Product Instructions
MDA2STXEAE48
EN Molecular Detection Assay 2 - STEC Gene Screen (stx and eae)FR

Kit de détection moléculaire version 2 - STEC Screening des Gènes(stx et eae)

DE

Molekulares Detektions Assay 2 - STEC Gene Screen (stx und eae)

ES

Sistema de Detección Molecular 2 - Ensayo de Detección Genética de STEC
(stx y eae)

PT

Ensaio de Detecção Molecular 2 - Teste de Detecção Genética de STEC
(stx e eae)

JA

病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子スクリーニング (stx/eae) 用（stx 基因和 eae 基因）ZH 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选้ ระดับโมเลกุล 2 - STEC Gene Screen (stx และ eae)TH ชุดทดสอบเชือ

KO Molecular Detection Assay 2 - 시가독소 생성 대장균 (STEC)(stx 및 eae)

2

STEC Gene Screen (stx and eae)

EN

(English)Issue Date: 2024-01

Product Instructions
Molecular Detection Assay 2 - STEC Gene Screen (stx and eae)
Product Description and Intended Use

The Neogen® Molecular Detection Assay 2 - STEC Gene Screen (stx and eae) is used with the Neogen® Molecular
Detection System for the rapid and specific detection of Shiga toxin gene (stx1 and/or stx2) and intimin gene (eae)from Shiga toxin-producing E. coli (STEC, also known as “verocytotoxin-producing E. coli”) in enriched foods and foodprocess environmental samples. The term STEC refers to E. coli pathotypes capable of producing Shiga toxin type 1(Stx1), type 2 (Stx2), or both, encoded by stx1 and stx2 genes, respectively. STEC containing virulence genes for stx1
and/or stx2 and eae (intimin gene involved in attaching and effacing phenotype) are designated enterohemorrhagic
E. coli (EHEC). The screening kit contains two separate reagent tubes, one to detect virulence genes stx1 and/or stx2
and the other to detect eae from STEC (EHEC). The Neogen® Molecular Detection System Software reports results
separately for each of the assays and uses results from both assays to call the sample positive or negative for STEC(EHEC). For a presumptive positive for STEC (EHEC), both gene targets (stx1 and/or stx2 and eae) must be positive.
The stx assay does not differentiate between stx1 and stx2, but detects presence of stx1 and/or stx2.
The Neogen Molecular Detection Assay uses loop-mediated isothermal amplification to rapidly amplify nucleic acidsequences with high specificity and sensitivity, combined with bioluminescence to detect the amplification. Presumptive
positive results are reported in real-time while negative results are displayed after the assay is completed. Presumptive
positive results should be confirmed using your preferred method(1, 2, 3) or as specified by local regulations.
The Neogen Molecular Detection Assay 2 - STEC Gene Screen (stx and eae) is intended for use in a laboratoryenvironment by professionals trained in laboratory techniques. Neogen has not documented the use of this productin industries other than food or beverage. For example, Neogen has not documented this product for testing
pharmaceutical, cosmetics, clinical or veterinary samples. The Neogen Molecular Detection Assay 2 - STEC Gene
Screen (stx and eae) has not been evaluated with all possible food products, food processes, testing protocols or with all
possible strains of bacteria.
As with all test methods, the source, formulation and quality of enrichment medium can influence the results. Factors
such as sampling methods, testing protocols, sample preparation, handling, and laboratory technique may also influence
results. Neogen recommends evaluation of the method including enrichment medium, in the user’s environment using
a sufficient number of samples with particular foods and microbial challenges to ensure that the method meets theuser’s criteria.
Neogen has evaluated the Neogen Molecular Detection Assay 2 - STEC Gene Screen (stx and eae) with buffered
peptone water (BPW)-ISO enrichment broth.
The Neogen® Molecular Detection Instrument is intended for use with samples that have undergone heat treatment
during the assay lysis step, which is designed to destroy organisms present in the sample. Samples that have not been
properly heat treated during the assay lysis step may be considered a potential biohazard and should NOT be inserted
into the Neogen Molecular Detection Instrument.
Neogen Food Safety is certified to ISO (International Organization for Standardization) 9001 for design andmanufacturing.

1

EN(English)

The Neogen Molecular Detection Assay 2 - STEC Gene Screen (stx and eae) test kit contains 48 tests of each of stx andeae reagents, described in Table 1.
Table 1. Neogen Molecular Detection Assay Kit Components.
Item

Identification

Quantity

Contents

Comments

Neogen® Lysis Solution (LS)

Pink solution inclear tubes

96 (12 strips of 8 tubes)

580 μL of LS per tube

Racked andready to use

Neogen® Molecular Detection
Assay 2 - STEC Gene Screen Orange tubes(stx) Reagent Tubes

Lyophilized specific
48 (2 pouches; containing
amplification and3 strips of 8 tubes)
detection mix

Ready to use

Neogen® Molecular Detection
Assay 2 -STEC Gene Screen
Red tubes(eae) Reagent Tubes

Lyophilized specific
48 (2 pouches; containing
amplification and3 strips of 8 tubes)
detection mix

Ready to use

Extra caps

Orange caps

96 (12 strips of 8 caps)

Ready to use

Extra caps

Red caps

96 (12 strips of 8 caps)

Ready to use

Neogen® Reagent Control(RC)

Clear flip-top tubes

16 (2 pouches of 8
individual tubes)

Lyophilized control
DNA, amplificationand detection mix

Ready to use

The Negative Control (NC), not provided in the kit, is a sterile enrichment medium, e.g., BPW-ISO. Do not use water as aNC.
A quick start guide is available at www.neogen.com

SafetyThe user should read, understand and follow all safety information in the instructions for the Neogen Molecular
Detection System and the Neogen Molecular Detection Assay 2 - STEC Gene Screen (stx and eae). Retain the safety
instructions for future reference.
WARNING: Indicates a hazardous situation, which, if not avoided, could result in death or serious injury and/or
property damage.
NOTICE: Indicates a potentially hazardous situation which, if not avoided, could result in property damage.

WARNING
Do not use the Neogen Molecular Detection Assay 2 - STEC Gene Screen (stx and eae) in the diagnosis of conditions
in humans or animals.
The user must train its personnel in current proper testing techniques: for example, Good Laboratory Practices(4),ISO/IEC 17025(5), or ISO 7218(6).
To reduce the risks associated with a false-negative result leading to the release of contaminated product:• Follow the protocol and perform the tests exactly as stated in the product instructions.
• Store the Neogen Molecular Detection Assay 2 - STEC Gene Screen (stx and eae) as indicated on the package andin the product instructions.
• Always use the Neogen Molecular Detection Assay 2 - STEC Gene Screen (stx and eae) by the expiration date.
• Use the Neogen Molecular Detection Assay 2 - STEC Gene Screen (stx and eae) with food and environmental
samples that have been validated internally or by a third party.
• Use the Neogen Molecular Detection Assay 2 - STEC Gene Screen (stx and eae) only with surfaces, sanitizers,
protocols and bacterial strains that have been validated internally or by a third party.
• For an environmental sample containing Neutralizing Buffer with aryl sulfonate complex, perform a 1:2 dilution
before testing (1 part sample into 1 part sterile enrichment broth). Another option is to transfer 10 μL of theneutralizing buffer enrichment into the Neogen Lysis Solution tubes. Neogen® Sample Handling Products which
include Neutralizing Buffer with aryl sulfonate complex: RS96010NB, RS9604NB, SSL10NB, SSL10NB2G, HS10NB,
HS10NB2G, and HS2410NB2G.
To reduce the risks associated with exposure to chemicals and biohazards:• Perform pathogen testing in a properly equipped laboratory under the control of trained personnel. Incubatedenrichment media and equipment or surfaces that have come into contact with incubated enrichment media may
contain pathogens at levels sufficient to cause risk to human health.
2

EN
•
•
•
•

(English)

Always follow standard laboratory safety practices, including wearing appropriate protective apparel and eye
protection while handling reagents and contaminated samples.
Avoid contact with the contents of the enrichment media and reagent tubes after amplification.
Dispose of enriched samples according to current local/regional/national regulatory standards.
Samples that have not been properly heat treated during the assay lysis step may be considered a potential
biohazard and should NOT be inserted into the Neogen Molecular Detection Instrument.

To reduce the risks associated with cross-contamination while preparing the assay:• Always wear gloves (to protect the user and prevent introduction of nucleases).
To reduce the risks associated with exposure to hot liquids:• Do not exceed the recommended temperature setting on heater.
• Do not exceed the recommended heating time.
• Use an appropriate, calibrated thermometer to verify the Neogen® Molecular Detection Heat Block Insert temperature(e.g., a partial immersion thermometer or digital thermocouple thermometer, not a total immersion thermometer). The
thermometer must be placed in the designated location in the Neogen Molecular Detection Heat Block Insert.

NOTICETo reduce the risks associated with cross-contamination while preparing the assay:• Change gloves prior to reagent pellet hydration.
• Use of sterile, aerosol barrier (filtered), molecular biology grade pipette tips is recommended.
• Use a new pipette tip for each sample transfer.
• Use Good Laboratory Practices to transfer the sample from the enrichment to the lysis tube. To avoid pipettor
contamination, the user may choose to add an intermediate transfer step. For example, the user can transfer eachenriched sample into a sterile tube.
• Use a molecular biology workstation containing germicidal lamp where available.
• Periodically decontaminate laboratory benches and equipment (pipettes, cap/decap tools, etc.) with a 1-5% (v:v inwater) household bleach solution or DNA removal solution.
To reduce the risks associated with a false-positive result:• Never open reagent tubes post amplification.
• Always dispose of the contaminated tubes by soaking in a 1-5% (v:v in water) household bleach solution for 1 hour
and away from the assay preparation area.
• Never autoclave reagent tubes post amplification.
Consult the Safety Data Sheet for additional information and local regulations for disposal.
If you have questions about specific applications or procedures, please visit our website at www.neogen.com or contact
your local Neogen representative or distributor.

User Responsibility

Users are responsible for familiarizing themselves with product instructions and information. Visit our website atwww.neogen.com or contact your local Neogen representative or distributor for more information.
When selecting a test method, it is important to recognize that external factors such as sampling methods, testing
protocols, sample preparation, handling, laboratory technique and the sample itself may influence results.
It is the user’s responsibility in selecting any test method or product to evaluate a sufficient number of samples with theappropriate matrices and microbial challenges to satisfy the user that the chosen test method meets the user’s criteria.
It is also the user’s responsibility to determine that any test methods and results meet its customers’ and suppliers’
requirements.
As with any test method, results obtained from use of any Neogen Food Safety product do not constitute a guarantee ofthe quality of the matrices or processes tested.
To help customers evaluate the method for various food matrices, Neogen has developed the Neogen® Molecular
Detection Matrix Control kit. When needed, use the Neogen Molecular Detection Matrix Control (MC) to determine if
the matrix has the ability to impact the Neogen Molecular Detection Assay 2 - STEC Gene Screen (stx and eae) results.
Test several Samples, representative of the matrix, i.e. samples obtained from different origin, during any validation
period when adopting the Neogen method or when testing new or unknown matrices or matrices that have undergone
raw material or process changes.

3

EN(English)A matrix can be defined as a type of product with intrinsic properties such as composition and process. Differences
between matrices may be as simple as the effects caused by differences in their processing or presentation for example,
raw versus pasteurized; fresh versus dried, etc.

Limitation of Warranties / Limited Remedy

EXCEPT AS EXPRESSLY STATED IN A LIMITED WARRANTY SECTION OF INDIVIDUAL PRODUCT PACKAGING, NEOGENDISCLAIMS ALL EXPRESS AND IMPLIED WARRANTIES, INCLUDING BUT NOT LIMITED TO, ANY WARRANTIES OF
MERCHANTABILITY OR FITNESS FOR A PARTICULAR USE. If any Neogen Food Safety Product is defective, Neogen or
its authorized distributor will, at its option, replace or refund the purchase price of the product. These are your exclusive
remedies. You must promptly notify Neogen within sixty days of discovery of any suspected defects in a product and return it
to Neogen. Please contact your Neogen representative or authorized Neogen distributor for any further questions.

Limitation of Neogen Liability

NEOGEN WILL NOT BE LIABLE FOR ANY LOSS OR DAMAGES, WHETHER DIRECT, INDIRECT, SPECIAL, INCIDENTAL
OR CONSEQUENTIAL DAMAGES, INCLUDING BUT NOT LIMITED TO LOST PROFITS. In no event shall Neogen’s
liability under any legal theory exceed the purchase price of the product alleged to be defective.

Storage and Disposal

Store the Neogen Molecular Detection Assay 2 - STEC Gene Screen (stx and eae) at 2-8°C (35-47°F). Do not freeze. Keep
kit away from light during storage. After opening the kit, check that the foil pouch is undamaged. If the pouch is damaged,
do not use. After opening, unused reagent tubes should always be stored in the re-sealable pouch with the desiccant inside
to maintain stability of the lyophilized reagents. Store resealed pouches at 2-8°C (35-47°F) for no longer than 90 days.
Do not use Neogen Molecular Detection Assay 2 - STEC Gene Screen (stx and eae) past the expiration date. Expiration
date and lot number are noted on the outside label of the box. After use, the enrichment medium and the Neogen
Molecular Detection Assay 2 - STEC Gene Screen (stx and eae) tubes can potentially contain pathogenic materials.
When testing is complete, follow current industry standards for the disposal of contaminated waste. Consult the Safety
Data Sheet for additional information and local regulations for disposal.

Instructions for Use

Follow all instructions carefully. Failure to do so may lead to inaccurate results.
Periodically decontaminate laboratory benches and equipment (pipettes, cap/decap tools, etc.) with a 1-5% (v:v inwater) household bleach solution or DNA removal solution.
The user should complete the Neogen Molecular Detection System operator qualification (OQ) training, as describedin the “Installation Qualification (IQ) / Operational Qualification (OQ) Protocols and Instructions for Neogen Molecular
Detection System” document(7).
See Section “Specific Instructions for Validated Methods” for specific requirements:
Table 3 for enrichment protocols according to Performance Tested MethodSM (PTM) Certificate #071902.
Sample Enrichment
Tables 2 and 3 present guidance for general enrichment protocols for food.
It is the user’s responsibility to validate alternate sampling protocols or dilution ratios to ensure this test method meetsthe user’s criteria.
Foods
1. Allow BPW ISO enrichment medium to equilibrate to 41.5 ±1°C.
2. Aseptically combine the enrichment medium and sample. For all meat and highly particulate samples, the use offilter bags is recommended.
3. Mix all matrices and incubate as outlined in the appropriate protocol table (see Table 2 or 3).
Environmental samples
WARNING: Should you select to use neutralizing buffer that contains aryl sulfonate complex as the hydrating
solution for the sponge, it is required to perform a 1:2 dilution (1 part sample into 1 part sterile enrichment broth)of the enriched environmental sample before testing in order to reduce the risks associated with a false-negative
result leading to the release of contaminated product. Another option is to transfer 10 μL of the neutralizing buffer
enrichment into the Neogen Lysis Solution tubes.
It is the user’s responsibility to validate alternate sampling protocols or dilution ratios to ensure this test method meetsthe user’s criteria.
4

EN(English)

Table 2. General Enrichment Protocols.
Sample Matrix

Sample Size

Enrichment Broth
Volume (mL)(pre-warmed)

Enrichment
Temperature(± 1°C)

Enrichment
Time (hours)

SampleAnalysis
Volume (μL)

Raw ground beef , pieces
and trim(a)375 g1125 BPW-ISO

41.5

10-18

20

Raw Meat (pork, poultry,lamb, bison)(a)375 g1125 BPW-ISO

41.5

10-18

20

Leafy Produce(b)200 g

450 BPW-ISO

41.5

18-24

20

25 g

225 BPW-ISO

41.5

18-24

20

25 g or 25 mL

225 BPW-ISO

41.5

18-24

20

Sprouts(c)

Raw Dairy(d)(a)

Hand massage the beef (ground beef, pieces and trim) and raw meat (ground pork, poultry and non-beef meat)
samples for 30-60 seconds to disperse and break apart clumps after adding pre-warmed BPW-ISO.

(b)

For leafy produce, rinse enrichment broth (pre-warmed BPW-ISO) over leaves and agitate gently for 30-60 seconds.
Do not massage or homogenize leaves.

(c)

For sprouts, rinse enrichment broth (pre-warmed BPW-ISO) over sprouts for 30-60 seconds and do not massage or
homogenize.

(d)Homogenize the raw dairy samples for 30 to 60 seconds after adding pre-warmed BPW-ISO.

Specific Instructions for Validated Methods

AOAC® Performance Tested MethodSM (PTM) Certificate #071902

In AOAC Research Institute PTMSM studies, the Neogen Molecular Detection Assay 2 – STEC Gene Screen (stx and eae)
was found to be an effective method for the detection of STEC. The matrices tested in the study are shown in Table 3.
Table 3. Enrichment Protocols According to AOAC PTMSM Certificate #071902.
Sample Matrix
Raw beef trim(a)SampleSize

Enrichment Broth
Volume (mL)

Enrichment
Enrichment Sample Analysis
Temperature (± 1°C) Time (hours)
Volume (μL)

375 g1125 BPW-ISO (pre-warmed)

41.5

10-18

20

Raw ground beef

(a)

375 g

1125 BPW-ISO (pre-warmed)

41.5

10-18

20

Raw ground beef

(a)

25 g

225 BPW-ISO (pre-warmed)

41.5

10-18

20

Raw ground pork

375 g

1125 BPW-ISO (pre-warmed)

41.5

10-18

20

(a)

375 g

1125 BPW-ISO (pre-warmed)

41.5

10-18

20

Mechanicallyseparated chicken

25 g

225 BPW-ISO (pre-warmed)

41.5

10-24

20

Spinach(b)200 g

450 BPW-ISO (pre-warmed)

41.5

18-24

20

Sprouts

25 g

225 BPW-ISO (pre-warmed)

41.5

18-24

20

Dried cannabis flower,
dried hemp flower(4)10 g

90 BPW-ISO

41.5

28-32

20

(a)

Raw poultry parts

(c)

(a)

For the beef samples (ground beef and trim) add pre-warmed BPW-ISO to the beef sample. Hand massage for 30-60
seconds to disperse and break apart clumps.

5

EN(English)(b)

For spinach, add pre-warmed BPW-ISO to the matrix. Rinse liquid over leaves and agitate gently for 30-60 seconds.
Do not massage or homogenize leaves.

(c)

For the sprouts, rinse enrichment broth (pre-warmed BPW-ISO) over sprouts for 30-60 seconds and do not massage
or homogenize.

(d)Dried cannabis flower (>0.3% THC) and dried hemp flower (≤0.3%THC)

Preparation of the Neogen® Molecular Detection Speed Loader Tray
1. Wet a cloth or disposable towel with a 1-5% (v:v in water) household bleach solution and wipe the Neogen Molecular
Detection Speed Loader Tray.
2. Rinse the Neogen Molecular Detection Speed Loader Tray with water.
3. Use a disposable towel to wipe the Neogen Molecular Detection Speed Loader Tray dry.
4. Ensure the Neogen Molecular Detection Speed Loader Tray is dry before use.
Preparation of the Neogen® Molecular Detection Chill Block Insert
Place the Neogen Molecular Detection Chill Block Insert directly on the laboratory bench: The Neogen Molecular
Detection Chill Block Tray is not used. Use the block at ambient laboratory temperature (20-25°C).
Preparation of the Neogen® Molecular Detection Heat Block Insert
Place the Neogen Molecular Detection Heat Block Insert in a dry double block heater unit. Turn on the dry block heater
unit and set the temperature to allow the Neogen Molecular Detection Heat Block Insert to reach and maintain atemperature of 100 ± 1°C.
NOTE: Depending on the heater unit, allow approximately 30 minutes for the Neogen Molecular Detection Heat Block
Insert to reach temperature. Using an appropriate, calibrated thermometer (e.g., a partial immersion thermometer,
digital thermocouple thermometer, not a total immersion thermometer) placed in the designated location, verify that
the Neogen Molecular Detection Heat Block Insert is at 100 ± 1°C.
Preparation of the Neogen® Molecular Detection Instrument
1. Launch the Neogen Molecular Detection System Software and log in. Contact your Neogen Food Safety
representative to ensure you have the most updated version of the software.
2. Turn on the Neogen Molecular Detection Instrument.
3. Create or edit a run with data for each sample. Refer to the Neogen Molecular Detection System User Manual for
details.
3.1.

Selection of STXEAE-2 icon in software selects two adjacent wells (like A1, A2, B1, B2, etc.), one for stx andthe other for eae reagent tube, as each sample is run with two assays. NC is set up for each of the reagent
tube and one RC is set up for the kit.
1
SAL-2

A

ECO-2
LIS-2

B

LMO-2
CAM-2

C

CRO-2
STXEAE-2
STX-2
EAE-2
MC-2

D
E
F
G
H

2

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

RC

2 STXEAE
2

6

NC

STX 2

NC
EAE

EN

(English)

NOTE: The Neogen Molecular Detection Instrument must reach Ready state before inserting the Neogen Molecular
Detection Speed Loader Tray with reaction tubes. This heating step takes approximately 20 minutes and is indicatedby an ORANGE light on the instrument’s status bar. When the instrument is ready to start a run, the status bar will turn
GREEN.

Lysis

Remove the bottom of Neogen Lysis Solution Rack with a screwdriver or spatula before placing in in the Neogen
Molecular Detection Heat Block Insert.

1. Allow the Neogen Lysis Solution tubes to warm up by setting the rack at ambient temperature (20-25°C) overnight(16-18 hours). Alternatives to equilibrate the Neogen Lysis Solution tubes to ambient temperature are to set the
Neogen Lysis Solution tubes on the laboratory bench for at least 2 hours, incubate the Neogen Lysis Solution tubes
in a 37 ± 1°C incubator for 1 hour or place them in a dry double block heater for 30 seconds at 100°C.
2. Invert the capped tubes to mix. Proceed to next step within 4 hours after inverting.
3. Remove the enriched sample from the incubator.
4. One Neogen Lysis Solution tube is required for each sample and the NC (sterile enrichment medium).
4.1.

Neogen Lysis Solution tube strips can be cut to desired tube number. Select the number of tubes or 8-tube
strips needed. Place the Neogen Lysis Solution tubes in an empty rack.

4.2.

To avoid cross-contamination, decap one Neogen Lysis Solution tube strip at a time and use a new pipette tip
for each transfer step.

4.3.

Transfer enriched sample to Neogen Lysis Solution tubes as described below:

Transfer each enriched sample into an individual Neogen Lysis Solution tube first. Transfer the NC last.
4.4.

Use the Neogen® Molecular Detection Cap/Decap Tool-Lysis to decap one Neogen Lysis Solution tube strip one strip at a time.

4.5.

Discard the Neogen Lysis Solution tube cap - If lysate will be retained for retest, place the caps into a clean
container for re-application after lysis.
4.5.1. For processing of retained lysate, see Appendix A.

4.6.

Transfer 20 µL of sample into a Neogen Lysis Solution tube.

5. Repeat steps 4.4 to 4.6 as needed, for the number of samples to be tested.
6. When all samples have been transferred, transfer 20 µL of NC (sterile enrichment medium e.g. BPW) into Neogen
Lysis Solution tube. Do not use water as a NC.
7. Verify that the temperature of the Neogen Molecular Detection Heat Block Insert is at 100 ± 1°C.
8. Place the uncovered rack of Neogen Lysis Solution tubes in the Neogen Molecular Detection Heat Block Insert andheat for 15 ± 1 minutes. During heating, the Neogen Lysis Solution will change from pink (cool) to yellow (hot).

7

EN
8.1.

(English)Samples that have not been properly heat treated during the assay lysis step may be considered a potential
biohazard and should NOT be inserted into the Neogen Molecular Detection Instrument.

9. Remove the uncovered rack of Neogen Lysis Solution tubes from the Neogen Molecular Detection Heat Block andallow to cool in the Neogen Molecular Detection Chill Block Insert at least 5 minutes and a maximum of 10 minutes.
The Neogen Molecular Detection Chill Block Insert, used at ambient temperature without the Neogen® Molecular
Detection Chill Block Tray, should sit directly on the laboratory bench. When cool, the Neogen Lysis Solution willrevert to a pink color.
10. Remove the rack of Neogen Lysis Solution tubes from the Neogen Molecular Detection Chill Block Insert.
00:15:00

99–101 ºC

20–25 ºC

00:05:00

Amplification

1. One Neogen Molecular Detection Assay 2 - STEC Gene Screen (stx) and one Neogen Molecular Detection Assay 2 STEC Gene Screen (eae) Reagent Tube is required for each sample and the NC.
1.1.

Tube strips can be cut to desired tube number. Select the number of individual Neogen Molecular Detection
Assay 2 - STEC Gene Screen (stx) and Neogen Molecular Detection Assay 2 - STEC Gene Screen (eae)
Reagent Tube or 8-tube strips needed.

1.2.

Place Neogen Molecular Detection Assay 2 - STEC Gene Screen (stx) tubes in an empty rack in one column.

1.3.

Place Neogen Molecular Detection Assay 2 - STEC Gene Screen (eae) tubes in the adjacent right column.

1.4.

Avoid disturbing the reagent pellets from the bottom of the tubes.

2. Select one Neogen Reagent Control Tube and place in rack.
3. For NC lysate, select one Neogen Molecular Detection Assay 2 - STEC Gene Screen (stx) Reagent Tube and one
Neogen Molecular Detection Assay 2 - STEC Gene Screen (eae) Reagent Tube and place in rack.

4. To avoid cross-contamination, decap one Neogen Molecular Detection Assay 2 - STEC Gene Screen (stx or eae)
Reagent Tube strip at a time and use a new pipette tip for each transfer step.
5. Transfer each of the lysate to a Neogen Molecular Detection Assay 2 - STEC Gene Screen (stx or eae) Reagent Tube
as described below.
5.1.

First, transfer each of the sample lysate to a Neogen Molecular Detection Assay 2 - STEC Gene Screen (stx)
Reagent Tube as described in 5.5 and 5.6.

5.2.

Second, transfer each of the same sample lysate to a Neogen Molecular Detection Assay 2 - STEC Gene
Screen (eae) Reagent Tube in the adjacent right column as described in 5.5 and 5.6.

NOTE: Use new pipette tip for each transfer. Do not use same pipette tip for transfer to stx and eae reagent
tube from the same lysate sample.
8

EN(English)5.3.

After all sample lysate transfer, add NC lysate to each of Neogen Molecular Detection Assay 2 - STEC Gene
Screen (stx) Reagent Tube and Neogen Molecular Detection Assay 2 - STEC Gene Screen (eae) Reagent Tube.

5.4.

Transfer NC lysate last to Reagent Control Tube.

5.5.

Use the Neogen® Molecular Detection Cap/Decap Tool-Reagent to decap the Neogen Molecular Detection
Assay 2 - STEC Gene Screen (stx or eae) Reagent Tubes - one strip at a time. Discard cap.

5.6.

Transfer 20 µL of sample lysate from the upper ½ of the liquid (avoid precipitate) in the Neogen Lysis
Solution Tube into corresponding Neogen Molecular Detection Assay 2 - STEC Gene Screen (stx or eae)
Reagent Tube. Dispense at an angle to avoid disturbing the pellets. Mix by gently pipetting up and down 5times.

NOTE: Use new pipette tip for each transfer. Do not use same pipette tip for transfer to stx and eae
reagent tube from the same lysate sample.
5.7.

Repeat step 5.6 until individual sample lysate has been added to a corresponding Neogen Molecular
Detection Assay 2 - STEC Gene Screen (stx or eae) Reagent Tube in the strip.

5.8.

Cover the Neogen Molecular Detection Assay 2 - STEC Gene Screen (stx or eae) Reagent Tubes with theprovided extra caps and use the rounded side of the Neogen Molecular Detection Cap/Decap Tool-Reagent
to apply pressure in a back and forth motion ensuring that the cap is tightly applied.

5.9.

Repeat steps 5.6 to 5.8 as needed, for the number of samples to be tested for both Neogen Molecular
Detection Assay 2 - STEC Gene Screen (stx and eae) reagent tubes.

5.10. When all sample lysates have been transferred, repeat 5.6 to 5.8 to transfer 20 µL of NC lysate into each of a
Neogen Molecular Detection Assay 2 - STEC Gene Screen (stx) and Neogen Molecular Detection Assay 2 STEC Gene Screen (eae) Reagent Tube.
5.11. Transfer 20 µL of NC lysate into a Neogen Reagent Control Tube. Dispense at an angle to avoid disturbing
the pellets. Mix by gently pipetting up and down 5 times.
Transfer each sample lysate into individual Neogen Molecular Detection Assay 2 - STEC Gene Screen
Reagent Tube (stx or eae) first followed by the NC. Hydrate the Neogen Reagent Control Tube last.
6. Load capped tubes into a clean and decontaminated Neogen Molecular Detection Speed Loader Tray then close andlatch the lid.

9

EN

(English)

7. Review and confirm the configured run in the Neogen Molecular Detection System Software
8. Click the Start button in the software and select instrument for use. The selected instrument’s lid automatically
opens.
9. Place the Neogen Molecular Detection Speed Loader Tray into the Neogen Molecular Detection Instrument andclose the lid to start the assay. Results are provided within 60 minutes, although positives may be detected sooner.
10. After the assay is complete, remove the Neogen Molecular Detection Speed Loader Tray from the Neogen Molecular
Detection Instrument and dispose of the tubes by soaking in a 1-5% (v:v in water) household bleach solution for
1 hour and away from the assay preparation area.
NOTICE: To minimize the risk of false positives due to cross-contamination, never open reagent tubes containing
amplified DNA. This includes Neogen Molecular Detection Assay 2 - STEC Gene Screen (stx and eae) Reagent,
Neogen Reagent Control, and Neogen Matrix Control Tubes. Always dispose of sealed reagent tubes by soaking in a
1-5% (v:v in water) household bleach solution for 1 hour and away from the assay preparation area.

Results and Interpretation

An algorithm interprets the light output curve resulting from the detection of the nucleic acid amplification. Results
are analysed automatically by the software and are color-coded based on the result. A Positive or Negative result isdetermined by analysis of a number of unique curve parameters. Presumptive Positive results are reported in real-time
while Negative and Inspect results will be displayed after the run is completed.
The Neogen Molecular Detection System Software reports results separately for each of the assays (stx and eae)
and uses results from both assays to call the sample positive or negative for STEC (EHEC) (see Figure below). For apresumptive positive for STEC (EHEC), both gene targets (stx1 and/or stx2 and eae) must be positive. If any of theindividual assays show error or inspect, the final result will be error or inspect. Retest is needed to properly callout
the final result (see result key). The software also allows to set up individual assays if needed and the sample lysate
or fresh lysate from enrichment can be retested with the assays following steps as outlined in Appendix A for retained
lysates and steps under Lysis and Amplification section for retained enrichment.

10

EN

(English)

Enriched sample lysate result keys
+ +2 + Both positive, final result positive2+ -2 – stx positive, eae negative, final result negative2+ ?2 ? stx positive, eae inspect, final result inspect, retest2+ 2
stx positive, eae error, final result error, retest2– 2 + stx negative, eae positive, final result negative2– -2 – stx negative, eae negative, final result negative2– ?2 ? stx negative, eae inspect, final result inspect, retest2
stx negative, eae error, final result error, retest– 22?
? 2 + stx inspect, eae positive, final result inspect, retest2? ?2 – stx inspect, eae negative, final result inspect, retest
2
STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

? ?2 ?
2stx inspect, eae inspect, final result inspect, retest?

stx inspect, eae error, final result error, retest

STX

2

STX

EAE

2

EAE

2

STX

2

STX

+
2
–
2

2

STX

2

2

STX

2

stx error, eae positive, final result error, retest?

stx error, eae inspect, final result error, retest

EAE
EAE
EAE
EAE

stx error, eae negative, final result error, retest
stx error, eae error, final result error, retest

Negative control keys
2
2
2
2
2
2

NC
STX

NC
STX

NC
STX

NC
STX

NC
STX

NC
STX

2
2
2
2
2
2

NC
EAE

NC
EAE

NC
EAE

NC
EAE

NC
EAE

NC
EAE

Valid for both, link valid
Valid for one, other error, link error, retest
Valid for one, other invalid, link invalid, retest
Both error, link error, retest
Both invalid, link invalid, retest
One error, other invalid, link error, retest

Presumptive positive samples should be confirmed as per the laboratory standard operating procedures or by following
the appropriate reference method confirmation(1, 2, 3), beginning with transfer from the primary enrichment broth toselective plates, confirmation of isolates using appropriate biochemical and serological methods. For matrices specified
by MLG 5C, immunomagnetic separation (IMS) should be done prior to plating on selective medium.
NOTE: Even a negative sample will not give a zero reading as the system and Neogen Molecular Detection Assay 2 STEC Gene Screen (stx and eae) amplification reagents have a “background” relative light unit (RLU) reading.
In the rare event of any unusual light output, the algorithm labels this as Inspect. Neogen recommends the user torepeat the assay for any Inspect samples. If the result continues to be Inspect, proceed to confirmation test using yourpreferred method (1, 2, 3) or as specified by local regulations.

11

EN

(English)

Table 4. Symbols and info for various software results.
Well Type
SampleSampleWell Result Symbol Result+–

SampleSample?

SampleInterpretation

Positive

The sample is presumptive positive for the target pathogen.

Negative

The sample is negative for the target pathogen.

Inhibited

The sample matrix was inhibitory to the assay. A re-test may berequired. Refer to the troubleshooting section and the assay kit
Product Instructions for more information.

Inspect

The presence or absence of the target pathogen was indeterminate. A
re-test may be required. Refer to the troubleshooting section and theassay kit Product Instructions for more information.

Error

No bioluminescence was detected. A re-test may be required. Referto the troubleshooting section and the assay kit Product Instructions
for more information.

Appendix A. Protocol Interruption: Storage and re-testing of samples

1. To store a heat-treated lysate, re-cap the Neogen Lysis Solution Tube with a clean cap (see Lysis section, 4.5).
2. To store an enriched sample, incubate for a minimum of 18 hours prior to storage.
3. Store at 4 to 8°C for up to 72 hours.
4. Prepare a stored sample for amplification by inverting 2-3 times to mix.
5. Decap the tubes.
6. Place the mixed lysate tubes on Neogen Molecular Detection Heat Block Insert and heat at 100 ± 1°C for 5 ± 1 minutes.
7. Remove the rack of Neogen Lysis Solution tubes from the Neogen Molecular Detection Heat Block and allow to coolin the Neogen Molecular Detection Chill Block Insert at least 5 minutes and a maximum of 10 minutes.
8. Continue the protocol at the Amplification section detailed above.

References:

1. Microbiology Laboratory Guidebook. U. S. Department of Agriculture (USDA) Food Safety and Inspection Service(FSIS) Microbiology Laboratory guidebook 5C.00. Detection and isolation of top seven Shiga toxin-producing
Escherichia coli (STECs) from meat products and carcass and environmental sponges. Feb 4, 2019.
2. US Food and Drug Administration Bacteriological Analytical Manual. Chapter 4A: Diarrheagenic Escherichia coli.
October 2018.
3. ISO/TS 13136:2012: Microbiology of food and animal feed — Real-time polymerase chain reaction (PCR)-based
method for the detection of food-borne pathogens — Horizontal method for the detection of Shiga toxin-producing
Escherichia coli (STEC) and the determination of O157, O111, O26, O103 and O145 serogroups
4. U.S. Food and Drug Administration. Code of Federal Regulations, Title 21, Part 58. Good laboratory practice fornonclinical laboratory studies.
5. ISO/IEC 17025. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories.
6. ISO 7218. Microbiology of food and animal feeding stuffs - General rules for microbiological examination.
7. Neogen Installation Qualification (IQ) / Operational Qualification (OQ) Protocols and Instructions for Neogen
Molecular Detection System. Contact your Neogen Food Safety representative to obtain a copy of this document.

Explanation of Symbols
info.neogen.com/symbols

12Neogen Food Safety
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620 Lesher Place
Lansing, MI 48912 USA
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The Dairy School
Auchincruive
Ayr, KA6 5HU
Scotland, UK
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Bray Business Park, Bray
Co. Wicklow
A98YV29, Ireland© Neogen Corporation 2024. All rights reserved.
Neogen is a trademark of Neogen Corporation.
All other trademarks are the property of their respective companies.

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www.neogen.com© 2024, Neogen. Tous droits réservés.
Neogen est une marque de commerce de Neogen.
Toutes les autres marques decommerce appartiennent à leur propriétaire respectif.
FS00918A

FR(Français)Date de parution : 2024-01

Instructions relatives au produit
Kit de détection moléculaire version 2 - STEC Screening des Gènes(stx et eae)
Description et utilisation du produit

Le kit de détection moléculaire version 2 - STEC Screening des Gènes (stx et eae) de Neogen® est utilisé avec
le système de détection moléculaire Neogen® pour la détection rapide et spécifique du gène de shigatoxine(stx1 et/ou stx2) et le gène de l’intimine (eae) des E. coli productrices de shigatoxine (STEC, également connues
comme « E. coli productrices de vérocytotoxine ») dans les échantillons environnementaux d’aliments enrichis et deprocessus de transformation d’aliments. Le terme STEC se réfère à des pathotypes de E. coli capables de produire uneshigatoxine de type 1 (Stx1), de type 2 (Stx2) ou les deux, codées respectivement par les gènes stx1 et stx2. Les STEC
contenant des gènes de virulence pour stx1et/ou stx2 et eae (gène de l’intimine impliqué dans la fixation et l’effacement
du phénotype) sont appelées E. coli entérohémorragiques (EHEC). Le kit de détection contient deux tubes de réactif
distincts, l’un pour détecter les gènes de virulence stx1 et/ou stx2 et l’autre pour détecter les eae à partir des STEC(EHEC). Le logiciel du Système de détection moléculaire Neogen® rapporte les résultats séparément pour chacun destests et utilise les résultats des deux tests pour considérer l’échantillon positif ou négatif pour les STEC (EHEC). Pour unpositif présumé pour le STEC (EHEC), les deux cibles génétiques (stx1 et/ou stx2 et eae) doivent être positives. Le test
stx ne fait pas de distinction entre stx1 et stx2, mais détecte la présence de stx1 et/ou stx2.
Le kit de détection moléculaire Neogen utilise la technique LAMP (amplification isotherme médiée par des boucles)
afin d’amplifier rapidement les séquences d’acide nucléique de façon extrêmement spécifique et sensible, associée
à la bioluminescence pour détecter l’amplification. Les résultats présumés positifs sont visibles en temps réel tandis
que les résultats négatifs sont affichés à la fin de l’essai. Les résultats présumés positifs doivent être confirmés par vos
méthodes usuelles(1, 2, 3) ou en fonction des méthodes spécifiques répondant aux normes locales.
Le kit de détection moléculaire version 2 - STEC Screening des Gènes (stx et eae) de Neogen est destiné à être utilisé enlaboratoire par des professionnels formés aux techniques de laboratoire. Neogen n’a pas étudié l’utilisation de ce produit
dans des secteurs autres que l’alimentaire et les boissons. Par exemple, Neogen n’a pas étudié ce produit dans le cadrede tests sur des échantillons de produits pharmaceutiques, cosmétiques, cliniques ou vétérinaires. Le kit de détection
moléculaire version 2 - STEC Screening des Gènes (stx et eae) Neogen n’a pas été évalué en utilisant tous les produits etprocessus de transformation alimentaire, tous les protocoles de test ou toutes les souches bactériennes possibles.
Comme avec toutes les méthodes de test, la source, la formulation et la qualité du milieu d’enrichissement peuvent
influencer les résultats. Des facteurs tels que les méthodes d’échantillonnage, les protocoles de test, la préparationdes échantillons, la manipulation et les techniques de laboratoires peuvent également influencer les résultats.
Neogen recommande d’évaluer la méthode, notamment le milieu d’enrichissement, dans l’environnement de l’utilisateur
à l’aide d’un nombre d’échantillons suffisant et avec des charges microbiennes déterminées pour répondre aux critèresde l’utilisateur.
Neogen a évalué le kit de détection moléculaire version 2 - STEC Screening des Gènes (stx et eae) Neogen avec dubouillon d’enrichissement à l’eau peptonée tamponnée ISO (BPW).
L’instrument de détection moléculaire Neogen® est conçu pour être utilisé avec des échantillons traités thermiquement
pendant l’étape de lyse, procédé qui détruit les organismes présents dans l’échantillon. Les échantillons qui n’ont pas
été soumis à un traitement thermique adéquat pendant l’étape de lyse peuvent être considérés comme potentiellement
dangereux et ne doivent PAS être insérés dans l’instrument de détection moléculaire Neogen.
Neogen Sécurité Alimentaire respecte la norme ISO (International Organization for Standardization) 9001 en matière deconception et de fabrication.
Le kit de détection moléculaire version 2 - STEC Screening des Gènes (stx et eae) de Neogen contient 48 tests dechacun des réactifs stx et eae, décrits dans le tableau 1.

1

FR(Français)

Tableau 1. Composants du kit de détection moléculaire Neogen.
Élément

Identification

Quantité

Solution de lyse (LS)
Neogen®

Solution roseen tubestransparents

Contenu

Commentaires

96 (12 barrettes de
8 tubes)

580 µL de LS par tube

Placé surportoir et prêt à
l’emploi

48 (2 poches, contenant
3 barrettes de 8 tubes)

Mélange spécifiquelyophilisé pourl’amplification et ladétectionPrêts à l’emploi

Tubes de réactifs du kit
de détection moléculaire
version 2 - STEC Screening Tubes rouges
des Gènes (eae) de
Neogen®

48 (2 poches, contenant
3 barrettes de 8 tubes)

Mélange spécifiquelyophilisé pourl’amplification et ladétectionPrêts à l’emploi

Bouchons supplémentaires

Bouchons orange

96 (12 barrettes de8 bouchons)Prêts à l’emploi

Bouchons supplémentaires

Bouchons rouges

96 (12 barrettes de8 bouchons)Prêts à l’emploi

Contrôle de réactif
Neogen® (RC)

Tubes « Flip-Top » 16 (2 poches de 8 tubes
transparents
individuels)

Tubes de réactifs du kit
de détection moléculaire
version 2 - STEC Screening Tubes orange
des Gènes (stx) de
Neogen®

ADN témoin lyophilisé,mélange pourl’amplification et ladétectionPrêts à l’emploi

Le témoin négatif (NC), non fourni dans le kit, est un milieu d’enrichissement stérile, par exemple BPW ISO. Ne pas
utiliser d’eau comme NC.
Un guide de démarrage rapide est disponible à l’adresse www.neogen.com

Sécurité

L’utilisateur doit lire, comprendre et suivre toutes les informations de sécurité mentionnées dans les instructions relatives
au système de détection moléculaire Neogen et au kit de détection moléculaire version 2 - STEC Screening des Gènes(stx et eae) Neogen. Conserver ces consignes de sécurité pour référence ultérieure.
AVERTISSEMENT :AVIS :

indique une situation dangereuse qui, si elle n’est pas évitée, pourrait entraîner un décès, desblessures graves et/ou des dommages matériels.
indique une situation potentiellement dangereuse qui, si elle n’est pas évitée, pourrait entraîner
des dommages matériels.

AVERTISSEMENT
Ne pas utiliser le Neogen Kit de détection moléculaire version 2 - STEC Screening des Gènes (stx et eae) dans lediagnostic de maladies chez les humains ou les animaux.
L’utilisateur doit former son personnel aux techniques d’analyse actuelles appropriées, par exemple : les bonnes
pratiques de laboratoire(4), la norme ISO/CEI 17025(5) ou ISO 7218(6).
Afin de réduire les risques associés aux faux négatifs, qui peuvent entraîner la diffusion de produits contaminés :• Se conformer au protocole et effectuer les tests en suivant exactement les instructions relatives au produit.
• Conserver le kit de détection moléculaire version 2 - STEC Screening des Gènes (stx et eae) Neogen comme
indiqué sur l’emballage et dans les instructions relatives au produit.
• Toujours utiliser le kit de détection moléculaire version 2 - STEC Screening des Gènes (stx et eae) Neogen avant ladate d’expiration.
• Utiliser le Neogen Kit de détection moléculaire version 2 - STEC Screening des Gènes (stx et eae) avec deséchantillons alimentaires et environnementaux qui ont été validés en interne ou par un tiers.
• N’utiliser le Neogen Kit de détection moléculaire version 2 - STEC Screening des Gènes (stx et eae) qu’avec dessurfaces, des désinfectants, des protocoles et des souches bactériennes validés en interne ou par une tierce partie.

2

FR
•

(Français)En cas d’échantillon environnemental contenant un tampon neutralisant avec un composé d’aryle sulfonate, diluerl’échantillon dans un bouillon d’enrichissement stérile 1:2 avant l’analyse (1 volume d’échantillon pour 1 volume
de bouillon). Une autre option consiste à transférer 10 µL de l’enrichissement du tampon neutralisant dans lestubes de solution de lyse Neogen. Produits pour la manipulation des échantillons Neogen® comprenant un tampon
neutralisant contenant un complexe d’aryle sulfonate : RS96010NB, RS9604NB, SSL10NB, SSL10NB2G, HS10NB,
HS10NB2G et HS2410NB2G.

Afin de réduire les risques associés à l’exposition aux produits chimiques et aux dangers biologiques :• Effectuer les analyses bactériologiques dans un laboratoire correctement équipé et sous la supervision deprofessionnels qualifiés. Les milieux et les équipements d’enrichissement incubés ou les surfaces ayant été
en contact avec des milieux d’enrichissement incubés peuvent contenir des agents pathogènes à des niveauxsuffisamment élevés pour entraîner des risques pour la santé humaine.
• Toujours respecter les consignes de sécurité courantes du laboratoire, porter des tenues et lunettes de protection
adaptées lors de la manipulation de réactifs et d’échantillons contaminés.
• Éviter tout contact avec le contenu du milieu d’enrichissement et les tubes de réactifs après l’amplification.
• Éliminer les échantillons enrichis conformément aux normes locales/régionales/nationales/réglementaires actuelles.
• Les échantillons qui n’ont pas été soumis à un traitement thermique adéquat pendant l’étape de lyse peuventêtre considérés comme potentiellement dangereux et ne doivent PAS être insérés dans l’instrument de détection
moléculaire Neogen.
Afin de réduire les risques associés à la contamination croisée lors de la préparation de l’analyse :• Toujours porter des gants (afin de protéger l’utilisateur et de prévenir l’introduction de nucléases).
Afin de réduire les risques associés à l’exposition à des liquides très chauds :• Ne pas dépasser le paramètre de température recommandé sur le dispositif de chauffe.
• Ne pas dépasser le temps de chauffe recommandé.
• Utiliser un thermomètre étalonné adapté pour vérifier la température du support de bloc chauffant pour systèmede détection moléculaire Neogen® (p. ex. thermomètre à immersion partielle ou thermomètre à thermocouple
numérique et non un thermomètre à immersion totale). Le thermomètre doit être placé à l’endroit indiqué du support
de bloc chauffant pour système de détection moléculaire Neogen.

AVIS
Afin de réduire les risques associés à la contamination croisée lors de la préparation de l’analyse :• Changer de gants avant l’hydratation des pastilles réactives.
• Utiliser de préférence des pipettes de qualité conforme à la biologie moléculaire, stériles et munies d’embouts
à filtre.
• Utiliser une nouvelle pipette pour chaque transfert d’échantillon.
• Utiliser les bonnes pratiques de laboratoire pour transférer l’échantillon de l’enrichissement vers le tube de lyse.
Pour éviter toute contamination des pipettes, l’utilisateur peut choisir d’ajouter une étape de transfert intermédiaire.
Par exemple, l’utilisateur peut transférer chaque échantillon enrichi dans un tube stérile.
• Utiliser un poste de travail de biologie moléculaire disposant si possible d’une lampe germicide.
• Décontaminer régulièrement les plans de travail et le matériel du laboratoire (pipettes, outils d’ouverture/defermeture, etc.) avec une solution de 1-5 % d’eau de Javel (v:v dans de l’eau) ou avec une solution pour l’élimination
de l’ADN.
Afin de réduire les risques associés à un résultat faux positif :• Ne jamais ouvrir les tubes de réactif après amplification.
• Toujours éliminer les tubes contaminés en les faisant tremper dans une solution d’eau de Javel concentrée à 1-5 %(v:v dans l’eau) pendant 1 heure. Effectuer cette procédure à distance de la zone de préparation de l’analyse.
• Ne jamais stériliser à l’autoclave les tubes de réactifs après amplification.
Consulter la fiche de données de sécurité pour obtenir des informations supplémentaires et connaître la réglementation
locale relative à la mise au rebut.
Pour toute question concernant des applications ou procédures spécifiques, consulter notre site Internet à l’adressewww.neogen.com ou contacter votre représentant ou distributeur Neogen local.

Responsabilité de l’utilisateur

Il incombe aux utilisateurs de prendre connaissance des instructions et des informations relatives au produit. Consulter
notre site Web www.neogen.com pour obtenir davantage d’informations ou contacter votre représentant ou
distributeur Neogen local.
3

FR(Français)Lors du choix d’une méthode d’analyse, il est important d’admettre que des facteurs externes comme les méthodesd’échantillonnage, les protocoles de test, la préparation des échantillons, la manipulation, les techniques de laboratoire
et l’échantillon lui-même peuvent influencer les résultats.
Il incombe à l’utilisateur de sélectionner une méthode ou un produit d’analyse adapté pour évaluer un nombre suffisantd’échantillons avec les matrices et les souches microbiennes appropriées, afin de garantir que la méthode d’analyse est
conforme à ses critères.
Il incombe également à l’utilisateur de déterminer si une méthode d’analyse et ses résultats répondent aux exigences deses clients ou fournisseurs.
Comme pour toute méthode d’analyse, les résultats obtenus avec un produit Neogen Sécurité Alimentaire ne
constituent pas une garantie de la qualité des matrices ou des processus testés.
Dans le but d’aider les clients à évaluer la méthode pour différentes matrices alimentaires, Neogen a élaboré le kit decontrôle de matrice pour système de détection moléculaire Neogen®. Lorsque cela est nécessaire, utilisez le kit decontrôle de matrice (MC) pour système de détection moléculaire Neogen pour déterminer si la matrice peut avoir un
impact sur les résultats du kit de détection moléculaire version 2 - STEC Screening des Gènes (stx et eae) Neogen.
Tester plusieurs échantillons représentatifs de la matrice, c.-à-d. des échantillons d’origines différentes, au cours detoute période de validation lors de l’adoption de la méthode Neogen ou dans le cadre d’analyses de matrices nouvelles,
inconnues ou ayant subi des modifications de matières premières ou de processus.
Une matrice peut être définie comme un type de produit présentant des propriétés intrinsèques, telles que lacomposition et le processus. Les différences entre les matrices peuvent être aussi simples que les effets causés par leursdifférences de traitement ou de présentation, par exemple, cru/pasteurisé, frais/sec, etc.

Limitations de garanties/Limites de recours

SAUF SI EXPRESSÉMENT ÉTABLI DANS LA SECTION DE GARANTIE LIMITÉE D’UN EMBALLAGE DE PRODUITINDIVIDUEL, NEOGEN RENONCE À TOUTE GARANTIE EXPLICITE ET IMPLICITE, Y COMPRIS, MAIS SANS S’Y
LIMITER, TOUTE GARANTIE DE COMMERCIALISATION OU D’ADAPTATION POUR UN USAGE SPÉCIFIQUE. En
cas de défaut de tout produit Neogen Sécurité Alimentaire, Neogen ou son distributeur agréé s’engage, à son entière
discrétion, au remplacement ou au remboursement du prix d’achat du produit. Il s’agit de vos recours exclusifs. Toutdéfaut supposé du produit devra être notifié à Neogen dans un délai de soixante jours et le produit renvoyé à Neogen.
Merci de contacter votre représentant Neogen ou votre distributeur Neogen agréé pour toute autre question.

Limitation de responsabilité de Neogen

NEOGEN NE SERA PAS TENUE RESPONSABLE DES PERTES OU DES DOMMAGES ÉVENTUELS, QU’ILS SOIENTDIRECTS, INDIRECTS, SPÉCIFIQUES, ACCIDENTELS OU CONSÉCUTIFS, Y COMPRIS, MAIS SANS S’Y LIMITER, LES
PERTES DE PROFITS. En aucun cas et en aucune manière, la responsabilité de Neogen ne sera engagée au-delà du prixd’achat du produit prétendu défectueux.

Stockage et mise au rebut

Stocker le kit de détection moléculaire version 2 - STEC Screening des Gènes (stx et eae) Neogen à 2 et 8 °C (35 et 47 °F).
Ne pas congeler. Conserver à l’abri de la lumière. Une fois le kit ouvert, vérifier que le sachet en aluminium est intact. Si
ce sachet est endommagé, ne pas utiliser le kit. Après ouverture, les tubes de réactif non utilisés doivent toujours êtreconservés dans le sachet refermable, en laissant l’agent déshydratant à l’intérieur afin de maintenir la stabilité des réactifs
lyophilisés. Conserver les poches refermées à une température comprise entre 2 et 8 °C (entre 35 et 47 °F). Ne pasconserver plus de 90 jours.
Ne pas utiliser kit de détection moléculaire version 2 - STEC Screening des Gènes (stx et eae) Neogen après la dated’expiration. La date de péremption et le numéro de lot sont inscrits sur l’étiquette extérieure de la boîte. Après
utilisation, le milieu d’enrichissement et les tubes du kit de détection moléculaire version 2 - STEC Screening des Gènes(stx et eae) Neogen peuvent potentiellement contenir des matériaux pathogènes. Lorsque l’analyse est terminée, suivre
les normes actuelles du secteur pour l’élimination des déchets contaminés. Consulter la fiche de données de sécurité
pour obtenir des informations supplémentaires et connaître la réglementation locale relative à la mise au rebut.

Instructions d’utilisation

Suivre attentivement toutes les instructions. Dans le cas contraire, les résultats obtenus risquent d’être inexacts.
Décontaminer régulièrement les plans de travail et le matériel du laboratoire (pipettes, outils d’ouverture/de fermeture,etc.) avec une solution de 1-5 % d’eau de Javel (v:v dans de l’eau) ou avec une solution pour l’élimination de l’ADN.

