研究助成業績報告集

第 30 回（2022 年度）バイエル循環器病研究助成『糖尿病と循環器疾患』

公益財団法人循環器病研究振興財団

No

研

＊

目

次 ＊

究

課

題

研 究 者

頁

1

エネルギー代謝障害に着目した糖尿病性心腎連関の新規病態解明
および新規治療法探索

小豆島 健護12

糖尿病性心筋症における心筋変性機構の解明

寺本 了太

４

3

糖尿病合併 HFpEF での O-結合型グリコシル化に着目した
HFpEF 治療の新展開

天満 太郎

９

4

脂肪由来アディポネクチンと肝由来 XOR の糖尿病・代謝性
血管障害における意義の解明

藤島 裕也

1２

エネルギー代謝障害に着目した糖尿病性心腎連関の新規病態解明および新規治療法探索―糖尿病性心腎連関におけるエネルギー代謝障害の意義―

横浜市立大学医学部 循環器・腎臓・高血圧内科学

助教

小豆島 健護めず，
DKD の早期特徴しか再現できなかったため 5，

Ⅰ．緒 言
糖尿病患者は世界で 4 億 2 千万人に達し，増加の一

適切な糖尿病性 CRS モデルが存在しない状況であっ途を辿っている．糖尿病性腎臓病（Diabetic Kidney

た．申請者は，レニン-アンジオテンシン系（RAS）おDisease; DKD）は重大な糖尿病合併症であり，末期よび遺伝背景に着目することによって，糖尿病性腎不全および透析導入の原疾患として最も多いが，そCRS モデルマウスの開発に成功した 6．C57BL/6 をの過程で心血管疾患（Cardio-Vascular Disease; CVD）

遺伝背景とする 1 型糖尿病モデル Akita マウスのを高頻度に合併することから，病態の背景に心腎連関

RAS を活性化（肝特異的 Renin 高発現）するだけで（Cardio-Renal Syndrome; CRS）が大きく関わっては 糖 尿 病 性 CRS 病 態 を 再 現 で き な か っ た がいると考えられている．現在，糖尿病治療において血（C57BL/6-Akita-ReninTG マウス；B6AR（非 CRS

圧・糖代謝・脂質代謝などへの包括的介入が積極的に

モデル）
，図 1）
，同マウスの遺伝背景を 129/Sv へ操行われるようになっているが，糖尿病患者における腎作することにより劇的なアルブミン尿の増加と腎組障害進行および CVD 発症のリスクは依然として極め

織像増悪および顕著な心肥大を認めた（129/Sv-て高く，それに対する効率的なリスク低減治療も困難

Akita-ReninTG マウス；129AR（CRS モデル）
，図な状況にある．その原因として，糖尿病における CRS

1）．

の病態生理はいまだに未解明の部分が多く，その発症・進展を抑制する治療法も極めて限られている現状が挙げられる 1．
近年，心臓・腎臓におけるエネルギー代謝障害，特に脂肪酸酸化（Fatty Acid Oxidation; FAO）障害が，慢性心不全（Chronic Heart Failure; CHF）および慢性腎臓病（Chronic Kidney Disease; CKD）の発症・進展を促進させることが明らかになってきた 2, 3．心図1

臓・腎臓は人体でも第一・第二にエネルギー消費が活

左：C57BL/6-Akita-ReninTG マウス（B6AR，非 CRS モ

発な臓器であり，どちらの臓器でも主に脂肪酸をエネデル）と比較し，129-Akita-ReninTG マウス（129AR，CRS モデ

ルギー源としてその生理的機能（心収縮や体液・電解

ル）では心肥大が増悪する． 右： B6AR（非 CRS モデル）と比較

質バランスの調整など）を果たしていることから 4，

し，129AR（CRS モデル）ではアルブミン尿が著増する．** P < 0.01,

生理学的観点からも CHF・CKD の発症・進展におけ*** P < 0.001 vs WT within the same strain, ## P < 0.01, ### P <る FAO 障害は注目されている．しかしながら，これ0.001 vs B6 within the same genotype. n = 5-10. WT, wild type.

まで糖尿病性 CRS におけるエネルギー代謝の意義を検討した報告は非常に少ない．

本研究では，上記のモデルマウスを用いて，①糖尿病
性 CRS におけるエネルギー代謝変化の検討，および②エネルギー代謝に着目した糖尿病性 CRS に対する

Ⅱ．対象・方法
これまでの糖尿病モデルマウスは，腎機能低下を認治療法の探索を行った．

1

Akita-ReninTG マウス（129AR，CRS モデル）では，129/Sv マウ①糖尿病性 CRS 進展におけるエネルギー代謝変化のス（129WT，野生型対照マウス）と比較して血液中の偶数鎖アシル

検討

カルニチンが増加している．* P < 0.05 vs WT within the same

CRS および非 CRS モデルマウス（129AR および

strain. WT. n = 5-10.

B6AR），そして各々の野生型対照マウス（C57BL/6（B6WT）および 129/Sv マウス（129WT））を 24 週②エネルギー代謝に着目した糖尿病性 CRS に対する齢の時点で解剖し，血液におけるエネルギー代謝を治療法の探索FAO 障害に着目してメタボローム解析により評価し12 週間の ARB 投与により，糖尿病性 CRS モデ
ルマウス（129AR）における UAE 増加と心肥大は著た．

明に抑制された（図 3）．
②エネルギー代謝に着目した糖尿病性 CRS に対する治療法の探索12 週齢の CRS モデルマウス（129AR）およびその野生型対照マウス（129WT）に対して，ARB（ロサ
ルタン 10 mg/kg/day）を 12 週間投与し，代謝ケージを用いて 24 時間尿中アルブミン排泄量（Urinary
Albumin Excretion; UAE）を測定した後に解剖し，血液におけるエネルギー代謝を FAO 障害に着目して

図3

評価した．

デル）における心肥大を改善する． 右：ARB は 129AR（CRS モ

左：ARB は 129-Akita-ReninTG マウス（129AR，CRS モデル）におけるアルブミン尿増加を抑制する．** P < 0.01, *** P <Ⅲ．結 果

0.001 vs WT, ## P < 0.01, ### P < 0.001 vs 129AR treated with

①糖尿病性 CRS 進展におけるエネルギー代謝変化のvehicle. n = 6-10. WT, wild type; (V), vehicle; (A), ARB.

