The Journal of Farm Animal in Infectious Disease
Vol.4 No.3 2015

TREHALOSE EFFECTS ON IL-6 GENE IN BMEC

原著論文

ウシ乳腺上皮細胞における炎症性サイトカイン遺伝子発現に及ぼすトレハロース添加の影響
芳賀

聡 1）*

中野美和 1） 小林洋介 2） 石崎

1）国立研究開発法人

農業・食品産業技術総合研究機構

畜産草地研究所那須研究拠点〒 329-2793

宏 1）

草地管理研究領域

栃木県那須塩原市千本松 768

2）国立研究開発法人

農業・食品産業技術総合研究機構

畜産草地研究所

家畜生理栄養研究領域〒 305-0901

茨城県つくば市池の台 2

連絡担当者： 芳賀聡
国立研究開発法人
畜産草地研究所

農業・食品産業技術総合研究機構
草地管理研究領域

Tel：0287-37-7239

Fax：0286-37-7239

E-mail：hagatiku@affrc.go.jp［要約］

大腸菌性乳房炎の対策として、エンドトキシン（ET）誘導による炎症性サイトカイン産生亢進を防ぐことが重要である。トレハロース（TRE）には抗炎症作用があるが、ウシ細胞に対する影響は不明である。本研究では、大腸菌の乳房内感染時、最前線で炎症を起こすウシ乳腺上皮細胞（BMEC）に着目し、リポ多糖（LPS）刺激実験により、炎症性サイトカイン発現亢進に対する TRE の抑制作用および機序について解析を試みた。その結果、LPS 刺激により誘導される IL-1β および TNFα mRNA の発
現亢進に対する TRE の抑制作用は認められなかったが、TRE 100 mM 添加において IL-6 mRNA 発現
亢進が有意に抑制された（p<0.05）。LPS 無刺激下においても TRE 100 mM 添加により IL-6 mRNA の基礎発現レベルが有意に低下した（p<0.05）。一方、TRE 100 mM 添加は受容体群 TLR4 および MD-2
mRNA 発現を有意に増加（p<0.05）させたが、シグナル伝達経路分子 NF-κB および MAPK ERK1/2の活性化に影響はなかった。また、ウシ乳腺組織および BMEC における TRE 受容体（T1R3）mRNA発現が確認された。以上より、BMEC において TRE の IL-6 発現抑制作用が新規に見出され、その機序は NF-κB および MAPK ERK1/2 を介した LPS-TLR4 シグナル伝達経路以外にあり、T1R3 を介する可能性が示唆された。
キーワード：ウシ乳腺上皮、エンドトキシン、抗炎症、大腸菌性乳房炎、トレハロース

受付：2015 年 2 月 9 日
受理：2015 年 6 月 3 日－ 87 －

家畜感染症学会誌４巻 3 号 2015

ウシ乳腺上皮細胞のサイトカイン発現に対するトレハロース作用

コース二分子が結合した単純二糖類であるが、［緒論］

高い抗酸化性や保水性を有し、また安価なため乳房炎による酪農経営の損失は甚大である。

主に食品加工分野で、澱粉硬化抑制、冷凍変性

大腸菌性乳房炎はへい死や廃用を招く重篤な甚抑制および油変敗臭抑制などの食品品質保持を急性乳房炎を引き起こしやすい。大腸菌性乳房

目的として添加物利用されている機能性糖質で炎の臨床症状は、菌自体ではなく、菌体由来のある。TRE 自体は経口摂取後、消化管内でト

エンドトキシン（endotoxin; ET）刺激を受けレハラーゼにより分解され、体内移行はしな

た免疫担当細胞等から過剰産生される炎症性サい。しかし、Aoki ら［1, 2］は乳牛へ飼料添加

イトカインに起因する。炎症性サイトカイン産することでルーメン内環境に作用し、採食促進

生が亢進することで、全身に至る過剰な炎症や乳量増加、血中および乳中の抗酸化能向上に（ET ショック）が誘導される［18］。大腸菌性

間接的に寄与すると報告しており、今後の畜産

乳房炎治療法に関しては、菌や ET の排出を促現場における応用も期待される。一方で、外科

す頻回搾乳や乳房内洗浄よりも抗生剤投与（全手術時において、組織への TRE 液噴霧が組織

身および乳房局所）が全国的に主流となってい癒着防止効果を示す［11］など、TRE の生体る［16］。しかし、セファム系をはじめとする組織への直接的な有効性に関する研究が近年進

抗生剤は大腸菌に対し強力な殺菌作用を有す

められており、その中で、TRE には炎症性サ

る一方、殺菌の副作用として ET が放出される

イトカイン産生抑制作用があることが以下のよ［15, 17］。萩原ら［7］は、北海道内の診療所調

うに報告されている。Minutoli ら［13, 14］は、査により、フルオロキノロン系抗生物質の全身

LPS 投与ラットにおいて、TRE 腹腔内投与が投与やセファゾリン乳房注入剤の使用量が多い炎 症 性 サ イ ト カ イ ン で あ る Tumor Necrosis

