令和２～４年度日本中央競馬会畜産振興事業

牛ガラス化胚移植による受胎率向上への取り組み～新規凍結・融解移植法 KVSダイレクトシステムの開発～（牛ガラス化胚の新規移植法開発・実用化事業）

永野 昌志 (発表者)

桃沢 健二

鍋西 久

学校法人北里研究所 北里大学獣医学部

乳牛のライフサイクルと和牛生産採精・凍結保存

性選別精液

人工授精 90%以上♀
発情

21日周期

妊娠

成熟

280日

泌乳
分娩
1

乳牛のライフサイクルと和牛生産採精・凍結保存

胚移植

性選別精液
90%以上♀

発情
21日周期

妊娠

和牛生産増加
成熟
農家の収入増

280日

泌乳分娩
2

世界における牛胚生産の現状
100

1480

1260

10840

6
420

体外胚の割合（%）

受精卵個数 (×105個)

1620 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018 2019 2020 2021 0

体内胚

体外胚% 体内胚/合計体外胚が合計に占める割合 (2021): 79.8%(2022 Embryo Transfer Newsletter を改変)

3

日本における牛胚生産の現状
608406420

体外胚の割合（%）

受精卵個数 (×104個)

10200

体内胚体外胚% 体内胚/合計

体外胚が合計に占める割合 (2015): 23.5%(農林水産省、2016年)

4牛胚移植(ET)頭数およびET産子数
北海道の600頭以上飼養するあるフリーストール乳用牛群では70％超が黒毛和種胚移植

独立行政法人 農畜産業振興機構 alic
https://www.alic.go.jp/joho-c/joho05_000773.html

5

近年の牛の産子生産の状況
世界的に牛胚移植による産子生産が増加
体外胚生産( IVP )由来牛胚の割合 → 約80%
☆日本でも施策として胚移植技術を利用した繁殖基盤の強化を推進

凍結体外受精胚移植後の全国平均受胎率は50％に未到達
農林水産省 37％ (H27)、家畜改良事業団 41.7% (R3)

胚移植を成功させるために重要な項目
受胚雌の状態 ・ 移植胚の状態

6

哺乳動物胚の凍結保存法
緩慢凍結法
・主な利用分野：牛胚の移植（畜産分野）
・凍結融解後の生存率：約70～90％・体外受精胚は低耐凍性：移植後受胎率30～40％
緩慢凍結胚の入ったストローを農家で融解し、直接移植するダイレクト移植法の利用が主流
ガラス化保存法・主な利用分野：実験動物、生殖補助医療
・融解後の生存率：ほぼ100％（低品質胚にも有効）
牛胚移植現場での利用は進んでいない7

牛胚移植におけるガラス化保存利用の課題
・高濃度の耐凍剤による細胞毒性が高い(胚の取り扱いに高度な技術が必要)
・胚のガラス化および融解操作が煩雑

1. 作業者の技術レベルに左右されない
生存性の高い牛胚のガラス化処理法
2. 農家の庭先で行える牛ガラス化胚の簡便な融解・移植方法
これらの開発により、移植後受胎率の大幅な向上
60％以上が目標‼

8牛ガラス化胚の新規移植法開発・実用化事業（令和2～4年度）

1. 作業者の技術レベルに左右されない生存性の高い牛胚のガラス化処理法
・新規デバイスによる牛胚ガラス化処理の最適化

2. 農家の庭先で行える牛ガラス化胚の簡便な融解・移植方法
・牛ガラス化胚の庭先融解移植を想定した加温・耐凍剤希釈処理法の最適化

・牛ガラス化胚の1 step耐凍剤希釈処理用の融解器具の開発およびその有効性
農家での実証試験
9

細胞の凍結保存
緩慢冷却とガラス化
一般的な緩慢冷却による凍結保存であっても細胞内はガラス化(非結晶化の固体)耐凍剤が約50％以上細胞内に存在した場合、水分子同士の水素結合が阻害され、冷却時に結晶形成が阻害→ガラス化
ストロー内の液体がガラス化して透明結晶化して不透明
10一般的な牛胚移植に用いられる緩慢凍結法
胚（細胞）

