The Journal of Farm Animal in Infectious Disease
Vol.9 No.2･3 2020

RU EFFECTS ON LIVER IN POSTPARUM COWS

原著論文

クローズアップ期の Rhizopus oryzae 水抽出物給与が産褥期における乳牛の血清中肝障害マーカーおよび肝組織中の機能関連遺伝子発現の動態に及ぼす影響芳賀1

聡 1 †、石崎宏 1、鈴木武人 2

国立研究開発法人

農業・食品産業技術総合研究機構

放牧家畜ユニット

栃木県那須塩原市千本松 768

2

麻布大学

†

連絡担当者：芳賀獣医学部

栄養学研究室

畜産研究部門

草地利用研究領域

神奈川県相模原市中央区淵野辺 1-17-71

聡

国立研究開発法人
畜産研究部門農業・食品産業技術総合研究機構

草地利用研究領域

放牧家畜ユニット

住所：栃木県那須塩原市千本松 768
電話：0287-37-7239

FAX：0287-36-6629

E-mail：hagatiku@affrc.go.jp［要約］

クローズアップ期の乳牛への Rhizopus oryzae 水抽出物（RU）連日給与が、産褥期の肝臓の障害、急性の炎症応答、小胞体（ER）ストレスの亢進および機能関連遺伝子発現抑制を予防すると仮説を立て検証を試みた。移行期の乳牛各 3 頭を RU 区およびプラセボ（P）区に配置した。RU 区には RU 製剤
10g（RU 実質量 0.5g/ 頭 / 日）を、P 区には RU 不含有疑似製剤 10g を、クローズアップ期に毎日給与し、定期的に経静脈採血、肝生検を行った。その結果、P 区と比較し RU 区では、産褥期におけるアス
パラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）の血清中活性値の増加が抑制された。分娩 3 週前と比較して ER ストレスマーカーである成熟型 X-box
binding protein 1 および急性炎症マーカーハプトグロビンの肝組織中 mRNA 発現量は分娩直後に著増し、アルブミン、カタラーゼおよびビタミン E 特異的輸送タンパク質の肝組織中 mRNA 発現量は分娩直後に著減し分娩 3 日後も発現抑制が続いた。しかし、いずれの遺伝子も移行期を通して、両区間の有意差は認められなかった。以上より、クローズアップ期の RU 連日給与（実質 0.5g/ 頭 / 日）は、産褥
期乳牛の肝障害緩和効果を示すが、急性炎症応答、肝 ER ストレスの亢進と肝機能関連遺伝子発現抑制に対する予防効果は得られないことが示唆された。
キーワード：分娩、肝生検、ネクローシス様細胞死、予防効果、Rhizopus oryzae 水抽出物に最も多発する［10］。すなわち、乳牛の健全［緒論］

性と生産性の維持向上において、産褥期の疾病

後継牛および生乳の生産上、乳牛の分娩は、リスクを効率的に低減できる、移行期の飼養技

飼養管理において最も重要なイベントのひとつ術が不可欠である。しかし、産褥期の多くの疾

で細心の注意を要する。さらに、乳牛における病罹患フローは複雑な要因が交絡しており、各疾病発生は、分娩直後から 1 週間程度の産褥期

疾病の末端要因を改善する対策だけでは乳牛が抱え得る疾病罹患リスクの抜本的な低減には繋がりにくい。

受付：2020年5月15日
受理：2020年6月2日

肝臓は、糖代謝、脂質代謝、コレステロール－ 69 －

家畜感染症学会誌
9 巻 2・3 号 2020

Rhizopus oryzae 水抽出物給与が産褥期乳牛の肝臓に及ぼす影響

生合成、タンパク質合成、脂溶性ビタミン体内能関連遺伝子発現抑制を防ぐことが戦略的に有輸送調節、解毒などあらゆる機能を担う代謝の効であると考えられる。

中枢器官である。特に高泌乳牛では分娩後、泌

接合菌門接合菌綱ケカビ科のリゾープス麹菌

乳開始に伴う著しい代謝亢進のため、肝臓が担（Rhizopus oryzae）はアジア諸国で紹興酒やテう役割は一層大きくなる。しかし実際には、分ンペなどの麹製造工程において用いられるが、娩に伴う炎症、生理的ストレスおよび酸化スト

その抽出物は動物体に対して免疫調節作用などレスの増大、急激な泌乳開始による負のエネル

様々な生理活性を示すことが知られている

ギーバランスが引き起こす体脂肪動員により、［17］。また、Suzuki ら（2015）は四塩化炭素

肝臓において細胞死（ネクローシス様ならびに（CCl4）投与による肝障害誘発ラットにおいて、アポトーシス様）や機能低下が起こり生産性に

Rhizopus oryzae 水抽出物（RU）を誘発前に経影響する［2］。Tharwat ら（2012）の報告［19］口投与しておくことにより肝障害を低減できる

では、臨床症状がない乳牛においても、分娩約こと［18］、さらに、乳牛への RU 給与が肝臓1.5 日後および 3 週後の肝組織中では中性脂肪から分泌されるインスリン様成長因子 -1（IGF-の蓄積（脂肪肝）と共に、肝細胞のアポトーシ

1）の血中濃度を増加させる可能性を見出し［第スが増加した。産褥期にケトーシスを発症した

155 回日本獣医学会発表］、RU に肝障害改善作

乳牛では肝過酸化脂質含量の増加と共に、アス用や肝機能賦活化作用があることを示唆していパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）る。そこで著者らは、クローズアップ期の乳牛

