川崎医療福祉学会誌
原Vol. 28

No. 1

2018

125 － 133

著

画像解析によるマウスの体毛成長の評価
中村博範＊1 三宅沙知＊1

要約

本研究は，画像解析によるマウスの体毛成長の評価法を確立するために行った．はじめに，画像解析ソフトのImageJを用いた画像解析の手順とその性能を確認した．その結果，画像解析で測定した図形の面積は，計算した面積と一致し，また，平均画素値は図形の濃淡を反映した．次に，写真の画像解析によるマウスの体毛成長の評価法を検討した．マウスの背部の体毛を除毛して体毛の成長期を誘導し，体毛成長は体毛と皮膚の色（画素値）の違いを基に評価できた．除毛から14日目の体毛成長率は，コントロール群（非ストレス）は65.5％，1日2時間の拘束ストレスを与えた慢性ストレス群は22.9％であった．ImageJによる写真の画像解析は，マウスの体毛成長の客観的な評価に有用であることが分かった．
１．緒言

価法の確立が不可欠である．実験でよく使用される毛は哺乳類の特徴の一つで，皮膚に埋まった毛包C3H マウスは毛色が野生色（アグーチ）で，生後1）という組織で作り出される ．毛包は，成長期，退45日から95日までの毛周期は細胞分裂が止まった休

行期，休止期からなる毛周期を繰り返し，新しい毛止期となっている13）．そのため，実験では，休止期

周期が始まると前の毛は失われる2）．毛球というふから成長期に誘導するために，体毛の除毛が行わ

くらんだ部分は成長期にのみ見られ，毛母細胞が毛れる11,15）．したがって，体毛成長は，マウスの体毛

球の底部に局在する毛乳頭細胞からシグナルを受けと皮膚の色の違いによって評価できる．そこで，本て増殖，分化し，ケラチンたんぱく質が合成され毛研究では，画像解析ソフトのImageJ16）を用いて検が形成される3）．毛母細胞の分裂速度は極めて速く4），討を行い，さらに，その方法を用いて，ストレス条

また，毛包におけるエネルギー代謝やアミノ酸代

件下でのマウスの体毛成長について評価した．

謝5-7） は，一般的な細胞の代謝とは異なり，がん細胞の代謝に似ている．すなわち，グルコースやグル２．方法

タミンを効率的に利用して，細胞分裂に必要な脂質

２.１

8-10）

ImageJによる図形の面積測定．そのため，

ImageJによる解析手順とその精度を確認するた毛の成長を制御できれば，がん研究にも応用できる

め，Microsoft Power Pointの図形ツール（挿入→可能性がある．

図形）を使用して図形を描き，その図形の面積の測やたんぱく質，
核酸を活発に合成する

ヒトの毛周期は毛包ごとに独立しているが，マウ定を行った．まず，除毛したマウスを想定して，一スなどの小型のげっ歯類では，毛周期が同調してい辺が3.5cmの正方形を背景とし，直径3.0cmの円をる11,12）．そのため，毛周期に対する効果を容易にみ

描き円の色を段階的に濃くしたものを準備した（図ることができる．マウスの体毛成長の客観的な評価

1－A，B，C，D）．次いで，図1－Aの円を，3/4，

については，一般に除毛部に対する再発毛面積の比

1/2，1/4，１/8にしたものを準備した（図1－E，F，G，率や皮膚の色調変化によって行われる11）．しかし，H）．スライドは画像ファイル形式（TIFF）で保存

13,14）

これまで我々が行った研究

して，ImageJでの画像解析に用いた．

では客観的な評価ができておらず，主観的な評価に留まっている．した

ImageJによる画像解析手順は，①基準となる長がって，今後，毛母細胞の細胞増殖の制御についてさの設定，②画像のグレースケール化，③閾値の設研究を進めていくためには，体毛成長の客観的な評定（2値化処理），④領域の選択，⑤面積の測定とい＊1 川崎医療福祉大学

医療技術学部 臨床栄養学科（連絡先）中村博範 〒701-0193 倉敷市松島288 川崎医療福祉大学
E-mail : hironori@mw.kawasaki-m.ac.jp