ほど、大腸菌性乳房炎の治癒割合が低下するこ

Factor alpha（TNFα）、Interleukin（IL）-1 おとを報告しており、抗生剤誘導性 ET ショック

よび IL-6 の産生亢進を抑制することを明らかが起こっている可能性が指摘されている。つまにしている。また Taya ら［20］も TRE がマり、大腸菌の感染排除を目的として行われる抗ウス由来マクロファージ（macrophage; MΦ）

生剤治療だけでなく、ET 排出を促進する頻回に お け る LPS 刺 激 誘 導 に よ る TNFα お よ び

搾乳などを活用しつつ、ウシ細胞側の ET 誘導

IL-1β の産生を抑制することを報告している。

性炎症性サイトカイン過剰産生を抑制すること

さらに TRE 特異的な味覚受容体である Taste

が、大腸菌性乳房炎の対策として重要である。

receptor type 1 member 3（T1R3）の遺伝子

乳房局所では、外界と境する乳腺上皮が細菌感発現を MΦ に見出しており、T1R3 を介して炎染の最前線として機能する。ウシ乳腺上皮細胞

症性サイトカインの産生を抑制した可能性を示（Bovine Mammary Epithelial Cells; BMEC）

唆している。以上、TRE の炎症性サイトカイには菌体成分認識受容体である Toll 様受容体

ン産生抑制作用を有効に応用できれば、TRE（Toll-like receptors; TLRs）が発現しており、が安全かつ安価な新しい乳房炎用の抗炎症剤のET 成 分 で あ る リ ポ 多 糖（lipopolysaccharide;

基材となり得ると期待される。しかし、ウシ細LPS）刺激により、BMEC における感染シグ胞に対する TRE の炎症性サイトカイン産生抑ナル伝達経路が活性化し、炎症性サイトカイ

制作用を検討した研究報告はこれまでにない。

ンの発現が亢進することが確認されている［9,そこで本研究は、新たな抗炎症剤開発に向けた21］。このことは大腸菌感染時および抗生剤乳基礎的検討として、機能性糖質 TRE が、大腸房注入治療時に遊離した ET が、感染最前線に菌の乳房内感染の最前線である BMEC に対し存在する BMEC に受容、認識され、炎症性サて、炎症性サイトカイン産生亢進の抑制作用をイトカイン産生亢進が誘導されて ET ショック

発揮するかどうかを明らかにすることを目的とのトリガーの一つになり得ることを示唆しておして実施した。

り、BMEC が抗炎症の重要なターゲットの一つであると推察される。
ト レ ハ ロ ー ス（trehalose; TRE） は、 グ ル－ 88 －

The Journal of Farm Animal in Infectious Disease
Vol.4 No.3 2015

TREHALOSE EFFECTS ON IL-6 GENE IN BMEC

レプトマイシンおよび 2％ FBS）に置換し、6［材料と方法］

時間の前培養を行った。さらに TRE（終濃度

本研究は、国立研究開発法人農業・食品産業

0, 1, 10 および 100mM）を培地に添加し、3 時

技術総合研究機構畜産草地研究所（畜草研）動間反応させた。その後、LPS（終濃度 5μg/ml）

物実験委員会の承認を得て「畜草研動物実験等

刺激を 10 分間（タンパク発現解析用）または実施要領」に従って実施された。

6 時間（mRNA 発現解析用）行い、それぞれ細胞を回収した。各処理は n = 3 で行い、独立

1．細胞培養した実験を 2 回（タンパク発現解析用）またはトリプシン -EDTA、ダルベッコ変法イーグ

3 回（mRNA 発現解析用）繰り返して実施した。

ル培地（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium;
2．RNA 抽出および定量 RT-PCR

DMEM）、HEPES、 ペ ニ シ リ ン - ス ト レ プ ト
マイシンおよび LPS（E. Coli O111：B4 由来）

BMEC から AGPC 法（TRIzol Reagent, Life

は SIGMA-ALDRICH（St. Louis, MO, USA）製

Technologies, Carlsbad, CA, USA）により、全を用いた。ウシ胎子血清（fetal bovine serum;

