日本薬学会第138年会

コアシェルカラムを用いる
ペプチド・タンパク質の分離(クロマニックテクノロジーズ)
長江 徳和, 塚本友康，佐藤誠コアシェル型シリカの歴史
1967・1968年に基本特許は出願されている。

(1) J.J. Kirkland, F.A. Truszkowski, C.H. Dilks, and G.S. Engel, J. Chromatogr.,
A 890, 3–13 (2000).
(2) J.J. Kirkland, T.J. Langlois, and J.J. DeStefano, Am. Lab. 39, 18–21 (2007).

2007年に微小粒子の製造法の特許が出願された。
2

コアシェルカラム
Manufacturer

Brand

Porous layer Pore
Particle size
thicknessdiameter
(μm)
(µm)
(nm)

Surface area
Bonded phase(m2/g)

1Advanced
Chromatography
TechnologiesUltraCore

2.5, 5130

2Advanced Mterials
Technologies

HALO

2.0, 2.7,3.4,4.6

3

AkzuNobel

Kromasil ClassicShell/
2.5
EternityShell

9.5

C18, Phenyl-hexyl

0.4, 0.5, 0.2, 9, 16, 40,100
0.6120, 135, 15, C18, C8, Phenyl-Hexyl, PFP, Cyano, RP-Amide, HILIC, Pentahydroxy90
HILIC, C4, Glycan

0.5

110

C18, C8
C18, C8, Phenyl-Hexyl, PFP, SB-Aq, Cysno, HILIC

4

Agilent Technologies

PoroShell

1.9, 2.7, 4, 5 0.25, 0.5

12, 301305

Chrom4Isosceles

2.6, 4.6

9.5, 16140, 90

C18, RP-AQUA, C8, PFP, Pnenyl-Hexyl, 2-Etheylpyridine, HILICAmide, C30, Hexafunctional C18, C4
C180.5, 0.6

6

ChromaNik Technologies

SunShell

2.0, 2.6, 3.4, 0.4, 0.5, 0.4, 9, 12, 16, 30, 150, 90,
4.6
0.6
100
40,15

7

Dr MaischPeproShell

2.6

C18, AQ, C8，C3, Phenyl-hexyl, PFP, Amide(HILIC)

8

Fortis Technologies

SpeedCore

2.6, 3.5, 5

0.4

8, 16, 30140

9GL Sciences

InertCore

2.40.3

9100

C1810

KnauerBlueShell

2.6, 4.5

0.5

8

130

C18, C811Merck (supelco)

Ascentis Express/
BioShell

2.0, 2.7, 3.4, 0.4, 0.5, 0.2,9, 16, 40,
50.6120, 135, 80, C18, C8, C4, RP-Amide Phenyl-Hexyl, Biphenyl, Cyano, PFP,
15, 90Pentahydroxy-HILIC

12

Macherey-Nagel

NucleoShell

2.7

0.5

9130

13Nacalai Tesque

CosmoCore

2.6

0.5

9150

14Perkin Elmer

Brownlee SPP

2.7

0.5

9, 16

15

Phenomenex

Kinetex/ Aeris

1.3, 1.7, 2.6, 0.2, 0.23,3.6, 50.35, 0.67

16RestekRaptor

2.7

9150

C18, Biphenyl, PFP, HILIC17Sepax Technologies

Opalshell

2.6

0.5

9150

C1818

Shiseido

Capcell Core

2.7

0.5

9, 16, 30

150

19

SIELC Technologies

Coresep

2.7

20

Thermo ScientificAccucore

2.6, 4

C18, AQ, Adamantyl , Phosphocholine, PFP
Mixed mode: RP + cation exchange, aRP + anion exchnge, HILIC + ion
exchange
C18, C8, AQ, henyl-Hexyl, Phenyl, C30, PFP