125

126

中村博範・三宅沙知

A

B

C

D

E

F

G

H

図1

画像解析に用いた図形
除毛クリーム（Veets，レキットベンキーザー・ジャ

う手順で行った．
具体的には，画像データをImageJで開き，まず，

パン，主成分：チオグリコール酸）を使用して背部Line）を使って，正体毛を除毛した．除毛の翌日より，S 群は，ストレ方形の一辺（3.5㎝）に合わせて線を引き，基準となスケージ（シナノ製作所）で1日2時間（10～12時）

る長さを設定した（Analyze → Set Scale → Knownの拘束ストレスを4週間与えた．体重と摂食量につDistance →3.50と入力）．次に，画像をグレースケー

いては毎日定時に測定した．

ツールバーの直線（Straight

ル画像に変換（グレースケール化）し，画像を構

また，C 群，S 群については，体毛成長を記録す

成するそれぞれの画素を0～255の256階調の画素値るため，除毛翌日（開始時），7日目，14日目，21日目，に変換した（Image → Type →8-bit）．続いて，特28日目に，背部写真をデジタルカメラ（キャノン，定の領域を抽出するために基準となる閾値を設定しkiss x3）で撮影した．撮影はイソフルラン麻酔下て，その値以上の画素を1（ 白），その値未満の画素で行い，長さが分かるように方眼紙を敷いた上にマ

値を0
（ 黒）
として2値化処理（白と黒の2色の画像にウスを横臥させた．また，1匹につき約10枚撮影した．

変換）を行った（Image → Adjust → Threshold，

4週間の飼育終了後，一晩絶食させ，イソフルラ「Red」を「B ＆ W」に変更→スライドバーの上段

ン麻酔下にて下大静脈から採血した．血液はマイクの数値を160，下段の数値を255に設定）．そして，ロテストチューブに入れて，室温に30分放置したあ測定する領域を自動選択（ワンド）
ツールで選択し，と遠心分離（3000回転，5分）して血清を分離した．

面積（㎠）と平均画素値（選択領域の画素値の平均

血清は，分析まで冷凍保存（−50℃）した．その他，値）を測定した（Analyze → Measure）．面積（㎠）

慢性ストレスの指標となる副腎と脾臓を採取して，の計算値は，円の面積を1.5×1.5×3.14で求め，そ湿重量を測定した．

の値を基準にしてそれぞれ求めた．
２.２

実験動物及び飼育環境

7週齢のオス C3H（C3H/HeJJcl）を日本クレア（東本動物実験は，川崎医療福祉大学動物実験委員会の承認を得て行った（承認番号14-004）．
２.４

マウスの背部写真の画像解析

京）から購入して使用した．飼育は，1ケージ1匹でマウスの背部写真の画像データの解析手順は，行い，飼料にはオリエンタル酵母工業（東京）の図形の解析手順と同様であるが，基準となる長さ

MF（固形）
飼料を用いた．飼育環境は，室温23±2℃，

は，撮影時にマウスの下に敷いた方眼紙の目盛を明暗サイクル12時間（明期8:00-20:00）であった．

使用し，マウスに近い目盛りに合わせて今回は5

２.３㎝の 線 を 引 き， 長 さ を 設 定 し た（Analyze → Set

実験飼育

7週齢のマウスを1週間予備飼育した後，平均体重

Scale → Known Distance →5.00と入力）．また，閾

が同じになるように，通常群（N 群：5匹），コント

値の設定については，グレースケール化した画像

ロール群（C 群：非ストレス：5匹），ストレス群（S

データを用いて，マウスの鼻先から尾部までを直線

群：5匹）の3群に分けた．C 群と S 群は体毛の成長（Straight

期を誘導するため，
はじめにイソフルラン麻酔下で，測定（Analyze → Plot Profile）して，体毛と皮膚

動物用バリカン（ポケットプロ，日本ウォール）との画素値の違いを見極めて設定した．皮膚領域のLine）で結び，画素値（グレー値）を

画像解析によるマウスの体毛成長の評価

127

Statistics 22を用いた．

選択においては，その領域が仕切られている必要があるが，仕切られていない場合は，描画ツール（Drawing Tools）で線を引いた．また，皮膚領域

３． 結果が複数ある場合は，それぞれ面積を測定して合計し３.１ ImageJによる図形の面積と平均画素値の測定

た．1匹につき写真3枚を測定し，その平均値を値と図1の図形をImageJで測定した結果を表1に示す．
面積の測定値の誤差は最大で2％であった．また，した．

図1A － D の平均画素値は，円の色が明るいと値が体毛成長率（％）は，開始時の皮膚面積から各段階での皮膚面積を差し引いて発毛面積を求め，それ高く，逆に暗いと値が低かった．

