230907-1530

C18(ODS)で困った時の？
？

HPLCカラム選択：高吸着化合物編
ChromaNik

株式会社クロマニック テクノロジーズ
カラムコンシェルジュ 小山 隆次
koyama@chromanik.co.jp

ChromaNik

吸着って、ナンダ？
吸着：二相が接する界面上で、特定の成分濃度が上昇する現象
液相

液相

固相

固相
（: 分析種）： ファンデルワールス力、イオン交換作用など

吸着＆脱離のメカニズムを利用の例

シリカゲル等を吸着剤に用いた、吸着クロマトグラフィー
2

ChromaNik

吸着と分配…

特異的な吸着を利用

吸着⇆

分配クロマトグラフィー（逆相HPLCでの利用など）

液相（例： 水、アセトニトリル）

⇆

●

逆相

★

固定相（例： C18）
抗原・抗体検査キットにおける免疫クロマトグラフィー

固相（例： シリカゲル、金属、樹脂）●：理想的な相互作用系

良質な検査・分析のために重要 ： （非特異的な）★：実際の相互作用系

吸着 の排除3ChromaNik

吸着で生じ得る、ＨＰＬＣ分析への影響？
⚫ ピーク形状の劣化⚫ 検量線の直線性が崩れる。

？

⚫ ピークの消失⚫ 打つたびに、面積値が変動⚫ キャリーオーバー
4ChromaNik

吸着箇所も色々

9００minmin⚫ バイアル、前処理
経時的な容器内壁への吸着⚫ サンプラーニードル
ピーク消失、面積値の変動⚫ システム配管系（ＳＳ）ピーク消失、面積値の変動、キャリーオーバー⚫ カラム
ピーク形状の劣化・消失、値の変動...
5

ChromaNik

カラム内の吸着箇所① 充填剤② カラム管（内壁）③ フリット（焼結フィルター）④ カラム接続部

シリ
カ
ゲ
ル
基材
由
来

金属部
（ＳＳ）
由
来
6

シリカゲル基材
ChromaNik

シラノールとend-capping7

ChromaNik

シリカゲル基材の表面状態 （シラノール基の存在）
OC18（固定相）

移動相（水和，溶媒和）

ACNACNSiACN
H2 O

ACN

O

O Si O
OH
O
SiACN

H2O

分析種

ACN

H2 O
H2O

H2O（基シ材リカゲル）

HOH3C

SiOOOOSiO

O

OSiO

O

Si
O

TMS エンドキャッピングColumn size:
4.6 X 150mm<例>
エンドキャッピング処理を行っていない他社製C18O

Si

O
O

Si-OH → Si-O- ＋ H+
シラノールの解離（アニオン化）

１

H2 O

Mobile phase:
CH3OH/H2O = 30:70
Sample:1 = Uracil
2 = Phenol

3OHSi

3 = Pyridine

H2 O

SiO

テーリング

CH3

H2 O

OH

Si

塩基性化合物の過度なCl Si CH32CH3O

HOSiTMSSi

H3C

例CH3OH

05OSi-OH: 水和を供するシラノール基
Si-OH: 水和を供さないシラノール基

101520N

Retention time / min

塩基性化合物のテーリング ： 不均一な相互作用が原因

8ChromaNik

シラノール基の吸着性と、コントロール
塩基性化合物の良好な⇔対称性

クロマニック製 Sunrise C18-SAC

塩基性化合物の過度なテーリング(エンドキャッピングを行っていない* C18)

