クイックスタートガイド

第五版:2023.8
Cat. No. A238-0303

タンパク質合成キット

無細胞くん® N Mini SS
取扱説明書
本製品は、非標識タンパク質合成用です。安定同位体標識タンパク質の合成には、無細胞くん SI SS、または無細胞くん SI SS(PEG 不含)をご使用ください。
ご使用前に、本書をよくお読みいただき、正しいお取扱い方法を十分ご理解ください。
-本書の著作権は弊社に帰属するものです。本書の一部、または全部を弊社に無断で転載、複製、改変することを禁止します。
-本書に記載された仕様、デザイン、文書等は改良のため、予告することなしに変更することがあります。
-本書を作成するにあたり万全を期しておりますが、万一ご不明な点、記載漏れ等お気づきの点がございましたら、下記連絡先にお問い合わせください。
お問い合わせ窓口 E-mail: Isotope.TNS@tn-sanso.co.jp
テクニカルインフォメーションは QR コードからアクセスしてください。

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１．はじめに

４．保存方法このたびは、タンパク質合成キット「無細胞くん® N Mini SS」をお買い上げいただき、誠にありがとうございます。本製品は、国立研究開発法人 理化学研究所からライセンスを受け、その高度な無細胞タンパク質合成技術をキット化いたしました。

-80℃±2℃で保存してください。
-80℃を大きく逸脱した温度で保存するとタンパク質合成性能が低下します。

「無細胞くん® N Mini SS」は、大腸菌抽出液を用いたタンパク質合成系キットです。テ運搬や一時保存は、ドライアイスを入れた発泡スチロール等の容器で行ってください。

ンプレート DNA を加えてインキュベートするだけで、数時間以内に一反応あたり最大数一度解凍した反応液プレミックスは、氷上で速やかに必要量小分けした上で、液体窒十マイクログラム程度の目的タンパク質を簡単に合成できるキットです。96 穴プレートな素や粉末ドライアイスで急速凍結し、-80℃で保存してください。その他の溶液は、同様どを用いることで多検体の合成にも適しています。また、合成したタンパク質は、そのままに小分けし、-30℃以下で保存してください。小分け保存した溶液は、次回ご使用の精製などの工程に進むことができます。

際、使い切ってくだい。凍結融解を繰り返すとタンパク質合成性能が低下します。

２．安全上の注意
本製品は試験研究用です。本製品および本製品により得られたタンパク質等の成分を、人・動物の医療・臨床診断へ使用することおよび飲料品・食品へ添加することを禁止します。
一般的な生化学実験経験者およびマイクロピペット操作に慣れた方を対象としています。それ以外の方のご使用はご遠慮ください。
ご使用にあたっては安全ゴーグル、手袋、白衣等、適切な保護具を着用してください。
万一、溶液などが眼や皮膚に付着した場合には、清浄な流水で洗浄してください。炎症が見られる場合には、医師の診察を受けてください。

５．キット構成液主要成分
反応液プレミックス
大腸菌抽出液酢酸マグネシウム

NTP

クレアチンキナーゼ

クレアチンリン酸

HEPES

T7 RNA ポリメラーゼ

アミノ酸（20 種類）

アジ化ナトリウム

tRNA

葉酸

DsbC

GSSG

L-グルタミン酸カリウム

劇物および劇物取締法における毒物指定物質のアジ化ナトリウムを 0.05%含みます。含有量が 0.1％以下であることから上記適用外となりますが、お取扱いおよび廃棄には十分ご留意ください。

本書に記載されていないご使用方法により発生した安全上の問題については、弊社は責任を負いかねますので予めご了承ください。
安全にご使用いただくために、特にご注意いただきたい内容に下記注意マークを表示しております。本マークに併記される注意事項は必ずお守りください。
取り扱いを誤った場合に、軽傷を負う恐れがあります。

３．キット内容●反応液プレミックス (50 µL 反応 x 18 回分)●100 ng/µL コントロール DNA(pUC-BAP) *

1本
50 µL

1本

*大腸菌由来アルカリホスファターゼ(BAP)を発現します。
34６．廃棄方法

８．テンプレート DNA
本キットの溶液および溶液が付着した容器・器具の廃棄は、必ずオートクレーブ等で不活化処理した後、５項のキット構成液主要成分および SDS をご参照の上、地域の条例等で指定された方法に従ってく

本製品でのタンパク質の発現には、以下の図のように目的遺伝子以外に、T7 RNA ポリメラーゼによる mRNA の転写に必要な T7 プロモーター、T7 ターミネーターおよび、転写開始に必要なリボソーム結合サイト(RBS)を含むテンプレート DNA が必要です。

ださい。キット内に大腸菌（遺伝子組換えでない）が残存している可能性があります。
本キットで得られたタンパク質等の生成物の廃棄はお客様の責任で行ってください。

９．タンパク質合成操作

７．保証

本キットを素手で扱わないでください。

保証期間

低温のため、凍傷の危険性があります。

取扱説明書に貼付されております使用期限内にご使用ください。

安全ゴーグル、手袋、白衣等の保護具を着用して操作してください。

ドライアイス冷凍で配送されます。到着時、配送ボックス内にドライアイスが残っていなか

キット溶液が眼や皮膚に付着すると炎症の原因になる場合があります。

った場合や、容器の破損、液漏れが確認された場合は、品質が低下している可能性必要な器具・試薬類がありますのでお問い合わせください。無償で交換いたします。

１）テンプレート DNA (環状 DNA のご使用をお勧めします。)

