THE CHEMICAL
TIMES2016 No.3（通巻241号）
ISSN 0285-2446

特集

再生医療
板東 哲哉

●昆虫に学ぶ器官再生

濱田 良真
坂東 優希

●応用利用に向けた低分子化合物によるヒトiPS細胞の培養
ヒトiPS細胞の分化誘導プロセスにおける細胞の構造構築段階の重要性

池田 達彦
長谷川 光一 07
大貫 喜嗣
黒澤 尋 12関谷 佐智子
清水 達也 17細胞シート工学研究の基礎と医療への発展トピックス ad-MEDビトリゲル®とその創薬, 化学物質安全性試験への応用

URL http://www.kanto.co.jp

奥村 美紗
大内 淑代 02

山口 宏之 22

KANTO CHEMICAL CO., INC.

特集

再生医療

昆虫に学ぶ器官再生

Molecular basis of insect leg regeneration.

岡山大学大学院 医歯薬学総合研究科 細胞組織学分野 助教

板東 哲哉

岡山大学大学院 医歯薬学総合研究科 細胞組織学分野 博士研究員

濱田 良真

岡山大学 医学部医学科 医学科学生

奥村 美紗

岡山大学 医学部医学科 医学科学生

坂東 優希

岡山大学大学院 医歯薬学総合研究科 細胞組織学分野 教授

大内 淑代

Tetsuya Bando (Assistant Professor)
Department of Cytology and Histology, Okayama University Graduate School of Medicine, Dentistry and Pharmaceutical Sciences

Yoshimasa Hamada (Postdoctral fellow)
Department of Cytology and Histology, Okayama University Graduate School of Medicine, Dentistry and Pharmaceutical Sciences

Misa Okumura (Undergraduate student)
Faculty of Medicine, Okayama University Medical School

Yuki Bando (Undergraduate student)
Faculty of Medicine, Okayama University Medical School

Hideyo Ohuchi (Professor)
Department of Cytology and Histology, Okayama University Graduate School of Medicine, Dentistry and Pharmaceutical Sciences

キ ーワード01

再生芽、位置情報、エピジェネティック制御

はじめにヒトは事故や怪我などで手足を失うと再生することはできず、義肢に頼る生活を余儀なくされる。ES細胞やiPS細胞などの幹細胞から特定の細胞を作り出して機能を補う再生医療の基生息するフタホシコオロギを再生モデル昆虫とし、脚再生過程に働く分子メカニズムの解明に取り組んでいる。

02

コオロギの脚再生過程

礎研究と臨床応用は日進月歩で進んでいるが、現在の再生医

フタホシコオロギ（以下、
コオロギ）
はペットショップから安価

療技術では複数種の細胞が立体的な構造を形成する手足のよで購入できる（図1A）。卵から孵化した幼虫は8回の脱皮を経てうな器官を再生させることは未だ実現できておらず、失った体約1ヶ月で成虫となる3),4)。脚再生の実験には、体長約5mmの3の組織や器官を再生することは人類の夢となっている。ヒトに齢幼虫を使用する5)。コオロギのゲノムサイズは約1.7Gb、遺伝限らずマウスやニワトリなど哺乳類や鳥類の再生能は低く、既存の実験モデル動物を用いた器官再生の基礎研究には困難が伴う。
しかしながら実験室の外に目を向けると、器官再生能の高い生物が多数存在することに気づく。
トカゲは、敵に襲われると尻尾を自切し、その後に元通りに再生することができる。両生類の再生能が非常に高いことはよく知られており、イモリやサンショ
ウウオは手足や尻尾、脳や心臓の一部すら再生できる。扁形動
物のプラナリアに至っては、小さく切られた断片から体全体を再生することが可能である1)。昆虫類では、蛹期を経ずに成虫へと成長する不完全変態昆虫類の幼虫が非常に高い再生能を有している。ゴキブリを用いた器官再生の形態学的解析が1970年代に精力的に行われていたが、分子生物学的な解析が行われないままに研究が途絶えてしまっていた2)。我々は、亜熱帯に2

