２０１２年度両生類研究施設研究活動及び研究成果報告書	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 

平成２５年８月１日	
 	
 広島大学大学院理学研究科附属両生類研究施設	
 
	
 

撮影	
  檜垣俊忠

目次	
 
	
 
I.	
 	
 	
 施設概要…………………………………………………	
  ３	
 
II.	
 	
 教育活動…………………………………………………	
  ５	
 
III.	
 研究活動と研究内容現況………………………………	
  ６	
 
IV.	
 社会活動…………………………………………………	
 １８	
 
V.	
 	
 国際交流活動……………………………………………	
 ２０	
 
VI.	
 その他（特記事項）……………………………………	
 ２１	
 
VII.	
 各部門の研究内容と研究業績	
 ………………………	
 ２３	
 
	
  	
  	
  	
  	
  発生遺伝学研究部門	
 ………………………………２３	
 

	
  	
  	
  	
  分化制御機構研究部門	
 ……………………………４０	
 
	
  	
  	
  	
  多様化機構研究部門	
 ………………………………５１	
 
	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 学長裁量による特任教員	
 …………………………８９	
 
	
  	
  	
  	
  生理生態学研究部門（客員部門）	
 
	
  	
  	
  	
  プロジェクト研究	
 ①………………………………９５	
 
	
  	
  	
  	
  プロジェクト研究	
 ②………………………………９９	
 
	
  	
  	
  	
  プロジェクト研究	
 ③……………………………１０４	
 
	
 
	
 
	
 

2

I.	
 施設概要	 	
  両生類研究施設は，元広島大学長の川村智治郎先生が在職中に挙げられた業
績を基礎にして，昭和 42 年６月に創設された，世界で類例のない研究施設である。	
 	
  創設時の第１研究部門「発生遺伝学」は，定員が教授１，助教授１，助手２，
その他職員２であったが，昭和 49 年４月に系統維持班の附設が認められた。従来から実験動物飼育に従事していた教務員１に加え，新たな飼育要員として一般職員２（行一技官）の増員，技能補佐員３，臨時職員２の予算化が認められた。昭和 51 年４月に系統維持班の強化のために助教授１の増員，臨時職員１の予算化が認められた。その後，行一技官１の教務員１への振替が行なわれ，充実した系統維持体制が整った。	
 	
  昭和 56 年４月，第２研究部門「生理生態学」が客員部門として増設された。
昭和 59 年４月，第３研究部門「進化生化学」が増設された。平成元年４月，第４研究部門「形質発現機構」が新たに増設され，増員が認められた。平成２年
11 月末には，東広島市の新キャンパスに，４つの研究部門の研究棟，飼育棟および野外飼育場が完成した。新キャンパスへの移転は，平成３年２月から始まり，平成４年１月末に完了した。	
 	
  平成６年６月，10 年時限が到来した進化生化学研究部門に代わり，種形成機
構研究部門が新設され，増員が認められた。また，平成 11 年４月からは形質発現機構研究部門に代わり，分化制御機構研究部門が，平成 16 年４月からは種形成機構研究部門に代わり，多様化機構研究部門が固定部門として新設された。	
 	
  しかし，平成 17 年度に系統維持班の助教授が定員削減の対象となり，発生遺伝学研究部門の助教授が兼任することで，定員削減による影響を最少に留めるよう努力し続けている。平成 19 年度に助手２と教務員２から助教４への振替が行われた。平成 21 年度に定年退職した助手のポストで,平成 22 年度には２名の特任助教が採用された。また、今年度４月から NBRP 再建のために、学長裁量経費により特任教授が採用された。平成 24 年度における施設教員の構成は教授２（矢尾板芳郎、住田正幸：施設長），特任教授１（柏木昭彦）,	
 准教授４（鈴木厚、古野伸明、三浦郁夫、高瀬稔），助教４（中島圭介、倉林敦、花田秀樹、田澤一朗），特任助教２（竹林公子、柏木啓子），客員教授２（Ezaz	
 Tariq,	
 Merila	 Juha）,	
 研究員（Alam	
 Mohammad	
 Shafiqul,	
 Hasan	
 Mahmudul,	
 岡田守弘<平成 24
年 9 月まで>）、契約一般職員（中島妙子）である。系統維持班の人員の構成は准教授１（高瀬稔、兼任），助教２（花田秀樹、田澤一朗、いすれも兼任），技術員１（宇都武司），契約技能員２（難波ちよ、玉城淳子），契約用務員２（水戸妙子、渡辺八重子）、である。事務室には契約一般職員 1（島田歩稀）がいる。	
 	
  系統維持班では，両生類37	
 種196	
 系統の野外系統及び突然変異系統等の特殊系統を保存している。これまでに確立されている系統には，自然・人為色彩突
然変異系統，野外種育成系統（近交系），四肢形成異常系統，癌多発系統，遺伝子組換え系統，遺伝子連鎖群解析系統，人工新種系統，核細胞質雑種系統お3

よび人為倍数体系統などがある。現在維持している変異系統は50	
 系統にのぼる。	
 系統維持班では平成 24 年度には，系統維持している変態完了個体から成体まで
約 4500 匹の飼育に加えて，交配系統数：50	
 系統，飼育幼生数：5571	
 匹，新しい系統数：9	
 系統，新しい系統の飼育幼生数：522	
 匹の系統維持活動を行い，8	
 系統 1427	
 個体を研究・教育材料として大学および高等学校，中学校，小学校に配布した。特に、系統維持班と NBRP からは広島県教育バザールへ参加し、生物教材としてネッタイツメガエル、アホロートル、アズマヒキガエルを 37 件 364匹、およびフタホシコオロギ 2,000 匹を提供した。また，日本や世界各地から
昭和 51 年より約 30 年あまりかけて野外収集した９科 27 属 112 種 320 集団 12,600匹及び実験的に作製された特殊系統 100 系統４千匹のカエルがマイナス 80 度に凍結保存されている。	
 	
  平成 14 年度より文部科学省の第 1 期と第 2 期のナショナルバイオリソースプ
ロジェクト（NBRP）の中核的拠点整備プログラム「ネッタイツメガエル」の中核機関としての事業は、昨年度末で一旦終了した。今年度６月から、第３期 NBRPの新規採択課題として、あらたに「ネッタイツメガエル」の中核機関として「ネッタイツメガエルの近交化・標準系統の樹立・提供」を行っている。課題管理者として住田正幸、課題協力者として柏木昭彦、鈴木厚、古野伸明、倉林敦、
中島圭介、花田秀樹、田澤一朗、柏木啓子、竹林公子、彦坂暁（総合科学院）
が参加している。また、このプロジェクトには 2 名の契約技術職員（小林里美,	
 竹中純子<平成 24 年 7 月から>）が従事している。第３期 NBRP が６月１日から新規採択されたことに関連して、両生類研究施設で運営委員会＆SiteVisit を８
月 24 日に開催した。この委員会には、運営委員５名（基礎生物学研究所・教授	
 上野直人：委員長、東京大学大学院理学系研究科・准教授	
 平良眞規、東北大学
大学院生命科学研究科・教授	
 田村宏治,広島大学大学院理学研究科・教授	
 住田
正幸:代表機関課題管理者、情報・システム研究機構国立遺伝学研究所・准教授	
 山崎由紀子:オブザーバー）、NBRP 推進委員会委員４名（情報・システム研究機
構国立遺伝学研究所・所長	
 小原雄治：主査、筑波大学生命環境系・教授	
 漆原秀子、自然科学研究機構基礎生物学研究所・所長	
 岡田清孝、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター・特別顧問	
 森脇和郎）、NBRP 事務局３名（事務局長	
 佐藤清、事務局員	
 高野道子、平田裕美）、広島大学３名（理学研究科長	
 出口博則、研究企画室長	
 小佐古学、研究企画主査	
 伊賀敏明）、課題協力者
９名（住田正幸、柏木昭彦、鈴木厚、古野伸明、倉林敦、中島圭介、、柏木啓子、
竹林公子、花田秀樹と田澤一朗は途中参加）が参加し、本事業の概要説明と施設見学のあとで、事業に対するコメントや助言をいただいた。さらに、第 3 期
NBRP 開始記念シンポジウム	
 − 第３期への挑戦	
 −	
 （11 月 21 日）で住田施設長が講演を行い、12 月 11 日〜14 日分子生物学会での本リソースを展示し、３月
13 日〜16 日には実験技術講習会を開催した。今年度の保存実績は 7,061 匹、提供実績は 90 件 2,014 匹、論文実績は（当施設で把握している限りで）8 編（内1 編は nature	
 communication）であった。	
 	
  平成 21 年度より特別教育研究経費「先端的両生類研究の展開－両生類の絶滅

4危惧種の保全と標的遺伝子破壊方法の開発－」(平成 26 年 3 月まで)が５年プロジェクトとして展開されている。今年度も、２名の特任助教（井川武、Islam	
 Mohammed	 Mafizul）が採用され研究に従事している。今年で４年目であるため、全学での大型プロジェクト事業報告会（2012 年 12 月 11 日）で矢尾板教授が成果発表を行った。最終年度の来年には総括として国際シンポジウムを計画している。終了後も、これらの成果をもとに、両生類研究リソースセンターの機能を備え持つ、世界的拠点形成を目指して、新規に概算要求を行っている。	
 	
  平成 23 年 10 月から資格審査によって助教以上 10 名の教員が学部教育担当になっており、今年度から「教養ゼミ」	
 「生物の世界」	
 「自然科学概説 A」、教養教育科目「カエルから見た生命システム」、学部生チューター、教務委員などを担当している。来年度には学科専門科目「動物の系統と進化」「実習」を担当予定である。また、来年度から STEP10(国立 10 大学大学院理学研究科等学
生交流推進プログラム)として、10 大学学生のための集中講義「両生類を用いた先駆的研究」を開講予定している。部門制からグループ制と系統維持班の改組について、検討を開始した。	
 	
  今年度から総合博物館の理学研究科サテライト館のオープンスペースを玄関ロビーに開設し、４月 26 日オープニング講演会で住田施設長が講演を行い、一般公開を開始した。今年度の施設見学者/施設訪問者は 32 件 719 人で、その中には、益川敏英博士、高知大学と東京芸術大学の学長などもある。	
 	
  昨年度から研究活動の活性化を目指して、研究員体制をはじめた。今年度は、学内から15名の研究員、学外海外から34名の客員研究員が推薦され、学内外および海外とも共同研究を展開している。共同研究相手先は、国内では東京大学、
京都大学、九州大学、名古屋大学、徳島大学、鹿児島大学、札幌医科大学、県立広島大学、福岡教育大学、長浜バイオ大学、いわき明星大学、芝浦工業大学、
基礎生物学研究所、東京都医学総合研究所、JT生命誌研究館、中外製薬、広島
大学（原医研、理学研究科、医歯薬保健学研究科）、海外ではヴァージニア大学（米国）、レンヌ１大学（フランス）、キャンベラ大学（豪州）、成都生物学研究所（中国）、バングラデシュ農業大学（バングラシュ）、ブラビジャヤ大学（インドネシア）、ポーツマス大学（英国）、ウッズホール海洋生物学研究所（米国）、
ブラウンシュバイク工科大学（ドイツ）等がある。	
 	
  今年度は、６月11日と１月21日に両生類研究施設運営委員会を開催し、施設の活動実績と活動計画報告及び平成25年度の客員教員と研究員/客員研究員及び次期施設長の推薦を行った。	
 
	
 

II.	
 教育活動	 	
  両生類研究施設は，生物科学専攻で両生類発生遺伝学演習，両生類多様化機
構学演習，両生類分化制御機構学演習を開講し，細胞と生命，形態形成，性の起源，分類・進化の授業やスロー生物学演習,社会実践生物学特論,生物科学特別研究や生物科学研究セミナーに携わっている。今年度，博士課程前期１年に5

１名，２年に２名，後期１年に２名，２年に２名，３年に１名で合計８名の院生が在学しており，当施設で大学院研究に励んでいる。博士課程前期学生の国内学会発表は４件であり，博士課程後期学生の国際学会発表は２件，国内学会
発表は４件である。原著論文発表は博士課程前期学生で１編、博士課程後期学生で６編である。大学院生による RA は１件であり、TA は４件である。今年度は、博士課程前期学生２名が以下の修士論文により修士号を取得しており，博士課
程後期学生１名が，以下の学位論文により博士号を取得している。	
 	
 修士論文発表実績	
 	
 中井裕也「ツメガエルの変態期の尾の退縮における ouro 遺伝子の役割の検討」	
 
	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 2013 年 2 月	
 
	
 新谷	
 望	
 「アマミイシカワガエルの飼育下における温度条件と遺伝的要因が個	
 
	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 体生存率に与える影響」2013 年 2 月	 	 博士学位授与実績	
 
	
 柳澤	
 誠	
 
	
 	
 	
 	
 Effects	
 of	
 hypergravity	
 on	
 gene	
 expression	 and	
 molecular	
 analysis	
 of	
 	
 	
 	
 
	
 	
 	
 	
 head-defects	
 in	
 early	
 Xenopus	 embryos	 	 	 	 （アフリカツメガエル初期胚に対する過重力の遺伝子発現への影響と頭部	
 	
 	
 
	
 	
 	
 	
 	
 形成異常の分子的解析）	
 	
 	
 	
 	
 
	
 	
 	
 	
 	
 2013年3月23日	
 	 	  学部教育科目として「教養ゼミ」「生物の世界」「自然科学概説 A」「カエルから見た生命システム」を分担または担当し、さらに、学部生チューターや教務委員を担当している。	
 	 	  大学院生の教育活動の一環として，月に２回，教員，ポスドク，博士課程後期の大学院生が研究活動報告を両生類研究施設公開セミナーとして行っている。	
 
	
  	
 
	
  鈴木准教授は名古屋大学医学部において非常勤講師を担当している。百名程
度の医学部生を対象に発生学の講義を行い，臨床医学における基礎研究の重要性などについて解説し，基礎生物学および先端医療への理解を促すとともに、ノートルダム清心高等学校（広島市）では、高校生受講者約 90 名に出張講義を行った。倉林助教は安田女子高校で模擬授業の講師を勤めた（H24 年 12 月）。	
 
	
 

III.	
 研究活動と研究内容現況 	
 発生遺伝学研究部門	
 ○研究活動の概要	
 	
  本研究部門は「種々の両生類を材料として，遺伝学と発生学との新領域を開6

拓する。」ことを目標として，昭和４２年６月に最初の両生類研究施設の研究部門として創設された。それから４０年余りの間に古典的遺伝学的手法や実験動物学的手法に重きを置く研究から，次第に遺伝子工学的手法，細胞生物学的手法なども取り入れて，両生類の発生を分子生物学的視点から考察する研究へと進んでいる。平成２４年度には本研究部門では、原著論文１１編、総説・解説
１編、国際学会での一般講演０件、国内学会での一般講演８件、研究助成金の受入は１件である。研究内容は以下の通りである。	
 １）ネッタイツメガエルでの遺伝子破壊法の確立およびアルビノ系統の確立
	  Zinc-finger nuclease (ZFN)法や Transcription activator-like effector nuclease(TALEN)法は標的遺伝子を破壊するのに優れた方法である。メラニン色素合成に必須である tyrosinase 遺伝子を標的とする ZFN や TALEN を作製して、そのmRNA を合成し、ネッタイツメガエル受精卵に注入した。皮膚のメラニン色素を一部欠損するキメラ個体 F0 を複数得た。F0 を交配することによって完全なア
ルビノネッタイツメガエルを得ることに成功し、アルビノ系統を樹立した。ネッタイツメガエルには今まで、アルビノ系統が無く、その作製が望まれていたので、その樹立はネッタイツメガエル研究者に貢献できる。
	  更に、TALEN の基幹構造を変化させることにより、ネッタイツメガエルでの標的遺伝子破壊方法を検討した。
２）ツメガエル幼生の変態での尾の退縮における ouro 遺伝子の機能の再評価
	  私たちは、「変態クライマックス初期では尾の筋細胞が直接に甲状腺ホルモンに反応してアポトーシスをおこし、後半はそれに加えて細胞外基質分解酵素が甲状腺ホルモン反応遺伝子として誘導され、細胞が足場を失い、死んでいき、尾が退縮する。」と考えてきたが、井筒らが「Ouro 蛋白質を発現している尾が免疫系により拒絶されて退縮する。」という説を提唱している。「甲状腺ホルモン
シグナルによる尾の退縮」と「Ouro 蛋白質への拒絶反応による尾の退縮」の関係を探るために以下の実験を行った。
a) ouro 1 遺伝子に EGFP 遺伝子を ouro 2 遺伝子に mCherry 遺伝子を融合させた発現型ベクターを作製して、幼生尾の筋細胞（ouro 遺伝子を発現していない）に導入した。ouro 1 遺伝子と ouro 2 遺伝子の筋細胞での過剰発現は、変態最盛期でもその筋細胞死を促進しなかった。
b) 甲状腺ホルモンシグナルを阻止するドミナントネガティブ甲状腺ホルモン受容体を共発現させて、甲状腺ホルモンによる尾の筋細胞死を抑制させても、ouro
遺伝子の過剰発現による筋細胞死の促進は尾の退縮時でも観察されなかった。
また、ouro 遺伝子の過剰発現に関わらず、ドミナントネガティブ甲状腺ホルモン受容体の共発現により、尾の筋細胞死は同様に抑制された。
	
  したがって、ouro 遺伝子を発現していない尾の筋細胞では ouro 遺伝子を過剰発現させても変態時でさえ細胞死を促進できないと考えられる。
３）無尾両生類の変態期尾退縮に於ける Hox 遺伝子の機能
	  無尾両生類幼生の尾部では変態期にプログラム細胞死が活発に起こる。一方、胴部では一部細胞死も起きるが、細胞増殖も起こり、結果として尾部のみが消7

失する。この予定消失域を決定する機構において、体軸に沿って発現する Hox
遺伝子が重要な役割を担っているのではないかと仮説をたてて、本研究ではそれを検証することを目的としている。
	
  尾部を切断した無尾類幼生をレチノイド処理することによって、尾のかわりに後肢様の構造が生じることが一部のカエルで知られていた。しかし、アフリ
カツメガエルや本邦産の無尾類ではこの現象は再現されていなかった。この状
況下で我々はこの現象を再現させることを試み、本邦産無尾類を用いて初めて成功した。
４）性転換機構の解析：両生類における精巣卵形成および雌への性転換誘導	 本研究では、ツチガエルまたはトノサマガエルを用いて、雄の精巣における卵形成や雄から雌への性転換について調べた。	
 トノサマガエルおよびネッタイツメガエルの変態完了個体に対して環境化学物質であるビスフェノールＡ（BPA）やノニルフェノール（NP）を投与すると、トノサマガエルでのみ精巣卵が形成されることをこれまで明らかにしてきた。
そこで、性分化後の幼生に対するBPAおよびNPの精巣卵形成に対する影響について、トノサマガエルに加えて、雌雄どちらにも性転換が誘導される広島県ツチガエルも用いて調べた。その結果、両種共に精巣卵形成が観察され、生殖細胞の減少および精細管の形成不全も観察された。さらにツチガエルでは、卵巣の発達抑制や退化が観察された。今後は広く感受性を持つ広島県ツチガエルをモ
デル実験両生類として、精巣卵形成機構を詳しく解析する予定である。	
 また、トノサマガエルにおいても広島県ツチガエルと同様に精巣卵形成が誘導された。そこで、トノサマガエル幼生の性分化前からエチニルエストラジオールを変態期近くまで投与したところ、対照群と比較して卵巣を持つ個体が有意に多く、雌への性転換が示唆された。トノサマガエルでは雌から雄への性転換が良く知られていることから、今回の実験結果からトノサマガエルも広島県
ツチガエルと同様に雌雄どちらにも性転換が誘導される可能性が考えられた。
今後、再現性を確かめる必要がある。	
 ５）生殖腺分化機構の解析：ネッタイツメガエル生殖腺分化に対する温度影響	 エストロゲン投与により得られたネッタイツメガエル雌（遺伝的雄が性転換したと思われる個体）を用いた戻し交配により、雄が有意に多い幼生集団は得られたが、期待された全雄幼生集団は得られなかった。そこで、飼育条件、特に飼育温度による生殖腺分化への影響を調べた。その結果、高水温では卵巣の発達が悪く、雌の比率が高くなる傾向が見られた。従って、一部の幼生では高温飼育による雄から雌への性転換の可能性が考えられるが、低温域から適温域の飼育においても全雄幼生集団は得られなかった。そこで、全雄幼生集団が得られなかった理由として、ZZ/ZW型と考えられているネッタイツメガエルの性決
定機構について再考するなど、飼育温度以外の可能性を考える必要がある。	
 ６）ビタミンE合成アナログのブチル化ヒドロキシトルエンは除草剤パラコート
によって誘導される培養カエル白血球細胞の細胞遺伝毒性を強める	 	
  抗酸化物質ビタミンEはヒトや動物の生体で生じる脂質過酸化から防いでい8

る。しかしながら、アゾなどの化合物と共存下にあるビタミンEはヒト由来の低比重リポプロテインの酸化を促進することが知られている。最近、私は、ビタ
ミンEが除草剤パラコートによって誘導される培養カエル白血球細胞の染色体異常をさらに増加させることを明らかにした。本研究において、ビタミンE合成
アナログである抗酸化物質のブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)もまたパラコートによって誘導される培養カエル白血球細胞の染色体異常をビタミンE同様に増加させることがわかった。この染色体異常の増加は脂質過酸化を抑制する働きのあるスーパーオキシドジスムターゼmimicのMn(III)tetrakis(1-metyl-4-pyridl)porphyrineと過酸化水素のスカヴェンジ
ャーであるカタラーゼのコンビネーションによって抑制されることもわかった。
さらに、パラコートを使用した還元テストの結果、BHTはパラコートを化学的に還元しうることがわかった。以上のことから、BHTはパラコートの電子ドナーとして働き、パラコートを介して増幅される電子はスーパーオキシドなどの活性酸素を誘発し、染色体異常を増加させることが示唆された。	
 	
 分化制御機構研究部門	
 ○研究活動の概要	
 	
  分化制御機構研究部門は，卵の分化，生殖腺，体色を決定する機構，環境と内分泌撹乱などについて分子細胞生物学的な手法を用いて研究している。平成２４年度には本研究部門では、原著論文８編、著書・総説４編、国際学会での一般講演２件、国内学会での招待講演１件、国内学会での一般講演５件、研究助成金の受入は３件である。研究内容は以下の通りである。	
 1）卵形成における卵特異的細胞周期調節遺伝子の発現調節機構と機能解析
	  卵分化機構の研究を、卵特異的に発現する遺伝子に着目し、その卵特異的な発現調節機構を解明する事で進めている。卵は、減数分裂や受精後に特殊な細胞分裂を行う。例えば、減数分裂では、DNA 複製をスキップした２回の連続した分裂をするが、そのために、Mos という卵特異的な細胞周期調節因子を発現しており、この発現が DNA 複製のスキップのため必須である事を報告した。また、受精後、卵は最初の一回を除き、G１,G2 期のない細胞分裂（卵割）を中期
胞胚まで行うが、そのためには、卵特異的な細胞周期調節因子である Wee1A の発現が必須である。もし、体細胞特異的な Wee1B が発現すれば受精後の卵割はしない。よって、これらの卵特異的な細胞周期調節因子の発現調節機構の解明
は、卵への決定・分化の機構解明につながる。現在、ニシツメガエルの Mos とWee1A のプロモ−タ−領域と思われる部分（翻訳開始点より１０kbo 上流まで）をクローニングし、GFP の上流に挿入した transgenic ガエル作製用のベクターを構築した。このコンストラクトや、プロモーターにいろんな欠失を導入したコンストラクトで transgenic ガエルを作製し、卵特異的な発現に必要な領域を特定する。また、これらの遺伝子のノックアウトも行いたい。このようにして卵特異的な細胞周期調節因子の発現調節機構と機能の解析を行う。
２）生殖腺性差構築機構の多様性と普遍性	  ツチガエルの地域集団は性決定機構および性染色体の分化の程度によって大9

きく５つに分けられる。性染色体が未分化な東日本と東日本集団、そして性染色体の形態が分化した ZW 集団と XY 集団、そして、XY 集団からさらに分岐した
Neo-ZW 集団である。このうち、Neo-ZW 集団を除く４つの集団において性ホルモンおよびその阻害剤による性転換の程度には違いが知られている。東日本と西日本の２つの集団は雄から雌、雌から雄への性転換が容易に誘導されるが、ZW型では雌から雄、XY 集団では両方向への性転換に抵抗性を示す。今回、性転換に伴って変化する４つの性分化関連遺伝子（Dmrt1,	
 Cyp17,	
 Cyp19,	
 Foxl2）の発現を定量 PCR によって調べた。その結果、性転換と強く連鎖して発現が変化する遺伝子は Cyp19 と Foxl2 の卵巣分化に関与する遺伝子であることがわかった。とくに ZW 集団では ZW 雌における両遺伝子の高発現が変化せず、それが性転換を拒否する原因と推察された。一方、XY 集団ではエストロゲンによる誘導とその阻害処理によって Cyp19 の発現が変化したにも関わらず性転換は生じなかった。以上の結果と４つの地域集団の系統発生を合わせると、ツチガエルの元祖集団である西日本と東日本集団の生殖腺分化は性ホルモンに高い感受性を示すが、そこから派生した ZW 集団や XY 集団では性ホルモンに対する感受性が失われており、その現象が性染色体の分化や新たな性決定機構の出現と密接に連関していることが考察された。特に、ZW 集団では W 染色体上にある Sox3 遺伝
子の卵巣決定機能が示唆された。今後、さらに詳細に調べていく。	
 ３）卵成熟および初期発生におけるサイクリン B2 の２極紡錘体形成における機能	  MPF はサイクリン B と Cdc2 の複合体であり、M 期を引き起こす普遍的な因子である。MPF が活性化すると核膜崩壊、染色体凝縮、紡錘体の形成が起こり、M 期が開始する。サイクリン B は MPF の調節サブユニットであり、多くの種でサブタイプが複数存在し、また、それぞれのサブタイプの細胞内局在も違っている。しかしながらその機能に違いがあるかどうか報告はほとんどない。この研究ではサイクリン B1 と B2 の機能の違いについて研究している。
	  ツメガエルの卵母細胞や胚ではサイクリン B1 とサイクリン B2 が主に発現しており、機能差を解析する良い系である。今までに、この系を用いて、サイクリン B１でなくサイクリン B２が正常な紡錘体の形成に関与することを明らかにした。また、サイクリン B2 の N 末端から約９０アミノ酸から１２０アミノ酸までに２極の紡錘体を形成するのに働く領域があることがわり、この領域がNES (Nuclear export signal)として働くことや、その NES の機能と２極の紡錘体の形成能が関係していることが明らかになった。最近、正常はサイクリン B
２が紡錘体の極を作る領域に局在する事、また、その局在がサイクリン B２のNES を過剰発現させる事で乱され、これが CRS 過剰発現による２極紡錘体の形成異常を引き起こす原因であると推定された。さらに、２極紡錘体形成に必
要な Eg5 が関与していることを示唆する結果をえている。
４）佐渡島で発見されたカエルをサドガエル(Rugosa	 susurra)と命名	
 	
  佐渡島で発見され、形態的にユニークな特徴をもつカエルについて、これまで遺伝学的調査を行ってきた。今回、原種と予想されるツチガエルとの交雑を10行い、生殖的隔離の存在を調べた。その結果、正逆雑種はほぼすべて雄となり、極めて少数が雌となった。その雌の卵巣は退化的であった。また、雄の精巣内には精子が極めて少なく、もどし交配を行ったところ、わずかに発生した幼生も変態まではほとんど到達しなかった。さらに、鳴き声分析も両者間で著しい違いを明らかにした。以上の結果にもとづき、さらにタイプ標本を採集して外部形態の計測を行うことによって、この佐渡島のカエルをサドガエル(Rugosa	 susurra)と命名した。本種は集団が限定的であるため、既に希少種であり、今後保全に向けた活動も行っていく。	
 ５）アフリカツメガエル初期胚に対する過重力の影響	  将来、人類が宇宙へ進出して行くためには地球とは異なった重力環境下でヒトを含めた動植物が正常で健康な子孫を作れるかどうかを知る事が重要であり、もし、正常な子孫が作れないようなら、どのようにすれば異なった重力環境で正常に生活環が回るかどうか調べる事が重要である。両生類をモデル生物として過重力が発生にどのような影響を与えるかを調べ、その分子的な機構を調べる。両生類であるアフリカツメガエルをモデル生物として、初期発生やに焦点を絞って過重力の影響を調べる。その結果、過重力に感受性が高い時期は、受精後から卵割が始まるまでである事が判明した。WISH を用いた実験から、頭部特異的な遺伝子発現（Xag,Xotx2, En2）が過重力によって抑制されたが、後脳以降の神経マーカー（Krox20, HoxB9）は、影響を受けていなかった。過重
力は頭部形成に特に影響を与える事が明らかになった。また、RT-PCR を用いる事より、Wnt のシグナルの下流の遺伝子、Xnr-3 や Siamois の発現が、過重力で抑制されていることを示し、過重力は、少なくとも Wnt のシグナルを弱めるように作用して、頭部形成に影響を及ぼしている事が明らかになった。
６）TALEN によるアフリカツメガエルの F0 における遺伝子破壊	  ノックアウトによる特定の遺伝子破壊は、その遺伝子の機能を探る上で非常に有効な手段である。この技術は、マウスでは ES 細胞を用いて確立されてポピ
ュラーにつかわれるようになっているが、それ以外の動物では ES 細胞が確立されていない事で不可能である。しかしながら、最近、ZNF (Zinc finger nuclease),
さらに TALEN(Transcription activator-like feector nuclease)を使用すると、特定の配列に突然変異が入れられる事がわかり、コオロギやラットなどで応用されて来た。この技術をカエルで確立する事は、カエルの実験動物として有用性を飛躍的に高める。昨年、カエルで ZNF が応用可能かどうか実験を行い、良い結果をえていたが、ZNF は作成が複雑である。その点、TALEN は（難しいとはいえ）ZNF よりは操作が容易である。また、破壊の効率が高く、次世代を待たずに、目標となる遺伝子を破壊し F0 でその効果を見れる可能性が出て来た。
今回、いろいろ TALEN を改良して、Xenopus を使って、F0 で有効かどうかを調べた。使った遺伝子は、既に遺伝子の機能が報告されている tyrosinase と pax6を用いた。祖の結果、TALEN を使ってそれぞれの遺伝子を破壊した結果、高効率で今まで報告されている表現形が観察され、TALEN が F0 でも有効である事が示された。

11７）両生類の生活環に対する強磁場の影響	  現在、携帯電話や高圧送電線、家電製品などから磁場にさらされる機会が多くなってきた。それにもかかわらず、脊椎動物の発生および遺伝子発現に対する強磁場の影響に関する研究は少ない。両生類を用いて、その生活環に対する影響を調べる。カエル胚は、体外受精を行うので胚の観察が容易で、発生も早いことから、磁場の影響を調べるには有用と考えられる。アフリカツメガエルやニシツメガエルを用いて、卵減数分裂から変態までの磁場の影響を調べた。
その結果、卵成熟過程において卵の色素の分布に影響を与える事や、初期発生にさまざまな影響を与える事が明らかになった。また、オタマジャクシを強磁場に曝露すると、行動に異常が生じる事もわかった。現在、その行動異常の原因を探っている。
８）mTOR 情報伝達系の解析
	  炎症は、生体の損傷に対する組織の反応であり、その反応の一部には mTOR
(mammalian target of rapamycin の略。ほ乳類などの動物の細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質キナーゼ。最初に rapamycin の標的タンパク質として見つかったのでこの名前がついた)情報伝達系が関与している。この情報伝達系の研究を進めている。炎症に関与する mTOR 情報伝達系に関与するタンパク質や、その相互作用を調べる事でこの情報伝達系の全貌を解明しようとしている。
その結果、mTOR 伝達系に Ego1, Ego3 と Gtr1,Gtr2 のタンパク質が関与していることがわかった。
９）サイトグロビンやアンドログロビンの初期胚における機能解析	 	
  サイトグロビンはミオグロビンやヘモグロビンの仲間で、グロビンタンパク質の一種であり、酸素の運搬に関わっているタンパク質であるが初期胚における機能はわかっていない。また、アンドログロビンは最近のゲノム解析の結果から見つかってきたタンパク質で、最近、オスの精巣で特異的に発現している事が分って来たが、その機能は不明である。サイトグロビンの初期発生における機能を調べるため、この遺伝子を過剰発現させて、どのような表現系がでるか調べる。また、アンドログロビンの発生における機能をアフリカツメガエルやニシツメガエルを用いて調べる。
１０）Nramp ファミリーの新規バナジウム／プロトン共役輸送体の同定
	  海産動物のホヤは体内に高濃度のバナジウムをもっている。これは、海中のバナジウムから濃縮されたもので、ホヤはバナジウムを高濃度に濃縮する機構を持っている。その機構を研究している。Nramp/DCT ファミリーは、二価金属イオンの輸送に関わる膜輸送体である。我々はバナジウムを高度に濃縮する
海産動物ホヤ類の血球から Nramp ファミリーの新規膜輸送体遺伝子を同定した。この遺伝子 AsNramp はヒトの Nramp1 および 2 と、アミノ酸レベルで約60%の相同性があった。アフリカツメガエルの卵母細胞による発現系を用いて金属輸送活性を検証したところ、プロトンとの共役輸送によって四価バナジウ
ムを取り込む共役輸送体であることがわかった。さらに、四価バナジウムの輸送は Na による阻害を受けること、AsNramp は血球の液胞膜画分に局在するこ12

とも明らかになった。	
 	
 多様化機構研究部門	
 ○研究活動の概要	
 	
  多様化機構研究部門では，分子生物学的手法や交雑実験に基づいて両生類における種の多様性やゲノム構造の分子進化プロセスを究明するとともに，人工繁殖と精子凍結保存による絶滅危惧種の効率的な保全方法の確立を目指した研究や，光る透明ガエルの作製を進めている。また，両生類初期胚を用いた形態形成の研究も展開している。平成２４年度には本研究部門では、原著論文８編、総説・解説など４編、国際会議での一般講演１３件、国内学会での招待講演２
件、国内学会での一般講演１２件、研究助成金の受入は６件である。研究内容
は以下の通りである。	
 １）絶滅危惧種アマミイシカワガエルの飼育下における温度条件と遺伝的要因
が個体生存率に与える影響	 	  西南諸島は両生類に限らず動植物全般における生物多様性のホットスポット
であると同時に、島嶼という限定的な生息域によって絶滅の危険性も高い。実際、日本の両生類相における絶滅危惧種（環境省レッドリスト・IA、IB、および IIB 類）の半数は西南諸島固有種である。特に、日本産両生類における最美麗種といわれることも多い、イシカワガエルについては、最近、奄美大島集団が O.	
 splendida（アマミイシカワガエル）として新種記載された	
 (Kuramoto	
 et	
 
al.,	
 2011)。また、これらの種については、すでに人工交配と継代飼育に成功しており(Sumida	
 et	
 al.,	
 211)、島内における遺伝的多様性についても、マイクロサテライト遺伝子座を利用して、遺伝的多様性と微細集団構造が解明されている(Igawa	
 et	
 al.,	 2013)。遺伝的多様性と表現型との相関関係は、生物の保全を考える上で非常に重要であり、これらの正の相関は様々な分類群で報告されている。特に絶滅危惧種においては、個体数の減少と合わせて絶滅への負の連鎖を引き起こすことが知られている。本研究では、飼育条件及び遺伝的要因が与える影響を検証するとともに、各世代の遺伝的指標の変化を予測し、遺伝的多様性を維持した効率的な継代飼育の方策を検討することを目的として、定量的な条件下での個体生存率の調査、シミュレーターによる継代後の遺伝的多様性変化の検証を行った。その結果、本種の正常発生には温度条件が大きく影響し、近親交配一世代目においても近交弱勢の影響が示唆された。また、遺伝的影響の指標には、子孫の予測ヘテロ接合度が有効であり、本種の継代維持には MK 交配法が望ましいと考えられた。	
 ２）絶滅危惧種イボイモリにおける飼育下繁殖と繁殖行動および行動の季節変化の観察（継続）	
 	
  生物種の保全において、最も優先すべきは野外集団の保護、およびその周辺環境の維持である。しかしながら、多くの絶滅危惧種においては種生態学的知見が不足しており、具体的にどの時期に、どのような環境を利用しているのか
不明確な場合が多い。特に、イボイモリは側溝などの人工構造物などによって行動範囲が制限されるなど、移動能力に乏しいと考えられ、生息域における環
境利用の実態の解明が求められている。したがって、本研究では、集団の飼育13下繁殖を試みるとともに、存続に最も重要な繁殖行動、特に有尾両生類に特徴的な求愛・産卵行動および、行動の季節変化を観察することを目的として研究を行った。その結果、今年度も昨年に続いて、徳之島のもので、飼育下繁殖に成功した。また、求愛行動については、近縁種であるチンハイイボイモリで観察された行動パターン(Sparreboom	
 et	
 al.,	 2001)とよく似た行動を観察できた。
本研究によりイボイモリの繁殖行動が初めて明らかになった。特に、イボイモ
リの繁殖行動には地表面の湿度および、適当な遮蔽物が必要であることが示唆された。したがって、イボイモリは普段は比較的乾燥した場所に生息するが、繁殖行動を行う上では、生息地周辺に適度な大きさの水辺が必要であり、生息域の景観の維持が個体群の存続に重要であると考えられた。	
 ３）オットンガエル及び、ホルストガエルにおける新規マイクロサテライトマ
ーカーの開発	 	  オットンガエル	
 (Babina	
 subaspera)と、ホルストガエル	
 (B.	
 holsti)は、そ
れぞれ奄美大島及び、沖縄島と渡嘉敷島に固有に生息する姉妹種であり、鹿児島県及び、沖縄県における天然記念物である。両種は元々島嶼という狭小な生息域であるのに加えて、森林の伐採による生息域の減少、マングースによる捕食などにより絶滅が危惧されており、IUCN レッドリストにおける絶滅危惧 B1 類に位置付けられている。このような絶滅危惧種の効率的な保全には分子マーカーによる集団構造及び、遺伝的多様性の解明が必要であり、すでにオットンガ
エルについては、Iwai	 et	
 al.(2011)により 8 つのマイクロサテライトマーカーが単離されている。しかしながら、個体識別、親子鑑定といったより詳細な分
析にはさらに多くの遺伝子座が必要である。また、これらの遺伝子座のホルス
トガエルでの有効性は確認されていない。そこで、両種における新規マイクロサテライトマーカーの開発を目的として、既存のマイクロサテライトマーカーのホルストガエルにおける増幅及び多型性の有無を確認すると同時に、新規マ
イクロサテライト遺伝子座の単離を行った。その結果、既知の 8 遺伝子座はす
べてホルストガエルにおいて利用可能であり、オットンガエルと同等の十分な多型性を示した。また、新規にプライマーを設計した 16 遺伝子座のうち、オットンガエルにおいて 8 遺伝子座、ホルストガエルにおいて 4 遺伝子座が多型性を示した。最終的にオットンガエル及び、ホルストガエルにおいて利用可能な遺伝子座は、既知の 8 遺伝子座と合計して、それぞれ 16 遺伝子座及び 12 遺伝
子座となった。	
 ４）バングラデシュ産のトラフガエルにおける飼育下繁殖	
 	
  バングラデシュでは乱獲等によりトラフガエル（Hoplobatrachus	
 tigerinus）
が野外で激減しており、本種の採集は法律で禁止されている。本研究では、本種の域外保全を目的に、野外から採集した個体を使って飼育下繁殖を試みた。
トラフガエル H.	
 tigerinus の雌親 2 匹と雄親１匹を用いて、人工交配によって交雑実験を行い、その子孫の生活力を観察した。その結果、全体の卵のうち、89%が正常に卵割し、70%が尾芽胚に到達し、56%が正常に孵化し、46%が正常な接餌幼生になった。しかし、わずか 10%が正常に変態した。共食いが幼生の間で観察され、これは変態率の減少の要因と考えられた。これに加えて、未確認の真菌感染と夏場を過ぎての低温も、変態率の減少の原因になった。	
 H.	
 tigerinus

14の繁殖力は正常であったが、H.	
 tigerinus の子ガエルの大量生産にはさらに改善が必要である。将来、H.	
 tigerinus の実験で大量生産と保護を確実にするために、変態までのすべての段階で水温の厳しいコントロールが必要であることがわかった。	
 ５）絶滅危惧種における精子凍結保存法の確立	 	
  絶滅危惧種の域外保全を行う上で、精子凍結保存は有効な手法である。両生類では、ツメガエルで精子凍結保存法が一般化されており、また、陸上性ガエ
ルでも、精子凍結保存後の受精率を観察した例がある。しかし、絶滅危惧両生類において、精子凍結保存を用いた域外保全法は確立されていない。本研究では、絶滅危惧両生類において精子凍結保存と人工受精を組み合わせた簡便な域外保全法を確立することを目的とした。ツメガエル類で確立されている精子凍結保存法は、液体窒素の代わりに-80℃のディープフリーザーを用い、また、高価な試薬が不要という利点があり、きわめて低コストで実施が可能である。本
研究では、この方法を絶滅危惧種のイシカワガエルと、普通種のニホンアカガ
エル（ただし、広島県では絶滅危惧種）に適用した。凍結精子（27時間から1ヶ月、-80℃で凍結）を解凍し、運動能を調べた結果、凍結した精子のほとんどは、
運動能を喪失していた。しかし、この精子を用いて人工受精を行った結果、イシカワガエルとニホンアカガエルのどちらにおいても、正常卵割する卵が観察でき、-80℃保存精子にも受精能が残っていることが明らかになった。受精率は保存期間や卵の状態によって変動し、27時間保存では受精率は5.0～36.8％であり、1週間保存では、2.3～9.0％、1ヶ月保存では1.7％～4.6％であった。また、
イシカワガエル・ニホンアカガエルの双方で、尾芽胚期以降の発生は見られなかったが、これは凍結していない通常の精子を用いた人工受精コントロール胚でも同様であった。このため、本年度用いた卵の状態が悪く、発生が進行しなかったものと考えられた。	
 ６）アフリカガエル類（Afrobatrachia）のミトコンドリアゲノム：ゲノム構造の多様化、遺伝子配置変化メカニズム、および配置変化遺伝子の進化的傾向	
 	
