、安定同位体標識アミダ

基、糖、リン酸基という限られた化学構造でできている

イトユニットを用いたRNAの化学合成は重要である。試ことから、N M R シグナルが密集する傾向にある。した験管内転写法では、T 7 R N A ポリメラーゼを用いる方法

がって、核酸の N M R 解析において、安定同位体標識はが一般的であり、多くの場合、合成キットを用いた1 mL

必須である。

スケールの反応でNMR 測定に必要な量のRNA 試料が得られる。ただし、塩基配列によって転写反応の効率が■ 安定同位体標識の方法

大きく下がることがあり、また、5’ 末端が G 残基である

試料調製において、タンパク質の場合には、大腸菌なことが必要である。長いRNAの特定の位置を標識するた

ど生細胞を利用した大量発現系あるいは細胞抽出液をめには、化学合成等で調製した標識 R N A 断片を含む複利用した無細胞系が用いられているが、核酸の場合に数の断片をT4 RNA ligaseなどによって連結する方法がは、酵素合成あるいは化学合成が用いられる。これは有効である。

ppm
145
15N Chemical shift■ はじめにG

150

安定同位体標識核酸を用いたNMR解析

安定同位体標識核酸を用いたNMR解析

安定同位体標識核酸を用いたNMR解析

155
160

U

165
14.5

14.0

13.5 13.0 12.5 12.0
1H Chemical shift

11.5

ppm

図 1 RNAの15N-1N HMQC スペクトル（31 残基，軽水中）
15N 核の化学シフトの違いによって, GとUが明確に区別できる. 11.3 ppm 付近にG-U 塩基対に由来する2 つのシグナルが観測されているが, これについてもGとUが容易に区別できることがわかる.

主として、DNAは細胞中で大量に増えることはなく、また R N A については細胞内あるいは細胞抽出液内で分解が速いことによる。

■ 安定同位体標識核酸のNMR スペクトル解析
ワトソン・クリック塩基対が存在すると、グアニン（ G ）の N H 1 およびチミン（ T ）あるいはウラシル（ U ）のDNAの安定同位体標識：DNA 試料は、化学合成ある

NH3 のシグナルが10 ppmより低磁場に観測される。こいはPCRで調製することができる。DNAの場合には、化れらのイミノプロトンシグナルは、核酸の他のシグナ

学合成の効率が良いので、100 残基程度でも調製が可能

ルやタンパク質のシグナルと重ならないため、構造解である。安定同位体標識されたデオキシアミダイトユ

析や相互作用解析において重要である。安定同位体標

ニットを用いれば、配列中の任意の位置を標識できる。

識核酸を用いると、15 N 核の化学シフトから G であるか

PCRの場合には、安定同位体標識 dNTPを基質として用T/Uであるかが明確に区別できる（図 1）。

いることによって、標識 D N A の調製が可能である。413

C 核の化学シフトを利用すると、アデニン（A）のCH2

種類すべてを標識することもできるし、塩基の種類ごが他の塩基の C H と区別できる。また、シトシン（ C ）のとに標識することもできる。なお、プライマーの部分はCH5 とUのCH5 を区別できる。なお、DNAの場合には、標識されない。短いDNA 断片を作成する場合には、同じ

C と T でスピン系が異なっているため、標識しなくても配列を繰り返したDNAを用意して、PCRによって増やし区別が可能である。核酸の場合には、各残基がリン酸た後、制限酵素等で切断することによって効率良く調基を介してつながっているため、タンパク質のような製することも可能である。

三重共鳴実験による連鎖帰属はできないが、安定同位体標識を行うことによって、一つの残基内の塩基と29

TAIYO NIPPON SANSO Stable Isotopes for Biomolecular NMR

TAIYO NIPPON SANSO Stable Isotopes for Biomolecular NMR

30

核酸
創薬や生命科学の分野において、核酸（DNA/RNA）のとなる高品質な安定同位体標識デオキシリボヌクレオチド

構造・機能解析の重要性が高まっており、N M R 解析に（dNMP’s）、リボヌクレオチド（rNTP’s）
およびアミダイト試

必須な安定同位体標識技術（酵素合成法や化学合成法

薬（DNA/RNA Phosphoramidites）
を提供いたします。

等）が開発されております。大陽日酸は、これらの原料
西村善文
■ DNA
2’-Deoxyribonucleotide-13C,15N 5’-monophosphates
sodium salt (dNMPs-13C,15N)

