下痢性貝毒オカダ酸群の機器分析
Instrumental analysis of diarrhetic shellfish toxin okadaic acid analogues（独）水産総合研究センター中央水産研究所

水産物応用開発研究センター衛生管理グループ グループ長・博士

鈴木敏之

Toshiyuki Suzuki
National Research Institute of Fisheries Science

はじめには検出している毒の種類についての情報が得られるも東北地方では昔から「桐の花が咲く頃、ムラサキイガ手法とは言えない。マウス毒性試験の代替検査法としイを食べるな」という伝承があり、二枚貝がある特定のて様々な分 析 法が開 発されているが、麻 痺 性貝毒で時期に毒を持つことは古くから知られている。本来毒をは、蛍光 HPLC 法 3）が、また、下痢性貝毒においては、持たない二枚貝がどのようにして毒を蓄積するのか、とLC/MS/MS 法 4）が汎用的な検査法として注目されていいう毒化のメカニズムの詳細については、依然として解る。2015 年 1 月から欧州連合（EU）において下痢性貝

明すべき課題も残されてはいるが、ほとんどのケースで、毒のマウス毒性試験が廃止され、LC/MS/MS 法の導入

毒の一次生産者である有毒プランクトンを二枚貝が餌とが決定されるなど、欧米諸国ではマウス毒性試験のようして食べ、その毒を体内にそのまま蓄積するか、あるいに生きた動物を使用する検査を可能な限り制限しようとは代謝により毒の化学構造の一部を変換して蓄積するしている。また、国内の情勢としては、食品安全委員会

ことにより毒化する。こうして毒化した二枚貝は、外見やにおいて下痢性貝毒オカダ酸群のリスク評価が行われ味覚において普通の二枚貝と識別することが困難であており、検討内容は評価書として公開されることになる。

るため、人が中毒許容量を越える二枚貝を食べたときそれを受けて、厚生労働省や農林水産省においては、に食中毒が発生する。貝毒には中毒症状に因んで、麻下痢性貝毒公定法や関連通知等の改正が始まる見通痺性貝毒、下痢性貝毒、記憶喪失性貝毒など様々なしである。のの、検査対象である貝毒に対して必ずしも特異的な貝毒があるが、我が国で問題になっている貝毒は、麻痺性貝毒と下痢性貝毒である 1）。
貝毒による食中毒を防ぐために、水揚げされた二枚貝の毒力は定期的に検査されており、毒力が基準値を

本稿では、食品安全委員会で現在検討している下痢性貝毒について、化学構造と毒性などについて概説
し、当センターで学術雑誌等に報告した LC/MS/MSによる研究 4）を中心に分析例を紹介する。

越えると、生産者による出荷自主規制措置が講じられる1）。二枚貝の毒力検査は、厚生労働省が定めた公定法に基づいて実施されている 。公定法は、生きたマウ

下痢性貝毒オカダ酸（okadaic acid；OA）群による中毒と化学的性状

2）6スの腹腔内に貝の抽出液を投与し、マウスの生死や死

昭和 51 年に宮城県で発生したムラサキイガイによる亡時間で毒力を判定するマウス腹腔内投与法（マウス食中毒は下痢性貝毒と命名され、その後、ヨーロッパの毒性試験）である。マウス毒性試験は、貝毒検査の公大西洋岸など世界的に多くの中毒患者が発生した 5）。

定法として国際的にも広く普及しており、二枚貝の安全毒 化した二 枚貝をヒトが摂 取すると下 痢、吐き気、腹性を確保するために果たしている役割は極めて大きい。

痛、嘔吐などの症状を発症する。二枚貝を食べてからしかし、マウス毒性試験は、マウスの症状からある程度通常4時間以内に発症すること、発熱がなく腹痛が激し

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くないことでビブリオ菌食中毒などとは区別される。幸

Dinophysis 属有毒プランクトンが一次生産者であり7）、い、下痢性貝毒による死亡事例は報告されていない。

有毒プランクトンの摂食により二枚貝が毒化する。7 位水わが国では、北海道・東北沿岸域の二枚貝が毎年、散酸基に脂肪酸がエステル結合したジノフィシストキシン3発的に毒化している。貝毒監視体制により食中毒の発（dinophysistoxin-3：DTX3）は二枚貝の代謝物であり8）、生はほぼ完全に抑え込まれているが、出荷自主規制措

