紫外線応答型リポソームの膜融合性を用いた送達システムの開発
奈良工業高等専門学校物質化学工学科

宇田亮子

Liposomes are microscopic spheroidal capsules composed of phospholipids, and they have been extensively used as drug
nano-carriers. Ideal drug delivery systems contain interacting groups that can respond to environmental stimuli. Light canbe remotely applied with high spatial and temporal precision and we have therefore designed a triphenylmethane derivative
as a photoresponsive amphiphile which undergoes photoionization to become an amphiphilic compound consisting ofa hydrophilic triphenylmethyl cationic head group and a hydrophobic long alkyl chain tail. Under dark conditions, thehead group of the triphenylmethane derivative is less polar than after irradiation, and it is thus sufficiently lipophilic to besolubilized in the lipid membrane. We have found that photoionization of the triphenylmethane derivative induced fusion
between liposome membranes. Fusion between lipid membranes is one of the most important events in living cells forfertilization, cell fusion, endo- and exocytosis, reconstruction of damaged organelles, and cell division. The purpose of thiswork is to prepare photofusogenic liposomes containing the triphenylmethane derivative and to investigate the liposomes fortransdermal delivery sensitive to UVB light. The liposomes encapsulating calcein were prepared for characterization. The
encapsulation efficiency and photoinduced release were evaluated from the fluorescence of calcein. The morphology of theliposomes was observed by using transmission electron microscopy. The morphological changes in the liposomes indicatedthat UVB irradiation induced fusion between the liposomes. NR assay using HaCaT cells showed that the triphenylmethane
derivative in the liposomes was almost noncytotoxic up to a concentration of 220 µM. From the observation of LabCyte
EPI-Model treated with the liposomes encapsulating calcein, liposomes were permeated into the human skin model. We also
found that the UVB irradiation promoted the permeation of the liposomes.

１．緒とした。

言

これまでに我々は、暗時では脂溶性であるが紫外光照射

リポソームは、リン脂質二分子膜から成る数十 nm ～数によってカチオン性界面活性剤となるトリフェニルメタンµm の大きさの閉鎖小胞体である。化粧品製剤またはドラ誘導体（Fig. 1）を開発し、この分子を脂質膜に僅かに加えッグキャリアとして盛んに開発が進められており、リポソるだけで光融合性をリポソームに付与できることを明らか

ームの更なる多機能化が望まれている。ところで膜融合は、にしている 1）。トリフェニルメタン誘導体は親水基がかさリポソームを細胞に作用させる際の重要な現象であり、エ高い界面活性剤となるため、膜融合の中間体安定化に有利ンドサイトーシスといった細胞現象とも関係し、内包薬剤な構造を持つと言える 2）。そこで本研究では、このトリフを細胞質内に導入させるための重要な役割を果たしている。
しかし元来脂質二分子膜は安定であり、膜融合性を持たせるためにタンパク質やペプチドをリポソームに付与すると、それによりリポソーム自身が不安定化してしまうという矛盾が生じる。そこで必要となるのは、標的膜と相互作用するまで安定性を保つ仕組みである。本研究では、外部刺激として紫外線に応答するトリフェニルメタン誘導体を用い光照射でリポソームに膜融合性を誘起させ、このリポソームを用いた照射細胞への薬物送達を行うことを目的とした。
過度に紫外線を浴びると表皮はダメージを受け、肌の健康は損なわれてしまう。本研究では、紫外線に反応し薬剤や有効成分を表皮の細胞に届ける仕組みづくりを目指すことDevelopment of photofusogenic liposomes
for delivery system
Ryoko Uda
Department of Chemical Engineering,
National Institute of Technology, Nara
College− 27 −Fig. 1 トリフェニルメタン誘導体の光イオン化反応と膜融合

コスメトロジー研究報告 Vol. 31, 2023ェニルメタン誘導体を経皮リポソームに展開し、基礎物性

2 . 3 . リポソームへの紫外光照射評価に加えて送達システムへの展開を検討した。

2．方

光源には UVB（312 nm BLX UV tubes, コスモバイオ）を用いた。UVB の照射強度はトプコン UVR- 3036 /S 2 を法用い 305 nm にて評価した。調整したリポソーム懸濁液

