NAIST産学連携フォーラム 2008/2/13

光応答性タンパク質
およびペプチドの創製と利用

奈良先端科学技術大学院大学
物質創成科学研究科

廣田 俊

研究内容
生体超分子

合成超分子

タンパク質精製
ＤＮＡ合成
細胞培養
遺伝子工学

有機合成
錯体合成
有機無機複合体
超分子合成

機能・生命現象の解明
・生体分子を用いた
光スイッチング技術
・人工光合成・分子エレクトロニクス

分光学的解析

機能性材料、医療

ＮＭＲ
ラマン、赤外吸収
過渡吸収
紫外・可視吸収ＥＳＲ

1

光応答性タンパク質
およびペプチドの創製と利用
1. 光応答性修飾基を用いたタンパク質の構造制御
タンパク質のフォールディング反応の追跡に利用
2. 光応答性環状ペプチドの創製
タンパク質ーペプチド複合体形成の光制御
3. アゾベンゼン連結金属ペプチド錯体の構造制御
ＤＮＡ切断の光制御

光応答性タンパク質
およびペプチドの創製と利用
1. 光応答性修飾基を用いたタンパク質の構造制御
タンパク質のフォールディング反応の追跡に利用
2. 光応答性環状ペプチドの創製
タンパク質ーペプチド複合体形成の光制御
3. アゾベンゼン連結金属ペプチド錯体の構造制御
ＤＮＡ切断の光制御

2

タンパク質のフォールディング反応

~1 ms

変性状態

ネイティブ状態

ストップドフロー法によるタンパク質のフォールディング反応の追跡
D

変性状態
D D D
DD
D
D D

DDDD

DDD
D
D

ネイティブ状態

D?

D: 変性剤
希釈緩衝液?

混合時間
(数ms)

Time
0s

3

タンパク質のフォールディング反応?
~1 ms

変性状態

ネイティブ状態タンパク質のフォールディング反応の初期段階を追跡するのが困難- 混合測定法の限界
ストップドフロー法、急速混合法、急速凍結法などタンパク質のフォールディング反応の初期段階を追跡する一般的方法の開発が望まれている新しい測定法の提案
タンパク質への光解離性修飾基の導入
o-nitrobenzyl基導入とパルス光照射による反応
Cyt c

NH3+

NO2
Cyt c

修飾シトクロム c

NH

Cyt c

S

Cyt c

S+

NO2

シトクロム c4

o-nitrobenzyl基導入タンパク質への光照射によるシトクロムｃのフォールディング反応
パルス光照射後の時間分解吸収変化

NO2NO2hν+NOCHO~ 50 μs

10 ms

疎水部位が集まる

αへリックス形成
ヘム配位子交換

80 ms

・励起波長がタンパク部分の吸収帯に近い・１箇所修飾してもタンパク質が完全に変性しない・様々サイトが修飾されてしまう

アポプラストシアニンの構造崩壊とその巻き戻り反応
ー4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl基の導入ー●プラストシアニン

5アポプラストシアニンの構造崩壊とその巻き戻り反応
ー4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl基の導入ー
O 2N
Br CH2λmax 355 nm

OMe

O2N
CH2OMeOMe

OMe

unfoldingrefoldingON

アポプラストシアニン

OHChνOMe

修飾
アポプラストシアニン

OMe

修飾アミノ酸の特定
O2N?
修飾アポプラストシアニン

CH2OMeOMeλmax 355 nm◆ リジルエンドペプチダーゼによる酵素消化37°C、20時間、200 mM NH4HCO3 緩衝液 (pH 8.0)
◆ HPLCを用いたペプチド断片の分画◆ 各ペプチド断片の分析- アミノ酸シークエンス (エドマン分解)- MALDI-TOF MS, MS/MS- エルマン試験 (SH基の有無)

6未修飾および修飾アポプラストシアニンから得られた
ペプチド断片のHPLC溶出曲線
未修飾アポプラストシアニン

修飾アポプラストシアニン(mAbs)(mAbs)
m/z=2570.7 (31-54)200m/z=1409.2 (82-95)

m/z=1604.4 (modified 82-95)

250m/z=2565.2 (55-70)m/z=2519.3 (1-26)

150

m/z=2570.7 (31-54)

200apoPC

m/z=2565.2 (55-70)m/z=2519.3 (1-26)

150100at 215 nm
at 215 nm

1005050

at 280 nm

at 280 nm
at 355 nm

001020304050600at 355 nm
01020Retention Time (min)30405060Retention Time (min)

修飾アミノ酸の特定
修飾アポプラストシアニンから得られたペプチド断片のHPLC溶出曲線

82 84

95

FYCAPHAGAGMVGK(m/z 1409.2)(mAbs)

m/z=1604.4 (modified 82-95)

FYXAPHAGAGMVGK

m/z=2565.2 (55-70)200(m/z 1604.4)

m/z=2519.32(1-26)

m/z=2570.7 (31-54)- ペプチドマッピング
MALDI-TOF MS, MS/MS100

at 215 nm- アミノ酸シークエンス分析より、システイン残基以外は修飾されていない

at 280 nm
at 355 nm

0010203040Retention time (min)5060- エルマン試験
apoPCは１つのシステイン残基(Cys84)を有するが、SH基はない

7

アポプラストシアニンの構造崩壊とその巻き戻り
ー4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl基の導入ー

O2N
Cys84

Cys84

Br CH2O2N
CH2OMe

OMe
OMe

OMe

λmax 355 nm

unfoldingrefoldingON

アポプラストシアニン

OHCOMehν修飾
アポプラストシアニン

OMe

修飾アポプラストシアニンの15N-HSQC NMRスペクトル

光照射前光照射後

8

修飾アポプラストシアニンへの355 nmの光照射による吸収及びＣＤスペクトル変化
CD スペクトル

吸収スペクトル
1020

pH 7.0修飾基に由来

0.15

before3,000 pulses
9,000 pulses
30,000 pulses

0.10

修飾apoPC

0.05

5

Ellipticity (mdeg)

