再生医療原論

再生医療原論

序

PREFACE47 福島 雅典
公益財団法人 神戸医療産業都市推進機構
医療イノベーション推進センター
（TRI）
センター長

2	Masanori Fukushima
TRI Director

THEORY OF DISEASE CONTROL
3

An overview of regenerative medicine: its principles andthe scope of the current revolution

STEM-CELL THERAPY
5

Potential treatment of cerebral infarcts and spinal cord injury 		
with mesenchymal stem cell transplantation
Osamu Honmou

13 Tissue regeneration by Muse cells after acute myocardial infarction
Shinya Minatoguchi, Yoshihisa Yamada, Shingo Minatoguchi,
Toshiki Tanaka, Atsushi Mikami, Shohei Wakao,Yoshihiro Kushida 		and Mari Dezawa
20 Stem-cell therapy: Cell-based neovascularization therapy 			for peripheral arterial disease
Yasuyuki Fujita and Atsuhiko Kawamoto

TISSUE ENGINEERING
26 Autologous transplantation of peripheral blood CD34 cells
in patients with femoral and tibial fracture non-union
Ryosuke Kuroda, Tomoyuki Matsumoto and Takahiro Niikura+

30 Transplantation of cultivated autologous oral mucosal epithelial 		
sheets in order to restore sight	Chie Sotozono, Tsutomu Inatomi, Takahiro Nakamura, Noriko Koizumi,
Kojiro Imai, Shigeru Kinoshita, Yasuko Kimura, Masahiro J. Go
and Masanori Fukushima
38 A tissue-engineering approach to tympanic membrane regeneration
Shinichi Kanemaru

ADVANCES.TRI-KOBE.ORG/EN
The Principles of Regenerative Medicine is a publication of the Translational Research Center
for Medical Innovation — the first academic data and statistical analysis center in Japan.
「再生医療原論」は TRI* による出版物です。
*日本のアカデミアにおける初めてのデータセンター・解析センター

EDITORIAL
Translational Research Center for Medical Innovation
1-5-4 Minatojima-minamimachi, Chuo-ku, Kobe, Japan 650-0047
Phone: 078-303-9095 Fax: 078-303-9095
ISSN 2010-0531

疾病制圧の理論49 再生医療概論：
その原理と進行中の医療革命の見通し
幹細胞療法

53 間葉系幹細胞移植による脳梗塞および脊髄損傷の治療の可能性
本望 修

64 Muse 細胞による急性心筋梗塞後の組織修復再生
湊口 信也、山田 好久、湊口 信吾、田中 俊樹、
三上 敦、若尾 昌平、串田 良祐、出澤 真理
73 幹細胞を用いた末梢動脈疾患に対する血管再生療法藤田 靖之、川本 篤彦
組織工学的治療80 下肢難治性骨折に対する自家末梢血
CD34 陽性細胞の移植
黒田 良祐、松本 知之、新倉 隆宏

86 培養自家口腔粘膜上皮シート移植で光を取り戻す
外園 千恵、稲富 勉、中村 隆宏、小泉 範子、
今井 浩二郎、木下 茂、木村 泰子、郷 正博、
福島 雅典
95 組織工学的手法による鼓膜再生療法
金丸眞一

再生医療原論

COVER STORY
An image of a human retina.
Oral mucosal epithelial sheets
can be used to treat severe ocularsurface disorders (p30).
ヒト網膜の画像。

重症眼表面疾患に対し、口腔粘膜上皮シートを使用した治療が可能である。(86 ページ )© Peter Maloca. CC BY

Preface

Masanori Fukushima“This collection describes
the paradigm shift
occurring in medicine.”

Preface
Masanori Fukushima, TRI Director

Translational Research Center for Medical Innovation (TRI),
Foundation for Biomedical Research and Innovation at Kobe

Throughout its history, humanity has battled to overcome diseases anddisorders. This struggle has yielded revolutionary discoveries that havetransformed medical care. For example, in the early 20th century, French
surgeon Alexis Carrel developed a technique for sewing blood vessels
together, which is used in many surgical procedures including organtransplants. During the same decade, Canadian physician Frederick
Banting discovered insulin. A few years later, Scottish bacteriologist
Alexander Fleming discovered penicillin; this discovery and subsequentdevelopments made many infectious diseases treatable and triggered an
explosion in drug discovery.
In this way, humanity has gained considerable control over many
diseases. However, drugs have actually had a limited effect on extending
life expectancy since the most important factors for extending human life,
namely improving health and nutrition, depend on escaping from poverty.
Consequently, most diseases still remain a long way from being overcome.
Nevertheless, you are probably aware of a recent series of breakthroughs
in addressing diseases for which there are currently limited treatment options:the practical application of regenerative medicine by using stem cells derived
from the human body. For instance, a patient with severe spinal cord injury,
who had been unable to move and initially received a hopeless prognosis,
was able to recover by receiving stem cell treatment. His recovery is movingly
portrayed in a video showing him sufficiently recovered to be able to walk
home. I believe that necessary evidence from clinical trials will soon help
make this kind of dramatic improvement a clinical reality for many.
This collection of articles describes six emerging treatments approaches
involving the regeneration of nerves, blood vessels, myocardium, cornea,
eardrum and bone. The techniques involving the regeneration of nerves
and eardrum have been approved for manufacture and sale by theJapanese medical regulatory authority, the Pharmaceuticals and Medical
Devices Agency (PMDA)1, while the other four therapies have beenfavourably received in Japanese registration trials. Regenerative therapies
are characterized by the use of stem cells, or depending on the type of
injury, stem cells in combination with tissue engineering.
Some of the investigational approaches described in this collection wereshowcased in a Nature Outlook on Regenerative Medicine2 and five Natureadvances.tri-kobe.org/en

Outlines3–7, sponsored by TRI and others, which all received positive
feedback. Based on this response, we have produced this collection, titled
The Principles of Regenerative Medicine, to provide further information on
the treatments. It outlines the theory behind their common principles
and explains the specifics of each treatment method. In the future, we
intend to report on treatments for other difficult diseases based on new
therapeutic principles. But the present collection describes the paradigm
shift occurring in medicine. We live in a time of unprecedented scientificand technological revolution. Ten years from now, humankind will surely
have devised a specific road map for overcoming the major diseases of ourtime, and we will enter an age in which, by concerting our efforts, thejourney’s end will be near8,9.
The Foundation for Biomedical Research and Innovation at Kobe,
Translational Research Center for Medical Innovation (TRI), is a Japanesepublic institution that supports clinical trials led by academia. As TRI’s
director, I am very proud to endorse this publication.
REFERENCES

1. Pharmaceuticals and Medical Devices Agency website http://www.pmda.go.jp/
regenerative_medicines/2019/R20190125001/530100000_23000FZX00001_A100_1.
pdf [pdf; in Japanese]
2. Nature Outlook: Regenerative Medicine, Nature 540, S49 (7 December 2016),
https://www.nature.com/articles/540S49a
3. Nature Outline: Corneal Repair, Nature 544, 7650_supp_out (20 April 2017),
https://www.nature.com/collections/pdryjrsvnz/videos
4. Nature Outline: Eardrum Regeneration: Membrane Repair, Nature 546, 7659_supp(22 June 2017), https://www.nature.com/collections/rzfrydkflp/videos
5. Nature Outline: Critical Limb Ischaemia,Nature 548, 7668_supp (24 August 2017),
https://www.nature.com/collections/vmxkcnxvwg/videos
6. Nature Outline: Non‐union bone fracture: a quicker fix, Nature 550, S193
(26 October 2017), https://www.nature.com/collections/qmpthxknbn/videos
7. Nature Outline: Spinal‐cord Injury: Spurring Regrowth, Nature 552, 7684_supp(14 December 2017), www.nature.com/collections/ctdkppqqnx/videos
8. Fukushima, M., Austin, C., Sato, N., Maruyama, T., Navarro, E. et al.
The global academic research organization network: Data sharing to cure diseases
and enable learning health systems. Learning Health Systems e10073 (2018),
https://doi.org/10.1002/lrh2.10073
9. From Lab to Clinic, TRI Advances website https://advances.tri-kobe.org/en/feature/11/
from-lab-to-clinic

The Principles of Regenerative Medicine 2

Theory of Disease Control

Masanori Fukushima

An overview of regenerative medicine: its
principles and the scope of the current revolution
Masanori Fukushima, TRI Director

Translational Research Center for Medical Innovation (TRI),
Foundation for Biomedical Research and Innovation at Kobe

2. WHAT IS STEM-CELL THERAPY?
Stem cells are found in various tissues in the body, including the blood,bone marrow, fat, connective tissue, nerves, skin, etc. When stimulated,
stem cells have the capacity to produce specific, mature cell types. Stemcells are believed to replenish damaged or dead cells in the body.
The stem cell therapies described here use adult stem cells. Since cellmanipulation is not applied, there is no risk of developing tumours. The
ethical issues associated with embryonic cells are also avoided. There isno risk of rejection by the immune system, as the patient’s own cells or
immunotolerant stem cells are used. This means that, unlike organ transplantation, stem-cell therapy does not need adjuvant therapies such as thecontinuous administration of immunosuppressants. Furthermore, bothcell extraction from the body and cell replacement (either as-is or after
culturing) can be partially automated. Many procedures can be performed
using relatively simple techniques, such as intravenous infusion and othertechniques that do not require general anaesthetic.
Adult stem cells fall into two broad categories. One is haematopoietic
stem cells. As their name indicates, these stem cells can produce blood cells,
ATTACKS TO A LIVING BODY
Microbes

InjuryINTERNAL REPAIR IN A LIVING BODY
repairandnReconstructionio(regeneration)
M2
Stem cells:
Mesenchymal M1stem cells
and others
Innateimmunity

Neoplasm invasion

Clearance(phagocytosis)coInfarctreDegeneration, Prionoid

gni

tio n

Cell damage/
Necrosisbut they can also generate vascular cells. The other type is currently referred toas mesenchymal stem cells. They are so named because these stem cells wereoriginally thought to produce cells that originate in the mesoderm (mesenchyme), including the bone and fat. However, recent studies have revealed
that some mesenchymal stem cells can create nerve cells, which are not of mesodermal origin. Further research is needed to uncover more about these cells.
How do we identify adult stem cells when they exist only in minutequantities in the body? The answer lies in using markers for the glycoproteins that are expressed on their membranes. For example, since haematopoietic stem cells have a glycoprotein called CD34, they can be identified
as CD34+ cells. These CD34+ haematopoietic stem cells show potential fortreating blood vessels in the legs that have been obstructed in critical limb
ischemia (Stem Cell Therapy 3) and for treating intractable bone fractures(Tissue Engineering 1) in combination with a scaffold. An example of an
emerging stem-cell therapy that uses mesenchymal stem cells is one for spinal cord injuries (Stem Cell Therapy 1), in which nerve cells are regeneratedusing CD105+ cells.
Some adult stem cells defy categorization due to their diverse characteristics. For example, multilineage differentiating stress enduring (Muse) cells,
which were discovered by Mari Dezawa of Tohoku University in 20101,
are thought to create cells of various tissue types and to play a specializedrole in the repair of body tissues. Muse cells are the basis for a translational
approach to treating myocardial infarction (Stem Cell Therapy 2) and havebeen used to regenerate cardiac muscles, which had previously been considered difficult to do. Remarkably, studies have indicated that intravenous
infusion of Muse cells is effective for treating myocardial infarction patients
and, despite being an allogeneic transplant, immunosuppression is notneeded for the initial infusion.
The above-mentioned stem-cell approaches all employ extremely simple
medical procedures. They harness the body’s innate healing mechanism,by extracting stem cells, boosting them outside the body and then returning them to the patient, as is the case in intravenous infusion of stem cells
from the patient. The therapies are based on biological principles known as
stem-cell physiology, which have been described in the publications listed

Rege
ne
ra
t

1. INTRODUCTION
Regenerative medicine represents a coming revolution in the treatmentof many illnesses. Emerging therapies that use stem cells harvested fromthe patients themselves are demonstrating extremely promising results
in clinical trials and other studies. Referred to as stem-cell therapies, orjust cell therapies, they involve taking stem cells from the body, culturing them, and then putting them back into the body to induce tissue toregrow. Japanese researchers are world leaders in this field and their many
years of hard work are bearing fruit as clinical trials progress according toschedule. We can be optimistic that novel therapies will soon make currently untreatable diseases and disorders treatable.
The chapters of this collection describe six regenerative therapies. Before considering specifics, however, in this essay I provide an overview,
explaining the principles common to all regenerative therapies: the use of
bioactive stem cells in a patient and the provision of framework materials
as scaffolds for tissue regeneration using tissue engineering.

S e lf – n o n - selfFigure 1. Multicellular symbiotic system for maintaining homeostasis that inherits self-preserving ability

3 The Principles of Regenerative Medicineadvances.tri-kobe.org/en

Theory of Disease Controlin Ref. 2. The basic steps of this mechanism are tissue damage → signalling→ signal perception by stem cells → migration → homing → conditioning → repair. Stem cells are found throughout the body, and they maintainthe processes of life. But, when the need arises, stem cells are mobilized
from the bone marrow and home in on the site requiring repair, where
they enter the lesion to condition and conduct the repair process. This is
the essence of the morphological functional homeostatic mechanism of living organisms, which stem-cell therapies harness. In conjunction with this,regenerative medicine also uses cells that are not stem cells per se but can be
activated either to migrate to the lesion (for example, cells at the peripheryof the eardrum, which are induced by basic fibroblast growth factor; Tissue Engineering 3) or to self-renew (for example, oral mucosa cells; Tissue
Engineering 2). Tissue engineering is the key to the success of therapies that
use these cells (Fig. 1).
3. PROVIDING SCAFFOLDS THROUGH TISSUE ENGINEERING
When a damaged area of a tissue has a gap or hole, scaffolds are needed
for cells to grow on. This is the purview of tissue engineering, and someof its elemental techniques have already been commercialized. It is vital
to appropriately combine cellular regenerative medicine with tissue engineering techniques.
A diverse range of tissue engineering techniques are available. For example, a gelatin sponge called Spongel® is used in the regeneration of theeardrum (Tissue Engineering 3). Eardrum cells can be grown by stimulating
the basic fibroblast growth factor. To activate the cells, Spongel® is used toplug a hole in the eardrum. Since the eardrum is not flat, a three-dimensional approach is needed, which is why Spongel® is used to fill a perforationin the tympanic membrane. A coating of fibrin adhesive is then applied tocause the regenerative cells to migrate from the periphery of the eardrum to
the Spongel® scaffold — this is what makes the therapy effective. Remarkably, a natural three-layered membrane forms inside the Spongel® scaffold.
Investigational approaches to regenerating the cornea in the eye (Tissue
Engineering 2) involves culturing a sheet of oral mucosa cells on amnion
membrane. The damaged area of the cornea is cut away, and the cultured
cell sheet is placed on the area. In proposed treatments for intractable fractures (Tissue Engineering 1), CD34+ cells and collagen are injected together
into the non-union area of fractured bone. A fibrous protein known as atelocollagen is used to fill in the fractured part of the bone and form a scaffold for bone cell regrowth.
4. TREATMENT DESIGN BASED ON CELL PRINCIPLES
Research conducted globally on regenerative therapies for various diseases
has not always been successful. How have Japanese researchers achieved aseries of good outcomes? One reason is that they design therapeutic approaches based on a deep understanding of biological processes that occur
in the human body.
Living organisms maintain homeostasis through mutual interactions
between different cells. If some abnormality occurs in the body, it is detected and stem cells are mobilized to the site, where they start to address
the abnormality. This cell activity includes discriminating between cells
that should be allowed to live and those that should die. It then involves
sending in the necessary factors to cells designated for preservation, andeliminating inflammation or promoting blood-vessel development. New
cells are regenerated when the tissue has been repaired.
Cells function in a similar way to human society, performing operationsin an ordered sequence. Stem cells may be regarded as leaders in this process,giving instructions to other cells. For major traumas, there are insufficient
stem cells naturally present in the human body, and hence stem cells need
to be cultured in vitro to multiply their number and make up for what the
body cannot provide. When designing therapies, it is thus important toclearly identify what is happening in a specific disease or disorder as well as
what is missing.
For example, stem cells can be administered intravenously to the bodyor by local administration to the lesion. Intravenous administration gives
good outcomes when treating spinal injuries and myocardial infarction; thisadvances.tri-kobe.org/enMasanori Fukushima

is thought to be because the stem cells used are those normally involved inrepairing and regenerating the peripheral microcirculatory system.
Designing a therapy requires understanding the biological principles andcell processes involved in maintaining the homeostatic health of multicellular organisms. It is vital to consider how such organisms preserve integrity,
maintain homeostasis, form tissues and scaffolds. It also important to know
about other aspects such as self-organizational principles, cell symbiosis,
rhythm, synchronism and symmetry. These principles all orchestrate processes in living organisms and are overall encompassing activities. Keeping
these principles in mind, we then need a full understanding of the similarity
between animal models and human disorders; in other words, how animalmodels mirror the type, pathology, state and stage of a human disorder.
Therapies should be developed and evaluated by conducting registration
trials that comply with the law with a view to filing for licensing. When
conducting a registration trial, exact data satisfying the strict criteria of good
manufacturing practice (GMP), good laboratory practice (GLP) and goodclinical practice (GCP) standards can be obtained through the guidance
and advice offered by the Pharmaceuticals and Medical Devices Agency(PMDA; the Japanese equivalent of the FDA in the United States). In
Japan, the Ministry of Health, Labour and Welfare instituted the Sakigake
Designation System in 20153, which allows therapies developed in Japanthat show strong promise but that have not been approved in other countries to be fast tracked in the authorization process and to be prioritizedin screening and evaluation. Therefore, applying for licensing under thissystem is highly recommended.
5. TRANSFORMATION OF MEDICAL CARE
This collection of articles focuses on disorders resulting from damage to six
types of tissue: nerve, vascular, myocardial, bone, eardrum and corneal. New
therapies for more-complex diseases will be reported in the future. Promising targets for future therapies include conditions where the autoimmune
system attacks tissues, such as ulcerative colitis and hepatic cirrhosis, anddiseases where prionoids attack nerve cells, such as Alzheimer’s disease. To
deal with such diseases, our existing knowledge of cell mechanisms needs
to be supplemented by forthcoming therapeutic principles gained from thestem-cell therapies and tissue-engineering technologies presented in thiscollection. However, practical treatments for these diseases are not far off.
We also envisage developing ways to overcome arteriosclerosis and major
cancers, such as prostate and bowel cancers. We have already reported on
new treatments for ulcerative colitis in a white paper associated with a recent
Nature Outline. In the future, we hope to be able to report on the nextstages of regenerative medicine, such as one-step methods for adjusting thequantity of stem cells required for therapy, the use of new biologically active
materials produced by stem cells (but that does not require using stem cells),
and the development of drugs that mobilize or activate stem cells in vivo.
Regenerative medicine based on stem-cell therapy and tissue engineering promises to provide definitive therapeutic outcomes for various diseases
and disorders by applying relatively simple procedures. As such, regenerative
medicine has rendered obsolete the accepted norms of existing drug-development strategies, and it demands huge innovations in the concepts of drug
therapy and drug discovery. Regenerative medicine will be fundamental for
future medical care around the globe. As the development of regenerative
medicine enters its second exciting stage, we are certain this is where thefuture of medicine lies.
REFERENCES
1. Kuroda, Y., Kitada, M., Wakao, S., Nishikawa, K., Tanimura, Y. et al. Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations. Proceedings of the National
Academy of Sciences USA 107, 8639–8643 (2010).
2. For Nature supplements that highlight research conducted by researchers associatedwithTRI, see TRI Advances website https://advances.tri-kobe.org/en/collaborations. See
also Nature Outlook articles: www.nature.com/articles/540S49a
3. Sakigake Designation System (Japanese only), Ministry of Health, Labour and Welfare
website (https://www.mhlw.go.jp/seisakunitsuite/bunya/kenkou_iryou/iyakuhin/topics/
tp150514-01.html)

The Principles of Regenerative Medicine 4

Stem Cell Therapy 1

Potential treatment of cerebral
infarcts and spinal cord injury
with mesenchymal stem celltransplantation
Osamu Honmou

Department of Neural Regenerative Medicine, Research Institute for Frontier Medicine,
Sapporo Medical University School of Medicine, Sapporo, Japan

Current treatments for cerebral infarctions and spinal cord injuries are unsatisfactory.
Researchers at Sapporo Medical University supported by the Translational Research Center
for Medical Innovation (TRI) in Japan have been conducting transplantation experiments
using mesenchymal stem cells (MSCs) as donors in animal models of cerebral infarction andspinal cord injury. The results indicate the remarkable therapeutic benefits of intravenous
administration of these cells. A clinical study with subacute cerebral infarction patientssuggested the safety and potential therapeutic effects of autologous MSCs that had been
cultured using autologous human serum and administered by a single intravenous infusion.
A clinical trial on the application to cerebral infarction is ongoing, while a clinical trial on theapplication of MSCs to spinal cord injuries has also been completed. MSCs have the potential
to cause a paradigm shift in treatment strategies for refractory neurological diseases.

1. CEREBRAL INFARCTION
1.1 Introduction
Cerebral infarction is a disease that still lacks a cure, and recovery from the residual neurological dysfunction it causes is extremely difficult. Its annual incidence in Japan is just under 300,000. Most patients dieor are left with a serious residual disability. An estimated 5.2 million people in Japan will need nursing
care by 2025. The number of people with risk factors for cerebral infarction (such as diabetes, hypertension and hyperlipidemia) currently exceeds 10 million, and it is expected to continue rise as Japan’s population ages. The social burden of cerebral infarction is enormous — annual healthcare costs are estimated to be about 2 trillion yen and social costs about 8 trillion yen.
Treatment to date is based on the concept that the therapeutic window after the onset of cerebral infarction is very short. The harsh reality is that no effective treatment currently exists for infarct lesions
once they are complete. The gold standard has thus been to detect the ischemia site before an infarct iscomplete and to provide intensive treatment focused on thrombolytic therapy within a very limited period after onset. Current standard treatment is both medical (including antiplatelet and anticoagulant
therapies) and surgical (including cerebral revascularization), but the results are unsatisfactory. Intravenous tissue plasminogen activator therapy, a promising hyperacute treatment, has also been used, but
only a limited number of patients are eligible for it, since it must be given within 4.5 hours of onset.
It is thus difficult to treat cerebral infarction. Brain tissue is quickly damaged, and it is difficult to starteffective treatment during this time. Furthermore, there is no established treatment for regenerating central nervous tissue that has been damaged by ischemia. Rehabilitation is the only treatment for disability after cerebral infarction.
A new method of treatment is thus needed. With the recent advances in neuroscience and stem-cellresearch, it is becoming increasingly possible to treat central nervous system disorders using regenerative
medicine. However, although many studies have been conducted worldwide, covering many areas of basic research, most have not yet been translated into clinical practice.
Since the early 1990s, we have been actively conducting transplantation experiments using different typesof stem cells as donors in animal models of central neurological disease, including cerebral infarction models1–4. From the mid-1990s, we have focused on nerve regeneration research using bone marrow cells, whichwere expected to be closest to clinical application, as donor cells5–8. In particular, we have focused on mesenchymal stem cells (MSCs) that have a strong regenerative effect on the nervous system and have proven to bea useful source of donor cells. We have reported many basic research results that show the remarkable therapeutic effects of intravenous administration of these cells in animals with various neurological disease models, including cerebral infarction9–27, spinal cord injury28,29 and Parkinson’s disease28,29.
5 The Principles of Regenerative MedicineOsamu Honmou

SUMMARY
Current treatment for
cerebral infarction is effective
only in the acute phase;once the infarct is complete,
rehabilitation is the only
treatment. Treatment of the
spinal cord injuries using
current medical techniques
is similarly unsatisfactory.
We have been conducting
transplantation experiments
using mesenchymal stem cells(MSCs) as donors in animalmodels of cerebral infarction
and spinal cord injury since
the early 1990s. We haveconducted many basic
research studies that indicate
remarkable therapeutic
effects following intravenous
administration of these cells.
Following this basic research,
we started a clinical study
in patients with subacutecerebral infarction in
January 2007. We evaluatedthe safety and therapeutic
effects of autologous MSCs
that had been cultured andexpanded using autologous
human serum. MSCs
were administered by asingle intravenous infusion
rather than by surgery. The
potential therapeutic effects
produced by this treatment
come from the multilevelmechanisms of action of
MSCs minimizing the neuraldamage caused by cerebral
infarction and facilitating theneural regeneration. A clinical
trial on the application of
MSCs to spinal cord injury
has been completed. MSCs
have the potential to cause aparadigm shift in treatment
strategies for refractory
neurological diseases.
CORRESPONDING
AUTHOR
Osamu Honmou

E-mail: honmou@sapmed.ac.jp

advances.tri-kobe.org/en

Osamu Honmou

Neurotrophic (excitability modulation and neuroprotection)
and anti-inflammatory
Angiogenesis and axonal spouting
Neurogenesis and remyelination

A: 4h before

B: 4h after

C: 1w after

D: 2w after© 2019 Oxford University Press

Normalfunction
Symptom severity

Modified from Ref. 34, copyright (2019), with permission from Elsevier

Stem Cell Therapy 1

MSC infusion
Impairedfunction

1

Figure 2. Magnetic resonance imaging images of patients’ brains before and after theadministration of mesenchymal stem cells.

2

3 (months)

Time
Figure 1. Schematic plot of symptom severity against time following administration ofmesenchymal stem cells.

Based on the preclinical proof-of-concept studies to date, the mechanisms of action of MSCs may include:• accumulation of transplanted cells in the lesions (homing effect)10,13,20,30• neurotrophic, neuroprotective and anti-inflammatory effects oftransplanted cells via neurotrophic factors11,14,16,20• remyelination of demyelinated axons5,7,28,31• neural regeneration (differentiation into neural cells), regeneration ofdamaged axons and axonal sprouting28,31• stabilization of the blood–brain barrier (BBB)17,28,32
Since transplanted cells exert therapeutic effects over time on different processes and at different sites, we can expect good therapeutic effects
from a single treatment.
Following on from this basic research, we started a clinical study inJanuary 200733,34 (Fig. 1). We evaluated the safety and therapeutic effects
of autologous MSCs that had been cultured and expanded using autologous human serum in patients with subacute cerebral infarction. MSCs
were administered by a single intravenous infusion rather than by surgery.
We obtained data showing a certain improvement in recovery comparedwith the course of symptoms seen with conventional treatment. These results were evaluated based on imaging findings and clinical symptoms33,34.
The potential therapeutic effects produced by this treatment comefrom minimizing the neural damage caused by cerebral infarction and facilitating recovery (regeneration) of the nervous system. It is difficult torepair the damaged brain using conventional treatment. In contrast, thisnew treatment is expected to actively repair the ischemic brain via themultifaceted mechanisms described above. The proposed indication forthis investigational treatment is improvements in neurological symptoms
and signs, in impaired daily activities and in functional disability associated with cerebral infarction.
1.2. Clinical research
1.2.1 Overview
Autologous MSCs were cultured with autologous human serum and intravenously infused into 12 patients with supratentorial cerebral infarction33. Patients were enrolled in the study during the subacute phase after
receiving standard treatment for acute cerebral infarction. Causes of cerebral infarction could be any within the NINDS-III classification, but infratentorial infarcts, such as cerebellar infarction and brain stem infarcadvances.tri-kobe.org/ention, were excluded. Mild cases or extremely severe cases were excluded(patients with a modified Rankin scale score of 3–5 and Japan Coma Scalescore of 0–100 were included). When all patients had been examined andapproved by the Evaluation Committee, bone marrow aspirates (up to 60ml) were collected from the iliac crest under local anesthesia by a haematologist. MSCs were then cultured in a specialized culture facility (the Cell
Processing Center) for 2 to 3 weeks until the target cell number of 1 × 108
cells was reached. The cells were then frozen and their safety and quality tested; only those that passed the tests were administered. Administration was by intravenous infusion into a peripheral vein over 30–60 minutes. The study included nine men and three women, with ages ranging
from 41 to 73 years (59.2 ± 8.2 years); 12 patients had motor paralysis
and 5 patients had aphasia. The patients received cell transplantation between 36 and 133 days after the onset of cerebral infarction. Assessments
included general blood lab tests such as CBC, magnetic resonance imaging (MRI), and clinical symptom evaluation according to the NIH stroke
scale (NIHSS) and the modified Rankin scale (mRS).
According to NIHSS and mRS evaluation, the speed of recovery wassignificantly accelerated by transplantation (Fig. 2)33. Although spontaneous recovery, which occurs as part of the natural course of cerebral infarction, usually slows down during the subacute phase, further accelerationof symptom recovery occurred.
After cerebral infarction, changes in MRI (FLAIR) over time generally converge after approximately 1 month, the high-intensity area being
very similar in size, density and shape to the final infarct lesion. However, although transplantation was performed more than 30 days after onset,
high-intensity areas on MRI (FLAIR) still showed a statistically significant
reduction in size and density after transplantation (Fig. 3)33.
1.2.2 What can we learn from these results?
We need to recognize the importance of having multiple points of action
when developing new treatments for cerebral infarction. Over the pastfew decades, many drug candidates have been investigated, but their therapeutic effects are limited. The mechanism of action of a drug may be veryclear when it only has limited mechanisms of action. However, the conditions after cerebral infarction vary considerably and are highly complex,
as if a storm is raging in the ischemic brain. Why is cell therapy successful
in such conditions? We believe the answer lies in the diversity of mechanisms of action of cell therapy. As described above, cell therapy acts in varThe Principles of Regenerative Medicine 6

Stem Cell Therapy 1

1

2

3

Osamu Honmou

4

5

6

7

8

9

10

11

12

(NIHSS)
25

Modified from Ref. 34, copyright (2019), with permission from Elsevier

20

15

10

5

- 150

-50

0

50

150

250

350
(Days)

Figure 3. Effect of administration of mesenchymal stem cells on the NIH stroke scale (NIHSS) of patients.

ious ways over time on different processes and at different locations, andthis sets it apart from current pharmaceutical treatments.
We must reconsider the pathophysiology of cerebral infarction, in particular the conventional wisdom that brain tissue damage progresses irreversibly in a very short period after cerebral infarction, so that is impossible to treat the brain once it has been damaged. The therapeutic time
window is thus thought to be limited to the hyperacute phase, and treatment is focused on revascularization and neuroprotection. As describedabove, cerebral infarction regions treated 6 weeks or more after the onsetof cerebral infarction recovered very quickly after cell therapy. This indicates that there are treatable brain tissues remaining in regions where we
previously believed that irreversible damage had occurred. This does notrefer to the long-term existence of the penumbra; rather, neurons and axons can be dysfunctional but remain anatomically alive for a long time.
We also must treat the entire central nervous system, not just the damaged brain. Many people tend to think of regenerative medicine only as
regeneration of damaged brain tissues. However, they are failing to see theforest for the trees. The brain has a larger backup system than we think.
In evolutionary history, the nervous system, which is crucial to our survival, encountered many challenges and acquired various backup systems.
When trying to reduce disability after cerebral infarction, regenerating thedamaged brain is certainly important but so is increasing the plasticity of
the healthy areas of the brain. Indeed, increased plasticity is particularly
noticeable after cell therapy. In regenerative medicine for cerebral infarction, we must make a paradigm shift towards treating the entire central
nervous system.
And we need to recognize the importance of self-healing. Among the
7 The Principles of Regenerative Medicinevarious types of stem cells currently available, why does intravenous infusion of high-dose MSCs produce such a potential therapeutic effect? The
answer lies in the role that MSCs play under normal circumstances. Even
when we are healthy, MSCs seem to be released from the bone marrowinto the peripheral circulation and are likely to be involved in maintaining the function of organs and in healing wounds throughout our body.
MSCs are thought to be stem cells that make a considerable contribution
to self-healing. This sets them apart from other stem cells. Any healthcareintervention, whether drug treatment or surgery, relies on the self-healingthat follows. The more we learn about medicine, the less we know, andhence we must focus on maximizing self-healing abilities.
1.3. Treatment mechanism
1.3.1 The blood–brain barrier and the homing effectIt is well known that when central nervous system (CNS) tissues are damaged by ischemia, the BBB is destroyed, and this BBB dysfunction often
lasts for about 1 month, depending on the extent of ischemia. To evaluate the extent to which BBB destruction is involved in the accumulation
mechanism (homing effect) of intravenous MSCs in cerebral infarction
lesions, we used a rat model of permanent middle cerebral artery occlusion. In this cerebral infarction model, BBB breakdown lasted for approximately 2 weeks and was mostly repaired after 4 weeks13. However, intravenously administered MSCs continued to accumulate in the lesions inthe same manner more than 4 weeks after ischemic injury13. This suggeststhat breakdown of the BBB is not needed for MSCs to migrate from theblood vessels to the brain parenchyma. An experiment with a mouse model of prion disease, in which there is minimal BBB destruction, showed aadvances.tri-kobe.org/en

Stem Cell Therapy 1

similar homing effect35. We conclude that sufficient numbers of intravenously administered MSCs can reach lesions even in subacute or chronic
cerebral infarction where repair of the BBB is almost complete19, and canreach lesions not only in supratentorial but also in infratentorial regions18.
1.3.2 Multilevel mechanisms of action
We have published many basic research findings on the several possible
mechanisms involved in using MSCs to treat cerebral infarction. Thesemechanisms fall into three main groups: neurotrophic and neuroprotective effects by neurotrophic factors11,14,16,20, angiogenic effects (recoveryof cerebral blood flow)22,26,27 and neural regeneration10,11,14,15,20,25,28,29,36,37.
We presume that these therapeutic effects are produced at different times.
Neurotrophic and neuroprotective effects by neurotrophic factors occur
very quickly, in a matter of hours, because humoral factors produced by
MSCs act directly on the cerebral infarct lesion. Angiogenic effects start
to appear approximately 3 days after the onset of cerebral infarction, andthe recovery of cerebral blood flow becomes obvious after 1 week. The effects of neural regeneration first become apparent after 1 week and they
increase over at least several months. Although these mechanisms are
based on inherences drawn from animal studies, the results of our clinicalstudy33,34 suggest similar multilevel effects also occur in humans.
1.3.3 Mechanisms of action of neurotrophic factors
We confirmed a statistically significant change in clinical symptoms and
MRI measurements within 1–2 weeks after cell transplantation. Most patients showed reduced motor paralysis and improved resolution of spasticity within 1–3 days after transplantation, and reduction in the high-intensity area in MRI (FLAIR) within 1–2 weeks. These changes, observed
soon after transplantation, are thought to be mainly due to the activity ofneurotrophic factors secreted by the transplanted cells. After intravenous
administration, transplanted cells accumulate in the cerebral infarct lesion
and increase local levels of neurotrophic factors (e.g., brain-derived neurotrophic factor [BDNF]20 and glial-derived neurotrophic factor [GDNF]11)
within several days14.
The effects of BDNF and GDNF on brain edema are well known, butthese two factors are effective only in reducing edema in the acute phaseof cerebral infarction. The patients in our clinical study were subacute cases, so this mechanism may differ slightly from the effects on regular brain
edema. It may be more accurate to say that the high-intensity area on MRI(FLAIR) during this phase indicates a condition where intra- and extracellular fluid volumes are high. In current clinical practice, this high-intensity region has been considered dead or close to dying, and hence unable tobe reduced using existing drugs (such as osmotic diuretics and steroids). If
the recovery of neural function in our patients did indeed result from a reduction in brain edema due to the increased concentration of neurotrophic factors at the local lesion site, we may have to fundamentally reconsider the currently accepted pathophysiological concepts of cerebral infarctlesions. The region we have considered to be untreatable in subacute cerebral infarctions is not in fact damaged beyond repair, but consists of brain
tissues that can still be treated.
Not only do neurotrophic factors have anti-edematous and apoptosisreducing effects14, they also affect neuronal excitability by acting directly
on ion channels on the surface membrane of both neural cells and axons33.
For example, BDNF causes changes in neuronal excitability by altering
the potassium channel kinetics and the properties of the resting membrane potential, polarization of the action potential, and after-hyperpolarization, all of which occur extremely quickly. The excitability of the neural cell changes within milliseconds of BDNF reaching a cell. BDNF also
directly affects the efficiency of neurotransmission in the synapses. Therapeutic effects seen during the early stages after transplantation may due tothe effects of these neurotrophic factors, which may restore the functionsof the surviving dysfunctional neural cells and axons.
We also know that BDNF restores the activity of K–Cl transporters
in the spinal cord and increases the effects of GABA, thereby reducing
spasticity. Indeed, spasticity reduction was seen within several days afadvances.tri-kobe.org/en

Osamu Honmou

ter transplantation. These results suggest that cell therapy’s site of action
is not limited to the local cerebral infarct; we may have to consider thatcell therapy improves the overall function of the brain, spinal cord andnerves. From this perspective, systemic administration by intravenous injection is reasonable.
1.3.4 Angiogenesis and stabilization of the BBB
One of the effects of MSCs during treatment is recovery of cerebral
blood flow by angiogenesis22,26,27. There are two possible mechanisms
for this: MSCs accumulating in the local cerebral infarct induce angiogenesis by secreting angiogenic factors (e.g., vascular endothelial growth
factor [VEGF] and angiopoietin); and transplanted MSCs differentiate
into vascular endothelial cells and form new blood vessels. Approximately 90% of the endothelial cells of the new vessels are derived from thehost, while the other 10% are derived from donor cells. According to
the results of our basic research based on animal studies, recovery of cerebral blood flow due to angiogenesis becomes significant approximately 1 week following transplantation27. A clinical study showed improved
cerebral blood flow 1 week after transplantation33.
As part of their effect on blood vessels, MSCs have also been found
to repair the disrupted BBB. The BBB is impaired regardless of the cause
of injury (i.e., ischemia or trauma). BBB injury recovers to some extent after approximately 1 month; however, recent studies have revealed
that the BBB is not completely repaired even in the chronic phase, andinjury continues to negatively affect the surrounding brain tissues. Intravenously administered MSCs have been demonstrated to repair thislonger-term breakdown of the BBB, leading to therapeutic effects17,28,32.
1.3.5 Neural regeneration
It has been suggested that neural regeneration is involved in the therapeutic
action of MSCs. There are two possible mechanisms for this: MSCs accumulating in the local cerebral infarct promote endogenous neurogenesis;
and transplanted MSCs differentiate into neuronal and glial cells10,11,14,15,20,25,28,29,36,37. Remyelination due to differentiation of MSCs into myelinforming cells, and stimulation of axonal sprouting and regeneration havealso been reported5,7,28,31. Thus, neural regeneration is believed to involve
various multilevel regenerative processes.
1.3.6 Regeneration of the entire central nervous system
MSCs are known to induce regeneration at the local site of injury, butthey have also been shown to increase the plasticity of the area surrounding the injured site and of the normal brain on the opposite side15,25,37.
These effects are enhanced when combined with rehabilitation24. Thus, forbrain/spinal cord regeneration, it is important to treat not only the local
site of injury but the entire CNS. For this reason, intravenous administration of the cells, which enables them to be delivered to the entire CNS, ispreferred over local transplantation.
1.4 Cell culture: Autologous human serum versus fetal bovine serum
Like any other stem cells, MSCs change during culture depending on
their collection site and culture method. For example, even if we use thesame basic medium, culturing cells using fetal bovine serum (FBS) willproduce cells with different biological characteristics from those produce
by culturing cells using autologous human serum. Using autologous human serum reduces the potential risk of infection, for example by prions33. The cells are also maintained in a less differentiated state and havemore stable gene expression and more rapid proliferation than cells cultured with FBS33.
Gene expression analysis reveals that angiopoietin-like 4, which inhibits apoptosis, is upregulated in MSCs cultured in autologous human serum, resulting in reduced cell death; in contrast, growth arrest-specificprotein 1 and anti-proliferative protein 1 are highly expressed in MSCs
cultured in FBS, slowing the proliferation rate.
FBS also induces differentiation into mesenchymal lineages. For example, cells cultured in FBS have high expression levels of genes associated withThe Principles of Regenerative Medicine 8

Stem Cell Therapy 1

differentiation into osteoblasts (cytokine-receptor-like factor 1, transmembrane glycoprotein NMB), adipocytes (leptin receptor, inhibitor of DNA
binding 4, members of the complement system), and chondrocytes (extracellular matrix genes, cytokine receptor–like factor 1, leptin receptor, ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 2, transforming growth
factor-β, SMAD6, OLF1/EBF-associated zinc finger gene)33.
A further problem with the use of FBS is the development of acuteand delayed immune reactions caused by xenogeneic protein contamination. When human MSCs cultured in xenogeneic serum (108 cells)
are transplanted, approximately 7–30 mg of xenogeneic serum protein is
known to enter the host; side effects caused by xenogeneic protein havebeen reported33.
1.5 Autologous versus allogeneic transplantation
Since it takes about 1 to 2 weeks to culture autologous MSCs, we need todevelop ways to treat acute diseases, for example, cell banking. Cultured
autologous MSCs can be stored frozen for more than 10 years long periods. Patients with a history of transient ischemic attack or high-risk factors
may have their MSCs cultured, expanded and cryopreserved in advance,
so that they can be administered immediately after cerebral infarction.
In patients whose MSCs need to be cultured after the onset of infarction, cell therapy may be combined with traditional treatment methods; for example, MSCs can be cultured while the patient is being treated with hypothermia during the acute phase to delay the damage to thebrain tissues.
Although allogeneic transplantation would solve the problem of culture time, significant challenges are associated with it, such as immune
rejection. In T cell activation — the starting point of immune rejection — cell-surface MHC molecules bind to the T cell receptor/CD3
complex on the T cell surface and adhesion molecules mediate co-stimulatory signals. Since MSCs are positive for both HLA classes I and II
and adhesion molecules (e.g., CD40 and CD59), intercellular adhesion
molecule (ICAM)-1, ICAM-2, ICAM-3 and vascular adhesion molecule(VCAM)-1, MSCs are highly likely to become antigen-presenting cells.
After transplantation, MSCs differentiate in the host’s body, resulting
in higher expression of antigen-presenting molecules. Therefore, co-administration of immunosuppressants is mandatory when transplanting
allogeneic MSCs. However, given the short- and long-term side effects
of immunosuppressants, their use would be very limited. Even when
immunosuppressants are used, allogeneic transplantation is less effective than autologous transplantation. Obtaining large numbers of allogeneic MSCs that are safe and high quality also presents methodologicalproblems. Thus, the use of allogeneic MSCs would be limited to diseases for which autologous MSC transplantation cannot be performed.
For the time being, regenerative medicine using autologous MSCs willtake precedence.
1.6 Mode of administration
In cell therapy, we must account for the particular challenges of administering suspensions of living cells. First, these cells are not always 100%
separated to the single-cell level. Second, not all cells are alive, so thatclumps of cells, particularly dead cells, could become sources of emboli. There is very little difference in therapeutic effect between intra-arterial
and intravenous administration. If MSCs are to be administered intravascularly, we can ensure both safety and effectiveness with intravenous administration. Intrathecal administration has the advantage that it needs
relatively few cells, but it leads to a lower rate of cell accumulation at thelesion site, and it is difficult to deliver the cells deep into the brain. Thisadministration mode cannot be used when cerebrospinal fluid (CSF) flowis blocked.
If MSCs are to be transplanted directly into the brain by stereotactic surgery, as has been done in small-animal studies, they would need to be injected at multiple points because of the larger size of the human brain. This
would increase the risk of bleeding, infection and additional injury. Furthermore, there are no criteria for determining appropriate transplantation sites.
9 The Principles of Regenerative MedicineOsamu Honmou

Although it requires administering a relatively high number of cells,
intravenous administration is considered best in terms of safety, cell delivery, targeting, effectiveness, versatility and equipment needed.
1.7 Topics for future investigation
The results of our clinical study raise new questions. Functional recovery
in cerebral infarct patients treated with MSC transplantation did not always follow the same course as that observed in patients not treated with
MSCs. For example, shortly after MSC transplantation, some patients
showed further improvement in volitional control of their peripheral extremities, and some showed improvement in complete flaccid paralysis of
their upper extremities. The effects of MSC transplantation are thought
to be due to both donor and host cells, and are characterized by various
mechanisms operating at different times and different sites. This may explain why the recovery course seen in this study differed from the conventional course. Points to reconsider include the development of new
measures of effectiveness, and different approaches to rehabilitation andgoal setting.
Most methods of assessing stroke are based on data obtained by observing the course of spontaneous functional recovery. The various recovery processes induced by MSC transplantation, which differ from traditional processes, cannot be fully assessed by traditional methods; we needto develop new measures that account for treatment mechanisms. MSC
transplantation is also likely to lead to recovery in smaller motor units,
which we need to be able to assess in detail. One possible way is to use objective data obtained from 3D motion analysis. However, we also need asimpler assessment method that does not require special equipment.
Rehabilitation strategies also need to be reconsidered in order to increase the therapeutic effects of MSC transplantation. Neural cells start
to regenerate soon after treatment and the process continues for several
months; differentiation of donor cells into neural cells and activation ofhost cells continue, resulting in reconstruction of neural circuits. The keyrole of rehabilitation is to facilitate this reconstruction effectively and efficiently. We need to investigate what methods are most appropriate forreconstructing neural circuits, making use of existing and new methods.
It is important to accurately activate the target neural circuit and increase
its use; the key factors are the form, number of sessions and frequencyof exercise.
We can expect a change in the overall goal of rehabilitation. Traditionally, the goal has been to help patients return to home and work, based on
the prevailing idea that it is difficult to regenerate the impaired brain. In
addition to preventing joint contractures and disuse syndrome, rehabilitation aims at maximizing the use of remaining function, using assistive
devices to compensate for lost function, and enabling patients to performdaily living activities. Achievement of higher goals such as walking depends on how much function remains. Regenerative medicine using MSC
transplantation will overturn current ideas on rehabilitation and will fundamentally change rehabilitation strategies. MSC transplantation promises further improvement in the functions of the extremities and trunk, andso we can set higher goals and see higher success rates.
2. SPINAL CORD INJURY
2.1 The need for a new treatment
Spinal cord injuries occur when the spinal column is subjected to a powerful external force, usually trauma. The most common causes are traffic accidents, followed by sport- or work-related accidents and falls from stairs.
There are 100,000 affected patients in Japan, and an estimated 5,000 people are injured each year. The cost of healthcare in the first year after an
injury is over 10 million yen per patient; the total annual healthcare costfor those who are newly injured is 50 billion yen. According to a closed
commercial report by Thomson Reuters, social security for spinal-cordinjury patients costs more than 10 billion yen globally each year. In addition, there are large financial losses, including lost employment opportunities for patients with spinal cord injury and for family members who
provide care.
advances.tri-kobe.org/en

Stem Cell Therapy 1

When the spinal cord is injured, the patient loses movement and sensation in the arms and legs below the level of injury. The higher the injury,
the more extensive the paralysis and the more severe the disability. Damage at the thoracic or lumbar level can cause paralysis of the lower body,whereas damage at the cervical level can produce quadriplegia. Unfortunately, it is impossible to regenerate the injured spinal cord using current
medical techniques, so development of a new treatment has been eagerly anticipated for years. In Japan, many of these patients are young, andmost of them must live with serious disabilities for the rest of their lives.
Currently, there are three standard treatment methods, none of which
provide satisfactory outcomes.
1. Decompression and stabilization surgery during the acute phase
It is impossible to repair the injured spinal cord itself by surgery. The main
purpose of surgery is to reduce and stabilize fractures and dislocations of
the spinal column. A direct therapeutic effect on residual disability cannot
be expected from surgery.
2. High-dose methylprednisolone therapy during the acute phase
Within 8 hours of injury, methylprednisolone 30 mg/kg is given over 15
minutes, followed after a further 45 minutes by continuous infusion of
5.4 mg/kg/h for 23 hours. However, this treatment has many side effects,
and its therapeutic effect is being re-examined.
3. Rehabilitation
Rehabilitation centres mainly on physical and occupational therapy, inwhich patients practice activities of daily living with the aim of returning to their social activities. However, rehabilitation has very limited therapeutic effect. Rehabilitation for spinal cord injuries does not aim to recover lost functions; rather its main aim is to make the most effective
use of remaining functions and to enable patients to perform activities ofdaily living.
2.2 Research overview
The basic research we have conducted over many years leads us to expectthat autologous MSCs (STR01) (the study drug used in investigatorsponsored trials for cerebral infarction) will also be effective for spinal
cord injury28,29,38. We are therefore attempting to expand the indicationof this investigational drug to spinal cord injury. We submitted a clinical
trial notification in October 2013 and started an investigator-sponsored
trial (phase II: open label, exploratory trial). The proposed indication is“improvement of neurological symptoms and signs and functional disability associated with spinal cord injury (therapeutic classification code:other biological products 639).” This trial is registered in the Clinical
Trials Registry of the Japan Medical Association Center for Clinical Trials (https://dbcentre3.jmacct.med.or.jp/jmactr/App/JMACTRE02_04/
JMACTRE02_04.aspx?kbn=3&seqno=3923).
Neuroradiological, histological and behavioural improvement has
been seen in rat models of spinal cord injury after intravenous transplantation of MSCs28,29,38. Treatment mechanisms may include neuroprotective, neuroregenerative, angiogenic and anti-inflammatory effects28,29,38.
Treatment was found to be effective not only in the hyperacute phase29,38
but also in the chronic phase28, demonstrating a relatively broad therapeutic time window.
Most studies on regenerative medicine for spinal cord injury adopt
the method of directly transplanting cells into the injury site. However,this necessitates inserting a needle into the injured spinal cord to infuse
cells, which risks causing additional damage. Direct transplantation also
has limited potential treatment mechanisms. Furthermore, even if efficacy can be demonstrated in animal models, the potential risk is considered
too high for humans. In this trial, however, autologous MSCs are delivered through intravenous infusion; this procedure is simpler, less invasive
and allows the administered cells to reach the entire damaged area due totheir natural capacity to accumulate at the injury site. Treatment is expected to produce excellent results.
advances.tri-kobe.org/en

Osamu Honmou

Intravenously administered MSCs are known to induce regenerationof the motor areas of the cerebral cortex in rats with spinal cord injury38.
To maximize the possible therapeutic effect, it is important to induce regeneration of the entire CNS and not just at the spinal cord injury site.
Consequently, intravenous injection, which can deliver cells to the entire
CNS, is considered a better administration route.
At present, techniques exists to alleviate the damage of spinal cord injury (surgery and drug therapy during the acute phase, followed by rehabilitation), but no techniques can repair the damaged spinal cord itself.
MSC administration could become a breakthrough therapy.
2.2.1 An investigator-sponsored trial of STR01 in spinal cord injury
We aim to establish a completely new treatment for spinal cord injury
in this investigator-sponsored trial. The indication for this investigational treatment is “improvement of neurological symptoms and signs, impaired activities of daily living, and functional disability associated withspinal cord injury.”
Basic research and preclinical proof of concept studies conducted todate suggest that the action mechanisms of this treatment may include
accumulation of transplanted cells in the lesions (homing effect); neurotrophic, neuroprotective and anti-inflammatory effects of transplanted
cells via neurotrophic factors; remyelination of demyelinated axons; neural regeneration (differentiation into neural cells), regeneration of damaged axons and axonal sprouting; stabilization of the blood–spinal cord
barrier. Since transplanted cells exert multiple therapeutic effects at different times and sites, we can expect very good therapeutic effects after asingle treatment.
This treatment is expected to produce greater therapeutic effects thanexisting treatments since it will minimize neural damage caused by spinal
cord injury, inhibit progression of delayed secondary neural injury andfacilitate recovery and regeneration of neural cells and axons. Standard
treatment cannot repair the damaged spinal cord. In contrast, this newtreatment is expected to actively repair the injured spinal cord by the multifaceted mechanisms described above.
The three measures used to assess improvement of neurological symptoms and signs, impaired activities of daily living and functional disability associated with spinal cord injury are:
• ASIA Impairment Scale, developed by the American Spinal Injury
Association (ASIA), which is used as the primary outcome measure
for assessing improvement in impaired movement and perception• International Standards for Neurological and Functional 		Classification of Spinal Cord Injury (ISCSCI-92) designed by ASIA
• Spinal Cord Independence Measure (SCIM-III), an activity of dailyliving measure designed specifically for spinal cord injury.
Patients included in the trial are those with cervical cord injury (severe cases categorized as grade A, B or C in the ASIA Classification).
First registration occurs within a few weeks of spinal cord injury. This isimmediately followed by collection of bone marrow and culture of mesenchymal stem cells. The cells are administered intravenously on day 40,
and efficacy and safety are evaluated on day 220 (about 6 months after
treatment). This clinical trial has already been completed, and the Japan
Ministry of Health, Labor and Welfare officially approved “Conditional/Time-limited Authorization” (28 December 2018).
3. FUTURE PROSPECTS
Intravenous MSC therapy is known to be effective not only for localized
brain ischemias such as cerebral infarctions, but also for global cerebral ischemias such as post-resuscitation encephalopathy39. It has thus been suggested that intravenous administration of autologous MSCs will be effective forany type of ischemia and will have a wide range of applications. In short,
this treatment can act as a potential neuroprotective agent during ischemiaof the brain, spinal cord and nerves, and has various potential uses.
The treatment mechanisms of MSCs are wide ranging and include neurotrophic and neuroprotective effects via neurotrophic facThe Principles of Regenerative Medicine 10

Stem Cell Therapy 1

tors; angiogenic effects (recovery of blood flow); stabilization of the
BBB; neural regeneration; and an increase in plasticity, which is believed to contribute greatly to therapeutic effects during the chronic
phase. These effects are seen in both adult24,25 and developing brains37.
Intravenous administration of MSCs to a neonatal rat model of cerebral infarction has demonstrated increased plasticity of the normal sideof the brain, increased brain volume and number of neural cells, andbehavioural improvements37.
MSCs have an inhibitory effect on abnormal neural circuits40. Intravenous administration of MSCs in a rat epilepsy model has reduced epileptic seizures by inhibiting abnormal neural circuits and increasing thenumber of inhibitory GABA neurons40. Thus, MSCs have complementary effects on the CNS when there is a deficit in neuronal activity, and inhibitory effects when there excessive neuronal activity.
We can therefore safely say that MSCs greatly contribute to self-healing. In animal studies, their effectiveness has already been demonstrated
in various neurological diseases including:• chronic cerebral infarction13,19• cerebral hemorrhage17• chronic spinal cord injury28• post-resuscitation encephalopathy39• Parkinson’s disease41• prion disease35• hypoxic ischemic encephalopathy in the developing brain37• epilepsy40• brain tumours42• peripheral nerve injury43,44
Regenerative medicine using somatic stem cells, including bone marrow transplantation, is expected to be put to practical use very soon because
it has a high safety profile, allows for autotransplantation, and some of its
techniques are already being used. In particular, since MSCs can be cultured
and expanded from very small amounts of bone marrow, they are increasingly being recognized as convenient cells for clinical application.
MSCs have the potential to cause a paradigm shift in treatment strategies for refractory neurological diseases including stroke and spinal cord
injury, and we anticipate that the indications for “autologous mesenchymal stem cells (STR01)” to be expanded to many refractory neurological diseases.
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Stem Cell Therapy 1

Osamu Honmou

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advances.tri-kobe.org/en

The Principles of Regenerative Medicine 12

Stem Cell Therapy 2

Tissue regeneration
by Muse cells after
acute myocardial infarction
Shinya Minatoguchi1,2, Yoshihisa Yamada3, Shingo Minatoguchi3,
Toshiki Tanaka3, Atsushi Mikami1, Shohei Wakao4, Yoshihiro Kushida4 andMari Dezawa4
Department of Circulatory and Respiratory Advanced Medicine, Gifu University Graduate School of
Medicine, Gifu, Japan.
2
Heart Failure Center, Gifu Municipal Hospital, Gifu, Japan.
3
Department of Cardiology, Gifu University Graduate School of Medicine, Gifu, Japan.
4
Department of Stem Cell Biology and Histology, Tohoku University Graduate School of Medicine,
Sendai, Japan.
1

Multilineage-differentiating stress enduring (Muse) cells are promising for treating acute
myocardial infarction. Specifically, animal studies conducted by researchers associatedwith the Translational Research Center for Medical Innovation (TRI) in Japan have shownthat they improve cardiac function and attenuate left ventricular remodelling after acute
myocardial infarction.

