藻類 Jpn.J.Phycol.(Sorui)43:3
1‑
37，
March10，1995

31

盆研究技術紹介
共焦点レーザー走査顕微鏡による植物体像の観察
松井透
高知大学理学部生物学教室干 780高知市曙町 2
δー1Mats
凶，T.
:The∞m
田 8
1
1
田 町 田 富 田 恒g
micro
配opyforplan
ts
町f
田 eob
嶋lVationsJ
pn.J.Phyco.
l(Sorui)34:30‑
36.
Amethodforplan
tsur
faceobselVal
Ionsusin
gcon
focallaserscann
in
gm
i
cr
os
copywasd
ev
e
lope
d.I
ti
spossibleto
曲。ffocusandfmerre
回，Iu
tion白 血 w
it
hs組ndar
廿o
pt
i
ca
lm
i
cr
osco
p
y， 回d血.
esμcim巴 悶 C岨 b
eob
t
ai
ng
r
eate
rdep
国 間e
dwi
血.
ou
tb
e
in
gd
血n
age
d.
ob

KeyInd田I Wor
ds:au
to
fluor
esen
c
e‑com即'aJJ
田 町 町 岨n，
釦Igmicro由，。戸ー imageprocessing‑s
山命田observation・
伽 田 品 調 聞S;I即 d加 aging

TohruMatsui: D叩 町 加 叩tofB
iology，Fac
叫tyofS
cience，K田，hiU凶ve四ity，Ake加nかcho，
K田悩 78O，J叩叩

はじめにレンズで兼ねているため，絞りを設定できないので焦点深度を稼ぐことができない。熟練した研究者なら微小さな植物体をもっ藻類やコケ類などの形態を顕微

妙にフォーカスをリアルタイムに変えながら正確な観鏡写真撮影する場合，顕微鏡像の焦点深度が浅く，全察を行い， 3次元立体構築すら行っている。しかし，面にフォーカスの合った写真を撮影できないことが多写真撮影の場合，ある一瞬をフィルムに写しこむのい。田中 (1962)によると 20歳台の人が 10倍の接眼レで，熟練研究者の技術を写真として表現することは極ンズで適切な照明法のもとで光学顕微鏡観察を行っためて困難である。

場合，対物レンズが 10倍の時でおよそ 47
凹 1，40倍の共焦点レーザー走査顕微鏡はごく最近実用化され，時でおよそ 3.
1J1IIlの焦点深度が得られるという。明視

生物学の諸分野で急速に利用されはじめたまったく新野照明法での観察の場合，焦点位置から大きくずれたしい光学顕微鏡である。この顕微鏡を用いて厚い試料試料は見ることができないが，わずかにずれた試料はを観察した場合，あたかもミクロトームで試料を薄〈ぼやけた像として見え，観察や写真撮影に支障をきたスライスしたかのように焦点の合っている部分の像だ

す場合カヲPなくない。コンデンサの絞りを深〈絞りこけが取り出され，理想的な光学切片像が得られる。まむことにより焦点深度を深くすることができるが，解た，わずかでも焦点の合っていない部分の像はぼぼ完

像度の悪化を覚悟しなければならない。暗視野照明法

全に取り除かれるので，観察にはほとんど影響を与えや務射照明法，特に落射蛍光観察の場合は試料そのもない。このようにして得られる非常に薄い光学切片像のが輝いて見えるため問題はより深刻である。焦点位を，指定した厚みで連続して取り出すことも可能で，置から大きくずれた試料からの光も観察に悪影響を及得られた多数の光学切片を次々に重ね合わせて，試料ぼす。また，コンデンサレンズと対物レンズを lつのの立体観察を行うことすら可能である。すなわち共焦32

松井点レーザー走査顕微鏡は試料内の構造の厚さ方向の分共焦点光学系の原理

布解析を行う場合に特に優れた能力を発揮する。また，梶谷・徳田(1994) によると理論的には通常の光共焦点光学系とは対物レンズに対して共役な位置

学顕微鏡の約1.4倍の分解能が得られるため，これま(対称的な位置)に焦点位置とピンホールが置かれたで以上に微細な構造の観察を行うことができるとい光学系をさす。光源側のピンホールで点光源を作り，う。生物学，特に細胞生物学の分野では超薄光学連続検出器側のピンホールで焦点位置以外の光を除去す切片が得られる落射蛍光顕微鏡として利用され，微小る。通常の光学顕微鏡では焦点位置以外からの光が焦管やマイクロフィラメント等の細胞骨格要素が細胞内点位置からの光と重なり，全体的にぼやけた像になでどのように分布しているかを 3次元的に観察でき，る。これに対して共焦点光学系では検出器側のピンその威力を発揮している。また，花粉等の微小な試料ホールによって焦点位置以外からの光を除去できるのの立体構造の観察にも利用されている(Lichtman

