新規変異評価システムを用いた長波長の紫外線（UVA）による突然変異誘発機構の解明
広島大学大学院統合生命科学研究科

津田雅貴

UVA increases the risk of human cancer. One of the mutation patterns, mainly found in cancers derived from tissues
directly exposed to UVA, is attributable to misreplication of DNA damage caused by 7,8-dihydro-8-oxyguanine(8-oxoG).
However, little is known the mechanism of UVA mutagenesis. I previously developed the piggyBlock system. The system
employs the random integration of UV damage (CPD) into the genome of cells using the ‘piggyBac’ transposon-based vector
assay. I measured the mutation rate in human TK6 cells at a chemically synthesized 8-oxoG and CPD integrated into genomic DNA. I transfected the piggyBlock vector carrying CPD into wild-type, RAD18−/−, and POLη−/− cells. I then selected cellswith puromycin, PCR amplified nucleotide sequences over the CPD site in individual puror clones. I found that the mutation
rate of RAD18−/− cells was comparable to that of wild-type. Phenotype of RAD18-deficient cells is almost all normal, in
terms of the bypass of CPD site, suggesting that some redundant pathways might operate the mutation induced by CPD.
Topoisomerase I (TOP1) resolves DNA topology during replication and transcription. The enzyme forms an intermediate
TOP1 cleavage complex (TOP1cc) through transient TOP1–DNA-protein crosslinks. Some anticancer drugs and carcinogenfreeze this reaction intermediate. However, it is not known whether UVA generates TOP1cc. Thus, I developed an assay system to estimate the TOP1cc using anti-TOP1 antibody. In future, I will analyze the TOP1cc removal mechanism using thisassay system genome editing cells.

1．緒

ンダイマー（CPD）という DNA 損傷箇所で、PDIP 38 とい言うタンパク分子が変異を促進することを、新規変異評価シ

紫外線は DNA に突然変異を引き起こしうる。突然変異

ステム（piggyBlock システム）とヒトゲノム編集細胞を用は発がんの発生につながる。紫外線は波長により、短波長

いて、明らかになった 3）。piggyBlock システムは、これま（UVC：190 - 280 nm）、 中 波 長（UVB：280 - 320 nm）、 長

で使われていた変異評価手法と異なり、人工的に合成した

波長（UVA：320 - 400 nm）に分類される。多くの研究者が、DNA 損傷をゲノム DNA に挿入し、ゲノム上で起こる変異

エネルギーが高い UVC を用いて突然変異誘発機構を調べの頻度（変異率）とどのような変異が起きるかを直接調べる

1）てきた 。しかし、UVC は、オゾン層や大気に吸収され手法である（図 1）4）。piggyBlock を用いれば、UVA によ

地上に到達しないので、人体に突然変異を引き起こす因子って生成する DNA 損傷箇所での突然変異誘発分子を見つとは考えにくい。一方、UVA は、ほとんどのエネルギー

けることが可能である。本研究では、コントロールとして、が地表に到達している。UVA は、透過力が大きく、ほとCPD 損傷入り piggyBlock も解析を行う。

んどが表皮を通過し、真皮もしくは皮下組織まで到達する。

DNA の複製や転写の際に生じるスーパーコイルは、ト

しかし、UVA はエネルギーが弱いという理由から、突然

ポイソメラーゼ 1（TOP 1）という酵素が DNA に一本鎖切変異に関して解析されてこなかった。ところが、近年、

断 を 引 き 起 こ す こ と で 解 消 す る 5）。 こ の 反 応 の 際 に、

UVA が突然変異を誘発することが示された 2）。その原因

TOP 1 は一過的に DNA の 3’ 末端に共有結合する。スーパ

は、UVA が活性酸素種やラジカルを生成し、7 , 8 -dihydro8 -oxyguanine（8 -oxoG）という DNA 損傷を引き起こすか
らだと推定されている。本研究の目的は、新規変異評価システム（piggyBlock システム）を用いて、8 -oxoG 損傷箇所の突然変異発生を引き起こす DNA 合成酵素やその制御分子を見つけ出すことである。
最近、UVC によって生成するシクロブタン型ピリミジ