をさらに開始時の皮膚面積で割って計算した．

３.２

２.５

血清成分の測定

体重及び摂食量

各群の体重変化を表2に示す．体重は，3群間に血清中のグルコース，アルブミン，トリグリセリ

有意な差はなかったが，S 群では，他の２群と比ド，総コレステロール，遊離脂肪酸を測定し，測定較して7日目，14日目は低い傾向にあった．一方，には，和光純薬工業（大阪）の測定キット（グル各群の摂食量は表3に示すように，7日間ごとの合コース C- テストワコー，アルブミン II-HA- テスト

計摂食量と28日間の総摂食量は，いずれも N 群とワコー，トリグリセライド E- テストワコー，コレ

比較して，C 群，S 群では有意に高値であった．まステロール E- テストワコー，
NEFA テストワコー）

た，S 群と C 群の間には有意差はなかった．

を用いた．

３.３

２.６

統計処理

副腎及び脾臓重量

実験終了時における副腎と脾臓の湿重量を表4に

値は平均値±標準誤差で示した．2群間での比示す．副腎は，3群間での有意な差はなかったが，較は，対応なしの t 検定を用いて行った．また，3S 群が最も高く，次いで C 群，N 群の順であった．

群間の多重比較は，一元配置分散分析後，Tukey

一方の，脾臓は，S 群は N 群と比較して有意に低法を用いて行った．p 値が5％未満（p ＜0.05）を値で，また，C 群よりも低い傾向にあった．

有意差ありとした．統計ソフトには，IBM SPSS
表１

図形

図形の面積及び平均画素値

測定値(a) 計算値(b)

A
B
C
D
E
F
G
H

a/b

cm2

cm2

％

7.089
7.081
7.108
6.973
5.318
3.556
1.765
0.901

7.065
7.065
7.065
7.065
5.299
3.533
1.766
0.883

100.3
100.2
100.6
98.7
100.4
100.7
99.9
102.0

表2

平均画素値

241.2
216.4
190.8
166.0
240.8
241.2
240.1
238.8

実験期間中の体重変化

NCS
24.9 ± 0.4

開始時

（g）

24.5 ± 0.4

24.9 ± 0.3

7日目

（g）

25.5 ± 0.3

25.3 ± 0.3

24.7 ± 0.3

14日目

（g）

26.9 ± 0.6

26.6 ± 0.4

25.9 ± 0.4

21日目

（g）

27.2 ± 0.3

27.5 ± 0.5

26.9 ± 0.5

28日目

（g）

27.6 ± 0.5

28.4 ± 0.6

27.5 ± 0.4

増加量（g/28日） 3.1 ± 0.6

3.5 ± 0.4

2.7 ± 0.4

値は平均値±標準誤差を示す．

128

中村博範・三宅沙知
表3

実験期間中の摂食量

1- 7日 (g/7日)

Na23.0 ± 0.6

Cb25.9 ± 0.6

Sb26.5 ± 0.6

8-14日 (g/7日)

23.7 ± 0.4

a26.9 ± 0.5 b

27.8 ± 0.7 b

15-21日 (g/7日)

22.4 ± 0.3

a25.6 ± 0.3

b25.1 ± 0.4 b

22-28日 (g/7日)

20.9 ± 0.5

a24.7 ± 0.8 b

24.1 ± 0.6 b

90.0 ± 1.0

a103.1 ± 1.1

b103.4 ± 2.0

総摂食量(g/28日)b

値は平均値±標準誤差を示す．
異なる文字を有する群間に有意差あり(p＜0.05)

表4

実験飼育終了時の副腎及び脾臓重量

副腎

(mg)

N
2.2 ± 0.3C
2.6 ± 0.2S
2.8 ± 0.2

脾臓(㎎)

74.6 ± 1.5 a

68.0 ± 2.4 ab63.1 ± 4.0 b

値は平均値±標準誤差を示す．
異なる文字を有する群間に有意差あり(p＜0.05)
グレースケール画像

画素値（グレー値）

2値化処理画像（閾値50）

1.0cm（A）開始時グレースケール画像

画素値（グレー値）

2値化処理画像（閾値50）

1.0cm（B）除毛後14日目

図2

グレースケール画像と2値化処理画像
画像はC群の一例を示す.