4

FR(Français)L’utilisateur doit suivre la formation de qualification de l’opérateur (OQ) du système de détection moléculaire
Neogen, comme décrit dans le document intitulé « Protocoles et instructions relatifs à la qualification d’installation (IQ)/
qualification opérationnelle (OQ) pour le système de détection moléculaire Neogen »(7).
Se référer à la section « Instructions spécifiques pour méthodes validées » pour connaître les exigences spécifiques :Tableau 3 pour l’enrichissement des protocoles en fonction du certificat no 071902 de la Performance Tested MethodSM(PTM).
Enrichissement de l’échantillon
Les tableaux 2 et 3 présentent des lignes directrices pour les protocoles généraux d’enrichissement des aliments.
Il incombe à l’utilisateur de valider des protocoles d’échantillonnage ou des proportions de dilution différent(e)s pourgarantir que cette méthode d’analyse est conforme à ses critères.
Aliments
1. Laisser le milieu d’enrichissement BPW ISO s’équilibrer à 41,5 ± 1 °C.
2. Mélanger de manière aseptique le milieu d’enrichissement et l’échantillon. Pour tous les échantillons de viande et à
forte teneur en particules, il est recommandé d’utiliser des sacs avec filtre.
3. Mélanger toutes les matrices et incuber comme indiqué dans le tableau de protocole approprié (Voir Tableau 2ou 3).
Échantillons environnementaux
AVERTISSEMENT : si vous choisissez d’utiliser un tampon neutralisant contenant un complexe d’aryle sulfonate
comme solution hydratante pour l’éponge, il sera nécessaire d’effectuer une dilution de 1:2 (1 volume d’échantillon
pour 1 volume de bouillon d’enrichissement stérile) avant l’analyse, afin de réduire les risques associés aux résultats
faux négatifs pouvant libérer du produit contaminé. Une autre option consiste à transférer 10 µL de l’enrichissement
du tampon neutralisant dans les tubes de solution de lyse Neogen.
Il incombe à l’utilisateur de valider des protocoles d’échantillonnage ou des proportions de dilution différent(e)s pourgarantir que cette méthode d’analyse est conforme à ses critères.
Tableau 2. Protocoles d’enrichissement généraux.
Matrice de l’échantillon

Taille del’échantillon

Bouillond’enrichissement
Volume (mL)(préchauffé)

Températured’enrichissement(± 1 °C)Bœuf haché cru,
morceaux et émincé(a)375 g

1 125 BPW ISO

41,5

10-18

20

Viande crue (porc,
volaille, agneau, boeuf)(a)375 g

1 125 BPW ISO

41,5

10-18

20

Légumes-feuilles(b)200 g

450 BPW ISO

41,5

18-24

20

Choux

25 g

225 BPW ISO

41,5

18-24

20

25 g ou
25 mL

225 BPW ISO

41,5

18-24

20

(c)

Produits laitiers crus(d)Durée
Volumed’enrichissement d’échantillon(h)d’analyse (µL)(a)

Malaxer à la main les échantillons de bœuf (bœuf haché, morceaux et émincé) et de viande crue (porc haché, volailleet viande non bovine) pendant 30 à 60 secondes afin de disperser et de briser les morceaux après l’ajout de BPW-ISO
préchauffé.

(b)

Pour les légumes feuilles, rincer le bouillon d’enrichissement (BPW-ISO préchauffé) sur les feuilles et agiter
doucement pendant 30 à 60 secondes. Ne pas malaxer ou homogénéiser les feuilles.

(c)

Pour les graines germées, rincer le bouillon d’enrichissement (BPW-ISO préchauffé) sur les graines germées pendant
30 à 60 secondes et ne pas malaxer ni homogénéiser.

(d)Homogénéiser les échantillons laitiers crus pendant 30 à 60 secondes après l’ajout de BPW-ISO préchauffé.

5

FR(Français)Instructions spécifiques pour méthodes validées

AOAC® Performance Tested MethodSM (PTM) certificat No 071902

Dans les études PTMSM de l’Institut de recherche de L’AOAC, le kit de détection moléculaire version 2 - STEC Screening
des Gènes (stx et eae) Neogen s’est avéré être une méthode efficace pour la détection des STEC. Les matrices testéesau cours de l’étude sont répertoriées dans le tableau 3.
Tableau 3. Protocole d’enrichissement selon l’AOAC PTMSM Certificat nº 071902.
Matrice del’échantillon

Taille del’échantillon

Volume du bouillond’enrichissement (mL)Températured’enrichissement(± 1 °C)

Durée
Volumed’enrichissement d’échantillon(h)d’analyse (µL)

Émincé debœuf cru(a)375 g

1 125 BPW ISO(préchauffé)

41,5

10-18

20

Bœuf cru haché(a)375 g

1 125 BPW ISO(préchauffé)

41,5

10-18

20

Bœuf cru haché(a)25 g225 BPW ISO(préchauffé)

41,5

10-18

20

Porc cru haché(a)375 g

1 125 BPW ISO(préchauffé)

41,5

10-18

20

Morceaux devolaille crus(a)375 g

1 125 BPW ISO(préchauffé)

41,5

10-18

20

Poulet séparé
mécaniquement

25 g

EPT 225 ml (ISO)(pré-chauffée)

41,5

10-24

20

Épinards(b)200 g

450 BPW ISO(préchauffé)

41,5

18-24

20

Choux(c)25 g

225 BPW ISO(préchauffé)

41,5

18-24

20

Fleur de cannabisséchée, fleur dechanvre séchée(4)10 g

EPT 90 ml (ISO)

41,5

28-32

20

(a)

Pour les échantillons de bœuf (bœuf haché et émincé), ajouter le BPW-ISO préchauffé à l’échantillon de bœuf.
Malaxer à la main pendant 30-60 secondes pour disperser et briser les morceaux.

(b)Pour les épinards, ajouter le BPW-ISO préchauffé à la matrice. Rincer le diluant sur les feuilles et agiter doucement
pendant 30 à 60 secondes. Ne pas malaxer ou homogénéiser les feuilles.

(c)

Pour les graines germées, rincer le bouillon d’enrichissement (BPW-ISO préchauffé) sur les graines germées pendant
30 à 60 secondes et ne pas malaxer ni homogénéiser.

(d)Fleur de cannabis séchée (> 0,3 % THC) et fleur de chanvre séchée (≤ 0,3 % THC)

Préparation du plateau de chargement rapide pour système de détection moléculaire Neogen®
1. Humidifier un chiffon ou une serviette jetable à l’aide d’une solution de 1-5 % d’eau de Javel (v:v dans de l’eau) et
nettoyer le plateau de chargement rapide pour système de détection moléculaire Neogen.
2. Rincer le plateau de chargement rapide pour système de détection moléculaire Neogen à l’eau.
3. Utiliser un chiffon jetable pour sécher le plateau de chargement rapide pour système de détection moléculaire Neogen.
4. S’assurer que le plateau de chargement rapide pour système de détection moléculaire Neogen est sec avant toute utilisation.
6

FR(Français)Préparation du support de bloc refroidissant pour système de détection moléculaire Neogen®
Poser le support de bloc refroidissant pour système de détection moléculaire Neogen sur le plan de travail dulaboratoire : le plateau de bloc refroidissant pour système de détection moléculaire Neogen n’est pas utilisé. Utiliser lebloc refroidissant à la température ambiante du laboratoire (20 et 25 °C).
Préparation du support de bloc chauffant pour système de détection moléculaire Neogen®
Placer le support de bloc chauffant pour système de détection moléculaire Neogen dans une unité de traitement
thermique à sec à double bloc. Allumer l’unité de traitement thermique à sec et régler la température afin que le support
de bloc chauffant pour système de détection moléculaire Neogen atteigne et conserve une température de 100 ± 1 °C.
REMARQUE : selon l’unité de traitement thermique utilisée, le support de bloc chauffant pour système de détection
moléculaire Neogen atteint la température souhaitée en 30 minutes environ. Utiliser un thermomètre étalonné adapté(p. ex., un thermomètre à immersion partielle ou un thermomètre à thermocouple numérique, et non un thermomètreà immersion totale) placé à l’endroit indiqué du support de bloc chauffant pour système de détection moléculaire
Neogen afin de vérifier que sa température est de 100 ± 1 °C.
Préparation de l’instrument de détection moléculaire Neogen®
1. Lancer le logiciel du Système de détection moléculaire Neogen et ouvrir une session. Contacter le représentant
Neogen Sécurité Alimentaire pour s’assurer d’avoir la version la plus récente du logiciel.
2. Mettre l’instrument de détection moléculaire Neogen sous tension.
3. Créer ou modifier une analyse en saisissant les données pour chaque échantillon. Pour plus de précisions, consulter
le manuel d’utilisation du système de détection moléculaire Neogen.
3.1.

La sélection de l’icône STXEAE-2 dans le logiciel sélectionne deux puits adjacents (comme A1, A2, B1, B2,etc.), un pour stx et l’autre pour le tube de réactif eae, car chaque échantillon est soumis à deux tests. Le NC
est configuré pour chaque tube de réactif et un RC est configuré pour le kit.
1
SAL-2

A

ECO-2
LIS-2

B

LMO-2
CAM-2

C

CRO-2
STXEAE-2
STX-2
EAE-2
MC-2

D
E
F
G
H

2

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

RC

2 STXEAE
2

NC

STX 2

NC
EAE

REMARQUE : l’instrument de détection moléculaire Neogen doit être prêt avant l’insertion du plateau de chargement
rapide pour système de détection moléculaire Neogen, dans lequel sont placés les tubes de réactif. Cette étape dechauffage prend environ 20 minutes ; pendant ce processus, un voyant lumineux ORANGE s’allume sur la barre d’étatde l’instrument. Lorsque l’instrument est prêt pour l’analyse, la barre d’état passe au VERT.

Lyse

Retirer le portoir pour tubes de solution de lyse Neogen avec un tournevis ou une spatule avant de le placer dans lesupport de bloc chauffant pour système de détection moléculaire Neogen.

7

FR(Français)1. Laisser les tubes de solution de lyse Neogen se réchauffer en plaçant le support à température ambiante (20 et
25 °C) pendant une nuit (16 et 18 heures). Il est également possible d’amener les tubes de solution de lyse Neogen à
température ambiante en les plaçant sur le plan de travail du laboratoire pendant au moins 2 heures, en incubant les
tubes de solution de lyse Neogen dans un incubateur à 37 ± 1 °C pendant 1 heure ou en les plaçant dans une unitéde traitement thermique à sec double bloc pendant 30 secondes à 100 °C.
2. Retourner les tubes recouverts d’un bouchon pour les mélanger. Passer à l’étape suivante dans un délai de 4 heuresaprès avoir retourné les tubes.
3. Retirer l’échantillon enrichi de l’incubateur.
4. Un tube de solution de lyse Neogen est nécessaire pour chaque échantillon et pour l’échantillon NC (milieu
d’enrichissement stérile).
4.1.

Les barrettes de tubes de solution de lyse Neogen peuvent être coupées de manière à obtenir le nombre detubes souhaité. Sélectionner le nombre de tubes ou de barrettes de 8 tubes nécessaire. Placer les tubes desolution de lyse Neogen dans un portoir vide.

4.2.

Pour éviter toute contamination croisée, ouvrir une barrette de tube de solution de lyse Neogen à la fois et
utiliser un nouvel embout de pipette pour chaque étape de transfert.

4.3.

Transférer l’échantillon enrichi dans les tubes de solution de lyse Neogen comme indiqué ci-dessous :Transférer tout d’abord chaque échantillon enrichi dans des tubes de solution de lyse Neogen individuels.
Transférer le NC en dernier.
4.4.

Ouvrir les barrettes de tubes de solution de lyse Neogen une à une à l’aide de l’outil d’ouverture/fermeturepour système de détection moléculaire Neogen® - Lyse.

4.5.

Jeter le bouchon du tube de solution de lyse Neogen. Si le lysat doit être soumis à un nouveau test, placer lesbouchons dans un récipient propre pour réapplication après la lyse.
4.5.1. Pour le traitement du lysat conservé, voir l’annexe A.

4.6.

Transférer 20 µL d’échantillon dans un tube de solution de lyse Neogen.

5. Répéter les étapes 4.4 à 4.6 en fonction des besoins pour tous les échantillons à analyser.
6. Une fois tous les échantillons transférés, transférer 20 µL de NC (milieu d’enrichissement stérile, p. ex. BPW) dans un
tube de solution de lyse Neogen. Ne pas utiliser d’eau comme NC.
7. Vérifier que la température du support de bloc chauffant pour système de détection moléculaire Neogen est de
100 ± 1 °C.
8. Placer le portoir non couvert de tubes de solution de lyse Neogen dans le support de bloc chauffant pour systèmede détection moléculaire Neogen et chauffer pendant 15 ± 1 minutes. Lors du chauffage, la solution de lyse Neogen
passera de rose (froide) à jaune (chaude).
8.1.

Les échantillons qui n’ont pas été soumis à un traitement thermique adéquat pendant l’étape de lyse peuventêtre considérés comme potentiellement dangereux et ne doivent PAS être insérés dans l’instrument dedétection moléculaire Neogen.

9. Retirer le portoir non couvert de tubes de solution de lyse Neogen du bloc chauffant pour système de détection
moléculaire Neogen et laisser refroidir dans le support de bloc refroidissant pour système de détection moléculaire
Neogen pendant au moins 5 minutes et au plus 10 minutes. Utilisé à température ambiante sans le plateau de bloc
refroidissant pour système de détection moléculaire Neogen®, le support de bloc refroidissant pour système dedétection moléculaire Neogen doit être posé directement sur le plan de travail du laboratoire. Une fois froide, lasolution de lyse Neogen retrouvera une couleur rose.

8

FR(Français)10. Retirer le couvercle des tubes de solution de lyse Neogen du support de bloc refroidissant pour système dedétection moléculaire Neogen.
00:15:00

99–101 ºC

20–25 ºC

00:05:00

Amplification

1. Un tube de réactif pour le kit de détection moléculaire version 2 - STEC Screening des Gènes (stx) Neogen et
un tube de réactif pour le kit de détection moléculaire version 2 - STEC Screening des Gènes (eae) Neogen sontnécessaires pour chaque échantillon et pour le NC.
1.1.

Les barrettes de tubes peuvent être coupées de manière à obtenir le nombre de tubes souhaité. Sélectionnez
le nombre nécessaire de tubes de réactif individuels ou de bandes de 8 tubes du Neogen Kit de détection
moléculaire version 2 - STEC Screening des Gènes (stx) et du Neogen Kit de détection moléculaire
version 2 - STEC Screening des Gènes (eae).

1.2.

Placer les tubes du Neogen Kit de détection moléculaire version 2 - STEC Screening des Gènes (stx) dans un
portoir vide dans une colonne.

1.3.

Placer les tubes du Neogen Kit de détection moléculaire version 2 - STEC Screening des Gènes(eae) dans lacolonne de droite adjacente.

1.4.

Éviter de toucher les pastilles réactives se trouvant au fond des tubes.

2. Sélectionner un tube de contrôle de réactif Neogen et le placer dans le portoir.
3. Pour le lysat NC, sélectionner un tube de réactif du kit de détection moléculaire version 2 - STEC Screening desGènes (stx) Neogen et un tube de réactif du kit de détection moléculaire version 2 - STEC Screening des Gènes(eae) Neogen et les placer dans le portoir.

4. Afin d’éviter toute contamination croisée, ouvrir une barrette de tubes de réactif du kit de détection moléculaire
version 2 - STEC Screening des Gènes (stx ou eae) Neogen à la fois et utiliser un nouvel embout de pipette pourchaque étape de transfert.
5. Transférer chacun des lysats dans un tube de réactif du kit de détection moléculaire version 2 - STEC Screening desGènes (stx ou eae) Neogen comme décrit ci-dessous.
5.1.

Tout d’abord, transférer chaque lysat d’échantillon dans un tube de réactif du kit de détection moléculaire
version 2 - STEC Screening des Gènes (stx) Neogen comme décrit aux étapes 5.5 et 5.6.

5.2.

Ensuite, transférer chacun des mêmes lysats d’échantillon dans un tube de réactif du Kit de détection
moléculaire version 2 - STEC Screening des Gènes (eae) Neogen dans la colonne de droite adjacente commedécrit aux étapes 5.5 et 5.6.

REMARQUE : Utiliser un nouvel embout de pipette pour chaque transfert. Ne pas utiliser le même embout depipette pour le transfert dans le tube de réactif stx et eae du même échantillon de lysat.
9

FR(Français)5.3.

Après tous les transferts de lysats d’échantillon, ajoutez le lysat de NC dans chacun des tubes de réactif
du kit de détection moléculaire version 2 - STEC Screening des Gènes (stx) Neogen et du kit de détection
moléculaire version 2 - STEC Screening des Gènes (eae) Neogen.

5.4.

Transférer le lysat NC en dernier dans le tube de contrôle de réactif.

5.5.

Ouvrir les tubes de réactif du Neogen Kit de détection moléculaire version 2 - STEC Screening des Gènes(stx ou eae) à l’aide de l’outil d’ouverture/fermeture pour système de détection moléculaire Neogen® - Réactif,
une barrette à la fois. Jeter le bouchon.

5.6.

Transférer 20 µL de lysat d’échantillon de la moitié supérieure du liquide (éviter le précipité) du tube
de solution de lyse Neogen dans le tube de réactif correspondant du Neogen Kit de détection moléculaire
version 2 - STEC Screening des Gènes (stx ou eae). Incliner la pipette pour ne pas toucher les pastilles.
Mélanger en effectuant 5 cycles d’aspiration / de refoulement avec la pipette.

REMARQUE : Utiliser un nouvel embout de pipette pour chaque transfert. Ne pas utiliser le même emboutde pipette pour le transfert dans le tube de réactif stx et eae du même échantillon de lysat.
5.7.

Répéter l’étape 5.6 jusqu’à ce que le lysat de l’échantillon individuel ait été ajouté à un tube de réactif
correspondant du kit de détection moléculaire version 2 - STEC Screening des Gènes (stx ou eae) Neogen
dans la barrette.

5.8.

Placer la capsule supplémentaire prévue à cet effet sur les tubes de réactif du kit de détection moléculaire
version 2 - STEC Screening des Gènes (stx ou eae) Neogen puis prendre le bord arrondi de l’outil d’ouverture/
fermeture pour système de détection moléculaire Neogen - Réactif et appuyer dans un mouvement de va-etvient afin de s’assurer que la capsule est fermement insérée sur le tube.

5.9.

Répétez les étapes 5.6 à 5.8 au besoin, pour le nombre d’échantillons à tester pour les deux tubes de réactifs
du kit de détection moléculaire version 2 - STEC Screening des Gènes (stx et eae) Neogen.

5.10. Lorsque tous les lysats d’échantillon ont été transférés, répéter 5.6 à 5.8 pour transférer 20 µL de lysat NC
dans chaque tube de réactif du kit de détection moléculaire version 2 - STEC Screening des Gènes (stx)
Neogen et du kit de détection moléculaire version 2 - STEC Screening des Gènes (eae) Neogen.
5.11. Transférer 20 µL de lysat de NC dans un tube de contrôle de réactif Neogen. Incliner la pipette pour ne pas
toucher les pastilles. Mélanger en effectuant 5 cycles d’aspiration / de refoulement avec la pipette.
Transférer chaque lysat d’échantillon dans un tube de réactif du kit de détection moléculaire version 2 - STEC
Screening des Gènes (stx ou eae) Neogen d’abord suivi par le NC. Hydrater le tube de contrôle de réactif
Neogen en dernier.
6. Charger les tubes recouverts d’un bouchon dans un plateau de chargement rapide pour système de détection
moléculaire Neogen propre et décontaminé, puis fermer et verrouiller le couvercle.

10

FR

(Français)7. Examiner et confirmer l’analyse configurée sur le logiciel du système de détection moléculaire Neogen.
8. Cliquer sur l’icône « Démarrer » du logiciel et sélectionner l’instrument à utiliser. Le couvercle de l’appareil
sélectionné s’ouvre automatiquement.
9. Placer le plateau de chargement rapide pour système de détection moléculaire Neogen dans l’instrument dedétection moléculaire Neogen et fermer le couvercle pour lancer l’essai. Les résultats sont obtenus en 60 minutes ;toutefois, les résultats positifs peuvent être détectés plus tôt.
10. Une fois l’analyse terminée, retirer le plateau de chargement rapide pour système de détection moléculaire Neogen
de l’instrument de détection moléculaire Neogen et tremper les tubes dans une solution d’eau de Javel à 1-5 % (v:vdans de l’eau) pendant 1 heure, et ce, à l’écart de la zone de préparation des analyses.
AVIS : pour réduire le risque de résultats faux positifs dus à une contamination croisée, ne jamais ouvrir les tubes deréactif contenant de l’ADN amplifié. Ceci inclut les tubes de réactif, de contrôle de réactif Neogen et de contrôle dematrice Neogen du kit de détection moléculaire version 2 - STEC Screening des Gènes (stx et eae) Neogen. Toujours
éliminer les tubes de réactif fermés en les trempant dans une solution d’eau de Javel à 1-5 % (v:v dans de l’eau)
pendant 1 heure, et ce à l’écart de la zone de préparation des analyses.

Résultats et interprétation

Un algorithme interprète la courbe de résultats provenant de la détection de l’amplification de l’acide nucléique.
Les résultats sont automatiquement analysés par le logiciel et sont codés par couleur en fonction du résultat. Un résultat
positif ou négatif est déterminé par l’analyse d’un nombre de paramètres des courbes individuelles. Les résultats
présumés positifs sont rapportés en temps réel tandis que les résultats négatifs ou à vérifier sont affichés à la fin
de l’essai.
Le logiciel du Système de détection moléculaire Neogen rapporte les résultats séparément pour chacun des tests (stxet eae) et utilise les résultats des deux tests pour considérer l’échantillon positif ou négatif pour les STEC (EHEC) (voirFigure ci-dessous). Pour un positif présumé pour le STEC (EHEC), les deux cibles génétiques (stx1 et/ou stx2 et eae)
doivent être positives. Si l’un des dosages individuels montre une erreur ou une vérification, le résultat final sera
« Erreur » ou « À vérifier ». Un nouveau test est nécessaire pour appeler correctement le résultat final (voir touche derésultat). Le logiciel permet également de mettre en place des tests individuels si nécessaire, et le lysat d’échantillon ou
le lysat frais provenant de l’enrichissement peuvent être testés à nouveau avec les tests, en suivant les étapes décrites àl’Annexe A pour les lysats conservés et les étapes de la section Lyse et Amplification pour l’enrichissement conservé.

11

FR

(Français)Touches de résultat de lysat d’échantillon enrichi+ +2 + Deux résultats positifs, résultat final positif2+ -2 – stx positif, eae négatif, résultat final négatif2+ ?2 ? stx positif, eae à inspecter, résultat final à inspecter, analyser de nouveau2+ 2
stx positif, eae erroné, résultat final erroné, analyser de nouveau2– 2 + stx négatif, eae positif, résultat final négatif2– -2 – stx négatif, eae négatif, résultat final négatif2– ?2 ? stx négatif, eae à inspecter, résultat final à inspecter, analyser de nouveau2
stx négatif, eae erroné, résultat final erroné, analyser de nouveau– 22?
? 2 + stx à inspecter, eae positif, résultat final à inspecter, analyser de nouveau2? ?2 – stx à inspecter, eae négatif, résultat final à inspecter, analyser de nouveau
2
STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

? ?2 ?
2stx à inspecter, eae à inspecter, résultat final à inspecter, analyser de nouveau?

stx à inspecter, eae erroné, résultat final erroné, analyser de nouveau

STX

2

STX

EAE

2

EAE

2

STX

2

STX

+
2
–
2

2

STX

2

2

STX

2

stx erroné, eae positif, résultat final erroné, analyser de nouveau?

stx erroné, eae à inspecter, résultat final erroné, analyser de nouveau

EAE
EAE
EAE
EAE

stx erroné, eae négatif, résultat final erroné, analyser de nouveau
stx erroné, eae erroné, résultat final erroné, analyser de nouveau

Touches de contrôle négatif
2
2
2
2
2
2

NC
STX

NC
STX

NC
STX

NC
STX

NC
STX

NC
STX

2
2
2
2
2
2

NC
EAE

NC
EAE

NC
EAE

NC
EAE

NC
EAE

NC
EAE

Deux résultats valides, lien valideUn résultat valide, un résultat erroné, erreur de lien, analyser de nouveau
Un résultat valide, un résultat non valide, lien non valide, analyser de nouveau
Deux résultats erronés, lien erroné, analyser de nouveau
Deux résultats non valides, lien non valide, analyser de nouveau
Un résultat erroné, un résultat non valide, lien erroné, analyser de nouveau

Les échantillons présumés positifs doivent être confirmés conformément aux modes opératoires normalisés dulaboratoire ou en suivant la confirmation par une méthode de référence appropriée(1, 2, 3), en commençant par le transfert
du bouillon d’enrichissement primaire vers des géloses sélectives et la confirmation des isolats à l’aide de méthodes
biochimiques et sérologiques appropriées. Pour les matrices spécifiées par MLG 5C, la séparation immunomagnétique(IMS) doit être effectuée avant l’inoculation sur un milieu sélectif.
REMARQUE : même un échantillon négatif ne donnera pas de résultat égal à zéro, car le système et les réactifs
d’amplification du kit de détection moléculaire version 2 - STEC Screening des Gènes (stx et eae) Neogen effectuent
une lecture d’unité relative de lumière (RLU) « de base ».
Dans le cas peu probable d’un résultat inhabituel, l’algorithme considérera ce dernier comme « À vérifier ».
Neogen recommande à l’utilisateur de recommencer l’essai pour tout échantillon considéré comme « À vérifier ». Si lerésultat continue à être « À vérifier », passer au test de confirmation en utilisant la méthode(1, 2, 3) de votre choix ou en
utilisant une méthode conforme aux règlementations locales.

12

FR

(Français)

Tableau 4. Symboles et informations pour divers résultats logiciels.
Type depuits

Symbole durésultat du puits

Échantillon
Échantillon+–

Échantillon

Échantillon?

Échantillon

Résultat Interprétation
PositifL’échantillon est présumé positif pour le pathogène cible.

NégatifL’échantillon est négatif pour le pathogène cible.

Inhibé

La matrice de l’échantillon est inhibée pour le dosage. Un second
test peut être nécessaire. Consulter la section de dépannage et les
instructions relatives au produit du kit de détection pour obtenir plusde renseignements.

À
vérifier

La présence ou l’absence du pathogène cible est indéterminée. Un second
test peut être nécessaire. Consulter la section de dépannage et les
instructions relatives au produit du kit de détection pour obtenir plusde renseignements.

ErreurAucune bioluminescence n’a été détectée. Un second test peut êtrenécessaire. Consulter la section de dépannage et les instructions relatives
au produit du kit de détection pour obtenir plus de renseignements.

Annexe A. Interruption du protocole : conservation et nouveau test des échantillons

1. Pour conserver un lysat soumis à un traitement thermique, refermer le tube de solution de lyse Neogen avec unbouchon propre (se reporter à la section Lyse, 4.5).
2. Pour conserver un échantillon enrichi, incuber pendant au moins 18 heures avant la conservation.
3. Stocker à une température comprise entre 4 et 8 °C jusqu’à 72 heures.
4. Préparer un échantillon conservé pour amplification en retournant 2 à 3 fois pour mélanger.
5. Ouvrir les tubes.
6. Placer les tubes pour lysats mélangés dans le support de bloc chauffant pour système de détection moléculaire
Neogen et chauffer à 100 ± 1 °C pendant 5 ± 1 minutes.
7. Retirer le portoir de tubes de solution de lyse Neogen du bloc chauffant pour système de détection moléculaire
Neogen et laisser refroidir dans le support de bloc refroidissant pour système de détection moléculaire Neogen
pendant au moins 5 minutes et au plus 10 minutes.
8. Poursuivre le protocole à la section Amplification détaillée ci-dessus.

Références :1. Microbiology Laboratory Guidebook. U. S. Department of Agriculture (USDA) Food Safety and Inspection Service(FSIS) Microbiology Laboratory guidebook 5C.00. Detection and isolation of top seven Shiga toxin-producing
Escherichia coli (STECs) from meat products and carcass and environmental sponges. Feb 4, 2019.
2. US Food and Drug Administration Bacteriological Analytical Manual. Chapter 4A: Diarrheagenic Escherichia coli.
October 2018.
3. ISO/TS 13136:2012: Microbiology of food and animal feed — Real-time polymerase chain reaction (PCR)-based
method for the detection of food-borne pathogens — Horizontal method for the detection of Shiga toxin-producing
Escherichia coli (STEC) and the determination of O157, O111, O26, O103 and O145 serogroups
4. U.S. Food and Drug Administration. Code of Federal Regulations, Title 21, Part 58. Good laboratory practice fornonclinical laboratory studies.
5. ISO/IEC 17025. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories.
6. ISO 7218. Microbiology of food and animal feeding stuffs - General rules for microbiological examination.
7. Neogen Installation Qualification (IQ) / Operational Qualification (OQ) Protocols and Instructions for Neogen Molecular
Detection System. Contacter un représentant de Neogen Sécurité Alimentaire pour obtenir un exemplaire de ce document.

Explication des symboles
info.neogen.com/symbols

13

Neogen Food Safety
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620 Lesher Place
Lansing, MI 48912 USA
Neogen.com
Neogen Europe Ltd.
The Dairy School
Auchincruive
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Neogen est une marque de commerce de Neogen.
Toutes les autres marques decommerce appartiennent à leur propriétaire respectif.
FS00918A

DE (Deutsch)
Erscheinungsdatum: 2024-01

Gebrauchsanweisungen
Molekulares Detektions Assay 2 - STEC Gene Screen (stx und eae)
Produktbeschreibung und Verwendungszweck

Der Neogen® Molekulares Detektions Assay 2 - STEC Gene Screen (stx und eae) wird mit dem Neogen® Molekulares
Detektionssystem für den schnellen und spezifischen Nachweis von Shigatoxin-Genen (stx1 und stx2) und IntiminGen (eae) von Shigatoxin-produzierenden E. coli (STEC, auch als „Verotoxin-produzierende E. coli“ bezeichnet) inangereicherten Proben aus Lebensmitteln und Umgebungen der Lebensmittelverarbeitung verwendet. Der Begriff STEC
bezieht sich auf E. coli-Pathotypen, die in der Lage sind, Shigatoxin-Typ1 (stx1), -Typ 2 (stx2) oder beide zu produzieren,
die durch das Gen stx1 bzw. stx2-Gen kodiert werden. STEC-enthaltende Virulenzgene für stx1 und/oder stx2 undeae (Am Attaching/Effacing des Phenotyps beteiligtes Intimin-Gen) sind designierte enterohämorrhagische E. coli
(EHEC). Das Screening-Kit enthält zwei separate Reagenzgefäße: eines für den Nachweis der virulenten Gene stx1 und/oder stx2 und das andere für den Nachweis von eae aus STEC (EHEC). Die Neogen® Molekulares Detektionssystem –Software meldet Ergebnisse separat für jeden Assay und verwendet Ergebnisse beider Assays, um die Probe als STEC(EHEC) positiv oder negativ zu bezeichnen. Für ein vorläufig positives Ergebnis für STEC (EHEC) müssen beide Genziele(stx1 und/oder stx2 und eae) positiv sein. Der stx-Assay unterscheidet nicht zwischen stx1 und stx2, weist jedoch das
Vorhandensein von stx1 und/oder stx2 nach.
Der Neogen Molekulares Detektions Assay verwendet die mittels einer „Loop“ initiierte isotherme Amplifikation, um
Nukleinsäuresequenzen mit hoher Spezifität, Sensitivität und Geschwindigkeit zu amplifizieren, und kombiniert diese mit
Biolumineszenz für den Nachweis der Amplifikation. Die vorläufig positiven Ergebnisse werden in Echtzeit erstellt, während
negative Ergebnisse erst nach Abschluss des Tests dargestellt werden. Die vorläufig positiven Ergebnisse sollten mithilfe
eines Testverfahrens Ihrer Wahl(1, 2, 3) oder gemäß den jeweils geltenden örtlichen Richtlinien bestätigt werden.
Der Neogen Molekulares Detektions Assay 2 ‑ STEC Gene Screen (stx und eae) ist für den Gebrauch in Laboren
bestimmt und muss von in Laborverfahren geschultem Fachpersonal angewendet werden. Neogen verfügt über keine
Daten zur Anwendung dieses Produkts in anderen Industrien als der Lebensmittel- und Getränkeindustrie. Zum Beispiel
verfügt Neogen über keine Daten zur Verwendung dieses Produkts mit Pharmazeutika-, Kosmetika- oder klinischen
und tiermedizinischen Proben. Der Neogen Molekulares Detektions Assay 2 - STEC Gene Screen (stx und eae) wurde
nicht für alle möglichen Lebensmittelprodukte, Lebensmittelverarbeitungsverfahren, Testprotokolle oder alle möglichen
Bakterienstämme evaluiert.
Wie bei allen Testverfahren können die Ergebnisse durch die Quelle, Zusammensetzung und Qualität des Anreicherungsmediums beeinflusst werden. Faktoren wie Probennahme, Testprotokolle, Probenaufbereitung, Handhabungund Labortechnik können die Ergebnisse beeinflussen. Neogen empfiehlt die Beurteilung der Methode einschließlich
Anreicherungsmedium in der Umgebung des Benutzers mit einer ausreichenden Anzahl an Proben mit bestimmten
Lebensmitteln und mikrobiellen Pathogenen, um sicherzustellen, dass die Methode den Anforderungen des Benutzers
entspricht.
Neogen hat den Neogen Molekulares Detektions Assay 2 - STEC Gene Screen (stx und eae) mit gepuffertem
Peptonwasser (BPW)-ISO als Anreicherungsbouillon evaluiert.
Das Neogen® Molekulare Detektion – Gerät ist für die Verwendung mit Proben bestimmt, die während der Assay-Lyse
wärmebehandelt wurden, wodurch die in der Probe vorhandenen Organismen zerstört werden sollen. Proben, diewährend der Lyse nicht ordnungsgemäß wärmebehandelt wurden, stellen möglicherweise ein biologisches Risiko dar
und sollten NICHT in das Neogen Molekulare Detektion – Gerät eingesetzt werden.
Neogen Food Safety hat für die Bereiche Entwicklung und Fertigung die Zertifizierung ISO 9001 der Internationalen
Organisation für Normung (ISO) erhalten.
Das Testkit für den Neogen Molekulares Detektions Assay 2 - STEC Gene Screen (stx und eae) enthält jeweils 48 Tests
mit stx- und eae-Reagenzien, die in Tabelle 1 beschrieben werden.

1

DE (Deutsch)
Tabelle 1. Komponenten des Neogen Molekulares Detektions Assay-Kits.
ArtikelKennzeichnung

Stückzahl

InhaltKommentare

Neogen® Lyselösung (LS)

Rosafarbene
Lösung intransparenten
Gefäßen96 (12 Streifen mit
je 8 Gefäßen)580 µl LS pro Gefäß

Abgefüllt undgebrauchsfertig

Reagenzgefäße für den
Neogen® Molekulares
Detektions Assay 2 - STEC
Gene Screen (stx)Orangefarbene
Röhrchen48 (2 Beutel mit
je 3 Streifen à
8 Gefäße)Lyophilisierte
spezifische
Amplifikations- und
DetektionsmischungGebrauchsfertig

Reagenzgefäße für den
Neogen® Molekulares
Detektions Assay 2 - STEC
Gene Screen (eae)Rote Gefäße

48 (2 Beutel mit
je 3 Streifen à
8 Gefäße)Lyophilisierte
spezifische
Amplifikations- und
DetektionsmischungGebrauchsfertig

Zusätzliche Kappen

Orangefarbene
Kappen96 (12 Streifen mit
je 8 Kappen)

Gebrauchsfertig

Zusätzliche Kappen

Rote Kappen

96 (12 Streifen mit
je 8 Kappen)

Gebrauchsfertig

Neogen® Reagenzkontrolle(RC)

Durchsichtige
Gefäße16 (2 Beutel
mit 8 einzelnen
Gefäßen)

Lyophilisierte KontrollDNS, Amplifikationsund Detektionsmatrix

Gebrauchsfertig

Die Negativkontrolle (NC), nicht im Kit enthalten, ist ein steriles Anreicherungsmedium, z. B. BPW-ISO. Als
Negativkontrolle kein Wasser verwenden.
Eine Kurzanleitung finden Sie unter www.neogen.com

Sicherheit

Der Anwender muss sämtliche in der Gebrauchsanweisung des Neogen Molekulares Detektionssystem und desNeogen Molekulares Detektions Assay 2 - STEC Gene Screen (stx und eae) aufgeführten Sicherheitshinweise gelesen
und verstanden haben. Bewahren Sie diese Sicherheitshinweise auf, um später auf sie zurückgreifen zu können.
WARNUNG: Bezeichnet eine Gefahrensituation, die – wenn sie nicht vermieden wird – zum Tode oder zu schweren
Verletzungen und/oder Sachschäden führen kann.
HINWEIS: Bezeichnet eine potenzielle Gefahrensituation, die – wenn sie nicht vermieden wird – zu Sachschäden
führen kann.

WARNUNGDen Neogen Molekulares Detektions Assay 2 - STEC Gene Screen (stx und eae) nicht zur Diagnose vonErkrankungen bei Menschen oder Tieren einsetzen.
Der Anwender muss sein Personal in den entsprechenden Testmethoden unterweisen: z. B. laut den Grundsätzen derguten Laborpraxis(4), ISO/IEC 17025(5) oder ISO 7218(6).
Maßnahmen zur Reduzierung der mit einem falsch negativen Ergebnis verbundenen Risiken, die zur Freigabe eines
kontaminierten Produkts führen können:• Befolgen Sie das Protokoll und führen Sie die Tests genau wie in der Gebrauchsanweisung angegeben durch.
• Lagern Sie den Neogen Molekulares Detektions Assay 2 - STEC Gene Screen (stx und eae) wie auf der Packung und
in den Gebrauchsanweisungen beschrieben.
• Verwenden Sie den Neogen Molekulares Detektions Assay 2 - STEC Gene Screen (stx und eae) stets vor Ablauf desVerfalldatums.
• Verwenden Sie den Neogen Molekulares Detektions Assay 2 - STEC Gene Screen (stx und eae) mit Lebensmittelund Umweltproben, die intern oder durch Dritte validiert wurden.
• Verwenden Sie den Neogen Molekulares Detektions Assay 2 - STEC Gene Screen (stx und eae) nur mit Oberflächen,
Desinfektionsmitteln, Protokollen und Bakterienstämmen, die intern oder durch Dritte validiert wurden.

2

DE (Deutsch)•

Wenn Sie eine Umgebungsprobe haben, die einen Neutralisationspuffer mit einem Acrylsulfonat-Komplex
enthält, dann müssen Sie vor dem Testen der Probe eine 1:2 Verdünnung (1 Teil Probe in 1 Teil steriler
Anreicherungsbouillon) vornehmen. Ebenso können Sie 10 µl Anreicherungsmedium mit Neutralisationspuffer
in die Neogen Lysegefäße übertragen. Neogen® Produkte zur Probenhandhabung, die Neutralisationspuffer mit
Acrylsulfonat-Komplex enthalten: RS96010NB, RS9604NB, SSL10NB, SSL10NB2G, HS10NB, HS10NB2G und
HS2410NB2G.

Zur Verminderung der Risiken, die mit der Exposition gegenüber Chemikalien und biogefährlichen Stoffen
verbunden sind:• Führen Sie die Testverfahren mit Pathogenen in einem entsprechend ausgerüsteten Labor und unter der Aufsicht
von geschultem Fachpersonal durch. Inkubierte Anreicherungsmedien und Arbeitsgeräte oder Oberflächen, die in
Kontakt mit inkubierten Anreicherungsmedien gekommen sind, können so stark mit Krankheitserregern belastet
sein, dass ein Risiko für die menschliche Gesundheit besteht.
• Befolgen Sie stets die üblichen Labor-Sicherheitsmaßnahmen und tragen Sie bei der Handhabung von Reagenzienund kontaminierten Proben angemessene Schutzkleidung und geeigneten Augenschutz.
• Vermeiden Sie nach der Amplifikation den Kontakt mit dem Anreicherungsmedium und den Reagenzgefäßen.
• Die angereicherten Proben sind gemäß lokaler/regionaler/landesweiter regulatorischer Standards zu entsorgen.
• Proben, die während der Lyse nicht ordnungsgemäß wärmebehandelt wurden, stellen möglicherweise ein bio-logisches
Risiko dar und sollten NICHT in das Neogen Molekulare Detektion – Gerät eingesetzt werden.
Zur Verminderung von Kreuzkontaminationsrisiken bei der Vorbereitung des Tests:• Tragen Sie stets Handschuhe (sowohl zum Schutz des Anwenders als auch, um ein Einbringen von Nukleasen zu
vermeiden).
Zur Verminderung der Risiken, die mit der Exposition gegenüber heißen Flüssigkeiten verbunden sind:• Achten Sie darauf, die empfohlene Temperatur des Heizgeräts nicht zu überschreiten.
• Achten Sie darauf, die empfohlene Anwärmdauer nicht zu überschreiten.
• Verwenden Sie ein geeignetes, kalibriertes Thermometer, um sicherzustellen, dass der Neogen® Molekulare
Detektion – Heizblockeinsatz die richtige Temperatur aufweist (z. B. ein Thermometer zum partiellen Eintauchenoder ein Digitalthermometer, kein Tauchthermometer). Das Thermometer muss an der vorgesehenen Stelle desNeogen Molekulare Detektion – Heizblockeinsatzes platziert werden.

HINWEIS
Zur Verminderung von Kreuzkontaminationsrisiken bei der Vorbereitung des Tests:• Wechseln Sie vor Hydratation der Reagenzpellets die Handschuhe.
• Es wird empfohlen, sterile, hochreine Pipettenspitzen mit Aerosolschutz (Filter) zu verwenden.
• Verwenden Sie für jede Probenübertragung eine neue Pipettenspitze.
• Wenden Sie die Grundsätze der Guten Laborpraxis bei der Übertragung der angereicherten Probe auf das
Lysegefäß an. Um eine Kontamination der Pipette zu vermeiden, sollte der Anwender bei der Übertragung einen
Zwischenschritt durchführen. Beispielsweise kann der Anwender jede angereicherte Probe auf ein steriles Gefäßübertragen.
• Sofern möglich, arbeiten Sie an einer molekularbiologischen Arbeitsstation mit Germizidlampe.
• Desinfizieren Sie die Laborbänke und Arbeitsgeräte (Pipetten, Cap/Decap-Werkzeuge usw.) regelmäßig mit einer
1–5%igen Haushaltsbleichmittellösung (v:v in Wasser) oder DNS-Entfernungslösung.
Zur Verminderung der Risiken, die mit einem falsch positiven Ergebnis verbunden sind:• Öffnen Sie die Reagenzgefäße niemals nach der Amplifikation.
• Kontaminierte Gefäße immer aus dem Nachweis-Vorbereitungsbereich entfernen, in 1–5%iger (v:v in Wasser)
Haushaltsbleichmittellösung für 1 Stunde einweichen und dann entsorgen.
• Autoklavieren Sie die Reagenzgefäße niemals nach der Amplifikation.
Weitere Informationen sowie die jeweils vor Ort geltenden Richtlinien zur Entsorgung entnehmen Sie bitte dem
Sicherheitsdatenblatt.
Sollten Sie Fragen zu bestimmten Anwendungen oder Verfahren haben, besuchen Sie unsere Website unter
www.neogen.com oder wenden Sie sich an den lokalen Neogen-Verkaufsvertreter oder Händler.

Verantwortung des Anwenders

Anwender müssen sich auf eigene Verantwortung mit den Gebrauchsanweisungen und Informationen des Produkts
vertraut machen. Für weitere Informationen besuchen Sie unsere Website unter www.neogen.com oder wenden Sie
sich an Ihren lokalen Neogen Verkaufsvertreter oder Händler.
3DE (Deutsch)
Bei der Auswahl einer Testmethode ist zu beachten, dass externe Faktoren wie Probennahme, Testprotokoll, Probenaufbereitung, Handhabung, Labortechnik und die Probe selbst die Ergebnisse beeinflussen können.
Es liegt in der Verantwortung des Anwenders bei der Auswahl einer Testmethode oder eines Produkts, diese mit einer
ausreichenden Anzahl von Proben und Kontrollen zu evaluieren, um sicherzustellen, dass die gewählte Testmethodeseinen Anforderungen entspricht.
Der Anwender trägt ebenfalls die Verantwortung dafür, dass die angewendeten Testmethoden und Ergebnisse den
Anforderungen seiner Kunden und Lieferanten entsprechen.
Wie bei allen Testmethoden, stellen die mit Neogen Lebensmittelsicherheitsprodukten erhaltenen Ergebnisse keine
Garantie für die Qualität der untersuchten Matrices oder Prozesse dar.
Als Unterstützung von Kunden bei der Validierung der Methode für verschiedene Lebensmittel-Matrices hat Neogen
das Set Neogen® Molekulare Detektion Matrixkontrolle entwickelt. Verwenden Sie bei Bedarf die Neogen Molekulare
Detektion – Matrixkontrolle (MC), um zu bestimmen, ob die Matrix in der Lage ist, die Ergebnisse des Neogen
Molekulares Detektions Assay 2 - STEC Gene Screen (stx und eae) zu beeinträchtigen. Testen Sie mehrere für die Matrix
repräsentative Proben, d. h. Proben unterschiedlicher Herkunft, während einer Validierungsphase, wenn die Neogen
Methode zum Einsatz kommt oder beim Testen neuer oder unbekannter Matrices oder Matrices, die Rohmaterial- oder
Verfahrensänderungen durchlaufen haben.
Eine Matrix kann als eine Produktart mit spezifischen Eigenschaften, z. B. in Bezug auf ihre Zusammensetzung undVerarbeitung, definiert werden. Unterschiede zwischen Matrices können so einfach sein wie die Auswirkungen, die vonUnterschieden bei deren Verarbeitung oder deren Präsentation (z. B. roh im Vergleich zu pasteurisiert; frisch im Vergleich
zu getrocknet usw.) verursacht werden.

Haftungsbeschränkungen/Beschränkte Rechtsmittel

AUSSER ES WIRD AUSDRÜCKLICH ANDERS IM ABSCHNITT DER HAFTUNGSBESCHRÄNKUNGEN DER VERPACKUNG DES JEWEILIGEN PRODUKTS ANGEGEBEN, LEHNT NEOGEN ALLE AUSDRÜCKLICHEN UND STILLSCHWEIGENDEN GARANTIEN, EINSCHLIESSLICH, JEDOCH NICHT BESCHRÄNKT AUF, DIE GEWÄHRLEISTUNG
DER MARKTGÄNGIGKEIT ODER DER EIGNUNG FÜR EINEN BESTIMMTEN ZWECK AB. Sollte sich ein Produkt
von Neogen Food Safety als defekt herausstellen, wird es von Neogen oder einem autorisierten Vertragshändler
nach eigenem Ermessen ersetzt oder der Kaufpreis zurückerstattet. Gewährleistungsansprüche bestehen nicht. Siesind verpflichtet, Neogen umgehend innerhalb von sechzig Tagen, nachdem die mutmaßlichen Defekte am Produkt
festgestellt wurden, darüber zu informieren und das Produkt an Neogen zurückzusenden. Bei weiteren Fragen wenden
Sie sich bitte an den Neogen-Verkaufsvertreter oder autorisierten Neogen-Händler.

Haftungsbeschränkungen von Neogen

NEOGEN HAFTET NICHT FÜR VERLUSTE ODER SCHÄDEN, GANZ GLEICH OB MITTELBARE, UNMITTELBARE,
SPEZIELLE, NEBEN- ODER FOLGESCHÄDEN EINSCHLIESSLICH, ABER NICHT BESCHRÄNKT AUF ENTGANGENEN
GEWINN. In keinem Fall übersteigt die Haftung von Neogen den Kaufpreis des angeblich defekten Produkts.

Lagerung und Entsorgung

Lagern Sie den Neogen Molekulares Detektions Assay 2 - STEC Gene Screen (stx und eae) bei 2–8 °C (35–47 °F). Nicht
einfrieren. Lichtgeschützt lagern. Vergewissern Sie sich nach dem Öffnen des Sets, dass der Folienbeutel unbeschädigt
ist. Verwenden Sie das Set keinesfalls bei beschädigtem Beutel. Nach dem Öffnen sollten nicht verwendete Reagenzgefäße gemeinsam mit dem Trockenmittel stets im wiederverschließbaren Beutel verwahrt werden, um die Stabilität derlyophilisierten Reagenzien sicherzustellen. Wiederverschlossene Beutel höchstens 90 Tage lang bei 2–8 °C (35–47 °F)
lagern.
Verwenden Sie den Neogen Molekulares Detektions Assay 2 - STEC Gene Screen (stx und eae) nicht nach Ablauf desVerfalldatums. Das Verfalldatum und die Chargennummer sind auf dem äußeren Etikett der Packung angegeben. Nachdem Gebrauch können das Anreicherungsmedium und die Gefäße des Neogen Molekulares Detektions Assay 2 - STEC
Gene Screen (stx und eae) pathogene Stoffe enthalten. Beachten Sie nach Abschluss der Testverfahren die gültigen
Branchennormen für die Entsorgung von kontaminierten Abfällen. Weitere Informationen sowie die jeweils vor Ort
geltenden Richtlinien zur Entsorgung entnehmen Sie bitte dem Sicherheitsdatenblatt.

Gebrauchsanweisung

Befolgen Sie alle Anweisungen genau. Andernfalls werden möglicherweise ungenaue Ergebnisse erzielt.
Desinfizieren Sie die Laborbänke und Arbeitsgeräte (Pipetten, Cap/Decap-Werkzeuge usw.) regelmäßig mit einer
1–5%igen Haushaltsbleichmittellösung (v:v in Wasser) oder DNS-Entfernungslösung.

4DE (Deutsch)
Der Anwender sollte die Funktionsqualifizierung (Operational Qualification, OQ) für das Neogen Molekulare
Detektionssystem absolvieren wie im Dokument „Protokolle und Anweisungen für Installationsqualifizierung (IQ) /Funktionsqualifizierung (OQ) für das Neogen Molekulare Detektionssystem“ beschrieben(7).
Spezifische Anweisungen finden Sie im Abschnitt „Spezielle Anweisungen für validierte Verfahren“:
Für Anreicherungsprotokolle gemäß Performance Tested MethodSM (PTM) Nr. 071902 in Tabelle 3.
Probenanreicherung
Tabelle 2 und 3 enthalten Richtlinien für das Anreichern von Lebensmittelproben.
Der Anwender ist selbst für die Validierung von alternativen Probennahmeprotokollen oder Verdünnungsverhältnissenverantwortlich, durch die sichergestellt werden muss, dass dieses Testverfahren den Anforderungen entspricht.
Lebensmittel
1. Anreicherungsmedium BPW ISO auf 41,5 ± 1 °C erwärmen.
2. Vereinen Sie das Anreicherungsmedium und die Probe gemäß einem aseptischen Verfahren. Bei der Handhabungvon Fleisch- und partikelreichen Proben wird die Verwendung von Filterbeuteln empfohlen.
3. Mischen Sie alle Matrices und inkubieren Sie sie wie in der entsprechenden Protokolltabelle beschrieben (siehe
Tabelle 2 oder 3).
Umgebungsproben
WARNUNG: Sollten Sie einen Neutralisationspuffer mit Acrylsulfonat-Komplex als Hydrierlösung für den Schwamm
verwenden, müssen Sie vor dem Testen eine 1:2-Verdünnung (1 Teil Probe in 1 Teil steriler Anreicherungsbouillon) derangereicherten Umgebungsprobe vornehmen, um die mit einem falsch negativen Ergebnis verbundenen Risiken, die zur Freigabe eines kontaminierten Produkts führen können, zu verringern. Ebenso können Sie 10 µl Anreicherungsmedium mit Neutralisationspuffer in die Neogen Lysegefäße übertragen.
Der Anwender ist selbst für die Validierung von alternativen Probennahmeprotokollen oder Verdünnungsverhältnissenverantwortlich, durch die sichergestellt werden muss, dass dieses Testverfahren den Anforderungen entspricht.
Tabelle 2. Allgemeine Anreicherungsprotokolle.
Probenmatrix

Probengröße

Anreicherungsbouillon
Volumen (ml)(vorgewärmt)Anreicherungstemperatur(± 1 °C)

Anreicherungszeit(Stunden)

Probenanalysevolumen (µl)

Rohes Rinderhackfleisch, Schabefleischund Abschnitte(a)375 g1125 BPW-ISO

41,5

10–18

20

Rohes Fleisch (Schwein,
Geflügel, Lamm, Bison)(a)375 g1125 BPW-ISO

41,5

10–18

20

Blattsalate(b)200 g

450 BPW-ISO

41,5

18–24

20

25 g

225 BPW-ISO

41,5

18–24

20

25 g oder 25 ml

225 BPW-ISO

41,5

18–24

20

Sprossen(c)

Rohmilchprodukte

(d)

(a)

Massieren Sie die Proben von Rindfleisch (Hackfleisch, Schabfleisch und Abschnitte) und Rohfleisch (Hackfleischvom Schwein, Geflügel und anderes als Rindfleisch) 30–60 Sekunden, um Klumpen nach Zugabe von vorgewärmtem
BPW-ISO aufzulösen und auseinanderzubrechen.

(b)

Gießen Sie bei Blattsalaten Anreicherungsbouillon (vorgewärmtes BPW-ISO) über die Blätter und schütteln Sie sie
sanft 30–60 Sekunden lang. Blätter nicht massieren oder homogenisieren.

(c)

Gießen Sie bei Sprossen 30–60 Sekunden lang Anreicherungsbouillon (vorgewärmtes BPW-ISO) über die Sprossen
und massieren oder homogenisieren Sie sie nicht.

(d)Homogenisieren Sie die Rohmilchprodukt-Proben nach Zugabe von vorgewärmtem BPW-ISO 30–60 Sekunden lang.

5DE (Deutsch)

Spezifische Anweisungen für validierte Verfahren

AOAC® Performance Tested MethodSM (PTM) Zertifikat-Nr. 071902

In PTMSM-Studien des AOAC-Forschungsinstituts wurde der Neogen Molekulares Detektions Assay 2 - STEC Gene
Screen (stx und eae) als effektive Methode für den Nachweis von STEC bewertet. Die in der Studie getesteten Matrices
sind in Tabelle 3 aufgeführt.
Tabelle 3. Anreicherungsprotokolle gemäß AOAC PTMSM Zertifikat Nr. 071902.
Probenmatrix

Probengröße

Rohes Rindfleisch,
Abschnitte(a)375 gRohes Hackfleisch,
Rind(a)Anreicherungstemperatur(± 1 °C)

Anreicherungszeit(Stunden)

Probenanalysevolumen (µl)

1125 BPW-ISO(vorgewärmt)

41,5

10–18

20

375 g

1125 BPW-ISO(vorgewärmt)

41,5

10–18

20

Rohes Hackfleisch,
Rind(a)25 g

225 BPW-ISO(vorgewärmt)

41,5

10–18

20

Rohes Hackfleisch,
Schwein(a)375 g1125 BPW-ISO(vorgewärmt)

41,5

10–18

20

Rohgeflügel-Teile(a)375 g1125 BPW-ISO(vorgewärmt)

41,5

10–18

20

Mechanischsepariertes
Hühnerfleisch25 g

225 BPW-ISO(vorgewärmt)

41,5

10–24

20

450 BPW-ISO(vorgewärmt)

41,5

18–24

20

Spinat(b)200 gAnreicherungsbouillon
Volumen (ml)Sprossen(c)25 g

225 BPW-ISO(vorgewärmt)

41,5

18–24

20

Getrocknete
Cannabisblüten,getrocknete
Hanfblüten(4)10 g

90 BPW-ISO

41,5

28–32

20

(a)

Geben Sie für Rindfleischproben (Hack- und Schabfleisch) vorgewärmte BPW-ISO zur Rindfleischprobe. 30–60
Sekunden lang von Hand massieren, um Klumpen aufzulösen und zu zerteilen.

