The Journal of Farm Animal in Infectious Disease
Vol.5 No.3 2016

THE SIMPLE ESTIMATION OF E.COLI.

原著論文

アンピシリン感受性とセフロキシム誘発性溶血現象を利用した
牛乳汁由来 Escherichia coli の簡易菌種推定の試み
千徳芳彦 1） 大久保宏平 1）
1）NOSAI オホーツク北見家畜診療所〒 099-0879 北海道北見市美園 497-1
連絡担当者：千徳芳彦
Tel：0157-66-6702

Fax：0157-35-3911

E-mail：y-sentoku@nosaiok.or.jp［要約］

牛の乳汁検査において、Escherichia coli（EC）とその他（Klebsiella spp. 他）を鑑別するための既存の検査手技は煩雑化することが想定される。臨床家は、より簡易な検査方法を望むが、そのような報告はない。グラム陰性桿菌（Gram-negative rod-shaped bacteria: GNR）のディスク阻止円周囲には、
β 溶血とは異なる限局した溶血現象がしばしば観察されるが、本現象に関する報告はなく、その現象を利用した菌種推定への活用もない。そこで、本現象の特徴の菌種推定への活用につき調査したところ、
主に β ラクタムの阻止円周囲に観察され、セフロキシム（CXM）で最も高頻度（約 50％）に、かつ他抗菌剤で溶血が観察される場合は、CXM でも観察されることがわかった。本現象を CXM 誘発性溶血現象（CXM-induced Hemolysis: CXM Hly）とし、CXM Hly の菌種別、地域・年代別の発現状況、薬剤耐性との関連性について調査したところ、CXM Hly は EC に特異性が高い上、ABPC 耐性株で有意に多く、かつ地域・年代を問わず普遍的に観察される現象であることがわかった。また、EC の定義
を ABPC 感受性、あるいは溶血性あり（β・CXM Hly）と仮定した上で、EC と EC 以外の理論的な鑑
別精度について検証したところ、ABPC 耐性割合 18％で感度 97.4％、特異度 90.7％、ABPC 耐性割合
100％で感度 86.0％であり、EC 有病率 50％以上で、EC 的中度は ABPC 耐性割合にかかわらず 90％以上であることが判明した。以上から、ABPC 耐性割合にかかわらず簡易で迅速かつ高い精度の EC の推定に、ABPC 感受性と溶血性の併用が活用できることがわかった。
キーワード：セフロキシム、E.coli、グラム陰性桿菌性乳房炎、簡易菌種推定、溶血性ら、臨床現場では鑑別用のキットや特殊培地の［緒論］

利用が普及しつつある［9］。しかしながらキッ

近年、Escherichia coli（EC）と Klebsilla spp.

トや培地の使用はコストの増加、作業の混乱かの乳汁検査における鑑別の必要性についていく

ら煩雑性が増し［4］、かつ作業に時間がかかる

つか報告されているが［2, 17, 18］、この 2 菌種ことから［9］、実際には現場の臨床家にとっての官能検査による鑑別は習熟度を要することかは厳しい選択肢となっている。それらのことか
ら臨床現場では簡易性を重視した菌種推定方法の利用が望まれるが、これまでのところ既存の受付：2015 年 11 月 25 日
受理：2016 年 4 月 25 日

鑑別方法に変わる簡易な方法の報告はなされて－ 83 －

家畜感染症学会誌
5 巻 3 号 2016

E.coli の簡易推定いない。

上に塗抹し、37℃ 12–24 時間培養した。分離

官能検査で菌種推定が困難な牛乳汁由来グラ

された GNR の同定と薬剤感受性試験は外部検

ム陰性桿菌（non-sensory Gram-negative rod-

査機関に依頼し（細菌同定・薬剤感受性自動測

shaped bacteria: ns GNR）のうち、分離頻度が定装置 VITEC）、同定された菌種の分離頻度、最も高いのは EC である［3, 5, 12, 16］。EC の

