〔微探収報 19: 9－16，2006〕

ダイズの実用栽培品種からの根粒菌の探索収集
青森県農林総合研究センター

桑田 博隆・近藤 伸子・岩谷香緒里

Collection of the Root Nodule Bacterium from Commercial
Soybean Cultivars
Hirotaka KUWATA，Nobuko KONDO and Kaori IWAYA

Aomori Prefectural Agriculture and Forestry Research Center
Sakaimatsu1-1-1, Kuroishi, Aomori 036-0389, Japan
1 ．目的
ダイズ根粒菌は、世界的な食料安定供給のみならず、窒素質肥料がごく少なくて済むという点において、環境保全型農業に最大級の貢献をなしてきた。
ダイズ根粒菌に関しては、「生物窒素固定」という学問的見地からの研究例は極めて多数にのぼり、そのために収集された菌株も多数が保存されているが、それらのほとんどは研究目的のための特殊なダイズ品種由来のものであり、実用品種由来の菌株はごく少数に限られている。
根粒菌に関する実用技術開発試験を実施するに当たり、「ダイズ品種と根粒菌の親和性」の問題は常につきまとう課題であり、研究目的達成のためには、対象とするダイズ品種固有の「親和性菌株」を探索することが大前提となる。そこで、青森県を中心とする主に東北地域の栽培品種並びに有望系統ダイズの根粒菌を探索収集することとした。

2 ．探索概要1 ）根粒菌の分離
 供試ダイズ品種：下記の27品種・系統を供試した○青森県栽培ダイズ品種
青森県農林総合研究センター畑作園芸試験場作物改良部より分譲
普通ダイズ：おおすず・スズカリ・オクシロメ・ワセスズナリ、納豆用小粒：鈴の音
エダマメ：あおもり福丸・あおもり豊丸・毛豆、黒豆：桧山黒・光黒○東北他県主要品種・有望系統（独）東北農業研究センター水田利用部大豆育種研究室（刈和野）より分譲― 9 ―主要品種：ナンブシロメ・トモユタカ・タンレイ・リュウホウ・あやこがね・ミヤギシロ
メ・タチナガハ・ふくいぶき・タチユタカ・スズユタカ・青丸くん・コスズ
有望系統：東北１４６・１５４・１５９・１６０・１６１号
 供試土壌：当初構想では、ほとんどの品種・系統の育成地である「刈和野土壌」を用いる計画であったが、今冬の記録的豪雪により消雪が大幅に遅れる見込みとなったことから、畑作園芸試
験場の硬質プラスチックハウスで、2004年度にエダマメ栽培試験を実施した場所（根粒着生は試験担当者により確認）の土壌を採取し、1／5000ａワグネルポットにつめて供試した（表-1、図-1）。
 ダイズ播種：2005年 3 月19日実施。各品種・系統の種子をポット当たり数粒ずつ播種し、萌芽後にポット当たり 1 本に仕立て、ガラス室内に管理した。

表－ 1年月日2005.3.15

探索日程表
行程及び行動内容

黒石市 →
（出発）

上北郡六戸町：県畑作園芸試験場（土壌試料採取）

→

黒石市
（帰着）

注）青森県公用車により移動

図－ 1



探索収集地点根粒からの菌の分離：2005年 5 月 1 日実施（播種42日後）。ダイズ各個体から外観正常な根粒4 個ずつを選抜し、水道水で洗浄後に75％エタノールに数秒間浸漬し、有効塩素 2 ％次亜塩素酸ソーダ溶液に 2 分間浸漬した後、滅菌蒸留水で 3 回洗浄した。根粒 1 個ずつを数 ml の滅菌水

― 10 ―

中で火炎滅菌ガラス棒先端により砕き、白濁が速やかに水中に拡散することが確認されたものにつき、ＹＭＡ平板培地に画線移植し、27℃暗黒下に培養した。培養14日後に、1 根粒由来のBradyrhizobium sp . と推定される単コロニーを釣菌し、ＹＭＡ斜面培地に移植し、暫定的な菌株とした。


