グリコサミノグリカンが脈管形成機構に及ぼす影響の解明
大阪大学大学院歯学研究科顎口腔機能再建学講座（歯科理工学教室）

佐々木淳一

Vasculogenesis is referred to as the assembling of stem cells and endothelial progenitor cells into endothelium andsubsequent formation of nascent capillaries. The elucidation of vasculogenesis of stem cells will facilitate control ofneovascularization and further development of novel cosmetics as well as tissue regenerative therapies. Heparan sulfate (HS)proteoglycans, which are composed of HS glycosaminoglycan chains and covalently attached core protein, are a widelydistributed constituent of extracellular matrices in all mammalian tissues. HS could enhance the binding affinity between
growth factors and related receptors to modulate a variety of biological activities, however little is known about the role of
HS in endothelial differentiation and neovascularization of mesenchymal cells. Dental pulp stem cells (DPSCs), which areclassified as mesenchymal stem cells, are highly proliferative and exhibit a multipotent differentiation ability. Notably, owing
to constitutive expression of vascular endothelial growth factor receptor 1, DPSCs more readily differentiate into vascularendothelial lineages compared with other mesenchymal cells. In this study, we hypothesized that HS highly orchestrates
vasculogenesis of mesenchymal stem cells and the role of HS on endothelial differentiation was investigated by using
DPSCs. It was revealed that an HS antagonist suppressed the sprouting ability and endothelial differentiation of DPSCs.
Silencing of exostosin-1 (EXT1), a crucial glycosyltransferase for HS biosynthesis, in DPSCs significantly altered theirgene expression profile. In addition, EXT1-silenced DPSCs expressed lower levels of endothelial differentiation markers
and displayed a reduced vascular formation capacity compared with control DPSCs transduced with scrambled sequences.
Collectively, these findings indicate the crucial role of HS on endothelial differentiation and vasculogenesis of mesenchymal
stem cells, opening new perspectives for the application of HS to novel cosmetics and regenerative medicine.

１．緒合することで、間葉系幹細胞の血管内皮細胞分化が開始し、言脈管形成能が発揮されることを報告してきた 1 , 2）。しかし、血管は健康の維持・増進に重要であるとされ、特に、血これら血管の形成を促進する増殖因子やサイトカインが多管の 95 % 以上を占める直径 20 μm 以下の毛細血管は免疫く発見されている一方で、その精製タンパク質は非常に高や創傷治癒に大きく関わっていることが知られている。一価なうえに、強い薬理作用が故の生体安全性の問題から血方で、毛細血管の数は加齢によって減少することが報告さ管再生療法への適用は大きく制限されている。

れており、真皮毛細血管の密度や機能の低下は皮膚の老化

近年の糖鎖生物学の発展によって、糖鎖と幹細胞分化の関係性が徐々に解明されつつあり、強い負電荷を有するプを招く。
体内における血管形成の過程には、Angiogenesis（血管ロテオグリカンが細胞周囲の増殖因子を捕捉することで、新生）と Vasculogenesis（脈管形成）の 2 種類がある。血管細胞分化を制御していることが報告された。プロテオグリ新生は、既存の血管が分枝を形成することで新規の血管がカンは、1 本のコアタンパク質に複数本のグリコサミノグ形成される事象を指し、脈管形成は、血管前駆細胞から分リカンが共有結合した構造をもち、プロテオグリカンの負化した血管内皮細胞が血管非存在下の領域に血管を形成す

電荷はグリコサミノグリカンの硫酸基に由来する。すなわることをいう。これまで、脈管形成は初期胚から循環系のち、硫酸化多糖鎖であるグリコサミノグリカンの強い負電発生段階のみで見られるプロセスと考えられていたが、近荷は、生体内で増殖因子の安定化や受容体への結合につい年、成人の血液中で血管前駆細胞が発見され、脈管形成がての重要な働きを担っている 3）。また、ヘパラン硫酸はグヒトの血管形成においても作用していることが分かってきリコサミノグリカンのなかでも特に強い負電荷をもち、さた。そういったなか、これまでに我々は、血管内皮細胞増らには間葉系幹細胞の細胞外基質にも含まれていることか殖因子（VEGF）や肝細胞増殖因子が特異的レセプターに結ら、我々はヘパラン硫酸が間葉系幹細胞の脈管形成能に関与しているのではないかと着想した。
ところで、歯髄幹細胞（DPSCs）は、俗に歯の神経と呼The Role of Glycosaminoglycan on
Vasculogenesis

ばれる歯髄に存在する間葉系幹細胞であり、高い増殖能とJun-Ichi Sasaki

る。また、DPSCs は VEGF のレセプターを常に発現してDepartment of Biomaterials Science,
Osaka University Graduate School ofDentistry

