脂肪細胞移植治療応用に資する脂肪細胞多様性の単一細胞解析とエピジェネティクス制御を介した脂肪細胞機能調整法の開発
千葉大学大学院医学研究院分子病態解析学

田中知明

With the advent of single cell analysis, it has become possible to understand the characteristics of diverse cell populations and differences in molecular biological properties of individual cells in an integrated manner, which could not becaptured by conventional bulk analysis. On the other hand, we have studied the mechanisms of adipocyte aging, functionaland epigenetic regulation through bulk NGS analysis of human adipose tissue, with the aim of applying our findings to thedevelopment of innovative therapeutic methods for adipose transplantation. Indeed, we have also shown that fractionationof undifferentiated mesenchymal cells, including adipocyte progenitors, in adipose tissue by a ceiling culture method maylead to improved transplantation rates, and that differences in epigenetics including CpG DNA methylation and H3K4me3 in
PPARG promoter have been shown to produce differences in cellular function and adipogenic differentiation potential. However, tissue-derived cell populations showed greater diversity than expected, limiting previous bulk analysis alone. Here, weperformed FACS and single-cell RNA sequencing analysis (scRNA-seq) of human subcutaneous adipose tissue to investigate the cellular lineage diversity of and their molecular basis. FACS analysis identified DPP4+/CD34+ fractions, a progenitor marker of adipocytes, and that of the total number of adipocytes , 74.9% were detected. UMAP by scRNAseq classified
adipose tissue into nine clusters. The CD34+/PDGFRA/B+ mesenchymal cell population, including adipocytes, was classified
into four subclusters, one of which was the DPP4+ adipocyte progenitor. Gene Ontology analysis with differentially expressed genes, specifically expressed in each cluster, demonstrated that the differences in each cluster characteristics wereenriched while having commonality as mesenchymal cells. Thus, these results indicate that scRNA-seq using human adipose
tissue can reveal the cellular diversity and molecular biological characteristics of subcutaneous adipose tissue-derived cells,
and that detailed analysis of the diverse subclusters may detect the underlying molecular mechanisms that regulate differentiation induction efficiency.

1．緒能性を示してきた 1 , 2）。さらに、そのメカニズムとして、

言

PPARG promoter に お け る CpG の DNA メ チ ル 化 や脂肪組織を含めて生体組織には多種多様な細胞が存在す

H 3 K 4 me 3 などのエピジェネティクスの違いが細胞機能る。それらは、発生分化プロセスを通じて、異なる系譜と差と脂肪分化誘導能の差異を生み出していることを明らか

機能を持って組織や臓器を構築することで、生体を生命体にした 1 , 2）。しかしながら、天井培養の分画でも個々の細たらしめている。また、細胞内外からのシグナルや環境変胞には大きな多様性が認められ、これまでの bulk RNA-化に応答して、相互反応や細胞間コミュニケーションを介

seq や bulk ChIP-seq の NGS 解析だけでは、分化効率・成して生命活動を営む。
「シングルセル解析」
は、これまでの熟度を飛躍的に向上させるには限界があった。そこで、本

1 細胞レベルでの解析を大きく飛び越えて、分子生物学的研究では、ヒト脂肪組織を用いたシングルセル解析（singleなオミクス研究を 1 細胞レベルで、かつ、多様な細胞集団cell RNA-seq）を行い、皮下脂肪組織由来細胞の細胞起源の視点で統合的に捉えようとするものである。と系譜の多様性とその分子基盤を明らかにすることとした。

一方、我々は脂肪移植の革新的治療法開発への応用を目

これらの知見を通して、従来の方法ではなしえなかった脂指すため、ヒト脂肪組織の bulk NGS 解析を通じて、脂肪肪細胞移植治療の向上効果（分化能・生着）に資する新たな細胞の老化や機能制御、エピジェネティクス制御機構の研

脂肪細胞機能調整法の開発に発展させることを目指す。

究を推進してきた。そして、脂肪組織中の未分化な間葉系２．方細胞（adipocyte progenitor を含む）を天井培養法により分法画したり、深層と浅層に分けることで、より脂肪分化能の対象は、千葉大学医学部附属病院形成外科において、手高い細胞群を抽出し、脂肪細胞の移植率向上につながる可術にて摘出したヒト腹部皮下脂肪組織検体（女性）。これまSingle cell analysis of adipocyte diversity
for therapeutic application of adipocytetransplantation and development ofmethods to regulate adipocyte function
through epigenetic regulation
Tomoaki Tanaka
Department of Molecular Diagnosis, Chiba
University Graduate School of Medicine

での既報のプロトコール 1 , 2）を用いて、コラゲナーゼ処理を行い FACS による細胞表面マーカーのプロファイリングを施行した。また、遠心分離後に、天井培養（ccdPA）を行い、分化誘導にて in vitro での分化誘導のシステムを構築した。分化の評価は oil-redO 染色を用いた。ヒト脂肪組織を用いたシングルセル解析の条件検討として、Chromium
Controller を用いて、scRNAseq 解析を施行した。データ− 123 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 31, 2023

