環境感染誌

Vol. 36 no. 6, 2021

〈原 著〉

オゾン化ノンアルコール消毒剤の抗アデノウイルス活性について花岡希 1）・吉田英一 2）・藤本嗣人 1）

Evaluation of the Anti-adenoviral Activity of Ozonated Non-alcohol Disinfectant
Nozomu HANAOKA1）, Eiichi YOSHIDA2）and Tsuguto FUJIMOTO1）
1）
Center for Emergency Preparedenss and Response, National Institute of Infectious Diseases, 2）E-TECH Co., Ltd（2021 年 5 月 24 日受付・2021 年 9 月 7 日受理）
要旨
Human mastadenovirus（HAdV）は，一般的な手指消毒薬には強い抵抗性を示す．HAdV によって引き起こされる流行性角結膜炎や咽頭結膜熱は，院内感染や集団感染など，爆発的な感染を引き起こすことがある．また，HAdV-11 による出血性膀胱炎や DIC も造血幹細胞移植時に大きな問題となっている．HAdV 感染症に対する効果的な抗ウイルス剤は今のところないため，消毒薬による感染拡大の防止が重要である．
オゾンの殺菌，殺ウイルス能力はすでに広く知られている．我々は，2019 年に，オゾン化アルコール製剤が高い殺 HAdV 効果を有することを報告した．一方，アルコール消毒薬は，対象素材の問題等によって使用が難しい場合もある．そこで，本研究では，オゾンをアルコールではなく，オイル内に安定化させた薬剤の消毒薬としての能力を評価するため，アデノウイルスを用いて，抗ウイルス活性を評価した．既報と同様に 30 秒から 5 分間までの反応時間でウイルスの生存率を評価した．試験の結果，各 HAdV 型で若干の反応性の違いが確認されたが，薬剤の作用開始から 30秒で 70％ 以上ウイルスを死滅し，3 分間にウイルス生存率を 1/100 に低下させ死滅させた．オゾン化ノンアルコール製剤は，殺 HAdV 効果を有することが確認できた．
Key words：アデノウイルス，オゾン化オイル製剤，ノンアルコール消毒剤

序

オゾンの殺菌，殺ウイルス能力は，すでに一般的に知文
アデノウイルス（Human mastadenovirus（HAdV））

られておりオゾン化水溶液による消毒は，上下道の水消は A〜G の 7 種に分類され，血清型や遺伝型として 100

毒にも使用されている５）．腸管系 HAdV として知られる

１）を超える型が報告されている ．HAdV は，一般的な手
２）40 および 41 型の下水処理におけるオゾンの有効性も証

指消毒薬には強い抵抗性を示す ．HAdV は，1 ウイル

明されている６）．オゾン使用のメリットは，高い抗バクスが存在するだけでも，ウイルスが増殖すると考えられテリア，抗ウイルス作用に限らず，トリハロメタン等の３）ており，感染力が高い ．HAdV は，病棟閉鎖につなが有機塩素化合物を作らず，除鉄，除マンガンが容易，臭る院内感染など爆発的な感染を引き起こすことが知られ気の除去ができる点である．一方，デメリットとしては，ている．近年，感染可能な HAdV が唾液や尿から長期残留性がなく，効果が一時的であること（これらはメリッ４）間にわたって排出されていることも報告されている ．

トでもある），比較的低濃度でも細胞毒性が強いこと，腐HAdV 感染症に対する抗ウイルス薬は現在まで実用化

食性が強く，特にゴム・プラスチックを侵すことである．
近年，オゾンをアルコール内に安定的にとどめた消毒されてないため，消毒薬による感染拡大の防止が重要である２）．

７）
薬（アルタント），オゾンをオイル内にとどめた消毒薬
８）（イソタント）が開発された［株式会社 E テック（神戸，1）国立感染症研究所感染危機管理研究センター，2）株式会社 E・テック医療機器開発研究所日本）］．本消毒薬は過酢酸，グルタールやフタラールと同等以上の消毒効果を持ち，安全性は急性経口毒性，眼― 316 ―環境感染誌
刺激性，皮膚刺激性，変異原性，口腔粘膜刺激性試験で８）評価されている ．芽胞菌 Bacillus

