コラーゲン合成に必須なビタミン C 輸送メカニズムの解明
岡山大学学術研究院医歯薬学域

日浅未来

Collagen is abundant in skin and blood vessel walls and provides mechanical strength and flexibility to tissues andorgans. Collagen is a protein synthesized by mesenchymal cells; it is synthesized intracellularly as procollagen, which issecreted extracellular space and then polymerized. In procollagen biosynthesis, proline is hydroxylated in the endoplasmic
reticulum by proline hydroxylase, an enzyme that requires ascorbic acid, so-called vitamin C, as a coenzyme, to convert itto hydroxyproline. Hydroxyproline contributes to the stability of the triple helix structure, and a deficiency of vitamin C orproline hydroxylase results in immature collagen. Vitamin C is essential for collagen synthesis and maturation, but the mechanism by which vitamin C is transported to the endoplasmic reticulum, the site of proline hydroxylation, is not clear. In thisstudy, we focused on glucose transporters (GLUTs) belonging to the SLC2A family as transporters that accumulate vitamin
C in the endoplasmic reticulum. There are 13 subtypes of GLUTs, which are classified into Classes I-III based on amino acidsequence homology. GLUTs belonging to Class III have not been well studied, but they are intracellular membrane-localized
transporters that recognize DHA, an oxidized form of vitamin C, as a substrate. The aim of this study is to demonstrate that
GLUTs function as vesicular DHA transporters and to elucidate their physiological actions. We investigated GLUTs that are
mainly expressed in collagen-secreting vascular smooth muscle cells and found that GLUT8, 10, and 12 are expressed in
vascular smooth muscle cells (VSMCs). The fact that GLUT10 and 12 are well expressed in the endoplasmic reticulum andthe low expression of GLUT12 suggests that GLUT10 is the GLUT that can function in the ER in VSMCs. To elucidate thephysiological functions of GLUT10 as a vesicular DHA transporter, we plan to examine DHA transport activity and quantification of collagen and hydroxyproline in GLUT10 knockdown cells.

1．緒

C を蓄積するトランスポーター（輸送体）として、SLC 2 A

言ファミリーに属するグルコーストランスポーター（GLUT）

コラーゲンは、皮膚や腱、軟骨、骨、血管壁に多く存在に注目した。

し、組織や器官に機械的な強さや柔軟性を賦与する。コラ

GLUT は細胞膜に局在し、細胞内にグルコースを供給すーゲンは間葉性細胞が合成するタンパク質であり、細胞内ることで生体恒常性の維持に関与している。GLUT にはでプロコラーゲンとして合成され、細胞外に分泌された後13 種のサブタイプが存在し、アミノ酸配列の相同性からに重合化して線維が形成される。細胞内のプロコラーゲン

クラスⅠ〜Ⅲに分けられる 1）。クラスⅠには、GLUT 1 , 2 ,生合成過程において、小胞体でペプチド鎖中の Y 位のプロ

3 , 4 が属している。GLUT 1 をはじめとして、現在最も研リンがプロリンヒドロキシラーゼの作用により水酸化され、究が進んでおり、その生理学的役割も確認されている。

ヒドロキシプロリンへと変換される。この酵素は補酵素とGLUT 1 は脳血液関門のグルコース輸送を担っており、遺してアスコルビン酸、いわゆるビタミン C を必要とする。

伝的欠損によって小児性のてんかんや発達遅延が発症する

このヒドロキシプロリンはコラーゲンを特徴づけるトリプ

ことがわかっている 2）。また、GLUT 2 は SGLT 2 と共役し、

ルへリックス構造の安定性に寄与しており、ビタミン C の不足やプロリンヒドロキシラーゼが欠損するとコラーゲンが成熟できない。実際に個体レベルでビタミン C が不足す
るとコラーゲン形成が障害され、血管壁の損傷や出血を伴う壊血病や骨形成異常を示す。以上のようにコラーゲン合成・成熟にはビタミン C が必須であるが、プロリン水酸化の場である小胞体へとビタミン C を供給するメカニズムは明らかになっていない。本研究では、小胞体内にビタミンTransport mechanism of vitamin C
essential for collagen synthesis
Miki Hiasa
Okayama University, Faculty of Medicine,
Dentistry and Pharmaceutical Sciences− 149 −

図1 小胞体におけるコラーゲン合成とGLUTsコスメトロジー研究報告 Vol. 31, 2023

腎臓の近位尿細管においてグルコースの再吸収に関与して２．方いる。そのため、GLUT 2 の欠損はグリコーゲン貯留や高血糖からなる肝腫大を引き起こすファンコニー・ビッケル法