およびアラニンアミノトランスフェラーゼ

への RU 給与が産褥期の肝臓において起きる障（ALT）の血中活性（ネクローシス様細胞死等

害、急性の炎症応答、ER ストレスの亢進およによる肝細胞障害マーカー）と肝カスパーゼ 3

び機能関連遺伝子発現抑制を予防・緩和できる活性（アポトーシスマーカー）がさらに亢進すのではないか、という仮説に至った。

る［3］。Gessner ら（2014）は、分娩に伴う炎以上より本研究では、仮説を詳細に検証する

症刺激や、体脂肪動員による肝臓への遊離脂肪ため、1）産褥期の肝機能関連遺伝子発現解析

酸（NEFA）の大量流入により、特に産褥期のに関して、分娩直後および分娩 1 週後の 2 時点

肝臓において強い小胞体（ER）ストレスが誘に留まっていた既報［8］に対し、産褥期の推導されることを報告している［5］。過剰な ER

移をより正確に捉えるため、分娩 3 日（0.5 週）

ストレスが生じた細胞ではさらに炎症やアポ後を含めた 3 時点連続肝生検を試みた。そして、トーシスが誘導される。また、頻発する後産停

2）RU 給与区とプラセボ区を設定し、産褥期滞や第四胃変位等のリスクファクターとして、の乳牛における血清中肝障害マーカーならびに移行期の血中ビタミン E（α- トコフェロール：肝組織中の ER ストレスマーカー、急性期タンα-Toc）不足が報告されている［13, 14］。α-Toc

パク質および肝機能関連遺伝子の mRNA 発現の体内動態は、主に肝臓に発現する α-Toc 特異量を測定し動態を比較解析した。

的輸送タンパク質（αTTP）がキーレギュレー［材料と方法］

ターとなっているが［9］、著者らは高泌乳牛の分娩直後の肝組織において、急性的な炎症マー

本研究は、国立研究開発法人農業・食品産業

カーと ER ストレスマーカーの発現亢進、そし

技術総合研究機構（農研機構）畜産研究部門動てアルブミン（Alb）や抗酸化酵素といった肝物実験委員会の事前計画承認を得て（承認番号

機能関連遺伝子の発現抑制に加え、αTTP の遺

1711C074）、「畜産研究部門動物実験等実施要伝子発現も強く抑制されることを見出し、産褥領」に従って実施された。なお本稿では、「クロー

期の低 α-Toc 血症との関連性を報告している

ズアップ期」を分娩予定 3 週前から分娩までの［8］。以上より、現在の乳牛では分娩後に肝障期間、「産褥期」を分娩直後から 7 日間とそれ害および肝機能低下が必発し、産褥期の疾病罹ぞれ定義し、分娩前後 3 週間の期間を「移行期」

患リスクと強く繋がっていると推察される。そ［6］と称した。

こで産褥期疾患の効率的な予防法を開発する上で、肝臓をターゲットとし、肝障害および肝機－ 70 －

The Journal of Farm Animal in Infectious Disease
Vol.9 No.2･3 2020

RU EFFECTS ON LIVER IN POSTPARUM COWS

1．供試牛、飼養法および採材

糖）、RU 実質投与量は 0.5g/ 頭 / 日であった。

栃木県那須塩原市にある農研機構畜産研究部

なお、フリーストールにおいて RU 区以外の同門畜産飼料作研究拠点において、2017 年 5 月

居牛が RU 製剤を誤摂取しないこと、かつ RU

から 8 月にかけて分娩したホルスタイン経産牛

区の牛が毎日規定給与量を確実に摂取できるこ

6 頭を供試し、移行期を試験期間とした。給餌とを担保するため、保定し直接経口投与とした。

条件は、日本飼養標準・乳牛（2006）［12］を対照区である P 区の乳牛には RU 粉末を含ま基に給与量を設計し、朝夕（9:30 および 16:30）

ない賦形剤成分のみの疑似 RU 製剤 10g を RUの 2 回 / 日給餌とした。分娩前は市販の乾乳期区と同法により給与した。本試験における RU

用配合（乾物当たりの粗タンパク（CP）20%、

実質投与量および期間（クローズアップ期のみ）

可消化養分総量（TDN）72% 以上）、コーンサの設定は、鈴木らの既試験結果（第 155 回日本

イレージ（CP6.4%、TDN67%）およびイネ科

獣医学会発表）を参考にして決定した。

乾 草（ チ モ シ ー ま た は ク レ イ ン グ ラ ス：

分娩予定日の 3 週前（実分娩日に対する平均

CP16.5%、TDN63%）から成る飼料を給与し、日数± SEM：－ 18 ± 1.3 日）、1 週前（－ 6 ±分 娩 後 は 市 販 の 搾 乳 牛 用 配 合（CP17%、

0.3 日）、分娩直後（約 9－ 13 時間後）、分娩 0.5

TDN74% 以上）、分娩前と同様のコーンサイ

週 後（3 ± 0.2 日 ）、1 週 後（7 ± 0.2 日 ）、2 週

レージおよびイネ科乾草から成る飼料を給与し後（14 ± 0.4 日 ）、3 週 後（21 ± 0.3 日 ） に、た。試験期間を通じて夕方給与飼料にマグネシ

21G 採血針および血清用真空採血管（テルモ ,ウム剤（ハイマグ Z60HAP, 日本全薬工業 , 福東京）を用いて頸静脈から採血を行い、その後島）50g とビタミン剤（DC ガード P, DSM, 東京）

