資料5-2

平成25年11月14日
平成25年度全国水産試験場長会全国大会（岡山）地方独立行政法人 北海道立総合研究機構 水産研究本部 栽培水産試験場 ホタテガイ幼生判別技術グループ 清水です。
このたびは、全国場長会長賞という名誉ある賞を受賞することができ、大変うれしく思っております。
では、免疫染色法を応用したホタテガイ幼生判別技術の開発について、その概要を説明します。

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平成25年度全国水産試験場長会全国大会（岡山）

まず本研究で対象としたホタテガイの北海道における漁業の現状について説明させていただきます。
ホタテガイは北海道の基幹産業であり、平成23年には年間約39万トンの生産量があり、北海道の漁業生産量の約30％を占めています。
ほたてがい漁業は、北海道の漁業生産額の約23％を占める638億円に加え、ほたてがい漁業に必要な稚貝の販売を含めると約700億円の巨大な産業となっています。

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平成25年度全国水産試験場長会全国大会（岡山）この巨大なほたてがい産業は、主にほたてがい桁網漁業とほたてがい養殖業の２つの漁業により営まれています。
ほたてがい桁網漁業はホタテガイの稚貝を漁場に放流し、３年から４年後に桁網を用いて漁獲する漁業で、主にオホーツク海で行われています。
ほたてがい養殖業は写真のようにロープに稚貝を耳吊りして海中で育て、１年から２年後に漁獲する漁業で、日本海や噴火湾で行われています。

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これらのほたてがい漁業は、どちらもホタテガイの稚貝を採集するところから始まります。このことを天然採苗といいます。
ホタテガイの産卵期は４月から５月であり、ふ化した幼生は殻長0.3ミリメーターとなるころまで海中を遊泳しながら成長します。
幼生は、その後、付着物に付着して遊泳するのをやめ、底生生活を送るようになりますが、天然採苗は、ホタテガイ幼生が付着するという生態を利用して行います。
天然採苗ではまず、古い漁網を用いた天然採苗器を自然の海に投入して設置します。
採苗器を投入して約２カ月後の７月ころ、採苗器に付着したホタテガイ稚貝が数mmの大きさに成長したころに、海中に設置していた採苗器を引き揚げます。

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採苗器には、写真のように殻高5mm程度のホタテガイの稚貝が付着しています。
このホタテガイの稚貝をたまねぎ袋や右の写真のような座布団かごに入れ、海中で約１年間、殻高約８cmの大きさまで育てます。
ほたてがい漁業では、この育てられた稚貝を、桁網漁業では海中へ放流し、養殖業では耳吊りして漁獲・出荷まで育てます。

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平成25年度全国水産試験場長会全国大会（岡山）このように、北海道の基幹産業であるほたてがい漁業は天然採苗により得られた稚貝を用いて行われているため、この天然採苗の善し悪しがほたてがい漁業に大きな影響を与えます。
そこで、この天然採苗を効率よく行い、稚貝を安定的に得るため、ほたてがい漁業の関係機関では、ホタテガイ幼生の分布調査を行い、天然採苗器を海中へ投入する時期を決定しています。

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平成25年度全国水産試験場長会全国大会（岡山）関係各機関が行っているホタテガイ幼生の分布調査について説明させていただきます。
まず、海上の定点でプランクトンネットを用いて二枚貝幼生を採集します。
この時期、さまざまな種類の二枚貝が産卵期を迎えているため、写真のように様々な二枚貝幼生が観察できます。
この分布調査では、これら二枚貝幼生の中から、貝殻の形を基準にしてホタテガイ幼生を判別し、その大きさと数を測定することで、サイズ別に幼生の出現状況を調べています。
時には、1地点あたり１千から２千個体の幼生すべてに目を通し、ホタテガイ幼生の判別を行うこともあります。