象牙芽細胞などへの分化能を有していることが知られていいることから、骨髄や脂肪由来の間葉系幹細胞と比較して高い脈管形成能をもつことが報告されている。このように、− 103 −コスメトロジー研究報告 Vol. 31, 2023

DPSCs は in vitro で簡便に血管内皮細胞に分化誘導するこ

また、EXT 1 のノックダウンが DPSCs の遺伝子発現とが可能であり、DPSCs の脈管形成能を評価する手法もに及ぼす影響を網羅的に解析した。すなわち、ED 培地で確立されている 4）。

14 日 間 培 養 し た shEXT 1 -DPSCs、shCon-DPSCs か ら

以上を背景として、本研究では、グリコサミノグリカン

mRNA を抽出し、Novaseq 6000 を用いて次世代シークエが間葉系幹細胞の脈管形成能を制御していると仮説を立て、ンス解析を行った。さらに、ED 培地で 7 日間および 14 日

DPSCs を用いてヘパラン硫酸の産生抑制が脈管形成能に間培養したこれら細胞について、VEGFA および Nanog の及ぼす影響を in vitro および in vivo で検討することを目的

mRNA 発現量を Real-time PCR 法によって評価した。とした。

２．方2 . 3 . EXT1 発現阻害が脈管形成能に与える影響

法

EXT 1 のノックダウンが DPSCs の細胞増殖能に与える

2 . 1. ヘパラン硫酸合成阻害が脈管形成能に与える影
響
DPSCs の脈管形成能発現におけるヘパラン硫酸の役割影響を検討することを目的として、遺伝子導入した細胞を通常培養（GC）培地あるいは ED 培地を用いて二次元培養
下で最長 5 日間培養し、細胞数を測定した。

を検討するために、ヘパラン硫酸の合成阻害剤である bis-さらに、shCon-DPSCs と shEXT 1 -DPSCs をマトリゲ

2-methyl-4-amino-quinolyl-6-carbamide（surfen）を添加

ル上で ED 培地を用いて最長 14 日間培養し、形成されたした培地で DPSCs を培養し、細胞増殖や分化に与える影網目状構造の分岐の数および長さを ImageJ を用いて定量響を評価した。具体的には、血管内皮細胞分化誘導（ED）評価した。また同時に、100 µg/mL のヘパラン硫酸を添加培地に 1 ～ 10 µM の surfen を添加し、培養皿で最長 5 日した ED 培地を用いて shEXT 1 -DPSCs を培養し、ヘパラ間培養した後に、細胞数を MTT assay で検討した。また、

ン硫酸添加が網目状構造形成能に与える影響を検討した。

同様に 7 日間培養した DPSCs について、血管内皮細胞分化マーカーである VEGFA、および幹細胞マーカーであるNanog の mRNA 発現量を Real-time PCR 法によって評価した。

2 . 4 . EXT1 発現阻害が in vivo 血管形成に与える
影響
EXT 1 のノックダウンが DPSCs の血管形成に与える影

さ ら に、 マ ト リ ゲ ル を 用 い た 三 次 元 培 養 に よ っ て

響を in vivo で評価するために、マウス血管新生モデルを

DPSCs の脈管形成能を評価した。細胞培養用 24 ウェルプ用いた検討を行った。具体的には、内径 8 mm のポリエチレートに 300 µL のゾル状のマトリゲルを注ぎ、37 ℃で 1

レンチューブ内腔に多孔性のポリ乳酸スキャフォールド時間静置することでゲル化させた。このマトリゲル上にを作製し、厚さ 1 mm に切り出した。その内部に shCon-DPSCs を播種し、分化誘導によって形成された網目状構

DPSCs あるいは shEXT 1 -DPSCs を播種し、重症複合免疫造を光学顕微鏡で最長 14 日間観察した。網目状構造の分不全マウスの背部皮下に移植した。移植 5 週間後に試料を岐の数および長さは、画像解析ソフトウェア ImageJ を用回収し、パラフィン包埋薄切切片を作製後、ヘマトキシリいて定量評価した。また、マトリゲルで三次元培養したン・エオジン（HE）染色を行った。また、薄切切片に対し