ダイズ各品種・系統の根粒着生程度の評価：ダイズの根を水洗後、達観調査により「おおすず」の根粒着生程度を「＋＋＋」と評価（根粒の大きさは 5 ～ 7 mmで、ダイズ１個体当たり50～70個程度で、経験的にこの程度の着生であれば十分と判定）し、下記基準により他品種・系統の着生程度を評価した。
「おおすず」は青森県の主要品種（2005年度ダイズ作付面積3,770haのうち93％）であることから暫定的に対照品種とした。
＋＋：根粒の大きさはほぼ同じであるが若干少なめ（おおすずでも個体により＋＋）＋ ：根粒の大きさはほぼ同じであるが極めて少ない（個体当たり10個未満）± ：根粒は極めて小さい（直径 2 mm前後）かつ極めて少ない（個体当たり10個未満）
但し、＋及び±でも「親和性菌の分離」目的は達成可能

2 ）分離菌株の接種及び再分離

分離菌株の接種源培養：500ml容三角フラスコにＹＭ液体培地400mlを分注し、121℃・15分間のオートクレーブ滅菌・冷却後に、ダイズ各品種・系統由来の各 4 菌株（一部 3 菌株）につき 1菌株ずつを移植し、27℃暗黒下に静置培養し、菌濃度約10６cfu／mlに増殖した段階で接種に供試した。
ダイズへの接種：直径12cm丸型黒ポリポットにバーミキュライトをつめ、各品種・系統の種子を 1 粒ずつ播種し、ガラス室内に管理し、初生葉展開時（Ｖ１）に接種源培養をポット当たり200ml 潅注した。
接種菌の再分離（接種 6 週間後）
：各ダイズをポットから取り出し、根を水洗後に根系全体の根粒着生程度を達観により調査し、「おおすず：経験的にこの程度の着生であれば十分と判断される数」と同等またはそれ以上の根粒形成の認められたダイズ各品種・系統を 2 個体選抜し、各個体からの 5 根粒を再分離試験に供試した。再分離試験の結果、再分離供試 5 根粒のうち 1 根粒でも菌の発育不良その他のトラブル発生が認められた菌株は廃棄した。

3 ）分離菌株の細菌学的性質の検査
 供試菌株：ダイズ分離菌40菌株を検査に供試した。
 検査項目：末尾記載の文献から主要な項目を適宜選択して実施した。これらの文献はまた分類学的考察の典拠としても引用した。
 検査方法ⅰ）接種試験：前出 2 ）－に記した接種方法によった。
ⅱ）細菌学的性質の検査：基本培地をＹＭＡ培地 1）とした他は後藤・瀧川 3）に従った。
ⅲ）培養条件：培養はすべて25℃で行い、特記以外は培養期間を 2 週間とした。

― 11 ―

3 ．収集成果1 ）ダイズ品種・系統による根粒着生程度：青森県栽培各品種では、10品種のいずれも十分な量の根粒着生が認められたが、他県栽培主要品種並びに有望系統では、根粒の大きさは同等であるものの着生数が著しく少ないもの、あるいは根粒の大きさ・数とも著しく劣るものが幾つか認められた（表－ 2 ）。

表－ 2

ダイズ品種・系統による根粒着生程度の比較

青森県栽培品種

東北他５県栽培品種

有望系統

品種名

着生程度

品種名

着生程度

系統名

着生程度

おおすず＋＋＋

ナンブシロメ＋

東北１４６号±

スズカリ＋＋

トモユタカ＋＋

東北１５４号＋

オクシロメ＋＋

タンレイ＋＋

東北１５９号±

ワセスズナリ＋＋リュウホウ＋

東北１６０号±

鈴の音＋＋＋

あやこがね＋＋東北１６１号±

あおもり福丸＋＋＋ミヤギシロメ＋

あおもり豊丸＋＋＋

タチナガハ＋＋

毛豆＋＋＋

ふくいぶき＋＋

桧山黒＋＋＋

タチユタカ＋

光黒＋＋＋

スズユタカ＋＋

青丸くん＋

コスズ

±注）＋＋＋及び＋＋が実用上十分の着生程度と判定＋及び±でも「親和性菌の分離」目的は達成可能

2 ）分離菌株の選定：ダイズの全27品種・系統から各 4 根粒ずつ、合計108根粒のうち、102根粒から Bradyrhizobium sp. と推定される菌が分離された。接種及び再分離の結果に基づき、最終的に27品種・系統よりの40菌株を選定した。菌株番号は選定された順に１～４０の通し番号を付し、番号の前にダイズを意味するＧｍ（ダイズ学名の頭文字）を付した（表－ 3）。
例：Ｇｍ－２１

