別紙１
様式（年次報告書）
令和３年

６月１６日

令和２年度極みプロジェクト年次報告書
１．プロジェクト概要
プロジェクト の 名 称

ホログラフィック技術による生命現象の 4 次元計測・操作の実現とその臨床応用

部局・専攻・氏名 先端融合研究環・的場修

研究代表者
特許出願件数

1 件，論文発表件数

21 件，著書数0 件

役分

２．構成員とその役割分担
氏

名

部局・専攻

割

担

的場 修

先端融合研究環

ホログラフィック技術のよる
4 次元計測・操作システムの構築

和氣 弘明

先端融合研究環／名古屋大学 ホログラフィック技術に基づ
大学院医学系研究科
く高次脳機能解明・臨床利用森田 光洋

理学研究科・生物学専攻

大森 敏明

工学研究科・電気電子工学専 数理データサイエンス解析
攻

滝口 哲也

都市安全研究センター

画像処理，機械学習を用いた脳機能細胞抽出に関する研究塚本 寿夫

理学研究科・生物学専攻

新規光応答性タンパク質の合成

高島 遼一

都市安全研究センター

画像処理，機械学習を用いた脳機能細胞抽出に関する研究

中村 誠

医学研究科

眼科領域におけるホログラフ
ィック技術の実用化

青井 貴之

医学・科学技術イノベーショ iPS 細胞領域におけるホログ
ン研究科
ラフィック技術の実用化

全 香玉

システム情報学研究科・シス ホログラフィック技術によるテム科学専攻4 次元計測・操作システムの構築

Manoj Kumar

システム情報学研究科・シス ホログラフィック技術によるテム科学専攻4 次元計測・操作システムの構築

培養細胞系を用いた光学技術の評価

Sudheesh K.
Rajput加藤 大輔

システム情報学研究科・シス ３次元蛍光イメージング技術
テム科学専攻の構築
名古屋大学大学院医学系研究 ホログラフィック技術に基づ
科
く高次脳機能解明・臨床利用

３．研究成果の概要等について

マルチモーダルイメージングの開発（的場）
我々のグループでは光遺伝学を用いた細胞機能操作のための多点同時３次元光刺激としてのホログラフィック光刺激技術と，光操作により生じる細胞活動の３次元モニタリングのために高速３次元蛍光イメージング技術の開発を行っている。この光刺激と観察を同時に行うことのできる一体化ホログラフィック顕微鏡の構築を進めている。また，植物細胞の幹細胞化プロセスの解明に向けて，蛍光と位相の同時３次元イメージング可能なマルチモーダルイメージング技術を開発している。本年度は，マルチモーダルイメージ
ングにおいて，ディジタルホログラフィー及び強度輸送方程式を用いた２つのアプローチについて研究を行った。特にディジタルホログラフィーでは，３次元蛍光観察に適した同軸型新規配置を提案し，神戸大学特許として出願した。この技術を用いて，蛍光と位相の同時測定をヒメツリガネゴケを用いて行った。また，強度輸送方程式では，0.8 mm 厚の蛍光ビーズを再構成することに成功し，超深度観察手法を確立した。
生きた３次元神経細胞の制御実験（和氣）
今年度はニコン正立型 2 光子顕微鏡ベースにホログラフィック操作・計測の
光 路 を 導 入 し ，こ れ に よ る 刺 激 の 最 適 化 を 図 り ，細 胞 数 50-100 個 ま で の 刺 激 を30Hz で 行 う こ と を 可 能 に し た 。ま た 刺 激 の 形 状 を 最 適 化 す る こ と に よ っ て ，刺激効率の向上を図った。さらに網羅的に画像内の神経細胞の組み合わせを自動で 変 更 し ，こ れ を 全 て の パ タ ー ン で 刺 激 す る こ と が 可 能 と な っ た 。開 発 し た ホ ロ
グ ラ フ ィ ッ ク 顕 微 鏡 を 用 い て ，神 経 細 胞 間 の 機 能 的 結 合 の 評 価 を 行 い ，慢 性 疼 痛
モ デ ル に お い て ，神 経 細 胞 間 の 機 能 的 結 合 が 強 化 さ れ て い る こ と に よ っ て ，同 期
性及び活動強度が増加することがわかった。さらにこれらの神経細胞活動を操作 す る こ と で 痛 み と い う 感 覚 の 人 為 的 操 作 に 成 功 し た (Okada et al., Sci Adv,2021)。さ ら に 現 在 ニ コ ン ソ リ ュ ー シ ョ ン ズ と と も に 現 行 の ２ 光 子 ホ ロ グ ラ フ ィック顕微鏡を市販化するための改良に取り組むとともに，生物応用のアプリケーションを開発している。
培養細胞におけるホログラフィック光刺激応答（森田）ホログラム光照射が光遺伝学において有用であることを実証するために，培養細胞にカルシウム蛍光タンパク質 RCaMP と光活性化タンパク質 ChR2 または opto-a1AR を発現させたものを用いて，光依存的な応答を検討した。初代培養神経細胞に RCaMP とChR2 を発現させた場合，80 nm の 1 光子ホログラム刺激により，標的細胞特異的な応答が誘導されたが，800 nm の２光子ホログラム刺激による応答は見られなかった。これに対し，CHO 細胞または培養アストロサイトに RCaMP と opto-a1AR を発現させた場
合，上記の 1 光子と 2 光子ホログラム刺激に対する応答が見られ，2 光子を利用することにより，細胞局所的な応答が誘導できることが明らかとなった。照射条件の影響を検討したところ，スポット径は 1-10 um の範囲で影響が見られなかったが，照射時間は 50-200msec の範囲で顕著に応答を増加させた。さらに，培養アストロサイトについては２光子