  アフリカガエル類（Afrobatrachia）は、2006 年に	
 Frost	 et	 al.によって新設された、カエル亜目（Neobatrachia）に属する分類群で、ヒメアマガエル類（Microhylidae）とアカガエル類（Natatanura）とともに、アカガエル上科（Ranoidae）を形成する３つの主要なグループの一つである。アフリカガエル類は、アナホリガエル科・フクラガエル科・サエズリガエル科・クサガエル科の４科を含み、その名の通り、アフリカ大陸にのみに分布する。これら４科の類縁関係は従来不明な点が多く議論が続いていた。最近の研究から、これらの科が単系統群である事が確かめられているが、アフリカガエル類を特徴づける
共有派生形質はこれまでに発見されていない。アカガエル上科内でのアフリカ
ガエル類の系統関係についてはコンセンサスが得られていない。本研究では、（1）ミトゲノムおよび核遺伝子の大量塩基配列情報を用いたアフリカガエル類の系統的位置の解明。（2）アフリカガエル類ミトゲノムにおけるミトゲノム構
造変化（遺伝子重複・遺伝子配置変化）の探索。（3）アカガエル上科における
ミトゲノム構造変化に基づく遺伝子配置メカニズムの検証。（4）重複および配置変化ミトゲノム遺伝子の分子進化傾向の推定を目的とした。本研究の結果、

15

アフリカガエル類は単系統群となり、さらに、ヒメアマガエル類と姉妹群を形成した。また、アフリカガエル類を特徴づける共有派生形質はこれまでに見つかっていなかったが、今回解析したアフリカガエル類全種のミトゲノムにおいて、通常の WANCY-	
  tRNAs という遺伝子配置から変化した、WNACY-tRNAs	
 という配置が共有されていた。この新たに発見された遺伝子配置は、アフリカガエ
ル類の共有派生形質としてみなせるものと考えられた。アフリカガエル類の中でも、Hemisus（アナホリガエル）のミトゲノムの遺伝子配置は、一般的なカエル亜目型とほぼ同じであった。一方で、他の 3 種のミトゲノムは、カエル亜目
一般型から大きく逸脱していた。なお、動物のミトゲノムの遺伝子配置変化は、
主に複製エラーによって生じる縦列重複を通じて生じると考えられてきた（TDRL モデル）。最近我々は、動物の mt ゲノムで、非縦列重複を説明するために、「第一縦列・第二非縦列モデル」を提唱した。アフリカガエル類のミトゲノムで多く観察された、縦列重複領域内に位置する非縦列重複遺伝子領域は、このモデルと同じプロセスによって、アフリカガエル類のミトゲノムの遺伝子配置変化が生じたことを実証するものであった。	
 ７）光る透明ガエル「スケルピョン」の作製	
 	
  これまでに、2 種の色素細胞を欠き、皮膚が透けて見えるニホンアカガエル「透明ガエル」（通称・スケルピョン）の作出と継代維持に成功している。透明ガエ
ルは、実験的に生み出された内臓透視可能な唯一の四足動物であり、実験動物としてのポテンシャルは高い。一方で、アカガエルは非モデル動物であるため、透明ガエルを研究界に導入するためには、実験手法の確立・基礎データの収集・実験の成功例の明示というステップが必須である。本研究では、透明ガエルの有用実験動物化の第一ステップとして、ニホンアカガエルへの遺伝子導入方法を構築し、「光る透明ガエル」の作出を目的として研究を開始した。ニホンアカ
ガエル野生型を実験に用いた。顕微注入の前段階として、受精卵のゼリーを除去する方法を検討した。また、顕微注入の条件検討を行うために、mCherrymRNA	
 をマーカとして用いた。さらに、ツメガエルのプロモーターがニホンアカガエ
ルでも機能するかを検討するために、アフリカツメガエルカルディアックアク
チンプロモーター連結 EGFP ベクターをニホンアカガエル幼生尾部の体節に顕微注入し、EGFP の発現を蛍光顕微鏡で確認した。本年度の研究により、卵ジェリーを取り除く溶液、インジェクション時の針の太さ、インジェクション時のガ
ス圧、注入 DNA、I-SceI（あるいは蛍光色素タンパク質 mRNA）の濃度と容量、
インジェクション時とその後の受精卵維持水の水質と至適温度など、顕微注入実験に必要な条件を大幅に絞り込むことができた。	
 ８）ヌマガエル科３属６種における繁殖隔離機構	
 	 	
  ヌマガエル科のカエルにおける交配後隔離機構を明らかにすることを目的に、ヌマガエル科の 3 属（Hoplobatrachus、Euphlyctis と Fejervarya）から 6 種を使って交雑実験を行ない、雑種について生活力を調べ、成熟期に達した雑種については、形態計測、ミトコンドリア DNA 解析およびアロザイム分析を行うとともに、生殖腺で染色体観察や組織学的観察を行なった。本研究でHoplobatrachus 属と Euphlyctis 属の間には、完全な雑種致死による隔離がある16

ことがわかった。H.	
 tigerinus 雌と H.	
 chinensis 雄との雑種は、幼生の段階で発育不全により死亡したが、いくつかの雑種個体は正常に発育して、成熟期まで生き残った。	
 染色体観察と mtDNA とアロザイム酵素分析により、これらの成熟した雑種は、2 つの雌親ゲノムと 1 つの雄親ゲノムからなる異質三倍体である
ことを確認した。本結果は、異質三倍体が自発的に生産されたことを示唆した。
さらに、組織学的観察によって、これらはすべて不妊の雄であることが明らかになった。本研究により、交配後隔離の程度は、系統関係を明確に反映することがわかった。	
 ９）胚発生初期に背腹と頭尾のパターン形成が調和する機構	
 初期発生過程で背腹と頭尾の体軸が形成されると初めて胚の３次元座標が決まり、基本的な体の設計図（ボディープラン）が確立する。背腹軸は腹側化因子（BMP）によって、頭尾軸は後方化因子（Wnt・FGF・レチノイン酸）によって、それぞれ決定される。胚が正常発生するためには背腹と頭尾の体軸形成が互いに調和しながら形成される必要があるが、この調和機構の解析は進んでいない。
本研究は、アフリカツメガエル胚から機能スクリーニングにより新たに単離した Biz(BMP	 inhibitory	
 zinc-finger)タンパク質による体軸形成の調和機構を明らかにすることを目的とした。昨年度までに、Biz が腹側化因子 BMP のシグナルを抑制して神経誘導（背側化）を引き起こすこと、さらに後方化因子 Wnt シグ
ナルと協調して頭尾軸形成を調節することを明らかにした。Biz 特異的なアンチ
センスモルフォリノオリゴ（MO）を初期胚に注入して機能を阻害すると、後方神経マーカーHoxB9 の発現が著しく低下したため、Biz が胚の後方形成に必要であることが分かった。一方、背腹軸形成について調べると、Biz	
 MO 注入胚では神経マーカーNCAM の発現が著しく低下した。興味深いことに、別の初期神経マ
ーカーSox2 の発現は、ほとんど影響を受けなかった。背腹軸形成が進行して背側と腹側にそれぞれ神経と表皮が分化し始めると、神経領域では最初に Sox2 が発現して神経分化への方向付けが行われ、続いて最終的な神経分化が進むとNCAM の発現が始まることが知られている。したがって、Biz は神経分化初期の
方向付け段階ではなく、より後期の神経分化段階に必要であると考えられた。	
 １０）ネッタイツメガエルを活用した Biz の機能解析	 本研究施設は、本年度から文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェク
ト（NBRP）に新規採択され、ネッタイツメガエルのリソース拠点となった。そこで、アフリカツメガエルに比べて優れた特徴を持つネッタイツメガエルから
Biz 遺伝子（XtBiz）を単離し、機能解析に利用した。データベースの塩基配列を参考にして、PCR 法により XtBiz 遺伝子を得た。次に、XtBiz 特異的なアンチ
センスモルフォリノオリゴ（XtBiz	 MO）を作製して機能阻害を行ったところ、尾部構造が縮小する一方、頭部構造が拡大した。この表現型は、アフリカツメ
ガエルを用いたマーカー遺伝子発現解析から予想される表現型と一致していた。
さらに、ホールマウント	
 in	
 situ	 ハイブリダイゼーション法によって、発生過程における XtBiz 遺伝子の発現を調べたところ、アフリカツメガエル胚を用いた解析に比べて遙かに良好な結果を得た。したがって、ネッタイツメガエルは、
アフリカツメガエルに対して有利な点を持つことを改めて確認できた。これらの結果から、Biz 遺伝子は予定神経領域に発現することが明らかになり、Biz が
背腹軸と頭尾軸の調和に働く可能性がさらに強まった。	
 17１１）アフリカツメガエル初期発生過程における神経誘導保証機構の解析	
 両生類の胚は羊膜や卵殻を持たず様々な影響を受けやすいにも関わらず、正常に発生する。これは、両生類が遺伝的・環境的変化に適応する仕組み、すな
わち発生生物学者 C.H.Waddington が提唱するキャナリゼーションを発達させてきたことを示唆する。初期胚は様々な遺伝的・環境的変化にさらされながらも、背腹と前後の軸が形成されボディープランが確立される。私たちが単離した
FoxB1 転写因子は腹側化因子 BMP のシグナルを抑制して神経を誘導（背側化）し、後 方 化 因 子 Wnt ・ FGF の シ グ ナ ル を 活 性 化 し て 胚 を 後 方 化 す る(Takebayashi-Suzuki	
 et	
 al.,	 2011)	
 。本研究では、FoxB1 転写因子を中心に、背腹軸と頭尾軸の調和機構、および神経誘導の保証機構に関する分子メカニズ
ムを解析することを目的とした。昨年度までの研究から、FoxB1 と、その上流で働く Oct-25 は外胚葉中で feed-forward	 loop	
 ネットワークを形成し、Oct-25の働きが低下しても FoxB1 が神経誘導を保証していると考えられた。神経誘導には、外胚葉を裏打ちする中胚葉からのシグナルも重要である。そこで、外胚葉と裏打ちする中胚葉との組織間相互作用を弱めるため、神経外胚葉の一部を切り出して培養すると、FoxB1 機能阻害胚では神経誘導が著しく低下するが、FoxB1 が存在すると神経は正常レベルで誘導されていた。つまり、外胚葉に発現する FoxB1 と中胚葉との間にも、協調的な神経促進作用が存在することが確認できた。以上の結果から、FoxB1 は背腹軸と頭尾軸の調和に働くだけでなく、様々な遺伝的・環境的変化に初期胚がさらされても神経が誘導されるように保証する機構として、正常な発生を促していると考えられた。	
 
	
 

IV.	
 社会活動	
 ○見学研修等	 中島圭介、中島妙子	
 ・施設訪問者見学者に遺伝子破壊ネッタイツメガエルの概要説明（2012 年 8 月〜2013 年 3 月）	
 
住田正幸	
 
・	
 淡島マリンパーク夏休み「日本のカエル天然記念物」特別展	
 （2012 年 7 月〜8 月）（イボイモリ、オットンガエル、ホルストガエルの繁殖個体展示）	
 住田正幸、井川武、新谷望、Islam	
 M.	
 Mafizul、倉林	
 敦、大海昌平、勝連盛輝	
 ・動物ひろば「見てみよう触ってみよう―多様な動物の世界」で『生きた化石「イボイモリ」と日本一きれいな「イシカワガエル」と内臓透視「スケルピョン」	
 』展示（大阪大学総合学術博物館）（2012年9月15日）	
 鈴木厚、竹林公子	
 ・施設訪問者見学者に NBRP オープンラボの概要説明（2012 年 8 月〜2013 年 3月）	
 柏木昭彦、柏木啓子	
 ・施設訪問者見学者にネッタイツメガエルリソースの概要説明（2012 年 8 月〜
2013 年 3 月）	
 柏木昭彦、鈴木厚	
 18

・「NBRP メダカ-NIBB	
  精子凍結・人工授精トレーニングコース」参加（2012 年
８月、基礎生物学研究所、岡崎）	
 柏木昭彦、田澤一朗	
 ・「第６回 NBRP データベース研究会」参加（2013 年３月、国立遺伝学研究所、三島）	
 柏木昭彦、柏木啓子、花田秀樹、小林里美、難波ちよ	
 ・「教材としてのネッタイツメガエルおよびアホロートルの展示」第 94 回日本
生物教育学会（2013 年１月、広島大学、東広島）	
 柏木昭彦、柏木啓子、花田秀樹、小林里美、竹中純子、住田正幸	
 ・「ツメガエルって、どんなカエル？」第 83 回日本動物学会（2012 年 9 月、大阪大学、大阪）	
 柏木昭彦、柏木啓子、花田秀樹、中島圭介、住田正幸	
 ・「ネッタイツメガエルの近交化・標準系統の樹立・提供」第 35 回日本分子生物学会（2012 年 12 月、マリンメッセ福岡、福岡）	
 	
 ○セミナー講演会講師等	
 矢尾板芳郎	
 ・平成２４年度	
 広島県科学オリンピック科学セミナー（生物分野）25 人参加	 「カエルの解剖」2012 年 11 月 10 日	
 ・	
 第４回遺伝子組換え実験安全研修会—遺伝子組換え実験の安全管理・教育訓
練—、２０１２年７月７日、神戸市、神戸大学瀧川記念学術交流会館	
 矢尾板芳郎、住田正幸、倉林敦	
 ・大型プロジェクト事業報告会「先駆的両生類研究の展開－両生類の絶滅危惧種の保全と標的遺伝子破壊方法の開発－」2012 年 12 月 11 日（広島大学）	
 
三浦郁夫	
 
・
“カエルの性決定：例外が進化を証明する“特別講義	
  東京大学水産実験所	
  １
１月９日（金）２０１２年	
  浜松市	
 ・
“生物と性の進化”放送大学面接授業	
  放送大学広島学習センター	  11 月 27−
28 日	
  ２０１２年	
  広島市	 ・“トキが見つけた新種のカエル“	
 東広島市河内地域センター	
  生涯学習まちづくり出前講座	  １１月２９日（木）２０１２年	
  東広島市	 ・“科学研究の原点	
  –私と生物学–”	
 	
 広島国泰寺高校	
  国泰寺科学クラブ	
  １
２月１５日（土）２０１２年	
  広島市	
 ・“新種サドガエル進化の謎 〜A	 new	 frog	
 species	
 "Sado-gaeru":	
 its	
 evolutionary	 mysteries〜	
 広島大学大学院理学研究科理学融合センター・ラ
ンチタイムセミナー	  1 月２２日（火）２０１３年	
  東広島市	 ・	
 “トキが見つけた新種のカエル”広島大学第４７回東京イブニングセミナー	 ３月８日（金）２０１３年	
  東京	
 
住田正幸	
 
・総合博物館サテライト館オープニング講演会『世界でオンリーワンの両生類

19

研究施設』	
 2012 年 4 月 26 日（広島大学理学研究科）	
 ・第 3 期 NBRP 開始記念	
 シンポジウム	 −	
 第 3 期への挑戦	
 −	
 「ネッタイツメガ
エルの近交化・標準系統の樹立・提供」2012 年 11 月 21 日	
 （品川）	
 ・第 7 回国際両生爬虫類会議「両生類景観生態学保全遺伝学」部門 9 演題座長
2012 年 8 月 11 日（カナダ、バンクーバー）	
 
鈴木厚	
 
・MRC	
 National	
 Institute	
 for	
 Medical	
 Research,	
 London 研究所セミナー講師(イギリス)	
  	 	
 ・第 6 回日本ツメガエル研究集会・講演「NBRP ネッタイツメガエルの現況」2012
年 7 月 14 日（立教大学・東京）	
 	
 ○各種役員、委員等（学外のみ）	
 
古野伸明	
 
・	
 広島工業大学入試委員	
 
三浦郁夫	
 
・（財）染色体学会・理事、学会賞選考常任委員、学会誌編集委員	
 ・Editorial	 Board	 of	
 Asian	 Herpetological	
 Research	
 ・豪州キャンベラ大学非常勤准教授	
 ・	
 ポーランド科学研究費審査員（Narodowe	
 Centrum	
 Nauki）	
 住田正幸	
 ・生物遺伝資源委員会委員（国立遺伝学研究所）	
 	
 ・ナショナルバイオリソースプロジェクト運営委員会委員長会議委員	
 ・日本動物学会支部代表委員･学会賞等選考委員会委員	
 ・国際両生爬虫類学会・執行委員	
 鈴木厚	
 ・日本ツメガエル研究集会	
  組織委員	 ・米国 Department	
 of	
 Cell,	
 Developmental	
 and	
 Integrative	 Biology	
 at	
 the	
 
University	
 of	
 Alabama	
 at	
 Birmingham 教授選考業績評価者	 ・14th	
 International	
 Xenopus	 Conference（国際ツメガエル会議、フランス）
ポスター賞選考委員	
 倉林敦	
 ・ISRN	 Genomics	
 編集委員	
 柏木昭彦	
 ・広島工業大学および山陽女子短期大学の試験委員	
 
	
 

V.	
 国際交流活動	 ○国際共同研究	
 矢尾板芳郎	
 ・ヴァージニア大学（米国）	
 

20

	
  研究テーマ：「ネッタイツメガエルの遺伝子変異作製について」	
 
古野伸明	
 
・レンヌ１大学（フランス）Prof.	
 Claud	 Prigent	
 	 	
  研究テーマ：「サイクリン B2 の卵成熟過程における紡錘体形成の機能解析」	
 
三浦郁夫	
 
・キャンベラ大学（豪州）Dr.	
 Tariq	
 Ezaz	
 	 	 	 	
  研究テーマ：「性染色体に関する研究」	
 ・成都生物学研究所（中国）Dr.	
 Xiaomao	
 Zeng	
 	 
	
  研究テーマ：「ツチガエルの進化に関する研究」	
 
住田正幸	
 
・バングラデシュ農業大学（学部間協定締結校）Khan,	
 M.	
 M.	
 R.	
 教授	
 
研究テーマ：「バングラデシュのカエル類の種多様性と遺伝的多様性に関す
る研究」	
 
鈴木厚	
 
・米国エネルギー省ほか	
  	 	
  研究テーマ：「アフリカツメガエルゲノムプロジェクト」	
 ・英国ポーツマス大学および米国ウッズホール海洋生物学研究所	
  	
 	
  研究テーマ：「国際ツメガエルリソース拠点形成」	
 倉林敦	
 ・ブラウンシュバイク工科大学	
  	
 	
  研究テーマ：「無尾類における転移因子の研究」	
 	
 ○外国人研究員受入れ	
 
住田正幸	
 
・	
 Aris	
 Soewondo(ブラビジャヤ大学・講師)2012 年 6 月 1 日〜2012 年 7 月 1 日	 	 ○外国人留学生の受入れ	
 
住田正幸	
 
・	
 文部科学省国費留学生（Sultana	
 Nasrin,	
 バングラデシュ）（研究生	 2012 年 10 月 4 日から）	
 
	
 

VI.	
 その他（特記事項）	
 ・文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクト(NBRP)「ネッタイツメガ
エルの近交化・保存・提供」が新規に採択され、これに関連して、今年度は
主に以下の事業を行った。NBRP 運営委員会＆SiteVisit（H24 年８月 24 日）。
第３期 NBRP 開始記念シンポジウム-第 3 期への挑戦-で講演（H24 年 11 月 21日）。３学会での展示説明（第 83 回日本動物学会「動物学ひろば」H24 年９月、第 35 回日本分子生物学会 H24 年 12 月、第 94 回日本生物教育学会 H25 年１月）。
ネッタイツメガエル技術講習会開催（H25 年３月 13 日〜16）。これらの事業は、
前記９名の課題協力者による献身的な奉仕により達成され、その成果は両生21

類研究施設の紹介記事として、日本経済新聞「知の明日を築く」（H25 年３月14 日）に取り上げられた。	
 ・総合博物館サテライトとして玄関ロビーを一般公開した。理学研究科で 4 月
26 日に記念講演会を開催した。	
 ・理学部・大学院理学研究科公開（2012年11月5日）において研究施設を公開し、およそ300名が見学した。上記とは別に，2012年度には37件総数500名が施設見学をしている。施設見学には、益川敏英先生（ノーベル物理学賞受賞）（2012年10月）および	
 高知大学と東京芸術大学の学長（2012年５月、11月）などがある。	
 ・花田秀樹助教と田澤一朗助教は附属両生類研究施設で行われている系統保存事業に従事するとともに、総合博物館サテライトのオープンに貢献した。	
 ・三浦郁夫准教授らは佐渡島に新種のカエルを発見し、サドガエル(Rugosa	 susurra)と命名した。本州のカエルでは22年ぶりの発見であり、佐渡島における最初の脊椎動物固有種の記載である。これは、佐渡島の生物地理学的常識を覆す発見であり、主要新聞をはじめとして国内ほぼ全ての新聞に掲載された（2012年12月11〜12日）。またテレビやラジオなどでも紹介され、大きな注目を集めた。	
 ・絶滅危惧種「アマミイシカワガエル」で人工繁殖による保全の成功について、紹介された（奄美新聞	
 2013年３月24日）。	
 ・三浦郁夫准教授は国際ワークショップ	
 “The	 Workshop	
 on	
 Sex	
 Determination	
 in	
 Dragons,	
 Frogs	 and	
 Fugu	 fish”を2013年３月６日、広島大学大学院理学研究科大会議室で開催した（招待講師：国内３名、国外２名）。	
 ・倉林敦助教はBMC	
 Evolutionary	 Biology誌、Mitochondrial	
 DNA誌において、
論文レビューサービスを行った。	
 ・鈴木厚准教授と竹林公子特任助教は広島県立教育センター「第 16 回教材生物
バザール」に出展・解説を行った。	
 

	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 

22

VII.各部門の研究内容と研究業績	
 [発生遺伝学研究部門]	
 	
 教授･矢尾板芳郎（Yoshio	 Yaoita）	
 
	
 
研究内容	
 
	
  両生類の変態（メタモルフォシス）は、甲状腺ホルモンの血中濃度上昇に伴い、幼生から成体へと体の作り替えが起きる現象である。特に無尾両生類の変態は劇的であり、四肢の発生、成長と尾の退縮が連続して起きる。体長の２倍以上の長さである尾が数日のうちに完全に消失する。変態に伴い、ほとんど全ての体内器官が変化していく。このような体の再構成のメカニズムを分子生物学的な立場から明らかにすることを研究目的としている。	
 	
 １.ネッタイツメガエルでの遺伝子破壊法の確立およびアルビノ系統の確立	
 The	
 establishment	
 of	
 the	
 gene	
 knockout	 methods	
 to	
 generate	 the	
 albino	 Xenopus	 tropicalis	
 line	
 
	
 
[目的]	
 
	
  Zinc-finger	
 nuclease	
 (ZFN)法や Transcription	
 activator-like	 effector	
 nuclease	
 (TALEN)法は標的遺伝子を破壊するのに優れた方法である。これらの方法を用いて二倍体のネッタイツメガエルで標的遺伝子破壊方法を確立し、ネッタイツメガエルのアルビノ系統を確立することを目的とする。ネッタイツメ
ガエルには現在、アルビノ系統が無く、その作製が望まれている。	
 	
 [成果･考察]	
 １）メラニン色素合成に重要な役割を果たす tyrosinase 遺伝子を標的として ZFNを合成して、その mRNA をネッタイツメガエル受精卵に注入した。皮膚のメラニ
ン色素を一部欠損するキメラ個体 F0 を複数得た。F0 を交配することによって完全なアルビノネッタイツメガエルを得ることに成功し、アルビノ系統を確立した。	
 ２）TALEN 法を用いても効率良くアルビノネッタイツメガエルを作製できた。	
 ３）TALEN 法として様々なベクターが開発されてきた。それらを同一基準で比較したことにより、DNA 結合部位の N 末、C 末を欠損させることにより標的遺伝子
破壊活性が高くなること、ヘテロダイマーを形成するベクターでは毒性が低くなることが明らかになった。	
 	
 [将来の展望]	 	  F0 で標的遺伝子をすべて破壊する方法や F1 で効率的にホモの変異を有する個体を獲得する手段を開発する。その上で変態に関係すると考えられてきた遺伝子を不活化して、機能を推定していく。	
 （共同研究者：中島圭介、中島妙子、高瀬稔、岡田守弘、中井裕也）	
 	
 ２.ツメガエル幼生の変態での尾の退縮における ouro 遺伝子の機能の再評価	
 23

Reexamination	
 of	
 ouro	 gene	
 function	
 in	
 tail	 regression	
 during	 metamorphosis	
 of	
 Xenopus	
 tadpole	
 
	
 
[目的]	
 
	
  井筒らが 2009 年に PNAS に発表した「Ouro 蛋白質を発現している尾が免疫系により拒絶されて退縮する。」という説は斬新なものであった。当時は私たちの研究室等が「変態クライマックス初期では尾の筋細胞が直接に甲状腺ホルモンに反応してアポトーシスをおこし、後半はそれに加えて細胞外基質分解酵素が甲状腺ホルモン反応遺伝子として誘導され、細胞が足場を失い、死んでいき、尾が退縮する。」と考えていた。前者の説によれば「Ouro 蛋白質を変態クライマックスに発現すれば拒絶されて死が促進される。」、後者の説は「甲状腺ホルモ
ンシグナルを阻止すれば変態初期では死なない。」となる。本研究は、この２つの説が共に正しいのか、またその時は、どちらの効果が大きいのかを明らかにすることを目的とする。	
 	
 [成果･考察]	
 １）ouro	 1 遺伝子に EGFP 遺伝子を ouro	
 2 遺伝子に mCherry 遺伝子を融合させた発現型ベクターを作製して、幼生尾の筋細胞に導入した。ouro	
 1 遺伝子と ouro	 2 遺伝子の筋細胞での過剰発現は、変態クライマックスでもその筋細胞死を促進しなかった。	
 ２）ドミナントネガティブ甲状腺ホルモン受容体を共発現させて、甲状腺ホルモンによる尾の筋細胞死を抑制させても、ouro 遺伝子の過剰発現による筋細胞死の促進は尾の退縮時でも観察されなかった。	
 	
  したがって、ouro 遺伝子をほぼ発現していない尾の筋細胞で ouro 遺伝子を過剰発現させても変態時でさえ細胞死を促進できないと考えられる。	
 	
 [将来の展望]	 	  今後は TALEN 法を用いて ouro 遺伝子を破壊した場合、どのような表現型が出現するかを検討して行きたい。	
 （共同研究者：中井裕也、中島圭介）	
 
	
 
３.	
 無尾両生類の変態期尾退縮に於ける Hox 遺伝子の機能	 The	
 function	
 of	
 the	
 Hox	
 genes	 during	 anuran	 tail	
 resorption	
 
	
 
[目的]	
 
	
  無尾両生類幼生の尾部では変態期にプログラム細胞死が活発に起こる。一方、胴部では一部細胞死も起きるが、細胞増殖も起こり、結果として尾部のみが消失する。この予定消失域を決定する機構において、体軸に沿って発現する Hox
遺伝子が重要な役割を担っているのではないかと仮説をたてて、本研究ではそれを検証することを目的としている。	
 	
 [成果･考察]	
 24	  尾部を切断した無尾類幼生をレチノイド処理することによって、尾のかわりに後肢様の構造が生じることが一部のカエルで知られていた。しかし、アフリ
カツメガエルや本邦産の無尾類ではこの現象は再現されていなかった。この状
況下で我々はこの現象を再現させることを試み、本邦産無尾類を用いて初めて成功した。	 	
 [将来の展望]	 	  レチノイド処理により生じた後肢様構造が成体であることを、成体型マーカ
ー遺伝子発現で確かめる。レチノイド処理による後肢形成における Hox 遺伝子の発現変化と変態期細胞死および成体器官発生との関係を調べる。	
 （共同研究者：田澤	
 一朗）	
 
	
 
研究業績	
 
①原著論文	
 1.Keisuke	 Nakajima,	
 Yuya	 Nakai,	 Morihiro	
 Okada	 and	
 Yoshio	
 Yaoita	 Targeted	  gene	  disruption	  in	
  the	
  Xenopus	
  tropicalis	  genome	  using	 designed	
 TALE	
 nucleases	
 Zoological	
 Science,	
 in	 press	 	
 2.Morihiro	
 Okada,	
 Ichiro	
 Tazawa,	
 Keisuke	 Nakajima	
 and	
 Yoshio	
 Yaoita	 The	 expression	
 of	
 the	
 amelogenin	
 gene	 in	
 the	
 skin	 of	
 Xenopus	 tropicalis	 Zoological	
 Science	
 30(3),	
 154-159,	
 2013	 	
 3.Keisuke	 Nakajima,	
 Taeko	 Nakajima,	
 Minoru	
 Takase	 &	 Yoshio	
 Yaoita	 Generation	
 of	
 albino	
 Xenopus	 tropicalis	
 using	 zinc-finger	
 nucleases	
 Development,	
 Growth	 &	
 Differentiation	
 54,	
 777-784,	
 2012	 	
 4.Keisuke	 Nakajima,	
 Kenta	 Fujimoto	
 and	
 Yoshio	
 Yaoita	 Regulation	
 of	
 thyroid	
 hormone	 sensitivity	
 by	
 differential	
 expression	
 of	
 
the	
 thyroid	
 hormone	 receptor	
 during	
 Xenopus	 metamorphosis	
 Genes	 to	
 Cells	
 17,	
 645-659,	
 2012	 	
 5.Morihiro	
 Okada,	
 Keisuke	 Nakajima,	
 Yoshio	
 Yaoita	 Translational	
 regulation	
 by	
 the	
 5’-UTR	 of	
 thyroid	
 hormone	 receptor	 α	 (TRα)	 mRNA.	
 J.	
 Biochemistry	
 151,	
 519-531,	
 2012	 	
 ②総説･著書	 1.矢尾板芳郎「蛙や昆虫の変態について」日本医事新報	
 No.4584、62-64、2012

25

年	
 
	
 
③学会発表	 	  国内学会	 1.岡田守弘、中島圭介、矢尾板芳郎	
 甲状腺ホルモン受容体αmRNA の翻訳を抑制する 5’非翻訳領域の解析	
 第 53 回日本生化学会中国四国支部例会、２０１２年５月１８日、岡山市、岡山大学キャンパス	 	 2.矢尾板芳郎	 検討中の拡散防止措置の例—カエル	
 第４回遺伝子組換え実験安全研修会—遺伝子組換え実験の安全管理・教育訓練—、２０１２年７月７日、神戸市、神戸大学瀧川記念学術交流会館	
 	
 3.中島圭介、中井裕也、岡田守弘、高瀬稔、矢尾板芳郎	
 ネッタイツメガエルにおけるノックアウト法の活用	
 第 83 回日本動物学会、大阪（２０１２年９月１４日）	
 	
 4.中井裕也、中島圭介、矢尾板芳郎	
 アフリカツメガエルの変態期の尾の筋細胞における Ouro の強制発現	 第 83 回日本動物学会、大阪（２０１２年９月１５日）	
 	
 5.中島圭介、中島妙子、岡田守弘、矢尾板芳郎	
 Zinc-finger	
 nucleases	
 (ZFNs)	
 を用いたアルビノ Xenopus	
 tropicalis の作製	
 第３５回日本分子生物会年会、福岡（２０１２年１２月１２日）	
 	 	  国際学会	 	  該当なし	 	
 ④科研費等の受け入れ状況	 	  該当なし	
 
	
 

	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 

26

准教授・髙瀬	
  稔（Minoru	
 Takase）	
 
	
 
研究内容	
 
１．性転換機構の解析：	
 トノサマガエル幼生へのエストロゲン投与による生殖腺への影響	
 Analysis	
 of	
 mechanism	
 of	
 sex	
 reversal	
 in	
 amphibians:	
 Effects	
 of	
 estrogen	
 
on	
 the	
 gonad	 of	 the	 frog	
 Rana	
 nigromaculata	
 
	
 
[目的]	
 
両生類では性ホルモン処理により性転換が誘導されることが古くから知られている。しかし、そのメカニズムに関してはほとんど解明されていない。	
 特に、すでに分化した生殖腺から精巣または卵巣への性転換現象には、	
 ①脱分化・リプログラミングからなると思われる分化転換機構および生殖細胞	
 などの生殖腺を形成する細胞の性分化機構	
 ②幹細胞から生殖細胞などの生殖腺を形成する細胞への性分化機構	
 などの作用機構が、少なくとも一部には働いていることが考えられる。	
 これまで実験材料として、性ホルモン投与により雄へも雌へも性転換が誘導される利点を持つ広島県ツチガエル（R.	
 rugosa）を主な実験材料として用いてきた。本研究では、ツチガエル同様に両方の性に性転換が誘導される種を見つけるために、アンドロゲンによって容易に雌から雄へ性転換が誘導されるトノ
サマガエル（R.	
 nigromaculata）を用いて、性分化前から変態期までの長期間にエストロゲンを投与した時の性転換の有無を調べた。	
 	 [材料・方法]	
 
材料には富山県で採集したトノサマガエルを用いた。人工媒精により受精卵を得て、受精後 10 日目の幼生を 2 匹/リットル飼育水で飼育し、人工エストロ
ゲンであるエチニルエストラジオール（EE2）を終濃度が 0.3 および 3.0、30	
 nMになるように、それぞれ飼育水に添加した。その後、一日おきに EE2 を含んだ
新しい飼育水に交換し、TK ステージ XX まで飼育した後に生殖腺を取り出した。
取り出した生殖腺をブアン液に固定し、厚さ 7	
 mm のパラフィン薄切切片を作成した後にヘマトキシリン染色を行い、検鏡した。対照群として、溶媒である DMSO
を飼育水に添加した。	
 
	
 
[成果]	
 
	
  EE2 の 0.3 および 3.0nM 処理では正常な精巣を持つ個体は見られなかったが、精巣卵を持つ個体が見られ、出現率はそれぞれ 14.3%および 12.5%であった。30	
 nM 処理では、全ての幼生は卵巣を持っていた。一方、対照群の性比は雄：雌＝４：５であった。	
 
	
 
[考察]	
 
今回、広島県ツチガエルの他に、富山県トノサマガエルも低濃度の性ホルモン投与により雄へも雌へも性転換が誘導される可能性が示唆された。富山県トノサマガエルは広島県トノサマガエルとは異なり、野外の雄において高率に精27

巣卵が観察される。その原因が遺伝的背景によるのか、環境化学物質によるのかは研究中であるが、もしかしたら何らかの遺伝的背景が影響しているのかも知れない。	 	
 [将来の展望]	
 今回、EE2 の最小投与量においても高率に卵巣が誘導された。さらに低濃度のEE2 を投与し、濃度依存的に卵巣の誘導率が変化することを確かめる必要がある。
また、広島県トノサマガエルの幼生を用いて、エストロゲン投与による性転換の有無を調べる必要がある。様々な両生類種における性転換現象を比較することにより、将来的に両生類性転換の共通機構が明らかになっていくことが期待
される。	
 
	
 
２．性転換機構の解析：ツチガエルおよびトノサマガエルの生殖腺に対する環
境化学物質の影響	 Analysis	  of	  mechanism	  of	  sex	
  reversal	  in	  amphibians:	
  Influences	  of	
 estrogenic	  chemicals	
  on	
  the	
  gonads	
  of	  the	
  frogs,	  Rana	  rugosa	
  and	
  R.	
 nigromaculata	
 	
 
	
 
[目的]	
 
これまで、トノサマガエルおよびネッタイツメガエルの変態完了個体に対して環境化学物質であるビスフェノールＡ（BPA）やノニルフェノール（NP）を投与したところ、トノサマガエルでのみ精巣卵が形成されることを明らかにしてきた。本研究では、トノサマガエルおよび広島県ツチガエルの性分化後の幼生に環境化学物質を投与した時の生殖腺への影響を組織学的に調べた。	
 	 [材料・方法]	
 野外個体において精巣卵出現率が異なる広島県および富山県のトノサマガエ
ル、および広島県ツチガエルの TK ステージ X の幼生にノニルフェノール（NP）
およびビスフェノール A（BPA）を飼育水に添加し、TK ステージ XX まで連続投与した。投与後に生殖腺を取り出し、組織学的解析を行った。対照群として、溶媒である DMSO を飼育水に添加した。	
 
	
 
[成果]	
 
両種共に精巣卵形成に加えて、生殖細胞の減少および精細管の形成不全が観察された。さらにツチガエルでは、卵巣の発達抑制や退化が観察された。	
 
	
 
[考察]	
 
ネッタイツメガエルおよびトノサマガエル（広島県産および富山県産）、ツチガエル（広島県産）の両生類 3 種の中では、広島県ツチガエルの生殖腺がより広く環境化学物質の影響を受けることが確かめられた。また、トノサマガエルにおいても、環境化学物質の影響を強く受けることが示された。ネッタイツメ
ガエルは、エストロゲンにより性転換は誘導されるが、臨界期は限定的である。
一方、ツチガエルおよびトノサマガエルはアンドロゲンにより性転換は誘導さ

28

れ、長い臨界期を持つ。また、エストロゲンによる性転換は、広島県ツチガエ
ルにおいてすでに確かめられており、富山県トノサマガエルにおいても近年示唆された（研究内容１．を参照）。性分化後における環境化学物質の精巣卵形成
作用は環境化学物質が持つと考えられている性ホルモン様作用とは異なると考えられるが、環境化学物質の影響と性転換能との間に何らかの関係があるのかも知れない。	
 	
 [将来の展望]	
 今後、環境化学物質による精巣卵形成機構を解析するためのモデル実験両生類として広島県ツチガエルを用いて、精巣卵形成過程において発現変化する遺伝子を探索する予定である。精巣卵形成を誘導する環境化学物質作用は、性ホルモン様作用とは異なると考えられるため、生殖細胞分化に関するユニークな因子が同定されることが期待される。	
 	
 ３．両生類生殖腺分化機構の解析：ネッタイツメガエル幼生の生殖腺分化に対する飼育温度の影響	 Analysis	
 of	
 mechanism	
 of	 gonad	 differentiation	
 in	
 amphibians:	
 Influences	
 of	
 breeding	 temperature	
 on	
 the	
 gonad	 of	 the	 tadpole	
 of	
 Silurana	
 tropicalis	
 
	
 
[目的]	
 
性転換機構や性分化機構を解析する場合、性に関して汎用性のある遺伝子マーカーが得られていない種においては、全て雄または全て雌からなる幼生集団が有用な材料になる。ネッタイツメガエル幼生にエストロゲンを投与すると、ほとんどが雌からなる集団が得られることから、雄から雌への性転換が誘導されることが考えられる。そして、その雌（遺伝的雄の性転換個体）を用いた戻し交配により、全雄幼生集団が得られることが期待される。しかし、戻し交配を行ったところ、雄が有意に多い幼生集団は得られるが、ほぼ全てが雄からなる幼生集団は得られなかった。そこで本研究では、飼育条件、特に飼育温度による性転換の可能性を調べた。	
 	 [材料・方法]	
 	
  幼生期にエストロゲン処理したネッタイツメガエルの雌を用いて戻し交配を行い、得られた幼生を NF ステージ 45 から水温 20 および 22-23、24、26、28℃で飼育し、変態完了期の生殖腺を組織学的に解析した。	
 
	
 
[成果]	
 
	
  全体的に、水温が高くなると雌の比率が高くなる傾向が見られた。しかし、ほとんど全てが雄からなる集団を安定して得ることはできなかった。また、水温 20 および 28℃の飼育では、発達が遅れた卵巣が多く観察される傾向が見られ
た。	
 
	
 
[考察]	
 
	
  高温飼育により、卵巣の分化や発達が影響を受ける可能性が示唆された。一29

部は、雄から雌への性転換が誘導される可能性も考えられる。しかし、適温飼育を行ってもほとんど雄からなる幼生集団を安定して得ることはできなかった。
従って、全雄幼生集団が得られない原因として、温度による雄から雌への性転
換以外の可能性を考える必要がある。ネッタイツメガエルの性決定機構は遺伝学的に未だ確かめられていない。ZZ/ZW 型の性決定機構を持つアフリカツメガエル（Xenopus	
 laevis）の近縁種であること、さらに ZZ/ZW 型の性決定機構を持つ両生類種によく見られるエストロゲンによる雄から雌への性転換が観察されることから、ネッタイツメガエルの性決定機構は ZZ/ZW 型であると推察される。
しかし、今回の異なる飼育温度における全ての幼生をまとめて性比を調べてみると、雄：雌＝約 3.4：1 になる。これは、ネッタイツメガエルの性決定機構がXX/XY 型であり、YY 個体が生存可能であると仮定した場合の性比（雄：雌＝3：1）に近い値である。また、アフリカツメガエルの卵巣分化誘導遺伝子である DM-Wのオルソログがネッタイツメガエルからは単離されていない。従って、今後ネッタイツメガエルの性決定機構についても確かめる必要があると考える。	
 	
 [将来の展望]	
 	  人工交配によりネッタイツメガエル全雄幼生集団を得ることができれば、ネッタイツメガエルの性転換・性分化機構を解析するための大変有用な材料になると考える。また、ネッタイツメガエルの性決定機構が確かめられた場合、ア
フリカツメガエルにおける性決定機構との比較から、大変興味深いテーマになる可能性がある。	
 
	
 
研究業績	
 
①原著論文	
 1.Takase	  M.,	
  Shinto	
  H.,	
  Takao	  Y.,	
  Iguchi,	  T.	
  (2012)	
  Accumulation	  and	
 pharmacokinetics	
  of	  estrogenic	  chemicals	
  in	
  the	
  pre-	  and	
  post-hatch	 embryos	
 of	
 the	
 frog	
 Rana	
 rugosa.	
 In	
 Vivo	 26,	 913-920.	
 2.Oka	 T.,	 Mitsui-Watanabe	
 N.,	
 Tatarazako	
 N.,	
 Onishi	
 Y.,	
 Katsu	 Y.,	
 Miyagawa	 S.,	
 Ogino	 Y.,	
 Yatsu	
 R.,	
 Kohno	 S.,	
 Takase	
 M.,	
 Kawashima	
 Y.,	
 Ohta	 Y.,	 Aoki	 Y.,	  Guillette	  L.T.	
  Jr.	
  and	
  Iguchi	
  T.	
  (2012)	
  Establishment	  of	 transactivation	
 assay	 systems	
 using	 fish,	
 amphibian,	
 reptilian	 and	
 human	 thyroid	
 hormone	 receptors.	
 J.	
 Appl.	
 Toxicol.	
 doi:	
 10.1002/jat.2825.	
 3.Nakajima	
 K.,	
 Nakajima	
 T.,	
 Takase	
 M.,	
 Yaoita	
 Y.	
 (2012)	
 Generation	
 of	
 albino	 Xenopus	 tropicalis	
 using	 zinc-finger	
 nucleases.	
 Dev.	
 Growth	
 Differ.	
 54,	
 777-784.	
 	
 ②総説・著書	 	  該当なし	 	
 ③学会発表	
 
国内学会	
 
	
  髙瀬	
  稔	
  「性分化後のツチガエルおよびトノサマガエルの生殖腺に対する
ノニルフェノールおよびビスフェノール A の影響」	
  環境ホルモン学会、

30

12/18-19、2012、東京.	
 