Ｇｍ：Glycine max

２１：21番目の菌株3 ）検査結果の概要
ⅰ）属レベルの判定
分離菌40菌株はいずれも斉一な性質を示し、ダイズに根粒を形成したが、エンドウ・インゲンマメ・シロクローバには根粒を形成しなかった。グラム陰性・好気性で、ＹＭＡ培地上で粘液性の発育をし、コロニーは白色・円形・全縁・わずかに中高で、27℃で培養 7 日後のコロ ニー― 12 ―

表－ 3
菌株番号
Ｇｍ－１
Ｇｍ－２
Ｇｍ－３
Ｇｍ－４
Ｇｍ－５
Ｇｍ－６
Ｇｍ－７
Ｇｍ－８
Ｇｍ－９
Ｇｍ－１０
Ｇｍ－１１
Ｇｍ－１２
Ｇｍ－１３
Ｇｍ－１４
Ｇｍ－１５
Ｇｍ－１６
Ｇｍ－１７
Ｇｍ－１８
Ｇｍ－１９
Ｇｍ－２０

選抜菌株番号及び由来ダイズ品種・系統名

ダイズ品種・系統名
おおすず
おおすず
スズカリ
スズカリ
オクシロメ
ワセスズナリ
ワセスズナリ
鈴の音
あおもり福丸あおもり豊丸あおもり豊丸毛豆桧山黒光黒ナンブシロメ
トモユタカ
タンレイ
リュウホウ
あやこがねあやこがね

菌株番号
Ｇｍ－２１
Ｇｍ－２２
Ｇｍ－２３
Ｇｍ－２４
Ｇｍ－２５
Ｇｍ－２６
Ｇｍ－２７
Ｇｍ－２８
Ｇｍ－２９
Ｇｍ－３０
Ｇｍ－３１
Ｇｍ－３２
Ｇｍ－３３
Ｇｍ－３４
Ｇｍ－３５
Ｇｍ－３６
Ｇｍ－３７
Ｇｍ－３８
Ｇｍ－３９
Ｇｍ－４０

ダイズ品種・系統名
ミヤギシロメ
タチナガハ
タチナガハ
ふくいぶき
ふくいぶき
タチユタカ
タチユタカ
スズユタカ
スズユタカ
青丸くん
青丸くん
コスズ
コスズ
東北１４６号
東北１５４号
東北１５９号
東北１５９号
東北１６０号
東北１６０号
東北１６１号は直径１mmに達せず、14日後に直径１mmを超え、アルカリを産生した。以上の結果より、本分離菌40菌株はいずれも Bradyrhizobium 属１，２，４）に属するものと判定された（表 -4）。
ⅱ）種レベルの判定39℃で発育できず、 2 ％ NaCl 耐性は陰性、硝酸還元は 6 菌株のみ陽性で他は陰性、硝酸イオン存在下での嫌気的発育・ 3 - ケトラクトース産生・カゼイン加水分解は陰性で、ＹＭＡ培地上で 0.0025％コンゴーレッドを吸収した。単糖類グルコース・ガラクトース・フルクトース・ラムノースを利用しアルカリを産生した。アラビノース（培養期間 3 週間）を利用したが、他の糖類と異なり酸を産生した点で特異的であった。二糖類ラクトース・スクロース（培養期間3 週間）を利用しアルカリを産生した。マロン酸は利用したにも拘わらず酸もアルカリも産生しなかった。ナリジクス酸50mg/l 及びクロラムフェニコール500mg/l に対して耐性を示し、ス
トレプトマイシン100mg/l には 3/40 が耐性、カルベニシリン500mg/l には 2/40 が耐性を示したが、その他の抗生物質に耐性を示さなかった（表 -4）。
ⅲ）分類学的考察

Bradyrhizobium 属として記載されている 4 種 1，2，4，5，6，7，8）の中で、B. liaoningense 7）とは発育速度の点で、また B. yuanmingense 8）とはダイズに対する寄生性の点で、それぞれ異なる。

― 13 ―

表－ 4性

ダイズ分離菌株の細菌学的性質
供試菌株※※

質

根粒形成能：ダイズ
エンドウ
インゲンマメ
シロクローバ
グラム反応
好気性発育
形態※
運動性※
ＹＭＡ培地・27℃・1 週間後のコロニー直径〃
2 週間後のコロニー直径
ＹＭＡ培地上での粘液性発育ＹＭＡ培地上でのコロニー

