PF-UAサマースクール「放射光分析⼿法の初⼼者向け勉強会」

2023.9.19 Zoom

From KEK IMSS website

タンパク質結晶構造解析
伏信進⽮（東京⼤学 ⼤学院農学⽣命科学研究科）

タンパク質(結晶)構造解析で得られた研究成果
Myoglobin & Hemoglobin

Ribosome

KEK-PF BL-6A

Copyright © Nobel Prize Outreach AB 2023

G Protein-Coupled Receptor (GPCR)The Nobel Prize Chemistry2017

ワイセンベルクカメラ

cryo-electron microscopy

News@KEKより
From
PDB-101 (RCS-PDB)

Illustration: ©Martin Högbom
The Royal Swedish Academy of Sciences

タンパク質の構造解析⼿法の概要
タンパク質を作ってX線結晶構造解析
X線回折の測定

結晶化

電⼦密度マップ

X線ビーム

Taken from Wikipedia

X線源：
シンクロトロン放射光
実験室線源(回転対陰極など)精製する単結晶が必要

フーリエ逆変換

クライオ電⼦顕微鏡解析 (cryo-EM)
グリッド作成(氷包埋法)

電顕マップ

単粒⼦解析

透過電顕(TEM)
Illustration:©Johan Jarnestad
The Royal Swedish
Academy of Sciences

Sato et al., J. Str. Biol: X, 2020

Photon Factoryの構造⽣物学ビームライン
主にタンパク質の単結晶X線結晶構造解析に使⽤されている

現在5本が稼働中

結晶スポンジ法など、他の回折実験にも⼀部使⽤される多数のユーザーグループが利⽤している
PAC採択課題数
G型 第4分科会(⽣命科学 I)
2023年度: 27(前期) +32(後期)AMED-BINDSでも多数の課題でビームタイム配分されている
From KEK PF website

Source: (Short Gap) Undulator, Multipole Wiggler
Energy range (λ): 0.75 – 2.2 Å (2.7 – 3.25 Å)
Beam size: 0.013 – 0.20 mm (H/V)
Photon Flux: 5 x 1010 – 2.5 x 1011 photons/s (λ~ 1 Å / 12.4 keV)KEK IMSS SBRC (物構研 構造⽣物学研究センター)によりビームラインの研究開発・⾼度化が進められてきた
⾼度に⾃動化され、ユーザー⽀援も充実している

https://www2.kek.jp/imss/sbrc/

タンパク質の結晶化
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タンパク質の単結晶を作る必要がある
タンパク質の溶解度を ゆっくり 下げる
⽔溶液中で 沈殿剤 の濃度を徐々に上げる
沈殿剤：硫酸アンモニウム、NaCl (塩析)、ポリエチレングリコール、アルコールなど
⼿法：蒸気拡散法、counter diffusion法(微⼩重⼒)など

例：蒸気拡散法(sitting drop vapor diffusion)
リザーバー溶液：沈殿剤の⼊った⽔溶液(バッファー)

結晶化ドロップ：
タンパク質溶液とリザーバー溶液を混合

蒸気拡散

容器にフタをして静置

蒸気拡散法における濃度変化（相図）

結晶化スクリーニング•••

基本的に、タンパク質(ソフトマター)は結晶化しにくい
タンパク質の性質はそれぞれ⼤きく違うので、結晶化条件をスクリーニングする必要がある
アミノ酸配列が１ヶ所違うだけでも結晶化条件が異なることがよくある

結晶化スクリーニングキット：
ある程度ランダムに設定された96条件がセットになっていることが多い
Sparse matrix
From the website of
Hampton Research

キットの組成の例

結晶化プレート(96 wells)

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光学顕微鏡で観察する

Crystal Screen (Hampton Research)室温で測定する場合もある(⽯英キャピラリ中に封⼊)結晶の冷却と抗凍結剤
冷却N2ガス

••••

X線ビームによる結晶のダメージを抑えるために冷却した窒素ガス(~ 100 K)を吹き付けながら照射する
氷の成⻑による結晶の破壊を防ぐために抗凍結剤(cryoprotectant)を加える
抗凍結剤：グリセロール、トレハロース(糖)、低分⼦量PEG、アルコール類などループで結晶をすくい、液体窒素に⼊れて冷却する、もしくは冷却窒素ガスのストリームに直接⼊れる

X線

From KEK IMSS SBRC website

タンパク質の結晶のパッキング
間隙が⽔溶液で満たされている
溶媒含量 25 ~ 75% (平均値は~45%)液体窒素に突っ込む

Uni-puck

胃がん関連タンパク質CagAの結晶化

多段階ソーキング法で分解能アップ

BLへ
物構研トピックス 2016.3.9
https://www2.kek.jp/imss/news/2016/topics/0309Crys/

X線回折データ測定
オシレーション法

DetectorΔφ < 1.0°
A crystal in front of the detector isslightly rotated around φ axis
during X-ray exposure