1. ACUTE MYOCARDIAL INFARCTION: CURRENT TREATMENT AND
THERAPEUTIC CHALLENGES
Acute myocardial infarction (AMI) is caused by a sudden occlusion of the coronary artery. The occlusion
blocks blood flow, which delivers oxygen and nutrients to the myocardial tissue, and hence causes necrosis of the tissue. AMI leads to heart failure because of reduced cardiac function and left ventricular (LV)
remodelling and is associated with high mortality1.
After complete occlusion of the coronary artery, necrosis commences in the ventricular wall in the region that has lost the blood supply by the occluded coronary artery. Necrosis then gradually extends fromthe endocardium towards the epicardium. Because of this progression of necrosis, which is termed a wavefront phenomenon2, early reperfusion after myocardial ischemia can confine myocardial necrosis to thesubendocardial region, resulting in a smaller infarct size and less impairment of cardiac function. However, failure to perform early reperfusion results in a transmural infarct that extends from the endocardium to the epicardium. If the coronary artery involved is a large proximal blood vessel, massive myocardial
infarction occurs and seriously impairs cardiac function. In the subacute and chronic phases, the infarcted LV wall undergoes remodelling, which thins the wall and increases the LV chamber diameter. This remodelling can lead to heart failure. Consequently, one of the major problems in treating AMI is that patients saved in the acute phase (about 1 week after onset) still have a risk of heart failure in the chronic
phase and may have a poor prognosis.
The current first-line and most effective therapy for AMI is reperfusion of the occluded coronary artery, implemented as early as possible after AMI onset to save residual viable cardiomyocytes and minimize damage to the myocardium. The therapy involves diagnosing as soon as possible after AMI andtransporting the patient to a catheterization laboratory, where the occluded coronary artery is revascularized by percutaneous coronary intervention (PCI) to restore blood flow to myocardial tissue. Patients who
received reperfusion within 60 minutes from AMI onset had a good prognosis, whereas prognosis was significantly poorer if reperfusion was delayed for longer than 120 minutes3. Reperfusion by PCI within 90
minutes of onset is considered the gold standard, but AMI patients commonly fail to receive therapy within 90 minutes, if they receive it at all4. Reperfusion may also fail. Therefore, AMI treatment with reperfusion by PCI alone is not enough to improve prognosis.
The process of LV remodelling during the transition from the subacute to the chronic phase is complex and closely related to the healing process, including hypertrophy of residual cardiomyocytes and reconstruction of the LV by non-cardiomyocytes such as stromal cells5,6. The extent to which cardiac function recovers after AMI depends on the effect of remodelling on the healing process of the AMI lesion.
If pluripotent stem cells that can differentiate into cardiomyocytes could be efficiently engrafted into theinfarcted area and replace dead cardiomyocytes during the healing process, cardiac function impairment
13 The Principles of Regenerative Medicine

Shinya Minatoguchi et al.

SUMMARY
Multilineage-differentiatingstress enduring (Muse)cells are non-tumorigenic
pluripotent stem cells thatexist naturally in the humanbody. A clinical study in 79
acute myocardial infarction(AMI) patients showedthat Muse cells increased
during the acute phase of
AMI. Also, patients withhigh Muse cell numbersin the acute phase showed
improved cardiac function
and attenuation of left
ventricular remodelling
6 months after AMI,
suggesting that an increased
number of Muse cells in the
peripheral blood is associatedwith improved cardiac
function and attenuatedleft ventricular remodelling.
After intravenously injecting
Muse cells derived fromthe bone marrow into therabbit AMI model upon
the onset of infarction,
Muse cells homed in on
the infarct region andthen differentiated into
cardiomyocytes and bloodvessels. Muse cells wereshown to have a paracrine
effect, which is associatedwith reduced infarct size,
improved cardiac function,
and attenuated ventricularremodelling. These results
confirmed the safety andefficacy of Muse cells.
Clinical trials of AMI
treatment using Muse cells
are ongoing.
CORRESPONDING
AUTHOR
Shinya Minatoguchi

E-mail: minatos@gifu-u.ac.jp

advances.tri-kobe.org/en

Stem Cell Therapy 2

A

Shinya Minatoguchi et al.

B

Changes in Number of Muse Cells(Cells/100μL)(Cells/100μL)

400
350
300
250
200
150
100
50
0

N.S.

400
350
300
250
200
150
100
50
0

*

*

*

Number of Muse Cells**(Cells/100μL)

500

**
*

400
300
200
100
0

CTRL

(n=64)C Relationship between ∆Muse and ∆EF
ΔMuse cells(Cells/100µl)
400

From Ref. 16 © 2019 Japanese Circulation Society**

P=0.010D

ΔMuse cells(Cells/100µl)
400
300

200

200

100

100
ΔEF<0
(n=17)

0≤ΔEF(n=38)(%)

AMI(MAX)(n=79)

Relationship between ∆Muse and ∆LVDd

300

0

CAD

(n=44)

0

P=0.005

ΔLVDd≤0 0<ΔLVDd(n=22)(n=33)(mm)

Figure 1. A, Changes in Muse cell numbers with time in the peripheral blood of AMI patients. B, Muse cell numbers in the peripheral blood of AMI patients, CAD patients and subjects
with normal coronary arteries (control). C, Relationship between the increase in the number of Muse cells (∆Muse) in the acute phase and cardiac function improvement in the chronic
phase measured as the change in ejection fraction (∆EF). D, Relationship between ∆Muse in the acute phase and ∆LVDd in the chronic phase.
* p < 0.05; ** p < 0.01; LVDd, left ventricular end-diastolic dimension
Reproduced from Ref. 16.

and LV remodelling, as well as heart failure in the chronic phase, could be
prevented and the patient’s prognosis improved. Autologous stem cells derived from the bone marrow (BM) have been used, and various regenerative effects have been reported7,8. Clinical application of autologous cells
should be straightforward since there are no ethical concerns with theiruse. Many clinical studies of tissue repair and regeneration therapy after
AMI have been conducted worldwide using BM nucleated cells and BMderived mesenchymal stem cells (MSCs)7,8. In placebo-controlled studies, the therapy showed no or minimal improvement in cardiac functionin the chronic phase7,8. These limitations of postinfarct regenerative therapy using BM nucleated cells or BM-derived MSCs as a cell source haveprompted a search for an alternative cell source that readily differentiates into cardiomyocytes and has a potent repair and regenerative ability.
In 2010, Dezawa et al. discovered multilineage-differentiating stressenduring (Muse) cells9. Muse cells are selected as cells positive for stagespecific embryonic antigen-3 (SSEA-3), a cell surface marker for pluripotent stem cells9–12. Muse cells also express pluripotency markers such as
Sox2, Oct3/4 and Nanog, and they can differentiate into cells of all threegerm layers (ectodermal, mesodermal and endodermal lineage cells) froma single cell9. Moreover, Muse cells reside naturally in the human bodyand are located in the BM9, skin10, adipose tissue12,13, connective tissueof various organs14 and peripheral blood15,16. Because Muse cells are pluripotent stem cells and the therapy does not require gene transfer, theyshould be safe and clinical application should be straightforward. Reports
have shown that about 1 million Muse cells can be collected from approxadvances.tri-kobe.org/en

imately 30 mL of fresh human BM aspirates cultured for 3 days14,17. Thisease of culture suggests that therapy using Muse cells are considered feasible for clinical application.
2. MUSE CELL NUMBERS IN THE BLOOD OF ACUTE-PHASE
AMI PATIENTS AFFECT CARDIAC FUNCTION AND LVREMODELLING IN THE CHRONIC PHASE
The existence of Muse cells in the peripheral blood has previously been
documented for ischemic stroke patients15, but the kinetics of Muse cells
in the peripheral blood of AMI patients during the acute phase had notbeen characterized. We thus investigated changes in the number of Musecells in the blood during the acute phase in 79 AMI patients admitted to
Gifu University Hospital (AMI group). We also investigated the effect of
the change in Muse cell numbers on cardiac function and LV remodelling
6 months after the onset of AMI. The results were compared with two further groups: a coronary artery disease (CAD) group (n = 44) consisting ofpatients with ≥75% coronary artery stenosis on coronary angiography anda control group (n = 64) consisting of patients with <75% coronary arterystenosis. Muse cell numbers (cells/100 µL) in the peripheral blood were
determined as SSEA3+/CD105+ double-positive cells by fluorescence-activated cell sorting16. Muse cell numbers in the blood were measured on the
day of admission (day 0) and at 1, 7, 14 and 21 days after AMI.
We obtained the following results16. No significant difference was detected in Muse cell numbers between the AMI group and the control
group on the day of admission. Muse cell numbers in the AMI group
The Principles of Regenerative Medicine 14

Stem Cell Therapy 2

AAuto (2W)Muse

Non-Muse

MSC

VehicleB

C

Auto (2M)Muse

Non-Muse

MSC
fibrosis/LV (%)

VehicleShinya Minatoguchi et al.

Infarct size

Infarct size

Non-Muse

MSC

VehicleMuse

non-Muse

MSC

Figure 2. A, Effects of autograft Muse cells, non-Muse cells and MSCs on infarct size (2 weeks after AMI). B, Effects of autograft Muse cells, non-Muse cells, and MSCs on infarct size
(2 months after AMI).
* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; AMI, acute myocardial infarction; MSC, mesenchymal stem cell
Reproduced from Ref. 19.

peaked 24 hours after AMI onset and were significantly higher than on
the day of admission. This significant increase was maintained at 7 days.
After 14 days, the Muse cell numbers had decreased significantly, and by
21 days they had returned to baseline (Fig. 1A). Muse cell numbers inthe blood in the CAD and control groups were not significantly different (Fig. 1B).
These results demonstrate that Muse cell numbers in the peripheral
blood do not increase in CAD patients with significant coronary arterystenosis, but are mobilized into blood only when AMI occurs, causing
necrosis of myocardial tissue. MAX Muse was defined as the maximum
number of Muse cells measured within 21 days of admission due to AMI(up to 21 days), and ∆Muse was defined as the difference in Muse cellnumbers between MAX Muse and the minimum number. Both the peakcreatine kinase (PCK) level after AMI onset and ∑CK, the sum of creatine
kinase levels, are considered measures of myocardial infarct size18. A high∆Muse in patients with a high PCK or ∑CK was associated with a large
infarct size; that is, the more damaged the myocardium was, the moreMuse cells were mobilized. We also measured plasma sphingosine-1-phosphate (S1P) levels by liquid chromatography–tandem mass spectrometry.
Plasma S1P levels in the AMI group were significantly higher than in thecontrol group, whereas plasma S1P levels in the CAD and control groups
were not significantly different. Plasma S1P levels and MAX Muse showeda significant positive correlation (r = 0.330)16. These results suggest that
S1P might be involved in mobilizing Muse cells in the blood16.
We then investigated the effect of the number of Muse cells mobilized
in the acute phase on cardiac function and LV remodelling in the chronic phase (at 6 months). The results were as follows. ∆Muse (maximum –15 The Principles of Regenerative Medicineminimum Muse cell number) was significantly higher in patients withimproved cardiac function, as measured by ejection fraction (EF), in thechronic phase (at 6 months) than in patients without an improvementin EF (Fig. 1C); ∆Muse was also significantly higher in patients with decreased LV end-diastolic dimension (LVDd) (that is, attenuated LV remodelling) than in patients with increased LVDd (that is, accelerated LV
remodelling) in the chronic phase (Fig. 1D). These results demonstratethat cardiac function is improved and LV remodelling is attenuated in thechronic phase if large numbers of Muse cells are mobilized into the peripheral blood during the acute phase of AMI16. Administering exogenous
Muse cells in the acute phase is thus expected to improve cardiac function
and attenuate LV remodelling in the chronic phase.
3. TISSUE REPAIR/REGENERATION THERAPY FOR
INFARCTED MYOCARDIUM USING MUSE CELLS
3.1 Effect on infarct size, cardiac function, and LV remodelling
We conducted an in vitro study to investigate the differentiation of Musecells into cardiomyocytes by culturing rabbit BM-derived Muse cells andhuman BM-derived Muse cells. Muse cells differentiated into cardiomyocyte-like cells that expressed cardiac troponin I and sarcomeric α-actinin19.
To develop a tissue repair and regeneration therapy for human MI using
Muse cells and to demonstrate the efficacy and safety of the therapy invivo, we developed a rabbit AMI model by occluding the coronary arteryof Japanese white rabbits for 30 minutes and reperfusing it (ischemia reperfusion model)19.
The current first-line therapy for AMI is revascularization of the occluded coronary artery by PCI using a cardiac catheter. Therapy using auadvances.tri-kobe.org/en

From Ref. 19 © 2019 American Heart Association, Inc.

Muse

30

20

10

0

% of infarction to LV% of infarction to LV

Vehicle40

DA

Stem Cell Therapy 2

B
x104
4.0

x104
5.0

4.5

C

Distance from occlusion
3 mm
6 mm
9 mm

Engrafted cell number

x104
4.0

***

2.5

Muse

Lung

Muse
Non-Muse

D

Muse +
JTE-013

***
***

100
90
80

*

**

***

**

70
60

ng/g

non-Muse

2.5

Heart

Total Flux [p/s]

From Ref. 19 © 2019 American Heart Association, Inc.

2W

Muse

Distance from occlusion
3 mm
6 mm
9 mm

Muse cells+JTE-013

2W

Muse

A

Shinya Minatoguchi et al.

50
40
30
20
10
0

sham

MI (6h)MI (24h)

Infarct area

MI (6h)MI (24h)border area

Figure 3. A, Nano-lantern-labelled Muse cells accumulated in the infarct area, but non-Muse cells did not (2 weeks after AMI). B, Nano-lantern-labelled Muse cells detected in theinfarct area did not accumulate when co-injected with JTE-013, an antagonist selective for S1PR2 (2 weeks after AMI). C, Numbers of Muse cells engrafted in the infarct area with andwithout JTE-013 estimated from immunohistochemical analysis 3 days after AMI. D, S1P levels in the infarct area and the border area of infarcted and normal myocardial tissue.
S1P, sphingosine-1-phosphate; S1PR2, sphingosine-1-phosphate receptor 2* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; Reproduced from Ref. 19.

tograft Muse cells would be worth developing if it were found to be more
effective in improving cardiac function and attenuating LV remodellingthan stem-cell therapies primarily involving autograft MSCs, which havebeen used in clinical studies to date.
The effects of 3 × 105 autograft Muse cells intravenously infused into
rabbit 24 hours after AMI onset (the Muse group) were compared withan equal number of autograft MSCs (the MSC group). As MSCs include
several percent of Muse cells, the effects of MSCs that do not include
Muse cells (the non-Muse group) were also studied. The parameters studied were the myocardial infarct size and those that indicate LV function:
LV ejection fraction (EF%), LV fractional shortening (FS%), LV systolic function (+dP/dt) and LV diastolic function (−dP/dt); and those thatindicate LV remodelling: LVDs and LVDd. These parameters were compared 2 weeks and 2 months after AMI in the Muse, non-Muse and MSC
groups, as well as in a control group, which was injected with vehicle only.
The results showed that the MSCs moderately reduced infarct size at both
2 weeks and 2 months compared with the control group, but that there
was a marked reduction in infarct size in the Muse group, approximately
two times greater than in the MSC group (Fig. 2A and 2B). The attenuating effect on LV remodelling and the effect on cardiac function improvement were also significantly greater in the Muse group than in the MSC
group at 2 weeks and 2 months. The greater improvement achieved using
Muse cells compared with conventional stem cells (MSCs) indicates thatdevelopment of tissue repair/regeneration therapy using Muse cells for
AMI would be clinically very significant.
As we anticipated, AMI treatment using Muse cells could potentially be more effective than conventional therapies. However, some problems arise when autograft Muse cells are used in clinical practice. Collecting BM aspirates from patients immediately after AMI onset in the acutephase is an invasive procedure. At least 7 days is required to isolate Museadvances.tri-kobe.org/en

cells from BM aspirates and culture a sufficient number of Muse cells fortissue repair and regeneration. It is thus more realistic in clinical practiceto use allograft Muse cells, which can be administered within the optimal time window, instead of autograft Muse cells. When 3 × 105 allograftMuse cells derived from rabbit BM cells were intravenously infused into
rabbits 24 hours after AMI onset, the reduction in infarct size at 2 weeks
was comparable to that seen with autograft Muse cells19. The effect of allograft Muse cells persisted for a long time — the effects of allograft Musecells in reducing infarct size, improving LV function and attenuating LV
remodelling were sustained for 6 months after AMI19.
3.2 Mechanism of engraftment of Muse cells into the infarct region
One remarkable characteristic of Muse cells intravenously injected after
AMI was preferential engraftment into the infarct area. Engraftment in theMI site was investigated using Muse and non-Muse cells labelled with theluminescent Nano-lantern protein. Muse cells were engrafted into the infarct region but non-Muse cells were not (Fig. 3A). Co-injection of Musecells with JTE-013, an antagonist selective for sphingosine-1-phosphate receptor 2 (S1PR2), significantly blocked the engraftment of Muse cells onto
the infarct region (Fig. 3B). Histological analyses of Muse cell engraftment
3 days after AMI also showed that Muse cells were engrafted into the infarct area, and that this engraftment was substantially inhibited by co-injection with JTE-013 (Fig. 3C). The engraftment rate of Muse cells was 14.5%
at 3 days19. Given that the engraftment rates usually reported for MSCs are
0–3%20,21, the rate for Muse cells is high. The S1P levels were significantly higher in the infarct area and the infarct border area than in the corresponding areas in normal myocardial tissue (Fig. 3D). This result is due tothe preferential engraftment of intravenously injected Muse cells into theborder area and the infarct area. An in vitro assay using a Boyden chamber to quantify Muse cell migration showed that the number of migrated
The Principles of Regenerative Medicine 16

Shinya Minatoguchi
et al.
Muse Cells Repair the Acute Myocardial Infarction
1073

From Ref. 19 © 2019 American Heart Association, Inc.

Stem Cell Therapy 2Yamada et al

Figure 4. A–D, GFP-labelled autograft Muse cells engrafted into the infarcted myocardial region expressed cardiac markers ANP, troponin I and α-actinin (2 weeks after AMI).
GFP-labelled Muse cells also expressed connexin-43 between themselves and host cardiomyocytes (2 weeks after AMI). E–H, GFP-labelled autograft Muse cells engrafted into theinfarct myocardial region expressed cardiac markers ANP, troponin I and α-actinin (2 months after AMI). AMI, acute myocardial infarction; ANP, atrial natriuretic peptide; GFP, green
fluorescent protein
Reproduced from Ref. 19.

Muse cells increased significantly and in a dose-dependent manner in response to the S1PR2 agonist SID46371153. A marked level of migration ofMuse cells towards affected cardiac tissue was observed, but this migration
was blocked in a dose-dependent manner by JTE-013. S1PR2 is expressedon the surface of Muse cells. Silencing S1PR2 on Muse cells using siRNA
significantly inhibited migration of Muse cells towards the S1PR2 agonist
SID46371153 or AMI cardiac tissue19. These in vivo and in vitro data indicate that the S1P–S1PR2 axis is involved in the mechanisms of migrationand engraftment of Muse cells into AMI cardiac tissue.

We then investigated whether cardiomyocytes that had differentiated from Muse cells were playing a functional role as working myocardium in the beating heart. GCaMP3-labelled human Muse cells were transplanted into AMI cardiac tissue in the rabbit AMI model. GCaMP is a
calcium sensor protein obtained by genetically engineered fusion of enhanced GFP (EGFP), calmodulin (CaM) and myosin light chain fragment (M13). When a calcium ion binds to calmodulin, an interaction between the Ca2+/CaM complex and M13 induces a conformational change
in EGFP (fluorophore), which changes the fluorescence intensity. Thischange in GCaMP fluorescence intensity can be used to detect changes in
the calcium concentration. Two weeks after infarction, thoracotomy was
performed to observe the postinfarct heart with an epifluorescence stereomicroscope (Nikon, SMZ745T) equipped with an EXFO X-Cite® illumination source. A time-intensity curve showed that a green signal synchronous with ECG recordings was intensified during systole and became lessintense during diastole19. This signal represented the changes in intracellular Ca2+ concentration in cardiomyocytes that had differentiated fromMuse cells, demonstrating that differentiated cardiomyocytes were functioning as working myocardium.

3.3 Differentiation of Muse cells into cardiomyocytes
Thin sections of affected cardiac tissue were stained 2 weeks after AMI
to investigate the expression of cardiac markers atrial natriuretic peptide(ANP), troponin I, sarcomeric α-actinin and gap-junction marker connexin-43 in engrafted Muse cells. Confocal microscopy showed that green
fluorescent protein (GFP) used to label Muse cells merged with ANP, troponin I and sarcomeric α-actinin around the border area. Expression ofcardiac markers on Muse cells confirmed differentiation of these cells into
cardiomyocytes (Fig. 4A, 4B and 4C). Moreover, the expression of connexin 43 between the Muse cells that had differentiated into cardiomyocytes and the host cardiomyocytes suggested potential intercellular prop3.4 Differentiation of Muse cells into blood vessels and paracrine effectagation of excitation and signalling between these cells via gap junctions
Two weeks after AMI, GFP-labelled Muse cells expressed vascular endo(Fig. 4D). Two months after AMI, GFP-labelled Muse cells expressed lowthelial marker CD31 and vascular smooth muscle cell marker α-smooth
er levels of ANP and higher levels of troponin I and sarcomeric α-actinin
muscle actin, and they formed blood vessels. The Muse group had sig(Fig. 4E, 4F, 4G and 4H). Sarcomeric α-actinin-positive cells showednificantly more capillaries in the border area than the control, nonclear
striations
characteristicofmaturecardiomyocytes
(Fig.
4H).
GFPMuseand MSC
groups5B). Musecells have a paracrine
Figure 2. Immunohistologic and fluorescence in situ hybridization (FISH) analyses.
A throughD, at
2 wk (Fig.
(2W) 5A
andand(E throughG) at+allograft
Muse protein–positive
cells also expressed
ANP,
troponin I and actinin at stresseffectenduringthat is also
observed
MSCs. Vascular endothelial growth fac2 mo (2M) in labelled
the green
fluorescent(GFP) multilineage-differentiating(Muse)
group.inImmunohistochemistry
19
weeks natriuretic
and still expressed
I andactininat 6 months. Theseretor (VEGF),
growthfactor(connexin-43;(HGF), matrix metalloproteinIHC) for ANP2 (atrial
peptide;troponin
A and E),
cardiactroponin-I(B andF), sarcomeric
α-actinin hepatocyte(C, G, and H),
and Cx43
sults
indicatethatcardiomyocytes
thathaddifferentiatedfrom
allograft(MMP)-2atandwere(G)detectedin thesupernatant of
D). Striation-like arrangement of troponin-I at 2W (box) is enlarged in the inset
and thataseof α-actinin
2 MMMP-9
in the box
is enlarged
in cultureH.
19
19
Bars: A=100 Museµm; Bcells
through
H=50inµm.
and forJ, IHC
and6FISHin neighboring
sections ofMuse
GFP+cells
humanMuseintravenous
cell infusioninjection
at 2W. Left,
Low cells, VEGF, HGF,
remainedthe Iheart
at least
months.
. Afterof Musemagnification of the observed field. (V represents vessels; dashed line in I represents infarct area; and square represents that this area isenlarged in the right 3 figures). In neighboring sections, cell location in IHC and FISH was not exactly the same. Cell numbers (Continued )17 The Principles of Regenerative Medicineadvances.tri-kobe.org/en

Stem Cell Therapy 2

2W (Autograft )vehicle

***

MSC

4500

Muse

Non-Muse

Number of CD31(+)
microvessels/mm2

4000

***

B

***
**

M

**

3000

1500

D

1000

vehicleMuse

non-Muse

VEGF

HGF
VEGF
MMP-2
MMP-9
αTubulin

MSC

αSMA

TUNEL/myoblobin

Muse

E

TUNEL
positivity

50μm

20 μm

50μm

20 μm

14
14
12
10
9
8
6
44
2
0
-1

*

vehicle Muse20

vehicleμm
Sirius
Red positive
area ratioMuse

α-Tubulin%

From Ref. 19 © 2019 American Heart Association, Inc.

GFP

Fig. 5

2000

HGF

MMP-9

CD31

2500

0

MMP-2

ＧＦＰ
②

①
Merged

3500

500

C

MergedVehicleA

Shinya Minatoguchi et al.

100 μm

100 μm

30
25
20
15
10
5
0

*

Figure 5. A, Numbers of CD31-positive blood vessels in the infarct border area 2 weeks after AMI (comparison of vehicle control, Muse, non-Muse and MSC groups). B, GFP-labelledMuse cells expressed vascular endothelial marker CD31 and vascular smooth muscle marker α-smooth muscle actin (2 weeks after AMI). C, Western blot showing the expression of
HGF, VEGF, MMP-2 and MMP-9 in the infarct border area 3 days after AMI (vehicle control, Muse, non-Muse and MSC groups). D, Comparison of TUNEL-positive cardiomyocytes in theinfarct border area (vehicle and Muse groups). E, Comparison of areas of the Sirius Red-positive region in the infarct regions (vehicle and Muse groups).
* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; αSMA, α-smooth muscle actin; AMI, acute myocardial infarction; GFP, green fluorescent protein; HGF, hepatocyte growth factor; MMP, matrix
metalloproteinase; MSC, mesenchymal stem cell; TUNEL, terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labelling; VEGF, vascular endothelial growth factor
Reproduced from Ref. 19.

MMP-2 and MMP-9 were expressed in the infarct border area, as wasobserved with MSCs. The level of VEGF expression was particularlyhigh compared with MSCs and non-Muse (Fig. 5C). VEGF and HGF
are angiogenic factors22,23, and HGF exhibits an anti-apoptotic effect23.
MMP-2 and MMP-9 have antifibrotic or fibrolytic effects24. Administration of Muse cells reduced the number of terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick-end labelling (TUNEL)-positive cells in the infarct border area, indicating that Muse cells have an anti-apoptotic effect (Fig. 5D). The area of the Sirius Red-positive region in the infarct
area was also reduced (Fig. 5E). These results indicate that Muse cells arevery likely associated with the increased number of capillaries in the border area, the reduced area of the fibrotic scar region in the infarct area,
and the reduced infarct size.
3.5 Immunomodulatory effect of Muse cells
Because Muse cells do not express human leukocyte antigen (HLA)DR (HLA class II) on the cell surface, they are not attacked by T cells19.
Furthermore, because Muse cells express HLA-G, a protein that is present in the placenta to prevent the fetus from being attacked19, they exert immunomodulatory effects and are not attacked by the host receiving Muse cells. These characteristics may partially explain why Musecells are not eliminated and persist in the infarct area for a long timeafter engraftment.
3.6 Significance of the persistence of Muse cells in the infarct area
When the rabbit AMI model was co-injected with the selective S1PR2 antagonist JTE-013 and allograft Muse cells, the therapeutic effects of theseadvances.tri-kobe.org/en

cells in terms of reducing infarct size and improving cardiac function at
2 weeks were reduced (Fig. 6). When the suicide gene herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-tk) was introduced into human Muse cells
and these cells were then injected intravenously into AMI rabbits, the human Muse cells were destroyed after engraftment and their effects in termsof reducing infarct size and improving cardiac function (EF) were largely abolished19.
Human Muse cells were transplanted after silencing the gene coding for GATA4, a transcription factor expressed during the generationof cardiomyocytes, using siRNA. Reduction in infarct size and EF improvement were significantly attenuated 2 weeks after AMI. Histologicalanalysis showed no differentiation of GFP-labelled Muse cells into cardiomyocytes. The observed attenuation of the effects of the human Muse cells
can thus be attributed to blockage of differentiation of the Muse cells into
cardiomyocytes by GATA4 silencing19.
These findings indicate that Muse cells are involved in reducing infarct
size and improving cardiac function by persisting in the infarct area, differentiating into cardiomyocytes, regenerating blood vessels, and exhibiting paracrine effects such as anti-apoptotic and antifibrotic effects.
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The Principles of Regenerative Medicine 18

60

%

50

1530

B

70

40
30

1020

20

510

10

00

VehicleVehicle allograft
allograftallograft
allograft
Muse
++ ++
Muse
S1PR2
S1PR2
JTE-013
JTE-013antagonist
antagonist

0

***
**

*

*

35
30

25
20
15
10
5
0

VehicleallograftEjection
Fraction (%)
Infarct Size

25
20

60

*

***

**

**

40

15

30

10

20

5

10

0

0

allograft
Muse ++
S1PR2
JTE-013antagonist

***

50

%

**

*

35
***
30

C

fibrosis/LV (%)****

fibrosis/LV (%)
%

35
70
30
60
25
50
2040

ograft++Muse
S1PR2
TE-013tagonist

Infarct Size
CEjection Fraction

Ejection
Fraction
Infarct Sizefibrosis/LV (%)

A

Shinya Minatoguchi et al.

From Ref. 19 © 2019 American Heart Association, Inc.

Stem Cell Therapy 2

Figure 6. Effect of sphingosine-1-phosphate receptor 2 (S1PR2) antagonist JTE-013 on the reduction in infarct size and improvement in cardiac function following administration ofallograft Muse cells. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001;
Reproduced from Ref. 19.

D

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19 The Principles of Regenerative MedicineD

GATA-4 siRNA-GFP-Muse

GATA-4 siRN

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advances.tri-kobe.org/en

Stem Cell Therapy 3

Yasuyuki Fujita and Atsuhiko Kawamoto

Stem-cell therapy: Cell-based
neovascularization therapy
for peripheral arterial disease
Yasuyuki Fujita and Atsuhiko Kawamoto

Institute of Medical Research and Development, Translational Research Center for Medical Innovation, Foundation for Biomedical Research and Innovation at Kobe, Japan

A neovascularization therapy developed by Translational Research Center for Medical
Innovation (TRI) researchers in Japan and based on stem cells is showing great promisefor treating chronic critical limb ischemia, offering hope to patients who are out of options.

1. INTRODUCTION
1.1 Pathology, epidemiology and treatment of chronic critical limb ischemia
A circulation disorder caused by the narrowing or occlusion of arteries in the limbs, peripheral arterial
disease (PAD) is estimated to affect more than 200 million people globally1, ranging from asymptomatic to severe. The most common underlying disease is arteriosclerosis obliterans (ASO) caused mainly byatherosclerosis; other underlying diseases include thromboangiitis obliterans (also known as Buerger’s disease), vasculitis and autoimmune diseases.
Chronic critical limb ischemia (CLI) is defined as advanced PAD for which sufferers experience pain
at rest and have ulcers or gangrene on their lower limbs (Fontaine classification stage III or more severe,or Rutherford classification category 4 or more severe) that persist for two weeks or longer. The end stageof PAD, CLI (also called chronic limb-threatening ischemia recently) generally has a very poor prognosis, being comparable with those of some advanced malignancies. It has a mortality rate of 25%, a survival rate of 30% after major amputation, and a CLI persistence rate of 20% at 1 year. Furthermore, CLI
patients have a 5-year survival rate of 40–50%2. The annual incidence of CLI is 500–1,000 per million
in Europe and the United States. An estimated 250,000 amputations of lower limbs are performed annually because of CLI1. The global number of patients with PAD has increased by 23.5% between 2000
and 20102, and there is concern that the number of patients may increase rapidly in the future. Amputation of lower limbs not only seriously deteriorates the patient’s quality of life but also causes major social and economic loss.
The currently recommended therapeutic interventions for CLI include pain control, risk factor management, treatment of ulcers or gangrene, and, for suitable patients, revascularization by bypass surgery
1997~

2003~

2007~

2008~

2017~

Discoveryof EPC(CD34+ cell)in 1997

Phase I/IIa
Phase I/IIa
Clinical study (Japan) Clinical study (US)Phase II
Investigatorinitiatedclinical study
for medical
device (Japan)

Phase II
Sponsor-initiatedclinical study
for regenerative
medicine product(Japan)Non-clinicalstudies

Dose-escalation,
single arm

Single centre,
single arm

Multicenter,randomized,
controlled,
open label

No-option CLI
N = 6: 1 x 105 cells/kg
N = 8: 5 x 105 cells/kg
N = 3: 1 x 106 cells/kg

Multicentre,
randomized,
double-blind,placebo-controlled
No-option CLI
N = 7: 1 x 105 cells/kg
N = 9: 1 x 106 cells/kg
N = 12: placebo

No-option CLI
N = 11SUMMARY
Chronic critical limb
ischemia is a painful
condition that often requires
amputation of a lower
limb and can prove fatal.
A new treatment based on
CD34+ stem cells has given
good results in animal,
nonclinical and clinical
trials. A neovascularization
therapy of the lower limbs
using G-CSF-mobilized
autologous CD34+ cells
as the novel standard ofcare is currently being
developed under theJapanese government’s
Sakigake Strategy. The
approval of CD34+ cells
as a regenerative-medicine
product is expected topave the way for extending
application to diseases
other than chronic criticallimb ischemia.
CORRESPONDING
AUTHORS
Yasuyuki Fujita

E-mail: yasufujita-ths@umin.ac.jp

Atsuhiko Kawamoto

E-mail: kawamoto@fbri.org

No-option CLI
N = 35Figure 1. Lower limb neovascularization therapy using G-CSF-mobilized CD34+ cells in CLI patients: path from nonclinicalstudies to clinical development. CLI, critical limb ischemia; EPC, endothelial progenitor cell; G-CSF, granulocyte colony
stimulating factor

advances.tri-kobe.org/en

The Principles of Regenerative Medicine 20

Yasuyuki Fujita and Atsuhiko Kawamotoor endovascular repair3. However, revascularization is unsuitable for approximately 25% to 40% of CLI patients because they lack the vein grafts
needed for bypass surgery or have multiple extensive artery lesions or comorbidities1,4,5. The primary goal of CLI treatment is to save the patient’s
life and limbs. Given that patients who are not suitable for revascularization or have refractory conditions have a very poor prognosis, it is socially and medically imperative to develop a treatment strategy for such ‘nooption’ CLI patients.
1.2 Neovascularization therapy using CD34+ cells for CLI patients
Basic and clinical research into endothelial progenitor cells (EPCs) took
off after 1997, when Asahara and co-workers demonstrated that they area subset (the CD34+ fraction) of human peripheral blood mononuclear
cells (PBMCs)6. Neovascularization therapy involving the transplantationof EPCs has attracted attention as a novel therapy for ischemic diseases.
Clinical studies of neovascularization therapy using autologous bone marrow–derived CD34+ cells are being performed globally for diseases such as
angina pectoris, acute myocardial infarction, dilated cardiomyopathy, cerebral infarction and CLI.
In 2003, we initiated a world-first phase I/IIa clinical study of lowerlimb neovascularization therapy using granulocyte colony stimulating factor (G-CSF)-mobilized autologous CD34+ cells in CLI patients and demonstrated safety and clinical efficacy7. Beginning in 2008, we conducted
an investigator-initiated study of a CD34+ cell sorter in compliance withgood clinical practice and again demonstrated efficacy and safety8. A multicentre, randomized comparative study (sponsor initiated) was started in
December 2017 with the aim of obtaining regulatory approval for CD34+
cells as a regenerative medicine product (Fig. 1). This chapter overviews
the background to these studies as well as the prospects for CD34+ cells asa regenerative medicine product.
2. NONCLINICAL STUDIES
2.1 Characteristics and kinetics of EPCs
Angiogenesis, which involves the proliferation and migration of pre-existing mature vascular endothelial cells, was originally proposed as the vascularization mechanism in adults. However, the identification of EPCs inadults as a subset (CD34+ cells) of PBMCs by Asahara and co-workers in
19976 led to the new concept of vasculogenesis, which differs from angiogenesis in that it involves progenitor cells rather than mature endothelial
cells. Neovascularization in adults is now thought to occur through interactions between angiogenesis and vasculogenesis.
EPCs exist within the peripheral blood as mononuclear cells expressing
the hematopoietic stem cell surface antigen (CD34) and the early hematopoietic stem cell surface antigen (CD133)9. When isolated and cultured
in an endothelial cell growth medium at an appropriate density, thesecells differentiate into spindle-shaped adherent cells that express CD34,
CD31, vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor 2 (also known
as kinase insert domain receptor), Tie-2 and E-selectin. Also, their uptakeof acetylated low-density lipoprotein has been confirmed6,10.
Basic research using mouse or other animal models of bone-marrowtransplantation has shown that EPCs are abundant in the bone marrowin adults. EPCs are forcefully mobilized from the bone marrow to theperipheral blood in conditions such as ischemia, inflammation, wounds,
and tumorigenesis, or following the administration of cytokines such as
G-CSF and granulocyte and macrophage colony stimulating factor, andhormones such as estrogen. They reach the neovascularization site by circulating blood, where they contribute to the formation of new blood vessels11,12. These findings have been useful for establishing a method for collecting and isolating EPCs for neovascularization therapy (Fig. 2).
2.2 Nonclinical studies on EPC transplantation
Kalka and co-workers obtained EPCs by culturing PBMCs from healthy
subjects, and they transplanted them into the nude mouse model of hindlimb ischemia. When EPCs were intravenously injected after two daysof hind-limb ischemia, accumulation of transplanted cells at the isch21 The Principles of Regenerative MedicineStromal cells

Quiescentstem cells

IschemicstressSelf-renewal
VEGF, PIGF, SDF-1,
G-CSF, GM-CSF

Bone marrow

sKit L

MMP-9

EPCs
Peripheral blood

Mobilization
Recruitment ofadditional
progenitor cells

HomingECs

Incorporation &differentiation

Angiogenesis
TissueVasculogenesis

Paracrine
effectOverexpressionof proangiogenic
growth factors

Figure 2. Kinetics of EPCs. EC, endothelial cell; EPC, endothelial progenitor cell;
G-CSF, granulocyte colony stimulating factor; GM-CSF, granulocyte macrophage colony
stimulating factor; MMP-9, matrix metalloproteinase-9; PlGF, placental growth factor;
SDF, stromal cell-derived factor; sKit L, soluble kit ligand; VEGF, vascular endothelial
growth factor

emia site was histologically confirmed, indicating that they contributed
to neovascularization in collaboration with mouse-derived vascular endothelial cells. Transplantation significantly improved the capillary density(observed histologically) and blood perfusion in the ischemic limbs (asmeasured by laser Doppler flowmetry). As a result, the limb salvage ratefrom necrosis due to severe ischemia was 59% in the EPC transplantation group, compared with only 7–8% in the control group13. Murohara
and co-workers reported similar positive results after they collected EPCs
from human umbilical cord blood and cultured and transplanted theminto nude rats with hind-limb ischemia14. Losordo and co-workers also
obtained favourable results after they collected and isolated CD34+ cells
from the peripheral blood of healthy subjects who had received a subcutaneous injection of G-CSF and transplanted them into nude rats withhind-limb ischemia (unpublished data).
Nonclinical studies have also shown that EPC transplantation therapy is effective for treating other diseases such as myocardial infarction15,16, cerebral infarction17 and refractory fracture18. These results theoretically support not only EPC transplantation but also transplantationof bone-marrow mononuclear cells (BMMCs, a cell group that includes
hematopoietic and mesenchymal cells as well as EPCs). EPCs transplanted into the animal model of ischemia were directly integrated into
new blood vessels in the ischemic tissue by vasculogenesis to form thevascular endothelium. The transplanted EPCs were found to produce
various cytokines and vascular growth factors involved in angiogenesis,
such as VEGF, hepatic growth factor, angiopoietin-1, stromal-cell-derived factor-1 alpha, insulin-like growth factor-1 and endothelial nitricadvances.tri-kobe.org/en

Reprinted from Y. Fujita & A. Kawamoto Adv. Drug Deliv. Rev. 120, 25-40 (2017), with permission from Elsevier

Stem Cell Therapy 3

Stem Cell Therapy 3

Yasuyuki Fujita and Atsuhiko Kawamoto

RUTHERFORD’S CATEGORYMAGNETIC MICROBEAD-CONJUGATEDANTI-HUMAN CD34 ANTIBODY

100

Murine monoclonal antibody
against human CD34 antigen

**

**

4

8

12

0
**

1
**

2

3
**

52

24
52
Weeks

4

5
**

6
**

104

156

208

104

156

208

80

S

Percentage (%)

Iron-dextran beadN

CD34 antigen
CD34+ cell

60
40
20
0

+

ON

Pre

24
Weeks

OFF

MAGNET
Permanent
magnetPROPORTION OF PATIENTS FREE OF CLI
100

Separation
columnFigure 3. Fundamental principles of magnetic separation of CD34+ cells

Day 1–5

Day 5

G-CSF
subcutaneous
injection

Leukapheresis

Magnetic
sorting of
CD34 + cells

Day 6Intramuscular
injection of
CD34 + cells

EPC
mobilization

Total PBMCs
harvestEPC
purification

EPC
transplantation

Figure 4. Mobilization, harvesting, isolation and transplantation of CD34+ cells in CLI
patients EPC, endothelial progenitor cell; G-CSF, granulocyte colony stimulating factor;
PBMC, human peripheral blood mononuclear celloxide synthase19–21, promoting the proliferation of the existing vascular endothelium and cellular migration (the paracrine effect). Moreover,
EPCs have been shown to release not only angiogenesis-related proteinsbut also RNAs and exosomes containing microRNA, which contributeto the paracrine effect via gene-control mechanisms (Fig. 2)22,23.
While transplantation can be performed using EPCs (CD34+ cells)
isolated from BMMCs or PBMCs and purified, many methods fortransplanting mononuclear cells (BMMC or PBMC transplantation)
without isolating and purifying EPCs have been attempted in nonclinical studies. However, several studies have highlighted the risks associated with transplanting mixed cell groups, including ossification by osteoblasts, chondrification by chondroblasts and fibrosis by fibroblasts.
The nonclinical study by Yoon and co-workers also showed that myocardial calcification occurred with high frequency when whole bone marrow cells were transplanted intramyocardially into the rat model of acute
myocardial ischemia24. We have also demonstrated that intramyocardial transplant of high-dose PBMCs into the rat model of acute myocardial ischemia led to intramyocardial hemorrhage with infiltration of many
inflammatory cells and a reduced improvement in neovascularizationand cardiac function. In contrast, transplantation of purified CD34+
cells alone was associated with an absence of adverse reactions, high levels of neovascularization and sustained recovery of cardiac function16.
The in vitro EPC colony-forming assay developed by Masuda and coworkers showed that EPC colonies are formed from CD34+ cells at aadvances.tri-kobe.org/enPercentage (%)

80
60
40
20
0
Pre

4

8

12

Figure 5. Changes with time in Rutherford’s category and the proportion of CLI patients
free of CLI in the four years after transplantation of CD34+ cells: results from theJapanese phase I/IIa clinical study*, P < 0.05; **, P < 0.01 (compared with pre-transplant); CLI, critical limb ischemia.

high frequency, whereas colonies could not be obtained from CD34−
mononuclear cells even when using 100 times more cells, demonstratinga marked difference in vascularization potential between the EPC andnon-EPC fractions25. These fundamental research and nonclinical studies suggest that transplantation of purified EPCs is superior to BMMCor PBMC transplantation in terms of low invasiveness, therapeutic effect and safety.
3. CLINICAL STUDIES
3.1 Physiological significance of EPCs
Reports have shown that patients with diabetes mellitus and patients withmany risk factors for arteriosclerosis have fewer EPCs circulating in their
peripheral blood than healthy individuals and that EPCs in these patients
have lower proliferative and migratory capacities26,27. Arteriosclerosis patients with fewer EPCs in circulation have many risk factors for poor cardiovascular prognosis and reduced vascular endothelial function28. Thus,
EPCs have been shown to be one of the important intrinsic factors that
determine the prognosis of patients with arteriosclerosis.
3.2 Phase I/IIa clinical study of neovascularization therapy for
CLI patients
Based on the results from the nonclinical studies, we conducted a multicentre, single-blinded, dose-escalation phase I/IIa clinical trial of intramuscular transplantation of G-CSF-mobilized CD34+ cells in CLI paThe Principles of Regenerative Medicine 22

Reprinted from Ref. 29, with permission from Elsevier

CD34 cellCD34- cell
Magnetic microbeadconjugated antibody
Magnetically labeled
CD34+ cell*Yasuyuki Fujita and Atsuhiko Kawamoto

SPP

0.5

0.3
0.2
0.1

0

2

4

8 12 24 36 52
Weeks

500
400

40

Distance (m)Pressure (mmHg)

TBI

Total walking distancePain-free walking distance

60

0.4

0

TCPO2

20

0

0

2

4

8

12 24 36 52

Weeks

300
200
100
0

0

2

4

8

12 24 36 52

Weeks

Figure 6. Changes with time in measures of signs and symptoms up to 52 weeks after transplantation of CD34+ cells into CLI patients: results from the exploratory investigatorinitiated study.
SPP, skin perfusion pressure; TBI, toe brachial pressure index; TcPO2, transcutaneous oxygen partial pressure

tients, which started in 20037. The study enrolled 17 CLI patients (fivewith ASO, including one on hemodialysis, and 12 with Buerger’s disease). Mononuclear cells mobilized from the bone marrow to the peripheral blood by five days of G-CSF treatment were collected by leukapheresis with high efficiency, and CD34+ cells were further isolatedusing a magnetic-activated cell sorter (CliniMACS®) (Figs. 3 and 4).
The isolated CD34+ cells, which had a mean purity of 92% and a meancell viability of 87%, were transplanted to the ischemic lower limbs intramuscularly under lumbar spinal anesthesia (Fig. 4). No death or major amputation of lower limbs was reported for any patient in the year
following treatment, and all patients maintained independent walking
function. Healing of ulcers or necrosis, relief of ischemic pain and improvement over time in physiological measures (for example, toe brachial pressure index (TBI), transcutaneous oxygen partial pressure (TcPO2)
were observed, and 88% of patients were free of CLI one year after treatment29. Long-term follow up over the four years following treatment revealed no deaths in the first two years. Four patients died of cardiac diseases after the first two years, but a relationship with the cell therapy was
ruled out. No major amputation of lower limbs was reported. The proportion of patients free of CLI remained at over 80% (Fig. 5). Significant improvements were noted in TBI at four years and in TcPO2 atthree years compared with pre-treatment data29.
In the United States, Losordo and co-workers initiated a multicentre,
randomized, double-blind, placebo-controlled study (study ACT34CLI) in 2007, using transplantation of G-CSF-mobilized CD34+ cells
in 28 patients with CLI caused by ASO30. The incidence of minor andmajor amputations of lower limbs tended to be lower in the CD34+ celltransplantation group than in the placebo group at 6 months (P = 0.125)
and 12 months (P = 0.054) after treatment. No adverse events related
to the cell therapy were reported during the one-year follow-up period.
3.3 Investigator-initiated study of CD34+ cell sorter
Following the early clinical studies described above, we sought regulatory approval of the CD34+ cell sorter Isolex®. We began an investigator-initiated study in 2008 in 11 CLI patients (seven with Buerger’s disease and four with ASO who were not on dialysis), in compliance withgood clinical practice for medical devices, and completed it in March
2012. This exploratory phase II study was the first investigator-initiatedregenerative medicine study in Japan and is still the only Japanese clinical study of lower-limb neovascularization therapy by cell transplantation in which data reliability was assured in accordance with goodclinical practice. This investigator-initiated study showed favourable
safety and efficacy, as had been previously demonstrated in the phase
23 The Principles of Regenerative Medicine

I/IIa study described above. Measures of signs and symptoms, as wellas quality-of-life indices, clinical severity, pain at rest, blood flow improvement indices, and walk test results, were evaluated frequently. Painat rest improved soon after transplantation of CD34+ cells. Physiological improvement was confirmed, and improvement in Rutherford classification, the clinical severity index, was demonstrated at approximately 6 months (Fig. 6)8.
3.4 Sponsor-initiated study aiming for regulatory approval of CD34+
cells as a regenerative-medicine productBased on the positive results from the phase I/IIa clinical study and the
exploratory investigator-initiated study of the medical device, we currently aim to establish a neovascularization therapy of lower limbs using G-CSF-mobilized autologous CD34+ cells as the novel standard ofcare. When we initiated the exploratory investigator-initiated study in2008, the company that was intending to file an approval application
was trying to develop a CD34+ cell sorter and to file an application for a
medical device, but following the completion of our study, the company decided to develop CD34+ cells instead and file an application for atherapeutic cell product.
If a CD34+ cell sorter were developed, it would be installed at each
medical institution, and each step — G-CSF administration, apheresis,
isolation of CD34+ cells, and cell transplantation — would be completed
within the medical institution as a self-contained manufacturing
process (Fig. 7). On the other hand, if a therapeutic cell product weredeveloped, G-CSF administration and apheresis would be implemented
at each medical institution, and the apheresis product would thenbe transported to an external cell-processing centre. The CD34+ would
be isolated at the cell-processing centre and transported to each medical
institution, where transplantation (treatment) would be performed(Fig. 7). Developing a therapeutic cell product has the advantages ofeasy and wide dissemination (because it is not necessary for every medical
institution to install the cell sorter or employ technicians experienced
in cell sorting) and a stable supply of high-quality products (because
cell products are manufactured by experienced technicians under amore-controlled environment at a cell-processing centre than at general
medical institutions). Disadvantages include a high manufacturing cost.
After the company developing the product had changed its plans,
the cell-manufacturing process was commissioned to the Foundationfor Biomedical Research and Innovation at Kobe. Preparation fora clinical study was initiated in compliance with the structure andfacility regulations, cell-manufacturing control, and quality standards
based on the Ordinance on Standards of Manufacturing Control andadvances.tri-kobe.org/en© 2019 Japanese Circulation Society. Reprinted from Ref. 8

Stem Cell Therapy 3

Stem Cell Therapy 3

Yasuyuki Fujita and Atsuhiko Kawamoto

REFERENCES

IN-HOUSE PRODUCTION (NON-GCTP)

Leukapheresis
product

Medical device

CD34+ cells

EXTERNAL PRODUCTION (GCTP)

Leukapheresis
product

Cell processing center(with medical device)

Regenerative
medicine product(CD34+ cells)

Figure 7. Development of medical device (magnetic cell sorter) and cell product (CD34+
cells) for CD34+ cell therapy during clinical trials. GCTP: Good Gene, Cellular, andTissue-based Products Manufacturing Practice

Quality Control for Cellular and Tissue-based Products (Good Gene,
Cellular, and Tissue-based Products Manufacturing Practice). In 2013,
the Pharmaceutical Affairs Law was amended, and the Law on Securing
Quality, Efficacy and Safety of Products including Pharmaceuticals
and Medical Devices (Pharmaceutical and Medical Devices Act)was enacted. In addition to pharmaceuticals and medical devices, a
new category of regenerative-medicine products was introduced forregulatory review. Following consultation with the Pharmaceuticals
and Medical Devices Agency (PMDA) regarding the amendment,
we changed our product from the pharmaceutical category to theregenerative-medicine product category. After repeated consultations
with the PMDA, the next-phase sponsor-initiated study was designed
to be conducted as a multicentre, randomized, comparative study,
aiming for regulatory approval of CD34 + cells under the category ofregenerative-medicine products. The study was initiated in December
2017, and the first patient was enrolled in the same month. It iscurrently ongoing. In March 2018, this regenerative-medicine productwas designated by the Ministry of Health, Labour and Welfare as an
appropriate product for the Sakigake Strategy, which consists of the
Sakigake Designation System and the Scheme for Rapid Authorizationof Unapproved Drugs. This strategy identifies breakthrough medical
devices, pharmaceuticals and regenerative-medicine products that aredesigned to treat serious diseases and are likely to be developed firstin Japan. Such products are then given priority in consultations andreviews to reduce the review time for approval.
4. FUTURE PROSPECTS
The efficacy and safety of this cell therapy have been demonstrated not
only for CLI and other ischemic diseases such as refractory angina pectoris31–34, acute myocardial infarction35,36, dilated cardiomyopathy37–42,
and cerebral infarction43, but also in refractory fracture44 and liver cirrhosis patients45. The approval of CD34+ cells as a regenerative-medicine
product is expected to pave the way for extending application to diseases other than CLI.
advances.tri-kobe.org/en

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Stem Cell Therapy 3

Yasuyuki Fujita and Atsuhiko Kawamoto

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25 The Principles of Regenerative Medicineadvances.tri-kobe.org/en

Tissue Engineering 1

Autologous transplantationof peripheral blood CD34+ cells inpatients with femoral
and tibial fracture non-union
Ryosuke Kuroda, Tomoyuki Matsumoto and Takahiro Niikura

Department of Orthopaedic Surgery, Kobe University Graduate School of Medicine,
Kobe, Japan

About 5–10% of bone fractures fail to heal after conventional treatment. Stem cell therapy
is promising for treating these cases, but initial results using mesenchymal stem cells havebeen disappointing. In a phase I/II clinical study, researchers associated with the Translational
Research Center for Medical Innovation (TRI) in Japan have shown that transplantation of
autologous CD34+ cells from peripheral blood in patients with non-union fractures is safe andeffective way to heal such non-union fractures.

