Proteome Letters

2017；2：59-66

2017 年奨励賞受賞論文
総説

分裂期クロマチンの制御機構を理解するプロテオミクス解析
太

田

信

哉*

*E-mail: shinya.ohta@kochi-u.ac.jp
高知大学医学部生化学講座：783-8505 高知県南国市岡豊町小蓮（受付 2017 年 10 月 2 日，改訂 2017 年 10 月 30 日，受理 2017 年 11 月 8 日）
これまで分裂期染色体上に，約 4,000 種類のタンパク質を同定した．そこに含まれる非特異的結合タンパク質を除いた
真の 染色体タンパク質の抽出や，隠されたタンパク質間の相互作用を見いだすために，機械学習を基盤としたコンピュータシミュレーションが応用できる．一方で，分裂期の制御を理解する上で，タンパク質リン酸化の包括的な理解は欠かせない．これまでに，染色体上の分裂期特異的リン酸化と脱リン酸化を決定しており，これらは，今後の染色体動態の制御機構の解明に向けて大きな足がかりとなる．

1

序を含むヌクレオソームのヒストン H4 の 20 番目のリジン

論がメチル化されていることが報告されている 8）．さらには，分裂期の染色体は，1882 年に Walther Flemming によっ

両端のペリセントロメアの領域に CENP-B が特異的に結て観察されて以来，その特徴的な構造から多くの生物学

合し 9），ヒストンが高度に修飾され，ヘテロクロマチンを研究者の興味の対象となってきた．1977 年に Uli Laemmli

形成していることもわかっている 10）．このセントロメア

ら は，Chromosome Scaffold と そ れ に よ る 染 色 体 の 分 裂

上には分裂期には数十種類のタンパク質からなる巨大複合1）

期特異的な規則的な折りたたみのモデルを提唱し ，そ体，キネトコアが形成される 11）．キネトコアは微小管との後，DNA トポイソメラーゼ IIα（TopoIIα）と Structureの接合や，分裂期チェックポイントのモニタリングなどのmaintenance of chromosome 2（SMC2） と い う ２ つ の機能を担っている．

Chromosome Scaffold 因子が決定されている．特に SMC2

このように，正確な分裂期の染色体構造の構築機構を解は SMC4，Chromosome-associated protein D2（CAP-D2），

明することは非常に重要であるが，未だに解明されていな

CAP-H，CAP-G とともにコンデンシン複合体を形成し，い点が多い．我々は，これまでに，こうした重要な機構を

分裂期特異的染色体凝縮に重要であることが示されてい作り上げている分裂期染色体のタンパク質組成を決定する

る

2）
,3）

．後に，この複合体はコンデンシン I となり，SMC2，

SMC4，CAP-D3，CAP-H2，CAP-G2 か ら な る 複 合 体， コ
4）ことを目的として研究を進めてきた．もちろん同様に分裂期の染色体タンパク質組成の決定を目的とした研究はこれ

ンデンシン II も近年見いだされている ．最近では，こまでもなされてきたが 12）,13），染色体という巨大なタンパ

れらのコンデンシンと Kinesin family member 4A（Kif4A）

ク質複合体の組成決定には，非特異的結合タンパク質を考の働きが，反対の作用を持つ TopoIIα とバランスよく組み

慮しなくてはならず，タンパク質組成の完全決定には至っ合わされることで，分裂期染色体の構造が形成されているていなかった．我々は，この問題を解決するために，機5）ことが示されている ．しかし，この分裂期の染色体凝縮

械学習を応用した Multi-classifier combinational proteomics

は未だに未知部分が多く，PMM 標識と呼ばれるヒストン（MCCP）という解析方法を作り上げ，意味のある分裂期

H3 の修飾（H3pT3K4me2R8me2）が染色体構造を形成し染色体のタンパク質組成決定に至った．そして，近年では

6）ている原動力であるという報告もなされている ．

それをさらに発展させ，分裂期染色体上の相互作用をシ

一方で，染色体が正確に娘細胞に分配される際には，染ミュレーションする手法，nano Random Forest（nanoRF）

色体狭窄部のセントロメアが重要な領域となる．近年，こを開発した．また，これらとは別に我々は分裂期染色体上の 領 域 の ヒ ス ト ン は 一 部 の H3 が Centromere protein Aのタンパク質リン酸化サイトを網羅的に決定している．

