Influence of Probiotics (Bovactin®) for Intestinal Flora of Calves

原著

子牛の腸内細菌叢に対する生菌剤（ボバクチン®）の影響高橋

純1)＊ 高橋純子2) 田中

愛3) 遠藤洋2)

小形芳美3) 加藤敏英4) 松田典子5) 田中

守5)

山形県農業共済組合連合会中央家畜診療所最上出張所

1)

同

3)

中央家畜診療所

家畜診療研修所

5)

同＊連絡担当者：高橋

純

4)

同

置賜家畜診療所

2)

ミヤリサン製薬㈱研究部

山形県農業共済組合連合会中央家畜診療所最上出張所（〒996-0001
Tel(023)684-5531

山形県新庄市五日町276）

Fax(023)684-5538[要約]e-mail takahashi_jun@yynosai.or.jp[緒論]

29頭の黒毛和種子牛を用いて、生菌剤が下乳酸菌等の各種生菌剤は腸内細菌叢のバラン

痢症発生と腸内細菌叢に及ぼす影響について調スを改善する製剤として認識されており、家畜

べた。試験群（n=18）には10日齢より29日齢においては主に成長促進や消化機能改善を目的まで（20日間）生菌剤（ボバクチン ）を1日10gとして投与されている。特に、若齢の牛や豚で経口投与し、非投与牛（n=11）を対照群としは腸内細菌叢が不安定で下痢を発症しやすいとた。供試牛の10日齢および29日齢に血液と糞いわれており、生菌剤は予防および治療の目的便を採取し、血液および血液生化学的検査、糞で投与されることが多く、その効果も報告され

便中IgA濃度、T-RFLP法による腸内細菌叢解ている[1,10,11]。このようなことから、近年

析、定量的PCR法による腸内の優勢構成菌群

生菌剤の使用頻度は急速に高まっているが、臨の定量を行った。臨床的には、60日齢までの床症状以外の効果について客観的に評価した報

下痢症発生率を調べた。その結果、血液所見に告は少ない。そこで今回、牛の第一胃異常発酵は大きな変化が認められなかったが、T-RFLP

改善効果が確認されている生菌剤を子牛に投与のフラグメントパターンには群間に相違がみし、下痢症発生および腸内細菌叢に対する影響られ、クラスター解析において試験群が１つを調査した。

®

のクラスターを構成することが確認された。
また、試験群ではBifidobacterium が増加し、[材料と方法]Enterobacteriaceae が減少する傾向にあった。

1)供試牛：1～60頭の黒毛和種繁殖牛を飼養

今回の成績では、下痢症発生率は群間に有意差する農家15戸から無作為に抽出した黒毛和はみられなかったものの、ボバクチン®)は子牛

種子牛29頭であり、試験群には生後10日齢の腸内細菌叢の安定化を促すことが示唆されより29日齢まで20日間生菌製剤（ボバクチた。

ン®)、Bov；㈱共済薬事、東京）を1日10g強

Keyword制経口投与し（n=18）、非投与牛を対照群と子牛、生菌剤、下痢症、腸内細菌叢した（n=11）。供試農場のうち9戸は、子牛が母牛と同居し母乳を自由に摂取できる環−9−

Journal of Japanese Society for Clinical Infectious Disease
in Farm Animals Vol.5 No.1 2010

子牛の腸内細菌叢に対する生菌剤（ボバクチン®）の影響境であった。一方、他の6戸は子牛を生後24)T-RFLP法：Hayashiら[3]およびSakamoto～30日で母牛から隔離する、いわゆる早期