横浜市立大学
学長補佐

2’-Deoxyribonucleotide-13C,15N 5’-triphosphates
sodium salt solution (dNTPs-13C,15N)

製品番号

製品名

濃縮度

製品番号

製品名

濃縮度

64,862-0

dAMP-13C10,15N5 (90% CP)

98 atom % 	13C‥
98 atom % 	15N

64,623-7

dATP-13C10,15N5 (90% CP)

98 atom % 	13C‥
98 atom % 	15N

64,860-4

dGMP-13C10,15N5 (90% CP)

98 atom % 	13C‥
98 atom % 	15N

64,621-0

dGTP-13C10,15N5 (90% CP)

98 atom % 	13C‥
98 atom % 	15N

64,861-2

dCMP-13C9,15N3 (90% CP)

98 atom % 	13C‥
98 atom % 	15N

64,622-9

dCTP-13C9,15N3 (90% CP)

98 atom % 	13C‥
98 atom % 	15N

64,859-0

13

15

TMP- C10, N2 (90% CP)

1398 atom % 	 C‥98 atom % 	15N

64,620-2

13

15

13

TTP- C10, N2 (90% CP)

98 atom % 	 C‥98 atom % 	15N

* Supplied as sodium salt in 100 mM soln in H2O, 5 mM Tris HCl buffer■ RNA
Ribonucleotide-15N 5’-monophosphates sodium salt
(rNMPs-15N)
製品番号

製品名

濃縮度

15

15

66,265-8

AMP- N5 (90% CP)

98 atom % 	 N

66,267-4

GMP-15N5 (90% CP)

98 atom % 	15N

15

1566,268-2

CMP- N3 (90% CP)

98 atom % 	 N

66,266-6

UMP-15N2 (90% CP)

98 atom % 	15N

Ribonucleotide-13C,15N 5’-Triphosphates sodium salt
(rNTPs-13C,15N)
濃縮度

Ribonucleotide-13C,15N 5’-monophosphates
sodium salt (rNMPs-13C,15N)の場合、タンパク質に翻訳されて機能する。生じたタン

タンパク質をこれら安定同位体でラベルするためには、パク質は様々な生体分子と相互作用して、その機能を発通常、大腸菌を用いた組換えタンパク質として発現し、揮する。よって遺伝子の働きを知るためには、遺伝子精製してNMRの測定に用いる。大腸菌は、リン酸と窒素産物であるタンパク質の働きを知る必要がある。タン化合物と糖があれば生育できる。窒素化合物として安パク質は他のタンパク質やDNA、RNA 等の核酸や、様々

定同位体ラベルした 15N H 4 C lと、糖として安定同位体でな代謝化合物と相互作用して働く。その結合の詳細をラベルした 13C - グルコースをリン酸緩衝液中に溶解し、知るために、タンパク質を構成している分子の原子レベ

大腸菌を培養すると、大腸菌内のタンパク質の全てのルでの理解が必須となりつつある。タンパク質の働き

炭素は 13 Cでラベルされ、窒素は 15Nでラベルされる。そは様々な生命機能の維持に必要なので、その働きが異常の様にして調製したタンパク質を用いて、N M R による

AMP- C10, N5 (90% CP)

98 atom % 	13C‥
98 atom % 	15Nになると様々な病気になる。このような様々な病気に構造解析を当研究室では行っている。また、分子量が65,068-4

GMP-13C10,15N5 (90% CP)

98 atom % 	13C‥
98 atom % 	15N

関わるタンパク質の働きを制御できれば、病気の治療

大きなタンパク質では、15N や 13C の測定に影響を及ぼす

65,069-2

CMP-13C9,15N3 (90% CP)

98 atom % 	13C‥
98 atom % 	15Nも可能になる。病気の原因となるタンパク質は、様々な（D）に置き換えるために、
水素原子1Hを質量2 の重水素2H

理由で機能が異常になっているが、機能異常を制御で中で培養する事もある。その様にし大腸菌を重水（D2O）

65,137-0

UMP-13C9,15N2 (90% CP)

98 atom % 	13C‥
98 atom % 	15N

きる化合物が薬となる。タンパク質の相互作用を精密に溶かすと、炭て調製したタンパク質を通常の水（H 2O）に制御するためには、タンパク質による相互作用の詳細

素原子などに結合した水素原子は D のままだが、アミドを知る必要があり、タンパク質を構成する分子中の原子のように窒素原子に結合した D は溶媒中の H と交換し、レベルでの相互作用を解明する必要がある。

1

rN-Phosphoramidites-13C,15N

64,570-2

ATP- C10, N5 (90% CP)

