第３６回動物生殖工学研究会

つくばシンポジウム

2018 年 7 月 28 日～29 日

筑波大学生命環境学群 2C107

http://www.tsukuba.ac.jp/access/tsukuba_access.html

日時：2018 年 7 月 28 日(土)～29 日(日)場所：筑波大学 生命環境学群棟 2C107 教室
最寄り駅：「つくばエクスプレス線」つくば駅(終点)から関東鉄道バス 「筑波大学中央行き」に乗り換え
終点 「筑波大学中央」下車
自家用車：
筑波大学本部棟北駐車場、または筑波大学本部棟南駐車場をご利用ください。当なお、日は大学の行事が行われており、駐車場の混雑が予想されますのでご注意ください。
参加費：
会員・非会員 ２,０００円（予定）当日、会場で受け付けます。
学生無料。
日程：
２０１８年７月２８日（土）
１２：３０

一般受付

１３：００～１７：００

特別講演＆招待講演

１８：３０～２０：３０

研究交流会 (筑波大学 生命環境学群小食堂)

２０１８年７月２９日（日）９：００～１１：３０

現地見学会
見学先： 国立環境研究所
生物・生態系環境研究センター

１２：００ 解散

つくばエクスプレス線つくば駅

テーマ：野生動物の保全と生殖工学の応用<特別講演> 13:00-13:50 (質疑 5 分を含む)
国立環境研究所 生物・生態系環境研究センター
主任研究員 大沼 学 先生
演題 国内および国外における絶滅危惧種の培養細胞保存活動について
休憩 10 分<招待講演> (質疑 5 分を含む)
1．14:00-14:30
国立環境研究所・生物・生態系環境研究センター
特別研究員 片山 雅史先生
野生動物由来の新規細胞の樹立-保全への応用を目指したリソース開発2．14:30-15:00
近畿大学先端技術総合研究所・生物工学技術研究センター
安齋 政幸先生
動物園施設との共同研究で感じた生殖工学技術の課題
休憩 15 分
3．15:15-15:35
国立研究開発法人 農業・食品産業技術総合研究機構
生物機能利用研究部門 動物機能利用研究領域 動物生殖機能制御ユニット
主席研究員 菊地 和弘先生
ベトナム在来豚の保存と利用の取り組み（SATREP プロジェクト）
4．15:45-16:15
帯広畜産大学 原虫病研究センター
ゲノム機能学分野 鈴木 宏志先生
発生工学の応用によるマラリア予防・治療法の開発
5．16:15-16:30 総合討論
6. 17:30 - 20:30
研究交流会 (筑波大学 生命環境学群小食堂)

特別講演

国内および国外における絶滅危惧種の培養細胞保存活動について
大沼学
国立研究開発法人国立環境研究所

生物・生態系環境研究センター

絶滅危惧種の遺伝資源保存は、保全生物学的に「生息域外保全(ex situ conservation)」の一手法に分類することができる。遺伝資源の中で、絶滅危惧種の保全を考えるうえで重要なのは、核酸（RNA、DNA）、生殖細胞（卵子、精子、始原生殖細胞等）、体細胞である。生殖細胞の保存は、その細胞を個体増殖に利用できることから、種の存続に直接貢献することが可能である。一方、その他の遺伝資源（体細胞、RNA、DNA 等）は個体増殖に直接は利用できないため、その保存は、絶滅危惧種の遺伝学的、生理学的情報を保存していることになる。
国立環境研究所では環境省レッドリスト（日本の絶滅のおそれのある野生生物の種のリスト）に記載されている動物の中で主に哺乳類と鳥類を対象に遺伝資源の長期凍結保存事業を2002 年に開始した。現在も「希少な野生動物を対象とする遺伝資源保存」として継続中である。これまでに、国内で野生絶滅した日本産トキ（Nipponia nippon）をはじめ、ヤンバルクイナ（Gallirallus okinawae）、ツシマヤマネコ（Prionailurus bengalensis euptilurus）、アマミノクロウサギ（Pentalagus furnessi）などについて遺伝資源の凍結保存を実施した。
平成 30 年 3 月までに 3,323 個体（鳥類 2,366 個体、哺乳類 364 個体、魚類 587 個体、爬虫類6 個体）から凍結保存用チューブ 62,387 本の遺伝資源を採取・凍結した。また、海外の絶滅危惧種の遺伝資源保存を計画中である。この新しい計画では IUCN Red List of Threatened
Species に掲載され、且つ、アジア地域に分布している絶滅危惧種の遺伝資源保存を優先して実施することを予定している。遺伝資源の凍結保存と同時に、国立環境研究所では遺伝資源を活用した研究も行ってる。これまでに、ヤンバルクイナやコウノトリの遺伝的多様性に関する研究や、絶滅危惧種のゲノム解析（対象種：コウノトリ、タンチョウおよびヤンバルクイナ）を、凍結保存していた遺伝資源を活用して実施した。このように、遺伝資源保存と研究活動を連携させ、国立環境研究所がアジア地域における生息域外保全関連の研究拠点となることを目指している。

