The Journal of Farm Animal in Infectious Disease
Vol.6 No.1 2017

THE SIMPLE ESTIMATION OF GNR SPECIES FROM MILK

原著論文

牛乳汁由来グラム陰性桿菌の簡易菌種推定の試み―臨床疫学的、公衆衛生学的分類とその簡易グループ推定法―
千徳芳彦、大久保宏平
NOSAI オホーツク北見家畜診療所
099-0879 北海道北見市美園 497-1
連絡担当者：千徳芳彦
TEL 0157-66-6702

FAX 0157-35-3911

E-mail y-sentoku@nosaiok.or.jp［要約］

官能検査で菌種推定が困難な牛乳汁由来グラム陰性桿菌（non-sensory Gram-negative rod-shaped
bacteria: ns GNR）は分離頻度と薬剤感受性、臨床的、公衆衛生学的重要性から「Escherichia coli（EC）」、「Klebsiella spp.（Kleb）」、「その他」の 3 つのグループに分類できた。鑑別培地あるいは EC 簡易推定方法で「EC 以外」とされたグループから Kleb を同定・推定するには外部検査機関への依頼や市販キッ
ト、特殊染色などを行う必要があるが、臨床現場ではより簡易性とコストを重視した推定方法が望まれる。上記 3 群へのグループ分けを前提とした ns GNR の菌種推定方法を考案するにあたり、まず、「EC以外」に鑑別されたグループにおける Kleb の簡易推定方法について検討した。「Kleb」の定義を CEZ
感受性、「その他」の定義を CEZ 耐性とした場合の理論的な鑑別精度について検証したところ、CEZ
耐性割合によって感度は大きく変動するが特異度は 94.1％と高く、通常想定される Kleb の分離割合では CEZ 耐性割合にかかわらず Kleb 的中度は 89.5−99.7％で、「Kleb」と鑑別された場合には Kleb と推定できることがわかった。一方、「その他」の的中度は CEZ 耐性 Kleb の存在により非常に低かった。
第一鑑別に EC 簡易推定方法、第二鑑別に Kleb 簡易推定方法を用いた ns GNR のグループ推定方法（簡易二段鑑別法）を用いた場合、ns GNR の 7−8 割は菌種が推定でき、同定検査にかかわる手間やコストの大幅な削減が期待できた。簡易二段鑑別法は、制約の多い臨床現場において有用な菌種推定方法の1 つになりうると思われた。
キーワード：E.coli、グラム陰性桿菌、Klebsiella、簡易菌種推定、牛乳房炎鑑別する方法には市販の鑑別培地が一般的と【はじめに】

なってきているが［9, 14］、Kleb を推定・鑑別

近 年、Escherichia coli（EC） と Klebseilla

することはできない。我々はよりコスト、作業

spp.（Kleb）による病原性の違いに関する報告

効率を考慮した EC の簡易推定法について過去がいくつかなされ［3, 27, 28］、両者の鑑別意義に報告し、全身症状発現例では「EC 以外」とについて認識されつつある。牛乳汁由来グラム

された場合にはほとんど Kleb であることを明

陰性桿菌（Gram-negative rod-shaped bacteria:

らかにしたが［26］、局所症状のみのものや症

GNR）の菌種を推定するにあたり、EC を推定・状の情報が不明なものについては応用ができない。「EC 以外」のグループから Kleb を同定・推定するには外部検査機関への提出やキット、