	
 
国際学会	
 
	
  該当なし	 	
 ④科研費等の受け入れ状況	 	
  科学研究補助金	
  基盤研究（Ｃ）「カエル精巣卵形成に対する内分泌かく乱物
質のエストロゲン作用とは異なる遺伝子発現」代表者：髙瀬	  稔	
  1,200 千円.	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 

31

助教・中島圭介	
 (Keisuke	 Nakajima)	
 
	
 
研究内容	
 
１.ネッタイツメガエルにおける遺伝子破壊法の開発およびアルビノ系統の確立	 	  The	 development	
 of	
 gene	
 knock-out	 methods	
 and	
 the	
 generation	
 of	
 albino	 	
 Xenopus	 tropicalis	
 line	
 
	
 
[目的]	
 
	
  近 年 開 発 さ れ た 	  Zinc-finger	  nuclease	  (ZFN)	
  法 お よ び 	  Transcription	
 activator-like	 effector	
 nuclease	 (TALEN)	
 法はゲノム中の目的遺伝子を破壊することができる極めて効果的な手法である。本研究はこれらの手法をネッタ
イツメガエルで有効に利用することが可能であるか否かを検討するとともに、色素の沈着に必須なタイロシナーゼ遺伝子を破壊することにより、アルビノ系
統を作出することを目的とする。	
 	
 [材料・方法]	
 	  1)	
 Sigma	
 社より購入したタイロシナーゼ遺伝子を破壊する	
 ZFN	
 の	
 mRNA	
 を
ネッタイツメガエルの受精卵にインジェクションし、体の一部でタイロシナー
ゼ遺伝子を欠失した個体、つまり体の一部が白い個体を作出する。この個体同士を掛け合わせ、タイロシナーゼ遺伝子を全く持たないアルビノ系統を確立す
る。	
 
	
  2)	
 Golden	
 Gate	 cloning	
 法を用いて、タイロシナーゼ遺伝子を破壊する	
 TALEN	 を作成する。	
 1)	
 と同様にタイロシナーゼ遺伝子を一部欠失したキメラ個体を作成する。	 	
 [成果と考察]	
 
	
  	
 ZFN	
 法によりタイロシナーゼ遺伝子を一部欠失したキメラ個体を得ることができた。さらにこのキメラ個体同士を交配させ、世界初の完全なアルビノネ
ッタイツメガエルを作出した。また、Golden	
 Gate	 cloning	
 法を用いて作成した	 TALEN	 が目的配列を切断する活性を持つこと、この変異が生殖細胞に導入されて次世代に伝わる事を確認した。この第一世代の	 TALEN	
 よりも活性の強い	
 GoldyTALEN 、 さ ら に 	  DNA	
  切 断 酵 素 の ホ モ ２ 量 体 化 を 抑 え て 毒 性 を 弱 め た	 ELD/KKR、２量体化を抑える別のタイプである	
 DAD/RVR、活性が更に１５倍強いと報告された	 Sharkey	
 変異体等の活性と毒性を比較した。この結果	
 ELD/KKR	
 タイプの	
 GoldyTALEN	
 が最も活性と毒性のバランスが優れている事を確認した。	
 
	
  	
 ZFN	
 法は効果的では有るが、自分で作成するには技術的な困難が伴う。また、外注した場合は高額な研究費が必要となり、多種類の遺伝子破壊を行うことは現実的に不可能である。一方、初期の	
 TALEN	
 法は	
 ZFN	
 法と比較して活性は弱いものであったが、様々な改良により今では	
 ZFN	
 の数倍の活性と低毒性を獲得しており、低予算で自作できるという利点も有る。これらのことから今後は	
 TALEN	
 法が主流となっていくものと思われる。	
 
	
 

32

[将来の展望]	
 	  TALEN	 法を用いて変態に関わると考えられている様々な遺伝子を破壊し、変態期の分子機構を明らかにしていく。同時に	 TALEN	
 法に更なる改良を加え、	
 F0	
 で完全な遺伝子破壊個体を得る方法を模索する。	
 	 ２.ツメガエル幼生の変態での尾の退縮における ouro 遺伝子の機能の再評価	
 Reexamination	
 of	
 ouro	 gene	
 function	
 in	
 tail	 regression	
 during	 metamorphosis	
 of	
 Xenopus	
 tadpole	
 
	
 
[目的]	
 
	
  井筒らが 2009 年に PNAS に発表した「Ouro 蛋白質を発現している尾が免疫系により拒絶されて退縮する。」という説は斬新なものであった。当時は私たちの研究室等が「変態クライマックス初期では尾の筋細胞が直接に甲状腺ホルモンに反応してアポトーシスをおこし、後半はそれに加えて細胞外基質分解酵素が甲状腺ホルモン反応遺伝子として誘導され、細胞が足場を失い、死んでいき、尾が退縮する。」と考えていた。前者の説によれば「Ouro 蛋白質を変態クライマックスに発現すれば拒絶されて死が促進される。」、後者の説は「甲状腺ホルモ
ンシグナルを阻止すれば死なない。」となる。本研究は、この２つの説が共に正しいのか、またその時は、どちらの効果が大きいのかを明らかにすることを目的とする。	 	
 [成果･考察]	
 １）ouro	 1 遺伝子に EGFP 遺伝子を ouro	
 2 遺伝子に mCherry 遺伝子を融合させた発現型ベクターを作製して、幼生尾の筋細胞に導入させた。ouro	
 1 遺伝子とouro	
 2 遺伝子の筋細胞での過剰発現は、変態クライマックスにその筋細胞死を促進しなかった。	
 ２）ドミナントネガティブ甲状腺ホルモン受容体を共発現させて、甲状腺ホルモンによる尾の筋細胞死を抑制させても、ouro 遺伝子の過剰発現による筋細胞死の促進は尾の退縮時でも観察されなかった。	
 	
  したがって、ouro	
 1 遺伝子や ouro	
 2 遺伝子をほぼ発現していない尾の筋細胞で過剰発現させても変態時の細胞死を促進できないと考えられる。	
 	
 [将来の展望]	 	  今後は TALEN 法を用いて ouro 遺伝子を破壊した場合、どのような表現型が出現するかを検討して行きたい。	
 
	
 
研究業績	
 
①原著論文	
 1.	
 M.	
 Okada,	
 I.	
 Tazawa,	
 K.	
 Nakajima	
 and	
 Y.	
 Yaoita	 Expression	
 of	
 the	
 amelogenin	
 Gene	 in	
 the	
 Skin	 of	
 Xenopus	 tropicalis	 Zoological	
 Science	
 2013	
 Mar;	
 30(3):	
 154-159	
 
	
 
2.	
 K.	
 Nakajima,	
 T.	
 Nakajima,	
 M.	
 Takase	 and	
 Y.	
 Yaoita	 33

Generation	
 of	
 albino	
 Xenopus	 tropicalis	
 using	 zinc-finger	
 nucleases	
 Development	
 Growth	 &	
 Differentiation	
 2012	 December;	
 54(9):	
 777-784	
 
	
 
3.	
 K.	
 Nakajima,	
 K.	
 Fujimoto	
 and	
 Y.	
 Yaoita	 Regulation	
 of	
 thyroid	
 hormone	 sensitivity	
 by	
 differential	
 expression	
 of	
 
the	
 thyroid	
 hormone	 receptor	
 during	
 Xenopus	 metamorphosis	
 Genes	 to	
 Cells	 2012	 August;	
 17(8):	
 645-659	
 
	
 
4.	
 M.	
 Okada,	
 K.	
 Nakajima	
 and	
 Y.Yaoita	 Translational	
 regulation	
 by	
 the	
 5’-UTR	 of	
 thyroid	
 hormone	 receptor	
 α	
 
mRNA	
 
Journal	 of	
 Biochemistry	
 2012	
 May;	 151(5):	
 519-531	
 	
 ②総説・著書	 	  該当なし	 	
 ③学会発表	 	  国内学会	 1.	
  ZFN-finger	
 nuclease	
 (ZFNs)	
 を用いたアルビノ	
 Xenopus	 tropicalis	
 の作製	
 中島圭介、中島妙子、高瀬稔、矢尾板芳郎	
 第 35 回日本分子生物学会年会、博多(2012,	
 12.12)	
 	
 2.	
  ネッタイツメガエルにおけるノックアウト法の活用	
 中島圭介、中井裕也、岡田守弘、高瀬稔、矢尾板芳郎	
 第 83 回日本動物学会、大阪(2012,	
 9.14)	
 	
 3.	
  アフリカツメガエルの変態期の尾の筋細胞における	
 Ouro	
 の強制発現	 中井裕也、中島圭介、矢尾板芳郎	
 第 83 回日本動物学会、大阪(2012,	
 9.15)	
 	
 4.	
  ネッタイツメガエルでの	 TALEN	
 法の報告	 中島圭介	
 XCIJ-All/MA	
 研究集会、東京(2012,	
 7,	
 14)	
 
	
 
5.	
  甲状腺ホルモン受容体α	 mRNA	
 の翻訳を抑制する	 5’	
 非翻訳領域の解析	 岡田守弘、中島圭介、矢尾板芳郎	
 第 53 回日本生化学会中国・四国支部例会、岡山(2012,	
 5.18)	
 	 	
  国際学会	 	  該当なし	 	
 ④科研費の受け入れ状況	  該当なし	 34

助教・花田秀樹（Hideki	 Hanada）	
 
	
 
研究内容	
 
	
  無尾両生類は、甲状腺ホルモンによってオタマジャクシ尾部アポトーシスを誘導できること、またそれを時系列に外部形態の変化として捉えることができることなどから、アポトーシス研究には最適な研究材料の一つと考えられている。さらには、化学物質、過重力および強磁場に対するカエルの感受性の高さから、卵、胚，オタマジャクシおよびカエルを様々な研究に用いてきた。現在研究中の下記項目について述べる。	
 
	
 
１.	
 甲状腺ホルモン誘導による無尾両生類オタマジャクシ尾部短縮の機構	 Mechanism	
 for	
 thyroid	
 hormone-induced	
 shortening	
 of	
 anuran	 tadpole	 tail	 	 	 	
  筋細胞アポトーシスを通じて起こるオタマジャクシ尾部短縮は変態期における無尾両生類の最も劇的な現象のうちの一つである。多くの研究はミトコンド
リア膜透過性（MPT）がアポトーシスの重要な役割を果たしていることが示してきた。これまで我々はサイクロスポリン A（CsA）が、甲状腺ホルモン（T３）によって誘導されるミトコンドリアの膨潤と、それに伴って起こる MPT からのサ
イトクロム c（Cyt.c）漏出を抑制することを報告してきた。オタマジャクシの変態機構のさらなる解明を目的として、T3 誘導尾部短縮におけるサイクロスポ
リンの効果を調べた。低濃度の T3 によってオタマジャクシ尾部は短縮し、それに伴う caspase-3 と-9 様酵素の活性増加、DNA 断片化およびラダー形成の増加が起こった。CsA はこれらの T3 の効果を抑制した。より高濃度の T3 とカルシウ
ムイオンは成体のカエル肝臓から単離したミトコンドリアの膨潤の誘導とその膨潤に伴ったアポトーシス関連物質の放出を起こし、その放出された物質を含むフラクションは dATP の存在下において caspase-3 様酵素を活性化させた。この結果は T3 の直接的間接的作用を通じ、T3 によってミトコンドリアから Cyt.cが放出されたことを示す。これらの結果とこれまでの研究データから、ミトコ
ンドリア MPT は T3 誘導による尾部アポトーシスにおいて重要な役割を担っており、CsA はそれらの T3 の効果を抑制すると結論づけた。	
 
	
 
２.	
 除草剤パラコートによって誘起される培養カエル白血球細胞の染色体損傷に対するビタミン E の坑酸化機能のかく乱	 Disruption	  of	  Vitamin	  E-antioxidant-function	  in	  response	  to	  paraquat	 (herbicide)-induced	  	  structural	  chromosomal	  damage	  in	
  cultured	  anuran	 leukocytes	
 	 	  両生類が世界的にその数を急激に減らしている。その原因の一つに考えられるのが農薬などの化学物質の影響といわれている。ビタミン E は生体を脂質過酸化から防御するために欠かせない物質である。もし、ビタミン E の機能が農薬など化学物質によってその機能がかく乱されたとしたなら、生体内に発生する活性酸素を除去できず、悪影響を及ぼすことに疑いはない。農薬の一つであ35

る除草剤パラコート（PQ）の遺伝毒性には脂質過酸化物が発生すると考えられており、ビタミン E はこの脂質過酸化物の発生を抑えることで染色体異常の誘起を阻害すると考えられた。しかしながら、PQ と共存下にあるビタミン E は PQの遺伝毒性を阻害せず、むしろ、PQ の電子ドナーとなって遺伝毒性を強化する
ことがわかった。	
 	
 ３.ブチル化ヒドロキシトルエンはパラコートによって誘起される培養カエル
白血球細胞の染色体損傷を抑制しない	 Butylated	  hydroxytoluene	  does	  not	
  inhibit	  paraquat-induced	  structural	 chromosomal	 damage	
 in	
 cultured	 anuran	 leukocytes	
 	 	  化学物質が複合的反応し、それらの化学的変化が生物に与える影響はよくわ
かっていない。ビタミン E の合成アナログである抗酸化物質のブチル化ヒドロ
キシトルエンはビタミン E と同様に脂質過酸化を抑制する。しかしながら、パラコートによって誘起された培養カエル白血球細胞の染色体損傷を抑制することはず、むしろ染色体損傷を増加させる結果となった。このようなことから、
ビタミン E 同様に、パラコートの共存下にあるヒドロキシトルエンは本来の働きである坑酸化作用をかく乱され、パラコートの電子ドナーとなることがわかった。化学物質が単独で働く場合と、複合的に作用する場合とではその働きが異なる一つの例である。	
 
	
 
研究業績	
 
①原著論文	 1.	
 Hanada,	
 H.	
 (2012)	
 Phenolic	
 antioxidant	
 2,6-di-tert-butyl-p-cresol	 (vitamin	 E	 synthetic	
 analogue)	
 does	 not	
 inhibit	 1,1’-dimetyl-4,4’-bipyridium	 dichloride	 (paraquat)-induced	
 structural	 chromosomal	 damage	
 in	
 cultured	 leukocytes	
 of	
 the	
 
dark-spotted-frog	
 Pelophylax	
 (Rana)	
 nigromaculatus.	
 Hereditas	
 149,	
 173-177.	
 	
 2.	
 Yanagisawa,	
 M.,	
 Furuno,	
 N.*,	 Watanabe,	
 M.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Hanada,	 H.,	
 Shinkai,	
 T.,	
 Yoshitome,	
 S.,	
 Kubo,	
 H.,	
 Sakai,	
 M.,	
 Fujii,	
 H.,	
 Suzuki,	 K.,	
 Yamashita,	
 M.	
 and	
 Kashiwagi,	
 A.	
 (2012)	
 Hypergravity	
 specifically	 effects	 head	
 formation	
 in	
 the	
 Xenopus	 embryos	 raseid	
 under	 hypergravity	 condition.	
 Space	
 Utili.	
 Res.	 28,	 172-175.	
 
	
 
3.	
 Fujiwara,	
 Y.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Nakagawa,	
 M.,	
 Shinkai,	
 T.,	
 Yanagisawa,	
 M.,	
 Furuno,	
 N.,	
 Hanada,	
 H.,	
 Suzuki,	
 K.,	
 Katsu,	
 K.,	
 Yamashita,	
 M.,	
 Yamamoto,	
 T.,	
 Tanimoto,	
 Y.	
 and	
 Kashiwagi,	
 A.	
 (2012)	
 Effects	
 of	
 magnetically	 controllled	
 microgravity	
 and	
 hypergravity	
 environment	 on	
 amphibian	 behavior.	
 Space	 Utili.	
 Res.	 28,	 176-179.	
 
	
 

36

4.	
 Yanagisawa,	
 M.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Hanada,	
 H.,	
 Shinkai,	
 T.,	
 Yoshitome,	
 S.,	
 Kubo,	 H.,	 Sakai,	
 M.,	
 Fujii,	
 H.,	
 Yamashi,	
 M.,	
 Kashiwagi,	
 A.	
 Furuno,	
 N.	
 *,	
 
Watanabe,	
 M*.	
 (2012)	
 Analysys	
 of	
 the	
 head-defects	
 caused	 by	 hypergravity	 in	
 early	
 Xenopus	 embyos.	
 Biol.	
 Sci.	 Space	 26,	  1-6.	
 	
 ②総説･著書･その他	
 	  該当なし	 	
 ③学会発表	
 	
 国内学会	
 
1.	
 柏木	
 昭彦,	
 柏木	
 啓子,	
 花田	
 秀樹,	
 中島	
 圭介,	
 住田	
 正幸	
  NBRP「ネッタイツメガエル」:ネッタイツメガエルの近交化・標準系統の樹立・提供	
  第35回	 分子生物学会	  特別企画「ナショナルバイオリソースプロジェクト」2012年12月11日～14日、福岡国際会議場・福岡マリンメッセ。	
 
	
 
2.	
 柏木昭彦、柏木啓子、花田秀樹、小林里美、竹中純子、住田正幸	
 「ツメガエル」って、どんなカエル?	
  日本動物学会	
  第83回	  動物学ひろば	
  2012年	  9月15日、大阪。	
 	
 3.	
 柏木昭彦、柏木啓子、花田秀樹、小林里美、難波ちよ	  「教材としてのネッ
タイツメガエルおよびアホロートルの展示」	
  第94回	 日本生物教育学会	
  2013年	
 １月、広島大学、東広島。	
 	 	
 国際学会	 	  該当なし	 	
 ④科研費等の受け入れ状況	 	  該当なし	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 

37

助教・田澤一朗（Ichiro	
 Tazawa）	
 
	
 
研究内容	
 
無尾両生類の変態期尾退縮に於ける Hox 遺伝子の機能	 The	
 function	
 of	
 the	
 Hox	
 genes	 during	 anuran	 tail	
 resorption	
 
	
 
[目的]	
 
	
  両生類の変態は甲状腺ホルモンによって引き起こされる。血中の甲状腺ホルモン濃度は体中で差が無いと考えられるにもかかわらず、甲状腺ホルモンに対する応答性は体の部域ごとに異なる。無尾両生類幼生の皮膚、筋および脊髄は体の前後軸に沿って連続した組織であるが、胴部と尾部とでは変態後の運命が全く異なる。変態期に両部域でプログラム細胞死が活発に起こるが、胴部でのみ活発な細胞増殖が起こり、結果として尾部のみが消失する。この予定消失域を決定する機構は全く解明されていない。	
 	
  Hox 遺伝子群は初期発生の動物の細胞に体軸に沿った位置価を与えると考えられている。また、Hox 遺伝子による細胞死調節の報告もあることから、私は「無尾両生類幼生期に発現する Hox 遺伝子が消失域を決定する」という仮説（以下、仮説）を立てた。本研究の目的はこの仮説の検証である。	
 	
 [材料と方法]	
 	
  本研究では、最初の段階として、無尾両生類変態期における Hox 遺伝子群の詳細な発現パターンを明らかにし、発現する細胞を同定する。次いで、幼生胴部または尾部特異的に発現する Hox 遺伝子の強制発現および機能阻害実験を生
体の胴部および尾部にて行う。これらの実験による変態現象に与える影響を、
形態、細胞増殖、および細胞死などに関して明らかにする。同様の遺伝子機能検定は、甲状腺ホルモン処理した培養細胞（幼生由来）を用いても行う。さらに、幼生生体をレチノイド処理することで Hox 遺伝子群の発現を変化させ、Hox
コードと変態後の予定運命との関連を調べる。	
 	
 [２０１２年度までに得られた結果と考察]	
 	  無尾両生類の Hox 遺伝子発現パターンは、発生が進んだ尾退縮間近の幼生でも尾芽胚期とよく似ていることが本研究から明らかになった。このことから Hox
遺伝子が胚期だけではなく幼生期以降の部域性決定にも関わっているものと推測される。また、HoxA13 など所謂「遠位側」Hox 遺伝子が尾部特異的発現をしていた。また、成熟個体の脊髄でも	
 Hox	
 遺伝子が相当な量で発現しており、その胴部での発現パターンは幼生と基本的に同じであった。つまり、幼生尾部において検出された	
 HoxA13	
 は成熟個体ではほぼ検出されなかったのである。前
述の仮説が正しければ、これらの「遠位側」Hox 遺伝子が変態期尾部特異的な尾部退縮に関わる遺伝子発現を制御している可能性が高い。	
 	
  幼生をレチノイドで処理したところ、初期胚でのレチノイド処理同様 Hox	 遺伝子発現パターンに変化が起きた。これはレチノイン酸を介した	
 Hox コード調
節が胚同様幼生でも行われていることを示唆する。	
 
	
 

38

[２０１２年度内に得られた結果と考察]	
 	
  尾部を切断した無尾類幼生をレチノイド処理することによって、尾のかわりに後肢様の構造が生じることが知られている。この現象は本仮説を検証するためには有用な系である。しかし、モデル実験動物であるアフリカツメガエルや本邦産の無尾類ではこの現象は再現されていない。そこで我々は実験条件を検討してこれらの無尾類などで現象を再現させることを試みた。その結果、本邦産無尾類でこの現象を再現させることに成功した。	
 	 [これからの展開]	
 	
  脊髄や筋管での Hoxa13 など尾部特異的の発現をする	
 Hox	
 遺伝子の機能検定を in	
 vivo で行うことが、本研究の仮説を証明する上でも棄却する上でも必要である。また、前述の通り、幼生をレチノイド処理することで Hox コードを変化させることができた。また、本来幼生器官である尾部が再生するべきところに成体器官の後肢様構造を生じさせることにも成功した。これらの処理によるHox コードの変化と変態期細胞死および成体器官発生との関係を調べることは
仮説検証につながるものと期待できる。まずは、レチノイド処理により生じた後肢様構造が成体マーカー遺伝子を発現していることを確かめる。	
 
	
 
研究業績	
 
①	
 原著論文	 M.	
  Okada,	  I.	
  Tazawa,	
  K.	
  Nakajima,	  Y.	
  Yaoita.	
  The	
  expression	
  of	  the	
 amelogenin	
 gene	 in	
 the	
 skin	 of	
 Xenopus	 tropicalis.	
 Zoological	
 Science,	
 vol.	 30	 (3):	
 pp.	
 154-159	
 (2013)	
 	
 ②	
 総説・著書	 	  該当なし	 	 ③	
 学会発表	
 
国内学会	
 
	
 	
 	
 倉林敦（発表者）、掛橋竜祐、田澤一朗、住田正幸、原本悦和、大嶋友美、伊藤弓弦「次世代モデル動物ネッタイツメガエルとその輸送法の改善について」日
本爬虫両棲類学会第 51 回大会、豊田市、11 月 10-11 日（発表日 10 日）、2012
年	
 
	
 
国際学会	
 
	
  該当なし	 	 ④	
 科研費等の受け入れ状況	 	  該当なし	
 
	
 
	
 
	
 

39

[分化制御機構研究部門]	
 准教授・古野伸明（Nobuaki	 Furuno）	
 
	
 
研究内容	
 
１.卵形成における卵特異的細胞周期調節遺伝子の発現調節機構と機能解析	
 Analysis	
 of	
 the	
 regulatory	
 mechanisms	
 of	
 oocyte	 specific	
 cell	
 cycle	 gene	
 expression	
 and	
 function	
 during	
 Xenopus	
 oogenesis	 	 	  卵の分化機構を研究する為には、卵特異的に発現する遺伝子に着目し、その卵特異的な発現調節機構を解明する事がきわめて重要であると考えられる。卵は、減数分裂や受精後に特殊な細胞分裂を行う。例えば、減数分裂では、DNA 複製をスキップした２回の連続した分裂をするが、そのために、Mos という卵特異的な細胞周期調節因子を発現しており、この発現が DNA 複製のスキップのため必須である事を報告した。また、受精後、卵は最初の一回を除き、G１,G2 期のない細胞分裂（卵割）を中期胞胚まで行うが、そのためには、卵特異的な細胞
周期調節因子である Wee1A の発現が必須である。もし、体細胞特異的な Wee1Bが発現すれば受精後の卵割は失敗する。よって、これらの卵特異的な細胞周期
調節因子の発現調節機構の解明は、卵への決定・分化の機構解明につながる。	
 	
 ［目的と結果］	
 	
  細胞周期調節因子に母性型があると分かって来たのは最近であり、その発現調節機構の研究は今までに行われていない。現在、ニシツメガエルの Mos と Wee1Aのプロモ−タ−領域と思われる部分（翻訳開始点より１０kbo 上流まで）をクロー
ニングし、GFP の上流に挿入した transgenic	
 ガエル作製用のベクターを構築した。このコンストラクトや、プロモーターにいろんな欠失を導入したコンストラクトで transgenic	 ガエルを作製し、卵特異的な発現に必要な領域を特定する。
また、これらの遺伝子のノックアウトも行いたい。昨年は ZNF を用いて、mos の遺伝子破壊を試みて positive な結果を得ている。このようにして卵特異的な細胞周期調節因子の発現調節機構と機能の解析を行う。	
 
	
 
２.	
 卵成熟および初期発生におけるサイクリン B2 の２極紡錘体形成における機
能	
 
The	
 role	 of	
 the	
 cyclin	
 B2	
 in	
 the	
 bipolar	 spindle	 formation	
 during	 oocyte	 maturation	
 and	
 early	 embryogenesis	 	 	  MPF はサイクリン B と Cdc2 の複合体であり、M 期を引き起こす普遍的な因子である。MPF が活性化すると核膜崩壊、染色体凝縮、紡錘体の形成が起こり、M期が開始する。サイクリン B は MPF の調節サブユニットであり、多くの種でサブタイプが複数存在し、また、それぞれのサブタイプの細胞内局在も違っている。しかしながらその機能に違いがあるかどうか報告はほとんどない。この研究ではサイクリン B1 と B2 の機能の違いについて研究している。	
 
	
 

40

［目的と成果］	
 ツメガエルの卵母細胞や胚ではサイクリン B1 とサイクリン B2 が主に発現しており、機能差を解析する良い系である。今までに、この系を用いて、サイクリン B１でなくサイクリン B２が正常な紡錘体の形成に関与することを明らかにした。また、サイクリン B2 の N 末端から約９０アミノ酸から１２０アミノ酸までに２極の紡錘体を形成するのに働く領域があることがわり、この領域が NES	 (Nuclear	 export	 signal)として働くことや、その NES の機能と２極の紡錘体の形成能が関係していることが明らかになった。最近、正常はサイクリン B２が紡
錘体の極を作る領域に局在する事、また、その局在がサイクリン B２の NES を過剰発現させる事で乱され、これが CRS 過剰発現による２極紡錘体の形成異常を引き起こす原因であると推定された。さらに、２極紡錘体形成に必要な Eg5	
 が関与していることを示唆する結果をえている。	
 
	
 
３.	
 アフリカツメガエル初期胚に対する過重力の影響	
 Effects	
 of	 hypergaravity	
 on	
 gene	
 expression	 and	
 molecular	
 analysis	
 of	
 head-deffects	
 in	
 early	
 Xenopus	 embryos	 	 将来、人類が宇宙へ進出して行くためには地球とは異なった重力環境下でヒトを含めた動植物が正常で健康な子孫を作れるかどうかを知る事が重要であり、もし、正常な子孫が作れないようなら、どのようにすれば異なった重力環境で正常に生活環が回るかどうか調べる事が重要である。両生類をモデル生物として過重力が発生にどのような影響を与えるかを調べ、その分子的な機構を調べ
る。	
 
	
 
[目的と成果]	
 
両生類であるアフリカツメガエルをモデル生物として、初期発生やに焦点を絞って過重力の影響を調べる。その結果、過重力に感受性が高い時期は、受精後から卵割が始まるまでである事が判明した。WISH を用いた実験から、頭部特異的な遺伝子発現（Xag,Xotx2,	
 En2）が過重力によって抑制されたが、後脳以降の神経マーカー（Krox20,	
 HoxB9）は、影響を受けていなかった。過重力は頭部形成に特に影響を与える事が明らかになった。また、RT-PCR を用いる事より、
Wnt のシグナルの下流の遺伝子、Xnr-3 や Siamois の発現が、過重力で抑制されていることを示し、過重力は、少なくとも Wnt のシグナルを弱めるように作用
して、頭部形成に影響を及ぼしている事が明らかになった。	
 
	
 
研究業績	
 
①原著論文	
 1.Yanagisawa,	
 M.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Hanada,	
 H.,	
 Shinkai,	
 T.,	
 Yoshitome,	
 S.,	
 Kubo,	 H.,	 Sakai,	
 M.,	
 Fujii,	
 H.,	
 Yamashi,	
 M.,	
 Kashiwagi,	
 A.	
 Furuno,	
 N.	
 *,	
 
Watanabe,	
 M*.	
 (2012)	
 Analysys	
 of	
 the	
 head-defects	
 caused	 by	 hypergravity	 in	
 early	
 Xenopus	 embyos.	
 Biol.	
 Sci.	 Space,	
 26	
 1-6	
 	
 	
 
(*	
 Corresponding	 author)	
 
	
 

41

2.	
 Yoshitome,	
 S.,	
 Furuno,	
 N.,	
 Prigent,	
 C.	
 and	
 Hashimoto,	
 E.	
 (2012)	
 The	
 subcellular	
 localization	
 of	
  cyclin	
 B2	
 is	
 required	
 for	
 bipolar	 spindle	 formation	
 during	
 Xenopus	
 oocyte	 maturation.	
 Biochemical	
 and	
 Biophysical	
 Research	
 communication,	
 422	
 770-775	
 	
 3.	
 Yanagisawa,	
 M.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Hanada,	
 H.,	
 Shinkai,	
 T.,	
 Yoshitome,	
 S.,	
 Kubo,	 H.,	 Sakai,	
 M.,	
 Fujii,	
 H.,	
 Yamashi,	
 M.,	
 Kashiwagi,	
 A.	
 Watanabe,	
 M*,	
 	
 
Furuno,	
  N.	
  *.	
  (2012)	
  Hypergravity	  specifically	  affects	  anterior	  head	 formation	
 in	
 early	
 Xenopus	 embryos.	
 Biol.	
 Sci.	 Space,	 26	
 47-52	 	 	 (*	
 Corresponding	 author)	
 	
 4.	
 Suzuki,	
 K.,	
 Isoyama,	
 Y.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Sakuma,	
 T.,	
 Ochiai,	
 H,	
 Sakamoto,	
 N.,	
 Furuno,	
 N.,	
 Kashiwagi,	
 A.	
 and	
 Yamamoto,	
 T.	
 High	
 efficiency	
 TALENS	 enable	
 F0	
  functional	
 analysis	
 by	
 targeted	  gene	 disruption	
 in	
  Xenopus	
 laevis.	
 Biology	 Open,	
 in	
 press	 	 5.	
 Yanagisawa,	
 M.,	
 Furuno,	
 N.*,	 Watanabe,	
 M.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Hanada,	 H.,	
 Shinkai,	
 T.,	
 Yoshitome,	
 S.,	
 Kubo,	
 H.,	
 Sakai,	
 M.,	
 Fujii,	
 H.,	
 Suzuki,	 K.,	
 Yamashita,	
 M.	
 and	
 Kashiwagi,	
 A.	
 Hypergravity	
 specifically	 effects	
 head	
 formation	
 in	
 the	
 Xenopus	 embryos	 raseid	
 under	 hypergravity	 condition.	
 Space	 Utili.	
 Res.	 2012,	
 in	
 press	 	 (*	 Corresponding	 author)	
 	
 6.	
 Fujiwara,	
 Y.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Nakagawa,	
 M.,	
 Shinkai,	
 T.,	
 Yanagisawa,	
 M.,	
 Furuno,	
 N.,	
 Hanada,	
 H.,	
 Suzuki,	
 K.,	
 Katsu,	
 K.,	
 Yamashita,	
 M.,	
 Yamamoto,	
 T.,	
 Tanimoto,	
 Y.	
 and	
 Kashiwagi,	
 A.	
 Effects	
 of	
 magnetically	 controllled	
 microgravity	
 and	
 hypergravity	
 environment	 on	
 amphibian	 behavior.	
 Space	 Utili.	
 Res.	 2012,	
 in	
 press	 	
 ②総説・著書	 サイクリン B2 の細胞内局在と紡錘体形成	  吉留賢、古野伸明	
  生体の科学	
  印
刷中	
 
	
 
③学会発表	 	  国内学会	 	  該当なし	 	 	  国際学会	 	  該当なし	 	
 ④科研費等の受け入れ状況	
 宇宙環境利用科学委員会研究班ワーキンググループ（２０１2）両生類の生活環に対する過重力の影響、１５万円、研究分担者	
 
	
 

42

准教授･三浦郁夫（Ikuo	
 Miura）	
 
	
 
研究内容	
 
１.生殖腺性差構築機構の多様性と普遍性	
 The	
 diversity	
 and	
 universality	
 in	
 the	
 establishment	
 mechanisms	
 of	
 gonadal	 sex-differences	 	 	  ツチガエルの地域集団は性決定機構および性染色体の分化の程度によって大きく 5 つに分けられる。性染色体が未分化な東日本と東日本集団、そして性染色体の形態が分化した ZW 集団と XY 集団、そして、XY 集団からさらに分岐した
Neo-ZW 集団である。このうち、Neo-ZW 集団を除く 4 つの集団において性ホルモンおよびその阻害剤による性転換の程度には違いが知られている。東日本と西日本の２つの集団は雄から雌、雌から雄への性転換が容易に誘導されるが、ZW型では雌から雄、XY 集団では両方向への性転換に抵抗性を示す。今回、性転換に伴って変化する４つの性分化関連遺伝子（Dmrt1,	
 Cyp17,	
 Cyp19,	
 Foxl2）の発現を定量 PCR によって調べた。その結果、性転換と強く連鎖して発現が変化する遺伝子は Cyp19 と Foxl2 の卵巣分化に関与する遺伝子であることがわかった。とくに ZW 集団では ZW 雌における両遺伝子の高発現が変化せず、それが性転換を拒否する原因と推察された。一方、XY 集団ではエストロゲンによる誘導とその阻害処理によって Cyp19 の発現が変化したにも関わらず性転換は生じなかった。以上の結果と 4 つの地域集団の系統発生を合わせると、ツチガエルの元祖集団である西日本と東日本集団の生殖腺分化は性ホルモンに高い感受性を示すが、そこから派生した ZW 集団や XY 集団では性ホルモンに対する感受性が失われており、その現象が性染色体の分化や新たな性決定機構の出現と密接に連関していることが考察された。特に、ZW 集団では W 染色体上にある Sox3 遺伝
子の卵巣決定機能が示唆された。今後、さらに詳細に調べていく。	
 	
 ２.佐渡島で発見されたカエルをサドガエル(Rugosa	 susurra)と命名	
 Description	
 of	
 a	
 new	
 frog	
 species	
 Rugosa	
 susurra	
 found	 on	 Sado	 Island,	 Japan	 	 	  佐渡島で発見され、形態的にユニークな特徴をもつカエルについて、これまで遺伝学的調査を行ってきた。今回、原種と予想されるツチガエルとの交雑を行い、生殖的隔離の存在を調べた。その結果、正逆雑種はほぼすべて雄となり、極めて少数が雌となった。その雌の卵巣は退化的であった。また、雄の精巣内には精子が極めて少なく、もどし交配を行ったところ、わずかに発生した幼生も変態まではほとんど到達しなかった。さらに、鳴き声分析も両者間で著しい違いを明らかにした。以上の結果にもとづき、さらにタイプ標本を採集して外部形態の計測を行うことによって、この佐渡島のカエルをサドガエル(Rugosa	 susurra)と命名した。本種は集団が限定的であるため、既に希少種であり、今後保全に向けた活動も行っていく。	
 
	
 
研究業績	
 
①原著論文	
 43

1.	
 Sekiya	
 K,	
 Miura	 I,	
 and	
 Ogata	 M	
 (2012)	
 A	
 new	
 frog	
 species	
 of	
 the	
 genus	 Rugosa	 from	
 Sado	 Island,	 Japan	 (Anura,	
 Ranidae).	
 Zootaxa	
 3575:	
 49-62.	
 	 2. Ohtani	
 H,	
 Sekiya	 K,	
 Ogata	 M,	
 and	
 Miura	 I	
 (2012)	
 The	
 postzygoitc	
 isolation	
 
of	
 a	
 unique	 morphotype	 of	 frog	
 Rana	
 rugosa	 found	 on	 Sado	 Island,	 Japan.	
 Journal	 of	
 Herpetology	
 46(3):	
 325-330.	
 	
 ②総説・著書	
 1.	
 三浦郁夫	 (2013)	
  新種サドガエル	  —その誕生と進化の謎−	  生物工学会誌	
 	
 
	
 	
 	
 91:	
 161-164.	
 
	
 
2.	
 三浦郁夫（2013）朱鷺がみつけた新種のサドガエル	  私たちの自然	
 3:	
 5-7.	 	 3. 土井敏男、三浦郁夫(2012)	
 神戸市で観察された局所的に尾が赤いニホンアマ
ガエルの幼生	
  両生類誌	
 23:	
 11-12.	
 	
 ③学会発表	
 
国内学会	
 
1.	
 尾形光昭、三浦郁夫	
  ツチガエルの XY 型と ZW 型集団の接触地帯における性決定機構の進化	  日本進化学会	
  2012 年 8 月 21 日	
  東京	
 
	
 
2.	
 三浦郁夫、大谷浩己、尾形光昭、長谷川嘉則	
  ツチガエルの性決定に関する
性連鎖遺伝子 SOX3 と AR の機能解析	
  日本動物学会	
  2012 年 9 月 13 日	
 大阪市	
 
	
 
3.	
 三浦郁夫、尾形光昭	
 	
 XY 型と ZW 型性決定機構：	
  天下分け目の戦い	  (財)染色体学会	
  2012 年 10 月 5 日	  旭川市	 	
 4. 三浦郁夫、大谷浩己、藤谷武史	
  ヌマガエルの性比と性決定	
  日本爬虫両生類学会第５１回大会	
  2012年11月10日	
  豊田市（愛知県）	
 
	
 
	
 
5. 尾形光昭、三浦郁夫	
  ツチガエルのXY型とZW型集団の接触地帯における遺伝的調査	
  日本爬虫両生類学会第51回大会	
  2012年11月11日	
  豊田市（愛知県）	
 
	
 
国際学会	
 
1.	
  Miura	  I,	  Ohtani	  H,	  Koizumi	  Y,	  and	  Ogata	  M.	
  Evolution	  of	  gonadal	 sex-differentiation	
 mechanism	
 from	 sex	
 hormone	 dependent	
 to	
 independent	
 in	
 frog.	
 	
 Sixth	 international	
 symposium	
 on	
 the	
 biology	
 of	 vertebrate	
 sex	
 determination.	
 	
 23-27	
 April	 2012.	
 	
 Hawaii	 (Kona),	
 USA	
 
	
 
2.	
 Miura	 I	 and	
 Ogata	 M.	
 	 A	 battle	 between	
 the	
 XY	
 and	
 ZW	
 systems	
 in	
 Japanese	 frog.	
 	
 Evolution	
 of	
 sex	
 determination	
 mechanisms.	
 6-9	
 June	 2012,	
 La	
 Sage,	
 Switzerland.	
 	