98 atom % 	 C‥98 atom % 	15N

A24-0054

劇

rA-Phosphoramidites- C10, N5

98 atom % 	 C‥98 atom % 	15N

64,568-0

GTP-13C10,15N5 (90% CP)

98 atom % 	13C‥
98 atom % 	15N

A25-0055

劇

rG-Phosphoramidites-13C10,15N3

98 atom % 	13C‥
98 atom % 	15N

64,569-9

CTP-13C9,15N3 (90% CP)

98 atom % 	13C‥
98 atom % 	15N

A26-0056

劇

rC-Phosphoramidites-13C9,15N3

98 atom % 	13C‥
98 atom % 	15N

64,567-2

UTP-13C9,15N2 (90% CP)

98 atom % 	13C‥
98 atom % 	15N

A27-0057

劇

rU-Phosphoramidites-13C9,15N2

98 atom % 	13C‥
98 atom % 	15N

製品番号

製品名

濃縮度
13

15

*5’-O-DMTr-2’-O-tBDMS-N-Pac-CE Phosphoramidites■ 安定同位体標識DNA/RNA 受託合成
高 純 度 精 製：20% 変性 PAGE/HPLC
大 量 調 製：20 ODU ～（100 ODU 以上も合成可能）
標識パターン：13C,15N,D 標識、選択標識、等31

質量を 13 に、窒素原子の質量を 15 にする必要がある。

65,067-6

13

13

特徴

子を持っている事が分かった。これらの遺伝子は多く

濃縮度

製品名

製品名

13

N M R の測定のためには、タンパク質中の炭素原子の

15

製品番号

製品番号

15

ヒトゲノムの解析により、ヒトは約 23, 000 個の遺伝

TAIYO NIPPON SANSO Stable Isotopes for Biomolecular NMR

13タンパク質とタンパク質や核酸等との相互作用

核酸

タンパク質とタンパク質や核酸等との相互作用

H - 15N の相関を測定できる。また、更に大きなタンパク

このような合理的な考えかたで薬を創造していくた

質では 1Hと 15Nと 13Cの全てを観測するのではなく、タン

めには、原子レベルでタンパク質の相互作用の実態をパク質中のメチル基のみを13C-1H3 に置換し、他の原子を解明する必要がある。その中の手法の一つとして近年

14

注目を浴びているのが、核磁気共鳴（Nuclear Magnetic

る。その場合には、重水素化グルコースとメチル基をResonance：NMR）である。NMRは、原子核のスピンの状ラベルした酪酸を培養に用いる。

Nと12C 、Dにして観測するMe-TROSY法もよく使用され態を検査する手法である。原子核のスピンは、陽子の数

また、タンパク質発現に必要な細胞の破砕液を用意が同じ原子でも、構成している中性子の数によって変化し、細胞中ではなくセルフリーの系にタンパク質発現し、質量が異なる同位体が存在する。タンパク質中の原子のための遺伝子 DNAを加えて、安定同位体ラベルタンとして非常に多いものには、水素原子、炭素原子、窒素原

パク質を得る事も行われている。この場合、安定同位子がある。これらの原子核で、通常は質量が1の水素原子体でラベルしたアミノ酸を加える必要があるが、15N でのみがNMRで活性である。炭素原子（C）
は、通常は
（1H）

ラベルされたアミノ酸、15Nと13 Cでラベルされたアミノで全くNMR 活性ではないが、安定同位体
質量が12（12C）酸、15N と 13C と D でラベルされたアミノ酸、更にはメチの質量が 13 の炭素原子 C は、水素原子と同じ核スピン

レンやメチル基の水素原子の 1 個のみを立体特異的にを持ち、NMR活性になる。また、窒素原子も通常は質量1が 14 で N M R 活性は弱いが、質量が15の窒素原子 15N はミノ酸）など、様々な安定同位体ラベルアミノ酸が市

水素原子と同じ核スピンを持ちNMR 活性が強くなる。

販されている。また、細胞破砕液としては、大腸菌由

13

Hとし、15Nと 13CとDでラベルされたアミノ酸（SAIL アTAIYO NIPPON SANSO Stable Isotopes for Biomolecular NMR