Elucidation of Mutagenesis Mechanism
by UVA Using a Novel Mutagenesis
Assay
Masataka Tsuda
Graduate School of Integrated Sciencesfor Life, Hiroshima University

図1 piggyBlockシステムとは？
DNA損傷の両端にITRという配列を入れたプラスミドDNAを用意する。このITRの間の配列がトランスポゼースという酵素によって細胞のゲノムDNAに挿入される。DNA複製後にゲノム抽出をし、損傷箇所の塩基配列を調べ、変異率を算出できる。

− 128 −

新規変異評価システムを用いた長波長の紫外線 (UVA) による突然変異誘発機構の解明

再結合する。しかし、一部の抗がん剤や環境変異原によっ

2. 3. RAD18/POLη遺伝子欠損細胞における紫外
線損傷（CPD）箇所における変異解析て、TOP 1 は DNA 末端にトラップされてしまうことがあ

以前作製した 3）、CPD が結合した piggyBlock プラスミ

る。この DNA と TOP 1 の複合体を TOP 1 cc という。本研

ド 10 ng と 1 μg の Transposase 発 現 プ ラ ス ミ ド を 同 時 に

究では、UVA によって発生する DNA 損傷が TOP 1 cc をNEON トランスフェクションで POLη 遺伝子欠損細胞およ形成させるのかを検討する。

び PDIP 38 遺伝子欠損細胞に導入しに遺伝子導入した。

ーコイルが解消されると、TOP 1 は DNA 末端から離れ、

２．方

96 well plate に細胞を播き、トランスフェクション 30 時

法間後にピューロマイシンで、BPDG 損傷がゲノムにインテ

2. 1. 細胞培養

グレーションされた細胞のみをセレクションした。10 日

ヒト B リンパ芽球細胞由来の TK 6 細胞は RPMI 1640 培地（富士フィルム和光純薬株式会社）に、非働化したウマ血後、ピューロマイシン耐性コロニーからゲノム DNA を抽出した。

清（Thermo Fisher Scientific）を 5 ％、L- グルタミン（ナカAldrich）を 0 . 2 mg/mL、ペニシリン（ナカライテスク株式

2. 4. 塩化セシウム密度勾配遠心法によるゲノムDNAの精製会社）を 100 U/mL、ストレプトマイシン（ナカライテスク

5 . 0 × 107 TK 6 細胞を 900 mL の Lysis バッファー（10 mM株式会社）を 100 mg/mL になるように加え、CO 2 濃度 5 ％、リン酸バッファー［pH 7 . 5］
，1 mM EDTA, RNaseA［20 mg］，

37 ℃で培養した。

プロテアーゼインヒビターカクテル）で懸濁し、10 分間

ライテスク株式会社）、ピリビン酸ナトリウム（Sigma-

氷上でインキュベートした。サルコシルを終濃度 1 % にな

2. 2. RAD18/POLη遺伝子欠損細胞の作製

るように添加し、30 分間 氷上でインキュベートした。ゲRAD 18 遺伝子を破壊する為に、ターゲティングベクタ

ノム DNA を剪断する為に、23 ゲージの針で 20 回、通過

ーとして RAD 18 -HYGR と RAD 18 -NEOR を作製した。こさせ 10 mM リン酸バッファー［pH 7 . 5］でサンプル全量をのベクターを作製するために、ゲノム DNA を鋳型に、プ

9 mL と し、9 . 3 g の CsCl を 混 ぜ、694 , 000 × g で 17 時 間

ライマーとして、5 ʼ-GCGAATTGGGTACCGGGCCGTTA遠心した。遠心後、500 mL ずつ分取し、ゲノム DNA が含

ATACAGCATAA- 3 ʼ と 5 ʼ-CTGGGCTCGAGGGGGGGCC

まれるフラクションを回収し、アガロースゲル電気泳動でTTGGGCAGCGGCTTC- 3 ʼ を用いてレフトアームを PCR

調べ、10 mM リン酸バッファー［pH 7 . 5］、1 mM EDTA増幅した。また、5 ʼ-TGGGAAGCTTGTCGACTTAATAが含まれたバッファーで透析した。もう一度、塩化セシウ