7）（CENP-A）に置き換わっているだけではなく ，CENP-A© 2017 Japanese Proteomics SocietyProteome Letters2

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分裂期染色体をターゲットとしたプロテオミクス解析
様々な機能のタンパク質が結合している巨大複合体である染色体の組成の決定を試みる研究は，染色体の制御メカ
ニズムを明らかにする上で必須となる．近年いくつかのグ
ループにより分裂期染色体プロテオームの決定が試みられたが，明確な知見が得られてこなかった 12）,13）．それは，染色体は非常に大きく複雑な複合体であるため単離が困難
であり，加えて核膜消失後に大量の細胞質タンパク質が非特異的に結合してしまうことが原因であった．我々はニワ

トリ DT40 細胞より分裂期染色体の単離を試み，質量分析
でその組成を確認したところ，4,027 種類の染色体タンパ
ク質を同定した．この中には，122 のこれまでに見いだされているほぼ全ての分裂期セントロメア局在タンパク質が含まれており（Fig. 1A），4,027 種類の染色体タンパク質に，新規の機能的な染色体タンパク質が含まれている可能性が高く存在する．
一方で，他グループの先行研究と同様に，非特異的染色体結合タンパク質と考えられるものも含まれていたFig. 1 Proteomic analysis of mitotic chromosome proteins with Random forest analysis predicting novel proteins of interest(A) The 27 classes of proteins found in chromosomes. (B) The rank of all proteins observed for proteomic abundance, enrichment,
retention, SMC2 dependency is plotted as vertical color coded lines (rug plots). Proteins are ranked from the highest (left) tolowest values. Centromere proteins are indicated by longer bars. (C) Separation of the two training sets by RF analysis. The line
provides optimal separation of the two training sets. RF analysis of B includes the bioinformatic analysis. (D) Position of novel
cloned proteins and remaining uncloned proteins in the same 2d analysis with classification of newly cloned proteins from regions
to the left and right of the dividing line, respectively. This figure was modified from Ohta et al., 2010 (15).

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2017；2：61（Fig. 1A）．質量分析スペクトラムから定量すると，それら

しかし，コピー数を基盤とした切り口のみでは，実際のが全体に占める質量の割合は 16％に過ぎず，ごく少量で染色体たんぱく質を決定するための強力なパラメータとははあった．しかし，その種類は 1,700 種類ほどもあり，有ならず（Fig. 1B），異なるパラメータの導入が必要である

益なタンパク質の発見を試みるためにはこの数字は少ない

ことが示唆された．

とは言えない．そこで，得られたプロテオームから意味の4あるタンパク質とそれ以外を分類する手法を兼ね備えた新分裂期においては，「目的とする染色体タンパク質は染しい解析法を取り入れたプロテオミクスが必要となった．
3

分裂期染色体上のタンパク質コピー数の決定

多次元プロテオミクスによる組成の決定

色体上に多く存在し，細胞質内には少ない」と仮定し，そのようなタンパク質を抽出する定量プロテオミクスを展開

最初に，質量分析により決定した 4,027 種類のタンパクすることを試みた．実際には，SILAC を基盤に，安定同質全てにおいて，染色体に結合しているタンパク質のコ位体でラベルした細胞質と非ラベルの染色体を単離し，１ピー数を決定することを試みた．その結果，質量分析によ

対１に混合し質量分析を行い，全てのタンパク質の染色体

るペプチドのスペクトラルカウント数とタンパク質コピー

特異性数の相関を基にした下記の式と定数 a を決定することで，体タンパク質を抽出する傾向にはあるが，完全に分裂期

全ての染色体タンパク質のコピー数を推測することが可能

染色体タンパク質とそれ以外を分けるには至らなかったとなった．定数 a の決定のため，数種類の染色体タンパク（Fig. 1B）．

Enrichmentを決定した．得られた結果は，染色そこで，単離した染色体と細胞質を用いて， 全ての質を大腸菌の大量発現系より精製，濃度を決定した．それを標準タンパク質として，単離した炭素 13 でラベルしたタンパク質の in vitro における置換速度 Retention