検討
糖尿病性 CRS モデルマウス（129AR）では，血液

また，血液中の偶数鎖アシルカルニチン（FAO 機

中の偶数鎖アシルカルニチン（FAO 機能の指標）が能の指標）の増加も ARB により抑制傾向にあった（図

野生型対照マウス（129WT）と比較して著明に増加し4）．

ている一方で，非糖尿病性CRSモデルマウス（B6AR）
ではこの変化が認められなかった（図 2）．これらの結果は，糖尿病性 CRS において FAO 障害が背景に存在していることを示唆している．

図4

ARB は 129-Akita-ReninTG マウス（129AR，
CRS モデル）

における血液中の偶数鎖アシルカルニチン増加を抑制する傾向がある．* P < 0.05 vs WT, # P < 0.05 vs 129AR treated with vehicle. n= 6-10. WT, wild type; (V), vehicle; (A), ARB.

Ⅳ．考 察
糖尿病性 CRS モデルマウスでは，ミトコンドリ
アにおける FAO 機能を反映している可能性がある，
血液中の偶数鎖アシルカルニチンの幅広い増加が見
上：C57BL/6-Akita-ReninTG マウス（B6AR，非 CRS モデられた．特筆すべきは，これらの変化は 129/Sv バッル）では，C57BL/6 マウス（B6WT，野生型対象マウス）と比較しクグラウンドの CRS モデルでのみ認め，C57BL/6 バて血液中の偶数鎖アシルカルニチンの増加を認めない． 下： 129-

ックグラウンドの非 CRS モデルでは認められなかっ図2

2

た．また，ARB の投与により，糖尿病性 CRS モデル
マウスにおけるUAE 増加と心肥大は著明に抑制されるだけでなく，血液中の偶数鎖アシルカルニチン増加も抑制傾向にあった．本研究結果は，FAO 機能障害が糖尿病における CRS の進展に関連していることを示唆している．

Ⅴ．結 論
エネルギー代謝，特に FAO への介入は，糖尿病における CRS に対する新しい治療候補となり得るため，
今後さらなる研究が必要である．

Ⅵ．研究協力者
涌井 広道・横浜市立大学医学部・准教授
山地 孝拡・Duke-NUS Medical School・研究員
Thomas Coffman・Duke-NUS Medical School・教授

Ⅶ．参考文献1)

Zannad F, Rossignol P. Cardiorenal Syndrome
Revisited. Circulation 2018; 138: 929-944.

2)

Kang HM, Ahn SH, Choi P, et al. Defective
fatty acid oxidation in renal tubular epithelial
cells has a key role in kidney fibrosis
development. Nat Med 2015; 21: 37-46.

3)

Lopaschuk GD, Karwi QG, Tian R, et al.
Cardiac Energy Metabolism in Heart Failure.
Circ Res 2021; 128: 1487-1513.

4)Gewin LS. Sugar or Fat? Renal Tubular
Metabolism Reviewed in Health and Disease.
Nutrients 2021; 13: 1580.

5)

Azushima K, Gurley SB, Coffman TM.
Modelling diabetic nephropathy in mice. Nat
Rev Nephrol 2018; 14: 48-56.

6)Gurley SB, Ghosh S, Johnson SA, et al.
Inflammation

andImmunity

Pathways

Regulate Genetic Susceptibility to Diabetic
Nephropathy. Diabetes 2018; 67: 2096-2106.

3糖尿病性心筋症における心筋変性機構の解明
国立研究開発法人理化学研究所・基礎科学特別研究員

寺本了太
Ⅰ．緒 言

のような分子病態を経て心血管合併症を引き起こす

糖尿病と心不全は互いに増悪因子となり、心血管のかは未解明の部分が多く、病態特異的な治療法は死亡率を高めることは古くから知られてきた。中で存在しない。

も 1970 年代に提唱された明らかな冠動脈疾患を有しない糖尿病合併心機能低下例である“糖尿病性心筋症”は特に予後が悪く、心不全罹患者の爆発的増加や予備群を含めた糖尿病人口の増加と相まって喫緊の解決課題となっている。
糖尿病性心筋症における心機能低下の病理学的本
態は心筋の線維化とされるが、カルシウムイオン（Ca2+）を始めとする心筋収縮サイクルに関わる分子シグナル恒常性の破綻、さらに心筋に豊富に存在するミトコンドリアの代謝異常が深く関わるとされ、

図 1 糖尿病性心筋症の概念

その分子病態は多層的である 1。糖尿病が引き起こ
す高血糖・糖代謝ホルモン異常・インスリン抵抗性

これを解明するため本研究課題では、光学マッピ

がその相互作用の中で様々な二次的な病態を引き起ング法を用いた空間的心臓電気生理学的解析およこし、心臓リモデリングおよび心収縮・拡張障害をび心臓トランスクリプトーム解析を展開する。糖尿主体とした心機能低下に帰結すると考えられる。そ病は心房細動における血栓塞栓症の明らかなリスクの鍵となる病態として、分子シグナリング異常、酸因子であることからも、高血糖・糖代謝ホルモン異化ストレス、ミトコンドリア障害などが推測されて