薬剤耐性状況、菌数 +++ 以上を対象とした全簡易菌種推定のためには、いくつかの指標が考身症状発現例の菌種分離割合と全身症状発現割

えらていたが、それぞれ単独での応用は難しい。

合（全身症状発現個体数／分離個体数）を調査

そこで我々は ns GNR の感受性試験（ディスクした。

拡散法）の血液寒天培地上でしばしば観察され溶血現象の観察：る阻止円周囲に限局した溶血現象が、菌種推

外部検査機関に提出したものと同一菌株を血定に利用可能なのではないかと考えた（図 1）。

液寒天培地上に適当量塗抹し β 溶血、およびそこで本研究ではまず、その特徴を明らかにす

ディスク拡散法を実施した場合の阻止円周囲のることを試み、かつ本現象を活用して簡易な限局的溶血現象を観察し、阻止円周囲の限局的EC の菌種推定方法を考案し、その精度につい溶血現象が観察されたものについて、その発現て検証したので報告する。

時間、抗菌剤および菌種別の陽性頻度（GNR
n=185）、薬剤耐性との関連性（E.coli n=138）［材料と方法］

について調査した。本現象の普遍性を調査する

研究材料は、北見家畜診療所で実施されたため、抗菌剤別陽性頻度と過去に別の地域（網2014 年 7 月 か ら 2015 年 8 月 の 乳 汁 検 査 で 分

走市・常呂町、1999 年 9 月–2000 年 3 月、全身離されたグラム陰性桿菌（Gram-negative rod-

症状発現例由来 n=64）で調査した GNR の抗

shaped bacteria: GNR）のうち、官能検査で菌菌剤別の溶血割合成績とを突合し、2015 年 10

種推定が困難だった緑膿菌、Pasteurella spp.、

月から 11 月に改めて調査した北見地区の成績

Serratia marcescens、Proteus spp. などのコロ（乳汁検査分離例由来 n=109）との比較を行っ

ニー形態・色調・臭気が特徴的な菌種は除いたた。なお、この現象がセフロキシム（CXM）

388 株を対象とした。

で高頻度に観察されることがあらかじめわかっ

GNR 分離頻度と薬剤耐性状況の調査：ていたので、菌種別陽性頻度、薬剤耐性との乳汁検体は綿棒で血液寒天培地（バイタルメ

関連性について CXM 誘発性溶血現象（CXM-

ディア羊血液寒天培地、極東製薬工業株式会社）

induced hemolyis: CXM Hly）についても調査

図1

図1

阻止円周囲の限局的溶血現象。β ラクタムで見られる（左）。右の写真の画線株は全て E.coli。
AM：アンピシリン、CZ：セファゾリン、CXM：セフロキシム、K：カナマイシン、T：オキシ
テトラサイクリン。

－ 84 －

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THE SIMPLE ESTIMATION OF E.COLI.

した。

［結果］

E.coli 推定方法の考案と検証：
GNR 分離頻度：

E.coli（EC）の定義を ABPC 感受性、あるいは 溶血性あり（β・CXM Hly）とし、この官能検査で菌種推定が困難だった牛乳汁由

定義に合致しないものを EC 以外 とし、鑑別来 GNR（non-sensory GNR: ns GNR）388 株

精度を評価した。感度と特異度は、ABPC 耐の分離割合は、それぞれ E.coli（EC）68.6％

性割合 18％および 100％の場合で EC の定義に（266 株合致しない EC の割合（偽陰性率）、EC 以外（K.pneumoniae 59、K.oxytoca 20、 他 9 株 ）、の定義に合致しない EC 以外の割合（偽陽性率）

Enterobacter spp.（Ent）4.6 ％（E.cloacae 6、を求めて計算した。その結果をもとに、EC 有

E.aerogenes 4、他 8 株）、Citrobacter spp.（Cit）

病率 50％および 70％の場合で的中度、正確性

2.3％（C.koseri 5、C.freundii 2、他 2 株）、そを計算した。

の他 1.8％（Chryseobacterium indologens 2 株、）、Klebsiella spp（Kleb）22.6％

Acinetobacter baumannii、Alcaligenes sp.、

［統計方法］

Myroides odoratus、Pantoea agglomerans、菌 種 と 全 身 症 状 と の 関 連 性 は、Klebsiella

Serratia sp. それぞれ 1 株）だった（表 1）。

spp. 分離例とその他の分離例の全身症状発現割

また、菌数 +++ 以上の症例を詳細に調査し合、また ABPC 感受性と溶血性との関連性のたところ、全身症状発現例（n=112）におけ分析は、ABPC 感受性群と耐性群の間の CXM

