多くの水分子を保持した機能性親水コロイドの開発
昭和薬科大学唐澤悟

Hydrophilic-gels and -nanoparticles are paid much attention in medicinal and cosmetic fields. Especially in the fieldof contrast agents such MRI, fluorescence and RI, the functional nanoparticles, which form approximately 100 nm size
in solutions, are passively accumulated in tumor tissues, thus many researchers have reported the tumor-accumulating
nanoparticles based on the 100 nm. This tumor-accumulating behavior utilizing the nanoparticles is known as Enhanced
Permeability Retention (EPR) effect. Moreover, there is a deep relationship between MRI contrast agents and watermolecules; the high contrast ability is derived from presence of many water molecules around the contrast agents. Thus,
the hydrophilic nanoparticles, in which many water molecules are taken the core of the particle into, are promising as MRI
contrast agents with a high contrast ability. We have studied on the MRI contrast agents utilizing the organic radical. Because
the typical MRI contrast agents in clinical, which are consisted of Gadolinium ions (Gd) as a metal spin source, have someissues; renal disorder and brain accumulation by an excess usage. Accordingly, instead of Gd ion, the metal free contrast
agents consisting of organic radical are planned. This time, three nanoparticles consisted of radical species are prepared andthe physical parameters such rotational correlation time (τR) bases on the ESR signal intensity and width, T1-weighed image
with T1-relaxation time, hydrodynamic diameter (DH) by a dynamic light scattering (DLS), and morphology observationsof nanoparticles using a transmission electron microscopy (TEM). Due to checks of the hydrophilicity of the nanoparticles,
ClogP values of the nanoparticles were calculated by a ChemDraw Professional 16.0.
Three nanoparticles with organic radicals, RNP-OTHP, -OH, and OAc, were prepared according to a previous ourreport. In the DLS of the aqueous solutions, DH values for all RNP-X showed the similar 100 - 200 nm size-distribution. In
contrast, TEM images of RNP-OH and -OTHP showed the different morphology; film-like particles and spherical particles,
for RNP-OTHP and –OH, suggesting that the former and latter are vesicle-like and micelle-like particles, respectively. In
the contrast agent ability, the relaxivities (r1) of RNP-OH and -OAc, which are calculated by a slope of the plot of inverse
T1 relaxation times vs concentration of contrast agents, showed 0.17 and 0.31 mM-1s-1, respectively, indicating that thelatter is more than 1.7 time larger than that of the former, and the highest value among the radical nanoparticles reported
by our group. To reveal the relationship between r1 value and hydrophilicity, ClogP values were estimated to be -0.38 and1.4 for RNP-OH and -OAc, respectively. In the previous our report, the micelle-like nanoparticle, PRO2, possesses thesmaller ClogP (-0.037) and r1 (0.17 mM-1s-1) values rather than those of RNP-OAc. The above-mentioned results indicatethat the morphology of the nanoparticles are control by the ClogP value: the value of approximately 1.0 as a borderline, thenanoparticles with the smaller and larger ClogP value rather than 1.0, would form the micelle and vesicle-like morphology.
Accordingly, the vesicle-like nanoparticle based on own ClogP value caused the high r1 value of RNP-OAc.
Considering the above-mentioned results, by controlling the suitable ClogP value, the construction of the metal-free
MRI contrast with the high contrast ability (relaxivity: r1) is underway.

１．緒るガドリニウム錯体の導入、②金属を含まないメタルフリ

言ー造影剤のための有機ラジカルの導入、③マラリア・癌治

香粧品の素材として、多くの水分子を保持できるハイド
ロゲルは魅力的であり、これらを基盤として香粧品素材研

療効果を有するアルテミシニン類縁体導入などを行い、それらコロイド粒子の機能性について報告してきた 1 , 2）。

究が発展してきた経緯がある。親水性コロイドはハイドロ

MRI 造影剤は水分子との間に非常に密接な関係があり、ゲルと同様に多くの水分子を保持できる点と、ハイドロゲ

この関係性について我々が開発してきたナノ微粒子型造影

ルに比べて機能性を付与しやすい点で魅力的な素材である。

剤に加え、ガドリニウム原子と有機ラジカルのスピン量子

我々のグループでは、機能性コロイド粒子の研究を進めて数（S）を使って説明する 3）。画像診断法においては、MRI

おり、最近では両親媒性側鎖を導入した超分子型ウレアベ

造影剤が体内へ投与された組織画像はより強調される（輝ンゼン誘導体を基本骨格として、① MRI 造影機能を有す度が高い白い画像と黒い画像のコントラスト比が大きい）のが一般的である。これは造影剤の造影能によって T 1 とT 2 緩和時間（縦緩和と横緩和）の短縮効果がバックグラウ