32

ンと7種類以上の標的タンパク質の複合体構造が解析されている。

れてきたが、解析されたその全てのp53の転写活性化ド

また、安定同位体を利用した N M R 構造解析の利点として、もう一つ例を挙げる。

タンパク質の構造解析として、X 線結晶構造解析がよ

メインは非リン酸化体であった。非リン酸化体のp53の遺伝子 D N A は、細胞の核内でコンパクトに折りたたく用いられる。結晶ができれば、巨大なタンパク質複合

転写活性化ドメインは、標的タンパク質の表面で両新媒まれた染色体（クロマチン）構造をとっている。細胞毎

体でも構造が解析できるので、様々なタンパク質やそ性ヘリックスを形成していたので、結合に伴うヘリックスに D N A の情報の発現は制御され、遺伝情報が発現しての複合体構造が解析され、報告されている。

形成が重要な認識機構である事が示唆された。しかし、いるところのクロマチンは緩んでいて、発現していな

その様な状況で、N M R によるタンパク質の構造解析

最近、当研究室の特任助教の奥田博士が、46番のセリンいところでは非常に高度に凝集したヘテロクロマチンの利点があるとしたら、結晶化できないタンパク質のと56番のトレオニンがリン酸化されたp53の転写活性化を形成する。ヘテロクロマチンの形成に関与する C h p 1

構造解析である。特に最近、真核生物の核内に存在するドメインと基本転写因子の T F I I H の p 62 サブユニットのタンパク質中のクロモドメインとヘテロクロマチンのタンパク質の半分以上は、単独では特定の構造をとっPHドメインとの複合体構造をNMRで解析したところ、リ

ヒストンとの複合体構造を、我々は N M R で解析した。

ていない天然変性タンパク質である事が知られるようン酸化したp53の転写活性化ドメインが、標的タンパク

その構造は、それまで X 線を用いた結晶構造の結果とはになってきた。これら核内タンパク質は、遺伝子の総質の表面で伸びた紐状構造で結合している事を初めて解異なり、図 2 の上部に長い紐状構造とそれに続く短いら体であるゲノムが同じでも、表現形が異なるエピゲノ

明した。この解明には、先ほど述べた安定同位体でラベせんが認められた。ヘテロクロマチンの形成には非コームと呼ばれるゲノムを超えた現象に関係している。遺ルしたタンパク質を使用している。リン酸化された天然ド RNAが関与する事が分かっているが、NMRで新たに伝子 DNAが全く同じでも、DNAが核内でとるクロマチ

変性タンパク質が伸びた紐状構造で結合する様子を、初解析できた紐状構造と短いらせん構造部位が R N A 結合

ン構造が異なると、遺伝子の発現は異なる。遺伝子の発めて明らかにする事ができた。伸びた紐状の転写活性化に必要である事を明らかにした。これは結晶構造では

現は多くの場合、転写レベルで調節されているので、クドメインは、リン酸化セリンとリン酸化トレオニンとア分からない事であった。

ロマチン構造や転写に関連するタンパク質が、エピゲノ

スパラギン酸やグルタミン酸を含んだ酸性ドメインなのムの中心になっている。エピゲノムが重要視されるので、負に荷電した紐である。その紐が PHドメインの正には、同じ遺伝子を持っている生体の細胞に 4 種類の転写

荷電した溝に埋まっている。さらに、この静電的な相互因子を発現させると、初期化細胞である i P S 細胞が誘導作用だけではなく、p53の転写活性化ドメイン中のトリされる事である。また、神経疾患やがん等の様々な病

プトファンの芳香環がPHドメインの疎水的な窪みに収気でエピゲノムの変化が重要である事が分かってきた。

まって、紐の位置を確定していた。この結合の様子は、

これらエピゲノム関連タンパク質は、ほとんどの場合、

既に我々が解析していたTFIIHと基本転写因子 TFIIEとの天然変性領域を持っている。

相互作用と似ていた。遺伝子の発現の時にはTFIIHがTFIIE

p53はゲノムの守護神と呼ばれ、様々な生物学的過程に結合してRNA合成酵素が活性化し、mRNAが合成されに関与する非常に重要なタンパク質で、がん抑制タンパ

る。遺伝子 DNAが傷付くと、遺伝子の発現の転写を止めク質として知られ、悪性腫瘍の半分以上でp53遺伝子のて遺伝子を修復する。その時には、損傷したDNAに応じ異常が見つかっている。p53の働きを正常化できると、てp53がリン酸化され、TFIIHのPHドメインに強く結合で多くのがんは治癒できる可能性がある。p53は、N末約

