平成３０年度

神戸大学先端融合研究環
極みプロジェクト
実績報告書

神戸大学先端融合研究環

別紙１様式（年次報告書）
平成 31 年 4 月 26 日

平成３０年度極みプロジェクト年次報告書
１．プロジェクト概要
プロジェクト の 名 称

ホログラフィック技術による生命現象の 4 次元計測・操作の実現とその臨床応用研究代表者 部局・専攻・氏名 システム情報学研究科・システム科学専攻・的場修
外 部 資 金

科学研究費補助金 40,894 千円， 受託研究経費 99,645 千円

獲 得 実 績奨学寄附金

特許出願件数

1 件，3,000 千円， 共同研究経費 5,200 千円
論文発表件数 23 件，著書数 0

部局・専攻役件

２．構成員とその役割分担
氏

名割分担

的場 修

システム情報学研究科・シス ホログラフィック技術のよる
テム科学専攻4 次元計測・操作システムの構築

和氣 弘明

医学研究科

ホログラフィック技術に基づ
く高次脳機能解明・臨床利用

森田 光洋

理学研究科

ホログラフィック技術を用いた細胞研究

大森 敏明

工学研究科

数理データサイエンス解析

滝口 哲也

都市安全研究センター

画像処理，機械学習に関する研究

中村 誠

医学研究科

眼科領域におけるホログラフ
ィック技術の実用化

青井 貴之

医学・科学技術イノベーショ ips 細胞領域におけるホログン研究科
ラフィック技術の実用化

杉尾 翔太

医学研究科

全 香玉

システム情報学研究科・シス ホログラフィック技術によるテム科学専攻4 次元計測・操作システムの構築

ホログラフィック技術を用いた細胞・脳機能研究

３．研究成果の概要等について
ホログラフィック技術のよる 4 次元計測・操作システムの構築（的場・全）
細 胞 の ４ 次 元 操 作 に 向 け て ， (1) ホ ロ グ ラ フ ィ ッ ク ３ 次 元 光 刺 激 シ ス テ ム の 開発 ，(2) ホ ロ グ ラ フ ィ ッ ク ３ 次 元 蛍 光・位 相 イ メ ー ジ ン グ 技 術 の 開 発 ，(3)光 刺 激と観察の２つの技術を同時に組み合わせた新規ホログラフィック顕微鏡の開発の ３ つ の テ ー マ で 研 究 を 進 め て い る ． (1)の ホ ロ グ ラ イ フ ィ ッ ク ３ 次 元 光 刺 激 システムの開発では図１に示す光学系を構築し，可変焦点レンズを用いた奥行き
観 察 系 を 合 わ せ る こ と で ３ 次 元 光 刺 激 が 可 能 で あ る こ と を 確 認 し た ． (2)の ３ 次
元 蛍 光・位 相 イ メ ー ジ ン グ 技 術 で は ，細 胞 核 に 蛍 光 タ ン パ ク 質 を 遺 伝 子 導 入 し た
ヒメツリガネゴケを用いて蛍光による細胞核の観察と位相による細胞構造の同時 計 測 実 験 を 行 な っ た ． (3)の 新 規 ホ ロ
グラフィック顕微鏡では，選択的に細胞を刺激し，それによるカルシウムイオンの変化を蛍光で観察可能な一体型システムを構築した．この研究成果を
ア メ リ カ 光 学 会 の 論 文 誌 Optics
Letters, Vol. 43, p. 5447, 2018 年 に 発
表 す る と と も に ，プ レ ス リ リ ー ス し ，日刊工業新聞と下野新聞に掲載された．
ホ ロ グ ラ フ ィ ッ ク 技 術 に 基 づ く 高 次 脳 機 能 解 明 ・ 臨 床 利 用 (和 氣 ・ 杉 尾 ）高次脳機能の解明や臨床利用を目的とした研究には，モデル動物として生きた
マ ウ ス を 用 い た 研 究 が 不 可 欠 で あ る ．現 在 ，生 き た マ ウ ス の 細 胞 活 動 を 光 で 制 御可 能 な 光 感 受 性 機 能 分 子 (ChR2 や C1V1 な ど )が 数 多 く 開 発 さ れ ，生 体 機 能 を 人為的に制御する研究が広く行われるようになっている．生きたマウスにホログ
ラ フ ィ ッ ク 刺 激 光 を 導 入 す る に は， 800-1200nm の 波 長 帯 の 光 を 用 い た 2 光 子励起が必須となる．そこで，的場研究室で構築されたホログラフィック光刺激系を 2光子顕微鏡に組み込んだ 2 光子励起ホログラフィック顕微鏡を新たに構築した（図1）． こ の 顕 微 鏡 を 用 い て ， ① 2 光 子 励 起 によるホログラフィック光刺激が可能か，並びに②生体マウスへの応用可能性について

