1 細胞ゲノミックスの為の試薬と環境
DNA-free phi29 DNA ポリメラーゼの開発
Reagents and environment for single cell genomics
高橋宏和① , ② , ③、岡村好子① , ②、小堀俊郎③

Hirokazu Takahashi, Yoshiko Okamura, Toshiro Kobori①広島大学大学院 先端物質科学研究科
Graduate School of Advanced Sciences of Matter, Hiroshima University②独立行政法人科学技術振興機構 , CREST, 広島
CREST, Japan Science and Technology Agency (JST), Hiroshima③（独）農業・食品産業技術総合研究機構 食品総合研究所
National Food Research Institute, National Agriculture and Food Research Organization

短く、特に NGSではさらに短いため、様々な微生物種のはじめに膨大な短い断片情報の中から、断片化前のゲノム配列

人類にとって微生物は重要な生物資源であり、これを再構築して有用遺伝子を探索することは非常に困難

までに様々な酵素が微生物から発見され、食品加工やである。そのため、メタゲノム解析で新規有用遺伝子を医薬品製造など多くの産業分野で利用されている。し単離したという報告は、メタゲノム解析の報告数に比べかし、従来の微生物研究は単離・培養を基本技術として格段に少ない。ていることから、これまでは培養可能な微生物しか有用

そこで近年では難培養微生物の生態や生理機能を酵素の探索対象にされてこなかった。このため、地球上解析する方法として、シングルセルゲノミクス（single cellに存在する微生物種の 99% 以上を占めると言われていgenomics）と呼ばれる手法が提案されている 3）。これは、る培養が困難または不能な難培養微生物の生態につ環境中の微生物群集から微生物 1 細胞を単離し、全ゲいては現在もほとんど解析が進んでいない。従って、難ノム増幅（Whole genome amplification, 以下 WGA）と呼培養微生物は生物資源として非常に大きな潜在的可ばれる手法でゲノムDNA 全体を複製し、複製したゲノ能性を秘めているにも関わらず、未だ手付かずの状態

ム DNA の塩基配列を決定する方法である。微生物 1である 。

細胞から全ゲノム配列の解析が可能となれば、培養す

1）22これら難培養微生物を解析する方法としてメタゲノムることができない微生物であってもゲノムDNAの情報か解析という手法が主に利用されてきた。メタゲノム解析

ら生態や生理機能を推測することができ4-5）、さらにはゲ

は、海水や土壌など環境サンプルに含まれる微生物群

ノム配列情報から難培養性微生物の培養条件の推定集や、糞便に含まれる腸内細菌群集の DNAをまとめてや、新規有用遺伝子群を探索することも可能であるとさ回収し、その塩基配列をそのまま大量解読する手法でれている。この WGAに最適な増幅方法として、10 年ほある 2）。メタゲノム解析はサンプルに含まれる微生物のど前からphi29 DNAポリメラーゼ（以下、phi29 DNAP）

種類やその構成等を解析するには非常に有効な手法を利用した Multiple displacement amplification（ MDA）

であり、特に次世代シークエンサー（NGS）の登場によっ法 6）が有力な方法として今日最も多く利用されている。て解析量が飛躍的に拡大してからは、メタゲノム解析

しかしながら、実際に MDAをシングルセルゲノミクスにの報告は年々増加増傾向にあり、例えば、腸内細菌の適用するためにはいくつかの問題が存在している。

種類比が肥満に関与していることや病気との因果関係

本報ではまず初めに、シングルセルゲノミクスのキーポなどが示唆されている。しかしながら、シークエンサーでイントであるWGAに適した試薬としての DNA-free phi29

解読できる個々の塩基配列長は長くても600 bp 程度とDNAPの開発について報告する。

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DNA-free phi29 DNA ポリメラーゼの開発て、（1）増幅バイアスが起きにくい、（2）全ゲノム配列に対

phi29 DNAPとMDA 法するカバー率が高い、（3）増幅後の収量がマイクログラ

phi29 DNAPは、枯草菌（Bacillus subtilis）に感染する

ムからミリグラムオーダーと非常に高い、などがあり、限ら7）バクテリオファージphi29が持つDNAポリメラーゼである 。

れた数の細胞や貴重なサンプルもMDA で試料 DNA 全

phi29 DNAPは、（1）30℃付近で活性を持つ、（2）強い 3ʼ

体を複製することにより、様々な遺伝子解析に用いること→ 5ʼエキソヌクレアーゼ活性を持ち、複製のエラー率がが可能になる。実際 MDA は現時点で最も主力となる極めて低い、（3）DNA 合成速度が速い、（4）一度の反WGAであり、既に海外メーカーでキット化されている。