21

WatersCortecs

1.6, 2.7

0.26

9100

C18, C8, Phenyl-Hexyl, HILIC

22

Welch

Boltimate

2.7

0.5

9120

C18, Phenyl-Hexyl, PFP, HILIC

23

YMC

Meteoric Core2.70.58, 16

150, 90

C18, C810, 20

C18,Phenyl-Hexyl, PFP, HILIC
C18, Cholestrol, Pentabromobenzyl
C18, C8, Phnyl-Hexyl, PFP, RP-Amide, HILIC

200

98, 15

C18, C18-Amide, C18-PFP, Diphenyl, PFP, HILIC C8, C4

130

C18, C8, Phenyl-hexyl, PFP, Biphenyl, HILIC, C4

コアシェル粒子（クロマニックテクノロジーズ）
5 μm for routine

2.6 μm
0.5 μm
1.6 μm

0.6 μm

9 nm,16 nm,30 nm,
100 nmCore

2.6 μm

3.4 μmCore4.6 μm

3.4 μm for protein

9 nm

0.2 μm2 μm
0.4 μm
3.0 μm3.4 μm

Core

1.2 μm30 nm

Core2 μm

9 nm

ペプチド分離用コアシェルカラム

P/N

Porediameter

SurfaceareaCarbon
loading

SurfacecoverageEndcapping

SunShell C18-WP
4.6 x 150 mm

CW6471

16 nm

90 m2/g

5%2.5 μmol/m2

Yes

SunShell HFC18-16
4.6 x 150 mm

CG6471

16 nm

90 m2/g

2.5%

1.2 μmol/m2

Yes

SunShell RP-AQUA
4.6 x 150 mm

CR6471

16 nm

90 m2/g

4%

1.2 μmol/m2

Yes

Particle diameter is 2.6 μm for all.

5

結合密度の異なるC18のペプチドの分離比較
SunShell HFC18-16

SunShell C18-WP

Column: SunShell HFC18-16, 2.6 μm (16 nm) 150 x 4.6 mm,SunShell C18-WP, 2.6 μm (16 nm) 150 x 4.6 mm
Mobile phase: A) 0.1% TFA in Acetonitrile/water(10:90)
B) 0.1 % TFA in Acetonitrile
Gradient program:
Flow rate: 1.0 mL/min , Temperature: 256ºC,
Sample: Tryptic digest of myoglobin

Detection: UV@210 nm,

Separation of peptides using
the 1.0 mm i.d. column

123Column: SunShell RP-AQUA (16 nm), 2.6 μm 100 x 1.0 mm
Mobile phase: A) 0.1 % trifluoroacetic acid (TFA) in waterB) 0.08 % trifluoroacetic acid (TFA) in acetonitrile%B 10% to 30% in 25 min
Flow rate: 0.15 mL / minTemperature: 60 oC
Detection: UV@214 nm
Sample: 1 = Gly-Tyr, 2 = Val-Tyr-Val, 3 = Met enkephalin,
4 = Leu enkephalin, 5 = Angiotensin II(HPLC peptide standard mixture by Sigma-Aldrich)
UHPLC instrument: Jasco X-LC

540246810Retention time/min

1214高分子分離用コアシェルカラム
（タンパク質用）

P/N

Particle
CoresizediameterThickness ofporous
layer

Pore
diameter

Surfacearea

Carbonloading

Surfacecoverage

Endcapping

SunShell C4-100C66961 2.6 μm
2.1 x 100 mm

1.6 μm

0.5 μm

100 nm

22 m2/g

0.6%3µmol/m2

Yes

SunShell C4-30
4.6 x 150 mm

C26961 2.6 μm

1.6 μm

0.5 μm

30 nm

40 m2/g

0.9%3µmol/m2

Yes

SunShell C8-100
C76961 2.6 μm
2.1 x 100 mm

1.6 μm

0.5 μm

100 nm

22 m2/g

0.9%2.5µmol/m2

Yes

SunShell C8-30
2.1 x 100 mm

C36961 2.6 μm

1.6 μm

0.5 μm

30 nm

40 m2/g

1.2%2.5µmol/m2

Yes

SunShell C8-30HT
C56961 3.4 μm
2.1 x 100 mm

3.0 μm

0.2 μm30 nm

15 m2/g

0.5%2.5µmol/m2Yes8コアシェル粒子の細孔分布
Desorption Dv (log d) (cc/g)

