刺激応答性 DNA ナノ構造体の構築
岐阜大学工学部

池田将

Nucleic acids have been employed as programmable building blocks in the construction of various DNA nanostructures
through self-assembly, which is based on Watson–Crick base pairing. DNA nanostructures with stimuli-responsive properties
have been used in various applications such as sensors, controlled release and delivery, and actuators. Here, we describe
the design and synthesis of a new reduction-cleavable spacer (RCS) based on a nitrobenzene scaffold for constructing
reduction-responsive oligonucleotides according to standard phosphoramidite chemistry. In addition, we demonstrate that theintroduction of the RCS in the middle of an oligonucleotide (30 nt) enables the construction of a self-assembled microspherecapable of exhibiting a reduction-responsive disassembly. Since the preparation of RCS-based phosphoramidite reagent
for the construction of oligonucleotides containing RCS is straightforward, the RCS could allow for the introduction of thereduction-responsiveness into various functional oligonucleotides and nucleic acid-based architectures toward therapeuticand diagnostic applications in near future.

１．緒は、DNA ナノ構造体の美容・医療応用につながり、コス言メトロジー分野の進歩・発展に寄与できると期待される。

本研究の目的は、新規な刺激応答性 DNA ナノ構造体の加えて、DNA ナノ構造体は、毒性が低い（生体適合性が高創製である。特定の疾病に関係する生体内環境や外部環境い）ことが期待され、本研究で開発する刺激応答性 DNAを刺激として応答する機能を DNA ナノ構造体に搭載できナノ構造体はバイオ応用展開するうえで魅力的な素材といれば、バイオナノテクノロジー分野のブレークスルーの一える。

つになる可能性がある。1953 年に生命の遺伝情報を保存２．方する重要な役割を担う DNA が二重らせん構造であるとい法

う発見以来、着実に精密化された原子・分子レベルの構造

本研究では、低酸素状態依存的なオリゴ DNA（ODN）の知見を基に、世界初の人工的に設計された立方体状 DNA切断反応を可能にする新たな分子として、ニトロアリールナノ構造体が創出されたのは 1991 年とされている 。近基 3）を組み込んだスペーサ型モノマー分子（RCS）を設計し、年では、DNA ナノ構造体に関する研究は、ナノテクノロその有機合成手法を確立することから研究を計画した。ニジーの中核分野へと発展し、DNA 鎖の長さ・配列・組みトロアリール基は、低酸素状態においてアミノ基などに還合わせなどを設計することによって新たな形状の構造体が元されることが知られており、このことを利用することで、創出され続けている。しかしながら、その一方、狙った刺低酸素状態依存的な ODN の切断反応が可能になると期待激に応答する DNA ナノ構造体の構築とそのための化学的される。

1）

な方法論の開発は、ほぼ未着手のまま残されている。

示すものがあると報告されている。ごく最近では、DNA

2 . 1. 還元反応に応答して切断されるスペーサ型モノマー 分 子 4（Reduction cleavable spacer:RCS）の有機合成

ナノ構造体が、経皮投与でのドラッグデリバリーにおける図 2 に示す合成スキームにしたがって化合物 4（RCS）を2）キャリアーとしても利用可能であることが示されている 。

合成した。得られた化合物 4 は、1 H, 13 C, 31 P NMR スペク

したがって、DNA ナノ構造体に狙った刺激に対する応答

トル、およびESI-TOF-HRMSスペクトルにより同定した 4）。

近年、DNA ナノ構造体には、トランスフェクション試薬を用いる必要がなく、そのまま細胞内に移行する性質を機能の付与が可能になれば、経皮投与でのドラッグデリバリーをより精密に達成できる可能性があり（図 1）、ひいて

2 . 2 . RCS を組み込んだ ODN（s1RCS）の構築合成したモノマー分子（化合物 4 , RCS）を用いて、核酸自動合成装置（HTS H-Series H- 6 G 8 A）によって RCS を組み込んだ ODN（s 1 RCS）を構築した。具体的には、ホスホ
Construction of stimuli-responsive DNAnanostructures

