2022/11/17
R4調査研究発表会

日本中央競馬会畜産振興事業

アミノ酸プロファイルによる不受胎牛の判別：
利点と欠点
不受胎牛の早期判別による分娩間隔の短縮

今川和彦（発表者）
松野雄太
東海大学総合農学研究所

草間和哉
東京薬科大学

ウシ受胎率の現状
農水省「家畜改良増殖目標」
牛：効率的な繁殖・子牛生産を推進

70

肉用牛

65
60
55
50
10%の低下で年間約30億円の損失20%の低下で年間約60億円の損失

45(北海道ETセンターによる試算）

年次（平成）

2423222120191817161514131211109876543240
元年

受胎率（％）

乳用牛

乳用牛の分娩間隔の度数分布
多くは１年１産44.7%

55.3%

これらのウシの分娩間隔を改善する事が課題

ウシの分娩間隔の延長は空胎期間の延長によるものである
ウシの空胎日数を改善する事が課題
家畜改良事業団 乳用牛群能力検定成績のまとめ－平成25年度－図37より引用

空胎日数の短縮
早期胚死滅の減少⇒受胎率の向上

•
•
•
•
•

触診
超音波診断法プロゲステロン濃度測定
ELISA法（PAGなど）
簡便な方法？

分娩
妊娠280~285日

受精率
95%

妊娠・受胎率40~55%
受精率100%
初期胚の発達胚盤胞率
100%

妊娠・受胎率45~60%

妊娠には性周期、排卵、受精や初期胚の発達が絶対条件であるが、妊娠の成立には「着床」や「胎盤形成」が必須である

「着床」の制御こそが、「妊娠」の制御である
この期間に妊娠が不成立となる

Day 8
孵化

胚の伸長

Day 19~
接着
子宮

Day 1
受精

排卵

プロゲステロン（P4)

妊娠

インターフェロンタウ
(IFNT)
1

1019

妊娠（日）

妊娠鑑定剤の開発のためには、プロゲステロンとIFNTに制御される子宮内因子群とそれに呼応する血清因子の特定が必須となる

ウシ妊娠17∼20日・胚着床期の子宮内環境の構築
子宮灌流液に、受胎・不受胎のための因子が存在する子宮内環境を血中から測れないか？
その中に、受胎・不受胎牛判別のための因子が存在する？
早期胚死滅を避け、胚を順調に伸長させるためには？

子宮内遺伝子発現・子宮灌流液の解析、候補因子群の抽出
子宮内環境を反映する血中タンパク性因子はあるか？

受胎判別候補因子の存在とその同定
妊娠ウシ子宮灌流液や血液（D17 vs. D20 vs. 22）

網羅的タンパク質解析
アミノ酸解析

不受胎牛判別法開発のための指標探索
子宮内と血清の共通因子の同定

血清因子による不受胎牛判別法の開発

着床前後により変化する因子の同定

妊娠（＋） 17日

20日

22日

妊娠（―） 17日

20日

22日

ETありETなし

0日

7日

14日

17日

受胎・不受胎を決定する因子の同定

不受胎牛判別候補因子
妊娠により変化する
血中因子の同定

iTRAQ・メタボローム解析による全因子の同定をおよび定量
ウシ血清サンプルは、共同研究グループである北海道JA全農ET研究所より供与ウシ血清中プロゲステロン濃度：妊娠13日vs.20日の判別可能性
死滅胚には、胚伸長しえないものも胚伸長できるものも存在する
P1712P20P22Y9001Y8413

P17P20P22C1710ng/ml

86420Y8375

Y8479

ET(+)
妊娠(＋)

Y8447

Y8420

Y8445

ET(+)
妊娠(ｰ)

Y8557

Y8564

Y8567

ET(ｰ)

早期死滅胚の中には胚の伸長をしているものが存在する⇒伸長胚が着床できない可能性あり⇒妊娠13日での不受胎牛判別は、胚伸長しえない牛は判別できるが伸長後に胚死滅に至る不受胎牛を判別できない

不受胎牛早期判別法開発のための研究戦略
血清と子宮内共通因子の探索が必要
子宮・胚組織中の全発現因子の解析

子宮組織
胚組織
遺伝子発現

血清
血液中因子の探索

機能性候補
因子群の同定子宮灌流液
子宮内環境の精査

子宮内遺伝子発現に裏打ちされた子宮灌流液因子と血清中から共通因子を抽出⇒候補因子の特定

Day22 serum

iTRAQ heat map

一連の解析から20種類のタンパク質候補因子を抽出⇒ウエスタンブロット解析

FAS：Fatty acid

iTRAQ解析
タンパク質性因子群

簡便法開発（ELISA）のためのウエスタンブロット解析
Preg. (n=11)

