「様式３」課題番号 ２７タンパク質架橋酵素トランスグルタミナーゼによる腫瘍血管形成維持におけるバソヒビンの役割解明［１］組織
代表者：小嶋 聡一（理化学研究所基幹研究所）
対応者：佐藤 靖史（東北大学加齢医学研究所）
分担者：
辰川 英樹（理化学研究所基幹研究所）
李 殷瑞 （理化学研究所基幹研究所）
鈴木 康弘（東北大学加齢医学研究所）
研究費：物件費２４万５千円，旅費５万５千円［２］研究経過腫瘍血管選択的な血管形成の制御法の研究・開発
は，近年ますますその重要性を増している。本共同研究では、タンパク質架橋酵素トランスグルタミナーゼ２（TG2）KO マウスに移植した癌細胞周囲で観察される腫瘍血管新生の著しい欠損、言い換えれば、TG2 による腫瘍血管形成維持機能に、腫瘍血管新生の抑制と促進に働くバソヒビン(VASH)１と２がどのように関与するのかを解明することを目的として平成２２年度より共同研究を行った。
以下，研究活動状況の概要を記す。
平成２２年５月２７日の佐藤研における研究討議の結果策定した実験計画に基づき、
平成２２年度は、
まず、VASH1-TG2 の直接的相互作用を調べた。
VEGF（VASH 誘導剤）刺激ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)にTG2 基質プローブのビオチン化ペンチルアミンを添加し、TG2 の作用で細胞中タンパク質に架橋されたビオチン化ペンチルアミンの量をスト
レプトアビジンによる免疫沈降を行うことで定量したが、免疫沈降後の抽出液に VASH1 が入っていなかったことから、VASH1 は TG2 のＧｌｎ基質とはならないことがわかった。次に、TG2-VASH1 複合体形成の有無を IP/WB により調べた。VEGF 刺激HUVEC 抽出液より TG2 及び VASH1 抗体により免疫沈降を行ったが、バンドは確認できなかった。

これらのことから HUVEC では TG2 と VASH1 の物理的相互作用はないことがわかった。
次に、VASH1-TG2 の機能的相互作用について調べた。HUVEC を VEGF 処理する際に A23187（TG2 活性促進剤）を同時に処理すると、VASH1mRNA 誘導量が低下する結果を得、TG2 が VASH1の発現を制御している可能性が示唆された。
平成２２年１２月１日に大阪にて開かれた日本血管生物医学会にてデータを持ちより、さらにディスカッションを行った結果、引き続き、TG2 の機能に及ぼす VASH の影響を探索するために、理研にVASH1 KO マウスを導入し、肝線維化/肝硬変・肝癌モデルを作成し、病態形成過程における血管新生に伴う TG2 とバソヒビンの発現・機能の変化をPCR/WB/IHC などの方法で調べる計画を策定し、実験動物委員会、並びに遺伝子組換え実験委員会の了承を得た。
平成２３年度は、東日本大震災後の混乱の中、MTA 契約を結ぶことから共同研究を継続した。
VASH1 KO マウスを７月１２日に理研動物施設に導入後、クリーニング作業を経て、１２月より系統維持を開始した。平成２４年１月より VASH1-TG2
ダブル KO マウスの作製を開始し、３月にダブルヘテロ KO マウスが生まれた。
一方、WT マウスと TG2 KO マウスから肝類洞壁内皮細胞(LSEC)を単離し、Affymetrix GeneChip
解析を行い前年度の解析で示唆されていた TG2 がVASH1 の発現制御因子である可能性を強める結果が得られた。
平成２４年２月２０日加齢研で開催された第７回
Vasohibin 研究会に小嶋と李が参加し、ここまでの結果を報告し、佐藤、鈴木とディスカッションした
結果、TG2-VASH1 ダブル KO マウスを用いた作業仮説の証明を継続するとともに、腫瘍血管内皮細胞と正常血管内皮細胞を北海道大学の樋田准教授より入手し、TG2 による VASH1 発現制御分子機構の解析を行う計画を策定した。

<腫瘍血管形成における TG2 による VASH 発現抑制>

Cancer Cell. 18: 185 (2010) を改変［３］成果
本年度は，以下に示す研究成果を得た。
まず第１に、WT マウスと TG2 KO マウスから肝類洞壁内皮細胞(LSEC) を単離し、Affymetrix
GeneChip 解析をしたところ、TG2(+/-)LSEC では、TG2(+/+) LSEC に比べ VASH1 発現量が 73 倍高いことが示唆され、qPCR により確かめられた。
TG2(-/-)LSEC は、RNA がおかしな状態にあるためなのか、なぜか PCR がうまく走らず定量できなかった。
第２に、TG2 の関与が知られている胆管結紮肝線維化モデルを作製したところ、TG2 KO マウスでは、肝線維化とともに血管形成の抑制が見られ、
VASH1の発現量の亢進が示唆された。
以上の結果から、TG2 が VASH1 発現抑制因子として働いている可能性が示唆された。最近、ポリコーム群タンパク質の１つである Enhancer of zeste
homologue 2 (EZH2：ヒストンメチル化酵素）による VASH1 発現抑制が報告されており（Cancer Cell2010）、さらに、同論文では EZH2 の発現には転写調節因子 E2F が大切であることも示されている。
TG2 は E2F の分解を防ぐことで細胞内での安定性、を亢進することが知られており（FEBS J 2011）
TG2 が E2F ↑⇒EZH2 ↑⇒VASH1 ↓という分子機構で VASH1 の発現を抑制している可能性が考えられ（上図）、今後検証していく。
TG2 が腫瘍組織で高発現している報告と考え合
わせ、“腫瘍血管内皮細胞では（正常血管内皮細胞に比べて）VEGF 刺激の量が多いので、本来（正常血管内皮細胞に比べて）多量の VASH1 発現が誘導されるべきところ、TG2 発現量が高いために思ったほど VASH1 の発現は高くならず、腫瘍血管形成が助長される。TG2 を KO するとこの仕組みが解除されVASH1 発現が一挙に高まるために腫瘍血管新生が強く抑えられる。”という仮説をたてた。この作業仮説を証明するために現在 TG2(-/-)VASH1(-/-)ダブルKO マウスを作製中である。TG2 KO マウスで観察される腫瘍血管欠損が VASH1 のダブル KO によりレスキューされるかどうかを平成２３年度中に調べる計画である。

（３－２）波及効果と発展性など
TG2 は老化に伴い発現が上昇することが知られている酵素である。米国テキサス大 MD Anderson癌センターのKapil教授らのグループを中心にTG2がその scaffold 活性により癌細胞の生存を維持するのに働いていることが矢継ぎ早に報告され(CanRes 2008, 2009)、老化に伴う癌の増大に TG2 が働いていることが示唆されている。本研究は、これに加えて、老化に伴う腫瘍血管新生にも TG2 が働いており、その作用は TG2 による VASH1 の腫瘍血管新生抑制機能の低下によることを、動物モデルを用いて検証しようとするものであり、これが証明できると、老化と癌に関する理解が深まると共に、TG2による VASH1 の発現抑制反応を阻害する低分子薬剤を用いた新しい予防・治療法の開発につながることが期待される。なによりも夢の技術と思われていた腫瘍血管選択的な抑制技術の開発に繋がることが大いに期待できる。小嶋研ではマルチファンクショ
ナルな TG2 の機能ドメインの分離を進めており、理研で開発したこれらの技術と佐藤研におけるVASH の研究成果とを結び付けることによって、高齢化社会に貢献できる研究成果を社会還元できるようになる。
［４］成果資料
該当なし