常・インスリン抵抗性の相互作用の結果生じる組織

いる（図 1）。

レベルでの変化が心臓内の部位特異的に生じている

近年、グルコースを起点としたアミノカルボニル可能性が高い。光学マッピング技術は分子特異的に反応の生成物である advanced glycation end

結合する蛍光プローべを用いて、組織の活動電位おproducts（AGEs、終末糖化産物）が、活性酸素のよび Ca2+動態を可視化し、空間的に精緻な解析を行

生成を通じて老化、糖尿病、アルツハイマー病等のうことが可能なツールである。

疾病の進行に関与することが示唆されている。アミ

心筋線維化を惹起するメカニズムとしてサイトカ

ノカルボニル反応とは食品における褐色物質を生成

イン産生異常、電子伝達系制御異常による酸化ストする非酵素的反応であり、特に焼く・揚げるなど高レス増加などが想定されるため、免疫系細胞を包括

温で調理する際により AGEs は多く生成される。

した心筋における多様な転写プロファイルの解明をAGEs は血管内皮細胞の分子経路に作用し、細胞外心筋 RNA シーケンスを用いて行う。

基質を増大させ、血管の剛性を高めていることが明らかにされており 2、高血糖を起点として、AGEs

Ⅱ．対象・方法とその受容体（RAGE）の活性化が心筋組織内にお① 糖尿病モデルゼブラフィッシュの作成

けるシグナル異常および心筋細胞内の Ca イオン恒モデル生物としてのゼブラフィッシュの特徴は短い世代交代期間（約 3 ヶ月）と多産（100〜200 受

常性を破綻させていることが考えられる。

精卵/回）にあり、比較的短期間に多数のデータが得

しかしながら、AGEs を含む糖尿病関連病態がど4

ることが可能である。食欲旺盛であるため過剰給餌

ィルターと 50mm×70mm のダイクロイックミラ

により肥満・高血糖を呈する 2 型糖尿病モデルが約ーを使用する 50mm 径の光路を基本にして設計さ6 週間で比較的容易に作製可能である 3。

れている。また、LED 光源から出力した光をストレ

生後 3 ヶ月齢の RW（RIKEN wild-type）系統のートライトガイドを介して投光することが可能である。

個体を使用し、給餌する粉末人工飼料はひかりラボ
450（キョーリン社）［粗タンパク質: 45%以上、粗

B：光学マッピング

脂肪: 11%以上、粗繊維: 3.0%以上、粗灰分: 14%以

１）心臓摘出および光学マッピング実験を通じて使下、りん: 1.2%以上、水分: 10%以下、他: 15.8%］

用する TBH solution を作成する。Tyrode bufferを用いた。2L 水槽に 10 匹の密度とし、Control 群（NaCl 138mM, KCl 2.9mM, HEPES 10mM,へのエネルギー供給量として、1 匹あたり

MgCl2 1mM, NaH2PO4 0.36mM, NaHCO3 12mM,

68kcal/dayを1日2回に分けてを与え、Overfeeding

Glucose 5mM, CaCl2 1mM, pH 7.4）40mL に BSA

群には 1 匹あたり 408kcal/day を 1 日 6 回に分けて（ウシ血清アルブミン）0.4g を加えて溶解させる。

を与え、6 週間継続することで糖尿病モデルを作出

また、手技中に発生する血栓は画像データ上、アーした。

チファクトとなるため Heparin（1mg/40mL）を使② ゼブラフィッシュ成魚における血糖測定用する。

過食プロトコールにより作出したゼブラフィッシ

２）摘出した心臓を TBH solution 内で 10 分間拍動

ュ糖尿病モデルにおける空腹時血糖（fasting bloodを維持する。これにより心腔内に残存した赤血球がglucose, mg/dL）を以下のプロトコールに則って測拍出され、最終的な画像データの S/N 比向上に寄与

定し、モデルの妥当性を評価した 4。

すると考えられる。

１）測定前日の給餌は午後 5 時までに実施する。

３）電位感受性蛍光プローブである FluoVolt™

２）測定当日、午前 10 時に給餌前のゼブラフィッ

Membrane Potential Kit（Invitrogen 社）を用い、シュ成魚を 0.01% Tricaine 溶液に 2 分間浸し、麻酔

摘出心の染色を行う。FluoVolt™膜電位色素は電位を実施する。

依存的な蛍光反応を起こす高速反応プローブであり、３）体表の水分を拭き取り、体重を測定する（mg）。

興奮細胞の一過性の電位変化がミリ秒単位の時間分

体表的特徴から雌雄を記録する。

解能で検出される。プローブは 100 mV あたり 25%４）マイクロニードルおよび吸引チューブを用いてを超えるシグナル変化により反応し、心臓組織の電dorsal aorta を穿刺し採血する。

気的活動のイメージング・刺激に応答した膜電位変５）血糖測定器（ニプロスタットストリップ）で血化の測定が可能となる。同キットに含まれる糖を測定する。

PowerLoad™（非イオン性の界面活性剤）を使用し、蛍光プローベの組織浸透性を高めることが重要であ③ 成魚心臓における光学マッピングを用いた心筋る。次に、染色に用いる Voltage dye solution（TBH

電気生理学的機能解析

solution 245µL + FluoVolt™ 5µL + PowerLoad™

光学マッピング技術を用いた生理学的機能解析法

50µL）を作成し、暗所にて同 solution をシャーレを用いて 5,6、糖尿病モデル心臓における興奮伝導お内に 20µL 滴下し、摘出心を移して 45 分間染色す

よび活動電位の形態変化を空間的に把握することでる。

糖尿病と心機能低下の関連を機能面で明らかにする。

４）Blebbistatin による心筋収縮抑制を行う。染色

A：イメージングシステム

後の心臓を Blebbistatin 溶液（10µM）に移し、5

高 解 像 度 CMOS カ メ ラ シ ス テ ム と し て

分毎に心拍動の推移を顕微鏡で観察する。心収縮がMiCAM05-N256（ブレインビジョン社）を用い、十分に抑制され、かつ電気的興奮が維持された状態

空間解像度は毎秒 500-1000 フレームの撮影時ででLED 投光に同期して500fps のフレーム速度で撮像する。

256ｘ256 画素とした。撮像開始前の任意の先行時
間で LED 光源を点灯させ、撮像の終了と共に消灯④ 心筋 bulk-RNA シーケンス解析

させ光源の同期制御が可能な基盤プロセッサを搭載

高血糖および血糖調整ホルモン異常による心筋している。マクロ蛍光顕微鏡は、50mm 径の光学フ線維化カスケードの分子基盤を捉えるため、同モデ

5

ルにおける心筋 bulk-RNA シーケンスを実施する。

プロトコール終了時の全長・体重・Body massindex（BMI）
・空腹時血糖（Fasting blood glucose）

ゼブラフィッシュ成魚における心臓摘出は冷却にを測定した結果を図 3 に示す。全長に差は無く、よる麻酔下で行う。Tricaine 等の麻酔薬は心臓トラ

Overfeeding 群で体重の増加と空腹時血糖の上昇を

ンスクリプトームに影響を与える可能性があるため

認めた。

避ける。
氷上に設置した水槽タンクに飼育水を入れ、光学マッピング法による心臓電気生理解析の結果

0〜4℃に調整し、対象の魚を約 20 分間冷却し安楽を図 4 に示す。糖尿病モデルでは特に心房において死させる。その後、実体顕微鏡観察下で内臓の損傷

興奮伝導速度の有意な低下が認められた（Control

を避けるよう注意を払いながらマイクロ剪刀にて腹54.72 mm/sec. vs DM model 25.92 mm/sec., p

部を切開する。表層にはメスであれば卵巣（オスの<0.0001）。また、同部位の活動電位波形を詳細に解

精巣はやや背部に陥入しているため目立たない）が析したところ、心室では活動電位持続時間（APD）

腹腔に充満している場合が多く、これを先端が鈍なが有意に延長していることが明らかとなった

ピンセットで丁寧に除去する。腸管に被さるように（Control 302.2 msec. vs DM model 367.9 msec.,

肝臓が観察されるため、出血させないように丁寧に

p <0.01）。また、活動電位の立ち上がり速度を示す

剥離する。これにより腸管の頭側に心臓が観察されVmax においては、糖尿病モデルの心房で有意に低るため、心臓のさらに頭側に位置する動脈球を同定下していた（Control 83.9. 1/sec.. vs DM model 57,4する。動脈球の遠位端で切除し、心臓を摘出する（図2）。