(b)Geben Sie für Spinat vorgewärmtes BPW-ISO zur Matrix. Gießen Sie die Flüssigkeit über die Blätter und schütteln Siesie sanft 30–60 Sekunden lang. Blätter nicht massieren oder homogenisieren.

(c)

Gießen Sie für Sprossen 30–60 Sekunden lang Anreicherungsbouillon (vorgewärmtes BPW-ISO) über die Sprossen
und massieren oder homogenisieren Sie sie nicht.

(d)Getrocknete Cannabisblüten (>0,3 % THC) und getrocknete Hanfblüten (≤0,3 % THC)

Vorbereitung der Neogen® Molekulare Detektion – Beladehilfe
1. Befeuchten Sie ein Tuch oder ein Einwegtuch mit einer 1-5%igen Haushaltsbleichmittellösung (v:v in Wasser) undwischen Sie die Neogen Molekulare Detektion – Beladehilfe ab.
2. Spülen Sie die Neogen Molekulare Detektion – Beladehilfe mit Wasser ab.
6DE (Deutsch)
3. Trocknen Sie die Neogen Molekulare Detektion – Beladehilfe mit einem Einmalhandtuch.
4. Vergewissern Sie sich, dass die Neogen Molekulare Detektion – Beladehilfe vor dem Gebrauch trocken ist.
Vorbereitung des Neogen® Molekulare Detektion – Kühlblockeinsatzes
Stellen Sie den Neogen Molekulare Detektion – Kühlblockeinsatz direkt auf die Laborbank: Der Neogen Molekulare
Detektion – Kühlblockträger wird nicht verwendet. Verwenden Sie den Block bei Laborraumtemperatur (20–25 °C).
Vorbereitung des Neogen® Molekulare Detektion – Heizblockeinsatzes
Legen Sie den Neogen Molekulare Detektion – Heizblockeinsatz in ein Trocken-Doppelblock-Heizgerät. Schalten Sie
das Trockenblock-Heizgerät ein und stellen Sie die Temperatur für den Neogen Molekulare Detektion – Heizblockeinsatz
auf 100 ± 1 °C ein.
HINWEIS: Warten Sie je nach Heizgerät etwa 30 Minuten, bis der Neogen Molekulare Detektion – Heizblockeinsatz
die geeignete Temperatur erreicht hat. Stellen Sie mit einem kalibrierten Thermometer (z. B. ein Thermometer zum
partiellen Eintauchen oder ein Digitalthermometer, kein Tauchthermometer) an der vorgesehenen Messposition fest,
ob der Neogen Molekulare Detektion – Heizblockeinsatz die erforderliche Temperatur von 100 ± 1 °C erreicht hat.
Vorbereitung des Neogen® Molekulare Detektion – Geräts
1. Starten Sie die Neogen Molekulares Detektionssystem – Software und loggen Sie sich ein. Setzen Sie sich mit dem
Ihrem Neogen Food Safety Vertreter in Verbindung, um sicherzustellen, dass Sie über die aktuellste Softwareversion
verfügen.
2. Schalten Sie das Neogen Molekulare Detektion – Gerät ein.
3. Erstellen oder bearbeiten Sie für jede Probe einen Testdurchlauf. Weitere Details entnehmen Sie bitte dem
Benutzerhandbuch zum Neogen Molekularen Detektionssystem.
3.1.

Durch Auswahl des STXEAE-2-Symbols in der Software werden zwei nebeneinander liegende Vertiefungen(wie z. B. A1, A2, B1, B2 usw.) ausgewählt, eine für das stx- und die andere für das eae-Reagenzgefäß, da jede
Probe mit zwei Assays durchgeführt wird. Die Negativkontrolle ist für die einzelnen Reagenzgefäße und eine
Reagenzkontrolle ist für das Kit vorbereitet.
1
SAL-2

A

ECO-2
LIS-2

B

LMO-2
CAM-2

C

CRO-2
STXEAE-2
STX-2
EAE-2
MC-2

D
E
F
G
H

2

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

RC

2 STXEAE
2

NC

STX 2

NC
EAE

HINWEIS: Das Neogen Molekulare Detektion – Gerät muss bereit sein, bevor die Neogen Molekulare Detektion –Beladehilfe mit den Reaktionsgefäßen eingesetzt werden kann. Dieses Erwärmungsverfahren nimmt etwa 20 Minuten
in Anspruch und wird durch eine ORANGEFARBENE Leuchte auf der Statusleiste des Geräts angezeigt. Sobald das
Gerät einsatz-bereit ist, wechselt die Leuchte der Statusleiste auf GRÜN.

Lyse

Entfernen Sie die Unterseite des Neogen Lyselösungsträgers mit einem Schraubendreher oder Spatel, bevor Sie ihn im
Neogen Molekulare Detektion – Heizblockeinsatz platzieren.

7DE (Deutsch)

1. Lassen Sie die Neogen Lyselösung im Gefäß über Nacht (16–18 Stunden) bei Raumtemperatur (20–25 °C)
aufwärmen. Um die Neogen Lysegefäße auf Raumtemperatur zu erwärmen, können Sie die Neogen Lysegefäße fürmindestens 2 Stunden auf die Laborbank stellen, für 1 Stunde bei 37 ± 1 °C inkubieren oder die Neogen Lysegefäße
für 30 Sekunden bei 100 °C in ein Trocken-Doppelblock-Heizgerät setzen.
2. Mischen Sie die mit Kappen verschlossenen Gefäße. Fahren Sie innerhalb von 4 Stunden nach dem Mischen mit
dem nächsten Schritt fort.
3. Nehmen Sie die angereicherte Probe aus dem Inkubator.
4. Für jede Probe (steriles Anreicherungsmedium) und die NC wird jeweils ein Gefäß mit Neogen Lyselösung benötigt.
4.1.

Die Neogen Lysegefäßstreifen können auf die gewünschte Anzahl an Gefäßen zurechtgeschnitten
werden. Wählen Sie die erforderliche Anzahl Gefäße oder Streifen mit 8 Gefäßen aus. Setzen Sie die
Neogen Lysegefäße in einen leeren Gefäßträger.

4.2.

Um eine Kreuzkontamination zu vermeiden, öffnen Sie jeweils nur einen Neogen Lysegefäßstreifen undverwenden Sie bei jeder einzelnen Übertragung eine neue Pipette.

4.3.

Übertragen Sie die angereicherte Probe wie unten beschrieben auf die Neogen Lysegefäße:Übertragen Sie zuerst die angereicherten Proben jeweils einzeln in ein Neogen Lysegefäß. Übertragen Sie die
NC zuletzt.
4.4.

Öffnen Sie jeden Neogen Streifen mit Lysegefäßen einzeln mit dem Neogen® Molekulare Detektion –Cap/Decap-Werkzeug – Lyse.

4.5.

Entsorgen Sie die Kappen der Neogen Lysegefäße. Wenn noch Lysat für weitere Tests übrig bleibt, bewahren
Sie die Kappen in einem sauberen Behälter auf, um sie nach der Lyse wieder aufzusetzen.
4.5.1. Informationen zur Verarbeitung von nicht verwendetem Lysat finden Sie in Anhang A.

4.6.

Übertragen Sie 20 µl Probe in ein Neogen-Lysegefäß.

5. Wiederholen Sie bei Bedarf die Schritte 4.4 bis 4.6 bei allen zu prüfenden Proben.
6. Sobald Sie alle Proben übertragen haben, übertragen Sie 20 µl der Negativkontrolle (steriles Anreicherungsmedium,z. B. gepuffertes Peptonwasser BPW) in ein Neogen Lysegefäß. Als Negativkontrolle kein Wasser verwenden.
7. Stellen Sie fest, ob der Neogen Molekulare Detektion – Heizblockeinsatz die erforderliche Temperatur von
100 ± 1 °C erreicht hat.
8. Stellen Sie den Träger ohne Deckel mit Neogen Lysegefäßen in den Neogen Molekulare Detektion –Heizblockeinsatz und erwärmen Sie ihn 15 Minuten ± 1 Minute lang. Dabei ändert sich die Farbe der Neogen
Lyselösung von rosafarben (kalt) zu gelb (heiß).
8.1.

Proben, die während der Lyse nicht ordnungsgemäß wärmebehandelt wurden, stellen möglicherweise ein
biologisches Risiko dar und sollten NICHT in das Neogen Molekulare Detektion – Gerät eingesetzt werden.

8DE (Deutsch)
9. Nehmen Sie den Träger ohne Deckel mit den Neogen Lysegefäßen aus dem Neogen Molekulare Detektion –Heizblockeinsatz. Lassen Sie ihn im Neogen Molekulare Detektion – Kühlblockeinsatz 5 bis 10 Minuten langabkühlen. Der Neogen Molekulare Detektion – Kühlblockeinsatz wird bei Raumtemperatur ohne den Neogen®
Molekulare Detektion – Kühlblockträger verwendet und sollte direkt auf die Laborbank gesetzt werden. Wenn die
Neogen-Lyselösung abgekühlt ist, nimmt sie wieder eine rosa Farbe an.
10. Nehmen Sie den Träger mit den Neogen Lysegefäßen aus dem Neogen Molekulare Detektion – Kühlblockeinsatz.
00:15:00

99–101 ºC

20–25 ºC

00:05:00

Amplifikation

1. Für jede Probe und ihre Negativkontrolle ist ein Neogen Molekulares Detektions Assay 2 - STEC Gene Screen (stx)und ein Neogen Molekulares Detektions Assay 2 - STEC Gene Screen (eae)-Reagenzgefäß erforderlich.
1.1.

Die Gefäßstreifen können auf die gewünschte Anzahl der Gefäße zurechtgeschnitten werden. Wählen Sie
die Anzahl der erforderlichen Reagenzgefäße oder den Streifen mit 8 Gefäßen für den Neogen Molekulares
Detektions Assay 2 ‑ STEC Gene Screen (stx) oder den Neogen Molekulares Detektions Assay 2 ‑ STEC Gene
Screen (eae) aus.

1.2.

Setzen Sie die Gefäße des Neogen Molekulares Detektions Assay 2 - STEC Gene Screen (stx) in eine Reihe
eines leeren Trägergestells.

1.3.

Setzen Sie die Gefäße des Neogen Molekulares Detektions Assay 2 - STEC Gene Screen (eae) in die
angrenzende rechte Reihe.

1.4.

Vermeiden Sie es, die Reagenzkügelchen im unteren Teil der Gefäße aufzurühren.

2. Wählen Sie ein Gefäß mit Neogen Reagenzkontrolle und stellen Sie es in den Gefäßträger.
3. Wählen Sie für das Negativkontroll-Lysat ein Reagenzgefäß für den Neogen Molekulares Detektions Assay 2 ‑ STEC
Gene Screen (stx) und eines für den Neogen Molekulares Detektions Assay 2 ‑ STEC Gene Screen (eae) aus undstellen Sie sie in den Gefäßträger.

4. Um eine Kreuzkontamination zu vermeiden, öffnen Sie jeweils nur einen Reagenzgefäßstreifen desNeogen Molekulares Detektions Assay 2 ‑ STEC Gene Screen (stx oder eae) und verwenden Sie bei jedemÜbertragungsschritt eine neue Pipettenspitze.
5. Übertragen Sie wie unten beschrieben die einzelnen Lysate in ein Reagenzgefäß für den Neogen Molekulares
Detektions Assay 2 ‑ STEC Gene Screen (stx oder eae), wie unten beschrieben.
5.1.

Übertragen Sie zunächst die einzelnen Lysate in ein Reagenzgefäß für den Neogen Molekulares Detektions
Assay 2 - STEC Gene Screen (stx), wie in 5.5. und 5.6 beschrieben.

5.2.

Übertragen Sie im zweiten Schritt alle gleichen Probenlysate auf ein Reaktionsgefäß des Neogen Molekulares
Detektion Assay 2 - STEC Gene Screen (eae) in der angrenzenden rechte Reihe, wie in 5.5 und 5.6 be-schrieben.
9DE (Deutsch)
HINWEIS: Verwenden Sie für jede Übertragung eine neue Pipettenspitze. Verwenden Sie nicht die gleiche
Pipette für die Übertragung der gleichen Lysatprobe auf das stx- und eae-Reagenzgefäß.
5.3.

Sobald Sie alle Probenlysate übertragen haben, geben Sie NC-Lysat in jedes Reagenzgefäß für den
Neogen Molekulares Detektions Assay 2 - STEC Gene Screen (stx) und den Neogen Molekulares Detektions
Assay 2 - STEC Gene Screen (eae).

5.4.

Übertragen Sie zuletzt das Negativkontroll-Lysat auf das Reagenzkontroll-Gefäß.

5.5.

Öffnen Sie die Reagenzgefäße für den Neogen® Molekulares Detektions Assay 2 - STEC Gene Screen (stxoder eae) mit dem Neogen Molekulare Detektion – Cap/Decap-Werkzeug – Reagenz, und zwar immer nur
einen Streifen auf einmal. Werfen Sie die Kappe weg.

5.6.

Übertragen Sie 20 µl des Probenlysats aus der oberen Hälfte der Flüssigkeit (Ablagerungen vermeiden) im
Neogen Lysegefäß in das entsprechende Reagenzgefäß für den Neogen Molekulares Detektions Assay 2 STEC Gene Screen (stx oder eae). Pipettieren Sie schräg in die Gefäße, um ein Aufrühren der Kügelchen zu
vermeiden. Mischen Sie anschließend den Gefäßinhalt, indem Sie ihn 5 Mal auf und ab pipettieren.

HINWEIS: Verwenden Sie für jede Übertragung eine neue Pipettenspitze. Verwenden Sie nicht die gleiche
Pipette für die Übertragung der gleichen Lysatprobe auf das stx- und eae-Reagenzgefäß.
5.7.

Wiederholen Sie Schritt 5.6, bis Sie jedes einzelne Probenlysat einem entsprechenden Reagenzgefäß für den
Neogen Molekulare Detektions Assay 2 - STEC Gene Screen (stx oder eae) im Streifen hinzugefügt haben.

5.8.

Verschließen Sie die Reagenzgefäße für den Neogen Molekulares Detektions Assay 2 - STEC Gene
Screen (stx oder eae) mit den mitgelieferten zusätzlichen Kappen und üben Sie mit der abgerundeten
Seite des Neogen Molekulare Detektion – Cap/Decap-Werkzeugs – Reagenz in einer Vorwärts- undRückwärtsbewegung Druck aus, um sicherzustellen, dass die Kappe fest sitzt.

5.9.

Wiederholen Sie bei Bedarf die Schritte 5.6 bis 5.8 für die Anzahl der zu testenden Proben für die Reagenzgefäße des Neogen Molekulares Detektions Assay 2 - STEC Gene Screen (stx und eae).

5.10. Sobald Sie alle Probenlysate übertragen haben, wiederholen Sie die Schritte 5.6 bis 5.8, um 20 µl des
NC-Lysats in ein Reagenzgefäß für den Neogen Molekulares Detektions Assay 2 - STEC Gene Screen (stx)und Neogen Molekulares Detektions Assay 2 - STEC Gene Screen (eae) zu übertragen.
5.11. Übertragen Sie 20 µl des NC-Lysats in ein Gefäß mit Neogen Reagenzkontrolle. Pipettieren Sie schräg in die
Gefäße, um ein Aufrühren der Kügelchen zu vermeiden. Mischen Sie anschließend den Gefäßinhalt, indem Sie
ihn 5 Mal auf und ab pipettieren.
Übertragen Sie jedes Probenlysat zuerst in ein eigenes Reagenzgefäß für den Neogen Molekulares Detektions
Assay 2 - STEC Gene Screen (stx oder eae), gefolgt von der Negativkontrolle. Hydrieren Sie das Gefäß mit
Neogen Reagenzkontrolle als letztes.
6. Beladen Sie eine saubere und dekontaminierte Neogen Molekulare Detektion – Beladehilfe mit den mit Kappen
verschlossenen Gefäßen. Anschließend die Klappe schließen und verriegeln.
10DE (Deutsch)

7. Überprüfen und bestätigen Sie die Konfiguration des Durchlaufs in der Neogen Molekulare Detektion – Software.
8. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Start“ in der Software und wählen Sie anschließend das zu verwendende Gerät aus.
Die Klappe des gewählten Geräts öffnet sich automatisch.
9. Setzen Sie die Neogen Molekulare Detektion – Beladehilfe in das Neogen Molekulare Detektion – Gerät undschließen Sie die Klappe, um mit dem Test zu beginnen. Die Ergebnisse sind innerhalb von 60 Minuten verfügbar,
obgleich positive Ergebnisse möglicherweise schneller erfasst werden.
10. Nehmen Sie nach Abschluss des Tests die Neogen Molekulare Detektion – Beladehilfe aus dem Neogen Molekulare
Detektion – Gerät und entsorgen Sie die Gefäße, indem Sie sie 1 Stunde lang in ausreichender Entfernung vom
Vorbereitungsbereich in einer 1–5%igen Haushaltsbleichmittellösung (v:v in Wasser) einweichen.
HINWEIS: Um das Risiko eines falsch positiven Ergebnisses infolge einer Kreuzkontamination zu minimieren, öffnen
Sie niemals Reagenzgefäße, die amplifizierte DNS enthalten. Dies betrifft Reagenzien für den Neogen Molekularer
Detektions Assay 2 - STEC Gene Screen (stx und eae) sowie Gefäße mit Neogen Reagenzkontrolle und Neogen
Matrix-kontrolle. Entsorgen Sie die verschlossenen Reagenzgefäße, indem Sie sie 1 Stunde lang in ausreichenderEntfernung vom Vorbereitungsbereich in einer 1–5%igen Haushaltsbleichmittellösung (v:v in Wasser) einweichen.

Interpretation der Ergebnisse

Die durch die Detektion der Nukleinsäureamplifikation entstehende Lichtkurve wird anhand eines Algorithmus
ausgewertet. Die Ergebnisse werden automatisch von der Software analysiert und je nach Ergebnis farbcodiert. Ein
positives oder negatives Ergebnis wird durch die Analyse einer bestimmten Anzahl an eindeutigen Kurvenparameternbestimmt. Die vorläufigen positiven Ergebnisse werden in Echtzeit erstellt, während negative und zu überprüfende
Ergebnisse erst nach Abschluss des Testdurchlaufs dargestellt werden.
Die Neogen Molekulares Detektionssystem – Software meldet Ergebnisse separat für jeden Assay und verwendet
Ergeb-nisse beider Assays (stx und eae), um die Probe als STEC (EHEC) positiv oder negativ zu bezeichnen. Für ein
vorläufig positives Ergebnis für STEC (EHEC) müssen beide Genziele (stx1 und/oder stx2 und eae) positiv sein. Wennfür einzelne Assays „Fehler“ oder „Zu überprüfen“ angezeigt wird, lautet das Endergebnis „Fehler“ oder „Zuüberprüfen“. Der Test muss wiederholt werden, um die Endergebnisse richtig anzuzeigen (siehe Ergebnisschlüssel).
Die Software ermöglicht es zudem, bei Bedarf einzelne Assays einzurichten; das Probenlysat oder frische Lysat aus derAnreicherung kann mit den Assays erneut getestet werden, indem die in Anhang A beschriebenen Schritte für nichtverwendete Lysate und die Schritte m Abschnitt Lyse und Amplifikation für nicht verwendete Anreicherung durchgeführt
werden.

11DE (Deutsch)

Ergebnisschlüssel für das angereicherte Probenlysat+ +2 ++ -2 –
2+ ?2 ?
2+ 2
2– -2 +
2– -2 –
2– ?2 ?
2– 2
2? ?2 +
2? ?2 –
2

Beide positiv, Endergebnis: positiv? ?2 ?

stx zu überprüfen, eae zu überprüfen, Endergebnis: zu überprüfen, Test wiederholen?

stx zu überprüfen, eae Fehler, Endergebnis: Fehler, Test wiederholen

2

2
2

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

stx positiv, eae negativ, Endergebnis: negativ
stx positiv, eae zu überprüfen, Endergebnis: zu überprüfen, Test wiederholen
stx positiv, eae Fehler, Endergebnis: Fehler, Test wiederholen
stx negativ, eae positiv, Endergebnis: negativ
stx negativ, eae negativ, Endergebnis: negativ
stx negativ, eae zu überprüfen, Endergebnis: zu überprüfen, Test wiederholen
stx negativ, eae Fehler, Endergebnis: Fehler, Test wiederholenstx zu überprüfen, eae positiv, Endergebnis: zu überprüfen, Test wiederholenstx zu überprüfen, eae negativ, Endergebnis: zu überprüfen, Test wiederholen

stx Fehler, eae positiv, Endergebnis: Fehler, Test wiederholen

STX

+
–
2

2

STX

2

?

stx Fehler, eae zu überprüfen, Endergebnis: Fehler, Test wiederholen

2

STX

2

EAE
EAE
EAE

stx Fehler, eae negativ, Endergebnis: Fehler, Test wiederholen
stx Fehler, eae Fehler, Endergebnis: Fehler, Test wiederholen

Schlüssel der Negativkontrolle
2
2
2
2
2
2

NC
STX

NC
STX

NC
STX

NC
STX

NC
STX

NC
STX

2
2
2
2
2
2

NC
EAE

NC
EAE

NC
EAE

NC
EAE

NC
EAE

NC
EAE

Beide gültig, Link gültig
Einer gültig, anderer fehlerhaft, Link fehlerhaft, Test wiederholen
Einer gültig, anderer ungültig, Link ungültig, Test wiederholen
Beide fehlerhaft, Link fehlerhaft, Test wiederholen
Beide ungültig, Link ungültig, Test wiederholen
Einer fehlerhaft, anderer ungültig, Link fehlerhaft, Test wiederholen

Vorläufig positive Ergebnisse sollten anhand der Standardarbeitsanweisung (SOP) für Laboratorien oder durch dasanschließende Referenzverfahren(1, 2, 3) bestätigt werden, beginnend mit der Übertragung primären Anreicherungsbouillon auf selektive Platten, Bestätigung von Isolaten anhand entsprechender biochemischer, mikroskopischer undserologischer Verfahren. Für mit MLG 5C spezifizierte Matrices sollte vor der Ausplattierung auf einem selektiven
Medium eine immunomagnetische (IMS) Separation erfolgen.
HINWEIS: Selbst ein negatives Ergebnis führt nicht zu einem Ergebnis von null, da das System und die Amplifikationsreagenzien des Neogen Molekulares Detektions Assay 2 - STEC Gene Screen (stx und eae) über einen„Hintergrund“ verfügen, der in relativem Verhältnis zur Lichteinheit (RLU) steht.
Falls es in seltenen Fällen zu einer ungewöhnlichen Lichtleistung kommt, wird diese vom Algorithmus als „Zu überprüfen“ gekennzeichnet. Neogen empfiehlt, den Nachweis der so gekennzeichneten Proben zu wiederholen. Falls das
Ergebnis weiterhin als „Zu überprüfen“ gekennzeichnet bleibt, bestätigen Sie das Ergebnis anhand Ihres bevorzugten
Testverfahrens(1, 2, 3) oder gemäß den jeweils geltenden Richtlinien.

12DE (Deutsch)
Tabelle 4. Symbole und Informationen zu verschiedenen Softwareergebnissen.
Vertiefungstyp
Probe
Probe

Vertiefungsergebnissymbol

+
–

Probe

Probe

?

Probe

ErgebnisInterpretation

Positiv

Die Probe wird vorläufig positiv für das
Zielpathogen betrachtet.

Negativ

Die Probe wird negativ für das Zielpathogen betrachtet.

Inhibiert

Die Probenmatrix hat den Nachweis gehemmt. Einneuer Test ist erforderlich. Weitere Informationen
finden Sie im Problemlösungsabschnitt und derGebrauchsanweisung des Testkits.

Zuüberprüfen

Das Vorhandensein oder Fehlen des Zielpathogens war
nicht ermittelbar. Ein neuer Test ist erforderlich.
Weitere Informationen finden Sie im Problemlösungsabschnitt und der Gebrauchsanweisung
des Testkits.

FehlerKeine Bioluminszenz festgestellt. Ein neuer Test ist
erforderlich. Weitere Informationen finden Sie im
Problemlösungsabschnitt und der Gebrauchsanweisung
des Testkits.

Anhang A. Protokoll-Unterbrechungen: Lagerung und erneutes Testen von Proben

1. Um ein wärmebehandeltes Lysat zu lagern, verschließen Sie das Neogen Lysegefäß wieder mit einer sauberen Kappe(siehe Lyse, Abschnitt 4.5).
2. Zum Lagern einer angereicherten Probe, inkubieren Sie diese mindestens 18 Stunden lang vor der Einlagerung.
3. Lagern Sie sie bis zu 72 Stunden bei 4 bis 8 °C.
4. Bereiten Sie eine gelagerte Probe zur Amplifikation vor, indem Sie sie zum Mischen 2 bis 3 Mal umdrehen.
5. Öffnen Sie die Gefäße.
6. Setzen Sie die gemischten Lysatgefäße in den Neogen Molekulare Detektion – Heizblockeinsatz und erwärmen Sie
sie 5 Minuten ± 1 Minute lang bei 100 ± 1 °C.
7. Nehmen Sie den Träger mit den Neogen Lysegefäßen aus dem Neogen Molekulare Detektion – Heizblockeinsatz.
Lassen Sie ihn im Neogen Molekulare Detektion – Kühlblockeinsatz 5 bis 10 Minuten lang abkühlen.
8. Setzen Sie das Protokoll ab dem oben beschriebenen Abschnitt Amplifikation fort.

Literaturnachweise:

1. Microbiology Laboratory Guidebook. U. S. Department of Agriculture (USDA) Food Safety and Inspection Service(FSIS) Microbiology Laboratory guidebook 5C.00. Detection and isolation of top seven Shiga toxin-producing
Escherichia coli (STECs) from meat products and carcass and environmental sponges. Feb 4, 2019.
2. US Food and Drug Administration Bacteriological Analytical Manual. Chapter 4A: Diarrheagenic Escherichia coli.
October 2018.
3. ISO/TS 13136:2012: Microbiology of food and animal feed — Real-time polymerase chain reaction (PCR)-based
method for the detection of food-borne pathogens — Horizontal method for the detection of Shiga toxin-producing
Escherichia coli (STEC) and the determination of O157, O111, O26, O103 and O145 serogroups
4. U.S. Food and Drug Administration. Code of Federal Regulations, Title 21, Part 58. Good laboratory practice fornonclinical laboratory studies.
5. ISO/IEC 17025. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories.
6. ISO 7218. Microbiology of food and animal feeding stuffs - General rules for microbiological examination.
7. Neogen Installation Qualification (IQ) / Operational Qualification (OQ) Protocols and Instructions for Neogen
Molecular Detection System. Eine Kopie dieses Dokuments erhalten Sie über Ihren Neogen Food SafetyRepräsentanten.

Erklärung der Symbole
info.neogen.com/symbols

13

Neogen Food Safety
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620 Lesher Place
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Neogen.com
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Auchincruive
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Co. Wicklow
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All other trademarks are the property of their respective companies.

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Neogen est une marque de commerce de Neogen.
Toutes les autres marques decommerce appartiennent à leur propriétaire respectif.
FS00918A

ES(Español)Fecha de emisión: 2024-01

Instrucciones del Producto
Sistema de Detección Molecular 2 - Ensayo de Detección Genética de
STEC (stx y eae)
Descripción del producto y uso previsto

El Neogen® Sistema de Detección Molecular 2 - Ensayo de Detección Genética de STEC (stx y eae) se usa con el
Sistema de Detección Molecular Neogen® para la detección rápida y específica del gen de la toxina Shiga (stx1 y/ostx2) y el gen intimina (eae) de E. coli productora de toxina Shiga (STEC, también conocida como “E. coli productora deverocitotoxina”) en muestras ambientales de procesos de alimentos y alimentos enriquecidos. El término STEC se refierea los patotipos de E. coli capaces de producir la toxina Shiga tipo 1 (Stx1), tipo 2 (Stx2) o ambas, codificados por losgenes stx1 y stx2, respectivamente. Las STEC que contienen genes de virulencia para stx1 y/o stx2 y eae (gen intimina
involucrado en el fenotipo de adherencia y destrucción) son designados como E. coli enterohemorrágica (EHEC). El kit
de detección contiene dos tubos de reactivo separados, uno para detectar los genes de virulencia stx1 y/o stx2 y el otro
para detectar los eae de STEC (EHEC). El software del Sistema de Detección Molecular Neogen® informa los resultados
por separado para cada uno de los ensayos y utiliza los resultados de ambos ensayos para denominar la muestra positivao negativa para STEC (EHEC). Para un presunto positivo de STEC (EHEC), ambos objetivos genéticos (stx1 y/o stx2 yeae) deben ser positivos. El ensayo de stx no distingue entre stx1 y stx2, pero detecta la presencia de stx1 y/o stx2.
El Neogen Sistema de Detección Molecular usa amplificación isotérmica mediada por asas para amplificar rápidamente
las secuencias de ácidos nucléicos con alta especificidad y sensibilidad, combinadas con bioluminiscencia para detectar
la amplificación. Los resultados presuntamente positivos se reportan en tiempo real, mientras que los resultados
negativos se revelan una vez terminado el ensayo. Los resultados presuntamente positivos se deben confirmar con el
método que se prefiera(1, 2, 3) o según lo especifiquen las regulaciones locales.
El Neogen Sistema de Detección Molecular 2 - Ensayo de Detección Genética de STEC (stx y eae) está previsto para el
uso en laboratorios con profesionales capacitados en el empleo de técnicas de laboratorio. Neogen no documentó el
uso de este producto en otras industrias que no sean la alimentaria o la de bebidas. Por ejemplo, Neogen no documentó
este producto para el análisis de muestras clínicas, veterinarias, cosméticas o farmacéuticas. El Neogen Sistema
de Detección Molecular 2 - Ensayo de Detección Genética de STEC (stx y eae) no ha sido evaluado con todos los
productos alimenticios ni todos los procesos alimenticios, tampoco con todos los protocolos de evaluación ni con todas
las cepas de bacterias posibles.
Como con todos los métodos de prueba, el origen, la formulación y la calidad del medio de enriquecimiento pueden
influir sobre los resultados. Factores tales como los métodos de muestreo, los protocolos de análisis, la preparaciónde la muestra, la manipulación y la técnica de laboratorio también pueden afectar los resultados. Neogen recomienda
la evaluación del método lo que incluye el medio de enriquecimiento usando un número suficiente de muestras en
alimentos representativos y con exposición a ciertas cepas o bacterias desafiantes para garantizar que el método
satisface los criterios del usuario en su propio entorno.
Neogen ha evaluado el Neogen Sistema de Detección Molecular 2 - Ensayo de Detección Genética de STEC (stx y eae)
con agua peptonada tamponada (BPW)-ISO como caldo de enriquecimiento.
El Equipo de Detección Molecular Neogen® está previsto para ser utilizado con muestras que hayan sido tratadas con
calor durante el paso de lisis del ensayo, que se diseñó para destruir los microorganismos presentes en la muestra.
Las muestras que no se hayan tratado debidamente con calor durante el paso de lisis del ensayo pueden considerarse
un posible riesgo biológico y NO deben introducirse en el Equipo de Detección Molecular Neogen.
Neogen Food Safety cuenta con certificación de la Organización Internacional para la Estandarización (ISO) 9001 dediseño y fabricación.
El kit de prueba del Neogen Sistema de Detección Molecular 2 - Ensayo de Detección Genética de STEC (stx y eae)
contiene 48 pruebas de cada uno de los reactivos de stx y eae, que se describen en la Tabla 1.

1

ES(Español)Tabla 1. Componentes del kit del Neogen Sistema de Detección Molecular.
Artículo

Identificación

Solución de Lisis (LS) Neogen®

Solución
rosada en tubos 96 (12 tiras de 8 tubos)
transparentes

CantidadContenido

Comentarios

580 µL de LS por tubo

En gradilla ylista para usar

Tubos de reactivo del Neogen®
Sistema de Detección Molecular
Tubos naranjas
2 - Ensayo de Detección
Genética de STEC (stx)

48 (2 bolsas con 3 tirasde 8 tubos)

Mezcla de deteccióny amplificación
específica liofilizada

Listos para usar

Tubos de reactivo del Neogen®
Sistema de Detección
Molecular 2 - Ensayo de
Detección Genética de STEC
(eae)

Tubos rojos

48 (2 bolsas con 3 tirasde 8 tubos)

Mezcla de deteccióny amplificación
específica liofilizada

Listos para usar

Tapas adicionales

Tapas naranjas

96 (12 tiras de 8 tapas)

Listos para usar

Tapas adicionales

Tapas rojas

96 (12 tiras de 8 tapas)

Listos para usar

Control de Reactivos Neogen®
(RC)

Tubos
transparentes
con tapa debisagra16 (2 bolsas de 8 tubos
individuales)

Mezcla de deteccióny amplificación decontrol liofilizado
de DNA

Listos para usar

El Control Negativo (NC), no provisto en el kit, es un medio de enriquecimiento estéril, por ejemplo, BPW-ISO. No use
agua como un NC.
Puede encontrar una guía de inicio rápido en www.neogen.com

Seguridad

El usuario debe leer, comprender y seguir toda la información de seguridad incluida en las instrucciones para el Sistema
de Detección Molecular Neogen y el Neogen Sistema de Detección Molecular 2 - Ensayo de Detección Genética de
STEC (stx y eae). Guarde las instrucciones de seguridad para consultas futuras.
ADVERTENCIA: Indica una situación peligrosa que, si no se evita, podría ocasionar la muerte o lesiones graves,o daños materiales.
ATENCIÓN: Indica una situación potencialmente peligrosa que, si no se evita, podría ocasionar daños materiales.

ADVERTENCIA
No utilice el Neogen Sistema de Detección Molecular 2 - Ensayo de Detección Genética de STEC (stx y eae) para eldiagnóstico de afecciones en seres humanos o animales.
El usuario debe capacitar a su personal en lo que respecta a las técnicas de prueba adecuadas, por ejemplo, Buenas
prácticas de laboratorio(4), ISO/IEC 17025(5) o ISO 7218(6).
Para reducir los riesgos asociados con un resultado falso negativo que provoque la liberación de productos contaminados:• Siga el protocolo y realice las pruebas exactamente como se indica en las instrucciones del producto.
• Almacene el Neogen Sistema de Detección Molecular 2 - Ensayo de Detección Genética de STEC (stx y eae) como
se indica en el embalaje y en las instrucciones del producto.
• Siempre utilice el Neogen Sistema de Detección Molecular 2 - Ensayo de Detección Genética de STEC (stx y eae)
antes de su fecha de vencimiento.
• Utilice el Neogen Sistema de Detección Molecular 2 - Ensayo de Detección Genética de STEC (stx y eae) con
muestras ambientales y de alimentos que hayan sido validadas internamente o por un tercero.
• Utilice el Neogen Sistema de Detección Molecular 2 - Ensayo de Detección Genética de STEC (stx y eae) solo con
cepas bacterianas, superficies, desinfectantes y protocolos que hayan sido validados internamente o por un tercero.
• En el caso de muestras ambientales que contengan una solución amortiguadora neutralizante con un complejo
de aril sulfonato, prepare una dilución en una proporción de 1:2 (1 parte de muestra en 1 parte de caldo deenriquecimiento estéril) antes de realizar la prueba. Otra opción es transferir 10 µL de la muestra de la solución
amortiguadora neutralizante enriquecida a los tubos de Solución de Lisis Neogen. Productos para la manipulaciónde muestras Neogen® que incluyen una Solución Amortiguadora Neutralizante con el complejo aril sulfonato:
RS96010NB, RS9604NB, SSL10NB, SSL10NB2G, HS10NB, HS10NB2G y HS2410NB2G.
2

ES(Español)Para reducir los riesgos asociados con la exposición a productos químicos y riesgos biológicos:• Realice las pruebas de patógenos en un laboratorio debidamente equipado, bajo la supervisión de personal
capacitado. El medio de enriquecimiento incubado y el equipo o las superficies que hayan entrado en contacto con
el medio de enriquecimiento podrían contener patógenos en niveles suficientes para provocar un riesgo para lasalud humana.
• Siempre proceda de acuerdo con las prácticas estándar de seguridad del laboratorio. Eso incluye usar la ropa deprotección adecuada y protección para los ojos al manipular reactivos y muestras contaminadas.
• Evite el contacto con el contenido del medio de enriquecimiento y de los tubos de reactivos después de laamplificación.
• Deseche las muestras enriquecidas de acuerdo con las normas regulatorias locales/regionales/nacionales actuales.
• Las muestras que no se hayan tratado debidamente con calor durante el paso de lisis del ensayo pueden
considerarse un posible riesgo biológico y NO deben introducirse en el Equipo de Detección Molecular Neogen.
Para reducir los riesgos relacionados con contaminación cruzada mientras se prepara el ensayo:• Use siempre guantes (para proteger al usuario y evitar que se introduzcan nucleasas).
Para reducir los riesgos relacionados con la exposición a líquidos calientes:• No exceda la temperatura recomendada al configurar el calentador.
• No exceda el tiempo de calentamiento recomendado.
• Use un termómetro calibrado adecuado para verificar la temperatura del Bloque de Calor para el Sistema de
Detección Molecular Neogen® (p. ej., un termómetro de inmersión parcial o un termómetro digital termopar, no un
termómetro de inmersión total). El termómetro debe colocarse en la ubicación designada en el Bloque de Calor parael Sistema de Detección Molecular Neogen.

ATENCIÓN
Para reducir los riesgos relacionados con contaminación cruzada mientras se prepara el ensayo:• Cámbiese los guantes antes de hidratar los gránulos reactivos.
• Se recomienda usar puntas de pipetas estériles de calidad de biología molecular con barrera para aerosoles(con filtro).
• Use una nueva punta de pipeta para cada transferencia de muestra.
• Use las Buenas Prácticas de Laboratorio para transferir la muestra del enriquecimiento al tubo de lisis. Para evitar
la contaminación de la pipeta, el usuario puede elegir agregar un paso de transferencia intermedia. Por ejemplo, el
usuario puede transferir cada muestra enriquecida a un tubo estéril.
• Use una estación de trabajo de calidad para biología molecular con una lámpara germicida, siempre que disponga
de una.
• Descontamine periódicamente las mesas y el equipo de laboratorio (pipetas, herramientas para tapar/destapar, etc.)
con una solución de cloro de uso doméstico del 1 % al 5 % (v:v en agua) o en una solución para eliminación de DNA.
Para reducir los riesgos relacionados con un resultado falso positivo:• Nunca abra los tubos de reactivos después de la amplificación.
• Siempre deseche los tubos contaminados sumergiéndolos en una solución de cloro de uso doméstico del 1 % al 5 %(v:v en agua) durante 1 hora y lejos del área en que se prepara el ensayo.
• Nunca ponga en autoclave los tubos de reactivos después de la amplificación.
Consulte la Hoja de Datos de Seguridad para obtener más información y conocer las normativas locales para el desechode materiales.
Si tiene preguntas acerca de los procedimientos o las aplicaciones específicas, visite nuestro sitio web en
www.neogen.com o comuníquese con su representante o distribuidor local de Neogen.

Responsabilidad del usuario

Los usuarios son responsables de familiarizarse con las instrucciones e información del producto. Visite nuestro sitio
web en www.neogen.com o póngase en contacto con su representante o distribuidor local de Neogen para obtener
más información.
Al seleccionar un método de prueba, es importante reconocer que factores externos tales como los métodos demuestreo, los protocolos de prueba, la preparación de la muestra, la manipulación, la técnica de laboratorio y la muestra
en sí pueden afectar los resultados.

3

ES(Español)Al seleccionar cualquier método de prueba o producto, es responsabilidad del usuario evaluar un número suficiente demuestras con retos microbianos y matrices apropiadas para satisfacer al usuario en cuanto a que el método de prueba
cumple con los criterios necesarios.
Además, es responsabilidad del usuario determinar que cualquier método de prueba y sus resultados cumplen con losrequisitos de sus clientes y proveedores.
Como sucede con cualquier método de prueba, los resultados obtenidos del uso de cualquier producto de Neogen Food
Safety no constituyen una garantía de calidad de las matrices ni de los procesos analizados.
Para ayudar a los clientes a evaluar el método de varias matrices, Neogen ha desarrollado el kit de Control de Matriz
para Detección Molecular Neogen®. Cuando sea necesario, utilice el Control de Matriz (MC) para Detección Molecular
Neogen para determinar si la matriz tiene la capacidad de influir en los resultados del Neogen Sistema de Detección
Molecular 2 - Ensayo de Detección Genética de STEC (stx y eae). Analice varias muestras representativas de la matriz,es decir, las muestras obtenidas de diferente origen, durante cualquier periodo de validación al adoptar el método de
Neogen o al analizar matrices nuevas o desconocidas, o matrices que hayan sido sometidas a cambios en el proceso o lamateria prima.
Una matriz se puede definir como un tipo de producto con propiedades intrínsecas, tales como composición yproceso. Las diferencias entre las matrices pueden ser tan simples como los efectos causados por las diferencias
en su procesamiento o presentación, por ejemplo, productos crudos versus pasteurizados; alimentos frescos versus
secos, etc.

Limitación de garantía/Recurso limitado

SALVO LO EXPRESAMENTE ESTIPULADO EN UNA SECCIÓN DE GARANTÍA LIMITADA O EN EL EMBALAJE DE
UN PRODUCTO ESPECÍFICO, NEOGEN RENUNCIA A TODAS LAS GARANTÍAS EXPRESAS Y TÁCITAS INCLUIDA,ENTRE OTRAS, CUALQUIER GARANTÍA DE COMERCIABILIDAD O IDONEIDAD PARA UN USO EN PARTICULAR.
Si un producto de Neogen Food Safety es defectuoso, Neogen o su distribuidor autorizado reemplazará el productoo reembolsará el precio de compra del producto, a su elección. Estos son sus recursos exclusivos. Deberá notificar
inmediatamente a Neogen en un lapso de sesenta días a partir del descubrimiento de cualquier sospecha de defecto en
un producto y devolver dicho producto a Neogen. Póngase en contacto con su representante de Neogen o distribuidor
autorizado de Neogen si tuviera cualquier otra pregunta.

Limitación de responsabilidad de Neogen

NEOGEN NO SERÁ RESPONSABLE DE NINGUNA PÉRDIDA O DAÑO, YA SEA DIRECTO, INDIRECTO, ESPECIAL,DAÑOS ACCIDENTALES O CONSECUENCIAS, INCLUIDOS ENTRE OTROS, LA PÉRDIDA DE BENEFICIOS. En
ningún caso la responsabilidad de Neogen conforme a ninguna teoría legal excederá el precio de compra del producto
supuestamente defectuoso.

Almacenamiento y desecho

Almacene el Neogen Sistema de Detección Molecular 2 - Ensayo de Detección Genética de STEC (stx y eae) a 2 °C-8 °C(35 °F-47 °F). No lo congele. Durante el almacenamiento, mantenga el kit fuera del alcance de la luz. Después de abrir
el kit, verifique que la bolsa de aluminio no esté dañada. Si la bolsa está dañada, no use el producto. Después de abrir elembalaje, los tubos de reactivo no utilizados se deberán guardar siempre en la bolsa resellable junto con el desecante paraconservar la estabilidad de los reactivos liofilizados. Almacene las bolsas reselladas a 2 °C-8 °C (35 °F-47 °F) durante nomás de 90 días.
No utilice el Neogen Sistema de Detección Molecular 2 - Ensayo de Detección Genética de STEC (stx y eae) después desu fecha de vencimiento. La fecha de vencimiento y el número de lote están impresos en la etiqueta externa de la caja.
Después de usarlo, el medio de enriquecimiento y los tubos del Neogen Sistema de Detección Molecular 2 - Ensayo de
Detección Genética de STEC (stx y eae) podrían contener material patógenos. Una vez terminada la prueba, proceda
de acuerdo con los estándares actuales de la industria para el desecho de residuos contaminados. Consulte la Hoja deDatos de Seguridad para obtener más información y conocer las normativas locales para el desecho de materiales.

Instrucciones de uso

Siga todas las instrucciones atentamente. De lo contrario, los resultados obtenidos podrían llegar a ser incorrectos.
Descontamine periódicamente las mesas y el equipo de laboratorio (pipetas, herramientas para tapar/destapar, etc.)
con una solución de cloro de uso doméstico del 1 % al 5 % (v:v en agua) o en una solución para eliminación de DNA.
El usuario debe completar la capacitación de calificación del operador (OQ) del Sistema de Detección Molecular
Neogen según se describe en el documento “Protocolos de Calificación para la Instalación (IQ)/Calificación Operativa(OQ) e Instrucciones para el Sistema de Detección Molecular Neogen”(7).
4ES(Español)Consulte la sección “Instrucciones específicas para métodos validados” para obtener requisitos específicos.
Tabla 3 para los protocolos de enriquecimiento según el Performance Tested MethodSM (PTM) N.° de certificado
071902.
Enriquecimiento de la muestra
En las Tablas 2 y 3 se presenta una guía para los protocolos de enriquecimiento generales para alimentos.
Es responsabilidad del usuario validar protocolos de muestreo o proporciones de dilución alternativos para garantizarque este método de prueba satisface los criterios del usuario.
Alimentos
1. Permita que el medio de enriquecimiento de BPW ISO se equilibre a 41,5 °C ± 1 °C.
2. Combine el medio de enriquecimiento y la muestra de forma aséptica. Para todas las muestras con alto contenidode partículas y carne, se recomienda utilizar bolsas con filtro.
3. Mezcle todas las matrices e incúbelas como se resume en la tabla del protocolo correspondiente (consulte la Tabla 2o la Tabla 3).
Muestras ambientales
ADVERTENCIA: Si decidiera usar una solución amortiguadora neutralizante que contenga el complejo aril sulfonato
como solución hidratante para la esponja, deberá preparar una dilución 1:2 (1 parte de muestra en 1 parte de caldode enriquecimiento estéril) de la muestra ambiental enriquecida antes de realizar la prueba para reducir los riesgos
asociados con un resultado falso negativo que provoque la liberación del producto contaminado. Otra opción estransferir 10 µL de la muestra de la solución amortiguadora neutralizante enriquecida a los tubos de Solución deLisis Neogen.
Es responsabilidad del usuario validar protocolos de muestreo o proporciones de dilución alternativos para garantizarque este método de prueba satisface los criterios del usuario.
Tabla 2. Protocolos Generales de Enriquecimiento.
Matriz de lamuestraTamaño de lamuestraVolumen del caldo deenriquecimiento (mL)(precalentado)

Temperatura deenriquecimiento(± 1 °C)

Tiempo deenriquecimiento(horas)Volumen deanálisis de lamuestra (μL)

Carne de res
molida cruda,trozos y recortes(a)375 g1125 BPW-ISO

41,5

10-18

20

Carne cruda(cerdo, carnede ave, cordero,bisonte)(a)375 g1125 BPW-ISO

41,5

10-18

20

vegetales de hoja(b)200 g

450 BPW-ISO

41,5

18-24

20

germinados

25 g

225 BPW-ISO

41,5

18-24

20

25 g o 25 mL

225 BPW-ISO

41,5

18-24

20

(c)

productos lácteos
crudos(d)(a)

Masajee con las manos las muestras de carne de res (carne de res molida, trozos y recortes) y de carne cruda (cerdo
molido, carne de ave y carne que no sea de res) entre 30 y 60 segundos para dispersar y desintegrar los grumos
después de agregar BPW-ISO precalentada.

(b)

En el caso de las vegetales de hoja, enjuague el caldo de enriquecimiento (BPW-ISO precalentada) sobre las hojas yagite suavemente entre 30 y 60 segundos. No masajee ni homogeneice las hojas.

(c)

En el caso de los germinados, enjuague el caldo de enriquecimiento (BPW-ISO precalentada) sobre los germinados
entre 30 y 60 segundos sin masajear ni homogeneizar.

(d)Homogeneice las muestras de productos lácteos crudos entre 30 y 60 segundos después de agregar BPW-ISO
precalentada.

5

ES(Español)Instrucciones específicas para métodos validados

AOAC® Performance Tested MethodSM (PTM) N.° de certificado 071902

En los estudios de AOAC Research Institute PTMSM, se halló que el Neogen Sistema de Detección Molecular 2 - Ensayo
de Detección Genética de STEC (stx y eae) es un método efectivo para la detección de STEC. Las matrices evaluadas enel estudio se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3. Protocolos de enriquecimiento según AOAC PTMSM N.º de certificado 071902.
Matriz de lamuestraTamañode lamuestraVolumen del caldo deenriquecimiento (mL)

Temperatura deenriquecimiento(± 1 °C)

Tiempo deenriquecimiento(horas)Volumen deanálisis de lamuestra (μL)

Recorte de carne
de res cruda(a)375 g1125 BPW-ISO(precalentada)

41,5

10-18

20

Carne de res
molida cruda(a)375 g1125 BPW-ISO(precalentada)

41,5

10-18

20

Carne de res
molida cruda(a)25 g

225 BPW-ISO (precalentada)

41,5

10-18

20

Carne de cerdo
molida cruda(a)375 g1125 BPW-ISO(precalentada)

41,5

10-18

20

Piezas crudas decarne de ave(a)375 g1125 BPW-ISO(precalentada)

41,5

10-18

20

Pollo dividido
mecánicamente

25 g

225 BPW-ISO (precalentado)

41,5

10-24

20

Espinacas(b)200 g

450 BPW-ISO (precalentada)

41,5

18-24

20

25 g

225 BPW-ISO (precalentada)

41,5

18-24

20

10 g

90 BPW-ISO

41,5

28-32

20

germinados(c)

Flor de cannabis
seca, planta decannabis seca(4)(a)

En el caso de las muestras de carne de res (carne de res molida y recortes), agregue BPW-ISO precalentada a lamuestra de carne de res. Masajee con las manos entre 30 y 60 segundos para dispersar y desintegrar los grumos.

(b)

En el caso de las espinacas, agregue BPW-ISO precalentada a la matriz. Enjuague el líquido sobre las hojas y agite
suavemente entre 30 y 60 segundos. No masajee ni homogeneice las hojas.

(c)

En el caso de los germinados, enjuague el caldo de enriquecimiento (BPW-ISO precalentada) sobre los germinados
entre 30 y 60 segundos sin masajear ni homogeneizar.

(d)Flor de cannabis seca (>0.3 % THC) y planta de cannabis seca (≤0.3 % THC)

Preparación de la Bandeja de Carga Rápida para el Sistema de Detección Molecular Neogen®
1. Humedezca un paño o una toalla desechable con una solución de cloro de uso doméstico del 1 % al 5 % (v:v en agua)
y limpie la Bandeja de Carga Rápida para el Sistema de Detección Molecular Neogen.
2. Enjuague la Bandeja de Carga Rápida para el Sistema de Detección Molecular Neogen con agua.
3. Utilice una toalla desechable para secar la Bandeja de Carga Rápida para el Sistema de Detección Molecular
Neogen.
4. Antes de utilizarla, asegúrese de que la Bandeja de Carga Rápida para el Sistema de Detección Molecular Neogen
esté seca.
6

ES(Español)Preparación del Bloque de Frío para el Sistema de Detección Molecular Neogen®
Coloque la Inserción del Bloque de Frío para el Sistema de Detección Molecular Neogen directamente sobre la mesa delaboratorio: No se usa la Bandeja para el Bloque de Frío del Sistema de Detección Molecular Neogen. Use el bloque atemperatura ambiente del laboratorio (20 °C-25 °C).
Preparación del Bloque de Calor para el Sistema de Detección Molecular Neogen®
Coloque el Bloque de Calor para el Sistema de Detección Molecular Neogen en una unidad o plancha de calentamientoseca. Encienda la unidad de calentamiento de bloques seca y ajuste la temperatura para permitir que el Bloque de Calorpara el Sistema de Detección Molecular Neogen alcance y mantenga una temperatura de 100 °C ± 1 °C.
NOTA: Según la unidad de calentamiento, espere aproximadamente 30 minutos para que el Bloque de Calor para el
Sistema de Detección Molecular Neogen alcance la temperatura deseada. Con un termómetro calibrado apropiado(p. ej., un termómetro de inmersión parcial o un termómetro digital termopar, no un termómetro de inmersión total)
colocado en la ubicación designada, verifique que el Bloque de Calor para el Sistema de Detección Molecular Neogen
se encuentre a 100 °C ± 1 °C.
Preparación del Equipo de Detección Molecular Neogen®
1. Inicie el software del Sistema de Detección Molecular Neogen e inicie sesión. Contacte a su representante de
Neogen Food Safety para asegurarse de que tiene la última versión del software.
2. Encienda el Equipo de Detección Molecular Neogen.
3. Cree o edite un ensayo con datos para cada muestra. Para obtener detalles, consulte el Manual del Usuario delSistema de Detección Molecular Neogen.
3.1.

La selección del ícono STXEAE-2 en el software selecciona dos pozos contiguos (como A1, A2, B1, B2, etc.),
uno para el tubo de reactivo de eae y el otro para stx, puesto que cada muestra se hace con dos ensayos.
El NC se configura para cada tubo de reactivo y un RC se configura para el kit.
1
SAL-2

A

ECO-2
LIS-2

B

LMO-2
CAM-2

C

CRO-2
STXEAE-2
STX-2
EAE-2
MC-2

D
E
F
G
H

2

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

RC

2 STXEAE
2

NC

STX 2

NC
EAE

NOTA: El Equipo de Detección Molecular Neogen debe alcanzar el estado de Listo antes de insertar la Bandeja de
Carga Rápida para el Sistema de Detección Molecular Neogen con los tubos de reacción. Este paso de calentamiento
lleva unos 20 minutos y aparece indicado por una luz NARANJA en la barra de estado del equipo. Una vez que elequipo esté listo para iniciar un ensayo, la barra de estado se cambiará a color VERDE.

Lisis

Retire la parte inferior de la Gradilla para Solución de Lisis de Neogen con un destornillador o una espátula antes decolocarla en el Bloque de Calor para el Sistema de Detección Molecular Neogen.

7

ES(Español)1. Permita que los tubos de Solución de Lisis Neogen se calienten colocando la gradilla a temperatura ambiente(20 °C-25 °C) durante la noche (16-18 horas). Las alternativas para que los tubos de Solución de Lisis Neogen
alcancen temperatura ambiente son colocar los tubos de Solución de Lisis Neogen sobre la mesa de laboratorio
durante por lo menos 2 horas, incubar los tubos de Solución de Lisis Neogen en una incubadora a 37 °C ± 1 °C
durante 1 hora o colocarlos en una unidad de calentamiento de dos bloques seca durante 30 segundos a 100 °C.
2. Invierta los tubos tapados para mezclarlos. Proceda con el paso siguiente dentro de las 4 horas después de la
inversión.
3. Retire la muestra enriquecida de la incubadora.
4. Se requiere un tubo de Solución de Lisis Neogen para cada muestra y el NC (medio de enriquecimiento estéril).
4.1.

