日本人における接触皮膚炎とバリア機能に関与する遺伝子変異の解析
および 3D スキンモデルを用いた接触皮膚炎の最適な治療法の探索
新潟大学医歯学総合病院皮膚科

林良太

Contact allergy (CD) is an allergy reaction caused by exposure to a substance and the patients with CD is suffer frompain and itchy. We usually perform patch test to identify cause of CD. However, there are many causes of CD including metal, detergent and flavoring. While it take a lot of time to perform patch test and it is difficult to perform it in all clinic. If we
can predict a risk of CD, the patients with CD may be decreased. Recent study demonstrated that the genes of barrier function including FLG were related with CD. However, it is not clear the relationship between CD and genes of barrier functionin Japanese population.
Therefore, we performed mutation analysis of the genes related with barrier function including FLG, FLG2 and TGM5.
We could not perform sufficient number of cases, and it was difficult to conclude the relationship between CD and genes ofbarrier function in Japanese population at this point. While the mutations in the FLG2 gene were identifies in several patientswith CD. We need further studies to clear the relationship between FLG2 gene and CD.
We also tried to establish 3D skin model of CD. It was difficult to use cells of the patients with CD, and we tried to make3D skin models using normal keratinocytes, cytokines including IL– 4, and metal.

1．緒連を特定することを最大の目的とした。この関連性を明ら言かにすることでパッチテストを行わずに原因物質を予想し、接触皮膚炎は外界の刺激、物質に対するアレルギー反応原因物質を除去することで症状が改善する可能性がある。

によって生じる。かゆみや疼痛といった症状の他、見た目申請者は遺伝性皮膚疾患患者の皮膚を用いた 3 D スキンの問題から精神的苦痛を生じる場合もある。症状が酷い患モデルの作製を行っており、様々な皮膚疾患の患者細胞を者では、パッチテストにより原因物質を特定し、原因物質用いた 3 D スキンモデルの作製を試みている。この手法をを除去することで症状の緩和を目指している。しかし、接用いて、3 D スキンモデルに様々な薬剤を添加することで触皮膚炎の原因は金属アレルギー、洗剤、ハンドクリーム患者に最適な治療の探索を目指している。本研究では、バなどの使用品、香料など多岐にわたり、原因となるアレルリア機能に関与する遺伝子に変異／多型が同定された接触

ゲンを調べるためには検査を行う人数の確保、多大な時間皮膚炎患者の皮膚を用いた 3 D スキンモデル作製を試みた。の確保が必要であるため全ての施設で行うことは難しい。

２．方

よって、事前に接触皮膚炎のリスクとなる原因物質が分か法

皮膚バリア機能に関与する遺伝子の代表例がフィラグリン

2. 1. 遺伝子解析による病的変異および遺伝子多型の検索をコードする FLG 遺伝子であり、日本人のアトピー性皮遺伝子解析に関して同意説明を行い、同意いただいた接膚炎患者の 30 % 程度に FLG 遺伝子変異が同定される。ま触皮膚炎患者の血液 2 mL を用いて DNA を抽出した。患た、近年 FLG 遺伝子とニッケルなどの金属アレルギーの者 DNA を用いて FLG 遺伝子、TGM 5 遺伝子、LOR 遺伝関与が指摘されている 1）。

子など皮膚のバリア機能に関与する遺伝子を Polymerase

れば、接触皮膚炎の患者数を減少することが可能となる。

しかし、日本人における FLG 遺伝子とアレルゲンの関

chain reaction（PCR）法により増幅し、direct sequence 法

連を検討した論文はなく、FLG 遺伝子以外のバリア機能により全エクソンおよびエクソン・イントロン境界部を解に関与する遺伝子の変異とアレルゲンの関連は明らかでな析し、病的変異／多型の有無を確認した。一部の患者におい。本研究の第一の目的は、日本人における接触皮膚炎のいてはエクソーム解析によりこれらの遺伝子の変異の有無

原因物質とバリア機能に関与する遺伝子変異／多型との関を確認した。

Mutation analysis for the genes relatedwith contact dermatitis and barrier
function in the Japanese population, andanalysis for the optimal treatment ofcontact dermatitis using 3 D skin model
Ryota Hayashi
Niigata University Medical and Dental
Hospital, Division of Dermatology