Dinophysis 属有毒プランクトンが生産するジノフィシスト

置により二枚貝の出荷が滞るため、二枚貝産業上の大キシン1（ dinophysistoxin-1：DTX1）が前駆体である。こきな問題となっている。

れらはいずれも脂溶性物質であり、メタノール、クロロホ

下痢の原因となっているオカダ酸（OA）群 は、これまルム、アセトンなどの有機溶媒に容易に溶解する。そのでに 10 成分を越える類縁体が報告されている（図 1）。

他に 1 位カルボキシル基にジオール類がエステル結合し6）た OAジオールエステル類も報告されている。これらはProrocentrum limaや Dinophysis 属など有毒藻類により生産され 9，10）、二枚貝に取り込まれると加水分解を受けて遊離 OAとなるため、二枚貝から検出されることはほとんどない。OAジオールエステルも脂溶性でメタノールなどには容易に溶解するが、DTX5などは極性が高く水溶性である。
OA 群の LC/MS 及び LC/MS/MS 分析
これまでに報告されている下痢性貝毒の LC/MS やLC/MS/MSによる毒の分離は、下痢性貝毒が疎水性化合物であるため、C8 や C18などの逆相分配系で内径2mm 前後のセミミクロカラムが用いられ、また、質量分析計による検出の際のイオン化は、電子スプレーイオン化法が採用されている。LC 分離の際の移動相として、蒸留水にアセトニトリルかメタノールを混合し、それに酢酸、ギ酸、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウムなどを添加した溶液が用いられている4）。酢酸やギ酸などの酸を加える理由は、貝毒化合物のイオン化の促進だけではなく、OA、DTX 群などカルボキシル基を有する酸性毒をカラムで分離する際に、移動相を酸性にすることにより、酸性官能基の解離が抑制され、酸性毒に対する分離用カラムの保持能が向上し選択性が高まる。その結果、ピーク形状がシャープになり、検出感度が向上する。最近では、カラムの保持力の向上と担体の処理技術の向上による安定性の向上により、塩基性移動相を用いた分析例も報告されている 11）。陰陽両モードによる検出が可能であるが、定 量 分 析 では 陰イオンモードによりOA や−DTX1 の［M-H］を選択する Selected Ion Monitoring−（SIM）や、［M-H］のフラグメントイオンであるm/z 255を

図 1 オカダ酸（OA），ジノフィシストキシン（DTX）群の化学構造検出するMultiple Reaction Monitoring（ MRM）分析がTHE CHEMICAL TIMES

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7一般的である。図 2 は有毒プランクトンDinophysis fortii
50 細胞からLC/MS/MSにより検出した DTX1とペクテノトキシン 2（ Pectenotoxin-2；PTX2）のクロマトグラムである 12）。Dinophysisの細胞あたりの毒量は平均すると数ピコグラムから数十ピコグラムであるが、LC/MS/MSは極めて高感度であるため、50 細胞程度を集めることにより、容易に毒を検出することが可能である。

図 3 LC/MS/MSによりホタテガイから検出される様々なDTX3 群

図 2 有毒藻類Dinophysis fortii 50 細胞から得られるLC/MS/MSクロマトグラム

OAや DTX1の二枚貝代謝物であるDTX3 群は、7 位水酸基に様々な脂肪酸がエステル結合した化合物であり、総 称して DTX3と呼ばれている。DTX3 群は、LC/MS/MSにより、結合している脂肪酸種ごとの分析が可能 である 13）。分 析 は 陰イオンモードによりDTX3 の−［M-H］を選択し、衝突解離により生じたフラグメントイオンである遊 離 脂 肪 酸に相 当するイオンを選 択 する
MRMにより、高感度な検出が可能である。二枚貝から検出される主要な DTX3 はパルミチン酸（C16：0）が結