 

44

	
 
招待講演	
 
1.	
 三浦郁夫	
 “性の起源はコピー伝達とう共生（寄生）体の生き残り戦略に発した”日本動物学会第 83 回大会	  シンポジウム	
  性と生殖の意味を問う	 Reproduction	
 and	
 sexuality:	
 What	 are	
 these?	
 2012 年 9 月 14 日大阪市	
 
	
 
2.	
 三浦郁夫“カエルの性決定：例外が進化を証明する“	 	  	  特別講義	
  東京大学水産実験所	
  2012 年 11 月 9 日	
 浜松市	
 
	
 
3.	
 三浦郁夫“生物と性の進化”放送大学面接授業	
  放送大学広島学習センター	 2012 年 11 月 27−28 日	
 広島市	
 
	
 
4.	
 三浦郁夫“トキが見つけた新種のカエル“	
 東広島市河内地域センター	  生
涯学習まちづくり出前講座	
 2012 年 11 月 29 日	
 東広島市	 	
 5.	
 三浦郁夫“科学研究の原点	
  –私と生物学–”	
 	
 広島国泰寺高校	
  国泰寺科学クラブ	
 2012 年 12 月 15 日	
 広島市	
 
	
 
6.	
 三浦郁夫“新種サドガエル進化の謎 〜A	 new	 frog	
 species	
 "Sado-gaeru":	 its	
 evolutionary	 mysteries〜	
 広島大学大学院理学研究科理学融合センター・
ランチタイムセミナー	
 203 年 1 月 22 日	
 東広島市	 	 7.	
 三浦郁夫“トキが見つけた新種のカエル”広島大学第４７回東京イブニングセミナー	
 2013 年 3 月 8 日	
 東京	
 
	
 
④科研費等の受け入れ状況	
 1.	
 科学研究費新学術領域研究（公募、代表）4,500 千円	
 「ツチガエル地域集団
における生殖腺性差構築システムの多様性と普遍性」	
 
	
 
2.	
 科学研究費挑戦的萌芽研究（代表）	
 1,300 千円	
 XY 型から ZW 型へ性決定機
構の進化	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 

45

特任助教・柏木啓子（Keiko	
 Kashiwagi）	
 
	
 
１.	
 両生類における TALEN 技術を用いた標的遺伝子の破壊	 Targeted	 gene	
 disruption	
 by	
 TALENs	 in	
 amphibians	
 
	
 
[目的]	
  	
 
	
  両生類の変態および再生は発生学や遺伝学、進化学的にも非常に興味深い生命現象である。特に無尾両生類は、オタマジャクシからカエルになる変態過程
で尾の短縮など大掛かりな体の作り換えが起こることから、変態に関する分子機構を解明するための有用なモデルとなりうる。変態や再生に関与する遺伝子の機能を明らかにするために、特定の遺伝子を個体レベルで破壊する技術の確立は必要不可欠ある。数理分子生命理学専攻の山本	
  卓教授と共同で、カスタマイズ TALE ヌレアーゼ(TALENs)を用いて、ツメガエルの標的遺伝子破壊を試み
ている。	
 
	
 
[方法]	
  	
 	
 
	
  外来性遺伝子の破壊効果を調べるために、CMV:eGFP アフリカツメガエルトラ
ンスジェニック系統と野生型のカエルを交配させて得られた受精卵(F1)に eGFP	 TALEN	 mRNA を顕微注入した。さらに内在性遺伝子の破壊効果については、メラニン合成に関わるチロシナーゼ遺伝子(try)、および眼の形成に必要なマスター
制御遺伝子 pax6 を標的とする TALENs をアフリカツメガエル受精卵に導入した。
標的遺伝子の破壊を EGFP 蛍光観察、Cel-1	
 アッセイ、及びシークエンス解析により検証した。	
 	
 [成果と考察]	  	 	 	  TALEN は標的 DNA 配列を認識する TALE ドメインのリピートと、II 型制限酵素である FokI 由来のヌクレアーゼドメインから成る人工酵素である。標的配列に
Double	 Stranded	
 Breaks	
 (DSB)を高頻度に導入し、非相同末端結合(NHEJ)によって修復される際に置換や挿入、欠失を引き起こす。その結果、フレームシフ
トにより遺伝子破壊を高頻度で生じさせる。	
 CMV:EGFP	 TALENs	 mRNA を注入した受精卵から発生し eGFP を全身に発現するトランスジェニックの胚(F1)のうち殆どのものでは、顕著な eGFP 蛍光の減少が確認された。TALEN 標的領域を Cel-1 アッセイやシークエンスにより解析したとこ
ろ、高頻度で挿入や欠失による変異が確認された。try および pax6 両遺伝子も高効率で破壊されており、前者では白化現象、後者では無眼症・小眼症が見ら
れた。	
  	
  	
  	
 
TALEN 標的遺伝子破壊法は、外来性、外来性を問わず遺伝子の改変を行うのに非常に優れた技術であることがわかった。	
 	
 [将来の展望]	  	 	  今後、TALEN 技術を用いて変態等に重要な遺伝子の破壊を行い、遺伝子機能を解析していく予定である。	
 
	
 

46

２.	
 両生類を用いた生活環に対する過重力および強磁場の影響	
 Effects	
 of	 hypergravity	
 environments	
 and	
 strong	 static	
 magnetic	
 fields	
 on	
 amphibian	 life	
 cycle	
 
	
 
[目的]	
 	
 
	
  今年の３月 12 日に米航空宇宙局(NASA)は、火星無人探査機キュリオシティが採取した岩石を調べたところ、地球型生命が活動を営むうえで必要な６元素が見つかったと発表、「火星にはかって微生物の生存を支える環境があった」としている。これからも次々と新たな発見があるだろう。ところで、ヒトが長期間にわたって滞在する場合の宇宙環境の影響に関する研究は少ないため、詳細なデータの蓄積が必要である。両生類は宇宙環境が及ぼす影響を調べるうえで格好のモデル動物であって、これまでに多くの地上および宇宙実験の材料として用いられてきた。ツメガエルを用いて過重力や強磁場の影響を調べた。	
 
	
 
[方法]	
  	
 
	
  過重力影響については２Ｇ、５Ｇを媒精後 10 分、20 分の未受精卵、２細胞期の胚、原腸胚に印加して調べた。強磁場影響は 11T(-1400T2m-1)、15T(0T2m-1)、
12T(+1200T2m-1)を印加した。	
 	
 [成果と考察]	
 	
  アフリカツメガエル(Xenopus	
 laevis)およびネッタイツメガエル(Xenopus	
 (Silurana)	
 tropicalis)を用いた過重力・強磁場影響に関する私達の一連の研究から、発生段階中、受精直後～第一卵割開始にかけての感受性は最大で、曝露された受精卵から発生した胚には頭部における双頭・小頭・小眼など多様な奇形が発症した。過重力に曝露されて頭部に障害を持つ個体では頭部形成に関
わる Wnt 遺伝子の発現が抑制されていることや、頭部の前方は特に過重力に対する感受性が高いことなどがわかった。また、強磁場に曝されたネッタイツメ
ガエルオタマジャクシは回転運動をしたり、容器底面で横たわるなどの異常行動を示した。	
 	
 [将来の展望]	  	 	 	  過重力や強磁場曝露による影響のメカニズムを遺伝子レベルも含めて調べて
いく。	
 
	
 
３.	
 トランスジェニックガエルを用いた甲状腺ホルモンかく乱物質スクリーニ
ングシステムの開発	 Development	
 of	
 a	
 screening	 system	
 for	
 thyroid	
 hormone	 disrupting	 chemicals	 using	
 transgenic	
 Xenopus	 laevis	
 
	
 
[目的]	
 
	
  環境中の化学物質の生物に対する悪影響（例えば、内分泌かく乱作用）が危
惧されている。両生類の変態は甲状腺ホルモン(TH)に支配されている。変態中のオタマジャクシからカエルへの体の作り変えは無尾両生類が最も顕著である

47

という点で、この動物は甲状腺ホルモンかく乱作用を持つ化学物質の生体影響の試験評価系として非常に優れている。私達は、甲状腺ホルモンアゴニストまたはアンタゴニストである化学物質を高感度に検出するためのトランスジェニ
ック系統を開発中である。その一例として、TH により活性化される TRβ遺伝子のプロモーター/エンハンサーとホタルルシフェラーゼ遺伝子を連結させてつ
くったレポーターベクターを導入して作出されたアフリカツメガエルのトラン
スジェニック(Tg)系統について紹介する。この系統を利用した TH かく乱物質を評価する試験系の確立を目指し、F1 世代の TH 反応性や化学物質の影響をルシフ
ェラーゼ活性を通して評価する方法を検討した。	
 
	
 
[方法]	
 
	
  すでに樹立している TRpromoter/enhancer/Luciferase	
 Tgβ系統の F1 幼生に様々な濃度の TH(T3)を加え、個体レベルでのルシフェラーゼ活性をルミノメー
ターにより測定した。また、オリンパス LV200 発光顕微鏡を用いて in	
 vivo ルシフェラーゼイメージング解析も行った。	
 	
 [成果と考察]	
 	  in	
 vivo ルシフェラーゼイメージング解析の結果、TH に高い反応性を示すことが知られている幼生の脳や四肢において、強いルシフェラーゼ活性の誘導を確認した。また、TH 曝露された Tg 幼生のホモジェネートを用いてルシフェラー
ゼ活性を測定した結果、濃度依存的なレポーター活性の増大も確認された。以上の結果により、この Tg 系統を用いて、TH 応答性をルシフェラーゼ活性に基づいてモニターすることが可能であることが証明された。	
 	
 [将来の展望]	 	  非常に多くの人工化学物質が環境中に放出されており、その中には正常な TH作用をかく乱するものが含まれことが知られている。TH は成長や発生を調節し、代謝ホメオスタシスの維持に重要な役割を果たしている。現在使われている 10万種類以上の化学物質のうちで、ヒトを含む生物への安全性が確認されているものは僅かである。安全性に関する情報を得るための優れた in	
 vivo 試験法は少なく、その開発が喫緊の課題である。本研究課題で開発したルシフェラーゼ
遺伝子を導入したアフリカツメガエル Tg 系統は、TH の働きをかく乱すると危惧される化学物質を簡単・迅速・高感度に調べられるツールとして極めて有用である。今後、私たちはこのカエル系統を用い、TH 作用をかく乱する化学物質をスクリーニングしていく予定である。	
 
	
 
研究業績	
 
①	
 原著論文	 1.	
 Hanada	
 ,H.,	
 Kobuchi,	
 H.,	
 Yamamoto,	
 M.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Katsu,	
 K.,	
 Utsumi,	 T.,	
  Kashiwagi,	  A.,	
  Sasaki,	  J.,	
  Inoue,	  M.	
  and	
  Utsumi,	
  K.	
  2013.	
 Acetyl-L-carnitine	
 suppresses	
 thyroid	
 hormone-induced	
 and	
 spontaneous	 anuran	 tadpole	 tail	 shortening.	
 Hereditas	
 150:	
 1-9.	
 
	
 

48

2.	
 Suzuki,	
 K.,	
 Isoyama,	
 Y.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Sakuma,	
 T.,	
 Ochiai,	
 H.,	
 Sakamoto,	
 N.,	
 Furuno,	
 N.,	
 Kashiwagi,	
 A.	
 and	
 Yamamoto,	
 T.	
 2013.	
 High	
 efficiency	 TALENs	 enable	
 F0	
 functional	
 analysis	
 by	
 targeted	 gene	
 disruption	
 in	
 Xenopus	  laevis	  embryos.	
  Biology	
  Open	  BIO_2013_3855.3d.	
  doi:	
  10.	
 1242/bio.20133855:	
 1-5.	
 	 
	 3.	
 Sakuma,	
 T.,	
 Hosoi,	
 S.,	
 Woltjen,	
 K.	
 I.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Wada,	
 H.,	
 Ochiai,	
 H.,	
 Miyamoto,T.,	
 Kawai,	
 N.,	
 Sasakura,	
 Y.	
 et	
 al.	
 2013.	
 	
 Efficient	
 TALEN	 construction	  and	
  evaluation	  methods	
  for	
  human	  cell	  and	
  animal	 applications.	
 Genes	 to	
 Cells	 18(4):	
 315-326	
 	
 4.	
 Yanagisawa,	
 M.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Hanada,	
 H.,	
 Shinkai,	
 T.,	
 Yoshitome,	
 S.,	
 Kubo,	 H.,	 Sakai,	
 M.,	
 Fujii,	
 H.,	
 Yamashita,	
 M.,	
 Kashiwagi,	
 A.,	
 Watanabe,	 M.	
  and	
  Furuno,	
  N.	
  2012.	
  Analysis	
  of	
  the	
  head-defects	  caused	  by	
 hypergravity	
 in	
 early	
 Xenopus	 embryos.	
 Biol.	
 Sci.	 Space	
 26:	
 1-6.	 	
 5.	
 Yanagisawa,	
 M.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Hanada,	
 H.,	
 Shinkai,	
 T.,	
 Yoshitome,	
 S.,	
 Kubo,	 H.,	 Sakai,	
 M.,	
 Fujii,	
 H.,	
 Yamashita,	
 M.,	
 Kashiwagi,	
 A.,	
 Watanabe,	
 
M.	
 and	
 Furuno,	
 N.	
 2012.	
 Hypergravity	
 specifically	 affects	
 anterior	 head	
 formation	
 in	
 early	
 Xenopus	 embryos.	
 Biol.	
 Sci.	 Space.	
 26:	
 47-52.	
 	 ②	
 総説・著書	 	  該当なし	 	
 ③ 学会発表	
 
国内学会	
 
1.	
 柏木昭彦、柏木啓子、花田秀樹、小林里美、難波ちよ「教材としてのネッタ
イツメガエルおよびアホロートルの展示」第 94 回日本生物教育学会（2013 年
１月、広島大学、東広島）	
 
	
 
2.	
 Ken-ichi	
 T.	
 Suzuki1,	
 Keiko	 Kashiwagi,	 Tetsushi	
 Sakuma,	 Yukiko	
 Isoyama,	 Hiroshi	 Ochiai,	
 Akihiko	
 Kashiwagi,Takashi	 Yamamoto．Targeted	 disruption	
 of	
 EGFP	
 transgene	
 in	
 Xenopus	 laevis	
 using	 customized	
 transcription	
 activator-like	 	 (JYSS1-18)	
 	
 effector	
 nucleases	
 (TALENs)	
  第45回日本発生生物学会	
  （2012年	
  5月	
  神戸インターナショナル	  コンファレンスセン
ター	  神戸）	 
	 3.	
 柏木昭彦、柏木啓子、花田秀樹、小林里美、竹中純子、住田正幸「ツメガエ
ルって、どんなカエル？」第 83 回日本動物学会（2012 年 9 月、大阪大学、大
阪）	
 
4.	
 柏木昭彦、柏木啓子、花田秀樹、中島圭介、住田正幸「ネッタイツメガエルの近交化・標準系統の樹立・提供」第 35 回日本分子生物学会（2012 年 12 月、
マリンメッセ福岡、福岡）	
 

49

	
 
5.	
 磯山由樹子、佐久間哲史、柏木啓子、落合	
  博、柏木昭彦、山本	  卓、鈴木賢一「アフリカツメガエルにおける TALEN を用いた効率的な標的遺伝子破壊」
第 35 回日本分子生物学会（2012 年 12 月、マリンメッセ福岡、福岡）	
 	
 6. 佐能正剛、	
 柏木啓子、	
 花田秀樹、	
 松原加奈、	
 川畑公平、	
 中村直樹、	 鈴
木賢一、山本	
  卓、	
 新海	
  正、	
 藤本成明、	
 杉原数美、	
 北村繁幸、	
 柏木昭
彦、	
 太田	
  茂	
 「甲状腺ホルモン様化学物質アミオダロン曝露によるカエルの変態に対する影響」第２６回環境ホルモン学会	
  （2012	
 年	
  6月、東京大学	
  山上会館、東京）	
 
	
 
	
 	
 国際学会	 	  	  該当無し	 	 ④	
 科研費等の受け入れ状況	
 1.	
 平成 24 年度	
  EXTEND2010 基盤的研究「ツメガエル変態アッセイを用いた甲状腺ホルモンかく乱化学物質のスクリーニングシステムの開発」3000 千円（分
担）	
 
	
 
2.	
 宇宙環境利用科学 WG「両生類の生活環に対する重力影響」150 千円（分担）	
 	
 ⑤	
 その他（会合への参加・出席）	
 鈴木賢一、柏木啓子、磯山由樹子、佐久間哲史、落合	  博、柏木昭彦、山本	 卓．人工ヌクレアーゼを利用した両生類におけるゲノム編集．	
  第 2 回ゲノム編集研究会	  (2012 年 9 月 20 日、岡崎コンファレンスセンター)	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 

50

[多様化機構研究部門]	
 	
 教授･住田正幸（Masayuki	
 Sumida）	
 
	
 
研究内容	
 
	
 １.	
 ヌマガエル科３属６種における繁殖隔離機構	
 Postmating	 isolation	
 in	
 six	
 species	 of	
 three	 genera	
 from	
 Dicroglossidae	 (Anura),	
 	
 
	
 
[目的]	
 	
 
	
  生物学的種の概念によると、種は生殖的に隔離された集団である。ヌマガ
エル科のカエルにおける交配後隔離機構を明らかにすることを目的に、ヌマガエル科の 3 属（Hoplobatrachus、Euphlyctis と Fejervarya）から 6 種を使って交雑実験を行ない、雑種の生活力を調べた。	
 	 [材料･方法]	 	 	  ヌマガエル科の 3 属（Hoplobatrachus、Euphlyctis と Fejervarya）から 6種を使って交雑実験を行なった。雑種について、生活力を調べるとともに、成熟期に達した雑種については、形態計測、ミトコンドリア DNA 解析およびアロザイム分析を行うとともに、生殖腺で染色体観察や組織学的観察を行な
った。	
 
	
 
[成果･考察]	
 	
 	
  本研究で E.	
 cyanophlyctis 雌と H.	
 tigerinus 雄との雑種は、孵化の段階
ですべて致死になり、E.	
 cyanophlyctis 雌と H.	
 chinensis 雄との雑種は、幼生の段階ですべて致死になった。これらの結果は、Hoplobatrachus 属とEuphlyctis 属の間には、完全な雑種致死による隔離があることを明示している。H.	
 tigerinus 雌と H.	
 chinensis 雄との雑種は、幼生の段階で発育不全により死亡した。ところが、いくつかの雑種個体は正常に発育して、成熟期まで生き残った。	
 染色体観察と mtDNA とアロザイム酵素分析により、これらの成熟した雑種は、2 つの雌親ゲノムと 1 つの雄親ゲノムからなる異質三倍体であることを確認した。本結果は、異質三倍体が自発的に生産されたことを示唆した。さらに、組織学的観察によって、これらはすべて不妊の雄であることが明らかになった。また、ミトコンドリア DNA の Cytb、12SrRNA と 16S	 rRNAの遺伝子の塩基配列分析によって、H.	
 tigerinus、H.	
 chinensis と異質三倍体の系統関係を解明した。さらに、ミトコンドリアゲノムの母性遺伝は、雑種で保持されていることも明らかになった。本研究により、交配後隔離の程度は、系統関係を明確に反映することがわかった。	
 	
 [将来の展望]	
  	
  	
 
	
  本研究により、交配後隔離の程度と系統関係は、相関することがわかった。	
 これに加えて、異質三倍体が、近縁種の間で交雑を通して生産されるかもしれないと推測された。繁殖隔離と系統関係を直接比較した研究は、両生類研

51

究施設でしかなし得ない分野であり、今後も研究の発展が期待される。	
 	 	
 ２.バングラデシュ産のトラフガエルにおける飼育下繁殖	
 Artificial	
 Breeding	
 of	
 the	
 Endangered	
 Indian	 Bull	
 frog	 (Hoplobatrachus	
 tigerinus)	
 from	 Bangladesh:	
 A	
 Case	
 Study	 of	
 Production	
 and	
 Conservation	
 
	
 
[目的]	
 	
 
	
  バングラデシュでは乱獲等によりトラフガエル（Hoplobatrachus	
 tigerinus）が野外で激減しており、本種の採集は法律で禁止されている。本
研究では、本種の域外保全を目的に、野外から採集した個体を使って飼育下繁殖を試みた。	
 	 [材料･方法]	
 	  トラフガエル H.	
 tigerinus の雌親 2 匹と雄親１匹を用いて、人工交配によって交雑実験を行い、その子孫の生活力を観察した。	
 	 [成果･考察]	
 	
  2 匹の雌親から得られた合計 10,332 の卵を、１匹の雄の精子で受精させた。
初期発生は、23℃のインキュベーターで飼育しながら観察した。受精後 80 分
で第一卵割、受精後 48 時間で尾芽胚、さらに受精後 72 時間後で孵化した。
受精後 5 日目から幼生にはゆでたホウレンソウを与えた。、23℃のインキュベーターで 2 週間飼育した後、ガラス温室の中に設置されているコンクリート
水槽で飼育した。変態は、受精後 42 日目ごろから始まった。全体の卵のうち、89%が正常に卵割し、70%が尾芽胚に到達し、56%が正常に孵化し、46%が正常な接餌幼生になった。	
 しかし、わずか 10%が正常に変態した。	
 共食いが幼生の間で観察され、これは変態率の減少の要因となった。これに加えて、未確認の真菌感染と夏場を過ぎての低温も、変態率の減少の原因になった。	
 H.	
 tigerinus の繁殖力は全く正常だったが、H.	
 tigerinus の子ガエルの大量生産には失敗した。将来、H.	
 tigerinus の実験で大量生産と保護を確実にするために、変態までのすべての段階で水温の厳しいコントロールが必要である
ことがわかった。	
 	
 ３.イボイモリの飼育下繁殖（継続）	
 Attempts	
 at	
 natural	 reproduction	
 in	
 an	
 endangered	 amphibian	 species	 Echinotriton	
 andersoni	
 from	
 the	
 Central	
 Ryukyus	
 
	
 
[目的]	
 
	
  中央琉球に分布する絶滅危惧（および天然記念物）のイボイモリは、奄美大島や沖縄島北部などに分布する種で、鹿児島県と沖縄県の天然記念物に、
環境省レッドリストの絶滅危惧 II 類に指定されるなど、早急な保護対策が求められている。本研究では、本絶滅危惧種について効率的な域外保全に資することを目的に、実験室での適切な人工繁殖・飼育維持方法を確立した。	
 
	
 

52

[材料･方法]	
 	 	  イボイモリは鹿児島県と沖縄県で天然記念物に指定されているため、採集には各県の許可申請が必要であるが、著者らは、この種について、既に天然記念物現状変更許可申請を得ている。本種の飼育下繁殖を試みるため、野外の産卵場所を確認し、その状況をもとに飼育装置を作製して、その中で自然繁殖を試みた。	
 	 [成果･考察･将来の展望]	 	  イボイモリでは、沖縄産と徳之島と奄美産で実験室に作製した飼育装置の中で自然産卵に成功した。産卵行動は2月下旬から6月上旬まで行われ、産卵場所は野外における産卵と同様に、水辺付近の直接水に浸らない斜面であった。実験室で自然繁殖した1〜3年齢100個体が順調に生育している。将来的には必要に応じてリリースも考慮に入れ、これらの絶滅危惧種について飼育下繁殖と域外保全を行い、「両生類ノアの方舟」を目指している。	
 
	
 
４.	
 光る透明ガエル「スケルピョン」の量産化（継続）	
 Production	
 of	
 illuminating	 see-through	 frogs	 by	
 injecting	 into	 the	
 transparent	 frogs	 an	
 illuminating	
 GFP	
 protein	 gene	
 attached	
 to	
 a	
 gene	
 
	
 
[目的]	
 
	
  ニホンアカガエルにおいては、黒色眼と灰色眼の二つの色彩突然変異系統があり、これらの突然変異系統を用いて、2007 年には両生類で初となる体が透明で内臓が透けて見える「透明ガエル」（スケルピョン）を誕生させることに成功しており、「透明ガエルおよびその作製方法」	
 については特許を取得している。本研究では、有用な実験動物の実用化を目的に、透明ガエルの量産化を行った。	
 	 [材料･方法]	
 	
  「透明ガエル」の雌雄の組合せで交配を行い、2 代目「透明ガエル」の系統確立を試みるとともに、黒色眼と灰色眼の二つの色彩突然変異遺伝子をヘテ
ロ接合に持つ雌雄を用いて、種々の組合せで交配を行うことによって、これらの遺伝子をホモ接合に持つ「透明ガエル」を飼育維持して、量産化を試み
た。	
 
	
 
[成果･将来の展望]	
 	
  「透明ガエル」をふやし、今後も量産の目途をたてることに成功した。これらは、内臓透視のできる新しい実験動物として、環境、医学、生物学の分野において実験材料や教材として利用価値が高いと思われ、すでに需要がある。動物愛護の伝統がある欧米では特に「透明ガエル」への関心は高い。ただ、２代目の「透明ガエル」は生活力が弱いため、以降の継代飼育がかなり困難であったため、安定した系代飼育のため改良が必要であり、現在、生活力改善のために、改良を試みている。さらに今後は、実用化に向けては、背面の透明度を上げるような工夫（黄色素胞を欠く突然変異を導入）も必要で53

ある。また、今後は、「透明ガエル」に GFP(蛍光蛋白質)遺伝子をつないだベ
クターをインジェクションすることで、トランスジェニック「光る透明ガエル」を作成する計画である。これにより、遺伝子発現の様子を外部から蛍光によってリアルタイムで観察でき、この方法では、プロモーターの設計を変えることで、さまざまな遺伝子の発現解析への応用が可能である。	
 
	
 
研究業績	
 
①原著論文	
 1.	
 Komaki,	
 S.,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 K.	
 Tojo,	
 and	 M.	
 Sumida	 (2012)	
 Distributional	
 change	 and	
 epidemic	
 introgression	
 in	
 overlapping	 areas	 of	
 Japanese	 pond	
 frog	
 species	 over	 30	
 years.	
 Zool.	
 Sci.,	
 29:	
 351-358.	
 
	
 	
 	
 
2.	
 Hasan,	
 M.,	
 M.	
 Kuramoto,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 S.	
 Alam,	
 M.	
 M.	
 R.	
 Khan	 and	
 M.	
 Sumida	 (2012)	
 A	
 new	
 species	 of	
 genus	 Hoplobatrachus	
 (Anura,	 Dicroglossidae)	
 from	 the	
 coastal	
 belt	 of	
 Bangladesh.	
 Zootaxa,	
 3312:	 45-58.	
 	
 3.	
 Sugawara,	
 H.,	
 T.	
 Igawa,	
 M.	
 Yokogawa,	
 M.	
 Okuda,	
 S.	
 Oumi,	
 S.	
 Katsuren,	
 S.	
 Kaneko,	
 T.	
 Umino,	
 Y.	
 Isagi	
 and	 M.	
 Sumida	 (2012).	
 Isolation	
 and	
 characterization	
 of	
 ten	
 microsatellite	 loci	 of	
 endangered	
 Anderson’s	 crocodile	 newt,	
 Echinotriton	
 andersoni.	
 Conser.	
 Genet.	
 Res.,	
 4:	
 595–598.	
 
	
 
4.	
 Alam,	
 M.	
 S.,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 M.	
 R.	
 Khan,	
 M.	
 Hasan,	
 R.	
 Wanichanon	
 and	
 
M.	
 Sumida	 (2012)	
 Postmating	 isolation	
 in	
 six	
 species	 of	
 three	 genera	 (Hoplobatrachus,	
 Euphlyctis	
 and	
 Fejervarya)	
 from	
 family	
 Dicroglossidae	 (Anura),	
 with	
 special	
 reference	
 to	
 spontaneous	
 production	
 of	
 allotriploids.	
 Zool.	
 Sci.,	
 29:	
 743-752.	
 
	
 
5.	
 Igawa,	
 T.,	
 S.	
 Oumi,	
 S.	
 Katsuren	
 and	
 M.	
 Sumida	 (2013)	
 Population	 structure	
 and	
 landscape	 genetics	
 of	
 two	
 endangered	 frog	
 species	 of	
 Genus	 Odorrana:	
 different	 scenarios	
 on	
 two	
 islands.	
 Heredity,	
 110:	
 46-56.	
 	
 
	
 
6.	
 Kakehashi,	
 R.,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 S.	
 Oumi,	
 S.	
 Katsuren,	
 M.	
 Hoso	 and	
 M.	
 Sumida	 (2013)	
 Mitochondrial	 genomes	 of	
 Japanese	
 Babina	 frogs	 (Ranidae,	 Anura):	
 unique	 gene	 arrangements	
 and	
 the	
 phylogenetic	
 position	
 of	
 genus	 Babina.	
 Genes	 Genet.	
 Syst.,	
 88:	
 59-67.	
 	
 7.	
 Kakehashi,	
 R.,	
 T.	
 Igawa,	
 N.	
 Iwai,	
 E.	
 Shoda-Kagaya,	
 and	
 M.	
 Sumida	 (2013)	
 Development	
 and	
 characterization	
 of	
 new	
 microsatellite	 loci	
 in	
 the	
 Otton	 frog	
 (Babina	
 subaspera)	
 and	
 cross-amplification	
 in	
 a	
 congeneric	 species,	 Holst’s	 frog	 (B.	
 holsti).	
 Conser.	
 Genet.	
 Res.,	
 5:	
 in	 press.	
 	 54

②総説･著書･その他	
 1.	
 住田正幸(2012)「東広島キャンパスにする棲息するカエル」広島大学	
 環
境報告書 Environmental	
 Report	 2012：20.	
 
	
 
2.	
 住田正幸（2012）『世界でオンリーワンの両生類研究施設で誕生した世界
初の「透明ガエル」』広島大学	
 生協だより 129：1.	
 
	
 
3.	
 住田正幸（2012）「サテライト館の整備-両生類研究施設展示スペース」
広島大学	
 総合博物館ニュースレター	
 6：9.	 	
 4.	
 住田正幸（2012）「ネッタイツメガエルの近交化・標準系統の樹立・提供」
第 3 期 NBRP 開始記念	
 シンポジウム	 −	
 第 3 期への挑戦	
 −	
 講演要旨集:	
 15.	
 
	
 
③学会発表	
 
国際学会	
 
1.	
 Komaki,	
 S.,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 K.	
 Tojo,	
 and	 M.	
 Sumida	 “Distributional	
 change	 and	
 epidemic	
 introgression	
 in	
 overlapping	 areas	 of	
 Japanese	 pond	
 frog	
 species	 over	 30	
 years”	
 7th	
 World	 Congress	 of	
 Herpetology	
 (August	
 9,	
 2012,	
 University	
 of	
 British	
 Columbia,	
 Vancouver,	 Canada)	
 	
 2.	
 Kurabayashi,	
 A.,	
 M.	
 Matsui,	 Daicus,	
 M.	
 B.,	
 H.	
 S.	
 Yong,	
 N.	
 Ahmad,	 A.	
 Sudin,	
 M.	
 Kuramoto,	
 A.	
 Hamidy,	
 and	
 M.	
 Sumida	 “From	 Antarctica	 or	
 Asia?	
 New	
 colonization	
 scenario	
 for	
 Australian-New	
 Guinean	 narrow	 mouth	 toads	 suggested	
 from	 the	
 findings	
 on	
 a	
 mysterious	
 genus	 Gastrophrynoides”	
 7th	 World	 Congress	 of	
 Herpetology	
 (August	
 10,	
 2012,	
 University	
 of	
 British	 Columbia,	
 Vancouver,	
 Canada)	
 	
 3.	
 Islam,	
 M.	
 M.,	
 H.	
 Tokimitsu,	
 M.	
 Uchida,	
 M.	
 Iwanari,	
 T.	
 Fujii,	
 and	
 M.	
 
Sumida	 “Genetic	
 divergence	
 and	
 postmating	 isolation	
 among	 the	
 brown	 frogs	 from	 Ryukyu	
 Archipelago,	
 Japan,	
 elucidated	
 by	 allozyme	
 and	
 mitochondrial	
 gene	
 sequence	 analyses,	 crossing	 experiments	
 and	
 cytological	
 observations”	
 7th	
 World	 Congress	 of	
 Herpetology	
 (August	
 11,	
 2012,	
 University	
 of	
 British	
 Columbia,	
 Vancouver,	
 Canada)	
 	
 4.	
 Sumida,	
 M.,	
 N.	
 Satou,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 T.	
 Igawa,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 K.	
 Ukena,	 S.	
 Oumi,	
 S.	
 Katsuren,	
 and	
 T.	
 Fujii	 “Artificial	
 and	
 natural	 breeding	
 of	
 
the	
 endangered	 frog	
 species	
 Odorrana	 ishikawae	
 and	
 Odorrana	
 splendida,	
 analysis	 of	 genetic	
 diversity,	
 and	
 usage	 as	 resource	 materials:	
 Case	
 study	
 of	
 fauna	 conservation	
 in	
 Japan”	
 7th	 World	 Congress	 of	
 Herpetology	 (August	 11,	
 2012,	
 University	
 of	
 British	
 Columbia,	
 Vancouver,	
 Canada)	
 	
 5.	
 Alam,	
 M.	
 S.,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 M.	
 R.	
 Khan,	
 M.	
 Hasan,	
 R.	
 Wanichanon	
 and	
 

55

M.	
 Sumida	 “Postmating	 isolation	
 in	
 six	
 species	 of	
 three	 genera	 (Hoplobatrachus,	
 Euphlyctis	
 and	
 Fejervarya)	
 from	
 family	
 Dicroglossidae	 (Anura),	
 with	
 special	
 reference	
 to	
 spontaneous	
 production	
 of	
 allotriploids”	
 7th	
 World	 Congress	 of	
 Herpetology	 August	 11,	
 2012,	
 University	
 of	
 British	
 Columbia,	
 Vancouver,	
 Canada)	
 	
 6.	
 Hasan,	
 M.,	
 M.	
 Kuramoto,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 S.	
 Alam,	
 M.	
 M.	
 R.	
 Khan	 and	
 M.	
 Sumida	 “A	 new	 species	 of	
 genus	 Hoplobatrachus	
 (Anura,	 Dicroglossidae)	
 
from	
 the	
 coastal	
 belt	 of	
 Bangladesh”	
 7th	
 World	 Congress	 of	
 Herpetology	 (August	 12,	
 2012,	
 University	
 of	
 British	
 Columbia,	
 Vancouver,	
 Canada)	
 	
 7.	
 Kakehashi,	
 R.,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 S.	
 Oumi,	
 S.	
 Katsuren,	
 M.	
 Hoso,	
 and	
 M.	
 
Sumida	 “Complete	 mitochondrial	 sequences	
 of	
 the	
 three	 Japanese	
 Babina	 (Ranidae,	 Anura)	
 species	
 and	
 the	
 phylogenetic	
 position	
 among	 Ranidae”	
 7th	 World	 Congress	 of	
 Herpetology	
 (August	
 12,	
 2012,	
 University	
 of	
 British	 Columbia,	
 Vancouver,	
 Canada)	
 	
 8.	
 Hasan,	
 M.,	
 M.	
 Kuramoto,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 S.	
 Alam,	
 M.	
 M.	
 R.	
 Khan	 and	
 M.	
 Sumida	 “A	 new	 species	 of	
 genus	 Hoplobatrachus	
 (Anura,	 Dicroglossidae)	
 
from	
 the	
 coastal	
 belt	 of	
 Bangladesh”	
 18th	 Biennial	
 International	 Conference	
 and	
 Annual	
 General	
 Meeting	 2012,	
 (December	
 22,	
 2012,	
 University	
 of	
 Dhaka,	 Bangladesh)	
 
	
 
国内学会	
 
1.	
 住田正幸・井川武・Islam	
 M.	
 M.・新谷望・掛橋竜祐・菅原弘貴・倉林敦・
大海昌平・勝連盛輝・田戸美雪・藤井保「中央琉球産絶滅危惧両生類 5 種の遺伝的分化と飼育下繁殖」	
 日本動物学会第 83 回大会（2012 年 9 月 15 日、大阪大学、豊中）	
 
	
 
2.	
 Alam,	
 M.	
 S.・M.	
 M.	
 Islam・M.	
 M.	
 R.	
 Khan・	
 M.	
 Hasan・R.	
 Wanichanon・M.	
 Sumida	 “Postmating	 isolation	
 in	
 six	
 species	 of	
 three	 genera	 (Hoplobatrachus,	
 Euphlyctis	
 and	
 Fejervarya)	
 from	
 family	
 Dicroglossidae	 (Anura),	
 with	
 special	
 reference	
 to	
 spontaneous	
 production	
 of	
 allotriploids”	
 日本動物学会第 83 回大会（2012 年 9 月 15 日、大阪大学、豊
中）	
 
	
 
3.	
 小巻翔平・倉林敦・イスラム	 モハメド	 マフィズル・東城幸治・住田正幸「日本産トノサマガエル種群の分布重複域における浸透交雑と 30 年間で生じた分布変化」日本動物学会第 83 回大会（2012 年 9 月 15 日、大阪大学、豊中）
	
 
	
 
4.	
 井川武・菅原弘貴・本田正尚・富永篤・大海昌平・勝連盛輝・太田英利・
松井正文・松井正文「マイクロサテライトマーカーを用いた絶滅危惧種および天然記念物イボイモリの遺伝的集団構造の解明」日本遺伝学会第 84 回大会

56

（2012 年 9 月 25 日、九州大学、福岡）	
 
	
 
5.	
 Islam,	 M.	
 M.・H.	
 Tokimitsu・M.	
 Uchida・M.	
 Iwanari・T.	
 Fujii・M.	
 Sumida	 “Genetic	
 divergence	
 and	
 postmating	 isolation	
 among	 the	
 brown	 frogs	 from	
 Ryukyu	 Archipelago,	
 Japan,	
 elucidated	
 by	 allozyme	
 and	
 mitochondrial	
 gene	
 sequence	 analyses,	 crossing	 experiments	
 and	
 cytological	
 observations”	
 日
本遺伝学会第 84 回大会（2012 年 9 月 26 日、九州大学、福岡）	
 
	
 
6.	
 住田正幸・井川武・イスラム	 モハメド	 マフィズル・新谷望・掛橋竜祐・
菅原弘貴・西谷琢磨・倉林敦・大海昌平・勝連盛輝・田戸美雪・藤井保	
 「南西諸島の絶滅危惧両生類における遺伝的分化と飼育下繁殖」日本爬虫両棲類
学会第 51 回大会（2012 年 11 月 10 日、愛知学泉大学、豊田）	
 
	
 
7.	
 新谷望・井川武・住田正幸	
 「アマミイシカワガエルの飼育下における温度条件と遺伝的要因が個体生存率に与える影響」日本爬虫両棲類学会第 51 回
大会（2012 年 11 月 10 日、愛知学泉大学、豊田）	
 
	
 
8.	
 倉林敦・掛橋竜祐・田澤一朗・住田正幸・原本悦和・大嶋友美・伊藤弓弦	 「次世代モデル動物ネッタイツメガエルとその輸送法の改善について」日本
爬虫両棲類学会第 51 回大会（2012 年 11 月 10 日、愛知学泉大学、豊田）	
 
	
 
9.	
 徳増大輔・井川武・Min	 Mi-Sook・住田正幸「ウシガエルはどこから来て、なぜ駆逐されないのか？：侵入成功と個体群存続における遺伝的要因の調査」
日本爬虫両棲類学会第 51 回大会（2012 年 11 月 10 日〜11 日、愛知学泉大学、
豊田）	
 
	
 
10.	
 Hasan,	
 M.・M.	
 Kuramoto・M.	
 M.	
 Islam・M.	
 S.	
 Alam・M.	
 M.	
 R.	
 Khan・
M.	
 Sumida	 “A	 new	 species	 of	
 genus	 Hoplobatrachus	
 (Anura,	 Dicroglossidae)	
 
from	
 the	
 coastal	
 belt	 of	
 Bangladesh”	 	
 日本爬虫両棲類学会第 51 回大会（2012 年 11 月 11 日、愛知学泉大学、豊田）	
 
	
 
11.	
 住田正幸「ネッタイツメガエルの近交化・標準系統の樹立・提供」第３
期 NBRP 開始記念ナショナルバイオリソースプロジェクト(NBRP)シンポジウム-第３期への挑戦-（2012 年 11 月 21 日、品川）	
 	
 ④科研費等の受け入れ状況	
 1.	
 文部科学省特別教育研究経費—国際的に卓越した教育研究拠点機能の充実	
 先駆的両生類研究の展開—両生類絶滅危惧種の保全	
  12,740 千円	
  （担当	 住田正幸、矢尾板芳郎）	
 
	
 
2.	
 文部科学省第 3 期 NBRP「ネッタイツメガエルの近交化・標準系統の樹立・提供」中核機関（H24 年度）16,401 千円	
 (課題代表者	
 住田正幸)	
 
	
 

57

3.	
 科学研究費補助金	
 基盤研究(B)「絶滅危惧両生類における遺伝的多様性評
価と保全のための包括的研究」5,850 千円（研究代表者	
 住田正幸）	
 	
 4.	
 奨学寄付金「インドネシアの種多様性に関する研究」（ブラビジャヤ大学
Aris	
 Soewondo）3,000 ドル（担当	
 住田正幸）	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 

58

准教授・鈴木	  厚（Atsushi	
 Suzuki）	
 
	
 
研究内容	
 
	
  胚発生初期に背腹と頭尾のパターン形成が調和する機構	 	  A	 mechanism	
 coordinating	 the	
 establishment	
 of	
 the	
 dorsal-ventral	
 and	
 anterior-posterior	
 axes	 during	 early	
 Xenopus	 embryogenesis	
 
	
 
[目的]	
 
	
  初期発生過程において、背腹と頭尾の体軸が形成されると初めて胚の３次元座標が精確に決まり、基本的な体の体制（ボディープラン）が確立する。近年の研究から、様々な細胞増殖因子によって体軸形成が制御されることが知られており、背腹軸は腹側化因子（Bone	
 Morphogenetic	
 protein,	
 BMP）によって、頭尾軸は後方化因子（Wnt・FGF・レチノイン酸）によって、それぞれ決定されている。胚が正常に発生するためには、背腹と頭尾の体軸形成が互いに調和しながら形成される必要があるが、この調和機構については、ほとんど理解が進んでいなかった。また、数学者 Thompson をはじめとする研究者によって、生物の多様な形態を、背腹軸と頭尾軸の調和機構の変化で説明しようとする試みがなされている。最近、私達の発見を含めて、体軸形成の調和機構に関する知見が得られつつある（Fuentealba	
 et	
 al.	
 Cell	
 131,	
 980-993,	
 2007;	
 Eivers	
 et	
 al.	
 
Science	
 Signaling	
 4,	
 ra68,	
 2011;	
 Takebayashi-Suzuki	
 et	
 al.	
 Developmental	
 Biology	
 360,	
 11-29,	 2011）。本研究では、アフリカツメガエル胚を用いた機能スクリーニングにより新たに単離した Biz(BMP	 inhibitory	
 zinc-finger)が、背腹軸と頭尾軸の制御に関わることから、Biz の機能解析を通じて体軸形成の調和
機構を明らかにすることを目的とした。	
 	
 [成果と考察]	
 	  昨年度までの研究により、Biz が腹側化因子 BMP のシグナルを抑制して神経誘導（背側化）を引き起こすこと、および、他の細胞増殖因子シグナル（Wnt）と協調して頭尾軸形成を調節することを明らかにしてきた。すなわち、Biz の過剰発現を行うと頭部構造の形成が阻害され、胴尾部領域の神経マーカーの発現が誘導される。また、Biz 特異的なアンチセンスモルフォリノオリゴ（MO）をアフ
リカツメガエル初期胚に注入して機能阻害実験を行うと、前後軸形成について
は、後方神経マーカーの１つである HoxB9 の発現が著しく低下することが分かった。また、この表現型は、Biz	
 MO の標的配列をもたない変異型 Biz の過剰発現によって回復することから、Biz 機能阻害による特異的な表現型であることが確認できた。したがって、Biz は、胚の後方領域の形成に重要であり、頭尾軸の制御に必要であると考えられる。一方、背腹軸形成について調べると、Biz	
 MO
注入胚では、神経マーカーNCAM の発現が著しく低下することが分かった。しかし、興味深いことに、別の神経マーカーSox2 の発現は、ほとんど影響を受けていなかった。背腹軸形成が進行して背側と腹側にそれぞれ神経と表皮が分化し始めると、神経領域では、最初に Sox2 が発現して神経分化への方向付けが行われ、続いて最終的な神経分化が進むと NCAM の発現が始まることが知られている。
したがって、Biz 機能阻害により、Sox2 の発現が変化せずに NCAM の発現が抑制

59

されていることは、Biz が神経分化の方向付けの段階ではなく、より後期の神経分化段階に必要であることを示している。	
 	
  両生類研究施設は、本年度から文部科学省ナショナルバイオリソースプロジ
ェクト（NBRP）に新規採択され、ネッタイツメガエルのリソース拠点として様々な研究支援を開始した。ネッタイツメガエルは、アフリカツメガエルより優れた特徴を持つことから、背腹と頭尾のパターン形成機構の研究にもネッタイツ
メガエルを利用した。データベースに登録されている cDNA およびゲノム DNA の塩基配列を参考にして Biz 遺伝子特異的プライマーを作製し、PCR 法によりシングルバンドのネッタイツメガエル Biz 遺伝子を得た。塩基配列を決定したとこ
ろ、5’および 3’UTR を含めて約 1.8	 kb の領域について、データベースに登録された塩基配列と 1 塩基しか違わず、この変異も同義置換であることが確認できた。これまで実験に用いていたアフリカツメガエルは 4 倍体であり、遺伝子
増幅時に複数の PCR 産物（バンド）が得られることが多く、塩基配列のバリエーションも極めて多様である。一方、両生類研究施設で増殖中のネッタイツメ
ガエルを用いた今回の解析では、アフリカツメガエルで見られるような複雑性は全く無く、極めて容易に遺伝子の単離・解析を行うことが出来た。次に、ネッタイツメガエル Biz 遺伝子特異的なアンチセンスモルフォリノオリゴ（XtBiz	 MO）を作製し、ネッタイツメガエル Biz 遺伝子の機能阻害を行った。Biz 阻害胚を尾芽胚期まで発生させると、尾部構造が縮小し、頭部構造が拡大することが分かった。現在詳細な解析を始めた段階ではあるが、この表現型は、アフリカ
ツメガエルを用いた解析から予想される表現型と一致していた。ホールマウン
ト	 in	
 situ ハイブリダイゼーション法による遺伝子発現解析についても、ネッ
タイツメガエルの優位性が明らかになっているので、今後は上記の遺伝学的な利点と併せて、ネッタイツメガエルを活用した解析を展開していく予定である。	
 	
 [将来の展望]	 	  これまでの研究では、Biz 過剰発現と機能阻害の表現型を解析することによって、体軸形成における Biz の重要性が明らかになりつつある。特に、ナショナ
ルバイオリソースプロジェクトによって供給される高品質なカエル、およびネッタイツメガエルの利点を活かすことで、研究が加速することが期待される。	
 
今後は、Biz による背腹軸と頭尾軸の制御機構を分子レベルで解明することが、
体軸形成の調和機構を明らかにするうえで非常に重要になると考えている。背腹軸の制御については、Biz が腹側化因子 BMP のシグナル伝達を Smad レベルで抑制することを既に明らかにしているので、Biz が Smad を調節する機構を中心に解析を進めていく。一方、頭尾軸の制御については、Biz が Wnt シグナルと協調的に働くことに着目し、Biz による Wnt シグナルの制御機構を明らかにしたいと考えている。さらに、私達が既に論文発表をした FoxB1 転写因子も Biz と同様に体軸形成の調和に関与するので（詳細については本研究グループ・竹林公
子特任助教の項目を参照）、FoxB1 と Biz の機能的な関連や役割分担についても明らかにしたい。これらの研究から、頭尾軸と背腹軸の調和機構の全体像や制御ネットワークが明らかになり、ボディープランの成立機構が明確になると考えている。最終的には、ボディープランの成立機構が明らかになることで、動物の多様な形態が生じる機構の理解に繋がると期待している。	
 

60

	
 
研究業績	
 
①原著論文	
 
該当なし	
 
	
 
②総説・著書	
 
該当なし	
 
	
 
③学会発表	
 （国内学会）	
 1．Kimiko	
 Takebayashi-Suzuki,	
 Hidenori	
 Konishi	
 and	
 Atsushi	 Suzuki	 	 “The	 forkhead	 transcription	
 factor	
 FoxB1	
 mediates	
 body	
 axis	
 coordination	 and	
 developmental	
 canalization	
 during	 early	
 Xenopus	 embryogenesis.”	 	 	
 第 45 回	 日本発生生物学会	
 第 64 回日本細胞生物学会	
 合同年会	 ワークショップ(2012 年 5 月 31 日、神戸）	
 	
 2．竹林公子、鈴木	
  厚	
 
“The	
 forkhead	 transcription	
 factor	
 FoxB1	
 mediates	
 body	
 axis	
 coordination	 and	
 developmental	
 canalization	
 during	 early	
 Xenopus	 embryogenesis.	
 	