1/sec., p = 0.045）。

図 2 ゼブラフィッシュ成魚における心臓摘出

摘出した心臓は 1.5mL チューブを用いて TRIzol（Thermo Fisher Scientific 社）100µL に漬け、ホモジェナイザーで破砕する。Total RNA 抽出キット

図 4 糖尿病モデル心筋における光学マッピングのインストラクションに沿ってライブラリを作成し、次に、心筋 Bulk-RNA シーケンスの結果を図 5

Illumina HiSeq にて RNA シーケンスを実施する。

に示す。糖尿病モデル心筋においてアップレギュレートされた遺伝子が 237 あり、ダウンレギュレート

Ⅲ．結 果

された遺伝子が 87 であった。これらの発現量に差

RW の掛け合わせから産まれた稚魚を通常の給餌の見られた遺伝子群について Gene ontology 解析を方法にて 3 ヶ月齢まで育て、その後、Control 群お行ったところ、
MAPK シグナリングパスウェイが有

よび Overfeeding 群に分けて給餌を 6 週間行った。

意に不活化されていた。さらに、KEGG パスウェイ
解析においても MAPK および FoxO シグナリング
パスウェイが負に制御されており、前者にクラスタリングされた遺伝子には nr4a1、dusp8a、gadd45bb
といった MAPK 関連分子のみならず、fgf7、vegfaa
といった線維化や血管新生に寄与するものが含まれていた。

図 3 糖尿病モデルゼブラフィッシュにおける体格・血糖測定6心筋組織には心筋細胞とともに線維芽細胞、血管
内皮細胞、免疫系細胞などが混在し、個々の発現活性は心不全における炎症反応（細胞浸潤）・創傷治癒過程に合わせてダイナミックに変動することが知られている。その過程で一部の心筋細胞は肥大化し、主に線維芽細胞からのシグナルにより細胞外マトリックスが増殖の方向へ向かい、間質線維化が進行すると考えられる。糖尿病モデル心を対象に実施した
bulk-RNA シーケンスでは、
MAPK シグナリングパ
スウェイが抑制されていることが明らかとなった（図 5）。同カスケードは最終的に核内の転写因子活性による種々の遺伝子の発現を制御するが、本モデルでは一方で fibroblast growth factor や fibroblast
growth factor binding protein などの線維化を亢進する分子が有意に活性化していることが判明した。

図 5 糖尿病モデル心におけるトランスクリプトーム解析

近年の研究から終末糖化産物（AGEs）が糖尿病

Ⅳ．考 察の発症・進行に深く関わっていることが明らかとな

本研究課題ではゼブラフィッシュ成魚を用いた過っているが 2、AGEs は主なものとして、架橋性の食プロトコールにより比較的簡便に体重増加・空腹

基 質 で あ る pentosidine 、 methylglyoxal-lysine

時高血糖を示す２型糖尿病モデルを作出することにdimers などである。生体内では血管壁等において、成功した（図 3）。本モデルにおける高血糖を起因と過剰なグルコースが停滞することにより遊離アミノした病態の把握には体格・血清生化学的プロファイ

基と成分間反応を起こし、アマドリ化合物を経てルの比較のみでは不十分と考えられる。現在、図 2

AGEs が生成される。
AGEs はその受容体（RAGE）に示す通り、各臓器の正確な摘出に成功しており、を介し、細胞外基質を増大させるため、心筋の線維各臓器におけるプロテオーム解析を実施中である。

化を亢進させている可能性がある。従って、糖尿病

我々が行った成魚心臓における詳細な電気生理学性心筋症において糖尿病表現型と心筋変性に基づく的解析の結果、マクロでは糖尿病モデル心にサイズ機能低下が相互作用的に発生するキー分子となると等の差は見られないものの、電気生理学的特性には考えられる。我々の RNA シーケンス解析では明らかな変化を認めた。すなわち、糖尿病モデルで同部位の変性が進んでいることが示唆された（図 4）。

RAGE の ゼ ブ ラ フ ィ ッ シ ュ ホ モ ロ グ で あ る
si:ch211-79k12.1 は有意に活性化されており、糖尿病性心筋症の病態形成に RAGE の過剰な発現が関

さらに心筋では興奮伝導速度に変化はみられたなか与していると考えられた。

は心房筋における興奮伝導性が有意に低下しており、今後はより詳細な分子病態メカニズムの解明のたったものの、活動電位持続時間が糖尿病モデルでは延長し、活動電位の立ち上がり速度も同モデルで低め、同モデルへの Cap analysis of gene expression

下がみられた。これらの結果は、ヒトにおいて心房（CAGE）法を用いたシングルセル解析を予定してを基質とした心房細動・心房粗動等の不整脈は糖尿いる。現在、既に細胞分離実験を終え、良好な生細病の合併をもってその予後が悪化する背景には、発胞率を得られている。これにより希少細胞種の発現

症早期から心房筋に興奮伝導を低下させる病態が起解析を可能とする飛躍的な RNA 検出感度の向上がこっていることを示唆する。また、心室においても見込まれ、細胞種毎の線維化基質形成に関わる転写

ナトリウムチャネル、カルシウムチャネルを介したおよびシグナル伝達カスケードの解明に大きく寄与

シグナル異常が発生していることが考えられた。現することが期待される。

在、これら心筋の変性を病理学的に証明するため、

Ⅴ．結 論

同モデルにおける心筋細胞のサルコメア構造・核形
態・細胞増殖能・線維化等の定量評価を免疫染色お

糖尿病モデルゼブラフィッシュ心において、線維よびトランスジェニックラインにて実施中である。

化カスケードの亢進を基盤とする心房・心室の部位

7特異的な電気生理異常が認められ、糖尿病性心筋症の分子病態として終末糖化産物受容体活性の関与が示唆された。

Ⅵ．研究協力者
後藤信一・Harvard Medical School・Research
fellow

Ⅶ．参考文献1.

