ヒアルロン酸とデスモソームタンパクとの新規結合が皮膚機能に及ぼす影響の解明
大阪公立大学医学研究科病態生理学

高杉征樹

Hyaluronan (HA), a linear polysaccharide and a major component of the extracellular matrix, plays a role in supporting tissue structure and regulating cellular signaling pathways depending on its size. Here, we identified proteins that areassociated with HA in the extracellular space and found that desmosome proteins, especially desmoplakin, were associatedwith HA. Our results suggest that HA is associated with desmoplakin in the blood, where HA is partially degraded. However, although such low molecular weight (LMW) HA is considered to be pro-inflammatory based on many in vitro studies,mouse transplanted with LMW-HA-releasing capsule did not show any differences in the transcriptome of liver, kidney, andspleen after 1 week of transplantation. In order to reveal the role of association between HA and desmoplakin, we need tounderstand the function of LMW HA and thus we generated transgenic mouse that has extra copy of hyaluronan synthase 2(HAS2) gene. Long-term evaluation of this transgenic mouse will lead to understanding of the function of LMW-HA in theblood, and will ultimately allow us to investigate the role of association of hyaluronan and desmoplakin.

1．緒れ、表皮の細胞接着に重要な役割を果たし、HA 同様皮膚言中に多く存在している事が知られている。細胞内においてヒアルロン酸（Hyaluronan：HA）は直鎖状のグリコサミ

デスモプラキンはデスモコリンやデスモグレインといったノグリカンで細胞外マトリックスの主要な構成要素の一つ細胞接着分子と中間径フィラメントを結びつける役割を果であり、高分子ポリマーとして主に皮膚・筋肉・支持組織たしている。このようにデスモプラキンは主には細胞内で中に存在している。これらの高分子 HA は高い保水作用を機能すると考えられているものの、一方で意義は不明なが有し構造的な役割を果たすだけでなく、CD 44 などの受容らデスモプラキンが細胞外マトリックス中にも存在する事体との結合により制御されるシグナル伝達を介して様々なが確認されている 2）。細胞外に放出されたデスモプラキン

細胞機能を調節している。HA は肌に弾力を与える成分とが多量体化する場合、デスモプラキンを介して HA が架橋して、既に化粧品や美容品に広く用いられている物質であされ、その事によって HA の大きさが変化し機能にまで変り、その保水作用に留まらない複雑な生理作用が詳細に解化が生じる可能性が考えられる。また基本的に細胞内に存明されれば HA の利用を最適化し、これを含む化粧品や美在するデスモプラキンが一部細胞外にも存在しているよう容品の改善に繋げていく事が可能となる。重要な事に、に、通常細胞外に存在するヒアルロン酸についても一部細HA が細胞に及ぼす機能はそのポリマー長（分子量）に大き胞内に存在している事が報告されている 3）。したがって、く依存する。

細胞内における HA とデスモプラキンなどのデスモソーム

しかし、ヒアルロン酸の大きさを規定するのは、単一の構成タンパクとの結合がデスモソームの形成や機能に影響ヒアルロン酸分子のポリマー長だけではない事が近年明らを及ぼしている可能性も考えられる。そこで本研究では細かになりつつある。生体内の細胞外マトリックス中の HA

胞外マトリックスにおけるタンパク質との相互作用に基づ

1）はタンパク質による架橋を受ける場合があり 、したがっく HA の機能調節の実態、および細胞内の HA の意義を明て HA とタンパクの相互作用を包括的に捉える事が HA のらかにし、それらの皮膚機能との関係を解明する事を目指生体機能を正しく理解する上で重要である。我々は細胞培した。

養上清において HA と結合する細胞外マトリックス成分を２．方質量分析により初めて網羅的に解析し、デスモソーム構成因子、特にデスモプラキンが強く HA と結びついている事を見出した。興味深い事にデスモソームは接着斑とも呼ば法

2. 1. HEK293T細胞の培養とトランスフェクション
HEK 293 T 細胞は ATCC より入手し、10 % FBS を含むDMEM の中で 37 ℃、5 % CO 2 の条件下で培養を行った。