緩慢冷却

１）あらかじめ細胞内に約10%(v/v)濃度の耐凍剤を浸透。
２）ストロー内に胚を導入し、植氷により細胞外に氷晶形成後、－5～７℃から毎分0.3～0.5℃ずつ緩慢冷却
３）約－30℃まで冷却し細胞外氷晶を成長させ細胞内の耐凍剤濃度を50%以上に濃縮

氷晶

４）液体窒素（LN2）中で急速冷却
細胞内塩類濃度の上昇や氷晶形成による傷害
移植器にストローをセットしてダイレクト移植可能

LN2

11

緩慢凍結法の欠点
・プログラムフリーザーが必要
・凍結融解後の生存率：約70～90％・体外受精胚は低耐凍性：移植後受胎率30～40％
子宮深部への胚注入可能器具の普及
動物用受精卵注入カテーテル モ４号

ストロー内容を移植器へ移動

注射筒に付け替え胚をストロー内に封入する必要なし‼

12ヒト不妊治療や実験動物胚の保存に用いられるガラス化保存法
胚（細胞）１）あらかじめ細胞内に10～15%(v/v)濃度の耐凍剤を浸透
平衡液

２）耐凍剤を30～40％含むガラス化液に短時間浸漬（30～60秒間の作業）

３）液体窒素（LN2）中で保存
ガラス化液

LN2

高濃度の耐凍剤による毒性‼
移植前の耐凍剤除去作業必要
ダイレクト移植不可‼
13ガラス化保存法の利点と欠点
・主な利用分野：実験動物、生殖補助医療・特殊な機器は不要

・凍結融解後の生存率：ほぼ100％（低品質胚にも有効）▼ガラス化保存デバイス クライオトップ

実体顕微鏡下で観察しながら卵子をガラス化処理してデバイス上に少量の保存液と載置 → 液体窒素に浸漬
ガラス化液
胚

デバイス上の液量により冷却速度変化

液量多いと胚生存性低下 技量差の影響大
14

Kitasato Vitrification system (KVS)を用いたガラス化デバイス（製品名：Diamour）
デバイス本体部＋保管部

0.5cm
フィルム表面に特殊な吸収支持体＊液体に触れると光透過性0.5cm
ガラス化液
胚吸収支持体液体窒素

胚周辺の余分なガラス化液を吸収
技術者の技量に影響されず高い胚生存性 15

KVSガラス化デバイス上への胚の移動とガラス化保存液の吸収16牛ガラス化胚の新規移植法開発・実用化事業（令和2～4年度）

1. 作業者の技術レベルに左右されない生存性の高い牛胚のガラス化処理法
・新規デバイスによる牛胚ガラス化処理の最適化
処理時間の影響

2. 農家の庭先で行える牛ガラス化胚の簡便な融解・移植方法
・牛ガラス化胚の庭先融解移植を想定した加温・耐凍剤希釈処理法の最適化

・牛ガラス化胚の1 step耐凍剤希釈処理用の融解器具の開発およびその有効性
17

デバイス上のガラス化液容量が融解後の胚生存性に与える影響
コントロール（吸収体無）

KVSデバイス（吸収体有）

約0.4 µL
融解後の胚生存性評価
融解直後

胞胚腔の再拡張24ｈ

透明帯からの孵化

48, 72ｈ18

KVSによるガラス化が牛胚の融解後の発生に与える影響
融解後時間毎の胚発生率(％)
使用デバイス

検査
胚数

胞胚腔の再拡張

孵化

24ｈ

48ｈ

72ｈ

コントロール6687.9a60.6a66.7a

KVS

7198.6b

83.1c

87.3c

新鮮胚

56100bc

85.7c85.7bc(Momozawa et al. 2023)

ab: P＜0.05, ac: P＜0.01 19

ガラス化時の平衡時間が牛胚生存性に与える影響
平衡（浸透）

濃縮・脱水

液体窒素に浸漬

0.25 Mスクロース
7.5％EG、7.5％DMSO

0.5 Mスクロース
15％EG、15％DMSO

脱水による胚収縮・耐凍剤と水分の置換を促す
・保存液浸漬時の急激な体積変化によるストレスを抑制

牛胚取り扱い現場では一度の多くの胚を扱う可能性が高い→ 胚ごとに処理時間が異なる可能性 20

ガラス化時の平衡時間が牛胚生存性に与える影響
ガラス化処理
室温下、平衡液で６分あるいは10分間処理後、ガラス化液で30秒処理し、KVSデバイス上に移動、液体窒素に浸漬

