Protective Vaccine against Bacterial Infection

総説

細菌感染に対する防御ワクチン渡耒

仁

大阪府立大学大学院生命環境科学研究科（〒 598-8531

大阪府泉佐野市りんくう往来北 1-58）

た。新規 pH 感受性膜融合高分子を修飾したリ［はじめに］
感染症を予防するうえで有効なワクチンは、

ポソームは樹状細胞に対して指向性を持ち、高自然感染による免疫応答の誘導プロセスを模倣い免疫応答を誘導できることから、家畜におけできるワクチンが有用である。病原微生物が生る感染症予防のための防御ワクチン（新規粘膜体に感染する場合その多くは粘膜を介して感染

ワクチン）として応用が可能である。今回、細し、その後誘導される免疫（粘膜局所免疫なら菌感染に対する防御ワクチンとして新規 pH 感

びに全身免疫）応答により排除される。そのた

受性膜融合高分子修飾リポソーム粘膜ワクチン

め、病原微生物感染の第一ステップである粘膜の有用性について概説する。

感染を防止できるワクチン（粘膜ワクチン）は、［粘膜免疫］

感染症を予防する上で特に有効な防御ワクチンとなる。しかしながら、従来からの注射によるほ乳類において粘膜は、生体が直接外界と接ワクチンは、全身免疫応答を効率よく誘導できし無数の病原微生物や外来抗原などの異物と直るが、病原微生物の感染部位である粘膜局所に接接触する最前線である。外部環境と接する界

免疫応答を誘導できない。そのため防御効果は

面の粘膜は、同じく外界と接する皮膚に比べて不十分である。自然感染による免疫応答の誘導

数百倍の表面積を有しており、さまざまな病原プロセスを模倣できる粘膜ワクチンの開発に微生物にとって動物体内に侵入する主要な経路

は、粘膜免疫誘導組織へ効率よくワクチン抗原となっている。そのため、あらゆる異物の体内を送達できるシステムの構築が重要である。

への侵入を阻止する上で、粘膜面における免疫防御機構が重要な役割を果たしている。

近年、粘膜免疫誘導組織にワクチン抗原を送達させるシステムとして人工マイクロカプセル

例えば、消化管や呼吸器などの生体粘膜は、であるリポソームが注目されている。リポソー

絶えず暴露されている細菌、ウイルスなどの微ムは、その膜上に病原体の抗原物質を再構成す

生物、異物の侵入を阻止するために、粘膜免疫ることができるだけでなくカプセル内に封入すを誘導する誘導組織と実際に粘膜免疫が機能することもできる。さらにリポソームは、免疫担る実行組織からなる共通粘膜免疫機構（com-

当細胞への抗原の提示をより有効なものとする

mon mucosal immune system: CMIS）を形ように働くため、ワクチンキャリアーとしての成し、粘膜局所において生体防御を営んでいる応用研究が多くなされている。これまで我々は、（図 1A ＆ B）［9，10］。消化器・呼吸器の粘効率の良い免疫誘導能をリポソームに持たせる

膜面に存在する粘膜関連リンパ組織（mucosa-

ために新たに pH 感受性膜融合高分子を構築し

associated lymphoid tissue: MALT）は粘膜－ 77 －

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細菌感染に対する防御ワクチン

図 1A

粘膜免疫システム

込まれ、その後、下層に存在するマクロファー
ジや樹状細胞などの抗原提示細胞へ効率的に抗原が送達され、抗原特異的な粘膜免疫が誘導される（図 1A ＆ B）［1，4，7］。
このように、粘膜免疫が誘導されるためには、ワクチン抗原が粘膜面を介して取り込まれる必要性があり、従来から行われている筋肉内や皮下へのワクチン接種では誘導されない。感染症の多くは粘膜を介して起こるため、効果的な感
染防御の手段として、粘膜免疫の重要性が高
図 1Bまっている。さらに、粘膜面を介した免疫誘導

