The Journal of Farm Animal in Infectious Disease
Vol.4 No.3 2015

EPIDEMIOLOGICAL SURVEY OF MANNHEIMIA SPP.

原著論文

牛から分離される Mannheimia 属菌の野外実態と生化学的性状について
勝田

賢 1） 小嶋暢 2） 富山美奈子 3） 佐藤裕夫 4） 三上

修 1）

1）
（独）農研機構・動物衛生研究所〒 305-0856

茨城県つくば市観音台 3-1-52）山形県中央家畜保健衛生所〒 990-2161

山形県山形市漆山 736

3）青森県十和田家畜保健衛生所〒 034-0093

青森県十和田市西十二番町 19-23

4）岩手県中央家畜保健衛生所〒 020-0605
連絡担当者： 勝田

岩手県滝沢市砂込 390-5

賢

Tel & Fax：029-838-7925
E-mail：katsuda@affrc.go.jp［要約］Mannheimia 属 菌 の 野 外 分 離 状 況 を 16S rRNA 遺 伝 子 の 塩 基 配 列 解 析 に よ り 調 査 し、 血 清 型 別
試験と 11 項目の追加の生化学性状試験を合せて実施した。市販の生化学性状同定キットにより
M. haemolytica と同定された 363 株中 303 株は、16SrRNA 解析により、M. haemolytica と同定されたが、残り 60 株は M. haemolytica 以外の菌種であった。血清型別試験では、一部の菌株に非特異反応が認められたが、血清型が特定された菌株の 99.0% は 16SrRNA 解析で M. haemolytica または M. glucosidaと同定された菌株であった。同定キットにより M. haemolytica と同定された菌株については、オルニ
チンデカルボキシラーゼ反応、L- アラビノース分解、D- ソルビトール分解、エスクリン反応および
β- グルコシダーゼ反応を追加試験として実施し、血清型を特定することにより、同定精度が向上すると考えられる。
キーワード：Mannheimia 属菌、生化学的性状、16SrRNA 解析、血清型別より、M. haemolytica complex には少なくと

緒論

も、5 菌種（M. glucosida, M. granulomatis, M.

Mannheimia haemolytica は，牛呼吸器病のhaemolytica, M. ruminalis, M. varigena）が含主要原因菌の 1 つである［8］。本菌には複数のまれることが明らかとなった［3］。

生物型が存在し、M. haemolytica complex と病性鑑定において原因を正確に同定するこも呼ばれていた。近年、16S rRNA の塩基配と は 極 め て 基 本 的 な 事 で あ り、 ま た、 疾 病

列 や DNA-DNA hybridization な ど の 解 析 に

予 防 の た め に 重 要 で あ る。 し か し、 一 般 に用いられている生化学性状検査キットでは、
M. haemolytica 以外の菌種に対応しておらず、

受付：2014 年 12 月 16 日
受理：2015 年 1 月 22 日

生化学性状検査キットで Mannheimia 属菌を－ 81 －

家畜感染症学会誌４巻 3 号 2015

Mannheimia 属菌の野外実態調査

3．生化学的性状検査および血清型別

正確に同定することは困難と考えられる。このため国内での Mannheimia 属菌の分離状況は

16S rRNA 塩基配列解析により M. glucosida、十分に解明されていない。

M. granulomatis、M. haemolytica、M. ruminalis

今回、生化学的性状検査キットにより M.

または M. varigena と同定された分離株 339 株

haemolytica と同定された菌株の 16SrRNA のと基準株について表 2 に示した 11 項目の生化

塩基配列解析し、Mannheimia 属菌の再同定を学的性状について検査を実施した。生化学的性行った。また、再同定された菌株の血清型や生状検査は、既報［2］に基づいて実施した。

化学的性状について検討を行ったので報告す

血 清 型 別 試 験 に 用 い た 免 疫 血 清 は、M.

る。

haemolytica 血清型 1 ～ 16 型参照株を用いて家兎を定法により免疫し作成した。分離株の血材料及び方法清型別試験は間接赤血球凝集反応により実施し

1．供試菌株た［5, 7］。

1998 年 か ら 2013 年 に 牛 か ら 分 離 さ れ、 市

成績

販 の 生 化 学 性 状 同 定 キ ッ ト（API20NE） を用 い た 検 査 に よ り M. haemolytica と 同 定 さ

供試菌株は 16S rRNA 遺伝子の塩基配列にれ た 363 株 を 供 試 し た。 ま た、 基 準 株 と し

よ り、303 株（83.5%） が M. haemolytica、29て M. haemolytica NCTC 9380, M. glucosida株（8.0%）が M. varigena、3 株（0.8%）が M.

