■研究成果報告
奈良先端科学技術大学院大学支援財団では、地元の中小企業等が奈良先端科学技術大学院大学と連携し、大学内で生まれた研究成果や技術シーズの実用化に向け取り組む研究を支援しています。令和５年度の研究の一つを紹介します。

機能性アミノ酸高生産酵母の育種技術を活用したクラフトビールのブランド化
テンフィールズファクトリー株式会社
NAIST 研究推進機構・特任教授 高木 博史【背景】
日本国内には 700 ヶ所を超えるビールの醸造所があり、多種多様なクラフトビールが販売されている。その中で、味や風味の点で差別化できるビールの開発が注目されている。ビールの主要な有用・芳香・味成分は醸造過程において、酵母のアミノ酸代謝によって生成されるものが多いため、ビールの品質向上や酒質の差別化には、アミノ酸の組成や生成量に特徴を有する酵母の開発が極めて重要である。また、地域独自の野生酵母（ローカル酵母）の活用もビールのブランド化に貢献できる。
【目的と研究プロセス】
本研究では、テンフィールズファクトリー株式会社（TFF）と奈良先端大（NAIST）の共同研究によって、本学のキャンパス内から野生酵母を単離し、ビール醸造への応用を検討する。具体的には、NAIST のキャンパス内に自生する植物（葉や果実など）から野生酵母を単離し、ビール醸造が可能な酵母（NAIST 酵母）を取得する。
さらに、この酵母の高機能開発を目指し、オルニチンを高生する株も育種する。一方、TFF はそれらの酵母を用いてビールの試験醸造を行い、ビール醸造への有用性（味・香りの差別化、高付加価値化など）を実証する。
【実験方法】◎ ビール醸造に適した酵母の単離
NAIST キャンパス内の池エリアに自生する植物からスワプで試料を採取し、マルトース培地（2%マルトース、1%酵母エキス、2%ペプトン）で集積培養（23°C、静1置培養）を行った。その後、2%寒天入りのマルトース培地に塗布し、コロニーを単離した。各コロニーを生理食塩水に懸濁し、顕微鏡観察によって出芽タイプの酵母を選抜した。最後に、26S rDNA D1/D2 領域の配列を２種類のプライマー（NL1: 5’GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3’、NL4: 5’-GGT CCG TGT TTC AAG ACGG-3’）を用いて決定することで、Saccharomyces cerevisiae を同定した。
◎ 発酵試験
各菌株をオートクレーブ滅菌済みの麦汁に植菌し、ファーモグラフ（アトー社）によって生成する炭酸ガス量を経時的に測定することで発酵力を評価した。測定条件としては、初期菌体濃度を OD600=1.5 に調整し、23°C で静置培養を行った。
◎ 試験醸造TFF が経営する羊肉料理専門店「ビールと羊」内に併設するマイクロブリュアリーにおいて、ケルシュ（Kolsch）様式のエールビールを醸造した。
◎ 香気成分の測定
各種香気成分は TurboMatrix HS と Stabilwax column が付属した GC-2010 plus を使用したヘッドスペースガスクロマトグラフィーによって測定した。条件：カラム温度 50°C（5 min）→ 50-100°C（5°C/min）→ 100-220°C（10°C/min）→ 220°C（3 min）、注入温度 220°C、検出温度 220°C, キャリア窒素ガス（0.2 kPa）、速度 1.0 ml/min で測定した。
◎ オルニチン含量の分析
各変異株を YPD 培地（2％グルコース、1%酵母エキス、2%ペプトン）で 30°C、250 rpm、24 時間、もしくは麦汁で 23°C、静置、48 時間培養した。集菌・洗浄後に、OD600 = 40 相当の細胞を 1 mL の水で懸濁し、100°C で 20 分間処理し、細胞から総アミノ酸を抽出した。遠心分離後の上清に等量のクエン酸リチウム緩衝液（pH 2.0）を加えてフィルターろ過（0.22 µm）することで、アミノ酸分析用の試料とした。オ
ルニチン含量は JLC500/V2 （日本電子社）で測定し、細胞内アミノ酸含量はnmol/OD600 unit で示した。アミノ酸定量用の濃度既知スタンダードは、標準アミノ酸混合液（和光純薬社）を用いた。
◎ アミノ酸の毒性アナログを用いたスクリーニング
ADH837 にエチルメタンスルホン酸（EMS）処理を施し、染色体 DNA にランダムな変異を導入した。EMS 処理後の細胞を 200 μg/mL のカナバニンを含有する SD2培地（2％グルコース、0.17%窒素源ベース、0.5%硫酸アンモニウム）に撒いた後、30℃で静置培養を行い、生育の速いコロニーを取得した。

【実験結果】◎ NAIST キャンパス内からの野生酵母の単離
TFF は多数の事業を展開しており、それらを組み合わせた「マイクロブリュワリー併設型レストランのトータルコンサルティング」の開始を検討している。その中で、ライセンスフリーの独自性が高い酵母の提供ビジネスを模索している。そこで、ビール醸造が可能な野生酵母（NAIST 酵母）の単離を試みた。野生酵母を単離する場所として、NAIST 内の池エリア（図 1）に焦点を当てた。まず、池エリアに生息する植物から採取した複数の試料をマルトースの資化性によって選抜した。その結果、マルトース資化性を示す酵母が約 100 株得られた。その後、コロニーの色や出芽タイプの細胞を指標に酵母を選抜したところ、20 株の候補株を取得した。さらにrDNA 配列のシークエンス解析から、S. cerevisiae を 1 株単離することに成功した（ADH837 と命名）（図 2）。