図1

再生モデル昆虫コオロギの脚再生過程

THE CHEMICAL TIMES
2.2. 再生芽形成

器官再生において最も重要なステップが再生芽の形成であ発現解析が可能であり、またRNA干渉法(RNAi)による遺伝子る。再生芽は、傷上皮の直下、既存の組織の遠位端に形成され機能阻害、piggy/Bacトランスポゾンを用いた遺伝子導入、人る組織で、幹細胞と同様の高い増殖能と多分化能を有する再工酵素ZFN、TALEN、CRISPR/Casによるゲノム編集などを応

生芽細胞の塊である。再生芽には気管や筋肉が無く細胞の密用することで、器官再生を遺伝子レベルで解析することができ度が高いため、既存の組織との判別は容易である。分化した細る。

6), 7)

胞がiPS細胞のように脱分化を起こして再生芽細胞になると考

コオロギの脚は、体幹部に近い側から基節、転節、腿節、脛

えられており、速やかに細胞増殖を繰り返して再生芽を形成し節、附節、爪に分かれている。後脚の脛節は背側に数対の棘が、たのち、適切な時期に細胞増殖を停止し様々な細胞へと分化す

遠位端に6本の脛節棘が形成される。附節はさらに3つの脚節ることで、失った組織を再生させる。

に分かれており、附節第1節には附節棘が形成される（図1B）。

再生芽形成にはたらく分子メカニズムを明らかにするため、コオロギの脚を脛節の中ほどで切断すると、以下の4つのス

切断後24時間のコオロギの脚ならびに未切断の脚からRNAをテップを経て失われた部分が再生される。
（１）
創傷治癒；切断面抽出し、次世代シーケンサーを用いて比較トランスクリプトーが瘡蓋で覆われた後、傷上皮が傷口を塞ぐ。
（２）
再生芽形成；脚ム解析を行った。再生脚では、免疫や幹細胞の増殖に関わるの遠位端において、再生芽が形成される。再生芽細胞は分化細Jak/STATシグナル因子や、腫瘍形成の抑制にはたらくHippo胞が脱分化した細胞で、幹細胞と同様に高い増殖能と多分化能

シグナル因子の発現上昇が見られた。再生芽形成におけるこれを持つ細胞であり、再生する組織の元となる。
（３）
位置情報の

らシグナル経路の役割を明らかにするため、RNAiを用いてシ認識；既存の組織の位置情報と遠位端に形成された再生芽の位

グナル因子の機能低下実験を行った。Jak/STATシグナルを構

置情報を元に、失われた部分が認識される。
（４）
再パターン形成するインターロイキン受容体Domeless (Dome)、
ヤヌスキ

成；再生芽においてパターン形成遺伝子が再発現し、失われた

ナーゼHopscotch (Hop)、転写因子Statに対してRNAiを行う

部分のみが再生芽細胞から分化して再構築される

8), 9)。これらのステップを経て、約2週間で元通りの形態と機能を有する脚が再生する（図1C, 図2）
。以下にコオロギ脚再生の各ステップの分子メカニズムを概説する。

特集 再 生 医 療

子数は約20,000と推定されている。幼虫および成虫のさまざ

まな組織に対してin situ hybridization法を用いた遺伝子の

hop RNAi個体では附節が小さく再生したが、dome RNAi個体とと、Stat RNAi個体では再生が全く起こらなかった（図3A）。
Stat RNAi個

体では、細胞分裂の進行に必須なサイクリンEの発現が半減していたことから、再生芽細胞の細胞増殖が低下して再生が阻害されたと考えられる（図3B）。またJak/STATシグナルの活性を抑制するSocs2やSocs5に対してRNAiを行うと、再生脚におけるサイクリンEの発現は上昇し、再生脚は正常脚よりも長くなった（図3A,B）。これらの結果からJak/STATシグナルは再生芽の細胞増殖を活性化する、再生に必須のシグナル経路といえる
11)。また、Hippoシグナルを構成するセリンスレオニンキナーゼ

Warts (Wts)や、Hippoシグナルの上流ではたらくプロトカド
ヘリンFatやDachsous (Ds)に対してRNAiを行うと再生芽領

図2

脚再生過程の組織学的解析（文献 8)を一部改編）

2.1. 創傷治癒

ヒトと同様に昆虫も体が傷つくと瘡蓋が形成されるが、昆虫は脊椎動物とは異なり開放血管系であるため血球成分は異なっている。ショウジョウバエを用いた研究から、瘡蓋の形成に

