天然由来物質による claudin-1 を介した高分子送達の科学的基盤研究
筑波大学生命環境系

南雲陽子

Tight junctions (TJ) are intercellular barriers between epithelial cells that separate the internal and external environmentsof cellular sheets, and control invasion of foreign substances and a diffusion of solutes and water across the epithelium. Macromolecules such as biologics with high molecular weight and hydrophilicity are unable to diffuse through the lipid bilayerof the cell membrane. Control of TJ opening by attenuating the barrier function of TJ has proved to be attractive because it
could allow safe and controllable transdermal administration of macromolecules.
MA026, a cyclic depsipeptide with 14 amino acid residues, is a natural product isolated from Pseudomonas sp. RtIB026
as an antiviral compound. It was recently suggested that MA026 binds to claudin-1. Because claudin is the essential component of tight junction complex, we investigated the effects of MA026 on TJ and found that MA026 opens TJ of MDCK II
cell monolayer, reversibly. This result suggests that MA026 is a candidate for TJ reversible opener.
Here, we report the binding specificities and activity of MA026 toward claudin-1 and other claudin family proteins revealed by several methods, and the 3-dimensional structure of MA026. Our results not only reveal the mode of action of TJ
regulator MA026 with novel binding site but also are useful for transdermal administration of large hydrophilic biologics.

1．緒

点が挙げられる。

言

これまで我々は、上皮細胞層 TJ を可逆的に開口させる

スキンケア用品の作用には、保湿から皮膚トラブルの予薬剤（可逆的 TJ 開口剤）について研究を行ってきた 4 - 7）。可防や治療など様々なものがある。特に近年では美白や肌の逆的 TJ 開口剤は、有効成分投与時のみ短時間 TJ を開口さ

新陳代謝促進など、より特異的な効果を狙うものも見受けせ、その後、速やかに閉口させることができるため、異物られる。そのような特異的作用を狙う場合、各種有効成分の侵入を抑えつつ、有効成分の浸透を促進することが可能

を作用対象であるメラノサイトや基底細胞が存在する基底に な る と 考 え ら れ る。MA 026（ 図 1 A）は Pseudomonas層付近まで届ける必要がある。しかしながら、元来皮膚のsp. から単離された環状デプシペプチドである 8）。抗 C 型

最も重要な機能は水分が外に逃げるのを防ぐと同時に雑菌

肝炎ウイルス（HCV）活性を有しており、HCV 感染に必要などの外部刺激から守るバリア機能であり、LogP 値などなタンパク質 claudin- 1 の部分配列に結合する報告がなさにも依存するものの、500 Da 以上の分子は皮膚透過性がれていた 9）。Claudin- 1 は TJ の主要構成因子であり、皮膚乏しいことが知られている 1）。従って有効成分が 500 Da

バリア機能に不可欠なタンパク質である 10）。そこで我々以上の場合、作用部位に効率的に浸透させるための工夫がは本化合物による TJ への影響を検討したところ、大きな必要だと考えられる。

細胞障害性を示すことなく、処理後約 1 時間で強く TJ 開

皮膚のバリア機能には，角質層による静的なバリアと、口を引き起こし（開口期）、その後徐々に閉口していく（閉

その下層の生細胞層（顆粒層）に存在するタイトジャンクシ

11）口期）
可逆的 TJ 開口作用を見出すことができた（図 1 B, C）。

ョン（TJ）による動的なバリアがあり、後者の重要性は近その後、既報の MA 026 の構造に誤りがあることが明らか

年ますます増加している。角質層への浸透はナノカプセルになり、構造を訂正するとともに特許を取得した 12 , 13）。本化など製剤を工夫するアプローチがとられているが、TJ

化合物の実用化のためには MA 026 のターゲットの特定、へのアプローチは検討例が少ない

2 , 3）。その理由の一つと標的分子への作用を介して TJ を開口するという proof of

して、TJ へのアプローチは角質より下層へのアクセスを

concept が必要である。そこで本研究では、1）MA 026 の可能にするため、細胞障害性や異物の侵入を抑えるなど、

claudin- 1 を 介 し た 作 用 メ カ ニ ズ ム 解 析、2）MA 026 と相反する目的を満たすための慎重な研究開発が必要となる

claudin-1 及び他のclaudin family proteinとの結合解析、3）
MA 026 の X 線結晶構造解析を行い、MA 026 の TJ 開口活性についての分子標的・作用機構解析を目的とした。