RNA を抽出し、RNA 純度および濃度を分光光

FBS）はHyClone Laboratories（Logan, UT, USA）

度計（Nano Drop ND-1000, Life Technologies）

製を使用した。TRE（ET free）は林原（岡山）に よ り 確 認 し た。 逆 転 写 酵 素 お よ び DNase

より研究用譲渡を受けて用いた。

（PrimeScript RT reagent Kit with gDNA

泌乳前期のホルスタイン乳牛の乳腺組織実質

Eraser, タカラバイオ , 滋賀）を用いて、定法より細胞を単離し、限界希釈法によりクローニ

に従いゲノム DNA を除去し、全 RNA 500 ng

ングした BMEC（継代数 14-15）を用いた。本を逆転写して cDNA を得た。続いて、PCR 酵細胞について、催乳性ホルモン（デキサメタゾ

素（THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix,

ン、インスリンおよびプロラクチン：DIP）を

洋 紡 , 大 阪 ） お よ び StepOnePlus Real Time

用いた分化刺激により、乳腺分化マーカーであPCR System（Life Technologies）を用いて定る kappa-casein mRNA を強く発現する性質を量 RT-PCR を行った。PCR 反応条件は、95℃有することを確認した（Fig.1）。BMEC を培養

1 分間の熱処理後、95℃ 15 秒・60℃ 1 分間のプレートに 1 × 104 細胞 /cm2 で播き、増殖用

変性・伸長・検出サイクルを 50 サイクル行っ

DMEM 培地（以下添加：20mM HEPES、100た。増幅産物が単一であることを融解曲線解析

U/ml ペニシリン、100μg/ml ストレプトマイ

により、増幅産物の目的長をアガロースゲル電シンおよび 10％ FBS）で、37℃、5％ CO2 条

気泳動により、それぞれ確認した。各遺伝子の件下でコンフルエントまで培養し、各実験に発現定量は PCR 効率の妥当性（85-110％以内）

用いた。LPS および TRE 添加実験において、を確認した上で、beta-actin（ACTB）を内部

FBS 成分の影響を最小限にするため、FBS 低標準として⊿⊿ Ct 法を用いて解析した。なお、含有の刺激用 DMEM 培地（以下添加：20mM

各遺伝子のプライマー配列、PCR 産物目的長

HEPES、100U/ml ペニシリン、100μg/ml スト

および Accession No. は Table 1 に示した。

KCSN
ACTB

1.4

*
IL-1β / ACTB mRNA

1.2
1

DIP

0.8
0.6

東

--- +++

Fig. 1F

0.4 Messenger RNA expression of kappa-casein (KCSN) in bovine mammary epithelial cells (BMEC). Expressionof KCSN mRNA in BMEC upregulated by differential stimulus (dexamethasone, insulin and prolactin mixture:

0.2 DIP, each 10 μg/ml) for three days (n = 3, RT-PCR). Beta-actin (ACTB) mRNA expressions are shown as aninternal control.

0＋
TRE(mM)
1.6

A

1.4

0

LPS (＋)
1
10100－ 89 －

家畜感染症学会誌４巻 3 号 2015

ウシ乳腺上皮細胞のサイトカイン発現に対するトレハロース作用

3．タンパク抽出、SDS-PAGE

騰した熱水中で SDS 化した。サンプルは加熱および Western blotting

後速やかに氷上で冷却し、分析に使用するまで

LPS 刺激を 10 分間行った後、直ちに BMEC

1
2

-80℃で保管した。

を洗浄し、タンパク分解およびリン酸化インヒビ

10％アクリルアミドゲルを用い、タンパク

ター（Thermo Halt Protease and Phosphatase

10μg 当量のサンプルを SDS-PAGE した。SDS-

Inhibitor, Life Technologies）を添加し、氷上でPAGE 後、 タ ン パ ク を PVDF 膜（Hybond-P,

細胞を回収した。抽出試薬（NE-PER Nuclear

GE ヘルスケアジャパン , 東京）に転写した。

and Cytoplasmic Extraction Reagents, Life

転写後、ブロッキングを行い（ブロックエース ,Technologies）を用いて、定法に従い細胞質タ

DS ファーマバイオメディカル , 大阪）、免疫反

ンパク画分と核タンパク画分を分離抽出した。

応促進剤（Can Get Signal, 東洋紡）で希釈しタンパク濃度はウシ血清アルブミンを標準物質

た 1 次抗体液により、4℃で一晩反応させた。

として測定した（プロテインアッセイ CBB 液 ,用 い た 1 次 抗 体 お よ び 希 釈 率 は、 抗 nuclear

ナカライテスク , 京都）。サンプルは SDS サン

factor κB（NF-κB）p65（1：2000） お よ び

プルバッファー（和光純薬 , 大阪）を加え、沸抗 p44/42 Mitogen-activated Protein Kinese

Table 1

Primers and product sizes used for RT-PCR and Q-RT-PCR to analyze

mRNA
expressions
Table
1 Primers
and product sizes used for RT-PCR and Q-RT-PCR to analyze mRNA expressions
GeneSequence (5’ to 3’)

Size (bp)

Accession No.