Investigation of the role of associationof hyaluronan and desmosome proteinson skin function
Masaki Takasugi
Department of Pathophysiology, Osaka
Met ropolita n University Graduate
School of Medicine

デ ス モ プ ラ キ ン 発 現 ベ ク タ ー は、HEK 293 T 細 胞 よ り
KOD FX DNA ポリメラーゼ（TOYOBO）を用いてクローニングしたデスモプラキン遺伝子を In Fusion kit（Takara）によって pEF vector に組み込んだものを使用した。pEF3 xFLAG -デスモプラキンはPEI-Maxを用いてHEK 293 Tにトランスフェクションし、トランスフェクション後 48~72− 119 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 31, 2023

時間の細胞をスクレーパーで剥がして 1 % Triton buffer にタンパク質を 10 種類同定した。最も HA との結合量が多溶解して細胞ライセートを調製した。

い（質量分析で多く検出された）タンパク質はデスモソームの重要な構成因子であるデスモプラキン（DESP）であり、2. 2. ELISAによるHAとデスモプラキンの結合の解析驚いた事に同定した 10 種類のタンパク質中 4 種類のタンマルチソープ 96 ウェルプレートに 10 mg/ml、100 µl のパク質がデスモソームの構成因子であった（DESP、PLAK、

LMW-HA または PBS を分注し、16 時間静置しコーティ

DSC 1、DSG 1）。HA との結合量が 2 番目に多いタンパクングを行った。0 . 02 % TBST で１回洗浄後、2 ％ milk/ 2 %質は既に HA と結合する事が報告されている ITIH 2 であTriton-X 100 100 µL を加え 4 ℃で 16 時間ブロッキングをった事から、本実験は HA と結合するタンパク質を確かに行った。pEF- 3 xFLAG -デスモプラキンをトランスフェ回収する事ができていると考えられる。したがってこれらクションした HEK 293 T をスクレ ーパーで 剥 がして 2 ％の結果から細胞外マトリックスにおいて HA がデスモソーtritoni bufferに溶解したライセート（タンパク質濃度 0 . 13 mg/ム構成タンパク質、特にデスモプラキンと相互作用していml）に HRP-conjugated anti-FLAG antibody（SIGMA）をる事が強く示唆された（図 1 A、B）。デスモソームは細胞

1 : 1000 倍希釈で添加し 4 ℃で 16 時間反応させたものをサ内において他のデスモソーム構成タンパクとの結合を介しンプルとし、これをブロッキング液を除いた 96 ウェルプレて局所に集積する事が知られており、同様な集合・多量体ートに 100 µl 加えた。４℃で２時間反応させ、2 ％ Triton化が細胞外でも起こっているとすれば、そこに結合するbuffer で 4 回洗浄を行ったのち、ECL mixture 100 µl を加HA も架橋されるものと予想される（図 1 C）。
しかしながら、1 回の質量分析の結果だけでは、実験者え、発光を計測した。

３．結の手指上にも多く存在し実験環境におけるコンタミネーシ

果ョンのリスクが比較的大きいと考えられるデスモプラキン

ヒトの皮膚の中でヒアルロン酸が細胞外マトリックス中が本当に HA と結合しているかどうかを結論する事はできでどのようなタンパク質と相互作用しているのかを明らかないと考えられた。そこでデスモプラキンと HA との結合にするため、まず広範に使われる細胞株である正常ヒト線を裏付けるため、HEK 293 T 細胞にデスモプラキン発現プ

維芽細胞 IMR 90 を通常の EMEM 培地中で培養し、そこにラスミドをトランスフェクションしデスモプラキンを一過ビオチン標識した HA を加えて 24 時間培養を続けた後、的に過剰発現させ、そのライセートをビオチン標識 HA と培地中でビオチン標識 HA に結合しているタンパク質を回混合した後、ビオチン標識 HA とそれに結合するタンパク収・同定する事を試みた。培地中のビオチン標識 HA とそ質をストレプトアビジン標識マグネットビーズとマグネッれに付随するタンパク質はストレプトアビジン標識マグネトスタンドを用いて回収した。回収されたタンパク質をウットビーズとマグネットスタンドを用いた沈降法によってェスタンブロットにより解析したところ、デスモプラキン