粘膜免疫システムは、粘膜局所のみならず全身における免疫も活
免疫誘導組織としてその中核をなし、ほ乳類で性化できることから、効果的な感染症予防法とは鼻咽頭関連リンパ組織（nasopharynx-as-

して臨床への応用が期待されている。

sociated lymphoid tissue: NALT）、 気 管 支関連リンパ組織（bronchus-associated lym-

［pH 感受性膜融合高分子修飾リポソーム］

phoid tissue: BALT）、腸管関連リンパ組織

pH 感受性膜融合高分子（gut-associated lymphoid tissue: GALT）

粘膜免疫を誘導するためには、粘膜免疫誘導がある。また、鳥類ではハーダー腺も MALT

組織にワクチン抗原を効率よく送達させる必要として機能している（図1A）。これらいずれかがある。近年、ワクチン抗原のキャリアー（抗の粘膜面を介して侵入してきた抗原は、MALT

原デリバリーシステム（ADS））として人工マの上皮細胞層に存在する M 細胞によって取りイクロカプセルであるリポソームが注目されて

日本家畜臨床感染症研究会誌
６巻3号 2011－ 78 －

Protective Vaccine against Bacterial Infection

おり、多くの応用研究がなされている［2，3，5，た（図 2）。
図 2 に示すように、pH 感受性膜融合高分子

6，8，13-15］。
ADS としてリポソームの有用性を高めるたである SucPG ならびに MGluPG はいずれもめには、リポソームに新たな機能を与え、しかカルボキシル基（R-COOH）を有している。

も高いパフォーマンスを実現することが重要とカルボキシル基（R-COOH）は、中性環境下なる。リポソームに新たな機能とパフォーマン

ではプロトン（H ＋）が電離してカルボキシラー

スを持たせるためには、温度、pH、光など、

ト ア ニ オ ン（R-COO-） と な る。 そ の た め、さまざまな刺激や環境変化に対して感受性を有pH 感受性膜融合高分子を修飾したリポソームする高分子を修飾し機能化する必要がある。

膜表面は、中性下においてはカルボキシラート

ADS としてのリポソームを考えた場合、高いアニオン（R-COO-）を発現し、陰性に荷電し免疫応答を誘導するために樹状細胞内に効率よ安定化する。陰性に荷電したリポソームは樹状く封入抗原をデリバリーする必要がある。その細胞の持つスカベンジャーレセプターを介してためには、抗原を封入したリポソームが、樹状細胞内に特異的に取り込まれる事が知られてい細胞のレセプターを介して取り込まれた後、エる。取り込まれた後、樹状細胞のエンドソーム

ンドソーム膜と融合し、封入抗原を細胞質に放内においてリポソームを修飾している pH 感受

出できることが重要である。そのため我々は、性 高 分 子 の カ ル ボ キ シ ラ ー ト ア ニ オ ン（R-エンドソームの持つ特殊環境である弱酸性の環

COO-）がプロトン（H ＋）化され、再度カル境下で膜融合を起こす pH 感受性膜融合高分子

ボキシル基（R-COOH）となる。エンドソー（サクシニル化ポリグリシドール（SucPG）な

ムの酸性環境下で形成されたリポソームの pH

らびにメチルグルタリル化ポリグリシドール

感 受 性 膜 融 合 高 分 子 の カ ル ボ キ シ ル 基（R-（MGluPG）を構築し、これらの高分子を修飾

COOH）は、エンドソーム膜のリン酸極性基した新規 pH 感受性膜融合リポソームを考案しと水素イオン結合し、リポソーム膜とエンド

図2

pH 感受性膜融合高分子修飾リポソームによる樹状細胞内への抗原の送達－ 79 －

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in Farm Animals Vol.6 No.3 2011

細菌感染に対する防御ワクチン

ソーム膜が膜融合を引き起こす。その結果、リソームが粘膜ワクチンとして機能し、免疫応答

ポソーム内に封入された物質（抗原）が樹状細を誘導するかについて明らかにするために、モ胞内へ移行し、効率の良い免疫応答（液性免疫デ ル 抗 原 と し て 卵 白 ア ル ブ ミ ン（OVA） を