Rydén L, Grant PJ, Anker SD, et al. ESC
Guidelines on diabetes, pre-diabetes, andcardiovasculardiseasesdevelopedincollaboration with the EASD: the Task
Force on diabetes, pre-diabetes, andcardiovascular diseases of the European
Society of Cardiology (ESC) and developedincollaboration

with

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European

Association for the Study of Diabetes(EASD). Eur Heart J. 2013;34:3035-3087.
2.

Goldin A, Beckman JA, Schmidt AM, et al.
Advanced glycation end products: sparking
the development of diabetic vascular injury.
Circulation. 2006;114:597-605.

3.

Zang L, Shimada Y, Nishimura N.
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2017;7:1461.

4.

Zang L, Shimada Y, Nishimura Y, et al.
Repeated Blood Collection for Blood Tests
in Adult Zebrafish. J Vis Exp. 2015:e53272.

5.

Turan NN, Moshal KS, Roder K, et al. The
endosomal trafficking regulator LITAF
controls the cardiac Nav1.5 channel via theubiquitinligaseNEDD4-2.

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Biol

Chem. 2020;295:18148-18159.
6.

Hayashi K, Teramoto R, Nomura A, et al.
Impact of functional studies on exome
sequence

variant

interpretationinearly-onset cardiac conduction systemdiseases.

CardiovascRes.

2020;116:2116-2130.

8糖尿病合併 HFpEF での O-結合型グリコシル化に着目した
HFpEF 治療の新展開
北海道大学病院 循環器内科 助教

天Ⅰ．緒 言
高齢化を迎えるわが国においては、心不全患者の激増（心不全パンデミック）を迎えると考えられており、その半数が駆出率が保たれた心
不 全 （ Heart failure with preserved ejection
fraction：HFpEF）患者と予想されている。ゆえに HFpEF 患者に対する詳細な理解や治療法の開発は、喫緊の課題である。
HFpEF の主な病態は、心筋の肥大や線維化、収縮関連の蛋白質発現の変化・機能異常が統一した機序とされる。一方で、糖尿病や高血圧、心房細動、加齢などの多様な併存疾患を有する
HFpEF は、上記のシグナルを抑える画一的な薬物治療の有効性は認められず、多様な併存疾患に応じた HFpEF 治療が必要と考えられている。
その中でも、糖尿病は HFpEF の約半数に合併しており、糖尿病の有無による HFpEF の分子生物評価は、疫学的観点並びに分子標的治療薬
開発の観点においても必須であるが、いまだ十分に理解されていない。
申請者らは、高血圧 HFpEF モデルにおいて、
タ ン パ ク 質 の 翻 訳 後 修 飾（ Post-translational
modification：PTM）が致死的不整脈の易誘発
性をもたらすと報告し 1 ）、HFpEF におけるPTM の 重 要 性 に 着 目 し て き た 。 ま た 近 年 、PTM の一つである O-結合型グリコシル化（OGlcNAc）は２型糖尿病で亢進し、糖尿病性心筋症の病態に深く関連していることが報告されている 2)。
以上より本研究では、糖尿病合併 HFpEF では、タンパク質の O-GlcNAc により心筋細胞内の恒常性変化おおび致死性不整脈が増悪するという仮説を検証することとした。

Ⅱ．対象・方法
糖尿病性心筋症モデルとして、16 週齢オスの遺伝的レプチン受容体欠損 2 型糖尿病モデルマ
ウ ス で あ る db/db マ ウ ス （ C57BLKS/Jleprdb/db）、Control 群として同週齢のヘテロ接合体（C57BLKS/J-leprdb/+）を使用した。同モデルを使用し、下記実験方法を行った。
1 拡張障害評価

9

2

3

4

満 太 郎

心エコー測定およびマイクロマノメータ
ーチップカテーテルによる観血的左室圧測定で評価した。
不整脈誘発性評価
Langendorff 灌流心を作製し、薬剤負荷による不整脈誘発性を評価した。
細胞内カルシウムハンドリング評価
共焦点レーザー顕微鏡を用いてカルシウ
ムハンドリング（ウェーブ・スパーク・
小胞体カルシウム含有量）を評価した。
0.5Hz で field stimulation をおこない定常状態に達した後、ラインスキャンモード
で撮像し、カルシウムトランジェントの評価を行った。
O-GlcNAc 評価
心室筋タンパク質の O-GlcNAc やカルシ
ウム動態を制御するタンパク質の翻訳後修飾をウェスタンブロット法で評価し
た。

Ⅲ．結 果
1

拡張障害評価16 週齢での心エコー評価では、左室壁厚、
左室拡張・収縮末期径および左室内径短縮
率に両群間で有意差は認めなかったが、観血的左室内圧測定では、左室内圧陰性最大
変化率：-dP/dt の絶対値および左室圧曲線の減衰時定数 τ は db/db 群で有意に低下、延長しており、16 週齢の db/db マウスは拡張障害を呈していることが示された（表 1）。

表１ 16 週齢での血行動態指標

2

不整脈誘発性評価
薬剤負荷：イソプロテレノール（1μＭ）
db/db 群では control 群と比較して有意に心室性 期 外 収 縮 の 発 生 数 お よ び Arrhythmia
score 3)が増加した（図 1）。
図４ 電気刺激によるカルシウムトランジェント
各群におけるカルシウムトランジェント（左からAmplitude, CaT decay, T1/2, SERACA activity）

4

図１ 薬剤負荷による不整脈誘発性評価
30 分間の薬剤負荷による心室性期外収縮の発生数（左）および Arrhythmia score（右）3細胞内カルシウムハンドリング評価
カルシウムウェーブおよびスパークの頻度は
control 群と比較して db/db 群で有意に増加し（図 2）、db/db 群では小胞体カルシウム含有量の有意な低下を認めた（図３）。また、カルシウムトランジェントの波高値、減衰時間の時定数 τ、半減期は control 群と比較してdb/db 群で有意に低下した（図４）。

O-GlcNAc 評価
db/db 群 では 心 筋全 体 の タン パ クの O GlcNAc 付加が増加し（図５）、CaMKII の
リン酸化の増加および RyR の過リン酸化が増加していた（図６）。