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め培地との混合には，イソタント 900 uL に対して，0.5%subtilis やノロウイ

tween 80 を 100 uL 加え，1 分間ボルテックスした溶液

ル ス 代 替 ウ イ ル ス で あ る 猫 カ リ シ ウ イ ル ス Felineをアッセイに使用した．対照として，イソパラフィン 900

calicivirus 等に対する消毒薬効果が検証されており，広uL に 0.5% tween 80 を 100 uL 加えて 1 分間ボルテック７）

範での殺ウイルス効果があると推定されている ．我々スした溶液を用いた．European Committee for Stan-は，アルタントが高い殺 HAdV 効果を示すことを，日dardization：CEN１０）の EN 14476１１）や既報９）に従ってエ本で流行している主要な HAdV である 1，2，3，4，5，

ンドポイントアッセイを行った．薬剤の培養細胞への影

6，37，53，54，56，64，および 85 型，世界的に重症呼響を中和するために，薬剤とウイルス混合液に培養培地

吸器疾患と関連して死亡率が高い 7 型，および出血性膀を添加し中和した．HAdV と薬剤溶液を 30 秒，1 分，3胱炎と関連する 11 型について既に報告した９）．しかし，分，5 分間混合し中和した混合溶液を 2 倍希釈で 23 段

アルコール消毒薬は，対象素材の問題等で使用が難しい階希釈し 21 日間 CPE の観察を行った．すべてのアッセ場合がある．

イを独立的に 2 回実施した．

そこで，本研究では，オゾンをオイル内に安定化させ８）たイソタント（ISOTANT）の消毒薬としての能力を結果
イソタントは MEM 細胞生育培地で 1/2500 倍希釈し抗 HAdV 活性により評価した．

た場合では，生育に影響を与えないことが分かった（datanot shown）．HAdV の感染力価（TCID50）は，接種ウ材料と方法

イルスコピー数を 1x105 に揃えて，求めた．培養後 14−

ウイルス調整９）

既 報 に 従 い A549 培 養 細 胞（CCL-185，American

18 日目，希釈限界点の Line 16 前後の時点での CPE のType Culture Collection（ATCC））を用いた．細胞の出現を観察し計算した．結果を表に示した．HAdV-54

培養には，Minimum Essential Medium 培地（Eagleʼs型は，著しい増殖遅延を示すことから，培養後 Day18MEM，Sigma-Aldrich Japan，Tokyo，Japan）に，非目で観察した CPE を対象とした．株間での若干のばら

動 化 濾 過 滅 菌 牛 胎 児 血 清 を 10％，1%

L-Alanine/L-つきがあった．感染力価はおよそ 4.36 ― 5.27 log10 TCIDGlutamine（200 mmol/L）（Wako Pure Chemical Indus-50/mL であった（表）．2 回の独立した試験では，結果tries（Wako），Osaka，Japan），0.2% gentamicin sulfateに大きな差は認められなかった．CEN の EN-14476 を

solution（50 mg/mL）（Wako）および 0.1% amphotericin

基に結果を判定し，表にまとめた．数秒での混合では，B（Wako）を添加した培地を用いた．ウイルスの培養

アルコール製剤ほどの抗ウイルス作用は確認できなかっには血清を 5％ にした培地を用いた．ウイルスの増殖はた．これは，使用している基材の影響と考えられ，アル顕鏡下での細胞変性効果 cytopathic effect（CPE）を指コールと比較するとオイルとウイルス培養液との親和性

標 と し た．HAdV 株 は ATCC 株 や 標 準 株 を 用 い た９）．

が低いためと考えられた．

使 用 し た 株 は 咽 頭 結 膜 熱 関 連 株 と し て HAdV-

すべての HAdV 型で，3 分間の反応で 99.9％ 以上の1，-2，-3，-4，-5 と，-6 型急性呼吸器疾患と関連する HAdV-殺ウイルス効果が確認できた．5 分間の反応では，EN-7 型，出血膀胱炎と関連する HAdV-11 型，流行性角結14476 で抗ウイルス効果が規定される，＞4 log10 を，す膜炎と関連する HAdV-37，-53，-54，-56，-64，-85 型を