受付：2016年6月29日
受理：2017年2月16日

莢膜染色などを行う必要があり、コストと時間－ 21 －

家畜感染症学会誌
6 巻 1 号 2017

牛乳汁由来 GNR の簡易菌種推定がかかるのが現状である。人員・作業スペース

度、アンピシリン（ABPC）およびセファゾリの不足やコストなどの問題からより簡易性を重ン（CEZ）薬剤感受性状況について調査した。

視した Kleb 推定方法が望まれるが、そのようまた、その結果をもとに ns GNR のグループ分な報告は見当たらない。

けを試みた。
簡易菌種推定方法の考案と検証：

官 能 検 査 で 菌 種 推 定 が 困 難 な GNR（nonsensory GNR: ns GNR）は菌種別分離頻度と薬

1. Kleb 簡易推定方法（CEZ 感受性による剤感受性、臨床的重要性、公衆衛生学的重要性

Kleb 推定方法）の妥当性評価：EC を除外しから「EC」、「Kleb」、「その他」の 3 つのグルー

た 122 株を対象とした CEZ 感受性データから、プに分類できることが予測される［6, 12, 16,「Kleb」の定義を CEZ 感受性とし、「その他」

26, 27, 28］。特に薬剤感受性において、「EC 以の定義を CEZ 耐性とした場合の、偽陽性率、外」のグループでは Kleb を除くほとんどがセ偽 陰 性 率 を 試 算 し、CEZ 耐 性 割 合 が 19.3・

ファゾリン（CEZ）耐性であるため［1, 12, 15,50.0 ％［2, 13, 15, 21, 24］、Kleb 有 病 率 が 50・16, 21］、CEZ 感受性の有無が Kleb 推定の指標

72・96％［26, 28］の場合を想定して、感度、の 1 つになりうる。Kleb は基質拡張型 β ラク

特異度、陽性反応的中度（Kleb 的中度）、陰性

タ マ ー ゼ（Extended-Spectrum β-Lactamases;

反応的中度（「その他」的中度）、正確性をシミュ

ESBLs）産生性をもつことがあることが広く知レートした。

られているため CEZ 耐性割合の地域による変2. ns GNR 簡易グループ推定方法（簡易二段動が予想されるが、その分離頻度は今のところ鑑別法）の考案と「その他」に鑑別される検体非常に低い［4, 5, 17, 18, 20, 22, 23］。そこで、数の予測：EC 簡易推定方法と Kleb 簡易推定

市販鑑別培地や EC 簡易推定方法により「EC方法を併用した場合の、ns GNR のグループ推以外」とされたグループにおいて、セファゾリ

定方法について、視覚的にわかりやすくチャー

ン感受性に従って Kleb を推定した場合の理論

ト作成を試みた。また、「その他」に鑑別され的精度と実用性について検証した。また、これたグループを同定検査に供する場合を想定し、らの結果をもとに ns GNR から「EC」、「Kleb」、

業務量やコスト検証のため検体数を予測した。

「その他」の 3 つのグループを簡易に推定する

EC の 分 離 割 合 60 ％、ABPC 耐 性 割 合 18.0・

方法についてチャート化し、同定検査にかかわ100％、感度 84.0・97.0％［26］、Kleb の分離割る業務軽減、コスト削減効果について検証した

合 30 ％、CEZ 耐 性 割 合 19.3・50.0 ％、 感 度

ので報告する。

50.0・80.7％で予測した。
［材料と方法］［結果］

北見家畜診療所で実施された 2014 年 7 月か

分離頻度と薬剤感受性 : 官能検査で菌種推定

ら 2015 年 8 月の乳汁検査で分離されたグラムが困難だった GNR 388 株の分離割合は、それ

陰菌（Gram-negative rod-shaped

ぞ れ E.coli（EC）68.6 ％（266 株 ）、Klebsiellabacteria:GNR） の う ち、 緑 膿 菌、Pasteurellaspp.（Kleb）22.6％（K.pneumoniae 59、K.oxytoca

spp.、Serratia marcescens、Proteus spp. な ど

20、他 9 株）、Enterobacter spp. 4.6％（E.cloacaeのコロニー形態・色調・臭気が特徴的な菌種を

6、E.aerogenes 4、他 8 株）、Citrobacter spp.