きるようになり、TFIIHとTFIIEの相互作用を妨げ、TFIIHを

70アミノ酸領域の転写活性化ドメインと中央部約200 ア

DNA損傷部位にp53がリクルートする。その時のp53のミノ酸領域のDNA結合ドメインとC末の4量体形成ドメ

認識機構を我々は解明した（図1）。

図 2 水色で表示したヘテロクロマチンのヒストンに結合したChp1のクロモ‥ドメインを緑色で表示した. 上部に伸びている短いらせんとそれに続く‥
ひも状構 造 は結晶構造では解析されていないが, その領域で非コード‥
RNAと相互作用しする事を見出した.（Ishida M, Shimojo H, Hayashi A,
Kawaguchi R, Ohtani Y, Uegaki K, Nishimura Y, Nakayama J. Intrinsic
nucleic acid-binding activity of Chp1 chromodomain is required forheterochromatic gene silencing. Mol. Cell, 47, 228-241 (2012).）タンパク質とタンパク質や核酸等との相互作用

タンパク質とタンパク質や核酸等との相互作用

来と小麦胚芽由来のものなどがあり、どちらも市販さインを持つ約400 アミノ酸からなるタンパク質である。
各々のドメインの複合体の構造解析は、そのタンパク質の重要性から長年にわたって多くの研究者により解析されてきた。N末の転写活性化ドメインは、9個のリン酸化されるセリン残基やトレオニン残基を持っている。各々のリン酸化が標的タンパク質との相互作用を制御しているので、p53の転写活性化ドメインの特定の部位のリン酸化が構造に及ぼす影響を研究する事は非常に重要である。約70アミノ酸からなるp53の転写活性化ドメインは、単独では特定の構造をとらない天然変性タンパク質であるので、標的タンパク質とどのように相互作用するかが注目されてきた。これまでにもp53の転写活性化ドメイ

33

図 1 青で表示した p 53 のリン酸化転写活性化ドメインと標的タンパク質の複合体構造（Okuda, M. and Nishimura, Y., Extended String Binding Mode of
the Phosphorylated Transactivation Domain of Tumor Suppressor p53. J.
Am. Chem. Soc., 136, 14143-14152 (2014).）TAIYO NIPPON SANSO Stable Isotopes for Biomolecular NMR

TAIYO NIPPON SANSO Stable Isotopes for Biomolecular NMR

34

大陽日酸は、Biomolecular NMR 分野に最適な安定同位体標識試薬および関連商品を幅広く取り揃えております。
カタログ商品以外も、お気軽にお問い合わせください。

FMOC アミノ酸
製品番号

製品名

濃縮度

製品番号

製品名

濃縮度

製品番号

製品名

濃縮度

製品番号

製品名

濃縮度

48,675-2

FMOC-Ala-OH-1-13C

99 atom % 	13C

57,862-2

FMOC-Ile-OH-15N

98 atom % 	15N

49,288-4

BOC-Ala-OH-12C3 (13C-depleted)

99.9 atom % 	12C

48,955-7

BOC-Gly-OH-2-13C,15N

60,515-8

FMOC-Ala-OH-2-13C

99 atom % 	13C

59,722-8

FMOC-Ile-OH-13C6,15N (98% CP)

98 atom % 	13C98 atom % 	15N

48,676-0

BOC-Ala-OH-1-13C

99 atom % 	13C

99 atom % 	13C98 atom % 	15N

60,507-7

BOC-Ala-OH-2-13C

99 atom % 	13C

58,773-7

BOC-Gly-OH-13C2,15N

99 atom % 	13C98 atom % 	15N

99 atom % 	13C

49,289-2

BOC-Ala-OH-3-13C

99 atom % 	13C

48,594-2

BOC-Leu-OH-1-13C･H2O

99 atom % 	13C

48,995-6

FMOC-Ala-OH-3-13C

99 atom % 	13C

60,513-1

FMOC-Ala-OH-13C3

99 atom % 	13C

48,990-5

FMOC-Ala-OH-15N

98 atom % 	15N

61,604-4

FMOC-Ala-OH-2,3,3,3-d4

98 atom % 	 D

48,588-8

FMOC-Ala-OH-3,3,3-d3

99 atom % 	 D

66,706-4
65,365-9

13

15

13

FMOC-Ala-OH, C3, N
13

99 atom % 	 C
98 atom % 	15N15

FMOC-Arg(Pbf)-OH- C6, N4 (97% CP)

1398 atom % 	 C
98 atom % 	15N

66,874-5

FMOC-Asn(Trt)-OH-15N2 (95% CP)

98 atom % 	15N

57,989-0

FMOC-Asn-OH-15N2

98 atom % 	15N

60,913-7

15

FMOC-Asn-OH-α- N (amine- N)