AATCAGGTAAAGTAAT- 3 ʼ と 5 ʼ-CACTAGTAGGCGC

ム密度勾配遠心法を行った。ゲノム DNA が含まれるフラGCCTTAAAGCAACAAAAATGAA- 3 ʼ を 用 い て、 ラ イ

クションを回収し、10 mM リン酸バッファー［pH 7 . 5］、

トアームをPCR増幅した。レフトアームとライトアームは、

1 mM EDTA が含まれるバッファーで 3 時間透析し、こR

DT-ApA/HYG ベクターおよび DT-ApA/NEOR の ApaI

れを 2 回行った。さらに、2 M NaCl, 10 mM リン酸バッフ

サイトと AflII に GENEART Seamless Cloning キットを用ァー［pH 7 . 5］、1 mM EDTA が含まれるバッファーで 3 時

いてそれぞれ挿入した。また、RAD 18 遺伝子のエキソン

間透析し、これを 2 回行った。最後に、MilliQ 水で 3 時間

7 を標的とする gRNA を発現させるために、pX 330 ベク

透析し、これを 2 回行った。遠心濃縮を用いてサンプルボ

タ ー に 5 ʼ-GAGCATGGATTATCTATTCA- 3 ʼ を ラ イ ゲ

リュームを減らした。ナノドロップを用いて、260 nm のーションで挿入し、CRISPR-RAD 18 を作製した。POLη

波長で DNA 濃度を測定した。

R

遺伝子欠損細胞に、2 μg の RAD 18 -HYG 、2 μg の RAD 18 PUROR、6 μg の CRISPR-RAD 18 を NEON ト ラ ン ス フ ェ

2. 5. ウェスタンブロットを用いたTOP1ccの検出

クションシステム（1350 V, 10 msec, 3 pulse）で遺伝子導入

2 . 4 . の方法で精製したゲノム DNA を 30 mg 用意し、した。48 時間後、ピューロマイシンとハイグロマイシン

10 mM の Tris-HCl（pH 7 . 6）、25 mM の MgCl 2、0 . 5 mMを加え、細胞を 96 穴プレートに播いた。7 〜 10 日後に、の CaCl 2 を 含 む DNaseI バ ッ フ ァ ー に 溶 か し、 全 量 がシングルコロニーをピックアップし、候補の細胞のゲノム

33 mL になるように３ユニットの DNaseI（New England

DNA を抽出した。標的組換えが起きているかを、ゲノミ

Biolabs）で 37 ℃、2 時間インキュベートした。サンプルをッ ク PCR で 確 認 し た。 さ ら に、 作 製 し た 細 胞 か ら、

レムリサンプルバッファー（BIO-RAD）で変性させ、7 . 5

R

PURO 遺伝子を取り除くために、Cre 組換え酵素を一過％ の SDS-PAGE ゲ ル で 分 離 さ せ た。 そ の 後 Trans-Blot

性発現させ、ピューロマイシン感受性の細胞を獲得した。

Turbo（BIO-RAD）を用いてメンブレンに写し取り、1 次抗体として、抗 TOP 1 抗体および抗マルチユビキチン抗体を用い、HRP 標識二次抗体で反応させた。ECL で化学− 129 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 31, 2023

発光させ、ChemiDoc イメージングシステムで検出した。

チか損傷乗り越えによる複製ブロックの解除は、区別することができる。TLS が起きると ApA（正確な TLS）か他の

2. 6. スロットブロットを用いたTOP1ccの検出

塩基が挿入（不正確な TLS, 突然変異）され、ダブルピーク

2 . 4 . の方法で精製したゲノム DNA を 2 mg 用意し、として検出される（図 2 A 左）。テンプレートスイッチによ

ECL ニトロセルロースメンブレン（GE Healthcare）にスロる解除では、CPD 損傷箇所では GpC が挿入され、シークットブロットを用いて吸着させた。ゲノム DNA を吸着しエンス解析ではGCのシングルピークとして検出される（図