図3

はプロフェノールオキシダーゼカスケードによる血漿成分の凝

域が肥大し
（図4A）
、再生芽での細胞分裂が増加した（図4B）。

固が必要であることが分かっている。傷を受けた上皮細胞では

FatやDsとHippoシグナルを中継する非典型ミオシンDachs

JNKやERKが活性化し、転写因子Grainy headの働きにより上皮細胞が移動して傷口を閉鎖することも明らかにされている
10)。コオロギの創傷治癒についてはまだほとんど分かっていな

いが、同様の分子メカニズムで瘡蓋や傷上皮の形成が起こると考えている。

Jak/STATシグナルによる再生芽形成の制御（文献 11)を一部改編）(D)や、Hippoシグナルにより抑制的に制御される転写コアク

fat RNAi,
チベーターYorkie (Yki)に対してRNAiを行うことで、

ds RNAiやwts RNAiによる再生芽の肥大は抑えられた
（図4A）
。これ

らの結果から、Hippoシグナルは再生芽細胞の増殖を抑制するために必要であることが分かった12)。

3

THE CHEMICAL TIMES

特集 再 生 医 療の移植部位から、前側と後側に過剰な脚が形成された（過剰肢
形成）。これらの移植実験の結果から、コオロギの脚にも遠近軸
方向や円周方向に沿った位置情報があること、移植により位置情報の不連続が発生した場合は連続性を回復するよう最短で位置情報を挿入するように挿入再生が起こること、各脚節の位
置情報は等価であること、が示唆された8), 13)。
図4

Hippoシグナルによる再生芽形成の制御（文献 12)を一部改編）

既存の組織の分化した細胞が脱分化する過程を制御する分子メカニズムは未だ不明な点が多い。分化した細胞では、特定の細胞系譜で発現する遺伝子の発現はオンに、不必要な遺伝子の発現はオフに制御されており、遺伝子発現のオンオフはエ
ピジェネティックな機構により制御されると考えられている。実際、
ヒトiPS細胞においても、
ヒストンH3のメチル化状態がiPS
細胞への脱分化の効率に影響することが分かっている。前述のコオロギ再生脚の比較トランスクリプトーム解析においてもヒストンの修飾酵素の発現が変化していることから、再生芽細胞への脱分化にエピジェネティックな機構が働いているのは確からしいが、詳細な分子メカニズムは未解明である。また近年、
カエルの尾部再生やアホロートルの四肢再生において、切断に伴って傷害部位に遊走してくるマクロファージが再生に重要な働きをすることが報告された。コオロギの脚再生においてもマ
クロファージによる炎症と脚再生の関係が明らかになりつつあ

図5

遠近軸方向の位置情報と挿入再生

器官再生において位置情報を担う分子は、遠近軸方向または円周方向に濃度勾配を形成し、各脚節に繰り返して同じパターンで発現する、と期待される。位置情報を担う分子の候補として、我々はHippoシグナルの上流ではたらくプロトカドヘリン
FatとDsおよび非典型ミオシンDに着目した。胚の肢芽と再生

ds とd は遠位から濃脚においてfat は近位から中位にかけて、度勾配を形成し、各脚節で繰り返し同じパターンで発現した。そる（板東、未発表）。

こでRNAiを用いてこれら遺伝子の発現を低下させたコオロギ

2.3. 位置情報の認識（図6A）。挿入再生や逆挿入再生は位置情報の不連続が生じ

胞は、既存の組織の位置情報を認識し、組織の失われた部分のたコオロギでは位置情報が保持されていないと考えられた。位切断された脚の遠位端に再生芽が形成される。再生芽の細みを再生させる。生物における位置情報とは、組織などの細胞集団の中でそれぞれの細胞が持つ空間的な場所の情報を指す

で移植実験を行うと、挿入再生や逆挿入再生が起こらなかった
たときに起こることから、RNAiによりfat, ds, d の発現が低下し置情報が保持されていない脚を切断した場合、どの位置で切断されたか、どの部分を再生するべきかが認識されないため、概念である。発生過程においては前後、背腹、左右の3軸に沿って形成されるモルフォゲンの濃度勾配やホメオボックス遺伝子の発現などにより規定されると考えられている。器官再生においては、1970年代にFrenchらによるゴキブリの脚の移植実験