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このホタテガイ幼生の分布調査を定期的に行い、その都度、図のようなホタテガイの採苗情報を漁業者に発信しています。
調査の結果、図では、たとえば、室蘭海域では6月1日の調査では、1トンの海水中に292個体のホタテガイ幼生がおり、その殻長組成のピークは230マイクロメーターということが分かります。
また、採苗器投入の目安となる着底期幼生、赤色のバーで示されていますが、この幼生も出現していることも分かります。
漁業者はこの情報を基に採苗器を投入するタイミングを決定しています。
このように、ホタテガイ幼生の分布調査はほたてがい漁業者にとって重要な情報であるため、この調査は全道の関係各機関により行われています。

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左の切り抜きは、1936年に発行された「帆立貝の知識」という本の採苗器投入時期に関する文章です。
このころからホタテガイ幼生の分布調査が行われており、ホタテガイ幼生を形で判断していることがうかがえます。
このように70年以上に亘って行われているホタテガイ幼生分布調査ですが、様々な問題を抱えています。
先のスライドで示しましたように、本調査では様々な二枚貝幼生の中からホタテガイ幼生を形を基準に判別しています。
しかしながら二枚貝幼生の形態は種間でもよく似ており、形を基にした判別では、経験豊富な人しかホタテガイ幼生を判別できません。また、判別の難しさからなかなか次世代へと技術が伝わっていきません。
さらに、噴火湾のように二枚貝幼生の出現密度が高い地域では、1地点あたり数千もの二枚貝幼生すべてに目を通してホタテガイ幼生を判別したり、出現密度の低い地域では、１つの誤判別が、調査結果に大きな影響を与えることがあります。
このようにホタテガイ幼生の分布調査は多大な経験・時間・労力を要する大変な調査でした。
そのため、このホタテガイ幼生の分布調査をより効率よく行うため、「誰でも」「簡単に」「精度良く」ホタテガイ幼生を判別できる技術の開発が求められていました。

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そこで私どもはホタテガイ幼生の判別を「誰でも」「簡単に」「短時間で」「精度良く」行えるように、アサリやカキ類等で開発されている幼生の免疫染色技術を参考にして、ホタテガイ幼生を色で判別できる技術を開発すること、また、現場への普及を図るため、現場での実践から抽出された問題点の対策方法を開発し、普及しやすい技術へと改良を行こと、を目的とし、研究を行いました。

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私たちは、アサリやカキ類で用いられているモノクローナル抗体ではなく、ポリクローナル抗体を作ることにしました。理由は、モノクローナル抗体に比べ、作製に費用も労力も少なく済むと考えてのことでした。
ホタテガイ幼生に対する抗体の作製に先立ち、殻長約160マイクロメーターのホタテガイ人工種苗を生産しました。これを集めて粉砕したものを抗原とし、ウサギおよびモルモットに注射しました。
抗原を注射した動物から定期的に採血を行い、抗体価のチェックを繰り返し、抗体価が高まったところで全採血により抗血清を採集し、これを抗体としました。抗体の作製方法については、「抗ホタテガイ幼生抗体作製マニュアル」に詳しく取りまとめました。

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作製した抗体を用いたホタテガイ幼生の免疫染色方法の概要を説明します。
免疫染色には、赤で示しました今回作製した抗ホタテガイ幼生抗体と黄色で示したアルカリフォスファターゼが結合した青で示した二次抗体が必要となります。
まず、ホタテガイ幼生と抗ホタテガイ幼生抗体を結合させます。
次にアルカリフォスファターゼが結合した二次抗体を抗ホタテガイ幼生抗体に結合せさます。
最後に発色基質を投入すると、アルカリフォスファターゼにより抗ホタテガイ幼生抗体が結合したところだけに紫色の沈殿物が堆積します。
これにより、抗ホタテガイ幼生が結合した幼生のみが紫色に染色されます。