30,000 pulses 109,000 pulses
03,000 pulses-10
before0-5apoPC

pH 2.0-20200220250240

修飾apoPC-100.00200300400500200600210220230240250

Wavelength (nm)Wavelength (nm)

修飾プラストシアニンへの光照射により修飾基が解離することを確認

修飾によりタンパク質の構造が崩れ、修飾タンパク質への光照射により構造が元に戻る

時間分解測定によるフォールディング反応の追跡が可能に

アポプラストシアニンのフォールディング反応の模式図
OCH3OCH3

過渡回折格子シグナル

OCH3OHC

CH280+60
ITG / a.u.

SON

OCH3

400 ns

40200024t / μs

68270 μs
10080slow
23 ms30 - 1000 s/ a.u.

O2NTGhνI

Absorbance0.20(a)(b)(c)

6040200-610-510-410-310t/s-210-110

J. Am. Chem. Soc., 128, 7551-7558 (2006).

9光応答性タンパク質
およびペプチドの創製と利用
1. 光応答性修飾基を用いたタンパク質の構造制御
タンパク質のフォールディング反応の追跡に利用
2. 光応答性環状ペプチドの創製
タンパク質ーペプチド複合体形成の光制御
3. アゾベンゼン連結金属ペプチド錯体の構造制御
ＤＮＡ切断の光制御

PI3-K SH3ドメインとペプチドリガンドの相互作用

SH3ドメインクロスβ構造ペプチドリガンド (RLP1)
RKLPPRPSK
Cys導入ペプチドリガンド
CRKLPPRPSKC(C-RLP1-C)

10光応答性環状ペプチドを用いたタンパク質ーペプチドの複合体形成の制御

特許：光制御ペプチドおよび光制御ペプチドを用いたペプチドー蛋白質複合体の制御法 、
特願2005-238275

SH3ドメインのＣＤスペクトル変化

環状ペプチド存在下
光照射後 － 光照射前
αへリックスの減少

環状ペプチド存在下 － 非存在下

変化なし

11光応答性タンパク質およびペプチドの創製と利用
1. 光応答性修飾基を用いたタンパク質の構造制御
タンパク質のフォールディング反応の追跡に利用
2. 光応答性環状ペプチドの創製と利用
タンパク質ーペプチド複合体形成の光制御
3. アゾベンゼン連結金属ペプチド錯体の構造制御
ＤＮＡ切断の光制御

金属錯体によるＤＮＡ切断
人工酵素、抗がん剤

K. D. Karlin et al.,J. Am. Chem. Soc., 128, 7003 (2006).

複核銅錯体

V. A. Tieme et al.,Chem. Commun., 180 (2007).

単核および複核鉄錯体

複核金属錯体のほうが単核金属錯体よりもＤＮＡ切断活性が高い

12

金属部位間距離の光制御

OO

N N

H2OCu

N

NH2O

Shν

NN

SO

H2N

N

SSOOhν'Cu

銅イオン

H2OO

N

H2N

NH2OONCuCu

O

H2O

H2O

OO

シス体

トランス体

光照射（355 および430 nm）によるGlyCys
アゾベンゼン連結体の吸収スペクトル変化
吸収スペクトルO

430 nmの吸光度変化

N NOHNHO

NH2355 nm

シス体

NSNSH2N

トランス体

SO

430 nmHNHOSOONHNH2H2N

HNO
OOH

HOO

13

光照射（355 および430 nm）によるGlyCys
アゾベンゼン連結体のNMRスペクトル変化

トランス体への355 nm
レーザー光照射

シス体への430 nm
レーザー光照射シス体へ変化

トランス体へ変化

GlyCysアゾベンゼン連結体の吸収およびESRスペクトル
trans638 nm

cisON
O

NH2Cu
O H2O

g|| = 2.255
A|| = 174 x 10-4 cm-1

Dotted line, azopeptide
Solid line, azopeptide: copper= [1]:[2]blue line, trans; red line, cis form銅錯体の吸収およびESRスペクトルに変化なし
2つの銅部位の間隔が変化
O

O

N N

H2O

transCuNNH2OScis355 nm hνNNS

O

H2N

N

SSOONCu
H2O

O

NH2H2N

O

O

H2O

N
CuCu

O

H2O

O

O

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プラスミドＤＮＡの切断

スーパーコイル型

損傷型

直線型

１箇所で切断２箇所で切断

ＤＮＡ切断のアガロース電気泳動図

NickedMobilityTime
LinearSupercoiled

Supercoiledはスーパーコイル型、Nickedは損傷型、Linearは直線型ＤＮＡを表す。

15

CysGly-アゾベンゼン銅錯体のシス体およびトランス体によるＤＮＡ切断のアガロース電気泳動図

transNS

低活性cisNS

L 高活性N

0102030 50(min)60 953(hour)

Ｓはスーパーコイル型、Ｎは損傷型、Ｌは直線型ＤＮＡを表す。

特許：アゾペプチド複合体、特願2007-179592

光応答性タンパク質
およびペプチドの創製と利用
1. 光応答性修飾基を用いたタンパク質の構造制御
タンパク質のフォールディング反応の追跡に利用
2. 光応答性環状ペプチドの創製と利用
タンパク質ーペプチド複合体形成の光制御
3. アゾベンゼン連結金属ペプチド錯体の構造制御
ＤＮＡ切断の光制御

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