Las tiras de tubos de Solución de Lisis Neogen pueden cortarse para obtener la cantidad deseada de tubos.
Seleccione la cantidad de tubos o de tiras de 8 tubos necesarias. Coloque los tubos de Solución de Lisis
Neogen en una gradilla vacía.

4.2.

Para evitar la contaminación cruzada, destape una tira de tubo de Solución de Lisis Neogen por vez y use una
nueva punta de pipeta para cada paso de transferencia.

4.3.

Transfiera la muestra enriquecida a los tubos de Solución de Lisis Neogen como se describe a continuación:

Transfiera cada muestra enriquecida a un tubo de Solución de Lisis Neogen individual primero. Transfiera el NC
al final.
4.4.

Utilice la Herramienta para tapar/destapar del Sistema de Detección Molecular – Lisis Neogen® para destapar
una tira de tubo de Solución de Lisis Neogen, una tira a la vez.

4.5.

Deseche la tapa del tubo de Solución de Lisis Neogen; si se conservará el lisado para una repetición deprueba, coloque las tapas en un envase limpio para su reaplicación luego de la lisis.
4.5.1. Para procesar el lisado conservado, consulte el Apéndice A.

4.6.

Transfiera 20 µL de muestra a un tubo de Solución de Lisis Neogen.

5. Repita los pasos 4.4 a 4.6 según sea necesario para la cantidad de muestras que se deben analizar.
6. Cuando se hayan transferido todas las muestras, transfiera 20 µL del NC (medio de enriquecimiento estéril,p. ej., BPW) a un tubo de Solución de Lisis Neogen. No use agua como un NC.
7. Verifique que la temperatura del Bloque de Calor para el Sistema de Detección Molecular Neogen sea de
100 °C ± 1 °C.
8. Coloque la gradilla descubierta de tubos de Solución de Lisis Neogen en el Bloque de Calor para el Sistema de
Detección Molecular Neogen y caliente durante 15 ± 1 minutos. Durante el calentamiento, la Solución de Lisis
Neogen cambiará de rosado (frío) a amarillo (caliente).
8.1.

Las muestras que no se hayan tratado debidamente con calor durante el paso de lisis del ensayo pueden
considerarse un posible riesgo biológico y NO deben introducirse en el Equipo de Detección Molecular
Neogen.

9. Retire la gradilla descubierta de tubos de Solución de Lisis Neogen del Bloque de Calor para la Detección Molecular
Neogen y deje que se enfríe en la Inserción del Bloque de Frío para el Sistema de Detección Molecular Neogen almenos durante 5 minutos y por un máximo de 10 minutos. Cuando se usa la Inserción del Bloque de Frío del Sistema
de Detección Molecular Neogen a temperatura ambiente sin la Bandeja para el Bloque de Frío para el Sistema de
Detección Molecular Neogen®, debe colocarse directamente sobre la mesa de laboratorio. Cuando esté frío, la
Solución de Lisis Neogen se revertirá a un color rosado.
10. Retire la gradilla de tubos de Solución de Lisis Neogen de la Inserción del Bloque de Frío para el Sistema de
Detección Molecular Neogen.
8

ES(Español)00:15:00

99–101 ºC

20–25 ºC

00:05:00

Amplificación

1. Para cada muestra y el NC, se requiere un tubo de reactivo del Neogen Sistema de Detección Molecular 2 - Ensayo
de Detección Genética de STEC (eae) y uno del Neogen Sistema de Detección Molecular 2 - Ensayo de Detección
Genética de STEC (stx).
1.1.

Las tiras de tubos pueden cortarse para obtener la cantidad deseada de tubos. Seleccione la cantidadde tubos de reactivos individuales del Neogen Sistema de Detección Molecular 2 - Ensayo de Detección
Genética de STEC (eae) y del Neogen Sistema de Detección Molecular 2 - Ensayo de Detección Genética de
STEC (stx) o las tiras de 8 tubos que se necesitan.

1.2.

Coloque los tubos del Neogen Sistema de Detección Molecular 2 - Ensayo de Detección Genética de STEC(stx) en una gradilla vacía en una columna.

1.3.

Coloque los tubos del Neogen Sistema de Detección Molecular 2 - Ensayo de Detección Genética de STEC(eae) en la columna derecha contigua.

1.4.

Evite mover las perlas de reactivo en el fondo de los tubos.

2. Seleccione un tubo de Control de Reactivos Neogen y colóquelo en la gradilla.
3. Para el lisado NC, seleccione un tubo de reactivo del Neogen Sistema de Detección Molecular 2 - Ensayo de
Detección Genética de STEC (stx) y un tubo de reactivo del Neogen Sistema de Detección Molecular 2 - Ensayo de
Detección Genética de STEC (eae) y colóquelos en la gradilla.

4. Para evitar la contaminación cruzada, destape una tira de tubos de reactivo del Neogen Sistema de Detección
Molecular 2 - Ensayo de Detección Genética de STEC (stx o eae) por vez y utilice una nueva punta de pipeta paracada paso de transferencia.
5. Transfiera cada uno de los lisados a un tubo de reactivo del Neogen Sistema de Detección Molecular 2 - Ensayo de
Detección Genética de STEC (stx o eae) como se describe a continuación.
5.1.

Primero, transfiera cada uno de los lisados de muestra a un tubo de reactivo del Neogen Sistema de
Detección Molecular 2 - Ensayo de Detección Genética de STEC (stx) como se describe en los pasos 5.5 y en
5.6.

5.2.

Segundo, transfiera cada uno de los mismos lisados de muestra a un tubo de reactivo del Neogen Sistema de
Detección Molecular 2 - Ensayo de Detección Genética de STEC (eae) en la columna derecha contigua como
se describe en los pasos 5.5 y en 5.6.

NOTA: Use una nueva punta de pipeta para cada transferencia. No utilice la misma punta de pipeta paratransferir al tubo de reactivo de stx y eae desde la misma muestra de lisado.

9

ES(Español)5.3.

Después de transferir todo el lisado de muestra, agregue el lisado NC a cada uno de los tubos de reactivodel Neogen Sistema de Detección Molecular 2 - Ensayo de Detección Genética de STEC (stx) y del Neogen
Sistema de Detección Molecular 2 - Ensayo de Detección Genética de STEC (eae).

5.4.

Transfiera el lisado NC al final al tubo de control de reactivos.

5.5.

Utilice la Herramienta para tapar/destapar del Neogen® Sistema de Detección Molecular – Reactivo paradestapar los tubos de reactivo del Neogen Sistema de Detección Molecular 2 - Ensayo de Detección Genética
de STEC (stx o eae), una tira por vez. Deseche la tapa.

5.6.

Transfiera 20 µL del lisado de muestra de la ½ superior del líquido (evite el precipitado) en el tubo de
Solución de Lisis Neogen al tubo de reactivo del Neogen Sistema de Detección Molecular 2 - Ensayo de
Detección Genética de STEC (stx o eae) correspondiente. Aplique en un ángulo que permita evitar que semuevan los gránulos. Mezcle pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 5 veces.

NOTA: Use una nueva punta de pipeta para cada transferencia. No utilice la misma punta de pipeta paratransferir al tubo de reactivo de stx y eae desde la misma muestra de lisado.
5.7.

Repita el paso 5.6 hasta que se haya agregado el lisado de muestra individual a un tubo de reactivodel Neogen Sistema de Detección Molecular 2 - Ensayo de Detección Genética de STEC (stx o eae)
correspondiente en la tira.

5.8.

Cubra los tubos de reactivo del Neogen Sistema de Detección Molecular 2 - Ensayo de Detección Genética
de STEC (stx o eae) con las tapas adicionales provistas y utilice el lado redondeado de la Herramienta
para tapar/destapar del Neogen Sistema de Detección Molecular – Reactivo para aplicar presión con un
movimiento hacia adelante y hacia atrás para asegurarse de que la tapa quede bien ajustada.

5.9.

Repita los pasos 5.6 a 5.8 según sea necesario para la cantidad de muestras que se analizarán para ambos
tubos de reactivo del Neogen Sistema de Detección Molecular 2 - Ensayo de Detección Genética de STEC
(stx y eae).

5.10. Cuando se hayan transferido todos los lisados de muestra, repita los pasos 5.6 a 5.8 para transferir 20 µL dellisado NC a cada uno de los tubos de reactivo del Neogen Sistema de Detección Molecular 2 - Ensayo de
Detección Genética de STEC (stx) y del Neogen Sistema de Detección Molecular 2 - Ensayo de Detección
Genética de STEC (eae).
5.11. Transfiera 20 µL del lisado NC a un tubo de Control de Reactivos Neogen. Aplique en un ángulo que permita
evitar que se muevan los gránulos. Mezcle pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 5 veces.
Transfiera cada lisado de muestra a un tubo de reactivo individual del Neogen Sistema de Detección
Molecular 2 - Ensayo de Detección Genética de STEC (stx o eae) primero, seguido por el NC. Hidrate el tubo
de Control de Reactivos Neogen al final.

10

ES

(Español)6. Cargue los tubos tapados en una Bandeja de Carga Rápida para el Sistema de Detección Molecular Neogen limpia
y descontaminada. Luego cierre la tapa.

7. Revise y confirme la corrida configurada en el software del Sistema de Detección Molecular Neogen.
8. Haga clic en el botón de inicio del software y seleccione el equipo que usará. La tapa del equipo seleccionado se
abrirá automáticamente.
9. Coloque la Bandeja de Carga Rápida para el Sistema de Detección Molecular Neogen en el Equipo de Detección
Molecular Neogen y cierre la tapa para comenzar con el ensayo. Obtendrá los resultados al cabo de 60 minutos,
aunque los positivos pueden detectarse antes.
10. Después de completar el ensayo, retire la Bandeja de Carga Rápida para el Sistema de Detección Molecular Neogendel Equipo de Detección Molecular Neogen y deseche los tubos sumergiéndolos en una solución de cloro de uso
doméstico del 1 % al 5 % (v:v en agua) durante 1 hora y lejos del área en que se prepara el ensayo.
ATENCIÓN: Para minimizar el riesgo de falsos positivos a causa de contaminación cruzada, nunca abra tubos dereactivo que contengan DNA amplificado. Esto incluye los tubos de Control de Matriz Neogen, el Control de Reactivos
Neogen y el reactivo del Neogen Sistema de Detección Molecular 2 - Ensayo de Detección Genética de STEC (stx yeae). Siempre deseche los tubos de reactivo sellados sumergiéndolos en una solución de cloro de uso doméstico al
1 % a 5 % (v:v en agua) durante 1 hora y lejos del área en que se prepara el análisis.

Resultados e interpretación

Un algoritmo interpreta la curva de producción de luz que se obtiene de la detección de ácido nucleico amplificado.
El software analiza automáticamente los resultados y los expresa en color según el resultado. Los resultados Positivo o
Negativo se determinan mediante el análisis de una cantidad de parámetros característicos de la curva. Los resultados
presuntivos positivos se informan en tiempo real, mientras que los resultados Negativo e Inspeccionar se muestran una
vez terminado el análisis.
El software del Sistema de Detección Molecular Neogen informa los resultados por separado para cada uno de losensayos (stx y eae) y utiliza los resultados de ambos ensayos para llamar a la muestra positiva o negativa de STEC(EHEC) (consulte la Figura que aparece a continuación). Para un presunto positivo de STEC (EHEC), ambos objetivos
genéticos (stx1 y/o stx2 y eae) deben ser positivos. Si alguno de los ensayos individuales indica un error o que se debe
inspeccionar, el resultado final será error o inspeccionar. Repita la prueba para obtener el resultado final debido(consulte las claves de resultados). El software también permite configurar ensayos individuales si es necesario y ellisado de muestra o el lisado fresco del enriquecimiento pueden volver a analizarse con los ensayos siguiendo los pasos
que se resumen en el Apéndice A para los lisados conservados y los pasos en la sección Lisis y Amplificación para elenriquecimiento conservado.

11

ES

(Español)Claves de resultados del lisado de muestra enriquecido+ +2 + Ambos positivos, resultado final positivo2+ -2 – stx positivo, eae negativo, resultado final negativo2+ ?2 ? stx positivo, eae inspeccionar, resultado final inspeccionar, repita la prueba2+ 2
stx positivo, eae error, resultado final error, repita la prueba
2– 2 + stx negativo, eae positivo, resultado final negativo
2– -2 – stx negativo, eae negativo, resultado final negativo2– ?2 ? stx negativo, eae inspeccionar, resultado final inspeccionar, repita la prueba
2
stx negativo, eae error, resultado final error, repita la prueba– 22?
? 2 + stx inspeccionar, eae positivo, resultado final inspeccionar, repita la prueba
2? ?2 – stx inspeccionar, eae negativo, resultado final inspeccionar, repita la prueba
2
STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

? ?2 ?
2stx inspeccionar, eae inspeccionar, resultado final inspeccionar, repita la prueba?

stx inspeccionar, eae error, resultado final error, repita la prueba

STX

2

STX

EAE

2

EAE

2

STX

2

STX

+
2
–
2

2

STX

2

2

STX

2

stx error, eae positivo, resultado final error, repita la prueba?

stx error, eae inspeccionar, resultado final error, repita la prueba

EAE
EAE
EAE
EAE

stx error, eae negativo, resultado final error, repita la prueba
stx error, eae error, resultado final error, repita la prueba

Claves del control negativo
2
2
2
2
2
2

NC
STX

NC
STX

NC
STX

NC
STX

NC
STX

NC
STX

2
2
2
2
2
2

NC
EAE

NC
EAE

NC
EAE

NC
EAE

NC
EAE

NC
EAE

Válido para ambos, enlace válido
Válido para uno, error en el otro, error de enlace, repita la prueba
Válido para uno, el otro inválido, enlace inválido, repita la prueba
Error en ambos, error de enlace, repita la prueba
Ambos inválidos, enlace inválido, repita la prueba
Error en uno, el otro inválido, error de enlace, repita la prueba

Las muestras presuntamente positivas deben confirmarse de acuerdo con los procedimientos operativos estándar dellaboratorio o mediante la confirmación del método de referencia apropiado(1, 2, 3), comenzando con la transferencia delcaldo de enriquecimiento primario a las placas selectivas y la confirmación de aislados usando los métodos serológicos
y bioquímicos apropiados. En el caso de las matrices especificadas por el MLG 5C, la separación inmunomagnética
(IMS) debe hacerse antes de preparar las placas en un medio selectivo.
NOTA: Incluso una muestra negativa no arrojará una lectura de cero ya que los reactivos de amplificación delNeogen Sistema de Detección Molecular 2 - Ensayo de Detección Genética de STEC (stx y eae) y el sistema tienen una
lectura de unidades relativas de luz de fondo (RLU).
En el raro caso de que se emita una señal de luz inusual, el algoritmo lo indicará como “Inspeccionar”. Neogen
recomienda al usuario repetir el ensayo para aquellas muestras etiquetadas como Inspeccionar. Si el resultado sigue
siendo Inspeccionar, proceda con la prueba de confirmación usando su método preferido (1, 2, 3) o según se especifiqueen las regulaciones locales.

12

ES

(Español)Tabla 4. Símbolos e información para diversos resultados del software.
Tipo depozo
MuestraMuestraSímbolo delresultado del pozo+–

MuestraMuestra?

MuestraResultado

Interpretación

Positiva

La muestra es presuntamente positiva para el patógeno objetivo.

Negativa

La muestra es negativa para el patógeno objetivo.

Inhibida

La matriz de la muestra fue inhibidora para el ensayo. Es posible
que se requiera una repetición de la prueba. Para obtener más
información, consulte la sección de solución de problemas y las
instrucciones del producto del kit de ensayo.

Inspeccionar

No se pudo determinar la presencia o ausencia del patógeno
objetivo. Es posible que se requiera una repetición de la prueba.
Para obtener más información, consulte la sección de solución deproblemas y las instrucciones del producto del kit de ensayo.

Error

No se detectó bioluminiscencia. Es posible que se requiera una
repetición de la prueba. Para obtener más información, consulte lasección de solución de problemas y las instrucciones del productodel kit de ensayo.

Apéndice A. Interrupción por protocolo: Almacenamiento y nuevo análisis de las muestras

1. Para almacenar un lisado tratado con calor, vuelva a tapar el tubo de Solución de Lisis Neogen con una tapa limpia(consulte la sección 4.5, Lisis).
2. Para almacenar una muestra enriquecida, incube durante 18 horas como mínimo antes de almacenar.
3. Almacene entre 4 °C y 8 °C por hasta 72 horas.
4. Prepare una muestra almacenada para amplificación invirtiéndola 2 a 3 veces para mezclar.
5. Destape los tubos.
6. Coloque los tubos de lisado mezclados en el Bloque de Calor para el Sistema de Detección Molecular Neogen ycaliéntelos a 100 °C ± 1 °C durante 5 ± 1 minutos.
7. Retire la gradilla descubierta de tubos de Solución de Lisis Neogen del Bloque de Calor para el Sistema de
Detección Molecular Neogen y deje que se enfríe en la Inserción del Bloque de Frío para el Sistema de Detección
Molecular Neogen al menos durante 5 minutos y por un máximo de 10 minutos.
8. Siga el protocolo en la sección Amplificación que se detalla arriba.

Referencias:

1. Microbiology Laboratory Guidebook. U. S. Department of Agriculture (USDA) Food Safety and Inspection Service(FSIS) Microbiology Laboratory guidebook 5C.00. Detection and isolation of top seven Shiga toxin-producing
Escherichia coli (STECs) from meat products and carcass and environmental sponges. Feb 4, 2019.
2. US Food and Drug Administration Bacteriological Analytical Manual. Chapter 4A: Diarrheagenic Escherichia coli.
October 2018.
3. ISO/TS 13136:2012: Microbiology of food and animal feed — Real-time polymerase chain reaction (PCR)-based
method for the detection of food-borne pathogens — Horizontal method for the detection of Shiga toxin-producing
Escherichia coli (STEC) and the determination of O157, O111, O26, O103 and O145 serogroups
4. U.S. Food and Drug Administration. Code of Federal Regulations, Title 21, Part 58. Good laboratory practice fornonclinical laboratory studies.
5. ISO/IEC 17025. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories.
6. ISO 7218. Microbiology of food and animal feeding stuffs - General rules for microbiological examination.
7. Neogen Installation Qualification (IQ) / Operational Qualification (OQ) Protocols and Instructions for Neogen Molecular
Detection System. Contacte a su representante de Neogen Food Safety para obtener una copia de este documento.

Explicación de los símbolos
info.neogen.com/symbols

13

Neogen Food Safety
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620 Lesher Place
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Neogen is a trademark of Neogen Corporation.
All other trademarks are the property of their respective companies.

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Toutes les autres marques decommerce appartiennent à leur propriétaire respectif.
FS00918A

PT(Português)Data de emissão: 2024-01

Instruções do produto
Ensaio de Detecção Molecular 2 - Teste de Detecção Genética de STEC
(stx e eae)
Descrição e uso recomendado do produto

O Neogen® Ensaio de Detecção Molecular 2 - Teste de Detecção Genética de STEC (stx e eae) é utilizado com o
Neogen® Sistema de Detecção Molecular para a detecção rápida e específica dos genes de toxina de shiga (stx1 e/oustx2) e gene intimina (eae) da E. coli produtora de toxina de shiga (STEC, também conhecida como “E. coli produtora deverocitotoxina”) em alimentos enriquecidos e amostras ambientais de processos de alimentos. O termo STEC referese aos patótipos de E. coli capazes de produzir a toxina de shiga do tipo 1 (Stx1), tipo 2 (Stx2), ou ambos, codificada
pelos genes stx1 e stx2, respectivamente. STEC contendo genes de virulência para stx1 e/ou stx2 e eae (gene intimina
envolvido na fixação e apagamento do fenótipo) são E. coli entero-hemorrágicas designadas (EHEC). O kit de triagem
contém dois tubos de reagentes separados, um para detectar genes de virulência stx1 e/ou stx2 e outro para detectar
eae de STEC (EHEC). O software do Neogen® Sistema de Detecção Molecular relata resultados separadamente paracada um dos ensaios e usa os resultados de ambos para chamar a amostra de positiva ou negativa para STEC (EHEC).
Para uma positiva presuntiva de STEC (EHEC), ambos os alvos genéticos (stx1 e/ou stx2 e eae) devem ser positivos. O
ensaio de stx não diferencia entre stx1 e stx2, mas detecta a presença de stx1 e/ou stx2.
O Neogen Ensaio de Detecção Molecular utiliza amplificação isotérmica mediada por alça para amplificar rapidamentesequências de ácidos nucleicos com alta especificidade e sensibilidade, combinadas com bioluminescência paradetectar a amplificação. Os resultados positivos presuntivos são relatados em tempo real enquanto os resultados
negativos são exibidos após a conclusão do ensaio. Os resultados positivos presuntivos devem ser confirmados por
meio de seu método de preferência(1, 2, 3) ou conforme especificado pelos regulamentos locais.
O Neogen Ensaio de Detecção Molecular 2 - Teste de Detecção Genética de STEC (stx e eae) destina-se ao uso em
ambiente laboratorial por profissionais treinados em técnicas laboratoriais. A Neogen não documentou o uso deste
produto em outros setores que não o de alimentos e bebidas. Por exemplo, a Neogen não documentou este produto
para testar amostras farmacêuticas, de cosméticos, clínicas ou veterinárias. O Neogen Ensaio de Detecção Molecular
2 - Teste de Detecção Genética de STEC (stx e eae) não foi avaliado com todos os possíveis produtos e/ou processos
alimentícios e protocolos de teste, tampouco com todas as estirpes de bactérias possíveis.
Assim como em todos os métodos de teste, a fonte, a formulação e a qualidade do meio de enriquecimento podem
influenciar os resultados. Fatores como métodos de amostragem, protocolos de teste, preparação de amostras,
manuseio e técnica de laboratório também podem influenciar os resultados. A Neogen recomenda a avaliação dométodo, incluindo meio de enriquecimento no ambiente do usuário, usando um número suficiente de amostras com
alimentos específicos e desafios microbianos para garantir que o método atenda aos critérios do usuário.
A Neogen avaliou o Neogen Ensaio de Detecção Molecular 2 - Teste de Detecção Genética de STEC (stx e eae) comágua peptonada tamponada (BPW ISO) como caldo de enriquecimento.
O Neogen® Equipamento de Detecção Molecular destina-se ao uso com amostras que passaram por tratamento térmico
durante a etapa de lise do ensaio, projetado para destruir organismos presentes na amostra. Amostras que não foram
tratadas com aquecimento de forma adequada durante a etapa de lise do ensaio podem ser consideradas um risco
biológico potencial e NÃO devem ser inseridas no Neogen Equipamento de Detecção Molecular.
A Neogen Food Safety é certificada pela Organização Internacional de Normalização (ISO) 9001 para projeto efabricação.
O kit de testes do Neogen Ensaio de Detecção Molecular 2 - Teste de Detecção Genética de STEC (stx e eae) contém
48 testes de cada um dos reagentes stx e eae, conforme descrito na Tabela 1.

1

PT(Português)Tabela 1. Componentes do kit Neogen Ensaio para Detecção Molecular.
Item

Identificação

Quantidade

Conteúdo

Comentários

Neogen® Solução de Lise(LS)

Solução rosa
em tubostransparentes

96 (12 tiras de 8 tubos)

580 µL de LS por
tubo

Armazenados norack e prontos
para o uso

Tubos de reagentes
do Neogen® Ensaio de
Detecção Molecular
2 - Teste de Detecção
Genética de STEC (stx)

Tubos laranjas

48 (2 embalagens com
3 tiras de 8 tubos)

Mistura de detecção
e amplificação
Pronto para uso
específica liofilizada

Tubos de reagentes
do Neogen® Ensaio de
Detecção Molecular 2 Teste de Detecção Genética
de STEC (eae)Tubos vermelhos

48 (2 embalagens com
3 tiras de 8 tubos)

Mistura de detecção
e amplificação
Pronto para uso
específica liofilizada

Tampas adicionais

Tampas laranjas

96 (12 tiras de 8 tampas)

Pronto para uso

Tampas adicionais

Tampasvermelhas

96 (12 tiras de 8 tampas)

Pronto para uso

Neogen® Controle deReagentes (RC)

Tubostransparentes
com tampa
articulada

16 (2 embalagens de
8 tubos individuais)

Mistura de DNA
de controle,
amplificação edetecção liofilizada

Pronto para uso

O Controle Negativo (NC), não fornecido no kit, é um meio de enriquecimento estéril, por exemplo, BPW ISO. Não useágua como um NC.
Um guia de início rápido está disponível em www.neogen.com

Segurança

O usuário deve ler, entender e seguir todas as informações de segurança contidas nas instruções do Neogen Sistema de
Detecção Molecular e do Neogen Ensaio de Detecção Molecular 2 - Teste de Detecção Genética de STEC (stx e eae).
Guarde as instruções sobre segurança para consulta posterior.
ADVERTÊNCIA: indica uma situação de perigo que, se não evitada, pode resultar em morte ou ferimentos graves
e/ou danos materiais.
AVISO: indica uma situação potencialmente perigosa que, se não evitada, pode resultar em danos materiais.

ADVERTÊNCIA
Não use o Neogen Ensaio de Detecção Molecular 2 - Teste de Detecção Genética de STEC (stx e eae) no diagnósticode problemas de saúde em humanos ou animais.
O usuário deve treinar sua equipe com técnicas de testes atuais apropriadas: por exemplo, Boas Práticas deLaboratório(4), ISO/IEC 17025(5) ou ISO 7218(6).
Para reduzir os riscos associados a um resultado falso-negativo levando à liberação do produto contaminado:• Siga o protocolo e realize os testes exatamente conforme especificado nas instruções do produto.
• Armazene o Neogen Ensaio de Detecção Molecular 2 - Teste de Detecção Genética de STEC (stx e eae) conforme
indicado na embalagem e nas instruções do produto.
• Utilize sempre o Neogen Ensaio de Detecção Molecular 2 - Teste de Detecção Genética de STEC (stx e eae) antes
do vencimento.
• Utilize o Neogen Ensaio de Detecção Molecular 2 - Teste de Detecção Genética de STEC (stx e eae) para amostras
alimentares e ambientais que tenham sido validadas internamente ou por um terceiro.
• Utilize o Neogen Ensaio de Detecção Molecular 2 - Teste de Detecção Genética de STEC (stx e eae) somente
com superfícies, desinfetantes, protocolos e estirpes de bactérias que tenham sido validados internamente ou por
um terceiro.

2

PT
•

(Português)Para uma amostra ambiental que contém um tampão neutralizante com complexo de sulfonato de arila, faça uma
diluição de 1:2 antes de testar (1 parte da amostra em 1 parte do caldo de enriquecimento estéril). Outra opção étransferir 10 µL do enriquecimento do tampão neutralizante para os tubos de Neogen Solução de Lise. Produtos
Neogen® Sample Handling que incluem tampão neutralizante com complexo de sulfonato de arila: RS96010NB,
RS9604NB, SSL10NB, SSL10NB2G, HS10NB, HS10NB2G e HS2410NB2G.

Para reduzir os riscos de exposição a produtos químicos e agentes biológicos nocivos:• Execute testes de agentes patogênicos em um laboratório adequadamente equipado, sob o controle de pessoal
bem treinado. O meio de enriquecimento incubado e equipamentos ou superfícies que tenham entrado em contato
com o meio de enriquecimento incubado podem conter patógenos em níveis suficientes para apresentar riscos à
saúde humana.
• Sempre adote as práticas de segurança padrão em laboratórios, como usar trajes de proteção adequados e óculosde proteção ao manipular reagentes e amostras contaminadas.
• Evite o contato com o conteúdo do meio de enriquecimento e dos tubos de reagentes após a amplificação.
• Descarte amostras enriquecidas de acordo com os regulamentos padrão locais/regionais/nacionais vigentes daindústria.
• Amostras que não foram tratadas com aquecimento de forma adequada durante a etapa de lise do ensaio
podem ser consideradas um risco biológico potencial e NÃO devem ser inseridas no Neogen Equipamento de
Detecção Molecular.
Para reduzir os riscos de contaminação cruzada ao preparar o ensaio:• Sempre use luvas (para proteger o usuário e evitar a introdução de nucleases).
Para reduzir os riscos de exposição a líquidos quentes:• Não exceda a temperatura recomendada ao ajustar o aquecedor.
• Não exceda o tempo de aquecimento recomendado.
• Utilize um termômetro calibrado adequado para verificar a temperatura do Neogen® Bloco de Aquecimento para
Detecção Molecular (por exemplo, um termômetro de imersão parcial ou termômetro termopar digital, e não umtermômetro de imersão total). O termômetro deve ser colocado no local indicado do Neogen Bloco de Aquecimentopara Detecção Molecular.

AVISO
Para reduzir os riscos de contaminação cruzada ao preparar o ensaio:• Troque de luvas antes da hidratação do pellet dos reagentes.
• Recomenda-se o uso de ponteiras de pipeta estéreis, com barreira aerossol (filtros) e nível de biologia molecular.
• Utilize uma nova ponteira de pipeta para cada transferência de amostra.
• Utilize Boas Práticas Laboratoriais para transferir a amostra do meio de enriquecimento para o tubo de lise. Para
evitar a contaminação da pipeta, o usuário pode decidir adicionar uma etapa de transferência intermediária. Por
exemplo, o usuário pode transferir cada amostra enriquecida para um tubo estéril.
• Utilize uma estação de trabalho de biologia molecular contendo lâmpada germicida sempre que possível.
• Periodicamente, descontamine as bancadas e os equipamentos do laboratório (pipetas, ferramentas de tampar/
destampar etc.) com uma solução de 1–5% (v:v em água) de água sanitária ou solução de remoção de DNA.
Para reduzir os riscos de um resultado falso-positivo:• Nunca abra tubos de reagentes após a amplificação.
• Sempre descarte os tubos contaminados mergulhando-os em uma solução de água sanitária de 1–5% (v:v em água)por 1 hora, longe da área de preparação de ensaio.
• Nunca submeta os tubos de reagentes a autoclave após a amplificação.
Consulte a Planilha de Dados de Segurança para obter informações adicionais e informações sobre os regulamentos
locais para descarte.
Em caso de dúvidas sobre aplicações ou procedimentos específicos, acesse nosso site www.neogen.com ou entre em
contato com o seu representante ou distribuidor local Neogen.

Responsabilidade do usuário

Os usuários são responsáveis por se familiarizar com as informações e instruções do produto. Visite nosso sitewww.neogen.com ou entre em contato com o representante ou distribuidor Neogen local para obter mais informações.

3

PT(Português)Ao selecionar um método de teste, é importante considerar que fatores externos, como métodos de amostragem,
protocolos de teste, preparo de amostras, manipulação, a técnica de laboratório utilizada e a própria amostra, podem
influenciar nos resultados.
É de responsabilidade do usuário, ao selecionar qualquer método de teste ou produto, avaliar um número suficientede amostras com as matrizes e testes microbiológicos que permitam assegurar que o método escolhido atenda aos
critérios por ele estabelecidos.
Também é de responsabilidade do usuário determinar se o método de teste e os resultados atendem às exigências deseus clientes e fornecedores.
Como em qualquer outro método de teste, os resultados obtidos com qualquer produto da Neogen Food Safety não
constituem garantia de qualidade das matrizes ou processos com eles testados.
Para ajudar os clientes a avaliar o método para diversas matrizes de alimentos, a Neogen desenvolveu o kit Neogen®
Controle de Matriz para Detecção Molecular. Quando necessário, utilize o Neogen Controle de Matriz para Detecção
Molecular (MC) para determinar se a matriz tem a capacidade de influenciar nos resultados do Neogen Ensaio de
Detecção Molecular 2 - Teste de Detecção Genética de STEC (stx e eae). Teste diversas amostras representativas damatriz, isto é, amostras obtidas a partir de diferentes origens, durante qualquer período de validação quando adotar ométodo da Neogen, quando testar matrizes novas ou desconhecidas ou matrizes que tiverem passado por mudanças deprocesso ou matéria-prima.
Uma matriz pode ser definida como um tipo de produto com propriedades intrínsecas, tais como composição eprocessamento. As diferenças entre matrizes podem ser tão simples quanto os efeitos causados pelas diferenças em seu
processamento ou apresentação, por exemplo, cru vs. pasteurizado, fresco vs. desidratado etc.

Limitação de garantias/recurso limitado

SALVO CONFORME DECLARADO EXPRESSAMENTE EM UMA SEÇÃO DE GARANTIA DE EMPACOTAMENTO DE
PRODUTO INDIVIDUAL, A NEOGEN REJEITA TODAS AS GARANTIAS EXPRESSAS E IMPLÍCITAS, INCLUINDO, ENTRE
OUTRAS, QUAISQUER GARANTIAS DE COMERCIALIZAÇÃO OU ADEQUAÇÃO PARA UM DETERMINADO USO.
Se ficar provado que qualquer produto da Neogen Food Safety se encontra defeituoso, a Neogen ou seu distribuidor
autorizado procederá à respectiva substituição ou, se assim o decidir, restituirá o dinheiro da compra do produto.
Estes são os seus únicos termos de recurso. A Neogen deverá ser prontamente notificada em até sessenta dias após adescoberta de qualquer defeito suspeito no produto, o qual deverá ser devolvido à Neogen. Entre em contato com o
representante da Neogen ou distribuidor autorizado da Neogen para qualquer dúvida adicional.

Limitações de responsabilidade da Neogen

A NEOGEN NÃO SE RESPONSABILIZARÁ POR QUAISQUER DANOS, SEJAM DIRETOS, INDIRETOS, ESPECIAIS,ACIDENTAIS OU SUBSEQUENTES, INCLUINDO, ENTRE OUTROS, PERDA DE LUCROS. Em nenhuma circunstância
nem ao abrigo seja de qualquer teoria jurídica, a responsabilidade da Neogen deverá exceder o preço de compra dos
produtos supostamente defeituosos.

Armazenamento e descarte

Armazene o Neogen Ensaio de Detecção Molecular 2 - Teste de Detecção Genética de STEC (stx e eae) a
2–8 °C (35–47 °F). Não congele. Mantenha o kit longe de luz durante o armazenamento. Após abrir o kit, verifique se aembalagem de alumínio não está danificada. Se a embalagem estiver danificada, não utilize. Após a abertura, os tubos
de reagentes não utilizados devem sempre ser armazenados na embalagem resselável, juntamente com o dessecantepara manter a estabilidade dos reagentes liofilizados. Armazene as embalagens resseláveis a 2–8 °C (35–47 °F) por, nomáximo, 90 dias.
Não utilize o Neogen Ensaio de Detecção Molecular 2 - Teste de Detecção Genética de STEC (stx e eae) depois dovencimento. A data de validade e o número do lote estão anotados no rótulo externo da caixa. Após o uso, o meio deenriquecimento e os tubos Neogen Ensaio de Detecção Molecular 2 - Teste de Detecção Genética de STEC (stx e eae)
podem conter materiais patogênicos. Quando o teste for concluído, siga os regulamentos padrão vigentes da indústria
para descarte de resíduos contaminados. Consulte a Planilha de Dados de Segurança para obter informações adicionais
e informações sobre os regulamentos locais para descarte.

Instruções de uso

Siga todas as instruções com atenção. Caso contrário, pode haver resultados imprecisos.
Periodicamente, descontamine as bancadas e os equipamentos do laboratório (pipetas, ferramentas de tampar/
destampar etc.) com uma solução de 1–5% (v:v em água) de água sanitária ou solução de remoção de DNA.

4

PT

(Português)O usuário deve concluir o treinamento de qualificação do operador (QO) do Sistema de Detecção Molecular Neogen,conforme descrito no documento “Protocolos e Instruções de Qualificação de Instalação (QI)/Qualificação Operacional(QO) para o Neogen Sistema de Detecção Molecular”(7).
Consulte a seção “Instruções Específicas para Métodos Comprovados” para obter os requisitos específicos:
Tabela 3 para protocolos de enriquecimento conforme o Performance Tested MethodSM (PTM) Certificado nº 071902.
Enriquecimento de amostra
As Tabelas 2 e 3 oferecem orientação para protocolos gerais de enriquecimento de alimentos.
É responsabilidade do usuário validar os protocolos de amostragem alternativos ou taxas de diluição para garantir que
este método de teste atenda aos critérios do usuário.
Alimentos
1. Permita que o meio de enriquecimento BPW ISO mantenha o equilíbrio a 41,5 ± 1 °C.
2. Combine, de forma asséptica, o meio de enriquecimento e a amostra. Para carnes e amostras altamenteparticuladas, recomenda-se o uso de sacos de amostra com filtro.
3. Homogeneíze todas as matrizes e incube-as, conforme destacado na tabela do protocolo apropriado (vide Tabela 2ou 3).
Amostras ambientais
ADVERTÊNCIA: caso escolha utilizar tampão neutralizador que contém complexos de sulfonato de arila como asolução hidratante para a esponja, será necessário que você execute uma diluição de 1:2 (1 parte da amostra em
1 parte do caldo de enriquecimento estéril) da amostra ambiental enriquecida antes de testar para reduzir os riscos
de um resultado falso-negativo que levaria à liberação de produtos contaminados. Outra opção é transferir 10 µL do
enriquecimento do tampão neutralizante para os tubos de Neogen Solução de Lise.
É responsabilidade do usuário validar os protocolos de amostragem alternativos ou taxas de diluição para garantir que
este método de teste atenda aos critérios do usuário.
Tabela 2. Protocolos gerais de enriquecimento.
Matriz de amostra

TamanhoVolume do Caldoda amostra de Enriquecimento(mL)(pré-aquecido)

Temperatura deenriquecimento(± 1 °C)

Tempo deEnriquecimento(horas)Volume da
Análise da
Amostra (μL)

Carne moída crua, em
pedaços e iscas(a)375 g1125 BPW-ISO

41,5

10-18

20

Carnes cruas (suína, aves,ovina, bisão)(a)375 g1125 BPW-ISO

41,5

10-18

20

Folhas frescas(b)200 g

450 BPW-ISO

41,5

18-24

20

Brotos(c)25 g

225 BPW-ISO

41,5

18-24

20

Laticínios crus(d)25 g ou
25 mL

225 BPW-ISO

41,5

18-24

20

(a)

Massageie com as mãos as amostras de carne bovina (carne moída, em pedaços e tiras) e carne crua (carne de porco
moída, ave e carne não bovina) por 30–60 segundos para dispersar e quebrar os aglomerados após a adição de BPWISO pré-aquecido.

(b)Para as folhas frescas, enxágue as folhas com caldo de enriquecimento (BPW-ISO pré-aquecido) e agite-as por
30–60 segundos. Não massageie ou homogeneíze as folhas.

(c)Para os brotos, enxágue-as com caldo de enriquecimento (BPW-ISO pré-aquecido) por 30–60 segundos e não asmassageie ou homogeneíze.

(d)Homogeneíze as amostras de laticínios crus por 30 a 60 segundos após adicionar BPW-ISO.

5

PT(Português)Instruções específicas para métodos comprovados

Certificado AOAC® Performance Tested MethodSM (PTM) nº 071902

Nos programas PTM do Instituto de Pesquisa AOACSM, o Neogen Ensaio de Detecção Molecular 2 - Teste de Detecção
Genética de STEC (stx e eae) foi constatado como um método eficiente para a detecção de STEC. As matrizes testadas
no estudo são apresentadas na Tabela 3.
Tabela 3. Protocolos de enriquecimento segundo o Certificado AOAC PTMSM nº 071902.
Matriz de amostra

TamanhodaamostraVolume do Caldode Enriquecimento(mL)

Temperatura deenriquecimento(± 1 °C)

Tempo deEnriquecimento(horas)Volume da
Análise da
Amostra (μL)

Carne bovina
moída(a)375 g1125 BPW-ISO(pré-aquecido)

41,5

10-18

20

Carne moída crua(a)375 g1125 BPW-ISO(pré-aquecido)

41,5

10-18

20

Carne moída crua(a)25 g

225 BPW-ISO(pré-aquecido)

41,5

10-18

20

Carne de porco
moída crua(a)375 g1125 BPW-ISO(pré-aquecido)

41,5

10-18

20

Partes cruas deaves(a)375 g1125 BPW-ISO(pré-aquecido)

41,5

10-18

20

Frango separado
mecanicamente

25 g

225 BPW-ISO(pré-aquecido)

41,5

10-24

20

Espinafre(b)200 g

450 BPW-ISO(pré-aquecido)

41,5

18-24

20

Brotos(c)25 g

225 BPW-ISO(pré-aquecido)

41,5

18-24

20

Flor de cannabis
seca, flor decânhamo seca(4)10 g

90 BPW-ISO

41,5

28-32

20

(a)

Para as amostras de carne bovina (moída e iscas) adicione BPW-ISO pré-aquecido. Massageie-as com as mãos por
30–60 segundos para dispersar e quebrar os aglomerados.

(b)Para espinafre, adicione BPW-ISO pré-aquecido à matriz. Enxágue as folhas com líquido e agite-as cuidadosamente
por 30–60 segundos. Não massageie ou homogeneíze as folhas.

(c)Para os brotos, enxágue-as com caldo de enriquecimento (BPW-ISO pré-aquecido) por 30–60 segundos e não asmassageie ou homogeneíze.

(d)Flor de cannabis seca (>0,3% THC) e flor de cânhamo seca (≤0,3%THC)

Preparo da Neogen® Bandeja de Carga Rápida para Detecção Molecular
1. Umedeça um pano em uma solução de 1–5% (v:v em água) de água sanitária e limpe a Neogen Bandeja de Carga
Rápida para Detecção Molecular.
2. Enxágue a Neogen Bandeja de Carga Rápida para Detecção Molecular com água.
3. Utilize uma toalha descartável para secar a Neogen Bandeja de Carga Rápida para Detecção Molecular.
4. Certifique-se de que a Neogen Bandeja de Carga Rápida para Detecção Molecular esteja seca antes de utilizá-la.
6

PT(Português)Preparação do Neogen® Bloco de Resfriamento para Detecção Molecular
Coloque o Neogen Bloco de Resfriamento para Detecção Molecular diretamente sobre a bancada do laboratório: a
Neogen Bandeja de Bloco de Resfriamento para Detecção Molecular não é utilizada. Utilize o bloco à temperatura
ambiente do laboratório (20–25 °C).
Preparo do Neogen® Bloco de Aquecimento para Detecção Molecular
Coloque o Neogen Bloco de Aquecimento para Detecção Molecular em uma unidade de aquecimento com bloco seco
duplo. Ligue a unidade de aquecimento de bloco a seco e defina a temperatura para permitir que o Neogen Bloco deAquecimento para Detecção Molecular alcance e mantenha a temperatura de 100 ± 1 °C.
NOTA: dependendo da unidade de aquecimento, aguarde aproximadamente 30 minutos até que o Neogen Bloco deAquecimento para Detecção Molecular alcance a temperatura. Utilizando um termômetro calibrado adequado (porexemplo, um termômetro de imersão parcial ou um termômetro digital de termopares, não um termômetro de imersão total)
colocado no local indicado, verifique se o Neogen Bloco de Aquecimento para Detecção Molecular está a 100 ± 1 °C.
Preparo do Neogen® Equipamento de Detecção Molecular
1. Inicie o Software Neogen Sistema de Detecção Molecular e faça log in. Entre em contato com o representante
Neogen Food Safety para garantir que você possui a versão mais atualizada do software.
2. Ligue o Neogen Equipamento de Detecção Molecular.
3. Crie ou edite uma execução com dados para cada amostra. Consulte o Manual do Usuário do Neogen Sistema de
Detecção Molecular para obter mais detalhes.
3.1.

A seleção do ícone STXEAE-2 no software seleciona duas cavidades adjacentes (como A1, A2, B1, B2, etc.),
uma para o tubo do reagente stx e outra para o tubo do eae, pois cada amostra é executada com dois ensaios.
O NC é configurado para cada tubo de reagente e um RC é configurado para o kit.
1
SAL-2

A

ECO-2
LIS-2

B

LMO-2
CAM-2

C

CRO-2
STXEAE-2
STX-2
EAE-2
MC-2

D
E
F
G
H

2

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

RC

2 STXEAE
2

NC

STX 2

NC
EAE

NOTA: o Neogen Equipamento de Detecção Molecular deve estar pronto para o uso antes de inserir a Neogen
Bandeja de Carga Rápida para Detecção Molecular com os tubos de reação. Esta etapa de aquecimento leva
aproximadamente 20 minutos e é indicada por uma luz LARANJA na barra de status do instrumento. Quando oequipamento estiver pronto para iniciar uma execução, a barra de status ficará VERDE.

Lise

Remova o fundo do Neogen Rack de Solução de Lise com uma chave de fenda ou espátula antes de inserir o Neogen
Bloco de Aquecimento para Detecção Molecular.

7

PT(Português)1. Deixe que os tubos de Neogen Solução de Lise cheguem à temperatura ambiente (20–25 °C), deixando os racks
fora de refrigeração de um dia para o outro (16–18 horas). A alternativa para equilibrar os tubos Neogen Solução
de Lise à temperatura ambiente é posicioná-los na bancada do laboratório durante pelo menos 2 horas, incubálos em uma incubadora de 37 ± 1 °C por 1 hora ou colocá-los em um aquecedor com bloco seco duplo por
30 segundos a 100 °C.
2. Inverta os tubos com tampa para misturar. Prossiga para a próxima etapa em até 4 horas após a inversão.
3. Remova o caldo de enriquecimento da incubadora.
4. Um tubo de Neogen Solução de Lise é necessário para cada amostra e do NC (meio de enriquecimento esterilizado).
4.1.

As tiras de tubos de Neogen Solução de Lise podem ser cortadas para obter o número desejado de tubos.
Selecione o número de tubos ou tiras de 8 tubos necessários. Coloque os tubos de Neogen Solução de Liseem um rack vazio.

4.2.

Para evitar contaminação cruzada, destampe uma tira de tubo de Neogen Solução de Lise de cada vez eutilize uma nova ponteira de pipeta para cada etapa da transferência.

4.3.

Transfira a amostra enriquecida para os tubos de Neogen Solução de Lise, conforme descrito abaixo:

Primeiro, transfira cada amostra enriquecida para um tubo Neogen Solução de Lise individual. Por último,transfira o NC.
4.4.

Use a Neogen® Ferramenta de Tampar/Destampar para Detecção Molecular - Lise para destampar uma tirade tubos de Neogen Solução de Lise — uma tira de cada vez.

4.5.

Descarte a tampa do tubo de Neogen Solução de Lise, se o lisado for mantido para novo teste, coloque as
tampas em um recipiente limpo para reutilização após a lise.
4.5.1. Para processar o lisado mantido, consulte o Apêndice A.

4.6.

Transfira 20 µL de amostra para o tubo de Neogen Solução de Lise.

5. Repita as etapas 4.4 a 4.6, conforme necessário, para o número de amostras a serem testadas.
6. Quando todas as amostras tiverem sido transferidas, transfira 20 µL de NC (meio de enriquecimento estéril, por
exemplo, BPW) para um tubo Neogen Solução de Lise. Não use água como um NC.
7. Verifique se a temperatura do Neogen Bloco de Aquecimento para Detecção Molecular está a 100 ± 1 °C.
8. Coloque o rack descoberto de tubos Neogen Solução de Lise no Neogen Bloco de Aquecimento para Detecção
Molecular e aqueça por 15 ± 1 minuto. Durante o aquecimento, a Neogen Solução de Lise mudará da cor rosa (frio)para amarelo (quente).
8.1.

Amostras que não foram tratadas com aquecimento de forma adequada durante a etapa de lise do ensaio
podem ser consideradas um risco biológico potencial e NÃO devem ser inseridas no Neogen Equipamento de
Detecção Molecular.

9. Retire o rack descoberto de tubos de Neogen Solução de Lise do Neogen Bloco de Aquecimento para Detecção
Molecular e deixe esfriar no Neogen Bloco de Resfriamento para Detecção Molecular por pelo menos 5 minutos
e no máximo 10 minutos. O Neogen Bloco de Resfriamento para Detecção Molecular, usado em temperatura
ambiente sem a Neogen® Bandeja de Bloco de Resfriamento para Detecção Molecular, deve ser colocado
diretamente sobre a bancada do laboratório. Quando resfriada, a Neogen Solução de Lise voltará à cor rosa.
10. Retire o rack de tubos Neogen Solução de Lise do Neogen Bloco de Resfriamento para Detecção Molecular.

8

PT(Português)00:15:00

99–101 ºC

20–25 ºC

00:05:00

Amplificação

1. Um tubo de reagente de Neogen Ensaio de Detecção Molecular 2 - Teste de Detecção Genética de STEC (stx) e
um tubo de reagente de Neogen Ensaio de Detecção Molecular 2 - Teste de Detecção Genética de STEC (eae) énecessário para cada amostra e para o NC.
1.1.

As tiras de tubos podem ser cortadas para obter o número de tubos desejado. Selecione o número de tubos
de reagentes individuais ou de tiras de 8 tubos individuais necessárias para o Neogen Ensaio de Detecção
Molecular 2 - Teste de Detecção Genética de STEC (stx) e para o Neogen Ensaio de Detecção Molecular 2 Teste de Detecção Genética de STEC (eae).

1.2.

Coloque os tubos do Neogen Ensaio de Detecção Molecular 2 - Teste de Detecção Genética de STEC (stx)em um rack vazio de uma coluna.

1.3.

Coloque os tubos do Neogen Ensaio de Detecção Molecular 2 - Teste de Detecção Genética de STEC (eae)na coluna adjacente da direita.

1.4.

Evite agitar os pellets dos reagentes da parte inferior dos tubos.

2. Selecione um tubo Neogen Controle de Reagentes e coloque-o no rack.
3. Para o lisado NC, selecione um tubo de reagentes para o Neogen Ensaio de Detecção Molecular 2 - Teste deDetecção Genética de STEC (stx) e um para o Neogen Ensaio de Detecção Molecular 2 - Teste de Detecção
Genética de STEC (eae).

4. Para evitar contaminação cruzada, destampe uma tira do tubo de reagente de Neogen Ensaio de Detecção
Molecular 2 - Teste de Detecção Genética de STEC (stx ou eae) de cada vez e utilize uma nova ponteira de pipeta
para cada etapa da transferência.
5. Transfira cada um dos lisados para um tubo de reagente Neogen Ensaio de Detecção Molecular 2 - Teste deDetecção Genética de STEC (stx ou eae), conforme descrito abaixo.
5.1.

Primeiro, transfira cada um dos lisados para um tubo de reagente Neogen Ensaio de Detecção Molecular 2 Teste de Detecção Genética de STEC (stx), conforme descrito em 5.5 e 5.6.

5.2.

Depois, transfira cada um dos lisados para um tubo de reagente Neogen Ensaio de Detecção Molecular 2 Teste de Detecção Genética de STEC (eae) na coluna adjacente da direita, conforme descrito em 5.5 e 5.6.

NOTA: utilize uma nova ponteira de pipeta para cada transferência. Não utilize a mesma ponteira de pipeta
para o tubo de reagente do stx e do eae da mesma amostra de lisado.
5.3.

Após todas as transferências de amostra de lisado, adicione o lisado NC a cada tubo de reagente do Neogen
Ensaio de Detecção Molecular 2 - Teste de Detecção Genética de STEC (stx) e do Neogen Ensaio de
Detecção Molecular 2 - Teste de Detecção Genética de STEC (eae).
9PT(Português)5.4.

Transfira o lisado NC por último ao tubo de controle de reagentes.

5.5.

Use a Neogen® Ferramenta de Tampar/Destampar para Detecção Molecular - Reagente para destampar os
tubos do reagente do Neogen Ensaio de Detecção Molecular 2 - Teste de Detecção Genética de STEC (stx oueae), uma tira de cada vez. Descarte a tampa.

5.6.

Transfira 20 µL de amostra de lisado da ½ superior do líquido (evite o precipitado) no tubo de Neogen
Solução de Lise para o tubo de reagente do Neogen Ensaio de Detecção Molecular 2 - Teste de Detecção
Genética de STEC (stx ou eae) correspondente. Dispense em um ângulo que evite a agitação dos pellets.
Misture pipetando gentilmente 5 vezes.

NOTA: utilize uma nova ponteira de pipeta para cada transferência. Não utilize a mesma ponteira depipeta para o tubo de reagente do stx e do eae da mesma amostra de lisado.
5.7.

Repita a etapa 5.6 até que a amostra de lisado individual tenha sido adicionada a um tubo de reagente para o
Neogen Ensaio de Detecção Molecular 2 - Teste de Detecção Genética de STEC (stx ou eae) correspondente
na tira.

5.8.

Cubra os tubos de reagentes do Neogen Ensaio de Detecção Molecular 2 - Teste de Detecção Genética
de STEC (stx ou eae) com a tampa adicional fornecida e utilize o lado arredondado da Neogen Ferramenta
de Tampar/Destampar para Detecção Molecular - Reagente para apertar com um movimento de vaivém,
garantindo que a tampa fique bem apertada.

5.9.

Repita as etapas 5.6 a 5.8 conforme necessário, para o número de amostras a serem testadas dos tubos dereagentes do Neogen Ensaio de Detecção Molecular 2 - Teste de Detecção Genética de STEC (stx e eae).

5.10. Quando todas as amostras de lisado tiverem sido transferidas, repita as etapas de 5.6 a 5.8 para transferir
20 µL de lisado NC para um tubo de reagente do Neogen Ensaio de Detecção Molecular 2 - Teste deDetecção Genética de STEC (stx) e do Neogen Ensaio de Detecção Molecular 2 - Teste de Detecção Genética
de STEC (eae).
5.11. Transfira 20 µL de lisado NC para um tubo de Neogen Controle de Reagentes. Dispense em um ângulo que
evite a agitação dos pellets. Misture pipetando gentilmente 5 vezes.
Transfira cada amostra de lisado para os tubos de reagentes individuais de Neogen Ensaio de Detecção
Molecular 2 - Teste de Detecção Genética de STEC (stx ou eae) primeiro e, em seguida, para o NC. Porúltimo, hidrate o tubo Neogen Controle de Reagentes.
6. Carregue os tubos tampados em uma Neogen Bandeja de Carga Rápida para Detecção Molecular limpa edescontaminada e, em seguida, trave a tampa.

10

PT

(Português)7. Analise e confirme a execução configurada no Software do Neogen Sistema de Detecção Molecular.
8. Clique no botão Iniciar do software e selecione o instrumento a utilizar. A tampa do instrumento selecionado abreautomaticamente.
9. Posicione a Neogen Bandeja de Carga Rápida para Detecção Molecular no Neogen Equipamento de Detecção
Molecular e feche a tampa para iniciar o ensaio. Os resultados são fornecidos em 60 minutos, embora os positivos
possam ser detectados ainda mais cedo.
10. Depois que o ensaio estiver concluído, remova a Neogen Bandeja de Carga Rápida para Detecção Molecular do
Neogen Equipamento de Detecção Molecular e descarte os tubos mergulhando-os em uma solução de 1–5% (v:vem água) de água sanitária por 1 hora, fora da área de preparação do ensaio.
AVISO: para minimizar o risco de falso-positivos por contaminação cruzada, nunca abra tubos de reagentes que
contenham DNA amplificado. Isto inclui o reagente para Neogen Ensaio de Detecção Molecular 2 - Teste de Detecção
Genética de STEC (stx e eae), o Neogen Controle de Reagentes e os tubos de Neogen Controle de Matriz. Sempre
descarte os tubos de reagentes selados mergulhando-os em uma solução de 1–5% (v:v em água) de água sanitária por
1 hora, fora da área de preparação do ensaio.