ならびに細胞性免疫）を誘導する。この様に、SucPG 修飾 pH 感受性膜融合高分子修飾リポ

リポソームへの pH 感受性膜融合能の賦与は、ソームに封入させ、マウスに経鼻免疫を行った。

樹状細胞内に効率よく封入抗原をデリバリー

その結果、SucPG 修飾リポソームによる免疫し、免疫誘導するうえで重要な機能となる。

は、修飾していないリポソームで免疫した場合

実 際 に pH 感 受 性 膜 融 合 高 分 子 で あ るに比べ血清ならびに腸液中に有意に高い抗SucPG を修飾したリポソームに蛍光物質であOVA 抗 体（IgG、IgA） を 誘 導 し た（ 図 3）。

るカルセインを封入し、牛マクロファージ細胞

一方、IgE 抗体の誘導は認められなかった。さ株である MP3 細胞を用いて細胞質内へのカルらに、血清中の抗 OVA-IgG 抗体のサブクラス

セインのデリバリーについて調べて見るとカルについて解析した結果、SucPG を修飾していセインが MP3 細胞に導入され、細胞質内にカないリポソームで免疫した場合においては、

ルセインの蛍光が観察された（写真 1）。このTh2 タイプのサブクラスである IgG1 のみ誘導

結果は、カルセインが pH 感受性膜融合高分子

されていたが、SucPG を修飾したリポソーム

修飾リポソームによって効率よく MP3 細胞のでは Th2 タイプのサブクラスである IgG1 の細胞質に導入されていることを示しており、

み な ら ず、Th1 タ イ プ の サ ブ ク ラ ス で あ る

pH 感受性膜融合高分子修飾リポソームをワク

IgG2a ならびに IgG3 の誘導を認めた（図 3）。

チン用 ADS として使用した場合、樹状細胞内

さらにサイトカインの mRNA について RT-に効率よく封入抗原をデリバリーできることをPCR 法により解析した結果、SucPG 修飾リ

示唆するものである。

ポソームで免疫したマウス脾臓リンパ球においてインターフェロン（IFN）-γならびに IL-4

pH 感受性膜融合高分子修飾リポソーム粘膜ワの mRNA の発現が認められた（図 3）。同様の

クチンによる免疫誘導

免疫応答の結果は、MGluPG 修飾リポソームを用いて経鼻免疫した場合においても認められそこで、pH 感受性膜融合高分子修飾リポ

た。特に、MGluPG 修飾リポソームは SucPG
修飾リポソームに比べ高い免疫応答を誘導できる こ と が 示 さ れ た［12］。 こ れ ら の 結 果 は、pH 感 受 性 膜 融 合 高 分 子（SucPG あ る い は
MGluPG）修飾リポソームを応用した粘膜（経鼻）ワクチンが、全身免疫ならびに粘膜局所免疫を効率よく誘導できること、さらに誘導される免疫応答が、液生免疫、細胞性免疫の両者であることを示している。
［リポソーム粘膜ワクチン］
写真 1

 H 感受性膜融合高分子修飾リポソームを用pいた牛マクロファージ細胞内へのカルセインの導入

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６巻3号 2011

牛における免疫誘導効果
上述した免疫誘導能に優れる pH 感受性膜融－ 80 －

Protective Vaccine against Bacterial Infection

合リポソームが、家畜においてもマウスと同様

いずれにおいても抗 SA 抗体（IgG、IgA）のに粘膜ワクチンとして機能することを明らかに誘導が確認されなかった。この結果は、MGlu­

するために牛を用いて解析を行なった。具体的

PG 修飾リポソームを応用した牛経鼻ワクチンには、高い免疫応答を誘導できる pH 感受性膜

は、全身免疫ならびに粘膜局所免疫を効率よく融合高分子（MGluPG）を修飾したリポソー

誘導でき、粘膜ワクチンとして機能しているこム（MGluPG リポソーム）に黄色ブドウ球菌とを示唆している。さらに、経鼻ワクチン接種（SA）の破砕抗原を封入し、7 ～ 10 歳の乳牛（1牛の末梢血リンパ球を用いて Th1 サイトカイ