Column size:<例>「選択的な不活性化」4.6 X 150mm

2

エンドキャッピング処理を行っていない他社製C183１2１0Mobile phase:
CH3OH/H2O = 30:70

51015Sample:
1 = Uracil
2 = Phenol

3

3 = Pyridine

20

Retention time / min

05101520

N

Retention time / min＊SAC(Silanol Acitivity Control)技術による、選択的シラノール処理は実施済

SAC技術で、シリカ表面の吸着性はコントロール可能

9

ChromaNik

シラノール活性コントロール技術 （SAC）• 不均一化した表面が、テーリングを引き起こす。
適切な処理を行えば、シラノールは保持に活かせる。

SunriseC18-SAC

SiSAC

OHOOOSiSi OH

シラノール
活性コントロール型C18

エンドキャッピングは未実施 （SAC：Silanol Acitivity Control）

詳細： http://chromanik.co.jp/product/Sunrise_C18sac.html
10ChromaNik

シラノール基の相互作用 （カチオン交換）
pH 3.04

解離状態のイメージ(pH 3.0)

A) Sunrise C18

23
15O
SiO

O SiOOSi

1O0OH223461B) Sunrise C18-SAC

8235125

エンドキャッピングは未実施（＊）

10

解離状態のイメージ(pH 4.5)

エンドキャッピング済み

54

pH 4.541214160

Retention time / min

24684310121416OSiOO SiOO
SiO-O-Retention time / min＊SAC(Silanol Acitivity Control)技術による、選択的シラノール処理は実施済

塩基性化合物

4.

3.
NH

CH3N

CH3Column size: 4.6x150 mm
Mobile phase: CH3CN/20mM Phosphate（pH3.0 or pH4.5）= 50/50
Flow rate: 1.0 mL/min, Temperature: 40 ºC

Sample:1 = Uracil
2 = Propranolol

3 = Nortriptyline
4 = Amitriptyline
5 = Toluene

CH3

塩基性化合物を（良好なピーク形状のまま）、強く保持
11ChromaNikO

シリカ基材とエンドキャッピング

CH3SiOCl Si CH3O Si OOHOSi

CH3End-capping(例)• 逆相では、エンドキャッピング したカラムが一般的
但し、カラムの種類によって、その吸着性は大きく異なる。
2逆相カラムの例

43Column dimension: 100 x 2.1 mm 2 μm (Core-Shell)

N4 = 21,096
TF4 = 1.18

1SunShell C18

Mobile phase:
CH3CN/10 mM ammonium acetate pH 6.8 = 40/60
Flow rate: 0.3 mL/min
Sample:1 = Uracil
2 = Propranolol
3 = Nortriptyline
4 = Amitriptyline

Temperature: 40 ºC

1Detection: UV@250 nm

23

4N4 = 6,778
TF4 = 3.58

4.

Company A C18
NCH3CH3Retention time / min（N：理論段数、TF：シンメトリー係数）

塩基性化合物12

ChromaNik

クロマニック基盤技術： 高度不活性処理
サニエスト

Sunniest
end-capping①広範・緻密なEnd-capping層

ダブルエンドキャッピング（2008年～）②シリカゲル表面のSiloxane化

高温反応OO
Si OH

多層的な不活性化
概要

C18

Si OH

イメージキャラクター
Twinシリル化

高密度修飾に有用

HO

C18Si

SiOSiOOSiSiOOOO

C18Si

OO

SiOO

SiOOO

Si

SiOSi

Si O SiSiO
O O

C18C18

C18C18O
Si

Si

OC18O

弊社独自の高温エンドキャッピング

「尺取虫くん」
OC18

Si O

O O

Si

O O SiEnd-capping layer

OSiO
O OHOSiOOOSiSiSi
HO O
O O
OO O
O OSiOSiOO
O Si O O Si O Si O
Si O O
SiOO
O
Silanol Activity Control Technology (SAC) によるシラノール基のシロキサン結合化
OSiOOSiSiSiEnd-capping layer

FinalTMS

SiC18OOOO

通常Si疎水性大13

ChromaNik

高度不活性処理による安定化
TIC of ＋Q1

表面多孔性（コアシェル）粒子にも、高度不活性処理を適用＋Q1: 5.997 min to 7.999 minof Sample

耐久性UP
Sunniest
end-capping

他社C18

ブリード低減SunＳｈｅｌｌ（2011年～）

SunShell C18

高安定化 & 高効率化

1

テーリング抑制
塩基性化合物2

1 2

Company E C1843

TF4=2.73
34

SunShell C18
TF4=1.20

012345678Retention time/min

9Column size: CoreShell 2.6 μm
or 2.7 μm, 150 x 4.6 mm
Mobile phase:
Acetonitrile/10mM ammonium
acetate pH6.8=(40:60)
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40oC