1. INTRODUCTION
Recent years have seen remarkable developments in the field of regenerative medicine as a result of research
into embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. However, unresolved issues with the use of
these so-called pluripotent cells, including ethical concerns and the potential for neoplastic cell transformation, make their clinical application problematic. Research into organogenesis and tissue regeneration has
hence mainly focused on somatic stem cells. Regeneration of bone and cartilage using mesenchymal stem
cells derived from the bone marrow or the synovial membrane is now attracting attention in orthopaedics
and has already been used clinically. However, serious disadvantages remain, including the invasiveness ofbone marrow collection, the difficulty and slowness of cell culture techniques, and the limited effectivenessof therapy. Thus, less invasive and more effective therapies are needed.
Vascular research has been conducted to establish the pathogenesis and improve the treatment of vasculardiseases. Developments up until now in this field have not always been comparable with the most advanced
research in fields such as oncology, hematology and neurology. However, the recent detailed characterization of the differentiation mechanisms involved in vascularization has opened up a new field of vascular research, incorporating trends in fields such as hematology and embryology. In the field of regenerative medicine, which is now part of mainstream medicine, research into organogenesis and tissue regeneration using
various stem cells is underway, but many aspects of the mechanisms by which the vascular system can be reconstructed to nourish regenerated organs and tissues remain unclear. Vasculogenesis thus has the potential
to play a key role in the development of regenerative medicine. After Asahara et al. discovered human peripheral blood vascular endothelial progenitor cells (EPCs) in 19971, several studies have elucidated the mechanism of vasculogenesis involving EPCs, in addition to that of conventional angiogenesis involving pre-existing vascular endothelial cells2,3. Revascularization is currently performed as therapy for lower-limb ischemia
and ischemic cardiac diseases. The significance of vascularization, particularly for bone regeneration, has long
been recognized in orthopaedics.
This article presents an overview of basic research, non-clinical studies and a phase I/II clinical study toinvestigate the in vivo kinetics of EPCs/peripheral blood CD34+ cells and bone revascularization therapy using EPCs/peripheral blood CD34+ cells, which have great potential for fracture treatment.

Ryosuke Kuroda et al.

SUMMARY
In recent years, regenerative
medicine for treatingrefractory diseases,
including the therapeutic
use of bone marrowmesenchymal stem cells,
has been exciting increasing
interest in orthopaedics.
At the same time, detailed
characterization of thedifferentiation mechanisms
in vascularization has led
to a new area of vascularresearch, which is expected
to find clinical applicationin orthopaedics. The close
relationship between thefracture healing process
and vascularization has
been well documented.
Our many in vitro and invivo studies on vascularendothelial progenitor cells
and fracture healing inanimals have indicated thetherapeutic usefulness ofthese cells. Based on theseresults, we conducted aphase I/II clinical study oftransplantation of autologous
CD34+ cells from peripheral
blood in patients with nonunion fractures to evaluate
safety and efficacy. We
anticipate these studies will
demonstrate the efficacy of
the therapy and provide hopefor patients suffering from
non-union fractures.
CORRESPONDING
AUTHOR
Ryosuke Kuroda

E-mail: kurodar@med.kobe-u.ac.jp

2. ANGIOGENESIS AND VASCULOGENESIS
Moses Judah Folkman first established the concept of angiogenic growth factor and its application to therapy, and he showed that angiogenic growth factors were expressed as a result of cancer growth and infiltration. He defined angiogenesis as the process of forming new blood vessels from pre-existing adjacent bloodvessels by the proliferation and migration of vascular endothelial cells induced by growth factors4. The recent discovery of various growth factors, including vascular endothelial growth factor (VEGF), has led to theclinical application of therapy that promotes angiogenesis. However, some patients derived no clear benefit
from this therapy. In these patients, the response of pre-existing vascular endothelial cells to vascular growth
factors was probably lower at the ischemic lesion site. Therefore, the next challenge was to deliver highly responsive vascular endothelial cells to ischemic lesions.
advances.tri-kobe.org/en

The Principles of Regenerative Medicine 26

Tissue Engineering 1

A

Ryosuke Kuroda et al.

Time(weeks)

CD34+ cells
No. (%)

Mononuclear cells
No. (%)PBS
No. (%)

2

0/15 (0)0/15 (0)0/15 (0)4

8/12 (66)

0/12 (0)0/12 (0)8

9/9 (100)

0/9 (0)0/9 (0)B

Time(weeks)G-CSF mobilized CD34+ cells
No. (%)PBS
No. (%)

105

104

103

2

0/12 (0)0/12 (0)0/12 (0)0/12 (0)4

3/9 (33)

1/9 (11)0/9 (0)0/9 (0)8

6/6 (100)

2/6 (33)

0/6 (0)0/6 (0)osteogenesis

Blood vessel
Capillaryvasculogenesis

VEGF

Bridging
callusOsteoblast

Cortical bone

Endothelial cell
Bone marrow

Table 1. Fracture healing following transplantation of human peripheral blood CD34+
cells into a nude rat model (basic nonclinical studies)

Figure 1. Kinetics of peripheral blood CD34+ cells in fracture healing. Intravenouslytransplanted human peripheral blood CD34+ cells were found to accumulate at the nonunion site, induce an environment suitable for fracture healing at the non-union sitethrough both vasculogenesis and osteogenesis, and contribute to fracture healing.

In 1997, Asahara et al. reported that EPCs were present in adult blood
circulation and involved in vascularization in severe ischemic lesions1. Thismechanism was found to be consistent with vasculogenesis, a process previously thought to occur only during fetal life, in which undifferentiated vascular EPCs migrate to a local site, where they reside, proliferate and differentiate to form a new blood vessel. This discovery led to the development of
a concept distinct from angiogenesis, which is the conventional concept ofvascularization in adults, where vascular endothelial cells proliferate and migrate to adjacent pre-existing blood vessels. When ischemia, cancer, woundhealing or neovascularization in the uterus and the ovary were induced ina transgenic mouse model of bone-marrow transplantation that expressed
β-galactosidase following expression of vascular endothelial cell-specificgenes (Flk-1, Tie-2), new blood vessels formed by cells expressing donorbone marrow–derived Flk-1 or Tie-25,6. These studies showed that vascularization is achieved by both vasculogenesis and angiogenesis in adults as wellas in fetal life. Neovascularization in adults is now thought to be mediatedby an interaction between angiogenesis and vasculogenesis.

cells into vascular endothelial cells would promote bone regeneration. In
our next study, we therefore intravenously transplanted 105 CD34+ cells collected from the peripheral blood of healthy humans into a nude rat model of non-union fracture and demonstrated that these cells accumulated at
the non-union site and contributed to fracture healing by inducing an environment suitable for healing through both vasculogenesis and osteogenesis(Fig. 1)10. Radiological and histological assessments showed that non-union
was still present in all animals in the control groups (one control group injected with phosphate-buffered saline [PBS] and one transplanted with human mononuclear cells) 8 weeks postoperatively, whereas bone union wasachieved in 66% of animals at 4 weeks and in all animals at 8 weeks in the
CD34+ cell transplant group (Table 1A). Mechanical assessment by a threepoint bending test demonstrated significantly stronger fracture healing in
the CD34+ cell transplant group than in the control groups.
Fluorescently labeled CD34+ cells were found to accumulate preferentially at the non-union site and contribute to revascularization and boneregeneration in collaboration with rat-derived endothelial cells and osteoblasts. Two weeks after transplantation, histological and molecular biological analyses showed the presence of human-derived mature vascular endothelial cells and osteoblasts at the non-union site, demonstrating that
CD34+ cells had differentiated into mature endothelial cells and osteoblasts.
Single-cell reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis showed that approximately 20% of CD34+ cells co-expressed osteocalcin,
an osteoblast-specific marker, immediately after isolation, and that humanCD34+ cells appeared to directly differentiate into osteoblasts without fusing with rat cells. Determination of the microvessel density and the osteoblast density in rats by immunostaining at the non-union site 2 weeks after
transplantation showed that angiogenesis and osteogenesis were significantly increased in the CD34+ cell transplant group compared with both control
groups. Because RT-PCR analysis identified angiogenic factors such as human-derived VEGF at the non-union site, the CD34+ cells were considered
to play a paracrine role locally. Administration of soluble Flt1, a VEGF antagonist, inhibited not only angiogenesis but also osteogenesis, showing thatangiogenesis by CD34+ cells plays a key role in the fracture healing process.
With eventual clinical application in mind, we also conducted an experiment to confirm that locally transplanted human peripheral blood
CD34+ cells induced an environment suitable for fracture healing at the
non-union site through both vasculogenesis and osteogenesis and contributed to fracture healing in a dose-dependent manner11. First, peripheral
blood granulocyte colony stimulating factor (G-CSF)-mobilized CD34+
cells were transplanted locally to the non-union site of the same animalmodel (using atelocollagen as a carrier). The numbers of cells transplanted were based on the results of the above-described intravenous transplantation. Radiological and histological assessments showed that bone union
was achieved in 33% of animals at 4 weeks and all animals at 8 weeks af-

3. FRACTURE HEALING BY PERIPHERAL BLOOD EPCS/CD34+
CELLS
Bone fractures usually heal through anatomical reduction and rigid immobilization. However, bone union fails to occur (non-union fractures) in
5–10% of patients with fractures, partly because appropriate circulation is
not achieved at the fracture site. Autologous free cancellous bone grafting
is performed and may be followed by vascularized bone grafting with a focus on revascularization, but healing of a non-union fracture is often difficult. We therefore focused on neovascularization through cell therapy using
EPCs and conducted basic experiments to examine the usefulness of thistherapy for non-union fractures in preclinical animal studies.
In a preliminary study, we analysed the in vivo kinetics of EPCs in thefracture healing process by developing a mouse model of closed fracture andusing fluorescence-activated cell sorting. EPCs were found to increase in
the bone marrow and the peripheral blood after fracture. Subsequently, todemonstrate local differentiation of bone marrow–derived EPCs into vascular endothelial cells, double immunostaining of Sca1 and CD31 in a Tie2/
LacZ transgenic mouse model of bone marrow transplantation was performed. It showed that bone marrow–derived EPCs differentiated into vascular endothelial cells at the fracture site. These results demonstrated thatfracture-induced mobilization of EPCs from the bone marrow to the peripheral blood occurs and that EPCs contributed to healing at the fracturesite7. Other research groups have also reported that EPCs were mobilized to
the fracture site in humans8 and to the distraction osteogenesis site in a rat
distraction osteogenesis model9. These reports support our findings.
Given that revascularization using peripheral blood cells was possible, it
was logical to assume that differentiation of human peripheral blood CD34+
27 The Principles of Regenerative Medicineadvances.tri-kobe.org/en

Tissue Engineering 1

Ryosuke Kuroda et al.

Time to union
Case

Sex

Age

Fracture type

Anatomical site

1

Male

41

Closed, oligotrophic

Tibia, shaft

2

Female38

Grade IIIA, oligotrophic

3

Male

31

4

Male

5

Sequence of operative interventions

Clinical(weeks)Radiological(weeks)1. ORIF
2. Cell and ABG

12

12

Femur, shaft

1. ORIF
2. Cell and ABG

12

19

Closed, oligotrophic

Femur, trochanteric

1. IMN
2. Exchange nailing, Cell and ABG

24

38

34

Grade II, oligotrophic

Tibia, shaft

1. ORIF
2. Cell and ABG

12

12

Male

28

Grade II, hypertrophic

Tibia, shaft

1. IMN
2. Dynamization
3. Exchange nailing
4. Dynamization
5. Exchange nailing, Cell and ABG

12

12

6

Male

20

Grade IIIB, defectTibia, shaft

1. IMN
2. Cell and ABG

8

8

7

Male

45

Closed, defectTibia, plateau

1. ORIF2. Revision plating, Cell and ABG

8

12Table 2. Clinical and radiological outcomes for each patient in the phase I/II clinical study
Abbreviations: ABG, autologous bone grafting; Cell, transplantation of autologous peripheral blood CD34+ cells; IMN, intramedullary nailing; ORIF, open reduction and internal fixation.

ter transplantation of 105 cells, and in 11% of animals at 4 weeks and 33%
at 8 weeks after transplantation of cells, but not after transplantation of
103 cells or in PBS controls (Table 1B). Determination of the microvessel
density and the osteoblast density at the non-union site by immunostaining at 2 weeks showed dose-dependent increases in angiogenesis and osteogenesis. Greater levels of angiogenesis and osteogenesis were observed
after transplantation of 104 cells and 105 cells than after transplantation of
103 cells or PBS injection. These results suggest that local transplantationof peripheral blood CD34+ cells would be useful as a new treatment option for non-union fractures.
To confirm the superiority of human peripheral blood CD34+ cells overmononuclear cells, we transplanted both cell types locally to the non-unionsite of the nude rat non-union fracture model and compared their effects.
Transplantation of 107 mononuclear cells induced an environment suitablefor fracture healing through both vasculogenesis and osteogenesis and contributed to fracture healing, but the efficacy was significantly inferior tothat of transplantation of 105 CD34+ cells as measured by microvessel density, osteoblast density, and the density of human-derived mature vascular endothelial cells and osteoblasts, as well as by radiological, histologicaland mechanical assessments12. These effects of CD34+ and mononuclear
cell transplantation have been confirmed not only in this refractory nonunion fracture model but also in the established non-union model13. The results were attributed partly to infiltration of more inflammatory cells in themononuclear cell transplant group than in the CD34+ cell transplant group.
Further characterization of the mechanisms involved in fracture healing
associated with EPCs would lead to more improvement in therapeutic effects. We therefore investigated the healing effects of mobilization of EPCs
to the non-union site by sustained released G-CSF14 and simvastatin15, thehealing effect of extracellular mobilization of adaptor protein Lnk16,17 mediated by SCF/c-Kit signalling, and mobilization of EPCs mediated by SDF1/CXCR4 signalling18. All studies confirmed that EPCs are closely associated with fracture healing.
4. CLINICAL STUDY: BONE REVASCULARIZATION BY
TRANSPLANTATION OF PERIPHERAL BLOOD CD34+ CELLS
Based on the above-described non-clinical research results, a phase I/II clinical trial of bone revascularization by transplantation of autologous peripheral blood CD34+ cells was conducted in patients with non-infectious, nonunion fractures, following approval by the Review Committee on ClinicalResearch of Human Stem Cells on 4 September 2009. An advantage ofbone revascularization therapy by transplantation of autologous peripheradvances.tri-kobe.org/enCD34 + cells

Historical control

Number of patients7

11

Sex (male/female)

6/1

9/2

Age

34 (20–45)

37 (21–56)

Femur/tibia

2/5

4/7

Union at week 12

5/7 (71.4%)

2/11 (18.1%)

Time to union (weeks)

16.1 (8-38)

29.1 (12-44)

Table 3. Comparison of Phase I/II study with historical control

al blood CD34+ cells over conventional therapies is that it regenerates bothbone and new blood vessels after proliferation of cells in an undifferentiatedstate and subsequent differentiation at the non-union site.
Eligible patients (two with femoral non-union fractures and five withtibial non-union fractures) aged between 20 and 70 years provided written informed consent in person. After obtaining consent, screening tests, acase review meeting and an eligibility assessment were conducted and patients were then enrolled. CD34+ cell isolation, non-union surgery and celltransplantation were performed at the Institute of Biomedical Research andInnovation, and patients were then transferred to Kobe University Hospital for observation.
G-CSF was subcutaneously injected for 5 days to mobilize CD34+ cells
into the peripheral blood. Mononuclear cells were collected by apheresis,
and CD34+ cells were isolated by magnetic-activated cell sorting. Treatment
involved non-union surgery (to improve internal fixation as needed in addition to autologous bone grafting) on day 6 and transplantation of 5 × 105
cells kg−1 of autologous peripheral blood CD34+ cells using atelocollagen asa carrier (Fig. 2). The primary endpoints were safety and the presence or absence of radiological fracture healing 12 weeks after surgery.
We first reported safety and efficacy in a patient who had tibial nonunion19. The mean postoperative time to clinical bone union was 12.6
weeks, and the mean postoperative time to radiological bone union was
16.1 weeks (Table 2)20. The efficacy of the therapy was demonstrated —71.4% of patients achieved radiological bone union at 12 weeks after surgery, the primary endpoint, compared with a healing rate of 18.1% in 11
patients with femoral or tibial non-union who underwent concomitantbone grafting in the same medical institution, a patient group selected asa historical control (Table 3)20. The safety evaluation 1 year after surgery
showed no serious adverse events.
The Principles of Regenerative Medicine 28

Tissue Engineering 1

Day 1

Ryosuke Kuroda et al.

Day 1–5

Day 6

Sampling
Retransfusion

Mononuclear
cells

Transplantation to nonunion site

Magnetic
cell sorting
G-CSF
subcutaneous injection
Extraction of the mononuclear
cells by apheresis

Isolation

CD34+ cells withatelocollagen

Figure 2. Overview of the clinical study. CD34+ cells were mobilized into the peripheral blood by subcutaneous injection of G-CSF, mononuclear cells were collected by apheresis,
and then CD34+ cells were isolated by magnetic-activated cell sorting. Non-union surgery (improvement of internal fixation as necessary in addition to autologous bone grafting) was
performed on day 6 and 5 ×105 cells kg–1 of autologous peripheral blood CD34+ cells were transplanted using atelocollagen as a carrier. G-CSF, granulocyte colony stimulating factor.

5. FUTURE PROSPECTS
The significance and efficacy of EPCs/CD34+ cells in fracture healing described so far have attracted the attention of other research groups in recent years, and the results of basic research continue to accumulate. The
effect of mobilization of EPCs to the peripheral blood has been reported
for the rat model of tibial distraction osteogenesis21 and the mouse modelof femoral fracture22 as well as for tibial long bone fracture in humans8,9.
As well as in our immunodeficient rat non-union fracture model10–12, immunodeficient rat non-union model13, and rat femoral defect model23,24,
the efficacy of EPCs/CD34+ cells in the fracture healing process has also
been reported for the ovine tibial defect model25. Thus, the importance of
EPCs/CD34+ cells has been increasingly recognized in recent years26–29.
The phase I/II clinical study demonstrated the efficacy and safety of thistherapy in patients with non-union fractures. With the aim of establishing
this therapy as a standard of care, we need to conduct a multicentre, investigator-initiated study in a larger number of patients. Transplantation of peripheral blood CD34+ cells, a novel therapy for non-union fractures, has already demonstrated high efficacy and safety in animal experiments and earlyclinical studies, and excellent therapeutic effects are expected in future extensive clinical applications.
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advances.tri-kobe.org/en

Tissue Engineering 2

Transplantation of cultivatedautologous oral mucosal epithelial
sheets in order to restore sight
Chie Sotozono1, Tsutomu Inatomi1,2, Takahiro Nakamura1,
Noriko Koizumi3, Kojiro Imai4, Shigeru Kinoshita1,5, Yasuko Kimura6,
Masahiro J. Go6 and Masanori Fukushima6
Department of Ophthalmology, Kyoto Prefectural University of Medicine, Kyoto, Japan.
²Department of Ophthalmology, National Center for Geriatrics and Gerontology, Aichi, Japan.
³Faculty of Life and Medical Sciences, Doshisha University, Kyoto, Japan.
4
Department for Medical Innovation and Translational Medical Science, Kyoto Prefectural Universityof Medicine, Kyoto, Japan.
5
Department of Frontier Medical Science and Technology for Ophthalmology, Kyoto Prefectural
University of Medicine, Kyoto, Japan.
6Foundation for Biomedical Research and Innovation at Kobe, Kobe, Japan.
1

Severe ocular surface disorders such as Stevens–Johnson syndrome, ocular pemphigoid
and thermal or chemical injury are difficult to treat and have a poorer visual prognosis
than other stem cell deficiency conditions. Using an amniotic membrane as a substrate forculturing cells, researchers associated with the Translational Research Center for Medical
Innovation (TRI) in Japan have generated stratified mucosal epithelial sheets consisting ofcorneal epithelial stem cells or autologous oral mucosal epithelial cells, and have used
these to regenerate the ocular surface. Early clinical studies have demonstrated visual
improvement for cicatricial corneal opacity, epithelial repair for refractory epithelial defectand efficacy for conjunctival sac reconstruction. The technique should be applicable toother diseases of the ocular surface.

1. INTRODUCTION
There are two types of mucosal epithelia on the ocular surface: the corneal epithelium and the conjunctivalepithelium. The narrow interface between the cornea and conjunctiva is called the limbus. The basal layerof the limbal epithelium is believed to contain corneal epithelial stem cells1–4. Corneal epithelial cells canno longer be supplied when the limbus is extensively damaged, which leads to the corneal surface being
covered with the neighbouring conjunctival epithelium, fibrous tissue and blood vessels, severely impairing visual function. Diseases in which the function of corneal epithelial stem cells are impaired are known
as limbal stem cell deficiency conditions3,5,6. Such conditions, which include Stevens–Johnson syndrome(SJS), ocular pemphigoid and thermal or chemical injury, are characterized by progressive fibrosis of subconjunctival connective tissues and inflammation. This leads to mucosal shrinkage or scarring or adhesionof the ocular surface, which produces severe dry eyes. SJS, ocular pemphigoid and thermal or chemical injury all involve cicatricial changes to the ocular surface and poor ocular surface conditions. These conditions have been classified as severe ocular surface disorders because they are especially severe, difficult totreat and have a poor visual prognosis compared to other stem cell deficiency conditions6,7.
Penetrating (or lamellar) keratoplasty, a common transplantation procedure, does not transplant
limbal stem cells and thus it cannot be expected to give any clinical benefit for conditions involving
stem cell deficiency. Transplantation of the mucosal epithelium, which contains stem cells, is required
to treat stem cell deficiency. Hence, corneal epithelial transplantation procedures such as kerato-epithelioplasty and limbal transplantation have been developed8,9. However, epithelial transplantation requires a fresh donor, which is difficult to obtain. In addition, corneal epithelial transplantation has ahigher rejection rate than penetrating keratoplasty. Studies have shown that persistent epithelial defects
can easily occur after epithelial transplantation for severe ocular surface disorders. Even when an epithelial graft is accepted, progressive cicatricial changes can arise and persist in the long term, resulting
in a poor visual prognosis7,10.
In 1997, Pellegrini et al. developed tissue-engineered corneal epithelial sheet transplantation as a novel
therapeutic method for severe ocular surface disorders. They separated cells from a small amount of corneal–limbal epithelial tissue, generated epithelial sheets ex vivo, and then successfully transplanted themadvances.tri-kobe.org/enChie Sotozono et al

SUMMARY
Damage to the limbus
can result in conditions
arising from a deficiency inlimbal stem cells, such as
Stevens–Johnson syndrome,
ocular pemphigoid andthermal or chemical injury.
Transplantation of mucosal
epithelium containing
stem cells is needed to treat
these severe ocular surface
disorders. Our treatment
concept provides a sheetof mucosal epithelium
generated outside thebody. We use an amniotic
membrane as a substrate
for culturing cells, generate
stratified mucosal epithelial
sheets consisting of corneal
epithelial stem cells or
autologous oral mucosal
epithelial cells, and use theseto regenerate the ocularsurface. In unilateral diseases,
corneal epithelial sheets canbe generated using cells takenfrom the other (healthy)eye. Aiming for autologoustransplantation in bilateraldiseases, we developed
epithelial sheets using cells
from patients’ oral mucosa.
Basic research in rabbit
models of corneal diseaseconfirmed that oral mucosal
epithelial sheets cultivatedon amniotic membrane
can survive and expand
while maintaining corneal
transparency on the ocularsurface. Early clinical studies(72 patients) demonstrated
visual improvement for
cicatricial corneal opacity,epithelial repair for refractory
epithelial defect andefficacy for conjunctival
sac reconstruction. Similareffects were seen in aprospective clinical study. We
anticipate that our technique
can be applied to otherdiseases of the ocular surface.
CORRESPONDING
AUTHOR
Chie Sotozono

E-mail: csotozon@koto.kpu-m.ac.jp

The Principles of Regenerative Medicine 30

2. DEVELOPMENT OF NEW TREATMENT TECHNIQUES AND
NON-CLINICAL PROOF OF CONCEPT
2.1 Clinical studies of transplantation of corneal epithelial sheets
cultivated on amniotic membrane
The amniotic membrane is a thin membrane covering the fetal and placental surfaces. It consists of a basement membrane and a layer of amniotic epithelial cells. Because the amniotic membrane is unlikely to be rejected, it has long been used in surgery and dermatology. For example, it has
been used to prevent adhesion after abdominal surgery and to promote
epithelial repair of skin burns. The use of amniotic membrane in ophthalmology was reported in 1995 by Kim and Tseng, who used a cryopreserved amniotic membrane to reconstruct the ocular surface in rabbits15.
Thereafter, amniotic membrane transplantation, with or without corneal epithelial transplantation, has been used to treat cicatricial diseases, including recurrent pterygium and SJS16.
The amniotic membrane is known to have various beneficial effects,
including reducing scar formation, promoting epithelial growth mediatedby growth factors17, reducing inflammation18 and reducing neovascularization. In particular, the collagen that makes up its basement membrane
resembles that of the basement membrane of the ocular surface (i.e., corneal and conjunctival) epithelial cells19. Based on the assumption that selection of the substrate for culturing epithelial cells is important to obtain
good prognosis, we established a method for culturing mucosal epithelial stem cells using a denuded amniotic membrane as the substrate. Thiswas prepared by scraping off amniotic epithelial cells from cryopreserved
amniotic tissue20–22.
In 1999, we began the clinical application of cultivated allogeneic corneal epithelial sheet transplantation for treating bilateral severe ocular surface disorders23,24. Cultivated corneal epithelial sheets were successfully
grafted onto the cornea, and we were able to achieve epithelial reconstruction in patients having persistent epithelial defects with prolonged
acute-phase inflammation, for which no other treatment was available.
We also achieved visual improvement in patients with chronic visual impairment. Initially, we transplanted cultivated allogeneic corneal epithelial sheets in eyes with SJS, chemical injury or ocular pemphigoid (25 eyesin 23 patients). The transplanted corneal epithelium survived and maintained corneal transparency for a long time in patients with chemical injury. However, in patients with SJS and ocular pemphigoid the transplanted
corneal epithelium was slowly replaced by conjunctival epithelium. Adverse events were obvious rejection (observed in four eyes) and corneal
infection due to methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) andStaphylococcus epidermidis (three eyes).
Most severe ocular surface diseases are bilateral, but in unilateral diseases, corneal epithelial sheets can be generated using cells taken from theother (healthy) eye. A patient with a unilateral chemical injury who received an autologous epithelial sheet transplant had a favorable outcome
without developing complications25. Aiming for autologous transplantation in bilateral diseases, we started to develop cultivated epithelial sheets
using patients’ own cells.
2.2 Transplantation of autologous oral mucosal epithelial sheets
cultivated on amniotic membrane: establishing non-clinicalproof of concept
We created cultivated oral mucosal epithelial sheets from rabbits andperformed autologous transplantation of these sheets onto the ocularsurface26. Rabbit oral mucosal epithelial cells cultivated on an amniotic membrane reached confluence in approximately 7 days, producing
five to six layers of well-stratified epithelium, which was similar to cor31 The Principles of Regenerative Medicine

A

G

B

C

E

F

H

D

I

Figure 1. Establishment of non-clinical proof of concept. A, Rabbit oral mucosal
epithelial cells cultivated on amniotic membrane (asterisks) produced four to five layersof cells (circles) that resembled normal corneal epithelium. B, D, Tight junctions wereseen between the cells in the superficial layer (arrow in C). D, The most superficial
layer was covered with glycocalyx-like material (arrow). E, The cells were attachedto each other by many desmosomal junctions (arrows). F, The basal cells adhered
to the amniotic membrane via hemidesmosome attachments (arrows). G, Before
transplantation, the rabbit cornea showed stem cell loss and conjunctival invasion on thecornea. H, The oral mucosal epithelial sheet cultivated on amniotic membrane survived,
expanded and maintained corneal transparency on the rabbit ocular surface (10 days
after transplantation). I, The transplanted epithelial sheet attached to the corneal stroma
without developing inflammatory cell infiltration or stromal edema.

neal epithelium, in about 14 days. The surface layer had countless microvilli, and the cells were attached to each other by numerous desmosomal junctions. Hemidesmosome attachments were seen between thebasal cells and the amniotic membrane. Immunohistology for keratins
expressed in the cultivated oral mucosal epithelial sheets showed thepresence of mucosa-specific keratin-4 and keratin-13 and the absence of
epidermal-type keratin-1 and keratin-10, which was consistent with histological findings. Among corneal epithelial-specific keratins, keratin-3
was also present, but keratin-12 was not. These results allowed us to determine the histologic characteristics of the cultivated oral mucosal epithelial sheets: unlike the epidermis, which differentiates into keratinizedcells, the cultivated oral mucosal epithelial cells had the characteristics
of non-keratinized mucosa, while simultaneously expressing some cornea-specific keratins (keratin-3).
We created a corneal epithelial stem cell deficiency model. Briefly, after removing all corneal and conjunctival epithelial tissue up to 5 mmoutside the limbus in the albino rabbits from which we collected oral
mucosa, surrounding conjunctival tissue totally covered the ocular surface. After removing any conjunctival tissue covering the corneal surface in these eyes, we transplanted oral mucosal epithelial sheets that
had been cultured on an amniotic membrane. Immediately after transplanting, the ocular surface showed a similar transparency to that observed following transplantation of cultivated corneal epithelial sheets;
48 hours after transplantation, we could confirm the survival of the cultivated epithelium. Ten days after transplantation, not only had thetransplanted mucosal epithelial sheet survived on the ocular surface, butalso fluorescein staining revealed that the epithelial cells had expanded
outward from the mucosal sheet relative to 48 hours post-transplantation. These results confirmed that oral mucosal epithelial sheets cultivated on an amniotic membrane can survive and expand while maintaining
corneal transparency on the ocular surface26.
Based on the data obtained from animal models, we began work on
clinical application in humans. After obtaining adequate informed consent, we collected normal human oral mucosal tissue and attempted toadvances.tri-kobe.org/en

A, G, H, I Reprinted from Ref. 14. with permission of Elsevier.

into two patients11. Since then, basic and clinical research on corneal regeneration has gained momentum worldwide.
We have focused on amniotic membrane as a substrate for culturing
cells, generating stratified mucosal epithelial sheets consisting of corneal epithelial stem cells or oral mucosal epithelial cells, and using theseto regenerate the ocular surface in severe ocular surface disorders12–14.

Chie Sotozono et al

B, C, D, E, F: © 2019 Association for Research in Vision and Ophthalmology (Modified from Ref. 26);

Tissue Engineering 2

Tissue Engineering 2

Chie Sotozono et al

Amniotic membrane

Cultivated oral mucosa epithelial sheet

during surgery

1-2 weeks later

A: Corneal reconstruction

From Ref. 41 © 2019 Kyoto Prefectural University of Medicine

Amniotic membrane

6mm-diameter biopsyof buccal musoca

Dissemination and culture oforal mucosal cells on amniotic
membrane (10–14 days)

B. Conjunctival sac reconstruction

Feeder cells (3T3 fibroblasts)

Transplantation of cultured oral
mucosal epithelial sheet

Amniotic
membranetransplant
Before surgery

Cultivated oral
mucosal epithelial
sheet transplant

Growth of the oral
mucosal epithelium
led to regeneration ofepithelium on theamniotic membrane.

After surgery

Figure 2. Procedure for transplanting cultivated autologous oral mucosal
epithelial sheets. A mucosal specimen containing the oral mucosal epithelium wascollected to create an oral mucosal epithelial sheet at the Cell Procession Center. Afterabout 2 weeks, this stratified epithelial sheet was used for cultivated oral mucosal
epithelial sheet transplantation.

Figure 3. Extension of epithelial cells from the cultivated mucosal epithelial sheet after
transplantation. A, Corneal reconstruction; B, conjunctival sac reconstruction.

determine specific conditions for creating human cultivated oral mucosal epithelial sheets. We found it was difficult to create human sheets under the same conditions used to create rabbit cultivated oral mucosal epithelial sheets, and we observed interspecies differences in cellular kinetics.
However, we were able to facilitate the development of human cultivatedoral mucosal epithelial sheets by modifying the culture process, including
the culture medium27,28.
At almost at the same time, Nishida et al.29,30 developed another regenerative procedure using the patient’s own oral mucosal epithelial cells to cultivate and transplant autologous oral mucosal epithelial sheets. However, their method is very different as they transplanta sheet of epithelial cells fabricated on a temperature-responsive culture dish and do not use amniotic membrane. In our method, multilayered epithelial cells are attached to the base of the amniotic membrane,
and thus are less likely to be lost by external stresses such as blinking
or dryness.
With the aim of assessing the in vivo function of the human cultivated epithelial sheets, we performed xenogeneic transplantation ofthese sheets onto the ocular surface of rabbits. As with the rabbit model, the human cultivated oral mucosal epithelial sheet had similar morphologic features to corneal epithelium and survived on the ocularsurface (Fig. 1)26,31.

cultivated autologous oral mucosal epithelial sheet onto the cornea orsclera. The adhesion on the ocular surface is incised so as to release symblepharon and then subconjunctival proliferative tissues are removed.
Any abnormal proliferative tissues present on the cornea and limbus are
removed with a spatula to expose the corneal stroma. A microsponge
soaked in 0.04% mitomycin C is applied to the periphery of the subconjunctival area for 4 minutes after removing subconjunctival connective tissues. The surgical area is then washed with approximately 300 mlof saline. The cultivated autologous oral mucosal epithelial sheet is sutured onto the cornea or sclera; this is combined with amniotic membrane transplantation in patients with widely exposed sclera (Fig. 2)31.
When an amniotic membrane is transplanted, the oral mucosal epithelium extends smoothly from the transplanted oral mucosal epithelial
sheet to the amniotic membrane (Fig. 3).
As the transplanted tissue is autologous, there is no need to use
immunosuppressants to prevent rejection when transplanting cultivated oral mucosal epithelial sheets. However, in severe ocular surface diseases, particularly SJS and ocular pemphigoid, surgery induces significant inflammation, which induces epithelial disturbances andscarring of the ocular surface (e.g., symblepharon, which is conjunctivalization with fibrous tissue). It is thus critical to fully suppress inflammation of the ocular surface immediately after surgery. Since thisis difficult to do with steroids alone, systemic immunosuppressants (cyclosporine) should be co-administered for cases with severe ocular surface scarring13,32. Ocular pemphigoid is a chronic, progressive, refractory autoimmune disease, and the use of cyclophosphamide can prevent
disease progression.

3. SURGICAL PROCEDURES AND POSTOPERATIVEMANAGEMENT
Surgical procedures involve removing scar tissue from the ocular surface to expose the normal corneal stroma or sclera and transplanting theadvances.tri-kobe.org/en

The Principles of Regenerative Medicine 32

Tissue Engineering 2

Chie Sotozono et al

SJS

Ocular pemphigoid

Thermal/chemical injury

Other

Total

Number of patients

21

10

7

9

47

Mean age

43.0

73.5

50.0

34.0

57.0

LogMAR visual acuity (range)

2.40(1.40–3.00)

2.70(1.52–2.70)

2.70(1.22–2.70)

2.40(1.10–2.70)

2.40(1.11–3.00)

Symblepharon (%)

18 (85.7)

10 (100)

6 (85.7)

3 (33.3)

37 (78.7)

Keratinization (%)

8 (38.1)

1 (10.0)0 (0)1 (11.1)

10 (21.3)

2 (9.5)0 (0)6 (85.7)

2 (22.2)

10 (21.3)

Before surgery

Delayed surgery (%)
Table 1. Characteristics of patients treated for visual improvement.

Almost all patients also have dry eyes, and so artificial tears should be
used frequently. The ocular surfaces of patients with severe ocular surface
diseases, especially SJS, have an increased susceptibility to infection; particular attention should be paid to MRSA colonization and infection13,32.
Preoperative assessment of the ocular surface and postoperative management are important factors that determine the prognosis after surgery.
4. THERAPEUTIC EFFECTS IN CLINICAL TRIALSAND INTERPRETATION
4.1 Overview
Since performing the world’s first successful transplantation of cultivated oral mucosal epithelial sheets in humans at Kyoto Prefectural University of Medicine in 200231, we have carefully collected cases of treatmentof stem cell deficiency in refractory ocular conditions33,34. As the number of patients gradually increased, our project became an external seedtranslational research project within the Foundation for Biomedical Research and Innovation in 2008. With the support of the Translational Research Informatics Center, we conducted a retrospective study and statistical analysis of 72 patients (81 eyes, 86 surgeries) who had undergone
transplantation of cultivated autologous oral mucosal epithelial sheets between June 2002 and December 200814,35–37.
Conditions that led to transplantation included SJS (21 patients), ocular pemphigoid (20 patients), thermal or chemical injury (13 patients),
conjunctival malignancy (4 patients) and other conditions (14 patients).
The purpose of treatment was broadly classified into four categories: visual
improvement for cicatricial corneal opacity (47 transplants); epithelial repair for persistent epithelial defects with accompanying subacute inflammation (10 transplants); release of conjunctival sac adhesion (22 transplants); and other (7 transplants) (Fig. 4). The most common condition
treated by corneal reconstruction (visual improvement and epithelial repair) was SJS, and the most common condition treated by conjunctival
sac reconstruction was ocular pemphigoid.
We examined visual acuity and ocular surface findings before transplantation, at weeks 4, 12 and 24 after transplantation, and at the final
visit before the end of 2008, and assessed the success of the transplantation. We also noted all adverse events and used multivariate analysis to
identify factors associated with their occurrence35,38.
4.2 Effects of epithelial sheet transplantation
Improvement in best-corrected visual acuity at the 24th week after surgery
occurred in 46.8% of eyes in the visual improvement group; improvement
in epithelial defect score was seen in 90.0% of eyes in the epithelial repair group; and improvement of symblepharon score was seen in 68.2%
33 The Principles of Regenerative Medicine

of eyes in the adhesion release group. Statistically significant efficacy wasdemonstrated in all groups.
4.2.1 Visual improvement
In total, 47 surgeries were performed in 46 eyes of 40 patients with the
purpose of improving vision35. Conditions included SJS (21 eyes in 17 patients), ocular pemphigoid (10 eyes in 9 patients), thermal or chemical injury (7 eyes in 6 patients) and other (8 eyes in 8 patients), including idiopathic stem cell deficiency, radiation keratopathy, graft versus host disease(GVHD) and aniridia (Table 1, Fig. 4). Retransplantation was performed
in one eye with radiation keratopathy.
Improvement in best-corrected visual acuity at the 24th postoperative
week was seen in 12 of 21 eyes with SJS (57.1%; 95% CI 34.0–78.1%),
3 of 10 eyes with ocular pemphigoid (30.0%; 95% CI 6.7–65.2%), and
3 of 7 eyes with thermal or chemical injury (42.9%; 95% CI 9.9–81.6%)(Fig. 5A and B). Patients with severe corneal stromal opacity underwent penetrating or lamellar keratoplasty after stabilizing the transplanted epithelium34. Six patients with thermal or chemical injury underwent
this two-stage procedure and saw an improvement in their visual acuity
after transplantation.
Cases with keratinization (abnormal differentiation of the epithelium)
and symblepharon are the most serious of severe ocular surface diseases;
they are also known as end-stage ocular surface diseases, and patients areusually ineligible for transplantation7. In the visual improvement group,
preoperative symblepharon was observed in 37 eyes (78.7%) and keratinization in 10 eyes (21.3%), and the mean LogMAR visual acuity before
surgery was 2.40 (i.e., counting fingers vision). If surgery can improve visual acuity below counting fingers to 0.01 or better, patients will be able
to read or walk independently. We calculated the critical visual improvement rate as the proportion of patients whose preoperative vision was below counting fingers (best-corrected visual acuity of less than 0.01) andwhich had improved to 0.01 or better by the 24th postoperative week; theresults were 50.0% (7 of 14 eyes), 42.9% (3 of 7 eyes) and 20.0% (1 of 5eyes) for SJS, ocular pemphigoid and thermal or chemical injury, respectively. Eyes with thermal or chemical injury achieved visual improvement
after delayed penetrating or lamellar keratoplasty. Improvement was seenin about half of the eyes with a severe disease that are usually consideredunsuitable for surgery.
4.2.2 Epithelial repair
Epithelial repair was achieved in all patients with persistent epithelial defects and accompanying sub-acute inflammation (10 eyes in 9 patients [both eyes in 1 patient]), and the epithelial defect resolved withadvances.tri-kobe.org/en

Tissue Engineering 2

Chie Sotozono et al

A: Categorized by purpose of transplantation
Transplantation performed between: First: 24 June 2002, Last: 26 December 2008
Breakdown
1 transplant

2 transplants

Retrospective study subjects 72 patients (81 eyes)

58 patients

14 patients(1 transplant in each of both eyes:
9 patients, 2 transplants in 1 eye: 5 patients)

Number of transplants
86 eyes (transplant/eye)76 eyes

5 eyesTarget therapeutic effectBreakdown
1 transplant

Diagnosis

2 transplants• SJS: 21 eyes (including 2 eyes with 2-stage surgery)• Ocular pemphigoid: 10 eyes
• Thermal/chemical injury: 7 eyes (including 6 eyes with
2-stage surgery)• Aniridia: 1 eye• Stem cell deficiency due to drug toxicity: 1 eye• Unknown cause: 3 eyes (including 2 eyes with 2-stage
surgery)• GVHD: 1 eye*
• Salzmann’s corneal degeneration: 1 eye• Radiation keratopathy: 2 eyes

Visual improvement for
cicatricial corneal opacity
40 patients# (46 eyes)

33 patients

7 patients

Number of transplants
47 eyes (transplant/eye)46 eyes

1 eye

Epithelial repair for subacutepersistent epithelial defect9 patients (10 eyes)

9 patients

1 patient(1 transplant in eachof both eyes 1 patient)

Number of transplants
10 eyes (transplant/eye)

10 eyes-Release of conjunctival sac
adhesion 21 patients (22 eyes)

21 patients

Number of transplants
22 eyes (transplant/eye)

22 eyes

Malignant tumour excision
4 patients (4 eyes)

2 patients

2 patients(2 transplants in
1 eye 2 patients)

Number of transplants
6 eyes (transplant/eye)

2 eyes2 eyesOther (cosmetic)
1 patient (1 eye)

1 patient

Number of transplants
1 eye (transplant/eye)

1 eye

1 patient(1 transplant in eachof both eyes 1 patient)-• SJS: 3 eyes
• Ocular pemphigoid: 2 eyes
• Thermal/chemical injury: 5 eyes**• SJS: 1 eye• Ocular pemphigoid:10 eyes
• Thermal/chemical injury: 4 eyes**• Severe recurrent pterygium with symblepharon: 2 eyes
• GVHD: 1 eye*• Trachoma: 1 eye• Ocular pseudopemphigoid: 1 eye• Idiopathic cicatricial keratoconjunctival epitheliopathy: 1 eye• Measles: 1 eye• CIN: 1 eye• Conjunctival squamous cell carcinoma: 1 eye• Conjunctival melanoma: 2 eyes $-Figure 4. Patient details in early clinical studies. a, Categorized according to reason for transplantation; b, Categorized according to disease.
CIN, conjunctival intraepithelial neoplasia ; GVHD, graft versus host disease; SJS, Stevens–Johnson syndrome#: Includes 1 patient in whom a transplant was also given to the other eye for a different purpose.
*, **: Each includes 1 transplant performed on the same eye of the same patient for a different purpose.
$: 2 transplants were given to the same eye of the same patient for the same purpose.

advances.tri-kobe.org/en

The Principles of Regenerative Medicine 34

A, B: Reprinted from Ref. 35 with permission from Elsevier; C, D: © 2017 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

Tissue Engineering 2

Chie Sotozono et al

A

B

C

D

E

F

Figure 5. Representative cases. A, B, Epithelial sheet transplantation was performedfor visual improvement; C, D, for epithelial repair; E, F, for fornix reconstruction.
photographs were taken before surgery (A, C, E) and at the 24th postoperative week
(B, D, F).

in 4 weeks of transplantation in 7 eyes (Figs. 5C and D)38. Conditions
treated included SJS (3 eyes), ocular pemphigoid (2 eyes) and thermal orchemical injury (5 eyes).
Persistent epithelial defect with accompanying sub-acute inflammation is a condition in which a non-healing epithelial defect is accompanied by persistent inflammation resulting from the development of a total corneal epithelial defect extending beyond the limbus during the acutephase of SJS or a thermal or chemical injury. This condition is resistantto all treatments, including eye drops and ointments, oral anti-inflammatory drugs and epithelial protection by eye patching or medical-use soft
contact lenses. It carries a high risk of corneal infection, corneal stromalmelting and corneal perforation, and may lead to blindness. Even if thesecomplications are avoided, conjunctival and connective tissues eventually cover the corneal surface, leading to blindness. When cultivated mucosal epithelial sheet transplantation is used to treat this disease, epithelialization of the corneal surface is achieved at the time of surgery, which canhelp to prevent serious complications, such as infection and perforation.
In addition, it can help inhibit postoperative inflammation of the ocularsurface and reduce cicatricial changes6,38.
Transplantation of cultivated allogeneic corneal epithelial sheets produced a favorable outcome in treating this condition6,23. We obtained
similar results with transplantation of cultivated autologous oral mucosal
epithelial sheets.
4.2.3 Release of adhesion
Fornix reconstruction was performed in 22 eyes in 21 patients (both eyesfor 1 patient) using cultivated autologous oral mucosal epithelial sheets forthe purpose of adhesion release. The most common underlying condition
was ocular pemphigoid (10 eyes), followed by thermal or chemical injury(4 eyes), SJS (1 eye) and other (7 eyes).
For the adhesion release group in ocular pemphigoid patients, thesymblepharon score improved for 6 of 10 eyes, and the total upper and
35 The Principles of Regenerative Medicine

lower conjunctival sac adhesion score improved for 7 of 10 eyes (Figs. 5E
and F). Cataract surgery involving transplanting epithelial sheets was
performed in 5 eyes (50%) with ocular pemphigoid.
Ocular pemphigoid rarely presents with the acute symptoms seen
in SJS or thermal or chemical injury. It develops without symptoms;
shrinkage of the conjunctival sac progresses slowly over several years,
and eventually leads to corneal epithelial stem cell deficiency andcorneal opacity. Using transplantation of cultivated autologous oral
mucosal epithelial sheets to reconstruct the conjunctival sac in ocular
pemphigoid patients is significant because of its role as a rescue therapy,
namely stem cell protection before the development of epithelial
stem cell deficiency.
All patients with thermal or chemical injury saw an improvementin their adhesion score within 4 weeks of transplantation with notendency towards recurrence thereafter. However, in the ocular
pemphigoid group, improvement was maintained in 5 eyes (50%), butadhesion recurred in 4 eyes (40%). It is unclear whether the two different
postoperative courses were due to host factors or environmental factors.
Further investigation is needed to clarify the role of cultivated autologous
oral mucosal epithelial sheet transplantation in ocular pemphigoid.
4.3 Adverse events
Adverse events included 24 cases of persistent epithelial defects in 22 patients (30.6%), 3 cases of infection in 3 patients (4.2%) and 7 cases ofincreased intraocular pressure due to steroids in 7 patients (9.7%). All
cases of persistent epithelial defect ultimately healed, and none resulted in blindness.
Multivariate analysis to determine the factors associated with theoccurrence of persistent epithelial defect in all cases of transplantation identified three factors: underlying disease (p = 0.0119), meniscus(p = 0.0323) and preoperative corneal neovascularization (p = 0.0806).
These results indicate that an underlying condition of SJS, poor tearproduction with a very low meniscus and preoperative corneal neovascularization severe enough to cover the pupil are risk factors for developing persistent epithelial defect. In fact, persistent epithelial defect developed in 7 of 10 eyes having all three of these risk factors.
4.4 Long-term course
A long-term clinical follow-up of 19 eyes in 17 patients for over 3 years
without additional intervention (including delayed surgery) revealed
that the transplanted oral mucosal epithelium stabilized at 6 months
after surgery and that a good epithelium was maintained on the ocularsurface over a long period36.
4.5 Prospective clinical study
Based on the above results, we limited patients for a prospective clinicalstudy to those with the three most severe refractory conditions (SJS, ocular pemphigoid and severe thermal or chemical injury) and performed
transplantation of cultivated autologous oral mucosal epithelial sheets in
22 patients between September 2014 and March 2017 as part of a prospective clinical study under the Advanced Medical Care System37. The
results are currently being analyzed.
4.6 Visual rehabilitation using limbal contact lenses
With the aim of reducing irregular astigmatism and dry eyes in severe
ocular surface diseases, we developed our own rigid contact lens (limbal rigid contact lens) design with a diameter of 13 to 14 mm. A clinicalstudy demonstrated significant improvement in visual acuity and qualityof life, particularly in SJS patients39. Therefore, we conducted an investigator-initiated study in SJS patients and obtained regulatory approval in February 201640.
Irregular astigmatism is present on the ocular surface after transplantationof cultivated autologous oral mucosal epithelial sheets. The use of limbal rigid contact lenses following epithelial stabilization after transplantation can
reduce irregular astigmatism and improve visual function (Fig. 6)41. Limbal
advances.tri-kobe.org/en

Tissue Engineering 2

From Ref. 41 © 2019 Kyoto Prefectural University of Medicine

CF (0.004)

Chie Sotozono et al

COMET

5.3 Social challenges
Practical application of regenerative medicine requires a large investment
in facilities, including cell-culture facilities; however, companies cannot
expect to recoup their investments for rare diseases. Reducing visual impairment can reduce social security expenses (e.g., by removing the needfor disability pensions) and increase the labour force, which greatly benefits society. However, reduced social security expenses are not reflected incorporate profits. Finding a balance between corporate profit and social
benefit is critical for determining which problems should be addressed.