胚の超急速ガラス化保存における平衡時間
牛胚盤胞 … 10～12分（Tajimi et al. 2017）
10分（Juanpanich et al. 2018）

マウス胚盤胞 … 6分（Momozawa et al. 2017, 2019）21平衡処理時間がガラス化牛胚の融解後の発生に与える影響
処理時間
（分）

融解後時間毎の胚発生率(％)
検査
胚数

胞胚腔の再拡張

孵化

24ｈ

48ｈ

72ｈ

08781.6x

51.7a

57.5a

385

97.6y

65.9ab

71.8ab686

96.5y

72.1bc77.9bc

1085

98.8y

82.4c

85.9c

(Momozawa et al. 2023)

xy: P＜0.05, abc: P＜0.0122牛ガラス化胚の新規移植法開発・実用化事業（令和2～4年度）

1. 作業者の技術レベルに左右されない生存性の高い牛胚のガラス化処理法
・新規デバイスによる牛胚ガラス化処理の最適化

2. 農家の庭先で行える牛ガラス化胚の簡便な融解・移植方法
・牛ガラス化胚の庭先融解移植を想定した加温・耐凍剤希釈処理法の最適化

・牛ガラス化胚の1 step耐凍剤希釈処理用の融解器具の開発およびその有効性
23

牛ガラス化胚の簡便な融解方法の検討
ガラス化保存法における融解・耐凍剤希釈処理
顕微鏡下での段階希釈（３step）が基本

水

融解希釈（1 Mスクロース） （0.5 Mスクロース）

洗浄（基礎液）→ ダイレクト移植法による庭先融解移植の適用困難

1 stepでの簡便な融解・耐凍剤希釈処理⇓ダイレクト移植

24牛ガラス化胚の新規移植法開発・実用化事業（令和2～4年度）

1. 作業者の技術レベルに左右されない生存性の高い牛胚のガラス化処理法
2. 農家の庭先で行える牛ガラス化胚の簡便な融解・移植方法
顕微鏡下での操作を必要としない１stepでの簡便な加温・耐凍剤希釈処理
季節や地域気候により環境温度は変化し、庭先で融解移植を行う際に融解液を一定の温度に保つことが困難
融解時環境温度の影響
25

実験３

牛ガラス化胚の簡便な融解方法の検討
1 step融解処理後の牛ガラス化胚の生存性
1 ml 融解液（0.3 Mスクロース）にデバイスを浸漬し、約20秒間保持10秒程度デバイスを振盪させ、希釈液内に1分、5分、あるいは10分間胚を静置融解液にデバイスを浸漬
胚を発生培地に移し替えて、72時間培養し、24時間ごとに胚の発生形態を観察・評価＊顕微鏡観察なしで作業しても胚が確実にデバイスから遊離することを確認26

1 step融解処理時間がガラス化・融解胚の発生に与える影響
融解後時間毎の胚発生率 (%)
処理時間（分）

検査
胚数

胞胚腔
再拡張

孵化

24ｈ

48ｈ

72ｈ

15196.774.5

74.5

55298.1

82.7

84.6

1051

10080.4

82.4

有意差はないものの5～10分間処理で高い生存性

27

牛ガラス化加温胚の耐凍剤希釈時の保持温度の違いが孵化に与える影響
融解後時間毎の胚発生 (%)
保持温度（℃）

検査
胚数

胞胚腔
再拡張

孵化

24ｈ

48ｈ72ｈ45098.0

68.0a88.0

2051

10090.2b94.1

3950

97.4

87.2b92.3
ab: P<0.0528

耐凍剤希釈後の39℃融解液の温度
周囲温度（℃）

実測温度*（℃）

2024.3 ± 0.7a

413.4 ± 0.6b

*8回繰り返し実験

ab: P＜0.0129

牛ガラス化胚の新規移植法開発・実用化事業（令和2～4年度）

1. 作業者の技術レベルに左右されない生存性の高い牛胚のガラス化処理法
2. 農家の庭先で行える牛ガラス化胚の簡便な融解・移植方法
農家での実証試験に向けて・融解および移植器への胚導入が容易な器具開発
・希釈液の子宮内注入が子宮と黄体に与える影響