る菌種別分離割合は EC 76.8％（86 例）、Kleb

Hly 陽性割合で、ともに Fisher の直接確率計

22.3％（25 例）であり、その他（Ent・Cit・他）

算法（両側検定）で検定し、p<0.05 をもっては 0.9％（1 例）であり、その他の全身症状発有意差ありとした。

現例は非常に少なかった。また分離された場合の全身症状発現割合も、Kleb と比較し有意に少ないことがわかった（p= 0.0119）。EC 以外のみを対象に分析したところ、全身症状発現例

表1
表１

菌種と各種割合の関連性。ns GNR 全体の CXM Hly 陽性割合は約 50％（88/185 株）であり、先に行った調査、および 15 年前の別の地区の調査成績とほぼ同じだった（図 2）。
菌数 +++ 以上の個体 (n=207)

菌

分離 ％（n=388）種

全身症状発現例(n=112)

溶血性 ％（n=185）

ABPC耐性 ％（n=388）g)

株数

CXM Hly

β溶血

個体数

分離 ％

全身症状
発 現 ％

137

76.8

62.8

E.coli

68.6

18.0

126

66.7
c)
(84.0)

10.0

E.coli 以外

31.4

97.5

59

6.8

0

70

23.2

37.1

Klebsiella spp.

22.6

97.7

47

4.3

d)

0

56

22.3

44.6

h)

その他

8.8

97.1

12

16.7

0

14

0.9

7.1

h)

4.6

100

3

0

0

14

0.9

7.1

0

0

0

0

0

0

0

0

Enterobacter spp.
Citrobacter spp.
他

a)

2.3
1.8

100

6

85.7

b)

3

33.3
0

e)

f)

a) Chryseobacterium indologens 2株, Acinetobacter baumannii , Alcaligenes sp. , Myroides odoratus , Pantoea agglomerans , Serratia sp .
b) Serratia spp. 2株, Chryseobacterium indologense) Citrobacter koseri 2株f) 株数=140c) ABPC 耐性株d) Klebseilla pneumoniae , K.oxytoca それぞれ1株g) 全身症状発現個体数／分離個体数－ 85 －h)-h) 直接確率 p=0.0119

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E.coli の簡易推定で Kleb 96.2％（25 例）、その他が 3.8％（1 例）

マイシンでは確認されなかった。CXM で最もであった（表 1）。

高頻度に観察され、他抗菌剤で溶血現象が確認

薬剤耐性状況：できる場合には必ず CXM も陽性であった（溶菌種別の ABPC 耐性割合は、EC 18.0％（48/266

血株総数 n=179）。その事実を踏まえ、以降は

株中）、Kleb 97.7％（86/88 株）、Ent 100％（18/18

本溶血現象を CXM 誘発性溶血現象（CXM –株 ）、Cit 100 ％（9/9 株 ） で あ り、 そ の 他 がinduced Hemolysis: CXM Hly）とした。

85.7 ％（6/7 株 ） で あ っ た。 ま た、ABPC 感

15 年前の異なる地域との比較により、抗菌受 性 に よ っ て ns GNR を EC と EC 以 外 の グ

剤別の溶血現象の発現割合には年代・地域に

ループに分けることができた（表 1）。セファ

よる差がほとんどないことがわかった（図 2）。

ゾ リ ン 耐 性 割 合 は、 そ れ ぞ れ 5.3 ％、19.3 ％、また、合計 3 回の調査にいおいて ns GNR 全体

100％、88.9％、90.0％であった。

における CXM Hly 陽性割合にも約 50％とほ溶血現象の観察：とんど差がなく（表 1 との比較）、年代・地域

β 溶血が確認されたのは EC のみであり、そを問わずこの現象は普遍性が高いことが推察さの頻度は 10％だった（14/140 株）（表 1）。阻れた。

止円周囲の限局的な溶血現象の発現時間は、早菌種と CXM Hly との関係 :くて 6 時間後、通常では 12 時間後以降におい菌種別の CXM Hly について調査したとこて観察することができた。この溶血現象は、発ろ、EC が 66.7％、Kleb が 4.3％、Ent が 0％、育阻止濃度前後の特定濃度でのみ発現しておCit が 33.3％で陽性であったことから、この現り（図 1）、抗菌作用との関連性が示唆された。