 FoxB1 転写因子はツメガエル初期発生過程で神経誘導を保証している”	
 第 35 回	 日本分子生物学会	
 (2012 年 12 月 12 日、福岡）	
 
	
 
3.	
 鈴木	
  厚、竹林公子	
 “体軸パターン形成の統合的理解に向けて”	
 細胞のかたちと機能プロジェクト研究センター・成果発表会	
 (2013 年 3 月 26 日、
東広島）	
 
	
 
（国際学会）	
 1．Kimiko	
 Takebayashi-Suzuki,	
 Hidenori	
 Konishi	
 and	
 Atsushi	 Suzuki	 “The	 forkhead	 transcription	
 factor	
 FoxB1	
 mediates	
 body	
 axis	
 coordination	 and	
 developmental	
 canalization	
 during	 early	
 Xenopus	 embryogenesis”	
 BSCB-BSDB-JSDB	
 2012	 (2012 年 4 月 17 日、イギリス)	
 	
 2．Atsushi	
 Suzuki	 “The	 forkhead	 transcription	
 factor	
 FoxB1	
 mediates	
 body	
 axis	
 coordination	 and	
 developmental	
 canalization	
 during	 early	
 Xenopus	 embryogenesis”	
 MRC	
 National	
 Institute	
 for	
 Medical	
 Research,	
 London・研究所セミナー	 (2012 年 4 月 20 日、イギリス)	
 
	
 
3.	
 Kimiko	
 Takebayashi-Suzuki,	
 Hidenori	
 Konishi	
 and	
 Atsushi	 Suzuki	 “The	 forkhead	 transcription	
 factor	
 FoxB1	
 mediates	
 body	
 axis	
 coordination	 and	
 developmental	
 canalization	
 during	 early	
 Xenopus	 embryogenesis”	
 14th	
 International	
 Xenopus	 Conference	 (2012 年 9 月 11 日、フランス)	
 

61

	
 
4.	
 Shuji	 Takahashi,	 Atsushi	 Toyoda,	 Yoko	 Kuroki,	 Yoshinobu	
 Uno,	 Yumi	
 Izutsu,	 Atsushi	  Suzuki,	  Tatsuo	  Michiue,	
  Hajime	  Ogino,	  Hirofumi	  Ochi,	  Toshiaki	 Tanaka,	
 Akimasa	
 Fukui,	 Yuzuru	
 Ito	
 Naoto	
 Ueno,	
 M.	
 Asashima,	
 Yoichi	 Matsuda,	 Masanori	
 Taira	 and	
 A.	
 Fujiyama	 “Analysis	
 of	
 the	
 Xenopus	 laevis	 J-strain	
 genome	
 by	
 BAC	
 end	
 sequencing,	
 FISH,	 and	
 RNA-sequence”	
 14th	
 International	
 Xenopus	 Conference	 (2012 年
9 月 11 日、フランス)	
 
	
 
5.	
 Shuji	 Takahashi,	 Atsushi	 Toyoda,	 Yoko	 Kuroki,	 Yoshinobu	
 Uno,	
 Hideki	 Noguchi,	  Yumi	  Izutsu,	  Atsushi	  Suzuki,	  Tatsuo	  Michiue,	
  Hajime	  Ogino,	 Hirofumi	 Ochi,	
 Toshiaki	 Tanaka,	
 Akimasa	
 Fukui,	 Yuzuru	
 Ito	
 Naoto	
 Ueno,	
 M.	
 Asashima,	
 Yoichi	 Matsuda,	
 Masanori	
 Taira	 and	
 A.	
 Fujiyama	 “Analysis	
 of	
 the	
 Xenopus	 laevis	 J-strain	
 genome	
 by	
 BAC	
 end	
 sequencing,	
 FISH,	
  and	
  RNA-sequence”	
  International	  Symposium	  on	  Genome	  Science“Expanding	
 Frontiers	
 of	
 Genome	 Science”	
 (2013 年 1 月 9 日、東京)	
 
	
 
	
 
④科研費等の受け入れ状況	
 
該当なし	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 

62

助教・倉林	
 敦（Atsushi	
 Kurabayashi）	
 
	
 
研究内容	
 
アフリカガエル類（Afrobatrachia）のミトコンドリアゲノム：ゲノム構造の多様化、遺伝子配置変化メカニズム、および配置変化遺伝子の進化的傾向	
 Afrobatrachian	 mitochondrial	 genomes:	
 Extensive	
 genome	 reorganization,	 mechanism	
 of	
 gene	
 rearrangement,	
 and	 evolutionary	 trends	
 of	
 duplicated	
 and	
 rearranged	
 genes	
 	
 
	
 
[目的]	
 
	
  アフリカガエル類（Afrobatrachia）は、2006 年に	
 Frost	 et	 al.によって新設された、カエル亜目（Neobatrachia）に属する分類群で、ヒメアマガエル類（Microhylidae）とアカガエル類（Natatanura）とともに、アカガエル上科（Ranoidae）を形成する３つの主要なグループの一つである。アフリカガエル類は、アナホリガエル科・フクラガエル科・サエズリガエル科・クサガエル科の４科を含み、その名の通り、アフリカ大陸にのみに分布する。これら４科の類縁関係は従来不明な点が多く議論が続いていた。最近の研究から、これらの科が単系統群である事が確かめられているが、アフリカガエル類を特徴づける
共有派生形質はこれまでに発見されていない。アカガエル上科内でのアフリカ
ガエル類の系統関係についてはコンセンサスが得られていない。	
 	
  動物のミトコンドリアゲノム（ミトゲノム）において遺伝子が並んでいる順
序（遺伝子配置）は、一般的に保守性が高く、近縁な動物内では変化しない。
アカガエル上科の中のヒメアマガエル類ではミトゲノムの遺伝子配置変化は知られていないが、アカガエル類では大規模な配置変化が生じていることが知られている。一方で、アフリカガエル類では、ミトゲノムの報告がなかった。さらに、ミトゲノムの遺伝子配置変化メカニズムについては、幾つかの仮説が提案されているが、それらを証拠づける観察は現時点では不十分であった。さらに最近、カエル類のミトゲノムでは、カエル亜目において、負の制約が緩むことで、ミトゲノム遺伝子の塩基置換速度が加速したことが示されたが、カエル亜目の中のミトゲノム遺伝子の分子進化速度の変化は詳しく調べられていない。
さらに、重複や配置変化を起こしたミトゲノム遺伝子の分子進化の傾向については、これらの減少が稀であることからほとんど研究されてきていなかった。	
 	
  以上の点をふまえ、以下の４点を目的として研究を行った。	
 （1）ミトゲノムおよび核遺伝子の大量塩基配列情報を用いたアフリカガエル類の系統的位置の解明。（2）アフリカガエル類ミトゲノムにおけるミトゲノム構
造変化（遺伝子重複・遺伝子配置変化）の探索。（3）アカガエル上科における
ミトゲノム構造変化に基づく遺伝子配置メカニズムの検証。（4）重複および配置変化ミトゲノム遺伝子の分子進化傾向の推定。	
 	 [材料・方法]	
 	  アフリカガエル類各科から、1 種の代表種を選び（ Breviceps	
 adspersus、Hemisus	  marmoratus 、 Hyperolius	  marmoratus 、 お よ び 	  Trichobatrachus	 robustus）、ミトゲノム全塩基配列とゲノム構造を決定した。これらに加え、

63

５種のアカガエル類（ Babina	
 holsti、Lithobates	 catesbeianus、Buergeria	
 buergeri、Hoplobatrachus	
 tigerinus と Limnonectes	
 fujianensis）について、
核タンパク質をコードする遺伝子（BDNF、CXCR4、ヒストン-3A、POMC、RAG1、
RAG2、rho、slc8a1、及び slc8a3）のシーケンスを行い、これらのデータをもとに系統解析と分岐年代推定を行った。	
 	  ミトゲノム増幅とシークエンスは LA-PCR 法とプライマーウォーキング法を用いたた。系統解析には、最尤法とベイズ法を用い、分岐年代解析には、Bayesian	 relaxed	 clock	 法を用いた。それぞれの解析は、RaxML、MrBayes3.12、MCMCtree
プログラムを用いた。さらに、分類群ごとのミトゲノム遺伝子の進化速度の差
異を相対速度テストによって比較した。このテストには、RRTree	
 プログラムを用いた。さらに、「ブランチモデル」の比較を行い、系統樹の枝ごとのミトゲノム遺伝子への選択圧の違いを推定した。この推定には PAML プログラムを用い
た。	
 
	
 
[結果・考察・成果]	
 （1）アフリカガエル類の系統的位置	
 	  ミトゲノムおよび 9 種の核遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列データに基づき分子系統解析を行った。その結果、どちらのデータでも、アフリカガエル類は単系統群となり、さらに、ヒメアマガエル類と姉妹群を形成した。アフリ
カガエル類と秘めアマガエル類の関係については、アミノ酸データを用いた場
合のブートストラップ値は低かった（61％）ものの、塩基配列データでのブートストラップ値は比較的高く（76％）、どちらのデータでもベイズ事後確率については高い支持が得られた（100／99%）。これらの統計的信頼値に加え、本研究で用いた分子データがこれまでにアフリカガエル類の系統推定に用いられたものの中で最大であることを考慮すると、今回得られた仮説は信頼性の高いものであると考えられる。	
 	  また、アフリカガエル類を特徴づける共有派生形質はこれまでに見つかっていなかったが、今回解析したアフリカガエル類全種のミトゲノムにおいて、通常の WANCY-	
  tRNAs という遺伝子配置から変化した、WNACY-tRNAs	
 という配置が共有されていた。この新たに発見された遺伝子配置は、アフリカガエル類の共有派生形質としてみなせると考えられた。	
 	
  また、アフリカガエル類と他のアカガエル上科の分岐年代はおよそ 1 億年前と推定された。これは、ゴンドワナ大陸分断の最終局面のアフリカと南アフリカの分断時期に近い。この分岐年代は、本グループがアフリカ大陸のみに分布していることの原因と考えられた（アフリカが他の大陸と分断した時期に出現したので、他の大陸に分布しない）。	
 （2）アフリカガエル類のミトゲノムの構造変化	 	  アフリカガエル類の中でも、Hemisus（アナホリガエル）のミトゲノムの遺伝子配置は、一般的なカエル亜目型とほぼ同じで合った。一方で、他の 3 種のミトゲノムは、カエル亜目一般型から大きく逸脱していた。具体的には、Breviceps（フクラガエル）のミトゲノムでは、LTPF	
 tRNs-12S	
 rrn-trnV-16Srrn のからなる領域は、縦列に３重に重複しており、さらに、	
 trnHS2 セグメントが 3 重領域の間に転座していた。さらに、trnWN-OL セグメントが重複し、この間にコント64

ロール領域（CR）が挿入されていた（結果的に CR は２つ存在した）。は、これらの 2 つのコピーの間に発生しました。これらの多数の重複領域の存在により、Breviceps のミトゲノムは、これまでに知られている脊椎動物のミトゲノムの中で最大のものとなっていた（28757	
 bp）。	 	
 Hyperolius（マダラクサガエル）のミトゲノムでは、典型的な LTPF	
 tRNA クラスターが PTLF に再配置され、比較的大きな非コード領域が trnP と trnT（1.3	
 kbp）の間、および trnL2 と trnF（0.4	
 KBP）の間に発見された。さらに、trnM-ND2
セグメントが重複しており、この２つのコピーの間に２つめのの CR が存在していた。同様に、Trichobatrachus	 （ケガエル）のミトゲノムでは、trnHS2-ND5セグメントが縦列に重複しており、この２つのコピーの間に、余分な CR-LTPF	
 tRNA セグメントが存在していた。	
 	
  重複遺伝子の種類と遺伝子の配置変化パターンはアフリカガエル類の分類群間で異なっていた。したがって、大規模なミトゲノム再編成は、少なくとも 3
つの異なるアフリカガエル系統で独立に生じたと結論できる。しかし、アフリ
カガエル類では、縦列に重複した遺伝子領域の間に、他の領域の挿入が(非縦列的に)生じているという点で共通性が見られた。	
 (3)	
 遺伝子配置・協調進化のメカニズム	
 	
  動物のミトゲノムの遺伝子配置変化は、主に複製エラーによって生じる縦列
重複を通じて生じると考えられてきた（TDRL モデル）。最近我々は、動物の mt
ゲノムで、非縦列重複を説明するために、「第一縦列・第二非縦列モデル」を提唱した。	
 アフリカガエル類のミトゲノムで多く観察された、縦列重複領域内に位置する非縦列重複遺伝子領域は、このモデルと同じプロセスによって、アフリカガエル類のミトゲノムの遺伝子配置変化が生じたことを実証するものであった。	
 	  これまでに、動物ミトゲノムの重複領域で観察される協調進化については、
相同組換えモデルと、複製エラーモデルの、２つの異なるメカニズムが提案されている。アフリカガエル類の重複領域の多くは、互いに高い塩基配列相同性を示すため、これらの領域には協調進化が働いていることは間違いない。なかでも、Breviceps に見られた rRNA 遺伝子を含む３重重複領域では、３つのコピーのうち、隣り合わないコピー同士が協調進化を受けていた。複製エラーモデ
ルでは、隣り合わないコピーの配列均質化の説明が困難であることから、Breviceps の３重重複領域では、組換え機構を介した協調進化が生じていることが示唆された。	
 （4）重複・配置変化遺伝子の進化傾向	 	  重複した遺伝子は、機能的に冗長なコピーがあるため、少なくとも片方のコ
ピーにおいては、負の選択圧が緩和されると考えられ、これにより重複遺伝子の進化速度（塩基置換速度）は高まると考えられる。この仮説を検証するために、アカガエル上科で重複や配置変化を起こした（配置変化遺伝子は、配置変化の過程で必ず重複時期を経験している）遺伝子の進化速度を、重複や配置変化していない遺伝子と比較した。その結果、重複・配置変化遺伝子は、必ずしもに速い塩基置換率を持っていないことが明らかになった。さらに、重複遺伝
子や配置変化タンパク質遺伝子に対する選択圧を調べた所、必ずしも選択圧は緩んでいないことが示された。	
 

65

	
  また、脊椎動物のミトゲノムは、CR に存在する H 鎖複製開始点から H 鎖の複製が開始され、この複製が WANCYtRNA クラスターに存在する L 鎖複製開始点に到達するまでの間 H 鎖が 1 本鎖の状態に留まるという特徴がある。DNA が 1 本鎖で存在する場合、脱アミノ基反応が生じやすくなり、この結果、C→T（U）と→ヒポキサンチン（C とのペアリング）→G の置換が生じやすくなる。このため、
L 鎖複製起点から遠い位置にある遺伝子では G と T の組成が増え、近い位置の遺伝子は C と A 組成が多くなる現象が知られている。アカガエル上科の中で配置変化を起こした遺伝子について、この塩基組成傾向が観察されるかを検証した
所、本来の位置から、L 鎖複製起点より遠い位置に移動した遺伝子は、必ずしも高い GT 組成を持たないことが分かった。	
 	  特定の進化トレンドが、重複・配置変化遺伝子に存在する場合、これらの遺伝子からのデータが、系統構築を行う際に悪い影響（塩基組成の偏りや速い塩
基置換速度）を与える可能性がある。しかし、本研究で明らかになったように、
ミトゲノムの重複・配置変化遺伝子は特別な進化傾向を示さず、系統解析時のデータとして用いても、問題はないことが示唆された。	
 	
  以上の成果を論文にまとめ、現在、国際誌に投稿中である。	
 
	
 
研究業績	
 
①	
 原著論文	
 1.	
 Komaki,	
 S.,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 K.	
 Tojo,	
 &	 M.	
 Sumida(2012)	
 Distributional	
 change	 and	
 epidemic	
 introgression	
 in	
 overlapping	 areas	 of	  Japanese	  pond	  frog	  species	  over	  30	
  years	  Zoological	
  Science	  29:	
 351-358.	
 	
 2.	
 Kakehashi,	
 R.,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 S.	
 Oumi,	
 S.	
 Katsuren,	
 M.	
 Hoso	 and	
 M.	
 Sumida	 (2013)	
 Mitochondrial	 genomes	 of	
 Japanese	
 Babina	 frogs	 (Ranidae,	 Anura):	
 unique	 gene	 arrangements	
 and	
 the	
 phylogenetic	
 position	
 of	
 genus	 Babina.	
 Genes	 Genet.	
 Syst.,	
 88:	
 59-67.	
 	
 ②	
 総説・著書	
 
	
 	
 	
 なし	
 
	
 
③	
 学会発表	
 国際学会	
 1. Kurabayashi,	
 A.,	
 Matsui,	
 M.,	
 Daicus,	
 M.B.,	
 ong,	
 H.-S.,	
 Ahmad,	
 N.,	
 Ahmad,	
 S.,	
 Kuramoto,	
 M.,	
 Hamidy,A.,	
 and	
 Sumida,	
 M.	
 “From	 Antarctica	 or	
 Asia?	
 New	
 colonization	
 scenario	
 for	
 Australian‐New	
 Guinean	 narrow	 mouth	 toads	 suggested	
 from	 the	
 findings	
 on	
 a	
 mysterious	
 genus	 Gastrophrynoides”	
 
2012	
 7th	
 World	 Congress	 of	
 Herpetlogy	
 (August	
 8-14	 2012,	
 Vancouver,	 Canada)	 	
 2. Kakehashi,	
 R.,	
 Kurabayashi,	
 A.,	
 Oumi,	
 S.,	
 Katsuren,	
 S.,	
 Hoso,	
 M.,	
 and	
 
Sumida,	
 M.	
 “Complete	 mitochondrial	 sequences	
 of	
 three	 Japanese	
 Babina	
 66

(Ranidae,	 Anura)	
 species	 and	
 their	 phylogenetic	
 position	
 in	
 Ranidae”	
 
2012	
 7th	
 World	 Congress	 of	
 Herpetlogy	
 (August	
 8-14	 2012,	
 Vancouver,	 Canada)	
 	
 3. Komaki,	  S.,	
  Kurabayashi,	  A.,	
  Islam,	  M.M.,	  Tojo,	  K.,	
  and	
  Sumida,	  M.	
 “Distributional	
 change	 and	
 epidemic	
 introgression	
 in	
 overlapping	 areas	 of	
 Japanese	 pond	
 frog	
 species	 over	 30	
 years”2012	
 7th	
 World	 Congress	 of	
 Herpetlogy	
 (August	
 8-14	 2012,	
 Vancouver,	
 Canada)	 	
 4. Sumida,	
 M.,	
 N.	
 Satou,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 T.	
 Igawa,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 K.	
 Ukena,	 S.	
 Oumi,	
 S.	
 Katsuren,	
 and	
 T.	
 Fujii	 “Artificial	
 and	
 natural	 breeding	
 of	
 
the	
 endangered	 frog	
 species	
 Odorrana	 ishikawae	
 and	
 Odorrana	
 splendida,	
 analysis	 of	 genetic	
 diversity,	
 and	
 usage	 as	 resource	 materials:	
 Case	
 study	
 of	
 fauna	 conservation	
 in	
 Japan”	
 7th	 World	 Congress	 of	
 Herpetology	 (August	 11,	
 2012,	
 University	
 of	
 British	
 Columbia,	
 Vancouver,	
 Canada)	
 
	
 
国内学会	
 
1. 倉林敦・掛橋竜祐・田澤一朗・住田正幸（広島大・両生類研）・原本悦和、
大嶋友美、伊藤弓弦（産総研・幹細胞）「次世代モデル動物ネッタイツメガ
エルとその輸送法の改善について」日本爬虫両棲類学会	
 第51回記念大会（11月10-11日、2012年、豊田市、愛知県）	
 	
 2. 住田正幸・井川武・Islam	
 M.	
 M.・新谷望・掛橋竜祐・菅原弘貴・倉林敦・
大海昌平・勝連盛輝・田戸美雪・藤井保「中央琉球産絶滅危惧両生類 5 種の遺伝的分化と飼育下繁殖」日本動物学会第 83 回大会（2012 年 9 月 15 日、大阪大学、豊中）	
 	
 3. 小巻翔平・倉林敦・イスラム	 モハメド	 マフィズル・東城幸治・住田正幸「日本産トノサマガエル種群の分布重複域における浸透交雑と30年間で生じた分布変化」日本動物学会第83回大会（2012年9月15日、大阪大学、豊中）	
 	
 4. 住田正幸・井川武・イスラム	 モハメド	 マフィズル・新谷望・掛橋竜祐・
菅原弘貴・西谷琢磨・倉林敦・大海昌平・勝連盛輝・田戸美雪・藤井保	
 「南西諸島の絶滅危惧両生類における遺伝的分化と飼育下繁殖」日本爬虫両棲類
学会第 51 回大会（2012 年 11 月 10 日、愛知学泉大学、豊田）	
 	
 ④	
 科研費等の受け入れ状況	
 1.	
 日本学術振興会科学研究費補助金・若手研究（B）2012 年	
  130 万円（研
究代表）	
 
	
 
	
 	
 	
 2.日本学術振興会科学研究費補助金・基盤研究（B）2012 年	
  30 万円（分担）	
 
	
 
	
 

67

特任助教・竹林公子	  (Kimiko	 Takebayashi-Suzuki)	
 
	
 
研究内容	
 
アフリカツメガエル初期発生過程における神経誘導保証機構の解析	
 The	
 forkhead	 transcription	
 factor	
 FoxB1	
 mediates	
 body	
 axis	
 coordination	 and	
 developmental	
 canalization	
 during	 early	
 Xenopus	 embryogenesis.	
 	
 
	
 
[目的]	
 
	
  生物は遺伝的・環境的変化にうまく適応して生息圏を拡大している。両生類の胚は羊膜や卵殻を持たず様々な影響を受けやすいにも関わらず、正常に発生することができる。これは、両生類が遺伝的・環境的変化に適応する仕組み、
すなわち発生生物学者 C.H.Waddington により提唱されたキャナリゼーションを発達させてきたことを示唆する。初期胚は様々な遺伝的・環境的変化にさらされながらも、発生過程で背腹と前後の軸が形成され、初めて胚の３次元座標が精確に決まり、基本的な体の設計図（ボディープラン）が確立される。背腹軸は腹側化因子 BMP によって、前後軸は後方化因子 Wnt、FGF やレチノイン酸によって、それぞれ決定されている。従来から、背腹軸と頭尾軸は互いに調和しながら形成されると考えられているが、体軸形成の調和に働く遺伝子の同定は進んでいなかった。近年になり、いくつかの知見が報告され始めたが、背腹軸と頭尾軸の個々の制御機構の理解が大幅に進んでいるのに比べ、背腹軸と頭尾軸の調和機構は、ほとんど未解明である。これまでに、私達の研究グループで同定した FoxB1 転写因子が、腹側化因子 BMP のシグナルを抑制して神経を誘導（背側化）し、後方化因子 Wnt・FGF のシグナルを活性化して胚を後方化することを明らかにしている(Takebayashi-Suzuki	
 et	
 al.,	 Dev.	 Biol.	
 2011)	
 。すなわち、FoxB1 は、胚の背腹軸と頭尾軸の形成を制御し、これらの軸形成システムを調和させてボディープランの成立に働く。	
 最近、FoxB1 転写因子が背腹軸と頭尾軸の調和だけでなく、神経誘導の保証機構にも重要な働きを示すことが分かった。本研究では、FoxB1 転写因子を中心に、背腹軸と頭尾軸の調和機構、および神経誘導の保証機構に関する分子メカニズ
ムを解析することを目的とする。	
 	
 [成果と考察]	
 	  昨年度までに、Oct-25 転写因子が腹側化因子 BMP のシグナルを抑制して神経形成を促進すること、および Oct-25 転写因子の下流遺伝子として同定した FoxB1
転写因子が背腹・前後軸の両方を制御してボディープランの成立に働くことを明らかにした。しかしながら、FoxB1 の単独機能欠損胚では、前方構造が拡大し後方形成が阻害されて前後軸パターン形成は影響を受けたが、背側組織である神経の誘導は、ほぼ正常で背腹軸形成にほとんど影響がなかった。そこで FoxB1と、その上流で働く Oct-25 の両方を同時に機能欠損させると、神経誘導が著しく低下した。また、Oct-25 による神経形成の促進作用は、FoxB1	
 MO 注入胚で部68

分的に抑制されることから、Oct-25 転写因子は FoxB1 を介した経路を使って神経を誘導していることがわかった。したがって、Oct-25 と FoxB1 は外胚葉中でfeed-forward	 loop	
 ネットワークを形成しており、Oct-25 の働きが低下してもFoxB1 が機能すれば、ある程度、正常に神経が誘導されるシステムが存在すると考えられた。神経誘導には、外胚葉を裏打ちする中胚葉からのシグナルも重要である。そこで、外胚葉と裏打ちする中胚葉との組織間相互作用を弱めるため、
神経外胚葉の一部を切り出して培養すると、FoxB1 機能阻害胚では神経誘導が著しく低下するが、FoxB1 が存在すると神経は正常レベルで誘導されていた。つまり、外胚葉に発現する FoxB1 と中胚葉との間にも、協調的な神経促進作用が存在することが確認できた。中胚葉には複数の神経誘導因子（noggin,	
 chordin,	
 follistatin,	
 cerberus 等）が発現して外胚葉との組織間相互作用に関与すると考えられている。現在、中胚葉に発現する神経誘導因子の候補対象を拡げてFoxB1 と協調的な神経促進作用に働く中胚葉からのシグナルを同定するため、詳細な解析を進めている。以上の結果から、FoxB1 は背腹軸と頭尾軸の調和に働くだけでなく、様々な遺伝的・環境的変化に初期胚がさらされても神経が誘導されるように保証する機構として、正常な発生を促していると考えられた。	
 	
  私達の研究グループでは、FoxB1 転写因子以外にも体軸形成の調和機構に関わる因子として、Biz	
 (BMP	
 inhibitory	
 zinc-finger)遺伝子を機能スクリーニ
ングにより単離している（詳細については本研究部門・鈴木准教授の項目を参照）。Biz 遺伝子は腹側化因子 BMP のシグナルを抑制して神経誘導を引き起こす
こと、さらに Wnt シグナルと協調して頭尾軸形成を調節し、体軸形成の調和機構に関わることを明らかにした。発生過程においてボディープランが確立される時期に Biz 遺伝子が発現するかを調べたところ、アフリカツメガエル胚ではシグナルが非常に弱く確認が難しかった。そこで、ホールマウント	
 in	
 situ	 ハ
イブリダイゼーション法による遺伝子発現解析について優位性が明らかなネッ
タイツメガエル胚を用いて Biz 遺伝子の発現解析をおこなった。その結果、神経誘導がおこる原腸胚期に、背側外胚葉を中心に Biz 遺伝子の発現が確認され、神経胚期にわたって予定神経領域に発現が続くことが明らかになった。したがって、Biz 遺伝子は、実際の体軸形成期に神経領域に発現しており、背腹軸と頭尾軸の調和に働く可能性がさらに強まった。	
 	
 [将来の展望]	 	  FoxB1 転写因子が、背腹軸と頭尾軸の調和機構だけでなく、神経誘導の保証機構にも重要であることが明らかになりつつあるが、FoxB1 機能欠損マウス胚でも神経形成に異常が認められることから(Labosky	 et	
 al.,	 Development,	
 1997,	
 他数編)、動物種間で保存された神経誘導の保証機構が存在する可能性が考えられる。今後は、外胚葉に発現する FoxB1 と、中胚葉由来神経誘導因子との協調作
用（組織間相互作用に基づく保証機構）、および、私たちが既に同定している新規 Oct-25 下流因子と Oct-25/FoxB1	
 feed-forward	 loop ネットワークとの協調作用（外胚葉内の保証機構）を詳細に調べる。さらに、Biz 遺伝子も、FoxB1 転69写因子と同様に体軸形成の調和に関与するので、FoxB1 と Biz の機能的な関連や役割分担についても明らかにしたい。また、本年度確立したネッタイツメガエ
ル胚のホールマウント	
 in	
 situ	 ハイブリダイゼーション法を活用し、アフリカ
ツメガエルとネッタイツメガエル胚の両方の種を用いて、未解析の Oct-25 転写因子下流遺伝子の発現についても解析をおこなう予定である。これらの研究か
ら、神経誘導の保証機構、および頭尾軸と背腹軸の調和機構の体系的な理解が可能になると考えている。	
 
	
 
研究業績	
 
①原著論文	 	  該当なし	 	
 ②総説・著書	 	  該当なし	 	
 ③学会発表	 	  国内学会	 1．Kimiko	
 Takebayashi-Suzuki,	
 Konishi	
 H.	
 and	
 Atsushi	 Suzuki	 	 “The	 forkhead	 transcription	
 factor	
 FoxB1	
 mediates	
 body	
 axis	
 coordination	 and	
 developmental	
 canalization	
 during	 early	
 Xenopus	 embryogenesis.”	 	 	
 第 45 回	 日本発生生物学会	
 第 64 回日本細胞生物学会	
 合同年会	 (2012 年 5 月
31 日、神戸）	
 	
 2．竹林公子、鈴木	
  厚	
 
「The	
 forkhead	 transcription	
 factor	
 FoxB1	
 mediates	
 body	
 axis	
 coordination	 and	
 developmental	
 canalization	
 during	 early	
 Xenopus	 embryogenesis.	
 	
 FoxB1転写因子はツメガエル初期発生過程で神経誘導を保証している」	
 	 	
 第 35 回	 日本分子生物学会	
 (2012 年 12 月 12 日、福岡）	
 
	
 
3.	
 鈴木	
  厚、竹林公子	
 “体軸パターン形成の統合的理解に向けて”	
 細胞のかたちと機能プロジェクト研究センター・成果発表会	
 (2013 年 3 月 26 日、
東広島)	
 
	
 
	
  国際学会	 1．Takebayashi-Suzuki,	
 K.,	
 Konishi,	
 H..	
 and	
 Suzuki,	
 A.	
 
“The	
 forkhead	 transcription	
 factor	
 FoxB1	
 mediates	
 body	
 axis	
 coordination	 and	
 developmental	
 canalization	
 during	 early	
 Xenopus	 embryogenesis”	
 BSCB-BSDB-JSDB	
 2012	 (2012 年 4 月 17 日、イギリス)	
 
	
 

70

2．Takebayashi-Suzuki,	
 K.,	
 Konishi,	
 H.	
 and	
 Suzuki,	
 A.	
 
“The	
 forkhead	 transcription	
 factor	
 FoxB1	
 mediates	
 body	
 axis	
 coordination	 and	
 developmental	
 canalization	
 during	 early	
 Xenopus	 embryogenesis”	
 14th	
 International	
 Xenopus	 Conference	 (2012 年 9 月 11 日、フランス)	
 	
 
④科研費等の受け入れ状況	 	  該当なし	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 

71

特任助教・井川	
 武（Takeshi	
 Igawa）	
 
	
 
研究内容	
 
１.	
 絶滅危惧種イボイモリにおける遺伝的集団構造の解明	
 Population	
 structure	
 of	
 an	
 endangered	 newt,	
 Echinotriton	
 andersoni	
 
	
 
[目的]	
 
	
  イボイモリ Echiinotriton	
 andersoni は、奄美大島、請島、徳之島、沖縄島、
瀬底島、渡嘉敷島の 6 島に生息する西南諸島固有種である。しかしながら、他の絶滅危惧種と同様に、生息地の消失や、環境改変、ジャワマングースによる食害により個体数が激減しており、本種は IUCN レッドリストにおける絶滅危惧
IB 類に指定されている。本種の包括的かつ、効率的な保全には種内の遺伝的多様性に関する知見が不可欠である。そこで本研究では種内の遺伝的構造と、集団内の遺伝的多様性を評価することを目的として、多型性の高い分子マーカーであり、保全遺伝学の分野で広く用いられているマイクロサテライトマーカーに基づいて集団遺伝学的解析を行った。	
 	
 [材料・方法]	
 	  奄美大島産 31 個体、請島産 3 個体、徳之島産 29 個体、沖縄島産 95 個体、瀬底島産 3 個体、渡嘉敷島産 13 個体からゲノム DNA を抽出し、本種におけるマイクロサテライト遺伝子座	
 (Sugawara	
 et	
 al.,	 2011)のうち、9 座位について遺伝
子型を決定した。その後、個体ごとの遺伝的要素をハーディー＝ワインベルグ
平衡を指標として検出する方法を実装したソフトウェア、Structure	 (Pritchard	
 et	
 al.,	 2000)、および Geneland	
 (Guillot	
 et	
 al.,	 2005)を用いて集団構造を推定するとともに、それぞれの集団内の遺伝的多様性について、ヘテロ接合度、
有効アリル数などの基礎的データを求めた。	
 	
 [結果・考察・成果]	
 	
  集団構造解析の結果、イボイモリは、奄美系統（奄美大島全域＋請島）、徳之島系統（徳之島全域）、沖縄系統（沖縄島全域＋瀬底島＋渡嘉敷島）の 3 つの遺伝的クラスタに分けられた。さらに、それぞれのクラスタ内で詳細に解析を行ったところ、請島、瀬底島、渡嘉敷島などの小さな島嶼も遺伝的に分化しており、奄美大島、徳之島、沖縄島内にも遺伝的に異なる集団が検出された。
特に沖縄島では最大で 8 つの分集団に分けることができ、北部地域では複数の集団が狭い地域に混在する独特の集団構造が観察された。これらの知見は、ミトコンドリア遺伝子による解析（Honda	
 et	
 al.,	 2012）と基本的には矛盾していないことから、主な集団構造は大過去に生じた分断イベントによって形成され、一部の集団ではその後も、ある程度の生殖的隔離が持続していると考えられた。また、各集団内の遺伝的多様性を比較したところ、島の面積とある程度相関が見られた。	
 	
 ２.	
 オットンガエル及び、ホルストガエルにおける新規マイクロサテライトマ
ーカーの開発	 72

Development	
 and	
 characterization	
 of	
 new	
 microsatellite	 loci	
 in	
 the	
 Otton	 frog	
 (Babina	
 subaspera)	
 and	
 cross-amplification	
 in	
 a	
 congeneric	 species,	 Holst's	 frog	 (B.	
 holsti)	
 
	
 
[目的]	
 
オットンガエル	 (Babina	
 subaspera)と、ホルストガエル	
 (B.	
 holsti)は、そ
れぞれ奄美大島及び、沖縄島と渡嘉敷島に固有に生息する姉妹種であり、鹿児島県及び、沖縄県における天然記念物である。両種は元々島嶼という狭小な生息域であるのに加えて、森林の伐採による生息域の減少、マングースによる捕食などにより絶滅が危惧されており、IUCN レッドリストにおける絶滅危惧 B1 類に位置付けられている。このような絶滅危惧種の効率的な保全には分子マーカーによる集団構造及び、遺伝的多様性の解明が必要であり、すでにオットンガ
エルについては、Iwai	
 et	
 al.	
 (2011)により 8 つのマイクロサテライトマーカ
ーが単離されている。しかしながら、個体識別、親子鑑定といったより詳細な分析にはさらに多くの遺伝子座が必要である。また、これらの遺伝子座のホル
ストガエルでの有効性は確認されていない。そこで、両種における新規マイク
ロサテライトマーカーの開発を目的として、既存のマイクロサテライトマーカ
ーのホルストガエルにおける増幅及び多型性の有無を確認すると同時に、新規マイクロサテライト遺伝子座の単離を行った。	
 	
 [材料・方法]	
 	  Iwai	 et	
 al.(2011)	
 の方法に従って、オットンガエルより得られたマイクロ
サ テ ラ イ ト 遺 伝 子 座 の う ち 、 16 の 新 規 遺 伝 子 座 に つ い て MSATCOMMANDER	 (Faircloth	 2008)	
 を用いてプライマーを設計した。その後、それぞれ奄美大島、沖縄島内の 1 集団に由来するオットンガエル及び、ホルストガエル 10 個体において、これらの遺伝子座の増幅及び、多型性を確認した。	
 	
 [成果・考察]	
 	  既知の 8 遺伝子座はすべてホルストガエルにおいて利用可能であり、オット
ンガエルと同等の十分な多型性を示した。また、新規にプライマーを設計した
16 遺伝子座のうち、オットンガエルにおいて 8 遺伝子座、ホルストガエルにおいて 4 遺伝子座が多型性を示した。最終的にオットンガエル及び、ホルストガ
エルにおいて利用可能な遺伝子座は、既知の 8 遺伝子座と合計して、それぞれ
16 遺伝子座及び、12 遺伝子座となった。これらの遺伝子座については、集団遺伝学的解析および、個体識別に有用なマイクロサテライトマーカーとしてConservation	
 Genetics	
 Resources 誌に掲載予定である。	
 
	
 
	
 
３.	
 飼育下における温度条件と遺伝的要因がアマミイシカワガエルの生活力に与える影響	
 Influence	
 of	
 temperature	
 condition	
 and	
 genetic	
 factors	
 on	
 survival	
 rates	 of	
 captive	 breeding	
 populations	 of	
 Odorrana	
 splendida	
 
	
 

73

[目的]	
 遺伝的多様性と生活力の相関は様々な分類群で報告されており、特に絶滅危惧種においては、個体数減少との負のフィードバックにより深刻な影響を及ぼすことが知られている。また、近年、地球温暖化により両生類の生息環境も気温が上昇傾向にあり、生存率における影響が懸念されている。アマミイシカワ
ガエルは奄美大島の固有種で、IUCN レッドリストの絶滅危惧 IB 類に指定される
絶滅危惧種である。我々は既に本種の人工交配と継代飼育に成功しており(Sumida	 et	
 al.,	 2011)、さらに野外個体群における遺伝的集団構造も明らかにしている	
 (Igawa	
 et	
 al.,	 2013)。そこで、本研究では、実験室内における均一な環境的・生理的条件下において、個体生存率に対する飼育温度及び、遺伝的要因の影響を検証することを目的として、人工交配及び、飼育試験を行い子孫の生存率を検証した。	
 	 [材料・方法]	
 	  奄美大島・福元地区で採集されたアマミイシカワガエルの単一のペアの子で、実験室にて成熟させたメス 3 個体について、それぞれの卵を 3 つに分け、次の血縁度の異なる 3 種類のオスの精子と交配させた。①同じペアの子でメスと兄妹関係にあるオス（兄妹交配＝近親交配）、②同じ福元地区で採集された別ペアの子でメスとは兄妹関係にはないオス（非兄妹交配）、③福元地区の個体群とは遺伝的に異なる奄美大島・西古見地区で採集されたオス（異系交配）。これらの受精卵をさらに 18℃、20℃、22℃の 3 つの温度条件で変態するまで飼育し、各発生段階における生存率を観察した。	
 	 [成果・考察]	
 	
  その結果、温度条件における生存率は 18℃が最も高く、20℃では劣り、22℃
では、孵化段階でほぼ全個体が死亡した。遺伝的影響については、18℃では近親交配となる交配が最も生存率が低く、マイクロサテライト遺伝子座における子孫の予測ヘテロ接合度との間に正の相関がみられた。	
 
	
 
研究業績	
 
①原著論文	
 1. Igawa,	
 T.,	
 Oumi,	
 S.,	
 Katsuren,	
 S.,	
 and	
 Sumida,	
 M.	
 (2013).	
 Population	 structure	
 and	
 landscape	 genetics	
 of	
 two	
 endangered	 frog	
 species	 of	
 genus	 Odorrana:	
 different	 scenarios	
 on	
 two	
 islands.	
 Heredity,	
 110,	
 46–56.	
 	