ホログラムによる細胞局所のカルシウム上昇が細胞内を伝搬する過程について詳細な検討を行い，単発刺激ではほとんど伝搬が見られないのに対し，連続刺激をした場合，ストア作動性カルシウム流入が誘導されることにより，カルシウム上昇が細胞内で伝搬する現象，いわゆるカルシウム波が発生することが明らかになった。

光遺伝学用光操作ツール開発（塚本）
現 在 ，光 受 容 タ ン パ ク 質 を 神 経 細 胞 な ど に 強 制 発 現 さ せ て ，光 刺 激 に よ っ て 細胞応答を操作する，光遺伝学解析が進展している。これまでの光遺伝学解析では、光によってイオンを透過する光感受性イオンチャネルのチャネルロドプシンが光操作ツールとして最もよく用いられてきた。続いて，光感受性 G タンパ
ク 質 共 役 受 容 体 (GPCR)で あ る ，動 物 が 持 つ オ プ シ ン が 第 ２ 世 代 光 操 作 ツ ー ル として，細胞のイオン電流のみならず代謝応答も操作するために用いられ始めてい る 。こ れ ま で に 数 千 種 類 同 定 さ れ て い る オ プ シ ン の 中 で も ，ヒ ト な ど 哺 乳 類 の視細胞で機能するオプシンがよく用いられているが，これらは光によってオン
反 応 し か 起 こ せ な い と い う 欠 点 が あ っ た 。こ の 点 に 対 し て ，無 脊 椎 動 物 で は た らくオプシンを用いることで，特定の波長（色）の光でオン反応を起こすとともに ，異 な る 波 長 の 光 に よ っ て オ フ 反 応 も 引 き 起 こ せ る こ と を 利 用 す る こ と で ，第３世代の光操作ツールとして活用できるのではないかということを提案した。
これまでに光操作ツールとして有用な光応答を示すいくつかの無脊椎動物由来
オ プ シ ン に つ い て ，そ の 光 応 答 特 性 を 詳 細 に 検 討 し ，紫 外 領 域 か ら 青 領 域 の 波 長で細胞応答をオンし，緑領域から橙領域でオフできるよな光操作ツール群を揃えることができている。
観測データに基づいた神経ダイナミクスの推定と動的制御（大森）近年の光計測と光操作の進展により，神経応答を踏まえた神経制御の数理基盤の確立が
求 め ら れ て い る 。本 年 度 は ，観 測 デ ー タ に 基 づ
いた神経ダイナミクスの推定と動的制御を同時に実現するアルゴリズムの開発を行った。
これまでに構築してきた単一神経細胞のダイナ ミ ク ス 推 定・制 御 技 術 を さ ら に 進 展 さ せ ，複数神経細胞の非線形ダイナミクス推定と回路制御を実現するアルゴリズムの構築を行っ