たメンブレンを Tris バッファーで洗浄した。抗 TOP 1 抗

2 A 右）。

体および抗 TOP 1 cc 抗体を用いて、ウェスタンブロット

発生頻度を調べた。Polη の遺伝子欠損により、TLS の頻と同様の方法で検出した。

３．結

この原理に基づいて、TLS とテンプレートスイッチの度は、4 . 7 % から 11 . 6 ％に増加した（図 2 B）
。突然変異の果正体である、不正確な TLS の頻度は、0 % から 3 . 6 % に増

3. 1. CPD損傷箇所における突然変異解析加した（図 2 C）。一方、RAD 18 遺伝子の欠損により、TLS

CPD 損傷入り piggyBlock プラスミドを POLη/RAD 18の頻度および不正確な TLS の頻度は野生型と同じであっ

遺伝子欠損細胞に遺伝子導入し、ピューロマイシン耐性ク

た。POLη/RAD 18 遺 伝 子 欠 損 細 胞 は、TLS の 頻 度 はローンを獲得した。これらのクローンは、CPD 損傷が挿POLη 遺伝子欠損細胞とほぼ同じであったが、不正確な入された親細胞のワトソン鎖およびクリック鎖のどちらか

TLS（突然変異）は 5 . 8 % に上昇した。従って、RAD 18 は、を受け継ぎ、クローン内でモザイク状となる。従って、こPOLη が存在しない状況では、正確な TLS を促進する。

のアッセイにおいて、エラーフリーのテンプレートスイッ

図2

piggyBlock解析の結果− 130 −

新規変異評価システムを用いた長波長の紫外線 (UVA) による突然変異誘発機構の解明

3. 2. TOP1ccの定量

2 μg のゲノム DNA をスロットブロットし、シグナルを検細胞内の TOP 1 cc を正確に定量するために、塩化セシ

出した（図 4 A、B）。その結果、TK 6 細胞に CPT を 0 . 4、

ウ ム 密 度 勾 配 遠 心 法を 2 回繰り返し、細胞抽出 液 か ら

1 . 9、7 . 1 mM 処 理 し た 場 合、 そ れ ぞ れ、 ゲ ノ ム DNA

DNA が結合していない TOP 1 と TOP 1 ㏄を分離した。そ107 bp に当たり TOP 1 cc が 102、297、469 個生成していの 後、 精 製 し た ゲ ノ ム DNA に DNaseI を 添 加 し ゲ ノ ム

たことが分かった。細胞内にある全 TOP 1 タンパク質の内、DNA を分解し、ウェスタンブロットで TOP 1 cc の検出を

TOP 1 cc の割合を計算する為に、ウェスタンブロットを用試みた。メンブレンに転写した後、抗 TOP 1 抗体を用い

いて細胞内の全 TOP 1 タンパク量を求めた。CPT を 0 . 4、て検出した。CPT を処理した細胞の TOP 1 cc は、予想さ

1 . 9、7 . 1 mM 処理した細胞内の全 TOP 1 の量はそれぞれれる TOP 1 のバンドの位置（TOP 1 ＝ 91 kDa）より高分子

5 . 5 × 103 細胞あたり 13 . 5、12 . 7、9 . 3 ng であった（図 4）。

側に、スメアなシグナルとして検出され、このシグナルは

従って、細胞内の全 TOP 1 タンパク分子の内の TOP 1 cc処理した CPT の濃度依存的に強くなった（図 3 , 左のパネ

分子の割合は、CPT を 0 . 4、1 . 9、7 . 1 mM 処理した細胞でル）。TOP 1 cc のバンドよりも高分子側に検出されたシグそれぞれ 0 . 8、1 . 2、1 . 7 ％であった。

ナルは、翻訳後修飾が起こった可能性が高い。そこで、同
じサンプルを抗マルチユビキチン抗体で調べたところ、
CPT の処理濃度依存的に、ポリユビキチン化の量が増え

3. 3. TOP1cc修復の各ステップの除去動態を個々に計測する方法の確立ていた（図 3 , 右のパネル）。CPT は TOP 1 のポリユビキチ

本研究では、エピトープの異なる 2 つの抗体（抗 TOP 1ン化を促進することはすでに報告されている。従って、抗体と抗 TOP 1 cc 抗体）を用いて、TOP 1 cc 修復の各ステ