３.４

体毛成長の観察と画像解析による評価

膚領域を区分し，皮膚領域の面積と平均画素値を測

マウスの背部写真の画像データを用いて，体毛領定した．測定結果を表5，表6に示す．開始時の除毛域と皮膚領域の画素値を測定した．その一例を図2

部位の皮膚面積（㎠）と皮膚領域の平均画素値は，両に示す．体毛領域と皮膚領域の画素値は異なり，体群間に差はなかった．7日目は，C 群と S 群の皮膚毛領域の値と比較して，皮膚領域の値は高かった．

面積に差はなかったが，平均画素値は，C 群は S 群

画像解析では，閾値を50に設定して，体毛領域と皮と比較して有意に低値であった．14日目は，図3に

画像解析によるマウスの体毛成長の評価
表5

皮膚面積
（cm2）
の変化

表6

S

開始時

112 ± 2110 ± 18.77 ± 0.24

7日目

97 ± 2104 ± 1 ＊3.06 ± 0.50

6.59 ± 0.39 ＊14日目

68 ± 383 ± 2 ＊0.08 ± 0.01

0.58 ± 0.07 ＊21日目

68 ± 374 ± 20.00

0.10 ± 0.02 ＊

28日目

-

S

開始時

8.73 ± 0.46

8.57 ± 0.15

7日目

8.53 ± 0.38

14日目
21日目
＊

皮膚領域の平均画素値

C

C

28日目

129

＊

2群間で有意差あり（p＜0.05）

表7

2群間で有意差あり（p＜0.05）

体毛成長率（％）

C
開始時

S

-

-

7日目

2.0 ± 1.9

-2.3 ± 1.4

14日目

65.6 ± 4.6

22.9 ± 4.8 ＊21日目

99.1 ± 0.1

93.2 ± 0.9 ＊

28日目

100.0

98.9 ± 0.3 ＊＊74 ± 4 ＊2群間で有意差あり（p＜0.05）

C-1

C-2

C-3

C-4

C-5

S-1

S-2

S-3

S-4

S-5

図3

除毛後14日目における背部写真

C-1〜C-5はコントロール群，
S-1〜S-5はストレス群

示すように C 群と比較して S 群では発毛の遅れがは，両群ともほぼ全領域で発毛が観察されたが，S観察された．画像解析の結果，S 群は C 群と比較し群では尾部側が生えておらず有意に高値であった．

て皮膚面積が有意に高値であった．21日目，28日目

皮膚面積より求めた体毛成長率（％）は，表7に示

130

中村博範・三宅沙知
表8

血液生化学データ

C

S

グルコース

(mg/dL)170 ± 19155 ± 16170 ± 9アルブミン

(g/dL)

3.2 ± 0.1

3.2 ± 0.1

3.4 ± 0.1

トリグリセリド(mg/dL)125 ± 9120 ± 11110 ± 12

総コレステロール (mg/dL)

130 ± 1121 ± 4129 ± 2遊離脂肪酸

0.99 ± 0.13

0.87 ± 0.03

0.92 ± 0.06

(mEq/L)