30

ガラス化・融解牛胚の直接移植のポイント① 融解方法および移植器への胚導入が容易
実体顕微鏡による胚確認が不要
保存液の段階希釈が不要
胚は確実に子宮内に導入② 希釈液の子宮内注入による子宮および黄体機能障害
ガラス化胚の融解および移植に適切な希釈液

黄体機能の評価
移植胚の発育評価31ガラス化・融解牛胚の直接移植のポイント① 融解方法および移植器への胚導入が容易
実体顕微鏡による胚確認が不要
保存液の段階希釈が不要
胚は確実に子宮内に導入② 希釈液の子宮内注入による子宮および黄体機能障害
ガラス化胚の融解および移植に適切な希釈液

黄体機能の評価
移植胚の発育評価32ガラス化胚直接移植用試作品
による胚排出試験

33

実験方法
各デバイスに10個ずつ胚を導入 ⇒ モ4号から排出0.25 ml ストロー
2 ml

試作品A

2 ml

試作品B

1 ml
1 ml

34

異なるデバイスを用いた場合の移植器からの胚排出デバイス

液量(ml)

実験回数

胚回収率

P値

ストロー0.25

10

100.0 ± 0.0

ー

試作品A

21085.0 ± 20.10.07

試作品B

21086.0 ± 15.80.091+110

90.0 ± 13.3

0.29

数値は平均値±標準偏差（Dunnettの多重比較検定）35ガラス化胚直接移植用試作品

深部移植器内容量は0.4～0.5 ml

D0.35 ml

C0.5 ml

B2.0 ml

A2.0 ml36

新規デバイスを用いた移植器からの胚排出
デバイス
ストロー
試作品C
試作品D

液量(ml)

0.25
0.50.35

実験
回数

胚回収率

10 100.0 ± 0.0
5 78.0 ± 21.7
1098.0 ± 6.3

P値
aba

ー
0.001
0.87

数値は平均値±標準偏差（Dunnettの多重比較検定）
37

試作品Dを用いたガラス化胚融解と移植器具への装着①②③④⑤

ツベルクリン用

1 ml空気の注入で予防接種用と試作品Dを接続した長さはツベルクリン用単体と同等

予防接種用

38

試作品Dを用いた融解時における胚温度変化
40Temperature (℃)

3020

上下動 [℃]10

静止 [℃]

00.00

0.50

1.00

1.50

2.00

Time (s)-10デバイスを動かすことで加温速度が上昇‼
-202秒間上下動後8秒間保持・ 外気 の 温度条件 25℃
・ 容器内 の 温度 条件 25℃の 大気
・ 凍結 し た 胚 の 初期温度 -196℃
・ デバイス の 初期温度： -196℃
・ 融解液 の 初期温度： 39℃
・ 融解液量：～0.35 ml
39新規融解移植器具を用いて加温した
牛ガラス化胚の生存性
融解後時間毎の胚発生 (%)
融解方法

胞胚腔
再拡張検査
胚数24ｈ

孵化48ｈ

72ｈ

対照

109

94.8±6.3

82.2±13.6 86.6±10.0

新規

103

97.8±4.586.8±12.4 86.8±12.4

平均値±標準偏差

対照：ディッシュ1 ml

新規：試作品D0.35 ml40

ガラス化・融解牛胚の直接移植のポイント① 融解方法および移植器への胚導入が容易
実体顕微鏡による胚確認が不要
保存液の段階希釈が不要
胚は確実に子宮内に導入② 希釈液の子宮内注入による子宮および黄体機能障害
ガラス化胚の融解および移植に適切な希釈液

黄体機能の評価
移植胚の発育評価41

希釈液組成が子宮および黄体に与える影響
ショ糖など非浸透性凍害防止剤を高濃度含有
子宮内膜に悪影響？
プロスタグランジン産生？
黄体機能低下？

希釈液注入後の黄体血流および血中プロジェステロン濃度確認
42

実験方法
黒毛和種経産牛 3頭
黄体側子宮0.5 Mスクロース添加融解液

3 ml注入黒毛和種経産牛 3頭、日本短角種未経産牛 1頭
無処置（コントロール）
発情同期化

無処置牛

40714日目

発情採血
超音波検査

採血
超音波検査

黄体血流

5714日目43

希釈液投与が牛黄体機能に与える影響
血中プロジェステロン濃度 (ng/ml)