ら[9]の 方 法 に 準 じ て 行 っ た。5’末 端 を離乳の環境であった。このうち5戸（9頭）は6-FAMで蛍光標識したユニバーサルプライ

試験群のみに区分された。なお、Bovは2種

マー27Fと未標識の1492Rとを用い、抽出

類 の ア ン モ ニ ア 耐 性 乳 酸 菌（Lactobacillus

し たDNAの16S rRNA遺 伝 子 を 増 幅 し た。

plantarum 220：100g 中 1 × 107-9 × 108

増幅後、PCR産物を制限酵素（HhaI，MspI）

個含有，Streptococcus faecium 26：100g

により消化し、ABI

中1×106-9×107個 含 有 ）、 お よ び 酪 酸 菌

Analyzer (Applied Biosystems)に て 蛍（Clostridium butyricum Miyairi：100g 中光標識されたフラグメントサイズを測定し1×105-9×106個含有）を含む生菌製剤であた。なお、サイズマーカーには、1200 LIZ

る。

（Applied Biosystem）を使用した。検出さ

PRISM 310 Genetic

2)採 材 お よ び 検 査 項 目： 投 与 開 始 日（10日

れたT-RF（蛍光標識された末端DNA断片）

齢 ）お よ び 終 了 日（29日 齢 ）に 血 液 を 採 取

は、Microbiota Profiler（infocom）を用いし、 血 液 お よ び 血 液 生 化 学 的 検 査 を 行 って、菌種の推定を行った。また、T-RFLPのた。検査項目は、赤血球数、白血球数、ヘフラグメントパターンに基づき、Ward法にマ ト ク リ ッ ト 値（ 以 上、 血 球 自 動 計 算 器て個体間のクラスター解析を行った。

K-4500,Sysmex）、総タンパク、アルブミ

さらに、いくつかの個体のDNA抽出物にン、血液尿素態窒素（BUN）、総コレステロー

ついて、16S rRNA遺伝子のPCR産物を大ル（T-cho）および免疫グロブリン（IgG）（以腸菌にクローニングし、シーケンス解析を上、 血 液 自 動 分 析 器AU640,OLYMPUS）行った。配列データをもとに相同性検索を行とした。同時に直腸便を採取し糞便中IgA

い、菌種を推定するとともに、推定された菌濃度をELISA法（試薬；Bovine IgA ELISA種に由来するT-RFを確認した。

Quantitation Kit,BETHYL）に て 測 定 し、

5)定 量 的PCR法： 腸 内 の 優 勢 構 成 菌 群 で あ製剤が含む酪酸菌（Clostridium butyricum

る7グループについて特異的なプライマー

MIYAIRI）を検出（C.butyricum 選択培地にを用い、投与終了時における糞便中の菌数て24時間嫌気培養）するとともに、T-RFLPを定量した（Table. 1）。検出には、SYBR

法（terminal-restriction fragment length

GreenⅠ（Takara）を 用 い、 リ ア ル タ イ

polymorphism）による腸内細菌叢の解析な

ムPCR装 置 に は、Thermal Cycler Dice

らびに定量的PCR法による腸内の優勢構成

TP800（Takara）を使用した。

菌群の定量を行った。また、投与開始から終

6)統計処理：得られた成績について、群ごとの了後1ヶ月（およそ60日齢）までの間に、臨床比較は対応のあるt検定、群間の比較は対応的に治療が必要と診断された下痢症の発生頭のないｔ検定、χ2検定またはFisherの直接数ならびに発生までの日数を調べた。

確率計算法にて行った。

3)糞便からのDNAの抽出：採取した糞便は－80 ℃ に て 保 存 し、Matsukiら[6]の 方 法 に準じてDNAを抽出した。抽出したDNAは、
TEバッファーに溶解し、分析まで－20℃にて保存した。

日本家畜臨床感染症研究会誌
５巻１号 2010− 10 −

Influence of Probiotics (Bovactin®) for Intestinal Flora of Calves

Table1. 16S rRNA gene-targeted group-specific primers used in this study
Target bacterial group
Clostridium coccoides group
Clostridium leptum subgroup
Bacteroides fragilis group
Bifidobacterium
Atopobium cluster
PrevotellaEnterobacteriaceae

namePrimer sequence (5’-3’)