2. 2. 接触皮膚炎3Dスキンモデルの作製
接触皮膚炎患者の表皮細胞および線維芽細胞を用いて3 D スキンモデルを作製することが理想的ではあるが、接触皮膚炎において皮膚生検を行う機会が少ないため、接触皮膚炎患者組織を用いて 3 D スキンモデルを作製することが難しい。よって、健常皮膚を用いた 3 D スキンモデルを− 140 −

日本人における接触皮膚炎とバリア機能に関与する遺伝子変異の解析および 3D スキンモデルを用いた接触皮膚炎の最適な治療法の探索作製し、サイトカインなどを添加することにより接触皮膚生検を行うことが少ない点からも、残余健常皮膚を用い、炎の 3 D スキンモデル作製を目指した。健常人由来の皮膚サイトカインを添加することにより接触皮膚炎 3 D モデルを用いた 3 スキンモデル作製法は以下の通りである。の作製を行う方針とした。健常人由来の細胞を用いた検体

健 常 人 由 来 の 線 維 芽 細 胞 と １ 型 コ ラ ー ゲ ン、Fetalの作製法は上記の通りであり、作製した 3 D スキンモデル

Bovine Serum（FBS）、NaHCO 3 などの混合液を混和し、の Hematoxyrin Eosin（HE）染色は図のように正常な角層、培養容器に入れ、真皮成分のコンストラクトを作製した。

顆粒層、有棘層、基底層を有する表皮構造となった。一方、数日間、線維芽細胞用培養液で培養を行い。数日後に健常

真皮成分はある程度構成はされているものの、我々が普段人に由来の表皮細胞を真皮成分のコンストラクト上層に添見慣れている健常皮膚の HE 染色よりも細胞密度が乏しく、2+加した。以後は Ca 非含有ケラチノサイト用培養液で培更なる改善をする必要があると思われた。

養を行った。3 - 5 日後に Ca 2 + 含有のケラチノサイト用培

過去の報告では、HaCaT 細胞で作成した 3 D スキンモ養液に変更し、培養を行うことで 3 D スキンモデルを作製

デルに IL- 4、IL- 13 を添加することによりアトピー性皮した。さらに培養液中に IL- 4 などのサイトカインの他、膚炎様の表皮変化を伴う 3 D スキンモデルが出来ることが様々な金属を表皮側に添加することにより接触皮膚炎様の明らかになっている 4）。申請者も健常人皮膚を用いた 3 D

3 D スキンモデルが再現出来るかどうかについて検討した。

スキンモデルの培養液中に IL- 4 や IL- 13 もしくは両サイ

３．結トカインを添加した。IL- 4、IL- 13 の濃度による影響もあ果るかもしれないが、現段階では安定してアトピー性皮膚炎

3. 1. 接触皮膚炎患者の遺伝子解析様の表皮変化を伴う 3 D スキンモデルを作製することが出現段階では遺伝子解析を施行した患者数が少なく、日本来なかった。

人におけるバリア機能に関与する遺伝子と接触皮膚炎の関４．考連を明確に言えるほど明らかにすることは出来なかった。

察接 触 皮 膚 炎 の 原 因 が 同 定 さ れ た 患 者 で FLG 遺 伝 子、アトピー性皮膚炎において皮膚のバリア機能は極めて重TGM 5 遺伝子、LOR 遺伝子などのバリア機能関連遺伝子

要であるが、アトピー性皮膚炎患者では接触皮膚炎を合併に変異が同定されなかった患者がいる一方で、若年で金属することが多いこと、アトピー性皮膚炎患者の 30 % 程度アレルギーを有する難治性手湿疹の患者においては FLGが FLG 遺伝子に変異を有すること、FLG 遺伝子変異とニ遺伝子に病的変異を有する症例も存在した。TGM 5 遺伝ッケルなどの金属アレルギーの関与があること、などから子、LOR 遺伝子に明らかな病的変異をもつ症例はなかった。

接触皮膚炎と FLG 遺伝子などのバリア機能関連遺伝子と一方、一部の患者おいて FLG 2 遺伝子にナンセンス変の関連があると考えられる 1）。一方で、日本人においては異がみられたが、現段階では接触皮膚炎と関与するかどう

