第２８回

動物生殖工学研究会

プログラム・抄録集

平成２４年１２月２日（日）
北里本館

大会議室

プログラム
開会挨拶
１．特別講演会長 横山峯介（新潟大学脳研究所）
司会：浜野晴三（家畜改良事業団）
鳥類における遺伝資源保存の現状と課題
田島 淳史 先生
（筑波大学・教授）

２．一般講演１）～４）司会：日野敬昭（旭川医科大学）
１）蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)法によるイヌの異数性精子率の検出○小牧春菜¹、大井真矢¹ 、 ²、鈴木宏志¹ (¹帯広畜産大学原虫病研究センター ゲノム
機能学分野、²現所属：長野県佐久家畜保健衛生所)
２）産業化学物質の有害性・リスク評価－生殖発生毒性の視点から－
奥田 裕計（中央労働災害防止協会(中災防)・日本バイオアッセイ研究センター）３）細胞質酸化ストレスは黄体機能不全による不育症を呈する○野田 義博 1,2 、太田 邦明 3 、白澤 卓二 4 、清水 孝彦 1,5 （ 1 東京都健康長寿医療センター・老化機構、 2 株式会社ラボテック、 3 東邦大医・産婦人科、 4 順天堂大院医・
加齢制御医学、 5 千葉大院医・先進加齢医学）
４）栃木県日光国立公園に生息するニホンジカにおける放射性セシウムの調査○樫野恒平、福井えみ子、松本浩道、小金澤正昭、吉澤 緑(宇都宮大学 農学部)
５）～８）司会：竹尾 透（熊本大学）
５）ホンドハタネズミの凍結-融解精子を用いた人工授精による産仔作出○影山敦子、牛島仁、岡田幸之助（日本獣医生命科学大学動物科学科動物生殖学教室）
６）過剰排卵処置マウスにおける安楽死から採卵までの所要時間と卵子の生存性、受精・発生能との相関について○石束祐太、酒匂一仁、中尾聡宏、吉本英高、坂井裕輝、堀越裕佳、前田佳子、武氏
志保里、廣瀬優美子、竹尾 透、中潟直己（熊本大学 生命資源研究・支援センター（CARD）資源開発分野）
７）冷蔵輸送マウス精巣上体尾部精子を用いた体外受精
近藤朋子、福本紀代子、春口幸恵、竹下由美、中牟田裕子、松永寛子、梅野智子、西村愛美、岩本まり、高橋 郁、古波蔵恵里、土山修治、竹尾 透、中潟直己（熊本大学 生命資源研究・支援センター（CARD）資源開発分野）
８）マウス受精卵の第二極体における半数体ゲノムの安定性の検討○日野敏昭、日下部博一、立野裕幸（旭川医科大学医学部生物学教室）

閉会挨拶

副会長 浜野晴三（（社）家畜改良事業団）

１．特別講演

鳥類における遺伝資源保存の現状と課題
田島 淳史 先生
筑波大学生命環境系
鳥類は、生物学的にも産業的にも重要な位置を占めているが、現在知られている 10,064
種の鳥類のうち 1,240 種 (12.3%) の絶滅が危惧されていることから(IUCN, 2012)、鳥類の遺伝資源を体系的に保存する必要がある。哺乳類においては、精子と卵子のいずれの凍結保存技術も実用化されており、産業 動物のみならず、ヒト、実験動物ならびに野生 動物において広く応用されている。これに対し、鳥類においてはニワトリ精子の凍結保存は可能であるものの、卵子の凍結保存が技術的に困難であるため、鳥類 の遺伝資源を保存するためには哺乳類とは異なった手法を用いる必要がある。そこで生殖系列キメラを用いた遺伝資源保存技術の開発が行なわれた結果、現在までに家禽における遺伝資源を保存するため必要な基本 的な技術は揃ったといえる。
近年、家禽における生殖系列キメラの作製技術を応用し、異種間で生殖系列キメラを作製する事が試みられている。 今後、生殖系列キメラの作製技術を希少野 生鳥類の保存・増殖･復活に応用するためには、種間差を踏まえた生殖細胞の分離、回収、分化、増殖に関する基礎研究を進め、様々な鳥類の遺伝資源を体系的 に保存・復活できるように基礎から応用までの幅広い研究を展開する必要がある。

