ペトリフィルム™
大腸菌群数迅速測定用プレート（RCCプレート） 
この解説書はペトリフィルム™ 大腸菌群数迅速測定用プレート（以下「本プレート」という）に現れた結果を良く理解していただく為のものです。

AOAC International、FDA BAMでは、大腸菌群をグラム陰性菌で、乳糖を分解して酸とガスを産生する菌としています。

大腸菌群は本プレートでコロニーを形成して酸を産生し、本プレートに含まれているｐＨ指示薬により、黄色域を示します。

コロニーの周りに気泡があるものは、確定大腸菌群です。

ISO では、選択培地を用いて生育する菌を大腸菌群としています。大腸菌群数の測定方法として、ISO4832 法では、乳糖添加ＶＲＢ培地（VRBL）を用い、コロニーの大きさ、酸の産生により確認します。本プレート上では、酸の産生により、黄色域を示し、気泡を伴う、あるいは気泡を伴わない赤色コロニーとして見られます。ISO4831 法では、大腸菌群はＭＰＮ法で測定され、選択培地で乳糖を分解してガスを発生するとしています。本プレート上で大腸菌群は、気泡を伴う赤色コロニーとして見られます。
ＡＦＮＯＲでは、ISO4831 法とISO4832 法と比較して、精度を確認しています。

図1
6 時間培養 酸産生領域（黄色域）による大腸菌群測定（6－14 時間）

6 時間ほどで黄色域が現れます。大腸菌群が増殖すると、黄色域が現れます。
● AOAC ／ FDA BAM 法と比較したときの解釈
中心部の赤い点の有無に関わらず、黄色域を数え、推定大腸菌群とします。
● ISO4832（VRBL）と比較したときの解釈
中心部の赤い点の有無に関わらず、黄色域を数え、大腸菌群とします。
AFNORでは、14 時間培養後、最終判定とします。

図2
14 時間培養 大腸菌群コロニー測定（8－24 時間）

8 時間以上培養すると、気泡を伴う赤色コロニー、気泡を伴わない赤色コロニーが見られます。
● AOAC ／ FDA BAM 法と比較したときの解釈
気泡を伴う赤色コロニーを測定し、確定大腸菌とします。
● ISO4831（MPN）と比較したときの解釈
気泡を伴う赤色コロニーを測定し、大腸菌群とします。
豚加工品以外はＡＦＮＯＲ精度管理では、最終結果は 24±2 時間培養します。
● ISO4832（VRBL）と比較したときの解釈
気泡の有無にかかわらず赤色コロニーを測定し、大腸菌群とします。
AFNORでは、24±2 時間培養後、最終測定します。

適正測定範囲：～150コロニー（コロニー総数）～50コロニー（黄色域）
酸産生領域（黄色域）（6－14 時間）

図 3 から図 10までのゲルの変化に注目してください。大腸菌群が酸を産生するために、ゲルの色が、赤橙色から橙黄色に変化します。
菌数の多い大腸菌群（10 3 個／プレート以上）では 4 時間の培養で全体的に黄変します。
（図４参照）この場合には、更に希釈してください。
大腸菌群の中には、大量の酸を産生するものもあります。この様な場合、コロニー数が本プレート当り20 を超えなくても、黄色域の融合が起きる事があります。また目立たない黄色域 50ヶ所以上を含む本プレートで推測することもできます。

図3

本プレート上の接種エリアの面積は 20cm２です。1つの格子（1cm２）以上の中の黄色域の平均数を求め、20 倍することにより本プレート１枚あたりの推定菌数を求めることができます。図 5で囲った□1 の中には、6つの推定大腸菌群（黄色域）が認められます。
大腸菌群が生育するに従って、赤色コロニーが黄色域の中に現れ始めます。
（図 6 参照）