群 3 頭）に 2 週間間隔で 3 回経鼻免疫を行い、ン で あ る イ ン タ ー フ ェ ロ ン（IFN）-γ の

全身ならびに乳房局所における免疫誘導効果にmRNA の発現について RT-PCR 法により解析

ついて調べた。経鼻免疫の抗原量は、1 頭 1 回した結果、免疫牛の全例においてインターフェ

当たり 5mg（破砕抗原のタンパク量）とした。

ロン（IFN）-γの mRNA（77bp）の発現が確

図 4 に示すように、SA 抗原封入 MGluPG リ

認 さ れ た（ 写 真 2）。 こ れ ら の 結 果 は、MG-

ポソームを乳牛に経鼻免疫した結果、免疫前にluPG リポソームを応用した経鼻ワクチンは、比べ、免疫後 42 日目において血清ならびに乳牛において液生免疫のみならず細胞性免疫も誘

汁中に有意に高い抗 SA 抗体（IgG、IgA）の導できることを示唆するものである。さらに、誘導が確認された。血清中では、IgA 抗体に比SA 抗原封入 MGluPG リポソームの牛への経

べて高い IgG 抗体が誘導されたのに対して、鼻投与による免疫誘導効果は、牛乳房炎に対す

乳汁中においては、IgG 抗体よりも高い IgAる新規リポソーム経鼻ワクチン開発の可能性を抗体が誘導された。一方、SA 抗原のみを経鼻示唆している。

免疫した場合においては、血清ならびに乳汁の

図3

pH 感受性膜融合高分子修飾リポソーム粘膜ワクチンによる免疫応答－ 81 －

Journal of Japanese Society for Clinical Infectious Disease
in Farm Animals Vol.6 No.3 2011

細菌感染に対する防御ワクチン

図4

写真 2

黄色ブドウ球菌（SA）破砕抗原封入 MGluPG リポソーム経鼻免疫牛における免疫応答 色ブドウ球菌（SA）破砕抗原封入 MGluPG リポソーム経鼻免疫牛の末梢血リンパ球におけるインターフェ
黄ロン -γmRNA の発現解析

牛における感染防御効果

luPG リポソーム経鼻ワクチンにより SA に対牛において、SA 抗原を封入した新規 pH 感する免疫応答を誘導した牛の乳房内へ SA を接受性膜融合高分子修飾リポソーム粘膜ワクチン

種し、その感染防御効果（乳房炎発症防御効果）（MGluPG リポソームワクチン）の経鼻免疫にについて乳汁中からの SA の分離、乳汁体細胞

より、SA に対して全身ならびに乳房局所にお数の変化を指標に試験を行った。

いて高い免疫応答が誘導できた（図 4）。そこで、

まず、ワクチン接種群、ワクチン非接種群の細菌感染に対する防御ワクチンとして MGlu­

乳牛の乳房内へ乳頭から 100CFU の SA を感

PG リポソームワクチンが機能するか否かにつ染させ、その後、乳汁から SA の分離を行った。

いて明らかにするために、SA 抗原封入 MG-

その結果、ワクチンを接種していないコント

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Protective Vaccine against Bacterial Infection

ロール群（Cont. 群）の乳牛においては、接種て、スカベンジャーレセプターを介してワクチ

後 2 日目から実験期間中の間、実験に供した

ン抗原を効率良く送達できる機能をリポソーム

乳牛全例の乳汁から SA が分離された（表）。

に与えることができた。この機能は、リポソー

一方、ワクチン接種群（Vac. 群）においては、

ムを応用したワクチン開発において高い免疫応

実験期間中、いずれの乳牛の乳汁からも SA は答を効果的に誘導するうえで重要な機能とな

分離されなかった（表）。さらに、乳汁体細胞る。リポソームの pH 感受性膜融合能による樹数の変化について調べた結果、コントロール群状細胞の細胞質内への封入抗原の内在化は、免（Cont. 群）の乳汁においては、菌接種後 2 日