4. Amitriptyline

Sample: 1=Uracil, 2=Propranolol,
3= Nortriptyline, 4=Amitriptyline

10（TF: シンメトリー係数）

14

ChromaNik

塩基性ポリペプチドの分離
32C18 (Pore size: 9 nm)

Rs1,2 = 1.33
4

Rs3,4 = 2.1421837

Protamine ： アミノ酸一次配列

Column: Core-shell C182.6 μm 150 x 2.1 mm
Flow: 0.3 ml/min

Rs2,3 = 1.881塩基性化合物

塩基性アミノ酸（R: アルギニン）を多く含む、類縁のペプチド群で構成される。
Ⅰ: PRRRRRSSSRPIRRRRRPRASRRRRR-GGRRRR

05101520

Ⅱ: PRRRR-SSRRPVRRRRRPRVSRRRRRRGGRRRR

Retention time / min

SunShell Bio C182

Rs1,2 = 2.28
41

(Pore size: 100 nm)

Ⅲ：PRRRR-SSSRPVRRRRRPRVSRRRRRRGGRRRR

3Rs2,3 = 2.32
Rs3,4 = 2.59

Column: SunShell Bio C18
2.6 μm 100 x 2.1 mm
Flow: 0.2 ml/min

Ⅳ：PRRRR-ASRR-IRRRRRPRVSRRRRR-GGRRRR（Rs:分離度）

タンデムTMS法

61649

051015

Tandem-TMS
end-capping

20Retention time / minTemperature: 40℃
Detection: UV@220 nm
Injection volume: 1.0 μLMobile phase: A)0.1% TFA in Water, B)Acetonitrile
Gradient program:10% B (0 min)→20% B (20 min)Sample: Protamine Sulfate from Salmon in Mobile phase A

Pore size

100 nm（1000Å）（2022年～）
適用品
15

ChromaNik

Tandem TMS ： アルカリ耐久性の比較
120

HO
H2CSiO

H2C

Si

H2C
H2C

O

CH2O

SiO

H2COOOOOOSiOSi

H2CO

CH2OSiOO

相対理論段数/%HOpH相 100対理論 80
段数 60維持 40率（％ 20）

OO

ハイブリッド型シリカ

アルカリ性移動相通液条件
カラムサイズ: 50 x 2.1 mm
移動相: メタノール/10 mM 重炭酸アンモニウム(pH 10.5, アンモニア水で調整) = 30/70
流速: 0.8 mL/min, カラム温度: 60 ºC●Prominert C18◆A社ハイブリッド型シリカ C18▲B社ハイブリッド型シリカ C18

00200

400

600

800

理論段数測定条件
カラムサイズ: 50 x 2.1 mm
移動相: アセトニトリル/水 = 60/40
流速: 0.2 mL/mizn, カラム温度: 40 ºC
試料: ブチルベンゼン

通液時間/hV.S.