0.05

limbal rigid contact lens

0.9
Figure 6. Improvement in visual function using limbal rigid contact lenses. A patientwith Stevens–Johnson syndrome with severe adhesion on the ocular surface anda preoperative vision of counting fingers (0.004). The patient’s own oral mucosal
epithelium transplanted onto the cornea was nearly stabilized 6 months after surgery,improving visual acuity to 0.05; the use of limbal rigid contact lenses further improved
visual acuity to 0.9–1.0. This improvement has been maintained for over 7 years since
surgery. (Modified from Ref. 41.)
COMET, cultivated oral mucosal epithelial sheet transplantation

rigid contact lenses can increase the therapeutic effects of cultivated autologous oral mucosal epithelial sheet transplantation.
5. FUTURE PROSPECTS AND CHALLENGES
Transplantation of cultivated autologous oral mucosal epithelial sheets
brings a ray of hope to vision-impaired patients with severe ocular surface diseases. The technique could be expanded to treat other conditions.
However, both social and medical challenges need to be overcome in order to further improve outcomes.
5.1 Expansion of indications
SJS, ocular pemphigoid and thermal or chemical injury lead not only to lossof the corneal epithelium, but also to the loss of conjunctival epithelial stem
cells. Diseases with similar conditions include GVHD and idiopathic stem
cell deficiency, and future expansion to include these indications is expected.
Among the patients classified in the ‘Other’ category in our early clinical studies, 4 patients had malignant tumours. If transplantation of cultivated autologous oral mucosal epithelial sheets could be used to treat
malignancy, it would allow us to take a sufficient safety margin during tumour excision and expect rapid epithelial repair after surgery.
5.2 Medical challenges
One study has reported the induction of differentiation of iPS cells into
corneal epithelial cell-like cells, which may enable cultivated autologous
corneal epithelial sheets to be transplanted for bilateral diseases in the future42. However, the morphology and nature of epithelial cells vary withtransplantation site and environment, and the factors that control thesechanges are not fully understood. Transplanting cultivated autologous oral
advances.tri-kobe.org/en

mucosal epithelial sheets had different outcomes depending on the underlying disease. We must continue our exploration of cell biology, including
studying the cells in epithelial sheets and the relationship between the nature of the cells and their environment.
Recently, our group has developed a novel technique for culturing oral
mucosal epithelial sheets using a feeder-free and serum-free culture system. Using this new protocol, we obtained favourable results in non-clinical studies43. A phase 3 clinical trial using the new culture protocol is currently being conducted.

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The Principles of Regenerative Medicine 36

Tissue Engineering 2

Chie Sotozono et al

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37 The Principles of Regenerative Medicineadvances.tri-kobe.org/en

Tissue Engineering 3

Shinichi Kanemaru

A tissue-engineering
approach to tympanic
membrane regeneration
Shinichi Kanemaru

Translational Research Center for Medical Innovation, Foundation for Biomedical
Research and Innovation at Kobe, JapanA new treatment has been developed by researchers associated with the Translational
Research Center for Medical Innovation (TRI) in Japan that involves stimulating tissue
stem cells or progenitor cells in order to repair perforations in the tympanic membrane.
This treatment is safer and easier to administer than currently available therapies. It
involves enlarging perforations and providing a gelatin sponge impregnated with basic
fibroblast growth factor as a substrate for new cells to grow on. The Japanese government
approved the treatment in August 2019, making it the first approved tissue-engineering
treatment in Japan for repairing perforations in the tympanic membrane.

1. INTRODUCTION
Regenerative medicine seeks to harness the natural process of regeneration by inducing cells todifferentiate and proliferate so that they reconstruct irreversibly damaged tissues and organs.
A fundamental property of living organisms is their ability to restore damaged components. The
extent of restoration depends on the severity of the damage. In cases of fairly minor damage, tissues
or organs can spontaneously heal through regeneration, being completely restored to their originalstate. In more severe cases, healing may fail to restore the original state, resulting in deformation or
degeneration. The innate regenerative capacity also varies with the tissue or the organ. For example, evenwhen cut in half, the liver can regenerate to almost its original size within a few months. Regenerative
capacity also varies with species. For instance, newts and lizards can regrow severed tails and limbs.
Generally, tissues and organs with active cell division, and lower forms of life, have a high regenerative
capacity. Research into developmental processes and regeneration in various animal species has led tothe development of regenerative medicine, which seeks to find ways to restore tissues and organs totheir original state by promoting non-spontaneous regeneration.
Regenerative medicine has its origins in the artificial-organ research conducted in the 1950s, mainly inEurope and the United States. Materials with a high affinity for tissues were studied and developed witha view to implanting artificial organs in the body, a contrasting approach to ex vivo technologies such as
dialysis. This led to the emergence of the new medical field of tissue engineering1–3 (also called regenerative
medical engineering or regenerative tissue engineering). Combining medicine and engineering, tissue
engineering forms the basis of regenerative medicine. To regenerate tissues and organs the following threeelements need to be placed in a suitable environment: cells that provide the basis for tissue regeneration; ascaffold to support cell differentiation and proliferation; and factors that regulate these processes (Fig. 1).
These three elements are known as the triad of tissue engineering. The development of regenerative medicine
Tissue Engineering Triad
Scaffold

Cells

SUMMARY
A tympanic membrane
perforation is more thansimply a hole in the eardrum— it causes or augments
hearing loss, significantly
reducing a patient’s
quality of life. Recent
studies have found thathearing loss is one of the
major contributors to thedevelopment of dementia.
In rapidly ageing countries,
such as Japan, the impact
of problems resulting
from communication
disorders should not be
underestimated. Advancesin tissue engineering
have delivered a major
breakthrough in thetreatments available: thedevelopment of a therapy
involving the body’s
self-repair system (i.e.,
regenerative medicine).
The tympanic membrane
has a natural capacity toregenerate. Elucidating
and understanding
the mechanism of thisregeneration has inspired
the development of a safer
and more convenient
therapy, which is amenable
to patients. This treatment
involves enlarging
perforations and providing agelatin sponge impregnatedwith basic fibroblast growth
factor as a substrate for new
cells to grow on.

CORRESPONDING
AUTHOR
Shinichi Kanemaru

E-mail: kanemaru@ent.kuhp.
kyoto-u.ac.jp

Regulatory factors

Good regenerative conditions

Regeneration of the tissue/organ
Figure 1. The tissue engineering triad.

advances.tri-kobe.org/en

The Principles of Regenerative Medicine 38

Tissue Engineering 3

Shinichi Kanemaru

Manubrium of malleus
OssiclesTympanic
membrane

Semicircular canalPars flaccia

Manubrium of malleus

Cochlea

Cartilaginous
portionBone portion

Middle ear
External auditory canal

Inner ear

Annular ligament
Umbo

Pars tensa

Figure 2. Structure of tympanic membrane.

has been undergirded by recent remarkable developments in fields suchas tissue engineering, molecular biology and developmental genetics, andespecially by huge advances in stem-cell research, including the generationof induced pluripotent tissue stem cells or progenitor cells. These advances
have extended the range of cells that can be used and have found wide
application in the development of disease models and the discovery of
new drugs. However, clinical applications have been limited as there aremany unresolved issues, including medical, ethical and social ones, such as
the safety of cell transplantation, sources of tissue stem cells or progenitor
cells, and rejection reactions. Whether regenerative medicine will become amajor pillar of medical treatment in the future is still uncertain, but some
progress in regenerating tissues and organs has already been reported andregenerative medicine is likely to significantly change clinical practice inthe near future.
Here, we describe the background and development of theregenerative therapy for the tympanic membrane that we havedeveloped4,5 and present clinical results from a preliminary single-centre
study and an investigator-initiated clinical study.
1.1 Structure of the tympanic membrane
The tympanic membrane is a very thin membrane located between
the outer and middle ear. It is 8 to 10 mm in diameter and shaped
like a funnel, with a concave region known as the umbo in its centre(Fig. 2). The manubrium of the malleus, one of the auditory ossicles, isattached to the tympanic cavity side. A fibrocartilage-like tissue called
the tympanic ring connects the outer edge of the tympanic membrane
to the external auditory canal bone. The membrane has a trilaminarstructure: an epithelial layer, which is continuous with the skin of
the external auditory canal; the lamina propria (the middle layer),which consists of fibrous collagen tissue and which imparts strength
to the tympanic membrane; and the mucous membrane layer, whichis continuous with the mucous membrane of the tympanic cavity.
The tympanic membrane consists of two parts: the pars tensa and thepars flaccida. The pars tensa has this trilaminar structure, but the parsflaccida lacks the middle layer, making it susceptible to the impact of
39 The Principles of Regenerative Medicinepressure in the middle ear. The nutrient vessels that supply the tympanic
membrane run in the lamina propria, and their numbers tend to
decrease with age. Many nutrient vessels are concentrated around the
tympanic ring and the manubrium of the malleus and the umbo in anormal tympanic membrane.
1.2 Problems caused by perforation of the tympanic membrane
Not only is a perforated tympanic membrane unable to capturesound sufficiently well for normal hearing, but also sound penetrates
the tympanic cavity through the perforation, enters the inner ear as
vibrational energy through the round window of the cochlea, and ascends
the cochlear floor from the bottom (cochlear basal turn) to the top(cochlear apex). Sound entering by the normal route via the residual
tympanic membrane and the oval window ascends the scala vestibuli
from the bottom to the top through the oval window. When these two
vibrations collide with each other near the cochlear apex, energy is
rapidly attenuated because of cancellation, resulting in hearing loss. The
intelligibility of speech is also reduced, making it difficult to understandspoken words6. Patients with both presbycusis (age-related hearing loss)
and tympanic membrane perforations experience significant hearing
loss and may require a hearing aid depending on perforation size. A
hearing aid further increases the cancellation effect. Consequently,
while it amplifies the sound entering the ear, it does not improveword recognition.
When there is a tympanic membrane perforation, the middle ear is
directly exposed to the outside via the external auditory canal. The resulting
susceptibility to infection can lead to otitis media. Changes in temperatureand pressure can damage the inner ear and cause dizziness, which leads tosensorineural hearing loss over time. It is thus desirable to close membrane
perforations as much as possible to maintain a good conduction environment
in the middle ear and to prevent injury to the inner ear.
1.3 Causes of tympanic membrane perforations
According to the World Health Organization, chronic otitis media
affects up to 330 million patients worldwide7. Tympanic membraneadvances.tri-kobe.org/en

Tissue Engineering 3

perforations usually accompany chronic otitis media, but they canalso be caused by trauma, incision, tube placement in the tympanic
membrane, burns, radiotherapy and other causes. Thus, the number ofpatients with tympanic membrane perforations is likely to exceed theabove number.
Perforations due to physical or mechanical injury generally heal bythemselves within three months in most patients8. Therefore, with the
exception of cases where skull fracture or other severe injuries have greatly
deformed the tympanic membrane, observation for at least six months
is standard first-line management for simple perforations caused by, forexample, a cotton bud, a slap in the face, or barotrauma due to rapid
pressure changes caused by a blast or air travel. In contrast, persistent
perforations following otitis media or tube placement in the tympanic
membrane as well as perforations caused by burns or radiotherapy often
require some surgical treatment.
1.4 Current treatment of tympanic membrane perforations
The current methods for closing perforations in the tympanic membrane
are primarily myringoplasty and tympanoplasty. For small perforations,the surface may be covered with collagen and chitin membranes
after transforming the perforation edges into an open wound9.
Myringoplasty targets tympanic membrane perforations alone and is
performed in patients with a normal ossicular chain and who have noinflammation, infection or lesions in their middle ear. Tympanoplasty
involves reconstructing the ossicular chain regardless of the presence ofa tympanic membrane perforation and is classified into types I–V basedon the severity of defects in the auditory ossicles. Type I tympanoplasty
is performed primarily on patients with a normal ossicular chain to
suppress inflammation, infection or lesions in the middle ear. In any
type of tympanoplasty, autologous tissue such as temporal fascia iscollected as material for reconstructing the tympanic membrane, andthe epithelial layer of the residual tympanic membrane is detached toinsert the autologous tissue between the epithelial layer and the fibrous
middle layer. Alternatively, the mucous membrane layer (the deepest
layer) around the perforation may be incised to adhere the autologous
tissue to the wound site. The tympanic membrane is closed when theupper epithelial layer and the mucous membrane layer are extended
with the autologous tissue as the scaffold.
Tympanoplastic methods have high success rates because of thestrong affinity between tissues due to the use of autologous tissues
for reconstruction. However, tympanic membranes produced bythese procedures usually lack a normal middle layer because it isharder to regenerate that fibrous layer than the other two layers in the
tympanic membrane. The transplanted autologous tissue may gradually
degenerate, resulting in a weak tympanic membrane that lacks a middle
layer. Alternatively, if it does not degenerate, a very thick tympanic
membrane may result. A mixture of these two patterns may occur. New
perforations at this site rarely close spontaneously.
If the ossicular chain is normal, hearing recovers to some extent after
closing the perforation, but perfect hearing with no air–bone gap ishard to achieve because the conduction efficiency varies depending on
both the degree of contact with the malleus and the thickness of the
tympanic membrane. Incision of the postauricular skin and collectionof autologous tissue for reconstructing the tympanic membrane may
result in various sequelae, such as sensory loss and discomfort aroundthe auricle.
2. THE BIOLOGY AND NON-CLINICAL PROOFS OF CONCEPTOF NEW TREATMENTS
2.1 Healing mechanism for tympanic membrane perforations
Since small perforations in healthy tympanic membranes caused bytrauma often heal, many studies have focused on this mechanism
for regenerating the membrane10–13. Most of these studies are animal
experiments, and they have shown that the epithelial layer in thetrilaminar structure of the tympanic membrane extends first andadvances.tri-kobe.org/en

Shinichi Kanemaru

Figure 3. Tympanic membrane that has healed spontaneously. The white arrow points toa transparent area of tympanic membrane that has formed without the middle layer. No
nutrient vessels can be seen. The edge of the middle layer can be observed as a whitemargin surrounding the transparent tympanic membrane.

that the two other layers then extend using the epithelial layer as thescaffold10. Thus, each layer has a different rate of regeneration and adifferent capacity to regenerate. The fibrous middle layer gives strengthand elasticity to the tympanic membrane, but it regenerates slower thanthe epithelial layer above it and the mucous membrane layer beneathit. Therefore, if the epithelial and mucous membrane layers, which
regenerate faster, adhere to each other in regions beyond the middle
layer, the fibrous layer will lack space to grow further and the perforation
will persist if regeneration of the epithelial and mucous membrane
layers stops at this point. If regeneration proceeds and the perforation
is closed, a fragile and transparent tympanic membrane will form thatlacks a fibrous layer (Fig. 3). The edge of the regenerated fibrous layer
turns white. A slight pressure change can then cause reperforation.
The tympanic membrane’s regenerative capacity indicates thepresence of tissue stem cells or progenitor cells in the membrane and its
surroundings. Indeed, animal experiments have shown that these cells
probably exist in the tympanic membrane ring and the malleus (umboand manubrium) and that injuring the membrane initiates their active
proliferation14,15. Normally, these cells only support cell turnover in the
tympanic membrane, but an injury to the membrane appears to trigger
the repair system and initiate active reactions. However, these cells aredormant in chronic tympanic membrane perforations. Thus, when the
tympanic membrane is injured, the regeneration mechanism is switchedon by the injury itself. However, if the regeneration environment isunfavourable (as is the case in an infection and chronic inflammation)or if the perforation is large, cell growth stops prematurely andthe perforation persists. It is thus critical to maintain a favourable
regeneration environment.
Observation of the natural course of tympanic membrane regeneration
indicates that it is necessary to:•promote growth of the fibrous middle layer of the membrane;•
provide a scaffold on which each membrane layer can grow;•maintain a suitable regeneration environment that efficiently
promotes membrane regeneration.
2.2 Promoting growth of the fibrous middle layer of
the tympanic membrane
Various growth factors have been found for the fibrous middle layer of
the tympanic membrane, but few are suitable for clinical application.
Among those that are suitable, basic fibroblast growth factor (bFGF)
is already marketed as a drug product in Japan, and its use for treating
skin ulcers is covered by health insurance. bFGF directly affects cellproliferation and blood vessel growth16,17.
During regeneration of a normal tympanic membrane, it is essential
to maintain enough blood flow to support regeneration of the trilaminarstructure, particularly the fibrous middle layer, which regenerates very
The Principles of Regenerative Medicine 40

Tissue Engineering 3

Shinichi Kanemaru

1

100µm

100µm

Collagen

E
H
21
14

Local anesthesia
by 4% lidocaine

Gelatin sponge

Figure 4. Difference in density between collagen and gelatin sponge (electron
micrographs).

23Disruption of
TM perforation edge
4

E
H
25
47
Trimmed gelatin spongewith bFGF
5

Before regeneration

Placement of gelatinspongewith bFGF
6

Two months
after regeneration therapy

Figure 5. Observation of regenerated tympanic membrane. A regenerated tympanic
membrane with the appearance of frosted glass and numerous capillaries two months
after tympanic membrane regeneration therapy, indicating that the middle layer has
regenerated. The white arrow points to the remaining gelatin sponge.

Covering and fixation ofgelatin songe by fibrin glue

3 weeks
after removing the crust

Figure 6. Steps involved in tympanic membrane regeneration therapy. 1. Infiltration
anesthesia of the remaining tympanic membrane and the tympanic membrane perforationedge with a 4% lidocaine swab; 2. Transformation of the tympanic membrane edge into
an open wound; 3, 4. Placement of b-FGF-impregnated gelatin sponge; 5. Covering theb-FGF-impregnated gelatin sponge with fibrin glue; 6. Removal of the crust three weeks
after treatment.

slowly. bFGF is therefore ideal as it directly affects the growth offibroblasts essential for regenerating the fibrous layer18 and also induces
blood vessels to supply nutrients to the surrounding tissues.
2.3 Providing a scaffold on which each tympanic membrane layer
can grow
In tissue regeneration, selection of a scaffold for cell growth is critical. A
scaffold needs to have a high tissue affinity and be able to be eliminatedby absorption or degradation after serving as a scaffold.
Our tympanic membrane regeneration therapy involves impregnatinga bioabsorbable scaffold material with the growth factor, placing it
within the tympanic membrane defect and fixing it with a bioadhesive
glue. We selected gelatin sponge as the scaffold material for regenerating
the tympanic membrane. Its primary component is the triple-helicalstructure of collagen molecules uncoiled by heat denaturation. When a
41 The Principles of Regenerative Medicineliquid is added, it becomes a free-shaped pliable mass and has a muchlooser structure than collagen (Fig. 4). Gelatin sponge is hydrolyzed andeliminated from the body within 1 month19,20, although it may take a
few months to eliminate it from the tympanic membrane because thetympanic cavity contains air and is not in living tissue.
Our therapy differs from many conventional ones in that it uses
free-shaped gelatin sponge as a scaffold. Conventional therapies repair
defects in the tympanic membrane by extending the surrounding tissues
along the inner and outer surfaces of the sheet-like scaffold material
glued to the portion of the tympanic membrane with the defect. If themembrane perforation is small and the entire defective portion is flat, it
can be effectively repaired by conventional methods. If the defect is larger
however, it is difficult to cover the entire defective portion with a flat sheetof material because of the complicated shape of the tympanic membrane
and the auditory ossicle attached to it. If the defective portion cannot be
advances.tri-kobe.org/en

Tissue Engineering 3

Shinichi Kanemaru

1

2

3

4

6

Reprinted from Ref. 4, with permission

5

Figure 7. Tympanic membrane regeneration in a 65-year-old woman who had chronic
otitis media for 30 years. 1, Before regeneration treatment; 2, transformation of the
tympanic membrane perforation edge into an open wound; 3, placement of b-FGFimpregnated gelatin sponge and covering with fibrin glue; 4, regenerated tympanic
membrane and remaining gelatin sponge in the tympanic cavity 3 weeks after treatment;
5,6, the gelatin sponge in the tympanic cavity is eliminated, and numerous capillaries
are observed in the regenerated tympanic membrane 4 months after treatment.

completely covered, the tympanic membrane cannot be repaired without ascaffold, or the membrane may fuse with the surrounding tissue, resulting
in sequelae. In fact, if the tympanic membrane defect exceeds a certain
size or if part of the auditory ossicle is affected, conventional therapies
will fail to repair the perforation because the scaffold cannot cover theentire defect.
In contrast, gelatin sponge can easily cover an entire defect regardless
how complex its shape is. And it is effective even for defects that spanthe entire tympanic membrane. This scaffold material has enabled thesuccessful regeneration of a tympanic membrane with large perforationsand virtually no residual membrane21. Gelatin sponge can also releasebFGF in a sustained manner22, which is advantageous for tympanic
membrane regeneration.
Observation of a patient whose tympanic membrane had been
completely regenerated by this therapy (Fig. 5) reveals that part of
the gelatin sponge remains inside the tympanic membrane (in theadvances.tri-kobe.org/en

tympanic cavity), and the gelatin sponge on the outside (in the external
auditory canal) has separated as a crust. This indicates that the regenerated
tympanic membrane grows through the inside of the very loose open
structure of the gelatin sponge (Fig. 4), which shows that the therapy
is based on a different concept from that of conventional tympanic
membrane regeneration. Tissues do not regenerate through the insideof a dense scaffold, such as the sheet-like collagen membrane used inconventional therapy, but rather grow along the surface of the scaffold.
But because a loosely structured scaffold such as gelatin sponge does notinterfere with the expansion of cells, regenerative cells can pass throughthe inside of the loose structure to repair the tympanic membrane.
2.4 Maintaining a favourable regeneration environment
For tissue regeneration to occur, the conditions must be suitable forin vivo cell culture. In our therapy, the scaffold is fixed in place for acertain time by dripping fibrin glue onto it and thereby covering thesurface of the gelatin sponge with a fibrin membrane. The inside of thegelatin sponge is kept moist to isolate the culture environment fromthe outside.
3. TREATMENT PROCEDURE
Tympanic membrane regenerative therapy is based on the concept
of in situ tissue engineering. The tissue engineering elements used
are endogenous tissue stem cells or progenitor cells, gelatin sponge(Spongel®, Astellas Pharma Inc., Tokyo, Japan) as a scaffold and basic
bFGF (Fiblast®, Kaken Pharma Co., Ltd, Tokyo, Japan) as a regulatory
factor. A fibrin glue (Bolheal®, Chemo-Sero-Therapeutic ResearchInstitute [Kaketsuken], Kumamoto, Japan; Beriplast®, CSL Behring
K.K., Tokyo, Japan) is also used to prepare a favourable regeneration
environment. Cells are not transplanted in this environment; rather
the edge of the tympanic membrane perforation is made into an open
wound, which activates dormant endogenous tissue stem cells orprogenitor cells.
Figure 6 shows the steps involved in the therapy. To anaesthetize
the external auditory canal, including the residual tympanic membranearound the perforation and its surroundings, a swab impregnated with
4% lidocaine is inserted and kept in place for 15–20 minutes. The edgeof the tympanic membrane perforation is then transformed into an open
wound using a myringotomy knife or a Rosen probe. At this point,
the circumferential edges of all three layers of the tympanic membrane
are exposed.
Gelatin sponge impregnated with bFGF is then trimmed to fit
the size of the tympanic membrane perforation and placed between
the tympanic cavity and the external auditory canal. It is importantto place sufficient sponge pieces to sandwich the residual tympanic
membrane from both the tympanic cavity side and the external auditory
canal side, so that the gelatin sponge is in complete contact with thewhole tympanic membrane perforation edge and there are no gaps.
Finally, a few drops of a fibrin glue are dripped from a syringe to coverand stick to the entire gelatin sponge. After three weeks, the woundcrust is removed from the upper surface of the tympanic membrane
to check for regeneration. If the crust adheres to the surface, it may
be removed by inserting a swab impregnated with 4% lidocaine fromthe external auditory canal for 15–20 minutes. If complete regeneration
does not occur after the first treatment, the treatment may be repeatedafter removing the gelatin sponge retained in the tympanic cavity or theexternal auditory canal. Retreatment should be limited to four attempts,
as clinical experience has shown that the probability of regenerating
the tympanic membrane is very low beyond the fourth treatment. If
otorrhea due to infection or inflammation is observed after regeneration
treatment, further treatments are suspended, and oral or eardrop
antibiotic therapy is initiated to suppress inflammation and otorrhea.
Treatment is resumed after adequate healing (which may be several
months). There may be allergic reactions to gelatin sponge, bFGF, or
fibrin glue in rare cases.
The Principles of Regenerative Medicine 42

Tissue Engineering 3

Shinichi Kanemaru

Classification of
TM perforation by size

Grade I
(N = 85)

Grade II(N = 83)

Grade III(N = 64)

Incomplete closure
19%

TM perforation closure rate

81.2%
(69/85)

86.7%(72/83)75.0%(48/64)Complete closure
81%

Hearing improvement(three-frequency average)

9.1 dB

12.4 dB

16.3 dB

Chole

1

3

5

TO

8

14

13

DTM

4

8

7

Major AEs

• Grade I, perforation occupying < 1/3 of the TM; Grade II, perforation occupying 1/3–2/3 of
the TM; Grade III, perforation occupying > 2/3 of the TM

Tympanic membraneregeneration rate
N = 232

4 times 8%
3 times 10%
2 times 18%
1 time 64%

Number oftreatments required
for regeneration
N = 189• TM, tympanic membrane; AEs, adverse events; Chole, cholesteatoma; TO, transient otorrhea; DTM, depressed TM

Table 1. Results of preliminary single-centre study of tympanic membrane regeneration
therapy

Figure 8. Tympanic membrane regeneration rate and number of treatments required
for regeneration in preliminary study. The tympanic membrane regeneration rate after
a maximum of four treatments was 81% (189/232 ears), and 82% of tympanic membraneregenerations were achieved with two or fewer treatments.

4. CLINICAL RESULTS
4.1 Preliminary single-centre study
4.1.1 Selection of patients and materials
This new therapy was approved by the institutional review board of
Kanai Hospital in Kyoto. And patients were limited to those who fully
understood the procedure and agreed to pursue this new treatment
by signing informed consent documents. To examine the efficacy andsafety of tympanic membrane regenerative therapy in a clinical setting,
we first conducted a single-centre preliminary study. This involved
218 patients (232 ears) with tympanic membrane perforations andno confirmed active infection or inflammation in the middle or outerear. The causes of tympanic membrane perforations were chronic otitis
media (n = 136), old traumatic tympanic membrane perforations (n= 42), persistent perforations after tympanic membrane incision or
tympanic membrane tube placement due to exudative otitis media (n= 26), reperforations after closure of tympanic membrane perforations
or tympanoplasty (n = 15), burns (n = 4), post-irradiation (n = 3) andunknown (n = 6). The male/female ratio was 101:117. Patients ranged
from 8 to 91 years of age.
Patients were divided into three groups according to perforation size.
Perforations occupying less than 1/3, 1/3 to 2/3 and more than 2/3 of the
tympanic membrane were classified as grades I, II and III, respectively.

degree of hearing improvement three months after the final treatment.
Occurrences of adverse events were recorded.

4.1.2 Treatment method
The treatment procedures are described above. After treatment, patientswere instructed not to apply pressure to the ear by strong sniffing or nose
blowing, to use caution when washing their hair or having a bath so thatwater would not enter the affected ear and to visit the outpatient clinic
3 weeks after surgery.
4.1.3 Assessment
The success of perforation closure was assessed according to the size ofthe perforation, the number of treatments required for closure and the43 The Principles of Regenerative Medicine

4.1.4 Results
Table 1 shows the results, while Fig. 7 shows an example of regeneration.
Overall, the tympanic membrane perforation closure rate (189/232
ears) was 81%, and favourable hearing improvement was achieved
with a small air–bone gap. Of the 189 ears with successful tympanic
membrane regeneration, 80% or more had perforation closure with
two or fewer treatments (Fig. 8). The most common adverse event
was transient otorrhea (35/232 ears, 15.1%). Some cases of depressed
tympanic membrane (19/232 ears, 8.2%) required tympanic membrane
incision (5/232 ears, 2.2%). Additionally, cholesteatoma (9/232 ears,
3.9%) occurred under the epithelium of the tympanic membrane, but
all lesions could be removed with a probe.
Regeneration is difficult if the tympanic membrane ring or the malleus
has been lost during tympanoplasty or by other causes. Regeneration
was successful in some patients with the tympanic membrane ring andthe malleus conserved in tympanoplasty, and the regeneration rate
(4/15 ears) was only 26.7%. No regeneration occurred in membrane
perforations caused by burns or radiotherapy. These results suggest thattissue stem cells or progenitor cells may have been eliminated in thesepatients. Reperforation occurred in four patients (1.7%, 4/232 ears)
during the three-month observation period, and all these perforations
were about the size of a pin hole.
5. INDICATIONS FOR TYMPANIC MEMBRANE REGENERATION
5.1 Exclusion criteria for tympanic membrane regeneration
Only 20–30% of patients with perforations meet the eligibility criteria
for tympanic membrane regeneration. Finding ways to increase thenumber of eligible patients in the future is thus important. The exclusion
criteria for receiving tympanic membrane regenerative therapy shown
below are based on the results of previous clinical studies:advances.tri-kobe.org/en

Tissue Engineering 3

1

Shinichi Kanemaru

23Figure 9. Tympanic membrane regeneration in a 39-year-old woman with chronic otitis media. Fibrescope images (1, 2) before treatment and (3) two months after treatment. The patient
had otorrhea and calcification in the remaining tympanic membrane (black arrows). The perforation edge could not be directly observed microscopically because of the extension of theanterior and lower walls of the external auditory canal (white arrows). Regeneration treatment was performed after washing the inside of the tympanic cavity and removing the calcified
remaining tympanic membrane endoscopically. The regenerated tympanic membrane is virtually normal without calcification 2 months after treatment.

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

The patient has active infection or inflammation in the tympanic
cavity or the external auditory canal as well as otorrhea.
The tympanic membrane, tympanic cavity and external auditory
canal are not dry, or advanced calcification is observed in theresidual tympanic membrane.
High-resolution computed tomography of the temporal boneshows a soft tissue shadow in the tympanic cavity or the
mastoid cavity.
The patient has a history of middle-ear surgery such as
tympanoplasty or myringoplasty.
The tympanic membrane perforation was caused by radiationor burns.
The normal structure of the middle ear is lost (including lossof the tympanic membrane ring and fusion of the residual
tympanic membrane).
The edge of the perforation cannot be directly observed using
microscopy because of a narrow external auditory canal.

These criteria can be divided into three categories. Criteria 1, 2 and 3
represent a poor regeneration environment; criteria 4, 5 and 6 represent a
partial or total lack of tissue stem cells or progenitor cells supporting tympanic
membrane regeneration; and criterion 7 represents a condition where theentire circumferential edge of the perforation cannot be transformed into an
open wound because of the narrow external auditory canal.
5.2 Expansion of indications
Among the exclusion criteria, a lack of tissue stem cells or progenitor cells
presents the most difficulties for regeneration, and co-transplantation ofcells with the scaffold is the only conceivable regeneration method. For
criteria 1, 2 and 3, tympanic membrane regeneration can be performed
if the regeneration environment is improved. For criterion 7, where theperforation edge cannot be directly observed by microscopy because ofa narrow external auditory canal, tympanic membrane regeneration canbe performed endoscopically if an endoscope can be used to observe
the entire tympanic membrane and perform treatment. If observationand treatment are still difficult, tympanic membrane regeneration may
be performed after expansion of the external auditory canal. All thesesolutions are more straightforward than those for criteria 4, 5 and 6.
Where a soft tissue shadow is present in the tympanic or mastoid cavity(criterion 3), such lesions usually need to be removed by opening anddrilling the bone using a procedure such as tympanomastoidectomy. In
conditions corresponding to criterion 6, a significant loss of middle-ear
structure and large displacement of the residual tympanic membrane
due to adhesive otitis media make regeneration very difficult.
advances.tri-kobe.org/en

5.3 Improving the regeneration environment before regeneration
If the inside of the ear is wet during the inactive phase of chronic otitis
media or the patient has active infection or inflammation and otorrhea
that is considered to be acute exacerbation of chronic otitis media, but
meets other eligibility criteria, conservative treatment is first performed
with oral antibiotics and eardrops, and followed up for one to twomonths. When inflammation has been suppressed, the tympanic cavity is
washed repeatedly in the operating room, mucus in the tympanic cavity iscompletely removed with a swab, and the patient continues with tympanic
membrane regenerative therapy. This method resulted in a tympanic
membrane regeneration rate of 70–80% in our patients (Fig. 9)21.
For patients with advanced calcification or ectopic ossification in
the residual tympanic membrane or epithelial invasion (cholesteatoma)
into the back of the tympanic membrane, all the residual tympanic
membrane is removed before regeneration (Fig. 9).
For patients with a lesion in the tympanic cavity, mainly cholesteatoma
or tumour confined to the tympanic cavity, the cholesteatoma or
tumour is removed before starting membrane regeneration. The lesion
may be removed microscopically or endoscopically, but the inside of the
tympanic cavity must be observed endoscopically after removal to check
whether there is any remaining lesion. Among cases of cholesteatoma
confined to the tympanic cavity, congenital cholesteatoma is mostsuitable for regeneration treatment. Among tumours, glomus
tympanicum tumours are suitable. The membrane regeneration rate isvery high among patients with these conditions, being 95% or higher
in our patients21.
5.4 Expansion of the external auditory canal
Many patients have a narrow external auditory canal. The external auditory
canal has a tubular structure 30–35 mm long and 10 mm in diameter.
The proximal half from the entrance of the external auditory canal is the
cartilaginous portion, and the distal half is the bone portion. Although
there are some differences in shape between adults and children, the section
connecting the cartilaginous portion and the bone portion has a slightbend (Fig. 2). In many patients with a narrow external auditory canal,
the edge of the perforation cannot be directly observed microscopicallybecause of an extension of the bone portion. The perforation edge can betransformed into an open wound by using an endoscope in most patients.
However, because surgical instruments cannot be inserted together withan endoscope into an ear with a very long extension of the bone portion,
the external auditory canal needs to be expanded.
To expand the external auditory canal, incisions are made on the luminal
surface of the narrow lesion of the external auditory canal longitudinallyand perpendicularly to it, in order to peel back part of the soft tissue on the
The Principles of Regenerative Medicine 44

Tissue Engineering 3

surface and expose the surface of the extended bone. This is removed witha diamond bur, and the surface is smoothed. The external auditory canal isexpanded until the edge of the perforation can be sufficiently well observed
for regeneration treatment. The detached soft tissue of the external auditory
canal is replaced, and bFGF-impregnated gelatin sponge pieces used for
tympanic membrane regeneration are placed around the exposed bone
and fixed with fibrin glue. If the bone is exposed over a wide area, gelatin
sponge is used to fill the external auditory canal and fixed with fibrin glue.
The entire auricle is covered and sealed with medical film. The filled gelatin
sponge is removed after three weeks. The soft tissue of the external auditory
canal and the tympanic membrane can both be regenerated simultaneously
using this method22,23.
6. FUTURE PROSPECTS
6.1 Prospects and issues for chronic otitis media
The primary goal of tympanic membrane regeneration is to restore ideal
hearing with no air–bone gap by minimally invasive surgery. There
are several advantages of closing the tympanic membrane, including
improved hearing, relief of discomfort, prevention of otitis media and,in the longer term, protection of the middle and inner ear. However,hearing is not only affected by tympanic membrane perforations,but also by complex factors relating to other structures in the middle
and inner ear and to the retrocochlear region and the central nervous
system. For example, if tympanic membrane regeneration is performedin patients with a perforation and a poorly functioning eustachian tube
due to poor growth of mastoid air cells, depression of the tympanic
membrane and exudative otitis media may occur, because the middle earpressure, which was regulated via the perforation, is no longer regulated,and hearing recovery may be inadequate.
As tympanic membrane perforations are mainly caused by chronic otitis
media, eligibility for membrane regeneration is most critical for patients withthis condition. Many patients with chronic otitis media have lesions in the
mastoid cavity as well as in the tympanic cavity. A combination of tympanic
membrane regeneration and conventional tympanomastoidectomy isrecommended for patients with lesions in both cavities. To establish adequate
communication between the tympanic and mastoid cavities, the lesions inboth cavities are removed by procedures such as tympanomastoidectomy.
Membrane regenerative therapy, rather than the usual autologous tissuetransplantation, is performed to reconstruct the tympanic membrane.
However, to allow for tympanic membrane regeneration, it is essential
not to injure the tympanic membrane ring when detaching all tympanic
membrane layers in order to retain tissue stem or progenitor cells and toretain the residual tympanic membrane attached to the malleus, and theumbo and manubrium15,16. This therapy is suitable for only certain patients,
and it requires a high level of surgical skill. In addition, otitis media withcholesteatoma will reoccur if the mechanisms are not improved that reducepressure in the middle ear, since impaired middle ear gas exchange leads todepression of the upper tympanic cavity and the formation of cholesteatoma.
Because adhesive otitis media is also caused by reduced pressure in the
middle ear, a simple combination of tympanomastoidectomy and tympanic
membrane regeneration cannot cure the disease completely. Poor mastoid
cell growth leads to a poorly functioning eustachian tube. They facilitate
middle ear gas exchange in a complementary way. Therefore, regenerationof mastoid air cells may be needed in combination with these procedures toimprove middle ear gas exchange23,24.
6.2 Prospects and issues for patients lacking tissue stem cells orprogenitor cells
Regeneration is most difficult when tissue stem cells or progenitor cells are
not present. Obtaining tissue stem cells or progenitor cells is hence a vital
issue. We previously reported that these cells are present in the tympanic
membrane ring and the malleus (umbo and manubrium)15,16. Both the
tympanic membrane ring and the malleus are essential to regenerate thetympanic membrane with a complex shape. One method uses the tympanic
membrane ring and tympanic membrane, including the malleus, from
45 The Principles of Regenerative Medicine

Shinichi Kanemaru

a cadaver as a scaffold. It involves decellularizing, removing antigens,culturing autologous mesenchymal tissue stem cells or progenitor cells andtransplanting these cells together with the scaffold. In this method, thequestion of whether to perform partial or full transplantation needs to beconsidered for each patient, but the method can be used in combination
with tympanoplasty because the tympanic membrane and the auditory
ossicle do not vary greatly in size between individuals.
6.3 Prospects for tympanic membrane regeneration
Otologic surgeries, such as common myringoplasty, require a fully
equipped operating room and a wide variety of surgical instruments andare usually performed under general anesthesia. In addition to incisionof the postauricular skin and collection of autologous tissues such as
temporal fascia, these surgeries require multistep surgical procedures
such as detaching the external auditory canal, opening and drillingthe bone, raising the epithelial layer of the tympanic membrane,transforming the perforation edge into an open wound, transplanting the
temporal fascia and tamponing. At least 1 hour of surgery is required. In
addition, patients need to rest in bed and limit daily activities to prevent
infection and displacement of the transplanted fascia. An even bigger
challenge is training surgeons well enough to perform these otologic
surgeries, because training takes a long time and requires the input ofsenior surgeons. In contrast, tympanic membrane regenerative therapy
for a simple perforation involves only transforming the perforation edge
into an open wound and placing the gelatin sponge. Treatment takes
only about 15 minutes. Treatment can be performed on a chair or a
cot bed in an outpatient setting, and only a few types of instrument areneeded, including a simple microscope or endoscope. Hospitalization
or bed rest is unnecessary after surgery, and patients need to visit theclinic for a checkup only once every three or four weeks after treatment.
Physicians can be quickly trained in this therapy because the treatment
is very simple and non-invasive compared with conventional surgicalprocedures. This therapy costs only a fraction of tympanic membraneregenerative therapy combined with myringoplasty. As well as being costeffective, tympanic membrane regenerative therapy realizes closure of
the tympanic membrane perforation for a similar percentage of patients
as conventional surgeries, while it achieves far better hearing.
Convenience and low cost are great advantages in developing
countries, where the therapy is needed most by young patients. In
developed countries, the therapy will lower the psychological hurdle
for middle-aged and senior patients who have given up on treatment
for tympanic membrane perforations and, in addition to improving
hearing, it will reduce the risks of dementia due to hearing loss.
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advances.tri-kobe.org/en

The Principles of Regenerative Medicine 46

Osamu Honmou
福島 雅典

Stem
序

Cell Therapy 1

“今 、医学で起きている
パラダイムシフト ”

序

福島 雅典

公益財団法人 神戸医療産業都市推進機構 医療イノベーション推進センター（TRI）センター長

人類は、病気を克服するために、常に闘ってきた。その過程で、ほど遠いといってよい。

ときに革命的と呼べる発見や発明が生まれ、それまでの医療を

しかし今、そのような治癒できなかった疾病に関して、征圧一変させてきたことはよく知られている。例えば 20 世紀初頭、の目途がつくような画期的な出来事が相次いでいることをごフランスの医師アレクシス・カレルは血管の縫合術を発明し、存知だろうか。それは、生体に含まれる幹細胞を利用した再生

それは臓器の再建術をはじめとするさまざまな手術に用いられ医療の実用化である。例えば、重篤な機能障害あるいは厳しいるようになった。同じく 20 世紀前半には、カナダの医師フレ予後が予想された重度の脊髄損傷の患者を、回復に導いた幹細

デリック・バンティングがインスリンを発見している。さらに、胞治療がある。その様子はビデオ映像に収められており、動く

その数年後には、イギリスの細菌学者アレクサンダー・フレミ

ことのできなかった患者が、歩いて帰れるほどまでに回復する

ングによるペニシリンの発見があり、感染症の治療薬が開発さ様子を見て感動を覚えるのは、筆者だけではないだろう。

れて、創薬研究が爆発的に盛んになるきっかけとなった。

本書では、神経、血管、心筋、角膜、鼓膜、骨の再生を利用

このように人類は、さまざまな疾患をコントロールする方法

した疾患の治療法の開発成功事例を 6 例紹介する。神経と鼓膜を、ある程度は手に入れてきたといえる。しかしながら、そのについては、すでに医薬品の承認審査を行う医薬品医療機器総疾患のコントロールも、人間の寿命延伸という点においては、合機構（PMDA）1 に承認されており、残りの 4 つについては、

限定的といわざるをえない。人間の寿命延伸に関しては、実際

いずれも日本における治験が順調に進行しており、治験終了次には、貧困からの脱出、すなわち衛生と栄養の改善によるとこ

第、順次承認申請に入ることになっている。これらの再生医療

ろがきわめて大きく、医薬品による寿命の延伸効果は限られた

は幹細胞を利用するか、または、損傷のタイプによっては、組ものなのである。つまり、ほとんどの疾病は、その征圧からは織工学的技術を上手に組み合わせている点を特徴とする。

47 The Principles of Regenerative Medicineadvances.tri-kobe.org/en

Stem
序

Cell Therapy 1

Osamu Honmou
福島 雅典

これらの治療法の一部は、これまでに Nature Outlook2 やNature Outline3 〜 7 をも通じて紹介してきており、大きな反響を得ている。それらの反応を踏まえ、『The Principles ofRegenerative Medicine』と題して、より詳しい解説書としてまとめたものが本書である。内容は、これらの治療法の原理として共通する理論を概説する総論（Theory）と、各治療法を詳述する各論から構成されている。将来、新しい治療原理に基づくその他の難治性疾患に対する治療法なども、出版したいと考える。しかしその前に、医学領域におけるパラダイムシフトが起きていることを、まずはこの 1 冊で理解していただきたい。
我々は今、人類未曾有のただならぬ科学・技術の革命期に生きている。向こう 10 年の間に人類は主要な疾患征圧へのロード
マップを明確に描くことができるようになり、その実現に向けて一致協力して邁進する時代に入ることを確信している 8,9。
公益財団法人 神戸医療産業都市推進機構 医療イノベーショ
ン推進センター（TRI）は、アカデミアが主導する臨床研究を支援するための日本の公的機関である。そのセンター長として、本書を世に問うことを誇りに思う。
文献

1. Pharmaceuticals and Medical Devices Agency website http://www.pmda.go.jp/
regenerative_medicines/2019/R20190125001/530100000_23000FZX00001_A100_1.
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https://www.nature.com/collections/pdryjrsvnz/videos
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5. Nature Outline: Critical Limb Ischaemia,Nature 548, 7668_supp (24 August 2017),
https://www.nature.com/collections/vmxkcnxvwg/videos
6. Nature Outline: Non‐union bone fracture: a quicker fix, Nature 550, S193
(26 October 2017), https://www.nature.com/collections/qmpthxknbn/videos
7. Nature Outline: Spinal‐cord Injury: Spurring Regrowth, Nature 552, 7684_supp(14 December 2017), www.nature.com/collections/ctdkppqqnx/videos
8. Fukushima, M., Austin, C., Sato, N., Maruyama, T., Navarro, E. et al.
The global academic research organization network: Data sharing to cure diseases
and enable learning health systems. Learning Health Systems e10073 (2018),
https://doi.org/10.1002/lrh2.10073
9. From Lab to Clinic, TRI Advances website https://advances.tri-kobe.org/en/feature/11/
from-lab-to-clinic

advances.tri-kobe.org/en

The Principles of Regenerative Medicine 48

福島 雅典疾 病 征 圧の理 論 

再生医療概論：その原理と進行中の医療革命の見通し

福島 雅典

公益財団法人 神戸医療産業都市推進機構 医療イノベーション推進センター（TRI）センター長

1. はじめに2. 幹細胞療法とは？

している。患者自身の幹細胞を利用するという新たな治療法のさまざまな部位に分布しており、刺激を受けると、特定のが、臨床試験などできわめて有望な結果を出しているのだ。幹

成熟した細胞タイプを作り出す。生体において、細胞が死ん

細胞療法あるいは細胞療法とも総称されるこの治療法は、幹だり傷ついたりしたときに、それを修復補充する役目を担っ細胞を一度体外に取り出して、増やしてから体内に戻し、組織ているものと考えられている。

再生医療は、さまざまな病気の治療に革命を引き起こそうと幹細胞は、血液、骨髄、脂肪、結合組織、神経、皮膚など、体の再生を促すというものである。日本の研究者が世界をリー

ここで述べる幹細胞療法で使用するのは、成体幹細胞とドしてきた治療法であり、日本において臨床試験が順調に進総称される種類の幹細胞である。細胞には操作を加えないのんでいる。長年にわたるその地道な研究がようやく実を結びで腫瘍化するおそれがなく、胚の細胞は使用しないので倫理はじめたと言ってよいだろう。これまでは治療法がなかった的な問題も生じない。用いるのは自分自身の細胞、あるいは疾患や障害を治癒へと導く根治的な治療法が、今まさに登場

免疫学的に寛容な幹細胞なので、拒絶反応の心配も不要であしようとしている。

る。したがって、臓器移植のときのような、免疫抑制剤の継続

この総説集では、6 つの再生療法について詳述していくが、投与といった補助療法も必要ないのである。また、細胞を生その前に、この概論において、各治療法を貫く共通の原理─

体から取り出し、そのままで、または増殖させてから戻す操─生体で生理活性をもつ幹細胞の利用、および組織工学と呼作は、一部自動化も可能であり、投与の仕方としては静脈注ばれる技術を用いた組織再生の場となる足場素材の供給──

射または、全身麻酔不要の比較的簡単な手技で行えるものがについて説明する。

多い。
生体の修復機構怪我

復修・

再構築（再生）

再生

微生物

生体への攻撃M�
幹細胞：
間葉系幹細胞、 M�
その他

細胞損傷・壊死

図 1 自己保持能を備えた恒常性維持のための多細胞共生系

49 The Principles of Regenerative Medicine

クリアランス（食作用）識

新生物の浸潤

認

梗塞

自己

自

己

プリオノイドによる変性

自然免疫

非

advances.tri-kobe.org/en

福島 雅典疾 病 征 圧の理 論 

成体幹細胞は大きく 2 つのタイプに分類される。1 つは、コンディショニング → 修復、である。幹細胞は体中の組織に造血幹細胞である。その名の通り血液細胞を作り出す能力を存在し、生命の成り立ちを維持している。そして、必要とさもつが、それに加えて、血管の細胞をも作り出すことができれる事態が起こると、骨髄から動員され、修復が必要な場にる。もう 1 つは、現在、間葉系幹細胞と総称されるタイプで、入り込み、場を整え、修復を行うのだ。これが、生命の形態 –もともとは骨や脂肪など、中胚葉（間葉）から発生する細胞

機能恒常性維持機構の本態である。幹細胞療法は、この仕組を作り出すとされた幹細胞であることが名前の由来である。

みを利用する医療技術なのである。さらに、幹細胞には属さ

ただしその中には、最近の研究によって、中胚葉由来でない

ないが、病変部位に動員されうる細胞（例えば、鼓膜の辺縁神経などの細胞を作り出すものも見つかっており、その全容部に存在する細胞で、bFGF〔basic fibroblast growth factor：

解明には至っていないといえよう。

塩基性線維芽細胞増殖因子〕により誘引される；組織工学 3）

ところで、こうした成体幹細胞は生体組織中に微量にしかや、自己複製活性をもつ細胞（例えば、口腔粘膜細胞；組織存在しないことが多いのだが、どのようにして識別し同定す工学 2）も利用可能だ。これらの治療法を成功させる上で鍵るのだろうか。その答えは、幹細胞の表面に発現する糖タンパになっているのが、組織工学である（図 1）。

ク質をマーカーとして利用することだ。例えば、造血幹細胞
は CD34 という糖タンパク質をもつことから、CD34 陽性細胞として認識されるといった具合である。重症下肢虚血（CLI）

3. 組織工学が足場の問題を解決する

組織の損傷した部分に空間的な隙間ができたり、欠損してしにおける閉塞した足の血管の治療（幹細胞療法 3）や、難治まっているときには、細胞が増殖して場を形成するための足性骨折の治療（組織工学 1）では、CD34 陽性の造血幹細胞場（スキャフォールド）が必要となる。それを扱う分野を組が、足場（スキャフォールド）とともに用いられるだろう。

織工学と呼び、すでに商品化されている技術も多い。再生医

また、脊髄損傷に対する新たな治療法（幹細胞療法 1）では、療の開発には、必要に応じて組織工学的技術を工夫して併用

CD105 陽性の間葉系幹細胞が、神経の再生に用いられる。

することが重要である。

成体幹細胞という分類には収まりきらない多彩な性質をも組織工学的技術にはさまざまなものが存在する。例えば、鼓つ幹細胞も存在する。2010 年に東北大学の出澤真理教授に膜の再生では（組織工学 3）、スポンゼル ® という商品名のゼより発見された Muse 細胞 1 がそうである。いろいろな組織のラチンスポンジが利用されている。鼓膜の細胞は bFGF の刺激

細胞を作り出す能力を保持しており、体の組織の修復に特化で増殖できるのだが、その細胞を活性化させるために、bFGFした働きをもつと推測されている。Muse 細胞は、心筋梗塞の含有のスポンゼル ® で鼓膜の穴をふさぐのである。鼓膜は平治療におけるトランスレーショナル臨床試験の基礎となって坦ではなく立体的な形状をしているが、スポンゼル ® を丁度おり（幹細胞療法 2）、これにより、これまで難しいと考えら

綿球のように鼓膜穿孔部につめ、フィブリン糊でコーティン

れていた心筋の再生に成功している。驚くべきことに、Muse

グして固定すれば、鼓膜辺縁部から再生にかかわる細胞がス

細胞は心筋梗塞患者に静注することで効果を示すと報告されポンゼル足場の中に遊走してくる。これが成功の鍵で、驚くており、他家移植にもかかわらず、少なくとも 1 回目の静注べきことに、スポンゼル ® の中に、3 層からなる自然な鼓膜においては免疫抑制剤が不要であった。

が形成されるのである。

以上の幹細胞を用いた方法で用いられる医療技術は、患者

角膜の再生に関する研究では（組織工学 2）、口腔粘膜細胞

本人、また他家由来の幹細胞を静注するというようなきわめを羊膜の上でシート状に増殖させる。角膜の損傷した部分をて単純な手順からなる。つまり、幹細胞を体外に取り出し、切除し、そこに作製した細胞シートを貼り付けるという方法

増殖させ、患者に戻すというものであり、これにより、生体をとる。一方、難治性骨折の治療に関する報告では（組織工に備わっている治癒機構を利用するのである。この治療原理

学 1）、CD34 陽性細胞とともにコラーゲンを、骨折部の周囲は、すでに文献 2 で紹介したが、幹細胞生理という生物学的に注射する。アテロコラーゲンは線維状タンパク質であり、原理にもとづいている。すなわち、組織の損傷 → シグナル

骨の欠損部を埋めて、骨の細胞が増殖するための足場となる

放出 → 幹細胞によるシグナル受容 → 動員 → ホーミング →のである。

advances.tri-kobe.org/en

The Principles of Regenerative Medicine 50

福島 雅典疾 病 征 圧の理 論 

4. 細胞社会の原理を知って治療をデザインする

また、治療の開発および評価は、承認申請を前提とした法さまざまな病気に対する再生療法がこれまで世界中で研究さ律にもとづく registration trial（治験）により行うべきであれてきたにもかかわらず、必ずしも成功に至っていない。そる。registration trial を行うことで、PMDA（医薬品医療機器の中で今、日本の研究者たちが次々と成果をあげはじめたの

総合機構）の指導および助言の下、GMP（good manufacturing

は、どうしてなのだろうか。1 つの理由は、生体内で起こっpractice： 製 造 管 理 お よ び 品 質 管 理 の 基 準 ）、GLP（goodている生物学的プロセスを詳細に理解し、それにもとづいてlaboratory practice：非臨床試験の実施の基準）、GCP（good

治療方法をデザインしているからである。

clinical practice：臨床試験の実施の基準）などの厳格な基生体では、さまざまな種類の細胞が相互に作用を及ぼしな準に沿った厳密なデータが得られるのである（PMDA は米

がら、生体の恒常性を維持している。生体に異常が起きたと

国 の FDA に 相 当 す る ）。 な お、 日 本 で は、2015 年 に 厚 生

きには、まずその異常が検知され、幹細胞がその部位に動員労働省が「先駆け審査指定制度」（URL: https://www.mhlw.

