ペプチド特異的な新規蛍光反応による
ヒト生体試料中のコラーゲンの定量
長崎大学大学院医歯薬学総合研究科 生命薬科学専攻
発明者 甲斐 雅亮
発表者 椛島 力

新規コラーゲン定量法

ヒト試料中のコラーゲンの定量(a) 3,4-DHPAAによるコラーゲンの定量

コラーゲンは細胞外マトリックスの主成分であり、ヒト全タンパク質の約30%を占める。最近の研究
で、老化した皮膚においてコラーゲンの産生が低下していること、特定の疾病においてコラーゲンの分解や蓄積が見られること、などが明らかになっている。従って、コラーゲンを正確に定量する技術は、健康維持や疾病診断において重要なツールである。
我々は最近、3,4-Dihydroxyphenylacetic acid (3,4-DHPAA)による、N末端にグリシンを有するペプチドに選択的な、新規蛍光反応を開発した(Figure 1)。本研究では、3,4-DHPAAを用いて、ヒト生体試料中に含まれるコラーゲン量を簡便かつ高感度に定量する技術を開発した。

検出限界: 0.18 µg/mL
コラーゲン標品 / 細胞抽出液
130 L
1 M 微生物コラゲナーゼ
20 L
5 mM CaCl2を含む125 mM ホウ酸緩衝液(pH 7.5)
100 L

酵素分解後酵素分解無し

蛍光強度6037˚C, 1 h50

y = 4.8137x + 2.1769
R² = 0.995

40530BO33-, pH 8.0

200100037 ˚C, 10 min

NaIO4, 37ºC, 10 min

030.2

60.4

912

ウシコラーゲン-I (µg/mL)

蛍光誘導体(c) 生体試料を用いたコラーゲン定量(b) 本技術のコラーゲン選択性

コラーゲン (ng)/µg 全タンパク質P < 0.0115

タンパク質: 10 nM*(300 KDa)

H 2O

(4.5 kDa)

H2O

アミロイドβAmyloid βprotein(37 kDa)(16.7 kDa)

トロンビンThrombin

ミオグロビン
Myoglobin(14.7 kDa)

リソソーム
Lysozyme(23 kDa)

カゼイン
Casein10

ウシ血清アルブミン
BSA（57 kDa)

N末端グリシン含有ペプチドの選択的な蛍光反応20

酵素分解後酵素分解無し

ヒトコラーゲン-III
collagen-III
Human

蛍光強度

コラーゲンは、Gly-X-Y(X, Yは主にプロリン、ヒドロキシプロリン)という3アミノ酸残基の繰り返し配列を持つ。コラーゲンを微生物由来コラゲナーゼで分解すると、N末端にグリシンを有するペプチドフラグメントを大量に生成する。これを、3,4-DHPAAによって選択的に蛍光体に変換することで、コラーゲン由来の検出シグナルを増幅でき、蛍光分光光度計にて蛍光強度を測定するだけでコラーゲンの定量が可能となる (Figure 2) 。

120100806040200

ヒトコラーゲン-IIcollagen-II
Human

Figure 1. 3,4-DHPAAを用いたN末端グリシン含有ペプチドの蛍光反応

ヒトコラーゲン-I
collagen-IHuman

3,4-DHPAA

ウシコラーゲン-I
collagen-I
Bovineペプチド250 L
250 L250 L0.75mM 3,4-DHPAA
125 mM ホウ酸緩衝液 (pH 8.0)
1.25 mM NaIO42.55*0
Cheektissue HeLa細胞
HeLa cells
頬組織

Figure 5. (a) ウシ由来コラーゲン-Iの検量線（挿入図は低濃度領域を示す） (b) 各種コラーゲンと他のタンパク質の比較 (c) ヒト試料中のコラーゲンの定量
37˚C, 1 h

現行法との比較(a) o-フタルアルデヒド（OPA）を用いたアミノ酸、ペプチドの蛍光反応
120

アミノ酸およびペプチド (10 M)
酵素分解後酵素分解無し

1201008080604037˚COn ice

10 min~10 min

蛍光測定(Ex/Em: 375/465 nm)(c) SIRCOL®コラーゲンアッセイキットを用いたコラーゲンの定量

BSA (5.0 mg)

ウシコラーゲン-I (5.0 mg)
Bovinecollagen-I (5.0 mg)

蛍光強度

5025

ウシコラーゲン-I+ウシ血清アルブミン (各5.0 mg)

Bovine collagen-I (5 mg) + BSA (5 mg)

Blank

YY

YL

YG

YF

YE

WW

WL

WG

WA

VG

PP

PG

PA

LG

LF

KA

HW

GY

GW

GP

GG

FG

EV

AP

AG0

頬組織 (33.6 mg全タンパク質)
Cheek tissue(33.6 mg total protein)

0.2

16.8
00.4

0.8

1.2

25Blank

YYY

YYL

YVG

YGG

WGG

LSF

LLL

LGF

GPHyp

GPP

GPG

(c) 長鎖ペプチド

GLF

GLA

GHK

EVF

APF

ALG

ALA

0100

33.6

頬組織Abs 55050H2OBlank

0.40Blank

75

3,4-DHPAA0.6(220 mg全タンパク質)
HeLa HeLa細胞
cells (220mg total protein)
H2O100蛍光強度

コラーゲン (g)