すように，14日目に，C 群が65.5％だったのに対し，
S 群では22.9％と有意に低値であった．
３. ５

N

能になる．
マウスの皮膚面積を測定する場合は，体毛領域と血液成分

皮膚領域を区別するために閾値を設定する必要があ

各群の血液生化学データの結果を表8に示す．グる．図2の結果で示したように，体毛領域と皮膚領

ルコース，アルブミン，トリグリセリド，総コレス

域では画素値が異なるため，閾値の設定によって両テロール，遊離脂肪酸を測定した結果，すべての項

者を区別することができた．閾値の設定においては，目において3群間に有意差はなかった．

除毛した皮膚領域と画像解析での選択領域が一致することを目視で確認し，閾値は50が妥当である判断

４．考察した．したがって，すべての画像解析で，閾値を50

４.１

図形及びマウスの背部写真の画像解析として測定を行った．また，この前提条件として，

本研究では，画像解析ソフトのImageJを使用し，写真の明るさが測定値に影響するため，マウスを撮

マウスの体毛成長の評価法について検討した．

影する際は，部屋の明るさやカメラの設定など同じ

ImageJは，アメリカ国立衛生研究所（National

条件で行った．その他，背部の面積は，マウスの姿

Institute of Health）で開発された画像解析ソフト

勢によって影響を受け，背が曲がり丸まっていると，

16）

で，ダウンロードして無償で使用することができる ．

背部面積が小さくなるため，撮影時は，マウスの姿

ImageJは，組織・細胞画像や電気泳動のゲルの解勢についても注意し，麻酔下でマウスの体位を整え

17）析など幅広く使用でき ，日本語訳や操作手順につて撮影した．

いてはインターネット上に公開されている．

４.２

ストレスと体毛成長

実験では，ImageJの操作手順とその精度につい画像解析を用いて，慢性ストレスがマウスの体毛て図形を用いて確認した．除毛したマウスを想定し成長に及ぼす影響について評価した．実験では，Cて図形を描き，それぞれ面積と平均画素値を測定し群と S 群は体毛の成長期を誘導するため除毛を行た．その結果，面積の測定値は計算値と一致し，正い，また，S 群は1日2時間の拘束ストレスを4週間確に面積を測定できることが分かった．また，図形与えた．

の濃淡については，平均画素値によって評価できることが分かった．

慢性ストレスでは，副腎の肥大や胸腺や脾臓の萎
縮することが知られている18）．そこで，ストレスの画像解析における面積の測定では，2値化処理よっ有無を確認するため，4週間の実験飼育後に副腎とて特定の領域を抽出する必要がある．デジタル画像

脾臓を採取して湿重量を測定した．その結果，副腎を構成する1つ1つのマス目のことを画素というが，重量は，有意な差はなかったが，高い順に S 群，C

画像をグレースケールに変換（グレースケール化）群，N 群であった．一方，脾臓重量は，高い順に，すると，それぞれの画素が0～255の256階調の画素

N 群，C 群，S 群で，S 群は N 群と比較して有意に値に変換され，暗い画素は低い画素値，明るい画素

低値であった．この結果から，除毛はマウスにとっは高い画素値となる．2値化処理では，基準となるてストレスになっていたこと，そして，拘束ストレ閾値（Threshold）を設定し，その値以上の画素値

スはさらに大きなストレスであったと考えられた．

を1（白），その値未満の画素値を0（黒）として，白と次に，体毛成長へのストレスの影響については，

黒の2色の画像にさらに変換される（測定に使用しC 群と S 群を比較して7日目の皮膚面積に差はな

た「B&W」では，白と黒が逆になる）．この画像処

かったが，平均画素値では2群間で有意な差がみら

理によって，特定の領域が選択でき面積の測定が可れた．さらに，7日目には，C 群では頭部側から皮画像解析によるマウスの体毛成長の評価

131

膚が黒くなりはじめているのが観察された．体毛のして，視床下部－下垂体前葉－副腎皮質系や視床下合成は毛包の成長期に進み，毛母細胞の細胞分裂と部－交感神経－副腎髄質系の活性化を生じる22）．そ同時に毛球に存在するメラノサイトでメラニンが合のため、異なるストレス条件でみられる体毛成長の成されるため皮膚の色が変化する．したがって，平変化は，これらのストレス反応に起因するものと考