応で長い DNA（70 kb 以上）を合成できる、そしてなにより（5）強い鎖 置 換 活 性を持ち、伸 張 方 向にある 2 本 鎖DNAをほどきながらDNA 合成を進めることができる（図MDA の問題点

1）、といった他の DNAポリメラーゼにはないユニークな特MDAは極わずかな試料 DNA でもDNA 全体を正確徴を持つ。phi29 DNAPのこのような特徴を最大限に利用かつ大量に複製することができる革新的な技術である。

したMDAの増幅原理 は図 2に示す。MDAの特性とししかし、MDAはその増幅原理から、反応溶液に含まれ6）る全ての DNA が増幅されてしまう。そればかりか反応溶液に試料 DNAを添加していないにも関わらず、試料DNAを添加した場合とほぼ同等量の増幅産物が検出され（図 3）、何らかの DNA が非特異的な増幅産物として生成されたことが分かる。また、極めて微量の試料DNAを MDAに用いた場合、試料 DNAに対する夾雑DNAの割合が高くなり、結果として非特異産物が大部分を占めることになり、実験結果の信頼性を揺るがす大きな問題になる。このように、増幅産物の有無または増幅量だけでは目的の DNA が増幅されたかどうかを判断できないため、増幅産物が目的の試料 DNAに由来するかどうかを検証する何らかの方法、例えば制限酵素切
図 1 phi29 DNAポリメラーゼによるDNA 合成の模式図
phi29 DNAポリメラーゼは強い鎖置換活性を持ち、伸張方向にある2 本鎖DNAをほどきながら（鎖置換反応）、DNA 合成はそのまま継続される。

断によるバンドパターンの解析や PCRによる既知領域の増幅等が必要である 8-9）。

図 3 MDA 反応産物のアガロース電気泳動結果（+）
鋳型有り、（−）
鋳型無し、MはDNAサイズマーカー。全ゲノムMDA 反応産物は非常に大きな長さになるため、ゲノム DNA の電気泳動同様に約20 kb 近辺に滞留する。

例として、既に市販されているphi29 DNAPを用いて試料 DNA（pUC19）で MDA 反応を行い、増幅産物を制図 2 MDA 法の全ゲノム増幅模式図限酵素（BamH Ⅰ／EcoR Ⅰ）で切断した結果を示す（図THE CHEMICAL TIMES

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234）。pUC19 DNAに由来する増幅産物は図中に黄色の菌のゲノム DNAを吸着し、精製した酵素溶液に夾雑矢印で示した約 2.7 kb の明瞭なバンドとして検出され、DNAとして混入するものと考えられている。このような夾

pUC19 DNAに由来しない非特異産物（赤矢印）と区別

雑 DNAによるDNA 合成酵素の汚染は、PCRで用いられすることができる。試料 DNAが多い場合は pUC19 DNA

る耐熱性 DNAポリメラーゼでも報告 10）されており、このた由来の増幅産物が検出されるが、試料 DNA が少なくな

め PCRは非常に高感度であるにもかかわらず、これまでるにつれ pUC19 DNA 由来の増幅産物は認められず、特に原核微生物感染症診断には積極的に利用されてこ非特異産物だけが検出されることが分かる。しかしながなかった経緯がある11）。そこで我々は関東化学株式会社

ら、配列情報が不明な難培養微生物ではこのような検と共 同で、phi29 DNAP の DNA-free 化を図ることで、証を行うことができないため、配列解析の結果が出るまMDAにおける非特異産物の抑制を目指すこととした。

で「何が増幅されたか判らない」という状況にある。
従来法によるphi29 DNAP の精製
DNA に高い親和性を示す酵素の精製方法として、
DNA 分解酵素（以下、DNase）により夾雑 DNAを分解除去する方法が一般的に用いられてきた 12）。PCR 法に使用される耐熱性の DNAポリメラーゼでは、非耐熱性のDNaseを用いて夾雑 DNAを分解した後、加熱処理に図 4 増幅産物を制限酵素 BamHⅠ/EcoRⅠで切断後に電気泳動した結果
pUC19 由来の産物は2.7 kb の明瞭なバンド（黄矢印）を示すのに対し、非特異産物（赤矢印）は制限酵素で切断されないため区別が可能。