37℃の温浴で 1 時間凝血させてから 1000g、4℃、100g を飼料へトップドレスにより添加補給し、20 分間の遠心処理を行い、血清サンプルを得

自由飲水および鉱塩（鉱塩セレニクス TZ, 日た。得られた血清サンプルは分析に供するまで、

本全薬工業）を自由摂取とした。分娩後および－ 30℃で冷凍保管した。肝組織採材は、分娩その翌日には、低 Ca 血症予防のため Ca 補給

予定 1 週前および分娩 2 週後を除き、採血日程剤（ゲンキコール Ca, 日産合成 , 東京）を各に併せて行った。自動生検装置バードマグナム

500mL 経口投与した。飼養条件は、全頭をフ（Bard Biopsy Systems, Tempe, AZ, USA）おリーストールバーンにて飼養し、分娩前後約 3

よび 12G、10cm バードマグナムニードル（Bard

日間は分娩房で単飼養した。産子は分娩当日中

Biopsy Systems）を用いて、著者らの既報［8］に分離飼養とし、分娩以降は毎日、朝（8:45 －に基づいた立位術式により右側第 11 － 12 肋間9:30）および夕（15:30 － 16:15）の 2 回搾乳を行っ部位から生検し、肝組織サンプル（1 片は約た。搾乳は、分娩後数日間は牛の体調を確認し1.5cm、50mg）を得た。採取した肝組織片は直ながら、搾り切らず徐々に搾乳量を増やし、そ

ちに、滅菌冷 PBS（－）が入ったチューブにの後、全量搾り切る搾乳に切り替えた。

回収して氷中保管し、1 時間以内に滅菌冷 PBS

供試牛の産次および分娩月を揃え、3 頭を（－）にて洗浄後、液体窒素を用いて凍結させ、RU 給与区（RU 区、平均産次±標準誤差（SEM）：

分析まで－ 80℃にて冷凍保管した。分娩直後

3 ± 0.6）、3 頭を対照となるプラセボ（Placebo）の 採 材 を 除 い た 全 て の 採 材 時 刻 は 13:15 －区（P 区、3 ± 0.6）に配置した。RU 区では、

14:30 とし、合わせて各牛の体重計量とボディ

分娩予定日の 21 日前から分娩日まで毎日、夕コンディションスコア（BCS）の判定記録も行っ

給餌前（16:15 － 16:30）に RU 製剤（へパエイド ,た。BCS 判定については、毎回、スコアリン

牛越生理学研究所 , 千葉）10g を給与した。本グ 経 験 者 を 3 名 無 作 為 に 抽 出 し、UV 法［4］RU 製剤は、リゾープス麹菌（Rhizopus oryzae

により個別に判定した結果を平均して判定値と/ U-1 株）培地を温水抽出しオートクレーブ後、した。両区共に分娩 30 日後までの泌乳量を毎

デキストリンと重量比 50% で混合しスプレー日記録した。なお、本試験では残飼量記録に基ドライした RU 粉末が重量 10% 含有した粉末

づく採食量調査は行わなかった。

製剤であり（残り 90% を構成する賦形剤成分
は脱脂米ぬか、炭酸カルシウムおよびブドウ－ 71 －

家畜感染症学会誌
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Rhizopus oryzae 水抽出物給与が産褥期乳牛の肝臓に及ぼす影響

2．血清中成分分析

System （Life Technologies）を用いて定量

血清中の NEFA、β- ヒドロキシ酪酸（BHBA）

RT-PCRを行った。PCR反応条件は、95℃

濃度および AST、ALT の血清中活性値は、自1minの熱処理後、95℃ 15sec、60℃ 1minの変動分析装置（Hitachi LABOSPECT, 日立ハイ性・伸長・検出サイクルを40または50cycle

テク , 東京）により分析した。血清中 α-Toc 濃行った。増幅産物が単一であることを融解曲線

度は著者らの既報［7］に基づき抽出し逆相高解析により、増幅産物の目的長をアガロースゲ

速液体クロマトグラフ（LC-1500 シリーズ、日ル電気泳動により、それぞれ確認した。各遺伝

本分光、東京）を用いて測定した。

子のプライマーは、PCR効率の妥当性を確認した（92－105%以内）上で使用し、その配列、

3．肝 組織中の RNA 抽出、cDNA 合成および増幅産物長およびAccession No.は表1に示し

定量 RT-PCR

た。各遺伝子の発現定量は、既報［8］に基づ

凍結肝組織片を破砕機（マルチビーズショッき、ribosomal protein S9 mRNA（RSP9）およカー, 安井器械, 東京）を用いて液体窒素凍結

びβ-actin mRNA（ACTB）をマルチ内部標準遺条件下で粉砕後、AGPC法（TRIzol Reagent,

伝子とした⊿⊿Ct法により、専用ソフトウェ

Life Technologies, Carlsbad, CA, USA）によア（StepOne Software v2.1, Life

り全RNAを抽出し、分光光度計（Nano Drop

Technologies）を用いて解析した。各遺伝子のND-1000, Life Technologies）を用いてRNA溶mRNA発現量は、6頭の分娩3週前サンプルに液の純度確認（A260/A280範囲：1.75－1.94）

おける平均発現量を基準値1とした相対値によと濃度測定を行った。逆転写酵素およびDNase

り示した。

（PrimeScript RT reagent Kit with gDNA
4．統計解析

Eraser, タカラバイオ, 滋賀）を用いて、定法に従いゲノムDNAを除去し、全RNA 1μgを逆各測定結果は、平均値±SEMで示した。統転写してcDNAを得た。続いて、PCR酵素

計処理にはSAS（Version ADD-In 7.1 for（THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix, 東洋紡,

Microsoft Office, SAS Institute Japan, 東京）大阪）およびStepOnePlus Real Time PCRを用いた。個体を変動効果とし、分娩後週

表1

定量RT-PCRに用いた標的遺伝子および内部標準遺伝子のプライマー配列、増幅産物
長およびAccession No.