べ て の 試 験 し た HAdV に 対 し て 示 し た．PCF 関 連用いた．試験用の感染性の HAdV 溶液として，CPE がHAdV（1，2，3，4，5，6 型）では，1 分間の反応で 87.5〜観察できた培養液を 1,500×g で 2 分間遠心し，上清を99.9％ の殺ウイルス効果が確認できた．重症呼吸器疾患

分注後­80˚C で保管した．

を関連する HAdV-7 は 30 秒間の反応でも 96.9％ の高いウイルス定量と TCID50 測定

殺ウイルス効果感受性を示した．出血性膀胱炎に関連す３）

ウイルスの定量は既報 に従って Real time PCR 法でる HAdV-11 も同様に高い感受性を示した．一方，EKC5実施した．96well プレートの 1 ウェル当たり，1 x 10

関 連 HAdV の う ち，HAdV-37，-53，-54，-56，-64，おcopy になるように調整した HAdV 溶液を 2 分の 1 階段

よ び-85 で，感 受 性 が PCF 関 連 HAdV よ り も 低 く，1希釈法で 23 段階希釈し，コンフルエントになった A549分の反応でも HAdV-53 および HAdV-64 は 75.0％ の殺細胞へ接種した．5% CO2，34˚C のインキュベータで CPEウイルス効果のみ確認された．しかし同じ EKC 関連のの出現を 21 日間毎日観察した．Spearman-Karber 法を

HAdV-37，-54，-56，および-85 はおよそ 90％ 程度の殺用いて median tissue culture infective dose（TCID50）/ウイルス効果を示し，3 分間の反応では，すべて 99.8％mL を算出した．

以上の殺ウイルス効果を示した．

オゾン化オイル製剤の殺アデノウイルス効果判定法
オゾン化オイル製剤は基材がイソパラフィンであるた― 317 ―

環境感染誌

Vol. 36 no. 6, 2021
表1

オゾン化オイル製剤の殺アデノウイルス（HAdV：Human adenovirus）効果

HAdV titer#30ʼʼ＊

1ʼ＊

3ʼ＊

5ʼ＊

HAdVtypeLog TCID50/mL

Log10%

Log10%

Log10%

Log10%

1234567113753
54$
5664854.97
4.97
4.364.364.67
4.97
4.36
4.67
4.97
4.97
4.36
5.27
4.97
4.97

1.20
0.60
1.51
0.90
0.60
0.60
1.51
1.20
0.60
0.60
0.60
0.60
0.60
0.60

93.75
75.00
96.88
87.50
75.00
75.00
96.88
93.75
75.00
75.00
75.00
75.00
75.00
75.00

1.81
1.51
2.11
3.01
0.90
1.20
2.71
2.71
0.90
0.60
0.90
1.51
0.60
0.90

98.44
96.88
99.22
99.90
87.50
93.75
99.80
99.80
87.50
75.00
87.50
96.88
75.00
87.50

3.61
3.61
3.61
＜4.36
3.61
2.71
＜4.36
3.61
3.61
3.61
3.61
3.61
2.71
3.6199.98
99.98
99.98
＜99.9999.98
99.80＜99.99
99.98
99.98
99.98
99.98
99.98
99.80
99.98

＜4.97
＜4.97
＜4.36＜4.36
＜4.67
＜4.97
＜4.36
＜4.67
＜4.97
＜4.97
＜4.36
＜5.27
＜4.97
＜4.97

＜99.99＜99.99＜99.99＜99.99＜99.99＜99.99＜99.99＜99.99＜99.99＜99.99＜99.99＜99.99＜99.99＜99.99＊ 30ʼʼ は 30 秒を，1ʼ は 1 分，3ʼ は 3 分，5ʼ は 5 分での反応時間を示す．
#1×105 copy の HAdV を培養細胞へ接種し，培養 14-16 日前後の TCID50 値を求めた．
$ HAdV54 は増幅速度が遅いため，培養後 18 日の TCID50 値を求めた．

考価設定は困難である．HAdV は型間での増殖速度に違察
現在 HAdV は 100 を超える型が報告されているが，そいがあること１４），型間での薬剤感受性が異なる１）ことかのほとんどの表現型が不明である１）．HAdV に対する消ら，ウイルス間での統一的な感染力価設定は困難である．