Development of Functional Hydrophilic
Colloids Containing Many Water Molecules

ンドと比べて著しく大きいことを意味する。造影能を大きくする即ち緩和時間短縮には、電子スピン（不対電子）を有する分子即ち磁石のような物質がスピン源として働いてSatoru Karasawa

いる。短縮効果はスピン種のスピン量子数（S）に対して強Showa Pharamaceutical University

く反映するため、元素で最も大きい S= 7 / 2 を有するガド− 53 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 31, 2023

リニウムを含む造影剤がひろく臨床現場で用いられてい形態観察を行った。さらに、環境応答型蛍光分子 N 15 Clる。またガドリニウム錯体のような金属を含まないメタル

を PRO 1 と PRO 2 中に導入し 6）、ラジカル周辺の水環境

フリーの造影剤では、代替として有機ラジカルを用いる戦について蛍光強度から考察を行った。その結果、PRO 1

略が示されており、ガドリニウム錯体で報告されているいは 100 nm サイズのナノ微粒子であり、混合した N 15 Cl の

くつかの副作用、例えば腎障害や脳蓄積などを示さない新

蛍光強度低下や TEM 観察より、ナノ微粒子はベシクル状

しいタイプの造影剤構築を目指している。しかしながら有構造であると判断した（Fig. 2 と 3）
。一方 PRO 2 について、

機ラジカルは S= 1 / 2 と小さく、緩和時間短縮効果が著し同様に 100 nm 程度のナノ微粒子であるが、TEM 観察やく低い欠点がある。この欠点を克服するために、我々はナ

N 15 Cl の蛍光強度からミセル状構造のナノ微粒子である

ノ微粒子化と微粒子中の水分子に着目した研究を実施してと判断した（Fig. 2 と 3）
。ベシクル状の PRO 1 は水分子がきた 3 , 4）。先に緩和時間短縮効果には S の大きさが重要で微粒子内へ入り込んでいるため、スピン源である NO と接あると述べたが、それ以外の要因も重要であり 1）分子の触または水素結合しやすいのに対して、PRO 2 ではミセ

回転相関時間の延長、2）スピン結合水の最適化、などが挙ル状となるため、水分子が少ない疎水性部がナノ微粒子のげられる。1）や 2）は複雑な要因が絡んだ結果示されるパ内側に存在し、その疎水部へ NO が配置された可能性を考

ラメータであるが、平たく言うと 1）はスピンを含んだ分えている。即ち、水分子が多く集まっている部位へ NO が子のサイズが大きいほど分子運動が抑制されて回転相関時配置された PRO 1 の緩和能は大きくなり、水分子が少な

間が延長となる。即ちナノ微粒子化することで緩和時間短い部位へ NO が配置されている PRO 2 は緩和能が小さくな

縮が予期される。2）については、短縮効果にはスピン源周ると考えた。言い換えると PRO 1 は親水性コロイドであ

辺に十分な水分子が必要であり、数が少ないと短縮効果がるため緩和能増大を示し、PRO 2 は疎水性コロイドであ限定される。また、このスピン源周辺の水分子の拡散速度るため緩和能低下を示した。
今回有機ラジカルを用いたメタルフリー造影剤に関して、の最適化が必要である。この 2）が、MRI 造影剤と水分子との深い関係性を表すことになる。我々は Fig. 1 に示す 2