し かし、phi29 DNAP は 中 温 性 の 酵 素 であるため、DNase だけを熱 変 性させることはできない。そこで、このように試料 DNA が少ないほど、非特異産物のリphi29 DNAPを精製用タグとの融合タンパク質として大スクが高まるため、既報の MDA 法の推奨プロトコルで腸 菌に発 現させ、アフィニティーレジンにタグを介しては、安定した増幅産物を得るために、1 ナノグラム以上phi29 DNAPを固定化し、DNaseと分解した夾雑 DNAを（ヒト細胞で 10 細胞分、大腸菌で 10 細胞分）の試料洗浄除去する方法をまず始めに検討した（図 5A）。

36DNAを要求している。したがって、MDAによる再現性・本精製方法を用いて、DNaseとしてDNA 断片の末端信頼性の高いシングルセルゲノミクスを行うためには、こから分解する酵素、DNA 断片の内部から分解する酵の非特異産物の問題を原因から解決する必要があっ

素、2 本鎖 DNAを分解する酵素、1 本鎖 DNAを分解すた。その原因は、増幅に使用するランダム DNAプライる酵素など種々の DNaseを用いて夾雑 DNA の分解除マー同 士 による増 幅と phi29 DNAP に 夾 雑している去を試みた。しかし、何れの DNaseを用いて調製したDNA 由来の増幅であるとされ、国内外の研究者がこのphi29 DNAPも全ゲノム増幅法において、非特異産物を問題におよそ 10 年以上も取り組んでいる。

抑えることはできなかった（図 5B）。この 原 因として、我々はまず、プライマーの構成をDNAからRNAに変更

phi29 DNAPとDNase が立体的に干渉し、phi29 DNAPすることによって、プライマー由来の非特異産物を抑制すと結合した DNA 分子に DNase が接触できなかったのでることに成功した 9）。phi29 DNAPは逆転写酵素活性を持はないかと推測した。また、逆に DNase 由来と思われるたないため、RNAを鋳型としては使えないが、プライマーとDNAの混入が一部で観察された（図 5C）。さらには、本しては使えるためである。しかしながら、RNAプライマーの精 製 方 法 は 大 量 の DNase を 使 用 するため、phi29利用によって、phi29 DNAPに夾雑しているDNA が増幅

DNAP からDNaseを完全に洗浄・除去することが非常結果に直接影響すること、すなわちphi29 DNAP 製品のに困 難 であることも判 明した。同 様な DNase 残 存 やロット間差がより明確に結果に現れるようになってきた。

DNA 混入は、耐熱性 DNAポリメラーゼの DNA-free 化

phi29 DNAPは遺伝子組換え大腸菌で生産されるため、生産過程や精製過程において、phi29 DNAP が大腸24よりDNaseだけを熱変性により失活させることができる。

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でも報告 11-12）があったため、DNaseに依存しない全く新しい精製方法を検討することとした。

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DNA-free phi29 DNA ポリメラーゼの開発