回収し、回収されたタンパク質は質量分析によって同定しが回収されている事が確認され（図 2 A）、したがって質量た。コントロールとしてビオチン標識 HA でなく同量のビ分析の結果を裏付ける事ができた。次に、両者の結合がオチンのみを加えて実験を行った結果、コントロールで検HA に付加したビオチンに由来する実験的アーティファク出されずビオチン標識 HA を用いた場合にのみ検出されるトでない事を確認するために、ストレプトアビジンビーズ

図1HAと細胞外マトリックスタンパクとの結合− 120 −

ヒアルロン酸とデスモソームタンパクとの新規結合が皮膚機能に及ぼす影響の解明を用いた共沈降実験はなく、プラスチックプレートに無標的に有意に発現レベルが変化している遺伝子はなんと一つ識の HA を吸着させ、そこにデスモプラキンを過剰発現さも認められなかった。しかしながらこの結果は必ずしも血せた HEK 293 T 細胞のライセートを反応させた。プレート

中小分子 HA とそのデスモプラキンに対する結合が無意味上の HA にトラップされたデスモプラキンの量を ELISAである事を意味していない。そこで、1 週間の間だけ血中により調べたところ、無標識の HA であってもデスモプラ小分子 HA のレベルを上昇させてその影響を見ようとするキンと結合をする事が確認できた（図 2 B）
。最後に、デスのではなく、ヒアルロン酸合成酵素 HAS 2 をコードするモプラキンがどのようにして細胞外マトリックスに現れる遺伝子を余分に持ち、血中を含め全身で HA レベルが恒常のかを調べるため、最初に実験に用いた IMR 90 の遺伝子的に上昇している HAS 2 トランスジェニックマウスを大発現プロファイルを RNA-Seq により確認したところ、そ阪大学 発生工学研究会の助力を得て作出した。現在、もそもこの細胞は全くデスモプラキンを発現していない事

HAS 2 トランスジェニックマウスの複数の組織で HAS 2が分かった。実は、培養上清中のデスモプラキンは FBS遺伝子の発現レベルが野生型のマウスに比べ確かに上昇し由来のものであり、マウスの血清にも同様に多量のデスモている事の確認を終え、本トランスジェニックマウスを利プラキンが含まれている事が確認できた。実はヒトにおい用した実験の展開に向けて交配によりマウスを増やしていても、腸で発現するデスモプラキンが血中に流れ込む事がる最中である。今後、本マウスが寿命を迎えるまで飼育し、過去に報告されている 。したがって、HA とデスモプラ老化、寿命、その他様々な生理機能について評価を進め、キンの結合はデスモソーム中のデスモプラキンが豊富な皮まずは血中性分子 HA を含む HA の生体内の機能について膚など一部の組織に限局して起こっているのではなく、血評価を進め、その後改めてその機能が HA とデスモプラキ

管の通う全身の組織で起こっているものである事が考えらンとの結合によってどのように影響されるかを調べていくれた。血中の HA は基本的に組織中で生産された HA が部事を予定している。