疎水性コロイドの Proxyl ラジカルの PRO 2 の骨格に注目

種類の五員環 Proxyl ラジカル PRO 1 と PRO 2 を合成し物性を評価してきた 5）。それぞれには水分子と水素結合することで知られているエチレングリコール鎖を導入しており、水分子を集める効果を狙った。PRO 1 は Proxyl 骨格の NO に対して左右にエチレングリコール鎖を導入し、一方 PRO 2 では NO に対して片方のみにエチレングリコール鎖を導入している。これら PRO 1 と 2 の緩和時間（T 1）の濃度変化を測定し、T 1 の逆数を濃度に対してプロットした傾きから造影能の指標である緩和能（r 1）を評価した結果、PRO1 は 0 . 27mM-1 s-1 に対してPRO2 は 0 .17mM-1 s-1 となり、同じエチレングリコール鎖を導入しても緩和能に差が生じることが分かった。次に PRO 1 と PRO 2 の緩和能の差を検証するために、動的光散乱（DLS）による水溶液中の微粒子のサイズと透過型電子顕微鏡（TEM）による微粒子のFig. 1 PRO1 と PRO2 の分子構造。極性置換基であるエチレ
ングリコールを紫色で強調している。

Fig. 2 ミセ ル 型とベシクル 型 の 微 粒 子 の 構 造。 親 水 性 部（Hydrophilic part）にスピン源が配置している方が緩和能増大を示す可能性が高い。

Fig. 3 PRO1 と PRO2 で予想されている形態と水分子が分散している様子。PRO1 と PRO2 の NO 部が水分子と接触している方が緩和能増大を示す可能性が高い。

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多くの水分子を保持した機能性親水コロイドの開発

し、エチレングリコールの代わりに様々な置換基を導入しえた後乾燥させ、サイズと形態観察を行った。MR 画像にた NO ラジカルを合成した。置換基の疎水性度（ClogP 値）

ついては 1 . 5 テスラーの磁場を用いて、濃度の異なる試料に注目し、緩和能と ClogP とナノ微粒子（コロイド）の形態の T 1 強調画像を撮像し、T 1 緩和時間を見積った。得られとの相関関係を明らかとした。即ち疎水性コロイド（PROた T 1 緩和時間の逆数を濃度でプロットし、直線の傾きか

２）を親水性コロイドへ変換するアプローチの検討を行っ

ら緩和能を算出した。またラジカルの疎水性についてはた。

ChemDraw Professional 16 . 0 を用いて ClogP を見積った。

２．方

法

３．結

Proxyl ラジカルに様々な置換基を導入するため、メトキ

果

3 . 1. RNP-Xの ESR 測定と回転相関時間の算出

シエトキシテトラヒドロピラニル基（OTHP）を導入した

RNP-OTHP, -OH, -OAc の ClogP 値は、それぞれ 1 . 9 ,RNP-OTHP、メトキシエチルアセテート基（OAc）を導入−0 . 38 , 1 . 4 と見積られ、先に示した PRO 2 は ‒ 0 . 037 であした RNP-OAc、メトキシエタノール基（OH）を導入したった。1 mM 水溶液の ESR 測定によりシグナル強度と線幅

RNP-OH を Fig. 4 の方法に従って合成した 7）。2 -bromo-から τR を見積った結果、それぞれ 18 . 6 × 10 ‒ 11 s（OTHP）、

2 -nitropropane- 1 , 3 -diolを出発物質とし 4 ステップでニト

7 . 96 × 10 ‒ 11（OH）、9 . 38 × 10 ‒ 11（OAc）
が得られた。親ss

ロン体を得て、メチルマグネシウムブロミドによるグリ

水性基の水酸基が結合している RNP-OH が最も低い値をニャール反応によりラジカル体を得た。脱アセタール化

示し、値から OH ＜ OAc ＜ OTHP の順となり ClogP 値と後、目的とする置換基を変えた 3 種類のラジカル体を合成の相関が得られた（Fig. 4）。

した。得られたラジカルの ESR 測定により、ラジカル種
解析し、回転相関時間 τR を見積った。τR から NO ラジカル

3 . 2 . RNP-Xの DLS 測定とTEM 観察による微粒子の形態の違い

種の回転相関時間を見積ることが可能であり、粒子のサイDLS で得られた流体力学直径（DH）は、すべて 100 ～ズと一定の相関関係を有する。また水溶液中における粒子