図１）２光子励起ホログラフィック顕微鏡検討した．
まず，2 光子励起ホログラフィック光刺激が可能かを検討するために，波長1040nm の 光 を ホ ロ グ ラ フ ィ ッ ク で 位 相 変 調 し ， 蛍 光 ビ ー ズ (ビ ー ズ の 直 径 は 細

胞 1/2 個 分 に 相 当 )に 対 し て 多 点 照 射 を行 っ た ．そ の 結 果 ，細 胞 1 個 分 の 解 像 度で 一 度 に 最 大 50 点 の 多 光 子 励 起 が 確 認
さ れ ，2 光 子 励 起 ホ ロ グ ラ フ ィ ッ ク 光 刺
激 が 可 能 で あ る こ と が 実 証 さ れ た (図2)．
続 い て ，生 体 マ ウ ス へ の 応 用 可 能 性 を

図２）２光子ホログラフィック光照射。
緑：２光子励起。赤：１光子励起の参照画像。

検 討 す る た め に ，光 に よ っ て 細 胞 機 能 の制 御 が 可 能 な 機 能 分 子 (C1V1)と 蛍 光 カ ル シ ウ ム イ ン デ ィ ケ ー タ (GCaMP) を 発
現 し た マ ウ ス か ら 急 性 脳 ス ラ イ ス 標 本 を 作 成 し ，2 光 子 励 起 ホ ロ グ ラ フ ィ ッ ク 刺
激 を 行 っ た (図 3)． 2 光子ホログラフィック光
刺 激 (刺 激 点 5-10 点 )を脳細胞に連続照射すると C1V1 の 活 性 化 と 細胞内カルシウム濃度上昇 が 観 察 さ れ ，光 感 受 性
機能分子と２光子励起

図 3) 左：2 光子励起ホログラフィック照射パターンの１つ．
中央：カルシウムイメージング（疑似カラー），刺激前．
右：ホログラフィック光刺激の最中のカルシウム上昇．
矢印：急性脳スライス標本中の一部の細胞を例示．

ホログラフィック光刺激 に よ っ て 脳 細 胞 活 動 が 制 御 可 能 で あ る こ と が 示 さ れ た．
ホログラフィック技術を用いた細胞研究（森田）ホログラム光刺激の実用性を培養細胞系において検討した．具体的には初代培養アスト
ロサイトおよび神経細胞に，光感受性タンパク質（ChR2-EYFP）とカルシウム蛍光タンパク質（RCaMP）を発現させ，光刺激に伴う細胞内カルシウム上昇を測定した．
(1)アストロサイトの応答；下図に示すように，アストロサイトの①（ROI1）で示した部
位にホログラム光刺激を行ったところ，ROI1 のみならず，その近傍である②（ROI2）においてもカルシウム上昇を反映する RCaMP の蛍光上昇が見られた．アストロサイトは，膜電位上昇に伴うカルシウム輸送体の逆回転により細胞内カルシウムが上昇するため，ホログラム光照射が ChR2-EYFP を活性化し，アストロサイトの脱分極を引き起こすことが実証された．

(2) 神経細胞；神経細胞の細胞体または神経突起をホログラム光刺激したところ，刺激部位でカルシウム上昇が見られるだけでなく，神経突起刺激に対する細胞体の応答など，神経活動に依存する応答が見られた．このことから，ホログラム光刺激が，神経細胞の電気活動の誘導に有用であることが実証された．