図６ 心室筋全体の O-GlcNAc の比較
各群の代表的な O-GlcNAc のブロット（左）、CBB 染色のブロット（真中）、control 群のタンパク発現量を 1 として規格化したときのグラフ（右）。

図 2 カルシウムウェーブおよびスパークの評価
1 分間当たりのカルシウムウェーブ頻度（左）およびラインスキャンモードにｙほるカルシウムスパークの頻度（右）

図 5 細胞内カルシウム制御タンパクの比較
各群における、リアノジン受容体およびそのリン酸化(pSer2814) （ 左 ）、 CaMKII お よ び そ の リ ン 酸 化（pThr286）（右）のグラフ。

Ⅳ．考 察
上記の検討により、糖尿病を合併した拡張障
害心筋症においては、心室性不整脈の易誘発性および細胞内カルシウムハンドリング異常をきたしていることが証明された。またこの機序として、心室筋の O-GlcNAc による翻訳後修飾が関与している可能性が示された。心筋内カルシ
ウムハンドリング異常は、不整脈の原因の一つである撃発活動、とくに、細胞内カルシウム過負荷をきたす状態における、ナトリウム－カル
シウム交換輸送体を介した脱分極で、活動電位

図 3 小胞体のカルシウム含有量の評価
各群の代表的な蛍光強度比のプロット（左）および小胞体カルシウム含有量のグラフ（右）10再分極終了後の第 4 相に生じる遅延後脱分極をもたらすと報告されており、本実験の易不整脈の機序と考えられる。しかし、この細胞内カル
シウムハンドリング異常は、催不整脈だけではなく、心筋細胞の機能障害を引き起こし、心筋
肥大や繊維化および炎症をもたらし、心筋リモデリング亢進による HFpEF 進展を増悪させる可能性がある。本実験で示した、『糖尿病を併発した拡張障害心筋症における O-GlcNAc 付加による細胞内カルシウムハンドリング異常』が、易不整脈だけではなく、心筋リモデリングおよび HFpEF 進展に寄与するかについては、今後
より詳細な検討を行う必要がある。

Ⅴ．結 論
糖尿病を併発した拡張障害心筋症では、タン
パク質の O-GlcNAc による心筋細胞内のカルシ
ウム制御異常おおび致死性不整脈の易不整脈性を認めた。

Ⅵ．研究協力者
門坂崇秀・北海道大学大学院医学研究院・循環病態内科学教室・助教
渡邉昌也・北海道大学大学院医学研究院・循環病態内科学教室・客員研究員
安斉俊久・北海道大学大学院医学研究院・循環病態内科学教室・教授

Ⅶ．参考文献1)

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11脂肪由来アディポネクチンと肝由来 XOR の糖尿病・代謝性血管障害における意義の解明

大阪大学大学院医学系研究科

内分泌・代謝内科学

藤島 裕也

Ⅰ．緒言

パグリフロジンは 0.02 mg/mL に希釈し、高血糖

健康寿命延伸の観点から動脈硬化性心血管疾確認後より飲水投与した。

患の予防は重要な課題である。特に内臓脂肪蓄

網膜フラットマウントを用いた免疫染色より積を病態基盤とするメタボリックシンドローム

蛋白発現を評価し、血管内皮面積当たりの発現を背景とした、2 型糖尿病や脂肪肝・非アルコ

量を ImageJ により定量した。網膜血管透過性はール性脂肪性肝疾患（NAFLD）に代表される全身

Hoechst 3325 を左心室内投与し、その血管外への代謝異常は、動脈硬化症や血管障害と強く関の漏出を定量することで評価した。

連することが知られている。しかし、このよう（２）XOR の血管障害・動脈硬化症への関与

な病態における動脈硬化症進展の分子メカニズ

大阪大学医学部附属病院で腹腔鏡下スリーブ

ムは完全には明らかとなっておらず、有効な予状胃切除術を施行した高度肥満症患者 12 名を対防法や治療法は確立されていない。

象に、術前・術後 1 週間・術後 1 年で採血を行

そこで、本研究では、（１）内臓脂肪蓄積に伴い、血中 XOR 活性を測定した。XOR 活性およびい血中濃度が減少する脂肪細胞特異的蛋白・ア

各種プリン代謝物（ヒポキサンチン・キサンチ

ディポネクチン（APN）と、（２）NAFLD 病態でン・尿酸）は、LC/TQMS 法により定量した。ま著しく血中での活性が上昇するキサンチン酸化

た、XOR の 2 つの酵素型（XDH および XO）は、還元酵素（XOR）に注目し、これらの因子が血管

メチレンブルーの有無の条件下で、プテリンか障害・動脈硬化症に及ぼす影響を明らかとする

らイソキサントプテリンへの変換を HPLC-FLD

ことで、心血管疾患に対する治療応用を目指す

法により定量することで評価した。

ことを目的とした。

細胞実験にはヒト臍帯静脈血管内皮細胞（HUVEC）とヒト大動脈血管平滑筋細(HASMC)を

Ⅱ．対象・方法

使用し、肝由来 XOR のソースとしてヒト肝臓よ（１） APN の糖尿病性細小血管障害への作用り抽出したミクロソームとサイトゾルの混合物

雄の C57BL/6J・野生型（WT）マウス、APN 欠

である S9 分画を用いた。

損マウス（APN-KO）および T-cadherin 欠損 マウス（Tcad-KO）を用いた。糖尿病モデルマウス
は、streptozotocin（STZ）を、8 週齢のマウスに 60mg/kg で 5 日間腹腔内投与し作製した。ダ12食餌誘導性 NAFLD モデルマウスは、8 週齢の WT症後経時的に減少した（図 1B）。

マウスにコリン欠乏性メチオニン減量高脂肪食（CDAHFD）を負荷し作製した。負荷 4 週後より
XOR 阻害薬であるトピロキソスタット（TPX）を
1 mg/kg/day で混餌投与し上で、頸動脈結紮 3週間後に新生内膜と中膜の面積を定量し、新生内膜増殖の評価を行った。
図１．T-cadherin を介した網膜血管内皮へのアディポネク