象が EC に対して特異性が高いことがわかっns GNR による各抗菌剤別の溶血現象の頻度をた（表 1）。今回の GNR の定義から外れるが、網走市・常呂町で 2000 年に調査した成績、おProteus spp. に も 一 部 CXM Hly 陽 性 株 が 存

よびそれに 2015 年において追加調査した成績在した（1/4 株）。また、その他のマイナーなを記した（図 2）。本現象はエンロフロキサシ

菌種では CXM Hly 陽性株は確認できなかっンを除けば β ラクタム系でのみ観察され、カナた。なお、GNR 全体の CXM Hly 陽性割合はマイシン、オキシテトラサイクリン、エリスロ

47.6％（88/185 株）だった。

図 2 「官能検査で菌種推定が困難な牛乳房炎由来 GNR：ns GNR」の抗菌剤別の限局的溶血現象の頻度。
2000 年（網走市・常呂町）、2015 年（北見地区）に調査。主に β ラクタム系で見られ、CXM の頻度が最も高い。EM：エリスロマイシン、ERFX：エンロフロキサシン、OTC：オキシテトラサ
図2
イクリン、KM：カナマイシン、PC：ペニシリン、PMPC：ピブメシリナム。

100

GNR の抗菌剤別の溶血割合 ％80

2000年 （網走・常呂 n=64）
2015年 （北見 n=109）60

51.6 53.2

40

ND : 未実施

41.3

38.5
34.4
29.4

20

12.5
1.6

0

ND

PC

ND

ND

PMPC ABPC CEZ
n=34

CXM

n=104

0

0

0 ND

ND

KM

OTC

EM

ERFX
n=32

－ 86 －

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薬剤耐性と CXM Hly の関連性：［考察］

EC における薬剤耐性と CXM Hly との関連性について調査したところ、ABPC 耐性株に官能検査で菌種推定が困難な牛乳汁由来グラ

おいて CXM Hly 陽性頻度がより高いことがわ

ム陰性桿菌（non-sensory Gram-negative rod-

かった（84.0％ vs. 61.1％、p=0.0363、それぞshaped bacteria: ns GNR）の簡易な菌種推定

れ n=25、113）。その他の抗菌剤耐性との関連方法を考案するにあたり、まずその菌が分離性は認められなかった。

される頻度について調査した。菌種別の分離

EC 推定方法の考案と検証：

頻度は過去の報告と同様であり［3, 5, 12, 16］、

ABPC 耐 性 割 合 18 ％ に お け る 偽 陰 性 率 は

ns GNR は E.coli（EC）（68.6 ％） と EC 以 外

2.6％（ABPC 耐性割合 18％× CXM Hly 陰性（31.4％）の 2 つに大きく分けることができた（表割合 16％× β 溶血陰性割合 90％）、偽陽性率は1）。最も分離頻度が高い EC の推定により、残9.3％（ABPC 感受性割合 2.5％＋ CXM Hly 陽りの検査による手間とコストの削減が期待でき

性割合 6.8％ ＋ β 溶血陽性割合 0％）であった。

た。EC 以 外 は、Klebsiella spp.（Kleb） と そ

ABPC 耐性割合 100％では偽陰性率は 14％での他に分けられるが、その約 70％が Kleb でああった。この結果から、ABPC 耐性割合 18％

ることがわかった。また全身症状との関連性ので は 感 度 は 97.4 ％（ABPC 耐 性 割 合 100 ％ で

調査では、その他の菌種により全身症状が発現

86.0％）、特異度 90.7％となった。また、ABPC

することは Kleb より有意に少なく（p=0.0119）、

耐性割合 18、100％、EC 有病率 50、70％では、全身症状がある場合、Kleb の分離割合が非常

EC 的中度 90.5-96.2％、EC 以外の的中度 73.4-に高いこともわかった（96.2％、表 1）。したがっ97.3％、正確性は 87.4-95.2％であった。ABPCて、状況により EC であることが否定できれば、耐性割合にかかわらず、EC 有病率の増加によ