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平成25年度全国水産試験場長会全国大会（岡山）次に、この抗体がホタテガイ幼生を特異的に認識しているかどうかを検証する必要がありました。
そこで、噴火湾で得られた二枚貝幼生の免疫染色を行い、染色された幼生とされなかった幼生を分離し、それぞれの幼生の鉸装を観察し、ホタテガイ幼生を判別しました。
ホタテガイ幼生の鉸装の特徴は写真のように、左右に角型の幼鉸歯があり、その間に直線状の幼鉸板が見られます。
免疫染色を行った後に、このように鉸装の観察を行いました。
その結果、ウサギ抗体１では、染色された二枚貝幼生256個体を観察した結果、255個体がホタテガイ幼生でした。
一方、染色されなかった二枚貝幼生248個体を観察した結果、247個体がホタテガイ幼生ではありませんでした。
他の抗体も同様の結果になりました。
このように、作製した抗ホタテガイ幼生抗体はすべて、ホタテガイ幼生に対して高い特異性を持っていることが分かりました。
これらの結果から、免疫染色法を応用したホタテガイ幼生判別技術が開発され、「ホタテガイ幼生の免疫染色マニュアル」を作成しました。

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さて、いったんでき上がったホタテガイ幼生免疫染色技術ですが、次は普及に向け、技術の簡易化をする必要がありました。
これまでに説明した方法では、１次抗体の後に、アルカリフォスファターゼが結合した２次抗体を反応させるという工程がありました。
しかし、工程をより簡単にするため、より成績の良かったモルモットの抗血清からイムノグロブリンG（IgG）を精製し、直接アルカリフォスファターゼを結合させました。
これにより、２次抗体が不要になり、2行程減らすことで作業にかかる時間が約２時間から１時間３０分へと短縮されました。

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新しく簡易化した免疫染色法について説明します。
まず、二枚貝幼生標本のうち、ホタテガイ幼生のみに抗ホタテガイ幼生抗体が結合します。
この抗ホタテガイ幼生抗体にはすでにアルカリフォスファターゼが結合しているため、２次抗体反応が不要であり、基質を加えると、抗体が結合したホタテガイ幼生のみが紫色に染色されます。
このように免疫染色工程が2工程、約30分省力化されました。

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次に、染色方法を簡易化するため精製した抗体の、ホタテガイ幼生の判別精度をDNAレベルで検証しました。
今回は、後にDNA解析を行う必要がり、アルカリ処理するとDNAが壊れてしまうことからアルカリフォスファターゼによる発色は用いられないので、標識に緑色の蛍光色素を用いて免疫染色を行いました。
免疫染色の結果、左上の写真のように抗体が結合した二枚貝のみが緑色に染色されます。
この染色された幼生とされなかった幼生を分離し、それぞれの幼生１個体ずつからDNAを抽出しました。
このDNAの16SリボゾームRNA遺伝子の部分配列をPCRにより増幅した
後、シークエンサーを用いて塩基配列を決定し、幼生の種を特定しました。
その結果、染色された二枚貝幼生115個体のうち、114個体がホタテガイ幼生でした。残りの1個体はエゾマテガイでした。
また、染色されなかった二枚貝幼生81個体はすべてホタテガイではありませんでした。中でも67個体はエゾマテガイでした。
この結果から、精製した抗ホタテガイ幼生抗体もホタテガイ幼生を特異的に染色でき、特異性が高いことが示されました。

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平成25年度全国水産試験場長会全国大会（岡山）このように、ホタテガイ幼生の判別精度が確認された抗体を用いて、現場で使えるレベルまで免疫染色法を簡易化するため、道総研栽培水産試験場で試薬類をキット化しました。
免疫染色の反応は、右の写真のようなチューブを用いて行います。
キットは、洗浄液１、抗体溶液、洗浄液２、発色基質の４つの試薬だけで、それぞれドロッパーボトルや点眼容器を使い、試薬をチューブに入れやすくしました。
また、チューブの試薬の除去はパスツールピペットやアスピレーターを使うことで容易に行えます。
基本的に、免疫染色は試薬類の出し入れと、抗体反応と発色反応のための攪拌だけの簡単な操作で行うことができ、免疫染色工程は１時間から１時間30分で終了するようになりました。