除いた、すなわち官能検査で菌種推定が困難

2.3％（C.koseri 5、C.freundii 2、他 2 株）、そだった GNR（non-sensory GNR: ns GNR）388の他 1.8 ％（Chryseobacterium indologens 2 株、株を対象とした。

Acinetobacter baumannii、Alcaligenes sp.、性

桿

分離頻度と薬剤感受性状況：乳汁検体は綿棒

Myroides odoratus、Pantoea agglomerans、で羊血液寒天培地（極東製薬工業株式会社）上Serratia sp. それぞれ 1 株）だった。

に塗抹し、37℃ 12 − 24 時間培養した。分離

「EC 以外」のグループ内における分離割合

された ns GNR の同定と薬剤感受性試験は外部（n=122）は、Kleb 72.1％、
その他（Enterobacter

検査機関に依頼し（細菌同定・薬剤感受性自動spp. 、Citrobacter spp. 、他）27.9％だった。菌測定装置

種別の分離頻度から「EC」、「Kleb」、「その他

VITEC）、同定された菌種の分離頻－ 22 －

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THE SIMPLE ESTIMATION OF GNR SPECIES FROM MILK

（Enterobacter spp.、Citrobacter spp. 他）」の 3

正確性は 80％以上であったが、「その他」的中

つのグループに分けられることがわかった（図度と連動して変化した（表 1）。

1）。

2. ns GNR 簡易グループ推定方法（簡易二段

ABPC 耐性割合は EC18.0％、Kleb97.7％、「そ鑑別法）の考案と「その他」に鑑別される検体の 他 」97.1 ％、CEZ 耐 性 割 合 は EC5.3 ％、数の予測：EC 簡易推定法を第一鑑別、CEZ 感

Kleb19.3％、「その他」94.1％だった。ns GNR

受性による Kleb 簡易推定法を第二鑑別としたは ABPC と CEZ 感受性の有無でも上記 3 つの場合の ns GNR のグループ推定方法について、グループにわけられ、「EC 以外」では CEZ 感

視覚的にわかりやすくチャートを作成した（簡

受性の有無で 2 つのグループにわけられること

易二段鑑別法、図 2）。簡易二段鑑別法において、がわかった（図 1）。

「その他」に鑑別されたグループを同定検査に

簡易菌種推定方法の考案と検証：供する場合を想定し業務量やコスト検証のため

1. Kleb 簡易推定方法（CEZ 感受性によるEC の ABPC 耐 性 割 合 18.0-100 ％、Kleb のKleb 推定方法）の妥当性評価：CEZ 感受性デー

CEZ 耐性割合 19.3-50.0％の場合のそれぞれのタから偽陽性率 5.9％、偽陰性率 19.3％と計算感度から検体数を予測した結果、ns GNR100された。これらから、CEZ 耐性割合が 19.3・

株中の 70 から 85 株で菌種を推定できることが50.0％、Kleb 有病率が 50・72・96％の場合をわかり、業務軽減、コスト削減が期待できるこ想定して、感度、特異度、陽性反応的中度（Klebとがわかった。

的中度）、陰性反応的中度（「その他」的中度）、［考察］

正確性をシミュレートした結果、CEZ 耐性割
合により感度は大きく変動したが、特異度およ官能検査で菌種推定が困難な牛乳汁由来グラ

び Kleb 的中度は CEZ 耐性割合にかかわらず

ム陰性桿菌（non-sensory Gram-negative rod-

非常に高い値だった。また Kleb 的中度は Kleb

shaped bacteria: ns GNR）の菌種別の分離頻有病率が増加するほど高い傾向を示した。一方、

度は過去の報告とほぼ同様であり［8, 11, 19,「その他」的中度は Kleb 有病率および CEZ 耐

24］、最も分離頻度の高かったのは E.coli（EC）

性割合が低下するほど高値を示したが、今回ので 68.7 ％、 次 に 高 か っ た の は Klebsiella spp.