RT-PCR
KCSN
T1R3
ACTB
GAPDH

F:AGCAAGAGCTGACGGTCACAA
R: TGGCAGGCACAGTATTTGACA
F: GGCTATGACCTTTTCGACACA
R: ATACCTTGGGTGAGAGCCTGT
F: AACTCCATCATGAAGTGTGACG
R: GATCCACATCTGCTGGAAGG
F: TCAACGGGAAGCTCACTGG
R: CCCCAGCATCGAAGGTAGA

350

NM_174294.1

604

XM_588865.7

214

NM_173979.3

225

U85042

F: CAAGGAGAGGAAAGAGACA
R: TGAGAAGTGCTGATGTACCA
F: CCAGCCAGGAGAGAGACAAG
R: TTGTGGCAGGGTATGTGAGA
F: TCCAGAACGAGTATGAGG
R: CATCCGAATAGCTCTCAG
F: TAAACCACCTCTCCACCTTGAT
R: TGAGCCACATTAAGCTCTTTCA
F: CGTTGGGTCTGCAACTCCTC
R: TATTCCACGGCTTCCCTTCA
F: ACTATCGGCTGAAGTTGTGC
R: TCCTTGCTTTGCAGGTATTCF: CATCGCGGACAGGATGCAGAAA
R: CCTGCTTGCTGATCCACATCTGCT

236

M37211

112

NM_173966.3

236

X57317175

NM_174198.6

117

DQ319076.1

138

NM_001014382

158

NM_173979.3

Q-RT-PCR
IL-1β
TNFα
IL-6
TLR4
MD-2
MyD88
ACTB
3

Q-RT-PCR, quantitative RT-PCR; KCSN, kappa-casein; T1R3, taste receptor type 1 member 3; ACTB, beta actin;
GAPDH, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; IL-1β, interleukin-1 beta; TNFα, tumour necrosis factor alpha; IL6, interleukin-6; TLR4, toll-like receptor 4; MyD88, myeloid differentiation primary response 88; F, forward primer; R,
reverse primer－ 90 －

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Vol.4 No.3 2015

TREHALOSE EFFECTS ON IL-6 GENE IN BMEC（MAPK ERK1/2） ウ サ ギ モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗

マイド染色して目的 PCR 産物の発現有無を確

体（1：1000）（Cell Signaling Technology,

認した。

Danvers, MA, USA）であった。続いて、Can
5．統計解析

Get Signal で 1：20000 に希釈した 2 次抗体液に 1 時間室温で反応させた。2 次抗体には抗ウ

各実験結果は、代表的な単実験データの値

サギ HRP コンジュゲート（GE ヘルスケアジャを 平 均 値 ± 標 準 誤 差（standard error of theパン）を用いた。次に、検出試薬（ECL Plus

mean; SEM） で 示 し た。 統 計 処 理 に は SAS

Western Blotting Detection System, GE ヘ ル（Version ADD-In 6.1 for Microsoft Office, SAS

スケアジャパン）を用いて、5 分間 PVDF 膜

Institute Japan, 東京）を用いた。LPS 刺激にを化学発光反応させ、Chemi Stage CC-16（クよる炎症性サイトカインの mRNA 発現量変化

ラボウ , 東京）を用いてバンド強度の検出をに つ い て Student’s TTEST を 用 い て 検 定 し行った。検出に必要な露光時間は 1-5 分であった。炎症性サイトカインの mRNA 発現量に対た。検出後の PVDF 膜をクマシーブリリアンする TRE 添加濃度域の影響の検討では、一元

トブルー（CBB R-250, 和光純薬）染色し、各配置分散分析および Tukey の多重検定を用いサンプルのタンパクを可視化してローディングて検定した。IL-6 および TLR4 シグナル伝達量が等しいことを確認した（Fig. 3C）。

関連遺伝子の発現量について GLM プロシジャ
により分散分析を行い，LPS 刺激効果、TRE

4．組織採材および RT-PCR

100 mM 添加効果および LPS と TRE の交互作

T1R3 mRNA 発現における陽性対照を得る

用の有意性を検定した。また、交互作用が有意目的で、畜草研内で飼養された 1 カ月齢の黒毛であった場合には Tukey の多重検定を実施し和種哺乳雄仔ウシ 3 頭を用い、麻酔薬（ソムて、処理区間の差を検定した。いずれにおいてノペンチル , 共立製薬 , 東京）を頸静脈に 0.25

も p<0.05 を有意差ありとした。

ml/kg 体重量で急速投与し、過麻酔下で頸動脈［結果］

放血による安楽殺を施し、速やかに味覚受容体

1． 炎症性サイトカイン mRNA 発現に及ぼすが局在する舌根有郭乳頭組織を採材した。また、

LPS および TRE の影響

乳腺組織における T1R3 mRNA 発現を調べるため、同所内で飼養された分娩後約 2 カ月のホBMEC における炎症性サイトカイン（IL-1β、

ルスタイン泌乳牛 3 頭を同様に過麻酔下で、塩TNFα および IL-6）mRNA 発現量は LPS 無刺化カリウム飽和液の頸静脈急速注入により安楽激区と比べ、LPS 刺激区において著しく高かっ