g-Coc-F

AAATGACGGTACCTGACTAA

g-Ccoc-R

CTTTGAGTTTCATTCTTGCGAA

sg-Clept-F

GCACAAGCAGTGGAGT

sg-Clept-R3

CTTCCTCCGTTTTGTCAA

g-Bfra-F

ATAGCCTTTCGAAAGRAAGAT

g-Bfra-R

CCAGTATCAACTGCAATTTTA

g-Bifid-F

CTCCTGGAAACGGGTGG

g-Bifid-R

GGTGTTCTTCCCGATATCTACA

c-Atopo-F

GGGTTGAGAGACCGACC

c-Atopo-R

CGGRGCTTCTTCTGCAGG

g-Prevo-F

CACRGTAAACGATGGATGCC

g-Prevo-R

GGTCGGGTTGCAGACCCATTGACG

Eco1457FTTACCCGCAGAAGAAGC

Eco1652R

CTCTACGAGACTCAAGCTTGC

Ref *
5)
7)
5)
5)
7)
5)
8)

*)References No.( 参考文献番号 )[成績]

ぼ 全 頭 か らRuminococcus sp. と 推 定 さ1)血液および血液生化学的検査成績：試験開始

れる T-RF（Hha Ⅰ：183 bp，Msp Ⅰ：

日と終了日の成績をTable.2に示した。2時

215 bp）が 検 出 さ れ た（Fig. 1）。 こ れ よ

点での比較で、T-choは両群とも開始日よりり、この菌種は子牛の腸内に共通して存在

終了日が高値を示し、試験群では有意差が認す る こ と が 推 測 さ れ た。 ま た、 試 験 群 でめられた。また、開始日の測定値は試験群にはStreptococcus sp. と 推 定 さ れ るT-RF

比べ対照群で有意に高かった。IgG濃度は両（HhaⅠ：573 bp，MspⅠ：547 bp）お よ群とも開始日よりも終了日に低値を示し、こびBifidobacterium sp. と 推 定 さ れ るT-RFの時点で試験群は対照群に比べ有意に低かっ（Hha Ⅰ：368 bp，Msp Ⅰ：129 bp）

た。2時点の比較では対照群の終了日が開始が、対照群に比べ高頻度に検出された（検日に比べ有意に低値を示した。また、試験群

出 率； 試 験 群vs対 照 群，Streptococcus

では低値を示す個体が多く、２時点とも著し

sp. ；47% vs 0%，Bifidobacterium sp.；

い低値を示す個体も散見された。このほかの

41 % vs 18 %）。 一 方、 対 照 群 で は、 試

項目では、両群の2時点および群間の比較で

験 群 に 比 べEnterobacteriaceae と 推 定差はみられなかった。

さ れ るT-RF（HhaⅠ：368 bp，MspⅠ：

2)糞便中IgA濃度測定およびC. butyricum 分離

486 bp） お よ びFaecalibacterium sp. と成績(Table.3)：IgA濃度は両群とも個体に

推 定 さ れ るT-RF（MspⅠ：277 bp）の 検

よるバラつきが大きく、平均値は開始日に比出頻度が高かった（検出率；試験群vs対照

べ終了日に著しく上昇したが有意なものでは

群，Enterobacteriaceae ；47 % vs 64 %，なかった。また、C. butyricum 分離頭数はFaecalibacterium sp. ；41% vs 73%）。

試験群が8/16(50.0%)、対照群が0頭(0%)
で、群間に有意差が認められた。

T-RFLPパターンに基づきクラスター解析を行った結果、試験開始日、終了日ともに３3) T-RFLP法： 投 与 終 了 時 のT-RFLPの フ

つのクラスターが形成された（Fig.2,3）。開ラ グ メ ン ト パ タ ー ン を 比 較 す る と、 ほ

始日ではχ2検定においてクラスター間と群− 11 −

Journal of Japanese Society for Clinical Infectious Disease
in Farm Animals Vol.5 No.1 2010

