The Journal of Farm Animal in Infectious Disease
Vol.9 No.2･3 2020

MOLECULAR SURVEY OF ENDOCARDITIS AGENTS

原著論文

分子生物学的手法を用いた牛の心内膜炎に関与する細菌の検索
森川真子 1）* 渡邉謙一 1） 古林与志安 1） 猪熊壽 1）**

1）

帯広畜産大学獣医学研究部門〒 080-8555

北海道帯広市稲田町西 2 線 11

現所属 :
*  

：愛知県農業共済組合 〒 442-0811**：東京大学農学部

動物医療センター

連絡責任者氏名：猪熊
連絡先：〒 113-8657

愛知県豊川市馬場町宮脇 165〒 113-8657

東京都文京区弥生 1-1-1

壽
東京都文京区弥生 1-1-1

東京大学農学部

動物医療センター

TEL: 03-5841-5421 FAX: 03-5841-8012
E-mail: ainokuma@g.ecc.u-tokyo.ac.jp［要約］

牛の心内膜炎病変形成に関与する培養困難な細菌を明らかにする目的で、心内膜炎の疣贅物を対象として、分子生物学的手法を用いた菌種同定を行った。病理解剖によって心内膜炎と確定診断されたホルスタイン種牛 22 症例由来の疣贅物を材料とし、好気性および嫌気性細菌培養のほか、16S rRNA 遺伝子を標的とする broad-range PCR とシーケンス解析により細菌の検出と種の同定を行った。細菌培養
Truperella pyogenes（T.
では Streptococcus spp. が最も多くの症例から分離され、次いで Pseudomonas spp.、
pyogenes）、Staphylococcus spp.、Corynebacterium spp.、Acinetobacter spp. が分離された。一方で、分離培養できなかった Helcococcus ovis（H. ovis）がシーケンス解析では 22 例中 6 症例（27.3％）で検出され、また Fusobacterium necrophorum（F. necrophorum）、Peptoniphilus indolicus（P. indolicus）および Pseudomonas
spp. の遺伝子も検出された。さらに H. ovis 特異的 PCR では 15 症例（68.1%）、T. pyogenes 特異的 PCR
で は 13 症 例（59.1 ％）、Streptococcus spp. 特 異 的 PCR で は 4 症 例（18.2 ％）、F. necrophorum 特 異 的PCR では 3 症例（13.6％）が陽性を示した。牛の心内膜炎病変形成には、従来から報告されている細菌に加えて、H. ovis、F. necrophorum および P. indolicus が関与している可能性が示唆された。
キーワード：心内膜炎、原因菌、PCR、シーケンス

心内膜炎は血液中に侵入した細菌が心内膜に病変から細菌培養により分離される主要な細菌

付着・増殖することで疣贅物を形成し、弁の閉としてTrueperella pyogenes（T. pyogenes）や鎖不全や弁口部の狭窄による循環障害を引き起Streptococcus spp.、Staphylococcus spp. が知ら

こす［4, 5, 13, 16］。また、血流を介し疣贅物

れている［5, 13, 16］。しかし、血液寒天培地

から細菌が全身に播種し二次的な化膿性病変のを用いた24時間程度の好気または嫌気培養では原因となる ［5, 13, 16］。牛の疣贅性心内膜炎

分離できない細菌や培養に長時間を要する細菌が心内膜炎に関与している場合には、原因菌が見逃される可能性が大いにある。培養困難な細受付：2020年4月16日
受理：2020年5月20日

菌の検出にシーケンス解析技術が医学・獣医学－ 61 －

家畜感染症学会誌
9 巻 2・3 号 2020

分子生物学的手法を用いた牛の心内膜炎に関与する細菌の検索領域で用いられている［11］。本法を用いて増幅した（表 2）［10］。陽性検体についてはBartonella bovisやHelcococcus ovis（H. ovis）のQIAquick ® PCR Purification Kit（QIAGEN）

遺伝子が牛の心内膜炎病変から検出されているを用いて PCR 産物を精製した後、その 4µl を［1, 6, 7, 15, 20］。しかし、これまで牛の心内Sequence mix（BigDye™ Terminator v3.1膜炎臨床例について、分子生物学的方法を用い

Cycle Sequencing Kit, Thermo Fisherて病変形成に関与する細菌が検索されたことはScientific, Vilnius, Lithuania）0.5 µl、buffer 2.0