 2. Kim,	
 H.	
 L.,	
 Iwase,	
 M.,	
 Igawa,	
 T.,	
 Nishioka,	
 T.,	
 Kaneko,	
 S.,	
 Katsura,	
 Y.,	
 Takahata,	
 N.,	
 and	
 Satta,	
 Y.	
 (2012).	
 Genomic	
 structure	
 and	
 evolution	
 of	
 multigene	
 families:	
 “flowers”	
 on	
 the	
 human	 genome.	
 International	
 journal	
 of	
 evolutionary	 biology,	 2012,	
 917678.	
 	
 3. Sugawara,	
 H.,	
 Igawa,	
 T.,	
 Yokogawa,	
 M.,	
 Okuda,	
 M.,	
 Oumi,	
 S.,	
 Katsuren,	
 S.,	
 Kaneko,	
 S.,	
 Umino,	
 T.,	
 Isagi,	
 Y.,	
 and	
 Sumida,	
 M.	
 (2012).	
 Isolation	
 and	
 characterization	
 of	
 ten	
 microsatellite	 loci	 of	
 endangered	
 Anderson’s	
 74

crocodile	 newt,	
 Echinotriton	
 andersoni.	
 Conservation	
 Genetics	
 Resources,	
 4(3),	
 595–598.	
 	
 4. Kakehashi,	
 R.,	
 T.	
 Igawa,	
 N.	
 Iwai,	
 E.	
 Shoda-Kagaya,	
 and	
 M.	
 Sumida	 (2013)	
 Development	
 and	
 characterization	
 of	
 new	
 microsatellite	 loci	
 in	
 the	
 Otton	 frog	
 (Babina	
 subaspera)	
 and	
 cross-amplification	
 in	
 a	
 congeneric	 species,	 Holst’s	 frog	 (B.	
 holsti).	
 Conser.	
 Genet.	
 Res.,	
 5:	
 in	 press.	
 	 ②	
 総説・著書	 	 	
 該当なし	 	
 ③	 学会発表	
 	
 国際学会	
 1. Sumida,	
 M.,	
 Satou,	
 N.,	
 Islam,	 MM.,	
 Igawa,	
 T.,	
 Kurabayashi,	
 A.,	
 Ukena,	
 K.,	
 Oumi,	
 S.,	
 Katsuren,	
 S.,	
 and	
 Fujii,	
 T.	
 “Artificial	
 and	
 natural	 breeding	
 of	
 the	
 endangered	 frog	
 species	
 Odorrana	 ishikawae	
 and	
 Odorrana	 splendida,	  analysis	  of	  genetic	  diversity,	  and	
  usage	  as	
  resource	 materials:	
 Case	 study	 of	
 fauna	 conservation	
 in	
 Japan”	
 World	 Congress	
 of	
 Herpetology	
 (WCH)	
 2012	 （2012 年 8 月,	
 バンクーバー,	  カナダ）	
 	
 	
 国内学会	
 1.	
 井川武,	 菅原弘貴,	
 本多正尚,	
 富永篤,	
 大海昌平,	
 勝連盛輝,	
 太田英利,	
 松井正文,	
 住田正幸	
 「マイクロサテライトマーカーを用いた絶滅危惧種および天然記念物イボイモリの遺伝的集団構造の解明」日本遺伝学会	
 第 84回大会（2012 年 9 月,	
 福岡）	
 
	
 
2.	
 住田正幸,	
 井川武,	 Islam	 MM,	
 新谷望,	
 掛橋竜祐,	
 菅原弘貴,	
 倉林敦,	
 大海昌平,	 勝連盛輝,	
 田戸美雪,	
 藤井保	
 「西南諸島の絶滅危惧両生類における飼育下繁殖と遺伝的分化」	
 日本爬虫両棲類学会	
 第 51 回大会（2012 年
11 月,	
 愛知）	
 
	
 
3.	
 新谷望,	
 井川武,	
 住田正幸	
 「アマミイシカワガエルの飼育下における温度条件と遺伝的要因が個体生存率に与える影響」	
  日本爬虫両生類学会	
 第51 回大会（2012 年 11 月,	
 愛知）	
 
	
 
4.	
 徳増大輔,	
 井川武,	 Min	 Mi-Sook,	
 住田正幸	
 「ウシガエルはどこから来て,	
 なぜ駆逐されないのか？：侵入成功と個体群存続における遺伝的要因の調
査」	
 
	
 
5.	
 住田正幸・井川武・Islam	
 M.	
 M.・新谷望・掛橋竜祐・菅原弘貴・倉林敦・
大海昌平・勝連盛輝・田戸美雪・藤井保「中央琉球産絶滅危惧両生類 5 種の遺伝的分化と飼育下繁殖」日本動物学会第 83 回大会（2012 年 9 月 15 日、大阪大学、豊中）	
 

75

	
 
④	
 科研費等の受け入れ状況	
 	
 1.	
 科学研究費補助金	
  若手研究(B)	
 「西南諸島に産する両生類絶滅危惧種の遺伝的多様性の解明と飼育繁殖における遺伝的管理」	
  研究課題番号:	
 23710282	  代表者:	
 井川武	
  1300 千円	
 
	
 
	
 	
 	
 2.科学研究費補助金	
 基盤研究（B）2012 年	
  20 万円（分担）	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 

76

Assistant	 Professor・Islam	
 Mohammed	
 Mafizul	 	
 Title:	
 1. Genetic	
 divergence	
 and	
 postmating	 isolation	
 between	 endangered	
 Holst`s	
 
frog	
 and	
 Otton	 frog	
 from	 the	
 Ryukyu	
 Archipelago,	
 Japan,	
 elucidated	
 by	
 allozyme	
 analyses,	 crossing	 experiments	
 and	
 cytological	
 observations.	
 	
 Summary:	 	 I	 have	
 conducted	
 a	 comparison	
 between	
 two	
 allopatric	
 endangered	 species	 of	  genus	  Babina	  namely	
  B.	
  holsti	  and	
  B.	
  subaspera	  from	  the	
  Ryukyu	 Archipelago	 to	
 elucidate	 their	 genetic	
 divergence	
 and	
 postmating	 isolation.	
 I	
 performed	
 allozyme	
 electrophoresis	
 at	
 several	 loci,	
 crossing	 experiments	 using	
  both	  male	  and	
  female	  of	  both	  frogs	  and	
  spermatogenesis	  and	
 histological	
 observation	
 of	
 testes	 of	
 hybrids	
 and	
 their	 controls.	
 They	
 were	 found	 to	
 be	
 significantly	
 diverged	
 based	 on	 allozyme	
 data,	
 In	
 contrast,	
 they	
 were	 not	
 reproductively	
 isolated	
 based	 on	 the	
 developmental	
 capacity	
 of	
 their	 reciprocal	
 hybrids	
 compared	
 with	 the	
 controls.	
 Not	
 only	 the	
 hybrids	
 were	  viable	  but	
  also	  their	  sperm	  shape	  indicated	  their	  fertility.	
 Spermatogenesis	 and	
 histological	
 observation	
 of	
 the	
 testes	 from	 reciprocal	
 hybrids	
 confirmed	
 that	
 there	 was	 no	
 reproductive	 isolation.	
 Thus	
 there	 exist	
  morphological	
  and	
  genetic	  divergences	  between	  them,	  but	
  no	
 reproductive	 isolation	
 to	
 support	
 their	 specific	
 entity	 based	 on	 biological	
 species	
 concept.	
 	
 
	
 	
 
Materials	
 and	
 Methods:	 	 Allozyme	
 electrophoresis:	
 A	
 total	 of	 12	
 individuals	
 of	
 both	 male	 and	
 female	 individuals	
 of	
 the	
 B.	
 holsti,	 that	 of	
 10	
 individuals	
 of	
 B.	
 subaspera,	
 7	
 individuals	
  of	
  B.	
  okinavana	  were	  used	  for	
  allozyme	  study,	  whereas	  2	
 individuals	
 of	
 each	
 Odorrana	
 splendida,	
 O.	
 ishikawae,	
 O.	
 amamiensis,	
 O.	
 narina,	
 O.	
 supranarina,	
 and	
 O.	
 otsunomiyaorum	 were	
 used	
 for	
 comparison	
 and	
 
Rana	
 okinavana	 as	
 outgroup.	
 Muscle	 sample	 were	 collected	
 from	
 thigh	 region	
 
of	
 the	
 frogs	 immediately	 after	 sacrificing	 them	 and	
 same	
 time	
 blood	 samples	 were	
 also	 collected	
 and	
 stored	 in	
 freezer.	
 Sixteen	 enzymes	
 and	
 two	
 blood	 proteins	
 were	
 analyzed	
 by	
 Horizontal	
 starch	 gel	
 electrophoresis	 that	 was	
 conducted	
 based	 on	 the	 technique	
 described	
 by	
 Nishioka	
 et	
 al.	
 1980	 and	
 1992	
 with	
 some	 modification.	
 The	
 detection	
 of	
 the	
 enzyme	 was	
 carried	
 out	
 after	 staining	
 of	
 the	
 gel	
 performed	
 by	
 agar	 overlay	 method	
 outline	
 by	
 Harris	 and	
 Hopkins,	
 1976.	
 The	
 detection	
 of	
 blood	 proteins	
 were	 made	
 by	
 amino-black	 staining.	
 Analyses	
 were	
 done	
 by	
 using	 the	
 Phylip	
 version	
 3.65	 and	
 POPGENE	 version	 1.32	 computer	
 software.	
 77

Crossing	 experiments:	
 A	
 good	
 number	 of	
 mature	 male	 and	
 female	 individuals	
 were	
 used	
 for	
 crossing	 experiments.	
 Females	 were	
 injected	
 with	 Lithobates	 catesbeianus	
 pituitary	 gland	 (PG),	
 where	 sperm	 suspension	
 was	
 made	
 after	 crushing	  the	
  testes	  during	  fertilization.	
  After	  ovulation	
  eggs	  were	 stripped	 from	 female,	
 placed	 on	 glass	 slide	 and	
 fertilized	
 with	 the	
 sperm	 suspension.	
  The	
  fertilized	  eggs	  of	  the	
  controls	  and	
  hybrids	  and	
  the	
 resultant	 embryos	 as	
 well	 as	
 tadepoles	
 are	
 reared	 is	 glass	 petridishes	
 in	
 
a	
 controlled	
 temperature	
 of	
 22	
 in	
 incubator.	
 The	
 tadpoles	
 were	
 feed	
 with	
 boiled	 spinach	
 and	
 the	
 metamorphose	
 frogs	 were	
 feed	
 with	 cricket.	
 Cytological	
  observations:	
  The	
  cytological	
  observation	
  includes	
 histological	
 observations	 of	
 tastes	 of	
 mature	 control	 and	
 hybrids	
 and	
 the	
 
spermatogenesis	
 observation	
 in	
 1st	
 meiosis.	
 Histological	
 observations:	
 Testes	 of	
 mature	 male	
 frogs	 of	 all	
 hybrids	
 and	
 their	 controls	 were	 collected	
 from	 the	
 live	
 frog	
 and	
 were	
 fixed	 in	
 Novashin	 fixative.	
  After	  subsequent	  tissue	  processing,	  embedding,	
  and	
 microsectioning,	  slides	  were	  prepared	  and	
  slides	  were	  stained	  with	 Heidenhain’s	
 iron	 hematoxylin	
 for	
 histological	
 observation	
 and	
 mounted	
 with	 Canada	 balsam.	
 The	
 prepared	
 slides	 were	
 observed	
 under	 optical	 microscope	
 and	
 necessary	 photos	
 were	
 taken	 using	 digital	 camera.	
 Spermatogenesis	
 observations:	
 Meiotic	
 chromosomes	
 were	 prepared	
 according	
 
to	
 the	
 technique	
 described	
 by	
 Schmid	 et	
 al.	
 (1979)	
 with	
 some	 modification.	
 The	
 chromosomes	
 were	 stained	 with	 a	
 1.2%	
 Geimsa	 solution	
 for	
 5	
 minutes.	
 Chromosome	  analyses	  were	  carried	
  out	
  using	  only	  diploid	  cells	  at	
  the	 diakinesis	 and	
 metaphase	
 of	
 the	
 first	 reduction	
 division,	
 when	
 bivalent	
 and	
 univalent	 chromosomes	
 could	 be	 easily	 distinguished	
 from	 each	
 other.	
 	
 
	
 	
 
Findings:	
 	
 
From	
 the	
 allozyme	
 analyses	
 it	
 was	
 possible	
 to	
 find	 several	 diagnostic	 alleles	
 between	
 B.	
 holsti	 and	
 B.	
 subaspera.	
 Also	
 they	 showed	 remarkable	 genetic	  distance	  to	
  support	  their	  specific	
  entity.	
  But	
  little	  bit	
 contradictory	
  results	  were	  found	  in	
  crossing	  experiments.	
  During	  the	 crossing	 experiments	
 it	
 was	
 established	
 that	
 there	 was	 no	
 reproductive	 isolation	
 exist	 between	 this	 two	
 species.	
 After	 preparation	  slides	 of	
 meiotic	
 chromosomes,	
 spermatocytes	
 at	
 the	
 first	 meiosis	 and	
 chromosome	
 complements	
 in	
 the	
 hybrids	
 indicated	
 that	
 they	
 were	
 almost	 similar	 with	 the	
 control	 offspring	 thus	
 there	 were	 no	
 abnormalities	
 in	
 the	
 hybrids.	
 Also	
 histological	
 observation	
 of	
 testes	
 indicated	
 presence	
 of	
 normal	 sperm	 which	 indicates	 their	 fertility.	
 	
 
	
 

78

２.Postmating	 isolation	
 among	 several	 brown	 frogs	 from	
 Honshu	
 and	
 Ryukyu	 of	  Japan,	  and	  Mongolia	  by	  crossing	  experiments	  and	
  cytological	
 observations.	
 	
 Summary:	 	 I	 have	
 conducted	
 crossing	 experiments	
 between	 several	 brown	 frogs	 namely	 Rana	  japonica	  from	  mainland	  Japan,	  Rana	  ulma	  from	  Amamioshima	  Island	
 (previously	
 known	 as	  Rana	 okinava)	
 and	
  Rana	 amurensis	
 from	 Mongolia	 to	
 elucidate	  their	  postmating	  isolation.	
  It	  was	
  found	  that	  although	 taxonomically	 they	 are	
  diverged	
 well	 but	
 they	
 produce	  viable	 hybrids.	
 Compare	 to	 the	
 control	 the	
 developmental	
 capacity	
 of	
 hybrids	
 were	
 also	 well.	
 But	
 after	 studying	 the	
 spermatogenesis	 and	
 histology	
 of	
 their	 testes,	
 I	
 
have	
  found	  extreme	  abnormalities	
  by	
  means	  of	  100%	  univalent	  in	
 spermatogenesis	
 and	
 irregular	 shaped	 testes	 in	
 histological	
 observations.	
 
Thus	
 it	
 was	
 concluded	 that	 even	
 this	
 three	 allopatric	
 brown	 frogs	 were	
 able	
 to	
 produce	 some	
 viable	 hybrids	
 they	 are	
 completely	 differentiated	
 by	 means	 of	
 reproductive	 isolation.	
 	 	
 Materials	
 and	
 Methods:	 	
 I	 have	
 conducted	
 the	
 crossing	 experiments	
 with	 the	
 similar	 method	 mentioned	 in	
 previous	
 Babina	 crossing	 experiment	
 but	
 it	
 was	
 important	 to	
 maintain	 suitable	
 temperature	
 for	
 each	
 hybrid	
 and	
 their	 controls	
 as	
 all	
 three	 mention	 species	 has	
 different	 temperature	 preferences.	
 For	
 spermatogenesis	 and	
 Histological	
  observations	  I	  have	  also	  followed	
  the	
  same	  technique	  as	
 mentioned	
 in	
 previous	
 work.	
 	 	 	 Findings:	 	
 Crossing	 experiments	
 indicated	
 the	
 hybrids	
 between	
 R.	
 ulma	
 and	
 R.	
 japonica	
 was	
 more	
 viable	 compared	
 to	
 that	 of	
 R.	
 amurensis	
 and	
 R.	
 japonica	 although	
 
we	
 did	
 not	
 able	 to	
 get	
 hybrid	 between	
 R.	
 amurensis	
 and	
 R.	
 ulma.	
 But	
 after	 studying	 the	
 spermatogenesis	 and	
 histology	
 of	
 their	 testes	 I	 have	 found	 strange	  result.	
  In	
  case	  of	  spermatocytes	
  at	
  1st	
  meiosis,	  extreme	 abnormalities	
 by	
 means	 of	
 100%	 or	
 very	 high	
 number	 of	
 univalent	
 were	 found	 which	 indicating	 their	 reproductive	 isolation.	
 	
 Histological	
 observations	 also	
  let	
  me	
  know	  the	
  presence	  of	  irregular	  shaped	  spermatocyte	
  which	 indicated	 their	 sterility.	
 Thus	 it	
 was	
 concluded	 that	 even	
 this	
 three	 allopatric	  brown	  frogs	
  were	  able	  to	
  produce	  some	  viable	  hybrids	
 reprotuvelily	 they	 are	
 isolated	
 from	 each	
 other	 as	
 confirmed	
 from	 the	
 cytological	
 observation	
 of	
 the	
 testes	 of	
 their	 hybrids.	
 	
 
	
 

79

３.Conservation	
 of	
 endemic	
 Amami	
 Tip-nosed	
 frog	 (Odorrana	 amamiensis)	
 from	
 Amamioshima	
 Island	 by	 artificial	
 breeding	
 and	
 subsequent	 rearing	
 in	
 the	
 
laboratory.	
 	
 Amami	
 tip-nosed	
 frog,	
 Odorrana	 amamiensis	
 is	
 one	
 of	
 the	
 endangered	 frog	
 species	 distributed	
 only	 in	
 Amamioshima	
 and	
 Tokunoshima	
 Islands	
 of	
 Ryukyu	 Archipelago.	
  In	
  Amamioshima	  Island	  the	
  species	  is	
  commonly	  found	  in	
 mountain	 streams	
 and	
 occasionally	 in	
 mountain	 paths	 in	
 night,	 but	
 is	
 rare	 in	  lowland.	
  This	  species	  share	  almost	  similar	  habitat	  with	  Odorrana	 splendida	
 another	 national	
 monument	
 from	 the	
 same	 island.	
 The	
 possible	
 reasons	
 for	
 population	
 degradation	 are	
 loss	 of	
 habitat,	 natural	 predator	
 etc.,	
 thus	 it	
 was	
 essential	 to	
 develop	 some	 suitable	 technique	
 of	
 artificial	
 breeding	
 in	
 the	
 laboratory	 to	
 conserve	 the	
 species.	
 It	
 was	
 possible	
 to	
 breed	 the	
 frogs	 in	
 the	
 laboratory	
 by	
 using	 typical	 artificial	
 breeding	 technique	 developed	
 in	
 our	
 laboratory	
 using	 Lithobates	 catesbeianus	
 PG.	
 Although	 they	
 were	
 found	 to	 be	
 bred	
 in	
 prolong	 breeding	 season,	
 from	 January	 to	
 May,	 it	
 was	
 difficult	 to	
 find	 ready	 to	
 breed	 female	 and	
 male.	
 In	
 this	
 species	
 a	
 
low	
 temperature	 of	
 18°C	 was	
 found	 preferable	
 for	
 their	 early	 development	
 
and	
 for	
 tadepoles.	
 Finally,	
 it	
 was	
 possible	
 get	
 many	
 offspring	 which	 finally	 metamorphosed	
 and	
 now	
 kept	
 in	
 our	
 laboratory.	
 	 	
 ４.First	 attempt	
 of	
 cryopreservation	
 of	
 sperm	 with	 Japanese	 brown	 frog	
 (Rana	
 japonica	
 )	
 and	
 conservation	
 of	
 two	
 endangered	 species	
 from	 Ryukyu	 Archipelago	
 by	
 cryopreservation	
 of	
 their	 sperm	 	 Summary:	 	
 Amphibian	 decline	
 is	
 a	
 common	 trend	 all	 over	
 the	
 world. 	
 Due	
 to	
 environmental	
 degradation,	
 global	 warming	
 and	
 other	 man	
 made	
 causes,	
 biodiversity	
 is	
 threatened	  in	
  all	
  over	  the	
  world	  and	
  frogs	  are	
  most	  prone	  to	
  this	 environmental	  degradation.	
  It	
  is	
  a	
  major	  concern	
  of	  all	
  naturalists	 especially	
 to	
 herpetologists	 to	
 find	
 some	 sustainable	 techniques	 of	
 anuran	 conservation.	
 Cryopreservation	
 is	
 one	
 of	
 the	
 techniques	
 that	 have	 already	
 been	
 applied	
 for	
 many	 higher	
 taxon	 animals	 also	
 for	
 some	 European	 and	
 African	  frogs.	
  So	
  far	
  our	
  knowledge,	  this	  is	  the	
  first	  attempt	  in	
 cryopreservation	
 of	
 any	
 Japanese	 anurans.	
 For	
 this	 study	 I	 have	
 considered	
 4	
 species	 such	 as	
 Japanese	 brown	 frog	
 Rana	
 japonica,	
 as	 a	 typical	
 Japanese	 frog;	 Amami	 Ishikawa	 frog	
 Odorrana	
 splendida,	
 as	
 an	
 endangered	 species	 and	
 national	  monuments	  and	
  Amami	  tip-nosed	  frog	  Odorrana	  amamienesis	  an	
 endangered	 species	
 from	 Amami	 and	
 Babina	 holsti,	 an	 endangered	 species	
 from	
 Okinawa	 islands.	
 For	
 assessment	
 of	
 success	 of	
 cryopreservation	
 technique,	
 

80

I	
 not	
 only	 depend	 on	
 motility	
 of	
 the	
 sperms	 but	
 also	
 confirm	
 their	 ability	
 of	
 fertilization	
 by	
 fertilizing	
 the	
 eggs.	
 Among	 them,	
 I	
 was	
 able	 to	
 get	
 fertilized	
 eggs	
 and	
 offspring	 in	
 case	 of	
 R.	
 japonica	 using	 24hrs	 frozen	
 sperm	 and	
 10	 days	
 frozen	 sperm.	
 In	
 case	 of	
 O.	
 splendida	
 and	
 O.	
 amamiensis	
 
I	
 was	
 able	 to	
 fertilize	
 egg	
 using	 24	
 hours	 frozen	 sperm	 although	 I	 have	 not	
 find	 good	
 eggs	
 from	 any	
 female	 B.	
 holsti	 to	
 confirm	 the	
 fertility	
 of	
 frozen	 sperm	 of	
 B.	
 holsti.	
 	 	 Materials	
 and	
 Methods:	 	
 Sperm	
 was	
 collected	
 from	 the	
 of	
 mature	 male	
 from	
 after	 dissecting	 the	
 frog	 and	
 bringing	
 out	
 the	
 testes	 and	
 minced	 the	 testes	
 with	
 L-15	
 media	 in	
 a	
 thin-walled	 eppendorf	
 tube	 to	
 obtain	
 a	
 suitable	
 concentration	
 of	
 sperm.	
 The	 sperm	 suspension	
 was	
 mixed	 with	 same	
 volume	 of	
 cryoprotectent.	
 Then	 it	
 was	
 mixed	 by	 inverting	 and	
 immediately	
 transferred	 into	 the	
 –80°C	 deep	
 freezer	
 within	
 a	
 Styrofoam	
 box.	 I	
 froze	 different	 series	 of	
 sperm	 from	
 the	
 
same	
 testes	 to	
 be	
 used	 as	
 24hrs	 frozen	 sperm	 and	 followed	
 by	
 7	
 days,	
 30	
 
days	
 and	
 1	
 year	
 frozen	 sperm.	
 For	 thawing	
 of	
 the	
 frozen	 sperm,	 it	
 was	
 done	
 by	
 hand	 for	
 30	
 seconds	
 and	
 mixed	 with	
 0.1	 MBS	
 solution	
 and	
 immediately	 used	 to	
 fertilize	
 the	
 eggs.	
 At	
 same	
 time,	
 motility	 of	
 sperms	 were	 checked	
 and	
 sperm	
 concentration	
 were	 counted.	
 After	 that	
 fertilized	
 eggs	
 were	
 kept	 in	
 incubator	
 in	
 controlled	
 temperature	
 and	
 their	 developmental	
 capacity	 were	
 observed	
 and	
 compared	
 with	 the	
 eggs	 that	
 were	
 fertilized	
 with	 fresh	 sperm	 	 Findings:	 	
 Frozen	 sperm	 was	
 found	 to	
 capable	
 to	
 fertilize	
 eggs	
 by	
 this	
 cryopreservation	 technique	
 in	
 case	 of	
 R.	
 japonica,	
 O.	
 splendida	
 and	
 O.	
 amamiensis.	
 In	
 case	
 of	
 R.	
 japonica,	
 a	
 maximum	 fertilization	
 rate	 above	
 30%	
 were	 found	 using	 24hrs	
  sperm	  and	
  some	  success	
  using	  10	
  days	  sperm.	
  In	  other	  frog	  case	 availability	 of	
 good	 quality	 eggs	
 were	 limitations	 to	
 perform	
 the	
 fertility	
 
test	
 of	
 sperm	 thus	 checked	
 and	
 confirm	
 sperm	 activity	
 only	 for	
 24hours	
 frozen	 sperm.	
 Sperm	 concentration	
 was	
 found	 stable	 and	
 some	 motility	
 up	
 
to	
 30	
 days	 sperm	 were	 recorded	 in	
 other	 endangered	 species.	
 	 	 Future	 research	 plan:	 Research	
 is	
 going	 on	  to	
 establish	
 the	
 sustainable	
 artificial	
 breeding	 technique	
 for	
 endangered	  Odorrana	 amamiensis	
 and	
 some	
 other	 endangered	 frogs	 followed	
 by	
 mass	
 production	
 of	
 their	 offspring	 with	
 an	
 aim	
 to	
 conserve	 these	
 endangered	 species	
 as	
 it	
 has	
 already	
 been	 developed	
 for	
 O.	
 splendida	
 
in	
 our	
 laboratory.	
 I	 am	 planning	
 to	
 make	 several	 trial	 of	
 cryopreservation	 in	
 next	
 breeding	 season	 using	 all	
 R.	
 japonica,	
 O.	
 splendida,	
 O.	
 amamiensis	
 

81

and	
 B.	
 holsti	 using	 all	 24	
 hours,	
 7	
 days,	
 30	
 days	 and	
 1	
 year	
 frozen	 sperm	 to	
 optimized	
 cryopreservation	
 technique	 of	
 their	 sperm	 and	
 for	
 this	
 purpose	 I	 am	 rearing	
 many	 mature	 males	 and	
 females	 of	
 these	 species.	
 	
 Research	
 Achievements:	 Original	 paper	 1.	
 Komaki,	
 S.,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 K.	
 Tojo,	
 and	 M.	
 Sumida	 (2012)	
 Distributional	
 change	 and	
 epidemic	
 introgression	
 in	
 overlapping	 areas	 of	 Japanese	 pond	
 frog	
 species	 over	 30	
 years.	
 Zool.	
 Sci.,	
 29:	
 351-358.	
 
	
 	
 	
 
2.	
 Hasan,	
 M.,	
 M.	
 Kuramoto,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 S.	
 Alam,	
 M.	
 M.	
 R.	
 Khan	 and	
 M.	
 Sumida	 (2012)	
 A	
 new	
 species	 of	
 genus	 Hoplobatrachus	
 (Anura,	 Dicroglossidae)	
 
from	
 the	
 coastal	
 belt	 of	
 Bangladesh.	
 Zootaxa,	
 3312:	
 45-58.	
 	
 3.	
 Alam,	
 M.	
 S.,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 M.	
 R.	
 Khan,	
 M.	
 Hasan,	
 R.	
 Wanichanon	
 and	
 
M.	
  Sumida	  (2012)	
  Postmating	  isolation	
  in	
  six	
  species	
  of	  three	  genera	 (Hoplobatrachus,	
 Euphlyctis	
 and	
  Fejervarya)	
 from	
 family	
 Dicroglossidae	 (Anura),	
 with	
 special	
 reference	
 to	
 spontaneous	
 production	
 of	 allotriploids.	
 Zool.	
 Sci.,	
 29:	
 743-752.	
 	
 Presentation	
 in	
 conferences	
 (International	
 conference)	
 1.	
 Islam,	
 M.	
 M.,	
 H.	
 Tokimitsu,	
 M.	
 Uchida,	
 M.	
 Iwanari,	
 T.	
 Fujii,	
 and	
 M.	
 Sumida	 “Genetic	
 divergence	
 and	
 postmating	 isolation	
 among	 the	
 brown	 frogs	 from	
 Ryukyu	 Archipelago,	
 Japan,	
 elucidated	
 by	 allozyme	
 and	
 mitochondrial	
 gene	
 sequence	 analyses,	 crossing	 experiments	
 and	
 cytological	
 observations”	
 7th	 World	
  Congress	 of	
 Herpetology	
 (August	
 11,	
 2012,	
 University	
 of	
 British	 Columbia,	
 Vancouver,	
 Canada)	
 	
 2.	
  Komaki,	  S.,	
  A.	
  Kurabayashi,	
  M.	
  M.	
  Islam,	
  K.	
  Tojo,	  and	
  M.	
  Sumida	 “Distributional	
 change	 and	
 epidemic	
 introgression	
 in	
 overlapping	 areas	 of	 Japanese	 pond	
 frog	
 species	 over	 30	
 years”	
 7th	
 World	 Congress	 of	
 Herpetology	 (August	 9,	
 2012,	
 University	
 of	
 British	
 Columbia,	
 Vancouver,	
 Canada)	
 	
 3.	
 Alam,	
 M.	
 S.,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 M.	
 R.	
 Khan,	
 M.	
 Hasan,	
 R.	
 Wanichanon	
 and	
 
M.	
  Sumida	
  “Postmating	  isolation	
  in	
  six	
  species	
  of	  three	  genera	 (Hoplobatrachus,	  Euphlyctis	
 and	
  Fejervarya)	
 from	
 family	
 Dicroglossidae	 (Anura),	  with	  special	  reference	  to	
  spontaneous	  production	  of	
 allotriploids”	
  7th	  World	  Congress	
  of	  Herpetology	  August	
  11,	
  2012,	 University	
 of	
 British	
 Columbia,	
 Vancouver,	
 Canada)	
 	
 4.	
 Hasan,	
 M.,	
 M.	
 Kuramoto,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 S.	
 Alam,	
 M.	
 M.	
 R.	
 Khan	
 and	
 M.	
 

82

Sumida	 “A	 new	 species	 of	
 genus	 Hoplobatrachus	
 (Anura,	 Dicroglossidae)	
 from	
 the	
 coastal	
 belt	 of	
 Bangladesh”	
 7th	
 World	 Congress	 of	
 Herpetology	
 (August	
 12,	
 2012,	
 University	
 of	
 British	
 Columbia,	
 Vancouver,	
 Canada)	
 	
 5.	
 Sumida,	
 M.,	
 N.	
 Satou,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 T.	
 Igawa,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 K.	
 Ukena,	 S.	
 Oumi,	
 S.	
 Katsuren,	
 and	
 T.	
 Fujii	 “Artificial	
 and	
 natural	 breeding	
 of	
 the	
 
endangered	  frog	  species	  Odorrana	  ishikawae	
  and	
  Odorrana	  splendida,	
 analysis	 of	 genetic	
 diversity,	
 and	
 usage	 as	 resource	 materials:	
 Case	 study	 of	 fauna	 conservation	
 in	
 Japan”	
 7th	 World	 Congress	 of	
 Herpetology	
 (August	
 11,	
 2012,	
 University	
 of	
 British	
 Columbia,	
 Vancouver,	
 Canada)	
 	
 6.	
 Hasan,	
 M.,	
 M.	
 Kuramoto,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 S.	
 Alam,	
 M.	
 M.	
 R.	
 Khan	 and	
 M.	
 Sumida	 “A	 new	
 species	 of	
 genus	 Hoplobatrachus	
 (Anura,	 Dicroglossidae)	
 from	
 the	
 coastal	
 belt	 of	
 Bangladesh”	
 18th	 Biennial	
 International	 Conference	
 and	
 Annual	 General	
 Meeting	 2012,	
 (December	
 22,	
 2012,	
 University	
 of	
 Dhaka,	 Bangladesh)	
 	 (National	
 conference)	
 1.	
 住田正幸・井川武・Islam	
 M.	
 M.・新谷望・掛橋竜祐・菅原弘貴・倉林敦・
大海昌平・勝連盛輝・田戸美雪・藤井保「中央琉球産絶滅危惧両生類 5 種の遺伝的分化と飼育下繁殖」日本動物学会第 83 回大会（2012 年 9 月 15 日、大阪大学、豊中）	 	
 2.	
 Alam,	
 M.	
 S.・M.	
 M.	
 Islam・M.	
 M.	
 R.	
 Khan・	
 M.	
 Hasan・R.	
 Wanichanon・M.	
  Sumida	
  “Postmating	  isolation	
  in	
  six	
  species	
  of	  three	  genera	 (Hoplobatrachus,	
 Euphlyctis	
 and	
  Fejervarya)	
 from	
 family	
 Dicroglossidae	 (Anura),	  with	  special	  reference	  to	
  spontaneous	  production	  of	
 allotriploids”	
 日本動物学会第 83 回大会（2012 年 9 月 15 日、大阪大学、豊中）	
 
	
 
3.	
 小巻翔平・倉林敦・イスラム	 モハメド	 マフィズル・東城幸治・住田正幸「日本産トノサマガエル種群の分布重複域における浸透交雑と 30 年間で生じた分布変化」日本動物学会第 83 回大会（2012 年 9 月 15 日、大阪大学、豊中）	
 
	
 
4.	
 Islam,	 M.	
 M.・H.	
 Tokimitsu・M.	
 Uchida・M.	
 Iwanari・T.	
 Fujii・M.	
 Sumida	 “Genetic	
 divergence	
 and	
 postmating	 isolation	
 among	 the	
 brown	 frogs	 from	
 Ryukyu	 Archipelago,	
 Japan,	
 elucidated	
 by	 allozyme	
 and	
 mitochondrial	
 gene	
 sequence	 analyses,	 crossing	 experiments	
 and	
 cytological	
 observations”	
 日
本遺伝学会第 84 回大会（2012 年 9 月 26 日、九州大学、福岡）	
 
	
 
5.	
 住田正幸・井川武・イスラム	 モハメド	 マフィズル・新谷望・掛橋竜祐・菅原弘貴・西谷琢磨・倉林敦・大海昌平・勝連盛輝・田戸美雪・藤井保	
 「南西諸島の絶滅危惧両生類における遺伝的分化と飼育下繁殖」日本爬虫両棲類学会第51 回大会（2012 年 11 月 10 日、愛知学泉大学、豊田）	
 

83

	
 
6.	
 Hasan,	
 M.・M.	
 Kuramoto・M.	
 M.	
 Islam・M.	
 S.	
 Alam・M.	
 M.	
 R.	
 Khan・M.	
 Sumida	
 
“A	
 new	
 species	 of	
 genus	 Hoplobatrachus	
 (Anura,	 Dicroglossidae)	
 from	 the	
 coastal	 belt	 of	
 Bangladesh”	 	
 日本爬虫両棲類学会第 51 回大会（2012 年 11 月 11 日、愛知学泉大学、豊田）	
 	
 Grants	 Grants-in-Aid	
 for	
 Scientific	
 Research	
 (B)	
 (No.24310173)（Partaker）	
 

	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 

84

Researcher・Alam	
 Mohammad	
 Shafiqul	 	
 Title:	 	 Postmating	  isolation	
  in	
  six	
  species	
  of	  three	  genera	  (Hoplobatrachus,	 Euphlyctis	
  and	
  Fejervarya)	
  from	  family	  Dicroglossidae	  (Anura),	  with	 special	 reference	
 to	
 spontaneous	
 production	
 of	 allotriploids	 (continued)	
 	 Introduction:	 In	  light	  of	  reproductive	  isolation	
  being	  a	
  fundamental	
  aspect	
  of	  the	
 biological	
 species	 concept,	
 we	
 performed	
 crossing	 experiments	
 using	 six	
 species	 from	
 three	 genera	 (Hoplobatrachus,	
 Euphlyctis	
 and	
 Fejervarya)	
 of	
 family	  Dicroglossidae	  to	
  explore	  postmating	  isolation	  in	
  dicroglossid	
 frogs.	
 Furthermore,	
 we	
 focus	 on	 the	
 remarkable	
 survival	
 of	 allotriploids	
 and	
 their	 possible	
 relevance	
 to	
 speciation	
 elucidated	
 by	
 chromosomal	
 and	
 histological	
 observations,	
 as	
 well	 as	
 allozyme	
 and	
 mitochondrial	 analysis.	
 	 	 Materials	
 and	
 Methods:	
 Frogs	
  from	  genera	  Hoplobatrachus,	  Euphlyctis,	  and	
  Fejervarya	  were	 collected	
  from	  Bangladesh	  and	
  Thailand	  and	
  were	  used	  for	
  crossing	 experiments.	
  Artificial	  insemination	  was	
  conducted	
  for	
  crossing	 experiments	
 according	
 to	
 the	
 procedure	
 by	
 Sumida	 et	 al.	
 (2011)	
 with	 a	
 slight	 modification.	
 Chromosomes	
 were	
 observed	
 in	
 metaphase	
 plates	 of	
 bone	 marrow	 cells	 of	
 3-year-old	 mature	 interspecific	
 3	
 hybrids	
 (tigr.	
 ×	
 chin.),	
 2	
 controls	 (tigr.	
 ×	
 tigr.),	
 as	
 well	 as	
 their	 parent’s	
 (H.	
 tigerinus	
 and	
 H.	
 
chinensis)	
 by	
 Omura’s	 method	
 (1967).	
 The	
 same	 samples	 were	
 also	
 used	 for	
 histological	
  observation.	
  A	  total	
  of	
  25	
  frogs	
  were	  used	  for	
  allozyme	
 electrophoresis.	
 Fourteen	
 enzymes	
 and	
 two	
 blood	 proteins	
 were	
 analyzed	
 by	
 
the	
 method	 of	
 horizontal	
 starch-gel	
 electrophoresis.	
 The	
 details	
 of	
 the	
 
electrophoretic	
 method	 have	 been	
 reported	 previously	
 by	
 Nishioka	
 et	
 al.	
 
(1980).	
 A	
 total	 of	
 nine	 individuals	
 were	
 used	 for	
 mitochondrial	
 Cytb,	
 12S	
 
and	
 16S	
 rRNA	 gene	
 analysis.	
 	 Results:	 Results	
 revealed	 gametic	 isolation	
 among	 three	 genera	 (Hoplobatrachus,	 Euphlyctis	
  and	
  Fejervarya),	  although	  the	
  intergeneric	  hybrids	  between	
 female	 E.	
 cyanophlyctis	
 and	
 male	 H.	
 chinensis	
 were	
 inviable	
 at	
 the	
 tadpole	 stage,	
  while	  the	
  hybrids	  between	  female	
  E.	
  cyanophlyctis	
  and	
  male	  H.	
 tigerinus	  were	  inviable	  at	
  the	
  hatching	  stage.	
  These	  results	  showed	
 complete	  hybrid	  inviability	  between	  the	
  two	
  genera.	
  Almost	  all	 interspecific	
 hybrids	
 between	 female	 H.	
 tigerinus	
 and	
 male	 H.	
 chinensis	
 85died	 of	
 underdevelopment	
 at	
 the	
 tadpole	 stage,	 whereas	 several	 hybrids	
 developed	 normally,	
 and	
 survived	
 to	
 maturity.	
 Chromosomal	
 observations	 and	
 mtDNA	
  and	
  allozyme	  analyses	  confirmed	
  that	  these	  mature	  hybrids	  were	 allotriploid	 consisting	
 of	
 two	
 maternal	
 genomes	
 and	
 one	
 paternal	
 genome.	
 The	  present	  results	  suggest	  that	  the	
  allotriploids	  were	  produced	 spontaneously,	  and	
  histological	
  observations	  confirmed	
  their	  sex	
  as	
 sterile	  males.	
  Furthermore,	  we	
  also	  investigated	  the	
  molecular	
 relationships	
 between	  H.	
 tigerinus,	  H.	
 chinensis	
 and	
 the	
 interspecific	
 allotriploids	
 by	
 mitochondrial	
 Cytb,	
 12S	
 and	
 16S	
 rRNA	 gene	
 analysis.	
 The	 maternal	
 inheritance	 mode	 of	
 mitochondrial	 genomes	
 was	
 retained	
 in	
 the	
 
hybrids.	
  Finally,	  the	
  present	  results	  advocate	  that	  the	
  degree	  of	
 postmating	 isolation	
 reflects	 the	
 phylogenetic	
 relationship.	
 In	
 addition,	 we	
 speculate	
 that	
 allotriploids	
 may	
 be	
 produced	
 via	
 hybridization	
 among	 cryptic	
 species.	
 	 Conclusion:	
 We	
 found	 sterile	
 allotriploids	 between	 female	  H.	
 tigerinus	
 and	
 male	
  H.	
 chinensis	
 by	
 artificial	
 crossing;	
 whereas	
 it	
 has	
 been	
 reported	 that	
 diploid	
 and	
  tetraploid	  populations	  were	  found	  in	
  African	
  H.	
  occipitalis	 (Dicroglossus	
 occipitalis)	
 populations	 in	
 nature	 (Bogart	
 and	
 Tandy,	 1976).	
 However,	
 Mable	 et	 al.	
 (2011)	
 explained	
 in	
 detail	 genome	 duplication	
 in	
 amphibians	
 and	
 fish,	
 and	
 they	 suggested	
 that	 the	
 polyploids	
 could	 be	
 formed	 in	
 nature	 during	 times	 of	
 climatic	
 instability.	
 We	
 also	 found	 duplication	
 events	
 in	
 the	
 mt	
 genome	 of	  Hoplobatrachus	 and	
  Euphlyctis	
 genera	
 in	
 our	
 
previous	
 paper	 (Alam	 et	 al.,	 2010).	
 At	
 present,	
 we	
 would	 like	 to	
 avoid	 further	
 discussion	
 about	 the	 possibility	
 of	
 a	
 past	
 evolutionary	 route	 of	 tetraploid	 formation	
 via	
 the	
 triploid	 stage	 in	 nature.	
 In	 future	 studies,	
 cryptic	
 species	 of	
 Hoplobatrachus,	
 Euphlyctis,	
 and	
 Fejervarya	
 genera	
 need	 to	
 be	
 studied	
 more	 closely	 to	
 understand	
 the	
 polyploidization	
 that	 might	 occur	 during	 the	
 formation	
 of	
 species	 using	 multiple	
 genetic	
 markers.	
 	 Future	 research	 plan:	
 	
 
In	
 the	
 present	
 study,	 we	
 focused	 the	
 genus	 Hoplobatrachus	
 and	
 related	 genera	
 
and	
 in	
 the	
 next	 stage	 of	 this	
 research	
 we	
 have	 plan	 to	
 survey	 the	
 chromosomal	 polyploidization	
 among	 all	 the	 amphibian	 fauna	 from	 South	 Asian	 country	
 
and	
 try	
 to	
 find	 out	
 their	 evolutionary	 histories	
 that	
 could	 happen	
 in	
 the	
 
past.	 At	 present,	
 we	
 are	
 rearing	 the	
 crosses	
 of	
 Bangladesh	  Euphlyctis	
 cyanophlyctis	
 with	
 Indian	
 E.	
 cyanophlyctis	
 and	
 we	
 will	
 perform	 chromosomal,	
 histological,	
 allozyme	 and	
 molecular	
 analysis	
 in	
 near	
 future.	
 