Resultados e Interpretação

Um algoritmo interpreta a curva de saída de luz que resulta da detecção da amplificação do ácido nucleico.
Os resultados são analisados automaticamente pelo software e são codificados em cores de acordo com o resultado.
Um resultado é determinado positivo ou negativo pela análise de diversos parâmetros exclusivos das curvas. Resultados
positivos presuntivos são relatados em tempo real, enquanto resultados negativos e resultados de inspeção serão
exibidos após a conclusão da execução.
O software do Neogen Sistema de Detecção Molecular relata resultados separadamente para cada um dos ensaios(stx e eae) e usa os resultados de ambos para chamar a amostra de positiva ou negativa para STEC (EHEC) (consultea Figura abaixo). Para uma positiva presuntiva de STEC (EHEC), ambos os alvos genéticos (stx1 e/ou stx2 e eae)
devem ser positivos. Se algum dos ensaios individuais apresentar erro ou inspeção, o resultado final será erro ou
inspeção. É necessário refazer o teste para representar corretamente o resultado final (consultar a tecla de resultado).
O software também permite a configuração de ensaios individuais, se necessário, e a amostra de lisado ou lisado atual
do enriquecimento pode ser testado novamente com os ensaios, seguindo as etapas descritas no Apêndice A para
lisados mantidos e as etapas da seção Lise e Amplificação para o enriquecimento mantido.

11

PT

(Português)Teclas de resultado da amostra enriquecida de lisado+ +2 ++ -2 –
2+ ?2 ?
2+ 2
2– -2 +
2– -2 –
2– ?2 ?
2– 2
2? ?2 +
2? ?2 –
2

Ambos positivos, resultado final positivo? ?2 ?
2stx com Inspecionar, eae com Inspecionar, resultado final com Inspecionar, reteste?

stx com Inspecionar, eae com erro, resultado final com erro, reteste

2

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

2

EAE

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

stx positivo, eae negativo, resultado final negativo
stx positivo, eae com Inspecionar, resultado final com Inspecionar, reteste
stx positivo, eae com erro, resultado final com erro, reteste
stx negativo, eae positivo, resultado final negativo
stx negativo, eae negativo, resultado final negativo
stx negativo, eae com Inspecionar, resultado final com Inspecionar, reteste
stx negativo, eae com erro, resultado final com erro, reteste
stx com Inspecionar, eae positivo, resultado final com Inspecionar, reteste
stx com Inspecionar, eae negativo, resultado final com Inspecionar, reteste

stx com erro, eae positivo, resultado final com erro, reteste

STX

+
–
2

2

STX

2

?

stx com erro, eae com Inspecionar, resultado final com erro, reteste

2

STX

2

EAE
EAE
EAE

stx com erro, eae negativo, resultado final com erro, reteste
stx com erro, eae com erro, resultado final com erro, reteste

Teclas de controle negativo
2
2
2
2
2
2

NC
STX

NC
STX

NC
STX

NC
STX

NC
STX

NC
STX

2
2
2
2
2
2

NC
EAE

NC
EAE

NC
EAE

NC
EAE

NC
EAE

NC
EAE

Válido para ambos, ligação válida
Válido para um, outro com erro, link com erro, reteste
Válido para um, outro inválido, link inválido, reteste
Ambos com erro, link com erro, reteste
Ambos inválidos, link inválido, reteste
Um com erro, outro inválido, link com erro, reteste

Amostras positivas presuntivas devem ser confirmadas conforme os procedimentos operacionais padrão delaboratórios, ou seguindo o método de confirmação de referência apropriado(1, 2, 3), começando com a transferência
do caldo de enriquecimento primário para as placas seletivas e a confirmação de isolados por meio de métodos
bioquímicos, microscópicos e sorológicos apropriados. Para matrizes especificadas pelo MLG 5C, a separação
imunomagnética deve ser feita antes do plaqueamento no meio selecionado.
NOTA: até mesmo uma amostra negativa não resultará em leitura zero, pois o sistema e os reagentes de amplificação
do Neogen Ensaio de Detecção Molecular 2 - Teste de Detecção Genética de STEC (stx e eae) tem uma leitura de
Unidades Relativas de Luz (URL) em “plano de fundo”.
Em casos raros de saída de luz fora do comum, o algoritmo rotula o caso como Inspecionar. A Neogen recomenda que ousuário repita o ensaio para qualquer amostra Inspecionar. Se o resultado continuar como “Inspecionar”, prossiga com oteste de confirmação utilizando o método de sua preferência(1, 2, 3) ou conforme especificado pelos regulamentos locais.

12

PT

(Português)Tabela 4. Símbolos e informações para diversos resultados de software.
Tipo depoço
AmostraAmostraSímbolo de
resultado do poço+–

AmostraAmostra?

AmostraResultado

Interpretação

Positivo

A amostra é positiva presuntiva para o patógeno alvo.

Negativo

A amostra é negativa presuntiva para o patógeno alvo.

InibidoA matriz da amostra foi inibitória para o ensaio. Pode ser necessário
um novo teste. Consulte a seção de resolução de problemas e o kit
de Instruções do Produto do ensaio para obter mais informações.

Inspecionar

A presença ou ausência do patógeno alvo foi indeterminada. Pode
ser necessário um novo teste. Consulte a seção de resolução deproblemas e o kit de Instruções do Produto do ensaio para obter
mais informações.

ErroNão foi detectada bioluminescência. Pode ser necessário um
novo teste. Consulte a seção de resolução de problemas e o kit deInstruções do Produto do ensaio para obter mais informações.

Apêndice A. Interrupção de protocolo: armazenamento e novo teste das amostras

1. Para armazenar um lisado tratado termicamente, tampe novamente o tubo de Neogen Solução de Lise com uma
tampa limpa (consulte a seção “Lise”, 4.5).
2. Para armazenar uma amostra enriquecida, incube-a por no mínimo 18 horas antes do armazenamento.
3. Armazene entre 4 e 8 °C por até 72 horas.
4. Prepare uma amostra armazenada para amplificação invertendo de 2 a 3 vezes para misturar.
5. Destampe os tubos.
6. Coloque os tubos de lisado misturados no Neogen Bloco de Aquecimento para Detecção Molecular e aqueça a
100 ± 1 °C por 5 ± 1 minuto.
7. Retire o rack de tubos Neogen Solução de Lise do Neogen Bloco de Aquecimento para Detecção Molecular e deixe
esfriar no Neogen Bloco de Resfriamento para Detecção Molecular por pelo menos 5 minutos e no máximo 10
minutos.
8. Continue o protocolo na seção Amplificação detalhada acima.

Referências:

1. Microbiology Laboratory Guidebook. U. S. Department of Agriculture (USDA) Food Safety and Inspection Service(FSIS) Microbiology Laboratory guidebook 5C.00. Detection and isolation of top seven Shiga toxin-producing
Escherichia coli (STECs) from meat products and carcass and environmental sponges. Feb 4, 2019.
2. US Food and Drug Administration Bacteriological Analytical Manual. Chapter 4A: Diarrheagenic Escherichia coli.
October 2018.
3. ISO/TS 13136:2012: Microbiology of food and animal feed — Real-time polymerase chain reaction (PCR)-based
method for the detection of food-borne pathogens — Horizontal method for the detection of Shiga toxin-producing
Escherichia coli (STEC) and the determination of O157, O111, O26, O103 and O145 serogroups
4. U.S. Food and Drug Administration. Code of Federal Regulations, Title 21, Part 58. Good laboratory practice fornonclinical laboratory studies.
5. ISO/IEC 17025. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories.
6. ISO 7218. Microbiology of food and animal feeding stuffs – General rules for microbiological examination.
7. Neogen Installation Qualification (IQ) / Operational Qualification (OQ) Protocols and Instructions for Neogen
Molecular Detection System. Contate seu representante da Neogen Food Safety para obter uma cópia destedocumento.

Explicação dos símbolos
info.neogen.com/symbols

13

Neogen Food Safety
Neogen Corporation
620 Lesher Place
Lansing, MI 48912 USA
Neogen.com
Neogen Europe Ltd.
The Dairy School
Auchincruive
Ayr, KA6 5HU
Scotland, UK
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Bray Business Park, Bray
Co. Wicklow
A98YV29, Ireland© Neogen Corporation 2024. All rights reserved.
Neogen is a trademark of Neogen Corporation.
All other trademarks are the property of their respective companies.

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Neogen est une marque de commerce de Neogen.
Toutes les autres marques decommerce appartiennent à leur propriétaire respectif.
FS00918A

JA （日本語）

発行日：2024-01

病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子スクリーニング (stx/eae) 用

製品情報

製品の概要および用途

Neogen® 病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子スクリーニング (stx /eae) 用は、増菌した食品および食品製造工程の環境検体中における志賀毒素遺伝子（stx1および／またはstx2）およびインチミン遺伝子 (eae) を志賀毒素産生性大腸菌（STECあるいは「Vero毒素産生性大腸菌」とも呼ばれる）から特異的な病原体を迅速に検出するために、Neogen® 病原菌自動検出システムとともに使用されます。
STECとはstx1遺伝子によってコードされる志賀毒素1 (Stx1) またはstx2遺伝子によってコードされる志賀毒素2 (Stx2) のいずれか、もしくはその両方を産生する大腸菌の病原型を指します。
STECはstx1および／またはstx2およびeae（付着および消失表現型に関与するインチミン遺伝子）の病原性遺伝子を保有しており、腸管出血性大腸菌 (EHEC) とも称されます。
キットには試薬チューブ2本が含まれます。
1本はSTEC (EHEC) が保有する病原性遺伝子stx1および／もしくはstx2検出に使用し、残り1本はeae検出に使用します。
Neogen® 病原菌自動検出システムのソフトはアッセイごとに別々の結果を表示
し、両方のアッセイ結果をもとにSTEC (EHEC) 陽性または陰性の判定を行います。
両方の標的遺伝子（stx1および／またはstx2
およびeae）が陽性になった場合、STEC (EHEC) 推定陽性と判断します。
stxアッセイはstx1やstx2を特定することはできません
が、stx1および／またはstx2の存在を検出できます。
Neogen病原菌検出アッセイは、増幅した遺伝子を検出するために、高い特異性と感度で核酸配列を迅速に増幅するLAMP法と、生物発光を組み合わせています。
推定陽性結果はリアルタイムに表示され、陰性結果は検査が完了してから表示されます。
結果が陽性と推定される場合は、任意の別の方法(1, 2, 3)または行政の規制によって指定されたとおりに確認する必要があります。

Neogen 病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子スクリーニング (stx/eae) 用は、検査技術の訓練を受けた技術者が検査室環境で使用することを想定しています。
Neogenは、食品または飲料以外の産業における本製品の使用に関しては検証しておりません。
たとえば、Neogenは、本製品を医薬品、化粧品、臨床または動物診断検体の検査で使用することについて検証しておりません。
Neogen 病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子スクリーニング (stx/eae) 用は、可能性のあるすべての食品や食品製造工程、検査プロトコル、あるいはすべての菌株について評価されたわけではありません。

すべての検査法と同様に、増菌ブロスのメーカーや組成、品質などの要因が結果に影響する場合があります。
採取方法、検査プロ
トコル、検体の準備、取り扱い、および検査手技などの要因が結果に影響する場合もあります。
Neogenは、検査方法がお客様の基準を確実に満たすように、お客様の環境において、特定の食品および菌株を用いて十分な数の検体で、増菌ブロスを含む検査方法を評価することをお勧めします。
Neogenは、緩衝ペプトン水 (BPW)-ISO前増菌ブロスを使用して、Neogen 病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子スクリーニング(stx/eae) 用を評価してきました。

Neogen® 病原菌自動検出システムの装置は、アッセイのライシスステップ中に熱処理を行った検体を測定することを目的としており、検体中に存在する微生物を溶菌するように設計されています。
アッセイのライシスステップ中に適切な熱処理を行っていな
い検体は、潜在的バイオハザードと考えられる可能性がありますので、Neogen病原菌自動検出システムの装置内には入れないでください。
Neogen 食品衛生管理製品部門は、設計と製造についてISO（国際標準化機構）9001認証を取得しています。

Neogen 病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子スクリーニング (stx/eae) 用検査キットには表1に記載のとおり、stxおよびeaeのそれぞれ48回分の試薬が含まれます。

1表1. Neogen病原菌検出アッセイキットの内容。
品目

Neogen® ライシス液（LS溶液）

特徴

クリアチューブに入ったピンク色の液体

JA （日本語）
数量

内容

96検査分（8連チューブ12
セット）

チューブ1本につきLS580 μL

48検査分（8連チューブ3セ
ット入り2パウチ）

凍結乾燥済み特異的増
幅試薬および検出試薬

Neogen® 病原菌検出アッセイ
2 - STEC遺伝子スクリーニン オレンジ色チューブ
グ (stx) 用試薬チューブ

48検査分（8連チューブ3セ
ット入り2パウチ）

予備キャップ

オレンジ色キャップ

96検体分（8連キャップ12
セット）

Neogen® 試薬コントロール(RC)

凍結乾燥済みコントロ
フリップトップ式クリ 16検査分（チューブ8本入りールDNA、増幅試薬お
アチューブ
2パウチ）
よび検出試薬

Neogen® 病原菌検出アッセイ
2 - STEC遺伝子スクリーニン 赤色チューブ
グ (eae) 用試薬チューブ
予備キャップ赤色キャップ

96検体分（8連キャップ12セット）

凍結乾燥済み特異的増
幅試薬および検出試薬

コメント

ラック入り、
調整済み
調整済み

調整済み
調整済み
調整済み
調整済み

陰性コントロール (NC)（キットには付属しません）は、BPW-ISOなどの滅菌済前増菌培地です。
水は陰性コントロールとして使用しないでください。

クイックスタートガイドは、www.neogen.com でご覧いただけます。

安全性

Neogen病原菌自動検出システムとNeogen 病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子スクリーニング (stx/eae) 用の製品情報に記載のすべての安全情報を読み、理解し、遵守してください。
また、今後参照できるように、
この安全性指示を保管しておいてください。
警告： 警告は、それを避けなければ死亡または重篤な傷害ないし物的損害が発生しうる危険な状況を示します。
注記： 回避できない場合、物的損害が起こり得る危険な状況を示します。

警告

Neogen 病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子スクリーニング (stx/eae) 用は、
ヒトまたは動物の病態診断に使用しないでくださ
い。
検査実施担当者に適切な検査技術を身につけるように指導してください（例：Good Laboratory Practices(4)、ISO/IEC
17025(5)、ISO 7218(6)）。

汚染製品の出荷につながる偽陰性結果に伴うリスクを回避するために：• プロトコルに従い、製品情報に記載のとおりに検査を行ってください。
• Neogen 病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子スクリーニング (stx/eae) 用は、外箱表示および製品情報に記載のとおりに保管してください。
• Neogen 病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子スクリーニング (stx/eae) 用は、有効期限までに必ず使用してください。
• Neogen 病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子スクリーニング (stx/eae) 用は、社内または第三者による検証を行った食品検体および環境検体に使用してください。
• Neogen 病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子スクリーニング (stx/eae) 用は、社内または第三者によるバリデーションが行われた表面、殺菌剤、プロトコル、菌株のみに使用してください。
• アリルスルホン酸塩添加中和緩衝液を含む環境検体については、試験前に1:2の希釈（検体1に対して滅菌増菌ブロス1）
を行ってください。
別の方法としては、中和緩衝液増菌ブロス10 μLをNeogenライシスチューブに滴下します。Neogen® 検体処理製品のうち、アリルスルホン酸塩添加中和緩衝液を含む製品は、RS96010NB、RS9604NB、SSL10NB、
SSL10NB2G、HS10NB、HS10NB2G、HS2410NB2Gです。

化学物質およびバイオハザードへの暴露に伴う危険を回避するために：• 技能訓練を受けた検査実施担当者の管理下で、適切な設備のある検査室にて食中毒菌検査を行ってください。
培養済み増菌ブロスおよび培養済み増菌ブロスと接触する機器または接触面には、人体に有害となりうる量の病原体が含まれている可能性があります。
• 試薬および汚染された検体を取り扱う際は、適切な保護衣、保護メガネの装着など、標準的な検査室の安全手順に常に従ってください。
• 増菌後のブロスや、増幅後の試薬チューブ内容物には触れないでください。
2

JA （日本語）

現行の地方／地域／国の規制基準に従って、増菌された検体を廃棄してください。
アッセイのライシスステップ中に適切な熱処理を行っていない検体は、潜在的バイオハザードと考えられる可能性があります
ので、Neogen病原菌自動検出システムの装置内には入れないでください。
アッセイ準備中の交差汚染に伴う危険を回避するために：• 手袋を必ず着用してください（ユーザー保護と遺伝子の混入を避けるため）。
••高温の液体への暴露に伴う危険を回避するために：• ヒーターの温度設定を推奨温度以上にしないでください。
• 推奨される加熱時間を超えないでください。
（例：浸線付• 適切な校正済みの温度計を使用して、Neogen® 病原菌検出ヒートブロックインサートの温度を確認してください
温度計またはデジタル熱電対温度計。
全浸没温度計は使用しないこと）。
温度計は、必ずNeogen病原菌検出ヒートブロック
インサートの指定の部位に設置してください。

注記

アッセイ準備中の交差汚染に伴う危険を回避するために：• 試薬ペレットを水和する前に、手袋を交換してください。
• 滅菌済みのエアロゾルバリア材（フィルター付）、分子生物学グレードのピペットチップの使用を推奨します。
• 検体ごとに新しいピペットチップを使用してください。
• GLP（医薬品安全性試験実施基準）に従って検体を増菌ブロスからライシスチューブに移してください。
ピペットの汚染を回避するため、中間的な滴下ステップを追加することもできます。
例えば、増菌された各検体を滅菌チューブに分注することができます。
• 利用可能な場合は、殺菌灯が装備された病原菌取扱エリアを使用してください。
• 検査室の作業台および備品（ピペット、
キャップ／デキャップツール等）は、水で1～5%（v/v）に希釈した家庭用漂白液またはDNA除去用液を使用して定期的に除染してください。
偽陽性の結果に伴う危険を回避するために：• 増幅後の試薬チューブは絶対に開けないでください。
• 汚染されたチューブは、常に、水で1～5%（v/v）に希釈した家庭用漂白液に1時間浸漬した後、アッセイの準備作業領域から隔離して、廃棄してください。
• 増幅後の試薬チューブは絶対にオートクレーブで加熱滅菌処理しないでください。
廃棄に関する詳細および行政の規制については、安全データシートをご参照ください。

具体的な用途や手順についてご質問がありましたら、当社のウェブサイト (www.neogen.com) をご覧いただくか、Neogen販売担当者または取り扱い販売店までお問い合わせください。

お客様の使用責任

お客様には、使用前に製品説明書および製品情報を熟知していただく責任があります。
詳細につきましては、当社ウェブサイト
www.neogen.com をご覧いただくか、
お近くのNeogen販売担当者または販売店にお問い合わせください。

検査方法を選択する際には、採取方法、検査プロトコル、検体の準備、取り扱い、検査手技、検体自体などの外的要因が結果に影響することを認識することが重要です。
検査方法または製品を選択する際に、適切なマトリックスおよび微生物負荷を用いて十分数の検体を評価して、選択した試験方法がお客様の基準を満たすことをお客様の責任でご確認ください。

また、検査方法および結果が顧客または供給業者の要件を満たしているかについても、事前にお客様の責任でご確認ください。
どの検査方法を使用した場合でも、Neogen食品衛生管理製品を用いて得られた結果は、検査を実施した食品マトリックスまたは工程の品質を保証するものではありません。

各種食品マトリックスの検査方法の評価にご利用いただくため、NeogenではNeogen® 病原菌検出マトリックスコントロールキットをご用意しました。
必要に応じて、
Neogen病原菌検出マトリックスコントロール (MC) を使用し、対象マトリックスがNeogen 病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子スクリーニング (stx/eae) 用の検査結果に影響を及ぼすかどうかを判定してください。
Neogenの検査法を採用する場合、または新規や由来の不明なマトリックス、あるいは原材料を加工したマトリックスや加工工程が変更されたマトリックスを検査する場合は、検証期間中に、
マトリックスの標準となる複数の検体（由来の異なる検体）を検査してください。

マトリックスは、成分や加工状態など固有の特性を備える製品の種類として定義されます。
マトリックス間の違いは、加工や外観（例：未加工か滅菌済みか、新鮮か乾物か、等）の違いに起因する効果と同じように単純な場合があります。

3

JA （日本語）

保証の範囲／賠償の制限

個々の製品パッケージの限定保証条項に明示されている場合を除き、NEOGENは明示または黙示を問わず、製品または特定の目的への適合性に関する保証を含むがこれに限定されない、
いかなる種類の保証も負いかねます。
Neogen食品衛生管理製品
部門の製品に欠陥があった場合、Neogenまたは指定販売店で交換あるいは製品購入価格の払い戻しをいたします。
対応は上記のみとさせていただきます。
製品の欠陥が疑われる場合は、判明した時点から60日以内に速やかにNeogenに通知し、製品をNeogenに返品する必要があります。
ご不明な点がございましたら、Neogen の担当者または Neogen の正規代理店までお問い
合わせください。

Neogenの保証責任範囲

NEOGENは、直接的、間接的、特殊なもの、偶発的または必然的であるかを問わず、利益損失を含むがこれに限定されないあらゆる損失または損害に対しての責任を負わないものとします。
いかなる場合も、
いかなる法的理論の下でも、Neogenの保証責任
範囲は、欠陥と申し立てられた製品の購入金額を超えないものとします。

保管と廃棄

Neogen 病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子スクリーニング (stx/eae) 用は2～8°C (35～47°F) で保管してください。
冷凍しな
いでください。
冷暗所で保管してください。
キット開封後は、ホイルパウチが破損していないことを確認してください。
パウチが破損している場合は、使用しないでください。
開封後、使用しない試薬チューブは、凍結乾燥試薬の安定性を保つため、乾燥剤と共に再密閉可能なパウチ内に必ず保管してください。
封をしたパウチは2～8°C (35～47°F) で、90日間保管できます。
有効期限が過ぎたNeogen 病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子スクリーニング (stx/eae) 用は使用しないでください。
使用期限とロット番号は箱の外側のラベルに記載しています。
使用後、前増菌培地およびNeogen 病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子ス
検査終了後は、汚染廃棄物に関する現行の業界
クリーニング (stx/eae) 用には病原性の物質が含まれている可能性があります。
基準に従って廃棄してください。
廃棄に関する詳細および行政の規制については、安全データシートをご参照ください。

使用方法

すべての指示に、注意深く従ってください。
従わない場合、正確な結果が得られないことがあります。

検査室の作業台および備品（ピペット、
キャップ／デキャップツール等）は、水で1～5%（v/v）に希釈した家庭用漂白液またはDNA除去用液を使用して定期的に除染してください。

（7）
ユーザーは、「Neogen病原菌自動検出システムの設置資格（IQ）／操作資格（OQ）
プロトコルと手順」に記載のとおり、Neogen病原菌自動検出システムのオペレーター資格（OQ）
トレーニングを受講する必要があります。

具体的な要件については、「バリデート済みメソッドに関する具体的な指示」の項を参照してください：表3. Performance Tested MethodSM (PTM) 認定証 #071902に基づく前増菌プロトコル。
検体の増菌
表2、3には、食品を増菌する場合の一般的なガイドラインを示しています。

この検査法がお客様の基準に合致するかを確かめるため、別の採取プロトコルまたは希釈率で事前に確認いただき、お客様の責任で使用の可否をご判断ください。
食品
1. BPW ISO前増菌培地を予め41.5 ± 1℃になるように加温します。

2. 増菌培地と検体を無菌的に混合します。
すべての肉検体および微粒子を多く含む検体に関しては、
フィルター付きホモジナイ
ザーバッグの使用を推奨します。
3. すべてのマトリックスを混合し、適切なプロトコル表（表2または表3を参照）の概要に従って培養します。
環境検体

警告：アリルスルホン酸複合体をスポンジの水和溶液として含む中和バッファーの使用を選択する場合には、汚染された製品の出庫につながる偽陰性の伴うリスクを回避するために、検査を行う前に増菌環境検体の1：2の希釈液（検体1に対し滅菌増菌ブロス1）を行う必要があります。
別の方法としては、中和緩衝液増菌ブロス10 μLをNeogenライシスチューブに滴下します。

この検査法がお客様の基準に合致するかを確かめるため、別の採取プロトコルまたは希釈率で事前に確認いただき、お客様の責任で使用の可否をご判断ください。

4

JA （日本語）表2. 一般的な増菌プロトコル。
検体マトリックス

検体量

生の牛ひき肉、角切り肉、切り落とし肉(a)

前増菌ブロス量 (mL)（加温済み）

増菌温度(± 1°C)

増菌時間（時間）

検体の分析量(μL)

375 g

1125 BPW-ISO

41.5

10-18

20

生肉（豚肉、鶏肉、子羊の肉、
野牛の肉）(a)375 g1125 BPW-ISO

41.5

10-18

20

もやし

200 g

450 BPW-ISO

41.5

18-24

20

25 g

225 BPW-ISO

41.5

18-24

20

225 BPW-ISO

41.5

18-24

20

葉状作物(b)

生乳

(a)

(b)
(c)
(d)

(c)

25 gもしくは25 mL(d)

加温済みBPW-ISOを加えた後、かたまりをほぐすために、牛肉（ひき肉、角切り肉、切り落とし肉）および生肉（豚肉、鶏肉、牛肉
以外の肉）検体を30秒から60秒間手で揉みます。
葉状作物に前増菌ブロス（加温済みBPW-ISO）を注ぎ、30秒から60秒間静かにかき混ぜます。
葉を揉んだり、
ホモジナイズは行わないでください。

30秒から60秒間前増菌ブロス（加温済みBPW-ISO）をもやしに注ぎます。
揉んだり、
ホモジナイズは行わないでください。

加温済みBPW-ISOを加えた後、生乳検体を30秒から60秒間ホモジナイズします。

バリデート済みメソッドに関する具体的な指示

AOAC® Performance Tested MethodSM (PTM) 認証 #071902

AOAC Research Institute PTMSM の試験において、Neogen 病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子スクリーニング (stx/eae) 用
は、STECの検出に有効な方法であることが確認されています。
上記試験において検査の対象となったマトリックスを表3に掲載
します。
表3. AOAC PTMSM 認証 #071902に従う増菌プロトコル。
検体マトリックス

生の牛切り落とし肉(a)
生の牛ひき肉(a)

生の牛ひき肉

生の豚ひき肉
生の鶏肉

(a)

(a)
(a)

機械分離鶏肉

検体量
375 g
375 g
25 g
375 g
375 g
25 g

前増菌ブロス量 (mL)

増菌時間（時間）

検体の分析量(μL)

225 BPW-ISO（加温済み）

41.5

10-18

20

41.5

10-18

20

1125 BPW-ISO（加温済み）

41.5

10-18

20

41.5

10-18

20

41.5

10-24

20

41.5

18-24

20

1125 BPW-ISO（加温済み）
1125 BPW-ISO（加温済み）
1125 BPW-ISO（加温済み）
225 BPW-ISO(温めておくこと)

450 BPW-ISO（加温済み）

増菌温度 (± 1°C)
41.5

10-18

20

ほうれん草(b)200 g

乾燥大麻の花、乾燥麻
の花(4)

25 g

225 BPW-ISO（加温済み）

41.5

18-24

20

10 g

90 BPW-ISO

41.5

28-32

20

もやし

(c)

(a)

牛肉検体（牛ひき肉、切り落とし肉）に加温済みBPW-ISOを加えます。
かたまりをほぐすために、30秒から60秒間手で揉み
ます。

5

(b)
(c)
(d)

JA （日本語）

マトリックスに加温済みBPW-ISOを入れます。
ほうれん草に前増菌ブロスを注ぎ、30秒から60秒間静かにかき混ぜてます。
葉を揉んだり、
ホモジナイズは行わないでください。
30秒から60秒間前増菌ブロス（加温済みBPW-ISO）をもやしに注ぎます。
揉んだり、
ホモジナイズは行わないでください。

乾燥大麻の花 (THCが 0.3% を上回る) と乾燥麻の花 (THC が 0.3% 未満)

Neogen® 病原菌検出スピードローダートレイの準備
1. 水で1～5%（v/v）に希釈した家庭用漂白液で湿らせた布か使い捨て用タオルを使って、Neogen病原菌検出スピードローダー
トレイを拭きます。
2. 水でNeogen病原菌検出スピードローダートレイを濯ぎます。

3. 使い捨てペーパータオル等で、Neogen病原菌検出スピードローダートレイを拭きます。

4. 使用前に、Neogen病原菌検出スピードローダートレイが乾燥していることを確認してください。

Neogen® 病原菌検出チルブロックインサートの準備
Neogen病原菌検出チルブロックインサートを作業台の上に直に置きます：Neogen 病原菌検出チルブロックインサートを室温（20～25℃）に置きます。

Neogen® 病原菌検出ヒートブロックインサートの準備
Neogen病原菌検出ヒートブロックインサートをドライダブルブロックヒーターユニットに入れます。
ドライブロックヒーターユニッ
トをオンにして、温度を100 ± 1°Cに設定します。
Neogen病原菌検出ヒートブロックインサートが設定温度に達したら、温度を保持します。
注：使用するヒーターユニットによっては、Neogen病原菌検出ヒートブロックインサートが設定温度に達するまでに約30分かかります。
適切な校正済みの温度計（例：浸線付温度計またはデジタル熱電対温度計。
全浸没温度計は使用しないこと）を指定の部位に設置し、Neogen病原菌検出ヒートブロックインサートが100 ± 1°Cであることを確認します。

Neogen® 病原菌自動検出システムの準備
1. Neogen病原菌自動検出システム用ソフトウェアを起動してログインします。
お使いのソフトウェアが最新バージョンであるかどうかを確認するには、Neogen食品衛生管理製品の営業担当者までお問い合わせください。
2. Neogen病原菌自動検出システムの装置の電源を入れます。

3. 各検体のデータを含む検出結果を作成、編集します。
詳細については、Neogen病原菌自動検出システムユーザーマニュアルを参照してください。
3.1. ソフトウェアのSTXEAE-2アイコンを選択すると、隣接する2つのウェル（例：A1、A2、B1、B2）が選択されます。
2つのアッセイを用いて各検体を測定するため、stx試薬チューブおよびeae試薬チューブごとにウェルが1つ選択されます。
各
試薬チューブ用にNCが配置され、キット用に1つのRCが配置されます。
1
SAL-2

A

ECO-2
LIS-2

B

LMO-2
CAM-2

C

CRO-2
STXEAE-2
STX-2
EAE-2
MC-2

D
E
F
G
H

2

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

RC

2 STXEAE
2

NC

STX 2

NC
EAE

注：Neogen病原菌自動検出システムは、反応チューブと共にNeogen病原菌検出スピードローダートレイを入れる前に、スタンバイ状態になっている必要があります。
この加熱ステップには約20分かかり、装置のステータスバーがオレンジ色に点灯します。
装置の準備ができると、ステータスバーは緑色に変わります。

6

JA （日本語）

ライシス

Neogen病原菌検出ヒートブロックインサートに入れる前に、ドライバーまたはスパーテルでNeogenライシスチューブラックの底部を取り外します。

1. Neogenライシスチューブは、
ラックに一晩（16～18時間）静置して、室温 (20～25°C) に戻します。
Neogenライシスチューブ
を室温に戻す別の方法としては、Neogenライシスチューブを作業台の上に2時間以上静置するか、Neogenライシスチューブ
を37 ± 1°Cの培養器内で1時間保温するか、Neogenライシスチューブをドライダブルブロックヒーターに入れて100°Cで30秒間加熱します。

2. キャップを閉めた状態のライシスチューブを反転させて中の液を混合させます。
反転後4時間以内に次のステップに進みます。
3. 培養器から増菌済みブロスを取り出します。

4. 各検体およびNC（滅菌増菌ブロス）につきNeogenライシスチューブ1本が必要です。

4.1. Neogenライシスチューブのストリップは、必要なチューブ数にカットすることができます。
各チューブまたは8連チュー
ブのストリップの数を選択してください。
Neogenライシスチューブを空のラックに置きます。

4.2. 交差汚染を回避するため、Neogenライシスチューブのキャップは一度に1ストリップずつ外し、滴下ステップごとに新しいピペットチップを使用してください。
4.3. 以下に記載のとおり、増菌した検体をNeogenライシスチューブに滴下します：

最初に、増菌した各検体を各Neogenライシスチューブに滴下します。
最後にNCを滴下します。

4.4. Neogen® 病原菌検出キャップ/デキャップツール - ライシス、Neogenライシスチューブのキャップを一度に1ストリップ
ずつ外します。

4.5. Neogenライシスチューブのキャップを廃棄します。
ライシスを再検査用に保存する場合は、キャップを清潔な容器に入れておき、ライシス後に再度キャップを閉めます。
4.5.1.

保存したライシスの処理については、付録Aを参照してください。

4.6. Neogenライシスチューブに検体20 µLを滴下します。

5. 検査する検体数に応じて、
ステップ4.4～4.6を繰り返します。

6. すべての検体を移注したら、NC（ネガティヴコントロール用滅菌増菌ブロス、例：BPW）20 µLをNeogenライシスチューブに滴下します。
水は陰性コントロールとして使用しないでください。
7. Neogen病原菌検出ヒートブロックインサートの温度が100 ± 1°Cであることを確認してください。

8. Neogen病原菌検出ヒートブロックインサート内にカバーを外したNeogenライシスチューブラックを入れて、15 ± 1分間加熱します。
加熱中、Neogenライシス液はピンク色（低温）から黄色（高温）に変色します。
8.1. アッセイのライシスステップ中に適切な熱処理を行っていない検体は、潜在的バイオハザードと考えられる可能性がありますので、Neogen病原菌自動検出システム装置内には入れないでください。

9. Neogen病原菌自動検出システム装置ヒートブロックからカバーを外したNeogenライシスチューブラックを取り出し、Neogen病原菌検出チルブロックインサート内で5分間以上（最大10分間）冷却します。
Neogen® チルブロックインサート
は、実験台の上に直接置いてください。
冷却されると、Neogenライシス液はピンク色に戻ります。
7

JA （日本語）

10. Neogen病原菌検出チルブロックインサートからNeogenライシスチューブラックを取り出します。
00:15:00

99–101 ºC

20–25 ºC

00:05:00

増幅

1. Neogen 病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子スクリーニング (stx) 用およびNeogen 病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子ス
クリーニング (eae) 用チューブが各検体およびNCにつき必要です。

1.1. チューブのストリップは、必要な数に合わせてカットできます。
Neogen 病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子スクリーニ
ング (stx) 用およびNeogen 病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子スクリーニング (eae) 用の試薬チューブまたは8連チ
ューブのストリップの数を選択してください。

1.2. Neogen 病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子スクリーニング (stx) 用チューブを1つの列の空のラックに置きます。

1.3. Neogen 病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子スクリーニング (eae) 用チューブを右隣の列に置きます。
1.4. チューブの底の試薬ペレットを撹拌しないでください。

2. Neogen試薬コントロールチューブを1本選択して、ラックに置きます。

3. NCライシスのために、Neogen 病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子スクリーニング (stx) 用およびNeogen 病原菌検出アッ
セイ2 - STEC遺伝子スクリーニング (eae) 用の試薬チューブを各1本選択して、ラックに置きます。

4. 交差汚染を回避するため、Neogen 病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子スクリーニング (stx/eae) 用試薬チューブのキャップ
は一度に1ストリップずつ外し、滴下ステップごとに新しいピペットチップを使用してください。

5. 下記のように、各ライシスをNeogen 病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子スクリーニング (stx/eae) 用試薬チューブに滴下してください。

5.1. 最初に、5.5および5.6に記載のとおり、各検体ライシスをNeogen 病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子スクリーニング(stx) 用の試薬チューブに滴下してください。

5.2. 次に、5.5および5.6に記載のとおり、各同一の検体ライシスを右隣の列にあるNeogen 病原菌検出アッセイ2 - STEC
遺伝子スクリーニング (eae) 用試薬チューブに滴下してください。
注：滴下ごとに新しいピペットチップを使用してください。
同一のライシス検体をstxおよびeae試薬チューブに滴下する際に、同一のペットチップを使用しないでください。

5.3. すべての検体ライシス滴下後、NCライシスをNeogen 病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子スクリーニング (stx) 用お
よびNeogen 病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子スクリーニング (eae) 用の各試薬チューブに添加します。

5.4. NCライシスを試薬コントロールチューブに滴下します。

8

JA （日本語）

5.5. Neogen® 病原菌検出キャップ/デキャップツール－ 試薬用を使用して、Neogen 病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子
スクリーニング (stx/eae) 用試薬チューブのキャップを一度に1ストリップずつ外します。
キャップを廃棄します。

5.6. 検液20 µLをNeogenライシスチューブの液体の上部1/2（沈澱物は避けてください）から取り、対応するNeogen 病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子スクリーニング (stx/eae) 試薬チューブに分注します。
ペレットが撹拌されないよう、一定の角度で分注します。
ピペット操作で5回静かに混合します。
注：滴下ごとに新しいピペットチップを使用してください。
同一のライシス検体をstxおよびeae試薬チューブに滴下する際に、同一のペットチップを使用しないでください。

5.7. 個々の検体ライシスをストリップ内の対応するNeogen 病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子スクリーニング (stx/eae)
用試薬チューブに添加するまで、
ステップ5.6を繰り返します。
5.8. Neogen 病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子スクリーニング (stx/eae) 用試薬チューブに同梱の予備キャップで蓋をし、Neogen病原菌検出キャップ/デキャップツール - 試薬用の丸い側を使用して前後に圧をかけ、キャップをしっかりと締めます。

5.9. Neogen 病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子スクリーニング (stx/eae) 用の試薬チューブの検査する検体数に応じて、
ステップ5.6から5.8を繰り返します。

5.10. すべての検体ライシス滴下際には、
ステップ5.6から5.8を繰り返し、NCライシス20 µLをNeogen 病原菌検出アッセイ
2 - STEC遺伝子スクリーニング (stx) 用およびNeogen 病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子スクリーニング (eae) 用の各試薬チューブに滴下します。

5.11. NeogenリエージェントコントロールチューブにNCライシス液20 µLを滴下します。
ペレットが撹拌されないよう、一定の角度で分注します。
ピペット操作で5回静かに混合します。
Neogen 病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子スクリーニング (stx/eae) 用の各試薬チューブにまず各検体溶解物を滴下し、次にNCを滴下します。
最後にNeogen試薬コントロールチューブを水和します。

6. 清潔な、
殺菌済みNeogen病原菌検出スピードローダートレイにキャップをしたチューブを装填し、蓋を閉め、掛け金を掛けます。

9

7. Neogen病原菌自動検出システム用ソフトウェアで設定した検査内容を確認します。

JA （日本語）

8. ソフトウェアのスタートボタンをクリックして、使用する装置を選択します。
選択した装置の蓋が自動的に開きます。

9. Neogen病原菌自動検出システムの装置内にNeogen病原菌検出スピードローダートレイを置き、蓋を閉めてアッセイをスタートします。
結果は60分ほどで判定されますが、陽性の場合はもっと早く検出されます。

Neogen病原菌検出スピードローダートレイをNeogen病原菌自動検出システムの装置から取り出し、チューブ
10. アッセイ終了後、は水で1～5%（v/v）に希釈した家庭用漂白液に1時間浸漬した後、アッセイの準備作業領域から隔離して、廃棄してください。
注記：交差汚染による偽陽性の危険を最小限に抑えるため、増幅DNAの入った試薬チューブは絶対に開けないでください。
こ
れには、Neogen 病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子スクリーニング (stx/eae) 用試薬、Neogen試薬コントロール、Neogenマ
トリックスコントロールチューブが含まれます。
汚染されたチューブは、常に、水で1～5%（v/v）に希釈した家庭用漂白液に1時間浸漬した後、アッセイの準備作業領域から隔離して、廃棄してください。

結果と解釈

アルゴリズムが核酸増幅の結果より得られた光出力曲線を解釈します。
結果はソフトウェアが自動的に解析し、結果に応じて色分けされます。
陽性または陰性の結果は、それぞれが持つ固有の曲線パラメータを解析することにより特定されます。
結果が陽性と推定される場合はリアルタイムでレポートされますが、陰性および再検査（検証が必要な結果）の場合は、その検査が完了した
後に表示されます。

Neogen病原菌自動検出システム用のソフトウェアはアッセイごと（stxおよびeae）に別々の結果を表示し、両方のアッセイ結果をもとにSTEC (EHEC) 陽性または陰性の判定を行います（下図参照）。
両方の標的遺伝子（stx1および／またはstx2およびeae）が陽性になった場合、STEC (EHEC) 推定陽性と判断します。
個々のアッセイにエラーもしくは再検査の表示が出た場合、最終結果
もエラーになるため、再検査を行ってください。
正確な最終結果を得るには、再検査が必要です（結果キーを参照してください）。
必要に応じて、個々のアッセイをソフトウェアで設定することが可能です。
付録Aに記載されている保存したライシスの処理ステッ
プおよびライシスと増幅セクションに記載されている保存した増菌の処理ステップ後にアッセイを用いて、増菌後の検体ライシス
および新鮮なライシスを再検査することが可能です。

検体の結果+ +2 + 両者共に陽性、最終結果陽性2+ -2 – stx陽性、eae陰性、最終結果陰性2+ ?2 ? stx陽性、eae再検査、最終結果再検査、再テスト2+ 2
stx陽性、eaeエラー、最終結果エラー、再テスト2– -2 + stx陰性、eae陽性、最終結果陰性2– -2 – stx陰性、eae陰性、最終結果陰性2– ?2 ? stx陰性、eae再検査、最終結果再検査、再テスト2– 2
stx陰性、eaeエラー、最終結果エラー、再テスト
2? ?2 + stx再検査、eae陽性、最終結果再検査、再テスト
2? ?2 – stx再検査、eae陰性、最終結果再検査、再テスト
2
STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

? ?2 ?
2
STX

2

?

EAE

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

+
–
2

2

STX

2

2

STX

2

EAE

?

EAE
EAE

stx再検査、eae再検査、最終結果再検査、再テスト
stx再検査、eaeエラー、最終結果エラー、再テスト
stxエラー、eae陽性、最終結果エラー、再テスト
stxエラー、eae陰性、最終結果エラー、再テスト

stxエラー、eae再検査、最終結果エラー、再テスト
stxエラー、eaeエラー、最終結果エラー、再テスト

陰性コントロールキー
2
2
2
2
2
2

NC
STX

NC
STX

NC
STX

NC
STX

NC
STX

NC
STX

2
2
2
2
2
2

NC
EAE

NC
EAE

NC
EAE

NC
EAE

NC
EAE

NC
EAE

両者共に有効、有効なリンク

片方は有効、もう片方はエラー、
リンクエラー、再テスト
片方は有効、もう片方は無効、無効なリンク、再テスト
両者共にエラー、
リンクエラー、再テスト
両者共に無効、無効なリンク、再テスト

片方はエラー、もう片方は無効、
リンクエラー、再テスト

10JA （日本語）

まず、一次前陽性と推定される検体は、検査室の標準作業手順書、または適切な参照法(1, 2, 3)に従って確認する必要があります。
増菌ブロスを選択的プレートに移し、適切な生化学的、血清学的手法を使用して単離菌を確認してください。
選択培地で培養する前に免疫磁気ビーズ法 (IMS) を実施し、MLG 5Cで指定されているマトリックスを準備する必要があります。

注：システムおよびNeogen 病原菌検出アッセイ2 - STEC遺伝子スクリーニング (stx/eae) 増幅試薬が「バックグラウンド」相対発
光量 (RLU) を示すことから、陰性検体でも読取り値がゼロになりません。

異常な光出力がみられるなどの稀なケースについては、
アルゴリズムがこれを「再検査してください」と表示します。
Neogen社はお客様に、「再検査」検体に対して検査を再度行うことを推奨します。
その結果が続けて再検査であった場合は、任意の別の方法(1, 2, 3)
または行政の規制によって指定されたとおりに確認検査を行ってください。
表4. ソフトウェア結果の記号と情報。
ウェルタイプ ウェルの結果の記号
検体

検体

+
–

?

検体

判定

陽性

検体の標的病原体について陽性と推定されます。

陰性検体の標的病原体について陰性と推定されます。

阻害

検体
検体

結果

検証が必要
エラー

検体基質がアッセイを阻害しました。
差異検査が必要な場合があります。
詳細については、
トラブルシューティングセクションおよびアッセイキット製品情報を参照してください。

標的病原体の有無が確定できませんでした。
差異検査が必要な場合があります。
詳細については、
トラブルシューティングセクションおよびアッセイキット製品情報を参照してください。

生物発光が検出されませんでした。
差異検査が必要な場合があります。
詳細については、
トラブルシューティングセクションおよびアッセイキット
製品情報を参照してください。

付録A. プロトコルの中断：検体の保管と再検査

1. 加熱処理済みライシスを保管するには、Neogenライシスチューブに清潔なキャップを閉めます(「ライシス」セクション、4.5を参照）。
2. 前増菌した検体を保管するには、保管前に最低18時間培養してください。

3. 4～8°Cで最大72時間保管します。

4. 保管された検体を2-3回反転させて混合し、増幅用として準備します。

5. チューブのキャップを外します。

6. 混合したライシスチューブをNeogen病原菌検出ヒートブロックインサートに置き、100 ± 1°Cで5 ± 1分間加熱します。

7. Neogen病原菌検出ヒートブロックからNeogenライシスチューブラックを取り出し、Neogen病原菌検出チルブロックインサ
ート内で5分間以上（最大10分間）冷却します。

「増幅」セクションに詳述されているプロトコルを継続します。
8. 上記の

11

JA （日本語）参考文献：

1. Microbiology Laboratory Guidebook. U. S. Department of Agriculture (USDA) Food Safety and Inspection Service(FSIS) Microbiology Laboratory guidebook 5C.00. Detection and isolation of top seven Shiga toxin-producing
Escherichia coli (STECs) from meat products and carcass and environmental sponges. Feb 4, 2019.
2. US Food and Drug Administration Bacteriological Analytical Manual. Chapter 4A: Diarrheagenic Escherichia coli.
October 2018.
3. ISO/TS 13136:2012: Microbiology of food and animal feed — Real-time polymerase chain reaction (PCR)-based
method for the detection of food-borne pathogens — Horizontal method for the detection of Shiga toxin-producing
Escherichia coli (STEC) and the determination of O157, O111, O26, O103 and O145 serogroups
4. U.S. Food and Drug Administration. Code of Federal Regulations, Title 21, Part 58.Good laboratory practice fornonclinical laboratory studies.
5. ISO/IEC 17025. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories.
6. ISO 7218. Microbiology of food and animal feeding stuffs - General rules for microbiological examination.
7. Neogen Installation Qualification (IQ) / Operational Qualification (OQ) Protocols and Instructions for Neogen
Molecular Detection System. Contact your Neogen Food Safety representative to obtain a copy of this document.

記号の説明

info.neogen.com/symbols

12Neogen Food Safety
Neogen Corporation
620 Lesher Place
Lansing, MI 48912 USA
Neogen.com
Neogen Europe Ltd.
The Dairy School
Auchincruive
Ayr, KA6 5HU
Scotland, UK
Neogen Ireland, Ltd.
Bray Business Park, Bray
Co. Wicklow
A98YV29, Ireland© Neogen Corporation 2024. All rights reserved.
Neogen is a trademark of Neogen Corporation.
All other trademarks are the property of their respective companies.