φX-ray回折斑点

タンパク質結晶の回折像

Ewald sphere
Radius =1/λ (1/Å)
CrystalH K L(flag)

IσI
回折点を指数付け(indexing)
強度Iを測定する

・・・・

SBRCビームラインの⾼度化と⾃動化
微⼩ビーム

⾃動化：全⾃動測定システム

BL-1A: 0.013 x 0.013 mm
BL-17A: 0.02-0.04 x 0.016 mm

結晶交換ロボット PAM

・全⾃動測定・リモート測定
・現地測定
微⼩結晶やPolycrystalでもデータ測定できるいずれか選べる⻑波⻑X線の利⽤
BL-1A: 2.7 - 3.3 Å;

BL-17A: - 2.1 Å

データ測定システムPReMo
オンライン測定対応
⾃動センタリングも可能
From KEK IMSS SBRC website

S, Feなどの原⼦の異常分散を位相決定や原⼦位置の特定に⽤いる
タンパク質中の硫⻩原⼦(システイン、メチオニン), ⾦属原⼦など

SPring-8の構造⽣物学ビーム
ラインもハード・ソフトともに充実している

位相問題について|F|
IαI(強度)から|F|(構造因⼦)への変換 (F2 ∝ I)

|F|は測定できるが位相αは直接に測定できないρ(xyz) (電⼦密度)の計算には位相が必要

位相決定の⼿法
・直接法

・分⼦置換法・重原⼦同形置換法
類似構造が必要
AlphaFold2の登場
良質な予測構造が鋳型として使⽤できるようになった・異常分散法(Single-wavelengthor Multi-wavelength)
Anomalous Dispersion

SeのK吸収端=0.9795 Å(= 12.6578 keV)
タンパク質中のメチオニンのS原⼦をSeにしたセレノメチオニンでタンパク質を作る

PtのL-III吸収端 = 1.0722 Å
FeのK吸収端 = 1.7433 Å
SのK吸収端 > 5 Å
他の原⼦(⾦属、Br, Iなど)でも位相決定可能タンパク質の結晶構造解析 データ処理と構造決定
回折像から強度、構造因⼦を計算する：XDS, DIALS, HKL-2000/3000, iMosflm etc.
位相決定、モデル構築、精密化など最後まで：
PHENIX, CCP4 (aimless, (SHELX), CRANK2, Refmac5, Coot etc.), .. .. ..
構造表⽰：PyMOL, Chimera(X) etc.
CCP4i2

PHENIX

GUIも充実している
いずれもソフトウェアとしては枯れてきていると⾔ってもよいまとめ• Photon Factoryの構造⽣物学ビームラインは約40年の年⽉を経て⾼度に整備され、⾃動化も進んでおり、分野外の⼈にも使いやすくなっています。SPring-8も使いやすくて強⼒です。
• 結晶化というハードルさえ乗り越えれば、解析ソフトウェアも充実していますので、あとはすんなり⾏くことが多いです。
• 結晶化しやすいタンパク質も結構あり、やってみないと分からないです。スクリーニング試薬なども豊富。
• 構造⽣物学ではクライオ電顕が主流になりつつありますが、結晶構造解析でないと難しいこともまだ多いです。
• 国内に優秀なタンパク質結晶構造解析の専⾨家が多数いますし、BINDSによる⽀援もありますので、ぜひチャレンジしてみてください。

https://www.binds.jp

2ビームに対する期待タンパク質の中に含まれる⾦属の状態を精密に明らかにする

プローブ光Trichromatic beamline (SPring-8 RIKEN Beamline I)
例：光化学系II
全体構造は~1.0 Å
波⻑のX線結晶構
造解析で各種構造解析
ポンピング光(吸収端)
ケミカルプローブの活性化(caged化合物、ナノ粒⼦等)、
Yamamoto et al., J. Synchrotron Rad., 1998
化学結合の切断など

吸収端付近のXANES, EXAFSの同時測定で構造情報+電⼦状態も解析

Picures from Wikipedia

Hybridリング：超⾼性能のシングルパスビームと⾼性能・汎⽤のストレージビームのマルチビーム実験が可能
⾼分解能CTで細胞内構造を観察
例：植物細胞壁
複雑な多糖とタンパク質(酵素)の相互作⽤など

軟X線を結晶中の化合物を活性化するトリガーとして⽤いる
ポンピング光

基質

細胞内の結晶なども京都⼤学 ⽣存圏研究所 杉⼭淳司先⽣ (SPring-8⽂化財技術WS)

酵素の化学反応を観測

基質

産物

Caged 基質
(例: Caged ATP)Concepts: 鯨井智也先⽣(東⼤)のスライドより