から遠近軸方向と円周方向の位置情報の概念が提唱された2)。
Bryantらは、イモリの四肢再生においても同様の位置情報の概念が適応できることを見出したが、位置情報の分子実体は未解明のままである。
コオロギを用いてFrenchらと同様の4種類の移植実験を行った。
（１）
脛節を近位で切断したホストに、脛節を遠位で切断したグラフトを移植すると、脛節の中位部分が欠失した脚になる。欠失した中位部分は数回の脱皮の後に挿入再生された（図
5, 挿入再生）。
（２）
脛節を遠位で切断したホストに、脛節を近位で切断したグラフトを移植すると、中位部分が重複した長い脚になる。移植したコオロギを飼育すると、重複する中位部分がホストとグラフトの間にさらに逆向きに挿入再生され、
より長い
脚になった
（図5, 逆挿入再生）。
（３）
腿節を中位で切断したホス
トに、脛節を中位で切断したグラフトを移植すると、腿節に脛節が直接繋がった脚になる。移植したコオロギを飼育し続けても、
腿節や脛節の長さに変化はなく関節が再生されることはなかった。
（４）
右脛節を中位で切断したホストに、左脛節を中位で切断したグラフトを背腹軸の方向を揃えて移植すると、右脚に左脚が繋がった脚になる。移植したコオロギを飼育すると、グラフト4

図6

Fatを介した位置情報の認識（文献 12) を一部改編）

THE CHEMICAL TIMES

特集 再 生 医 療

器官再生が正常に起こらずに切断位置に対応した短い再生脚になると推測される。そこでRNAiによりfat, ds, d の発現を低下させたコオロギの脚の脛節を近位、中位、遠位で別々に切断

fat などの機能を低下さして再生脚の長さを比較した（図6B）。
せたコオロギの再生脚の長さをコントロール個体の再生脚の長さと比較すると、予想した通りに、遠位で切断した脚はやや短く、近位で切断した脚はより短く再生した。我々はFat, Ds, D
が位置情報を担う分子の候補と考えており12), 14)、コオロギ以外の再生可能動物での検証が待たれる。興味深いことに、FatとDsの細胞内ドメインに結合する2本鎖RNA結合タンパク質
Lowfat (Lft)は、遠近軸方向の器官再生の際には位置情報の認識に必要であるが、挿入再生や逆挿入再生の際には必要でコオロギが再生過程に応じて異なないことが分かっており15)、
る位置情報の分子メカニズムを利用している可能性が示唆されている。
Hippoシグナルの上流ではたらくアクチン結合タンパク質
Expanded (Ex)とMerlin (Mer)は、Hippoシグナルを活性化させることで細胞増殖を抑制する。RNAiによりex やMer の発現を低下させたコオロギでは、再生芽と既存の組織において細胞分裂が亢進し、再生脚はもとの脚よりも長く再生した。

またex RNAiやMer RNAi個体の脚を用いて移植実験を行うと、逆挿入再生のパターンが異常になり、過剰肢の形成が起こらなかった。野生型個体で見られる逆挿入再生ではより遠位の位置情

ex RNAiや報を有するグラフトからのみ逆挿入再生を起こすが、

図7

Mer RNAiではホストとグラフトの両側で細胞増殖が過剰になり

脚パターン形成遺伝子群による再パターン形成の制御（文献 8),16),9),17) を一部改編）

モログは接触阻害(contact-dependent inhibition of cellEgfr RNAiを行うと脚の遠位端が再生しなかった16)。脚パターン形

両側から挿入再生を起こしていた12)。脊椎動物のExやMerのホ

proliferation)の制御に必要であることが知られている。コオ
ロギの再生脚で逆挿入再生が起こる際の細胞増殖の方向性
は、ExやMerを介した接触阻害のメカニズムにより制御されてex
いるのかもしれない。

やMer

RNAi

により過剰肢形成が抑制

RNAi

ex RNAiやMer RNAi個体の再生されるメカニズムは未解明である。

脚では細胞分裂が亢進していたため、細胞増殖能の低下による過剰肢の形成不全とは考えにくい。ExやMerが円周方向の位置情報を担う分子メカニズムと関連している可能性を検討している。