Neogen Corporation
620 Lesher Place Lansing, MI 48912 USA
www.neogen.com© 2024, Neogen. Tous droits réservés.
Neogen est une marque de commerce de Neogen.
Toutes les autres marques decommerce appartiennent à leur propriétaire respectif.
FS00918A

ZH （简体中文）

发布日期：2024-01产品信息分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（stx 基因和 eae
基因）产品说明及预期用途

Neogen® 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（stx 基因和 eae 基因）旨在与 Neogen® 分子检测系统一
起使用，用于快速、专门检测增菌后的食品和食品加工环境样品中的产志贺毒素大肠埃希氏菌（STEC，也称作“产 Vero 毒素大
肠埃希氏菌”）的志贺毒素基因（stx1 和/或 stx2 基因）和紧密素基因（eae 基因）。
STEC 一词指的是可以产生 1 型 (Stx1)、2 型(Stx2) 志贺毒素或两者的致病性大肠埃希氏菌（分别采用 stx1 和 stx2 基因编码）。
含有 stx1 和/或 stx2 以及 eae（涉及附着和
消除表型的紧密素基因）致病基因的 STEC 被称作肠出血性大肠埃希氏菌 (EHEC)。
筛查试剂盒包含两支独立的试剂管，一支用于检测致病基因 stx1 和/或 stx2，另一支用于检测 STEC (EHEC) 中的 eae。
Neogen® 分子检测系统软件会单独报告每个检测的结果，并使用两个检测得出的结果来鉴定样品中的 STEC (EHEC) 阳性或阴性。
如推定 STEC (EHEC) 阳性，则两个靶基因（stx1 和/或 stx2 以及 eae）都必须为阳性。
stx 检测无法区分 stx1 和 stx2，但可以检测是否存在 stx1 和/或 stx2。
Neogen 分子检测试剂盒采用环介导等温扩增技术来快速扩增核酸序列，其具有特异性强、灵敏度高的特点，并结合生物发光
特性来检测扩增反应。
假定阳性结果将实时报告，阴性结果则在分析完成后显示。
应使用您喜欢的方法或按照当地法规指定的方法(1, 2, 3)确认假定阳性结果。

Neogen 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（stx 基因和 eae 基因）专供受过实验室技术培训的专业人员在实验室环境下使用。
对于在食品或饮料以外的行业中使用此产品，Neogen 尚未有资料可证。
例如，对于将此产品用于检测
制药、化妆品、临床或家畜样品，Neogen 尚未有资料可证。
尚未针对所有可能的食品产品、食品加工、检测方案或针对所有可能
的细菌类型评估 Neogen 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（stx 基因和 eae 基因）。

正如所有检测方法一样，增菌培养基的来源、配方和质量都可能会影响结果。
取样方法、检测方案、样品制备、处理和实验室技术
等因素都可能会影响结果。
Neogen 建议在用户环境中利用充足数量的样品以及特定的食品和微生物激发试验对包括增菌培养基在内的方法进行评估，确保相应的方法符合用户的标准。

Neogen 已针对 Neogen 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（stx 基因和 eae 基因）与缓冲蛋白胨水(BPW)-ISO 增菌肉汤的联合使用进行了评估。

Neogen® 分子检测仪器专用于在分析裂解步骤中经过热处理的样品，该步骤旨在破坏样品中存在的微生物。
未在分析裂解步骤中经过适当热处理的样品可能会被视为具有潜在生物危害性，不应将其插入 Neogen 分子检测仪器。
Neogen 食品安全部的产品设计和生产已获得 ISO（国际标准化组织）9001 认证。

Neogen 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（stx 基因和 eae 基因）中包含 48 支 stx 和 eae 试剂检测反应管，详细信息请见表 1。
表 1. Neogen 分子检测试剂盒构成。
项目

数量

内容物

备注

Neogen® 分子检测试剂盒 2 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基 橙色管因筛选（stx 基因）试剂管

48（2 袋；3 排，每排 8 管）特定扩增和检测试剂的
冻干样

即开即用

额外的盖

橙色盖

96（12 排，每排 8 个盖）

Neogen® 试剂对照 (RC)透明翻盖管

Neogen® 裂解溶液 (LS)标识

透明管，粉红溶液

Neogen® 分子检测试剂盒 2 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基 红色管因筛选（eae 基因）试剂管
额外的盖

红色盖

96（12 排，每排 8 管）

48（2 袋；3 排，每排 8 管）
96（12 排，每排 8 个盖）
16（2 袋，每袋 8 管）

每管 580 μL LS

特定扩增和检测试剂的冻干样

DNA、扩增和检测试剂的冻干对照品阴性对照 (NC) 采用的是无菌增菌培养基（如 BPW-ISO），未在检测试剂盒中提供。
请勿将水用作 NC。
如需获取快速入门指南，请访问 www.neogen.com

1

已上架，即开
即用

即开即用
即开即用
即开即用

即开即用

ZH （简体中文）

安全用户应阅读、理解并遵守 Neogen 分子检测系统和 Neogen 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（stx 基
因和 eae 基因）说明中提供的所有安全信息。
妥善保存安全说明书，以备日后查阅。
警告：表示危险情况，如果不注意避免，可能造成死亡或严重的人身伤害和/或财产损失。
注意：表示潜在的危险情况，如果不注意避免，可能导致财产损失。

警告请勿在人类或动物的各种诊断中使用 Neogen 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（stx 基因和 eae 基因）。

用户必须就当前适用的检测技术对其人员进行培训，例如：优良实验室规范(4)、ISO/IEC 17025(5) 或 ISO 7218(6)。

为了降低与假阴性结果相关的风险，避免释放出受污染产品，请注意以下事项：• 遵守操作流程并按照产品信息中提供的方法执行检测。
• 按照包装和产品信息中的指示储存 Neogen 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（stx 基因和 eae
基因）。
• 始终在过期日期之前使用 Neogen 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（stx 基因和 eae 基因）。
• 将 Neogen 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（stx 基因和 eae 基因）用于经内部或第三方验证的
食品和环境样品。
• 仅将 Neogen 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（stx 基因和 eae 基因）用于经内部或第三方验证
的表面、消毒剂、方案和菌株。
• 对于含有中和缓冲液和芳基磺酸酯复合物的的环境样品，应在检测前按 1:2 的比例进行稀释（1 份样品对 1 份无菌增菌肉汤）。
另一种选择是将 10 µL 的中和缓冲培养液转移至 Neogen 裂解溶液管内。
含有中和缓冲液和芳基磺酸酯复合物的
Neogen® 采样产品包括：RS96010NB、RS9604NB、SSL10NB、SSL10NB2G、HS10NB、HS10NB2G 和 HS2410NB2G。

为了降低与化学品和生物危害暴露相关的风险，请注意以下事项：• 在训练有素的工作人员的控制下，于妥善配备的实验室中执行致病菌检测。
增菌培养基以及接触过增菌培养基的设备或表
面可能含有致病菌，足以对人体健康造成风险。
• 始终遵守标准实验室安全规范，包括在处理试剂和受污染样品时穿戴适当的防护服和护眼装置。
• 避免接触增菌培养基和扩增后试剂管的内容物。
• 根据当地/地区/国家法规标准的现行要求对经过增菌的样品进行废弃处理。
• 未在分析裂解步骤中经过适当热处理的样品可能会被视为具有潜在生物危害性，不应将其插入 Neogen 分子检测仪器。
为了在准备分析时降低与交叉污染相关的风险，请注意以下事项：• 始终戴手套（保护用户和防止引入核酸酶）。

为了降低与高温液体暴露相关的风险，请注意以下事项：• 不要超出建议的加热器温度设置。
• 不要超出建议的加热时间。
• 使用正确的经过校准的温度计检验 Neogen® 分子检测加热模块的温度（例如，局浸温度计或热电偶数字温度计，而非全浸温度计）。
温度计必须放置于 Neogen 分子检测加热模块中的指定位置。

注意为了在准备分析时降低与交叉污染相关的风险，请注意以下事项：• 在进行试剂小球水化之前更换手套。
• 建议使用无菌的、带气溶胶屏障（带滤芯）的分子生物级移液吸头。
• 每次转移样品时使用新的吸头。
• 将样品从增菌培养基转移至裂解管时遵循实验室良好操作规范。
为了避免移液管污染，用户可以选择增加一个中间转移步骤。
例如，用户可以将每个经过增菌的样品转移至无菌管中。
• 使用配有杀菌灯的分子生物工作站（如可行）。
• 使用 1-5%（与水的体积比）家用漂白溶液或 DNA 去除溶液定期净化实验室工作台和设备（移液管、开盖器等）。

为了降低与假阳性结果相关的风险，请注意以下事项：• 请勿在扩增后打开试剂管。
• 处理受污染的试管时，应先将其放在浓度为 1-5%（与水的体积比）的家用漂白溶液中浸泡 1小时，且始终远离分析准备区。
• 请勿在扩增后对试剂管进行高压灭菌。
请参考“安全数据表”了解其它信息和当地的弃置法规。

如果您对于特定的应用或程序存有疑问，请访问我们的网站 www.neogen.com，也可与您当地的 Neogen 代表或经销商联系以获得帮助。
2

ZH （简体中文）用户责任

用户有责任熟悉产品信息和说明。
请访问我们的网站 www.neogen.com 或联系您当地的 Neogen 代表或经销商，以了解更多信息。
选择检测方法时，务必认识到各种外部因素（如取样方法、检测方案、样品制备、处理、实验室技术和样品本身）都可能会影响结果。

用户在选择检测方法或产品时，应自行负责选用合适的基质和微生物激发试验对足够多的样品进行评估，以确保所选择的检测方法达到用户的标准。
检测方法及结果能否满足客户及供应商的要求也由用户负责。

同所有检测方法一样，使用任何 Neogen 食品安全部产品所得到的结果并不能保证受检基质或程序的质量。

为帮助客户评估各种食品基质方法，Neogen 开发了 Neogen® 分子检测基质对照试剂盒。
需要时，可以使用 Neogen 分子检测基质对照 (MC) 来确定基质是否会影响 Neogen 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（stx 基因和 eae 基因）的结果。
在采用 Neogen 方法或在检测新的或未知基质或者原材料或工艺发生变更的基质的任何验证期间，应对若干典型的基质样品进行检测，即通过不同来源获取的样品。

基质可定义为一种具备内源特性（如化学成分或工艺）的产品。
基质间的差异是因加工或外观的不同而导致的差异，例如原样和经过巴氏消毒处理之间的差异以及新鲜和干燥之间的差异。

有限保证/有限补救措施

除非各个产品包装的有限保证部分明确声明，否则，NEOGEN 将不提供任何明示或默示保证，包括但不限于适销性或特定用途
适用性保证。
如果证明任何 Neogen 食品安全部产品存在缺陷，Neogen 或其授权经销商可以自行决定是提供换货，还是对产品进行退款。
这是向您提供的唯一补救方案。
您必须在发现产品存在任何可疑缺陷的 60 天内立即通知 Neogen，并将该产品退还给 Neogen。
如有任何疑问，请联系 Neogen 代表或 Neogen 授权经销商。

Neogen 责任限制

对于任何损失或损害，无论是直接、间接、特殊、偶然或非直接原因造成的损害，NEOGEN 概不承担任何责任，包括但不限于利润损失。
根据法律理论，Neogen 对所谓存在缺陷的产品的赔付不会超过产品的购买价格。

储存和弃置

在 2-8°C (35-47°F) 温度下储存 Neogen 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（stx 基因和 eae 基因）。
请勿冷冻。
避光储存试剂盒。
打开试剂盒后，应检查铝箔袋是否破损。
如果铝箔袋破损，请勿使用。
打开之后，未使用的试剂管应始
终储存在内部带有干燥剂的可重新密封铝箔袋中，以保持冻干试剂的稳定性。
将重新密封的铝箔袋储存在 2-8°C (35-47°F) 温
度下，但储存时间不能超过 90 天。

请勿使用过期的 Neogen 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（stx 基因和 eae 基因）。
过期日期和批号注
明在包装箱外侧的标签上。
使用之后，增菌培养基和 Neogen 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（stx 基
因和 eae 基因）试剂管可能含有致病物质。
完成检测后，应遵照当前的行业标准弃置受污染的废弃物。
请参考“安全数据表”了解其它信息和当地的弃置法规。

使用说明请仔细遵循所有说明。
否则，可能会导致结果不准确。

使用 1-5%（与水的体积比）家用漂白溶液或 DNA 去除溶液定期净化实验室工作台和设备（移液管、开盖器等）。

用户应当遵照“针对 Neogen 分子检测系统的安装合格 (IQ)/操作合格 (OQ) 方案和说明”文档(7)中的规定接受 Neogen 分子检
测系统操作员资格验证 (OQ) 培训。
请参见“验证方法具体说明”部分，了解特定要求：
表 3：符合 Performance Tested MethodSM (PTM) 证书 #071902 的增菌方案。
样品增菌
表 2 和表 3 提供了针对食品的一般增菌方案指导。

用户有责任验证备用取样方案或者稀释率，以确保本检测方法符合用户的标准。
食品
1. 让 BPW ISO 增菌培养基平衡到 41.5 ± 1℃。

2. 在无菌环境下将增菌培养基和样品进行混合。
对于所有肉类和微粒样品，建议使用过滤袋。

3. 将所有基质混合并按照相应的方案表进行培养（参见表 2 或表 3）。

3

ZH （简体中文）

环境样品

警告：如果您选择使用含芳基磺酸酯复合物的中和缓冲液作为海绵的水化溶液，则必须在检测之前按 1:2 的比例（1 份样品对 1 份无菌增菌肉汤）稀释增菌的环境样品，以降低导致受污染产品释放的假阴性结果的相关风险。
另一种选择是将 10 µL
的中和缓冲培养液转移至 Neogen 裂解溶液管内。

用户有责任验证备用取样方案或者稀释率，以确保本检测方法符合用户的标准。
表 2. 通用增菌方案。
样品基质

样品大小

生的碎牛肉、肉块和切下的肉(a)

生肉（猪肉、家禽、羔羊肉和野
牛肉）(a)
叶菜类农产品(b)

豆芽

生奶

(a)

(b)
(c)
(d)

(c)

增菌温度
(± 1°C)

增菌时间
（小时）

样品分析量
(μL)

375 g

增菌肉汤
量 (mL)（预热）1125 BPW-ISO

41.5

10-18

20

375 g

1125 BPW-ISO

41.5

10-18

20

200 g

450 BPW-ISO

41.5

18-24

20

25 g

225 BPW-ISO

41.5

18-24

20

225 BPW-ISO

41.5

18-24

20

25 g 或 25 mL(d)加入预热的 BPW-ISO 后，用手揉搓牛肉（碎牛肉、肉块和切下的肉）和生肉（碎猪肉、家禽肉以及牛肉以外的肉类）样品
30-60 秒使肉块分散。
对于叶菜类农产品，将增菌肉汤（预热的 BPW-ISO）浇在叶子上并轻轻搅动 30-60 秒。
切勿揉搓叶子或使其均质化。

对于豆芽，将增菌肉汤（预热的 BPW-ISO）浇在豆芽上（持续 30-60 秒），切勿揉搓豆芽或使其均质化。

加入预热的 BPW-ISO 后，摇晃生奶样品 30 至 60 秒，使其混匀。

验证方法具体说明

AOAC® Performance Tested MethodSM (PTM) 证书 #071902

AOAC 研究所 PTMSM 研究结果显示，Neogen 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（stx 基因和 eae 基因）是一种有效的 STEC 检测方法。
研究中检测的基质显示在表 3 中。
表 3. 符合 AOAC PTMSM 证书 #071902 的增菌方案。
样品基质

生肉块(a)

生的碎牛肉(a)生的碎牛肉(a)

样品大小
375 g
375 g
25 g

生的碎猪肉(a)

375 g

鸡肉靡

25 g

生禽产品(a)

375 g

菠菜

200 g

干燥的大麻花、干燥的汉麻花(4)

10 g

(b)

豆芽

(c)

25 g

增菌肉汤
量 (mL)

增菌温度 (± 1°C)

1125 BPW ISO（预热）增菌时间（小时） 样品分析量 (μL)

41.5

10-18

20

41.5

10-18

20

1125 BPW ISO（预热）

41.5

10-18

20

41.5

10-18

20

41.5

10-18

20

225 BPW-ISO (预热)

41.5

10-24

20

41.5

18-24

20

41.5

18-24

20

41.5

28-32

20

1125 BPW ISO（预热）225 BPW ISO（预热）1125 BPW ISO（预热）450 BPW ISO（预热）225 BPW ISO（预热）90 BPW-ISO

4

(a)
(b)
(c)
(d)

ZH （简体中文）

对于牛肉样品（碎牛肉和肉块），将预热的 BPW-ISO 加入牛肉样品。
用手揉搓 30-60 秒使肉块分散。

对于菠菜，将预热的 BPW-ISO 加入基质。
将液体浇在叶子上并轻轻搅动 30-60 秒。
切勿揉搓叶子或使其均质化。

对于豆芽，将增菌肉汤（预热的 BPW-ISO）浇在豆芽上（持续 30-60 秒），切勿揉搓豆芽或使其均质化。

干燥的大麻花 (>0.3% THC) 和干燥的汉麻花 (≤0.3%THC)

Neogen® 分子检测快速转移托盘的准备工作
1. 将一块干布或一次性纸巾用 1-5%（与水的体积比）家用漂白溶液浸湿，用来擦拭 Neogen 分子检测快速转移托盘。
2. 用清水清洗 Neogen 分子检测快速转移托盘。

3. 使用一次性纸巾擦干 Neogen 分子检测快速转移托盘。
4. 使用前确保 Neogen 分子检测快速转移托盘保持干燥。

Neogen® 分子检测冷却架的准备工作
将 Neogen 分子检测冷却架直接置于实验室工作台上：
无需使用 Neogen 分子检测冷却模块托盘。
在实验室环境温度 (20-25℃)
下使用模块。
Neogen® 分子检测加热模块的准备工作
将 Neogen 分子检测加热模块放入双干燥块加热器中。
开启干燥模块加热装置并设定温度，使 Neogen 分子检测加热模块达到并保持 100 ± 1℃。

注释：根据不同的加热器，允许 Neogen 分子检测加热模块在大约 30 分钟后达到工作温度。
使用放在指定位置的、正确的、
经过校准的温度计（如局浸温度计或热电偶数字温度计，而非全浸温度计）检验 Neogen 分子检测加热模块的温度是否达到
100 ± 1℃。

Neogen® 分子检测仪器的准备工作
1. 启动 Neogen 分子检测系统软件并登录。
请联系您的 Neogen 食品安全部代表，确保您使用的是最新版的软件。
2. 打开 Neogen 分子检测仪器。

3. 利用每个样品的数据为其创建或编辑一次运行检测。
请参考“Neogen 分子检测系统用户手册”了解详细信息。

3.1. 在软件中选择 STXEAE-2 图标即可选定两个相邻的孔（例如 A1、A2、B1、B2 等），一个用于 stx 试剂管，另一个用于
eae 试剂管，因为每个样品要进行两种检测运行。
已为每支试剂管设置了 NC，并为试剂盒设置了一个 RC。
1
SAL-2

A

ECO-2
LIS-2

B

LMO-2
CAM-2

C

CRO-2
STXEAE-2
STX-2
EAE-2
MC-2

D
E
F
G
H

2

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

RC

2 STXEAE
2

NC

STX 2

NC
EAE

注释：插入带反应管的 Neogen 分子检测快速转移托盘前，Neogen 分子检测仪器必须处于就绪状态。
此加热步骤大概需要
20 分钟，由仪器状态栏中的一个“橙色”灯进行指示。
当仪器准备好启动检测时，状态栏将变为“绿色”。

裂解请用螺丝刀或抹刀移除 Neogen 裂解溶液管架的底部，然后再将其置于 Neogen 分子检测加热模块中。

5

ZH （简体中文）

1. 将管架置于室温 (20-25℃) 环境下一整夜（16-18 小时），让 Neogen 裂解溶液管预热。
使 Neogen 裂解溶液管平衡到室温
的另一种方法是将 Neogen 裂解溶液管放在实验室工作台上至少 2 小时、在 37 ± 1℃ 培养设备中培养 Neogen 裂解溶液
管 1 小时，或将其置于双干燥块加热器中在 100℃ 下持续加热 30 秒。
2. 倒置封盖的裂解溶液管，使其混合均匀。
在倒置后 4 小时内继续执行下一步。

3. 从培养设备中取出增菌样品。

4. 每个样品和 NC（无菌增菌培养基）都需要一支 Neogen 裂解溶液管。

4.1. 可以根据所需的试管数，对 Neogen 裂解溶液联排管进行切割。
选择所需数量的试管或 8 联排管。
将 Neogen 裂解
溶液管放入空管架中。
4.2. 为了避免交叉污染，请一次仅打开一排 Neogen 裂解溶液管的管盖，并且每次转移溶液时使用新的移液吸头。

4.3. 按如下所述将经过增菌的样品转移到 Neogen 裂解溶液管：

首先将每个经过增菌的样品转移到单个 Neogen 裂解溶液管中。
最后转移 NC。

4.4. 使用 Neogen® 分子检测开盖器 - Lysis 打开 Neogen 裂解溶液联排管的管盖，一次仅打开一排。

4.5. 丢弃 Neogen 裂解溶液管的管盖 – 如果要保留裂解液以重新检测，请将管盖放入干净的容器中，以备裂解后重新使用。
4.5.1. 如需处理保留的裂解液，请参阅附录 A。

4.6. 将 20 µL 样品转移到 Neogen 裂解溶液管内。

5. 根据需要对待检测的样品重复步骤 4.4 到 4.6。

6. 当转移完所有样品后，将 20 µL 的 NC（无菌增菌培养基，如 BPW）转移到一支 Neogen 裂解溶液管中。
请勿将水用作 NC。

7. 检验 Neogen 分子检测加热模块的温度是否达到了 100 ± 1℃。

8. 将未加盖的 Neogen 裂解溶液管架放入 Neogen 分子检测加热模块中加热 15 ± 1 分钟。
加热期间，Neogen 裂解溶液将
从粉红色（冷）变为黄色（热）。
8.1. 未在分析裂解步骤中经过适当热处理的样品可能会被视为具有潜在生物危害性，不应将其插入 Neogen 分子检测仪器。

9. 从 Neogen 分子检测加热模块中取出未加盖的 Neogen 裂解溶液管架，将其放入 Neogen 分子检测冷却架中冷却至少 5分钟，最长 10 分钟。
如果 Neogen 分子检测冷却架在环境温度下不与 Neogen® 分子检测冷却模块托盘配套使用，则应将
其直接置于实验室工作台上。
冷却后，Neogen 裂解溶液将恢复为粉红色。
10. 从 Neogen 分子检测冷却架上移除 Neogen 裂解溶液管架。

6

ZH （简体中文）
00:15:00

99–101 ºC

20–25 ºC

00:05:00

扩增

1. 每个样品和 NC 都需要一支 Neogen 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（stx 基因）和一支 Neogen
分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（eae 基因）试剂管。
1.1. 根据所需的试管数，对联排管进行切割。
选择所需数量的 Neogen 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（stx 基因）和 Neogen 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（eae 基因）试剂管或 8 联排管。

1.2. 将 Neogen 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（stx 基因）试剂管放入一列空管架中。

1.3. 将 Neogen 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（eae 基因）试剂管放在右侧相邻列中。
1.4. 请勿将试剂小球搅离管底。

2. 选择一支 Neogen 试剂对照管并放入管架。

3. 对于 NC 裂解液，选择一支 Neogen 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（stx 基因）试剂管和一支
Neogen 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（eae 基因）试剂管并放入管架中。

4. 为了避免交叉污染，请一次仅打开一排 Neogen 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（stx 或 eae 基因）试剂管的管盖，并且每次转移溶液时使用新的移液吸头。

5. 按如下所述将相应的裂解液分别转移到 Neogen 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（stx 或 eae 基因）试剂管。
5.1. 首先，按 5.5 和 5.6 所述将相应的样品裂解液转移到 Neogen 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（stx 基因）试剂管。

5.2. 然后，按 5.5 和 5.6 所述将相同的样品裂解液转移到右侧相邻列中的 Neogen 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠
埃希氏菌的基因筛选（eae 基因）试剂管。
注释：每次转移液体时使用新的吸头。
请勿使用同一移液吸头将相同的样品裂解液转移到 stx 基因和 eae 基因试剂管。

5.3. 所有样品裂解液转移完毕后，将 NC 裂解液添加到每一支 Neogen 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（stx 基因）试剂管和 Neogen 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（eae 基因）试剂
管。

5.4. 最后将 NC 裂解液转移到试剂对照管。

7

ZH （简体中文）

5.5. 使用 Neogen® 分子检测开盖器 - Reagent 打开 Neogen 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（stx 或 eae 基因）试剂管的管盖，一次仅打开一排。
丢弃管盖。

5.6. 将 Neogen 裂解溶液管液体上部 ½ 层的 20 µL 样品裂解液（避免沉淀）转移到对应的 Neogen 分子检测试剂盒 2- 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（stx 或 eae 基因）试剂管。
成角度注入，以避免搅动小球。
轻轻地上下吸动 5
次，以充分混合。
注释：每次转移液体时使用新的吸头。
请勿使用同一移液吸头将相同的样品裂解液转移到 stx 基因和 eae 基因试剂管。

5.7. 重复步骤 5.6，直到将所有样品裂解液添加到联排管对应的 Neogen 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（stx 或 eae 基因）试剂管为止。

5.8. 使用额外的盖盖住 Neogen 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（stx 或 eae 基因）试剂管，并
使用 Neogen 分子检测开盖器 - Reagent 较圆的一侧以前后移动的方式加压，以确保将盖子盖紧。

5.9. 根据需要，对要进行 Neogen 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（stx 基因和 eae 基因）试剂
管检测的样品重复步骤 5.6 至 5.8。

5.10. 当所有样品裂解液转移完毕后，重复步骤 5.6 到 5.8 以将 20 µL NC 裂解液转移到 Neogen 分子检测试剂盒 2 - 产
志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（stx 基因）试剂管和 Neogen 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（eaex 基因）试剂管。

5.11. 将 20 µL NC 裂解液转移至 Neogen 试剂对照管。
成角度注入，以避免搅动小球。
轻轻地上下吸动 5 次，以充分混合。
首先将各个样品裂解液转移到单个 Neogen 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（stx 或 eae
基因）试剂管，然后再转移 NC。
最后对 Neogen 试剂对照管进行水化。

6. 将加盖的试管放入干净且经过净化处理的 Neogen 分子检测快速转移托盘中，然后合上并锁定盖子。

7. 在 Neogen 分子检测系统软件中查看和确认配置的检测

8. 在软件中单击“启动”按钮并选择要使用的仪器。
所选仪器的盖会自动打开。
8

ZH （简体中文）

9. 将 Neogen 分子检测快速转移托盘放入 Neogen 分子检测仪器并合上盖子，以启动分析。
结果将在 60 分钟内提供，但阳性结果可以更快检测到。

10. 分析完成后，从 Neogen 分子检测仪器中取出 Neogen 分子检测快速转移托盘，通过将试管浸入 1-5%（与水的体积比）家用漂白溶液 1 小时并使其远离分析准备区，对试管进行废弃处理。

注意：为了将因为交叉污染而导致的假阳性结果风险降至最低，请勿打开包含扩增的 DNA 的试剂管。
这包括 Neogen 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（stx 基因和 eae 基因）试剂管、Neogen 试剂对照管和 Neogen 基质对照管。
对密封的试剂管进行废弃处理时，应始终将其放入浓度为 1-5%（与水的体积比）的家用漂白溶液中浸泡 1 小时，并确保其远离分析准备区。

结果和说明软件会使用一种算法对来自核酸扩增检测的光输出曲线进行解读。
软件会自动分析结果并根据不同结果用不同颜色进行标记。
通过分析一系列独一无二的曲线参数可以确定阳性结果或阴性结果。
“假定阳性”结果实时报告，“阴性”和“检查”结果则在检测
完成后显示。

Neogen 分子检测系统软件会单独报告每个检测的结果，并使用两个检测（stx 基因和 eae 基因）得出的结果来鉴定样品中的STEC (EHEC) 阳性或阴性（见下图）。
如推定 STEC (EHEC) 阳性，则两个靶基因（stx1 和/或 stx2 以及 eae）都必须为阳性。
如果
任一检测显示错误或检查，则最终结果也将是错误或检查。
需要再次检测以得出最终结果（参见结果图例）。
软件还允许用户根据需要设置单个检测，对于保留的裂解液，可以根据附录 A 中所述的步骤重新检测增菌物中样品裂解液或新鲜裂解液；对于保
留的增菌物，可以根据“裂解”和“扩增”部分中的步骤进行重新检测。

增菌样品裂解液结果图例+ +2 + 两者皆为阳性；最终结果：阳性2+ -2 – stx 基因：阳性；eae 基因：阴性；最终结果：阴性
2+ ?2 ? stx 基因：阳性；eae 基因：检查；最终结果：检查；重新检测2+ 2
stx 基因：阳性；eae 基因：错误；最终结果：错误；重新检测2- + stx 基因：–阴性；eae 基因：阳性；最终结果：阴性22– -2 – stx 基因：阴性；eae 基因：阴性；最终结果：阴性
2– ?2 ? stx 基因：阴性；eae 基因：检查；最终结果：检查；重新检测2– 2
stx 基因：阴性；eae 基因：错误；最终结果：错误；重新检测2? ?2 + stx 基因：检查；eae 基因：阳性；最终结果：检查；重新检测2? ?2 – stx 基因：检查；eae 基因：阴性；最终结果：检查；重新检测
2
STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

? ?2 ?
2
STX

2

?

EAE

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

+
–
2

2

STX

2

2

STX

2

EAE

?

EAE
EAE

stx 基因：检查；eae 基因：检查；最终结果：检查；重新检测
stx 基因：检查；eae 基因：错误；最终结果：错误；重新检测
stx 基因：错误；eae 基因：阳性；最终结果：错误；重新检测
stx 基因：错误；eae 基因：阴性；最终结果：错误；重新检测
stx 基因：错误；eae 基因：检查；最终结果：错误；重新检测

stx 基因：错误；eae 基因：错误；最终结果：错误；重新检测阴性对照图例
2
2
2
2
2
2

NC
STX

NC
STX

NC
STX

NC
STX

NC
STX

NC
STX

2
2
2
2
2
2

NC
EAE

NC
EAE

NC
EAE

NC
EAE

NC
EAE

NC
EAE

两者皆有效，关联有效

一个有效，另一个错误，关联错误，重新检测一个有效，另一个无效，关联无效，重新检测两者均为错误，关联错误，重新检测两者皆无效，关联无效，重新检测一个错误，另一个无效，关联错误，重新检测假定阳性样品应当遵循实验室标准操作规程或正确的参考方法进行确认(1, 2, 3)，应首先从初步的增菌肉汤转移至选择性微孔板，
然后利用正确的生化和血清方法对分离菌进行确认。
对于 MLG 5C 指定的基质，应在添加到选择性培养基进行平板培养前完
成免疫磁珠分离 (IMS)。

注释：因为系统和 Neogen 分子检测试剂盒 2 - 产志贺毒素大肠埃希氏菌的基因筛选（stx 基因和 eae 基因）扩增试剂带有“背景”相对光单位 (RLU) 读数，即使阴性样品也不会出现读数为零的情况。
9

ZH （简体中文）在极少数情况下，当存在异常光输出时，算法会显示“检查”标记。
Neogen 建议用户对所有“检查”样品重新进行分析。
如果结果(1, 2, 3)
或按照当地法规指定的方法进行确证试验。
仍为“检查”，请使用您喜欢的方法
表 4. 各种软件结果的符号和信息。
孔类型
样品

样品

孔结果符号

+
–

样品

样品

?

样品

结果

判读

阴性

样品是目标病原体的阴性样品。

阳性样品是目标病原体的假定阳性样品。

抑制样品基质对分析有抑制作用。
可能需要重新检测。
有关更多信息，请参阅故障排除部分和分析试剂盒产品信息。

错误

未检测到生物发光。
可能需要重新检测。
有关更多信息，请参阅故障排除部
分和分析试剂盒产品信息。

检查附录 A. 方案中断：储存和重新检测样品

不确定目标病原体是否存在。
可能需要重新检测。
有关更多信息，请参阅故障排除部分和分析试剂盒产品信息。

1. 如需储存热处理后的裂解液，应使用干净的盖子为 Neogen 裂解溶液管重新封盖（参见“裂解”部分 4.5）。
2. 如要储存增菌的样品，应在储存前至少培养 18 小时。

3. 在 4 - 8℃ 温度下最多储存 72 小时。

4. 取出储存的样品以准备用于扩增，将其倒置 2-3 次进行混合。
5. 打开管盖。

6. 将混合后的裂解液管置于 Neogen 分子检测加热模块中并在 100 ± 1℃ 温度下加热 5 ± 1 分钟。

7. 从 Neogen 分子检测加热模块中取出 Neogen 裂解溶液管架，将其放入 Neogen 分子检测冷却架中冷却最短 5 分钟，最长
10 分钟。
8. 继续执行上文详述的“扩增”部分的方案。

参考资料：

1. Microbiology Laboratory Guidebook. U. S. Department of Agriculture (USDA) Food Safety and Inspection Service(FSIS) Microbiology Laboratory guidebook 5C.00. Detection and isolation of top seven Shiga toxin-producing
Escherichia coli (STECs) from meat products and carcass and environmental sponges. Feb 4, 2019.
2. US Food and Drug Administration Bacteriological Analytical Manual. Chapter 4A: Diarrheagenic Escherichia coli.
October 2018.
3. ISO/TS 13136:2012: Microbiology of food and animal feed — Real-time polymerase chain reaction (PCR)-based
method for the detection of food-borne pathogens — Horizontal method for the detection of Shiga toxin-producing
Escherichia coli (STEC) and the determination of O157, O111, O26, O103 and O145 serogroups
4. U.S. Food and Drug Administration. Code of Federal Regulations, Title 21, Part 58. Good laboratory practice fornonclinical laboratory studies.
5. ISO/IEC 17025. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories.
6. ISO 7218. Microbiology of food and animal feeding stuffs - General rules for microbiological examination.
7. Neogen Installation Qualification (IQ) / Operational Qualification (OQ) Protocols and Instructions for Neogen
Molecular Detection System。请联系您的 Neogen 食品安全部代表，以获取本文档的副本。

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� อก: 2024-01

คำำ�แนะนำำ�การใช้้งานผลิิตภััณฑ์์
ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุล 2 - STEC Gene Screen (stx และ eae)รายละเอีียดผลิิตภััณฑ์์และวััตถุุประสงค์์การใช้้งาน

Neogen® ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุล 2 - STEC Gene Screen (stx และ eae) ใช้้กัับระบบทดสอบเชื้้�อก่่อโรคระดัับโมเลกุุลโดยวิิธีี
Neogen® สำำ�หรัับการตรวจหายีีน (stx1 และ/หรืือ stx2) และโปรตีีนอิินติิมิิน (Intimin) (eae) จากเชื้้�ออีีโคไลที่่�สร้้างพิิษชิิก้้า (Shiga
Toxin-Producing E. coli: STEC) ยัังเป็็นที่่�รู้้�จัักกัันในชื่่�อเชื้้�ออีีโคไลที่่�สร้้างสารพิิษเวอโรไซโตท็็อกซิิน (“Verocytotoxin-Producing E.
coli”) ในตััวอย่่างอาหารที่่�ได้้รัับการเลี้้�ยงเชื้้�อและในตััวอย่่างจากสิ่่�งแวดล้้อมกระบวนการแปรรููปอาหาร คำำ�ว่่า STEC หมายถึึงเชื้้�อ E.
coli สายพัันธุ์์�ที่่�สามารถสร้้างสารพิิษชิิก้้าชนิิดที่่� 1 (Stx1) ชนิิดที่่� 2 (Stx2) หรืือทั้้�งสองชนิิด ซึ่่�งเข้้ารหััสด้้วยยีีน stx1 และ stx2 ตามลำำ�ดัับ
STEC ประกอบด้้วยยีีนที่่�มีีความรุุนแรงในการก่่อโรค stx1 และ/หรืือ stx2 และ eae (ยีีนอิินทิิมิินมีีความเกี่่�ยวข้้องกัับฟีีโนไทป์์ในการยึึดติิด
และทำำ�ลาย) ซึ่่�งจััดเป็็นกลุ่่�มเชื้้�อ Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) ชุุดทดสอบคััดกรองประกอบด้้วยหลอดรีีเอเจนต์์สองหลอดแยกกััน
หลอดหนึ่่�งงเพื่่�อตรวจหายีีนความรุุนแรงในการก่่อโรค stx1 และ/หรืือ stx2 และอีีกหลอดหนึ่่�งเพื่่�อตรวจหายีีน eae จาก STEC (EHEC)
ซอฟต์์แวร์์ระบบทดสอบเชื้้�อก่่อโรคระดัับโมเลกุุลโดยวิิธีี Neogen® รายงานผลการทดสอบแยกกัันสำำ�หรัับแต่่ละวิิธีีทดสอบ และใช้้ผลการ
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เบื้้�องต้้นสำำ�หรัับยีีนเป้้าหมายทั้้�งสองชนิิด (stx1 และ/หรืือ stx2 และ eae) ผลการทดสอบต้้องเป็็นบวก ชุุดทดสอบ stx จะไม่่แยกว่่าเป็็นสาร
พิิษชนิิดใดระหว่่าง stx1 และ stx2 แต่่จะตรวจหาว่่ามีียีีน stx1 และ/หรืือ stx2 หรืือไม่่
ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุลโดยวิิธีี Neogen ใช้้การเพิ่่�มขยายยีีนแบบลููปที่่�อุุณหภููมิิเดีียว (Loop-mediated isothermal amplification)เพื่่�อเพิ่่�มขยายกรดนิิวคลีีอิิกด้้วยวิิธีีที่่�มีีความจำำ�เพาะเจาะจงและความไวสููงผสานกัับการเรืืองแสงทางชีีวภาพเพื่่�อตรวจจัับการเพิ่่�มขยาย
จำำ�นวนผลการทดสอบเบื้้�องต้้นที่่�เป็็นบวกจะได้้รัับการรายงานในทัันทีี ขณะที่่�ผลการทดสอบที่่�เป็็นลบจะแสดงผลภายหลัังจากที่่�การทดสอบ
ดัังกล่่าวเสร็็จสมบููรณ์์แล้้ว ผลที่่�สัันนิิษฐานว่่าเป็็นบวก ควรได้้รัับการยืืนยัันโดยใช้้วิิธีีที่่�ท่่านเห็็นสมควร(1, 2, 3) หรืือตามที่่�ระบุุไว้้ในระเบีียบข้้อ
บัังคัับระดัับท้้องถิ่่�น
Neogen ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุล 2 - STEC Gene Screen (stx และ eae) ออกแบบมาให้้ใช้้ในสภาพแวดล้้อมห้้องปฏิิบััติิการโดย
เจ้้าหน้้าที่่�ห้้องปฏิิบััติิการที่่�ผ่่านการอบรมเทคนิิคการปฏิิบััติิงานในห้้องปฏิิบััติิการ Neogen ยัังไม่่ได้้จััดทำำ�เอกสารเกี่่�ยวกัับการใช้้ผลิิตภััณฑ์์
นี้้�ในอุุตสาหกรรมอื่่�นๆ นอกจากอุุตสาหกรรมอาหารหรืือเครื่่�องดื่่�ม ตััวอย่่างเช่่น Neogen ยัังไม่่ได้้ออกเอกสารเกี่่�ยวกัับผลิิตภััณฑ์์นี้้�สำำ�หรัับ
การทดสอบตััวอย่่างยา ตััวอย่่างเครื่่�องสำำ�อาง ตััวอย่่างทางคลิินิิก หรืือตััวอย่่างเกี่่�ยวกัับสััตว์์ Neogen ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุล 2 STEC Gene Screen (stx และ eae) ยัังไม่่ได้้รัับการประเมิินกัับผลิิตภััณฑ์์อาหาร การแปรรููปอาหาร ระเบีียบการทดสอบที่่�เป็็นไปได้้
ทั้้�งหมดหรืือกัับสายพัันธุ์์�แบคทีีเรีียที่่�เป็็นไปได้้ทั้้�งหมด
เช่่นเดีียวกัับวิิธีีทดสอบทั่่�วๆ ไป แหล่่งที่่�มา สููตร และคุุณภาพของอาหารสำำ�หรัับเพิ่่�มจำำ�นวนเชื้้�อสามารถส่่งผลกระทบต่่อผลการทดสอบที่่�ได้้
นอกจากนี้้� ปััจจััยต่่างๆ เช่่น วิิธีีการสุ่่�มเก็็บตััวอย่่าง วิิธีีการทดสอบ การเตรีียมตััวอย่่าง การจััดการและเทคนิิคที่่�ใช้้ในห้้องปฏิิบััติิการอาจส่่ง
ผลกระทบต่่อผลการทดสอบที่่�ได้้ด้้วยเช่่นกััน Neogen ขอแนะนำำ�ให้้ประเมิินวิิธีีการทดสอบรวมทั้้�งอาหารเพิ่่�มจำำ�นวนเชื้้�อในสภาพแวดล้้อม
ของผู้้�ใช้้โดยใช้้จำำ�นวนตััวอย่่างที่่�เพีียงพอกัับอาหารแต่่ละชนิิดและสภาวะที่่�มีีความท้้าทายกัับการเจริิญเติิบโตของจุุลิินทรีีย์์ เพื่่�อให้้มั่่�นใจ
ว่่าวิิธีีการดัังกล่่าวเป็็นไปตามเกณฑ์์ของผู้้�ใช้้
Neogen ได้้ประเมิิน Neogen ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุล 2 - STEC Gene Screen (stx และ eae) ด้้วยบััฟเฟอร์์เปปโตนวอร์์เตอร์์
(BPW)-ISO เป็็นอาหารเหลว
เครื่่�องมืือสำำ�หรัับทดสอบเชื้้�อก่่อโรคระดัับโมเลกุุลโดยวิิธีี Neogen® มีีจุุดมุ่่�งหมายในการใช้้กัับตััวอย่่างที่่�ได้้ผ่่านกระบวนการให้้ความร้้อน
ในระหว่่างขั้้�นตอนการไลซีีสของการทดสอบ ซึ่่�งได้้รัับการออกแบบมาเพื่่�อทำำ�ลายเชื้้�อที่่�มีีในตััวอย่่าง ตััวอย่่างซึ่่�งไม่่ได้้รัับความร้้อนอย่่าง
เหมาะสมในระหว่่างขั้้�นตอนการไลซีีสของชุุดทดสอบอาจถืือว่่าเป็็นสารที่่�อาจมีีอัันตรายทางชีีวภาพ และไม่่ควรใส่่เข้้าไปในเครื่่�องมืือ
สำำ�หรัับทดสอบเชื้้�อก่่อโรคระดัับโมเลกุุลโดยวิิธีี Neogen
Neogen Food Safety ได้้รัับการรัับรองตามมาตรฐาน ISO (องค์์การระหว่่างประเทศว่่าด้้วยการมาตรฐาน) 9001 ด้้านการออกแบบและ
การผลิิต
Neogen ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุล 2 - STEC Gene Screen (stx และ eae) มีี stx และ eae อย่่างละ 48 หลอดทดสอบตามที่่�อธิิบาย
ไว้้ในตารางที่่� 1

1

TH (ภาษาไทย)ตารางที่่� 1 ส่่วนประกอบของชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุลโดยวิิธีี Neogenรายการ

การคััดแยก

จำำ�นวน

สิ่่�งที่่�บรรจุุภายใน

ความคิิดเห็็น

หลอดสารละลายไลซีีส
Neogen® (LS)สารละลายสีีชมพูู
ในหลอดใส

96 หลอด (12 แถว แถวละ
8 หลอด)ปริิมาตร LS 580
ไมโครลิิตรต่่อหลอด

บรรจุุอยู่่�ในที่่�
วางและพร้้อม
ใช้้งาน

หลอดสีีส้้ม

48 หลอด (2 ถุุง มีี 3 แถว แถว
ละ 8 หลอด)ส่่วนผสมสำำ�หรัับการเพิ่่�ม
ขยายและการตรวจหาเชื้้�อ
พร้้อมใช้้งาน
โรคแบบเฉพาะเจาะจงที่่�
ทำำ�ไลโอฟิิไลซ์์แล้้ว

หลอดรีีเอเจนต์์ Neogen®
ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุล
2 - STEC Gene Screen (stx)หลอดรีีเอเจนต์์ Neogen®
ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุล
2 - STEC Gene Screen (eae)หลอดสีีแดง

48 หลอด (2 ถุุง มีี 3 แถว แถว
ละ 8 หลอด)ส่่วนผสมสำำ�หรัับการเพิ่่�ม
ขยายและการตรวจหาเชื้้�อ
พร้้อมใช้้งาน
โรคแบบเฉพาะเจาะจงที่่�
ทำำ�ไลโอฟิิไลซ์์แล้้ว

ฝาสำำ�รอง

ฝาสีีส้้ม

96 ฝา (12 แถว แถวละ 8 ฝา)พร้้อมใช้้งาน

ฝาสำำ�รอง

ฝาสีีแดง

96 ฝา (12 แถว แถวละ 8 ฝา)พร้้อมใช้้งาน

Neogen® รีีเอเจนต์์คอนโทรล
(RC)หลอดใสชนิิดเปิิด
ฝาด้้านบน

16 หลอด (2 ถุุง ถุุงละ 8 หลอด)ส่่วนผสมที่่�ทำำ�ไลโอฟิิไลซ์์
สำำ�หรัับควบคุุม DNA การ พร้้อมใช้้งาน
เพิ่่�มขยายและการตรวจหา

ชุุดควบคุุมผลลบหรืือ Negative Control (NC) เป็็นอาหารเพิ่่�มจำำ�นวนเชื้้�อที่่�ปลอดเชื้้�อ เช่่น BPW-ISO ไม่่ได้้รวมอยู่่�ในชุุดอุุปกรณ์์ ห้้าม
ใช้้น้ำำ��เป็็น NC
โปรดดููคู่่�มืือฉบัับย่่อที่่� www.neogen.com

ความปลอดภััย

ผู้้�ใช้้ควรอ่่าน ทำำ�ความเข้้าใจ และปฏิิบััติิตามข้้อมููลความปลอดภััยทั้้�งหมดในคำำ�แนะนำำ�การใช้้งานระบบทดสอบเชื้้�อก่่อโรคระดัับโมเลกุุล
โดยวิิธีี Neogen และ Neogen ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุล 2 - STEC Gene Screen (stx และ eae) เก็็บคำำ�แนะนำำ�ด้้านความปลอดภััยนี้้�
ไว้้สำำ�หรัับใช้้อ้้างอิิงในอนาคต
คำำ�เตืือน
น:	บ่่งชี้้�ว่่าเป็็นสถานการณ์์ที่่�เป็็นอัันตราย ซึ่่�งหากไม่่มีีการหลีีกเลี่่�ยง อาจก่่อให้้เกิิดการเสีียชีีวิิตหรืือการบาดเจ็็บรุุนแรงและ/หรืือความเสีียหายต่่อทรััพย์์สิินได้้
ข้้อสัังเกต
เกต: ระบุุสถานการณ์์ที่่�อาจเป็็นอัันตราย หากไม่่หลีีกเลี่่�ยง อาจก่่อให้้เกิิดความเสีียหายต่่อทรััพย์์สิิน

คำำ�เตืือน
ห้้ามใช้้ Neogen ชุุดทดสอบ เชื้้�อระดัับโมเลกุุล 2 - STEC Gene Screen (stx และ eae) ในการวิินิิจฉััยโรคในมนุุษย์์หรืือสััตว์์
ผู้้�ใช้้งานต้้องฝึึกอบรมบุุคลากรเกี่่�ยวกัับเทคนิิคการทดสอบที่่�ถููกต้้องเหมาะสมในปััจจุุบััน ตััวอย่่างเช่่น หลัักปฏิิบััติิทางห้้องปฏิิบััติิการที่่�ดีี(4),ISO/IEC 17025(5), หรืือ ISO 7218(6)เพื่่�อลดความเสี่่�ยงที่่�เกี่่�ยวข้้องกัับผลลบปลอม ซึ่่�งนำำ�ไปสู่่�การปล่่อยผลิิตภััณฑ์์ที่่�มีีการปนเปื้้�อนไปขาย ให้้ปฏิิบััติิดัังนี้้�:• ปฏิิบััติิตามระเบีียบการและดำำ�เนิินการทดสอบดัังที่่�ระบุุไว้้อย่่างชััดเจนในคำำ�แนะนำำ�การใช้้งานผลิิตภััณฑ์์
• เก็็บ Neogen ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุล 2 - STEC Gene Screen (stx และ eae) ตามที่่�ระบุุไว้้บนบรรจุุภััณฑ์์และในคำำ�แนะนำำ�
การใช้้งานผลิิตภััณฑ์์
• ใช้้ Neogen ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุล 2 - STEC Gene Screen (stx และ eae) ก่่อนวัันหมดอายุุเสมอ
• ใช้้ Neogen ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุล 2 - STEC Gene Screen (stx และ eae) กัับตััวอย่่างในสิ่่�งแวดล้้อมและตััวอย่่างอาหารที่่�
ผ่่านการตรวจสอบภายในหรืือโดยบุุคคลที่่�สามแล้้วเท่่านั้้�น
• ใช้้ Neogen ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุล 2 - STEC Gene Screen (stx และ eae) เฉพาะกัับพื้้�นผิิว สารฆ่่าเชื้้�อ วิิธีีการและสายพัันธุ์์�
แบคทีีเรีียที่่�ผ่่านการตรวจสอบภายในหรืือโดยบุุคคลที่่�สามแล้้วเท่่านั้้�น
•	สำำ�หรัับตััวอย่่างจากสิ่่�งแวดล้้อมที่่�มีีบััฟเฟอร์์สำำ�หรัับทำำ�ให้้เป็็นกลางโดยมีีสารประกอบเชิิงซ้้อนของเอริิลซััลโฟเนตอยู่่�ด้้วย ให้้ทำำ�การ
เจืือจางด้้วยอััตราส่่วน 1:2 ก่่อนที่่�จะทดสอบ (เติิมตััวอย่่าง 1 ส่่วนลงในอาหารเหลวเพิ่่�มจำำ�นวนเชื้้�อที่่�ฆ่่าเชื้้�อแล้้ว 1 ส่่วน) อีีกหนึ่่�งตััว
เลืือกคืือถ่่ายบััฟเฟอร์์ที่่�เป็็นกลางที่่�มีีการเพิ่่�มเชื้้�อปริิมาณ 10 ไมโครลิิตรเข้้าไปยัังหลอดสารละลายไลซีีส Neogen ผลิิตภััณฑ์์ควบคุุม
ตััวอย่่างของNeogen® ซึ่่�งประกอบด้้วยบััฟเฟอร์์สำำ�หรัับทำำ�ให้้เป็็นกลางโดยมีีสารเชิิงซ้้อนของเอริิลซััลโฟเนตมีีดัังนี้้�: RS96010NB,
RS9604NB, SSL10NB, SSL10NB2G, HS10NB, HS10NB2G และ HS2410NB2Gเพื่่�อลดความเสี่่�ยงที่่�เกี่่�ยวข้้องกัับการสััมผััสสารเคมีีหรืือสารอัันตรายทางชีีวภาพ ให้้ปฏิิบััติิดัังนี้้�:• ให้้ทำำ�การทดสอบเชื้้�อก่่อโรคในห้้องปฏิิบััติิการที่่�มีีอุุปกรณ์์อย่่างเหมาะสมภายใต้้การควบคุุมของบุุคลากรที่่�ได้้รัับการอบรม อาหาร
เลี้้�ยงเชื้้�อเพื่่�อเพิ่่�มจำำ�นวนเชื้้�อที่่�บ่่มแล้้ว หรืือพื้้�นผิิวที่่�มีีการสััมผััสกัับอาหารเลี้้�ยงเชื้้�อหลัังเพิ่่�มจำำ�นวนเชื้้�อที่่�บ่่มแล้้ว อาจจะมีีเชื้้�อโรคใน
ระดัับเพีียงพอที่่�จะก่่อให้้เกิิดความเสี่่�ยงต่่อสุุขภาพของมนุุษย์์ได้้

2

TH (ภาษาไทย)ปฏิิบััติิตามแนวปฏิิบััติิเพื่่�อความปลอดภััยทางห้้องปฏิิบััติิการมาตรฐานทุุกครั้้�งโดยรวมถึึงการสวมเครื่่�องแต่่งกายเพื่่�อป้้องกัันและ
อุุปกรณ์์ปกป้้องดวงตาในขณะที่่�ปฏิิบััติิงานกัับรีีเอเจนต์์และตััวอย่่างที่่�มีีการปนเปื้้�อน
• หลีีกเลี่่�ยงการสััมผััสกัับอาหารหลัังบ่่มเพิ่่�มจำำ�นวนเชื้้�อและหลอดบรรจุุรีีเอเจนต์์ภายหลัังการเพิ่่�มจำำ�นวนดีีเอ็็นเอ
•	กำำ�จััดตััวอย่่างหลัังเพิ่่�มจำำ�นวนเชื้้�อตามมาตรฐานระดัับท้้องถิ่่�น/ภููมิิภาค/ประเทศ/ข้้อบัังคัับในปััจจุุบััน
•	ตััวอย่่างซึ่่�งไม่่ได้้รัับความร้้อนอย่่างเหมาะสมในระหว่่างขั้้�นตอนการไลซีีสของชุุดทดสอบอาจถืือว่่าเป็็นสารที่่�อาจมีีอัันตรายทาง
ชีีวภาพ และไม่่ควรใส่่เข้้าไปในเครื่่�องมืือสำำ�หรัับทดสอบเชื้้�อก่่อโรคระดัับโมเลกุุลโดยวิิธีี Neogen•เพื่่�อลดความเสี่่�ยงจากการปนเปื้้�อนข้้ามขณะเตรีียมชุุดทดสอบ ให้้ปฏิิบััติิดัังนี้้�:• สวมถุุงมืือตลอดเวลา (เพื่่�อปกป้้องผู้้�ใช้้งานและป้้องกัันการเกิิดนิิวคลีีเอส)เพื่่�อเป็็นการลดความเสี่่�ยงอัันเกิิดจากการสััมผััสโดนของเหลวร้้อน ให้้ปฏิิบััติิดัังนี้้�:•	ห้้ามตั้้�งเครื่่�องทำำ�ความร้้อนอุุณหภููมิิสููงกว่่าอุุณหภููมิิที่่�แนะนำำ�ไว้้
•	ห้้ามทำำ�ความร้้อนเกิินเวลาที่่�แนะนำำ�
• ใช้้เทอร์์โมมิิเตอร์์ที่่�ได้้รัับการสอบเทีียบตามมาตรฐานและเหมาะสม เพื่่�อยืืนยัันอุุณหภููมิิของของฮีีทบล็็อคสำำ�หรัับใส่่หลอดทดสอบระดัับ
โมเลกุุล โดยวิิธีี Neogen® (เช่่น เทอร์์โมมิิเตอร์์แบบจุ่่�มบางส่่วน หรืือเทอร์์โมมิิเตอร์์แบบดิิจิิทััล ที่่�ไม่่ใช่่เทอร์์โมมิิเตอร์์แบบจุ่่�มทั้้�งหมด)จะต้้องวางเทอร์์โมมิิเตอร์์ในบริิเวณที่่�กำำ�หนดไว้้ของฮีีทบล็็อคสำำ�หรัับใส่่หลอดทดสอบระดัับโมเลกุุล โดยวิิธีี Neogenข้้อสัังเกต
เพื่่�อลดความเสี่่�ยงจากการปนเปื้้�อนข้้ามขณะเตรีียมชุุดทดสอบ ให้้ปฏิิบััติิดัังนี้้�:• เปลี่่�ยนถุุงมืือก่่อนขั้้�นตอนการผสมสารละลายกัับเม็็ดรีีเอเจนต์์
• แนะนำำ�ให้้ใช้้ปิิเปตต์์ทิิประดัับชีีววิิทยาโมเลกุุลชนิิดที่่�มีีตััวกั้้�นละอองอากาศ (ชนิิดกรองแล้้ว) ที่่�ผ่่านการฆ่่าเชื้้�อแล้้ว
• ใช้้ปิิเปตต์์ทิิปอัันใหม่่สำำ�หรัับการถ่่ายตััวอย่่างในแต่่ละครั้้�ง
• ใช้้แนวปฏิิบััติิที่่�ดีีสำำ�หรัับห้้องปฏิิบััติิการ เพื่่�อถ่่ายโอนตััวอย่่างจากอาหารเพิ่่�มจำำ�นวนเชื้้�อที่่�บ่่มแล้้วไปยัังหลอดสายละลายไลซีีส เพื่่�อ
หลีีกเลี่่�ยงการปนเปื้้�อนในขั้้�นตอนการปิิเปตต์์ ผู้้�ใช้้อาจเพิ่่�มขั้้�นตอนในระหว่่างการถ่่ายตััวอย่่างสารละลาย ตััวอย่่างเช่่น ผู้้�ใช้้อาจถ่่าย
โอนแต่่ละตััวอย่่างอาหารที่่�เพิ่่�มจำำ�นวนเชื้้�อใส่่เข้้าไปในหลอดที่่�ฆ่่าเชื้้�อแล้้ว
• ปฏิิบััติิการทดสอบทางชีีววิิทยาโมเลกุุลบนโต๊๊ะที่่�มีีหลอดไฟฆ่่าเชื้้�อหากทำำ�ได้้
• ลดการปนเปื้้�อนบนโต๊๊ะปฏิิบััติิงานและอุุปกรณ์์ในห้้องปฏิิบััติิการ (ปิิเปตต์์ เครื่่�องมืือเปิิด/ปิิดฝา ฯลฯ) อย่่างสม่ำำ��เสมอด้้วยน้ำำ��ยาฟอกขาว
ที่่�ใช้้ในครััวเรืือนที่่�มีีความเข้้มข้้น 1-5% (ผสมกัับน้ำำ��ตามอััตราส่่วน) หรืือสารละลายกำำ�จััดดีีเอ็็นเอ
เพื่่�อลดความเสี่่�ยงจากผลบวกปลอม ให้้ปฏิิบััติิดัังนี้้�
•	ห้้ามเปิิดหลอดรีีเอเจนต์์ภายหลัังการเพิ่่�มขยายจำำ�นวนเชื้้�อ
•	กำำ�จััดหลอดทดลองที่่�ปนเปื้้�อนแล้้วเสมอ โดยแช่่ในน้ำำ��ยาฟอกขาวที่่�ใช้้ในครััวเรืือนที่่�มีีความเข้้มข้้น 1-5% (ผสมกัับน้ำำ��ตามอััตราส่่วน)เป็็นเวลา 1 ชั่่�วโมงและให้้อยู่่�ห่่างจากพื้้�นที่่�จััดเตรีียมชุุดทดสอบทุุกครั้้�ง
•	ห้้ามนึ่่�งฆ่่าเชื้้�อหลอดรีีเอเจนต์์ภายหลัังการเพิ่่�มขยายจำำ�นวน
ศึึกษาข้้อมููลเพิ่่�มเติิมในเอกสารข้้อมููลความปลอดภััยและระเบีียบข้้อบัังคัับการกำำ�จััดทิ้้�งในประเทศ
หากท่่านมีีข้้อสงสััยเกี่่�ยวกัับการใช้้งานหรืือกรรมวิิธีีที่่�เฉพาะเจาะจงใด ๆ โปรดเยี่่�ยมชมเว็็บไซต์์ของเราที่่� www.neogen.com หรืือติิดต่่อ
ตััวแทนจำำ�หน่่ายหรืือผู้้�จััดจำำ�หน่่ายของบริิษััท Neogen ในท้้องถิ่่�นของท่่าน

ความรัับผิิดชอบของผู้้�ใช้้

ผู้้�ใช้้จะต้้องทำำ�ความเข้้าใจเกี่่�ยวกัับคำำ�แนะนำำ�การใช้้งานผลิิตภััณฑ์์และข้้อมููลเกี่่�ยวกัับผลิิตภััณฑ์์ หากต้้องการข้้อมููลเพิ่่�มเติิม สามารถเยี่่�ยม
ชมเว็็บไซต์์ของเราได้้ที่่� www.neogen.com หรืือติิดต่่อตััวแทนหรืือผู้้�จััดจำำ�หน่่าย Neogen ในพื้้�นที่่�ของท่่าน
เมื่่�อเลืือกวิิธีีทดสอบ การคำำ�นึึงถึึงปััจจััยภายนอกนั้้�นเป็็นสิ่่�งสำำ�คััญ เช่่น วิิธีีการสุ่่�มตััวอย่่าง วิิธีีการทดสอบ วิิธีีการเตรีียมตััวอย่่าง การจััดการ
ควบคุุม เทคนิิคของห้้องปฏิิบััติิการรวมถึึงตััวอย่่างเองที่่�อาจส่่งผลกระทบต่่อผลลััพธ์์ได้้
ผู้้�ใช้้งานเป็็นผู้้�รัับผิิดชอบในการประเมิินความเหมาะสมสำำ�หรัับการเลืือกวิิธีีการทดสอบหรืือชนิิดผลิิตภััณฑ์์ เพื่่�อประเมิินจำำ�นวนเมทริิกซ์์ที่่�
เหมาะสมกัับความสามารถในการเหลืือรอดของจุุลิินทรีีย์์ เพื่่�อให้้ผู้้�ใช้้แน่่ใจว่่าวิิธีีการทดสอบที่่�เลืือกนั้้�นเป็็นไปตามเกณฑ์์ของผู้้�ใช้้เอง
นอกจากนี้้� ผู้้�ใช้้จะต้้องรัับผิิดชอบในการเลืือกวิิธีีการทดสอบและผลลััพธ์์ที่่�ได้้ให้้เป็็นไปตามข้้อกำำ�หนดของลููกค้้าและของซััพพลายเออร์์
เช่่นเดีียวกัับวิิธีีการทดสอบอื่่�น ๆ ผลการทดสอบที่่�ได้้จากการใช้้ผลิิตภััณฑ์์ Neogen Food Safety ใดก็็ตาม ไม่่ได้้รัับประกัันถึึงคุุณภาพ
ของเมทริิกซ์์หรืือขั้้�นตอนที่่�ใช้้ทดสอบ
Neogen ได้้พััฒนาชุุดน้ำำ��ยาควบคุุมเพื่่�อทดสอบผลของส่่วนประกอบในตััวอย่่างแต่่ละประเภท โดยวิิธีี Neogen® เพื่่�อช่่วยให้้ลููกค้้าประเมิิน
วิิธีีการสำำ�หรัับเมทริิกซ์์ต่่างๆ ของอาหารได้้ เมื่่�อจำำ�เป็็น ให้้ใช้้ Neogen ชุุดน้ำำ��ยาควบคุุมเพื่่�อทดสอบผลของส่่วนประกอบในตััวอย่่างแต่่ละ
ประเภท(MC) เพื่่�อทดสอบว่่าเมทริิกซ์์นั้้�นสามารถส่่งผลกระทบต่่อผลการทดสอบของ Neogen ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุล 2 - STEC
Gene Screen (stx และ eae) ทดสอบตััวอย่่างหลายๆ ที่่�ถืือว่่าเป็็นตััวแทนของเมทริิกซ์์นั้้�นๆ เช่่น ตััวอย่่างที่่�ได้้จากแหล่่งกำำ�เนิิดที่่�แตกต่่าง
กััน ตััวอย่่างในระหว่่างการตรวจสอบความใช้้ได้้ของวิิธีีทดสอบก่่อนนำำ�วิิธีีของ Neogen มาใช้้ หรืือเมื่่�อทำำ�การทดสอบเมทริิกซ์์ใหม่่หรืือที่่�
ไม่่เคยทำำ�หรืือเมทริิกซ์์ที่่�ผ่่านการเปลี่่�ยนแปลงวััตถุุดิิบหรืือการแปรรููป