数理データサイエンス解析（大森）近年の計測技術の発展に伴い，計測データの背後にある神経活動ダイナミクスをデータ駆動型のアプローチで抽出する方法の確立が求められている．本年度
は ，ま ず ，神 経 細 胞 の 非 線 形 ダ イ ナ ミ ク ス を デ ー タ 駆 動 で 抽 出 す る ア ル ゴ リ ズ ムの 構 築 を 行 っ た ．多 数 の イ オ ン 電 流 の 候 補 が 存 在 す る 状 況 を 想 定 し ，ス パ ー ス モ
デリングとコンダクタンスベース型の非線形神経細胞モデルとを融合すること
で，真のシステムが持つべき非線形ダイナミクスのみをデータ駆動で抽出する
方 法 を 構 成 し た ． 本 研 究 の 成 果 は ， Neural Networks 誌 (Otsuka and Omori,2019)に 掲 載 さ れ る と と も に ，シ ス テ ム 制 御 情 報 学 会 よ り 学 会 賞（ 奨 励 賞 ）を 受
賞 し た ．本 年 度 は ，さ ら に ，多 点 計 測 デ ー タ か ら 神 経 ネ ッ ト ワ ー ク の 構 造 を 推 定
す る た め の 統 計 的 ア ル ゴ リ ズ ム の 開 発 (Masahiro and Omori, 2018)に 着 手 し ，部分観測からのネットワーク結合推定のための機械学習アルゴリズムを考案するとともに，計測される動画像データからより精緻な動画像を得ることを目的と し て ， 時 空 間 構 造 を 考 慮 し た 深 層 学 習 ア ル ゴ リ ズ ム の 考 案 (Tanaka andOmori, 2019)を 行 っ た ．
画 像 処 理 ， 機 械 学 習 に 関 す る 研 究（ 滝 口 ）電子顕微鏡で撮影された 3 次元の神経細胞画像の領域セグメンテーションを機械 学 習 に 基 づ き 自 動 で 高 精 度 に 行 う こ と を 目 的 と し ， 今 年 度 は Affinity graphを 用 い た 手 法 を 検 討 し た ．具 体 的 に は ，ネ ッ ト ワ ー ク の 多 層 化 に よる メ モ リ 使 用量の増加問題に対処するため，メモリサイズに依存せず多層化を図れるインス
タ ン ス セ グ メ ン テ ー シ ョ ン モ デ ル を 提 案 し た．

図.

機械学習を用いた神経細胞画像のセグメンテーション結果

４．論文・著書・特許出願リスト[論文]
論文名：Review of three-dimensional imaging of dynamic objects by parallel phase-shifting
digital holography
著者名：T. Fukuda, Y. Awatsuji, P. Xia, T. Kakue, K. Nishio, and O. Matoba
掲載誌，巻，ページ：Opt. Eng. Vol.57, pp.061613-1-11, 2018 年
論文名：Three-dimensional/two-dimensional convertible display based on computer-generated
holograms and an amplitude-modulated spatial light modulator
著者名：O. Matoba, W.-K. Lin, F.-L. Hsiao, C.-Y. Huang, B.-S. Lin, W.-C. Su（国際共著）
掲載誌，巻，ページ：Opt. Eng., Vol. 57, No.6, 061614-1-6, 2018 年
論文名：Astigmatism and deformation correction for a holographic head-mounted display withwedgeshaped holographic waveguide
著者名：W.-C. Su, O. Matoba, W.-K. Lin, B.-S. Lin（国際共著）
掲載誌，巻，ページ：Appl. Opt., Vol. 57, No. 25, pp. 7094-7101, 2018 年
論文名：Characteristics of vibration frequency measurement based on sound field imaging bydigital holography
著者名：S. K. Rajput, O. Matoba, Y. Awatsuji
掲載誌，巻，ページ：OSA Continuum, Vol. 1, No. 1, pp. 200-212, 2018 年
論文名：Three-dimensional stimulation and imaging-based functional optical microscopy ofbiological cells
著者名：X. Quan, M. Kumar, O. Matoba, Y. Awatsuji, Y. Hayasaki, S. Hasegawa, H. Wake
掲載誌，巻，ページ：Opt. Lett., Vol. 43, No. 21, pp. 5447-5450, 2018 年
論文名：Holographic multi-parameter imaging of dynamic phenomena with visual and audiofeatures
著者名：S. K. Rajput, O. Matoba, Y. Awatsuji
掲載誌，巻，ページ：Opt. Lett., Vol. 44, No. 4, pp. 995-998, 2019 年
論文名：Regulation of myelin structure and conduction velocity by perinodal astrocytes.
著者名：Dutta DJ, Woo DH, Lee PR, Pajevic S, Bukalo O, Huffman WC, Wake H, Basser PJ,SheikhBahaei S, Lazarevic V, Smith JC, Fields RD.
掲載誌，巻，ページ：Proc Natl Acad Sci U S A, 115 (46), pp. 11832 - 11837, 2018.
論文名：Microglia mediate non-cell-autonomous cell death of retinal ganglion cells.
著者名：Takeda A, Shinozaki Y, Kashiwagi K, Ohno N, Eto K, Wake H, Nabekura J, Koizumi S.