BSA (10.0 mg)(b) トリペプチド

67.255110

220HeLa細胞

全タンパク質 (g)Figure 6. (a) o-フタルアルデヒド(OPA)を用いたアミノ酸とペプチドの蛍光検出 (b) OPAを用いたコラーゲンと各種タンパク質の検出 (c) SIRCOLコラーゲンアッセイキットを用いたコラーゲンの定量 (d) 3,4-DHPAAを用いた本技術と市販のコラーゲン検出キット（ELISA法）との比較

本技術の利点と応用例

75
5025

Figure 3. 3,4-DHPAA蛍光反応のペプチド選択性
500

GPP

y = 11.246x + 8.1361
R² = 0.9971

GP

400

y = 10.114x + 6.6049
R² = 0.9968
y = 7.9665x + 3.8836
R² = 0.9978

GPHyp300

Blank

YGGFMRRYGGFLRKLRRASLGWHWLQLSMSYTKGGGGGGYpVFALYVFAL

TpVFALTVFAL

SpVFAL

SVFAL

WMDF

PIVQ

PISP

GGGG

GGYR

FLDG

AGSE

0AEAM

蛍光強度

ELISA

ウシ血清アルブミン (10.0 mg)

75

蛍光強度

0.8

ウシ血清アルブミン (5.0 mg)

100

HeLa細胞HeLa cells(220 (220g全タンパク質)µg total protein)

ELISA法）の比較

BSA (2.5 mg)(RFI: Relative Fluorescence Intensity)

トロンビン
ThrombinKDa)
kDa)(37(37(d) 本技術とコラーゲン検出キット（ウシ血清アルブミン (2.5 mg)(a) ジペプチド

ミオグロビン
Myoglobin(16.7KDa)
kDa)(16.7(300 KDa)

頬組織
tissuecheek(33.6(33.6g全タンパク質)µg total protein)

250 L250 L250 L250 LアミロイドβAmyloid
β proteinkDa)(4.5(4.5KDa)

40 Mペプチド0.75 mM 3,4-DHPAA
125 mM ホウ酸緩衝液 (pH 8.0)
1.25 mM NaIO4

ヒトコラーゲン-IIcollagen-II
Human0A
C
D
E
F
G
H
I
K
L
M
N
P
Q
R
S
T
V
W
Y
GP
KA
YG
VG
EVF
GPP
YVG
TVFAL
WMDF
GGGGGGSMSYTKYGGFLRK

Procedure

collagen-I
Humanヒトコラーゲン-I

040

リソソーム
Lysozyme(14.7KDa)
kDa)(14.720collagen-I
Bovineウシコラーゲン-I

蛍光強度

3,4-DHPAA蛍光反応のペプチド選択性

タンパク質: 10 nM

カゼイン
CaseinKDa)
kDa)(23(23Figure 2. 新規コラーゲン定量法の原理図(b) OPAを用いたコラーゲンおよび他のタンパク質の検出

ウシ血清アルブミン
BSAKDa)kDa)（57(67

酵素分解によって生成した大量のN末端グリシン含有ペプチド

コラーゲンを含む生体試料

ヒトコラーゲン-III
collagen-III
Human

蛍光検出
（Ex/Em: 375/465 nm）

本技術は、組織学や疾病診断を目的とした簡便かつ高感度なコラーゲンの定量法として有用である＜利点＞• 簡便で迅速、安価であり、特別な装置を必要としない。
• 既存の方法と比較して、コラーゲン選択性が高く、かつ、高感度（OPA法の約60倍、Sircolコラーゲン
アッセイキットの約5倍、ELISA法の約10倍）である。
• 培養細胞や組織中のコラーゲンを前処理なしで測定できる。
＜応用例＞• 個人のコラーゲン発現量を低侵襲的かつ日常的にチェック• 微量の組織標本から疾病マーカーとしてコラーゲン量を検査• コラーゲン関連食品添加物などの安全性試験を指向したコラーゲンおよびコラーゲン代謝物のハイスループット分析

参考文献

200100001020304050

ペプチド (M)
Figure 4. N末端グリシン含有ペプチドの検量線

1. Kabashima T, Yu Z, Tang C, Nakagawa Y, Okumura K, Shibata T, Lu J, Kai M. (2008) Peptides
29: 356-363
2. Yu Z, Kabashima T, Tang C, Shibata T, Kitazato K, Kobayashi N, Lee MK, Kai M. (2010) Anal
Biochem 397: 197-201.
3. Yasmin H, Shibata T, Rahman MS, Kabashima T, Kai M. (2012) Anal Chim Acta 721: 162-166.
4. 甲斐雅亮、椛島力、柴田孝之：ペプチドの検出方法、特願2011-045491（2011年3月2日出願）
5. 甲斐雅亮、椛島力、柴田孝之：ウイルスの識別方法、特願2011-045488（2011年3月2日出願）
6. 甲斐雅亮、椛島力、柴田孝之：ペプチドの検出方法（コラーゲン定量法）、特願2011-187969（2011年8月30日出願）