Fig.
で，鮮明で焦点深度が浅い像を得ることができる (1994)。

1)0 Fig.laは焦点位置に試料がある場合で，試料から通常，共焦点レーザー走査顕微鏡観察では材料の固の光は検出器手前のピンホールを通過する。しかし91) は蛍光色素を含有定と蛍光染色を行う。瀬川(19Fig.
lbのようにわずかでも焦点位置から試料がずれてした培養液を用いて，生きた細胞のエクソサイトーシいると，光は検出器手前のピンホールを通過できなスとエンドサイトーシスの観察を取り上げているが，しミ。

筆者の知る限り生きた植物体の表面構造の 3次元立体

195
5年にハーバード大学の MarvinMinsky( 人工知観察に応用された例はないようである。本稿では共焦能の父"として有名)によって共焦点光学系の原理が点レーザー走査顕微鏡が生きたまま，または乾燥標本明らかにされた (Minsky1988)が，実用化するためにを材料とした植物体表面の微細な構造の 3次元的観察は極めて細く絞ることのできる高輝度の光源が必要でにも極めて有効であることがわかったのでその方法をあった。通常の光学顕微鏡に用いられている光源はそ紹介する。藻類やコケ類には非常に小さな体を持つ種の波長幅が広く，レンズを通過する時に波長によって類が多く，これらの全体像を詳細に観察・記録するた屈折率が異なるため，極めて細く絞ることができな

めには焦点深度の極端に深い像が得られる走査型電子い。その後， 1960年にレーザー光が発明された。レー顕微鏡が便利である。しかしながら通常行われている

ザ一光は高輝度で波長が一定で位相が揃っていてるた

高真空モードでの走査型電子顕微鏡観察の場合，あらめ極めて細く絞ることができ，共焦点光学系にとってかじめ試料を固定し脱水し，試料表面に金コーテイン

av
idov
it
sandEgger (1969) は共最適な光源である。 Dグをするというややめんどうな処理が必要である。ま

焦点光学系の光源としてレーザー光を用いた最初の顕

た固定や脱水処理の聞に組織や細胞の表面構造にダ微鏡を発明した。その後，数々の技術革新(特にレーメージを与え，人工物を生じる可能性がある。たとえザー走査法やコンピュータ処理法)により実用化さ低真空モードでの観察であっても細胞に多量の水を含れ，多数のメーカーから発売されるに至った。現在もんでいる植物，特に水中で生活している藻類などで生新しい技術が次々に導入され，高性能・高機能化してきたままの個体を観察する場合は乾燥によって細胞がいると同時に，操作方法はますます容易になってきて変形してしまう。また，どちらの方法を用いても試料いる。現在の一般的な共焦点レーザー走査顕微鏡はを試料台にしっかりと固定する必要があり，試料の損レーザー光源，共焦点光学系ユニット，落射蛍光顕微

傷を最小限にくいとめる工夫をしなければならず，簡鏡，制御・画像処理用コンピュータシステム等から構便であるとはいえない。共焦点レーザー走査顕微鏡は成される。より詳しい原理や構造はInoue(1989)や大極端に薄い光学切片が得られるという特徴を生かし出(1990)，梶谷・徳田(1994)，Lichtman (1994)等をて，多数の光学連続切片を重ね合わせることにより，参照されたい。

試料をまったく損傷することなく試料表面構造を 3次元的に立体観察することが可能であり，走査型電子顕観察方法

微鏡に匹敵する焦点深度を持った像を得ることができるのである (Matsui1994)。

通常，共焦点レーザー走査顕微鏡で観察する試料は固定と蛍光染色を施す必要がある(加藤・村上 1991等)。しかしながら植物組織の全体像を観察するため

レーザー顕微鏡

Detector

33

口B
eam‑splittingP
inholeaperturea

focus

bF
i
g.1.op面白1，
抽出ina∞nfi
田 almic
ros∞pe.配 布lespe
cimenis'infocus.
'b:羽田 S戸cim
叩 is'outofti
出 国Jには必ずしも蛍光染色の必要はない(Ma凶 i1994)。こ植物体そのものを共焦点レーザー走査顕微鏡で観察