掲載誌，巻，ページ：Glia, 66 (11), pp. 2366 - 2384, 2018.
論文名：Microglia enhance synapse activity to promote local network synchronization.
著者名：Akiyoshi R, Wake H, Kato D, Horiuchi H, Ono R, Ikegami A, Haruwaka K, OmoriT,Tachibana Y, Moorhouse AJ, Nabekura J.
掲載誌，巻，ページ： eNeuro, 5 (5), pii: ENEURO.0088-18, 2018.
論文名：Cortical astrocytes prime the induction of spine plasticity and mirror image pain.
著者名：Ishikawa T, Eto K, Kim SK, Wake H, Takeda I, Horiuchi H, Moorhouse AJ, Ishibashi
H, Nabekura J.
掲載誌，巻，ページ： Pain, 159 (8), pp. 1592 - 1606, 2018.
論文名：Activity-dependent functions of non-electrical glial cells.
著者名：Kato D, Eto K, Nabekura J, Wake H.
掲載誌，巻，ページ： J Biochem, 163 (6), pp. 457 - 464, 2018.
論文名：The dynamics of revascularization after white matter infarction monitored in Flt1-tdsRed
and Flk1-GFP mice.
著者名：Shimauchi-Ohtaki H, Kurachi M, Naruse M, Shibasaki K, Sugio S, Matsumoto K, Ema
M, Yoshimoto Y, Ishizaki Y.
掲載誌，巻，ページ：Neurosci Lett, 692, pp. 70 – 76, 2019.
論文名：Retinal Detachment-Induced Müller Glial Cell Swelling Activates TRPV4 Ion Channels
and Triggers Photoreceptor Death at Body Temperature.
著者名：Matsumoto H, Sugio S, Seghers F, Krizaj D, Akiyama H, Ishizaki Y, Gailly P, Shibasaki
K.
掲載誌，巻，ページ：J. Neurosci, 38 (41), pp. 8745 – 8758, 2018.
論文名：Ectopic positioning of Bergmann glia and impaired cerebellar wiring in Mlc1-overexpressing mice.
著者名：Kikuchihara S, Sugio S, Tanaka KF, Watanabe T, Kano M, Yamazaki Y, Watanabe M,Ikenaka K
掲載誌，巻，ページ：J. Neurochem, 147 (3), pp. 344 – 360, 2018.
論文名：Inhibitory effect of several sphingolipid metabolites on calcineurin
著者名：Maruyama, Y., , Ueno, S., Morita, M., Hayashi, F., and Maekawa, S.
掲載誌，巻，ページ：Neurosci Lett, 673, p132-135 (2018) doi: 10.1016/j.neulet.2018.03.010
論文名：Interaction of dynamin I with NAP-22, a neuronal protein enriched in the presynaptic
region著者名：Ueno, S., Miyoshi, H.,Maruyama, Y., Morita, M. and Maekawa, S.
掲載誌，巻，ページ：Neurosci Lett, 675, p59-63 (2018) doi: 10.1016/j.neulet.2018.03.061

論文名：Remyelination in the medulla oblongata of adult mouse brain during experimental
autoimmune encephalomyelitis
著者名：Hiratsuka, D., Furubea, E., Taguchi, K., Tanaka, M, Morita, M. and Miyata, S.
掲載誌，巻，ページ：J. Neuroimmiunol, 319, p41-54 (2018) doi: 10.1016/j.jneuroim.2018.03.014
論文名：Metabolic Plasticity of Astrocytes and Aging of the Brain
著者名：Morita, M., Ikeshima-Kataoka, H., Kreft, M., Vardjan, N., Zorec, R., Noda, M.
掲載誌，巻，ページ：. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20.

論文名：Estimation of Neuronal Dynamics Based on Sparse Modeling
著者名：Shinya Otsuka and Toshiaki Omori
掲載誌，巻，ページ：Neural Networks，Vol.109，PP. 137-146，2019 年【システム制御情報学会学会賞（奨励賞）を受賞】
論文名：Estimation of Neuronal Network Dynamics Based on Sparse Modeling
著者名：Ren Masahiro and Toshiaki Omori
掲載誌，巻，ページ：Proceedings of the SICE Annual Conference，PP. 1520-1523，2018 年
論文名：Spatio-Temporal Convolutional Neural Network for Frame Rate
Up-Conversion
著者名：Yusuke Tanaka and Toshiaki Omori
掲載誌，巻，ページ：ACM International Conference Proceeding Series，
PP. 1-8，2019 年【Best Paper Presentation Award，International Conference on Intelligent
Systems, Metaheuristics and Swarm Intelligence を受賞】
論文 名：Polar Transformation on Image Features for Orientation-Invariant Representations※
著 者 名 ： Jinhui Chen, Zhaojie Luo, Zhihong Zhang, Faliang Huang, Zhiling Ye, Tetsuya
Takiguchi, Edwin R. Hancock
IEEE Transactions on Multimedia, Vol. 21, Issue 2, pp. 300-313，2018 年
論文名：Entropy policy for supervoxel agglomeration of neurite segmentation
著者名：Tristan Hascoet, Baptiste Metge, Tetsuya Takiguchi, Yasuo Ariki
International Workshop on Frontiers of Computer Vision, 6 pages, 2019 年

[特許]ホログラフィック３次元マルチスポット光刺激装置及び方法，特願 2018-130309