最新技術によるエンドキャッピング

耐久性試験の結果は、ほぼ同等

Tandem-TMS
end-capping

推奨使用pH範囲： 1～12（C18の場合）＜適用カラム＞
Prominertシリーズ, SunShell Bio C18（NEW） 他

過酷条件で高安定： オリゴ核酸／ペプチド分析に有用
16ChromaNik

バイオ向け新製品： SunShell Bio C18
Tandem-TMS end-capping

32#10

移動相条件#1で温度60℃の場合（Rs:分離度）

3

Rs2,3 = 2.18

Rs3,4 = 2.51

#1

13.5 MPa

60℃

4140℃

Rs1,2 = 2.39
24

1

Rs1,2 = 3.03

81558

Rs2,3 = 2.15

#2

9.6 MPa

Rs3,4 = 2.6281725

510152025

Retention time / min
Sample: Protamine Sulfate from Salmon in Mobile phase AColumn: SunShell Bio C18 2.6 μm 100 x 2.1 mm
Gradient Program :Flow: 0.3 ml/min, Temperature: 40℃,60 ℃#1 10% B (0 min)→15% B (15 min)Detection: UV@220 nm, Injection volume: 0.5 μL# 2 5% B (0 min)→15% B (30 min)
Mobile phase: A)0.1% TFA in Water, B)Acetonitrile

中～高分子試料の保持性と、高温での溶出性を両立
17

金属部（SUS）
ChromaNik

吸着抑制とメタルフリー

18ChromaNik

金属部への吸着性の高い化合物の例⚫オキシン

Glyphosate - FMOC

Oxine

⚫EDTA
N

⚫クエン酸

⚫ATP,ADP,AMP

ADP

EDTA

⚫グリホサート（農薬）
金属配位性化合物
19

ChromaNik

リン酸マスクと、充填剤の金属不純物試験
Metal chelating test
Column: Biphenyl 2.6 μm or 2.7 μm 150 x 4.6 mm
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample:Detection: UV@250 nm
1 = Oxine
NMobile phase: CH CN/
320mM H3PO4=10/90

PP

充填剤の、金属吸着性比較（TF:シンメトリー係数）

Company A

TF1=3.06

Company B

TF1=2.13

Company C

TF1=2.29

SunShell

TF1=1.21

金属配位性化合物

2 = Caffeine

PP

移動相にリン酸等を流す事で金属活性点をマスクし、試料の吸着を低減できる。但し、充填剤内の金属不純物影響までは、十分に排除できない。

（充填剤のエンドキャッピング＝不活性化が重要）

Retention time/min

20

ChromaNik

メタルフリーカラムの活用 for LC/MS
移動相にリン酸・EDTA等を流せない環境下（LC/MS）では、高耐圧PEEK管仕様の メタルフリーカラム が重用される。
金属配位性化合物

321高耐圧PEEK管仕様
ステンレス管 (通常)
01234567Column: Sunniest RP-AQUA
3 µm, 50 X 2.1 mmI.D.
Mobile phase: 10 mM HCOONH4
Flow rate: 0.2 mL/min
Temperature: 25 ℃
Detection: UV at 250 nm
Sample: 1. ATP 2. ADP 3. AMP
Injection: 1 µL (各成分濃度25 µg/mL)

装置環境 ： 接液部イナート化HPLC

Retention Time (min)21

ChromaNik

メタルフリーカラム接続時の留意点(一部)一部メタルフリー
カラムの内部構造

ワンピースナット（フェラル部一体型）※当社取り扱いのメタルフリーカラム2種（巴製作所、ＩＤＥＸ社）は対策済みにつき、内部破損の恐れはありません。
22

ChromaNik

メタルフリーカラム接続時の留意点
カラムエンド（ＰＥＥＫ）▼配管（ＳＳ）▼メタルフリーカラムはイナートHPLC環境 *での使用を原則推奨

ＳＳ配管がＰＥＥＫ面（強度がＳＳより弱い）に、直接押しあたる。

▼カラムエンド接続面

変形による破損リスク

汎用HPＬＣ （SS配管）＊変形対策を兼ねた、イナートHPLC環境構築の例
Marvel-X PLS（PEEK lined Stainless Steel）
配管先端部 ： PEEKチップ
23