図4

大腸菌群数 = 0

推定大腸菌群数 = 測定不能多数（105 以上）

1

図5
推定大腸菌群数 = 120

図6
推定大腸菌群数 = 280

コロニーと気泡の測定（8－24 時間）

図 7 および図 8 はそれぞれ異なる細菌をそれぞれの濃度で接種し、同じ時間培養した本プレートの例です。この時点で黄色域を伴う明瞭な赤色コロニーが両プレートに現れています。図 8 の細菌は図 7 の細菌と比較してより旺盛に乳糖を発酵し、ガスを産生することができると考えられます。基準に従って、気泡を伴うコロニーあるいは伴わないコロニーを測定してください。
（図７の◯1・2 を参照）図 9 は、気泡を伴うまたは気泡の伴わないコロニーが同じプレートに生育している場合の測定の例を示しています。測定は、次の規定にしたがって行ってください。

AOAC/FDA BAM 法による気泡を伴う赤色コロニー（確定大腸菌群数）= 72
ISO4831 法による気泡を伴う赤色コロニー（大腸菌群数）= 72● ISO4832 法による気泡の有無にかかわらない赤色コロニー（大腸菌群数）= 128●●

本プレート当たりのコロニー数が 150 を超える場合には推定菌数を測定することができます。フォームダム上にあるコロニーは培地の選択成分の影響を受けていないので測定しないでください。
（図 7－図 10 参照）

12
図7大腸菌群数 = 64

図9大腸菌群測定解釈参照

図8大腸菌群数 = 164

図 10
推定大腸菌群数 = 240

TNTC（Too Numerous to Count：測定不能多数）
より正確に測定するには、検体をさらに希釈します。

図 11
大腸菌群数 = TNTC（実数＞10 4）

測定不能なほど多数（TNTC）のコロニーが現れた本プレートは以下のうち１つ以上の特徴があります。
１）赤褐色から黄褐色へゲルの色の変化
２）多数の小型コロニー
３）多数の気泡（図 11 参照）

図 13
大腸菌群数 = TNTC（実数＞10 4）コロニーが見えないほど数が多くなっており、目視ではコロニーの測定が困難です。ゲルの色調が黄色に変化している、また多くの気泡が存在することからTNTCと判定します。

図 12
大腸菌群数 = TNTC（実数＞10 3）

本プレートには TNTCであることを示す２つの特徴があります。
１）ゲルの色調変化
２）多数の小型コロニー

図 14

大腸菌群数 = 0

グラム陰性菌の非大腸菌群のコロニーが多数生育した本プレートを示しています。乳糖を発酵しない細菌が多数現れた場合にはゲルの色調が暗赤色になります。

pH

殆どの細菌の生育至適 pH は、pH7.0 付近で至適成長します。pH の低い検体を希釈してプレートに接種する場合には、pH6.5-7.5 に調整してください。

図 15 および図 16 はｐＨ調整後に接種したフレッシュヨーグルトの例です。培地中の阻害剤によりグラム陽性菌であるヨーグルトのスターターカルチャーは生育が阻害されますがスターターカルチャーにより産生された酸によりゲルのバックグランドの色調が赤橙色から橙黄色へと変化し、TNTC の結果の早期の状態に似ることがあります。培養中に更にTNTC の大腸菌群類の生育の兆候が現れるかどうかフレッシュヨーグルトを含む本プレートを経過観察します。

図 15

図 16

大腸菌群数 = 0

上の陰性本プレートと前のページの TNTC の本プレートを比較してください。
TNTC の結果を示すコロニーや気泡が存在しないことに注目してください。

食品残渣

大腸菌群数 = 4

ゲルの色調変化にもかかわらず、大腸菌群が発生した酸は容易に確認することができます。

食品残渣は不規則な形をしており、気泡を伴いません。

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図 17

大腸菌群数 = 11

パプリカの希釈液を接種した本プレートの早期読み取り例です。◯1 は赤色の食品残渣周囲の酸性領域を示しています。食品の中には pH 指示薬と反応する酸性の細片を含むものがあります。
◯2 は赤色残渣の近くの気泡を示していますが、黄色域がありません。両方ともコロニーとして数えないでください。