CCUG 38457, M. varigena CCUG 38462, M.

glucosida、2 株（0.6%）が M. granulomatis、2granulomatis CCUG 45422 および M. ruminalis株（0.6%）が M. ruminalis と同定された。また、

CCUG 38470 の 5 株を用いた。全ての菌株は24 株（6.6%）が Mannheimia 属に分類された

30% グリセリンを添加した tryptic soy broth

が菌種レベルまで同定されなかった。（表 1）。

（Becton, Dickinson and Company, USA）、1ml

供試菌の血清型別を間接赤血球凝集反応によに濃厚浮遊させ -80℃に冷凍保存し、必要に応り決定した（表 1）。M. haemolytica と同定さじて 5% 羊血液寒天培地を用い、好気性下でれた 303 株は、血清型 1 型菌が 124 株（40.9%）、

37℃、24 時間培養し試験に供した。

血 清 型 2 型 菌 が 19 株（18.4%）、血清型 6 型

2．16S rRNA 塩基配列の決定（0.6%）に分類された。また，血清型別不能株

菌 が 102 株（33.7%）、 血 清 型 14 型 菌 が 2 株
供試 363 株の 16S rRNA 遺伝子を PCR 法でが 19 株（6.3%）存在した。M. glucosida と同増幅後、その塩基配列（約 1,500bp）を決定し、定された 3 株のうち、2 株は血清型 11 型であっ標準株と比較し、98.5% 以上の相同性が認めらたが、残り 1 株は血清型別不能であった。M.

れた場合同一菌種と同定した［3］。なお、鋳型

haemolytica ま た は M. glucosida 以 外 の 57 株

DNA は InstaGene（バイオラド）を用いてプ

で は、M. varigena 2 株 と Mannheimia sp．1

ロトコールに従い抽出した。

株 が、M. haemolytica の 6 型 お よ び 9 型 の 家兎免疫血清に対して交差反応を示したが、残り

Table 1．Identification of Mannheimia spp. by sequencing the 16S rRNA and serotype distribution
Taxon

No. of strains（%）

Serotype
1

2

6

9

11

14

NT

M. haemolytica

303（83.5%）

124

56

102

0

0

2

19

M. varigena

29 （8.0%）

0

0

2

0

0

0

27

M. glucosida

3 （0.8%）

0

0

0

0

2

0

1

M. ruminalis

2 （0.6%）

0

0

0

0

0

0

2

M. granulomatis

2 （0.6%）

0

0

0

0

0

0

2

M. sp

24 （6.6%）

0

0

0

1

0

0

23

NT: Not typeable－ 82 －

The Journal of Farm Animal in Infectious Disease
Vol.4 No.3 2015

EPIDEMIOLOGICAL SURVEY OF MANNHEIMIA SPP.

54 株はいずれの抗血清とも反応せず血清型別

M. glucosida（3 株）および M. ruminalis（2 株）不能であった。

の野外株では、今回実施した 11 項目の生化学

16SrRNA 解析により、M. haemolytica、M.

性状はすべて基準株と同様であった。

glucosida、M. varigena、M. granulomatis、M.

考察

ruminalis と同定された菌株について 11 項目の生化学性状試験を実施し、それぞれの基準株

Mannheimia 属 に 含 ま れ る 5 菌 種 の 内、M.

と比較を行った（表 2）。M. haemolytica（303haemolytica は線維素性肺炎を引き起こし、牛株）では、5% 牛血液寒天培地における溶血性、呼吸器病の主要原因菌として重要視されていウレアーゼ産生、オルニチンデカルボキシラー

る。M. varigena は牛の口腔、ルーメン、腸管

ゼ反応、L- アラビノース分解、マルトース分などに常在しており、肺炎、乳房炎および敗血解、D- ソルビトール分解、D- キシロース分解症の原因菌として報告されている。また、本および β- グルコシダーゼに対する性状試験の菌は豚の上部気道に常在し、豚の腸炎、肺炎、結果は基準株と同様であったが、エスクリン加

敗血症の原因となることが知られている［3］。

水分解試験では 3 株、α- フコシダーゼ産生でM. granulomatis は 牛 の 皮 下 脂 肪 織 炎 か ら 分

は 28 株、β- キシロシダーゼ産生では 15 株、基離され、シカの気管支肺炎や結膜炎に関与し準株と異なる性状を示した。M. varigena（29ていることも報告されている［3］。一方、M.