シングルセルの validationを行った。その結 果、nFeature_

解析は、R package Seurat 2 を用いた。

３．結RNA、nCount_RNA、percent mitochondriaは比較的良好

果な分布パターンを示した（図 2 A）。そこで、QC cutoff 値を、ヒト皮下脂肪組織を用いて、FACS 解析を行った（図 1）。
CD 45 - の 非 血 球 細 胞 を gating し て、 血 管 内 皮 は triple

200 <nFeature_RNA< 2500、percent mitochondria< 4 に設定し、合計 1606 細胞を解析細胞数とした。

positive（CD 31 +CD 34 +CD 146 +）を 指 標 に、mural cells

UMAP によるクラスター分類では、9 つのクラスターには CD 1 4 6 single positive（CD 3 1 -CD 3 4 -CD 1 4 6 +）、分類された（図 2 B）
。また、各種クラスターの発現変動遺adipocyte progenitor は CD 3 4 single positive（CD 3 1 -伝子解析では、血管内皮マーカーである PECAM 1（CD 31）

CD 34 +CD 146 -）で検出した。比較的最近用いられるようや CDH 5、組織マクロファージマーカーである CD 68 やになった脂肪細胞の progenitor marker である DPP 4 が、CD 14・CD 163、脂肪細胞を含む間葉系細胞のマーカー

CD 34 single positive faction のうち、74 . 9 ％に検出された。

である CD 34 や PDGFRA・PDGFRB が検出された。そこ

次に、ヒト脂肪組織を用いたscRNA-seq 解析を行った。約で、Find all marker を用いて各クラスターに特異的に発2 万細胞の生存細胞を採取し、エマルジョン作成を施行した。

現する遺伝子 DEGs（differentially expressed genes）を抽

今回、エマルジョンクロッグにより、解析対象細胞数の減少出して Heat map を作成した（図 2 C）。これらは、各クラを生じた。ライブラリー作成を実施し、シークエンスした後に、スター特性を反映する遺伝子シグニチャーを示している。

図1

図2

ヒト脂肪組織のFACS解析

ヒト脂肪組織のsingle cell RNA–seq解析− 124 −

脂肪細胞移植治療応用に資する脂肪細胞多様性の単一細胞解析とエピジェネティクス制御を介した脂肪細胞機能調整法の開発

次に、各クラスターにおける細胞特異的マーカーがどのよregulation of miRNA transcription, , endoplasmic

うに分布しているかを確認する目的で、重要な細胞マーカ

reticulum lumen, collagen trimerなど が エンリッチしていー 16 遺伝子につき、Featured plot を作成した（図 3）。そた。クラスター 2 の特性は、collagen-containing extracellularの結果、各種クラスターの細胞種を同定した。具体的には、

matrix, glycosaminoglycan binding, sulfur compound

クラスター 7 は、PECAM 1 および CDH 5 が特異的に発現

binding, extracellular matrix structural constituent がエンしており、血管内皮（Endothelial cell）クラスターと同定しリッチしていた。これらの結果は、Mesenchymal cellクた（図 3 左上：青の円）。クラスター 3 , 4 , 8 は、CD 68 およラスターの細胞種としての共通性を示すと同時に、それぞれのび CD 163 陽性であり、マクロファージ（MΦ）のクラスタクラスター特 性の違いを表している。 特に、より未 分 化なーと同定した（図 3 下：緑の円）。クラスター 0 , 1 , 2 , 5 は、DPP 4 陽 性であるクラスター 5 に関しては、cell adhesion

間葉系細胞のマーカーである PDGFRB および CD 34 が発

mediated by integrin, microfibril の GO がエンリッチして現しており、脂肪細胞を含む Mesenchymal cell クラスタいた。

ーとアノテーションした（図 3 の 2 段目パネル : 赤の円）。

４．考特 に 重 要 な 結 果 と し て、 比 較 的 新 た な 脂 肪 細 胞 のprogenitor marker である DPP 4 は、Mesenchymal cell ク

察

皮下脂肪組織から採取される細胞群を用いた脂肪移植は、ラスター（クラスター 0 , 1 , 2）に隣接するクラスター 5 に組織増量のみならず血管新生促進や瘢痕成熟を促し組織を集約していることが判明した（図 3 の 2 段目右：赤矢印）。

再構築させる優れた方法として用いられる。しかしながら、そこで、これらの Mesenchymal cell クラスター、特に脂肪移植治療の本質的な問題点として、生着率の低さや、DPP 4 を発現する progenitor 様の細胞特性を明らかにする

血管新生能や基質分解能・脂肪分化能を十分に発揮できな目的で、各クラスターの DEGs の top 50 遺伝子に対して、いことなど、即ち移植細胞の多面的機能を制御できない点

Gene Ontology 解析を試行した（図 4）。その結果、クラスタが挙げられる。今回のヒト脂肪組織を用いた検討において、ー 0 は、collagen-containing extracellular matrix,