ロアミダイト法の標準的条件にて、1 µmol スケールで合成を行い、天然型塩基のホスホロアミダイトは 50 mM、合Masato Ikeda

成したホスホロアミダイト化合物４（RCS）は 75 mM にな

Faculty of Engineering, Gifu University

るように乾燥アセトニトリルにそれぞれ溶解した。CPG− 16 −

刺激応答性 DNA ナノ構造体の構築

図１

図２

低酸素状態に関連する還元刺激で構造崩壊する DNA ナノ構造体

還元反応に応答して切断されるスペーサ型モノマー分子 4（Reduction cleavable spacer: RCS）の合成スキーム

樹 脂 は 活 性 に 基 づ き 1 μmol を カ ラ ム に 量り取り、核酸自動合成機に取り付けた。なお、5 ′- 末端の DMTr 基を脱保護せずに合成を終了させた。合成終了後、CPG 樹脂をサンプルストックチューブに移し、28 % アン
モニア水：40 % メチルアミン水溶液 = 1：1（1 . 5 mL）を加え、65 ℃で 20 分静置した。冷蔵庫で 1 時間静置した後、樹脂と上清を分け、上清を減圧濃縮し、1 . 5 mL エッペンチ
ューブに移し、IP-RP-HPLC にて精製した。
分取したサンプルを減圧濃縮した後、80 %酢酸（500 μL）を加え、37 ℃で加熱した。15分後、3 . 0 M 酢酸ナトリウム（50 μL）および、イソプロパノール（500 μL）を加え反転撹拌

図３ s1RCS の（A）MALDI-TOF-MS（linear, negative, matrix: 3-HPA）スペク
トルと（B）IP-RP-HPLC チャートし、‒ 80 ℃で 15 分間静置した。その後、15分間遠心（15000 rpm, 4 ℃）した。沈殿物と上清液を分け、できるピーク（m/Z= 9520 . 6）を検出した。また、イオン化沈殿物に 70 % エタノール（1 . 0 mL）を加え、15 分間遠心に用いる UV レーザー光によって切断されたと想定される（15000 rpm, 4 ℃）した。沈殿物と上清液を分け、沈殿物にピーク（m/Z= 3182 . 7）も確認された。

滅菌水（1 . 0 mL）を加え、溶解させ、IP-RP-HPLC にて精製した。溶媒を減圧濃縮した後、1 . 5 mL エッペンチュー

2 . 3 . 球状 DNA 構造体 1RCSの構築と機能評価

ブに移した。図 3 に示すように、IP-RP-HPLC の分析に図 4 に示した設計指針に沿って、また、水溶液中の 3 種より、精製した s 1 RCS が十分な純度であることを確認した。

類のオリゴ DNA 濃度（s 1 RCS, s 2 , s 3）と Mg 2 + 濃度を変化さ

さらに、MALDI-TOF-MS によって同定し、s 1 RCS に帰属せ、球状 DNA 構造体 1 RCS の構築条件を検討した。具体的− 17 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 31, 2023

図４

低酸素状態に関連する還元反応に応答して構造が崩壊する球状 DNA 構造体 1RCS の設計指針には、3 種類のオリゴ DNA 水溶液を混合し、加熱 - 冷却種類のオリゴ DNA（s 1 RCS, s 2 , s 3）の組み合わせにおいては、操作（サーマルアニーリング；70 ℃から 10 ℃ , 冷却速度：

DNA 濃度が 10 µM かつ Mg 2 + 濃度が 25 mM において球状1 ℃/min）を実行した。サーマルアニーリング後、蛍光性構造体が観察された（図 5 A）
。この結果は、RCS がスペー核酸染色剤（EvaGreen）を添加し、CLSM（confocal laserサ部位として組み込まれることで、図 4 に設計指針を示す

scanning microscopy）を用いて観察を行った。さらに、得ような球状構造を形成するために必要なネットワーク構造られた球状 DNA構造体 1 RCS の還元応答機能の評価を行った。

形成の安定性が低下したためであると考えられる。以降の実験では、球状構造体の形成が確認できた条件において評３．結果と考察
3 . 1. 球状 DNA 構造体 1RCS価を進めた。の構築

RCS観察を行った。その結果得られた画像を図 5 に示す。過3 . 2 . RCS を組み込んだ ODN（s1 ）および球状RCSの還元応答性の評価
DNA 構造体 1

去に報告 5）されている 3 種類のオリゴ DNA（s 1 , s 2 , s 3）のRCS を組み込んだ ODN（s 1 RCS）の還元反応に応答した組み合わせからなる球状 DNA 構造体 1 は、DNA 濃度が切断効率を PAGE 分析によって評価した。図 6 A に示す

2 . 5 µM および 10 µM のいずれの条件においても球状構造ように、水中においてもニトロ基を還元できる還元剤で体が観察された（図 5 B）
。一方で、今回新たに設計した 3ある Na 2 S 2 O 4 を添加すると、低分子量側にシフトしたバ

上記（2 . 3 .）に記載した設計指針と方法に従って CLSM− 18 −

刺激応答性 DNA ナノ構造体の構築

図5図6

球状 DNA 構造体 1 および 1RCS の形成を評価した CLSM 画像

s1RCS および球状 DNA 構造体 1RCS の還元応答性を評価した変性 PAGE 分析の結果ンドが新たに観察された。その移動度は、RCS 部位で切3 . 3 . 球状 DNA 構造体 1 および 1RCSの還元応答性断が進行したと想定される塩基数の ODN（20 nt）と良い一の評価致を示したことから、設計どおり（図 4）に切断反応が進