２．一般講演
１）蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)法によるイヌの異数性精子率の検出○小牧春菜¹、大井真矢¹ 、 ²、鈴木宏志¹ (¹帯広畜産大学原虫病研究センター ゲノム機能学分
野、²現所属：長野県佐久家畜保健衛生所)
動物の繁殖管理を行うにあたって、雄よりも雌の産仔を多く得ることは、コロニーの維持、拡大を図る上でその効率性を大いに高める事ができる。家畜やヒトにおいて染色体を半数体で持たない異数性精子の存在が報告されており、家畜では異数性精子率の把握が遺伝的改良の参考となること、繁殖のモニタリングに役立つと考えられている。また、ヒトや動物において生殖細胞の異数性は初期胚が死滅する原因の多くを占めており、不妊、流産につながることが知られている。しかしながら、イヌにおいて異数性精子率に関する報告はない。この異数性精子率の検出には、精子頭部の形状を確認できること、それぞれの精子において複数の染色体検査ができることから FISH 法が有効とされている。そこで本実験では、イヌ X-、Y-染色体特異的プローブ、および２倍体検出のためのイヌ 1 番染色体(Chr.1)特異的プローブを用いた FISH 法により、イヌの異数性精子の出現頻度について検討した。
８頭のラブラドール・レトリバーより精液を採取して、1.5ml のエッペンチューブに移し、PBS にて２回洗浄後、カルノア液にて４回洗浄して固定 を行った。この精子懸濁液をスライドグラスに滴下して精子標本を作製した。次に、精子頭部の DNA クロマチン構造を脱凝集する処理として、標本を 1M NaOH 溶液へ４分間浸漬させ、次いで、70％および 100%メタノールに浸漬させて脱水を行った。イヌ X-、Y-染色体特異的プローブ、およびイヌ Chr.1 特異的プローブを精子標本に滴下し、ホットプレート上で 70℃、５分間変性させた後、湿潤箱に入れ 37℃で 24 時間ハ
イブリダイゼーションさせた。２×SSC (Saline sodium citrate)、50%ホルムアミド/２×SSC、１×
SSC にて順に洗浄後、DAPI 染色 にて対比染色を行った。精子標本を乾燥させた後、退色防止剤をマウントしてカバーガラスをかけ、蛍光顕微鏡下で１個体あたり 1,500 個以上の精子をカウントした。
２個の Chr.1 シグナル、および２個の性染色体シグナル両方を持つものを２倍体と判定した。
８頭の精子から得られた X、Y 精子検出率は理論比 (X：Y＝50：50)に対して有意差が認められなかった(P > 0.05)。また、すべての精子において３種類いずれかのシグナルが検出される高い
ハイブリダイゼーション効率であった。性染色体における異数性精子は Chr.1 シグナル１個を持つ XX、YY、XY、及び Chr.1 シグナル２個を持つ XX、YY、XY 精子の合計で表され、今回の実験により得られた値は、8 頭の平均で 0.128％であった。すでに報告がある他の動物、ヒトでの性染色体における異数性精子率はウシ(0.096～0.51%)、ウマ(0.316%)、バッファロー(0.224%)、
ヒツジ(0.033%)、ヤギ(0.393%)、マウス(0.06%)、ヒト(0.17～0.90%)である。イヌの異数性精子の割合はマウス、ヒツジよりも高い傾向がみられたが、他の動物とは同程度であった。
表： X-、Y-染色体、および Chr.1 プローブを用いた FISH 法によるイヌの異数性精子率の検出