れは植物体を形作る細胞壁などが自己蛍光を発するた

すると，植物体内へレーザー光が届かないか，たとえめ，無染色でも共焦点レーザー走査顕微鏡で観察でき届いても励起された蛍光が植物体そのものによって遮る場合が多いためである。通常の植物細胞内の蛍光顕られてしまうため，レーザー光で励起される表面の輪微鏡観察では細胞壁の自己蛍光は観察の妨げになる郭だけの像が得られる。ちょうど地図の等高線だけがが，植物体の全体像を共焦点レーザー走査顕微鏡で観得られたようなものである。各等高線を重ね合わせれ察するにはこの自己蛍光が役に立つ。このため観察試

ばどのような起伏であるのかがわかるのと同様，多数料は通常の光学顕微鏡で観察するものとまったく同じの輪郭像だけの光学連続切片をコンピュータで重ね合でよい。また，かなり長時間レーザー光を照射してもわせることにより，植物体の全体像が明らかとなる

蛍光退色しないため，同じ試料に対して相当な回数の(Fig.
2)。

レーザー走査を行うことができる。

筆者は通常，ホールスライドグラスまたは通常のス

34

松井Fig.
2.Illlageprojeci
ton0"
1opli
calcro
附 討CCliols.a:Oplicalcrossse
cliol(10.30of64secliols.
)b:
Oplicalcrosssecilon(no.45.
)C:O
plic
川
口osssecilol(no.60.
)d:Il11ageprojccilolofa
l64oplicalcrusssecilols. CharabrmllliiGl
11clill

ライドグラスに試料を水て、マウントし ，カーハーガラる。この方法は図像を重ねた時， 画像を構成するピク;
虫せ， 10‑40倍の対物レンズで観察を行っていスを 1セルの明るさを比較し，明るい方の値を優先する 処理る。乾燥標本の場合は乾燥状態のままスライドグラス法でLある 。高知!
大学に設置されている B
io‑RadM RCーの上に載せ，カバーガラスを il乱せて観察している 。

600共焦点レーザー走査顕微鏡の場合，関口数 1.4の 60

レーザ一光は 51
411111の波長を 川い ，減光フィルタで本倍プランアポクロマー ト対物レンズで理想的 な光学 切

来の I~ J るさの 10 % まで光世を終とすか，場合によって片像が得られる (Bio‑Rad1991)。本稿で用いている 10は 100% の光量で観察を行う 。谷光ザ:切片はサンプリ倍 ‑40倍のような低 JifJ
口数 ，低倍率の対物レ ンズではング 1m隔を通常 2‑5μ111の!
平さに設定し，最も遅いJ.
ill
惣
的な象
{が符られないため，焦点位置か らわず かに

レ ーザー走査速度で l 枚の Illijf象につき 3 ~ 5 回程度の外れたぼやけた{象も少し写りこんでしまっている (Fig

レーザー走査を行い，データ を‘ 17. J~J 化して l 枚の画像2a‑c)。 しかし，最大師度投彩法て、画像を重ね合わせてを待ている 。立体構造を観察するためには多数の光学いるため ，焦点位泣からずれた像は焦点位置を正確に述続切片を得る必要がある 。このため，試李￨の奥から捉えた別の{象により f泣き換えられるので ，Fig.2dのよ

手前に向かつて 1O ~70 枚 ( 11 れこはそれ以上 ) の光学連

うにぼやけた部分はほぼ完全に除去される 。 この結Fig.2a‑c)。 こうして得られた各面
統切 j十を得ている (果， Fi g.2d では 250J.l 111 ほとごの焦点深度を持った .~I.l l列な{象をコンピュータ処理により屯ね令わせ，立体画像を画像が出 来上がって いる。対物レ ンズに試料が接しな

作 り tげる (Fig.2d)0ければより深い炉、 }~~i~~r支も得ることができるが，くれ画像を重ね合わせるためにい くつかの方法が準備さ

1止jcKo!
l支投彩法であれているが，今回用いた方法は 1

ぐれもレンスを傷っけない ように注意され たい。

レーザー顕微鏡

35Fig.3.I
mageprocessing.a:Acewb/llar;
acalyc/ll/ls
QuoyetGaimard.b:Sharpnesstilteringfrollla.c:Capsu
leandperiston
官 teethofHypoprel)
lg
iumj
apol
lic
umMitt.(driedherbariumspecimen.
)d:Digt
ialsbadowi
ngfr
omc.