23野生動物由来の新規細胞の樹立-保全への応用を目指したリソース開発-

片山雅史

国立環境研究所

生物・生態系環境研究センター

国立環境研究所

野生動物ゲノム連携グループ[目的]国立環境研究所環境試料タイムカプセル棟では、国内の野生動物由来の体細胞（主として線維芽細胞）を取得し、凍結保存を進めている。貴重な生物資源である野生動物由来の体細胞は、これまでゲノム解析を始め感染症の評価系への応用など様々な用途に利用されている。我々は、この様な体細胞の研究資源としての利用価値を向上させるため、野生動物から取得した体細胞由来の不死化細胞や iPS 細胞の樹立を試みている。
現在、我々は野生動物、特に鳥類由来の不死化細胞や iPS 細胞の樹立を試みている。
環境省レッドリスト 2015 では、国内に分布する鳥類約 700 種の中で 97 種が絶滅危惧種（絶滅危惧Ⅰ類およびⅡ類）に分類され、環境省が進める保護増殖事業においても鳥類は 15 種が指定されている（哺乳類 4 種、両生類 1 種、魚類 4 種）
。さらに、鳥類は、鳥インフルエンザのような人獣共通感染症の媒介主としても知られている。この様な背景のもと、我々は鳥類の新規細胞の樹立に注力を注いでいる。
iPS 細胞は、様々な細胞に分化する能力を有するため、腸管上皮細胞や肝細胞など様々な細胞への分化が理論的に可能になり、感染症や農薬の評価系構築への応用が期待される。絶滅危惧種の生体を利用した感染症や農薬の影響評価は、現実的に不可能なため、in vitro における特定細胞を用いた評価が可能になれば、大きなブレイクスルーとなる。
一方で、マウスの iPS 細胞樹立が発表され 10 年以上が経ち、様々な動物の iPS 細胞の樹立が報告されているが、その大半が哺乳類由来のものであり、鳥類由来の iPS 細胞は、簡単には樹立出来ないことが研究者間の認識になっている。この様な背景のもと、将来的な野生鳥類からの iPS 細胞の樹立を目指し、鳥類のモデル動物であるニワトリ由来の4細胞を用いて効率的な鳥類の iPS 細胞の樹立を試みた。
[材料および方法] 本研究では、2 種類の自作リプログラミングベクター(PB-6F, PB-R6F)を使用した 2,3,4。これらのベクターは、6 因子(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Lin28, Nanog)を自己消化性 2A ペプチドで連結させた PiggyBac トランスポゾンベクターである。PBR6F ベクターは Oct3/4 の転写活性を強化するために、MyoD 由来の転写活性領域を結合させた Oct3/4(M3O)1 を使用した。これらのベクターをニワトリ由来細胞に導入し、ニワトリの iPS 細胞の樹立を試みた。
[結果と考察] どちらのベクターを用いても平面的な初代コロニーは出現可したが、PB-R6F 使用のコロニーのみが長期間(50 回以上)継代可能であった(25 個の初代コロニー中 7 クローンが可能)。また、未分化マーカー陽性であること、テラトーマ作出解析により三胚葉分化能力を有することが確認された。さらに、詳細に遺伝子発現解析および増殖因子の依存性を確認したところ、内在性の PouV および Nanog 遺伝子が高発現すること、FGF シグナルに依存的に自己増殖することが明らかになった。この性質はヒト型の多能性幹細胞の性質を示すものであった。
本研究では、効率的なニワトリの iPS 細胞の樹立に成功した 4。本研究で使用したOct3/4 の転写活性を強化させた PB-R6F リプログラミングベクターを使用することで、野生鳥類由来の iPS 細胞を効率的に樹立できる可能性が示唆される。将来的には野生鳥類由来 iPS 細胞を利用することで、感染症や農薬の評価系の構築へつながることが期待される。

[参考文献]

1

Hirai H et al. 2011. Stem Cells.