ChromaNik

Marvel-X 配管システムの特徴
S S / 接液部：ＳＳ,PEEKor
PLS / 接液部：PEEK
フェラルレス
先端ＰＥＥＫチップ

デッドボリュームを極小化

手締めで高耐圧 （～130MPa）「HPLC/UHPLCカラムのエンドフィッティング接続の留意点」

URL: https://bunseki.jsac.jp/tech

HPLC/UHPLC装置は吐出ポンプ，オートサンプラー，インジェクター，カラム，検出器間を1/16インチのステンレススチール配管などで接続されており，配管の容量や，接続部で発生するカラム外容積はカラムの性能に大きく影響する事が知られている。本稿ではカ
ラムのエンドフィッティング接続での間違いやトラブル回避方法やエンドフィッティング規格に関わらず接続可能な配管の評価などを紹介する。･･･ (日本分析化学会機関紙「ぶんせき」技術紹介より)
キーワード：HPLC, Fitting, Ferrule
S1017 (2022)
24

ChromaNik

簡易メタルフリー化 / Marvel-X “PL ”
PLS (PEEK lined stainless steel)

輸入検査（当社独自）
目視検査（マイクロスコープ）および通液試験にて、成型不良品の入荷を防ぐ受け入れ態勢

ＰＬＳには、内径25μmと50μmもございます。お問い合わせ下さい 上記価格には消費税は含まれておりません。上記価格表は2023年9月現在の国内販売価格です。

25

ChromaNik

グリホサート類（農薬）の LC/MS分析例

6(x10,000)
51[HPLC Condition]
Column:390.0748>167.9500(-)

金属配位性化合物

Prominert C18 3.5 μm, 150 x 2.1 mm i.d. MTF (Metal free)

1,2Glyphosate - FMOC
4392.0748>170.1000(-)

2Mobile phase:A) 5 mM Ammonium acetate in WaterB) Acetonitrile
Time (min)Gradient Program: see right0 – 1.01

3402.1112>180.1000(-)

33Glufosinate - FMOC

＊Tubing: PLS (PEEK lined stainless steel)

2332.0693>110.1000(-)

HO

4

4,5

1334.0693>112.1000(-)

AMPA - FMOC

505.50Flow rate: 0.25 mL/min
Column Temperature: 35 ℃
Injection Volume: 10 μL
Instrument: LCMS-8050 (Shimadzu)*

H

5.75

6.00

6.25

6.50

6.75

7.00

7.25

7.50

Retention time/min

7.75

8.00

8.25

Sample:1 = Glyphosate - FMOC
2 = [13C,15N] Glyphosate - FMOC
3 = Glufosinate - FMOC
4 = AMPA - FMOC
5 = [13C,15N] AMPA - FMOC

B.Conc(%)
51.01 – 9.50

5 → 639.50 – 11.0

63 → 95

11.0 – 13.0

95

13.0 – 18.0

5

[MS Condition]
Interface: ESI
Nebulizing gas flow: 2 L/min
Drying gas flow: 10 L/min
Heating gas flow: 10 L/min
DL temp.: 150 ℃
Heat Block Temp.: 400 ℃
Interface Temp.: 300 ℃
CID-gas: 210 kPa
Interface voltage: -3 kV8.50(AMPA: Aminomethyl phosphonic acid)（データ提供： 一般社団法人 農民連食品分析センター）

26

ChromaNik

新製品 PS inert 「有機不活性」 カラム
低吸着を ーー あらゆるHPLCで 高分離をPS inertカラム、有機不活性処理のイメージ

ステンレススティール

2022年発売カラム

有機不活性化層

Prominert

配管・フィルター部を含む接液箇所を有機不活性化（プ ロ ミ ナ ー ト）
新開発した不活性化法で充填剤の内部を低吸着化
Prominertのコンセプトを継承し、Prominert
Surface= 有機不活性表面処理を施したカラム管

有機不活性管 PS inert(option)
SS管での接続も、問題なし

27

ChromaNik

PS inert : 有機不活性カラムの低吸着性
PS inert(mAU)
4000000
3500
3500000

700
7000003000
3000000

600
600000SS(Stainless Steel)