染色体に混合し，質量分析でその比を測定し，a の決定に

SILAC を応用することで決定した（Fig. 1B）．また，分裂至った．

期の染色体凝縮に必須と考えられる複合体，コンデンシンの存在下と非存在下の染色体における各タンパク質の量

estimated copy number= a*(10[b*(spectral count)/(protein-specific normalization)]

を，

– 1)

本定量法の正確性を示すために，Stable Isotope Labelingの比較 SMC2 dependency （Fig. 1B），そして新規に見いだしたアウターキネトコア（動原体外層部）局在タンパ
ク質 Ska3 の存在下と非存在下の染色体における各タンパを決定した 14）．しかwith Amino acids in Cell culture（SILAC）を用いてラベル

ク質の量の比較 Ska3 dependency

した，二種類の染色体を単離し，全タンパク質の相対差をし，どのパラメータ Classifier比較した．同時に上記の式を用いて，この二種類の染色体

ンパク質とそれ以外を分けるには至らない事実から，全てに含まれる全タンパク質の定量を行ない，その結果よりの classifier を組み合わせる事でそれが改善できないかを

個々のタンパク質の相対差を比較した．その結果，２つの検討した．実際に全てをクラスター解析で組み合わせると，定量法による相対差は，80％のタンパク質で 2 倍以内に，複合体ごとに一つのブランチに収まる傾向があり，プロテ

97％で 4 倍以内となった．この事実は，本項で開発した方オミクスの結果を多次元で解析することが，実際の染色体法が，SILAC を用いた方法と同程度に信頼できる定量性

タンパク質を決定するために有効であることが示唆された．

を持つこと，なおかつこれまで困難であった網羅的絶対量

しかし，このような解析法でもやはり非特異的染色体結合の推定を可能にするものであることを示している．解析結タンパク質が，染色体タンパク質を多く含むブランチに，果の一例として，ニワトリ DT40 細胞においては，1 つの無視できない程度含まれており，異なる解析法を開発する

セントロメアには CENP-A を含むヌクレオソームが約 12必要があった．

分子存在することを示した．これは，報告されているヒト
における CENP-A の数の 1/15 程度である．このことから，

5も完全に分裂期染色体タ

機械学習を応用した分裂期染色体プロテオームの理解

ヒトとニワトリでは，セントロメアの形成過程が異なるこ

前述の全ての定量プロテオミクスを，機械学習によってとが推測される．また，CCAN，Ndc80，Mis12 複合体は 1

染色体タンパク質と非特異的染色体結合タンパク質に分つのセントロメアにそれぞれ 51 ± 27，47 ± 5，40 ± 22

類することを試みた．実際にはランダムフォレストを用と，ほぼ 50 分子の複合体が存在することを明らかにした．

い，同定したタンパク質のうち，分裂期染色体に結合する

この事実とこれまでの電子顕微鏡による先行研究などから，ことがよく知られている，ヒストン，セントロメアタンパ

ニワトリ細胞のセントロメアには，6 つの微小管が結合しク質，テロメアタンパク質そしてコヒーシンなどの染色体それぞれに各 8 分子の複合体が存在することが示唆された．

タンパク質を True ，膜タンパク質やミトコンドリアタ

この数は酵母における微小管あたりの Ndc80 の数と完全ンパク質などをに一致した．

これまでのプロテオミクスの結果をもとにランダムな決定

False

として

Learning set

を構築し，

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木， Decision tree ，を数百通り作成した．一つ一つの決相互作用タンパク質を予測する解析アルゴリズム nanoRF

定木に従い，個々のタンパク質が染色体タンパク質と認識を開発した 18）．これにより，標的としたタンパク質複合されるかどうかシミュレーションしたところ，その確率を体の新規構成因子の予測を可能としただけでなく，タンパ

計算することが可能であると分かり，高い確率でク質複合体間の制御構造を理解することも可能であること

真の分裂期染色体タンパク質の抽出に成功した．既知の染色体を示した（Fig. 2A）．実際に，GFP 融合タンパク質の形でタンパク質と非染色体タンパク質で，この手法の正確性をの局在観察や siRNA を用いたノックダウン表現型の観察検証したところ，89％のタンパク質を正確に分類できたにより，これらの機能未知タンパク質がセントロメアや染（Fig. 1C）．