2 . 1. リポソームの調製

800 µL に UVB を照射し、そのリポソーム懸濁液を 700 µL

リン脂質に非イオン性界面活性剤を加えた経皮性リポを取り出しこれを内液とし、3 mL の PBS を外液としてソームが報告されており 3）、この報告を基に本研究のリポ25 ℃の恒温槽にて透析を 17 時間行った。その後外液のソームを調製した。まず卵黄レシチン（最終濃度 0 . 112 M）、515 nm におけるカルセインの蛍光強度から次式に従いカTween（最終濃度 13 . 1 g/L）
、トリフェニルメタン誘導体ルセインの放出率を測定した。測定は独立して調整した 3を含む薄膜を作製した。これに PBS 緩衝液（pH 7 . 4）を加つのリポソームについて行い、結果は平均値±標準偏差でえて懸濁させ、超音波処理を行い、孔径 100 nm のフィル示した。

ターを装着したエクストルーダーを用いた処理を経てリポ放出率（%）=［（外液中のカルセイン量）
÷ソームを調製した。内包や放出実験には、200 µM カルセ（内液のリポソームに含有されたカルセイン量）］×100

インを含む PBS 緩衝液を用いて調製し、透析によって内包されなかった物質を除去した。内包率は、透析後のリポ2 . 4 . クライオ透過電子顕微鏡観察

ソーム 50 µL に 950 µL の PBS と界面活性剤である dodecyl

調製したリポソームを PBS で 10 倍に希釈したものをサ

trimethyl ammonium chloride を 0 . 2 g 加えて完全にリポンプルとした。紫外光照射サンプルには、307 mJ/cm 2 のソームを破壊させ、カルセインの 515 nm における蛍光強UVB を照射した。クライオ透過電子顕微鏡（JEOL-JEM度から算出した。測定は独立して調整した 3 つのリポソー

2200 FS）観察は奈良先端科学技術大学院大学にて実施しムについて行い、結果は平均値±標準偏差で示した。ただた。

しトリフェニルメタン誘導体の割合が高く調製が困難であったリポソームに関しては、1 回分のデータを示した。

2 . 5 . 3 次元皮膚モデルを用いた浸透試験

2 . 2 . 細胞毒性試験社製）を用いた。ガラスバイアルにマグネチックスターラ

3 次元皮膚モデルには LabCyte EPI-MODEL 24（J-TEC
ヒ ト 表 皮 角 化 細 胞（HaCaT）は、Dulbecco’s Modified

ーと PBS を 19 . 0 mL を入れて培養カップごと皮膚モデルをEagle Medium に 10 % の牛胎児血清とペニシリン、ストレ装着した。32 ℃で 30 分間馴化した後、角層面に 2 . 1 . でプトマイシンを添加した培地を用い、炭酸インキュベータ作製した 100 µL のリポソーム懸濁液またはカルセイン溶ー（37 ℃、炭酸濃度 5 . 0 %）において培養した。HaCaT 細液（濃度はリポソーム内包量に相当）を曝露し 32 ℃で４時

胞に対するサンプルの細胞毒性を Neutral red（NR）取込み間静置した。その後マイクロピペットでサンプルを除去し、法によって評価した。96 well 細胞培養プレートに HaCaTUVB（312 nm BLX UV tubes, コスモバイオ）を 50 mJ/cm 24細胞を 2 × 10 cells/well の細胞密度で播種し、炭酸インキを照射した。その後 PBS を 20 µL 添加し、32 ℃で４時間ュベーターで培養を行った。約 24 時間後、2 . 1 . で得られ静置してから PBS で 10 回洗浄し、培養カップから 3 次元たリポソームを含む培地に交換し曝露培養を行った。陰性

皮膚モデルを取り出して蛍光顕微鏡にて角層面の観察を行対照群には、10 % PBS と 0 . 1 ％ DMSO を含む培地を添加った。また 3 次元皮膚モデル切片蛍光顕微鏡観察も行った。

した。24 時間後、細胞から培地をアスピレーターで除去し、この 3 次元皮膚モデル１枚に対して PBS 1 . 0 mL を添加し100 µL の PBS で 1 回リンスし 33 µg/mL の NR を含む培地て超音波ホモジナイザーでホモジナイズし、暗所で 1 時間

100 µL を添加した。炭酸インキュベーターで 2 時間培養振とうし、遠心分離を行い上清を回収した。上清 200 µLを行い、生細胞に NR を取り込ませた。100 µL の PBS で 2をブラックプレートに移して、蛍光（Excitation：485 / 20 ,回リンスし、NR 抽出液（1 % 酢酸を含む 50 % エタノール水

Emission：528 / 20）を測定しカルセイン濃度を求めた。

溶液）を 100 µL ずつ well に添加して室温で 20 分間振盪し、３．結果と考察生細胞に取り込まれた NR を抽出した。抽出液の 570 nmの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定して、陰性対