4）

分的に分解されて生じた比較的分子量の小さいものである

４．考事が知られており、そのような分子量の小さな HA はしば察

しば細胞に対して炎症応答を促進させる作用を発揮する事

本研究を通じて、HA とデスモプラキンの結合を裏付けが報告されている。そこで、血中の小分子 HA とデスモプる事ができたという点においては一定の成功を収める事がラキンとの相互作用の生理的意義を探るにあたり、まずはできたと考えられるものの、デスモプラキンが主に結合し血中小分子 HA そのものが生体に及ぼしている影響を評価ていると考えられる血中小分子 HA については、それ自体する事とした。この事を目的として、内容物を徐放する小の機能を十分に捉える事ができておらず、今後トランスジ型の Alzet 浸透圧ポンプに高濃度の小分子 HA を含む PBSェニックマウスを使った多面的な評価をじっくり進めていを満たし、マウスの背部に埋め込み、1 週間後に解析を行く必要があり、その結果 HA とデスモプラキンの結合が持った。マウスの生体内において小分子 HA を代謝する役割つ生理機能の解明という本研究の最終目標については、目を担っている肝臓、腎臓、脾臓について、小分子 HA を投標に向けて進み続ける事はできているものの、その都度ゴ与したマウスと PBS だけを投与したマウスそれぞれ 4 個ールポストが遠のくといった具合で、まだまだ時間がかか体の遺伝子発現プロファイルを RNA-Seq により比較したってしまうものと思われる。とはいえ、細胞外マトリック

ところ、HA の投与により血中の HA レベルは持続的に 2

ス中のデスモプラキンの由来が血中由来であったことは、倍程度に上昇している事が確認されたにも関わらず、統計HA とデスモプラキンの相互作用が皮膚に限らず全身性に

図2− 121 −コスメトロジー研究報告 Vol. 31, 2023

起こりうる事を意味するものであり、本研究の波及効果を週間にわたり 2 倍程度まで高めただけでは、肝臓や腎臓、高めるものであると考えられる事から、予想外の遅延を生

脾臓の遺伝子発現プロファイルには影響が認められず、しじているとはいえ、研究の有益性が損なわれているというたがって血中小分子 HA 自体がそもそも生体内でどのよう訳ではないと考えられる。また血中小分子 HA のレベルはな働きをしているのかが不明なままで、現状血中小分子ヒトでもマウスでも加齢に伴い大幅に増加していく事が知HA にデスモプラキンが結合する事の意義を問えずにいる。

られており、少なくとも in vitro では小分子 HA の炎症促

しかしながらその解明に向けて既に HAS 2 トランスジェ進作用が多くの研究室で確認されている事から、血中小分ニックマウスを作出しており、今後このマウスを用いてま子 HA の生体内における機能と、それが血中小分子 HA とずは長期の血中小分子 HA レベルの上昇がもたらす影響をデスモプラキンとの結合によってどう調節されるかを明ら解明し、次いでその影響が HA とデスモプラキンとの結合かにする事ができれば、高齢化社会が進む中で重要性が高によってどのように調節されるかを明らかにしていく予定

まりつつある抗加齢医学の発展にも寄与できる可能性が考である。

えられる。今後 HAS 2 トランスジェニックマウスを用い血中小分子 HA レベルが長期にわたって上昇した場合にマ（引用文献）

ウスに生じる影響を明らかにし、それに基づいて血中小分

1） Lesley et al. TSG-6 modulates the interaction be-

子 HA の機能がデスモプラキンとの結合によりどのようにtween hyaluronan and cell surface CD44. J Biol Chem

影響されるかを評価していく。

５．総

279, 25745-54（2004）
2） Schiller et al. Time- and compartment-resolved pro-括

teome profiling of the extracellular niche in lung injury本研究を通じて細胞外の HA が同定しているタンパク質and repair. Mol Syst Biol 11, 819（2015）を明らかにし、HA が特にデスモプラキンを始めとするデ

3） Skandalis et al. Intracellular hyaluronan: Importance

スモソーム構成タンパクと結合している事が複数の実験か

for cellular functions. Semin Cancer Biol 6 2, 2 0-3 0ら裏付けられた。当初の予定と異なり HA とデスモプラキ（2020）

ンの結合は皮膚などの局所ではなく主に血中で起こってい4） Yau et al. Serological Epithelial Component Proteins

る事が示され、当研究の波及効果の高さが示唆された。しIdentify Intestinal Complications in Crohnʼs Disease.

かしながら、血中小分子 HA は in vitro の実験からは炎症

Mol Cell Proteomics 16（7），1244-57（2017）促進作用が示されているものの、そのレベルを生体内で 1− 122 −