され、異常を是正する細胞活動が起こる。すなわち、死なせgo.jp/seisakunitsuite/bunya/kenkou_iryou/iyakuhin/topics/

るべき細胞と生かすべき細胞を峻別し、生かすべき細胞にはtp150514-01.html）を創設した 3。この制度の下では、世界必要な因子を送り込み、炎症を止めたり、血管を呼び込んだに先駆けて日本で開発された高い有効性が期待される製品にりなどが起こる。こうして再び、酸素・栄養が供給され、最ついては、審査の迅速化がはかられるとともに、優先的な審終的に組織の修復が整うと、新しい細胞が再生される。

査・評価を受けられることになっている。この申請を目指す

細胞どうしは、まるで社会を構成するように働き、このような過程を踏んだプロセスが遂行されるのである。その過程
では、幹細胞は指令を下すリーダーのような存在といえるのかもしれない。そして、損傷が大きい場合には、生体に備わことを強く推奨する。
5. これからの医療は変わる

この総説集では、神経、血管、心筋、骨、鼓膜、角膜の 6 つる幹細胞などの働きのみでは量が不足するため、体外で培養の組織の損傷による疾患に絞って説明しているが、今後、よして増殖させ、それを補うのである。何が起きていて、何がり複雑な病気に関しても、新しい治療方法について報告して足りていないのかを病気や障害ごとに見極め、治療法をデザいく考えである。その筆頭にあげられるのが、潰瘍性大腸炎やインしていくことが重要なのだ。

肝硬変などの自己免疫によって組織が攻撃を受け続けている

例えば、幹細胞を体内に戻すとき、静脈内投与するのか、疾患、および、アルツハイマー病のようなプリオノイド（プリ

患部に局所投与するのかといった選択肢がある。脊髄損傷やオン様タンパク質）によって神経系細胞が攻撃を受ける疾患

心筋梗塞の治療では、静脈内投与で行うことにより効果が上である。こられに対処するためには、既知の細胞メカニズム

がった。そのとき用いられた幹細胞は、ふだんから末梢微小に加えて、ここで紹介するまもなく登場しつつある幹細胞治

血循環のなかで修復・再生にかかわっているものだからだと療と組織工学医療技術から得られるさらなる治療原理を考慮考えられる。

していく必要があるが、実用化も間近である。さらに、前立治療をデザインする際には、多細胞生物の健常性維持にか

腺がん、大腸がんなど主要ながん、あるいは動脈硬化についかわる生物学的原理および細胞プロセスを理解しなければなても、征圧の目処が立つところまで来ている。潰瘍性大腸炎

らないが、そのためには、個体の統合性の保持、恒常性の維や肝硬変の新しい治療法については、既にホワイトペーパー

持、組織構築と足場の考慮が不可欠である。さらに、自己組および Nature Outline2 で紹介している。また、その後になる織化の能力、細胞の共生系としての作用、リズム、同期性、が、次世代の再生医療についても報告していきたいと考えて対称性について理解することも重要である。これらの諸原理いる。例えば、治療に必要な量の幹細胞を one step で調整すを総合的に念頭に置いた上で、動物モデルとヒトの疾患とのる方法、（幹細胞を用いることなく）幹細胞が作り出す新たな近似性、すなわち動物モデルがヒト疾患のどのような病型、生理活性物質を用いる方法、体内の幹細胞を動員ないしは活

病理、病態そして病期を反映しているのかを、十分に理解し性化させる薬物の開発などである。

ておくことが必要なのである。
51 The Principles of Regenerative Medicine

幹細胞療法と組織工学を基盤にした再生医療は、さまざま
advances.tri-kobe.org/en

疾 病 征 圧の理 論 

福島 雅典

な病気や障害に対して、比較的単純な処置により根本的な治療効果をもたらすことが期待できる。このような再生医療
は、これまでの治療法の常識をくつがえすものであり、薬物療法や創薬の概念に大きな変革を迫るものである。再生医療が世界の医療で中心的な位置をしめるようになることは間違いないだろう。再生医療の開発はこれから第 2 ラウンドに入るが、医療の未来がそこにあることは確かである。
文献

1. Kuroda, Y., Kitada, M., Wakao, S., Nishikawa, K., Tanimura, Y. et al. Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations. Proceedings of the National
Academy of Sciences USA 107, 8639–8643 (2010).
2. TRIが関連する研究者たちの研究を特集した Nature supplements, TRI Advances
https://advances.tri-kobe.org/en/collaborations, Nature Outlook articles: www.nature.com/
articles/540S49a も参照
3. 先駆け審査指定制度, 厚生労働省ウェブサイト https://www.mhlw.go.jp/seisakunitsuite/bunya/kenkou_iryou/iyakuhin/topics/tp150514-01.html

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The Principles of Regenerative Medicine 52

Osamu Honmou
本望 修

Stem Cell1Therapy
幹細胞療法
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1

間葉系幹細胞移植による脳梗塞および脊髄損傷の治療の可能性
本望 修

札幌医科大学医学部附属フロンティア医学研究所神経再生医療学部門

要旨

脳梗塞に対する現在の治療法は、急性期にのみ有効である。いったん梗塞が完成してしまうと、リハビリテー
ションが唯一の治療法となる。脊髄損傷に対する現在の治療法も、同様に満足の脳梗塞および脊髄損傷に対する現在の治療法は、満足のいくものとはいえない。これに対し、日本の医療イノベーション推進センター（TRI）の支援を受ける札幌医科大学の研究者たちは、脳梗塞や脊髄損傷の動物モデルに対して、骨髄間葉系幹細胞（MSC）をドナーとした移植実験を行ってきた。その結果、MSC の経静脈投与が顕著な治療効果を示すことが判明した。脳梗塞亜急性期の患者を対象とした臨床研究により、自己血清いくものではない。我々は1990 年代初めより、骨髄間葉系幹細胞（MSC）をドナーとした移植実験を、脳梗塞や脊髄損傷の動物モデルに対して行ってきた。我々が行ってきた数多くの基礎研により培養した自己 MSC の単回点滴静注という治療法の安全性と治療効果が示さ

究は、MSC の経静脈投与のへの適応拡大をめざした臨床治験は完了している。MSC は難治性神経疾患に対するる。これらの基礎研究の結れたのである。脳梗塞への適応拡大をめざした臨床試験は進行中であり、脊髄損傷
治療戦略に、パラダイムシフトを引き起こす可能性を秘めている。

著しい治療効果を示してい果を踏まえ、脳梗塞亜急性期の患者を対象とした臨床研究を 2007 年 1 月より開始し、自己血清を用いて培養・増殖させた自己 MSC の安全性と治療効果を評価し

1. 脳梗塞

1.1 はじめに脳梗塞は、今日においても根本的な治療法はみいだされておらず、残存する神経機能障
害の回復がきわめて困難な疾患の 1 つである。日本全国では年間 30 万人弱が新規に発症する国民病であり、その多くの場合、死亡するか重篤な後遺障害が残る。2025 年までに 520 万人の要介護者が生まれると推定されている。また、糖尿病、高血圧、高脂血症などによる脳梗塞予備軍は 1000 万人以上にのぼるが、高齢化の進む日本では、ますます増加していくと予測される。脳梗塞による社会的負担は甚大で、年間医療費は約 2 兆
円 / 年、社会的損失は約 8 兆円 / 年と推計されている。
これまでの脳梗塞に対する治療は、脳梗塞の発症後の therapeutic time window（治療可能な時間帯）がきわめて短いことを基本的なコンセプトとしていた。すなわち、脳梗

た。MSC は、手術ではなく単回点滴静注で投与した。
この治療法で得られる治療効
果は、脳梗塞によって生じた神経損傷を最小限に抑えると同時に神経再生を促進するという、MSC の多段階的に起こる作用メカニズムによってもたらされるものである。脊髄損傷への適応拡大をめざした MSC の臨床治験も完了している。MSC は
難治性神経疾患に対する治療戦略にパラダイムシフト

塞の治療において、完成してしまった梗塞病巣に対する有効な手段はない、という厳しを引き起こす可能性を持つい現実があったのである。その結果、梗塞が完成する前に虚血部位をとらえ、発症からものといえよう。

ごく限られた時間内に血栓溶解療法を中心とした集約的な治療を行うことができるかどうかが、治療の基準となっている。現在のおもな標準治療としては、抗血小板療法、

責任著者

抗凝固療法などの内科的治療や、脳血行再建術などの外科的治療が行われているが、そE-mail:

れらの治療効果は満足すべきものではない。また、最近では、超急性期治療として期待

本望 修

honmou@sapmed.ac.jp

されている組織プラスミノゲンアクチベーター静注療法も積極的に実施されるように
53 The Principles of Regenerative Medicineadvances.tri-kobe.org/en

Osamu Honmou
本望 修

神経栄養（興奮性の調節と神経保護）、抗炎症
血管新生、軸索の sprouting

これまでの前臨床試験（非臨床 POC）から考えられる MSCの作用メカニズムは、次のようなものである。

神経再生、再有髄化
機能正常•

移植細胞の病巣への集積（ホーミング効果）10,13,20,30•

移植細胞による神経栄養因子を介した神経栄養・保護作用、抗炎症作用 11,14,16,20

症状の程度

Modified from Ref. 34, copyright (2019), with permission from Elsevier

Stem Cell1Therapy
幹細胞療法
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•

脱髄軸索の再有髄化 5,7,28,31•

神経再生（神経系細胞への分化）、損傷軸索の再生や軸索の sprouting28,31•
MSC 投与治療効果はさまざまな過程や箇所において時間をかけて

機能不全
1

時間

血液脳関門（BBB）の安定化 17,28,32

2

多段階的に発揮されるため、1 回の投与で高い治療効果を期待

3（月）

できる。

図 1 間葉系幹細胞（MSC）投与後の時間と症状の程度との関係

これらの基礎研究の結果を踏まえ、2007 年 1 月より臨床研究を開始した 33,34（図 1）。自己血清を用いて培養・増殖させた自己骨髄 MSC を脳梗塞亜急性期の患者に投与し、安全性となってきたが、発症から 4.5 時間以内に投与しなければなら治療効果について検討したのである。MSC は、手術ではなくず、適応となる患者がきわめて限られた状況にある。

単回点滴静注で投与している。回復は画像診断および臨床症状

このように、脳梗塞の治療が困難な理由としては、脳神経組にもとづいて評価した 33,34。

織が障害されるまでの時間が短く、その間に有効な治療を開始

本治療法では、脳梗塞によって生じた神経損傷を最小限に抑することが難しいこと、虚血など障害を受けた脳神経組織を再え、神経系の回復（再生）を促進することで、治療効果が期待

生させる治療法が確立されていないこと、があげられる。脳梗できると考えている。従来の標準治療では損傷を受けてしまっ

塞後の後遺障害に対する治療としては、リハビリテーションがた脳の修復は困難であったが、それに比べ、本治療法は上記の主なもので根本治療は存在しない。

ような多面的なメカニズムによって虚血脳を積極的に修復す

それゆえ、新たな治療法の開発が望まれている。近年、

ることが期待される新しい治療法であり、本治験薬に報告され神経科学と幹細胞研究が大きく進歩し、脳神経疾患に対して再ている効能・効果は、脳梗塞に伴う神経症候、日常生活動作障

生医療が可能な時代になりつつある。基礎研究のさまざまな分

害、機能障害の改善である。

野では、世界的に多くの研究がなされてきている。ただし、ほ1.2 臨床研究

とんどがまだ臨床応用にまでは到達してない。
我々は 1990 年代初めより、脳梗塞モデルなどを含む動物の1.2.1 概要

中枢神経系疾患モデルに対して、各種幹細胞をドナーとした移自己血清を用いて自己 MSC を培養し、病変が脳のテント上に植実験を精力的に行ってきた。さらに 1990 年代中頃より、あった脳梗塞患者 12 例を対象に静脈内投与を行った 33。症例

実用化を念頭に、臨床応用に最も近いと予想された骨髄細胞

は、脳梗塞急性期の一般的な治療が終了した後の亜急性期にエをドナー細胞とした神経再生研究に着手してきている。特ントリした。脳梗塞の原因は NINDS- Ⅲ分類のいずれでもかまに、有用なドナー細胞として神経系に対する再生効果の強い

わないとしたが、小脳梗塞、脳幹梗塞のようなテント下の梗塞

骨髄間葉系幹細胞（MSC）に注目し、これを経静脈的に投与は除外した。また、軽症例や極端な重症例は除外した（modified

することで、脳梗塞

9 ～ 27、

Rankin scale〔mRS〕が 3 ～ 5、かつ Japan Coma Scale が 0 ～パーキンソン病など）のモデル動物に対して著明な治療

100 の患者を対象）。すべての症例は「評価委員会」で検討・効果が認められるという基礎研究結果を多数報告している。

承認を受けた後、血液内科専門医によって局所麻酔下で腸骨よ28,29

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1～4

5～8

を含む各種神経疾患（脊髄損傷28,29

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Osamu Honmou
本望 修

Stem Cell1Therapy
幹細胞療法
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A：� 時間前

B：� 時間後

C：� 週間後

D：� 週間後たが、それらの効果は限定的なものだった。これらの薬の作用メカニズムはきわめて明確なものだが、それゆえに作用点が限定されているのである。一方、脳梗塞後の病態はきわめて多様で複雑であり、虚血脳はまるで嵐の中に置かれたかのような状© 2019 Oxford University Press

況になっている。その中にあって、細胞治療がどうして著効したのだろうか？

その答えは、細胞治療の作用メカニズムの多様性にあると考える。上記のように、細胞治療は多様な作用メ
カニズムがさまざまな過程や箇所において時間をかけて多段階に発揮されることが、現在の薬物治療とまったく異なる点なのである。

図 2 間葉系幹細胞（MSC）投与前後の脳 MRI 画像

我々は脳梗塞の病態生理を再考する必要がある。従来から、脳梗塞後はきわめて短時間に脳組織の損傷が不可逆的に進行り骨髄液が最大 60 mL 採取され、専用の培養施設（CPC：Cell

するため、いったん損傷を受けてしまった脳は治療不可能と考Processing Center）で目標の細胞数である約 1 × 10 個にな

えられ、そのため therapeutic time window は超急性期のみにるまで 2 ～ 3 週間培養した。培養終了後、細胞をいったん凍

限られ、血流再建や神経保護が中心になると考えられてきた。

結し、安全性と品質性の検査の後、合格したもののみが投与さ

しかし、上記に示したように、脳梗塞から 6 週間以上経過しれた。投与方法は、末梢静脈内への点滴静注で、30 ～ 60 分

た脳梗塞領域が、細胞治療によりきわめて短時間で蘇るのであかけて行われた。症例の内訳は、男性 9 名・女性 3 名、年齢る。これは、不可逆的な損傷が起こってしまっていると思われは 41 ～ 73 歳（59.2 ± 8.2 歳）、運動麻痺 12 名・失語症 5 名ている脳の領域にも、まだ治療可能な組織が残存していることで、それぞれ脳梗塞発症後 36 ～ 133 日に細胞移植を行った。

を示している。これはペナンブラ領域の長期存続という意味で評価としては CBC のような一般検査のほか、画像診断学的検はない。機能不全には陥っていても、解剖学的に生き残ってい査（MRI）（図 2） 、および臨床症状の評価（NIH Stroke Scale

る神経細胞や軸索が長期にわたって存在しているということ〔NIHSS〕〔図 3〕 、mRS）を行っている。

である。

8

33

33

NIHSS および mRS での評価において、回復スピードが移植損傷された脳だけでなく、中枢神経系全体を扱わなければなによって統計学的に有意なレベルで加速されることが判明しらないということも重要である。再生医療と聞くと、損傷された。脳梗塞後のナチュラルコースとしての自然回復が緩慢にた脳組織の再生だけを考えがちであるが、それでは「木をみてなってくる亜急性期において、症状改善がさらに加速される

森を見ず」なのである。脳には我々が考えている以上のバック

結果となった。

アップ機構がある。おそらく進化の過程で、我々の生存に必須

また、一般的には、脳梗塞後の MRI（FLAIR）の経時的変化の神経系は、多くの試練に遭遇し、さまざまなバックアップ

は 1 カ月程度で収束し、高信号域のサイズ、密度、形が最終的機構を獲得したのである。脳梗塞後の後遺症改善においては、な梗塞巣ときわめて近いものとなる。しかし我々の臨床研究に

損傷脳の再生も重要であるが、健常側の脳の可塑性亢進もきわ

おいては、発作後 30 日以降の時点での移植にもかかわらず、めて重要といえよう。実際、細胞治療後には、このような可塑移植を契機に MRI（FLAIR）の高信号域が、統計学的に有意に性の亢進が顕著に観察される。脳梗塞の再生医療においては、減少することが判明した。

中枢神経系全体を治療するというパラダイムシフトが求められている。

1.2.2 これらの結果は何を意味しているのか？

自己治癒力の重要性についても認識する必要がある。現在、脳梗塞の新しい治療法の開発にあたっては、それが多数の作用

さまざまな幹細胞があるが、自己骨髄 MSC を静脈内に多量に点をもつ必要があることを、あらかじめ認識しておくべきであ投与することで、なぜこのような治療効果を出しうるのだろう

る。これまで過去何十年間にもわたって数々の新薬候補があっか？ その答えは、
MSC の通常時の役割にある。すなわち、健常

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1

2

3

4

5

6

7

8

9

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(NIHSS)
25

Modified from Ref. 34, copyright (2019), with permission from Elsevier

20

15

10

5

- 150

-50

0

50

150

250

350
（日）

図 3 間葉系幹細胞（MSC）投与の NIH Stroke Scale（NIHSS）に対する効果

時でも MSC は骨髄中から末梢循環に出ていると考えられ、全効果のメカニズムに、BBB の破壊がどの程度関与するかについ

身の臓器の機能維持や創傷治癒にかかわっている。言い換えれて、ラット中大脳動脈永久閉塞モデルを用いて検討した。このば、MSC は自己治癒力に大きく貢献していると考えられる幹細脳梗塞モデルでは、BBB の破綻は約 2 週間継続し、4 週間後に胞なのである。これが、MSC が他の幹細胞と大きく異なると思はかなり修復されていた 13。しかしながら、静脈内に投与した

われる点である。医学における治療（介入）は、薬物治療であMSC は、虚血損傷後 4 週間にわたって同程度に病巣へ集積しろうと外科手術であろうと、その後の自己治癒力を前提として続けていた 13。このことから、MSC が血管内から脳実質へ移いる。我々は、医学における「無知の知」を再認識し、自己治行する際、BBB の破綻は必要条件ではないことが示唆された。

癒力の最大活用をめざす必要がある。

また、BBB の破壊がきわめて少ないプリオン病モデルマウスを用いた実験でも、同様なホーミング効果が認められた 35。BBB

1.3 治療メカニズムが修復されつつある脳梗塞の亜急性期や慢性期においても 19、

1.3.1 血液脳関門とホーミング効果

また、テント上ばかりでなくテント下の領域に対しても 18、静中枢神経系組織が虚血によって損傷すると、血液脳関門（BBB）

脈内投与により十分量の MSC を病巣へ到達させることが可能が破壊されることはよく知られている。この BBB の機能不全と考えられた。

は、虚血の程度にもよるが、多くの場合約 1 カ月間継続する。

1.3.2 多段階に起こる作用のメカニズム

静脈内に投与した MSC が脳梗塞の病巣へ集積するホーミング脳 梗 塞 に 対 す る MSC を 用 い た 治 療 メ カ ニ ズ ム は い く つadvances.tri-kobe.org/en

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幹細胞療法
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か 推 測 さ れ、 我 々 は 基 礎 研 究 結 果 を 多 数 報 告 し て き た。

する既知の概念を根本的に考え直す必要があるかもしれない。

そ の メ カ ニ ズ ム は、 神 経 栄 養 因 子 に よ る 神 経 栄 養・ 保 護

すなわち、我々が脳梗塞亜急性期にはすでに治療不可能と思っ作用ていた領域は、実際には損傷は完成しておらず、まだ治療の可、 血 管 新 生 作 用（ 脳 血 流 の 回 復 ）11,14,16,20

再生作用

10,11,14,15,20,25,28,29,36,37、神経

22,26,27の 3 つに大別される。そして、能性が残っている脳組織といえることになる。

これらの治療効果が発揮される時期はそれぞれ異なっている

神経栄養因子は、抗浮腫作用やアポトーシス抑制作用 14 のと推測される。すなわち、神経栄養因子による神経栄養・保護

ほかにも、神経細胞や軸索の膜表面にあるイオンチャネルに直作用は、MSC が産生する液性因子が脳梗塞巣に直接的に作用接作用して、神経の興奮性に影響を及ぼすなど、さまざまな作するため、作用時期はきわめて早く時間単位である。血管新生用点をもつ 33。例えば BDNF は、カリウムチャネルの kinetics

作用は、脳梗塞発症のおよそ 3 日後から始まり、1 週間後にはを変化させて、静止膜電位・活動電位再分極・後過分極の特性

脳血流の回復が明らかに認められるようになる。神経再生作を変化させることにより、神経の興奮性を変化させるが、これ用は、1 週間後から顕著になり、少なくとも数カ月間は漸増す

らはミリ秒レベルのきわめて短時間に起こる変化である。すなる。これらは動物実験から示された治療メカニズムであるが、わち、BDNF が細胞に到達して何ミリ秒の間に、神経細胞の興

我々の臨床研究においても、同様のメカニズムによる多段奮性が変化する。BDNF はまた、シナプスにおける神経伝達効

階的作用がヒトで起こっていることを強く示唆する結果が示率にも直接影響を及ぼす。移植後早期にみられた治療効果は、されている。

このような神経栄養因子の作用により、生き残ってはいたもの

33,34の機能不全に陥っていた神経細胞や軸索の機能を、ふたたび蘇1.3.3 神経栄養因子の作用メカニズムらせたと推測される。

細胞移植後の 1 ～ 2 週間以内に、臨床症状および MRI 所見がまた、BDNF は脊髄の K-Cl 輸送体の活性を回復させ、GABA

統計学的に有意に変化することを我々の臨床研究で確認した。

の作用を増強させることにより spasticity を軽減させることがほとんどの症例で運動麻痺の改善や spasticity（痙性）の軽快

わかっている。実際、spasticity の軽減は、移植後数日以内にが移植後 1 ～ 3 日以内にみられ、MRI（FLAIR）の高信号域の認められた。このような観点からすれば、細胞治療の作用部位

縮小も 1 ～ 2 週間以内にみられた。移植後短期間にみられるは脳梗塞局所のみに限定するのではなく、脳・脊髄・神経全体

これらの変化は、おもに移植細胞が分泌する神経栄養因子の作の機能を総合的に改善させる、と考えたほうがよいのかもしれ

用によるものと推測される。静脈内に投与した移植細胞は脳梗ない。その点では、静注による全身投与が理にかなっている。

塞巣へ集積し、brain-derived neurotrophic factor（BDNF） 、
20

glial-derived neurotrophic factor（GDNF）11 といった神経栄養

1.3.4 血管新生と BBB 安定化

因子の局所レベルを数日以内に上昇させた 。

MSC による治療の効果の 1 つに、血管新生による脳血流の回

14

BDNF や GDNF が抗脳浮腫効果を呈することはよく知られて復がある 22,26,27。これには 2 通りの機序がある。1 つは、脳梗

いるが、これら 2 つが示す効果は、いずれも脳梗塞急性期に塞局所に集積した MSC が vascular endothelial growth factor

おけるものである。しかしながら、我々の臨床研究の患者は、 （VEGF）や angiopoietin のような血管新生因子を分泌して血管
亜急性期であり、通常の脳浮腫とは捉え方が若干異なる可能性

新生を誘導することであり、もう 1 つは、移植された MSC ががある。むしろ、この時期の MRI（FLAIR）の高信号域は、細血管内皮に分化して新たな血管を形成することである。新生血

胞内外の水分量が高い状態であると表現したほうがより正確

管の内皮細胞のうちの約 90％はホスト由来で、ドナー細胞由と思われる。しかし、現在の一般臨床では、この高信号域はす

来のものは約 10％である。動物を用いた我々の基礎研究の結でに死んでいるか、またはまもなく死ぬと予測されてきた領域

果によると、これらの血管新生による脳血流の回復は移植後約であり、少なくとも既存の薬物（浸透圧利尿薬やステロイド

1 週間程度で顕著になるが 27、臨床研究においても、移植後 1など）では縮小させることができなかった領域である。もし、週間で脳血流の改善が確認されている 33。

病巣局所の神経栄養因子濃度の上昇による抗浮腫作用のため

MSC の血管に対する作用としては、損傷した BBB を修復すに神経機能が回復したのだとすると、脳梗塞巣の病態生理に関ることも確認されている。虚血であれ外傷であれ、損傷原因

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を問わず BBB は障害される。損傷した BBB は 1 カ月程度で、遺伝子の発現解析を行うと、ヒトの自己血清で培養されたある程度は回復するが、近年の研究では、慢性期においても完MSC では、アポトーシスを阻害する angiopoietin-like 4 の発現

全には修復されず、損傷が周囲の脳神経組織に悪い影響を与えが上昇して、その結果細胞死が抑制されるが、それに対して、続けていることが判明した。静脈内に投与した MSC が、このFBS で培養された MSC では、growth arrest-specific protein 1

壊れ続けている BBB を修復し、治療効果を発揮することが確や anti-proliferative protein 1 の発現が増加し、増殖速度が低認されている下することがわかる 33。

。

17,28,32

加えて、FBS では間葉系への分化がより進む。例えば、FBS で1.3.5 神経再生

培養された細胞では、骨芽細胞への分化に関係する遺伝子

MSC による治療の効果には、神経再生が関与していると推測（cytokine-receptor-like factor 1、transmembrane glycoprotein

されている。これにも 2 通りの機序が考えられる。1 つはNMB）、脂肪細胞への分化に関係する遺伝子（leptin receptor、

脳梗塞局所に集積した MSC が内因性の神経発生を促進し

inhibitor of DNA binding 4、members of the complementて い る こ と で あ り、 も う 1 つ は 移 植 さ れ た MSC 自 身 がsystem）、軟骨細胞への分化に関係する遺伝子（extracellular

神経細胞ニューロン・グリア細胞へと分化していることで

matrix gene、cytokine receptor-like factor 1、leptin receptor、ある。また、髄鞘形成細胞への分化による

ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 2、

再有髄化、軸索の sprouting や再生の促進なども論文で報告さtransforming growth factor- β、SMAD6、OLF1/EBF-associatedれているzinc finger gene）の発現が高いことが確認されている 33。

10,11,14,15,20,25,28,29,36,37。このように、神経再生といっても、さまざま

5,7,28,31

なレベルでの再生が、多段階に起こっていると考えられるのである。

また、FBS を使用した場合の問題として、異種タンパク質の混入による急性および遅発性の免疫反応がある。異種血清で培養したヒト MSC（108 個）を移植した場合、約 7 ～ 30 mg の1.3.6 中枢神経系全体の再生

異種血清タンパク質がホストに入り込むことがわかっており、MSC は損傷局所の再生を誘導するほか、損傷周囲さらには対

この異種タンパク質による有害な副作用が報告されている 33。

側の正常脳の可塑性を亢進させることも判明している 15,25,37。
さらに、リハビリテーションとの組み合わせで、作用が増強さ

1.5 自家移植か他家移植か24れることも判明してきている 。このように脳や脊髄の神経の自己 MSC は、培養に 1 ～ 2 週間程度を要するため、急性の疾再生には、損所局所の再生だけではなく、中枢神経系全体の再患に対応するための工夫が必要である。例えば細胞バンクであ生が重要である。その点では、細胞は局所に移植するのではな

る。自己培養 MSC は 10 年以上にわたる長期の凍結保存が可

く、静脈内に投与して中枢神経系全体に行き届かせることが望能である。一過性脳虚血発作の既往や高リスク要因をもつ予

ましい。

備群に対しては、その MSC を、あらかじめ培養・増殖・冷凍
保存しておくことで、脳梗塞発症後、速やかに投与することが1.4 細胞培養：自己血清かウシ胎児血清か可能となる。

他の幹細胞と同様に、MSC は採取部位や培養方法によって変また、発症してから MSC の培養を行わなければならない場化する。例えば、同じ基礎培地を使用した場合でも、ウシ胎児合は、急性期に低体温療法などで脳神経組織のダメージを遅ら血清（FBS）を用いた場合と自己血清を用いた場合とでは、細せておいて、その間に培養するなど、従来の治療法との組み合

胞生物学的に多くの点で性質が異なる細胞となってしまう。自せも考えられる。

己血清であればプリオン病などの感染症の潜在リスク

は軽一方、他家 MSC なら培養時間の問題は解消できるものの、減されるといった利点があり、その他にも、自己血清で培養し免疫拒絶反応という別の重大な問題が生じてくる。免疫拒絶た場合は FBS で培養した場合と比べて、より未分化な状態にの開始点である T 細胞の活性化には、細胞表面上の MHC が T保たれ、遺伝子発現も安定しており、また、増殖速度も速いな

細胞の T 細胞受容体 /CD3 複合体に結合し、同時に接着分子

どの利点がある 。

を介した共刺激シグナルが必要である。MSC は、HLA クラス

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The Principles of Regenerative Medicine 58

33

33

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ⅠとⅡの両者および接着分子（CD40 や CD59）、intercellular

安全面、cell delivery、ターゲッティング、治療効果、汎用性、

adhesion molecule（ICAM）-1、ICAM-2、ICAM-3、vascular

必要設備などの点から、静脈内投与が最良の投与方法であると

adhesion molecule（VCAM）-1 などが陽性であるため、十分、考えられる。

抗原提示細胞となりうる細胞なのである。さらに、MSC は移植後にホストの体内で分化するが、その際、これらの抗原提示1.7 今後の検討事項

分子の発現がさらに高まるため、他家 MSC を移植する場合は我々の臨床研究の結果から、新たな検討事項も浮かびあがって免疫抑制薬の併用が必須であると考えられる。しかしながら、いる。MSC 移植を受けた脳梗塞患者の機能回復は、一般的な免疫抑制薬の短期的ならびに長期的な副作用を考えると、その脳梗塞の回復過程に、必ずしも一致するとは限らないことがわ

使用はきわめて限定的なものにならざるをえないと思われる。

かった。例えば、MSC 移植直後に、四肢末梢の随意性が一段

また、たとえ免疫抑制薬を使用したとしても、他家移植は自と改善した症例や、上肢の完全弛緩性麻痺が改善した症例がみ家移植より治療効果が劣ることが判明している。さらに、他家られた。MSC 移植の効果は、ドナー細胞とホスト細胞によるMSC を大量に入手する手段や、安全性や品質の担保、培養に反応の総和と理解され、多様な作用メカニズムがいろいろな

使用する血清の問題も解決しなければならない。このように、時間にいろいろな箇所で作用することが特徴である。よって、

他家 MSC を使用する場合は、自己 MSC 移植がどうしても使用

今回の臨床研究でみられたように、従来の回復過程とは異なる困難な疾患に限らざるをえず、当面は自己 MSC を用いた再生回復過程を示したと考えられる。このため、効果を評価する新医療が先行すると思われる。

たな指標の策定、リハビリテーションの介入方法、目標設定など、さまざまな面で再検討が必要である。

1.6 投与方法

これまでの脳卒中の評価方法は、自然回復でみられる機能回細胞治療の場合、生きた細胞の縣濁液を投与するという特殊性

復の過程を観察し、それで得られたデータをもとに策定されたを、十分に考慮する必要がある。第一に、個々の細胞が 100％

ものが多い。そのため、従来の過程とは異なる MSC 移植によ単一細胞レベルに分離しているとは限らず、数個程度は凝集る多彩な回復の評価には、十分には対応できないと考えられしていることを想定すべきである。第二には、すべての細胞る。したがって、その治療メカニズムを考慮した指標の策定がが生きているわけではなく、数％の死細胞の混入は避けられ必要である。MSC 移植における回復は、細かい運動単位でのない。したがって、塞栓源となる可能性を十分考慮する必要回復も期待できと考えられるので、その回復過程をより詳細にがある。また、動脈内投与と静脈内投与とでは、治療効果に評価できる方法を作成していく必要があるのである。その際、さほど差がないことも重要なポイントである。これらのことを

三次元動作解析装置などを用いて得られる客観的なデータを考慮すると、MSC を血管内へ投与する場合には、動注である

用いるのも 1 つの方法であると考えている。しかし将来的に必要性はなく、むしろ静注のほうが安全性と治療効果の両方をは、特別な機器を使用するのではなく、簡便に行える評価方法確保できると思われる。髄腔内投与の場合、比較的少ない細が必要となるであろう。

胞数でよいという利点がある一方、病巣局所への集積率が低

一方、リハビリテーションの介入方法においても、MSC 移

く、また、脳深部へ到達させることも困難である。また、髄液植の治療効果をより高めるためには、その戦略の再考が必要とフローにブロックがある場合などは髄腔内投与を行うことは考えられる。治療直後から神経細胞の再生が起こり、数カ月以できない。

上にわたってドナー細胞の神経細胞への分化やホスト細胞の手術によって直接脳に定位的に移植する場合、ヒトの脳は実活性化が続き、神経回路の再構築が起こる。神経回路の再構築

験小動物と比較してかなり大きいため、多数の部位への注入がをいかに有効かつ効率的に促進させるかが、MSC 移植におけ必要となるが、それにともなって、出血、感染症、さらなる損るリハビリテーションに期待される重要な役割と思われる。神

傷のリスクが高まる。何よりも、適切な移植部位を決定する合経回路の再構築にどのような方法が最適であるかを、既存の手理的な判断基準がない。

法や新たな手法なども取り入れて検討していく必要がある。目

以上を総合すると、必要とする細胞数は比較的多いが、59 The Principles of Regenerative Medicine

標とした神経回路を正確に賦活し、使用回数を増やすことが重advances.tri-kobe.org/en

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要となり、運動方法と運動回数・頻度が大切なポイントになっ1.

てくると考えられる。

急性期に行われる除圧および固定手術
脊髄損傷自体を手術によって修復することは不可能で

さらに、リハビリテーション全体における目標設定の変更もあり、手術の主目的は骨折や脱臼した脊椎の整復と固定で予想される。今までの目標設定は、障害された脳の再生は困難ある。後遺障害に対しては、手術による直接的な治療効果という広く行きわたっている考えのもとに、自宅や職場復帰をは期待できない。

めざすとするものであり、関節拘縮や廃用症候群を予防しなが2.

急性期に行われるメチルプレドニゾロン大量投与療法

ら、残存機能を最大限に活用し、足りない機能は補装具等で受傷後 8 時間以内にメチルプレドニゾロン 30 mg/kg を補い、日常生活動作の獲得を図っていくというものであった。

15 分かけて投与し、その 45 分後より 5.4 mg/kg/ 時で歩行などのより高い目標の達成には、残存機能がどの程度のも

23 時間持続点滴するものである。しかし、副作用などものかが大きく影響した。しかし、MSC 移植による再生医療は、多く、治療効果については再検討がなされている。

このリハビリテーション考え方を根幹から覆すものである。こ

3.

リハビリテーションの新たな治療の確立に伴い、リハビリテーションの戦略も抜本

理学療法および作業療法を中心として、患者の社会復帰の的に変化していくと予想される。MSC 移植では、四肢・体幹ための日常生活訓練等を行うが、治療効果についてはきわの機能障害のさらなる改善が期待でき、より高いレベルの目標

めて限定的である。脊髄損傷におけるリハビリテーション

設定や目標達成率の向上が期待できるのである。

の位置づけは、失われた機能の回復ではなく、残存機能を

2. 脊髄損傷

いかに有効活用して日常生活動作を可能にするか、ということに主眼がおかれている。

2.1 新しい治療法の必要性
脊髄損傷とは多くは外傷により、脊柱に強力な外力が加わ2.2 研究の概要

り脊髄が傷つくことから発生する病態である。原因として脳梗塞を対象として実施している医師主導治験の治験薬であ最も多いのは交通事故であるが、スポーツ事故や勤務中のる「自家骨髄 MSC（STR01）」は、これまで我々が長年にわ

事故、さらに階段からの転落などでも発症し、わが国ではすたり行ってきた基礎研究の結果から、脊髄損傷にも治療効果

でに累積 10 万人の患者が存在し、毎年 5000 人が新規に受傷が期待されることがわかった 28,29,38。そこで、同治験薬の適応すると推計されている。受傷後 1 年間の年間医療費は１人疾患を脊髄損傷に拡大することを試みた。2013 年 10 月に

あたり 1000 万円を超え、新規発生患者の医療費だけでも年間治験届を提出し、医師主導治験（第Ⅱ相：非盲検試験、探索500 億円にものぼると推定されている。トムソンロイター社に的試験）を開始した。予定される効能・効果は「脊髄損傷によると、脊髄損傷患者に対して全世界で年間 100 億円以上の伴う神経症候や機能障害の改善（薬効分類コード：その他の生

社会保障費が使われていると試算されている。また、脊髄損傷

物学的製剤 639）」である。またこの治験に関しては、公益社

患者および介護にあたる家族等の就労機会の逸失などによる団法人日本医師会治験促進センター臨床試験登録システムに経済的損失も大きい。

も登録済である（https://dbcentre3.jmacct.med.or.jp/jmactr/

脊髄損傷になると損傷脊髄下位の手足が動かなくなり、感覚も喪失する。損傷の位置が高いほど麻痺の範囲は広範になり、

App/JMACTRE02_04/JMACTRE02_04.aspx?kbn ＝ 3&seqno＝ 3923）。

障害は重度になる。胸腰部の損傷であれば下半身麻痺、頸部の脊髄損傷モデルラットで MSC を静脈内に移植すると、画像損傷であれば四肢麻痺となる。しかし、現代の医学では残念な

診断学的、組織学的および行動学的に改善が認められた 28,29,38。

がら損傷された脊髄の再生は不可能であり、新しい治療法の開治療メカニズムとしては、神経保護作用や神経再生作用、血管発が長年切望されてきた。わが国では若年者の受傷が多く、重再生作用、抗炎症作用等が関与していると考えられ 28,29,38、超篤な後遺症を残したまま、その後の人生を過ごすことも多い。

急性期 29,38 に治療した場合のみならず、慢性期 28 に治療を行っ

現在、標準的な治療法には以下の 3 つがあるが、治療成績はても効果が認められたことから、therapeutic time window は

いずれも満足のいくものではない。
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比較的広いとわかった。
The Principles of Regenerative Medicine 60

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脊髄損傷を対象とした再生医療の基礎研究の多くは、損傷局ることは可能ではなかった。しかし本治療法は、上記のような所に細胞を直接移植する方法を採用している。しかし、損傷

多角的なメカニズムにより、損傷脊髄を積極的に修復することを受けている脊髄にさらに針を刺し、細胞を注入することは、が期待されるまったく新しい治療法である。

その手技自体が脊髄を新たに損傷させるリスクが高い。直接移本医師主導治験では、脊髄損傷に伴う神経症候、日常生活動

植による治療メカニズムも限定的で、たとえ動物モデルで効果

作障害、機能障害の改善を評価するために、下記の 3 つの指標が認められても、ヒトへの適用はリスクが大きすぎると思われを用いた。

る。一方、本治験は、自己骨髄 MSC を静脈内に点滴投与する•

運動および知覚障害の改善度に関する主要評価指標としため、簡便かつ侵襲性は低く、投与した細胞が損傷局所に集積て、米国脊髄損傷協会（ASIA）が開発した ASIA Impairment

する特性により、投与した細胞が損傷領域全体に行き渡り、高Scale（ASIA 機能障害尺度）い効果を発揮すると期待される。

•

ASIA が 定 め た International Standards for Neurological

静脈内に投与した MSC は、脊髄損傷ラットの大脳皮質の運and Functional Classification of Spinal Cord Injury（脊髄動野の再生を誘導することが判明している 。高い治療効果を

損傷の神経学的ならびに機能的な分類のための国際基準、得るためには、脊髄損傷局所の再生だけではなく、中枢神経系

ISCSCI-92）

38

全体の再生を誘導することが必要であり、投与ルートは細胞が•脊髄損傷に特化した日常生活動作の評価法として開発さ中枢神経系全体に行き渡る方法、すなわち静脈内投与がよいとれた Spinal Cord Independence Measure（脊髄障害自立度

考えられる。

評価法、SCIM- Ⅲ）

現在のところ、脊髄損傷の損傷を軽減するための治療法（急性期の手術療法や薬物療法、その後のリハビリテーション療治験の対象は頸髄損傷患者（ASIA 分類で A 群、B 群、C 群の法）は存在するが、損傷を受けた脊髄そのものを修復する治療重症例）で、脊髄損傷発症後 2 〜 3 週間以内に一次登録を行い、法はなく、MSC を利用した本手法は画期的な治療法となりう

ただちに骨髄液の採取と MSC の培養を開始した。40 日目に細ると考えられる。

胞を静脈内より投与し、220 日目（治験薬投与の約半年後）に有効性および安全性を評価した。本治験はすでに完了し、厚生

2.2.1 脊髄損傷に対する STR01 の医師主導治験

労働省による条件・期限付き承認を正式に受けている（2018

本医師主導治験では、脊髄損傷のまったく新しい治療法の確立

年 12 月 28 日）。

をめざす。すなわち、
本治験薬の効能・効果は「脊髄損傷に伴う神経症候、日常生活動作障害、機能障害の改善」とする。
これまでの基礎研究ならびに前臨床 POC から示唆された

3. 今後の展望

MSC の静注療法は、脳梗塞のような限局した脳虚血ばかりで本治験薬の作用メカニズムは、1）移植細胞の病巣への集積

なく、蘇生後脳症のような全脳虚血に対しても効果があること（ホーミング効果）、2）移植細胞による神経栄養因子を介したが判明している 39。このように、自己 MSC の静脈内投与は、神経栄養・保護作用、抗炎症作用、3）脱髄軸索の再有髄化、虚血の種類を問わず有効であることが示唆されており、その応

4）神経再生（神経系細胞への分化）、損傷軸索の再生、軸索の用範囲はかなり広いと考えられる。端的にいうならば、脳・脊sprouting、5）血液脊髄関門の安定化、と考えられる。治療効

髄・神経の虚血時における強力な脳保護薬との位置づけが可能

果は時間的にも空間的にも多段階に発揮されるため、1 回の投であり、その用途は多岐にわたるであろう。

与で高い治療効果を発揮することが期待される。

また、MSC の治療メカニズムは、1）神経栄養因子による神本治験法は、脊髄損傷によって生じた神経損傷を最小限に

経栄養・保護作用、2）血管新生作用（血流の回復）、3）脳血液抑え、遅発性の二次的な神経損傷の進行を抑制すると同時に、関門の安定化、4）神経再生、と多岐にわたっているが、特に、神経細胞と軸索の回復ならびに再生を促進することで、既存の5）可塑性を亢進させる作用は、慢性期の治療効果に大きく貢治療法と比べて高い治療効果を期待できるものと考えている。

献すると思われ、さらに、成熟脳 24,25 のみならず、発達脳 37

従来までの標準治療では、損傷を受けてしまった脊髄を修復すにおいて顕著に認められる。生後すぐのラット脳梗塞モデルに

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おいては、MSC を静脈内投与すると正常側脳の可塑性が亢進し、脳体積および神経細胞数がともに増加し、行動学的な改善が観察される 37。

3.
4.

一方、異常神経回路に対しては、MSC は抑制効果を示すこと5.

が観察されている 40。てんかんモデルラットに MSC を静脈内6.

投与すると、てんかん発作を抑制すると同時に、異常神経回路を抑制し、抑制系ニューロンである GABA ニューロンを増やす効果がある 40。このように、MSC は中枢神経系に対して、神経

7.
8.

細胞の働きが足りないときには補完的に作用し、過剰なときには抑制的に作用する。
以上より、MSC は、
自己治癒力に大きく貢献している幹細胞と9.
10.

いってよいと考えられる。すでに、動物実験レベルでは、下記のようなさまざまな神経疾患に対する効果が確認されている。

11.

•

慢性期脳梗塞 13,19•

脳出血 1712.

•

慢性期脊髄損傷 28

13.

•

蘇生後脳症 39•

パーキンソン病 41•

プリオン病 35•

発達脳における低酸素性虚血性脳症 37•

てんかん 40•

脳腫瘍 42•

末梢神経障害 43,44

14.
15.

16.

17.

骨髄移植などを代表とする体性幹細胞を用いた再生医療は、安全性が高い、自己移植が可能、すでにその技術の一部は実用

18.

化されている、などの利点があるため、早急な実用化が期待されている。特に、MSC は非常に少量の骨髄液から、培養・増殖

19.