株）では、オルニチンデカルボキシラーゼ反応

glucosida と M. ruminalis は病原性が無く、家で 4 株、マルトース分解で 4 株、D- ソルビトー

畜の上部気道やルーメン等の常在菌と考えら

ル分解と D- キシロースで 1 株、エスクリン加れている［3］。このため、牛から分離された

水分解試験で 7 株、α- フコシダーゼ産生で 10

Mannheimia 属菌を菌種レベルまで同定するこ株、基準株と異なる性状を示す株が認められたとは、病性鑑定上極めて重要なことと考えらが、それ以外の生化学的性状は基準株と同様でれる。しかし、今回の検討では生化学的性状あった。M. granulomatis の基準株は D- キシ

検査キットにより M. haemolytica と同定されロース分解は陰性であったが、野外分離株 2 株

た菌株の 16.5% は、16SrRNA 解析の結果、M.

は陽性を示し、基準株と異なる性状を示した。

haemolytica 以外の菌種と同定され、生化学性

Table 2. Phenotypic characterizing reference and field isolates of Mannheimia spp.
Property

M. haemolytica

M. glucosida

NCT
Field CCUG
C9380T （303） 38457T

Field
（3）

M. varigena

M. granulomatis

CCUG Field CCUG
38462T （29） 45422T

M. ruminalis

Field
（2）

CCUG
38470T

Field（2）

Haemolysis

+

+

+

+

+

+

-

-

-

-

Urease

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Ornithine Decarboxylase

-

-

+

+

+

v（25）

-

-

-

-

Acid fromL-arabinose

-

-

-

-

+

+

-

-

-

-

Maltose

+

+

+

+

+

v（25）

+

+

-

-

D-Sorbitol

+

+

+

+

-

v（1）

+

+

-

-

D-xylose

+

+

+

+

+

v（28）

-

+

-

-

Esculin hydrolysis

-

v（3）*

+

+

-

v（22）

+

+

-

-

α-fucosidase+v（275）

+

+

+

v（19）

-

-

-

-

β-glucosidase

-

-

+

+

-

-

+

+

-

-

β-xylosidase

-

v（15）

+

+

-

-

-

-

-

-

+ = positive within 1-2 days,  - = negative,  v = variable* Number in square brackets is number of isolates positive.

－ 83 －

家畜感染症学会誌４巻 3 号 2015

Mannheimia 属菌の野外実態調査

状検査キットだけでは、Mannheimia 属菌を菌

D- ソルビトール分解、エスクリン反応および種レベルまで正確に同定することが困難である

β- グルコシダーゼ反応に対する結果に違いが認ことが示された。

められた。このため、生化学的性状同定キット

M. haemolytica は 12 種 類 の 血 清 型（1, 2,

で Mannheimia 属菌と同定された菌株につい5-9, 12-14, 16, 17） に 分 類 さ れ る［3, 6, 9］。

ては、オルニチンデカルボキシラーゼ反応、L-

ま た、 血 清 型 11 の 参 照 株 が、 新 た に M.

アラビノース分解、D- ソルビトール分解、エ

glucosida に分類され、本菌種に属する野外分

スクリン反応および β- グルコシダーゼ反応を離株 39 株中 19 株が血清型 11 に、残り 20 株

追加試験として実施し、合せて分離株の血清型

は血清型が特定されなかったことが報告されを特定することにより、その殆どが同定可能とている［4］。今回の検討でも 16SrRNA 解析に考えられる。

より M. glucosida と同定された 3 菌株中 2 株

近年、Alexander らが、M. haemolytica、M.

が血清型 11 に属しており、M. glucosida 以外

glucosida および M. ruminalis の 3 菌種を同定の菌株で血清型 11 と反応する菌株が認められ可能な multiplex-PCR 法を報告した［1］。今回なかったことから、生化学性状同定キットでの供試菌株について PCR を実施したところ、

M. haemolytica と同定され、血清型 11 に属す

M. haemolytica（303 株）、M. glucosida（3 株）

る株は M. glucosida と同定可能と考えられる。

および M. ruminalis（2 株）は 16SrRNA 解析

M. glucosida と M. haemolytica 以外の Mannheimiaの結果と一致した結果が得られた（結果は示属菌 127 株中 3 株（2.36%）が M. haemolyticaさず）。このことから Alexander の multiplex-

家兎免疫血清（6 型、9 型および 16 型）に対しPCR 法は、Mannheimia 属菌を同定するためて交差反応を示したことが報告されている［4］。

に非常に有用なツールとなると考えられる。し今回の検討でも 3 株が 6 型または 9 型の免疫血かし、本 PCR 法は牛に病原性が認められる M.