色体腕部などに局在し，分裂期の制御に関与することを確

実際にその有効性を示すためには，すべてのタンパク質の細胞内局在を細胞生物学的手法で確認しなくてはならな
い．したがって，未知タンパク質を分類し，そのうち染色（Fig. 2C）．
認している 17）
7 分裂期染色体のリン酸化プロテオーム解析

体タンパク質と分類された 34 種類のタンパク質について，

現在知られている制御機構だけでは染色体動態の全体像

そのヒト類似タンパク質を GFP と融合した形でヒト細胞を説明することは困難であり，未知の制御機構がまだ数多内において発現させ，蛍光顕微鏡を用いてその局在を確認

く残されていると考えられる．そこで，その機構に近づくした．結果，その中から 30 種類の新規染色体局在タンパことを目的として染色体上の未知の分裂期特異的リン酸化

ク質を見いだすことができた（Fig. 1C）．同様に，非染色を同定することを試みた．

体タンパク質と分類された 16 種類には 2 種類の染色体タチ タ ニ ア を 利 用 し た Hydroxy acid-modified metal oxide

ンパク質しか見いだせなかった（Fig. 1C）．以上の結果は，chromatography（HAMMOC）法を用いて 19），精製された93％の新規染色体タンパク質と 83％の非染色体タンパク

分裂期染色体からリン酸化ペプチドのみを濃縮した．続け

質を正確に分類したことを示している．この MCCP は分て，分裂期染色体のリン酸化部位の決定を行い，その結果

裂期染色体のみならず，精製が困難で明確な答えのでない

4,274 のリン酸化部位を決定した（Fig. 3A, B）．

あらゆる細胞内巨大複合体プロテオーム決定に応用できる
手法
6

Fuzzy proteomics

である

15）,16）．

機械学習による分裂期染色体上のタンパク質相互作用
解析

さらに，同定したリン酸化が，どの程度分裂期に特異的であるかを調べるために，分裂期の細胞から単離した複合体と，間期から単離したそれとを SILAC を用いて比較した．その結果 2,761 種類のリン酸化ペプチドについて分裂期と間期の間で起こる増減を調べることができた．さらに，我々は，プロテオミクス解析のモデル細胞としてニワト

分裂期と間期の個々のタンパク質の量比も決定し，この結

リ DT40 細胞を用いている．この細胞の最大の利点は，遺果も合わせて考察することで，351 の分裂期特異的リン酸

伝学的ノックアウト細胞を作製でき，これまでに構築した化サイトと 167 の分裂期特異的脱リン酸化サイトを決定す

ノックアウト細胞のライブラリーとプロテオミクス解析とるに至った．その詳細を見てみると，CENP-T や INCENPを融合することが可能な点にある．従って，染色体構造といったセントロメアタンパク質や Ki-67 やコンデンシン，の構築とその維持に重要な役割を担っている（あるいはTopoIIα などが分裂期特異的に高度にリン酸化されている

その可能性がある）遺伝子の欠失変異体から分裂期の染ことがわかった（Fig. 3C）．逆に，DNA 複製や組換え機構

色体を単離し，その欠失が染色体のタンパク質組成に及に関わるタンパク質群は分裂期において特異的に脱リン酸

ぼす影響を，前述の SILAC を用いることで定量的かつ網（Fig. 3C）．これらの分裂期化されていることを示した 20）

羅的に調べることが可能である．実際に，染色体構造に特異的なリン酸や脱リン酸化は，染色体動態の制御機構を関わる SMC タンパク質を含む複合体（コンデンシン I や知る上で大きな足がかりとなる．

コンデンシン II，あるいはその両方，そして，コヒーシン
や SMC5/6 複合体）をそれぞれ欠失させた変異体について，

8

終わりに

分裂期染色体上の全タンパク質の組成変化を測定し，それ質量分析装置に関する技術向上，あるいは新しい解析方

ぞれの複合体がどのように分裂期染色体構造に寄与してい法の開発は，非常に展開が早く，SILAC を含めた定量質

るかを明らかにした 17）．さらには，ここで得られた 5 種

量分析は今日では頻繁に目にする手法となっている．しか類の変異体における分裂期染色体タンパク質の組成変化をし，未だそこから得られる膨大なデータをシームレスに生基にして，分裂期染色体上のタンパク質間の相互作用や物の基本的システムの理解へと結びつけられる手法は限ら制御構造を，網羅的に予測することを試みた（Fig. 2A, B）．