一方で菌体を破砕すると、菌体から溶出される高分子ゲノムDNAが破砕液粘度の上昇を引き起こすため、
一 般 的には超 音 波 処 理や DNaseによる DNA 断 片 化処理が行われる。しかし、この断片化処理が強いとゲノムDNAとphi29 DNAPの吸着を促進する傾向が見られた。そのため、菌 体 破 砕 液の粘 度 低 下を確 保しつつ、ゲノム DNA の断 片 化を極 力抑える条 件を検 討した。その結果、DNase（ Benzonase ™ , Millipore 社）を用い、100 mM NaCl 存在下で氷温下、5 分間処理する条件が最適と判断された。さらにこの菌体破砕液に PEI溶液を添加することでゲノムDNAを不溶化させ、遠心分 離により菌 体 破 砕 物 残 渣と一 緒にゲノム DNAを沈殿 物として除 去した。結 果 的に菌 体 破 砕 液で検出された DNAは、PEI 添加後の遠心上清にはアガロースゲ
ル電気泳動レベルでの確認では全く検出されず、大部分のゲノムDNAを菌体破砕液から速やかに除去することが可能となった。
（2）EMAによるdsDNA の不活化
PEI 処理により大部分のゲノムDNAは除去されるが、phi29 DNAPと結合したDNA断片は残存したままである。
耐熱性 DNAポリメラーゼの場合、残存 DNAに対し短波長の紫外線（260 nm）を照射することにより、DNAを不活化することがこれまでにも行われてきた。しかしながら、紫外線照射は phi29 DNAPそのものにもダメージを与え活性の低下を引き起こすばかりか、完全に残存 DNAを不活化することができないことが報告されている 14）。
図 5 従来法によるphi29 DNAP の精製（A）
DNaseを用いた非耐熱性酵素の精製工程。
（B）
従来法で精製した酵素による増幅結果その 1。
（C）
従来法で精製した酵素による増幅結果その2。増幅産物はBamHⅠ/EcoRⅠで切断後、電気泳動している。M, 1kb
DNA サイズマーカー；NTC, no template control.

そこで、酵素活性には影響を与えない可視光を照射することで、2 本鎖 DNA（以下、dsDNA）を架橋可能なエチジウムブロミドモノアジド（以下、EMA）を利用して、残存するDNA 分子を不活化する方法 15）を検討することとした。

新たな精製方法の開発（1）PEIによるゲノムDNA の沈殿除去

EMA は低分子の化学物質であるため、高分子であるDNaseのように立体障害を受けることなく、phi29 DNAPに結合したdsDNAにも作用することができると考えられる。

phi29 DNAPを大腸菌から抽出する過程で、ゲノム光源としては、これまで利用されてきたハロゲンランプ

DNAを速やかに分離することが有効と考え、既に古典や 蛍 光 灯 では 無く、市 販 品 の 白 色 発 光ダイオード的な方法となりつつあるが、マイナスに荷電した DNA 分（LED）
ランプを利用した。白色 LEDランプは酵素にとっ子をプラスに荷電した分子、特に現存する素材の中でて有害な紫外線領域の波長を一切含まず、EMA の吸最もカチオン密度が高いポリマーであるポリエチレンイミン収波長（456 nm, 青色波長）を含む。また、LEDランプは（以下、PEI）で電気的に中和することで DNA 分子を沈

発熱量が低いため、40℃以上ではすぐに失活してしまう殿させる方法を検討した 13）。

phi29 DNAPにとっては、熱の影響を回避しながら、不THE CHEMICAL TIMES

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活化に必要な量の可視光を照射することが可能となり、を抑制する方法、例えば非イオン性の界面活性剤等の結果的に phi29 DNAPの失活を防ぎながらEMAによる添加物を検討した。その結果、酵素溶液にトレハロース

dsDNAの不活化に成功した。

を添加することで、phi29 DNAPの凝集を抑制できることを見出した。トレハロースは phi29 DNA 合成酵素の活性（3）phi29 DNAPによるssDNA の分解を阻害しないため 18）、phi29 DNAPを30℃付近で加温す

EMAによるDNA 不活化処理は dsDNAを架橋するもることができ、かつphi29 DNAPの3ʼ→ 5ʼエキソヌクレアーのであり、1 本鎖 DNA（以下、ssDNA）を不活化すること

ゼ活性を利用した ssDNAの分解除去が可能となった。

はできない。その一 方で、phi29 DNAP は dsDNAより

これまでに検討してきた（1）PEIによるゲノム DNA のssDNAに対して親和性が高い。さらに phi29 DNAPを利迅速な沈殿除去、（2）白色 LEDとEMAによる夾雑 2 本

用した DNA 増幅では ssDNAも非特異産物の原因にな鎖 DNAの不活化、（3）phi29 DNAPによる夾雑 ssDNAることからの分解除去の 3 工程を組み合わせ、新たなDNAポリメ、ssDNAの混入に対しても新たな対策が16-17）必要であった。そこで、我々は phi29 DNAP自身が持つ強い 3ʼ→ 5ʼエキソヌクレアーゼ活性に着目し、ssDNAを分解することができないか検討することとした。