ＹＭＡ培地上での酸・アルカリ産生
39℃での発育
2 ％ NaCl 耐性
硝酸還元
硝酸イオン存在下での嫌気的発育
3 －ケトラクロースの産生
カゼインの加水分解
ＹＭＡ培地上での 0.0025％コンゴーレッド吸収能
インドール -3- 酢酸の産生
単糖類利用能：グルコース
ガラクトース
フルクトースアラビノース
二糖類利用能：ラクトース
スクロース
ラムノース
マロン酸利用能
抗生物質耐性：ナリジクス酸
50mg/lテトラサイクリン100mg/l
ストレプトマイシン
100mg/l
エリスロマイシン
250mg/lクロラムフェニコール 500mg/l
リファンピシン
500mg/l
カルベニシリン500mg/l

40 菌株＋－－－－＋
短桿状＋
＜１mm
＞１mm
＋
白色
円形
全縁
中高
アルカリ
－
－
6/40 ＋－－－＋＋＋ア＋ア＋ア＋サ＋ア＋ア＋ア＋＋－
3/40 ＋－＋－
2/40 ＋

B. japonicum

B. elkanii

＋－－－
－＋
短桿状
＋
＜１mm
＞１mm
＋
白色
円形
全縁
中高
アルカリ
－－＋＋－－－－＋＋＋＋－－－＋－－－－－－－

＋n.d.
n.d.
n.d.
－＋短桿状
＋
＜１mm＞１mm＋白色
円形
全縁
中高
アルカリ－－－－－－
n.d.
＋＋＋＋＋＋＋＋－＋＋＋＋＋＋＋※一部の菌株のみ実施※※ B. japonicum ：蒲生（1988）及び Kuykendall（2005）のデータ
B. elkanii ：Kuykendall et al.（1992）及び Kuykendall（2005）のデータ＋：反応陽性 －：反応陰性 ア：アルカリ産生 サ：酸産生 n.d.：データなし

分離菌は、硝酸イオン存在下での嫌気的発育・ＹＭＡ培地上でのコンゴーレッド吸収能・インドー
ル－ 3 －酢酸産生・二糖類（ラクトース・スクロース・ラムノース）利用能などで B. japonicum と異なり、むしろ B. elkanii に近いと思われた。しかし抗生物質耐性検査では、分離菌はナリジクス酸及びクロラムフェニコールにのみ耐性を示し、多くの抗生物質に耐性である B. elkanii の大きな特徴 4，5，6）とは異なった。
以上の限られた範囲の表現形質検査結果からは、分離菌は B. japonicum と B. elkanii との中間的― 14 ―

な地位にあるものと考えられ、本報告では暫定的に分離菌をいずれも Bradyrhizobium sp. とするにとどめ、最終的な分類学的地位の確定のためには、16S-rRNA の塩基配列相同性に基づいて判定しなければならない。

4 ）最終選抜菌株のＭＡＦＦ登録番号
前掲40菌株の中から、各品種・系統由来の１菌株ずつ、計27菌株を選抜し、ＭＡＦＦに登録した。
青森県並びにＭＡＦＦにおける登録番号対照表を表－ 5 に示した。