3 . 1. リポソームの基礎物性

照群の細胞生存率を 100 % とした場合の各試料濃度での細Fig. 2 に含有トリフェニルメタン誘導体濃度を変化させ胞生存率を以下の式で求めた。独立した 6 回の試験を行い、た場合のカルセイン内包率を示す。レシチンに対するトリ結果は平均値±標準偏差で示した。

フェニルメタン誘導体濃度が 4 mol% 以下では内包率にほ細胞生存率（%）=［（試料添加群での OD 570）
÷

とんど違いはないが、この濃度を超えると内包率は著しく（陰性対照群での OD 570）
］×100低下した。また、4 mol% を超える濃度のトリフェニルメ− 28 −

紫外線応答型リポソームの膜融合性を用いた送達システムの開発

Fig. 2 リポソーム内包率のトリフェニルメタン誘導体濃度依存性
レシチンに対するモル濃度で表記 .

Fig. 3

調整したリポソームの cryo-TEM 像
矢印は変形したものを示す．

タン誘導体を含むリポソームは調整しにくく、内包率算出に至ったリポソームは少なかった。トリフェニルメタン誘導体は暗時では脂溶性物質であるため、リポソーム二分子膜に溶解させる必要がある。トリフェニルメタン誘導体の量が増えると、二分子膜中に収容しきれなくなりリポソーム構造を保つことが困難になったのではないかと考えられる。またこれまでの我々の研究から、膜融合に最適なトリフェニルメタン誘導体濃度は 2 mol% 程度であることを明らかにしている 2）。そこで以降の実験では、トリフェニルメタン誘導体濃度はレシチンに対して 2 mol% のリポソー
ムを用いることとした。
次にリポソームを透過型電子顕微鏡にて観察したところ、Fig. 4

トリフェニルメタン誘導体曝露時の HaCaT 細胞生存率

直径が数十～数百 nm の球状リポソームが観察された（Fig.
3）
。加えて Fig. 3 に矢印で示すような、球の一部が窪んだまたは扁平形状のリポソームも観られた。一般的なリポ

220 µM 以下では無視できる程度であることが分かった。

ソームは剛直であるが、経皮性リポソームには角層を通過するための弾力性や柔軟性が不可欠である。そのため Fig.

3 . 2 . 紫外光照射によるリポソームの変化

3 のような変形したリポソームが観られたと考えられる。

作製したリポソームの光化学反応について調べるために、作製したリポソームの生体適合性について調べるため、UVB 照射後の吸収スペクトルを測定した（Fig. 5）。積算光

HaCaT 細胞を用いた細胞毒性評価を行った。リポソーム量が増加するとともに 450 nm と 620 nm 付近の吸収ピーク

自体の細胞毒性は低いと考えられるが、光応答性をもたら強度が増大している。これらのピークはイオン化したトリすトリフェニルメタン誘導体の評価が必要である。そこでフェニルメタン誘導体に由来しており 4）、UVB 照射によ比較のために、トリフェニルメタン誘導体を 1 % の DMSOってトリフェニルメタン誘導体のイオン化反応が促進したを含む PBS 緩衝液に溶解させたサンプルについても試ことが分かった。

験を行った。HaCaT 細胞の生存率を Fig. 4 に示す。1 %次に内包したカルセインの紫外光照射による放出についDMSO 溶液中ではトリフェニルメタン誘導体濃度 4 . 5 µMて検討した。Fig. 6 に積算光量に対する放出率依存性を示の時に HaCaT 細胞の生存率は 90 % であったが、リポソす。UVB 未照射でもリポソームからカルセインが漏出しーム中ではトリフェニルメタン誘導体濃度 22 µM の時にていることが分かる。UVB 照射により放出率は増加した99 % となった。トリフェニルメタン誘導体の細胞毒性はが、102 mJ/cm 2 以上で放出率が飽和しており、これ以上リポソームに含有されることで軽減され、本研究で作製し照射を行っても放出されるカルセイン量にほとんど違いがたリポソームの細胞毒性はトリフェニルメタン誘導体濃度ないことが分かる。この結果は Fig. 5 の光イオン化反応が− 29 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 31, 2023

積算光量に対して明確な依存性を見せたのと対照的である。
307 mJ/cm 2 の UVB を照射したリポソームのクライオ電子顕微鏡像を Fig. 7 に示す。Fig. 3 の UVB 未照射時に比べると、リポソームサイズが大きくなっていることが分かる。以前我々は、トリフェニルメタン誘導体への紫外光照射が引き起こす膜融合とそれに伴うリポソームのマルチラメラ化や粒子径の増大を報告している 5）。また膜融合時には内包試薬の放出は僅かであることも明らかとした。つまりこれらの結果から、光イオン化反応が促進されているにもかかわらず内包物があまり放出されないのは、膜融合が起こっているためと考えられた。