ラーゼの精製方法として確立した（図 6）。
本精製方法で調製した phi29 DNAPの SDS-PAGEの結果を図 7に示した。本精製方法により、タンパク質の純

phi29 DNAP は 30℃付 近 で高 い 活 性を持 つため、度としてシングルバンドの phi29 DNAP（ 約 67 kDa）を調

ssDNAを分解するためには 30℃付近で加温する必要が製することができた。収量は大腸菌 1 g 当たり約 1.5 mgある。しかし、精製途中の phi29 DNAPは非常に不安定であり、phi29 DNAP 精製の原著論文 19）とほぼ同程度であり、30℃付近で加温すると凝集体を生じ、収量が著（50 mg/40 g of cells）かそれ以上を確保できている 20）。

しく減少する問題が生じた。そこで、phi29 DNAPの凝集

図 7 各精製工程の SDS−PAGE 結果
M, サイズマーカー；1, 大腸菌破砕液；2, PEI 沈殿後上清；3, カラム非吸着画分； 4, タグ切断前レジン； 5, タグ切断後レジン； 6, 精製画分
（グリセロール添加前）； 7, 精製画分（グリセロール添加前）； 8, 市販酵素（1µg）
。
黒矢印はGST-phi29、赤矢印はphi29 DNAP（64kDa）を示す。

（4）DNA-free phi29 DNAP の品質評価
新たに開 発した精 製 方 法で調 製した高 純 度 phi29
DNAPの品質を評価するため、本酵素をMDAに適用した（図 8）。試料 DNAとしてpUC19 DNAを用いて、MDAでの 検 出 下 限を調 査した 結 果、わ ず か 10 コピーのpUC19 DNAを特異的に増幅することが可能であった。
10コピーの pUC19 DNA は約 30アトグラム（3×10−17 g）であり、大腸菌 1 細胞のゲノムDNAが約 5フェムトグラム（5×10−15 g）であることから、10コピーの pUC19 DNAは大腸菌ゲノムDNAの約 100 分の 1 量に相当する。
このことから、今回我々が開発した DNA-free phi29
図 6 新しく開発した非耐熱性ポリメラーゼの精製工程の模式図

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DNAPを利用して MDAを行うことにより、微生物 1 細胞1 細胞ゲノミックスの為の試薬と環境分のゲノムDNAを試料としても、十分に特異的に増幅できるものと考えられる。

DNA-free phi29 DNA ポリメラーゼの開発

参考文献1）Uchiyama, T.; Miyazaki, T. Curr. Opin. Biotechnol. 2009, 20（6）, 616-622.
2）Venter, J.C.; Remington, K.; Heidelberg, J.F.; Halpern, A.L.;
Rusch, D.; Eisen, J.A.; Wu, D.; Paulsen, I.; Nelson, K.E.;
Nelson, W.; Fouts, D.E.; Levy, S.; Knap, A.H.; Lomas, M.W.;
Nealson, K.; White, O.; Peterson, J.; Hoffman, J.; Parsons, R.;
Baden-Tillson, H.; Pfannkoch, C.; Rogers, Y-H.; Smith, H.O.
Science. 2004, 304（5667）, 66-74.
3）Lasken, R.S. Nat. Rev. Microbiol. 2012, 10（9）, 631-640.

図 8 MDA 増幅産物の電気泳動増幅反応には開発した精製方法で精製したphi29 DNAポリメラーゼを用いた。増幅産物はBamHⅠ/EcoRⅠで切断後、電気泳動している。M, 1kb
DNA サイズマーカー；N, no template control.

まとめ
今回我々はDNA合成酵素の新たな精製方法を開発し、DNA-free phi29 DNAポリメラーゼの生産に成功した。本酵素をMDAに適用することで、夾雑 DNA の混入による非特異的なDNA 増幅を大幅に抑制することが可能となった。この結果、適切な条件で本酵素をMDAに用いれば、十分に 1 細胞分の DNAでも全ゲノム解析が可 能なまで増 幅 可 能となる。本 方 法で精 製された
phi29 DNAPは、平成 26年 12月に「phi29 DNAポリメラーゼセット」として販売が開始されている。
その一方で、本酵素とMDAを利用して DNA 増幅に使用する際には非常に注意しなければならない別の問題もより明確となった。ある程度予想はしていたことではあるが、MDA 増幅反応を行う実験環境そのものが、増幅結果に多大な影響を与えることがこれまで以上に明確になってきた。実験環境そのもの、特に空気中に浮遊している微生物や細胞の死骸由来の DNA が、直接 DNA増幅結果に影響をもたらすことは、これまでにも感染症検査や、古生物の DNA 増幅、法医学検査でもしばしば指摘されていた。MDAではその増幅原理のため影響が大きく、これまで PCR で取られてきた実験環境対策では不十分であることがより顕著になった（論文投稿中）。すな
わち、内在性の DNAコンタミネーション問題を解決した先にあったのは、外因性DNAコンタミネーション問題である。
次の機会に、シングルセルゲノミックスのみならず、DNA増幅を行う為の実験環境の重要性とその対策について報告する。