Dll RNAiでは脚の遠位側成遺伝子Dll やdac に対するRNAiでは、が再生せずdac RNAiでは脛節の遠位側と附節の近位側が再生し

17)。これらの遺伝子に対するRNAiの表現型は、
なかった
（図7C）

ショウジョウバエの相同遺伝子の変異体において観察される肢芽形成異常の表現型とよく類似しており、再生過程における再パターン形成が発生の繰り返しであることが分かる。

未切断の脚ではwg やEgfr は発現していないが、切断後の再生芽ではwg やEgfr の発現が再活性化される13), 16)。再生過程における遺伝子発現の再活性化の分子メカニズムを解析するため、再生脚で高発現するエピジェネティック因子に着目した11)。

2.4. 再パターン形成

脚の先端に形成された再生芽の細胞は、脚の位置情報を認識し、失われた部分のみを再生させるため様々な細胞へと再分化して器官を再形成する。再パターン形成は発生過程の繰
り返しと考えられており、発生過程にはたらく遺伝子の発現が再活性化されて器官を再形成すると考えられる。コオロギ肢芽
発生の初期にはWntシグナル、TGF-βシグナル、Shhシグナルのリガンドであるwingless (wg), decapentaplegic (dpp),
hedgehog (hh) がそれぞれ肢芽の腹側、背側、後側で発現する。再生過程においても再生芽でwg, dpp, hh が肢芽と同様

wg とdpp の発現が接する再生芽の遠のパターンで発現し8), 9)、

位端からEpidermal growth factor receptor (Egfr) の発現が誘導される16)。またwg やdpp の発現を受けて、再生芽の予定附節領域でDistal-less (Dll) 、予定脛節と予定附節第1節領（図7A）。コオロギにおいて域でdachshund (dac) が発現する

βカテニンをコードするarmadillo (arm) に対するRNAiを行

うとWntシグナルが不活性化されて器官再生が起こらず 、
13)遺伝子の発現はクロマチンの状態に強く依存し、クロマチンが凝集したヘテロクロマチン状態では遺伝子は発現せず、クロマチンが弛緩したユークロマチン状態に移行することで遺伝子発現が可能となる。
クロマチンの状態はDNAのメチル化やヒストンの化学修飾により制御されるが、昆虫ではDNAのメチル化はほとんど使われていないため、
ヒストンのメチル化とアセチル化を介したクロマチン状態制御が遺伝子発現の中心的な役割を担っている。なかでもヒストンH3の27番目のリジン残基のメチル化（ヒストンH3K27me3）はヘテロクロマチン化を誘導し、脱メチル化することでユークロマチン化を誘導して遺伝子発現を活性化できる。昆虫ではEnhancer of zeste (E(z))がヒ
ストンH3K27をメチル化し、UtxがヒストンH3K27me3を脱メチル化する酵素であり、未切断の脚と比較してコオロギの再生
脚ではE(z) とUtx はそれぞれ2.2倍と8.9倍に発現上昇していた11)。再生脚におけるヒストンH3K27me3はE(z) RNAiにより低下

Utx RNAiにより亢進した（図8A）。
E(z) RNAi個体の脚を脛節で切し、断して再生過程を観察すると、脛節の失われた部分と附節およ5THE CHEMICAL TIMES

特集 再 生 医 療

び爪が再生され、脛節と附節の間に過剰な脛節が挿入再生さE(z) RNAiの再生脚では脚パターン形成遺伝子dac
れた
（図8B）
。

が強く発現する領域が遠位側に拡大していた。
dac 発現の異所り、再生芽細胞の再分化にはたらくヒストンH3K27メチル化制的な再活性化により過剰な脛節形成が誘導されたと考えられる。またUtx

御因子E(z)とUtxはiPS細胞の分化においても重要なはたらき個体の再生脚では、附節において関節の形成がをすることが明らかになりつつある。昆虫からヒトへの進化には

RNAi

Utx RNAiの再生脚では附節中位において脚
抑制された
（図8B）
。

Egfr 発現
パターン形成遺伝子Egfr の発現が再活性化されず、3億年以上の隔たりがあるが、発生に重要な分子メカニズムは普遍的に保存されており、昆虫で分かったことの多くはヒトへもの低下により関節形成が阻害されたと考えられる18)。再生芽に応用できる。再生モデル昆虫から学んだ器官再生の分子メカニ