98 atom % 	 N

66,875-3

FMOC-Asn(Trt)-OH-13C4, 15N2 (95% CP)

99 atom % 	13C98 atom % 	15N

15

1558,862-8

FMOC-Asp-OH-1-13C

99 atom % 	13C

60,526-3

FMOC-Asp-OH-4-13C

98 atom % 	13C

49,290-6

FMOC-Asp-OH-15N

98 atom % 	15N

59,407-5

FMOC-Asp(OtBu)-OH-15N

98 atom % 	15N

68,363-9

FMOC-Asp(OtBu)-OH-13C4,15N (97% CP)

98 atom % 	13C98 atom % 	15N

67,660-8

15

FMOC-Cys(Trt)-OH- N (97% CP)

98 atom % 	 N

49,000-8

FMOC-Glu-OH-15N

98 atom % 	15N

60,915-3

15

FMOC-Glu(OtBu)-OH- N
13

15

15

98 atom % 	 N

FMOC-Gly-OH-1- C

99 atom % 	 C

48,954-9

FMOC-Gly-OH-2-13C

99 atom % 	13C

FMOC-Gly-OH-13C2

48,593-4
48,595-0
61,594-3

FMOC-Leu-OH-1-13C
15

FMOC-Leu-OH- N (98% CP)
FMOC-Leu-OH-5,5,5-d3

99 atom % 	13C

15

98 atom % 	 N
99 atom % 	 D

48,991-3
48,678-7

15

15

BOC-Ala-OH- N

98 atom % 	 N

BOC-Ala-OH-3,3,3-d3

60,344-9

BOC-Ala-OH-2- C, N

99 atom % 	 C
98 atom % 	15N

BOC-Ala-OH-13C3,15N

99 atom % 	13C98 atom % 	15N

FMOC-Leu-OH-d10

98 atom % 	 D

59,353-2

FMOC-Leu-OH-13C6,15N

98 atom % 	13C98 atom % 	15N

48,583-7

13

99 atom % 	 D

15

59,040-1

FMOC-Lys(BOC)-OH-15N2

98 atom % 	15N

57,978-5

BOC-Asn-OH- α -15N (amine-15N)

98 atom % 	15N

65,363-2

FMOC-Lys(BOC)-OH-13C6,15N2 (97% CP)

98 atom % 	13C98 atom % 	15N

58,618-8

BOC-Asp-OH-3-13C

99 atom % 	13C

58,640-4

BOC-Asp-OH-4-13C

99 atom % 	13C

60,511-5

FMOC-Met-OH-1-13C

99 atom % 	13C

58,768-0

BOC-Glu-OH-1-13C

99 atom % 	13C

60,919-6

FMOC-Met-OH-15N

98 atom % 	15N

58,769-9

BOC-Glu-OH-15N

98 atom % 	15N

65,364-0

FMOC-Met-OH-13C5,15N (97% CP)

98 atom % 	13C98 atom % 	15N

58,840-7

BOC-Glu-OBzl-13C5,15N (97% CP)

98 atom % 	13C98 atom % 	15N

58,770-2

BOC-Gln-OH-15N2

98 atom % 	15N

48,669-8

BOC-Gly-OH-1-13C

99 atom % 	13C

48,578-0

BOC-Gly-OH-2-13C

99 atom % 	13C

60,499-2

BOC-Gly-OH-13C2

99 atom % 	13C

48,670-1

BOC-Gly-OH-15N

98 atom % 	15N

58,771-0

BOC-Gly-OH-2,2-d2

49,296-5
60,907-2

FMOC-Phe-OH-2-13C

99 atom % 	13C

15

98 atom % 	15N

FMOC-Phe-OH- N

61,599-4

FMOC-Phe-OH-phenyl-d5-2,3,3-d3

98 atom % 	 D

65,144-3

FMOC-Phe-OH-13C9,15N (98% CP)

98 atom % 	13C98 atom % 	15N

58,951-9

FMOC-Pro-OH-15N

98 atom % 	15N

65,145-1

FMOC-Pro-OH-13C5,15N

98 atom % 	13C98 atom % 	15N

60,914-5

FMOC-Ser(tBu)-OH-15N
13

58,772-9

13

15

BOC-Gly-OH-1- C, N

98 atom % 	 D

69,427-4

FMOC-Thr(tBu)-OH- C4, N (97% CP)

99 atom % 	13C98 atom % 	15N

60,921-8

FMOC-Trp-OH- α -15N

98 atom % 	15N

64,830-2

15

FMOC-Trp-OH- N2 (98% CP)
FMOC-Trp(Boc)-OH-15N2 (97% CP)