平均(％)
±標準偏差

X
50.3
±0.57

Chr.1シグナル１個
Y
XX
YY
XY
49.36 0.016 0.024
0.08±0.56 ±0.045 ±0.047 ±0.1

※８個体を用いて求めた。

シグナルなし0.176±0.201

X
0.016
±0.03

Chr.1シグナル２個
Y
XX
YY
0
0
0
±0
±0
±0

XY
0.008
±0.022

Chr.1シグナルなし
X
Y
0
0.016
±0 ±0.03

図：X-、Y-染色体、および Chr.1 プローブを用いたイヌ精子の FISH

赤：Y 染色体、緑：X 染色体、黄色：Chr.1 染色体
矢印は赤、緑および黄色の３つの蛍光シグナルを持つ精子を示している。

２）産業化学物質の有害性・リスク評価－生殖発生毒性の視点から－
奥田 裕計（中央労働災害防止協会(中災防)・日本バイオアッセイ研究センター）「応援します 明日の安全・健康・快適職場」中災防 * が掲げているテーマには労働現場における安全衛生の確保だけでなく、さらに進んで健 康で快適な職場環境づくりを求めている。日本バイオアッセイ研究センターは、労働安全衛生法に基づいて既存の化学物質については国自らが有害性の調査を実施することとして設置された受託試験研究機関である。
現在、妊娠可能な女性の労働人口（20 歳～39 歳）は約 1 千万人と推定されている。法律では労働基準法の規程に基づき女性労働基準規 則が施行されており、女性労働者は妊娠・出産・授乳機能に悪影響を及ぼす恐れのある 25 物質が拡散する場所での就業が禁止されている。一方、今世紀に入り生殖毒性をエンドポイントとした化学物質の有害性評価への取組が国内外で強化され、現在、生殖毒性が懸念される物質数は約 400 にもおよんでいるが、規制の対象 となる情 報が十分 ではない。したがって、多 様な化 学物 質を取 扱う職 場にあっては女性（母性）保護の推進のため、予防的対応に基づく化学物質管理を自主的に実施することが望まれている。
実験動物を用いた生殖発生毒性試験には、催奇形性試験から多世代繁殖毒性試験に至るまで種々のガイドラインがあり、適切に実施された試験の結果報告から当該化学物質の生殖発生毒性の有無が厳密に判断される。ただし、判断に悩む要素として一般毒性 or 生殖発生
毒性、奇形 or 変異、母体毒性の二次的影響、胎児の感受期、種差と系統差等が挙げられる。
化学物質のリスク評価（リスクアセスメント）は以下の手順で行われている。毒性が化学物質固有であり、疫学調査結果等からヒトに同様の事象を示すか否かの確認、さらに有害性の程度、
量－反応 関係の有 無、不確 実係 数（動物 からヒトへの変換、個 体差）の設定、曝 露期 間での補正、経口から吸入への変換等に基づいて、まず「有害性（ハザード）評価（値）」される。
リスクはヒトがその化学物質に曝露されて初めて生じるものである。ヒトにおける曝露の濃度・頻度・期間・状況、分析方法等により曝露評価が行われ、「リスク評価」は有害性評価と曝露評
価から判定・算出される。したがって、有害性が大きくても曝露がなければ問題は少なくなる。
また、化学物質に曝露される環境を改善（排気装置設置やマスク着用）すればさらにリスクが小さくなることは明らかである。これが「リスク管理」と言われ、事業者が自主的に労働者の危険
または健康障害を防止するために必要な措置を講ずる義務とされている。

リスク評価（リスクアセスメント） ＝有害性（ハザード）×曝露
リスク管理（リスクマネージメント）＝リスク評価（リスクアセスメント）×環境管理*

中災防：中央労働災害防止協会 は、事業主の自主的 な労働災害防止活動の促進を通 じて、安全衛生の向上を図り、労働災害の絶滅をめざすことを目的に、労働災害防止団体法に基づき設立された団体です。
日本バイ オアッ セイ研 究セ ンター は、既 存化学 物質の 有害性を 調査 (特に 吸入に よる発 がん 性試験)するために国が設置し、中災防が厚生労働省の委託を受けて運営している受託試験研究機関です。