Ⅲ．結果

チン蛋白の集積と、その糖尿病病態における変化（１）APN の糖尿病性細小血管障害への作用

APN 欠損マウスにおける網膜血管障害の進展

APN は、脂肪細胞から特異的に分泌される蛋

糖尿病網膜症の初期には網膜血管透過性の亢白質であるにも関わらず、肥満・特に内臓脂肪進が惹起され、網膜症進展に重要な役割を果た蓄積に伴いその血中濃度が低下する。我々は、すことが報告されている。そこで、Hoechst（分APN が GPI アンカー型の膜蛋白である T-

子量 534 Da）を予め心室内投与し、網膜血管か

cadherin に特異的かつ高親和性に結合すること

らの漏出を評価した。その結果、糖尿病発症後により、大動脈血管内皮細胞や動脈硬化巣の増6 週の時点で、主に細動脈の抹消の分岐部周辺

殖型平滑筋細胞、腎尿細管周囲の血管周皮細胞

で血管外の Hoechst 陽性領域が認められ、糖尿（pericyte）に集積して存在し、動脈硬化症や病発症後早期における血管透過性亢進が確認さ

虚血再灌流障害による腎尿細管障害などに対しれた。一方で、SGLT2 阻害薬であるダパグリフて保護作用を示すことを報告してきた 1, 2。しかロジンによる糖尿病治療により、血管内皮のし、網膜症を初めとした糖尿病細小血管合併のAPN 集積の低下は回復し、網膜血管透過性の亢

発症・進展に対する APN の生理的意義について進も抑制された。最後に APN-KO マウスを用いては明らかでない。

網膜症の発症・進展に対する APN の役割を検討

網膜血管における APN 蛋白の局在と、糖尿病病した。STZ 負荷後血糖値の推移には WT と APN-KO

態での変化

マウスで差はみられなかったが、APN-KO マウス

WT マウスの網膜における APN の局在を、網では、糖尿病発症 4 週のより早期の時点で、網膜フラットマウントを用いた免疫蛍光染色によ

膜血管内皮における VCAM-1 発現が有意な上昇とって評価した。その結果、WT マウスでは主に網（図２A）、claudin-5 蛋白の減少が認められ膜の細動脈に沿って APN シグナルが検出され（図２B）、血管内皮の tight-junction の破綻が

（図１A）、血管平滑筋細胞マーカーであるαSMA示唆された。さらに、APN-KO マウスでは血管外とはマージしなかったが、毛細血管の移行部にへの Hoechst 漏出の顕著な増加が認められ、血かけての血管内皮細胞マーカーである CD31 と共管透過性が著しく亢進していた（図２Ｃ）。以上

局在していた。一方で、Tcad-KO マウスでは、の結果より、網膜における APN は、糖尿病網膜APN-KO マウスと同様に、このような網膜におけ症の病態進展に対して保護的に作用することがる APN のシグナルは完全に消失していたことか明らかとなった。

ら（図１A）、APN は T-cadherin 依存的に網膜の血管内皮に集積していることが示された。また、STZ 誘発糖尿病モデルマウスでは、このような網膜血管内皮に集積した APN は、糖尿病発13減量手術を施行した高度肥満症患者を対象に、血漿 XOR 活性の変化を評価したところ、術後 1 年の時点で有意な低下が認められ（図３
A）、その術前後での変化は血中 AST・ALT といっ
た肝逸脱酵素の変化と強い正相関を示した一方で（図３B）、BMI や血中尿酸値の変化とは相関しなかった。また、高 XOR 血症を呈する患者（Patient）の血漿中に、XOR の基質であるヒポ
キサンチン（100μM）を添加したところ、キサンチンの産生が観察されたが、このような反応は健常者（Control）の血漿中では認められず、
また XOR 阻害薬（TPX）の添加（10μM）によりキャンセルされた（図３C, D）。これらの結果か
図２．アディポネクチンの欠損による糖尿病発症早期での網ら、血中 XOR 活性は NAFLD に代表される肝障害

膜血管の変化に伴い上昇し、少なくともヒポキサンチンから血管内皮特異的 T-cad 欠損マウスの樹立

キサンチンへのプリン異化代謝反応がヒト血中

T-cadherin flox マウスと、VE-cadherin
Cre

ERT2

で惹起され得ることが示唆された。

マウスと交配させることによって、血管内皮特異的 T-cad 欠損マウスの樹立を行った。
このマウスにタモキシフェン（200mg/kg）を 5
日間経口投与し Cre 発現を誘導し 6 週間後に解析したところ、有意な血中 APN 濃度の上昇が認められ、大動脈や腎臓、骨格筋の免疫染色では血管内皮の APN 集積が消失する結果が得られた。現在血管内皮の T-cadherin の消失に伴う
APN の作用の変化について検討を進めている。
図３．減量手術後の血中 XOR 活性の変化と、ヒト血漿中にお（２）XOR の血管障害、動脈硬化症への関与

けるプリン異化代謝反応

XOR は、ヒポキサンチンおよびキサンチンから尿酸への変換を触媒する律速酵素であり、ヒ

血管内皮細胞および血管平滑筋細胞対する肝由トでは主に肝臓や小腸に高発現している。ま来 XOR の作用

た、その酸化型酵素である XO は反応過程において活性酸素種（ROS）を産生し、血管内皮に結合することが示されていることから 3、血管内皮障
害や動脈硬化症に関与することが示唆されてきた。近年、ヒト血漿中の XOR 活性の正確な測定が可能となったが、血中 XOR 活性上昇の病態学的意義は明らかでない。
血中 XOR 活性の規定因子

14

高 XOR 血症を呈する患者血漿と同程度となる
ように 1％に希釈した肝 S9 分画を用いて、肝由
来 XOR の血管構成細胞に対する作用を in vitro
で検討した。ヒト血管内皮細胞では XOR 活性は検出されず、培養上清中への比較的高濃度のヒ
ポキサンチン分泌が観察され、さらに肝由来
XOR の添加により、内皮細胞から分泌されたヒ
ポキサンチンが上清中でキサンチンおよび尿酸に代謝された（図４A）。またこの反応に伴い、
図５．NAFLD 病態マウスの新生内膜形成に対する XOR 阻害薬