2. 1. マウス血管平滑筋細胞（VSMC）初代培養

3）症候群を発症することが知られている 。クラスⅡには、安楽死させた C 57 BL/ 6 マウスより大動脈を摘出し、GLUT 5 , 7 , 9 , 11 が属しており、フルクトース輸送能をもPBS で血液を洗浄した。その後、10 % FBS を含む DMEM

つという特徴がある 4）。さらに GLUT 9 は腎臓や肝臓で尿培地中で中膜を採取した。採取した中膜を 1 mm 2 程度に酸を輸送するため、遺伝的欠損によって、腎性低尿酸血症

カットし、コラゲナーゼ溶液（3 . 0 mg/mL コラゲナーゼタの原因になることが報告されている

5 , 6）。一方で、クラス

イプⅡを添加した DMEM 培地）に回収し、37 ℃、5 % CO 2

Ⅲには、GLUT 6 , 8 , 10 , 12 , 13 が属しており、他のクラス存在下で 6 時間保温した。DMEM 培地で洗浄し、1250 rpm、と比較すると研究が進んでいない。また、このクラスは細室温で 5 分間遠心した。得られた沈殿物を DMEM 培地で胞内膜への局在モチーフをもつため、細胞膜上でなく細胞洗浄し、さらに 1250 rpm、室温で 5 分間遠心した。沈殿

内に局在するという特徴をもっている

7 , 8）。クラスⅢに属を DMEM 培地で懸濁し、37 ℃、5 ％ CO 2 存在下で 5 日間培養した。継代し、血管平滑筋細胞を得た。

する GLUT のうち、GLUT 8 は、酸化型ビタミン C である
デヒドロアスコルビン酸（DHA）を輸送することが強く示
唆されている 9）。また遺伝子レベルで精巣、脳、副腎、肝臓、脾臓、肺に発現することが示されている

10）。GLUT 12 は、

2. 2. 免疫組織化学
ポリ -L- リジンでコートしたカバーガラス上で培養した心臓や骨格筋などの組織に発現し、GLUT 4 同様にインス

血管平滑筋細胞を PBS で洗浄し、4 % パラホルムアルデヒ

リン感受性が示唆されている 11）。さらに当研究室での解ドで室温にて 30 分間固定した。PBS で洗浄した後、0 . 2 %12）。

サポニン、2 % ヤギ血清、1 % BSA を含む PBS で室温、15し か し、 組 織 で の 詳 細 な 局 在 や 機 能 は 不 明 で あ る。

分間反応させた。0 . 5 % BSA を含む PBS で希釈した一次

GLUT 10 は、GLUT 8 と同じようにグルコース以外にも抗体を室温で 1 時間反応させ、PBS で洗浄後、0 . 5 % BSA

析により、DHA を基質とすることが示唆されている

13）。さらに、動脈を含む PBS で希釈した二次抗体を室温で 1 時間反応させの蛇行や拡張、狭窄を引き起こす動脈蛇行障害（Arterial

た。切片を封入後、生物用共焦点レーザー走査型顕微鏡

Tortuosity Syndrome, ATS）の原因遺伝子であることが判

FV 1200 -IX 83（OLYMPUS）で観察した。

DHA を輸送することが報告されている8）

明している 。しかし GLUT 10 ミスセンス変異マウスを用いた実験では、動脈系の異常が見られない報告もあり 14 , 15）、

2. 3. ビタミンC処理によるコラーゲン量変化の定量

GLUT 10 欠損によってどのように ATS が引き起こされる

VSMC を、FBS を 含 ま な い 培 地 へ 培 地 交 換 し た。

か不明である。また、GLUT 10 が発現する細胞や細胞内100 µg/mL L- アスコルビン酸 2 - リン酸セスキマグネシの局在についても線維芽細胞や血管平滑筋細胞、小胞体やウムを添加し、5 日間培養した。ピクロシリウスレッド染13, 16）

色液 1 mL に培養上清を 100 µL 添加し、ローテーターで

以上のように、クラスⅢに属する GLUTs については機

30 分間撹拌した。12 , 000 rpm、10 分間遠心後、沈殿物を能や局在がよくわかっていないが、細胞内膜局在型のトラ

0 . 5 M 水酸化ナトリウムにて溶解し、吸光度（540 nm）測

ンスポーターであり、基質として酸化型ビタミン C である

定した。検量線を用いて吸光度からコラーゲンを定量した。

ミトコンドリアなどが報告されており、はっきりしない。

DHA を認識している。クラスⅢに属する GLUTs がコラー

３．結

ゲン産生細胞の小胞体に局在し、DHA を小胞体内へ輸送・

果

研究は GLUTs が小胞型 DHA トランスポーターとして機3. 1. マウス血管平滑筋細胞（ VSMC）の単離とGLUTsの発現能することを証明し、その生理作用を明らかにすることを大動脈の中膜には、血管平滑筋細胞（VSMC）が多く存在

