Immune Condition in the Cases of Dairy Cows with Abomasum Displacement

原著論文

乳牛の第四胃変位に罹患した症例における免疫状態
武井絵美 1 ） 武田絢子 1 ） 小 井 田 歩 2 ） 大 塚 浩 通 1 ） ★ 安 藤 貴 朗 3 ）小 比 類 巻 正 幸 4） 佐 藤 光 5） 加 藤 敏 英 5）1) 北里大学獣医学部（034 － 8628 青森県十和田市東二十三番町 35-1）
2）関口動物病院奥中山家畜診療所（028 － 5133 岩手県二戸群一戸町中山字大塚 82-2）
3）酪農学園大学（069-8501 北海道江別市文京台緑町 582 番地）
4）小比類巻家畜診療サービス（039-2683 青森県東北町大平 63-3）
5)NOSAI 山形（995-0201 村山市大字長善寺仲田 266-2）★連絡責任者：大塚浩通
TEL：0176-23-4371
FAX：0176-23-8703
E-mail otsuka@vmas.kitasato-u.ac.jp［要約］
DA 罹患牛の免疫状態を明らかにするため、末梢白血球ポピュレーションとサイトカイン mRNA 発
現量を解析した。供試牛は DA に罹患したホルスタイン種搾乳牛 26 頭で、第四胃左方変位（LDA 群、
N=18）と第四胃右方変位（RDA 群、N=8）とに分類し、対照群として DA の発生がみられた牧場の健康なホルスタイン搾乳牛（対照群、N ＝ 15）を用いた。採血し、WBC、ケトン体、第四胃変位、コルチゾール、末梢白血球ポピュレーションならびにサイトカイン mRNA 発現量を解析した。RDA
群のコルチゾール濃度は LDA 群に比べて高値の傾向にあった。RDA 群の末梢血中 CD3 ＋、CD4+、
CD8+T 細胞数と MHC class Ⅱ +CD14 － B 細胞は LDA 群に比べて低値の傾向にあり、DA 罹患牛では対照群に比べて有意な差を認めた。また DA の 2 群の IFN- γおよび IL-4 遺伝子発現量は対照群に比べ高い傾向にあった。DA 罹患牛では末梢 T 細胞ならびに B 細胞数が減少し、サイトカイン遺伝子
発現量が高まることが示唆された。
【キーワード：乳牛、免疫機能、周産期】

DA では第四胃を中心とした血液循環の低[ はじめに ]乳牛の（DA）は周産期に発生しやすい消下、重篤になると酸素不足による第四胃組織の化障害あるいは閉塞の症状を示す疾患であり、変性・壊死なども惹起され、炎症反応を誘発

様々な要因が複雑に関連して発症する。本症はすることもある [9]。人の急性虫垂炎では IL-8

乳房炎や子宮内膜炎など感染症の発生との関連

や IL-10 などのサイトカインの血中濃度が上も示唆されており [4]、DA にともなう免疫機

昇することが知られている [3]。さらに比較的能の低下が感染症の発症に関与する可能性があ

軽症の症例に比べ虫垂の壊疽をともなう症例でる。

Th1 応答が強く現れることも指摘されており－ 19 －

Journal of Japanese Society for Clinical Infectious Disease
in Farm Animals Vol.6 No.1 2011

第四胃変位の乳牛における免疫状態[20]、このような消化器疾患の病状と免疫応

ト メ ー タ ー（FACScan、Becton Dickinson

答とに関連のあることが示唆されている。しか社、USA）で測定した。その概要は次の通り

し牛の DA における免疫状態に関してはこれまであった。EDTA-2K 添加血液 2 ml をスピッで全く報告がない。本研究では DA 罹患牛におツ管に移し、0.83% 塩化アンモニウム溶液をける、初診時の免疫状態を明らかにするため、血液の 2 倍量加え赤血球を溶血させた。さら末梢白血球ポピュレーションとサイトカイン遺に、1,500rpm で 3 分間遠心し、沈査に PBS

伝子の解析を行った。

（0.8%NaCl、0.02 % 塩化カリウム、0.02% リ
ン酸水素二カリウム加 8mM リン酸水素二ナト[ 材料ならびに方法 ]リウム・十二水和物溶液）（pH7.32）を加え