表－ 5

最終選抜菌株の青森県及びＭＡＦＦにおける登録番号対照表

青森県番号

ダイズ品種名ＭＡＦＦ番号

青森県番号

ダイズ品種名ＭＡＦＦ番号

Ｇｍ－１

おおすず

２１１６４６

Ｇｍ－１９

あやこがね

２１１６６０Ｇｍ－３

スズカリ

２１１６４７

Ｇｍ－２１

ミヤギシロメ

２１１６６１

Ｇｍ－５

オクシロメ

２１１６４８

Ｇｍ－２２

タチナガハ

２１１６６２

Ｇｍ－６

ワセスズナリ

２１１６４９

Ｇｍ－２４

ふくいぶき

２１１６６３Ｇｍ－８

鈴の音

２１１６５０

Ｇｍ－２６

タチユタカ

２１１６６４

Ｇｍ－９

あおもり福丸２１１６５１

Ｇｍ－２８

スズユタカ

２１１６６５

Ｇｍ－１０

あおもり豊丸２１１６５２

Ｇｍ－３０

青丸くん

２１１６６７Ｇｍ－１２

毛豆２１１６５３

Ｇｍ－３２

コスズ

２１１６６８Ｇｍ－１３

桧山黒２１１６５４Ｇｍ－３４

東北１４６号

２１１６６９Ｇｍ－１４

光黒２１１６５５Ｇｍ－３５

東北１５４号

２１１６７０Ｇｍ－１５

ナンブシロメ

２１１６５６Ｇｍ－３６

東北１５９号

２１１６７１

Ｇｍ－１６

トモユタカ２１１６５７

Ｇｍ－３８

東北１６０号

２１１６７２

Ｇｍ－１７

タンレイ

２１１６５８Ｇｍ－４０

東北１６１号

２１１６７３

Ｇｍ－１８

リュウホウ

２１１６５９注）ＭＡＦＦ２１１６６６は欠番（ＭＡＦＦからの通知による）5 ．謝辞
本事業実施に当たり、ダイズ種子を分譲して頂いた青森県農林総合研究センター畑作園芸試験場
作物改良部前島敦夫技師並びに（独）東北農業研究センター水田利用部大豆育種研究室湯本節三室長に篤くお礼申し上げる。

6 ．参考文献
1 ）D.C.Jordan（1984）．FAMILY Ⅲ．RHIZOBIACEAE Conn 1938．
（In）N.R.Krieg and J.G.Holt（eds.）
Bergey's Manual of Systematic Bacteriology．vol.1:234-244．Williams & Wilkins, Baltimore, USA.

― 15 ―

2 ）蒲生卓磨（1988）．生物窒素固定研究における最近の成果［1］・［2］マメ科根粒菌の分類①・②．
農業及び園芸63：769-774・887-892．

3 ）後藤正夫・瀧川雄一（1984）．植物病原細菌同定のための細菌学的性質の調べ方・・・．
植物防疫

38：339-344・385-389・432-437・479-484．

4 ）L.D.Kuykendall（2005）．Genus I．Bradyrhizobium Jordan 1982．
（In）D.J.Brenner, N.R.Krieg andJ.T.Staley（eds.）Bergey' Manual of Systematic Bacteriology 2nd ed., vol.2, partC: 438-443．Springer,USA.
5 ）L.D.Kuykendall, B.Saxena, T.E.Devine and S.E.Udell（1992）．Genetic Diversity in Bradyrhizobium

japonicum Jordan 1982 and a Proposal for Bradyrhizobium elkanii sp. nov. Canadian Journal ofMicrobiology 38: 501-505.
6 ）澤田宏之（2003）．根粒菌の系統分類－過去・現在・未来－．土と微生物

57：39-64．

7 ）L.M.Xu, C.Ge, Z.Cui, J.Li and H.Fan（1995）．Bradyrhizobium liaoningense sp. nov., Isolated fromthe Root Nodules of Soybean. International Journal of Systematic Bacteriology 45: 706-711.
8 ）Z.Y.Yao, F.L.Kan, E.T.Wang, G.H.Wei and W.X.Chen（2002）．Characterization of Rhizobia that
Nodulate Legume Species of the Genus Lespedeza and Description of Bradyrhizobium yuanmingense sp.
nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 52: 2219-2230．

Summary

Twenty seven commercial cultivars of soybean were cultivated in pots using one kind of field soil undergreenhouse conditions. Isolation of the bradyrhizobia from the root nodules of each cultivar was conducted
42 days after sowing with the YMA medium. From the results of isolation, inoculation test to eachcorresponding cultivar, reisolation of the bacterium from the nodules formed, and tests of bacteriologicalcharacteristics, all 27 isolates revealed the intermediate characteristics between Bradyrhizobium

japonicum and B. elkanii . Therefore, they were treated as Bradyrhizobium sp. provisionally, and wereregistered in MAFF Genebank.

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微生物の探索収集プロフィール

探索収集地である北海道十勝の芽室圃場（斎藤）

コムギより分離した植物内生酵母の外観（斎藤）

ダイズ根粒の着生状況（桑田）

根粒菌のコロニー（桑田）台湾・宜蘭縣玉蘭 IIang（Yilang）のウーロン茶向け茶園での探索（長尾）マレーシア・キャメロンハイランドの紅茶向け茶園での探索（長尾）― 1 ―