殺し、速やかに乳腺組織を採材した。組織は血た（p<0.05, Fig. 2）。LPS 刺激により誘導され液除去後、液体窒素で急速凍結して -80℃で保る IL-1β および TNFα mRNA の発現亢進に対管した。

する TRE 添加による抑制効果は濃度に関わら凍結組織片を破砕機（マルチビーズショッ

ず認められなかった（Fig. 2A および B）。一カ ー , Yasui Kikai, 東 京 ） を 用 い て 粉 砕 後、方、LPS 刺激により誘導される IL-6 mRNA 発

AGPC 法により全 RNA を抽出した。上記と現亢進が、TRE 100 mM 添加時に有意に抑制

同様にゲノム DNA を除去し、1μg を逆転写しされた（p<0.05, Fig. 2C）。また、LPS 無刺激て cDNA を得た。T1R3 mRNA 発現について、

区においても、TRE 100 mM 添加により IL-6

glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

mRNA の基礎発現レベルが有意に抑制された（GAPDH）mRNA 発 現 を 内 部 標 準 と し て、

（p<0.05, Table 2）。

PCR 酵素（KOD-Plus-Neo, 東洋紡）を用いて
RT-PCR により調べた。RT-PCR 反応条件は、

2． TLR4 シグナル伝達経路分子 mRNA 発現に及ぼす LPS および TRE の影響

94℃ 2 分間の初期熱変性後、98℃ 10 秒変性・68℃伸長を 45 サイクル（T1R3）および 35 サ

IL-6 mRNA 発現亢進の抑制効果が確認されたイクル（GAPDH）行った。PCR 産物を 3％ア

TRE 100 mM 添加条件に着目し、TLR4、MD-2

ガロースゲルにて電気泳動後、エチジウムブロ

およびその下流の細胞内シグナル伝達経路分－ 91 －

家畜感染症学会誌４巻 3 号 2015

ウシ乳腺上皮細胞のサイトカイン発現に対するトレハロース作用

A

350

*

1.2

IL-1β / ACTB mRNA

300

IL-1β / ACTB mRNA

KCSN
ACTB

1.4

250
200
150
100
50

1

DIP

0.8
0.6
0.4
0.2

0

0

LPS

－

＋
TRE(mM)

B

--- +

2.5

0

LPS (＋)1
10100

LPS (＋)
1
10

100

1.6

TNFα / ACTB mRNA

TNFα / ACTB mRNA

1.4
2

1.5

1

1.2
1
0.8
0.6
0.4

0.5
0.2

N.D.

0

0

LPS

－

＋
TRE(mM)

C

1.2

3

*
IL-6 / ACTB mRNA

IL-6 / ACTB mRNA

A

A

A

1

2.5
2
1.5
1

0.8

B

0.6
0.4
0.2

0.5

0

0

LPS

0

－

＋
TRE(mM)

Fig. 20

LPS (＋)
1
10

100

Fig. 2Dose-dependent effects of trehalose (TRE) on the gene expression of pro-inflammatory cytokines inlipopolysaccharide (LPS)-stimulated BMEC. The mRNA expressions of pro-inflammatory cytokines in BMEC
were significantly upregulated by LPS (5μg/ml) stimulus for 6 h (*P<0.05, Student’s t-test). The cells wereincubated with the indicated concentrations of TRE for 3 h and then incubated in the presence of LPS (5 μg/ml) for 6 h. The cells were collected and analyzed using quantitative real time PCR (Q-RT-PCR) for the A)
Interleukin (IL)-1β, B) Tumour Necrosis Factor alpha (TNFα) and C) IL-6 mRNA levels. The mRNA expression
levels of all genes were normalized to beta-actin (ACTB) mRNA levels. Data are expressed as means ± standard
error of the mean of triplicates. Data shown are representative of triplicate separate experiments. Values
without associated common letters are significantly different (P<0.05, Tukey’s multiple range test). N.D. means
not detected from amplification by Q-RT-PCR.

－ 92 －

The Journal of Farm Animal in Infectious Disease
Vol.4 No.3 2015

TREHALOSE EFFECTS ON IL-6 GENE IN BMEC

4． ウシ乳腺における T1R3 mRNA 発現

子 の myeloid differentiation primary response
88（MyD88） の mRNA 発 現 量 の 変 化 に つ い

ウシ乳腺組織および BMEC における T1R3て調べた（Table 2）。いずれも LPS 刺激の影

mRNA 発現を RT-PCR により確認した（Fig.