図 18

大腸菌群数 = 10

チョコレートを希釈した場合を示しています。◯1で示したように気泡がコロニーに割り込み、コロニーが気泡の縁取りをするようになることがあります。
気泡周囲の酸の産生による黄色域により、大腸菌群のコロニーであることが分かります。

使用上の注意事項
保管1

開封前は、冷蔵庫（8℃以下）で保管してください。有効期限内に使用してください。

2

開封後は、開口部を折り、粘着テープでシールしてください。

3

5以下に示す滅菌希釈用液のうち1 種類を適量加えます。

6

開封後は室温（25° C 以下／相対湿度 50％以下）で保管してください。開封したパウチは冷蔵しないでください。開封後は 1 ヶ月以内に使用してください。

使用手順

4

高脂肪、低脂肪乳は直接接種できます。
その他の食品、乳製品については、少なくとも10 倍希釈してください。ストマッカー
バッグ、希釈瓶などに秤量または採取します。

● バターフィールドリン酸緩衝液（IDFリン酸緩衝液、リン酸二水素カリウムの 0.0425g/L 溶液をpH7.2 に調整）● 0.1% ペプトン水 ● ペプトン塩希釈 液（ISO 法 6887）● 緩 衝 ペ プトン 水（ISO 法6579）● 生 理 食 塩 水（0.85-0.90%）● 重 硫 酸 塩
無添加リージンブロス ● 蒸留水

検体を攪拌またはホモジナイズします。
希 釈した検 体の pH を6.5 から7.5 の間 に調整します。
● 酸性検体には 1N の NaOH を使用してください。
● アルカリ性検体には 1N の HCl を使用してください。

クエン酸、重亜硫酸塩、チオ硫酸塩を含む緩衝液は使用しないでください。菌の生育を阻害することがあります。

接種7

平らな台の上に本プレートを置きます。上部フィルムを持ち上げます。

8

本プレートに対して垂直にピペットを持ち、下部フィルムの中心に1mL の試料液を接種します。

9

気泡が入らないように上部フィルムを持ったままゆっくり下ろします。

凹面

平らな面

10

スプレッダーの平らな面を下にして、接種部分の上部フィルムの上に置きます。

培養

1311

ゲル化が始まる前にスプレッダーを上から軽く押し、試料を均一に広げます。スプレッ
ダーをひねったり、滑らせたりしないでください。

12

スプレッダーを取り、1 分間放置してゲルを固化させます。

読み取り上部フィルムを上にして水平に置き、35℃±1℃で6～24±2 時間培養します。20 枚まで重ねて培養できます。

14

本プレートの測定については、下から直接光を当てずに測定してください。本プ
レートは、コロニーカウンターまたは拡大鏡にて測定することができます。結果の確認は解説書を参照してください。

15

コロニーは釣菌することが出来ます。上部フィルムを持ち上げ、コロニーをゲルから釣菌します。

培養の時間や温度は方法によって異なります。
最も一般的な方法を以下に示します。
AOAC Official Method(OMA)2000.15

全食品：35±1℃、24±2 時間

AFNOR Validated Methods
3M 01/5-03/97A

3M 01/5-03/97B
3M 01/5-03/97C

豚肉加工製品および魚介類：30±1℃、14 時間 ±30 分

VRBL30℃との比較

豚肉加工製品および魚介類：30±1℃、24±2 時間

VRBL30℃との比較

魚介類

MPN 法との比較

その他の食品：35±1℃、14 時間 ±30 分

その他の食品：35±1℃、24±2 時間

その他の食品：35±1℃、24±2 時間：30±1℃、24±2 時間

使用者の責任：ペトリフィルム™ 培地の性能は、全ての微生物、培養条件、食品マトリクスについて評価されたわけではありません。
試験方法とその結果がお客様の必要条件を満たすかどうかの判断は、お客様ご自身の責任となります。本判定ガイドの複製が必要な場合、お客様の印刷設定が画像や色の質に影響する場合があります。

NEOGEN、ペトリフィルム、Petriﬁlm は、Neogen 社の商標です。

ネオジェンジャパン株式会社
https://www.neogen.jp/      