1

遺伝子名 a
XBP1s
HP
ALB
CAT
IGF1
ATTP
RPS9
ACTB

配 列 (5’→ 3’)

増 幅 産 物 長 (bp)

Accession No.

F b : TGCTGAGTCCGCAGCAGGTG
R c : GCTGGCAGACTCTGGGGAAG
F: GGGCGAAATGAAAACTTCAA
R: GTCGACGCCCTCATAGTGTT
F: AACAGACGGCCATGTTTCTC
R: TCTGCATGGAAGGTGAACAA
F: CTCAAACGCACCTGAAGGAT
R: GGAATCCCTCGATCACTGAA
F: TTGCACTTCAGAAGCAATGG
R: GAAGAGATGCGAGGAGGATG
F: CACCGGCAGCAAAGTTCTGA
R: TGTGTCTCTACCTCCTGGACAA
F: CCTCGACCAAGAGCTGAAG
R: CCTCCAGACCTCACGTTTGTTC
F: CATCGCGGACAGGATGCAGAAA
R: CCTGCTTGCTGATCCACATCTGCT

169

NM_001271737

99

NM_001040470

89

NM_180992

103

NM_001035386

118

NM_001077828

123

NM_001206676

63

NM_001101152

158

NM_173979.3

a

2 XBP1s = spliced form of X-box binding protein 1、HP = haptoglobin、ALB = albumin、CAT = catalase、IGF1= insulin-like growth factor 1、ATTP = α-tocopherol transfer protein (αTTP)、RPS9 = ribosomal protein S9、
ACTB = β-actin
3b
For = forward primerc
Rev = reverse primer

表１

4－ 72 －

5

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RU EFFECTS ON LIVER IN POSTPARUM COWS

（Week: W）、処理区（Treat: T）およびWとが、各週における両区間の体重に有意な差は確Tの交互作用を固定効果として混合モデル解析

認されなかった。BCS（図 1B）についても体を行い、P < 0.05の場合に有意な差が有り、P重と類似した傾向を示し、両区共に、期間推移< 0.1の場合に差の傾向有りと判定した。W×Tにおいて有意な変化（P < 0.05）を示し、分娩交互作用が有意であった場合にはTukeyの多重前と比較して分娩後に低下した。分娩後の平均検定を実施して、同一週における処理区間の差

BCS は RU 区が P 区よりも値が低かったが、Tを検定し、P < 0.05を有意差有り、P < 0.1の場効果および W × T 交互作用に有意な効果は認合に差の傾向有りと判定した。

められなかった。分娩 30 日後までの泌乳成績（データ略）では、両区の牛群の日泌乳量は共［結果］に泌乳最盛期に向けて著増し、試験期間におい1．体重、BCS、泌乳量変化および臨床所見て有意な日変化（P < 0.01）を示したが、両区両区の牛群の平均体重（図 1A）は共に分娩間における毎日の平均日泌乳量および 30 日間

前は 800kg を超えていた。期間推移においての平均泌乳総量に有意な差は確認されなかっ有意な変化（P < 0.01）を示し、分娩前と比較た。

して分娩後に約 100kg 程度減少した。W × T

臨床所見では、RU 区の乳牛 1 頭が分娩直後交互作用に有意な効果（P < 0.05）を検出したに臨床型乳房炎を発症し、分娩 4 － 6 日後に

図1

移行期の体重およびボディコンディションスコア（BCS）の変化
A）体重（kg）およびB）BCSの推移を、平均値±標準誤差（SEM）で示した。

図１

Rhizopus oryzae 水抽出物給与区（RU区、実線・〇、n = 3）およびプラセボ給与区（Placebo:

P区、破線・■、n = 3）。計量、判定実施は分娩予定日の3週前（実分娩日に対する日数：－18±1.3日）、1週前（－6±0.3日）、分娩0.5週後（3±0.2日）、1週後（7±0.2日）、2週後（14±0.4日）および3週後（21±0.3日）。BCS値はスコアリン
グ経験者3名がUV法［4］により判定した結果の平均値。統計処理は、個体を変動効果、
分娩後週（Week）、処理区（Treat）およびWとTの交互作用（W×T）を固定効果とした混合モデル解析（SAS）。P < 0.05の場合に有意な差有りと判定。

－ 73 －

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Rhizopus oryzae 水抽出物給与が産褥期乳牛の肝臓に及ぼす影響

40℃超の発熱、食欲停滞を呈した。罹患乳房へ化（P < 0.01）を示し、分娩直後から産褥期にの抗生物質（セファメジン Z, 日本全薬工業）

増加および高値が確認され、特に P 区では分投与および解熱鎮痛消炎剤（ザルソブロカ糖注

娩直後から著しく増加し、0.5 週後にピークとNZ, 日本全薬工業）を加えたリンゲル輸液によなり平均活性値（180 ± 59.9 IU/L）が分娩前る治療を行い、分娩 2 週後までに症状消失を確の値（47 ± 3.0 IU/L）の約 3.8 倍にまで達し、認した。