３）細胞質酸化ストレスは黄体機能不全による不育症を呈する○野田 義博 1,2 、太田 邦明 3 、白澤 卓二 4 、清水 孝彦 1,5（1 東京都健康長寿医療センター・老化機構、 2 株式会社ラボテック、 3 東邦大医・産婦人科、 4
順天堂大院医・加齢制御医学、 5 千葉大院医・先進加齢医学）
活性酸素種(ROS)と抗酸化系のアンバランスに起因する酸化ストレスは、DNA、脂質とタンパ
ク質の酸化修飾につながる。生体内において活性酸素はスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)
等の抗酸化酵素により処理され無毒化される。CuZn-SOD は、主要な抗酸化酵素の１つで、スーパーオキサイドを除去するために、細胞質に局在化する。CuZn-SOD ( Sod1 )欠損雌マウスは、妊娠は可能だが流産や死産を繰り返し、産仔を得ることができない不育症の症状を示すことが知られていたが、原因は不明であった。
本研究では不育症の要因を明らかにすることを目的し、 Sod1 欠損雌マウスの解析を行った。
ホルモン代謝を評価するために、 Sod1 欠損雌マウスの血漿で、下垂体卵巣ホルモン類を測定したところ、妊娠初期の黄体ホルモン(P4 )が Sod1 欠損雌マウスで有意に減少していた。また、発情前期における卵胞刺激ホルモン(FSH)、黄体 形成ホルモン(LH)とエストラジオール(E2 )は野生型と比較して Sod1 欠損雌マウスで変化がなかった。さらに、 Sod1 欠損雌マウスは、過剰排卵誘起により排卵および黄体形成を誘導しても P4 分泌が有意に減少した。組織化学的解析では、 Sod1 欠損雌マウス卵巣黄体域の有意な縮小と間質細胞の変性を観察した。また、 Sod1 欠損雌マウスの卵巣でスーパーオキサイドの産生亢進を呈し、黄体でアポトーシス細胞の増加と血管形成の抑制が認められた。これらの結果は CuZn-SOD 欠損卵巣で増加した活性酸素により黄体形成および黄体機能不全を誘導することを示唆した。生殖工学的手法により Sod1 欠損雌マウスの卵子および精子で体外受精を行ったところ、野生型と同様の受精能を示した。また、 Sod1 欠損２細胞期胚を野生型メスマウスへ胚移植したところ、正常に個体へと発生したことから、 Sod1 欠損雌マウスの低受胎性は胚ではなく、母体側の影響であることが判明した。
これらの結果は卵巣で増加した細胞内 ROS が黄体形成と P 4 産生を障害することで、不育症を呈すことを示唆し、CuZn-SOD が雌マウスの受胎能維持での黄体機能において重要な役割を果たしていることが判明した 1)。
1)
Noda, Y. et al., Biol. Reprod. , (2012) 86(1):16
PMID: 2190068
Key words: CuZn-SOD (SOD1), infertility, corpus luteum, progesterone４）栃木県日光国立公園に生息するニホンジカにおける放射性セシウムの調査○樫野恒平、福井えみ子、松本浩道、小金澤正昭、吉澤 緑(宇都宮大学 農学部)【目的】2011 年 3 月 12 日以降、東北地方太平洋沖地震による福島第一原子力発電所の事故によって放射性物質が広範囲に飛散し た。宮城県、福島県の野生のイノシシの肉から高い放射性セシウムが検出され、栃木県においても、同年 8 月、9 月に日光市内で捕獲された野生のシカの肉から食品の放射線量基準値(100Bq/Kg)を超える放射性セシウムが検出された。放射性セシウムの半減期は、セシウム 134(134 Cs)において 2 年、セシウム 137(137 Cs)において 30 年であり、現在でも場所により放射線量が高いことが報告されている。チェルノブイリ原子力発電所事故では、今日まで北半球高緯度の大部分を汚染しており、英国の高地では未だに放射性セシウムが食物連鎖を通じて、ヒツジの体内へ移行することが明らかにされている。本研究では、日光国立公園で捕獲されたニホンジカの各部位の放射線量を測定し、細胞遺伝学的影響を明らかにするために染色体分析を行った。
【方法】材料には、2012 年 2 月、3 月に男体山地域、足尾地域で県による個体数調整のため捕獲された野生ニホンジカ 65 頭から得られた筋肉(ロース、腿)、臓器、血液、胃内容物、直腸糞、羊水、胎子を用いた。放射性セシウム線量は、ALOKA AccuFLEX7001
を用いて計測した。また、細胞遺伝学的影響を調査するため、19 頭から採取した血液を微量全血培養法にて培養し、常法に従い染色体標本を作製した。その後顕微鏡下で数的および構造異常(異数性、転座など)の有無を観察した。
【結果】両地域の野生ニホンジカの各臓器、血液、筋肉(ロース、腿)の放射性セシウ
ム量の計測の結果、男体山地域では、心臓、肝臓、腎臓、肺で 21.7～78.2 Bq/Kg、ロースおよび腿肉で 51.3～119．6 Bq/Kg、足尾地域では心臓、肝臓、肺で 17.8～92.2 Bq/Kg、
血液で 19.1～24.6 Bq/Kg であり、心臓、肝臓、肺について両地域間で有意な差は見られなかった。
胃内容物などの測定の結果、男体山地域では、胃内容物で 91.9±37.42Bq/Kg、直腸
糞で 351.0±98.71 Bq/Kg、足尾地域では、胃内容物で 199.8±102.9 Bq/Kg、直腸糞で1012.4±387.67 Bq/Kg であり、足尾地域において有意に高かった。
胎子の測定結果の平均値は、男体山地域では、29.7 Bq/Kg、足尾地域では 28.9 Bq/Kg
であり 、有 意な 差は なか った。 羊水 は男 体山 地域の みで 得ら れ、 その 平均値 は 27.8
Bq/Kg であった。
染色体分析の結果、両地域のニホンジカの染色体数は 2n=68 であり、異数性、転座などの変異は見られなかった。
【考察】食用とされる筋肉(ロース、腿)、肝臓、心臓について、両地域で食品の放射線量基準値(100Bq/Kg)を超えるものは、男体山のニホンジカ 17 頭中 2 頭の筋肉で認められ、食用への影響が考えられた。胃内容物、直腸糞は両地域で他部位に比べ放射線量が高く、足尾地域では男体山地域より有意に高かった。このことから、ニホンジカ
が食物として摂取した草類、樹皮に含まれるセシウムが濃縮されたものと推測された。
胎子、羊水の放射線量は他部位と比べて低く、また染色体変異が見られなかったことから、子孫への影響は極めて少ないものと考えられた。