Kleb はほぼ確定することができ、Kleb を推定

り EC 的中度は増加した一方、ABPC 耐性割合

する簡易で有用な方法がない現状においては、の低下や EC 有病率の低下により EC 以外の的EC をまず先に推定する方が合理的であると考中度は増加した（表 2）。

えた。
EC の簡易推定方法を考案するにあたり、まず ABPC の感受性を考えた。乳汁由来 EC は他の菌種と異なり、通常 ABPC 感受性である［7,表2

簡易推定方法の理論的精度。E.coli の定義を「ABPC 感受性 あるいは溶血性（β、CXM Hly ）あり」
表２とした場合、
E.coli 有病率 50％以上では、ABPC 耐性割合にかかわらず E.coli 的中度は 90％以上。

EC a) ABPC 耐性割合

18.0 ( 100 )b)

EC 有 病 率
感
特

異

50.0

70.0

度

97.4 ( 86.0 )度

91.0 ( 91.0 )EC 的中度

91.5 ( 90.5 )96.2 ( 95.7 )EC 以外 的中度

97.3 ( 86.7 )92.9 ( 73.4 )

94.3 ( 88.5 )95.2 ( 87.4 )

正

確

単位 ％

性

a) E.colib) (－ 87 －) ABPC耐性割合 100％の場合

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E.coli の簡易推定

11, 14］ことから、海外でも乳汁由来の EC のたが、羊赤血球に対する溶血性は通常ないとさABPC 耐性の割合は 10–30％である。この割合

れていることから［1, 19］この 2 株は特殊では、年毎で変動は予想していたほど高くはなくあったといえる。Citrobacter spp. の一部を除［3, 5, 8, 12, 16］、今回の調査でも同様にその耐き、ブドウ糖非発酵菌の類のその他のマイナー性割合は 18％程度であった（表 1）。このことな菌種は、今のところ陽性株は確認できていなは糞便由来 EC の多くが ABPC 耐性であること

い。Citrobacter spp.、Enterobacter spp. を含めと対照的であり［5］、またその他の菌種は染色たマイナーな菌種はまだ調査した株数が少ない

体上で保有する β ラクタマーゼの性質上 ABPC

ので今後さらに検討する必要はあるが、それ自然耐性である［7, 10, 11, 14］。ABPC 耐性割らの分離頻度は簡易推定の上では特に問題に合を調査した結果では想定した通り ns GNR

ならないと思われる（表 1）。またこの菌種のを 2 グループに分けることができた（表 1）。

特異性は、CXM Hly の性質が容易に菌種の壁しかし、ABPC 耐性割合の変動幅を考えた場を越えるようなプラスミド性である可能性は合では、ABPC 感受性単独では EC の菌種推定低いと考えられる。さらに、R プラスミド性のは難しくなることが予想された。

可能性について確認するために、薬剤耐性状

溶血性においては、乳汁由来 EC には他の況との関連性を調査したところ、EC の ABPC

ns GNR にはほとんど見られない β 溶血株が存

耐性株の CXM Hly 陽性頻度は 84.0％であり、在しているが［6, 15］、今回の調査でも EC 以

感受性株の 61.1％よりも高いことがわかった

外の菌種には全く溶血は見られなかった。その（p=0.0363）。 し た が っ て CXM Hly は ABPC

頻度は過去の報告［6］と同じく 10％程度と低耐性割合が高い地域で高い頻度で観察される可

い頻度であった（表 1）。溶血は EC を特徴づ

能性が示唆された。一方その他の抗菌剤との関ける重要な指標ではあるが、β 溶血単独での菌連性は見られなかったので、上記菌種特異性と種推定は難しい。一方、β 溶血とは異なるディの関連性も含め、AmpC 型や基質拡張型 β ラ

スク周囲の限局した溶血現象（図 1）について

クタマーゼ産生などのプラスミド性の可能性はも全く報告がなく、現時点ではこの現象が菌種低いと考えられ［11, 13, 14］、局地的に発現頻推定に利用できるかどうかは不明である。本研