DPSCs に対して Live/Dead 染色を行い、蛍光顕微鏡で観て血管内皮細胞の分化マーカーである CD 31 あるいは von察した。

Willebrand Factor（vWF）と GFP の多重免疫染色を行い、スキャフォールド内に形成された血管数を評価するととも

2 . 2 . Exostosin-1（EXT1）発現阻害が血管内皮細胞分化に与える影響に、分化マーカー陽性細胞と GFP の局在についても検討した。

ヘパラン硫酸の産生を抑制した DPSCs を作製するた

３．結果と考察

め に、 糖 転 移 酵 素 EXT 1 に 対 す る short hairpin RNA（shRNA）をレンチウイルスベクターによって導入し、

3 . 1. HS 合成阻害が脈管形成能に与える影響

DPSCs の EXT 1 発現をノックダウンした。また、コントヘパラン硫酸合成阻害剤 surfen を加えた GC 培地あるいロールとして、スクランブル配列と緑色蛍光タンパク質は ED 培地を用いて DPSCs を培養したところ、培養 5 日（GFP）遺伝子を導入した DPSCs（shCon-DPSCs）を用意し目において ED 培地では surfen 濃度依存的に細胞増殖が抑た。EXT 1 をノックダウンした細胞（shEXT 1 -DPSCs）制されることが分かった（図 1 A）
。一方、GC 培地では培

あ る い は shCon-DPSCs を ED 培 地 で 7 日 間 お よ び 14 日

養 5 日目においても surfen の培地添加によって細胞増殖間培養し、EXT 1 発現量を Real-time PCR 法で、ヘパラに有意な変化は認められなかった。また、surfen 含有 EDン 硫 酸 産 生 量 を Enzyme-linked immuno-sorbent assay

培地で培養した DPSCs の血管内皮細胞分化を検討した結（ELISA）法で検討した。

果、surfen の濃度が増加するにつれて VEGFA の mRNA

− 104 −

グリコサミノグリカンが脈管形成機構に及ぼす影響の解明

量は減少するが、幹細胞マーカー Nanog の発現量は増加

10 µM の surfen を含む ED 培地で 14 日間培養した後におすることが分かった（図 1 B）
。ヘパラン硫酸は増殖因子といても、多くの細胞が生存していることが明らかとなった

電気的に結合することで、増殖因子の細胞表面の受容体へ（図 2 C）。これらのことから、DPSCs を surfen 添加培地での結合を補助していることが知られている。このことから、培養することで、血管内皮細胞分化および網目状構造を形

DPSCs のヘパラン硫酸合成阻害によって ED 培地に含まれ成する能力、すなわち脈管形成能が低下したことが示唆さ

る増殖因子が細胞に作用しづらくなったため、細胞増殖やれた。

血管内皮細胞分化が抑制されたと考えられた。一方、GCり、増殖因子を多く含む ED 培地に比べてヘパラン硫酸産

3 . 2 . EXT1 発現阻害が血管内皮細胞分化に与える影響生阻害の影響が少なく、surfen は GC 培地環境下では細胞EXT 1 発現を shRNA でノックダウンできているか調培地については、DPSCs を栄養する主体が血清成分であ増殖に変化を与えなかったと考えられた。

べたところ、培養 7 日目、14 日目のいずれにおいても、マトリゲル上で DPSCs を血管内皮細胞に分化誘導した

shEXT 1 -DPSCs の EXT 1 発現量は shCon-DPSCs と比較結果、毛細血管様の網目状構造が形成された（図 2 A）
。次して有意に低かった（図 3 A）。さらに、ELISA 法の結果かに、surfen を培地に加えて三次元培養したところ、培養 3らも、shEXT 1 -DPSCs のヘパラン硫酸産生量が減少して日目以降で surfen の濃度が増加するにしたがって DPSCsいることが分かった（図 3 B）
。これらの結果から、shRNAによって形成される網目状構造の分岐の数および長さがによって DPSCs の EXT 1 発現がノックダウンされ、ヘパ有意に減少することが分かった（図 2 B）
。一方で、DPSCs

ラン硫酸の産生が阻害されていることが分かった。

が surfen の影響で細胞死した場合には、マトリゲル上に次 に、 次 世 代 シ ー ク エ ン ス 解 析 を 行 っ た と こ ろ、

網目状構造が形成されなくなると考えられる。そこで、マCD 106 や TGF-β 1、ケモカインなど接着因子や炎症反応

トリゲル上で DPSCs の Live/Dead 染色を行ったところ、に関わる遺伝子群の発現が shEXT 1 -DPSCs で有意に減図 1 Surfen が DPSCs の細胞増殖と血管内皮細胞分化に与える影響
A．細胞増殖試験 B．Real-time PCR 法− 105 −コスメトロジー研究報告 Vol. 31, 2023