毒薬の評価は，ほとんどが 3 型（B 種）や 5 型（C 種）

そこで観測日を 21 日までとし，期間内での各 HAdV 型

１２）と限られた型（種）でのみ実施されている ．近年世界各々の感染力価を算出した．反応ウイルス液を限界希釈的に組み換え HAdV が流行しているが，多くの組み換し，CPE の観察を行う本方法では，最大希釈でのウイえ型の特徴は不明な点が多く，消毒薬への感受性も不明

ルス減少率は，殺ウイルス効果を示している．また，である．一部の型で実施された報告では，HAdV の血HAdV での 96 ウェルを用いた CPE は，1 ウェルの CPE

２）清型によって消毒薬への反応が異なる ので，実際に日が特に HAdV-5 などでは，1PFU と一致する．計算上 2本で流行している型に対しての消毒薬の評価が必要であ段階希釈系列の 16〜17 レーン目が 1 ウイルスコピーにる．先行研究では，オゾン化アルコール消毒薬の有効性なる．ほとんどすべての，株で 14〜16 レーンが CPE 出９）を評価した ．オゾン化アルコール製剤は培養細胞に対現の限界であった．本試験では，ウイルス核酸コピー数して細胞障害性を有するが，0.5％ のチオ硫酸ナトリウと，感染力価では，株間で異なりおおむね一致しているムを使用することで中和効果があることがわかった．一型と，10 倍程度の差がある型が認められた．これは，以方，本研究で用いたオゾン化オイル製剤では，培地での前の報告と一致していた１３）．一般的に消毒薬は，対象ウ2500 倍希釈のみが有効な中和法であった．CEN の標準

イルスやバクテリアが共存する現実の環境下では，多く化基準 EN1276 におけるバクテリア等での消毒薬評価でのタンパク質や塩などの影響で活性が大きく変化，特には，中和剤が示されているが，ウイルスの場合，培地成低下することが知られている１２）．本試験では，多くの血分が宿主細胞の生育に影響を与えるため使用できなかっ清成分が存在する条件で薬剤の評価を実施しており，よ９）

り，実際の環境に近い条件下での評価ができたと考えら

長期間培養観察し，CPE 出現を指標とする本研究でれた．しかし，実際の食品や環境中での検査はできておた ．
用いたアッセイは，対照群（イソパラフィン添加群）とらず今後の課題である．

比較することによって，完全な HAdV 殺効果のエンド本研究では PCF 関連 HAdV としては，HAdV-5 の感ポイントを確認できた．一般にウイルスの感染力価の設受性が少し弱く，オゾン化アルコール製剤の 場 合 は

定は，TCID50，PFU（Plaque Forming Unit），ウイル

HAdV-3 の感 受 性 が 低 い９）こ と と 違 い が 認 め ら れ た．

スコピー数を用いる方法による．一種類のウイルスを用EKC 関連株が特徴的な反応を示したのは，既報９）と同いた試験の場合，通常一種類の方法で感染力価を固定で様であり，EKC 関連型が有する宿主細胞への特異的なきるが，複数種のウイルスを用いた試験の場合，各ウイ侵入機構に起因するかもしれない１４）．オゾン化アルコー

ルスの生育状況や増殖能力が異なるため共通した感染力

ル製剤ほどの抗ウイルス作用は確認できなかったが，す― 318 ―環境感染誌

Deguchi T, et al.: Human Adenovirus B7d-Associated Urethritis after Suspected Sexual Transmission, Japan. Emerg
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5）Kosaka K, Yamada H, Shishida K, Echigo S, Minear A R,
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8）ISOTANT: http://www.e-teck.co.jp/product/37/#anchor5.
accessed July 7, 2021.
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10）European Committee for Standaraization: https://www.cen.eu/Pages/default.aspx. accessed May 28, 2021.
11）EN14476: https://standards.cen.eu/dyn/www/f?p=204:110:
0::::FSP̲PROJECT:69634&cs=148339425C3AEFAF3D8FA
B7DAF73080E0. accessed May 28, 2021.
12）Kampf G: Efficacy of ethanol against viruses in hand disinfection. J Hosp Infect 2018; 98: 331-8.
13）Tsukahara-Kawamura T, Hanaoka N, Konagaya M, Uchio
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14）Stasiak AC, Stehle T: Human adenovirus binding to hostcell receptors: a structural view. Med Microbiol Immunol
2020; 209: 325-33.