５）ホンドハタネズミの凍結-融解精子を用いた人工授精による産仔作出○影山敦子、牛島仁、岡田幸之助（日本獣医生命科学大学動物科学科動物生殖学教室）【目的】ハタネズミ( Microtus)属は複胃をもつ草食動物であり，中・大型草食性動物モデルやヒトと類似した配偶システムモデルなど，モデル動物としての有用性が期待されている。また，ハ
タネズミ属全 64 種のうち 10 種が絶滅の危機に瀕しており，生物多様性保護の観点から種の保存が必要とされている。これらのことから動物遺伝資源としてハタネズミ属を維持することは有意義である。本研究では，ハタネズミ属における個体再生-増殖法の確立を目的として，マウス精子の凍結法がホンドハタネズミ( Microtus montebelli )精子の凍結保存にも適用できるか否かを
精子性状検査により検討し，卵活性化能を異種間顕微授精により評価した。さらに，ホンドハタ
ネズミ精子凍結保存技術の最終的な検証を行うために子宮頸管経由法を用いて人工 授精し，産仔作出を試みた。
【方法】当研究室で系統維持している 12～67 週齢の雌および 9～49 週齢の雄ホンドハタネズミを実験に供した。精管および精巣上体尾部より精子を採取し，18%ラフィノースおよび 3%スキム
ミルクで構成した凍結 保護 剤中に浮遊させた。その後凍結チューブに分注し，実験まで液体
窒素中で保存した。凍結前後の精子生存性および DNA 損傷レベルについて，それぞれエオ
シン-ニグロシン染色およびアルカリコメットアッセイ法を用いて調べた。次に，過剰排卵処理した B6D2F1 雌マウスから採取した体内成熟卵母細胞にホンドハタネズミの凍結-融解精子を顕微注入して卵活性化能を評価した。凍結-融解精子を用いた人工授精では，ホンドハタネズミに 30 IU ウマおよびヒト絨毛性性腺刺激ホルモンを 46～48 時間間隔で腹腔内投与して過剰排卵を誘起した。次に，交尾確認後 4～6 時間で，精管結紮雄と交配させて偽妊娠を誘起した雌の子宮角に，2×106 個(20l/子宮角)の凍結-融解精子を移植した。この際，外子宮口を見やすくするために耳鏡を用い，肉眼で子 宮頚 管に注入器を挿入して精子懸濁 液 (20l/子宮)を移植した。さらに，凍結-融解 精子による産仔数 改善を試みるために，移植時間の遅延 (交 尾
確認後 7～9 時間)あるいは精子運動性を向上させる hypotaurine を培養液に添加して人工授精した。
【結果】ホンドハタネズミの新鮮および凍結-融解 精子の平均生存 率は，それぞれ 87%および67%であり，凍結-融解後にホンドハタネズミ精子の生存性は有意に低下した(P<0.05)。DNA 損
傷レベルについては，それぞれ 2.0%および 2.5%であり，凍結-融解後に値が上昇した。次に，
マウス卵母細 胞にハタネズミの新 鮮あるいは凍結 -融解精 子を顕 微 注入したところ，いずれも100%の卵母細 胞が減数分 裂を再開して前核を形 成した。このことから，凍結 -融解 後もホンドハタネズミ精子は卵活性化能を十分に維持していることが示された。ホンドハタネズミの新鮮および凍結-融解精子を用いた人工授精による産仔数は，それぞれ 24 匹および 3 匹だった。凍結-融解精子を用いた人工授精由来産仔数は少なかったが，凍結精子から個体を復元できる
ことが示された。さらに，移植時間の遅延(交尾確認後 7～9 時間)あるいは hypotaurine 添加を組み合わせることにより，凍結-融解精子由来産仔数は上昇した。以上の結果から，ホンドハタ
ネズミ精子にはマウス精子の凍結保存法が十分に適応できることが示され，人工授精により産仔を得られることが明らかになった。