供試牛：供試牛は青森県内と山形県内で飼育さて数回洗浄した後、PBS で適宜希釈して白血れていた、第四胃変位（DA）に罹患したため

球浮遊液を作製した。1 × 102 倍の一次抗体

整復手術を必要とした分娩 1 ヶ月以内のホルをマイクロチューブに加え、希釈白血球浮遊液

スタイン種乳牛 26 頭で、それらのうち第四胃を分注し、4℃で 1 時間反応させた。使用した

右方変位（RDA）を発症した牛群を RDA 群

一次抗体は VMRD（Pullman,USA）の抗ウシ（N=8）、第四胃左方変位（LDA）を発症した

CD3（MMIA）、CD4（CACT183B）、CD8

牛群を LDA 群（N=18）と分類した。採血は（9ACT80C）、CD21（GB25A）、TcR1-N12

DA 整復手術直前に行った。さらに、DA 罹患（CACT61A）、MHC class Ⅱ（TH14B） お牛と同牧場の分娩後 1 ヶ月以内の健康なホルよび抗ヒト CD14（MY-4; ベックマン コール

スタイン搾乳牛（N=15）を対照群として用い

ター、東京）である。反応後、PBS で洗浄し、た。

2 × 103 倍（FITC 標識抗マウス IgM 抗体）お検査項目：血液一般検査、血液性化学検査、末よび 4 × 103 倍（PE 標識抗マウス IgG １抗体）

梢血白血球のフローサイトメトリー法による白の二次抗体を加え、4℃で 30 分間反応させた。

血球表面抗原の解析を行った。血液一般検査、反応後 PBS で洗浄し、PBS で適宜希釈して測

血液性化学検査、末梢血白血球のフローサイト

定した。測定データは Cell Quest を用いて解メトリー法による白血球表面抗原の解析、血中析を行った。
サイトグラムの結果から、側方散乱光が低い

コルチゾール濃度の測定を行った。
血液の採材と処理法：供試牛から採取した血液

単球・リンパ球とそれ以外の白血球に分類し、は、プレーン、EDTA-2K およびヘパリン添加

単球とリンパ球は単核球とした。各表面抗原陽入り採血管に分注した。なお、プレーン血液は性細胞は各表面抗原の陽性率と白血球の実数

ホルモン濃度の測定に、EDTA-2K 添加血液は（× 102/ μl）で、また単核球数はサイトグラ

血液一般検査ならびに白血球表面抗原解析に、ムから得られた陽性率と白血球の実数値を用い

ヘパリン添加血液はサイトカイン遺伝子の解析

算出した。

に用いた。

real-time PCR：ヘパリン添加血液から比重

血液生化学検査：血清中の血清ケトン体は酵素

遠心法で単核球を分離し、mRNA を抽出した。

法、コルチゾールの測定はマイクロプレートを

これまでの報告 [18、19] を参考に、抽出した使用した酵素免疫測定法により実施した [1]。

mRNA を 用 い て cDNA を 合 成 し、real-time

末梢血白血球表面抗原の解析：白血球表面抗原

PCR に供した。PCR においては、ウシ内部の解析は間接蛍光抗体法で染色し、フローサイ

標 準 遺 伝 子 と し て β -actin を 用 い、IFN- γ

日本家畜臨床感染症研究会誌
６巻１号 2011－ 20 －

Immune Condition in the Cases of Dairy Cows with Abomasum Displacement

および IL-4 を解析した。SYBR Green PCRに比べ有意な低値を示したが、RDA 群と LDA

Master Mix（Applied Biosystems, CA,

群の間には有意な差は認められなかった。白血USA） を 利 用 し、7700 Sequence Detector

球数ならびに顆粒球数では、有意な差はなかっを用いて real-time PCR を実施した。またサた。RDA 群 お よ び LDA 群 の CD3+、CD4+、

イトカイン遺伝子発現量は増幅した各遺伝子のCD8+ ならびに TcR1-N12+T 細胞数は、対照

Threshold Cycle（Ct 値）を用いて、群に比べて有意な低値を示した。RDA 群のこ

サイトカイン遺伝子発現量 =2( ‐ ( サイトカインの Ct 値

れらの T 細胞数は、LDA 群に比べ低値の傾向- β -actin の Ct 値 ))にあったが 2 群間に有意な差は認められなかの計算式にて求めた。

った。3 群間において、CD21+B 細胞、MHC

2 群間の比較は Mann-Whitney の U 検定
により解析した。また、2 系列間の相関性はclass Ⅱ ＋ B 細胞数ならびに CD14+ 単球数には有意な差を認めなかった。
DA 罹患牛群における IFN- γならびに IL-4

Spearman の順位相関係数を求め、いずれも遺伝子発現量は対照群に比べ高い傾向にあっ

5％以下の危険率で有意な差とした。

た。RDA 群の IFN- γ /IL-4 比は LDA 群ならびに対照群に比べ低い傾向にあったが有意な[ 成績 ]RDA 群および LDA 群の総ケトン体値は対照群に比べて高値を示す傾向にあった。RDA