させることが可能であり、臨床応用においては誠に使い勝手のよい細胞として認知されつつある。
MSC は、脳卒中や脊髄損傷をはじめとする難治性神経疾患に対する治療戦略にパラダイムシフトを引き起こすと考えられる。同時に、「自家骨髄 MSC（STR01）」が、多くの難治性神経疾患へ適応拡大されることが期待される。
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The Principles of Regenerative Medicine 62

Stem Cell1Therapy
幹細胞療法

1

26.
27.
28.
29.
30.

31.

32.

33.
34.
35.
36.
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Osamu Honmou
本望 修

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63 The Principles of Regenerative Medicineadvances.tri-kobe.org/en

Osamu湊口
Honmou信也 他

Stem Cell2Therapy
幹細胞療法

1

Muse 細胞による急性心筋梗塞後の組織
修復再生
湊口 信也 1,2、山田 好久 3、湊口 信吾 3、田中 俊樹 3、三上 敦 1、
若尾 昌平 4、串田 良祐 4、出澤 真理 4

1. 岐阜大学大学院医学系研究科循環呼吸先端医学講座
2. 岐阜市民病院心不全センター

3. 岐阜大学大学院医学系研究科循環病態学分野
4. 東北大学大学院医学系研究科細胞組織学分野

要旨

Multilineage-differentiatingstress enduring（Muse）細胞は、ヒトの体内に元から存在する非腫瘍性多能性幹細胞である。79 例の急性心筋梗塞（AMI）患者を対象とした臨床研究により、Muse
細胞数が AMI の急性期に増加することが示された。また、AMI の 急 性 期 に Muse細胞が数多く動員された症例では、6 か月後の心機能が改善し、左室リモデリン

Multilineage-differentiating stress enduring（Muse）細胞は急性心筋梗塞の治療に有望である。公益財団法人神戸医療産業都市推進機構 医療イノベーション推進センター（TRI）に関連した研究者らが行った動物実験は、Muse 細胞が急性心筋梗塞後の心機能を改善し、左室リモデリングを抑制することを示している。

グが抑制されており、末梢血中の Muse 細胞数の増加
が、心機能改善と左室リモ
デリング抑制に関与していることが示唆された。ウサギ AMI モ デ ル に 骨 髄 由 来Muse 細胞を梗塞発症後に静脈注射したところ、Muse細胞は梗塞部位にホーミン
グし、心筋細胞・血管に分化した。Muse 細胞はパラク

1. 急性心筋梗塞：現状の治療法と課題

急性心筋梗塞（AMI）は、冠動脈の突然の閉塞により発症する。閉塞により血流の途絶が起こると、血流により酸素化あるいは栄養されていた心筋組織が壊死に陥る。その結果、心機能低下、左室リモデリングが起こり、心不全が発症するため、AMI の死亡率は高い 。
1

冠動脈が完全閉塞すると、その支配領域の心室壁は血流が途絶されるため壊死に陥っていくが、壊死は心内膜側からはじまり、時間経過とともに心外膜側まで拡大していく。
この現象は wavefront 現象と呼ばれる 。したがって、心筋虚血後、早期に再灌流を得
2ることができれば心筋組織の壊死は心内膜側にとどまり、梗塞領域を小さくおさえることができ、心機能には大きな影響を及ぼさない。しかし、早期に再灌流を得ることができなければ、梗塞は心内膜側から心外膜側に及び、貫壁性梗塞が成立する。この場合、閉塞冠動脈が近位部の太い血管であれば、大型心筋梗塞となり、深刻な心機能低下をもたらす。また、亜急性期から慢性期にかけて梗塞に陥った左室壁は薄くなり、左室内腔

ライン効果も有し、これらが梗塞サイズの縮小、心機
能改善、心室リモデリング抑制に関与していることが示された。これらの結果に
よ り、Muse 細 胞 の 安 全 性と有効性が確認され、現在、Muse 細胞による AMI 治療の治験が行われている。

責任著者
湊口 信也
E-mail:minatos@gifu-u.ac.jpが拡大して左室リモデリングが起こり、その結果、心不全が発症する。AMI で大きな問題となっているのは、たとえ急性期（発症後約 1 週間）に救命できたとしても、慢性期に心不全に陥り、生命予後が悪くなることである。
AMI の第一選択の治療法であり、かつ現在最も有効な方法は、AMI 発症後、できるだ
け早期に閉塞冠動脈の再灌流を行い、いまだ死に至っていない心筋細胞を救済し、心筋advances.tri-kobe.org/en

The Principles of Regenerative Medicine 64

Osamu湊口
Honmou信也 他

Stem Cell2Therapy
幹細胞療法

1

A

B

Changes in Number of Muse Cells(Cells/100μL)(Cells/100μL)

400
350
300
250
200
150
100
50
0

400
350
300
250
200
150
100
50
0

N.S.

*

*

*

Number of Muse Cells**(Cells/100μL)

500

**
*

400
300
200
100
0

CTRL

(n=64)C Relationship between ∆Muse and ∆EF
From Ref. 16 © 2019 Japanese Circulation Society**

ΔMuse cells(Cells/100µl)
400

P=0.010D

ΔMuse cells(Cells/100µl)
400
300

200

200

100

100
ΔEF<0
(n=17)

0≤ΔEF(n=38)(%)

AMI(MAX)(n=79)

Relationship between ∆Muse and ∆LVDd

300

0

CAD

(n=44)

0

P=0.005

ΔLVDd≤0 0<ΔLVDd(n=22)(n=33)(mm)

図 1 A：AMI 患者の末梢血中の Muse 細胞数の変化。B：AMI 患者（AMI）、冠動脈疾患患者（CAD）、冠動脈正常者（対照）の末梢血中の Muse 細胞数。C：急性期の Muse 細胞数の増加（∆ Muse）と、駆出率の変化（∆ EF）で評価した慢性期の心機能改善との関係。D：急性期の∆ Muse と慢性期の∆ LVDd との関係。
LVDd、左室拡張末期径*：P ＜ 0.05、**：P ＜ 0.01
文献 16 より改変（© 2019 Japanese Circulation Society）。

のダメージを最小限にとどめることである。具体的には、AMI

スは複雑であり、残存心筋細胞の肥大化、間質細胞などの非心が発症した後、可及的速やかに診断し、カテーテル室に搬送し筋細胞の構造的な再構築など、亜急性期から慢性期への治癒過て、経皮的冠動脈インターベンション（PCI）によって閉塞し程が深くかかわってくる 5,6。すなわち、心筋梗塞部の治癒過程

た責任冠動脈を再開通させ、心筋組織に血流を回復させることがどのような影響を受けるかによって、梗塞後の心機能回復のである。臨床的には AMI 発症後 60 分以内に再灌流ができれ程度が違ってくるのである。治癒過程において、死んでしまっば予後は良好であるが、120 分を超えると予後は有意に悪くた心筋細胞の代わりに、多能性幹細胞を効率よく梗塞部分に生なることが報告されている 。一般的には、PCI による再灌流

着させ、心筋細胞に分化させることができれば、心機能低下おは、発症後 90 分以内に行うのが gold standard といわれていよび左室リモデリングを防ぐことができ、慢性期の心不全を防る。しかし実際には、その時間内に処置を開始したとしても、止でき、患者の予後は明らかに改善する。この問題を解決する

再灌流できるとは限らない 。しかも多くの場合は、その時間

1 つの方法として、現在までに自己骨髄由来幹細胞を用いた研内に処置が開始できず、再灌流に失敗するケースもある。した究が行われてきた。自己骨髄由来幹細胞にはさまざまな再生効

がって、予後のことを考えた場合、PCI による再灌流療法だけ

果が報告されており 7,8、自己の細胞を用いるため倫理的なハーでは、AMI の治療は不十分である。

ドルも低く、臨床応用が容易である。そのため、現在までに、

34

亜急性期から慢性期にかけての左室リモデリングのプロセ
65 The Principles of Regenerative Medicine

骨髄単核細胞、骨髄由来間葉系幹細胞（MSC）などを用いて、advances.tri-kobe.org/en

Osamu湊口
Honmou信也 他

Stem Cell2Therapy
幹細胞療法

1

A

Auto (2W)
Muse

B

Auto (2M)
Muse

MSC

Non-Muse

fibrosis/LV (%)

VehicleVehicleMSC

Non-Muse

C

Infarct size

Infarct size

Non-Muse

VehicleMSC

Muse

non-Muse

MSC

図 2 A：自家 Muse 細胞、non-Muse 細胞、MSC の梗塞サイズへの効果（梗塞 2 週後）。B：自家 Muse 細胞、non-Muse 細胞、MSC の梗塞サイズへの効果（梗塞2 か月後）。
*：P ＜ 0.05、**：P ＜ 0.01、***：P ＜ 0.001；AMI、急性心筋梗塞；MSC、間葉系幹細胞
文献 19 より改変（© 2019 American Heart Association, Inc.）。

急性心筋梗発症後の組織修復再生療法に対する臨床研究が世組織 12,13、種々の臓器の結合組織 14、末梢血 15,16 に存在してい界中で数多く行われてきたのである 7,8。しかし、これらを用る。つまり、Muse 細胞は多能性幹細胞であり、応用に際していたプラセボ対照研究の結果は、効果がほとんどないか、ある遺伝子導入を必要としないという点で安全性が担保できるた

いは、効果があってもわずかな改善でしかないものだった。

め、臨床応用へのハードルは低いと考えられる。約 30 mL の

心筋梗塞後の再生医療に用いる細胞ソースとしては、骨髄単核

新鮮なヒト骨髄液から、3 日間の培養で約 100 万個の Muse 細細胞、骨髄由来 MSC には限界があるといわざるをえない。心胞が得られることも 14,17、臨床応用に有利である。

7,8

筋細胞への分化効率が高く、強力な修復再生能力を有する新たな細胞ソースを開発することが必要とされているのである。
2010 年、出澤らによって multilineage-differentiating stressenduring（Muse）細胞が発見された 。Muse 細胞は、多能92. AMI患者の急性期における血中Muse細胞数が心機能と左室リモデリングに与える影響

末梢血中に Muse 細胞が存在していることは、以前から脳卒中性幹細胞表面マーカーの stage-specific embryonic antigen-3患者で報告されていたが 15、AMI 患者の急性期に末梢血中の（SSEA-3）が陽性である細胞として分別できる 9 ～ 12。Muse 細Muse 細胞がどのような動態を示すかについては明らかでな胞は多能性マーカーである Sox2、Oct3/4、Nanog を発現し、かった。そこで我々は、岐阜大学病院に入院した 79 例の AMI

1 つの細胞から 3 胚葉系（外胚葉、中胚葉、内胚葉）すべての患者について（AMI 群）、急性期に血中 Muse 細胞数がどのよ細胞に分化できる能力を有する 。しかも、この細胞はヒトがうな変化を示すかについて調査し、さらにこの Muse 細胞数の

本来、体の中に有している細胞であり、骨髄 、皮膚 、脂肪変化が、AMI 発症後 6 か月の時点の心機能、左室リモデリング99advances.tri-kobe.org/en

10

The Principles of Regenerative Medicine 66

From Ref. 19 © 2019 American Heart Association, Inc.

Muse

30

20

10

0

% of infarction to LV% of infarction to LV

Vehicle40

DA

Osamu湊口
Honmou信也 他

Stem Cell2Therapy
幹細胞療法

1

B
x104
4.0

x104
5.0

non-Muse

2.5

Heart

4.5

C

Distance from occlusion
3 mm
6 mm
9 mm

Engrafted cell number

x104
4.0

***

2.5

Muse

Lung

Muse
Non-Muse

Total Flux [p/s]DMuse +
JTE-013

***
***

100
90
80

*

**

***

**

70
60

ng/g

From Ref. 19 © 2019 American Heart Association, Inc.

2W

Muse

Distance from occlusion
3 mm
6 mm
9 mm

Muse cells+JTE-013

2W

Muse

A

50
40
30
20
10
0

sham

MI (6h)MI (24h)

Infarct area

MI (6h)MI (24h)border area

図 3 A：Nano-lantern で標識した Muse 細胞は心筋梗塞部位に集積したが、non-Muse 細胞は集積しなかった（梗塞 2 週後）。B：心筋梗塞部位に集積していたNano-lantern で標識した Muse 細胞は、S1PR2 の選択的阻害薬である JTE-013 の共投与により集積しなくなった。C：免疫組織学的に評価した梗塞領域に生着したMuse 細胞数（梗塞 3 日後；JTE-013 の共投与のなし、あり）。D：梗塞心筋組織の梗塞領域と境界領域、正常心筋組織における S1P 濃度。
*：P ＜ 0.05、**：P ＜ 0.01、***：P ＜ 0.001；S1P、sphingosine-1-phosphate；S1PR2、sphingosine-1-phosphate receptor 2
文献 19 より改変（© 2019 American Heart Association, Inc.）。

にどのような影響を及ぼすかについて検討した。冠動脈造影でることが明らかになった。AMI による入院 21 日目までに示し75％以上の冠動脈狭窄を有する患者を冠動脈疾患（CAD）群

た最大の Muse 細胞数を MAX Muse、MAX Muse から最小の（n ＝ 44）、75％以上の狭窄を有さない患者を対照群（n ＝ 64）

Muse 細胞数を差し引いたものを∆ Muse と定義した。AMI 発として比較検討した。末梢血中の Muse 細胞数（cells/100µL）

症後、経時的に測定したクレアチンキナーゼ（CK）の最大値

を、蛍光活性化セルソーティング（FACS）を用いて、SSEA-3

peak CK（PCK）、そして CK の値を合計したΣCK は、いずれかつ CD105 細胞として測定し、AMI による入院当日（0 日）、も心筋梗塞サイズの指標であると考えられている 18。PCK ある

1 日後、7 日後、14 日後、21 日後に行った 16。

いはΣCK が高値を示す患者は、∆ Muse の高値を示すことか++

その結果、以下のような結果を得た 。入院当日は、AMIら、梗塞サイズが大きい、すなわち、心筋へのダメージが大き群と対照群の間で、Muse 細胞数に有意な差を認めなかった。

ければ大きいほど、Muse 細胞はより多く動員されることを示

AMI 発症 24 時間後に、入院当日に比べて、Muse 細胞数が有している 16。次に、血漿 sphingosine-1-phosphate（S1P）濃度

意に増加してピーク値を示し、その後、7 日後も有意な増加をを液体クロマトグラフィー – タンデム質量分析装置（LC–MS/

持続した。14 日後には、Muse 細胞数は有意に低下し、21 日

MS）で測定したところ、AMI 群の血漿 S1P 濃度は、対照群に後には、入院時の値に戻った（図 1A）。CAD 群の血中 Muse 細比べて有意に増加していた 16。一方、CAD 群の血漿 S1P 濃度

胞数は、対照群と同等の値であり、有意差は認められなかったは対照群と同等であり、有意差は認められなかった。さらに、（図 1B）。

血漿 S1P 濃度と MAX Muse は、有意な正の相関（r ＝ 0.330）

16

これらのことから、冠動脈の有意な狭窄を有する CAD 患者を示すことがわかった 16。これらのことから、血中への Museでは、末梢血中の Muse 細胞数は増加しないが、心筋組織が壊細胞の動員には、S1P が関与している可能性が示唆された 16。

死に陥る AMI が起こると、血中への Muse 細胞の動員が起こ

次に、AMI 急性期に動員される Muse 細胞数が、慢性期

67 The Principles of Regenerative Medicineadvances.tri-kobe.org/en

Muse Cells Repair the Acute Myocardial Infarction

Osamu
Honmou信也 他
1073湊口From Ref. 19 © 2019 American Heart Association, Inc.

Stem Cell2Therapy
幹細胞療法
1Yamada et al

図 4 A ～ D：梗塞心筋領域に生着した GFP で標識した自家 Muse 細胞は、心筋マーカーである ANP、troponin Ⅰ、α -actinin を発現した（梗塞 2 週後）。さらに、
GFP で標識した Muse 細胞は、host 心筋細胞との間に connexin-43 を発現した（梗塞 2 週後）。E ～ H：梗塞心筋領域に生着した GFP で標識した自家 Muse 細胞は、
心筋マーカーである ANP、troponin Ⅰ、α -actinin を発現した（梗塞 2 か月後）。
ANP、心房性ナトリウム利尿ペプチド；GFP、緑色蛍光タンパク質
文献 19 より改変（© 2019 American Heart Association, Inc.）。

（6 か月後）の心機能および左室リモデリングに与える影響にMuse 細胞は cardiac troponin Ⅰ（心筋トロポニン I）およびついて検討した。駆出率（EF）で評価した心機能が急性期と比sarcomeric α-actinin（サルコメアαアクチニン）を発現する

較して慢性期（6 か月後）に改善した患者では、改善しなかっ

心筋細胞様の細胞に分化することを確認した 19。Muse 細胞をた患者と比べて∆ Muse（最大−最小の Muse 細胞数）が有意

用いたヒト心筋梗塞に対する組織修復再生療法を開発するたな高値を示した（図 1C）。さらに、慢性期に左室拡張末期径

めには、まずは in vivo ウサギ AMI モデルでの有効性と安全性（LVDd）が減少した（左室リモデリング抑制）患者では、LVDdを証明する必要がある。そこで我々は、日本白色種ウサギの冠が増加した（左室リモデリング促進）患者に比べて、∆ Muse動脈を 30 分間閉塞し、その後再灌流する AMI モデル（虚血・が有意な高値を示した（図 1D）。これらの結果から、AMI の再灌流モデル）を用いて解析することにした 19。

急性期に末梢血に動員される Muse 細胞数が多い症例は、慢性

前述したように、現在、AMI の第一選択の治療法は、心臓期の心機能が改善し、左室リモデリングが抑制されることが明

カテーテルを用いた PCI によって、閉塞冠動脈を再開通させるらかとなった 。この結果から、AMI の急性期に Muse 細胞をことである。従来、臨床研究でも使用されてきた自家 MSC を

外因性に投与すれば、慢性期の心機能改善と左室リモデリング中心にした幹細胞療法と比較して、自家 Muse 細胞による治療抑制が期待できることが示唆された。

が、心機能改善や左室リモデリング抑制に対してより大きい効16

3. Muse細胞を用いた梗塞心筋組織修復再生療法

果を示すことがわかれば、治療法として開発する意味がある。
そのため、我々は 3 × 105 個の自家 Muse 細胞（Muse 群）

Figure 2. Immunohistologic
and fluorescence in situ hybridization (FISH) analyses.
A同じく
through3D,(2W) andMSC(E （MSCthrough 群）G) at
3.1 梗塞サイズ、心機能、左室リモデリングへの効果と、
×at1025wk
個の自家の効果を比較した。
2 mo (2M) in the green fluorescent protein–positive (GFP+) multilineage-differentiating stress enduring (Muse) group. Immunohistochemistry
IHC) for ANPin(atrial
natriuretic
peptide;A
andE),
cardiactroponin-I
(B
and
F),
sarcomeric
α-actinin
(C,
G,
and
H),
and
Cx43
(connexin-43;
vitro の実験で、ウサギ骨髄由来 Muse 細胞とヒト骨髄由
また、MSC の中には数％の Muse 細胞が含まれるので、Muse
D). Striation-like arrangement of troponin-I at 2W (box) is enlarged in the inset and that of α-actinin at 2 M in the box (G) is enlarged in H.
Bars: A=100 来µm;MuseB through
µm.
and
and
sections
GFP+ human Musecell infusion at 2W.
Left, Low
細 胞H=50を培養しI て心J,筋IHC細胞
へFISHの 分in化neighboringを試みた結果、 of細胞を除去した
MSC（non-Muse群）の効果についても比較を
magnification of the observed field. (V represents vessels; dashed line in I represents infarct area; and square represents that this area isenlarged in the right 3 figures). In neighboring sections, cell location in IHC and FISH was not exactly the same. Cell numbers (Continued )advances.tri-kobe.org/en

The Principles of Regenerative Medicine 68

Osamu湊口
Honmou信也 他

Stem Cell2Therapy
幹細胞療法

1
2W (Autograft )vehicle

***

MSC

4500

Muse

Non-Muse

Number of CD31(+)
microvessels/mm2

4000

***

B

***
**

M

**

3000

GFP

αSMA

Fig. 5

2000
1500

D

1000

vehicleMuse

non-Muse

MSC

VEGF

HGF

HGF
VEGF
MMP-2
MMP-9
αTubulin

TUNEL/myoblobin

Muse
MMP-9

E

TUNEL
positivity

50μm

20 μm

50μm

20 μm

14
14
12
10
9
8
6
44
2
0
-1

*

vehicle Muse20

vehicleμm
Sirius
Red positive
area ratioMuse

α-Tubulin%

From Ref. 19 © 2019 American Heart Association, Inc.

CD31

2500

0

MMP-2

ＧＦＰ
②

①
Merged

3500

500

C

MergedVehicleA

100 μm

100 μm

30
25
20
15
10
5
0

*

図 5 A：梗塞 2 週後の梗塞境界領域における CD31 陽性血管数（対照群、Muse 群、non-Muse 群、MSC 群の比較）。B：GFP で標識した Muse 細胞は、血管内皮のマーカーである CD31、血管平滑筋のマーカーであるα-smooth muscle actin を発現した（梗塞 2 週後）。C：梗塞 3 日目の梗塞境界領域におけるウェスタンブロットによる HGF、VEGF、MMP-2、MMP-9 の発現（sham 群、vehicle 群、MSC 群、Muse 群、non-Muse 群の比較）。D：梗塞境界領域における TUNEL 陽性心筋細胞の比較（対照群、Muse 群）。E：梗塞領域における Sirius Red 陽性領域面積の比較（対照群、Muse 群）。
*：P ＜ 0.05、**：P ＜ 0.01、***：P ＜ 0.001；αSMA、α-smooth muscle actin；GFP、 緑 色 蛍 光 タ ン パ ク 質；HGF、hepatocyte growth factor；MMP、matrix
metalloproteinase；MSC、間葉系幹細胞；TUNEL：terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labelling、VEGF：vascular endothelial growth factor
文献 19 より改変（© 2019 American Heart Association, Inc.）。

行った。心筋梗塞サイズを測定し、左室機能の指標としては、Muse 細胞を用いた AMI の治療が、従来の治療法に比べてよ

左室駆出率（EF％）
、左室短縮率（FS％）
、左室圧増加速度（＋

り有効である可能性が期待できる。しかし、自家 Muse 細胞を

dP/dt）、左室圧減少速度（－ dP/dt）を用い、左室リモデリン

使用する場合、急性期の AMI 患者から骨髄液を採取するのはグの指標としては、
左室収縮末期径（LVDs）と左室拡張末期径

侵襲的である。また、骨髄液から Muse 細胞を分離して培養す（LVDd）を用いた。Muse 群、MSC 群、non-Muse 群、対照群

る場合、組織の修復再生に十分な量の Muse 細胞を得るためにについて、AMI 発症の 2 週後と 2 か月後に比較を行った。対は、少なくとも 1 週間を要する。そのため実際の臨床現場で照群については、溶媒のみ投与した。その結果、梗塞サイズには、自家 Muse 細胞ではなく、他家 Muse 細胞を使用するのがついては、2 週後、2 か月後ともに、対照群に比較して MSC 群

現実的であると思われる。そこで、ウサギ骨髄細胞由来の他家で中等度な縮小が認められたのに対し、Muse 群での縮小はきMuse 細胞 3 × 105 個をウサギ心筋梗塞発症 24 時間後に静脈

わめて大きく、MSC 群の約 2 倍の縮小効果が認められた（図注射したところ、2 週後の梗塞サイズ縮小効果は自家 Muse 細

2A、2B）。さらに、左室リモデリング抑制効果、心機能改善効

胞と比べてほとんど遜色がなかった 19。また、他家 Muse 細胞

果についても、2 週後、2 か月後ともに、Muse 群では MSC 群の梗塞サイズ縮小効果、左室機能改善効果、左室リモデリングに比較して有意に大きかった。従来の幹細胞（MSC）を用いた

抑制効果は、梗塞 6 か月後にも持続していた 19。

場合に比較して、Muse 細胞を用いた場合に大きな改善が得られることから、Muse 細胞を用いて AMI 後の組織修復再生療法

3.2 Muse細胞の梗塞部位への生着メカニズムを開発することは、臨床において非常に重要と考えられる。

Muse 細胞の特筆すべき性質は、
AMI 後に静脈注射された Muse

69 The Principles of Regenerative Medicineadvances.tri-kobe.org/en

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Honmou信也 他

Stem Cell2Therapy
幹細胞療法

1

fibrosis/LV (%)
%

60

%

50

1530

tagonist

B

70

40
30

1020

20

510

10

00

VehicleVehicle allograft
allograftallograft
allograft
Muse
++ ++
Muse
S1PR2
S1PR2
JTE-013
JTE-013antagonist
antagonist

0

***
**

*

35
30

25
20
15
10
5
0

Vehicleallograft

25
20

60

***

*

***

**

50
40

15

30

10

20

5

10

0

0

allograft
Muse ++
S1PR2
JTE-013antagonist

図 6 他家 Muse 細胞の梗塞サイズ縮小効果、心機能改善効果に対する S1PR2 阻害薬 JTE-013 の影響。
*：P ＜ 0.05、**：P ＜ 0.01、***：P ＜ 0.001；
文献 19 より改変（© 2019 American Heart Association, Inc.）。

D

Ejection
Fraction (%)
Infarct Size**

From Ref. 19 © 2019 American Heart Association, Inc.

**

*

35
***
30

C

%

*

*

fibrosis/LV (%)

***

35
70
30
60
25
50
2040

ograft++Muse
S1PR2
TE-013

Infarct Size
CEjection Fraction

Ejection
Fraction
Infarct Sizefibrosis/LV (%)

A

D

GATA-4 siRNA-GFP-Muse

GATA-4 siRN細胞が梗塞領域に選択的に生着することである。Muse 細胞と塞心筋組織に対する Muse 細胞の遊走は有意に抑制された 19。

non-Muse 細胞を蛍光タンパク質 Nano-lantern で標識して、心これらの in vivo ならびに in vitro のデータは、Muse 細胞の梗

筋梗塞部位への生着を調べた。その結果、Muse 細胞は梗塞領

塞心筋組織への遊走生着のメカニズムには、S1P–S1PR2 シス

域に生着したが、non-Muse 細胞は生着しなかった（図 3A）。

テムが関与していることを示している。

JTE-013 は、sphingosine-1-phosphate receptor 2（S1PR2）の選択的阻害薬であるが、Muse 細胞と JTE-013 を共投与すると、3.3 Muse細胞の心筋細胞への分化

Muse 細胞の梗塞領域への生着は顕著に阻害された（図 3B）。梗梗 塞 2 週 後 の 心 筋 細 胞 組 織 の 薄 切 切 片 を 染 色 し て、 心 筋

塞領域への生着を組織学的手法により調べた場合においてもマ ー カ ー で あ る 心 房 性 ナ ト リ ウ ム 利 尿 ペ プ チ ド（ANP）、

同様の結果が得られた。すなわち、
AMI 発症 3 日後に Muse 細

troponin Ⅰ、sarcomeric α-actinin、およびギャップジャンク

胞は梗塞領域に生着したが、JTE-013 との共投与では生着がほションのマーカーである connexin-43（コネキシン 43）の発現

ぼ消失した（図 3C）。Muse 細胞の生着率は梗塞 3 日後で 14.5％を調べた。共焦点顕微鏡で観察したところ、梗塞境界領域を中であった 。通常報告されている MSC の生着率は 0 ～ 3％で心にして、Muse 細胞を標識した緑色蛍光タンパク質（GFP）と、あることを考えれば、Muse 細胞の生着率はきわめて高い

ANP、troponin Ⅰ、sarcomeric α-actinin の発現細胞が一致しことがわかる。梗塞心筋組織の梗塞領域と境界領域の S1P 濃ていた。Muse 細胞での心筋マーカーの発現から、これらの細胞度は、正常心筋組織の相当する領域に比べて有意に高値であっが心筋に分化したことが示された（図 4A、4B、4C）。さらに、た（図 3D）。このことから、静脈注射された Muse 細胞が、梗

Muse 細胞から分化した心筋細胞と、もともとあった host 心筋

塞領域と境界領域に選択的に生着していることがわかった。さ細胞との間には connexin-43 が発現していることから、分化しらに、Boyden chamber を用いた in vitro 遊走アッセイを行い、た心筋細胞はギャップジャンクションを介して host 心筋細胞

Muse 細胞の遊走を定量したところ、S1PR2 アゴニストであると細胞間の興奮伝播や情報伝達を行っている可能性が示され

SID46371153 に対して、Muse 細胞の遊走は有意に用量依存た（図 4D）。梗塞 2 か月後になると、GFP 標識 Muse 細胞の性を示した。Muse 細胞は、梗塞心筋組織に対しても顕著な遊

ANP 発現レベルは低下したが、troponin Ⅰあるいは sarcomeric

走を示し、この遊走は、JTE-013 で用量依存性に阻害された。

α-actinin の発現レベルは増加していた（図 4E、4F、4G、4H）。

Muse 細胞の表面には S1PR2 が発現しているが、siRNA によっ

特に、sarcomeric α-actinin 陽性細胞は、成熟した心筋細胞にて S1PR2 をサイレンシングすると、SID46371153 あるいは梗

特徴的である明瞭な横紋を示していた（図 4H）。GFP で標識

19advances.tri-kobe.org/en

20,21

The Principles of Regenerative Medicine 70

Osamu湊口
Honmou信也 他

Stem Cell2Therapy
幹細胞療法
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1

した他家 Muse 細胞でも同様に、2 週後に心筋マーカーである

MSC や non-Muse 細胞に比べて、Muse 細胞で特に高かった

ANP、troponin Ⅰ、α-actinin を発現し、6 か月後においても（図 5C）。VEGF と HGF は血管新生因子であり 22,23、HGF は抗troponin Ⅰ、α-actinin の発現があった 19。このことは、他家

アポトーシス効果を示す 23。MMP-2、MMP-9 は抗線維化あるMuse 細胞から分化した心筋細胞が、少なくとも 6 か月間は心いは線維分解作用を有する 24。Muse 細胞の投与により、梗塞

臓内にとどまっていたことを示している 19。

心筋境界領域の terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP

次に、Muse 細胞から分化した心筋細胞が、拍動している心

nick-end labelling（TUNEL）陽性細胞数が減少した（図 5D）。

臓において実際に作業心筋としての役割を果たしているかど

これは Muse 細胞が抗アポトーシス効果を有することを意味

うかを確認した。GCaMP3 で標識したヒト Muse 細胞をウサギしている。さらに、梗塞領域の Sirius Red 陽性領域面積の減少

AMI モデルの梗塞心筋組織に移植した。GCaMP は、enhancedも認められた（図 5E）。これらの結果から、Muse 細胞は梗塞

GFP（EGFP）、カルモジュリン（CaM）、ミオシン軽鎖フラグメ

境界領域の毛細血管数の増加、梗塞領域の線維化領域面積の減

ント（M13）を遺伝子工学的に連結したカルシウムセンサータ

少、梗塞サイズの縮小などに関与している可能性が高いと考えンパク質である。Caられる。

が CaM に結合すると、Ca

2＋

2＋/CaM 複合体が M13 と相互作用して蛍光団である EGFP の立体構造を変化させ、それにより蛍光強度が変化する。これを利用すること

3.5 Muse細胞の免疫調節効果

で、Ca濃度の変化を GCaMP 蛍光強度の変化として検出する

Muse 細胞は human leukocyte antigen（HLA）–DR（HLA ク

ことができる。梗塞 2 週後に開胸術を行って心臓を露出させ、ラスⅡ）を細胞表面に発現しないため、T 細胞の攻撃を受け

落射蛍光実体顕微鏡（Nikon、SMZ745T）と EXFO X-Cite 蛍

ない 19。さらに Muse 細胞は、HLA-G（胎盤に存在して胎児が光照明装置を用いて観察したところ、心電図に同期して、収縮

母胎の免疫から免れるように働くタンパク質）を発現するた期には緑色の信号が濃く（強く）なり、拡張期には薄く（弱く）め 19、Muse 細胞が投与された host からの攻撃を受けないようなるという時間強度曲線が描かれた 19。このことは、Muse 細に免疫が調節される。これらの性質が、Muse 細胞が梗塞領域

胞から分化した心筋細胞において、収縮期には細胞内 Caに生着した後も長期間にわたって排除されずに存在し続ける

2＋

®

2＋

濃

度が上昇した結果として緑色の強い信号が発生し、拡張期には
細胞内 Ca2＋

理由の 1 つかもしれない。

濃度が低下した結果として緑色の信号が弱くなったことを意味しており、分化した心筋細胞が作業心筋として機3.6 梗塞領域でのMuse細胞存在の意義能していることを示している。

他家 Muse 細胞と S1PR2 の選択的阻害薬である JTE-013 を、ウサギ AMI モデルに共投与すると、他家 Muse 細胞による

3.4 Muse細胞の血管への分化とパラクライン効果

2 週後の梗塞サイズ縮小効果ならびに心機能改善効果は減少

梗塞 2 週後の時点で、GFP で標識した Muse 細胞は血管内皮した（図 6）。さらに、自殺遺伝子である herpes simplex virus

細胞のマーカーである CD31、および血管平滑筋細胞のマー

thymidine kinase（HSV-tk）をヒト Muse 細胞に導入し、そのカーであるα-smooth muscle actin を発現し、血管の形状を形

細胞をウサギ AMI モデルに投与すると、ヒト Muse 細胞は生成していた。さらに、梗塞境界領域の毛細血管数は、対照群、着後に破壊され、その後は、ヒト Muse 細胞による梗塞サイズ

non-Muse 群、MSC 群に比較して、Muse 群で有意に多かった

縮小効果、心機能（EF）改善効果は、大幅に減少した 19。

（図 5A、5B）。Muse 細胞は MSC と同様のパラクライン効果を

次に、GATA4（心筋細胞発生の際に発現する転写因子の 1有する。Muse 細胞の培養液の上清中には、血管内皮増殖因子つ）をコードする遺伝子を siRNA でサイレンシングしたヒト（vascular endothelial growth factor：VEGF）、肝細胞増殖因子

Muse 細胞を、ウサギ AMI モデルに移植した。梗塞 2 週後の（hepatocyte growth factor：HGF）、matrix metalloproteinase-2

時点で、Muse 細胞による梗塞サイズ縮小効果ならびに心機能（MMP-2）、MMP-9 が発現していた。Muse 細胞を投与した（EF）改善効果は有意に減少していた。心臓の組織学的検討を

梗塞心筋組織の境界領域には、MSC と同様に、VEGF、HGF、行ったところ、GFP で標識した Muse 細胞からの心筋細胞の19

MMP-2、MMP-9 が発現していた 。VEGF の発現レベルは、分化が認められなかった。これは、ヒト Muse 細胞における71 The Principles of Regenerative Medicineadvances.tri-kobe.org/en

Stem Cell2Therapy
幹細胞療法
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GATA4 のサイレンシングにより心筋細胞への分化が阻害されたため、梗塞サイズ縮小効果、心機能改善効果が減少したことを意味している 19。
これらのことは、Muse 細胞が梗塞領域に存在し続け、心筋細胞への分化あるいは血管再生、抗アポトーシス効果や抗線維化効果などのパラクライン効果を発揮することが、梗塞サイズ
縮小、心機能改善に関与していることを意味している。
文献

Osamu
湊口
Honmou信也 他

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advances.tri-kobe.org/en

The Principles of Regenerative Medicine 72

藤田
Osamu
靖之、川本
Honmou篤彦

Stem Cell3Therapy
幹細胞療法

1

幹細胞を用いた末梢動脈疾患に対する血管再生療法藤田 靖之、川本 篤彦

要旨

慢性重症下肢虚血は疼痛や潰瘍・壊疽を伴い、しばしば下肢切断を余儀なくされ、致命的な結果となりうる病

公益財団法人 神戸医療産業都市推進機構 医療イノベーション態である。CD34 陽性細胞を推進センター メディカルイノベーションディビジョン

用いた新しい治療法は、動物実験、前臨床および臨床試験により良好な成績が示

公益財団法人神戸医療産業都市推進機構 医療イノベーション推進センター（TRI）の研究者らによって開発された幹細胞を用いた血管再生療法は、慢性重症下肢虚血の治療として大いに期待され、既存の治療法に対し抵抗性を示す、または適応外となる状態の患者に希望を与えるものである。

されてきた。現在、日本において、先駆け審査指定制
度の指定のもと、G-CSF 動員
自家 CD34 陽性細胞を用いた下肢血管再生療法は新たな標準治療となることを目指して開発を進められている。CD34 陽性細胞が再生医療等製品として承認されれば、慢性重症下肢虚血のみ

1. はじめにならず、それ以外の疾患へ

末梢動脈疾患（PAD）とは、四肢の動脈に生じた狭窄または閉塞により循環障害をもたれている。

の適応拡大への道も切り開

1.1 慢性重症下肢虚血の病態・疫学・治療
らす疾患群である。無症候性のものから重症のものまで合わせると、全世界で 2 億人以上が罹患していると見積もられている 1。原因疾患として最も多いのは動脈硬化に起因する閉塞性動脈硬化症（ASO）で、その他の原因疾患としては、閉塞性血栓血管炎（バージャー病とも呼ばれる）、血管炎、自己免疫疾患があげられる。
PAD が高度に進行し、下肢の安静時疼痛または潰瘍・壊疽を示すに至った病態
1997~

2003~

2007~

2008~

2017~

多施設共同非盲検
ランダム化比較試験

EPC（CD34 陽性細胞）の発見（1997）

第 I/IIa 相臨床試験（日本）

第 I/IIa 相臨床試験（米国）

第 II 相医師主導
第 II 相企業治験
治験（医療機器） （再生医療等製品）
（日本）
（日本）

前臨床試験

単群用量漸増試験

多施設共同二重盲検
ランダム化プラセボ
対照試験

単施設単群試験

治療手段のない CLI
N = 6；1 × 105 個 /kg
N = 8；5 × 105 個 /kg
N = 3；1 × 106 個 /kg

治療手段のない CLI
N ＝ 7；1 × 105 個 /kg
N ＝ 9；1 × 106 個 /kg
N ＝ 12；プラセボ

治療手段のない
CLI
N = 11

くことになるものと期待さ

責任著者
藤田 靖之
E-mail:yasufujita-ths@umin.ac.jp
川本 篤彦
E-mail:kawamoto@fbri.org

治療手段のない CLI
N = 35

図 1 CLI 患者に対する G-CSF 動員 CD34 陽性細胞を用いた下肢血管再生療法：これまでの前臨床～臨床開発の歩み。CLI：重症下肢虚血、EPC：血管内皮前駆細胞、G-CSF：顆粒球コロニー刺激因子

73 The Principles of Regenerative Medicineadvances.tri-kobe.org/en

藤田
Osamu
靖之、川本
Honmou篤彦（Fontaine 分類 III 度以上、または Rutherford 分類 4 群以上）

間質細胞

が 2 週間以上持続するものを、慢性重症下肢虚血（chronic
critical limb ischemia：CLI、近年では chronic limb-threating
ischemia：CLTI とも呼ぶ）と定義している。PAD の終末像ともいえる CLI 患者の予後はきわめて不良であり、いくつかの進

自己複製

休眠状態の幹細胞

行性悪性腫瘍の予後に匹敵する。CLI 発症から 1 年後の転帰は、死亡率 25％、大切断後生存率 30％、CLI 持続率 20％、また、5 年生存率は 40 ～ 50％と報告されている 2。欧米においては、

いる 。2000 年から 2010 年までの間に全世界の PAD 患者の1

CLI に対して現在推奨されている治療的介入方法は、まず、
疼痛コントロール、リスクファクターの管理、潰瘍・壊疽に対する創傷治療、そして適応がある場合には、外科的バイパス手術や血管内治療による血行再建である 3。しかし、CLI 患者の
約 25 ～ 40％は、バイパス手術に用いる静脈グラフトの欠如、多発性・広範囲に及ぶ動脈病変および併存する合併症を理由として血行再建の適応外となる。
CLI 患者に対する治療の最大

1,4,5の目的は救肢・救命であるが、血行再建の適応がない、あるいは治療抵抗性の患者はきわめて予後不良である。したがって、

MMP-9

動員

末梢血
ホーミング

数は 23.5％増加しており 、今後も患者数の急速な増加が懸念
でなく、同時に大きな社会経済的損失につながっている。

sKit L
EPCs

2

されている。下肢切断は患者自身の QOL を大きく損なうだけ

VEGF, PIGF, SDF-1,
G-CSF, GM-CSF

骨髄百万人あたり年間 500 ～ 1,000 人の新たな CLI 患者が発生し、CLI による下肢切断は年間 25 万件行われていると推定されて虚血ストレス

取り込み・分化

ECs
血管新生

組織
血管発生

さらなる前駆細胞の動員

パラクライン効果

血管新生誘導因子の過剰発現

Reprinted from Y. Fujita & A. Kawamoto Adv. Drug Deliv. Rev. 120, 25-40 (2017), with permission from Elsevier

Stem Cell3Therapy
幹細胞療法

1

図 2 EPC の体内動態。EC：血管内皮細胞、EPC：血管内皮前駆細胞、G-CSF：顆粒
球コロニー刺激因子、GM-CSF：顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、MMP9：matrix metalloproteinase-9、PlGF：placental growth factor、SDF：stromalcell-derived factor、sKit L：soluble kit ligand、VEGF：vascular endothelial
growth factor

このような CLI 患者に対する新しい治療戦略の確立が社会的・医学的急務となっている。

らは CD34 陽性細胞分離装置に関する医師主導治験を実施し、この GCP 準拠試験においても本治療の有効性および安全性を

1.2 CD34 陽性細胞を用いた CLI 患者の血管再生療法

確認した 8。さらに、2017 年 12 月から CD34 陽性細胞の再生

1997 年に Asahara ら 6 により、血管内皮前駆細胞（EPC）が医療等製品としての薬事承認を目指した多施設共同ランダム

ヒトの末梢血単核球（PBMC）の一成分（CD34 陽性分画）と化比較試験（企業治験）を開始した（図 1）。本稿では、CD34

して存在することが証明されて以来、EPC に関連する基礎・臨

陽性細胞の再生医療等製品としての開発を進めるに至った経床研究が幅広く行われてきた。その中で、虚血性疾患に対する

緯とその展望について概説する。

新しい治療法として、EPC 移植による血管再生療法が注目を集めている。現在、自家骨髄由来 CD34 陽性細胞を用いた血管再生療法の臨床試験が、狭心症、急性心筋梗塞、拡張型心筋症、脳梗塞、CLI などを対象に国際的に展開されている。

2. 前臨床研究2.1 EPC の特性・体内動態
成体の血管形成のメカニズムとして、既存の成熟血管内皮細筆者らは、CLI 患者を対象とした、顆粒球コロニー刺激因子胞の増殖・遊走による血管新生（angiogenesis）という仕組み（G-CSF）動員自家 CD34 陽性細胞を用いた下肢血管再生療法

が従来より提唱されてきた。しかし、1997 年に Asahara ら 6について、2003 年から第 I/IIa 相臨床試験を世界に先駆けて開は、成体における PBMC の一成分（CD34 陽性細胞）として始し、安全性および臨床効果を報告した 。また、2008 年か

EPC の存在を証明し、これにより、血管新生とは異なる血管

7advances.tri-kobe.org/en

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Stem Cell3Therapy
幹細胞療法

1

微小磁気ビーズを結合させた
抗ヒト CD�� 抗体

Rutherford 分類

ヒト CD�� 抗原に対する
マウスモノクローナル抗体

100

割合（％）

S

N

CD�� 抗原

CD�� 陽性細胞

第5日

4

8

12

1
**

2

3
**

24

52

24

52

4

5
**

6
**

104

156

208

104

156

208

40

永久磁石

磁石

なし
分離カラム

治療前

週

CLI からの離脱率
100
80
割合（％）

第6日

G-CSF 皮下注

アフェレシス

CD34 陽性細胞の磁気分離

CD34 陽性細胞の筋注

EPC の動員全 PBMC の採取

EPC の精製

EPC の移植

60
40
20
0

治療前

4

8

12

週

Reprinted from Ref. 29, with permission from Elsevierあり

図 3 CD34 陽性細胞の磁気分離方法の基本原理

第1～5日

0
**

20

CD�� 陽性細胞

磁気標識された CD�� 陽性細胞

**

60

0

微小磁気ビーズを結合させた抗体**

80

鉄デキストランビーズ

CD�� 陰性細胞*

図 4 CLI 患者に対する CD34 陽性細胞の動員、採取、分離および移植方法。EPC：
血管内皮前駆細胞、G-CSF：顆粒球コロニー刺激因子、PBMC：末梢血単核球

図 5 CLI 患者に対する CD34 陽性細胞移植後 4 年までの Rutherford 分類の推移と CLI からの離脱率（CLI-free ratio）：国内第Ⅰ / Ⅱ a 相臨床試験の成績。
*：P ＜ 0.05、**：P ＜ 0.01（治療前との比較）

発生（vasculogenesis）により成体血管が形成されるという新骨髄移植マウスなどを用いた基礎研究によると、EPC は成体

たな概念が生まれた。血管発生では、成熟血管内皮細胞ではな

内では骨髄に多く分布しているが、虚血・炎症・創傷・腫瘍形

く、血管内皮前駆細胞が関与する。それ以降、成体の新たな血成などの病態下、あるいは G-CSF、顆粒球マクロファージコロ

管形成は、血管新生と血管発生の相互作用により起こると考え

ニー刺激因子（GM-CSF）などのサイトカインやエストロゲンられるようになった。

などのホルモン投与により、骨髄から末梢血へ強制動員され、EPC は PBMC 中に、
CD34（造血幹細胞表面抗原）陽性細胞や循環血を介して血管形成部位へたどりつき、血管形成に貢献す

CD133（早期造血幹細胞表面抗原） 陽性細胞として存在する。

る 11,12。これらの知見は、血管再生療法のための EPC の採取・これらの細胞を単離し、内皮用培地を用いて一定の密度以上で分離法の確立にも役立っている（図 2）。

9培養すると、CD34、CD31、vascular endothelial growth factor（VEGF）receptor-2（KDR：kinase insert domain receptor とも

2.2 EPC 移植の前臨床試験呼ぶ）、Tie-2、E-selectin の発現を認める紡錘形の接着細胞に

Kalka らは、健常人の PBMC を培養して得られた EPC を、ヌー分化する。また、これらの細胞によるアセチル化低密度リポタ

ドマウスの下肢虚血モデルに移植した。それによると、下肢虚ンパク質（Ac-LDL）の取り込みも確認できるようになる

血 2 日後に EPC を静脈内投与すると、移植された細胞が虚血75 The Principles of Regenerative Medicine

。

6,10

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靖之、川本
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篤彦

SPP

0.5

跛行出現距離

0.2

500
400

40

距離（m）

圧（mmHg）

0.3

20

0.1
0

最大歩行距離

TCPO2

60

0.4

TBI

© 2019 Japanese Circulation Society. Reprinted from Ref. 8

Stem Cell3Therapy
幹細胞療法

1

300
200
100

0

2

4

8 12 24 36 52

0

0

2

4

8

週

12 24 36 52

0

0

2

4

8

12 24 36 52

週

週

図 5 CLI 患者に対する CD34 陽性細胞移植後 52 週までの自他覚的指標の推移：探索的医師主導治験の成績。
SPP：皮膚灌流圧、TBI：足趾・上腕血圧比、TcPO2：経皮的酸素分圧部位に集積し、マウス由来の血管内皮細胞と共同して血管再生

ボ核酸（RNA）そして microRNA を含むエキソソームが分泌さに貢献していることが組織学的に確認された。組織学的に確認れ、遺伝子機序によってもパラクライン効果に寄与することがされた毛細血管密度や、レーザードプラ法により測定された虚明らかになってきた（図 2）22,23。

血肢の血液灌流も、細胞移植後に有意に改善した。この結果、

EPC（CD34 陽性細胞）は、BMMC または PBMC から純化・

重症虚血後壊死に対する下肢温存率が、対照群で 7 ～ 8％に分離し、移植に用いることができる。一方、EPC の純化・分すぎなかったのに対し、EPC 移植群では 59％と著明に改善し離を行わずに単核球をそのまま移植する方法（BMMC またはた 。Murohara らは、ヒト臍帯血から採取・培養した EPC を

PBMC 移植）も、前臨床試験において数多く試されてきた。し下肢虚血ヌードラットに移植し、同様に良好な成績を報告してかし、BMMC・PBMC 移植では EPC だけでなく雑多な細胞群いる 。また、Losordo らは、健常人への G-CSF 皮下注後に末を移植することとなり、その危険性が指摘されてきた。すな梢血から採取・分離した CD34 陽性細胞を下肢虚血ヌードラッ

わち、骨芽細胞・軟骨芽細胞成分による骨化・軟骨化、線維トに移植し、同様に良好な結果を確認した（未発表データ）。

芽細胞成分による線維化などである。Yoon らの前臨床研究で

13

14

また、CD34 陽性細胞治療は、この他に心筋梗塞、脳梗は、ラット急性心筋虚血モデルに対して全骨髄細胞を心筋内移などの治療にも有効であることが前臨床植したところ、高頻度に心筋石灰化の出現が認められた 24。ま研究で証明されている。これらの成果は、EPC 移植のみならた、筆者らも、ラット急性心筋虚血モデルに対する PBMC の心ず、骨髄単核球（BMMC：EPC に加えて造血系細胞、間葉系細筋内移植で、細胞用量を高くすると移植後に多数の炎症細胞侵胞なども含む細胞群）移植による治療の理論的支柱にもなって潤を伴う心筋内出血が出現し、血管再生および心機能改善効果いる。また、虚血疾患モデル動物に移植された EPC は、血管の低下が認められたのに対し、純化された CD34 陽性細胞のみ発生の機序により虚血組織における新規血管に直接統合されを移植した場合には、これらの副反応は認められず、高い血管て血管内皮を形成するのみならず、EPC 自身が VEGF、hepatic

再生効果と心機能保持効果が得られることを確認した 16。さらgrowth factor、angiopoietin-1、stromal-cell-derived factor-1に、Masuda らが確立した in vitro における EPC colony-forming

alpha、insulin-like growth factor-1、endothelial nitric oxide

assay 法では、CD34 陽性細胞からは高頻度に EPC コロニーがsynthase といったさまざまな血管新生サイトカインおよび血形成される一方、単核球中の CD34 陰性細胞からは、細胞数を管成長因子を産生し、その結果、既存の血管内皮の増生

100 倍に増加させてもコロニーが得られず、EPC 分画と非 EPCと遊走を促進すること（パラクライン効果）も証明された。さ分画の間で血管発生能力に顕著な差があることを確認していらには、EPC からは血管新生関連タンパク質のみならず、リる 25。これらの基礎・前臨床研究の結果から、BMMC・PBMC

塞 、難治性骨折
17

18

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19 ～ 21

15,16

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幹細胞療法
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1

院内製造（GCTP 適用外）

スで高効率に採取し、さらに磁気細胞分離装置（CliniMACS®）を用いて高純度の CD34 陽性細胞を分離した（図 3、4）。分
離された CD34 陽性細胞は、純度が平均 92％、生存率が平均87％という高品質を示し、腰椎麻酔下で虚血下肢筋肉内へ移

アフェレシス
産物

医療機器

CD�� 陽性細胞植された（図 4）。全症例で治療後 1 年以内の死亡・下肢大切断は発生せず、自立歩行機能を温存することができた。また、潰瘍・壊死の治癒、虚血性疼痛の改善、生理検査指標（足趾・上腕血圧比〔TBI〕）、経皮的酸素分圧〔TcPO2〕などの経時的外部製造（GCTP 適用）