図１
シミュレート範囲では非実用的な低値だった。

（Kleb）で 22.6％であった。「EC 以外」のグルー

ABPC 耐性
CEZ 耐性n = 388

E.colin = 266

Klebsiellan = 88Enterobacter

Citrobacter 他
n = 34

％

0

20

40

60

80

100

図1
官能検査で菌種推定が困難だった牛乳汁由来GNR（ns GNR）388株の菌種別分離頻度とアンピシリン・
セファゾリン感受性による分類。3群に分けられた。

－ 23 －

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牛乳汁由来 GNR の簡易菌種推定

表1
Klebsiella簡易推定法によるKlebsiella spp.推定精度評価。セファゾリン耐性割合、Klebsiella spp.分離
割合をシミュレートした。
表1

Kleb

*

19.3（50.0） * * *CEZ 耐性割合

Kleb 有 病 率
感

**

50.0

72.0

％
96.0

80.7（50.0）

度

94.1

特 異 度

Kleb 的中度

93.1（89.5）

97.3（95.7）

99.7（99.5）

その他 的中度

82.1（65.3）

65.3（42.1）

16.9（7.3）

正 確 性

86.8（72.1）

84.4（62.3）

81.3（51.8）* Klebsiella spp.、 * * E.coli 以外のグループにおけるKlebsiella spp. の分離割合* * * （ ）CEZ耐性割合が50.0％の場合

プ内における分離割合は Kleb 72.1％、その他

17, 18, 20, 22, 23］。「その他」はもともと分離（Enterobacter spp.、Citrobacter spp.、他）27.9％

頻度が低く、特に全身症状発現例からはほとん

で、「EC 以外」の内、約 70％が Kleb であった。

ど分離されないが、多剤耐性あるいは多剤耐性

日 々 の 乳 汁 検 査 の 菌 種 別 分 離 頻 度 に よ り、化しやすいグループなので公衆衛生上重要であ「EC」、「Kleb」、「その他」の 3 グループに分類る。

可能だった。全身症状発現例においても、EC、

ns GNR の菌種推定を行うには、EC を推定

Kleb の分離頻度は高く、「その他」の分離頻度することを第一鑑別、「EC 以外」のグループ

は非常に低いこと［26, 28］、Kleb は EC より

から Kleb を推定することを第二鑑別とした、も重篤化する傾向にあると報告されていること

二段階のグループ推定が合理的であると思われから［3, 27, 28］、臨床的視点からも同様にこのた（簡易二段鑑別法）（図 2）。第一鑑別、すな

3 グループに分類可能である。

わち EC の簡易推定には、市販鑑別培地（クロまた、ns GNR は薬剤感受性（それぞれが染モアガー）の他に ABPC 感受性と溶血性を利色体性に持つ β ラクタマーゼの性質）でも、上用した EC 簡易推定方法がある［26］が、コス記 3 グループに分類できることが予測できた［6,トと簡易性を重視するため第一鑑別には EC 簡

12, 16］。すなわち ABPC 感受性の「EC（構成易推定法を用いることとした。第二鑑別、すな

型の AmpC 型）」、ABPC 耐性かつ CEZ 感受性

わ ち「EC 以 外 」 に お け る Kleb と「 そ の 他 」の「Kleb（クラス A 型）」、ABPC・CEZ ともの鑑別は通常であれば外部検査機関に依頼するに耐性の「その他（誘導型の AmpC 型）」であか市販同定キット、莢膜染色などが必要になる。

る。薬剤感受性でも予測通り、3 つのグループ

しかし、同定作業にはコストの増加と業務の煩に分類することが可能であった（図 1）。薬剤

雑化が避けられない。そこで、Kleb がもとも感受性には R プラスミドが関与してくる可能と CEZ 感受性であることを利用した簡易な鑑性が高いので地域によっては多少の変動が想定

別方法の可能性について検証した。

されるが、実際には牛乳汁由来 GNR における

「EC 以外」の菌種は、CEZ 感受性群、CEZ

基 質 拡 張 型 β ラ ク タ マ ー ゼ（Extended-

耐性群の 2 グループに分類可能であった（図 1）。

Spectrum β-Lactamases: ESBLs）や AmpC な

これらの結果から、「Kleb」の定義を CEZ 感

どのプラスミド性 β ラクタマーゼ産生菌の分離

受 性、「 そ の 他 」 の 定 義 を CEZ 耐 性 と し て、

頻度は非常に低いことが報告されている［4, 5,

Kleb の簡易推定方法の理論的精度について検－ 24 －

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Vol.6 No.1 2017

THE SIMPLE ESTIMATION OF GNR SPECIES FROM MILK

図2

図2
簡易二段鑑別法によるns GNRの菌種推定・分類チャート。CXM Hly:CXM誘発性溶血現象。第一鑑別にはE.coli簡易推定法を用いているが、市販鑑別培地でもよい。