200 nm サイズのナノ微粒子形成が示され（Table 1）、RNP

径測定を動的光散乱法（DLS）で見積った。透過型電子顕微

間でサイズによる大きな違いは観測されなかった。一方微鏡観察では（TEM）、水溶液試料をエラスチックカーボン

粒子の多分散指数（PDI）では違いが観測され、RNP-OH

グリッドへ塗布後、陰染色剤であるリンモリブデン酸を加は PDI が 0 . 1 以上で多分散な分布であったが、RNP-OAcの性質をシグナル強度と線幅からキベルソンの式に従って

Fig. 4RNP-X の合成ルート（上）と得られた RNP-X の水溶液中の ESR スペクトル（下）。

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コスメトロジー研究報告 Vol. 31, 2023

、アスコルビン酸に対する消失速度と ClogP 値）、Table 1 RNP の物理化学的パラメータ（ôR、緩和能（r1）、臨海ミセル濃度（CMC）
粒子径（PDI）と形態学的特徴（morphology）
RNP

τR /s（x 10 -11 )r 1 /mM -1 s-1-OTHP

18 . 6

-

-OH

7. 96

0 .13

-OAc

9 . 380 . 31

TEMPO

0 .10 - 0 . 20

size/nm (PDI)
134( 0 . 071)
154
( 0 .15 )190( 0 . 057 )CMC

rate / s-1

ClogP

morphology

-

-

1. 9

多層膜 orベシクル

5.5

0 . 034- 0 . 34

球状薄膜

5.0

0014

1. 4

-

-

0 . 070--

Fig. 5 DLS の結果。左から 1mM RNP-OTHP, -OH, -OAc 水溶液中の粒子の数と流体力学直径（D H）の相関。PDI：
多分散指数。

と -OTHP は 0 . 1 以下の 0 . 057 と 0 . 07 であり、ClogP が大
きい疎水性が高いほど水溶液中で単分散のナノ微粒子として存在することが明らかとなった 8）。
TEM 観 測 で は、 試 料 と し て RNP-OTHP と -OH に つ
い て 観 察 し た（Fig. 6）。 サ イ ズ は DLS で 得 ら れ た DH と比較して大きな相違点は見られなかった。形態観察の結果、RNO-OH では球状のナノ微粒子の存在が示唆されたが、RNP-OTHP では球状が崩れた膜状物質が多く観察さ
れ、RNP-OH とは異なった集積構造であることが示唆された（Fig. 6）。

3 . 3 . RNP-Xの緩和時間測定と緩和能（r 1）の算出
3 種類のラジカルについて T 1 緩和時間測定を行った（Fig. 7）
。RNP-OH と -OAc については、1 ‒ 10 mM の濃度
で、RNP-OTHP については 1 mM 以下の試料について実施した。1 mM 以下の RNP-OTHP については検出限度付

Fig. 6 RNP-THP（左）と -OH の TEM 画像。リンモリブデン
酸による陰染色による測定。

近であったため、高濃度で調整した RNP-OH と -OAc に
ついて T 1 から r 1 を見積った。Fig. 7 に示すように、T 1 強を示した。

調画像は濃度に依存し、高濃度ほど輝度が強くなった。r 1
について T 1 の逆数と濃度でプロットし、その直線の傾き

3 . 4 . アスコルビン酸に対するラジカルの消失速度から見積った結果（Fig. 8）、興味深いことにより疎水性‒1 ‒1の RNP-OAc（Clogp= 1 . 4）が 0 . 31 mM s と な り、 親 水‒1 ‒1Proxyl ラジカルなどの NO ラジカルは、生体内の還元物
質に対して高い反応性を示し、還元されヒドロキシアミ

性の高い RNP-OH（ClogP= 2 . 1）が 0 . 17 mM s となり、ン（NOH）へ変換されるため、ラジカルとしての機能を失RNP-OAc が 1 . 7 倍以上高い値を示した。また RNP-OAc

う。即ち、還元物質存在下では緩和時間短縮効果が抑制さ‒1 ‒1の 0 . 31 mM s の値は、先で述べた PRO 1 よりも大きなれる。そこで、還元物質であるアスコルビン酸と共存さ値であり、Proxyl 骨格を有するラジカルでは最も高い値せることでのラジカル消失速度を基準物質である TEMPO− 56 −