子牛の腸内細菌叢に対する生菌剤（ボバクチン®）の影響

間とに関連性は認められなかった。一方終5)下痢症発生率ならびに発生までの日数：群間了日では、Bov投与により腸内フローラのに有意差はなかったが、試験群でやや低い傾パターンが変動し、試験群の個体はクラス向にあった。子牛の飼養形態の違いによる発ターⅡよりクラスターⅢに多く存在していた症率をみると、早期離乳農場の15.4％（2/13）(P<0.05)。

に対し同居農場は56.3％（9/16）と後者が高4)定量的PCR法： 7グループについて菌数をい傾向にあった。また、試験開始から下痢症

定 量 し た と こ ろ、 両 群 と も にClostridium発生までの日数は、試験群が対照群に比べ有coccoides groupが最優勢グループであり、意に短かった（Table.5）。

試 験 群 で は、Atopobium clusterも 最 優 勢
グ ル ー プ で あ っ た（Table.4）。 ま た、 試 験
群では対照群に比べBifidobacterium の菌数が有意に増加し、検出率も高かった。一方、Enterobacteriaceae は、菌数、検出率ともに試験群で対照群より低い傾向にあったが、有意な差は認められなかった。

Table2. Blood and serum biochemical values of calves before and after administration
Treated group(n=18)

Control group(n=11)

Pre1)

Post2)preRBC(×104/μL)

801± 14WBC(×102/μL)

Post

804± 195

776± 142a)

79± 28Ht(%)

34.0± 7.5

TP(g/dL)

5.2± 0.963)809± 9388± 24a)125± 56

94± 2235.6± 9.831.5± 6.834.1± 4.2

5.0± 0.75.9± 0.45.8± 0.3

Alb(g/dL)

2.7± 0.22.9± 0.4

2.9± 0.2

3.4± 0.2

BUN(mg/dL)

12.4± 5.1

12.5± 3.7

11.5± 5.3

8.8± 2.7118± 45b)

115± 27a)132± 489.3± 3.818.1± 6.5

14.1± 2.8a,b)

T-cho(mg/dL)
IgG(mg/mL)

83± 29a,b)13.8± 8.4a)b)1)10 days after birth, 2)30 days after birth, 3)Mean ± SD.
a)-a):P<0.01, b)-b):P<0.05

Table3. Concentration of IgA and detections of C.butyrium 1) from feces
Treated group(n=18)
Pre2)

IgA(μg/g)4)
C.butyrium(%)

820±346―

Control group(n=11)

Post

3)

69,030pre
1,948±

Post
205,655±201,086

1,717±339,841

8/16(50.0) a)―

0/10(0.0) a)

1)Clostridium butyrium 2)10days after birth 3)30days after birth, 4)Mean ± SD, a)-a):P<0.01

日本家畜臨床感染症研究会誌
５巻１号 2010− 12 −

Influence of Probiotics (Bovactin®) for Intestinal Flora of CalvesFig.1. T-RFLP patterns of 16S rRNA genes from calves feces digested with Hha Ⅰ (A) and Msp
Ⅰ (B) . 16S rRNA genes were amplified with primer 5’6-FAM labeled 27F and 1492R.

Table 4. Quantification of predominant bacterial group in feces
Target bacterialgroup

Mean ± SD (log10 cells/g)
Treated group Control group(n=17)(n=11)

No. positive (% )Treated group(n=17)

Control group(n=11)

Clostridium coccoides group9.5± 0.99.8± 0.5

100

100

Clostridium leptum subgroup8.8± 1.1

9.2± 0.5100100Bacteroides fragilis group9.0± 1.3

9.4± 0.8

88.2

90.9

Prevotella6.4± 1.1

6.4± 0.7100

100

Atopobium cluster

9.5± 0.99.1± 0.5100

100

Bifidobacterium8.6± 0.8a)

7.7± 1.1a)

88.2

63.6

Enterobacteriaceae

8.4± 0.88.8± 1.2

94.1

100

a)-a):P<0.05

Table.5. The incidence of diarrhea and the day of onset diarrhea after initiation
Treated group (n=18)

Control group (n=11)

The incidence of diarrhea (%)

6/18 (33.3)

5/11 (45.5)

The day of onset

14.5(8～24)a)26.4(10～35)a)a)-a):P<0.05− 13 −

Journal of Japanese Society for Clinical Infectious Disease
in Farm Animals Vol.5 No.1 2010

子牛の腸内細菌叢に対する生菌剤（ボバクチン®）の影響

Fig.2. The dendrogram of the T-RFLP profiles of fecal flora in calves before administration.
T-RFLP profiles combined Hha Ⅰ and Msp Ⅰ digestion were analyzed by Ward’s method.
(*：treated group）The detection rates of treated calves in clusters are shown inparentheses (no.of treated calves/no. of total calves).