目的としている。クラスⅢ型 GLUTs のうち、GLUT 13している。マウス大動脈の中膜からコラゲナーゼにより（HMIT）は主に脳の神経に発現し、プロトンを駆動力としVSMC を単離した。VSMC のマーカーである抗 α-SMA 抗

蓄積する働きを担っているのではないかと考えられる。本17 , 18）

体を用いた免疫染色により VSMC が単離できたことを確グルコースの輸送には関与していないとされている。加え認した。RT-PCR 法を用いて単離 VSMC における GLUT 8 ,て GLUT 6 はリソソームに存在していることがわかってい10 , 12 の 発 現 を 確 認 し た。GLUT 12 の mRNA 発 現 はてミオイノシトールを輸送することが知られており、

1）

るため 、GLUT 6 , 13 は除外し、残りの GLUT 8 , 10 , 12

GLUT 10 , 12 と比較して少ないことが示唆された。

について検証を行った。コラーゲン産生細胞である、血管
平滑筋細胞（VSMC）
を用いて実験を行った。

− 150 −

コラーゲン合成に必須なビタミンC 輸送メカニズムの解明

3. 2. マウスVSMCオルガネラにおけるGLUTsの局
在数 を 算 出 し た（ 図 3）。 そ の 結 果、GLUT 8 は、PDI、次いで、間接蛍光抗体法を用いて免疫染色を行った。そおらず、ピアソンの相関係数は、COX Ⅳ : 0 . 22、GM 130 :の結果、GLUT 8 , 10 , 12 は VSMC に発現することが示さ

0 . 25、PDI : 0 . 07 で あ っ た。GLUT 10 は、PDI と 多 く 共

れ た が、GLUT 12 の シ グ ナ ル は 弱 か っ た。 ク ラ ス Ⅲ の局在しており、COX Ⅳともわずかに共局在していたがGLUTs について、その局在が細胞種で小胞体、ゴルジ体、GM 130 とはほとんど共局在していなかった。ピアソンのミトコンドリア等異なることが報告されているため、相関係数は、COX Ⅳ : 0 . 29、GM 130 : 0 . 16、PDI : 0 . 56

VSMC での GLUT 8 , 10 , 12 の局在を確認した。GLUT 8 ,であった。GLUT 12 は、PDI と多く共局在していた。Cox

GM 130、COX Ⅳのいずれにおいてもほとんど共局在して10 , 12 特異的抗体と小胞体、ゴルジ体、ミトコンドリア

Ⅳも部分的に共局在が観察されたが、GM 130 とはほとんのマーカーである PDI、GM 130、COX Ⅳを用いて二重染

ど共局在していなかった。ピアソンの相関係数は COX Ⅳ :色を行った（図 2）。得られた画像から、ピアソンの相関係

0 . 42、GM 130 : 0 . 05、PDI : 0 . 61 であった。

図2 VSMCにおけるGLUT 8 , 10 , 12の 発 現と局在。GLUTsの特異的抗体と各種細胞小器官マーカー（COXIV; ミトコンド
リア、GM 130 ; ゴルジ体、PDI; 小胞体）で二重染色した。右上枠内は線で囲んだ部分の拡大図。

− 151 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 31, 2023

図3 VSMCをGLUT 8 , 10 , 12特異的抗体と各種細胞小 器官マーカー（COXIV; ミトコンドリア、GM 130 ; ゴルジ体、PDI; 小胞体）で二重染色した写真から、Image Jを用いてピアソンの相関係数を算出し、グラ
フとして表示した。

3. 3. マウスVSMCのコラーゲン産生能の検討

条件下や加齢条件下ではミトコンドリアに局在する

VSMC におけるコラーゲン産生能の変化について検討

GLUT 10 が増えることが報告されている 20）。このことかした。アスコルビン酸で 5 日間処理した VSMC では、アら、GLUT 10 は DHA をミトコンドリア内に輸送すること

スコルビン酸処理していない細胞に比べて培地中のコラーで、活性酸素に対して抗酸化作用を有するアスコルビン酸

ゲン量が増加していた。細胞内のコラーゲン量についてもの 量 を 増 や す こ と が 示 唆 さ れ て き た。 本 研 究 で は、検討したところ、増加を確認した。ヒドロキシプロリン量