多くの水分子を保持した機能性親水コロイドの開発

ラジカルと比較した。1 mM の RNP-OH と -OAc に対して、1 mM のアスコルビン酸を加え ESR シグナル強度の減衰を時間プロットし、一次式により消失速度定数 k を見積った（Fig. 9）。その結果、RNP-OH と -OAc はそれぞれ、
0 . 034 と 0 . 014 s‒ 1 を示したが、TEMPO は 0 . 070 s‒ 1 であり、RNP-X の k は小さくなった。この結果は、ナノ微粒子を形成することでアスコルビン酸との反応性が抑制されたことを示唆している。

3 . 5 . RNP-Xの ClogP 値と緩和能と微粒子の形態との相関性今回得られた物理化学的パラメータ、粒子径と形態学的情報を Table 1 にまとめた。緩和能について、疎水性の高Fig. 7 試験管中の RNP-X 水溶液の T1 強調ファントム画像。
外部磁場：1.5T, TR：10000.0ms,
TE：12.0ms, SliceThickness：3.0mm.

い RNP-OAc が親水性の高い -OH よりも高い緩和能を示し た。RNP-OAc の 示 し た 0 . 31 mM‒ 1 s‒ 1 の 値 は、PRO 1（0 . 27 mM‒ 1 s‒ 1）よりも大きくなり、我々が報告したラジカ
ルナノ微粒子型造影剤で最も高い値であった点は評価できる。また RNP シリーズと類似骨格の PRO 2 と比較すると、PRO 2 の緩和能は 0 . 17 mM‒ 1 s‒ 1 であり、RNP-OAc の値は顕著に大きな緩和能を示した。一方 PRO 2 は先の研究からミセル状の微粒子を形成していることが明らかであり、ナノ微粒子の形態（ミセル状かベシクル状か）、緩和能とClogP との間に相関関係があることが示唆された。PRO 2の ClogP 値 が ‒ 0 . 037、RNP-OH が - 0 . 38、RNP-OAc が
1 . 4 であることから、Proxyl 骨格を基本とした（PRO 2 や
RNP の骨格）分子会合体がミセルまたはベシクルを形成す
るかの閾値は ClogP 値 0 . 0 ～ 1 . 0 付近にあることが示唆される。PRO 2 や RNP-OH のようなミセル状のナノ微粒子
は NO ラジカルが疎水性部に存在することが予想され、その結果低緩和能を示す。一方 RNP-OAc や PRO 1 のようなベシクル状のナノ微粒子は NO ラジカル部周辺に水分子

Fig. 8 RNP-OH と -OAc 水溶液中の緩和時間の逆数と濃度プロット。直線の傾きから緩和能（r 1）が算出される。

がミセル状ナノ微粒子よりも多く存在することから、高緩和能を示すことが示唆された。

Fig.9 ラジカル 1 mM 水溶液（RNP-OH, -OAc と TEMPO）に対してアスコルビン酸 1 mM 加えたときの ESR 強度変化と消失速度の算出：TEMPO と RNP-OH の ESR スペクトル中の最も低磁場側のシグナルの強度変化（図左と真ん中）。
強度変化の時間プロット（図右）。実線は減衰を 1 次式でフィティングした結果。

− 57 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 31, 2023

Fig. 10 予想される RNP-OH と -OAc を使った分子変換によるスイチィングと T1 強調ファントム画像の変化。T1 緩和時間が長い RNP-OH へアセチラーゼを加えることで、T1 緩和時間が短い RNP-OAc へ変換されることで T1 強調画像の輝度が高くなり白くなる（左から右）。一方、RNP-OAc へエステラーゼを加えることで RNPOH が生成し、輝度が下がった暗い T1 強調画像が得られる様子（右から左）。

秋月唯花氏、馬場果奈恵氏、斎藤大朗氏をはじめ多くの研４．考究室のメンバーのご協力のもと進めてまいりました。厚く

察

御礼申し上げます。

今回、PRO 2 と同様な Proxyl 骨格を有する有機ラジカ
ルを使って、ClogP 値、ナノ微粒子の形態と緩和能につい（引用文献）ての相関性を調べた。その結果、ある閾値以上の ClogP 値1） H. Hayashi, K. Ohkubo, S. Karasawa, and N. Koga

を有するナノ微粒子はベシクル状となり高緩和能を示すこAssemblies of Functional Small-Sized Moleculesとが明らかとなった。即ち ClogP 値を変えることによって、Having 4-Amino-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl

ナノ微粒子の形態を制御することが可能であることが示さ

Responsive to Heat and pH in Water and Their Water

れた。今回アセチル基を有する RNP-OAc が水酸基を有す

Proton Relaxivities

Langmuir 27, 12709（2011）．

る RNP-OH と比較すると 1 . 7 倍以上の高緩和能を示した。

2） H. Koi, N. Takahashi, Y. Fuchi, T. Umeno, Y.