Scientific research on claudin-1- mediatedmacromolecular delivery by naturally
derived compound
Yoko Nagumo
Institute of Life and Environmental
Sciences, University of Tsukuba

２．方法

2 . 1 . FITC 4 kDa dextran 透過促進活性測定（図2）
イヌ腎臓上皮細胞MDCK IIをtranswell insert（Corning）に播種し、７日間培養し単層形成させた。Insert の apical− 134 −

天然由来物質による claudin–1 を介した高分子送達の科学的基盤研究

図２ Transwell を用いたFITC 4 kDa dextran（FD- 4）透過促進活性測定模式図

ペプチド QCK-VFDSLL-NLSS を、lysine のアミノ基を介してアミノカップリング法により固定化した。74 . 5 RU の固定化量を得、種々濃度の MA 026 をアナライトとして流し Biacore X 100（Cytiva）で解析した。

2. 4. 各種claudin安定発現細胞株作成
複数の蛍光タンパク質を融合させたヒト claudin- 1 や他の ヒ ト claudin フ ァ ミ リ ー の 遺 伝 子 配 列 を pEF 1 vector（Thermo Fischer Scientific）に入れたコンストラクトを作成した。MDCK II 細胞に発現している claudin- 1 , - 2 ,- 3 , - 4 , - 7 を欠損させた quin KO MDCK II 細胞（quinKO細胞、生理学研究所古瀬教授よりご供与）に対し、Fugene（Promega）を用いてトランスフェクションした。2 日後よ
図１ MA 026の構造とTJ透過促進能（A）MA 026化 学 構造、（B）FITC 4 kDa dextran透 過、（C）経上皮電気抵抗値（TER）に対するMA 026の作用。TJ開口の後、MA 026を取り除かなくとも自然に閉口してくることがわかる。

り G 418（Nacalai Tesque）による薬剤選択を 10 日程度行い、遺伝子導入しなかったコントロール細胞が死滅したところ
で、遺伝子導入細胞群を限界希釈法により 96 穴プレート（Iwaki）に播種した。蛍光顕微鏡観察により蛍光タンパクの発現、局在などを確認した。さらに細胞抽出液を回収し、側にのみ FITC 4 kDa dextran（FD- 4 , Sigma）溶液を加えWB 法で抗 claudin- 1 抗体（Proteintech）を用いて検出する

たのち、MA 026 やその類縁体（3 μM）を処理した。Insert

ことにより、蛍光タンパク質と融合した claudin- 1 を検出の basal 側の溶液を経時的に回収し、その蛍光を Wallac

した。

1 4 2 0 ARVO Multilabel Counter（Perkin Elmer, Ex/

３．結果と考察Em= 485 / 528 nm）で測定することで、insert を透過した

3. 1. MA026のclaudin-1を介した作用メカニズム

FD- 4 を検出した。
ペプチド競合阻害実験の場合には、予め MA 026（3 μM）とペプチド（150 μM）を混ぜておき、その混合物を細胞に解析

MA 026 は claudin- 1 の部分配列 VFDSLL と結合することが示唆されている 1）。Claudin は、TJ 形成に必須な膜タ処理した。

ンパク質であり、隣接する細胞の細胞膜上で claudin 同士

2. 2. 蛍光染色が集積して形成される TJ ストランドと呼ばれる紐状の細単層状に培養した MDCK II 細胞にビオチン化 MA 026

胞密着構造を形成することでバリアを形成している（図 3）。

を処理し、ホルマリン固定した。Fluorescein avidin（A2011,

VFDSLL 相同領域を含むドメインは TJ ストランドを形成

Vector Laboratories）に よ り 染 色 し、 観 察 は Leica AF

する claudin 同士の cis 結合に関与する部位と考えられてい6000 fluorescence microscope（Leica Microsystems）によるため、MA 026 が VFDSLL 領域に結合し、cis 結合を乱り行った。