度が大きく異なる可能性は低いと思われた。こ究では本現象の特徴を明らかにすることも目的

れらは、CXM Hly がどの国・地域でも普遍的としている。ns GNR における本溶血現象の薬に観察できる現象であることを強く示唆してい剤別の発生状況を調査したところ、主にこの現る。

象は β ラクタム系の抗菌剤で観察される現象

以上のことから、CXM Hly は① EC 特異性であることがわかった（図 2）。特に CXM でが高い、② ABPC 耐性株でより多く発現する、陽性頻度は約 50％と最も高く、かつ他剤で溶③普遍的に観察される現象という、菌種推定に血現象が確認できる場合では必ず CXM も陽性利用可能な 3 つの特徴があることがわかった。

となった。CXM 誘発性溶血現象（Cefuroxime-

CXM Hly と ABPC 感受性との関連性が明らか

induced Hemolyis: CXM Hly）の年代別・地域になったたことから、EC のもう 1 つの特性で別発現状況について調査したところ、別地域

ある β 溶血性を加えた EC の推定方法を検証しの 15 年前の発現割合とほとんど差がなく（図た。EC の定義を ABPC 感受性あるいは溶血2）、特に ns GNR における CXM Hly 陽性割合性あり（β、CXM Hly）とし、EC 以外の定義が合計 3 回の調査でほぼ同様に約 50％だった

を ABPC 耐性かつ溶血性なしとした場合で鑑ことから（図 2、表 1）、この現象が ns GNR に別精度を計算したところ、EC の ABPC 耐性割

普遍的なものであり、どの国・地域でも観察さ合が 18％の場合、感度 97.4％、特異度 90.7％、れる現象であると示唆することができた。まABPC 耐性割合が 100％では感度は 86.0％だっ

た CXM Hly と菌種との関連性を調査したとこ

た（表 2）。ABPC 耐性割合の増減に合わせてろ、EC の 70％近くの株で観察される EC に特

EC 全体の CXM Hly 陽性割合も増減したので、異性の高い現象であることがわかった（表 1）。

CXM Hly 単独の場合よりも安定した精度が期

Kleb でも 47 株中 2 株で CXM Hly が陽性だっ待できることがわかった。的中度においても総－ 88 －

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THE SIMPLE ESTIMATION OF E.COLI.

じて高く、EC 的中度は ABPC 耐性割合にか

翌日には鑑別できる。今後は更なるコストと業かわらず EC 有病率（分離割合）が高いほど高務軽減のためにも Kleb とその他を鑑別する簡値を示すことがわかった。一方、EC 以外の的

易な方法について検討したいと考えている。ま中度は、EC 有病率がより低いほど、ABPC 耐

た、CXM Hly の発現機序は不明であるが、β性割合がより低いほど高値を示すことがわかっ

ラクタムの発育阻止濃度前後の特定の濃度で発た。以上のことから、EC と鑑別された場合に現する抗菌作用との関連性が示唆されたことは ABPC 耐性割合にかかわらず EC と推定でから（図 1）、CXM が最多である理由や ABPC

きること、また EC 以外と鑑別された場合でも、耐性株で多い理由または溶血素の種類とその放EC の ABPC 耐性割合が 100％のような極端な出（あるいは漏出）機序についても今後検討し場合でなければ EC 以外であると推定できるこ

たい。

とがわかった。したがってどの国や地域にお本研究において、ns GNR のうち最も分離頻いても臨床的に問題なく EC と EC 以外に識別度が高い EC を特別な検査手技に頼らず低コスすることができると思われた。なお、EC 以外

トでどの地域でも高い再現性で迅速に菌種が推の約 70％は Kleb であったが、全身症状を伴う定できる可能性を示すことができた。現場にお症例で EC が否定された場合、そのほとんどがける簡易性を重視した本推定法は、多忙で制約