Western blot
Antibody: FAS
Molecular weight: 273 kD
Dilution: 1:500

Non-Preg.
(n=5)

250
150
100755037Preg. (n=11)

Non-Preg.
(n=5)

250150100755037

I：Alubumin (-)

検出できなかった

II：Alubumin (+)

SNX5： sorting nexin 5

Western blot

Western blot

Antibody: SNX5_new
Molecular weight: 47 kD
Dilution: 1:500

Preg. (n=11)

Antibody: SNX5_new
Molecular weight: 47 kD
Dilution: 1:500

Non-Preg.
(n=5)

757550375037

Alubumin (-)

Non-Preg.
(n=9)

Preg. (n=7)

検体数が増えれば検出が可能かもしれないAI

血中タンパク質因子での受胎・不受胎牛判別は難しい

代謝産物及びアミノ酸解析
Cyclic vs D20

様々なタンパク性因子や代謝産物より血中アミノ酸が候補因子としての可能性が高い

JRA畜産振興
アミノ酸プロファイルによる不受胎牛の判別事業
受胎・不受胎の確認
妊娠17,20,22日

候補因子（遊離アミノ酸）
受胎・不受胎モデル式

着床周辺期の遺伝子データ

サンプル数確保確認試験

これまでの蓄積データ

東海大
熊本近隣農場
ETセンターなど

高感度
アミノ酸測定
味の素
現場に還元

バイオ
インフォマティクス

東大

東海大

早期妊娠判別法確立

アミノ酸プロファイルによる不受胎牛の判別事業
様々な病態ではアミノ酸バランスの変動の報告・定着

妊娠は病気ではない ⇒ 子宮内で初期胚や胎児が成長する
子宮内で胚が伸長する時期にはアミノ酸バランスが変動する可能性あり

アミノ酸プロファイルによる不受胎牛の判別事業
偶然を避けるために共培養系を用い科学的な裏付け
胚（妊娠 13, 15, 17, 20, 22日）
子宮内膜（妊娠同日、非妊娠）血清（妊娠期間中、非妊娠）In vitro共培養系
胚細胞の増殖性及びIFNT発現の上昇を胚着床能の指標にする

子宮・胚組織中の全発現因子の解析

不獲得
子宮組織
胚組織

血清
血液中因子の探索

獲得

機能性候補因子群の同定

増殖性 ↓IFNT↓

子宮灌流液

ウシ子宮灌流液（妊娠17, 20日）
子宮内環境の精査

増殖性 ↑IFNT ↑アミノ酸欠損培養液による胚増殖性とIFN産生能の精査

ウシトロホブラストCT-1細胞株獲得

早期妊娠鑑定に利用可能な因子（群）
ウシ子宮上皮細胞
タンパク質・アミノ酸の網羅的解析
標的アミノ酸の精査

IFNT ↑iTRAQによるタンパク質の網羅的解析

不受胎判別候補アミノ酸の絞り込み
アミノ酸指標の開発

In vitro共培養系による伸長胚に対する機能精査

In vivoによる妊娠鑑定プロトコルの試作
妊娠鑑定法の開発
ELISA法の開発とその検証
簡便な検出法の検証

不受胎牛発見後の処置法の開発およびマニュアル化

Day22

P：受胎
XP：不受胎Day22
T-test: 0.2176

T-test: 0.24299

AUC > 0.8をマーカー候補

T-test: 0.11091

Day20Day20T-test: 0.058757

T-test: 0.014257

T-test: 0.02619

T-test: 0.17447

AUC > 0.8をマーカー候補Day20T-test: 0.12048

Day17

Day17
T-test: 0.000030797

T-test: 0.0070078

T-test: 0.0051614

T-test: 0.0074065

AUC > 0.8をマーカー候補Day17
T-test: 0.016861

T-test: 0.028703

T-test: 0.083925

T-test: 0.035102

AICS値（AminoIndex Cancer Risk Screening値）

カットオフ値
アミノ酸の種類と量で、受胎・不受胎牛を振り分ける値
例：カットオフ値より高い値を示す牛を不受胎、低い値を示すものを受胎牛

特異度受胎牛でカットオフ値よりも低い値を示している牛の割合⇒受胎牛を正しく受胎牛と判別できる割合

感度
不受胎牛でカットオフ値よりも高い値を示している牛の割合⇒不受胎牛を正しく不受胎牛と判別できる割合

妊娠13日、15日、17日、20日および22日のアミノ酸プロファイルを検証した結果
いずれの採血ポイントにおいてもn数が両群30以上でないため、AUC>0.7以上であっても、それが偶然ではないと言い切れない
AUC>0.7のアミノ酸が一番多いのは13dおよび20d⇒判別の可能性が最も高いのは20d