9988877

希釈液子宮内投与

6665544433

222
1100000

22444566788101012121414141616

発情後日数
44

ガラス化・融解牛胚の直接移植のポイント① 融解方法および移植器への胚導入が容易
実体顕微鏡による胚確認が不要
保存液の段階希釈が不要
胚は確実に子宮内に導入② 希釈液の子宮内注入による子宮および黄体機能障害
ガラス化胚の融解および移植に適切な希釈液

黄体機能の評価
移植胚の発育評価45ガラス化・融解牛胚の子宮内での発育確認
発情後7日目にガラス化・融解胚および緩慢凍結・融解胚を移植
発情後14日目に移植胚を採取
07
発情同期化

発情

緩慢凍結胚

胚伸長を確認
14日目

胚移植
黄体側10個胚回収

ガラス化胚

農家における移植試験
ガラス化胚
54.5% (6/11)
Code 1, 8個
Code 2, 3個

緩慢凍結胚
42.9% (3/7)
500 µm500 µmCode 1, 7個

胚面積 50,486±12,874 µm2 95,467±19,834 µm2 (P=0.07)

46牛ガラス化胚の新規移植法開発・実用化事業（令和2～4年度）

1. 作業者の技術レベルに左右されない生存性の高い牛胚のガラス化処理法
・新規デバイスによる牛胚ガラス化処理の最適化

2. 農家の庭先で行える牛ガラス化胚の簡便な融解・移植方法
・牛ガラス化胚の庭先融解移植を想定した加温・耐凍剤希釈処理法の最適化

・牛ガラス化胚の1 step耐凍剤希釈処理用の融解器具の開発およびその有効性
農家での実証試験47

農場での試験に用いた移植用デバイス
上部ホルダー

注射筒がフィット

本体
転がらないための羽先端部キャップ

先端部
Diamourをスムーズに挿入可能
出口が持ち手より少し狭く、融解液の適切な位置に胚載部が浸漬
国内販売されているすべての深部移植器にセット可能48

農場での試験に用いた深部移植器
YTガン
モ4号
モ5号

YTガン

モ4号

全てに適合

モ5号

49

新規デバイスを用いたガラス化胚直接移植

50

新規デバイスを用いたガラス化胚移植受胎率
OPU-IVF胚
青森県

A 酪農家

45.5%（5/11頭）

Code 1: 50.0% (3/6), Code 2: 40.0% (2/5)

B 黒毛和種繁殖農家

20.0%（1/5頭）

Code 1: 100% (1/1), Code 2: 0% (0/4)

51新規デバイスを用いたガラス化胚移植受胎率と体卵巣由来IVF胚（すべてCode 1）
北海道

C 酪農家

33.3%（5/15頭）

鹿児島県

D 酪農家

50.0%（1/2頭）

E 酪農家

0%（0/2頭）

F 酪農家

16.7%（1/6頭）

20.0%（2/10頭）＊夏季実施

夏季の宮崎県における緩慢凍結IVF胚移植成績
14.3%（4/28頭）＊受胚牛はすべて経産ホルスタイン牛
52

牛受精卵の新規凍結・融解移植法
KVS直接システム

ET-ONE （イーティーワン）ガラス化保存用デバイス（Diamour-LS）

融解移植用デバイス（特願2022-047082）

製造： Diamour-LSおよび移植用デバイス (三菱製紙株式会社)
融解移植液 (ライブストックジャパン合同会社)

融解移植液（保存容器入り）53

研究成果の概要、新規ガラス化システムの説明動画は、以下よりご覧頂けます。
https://www.kitasato-u.ac.jp/vmas/features/research-and-development-of-kitasatovitrification-system
牛ガラス化胚の新規移植法開発・実用化事業（①概要）
https://youtu.be/z84hQxPQapM

牛ガラス化胚の新規移植法開発・実用化事業（②ガラス化凍結保存方法）
https://youtu.be/w8fd5PTbQhM
牛ガラス化胚の新規移植法開発・実用化事業（③ガラス化胚の融解方法）
https://youtu.be/n5CuzpG2qJI
牛ガラス化胚の新規移植法開発・実用化事業（④移植器への移植用デバイスのセット）
https://youtu.be/fXyNYm8KNLs

54