環境負荷低減材料の創製及び環境計測用バイオミメティックセンサーの開発
釘宮 章光

機能性モノマーの 1-アリル-2-チオウレアを使用することにより、リン酸イオン選択性をもつインプリントポリマーを合成し、このポリマーの結合能と選択性を評価した。このポリマーは水系でリン酸イオンに対して高い結合能と選択性を示した。また、このポリマーからのリン酸イオンの回収性を調べたところ、高濃度のリン酸イオンを回収することができた。

キーワード：分子インプリント法、人工レセプター、リン酸イオン、選択的回収、抽出１.背景

在する水溶液中においてリン酸に結合性を示すポリマ

河川中のリン酸イオンとアンモニウムイオン濃度のーの選択性をより高いものにすることを目指した。ま上昇はカビ臭の原因であるアオコの大量発生の原因とた、実際の河川水や下水処理水からリン酸イオンを回なっている。そのうちアンモニウムイオンの除去につ収する条件についても検討を行った。

いては窒素分解菌に関する研究が盛んになされているが、リン酸イオンの除去についてはまだ開発段階であ２.分子インプリント法

り効果的な方法がないのが現状である。その一方で、分子インプリント法とは、認識したい分子（本研究リンは有限の貴重な資源でもあり、リン酸イオンを効ではリン酸イオンやリン酸誘導体）を鋳型分子として率的に回収する方法の確立が望まれており、このよう用い、その鋳型分子に対して相補的な結合部位を有すな問題については各自治体や大学等において精力的にるポリマー材料をテーラーメイド的に得る手法である。

研究、取り組みが行われている(1)。

インプリント（imprint）とは｢刷り込む｣と訳され、認当研究所ではリン酸イオンに対して特異的結合能を識したい分子の型をポリマー材料の中に刷り込む、つ有する人工ポリマー材料の創製及びその人工ポリマーまり石膏で認識したい分子の型を取って、その部位に材料を用いたリン酸イオン計測法に関する研究を行っ目的の分子がピッタリとあてはまる、というようなイている。人工ポリマー材料は、分子インプリント法とメージであると考えていただければわかりやすいと思呼ばれる方法によりリン酸基に特異的結合性を有するう。

分子認識ポリマーを合成した。そしてそのポリマーのその原理は図１（次頁）に示すように、結合能の評価を行った。分子インプリント法とは、目(a) 認識対象分子（鋳型分子）と、その分子と相互作的とする分子に対して選択的結合能を有するポリマー用可能な官能基を持つモノマー（これを「機能性モノをテーラーメイド的に、かつ比較的容易に合成する方マー」と呼ぶ）を溶媒中で混合する。すると認識対象法であり、目的とするポリマーを安価に大量合成する分子と機能性モノマーとの官能基同士の相互作用（水ことが可能であるというメリットがある。本研究にお素結合や静電的相互作用など）により分子の自己集合いては、リン酸基に対して強い相互作用を示すチオウが生じる。本研究においてはジフェニルリン酸(1)とアレア基を官能基にもつ機能性モノマーを用いて、リンリルチオウレア(2)をアセトニトリル中で混合して相酸インプリントポリマーを合成し、他の夾雑物質が存互作用させた。

(b) 次に、1 分子内に 2 つのビニル基を持つ架橋のた

３.実験方法と結果めのモノマー（架橋剤）を加えて認識対象分子ごと重チオウレア基は、水系においてリン酸基に対して相合させる。本研究では架橋剤としてエチレングリコー互作用を示すことが知られている。そこで本研究ではルジメタクリレートを添加して加熱により重合を行っこの相互作用を利用するため機能性モノマーに 1-アリた。

ル-2-チオウレアを用いてリン酸インプリントポリマ(c) 認識対象分子を溶媒で洗浄してポリマーから除去ーを合成した。

することにより鋳型分子の形と化学的性質を保持した分子認識ポリマーが得られるというものである。つま3.1 インプリントポリマーの調製り、本研究においてはリン酸イオンが結合するのに適チオウレア基を有する機能性モノマーの 1-アリル-2-した結合部位を有するポリマーが得られ、これがリンチオウレア 1（4.0 mmol）と鋳型分子のフェニルホスホ酸結合性人工レセプター型ポリマー（以下、ポリマー）