Fig. 53 . 3 . 3 次元皮膚モデルを用いたカルセイン内包リポソームの浸透試験

UVB 照射によるリポソームの吸収スペクトル変化

カルセイン内包リポソームを曝露させた 3 次元皮膚モデ
ルの角層面蛍光強度を Fig. 8 に示す。リポソーム懸濁液よりカルセイン溶液を曝露した時の方が、カルセイン由来の蛍光強度が高くなっていることが分かる。またリポソーム懸濁液に UVB を照射しても 3 次元皮膚モデル内のカルセイン濃度に変化は観られなかった。そこで 3 次元皮膚モデル内のカルセイン濃度を調べた（Fig. 9）。Fig. 8 と類

Fig. 6UVB 照射によるリポソームからの内包カルセインの放出
Fig. 7

Fig. 8Fig. 93 次元皮膚モデル角層面の蛍光強度− 30 −UVB 照射後のリポソームの cryo-TEM 像

3 次元皮膚モデル内のカルセイン濃度

紫外線応答型リポソームの膜融合性を用いた送達システムの開発

Fig. 10 3 次元皮膚モデル切片の蛍光顕微鏡像a）カルセイン溶液曝露、b）カルセイン内包リポソーム曝露、c）
カルセイン内包リポソーム曝露後 UVB を照射似した結果となり、リポソームや UVB 照射の効果は観ら謝辞れなかった。表面に存在するカルセインの影響を受けてい本研究の実施にあたりご支援いただきました公益財団法るためではないかと考え、3 次元皮膚モデルの切片観察を人コーセーコスメトロジー研究財団に深く御礼申し上げま行った。カルセイン溶液のみを曝露した場合（Fig. 10 a）は、す。

Fig. 8・9 の結果と対応するように 3 次元皮膚モデル表面に強い蛍光が観察されたが、内部への浸透はあまり観られ（引用文献）なかった。それに対し、リポソーム懸濁液を曝露した場合

1） K. Hayashi, M. Watanabe, T. Iwasaki, M. Shudou, R.

（Fig. 10 b）は 3 次元皮膚モデル内部でも蛍光が観察された。

M. Uda, Endosomal escape by photo-activated fusion

これより Fig. 3 の結果から示される弾力性や柔軟性をもっof liposomes containing a malachite green derivative:

た本研究のリポソームは、3 次元皮膚モデルへの浸透性に

A novel class of photoresponsive liposomes for drug

優れていることが明らかとなった。さらに UVB 照射を行

delivery vehicles, Photochemical & Photobiologicalった皮膚モデルにおいてはより深部でも蛍光が確認できた

Science 18, 1471-1478（2019）．

（Fig. 10 c）。つまり Fig. 8 にてカルセイン溶液曝露の蛍光

2） R. M. Uda, Y. Yoshikawa, M. Kitaba, N. Nishimoto,が強く観察されたのは表面に吸着したカルセインに由来しIrradiation-induced fusion between giant vesicles andており、リポソームを用いた方が 3 次元皮膚モデル内部へ

photoresponsive large unilamellar vesicles containingの送達が促されること、さらに UVB 照射によってその送malachite green derivative, Colloids and Surfaces B,達が促進されることが示された。

167, 544-549（2018）．

４．総

3） Y.-K. Song, C.-K. Kim, Topical delivery of low-括

molecular-weight heparin with surface-charged flexible
liposomes, Biomaterials 27, 271-280（2006）．

本研究では、紫外光応答型経皮用製剤としての融合性リポソームの開発を目指し、トリフェニルメタン誘導体を含4） R. M. Uda, M. Oue, K. Kimura, Effective photocontrol

むリポソームを作製しその評価を行った。リポソームには、of micelle formation by malachite green derivative

内包薬剤の皮膚透過を制御し、皮膚中に比較的高濃度で薬

carrying a long alkyl chain, Chemistry Letters, 33, 586-

剤を留める働きがある。必要となるまでは皮膚の細胞間に587（2004）．

薬剤を留めておき外部刺激を受けて薬剤を細胞に届けるリ

5） R. M. Uda, E. Hiraishi, R. Ohnishi, Y. Nakahara,

ポソームには、医薬品に加えて医薬部外品や化粧品への展K. Kimura, Morphological changes in vesicles and開が期待できる。今後は、本研究の紫外線応答型融合性リ

release of an encapsulated compound triggered

ポソームを更に進展させコスメトロジーの発展に貢献した

by a photoresponsive malachite green leuconitrile

い。

derivative, Langmuir, 26, 5444-5450（2010）．

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