画像処理と加工
フィルムレコーダ等の画像記録/出力装置が付属して共焦点レーザ ー走査顕微鏡で撮影した画像はコンいるため，得られた画像をすぐにフィルム等に出力でピュータ処理が不可欠なため，デジタルデータとしてきる 。 しかしながら，付属のソフトウェアには貧弱な保存される 。このため目的 に応じた画像処理が非常にグラフイツク処理機能しか装備されいないことが多Fig.3)0Fi
g.3aはホソエガサ
容易に行うことができる (く，自分の思い通りの図版に 仕上げることが難しい場

Acetabulariacalyculus ( 緑藻類 ) の傘基 j~l\ の像で、ある 。

合がある 。特に植物体の全体像を得る場合 ，試料にゴこの像を元にして画像をシャープ化したものがFi
g.3bミが混入している場合があり，どうしてもこれらのゴで，元画像ではぼんやりとしていた個々の葉緑体がミを画像中から取り除きたい場合も少なくない。通常

くっ きりとしている 。 Fig.3cはヒメクジャクゴケの焼き付け作業の場合では暗室内で様々な技法を駆使

Hypopcerygiumjaponicum (辞類)の朔と朔歯の像であしなければならない 。 このような場合も共焦点レーる。 この像にシャドウ処理を行ったものが F
ig.3dで，ザー走査顕微鏡で符られた画像データをフォトレタッ

明るさの迷いを高さとして擬似立体化している o元画

チ用のソフトウェアに移すことにより，非常に手 il!
蚤に

像では 一様な明るさに見えていた構造にも微妙な淡淡行うことができる 。筆者は通常 ，画像データを Appleがあることが視覚的にわかる 。この他に も非常に多く社の Maci
ntoshへ移し.Adobe社のフォトレタッチソフの画像処理法があり ，これ らの処理法を複数組み合わoshopやアメリカ国立衛生研究所のフリーウエ
トPhotせることも可能である 。また画像処理専用ソフトウ ェア NIHImageでコントラストや明るさの変更，画像のアにも国{象データを移すことができる 。

修正，スケールや文字等を入れる作業，場合によって通常の共焦点レーザー走査顕微鏡のシステムにはを行い，フィルムレコーダ等で出力は株々な画像処理g36

松井Fi呂.
4. Confocallaserscanni
ngmi
crographs0'
11ll0SSandal
gae.a:Dislichoplり，
11/.
/
1/1calillifolill川 F
roeh.(
driedherbarilln
lspecimen.
)b:
E川 町 仰 /Olp!
t
aplVlifera(Mlleler)1.A
gar
dh.c:NOSIOCCOlllllllll
leVallche.
rd:Clwr
abralllliiGmelinするようにしている 。 本稿で朋いた写真はすべて料は死んでしまう 。また，低真空モードによる観察でPhotoshopで加工後，出力業者に依頼して Adob
巴社のも水分の多い藻類はすぐに乾燥してしまい ，原形を保I
Iluslratorで レイ アウトし ，Canon社の Pi
xelJelプリ ン

つことがむずかしい 。しかし共焦点 レーザー顕微鏡をタで出力したものである 。

mいることにより ，生きたままの藻体を通常の光学顕微鏡で観察するのとま ったく同じ状態で観察すること

今 回の材料 についてができる 。
Fi g . 3 a はホソエガサ(緑藻類)のぎ~基苦11 で，白くF
ig.2はシヤジクモ Charabrauni
パ輪藻類)の雌擦で光っているのは紫緑体に含まれるクロロフィルの i
当ある 。 64 枚の光学連続切片 {象を搬);}~している 。 Fig.2a蛍光である 。架線体が刻IIlJ包内に比較的均一 に観察されは 30枚目の光学切片像で，雌器の輪郭が明瞭に観察でるため，総体の輪郭もよくわかる 。 F
ig.3cはヒメク象で ，雌器のらせん細胞の配きる 。Fig.2bは 45枚目の {ジヤクゴケのiflJJと朔歯である 。乾燥標本を用いてい列状態が明瞭に観察できる 。また，卵細胞の輪郭も観0倍の対物レンズを用いて 5μml司る。この 写真の場合 1祭できる 。Fig.2cは 60枚目の像で，らせん細胞に業緑隔で 137枚の光学切片を得て，すべての像を重ね合わ体が直線状に配列 していることがわかる 。Fig.2dは 64せている 。このため焦点深度は約 685flm ある 。通常の枚の光学切片像をすべて重ね合わせた像である 。走査光学顕微鋭で 10倍の対物レンスを用いた場合，得られ型電子顕微鏡を朋いても同級な像を仰ることができる5倍もの能力向上がる焦点深度は約 47μmなので約 1が，高真空モードでの走査型電子顕微鏡観察では園行われたことになる 。朔壁の細胞 の形態や配列状態が定，脱水， 金コーテイングのプロセスを経るため ，材非常によくわかる 。通常の走査型電子顕微鋭写其ではレーザー顕微鏡37