製品番号

製品名

濃縮度

95 atom % 	 N

60,294-9

Water -17O

20-24.9 atom % 17O

97 atom % 	15N

60,302-3

Water -17O

25-29.9 atom % 17O

1548,577-2

FMOC-Gly-OH-2,2-d2

98 atom % 	 D

65,362-4

FMOC-Tyr-OH-15N (97% CP)

98 atom % 	15N

60,300-7

Water - O

35-39.9 atom % 17O

49,269-8

FMOC-Gly-OH-1-13C,15N

99 atom % 	13C98 atom % 	15N

48,599-3

FMOC-Val-OH-1-13C (98% CP)

99 atom % 	13C

60,296-5

Water -17O

40-44.9 atom % 17O

99 atom % 	13C98 atom % 	15N

48,953-0

FMOC-Gly-OH-13C2,15N

99 atom % 	13C98 atom % 	15N

67,696-9

FMOC-His(Trt)-OH-15N3 (97% CP)

98 atom % 	15N

17

48,600-0

FMOC-Val-OH-15N

98 atom % 	15N

60,303-1

Water - O

45-49.9 atom % 17O

61,608-7

FMOC-Val-OH-d8

98 atom % 	 D

60,986-2

Water -17O

90 atom % 17O

64,288-6

FMOC-Val-OH-13C5,15N

98 atom % 	13C98 atom % 	15NTAIYO NIPPON SANSO Stable Isotopes for Biomolecular NMR

98 atom % 	15N

58,923-3

BOC-Leu-OH-2- C, N･H2O

99 atom % 	13C98 atom % 	15N

60,916-1

BOC-Lys(Z)-OH-α-15N

98 atom % 	15N

49,007-5
48,596-9
60,520-4

15

BOC-Lys(Z)-OH-ε- N

98 atom % 	15N

13

99 atom % 	13C

13

99 atom % 	13C

13

BOC-Phe-OH-1- C
BOC-Phe-OH-2- C

49,297-3

BOC-Phe-OH-3- C

99 atom % 	13C

49,295-7

BOC-13C-Phe-OH (carbonyl-13C)

99 atom % 	13C

48,683-3

BOC-Phe-OH-15N

98 atom % 	15N

58,955-1

BOC-Phe-OH-phenyl-d5

98 atom % 	 D

48,597-7

BOC-Phe-OH-phenyl-d5-2,3,3-d3

98 atom % 	 D

67,286-6

BOC-Thr(Bzl)-OH-13C4,15N (97% CP)

99 atom % 	13C98 atom % 	15N

59,109-2

BOC-Tyr-OH-15N

98 atom % 	15N

60,497-6

13

BOC-Val-OH-1- C

99 atom % 	13C

48,601-9

BOC-Val-OH-15N

98 atom % 	15N

61,622-2

BOC-Val-OH-d8

98 atom % 	 D

Water-17O

98 atom % 	 N

FMOC-Gly-OH-2-13C,15N

15

98 atom % 	15N15

FMOC-Gly-OH- N

60,345-7

13

99 atom % 	 C
98 atom % 	15N

48,575-6

15

BOC-Leu-OH- N･H2O

13

67,697-7

15

49,293-0

15

13

57,796-0

1360,518-2

58,774-5

35

BOCアミノ酸

BOCアミノ酸, Water-17O

FMOCアミノ酸

各種安定同位体標識試薬

17

TAIYO NIPPON SANSO Stable Isotopes for Biomolecular NMR

36

バッファー, 界面活性剤, 還元剤
ユビキチン, ファージ

バッファー, 界面活性剤, 還元剤 他
製品番号15,178-5

労

製品名

濃縮度

製品番号

製品名

濃縮度

Acetic acid-d4

99.5 atom % 	D

68,702-2

MES-d13 (98% CP)

98 atom % 	 D

Ammonium-d4 bromide

98 atom % 	 D

27,717-7 劇 労Methanol-13C

99 atom % 	13C

Ammonium-d4 chloride

98 atom % 	 D

29,386-5 劇 労Methanol-13C,d4

Ammonium-d4 deuteroxide solution, ‥25 wt. % in D2O

99 atom % 	 D

99.5 atom % 	D
99 atom % 	13C

65,886-3

98 atom % 	 D

65,539-2

Bis-tris-d19 (98% CP)

98 atom % 	 D

Octyl- β -D-glucopyranoside-d24(97% CP)