複数項目での判別可能性を評価するために、各群n=50以上で評価する必要あり

13d15d17d20d22d

不受胎牛 (n数）99141515受胎牛 (n数)3030422057

AUC>0.7のAA数

32030

AUC>0.7のAA/TAA数

40060

AUC>0.7のEAA/TEAA,
NEAA/TNEAA数

20140

AUC： Area Under the Curve
血中濃度X時間：最高血中濃度（Cmax）や半減期（t1/2）
AUC値が高ければアミノ酸の種類と量の信頼性が高い
血中濃度が高くても消失が早いものや血中に長くとどまっていても濃度が低いもの⇒AUC値低ウシ血清中プロゲステロン濃度：妊娠13日vs.20日の判別可能性
死滅胚には、胚伸長しえないものも胚伸長できるものも存在する
P1712P20P22Y9001

Y8413

P17P20P22C1710ng/ml

86420Y8375

Y8479

ET(+)
妊娠(＋)

Y8447

Y8420

Y8445

ET(+)
妊娠(ｰ)Y8557

Y8564

Y8567

ET(ｰ)

早期死滅胚の中には胚の伸長をしているものが存在する⇒伸長胚が着床できない可能性あり⇒妊娠13日での不受胎牛判別は、胚伸長しえない牛は判別できるが伸長後に胚死滅に至る不受胎牛を判別できない

追加採材および不受胎牛判別のためのアミノ酸インデックス開発
17 d, 20dについて各群n=50以上を目標に追加採血を行い、判別可能性を評価する

2020年5月下旬
これまで採材に協力していただいた全農ET研究所より
コロナ禍の影響で、体力的に採材には協力できないとの知らせを受ける

全国的に採材協力可能者の探索⇒2020年7月下旬
北海道中央（留萌）農済 窪田健太郎 獣医師
北海道十勝農済 泉 大樹 獣医師

採材協力可能との連絡を受ける

共同研究契約書締結などの書類に時間がかかったものの2020年9月中旬より採材開始
2021/01/22現在、留萌35頭、十勝99頭
このうち十勝分60頭のアミノ酸解析を2月中旬～下旬に開始⇒2020年度中に不受胎牛判別のための「アミノ酸インデックス」構築開始
その他：
子宮内アミノ酸トランスポーター遺伝子（LAT1）の発現が21dに上昇⇒RNA-seq外注、iTRAQ外注

アミノ酸プロファイルによる不受胎牛の判別事業 2021年度
より正確な判別式（インデックス）の開発および2021年2月中旬
血中アミノ酸解析の開始

2021年3月中旬～下旬
経産牛103頭分でアミノ酸インデックス構築開始
残り（現在採材中 n=20）の血清のアミノ酸解析の継続

2021年4月～7月
アミノ酸インデックスの構築及び調整⇒ モデル式の開発⇒モデル式の調整：アミノ酸、血液生化学項目、ISG15を含めて判別能の改善可能か検討
2021年9月～
新たな採材（2回サンプル：AI時と妊娠20日目）
2022年2月～
判別式調整のための層別解析
2回サンプルのISG15及びアミノ酸プロファイルの解析

アミノ酸プロファイルによる不受胎牛の判別事業
偶然を避けるために共培養系を用い科学的な裏付け
胚（妊娠 13, 15, 17, 20, 22日）
子宮内膜（妊娠同日、非妊娠）血清（妊娠期間中、非妊娠）In vitro共培養系
胚細胞の増殖性及びIFNT発現の上昇を胚着床能の指標にする

子宮・胚組織中の全発現因子の解析

不獲得
子宮組織胚組織

血清血液中因子の探索

獲得

機能性候補因子群の同定

増殖性 ↓IFNT↓

子宮灌流液

ウシ子宮灌流液（妊娠17, 20日）
子宮内環境の精査

増殖性 ↑IFNT ↑アミノ酸欠損培養液による胚増殖性とIFN産生能の精査

ウシトロホブラストCT-1細胞株獲得

早期妊娠鑑定に利用可能な因子（群）
ウシ子宮上皮細胞
タンパク質・アミノ酸の網羅的解析
標的アミノ酸の精査

IFNT ↑iTRAQによるタンパク質の網羅的解析

不受胎判別候補アミノ酸の絞り込み
アミノ酸指標の開発

In vitro共培養系による伸長胚に対する機能精査

In vivoによる妊娠鑑定プロトコルの試作
妊娠鑑定法の開発
ELISA法の開発とその検証
簡便な検出法の検証

不受胎牛発見後の処置法の開発およびマニュアル化

アミノ酸プロファイルによる不受胎牛の判別事業 2021年度
モデル式の開発および調整

目標パフォーマンス
偽陽性（受胎牛を誤って不受胎と判別する確率）＜5%
真陽性（不受胎牛を正しく不受胎と判別する確率）＞80-90%

解析手順①規格化した数値のデータを作成
項目により単位が異なるため、値の範囲が同じになるように調整②Lassoによる正則化アルゴリズムを用いてモデリング
説明変数が多すぎると過学習の恐れがあるため、モデルに取り込まれる説明変数を減らしつつモデルを構築③規格化されていないデータで選択された変数を用いてモデリング④クロスバリデーション
母データを学習データと検証データに分割して作成したモデル評価