差は認められなかった（表 1）。表１について、それぞれの N 数が記載されていません。

群および LDA 群の血中コルチゾール濃度は対DA 罹患牛における血中コルチゾール濃度と照群に比べ高い傾向にあり、RDA 群と対照群

単 核 球 数（R=-0.54）、 末 梢 CD21+B 細 胞 数との間には有意な差を認めた。

（R=-0.60）ならびに CD14+ 単球数（R=-0.71）

RDA 群および LDA 群の単核球数は対照群には有意な負の相関性が認められた ( 図 1)。

Table 1 Serum ketone body, cortisol, peripheral leukocyte population and cytokines mRNA
expression－ 21 －

Journal of Japanese Society for Clinical Infectious Disease
in Farm Animals Vol.6 No.1 2011

0
0

20

30

Cortisol conc.（ng/mL）g

第四胃変位の乳牛における免疫状態

25

20CD14+monocyte（×102/L）

CD21
1+Bcell（×102/L）

10

20
15
10
5
0

15
10
5
0

0

10

20

30

0

Cortisol conc.（ng/mL）
g

10

20

30

Cortisol conc.（ng/mL）

CD14+monocyte（×102/L）

Figure 1 Relationship between serum Figure
cortisolconcentration
andnumber inconcentrationg
1 Relationshipp peripheral
betweenleukocyte
serum cortisol20
the cows with DA.
and peripheral leukocyte number in the cows with DA.

その他の項目において有意性のある相関は認め
15
られなかった。

ス下にあったものと考えられた。実験的なデキ
サメタゾンの投与による末梢リンパ球の減少が10

報告されていることから [14]、DA 群におけ[ 考察 ]る CD21+B 細胞の減少の要因としてコルチゾ

5
本研究では、DAに罹患した乳牛における免ールの高値が影響していることが示唆される。

疫状態の解明の一環として、発症牛の末梢白血

一方、ケトン体は免疫細胞対して直接的な機

球ポピュレーションならびにサイトカイン遺伝能抑制効果のあることが知られているが [22]、子発現量を解析し血液性状と比較した。その結本研究ではケトン体濃度と免疫細胞やサイトカ

Cortisol conc.（ng/mL）果、DA 牛では血中コルチゾール濃度の上昇、イン遺伝子発現量との間には有意な相関性は認末梢 T 細胞数の低下および単核球のサイトカ

められなかった。以上の結果より、DA 罹患牛に血中コルチゾール濃度と B 細胞または単球

方が免疫機能に影響する可能性があった。

0

0

10

20

30

Figureg
1 Relationshipp between serum cortisol concentration
イン遺伝子発現量の上昇が明瞭であった。さらand peripheralleukocyte number in the cows with DA. においてはケトン体よりむしろコルチゾールの数とに負の相関性が認められたことから、DA

RDA または LDA 罹患牛では発症時に急性牛においてストレスが強い症例ほど末梢免疫細総蛋白である血清アミロイド A やハプトグロ

胞数が減少すると示唆された。

ビンの上昇が報告されている [9]。これらの物

周産期における乳牛では末梢 T 細胞や B 細質の血中濃度は肺炎や乳房炎などの感染症に胞の減少やサイトカイン産生能の低下が認めら

お い て 上 昇 す る こ と か ら [8、17]、DA の 牛れるが [10、18]、DA の 2 群では健康な対照では炎症反応が誘導されるものと示唆される。

牛に比べても明らかな T 細胞の減少が観察さ

DA では第四胃の虚血性障害が発生することもれたにもかかわらず、サイトカイン遺伝子発現あるため [6]、これにともなった炎症刺激は急

量は高値の傾向にあった。DA は第四胃機能障性総蛋白の産生を促進する一因と考えられる。

害に起因した消化管疾患であり、DA 牛ではス

虫垂炎の患者の中で、壊死をともなった症例でトレスホルモンであるコルチゾールが上昇する

は軽症例に比べて、単核球の IFN- γ産生能や[16]。本研究においても DA の 2 群では血清

好中球ならびに単核球の IL-8 蛋白の発現量がコルチゾール濃度が高値を示しており、ストレ

高く、重篤な症例ほど Th1 サイトカインが優日本家畜臨床感染症研究会誌
６巻１号 2011－ 22 －

Immune Condition in the Cases of Dairy Cows with Abomasum Displacement

位になりやすい [3、20]。細胞の浸潤を調整すていることが示唆される [7]。しかし DA においる炎症反応では、組織での炎症性サイトカインては、負のエネルギーバランスに伴った代謝異常

産生が誘導される [13、15]。組織で産生されや第四胃障害の重症度も免疫機能に影響する可るサイトカインは、感染に対する好中球から T能性があるため、これらの要因を十分に加味して細胞や B 細胞への速やかな免疫反応を誘導す

DA と免疫防御性との関係について検証するべき

る必須の因子である。IFN- γは感染症だけでである。

なく組織障害でも産生され、免疫応答を介してさらなる組織障害を誘導することが報告され[ 引用文献 ]ている [2、21]。組織障害などの炎症刺激は白1. Ando, T., Annaka, A., Ohtsuka,

血球の粘着レセプターの発現を促進し、血流

H., Kohiruimaki, M., Hayashi, T.,

中の白血球数が血管に粘着しやすくなるため

Hasegawa, Y. and Watanabe, D. 2008.