ン酸 2（またはジフェニルリン酸）（1.0 mmol）、架橋である。

剤のエチレングリコールジメタクリレート（20 mmol）

これにリン酸イオンを加えるとポリマーと相互を 40.0 mL のアセトニトリルに溶解し（図１-a）、重作用して結合する。再びポリマーを洗浄することで(c)、合開始剤を加えて 50 ℃で 16 時間重合させた（b）。

ポリマーは再度、リン酸イオンと結合可能となる(d)。

得られた塊状のポリマーを粉砕して粒径を 80 μm にそ(d)ろえた。鋳型分子を除去するため、メタノール/トリエチルアミン溶液で洗浄、続けてメタノールで洗浄後、
1

S

架橋剤の添加

P
H

N

H

OO
O

O

H

HN

N

P

N

H

H

重合S

OO

H

HN

N

乾燥させた（c）。塊状のポリマーは 97 %の収率で得N

HOOSN

H

ものを篩いわけ、60 %のポリマー粒子を得た。

Sa)2られた。それを粉砕機で粉砕し、粒径が 80 μm 程度のb)

洗浄

3.2 リン酸イオンの結合性評価
合成したポリマーについて、リン酸イオンを含む溶NHOHOP
HOO

HHN

NH

S

認識N

H洗浄SHHN

N液（25 μM, pH 7.2）と相互作用させることによるリンN

H

S酸イオンのポリマーへの結合能を評価した。40 mg のN

ポリマー粒子と各溶液 2.0 mL をマイクロチューブに加えて 1 時間撹拌した。そして結合量の評価は、ポリマSd)c)ーと相互作用させる前後のサンプル溶液を HPLC 装置に電気伝導度検出器（島津製作所）を接続して、各イ

図１

分子インプリント法によるリン酸結合性人工レオンの濃度を計測することで行った。

セプター型ポリマー合成の原理

その結果、リン酸誘導体をインプリントしたポリマーは水系において 90 %のリン酸を回収可能であった。一

このようにして得られたポリマーは、鋳型に用いた方、リン酸誘導体をインプリントしていないブランク

認識対象分子の形状と化学的性質、官能基の位置を記のポリマーはほとんど結合性を示さなかった。得られ憶しており、分子インプリント法を用いると原理的にたインプリントポリマーの理論結合部位は 20 nmol/mg、は目的の分子に対して選択的結合性を示す人工レセプ

スキャッチャードプロットより解離定数 KD は 10.3 μM

ター型ポリマーが複雑な合成ステップを必要とせず比と求められた。

較的容易に、かつ、テーラーメイド的に安価に大量合成できるというメリットがある。

3.3 夾雑物質存在下でのポリマーの選択性評価
合成したポリマーについて、それぞれ 50 μM のリン

酸二水素ナトリウム、フッ化ナトリウム、塩化ナトリ子（10 g）をカラム（300 mm×20 mm i.d.）に充填し、ウム、臭化ナトリウム、硝酸ナトリウム、亜硝酸ナト

固相抽出の要領で分析物の溶液を流し込み、溶出物をリウムの 6 種類のアニオンを含む溶液（pH 7.1）と相イオンクロマトグラフィーにより分析することで結合互作用させて選択性の評価を行った（表１）。その結能の評価を行った。つまり、20 μM リン酸水溶液（pH果、インプリントポリマーはリン酸イオンに対して7.5）を 1 リットルずつ合計 20 リットルまで加えてい83 %の結合性を示したのに対し、他のアニオンに対しき、リン酸イオンのポリマーへの結合量を評価した。ては 18～38 %程度とアフィニティーは低かった。また、その結果、15 回、つまり 15 リットルのサンプル溶液リン酸をインプリントしていないブランクのポリマーの注入まではほぼ 100％のリン酸イオンがポリマーにについてはどのアニオンにもアフィニティーは低いと保持され、その後は保持能力が低下したものの 20 リッいう結果が出た。これはリン酸誘導体を鋳型分子に用トルのサンプル溶液の注入まで 80％以上のリン酸イオいてインプリントポリマーを合成したことで、リン酸ンがポリマーに保持された（図２）。