	
 

86

Research	
 Achievements:	 Original	 Paper:	
 1.	
 Alam,	
 M.	
 S.,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 M.	
 R.	
 Khan,	
 M.	
 Hasan,	
 R.	
 Wanichanon	
 and	
 
M.	
 Sumida	 (2012)	
 Postmating	 isolation	
 in	
 six	
 species	 of	
 three	 genera	 (Hoplobatrachus,	
 Euphlyctis	
 and	
 Fejervarya)	
 from	
 family	
 Dicroglossidae	 (Anura),	
 with	
 special	
 reference	
 to	
 spontaneous	
 production	
 of	 allotriploids.	
 Zool.	
 Sci.,	
 29:	
 743-752.	
 
	
 
2.	
 Hasan,	
 M.,	
 M.	
 Kuramoto,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 S.	
 Alam,	
 M.	
 M.	
 R.	
 Khan	 and	
 M.	
 Sumida(2012)	
 A	
 new	
 species	 of	
 genus	 Hoplobatrachus	
 (Anura,	 Dicroglossidae)	
 
from	
 the	
 coastal	
 belt	 of	
 Bangladesh.	
 Zootaxa,	
 3312:	
 45-58.	
 	 Presentation	
 in	
 Conferences:	 (International	 Conference)	
 1.	
 Alam,	
 M.	
 S.,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 M.	
 R.	
 Khan,	
 M.	
 Hasan,	
 R.	
 Wanichanon	
 and	
 
M.	
 Sumida	 “Postmating	 isolation	
 in	
 six	
 species	 of	
 three	 genera	 (Hoplobatrachus,	
 Euphlyctis	
 and	
 Fejervarya)	
 from	
 family	
 Dicroglossidae	 (Anura),	
 with	
 special	
 reference	
 to	
 spontaneous	
 production	
 of	
 allotriploids”	
 7th	
 World	 Congress	 of	
 Herpetology	 August	 11,	
 2012,	
 University	
 of	
 British	
 Columbia,	
 Vancouver,	
 Canada)	
 	
 2.	
 Hasan,	
 M.,	
 M.	
 Kuramoto,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 S.	
 Alam,	
 M.	
 M.	
 R.	
 Khan	 and	
 M.	
 Sumida	 “A	 new	
 species	 of	
 genus	 Hoplobatrachus	
 (Anura,	 Dicroglossidae)	
 from	
 the	
 coastal	
 belt	 of	
 Bangladesh”	
 7th	
 World	 Congress	 of	
 Herpetology	
 (August	
 12,	
 2012,	
 University	
 of	
 British	
 Columbia,	
 Vancouver,	
 Canada)	
 	
 3.	
 Hasan,	
 M.,	
 M.	
 Kuramoto,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 S.	
 Alam,	
 M.	
 M.	
 R.	
 Khan	 and	
 M.	
 Sumida	 “A	 new	
 species	 of	
 genus	 Hoplobatrachus	
 (Anura,	 Dicroglossidae)	
 from	
 the	
 coastal	
 belt	 of	
 Bangladesh”	
 18th	 Biennial	
 International	 Conference	
 and	
 Annual	 General	
 Meeting	 2012,	
 (December	
 22,	
 2012,	
 University	
 of	
 Dhaka,	 Bangladesh)	
 	 (National	 Conference)	
 1.	
 Alam,	
 M.	
 S.,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 M.	
 R.	
 Khan,	
 M.	
 Hasan,	
 R.	
 Wanichanon	
 and	
 
M.	
 Sumida	 “Postmating	 isolation	
 in	
 six	
 species	 of	
 three	 genera	 (Hoplobatrachus,	
 Euphlyctis	
 and	
 Fejervarya)	
 from	
 family	
 Dicroglossidae	 (Anura),	
 with	
 special	
 reference	
 to	
 spontaneous	
 production	
 of	
 allotriploids”	
 83th	 Annual	 Meeting	
 of	
 the	
 Zoological	
 Society	 The	
 83rd	 Annual	
 Meeting	
 of	
 the	
 Zoological	
 Society	
 of	
 Japan,	
 Toyonaka,	
 September	
 15,	
 2012.	
 	 
	 2.	
 Hasan,	
 M.,	
 M.	
 Kuramoto,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 S.	
 Alam,	
 M.	
 M.	
 R.	
 Khan	
 and	
 M.	
 

87

Sumida	 “A	 new	 species	 of	
 genus	 Hoplobatrachus	
 (Anura,	 Dicroglossidae)	
 from	
 the	
 coastal	
 belt	 of	
 Bangladesh”	
 The	
 51st	 Annual	 Meeting	
 of	
 the	
 Herpetological	
 Society	
 of	
 Japan,	 Yoyota,	
 November	
 11,	
 2012.	
 	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 

88

[学長裁量による特任教員]	
 特任教授・柏木昭彦(Akihiko	
 Kashiwagi)	
 	 	  大学院理学研究科附属両生類研究施設は、平成 24 年６月から５年間の予定で文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクト(NBRP)に参加、“ネッタイツメガエル”を研究者・教育担当者の要望に応えて提供を行う、わが国で唯一の中核期間である。広島大学学長のご要請をお受けして平成 24 年４月１日から特任教授として採用され、「ネッタイツメガエルの近交化・保存・提供」の任務に当たっている。平成 24 年度に実施した主な行事について以下に挙げる。	
 ・提供:学内はもとより京都大学、奈良女子大学、日本大学等に提供を行った。
平成 25 年３月 31 日の時点で、提供した件数 88、個体数 2,014 に上った。この
数値はいずれも平成 24 年度の目標を大幅に上回り、５年後のそれに迫るものとなった。	
 ・個別指導:ネッタイガエルを受け入れたものの飼育が思うようにいかない、などといった不満の声が研究者らから聞こえてきた。そこで、希望者を募って両生類研究施設 NBRP に来てもらい１週間以上にわたり、飼育のための個別指導を行っている。京都大学、日本大学、大阪大学から教員もしくは大学院生を受け入れた。	
 ・展示:第 83 回日本動物学会・動物学ひろば（大阪、９月）、第 35 回日本分子生物学会（福岡、12 月）、第 94 回日本生物教育学会（東広島、１月）	
 ・見学:ノーベル物理学賞受賞者の益川敏英先生を含め 405 名の方々が NBRP の見学に来られ案内した。	
 	
  研究内容等は以下の通りである。	
 	
 [研究内容]	
 １．NBRP ネッタイツメガエルの研究目的のための提供と、このカエルを用いた
研究提案	
 Supplying	 NBRP	
  Xenopus	  (Silurana)	
  tropicalis	  for	
 research	
 purposes	
 and	
 proposed	
 research	
 using	 such	
 frogs	
 
	
 
[目的]	
  	
 
	
  これまで半世紀以上にわたって、アフリカツメガエル(Xenopus	
 laevis)は医学・生物学における重要なモデル生物であったが、一方、ごく最近になってネッタイツメガエル(Xenopus	
 (Silurana)	
 tropicalis)が両生類のモデル生物として舞台に登場してきた。それには次のような理由が挙げられる：①ネッタイツ
メガエルは２倍体で、世代時間が比較的短く（雄６ヶ月、雌８ヶ月）、ゲノムや遺伝学の研究を行うのに好都合である。これに対して、アフリカツメガエルには異質４倍体、生活環が長い（1.5～2 年）とといった欠点がある。②ネッタイ
ツメガエルのゲノム配列は決定されている。	
 	  ネッタイツメガエルの属名についての論争がある。以前、ピパ科のカエルはピパ(Pipa)、ツメガエル(Xenopus)、コンゴツメガエル(Hymenochirus)、	
 89

コンゴツメガエルモドキ(Pseudhymenochirus)と４属から構成され、ネッタイツ
メガエルはツメガエル属の１種とされていた。ところが形態計測解析から、ネッタイツメガエルはツメガエル属のカエルよりも他の３属に近いことがわかり、別系統とみなしてネッタイツメガエル属(Silurana)の中に置くことが提案された(Cannatella	
 and	
 Trueb,	
 1988)。これに対して、リボソーム DNA 配列解析によれば、ネッタイツメガエルはツメガエル属のカエルと近縁である(de	
 Sa	
 and	
 
Hillis,	 1990)。ネッタイツメガエルの種名を Xenopus	
 (Silurana)	
 tropicalis	
 と表記する研究者は多く、私達もそれを受け入れる。	
 	
  両生類研究施設は、2012～2016 年にかけて、文部科学省の主催するナショナ
ルバイオリソースプロジェクト(NBRP)に参加、研究目的のためにネッタイツメ
ガエルを提供する中核機関に指名されている。	
 
	
  	
 
[将来の展望]	  	
 ネッタイツメガエルを用いて、私達はすでに環境中化学物質の内分泌かく乱影響を調べ、そして化学物質の作用をスクリーニングするための遺伝子改変ガエルを作製しているところである。今後は、簡便で確実な精子凍結法の開発、雌性発生法による近交系作出の促進、ミュータジェネシスなどを計画中である。	
 	 ２．トランスジェニックスクリーニング法を用いた化学物質による甲状腺ホルモンかく乱作用の評価	 	
 Evaluating	 chemical	
 related-thyroid	
 hormone	 disruption	
 using	 transgenic	 screening	 techniques	
 
	
 
[目的]	
  	
 
	
  環境中に存在する、天然もしくは人工の化学物質が正常な内分泌機能をかく乱することにより、ヒトや野生生物のホメオスタシスや発生、生殖、性分化、行動に悪影響を及ぼし、さらにはガンの発症をも惹起することが懸念されている。また、個体発生の初期段階における内分泌かく乱化学物質(EDCs)への曝露
影響は特に顕著で次世代にも伝わると考えられている。EDCs の作用メカニズムには、ホルモンレセプターとの相互関係はもとより、ホルモンの合成・移動・代謝の阻害、レセプターのリン酸化などが含まれる。多くの EDCs は非常に安定で親脂性であるから、曝露個体内に生物濃縮される。無尾両生類の変態現象は甲状腺ホルモンに負うところが大きく、そのシステムはヒトへの EDCs 曝露リス
クを推定するのに有用である。本研究では、甲状腺ホルモンアゴニストまたは
アンタゴニストである化学物質を高感度に検出するためのトランスジェニック
系統を開発する。	
 
	
 
[方法]	
  	
 
	
  甲状腺ホルモン応答レセプター依存性ルシフェラーゼ遺伝子を発現するトラ
ンスジェニックツメガエルの F1 幼生を用いて、甲状腺ホルモンおよびその合成を阻害するメチマゾールに曝露した。	
 	
 [結果と考察]	
  	
 

90

	
  あらかじめメチマゾール処理を施して甲状腺ホルモン合成を抑制しておいた
トランスジェニック F1 幼生を甲状腺ホルモンに曝したところ、幼生のルシフェラーゼ活性は甲状腺ホルモン濃度に依存して増加した。これらの結果から、本研究で開発したこのトランスジェニックガエル系統を使って甲状腺ホルモンア
ゴニズムもしくはアンタゴニズムを有する化学物質を簡単で迅速にしかも高感度で in	
 vivo バイオアッセイのできることがわかった。	
 	
 [将来の展望]	  	 	  このトランスジェニック系統を用いて、多種多様な化学物質の単品はもとより混合物のかく乱作用を調べる。	
 	
 ３．TALENs を用いたノックアウトアフリカツメガエルの作製	 The	
 production	
 of	
 knockout	
 Xenopus	 laevis	
 using	 TALENs	
 
	
 
[目的]	
  	
 
	
  本 研 究 の 目 的 は 、 DNA 結 合 ド メ イ ン の Transcription	  activator-like	 effectors	
 (TALEs)と切断ドメインの制限酵素 FokI を連結させた人工ヌクレア
ーゼ TALENs を用いた標的遺伝子破壊法がアフリカツメガエルで効率的に適用できるかどうかを調べることである。	
 
	
 
[方法]	
  	
 
	
  メラニン合成に関わるチロシナーゼ遺伝子(try)、および眼の形成に必要なマスター制御遺伝子 pax6 を標的とする TALEN をアフリカツメガエル受精卵に導入
した。	
 
	
 
[結果と考察]	  	 	  DNA２本鎖の切断が生じたのち、非相同末端再結合による塩基の置換・欠失・挿入が起こり try および pax6 両遺伝子のノックアウトが誘起されたため、前者
では白化現象、後者では無眼症・小眼症が高頻度で見られた。TALEN 標的遺伝子
破壊法は遺伝子改変ツメガエルを作製するのに非常に優れた技術であることが証明された。	
 	
 [将来の展望]	  	 	  TALEN 法の開発によって両生類逆遺伝学は新たな段階に突入した。	
 	
 ４．両生類の生活環に対する過重力と強磁場影響	 Effects	
 of	 hypergravity	
 and	
 strong	 static	
 magnetic	
 fields	
 on	
 amphibian	 life	
 cycles	
 
	
 
[目的]	
  	
 
	
  宇宙開発の長期ビジョンとしては、宇宙誕生の謎の解明、宇宙航空技術の活用による安全で豊かな社会の実現、宇宙空間での生活や火星への移住、などが挙げられる。しかし、宇宙環境中にヒトが長期間置かれたときの健康影響につ91

いてはまだよくわかっていない。宇宙環境影響の標的生物種として両生類は地上および宇宙空間における各種の実験に用いられてきた。	
 
	
 
[方法]	
  	
 
	
  過重力の実験ではアフリカツメガエルの受精卵を 2G または 5G に曝露した。
また強磁場の実験では 11T(－1400T2m－1)、15T(0	
 T2m－1)、12T(＋1200	
 T2m－1)を若いネッタイツメガエルオタマジャクシに印加した。	
 	
 [結果と考察]	  	 	
  過重力に曝された胚には多様な異常が認められたが、もっとも多いのが小頭症や小眼症であった。こうした頭部障害を持つ個体では頭部形成に関わる Wnt
遺伝子の発現が抑えられていること、頭部前方は特に過重力に対する感受性が高いこと、などが明らかになった。強磁場に曝されたオタマジャクシには回転運動をしたり、容器底面で横たわるなどの異常行動が認められた。	
 [将来の展望]	
  過重力印加による頭部障害の誘起や、強磁場曝露による異常行
動のメカニズムを調べる。	
 
	
 
研究業績	
 
①原著論文	 1.	
 Hanada	
 ,H.,	
 Kobuchi,	
 H.,	
 Yamamoto,	
 M.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Katsu,	
 K.,	
 Utsumi,	 T.,	
  Kashiwagi,	  A.,	
  Sasaki,	  J.,	
  Inoue,	  M.	
  and	
  Utsumi,	
  K.	
  2013.	
 Acetyl-L-carnitine	
 suppresses	
 thyroid	
 hormone-induced	
 and	
 spontaneous	 anuran	 tadpole	 tail	 shortening.	
 Hereditas	
 150:	
 1-9.	 	
 2.	
 Suzuki,	
 K.,	
 Isoyama,	
 Y.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Sakuma,	
 T.,	
 Ochiai,	
 H.,	
 Sakamoto,	
 N.,	
 Furuno,	
 N.,	
 Kashiwagi,	
 A.	
 and	
 Yamamoto,	
 T.	
 2013.	
 High	
 efficiency	 TALENs	 enable	
 F0	
 functional	
 analysis	
 by	
 targeted	 gene	
 disruption	
 in	
 Xenopus	  laevis	  embryos.	
  Biology	
  Open	  BIO_2013_3855.3d.	
  doi:	
  10.	
 1242/bio.20133855:	
 1-5.	
 	 
	 3.	
 Yanagisawa,	
 M.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Hanada,	
 H.,	
 Shinkai,	
 T.,	
 Yoshitome,	
 S.,	
 Kubo,	 H.,	 Sakai,	
 M.,	
 Fujii,	
 H.,	
 Yamashita,	
 M.,	
 Kashiwagi,	
 A.,	
 Watanabe,	 M.	
  and	
  Furuno,	
  N.	
  2012.	
  Analysis	
  of	
  the	
  head-defects	  caused	  by	
 hypergravity	
 in	
 early	
 Xenopus	 embryos.	
 Biol.	
 Sci.	 Space	
 26:	
 1-6.	 	
 4.	
 Yanagisawa,	
 M.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Hanada,	
 H.,	
 Shinkai,	
 T.,	
 Yoshitome,	
 S.,	
 Kubo,	 H.,	 Sakai,	
 M.,	
 Fujii,	
 H.,	
 Yamashita,	
 M.,	
 Kashiwagi,	
 A.,	
 Watanabe,	
 
M.	
 and	
 Furuno,	
 N.	
 2012.	
 Hypergravity	
 specifically	 affects	
 anterior	 head	
 formation	
 in	
 early	
 Xenopus	 embryos.	
 Biol.	
 Sci.	 Space.	
 26:	
 47-52.	
 	 ②	
 総説・著書	 	  該当なし	 	 92

④ 学会発表	
 
国内学会	
 
1.	
 柏木昭彦、柏木啓子、花田秀樹、小林里美、難波ちよ「教材としてのネッタ
イツメガエルおよびアホロートルの展示」第 94 回日本生物教育学会（2013 年
１月、広島大学、東広島）	
 
	
 
2.	
 Ken-ichi	
 T.	
 Suzuki1,	
 Keiko	 Kashiwagi,	 Tetsushi	
 Sakuma,	 Yukiko	
 Isoyama,	 Hiroshi	 Ochiai,	
 Akihiko	
 Kashiwagi,Takashi	 Yamamoto．Targeted	 disruption	
 of	
 EGFP	
 transgene	
 in	
 Xenopus	 laevis	
 using	 customized	
 transcription	
 activator-like	 	 (JYSS1-18)	
 	
 effector	
 nucleases	
 (TALENs)	
  第45回日本発生生物学会	
  （2012年	
  5月	
  神戸インターナショナル	  コンファレンスセン
ター	  神戸）	 
	 3.	
 柏木昭彦、柏木啓子、花田秀樹、小林里美、竹中純子、住田正幸「ツメガエ
ルって、どんなカエル？」第 83 回日本動物学会（2012 年 9 月、大阪大学、大
阪）	
 
	
 
4.	
 柏木昭彦、柏木啓子、花田秀樹、中島圭介、住田正幸「ネッタイツメガエルの近交化・標準系統の樹立・提供」第 35 回日本分子生物学会（2012 年 12 月、
マリンメッセ福岡、福岡）	
 
	
 
5.	
 磯山由樹子、佐久間哲史、柏木啓子、落合	
  博、柏木昭彦、山本	  卓、鈴木賢一「アフリカツメガエルにおける TALEN を用いた効率的な標的遺伝子破壊」
第 35 回日本分子生物学会（2012 年 12 月、マリンメッセ福岡、福岡）	
 
	
 
6.	
 佐能正剛、	
 柏木啓子、	
 花田秀樹、	
 松原加奈、	
 川畑公平、	
 中村直樹、	 鈴
木賢一、山本	
  卓、	
 新海	
  正、	
 藤本成明、	
 杉原数美、	
 北村繁幸、	
 柏木昭
彦、	
 太田	
  茂	
 「甲状腺ホルモン様化学物質アミオダロン曝露によるカエルの変態に対する影響」第２６回環境ホルモン学会	
  （2012	
 年	
  6月、東京大学	
  山上会館、東京）	
 	 	
 国際学会	 	  該当なし	 	 ④	
 科研費等の受け入れ状況	
 1.	
 平成 24 年度	
  EXTEND2010 基盤的研究「ツメガエル変態アッセイを用いた甲状腺ホルモンかく乱化学物質のスクリーニングシステムの開発」3000 千円（代
表）	
 
	
 
2.	
 宇宙環境利用科学委員会ワーキンググループ(WG)活動（JAXA）「両生類の生活環に対する過重力および磁場の影響」150 千円（代表）	
 	
 ⑤その他（会合への参加・出席）	
 

93

1.	
 柏木昭彦、鈴木	  厚「NBRP メダカ-NIBB	
  精子凍結・人工授精トレーニング
コース」（2012 年８月、基礎生物学研究所、岡崎）	
 
	
 
2.	
 鈴木賢一、柏木啓子、磯山由樹子、佐久間哲史、落合	  博、柏木昭彦、山本	
 卓．
「人工ヌクレアーゼを利用した両生類におけるゲノム編集」第 2 回ゲノム編集研究会	
  (2012 年 9 月 20 日、岡崎コンファレンスセンター、岡崎)	
 
	
 
3.	
 柏木昭彦、田澤一朗「第６回 NBRP データベース研究会」（2013 年３月、国立遺伝学研究所、三島）	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 

94

プロジェクト研究①	
 
	
 
[	
 1	
 ]ネッタイツメガエルを用いた研究提案	
 Proposed	
 research	
 using	 Xenopus	 (Silurana)	
 tropicalis	 	 柏木啓子（広島大学）、山本	
  卓（広島大学）、鈴木賢一（広島大学）、成瀬	
  清（基礎生物学研究所）、笹土隆雄（基礎生物学研究所）、花田秀樹（広島大学）、柏木昭彦（広島大学）	
 	 	  ネッタイツメガエルを用いて、私達は現在、化学物質の内分泌かく乱作用を調査したり、TALENs による遺伝子改変動物を作製中である。近い将来、簡便で確実な精子凍結法の開発、雌性発生法による近交系作出の促進、さらにはミュータジェネシスなどを計画している。	
 
	
 
[	
 2	
 ]トランスジェニックスクリーニング法を用いた化学物質による甲状腺ホルモンかく乱作用の評価	 	
 Evaluating	 chemical	
 related-thyroid	
 hormone	 disruption	
 using	 transgenic	 screening	 techniques	 	 	  柏木昭彦（広島大学）、鈴木賢一（広島大学）、花田秀樹（広島大学）、柏木啓子（広島大学）、山本	
  卓（広島大学）、太田	  茂（広島大学）	
 	
 世界規模でしかも地球生命史上前例のない速度で両生類個体群が減少していると報じられている。その原因として、生息場所の消失、紫外線量の増加、気候変動の他に残留性の高い化学物質による環境汚染が挙げられる。両生類は、透過性の高い皮膚を有していること、水陸双方に生息すること、発生過程で草食性オタマジャクシから肉食性カエルへと食物網が変化することなどから、いろいろな経路を通して環境汚染物質に曝露される可能性が高い。両生類にとって有害な要因がヒトにも健康被害を及ぼすことは多くの研究者の一致するところである。	
 	
  工業製品の原材料や医薬品・生活関連物質(Pharmaceuticals	
 and	
 Personal	
 Care	
 Products;	
 PPCPs)など多数の化学物質が世界の環境中から見つかっている。
その中には、脂質との親和性が顕著で、生物蓄積し、甲状腺機能障害を含めい
くつかの悪影響を及ぼすものもある。無尾両生類の変態現象は甲状腺ホルモンに負うところが大きく、そのシステムは正常な甲状腺ホルモン作用に対する化
学物質の曝露リスクを推定するのに有用である。本研究では、甲状腺ホルモン
アゴニストまたはアンタゴニストである化学物質を高感度に検出するためのト
ランスジェニック系統を開発し、環境中化学物質の内分泌かく乱作用の判定に役立てたいと考えている。	
 
	
 
[	
 3	
 ]両生類の生活環に対する過重力と強磁場影響	 Effects	
 of	 hypergravity	
 and	
 strong	 static	
 magnetic	
 fields	
 on	
 amphibian	 life	
 95

cycles	 	 	  柏木啓子（広島大学）、古野伸明（広島大学）、藤原好恒（広島大学）、新海	
  正（芝浦工業大学）、花田秀樹（広島大学）、山本	
  卓（広島大学）、鈴木賢一（広島大学）、柏木昭彦（広島大学）	
 	
 宇宙開発の長期ビジョンとしては、宇宙誕生の謎の解明、宇宙航空技術の活用による安全で豊かな社会の実現、宇宙空間での生活や火星への移住、などが挙げられる。しかし実際に、宇宙空間にヒトが長期間置かれたときの健康影響についてはまだよくわかっていない。宇宙環境影響の標的生物種として両生類は地上および宇宙空間における各種の実験によく用いられてきた。	
 これまで 10 年以上にわたって、私達は JAXA が主催する宇宙環境利用研究班・ワーキンググループ活動に参加し、両生類を用いて過重力および強磁場の実験を手がけてきた。過重力・強磁場の初期胚に与える影響は特に顕著で、発生阻害や形態形成不全、遺伝子発現低下などを引き起こす。今後は、こうした異常誘発のメカニズムを解明したいと考えている。	
 
	
 
[	
 4	
 ]ミトコンドリア膜透過遷移と無尾両生類における尾部アポトーシスのメカ
ニズム	
 Mitochondrial	 membrane	 permeability	 transition	
 and	
 the	
 mechanism	
 for	
 tail	
 apoptosis	
 in	
 anurans	 	 	  柏木昭彦（広島大学）、花田秀樹（広島大学）、柏木啓子（広島大学）、内海俊彦（山口大学）、井上正康（宮城大学）、佐々木順三（岡山大学）、勝	  賢二郎（熊本大学）、佐藤英介（鈴鹿医療科学大学）、内海耕慥（高知大学）	
 	 	  無尾両生類の変態時に見られるオタマジャクシの尾部消失にミトコンドリア
膜透過遷移(MPT)が重要な役割を果たしている。L－カルニチンがβ酸化およびエネルギー生成のために遊離脂肪酸(FFAs)をサイトゾルからミトコンドリアマ
トリックスに移動させることはよく知られている。以前に私達が行った研究か
ら L－カルニチン処理は FFAs レベルは減少させて T3 および FFA によって誘導された MPT を抑制することがわかった。昨年度の研究では、L－カルニチンと同じ
く脂肪酸酸化に関与するアセチル－L－カルニチン(ALC)に焦点を当てて、ツチ
ガエルオタマジャクシの T3 誘導による尾部短縮、およびアフリカツメガエルオ
タマジャクシの自然状態での尾部短縮の影響を調べた。	
 	
  T3 処理されたオタマジャクシの尾部アポトーシスの指標である DNA ラダー像の形成およびカスパーゼ－３、カスパーゼ－９活性の増加が ALC を添加することによって抑えられることがわかった。また、ALC はアフリカツメガエルオタマ
ジャクシの内在性甲状腺ホルモンによって制御される自然変態を抑制し、同時にカスパーゼやフォスフォリパーゼ A2 活性、DNA ラダー像の形成を減少させる
ことも明らかになった。	
 	
  以上の結果は、FFAs 活性の増加が MPT 開始を促し、無尾両生類の変態時におけるオタマジャクシ尾部のアポトーシスによる細胞死を制御するシグナル伝達

96

を活性化するという、私達がこれまでに得てきた結論を支持するものである。	
 	
  今後も引き続いて、両生類の変態におけるオタマジャクシ尾部アポトーシスの分子機構を調べていく予定である。	
 
	
 
研究業績	
 
①	
 原著論文	 1.	
 Hanada	
 ,H.,	
 Kobuchi,	
 H.,	
 Yamamoto,	
 M.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Katsu,	
 K.,	
 Utsumi,	 T.,	
  Kashiwagi,	  A.,	
  Sasaki,	  J.,	
  Inoue,	  M.	
  and	
  Utsumi,	
  K.	
  2013.	
 Acetyl-L-carnitine	
 suppresses	
 thyroid	
 hormone-induced	
 and	
 spontaneous	 anuran	 tadpole	 tail	 shortening.	
 Hereditas	
 150:	
 1-9.	 	
 2.	
 Suzuki,	
 K.,	
 Isoyama,	
 Y.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Sakuma,	
 T.,	
 Ochiai,	
 H.,	
 Sakamoto,	
 N.,	
 Furuno,	
 N.,	
 Kashiwagi,	
 A.	
 and	
 Yamamoto,	
 T.	
 2013.	
 High	
 efficiency	 TALENs	 enable	
 F0	
 functional	
 analysis	
 by	
 targeted	 gene	
  disruption	
 in	
 Xenopus	  laevis	  embryos.	
  Biology	
  Open	  BIO_2013_3855.3d.	
  doi:	
  10.	
 1242/bio.20133855:	
 1-5.	
 	 
	 3.	
 Sakuma,	
 T.,	
 Hosoi,	
 S.,	
 Woltjen,	
 K.	
 I.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Wada,	
 H.,	
 Ochiai,	
 H.,	
 Miyamoto,T.,	
 Kawai,	
 N.,	
 Sasakura,	
 Y.	
 et	
 al.	
 2013.	
 	
 Efficient	
 TALEN	 construction	  and	
  evaluation	  methods	
  for	
  human	  cell	  and	
  animal	 applications.	
 Genes	 to	
 Cells	 18(4):	
 315-326	
 	
 4.	
 Yanagisawa,	
 M.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Hanada,	
 H.,	
 Shinkai,	
 T.,	
 Yoshitome,	
 S.,	
 Kubo,	 H.,	 Sakai,	
 M.,	
 Fujii,	
 H.,	
 Yamashita,	
 M.,	
 Kashiwagi,	
 A.,	
 Watanabe,	
 
M.	
 and	
 Furuno,	
 N.	
 2012.	
 Analysis	
 of	
 the	
 head-defects	
 caused	 by	 hypergravity	 in	
 early	
 Xenopus	 embryos.	
 Biol.	
 Sci.	 Space	
 26:	
 1-6.	 	
 5.	
 Yanagisawa,	
 M.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Hanada,	
 H.,	
 Shinkai,	
 T.,	
 Yoshitome,	
 S.,	
 Kubo,	 H.,	 Sakai,	
 M.,	
 Fujii,	
 H.,	
 Yamashita,	
 M.,	
 Kashiwagi,	
 A.,	
 Watanabe,	
 
M.	
 and	
 Furuno,	
 N.	
 2012.	
 Hypergravity	
 specifically	 affects	
 anterior	 head	
 formation	
 in	
 early	
 Xenopus	 embryos.	
 Biol.	
 Sci.	 Space.	
 26:	
 47-52.	
 	 ②	
 総説・著書	 	  該当なし	 	 ③	
 学会発表	
 	
 国内学会	
 1.	
 柏木昭彦、柏木啓子、花田秀樹、小林里美、難波ちよ「教材としてのネッタ
イツメガエルおよびアホロートルの展示」第 94 回日本生物教育学会（2013 年
１月、広島大学、東広島）	
 
	
 
2.	
 Ken-ichi	
 T.	
 Suzuki1,	
 Keiko	 Kashiwagi,	 Tetsushi	
 Sakuma,	 Yukiko	
 Isoyama,	 Hiroshi	 Ochiai,	
 Akihiko	
 Kashiwagi,Takashi	 Yamamoto．Targeted	 disruption	
 

97

of	
 EGFP	
 transgene	
 in	
 Xenopus	 laevis	
 using	 customized	
 transcription	
 activator-like	 	 (JYSS1-18)	
 	
 effector	
 nucleases	
 (TALENs)	
  第45回日本発生生物学会	
  （2012年	
  5月	
  神戸インターナショナル	  コンファレンスセン
ター	  神戸）	 
	 3.	
 柏木昭彦、柏木啓子、花田秀樹、小林里美、竹中純子、住田正幸「ツメガエ
ルって、どんなカエル？」第 83 回日本動物学会（2012 年 9 月、大阪大学、大
阪）	
 
	
 
4.	
 柏木昭彦、柏木啓子、花田秀樹、中島圭介、住田正幸「ネッタイツメガエルの近交化・標準系統の樹立・提供」第 35 回日本分子生物学会（2012 年 12 月、
マリンメッセ福岡、福岡）	
 5.	
 磯山由樹子、佐久間哲史、柏木啓子、落合	
  博、柏木昭彦、山本	  卓、鈴木賢一「アフリカツメガエルにおける TALEN を用いた効率的な標的遺伝子破壊」
第 35 回日本分子生物学会（2012 年 12 月、マリンメッセ福岡、福岡）	
 
	
 
6.	
 佐能正剛、	
 柏木啓子、	
 花田秀樹、	
 松原加奈、	
 川畑公平、	
 中村直樹、	 鈴
木賢一、山本	
  卓、	
 新海	
  正、	
 藤本成明、	
 杉原数美、	
 北村繁幸、	
 柏木昭
彦、	
 太田	
  茂	
 「甲状腺ホルモン様化学物質アミオダロン曝露によるカエルの変態に対する影響」第２６回環境ホルモン学会	
  （2012	
 年	
  6月、東京大学	
  山上会館、東京）	
 	
 ④	
 科研費等の受け入れ状況	
 1.	
 平成 24 年度	
  EXTEND2010 基盤的研究「ツメガエル変態アッセイを用いた甲状腺ホルモンかく乱化学物質のスクリーニングシステムの開発」3,000 千円
（代表）	
 
	
 
2.	
 宇宙環境利用科学委員会ワーキンググループ(WG)活動（JAXA）「両生類の生活環に対する過重力および磁場の影響」150 千円（代表）	
 	
 ⑤その他（会合への参加・出席）	
 1.	
 柏木昭彦、鈴木	  厚「NBRP メダカ-NIBB	
  精子凍結・人工授精トレーニング
コース」（2012 年８月、基礎生物学研究所、岡崎）	
 
	
 
2.	
 鈴木賢一、柏木啓子、磯山由樹子、佐久間哲史、落合	  博、柏木昭彦、山本	
 卓．
「人工ヌクレアーゼを利用した両生類におけるゲノム編集」第 2 回ゲノム編集研究会	
  (2012 年 9 月 20 日、岡崎コンファレンスセンター、岡崎)	
 
	
 
3.	
 柏木昭彦、田澤一朗「第６回 NBRP データベース研究会」（2013 年３月、国立遺伝学研究所、三島）	
 

	
 

98

プロジェクト研究②	 	 古野伸明（広島大学）、吉留賢（鳥取大学）、渡部稔（徳島大学）、柏木啓子（広島大学）、花田秀樹（広島大学）、新海正（芝浦工業大学）、久保英夫（東京都医学総合研究所）、坂井雅夫（鹿児島大学）、藤井博匡（札幌医科大学）、山下雅道（JAXA）、柏木昭彦（広島大学）、谷本能文（大阪大谷大学）、藤原好恒（広島大学）、山本卓（広島大学）、鈴木賢一（広島大学）、植木龍也（広島大学）、関口猛（九州大学）、小林英紀（岡山大学）、小原政信（広島大学）	
 
	
 
研究内容	
 
［１］両生類の生活環に対する過重力の影響	 The	
 effect	
 of	 the	
 hypergaravity	
 on	
 the	
 life	
 cycle	 of	 amphibians	 	 	  将来、人類が宇宙へ進出して行くためには地球とは異なった重力環境下でヒトを含めた動植物が正常で健康な子孫を作れるかどうかを知る事が重要であり、もし、正常な子孫が作れないようなら、どのようにすれば異なった重力環境で正常に生活環が回るかどうか調べる事が重要である。我々は、両生類をモデル生物として過重力が成長や内分泌系にどのような影響を与えるかを調べ、その改善方法を探っている。	
 	
 [目的と成果]	
 	
  両生類をモデル生物として、生活環の重要な時期（初期発生や減数分裂など）に焦点を絞って過重力の影響を調べたり、長期にわたる過重力暴露におけるホルモン分泌を含む生理的影響を追跡する。また、過重力で生じた異常を正常に戻す手段を探索する。それらの実験を通じて、地上とは異なった重力環境下でヒトを含めた動植物の世代交代が可能かどうかを調べることを目標とする。その結果、過重力に感受性が高い時期は、受精後から卵割が始まるまでである事が判明した。WISH を用いた実験から過重力は頭部形成に特に影響を与える事が明らかになった。また、卵減数分裂に影響を与える事がわかった。また、長期に渡る過重力曝露によって、甲状腺ホルモンによって支配されている変態が遅れる事がわかり、内分泌系にも影響を与える事が明らかになった。	
 	 ［２］両生類の生活環に対する強磁場の影響	
 The	
 effect	
 of	
 strong	 static	
 magnetic	
 field	 (SMF)	
 on	
 the	
 life	
 cycle	 of	 amphibians	 	 	  現在、携帯電話や高圧送電線、家電製品などから磁場にさらされる機会が多くなってきた。それにもかかわらず、脊椎動物の発生および遺伝子発現に対する強磁場の影響に関する研究は少ない。両生類を用いて、その生活環に対する影響を調べる。	
 	 99[目的と成果]	
 	  カエル胚は、体外受精を行うので胚の観察が容易で、発生も早いことから、磁場の影響を調べるには有用と考えられる。アフリカツメガエルやニシツメガ
エルを用いて、卵減数分裂から変態までの磁場の影響を調べた。その結果、卵成熟過程において卵の色素の分布に影響を与える事や、初期発生にさまざまな影響を与える事が明らかになった。また、オタマジャクシを強磁場に曝露すると、行動に異常が生じる事もわかった。現在、その行動異常の原因を探ってい
る。	
 
	
 
［３］TALEN によるアフリカツメガエルの F0 における遺伝子破壊	 Targeted	 mutagenesis	
 of	
 genes	 by	
 TALEN	 in	
 Xenopus	 embryos	 	 	  ノックアウトによる特定の遺伝子破壊は、その遺伝子の機能を探る上で非常に有効な手段である。この技術は、マウスでは ES 細胞を用いて確立されてポピ
ュラーにつかわれるようになっているが、それ以外の動物では ES 細胞が確立されていない事で不可能である。しかしながら、最近、ZNF	
 (Zinc	 finger	
 nuclease),	 さらに TALEN(Transcription	
 activator-like	
 feector	 nuclease)を使用すると、特定の配列に突然変異が入れられる事がわかり、コオロギやラットなどで応用されて来た。この技術をカエルで確立する事は、カエルの実験動物として有用性を飛躍的に高める。	
 	
 [目的と成果]	
 	  昨年、カエルで ZNF が応用可能かどうか実験を行い、良い結果をえていたが、ZNF は作成が複雑である。その点、TALEN は（難しいとはいえ）ZNF よりは操作が容易である。また、破壊の効率が高く、次世代を待たずに、目標となる遺伝子を破壊し F0 でその効果を見れる可能性が出て来た。今回、いろいろ TALEN を改良して、Xenopus を使って、F0 で有効かどうかを調べた。使った遺伝子は、
既に遺伝子の機能が報告されている tyrosinase と pax6 を用いた。その結果、
TALEN を使ってそれぞれの遺伝子を破壊した結果、高効率で今まで報告されている表現形が観察され、TALEN が F0 でも有効である事が示された。	
 
	
 
［	
 ４	
 ］卵成熟および初期発生におけるサイクリン B2 の２極紡錘体形成におけ
る機能	
 
The	
 role	 of	
 the	
 cyclin	
 B2	
 in	
 the	
 bipolar	 spindle	 formation	
 during	 oocyte	 maturation	
 and	
 early	 embryogenesis	 	 	  MPF はサイクリン B と Cdc2 の複合体であり、M 期を引き起こす普遍的な因子である。MPF が活性化すると核膜崩壊、染色体凝縮、紡錘体の形成が起こり、M期が開始する。サイクリン B は MPF の調節サブユニットであり、多くの種でサブタイプが複数存在し、また、それぞれのサブタイプの細胞内局在も違っている。しかしながらその機能に違いがあるかどうか報告はほとんどない。この研究ではサイクリン B1 と B2 の機能の違いについて研究している。	
 
	
 

100

［目的と成果］	
 	  ツメガエルの卵母細胞や胚ではサイクリン B1 とサイクリン B2 が主に発現しており、機能差を解析する良い系である。今までに、この系を用いて、サイクリン B１でなくサイクリン B２が正常な紡錘体の形成に関与することを明らかにした。この系を用いてサイクリン B のサブタイプの機能を解析する事を目標として研究を行っている。その結果、サイクリン B２が何処に局在するか、また、
どういうモータータンパク質と共同して２極の紡錘体を形成しているかが明らかになっている。	
 
	
 
［	
 ５	
 ］Nramp ファミリーの新規バナジウム／プロトン共役輸送体	
 A	
 novel	 vanadium/proton	 antiporter	 of	 a	
 Nramp	 family	 	 	  海産動物のホヤは体内に高濃度のバナジウムをもっている。これは、海中のバナジウムから濃縮されたもので、ホヤはバナジウムを高濃度に濃縮する機構を持っている。その機構を研究している。	
 	
 [目的と成果]	 	  Nramp/DCT ファミリーは、二価金属イオンの輸送に関わる膜輸送体である。
我々はバナジウムを高度に濃縮する海産動物ホヤ類の血球から Nramp ファミリーの新規膜輸送体遺伝子を同定した。この遺伝子 AsNramp はヒトの Nramp1 および 2 と、アミノ酸レベルで約 60%の相同性があった。アフリカツメガエルの卵母細胞による発現系を用いて金属輸送活性を検証したところ、プロトンとの共役輸送によって四価バナジウムを取り込む共役輸送体であることがわかった。さらに、四価バナジウムの輸送は Na による阻害を受けること、AsNramp は血球の液胞膜画分に局在することも明らかになった。	
 
	
 
	
 
［	
 ６	
 ］mTOR 情報伝達系の解析	
 Analysis	
 of	
 the	
 mTOR	 signal	
 transduction	 	 	  炎症は、生体の損傷に対する組織の反応であり、その反応の一部には mTOR	 (mammalian	 target	 of	
 rapamycin の略。ほ乳類などの動物の細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質キナーゼ。最初に rapamycin の標的タンパク質として見つかったのでこの名前がついた)情報伝達系が関与している。この情報伝達系の研究を進めている。	
 	
 ［目的と成果］	
 炎症に関与する mTOR 情報伝達系に関与するタンパク質や、その相互作用を調べる事でこの情報伝達系の全貌を解明しようとしている。その結果、mTOR 伝達系に Ego1,	
 Ego3 と Gtr1,Gtr2 のタンパク質が関与していることがわかった。	
 
	
 
［	
 ７	
 ］サイトグロビンやアンドログロビンの初期胚における機能解析	
 Functional	
 analysis	
 of	
 the	
 cytoglobin	
 and	
 andoroglobin	
 in	
 Xenopus	 embryos	
 

101

	
 