球状 DNA 構造体 1 および 1 RCS が存在している水溶液行していることが示唆された。また、Na 2 S 2 O 4 の濃度依に、還元剤である Na 2 S 2 O 4 とそのコントロール実験とな存性（図 6 B）から、切断を十分に進行させるためには、終る Na 2 SO 4、DNA 加水分解酵素である DNase I、ニトロ基濃度として約 30 mM の Na 2 S 2 O 4 が必要であることも明らを還元する能力が不十分と考えられるチオール型の還元剤かになった。さらに、上記（3 . 1 .）の実験によって明らかGSH を、それぞれ添加した後に CLSM 観察を行った。図を形成している条件において7 A に示すように、球状 DNA 構造体 1 RCS は、Na 2 S 2 O 4 のも、Na 2 S 2 O 4 の効果（終濃度として 28 mM の Na 2 S 2 O 4 を添加後に消失することが明らかになった。一方で、同濃度にした球状 DNA 構造体 1RCS単独の結果と同様に低分子両の還元力を持たない塩 Na 2 SO 4 や GSH の添加では、球状側に新しいバンドが確認された（図 6 C）
。以下の CLSM 観構造体の消失は確認されなかった。これに対して、球状察の還元応答性の評価においても、28 mM になるようにDNA構造体 1 はNa 2 S 2 O 4 の添加後にも消失しなかった（図Na 2 S 2 O 4 を添加した。

7 B）。また、いずれの球状構造体も DNase I の添加によっ添加）を調べたところ、s 1RCSて消失した。以上の結果は、球状 DNA 構造体 1 RCS が、設− 19 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 31, 2023

図7球状 DNA 構造体 1 および 1RCS の環境応答性を評価した CLSM 画像

計通りに、RCS の還元反応に応答した切断によって崩壊

メトロジー研究財団に心より感謝申し上げます。

したことを強く支持している。

４．総（引用文献）

括1） J. Chen, N. C. Seeman, Synthesis from DNA of amolecule with the connectivity of a cube. Nature, 350,

以上のように、低酸素状態に関連した還元反応によって切断反応が進行する ODN（s 1 RCS）の開発と、そのためのモノマー分子（RCS）を独自に設計・開発した。開発したモノRCS631‒633（1991）．
2） C. Wiraja, Y. Zhu, D. C. S. Lio, D. C. Yeo, M. Xie, W.のFang, Q. Li, M. Zheng, M. V. Steensel, L. Wang, C. Fan,構築が可能であることを実証し、さらに、構築した球状

C. Xu, Framework nucleic acids as programmable

DNA 構造体が還元環境に選択的に応答した崩壊を示すこ

carrier for transdermal drug delivery. Nat. Commun.,とを明らかにした。以上の研究成果は、本研究の分子設計．
10, 1147（2019）

マー分子を組み込んだ ODN から球状 DNA 構造体 1指針の妥当性と高い応用性を支持している。今後、さらな

3） M. Ikeda, M. Kamimura, Y. Hayakawa, A. Shibata,

る研究を進めることで多様な形態とサイズの DNA 構造体

Y. Kitade, Reduction-responsive guanine incorporatedを構築できる可能性がある。今後の研究で構築する新たなinto G-quadruplex-forming DNA. ChemBioChem, 1 7,1304‒1307（2016）．

還元刺激応答性 DNA ナノ構造体の機能を評価し、必要に応じて分子設計（例えば、スペーサの導入や配列の最適化）

4） S. L. Higashi, A. Isogami, J. Takahashi, A. Shibata,にフィードバックすることで各課題を合理的に解決するこK. M. Hirosawa, K. G. N. Suzuki, S. Sawada, S. Tsukiji,とも可能である。そのような研究を通して、還元刺激応答

K. Matsuura, M. Ikeda, Construction of a reduction-性 DNA ナノ構造体の経皮投与でのドラッグデリバリー機

responsive DNA microsphere using a reduction-能を追求できる。今後もそのような研究に力を尽くし、還cleavable spacer based on a nitrobenzene scaffold.

元刺激応答性 DNA ナノ構造体の美容・医療応用を目指し、

Chem. Asian J., 17, e202200142（2022）．

コスメトロジー分野の進歩・発展に寄与したいと考えている。

5） K. Matsuura, K. Masumoto, Y. Igami, T. Fujioka,
N. Kimizuka, In situ observation of spherical dna謝辞assembly in water and the controlled release of bound

本研究にご支援を頂きました公益財団法人コーセーコス− 20 −dyes. Biomacromoleculs, 8, 2726‒2732（2007）．