0.9
0.8

Core shell 2.6um, 16nm

0.7Core shell 2.6um, 30nm
Core shell 3.4um, 30nm

0.6Core shell 2.6um, 100nm

0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
01

10

100

Pore Diameter (nm)91000タンパク質分離 温度の影響
Column:SunShell C8-30, 2.6 μm (30 nm) 100 x 2.1 mm,
Mobile phase: A) 0.1% TFA in waterB) 0.08 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 15 min%B 20% 65%Flow rate: 0.5 mL/min , Temperature: 80 C or 60 C
Detection: UV@215 nm,
Sample:1 = Cytochrome C, 2 = Lysozyme, 3 = BSA,
4 = Myoglobin, 5 = Ovalbumin
UHPLC instrument: Jasco X-LC
○25oC
150 mm L

○60 C
○80 C
○02

468Retention time/min

101210標準タンパク質の分離(5min)
Column:SunShell C4-100, 2.6 μm (100 nm) 100 x 2.1 mm,
SunShell C4-30, 2.6 μm (30 nm) 100 x 2.1 mm,
SunShell C8-100, 2.6 μm (100 nm) 100 x 2.1 mm,
SunShell C8-30, 2.6 μm (30 nm) 100 x 2.1 mm,
SunShell C8-30HT, 3.4 μm (30 nm) 100 x 2.1 mm,
Mobile phase: A) 0.1% TFA in waterB) 0.1 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 5 min%B 20% 65%
Flow rate: 0.5 mL/min ,Temperature: 80 oC
Detection: UV@215 nm,
Injection volume: 0.5 μL
Sample:1 = Cytochrome C, 2 = Lysozyme, 3 = BSA,
4 = Myoglobin, 5 = Ovalbumin
UHPLC instrument: HITACIHI Chromaster

ピーク幅(W0.5, min)
Cytochrome CLysozyme
BSA
Myoglobin
OvalbminC4-100
0.047
0.045
0.079
0.048
0.109

C4-30
0.057
0.056
0.122
0.066
0.133

C8-100
0.047
0.046
0.077
0.047
0.109

C8-30
0.057
0.056
0.100
0.063
0.119

C8-30HT
0.046
0.046
0.075
0.045
0.109

試料濃度
0.025%
0.025%
0.050%
0.025%
0.025%

標準タンパク質の分離(60min)
Column:SunShell C4-100, 2.6 μm (100 nm) 100 x 2.1 mm,
SunShell C4-30, 2.6 μm (30 nm) 100 x 2.1 mm,
SunShell C8-100, 2.6 μm (100 nm) 100 x 2.1 mm,
SunShell C8-30, 2.6 μm (30 nm) 100 x 2.1 mm,
SunShell C8-30HT, 3.4 μm (30 nm) 100 x 2.1 mm,Mobile phase: A) 0.1% TFA in waterB) 0.1 % TFA in Acetonitrile
Gradient program: Time 0 min 60、 min%B 20% 65%
Flow rate: 0.5 mL/min ,Temperature: 80 oC
Detection: UV@215 nm,
Injection volume: 1.0 μL
Sample:1 = Cytochrome C, 2 = Lysozyme, 3 = BSA,
4 = Myoglobin, 5 = Ovalbumin
UHPLC instrument: HITACIHI Chromaster
Retention time / min

ピーク幅(W0.5, min)
Cytochrome C
Lysozyme
BSAMyoglobin
OvalbminC4-100
0.167
0.164
0.308
0.197
0.391

