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論題

マイクロ液滴と分析

Title

Microdroplet Operations and Applications

著者

福山真央, 火原彰秀

AuthorMao Fukuyama, Akihide Hibara

掲載誌/書名ぶんせき, 2015, 1,

8-12

Journal/Book name

BUNSEKI, 2015, 1,

8-12

発行日 / Issue date2015, 1

Powered by T2R2 (Tokyo Institute Research Repository)

マイクロ液滴操作と分析
マイクロ・ナノ構造を用いた分析手法のなかで，液滴を利用した方法は分子（細胞）閉じ込めという観点から注目を集めている。例えば，マイクロ流路構造を用いて生成した液滴は，1 つ 1 つが孤立した反応・分析場であり，状況を上手く設定していくと分子カウントに基づく新しい分析法へと発展していくことがわかる。本稿では，発展著しいマイクロ液滴の生成法，操作法，解析法，応用例を紹介する。

1

福山真央， 火原彰秀図1(a) マイクロ流路中のマイクロ液滴の概観，(b) 溶液中は じ め に1990 年代以来，マイクロ・ナノ加工技術を用いて作製した分析デバイスが注目を集めている1)2) 。この研究分野は， MicroTAS あるいは Lab on Chip と呼ばれ，化学・生物・工学・医学・薬学など，幅広い分野の多くの研究者が集い研究が進展している3)～5)。マイクロ・ナ
ノスケールに分析化学の操作・反応などを集積化することで，省試料・省廃棄物・自動化・高速化などが達成され，化学・生化学分析の世界を変えつつある。例えば，
DNA 検出，電気化学検出，電気泳動，溶媒抽出，ガス分析，微粒子・細胞操作などの集積化が検討されている6)～10) 。近年では，ナノ空間の物性解明11) やナノ流路を用いた単一分子解析12)なども報告されている。
マイクロ・ナノスケールの空間を用いることで，分析操作上様々な利点が期待できる。 Y 字構造の流路を用いて，0.1～ 10 mm/s 程度の速度で水溶液同士を接触させると，慣性よりも粘性の支配的な（低レイノルズ数の）の定量操作（左）と液滴を用いる定量（右）の比較層流を形成する。このような状況では，拡散のみで溶質の混合が進行するが，数十 nm の空間では，撹拌などのめ，孤立した分析場・反応場として利用できる。この孤特別な操作なしでも，拡散係数に依存して数秒から 1立した空間というコンセプトは，定量操作など分析化学分程度で混合が終了する。また，互いに不溶な二つの液の基本的な考え方を大きく変える可能性がある。例え相を接触させる場合には，重力（密度差）により各相のば，図 1( b ) 左のように， 2 種類の溶質を含む溶液を考配置が決まるセンチメートルスケールの通常の実験と異えたとき，それぞれの物質をスペクトルに基づき定量すなり，界面張力が支配的な空間となるため接触させた順るためには，濃度と吸光（あるいは発光）の関係からそに各相の配置が維持される13)14) 。このような微小空間

れぞれの濃度を決定する。同じ溶液を，図 1(b) 右のよの効果を利用することで，様々な分析操作の集積化が検うに十分小さな体積の液滴とし，「液滴 1 個に溶質が一討されてきた。

つ入るかは入らないか」という状況にすれば，それぞれ粘性・界面張力が支配的な流れであることを，別の形の液滴の色を判別して計数（カウント）することで，で利用すると図 1(a) に示すような直径数 nm～数十 nm「定量操作」ができる。このような操作には，単一分子のマイクロ液滴を形成することができる。マイクロ流路検出可能な検出法，あるいは酵素反応や PCR のような内の安定した流れを利用することにより，液滴系の分散増幅反応が必要であるが，このようなコンセプトが拡がの小さい単分散液滴を形成でき，規定された pL～nL のりつつある。本稿では，マイクロ流路内のマイクロ液滴体積中に溶質分子・イオン・微粒子・細胞などを閉じ込の応用の基盤となる生成法や操作を概観した後，近年のひろマイクロ液滴の応用例を紹介する。
Microdroplet Operations and Applications.
8ぶんせき  

2マイクロ液滴の生成

これらの方法により，直径数 nm～数十 nm の液滴が生成できる。さらに，図 2(c) に類似の方法により，直マイクロ流路内で互いに不溶な 2 相を接触させると径 0.4 nm という小さな液滴生成も報告されている。液き，流路形状や流速などの条件により，一方の相（分散滴径を決定する変数としては，粘度と界面張力の比を表相）が破断（breakup）して他方の相（連続相）中で液す無次元数であるキャピラリー数（Ca＝mn/g，m：粘度，滴状あるいはプラグ状に流れる。生成した液滴の安定性

n：流速，g：界面張力）がよく用いられる。しかし，液向上のため，分散相または連続相中に界面活性剤を用い滴生成はミリ秒スケールの高速現象で，界面活性剤吸着ることが多い15)。