討した。国内における Kleb の CEZ 耐性割合

種は時間・コストをかけて確実に同定すべきでは 3−18％前後と報告されており［13, 15, 21,あると思われた。

24］、今回の調査でも 19.3％であったが、地域、「その他」のグループには公衆衛生上、重要農場において変動が予想される。特に ESBLs

な菌種が多く含まれる。本グループに鑑別され産生性はプラスミド性に伝播するため、局地的た EC、あるいは Kleb は ESBLs 産生性である

な耐性割合の増加も考えられる［2］。そこで、可能性があり、Citrobacter spp.、Enterobacter

Kleb の CEZ 耐性割合が 19.3％あるいは 50％［2］spp. や、 ブ ド ウ 糖 非 発 酵 菌 な ど の 誘 導 型

で、「EC 以外」のグループにおける Kleb 有病

AmpC 型 β ラクタマーゼ保有菌種の治療にお率（分離割合）が 50、72、96％［26, 28］の場

ける抗菌薬選択は、人では慎重になされている合を想定して検討したところ、感度は CEZ 耐［25］。また、ESBLs を含めた各種の β ラクタ

性割合の増加により明らかに低下したが、特異ム広域耐性に関与する β ラクタマーゼの多くは

度は 94.1％と高かった（表 1）。また、通常想

プラスミド性であり、他菌種への伝播の可能性

定される範囲（分離割合 72％以上）では Klebがあるため公衆衛生上重要視されている［1］。

的中度は CEZ 耐性割合にかかわらず 95％以上

牛乳房炎における ESBLs 陽性菌分離頻度は決であった。特に、全身症状発現例における場合

して高くはないが［4, 5, 20, 22, 23］、第三世代を想定した分離割合 96％［26］では、Kleb 的セファロスポリンの使用頻度が増加している現

中度は 99.5％以上だった。一方、「その他」的状を考慮すれば今後これらの監視体制強化が求

中度は CEZ 耐性割合および Kleb 分離割合のめられることが予想されるため［4, 7, 10, 21］、低下により増加したものの、非実用的な低値で限られた人員・時間・コストでそのようなニーあった。以上から、「Kleb」と推定されれば非ズに対応できるよう検査体制を準備しておく必