な改善も認められ、CLI からの離脱率は治療後 1 年で 88％であった 29。また、治療後 4 年に及ぶ長期成績についても検討した。死亡は移植後 2 年までは発生せず、移植後 2 年以降に 4例が心疾患により死亡したが、本細胞治療との関連は否定されアフェレシス
産物

細胞製造施設（医療機器設置）

再生医療等製品（CD�� 陽性細胞）図 7 治験に用いる CD34 陽性細胞の製造：医療機器（磁気細胞分離装置）治験と再生医療等製品（CD34 陽性細胞）治験。
GCTP: Good Gene, Cellular, and Tissue-based Products Manufacturing Practice

た。下肢大切断は発生しなかった。CLI からの離脱率は 80％以上の高率を維持した（図 5）。TBI は治療後 4 年、TcPO2 は治療後 3 年まで、治療前と比較して有意な改善を示した 29。
また、米国においては 2007 年から Losordo らにより、ASO
による CLI 患者 28 例を対象として、G-CSF 動員 CD34 陽性細胞移植に関する多施設共同ランダム化二重盲検プラセボ対照試験（ACT34-CLI 試験）が行われた 30。CD34 陽性細胞移植群移植と比べて純化 EPC 移植は、低侵襲性で治療効果・安全性

ではプラセボ対照群に比較して、治療後 6 か月、1 年におけるの面で優れるものと考えられる。

下肢大切断・小切断率が低い傾向を認め（それぞれ P ＝ 0.125、
P ＝ 0.054）、また、治療後 1 年までの観察期間で細胞治療に

3 臨床研究関連する有害事象は発生しなかった。

3.1 EPC の生理学的重要性
糖尿病の症例や動脈硬化危険因子を多数保有する症例では、健3.3 CD34 陽性細胞分離装置に関する医師主導治験常者と比べて循環血中の EPC 数が少なく、かつその増殖能・

上記の初期臨床試験に引き続き、筆者らは CD34 陽性細胞分遊走能なども低いことが報告されている。また、循環血中離装置「Isolex®」の薬事承認をめざし、2008 年より医療機器の EPC 数の少ない動脈硬化患者は心血管系の予後不良因子を

GCP に準拠した医師主導治験を 11 例の CLI 患者（バージャー

多数保有しており、血管内皮機能も低下していることが報告さ

病 7 例、ASO 4 例、ただし透析患者は除外した）に対して開れている 。つまり、EPC は動脈硬化患者の予後を規定しうる

始し、2012 年 3 月に終了した。この探索的な第 II 相試験は、重要な内因性因子の 1 つであることが判明してきた。

再生医療領域における国内初の医師主導治験であり、今日に至

26,27

28

るまで日本で実施された細胞移植による下肢血管再生療法に
3.2 CLI に対する血管再生療法の第 I/IIa 相臨床試験

関する臨床試験のうち、GCP にもとづきデータの信頼性が担

前臨床試験の結果を踏まえ、筆者らは 2003 年から「慢性重症保された唯一の試験である。この医師主導治験においても、前下肢虚血患者に対する自家末梢血血管内皮前駆細胞（CD34 陽

述の第 I/IIa 相試験での良好な安全性・有効性がほぼ再現され性細胞）移植による血管再生治療に関する第 I/IIa 相試験」をていた。また、臨床的重症度、安静時疼痛、血流改善指標およ実施した 。17 例の CLI 患者（ASO 5 例〔うち 1 例は血液透析

び歩行検査に加え、QOL 指標を含めた数多くの自他覚的所見

導入患者〕、バージャー病 12 例）を対象に、G-CSF 製剤を 5 日について、頻回の観察時点を設定して探索的に評価した結果、間投与して骨髄から末梢血に動員された単核球をアフェレシ

CD34 陽性細胞の移植後早期に安静時疼痛が改善し、その後、

7

77 The Principles of Regenerative Medicineadvances.tri-kobe.org/en

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幹細胞療法
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1

生理学的検査所見の改善が確認され、約半年後に臨床的重症

象カテゴリーが導入された。法改正に伴う対応については、医度の指標である Rutherford 分類の改善に至ることが明らかと

薬品医療機器総合機構（PMDA）と相談の結果、本開発のカテなった（図 6） 。

ゴリーを医薬品から再生医療等製品に変更することにした。そ8の後、PMDA との治験相談を繰り返した結果、次期企業治験
3.4 CD34 陽性細胞の再生医療等製品としての薬事承認をめざ

は、CD34 陽性細胞の再生医療等製品としての薬事承認をめざした企業治験

した、多施設共同ランダム化比較試験として施行する運びと

第 I/IIa 相臨床試験および探索的医療機器医師主導治験の良好なった。本治験は、再生医療等製品のカテゴリーの下、2017

な結果を踏まえ、筆者らは G-CSF 動員自家 CD34 陽性細胞を

年 12 月より開始し、同月 1 例目の患者が組み入れられ、現在用いた下肢血管再生療法の標準治療化をめざしている。筆者ら進行中である。2018 年 3 月には、厚生労働省より、本再生医が探索的医師主導治験を開始した 2008 年当時、薬事承認申請

療等製品が先駆け審査指定制度の対象品目に指定された。先駆の主体となる企業は、CD34 陽性細胞分離装置を医療機器としけ審査指定制度とは、対象疾患の重篤性、世界に先駆けた国内て開発することをめざしていたが、治験終了後に、CD34 陽性での開発など、一定の要件を満たす画期的な医療機器・医薬

細胞を細胞医薬品として開発する方針に変更した。

品・再生医療等製品を指定し、承認に係る相談・審査において医療機器として開発する場合、各医療機関に CD34 陽性細胞分離装置を設置し、医療機関内で G-CSF 投与からアフェレシ
ス、CD34 陽性細胞分離および細胞移植までの全過程を完結できる。すなわち、院内製造的なプロセスとなる（図 7）。一方、
細胞医薬品として開発する場合、各医療機関で G-CSF 投与お優先的な取り扱いをすることで、承認審査期間を短縮することを目的とするものである。
4. 今後の展望

CD34 陽性細胞治療については、CLI 以外にも、治療抵抗性狭よびアフェレシスを実施した後、アフェレシス産物が外部の細心症 31 ～ 34、急性心筋梗塞 35,36、拡張型心筋症 37 ～ 42、脳梗塞 43

胞製造施設（CPC）へ輸送される。CPC で CD34 陽性細胞の分などの虚血性疾患、さらには難治性骨折 44 や肝硬変 45 を対象離が行われた後、分離された CD34 陽性細胞が各医療機関へ輸にした臨床試験が行われ、その有効性および安全性が報告され送され、移植（治療）が行われる（図 7）。細胞医薬品としてつつある。CD34 陽性細胞が再生医療等製品として薬事承認さ開発する際の利点としては、まず、本医療技術の普及に有利とれれば、CLI 以外の疾患に対する将来の適応拡大への布石とないう点があげられる（各医療機関に細胞分離装置を設置する必ることが大いに期待される。

要がなく、細胞分離操作に熟練した技術者を雇用する必要もないため）。もう 1 つの利点は、より高品質な製品を安定供給できることである（一般の医療機関に比べて CPC では、高度に管理された環境下で、熟練した技術者が細胞製造を行うため）。
一方、難点としては、1 回の製造コストが高額となることがあげられる。
開発企業の計画変更により、細胞製造業務は神戸医療産業
都市推進機構が受託した。「再生医療等製品の製造管理及び品質管理の基準に関する省令」（Good Gene, Cellular, and Tissuebased Products Manufacturing Practice：GCTP）にもとづき、
構造施設規則ならびに細胞製造管理および品質基準を遵守して、治験準備を開始した。その後、2013 年に薬事法が改正され、「医薬品、医療機器等の品質、有効性及び安全性の確保等に関する法律（医薬品医療機器等法）」が制定されて、医薬品や医療機器とは別に、「再生医療等製品」という新しい審査対advances.tri-kobe.org/en

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79 The Principles of Regenerative Medicine

藤田
Osamu
靖之、川本
Honmou篤彦

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1830–1838 (2014).

advances.tri-kobe.org/en

Osamu黒田
Honmou良祐 他

Stem Cell Therapy
組織工学的治療11

下肢難治性骨折に対する自家末梢血
CD34 陽性細胞の移植
黒田 良祐、松本 知之、新倉 隆宏

神戸大学大学院医学研究科整形外科学

要旨

近年整形外科領域において、骨髄間葉系幹細胞の臨床応用をはじめ、
難治性疾患に対する再生医療が注目されている。その一方で、血管研究においては血管形成における詳細な分化メカニズ

骨折の約 5 ～ 10％は従来の治療法では治癒しない。幹細胞療法が、そのような症例の治療法として期待されているが、間葉系幹細胞を用いた場合の治療成績は満足のいくものではない。公益財団法人神戸医療産業都市推進機構 医療イノベーション推進センター（TRI）に関連した研究者は、難治性骨折（偽関節）患者を対象とした自家末梢血 CD34
陽性細胞移植の第Ⅰ/Ⅱ相臨床試験を実施し、その有効性と安全性を報告している。

ムの研究が新たな潮流を作
り出し、整形外科領域への応用が期待されている。
骨折治
癒過程と血管形成に密接な関係があることは周知の事
実であり、我々は成体の血管
内皮前駆細胞と骨折治癒過程・骨折治癒能につき、多くの in vitro/in vivo の実 験を通じて、その臨床応用に関する有用性を示唆する知見を

1. はじめに

胚性幹細胞（ES 細胞）、人工多能性幹細胞（iPS 細胞）の研究により、近年、再生医療の分野は目覚ましい発展を遂げている。一方で、これらの多能性細胞は、倫理上の問題や細胞のがん化の問題などを含んでおり、臨床応用を困難にしている。そこで、器官形成や組織再生の研究において中心的な役割を果たしてきたのが、体性幹細胞を用いた研究である。現在、骨髄あるいは滑膜由来の間葉系幹細胞を用いた骨・軟骨の再生が整形集積してきた。それらの成果をもとに第 I/II 相臨床試験
として、難治性骨折患者に対する自家末梢血 CD34 陽性細胞移植を試み、有効性と安全性の確認を行った。
有効性が証明され、難治性骨折・偽関節で苦しむ多くの人々

外科領域で注目されており、すでに臨床応用が実現している。しかし、骨髄採取の侵襲に新たな光明がもたらされ、性、細胞培養技術の難しさや培養に時間を要するという問題があり、また、治療の効果福音となることを期待する。

も限定的なものであった。そこで、より低侵襲で、より効果的な治療法の開発が必要とされている。
血管研究は、血管疾患の病態解明・治療法確立のために展開されてきた。この分野におけるこれまでの研究の歩みは、例えば腫瘍学や血液学、あるいは神経学などと比べれ

責任著者
黒田 良祐
E-mail:kurodar@med.kobe-u.ac.jp

ば、必ずしも最先端の科学レベルで進んできたものとはいえなかった。しかし、最近になって、血管研究は大きく進展し、血液学や発生学などの流れを取り入れながら、血管形成における分化メカニズムを詳細に明らかにするという、新たな研究領域が切り開かれている。また、今や医療の主流の一部をなす再生医療の分野において、さまざまな幹細胞を用いた器官形成や組織再生の研究が推し進められているが、再生された器官や組織を養う血管系がいかに再構築されていくかについては不明な点が多い。したがって、
今後、血管形成は再生医療の発展において中心的な役割を果たす可能性がある。1997 年に浅原ら 1 がヒト末梢血から血管内皮前駆細胞（EPC）を発見して以来、従来の既存血管内皮細胞の再形成（angiogenesis）のほかに、EPC からの血管発生（vasculogenesis）のメカニズムが関与していることが明らかとなり、現在では下肢虚血や虚血性心疾患のadvances.tri-kobe.org/en

The Principles of Regenerative Medicine 80

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Honmou良祐 他

Stem Cell Therapy
組織工学的治療
1
1

A

観察期間
（週）

B

CD34陽性細胞群
骨癒合率（％）

単核球細胞群
骨癒合率（％）

PBS 群
骨癒合率
（％）

2

0/15 (0)0/15 (0)0/15 (0)4

8/12 (66)

0/12 (0)0/12 (0)8

9/9 (100)

0/9 (0)0/9 (0)G-CSF 動員 CD34 陽性細胞群
骨癒合率（％）

PBS 群
骨癒合率
（％）

観察期間
（週）

105

104

103

2

0/12 (0)0/12 (0)0/12 (0)0/12 (0)4

3/9 (33)

1/9 (11)0/9 (0)0/9 (0)8

6/6 (100)

2/6 (33)

0/6 (0)0/6 (0)

骨新生

血管発生

血管
毛細血管
VEGF
架橋仮骨

骨芽細胞

皮質骨

骨髄

血管内皮細胞

表 1 ヒト末梢血 CD34 陽性細胞のヌードラットモデルへの移植による骨折治癒（非臨床基礎研究）。

図 1 骨折治癒における末梢血 CD34 陽性細胞の動態。経静脈移植されたヒト末梢血 CD34 陽性細胞は骨折部に集積し、骨折部において血管発生のみならず骨新生を通じて骨折治癒に適正な環境を誘導し、骨折治癒に貢献することが明らかになった。

血管再生療法として臨床に用いられるようになってきている症虚血部位の血管形成に関与することを報告した 1。そしてこ。整形外科領域においても、以前より特に骨再生における血の機序は、胎児期のみに存在すると考えられていた血管発生

管形成の重要性が指摘されており、血管医学は欠かせない分野（vasculogenesis）に一致することがわかった。つまり、血管となってきているといえる。

内皮前駆細胞が未分化のまま局所にたどりつき、定着、増殖、

2,3

本稿では骨折治療において大きな可能性を秘めている EPC/

分化することにより、新たな血管が構築されるという過程で末梢血 CD34 陽性細胞の生体内動態、EPC/ 末梢血 CD34 陽性ある。それまでは、成体における血管形成の過程は、既存隣細胞を用いた骨・血管再生療法に関する基礎研究、前臨床試

接血管の血管内皮細胞による増殖、遊走により成立する血管

験、第 I/II 相臨床試験につき概説する。

新生（angiogenesis）によるものと考えられていたのだが、そ2. 血管新生と血管再生

れとは異なる新たな概念が生み出されたのである。さらに、血管内皮系細胞に特異的な遺伝子（Flk-1、Tie-2）が発現すると血管新生増殖因子（angiogenic growth factor）とその治療応用

β- ガラクトシダーゼを発現するようにしたトランスジェニッの概念が初めて確立されたのは、Moses Judah Folkman によっ

クマウスの骨髄移植モデルにおいて、虚血、がん、創傷治癒、てである。彼はさらに、がんの発育浸潤のプロセスとして、血あるいは子宮、卵巣の血管形成を誘発すると、ドナー骨髄由来

管新生を招く増殖因子の発現を解明した。そして、増殖因子のの Flk-1 あるいは Tie-2 を発現している細胞が新たな血管を構働きにより、既存の近傍血管から血管内皮細胞を増殖・遊走さ成していることが示された 5,6。つまり、成体においても胎生期

せ、新たな血管を作り出す過程を「血管新生（angiogenesis）」と同様に、血管新生と血管発生の両方の機序を介して血管形成と定義した 。近年、血管内皮増殖因子（vascular endothelialが成立していることがわかってきたのである。これ以後、成体

growth factor：VEGF）をはじめとする数々の増殖因子が発見の新規血管形成は、血管新生と血管発生の相互作用によるもの

され、血管新生促進療法への臨床応用につながっている。一方と考えられるようになった。

4で、血管新生促進療法が奏効しない症例も存在し、そのような症例では、虚血部位における既存の血管内皮細胞の血管増殖因
子に対する反応性が低下している可能性が考えられた。そこ

3. 末梢血 EPC/CD34 陽性細胞による骨折治癒

通常、骨折は解剖学的整復と強固な固定により治癒に至る。しで、反応性に富む血管内皮細胞を虚血部に供給することが次のかし、骨折の 5 ～ 10％は骨癒合不全の状態に陥り（難治性骨課題であった。

折 / 偽関節）、それは、骨折部に適切な血行が得られないこと

1997 年に浅原らは、EPC が成体の循環血液中に存在し、重81 The Principles of Regenerative Medicine

が一因と考えられている。自家遊離海綿骨移植、さらには血行advances.tri-kobe.org/en

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組織工学的治療
1
1

症例

性別

年齢

骨折のタイプ

解剖学的部位1

男性

41

皮下骨折、骨萎縮型

脛骨骨幹部

2

女性

38

Grade Ⅲ A、骨萎縮型

大腿骨骨幹部3

男性

31

皮下骨折、骨萎縮型

大腿骨転子部

4

男性

34

Grade Ⅱ、骨萎縮型

脛骨骨幹部

5

男性

28

Grade Ⅱ、肥厚性

脛骨骨幹部

6

男性

20

Grade Ⅲ B、骨欠損型

脛骨骨幹部

7

男性

45

皮下骨折、骨欠損型

脛骨高原部

骨癒合に要した期間

外科的介入
1. ORIF
2. Cell ＋ ABG

臨床的
（週）

X 線学的
（週）

12

19

24

38

12

12

12

12

8

8

8

12

12

1. ORIF
2. Cell ＋ ABG

1. IMN
2. 髄内釘交換、Cell ＋ ABG
1. ORIF
2. Cell ＋ ABG

1. IMN
2. Dynamization
3. 髄内釘交換
4. Dynamization
5. 髄内釘交換、Cell ＋ ABG
1. IMN
2. Cell ＋ ABG

1. ORIF
2. プレート交換、Cell ＋ ABG

12

表 2 第Ⅰ / Ⅱ相臨床試験における各症例の臨床的・X 線学的転帰。
ABG：自家骨移植、Cell：自家末梢血 CD34 陽性細胞移植、IMN：髄内釘固定、ORIF：観血的整復内固定再建を重視して血管柄付骨移植を行うこともあるが、治癒に難モデルへの経静脈移植を試み、ヒト末梢血 CD34 陽性細胞が骨渋することも少なくない。そこで我々は、EPC を用いた細胞治折部に集積し、骨折部において血管発生のみならず骨新生を通療による新規血管形成に注目し、難治性骨折に対するその有効

じて骨折治癒に適正な環境を誘導し、骨折治癒に貢献すること

性を、基礎実験を通じて前臨床試験的に確認することとした。

を明らかにした（図 1）10。経時的な X 線学的・組織学的評価

まず予備実験として、骨折治癒過程における EPC の生体内では、術後 8 週目に対照群（リン酸緩衝生理食塩水〔PBS〕群

動態を、マウス閉鎖性骨折モデルを作製して、蛍光活性化セおよびヒト単核球細胞移植群）では偽関節に移行しているのにルソーティング（FACS）を用いて解析した。その結果、骨折

対し、CD34 陽性細胞群では 4 週目で 66％、8 週目には全例

後に骨髄中、末梢血中で EPC が増加していることが明らかにで骨癒合が得られた（表 1A）。3 点曲げ試験による力学的評価なった。次に骨髄の EPC が局所で血管内皮細胞に分化するこでは、対照群と比較して CD34 陽性細胞群では有意に高い強度とを確認するため、Tie2/LacZ トランスジェニックマウスの骨をもつ機能的骨折治癒が証明された。

髄移植モデルにおいて、Sca1 と CD31 の二重免疫染色を行っ

蛍光標識した CD34 陽性細胞は、骨折部に選択的に集積し、たところ、骨折部において骨髄由来の EPC が血管内皮細胞にラット由来の内皮細胞や骨芽細胞と共同して骨折部での血管分化することが確認された。これらの結果から、EPC は、骨再生および骨再生に寄与していた。移植 2 週後には、ヒト由

折後に骨髄から末梢血に動員され、骨折部で骨折治癒に貢献す

来の成熟血管内皮細胞と骨芽細胞が骨折部で組織学的・分子ることが明らかとなった 。さらに他の研究グループからも、生物学的に認められ、CD34 陽性細胞が標的部位で成熟血管内

ヒト骨折において EPC が動員されること 、ラット distraction

皮細胞および骨芽細胞に分化することが証明された。さらに、

osteogenesis モデルにおいて EPC が骨延長部へ動員されるこ

single cell RT-PCR 解析により、分離直後の CD34 陽性細胞の9と が報告され、我々の報告を支持している。

約 20％は骨芽細胞特異的マーカーとされるオステオカルシン

末梢血細胞による血管再生が可能となった現在、血管内皮細を共発現していることが明らかになり、ヒト CD34 陽性細胞は胞に分化するヒト末梢血 CD34 陽性細胞が骨再生を促進する

ラット細胞との細胞融合を経ることなく直接、骨芽細胞に分化と考えるのが合理的である。そこで、我々は健常人から得られするものと考えられた。移植 2 週後のラットの骨折部での免た末梢血 CD34 陽性細胞（10 個）のヌードラット難治性骨折

疫染色による微小血管密度、骨芽細胞様細胞密度の定量評価に

7

8

5

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組織工学的治療1
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CD34 陽性細胞

症例数

性別（男性 / 女性）
年齢

大腿骨 / 脛骨術後 12 週での骨癒合率

骨癒合に要した期間（週）Historical control

比較検討した。その結果、107 個の単核球細胞を移植した群で711も、血管発生のみならず骨新生を通じて骨折治癒に適正な環境

6/1

9/2

を誘導し、骨折治癒に貢献することが確認されたが、その有効

34 (20–45)

37 (21–56)

性は 105 個の CD34 陽性細胞を移植した群と比較して、ラット

2/5

4/7

の微小血管密度、骨芽細胞様細胞密度、ヒト由来の成熟血管内5/7 (71.4%)

2/11 (18.1%)

16.1 (8-38)

29.1 (12-44)

皮細胞密度、骨芽細胞密度、X 線学的・組織学的・力学的評価のいずれにおいても有意に劣っていた 12。さらに、
CD34 陽性細表 3 第Ⅰ/Ⅱ相試験と historical control の比較。

胞および単核球細胞の移植効果を、難治性骨折モデルのみならず、確立した偽関節モデルにおいても確認した 13。単核球細胞移植群では、CD34 陽性細胞移植群と比較して炎症性細胞の浸おいて、CD34 陽性細胞群の骨折部における血管新生および骨潤が多くみられ、結果の一因となっているものと考えられた。

新生は、対照群と比較して有意に亢進していた。RT-PCR 解析

EPC が関与する骨折治癒の機序をさらに解明していくことにより骨折部でヒト由来の VEGF などの血管新生因子が同定

は、さらなる治療効果の向上につながるものと考えられる。そできたことから、CD34 陽性細胞が局所でパラクリンの役割をこで我々は、G-CSF14、シンバスタチン 15 の局所徐放による骨担っているものと考えられた。さらに、VEGF のアンタゴニス

折部への EPC 動員の治癒効果、SCF/c-Kit シグナルを介した細トである可溶型 Flt1 の投与により、血管新生だけでなく骨新胞外アダプタータンパク質 Lnk16,17、SDF-1/CXCR4 シグナル 18

生も抑制されたことから、CD34 陽性細胞による骨折治癒過程

による EPC 動員の治癒効果につき検討し、それぞれが EPC のには血管新生が中心的な役割を果たしていることが明らかに骨折治癒に密接に関連していることを確認した。

なった。
次に我々は臨床応用を想定して、局所移植されたヒト末梢血CD34 陽性細胞が、骨折部において血管発生のみならず骨新生

4. 臨床試験：末梢血 CD34 陽性細胞移植による骨・血管再生療法を通じて骨折治癒に適正な環境を誘導し、用量依存的に骨折治

上述した基礎研究の成果を踏まえ、「ヒト幹細胞臨床研究に関11癒に貢献することを確認した 。まず、末梢血顆粒球コロニーする審査委員会」の 2009 年 9 月 4 日付承認にもとづき、「難刺激因子（G-CSF）動員 CD34 陽性細胞を、同じ動物モデルの治性骨折（偽関節）患者を対象とした自家末梢血 CD34 陽性細骨折部（担体としてアテロコラーゲンを使用）に移植した。移胞移植による骨・血管再生療法に関する第Ⅰ/Ⅱ相試験」を実施

植する細胞数は、上述の静脈内移植時の効果を参考にした。経した。自家末梢血 CD34 陽性細胞移植による骨・血管再生療法

時的な X 線学的・組織学的評価において、10 群では 4 週目では、骨折部での未分化な状態での増殖とその後の分化の過程を33％、8 週目には全例で骨癒合が得られ、10 群では 4 週目で経て、骨を再生しうるだけでなく、まったく新たな血管を再生

11％、8 週目で 33％の骨癒合が得られたが、10 群、PBS 群でしうる点で、従来の治療法と比較して利点があると考えられる。

は骨癒合はみられなかった（表 1B）。移植 2 週後の骨折部での被験者の適格基準としては、大腿骨（2 例）または脛骨（5免疫染色による微小血管密度、骨芽細胞様細胞密度の定量評価

例）の非感染性偽関節患者で、同意取得時の年齢が 20 歳以上において、骨折部における血管新生および骨新生は、10 群、

70 歳未満であり、本人から文書による同意が得られている患10 群では 10 群、PBS 群と比較して用量依存的に亢進してい者とした。試験の流れとしては、まず文書による同意が得られた。これらの結果から、難治性骨折治療の新たな選択肢の 1 つてからスクリーニング検査・症例検討会・適格性判定を行い、として、末梢血 CD34 陽性細胞の局所移植が有効であることがそのうえで登録する。CD34 陽性細胞の分離、偽関節手術、細示された。

胞移植は神戸医療産業都市推進機構 先端医療研究センターで

5

4

3

4

5

3

さらに、CD34 陽性細胞の単核球細胞に対する優位性を確認するため、ヒト末梢血 CD34 陽性細胞あるいは単核球細胞をヌードラット難治性骨折モデルの骨折部に移植し、その効果を83 The Principles of Regenerative Medicine

実施し、その後、神戸大学医学部附属病院に転院させて観察を行った。
まず G-CSF を皮下注射（5 日間）して、CD34 陽性細胞を末
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組織工学的治療
1
1

� 日目

� ～ � 日目

� 日目

サンプリング偽関節部に移植

単核球細胞
返血

磁気細胞分離装置
G-CSFを皮下注射

単離

アフェレーシスにより単核球細胞を採取

CD34陽性細胞と担体のアテロコラーゲン

図 2 臨床試験の概要。G-CSF を皮下注射して CD34 陽性細胞を末梢血中に動員し、アフェレシスにより単核球細胞を採取した後に CD34 陽性細胞を磁気分離する。
6 日目に偽関節手術（自家骨移植に加え、必要に応じて内固定の改善を行う）とともに、5 × 105 個 /kg の自家末梢血 CD34 陽性細胞をアテロコラーゲンを担体として移植する。
G-CSF：顆粒球コロニー刺激因子

梢血中に動員。アフェレシスにより単核球細胞を採取し、その全ラット偽関節モデル 13 やラット大腿骨骨欠損モデル 23,24 だ

後に、CD34 陽性細胞を磁気分離する。治療は、6 日目に偽関

けでなく、ヒツジ脛骨骨欠損モデル 25 においても報告されて

節手術（自家骨移植に加え、必要に応じて内固定の改善を行う）いる。このように、近年ますます EPC/CD34 陽性細胞の重要とともに、5 × 10 個 /kg の自家末梢血 CD34 陽性細胞をアテ性が認識されつつあるのである 26 ～ 29。

5

ロコラーゲンを担体として移植する（図 2）。主要評価項目は、

第Ⅰ/Ⅱ相臨床試験により、偽関節患者に対する本治療の有効

安全性および術後 12 週での X 線学的骨折治癒の有無とした。

性と安全性が示された。最終目的である医療技術としての定着・

1 症例目の脛骨偽関節患者に関して、本治療の有効性と安全普及をめざすためには、より多数の症例を対象に、多施設共同性を報告した 。術後平均 12.6 週には臨床的骨癒合が得られ、医師主導治験を行うことが必要である。偽関節に対するまった

術後平均 16.1 週で X 線学的骨癒合が得られた（表 2） 。主

く新しい治療法である末梢血 CD34 陽性細胞移植は、すでに動要評価項目である術後 12 週での X 線学的骨癒合率は 71.4％

物実験・初期臨床試験で高い有効性と安全性が示されており、であった。historical control として設定した、同施設内で骨今後の幅広い臨床適用においても高い効果が期待されている。

19

20

移植を併用して治療を行った大腿骨または脛骨の偽関節患者
11 例の治癒率は 18.1％であり、本治療の有効性が示された（表 3） 。術後 1 年での安全性評価においても、重篤な有害20

事象はみられなかった。
5. 今後の展望

これまでに述べてきた EPC/CD34 陽性細胞の骨折治癒における意義と有効性は他の研究グループからも注目され、近年、基礎研究成果が集積されつつある。EPC の末梢血への動員効果
は、ラット脛骨骨延長モデル 21、マウス大腿骨骨折モデル 22、さらにはヒトの脛骨・長管骨骨折 8,9 においても報告されている。
また、EPC/CD34 陽性細胞の骨折治癒効果については、我々が報告してきた免疫不全ラット難治性骨折モデル 10 ～ 12、免疫不advances.tri-kobe.org/en

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The Principles of Regenerative Medicine 84

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組織工学的治療
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Osamu
黒田
Honmou良祐 他

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85 The Principles of Regenerative Medicineadvances.tri-kobe.org/en

Osamu外園
Honmou千恵 他

Stem Cell Therapy
組織工学的治療2
1

培養自家口腔粘膜上皮シート移植で光を取り戻す外園 千恵 1、稲富 勉 1,2、中村 隆宏 1、小泉 範子 3、今井 浩二郎 4、
木下 茂 1, 5、木村 泰子 6、郷 正博 6、福島 雅典 6

1. 京都府立医科大学眼科

2. 国立研究開発法人 国立長寿医療研究センター眼科
3. 同志社大学生命医科学

4. 京都府立医科大学大学院医学研究科医療フロンティア展開学
5. 京都府立医科大学感覚器未来医療学

6. 公益財団法人 神戸医療産業都市推進機構

要旨

スティーヴンス・ジョンソン症候群、眼類天疱瘡、熱・化学外傷などにより眼の輪部が障害されると、角膜上皮幹細胞疲弊症を引き起こすおそれがある。これらの難治性
眼表面疾患を治療するには、幹細胞を含む粘膜上皮の移植を行う必要がある。我々の治療コンセプトは、生体外で作製したシート状の粘膜上皮を移植するというものである。すなわち、羊膜を細胞培養の基質として用いて、角膜上皮幹細胞や自家口腔粘膜上皮細胞からなる多層のスティーヴンス・ジョンソン症候群、眼類天疱瘡、眼の熱・化学外傷のような難治性粘膜上皮シートを作製し、そである。これに対し、公益財団法人神戸医療産業都市推進機構 医療イノベーション推の場合は、他眼（健眼）から

眼表面疾患は、幹細胞疲弊症のうちでも特に治療が難しく、視力予後はきわめて不良

進センター（TRI）と京都府立医科大学の研究者らは、羊膜を細胞培養の基質として用いる角膜再生医療の実用化への道をともに歩んできた。この再生医療では、羊膜の上に角膜上皮幹細胞や自家口腔粘膜上皮細胞からなる多層の粘膜上皮シートを作製し、その移植により眼表面を再建する。早期臨床研究では、高度角膜混濁での視力改善、遷延性上皮欠損での上皮修復、結膜嚢再建での効果が証明された。この技術は、その他の眼表面疾患にも拡大して適応できると考えられる。

の移植により眼表面を再建するのである。片眼性の疾患
採取した細胞を用いて角膜上皮シートを作製することが可能であるが、両眼性疾患
での自家移植の可能性を求めて、患者自身の口腔粘膜上皮細胞を用いた上皮シートを開発した。角膜疾患の家兎モデルでの基礎研究において、羊膜上で培養した口腔粘膜上皮シートが眼表面に生着・伸展し、角膜の透明性を維持することが確認された。

1. はじめに

眼表面には、角膜上皮および結膜上皮という性質の異なる 2 種類の粘膜上皮細胞が存在する。角膜上皮と結膜上皮の境界部分は輪部と呼ばれ、輪部の上皮基底層には角膜上皮幹細胞が存在すると考えられている 1 ～ 4。輪部領域が広範囲に障害されると、角膜上皮を供給できなくなり、周辺部の結膜上皮が結合組織や血管を伴って眼表面を覆い、高度の視機能障害をきたす。このように角膜上皮幹細胞が機能障害をきたす疾患を、角膜上皮幹細胞疲弊症と呼ぶ 3,5,6。このような疾患であるスティーヴンス・ジョンソン症候群（SJS）、眼類天疱瘡、あるいは眼の熱・化学外傷においては、炎症を伴って角膜上を結膜組織が被覆して高度の視力低下をきたす。さらに、眼表面粘膜の短縮ないし癒着とともに粘膜が瘢痕化し、高度ドライアイを伴うという特徴がある。SJS、眼類天疱瘡、熱・
化学外傷は、眼表面の瘢痕性変化と表面環境の悪化を伴い、幹細胞疲弊症のうちでも特advances.tri-kobe.org/en

早期臨床研究（72 例）では、
瘢痕性角膜混濁での視力改
善、遷延性上皮欠損での上皮修復、結膜嚢再建での効果が証明されていた。同様の結果
は、前向き臨床試験でも確認された。我々の技術の適応は、その他の眼表面疾患にも拡大できると考えている。

責任著者
外園 千恵
E-mail:csotozon@koto.kpu-m.ac.jp

The Principles of Regenerative Medicine 86

Osamu外園
Honmou
千恵 他

A

B

C

E

F

D

れてきた 6,7。
一般的な移植である全層（あるいは表層）角膜移植は、輪部の幹細胞を移植しないため、幹細胞疲弊症に対しては臨床的効
果が期待できない。幹細胞疲弊症を治療するには幹細胞を含む
粘膜上皮の移植を行う必要があり、そのため、角膜上皮形成術や輪部移植術などの角膜上皮移植術が開発されてきた 8,9。しか

G

H

I

し角膜上皮移植には新鮮なドナーを要し、全層移植よりも拒絶反応の発生率が高いという問題がある。さらに、難治性眼表面疾患では上皮移植を行っても遷延性上皮欠損をきたしやすく、たとえ上皮の生着を得ても長期経過の中で瘢痕性変化が進行し、視力予後はきわめて不良であった 7,10。
1997 年に Pellegrini らは、難治性眼表面疾患に対する新規治療法として、培養角膜上皮シート移植術を報告した。すなわ
ち、彼らは少量の角膜輪部上皮組織から細胞を分離、培養して、生体外で上皮シートを作製し、それらを 2 例に移植して成功した 11。これが皮切りとなり、角膜再生医療の基礎研究なら
びに臨床研究が世界的に活発に行われるようになった。

図 1 非臨床 POC。A：羊膜上で培養した家兎口腔粘膜上皮細胞は、正常角膜上皮に類似した 5-6 層の細胞層（破線円）を形成した。B、C：表層の細胞間にはタイトジャンクションがみられた（c の矢印）。D：最表層はグリコカリックス様物質で覆われていた（矢印）。E：細胞間には多数のデスモソームによる細胞接着が認められた（矢印）。F：基底細胞と羊膜の間にはヘミデスモソームによる接着構造が認められた（矢印）。G：移植前の家兎角膜では幹細胞が消失している。
H：羊膜上で培養した口腔粘膜上皮シートは家兎の眼表面に生着・伸展し、角膜の透明性を維持した（移植 10 日後）。I：移植された上皮シートは角膜実質に接着し、炎症細胞の浸潤や実質浮腫を認めなかった。
文献 14、26 より改変。

我々は、眼表面上皮再生の基質として羊膜組織に注目し、羊膜を用いた培養粘膜（角膜または口腔粘膜）上皮シート移植術

コラーゲンは、角膜や結膜などの眼表面上皮細胞の基底膜と類による眼表面再生医療の開発に取り組んできた。具体的には、似するものである 19。我々は、移植後の眼表面にシートが確実に羊膜を細胞培養の基質として用いて角膜上皮幹細胞や口腔粘生着するためには上皮培養の基質の選択が重要であると考え、膜上皮細胞からなる多層の粘膜上皮シートを作製し、重症眼表凍結羊膜組織から羊膜上皮細胞を掻爬した「上皮なし羊膜」を

面疾患を再建することに挑戦したのである

基質として用いた培養粘膜上皮幹細胞培養法を確立した 20 ～ 22。

。

12 ～ 14

我々は 1999 年に、両眼性の重症眼表面疾患の治療として、培2. 新たな治療技術の開発と非臨床 POC

養他家角膜上皮シート移植の臨床応用を開始した 23,24。培養角2.1 羊膜を用いた培養角膜上皮シート移植の開発と臨床研究

膜上皮シートは眼表面に良好に生着し、他に治療法のない急性

羊膜は、胎児と胎盤の表面を覆う薄い膜であり、基底膜と 1 層期炎症の持続を伴う遷延性上皮欠損症例では上皮再建を、慢性の羊膜上皮細胞からなる。羊膜は拒絶反応が起こりにくいとさ期の視力障害患者では視力改善を得ることができた。初期の培れ、腹部手術の際の癒着防止や皮膚の熱傷後の上皮修復促進

養他家角膜上皮シート移植は、SJS、化学外傷、眼類天疱瘡に対などの目的で、外科・皮膚科領域で古くから用いられてきた。

して行われた（計 23 例 25 眼）。このとき、化学外傷では移植

眼科領域では、1995 年に Kim と Tseng が凍結保存した羊膜

された角膜上皮が維持され、透明性が長期に持続したのに対しを動物モデル（ウサギ）眼の眼表面再建に用いたのを皮切りにて、SJS と眼類天疱瘡では全例で緩除に結膜上皮に置換された。

、再発翼状片や SJS などの瘢痕性疾患に対して、羊膜移植単有害事象として認められたのは、明らかな拒絶反応（4 眼）、メ

独、あるいは角膜上皮移植と併用した羊膜移植が行われるよう

チシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）、あるいはメチシリン耐になった 。

性表皮ブドウ球菌（MRSE）による角膜感染症（3 眼）であった。

1516

羊膜には、瘢痕形成抑制、増殖因子を介した角結膜上皮の増難治性眼表面疾患のほとんどは両眼性であるが、片眼性の疾殖促進効果 、抗炎症効果 、新生血管抑制効果などさまざま

患では他眼（健眼）から採取した少量の組織から自家の角膜上な効果があることが知られている。特にその基底膜を構成する

皮シートを作製することが可能である。実際に自家上皮シート

171887 The Principles of Regenerative Medicineadvances.tri-kobe.org/en

A, G, H, I Reprinted from Ref. 14. with permission of Elsevier.

に重症かつ難治性で予後不良であり、難治性眼表面疾患と呼ば

B, C, D, E, F: © 2019 Association for Research in Vision and Ophthalmology (Modified from Ref. 26);

Stem Cell Therapy
組織工学的治療2
1

Osamu外園
Honmou千恵 他

Stem Cell Therapy
組織工学的治療2
1

羊膜

培養口腔粘膜上皮シート

移植時

� ～ � 週後

A：角膜再建From Ref. 41 © 2019 Kyoto Prefectural University of Medicine

羊膜

直径 6 mm の
口腔粘膜片を採取

口腔粘膜上皮細胞を羊膜上で培養（10 〜 14 日間）
フィーダー細胞（3T3 線維芽細胞）

B：結膜嚢再建

培養口腔粘膜上皮シートを移植

羊膜移植

培養自家口腔粘膜
上皮シート移植口腔粘膜上皮が羊膜上に伸展移植後移植前

図 2 培養自家口腔粘膜上皮シート移植の流れ。口腔粘膜上皮細胞を含む粘膜片を採取し、細胞培養センターで口腔粘膜上皮シートを作製した。約 2 週間後、多層化した上皮シートを用いて培養自家口腔粘膜上皮シート移植（COMET）を行う。

図 3 培養口腔粘膜上皮シートからの上皮細胞の伸展。A：角膜再建。B：結膜嚢再建。

移植を実施した片眼性化学外傷では、合併症を生じず予後良好

であり、口腔粘膜の組織所見と一致した。角膜上皮特異的ケラであった 。そこで両眼性疾患での自家移植の可能性を求めて、チンとされているケラチン 3 も陽性を示したが、ケラチン 12

患者自身の細胞を用いた培養上皮シートの作製に着手した。

は陰性であった。以上の結果より、培養口腔粘膜上皮シートの25

組織学的特徴としては、表皮のように角化の方向へ分化してい2.2 羊膜を用いた培養自家口腔粘膜上皮シート移植の開発とるのではなく、非角化型の粘膜上皮としての性質を保持しなが非臨床 POC の取得

ら、角膜特異的なケラチンの一部（ケラチン 3）も同時に保持

まず家兎の培養口腔粘膜上皮シートを作製し、眼表面に自家移していることがわかった。

植して有用性について検討した 。羊膜上で培養した家兎口腔口腔粘膜を採取した同じ白色家兎に対して、輪部より 5 mm

粘膜上皮細胞は、約 7 日間でコンフルエントになり、約 14 日

外側から角膜と結膜上皮をすべて機械的に擦過除去し、角膜上間で角膜上皮に類似した 5 ～ 6 層に重層化した上皮層を形成

皮幹細胞疲弊症モデルを作製した。この眼に対して、角膜表面した。その最表層には無数の微絨毛が存在し、細胞間には多数を被覆している結膜組織を除去した後、前述の羊膜上培養口腔のデスモソームによる細胞接着が認められた。また、基底細胞

粘膜上皮シートを移植した。その結果、眼表面は移植直後からと羊膜の間にはヘミデスモソームによる接着構造が認められ

培養角膜上皮シート移植と同様な透明性を示し、移植 48 時間

た。培養口腔粘膜上皮シートのケラチンに対する免疫組織学的後には培養上皮が生着していることを確認した。移植 10 日後

検討では、粘膜特異的ケラチンであるケラチン 4 および 13 はにも、移植された粘膜上皮シートは眼表面に生着しており、し陽性、表皮角化型ケラチンであるケラチン 1 および 10 は陰性

かも 48 時間後と比較して粘膜シートより外側へ上皮細胞が伸26advances.tri-kobe.org/en

The Principles of Regenerative Medicine 88

Osamu外園
Honmou千恵 他

Stem Cell Therapy
組織工学的治療
2
1

SJS

眼類天疱瘡

熱・化学外傷

その他

合計

症例数

21

10

7

9

47

平均年齢

43.0

73.5

50.0

34.0

57.0

LogMAR 視力（範囲）2.40(1.40–3.00)

2.70(1.52–2.70)

2.70(1.22–2.70)

2.40(1.10–2.70)

2.40(1.11–3.00)

瞼球癒着（％）

18 (85.7)

10 (100)

6 (85.7)

3 (33.3)

37 (78.7)

角化（％）

8 (38.1)

1 (10.0)0 (0)1 (11.1)

10 (21.3)

2 (9.5)0 (0)6 (85.7)

2 (22.2)

10 (21.3)

術前二期的手術（％）
表 1 視力改善目的の症例構成。

展していることがフルオレセイン染色により観察された。以上の結果より、羊膜上で培養した口腔粘膜上皮シートは眼表面に

3. 手術の実際と術後管理

手術では、眼表面の瘢痕組織を切除して健康な角膜実質あるい生着・伸展し、角膜の透明性を維持することが確認された 。

は強膜を露出した後に、角膜表面あるいは強膜に培養自家口腔動物モデルでの基礎的データを踏まえ、ヒトへの臨床応用を

粘膜上皮シートを移植する。具体的には、まず眼表面の癒着部

めざしてヒト培養口腔粘膜上皮シートの作製に着手した。まを切開し、結膜下の増殖組織を除去する。角膜上に増殖組織がず、十分なインフォームドコンセントを得た後、ヒト正常口腔ある場合には、スパーテルなどを用いて輪部部分も含めて異粘膜組織を採取し、培養上皮シート作製の詳細な条件設定を試

常な増殖組織を除去し、角膜実質と強膜を露出する。0.04％

みた。家兎培養口腔粘膜上皮シート作製と同一の条件ではシー

マイトマイシン C を浸潤させたマイクロスポンジを癒着解除

ト作製が困難であり、動物種間の細胞動態の違いが観察された部の周辺結膜下に 4 分間留置し、ついで約 300 mL の生理食が、培養液も含めた培養操作過程の改変により、ヒト培養口腔

塩水で術野の洗浄を行う。広範に強膜が露出される症例では羊粘膜上皮シート作製は可能となった膜移植を併用し、培養自家口腔粘膜上皮シートを角膜または強

26

。

27,28

なお、患者自身の口腔粘膜上皮細胞を用いた再生医療として膜に縫合する（図 2）31。羊膜移植の併用例では、移植されたは、ほぼ同じ時期に Nishida ら 29,30 が開発した培養自家口腔粘上皮シートから羊膜上に口腔粘膜上皮がスムーズに伸展する

膜上皮シート移植がある。Nishida らの方法は温度感受性応答（図 3）。

皿を用いてシート状の上皮細胞を移植する方法であり、羊膜を培養口腔粘膜上皮移植は自家移植であることから、拒絶反応

使わない点が我々の方法と大きく異なる。我々が移植に用いてを制御する目的で免疫抑制薬を使用する必要はない。しかしきた培養自家口腔粘膜上皮シートは、羊膜を基質としているたながら、重症の難治性眼表面疾患、特に SJS、眼類天疱瘡におめ適度な伸縮性があり、角膜・強膜に密着するように移植する

いては、手術により高度の炎症が惹起され、上皮障害、眼表ことができる。多層の上皮細胞が基底部で羊膜と接着してお面の瘢痕化（癒着、結膜侵入など）を誘導する。したがって、り、瞬目や乾燥といった外的ストレスのもとでも細胞が脱落し術直後より眼表面の炎症を十分に抑制することがきわめて重にくいという特長を有する。

要である。ステロイド単独では眼表面炎症を制御することは困

この培養上皮シートの in vivo における機能的評価を目的と難であり、高度に眼表面が瘢痕化している症例では免疫抑制薬

して、家兎の眼表面に異種移植した。その結果、ヒト培養口腔（シクロスポリン）の全身投与を併用する 13,32。また、眼類天粘膜上皮シートは家兎モデルと同様に、角膜上皮と同様の形態

疱瘡は慢性、進行性の難治性自己免疫疾患であるが、シクロホ

学的特徴を保持し、眼表面に生着した（図 1）

スファミドなどによって疾患の進行を抑制することができる。

。

26,31

89 The Principles of Regenerative Medicineadvances.tri-kobe.org/en

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Stem Cell Therapy
組織工学的治療2
1

A: 移植の目的別、疾患別にみた症例の内訳
2002 年 6 月 24 日～ 2008 年 12 月 26 日の期間に移植を実施した症例

内訳

移植 1 回

移植 2 回

後ろ向き調査の対象：72 例 81 眼

58 例

14 例（両眼に移植：9 例、片眼に 2 回の移植：5 例）

移植数：86 移植

76 眼

5眼

移植の目的

瘢痕性角膜混濁での視力改善（40 例 #46 眼）

移植 1 回

内訳

移植 2 回

33 例

7例

移植数：47 眼

46 眼

1眼

亜急性炎症を伴う
遷延性上皮欠損での上皮修復（9 例 10 眼）

9例

1 例（両眼に移植）

移植数：10 眼

10 眼-

結膜嚢再建（21 例 22 眼）

21 例

1 例（両眼に移植）

移植数：22 眼

22 眼-

悪性腫瘍切除後再建（4 例 4 眼）

2例

2 例（両例とも片眼に2 回の移植）移植数：6 眼

2眼

2眼

その他（美容目的）（1 例 1 眼）

1例-

移植数：1 眼1眼-疾患
• SJS（21 眼、うち 2 眼に二期的移植実施）• 眼類天疱瘡（10 眼）• 熱・化学外傷（7 眼、うち 6 眼に二期的移植実施）• 無虹彩症（1 眼）• 薬物毒性による幹細胞疲弊症（1 眼）• 原因不明（3 眼、うち 2 眼に二期的移植実施）• GVHD（1 眼 *）• ザルツマン角膜変性症（1 眼）• 放射線角膜症（2 眼）• SJS（3 眼）• 眼類天疱瘡（2 眼）• 熱・化学外傷（5 眼 **）• SJS（1 眼）• 眼類天疱瘡（10 眼）• 熱・化学外傷（4 眼 **）• 瞼球癒着を伴う重度の再発翼状片（2 眼）• GVHD（1 眼 *）• トラコーマ（1 眼）• 偽眼類天疱瘡（1 眼）• 特発性瘢痕性角結膜上皮症（1 眼）• 麻疹（1 眼）• CIN（1 眼）• 結膜扁平上皮がん（1 眼）• 結膜黒色腫（2 眼 $）-図 4 早期臨床研究の症例構成。移植の目的別、疾患別にみた症例の内訳。
CIN：結膜上皮内新生物、GVHD：移植片対宿主病、SJS：スティーヴンス・ジョンソン症候群#：うち 1 例では左右の眼にそれぞれ異なる目的で移植を実施した。
*, **：同じ症例の同じ眼に異なる目的で 1 回の移植を実施した。
$：同じ症例の同じ眼に同じ目的で 2 回の移植を実施した。
（© 2019 Nature Research）

advances.tri-kobe.org/en

The Principles of Regenerative Medicine 90

難治性眼表面疾患では、ほぼ全例が高度ドライアイを合併しており、人工涙液の頻回点眼を行う。これらの患者では眼表面

A

B

C

D

E

F

が易感染性となっており、なかでも SJS では MRSA の保菌と感染に注意する必要がある 13,32。眼表面の術前評価および術後管理は、手術予後を決める重要な要因である。
4. 臨床試験での治療効果と解釈
4.1 概要京都府立医科大学において 2002 年に世界初の臨床での成功を得たのち 31、難治性眼表面疾患の病態を呈する幹細胞疲弊症を対象に、慎重に症例を重ねていった 33,34。症例数が次第に増えていくなかで、2008 年より先端医療振興財団における橋渡し事業の外部シーズとなり、臨床研究情報センターの支援のもとで、初回より 2008 年 12 月までに実施した培養自家口腔粘膜上皮シート移植全 72 例（81 眼、86 手術）を対象に、後ろ向き調査と統計学的解析を実施した 14,35 ～ 37。
移植対象となった疾患の内訳は、SJS（21 例）、眼類天疱瘡（20 例）、熱・化学外傷（13 例）、結膜悪性腫瘍（4 例）、その他（14 例）であった。治療目的は、瘢痕性角膜混濁での視力改善（47 移植）、亜急性炎症を伴う遷延性上皮欠損での上皮修

図 5 代表的な症例。
上皮シート移植を実施した目的は、A、B：視力改善、C、D：上皮修復、E、F：癒
着解除である。術前（A、C、E）と術後 24 週（B、D、F）の比較。
Elsevier 社の許諾を得て文献・38 より改変（© 2018 Elsevier）。

A, B: Reprinted from Ref. 35 with permission from Elsevier; C, D: © 2017 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

Osamu
外園
Honmou千恵 他

Stem Cell Therapy
組織工学的治療2
1

復（10 移植）、結膜嚢再建（22 移植）、その他（7 移植）に大別された（図 4）。角膜再建（視力改善、上皮修復の目的）では細胞疲弊症、放射線角膜症、移植片対宿主病（GVHD）、無虹