FACS および scRNAseq 解析から、組織を構成する多様な

endoplasmic reticulum lumen, collagen trimer, extracellular細胞集団とその細胞種の特定を明確に行うことが可能とな

matrix structural constituentなどがエンリッチしていた。クラった。実際に、脂肪組織中の CD 34・PDGFRA/B 陽性でス タ ー 1 は、response to reactive oxygen species, positive

ある Mesenchymal Cell 集団が、シングルセル遺伝子プロ

図3

ヒト脂肪組織scRNAseq解析における各種細胞マーカー発現− 125 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 31, 2023

図4

GO解析を用いたMesenchymal cellクラスター特性

ファイルにより 4 つのサブクラスターに分類することがでィック領域を、シングルセル解析によるサブクラスターときた。特に、adipocyte progenitor が明確に同定され、かして同定することができるであろう。これは、これまでのつ scRNAseq の解析基盤からその中でも DPP 4 + の特定のbulk 解析では捉えることができなかった細胞分類であり、クラスターを特定できたことは、重要な結果と考えられる。

新たなメカニズムや治療標的の発見に繋げることができる。

最近の報告では、新規 adipocyte progenitor マーカーであ従って、創薬の視点からは細胞機能に直接働きかける治療

る DPP 4 発現群が多分化能を有すると規定している 3）もの標的として応用が期待できるので、研究成果はより効率的の、逆に脂肪分化効率が低いなど不確かな部分が多い。今で質の高い「エピジェネティクス修飾制御による脂肪移植後、 幹 細 胞 マ ー カ ー と さ れ る CD 34 陽 性 細 胞 の 中 か ら法開発」の基盤となることが期待できるであろう。

DPP 4 陽性・陰性で分け、CD 34 陰性細胞と比較しながら、結論として、ヒト脂肪組織を用いたシングルセル解析

ChIP-sequence と bulk ATACseq を用いて H 3 K 4 me 3 や（single cell RNA-seq）を行うことで、皮下脂肪組織由来

H 3 K 27 me 3 などのエピジェネティックな状態の違いを評

細胞の細胞の多様性とその分子生物学的特性を明らかにす価することで、これらのサブクラスターごと脂肪分化能のることができた。中でも、未分化な progenitor 様の細胞集

potency がどのように異なるかを明らかにする必要がある。

団が含まれており、これらの多様なサブクラスターを詳細さらに、分化誘導後の脂肪定量評価とシングルセルマルチに解析することで、分化誘導効率を制御する分子基盤や分オーム解析（scRNA-seq+scATAC-seqの同時解析）を組み化誘導効率が低いメカニズムを検出するために役立つツー合わせることで、エピジェネティクスの違いがもたらすクルになることが明らかとなった。これらの研究成果と解析ラスターの違いをシングルセルレベルで明らかにすること

技術を基に、症例を積み重ねてさらに発展させることで、ができ、その結果分化効率を規定する重要なエピジェネテ

従来の方法ではなしえなかった脂肪細胞移植治療の向上効− 126 −

脂肪細胞移植治療応用に資する脂肪細胞多様性の単一細胞解析とエピジェネティクス制御を介した脂肪細胞機能調整法の開発

果（分化能・生着）に資する新たな脂肪細胞機能調整法の開発につなげることができる。さらに、ヒト脂肪組織の単一Surg. 2 0 1 9 Sep; 1 4 4（3）: 6 4 4-6 5 5. doi: 1 0. 1 0 9 7/PRS.
0000000000005913. PMID: 31461020

細胞解析データベースを構築することにより、脂肪細胞移

2） Epigenetic modifications underlie the differential ad-

植治療法において、いままでの懸案事項であった分化能おipogenic potential of preadipocytes derived from hu-

よび生着率増加を予測したり、評価することが可能となり、

man subcutaneous fat tissue. Kubota Y, Nagano H, Ko-脂肪細胞移植治療法の生着率の術前診断やマーカー開発に

saka K, Ogata H, Nakayama A, Yokoyama M, Murata

応用することが期待できる。

K, Akita S, Kuriyama M, Furuyama N, Kuroda M,
Tanaka T, Mitsukawa N. Am J Physiol Cell Physiol.

（引用文献）

2 0 2 1 Sep 1;3 2 1（3）: C5 9 6-C6 0 6. doi: 1 0.1 1 5 2/ajpcell.

1） Adipose-Derived Stem Cells and Ceiling Culture-00387. 2020. Epub 2021 Jul 28.

Derived Preadipocytes Cultured from Subcutaneous3） Are Perivascular Adipocyte Progenitors Mural Cells

Fat Tissue Differ in Their Epigenetic Characteristics

or Adventitial Fibroblasts? Guimarães-Camboa N, Ev-and Osteogenic Potential. Sasahara Y, Kubota Y, Kosa-ans SM. Cell Stem Cell. 2017 May 4;20（5）: 587-589.

ka K, Adachi N, Yamaji Y, Nagano H, Akita S, Kuroda

doi: 10.1016/j.stem.2017.04.010. PMID: 28475883

M, Tanaka T, Bujo H, Mitsukawa N. Plast Reconstr− 127 −