６）過剰排卵処置マウスにおける安楽死から採卵までの所要時間と卵子の生存性、受精・発生能との相関について○石束祐太、酒匂一仁、中尾聡 宏、吉本英高、坂井裕輝、堀越裕 佳、前田佳子、武氏志保里、廣瀬 優美 子、竹尾 透、中 潟直 己（熊 本大 学 生命資 源研 究・支 援センター（CARD）資源開発分野）【目的】生命科学研究において、遺伝子改変マウスが汎用されるようになり、マウス生殖工学技術の有用性が高まっている。中でも、体外受精技術の改善は目覚しく、新鮮精子のみならず、凍結あるいは冷蔵保存した精子を用いた体外受精においても、高い受精率が得られるようになった。しかしながら、現在でも、体外受精実施者によっては、受精率が不安定な場合がある。そこで本研究では、体外受精の際に、実施者間で最も操作に違いが生じる採卵操作に着目し、雌マウスを安楽死させてから採卵までに要する時間が、卵子の正常性および体外受精における受精・発生能に及ぼす影響を検討した（実験 1）。さらに、実験 1 により得られた条件を用いて、採取した卵子を凍結 保存し、凍結/融解 卵子の生存 率および体外 受精における受 精率を評価した（実験 2）。
【方法】（実験 1）：過剰排卵処理した C57BL/6J の雌マウスを頸椎脱臼により安楽死させた後に、HTF 中に卵子を採取した。採卵は、安楽死直後、3、5 あるいは 10 分後に行い、各時間に採取した卵子について、形態的正 常卵 子の割合と体 外受精による受精率を評価した。また、精子は、C57BL/6J の雄マウスより採取、メチル--シクロデキストリンを含有する TYH 中で培養（60分間）したものを体外受精に使用した。媒精 6 および 24 時間後に、卵子の観察を行い、卵子の正常性および 2 細胞期胚への発生について検討した。次に、得られた 2 細胞期胚を KSOM
培地中で体外培養を行い、胚盤胞への発生能を評価した。（実験 2）：実験 1 と同様の時間に採卵を行い、卵子の凍結保存を行った。卵子は、採卵後、0.1% ヒアルロニダーゼ処理により卵丘細胞を除去し、20% ウシ胎児血清を含有する HTF 中で 10 分間培養後、簡易ガラス化法にて凍結保存した（Nakao et al., 1997）。また、体外受精は、卵子を融解した後に、実験 1 と同様の方法で行い、受精率を評価した。なお、体外受精培地には、還元型グルタチオンを添加した
HTF を使用した。
【結果および考察】（実験 1）：安楽死から採卵までの所要時間の延長により、正常卵子の割合が減少し（直後：83%、3 分：80%、5 分：71%および 10 分：33%）、死滅卵子の割合が増加した（直後：0%、3 分：1%、5 分：10%および 10 分：43%）。また、体外受精における受精率は、採卵までの所要時間の延長に伴い低下した（直後：95%、3 分：73%、5 分：57%および 10 分：53%）。さらに、
胚盤胞への発生率も同様に、採卵までの所要時間の延長に伴い、漸次低下した（直後：98%、
3 分：64、5 分：34%および 10 分：9%）。
（実験 2）：凍結/融解卵子では、採卵までに要する時間を短縮することによって、生存率が改善された（直後：92%、3 分：83%、5 分：83%および 10 分：71%）。また、凍結/融解卵子を用いた体外 受精における受 精率は、採卵までの所 要 時 間 が短い方 ほど、高 値 を示した（直 後： 95%、3
分：83%、5 分：68%および 10 分：67%）。以上の結果から、安楽死から採卵時間までの時間を短縮することにより、卵子の質の低下を軽減し、安定した受精率が得られることが判明した。さらに、採卵までの所要時間の短縮は、凍結卵子の融解 後の生存率および受精率を向上せしめることも明らかとなった。すなわち、体外受精および卵子の凍結保存において、採卵操作を迅速にすることが、安定した受精率や生存率を得る上で極めて重要であることが示唆された。