図：神経回路ダイナミクス推定とダイナミクス制御へのデータ駆動型アプローチた 。 加 え て ，大脳皮質の層状構造を考慮した数理モデルに注目し，スパイク系列から，ネットワーク構造を推定するためのデータ駆動型手法を構築した。尤度の計算が困難な複 雑 シ ス テ ム の 推 論 に 有 効 で あ る 近 似 ベ イ ズ 計算と神経回路網モデルとを融合した数理・データサイエンス解析技術を構築した 。得 ら れ た 成 果 は ，北 米 神 経 科 学 会 や 脳 型 人 工 知 能 に 関 す る 国 際 会 議 に お い て公表するとともに，関連する研究会において依頼講演を受けた。

深層学習を用いた脳内電流源推定（滝口）本 研 究 で は ，頭 の 外 側 の セ ン サ で 非 侵 襲 に 測 定 し た ノ イ ズ を 含 む 観 測 信 号 か ら ，
脳 内 の 活 動 を 予 測 す る 逆 問 題 に 対 し て ， Deep Prior に 基 づ く 深 層 学 習 法 を 提 案
し た 。電 流 源（ 活 動 源 ）の 推 定 は ，人 間 の 複 雑 な 認 知 機 能 に 関 わ る 脳 の 領 域 の 発
見 や ，脳 疾 患 や 精 神 疾 患 に よ って変化した部分の発見に応用さ れ る こ と が 期 待 さ れ る ．一 般的な深層学習では大量の学習
デ ー タ が 必 要 と さ れ る が ，本 研

従来法

究では教師データ不要のニューラルネットワークを提案した 。明 示 的 に 電 流 源 の 事 前 分 布を与える必要のある従来手法と 比 較 し て ，本 提 案 手 法 で は 深Deep Prior層ニューラルネットワークを図. 推定電流源の空間分布用いて複雑なデータの事前分布をモデル化することで，誤差が削減されることが示された。

４．論文・著書・特許出願リスト

論 文 名 ： Digital

Holographic

Multimodal

Cross-Sectional

FluorescenceandQuantitative Phase Imaging System
著者名：M. Kumar, X. Quan, Y. Awatsuji, Y. Tamada, O. Matoba
掲載誌：Scientific Reports, Vol.10, 7580 (2020)
論文名：Speckle Denoising Techniques in Imaging Systems (国際共著論文)
著者名：M. Kumar, Y. Tounsi, K. Kaur, A. Nassim, F. Mendoza-Santoyo, O. Matoba
掲載誌：Journal of Optics, Vol. 22, 063001 (2020)
論 文 名 ： Sngle-shot common-path off-axis dualwavelength digital holographic
microscopy
著者名：M. Kumar, X. Quan, Y. Awatsuji, Y. Tamada, O. Matoba
掲載誌：Applied Optics, Vol. 59, Issue 24, pp. 7144-7152 (2020)
論文名：Interferenceless coded aperture correlation holography with synthetic
point spread holograms (国際共著論文)
著者名：M. Kumar, A.Vijayakumar, J. Rosen, O. Matoba
掲載誌：Applied Optics, Vol. 59, Issue 24, pp. 7321-7329 (2020)
論文名：Single-shot common-path off-axis digital holography: Applications in bioimaging and optical metrology
著者名：M. Kumar, O. Matoba, X. Quan, S. K. Rajput, Y. Awatsuji, Y. Tamada
掲載誌：Applied Optics, 60, A195-A204 (2021)
論文名：High-speed imaging of the sound field by parallel phase-shifting digitalholography
著者名：Y. Takase, K. Shimizu, S. Mochida, T. Inoue, K. Nishio, S. K. Rajput, O.
Matoba, P. Zia, and Y. Awatsuji
掲載誌：Applied Optics, 60, A179-A187 (2021)
論文名：Multimodal microscopy: fast 3D acquisition of quantitative phase imaging
and cross-sectional fluorescence imaging
著者名：X. Quan, M. Kumar, S. K. Rajput, Y. Awatsuji, Y. Tamada, and O. Matoba
掲載誌：IEEE J. Sel. Top. Quant. Elec. 27, 6800911 (2021)
論文名：Sound wave detection by common-path digital holography
著者名：S. K. Rajput, O. Matoba, M. Kumar, X. Quan, Y. Awatsuji
掲載誌：Optics and Lasers in Engineering, Vol. 137, 106331 (2021)