1 週後（141 ± 14.4 IU/L）でも約 3 倍高い状態が続いた。一方、W × T 交互作用に効果傾向（P2．血清中成分濃度および肝障害マーカー値の< 0.1）が検出され、RU 区では P 区と比較して変化

移行期において活性値が低い傾向（P < 0.1）

血清中 NEFA、BHBA および α-Toc 濃度のを示し、特に産褥期における増加度が小さく、移行期の変化について表 2 に示した。両区の血0.5 週後の平均活性値は P 区の約 1/2 であった。

清中 NEFA および BHBA 濃度は共に、期間推

血清中 ALT 活性値（図 2B）は、AST のよう移において有意な変化（P < 0.01）を示し、平な顕著な変化を示さなかったが、移行期全体の均 NEFA 濃度は分娩直後から、平均 BHBA 濃

推移は両区で大きく異なった（P < 0.05）。P 区

度は分娩 0.5 週後より、分娩前と比較して増加が期間を通じて漸増推移を示し、特に分娩 0.5

し た。 分 娩 2 週 後 以 降 で は、RU 区 の 平 均

週後には上昇ピークが確認された一方、RU 区

NEFA および BHBA 濃度が P 区より低く推移

では産褥期はわずかに平均活性値が低下した結したが、統計的な有意差はどちらも認められな果、分娩 0.5 週後および 1 週後の平均活性値はかった。血清中 α-Toc 濃度は両区共に移行期を

P 区の約 1/2 となった。また、W × T 交互作

通じて有意に変動した（P < 0.01）。具体的には、用に有意な効果（P < 0.05）を検出し、分娩 0.5

分娩 3 週前から分娩にかけて漸減し、分娩直後

週後において RU 区の活性値が P 区の活性値から産褥期は低値で推移した後、分娩 3 週後により統計的に低い傾向（P < 0.1）が確認された。

かけて漸増した。両区の濃度に有意な差は確認
3．肝生検組織中 mRNA 発現量の変化されなかった。

1

ネクローシス様細胞死等による肝細胞障害の分娩直後に mRNA 発現量が著増する 2 遺伝マーカーである AST および ALT の血清中活子および著減する 4 遺伝子の変動について図 3

性値の測定結果を図 2 に示した。血清中 ASTに示した。ER ストレスマーカーである転写因活性値（図 2A）は、移行期において有意な変子成熟型 X-box binding protein 1（XBP1s）お表2Rhizopus oryzae 水抽出物給与区（RU区）およびプラセボ給与区（P区）における血清中遊離脂肪酸（NEFA）、β-ヒドロキシ酪酸（BHBA）およびα-トコフェロール（α-Toc）濃度の変化（各 n = 3）
分娩後週数
-3

-1

0

0.5

1

2

3

0.25
0.14

0.32
0.17

0.77
0.51

0.75
0.74

0.54
0.63

0.83
0.43

0.59
0.30

0.59
0.58

0.67
0.68

0.66
0.59

0.94
0.69

1.17
0.82

1.65
0.87

0.38
0.40

0.26
0.36

0.19
0.23

0.16
0.21

0.20
0.18

0.25
0.23

SEM a

Pb
Week

Treat

W×T

0.05

< 0.01

0.24

0.44

2.34
1.67

0.10

< 0.01

0.22

0.28

0.32
0.38

0.02

< 0.01

0.60

0.80

NEFA (mEq/L)
P
RU
BHBA (mM)P
RU
α-Toc (mg/dL)
P
RU

2

a
b

標準誤差
Week：分娩後週数、Treat：処理区、W × T：分娩後週数と処理区の交互作用

3

45－ 74 －

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図2

RU EFFECTS ON LIVER IN POSTPARUM COWS

移行期の血清中肝障害マーカー値の推移
A）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）およびB）アラニンアミノト

図2

ランスフェラーゼ（ALT）の血清中活性値（IU/L）の推移。平均値±標準誤差（SEM）。
Rhizopus oryzae 水抽出物給与区（RU区、実線・〇、n = 3）およびプラセボ給与区（Placebo:

P区、破線・■、n = 3）。経静脈採血実施は分娩予定日の3週前（実分娩日に対する日数：－18±1.3日）、1週前（－6±0.3日）、分娩直後（約9－13時間後）、分
娩0.5週後（3±0.2日）、1週後（7±0.2日）、2週後（14±0.4日）および3週後（21±0.3日）。統計処理は、個体を変動効果、分娩後週（Week）、処理区（Treat）およびW とTの交互作用（W×T）を固定効果として混合モデル解析（SAS）。P < 0.05の場合に有意な差が、P < 0.1の場合に差の傾向有りと判定。W×T交互作用がP < 0.05時にTukeyの多重検定を実施、同一週における処理区間の差について、P < 0.1の場合に差の傾向有り（†）と判定。
よび急性炎症マーカーであり主に肝臓に発現す平均 mRNA 発現量の低下は P 区と比較して緩る急性期タンパク質ハプトグロビン（Hp）の慢であった。Hp の平均 mRNA 発現量は 0.5 週