材料の表面のみの観察しか行えないため，この写真のた1994年 5月のことである。それまで 共焦点レーように細胞の輪郭が明瞭な像は得られない。また，朔ザー走査顕微鏡"とういう名前は知っていても，何を歯表面の横条も明瞭に観察される。朔表面に見られる観察することができるのかさえ知らない状態であっ非常に輝度の高い穎粒状のものは本種の胞子である。

た。このようなまったくの初心者に様々なアドバイス

F
ig.
4aは D
istichophyllumcatinifolium(欝類)の配偶をしていただき，本稿をまとめるようご配慮いただい体で，乾燥標本を撮影したものである。葉の細胞の輪た高知大学理学部生物学教室の奥田一雄博士にこの場郭が明瞭になっているため，細胞の配列状態が一目瞭をお借りして感謝いたします。

然となる。 Fig.4bはスジアオノリ Enteromorphaprolifera(緑藻類)の主枝と小枝の断層写真である。小

引用文献

校内は空洞であることがわかる。小枝の断面は光学切片像で，機械的に切断したものではない。このように

B
io‑
RadMicroscienceDivision1991.BIO‑RAD蜘mc‑
縦淘共焦点レーザー顕微鏡を用いることにより材料を切断

L
aserS
canningConfocalImagingSystem.Operatingig.4cはイシクすることなしに断層像が観察できる。 FManual.Bio‑RadHouse，Herts.

ラゲ Nostoccommune(藍藻類)の糸状体である。かん

Dav
idov
its，P.andEgger，M.D.1
969.S
canninglaser

でん質の部分はまったく自己蛍光を発しないため何も.
microscope.Nature2
23:831Inoue，
S.1
989.Foundationsofconfocalscannedimaginginlightmicroscopy.p.
I‑13.I
n:Paw
ley，J.(ed.
) 百le

観察されない。このため糸状体のみが撮影できる。この写真では左上が最も手前で右下が最も奥であることもよくわかる。また，各糸状体の上下関係も明確にわかる。通常の光学顕微鏡写真では焦点深度を極端に浅くすることができないため，どうしても各糸状体が重なりあってしまい，上下関係を表現することは困難である。また，焦点面からわずかにずれた糸状体もぼや
ig.4dはシヤジクモ(輪藻類)けて写りこんでしまう oFの冠細胞である。白く光っているのは葉緑体に含まれるクロロフィルの自己蛍光である。冠細胞とらせん細胞の位置関係や冠細胞と葉緑体の配列が明瞭にわかる。また，らせん細胞では原形質流動が非常に速いため，葉緑体が高速に移動し，その道筋が帯状に観察される。これに対して冠細胞では葉緑体の移動が遅いため，各葉緑体の形態がはっきりと観察される。
おわりに共焦点レーザー走査顕微鏡は極めて薄い光学切片が得られるため，これまで困難であった様々な形態の解析が可能となった。しかし，これまで細胞生物学以外の分野ではあまり用いられてこなかったように恩われる。本稿で述べてきたように共焦点レーザー走査顕微
鏡はまったく無処理の材料を用いても，これまで観察できなかった世界を我々の前に見せてくれる。今後，生物学のあらゆる分野において強力な研究機器としてその能力が発揮されるものと期待される。
筆者が共焦点レーザー走査顕微鏡にはじめて触れたのは高知大学に B
io‑
RadMRC‑ωoシステムが設置されHandbooko
fB
iologicalConfoca
1Microscopy. IMRPress，Madison.
梶谷文彦・徳田周子 1994. 共焦点レーザー走査顕微鏡.蛋白質核酸酵素 39:1911・1919.
加藤一夫・村上 徹 1991.共焦点レーザー走査顕微
3:76‑10.
鏡:全載標本の観祭.細胞 2Lichtman，J.W.1
994.Confoca1microscopy.Sc.
iAm.2
71(2)
:30
・35.(大出考博訳.立体像が得られる共焦点
顕微鏡.日経サイエンス 24(10)
:1 ‑
106.
)
Matsui，T.1
994. LeskeodonrotundifoliusBartr.，anew
synonymo
fDistichophyllumcatin
i
foliu
mF
roeh.

∞Hikobi
a1
1:
423‑
428.
Minsky，M. 1
988. Memoironi
nv
entin
gthecon
fo
cals
cann
in
gm
i
c
ros
cope.S
cann
in
g1
0:1
28・138.
大出孝博 1990. レーザー走査顕微鏡の開発.日経サ10):42・53.
イエンス 20(瀬川彰久 1991.共焦点レーザー顕微鏡による生きた3:81・84.
細胞の観察.細胞 2
田中克巳 1
962.顕微鏡の使い方.裳肇房，東京.