図 2 Surfen が三次元培養環境下の DPSCs に与える影響
A．光学顕微鏡像 B．網目状構造の定量評価 C．Live/Dead 染色

図 3 DPSCs の EXT1 ノックダウン
A．EXT1 発現量 B．ヘパラン硫酸産生量少していることが明らかとなった（図 4 A）
。また、Real-3 . 3 . EXT1 発現阻害が脈管形成能に与える影響

time PCR で血管内皮細胞分化に関連する遺伝子発現を調shRNA を 用 い た 逆 遺 伝 学 的 ア プ ロ ー チ に よ っ て、べた結果、surfen を作用させた場合と同様に、shEXT 1 -shEXT 1 -DPSCs ではヘパラン硫酸の産生が減少し、血管DPSCs で VEGFA 発現量が減少し、Nanog が増加してい内皮細胞分化が抑制されることが明らかとなった。そこで、ることが分かった（図 4 B）
。このことから、EXT 1 のノッ三次元培養系で shEXT 1 -DPSCs が形成する網目状構造をクダウンによってヘパラン硫酸の産生を抑制することは、観察したところ、shCon-DPSCs と比較して分岐の数や長DPSCs の血管内皮細胞分化のみならず細胞接着や免疫とさが減少することが明らかとなった（図 5）。一方、ヘパラいった様々な細胞機能に影響を与える可能性が考えられた。

ン硫酸を添加した ED 培地で shEXT 1 -DPSCs を培養する− 106 −グリコサミノグリカンが脈管形成機構に及ぼす影響の解明

図 4 EXT1 ノックダウンによる DPSCs の遺伝子発現変化
A．次世代シークエンス解析 B．Real-time PCR 法

図5

shEXT1-DPSC の網目状構造形成能とヘパラン硫酸（HS）添加の効果− 107 −

コスメトロジー研究報告 Vol. 31, 2023と、shCon-DPSCs が形成する網目状構造と比べて、そのと、さらには DPSCs のヘパラン硫酸産生を阻害すること数や長さに有意な差が認められなくなった。この結果は、で血管の形成量が減少したことを示している。これらの結EXT 1 のノックダウンによって低下した DPSCs の網目状果から、生体内においてヘパラン硫酸が DPSCs の脈管形構造形成能が培地中に添加したヘパラン硫酸によってレス成能を制御している可能性が示された。

キューされたことを示しており、この結果は、DPSCs の4．総脈管形成能にヘパラン硫酸が関与していることを示唆している。

括本研究では、グリコサミノグリカンの一つであるヘパラン硫酸が脈管形成に与える影響を間葉系幹細胞の一つであ３．４．EXT1 発現阻害が in vivo 血管形成に与える影響
これまでの結果から、DPSCs の脈管形成能の発現には、る DPSCs を用いて検討した。その結果、DPSCs によるヘパラン硫酸の産生を阻害することで、DPSCs の脈管形成能が低下し、DPSCs によって形成される血管量が減少すヘパラン硫酸が重要な役割を担っていることを in vitro のることが示された。このことは、ヘパラン硫酸が DPSCs実験系で示すことができた。そこで、これらの in vitro での血管形成、すなわち間葉系幹細胞の脈管形成能の発現に見られた現象が in vivo でも生じることを確認するために、重要であることを示唆している。以上のことから、ヘパラマウス血管新生モデルを用いた評価を行った。その結果、ン硫酸が間葉系幹細胞由来の血管の増生に有効であり、本shEXT 1 -DPSCs を播種したスキャフォールド内に形成研究で得られた知見が、新たな血管再生療法の確立や血行された血管の数は、shCon-DPSCs を移植した試料と比較を促進する化粧品の開発に応用できる可能性が示された。

して有意に減少することが分かった（図 6 A）
。さらに、多重免疫染色の結果、移植した試料内に CD 31 や vWF とい謝

辞った血管内皮細胞分化マーカーと GFP を共発現している

本研究の遂行にあたり、ご支援いただきました公益財団

DPSCs が存在していることが明らかとなった（図 6 B）。こ

法人コーセーコスメトロジー研究財団に深く感謝申し上げのことは、移植した DPSCs が血管内皮細胞に分化したこます。

図 6 shEXT1-DPSC の in vivo 脈管形成能
A．HE 染色および血管形成量評価 B．vWF と GFP の多重免疫染色− 108 −グリコサミノグリカンが脈管形成機構に及ぼす影響の解明（引用文献）

3） Li A, Sasaki JI, Inubushi T, Abe GL, Nör JE,

1） Sasaki JI, Zhang Z, Oh M, Pobocik AM, Imazato S,Yamashiro T, Imazato S. Role of heparan sulfate onShi S, Nör JE. VE-cadherin and anastomosis of blood

vasculogenesis of dental pulp stem cells. J Dent Resvessels formed by dental stem cells. J Dent Res 99（4），102（2），207-216, 2023.
4） Katata C, Sasaki JI, Li A, Abe GL, Nör JE, Hayashi

437-445, 2020.
2） Zhang Z, Oh M, Sasaki JI, Nör JE. Inverse andM, Imazato S. Fabrication of vascularized DPSC

reciprocal regulation of p53/p21 and Bmi-1 modulates

constructs for efficient pulp regeneration. J Dent Res

vasculogenic differentiation of dental pulp stem cells.

100（12），1351-1358, 2021.

Cell Death Dis 12（4），644, 2021.

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