各 mRNA 発現量は、移行期に有意な変動（P後において、P 区では低下推移になっていたが、< 0.01）を示し、分娩 3 週前と比較して分娩直RU 区ではさらに高値となった。その後は両区

後 に 著 し く 高 い 発 現 量 を 示 し た。XBP1s の共に同様の発現量まで低下した。しかし、各週

mRNA 発現量は分娩直後がピークであり、Pにおける両区間の有意な違いはどちらの遺伝子

区では 0.5 週後にはほぼ分娩 3 週前の発現量とにおいても認められなかった。

同等レベルまで著減したが、一方、RU 区では肝臓において合成、分泌される主要タンパク－ 75 －

家畜感染症学会誌
9 巻 2・3 号 2020

図３

Rhizopus oryzae 水抽出物給与が産褥期乳牛の肝臓に及ぼす影響

移行期の肝生検組織中mRNA発現量の推移
XBP1s = spliced form of X-box binding protein 1、HP = haptoglobin、ALB = albumin、CAT = catalase、IGF1 = insulin-like growth factor 1および ATTP = α-tocopherol transfer

図3

Rhizopus oryzae水抽出物給与区
protein（αTTP）。
表示は平均値±標準誤差
（SEM）
。
（RU区、
実線・〇、n = 3）およびプラセボ給与区（Placebo:

P区、破線・■、n = 3）。肝生検実施

は分娩予定日の3週前（実分娩日に対する日数：－18±1.3日）、分娩直後（約9－13時間後）、分娩0.5週後（3±0.2日）、1週後（7±0.2日）および3週後（21±0.3日）。既報[8]に基づいた立位術式により右側第11－12肋間部位から生検。各遺伝子の発現定量は、既報[8]に基づき、ribosomal protein S9 mRNA（RSP9）およびβ-actin mRNA（ACTB）をマルチ内部
標準遺伝子とした⊿⊿Ct法により解析。各遺伝子のmRNA発現量は、6頭の分娩3週前サンプルにおける平均発現量を基準値1とした相対値。統計処理は、個体を変動効果、分娩後週（Week）、処理区（Treat）およびWとTの交互作用（W×T）を固定効果として混合モデル解析（SAS）。P < 0.05の場合に有意な差が、P < 0.1の場合に差の傾向有りと判定。

－ 76 －

The Journal of Farm Animal in Infectious Disease
Vol.9 No.2･3 2020

RU EFFECTS ON LIVER IN POSTPARUM COWS質である Alb および主要な抗酸化酵素であるは得ていないものの、以上の結果から、供試牛

カタラーゼ（Cat）の各 mRNA 発現量は、移全体において、分娩以降、高泌乳牛に典型的な行期に有意に変動し（P < 0.01）、いずれも分エネルギー不足［1］が生じていたと推察された。

娩 3 週前と比較して分娩直後に著減し分娩 0.5

分娩 2 週目以降、RU 区の血清中 NEFA およ

週後も発現抑制が続いた。Alb および Cat の平び BHBA 濃度が P 区より低く推移したが、統均 mRNA 発現量は、RU 区においては分娩 1

計的な有意差は認められず、クローズアップ期

週後に分娩 3 週前の値の約 40% 程度までの回の RU 給与（実質 0.5g/ 頭 / 日）に、移行期の復に留まったが、P 区の平均発現量は約 80%

エネルギー代謝負荷を改善する効果があったか程度まで回復した。分娩 3 週後には両区同等レ

どうかは明らかにはできなかった。

ベルの発現量となった。ただし、移行期を通し肝細胞の壊死等による細胞膜破裂に伴って細て、両区間の有意差はいずれも認められなかっ胞内から血中に逸脱する AST および ALT のた。 肝 臓 由 来 の 代 表 的 な 内 分 泌 因 子 で あ る

両酵素は、ネクローシス様細胞死等による肝細IGF-1 の mRNA 発現量は、移行期に有意な変胞障害レベルを評価できるマーカーである。

動（P < 0.01）を示し、分娩 3 週前と比較してCCl4 肝障害誘発ラットを用いた Suzuki らの実分娩直後に 20% 程度まで著減し、その後分娩

績［18］では、CCl4 投与前 10 日間の RU 連日

3 週後にかけて緩やかな回復推移となった。W

経口投与（10mg/kg BW）が、CCl4 誘発肝障× T 交互作用に効果傾向（P < 0.1）を検出し害による AST および ALT の血清中活性値のたが、両区間の有意差は認められなかった。

増加を顕著に抑制した。本研究においても、産

α-Toc の体内循環調節を担う αTTP の mRNA

褥期に起きる AST および ALT の血清中活性発現量は分娩前後の期間に変動する傾向が認め

値の増加が RU 区において抑制される傾向が確られ（P < 0.1）、分娩 3 週前と比較して分娩直認され、クローズアップ期 3 週間の RU 連日給後から 0.5 週後にかけて mRNA 発現量が 60 －与（実質 0.5g/ 日）が産褥期に起きる肝障害に70% まで低下した。分娩 3 週後に両区共に分対し保護・緩和効果を発揮した可能性が示唆さ娩 3 週前の約 80% 前後の発現量に回復した。