や流体界面変形など動的に扱うべき現象も多く，正確な

図 2(a) に示すような浅くて狭いマイクロ流路（MC）に油相を流すと，水相中に油滴が生成される16)～18)。その他にも，図 2(b) に示すような T 字合流型流路の片側から水相，他方から油相を流すことにより，液滴を生成

液滴径予測モデル構築には，より詳細な解析が必要である23)。

3

マイクロ液滴の操作と解析する手法がある19) 。流速・流量比により様々な液滴流

図 1 に示したようにマイクロ液滴の一つの特徴は，のパターンが形成されることが報告されている。図 2

溶質を閉じ込めて孤立空間をつくることにある。マイク(c) に示すように，これら二つの原理をあわせたようなロ流体は，低レイノルズ数の層流であり，二つ以上の溶浅い T 字合流構造をもつ液滴生成法もある20)。

液の合流も制御しやすい。図 3(a) に示すように，三の分散相の破断に対してより積極的にせん断を加える手水溶液を一定の比率で混合したあと液滴化し，液滴内部法として，図 2(d) に示すようなフローフォーカス法が流を利用してミリ秒スケールの高速混合を実現でき広く利用されている21)。図 2(d) 上の流路構造の左中段

る24)25)。逆に図 3(b) のように，マイクロ流路内の対称の流路から水相を，上下段の流路から油相を流し，それ性を高く保ち，内部流で混合が起こらないようにするこらを狭い流路を通すことで分散相（水相）を細く延ばし，ともできる。アクリル酸イソボルニル（モノマー）液滴

油相のせん断により破断する。図 2(e) のように，マイを生成したのちに重合し，半球ごとに異なる成分をもつ

クロ流路の分岐構造で，水相プラグが同体積に分割する

Janus 型粒子を作製した例が報告されている26)。ここでことを利用し，複数回の分岐をもつ構造で液滴を生成す

は炭素微粒子と TiO2 微粒子が，それぞれの半球に閉じる方法も用いられている22)。

込められている。
2 種類以上の液滴をまず生成して，その後に液滴間での溶質混合をすることを考えると，図 3(c) のように油中水滴（W/O 液滴）を，表面濡れ性を利用して水中油滴（ O / W 液滴）へと変換することで実現した例がある20)。また，図 3(d) のように 2 液滴を接触・合一させることで混合を実現する方法も広く研究されている27)。
3 種の流体を合流したときに， Janus 状態〔図 3 ( e )左上写真〕，二重液滴状態（同右上写真），接触 2 液滴となるかは，それぞれの相間の張力バランスで決定する〔図 3(e) 下〕28)。マイクロ流体を用いることで，簡便にこのような状態を調べることが可能である。
液滴生成前の水相中に粒子（あるいは細胞）を含む場
合，この水相の液滴化により何個の粒子が液滴内に閉じ込められるかは，確率分布（ポアソン分布）に従う。しかし，マイクロ流体中の粒子にかかる揚力を利用すると，図 3(f) のように粒子が規則的に並ぶことがある29) 。このような状態から適切な条件で液滴を生成すると，決定論に近い 1 粒子（1 細胞）閉じ込めを実現できる。
液滴における混合や接触のほかに，個別の液滴を分析・解析する技術も重要である。個別の液滴分析・解析
図2液滴生成法〔( a ) 浅い部分（テラス）とマイクロ流路には大きく分けて二つの考え方がある。一つは，図 4（チャネル）を利用した方法，( b) T 字型合流を利用し(a) に示すような分取法（Sort 法）である。分取部以前た方法，( c ) 浅い T 字型合流を利用した方法，( d ) フローフォーカスを利用した方法，(e) 複数回の分岐構造を利用した方法〕
ぶんせき  に蛍光法などで分取すべき液滴を定め，流路外の電極からの電場印加による誘電泳動により目的液滴を分取する
910

図3(a) 液滴内部流を利用した高速混合，(b) 液滴内部混合を抑制下 Janus 型粒子生成，(c) 油中水滴から水中油滴への変換を利用した混合，(d) 2 液滴の合一を利用した混合，(e ) 3 流体合流時の液滴形態変化，( f) 流体効果を利用した粒子閉じ込め

図4(a) 誘電泳動を利用した液滴分取法。(b) マイクロ構造を利用した液滴整列・保管
ぶんせき  

ことができる30)。別の考え方は，図 4(b) のように，液の溶液（プライマー，モノマー，酵素，検出用蛍光試薬滴を整列・保管したのちに画像解析などにより反応の有など）を混合し，液滴化する。このとき，1 液滴に含ま無などを調べる方法である31) 。図 3 に示したような操れる DNA 分子の平均数は十分小さく，確率分布から考作と図 4 に示したような解析法を組み合わせて様々なえて 1 分子あるいは 0 分子という状況にしておく。十分析応用が実現可能となる。