接触皮膚炎患者で遺伝子解析を行われることは多くないとかは症例数が少ないため不明である。

想定され、研究自体がほとんどないのが現状である。

3. 2. 接触皮膚炎患者細胞を用いた3Dスキンモデル

日本人における接触皮膚炎患者とバリア機能関連遺伝子の我々が行っている研究も検体数が少ないため、現段階での作製変異の有無については明らかなことがいえる状況ではない。

本来は、接触皮膚炎患者の生検検体の余剰皮膚を用いた

一 方、 若 年 の 難 治 性 手 湿 疹 で 当 初 acral peeling skin

表皮細胞、線維芽細胞を用いて 3 D スキンモデルを作製す

syndrome の可能性も考え、原因遺伝子である TGM 5 遺伝ることが理想ではあったが、接触皮膚炎患者において皮膚子を解析したが変異が同定されなかった患者が後に金属ア図

健常人細胞を用いた3 Dスキンモデル− 141 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 31, 2023

レルギーを有していることが明らかになった。この患者はでより安定した 3 D スキンモデルを作製することが出来る

FLG 遺伝子に機能喪失型変異を有しており、FLG 遺伝子かどうかについて検討を重ねていく。

変異が金属アレルギーの発症に関与していた可能性は否定

５．総できない。今後、症例数を増やすことにより日本人における FLG 遺伝子と金属アレルギーの関連が明らかになる可能性があり、研究を継続したいと考えている。

括

本研究の最大の目的である日本人におけるバリア機能関連遺伝子と接触皮膚炎の関連および接触皮膚炎モデルとな一方、今回の解析で接触皮膚炎を有した患者に一定数り得るについてはまだ結論が出ていない状態である。しかFLG 2 遺伝子にナンセンス変異を有していることが明らし、コーセーコスメトロジー研究財団の助成により、本研かになった。FLG 遺伝子と同様に FLG 2 遺伝子もバリア究の活動を開始することが出来た。これからも本研究のテ機能に関与することが知られており、アトピー性皮膚炎とーマを継続し、最終的には目的を達成したいと考えている。の関連や皮膚が剥脱しやすくなる Peeling Skin Syndromeの原因遺伝子として報告されているが 2 , 3）、FLG 遺伝子と（引用文献）

違い、皮膚のバリア機能との関連がはっきりとしている訳

1） Lagrelius M, Wahlgren CF, Bradley M et al.

ではない。実際に、今回の研究とは関連しないが申請者がFilaggrin gene mutations in relation to contact allergy

以前に他疾患の診断確定のためにエクソーム解析を施行しand hand eczema in adolescence. Contact Dermatitis

た際にも FLG 2 遺伝子に変異が同定されることも多く経82: 147-152, 2020.

験している。FLG 2 遺伝子が接触皮膚炎の疾患感受性遺2）Margolis DJ, Gupta J, Apter AJ, et al. Filaggrin-2伝子であるかどうかについては大規模な症例検討を行う必

variation is associated with more persistent atopic

要がある。

dermatitis in African American subjects. J Allergy Clin

3 D スキンモデル作製に関しては元々予定をしていた接Immunol; 133: 784-9, 2014.

触皮膚炎患者細胞を用いることは難しく、健常人の細胞お3）Mohamad J, Sarig O, Godsel LM, et al. Filaggrin 2

よび IL- 4 や IL- 13、金属を添加することにより接触皮膚Deficiency Results in Abnormal Cell-Cell Adhesion in

炎類似の 3 D スキンモデルを作製した。前述の通り健常人

the Cornified Cell Layers and Causes Peeling Skinの細胞を用いて作製した 3 D スキンモデルの真皮成分はや

Syndrome Type A. J Invest Dermatol; 138: 1736-1743,

や疎な印象はあるが、表皮に関しては我々が皮膚病理組織

2018.

を観察する正常の表皮と類似している。しかし、健常人の4）Clarysse K, Pfaff CM, Marquardt Y et al. JAK1/3細胞を用いた場合には表皮はややアトピー性皮膚炎様に肥inhibition preserves epidermal morphology in full-厚する場合があり、IL- 4 や IL- 13 を添加した場合とそれthickness 3D skin models of atopic dermatitis andほど差が出ない場合もあることから安定して接触皮膚炎様psoriasis. J Eur Acad Dermatol Venereol 33: 367-375,の表皮変化を伴う 3 D スキンモデルの作製が出来ていない。

2019.

今後は FLG 遺伝子に変異を有する患者細胞を用いること− 142 −