GLUT 10 はミトコンドリアにわずかに局在していたが、やエラスチン量についても検討中である。

本来は小胞体に局在するものと考えられる。

４．考GLUT 10 , 12 が 小 胞 体 に よ く 発 現 す る こ と、 ま た察

GLUT 12 の発現が少ないことから、VSMC において小胞本研究より、コラーゲン産生細胞である VSMC におい

体で機能する GLUT は GLUT 10 であることが示唆された。

て GLUT 8 , 10 , 12 が 発 現 し て い る こ と が 示 さ れ た。

GLUT 10 は VSMC 以外にも、ヒト線維芽細胞において小GLUT 8 は VSMC において、ゴルジ体、粗面小胞体、ミト

胞体に局在することが報告されている 21）。ATS では、血コンドリアのいずれにおいてもほとんど局在していなかっ管系の症状以外にも皮膚や結合組織の弛緩が確認されていた。GLUT 8 は後期エンドソーム／リソソーム局在化モチる 8）。以上のことから、GLUT 10 が普遍的に、VSMC やーフを持ち、精巣の精母細胞、精子細胞においてリソソー

線維芽細胞の小胞体においてコラーゲン合成に関連してい。VSMC においてることが示唆される。しかし、実際に GLUT 10 の DHA 輸

もリソソームに局在する可能性が考えられる。GLUT 12

送とヒドロキシプロリン量及びコラーゲン量について直接についても、VSMC では RT-PCR 法、間接蛍光抗体法と的に示したものはない。現在、GLUT 10 をノックダウン

もにシグナルは弱く発現量は少ないと考えられる。VSMCした細胞株において DHA 輸送能、コラーゲン及びヒドロ

は動脈の中膜にて弾性線維の間に層状に存在し、血管の収キシプロリンの定量を検討している。

ムに局在することが報告されている

19）

縮・弛緩を担う細胞である。また、α-アクチンを発現し５．総ており血管収縮としての機能をもつ収縮型
（分化型）
と、動

括

脈硬化発症の引き金となる内膜肥厚を形成する合成型（増線維芽細胞や血管平滑筋細胞が合成するコラーゲンは、殖型）の 2 つの表現型をもつという特徴がある。GLUT 12

皮膚や結合組織の弾性を保ち、人々の健康に寄与する重要は合成型 VSMC では収縮型 VSMC と比較して 3 倍近く発なタンパク質である。コラーゲンやビタミン C が健康に重現量が多いことが報告されている 20）。病態や血管壁の状要な役割をもつということは周知の事実であり、ビタミン態によっては GLUT 12 が機能することが示唆される。

C がコラーゲン合成に寄与するメカニズムについても広くGLUT 10 は VSMC において発現し、小胞体とわずかにミ知られている。しかし一方で、摂取したビタミン C がコラ

トコンドリアに局在するが、ゴルジ体ではほとんど局在しーゲン合成の場へどのように運ばれるか、についてはまだていなかった。一方で、VSMC において GLUT 10 はミト

不明な点が多い。本研究は、コラーゲン合成に必須である

コンドリアに局在し、過酸化水素処理による酸化ストレス

ビタミン C を産生細胞の小胞体という、まさに合成の場へ− 152 −

コラーゲン合成に必須なビタミンC 輸送メカニズムの解明

どのように輸送しているか、トランスポーターの観点から

10）Ibberson, M., Uldry, M., & Thorens, B. GLUTX1, a

解明を目指すものである。本研究より、GLUT 10 が VSMC

novel mammalian glucose transporter expressed in theや線維芽細胞の小胞体においてコラーゲン合成に関連してcentral nervous system and insulin–sensitive tissues. J

いるのではないかと示唆された。血管壁だけでなく、皮膚biol Chem. 275（7）4607-4612（2000）．

やその他結合組織でも同様に GLUT 10 がコラーゲン合成11）Stuart, C. A., Howell, M. E., Zhang, Y., & Yin, D.

に関与すると考えられる。本研究がコスメトロジー分野に

Insulin-stimulated translocation of glucose transporter

おいて貢献できる可能性は極めて高いと考えられる。

（GLUT）12 parallels that of GLUT4 in normal muscle.
J Clin Endocrinol Metab. 94（9）3535-3542（2009）．

謝辞12）Matsuo, S., Hiasa, M., & Omote, H. Functional

本研究の遂行にあたり、ご支援をいただきました公益財characterization and tissue localization of the

団法人コーセーコスメトロジー研究財団に心より感謝申し

facilitative glucose transporter GLUT1 2. J Biochem.
．
168（6）611-620（2020）

上げます。

13）Lee, Y. C., Huang, H. Y., Chang, C. J., Cheng, C. H., &（引用文献）

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