TOP 1 cc は CPT の処理によってポリユビキチン化を受けップの除去動態を個々に計測できると考えた。これまでのている可能性がある。このようにウェスタンブロットによ実験で用いた抗 TOP 1 抗体は、TOP 1 タンパク質の表面る分析では、TOP 1 cc はスメアとして検出されるので、バを認識する。このエピトープはプロテアソームによるタンンドの定量は難しい。そこで、DNaseI を使用せず、スロ

パク質分解を受けるので、TOP 1 cc 修復の 1 段階目を評価

ットブロットした。スタンダードの TOP 1 タンパク質とできる。一方、抗 TOP 1 cc 抗体は、TOP 1 活性部位前後

図3

CPT処理した野生型細胞のゲノムDNAを用いたウェスタンブロット解析

図4

CPTによって生成するTOP 1 ccの定量− 131 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 31, 2023

15 アミノ酸とホスホチロシン結合を認識する抗体である 6）。

謝辞

この抗体のエピトープは、TOP 1 cc 修復における 2 段階目

本研究の遂行にあたり、多大なるご支援をいただきましで除去される箇所である。従って、この抗体を用いれば 2た公益財団法人コーセーコスメトロジー研究財団に心より段階目の修復動態を評価できる。実際に、私は、これらの感謝申し上げます。

抗体が、報告されているエピトープを認識するかを検証する為に、CPT で処理した野生型細胞から精製したゲノム（引用文献）

DNA を用いて、スロットブロットで分析した。このサン

1） I k e h a t a H , O n o T . T h e m e c h a n i s m s o f U V

プルをプロテイナーゼ K（ProK）および V 8 プロテアーゼ

mutagenesis. J Radiat Res. 2011;52（2）: 115-25. Epubで消化し、ニトロセルロース膜にスロットブロットし、抗2 0 1 1/0 3/2 6. doi: 1 0.1 2 6 9/jrr. 1 0 1 7 5. PubMed PMID:

TOP 1 抗体および抗 TOP 1 cc 抗体で検出した。ProK は、21436607.

脂肪族アミノ酸と芳香族アミノ酸の C 末端側のペプチド結2） Kucab JE, Zou X, Morganella S, Joel M, Nanda AS,

合を切断する。従って、両抗体の認識箇所は消化される。

Nagy E, et al. A Compendium of Mutational Signatures

実際、いずれの抗体においてもシグナルは検出されなかっof Environmental Agents. Cell. 2019; 177（4）: 821-36.

た。一方、V 8 プロテアーゼは、アンモニウムイオン存在

e16. Epub 2019/04/16. doi: 10.1016/j. cell. 2019. 03. 001.

下でグルタミン酸の C 末端側のペプチド結合を切断し、抗PubMed PMID: 3 0 9 8 2 6 0 2; PubMed Central PMCID:

TOP 1 抗体のエピトープは消化されるが、抗 TOP 1 cc 抗

PMCPMC6506336.

体のエピトープは消化されない。実際、抗 TOP 1 抗体で

3） Tsuda M, Ogawa S, Ooka M, Kobayashi K, Hirota K,

はシグナルは検出されなかったが、抗 TOP 1 cc 抗体ではWakasugi M, et al. PDIP38/PolDIP2 controls the DNA

シグナルが検出された。これらの結果から、抗 TOP 1 抗damage tolerance pathways by increasing the relative体および抗 TOP １cc 抗体を用いて、TOP 1 cc 修復の 1 段

usage of translesion DNA synthesis over template

階目および 2 段階目を区別して除去動態を評価できること

switching. PLoS One. 2 0 1 9; 1 4（3）: e0 2 1 3 3 8 3. Epubが分かった。

2 0 1 9/0 3/0 7. doi: 1 0.1 3 7 1/journal. pone. 0 2 1 3 3 8 3.