ない。そこで、本研究では心内膜炎と診断されµl、シーケンスプライマー（10 pmol/µl）1.0

た牛22症例の疣贅物を材料に、16S rRNAの塩µl、蒸留水 2.5 µl に添加してシーケンス反応を

基配列解析および種または属特異的PCRを実施行った。ダイレクトシーケンスでは 600 ～ 700

し、心内膜炎病変形成に関与する細菌を検索す

bp しか決定できないため、約 1400 bp の長さることを目的とした。

の配列決定を目的として前述の 8UA、1485Bのほか、シーケンスプライマーとして 8UA の 5’

材料および方法

末 端 か ら 519 番 目 の 塩 基 の 位 置 に 3’ 側 へ

供試牛および疣贅物の処理

519F を、また 5’側へ 519R を、さらに 8UA2006 年 4 月～ 2017 年 10 月に病性鑑定のたの 5’末端から 907 番目の塩基の位置 3’側へ

め帯広畜産大学に搬入され、病理解剖によって907F を設計した（表 3）。シーケンス反応後は心内膜炎と確定診断された牛のうち、疣贅物が

ABI PRISM 3500 Genetic Analyzer（Thermo

マイナス 30℃に保存され、かつ細菌培養デー

Fisher Scientific）を用いて塩基配列を決定しタが保存されていた 22 症例を用いた。症例はた。 得 ら れ た 塩 基 配 列 は BLAST（http://

いずれも十勝管内に飼養されていたホルスタイ

blast.ncbi.nlm.nih. gov/）を用いて、既知遺伝

ン種雌牛で、月齢は 9 ～ 123（平均 57）であっ子配列との相同性を検索した。約 1400 bp の塩た。主な臨床所見としては心内膜炎に由来する

基配列と、既知の菌種の 16S rRNA 遺伝子とと思われるうっ血性心不全症状や心雑音のほの配列類似性が 98.7% より高い場合に当該菌種

か、跛行または関節腫脹、肺音粗励、乳房炎なと同定した［19］。

どが認められた（表 1）。疣贅物をディスポー
特異的 PCR

ザブルのメス刃によって細断後、QIAamp ®
DNA Mini Kit（QIAGEN GmbH, Hilden,

各疣贅物材料については、前項で抽出した

Germany）を用いて定法に従い DNA を抽出し、

D N A を 鋳 型 と し 、 H . o v i s 、 T. p y o g e n e s 、

解析までマイナス 30℃で保存した。疣贅物のS t r e p t o c o c c u s s p p .および F u s o b a c t e r i u m

細菌培養については、株式会社第一岸本臨床検

necrophorum（F. necrophorum）を特異的に増幅査センター（札幌市）に委託して実施した。すする、種特異的または属特異的PCRを既報に

なわち細断した疣贅物を 5% 羊血液寒天培地に従って実施した［2, 9, 14, 20］。使用したプラ

スタンプし、好気および嫌気条件下においてイマーを表2に示す。

37℃で 17 ～ 20 時間培養釣菌した。その後分離結果された純培養菌について、各種性状確認培地を細菌培養検査用いた生物学的性状解析および生化学的性状を解析し、属または種を同定した。なお、複数の細菌培養検査結果を表1に示す。細菌培養で弁に疣贅物が認められた症例については、材料

はStreptococcus sp. が8症例（36.4％）から分離

毎に DNA 抽出と細菌培養を行ったが、結果はされ最も多くを占めた。次いでPseudomonas

症例ごとにまとめて記載した。

sp.4症例（18.1％）、T. pyogenesとStaphylococcus
sp.各3症例（13.6％）、Corynebacterium sp.とBroad-range PCR とシーケンス解析

Acinetobacter sp. が各2症例（9.5％）から分離さBroad-range PCR による細菌検索にはユニれた。その他、Micrococcus sp.、Xanthomonas