常に高い精度で Kleb と推定できることがわ

要がある。

かったが、「その他」と鑑別された場合には条これらの結果をもとに第一鑑別に EC 簡易推件によっては CEZ 耐性 Kleb がかなりの割合

定法、第二鑑別に Kleb 簡易推定法を用いた nsで含まれることがわかった。公衆衛生学的な重GNR の簡易グループ推定法（簡易二段鑑別法）

要性も考慮すれば、「その他」に鑑別された菌を考案し（図 2）、本法による業務・コスト削－ 25 －

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6 巻 1 号 2017

牛乳汁由来 GNR の簡易菌種推定

減効果について検証した。その結果、理論的に［引用文献］

は日々の乳汁検査おいて ns GNR 100 株中 70
から 85 株で菌種がほぼ確定でき、「その他」、
すなわち獣・医療上および公衆衛生上問題となる可能性の高い菌種だけを同定検査に供することが可能となるので関連業務やコストの軽減が期待できることがわかった。なお、全身症状発
現例で EC が否定された場合、CEZ 感受性の有無にかかわらず Kleb と推定できるが［26］、
CEZ 耐性 Kleb が疑われる場合には外部検査機
関に提出して菌種の同定と ESBLs 産生性を確認した方がよい。
菌種の同定検査にはコスト、時間がかかることが問題であった［14］。そのため、すべてを
外 部 検 査 機 関 に 依 頼 し た り、 未 同 定 の ま ま
GNR として処理されている場合も多いと思われる［14］。今回報告した簡易二段鑑別法は個々の菌種を正確に同定するのではなく、官能検査、
菌種分離頻度、溶血性、薬剤感受性および臨床症状を用いて 3 つの意義のあるグループに簡易に分類する方法である。本法は、通常の検査手技の流れで特別な器材・資材を用いずに実施可能であり確認作業に時間もかからないこと、検体培養と感受性試験を同時に行う簡易方法（直接法）で実施すれば翌日には鑑別可能であり、全身症状発現例など迅速性が要求される場合にも対応できること、特別な訓練も必要なく誰にでも容易に低コストで実施可能であることか
ら、制約の多い業務多忙な臨床家にとって有用な菌種推定方法の 1 つになりうると思われた。
また、第一鑑別の部分を市販鑑別培地で実施することも可能であり、その場合の第二鑑別以降の解釈は本法と同じである。なお、本法は牛乳房炎由来の ns GNR を対象として考案した菌種推定方法であり、膿汁や糞便など各菌種の分離割合が乳汁とは異なる検体に適用してはならな
い。また、本法には薬剤感受性の判定という人
為的ミスの介入しやすい作業が含まれている。
理論的な精度と実践的な精度の違いについては今後の検討課題としたい。
［謝辞］
本稿を終えるにあたり、忙しい業務の中ご協力頂いた NOSAI オホーツク 北見家畜診療所の皆さまに深謝いたします。

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家畜感染症学会誌
6 巻 1 号 2017

牛乳汁由来 GNR の簡易菌種推定

An attempt of the simple estimation ofGram-negative rod-shaped bacteria species from dairy mastitis-the clinical epidemiological and public health classification,and the simple estimation of their groupYoshihiko Sentoku、Kohei Okubo
Kitami Veterinary Clinic, Okhotsk Agricultural Mutual Aid Association（497-1 misono, kitami-shi, hokkaidou 099-0879）
Correspondence to YOSHIHIKO SENTOKUTEL 0157-66-6702 FAX 0157-35-3911
E-mail y-sentoku@nosaiok.or.jp【Abstract】
Gram-negative bacteria that is difficult to estimate species by the sensory test (non-sensory GNR:
ns-GNR) were could be classified in 3 groups,“Escherichia coli (EC)”,”Klebsiella spp. (Kleb)”and“theother”,by their isolation frequency and antibiotics susceptibility,clinical and public health importance.
When we estimate the Kleb of "non-EC" group that was differentiated by mediums or EC simple
estimation method, it is necessary to use commercially available kits or special staining,or to submit
to the external inspection agency. More easily Kleb estimation method of "non-EC" group thatemphasizes simplicity and cost are desired in the clinical field. Upon devise ns-GNR species
estimation method that assumes the 3 grouping, we investigated Kleb simple estimation method of"non-EC". On the assumption that the definition of“Kleb”was cefazolin(CEZ)-susceptible and“theother”was CEZ-resistant, theoretical discrimination accuracy was examined. Sensitivity was varied
greatly by CEZ-resitant ratio, but specificity was 94.1%. Kleb predictive value at usual isolation ratioof Kleb was 89.5-99.7% regardless of CEZ-resitant ratio. So,if it was discriminated to“Kleb”, it could
be estimated Kleb. On the other hand,“the other”predictive value was very low due to the presenceof CEZ-resistant Kleb. By the group estimation method of ns-GNR that as the first by EC simple
estimation method and as the second by Kleb simple estimation method (the simple two-step
differentiation method),70-80% of the ns-GNR could be estimated species. Therefore a significant
reduction in labor and cost about the identification test could be expected. We concluded that thesimple two-step differentiation method is one of the useful species estimation method in the clinicalfield.
Keywords: D airy Mastitis, E.coli, Estimate species, GNR, Klebsiella－ 28 －