おいてはヒストンH3K4やH3K9を修飾するエピジェネティック

ズムが、ヒトの器官再生を実現する一助となれば幸いである。

因子群の発現も変化しており11)、多くの遺伝子の再発現がエピ
ジェネティックな制御を受けていると示唆されている。脚再生
におけるE(z) RNAiやUtx RNAiの表現型は、胚発生におけるE(z) RNAiやUtx RNAiの表現型とは異なっており18), 19)、
ヒストンH3K27me3

によりエピジェネティックに制御される標的遺伝子が脚再生と肢芽発生では一部異なっているのかもしれない。今後より詳細な解析に期待が持たれる。

図8

ヒストンH3K27のメチル化を介した再パターン形成の制御（文献 18)を一部改編）

03

おわりに

コオロギを再生モデル昆虫とし、脚再生過程を経時的に遺伝子レベルで解析することで、器官再生を制御する普遍的な分子メカニズムを明らかにしてきた（図9A, B）
。再生芽形成に重要

図96なJak/STATシグナルやHippoシグナルは、脊椎動物においても細胞増殖を制御する重要なシグナル経路として知られてお器官再生を制御する分子メカニズム

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Tomioka, H. Ohuchi, Leg regeneration is epigenetically regulated
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19) Y. Matsuoka, T. Bando, T. Watanabe, Y. Ishimaru, S. Noji, A. Popadić, T.
Mito, Short germ insects utilize both the ancestral and derived modeof Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes. Biol.
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特集

再生医療

応用利用に向けた
低分子化合物によるヒトiPS細胞の培養

iPS cells cultivation with small molecules for application.

京都大学 物質ー細胞統合システム拠点 研究員

池田 達彦

Tatsuhiko Ikeda, Ph.D. (Researcher)
Institute for Integrated Cell-Material Sciences (iCeMS), Kyoto University

京都大学 物質ー細胞統合システム拠点 特定拠点講師

長谷川 光一Kouichi Hasegawa, Ph.D. (Junior Associate Professor)
Institute for Integrated Cell-Material Sciences (iCeMS), Kyoto University

キ ーワード01

iPS, small molecules, cultivation

02

はじめに

ヒトES細胞/iPS細胞の培養方法

1981年にEvansらによって、はじめて多能性幹細胞である

当初ヒトES細胞の培養は牛胎仔血清を添加した培地で、
マウ

胚性幹細胞
（embryonic stem cell: ES細胞）がマウスから樹ス胎仔由来の線維芽細胞（mouse embryonic fibroblasts:

研究環境は大きく変化した。多能性幹細胞その立されて以来1)、

MEF）
をフィーダー細胞として、ES細胞とフィーダー細胞とのものに関する様々な研究が行われたのはもちろんのことであ共培養系で培養されていた。
しかしながら、牛胎仔血清や線維るが、ES細胞を用いることでキメラ胚の作製が可能となり、こ

芽細胞のロットが変わるとうまく培養できない場合がある等、れによって様々な種類のノックアウトマウスが作製されることと培養方法としては非常に不安定なものであった。そこで、フィーなった。ES細胞から作られた様々な培養細胞や病態モデルマウ

ダー細胞や血清から供給される成分の中からヒトES細胞の多ス等は今日でも多くの研究に用いられ、疾患の原因解明や治療能性の維持に寄与する成分を突き止め、安定的な培養方法を薬の開発に貢献している。さらに、1998年にはThomsonらに開発することが求められた。

よって、ヒトにおいてもES細胞が樹立され 、研究がますます加

先行するマウスES細胞の研究においては、マウスES細胞

速することとなった一方で、ES細胞の作製には生命の萌芽たるの多能性の維持にサイトカインの一種である白血病抑制因子

初期胚が必要となるとの考えから、倫理上の問題に対する議論（leukemia inhibitory factor: LIF）
が重要な役割を果たしてが持ち上がり、いくつかの国においては、ES細胞の作製が禁止いることが解明され、LIFの添加によって培養が安定することがされることとなった。そのような状況の中、2006年に山中らが明らかとなっていた。さらに近年、MAPKシグナルパスウェイがOct4, Sox2,Klf4,c-Mycの4つの遺伝子を導入することで体分化を誘導すること、wntシグナルパスウェイが多能性の維持