４．考PubMed PMID: 3 0 8 4 0 7 0 4; PubMed Central PMCID:察

PMCPMC6402704.

POLη は CPD 損傷箇所における正確な損傷乗り越えを行

4） Hirota K, Tsuda M, Mohiuddin, Tsurimoto T, Cohenう。これは、今回行った実験結果とも一致する。野生型細

IS, Livneh Z, et al. In vivo evidence for translesion

胞に RAD 18 遺伝子を欠損させた場合、この損傷乗り越え

synthesis by the replicative DNA polymerase δ.

の頻度および変異スペクトラムに変化は見られていない。

Nucleic Acids Res. 2 0 1 6; 4 4（1 5）: 7 2 4 2-5 0. Epub

しかし、POLη 遺伝子に RAD 18 遺伝子を欠損させた場合、

2016/05/18. doi: 10.1093/nar/gkw439. PubMed PMID:

不正確な TLS（突然変異）は上昇した。RAD 18 は、ユビキ

27185888; PubMed Central PMCID: PMCPMC5009730.

チンライゲース E 3 として知られており、PCNA のモノユ

5） Pommier Y, Sun Y, Huang SN, Nitiss JL. Roles of

ビキチン化を引き起こす 7）。このモノユビキチンにポリメ

eukaryotic topoisomerases in transcription, replication

ラーゼ η（Polη）がリクルートされる 。試験管内で Polη は、

and genomic stability. Nat Rev Mol Cell Biol. 2016; 17

紫外線損傷箇所を鋳型に DNA 合成でき、正確な塩基を挿（11）: 703-21. Epub 2016/10/21. doi: 10. 1038/nrm. 2016.

入する（例：チミン二量体を形成している場合、AA が挿

1 1 1. PubMed PMID: 2 7 6 4 9 8 8 0; PubMed Central

入）。従って、Rad 18 を欠損させた場合、Polη がリクルー

PMCID: PMCPMC9248348.

8）

トされないので、紫外線損傷箇所を鋳型として正確に

6） Patel AG, Flatten KS, Peterson KL, Beito TG,

DNA 合成できず、変異が誘発されると考えられる。本研

Schneider PA, Perkins AL, et al. Immunodetection of

究結果から、POLη は RAD 18 の有無に関わらず、紫外線

human topoisomerase I-DNA covalent complexes.

損傷箇所の TLS には影響を与えないことが分かった。

Nucleic Acids Res. 2 0 1 6; 4 4（6）: 2 8 1 6-2 6. Epub

POLη と RAD 18 のどちらも存在しない時は、不正確な

2016/02/27. doi: 10. 1093/nar/gkw109. PubMed PMID:

TLS が増加したことから、損傷乗越えポリメラーゼであ26917015; PubMed Central PMCID: PMCPMC4824114.

る Pol ι, Polκ, Rev 1 等が突然変異を誘発している可能性が

7） Geng L, Huntoon CJ, Karnitz LM. RAD18-mediatedある。また、TOP 1 cc を検出する実験系を構築することがubiquitination of PCNA activates the Fanconi anemia

できた。今後は、UVA 暴露で誘発する TOP 1 cc 修復を、

DNA repair network. J Cell Biol. 2010; 191（2）: 249-57.

ゲノム編集細胞を用いて解析していく予定である。

Epub 2010/10/13. doi: 10.1083/jcb. 201005101. PubMed
PMID: 2 0 9 3 7 6 9 9; PubMed Central PMCID:− 132 −

新規変異評価システムを用いた長波長の紫外線 (UVA) による突然変異誘発機構の解明

and PCNA monoubiquitination. Embo j. 2004; 23（19）:PMCPMC2958487.
8） Watanabe K, Tateishi S, Kawasuji M, Tsurimoto T,

3 8 8 6-9 6. Epub 2 0 0 4/0 9/1 1. doi: 1 0. 1 0 3 8/sj. emboj.

Inoue H, Yamaizumi M. Rad1 8 guides poleta to

7600383. PubMed PMID: 15359278; PubMed Central

replication stalling sites through physical interaction

PMCID: PMCPMC522788.

− 133 −