Fig.3. The dendrogram of the T-RFLP profiles of fecal flora in calves after administration.(*：treated group）The detection rate of treated calves in cluster Ⅲ was higher than those incluster Ⅱ .

日本家畜臨床感染症研究会誌
５巻１号 2010− 14 −

Influence of Probiotics (Bovactin®) for Intestinal Flora of Calves[考察]られたが、これは牛種、日齢および解析法のT-RFLP法による解析から、子牛の腸内に共違い等によるものと考えられた。現在、分子通して存在する菌種として、Ruminococcus

生物学的な腸内細菌叢の解析は、主な対象がsp. が推定され、定量的PCR法の結果から、こヒトであり、牛に関する情報が少ないため、の 菌 種 の 属 す るC. coccoides groupは 最 優

T-RFLP法にて菌種の推定困難なT-RFも多く

勢グループであることが認められた。また、存在した。また、定量的PCR法についても、C.

Bifidobacterium sp. は、T-RFLP法 に て 試 験botulinum groupなど牛特有のグループに特群 か ら 高 頻 度 に 検 出 さ れ、 定 量 的PCR法 に異的なプライマーの開発が進めば、より詳細

おいても試験群で有意に増加していた。同様な検討が可能になると考えられる。

に、T-RFLP法にて対照群から多く検出された

今回の成績では、両群の下痢症発生率に有意Enterobacteriaceae は、 定 量 的PCR法 に おな差はなく、Bovの予防効果を臨床的に裏付けいても対照群で増加傾向にあった。このようにることはできなかった。なお、下痢症発生が子T-RFLP法の結果は、定量的PCR法の結果と、牛の飼養形態の違いに影響を受けている可能性

ほぼ一致した。

が高いので、今後は群分けを適切に行うべきでところで、従来の培養法を用いた報告によある。また、糞便中IgA濃度の値は個体によりる と、 木 村 ら[4]は 下 痢 症 を 呈 す る 子 牛 で は大きく異なり、糞便性状との関連性は見出せな

健 康 子 牛 に 比 べ 総 菌 数、Bacteroidaceae，かった。試験前は、腸内細菌叢の安定化が糞便

Bifidobacerium お よ び Lactobacillus の 菌

中IgA濃度を上昇させるのではないかと予測し

数 が わ ず か に 減 少 し、Entrobacteriaceaeていたが、今回の成績では明らかにできなかっが 増 加 す る こ と を 明 ら か に し て い る。 本 試た。

験の試験群にて下痢症発生が低い傾向に

今後は、固有の腸内細菌叢が構成される前で、あ っ た こ と は、Bifidobacerium が 増 加 し、有益菌が定着しやすいと考えられる出生日からEntrobacteriaceae がやや減少したことに関のBov投与を試みる予定である。

係しているのかもしれない。同時に、このよ
うな菌の動きはBov投与が幼牛期の不安定な[参考文献]

腸内細菌叢を安定化させたためと推察され

１. Abe, F., Ishibashi, N. and Shimamura,

た。牛の腸内細菌についての分子生物学的なS. 1995. Effect of administration

検討は、成牛に関するものが多く、子牛につof Bifidobacteria and Lactic acid

いての報告は少ない。辨野[2]は、育成牛の腸bacteria to newborn calves and

内細菌叢を16S rRNA遺伝子のクローンライ

piglets. J. Dairy Sci. 78:2838-2846.