バーサルプライマー 8UA/1485B を用いて細菌

maltophilia、Escherichia coli、Enterococcusの 16S rRNA 遺伝子約 1400 bp の塩基配列を

faecaris、Proteus vulgaris、Myroides odoratus、－ 62 －

○

○

ー

ー

○

ー

ー

○

13

46

9

123

50

65

64

71

28

27

9

52

29

48

57

83

35

79

66

97

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

－ 63 －

18

19

20

21

22

○

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ー

○

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○

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ー

ー

胸壁膿瘍

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ー

下痢

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ー

放線菌症

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ー

ー

皮下膿瘍

ー

発熱

ー

ー

ー

鼻出血

ー

ー

ー

ー

ー

PV

TV

TV

TV

TV

PV, MV, AV

PV

TV

TV

TV

PV

PV, MVTV

TV, PV, MV

TV

TV

PV, MV, AV

TV

MV

PV

TV

TV, MVa) TV:：三尖弁、MV：僧帽弁、PV：肺動脈弁、AV：大動脈弁

ー

○

○

○

○

○

ー

○

ー

ー

○

○

○

2

○

89

105

1

心内膜炎以外の臨床症状
a)No. 月齢 跛行または 肺音
その他の 疣贅物部位
乳房炎
関節腫脹
病態
粗励
+
+
+
+
+
+

+
+

+
+

Helcococcus ovis
Helcococcus ovis
Helcococcus ovis
Helcococcus ovis
Helcococcus ovis
Helcococcus ovis
Trueperella pyogenes
Trueperella pyogenes
Trueperella pyogenes
Trueperella pyogenes
Trueperella pyogenes
Trueperella pyogenes
Streptococcus sp.
Streptococcus sp.
Streptococcus sp.
Streptococcus sp.

+-

Pseudomonas sp.
Alysiella sp.

++

Fusobacterium necrophorum

種の同定に至らず+

Fusobacterium necrophorum

Peptoniphilus indolicus+

H.ovisBroad range PCRとシーケンス

+

+

-

+

+

+

-

-

-

+

+

+

+

+

+

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+

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+

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+

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T. pyogenes

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+

+

+

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-

-

-

-

+

-

-

-

-

spp.

Streptococcus

種または属特異的PCR

心内膜炎病畜の情報及び疣贅物の細菌検査結果

Fusobacterium necrophorum

表１

-

-

-

+

+

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

-

-

-

-

F. necrophorum

Pseudomonas aeruginosa

Staphylococcus sp.

Streptococcus sp.

Xanthomonas maltophilia

Acinetobacter sp.

Pseudomonas aeruginosaActinomyces sp.

Micrococcus sp.

Pseudomonas sp.

Acinetobacter sp.

Streptococcus sp.

分離されず

Staphylococcus sp.

Streptococcus uberis

Staphylococcus sp.

Streptococcus uberis

Achoromobacter xylosoxidans

Streptococcus sp.

Corynebacterium sp.

Alcaligenes sp.

Streptococcus sp.

Streptococcus sp.

Pseudomonas sp.

Escherichia coli

Streptococcus bovis

Trueperella pyogenes

Trueperella pyogenes

Myroides odoratus

Proteus vulgaris

分離されず

Pasteurella multocida

Enterococcus faecalis

Trueperella pyogenes

Corynebacterium aquaticum

細菌培養

The Journal of Farm Animal in Infectious Disease
Vol.9 No.2･3 2020
MOLECULAR SURVEY OF ENDOCARDITIS AGENTS

家畜感染症学会誌
9 巻 2・3 号 2020

分子生物学的手法を用いた牛の心内膜炎に関与する細菌の検索

表２

本研究に用いたプライマーの塩基配列

用途・プライマー名

配列（5’ →3'）

文献

Broad-range PCR
8UA

AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG

10

1485B

TAC GGT TAC CTT GTT ACG AC

10

519F

CAG CMG CCG CGG TAA T

新規

519R

ATT ACC GCG GCK GCT G

新規

シーケンス反応

907F

AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG
Helcococcus ovis 特異的PCR

新規

Hel-1FACA CAT GCA AGT TGA ACG A

18

Hel-1R

GCG ATA TCT AAG TGT CAT AAG GT

18

ploF

CGA TCC CTC TGG TGT ACT TGC

2

ploR

GCT TGA CAA AAA TCT GGC GTC C

2

Str1

GTA CAG TTG CTT CAG GAC GTA TC

12

Str2

ACG TTC GAT TTC ATC ACG TTG

12

TP1

TCT ACG TAT GCC TCA CGG AT

9TP2ATC CTC ATC CTC ATA TTC CT

9

Truperella pyogenes 特異的PCR

Streptococcus spp. 特異的PCR

Fusobavterium necrophorum 特異的PCR

Achoromobacter xylosoxidans、Alcaligenes sp.、

（18.2％）、F. necrophorum 特異的 PCR では 3 症

Pasteurella sp.、Actinomyces sp. が各1症例

例（13.6％）が陽性を示した。特異的 PCR で 2（4.8％）から分離された。

種類に陽性を示したものは 22 症例中 9 症例
（40.9％）で、うち H. ovis と T. pyogenes が 6 症

Broad-range PCR とシーケンス解析

例（27.3％）、H. ovis と Streptcoccus spp. が 2 症

Broad-range PCRとシーケンス解析の結果を例（9.1％）、H. ovis と F. necrophorum が 1 症例

表1に示す。Broad-range PCRでは検索した22（4.6％）であった。3 種類が陽性を示したもの

症例全てで陽性反応が認められた。PCR産物のは 2 症 例（9.1 ％） で、 い ず れ も H. ovis、T.