７）冷蔵輸送マウス精巣上体尾部精子を用いた体外受精○近藤朋子、福本紀代子、春口 幸恵、竹下由美 、中牟田裕 子、松永寛子、梅野智子、西村
愛美、岩本まり、高橋 郁、古波蔵恵里、土山修 治、竹尾 透、中潟直己（熊本大学 生命資
源研究・支援センター（CARD）資源開発分野）【目的】
熊本大学・CARD では、マウス個体あるいは凍結胚・精子の輸送に代わる新規輸送法として
精巣上体尾部の冷蔵輸送を開発した。
この方法の利点は、1）輸送が簡単、2）輸送中の死亡・逃亡のリスクを回避、3）輸送費が安価、
4）体外受精により病原微生物による汚染を回避できることである。
CARD では、2010 年 4 月からマウス有償バンクシステムにて、2010 年 10 月から CARD マウス
バンクにおいて遺伝子改変マウスの精巣上体尾部の冷蔵輸送サービスを開始し、現在までに
85 系統の遺伝子改変マウスの精巣上体尾部の冷蔵輸送を行った。
本発表では、CARD に冷蔵輸送された遺伝子改変マウスの精巣上体尾部精子を用いた体外受精および胚移植の成績について報告する。
【方法】精巣上体尾部の冷蔵輸送法は、CARD の HP 上に記載されている方法に準じて行った（http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/japanese/gyoumu/teion/cetransp.html）。まず、依頼者が遺伝子改変雄マウスから採取した精巣上体尾部を CARD 冷蔵輸送キットに梱包し、冷蔵宅配便により CARD へ輸送した（精巣上体尾部の採取から採精までに要した時間：40-70時間）。CARD へ到着した冷蔵輸送精巣上体尾部から採取した精子は、FERTIUP®マウス精子 前 培 養 培 地 中 で 前 培 養 した。一 方 、卵 子 は過 排 卵 処 理 した C57BL/6、BALB/c、ICR、
FVB/N の雌から採取し、CARD MEDIUM マウス体外受精用培地（以下 CARD MEDIUM とする）に導入した。媒精は、前培養した精子を卵子を含む CARD MEDIUM 中に添加することにより行った。翌日、発生した 2 細胞期胚は仮親の卵管内に移植、一部の 2 細胞期胚については凍結保存を行い、後日融解、移植を行った。
【結果および考察】本法を利用して CARD へ冷蔵輸送された遺伝子改変マウスの精巣上体尾部精子を用いた体外受精率は、極めて高値であった（91.0±9.82％）。また、得られた 2 細胞
期 胚 を移 植 した結 果、産 子 への発 生 率 は、新 鮮 胚 で 20.0～80.0%、凍 結 融 解 胚 で 22.7～
63.2％であった。以上の結果より、本法を利用して冷蔵輸送されたマウス精巣上体尾部精子から、効率的に受精卵を作製し、胚移植により正常な産子が得られることが明らかになった。現在、本法は国内外のマウスバンクからも注目されており、今後、遺伝子改変マウスの簡便な輸送法として大いに期待されている。