疫誘導（液性免疫ならびに細胞性免疫）に役立

目で体細胞数が乳汁 1ml 当たり 20 万を超え、つ抗原搬送システムであり、感染防御に効果的

3 日目以降は乳汁 1ml 当たり 30 万以上の高いなワクチン開発に不可欠の新技術といえる。

値を示し、乳房炎を発症した（図 5）。しかし

pH 感受性膜融合高分子修飾リポソームを応用ながら、ワクチン接種群（Vac. 群）においては、した牛乳房炎のモデル経鼻ワクチンは、乳房内実験期間中、体細胞数は、乳汁 1ml 当たり 10

粘膜に IgA を中心とした免疫応答を効率よく万以下で推移し、乳房炎の発症は認められな誘導でき、誘導された免疫応答は原因菌の乳房か っ た（ 図 5）。 こ の 結 果 は、SA 抗 原 封 入

粘膜への定着阻止に有効に働くと考えられ、乳MGluPG リポソーム経鼻ワクチンにより乳房房炎発症予防ワクチンとして機能することが示

粘膜局所に誘導された免疫応答が SA の感染防唆された。そのため、pH 感受性膜融合高分子

御に有効に働いていることを示唆しており、今修飾リポソームを応用したリポソーム粘膜ワク

後の牛乳房炎ワクチン開発において、新規 pH

チンの技術は、実際の感染症予防に効果的な粘感受性膜融合高分子修飾リポソーム粘膜ワクチ

膜免疫応答を誘導できる有用な技術であるといンの有用性を示している。

える。また、封入抗原を樹状細胞の細胞質内への内在化できる本技術は、細胞内感染する細菌
やウイルス、原虫などの感染防御に有効な細胞［おわりに］
今回、新たに構築した pH 感受性膜融合高分性免疫応答を効率よく誘導できる。これまで生子を修飾したリポソームのワクチンキャリアー

ワクチンでしか誘導することが出来なかった細としての高い免疫誘導能と、それを応用した粘胞性免疫応答が本技術を応用することにより不膜（経鼻）ワクチンの細菌感染に対する防御ワ

活化抗原でも誘導でき、より安全性の高いワククチンとしての有用性について概説した。pH

チン開発が可能となる。今後、pH 感受性膜融

感受性膜融合高分子をリポソームに導入するこ合高分子修飾リポソームを応用したワクチンのとにより、抗原提示細胞である樹状細胞に対し技術が、多くの家畜感染症のワクチン開発のた

表

黄色ブドウ球菌（SA）感染後の乳汁からの菌の分離
群＊

Cont.
Vac.
＊

SA 陽性頭数 / 実験に供した頭数
感染前

1 日目

2 日目

3 日目

4 日目

5 日目

6 日目

7 日目

0/3

0/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

3/3

（0.0）

（0.0）

（100）

（100）

（100）

（100）

（100）

（100）

0/3

0/3

0/3

0/3

0/3

0/3

0/3

0/3

（0.0）

（0.0）

（0.0）

（0.0）

（0.0）

（0.0）

（0.0）

（0.0）

Cont.、コントロール群；Vac.、ワクチン接種群
カッコ内は％を表す。

－ 83 －

Journal of Japanese Society for Clinical Infectious Disease
in Farm Animals Vol.6 No.3 2011

細菌感染に対する防御ワクチン

図5

黄色ブドウ球菌感染後における乳汁体細胞数の変化

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Protective Vaccine against Bacterial Infection
Shinobu Watarai
Division of Veterinary Science, Graduate School of Life and Environmental Sciences,
Osaka Prefecture University(1-58 Rinkuuourai-kita, Izumisano, Osaka 598-8531, Japan)－ 85 －

Journal of Japanese Society for Clinical Infectious Disease
in Farm Animals Vol.6 No.3 2011