病原体由来および自己由来二本鎖 RNA がインターフェロン非依存的にコラーゲン産生を抑制する機構の解明
大阪大学大学院薬学研究科分子生物学分野

櫻井文教

Production of extracellular matrices, including collagen and fibronectin, is highly important for not only beauty andmoisturizing, but also biological defense system, such as maintenance of barrier ability and anti-inflammatory responses,
in the skin. Dermal fibroblasts mainly produce extracellular matrices in the skin. Therefore, regulation of extracellularmatrix production in the dermal fibroblasts is highly important. We previously found that double-stranded RNA (dsRNA)
suppressed the expression of extracellular matrices in the activated hepatic satellite cells. Dermal fibroblasts are also
exposed to not only pathogen-derived dsRNA but also endogenous dsRNA. These findings made us hypothesize that
pathogen-derived and endogenous dsRNA activated innate immune responses in the skin fibroblasts, leading to reduction in
extracellular matrix production in the skin. In this study, treatment with a synthetic dsRNA, polyI:C, resulted in significant
reduction in the expression of extracellular matrices, without significant reduction in the viabilities of normal human dermalfibroblasts. Furthermore, a short dsRNA (19 bp) also induced down-regulation of fibrotic marker gene expression in normal
human dermal fibroblasts. These results indicated that dsRNA is a hazard for skin by down-regulating the production of
extracellular matrices.

１．緒る polyI : C や二本鎖 RNA をゲノムに持つレオウイルスを言作用させることで、1 型インターフェロン（IFN）非依存的皮膚におけるコラーゲンやファイブロネクチンなどの細胞外マトリックスの産生は、皮膚の美容・保湿のみならず、バリア能の維持や抗炎症応答などの生体防御機構に極め
1）に、TGF-β/Smad シグナルおよびコラーゲン産生を抑制し、線維化を解消することに成功した。
近年、皮膚も日常生活のなかで、様々な二本鎖 RNA にて重要である 。皮膚において細胞外マトリックスは、主暴露されている。皮膚は、ウイルスや細菌など病原体にに線維芽細胞が産生しているが、線維芽細胞においては常に暴露されているが、ウイルスや一部の細菌は二本鎖Transforming Growth Factor-β（TGF-β）/Smad シグナル

RNA を多量に産生する。また、ケラチノサイトでは紫外が細胞外マトリックスの産生・分解制御に重要な役割を果

線照射により snRNA などのノンコーディング RNA が変性2）たしている 。したがって皮膚の健康・恒常性を保つためしたのち放出され、二本鎖 RNA として Toll-like receptorには細胞外マトリックスの産生・分解を適切に制御する必3（TLR 3）を介して炎症応答を誘導する 4）。さらに最近で要があり、そのためには TGF-β/Smad シグナルの制御がは、ミトコンドリア DNA より二本鎖 RNA が産生させる重要と考えられる。

ことが報告されている 5）。このような背景から、皮膚の線

著者らは近年、肝線維化などの線維化治療に関する研究

維芽細胞などが、病原体もしく自己由来の二本鎖 RNA にに取り組んでいる。線維化では、各組織の線維芽細胞にお暴露することによって、1 型 IFN 非依存的に TGF-β/Smad

いて TGF-β/Smad シグナルが過剰に活性化し、細胞外マシグナルが抑制され、コラーゲンなどの細胞外マトリックトリックスが過剰産生され蓄積することが原因となってスの産生抑制や分解促進、ひいては皮膚の保湿・バリア能いる 3）。線維化は、肝臓のみならず皮膚、腎臓、肺などあが低下するのではないかと考えた。そこで本研究では、病らゆる部位で発症し、多くの患者が苦しんでいるにもか原体由来および自己由来の二本鎖 RNA による I 型 IFN 非かわらず、効果的な治療薬が極めて少ないことから、ア依存的な細胞外マトリックス産生抑制の評価、およびそのンメットメディカルニーズの高い疾患となっている。著メカニズム解明を目的として検討を行った。

者は、活性化した肝星細胞（肝臓に局在する間葉系細胞２．方で、肝線維化の原因となる細胞）に、合成二本鎖 RNA であ法

2 . 1. 細胞培養
Elucidation of mechanism of suppression ofcollage production by pathogen-derived
and endogenous double-stranded RNA in
an interferon-independent mannerFuminori Sakurai
Graduate School of PharmaceuticalSciences, Osaka University