清に交差反応を示した。しかし、血清型が特定

varigena と M. granulomatis には対応していなされた 287 株中 284 株（99.0%）は、16SrRNA

いため、この 2 菌種については同定できない。

の塩基配列解析により M. haemolytica または

このため Mannheimia 属菌 5 菌種を菌種レベ

M. glucosida と同定されたことから、生化学的ルで同定可能な PCR 法の確立が必要と考えら

性状同定キットと血清型別試験を合わせて実施れる。

することにより、同定精度が上昇すると考えら

牛から分離される Mannheimia 属菌の国内れる。

での分離状況が解明されてれ、生化学性状検査

今回、16SrRNA 解析により、M. haemolytica、

キットにより M. haemolytica と同定された菌M. glucosida または M. varigena と同定された株の 6.5% は、別の菌種に分類されることが明335 株はすべて 5% 牛血液寒天平板上で溶血性らかとなった。牛から分離された Mannheimiaが認められた。一方、M. granulomatis または M.

属菌を同定する際は、生化学性状検査キットに

ruminalis と同定された菌株では溶血性が認め

加え、血清型、追加の生化学性状検査、PCR

られなかった。溶血性が認められた 3 菌種中 M.

法等、各検査機関で実施可能な手法を組み合わhaemolytica では、全ての株でオルニチンデカせることで、同定精度が向上すると考えられる。

ルボキシラーゼ反応が陰性を示し、また、また、
99.0% の株がエスクリン反応陰性であり、他の2 菌種と異なる性状を示した。M. glucosida ではエスクリン反応と β- グルコシダーゼが陽性を示し、他の 2 菌種と異なる性状を示した。M.
varigena では全ての株が L- アラビノース分解
陽性を示し、また、29 株中 28 株が D- ソルビ
トール分解陰性と他の 2 菌種と異なる性状を示した。一方、5% 牛血液寒天平板上で溶血性が認められなかった 2 菌種では、マルトース分解、－ 84 －

The Journal of Farm Animal in Infectious Disease
Vol.4 No.3 2015

EPIDEMIOLOGICAL SURVEY OF MANNHEIMIA SPP.

引用文献
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－ 85 －

家畜感染症学会誌４巻 3 号 2015

Mannheimia 属菌の野外実態調査

Epidemiological survey and phenotypic characterizationof Mannheimia spp. isolated from cattle
Ken Katsuda1）, Toru Ojima2）, Minako Tomiyama3）, Yasuo Sato4） and Osamu Mikami1）1）National Institute of Animal Health, NARO, 3-1-5 Kannondai, Tsukuba, 305-0856, Japan.
2）Yamagata Prefecture Central Livestock Hygiene Center, 736 Urusiyama, Yamagata, 990-2161, Japan.
3）Aomori Prefecture Towada Livestock Hygiene Service Center, 19-23 Nishi-Nijyuubantyou, Towada, 034-0093, Japan.
4）Iwate Prefecture Central Livestock Hygiene Service Center, 390-5 Sunagome, Takizawa, 020-0605, Japan.
Representative Author: Ken KATSUDATEL & FAX: 029-838-7925
E-mail: katsuda@affrc.go.jp［Abstract］
Reinvestigation of Mannheimia haemolytica-like organisms resulted in reclassification of theseorganisms and a new genus, Mannheimia, containing at least 5 species（M. haemolytica, M.
glucosida, M. varigena, M. granulomatis and M. ruminalis）was established. The aim of the present
investigation was to phenotyping, genotyping and serotyping a collection of bacteria previously
identified as M. haemolytica by commercial identification kit isolated from cattle in Japan.
In all 363 Mannheimia spp. isolated cattle between 1998 and 2013 were investigated. Three
hundred three isolates belonged to M. haemolytica, 29 isolates to M. varigena, and 3 isolates to M.
glucosida. Two isolates identified as M. granulomatis and M. ruminalis, respectively, were detected.
Twenty-four isolates belonged to unnamed groups with the genus Mannheimia. 34.2% of the isolates
belonged to serotype 1, 15.4% were serotype 2, 28.7% were serotype 6, 20.4% were untypeable, while
the rest belonged to serotypes 9, 11, and 14. However, three strains not belonging M. haemolytica
were typed as serotypes 6 and 9, 99.0% serologically typable strains were identified as M.
haemolytica or M. glucosida by their 16S rRNA gene sequences. In this investigation, 11 additional
phenotypic tests for identification of genus Mannheimia and consequently at least five additional
phenotypic test is necessary for identification.
These observations emphasize that biochemical, serological and genetic characterization isnecessary for the proper identification of these organisms.
Key words: Mannheimia spp., phenotyping, genotying, serotyping－ 86 －