ブ ラ リ ー 法 に て 解 析 し た 結 果、Clostridium

２. 辨野義己. 2004.腸内細菌の生態と機能.新leptum subgroupが最優勢であり、続いてC.

ル ー メ ン の 世 界.微 生 物 生 態 と 代 謝 制

coccoides group, Clostridium botulinum

御.534-543.

group, Bacteroidaceae が優勢グループであ３ . Hayashi, H., Kamagata. Y., Benno, Y.

ることを報告している。一方、本試験の結果

2002. Fecal microbial diversity in a

では、C. coccoides groupおよびAtopobium

strict vegetarian as determined byclusterが最優勢グループとして検出された。

molecular analysis and cultivation.

本 試 験 の 結 果 は、 辨 野[3]の 結 果 と 相 違 が み

Microbiol Immunol 46:819-31.

− 15 −

Journal of Japanese Society for Clinical Infectious Disease
in Farm Animals Vol.5 No.1 2010

子牛の腸内細菌叢に対する生菌剤（ボバクチン®）の影響

４. 木村修武, 吉金美和子, 小林照男, 辨野義己,

analysis of predominant bacteria

光岡光足. 1982.家畜の下痢と腸内フローin human feces. Appl. Environ.

ラ―乳用雄子ウシを中心に. 腸内フローラ

Microbiol.70:7220-7228.

シンポジウム2

腸内フローラと生体防８. 中山二郎, 田中重光, Prapa Songjinda, 立

御.143-162.

川 敦, 坪内美樹, 清原千香子, 白川太郎, 園

５. Matsuki, T., Watanabe, K., Fujimoto, J.,

元謙二. 2007. 各種分子生物学的手法によMiyamoto, Y., Takada, T., Matsumoto,る乳児腸内細菌叢の解析－乳児アレルギーK., Oyaizu, H. and   Tanaka, R. 2002.

発症ハイリスク原因究明の大規模疫学調査

Development of 16S rRNA-gene-にむけて－.腸内細菌学雑誌. 21:129-142.

targeted group-specific primers

９ . Sakamoto, M., Hayashi, H. andfor the detection and identification

Benno, Y. 2003. Terminal restrictionof predominant bacteria in humanfragment length polymorphism

feces. Appl. Environ. Microbiol.

analysis for human fecal microbiota

68:5445-5451.

and its application for analysis of

６ . Matsuki, T., Watanabe, K., Fujimoto,complex bifidobacterial communities.

J., Kado, Y., Takada, T., Matsumoto,K. and Tanaka, R. 2004. Quantitative

Microbiol. Immunol. 47:133-142.
10. 佐藤PCR with 16S rRNA-gene-targeted

博. 2000. 牛への生菌剤の利用とその効果.畜産の研究. 54:659-663.

species-specific primer for analysis

11. 高橋淳根, 田中清明. 2005. 哺乳期子牛のof human intestinal bifidobacteria.

下痢予防に対するバクト菌投与の効果. 畜

Appl. Environ. Microbiol. 70 :167-173.

産の研究. 59:379-382.

７. Matsuki, T., Watanabe, K., Fujimoto, J.,
Takada, T. and Tanaka, R. 2004. Useof 16S rRNA gene-targeted groupspecific primers for real-time PCR

Influence of Probiotics (Bovactin®) for Intestinal Flora of Calves
Jun Takahashi1), Junko Takahashi2), Ai Tanaka3),
Hiroshi Endo2), Yoshimi Ogata3), Toshihide Kato4),
Noriko Matsuda5) and Mamoru Tanaka5)1)Central-Mogami region Veterinary Clinical Center, 2)Okitama V.C.C,
3) Central V.C.C, 4)Veterinary Clinical Training Center, Yamagata PrefectualFederation of Agricultural Mutual Aid Association.
5)Miyarisan Pharmaceutical CO.,LTD.
(276,Miyauchi,Itsukamachi,Shinjo-shi,Yamagata,996-0001, Japan)
日本家畜臨床感染症研究会誌
５巻１号 2010− 16 −