均画素値の違いは，皮膚のメラニン含量の違いを反えられる．副腎皮質から分泌される糖質コルチコイ

映すると考えられ，S 群では毛包の成長期の開始がドには，体毛の休止期から成長期への誘導を抑制す

遅れていたと考えられた．14日目は，C 群と S 群

る作用があることが報告されている18）．また，毛包では，体毛成長に大きな違いが観察され，画像解析

周囲の神経線維から分泌される神経ペプチドのサブした結果，C 群での体毛成長率は65.5％で，S 群はスタンス P は，マスト細胞を活性化してサイトカ

22.9％と有意に低くかった．したがって，ストレスインを分泌させる。いくつかのサイトカインは，毛は，体毛成長に明らかに影響することが示された．

包細胞の増殖抑制やアポトーシスを引き起こすこと

体毛成長は，エネルギーやたんぱく質などの栄養が報告されている23）．したがって，本実験で観察さ状態によって影響を受ける13,14）．また，ストレスはれた S 群での体毛成長の遅れは，ストレス反応に

摂食量に影響することが知られている19）．そこで，ともなうホルモンや神経ペプチドなどの分泌の増加

実験では，摂食量や体重の変化，血液成分を調べた．

が，毛包における細胞増殖のシグナルの発現を低下

C 群と S 群は，摂食量や体重には有意な差はなく，させ，体毛合成に影響した可能性が考えられた．

また，アルブミンなどの血液成分にも違いはなかった．したがって，ストレスによる体毛成長の遅れは，栄養因子以外の要因に起因すると考えられた．

５．結論
ImageJを用いた画像解析によってマウスの体毛

本実験では，拘束ストレスによってマウスにスト

成長の評価法を検討した．除毛したマウスの背部写

レスを与えたが，足への電気ショックストレス20）や真を2値化処理し、皮膚面積を求めることで体毛成

予 測 で き な い軽度のストレスを組み合わせ た 実

長を客観的に評価することができた．また，その評験21） においても，体毛の成長や毛周期に影響がで

価法を用いて，ストレスがマウスの体毛成長を遅ることが報告されている．

延させることを明らかにした．以上のことから，生体は多種多様なストレスに対して共通の応答を示すことが知られている．つまり，ストレス反応と文

ImageJによる画像解析は，マウスの体毛成長の評価に有用である．
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hypothalamic gene expressions in mice．Endocrinology and Metabolism ，28，288-296，2013．
20）Aoki E，Shibasaki T and Kawana S：Intermittent foot shock stress prolongs the telogen stage in the hair cycleof mice．Experimental Dematology ，12，371-377，2003．

21）Liao S，Lv J，Zhou J，Kalavagunta PK and Shang J：Effects of two chronic stress on mental state and hairfollicle melanogenesisi in mice．Experimental Dematology ，26，1083-1090，2017．
22）田中喜秀，脇田慎一：ストレスと疲労のバイオマーカー．日本薬理学雑誌，137（4），185-188，2011．
23）Peters MJ，Arck PC and Paus R：Hair growth inhibition by psychoemotional stress: A mouse model for neuralmechanisms in hair growth control．Experimental Dematology ，15，1-13，2006．
（平成30年7月23日受理）

画像解析によるマウスの体毛成長の評価

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Estimation of Hair Growth in Mice by Image Analysis
Hironori NAKAMURA and Sachi MIYAKE（Accepted Jul. 23，2018）
Key words : hair growth, image analysis, mice，stress
Abstract
This study was conducted to establish a method to estimate hair growth in mice by image analysis. First, theprocedure and the performance for image analysis using ImageJ software was confirmed. As a result, it was foundthat the area of figures area measured by image analysis corresponded to the calculated area, and the mean pixel
value reflected the light and dark of the figures. Next, estimation method of hair growth in mice by image analysis ofa photograph was examined. The hair on the back of mice was removed to induce hair growth（anagen stage）, sothat the hair growth rate could be evaluated based on the difference in color（pixel value）between the hair and theskin. The hair growth rate on day 14 after hair removal was 65.5％ in the control group（non-stress）and 22.9％ in
the chronic stress group, which was subjected to a restraint stress for 2 h a day. The image analysis of a photographby ImageJ was found to be useful for objective estimation of hair growth in mice.
Correspondence to : Hironori NAKAMURA

Department of Clinical Nutrition
Faculty of Health Science and Technology
Kawasaki University of Medical Welfare
Kurashiki，701-0193，Japan
E-mail ：hironori@mw.kawasaki-m.ac.jp（Kawasaki Medical Welfare Journal Vol.28, No.1, 2018 125－133）