論文名：Dynamic phase measurement of a transparent object by parallel phaseshifting digital holography with dual polarization imaging cameras
著者名：P. Xia, S. Ri, T. Inoue, Y. Awatsuji, O. Matoba
掲載誌：ptics and Lasers in Engineering Vol. 141, 106583 (2021)
論文名：Multi-physical parameter cross-sectional imaging of quantitative phaseand fluorescence by integrated multimodal microscopy (国際共著論文)
著者名：S.K. Rajput, O. Matoba, M. Kumar, X. Quan, Y. Awatsuji, Y. Tamada, and
E. Tajahuerce
掲載誌：Journal of Selected Topics in Quantum Electronics, 27, 6801809 (2021)
論文名：Pain induces stable, active microcircuits in the somatosensory cortex
that provide a therapeutic target (国際共著論文)
著者名：T. Okada, D. Kato, Y. Nomura, N. Obata, X. Quan, A. Morinaga, H. Yano,Z. Guo, Y. Aoyama, Y.
Tachibana, A.J. Moorhouse, O. Matoba, T. Takiguchi, S. Mizobuchi, H. Wake
掲載誌：Science Advances, Vol.7, eabd8261 (2021)
論文名：Maternal immune activation induces sustained changes in fetal microglia
motility(国際共著論文)
著者名：Ozaki K, Kato D, Ikegami A, Hashimoto A, Sugio S, Guo Z, Shibushita M,
Tatematsu T, Haruwaka K, Moorhouse AJ, Yamada H, Wake H.
掲載誌：Scientific Reports, 10.1038/s41598-020-78294-2
論文名：Negative feedback control of neuronal activity by microglia(国際共著論文)
著者名：Badimon A, Strasburger HJ, Ayata P, Chen X, Nair A, Ikegami A, Hwang P,Chan AT, Graves SM, Uweru JO, Ledderose C, Kutlu MG, Wheeler MA, Kahan A, Ishikawa
M, Wang YC, Loh YE, Jiang JX, Surmeier DJ, Robson SC, Junger WG, Sebra R, Calipari
ES, Kenny PJ, Eyo UB, Colonna M, Quintana FJ, Wake H, Gradinaru V, Schaefer A.
掲載誌：Nature 10.1038/s41586-020-2777-8
論文名：Dual microglia effects on blood brain barrier permeability induced bysystemic inflammation(国際共著論文)
著者名：Haruwaka K, Ikegami A, Tachibana Y, Ohno N, Konishi H, Hashimoto A,Matsumoto M, Kato D, Ono R, Kiyama H, Moorhouse AJ, Nabekura J, Wake H.
掲載誌：Nature Communications, 10.1038/s41467-019-13812-z
論文名：Motor learning requires myelination to reduce asynchrony and spontaneity

in neural activity(国際共著論文)
著者名：Kato D, Wake H, Lee PR, Tachibana Y, Ono R, Sugio S, Tsuji Y, Tanaka YH,Tanaka YR, Masamizu Y, Hira R, Moorhouse AJ, Tamamaki N, Ikenaka K, Matsukawa N,Fields RD, Nabekura J, Matsuzaki M.
掲載誌：Glia, 10.1002/glia.23713
論文名：The Diversity of Intermediate Filaments in Astrocytes（国際共著論文）
著者名：Potokar, M., Morita, M., Wiche, G., Jorgačevski, J.
掲載誌，Cells. 9(7): 1604 (2020)
論文名：Replica Exchange Particle Gibbs Method with Ancestor Sampling
著者名：Hiroaki Inoue, Koji Hukushima, Toshiaki Omori
掲載誌：Journal of the Physical Society of Japan, Vol. 89, No. 10, 104801:1-7，2020 年
論文名：Online Bayesian Approach for Estimation and Control of Neural System
著者名：Shuhei Fukami, Toshiaki Omori
掲載誌：Proceedings of IEEE 3rd Global Conference on Life Sciences andTechnologies, pp. 103-105, 2021
論文名：Video Frame Rate Up-Conversion via Spatio-Temporal Generative
Adversarial Networks
Naomichi Takada, Toshiaki Omori
Journal of Image and Graphics，pp. 1-9, 2021
論文名：Multimodal fusion for indoor sound source localization(国際共著論文)
著者名：Jinhui Chen, Ryoichi Takashima, Xingchen Guo, Zhihong Zhang, Xuexin Xud,
Tetsuya Takiguchi, Edwin R.Hancock
掲載誌：Pattern Recognition, Vol. 115, 2021
論文名：Optogenetic Modulation of Ion Channels by Photoreceptive Proteins
著者名：Tsukamoto H, and Furutani Y.
掲載誌：Advances in Experimental Medicine and Biology、1293、73-88、2021