2

Katayama M, Hirayama T et al. 2016. Cell Transplant.

3

Katayama M, Hirayama T et al. 2017. J Reprod Dev.

4

Katayama M et al. 2017. J Cellular Physiology.

5

動物園施設との共同研究で感じた生殖工学技術の課題

安齋政幸
近畿大学先端技術総合研究所

現在、日本国内では、生息地における生息数の確保を目的とした「域内保全事業」や飼育下繁殖技術による「域外保全事業」といった相互理解とが深まりつつある。動物園や水族館では、レクリエーション主体から研究の場、生態と環境管理そして来園者の学習機会の提供と多岐に渡り、その役割が大きく変貌している。一方で、展示動物の高齢化がこれから益々深刻な状況にあることは否めず、動物福祉の観点と長期的な人材の育成と研究に係る負担そして専門知識と学術的知見の公開など時代の流れに対して十分な環境を整備しなければならない。動物園における研究には、研究分野や調査方法そして調査機関がそれぞれに分かれており、対象種もまた多様である。特に、遺伝資源の保存方法として生殖細胞（胚・配偶子）の保存が実験動物では極めて有効なツールであるが、各動物種に適応した保存方法の開発には、これから先も相当な時間を要する。
私たちの研究グループでは、以前より大阪市天王寺動物園と同市みさき公園そして富山市ファミリーパークと動物園動物試料の提供により、検体バンクや性判別に関する基礎的研究をおこなっている。また、広島市安佐動物公園とは、生理的寿命を終えた個体から試料を提供いただき遺伝資源の役割と研究資源の活性化に繋がる評価系の構築に向けた共同研究を開始している。さらに、和歌山アドベンチャーワールドは、本年から産学連携協定を締結し、キングペンギンおよびバンドウイルカ精液の保存技術を検討している。
本発表では、これまでに実施してきた検体（試料）の収集と遺伝資源保存の事例より研究概要を紹介し、課題点も見えてきているので合わせて報告したい。
【参考文献】
・楠田ら. (2017). 第１回野生動物保全繁殖研究会大会要旨集. pp.12.
・安齋ら. (2018). 日本実験動物技術者協会関東支部会報. 投稿中.
・安齋ら. (2017). 近畿大学先端技術総合研究所紀要. 22. 25-34.
・梶本ら. (2016). 近畿大学先端技術総合研究所紀要. 21. 1-10.

6

・安齋ら. (2014). 近畿大学先端技術総合研究所紀要. 19. 13-24.

7ベトナム在来豚の保存と利用の取り組み（SATREP プロジェクト）

菊地 和弘 1,2
1

国立研究開発法人 農業・食品産業技術総合研究機構 生物機能利用研究部門 動物機能利用研究領域 動物生殖機能制御ユニット 主席研究員

2

山口大学大学院 連合獣医学研

究科 客員教授

SATREPS とは地球規模課題対応国際科学技術協力プログラムの英語の略称で、国立研究開発法人科学技術振興機構(JST)並びに国立研究開発法人日本医療研究開発機構（AMED）と独立行政法人国際協力機構(JICA)が共同で実施している、開発途上国の研究者と共同で研究を行う 3～5 年間の研究プログラムです。2008 年 4 月以降、世界 46 カ国で約 120 プロジ
ェクトを実施しています。私どものプロジェクトは、生物資源分野での『ベトナム在来
ブタ資源の遺伝子バンクの設立と多様性維持が可能な持続的生産システムの構築』*で、2014 年度に採用され 1 年間の暫定研究期間をへて、2015 年度より 5 年間のプロジェク
トがスタートしました。現在、4 年目のプロジェクト活動を行っています。
* https://www.jst.go.jp/global/kadai/h2604_vietnam.html