4）Hongoh, Y.; Sharma, V.K.; Prakash, T.; Noda, S.; Taylor, T.D.;
Kudo, T.; Sakaki, Y.; Toyoda, A.; Hattori, M.; Ohkuma, M.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008, 105（14）, 5555-5560.
5）Hongoh, Y.; Sharma, V.K.; Prakash, T.; Noda, S.; Toh, H.;
Taylor, T.D.; Kudo, T.; Sakaki, Y.; Toyoda, A.; Hattori, M.;
Ohkuma, M. Science. 2008, 322（5904）, 1108-1109.
6）Dean, F.B.; Hosono, S.; Fang, L.; Wu, X.; Faruqi, A.F.; BrayWard, P.; Sun, Z.; Zong, Q.; Du, Y.; Du, J.; Driscoll, M.; Song,W.; Kingsmore, S.F.; Egholm, M.;Lasken, R.S. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 2002, 99（8）, 5261-5266.
7）Meijer, W.J.; Horcajadas, J.A.; Salas, M.; Microbiol. Mol. Biol.
Rev. 2001, 65（2）, 261-287.
8）Hutchison, C.A. Ⅲ .; Smith, H.O.; Pfannkoch, C.; Venter, J.C.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005, 102（48）, 17332-17336.
9）Takahashi, H.;Yamamoto, K.; Ohtani, T.; Sugiyama, S.
BioTechniques. 2009, 47（1）, 609-615.
10）Rand, K.H.; Houck, H. Mol. Cell. Probes. 1990, 4（6）, 445450.
11）Niimi, H.; Mori, M.; Tabata, J.; Minami, H.; Ueno, T.; Hayashi,S.; Kitajima, I. J. Clin. Microbiol. 2011, 49（9）, 3316-3320.
12）Corless, C.E.; Guiver, M.; Borrow, R.; Edwards-Jones, V.;
Kaczmarski, E.B.; Fox, A.J. J. Clin. Microbiol. 2000, 38（5）,1747-1752.
13）Burgess, R.R. Meth. Enzymol. 1991, 208, 3-10.
14）Woyke, T.; Sczyrba, A.; Lee, J.; Rinke, C.; Tighe, D.;
Clingenpeel, S.; Malmstrom, R.; Stepanauskas, R.; Cheng,J-F. PLoS One. 2001, 6（10）, e26161. http://journals.plos.org/
plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0026161,（accessed2011-10-20）.
15）Rudi, K.; Nogva, H.K.; Moen, B.; Nissen, H.; Bredholt, S.;
Moretro, T.; Naterstad, K.; Holck, A. Int. J. Food Microbiol.
2002, 78（1-2）, 171-180.
16）Kobori, T.; Matsumoto, A.; Takahashi, H.; Sugiyama, S. Anal
Sci. 2009, 25（12）, 1381-1383.
17）Takahashi, H.; Matsumoto, A.; Sugiyama, S.; Kobori, T. Anal.
Biochem. 2010, 401（2）, 242-249.
18）Pan, X.; Urban, A.E.; Palejev, D.; Schulz, V.; Grubert, F.; Hu, Y.;
Snyder, M.; Weissman, S.M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008,105（40）, 15499-15504.
19）Blanco, L.; Salas, M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984, 81（17）, 5325-5329.
20）Takahashi, H.; Yamazaki, H.; Akanuma, S.; Kanahara, H.;
Saito, T.; Chimuro, T.; Kobayashi, T.; Ohtani, T.; Yamamoto,K.; Sugiyama, S.; Kobori,T. PLoS One. 2014, 9（2）, e82624.
http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.
pone.0082624,（accessed 2015-02-20）.

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