[12]、末梢血の白血球数は低下する。また手Effect of hoof trimming before the dry++

術にともなって末梢血 CD4 や CD8 T 細胞がperiod on productive performance in

減少することも報告されている [23]。本研究

perinatal dairy cows. J. Vet. Med. Sci.

の DA の症例では IFN- γ遺伝子発現量の上昇

70: 95-98.

傾向と末梢血 T 細胞の低下が観察されたこと

2. Day, Y.J., Huang, L., Ye, H., Li, L.,から、感染によらない免疫反応が誘導されていLinden, J. and Okusa, M.D. 2006.

る可能性がある。

Renal ischemia-reperfusion injury

本研究において RDA 群では LDA 群に比べ高and adenosine 2A receptor-mediatedコルチゾールならびに低 T 細胞の傾向にあった

tissue protection: the role of CD4+ Tが、各検査項目において両群間に明らかな差を

cells and IFN-gamma. J. Immunol. 176:

認めなかった。一般に LDA に比べ RDA では捻

3108-3114.

転などを伴い重篤化することもあるとされるが3. Dalal, I., Somekh, E., Bilker-Reich,[5]、本研究では RDA 群と LDA 群の免疫機能のA., Boaz, M., Gorenstein, A. and

解析項目に明らかな差と認めなかったことから、

Serour, F. 2005. Serum and peritoneal

第四胃の変位の方向ではなくストレスや炎症反inflammatory mediators in children

応がより全身の免疫状態に影響を及ぼしているwith suspected acute appendicitis.

かもしれない。また、壊死性虫垂炎の患者では末Arch. Surg. 140:169-173.

梢血リンパ球数が減少するが [11]、本研究にお4. Doll, K., Sickinger, M. and Seeger,

ける DA 罹患牛の末梢リンパ球数の減少はこれに

T. 2009. New aspects in the

類似した現象であると示唆され、サイトカイン遺pathogenesis of abomasal

伝子が高値であったことから、少なくても乳牛のdisplacement. Vet. J. 181: 90-96.

DA の罹患時における免疫状態は機能低下という

5. Geishauser, T. 1995. Abomasal

よりむしろ第四胃変位にともなった組織での炎

displacement in the bovine-a review on

症刺激に反応している可能性があった。

character, occurrence, aetiology andDA など乳牛の代謝性疾患は分娩後 2 週間に発

pathogenesis. Zentralbl. Veterinarmed.

生率が高く、その発症によって感染症の発症リスクが高まるが、これには免疫機能の低下が関与し

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Journal of Japanese Society for Clinical Infectious Disease
in Farm Animals Vol.6 No.1 2011

第四胃変位の乳牛における免疫状態

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Journal of Japanese Society for Clinical Infectious Disease
in Farm Animals Vol.6 No.1 2011

第四胃変位の乳牛における免疫状態

Immune Condition in the Cases of Dairy Cows with Abomasum Displacement
Emi Takei, Ayako Takeda, Koida Ayumu, Hiromichi Ohtsuka, Takaaki Ando,
Masayuki Kohiruimaki, Hikaru Sato and Toshihide Kato
School of Veterinary Medicine, Kitasato University, Towada, Aomori 034-8628.
［ABSTRACT］
To clarify the immune condition in the dairy cows with abomasum displacement (DA),
we analyzed peripheral leukocyte population and cytokines mRNA expression. Twenty-six
dairy cows with DA were used in this study, and these cows were divided two groups; rightside DA (RDA group, N=8) and left side DA (LDA group, N=18), and healthy dairy cows
bred in same herd of DA cows (Control group, N=15). Blood samples were collected, andWBC, total ketone body, cortisol, leukocyte population and cytokines mRNA were analyzed.
Serum cortisol concentration in RDA group tented to high compared to that in LDA group.
Lower numbers of CD3+, CD4+, CD8+ T cells and MHC class Ⅱ +CD14 － B cell in RDA wereobserved and there were significant low these cells in two DA groups compared to Control
group. The levels of IFN- γ and IL-4 mRNA in two DA groups tend to higher compared tocontrol group. The results were suggested that peripheral T cells and B cells were decreased
and cytokines mRNA expression enhanced in the cows with DA.
【Key Word: abomasums displacement, cortisol, dairy cow, immune condition】

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６巻１号 2011－ 26 －