細胞を初期化し、誘導型多能性幹細胞（induced pluripotentに関与していることが明らかとなり、MAPK阻害剤およびwnt

stem cell: iPS細胞）を作製することに成功した3)。これによっシグナルにおいて抑制的に働いているGSK3の阻害剤を添加て、倫理上の問題に縛られることなく多様なヒト多能性幹細胞することで無血清培地での培養が確立されている4)。

2)

すなわちiPS細胞を作製・研究することが可能となり、疾患の原

一方、ヒトES細胞においては、LIFの添加は多能性の維持に因解明や治療薬の開発に加えて再生医療の分野においても研寄与しておらず、線維芽細胞増殖因子-2（fibroblast growth

究が加速することとなった。

factor-2: FGF2）やトランスフォーミング増殖因子ベータ(TGF

こうしてヒトiPS細胞を用いた研究が基礎研究から応用利用

β)スーパーファミリーのアクチビンなどからのシグナルによっへと発展する中で、その培養方法の研究・開発がますます重要て多能性が維持され、マウスと同様には培養できないことが分になってきている。すなわち、iPS細胞を作製・維持できることはかっていた。

もちろんであるが、より安全なiPS細胞を大量かつ安定的に供

このことから、現在もなお、ヒトES 細胞/iPS 細胞の培養給できる培養方法の開発が求められているのである。

は一般的にはフィーダー細胞としてMEFを用い、血清代替

本稿では、応用利用の観点からヒトiPS細胞の培養方法につい（KnockOut™ Serum Replacement: KSR）
およびFGF2をて概説する。

添加した培地で行われることが多い。一方で、フィーダー細胞を用いずマトリゲル等を基底膜マトリックスとして用いるフィー
7THE CHEMICAL TIMES

特集 再 生 医 療

ダーフリー培地も多数開発されている5)-7)。その一部を例としては解糖系がエネルギー代謝の中心となっており、酸素呼吸によ挙げると、mTeSR1やEssential8等がよく使われているほか、るエネルギー代謝は活性化していない。これは非常に興味深

国内においてはStemFit AK03Nもよく使用されているようでい現象で、発生の最初期であるnaïveでは酸素呼吸によってエある。
しかしながら、いずれも高価であるうえ、
これらにおいてネルギーを作り出しているにも関わらず、ほんのわずかに分化

もFGF2等の増殖因子が添加されており、こうしたタンパク質の進んだprimedでは発酵によってエネルギーを作り出しておの安定性が培養の安定性にも影響を与える場合があるため、り、やがて分化が進むと再び酸素呼吸によるエネルギー代謝へ応用利用のためにはより安価で安定性の高い完全合成培地のと戻っていくのである。当然のことながら、エネルギー効率の開発が望まれている。また、基底膜マトリックスはフィーダーフ

良い酸素呼吸を行っているnaïveの幹細胞はprimedよりも増リー培地で接着培養する際の細胞の足場となる重要な成分で、殖速度は速い。さらに、両者にはキメラ胚の形成能にも差があ

マトリゲル、
ビトロネクチン、ラミニン等がよく用いられているる。naïveの幹細胞はキメラ胚を形成することが可能であるが、が、継代の際には細胞と基底膜マトリックスとを解離させる必primedの幹細胞ではキメラ胚の形成は非常に困難である。

要がある。その方法としてはタンパク質分解酵素を用いる方法

通常のヒトiPS細胞はprimed状態であり、細胞の継代時にが一般的であるが、EDTAを加えたPBSを用いる方法 やカルは、単細胞に解離せずに細胞塊での継代が必要であり、継代効

シウムイオンを添加したPBSを用いる方法 8)等もあり、培地の率は作業者に依存する所も多い。ヒトiPS細胞の応用利用を考6)

種類や細胞の種類に合わせて適切な方法を選択する必要があえた場合、継代効率は非常に重要な要素であることから、
ヒトる。

におけるnaïve幹細胞の作出は近年の大きなテーマの一つで03とから、マウス等ではnaïveの幹細胞はprimedの培養条件であった。naïveから少し分化の進んだ状態がprimedであるこnaïve状態とprimed状態