図 1 NAIST キャンパス内の野生酵母の採取場所
ライセンスフリーの酵母を取得するために、NAIST キャリアパス内の池エリアから酵母の単離を試みた。

3

図 2 野生酵母を単離するための実験の概略
マルトース資化性 → コロニーの色・出芽様細胞の顕微鏡観察 → rDNA 配列によって、出芽酵母 S. cerevisiae を選抜した。

4

続いて、ADH837 がビール醸造に適しているかを検討するために、マルトース含有培地における発酵試験を行った（図 3）。その結果、ADH837 は市販のエールビール酵母と同程度の発酵力を有することが判明した。

図 3 マルトース含有培地における発酵試験
ファーモグラフによって炭酸ガス発生量をモニターし、発酵力を測定した。

5

最後に、TFF が経営するレストラン「ビールと羊」に併設するマイクロブリュ
アリーにおいて、ケルシュ（Kolsch）様式のエールビールを試作した。コントロールとして、一般的な市販エールビール酵母（Wyeast 社の 2575-PC 株）を使用した。完成したエールビールについて、香気成分の分析を行った（表 1）。その結果、市販エールビールに比べて、フーゼル油臭の l-プロパノール、接着剤臭のイ
ソアミルアルコール、リンゴ香のカプロン酸エチルの含量がそれぞれ半分程度に減少した。一方で、バナナ香の酢酸イソアミルの含量が約 1.7 倍に増加したことから、オフフレーバーが減少、フレーバーが増加していると考えられた。また、実際の官能評価でも、バナナ香を含むフルーティーさが指摘された。
表1

香気成分の比較

mg/L

ADH837（NAIST酵母）

市販酵母（Wyeast）

ADH837/市販

特徴

アセトアルデヒド

53411.3

青りんご

1-プロパノール

23590.4

フーゼル油臭イソブチルアルコール

34281.2

イソアミルアルコール

70860.8

接着剤様

酢酸エチル8.7200.4

酢酸イソアミル

0.72

0.421.7

バナナ様カプロン酸エチル

0.017

0.0260.7

リンゴ様6さらに、エールビール中のアミノ酸含量を測定したところ、必須アミノ酸のリジンと分岐鎖アミノ酸（BCAA; バリン・ロイシン・イソロイシン）、旨味を呈するア
スパラギン酸、健康機能性（リラックス効果、血圧降下作用、睡眠の質向上など）を有する γ-アミノ酪酸（GABA）がそれぞれ多く含まれていた（リジン：8.3 倍、BCAA：1.5～2.0 倍、アスパラギン酸：4.3 倍、GABA：3.3 倍）（表 2）。
以上の結果から、ADH837 は特徴的かつ健康イメージを付与したエールビールを醸造できることが判明した。なお TFF は、次年度早々に ADH837 で醸造したクラフトビールの販売開始を予定しており、現在そのための準備を行っている。
表2各アミノ酸含量の比較（NAIST 酵母/市販酵母の比）7◎ 健康系クラフトビールの開発を目指したオルニチン高生産株の育種
オルニチンはシジミやキノコ類に多く含まれるアミノ酸で、タンパク質の構成成分ではないが、肝臓の解毒作用の促進、アルコール性疲労の抑制、成長ホルモンの分泌促進などの効果が知られている。オルニチンは肝臓の働きを促進するため、ビールに含まれるアルコールの体内での分解を助けることが期待できる。したがって、オルニチン高生産株によって醸造したクラフトビールは、「健康イメージ」をアピールすることが可能になる。
オルニチンはアルギニンの代謝産物であるため、アルギニンを高生産させることでオルニチンが過剰に合成されると仮説を立てた。まず、ADH837 を突然変異誘導剤（EMS）で処理し、アルギニンの毒性アナログであるカナバニンの耐性株を 500株以上分離した（図 5）。その後、カナバニン耐性を再確認したところ、140 株がカナバニン耐性を示した。これらの変異株について、酵母の富栄養培地（YPD）でオルニチン含量を測定した。その結果、親株に比べてオルニチン含量が 2 倍以上に増加した株を取得した（最大で親株の 9.2 倍）（図 6）。さらに、ビール醸造条件においてオルニチン含量を測定した結果、親株よりオルニチン含量が 5 倍以上に増加した変異株を 2 株取得した（ADHorn4，ADHorn49 と命名）
（図 7）。さらに、これらの株の発酵試験を行ったところ、親株と同程度の発酵力であることが判明した（図 8）。
以上の結果から、ADHorn4 と ADHorn49 はオルニチン高生産株であり、健康イメージをアピールできるクラフトビールの創出に寄与できると考えられた。

図 5 オルニチン高生産株のスクリーニングの概要
EMS 処理によって突然変異を導入し、カナバニン培地でスクリーニングした。

8

図 6 酵母の細胞内オルニチン含量（YPD 培地で培養）
細胞内オルニチン含量をアミノ酸アナライザーによって測定した。

図 7 酵母の細胞内オルニチン含量（ビール発酵条件で培養）
細胞内オルニチン含量をアミノ酸アナライザーによって測定した。

9

図 8 麦汁を用いた ADHorn4 と ADHorn49 の発酵試験
ファーモグラフによって炭酸ガス発生量をモニターし、発酵力を測定した。

【今後の展開】◎ ADH837で醸造したクラフトビールの販売◎ ADHorn4またはADHorn49の試験醸造と醸造したビールの特性解析◎ オルニチン高産生に関わる遺伝子の同定とその解析
以 上10