すことで TJ 開口させている可能性が考えられる。そこで
VFDSLL ペプチドを合成し、ペプチドにより MA 026 の2. 3. SPR分子間相互作用解析

TJ 開口活性が競合阻害されるか検討した。MA 026 とペプ

CM 5 センサーチップ（Cytiva）に claudin- 1 の部分配列

チドの混合物を細胞に処理した結果、VFDSLL 配列を逆

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コスメトロジー研究報告 Vol. 31, 2023

図３

Claudinストランド模式図

向きにした LLSDFV ペプチドは MA 026 の TJ 開口活性に影響を示さなかったのに対し、VFDSLL ペプチドは 1 / 20
以下まで顕著に減少させることがわかった（学術論文作成
中）。この結果は MA 026 が claudin- 1 細胞外ドメインとの相互作用を介して TJ 開口活性を示していることを示唆し
ている。

図４

MA 026 は Claudin- 1 の VFDSLL 配 列 と 結 合 し、TJ ス

ヒトclaudinファミリータンパク質のVFDSLL相同領域
アラインメントと機能

トランドを形成する claudin- 1 の cis 結合を阻害している可能性が考えられたことから、MA 026 と VFDSLL ペプチ

より検討した。その結果、claudin- 1 の VFDSLL ペプチドドとの直接の相互作用を SPR により検討した。VFDSLL

が最も強く MA 026 の TJ 開口活性を阻害すること、またとその前後を含む 13 残基ペプチド QCK-VFDSLL-NLSS

各 claudin のペプチド配列によって阻害活性が異なることを合成し、アミノカップリング法により CM 5 センサーチがわかった（学術論文作成中）。中には VFDSLL 配列がごップに固定化した。アナライトとして種々濃度の MA 026

く一部異なるだけで阻害活性がほぼ完全に失われるものもを用いて検討を行ったものの、MA 026 が高濃度の条件にあれば、VFDSLL 配列のほとんどが異なっていてもある

おいても弱い結合しか見られず、ペプチド - 低分子間の弱程度阻害活性があるものもあり、配列特異性の高さを示す

い相互作用であることが示唆された。MA 026 は可逆的に興味深い結果となった。解析の詳細は現在作成中の学術論

TJ 開口を誘導すること、また強い相互作用で長時間結合

文にて記載するが、以上の結果は MA 026 が claudin- 1 にする TJ 結合物質の場合、TJ を長時間開口させてしまう可対 し て 高 い 特 異 性 を 示 す こ と、 ま た claudin- 1 以 外 の能性が考えられることから、MA 026 と VFDSLL 部位とのclaudin ファミリータンパク質に対しても、VFDSLL 相同相互作用が弱いことが TJ 開口の可逆性に重要である可能

領域を介してある程度相互作用し、TJ 開口を誘導できる性が考えられる。今後は claudin- 1 を固定化し MA 026 を可能性を示唆している。今後、MA 026 と VFDSLL 相同配

アナライトとして流し特異的結合を確認した後、VFDSLL

列との詳細な相互作用解析を行うことにより、claudin 発ペプチドでの結合阻害を見る定性的な解析を考えている。

現部位ごとに組織選択的な透過促進剤の開発が期待できる。

ところで、ヒト claudin には 20 種類以上のファミリーが存在し、1 個の細胞に複数種の claudin が発現、細胞や臓

3. 2. MA026 とclaudin-1の結合解析

器の特異性に関与していると考えられている。今回我々が我々はこれまでに MA 026 の構造活性相関研究を行い、MA 026 の TJ 開 口 活 性 に 重 要 で あ る こ と を 見 出 し た

MA 026 を構成する 14 アミノ酸のうち、TJ 開口活性に必VFDSLL 配列部分は、ヒト claudin ファミリー内で保存性要なアミノ酸残基や置換しても大きな影響がないアミノ酸がさほど高くない（図 4）。そこで MA 026 の claudin ファミ

残基について明らかにしている（論文査読中）。これら情報リーに対する特異性を検討することにした。

に基づき、TJ 開口活性に影響が少ないと考えられるアミ

各ヒト claudin の VFDSLL 相同領域ペプチドを合成し、ノ酸残基 1 か所をリジン残基に変換し、ビオチンを結合さMA 026 の TJ 開口活性に影響を与えるか競合阻害実験にせた化合物を合成した。このビオチン化 MA 026 の TJ 開