分蛍光が観測できる回数の反応サイクルを終えた後に，4マイクロ液滴の分析応用「単一細胞」の分析であれば，ある状態の細胞に特異蛍光観察することで， DNA を数えることができる。従来の増幅時の蛍光増加を計測する定量法と比べて，高精度・高感度になることが期待できる。

的に集積して発色する蛍光試薬を用いれば，1 細胞に多化学的な増幅法として，酵素反応による基質から生成数の蛍光分子が集まるためアッセイが比較的容易に実現物への変換を用いる方法も考えられる。図 5(b) では，できる。例えば，細胞の生死を見分ける蛍光色素を用いライブラリーとなる DNA（lacZ 配列とその変異体）を，て，細胞を閉じ込めた液滴ごとに蛍光波長を計測するこ

液滴に閉じ込め PCR で増幅したのち，無細胞転写・翻とで，細胞の生存率を決定できる32)。

訳（in vitro transcption translation, IVTT）を行う37)。

図 1 に示したような液滴への「単一分子」あるいは生成した酵素（ b galactosidase ）の反応による蛍光増少数分子閉じ込めの場合には，解析法の感度・検出限界加を計測して，図 4(a) のように分取することで活性のが問題となる可能性が高い。極限的な検出法では単一の高い配列を含む液滴を回収している。活性の高い酵素を小分子計測は実現している33)34) が，一般的な検出法と高効率に選別するタンパク工学の手法としての発展が期してはいまだ使いづらい面もある。なんらかの化学増幅待される。IVTT ではなく大腸菌による発現を利用したを利用すると，より簡便に単一分子検出を実現できる。

図 5(c) のような方法も同様に報告されている38)。

まず DNA の増幅法である PCR 法を利用した方法が考えられる。図 5 ( a ) に単一コピーの DNA を数える液滴 PCR 法の例を示す35)36)。対象とする溶液に，増幅用

図5

ぶんせき  5

お わ り にマイクロ・ナノ空間を用いる分析デバイスは，高度な(a) 液滴 PCR 法，(b) IVTT を用いた液滴タンパク工学，(c) 大腸菌を用いた液滴タンパク工学
11発展を続けている。今後も生命科学分野を中心に多くの応用デバイスが提案され，実用化されると期待できる。
分析デバイスの発展の観点から振り返ってみると，図2(a) や図 2(b) に示したような，一見単純な物理あるいは化学工学的な研究が，生命科学的な手法・アイデアと結びついて大きく進展してきたことがわかる。現在先進的な取り組みが行われているナノ構造を用いた操作・解析法11)12) も，他分野の手法・アイデアや本稿で示した液滴の手法などと融合して，大きな応用分野を生むと期待できる。
マイクロ・ナノ液滴を用いる分析法の今後の発展を考えてみると，本稿で例示した生命科学応用に加えて，より一般的な「ぶんせき」にも利用できる可能性をもつ。
例えば，仮想的に直径が 10 nm の液滴を考えると，体積は 1 zL ( 10－21 L ）程度であり， 1 mM 程度の溶液から単一分子閉じ込めが実現できる。このような状況でどんな操作・解析法が必要になるかは，今後の分野の発展を待たなければならないが，図 1 ( b ) で示したような「アナログ信号から分子カウントへ」という生命科学で起こっている変革が，一般の「ぶんせき」へと波及する可能性も高いと考える。
謝辞

科学研究費補助金（基盤研究 B，挑戦的萌芽研究，特別研究員奨励費）からの助成に感謝する。
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
福山真央（Mao FUKUYAMA）
東京工業大学大学院理工学研究科（〒152 8551 東京都目黒区大岡山 2 12 1 W4 20）。東京大学大学院工学系研究科応用化学専攻博士課程修了。博士（工学）。≪現在の研究テーマ≫マイクロ・ナノ流体の界面化学。≪趣味≫観劇，水草水槽。
E mail : fukuyama.m.aa＠m.titech.ac.jp

火原彰秀（Akihide HIBARA）
東京工業大学大学院理工学研究科（〒152 8551 東京都目黒区大岡山 2 12 1 W4 20）。東京大学大学院工学系研究科応用化学専攻博士課程中退。博士（工学）。≪現在の研究テーマ≫マイクロ・ナノ流体化学，マイクロ・ナノ空間の分光。≪主な著
書≫“分光測定入門シリーズ 10 顕微分光法”（分担執筆）（講談社）。≪趣味≫サッカー観戦（サンフレッチェ），野球観戦（カープ）。
E mail : ahibara＠chem.titech.ac.jp

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