このことを利用して Fig. 10 に示すように、生体内のアセMuramatsu, H. Seimiya, S. Karasawa and H. Oguri

チラーゼやエステラーゼにより緩和時間のスイッチングがOrg. Biomol. Chem.18, 5339（2020）．
3） K. Morishita, S. Ueki, Y. Fuchi, S. Murayama, T.

可能となることが期待される。
また我々は、MRI 造影剤に加えて、蛍光性物質のナノ

Kaneko, N. Narita, S. Kobayashi, G. Hirai, I. Aoki, and

微粒子化の研究も行っている 9）。疎水性の高い芳香族炭化S. Karasawa Self-Assembled Biradical Ureabenzene

水素にイオン性また非イオン性極性基を導入することによNanoparticles for Magnetic Resonance Imaging ACSって、ナノ微粒子の形態を制御することに成功しており、Appl. Nano Mater. 1, 6967（2018）．

今後疎水性コロイドと親水性コロイドの間のスイッチング4） R. Shiraishi, T. Kaneko, K. Usui, T. Naganuma,
N. Iizuka, K. Morishita, S. Kobayashi, Y. Fuchi, Y.

や生体蛍光イメージングへ展開させたい。

Matsuoka, G. Hirai, K. Yamada, and S. Karasawa
謝辞Effects of Substituents on the Properties of Metal-Free

本研究を進めるにあたり、多大なご支援をいただきまし

MRI Contrast Agents ACS Omega 4, 20715（2019）．

た公益財団法人コーセーコスメトロジー研究財団に心より

5） R. Shiraishi, S. Matsumoto, Y. Fuchi, T. Naganuma,
D. Yoshihara, K. Usui, K. Yamada, and S. Karasawa

感謝申し上げます。
電子顕微鏡測定では、公益財団法人九州先端科学技術研

Characterization and Water-Proton Longitudinal

究所の吉原大輔博士に有益なアドバイスをいただきながら

Relaxivities of Liposome-Type Radical Nanoparticles

測定ができましたことを厚く御礼申し上げます。

Prepared via a Supramolecular Approach Langmuir
36, 5280（2020）．

緩和時間測定では、すべての試料の測定を日本レドック
ス長沼辰弥博士に実施いただきました。厚く御礼申し上げ

6） J . H i r o t a , K . U s u i , Y . F u c h i , M . S a k u m a , S .
Matsumoto, R. Hagihara, and S. Karasawa Fluorescenceます。
本研究内容は、昭和薬科大学 梅野智大博士、飯塚直子氏、− 58 −

Properties and Exciplex Formation of Emissive多くの水分子を保持した機能性親水コロイドの開発

Naphthyridine Derivatives: Application as Sensors for9） R. Hagihara, T. Umeno, S. Ueki, D. Yoshihara,
Y. Fuchi, K. Usui, M. Sakuma, K. Yamada, andAmines Chem. Eur. J. 25, 14943（2019）．
7） T. Hirayama, M. Taki, M. Nakamura, T. Arata,

S. Karasawa Push–Pull Bisnaphthyridylamine

Y. Yamamoto, Synthesis of a New Water Soluble

Supramolecular Nanoparticles: Polarity-Induced

2,2-Bifunctionalized Spin Label and Its Application toAggregation and Crystallization-Induced Emission

Troponin C, Chem. Lett., 35, 834（2006）．

Enhancement and Fluorescence Resonance Energy8） F. Babick Suspensions of Colloidal Particles andAggregates, Springer, Switzerland, 2016, 40‒44.

− 59 −

Transfer Chem. Eur. J. 27, 3039（2021）．