れた。CCl4 の肝障害機序は多経路が関連する

ただし、移行期を通して、両区間の有意差はいが、その発端は、肝臓に存在する薬物代謝酵素

ずれも認められなかった。

cytochrome P450 群により CCl4 から生じるト
リクロロメチルラジカルが引き起こす酸化スト［考察］

レスと炎症だと考えられている［16］。乳牛の本研究では、クローズアップ期における RU

産褥期における肝障害発生要因も単純ではない

連日給与が、産褥期の乳牛に起きる肝臓の障害、が、分娩により誘導される酸化ストレスと炎症

急性の炎症応答、ER ストレスの亢進および機応答が産褥初期の肝障害に強く影響しているこ

能関連遺伝子発現の抑制を予防・緩和する、ととが推察されることから、実験モデル動物においう仮説の検証を試みた。その結果、クローズ

ける CCl4 の肝障害機序と共通する因子があり、アップ期の RU 給与（実質 0.5g/ 頭 / 日）は、同様に RU 給与効果が得られた可能性がある。

産褥期のネクローシス様細胞死等の肝細胞障害

一方、供試牛のクローズアップ期の平均体重はに対する保護・緩和効果を発揮した可能性が示

850kg 程度だったため、体重換算した RU 経口

唆された一方、急性的な炎症応答、ER ストレ

給与量は約 0.6mg/kg BW であり、単純計算にスの亢進および分娩直後から少なくても 3 日間

なるが CCl4 肝障害誘発ラット［18］に用いたに渡って生じる肝機能関連遺伝子の発現抑制に

用量の約 6% 程度という微量で作用が確認され対する予防効果は確認されなかった。

たことは特筆すべきである。これは実験動物へ

本試験では、分娩後の体重および BCS の有の肝局所的な毒性暴露に当たる CCl4 投与と比意な減少、泌乳最盛期に向けた泌乳量の急激な較した場合、乳牛の分娩に起因する肝臓への酸増加が確認された。また、血清中 NEFA およ

化ストレスや炎症刺激が比較的マイルドであっび BHBA 濃度の推移から、分娩後に体脂肪動たため、微量でも効果を示したのではないかと員とケトン血症の亢進を示した。採食量データ考えられる。

－ 77 －

家畜感染症学会誌
9 巻 2・3 号 2020

Rhizopus oryzae 水抽出物給与が産褥期乳牛の肝臓に及ぼす影響

著者らの既報［8］では、分娩直後におけるび Cat に つ い て は そ れ ぞ れ 1/50-100 お よ び

肝組織中の Alb、Cat および αTTP mRNA の1/10 程度と極めて強い発現抑制が生じていた。

発現抑制と、分娩 1 週後における発現量の回復

すなわち、乳房炎発症による炎症応答に伴い、を見出すに至っていた。しかし、肝生検を実施

肝機能を強く阻害したものと推察された。RUしたタイミングが分娩直後および分娩 1 週後の区の発現亢進した Hp と XBP1s の平均 mRNA

2 時点であり、産褥期において発現抑制がどの発現量の収束、そして Alb、Cat および αTTP

程度持続していたのかは不明であった。そこでの平均 mRNA 発現量の回復が P 区より遅れて

産褥期の推移をより正確に捉えるため、本試験

いた動態については、いずれも、この乳房炎罹

では、分娩 3 日後を含めた 3 時点連続肝生検を患牛の肝組織中 mRNA 発現量の他 2 頭との差実施した。その結果、対照区である P 区の各

異が強く寄与していた。乳房炎罹患牛の血清中mRNA 発現量推移から、通常、少なくても分

AST および ALT 活性値の上昇は抑制されて娩後 3 日間はこれらの遺伝子発現抑制が持続しいたため、乳房炎罹患にも関わらず RU の肝障ていることが示された。RU 区では、産褥期の害保護・緩和効果は発揮されていたと示唆されAST および ALT の血清中活性値の上昇は抑るが、クローズアップ期の RU 給与（実質 0.5g/

制されたものの、Hp と XBP1s mRNA 発現の頭 / 日）は乳房炎発症阻止に貢献することはで

亢 進、Alb、Cat、IGF-1 お よ び αTTP mRNA

きなかったと考えられる。1 頭のみのデータでの発現抑制を防ぐことはできなかった。著者らあったが、乳房炎による炎症が、このように肝は仮説において、産褥期の肝組織で観察される臓の急性炎症応答を励起し ER ストレスを亢進

Hp と XBP1s の発現亢進、肝機能関連遺伝子

させるだけでなく、重要な肝機能関連遺伝子のの発現抑制は肝障害に伴って生じるという現象発現を強く抑制する可能性が示唆された点は興フローを想定していた。そのため、肝細胞を障

味深い結果であった。

害から保護できれば、これらの遺伝子発現変化

予備実験の結果では、肝障害後に RU を給与を予防できると考えていたが、本結果はこれをしても肝障害治癒効果は認められず、RU の作

支持しなかった。そのため、肝臓では分娩に伴用は一定期間の継続的投与によって肝臓の障害

いネクローシス様細胞死等の障害を受ける細胞に対する耐性を付与するものと考えられる。例と受けない細胞が混在し（例えば肝小葉領域のえば腸内細菌叢を介した生体調節機能には、細違い）、障害を受けない細胞ではアポトーシス

菌叢の変化に一定の期間を要するが、RU 自体様細胞死を起こすものや、細胞死には至らなく

はオートクレーブによる滅菌を行った培養抽出ても炎症応答により遺伝子発現等の機能のみ阻物であるため生菌によるプロバイオティクス効

害される可能性が推察された。そしてこの機序果は見込まれない。一方、乳酸菌の加熱死菌体には、RU（0.5g/ 頭 / 日）の効果が低かったか、が免疫調節作用や腸内細菌叢の変化をもたらす