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天然由来物質による claudin–1 を介した高分子送達の科学的基盤研究

口活性を測定したところ、十分な TJ 開口活性を確認でき

定）。今後は抗 claudin- 1 抗体染色との共局在検討、pull

たことから（図 5）、このビオチン化体を MDCK II 細胞に

down assay などを試みる予定である。

処理し fluorescein avidin を用いた蛍光染色を試みた。し次に、claudin を発現していない上皮細胞に蛍光タンパ

かしながら非特異的な細胞内シグナルが強く、ビオチン化

ク質融合ヒト claudin- 1 や他のヒト claudin ファミリータ

MA 026 特異的なシグナルの検出が難しかった。そこで新ンパクを導入した細胞を作成し、MA 026 処理時の変動をたに TJ 開口活性に影響が少ないと考えられるアミノ酸残検出することで作用メカニズムを解析することとした。

基 3 か所を選び、それぞれをリジン残基に変換した上にポMDCK II 細胞で発現している claudin- 1 , - 2 , - 3 , - 4 , - 7

リエチレングリコールリンカーを介してビオチンを導入しを 欠 損 す る こ と に よ り TJ バ リ ア が 失 わ れ た quin KO

た。これらビオチン化 MA 026 の TJ 開口活性を同様に測MDCK II 細胞（quinKO 細胞）を生理学研究所古瀬教授より定したところ活性を確認できたため、そのうちの一つを用ご供与いただき 14）、蛍光ヒト claudin- 1 のみを発現する細いて同様に蛍光染色を試みたところ、ビオチン化 MA 026

胞を構築した。これらの細胞では claudin- 1 の細胞膜領域由来と考えられるシグナルが検出された（学術論文発表予での局在が観察されており、部分的なバリア機能が確認できた（図 6）。今後、TJ バリア機能に対する MA 026 の作用や、共培養における共局在、MA 026 処理時の局在変動観
察を検討する。並行して claudin ファミリーを個別に導入した細胞の TJ バリア機能検討を進めており、今後は他のclaudin フ ァ ミ リ ー タ ン パ ク 質 導 入 細 胞 単 独、 ま た は
claudin- 1 導入細胞との共培養における検討、及びそのMA 026 による TJ 開口活性などを検討することで claudin
特異性などの検討を行う予定である。

3. 3. MA026のX線結晶構造解析
生理活性物質とその標的タンパク質との相互作用を分子レベルで解析するには、双方の立体構造が明らかになっていることが重要である。そこで我々は MA 026 の結晶化を行い、その X 線結晶構造を得ることに成功した（論文査読
図５ ビオチン化MA 026のTJ開口活性DMSOコントロール、
MA 026、ビオチン化MA 026（bio-MA 026）のFD- 4累積 透 過 量（5時間処 理）。ビオチン化MA 026はTJ開口活性を示した。

中）。MA 026 は全体的な構造としては左巻き α ヘリックス構造をとっていた。その結果、図 7 に示すように N 末に存在するアシル鎖と疎水性アミノ酸残基が化合物の片側に集図６ 蛍光タンパク質融合ヒトclaudin- 1発現quinKO細胞（A）mCherry-claudin-1発現quinKO細胞（左）、YFP-claudin-1発現quinKO細胞（右）における蛍光タンパク発現局在。TJが作られる細胞間隙に主に発現が見られる。Bar, 20μm。
（B）MDCK II細胞、quinKO細胞、蛍光タンパク質融合claudin-1を発現したquinKO細胞クローンのFD- 4累積透過量（2時間処理）。複数のclaudinファミリータンパク質を発現し正常なバリア機能を有す
るMDCK IIではFD- 4透過量が少ないのに対し、MDCK IIから5種類のclaudinファミリータンパク質を欠損させたquinKO細胞ではバリア機能が失われ、FD- 4透過量が上昇する。蛍光claudin-1導入quinKOクローンでは部分的ではあるがFD- 4透過量の減少が観察される。

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コスメトロジー研究報告 Vol. 31, 2023

図7 MA 026 X線結晶構造解析結果（A）MA 026の化学構造のうち、N末アシル鎖と疎水性残基をマゼンタで示した。
（B）MA 026の結晶構造。
（A）で示した疎水性部分であるN末アシル鎖と疎水性残基が片側に集積し疎水性クラスターを形成していることがわかった。