2500
2500000

PS inert(mAU)
800000SS500500000

1. AMP

2000
2000000

400
4000001500
1500000

300000300

1000
1000000

20000020050050000010000010000

金属配位性化合物

2. ADP

00
000.2

0.2

0.4

0.4

0.6

0.6

0.8

0.8

1000.2

0.4

0.4

0.6

0.6

0.8

0.8

1

Retention time/min

Retention time/min
Column:SunShell C18 2.6 μm, 100 x 2.1 mm i.d. SS / PS inert

0.2

Mobile phase:
Acetonitrile : 0.1% formic acid in Water = 1 : 99

Detection: UV@254 nm
Flow rate: 0.45 mL/min

PS inertは、「Ｐｒｏｍｉｎｅｒｔ」以外の充填剤にも適用可能です。

良好なピーク形状と、汎用性の両立

Column Temperature: 40 ℃
Injection Volume: 2 μL
Sample： 1=AMP, 2=ADP

装置環境 ： 汎用HPLC （SS配管）
28

ChromaNik

Prominert（充填剤）の高効率性 & 選択性
12364

カラム効率18.0 MPa
k6 =7.1C18（理論段数÷圧力）２倍

N6=20,000

3576413.0 MPa
k6 =9.25104 = イソバニリン

ー2Prominert
Biphenyl35 4N6=28,000
004512Prominert
C18５ = バニリン

231751

6 = アミルベンゼン

Ｃ 社 C18 3.5μm（ハイブリッド型シリカ）

15202551015Retention time/min(k :保持係数、N：理論段数 )(分析条件詳細： Prominert専用カタログに記載)

Retention time/min⚫ 3.5 μm 粒子⚫ 2種の固定相 →⚫ 最高度不活性化

OO SiOＣ１８OO SiO

使用pH範囲:1～１２Ｂｉｐｈｅｎｙｌ

使用pH範囲:1～１0C

ＣＨ/π相互作用
29

ChromaNik

充填剤／カラム管を、ともに高不活性化
ー あらゆるHPLCで 高分離を ー
プ ロ ミ ナ ー ト

Prominert / 卓越した不活性さ

汎用ＨＰＬＣ（20MPa以下）でも高分離①充填剤の不活性化
Tandem-TMS end-capping

高密度エンドキャッピング処理による、不活性化法②充填剤の選別
３.５μm / C18, Biphenyl

低圧＆高分離を実現すべく厳選した2種の充填剤③イナート管対応 （option）
有機不活性管 PS inert

有機不活性化処理イナート管

ＳＳ配管系でも、低吸着30

ChromaNik

特殊イナート管のバリエーション
メタルフリーカラム

特殊イナート管IDEX 社 高耐圧PEEKカラム

種類

ＮEW
有機不活性カラム

巴製作所 高耐圧PEEKカラム（MTF）
Made in Japan（PS inertは、近日発売予定品です。）「PS inert」

PSinert- Current specification -カラムサイズ（内径x長さ）

耐圧

4.6 x 150 mm, 4.6 x 250mm,2.1 x 50 mm, 2.1 x 150 mm

2.1 x 150 mm, 2.1 x 250mm,
2.1 x 50 mm, 2.1 x 100 mm

2.1 x 150 mm, 2.1 x 50 mm,
2.1 x 100 mm （予定品）

100 MPa*

130 MPa*

価格

標準品カラム価格

標準品カラム価格

標準品カラム価格（税抜）＋30,000円＋20,000円＋型番□□□□□M□□□□□MTF□□□□□PS（例 CB694M）（例 CB694MTF）（例 CB694PS）＊カラムハードウェアとして（標準品型番：CB6941の場合）（カラム耐圧に準拠）,000円

31ChromaNik

まとめと留意点： HPLCでの吸着と対策⚫ シラノールは、必ずしも「吸着」の原因ではない。
⚫ 充填剤の高度不活性化は、低吸着化において重要⚫ メタルフリーカラム(PEEK)は、取り扱いに注意⚫ Marvel-X(PLS)活用で、簡易イナート環境を構築⚫ PS inertは、汎用HPLC(SS)で吸着を低減できる。
対象化合物の吸着特性によっても、最善手段は異なる。
32