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この方法で免疫染色を行うと、写真のようにホタテガイ幼生が紫色に染色されます。
これにより、今まで形基準でしか判別できなかったホタテガイ幼生が、色を基準に容易に判別できるようになり、だれでも判別できるようになりました。
これまで使ってきた万能投影機での観察でも、右の写真のように、ホタテガイ幼生を色で判別可能です。

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免疫染色技術を普及するに当たり、現場で使ってもらうと、様々な問題点が抽出され、これらの対策法について、検討を行ってきました。
例えば、免疫染色の染め分けがうまくいかないことについて、固定液は１％以上のグルタールアルデヒドを用いて、１時間以上固定することや、抗体反応や発色反応を寒いところで行わない、
また、発色が濃く感じるときには、抗体反応時間と発色反応時間を短くできる、
さらに、写真のように、１％の固定液で30分間しか固定しないと、幼生同士がくっついて観察しづらくなりますが、固定液濃度をあげることにより、幼生がばらばらになり、観察しやすくなるなど、対策法が見出され、今では、各現場とも、見やすくホタテガイ幼生を染色できるようになりました。

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これらの技術は、私ども栽培水産試験場から水産技術普及指導所やホタテガイ幼生分布調査を行っている市・町・漁業協同組合の多くの担当者へと研修を行い、また、水産技術指導所からも各機関へと普及されていきました。

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これらの研修と、水産技術普及指導所による積極的な普及により、現在では、噴火湾におけるホタテガイ幼生調査のすべてに免疫染色が用いられているなど、全道の多くの機関で免疫染色を活用していただいています。
特に、各漁協では、若い職員がこの調査を担当できるようになりました。

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以上の取り組みをまとめますと、ホタテガイ幼生分布調査におけるホタテガイ幼生の判別を簡易化・効率化することを目的として、抗ホタテガイ幼生抗体を作製し、免疫染色法を用いたホタテガイ幼生判別技術を開発しました。
これまで難しかったホタテガイ幼生の判別ですが、本技術を用いることで、ホタテガイ幼生を染色することができ、また、色を基準とすることで、誰でも簡単に判別できるようになりました。
染色されたホタテガイ幼生は、溶液を水道水に置換することで発色が止まり、水道水中で半永久的に保存することができます。
また、作業の簡易化・効率化を図ることにより、染色方法も容易になり、現場に即した技術となりました。
この技術開発により、分布調査の精度が上がったため、発生した幼生数に応じて漁業者が採苗器の投入数を調整できるようになるなど、天然採苗の効率が向上しました。その他、小型個体の判別精度も上がったため、大型個体が突然消失しても小型個体がいることが分かれば安心できるなど、天然採苗を長期的な視野で見られるようになりました。
本技術は、水産技術普及指導所と一緒に普及を行い、現在では、全道で活用されています。
なお、本研究は2007 年から取り組み、2011 年には試薬類がキット化され、ここ数年は、現場からの問題点に対する試験を実施してきました。
血清は現状で 10 年分ほど保存しており、もし無くなれば、また抗原を作るところから抗体作製を行うことで対応します。

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最後に、本研究の連携体制について説明させていただきます。
北海道の水産試験場では、北海道ほたて漁業振興協会の研究支援により、北海道大学とともに免疫染色技術の開発を行いました。
この技術を、これまで長年に亘って培ってきたほたてがい漁業に関する連携体制の下、水産技術普及指導所とともに市・町・漁業協同組合に普及し、活用していただくことにより、問題点を抽出し、試験場と指導所と共に技術改良等を行い、現在に至っています。
このように、北海道におけるほたてがい漁業にかかわる多くの機関が協力し合い、本技術が開発されました。
この技術は、まさにオール北海道の技術といえます。
このような技術の開発に対し、すばらしい賞をいただけたことは大変公栄と感じております。
以上で発表を終わります。
本日はありがとうございました。

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