正常ヒト皮膚由来線維芽細胞は、Dulbecco’ s modified
eagle medium（DMEM）（High glucose）（10 % fetal bovineserum（FBS），antibiotics 含 有 ）で 培 養 し た。 ヒ ト 肝 星
細 胞 株 で あ る LX- 2 細 胞 は、Dulbecco’ s modified eagle
medium（DMEM）（High glucose）（2 % FBS, antibiotics 含有）で培養した。実験の際には、12 時間 FBS 非含有培地− 100 −

病原体由来および自己由来二本鎖 RNA がインターフェロン非依存的にコラーゲン産生を抑制する機構の解明で培養したのち、TGF-β を終濃度 2 ng/ml で添加し 16 時

1 : 1000），anti-β-actin antibody（Sigma-aldrich, 1：2500）。

間培養したのちに実験に使用した。尚、使用した FBS は、

３．結56 ℃、30 分間の非働化処理を行った後に使用した。

果

まずはじめに正常ヒト皮膚線維芽細胞に二本鎖 RNA お

2 . 2 . レオウイルスの調製

よびレオウイルス作用後の細胞生存率を検討した。polyI:

レオウイルスを L 929 細胞に感染させ、2 日後に細胞をC 単独、polyI : C/Lipofectamine RNAiMAX 複合体、およ回 収・ 遠 心 後、HO buffer（1 M Tris-HCl（pH 7 . 5）、5 M

びレオウイルスを作用させたところ、用いた用量の範囲にNaCl、10 mM 2 -mercaptoethanol）に懸濁した。超音波処

おいては、正常ヒト線維芽細胞の細胞生存率に有意な低下

理を 4 秒間行ったのち、凍結融解により細胞を破壊した。

は観察されなかった（図 1）。そこで次に、ヒト線維芽細胞得られた細胞破砕液に、Vertrel（三井・デュポン フロロにおけるコラーゲンやファイブロネクチンなどの細胞外マケミカル）を全液量の 2 / 5 加え、超音波処理を 4 秒間行い、トリックスの遺伝子発現量を検討したところ、polyI: C/さらに、同量の Vertrel を加えて超音波処理を 4 秒行った。

Lipofectamine RNAiMAX 複合体群において、有意な低下

これを 9 , 000 g、5 分間遠心し、上清を新しいチューブにが観察された（図 2）。また ELISA によって培養上清中の回収した。回収した液量の 9 / 10 量のVertrelを加えたのち、IFN-β 産生量を検討したところ、polyI: C/Lipofectamine

超音波処理を行い、9 , 000 g、10 分間遠心し、上清を回収

RNAiMAX群でのみ、有意なIFN-β産生が観察された（図 3）。

した。超遠心機のスウィング・ローターのチューブに比重

次に同様の研究を短い塩基長の dsRNA（short dsRNA;

1 . 44 g/cm 3、1 . 22 g/cm 3 の塩化セシウム溶液を順に重層

sdsRNA）を用いて検討を行った。その結果、これらのし、その上に上記のレオウイルス懸濁液を加えて超遠心機

sdsRNA 作用時においてヒト皮膚線維芽細胞の細胞生存率を用いて 27 , 000 rpm、5 . 5 時間遠心した。その後、レオウの低下は観察されなかった。さらにこれらの sdsRNA におイルスのバンドを回収し、10 ｍ M Tris（pH 7 . 5）、1 ｍ M

いても、sdsRNA の濃度依存的に線維化マーカーの発現がMgCl 2、10 ％ glycerol からなる透析バッファーで 1 時間、有意に低下した。さらに Western blotting によって様々な4 ℃で透析し、透析バッファーを交換した後、一晩透析し線維化マーカーの発現を解析したところ、こちらにおいた。回収した懸濁液をレオウイルス懸濁液として回収した。ても線維化マーカーの発現が低下した。さらに sdsRNA による線維化マーカーの発現低下は、1 型 IFN の産生が抑制

2 . 3 . 二本鎖 RNA およびウイルス作用された条件下においても観察された。上記と同様の結果は、

合 成 二 本 鎖 RNA で あ る polyI: C を 培 地 中 に 添 加、 もヒト肝星細胞株である LX- 2 細胞でも観察された。以上のし く は Lipofectamine RNAiMAX を 用 い て Transfection