べての HAdV がオゾン化ノンアルコール製剤に強い感受性を示したことから，アルコール基材に代わるオイル製剤においても環境消毒等で強い有効性が期待できた．
オゾン化アルコール製剤と比較すると，数秒での混合では，アルコール製剤ほどの抗ウイルス作用は確認できなかった．これは，使用している基材の影響と考えられ，アルコールと比較するとオイルとウイルス培養液との親和性が低いためと考えられた．
以上より，各 HAdV 型で若干の反応性の違いが確認されたが，薬剤の作用開始から 1 分間でウイルス生存率を 1/10-1/100 に低下させ，5 分間ではウイルス減少を示し完全に死滅させていた．オゾン化ノンアルコール製剤（ISOTANT）は，強い殺 HAdV 効果を有することが確認できた．
利益相反自己申告：本研究は国立感染症研究所と株式会社 E・テックとの共同研究契約に基づいて遂行された研究であるが，結果の解析や考察には影響を与えていない．共著者の吉田英一は，株式会社 E・テックの代表取締役である．

文献1）Vol.42, No.4 (No.494) April 2021：https://www.niid.go.jp/ni
id/ja/iasr-vol42/10304-idx494.html：2021 年 7 月 16 日現在
2）Sauerbrei A, Sehr K, Brandstädt A, A Heim, K Reimer, PWutzler: Sensitivity of human adenoviruses to different
groups of chemical biocides. J Hosp Infect 2004; 57: 59-66.
3）Enomoto M, Fujimoto T, Konagaya M, Hanaoka N, Chikahira M, Taniguchi K, et al.: Cultivation for 21 days should
be considered to isolate respiratory adenoviruses fromsamples containing small numbers of adenoviral genomes.
Jpn J Infect Dis 2010; 63: 338-41.
4）Hanaoka N, Itho S, Nojiri N, Konagaya M, Yasuda M,

Vol. 36 no. 6, 2021

〔連絡先：〒162-8640 東京都新宿区戸山 1-23-1
国立感染症研究所感染危機管理研究センター第四室岡 希E-mail: nozomu@nih.go.jp〕― 319 ―

花環境感染誌

Vol. 36 no. 6, 2021

Evaluation of the Anti-adenoviral Activity of Ozonated Non-alcohol Disinfectant
Nozomu HANAOKA1）, Eiichi YOSHIDA2）and Tsuguto FUJIMOTO1）
1）
Center for Emergency Preparedenss and Response, National Institute of Infectious Diseases, 2）E-TECH Co., Ltd

Abstract
Human mastadenovirus (HAdV) is highly resistant to common hand disinfectants. Epidemic
keratoconjunctivitis and pharyngoconjunctival fever cause explosive infections in confined
spaces, leading to nosocomial infections and other mass infections. Hemorrhagic cystitis and DIC
caused by HAdV is also a major problem during hematopoietic stem cell transplantation, andsince there are currently no effective antiviral agents against HAdV infection, it is important tocontrol the spread of infection using disinfectants.
The disinfecting and virucidal abilities of ozone are already well known. In 2019, we reported
that ozonated alcohol agent has high virucidal potential. Contrarily, alcohol disinfectant is not adisinfectant that can be used universally; there are cases in which it cannot be used due to religious beliefs. Therefore, in this study, we evaluated the antiviral activity of the agent with ozone
stabilized in oil using adenovirus to evaluate its ability as a disinfectant. The viability of the virus
was evaluated through reaction times ranging from 30 s to 5 min. As a result of this study, slightdifferences in reactivity were observed among HAdV types, but more than 70% of the virus waskilled within 30 s, and the virus survival rate was reduced to 1/100 within 3 min. It was confirmed that the ozonated oil disinfectant is capable of killing HAdVs.
Key words: human adenovirus, ozonated oil, non-alcohol disinfectant― 320 ―