SJS が最も多く、結膜嚢再建では眼類天疱瘡が最も多かった。

彩症などが含まれていた（表 1、図 4）。放射線角膜症 1 眼で移植前、移植後 4、12、24 週、最終受診時（2008 年 12 月

は再移植を行った。

まで）の視力、前眼部所見を調査し、上皮シート移植の目的別

術後 24 週時に最良矯正視力の改善がみられたのは、SJS でに有効性を評価した。また有害事象をすべて抽出し、発現に関21 眼中 12 眼（57.1％；95％信頼区間〔CI〕34.0 ～ 78.1％）、

連する因子を、全例を対象に多変量解析により探索した眼類天疱瘡で 10 眼中 3 眼（30.0％；95％ CI 6.7 ～ 65.2％）、

。

35,38

熱・化学外傷で 7 眼中 3 眼（42.9％；95％ CI 9.9 ～ 81.6％）
4.2 上皮シート移植の効果であった（図 5A、5B）。このうち角膜実質混濁の高度な症例

視力改善目的群の術後 24 週における最良矯正視力の改善率

では、移植された上皮が安定化したのちに全層ないし表層角膜は 46.8％、上皮修復目的群での眼の上皮欠損スコア改善率移植を行った 34。熱・化学外傷では、そのような二期的移植を

は 90.0％、癒着解除目的群での瞼球癒着スコアの改善率は行った症例が 6 例あり、移植後に視力が向上した。

68.2％であり、各群ともに統計学的に有意な有効性を認めた。

最も重症の難治性眼表面疾患は、瞼球癒着や上皮の異常分化である角化を呈する症例であり、end-stage とも呼ばれ、通常

4.2.1 視力改善

は移植の適応外とされる 7。視力改善目的群のうち、術前の瞼視力改善を目的として 40 例 46 眼に 47 手術を実施した 35。移球癒着を 37 眼（78.7％）、角化を 10 眼（21.3％）に認め、術植対象となった疾患の内訳は、SJS（17 例 21 眼）、眼類天疱前の平均 LogMAR 視力は 2.40、すなわち指数弁であった。指瘡（9 例 10 眼）、熱・化学外傷（6 例 7 眼）、その他（8 例 9

数弁以下の視力が手術で 0.01 以上になれば、文字を読んだり眼）であった。「その他」の疾患には、特発性（原因不明）幹

自分で歩いたりすることが可能となる。そこで、術前に指数91 The Principles of Regenerative Medicineadvances.tri-kobe.org/en

Osamu外園
Honmou千恵 他

Stem Cell Therapy
組織工学的治療21

弁以下（最良矯正視力 0.01 未満）であった症例が術後 24 週眼類天疱瘡は、SJS や熱・化学外傷のような急性所見を呈すに 0.01 以上を得た割合を critical visual improvement rate とることはまれである。自覚症状に乏しいまま発症し、数年かけして計算したところ、SJS、眼類天疱瘡、熱・化学外傷の順にて緩徐に結膜嚢の短縮が進行し、最終的に角膜上皮幹細胞疲弊

50.0％（14 眼中 7 眼）、42.9％（7 眼中 3 眼）、20.0％（5 眼を生じて角膜混濁に至る。培養自家口腔粘膜上皮シート移植に

中 1 眼）であった。このうち、熱・化学外傷は二期的な全層なよる眼類天疱瘡での結膜嚢再建は、上皮幹細胞疲弊に至る前の

いし表層移植後に視力向上を得た。通常は手術適応外とされるレスキュー、すなわち stem cell protection としての意義が高重症眼で約半数に改善がみられたことは特筆すべきであると

いと考えられる。

考える。

熱・化学外傷では、移植後 4 週で全例の癒着スコア改善が得られ、以後再発傾向を認めなかった。一方、眼類天疱瘡で4.2.2 上皮修復は最終観察日まで 5 眼（50％）で改善が維持されたが、4 眼急性炎症を伴う遷延性上皮欠損（9 例 10 眼〔両眼が 1 例〕）の（40％）では癒着の再発を認めた。眼類天疱瘡の術後経過が改全例で上皮が修復し、7 眼は移植後 4 週以内に上皮欠損が消失

善と悪化の 2 群に分かれた理由が、ホスト要因によるものか、した（図 5C、5D） 。原疾患の内訳は SJS が 3 眼、眼類天疱

環境要因によるものなのかは不明であり、眼類天疱瘡のさらな瘡が 2 眼、熱・化学外傷が 5 眼であった。

る解明が今後の課題である。

38

急性炎症を伴う遷延性上皮欠損とは、SJS あるいは熱・化学
外傷の急性期に輪部を含む全角膜上皮欠損を生じ、眼表面の炎4.3 有害事象

症が遷延したまま上皮欠損が治癒しない病態である。点眼・軟

有害事象としては、遷延性上皮欠損を 24 件 22 例（30.6％）、

膏・内服による消炎、眼帯や治療用ソフトコンタクトレンズに感染症を 3 件 3 例（4.2％）、ステロイドによる眼圧上昇を 7よる上皮保護など、あらゆる治療に抵抗性であり、角膜感染症

件 7 例（9.7％）に認めた。遷延性上皮欠損は全例で最終的にや角膜融解、角膜穿孔を生じて失明に至るリスクが高い。これ治癒し、これらの有害事象のために失明した症例はなかった。

らの合併症を回避できたとしても、結合組織を伴った結膜組織

遷延性上皮欠損の発現の有無に関連する要因を、全移植例をが緩徐に角膜表面を被覆してほぼ失明に至る。この病態に対し対象に多変量解析で探索したところ、原疾患（P ＝ 0.0119）、て培養粘膜（角膜または口腔粘膜）上皮シート移植を行うと、涙液メニスカス（P ＝ 0.0323）、移植前の角膜内血管侵入手術と同時に角膜表面の上皮化が得られ、感染や穿孔といった（P ＝ 0.0806）の 3 つの要因が見いだされた。すなわち、原疾

重篤な合併症を回避できる。また手術による上皮化とともに眼患が SJS であること、涙液産生が乏しくメニスカスが非常に低表面炎症が沈静化し、瘢痕性変化を抑制できる

いこと、移植前の角膜内血管侵入が高度であり瞳孔を覆う程度

。

6,38

培養他家角膜上皮シート移植は急性炎症を伴う遷延性上皮欠損に良好な結果をもたらしたが、培養自家口腔粘膜上皮

6,23であることが、遷延性上皮欠損の発現のリスクとなることが示唆された。実際、これら 3 つの要因をすべてもつ移植眼 10 眼

シート移植でも同様の結果が得られた。

中、7 眼において術後に遷延性上皮欠損が発現していた。

4.2.3 癒着解除

4.4 長期経過

癒着解除を目的として培養自家口腔粘膜上皮シートを用いて二期的手術などの追加の介入なしに 3 年以上経過を観察した

結膜嚢再建された症例は 21 例 22 眼（両眼が 1 例）である。

17 例 19 眼における長期の臨床成績では、移植された口腔粘原疾患は眼類天疱瘡が 10 眼と最も多く、ついで熱・化学外傷

膜上皮は術後 6 カ月で安定化し、長期に眼表面で良好な上皮がが 4 眼、SJS が 1 眼、その他が 7 眼であった。

維持されていることが明らかとなった 36。

眼類天疱瘡における癒着解除目的群の瞼球癒着スコアは 10
眼中 6 眼で改善し、結膜嚢癒着スコア上下合計は 10 眼中 7 眼

4.5 前向き臨床試験

で改善した（図 5E、5F）。眼類天疱瘡の 5 眼（50％）では白以上の解析結果を踏まえ、対象を難治性疾患の中でも最重症の内障手術を上皮シート移植と同時に施行した。

3 疾患（SJS、眼類天疱瘡、重症熱・化学外傷）に限定し、前advances.tri-kobe.org/en

The Principles of Regenerative Medicine 92

Osamu外園
Honmou千恵 他

Stem Cell Therapy
組織工学的治療2
1

向き臨床試験として先進医療制度のもとに、2014 年 9 月から2017 年 3 月までに 22 例で培養自家口腔粘膜上皮シート移植を実施した 37。現在、その結果を解析中である。

CF (0.004)

難治性眼表面疾患における不正乱視とドライアイの軽減を目COMET的として、独自にデザインした直径 13 ～ 14 mm のハードコ
ンタクトレンズ（輪部支持型コンタクトレンズ）を開発した。
臨床研究では特に SJS 患者において著しい視力改善と QOL 改善が得られた 39。そこで SJS を対象として医師主導治験を実施
し、2016 年 2 月に薬事承認を得た 40。

0.05

培養自家口腔粘膜上皮シート移植後の眼表面にも不正乱視が存在する。移植後に上皮が安定化したのちに輪部支持型コン輪部支持型コンタクトレンズ

タクトレンズを装用すると、不正乱視が緩和されて視機能が向上する（図 6）41。すなわち、輪部支持型コンタクトレンズの装用により培養自家口腔粘膜上皮シート移植の治療効果を増強することが可能となる。
5. 今後の展望と課題

培養自家口腔粘膜上皮シート移植は、難治性眼表面疾患による視覚障害患者に光をもたらすものであり、将来的な適応拡大も可能と思われる。しかし社会への橋渡しにあたっては、医0.9

From Ref. 41 © 2019 Kyoto Prefectural University of Medicine

4.6 輪部支持型コンタクトレンズを用いた視覚リハビリテーション

図 6 輪部支持型コンタクトレンズによる視機能向上。
眼表面に高度の癒着を伴うスティーヴンス・ジョンソン症候群の症例であり、術前視力は指数弁（0.004）であった。角膜に移植された患者自身の口腔粘膜上皮
は術後半年でほぼ安定し、視力は 0.05 となった。さらに輪部支持型コンタクト
レンズを用いることで、視力 0.9 ～ 1.0 を得た。術後 7 年を経ても同じ状態を維持している。
COMET：培養口腔粘膜上皮シート移植
文献 41 より改変。

学的側面と社会的側面の双方に次のような課題がある。
植が可能になるかもしれない 42。一方で、上皮細胞は移植され5.1 適応拡大た部位と環境によってその形態や性質が変化するが、それらをSJS、眼類天疱瘡、熱・化学外傷は、角膜上皮だけでなく結膜制御する因子については十分にわかっていない。培養他家角膜上皮の幹細胞も失われる疾患である。類似の病態を呈する疾患

上皮シート移植、培養自家口腔粘膜上皮シート移植はともに、として、GVHD や特発性（原因不明）幹細胞疲弊症があり、将原疾患によって予後が異なった。上皮シートの細胞そのものに来的な適応拡大が望まれる。

関する研究や、細胞の性質と環境の関係など、細胞生物学的な早期臨床研究で、その他に分類された症例には悪性腫瘍 4 例

探求を今後も継続していく必要がある。

が含まれる。結膜扁平上皮がんでは、腫瘍切除後の再建のため

最近、我々はフィーダーフリーの無血清培養系を用いて口腔に羊膜移植と角膜上皮移植が単独あるいは併用して実施され粘膜上皮シートを作製する新しい技術を開発した。この新しいる。培養自家口腔粘膜上皮シート移植が併用できれば、腫瘍切プロトコルにより、非臨床研究で良好な結果を得ている 43。新除時に安全域を十分にとりやすくなり、手術後の速やかな上皮

しい培養プロトコルを用いた第 III 相臨床試験が進行中である。

修復が期待できる。
5.3 社会的課題
5.2 医学的課題

再生医療の実用化には、細胞培養センターなどの設備に多額のiPS 細胞から角膜上皮細胞様細胞への分化誘導が報告されたこ

投資が必要となるが、対象が希少疾患の場合には、企業は投資とから、将来的には両眼性疾患での培養自家角膜上皮シート移の回収が見込めない。一方、視覚障害の軽減は社会保障費（障93 The Principles of Regenerative Medicineadvances.tri-kobe.org/en

Stem Cell Therapy
組織工学的治療2
1

害年金など）の減少、労働力の増加につながり、社会への恩恵が多大である。ところがまた、社会保障費の減少は企業の収益には反映されないのである。企業収益と社会貢献の間のバラン
スをとることが非常に重要である。
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Osamu
外園
Honmou千恵 他

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The Principles of Regenerative Medicine 94

Osamu Honmou
金丸 眞一

Stem Cell Therapy
組織工学的治療3
1

組織工学的手法による鼓膜再生療法
金丸 眞一

公益財団法人 田附興風会 医学研究所 北野病院耳鼻咽喉科・頭頸部外科

公益財団法人 神戸医療産業都市推進機構 医療イノベーション 推進センター

要旨

鼓膜穿孔は単に鼓膜に穴が開くだけでなく、難聴の発症 や 悪 化 に 伴 い、 患 者 の
QOL を著しく低下させる。
また、最近の研究で、難聴は認知症の発症を助長する
大きな要因の 1 つであるこ

鼓膜穿孔に対する現行の治療法よりも安全で簡便な新しい閉鎖法が、公益財団法人神戸医療産業都市推進機構 医療イノベーション推進センター（TRI）に関連した研究者によって開発された。この手法では、穿孔縁を新鮮創化して幹細胞の活性化を図った
うえで、塩基性線維芽細胞増殖因子を含浸させたゼラチンスポンジを、新たな細胞が成長するための足場として留置するのが特徴である。2019 年 8 月、この治療法は厚生労働省による承認を受け、鼓膜穿孔を有する患者を対象とした国内発の組織工学的療法となった。

とがわかってきている。急速に高齢化が進む日本やその他の国々では、コミュニ
ケーション障害がもたらす種々の問題を過小評価すべきではない。近年の組織工学の発展は、我々が手にできる治療法に大きな変革を生じさせた。それは、生物が本来持つ自己修復のシス
テムを取り入れた治療法（再生医療）の開発である。
鼓膜は本来、再生しやすい組織である。そのメカニズ

1. はじめにムを解明して理解するこ再生医学では、不可逆的に損傷した組織・臓器の再構築を図るため、細胞の分化・増殖を誘導し、再生という生命現象を人為的にコントロールすることを目指すものである。
生体の一部が損傷された場合、生物には、それをもとに戻そうとする基本的な性質がそなわっている。もとの状態が回復する程度は、障害の大きさによる。ごく軽微な損傷の場合は自然に治癒し、完全にもとの状態にまで再生する。損傷がそれより重たい場合には、もとの状態には戻らず、変形や変質が伴う。自然にそなわった再生能力は、組織や臓器によっても異なる。例えば肝臓などは全体の半分を切除しても数か月でほぼもとの大きさまで再生できる。また、再生能力は動物種によっても大きく異なる。例えば、イモリやトカゲでは、尻尾や足を切ってももとの状態に戻る。一般に、細胞分裂の盛んな組織・
臓器ほど再生力は旺盛で、下等な動物ほどよく再生するといえる。さまざまな動物種の足場

組織工学の � 要素
細胞とが、患者にとって受け入れやすい、より安全でより簡便な治療法の開発につながった。穿孔縁を新鮮創化したうえで、塩基性線維芽
細胞増殖因子を含浸させたゼラチンスポンジを、新たな細胞が成長するための足場として留置する治療法で
ある。

責任著者
金丸 眞一
E-mail:調節因子

kanemaru@ent.kuhp.
kyoto-u.ac.jp

良好な再生環境

図 1 組織工学の 3 要素。

組織・臓器の再生

95 The Principles of Regenerative Medicineadvances.tri-kobe.org/en

Osamu Honmou
金丸 眞一

Stem Cell Therapy
組織工学的治療
3
1

ツチ骨柄

耳小骨

鼓膜

軟骨部

ツチ骨柄

弛緩部

半規管
蝸牛

骨部

中耳

外耳道

内耳

鼓膜輪

図 2 鼓膜の構造。

鼓膜臍

緊張部

発生過程や再生を研究することにより、自然には起こらないヒれを臨床に応用する段階となると、医学的のみならず倫理的、トの組織・臓器の再生を引き起こし、本来の状態を回復させる

社会的な問題が山積しているため、今のところは限定的であ方法を探るのが再生医学である。

る。例えば、細胞移植の安全性、採取する細胞の出所、拒絶反

再生医学の源流は、1950 年代に欧米を中心に行われた人工応などの課題がある。今後、再生医療が治療の中心的な柱とな臓器開発のための研究にある。人工臓器を体内に移植すること

るか否かは、現時点ではまだ未知数といわざるをえないが、数を目指して、組織親和性の高い素材の研究開発が行われたので多くの研究から、組織・臓器が再生するということの糸口はすある（これは、体外で使用することを念頭においた人工透析なでにつかめている。おそらくさほど遠くない将来には、再生医どの研究とは異なる流れとなる）。その結果、医学と工学が融療が現行の医療を変える新しい医療の 1 つになるのはまちが合し、組織工学という、再生医学の基盤ともいえる新しい医学

いないだろう。

の分野が生まれるに至った（〔組織〕再生医工学とも呼ば1～3れる）。組織・臓器を再生させるためには、組織再生のもとに

本稿では筆者らが鼓膜再生療法 4,5 の開発に至った経緯と、単一施設による予備試験の結果につき概説する。

なる細胞、それが分化・成長するための足場、それらを調節する因子、という 3 つの要素を適切な環境におくことが必要とな

1.1 鼓膜の構造る（図 1）。この細胞・足場・調節因子の 3 つを、組織工学の鼓膜は、外耳と中耳の境界にある非常に薄い膜である。直径

3 要素と呼んでいる。再生医学は、近年の組織工学、分子生物

8 ～ 10 mm で、漏斗状をしており、中央部には鼓膜臍と呼ば学、発生遺伝学などの目覚ましい進歩によって支えられ発展しれるくぼみがある（図 2）。鼓室側には、耳小骨の 1 つであるてきた。特に、人工多能性幹細胞（iPS 細胞）の作製をはじめツチ骨柄が付着している。また、鼓膜の周縁は、鼓膜輪と呼として、幹細胞の研究が大きく進んだことがある。こうした研ばれる線維軟骨様組織を介して外耳道骨と接している。鼓膜究の進展により、選択できる細胞の幅が大きく広がり、疾患モ

は、外耳道の皮膚に連なる上皮層、コラーゲン線維組織からデル、創薬への応用などに大きな飛躍がみられた。しかし、こなり鼓膜に強度を与える固有層（中間層）、鼓室粘膜に連なる

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粘膜層の 3 層構造をなしている。また、鼓膜は緊張部と弛緩な圧変化による圧外傷などを原因とする鼓膜穿孔に対しては、部に分けられ、前者はこの 3 層構造を有しているが、後者は少なくとも半年程度の経過観察が第一選択となる。一方、中耳中間層を欠いており、中耳内圧の影響を受けやすい構造となっ

炎後あるいは鼓膜チューブ留置後の穿孔遺残、さらに熱傷や放ている。鼓膜の栄養血管は固有層上にあり、その数は加齢と射線治療後の鼓膜穿孔については、何らかの外科的治療が必要

ともに減少する傾向がみられる。栄養血管の多くは、鼓膜輪、になることが多い。

ツチ骨柄・鼓膜臍に集まっている。
1.4 鼓膜穿孔に対する現行の治療
1.2 鼓膜穿孔の問題点

現行の鼓膜穿孔閉鎖治療は、鼓膜形成術と鼓室形成術が主体で鼓膜穿孔がある場合、鼓膜で音を十分にとらえられなくなるだある。また、小穿孔に対しては、穿孔縁を新鮮創化するなどしけではない。穿孔を通じて鼓室内に直接音が侵入し、その音がてコラーゲン膜やキチン膜などで表面を覆う治療がなされる

振動エネルギーとして蝸牛の正円窓を通じて内耳に入り、蝸牛場合もある 8。鼓膜形成術は、鼓膜穿孔だけを対象に治療する

階を下（蝸牛基底回転）から上（蝸牛頂）に向けてのぼっていもので、中耳内に炎症・感染や病変がなく、耳小骨連鎖が正常く。一方、残存鼓膜を通じて正規のルートで入った音は、卵円な症例を対象に行われる手術である。一方、鼓室形成術は鼓膜窓経由で前庭階を下から上へとのぼっていく。両方の振動が蝸

穿孔の有無にかかわらず、主として中耳内の炎症・感染や病変

牛頂付近でぶつかり合うと、キャンセル効果によって急激なエの除去を目的に行われる手術で、耳小骨連鎖が正常な症例に対ネルギーの減衰をきたし、聞こえを妨げることになる。また、する鼓室形成術Ⅰ型のほか、耳小骨損傷の程度に応じて耳小骨

語音明瞭度も下がるため、言葉を聞き取りにくくなる 。特に連鎖再建を行うⅡ型からⅤ型までの術式がある。いずれの術式

鼓膜穿孔に老人性難聴が加わると、穿孔の大きさにもよるが、でも鼓膜穿孔に対しては、側頭筋膜などの自家組織を採取し、聴力低下が著しくなり、補聴器が必要となる。しかし、補聴器

残存鼓膜の上皮層を剥離して中間層である線維層との間に挿装用は、上記のキャンセル効果をいっそう大きくすることにな

入する方法や、穿孔周囲の粘膜層（最深層）に傷をつけて、そり、大きな音が入っても言葉の聞き取りは改善されない。

の部位に自家組織を接着させる方法などが用いられている。自6

また、鼓膜穿孔があると中耳が外耳道を通じて直接外部に曝されることになる。その結果、中耳炎に罹患しやすくなる。ま家組織を足場として、上皮層と粘膜層が伸びることで鼓膜が閉鎖される。

た温度変化や圧変化が加わると、めまいや内耳障害をきたし、これらの方法の利点は、自家組織による再建であることから長期的には内耳障害による感音性難聴をも引き起こす。した

組織間の親和性がよく、成功率が高いことである。しかし、鼓膜がって、中耳の伝音環境を良好に維持し、内耳障害を予防するの 3 層構造のうち、中間にある線維層は他の 2 層と比較して再ためにも、できるかぎり穿孔を閉鎖することが望ましい。

生されにくいことから、通常、これらの術式で得られた鼓膜には正常な中間層はない。具体的には、移植した自家組織は、徐々1.3 鼓膜穿孔の原因に縮重して中間層を欠いた弱い鼓膜が残る場合と、縮重せずに

世界保健機関（WHO）によると、慢性中耳炎の患者数は全世界残った自家組織のために非常に分厚い鼓膜になる場合と、さらで 3.3 億人にものぼる 。通常、慢性中耳炎は鼓膜穿孔を伴っにそれらが混在する場合など、さまざまである。当然、その部ており、それに加えて、鼓膜穿孔の原因には物理的・機械的損位にふたたび穿孔が生じても自然閉鎖することは少ない。

7

傷、鼓膜チューブ留置後の穿孔遺残、熱傷、放射線治療なども聴力という観点からみると、耳小骨連鎖が正常である場合にあるため、鼓膜穿孔を有する患者の数がさらに多いことは確か

は、鼓膜穿孔を閉鎖することで、ある程度の聴力回復は得られである。

る。だが、気骨導差のない理想的な聴力を取り戻すことは難し

物理的・機械的損傷による鼓膜穿孔は、3 か月以内にほとんい。ツチ骨との接触具合や鼓膜の肥厚の有無によって伝音効率

どが自然治癒するといわれている 。したがって、頭部骨折なが変化するからである。また、耳後部の皮膚切開と、鼓膜再建

どで鼓膜に大きな変形をきたした場合などを除いて、耳かきな材料としての自家組織の採取が必要となり、それに伴う耳介周どによる単純な鼓膜穿孔や、平手打ちや爆風、航空機での急激囲の感覚消失や違和感などさまざまな後遺症を伴う。

7

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性化され、活発な活動が開始すると考えられる。一方、慢性の鼓膜穿孔では、これらの細胞は活発な活動を休眠している状態にある。このように、鼓膜が損傷した場合には、損傷そのものがトリガーとなって再生のメカニズムにスイッチが入るものと考えられる。しかし、感染や慢性炎症などによって再生環境が悪くなっている場合や、大穿孔の場合には、細胞の成長が途中で止まり、穿孔が残存することになるのである。したがって、
図 3 自然治癒した鼓膜穿孔。白い矢印は線維層のない透明な鼓膜を示している。その領域には栄養血管を認めない。透明な領域の周縁に白くみえるのは、再生した線維層の最先端部分である。

再生環境を良好な状態に保つことがきわめて重要である。
このような鼓膜再生の自然経過の観察から、鼓膜再生を効率よく進行させるには以下のことが必要であることがわかる。
• 中間層である線維層の成長促進• 各層が成長するための足場の提供

2. 新たな治療技術の生物学と非臨床 POC• 鼓膜の再生を効率よく行うための良好な再生環境の維持

2.1 鼓膜穿孔治癒のメカニズム

外傷などで健康な鼓膜に穿孔が生じても、小穿孔の場合は自然

2.2 中間層である線維層の成長促進

治癒することが多い。そのため、この鼓膜再生のメカニズムに種々の増殖因子が発見されているが、臨床に応用できるものは

ついて、多くの研究がこれまでに行われてきた。大半は少ない。この中で塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）は、日動物実験によるもので、それによると、鼓膜を構成する 3 層構

本国内では製剤としてすでに市販化されており、皮膚潰瘍など

造のうち上皮層が最初に伸び、それを足場にして他の層が伸びで保険適用が認められている。その薬理作用は、細胞に対するることが明らかになっている 。つまり、再生に際して各層の直接的な増殖効果と、血管に対する増殖効果である 15,16。

9 ～ 129再生速度と再生のしやすさが異なっている。中間の線維層は鼓正常鼓膜の再生には、再生速度が遅く再生しにくい中間層で膜に強度と弾力性を与えているが、その上と下にある上皮層やある線維層の再生と、3 層構造を支える十分な血流の維持が不粘膜層と比較して、再生速度が遅く再生しにくい。そのため、可欠である。この観点から bFGF は理想的な要素をそなえてい再生の速い上皮層と粘膜層が中間層を超えて互いに接着してる。すなわち、その名が示すとおり、線維層の再生に不可欠なしまうと、線維層が成長する場がなくなり、それ以上成長でき

線維芽細胞を増殖させる直接作用を有すると同時に 17、血管をなくなる。この時点で上皮層と粘膜層の再生が止まってしまう

誘導して周囲組織に栄養を供給する作用を兼ねそなえていると、穿孔が残存することになる。一方、再生が進行して穿孔がのである。

閉鎖された場合には、線維層のない脆弱で透明な鼓膜が形成されることになる（図 3）。再生した線維層の最先端部分は白色

2.3 各層が成長するための足場の提供となり観察可能である。再生した鼓膜は軽度の圧変化によって組織の再生において、細胞が成長するための足場の選択は非常

再穿孔をきたすことがある。

に重要である。足場として不可欠な性質は、組織親和性が高い

鼓膜は本来非常に再生しやすい組織である。このことから、
鼓膜およびその周辺には、鼓膜再生を推し進める組織幹細胞もことと、一定期間足場を提供した後に吸収・分解され消失することである。

しくは前駆細胞が存在することが示唆される。実際、これらの

我々の鼓膜再生療法は、鼓膜再生の足場素材として生体吸収細胞が鼓膜輪、ツチ骨柄・鼓膜臍に存在する可能性が高いこと、性材料に増殖因子を含浸させて鼓膜欠損部に留置し、これを生

また、鼓膜が損傷するとこれらの細胞が活発に増殖を開始する

体接着糊で固定するというものである。足場素材として我々がことが動物実験で報告されている。これらの細胞は、平常選択したのは、ゼラチンスポンジである。ゼラチンスポンジ

は鼓膜の細胞の入れ替わりを支える以上の活動は行っていな

は、コラーゲン分子の三重らせん構造が熱変性によってほどけ

いが、鼓膜が損傷を受けると、それによって修復システムが活たものを主成分とする混合物である。液体を含ませると、自由advances.tri-kobe.org/en

13,14

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E
H
25
47

E
H
21
14

コラーゲン

100µm

ゼラチンスポンジ

100µm

図 4 コラーゲンとゼラチンスポンジの構造の密度の違いを示した電子顕微鏡
写真。

再生前

再生処置後 � か月

図 5 再生した鼓膜。鼓膜再生処置から 2 か月後の再生した鼓膜は、すりガラスのような外見をしている。多くの血管がみられることから、中間層が再生していることがわかる。白い矢印は残存したゼラチンスポンジを示している。

な形状をとるやわらかい塊となり、コラーゲンと比較して非常に疎な構造をしている（図 4）。ゼラチンスポンジは生体内で存し、外側（外耳道側）には痂疲となって、ゼラチンスポンジ

は 1 か月以内に加水分解されて消失する

が、鼓室内は空が分断されて存在していることがわかる。このことは再生鼓膜気を有する空間であり、通常の生体内部とは異なるため、消失が、非常に疎な構造をもつゼラチンスポンジの内部（図 4）をまでには数か月を要すると思われる。

進んで成長していることを示しており、この点が、これまでの

18,19

本治療法がこれまでの多くの治療法と異なるのは、足場素材

鼓膜再生療法と異なっている。すなわち、シート状のコラーゲとして形状が自由な塊としてのゼラチンスポンジを使用した

ン膜のような密な構造の足場に対しては、組織はその足場の内点にある。これまでの手法では、鼓膜欠損部にシート状の足場部を進んで再生することはなく、上方か下方のいずれかに沿っ素材を張りつけ、その底面に沿って周囲組織が伸びるという方て再生する。一方、ゼラチンスポンジのような疎な構造の足場法をとる。鼓膜穿孔が小さく、修復する箇所が平面的な部位のは、細胞の伸長を妨害しないため、足場の中を再生細胞が通過みであれば、これでも修復可能な場合がある。しかし、鼓膜のして鼓膜を修復することが可能となる。

形状は複雑で、しかも耳小骨が付着するため、鼓膜欠損が大きくなればなるほど平面的なシート状の素材で全体を覆うこと

2.4 良好な再生環境の維持は難しくなる。完全に欠損部を覆うことができなければ、足場組織が再生するためには、生体内培養の良好な環境を整備するのない部分が生じて鼓膜の修復が不可能となるか、あるいは、ことが重要である。本治療法では、フィブリン糊を滴下してゼ周囲組織との癒着が生じて後遺症を残すことになる。実際、こラチンスポンジの表面をフィブリンの膜で被覆することによ

れまでの治療法では、ある程度以上の大きさの鼓膜欠損や耳小り、一定期間足場を固定し、ゼラチンスポンジの内部を湿った骨にかかる欠損がある場合には、足場で欠損部全体を覆うこと

状態に保ち、外部から隔絶された培養環境を作り出している。

ができないため、修復が不可能である。
一方、ゼラチンスポンジは、どのような複雑な鼓膜欠損に対しても容易に全体を覆うことができ、鼓膜の全欠損に対して

3. 処置の手順

鼓膜再生療法は in situ 組織工学の概念にもとづき、細胞・足も有効である。ほとんど残存鼓膜のない大穿孔であっても本場・調節因子という組織工学の 3 要素のうち、細胞として内因治療法により再生が可能であるのは 、この足場素材の選択に性の組織幹細胞 / 前駆細胞、足場としてゼラチンスポンジ（スよる。また、ゼラチンスポンジには bFGF を徐放する効果もあ

ポンゼル ®、アステラス製薬）、調節因子として bFGF（フィブ

り 21、そのことも鼓膜再生に有利に働いている。

ラスト ®、科研製薬）を用い、さらに再生環境を良好なものと20

本治療法による鼓膜再生が完了した症例を観察するとするためにフィブリン糊（ボルヒール ®、化学及血清療法研究（図 5）、鼓膜の内側（鼓室側）にゼラチンスポンジの一部が残

所 / ベリプラスト ®、CSL ベーリング）を使用している。細胞99 The Principles of Regenerative Medicineadvances.tri-kobe.org/en

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に関しては、細胞移植を行うのではなく、鼓膜穿孔縁の新鮮創

12

化によって、活動を停止している（休眠状態にある）内因性の組織幹細胞 / 前駆細胞が活性化されることを利用している。
具体的な処置の流れを図 6 に示した。残存鼓膜とその周辺を含めた外耳道を麻酔するために 4％リドカインを含浸させた綿球を外耳道から挿入し、約 15 ～ 20 分間留置する。その後、鼓膜切開刀やローゼンの探針などを用いて、鼓膜穿孔縁の新鮮創化を図る。その際、穿孔縁の全周にわたり、鼓膜が有する 3 層構造すべてが露出するようにする。
次に、ゼラチンスポンジに bFGF を含浸させ、鼓膜穿孔の大3

�％リドカインによる浸潤麻酔

鼓膜穿孔縁を新鮮創化

ゼラチンスポンジに
bFGF を含浸

ゼラチンスポンジを留置

4

きさに合わせてそれをトリミングし、鼓室内および外耳道に充填する。この際、ゼラチンスポンジが鼓膜穿孔縁と完全に接し、残存鼓膜を鼓室側と外耳道側から挟むように、複数個のス
ポンジを隙間なく留置することが重要である。最後にフィブリン糊を数滴滴下し、ゼラチンスポンジ全体を被覆・接着する。
3 週後、鼓膜上面の痂疲を除去すると、再生した鼓膜を確認できる。痂疲が固着している場合は、4％リドカインを含浸させた綿球を外耳道から挿入し、約 15 ～ 20 分間留置した後に除56

去するとよい。1 回の鼓膜再生処置で完全な再生が得られない
場合は、鼓室内や外耳道内に残ったゼラチンスポンジなどを除去した後に同処置を繰り返し行うが、最大 4 回までにとどめる。これは、これまでの臨床経験から、5 回目以降の処置で鼓膜再生が達成される確率が非常に低いからである。また、鼓膜再生処置を行った後、感染・炎症による耳漏を認めた場合は、
いったん再生処置を中止し、抗生物質の内服・点耳などにより消炎・耳漏停止を図り、十分な時間間隔（数か月かかる場合もある）ののち再開する。まれに、ゼラチンスポンジ、bFGF、フィブリン糊に対するアレルギー反応を示す症例もあることを念頭においておく必要がある。
4. 臨床試験の結果

フィブリン糊でゼラチン
スポンジを被覆・接着� 週後に痂疲を除去

図 6 鼓膜再生療法の処置の手順。1：4％リドカインを含浸させた綿球で、残存鼓膜とその周辺を含めた外耳道を浸潤麻酔。2：鼓膜穿孔縁を新鮮創化。3、4：
b-FGF 含浸ゼラチンスポンジを留置。5：フィブリン糊でゼラチンスポンジを被覆。6：処置から 3 週後に痂疲を除去。

4.1 単一施設による予備試験の範囲であった。鼓膜穿孔の原因の内訳は、慢性中耳炎（N ＝4.1.1 症例構成

136）
、外傷性鼓膜穿孔陳旧症例（N ＝ 42）、滲出性中耳炎に対

本鼓膜再生療法の臨床における有効性と安全性を評価する目的する鼓膜切開ないし鼓膜チューブ留置後の穿孔遺残（N ＝ 26）、

で、金井病院（京都）の治験審査委員会の承認を受け、書面に鼓膜穿孔閉鎖術ないし鼓室形成術施行後の再穿孔（N ＝ 15）、
熱よるインフォームドコンセントが得られた患者を対象に、単一傷（N ＝ 4）、放射線照射後（N ＝ 3）
、不明（N ＝ 6）であった。

施設による予備試験を実施した。患者は、鼓膜穿孔を有し、中鼓膜穿孔の大きさにより、患者を Grade Ⅰ（鼓膜穿孔が全耳・外耳に活動性の感染・炎症がないことを確認した総数 218

体の 1/3 以下）、Grade Ⅱ（全体の 1/3 以上 2/3 未満）、Grade例（232 耳）で、男性 101 例、女性 117 例、年齢は 8 ～ 91 歳

Ⅲ（全体の 2/3 以上）の 3 群に分類した。

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4.1.2 処置の手順

Grade Ⅰ
（N ＝ 85）

Grade Ⅱ（N ＝ 83）

Grade Ⅲ（N ＝ 64）

鼓膜穿孔閉鎖率81.2%(69/85)

86.7%(72/83)75.0%(48/64)

聴力改善（3 周波数の平均値）

9.1 dB

12.4 dB

16.3 dB

真珠腫

1

3

5

鼓膜陥凹

8

14

13

4.1.3 評価法

48

7

鼓膜穿孔閉鎖の成功を、穿孔の大きさ、閉鎖に要した処置の回

鼓膜穿孔の大きさによる分類

有害事象

一過性耳漏

Grade Ⅰ、鼓膜穿孔が全体の 1/3 以下；Grade Ⅱ、全体の 1/3 以上 2/3 未満；
Grade Ⅲ、全体の 2/3 以上
TM、鼓膜；AEs、有害事象；Chole、真珠腫性中耳炎；TO、一過性耳漏；
DTM、鼓膜陥凹

表 1 鼓膜再生療法に関する単一施設による予備試験の結果。

1

2

処置の手順は上述のとおりである。処置後は、患者に強い鼻す
すりや鼻かみなど耳に圧力がかかるようなことをしないよう、
また洗髪・入浴時に患側耳に水が入らないよう注意し、3 週間後の外来受診を指導した。

数、最終処置 3 か月後の聴力改善の程度で評価した。有害事象の有無は記録された。
4.1.4 結果
結果を表 1 に、再生例を図 7 に示す。鼓膜穿孔閉鎖率は 81％（189/232 耳）で、気骨導差の少ない良好な聴力改善が得られた。鼓膜再生が成功した 189 耳のうち、閉鎖に要した処置の回数は 2 回以下が 80％以上を占めていた（図 8）。有害事象としては一過性耳漏が最も多く（35/232 耳、15.1％）、鼓膜陥凹した症例（19/232 耳、8.2％）の一部で鼓膜切開を要したものがあった（5/232 耳、2.2％）。また、真珠腫（9/232 耳、
3.9％）は鼓膜上皮下にできたもので、いずれも探針で除去で34きる程度のものであった。
鼓室形成術などで鼓膜輪やツチ骨が欠損した術後の症例では、再生が難しかった。鼓膜輪やツチ骨が温存されていたとしても、術後症例での閉鎖率は 26.7％（4/15 耳）であった。熱傷、放射線治療後の鼓膜穿孔例は、まったく再生しなかった。以上の結果から、これらの症例では組織幹細胞 / 前駆細胞の消失が考えられた。3 か月の観察期間中、4 例に再穿孔が認められたが

5

6（4/232 耳、1.7％）、大きさはすべてピンホール程度であった。

Reprinted from Ref. 4, with permission

5. 鼓膜再生療法の適用基準

5.1 鼓膜再生療法の適用除外項目
鼓膜穿孔を有する患者のうち、鼓膜再生療法の現在の適用基準を満たすものは、わずか 20 ～ 30％程度である。今後、適用患者数をいかにして増大させるかが大きな課題となる。次に示
す鼓膜再生療法の適用除外項目は、これまでの臨床試験などの
図 7 慢性中耳炎を 30 年前から患っている 65 歳女性に対する鼓膜再生療法。
1：再生処置前。2：鼓膜穿孔縁を新鮮創化。3：b-FGF 含浸ゼラチンスポンジを留置し、フィブリン糊で被覆。4：処置から 3 週後の再生した鼓膜と、鼓室内に残ったゼラチンスポンジ。5、6：鼓室内に残ったゼラチンスポンジを除去すると、処置から 4 か月後の再生した鼓膜には多くの血管が認められる。

101 The Principles of Regenerative Medicine

結果を踏まえたものである。
1. 鼓 室や外耳道に活動性の感染・炎症あるいは耳漏がある患者
2. 鼓膜、鼓室、外耳道が湿った状態であるか、残存鼓膜に高度の石灰化を認める患者
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3. 側頭骨の高分解能 CT で鼓室や乳突腔に軟部組織陰影がみら
れる患者
4. 鼓
 膜形成術や鼓室形成術のような中耳手術の既往がある患者
5. 熱傷もしくは放射線治療による鼓膜穿孔の患者

不完全閉鎖

��％

完全閉鎖

��％

�回

�％

�回

��％

6. 中耳の正常な形態が損なわれている患者（鼓膜輪の欠損や残存鼓膜の癒着など）

鼓膜穿孔の閉鎖
N＝���
N

7. 外耳道が狭いために鼓膜穿孔縁の顕微鏡による直接の観察が不可能な患者
このうち 1 ～ 3 は再生環境が悪い状態、4 ～ 6 は鼓膜再生のもとになる組織幹細胞 / 前駆細胞が部分的にあるいは完全�回に欠如した状態、7 は外耳道が狭いために鼓膜穿孔縁の全周にわたる新鮮創化ができない状態、と分類できる。

�回5.2 適用拡大に向けて

��％
��％

閉鎖に要した
処置の回数
N＝���
N

適用除外項目の中で、4 ～ 6 の組織幹細胞 / 前駆細胞が欠如した状態は最も再生が難しく、細胞と足場の同時移植以外に再生方法はないと考えられる。一方、1 ～ 3 では、再生環境を改善
できれば、鼓膜再生が可能となる。また、7 では、外耳道が狭い
ために鼓膜穿孔縁が顕微鏡で直視できないが、内視鏡を使用す

図 8 予備試験における鼓膜穿孔閉鎖率と閉鎖に要した処置の回数。最大 4 回の処置による鼓膜穿孔閉鎖率は 81％（189/232 耳）であった。閉鎖に要した処置の回数は 2 回以下が 82％を占めていた。

ることで鼓膜全体の観察と処置が可能になるようであれば、内視鏡下での鼓膜再生が可能であり、それでも観察・処置が困難

残存鼓膜に高度の石灰化・異所性骨化を認める症例、あるいな症例では、外耳道拡大後の鼓膜再生といった手段が考えられは鼓膜裏面に上皮の侵入（真珠腫）を認める症例では、これらる。4 ～ 6 と比較すると、これらのいずれの処置も容易に行えの残存鼓膜をすべて除去したうえで鼓膜再生処置を施行するるものである。3 の鼓室や乳突腔に軟部組織陰影がみられる状（図 9）。

態では、通常、鼓室形成術・乳突削開術などで骨削開を行い、鼓室内に限局した病変がある症例、主として鼓室内に限局しこれらの病変を除去する必要がある。また、6 のうち中耳の形た真珠腫や腫瘍に対しては、真珠腫や腫瘍を除去した後に鼓膜態が著しく損なわれている場合や、癒着性中耳炎などで残存鼓再生処置を続けて施行する。病変の除去は顕微鏡下あるいは内膜に大きな変形がある場合は、再生が非常に困難と考えられる。

視鏡下いずれで行ってもよいが、その後必ず内視鏡による鼓室内の観察を行い、鼓室内に残存病変がないことを確認する必要

5.3 再生処置前に行う再生環境の改善がある。鼓室内に限局した真珠腫、なかでも先天性真珠腫は、手慢性中耳炎の非活動期で耳内が湿った状態の症例、あるいは活術時間も短く最もよい適用となる。また、腫瘍の中では、鼓室動性の感染・炎症や耳漏があるが、そのほかの適用基準を満た

型グロームス腫瘍がよい適用である。これらの症例での鼓膜穿す症例（いわゆる慢性中耳炎の急性増悪）に対しては、まず保孔閉鎖率は非常に高く、自験例では 95％以上となっている 20。

存的治療として抗生物質の内服・点耳を行って、1、2 か月経過観察する。これにより消炎が可能となった場合、手術室で鼓5.4 外耳道狭窄への対策

室内の洗浄を繰り返し行い、綿球で鼓室内の粘液などの除去を

鼓膜穿孔の有無にかかわらず、外耳道が狭い症例は比較的よく十分に行った後に続けて鼓膜再生処置を施行する。この方法でみられる。外耳道は長さ約 30 ～ 35 mm、直径約 10 mm の管の鼓膜穿孔閉鎖率はかなり高く、自験例では 70 ～ 80％となっ状構造で、入口から手前 1/2 が軟骨部外耳道、奥 1/2 は骨部ている（図 9） 。

外耳道となっている。成人と小児では若干の形状の差はある

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1

1

2

3

図 9 慢性中耳炎を有する 39 歳女性に対する鼓膜再生療法。処置前（1、2）および処置から 2 か月後（3）のファイバースコープ所見。この症例は耳漏があり、残存鼓膜には石灰化（黒い矢印）が認められた。外耳道の前壁と下壁が張り出しているため（白い矢印）、鼓膜穿孔縁の顕微鏡による直接の観察は不可能であった。鼓室内の洗浄を行い、石灰化した残存鼓膜を内視鏡的に除去してから鼓膜再生処置を施行した。処置から 2 か月後の再生した鼓膜には石灰化もなく正常にみえる。

が、軟骨部と骨部の移行部で軽度屈曲している（図 2）。外耳

内耳さらには後迷路、中枢神経に至る複雑な要因がかかわって道狭窄例では、骨部外耳道の張り出しのために、鼓膜穿孔縁のいる。例えば、乳突蜂巣の発育が悪く、耳管機能の悪い鼓膜穿顕微鏡による直接の観察が不可能になっていることが多い。こ孔症例に対して鼓膜再生処置を行った場合、穿孔を通じてなさの場合、上述したように内視鏡を使用することで、ほとんどのれていた中耳圧の調節ができなくなるため、鼓膜の陥凹や滲出症例で鼓膜穿孔縁の新鮮創化が可能となる。しかし、外耳道の性中耳炎が発症し、聴力の回復が不十分になることもある。

張り出しが極端に強い症例では、内視鏡とともに手術器具を入れて操作できないため、外耳道の拡大が必要となる。

鼓膜穿孔のおもな原因は、慢性中耳炎である。したがって、
慢性中耳炎症例の鼓膜再生は、最も大きな課題である。慢性中外耳道狭窄部の内腔表面に、長軸に沿った方向とそれに垂直耳炎症例の多くは、鼓室のみならず乳突腔にも病変が存在し、な方向に切開線を入れ、表面の軟組織を一部剥離して張り出し

乳突蜂巣の発育が悪く、耳管機能も悪いことが多い。このようた骨面を露出し、
ダイヤモンドバーを用いて削除して表面を平滑な症例では、従来の鼓室形成術・乳突削開術と鼓膜再生療法のにする。鼓膜穿孔縁が十分に観察できるまで拡大し、鼓膜再生処併用による治療が考えられる。すなわち、鼓室内病変と乳突腔置を施行する。この後、剥離した外耳道軟部組織をもとに戻し、の病変は乳突削開術を含めた術式によって除去し、鼓室と乳突

鼓膜再生処置で使用した bFGF 含浸ゼラチンスポンジ片を骨露腔の交通を十分につけたうえで、通常の自家組織移植ではなく出部を中心に留置し、フィブリン糊で固定する。骨露出範囲が広鼓膜再生療法により鼓膜を再建する。しかし、鼓膜再生を可能

い場合は、外耳道全体にゼラチンスポンジを充填し、フィブリンにするためには、組織幹細胞 / 前駆細胞を温存する目的で、鼓糊で固定する。その後、医療用フィルムで耳介全体をカバーして膜は全層剥離で鼓膜輪を損傷しないこと、ツチ骨およびツチ骨密閉する。充填したゼラチンスポンジは 3 週後に除去する。この柄・鼓膜臍に付着している残存鼓膜を温存することが必要不可

方法により、外耳道軟組織と鼓膜の同時再生が可能である欠である 13,14。このため適用症例は限られ、より高度の手術手

。

20,22

6. 今後の展望

技が要求される。また、真珠腫性中耳炎では、中耳ガス交換能の障害により、中耳の陰圧化、上鼓室の陥凹、真珠腫の形成が6.1 慢性中耳炎症例に対する展望と課題起こるが、ここに至るメカニズムを改善しなければ、再発が起鼓膜再生療法の最大の目的は、患者の負担が少ない低侵襲手術

こってしまう。さらに、中耳の陰圧化は癒着性中耳炎も引き起による、気骨導差のない理想的聴力の回復である。鼓膜穿孔をこすので、鼓室形成術・乳突削開術と鼓膜再生療法を単に併用

閉鎖することのメリットは、聴力改善や違和感の消失、中耳炎

するだけでは、この疾患の完治は望めない。乳突蜂巣再生術なの防止や長期的には中耳・内耳の保護など非常に多い。しかし、

ど、中耳ガス交換能の改善を含めた手術 23,24 との併用が必要に

聴力に関しては、単純に鼓膜穿孔だけの問題ではなく、中耳・なると考えられる。

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Osamu Honmou
金丸 眞一

Stem Cell Therapy
組織工学的治療
3
1

6.2 組織幹細胞 / 前駆細胞が欠如した症例に対する展望と課題

途上国にあっては若年者層が患者のボリュームゾーンである

組織幹細胞 / 前駆細胞が欠如した状態は、最も再生が難しいとことから、鼓膜再生療法の手軽さとコストの面でのメリットは、考えられる。したがって、組織幹細胞 / 前駆細胞をどのように大きな利点となる。先進国ではさらに、鼓膜穿孔に対する治療確保するかが、きわめて重要な問題となる。これらの細胞が鼓をあきらめていた中高年層の治療に対する心理的ハードルを下膜輪、ツチ骨柄・鼓膜臍に存在する可能性が高いことはすでにげ、難聴による認知症のリスクを減らすことが可能になる。

述べた。鼓膜は複雑な形状をしており、その再生には鼓膜14,15輪とツチ骨が両者ともに必要不可欠と考えられる。具体的な方法として、例えば死体から、鼓膜輪とツチ骨を含めた鼓膜を得る方法が考えられる。それらを脱細胞化し、抗原となる物質を除去したのちに、患者由来の間葉系幹細胞を培養する処置を経て、これを足場として移植するといった方法である。この場
合、部分的移植か全移植かは症例ごとに検討する必要がある
が、鼓膜や耳小骨の大きさには個人差が少ないこともあり、鼓室形成術との併用で実現可能な治療法である。
6.3 鼓膜再生療法の展望
通常の鼓膜形成術などの耳科手術は、本格的な手術室と多岐にわたる手術器具が必要で、通常は全身麻酔下で施行される。また、耳後部の皮膚切開と側頭筋膜など自家組織の採取をはじめとし、外耳道の剥離、骨削開、鼓膜上皮層の挙上、穿孔縁の新鮮創化、側頭筋膜の移植、タンポンワークなど多段階の手術処置を要し、少なくとも 1 時間程度の手術時間が必要である。加
えて、感染や移植筋膜のずれを防止するために、一定期間の安静や日常生活における制約を伴う。さらに大きな問題として、
これらの耳科手術を施行できる技量をもった医師の養成にはかなりの年月を要し、それを指導する上級医の存在が不可欠である。これに対し、本鼓膜再生療法で単純穿孔を処置する場合には、穿孔縁の新鮮創化とゼラチンスポンジの留置のみを行え
ばよく、わずか 15 分程度の処置で終わる。外来の診療用の椅
子あるいは簡易ベッド上での処置が可能で、使用する処置器具
も 3、4 種類にとどまり、簡便な顕微鏡あるいは内視鏡があれば十分治療可能である。術後の入院や安静も不要で、処置後の通院も 3、4 週に 1 回程度で済む。また、医師の養成に関しても、従来の手術手技と比較して非常に容易であることから、短期間により多くの術者を育成可能である。医療経済的な視点から両治療法を比較すると、鼓膜再生療法は鼓膜形成術の数分の 1 以下の費用に収まることになる。費用効率の利点に加えて、鼓膜
穿孔閉鎖率はほぼ同程度を達成し、聴力の改善については鼓膜再生療法の方がはるかに良好な結果をもたらすことができる。
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The Principles of Regenerative Medicine
再生医療原論                                                                                2020 年 1 月 X 日

初版第一刷発行

企画・総合監修

公益財団法人神戸医療産業都市推進

執筆

福島 雅典、本望 修、湊口 信也、藤田 靖之、黒田 良祐、外園 千恵、金丸 眞一  他

発行

センター長

福島 雅典

医療イノベーション推進センター

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