響はなかったが、TRE 100 mM 添加により、

4）。

TLR4 および MD-2 mRNA 発現量が有意に高［考察］くなった（p<0.05）。特に TLR4 mRNA 発現は
LPS 刺激の有無に関わらず、TRE 100 mM 添

IL-6 は肝臓に作用し、炎症の指標となる急加区では TRE 無添加区と比較して約 2.5-2.7 倍性期タンパク質の産生を亢進させるなど、代表高かった。

的な炎症性サイトカインである。大腸菌性の急性乳房炎および甚急性乳房炎発症牛群にお3． 細胞内シグナル伝達の活性化レベルに及ぼいて、健康牛群よりも血清および乳清中濃度

す LPS および TRE の影響が有意に高値を示し、また全身症状や乳房局

転 写 因 子 NF-κB の 活 性 化 を 示 す NF-κB の所の炎症状態と関連する［6, 8］。本研究では、

核内移行を調べた（Fig. 3A）。10 分間の LPS

BMEC へ の TRE 100 mM 添 加 が、LPS 刺 激

刺激において、NF-κB の核内移行は確認でき

による IL-6 mRNA 発現亢進を有意に抑制する

ず、TRE 100 mM 添加による影響も認められことを確認した。一方、LPS 刺激を受容するな か っ た。 次 に、MAPK フ ァ ミ リ ー で あ る

TLR4 を介した BMEC の細胞内シグナル伝達

ERK1/2 の 活 性 化 を 調 べ る た め に、ERK1/2

経路［21］に関して、TRE 100 mM 添加により、の 核 内 移 行 を 調 べ た（Fig. 3B）。LPS 刺 激 に

TLR4 および MD-2 mRNA 発現が有意に増加

おいて、細胞質内 ERK1/2 タンパク量が減少するという IL-6 発現亢進抑制作用とは矛盾す

し、核内 ERK1/2 タンパク量が増加しており、る結果となった。本研究では、LPS 刺激によ

LPS 刺激による ERK1/2 の活性化が確認される NF-κB シグナル伝達経路の活性化は確認さた。一方、LPS 無刺激条件において、TRE 100

れなかったため、用いた BMEC における LPS

mM 添加により、ERK1/2 の核内移行がわずか

刺激の TLR4 シグナル伝達経路は NF-κB 経路に亢進される傾向が確認されたが、LPS 刺激ではなく、MAPK 経路である可能性が示唆さ条件では、ERK1/2 の核内移行に及ぼす TREれた。そこで MAPK ファミリーについて調べ

100 mM 添加の影響は確認できなかった。

た結果、ERK1/2 の活性化が LPS 刺激により観察された。しかし、この時に起こる ERK1/2

1

Table 2

Effects of TRE on the gene expression of IL-6 and the molecules of TLR4

Table 2 Effects of TRE on the gene expression of IL-6 and the molecules of TLR4 signalling2
signalling
pathway inBMEC
LPS-stimulated BMEC
pathwayin LPS-stimulated
LPS(+)LPS(－ )

P-value

SEM

TRE

TRE

TRE

TRE

L

T

L×T

0 mM

100 mM0 mM

100 mM

IL-6

1.26 b0.42 c2.49 a1.08 b0.23< 0.01< 0.01< 0.05

TLR4

1.24

3.13

1.09

2.98

0.34

0.36

< 0.01

0.99

MD-2

0.87

1.15

0.86

1.18

0.06

0.97

< 0.01

0.80

MyD88

0.90

0.82

0.74

0.70

0.04

0.10

0.41

0.77

TRE,
3 trehalose; LPS, lipopolysaccharide; BMEC, bovine mammary epithelial cells; IL-6, interleukin-6; TLR4,
toll-like receptor 4; MyD88, myeloid differentiation primary response 88; L, LPS treatment; T, TRE 100 mM
treatment; L×T, interaction between LPS and TRE treatment
a-c
Denote significant differences (P < 0.05) among the values in four groups.

－ 93 －

家畜感染症学会誌４巻 3 号 2015

ウシ乳腺上皮細胞のサイトカイン発現に対するトレハロース作用

A NF-κB
Nuc
Cyto
LPS
TRE(100 mM)

－
－

－
＋

＋
－

＋
＋

－
－

－
＋

＋
－

＋
＋

B ERK1/2
Nuc
Cyto
LPS
TRE(100 mM)

C

Cyto. extract

kDa

Nuc. extract

103
77
50
34.3
28.8
20.7
LPS
－
TRE
－
(100 mM)