図 4 様々な脂肪酸が結合したDTX3 の MS/MSフラグメントイオン

合した 7-O-16:0-DTX1であるが、その他に様々な脂肪酸が結合した DTX3が検出される（図 3）。図 4，5 に様々な脂肪酸が結合した DTX3の MS/MSスペクトルとフラグメンテーションダイアグラムを示す。MS/MSスペクトルは、
図 4 のような各種遊離脂肪酸のイオンに加えて、DTX1の化学構造に帰属させることができる特徴的なフラグメントイオンが検出される。こうしたイオンにより、標準品の入手が困難なDTX3の同定が可能である。
LC/MS/MSは OA 群の構造解析にも有効である 10）。
陽イオンモードにより得られるMS/MSスペクトルの方が、陰イオンモードで得られるそれよりも情報量が豊富であることから、構造解析には適している。選択するイオンは、［M+NH 4 ］+ や［M+H］+ が一般的である。
［M+Na］+ は他の化合物と同様に、OA 群においても極めて安定なイ

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図 5 DTX3 の MS/MSフラグメンテーションダイアグラム

下痢性貝毒オカダ酸群の機器分析オンであるため、LC/MS/MSによりフラグメントイオンを得影響が出にくい陰イオンモードによるOA 群の分析におることは困難である。有毒プランクトンDinophysis acuta

いても、イオン化促進により回収率が 120％を超えることから検出される OAジオールエステル（OA D8）の MS/も珍しくない。そのため、マトリクス検量線を用いた定量MSスペクトル及び各スペクトルの化学構造への帰属をが有効であるが、装置のイオン源やカラムへの負担を考

図 6，7 に示す。図 7 の枠付きのフラグメントイオンは、測慮すると、適切な前処理法を検討することも重要であ定した精密質量が理論値との比較において、誤差の範る。当センターでは現在、有効な前処理法について検囲である5ppm以内で一致したイオンである。主要なフラ討中であり、近々、学会誌等で公表する予定である。

グメントイオンピークのほとんどが一致した。下痢性貝毒OA 群の LC/MS/MSフラグメンテーションは、トリプル四重極LC/MS/MSや四重極/飛行時間型LC/MS/MS（ qtof

OA 群のカラムスイッチング自動前処理蛍光 HPLC 分析

LC/MS/MS）においては、異なるメーカーの装置でもほOA 群の蛍光 HPLC 分析は、Leeらにより1987 年に開ぼ類似した MS/MSスペクトルが得られるため、新規類発された分析法 16）であり、LC/MSや LC/MS/MS が普及縁体が発見された場合の化学構造の解析などに極めするまでは、有毒プランクトンの毒生産能や二枚貝におけて有効である。

る減毒動態の解析など研究現場を中心に活用されてきた。この分析法は OA 群が有するカルボキシル基に蛍光化試薬アンスリルジアゾメタン（ADAM）を反応させ、蛍光誘導体となった OA 群を特異的に検出する手法である。
しかし、OA 蛍光誘導体を調製した後の前処理手順が煩雑であることから、多数検体の分析が必要となる二枚貝の貝毒検査には利用しにくい一面がある。そこで、前処理をカラムスイッチングHPLCにより自動化するとともに、抽出手順などの分析手順の改良を行った 17）。装置構成
及びこの分析法により得られる二枚貝試料中の OA 蛍光

図 6 OAジオールエステル（OA D8) の MS/MSフラグメントイオン誘導体のクロマトグラムを図 8，9に示す。OA 群の添加回収実験やバラツキに関するデータは LC/MS や LC/MS/MSと比較して、むしろ良好な結果が得られている。本改良法では、使用する有機溶媒量を減らすとともに、アルカリ処理を加えてDTX3や OAジオールエステルをDTX1やOAに加水分解することにより、エステル毒の一括分析も可能になり、毒化した二枚貝の検査法として、極めて有効な手法である。本法で使用したカラムは内径 4.6mmのカラムであるが、内径 2.0mm 以下のセミミクロカラムやミク図 7 OAジオールエステル（OA D8）のMS/MSフラグメンテーションダイアグラム

ロカラムを利用すれば、使用する移動総量を1/5 程度に減らすことが可能である。蛍光 HPLC 法は、LC/MS やOA 群を対象とした LC/MS/MS 法は、EUなどの SOPLC/MS/MSとは異なり、装置の違いによるイオン化効率や（Standard Operating Procedures） にも記載された手法マトリクスの影響による定量結果の差異が生じることはほである。わが国においてもLC/MS/MS 法は下痢性貝毒