れている．本稿でふれた機械学習を取り入れた解析に加え，そのために MCCP を発展させ，定量プロテオミクスデー

主成分分析や k-Neighbor 法など，数学，統計分野を取りタからコンピュータシミュレーションで標的タンパク質の入れた新手法を確立し駆使することで，質量分析を基盤とProteome Letters

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Fig. 2 Nano Random Forest to figure out the novel chromosomal regulation(A) Two-dimensional scatter graph plots of RF scores for (a) CPC versus condensin II and (b) CPC versus condensin I. Key
proteins are color coded by category: condensin I, pink; condensin II, purple; CPC, blue; kinetochore, orange; and CCAN, green.
(B) Magnification of the part of the heat map depicting the combined results of 5,058 proteins from nanoRF targeting condensin,
condensin I, condensin II, cohesin, SMC5/6, CPC, histones, CCAN, Nup-Ran complexes, kinetochore, chromosomal scaffolds, andribosomal proteins. (C) Relative mitotic index of HeLa cells after 28 individual siRNA treatments against human orthologues. * in(B) shows the siRNA target in. This figure was modified from Ohta et al., 2016 (17).

したプロテオミクス解析は，染色体構造だけでなく，多くの未解明のメカニズムの一端を解き明かす歩みに貢献できると考えている．
著者に開示すべき利益相反状態は無い．
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Fig. 3 Quantitative analysis of mitosis-specific phosphorylation(A) Experimental design for quantification of mitosis-specific phosphorylation. (B) Immunoblot analysis of the abundance of chromosomal markers and actin in each fraction. Proteins were resolved by SDS-PAGE and stained with Coomassie Brilliant Blue. Xs:
isolated mitotic chromosomes; mitotic WCE: whole-cell extract of mitotic cells; nuclear: nuclear fraction of unsynchronized cells;
WCE: whole-cell extract of unsynchronized cells. (C) Heat map showing the population category of the 28 protein categories;
clustering tendency is shown at the bottom. This figure was modified from Ohta et al., 2016 (20).

to mitotic chromosome architecture in vertebrate cells. Cell.
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Proteome Letters

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Proteomics Analysis Understanding the Regulation Systemof the Mitotic Chromosome
Shinya Ohta**E-mail: shinya.ohta@kochi-u.ac.jp
Department of Biochemistry, Medical School, Kochi University, Kohasu, Oko-cho, Nankoku, Kochi 783-8505, Japan(Received: October 2, 2017; Revised: October 30, 2017; Accepted: November 8, 2017)
Packaging of the DNA into condensed chromosomes during mitosis is essential for the faithful segregation of the
genome into daughter nuclei. Although intensely studied for over 100 years, mitotic chromosome structure andcomposition are still yet to be fully elucidated. We developed the multi-classifier combinatorial proteomics (MCCP)and nano Random Forest to reveal the protein composition in mitotic chromosomes purified from chicken DT40 cells.
One of the greatest advances from the MCCP approach to analysis of the mitotic chromosome proteome is the ability
to combine with genetic knock-out and the stable labeling with amino acids in cell culture. These approaches open
the door to the identification of all functional components of mitotic chromosomes despite the adventitious bindingof cellular background proteins during mitosis. Furthermore, they can be extended by adding additional classifiers todelineate protein complexes and define functional dependencies between them in the context of intact mitotic chromosomes. This will serve both as a starting point for systematic determination of the full range of functions involved
in mitotic chromosome segregation, and as a basis for the development of detailed structural and functional interaction maps of key chromosomal sub-domains. Indeed, we have discovered and characterized several number of novel
centromere or chromosomal proteins. Currently we succeeded the identification of 4,274 total phosphorylation sites
and 350 mitosis-specific phosphorylation sites in mitotic chromosome-associated proteins with using TiO2-basedhydroxy acid-modified metal oxide chromatography. In future, phosphoproteome analysis combined with MCCP and
nanoRF approaches based on machine learning would be useful for the analysis of much more complex hierarchicalregulation network on mitotic chromosomes.
Keywords: chromatin; mitosis; fuzzy proteomics; machine learning; phosphoproteome; SILAC.