結果より、二本鎖 RNA は皮膚における細胞外マトリックした。また二本鎖 RNA をゲノムに有するレオウイルススの産生を抑制することが示唆された。

を Multiplicity of infection（MOI）20、100 で作用させた。
19 塩基長の短い二本鎖 RNA（short dsRNA; sdsRNA）は、Lipofectamine RNAiMAX を用いて Transfection した。

2 . 4 . 細胞生存率の評価
正 常 ヒ ト 成 人 皮 膚 線 維 芽 細 胞 を 1 × 104 cells/well で
96 well plate に 播 種 し た。 翌 日、polyI: C、polyI: C/
Lipofectamine RNAiMAX 複合体、sdsRNA およびレオウイルスを作用した。作用 48 時間後に WST- 8 アッセイにより細胞生存率を評価した。

2 . 5 . 遺伝子発現解析
上 記 と 同 様 に、polyI: C、polyI: C/LipofectamineRNAiMAX 複 合 体、sdsRNA/Lipofectamine RNAiMAX複合体、およびレオウイルス作用 48 時間後に total RNAを回収し、定量的 RT-PCR により遺伝子発現解析を行った。
また同様に蛋白質を回収し、Western blotting により蛋白質発現解析を実施した。用いた抗体は以下の通りである。
Anti-α-smooth muscle actin（α-SMA）antibody（Abcam,

図 1 polyI: C, polyI: C/Lipofectamine RNAiMax 複 合 体、Reovirus 作用後の正常ヒト皮膚線維芽細胞の細胞生存率− 101 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 31, 2023

図 2 polyI: C, polyI: C/Lipofectamine RNAiMax 複合体、Reovirus 作用後の正常ヒト皮膚線維芽細胞における線維化マーカーの発現レベル。TGF-â 非作用群の値を 1 とした。

イルスの量が少なかったためと考えられる。レオウイルスの感染受容体は、Junction adhesion molecule-A（JAM-A）
であるが、線維芽細胞では JAM-A の発現が低いことが知られている。そのため、レオウイルスの細胞内取り込み量が少なかったと考えられた。
今回の二本鎖 RNA による線維化マーカー遺伝子の発現抑制メカニズムであるが、二本鎖 RNA が何らかの細胞側因子に認識されることで誘導されているものと予想される。
実際に種々の細胞側因子を siRNA を用いてノックダウンしたが、関与する分子の同定には至らなかった。現在、さらに多くの標的遺伝子をノックダウンし、検討を継続している。
図 3 polyI: C, polyI: C/Lipofectamine RNAiMax 複 合 体、Reovirus 作用後の正常ヒト皮膚線維芽細胞における IFN-â産生量（引用文献）
1） Chambers, E. S. & Vukmanovic-Stejic, M. Skinbarrier immunity and ageing. Immunology 1 6 0,116‒125（2020）．

４．考2） Flanders, K. C. Smad3 as a mediator of the fibrotic

察response. Int J Exp Pathol 85, 47‒64（2004）．

今回、polyI: C/Lipofectamine RNAiMAX 複合体作用群

3） Frangogiannis, N. G. Transforming growth factor–βにおいて細胞外マトリックス遺伝子の発現が有意に低下しin tissue fibrosis. Journal of Experimental Medicine 217,

た。細胞生存率については有意な低下は観察されなかった

e20190103（2020）．

ことから、この細胞外マトリックス遺伝子の発現低下は、

4） Bernard, J. J. et al. Ultraviolet radiation damages self

細胞毒性によるものではないと考えられる。実際に、ハウ

noncoding RNA and is detected by TLR3. Nat Med 18,

スキーピング遺伝子の発現にも変化は見られなかった。

1286‒1290（2012）．

今回、レオウイルスおよび polyI: C 単独作用群において5） Ren, B., Guan, M.-X., Zhou, T., Cai, X. & Shan, G.

は、細胞外マトリックス遺伝子の有意な低下は観察されな

Emerging functions of mitochondria-encoded noncoding

かった。これは、細胞内に取り込まれた polyI: C やレオウ

RNAs. Trends in Genetics 39, 125‒139（2023）．

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