－

＋

＋

－

－

＋

＋

＋

－

＋

－

＋

－

＋

Fig. 3Fig. 3

Effects of TRE on the activation of nuclear factor kappa B (NF-κB) and p44/42 Mitogen-activated Protein
Kinase (ERK1/2) in LPS-stimulated BMEC. BMEC were incubated with TRE (100 mM) for 3h. The cells werethen incubated in the presence or absence of LPS (5 μg/ml) for 10 min. Cell lysates were separated cytoplasmic(Cyto) and nuclear (Nuc) protein fractions, and two fractions were used for Western blot analysis using specificantibody for A) total NF-κB or B) total ERK1/2, respectively. Levels of respective proteins were used as anindication of equal loading (10 μg/lane). Blots are representative of duplicate separate experiments. C) After
detection, the PVDF membrane was stained with Coomassie brilliant blue as protein loading control. This
membrane was cut in half crosswise to detect total NF-κB (upper: 65 kDa) and total ERK1/2 (lower: 42 and 44
kDa).

－ 94 －

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Vol.4 No.3 2015

TREHALOSE EFFECTS ON IL-6 GENE IN BMEC

T1R3
GAPDH
RT

- - - ++ + - - - +++- - - +++
CP

MG

BMEC

Fig. 4

Expression of TRE receptor (taste receptor type 1 member 3: T1R3) mRNA in mammary gland tissue (MG)of lactating Holstein cows (peak lactation) and BMEC. T1R3 mRNA was examined using RT-PCR. The PCR
products were electrophoresed on a 3% agarose gel and visualized by EtBr staining (n=3). Expression of thedesired product was confirmed by the presence of a visible band at the predicted size. To exclude amplificationfrom genomic DNA contamination, the RNA was either treated with DNase before the RT reaction (RT+) or
run without RT (negative control, RT−). Bovine tongue circumvallate papillae (CP) were used as a positive
control. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as internal control. Dashed line shows
the border between two gels.

Fig. 4の 活 性 化 に 及 ぼ す TRE 100 mM 添 加 の 影 響進が TRE 添加濃度依存的（0-100 mM）に抑制は見られなかった。以上の結果より、TRE がされることを確認した。しかし BMEC を用い

LPS-TLR4 シグナル伝達経路ではなく、例えた本実験では、同濃度域および 100 mM におば IL-6 mRNA のプロモーター領域および転写

いて TNFα および IL-1β mRNA 発現亢進に対後の RNA 安定性に関与して、IL-6 特異的な発する抑制効果は認められなかった。以上より、

現抑制作用を示した可能性が示唆された。IL-6

BMEC の TRE 感受性は、血中等の免疫細胞

は炎症性サイトカインである一方で、B 細胞やとは異なることが示唆された。一方、Tanaka

形質細胞の増殖と抗体産生を促進する作用があら［19］ は 単 離 し た ヒ ト 好 中 球 を 用 い た inる。乳腺上皮に遊走、局在する IgA 産生細胞は、vitro 実験において、TRE には LPS 誘導による乳汁中に IgA を分泌することで恒常的な乳腺

TNFα 産生亢進の抑制作用はなかったことを報

免 疫 を 担 っ て お り［22］、BMEC の IL-6 分 泌

告している。これらのことから、TRE 感受性

がこの働きを制御している可能性がある。本研には細胞種差が存在し、特に単球系が TRE に究において、LPS 無刺激条件下において TRE

対する感受性が高い可能性が推察された。ま

100 mM 添加が IL-6 mRNA 発現の基礎レベル

た本研究における BMEC への LPS 感作が他のを有意に低下させた。この結果から、非感染

BMEC-LPS 感作実験の既報［12］と比較して乳房内への TRE 投与が、IL-6 を介した乳汁中軽度かつ単処理であったため、今後、刺激濃度

IgA 産生による乳腺免疫を抑制する可能性があや刺激条件を拡充した上で、TRE 作用についることが推察された。

て更に検討することが必要である。

著者らが調査した結果、ヒトや実験動物を

近年、甘味受容体ファミリーの中で T1R3 が含めて、乳腺上皮細胞に対する TRE 添加の作

TRE を認識し応答することが報告された［3］。

用を検討している報告は現在までなく、本研

味刺激は 30-70 個の細胞が集合した味蕾の中に

究 に お け る TRE 添 加 濃 度（1, 10 お よ び 100

含まれる味細胞によって受容される。この味蕾mM）の設定は、MΦ 等に着目した既報［4, 13,は舌の乳頭部に多く存在し、T1R3 は特に有郭20］を参考に実施した。Taya ら［20］はマウ

乳頭部において発現が強い［10］。一方、Tayaス MΦ において、LPS 刺激誘導による TNFα

ら［20］はマウス MΦ において T1R3 mRNAおよび IL-1β の mRNA 発現亢進および分泌亢の発現を見出している。T1R3 は G タンパク進に対する TRE の抑制作用は 10 mM 以下で質共役型受容体（G protein-coupled receptor;