48,553-5

DL-Dithiothreitol-d10 (98% CP)

98 atom % 	 D

69,663-3

PIPES-d18 (98% CP)

98 atom % 	 D

48,561-6

Dodecylphosphorylcholine-d38

98 atom % 	 D

48,937-9

EDTA-d1298 atom % 	 D

17,657-5
17,567-6

労17,670-2

劇 労

42,622-9

劇 労 Fomic acid-d2,95 wt.% in H2O

98 atom % 	 D

17,607-9

Sodium acetate-d3

99 atom % 	 D

28,201-4

Sodium acetate-13C2

99 atom % 	13C

29,911-1

Sodium acetate-13C2,d3

99 atom % 	13C99 atom % 	 D45,452-4

Glycerol-1,1,2,3,3-d5

98 atom % 	 D

45,185-1

Sodium dodecyl sulfate-d25

98 atom % 	 D

17,583-8

Glycine-d5

98 atom % 	 D

37,384-2

Sodium formate-d1

99 atom % 	 D

64,382-3

HEPES-d18 (98% CP)

98 atom % 	 D

48,835-6

Succinic acid-d6

98 atom % 	 D

36,602-1

Imidazole-d4

95 atom % 	 D

48,624-8

Tris-d11 solution,1 M in D2O

98 atom % 	 D

2-Mercaptoethanol-d6 (98% CP)

96 atom % 	 D

44,910-5

Tris-d11(Crystalline) (98% CP)

98 atom % 	 D

61,522-6

毒

ユビキチン
製品番号

製品名

標識核種

製品番号

製品名

標識核種

UB01

Ubiquitin his tagged

non-labeled

UB01-nt

Ubiquitin non tagged

non-labeled

UB02

Ubiquitin-N his tagged

15

UB02-nt

Ubiquitin-N non tagged

15

UB03

Ubiquitin-C his tagged

13

UB03-nt

Ubiquitin-C non tagged

13

N
C

UB04-80

Ubiquitin-D his tagged

D

UB04-nt-80

Ubiquitin-D non tagged

UB04-98

Ubiquitin-D his tagged

D

UB04-nt-98

Ubiquitin-D non tagged

Ubiquitin-ND his tagged

15

UB05-98

Ubiquitin-ND his tagged

15

UB06

Ubiquitin-CN his tagged

13

UB07-80

Ubiquitin-CD his tagged

N
C
D
D

Ubiquitin-ND non tagged

15

UB05-nt-98

Ubiquitin-ND non tagged

15

UB06-nt

Ubiquitin-CN non tagged

13

13

UB07-nt-80

Ubiquitin-CD non tagged

13

Ubiquitin-CD his tagged

13

UB07-nt-98

Ubiquitin-CD non tagged

13

UB08-80

Ubiquitin-CND his tagged

13

UB08-98

Ubiquitin-CND his tagged

13

UB05-80

UB07-98

N,D
N,D
C,15N
C,D
C,D

UB05-nt-80

N,D
N,D
C,15N
C,D
C,D

15

UB08-nt-80

Ubiquitin-CND non tagged

13

C,15N,D

UB08-nt-98

Ubiquitin-CND non tagged

13

C, N,D

C,15N,D
C,15N,D【お問合せ・ご注文先】

ファージ● Pf1 co-solvent, Protease free‥37● Pf1 co-solvent, RNAase and Protease free‥(in 10mM K-phosphate buffer pH7.6, 2mM MgCl2 and 0.05% NaN3)(in 10mM K-phosphate buffer pH7.6, DEPC-treated water)

製品番号

数量

製品番号

数量

P-50-P

50mg

P-50-RNA

50mg

P-100-P

100mg

P-100-RNA

100mg

P-300-P

300mg

P-300-RNA

300mg

P-500-P

500mg

P-500-RNA

500mg

P-700-P

700mg

P-700-RNA

700mg

P-1000-P  

1000mgP-1000-RNA 1

1000mgTAIYO NIPPON SANSO Stable Isotopes for Biomolecular NMR

E-MAIL：Isotope.TNS@tn-sanso.co.jp
SI 事業部ホームページ：http://stableisotope.tn-sanso.co.jp
TEL：03-5788-8550 月曜日～金曜日 9:00-17:50※土日、祝祭日はお休みです。

FAX：03-5788-8710 ※ FAXは24 時間受け付けています。
大陽日酸株式会社
メディカル事業本部 SI 事業部〒142-8558 東京都品川区小山1- 3-26 東洋Bldg.

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