3

TH (ภาษาไทย)สามารถให้้คำำ�จำำ�กััดความของเมทริิกซ์์ได้้ว่่า เป็็นชนิิดของผลิิตภััณฑ์์ที่่�มีีคุุณสมบััติิที่่�มาที่่�แตกต่่างกััน เช่่น องค์์ประกอบหลัักและ
กระบวนการแปรรููปที่่�ต่่างกััน ความแตกต่่างระหว่่างเมทริิกซ์์ต่่าง ๆ อาจจะเป็็นเพีียงผลที่่�เกิิดจากความแตกต่่างในกระบวนการแปรรููปหรืือ
สภาพลัักษณะของเมทริิกซ์์ เช่่น ดิิบกัับผ่่านการฆ่่าเชื้้�อแบบพาสเจอไรซ์์ สดกัับแห้้ง ฯลฯเงื่่�อนไขการรัับประกััน/การชดเชยแบบจำำ�กััด

NEOGEN ปฏิิเสธการรัับประกัันทั้้�งหมดทั้้�งอย่่างชััดแจ้้งและโดยนััย รวมถึึงแต่่ไม่่จำำ�กััดเพีียงการรัับประกัันใดๆ ถึึงความสามารถในการ
จำำ�หน่่ายหรืือความเหมาะสมสำำ�หรัับการใช้้งานโดยเฉพาะ เว้้นแต่่จะได้้อธิิบายไว้้อย่่างชััดแจ้้งในส่่วนการรัับประกัันแบบจำำ�กััดว่่าด้้วยบรรจุุ
ภััณฑ์์ของผลิิตภััณฑ์์แต่่ละชิ้้�น หากผลิิตภััณฑ์์ Neogen Food Safety ใดๆ มีีตำำ�หนิิบกพร่่อง บริิษััท Neogen หรืือผู้้�จััดจำำ�หน่่ายที่่�ได้้รัับ
อนุุญาตของบริิษััทจะใช้้ดุุลยพิินิิจของตนในการพิิจารณาเปลี่่�ยนแทนผลิิตภััณฑ์์หรืือคืืนเงิินค่่าผลิิตภััณฑ์์ดัังกล่่าว อัันนี้้�คืือการชดเชยพิิเศษ
หากสงสััยว่่ามีีข้้อบกพร่่องหรืือความเสีียหายกัับสิินค้้า ท่่านต้้องแจ้้ง Neogen ภายใน 60 วัันหลัังจากที่่�พบ และทำำ�การคืืนสิินค้้าที่่�เสีียหาย
ให้้ทาง Neogen โปรดโทรติิดต่่อแผนกบริิการลููกค้้า (1-800-328-1671 ในสหรััฐอเมริิกา) หรืือตััวแทน Neogen Food Safety เพื่่�อขอ
สิิทธิ์์�ส่่งคืืนผลิิตภััณฑ์์ โปรดติิดต่่อตััวแทน Neogen ของคุุณหรืือผู้้�จััดจำำ�หน่่าย Neogen ที่่�ได้้รัับอนุุญาตหากมีีคำำ�ถามเพิ่่�มเติิม

ขอบเขตความรัับผิิดชอบของ Neogen

NEOGEN จะไม่่รัับผิิดชอบต่่อการสููญเสีียหรืือความเสีียหายใดๆ ทั้้�งโดยตรง โดยอ้้อม ความเสีียหายจำำ�เพาะ ที่่�เกิิดขึ้้�นเนื่่�องจากการผิิด
สััญญาหรืือที่่�เป็็นผลสืืบเนื่่�อง รวมถึึงแต่่ไม่่จำำ�กััดเพีียงการสููญเสีียผลกำำ�ไร ความรัับผิิดชอบของทาง Neogen ในทางกฎหมายจะต้้องไม่่
เกิินราคาของผลิิตภััณฑ์์ที่่�เสีียหายหรืือบกพร่่องไม่่ว่่ากรณีีใดๆ ก็็ตาม

การเก็็บรัักษาและการกำำ�จััด

เก็็บ Neogen ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุล 2 - STEC Gene Screen (stx และ eae) ที่่อุ� ณุ หภููมิิ 2-8°C (35-47°F) ห้้ามแช่่แข็็ง เก็็บชุุดอุุปกรณ์์้ แสงในระหว่่างการเก็็บรัักษา หลัังจากเปิิดชุุดอุุปกรณ์์แล้้ว ให้้ตรวจสอบว่่าถุุงฟอยล์์ไม่่ชำ�ำ รุุดเสีียหาย หากถุุงฟอยล์์ชำ�ำ รุุดเสีียหาย ห้้ามใช้้
ให้้พ้น
ผลิิตภััณฑ์์นั้้�น หลัังจากเปิิดแล้้ว ควรเก็็บรัักษาหลอดรีีเอเจนต์์ที่ยั�่ งั ไม่่ได้้ใช้้ไว้้ในถุุงที่่ซีี� ลปิิดซ้ำำ�� ได้้โดยมีีสารดููดความชื้้�นใส่่อยู่่�ภายใน เพื่่�อให้้รีีเอ
เจนต์์ที่ทำ�่ �ำ ไลโอฟิิไลซ์์แล้้วอยู่่�ในสภาวะคงตััว เก็็บถุุงที่่ซีี� ลปิิดกลัับแล้้วไว้้ที่อุ�่ ณุ หภููมิิ 2-8°C (35-47°F) เป็็นเวลาไม่่เกิิน90 วัันห้้ามใช้้ Neogen ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุล 2 - STEC Gene Screen (stx และ eae) หลัังวัันหมดอายุุ วัันหมดอายุุและหมายเลข
ล็็อตจะแสดงไว้้บนฉลากด้้านนอกของกล่่อง หลัังใช้้งาน อาหารเพิ่่�มจำำ�นวนเชื้้�อและหลอดของ Neogen ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุล
2 - STEC Gene Screen (stx และ eae) อาจมีีสารจากเชื้้�อก่่อให้้เกิิดโรคอยู่่� เมื่่�อการทดสอบเสร็็จสมบููรณ์์แล้้ว ให้้ปฏิิบััติิตามมาตรฐาน
อุุตสาหกรรมในปััจจุุบัันสำำ�หรัับการกำำ�จััดและทิ้้�งขยะปนเปื้้�อน ศึึกษาข้้อมููลเพิ่่�มเติิมในเอกสารข้้อมููลความปลอดภััยและระเบีียบข้้อบัังคัับการ
กำำ�จััดทิ้้�งในประเทศ

คำำ�แนะนำำ�การใช้้งาน

ปฏิิบััติิตามคำำ�แนะนำำ�ทั้้�งหมดอย่่างละเอีียดรอบคอบ หากไม่่ปฏิิบััติิเช่่นนั้้�น อาจให้้ผลที่่�ไม่่ถููกต้้องแม่่นยำำ�ได้้
ลดการปนเปื้้�อนบนโต๊๊ะปฏิิบััติิงานและอุุปกรณ์์ในห้้องปฏิิบััติิการ (ปิิเปตต์์ เครื่่�องมืือเปิิด/ปิิดฝา ฯลฯ) อย่่างสม่ำำ��เสมอด้้วยน้ำำ��ยาฟอกขาวที่่�ใช้้
ในครััวเรืือนที่่�มีีความเข้้มข้้น 1-5% (ผสมกัับน้ำำ��ตามอััตราส่่วน) หรืือสารละลายกำำ�จััดดีีเอ็็นเอ
ผู้้�ใช้้ควรผ่่านการฝึึกอบรมคุุณสมบััติิสำำ�หรัับผู้้�ปฏิิบััติิงาน (OQ) ระบบทดสอบเชื้้�อก่่อโรคระดัับโมเลกุุลโดยวิิธีี Neogen ตามที่่�ระบุุใน
เอกสาร “แนวทางและระเบีียบการด้้านคุุณสมบััติิการติิดตั้้�ง (IQ) / คุุณสมบััติิการปฏิิบััติิการ (OQ) สำำ�หรัับระบบการทดสอบเชื้้�อก่่อโรคระดัับ
โมเลกุุลโดยวิิธีี Neogen”(7)ดููในส่่วน “คำำ�แนะนำำ�เฉพาะสำำ�หรัับวิิธีีที่่�ผ่่านการตรวจสอบแล้้ว” สำำ�หรัับข้้อกำำ�หนดเฉพาะ:ตารางที่่� 3 สำำ�หรัับระเบีียบวิิธีีการเพิ่่�มจำำ�นวนเชื้้�อตามPerformance Tested MethodSM (PTM) Certificate หมายเลข 071902
การเพิ่่�มจำำ�นวนเชื้้�อในตััวอย่่าง
ตารางที่่� 2 และ 3 แสดงคำำ�แนะนำำ�สำำ�หรัับระเบีียบวิิธีีทั่่�วไปในการเพิ่่�มจำำ�นวนเชื้้�อสำำ�หรัับอาหาร
ผู้้�ใช้้มีีหน้้าที่่�รัับผิิดชอบในการพิิสููจน์์ยืืนยัันระเบีียบการสุ่่�มตััวอย่่างหรืืออััตราส่่วนการเจืือจางแบบอื่่�นเพื่่�อให้้มั่่�นใจว่่าวิิธีีการทดสอบนี้้�
สอดคล้้องกัับเกณฑ์์ของผู้้�ใช้้งานเอง
อาหาร
1. ให้้อาหารเพิ่่�มจำำ�นวนเชื้้�อ BPW ISO ปรัับสมดุุลให้้ได้้ระดัับอุุณหภููมิิ 41.5 ± 1°C
2. ผสมอาหารเพื่่�อเลี้้�ยงเพิ่่�มจำำ�นวนเชื้้�อกัับตััวอย่่างอาหารเข้้าด้้วยกัันโดยใช้้วิิธีีการแบบปลอดเชื้้�อ สำำ�หรัับตััวอย่่างประเภทเนื้้�อสััตว์์และ
ตััวอย่่างที่่�มีีลัักษณะเป็็นอนุุภาคขนาดเล็็กทั้้�งหมด แนะนำำ�ให้้ใช้้ถุุงที่่�มีีตััวกรอง
3. ผสมรวมสารทั้้�งหมดและบ่่มไว้้ตามที่่�กำำ�หนดไว้้ในวิิธีีการเหมาะสม (ดููตาราง 2 หรืือ 3)ตััวอย่่างจากสิ่่�งแวดล้้อม
คำำ�เตืือน: หากคุุณเลืือกที่่�จะใช้้บััฟเฟอร์์สำำ�หรัับทำำ�ให้้เป็็นกลาง (NB) ซึ่่�งประกอบด้้วยสารเชิิงซ้้อนของเอริิลซััลโฟเนตเป็็นสารละลายเพื่่�อ
ทำำ�ให้้ฟองน้ำำ��ชุ่่�มชื้้�น ต้้องทำำ�การเจืือจางตััวอย่่างหลัังเพิ่่�มจำำ�นวนเชื้้�อแล้้วในอััตราส่่วน 1:2 (ตััวอย่่าง 1 ส่่วนในอาหารเหลวเพิ่่�มจำำ�นวนเชื้้�อ
ที่่�ฆ่่าเชื้้�อแล้้ว 1 ส่่วน) ก่่อนการทดสอบเพื่่�อที่่�จะลดความเสี่่�ยงอัันเกี่่�ยวข้้องกัับผลลบปลอมจซึ่่�งนำำ�ไปสู่่�การปล่่อยผลิิตภััณฑ์์ที่่�ปนเปื้้�อนออกสู่่�
ภายนอกได้้ อีีกหนึ่่�งตััวเลืือกคืือถ่่ายบััฟเฟอร์์ที่่�เป็็นกลางที่่�มีีการเพิ่่�มเชื้้�อปริิมาณ 10 ไมโครลิิตรเข้้าไปยัังหลอดสารละลายไลซีีส Neogenผู้้�ใช้้มีีหน้้าที่่�รัับผิิดชอบในการพิิสููจน์์ยืืนยัันระเบีียบการสุ่่�มตััวอย่่างหรืืออััตราส่่วนการเจืือจางแบบอื่่�นเพื่่�อให้้มั่่�นใจว่่าวิิธีีการทดสอบนี้้�
สอดคล้้องกัับเกณฑ์์ของผู้้�ใช้้งานเอง
4

TH (ภาษาไทย)ตารางที่่� 2 ระเบีียบการของอาหารเพิ่่�มจำำ�นวนเชื้้�อทั่่�วไป
เมทริิกซ์์ตััวอย่่าง

ขนาดตััวอย่่าง

ปริิมาตรอาหารเหลว
เลี้้�ยงเชื้้�อ (มลมล.)(อุ่่�นไว้้
อุ่่�นไว้้ก่่อนแล้้ว)อุุณหภููมิิในการ
เพิ่่�มจำำ�นวนเชื้้�อ
(± 1°C)เวลาการ
เพิ่่�มจำำ�นวน
เชื้้�อ (ชั่่�
ชั่่�วโมง
โมง)ปริิมาตรการ
วิิเคราะห์์ตััวอย่่าง
(ไมโครลิิ
ไมโครลิิตร)รเนื้้�อวััวดิิบบด ชิ้้�นและตััดแต่่ง(ก)

375 ก.

1125 BPW-ISO

41.5

10-18

20

เนื้้�อสััตว์์ดิิบ (หมูู, สััตว์์ปีีก,แกะ, วััวป่่า)(ก)

375 ก.

1125 BPW-ISO

41.5

10-18

20

พืืชผััก(ข)

200 ก.

450 BPW-ISO

41.5

18-24

20

ถั่่�วงอก

25 ก.

225 BPW-ISO

41.5

18-24

20

25 ก. หรืือ
25 มล.

225 BPW-ISO

41.5

18-24

20

(ค)

นมดิิบ(ง)นวดตััวอย่่างเนื้้�อวััว (เนื้้�อวััวบด ชิ้้�นและตััดแต่่ง) และเนื้้�อสััตว์์ดิิบ (เนื้้�อหมูู สััตว์์ปีีกและเนื้้�อสััตว์์ที่่�ไม่่ใช่่เนื้้�อวััวที่่�บดแล้้ว) ด้้วยมืือเป็็นเวลา
30-60 วิินาทีีเพื่่�อกระจายและทำำ�ให้้ก้้อนเนื้้�อแตกจากกัันหลัังจากการเติิม BPW-ISO ที่่�อุ่่�นไว้้ก่่อนแล้้ว

(ก)

	สำำ�หรัับพืืชผััก ให้้ริินล้้างด้้วยอาหารเหลว (BPW-ISO ที่่�อุ่่�นไว้้แล้้ว) ไปตามใบแล้้วเขย่่าเบาๆ เป็็นเวลา 30-60 วิินาทีี ห้้ามนวดหรืือทำำ�
ใบผัักให้้เป็็นเนื้้�อเดีียวกััน

(ข)

	สำำ�หรัับเถั่่�วงอก ให้้ริินล้้างด้้วยอาหารเหลว (BPW-ISO ที่่�อุ่่�นไว้้แล้้ว) 30-60 วิินาทีี และห้้ามนวดหรืือทำำ�ให้้เป็็นเนื้้�อเดีียวกััน

(ค)
(ง)

	ทำำ�ตััวอย่่างนมดิิบให้้เป็็นเนื้้�อเดีียวกัันเป็็นเวลา 30 ถึึง 60 วิินาทีีหลัังจากการเติิม BPW-ISO ที่่�อุ่่�นไว้้ก่่อนแล้้ว

คำำ�แนะนำำ�เฉพาะสำำ�หรัับวิิธีีที่่�ผ่่านการตรวจสอบแล้้ว

AOAC® Performance Tested MethodSM (PTM) Certificate หมายเลข 071902

จากการศึึกษา PTMSM ของสถาบัันวิิจััย AOAC, Neogen ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุล 2 – STEC Gene Screen (stx และ eae) พบว่่า
เป็็นวิิธีีการที่่�มีีประสิิทธิิภาพในการตรวจหา STEC เมทริิกซ์์ที่่�ได้้รัับการทดสอบในการศึึกษาดัังกล่่าวแสดงไว้้ในตารางที่่� 3ตารางที่่� 3 ขั้้�นตอนการเพิ่่�มจำำ�นวนเชื้้�อตามเอกสาร AOAC PTMSM หมายเลข 071902
เมทริิกซ์์ตััวอย่่าง

ขนาดตััวอย่่าง

ปริิมาตรอาหารเหลว
เลี้้�ยงเชื้้�อ (มล.)อุณหภูมิในการเพิ่ม
จ�ำนวนเชื้อ (±(± 1°C)
1°C)

เวลาการเพิ่่�ม
จำำ�นวนเชื้้�อ
(ชั่่�วโมง)ปริิมาตรการ
วิิเคราะห์์ตััวอย่่าง
(ไมโครลิิตร)เนื้้�อวััวดิิบตััดแต่่ง(ก)

375 ก.

1125 BPW-ISO (อุ่่�นไว้้ก่่อนแล้้ว)

41.5

10-18

20

เนื้้�อวััวดิิบบด

375 ก.

1125 BPW-ISO (อุ่่�นไว้้ก่่อนแล้้ว)

41.5

10-18

20

25 ก.

225 BPW-ISO (อุ่่�นไว้้ก่่อนแล้้ว)

41.5

10-18

20

375 ก.

1125 BPW-ISO (อุ่่�นไว้้ก่่อนแล้้ว)

41.5

10-18

20

ชิ้้�นส่่วนสััตว์์ปีีกดิิบ

375 ก.

1125 BPW-ISO (อุ่่�นไว้้ก่่อนแล้้ว)

41.5

10-18

20

ไก่่ที่่�แยกส่่วนด้้วย
เครื่่�อง

25 กรััม

BPW-ISO (อุ่่�นล่่วงหน้้า)225 กรััม

41.5

10-24

20

ผัักโขม(ข)

200 ก.

450 BPW-ISO (อุ่่�นไว้้ก่่อนแล้้ว)

41.5

18-24

20

ถั่่�วงอก(ค)

25 ก.

225 BPW-ISO (อุ่่�นไว้้ก่่อนแล้้ว)

41.5

18-24

20

ดอกกััญชาแห้้ง
ดอกกััญชงแห้้ง(4)10 กรััม

BPW-ISO 90 กรััม

41.5

28-32

20

(ก)

เนื้้�อวััวดิิบบด

(ก)เนื้้�อหมููดิิบบด

(ก)
(ก)

(ก)

	สำำ�หรัับตััวอย่่างเนื้้�อวััว (เนื้้�อบดและตััดแต่่ง) เติิม BPW-ISO ที่่�อุ่่�นไว้้ก่่อนแล้้วลงไปในตััวอย่่างเนื้้�อ นวดด้้วยมืือเป็็นเวลา 30-60 วิินาทีี
เพื่่�อเพื่่�อกระจายและทำำ�ให้้ก้้อนเนื้้�อแตกจากกััน

5

TH (ภาษาไทย)	สำำ�หรัับผัักโขม เติิม BPW-ISO ที่่�อุ่่�นไว้้ก่่อนแล้้วลงไปในเมทริิกซ์์ ริินล้้างด้้วยของเหลวไปตามใบแล้้วเขย่่าเบาๆ เป็็นเวลา 30-60 วิินาทีี
ห้้ามนวดหรืือทำำ�ใบผัักให้้เป็็นเนื้้�อเดีียวกััน

(ข)

	สำำ�หรัับถั่่�วงอก ให้้ริินล้้างด้้วยอาหารเหลว (BPW-ISO ที่่�อุ่่�นไว้้แล้้ว) 30-60 วิินาทีี และห้้ามนวดหรืือทำำ�ให้้เป็็นเนื้้�อเดีียวกััน

(ค)
(d)

ดอกกััญชาแห้้ง (THC >0.3%) และดอกกััญชงแห้้ง (THC ≤0.3%)

การเตรีียมถาดใส่่หลอดทดสอบสำำ�หรัับเข้้าเครื่่�องทดสอบระดัับโมเลกุุลโดยวิิธีี Neogen®
1.	ชุุบผ้้าหรืือกระดาษเช็็ดมืือแบบใช้้แล้้วทิ้้�งในน้ำำ��ยาฟอกขาว 1-5% (ผสมกัับน้ำำ��ตามอััตราส่่วน) และเช็็ดถาดใส่่หลอดทดสอบสำำ�หรัับเข้้า
เครื่่�องทดสอบระดัับโมเลกุุลโดยวิิธีี Neogen
2. ใช้้น้ำำ��ล้้างถาดใส่่หลอดทดสอบสำำ�หรัับเข้้าเครื่่�องทดสอบระดัับโมเลกุุลโดยวิิธีี Neogen นี้้�
3. ใช้้กระดาษเช็็ดมืือแบบใช้้แล้้วทิ้้�งเช็็ดถาดใส่่หลอดทดสอบสำำ�หรัับเข้้าเครื่่�องทดสอบระดัับโมเลกุุลโดยวิิธีี Neogen ให้้แห้้ง
4. ตรวจสอบให้้แน่่ใจว่่าถาดใส่่หลอดทดสอบสำำ�หรัับเข้้าเครื่่�องทดสอบระดัับโมเลกุุลโดยวิิธีี Neogen แห้้งสนิิทก่่อนใช้้งาน
การเตรีียมชิิลบล็็อคสำำ�หรัับใส่่หลอดทดสอบระดัับโมเลกุุล โดยวิิธีี Neogen®
วางชิิลบล็็อคสำำ�หรัับใส่่หลอดทดสอบระดัับโมเลกุุล โดยวิิธีี Neogen บนโต๊๊ะปฏิิบััติิงานของห้้องปฏิิบััติิการโดยตรง: ไม่่ต้้องใช้้ถาดวางชิิลบ
ล็็อคสำำ�หรัับใส่่หลอดทดสอบระดัับโมเลกุุล โดยวิิธีี Neogen ใช้้ชิิลบล็็อคที่่�อุุณหภููมิิห้้องปฏิิบััติิการ (20-25°C)
การเตรีียมฮีีทบล็็อคสำำ�หรัับใส่่หลอดทดสอบระดัับโมเลกุุล โดยวิิธีี Neogen®
วางฮีีทบล็็อคสำำ�หรัับใส่่หลอดทดสอบระดัับโมเลกุุล โดยวิิธีี Neogen ในเครื่่�องทำำ�ความร้้อนบล็็อกคู่่�แบบแห้้ง เปิิดเครื่่�องทำำ�ความร้้อนบล็็อค
แบบแห้้งและตั้้�งอุุณหภููมิิเพื่่�อให้้ฮีีทบล็็อคสำำ�หรัับใส่่หลอดทดสอบระดัับโมเลกุุล โดยวิิธีี Neogen มีีอุุณหภููมิิเพิ่่�มขึ้้�นจนถึึง 100 ± 1°C
หมายเหตุ: ให้ฮีทบล็อคสำ�หรับใส่หลอดทดสอบระดับโมเลกุล โดยวิธี Neogen มีอุณหภูมิตามที่กำ�หนดโดยทิ้งไว้ประมาณ 30 นาที ทั้งนี้
ขึ้นอยู่กับการทำ�งานของเครื่องทำ�ความร้อน ใช้เทอร์โมมิเตอร์ที่ได้รับการสอบเทียบอย่างเหมาะสม (เช่น เทอร์โมมิเตอร์แบบจุ่มบางส่วน
เทอร์โมมิเตอร์แบบดิจิตอล ที่ไม่ใช่เทอร์โมมิเตอร์แบบจุ่มทั้งหมด) วางไว้ในบริเวณที่กำ�หนด ตรวจสอบให้อุณหภูมิของฮีทบล็อคสำ�หรับ
ใส่หลอดทดสอบระดับโมเลกุล โดยวิธี Neogen อยู่ที่ 100 ± 1°C
การเตรีียมเครื่่�องมืือสำำ�หรัับทดสอบเชื้้�อก่่อโรคระดัับโมเลกุุลโดยวิิธีี Neogen®
1. เริ่่�มต้้นการใช้้งานซอฟต์์แวร์์ระบบทดสอบเชื้้�อก่่อโรคระดัับโมเลกุุลโดยวิิธีี Neogen แล้้วลงชื่่�อเข้้าสู่่�ระบบ ติิดต่่อตััวแทนของ
Neogen Food Safety ของคุุณเพื่่�อให้้แน่่ใจว่่าคุุณมีีซอฟต์์แวร์์เวอร์์ชัันที่่�อััปเดตล่่าสุุด
2. เปิิดเครื่่�องมืือสำำ�หรัับทดสอบเชื้้�อก่่อโรคระดัับโมเลกุุลโดยวิิธีี Neogen
3. สร้้างหรืือแก้้ไขชุุดการทดสอบที่่�มีีข้้อมููลสำำ�หรัับแต่่ละตััวอย่่าง ดููรายละเอีียดเพิ่่�มเติิมในคู่่�มืือการใช้้งานระบบทดสอบเชื้้�อก่่อโรคระดัับ
โมเลกุุลโดยวิิธีี Neogen
3.1. การเลืือกไอคอน STXEAE-2 ที่่�ซอฟต์์แวร์์ ให้้เลืือกสองหลุุมทดสอบที่่�อยู่่�ติิดกััน (เช่่น A1, A2, B1, B2 เป็็นต้้น) หนึ่่�งหลุุม
สำำ�หรัับหลอดรีีเอเจนต์์ stx และอีีกหลุุมสำำ�หรัับ eae เพราะแต่่ละตััวอย่่างทดสอบด้้วยสองวิิธีี ตั้้�งค่่า NC สำำ�หรัับแต่่ละหลอดรีีเอ
เจนต์์และตั้้�งค่่า RC หนึ่่�งค่่าสำำ�หรัับชุุดทดสอบ
1
SAL-2

A

ECO-2
LIS-2

B

LMO-2
CAM-2

C

CRO-2
STXEAE-2
STX-2
EAE-2
MC-2

D
E
F
G
H

2

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

RC

2 STXEAE
2

NC

STX 2

NC
EAE

หมายเหตุุ: ต้้องรอให้้เครื่่�องมืือสำำ�หรัับทดสอบเชื้้�อก่่อโรคระดัับโมเลกุุลโดยวิิธีี Neogen มีีสถานะพร้้อมใช้้ ก่่อนที่่�จะใส่่ถาดใส่่หลอด
ทดสอบเข้้าเครื่่�องทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุลโดยวิิธีี Neogen ขั้้�นตอนของการทำำ�ความร้้อนนี้้�ใช้้เวลาประมาณ 20 นาทีีและบ่่งชี้้�ด้้วยไฟสีี
ส้้มบนแถบบอกสถานะของเครื่่�อง เมื่่�อเครื่่�องมืือพร้้อมที่่�จะเริ่่�มต้้นการทำำ�งาน แถบบอกสถานะดัังกล่่าวจะเปลี่่�ยนเป็็นสีีเขีียว

การไลซีีส
ใช้้ไขควงไขหรืือไม้้พายถอดด้้านล่่างของที่่�วางสารละลายไลซีีส Neogen ออก ก่่อนวางลงบนฮีีทบล็็อคสำำ�หรัับใส่่หลอดทดสอบระดัับ
โมเลกุุลโดยวิิธีี Neogen6TH (ภาษาไทย)1. รอให้้หลอดสารละลายไลซีีส Neogen อุ่่�นขึ้้�นโดยนำำ�ออกมาวางที่่�อุุณหภููมิิห้้อง (20-25°C) ข้้ามคืืน (16-18 ชั่่�วโมง) ทางเลืือกอื่่�นๆ
นอกเหนืือจากการวางหลอดสารละลายไลซีีส Neogen ไว้้บนโต๊๊ะของห้้องปฏิิบััติิการอย่่างน้้อย 2 ชั่่�วโมง ให้้นำำ�หลอดสารละลายไล
ซีีส Neogen ไปบ่่มในที่่�ตู้้�บ่่มเชื้้�อที่่�อุุณหภููมิิ 37 ± 1°C เป็็นเวลา 1 ชั่่�วโมง หรืือวางหลอดสารละลายไลซีีสบนเครื่่�องทำำ�ความร้้อนแบบ
แห้้งเป็็นเวลา 30 วิินาทีีที่่�อุุณหภููมิิ 100°C
2.	พลิิกหลอดสารละลายไลซีีสที่่�ปิิดฝาอยู่่� เพื่่�อผสมให้้เข้้ากััน ดำำ�เนิินการต่่อในขั้้�นถััดไปไปภายใน 4 ชั่่�วโมง หลัังจากพลิิกหลอดแล้้ว
3.	นำำ�ตััวอย่่างอาหารเพิ่่�มจำำ�นวนเชื้้�อออกจากตู้้�บ่่มเชื้้�อ
4. ใช้้หลอดสารละลายไลซีีส Neogen หนึ่่�งหลอดต่่อตััวอย่่างและต่่อ NC (อาหารเลี้้�ยงเชื้้�อที่่�ปลอดเชื้้�อ)4.1. สามารถตััดแถวของหลอดสารละลายไลซีีส Neogen ออกเพื่่�อให้้มีีจำำ�นวนหลอดตามที่่�ต้้องการได้้ เลืือกจำำ�นวนหลอดหรืือทั้้�ง
แถวคืือ 8 หลอดต่่อแถวตามต้้องการ วางหลอดสารละลายไลซีีส Neogen ลงในที่่�วางงที่่�ว่่างอยู่่�
4.2. เพื่่�อหลีีกเลี่่�ยงการปนเปื้้�อนข้้าม ให้้เปิิดฝาของหลอดสารละลายไลซีีส Neogen ทั้้�งแถวในครั้้�งเดีียว และใช้้ปิิเปตต์์ทิิปอัันใหม่่
สำำ�หรัับถ่่ายตััวอย่่างในแต่่ละขั้้�นตอน
4.3.	ถ่่ายตััวอย่่างที่่�เพิ่่�มจำำ�นวนเชื้้�อแล้้วไปยัังหลอดสารละลายไลซีีส Neogen ตามคำำ�อธิิบายด้้านล่่างนี้้�:ถ่่ายตััวอย่่างที่่�เพิ่่�มจำำ�นวนเชื้้�อแต่่ละตััวอย่่างลงไปในหลอดสารละลายไลซีีส Neogen แต่่ละหลอด เป็็นอัันดัับแรก ถ่่าย NC เป็็น
อัันดัับสุุดท้้าย
4.4. ใช้้อุุปกรณ์์เปิิด/ปิิดฝาหลอดสารละลายไลซีีสโดยวิิธีี Neogen® ในการเปิิดฝาหลอดสารละลายไลซีีส Neogen ทีีละแถว
4.5.	ทิ้้�งฝาหลอดสารละลายไลซีีส Neogen – หากจะเก็็บไลเซตเอาไว้้เพื่่�อทดสอบซ้ำำ�� ให้้วางฝาในภาชนะที่่ส� ะอาดเพื่่�อนำำ�กลัับมาใช้้ซ้ำ�ำ�
4.5.1. หากต้้องการดููข้้อมููลเกี่่ย� วกัับการดำำ�เนิินการเก็็บไลเซต โปรดดููภาคผนวก A
4.6.	ถ่่ายตััวอย่่าง 20 ไมโครลิิตรลงในหลอดสารละลายไลซีีส Neogen

5.	ทำำ�ซ้ำำ��ขั้้�นตอน 4.4 ถึึง 4.6 ตามความจำำ�เป็็นสำำ�หรัับจำำ�นวนตััวอย่่างที่่�จะทดสอบ
6. เมื่่�อถ่่ายตััวอย่่างทั้้�งหมดเสร็็จแล้้ว ให้้ถ่่าย NC (อาหารเพิ่่�มจำำ�นวนเชื้้�อ ที่่�ปลอดเชื้้�อ เช่่น BPW) ปริิมาณ 20 ไมโครลิิตร ลงในหลอด
สารละลายไลซีีส Neogen ห้้ามใช้้น้ำำ��เป็็น NC
7. ตรวจสอบว่่าอุุณหภููมิิของ ของฮีีทบล็็อคสำำ�หรัับใส่่หลอดทดสอบระดัับโมเลกุุล โดยวิิธีี Neogen อยู่่�ที่่� 100 ± 1°C
8.	วางที่่�วางหลอดสารละลายไลซีีส Neogen ที่่�ไม่่มีีฝาปิิด ลงในฮีีทบล็็อคสำำ�หรัับใส่่หลอดทดสอบระดัับโมเลกุุลโดยวิิธีี Neogen และเพิ่่�ม
ความร้้อนเป็็นเวลา 15 ± 1 นาทีี ระหว่่างการทำำ�ให้้ร้้อน สารละลายในหลอดทดสอบไลซีีส Neogen จะเปลี่่�ยนจากสีีชมพูู (เย็็น) เป็็น
เหลืือง (ร้้อน)8.1.	ตััวอย่่างซึ่่�งไม่่ได้้รัับความร้้อนอย่่างเหมาะสมในระหว่่างขั้้�นตอนการไลซีีสของชุุดทดสอบอาจถืือว่่าเป็็นสารที่่�อาจมีีอัันตราย
ทางชีีวภาพ และไม่่ควรใส่่เข้้าไปในเครื่่�องมืือสำำ�หรัับทดสอบเชื้้�อก่่อโรคระดัับโมเลกุุลโดยวิิธีี Neogen
9.	นำำ�ถาดวางหลอดสารละลายไลซีีส Neogen ที่่�ไม่่มีีฝาปิิด ออกจากฮีีทบล็็อคสำำ�หรัับใส่่หลอดทดสอบระดัับโมเลกุุลโดยวิิธีี Neogenและปล่่อยให้้เย็็นลงในชิิลบล็็อคสำำ�หรัับใส่่หลอดทดสอบระดัับโมเลกุุลโดยวิิธีี Neogen อย่่างน้้อย 5 นาทีี แต่่ไม่่เกิิน 10 นาทีี ควรวางชิิลบล็็อคสำำ�หรัับใส่่หลอดทดสอบระดัับโมเลกุุลโดยวิิธีี Neogen ที่่�จะใช้้งานที่่�อุุณหภููมิิห้้อง โดยไม่่มีีถาดวางงชิิลบล็็อคสำำ�หรัับใส่่
หลอดทดสอบระดัับโมเลกุุล โดยวิิธีี Neogen® ลงบนโต๊๊ะในห้้องปฏิิบััติิการโดยตรง เมื่่�อเย็็นลงแล้้ว สารละลายไลซีีส Neogen ก็็จะ
เปลี่่�ยนกลัับเป็็นสีีชมพูู
10.	นำำ�เอาถาดวางหลอดสารละลายไลซีีส Neogen ออกจาก ชิิลบล็็อคสำำ�หรัับใส่่หลอดทดสอบระดัับโมเลกุุล โดยวิิธีี Neogen7TH (ภาษาไทย)00:15:00

99–101 ºC

20–25 ºC

00:05:00

การเพิ่่�มขยาย

1.	ต้้องใช้้หลอดรีีเอเจนต์์ของ Neogen ชุุดทดสอบระดัับโมเลกุุล 2 - STEC Gene Screen (stx) หนึ่่�งหลอดและ Neogen ชุุดทดสอบ
ระดัับโมเลกุุล 2 - STEC Gene Screen (eae) สำำ�หรัับแต่่ละตััวอย่่างและ NC
1.1. สามารถตััดแถวของหลอดออก เพื่่�อให้้มีีจำำ�นวนหลอดตามที่่�ต้้องการได้้ เลืือกจำำ�นวนหลอดรีีเอเจนต์์ของ Neogen ชุุดทดสอบ
เชื้้�อระดัับโมเลกุุล 2 - STEC Gene Screen (stx) และ Neogen ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุล 2 - STEC Gene Screen (eae)แต่่ละหลอด หรืือแถวที่่�มีี 8 หลอด ตามต้้องการ
1.2.	วางหลอด Neogen ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุล 2 - STEC Gene Screen (stx) ลงในที่่�วางหลอดที่่�วางหนึ่่�งคอลััมน์์
1.3.	วางหลอด Neogen ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุล 2 - STEC Gene Screen (eae) ลงในคอลััมน์์ที่่�อยู่่�ติิดกัันด้้านขวา
1.4. หลีีกเลี่่�ยงการรบกวนเม็็ดรีีเอเจนต์์ที่่�ก้้นหลอด
2. เลืือกหลอด Neogen รีีเอเจ้้นท์์คอนโทรลหนึ่่�งหลอดแล้้ววางลงในถาดวาง
3.	สำำ�หรัับไลเซท NC ให้้เลืือกหลอดรีีเอเจนต์์ Neogen ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุล 2 - STEC Gene Screen (stx) หนึ่่�งหลอดและ
Neogen ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุล 2 - STEC Gene Screen (eae) หนึ่่�งหลอดและวางไว้้ในที่่�วางหลอด

4. เพื่่�อหลีีกเลี่่�ยงการปนเปื้้�อนข้้าม ให้้เปิิดฝาของหลอดรีีเอเจนต์์ของ Neogen ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุล 2 - STEC Gene Screen(stx หรืือ eae) ทั้้�งแถวในครั้้�งเดีียว และใช้้ปิิเปตต์์ทิิปอัันใหม่่สำำ�หรัับถ่่ายตััวอย่่างในแต่่ละขั้้�นตอน
5.	ถ่่ายแต่่ละไลเซตไปยัังหลอดรีีเอเจนต์์ของ Neogen ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุล 2 - STEC Gene Screen (stx หรืือ eae) ตามคำำ�
อธิิบายด้้านล่่าง
5.1.	ขั้้�นแรก ถ่่ายไลเซตแต่่ละตััวอย่่างไปยัังหลอดรีีเอเจนต์์ของ Neogen ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุล 2 - STEC Gene Screen(stx) ตามคำำ�อธิิบายด้้านล่่างไว้้ใน 5.5 และ 5.6
5.2.	ขั้้�นที่่�สอง ถ่่ายไลเซตแต่่ละตััวอย่่างไปยัังหลอดรีีเอเจนต์์ของ Neogen ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุล 2 - STEC Gene Screen(eae) ในคอลััมน์์ด้้านขวาที่่�อยู่่�ติิดกัันตามคำำ�อธิิบายด้้านล่่างไว้้ใน 5.5 และ 5.6
หมายเหตุุ: ใช้้ปิิเปตต์์ทิิปอัันใหม่่สำำ�หรัับการถ่่ายตััวอย่่างในแต่่ละครั้้�ง ห้้ามใช้้ปิิเปตต์์ทิิปอัันเดีียวกัันในการถ่่ายตััวอย่่างไลเซต
เดีียวกัันไปยัังหลอดรีีเอเจนต์์ stx และ eae
5.3. หลัังการถ่่ายโอนตััวอย่่างไลเซททั้้�งหมด ให้้เติิมไลเซท NC ลงไปในแต่่ละหลอดรีีเอเจนต์์ Neogen ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับ
โมเลกุุล 2 - STEC Gene Screen (stx) และ Neogen ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุล 2 - STEC Gene Screen (eae)5.4.	ถ่่ายโอนไลเซต NC ลงในรีีเอเจนต์์คอนโทรลเป็็นขั้้�นสุุดท้้าย

8

TH (ภาษาไทย)5.5. ใช้้เครื่่�องมืือเปิิด/ปิิดฝารีีเอเจนต์์ของชุุดทดสอบเชื้้�อก่่อโรคระดัับโมเลกุุลโดยวิิธีี Neogen® ในการเปิิดหลอดรีีเอเจนต์์ของ
Neogen ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุล 2 - STEC Gene Screen (stx หรืือ eae) ทีีละแถว ทิ้้�งฝาปิิด
5.6.

ถ่่ายไลเซตของตััวอย่่างปริิมาณ 20 ไมโครลิิตร จากด้้านบน ½ ของของเหลว (หลีีกเลี่่ย� งตะกอน) ในหลอดสารละลาย
ไลซีีส Neogen เข้้าไปในหลอดรีีเอเจนต์์ของ Neogen ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุล 2 - STEC Gene Screen (stx หรืือ eae) ที่่�
ตรงกััน ปล่่อยสารละลายด้้านข้้างหลอด เพื่่�อหลีีกเลี่่ย� งการรบกวนเม็็ดรีีเอเจนต์์ที่ก้่� น้ หลอด ผสมโดยใช้้ปิเิ ปต ดููดขึ้้�นและลงเบาๆ 5 ครั้้�ง

หมายเหตุุ: ใช้้ปิิเปตต์์ทิิปอัันใหม่่สำำ�หรัับการถ่่ายตััวอย่่างในแต่่ละครั้้�ง ห้้ามใช้้ปิิเปตต์์ทิิปอัันเดีียวกัันในการถ่่ายตััวอย่่างไลเซต
เดีียวกัันไปยัังหลอดรีีเอเจนต์์ stx และ eae
5.7.	ทำำ�ซ้ำำ��ขั้้�นตอนที่่� 5.6 จนกว่่าจะเติิมแต่่ละไลเซตตััวอย่่างลงไปในหลอดรีีเอเจนต์์ของ Neogen ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุล
2 - STEC Gene Screen (stx หรืือ eae) ในแถวนั้้�น
5.8.	ปิิดหลอดรีีเอเจนต์์ของ Neogen ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุล 2 - STEC Gene Screen (stx หรืือ eae) ด้้วยฝาอีีกอัันที่่�ให้้มา
และใช้้ด้้านมนของเครื่่�องมืือเปิิด/ปิิดฝาหลอดทดสอบ โดยวิิธีี Neogen กดซ้ำำ��ไปซ้ำำ��มาเพื่่�อให้้แน่่ใจว่่าฝาปิิดสนิิท
5.9.	ทำำ�ซ้ำำ��ขั้้�นตอน 5.6 ถึึง 5.8 ตามความจำำ�เป็็นสำำ�หรัับจำำ�นวนตััวอย่่างที่่�จะทดสอบสำำ�หรัับหลอดรีีเอเจนต์์ Neogen ชุุดทดสอบเชื้้�อ
ระดัับโมเลกุุล 2 - STEC Gene Screen (stx และ eae) ทั้้�งสองหลอด
5.10. เมื่่�อถ่่ายไลเซตตััวอย่่างทั้้�งหมดแล้้ว ให้้ทำำ�ซ้ำำ��ขั้้�นตอนที่่� 5.6 ถึึง 5.8 เพื่่�อถ่่ายไลเซต NC ปริิมาณ 20 ไมโครลิิตร เข้้าไปใน
แต่่ละหลอดรีีเอเจนต์์ของ Neogen ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุล 2 - STEC Gene Screen (stx) และ Neogen ชุุดทดสอบเชื้้�อ
ระดัับโมเลกุุล 2 - STEC Gene Screen (eae)5.11.	ถ่่ายไลเซต
ไลเซต NC ปริิมาณ 20 ไมโครลิิตร เข้้าไปในหลอด Neogen รีีเอเจนต์์คอนโทรล ปล่่อยสารละลายด้้านข้้างหลอด เพื่่�อ
หลีีกเลี่่�ยงการรบกวนเม็็ดรีีเอเจนต์์ที่่�ก้้นหลอด ผสมโดยใช้้ปิิเปต ดููดขึ้้�นและลงเบาๆ 5 ครั้้�ง
ถ่่ายไลเซตของแต่่ละตััวอย่่างไปยัังหลอดรีีเอเจนต์์ของ Neogen ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุล 2 - STEC Gene Screen (stxหรืือ eae) แต่่ละชุุดก่่อนแล้้วจึึงถ่่าย NC เติิมสารละลายลงในหลอด Neogen รีีเอเจนต์์คอนโทรลเป็็นลำำ�ดัับสุุดท้้าย
6. บรรจุุหลอดที่่�ปิิดฝาแล้้วลงในถาดใส่่หลอดทดสอบสำำ�หรัับเข้้าเครื่่�องทดสอบระดัับโมเลกุุลโดยวิิธีี Neogen ที่่�สะอาดและขจััดการปน
เปื้้�อนแล้้ว จากนั้้�นปิิดและล็็อกฝาถาด

9

TH (ภาษาไทย)7. พิิจารณาทบทวนและยืืนยัันการดำำ�เนิินการที่่�กำำ�หนดค่่าไว้้ในซอฟต์์แวร์์ระบบทดสอบเชื้้�อก่่อโรคระดัับโมเลกุุลโดยวิิธีี Neogen
8.	คลิิกปุ่่�ม Start ในซอฟต์์แวร์์ แล้้วเลืือกเครื่่�องมืือที่่�จะใช้้ทดสอบ ฝาปิิดของอุุปกรณ์์ที่่�เลืือกจะเปิิดโดยอััตโนมััติิ
9. ใส่่ถาดใส่่หลอดทดสอบสำำ�หรัับเข้้าเครื่่�องทดสอบระดัับโมเลกุุลโดยวิิธีี Neogen ในเครื่่�องมืือสำำ�หรัับทดสอบเชื้้�อก่่อโรคระดัับโมเลกุุล
โดยวิิธีีNeogen แล้้วปิิดฝาเพื่่�อเริ่่�มต้้นการทดสอบ ระบบจะให้้ผลการทดสอบภายในเวลา 60 นาทีี แม้้ว่่าผลที่่�เป็็นบวกอาจจะตรวจจัับ
ได้้เร็็วกว่่านั้้�นก็็ตาม
10. หลัังจากการทดสอบเสร็็จสมบููรณ์์แล้้ว ให้้นำำ�ถาดใส่่หลอดทดสอบสำำ�หรัับเข้้าเครื่่�องทดสอบระดัับโมเลกุุลโดยวิิธีี Neogen ออกจาก
เครื่่�องมืือสำำ�หรัับทดสอบเชื้้�อก่่อโรคระดัับโมเลกุุลโดยวิิธีี Neogen แล้้วกำำ�จััดหลอดเหล่่านั้้�นทิ้้�งโดยแช่่ในน้ำำ��ยาฟอกขาวที่่�ใช้้ในครััว
เรืือนที่่�มีีความเข้้มข้้น 1-5% (ในน้ำำ��ที่่�มีีปริิมาตรเท่่ากััน) นาน 1 ชั่่�วโมง และปฏิิบััติิให้้ห่่างจากพื้้�นที่่�จััดเตรีียมชุุดทดสอบ
ข้้อสัังเกต:เกต เพื่่�อลดความเสี่่�ยงในการได้้ผลบวกปลอมอัันเนื่่�องมาจากการปนเปื้้�อนข้้าม ห้้ามเปิิดหลอดรีีเอเจนต์์ซึ่่�งบรรจุุ DNA ที่่�เพิ่่�มขยาย
แล้้ว ซึ่่�งรวมถึึงหลอดรีีเอเจนต์์ของ Neogen ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุล 2 - STEC Gene Screen (stx และ eae) หลอด Neogen รีีเอ
เจนต์์คอนโทรลและหลอดเมทริิกซ์์คอนโทรล Neogen กำำ�จััดทิ้้�งหลอดรีีเอเจนต์์ที่่�ปิิดฝาแล้้วทุุกครั้้�งโดยล้้างในสารซัักฟอกในครััวเรืือน
ความเข้้มข้้น 1-5% (ต่่อปริิมาตรน้ำำ��) เป็็นเวลา 1 ชั่่�วโมง และห่่างจากบริิเวณเตรีียมการทดสอบ

ผลการทดสอบและการแปลความหมาย

อััลกอริิธึึมจะแปลความหมายเส้้นโค้้งของแสงที่่�ส่่งออกมาอัันเป็็นผลมาจากการตรวจพบการเพิ่่�มขยายของกรดนิิวคลีีอิิก ซอฟต์์แวร์์จะ
วิิเคราะห์์ผลการทดสอบนี้้�โดยอััตโนมััติิและจะมีีการเข้้ารหััสสีีตามผลที่่�ได้้ดัังกล่่าว ผลการทดสอบที่่�ให้้ค่่าเป็็นบวกหรืือลบจะพิิจารณาตััดสิิน
โดยการวิิเคราะห์์พารามิิเตอร์์ของเส้้นโค้้งที่่�มีีลัักษณะเฉพาะตััวจำำ�นวนหนึ่่�ง ผลการทดสอบเบื้้�องต้้นที่่�เป็็นบวกจะมีีการรายงานในทัันทีี
ขณะที่่�ผลที่่�เป็็นลบและผลที่่�น่่าสงสััยจะแสดงผลภายหลัังการทดสอบเสร็็จสมบููรณ์์แล้้ว
ซอฟต์์แวร์์ระบบทดสอบเชื้้�อก่่อโรคระดัับโมเลกุุลโดยวิิธีี Neogen® รายงานผลการทดสอบแยกกัันสำำ�หรัับแต่่ละวิิธีีทดสอบ (stx และ eae)และใช้้ผลการทดสอบจากทั้้�งสองวิิธีีทดสอบเพื่่�อสรุุปว่่าผลตััวอย่่างเป็็นบวกหรืือเป็็นลบสำำ�หรัับ STEC (EHEC) (ดููรููปภาพด้้านล่่าง) สำำ�หรัับ
ผล STEC (EHEC) ที่่�เป็็นบวกในเบื้้�องต้้นสำำ�หรัับยีีนเป้้าหมายทั้้�งสองชนิิด (stx1 และ/หรืือ stx2 และ eae) ผลการทดสอบต้้องเป็็นบวก
หากวิิธีีทดสอบใดแสดงผลการทดสอบผิิดพลาดหรืือผลการที่่�น่่าสงสััย ผลการทดสอบในขั้้�นสุุดท้้ายจะเป็็นผลการทดสอบผิิดพลาดหรืือผล
ที่่�น่่าสงสััย จำำ�เป็็นต้้องมีีการทดสอบซ้ำำ��เพื่่�อให้้ได้้ผลการทดสอบในขั้้�นสุุดท้้ายที่่�ถููกต้้อง (ดููคู่่�มืืออ่่านผล) ซอฟต์์แวร์์ยัังอนุุญาตให้้ตั้้�งค่่าใน
แต่่ละวิิธีีทดสอบได้้ หากจำำ�เป็็น และตััวอย่่างหรืือไลเซตใหม่่จากการเพิ่่�มจำำ�นวนเชื้้�อสามารถทดสอบซ้ำำ��ด้้วยขั้้�นตอนในอัันดัับถััดไปของวิิธีี
ทดสอบดัังที่่�แสดงไว้้ในภาคผนวก A สำำ�หรัับไลเซตที่่�เก็็บไว้้ และส่่วนขั้้�นตอนภายใต้้การไลซีีสและการเพิ่่�มขยายจำำ�นวนสำำ�หรัับการเพิ่่�ม
จำำ�นวนเชื้้�อที่่�เก็็บไว้้

คู่่�มืืออ่่านผลตััวอย่่างไลเซตที่่�เพิ่่�มจำำ�นวนเชื้้�อ
+ +2 + เป็ นบวกทัง� คู,่ ผลลัพธ์สดุ ท ้ายเป็ นบวก2
+ -2 – stx เป็ นบวก, eae เป็ นลบ, ผลลัพธ์สดุ ท ้ายเป็ นลบ2+ ?2 ? stx เป็ นบวก, ตรวจสอบ eae, ตรวจสอบผลลัพธ์สดุ ท ้าย, ทดสอบใหม่2+ 2
stx เป็ นบวก, eae ผิดพลาด, ผลลัพธ์สดุ ท ้ายผิดพลาด, ทดสอบใหม่
2– -2 + stx เป็ นลบ, eae เป็ นบวก, ผลลัพธ์สดุ ท ้ายเป็ นลบ2– -2 – stx เป็ นลบ, eae เป็ นลบ, ผลลัพธ์สดุ ท ้ายเป็ นลบ2– ?2 ? stx เป็ นลบ, ตรวจสอบ eae, ตรวจสอบผลลัพธ์สดุ ท ้าย, ทดสอบใหม่2– 2
stx เป็ นลบ, eae ผิดพลาด, ผลลัพธ์สดุ ท ้ายผิดพลาด, ทดสอบใหม่
2? ?2 + ตรวจสอบ stx, eae เป็ นบวก, ตรวจสอบผลลัพธ์สดุ ท ้าย, ทดสอบใหม่
2? ?2 – ตรวจสอบ stx, eae เป็ นลบ, ตรวจสอบผลลัพธ์สดุ ท ้าย, ทดสอบใหม่
2
STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

? ?2 ?
2

EAEตรวจสอบ stx, ตรวจสอบ eae, ตรวจสอบผลลัพธ์สดุ ท ้าย, ทดสอบใหม่

?

STX
STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

stx ผิดพลาด, eae เป็ นบวก, ผลลัพธ์สดุ ท ้ายผิดพลาด, ทดสอบใหม่

2

STX

+
–
2

ตรวจสอบ stx, eae ผิดพลาด, ผลลัพธ์สดุ ท ้ายผิดพลาด, ทดสอบใหม่

EAE

stx ผิดพลาด, eae เป็ นลบ, ผลลัพธ์สดุ ท ้ายผิดพลาด, ทดสอบใหม่

2

STX

2

?