Kleb であり（表 1）［18］、その可能性を強く疑っの多い臨床家にとって有用な菌種推定方法の 1

た対応が可能であった。

つになりうるものと思われた。

菌種推定方法を考案するにあたり、その分離［謝辞］

頻度、臨床的重要性、公衆衛生学的重要性から
ns GNR を EC、Kleb、その他の 3 つのグルー

本稿を終えるにあたり、忙しい業務の中ご協

プに分けて検討するのが合理的であると思われ力頂いた、NOSAI オホーツク 北見家畜診療所

た。臨床的には EC よりも Kleb で重篤化するの皆さまに深謝いたします。

との報告もあるが［17, 18］、現場の臨床家が望
むような簡易で有用な Kleb 推定方法がない現状では、まず EC を先に推定（あるいは否定）すべきである。今回の調査により、EC の特性、
すなわち ABPC 感受性、溶血性（CXM Hly、
β 溶血性）を併用すれば、高い精度で EC であることを推定することが可能であった。また
EC 以外も高い精度で推定することが可能であり、特に全身症状発現例では、その分離頻度から Kleb とほぼ確定できることがわかった。
CXM Hly の利点として、簡易性の他にコスト、再現性の高さ、迅速性が挙げられる。使う資材・器材が少ないだけでなく、EC を推定する精度が高いことから EC 以外の菌種を同定する場合でも同定検査にまわす検体数を大幅に削減することができ、コストダウンと業務軽減もできる。また、CXM Hly および β 溶血性は視認性が高いため再現性が高く確認作業に時間もかからないという利点も併せて持つ。CXM
Hly は 6-12 時間で判定でき、感受性が判定できる程度のコロニーが生えれば CXM Hly の確認が可能である。検体培養と感受性試験を同時に行う簡易方法（直接法）でも実施可能であり、－ 89 －

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E.coli の簡易推定

参考文献
1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

Albesa I, Barberis LI, Pajaro MC, Farnochi MC,
Eraso A. 1985. A thiol-activated hemolysin in gramnegative bacteria. J. Can J Microbiol. Mar; 31 (3):297-300.
Bannerman D.D. 2004. Characterization of the
Bovine Innate Immune Response to Intramammary
Infection with Klebsiella pneumoniae. J. Dairy Sci.
87: 2420-2432.
Erskine RJ, Walker RD, Bolin CA, Bartlett PC
and White DG. 2002. Trends in Antibacterial
Susceptibility of Mastitis Pathogens. During a
Seven-Year Period. J. Dairy Sci. 85:1111-1118

14.

15.
16.

17.

福井 祥悟，松原 靖，伊藤 隆晶，渡辺 英樹．
2006．牛乳房炎起因菌の迅速・簡易同定における酵素基質培地の有用性．家畜診療 53（11），651-656
Hendriksen RS, Mevius DJ, Schroeter A, Teale C
et al. 2008. Prevalence of antimicrobial resistanceamong bacterial pathogens isolated from cattle indifferent European countries: 2002-2004. Acta Vet
Scand. 50 (1): 28
布施勝利，函城悦司，菊池直哉，中野良宣，中岡祐司，村上晋一．1993．乳牛の甚急性乳房炎から分離された大腸菌の性状．日獣会誌 46，917-919
池田文昭．多剤耐性菌検査の手引き．アシネト
バクターを含むブドウ糖非発酵菌．2012．日本
臨床微生物学会
http://www.jscm.org/tazaitaisei/54_03-02.html
神野雅子，今村智子，杉山美恵子，豊田洋治．
2010．Klebsiella Pneumoniae に よ る 牛 甚 急 性乳房炎に対する抗生剤の使用法の検討．家畜診療，57，259-263
菊 佳男．2015．わが国における牛乳房炎の発生状況ならびにその問題点と対策 : 乳牛の乳房炎に関する全国アンケート調査から．家畜感染症学会誌 4（3），109-132
厚生労働省 院内感染対策サーベイランス事業
JANIS．2014．
http://www.nih-janis.jp/report/open_report/
2014/3/1/ken_Open_Report_201400.pdf
小松方，多剤耐性菌検査の手引き . 腸内細菌．
2010．日本臨床微生物学会
http://www.jscm.org/tazaitaisei/54_03-01.html
Metzger SA and Hogan JS. 2013. Shortcommunication: Antimicrobial susceptibility andfrequency of resistance genes in Escherichia coli
isolated from bovine mastitis. J. Dairy Sci. 96 :3044–3049
中 村 文 子， 近 藤 成 美．2010．
「臨床検査ひと－ 90 －

18.