とんどない。したがって、異なる装置を用いた異なる試験

OA 群の公定法となる可能性が高い。LC/MS/MSによる室間においても均一な結果を得やすい利点がある。LC/OA 群の定量分析においては、二枚貝試料マトリクスのMSや LC/MS/MSによるOA 群の検査法の確立が注目さ影響により定量誤差が生じることが知られている

れているが、蛍光 HPLC 法についても再度、有効な検査

14）

。陰

15）

陽両モードにおいてマトリクスの影響が出るが、比較的法の一つとして認識する必要があろう。

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9機器分析用 OA 群標準品二枚貝の安全性管理のために、二枚貝試料を検査する際には、OA 群の分析用標準品が必要になる。さらに、標準品を二枚貝試料に添加し、回収率や定量結果のバラツキなどを調べ、分析手法の妥当性を評価する必要がある。分析用 OA 標準品は、カナダの NationalResearch Council（NRC）が販売しており、世界的に普及している国際標準物質である。しかし、在庫は必ずしも十分ではなく、世界的には標準品供給体制の強化が望まれているところである。NRC 標準品は、国内でも関東
図 8 OA 群分析用カラムスイッチング自動前処理 HPLCシステム

化学（株）を介して入手が可能である。DTX3 や OAジオールエステルのようなエステル型 OA 類縁体の標準品は市販されておらず、入手は極めて困難であるが、これらの化合物はアルカリ加熱条件下で、DTX1や OAに容易に加水分解される 14，17）。したがって、分析手順に簡単な加水分解手順を加えることにより、OAや DTX1に加えて、これらのエステル化合物を一括して分析することができる。現 在 検 討中の CODEX 基 準 値においても、OA 群の基準値（160μg/kg 二枚貝可食部）は、エステル毒も含めた OA 群の総量として定義されているため、試料のアルカリ加水分解は二枚貝の検査においても不可欠な処理である。
当センターでは OA 標準品を含めた様々な貝毒標準品を農林水産省の事業により製造し、配布を行ってきた。今後、下痢性貝毒検査の公定法が改正され、マウス毒性試験からLC/MS/MSなどの機器分析法に移行した場合に、貝毒の自主検査や流通した二枚貝の貝毒検査は機器分析等により行われることになる。そのためには、供給が不安定な海外の標準品のみに依存することなく、国内でも機器分析用標準品を安定的に供給できる体制を確立することが、二枚貝の安全性を確保し、それに裏付けられた二枚貝産業を振興する上で極めて重要な課題である。当センターでは、農林水産省が推進する「レギュラトリーサイエンス新技術開発事業」において、プロジェクト研究「有毒藻類の培養による各種貝毒標準品の製造技術の確立」を推進し、これまでのように毒化した二枚貝原料に依存せずに、有毒藻類の培養により貝毒標準品を安定的に製造する技術を開発した。本プロジェクト研究には、当センターの他に（株）トロ

図 9 ホタテガイから検出されるOA 蛍光誘導体のクロマトグラム

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ピカルテクノセンターが 参 画して、下 痢 性 貝 毒 OA や

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DTX1を効率的に生産する優良株を検索し、OA 群生

轄研究機関や（独）産業技術総合研究所など関係機産藻類 Prorocentrum limaの大量培養技術により、効率関が連携して、国家標準物質や国際標準物質を製造的に OA 群を製造する技術を開発した（図 10）。現在、することを目標に、関係機関間で調整が進められていこの技術を利用して、OA や DTX1 標準品を大量に製る。こうして製造された標準品が、将来的には市販さ造するとともに、厚生労働省や農林水産省及びその管れ、多くの貝毒検査者に利用されることを願ってやまない。また、国産標準品を海外に提 供・販 売することが可 能になれば、東 南アジア諸 国など、貝毒 問 題に対して十 分な対 応 がなされていない国々に対しても、少なからず貢 献することになるであろう。
謝辞
本 研 究で紹 介した研 究の一部 は、農 林 水 産 省「レギュラトリーサイエンス新 技 術 開 発 事業」におけるプロジェクト研 究「有毒藻類の培養による各種貝毒 標 準 品の製 造 技 術の確 立」中で実施された。関係者各位に図 10 OA 群生産藻類Prorocentrum lima の大量培養対して、深く謝意を表します。

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