EAE

stx ผิดพลาด, ตรวจสอบ eae, ผลลัพธ์สดุ ท ้ายผิดพลาด, ทดสอบใหม่

2

STX

2

EAE

stx ผิดพลาด, eae ผิดพลาด, ผลลัพธ์สดุ ท ้ายผิดพลาด, ทดสอบใหม่

2

10

TH (ภาษาไทย)คู่่�มืือผลควบคุุมผลลบ
2
2
2
2
2
2

NC
STX

NC
STX

NC
STX

NC
STX

NC
STX

NC
STX

2
2
2
2
2
2

NC
EAE

NC
EAE

NC
EAE

NC
EAE

NC
EAE

NC
EAE

ไม่ถก
ู ต ้องทัง� สองจุด, ลิงก์ถกู ต ้อง
ถูกต ้องหนึง� จุด, จุดอืน� ผิดพลาด, ลิงก์ผดิ พลาด, ทดสอบใหม่
ถูกต ้องหนึง� จุด, จุดอืน� ไม่ถกู ต ้อง, ลิงก์ไม่ถกู ต ้อง, ทดสอบใหม่
ผิดพลาดทัง� สองจุด, ลิงก์ผดิ พลาด, ทดสอบใหม่ไม่ถกู ต ้องทัง� สองจุด, ลิงก์ไม่ถกู ต ้อง, ทดสอบใหม่
ผิดพลาดหนึง� จุด, จุดอืน� ไม่ถกู ต ้อง, ลิงก์ผดิ พลาด, ทดสอบใหม่

ตััวอย่่างที่่�สัันนิิษฐานว่่าเป็็นบวกควรได้้รัับการยืืนยัันตามขั้้�นตอนการปฏิิบััติิการตามมาตรฐานทางห้้องปฏิิบััติิการ หรืือโดยปฏิิบััติิตามการ
ยืืนยัันวิิธีีการอ้้างอิิงที่่�เหมาะสม(1, 2, 3) เริ่่�มต้้นด้้วยการถ่่ายอาหารเลี้้�ยงเชื้้�อสำำ�หรัับเพิ่่�มจำำ�นวนเชื้้�อปฐมภููมิิไปยัังเพลทอาหารเลี้้�ยงเชื้้�อแบบ
จำำ�เพาะ การยืืนยัันการแยกเชื้้�อโดยใช้้วิิธีีการทางชีีวเคมีีและเซรุ่่�มวิิทยาที่่�เหมาะสม สำำ�หรัับเมทริิกซ์์ที่่�กำำ�หนดโดย MLG 5C, เทคนิิค
Immunomagnetic Separation (IMS) ควรดำำ�เนิินการก่่อนการนำำ�ตััวอย่่างไปเพาะเชื้้�อบนอาหารเลี้้�ยงเชื้้�อแบบจำำ�เพาะ
หมายเหตุุ: ตััวอย่่างที่่�ให้้ผลเป็็นลบค่่าแสงที่่�อ่่านได้้ก็็ไม่่ได้้มีีค่่าเป็็นศููนย์์ เนื่่�องจากระบบและรีีเอเจนต์์ในการเพิ่่�มขยายสำำ�หรัับ Neogen ชุุดทดสอบเชื้้�อระดัับโมเลกุุล 2 - STEC Gene Screen (stx และ eae) จะมีี “ค่่าพื้้�นหลััง” ในหน่่วย Relative Light Unit (RLU)
ในบางครั้้�งอาจพบว่่าแสงที่่�ได้้จากปฏิิกิิริิยานั้้�นมีีลัักษณะผิิดปกติิ อััลกอริิธึึมดัังกล่่าวจะถููกตีีความออกมาว่่าเป็็นผลที่่�น่่าสงสััย บริิษััท
Neogen แนะนำำ�ให้้ผู้้�ใช้้ทำำ�การทดสอบซ้ำำ��สำำ�หรัับตััวอย่่างที่่�ให้้ผลที่่�น่่าสงสััย หากผลการทดสอบยัังคงเป็็นที่่�น่่าสงสััย ให้้ทำำ�การทดสอบเพื่่�อ
ยืืนยััน โดยใช้้วิิธีีการตามที่่�ต้้องการ(1, 2, 3) หรืือตามที่่�ระบุุโดยหน่่วยงานกฎระเบีียบในประเทศ
ตารางที่่� 4 สััญลัักษณ์์และข้้อมููลสำำ�หรัับผลการทดสอบจากซอฟท์์แวร์์
ประเภทของ สััญลัักษณ์์ผลการตรวจ
ผลการตรวจ
หลุุมทดสอบ ที่่ไ� ด้้จากหลุุมทดสอบ
ตััวอย่่าง
ตััวอย่่าง

+–ตััวอย่่าง

ตััวอย่่าง

?

ตััวอย่่าง

การแปลผลการตรวจวิิเคราะห์์

บวกตััวอย่่างนี้้�ในเบื้้�องต้้นให้้ผลเป็็นบวกสำำ�หรัับเชื้้�อก่่อโรคเป้้าหมาย

ลบตััวอย่่างนี้้�ให้้ผลเป็็นลบสำำ�หรัับเชื้้�อก่่อโรคเป้้าหมาย

ถููกยัับยั้้�ง

เมทริิกซ์์ตััวอย่่างนี้้�มีีลัักษณะยัับยั้้�งต่่อการตรวจวิิเคราะห์์ อาจจำำ�เป็็นต้้องทำำ�การ
ทดสอบซ้ำำ�� สำำ�หรัับข้้อมููลเพิ่่�มเติิม โปรดดููในส่่วนหััวข้้อการแก้้ไขปััญหาและคำำ�
แนะนำำ�การใช้้งานผลิิตภััณฑ์์ของชุุดทดสอบ

ตรวจสอบ

มีีความคลุุมเครืือไม่่แน่่ชััดเกี่่�ยวกัับการมีีอยู่่�หรืือไม่่มีีอยู่่�ของเชื้้�อก่่อโรคเป้้าหมาย
อาจจำำ�เป็็นต้้องทำำ�การทดสอบซ้ำำ�� สำำ�หรัับข้้อมููลเพิ่่�มเติิม โปรดดููในส่่วนหััวข้้อ
การแก้้ไขปััญหาและคำำ�แนะนำำ�การใช้้งานผลิิตภััณฑ์์ของชุุดทดสอบ

ข้้อผิิดพลาด

ไม่่ตรวจพบการเรืืองแสงทางชีีวภาพ อาจจำำ�เป็็นต้้องทำำ�การทดสอบซ้ำำ�� สำำ�หรัับ
ข้้อมููลเพิ่่�มเติิม โปรดดููในส่่วนหััวข้้อการแก้้ไขปััญหาและคำำ�แนะนำำ�การใช้้งาน
ผลิิตภััณฑ์์ของชุุดทดสอบ

ภาคผนวก A การหยุุดการทดสอบชั่่�วคราว: การจััดเก็็บตััวอย่่างและการทดสอบซ้ำำ��

1. หากต้้องการเก็็บไลเซตที่่�ผ่่านความร้้อนมาแล้้ว ให้้ปิิดฝาหลอดสารละลายไลซีีส Neogen ด้้วยฝาที่่�สะอาด (ดููไลซีีสส่่วนที่่� 4.5)
2. หากต้้องการจััดเก็็บตััวอย่่างที่่�ได้้เพิ่่�มจำำ�นวนเชื้้�อแล้้ว ให้้บ่่มเชื้้�อไว้้เป็็นเวลาอย่่างน้้อย 18 ชั่่�วโมงก่่อนการจััดเก็็บ
3. เก็็บไว้้ที่่�อุุณหภููมิิ 4 ถึึง 8°C ไม่่เกิิน 72 ชั่่�วโมง
4. เตรีียมตััวอย่่างที่่�เก็็บไว้้ โดยพลิิกหลอดสารละลายไลซีีสไปมา 2-3 ครั้้�งเพื่่�อผสมตััวอย่่างให้้เข้้ากััน
5. เปิิดฝาหลอด
6. ใส่่หลอดไลเซตที่่�ผสมตััวอย่่างเข้้ากัันแล้้วลงในฮีีทบล็็อคสำำ�หรัับใส่่หลอดทดสอบระดัับโมเลกุุล โดยวิิธีี Neogen และให้้ความร้้อนที่่�
100 ± 1°C เป็็นเวลา 5 ± 1 นาทีี
7.	นำำ�ที่่�วางหลอดสารละลายไลซีีส Neogen ออกจากฮีีทบล็็อคสำำ�หรัับใส่่หลอดทดสอบระดัับโมเลกุุลโดยวิิธีี Neogen และปล่่อยให้้เย็็น
ลงในชิิลบล็็อคสำำ�หรัับใส่่หลอดทดสอบระดัับโมเลกุุลโดยวิิธีี Neogen อย่่างน้้อย 5 นาทีีแต่่ไม่่เกิิน 10 นาทีี
8.	ดำำ�เนิินการทดสอบขั้้�นต่่อไปในส่่วนการเพิ่่�มขยายจำำ�นวนตามรายละเอีียดข้้างต้้น

11

TH (ภาษาไทย)เอกสารอ้้างอิิง:1. Microbiology Laboratory Guidebook. U. S. Department of Agriculture (USDA) Food Safety and Inspection Service(FSIS) Microbiology Laboratory guidebook 5C.00. Detection and isolation of top seven Shiga toxin-producing
Escherichia coli (STECs) from meat products and carcass and environmental sponges. Feb 4, 2019.
2. US Food and Drug Administration Bacteriological Analytical Manual. Chapter 4A: Diarrheagenic Escherichia coli.
October 2018.
3. ISO/TS 13136:2012: Microbiology of food and animal feed — Real-time polymerase chain reaction (PCR)-based
method for the detection of food-borne pathogens — Horizontal method for the detection of Shiga toxin-producing
Escherichia coli (STEC) and the determination of O157, O111, O26, O103 and O145 serogroups
4. U.S. Food and Drug Administration. Code of Federal Regulations, Title 21, Part 58. Good laboratory practice fornonclinical laboratory studies.
5. ISO/IEC 17025. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories.
6. ISO 7218. Microbiology of food and animal feeding stuffs – General rules for microbiological examination.
7. Neogen Installation Qualification (IQ) / Operational Qualification (OQ) Protocols and Instructions for Neogen
Molecular Detection System. โปรดติิดต่่อตััวแทนของ Neogen Food Safety เพื่่�อรัับเอกสารนี้้�

คำำ�อธิิบายสััญลัักษณ์์

info.neogen.com/symbols

12Neogen Food Safety
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620 Lesher Place
Lansing, MI 48912 USA
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Ayr, KA6 5HU
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Toutes les autres marques decommerce appartiennent à leur propriétaire respectif.
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KO （한국어）발행일: 2024-01

Molecular Detection Assay 2 - 장출혈성 대장균 (EHEC)제품 설명서제품 설명 및 용도

Neogen® Molecular Detection Assay 2 - 장출혈성대장균 (EHEC) 은 증균된 식품과 식품 공정 환경 시료에 포함된 시가 독소 생성
대장균(STEC, ‘베로독소 생성 대장균’이라고도 함)에서 시가 독소 유전자(stx1 및 stx2)와 병원성 유전자(eae)를 빠르고 특이적으로
검출하기 위해 Neogen® Molecular Detection System과 함께 사용됩니다. STEC는 stx1 및 stx2 유전자로 각각 부호화된 시가 독소유형 1(Stx1), 유형 2(Stx2) 또는 두 유형 모두를 생성할 수 있는 병원성 대장균을 지칭합니다. stx1 및/또는 stx2와 eae(표현형에붙고 떨어지는 데 관여하는 병원성 유전자)에 대한 독성 유전자를 포함하는 STEC는 장출혈성 대장균(EHEC)으로 지정됩니다. 검사키트에는 STEC(EHEC)에서 독소 유전자 stx1 및/또는 stx2를 검출하는 시약 튜브와 eae를 검출하는 시약 튜브가 포함되어 있습니다.
Neogen® Molecular Detection System 소프트웨어는 각 시험에 대한 결과를 분리 보고하고 두 시험의 결과를 사용하여 시료가
STEC(EHEC)에 대해 양성인지 혹은 음성인지 판단합니다. EHEC에 대해 양성으로 추정되는 경우, 두 유전자 대상(stx1 및/또는 stx2
및 eae) 모두 양성이어야 합니다. stx 시험은 stx1과 stx2를 구별하지 않으며 stx1 및/또는 stx2의 존재만 감지합니다.

Neogen Molecular Detection Assay 키트는 고리 매개 등온 증폭 방식으로 증폭 감지를 위한 생체발광이 결합되어, 높은 특이성과민감도를 가진 핵산 염기 서열을 빠르게 증폭시킵니다. 추정 양성 결과는 실시간으로 보고되는 반면, 음성 결과는 시험이 완료된 후표시됩니다. 추정 양성 결과는 원하는 방법(1, 2, 3)을 사용하거나 현지 규정에 지정된 대로 확인되어야 합니다.
Neogen Molecular Detection Assay 2 - 장출혈성 대장균 (EHEC)은 실험 기법에 대해 적절한 교육을 받은 전문가들이 실험실환경에서 사용하도록 고안되었습니다. Neogen은 식품이나 음료가 아닌 다른 산업에서의 이 제품 사용을 문서화하지 않았습니다.
즉, Neogen은 약품, 화장품, 임상 또는 수의학 시료 시험에 대해서는 이 제품을 문서화하지 않았습니다. Neogen Molecular
Detection Assay 2 - 장출혈성 대장균 (EHEC)은 가능한 모든 식품 완제품, 식품 공정, 시험 프로토콜 또는 가능한 모든 박테리아종에 평가되지는 않았습니다.
모든 시험 방법처럼 증균 배지의 원료, 제조법 및 특성은 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 시료 추출 방법, 검사 계획서, 시료준비, 조작 및 실험 기법 또한 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. Neogen은 충분한 수의 특정 식품과 미생물 유발 시험을 이용하여사용자의 환경에서 사용자의 기준을 충족하는지 확인하기 위해 증균 배지를 포함한 해당 방법의 평가를 권장합니다.

Neogen은 Neogen Molecular Detection Assay 2 - 장출혈성 대장균 (EHEC)은 펩톤완충수(BPW)-ISO를 증균액으로 사용하여평가했습니다.

Neogen® Molecular Detection 장비는 시료에 있는 유기체를 파괴하기 위한 Lysis 단계 중에 열처리를 거친 시료와 함께 사용하기위한 것입니다. Lysis 단계 동안 적절하게 열처리가 되지 않은 시료는 잠재적인 생물학적 위험으로 간주되므로 Neogen Molecular
Detection 장비에 절대로 삽입하지 마십시오.
Neogen Food Safety는 설계 및 제조에 관한 ISO(International Organization for Standardization) 9001 인증을 받았습니다.

Neogen Molecular Detection Assay 2 - 장출혈성 대장균 (EHEC) 시험 키트에는 표 1에 설명된 바와 같이 각 stx 및 eae 시약에대한 48회 시험분이 포함되어 있습니다.
표 1. Neogen Molecular Detection Assay키트 구성요소.
항목

Neogen® Lysis Solution(LS)Neogen® Molecular
Detection Assay 2 - 시가독소생성 대장균 (STEC)(stx)
Reagent 튜브ID투명한 튜브의분홍색 용액

수량

96개(8개들이 튜브 12개
스트립)

목차

튜브당 580μL의 LS설명랙에 꽂혀 있고바로 사용 가능함주황색 튜브

48개(8개들이 튜브 3개동결 건조된 특정 증폭 및스트립이 들어있는 파우치 2개) 검출 혼합물바로 사용 가능함Neogen® Molecular
Detection Assay 2 - 시가독소생성 대장균 (STEC)(eae)
Reagent 튜브적색 튜브

48개(8개들이 튜브 3개동결 건조된 특정 증폭 및스트립이 들어있는 파우치 2개) 검출 혼합물바로 사용 가능함

예비 캡

적색 캡

96개(8개들이 캡 12개 스트립)바로 사용 가능함

예비 캡

주황색 캡

96개(8개들이 캡 12개 스트립)Neogen® Reagent 컨트롤(RC)투명 플립톱
튜브

16개(8개들이 개별 튜브 2개파우치)1

바로 사용 가능함동결 건조된 컨트롤 DNA,바로 사용 가능함증폭 및 검출 혼합물

KO （한국어）키트에 제공되지 않은 음성(NC) 대조군은 멸균 증균 배지(예: BPW-ISO)입니다. 물을 NC로 사용하지 마십시오.
빠른 시작 안내서는 www.neogen.com에서 확인할 수 있습니다.

안전사용자는 Neogen Molecular Detection System 및 Neogen Molecular Detection Assay 2 - 장출혈성 대장균 (EHEC) 과 관련된지침의 안전 정보 일체를 숙지하고 따라야 합니다. 나중에 참조할 수 있도록 안전 지침을 보관하십시오.
경고: 피하지 못할 경우 사망이나 심각한 부상 및/또는 재산상의 손해를 초래할 수 있는 위험 상황을 의미합니다.
주의: 피하지 못할 경우 재산상의 피해를 초래할 수 있는 잠재적으로 위험한 상황을 의미합니다.

경고인간 또는 동물의 상태를 진단하는 데 Neogen Molecular Detection Assay 2 - 장출혈성 대장균 (EHEC) 을 사용해서는 안됩니다.

사용자는 반드시 적절한 최신 시험 기법의 적용에 있어 담당 직원의 교육을 실시해야 합니다. 예: 우수 실험실 기준(4), ISO/IEC
17025(5), 또는 ISO 7218(6).

오염된 제품의 출고를 초래하는 위음성 결과와 관련된 위험을 줄이려면:• 계획서를 준수하고 제품 설명서에 명시된 대로 정확하게 시험을 수행하십시오.
• Neogen Molecular Detection Assay 2 - 장출혈성 대장균 (EHEC) 을 보관할 때는 포장 및 제품 설명서에 명시된 바를따릅니다.
• Neogen Molecular Detection Assay 2 - 장출혈성 대장균 (EHEC) 은 유효 기간까지만 사용해야 합니다.
• Neogen Molecular Detection Assay 2 - 장출혈성 대장균 (EHEC) 은 내부 또는 제3자가 검증한 식품 및 환경 시료와 함께사용하십시오.
• Neogen Molecular Detection Assay 2 - 장출혈성 대장균 (EHEC) 에는 내부적으로 또는 제3자가 검증한 표면, 살균제,프로토콜 및 박테리아 종만 사용하십시오.
• 아릴설포네이트 화합물이 포함된 Neutralizing Buffer를 함유하는 환경 시료의 경우 시험하기 전에 1:2로 희석하십시오(시료 1을 동량의 멸균 증균액 1에 넣음). Neutralizing Buffer 증균액 10µL를 Neogen Lysis Solution 튜브로 옮기는 방법도 있습니다.
아릴설포네이트 화합물과 함께 Neutralizing Buffer를 함유하는 Neogen® 시료 채취 제품: RS96010NB, RS9604NB,
SSL10NB, SSL10NB2G, HS10NB, HS10NB2G 및 HS2410NB2G.
화학물질 및 생물학적 유해 물질 노출 관련 위험을 줄이려면:• 교육을 받은 사람의 통제하에 적절하게 준비된 실험실에서 식중독균 시험을 수행하십시오. 배양된 증균 배지 및 장비 또는배양된 증균 배지에 접촉한 표면에는 인체 건강에 위험을 초래할 수 있을 정도의 식중독균이 들어있을 수 있습니다.
• 시약 및 오염된 시료를 다룰 때는 적절한 보호복과 보안경 착용을 비롯하여 항상 표준 실험실 안전 방침을 준수하십시오.
• 증폭 후 증균 배지 및 Reagent 튜브의 내용물과 접촉하지 않도록 하십시오.
• 증균 시료는 현행 지역/국가/규제 표준에 따라 폐기하십시오.
• Lysis 단계 동안 적절하게 열처리가 되지 않은 시료는 잠재적인 생물학적 위험으로 간주되므로 Neogen Molecular Detection장비에 절대로 삽입하지 마십시오.
시험을 준비하는 동안 교차 오염과 관련된 위험을 줄이려면:• (사용자를 보호하고 뉴클레아제의 침투를 막기 위해) 항상 장갑을 착용해야 합니다.

뜨거운 액체에 노출된 경우 가능한 위험을 줄이려면:• 권장 가열 온도를 초과하지 마십시오.
• 권장 가열 시간을 초과하지 마십시오.
• 적절하게 교정된 온도계를 사용하여 Neogen® 분자 검출 히팅 블록 인서트 온도를 확인하십시오(예: 부분 침지 온도계 또는디지털 열전대 온도계. 전체 침지 온도계는 안됨). 온도계는 반드시 Neogen Molecular Detection 히팅 블록 인서트의 지정된장소에 놓아야 합니다.

주의시험을 준비하는 동안 교차 오염과 관련된 위험을 줄이려면:• Reagent 펠릿 수화 전에 장갑을 교체하십시오.
• 미세입자를 차단하는 (필터 사용) 멸균된 분자 생물학 등급의 피펫 팁을 이용하는 것이 좋습니다.
• 각 시료 이동 시 새 피펫 팁을 사용하십시오.
• 우수 실험실 관리기준을 적용하여 증균된 시료를 Lysis 튜브로 옮기십시오. 피펫 오염을 방지하려면 중간 분주 단계를 추가해야할 수도 있습니다. 예를 들어 사용자는 증균된 각 시료를 멸균 튜브로 옮길 수 있습니다.
• 해당되는 경우 살균 램프가 있는 분자생물학 워크스테이션을 사용하십시오.
• 주기적으로 1~5%(v:v 물) 가정용 표백제 또는 DNA 제거 용액으로 실험실 벤치와 장비(피펫, 캡/디캡 도구 등)의 오염을제거하십시오.
2

KO （한국어）위양성 결과가 발생할 위험을 줄이려면:• 증폭 후에는 절대 Reagent 튜브를 열지 마십시오.
• 오염된 튜브는 항상 1~5%(v:v 물)의 가정용 표백제에 1시간 동안 담가두었다가 키트 준비 구역과 멀리 떨어진 위치에폐기합니다.
• 증폭 후 Reagent 튜브는 절대 오토클레이브하지 마십시오.
폐기에 대한 추가 정보 및 현지 규정은 안전보건자료(SDS)를 참조하십시오.

구체적인 용도나 절차에 대하여 궁금한 점이 있으면 당사 웹사이트(www.neogen.com)를 방문하거나 현지 Neogen 또는판매업체로 문의하십시오.

사용자의 책임

사용자는 제품 설명서와 정보를 숙지할 책임이 있습니다. 보다 자세한 정보는 당사의 웹사이트 www.neogen.com를 참고하거나
현지 Neogen이나 영업 대리점으로 문의하십시오.
시험 방법을 선택할 때, 시료 추출 방법, 시험 프로토콜, 시료 준비, 취급, 실험 기법, 시료 자체와 같은 외적 요인들이 결과에 영향을미칠 수 있음을 인식하는 것이 중요합니다.
시험 방법이나 제품을 선택할 때 선택된 시험 방법이 사용자의 기준을 충족할 수 있도록 적합한 매트릭스와 미생물 유발 시험을사용하여 충분한 수의 시료를 평가하는 것은 사용자의 책임입니다.
또한 사용자는 모든 시험 방법 및 결과가 고객 및 공급자의 요구사항을 충족하는지 판단할 책임이 있습니다.

다른 시험 방법과 마찬가지로 Neogen Food Safety 제품을 사용하여 얻은 결과가 시험된 매트릭스나 프로세스의 품질을 보장하는것은 아닙니다.

Neogen에서는 다양한 식품 매트릭스 방법 평가에 도움을 드리기 위해 Neogen® Molecular Detection Matrix Control 키트를개발했습니다. 필요한 경우 Neogen Molecular Detection Matrix Control(MC)을 이용하여 매트릭스가 Neogen Molecular
Detection Assay 2 - 장출혈성 대장균 (EHEC) 의 결과에 영향을 미칠 수 있는지 확인할 수 있습니다. 매트릭스를 대표하는 여러시료를 시험하십시오(예: Neogen 시험법을 적용하거나 신규 혹은 미지의 매트릭스 또는 원료나 공정의 변화가 있었던 매트릭스들을
검사하는 유효성 검증기간 동안 다양한 곳에서 채취한 시료).
매트릭스는 조성과 가공과 같은 내재적 특징을 포함한 제품의 종류로 정의할 수 있습니다. 매트릭스 간의 차이점은 매트릭스의 처리방법 또는 모양(예: 비살균 vs. 저온 살균, 생제품 vs. 건조제품 등)이 미치는 영향처럼 간단합니다.

보증의 한계/제한적 구제개별 제품 포장의 제한적 보증 부분에 명시된 경우를 제외하고, NEOGEN은 상품성 또는 특정 용도 적합성에 대한 보증을 포함한어떤 명시적이거나 암묵적인 보증도 거부합니다. Neogen Food Safety 제품에 결함이 있을 경우, Neogen이나 그의 공식판매업체는 자체 판단에 따라 제품을 교체하거나 구매 금액을 환불해 드립니다. 다음은 귀하의 유일한 구제 방법입니다. 제품에서의심되는 결함이 발견되면 발견일로부터 60일 이내에 Neogen으로 즉시 통지하고, 제품을 Neogen으로 반품해야 합니다. 추가질문이 있으면 Neogen 담당자 또는 Neogen 공인 대리점에 문의하십시오.

Neogen 책임의 제한

NEOGEN은 수익의 상실을 포함하여 어떤 직접적인, 간접적인, 특별한, 부수적인, 결과적인 손해나 손실에 대해서도 책임지지않습니다. 법 이론에 따른 Neogen의 책임은 어떤 경우에도 결함이 있다고 주장된 제품의 구매 대금을 초과하지 않습니다.

보관 및 폐기

Neogen Molecular Detection Assay 2 - 장출혈성 대장균 (EHEC) 은 2~8°C(35~47°F)에서 보관하십시오. 동결시키지 마십시오.
보관 중 키트가 빛을 받지 않도록 하십시오. 키트를 열어 보고 호일 파우치가 손상되지 않았는지 확인합니다. 파우치가 손상된 경우사용하지 마십시오. 개봉 후, 사용하지 않은 Reagent 튜브는 항상 다시 밀봉 가능한 파우치에 건조제와 함께 넣어 보관하여 건조동결된 시약의 안정성을 유지해야 합니다. 다시 밀봉한 제품은 최대 90일 동안 2~8°C(35~47°F)에서 보관하십시오.
유효 기간이 지난 Neogen Molecular Detection Assay 2 - 장출혈성 대장균 (EHEC) 은 사용하지 마십시오. 유효기한과 품목번호는 상자의 외부 라벨에 기입되어 있습니다. 사용하고 난 증균 배지와 Neogen Molecular Detection Assay 2 - 장출혈성대장균 (EHEC) 튜브에는 잠재적으로 병원성 물질이 들어 있을 수 있습니다. 시험이 완료되면 현재 업계 표준에 따라 오염 폐기물을폐기하십시오. 폐기에 대한 추가 정보 및 현지 규정은 안전보건자료(SDS)를 참조하십시오.

사용 지침모든 지침을 주의 깊게 준수하십시오. 그렇지 않으면 부정확한 결과가 나올 수 있습니다.

주기적으로 1~5%(v:v 물)의 가정용 표백제 또는 DNA 제거 용액으로 실험실 벤치와 장비(피펫, 캡/디캡 도구 등)의 오염을제거하십시오.

사용자는 “설치 적격성 평가(IQ)/작동 적격성 평가(OQ) 프로토콜 및 Neogen Molecular Detection System 지침” 문서(7)에
명시된 대로 Neogen Molecular Detection System 작업자 적격성 평가(OQ) 교육을 완료해야 합니다.
3특정 요건에 관해서는 “검증 방법 관련 상세 설명” 섹션을 참조하십시오:표 3. Performance Tested MethodSM (PTM) 인증서 #071902에 따른 증균 프로토콜.

KO （한국어）시료 증균
표 2와 3은 식품 증균 프로토콜에 대한 안내입니다.

다른 시료 추출 프로토콜 또는 희석 비율을 검증하여 이 시험 방법이 사용자의 기준을 충족하도록 하는 것은 사용자의 책임입니다.
식품
1. BPW ISO 증균 배지를 41.5±1°C로 평형시킵니다.

2. 증균 배지와 시료를 무균 방식으로 결합합니다. 모든 육류 및 입자가 매우 미세한 시료에 대해서는 필터 백을 사용하는 것이좋습니다.
3. 모든 매트릭스를 혼합하고 적절한 프로토콜 표(표 2 또는 3 참조)의 설명에 따라 배양합니다.

환경 시료

경고: 스폰지용 수화 용액으로 아릴설포네이트 화합물을 함유하는 Neutralizing Buffer를 사용하기로 선택하는 경우, 오염된 제품출고를 초래하는 위음성 결과와 관련된 위험을 줄이려면 시험 전에 증균된 환경 시료를 1: 2로 희석해야 합니다(시료 1을 동량의멸균 증균 배지 1에 넣음). Neutralizing Buffer 증균액 10µL를 Neogen Lysis Solution 튜브로 옮기는 방법도 있습니다.

다른 시료 추출 프로토콜 또는 희석 비율을 검증하여 이 시험 방법이 사용자의 기준을 충족하도록 하는 것은 사용자의 책임입니다.
표 2. 일반 증균 프로토콜.
시료 매트릭스

시료량증균배양액량(mL)(미리 가열)증균 온도(±1°C)

증균 시간(hr)시료 분석량(µL)

375g

1125 BPW-ISO

41.5

10~18

20

날고기(돼지고기, 가금류,양고기, 사슴 고기)(a)375g

1125 BPW-ISO

41.5

10~18

20

새싹채소

200g

450 BPW-ISO

41.5

18~24

20

25g

225 BPW-ISO

41.5

18~24

20

225 BPW-ISO

41.5

18~24

20

생소고기 분쇄육, 조각 및세절육(a)

잎채소(b)

(c)

생 유제품

(a)

(b)
(c)
(d)

(d)

25g 또는 25mL

소고기(소고기 분쇄육, 조각 및 세절육)와 날고기(돼지고기 분쇄육, 가금류 및 소고기가 아닌 고기) 시료 - 미리 가열한 BPW-ISO를 넣은 후 30~60초 동안 손으로 마사지하여 뭉친 부분을 풀어주고 분리합니다.
잎채소 - 잎을 증균액(미리 가열된 BPW-ISO)으로 헹구고 30~60초 동안 부드럽게 젓습니다. 잎을 마사지하거나 균질화하지
마십시오.

새싹채소 - 30~60초 동안 증균액(미리 가열된 BPW-ISO)으로 새싹채소을 헹구고 마사지하거나 균질화하지 마십시오.

생 유제품 시료 - 미리 가열한 BPW-ISO를 넣은 후 30~60초 동안 균질화하십시오.

검증 방법 관련 상세 설명

AOAC® Performance Tested MethodSM(PTM) 인증서 #071902

AOAC Research Institute PTMSM 연구에서, Neogen Molecular Detection Assay 2 - 장출혈성 대장균 (EHEC) 은 EHEC 검출에효과적인 방법이라는 점이 밝혀졌습니다. 이 연구에서 실험된 매트릭스는 표 3에 나와 있습니다.

4

KO （한국어）표 3. AOAC PTMSM 인증서 #071902에 따른 증균 프로토콜.
시료 매트릭스

시료량생소고기 세절육(a)생소고기 분쇄육

생소고기 분쇄육

375g

(a)
(a)

375g
25g

생돼지고기 분쇄육375g

기계적으로 분리된닭고기25g

생 가금류 조각시금치(b)

새싹채소

(c)

(a)

(a)

말린 대마초 꽃, 말린대마 꽃(4)

(a)

(b)
(c)
(d)

375g

200g

증균
배양액량(mL)증균 온도(±1°C)

증균 시간(hr)시료 분석량(µL)

41.5

10~18

20

41.5

10~18

20

1125 BPW-ISO(미리 가열)

41.5

10~18

20

41.5

10~18

20

41.5

10~18

20

225 BPW-ISO(미리 가열)

41.5

10-24

20

41.5

18~24

20

1125 BPW-ISO(미리 가열)

1125 BPW-ISO(미리 가열)
225 BPW-ISO(미리 가열)

1125 BPW-ISO(미리 가열)
450 BPW-ISO(미리 가열)

25g

225 BPW-ISO(미리 가열)

41.5

18~24

20

10g

90 BPW-ISO

41.5

28-32

20

소고기 시료(소고기 간 것과 다듬은 것) - 소고기 시료에 미리 가열한 BPW-ISO를 넣습니다. 30~60초 동안 손으로 마사지하여뭉친 부분을 풀어주고 분리합니다.
시금치 - 매트릭스에 미리 가열한 BPW-ISO를 넣습니다. 잎을 용액으로 헹구고 30~60초 동안 부드럽게 젓습니다. 잎을마사지하거나 균질화하지 마십시오.

새싹채소 - 30~60초 동안 증균액(미리 가열된 BPW-ISO)으로 새싹채소를 헹구고 마사지하거나 균질화하지 마십시오.

말린 대마초 꽃(>0.3% THC), 말린 대마 꽃(≤0.3%THC)

Neogen® Molecular Detection 스피드 로더 트레이 준비
1. 1~5%(v:v 물) 가정용 표백 용액을 천 또는 1회용 타월에 적셔 Neogen Molecular Detection 스피드 로더 트레이를 닦습니다.
2. 물로 Neogen Molecular Detection 스피드 로더 트레이를 헹굽니다.

3. 1회용 타월을 사용하여 Neogen Molecular Detection 스피드 로더 트레이를 닦아서 말립니다.

4. 사용하기 전에 Neogen Molecular Detection 스피드 로더 트레이가 마른 상태인지 확인하십시오.

Neogen® Molecular Detection 냉각 블록 인서트 준비
Neogen 분자 검출 냉각 블록 인서트를 바로 실험실 벤치에 놓아야 합니다. Neogen Molecular Detection 냉각 블록 트레이를사용하지 않습니다. 실험실 실온(20~25°C)에서 블록을 사용합니다.

Neogen® Molecular Detection 히팅 블록 인서트 준비건조 이중 블록 히터 장치에 Neogen Molecular Detection 히팅 블록 인서트를 놓습니다. 건조 블록 히터 장치를 켜고 Neogen
Molecular Detection 히팅 블록 인서트가 100±1°C를 유지할 수 있도록 합니다.

참고: 히터 장치에 따라, Neogen Molecular Detection 히팅 블록 인서트가 온도에 도달하는 데 약 30분이 걸릴 수 있습니다.
적절한 교정된 온도계(예: 부분 침지 온도계 또는 디지털 열전대 온도계. 전체 침지 온도계는 아님)를 지정된 위치에 놓아 Neogen
Molecular Detection 히팅 블록 인서트의 온도가 100±1°C인지 확인합니다.

Neogen® Molecular Detection 장비 준비
1. Neogen Molecular Detection System 소프트웨어를 실행하고 로그인합니다. Neogen Food Safety 담당자에게 문의하여 이소프트웨어가 최신 버전인지 확인하십시오.
2. Neogen Molecular Detection 장비를 켭니다.

3. 각 시료에 대한 데이터를 포함하는 실행을 만들거나 편집합니다. 자세한 내용은 Neogen Molecular Detection System 사용설명서를 참조하십시오.
3.1. 각 시료에 총 두 시험이 진행되므로 소프트웨어에서 STXEAE-2 아이콘을 선택하면 인접 웰(예: A1, A2, B1, B2 등)두 개가 stx에 한 개, eae 시약 튜브에 한 개 선택됩니다. NC는 각 시약 튜브에 대해 설정되며 RC 한 개는 키트에 대해설정됩니다.

5

KO （한국어）
1
SAL-2

A

ECO-2
LIS-2

B

LMO-2
CAM-2

C

CRO-2
STXEAE-2
STX-2
EAE-2
MC-2

D
E
F
G
H

2

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

RC

2 STXEAE
2

NC

STX 2

NC
EAE

참고: 반응 튜브를 포함한 Neogen Molecular Detection 스피드 로더 트레이를 삽입하기 전에 Neogen Molecular Detection장비가 준비 상태에 도달해야 합니다. 이 가열 단계는 약 20분이 걸리며 완료되면 기기의 상태 표시줄에 주황색 등이 켜집니다.
기기가 실행할 준비가 되면 상태 표시줄이 녹색으로 바뀝니다.

Lysis

Neogen Molecular Detection 히팅 블록 인서트에 부착하기 전에 스크루드라이버나 스패튤라로 Neogen Lysis Solution 랙의하단을 제거합니다.

1. 랙을 주변 온도(20~25°C)에서 하룻밤 동안(16~18시간) 두어 Neogen Lysis Solution 튜브를 온도 평형시킵니다. Neogen
Lysis Solution 튜브를 주변 온도로 평형시키는 또 다른 방법은 최소 2시간 동안 실험실 벤치에 Neogen Lysis Solution튜브를 두거나, 37±1°C 배양기에 1시간 동안 Neogen Lysis Solution 튜브를 배양하거나 100°C의 히팅 블록에 30초간 두는것입니다.
2. 캡을 씌운 튜브를 뒤집어 섞습니다. 뒤집은 다음 4시간 이내에 다음 단계를 진행하십시오.

3. 배양기에서 증균된 시료를 꺼냅니다.

4. 각 시료와 NC(멸균 증균 배지)에 Neogen Lysis Solution 튜브 1개가 필요합니다.

4.1. Neogen Lysis Solution 튜브 스트립을 원하는 튜브 수로 자를 수 있습니다. 필요한 튜브 또는 8개들이 튜브 스트립 수를선택합니다. Neogen Lysis Solution 튜브를 빈 랙에 놓습니다.

4.2. 교차 오염을 방지하기 위해 한 번에 하나씩 Neogen Lysis Solution 튜브 스트립의 캡을 벗기고 각 분주 단계에 새 피펫팁을 사용합니다.

4.3. 아래 설명된 대로, 증균된 시료를 Neogen Lysis Solution 튜브로 옮깁니다.

각 증균된 시료를 개별 Neogen Lysis Solution 튜브로 먼저 옮깁니다. NC를 마지막으로 옮깁니다.

4.4. Neogen® Molecular Detection Lysis Cap/Decap Tool을 사용하여 한 번에 스트립 하나씩, Neogen Lysis Solution튜브 스트립 1개의 캡을 벗깁니다.

4.5. Neogen Lysis Solution 튜브 캡 폐기 – 재시험을 위해 Lysate을 그대로 둘 경우 캡을 깨끗한 용기에 두어 Lysis 후 다시사용할 수 있도록 합니다.
4.5.1. 보존된 Lysate 처리에 대해서는 부록 A를 참조하십시오.

4.6. 시료 20µL를 Neogen Lysis Solution 튜브로 옮깁니다.

6

KO （한국어）5. 시험할 시료 수에 대해, 필요한 만큼 4.4~4.6단계를 반복합니다.

6. 모든 시료를 옮겼을 때 NC(멸균 증균 배지, 예: BPW) 20µL를 Neogen Lysis Solution 튜브로 옮깁니다. 물을 NC로 사용하지마십시오.
7. Neogen Molecular Detection 히팅 블록 인서트의 온도가 100±1°C인지 확인합니다.

8. 덮개를 씌우지 않은 Neogen Lysis Solution 튜브의 랙을 Neogen 분자 검출 히팅 블록 인서트에 놓고 15±1분 동안가열합니다. 가열 중 Neogen Lysis Solution 용액은 분홍색(차가움)에서 노란색(뜨거움)으로 바뀝니다.

8.1. Lysis 단계 동안 적절하게 열처리가 되지 않은 시료는 잠재적인 생물학적 위험으로 간주되므로 Neogen Molecular
Detection 장비에 절대로 삽입하지 마십시오.

9. 덮개를 씌우지 않은 Neogen Lysis Solution 튜브의 랙을 Neogen Molecular Detection 히팅 블록에서 제거하고 Neogen
Molecular Detection 냉각 블록 인서트에 최소 5분, 최대 10분 냉각시킵니다. Neogen Molecular Detection 냉각 블록인서트는 Neogen® Molecular Detection 냉각 블록 트레이 없이 상온에서 바로 실험실 벤치에 놓아야 합니다. 식었으면Neogen Lysis Solution이 분홍색으로 다시 바뀝니다.
10. Neogen Lysis Solution 튜브의 랙을 Neogen Molecular Detection 냉각 블록 인서트에서 제거합니다.
00:15:00

99–101 ºC

20–25 ºC

00:05:00

증폭

1. 각 시료와 NC를 위해 1개의 Neogen Molecular Detection Assay 2 - 시가독소 생성 대장균 (STEC)(stx)과 1개의 Neogen
Molecular Detection Assay 2 - 시가독소 생성 대장균 (STEC)(eae) Reagent 튜브가 필요합니다.
1.1. 튜브 스트립을 원하는 튜브 개수로 자를 수 있습니다. 개별 Neogen Molecular Detection Assay 2 - 시가독소 생성
대장균 (STEC)(stx)과 Neogen Molecular Detection Assay 2 - 시가독소 생성 대장균 (STEC)(eae) Reagent 튜브또는 필요한 8개들이 튜브 스트립 수를 선택합니다.

1.2. Neogen Molecular Detection Assay 2 - 시가독소 생성 대장균 (STEC)(stx) 튜브를 비어 있는 랙에 한 줄로 놓습니다.
1.3. Neogen Molecular Detection Assay 2 - 시가독소 생성 대장균 (STEC)(eae) 튜브를 비어 있는 랙에 인접한 오른쪽줄에 놓습니다.
1.4. 튜브 맨 아래 시약 알갱이를 휘젓지 마십시오.

2. 하나의 Neogen Reagent 컨트롤 튜브를 선택하고 랙에 놓습니다.

3. NC lysate의 경우, Neogen Molecular Detection Assay 2 - 시가독소 생성 대장균 (STEC)(stx) Reagent 튜브 1개와
Neogen Molecular Detection Assay 2 - 시가독소 생성 대장균 (STEC)(eae) Reagent 튜브 1개를 선택하여 랙에 놓습니다.

7

KO （한국어）4. 교차 오염을 방지하기 위해 한 번에 Neogen Molecular Detection Assay 2 - 장출혈성 대장균 (EHEC) Reagent 튜브 스트립 1개의 캡을 벗기고 각 분주 단계마다 새 피펫 팁을 사용합니다.
5. 아래 설명된 대로 각 lysate를 Neogen Molecular Detection Assay 2 - 장출혈성 대장균 (EHEC) Reagent 튜브로 옮깁니다.
5.1. 먼저 5.5와 5.6에 설명된 대로 시료 lysate 각각을 Neogen Molecular Detection Assay 2 - 시가독소 생성 대장균(STEC)(stx) Reagent 튜브로 옮깁니다.

5.2. 그 다음 5.5와 5.6에 설명된 대로 동일한 시료 lysate 각각을 가까운 오른쪽 줄의 Neogen Molecular Detection Assay
2 - 시가독소 생성 대장균 (STEC)(eae) Reagent 튜브로 옮깁니다.
참고: 각 이동 시 새 피펫 팁을 사용하십시오. 동일한 lysate 시료에서 stx 및 eae 시약 튜브로 옮길 때 같은 피펫 팁을사용하지 마십시오.

5.3. 모든 시료 lysate를 옮긴 후 Neogen Molecular Detection Assay 2 - 시가독소 생성 대장균 (STEC)(stx) Reagent
튜브와 Neogen Molecular Detection Assay 2 - 시가독소 생성 대장균 (STEC)(eae) Reagent 튜브 각각에 NC lysate를 넣으십시오.

5.4. 마지막으로 NC lysate를 Reagent 컨트롤 튜브로 옮기십시오.

5.5. Neogen® Molecular Detection Reagent Cap/Decap Tool를 사용하여 한 번에 스트립 하나씩 Neogen Molecular
Detection Assay 2 - 장출혈성 대장균 (EHEC) Reagent 튜브의 캡을 벗깁니다. 캡을 버리십시오.
5.6. Neogen Lysis Solution 튜브에서 용액의 상부 ½에서 시료 Lysate 20µL를 침전되지 않도록 하여 해당 Neogen
Molecular Detection Assay 2 - 장출혈성 대장균 (EHEC) Reagent 튜브로 옮깁니다. 알갱이가 휘저어져 섞이지않도록 기울여 붓습니다. 위아래로 가볍게 5번을 피펫팅하여 섞습니다.
참고: 각 이동 시 새 피펫 팁을 사용하십시오. 동일한 lysate 시료에서 stx 및 eae 시약 튜브로 옮길 때 같은 피펫 팁을사용하지 마십시오.

8

KO （한국어）5.7. 개별 시료 Lysate이 스트립의 해당 Neogen Molecular Detection Assay 2 - 장출혈성 대장균 (EHEC) Reagent 튜브를덮고, Neogen 분자 검출 Reagent Cap/Decap Tool의 둥근 면을 사용하여 앞뒤로 압력을 가하여 캡이 단단히 닫혀있는지 확인하십시오.

5.8. 제공된 여분의 마개로 Neogen Molecular Detection Assay 2 - 장출혈성 대장균 (EHEC) Reagent 튜브를 덮고,
Neogen 분자 검출 Reagent Cap/Decap Tool의 둥근 면을 사용하여 앞뒤로 압력을 가하여 캡이 단단히 닫혀 있는지확인하십시오.

5.9. Neogen Molecular Detection Assay 2 - 장출혈성 대장균 (EHEC) 시약 튜브에 대하여 시험할 시료 수에 대해, 필요한만큼 5.6~5.8 단계를 반복합니다.

5.10. 모든 시료 Lysate을 옮긴 후 5.6~5.8 단계를 반복하여 NC Lysate 20µL를 각각의 Neogen Molecular Detection Assay
2 - 시가독소 생성 대장균 (STEC)(stx) 및 Neogen Molecular Detection Assay 2 - 시가독소 생성 대장균 (STEC)(eae)
Reagent 튜브로 옮깁니다.

5.11. NC lysate 20µL를 Neogen Reagent 컨트롤 튜브로 옮깁니다. 알갱이가 휘저어져 섞이지 않도록 기울여 붓습니다.
위아래로 가볍게 5번을 피펫팅하여 섞습니다.
각 시료 용해물을 개별 Neogen Molecular Detection Assay 2 - 장출혈성 대장균 (EHEC) Reagent 튜브 로 먼저 옮긴뒤 NC를 옮기십시오. 마지막에 Neogen Reagent 컨트롤 튜브를 수화합니다.

6. 캡이 씌워진 튜브를 깨끗하고 오염되지 않은 Neogen Molecular Detection 스피드 로더 트레이에 내려놓은 다음 뚜껑을 닫고잠급니다.

7. Neogen Molecular Detection System 소프트웨어에서 구성된 실행을 검토하고 확인합니다.

8. 소프트웨어에서 시작 버튼을 클릭하고 사용할 기기를 선택합니다. 선택한 기기의 뚜껑이 자동으로 열립니다.

9. Neogen Molecular Detection 스피드 로더 트레이를 Neogen Molecular Detection 장비에 놓고 뚜껑을 닫으면 시험이시작됩니다. 결과는 60분 이내에 제공되지만 양성 여부는 더 일찍 검출할 수 있습니다.

10. 시험이 완료되었으면 Neogen Molecular Detection 장비에서 Neogen Molecular Detection 스피드 로더 트레이를 꺼내고
1~5%(v:v 물)의 가정용 표백 용액에 1시간 동안 담갔다가 분석 준비 영역에서 떨어진 곳에 폐기하십시오.

주의: 교차 오염으로 인한 위양성의 위험을 최소화하려면 증폭된 DNA를 함유한 Reagent 튜브를 절대 열지 마십시오. 여기에는Neogen Molecular Detection Assay 2 - 장출혈성 대장균 (EHEC) Reagent, Neogen Reagent 컨트롤 및 Neogen Matrix컨트롤 튜브가 포함됩니다. 밀봉된 Reagent 튜브는 1~5%(v:v 물)의 가정용 표백제에 1시간 동안 담가 두었다가 키트 준비 구역과멀리 떨어진 위치에 폐기합니다.

결과 및 해석

알고리즘은 핵산 증폭을 탐지할 때 생성되는 빛 출력 곡선을 해석합니다. 결과는 소프트웨어에 의해 자동으로 분석되고 결과에기반하여 색상으로 구분됩니다. 양성 또는 음성 결과는 다양한 고유 곡선 매개변수의 분석으로 판별됩니다. 추정 양성 결과는실시간으로 보고되는 반면, 음성 결과는 실행이 완료된 후 표시됩니다.

Neogen 분자 검출 시스템 소프트웨어는 각 시험(stx 및 eae)에 대한 결과를 분리 보고하고 두 시험의 결과를 사용하여 시료가
STEC(EHEC)(아래 그림 참조)에 대해 양성인지 혹은 음성인지 판단합니다. STEC(EHEC)에 대해 양성으로 추정되는 경우, 두유전자 대상(stx1 및/또는 stx2 및 eae) 모두 양성이어야 합니다. 개별 시험에서 오류나 검사가 표시된다면 최종 결과가 오류 또는검사로 나타납니다. 최종 결과를 적절하게 가져오려면 재시험이 필요합니다(결과 키 참조). 소프트웨어는 필요한 경우 개별 시험의설정도 허용하며 부록 A에 설명된 단계와 보존된 증균의 Lysis 및 증폭 섹션에 설명된 단계를 따라 보존된 lysate에 대해 시료 lysate또는 증균의 새 lysate를 다시 시험할 수 있습니다.

9

KO （한국어）증균된 시료 lysate 결과 키
+ +2 + 양쪽 모두 양성, 최종 결과 양성2+ -2 – stx 양성, eae 음성, 최종 결과 음성2+ ?2 ? stx 양성, eae 계속 검사, 최종 결과 계속 검사, 재시험2+ 2stx 양성, eae 오류, 최종 결과 오류, 재시험2– -2 + stx 음성, eae 양성, 최종 결과 음성2– -2 – stx 음성, eae 음성, 최종 결과 음성2– ?2 ? stx 음성, eae 계속 검사, 최종 결과 계속 검사, 재시험2– 2stx 음성, eae 오류, 최종 결과 오류, 재시험2?
? 2 + stx 계속 검사, eae 양성, 최종 결과 계속 검사, 재시험2? ?2 – stx 계속 검사, eae 음성, 최종 결과 계속 검사, 재시험
2
STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

STX

EAE

? ?2 ?
2
STX

2

?

EAE

STX

2

EAE

2

STX

2

EAE

2

STX

+
–
2

2

STX

2

2

STX

2

EAE

?

EAE
EAE

stx 계속 검사, eae 계속 검사, 최종 결과 계속 검사, 재시험
stx 계속 검사, eae 오류, 최종 결과 오류, 재시험
stx 오류, eae 양성, 최종 결과 오류, 재시험
stx 오류, eae 음성, 최종 결과 오류, 재시험

stx 오류, eae 계속 검사, 최종 결과 오류, 재시험
stx 오류, eae 오류, 최종 결과 오류, 재시험음성 컨트롤 키
2
2
2
2
2
2

NC
STX

NC
STX

NC
STX

NC
STX

NC
STX

NC
STX

2
2
2
2
2
2

NC
EAE

NC
EAE

NC
EAE

NC
EAE

NC
EAE

NC
EAE

양쪽 모두 유효, 링크 유효한쪽 유효, 다른 쪽 오류, 링크 오류, 재시험한쪽 유효, 다른 쪽 무효, 링크 무효, 재시험양쪽 오류, 링크 오류, 재시험양쪽 무효, 링크 무효, 재시험한쪽 오류, 다른 쪽 무효, 링크 오류, 재시험양성으로 추정되는 시료는 1차 증균 배양액 증균에서 선택적 플레이트로 이전하는 것에서 시작하여 적절한 생화학적 및 혈청학적방법으로 분리균 확인을 실시하는 등 실험실 표준 운영 절차 또는 적절한 참고 방법 확인(1, 2, 3)을 통해 확인해야 합니다. MLG 5C
에서 명시된 매트릭스의 경우, 선택적 배지에 플레이트를 놓기 전에 면역 자기 분리(IMS)를 수행해야 합니다.
참고: 시스템과 Neogen Molecular Detection Assay 2 - 장출혈성 대장균 (EHEC) 증폭 시약은 “배경” RLU 를 가지므로 음성
시료도 0을 기록값으로 제공하지 않습니다.
이례적인 빛 출력이 나타나는 경우, 알고리즘은 이를 검사(Inspect)로 분류합니다. Neogen은 모든 검사 시료에 대해 분석을반복하는 것을 권장합니다. 결과가 계속 검사인 경우, 기본 설정한 방법(1, 2, 3)을 사용하거나 현지 규정에 따라 확정 시험을진행하십시오.
표 4. 여러 소프트웨어 결과에 대한 기호 및 정보.
웰 유형
시료

시료

웰 결과 기호

+
–

시료

해석

음성

시료는 대상 식중독균에 대해 음성입니다.

양성

억제

시료
시료

결과

?

검사
오류

시료는 대상 식중독균에 대해 양성으로 추정됩니다.
시료 매트릭스는 시험에 대해 억제되었습니다. 재시험이 필요할 수 있습니다.
자세한 내용은 문제 해결 섹션과 시험 키트 제품 설명서를 참조하십시오.
대상 식중독균의 존재 여부를 확인할 수 없습니다. 재시험이 필요할 수
있습니다. 자세한 내용은 문제 해결 섹션과 시험 키트 제품 설명서를참조하십시오.

감지된 생체발광이 없습니다. 재시험이 필요할 수 있습니다. 자세한 내용은문제 해결 섹션과 시험 키트 제품 설명서를 참조하십시오.
10

KO （한국어）부록 A. 시험 계획서 중단: 시료의 보관 및 재시험

1. 열처리된 Lysate를 보관하려면 깨끗한 캡으로 Neogen Lysis Solution 튜브를 다시 씌웁니다(Lysis 섹션, 4.5 참조).

2. 증균된 시료를 보관하려면 최소한 보관 18시간 전에 배양합니다.
3. 4~8°C에서 최대 72시간 동안 보관합니다.

4. 2~3번 뒤집어서 혼합하여 보관된 시료를 증폭하도록 준비합니다.
5. 튜브의 캡을 벗깁니다.

6. Neogen 분자 검출 히팅 블록 인서트에 혼합된 Lysate 튜브를 놓고 100±1°C에서 5±1분간 가열합니다.

7. Neogen Lysis Solution 튜브의 랙을 Neogen 분자 검출 히팅 블록에서 제거하고 Neogen 분자 검출 냉각 블록 인서트에 최소 5
분, 최대 10분 냉각시킵니다.
8. 위에서 상세히 설명한 증폭 섹션의 프로토콜을 계속합니다.

참고자료:

1. Microbiology Laboratory Guidebook. U. S. Department of Agriculture (USDA) Food Safety and Inspection Service(FSIS) Microbiology Laboratory guidebook 5C.00. Detection and isolation of top seven Shiga toxin-producing
Escherichia coli (STECs) from meat products and carcass and environmental sponges. Feb 4, 2019.
2. US Food and Drug Administration Bacteriological Analytical Manual. Chapter 4A: Diarrheagenic Escherichia coli.
October 2018.
3. ISO/TS 13136:2012: Microbiology of food and animal feed — Real-time polymerase chain reaction (PCR)-based
method for the detection of food-borne pathogens — Horizontal method for the detection of Shiga toxin-producing
Escherichia coli (STEC) and the determination of O157, O111, O26, O103 and O145 serogroups
4. U.S. Food and Drug Administration. Code of Federal Regulations, Title 21, Part 58. Good laboratory practice fornonclinical laboratory studies.
5. ISO/IEC 17025. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories.
6. ISO 7218. Microbiology of food and animal feeding stuffs - General rules for microbiological examination.
7. Neogen Installation Qualification (IQ) / Operational Qualification (OQ) Protocols and Instructions for Neogen
Molecular Detection System. 본 문서의 사본을 얻으려면 Neogen Food Safety 담당자에게 문의하십시오.

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