シーケンス解析により同定された菌種として

pyogenes および F. necrophorum であった。

は、H. ovisとT. pyogenes が最も多く各6症例

考察（27.3％）から検出された。次いでStreptococcus
sp.が4症例（18.2％）、F. necrophorum が3症例、本研究では、培養に長時間を要する細菌やP e p t o n i p h i l u s i n d o l i c u s（ P. i n d o l i c u s ）、

生化学性状のみによる同定が難しい細菌も含め

Pseudomonas sp.および Alysiella sp.が各1症例て、牛の心内膜炎に関与する菌を明らかにする（4.6％）から検出された。症例22の疣贅物由ことを目的として、分子生物学的方法を用いて、来の塩基配列ではシーケンスに複数の波形が出

心内膜炎症例の疣贅物から細菌遺伝子の検出を現し解析不能であった。

試みた。なお、細菌検出にあたって、従来法であ る 細 菌 培 養 検 査 を 併 用 し た と こ ろ、種または属特異的 PCR

Streptococcus sp. が最多 8 症例（38.1 ％）で分

22 症例の心内膜炎疣贅物を材料とした種ま

離 さ れ、 次 い で Pseudomonas sp.（19.1%）、T.

たは属特異的 PCR の結果を表に示す。22 症例

pyogenes（14.3%）、Staphylococcus sp.（14.3 ％）中、H. ovis 特異的 PCR では 15 症例（68.2％）、が分離された。これらの細菌は牛の心内膜炎のT. pyogenes 特異的 PCR では 13 症例（59.1％）、

主要起因菌とされているが［5、13, 16］、本研

Streptococcus spp. 特 異 的 PCR で は 4 症 例

究においても分離細菌の多くを占めた。

－ 64 －

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Vol.9 No.2･3 2020

MOLECULAR SURVEY OF ENDOCARDITIS AGENTS

一方、分子生物学的手法を用いた細菌検索で

では、細菌検査に提出するまでの時間や材料のは、22 症例全てで broad-range PCR が陽性を保管方法に問題があった可能性も考えられた。

示し、また、ダイレクトシーケンスによるシー

一方、細菌培養により分離されたにもかかわらケンス解析により 21 症例で細菌の属あるいはず 特 異 的 PCR が 陰 性 で あ っ た 検 体 が T.

種を同定できた。とくに、H. ovis は T. pyogenes

pyogenes（No.7） と Streptococcus sp.（No.8, 9,と並び最も優勢に検出された（27.3 ％）。さら

10, 12, 13 および 20）において認められた。こに、H. ovis 特異的 PCR では 22 症例中 15 症例

れは分離菌の遺伝子性状の違いにより、用いた（68.2 ％）が陽性を示した。これらのことから、

プライマーセットで増幅されなかった可能性がH. ovis が牛の心内膜炎病変形成に関与する主考えられたが、今回は分離株の塩基配列を決定要な菌種の一つであると考えられた。H. ovis

しておらず詳細は分からなかった。

はカタラーゼ陰性通性嫌気性のグラム陽性球菌

Broad-range PCR 陽性を示したが、塩基配で、発育が極めて遅く［20］、培養のみによる列が決定できなかったものが 1 症例あったが、検索ではこれまで見逃されてきたと考えられその原因はシーケンス結果に複数の波形が重る。本菌は、牛のほか、めん羊、馬、豚の化膿なったためであり、複数種の細菌遺伝子が増幅

性 病 変 か ら も 分 離 さ れ て お り［1, 6, 7,15,17,

されたことが考えられた。今回の結果から、疣

21］、我が国の広範囲な地域の家畜に分布して贅物形成には複数の細菌が関与することが明らいると思われる。今回 H. ovis が検出された症かであり、broad-range PCR で複数の細菌が同例ではいずれも他の細菌との混合感染が認めら時に増幅されることは十分生じうると思われる

れているため、心内膜炎の病態形成における本

ため、クローニングまたは 16S rRNA メタゲ菌の役割については明確にはできなかった。

ノム解析を用いた塩基配列決定も必要と考えら

分子生物学的手法により F. necrophorum およれる。なお、今回 broad- range PCR とシーケ

び P. indolicus が検出された症例は、いずれもンスにより、単独の菌種だけが優勢に増幅され細菌培養でこれらの細菌が検出されなかった。

た原因については、材料中の細菌の DNA 量の

F. necrophorum と P. indolicus は、どちらも偏性差が反映される、あるいは菌種により増幅効率

嫌気性細菌であり、専用容器以外での保管や輸が異なることも考えられたが、確定はできな

送等、検体の取扱いが不適切であると培養陰性かった。

になることもある［10］。また、治療として抗今回の検索結果から、牛の心内膜炎に関与

菌薬が先行投与されている場合にも培養陰性とす る 細 菌 と し て、 従 来 か ら 報 告 さ れ て い る

な る こ と が あ る［12］。F. necrophorum は 牛 のS t re p t o c o c c u s s p . 、 P s e u d o m o n a s s p . 、 T.