プロジェクトで何をやるか？
ベトナムの在来豚のジーンバンクを構築して、養豚業に貢献すること(以下、1～4)、さらには、その潜在的価値を見いだして新たな産業に結びつけることを目指します(5)。
1）ジーンバンクシステムの確立および情報管理技術の開発
日本の農林水産ジーンバンクシステムを参考に、ベトナムに適したシステムを確立し導入します。さらに希少遺伝資源の探索調査を実施し、特性調査を行います。これらの8調査結果は、品種の分類・同定に重要な手法となります。
2）生殖工学技術による保存資源の再生と効率的活用
ブタ品種の多様性保全を図るには、保存した細胞、卵子、精子等の遺伝資源を必要時に再生・活用する技術が必須です。在来豚を対象に人工授精を含めた生殖工学による再生・活用技術を確立します。
3) 口蹄疫等の致命的感染症混入防御技術の開発
将来、価値の高い豚個体の輸出を将来的に可能とするために、ベトナムでの防疫管理技術を確立します。
4) 生産現場への飼養・衛生技術の導入
ホアビン省(ハノイ北西に位置し自動車で約 1 時間)の山地にモデル農家(少数民族の農家)を設定し、特に早期離乳を促進することで分娩間隔を短縮することを目的としています。これにより子豚の生産効率を高めます。さらに、人工授精を原則とした繁殖指導を行います。母豚や子豚の飼料の改善や衛生指導を通じて、子豚の損耗を防ぎ、現金収入を増やすことで農家への貢献をします。
5) ブタ内在性レトロウイルス低コピー豚の発見・育種
ブタは、実験動物・医療用動物としての期待が高まっています。特にブタ臓器を移植に用いる場合、超急性拒絶反応のほか、内在性のレトロウイルスが問題となります。これらのウイルスはゲノムに存在するだけでブタでは特に病気を引き起こしたりはしません。しかし、ヒトに移植することで、ウイルス粒子がブタの臓器・細胞から放出されることで、ヒトの臓器・細胞に外来性に感染することが危惧されています。できるだけ低コピーの個体を確保してゲノム育種に供することを目標にします。
これらの取り組みは、収入源である希少在来ブタを飼養・維持している多くの小数民族の暮らしを支えるものとなるほか、成長する養豚産業に寄与する技術になることが期待されます。

9発生工学の応用によるマラリア予防・治療法の開発-Potential of the induced vitamin E deficiency by inhibition of α-tocopherol efflux from liver
cells in malaria infection鈴木宏志
帯広畜産大学

原虫病研究センター

ゲノム機能学分野

発生工学とは、バイオテクノロジーの一分野で、動物の発生過程を人工的に制御して新しい動物を作り出すことを目指すものである。医学・薬学あるいは獣医学領域におけるこの発生工学の魅力は、興味ある遺伝子の機能を動物の個体レベルで解析可能にすることにある。例えば、培養細胞を用いて血圧の制御にかかわる遺伝子の機能を観察することは不可能であるが、発生工学は生体の高次機構の中で遺伝子機能を直接的に解析可能な検定系を提供でるので、その解析結果の臨床研究への応用展開も容易にさせるといえる。これまでに発生工学から生み出されたたくさんの遺伝子改変マウスが、生活習慣病、癌あるいは感染症などの理解のために活用されてきているが、これには、原虫関連疾患も例外ではない。筆者らは、2001 年の春以来、宿主の生理機能を修飾することによる原虫感染症の予防・治療の可能性を探索しており、これまでのビタミン E 転送タンパク欠損マウスを用いた解析から、宿主のビタミン E 欠乏が原虫感染症に効果的に働くことを明らかにしてきた。
ビタミンＥ転送蛋白は、食餌中から吸収されたビタミンＥを肝臓から循環中に放出させる機能を有している。この循環中のビタミン E 濃度を規定する分子であるビタミン転送タンパクの機能不全は、脂溶性の抗酸化物質であるビタミン E 欠乏を招くが、宿主の循環中のビタミン E 欠乏は、寄生マラリア原虫の DNA に障害を惹起し、マラリア原虫の増殖を抑制させる効果を発揮することが認められた。この効果は、マラリア原虫のみならず「眠り病」の原因病原体であるトリパノソーマ原虫感染においても観察されたことから、広く宿主の循環中に寄生する原虫の増殖抑制に働くことも期待された。
そこで、このストラタジーの臨床応用を目指すために、このビタミンＥ低下作用を誘導する化合物を探したところ、最近になって、すでに上市されている高脂血症薬プロブコールが、ビタミンＥの肝臓からのエフラックスを抑制することに起因するであろう循
環中ビタミン E レベル低下作用を有し、抗原虫効果を発揮することを見出した。
現在のマラリア治療においては、薬剤耐性原虫の出現も大きな問題になっているが、プロブコールと既存の抗マラリア薬である DHA (dihydroartemisinin)の併用効果が顕著
10であったことから、プロブコールの利用は薬剤耐性原虫の出現抑制にも寄与することが期待される。現在、臨床応用へ向けての研究を進行中である。

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