陽性率や偽陽性率など

AB

D

不受胎

受胎

検査

不受胎

真陽性（A）

偽陽性（B）検査

受胎

偽陰性（C）

真陰性（D）C
B：受胎しているのに不受胎と判断＝最も避けるべき事例
C：不受胎なのに検査では受胎
D:受胎で、検査でも受胎真陽性率＝A/(A+C) ⇒感度

真陰性率＝D/(B+D) ⇒特異度

１ー特異度＝B/(B+D) ⇒偽陽性率

ROC曲線：感度（真陽性率）と１- 特異度（偽陽性率）の関連を表す曲線
結果① 規格化した数値データを作成② Lassoによる正則化アルゴリズムを用いてモデリング③ 規格化されていないデータで選択された変数を用いてモデリング✓ ROC_AUC=0.76程度のモデルが得られたが、目標性能(ROC_AUC>0.8)には未達

真陽性率
60.0%

✓ 説明変数として3Mehis、TP、ALB、無機リンが選択された
ROC_AUC=0.761509

偽陽性率
11.3%

真陽性率＝A/(A+C) ⇒感度

真陰性率＝D/(B+D) ⇒特異度

１ー特異度＝B/(B+D) ⇒偽陽性率

④ クロスバリデーションによる性能の評価
新規データに対する判別性能がどのくらいか分からないので、母データをランダムに学習データ (train)：検証データ (test)=7：3に分割し、検証データでの性能がどの程度になるかを見積もる✓ 検証データでの性能にはばらつきがあるが、大体ROC_AUC=0.7くらいを中心に分布することを確認アミノ酸のみの解析結果 (FY2020の解析)✓ Phe、Gluが説明変数に選択された

判別式調整のまとめ• 3Mehis、TP、ALB、無機リンを説明変数とするモデルが得られた• 性能は大体ROC_AUC=0.7程度になると推測される• 目標性能（ROC_AUC>0.8以上）には届かず

追加解析案• 本データセットには様々な条件の個体が含まれる
産次、AI時期、AI時のDIMなど• 個体条件の違いが判別性能に影響している可能性⇒層別解析を実施し、判別性能が向上するか検討する

層別解析候補
層分娩回数
123以上
AI時の季節9月-10月分娩 (平均気温>5℃)
11月-1月分娩(平均気温<5℃)
AI時のDIM
100日以内100日-150日
150日以上AI時乳量30 kg以下
30 kg-40 kg
40 kg以上

DIM: days in milk(ing)

NPP

合計

4181761915103732263056272047131115131413262528024143261035024アミノ酸事業全体のまとめ（2021年8月）• 未経産牛の初回妊娠ではアミノ酸での判別能が高い• 経産牛での判別性能はそれほど高くない• ISG15は未経産牛では「マーカー」になりうる• ISG15は経産牛では「マーカー」ならない（下図）

経産牛サンプル未経産牛と経産牛での正確性の差異：アミノ酸も ISG15も2021年9月～

新たな採材（2回サンプル：AI時と妊娠20日目）
2022年3月～

2回サンプルのISG15及びアミノ酸プロファイルの解析⇒資金不足のため休止-------------------------------------------------------------------------------2021年12月
複合マーカーによる不受胎牛判別事業申請中⇒SNX5、アミノ酸及び核酸⇒コアラボの設立（一日以内に送付可能、翌日に結果）⇒不採択---------------------------------------------------------------------------------これまでのデータを基にしたデータ発表・公表
Kusama K, Bai R, Matsuno Y, Ideta A, Sakurai T, Nagaoka K, Hori M, Imakawa K.
Characterization of Serum Metabolome and Proteome Profiles Identifies SNX5Specific for Pregnancy Failure in Holstein Heifers. Life (Basel). 2022 Feb 18;12(2):309.
doi: 10.3390/life12020309

2回サンプルでの血中ISG15濃度

ただし、これらは血中濃度
子宮頚管などからの採材では違った結果かも・・・アミノ酸インデックス⇒血液サンプル vs. 組織サンプル⇒未経産牛の受胎・不受胎発見では非常に良いツールとなる⇒経産牛では、陽性率を上げ、１１．３％の擬陽性をどのように減らすか？

⇒P4との組み合わせ⇒SNX5など他のマーカーとの組み合わせ複合マーカーでの検証⇒北大プロジェクトとの関連 vs. 血液以外から

コアラボでの解析と結果の発信