作用点がなかったのかもしれない。Suzuki ら

ことが報告されており［11, 15, 20］、RU に含（2015）は、RU が肝障害後の細胞分裂に作用

まれる菌体成分が直接的あるいは腸内細菌叢のし肝細胞再生速度を高める可能性も示唆してい変化を介して生体に影響を与えている可能性はるが［18］、新生細胞が十分な機能を備えてい否定できない。実際のところ、牛のルーメン発

るかは明らかではない。故に AST や ALT が酵において RU がどのような物理的、化学的影示す肝障害に対して RU 給与は保護・緩和作用

響を受けるのか、またルーメン微生物叢にどのが観察され、肝臓全体の機能低下（肝機能関連

ような影響を与えるのかについても十分な知見

遺伝子の発現低下）については予防効果が認めが得られておらず、肝臓に対する RU 作用機序

られない結果となった可能性がある。

についてはなお一層の基礎研究が必要である。

分娩直後に臨床型乳房炎を発症した RU 区の

RU には様々な生理活性成分が含有されている

1 頭に関して個体別データを精査すると、産褥ことが示唆されているが、肝臓に作用している期における各 mRNA 発現量は RU 区他 2 頭と成分の同定も今後の重要な課題である。本研究比較して、Hp および XBP1s ではそれぞれ約 3では供試頭数が限定され、また投与量も一水準倍および 5 倍ほど発現が高く、一方、Alb およのみであったため、RU の乳牛への効用に関し－ 78 －

The Journal of Farm Animal in Infectious Disease
Vol.9 No.2･3 2020て、投与量や投与期間などをさらに詳細に検討する余地がある。
結論として、クローズアップ期の RU 連日経
口給与（実質 0.5g/ 日）は、産褥期における肝障害に対し保護・緩和効果を示すが、産褥期の急性炎症応答、肝 ER ストレスの亢進および肝機能関連遺伝子発現抑制に対する予防効果は得られないことが示唆された。
［謝辞］
本研究を遂行するにあたり、RU 製剤および
疑似 RU 製剤を製造し無償提供して頂きました
株式会社牛越生理学研究所に深謝致します。また、本研究をサポート頂きました畜産飼料作研
究拠点技術支援センター那須業務科諸氏ならびに試験牛に深謝致します。採材に助力頂きました狩野友佳氏（麻布大学）に深謝致します。本
研究の一部は、農林水産研究情報総合センターの科学技術計算システムを利用致しました。本
研究の一部は、公益財団法人伊藤記念財団平成29 年度研究助成を受けて実施致しました。こ
こに記して感謝致します。
［付記］
本論文に関して，開示すべき利益相反関連事項はない。また、英文については専門的校正（Editage、www.editage.com）を受けて記述した。
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－ 80 －

The Journal of Farm Animal in Infectious Disease
Vol.9 No.2･3 2020

RU EFFECTS ON LIVER IN POSTPARUM COWS

Effects of orally administered Rhizopus oryzae aqueous extracts in the close-up dry period on
postpartum serum liver injury markers and hepatic gene expression levels in dairy cows
Satoshi Haga1†, Hiroshi Ishizaki1, and Takehito Suzuki2
1

 razing Animal Unit, Division of Grassland Farming, Institute of Livestock and Grassland Science, NARO, 768
G
Senbonmatsu, Nasushiobara, Tochigi, Japan
2
School of Veterinary Medicine, Azabu University, 1-17-71 Fuchinobe, Chuo-ku, Sagamihara, Kanagawa, Japan†
Correspondence: Satoshi Haga
Grazing Animal Unit, Division of Grassland Farming, Institute of Livestock and Grassland Science,
NARO, 768 Senbonmatsu, Nasushiobara, Tochigi 329-2793, Japan
Tel: +81 287 37 7239 Fax: +81 287 36 6629
Email: hagatiku@affrc.go.jp【Abstract】
The aim of this study was to evaluate the preventive effects of orally administered Rhizopus oryzae aqueous
extracts (RU) on puerperal hepatic injury, inflammation, endoplasmic reticulum (ER) stress, and suppression ofhepatic gene expression in dairy cows. Treatments (n = 3) on 6 multiparous Holstein cows included the RU group(orally administered RU (0.5 g/head/day), and a placebo (P) group from −3 weeks to 0 days postpartum. Blood
samples were taken from the cows by jugular venipuncture, and liver tissue was obtained by biopsy. Liver injury
was assessed based on the serum activities of aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase(ALT). The hepatic mRNA expression levels of ER stress-induced unfolded protein response marker (XBP1s),
haptoglobin (Hp), albumin, catalase, and vitamin E transfer protein (αTTP) were measured by RT-qPCR. After
calving, AST and ALT serum activities in the RU group were lower than those in the P group. The hepatic mRNA
expression levels of XBP1s and Hp temporarily increased at calving, while the hepatic mRNA expression levels ofalbumin, catalase, and αTTP were downregulated during the 3 days after calving. However, we could not confirm
a significant difference between these two groups. These results indicate that RU (0.5 g/head/day in the close-up
period) may prevent liver injury after calving; however, they could not clearly demonstrate preventive effects on
puerperal acute hepatic dysfunction (the suppression of gene expression) in dairy cows.
Keywords: calving, liver biopsy, necrotic-like cell death, preventive effect, Rhizopus oryzae aqueous extracts－ 81 －