イオンがポリマーに結合するのに適した位置と角度を保って機能性モノマー由来の官能基であるチオウレア100.0基が配置されたためであると考えられる。
80.0

表１

リン酸結合性ポリマーの選択性の評価
アニオン混合溶液（pH 7.5、20 μM リン酸二水

60.0

素ナトリウム、フッ化ナトリウム、塩化ナトリ
40.0ウム、臭化ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、硝酸ナトリウムの混合溶液）

20.0

リン酸インプリントポリマーの結合量[%]

H2PO4-F-Cl-Br-NO2-NO3-PAT(DP)831818353238

PAT(none)

10041121200.0051015

溶液注入量

図２3.4 リン酸イオンの回収試験

20[L]

リン酸結合性ポリマーのリン酸イオンへの結合
試験結果得られたリン酸結合性人工レセプター型ポリマーの粒

a)

c)b)

ClPO43NO2-F-05

図３Br

PO43NO3-10[分]15PO43200510[分]15200510[分]15リン酸結合性ポリマーにおけるアニオン混合溶液との相互作用前後のクロマトグラム(a) リン酸結合性ポリマーと相互作用前の 6 種類のアニオン混合溶液のクロマトグラム(b) 相互作用後のクロマトグラム、(c) リン酸結合性ポリマーから濃縮されて回収した溶液のクロマトグラム

20さらに、そのポリマーを 50 mL のメタノールでソッ下水処理システムの構築を目的としてリン酸イオンのクスレー抽出法により洗浄し、濃縮して得られたリン計測や回収も検討されており、本研究が実現すること酸イオン濃度の評価を行った。すると図３(c)（前頁）

で将来的に下水処理場や河川などにおいて長期わたるに示すように純度の高いリン酸イオンが抽出され、そリン酸イオンのモニタリング及び選択的回収が可能にの濃度は 6.0 mM であり、注入した溶液が各 20 μM リなると考えられる。

ン酸水溶液であることから、約 300 倍に濃縮されたリ謝辞

ン酸水溶液が得られたことになる。

本研究の一部は、（独）科学技術振興機構研究成果
４.まとめ活用プラザ広島「実用化可能性試験」、（独）科学技

本研究では、河川水などから選択的にリン酸イオン術振興機構「シーズ発掘試験」、及び（財）中国電力を捉える人工分子認識材料を創製することを目的とし技術研究財団「国際交流活動（海外渡航）助成金」のており、今後は水系においてリン酸イオンに対してよ各補助を受けて行った。この場を借りて、厚く御礼申り選択的で、夾雑物質の影響を受けない高い結合能をし上げる。

もつポリマーの創製を目指す。さらに現在は、ISFET
参考文献（イオン感応性電界効果型トランジスター）電極という pH 変化を検出する電極を用い、その上にリン酸結(1)合性インプリントポリマーを薄膜状にコートし、ポリマーがリン酸イオンと特異的結合をすることによる局

釘宮章光、再生と利用、Vol. 30, No. 117 (2007)、
社団法人日本下水道協会(2)

Akimitsu Kugimiya, Hideo Takei, "Selectivity and所的な pH 変化を検出するというシステムを検討してrecoveryいる(4)。現在のところ河川やダム水中のリン酸イオン

molecularly imprinted polymer", Analytica Chimicaの計測は、深水を採取してモリブデンブルー吸光度法

Acta, 606, 252-256 (2008).

で人的に計測が行われているため、自動的にかつ長期(3)performanceofphosphate-selective

Akimitsu Kugimiya, Hideo Takei, "Selective

にわたってリン酸イオン濃度をモニタリングする方法

Recovery of Phosphate from River Water Usingが望まれているが、リン酸に特異性を有する酵素を用

Molecularly Imprinted Polymers", Analytical Letters,

いるバイオセンサーでは酵素の安定性に問題があり、

41, 302-311 (2008).

長期間の使用には不向きである。よって安価にかつ大(4) Akimitsu Kugimiya, Fumie Babe, "Phosphate ion

量供給可能で、安定性にも優れ、取り扱いも容易なリ

sensing using biomimetic artificial polymer receptor",

ン酸イオンに特異的結合性を示すポリマーのセンサー

Submitted.の開発が求められている。下水処理場においても高度