サイトグロビンはミオグロビンやヘモグロビンの仲間で、グロビンタンパク質の一種であり、酸素の運搬に関わっているタンパク質であるが初期胚における機能はわかっていない。また、アンドログロビンは最近のゲノム解析の結果か
ら見つかってきたタンパク質で、最近、オスの精巣で特異的に発現している事が分って来たが、その機能は不明である。	
 	
 ［目的と成果］	
 サイトグロビンの初期発生における機能を調べるため、この遺伝子を過剰発現させて、どのような表現系がでるか調べる。また、アンドログロビンの発生における機能をアフリカツメガエルやニシツメガエルを用いて調べる。	
 
	
 
研究業績	
 
①原著論文	 1.	
 Yanagisawa,	
 M.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Hanada,	
 H.,	
 Shinkai,	
 T.,	
 Yoshitome,	
 S.,	
 Kubo,	 H.,	 Sakai,	
 M.,	
 Fujii,	
 H.,	
 Yamashi,	
 M.,	
 Kashiwagi,	
 A.	
 Furuno,	
 N.	
 *,	
 
Watanabe,	
 M*.	
 (2012)	
 Analysys	
 of	
 the	
 head-defects	
 caused	 by	 hypergravity	 in	
 early	
 Xenopus	 embyos.	
 Biol.	
 Sci.	 Space,	
 26	
 1-6	
 	
 	
 
(*	
 Corresponding	 author)	
 	
 2.	
 Yoshitome,	
 S.,	
 Furuno,	
 N.,	
 Prigent,	
 C.	
 and	
 Hashimoto,	
 E.	
 (2012)	
 The	
 subcellular	
 localization	
 of	
 cyclin	 B2	
 is	
 required	
 for	
 bipolar	 spindle	 formation	
 during	
 Xenopus	
 oocyte	 maturation.	
 Biochemical	
 and	
 Biophysical	
 Research	
 communication,	
 422	
 770-775	
 	
 3.	
 Yanagisawa,	
 M.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Hanada,	
 H.,	
 Shinkai,	
 T.,	
 Yoshitome,	
 S.,	
 Kubo,	 H.,	 Sakai,	
 M.,	
 Fujii,	
 H.,	
 Yamashi,	
 M.,	
 Kashiwagi,	
 A.	
 Watanabe,	
 M*,	
 	
 
Furuno,	
  N.	
  *.	
  (2012)	
  Hypergravity	  specifically	  affects	  anterior	  head	 formation	
 in	
 early	
 Xenopus	 embryos.	
 Biol.	
 Sci.	 Space,	 26	
 47-52	 	 	 (*	
 Corresponding	 author)	
 	
 4.	
 Suzuki,	
 K.,	
 Isoyama,	
 Y.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Sakuma,	
 T.,	
 Ochiai,	
 H,	
 Sakamoto,	
 N.,	
 Furuno,	
 N.,	
 Kashiwagi,	
 A.	
 and	
 Yamamoto,	
 T.	
 High	
 efficiency	
 TALENS	 enable	
 F0	
  functional	
 analysis	
 by	
 targeted	 gene	
 disruption	
 in	
  Xenopus	
 laevis.	
 Biology	 Open,	
 in	
 press	 	 5.	
 Yanagisawa,	
 M.,	
 Furuno,	
 N.*,	 Watanabe,	
 M.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Hanada,	 H.,	
 Shinkai,	
 T.,	
 Yoshitome,	
 S.,	
 Kubo,	
 H.,	
 Sakai,	
 M.,	
 Fujii,	
 H.,	
 Suzuki,	 K.,	
 Yamashita,	
 M.	
 and	
 Kashiwagi,	
 A.	
 Hypergravity	
 specifically	 effects	
 head	
 formation	
 in	
 the	
 Xenopus	 embryos	 raseid	
 under	 hypergravity	 condition.	
 Space	 Utili.	
 Res.	 2012,	
 in	
 press	 	 (*	 Corresponding	 author)	
 
	
 

102

6.	
 Fujiwara,	
 Y.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Nakagawa,	
 M.,	
 Shinkai,	
 T.,	
 Yanagisawa,	
 M.,	
 Furuno,	
 N.,	
 Hanada,	
 H.,	
 Suzuki,	
 K.,	
 Katsu,	
 K.,	
 Yamashita,	
 M.,	
 Yamamoto,	
 T.,	
 Tanimoto,	
 Y.	
 and	
 Kashiwagi,	
 A.	
 Effects	
 of	
 magnetically	 controllled	
 microgravity	
 and	
 hypergravity	
 environment	 on	
 amphibian	 behavior.	
 Space	 Utili.	
 Res.	 2012,	
 in	
 press	 	
 ②総説・著書	 サイクリン B2 の細胞内局在と紡錘体形成	  吉留賢、古野伸明	
  生体の科学	
  印
刷中	
 
	
 
③学会発表	 	  国内学会	 	 	
  国際学会	 	
 ④科研費等の受け入れ状況	
 宇宙環境利用科学委員会研究班ワーキンググループ（2012）両生類の生活環に対する過重力の影響	
 15 万円、研究分但者	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 

103

プロジェクト研究③	
 先駆的両生類研究の展開	  −両生類絶滅危惧種の遺伝的多様性の解明と保全、および新規有用アプリケーションの開発-	
 
	
 
1)	
 
住田正幸,	 1)	 倉林敦，1)	
 井川武，1)	
 Islam	
 M.	
 Mafizul,	 1)	
 Alam	 M.	
 Shafiqul,	
 2)	
 
倉本満,	
 3)	
 大海昌平,	
 4)	
 勝連盛輝,	
 5)	
 海野徹也,	
 6)	
 浮穴和義,	
 7)	
 藤井保,	
 8)	
 井鷺
裕司	
 
1）
広島大学大学院理学研究科附属両生類研究施設	
 2）
宗像市ひかりが丘 3-6-15	
 3）
奄美市農林課	 4）
沖縄県環境衛生研究所	
 5）
広島大学大学院生物圏科学研究科	
 6）
広島大学大学院総合科学研究科	
 7）
広島県立大学人間文化学部	
 8）
京都大学大学院農学研究科	
 
	
 
研究内容	
 
[	
 １	
 ]	
 絶滅危惧種アマミイシカワガエルの飼育下における温度条件と遺伝的要因が個体生存率に与える影響	 Influence	
 of	
 temperature	
 condition	
 and	
 genetic	
 factors	
 on	
 survival	
 rates	 of	
 captive	 breeding	
 populations	 of	
 Odorrana	
 splendida	
 
	
 
[目的]	
 
	
  西南諸島は両生類に限らず動植物全般における生物多様性のホットスポット
であると同時に、島嶼という限定的な生息域によって絶滅の危険性も高い。実際、日本の両生類相における絶滅危惧種（環境省レッドリスト・IA、IB、および IIB 類）の半数は西南諸島固有種である。特に、日本産両生類における最美麗種といわれることも多い、イシカワガエルについては、最近、奄美大島集団が O.	
 splendida（アマミイシカワガエル）として新種記載された	
 (Kuramoto	
 et	
 
al.,	
 2011)。また、これらの種については、すでに人工交配と継代飼育に成功しており(Sumida	
 et	
 al.,	
 211)、島内における遺伝的多様性についても、マイクロサテライト遺伝子座を利用して、遺伝的多様性と微細集団構造が解明されている(Igawa	
 et	
 al.,	 2013)。	
 	
  遺伝的多様性と表現型との相関関係は、生物の保全を考える上で非常に重要であり、これらの正の相関は様々な分類群で報告されている。特に絶滅危惧種
においては、個体数の減少と合わせて絶滅への負の連鎖を引き起こすことが知られている。本研究では、飼育条件及び遺伝的要因が与える影響を検証すると
ともに、各世代の遺伝的指標の変化を予測し、遺伝的多様性を維持した効率的な継代飼育の方策を検討することを目的として、（1）定量的な条件下での個体生存率の調査、（2）シミュレーターによる継代後の遺伝的多様性変化の検証を
行った。	
 

104

	
 
[材料・方法]	
 (1)については、一腹卵を 3 分割し、血縁度の異なる 3 個体のオスの精子と受精させ、それぞれ 18℃、20℃、22℃の温度条件で飼育し、変態段階まで正常生存率を観察した。（2）については、各世代の作出に任意のペアを用いるランダム
モデル、アリル共有率が最も低いペアを用いる Minimal	
 Kinship	 （MK）モデルを C 言語により実装し、シミュレーションを行った。各世代の親数は 2～16 個
体とし、10 世代まで試行した。	
 	
 [結果・考察]	
 	
 (1)については、温度条件における生存率は 18℃が最も高く、20℃では劣り、22℃では、孵化段階でほぼ全個体が死亡した。遺伝的影響については、18℃では近親交配となる交配が最も生存率が低く、マイクロサテライト遺伝子座における子孫の予測ヘテロ接合度との間に正の相関がみられた。（2）については、親数が一定数以下の場合、MK 交配を行うことにより、ヘテロ接合度の減少が軽減されることが分かった。以上の結果から、本種の正常発生には温度条件が大きく影響し、近親交配一世代目においても近交弱勢の影響が示唆された。また、遺伝的影響の指標には、子孫の予測ヘテロ接合度が有効であり、本種の継代維
持には MK 交配法が望ましいと考えられた。	
 
	
 
[	
 ２	
 ]	
 絶滅危惧種オットンガエルとホルストガエルの人工繁殖の試みと繁殖隔離機構の解明（継続）	
 Artificial	
 breeding	
 and	
 postmating	 isolation	
 in	
 endangered	 frog	
 species	 Babina	 subaspera	
 and	
 B.	
 holsti	
 from	 Southwestern	
 Islands	
 
	
 
[目的]	
 
	
  オットンガエル（Babina	
 subaspera）とホルストガエル（Babina	
 holsti）は、
前足に５本の指を持つという無尾両生類としては特異な形態を持つことで広く知られている。両種は、それぞれ奄美大島（加計呂麻島含む）と沖縄島（渡嘉敷島含む）固有のカエルである。生息面積が少ないことに加え、昨今の環境破壊による個体数減少から、IUCN レッドリストにおいて、絶滅危惧種 B1 類にリス
トされ、さらに、鹿児島県および沖縄県の天然記念物に指定されている。これ
らの種を絶滅から防ぐ一つの方法として、飼育下繁殖を目指した研究を継続している。また、同胞種としての交配後隔離機構についての研究も継続している。	
 	 [材料・方法]	
 以前に交配を行った、オットンガエル 6 個体（雌親 3、雄親 3）、ホルストガエ
ル 4 個体（雌親 2、雄親 2）の人工交配によって生じた子孫（コントロールと正逆雑種）については、繁殖能力を調べるため、成熟期まで飼育を継続している。	
 
	
 

105

[結果・考察]	
 	  オットンガエルとホルストガエルのペアから得た 3 年齢の子孫（コントロー
ルと正逆雑種）（およそ 320 個体と 110 個体）を飼育中である。コントロールも
正逆雑種も正常に発育しており、生存率は、いずれも変態数のうちおよそ 20％で、雑種致死による隔離はみられなかった。なお、ヤエヤマハラブチガエル（雄）との交雑では、どちらの種も卵も卵割は見られるものの、孵化まではいたらず、
ヤエヤマハラブチガエルとオットン・ホルストガエル（狭義の Babina 属）の間には、完全な交配後隔離が発達していることが示されている。	
 	 	 [将来の展望]	
 	
  現在飼育中の人工交配子孫の飼育を継続し、性成熟を待って飼育下 2 世代目を得ることにより、絶滅危惧種であるオットンガエルとホルストガエルの飼育法と繁殖法を確立させる予定である。また、両種の正逆雑種については、成熟
させて、繁殖能力や精子形成について調べて、雑種不妊による隔離があるかど
うかを明らかにする予定である。これによって、両種の間の交配後の繁殖隔離機構を解明できる。	
 
	
 
	
 
[	
 ３	
 ]	
 絶滅危惧種イボイモリにおける飼育下繁殖と繁殖行動および行動の季
節変化の観察（継続）	
 Captive	 breeding,	
 reproductive	
 behaviors	
 and	
 seasonal	
 behavioral	
 changes	
 of	
 crocodile	 newt,	
 Echinotriton	
 andersoni	
 
	
 
[目的]	
 
	
  生物種の保全において、最も優先すべきは野外集団の保護、およびその周辺環境の維持である。しかしながら、多くの絶滅危惧種においては種生態学的知見が不足しており、具体的にどの時期に、どのような環境を利用しているのか
不明確な場合が多い。特に、イボイモリは側溝などの人工構造物などによって行動範囲が制限されるなど、移動能力に乏しいと考えられ、生息域における環
境利用の実態の解明が求められている。したがって、本研究では、集団の飼育
下繁殖を試みるとともに、存続に最も重要な繁殖行動、特に有尾両生類に特徴的な求愛・産卵行動および、行動の季節変化を観察することを目的として研究を行った。	 	
 [材料・方法]	
 ①	
 イボイモリにおける飼育下繁殖	 	
  昨年に続き、徳之島・三京産の野外個体について、繁殖装置での飼育下繁殖の試みを継続した。	
 ②求愛行動と行動の季節変化の観察	
 	  徳之島・三京産 9 個体を飼育しているケージに、赤外線ネットワークカメラ
および、赤外線 LED ライトを設置し、継続して録画を行った。求愛行動については、可能性の高い時間帯と時期を考慮し、5 分ごとに区切られた 55000 個のビ

106

デオ映像を目視により精査し、観察した。また、行動の季節変化については、
毎日の 2 時、8 時、14 時、20 時の 5 分間の映像を確認し、飼育ケージ内のシェルターから出てきた個体数をカウントした。	
 	
 [結果・考察]	
 ①今年度も昨年に続いて、徳之島のもので、飼育下繁殖に成功した。変態率は83％、2 ヶ月幼体で 61％であった。環流式の幼生飼育システムを確立して、共食いをさけて安定して幼生を飼育することが可能になった。	
 ②求愛行動については、近縁種であるチンハイイボイモリで観察された行動パ
ターン(Sparreboom	
 et	
 al.,	 2001)とよく似た行動を観察できた。具体的な行動は、まず、オスがメスに接近して体側面にアプローチし、メスが逃げるのをオスが追いかけることから始まる。その後、オスが再度メスに接触し、今度は雌雄が同円周状に回転するというパターンであった。一周が 5 分から 10 分と非常にゆっくりとしたペースであり、この回転の途中でオスが総排出腔付近を震わせる姿が確認できた。また、雌雄が回転している場所はケージ内の水辺に近い
湿度のある地面でのみ行われていた。また、行動が活発化していた時期も、2 月下旬から 3 月上旬、5 月上旬と 7 月上旬で、シェルターから出ている個体が増えており、求愛行動が観察された時期と一致していた。	
 	
  産卵行動については、メスが障害物の下に潜り込み、円周状に動きながら卵を産み落とす行動が観察できた。イボイモリの卵は、野外において落ち葉の下に見つかること、卵は塊状にまとまって確認されることが知られており(又吉ら	 1978)、観察された行動は野外においても同様の行動パターンであると考えられる。	
 	
  本研究によりイボイモリの繁殖行動が初めて明らかになった。特に、イボイ
モリの繁殖行動には地表面の湿度および、適当な遮蔽物が必要であることが示唆された。したがって、イボイモリは普段は比較的乾燥した場所に生息するが、繁殖行動を行う上では、生息地周辺に適度な大きさの水辺が必要であり、生息域の景観の維持が個体群の存続に重要であると考えられた。	
 
	
 
[	
 ４	
 ]	
 絶滅危惧種アマミハナサキガエルの飼育下繁殖の試み	
 Artificial	
 breeding	
 for	
 endangered	 frog	
 species	
 Odorrana	 amamiensis	
 from	
 Amami	 Island	
 
	
 
[目的]	
 
	
  アマミハナサキガエル(Odorrana	 amamiensis)は、奄美大島と徳之島に固有のカエルである。生息面積が少ないことに加え、昨今の環境破壊による個体数減
少から、IUCN レッドリストにおいて、絶滅危惧種 B1 類にリストされ、さらに、鹿児島県の天然記念物に指定されている。この種を絶滅から防ぐ一つの方法として、人工受精法による飼育下繁殖の確立を目指している。	
 	 [材料・方法]	
 	  奄美大島産アマミハナサキガエル 4 個体（雄親 2、雌親 2）を用いて、人工受

107

精法により、人工交配を行い、その後の生活力を調べた。	
 	
 [結果・考察]	
 	  アマミハナサキガエルの 2 ペアから得た子孫（およそ 70 個体）を飼育中である。生存率は、およそ 25％であった。	
 	 	 [将来の展望]	
 	
  現在飼育中の人工交配子孫の飼育を継続し、性成熟を待って飼育下 2 世代目を得ることにより、絶滅危惧種であるアマミハナサキガエルの飼育法と繁殖法を確立させる予定である。	
 
	
 
[	
 ５	
 ]バングラデシュ産トラフガエル類における遺伝的多様性と繁殖隔離機構	
 Genetic	 diversity	
 and	
 postmating	 isolation	
 of	
 the	
 Indian	 bullfrog	 (Hoplobatrachus	
 tigerinus	
 and	
 Hoplobatrachus	 lateralis)	
 from	 Bangladesh	
 
	
 
[目的]	
 	
 
	
  バングラデシュでは乱獲等によりトラフガエル H.	
 tigerinus が野外で激減しており、本種の採集は法律で禁止されている。一方最近、バングラデシュの南東沿岸域から近縁種ハマトラフガエル H.litoralis が新種として記載された(Hasan	 et	
 al.,	 2011)。本研究では、バングラデシュ全域における本種群の遺伝的多様性を明らかにするとともに、これら 2 種間の交配後隔離機構を明らかにすることを目的に、野外から採集した個体を使って、ミトコンドリア DNA の
Cytb 遺伝子を解析するとともに、人工受精法によって交雑実験を行った。	
 	
 [材料･方法]	
 バングラデシュのトラフガエルとハマトラフガエルについて、分布の全域を網羅した 34 集団から 133 個体を採集し、これらの個体の肢指から全ゲノム DNAを抽出精製して、Cytb 遺伝子全長の塩基配列を解析した。また、トラフガエ
ル 7 個体（雌親 3、雄親 4）とハマトラフガエル 5 個体（雌親 1、雄親 4）を用いて、人工受精法によって交雑実験を行い、雑種とそのコントロールの生活力を観察した。	
 	
 [成果･考察]	
 Cytb 遺伝子の塩基配列から、バングラデシュでは、本種群は大きく 2 つのグループに分化していること、各グループについては、集団間の分化はきわめて小さいことがわかった。また、2 種間の正逆雑種はコントロールとほぼ同様に正常に発育し、変態後も正常に発育している。変態率は 65％または 20％であった。
これら 2 種は配偶子隔離や雑種致死による隔離はないことがわかった。今後、成熟したもので、繁殖能力や精子形成などを観察することが必要である。	
 
	
 
[	
 ６	
 ]	
 絶滅危惧種における精子凍結保存法の確立	
 Establishment	  of	  the	
  sperm	  cryopreservation	  method	  in	
  the	
  endangered	
 108species	
 
	
 
[目的]	
 
	
  絶滅危惧種の域外保全を行う上で、精子凍結保存は有効な手法である。両生類では、ツメガエルで精子凍結保存法が一般化されており、また、陸上性ガエ
ルでも、精子凍結保存後の受精率を観察した例がある。しかし、絶滅危惧両生類において、精子凍結保存を用いた域外保全法は確立されていない。本研究では、絶滅危惧両生類において精子凍結保存と人工授精を組み合わせた簡便な域外保全法を確立することを目的とした	 	
 [材料・方法]	
 	  	  ツメガエル類で確立されている精子凍結保存法は、液体窒素を使わず、-80oCのディープフリーザーを用いる。また、高価な試薬が不要という利点があり、きわめて低コストで実施が可能である。本研究では、この方法を絶滅危惧種のイシカワガエルと、普通種のニホンアカガエル（ただし、広島県では絶滅危惧種）に適用した。	
 	
 [成果･考察]	
 
凍結精子（27 時間から 1 ヶ月、-80oC で凍結）を解凍し、運動能を調べた結果、凍結した精子のほとんどは、運動能を喪失していた。しかし、この精子を用いて人工授精を行った結果、イシカワガエルとニホンアカガエルのどちらにおいても、正常卵割する卵が観察でき、-80℃保存精子にも受精能が残っていることが明らかになった。受精率は保存期間や卵の状態によって変動し、27 時間保存
では受精率は 5.0～36.8％であり、1 週間保存では、2.3～9.0％、1 ヶ月保存では 1.7％～4.6％であった。また、イシカワガエル・ニホンアカガエルの双方で、尾芽胚期以降の発生は見られなかったが、これは凍結していない通常の精子を用いた人工授精コントロール胚でも同様であった。このため、本年度用いた卵の状態が悪く、発生が進行しなかったと考えられる。	
 
	
 
[	
 ７	
 ]絶滅危惧種イシカワガエルの皮膚に存在する抗菌ペプチドの解析（継続）	
 Minimal	 inhibitory	
 concentration	
 of	
 antimicrobial	
 peptides	
 in	
 the	
 skin	 of	
 an	
 endangered	 frog	
 Odorrana	 ishikawae	
 
	
 
[目的]	
 
日本で最も美しいといわれるイシカワガエル(Odorrana	 ishikawae)は、奄美大島と沖縄本島の固有種である。近年個体数が減少しており、環境省レッドリス
トでは絶滅危惧ⅠB 類に分類されており、沖縄県と鹿児島県では天然記念物に指定されている。一方、本種は人工繁殖に成功しており、飼育室では感染症に対する抵抗性を示すことが分かっている。このことから絶滅危惧に瀕している原因の一つに、野生環境下での自然免疫システムの低下の可能性が考えられる。
水辺という微生物の攻撃を受けやすい環境にいるカエルにとって、皮膚から分泌される抗菌ペプチドは重要な生体防御因子であり、自然免疫システムの要と109なっている。先行研究により、イシカワガエルの皮膚から生化学的手法により10 種類の抗菌ペプチドが単離・同定されている。さらに、分子生物学的手法により 12 種類の分泌ペプチドが推定され、これらの中には既存の抗菌ペプチドフ
ァミリーとは全く異なる構造を持つ新奇なペプチドが含まれている。本研究では、これら 22 種類のペプチドのグラム陰性菌・グラム陽性菌・真菌に対する最小発育阻止濃度（Minimal	
 inhibitory	
 concentration	
 ;	 MIC）を測定し、有効菌種のレパートリーを示す抗菌スペクトルを評価することを目的とした。	
 	 [材料・方法]	
 最小発育阻止濃度測定は、96 穴プレートの各ウェルに培地 49 レー、接種菌液
50 種菌、ペプチド 1 ペプ（2 倍希釈系列で 7 段階の濃度）を加え 100 濃度とし、37℃で 1 晩静置培養した。培養後、マイクロプレートリーダーで吸光度の測定を行うとともに、ウェルに白濁や沈殿がないかを目視することにより、効果を判定した。評価菌種は、グラム陰性菌の大腸菌(E.	
 coli)、グラム陽性菌の黄色ブドウ球菌(S.	
 aureus)・メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)・枯草菌(B.	
 subtilis)、真菌のカンジダ菌(C.	
 albicans)の計 5 種類を用いた。	
 	
 [結果と考察]	
 全体的な傾向として、細菌の E.	
 coli や S.	
 aureus には強い抗菌活性を示すペプチドが多く確認されたが、真菌の C.	
 albicans に対する抗菌活性は弱かった。
これらのペプチドの中には MRSA に対して強い抗菌活性を示すものもあった。また、皮膚から単離・同定されたペプチドは抗菌活性が強く、抗菌作用の有効菌種が多いことから広域の抗菌スペクトルを持つと考えられる。これに対して、遺伝子解析から推定された既存の抗菌ペプチドファミリーとは全く異なる構造を持つ新奇なペプチドには抗菌活性は認められなかったが、今回使用しなかった菌種に対し抗菌活性を持つ可能性も考えられる。以上の研究により、イシカ
ワガエルは多種多様の抗菌ペプチドを備えており、人工繁殖された本種では抗菌ペプチドによる自然免疫システムは正常に働いていると考えられる。今後は野生環境下のイシカワガエルや他の Odorrana 属・Rana 属のカエルの遺伝子発現レベルや抗菌活性と水質悪化や環境ホルモンなどとの関係を解析することで、野生環境におけるイシカワガエルの絶滅危惧の要因を解明していきたいと考え
ている。	
 
	
 
[	
 ８	
 ]	
 光る透明ガエル「スケルピョン」の作製（継続）	
 (Production	
 of	
 illuminating	 see-through	 frogs)	
 
	
 
[目的]	
 
これまでに、2 種の色素細胞を欠き、皮膚が透けて見えるニホンアカガエル「透明ガエル」（通称・スケルピョン）の作出と継代維持に成功している。透明ガエ
ルは、実験的に生み出された内臓透視可能な唯一の四足動物であり、実験動物としてのポテンシャルは高い。一方で、アカガエルは非モデル動物であるため、

110透明ガエルを研究界に導入するためには、実験手法の確立・基礎データの収集・実験の成功例の明示というステップが必須である。本研究では、透明ガエルの有用実験動物化の第一ステップとして、ニホンアカガエルへの遺伝子導入方法を構築し、「光る透明ガエル」の作出を目的として研究を開始した。	
 	 [材料・方法]	
 ニホンアカガエル野生型を実験に用いた。顕微注入の前段階として、受精卵のゼリーを除去する方法を検討した。また、顕微注入の条件検討を行うために、
mCherrymRNA	
 をマーカとして用いた。さらに、ツメガエルのプロモーターがニ
ホンアカガエルでも機能するかを検討するために、アフリカツメガエルカルディアックアクチンプロモーター連結 EGFP ベクターをニホンアカガエル幼生尾部の体節に顕微注入し、EGFP の発現を蛍光顕微鏡で確認した。	
 	
 [結果と考察]	
 	  ニホンアカガエル受精卵ゼリー層の除去を、ツメガエルで行われている方法
で行った所、卵が変形し、死亡した。このため、多数の試薬条件を検討した結果、チオグリコール酸ナトリウム 5％・pH9 の条件で、卵を生かしたまま脱ゼリーが可能であることが分かった。	
 	
  アフリカツメガエルカルディアックアクチンプロモーター連結 EGFP ベクター
を、ニホンアカガエル幼生尾部に顕微注入した。その後、注入部位を蛍光顕微鏡で観察した所、EGFP の発光が見られた。この結果から、アフリカツメガエル
カルディアックアクチンプロモーターがニホンアカガエルの筋組織でも機能することが確認された。	
 	
  ゼリー除去アカガエル受精卵に、mCherry	 mRNA	
 を顕微注入し、３日後に蛍光顕微鏡下で	 mCherry の発現を観察した。その結果、mCherry 溶液(107ng/ul)を
20・200nl 注入した胚で、mCherry の発現が見られた。これら mCherry 発現胚は、胞胚以降の発生が進まなかったが、ゼリーを除去せず顕微注入も行っていない
コントロール胚も同じステージ以降の発生が進まなかった。このため、胚の発生停止は、ゼリー除去や顕微注入が原因ではなく、本年度に準備できた受精卵の状態が悪かった（実験開始時期が、通常の繁殖シーズンより 3 ヶ月程遅かった）と考えられた。	
 	
  本年度の研究により、卵ジェリーを取り除く溶液、インジェクション時の針の太さ、インジェクション時のガス圧、注入 DNA、I-SceI（あるいは蛍光色素タ
ンパク質 mRNA）の濃度と容量、インジェクション時とその後の受精卵維持水の水質と至適温度など、顕微注入実験に必要な条件を大幅に絞り込むことができた。今後は、繁殖シーズンに状態の良い受精卵を用いてあわせて、実験を行う必要がある。	
 
	
 
	
 
研究業績	
 
①原著論文	
 1.	
 Komaki,	
 S.,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 K.	
 Tojo,	
 and	 M.	
 Sumida	 (2012)	
 111

Distributional	
 change	 and	
 epidemic	
 introgression	
 in	
 overlapping	 areas	 of	
 Japanese	 pond	
 frog	
 species	 over	 30	
 years.	
 Zool.	
 Sci.,	
 29:	
 351-358.	
 
	
 	
 	
 
2.	
 Hasan,	
 M.,	
 M.	
 Kuramoto,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 S.	
 Alam,	
 M.	
 M.	
 R.	
 Khan	 and	
 M.	
 Sumida	 (2012)	
 A	
 new	
 species	 of	
 genus	 Hoplobatrachus	
 (Anura,	 Dicroglossidae)	
 from	 the	
 coastal	
 belt	 of	
 Bangladesh.	
 Zootaxa,	
 3312:	 45-58.	
 	
 3.	
 Sugawara,	
 H.,	
 T.	
 Igawa,	
 M.	
 Yokogawa,	
 M.	
 Okuda,	
 S.	
 Oumi,	
 S.	
 Katsuren,	
 S.	
 Kaneko,	
 T.	
 Umino,	
 Y.	
 Isagi	
 and	 M.	
 Sumida	 (2012).	
 Isolation	
 and	
 characterization	
 of	
 ten	
 microsatellite	 loci	 of	
 endangered	
 Anderson’s	 crocodile	 newt,	
 Echinotriton	
 andersoni.	
 Conser.	
 Genet.	
 Res.,	
 4:	
 595–598.	
 
	
 
4.	
 Alam,	
 M.	
 S.,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 M.	
 R.	
 Khan,	
 M.	
 Hasan,	
 R.	
 Wanichanon	
 and	
 
M.	
 Sumida	 (2012)	
 Postmating	 isolation	
 in	
 six	
 species	 of	
 three	 genera	 (Hoplobatrachus,	
 Euphlyctis	
 and	
 Fejervarya)	
 from	
 family	
 Dicroglossidae	 (Anura),	
 with	
 special	
 reference	
 to	
 spontaneous	
 production	
 of	
 allotriploids.	
 Zool.	
 Sci.,	
 29:	
 743-752.	
 
	
 
5.	
 Igawa,	
 T.,	
 S.	
 Oumi,	
 S.	
 Katsuren	
 and	
 M.	
 Sumida	 (2013)	
 Population	 structure	
 and	
 landscape	 genetics	
 of	
 two	
 endangered	 frog	
 species	 of	
 Genus	 Odorrana:	
 different	 scenarios	
 on	
 two	
 islands.	
 Heredity,	
 110:	
 46-56.	
 	
 
	
 
6.	
 Kakehashi,	
 R.,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 S.	
 Oumi,	
 S.	
 Katsuren,	
 M.	
 Hoso	 and	
 M.	
 Sumida	 (2013)	
 Mitochondrial	 genomes	 of	
 Japanese	
 Babina	 frogs	 (Ranidae,	 Anura):	
 unique	 gene	 arrangements	
 and	
 the	
 phylogenetic	
 position	
 of	
 genus	 Babina.	
 Genes	 Genet.	
 Syst.,	
 88:	
 59-67.	
 	
 7.	
 Kakehashi,	
 R.,	
 T.	
 Igawa,	
 N.	
 Iwai,	
 E.	
 Shoda-Kagaya,	
 and	
 M.	
 Sumida	 (2013)	
 Development	
 and	
 characterization	
 of	
 new	
 microsatellite	 loci	
 in	
 the	
 Otton	 frog	
 (Babina	
 subaspera)	
 and	
 cross-amplification	
 in	
 a	
 congeneric	 species,	 Holst’s	 frog	 (B.	
 holsti).	
 Conser.	
 Genet.	
 Res.,	
 5:	
 in	 press.	
 	
 ②総説･著書･その他	
 	  該当無し	 	
 ③学会発表	
 
国際学会	
 
1.	
 Komaki,	
 S.,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 K.	
 Tojo,	
 and	 M.	
 Sumida	 “Distributional	
 change	 and	
 epidemic	
 introgression	
 in	
 overlapping	 areas	 of	
 Japanese	 pond	
 frog	
 species	 over	 30	
 years”	
 7th	
 World	 Congress	 of	
 Herpetology	
 (August	
 9,	
 2012,	
 University	
 of	
 British	
 Columbia,	
 Vancouver,	 112

Canada)	
 	
 2.	
 Kurabayashi,	
 A.,	
 M.	
 Matsui,	 Daicus,	
 M.	
 B.,	
 H.	
 S.	
 Yong,	
 N.	
 Ahmad,	 A.	
 Sudin,	
 M.	
 Kuramoto,	
 A.	
 Hamidy,	
 and	
 M.	
 Sumida	 “From	 Antarctica	 or	
 Asia?	
 New	
 colonization	
 scenario	
 for	
 Australian-New	
 Guinean	 narrow	 mouth	 toads	 suggested	
 from	 the	
 findings	
 on	
 a	
 mysterious	
 genus	 Gastrophrynoides”	
 7th	 World	 Congress	 of	
 Herpetology	
 (August	
 10,	
 2012,	
 University	
 of	
 British	 Columbia,	
 Vancouver,	
 Canada)	
 	
 3.	
 Islam,	
 M.	
 M.,	
 H.	
 Tokimitsu,	
 M.	
 Uchida,	
 M.	
 Iwanari,	
 T.	
 Fujii,	
 and	
 M.	
 
Sumida	 “Genetic	
 divergence	
 and	
 postmating	 isolation	
 among	 the	
 brown	 frogs	 from	 Ryukyu	
 Archipelago,	
 Japan,	
 elucidated	
 by	 allozyme	
 and	
 mitochondrial	
 gene	
 sequence	 analyses,	 crossing	 experiments	
 and	
 cytological	
 observations”	
 7th	
 World	 Congress	 of	
 Herpetology	
 (August	
 11,	
 2012,	
 University	
 of	
 British	
 Columbia,	
 Vancouver,	
 Canada)	
 	
 4.	
 Sumida,	
 M.,	
 N.	
 Satou,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 T.	
 Igawa,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 K.	
 Ukena,	 S.	
 Oumi,	
 S.	
 Katsuren,	
 and	
 T.	
 Fujii	 “Artificial	
 and	
 natural	 breeding	
 of	
 
the	
 endangered	 frog	
 species	
 Odorrana	 ishikawae	
 and	
 Odorrana	
 splendida,	
 analysis	 of	 genetic	
 diversity,	
 and	
 usage	 as	 resource	 materials:	
 Case	
 study	
 of	
 fauna	 conservation	
 in	
 Japan”	
 7th	 World	 Congress	 of	
 Herpetology	 (August	 11,	
 2012,	
 University	
 of	
 British	
 Columbia,	
 Vancouver,	
 Canada)	
 	
 5.	
 Alam,	
 M.	
 S.,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 M.	
 R.	
 Khan,	
 M.	
 Hasan,	
 R.	
 Wanichanon	
 and	
 
M.	
 Sumida	 “Postmating	 isolation	
 in	
 six	
 species	 of	
 three	 genera	 (Hoplobatrachus,	
 Euphlyctis	
 and	
 Fejervarya)	
 from	
 family	
 Dicroglossidae	 (Anura),	
 with	
 special	
 reference	
 to	
 spontaneous	
 production	
 of	
 allotriploids”	
 7th	
 World	 Congress	 of	
 Herpetology	 August	 11,	
 2012,	
 University	
 of	
 British	
 Columbia,	
 Vancouver,	
 Canada)	
 	
 6.	
 Hasan,	
 M.,	
 M.	
 Kuramoto,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 S.	
 Alam,	
 M.	
 M.	
 R.	
 Khan	 and	
 M.	
 Sumida	 “A	 new	 species	 of	
 genus	 Hoplobatrachus	
 (Anura,	 Dicroglossidae)	
 
from	
 the	
 coastal	
 belt	 of	
 Bangladesh”	
 7th	
 World	 Congress	 of	
 Herpetology	 (August	 12,	
 2012,	
 University	
 of	
 British	
 Columbia,	
 Vancouver,	
 Canada)	
 	
 7.	
 Kakehashi,	
 R.,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 S.	
 Oumi,	
 S.	
 Katsuren,	
 M.	
 Hoso,	
 and	
 M.	
 
Sumida	 “Complete	 mitochondrial	 sequences	
 of	
 the	
 three	 Japanese	
 Babina	 (Ranidae,	 Anura)	
 species	
 and	
 the	
 phylogenetic	
 position	
 among	 Ranidae”	
 7th	 World	 Congress	 of	
 Herpetology	
 (August	
 12,	
 2012,	
 University	
 of	
 British	 Columbia,	
 Vancouver,	
 Canada)	
 	
 8.	
 Hasan,	
 M.,	
 M.	
 Kuramoto,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 S.	
 Alam,	
 M.	
 M.	
 R.	
 Khan	 and	
 M.	
 Sumida	 “A	 new	 species	 of	
 genus	 Hoplobatrachus	
 (Anura,	 Dicroglossidae)	
 113

from	 the	
 coastal	
 belt	 of	
 Bangladesh”	
 18th	 Biennial	
 International	 Conference	
 and	
 Annual	
 General	
 Meeting	 2012,	
 (December	
 22,	
 2012,	
 University	
 of	
 Dhaka,	 Bangladesh)	
 
	
 
国内学会	
 
1.	
 住田正幸・井川武・Islam	
 M.	
 M.・新谷望・掛橋竜祐・菅原弘貴・倉林敦・
大海昌平・勝連盛輝・田戸美雪・藤井保「中央琉球産絶滅危惧両生類 5 種の遺伝的分化と飼育下繁殖」	
 日本動物学会第 83 回大会（2012 年 9 月 15 日、大阪大学、豊中）	
 
	
 
2.	
 Alam,	
 M.	
 S.・M.	
 M.	
 Islam・M.	
 M.	
 R.	
 Khan・	
 M.	
 Hasan・R.	
 Wanichanon・M.	
 Sumida	 “Postmating	 isolation	
 in	
 six	
 species	 of	
 three	 genera	 (Hoplobatrachus,	
 Euphlyctis	
 and	
 Fejervarya)	
 from	
 family	
 Dicroglossidae	 (Anura),	
 with	
 special	
 reference	
 to	
 spontaneous	
 production	
 of	
 allotriploids”	
 日本動物学会第 83 回大会（2012 年 9 月 15 日、大阪大学、豊
中）	
 
	
 
3.	
 小巻翔平・倉林敦・イスラム	 モハメド	 マフィズル・東城幸治・住田正幸「日本産トノサマガエル種群の分布重複域における浸透交雑と 30 年間で生じた分布変化」日本動物学会第 83 回大会（2012 年 9 月 15 日、大阪大学、豊中）
	
 
	
 
4.	
 井川武・菅原弘貴・本田正尚・富永篤・大海昌平・勝連盛輝・太田英利・
松井正文・松井正文「マイクロサテライトマーカーを用いた絶滅危惧種および天然記念物イボイモリの遺伝的集団構造の解明」日本遺伝学会第 84 回大会（2012 年 9 月 25 日、九州大学、福岡）	
 
	
 
5.	
 Islam,	 M.	
 M.・H.	
 Tokimitsu・M.	
 Uchida・M.	
 Iwanari・T.	
 Fujii・M.	
 Sumida	 “Genetic	
 divergence	
 and	
 postmating	 isolation	
 among	 the	
 brown	 frogs	 from	
 Ryukyu	 Archipelago,	
 Japan,	
 elucidated	
 by	 allozyme	
 and	
 mitochondrial	
 gene	
 sequence	 analyses,	 crossing	 experiments	
 and	
 cytological	
 observations”	
 日
本遺伝学会第 84 回大会（2012 年 9 月 26 日、九州大学、福岡）	
 
	
 
6.	
 住田正幸・井川武・イスラム	 モハメド	 マフィズル・新谷望・掛橋竜祐・
菅原弘貴・西谷琢磨・倉林敦・大海昌平・勝連盛輝・田戸美雪・藤井保	
 「南西諸島の絶滅危惧両生類における遺伝的分化と飼育下繁殖」日本爬虫両棲類
学会第 51 回大会（2012 年 11 月 10 日、愛知学泉大学、豊田）	
 
	
 
7.	
 新谷望・井川武・住田正幸	
 「アマミイシカワガエルの飼育下における温度条件と遺伝的要因が個体生存率に与える影響」日本爬虫両棲類学会第 51 回
大会（2012 年 11 月 10 日、愛知学泉大学、豊田）	
 
	
 
8.	
 倉林敦・掛橋竜祐・田澤一朗・住田正幸・原本悦和・大嶋友美・伊藤弓弦	 「次世代モデル動物ネッタイツメガエルとその輸送法の改善について」日本

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爬虫両棲類学会第 51 回大会（2012 年 11 月 10 日、愛知学泉大学、豊田）	
 
	
 
9.	
 徳増大輔・井川武・Min	 Mi-Sook・住田正幸「ウシガエルはどこから来て、なぜ駆逐されないのか？：侵入成功と個体群存続における遺伝的要因の調査」
日本爬虫両棲類学会第 51 回大会（2012 年 11 月 10 日〜11 日、愛知学泉大学、
豊田）	
 
	
 
10.	
 Hasan,	
 M.・M.	
 Kuramoto・M.	
 M.	
 Islam・M.	
 S.	
 Alam・M.	
 M.	
 R.	
 Khan・
M.	
 Sumida	 “A	 new	 species	 of	
 genus	 Hoplobatrachus	
 (Anura,	 Dicroglossidae)	
 
from	
 the	
 coastal	
 belt	 of	
 Bangladesh”	 	
 日本爬虫両棲類学会第 51 回大会（2012 年 11 月 11 日、愛知学泉大学、豊田）	
 
	
 
11.	
 住田正幸「ネッタイツメガエルの近交化・標準系統の樹立・提供」第３
期 NBRP 開始記念ナショナルバイオリソースプロジェクト(NBRP)シンポジウム-第３期への挑戦-（2012 年 11 月 21 日、品川）	
 	
 ④科研費等の受け入れ状況	
 1.	
 文部科学省特別教育研究経費—国際的に卓越した教育研究拠点機能の充実	
 先駆的両生類研究の展開—両生類絶滅危惧種の保全	
 12,740 千円	
 （担当：住田
正幸、矢尾板芳郎）	
 
	
 
2.	
 科学研究費補助金	
 基盤研究(B)「絶滅危惧両生類における遺伝的多様性評
価と保全のための包括的研究」5,850 千円（研究代表者：住田正幸、研究分担
者：倉林敦、井川武、Islam	
 M.	
 M.）	
 
	
 
3.	
 奨学寄付金「インドネシアの種多様性に関する研究」（Brawijaya 大学 Aris	 Soewondo）3,000 ドル（担当：住田正幸）	
 
	
 
4.	
 科学研究費補助金	
 若手研究(B)「西南諸島に産する両生類絶滅危惧種の遺伝的多様性の解明と飼育繁殖における遺伝的管理」1,300 千円（担当：井川武）	
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