積しており、疎水性クラスターを形成していることが明らであることが示唆された。このことから今後は定性的な解かとなった。これまでの構造活性相関解析から、MA 026

析となるが弱い相互作用でも検出できる手法の検討にシフの TJ 開口活性には疎水性アミノ酸が重要であることが示トする。今回のペプチド競合阻害実験から明らかとなったされていることから（論文査読中）、MA 026 の疎水性クラ

ように、選択性は高いがペプチド - 中分子間の弱い相互作

スター領域が claudin- 1 の VFDSLL 配列と相互作用してい用であることが TJ 開口の可逆性に寄与している可能性もると考えられる。今後、MA 026 の結晶構造と、現在得ら考えられるため、詳細に検討していく必要があると考えてれている claudin ファミリーの X 線構造解析結果を用いている。

結合モデル作成・相同配列領域比較などを行い、相互作用

最後に MA 026 の X 線結晶構造が得られたことで、構造や特異性に重要な部分構造について検討を進める予定であ

活性相関検討の結果を統一的に理解するための基盤が得らる。

れた。今後、VFDSLL ペプチドや相同領域配列との相互４．総作用を明らかにすることで、MA 026 を用いた非侵襲的薬

括剤送達の科学的基盤を確立する重要な知見となることが期

本研究では主に MA 026 の claudin- 1 を介した作用メカ待できる。

ニズム解析、特に claudin- 1 の部分配列であり、MA 026

皮膚研究の進展に伴い、皮膚トラブルの原因や老化に伴が結合すると示唆されていた VFDSLL 配列ペプチドとのう皮膚変性メカニズムが明らかになってきている。また、

相 互 作 用 解 析 を 行 っ た。VFDSLL ペ プ チ ド に よ り、

高齢社会における美しさ・若々しさに対するニーズから美MA 026 の TJ 開 口 活 性 が 失 わ れ た こ と は、MA 026 が容皮膚研究が進展し、老化に伴うしみ・しわなどの生成メ

claudin- 1 を介して TJ 開口していることを強く示唆するもカニズムについても明らかになっている。その結果、これのであった。さらに claudin ファミリーの VFDSLL 相同領らのトラブルやニーズに対応する成分などが研究開発され域ペプチド競合阻害実験では VFDSLL 配列がごく一部異新たに上市されている。この流れは今後も加速していくとな る だ け で 阻 害 活 性 が ほ ぼ 完 全 に 失 わ れ る も の や、考えられる。さらに科学技術の進歩により複雑な生体高分

VFDSLL 配列のほとんどが異なっていてもある程度阻害子の生産が容易になってきており、医療分野以外でも利用活性があるものもあるなど興味深い結果が得られた。これされるようになってきた。近年耳にすることが多くなったらの結果により、MA 026 の claudin- 1 特異性の高さとと「医薬部外品」では、医薬品のように治療には至らないまで

もに、他の claudin 特異的な阻害活性を示す MA 026 類縁も、高い効果・効能が期待されるような成分が配合され、体が合成できる可能性が見出され、組織選択的透過促進剤

皮膚を介してさらに奥の作用部位に有効成分を届けることと い う 新 た な コ ン セ プ ト を 得 る こ と が で き た。 各 種が必要となってきている。上記のような有効成分には親水

claudin を 導 入 し た quinKO 細 胞 も 取 得 で き て お り、

性の中・高分子化合物も多く存在するため、MA 026 をは

claudin を介した作用のメカニズム解析を進めている。

じめとする透過補助剤により、有効成分をその作用部位ま今回、MA 026 プローブを用いた claudin- 1 の結合解析で浸透させる技術も同時に進展していく必要があると考えでは、結合の証明までには至らなかったが、結合解析に有る。本助成の成果を MA 026 を用いた非侵襲的経皮投与に用なプローブ化に成功したことは今後の研究に大きく寄与

よる有効成分送達に繋げ、皮膚の健康促進に貢献する予定

すると考えられる。さらに SPR を用いた相互作用解析かである。

ら MA 026 と VFDSLL ペプチドとの結合が弱い相互作用− 138 −

天然由来物質による claudin–1 を介した高分子送達の科学的基盤研究（引用文献）

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