上清中で ROS が産生され（図４B）、VCAM-1 を初の効果めとした接着分子の遺伝子発現が有意に上昇し肝障害合併・高尿酸血症患者に対する XOR 阻害

たが、これら変化は XOR 阻害薬（TPX）（10μM）

薬の血管伸展性指標に対する効果

によって有意に抑制された。また、ヒト血管平血中 XOR 活性高値が予想される肝障害合併症

滑筋細胞への肝由来 XOR の添加により、細胞増例に対する XOR 阻害薬の投与が、心血管リスク

殖が亢進し SMC の脱分化が誘導されたが、いず低下に寄与するかを確認する目的で、共同研究

れも TPX により抑制された（図４C）。

により既存の介入臨床研究（BEYOND-UA study）
4のサブ解析を行った。高血圧合併・高尿酸血症患者を対象として 24 週間の XOR 阻害薬・TPX の投与が行われたが、主要アウトカムの血管進展性の指標である CAVI に有意な変化は認められなかった。そこで、ベースラインの肝機能（ALT値）による層別解析を行ったところ、まず血中図４. 肝由来 XOR のヒト血管内皮細胞および血管平滑筋細胞

XOR 活性は ALT 値が高値なるほど強い上昇を認に対する作用めたが、TPX 投与後は顕著に抑制されていた

NAFLD 病態マウスにおける血中 XOR 活性の上昇（図６A-C）。さらに、このような血中 XOR 抑制と XOR 阻害による血管新生内膜増殖の抑制に伴い、ALT≧30U/L および≧40U/L の群では、

CDAHFD を負荷した食餌誘導性 NAFLD モデルマ

有意な CAVI の改善を認めた（図６C-D）。

ウスでは、負荷 1 週の早期より経時的な血中
ALT の上昇が確認された（図５A）。そして、マウスにおいてもこのような NAFLD の病態進行に伴い、血中 XOR 活性の顕著な上昇が観察され、血中では ROS 産生に関与する XO の酵素型が大部分を占めていた（図５B）。また、NAFLD 病態マウスでは、通常食群に比して、左頸動脈結紮に
図６. XOR 阻害薬の血管伸展性指標に対する効果

よる新生内膜増殖の有意な亢進を認めたが、XOR
阻害薬（TPX）の投与により通常食群と同程度まⅣ．考察

で抑制された(図５C)。

本研究により APN は T-cadherin 依存的に網膜血管内皮に局在し、高血糖に伴う細小血管障

15

害に対して保護的な役割を担う可能性が初めて過剰に放出される XOR の関与が示唆された。ま示された 5。今回の検討では網膜での T-

た、我々は XOR の基質であるヒポキサンチンがcadherin の免疫染色は困難であったが、糖尿病

ヒト脂肪細胞から分泌されていることを過去に発症早期より網膜血管の APN 集積の減少が認め

報告しているが 11、加えてヒト血管内皮細胞内られ、これは糖尿病状態における血管内皮の T-からも多量のヒポキサンチンが分泌されている

cadherin 発現の低下が関与していると考えていことが明らかとなった。つまり、血中 XOR 活性

る。このような APN 集積の減少は、糖尿病性細の高い NAFLD 症例では、特異的に脂肪細胞や血小血管障害の発症・進展と関連している可能性

管内皮細胞から分泌されたヒポキサンチンが血があり、血管内皮の T-cadherin 発現制御による中あるいは血管局所で異化されることで、血管治療応用も期待される。飽和セラミドの細胞内リモデリングを加速させることが想定された。

蓄積は、炎症や酸化ストレスなどの脂質毒性に

XOR 阻害薬の動脈硬化症に対する臨床効果は依より、糖尿病性細小血管合併症の発症に関与す

然議論の余地がある。今回の前向き研究のサブ6

ることが指摘されているが 、APN は T-

解析の結果、肝障害を有する患者では XOR 阻害

cadherin 依存的なエクソソーム産生を促進し、薬の投与により CAVI の改善がみられたことか

細胞外へのセラミド排出の促進を介して、血管ら、血中 XOR 活性の上昇が予想される NAFLD 患

内皮細胞のセラミド含量を減少させることを明者ではその恩恵が最も期待されるが、エビデン

7

らかにしている 。従って、このような APN/T-スの構築には今後のより大規模な前向き研究が

cadherin システムによるエクソソーム産生・分必要である。以上、本研究の成果は、「肝臓-血泌促進作用が、血管内皮障害に対する保護作用

管の連関機構」における血中 XOR の動脈硬化症に貢献している可能性を想定している。以上よに対する役割について、新たな知見を加えるもり、血管内皮細胞への T-cadherin 依存的な APNのである。また、阻害薬による血中 XOR の抑制の結合は、糖尿病による血管障害に対して重要は、メタボリックシンドロームと強く関連するな役割を担っていると考えられた。今後は今回

NAFLD 患者の心血管疾患の進展を抑制する上で樹立した血管内皮特異的な T-cadherin 欠損マウの、重要な治療戦略となり得る可能性がある。

スを用いて、血管系組織および、全身臓器のAPN の作用に対する血管内皮の T-cadherin の重Ⅴ．結論

要性について、より詳細に検討する予定であAPN および XOR の糖尿病や NAFLD に関連する血る。

管障害の発症・進展に対する重要性について明

また、本研究では NAFLD 病態で上昇する血中らかとした。

XOR が、血管新生内膜の増殖や血管内皮障害に直接的に関与し得ることが明らかとした 8, 9。近Ⅵ．研究協力者

年、いくつかの疫学研究により NAFLD の合併が

塩出 俊亮

古典的な心血管危険因子とは独立して、動脈硬泌・代謝内科学化症や冠動脈疾患のリスクを上昇させることが

坂上 貴章

10

大阪大学大学院医学系研究科 内分
大学院生

大阪大学大学院医学系研究科 内分

明らかとなっている 。肝由来 XOR は ROS 産生

泌・代謝内科学を介して血管内皮細胞の接着分子を上昇させ、

川知 祐介

血管平滑筋細胞の増殖・脱分化を惹起させたこ

泌・代謝内科学とから、このような肝臓と血管との連関のメカ

喜多 俊文

ニズムの一つとして、障害時に肝臓から血中に脂肪病態学寄付講座

16

大学院生

大阪大学大学院医学系研究科 内分医員

大阪大学大学院医学系研究科 肥満
講師

西澤 均 大阪大学大学院医学系研究科 内分

microvascular

泌・代謝内科学2022;12:4159.

前田 法一

講師
6.

大阪大学大学院医学系研究科 代謝血管学寄付講座

Sci

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Mandal N, Grambergs R, Mondal K, et al.
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准教授

星出 聡 自治医科大学内科学講座 循環器内科

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部門 教授

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苅尾 七臣
科部門

7.

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教授

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