確認できたと報告している。我々も仔ウシ由来

GPCR）の一つである［3］。GPCR ファミリー

全血を用いた予備的な ex vivo 実験において、の共通基本的機能は細胞外情報を受容し、細胞

LPS 刺激誘導による白血球からの IL-1β 分泌亢

内へシグナルを伝達することであり、現在、臨－ 95 －

家畜感染症学会誌４巻 3 号 2015

ウシ乳腺上皮細胞のサイトカイン発現に対するトレハロース作用

床で使用されている医薬品の約半数が GPCRを標的にしており［5］、抗炎症作用にも密接に関与していることから、炎症性サイトカイン産
生亢進を抑制する TRE 作用は、T1R3 を介する可能性があると考えられる。本研究により、
我 々 は ウ シ 乳 腺 組 織 お よ び BMEC に お け る
T1R3 mRNA の発現を新規に見出した。味覚受容と関連性が低いと考えられるウシ乳腺上皮において T1R3 が発現していることは非常に興味深く、TRE 受容シグナルが乳腺においてどのような生理的役割を持つのか不明であるが、今回得られた TRE の IL-6 発現亢進抑制作用の機序に T1R3 が関与している可能性が示唆された。今後は T1R3 のタンパク発現や局在、閾値を検討する機能解析が必要である。
本 研 究 結 果 に よ り、BMEC に お い て TREの IL-6 発現抑制作用が新規に見出され、その機 序 は NF-κB お よ び MAPK ERK1/2 を 介 した LPS-TLR4 シ グ ナ ル 伝 達 経 路 以 外 に あ り、
T1R3 を介する可能性が示唆された。
［謝辞］
本研究を遂行するにあたり、試薬トレハロー
ス（Et free）を提供頂いた株式会社林原に謝意を表します。畜産草地研究所研究支援センター業務 3 科諸氏には家畜管理および組織採材に多大な支援を頂きました。本研究の一部は、農林水産研究情報総合センターの科学技術計算システムを利用致しました。本研究は、一般財
団法人旗影会 2013 年度一般研究助成を受けて実施致しました。ここに記して、感謝致します。
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家畜感染症学会誌４巻 3 号 2015

ウシ乳腺上皮細胞のサイトカイン発現に対するトレハロース作用

Effects of trehalose for the cytokine gene expressions
in bovine mammary epithelial cells
Satoshi Haga1）*, Miwa Nakano1）, Yosuke Kobayashi2）, Hiroshi Ishizaki1）1）Grassland Management Research Division, NARO, Institute of Livestock and Grassland Science
768 Senbonmatsu, Nasushiobara, Tochigi, Japan2）Animal Physiology and Nutrition Research Division, NARO, Institute of Livestock and Grassland Science
2 Ikenodai, Tsukuba, Ibaraki, Japan
Correspondence: Satoshi Haga
Grassland Management Division, NARO, Institute of Livestock and Grassland Science
768 Senbonmatsu, Nasushiobara, Tochigi 329-2793, Japan
TEL & FAX: +81 287 37 7239
E-mail: hagatiku@affrc.go.jp［Abstract］
In dairy cattle, infection of the udder by Escherichia coli often induces the hyper- production of
pro-inflammatory cytokines and elicits acute inflammation. This study was conducted to examine
whether trehalose（TRE）, a disaccharide, can inhibit lipopolysaccharide（LPS）-stimulated gene
expression of inflammatory response in bovine mammary epithelial cells（BMEC）in vitro. The
BMEC was treated with TRE and was stimulated by LPS（5 μ g/ml）. The mRNA expressions ofpro-inflammatory cytokines and the molecules of toll-like receptor 4（TLR4）signaling pathway in
BMEC were measured using quantitative RT-PCR. The activations of nuclear factor κB（NF-κB）and
p44/42 Mitogen-activated Protein Kinase（MAPK ERK1/2）were assessed using western blotting.
The mRNA expressions of TRE receptor（T1R3）in bovine mammary gland tissues and BMEC wereassessed using RT-PCR. Treatment with TRE（100 mM, 3 h）down-regulated the mRNA expressionof interleukin-6（IL-6）in the presence or absence of LPS stimulus. However, the mRNA expressionsof TLR4 and MD-2 were up-regulated by TRE treatment（100 mM）. The activations of NF-κB
and MAPK ERK1/2 were unaffected by TRE treatment（100 mM）. Additionally, we observed theexpression of T1R3 in both bovine mammary gland tissues and BMEC. These results suggest that
TRE can inhibit the expression of IL-6 in BMEC via TRE receptor T1R3, irrespective of NF-κB and
MAPK ERK1/2 pathways.
Key words: anti-inflammation, bovine mammary epithelial cell, coliform mastitis, endotoxin, trehalose－ 98 －