免責事項
保証期間内であっても以下のような場合には免責とさせていただきます。
１）誤った保存方法およびご使用方法による不具合

・それぞれのテンプレート DNA につき、50 ng/μL 以上で 5 μL 以上必要です。反応液に対して、終濃度で2~20 ng/μL の範囲で最適化することをお勧めします。
・テンプレート DNA の準備方法は、ホームページをご参照ください。

２）滅菌蒸留水

２）本キットの性能によらない不具合
タンパク質の発現量は、キットの性能以外の様々な要因により低下する可能性があります。そのため、タンパク質の発現を保証するものではありません。
本キットの不具合による免失利益、また本キットを使用して得られた生成物による損害等について、弊社では一切責任を負いかねますので予めご了承ください。

３）0.6 mL または 0.2 mL サンプルチューブ４）マイクロピペット一式
５）卓上遠心機
６）アルミブロックヒーターまたは水浴（30℃）
７）氷浴

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・アフィニティ樹脂等で精製する場合、回収した反応液を平衡化用緩衝液で 5～10 倍程度に希釈してからア準備

プライしてください。希釈しない場合、樹脂への目的タンパク質の吸着効果が低下することがあります。

② アルミブロックヒーターまたは水浴を 30℃にセットします。
② コントロール DNA および、テンプレート DNA を解凍し氷上に置きます。
③ 反応液プレミックスを 30℃水浴で解凍し（約１分間）、解凍次第直ちに氷上に

１０．参考文献■ Kigawa T. et al., Cell-free Protein Synthesis Methods and Protocols (Spirin, A. S. &Swartz, J. R., eds.), 83-97, 2007置きます。

■ Matsuda T. et al., J. Biomol. NMR., 37 (3), 225-229, 2007

・解凍前に、ふたの緩みや容器の破損が無いことをご確認ください。

■ Yabuki T. et al., J. Struct. Funct. Genomics, 8 (4), 173-191, 2007

・記載されている解凍時間は目安ですので、適宜調整してください。

■ Seki E. et al., Anal. Biochem., 377, 156-161, 2008

・解凍後は氷上に置き、直ちに使用してください。⾧時間放置すると性能が低下します。

■ Yokoyama J. et al., Anal. Biochem., 411, 223-229, 2011

④ 解凍した反応液プレミックス、コントロール DNA および、テンプレート DNA を卓上遠心機でスピンダウンし、氷上に置きます。

■ Matsuda T. et al., J. Bioorganic & Medicinal Chem., 20, 6579-6582, 2012

１１．トラブルシューティング
タンパク質が発現しない、または発現量が少ないなどの場合には、ホームページの FAQ を合成反応ご参照ください。その他ご不明な点は、お問い合わせ窓口までお願いいたします。

① 反応液プレミックスをピペッティングで均一になるまで泡立てないよう静かに撹拌しま考えられる原因推奨する対策

キット性能の低下 適正な温度で保管されていたかご確認ください。

す。
② 氷上で、サンプルチューブに反応液プレミックスを 40 µL、テンプレート DNA またはコントロール DNA を 5 µL、蒸留滅菌水を５ μL 添加し、気泡ができないよう静かにマイクロピペットで混合後、直ちにアルミブロックヒーターまたは水浴で 30℃、90 分

使用期限内で適正に保管されていた場合は、弊社までお問い合わせください。
テンプレート DNA ①テンプレート DNA の配列及び濃度が適切かご確認ください。テンプレート DNAによる問題の濃度を 260 nm の吸光度で定量した場合、不純物由来の吸光のため実際よりも低い鋳型 DNA 濃度で合成している場合があります。ゲノム DNA などが混間インキュベートします。

入していないか電気泳動でご確認ください。

試薬

分注量（μL）

終濃度②テンプレート DNA にプラスミド抽出時に用いた RNase が残留していることがあり反応液プレミックス

4080%ます。(1) フェノールクロロホルム抽出およびエタノール沈殿、もしくは、(2) 市販

テンプレート DNA [50 ng/µL(20~200 ng/µL)]

510(2~20) ng/µLの PCR 産物精製キットによる再精製で RNase を除去することで発現量が向上

滅菌蒸留水5－合計

50・溶液の混合は、氷上で行ってください。

する場合があります。
③N 末端の配列が発現量に影響します。N 末端にタグを導入する／タグを変更することで発現量が向上する場合があります。
タンパク質の性質 タンパク質によっては、合成中に分解、沈殿してしまう性質のものがあります。短時・タンパク質合成反応は、90 分で終了します。

③ 反応終了後、サンプルチューブを氷上に 5 分間置いて、反応を停止させます。

による問題

間反応や、界面活性剤の添加、酸化還元条件のスクリーニングをご検討ください。

④ 反応液または、反応液を 4℃で 15,000ｘg、1 分間遠心分離した上清を目的に合わせてご使用ください。
・タンパク質によっては沈殿するものがありますので、必ず SDS-PAGE 等で発現状況を確認してください。

大陽日酸株式会社

・反応終了後、氷上で⾧時間放置しますと、発現したタンパク質が沈殿したり、分解する可能性があります。直東京都品川区小山 1-3-26

ちにご使用いただくか、適切な方法で精製してください。
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TAIYO NIPPON SANSO CORPORATION8