８）マウス受精卵の第二極体における半数体ゲノムの安定性の検討○日野敏昭、日下部博一、立野裕幸（旭川医科大学医学部生物学教室）
多くの哺乳動 物の卵子は受精後に自身の染色 体 の半分を第二極 体(PB2)として細胞外に放出する。放出された PB2 はその後の受精卵の発生に影響を与えずに退化すると考えられている。一方、ヒトにおいて、受精卵の割球の 1 つと PB2 の融合で生じる混倍数性がヒトの先天異常の原因になることが報告されている。本研究では、PB2 における半数体ゲノムの遺伝的安定性について検討するために、種々のステージのマウス受精卵を用いて、PB2 における DNA 合成、アポトーシスの有無、早期染色体凝縮(PCC)法による染色体異常の有無を調査した。
また、PCC 誘導後のクロマチンの形態によって、PB2 における細胞周期の判定も試みた。
BrdU の取り込みを指標とした DNA 合成の解析結果から、1 細胞期受精卵の DNA 合成は受精後 12 時間までに完了するものの、PB2 のそれは 24 時間まで及んでいることが示された。
TUNEL 法とカスパーゼ法による解析では、アポトーシス陽性を示した PB2 の割合は受精後72 時間まで 10%以下であった。受精後 4–6 時間の 1 細胞期受精卵から採取した PB2 の染色体を PCC 法で分析したところ、ほぼ全ての染色体像は単一の染色分体から成る G1 期像であり、数的・構造的異常の出現頻度はそれぞれ 0.8%、1.7%と低かった。
一方、受精後 24、48 および 72 時間では 90%以上が不完全に組織化されたクロマチン塊である S 期像を示した。そのため、染色体解析はできなかった。最後に、不活化センダイウイルスを用いて PB2 を 2 細胞期の初期および中期–後期の割球の 1 つと融合し、4 細胞期になった時の各割球の核の形態と染色体の解析を行った。融合受精卵の 90%以上が 4 細胞期へ発生した。2 細胞期初期の融合では 4 細胞期受精卵の 80%以上が正常形態の核をもっていた。また
染色体分析によって、2 倍体と 3 倍体の割球が混在した 4 細胞期受精卵も確認された。一方、
2 細胞期の中期–後期の融合では異常形態の核が顕著に増加した。
以上の結果から、多くの PB2 が受精後 72 時間まで S 期にあるものの、アポトーシスを起こさずに生存していることが明らかとなった。また PB2 は、受精卵の割球の１つに融合することにより混倍数性受精卵の形成に関与することが示唆された。

第 29 回動物生殖工学研究会開催のお知らせ

期 日 平成２５年１２月（予定）
場 所 北里大学（東京都港区）