C4-300.177
0.180
0.410
0.221
0.889

C8-100
0.160
0.153
0.276
0.180
0.247

C8-30
0.155
0.166
0.514
0.199
0.428

C8-30HT
0.212
0.196
0.422
0.238
0.184

C8-30HT 0.5uL
0.144
0.145
0.330
0.176
0.176

試料濃度
0.050%
0.050%
0.100%
0.050%
0.050%

細胞培養によって得られた精製抗体（IgG）の分離
Mobile phase: A) water/TFA (100/0.1)
B) acetonitrile/TFA (100/0.085)
30-45%B (0-30 min)Flow rate: 0.4 mL/min
Temperature: 80 ºC
Detection UV at 215 nm
Injection 5 µL
Sample: 細胞培養によって得られた精製抗体（IgG, プロテインGアフィニテイーカラムで精製）
Not eluted

Totally porous C4, 300 ÅCore shell C4, 300 Å
SunShell C4-100, 1000 Å

Retention time/min

Core shellC8, 300 Å
この移動相条件の場合，C8カラムではIgGは溶出しない

2-プロパノールを移動相に添加したIｇGの分離
Mobile phase: A) water/TFA (100/0.1)
B) acetonitrile/2-propanol/TFA (80/20/0.085)
15%B (0-0.5 min) and 15-50%B (0.5-50 min)Flow rate: 0.4 mL/min
Temperature: 80 ºC
Detection UV at 215 nm
Injection 5 µL
Sample: 細胞培養によって得られた精製抗体（IgG, プロテインGアフィニテイーカラムで精製）

2-プロパノールはC8カラム
でもIgGを溶出させるが，分離は悪くなる。

Core shellC8, 1000 Å

SunShell C4-100, 1000 Å

0510 time/min
Retention

152025細孔径100nmの コアシェルシリカ

A: SEM image of a 2.7 μm superficially porous 1000Å particle. B: FIB image of a 1000Å SPP
showing the 1.7 μm core with 0.5 μm shell.

★直径0.1μmのシリカ一次粒子から多孔質層が形成されている。
★粒子径0.1μmのノンポーラス充填剤と同等な分離ができ，カラム圧は2.7μm粒子相当になる。
★したがって，粒子径0.1μmのカラムに比べ，2.7μmのカラムは 1/700の背圧になる。

まとめ
コアシェル粒子は表面に多孔質層が存在し，この層が0.5 μm以下であり，拡散の遅い高分子の移動距離が全多孔性粒子よりも短く，短時間で平衡化されるため，分離が改善される。
モノクロナール抗体のような分子量が15万を超える試料は，100nmの細孔径が有利に働く。
C4固定相は試料の吸着が少なく，2-プロパノールのような強溶媒を用いなくても分離可能である。

17

エンドフィッティングの違い
A 社 接続部

パーカータイプ 接続部（IDEX社 IsoBar hardware)
10.4
2.0

A 社 接続部

パーカータイプ 接続部（IDEX社 IsoBar hardware)
10.4
2.0

A 社 接続部

パーカータイプ 接続部（IDEX社 IsoBar hardware)
10.4
2.0

IDEX社 IsoBar と同じ接続のカラム

SunShell, Halo, Ascentis Express, Perkin Elmer SPP, Kinetex,
CosmoCore, ClassicShell, MeteoricCore, UltraCore,OpalShell, Capcell Core

エンドフィッティングの違い
A 社 接続部

パーカータイプ 接続部（IDEX社 IsoBar hardware)
10.42.0

A 社 接続部

パーカータイプ 接続部（IDEX社 IsoBar hardware)
10.42.0

A 社 接続部

パーカータイプ 接続部（IDEX社 IsoBar hardware)
10.42.0

IDEX社IsoBarと同じ接続のカラム

SunShell, Halo, PoroShell,
Ascentis Express, Perkin Elmer SPP,
Kinetex, CosmoCore, ClassicShell,
MeteoricCore, UltraCore, OpalShell,
Capcell Core