19.

くちメモ」No.205．モダンメディア 56（10）:250-256
大西守，加藤肇，大野浩．2008．乳房炎起因菌の薬剤耐性化の現状と牛における多剤耐性菌の疫学．家畜診療 55，17-26
小栗豊子 編．2008．臨床微生物検査ハンドブッ
ク 第三版．三輪書店，東京 pp83-91
酒 見 蓉 子， 御 囲 雅 昭， 篠 田 浩 二 郎， 村 松 康
和 , 上 野 弘 志， 田 村 豊．2010． 北 海 道 石 狩 地
域における牛乳房炎由来 Escherichia coli および Klebsiella 属菌の薬剤感受性．日獣会誌 63，215-218
Schukken YH, Bennett GJ, Zurakowski MJ, Sharkey
HL, Rauch BJ, Thomas M J, Ceglowski B, Saltman
RL, Belomestnykh N and Zadoks RN. 2011.
Randomized clinical trial to evaluate the efficacy
of a 5-day ceftiofur hydrochloride intramammary
treatment on nonsevere gram-negative clinicalmastitis. J. Dairy Sci.Dec; 94 (12): 6203-15.
杉山美恵子，渡部雅子，園部隆久，村上慶政，
井原晴喜，豊田洋治．2013．乳牛の Klebsiellapneumoniae による甚急性乳房炎の診断と治療方法の検討．家畜診療 60，265-270
Szramka B1, Kurlenda J, Bielawski K. 1998.
Hemolytic activity of Klebsiella pneumoniae andKlebsiella oxytoca. Med Dosw Mikrobiol.50 (3-4):
207-13.

The Journal of Farm Animal in Infectious Disease
Vol.5 No.3 2016

THE SIMPLE ESTIMATION OF E.COLI.

An attempt of the simple estimation of Escherichia coli from dairy cows mastitis
by combination with aminobenzylpenicillin susceptibility and cefuroxime-induce hemolysis
Yoshihiko Sentoku1）, Kohei Okubo1）
1）Kitami Veterinary Clinic, Okhotsk Agricultural Mutual Aid Association（497-1 misono, kitami-shi, hokkaidou 099-0879）
Correspondence to Yoshihiko SENTOKUTEL: 0157-66-6702 FAX: 0157-35-3911
E-mail: y-sentoku@nosaiok.or.jp［Abstract］
Microbiological examination procedures of dairy cows mastitis to distinguish Escherichia coli（EC）from Klebsiella spp. other（the others）have been complicated. Although there is a need formore simple differential methods for clinicians, such methods are not reported. The local hemolysis
that different from the β hemolysis, around a zone of inhibition of Gram-negative rod-shaped
bacteria（GNR）on blood agar plates is often observed, but this phenomenon is not reported. We
investigated characteristics of the phenomenon for estimaition of strains of GNR. It was observed
mainly around of β-lactam, hemolysis by cefuroxime（CXM）was the highest frequency and always
positive when observed hemolysis by other antibiotics. So, it was named CXM-induced Hemolysis（CXM Hly）for convenience. We investigated CXM Hly expression status of each strains, at anotherregion of 15 years ago, relevance of the antibitotics resistance. It was observed in high specificallyat EC, universally regardless of regions and age, more highly frequency in aminobenzylpenicillin（ABPC）resistance EC than ABPC susceptibile significantly. We assumed EC’s definition is“ABPC susceptible,or hemolytic（β, CXM Hly）” for distinguish EC from the others. According toit,theoretical discrimination accuracy were sensitivity 97.4% and specificity 90.7% in ABPC resistnace
ratio 18%. If ABPC resistance ratio 100%, sensitivity 86.0%. In EC prevalence of 50% or more, EC
predictive value were more than 90% regardless of EC’s ABPC resistance ratio. We concluded
that it is possible to distinguish EC from the others by combination with ABPC susceptibility andhemolysis with a high degree of accuracy, very simply and rapidly.
Key words: cefuroxime, coliform mastitis, E.coli, estimate a strain, hemolysis－ 91 －