常在菌であり、後大静脈血栓症、肝膿瘍、子牛

pyogenes、Staphylococcus sp. に加えて、H. ovis、のジフテリー、趾間腐乱等の化膿性疾患の原因

F. necrophorum および P. indolicus が関与してい菌として知られている［3］。一方、P. indolicus

る可能性が示唆された。とくに、H. ovis は高はグラム陽性偏性嫌気性球菌で、人の皮膚、消率に検出されており、今後その病原性を検討す

化管、産道の細菌叢を構成し、眼科領域や皮膚る必要がある。また、心内膜炎等に関与する細軟部組織感染症で分離される［8, 18］。これま菌の検索には、培養だけでなく PCR やシーケ

で医療および獣医療分野において、心内膜炎材

ンス解析の併用が有用であることが確認され料から P. indolicus が分離・検出されたことはた。

なく、牛における病原性は不明である。

引用文献

T. pyogenes と Streptococcus sp. は好気培養によって比較的容易に分離できる細菌であるが、今回培養陰性で PCR で検出されたものは、T.
pyogenes で 12 検体、Streptococcus sp. で 2 検体であった。細菌培養では生菌しか分離できないのに対し、PCR では生菌と死菌両方の DNAを検出可能である、今回培養陰性となった検体［1］ Colins, M.D., Falsen, E.,Foster, G., Monasterio, L.R.,
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分子生物学的手法を用いた牛の心内膜炎に関与する細菌の検索

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－ 66 －

The Journal of Farm Animal in Infectious Disease
Vol.9 No.2･3 2020

MOLECULAR SURVEY OF ENDOCARDITIS AGENTS

Molecular survey of bacteria associated with bovine endocarditis
Mako Morikawa1)*, Ken-ichi Watanabe1), Yoshiyasu Kobayashi1), Hisashi Inokuma1)**1)

 epartment of Veterinary Science, Obihiro University of Agriculture & Veterinary Medicine, Inada, Obihiro,
D
Hokkaido 080-8555, Japan
Present address*: Aichi Prefecture Agricultural Mutual Aid Association 165 Miyawaki, Baba-machi, Toyokawa, Aichi 442-0811, Japan**: Veterinary Medical Center, Graduate School of Agriculture and Life Science, The University of Tokyo, 1-2-1 Yayoi,
Bukyo-ku, Tokyo 113-8657, Japan
Corresponding to: Hisashi Inokuma
Veterinary Medical Center, Graduate School of Agriculture and Life Science, The University of Tokyo,
1-2-1 Yayoi, Bukyo-ku, Tokyo 113-8657, Japan
TEL: 03-5841-5421, FAX: 03-5841-8012, E-mail: ainokuma@g.ecc.u-tokyo.ac.jp【Abstract】
In order to identify bacteria involved in bovine endocarditis, vegetations from endocarditis in Holstein cows
were analyzed using molecular biology techniques. A combination of broad-range PCR and sequence analysis forthe 16S rRNA gene, as well as aerobic and anaerobic bacterial cultures, were used to detect and identify bacteria invegetations obtained from 22 cases of endocarditis confirmed at autopsy. Streptococcus spp. was the mostfrequently isolated bacteria from cultures, followed by Pseudomonas spp., Truperella pyogenes (T. pyogenes),
Staphylococcus spp., Corynebacterium spp, and Acinetobacter spp. Helcococcus ovis (H. ovis), which was not
isolated from cultures, was detected in 6 cases (27.3%) by broad-range PCR and sequence analysis. Fusobacterium
necrophorum (F. necrophorum), Peptoniphilus indolicus (P. indolicus), and Pseudomonas spp. were also detectedby broad-range PCR and sequence analysis. Species- or genus-specific PCR revealed that 15 cases (68.1%) werepositive for H. ovis, 13 cases (59.1%) for T. pyogenes, 4 cases (18.2%) for Streptococcus spp., and 3 cases (13.6%)
for F. necrophorum. Our findings suggest that, in addition to previously reported bacteria, H. ovis, F. necrophorum,and P. indolicus may be involved in the formation of endocarditis lesions in cattle.
Keywords: endocarditis, etiology, PCR, sequence－ 67 －