さて、前項においてマウスES/iPS細胞とヒトES/iPS細胞では多能性の維持機構が異なっていることを記したが、マウスやラッ
ト等のげっ歯類由来のES/iPS細胞とその他の哺乳類由来のES/iPS細胞では様々な特性が異なっている。当初これらの違い
は種特異的な差であると思われていたが、マウスの着床直後の培養することで容易にprimedへと変化するが、ヒトiPS細胞を
primedからnaïveへと変化させることは容易ではなかった。最初に作製されたヒトnaïve ESC/iPSCはOct4とKlf4、又はKlf4とKlf2を一時的に強発現させ、MAPKの一種であるERK1/2
阻害剤、GSK3阻害剤、LIFとフォルスコリンを加えた培地で培養することで、作製・維持が可能であった13)。つまり、遺伝子導入に依存していた。
しかしその後、様々な方法・培養条件でヒト胚からもヒトES/iPS細胞様の細胞が樹立できることが報告さnaïve ESC/iPSCが作製されるようになり、現在では上記の2つ、現在では多能性幹細胞の未分化の度合いの違いによるの阻害剤に加えて、さらにいくつかの阻害剤や成長促進因子をものと考えられており、マウスやラットES細胞様のより未分化

添加することで、Oct4やKlf4等の一過的な強発現を伴うことなな状態はnaïve状態、
ヒトES細胞やヒトiPS細胞等のやや分化のくprimedからnaïveへの移行が可能となっている。これによっ進んだ状態はprimed状態と名付けられた11)。

て、
ヒトES/iPS細胞を高増殖で、解離継代が容易な培養が可能naïveとprimedの差を表す特徴としては、
まずコロニーの外となった。

れ9), 10)観が挙げられる。naïveの幹細胞はやや厚みのある重層的なnaïve

primed

多能性の維持LIFシグナルに依存

FGF、
アクチビンシグナルに依存

コロニー形状

ドーム状で重層的

平面的

ティックな特徴としてX染色体の不活性化が挙げられる。ヒト

単一細胞での生存性
（継代時）

高

低

を含む哺乳類のX染色体はメスの場合は分化が始まるとすぐ

X染色体の不活性化

なし

あり

低

高

起こる。これに対して、naïveの幹細胞ではX染色体の不活性

発生関連遺伝子のプロモーター領域における
H3K27me3の蓄積化は起きていない。同様に、分化とともに進むことが知られてDNAのメチル化

低高いるヒストンやDNAのメチル化修飾においても両者には違い

呼吸

酸素呼吸

発酵

増殖速度

速い

遅い

容易

困難

ドーム状のコロニーを形成するのに対して、primedの幹細胞は薄く平らなコロニーを形成する。また、継代の際にトリプ
シン処理によって細胞塊を単一細胞にまでばらしてしまうと、
primedでは生存率が大きく低下するのに対して、naïveでは高い確率で生存できることが知られている。次にエピジェネに1本が不活性化されることが知られているが、わずかに分化が進んだ状態であるprimedの幹細胞でも同様に不活性化ががある。発生に関わる遺伝子のプロモーター領域に結合しているヒストンH3の27番目のリジン残基におけるトリメチル化（H3K27me3）はnaïveではほとんど蓄積されていないのに対して、primedではH3K27me3の蓄積がみられ、全体的なDNAのメチル化についてもprimedでは促進されている12)。これらのことからも、naïveがより未分化な状態であることが改めて伺える。また、naïveとprimedではエネルギー代謝も異なっている。naïveの幹細胞ではミトコンドリアの活性が高く、TCA

8

キメラ胚の形成表1naïveとprimedの特徴

0411), 12)

培養条件による細胞の状態の変化

サイクルや酸化的リン酸化によるエネルギー代謝が活性化しヒトnaïve iPS細胞が作製されたことを先に述べたが、厳密ており、酸素の消費量も多くなっているが、primedの幹細胞でにはそれらの細胞がnaïveの状態にあるかどうかは断定できTHE CHEMICAL TIMES
面的なコロニーを形成し、継代時にトリプシンを用いて単一細キメラ胚の形成能だからである。ヒトiPS細胞においてはキメ胞にすると生存率が著しく低下する等のprimedの特徴を有し

ラ胚を作って確かめるというわけにはいかないので、前述のヒていたが、naïveにおいて多能性維持に関わる遺伝子のうちのトnaïve iPS細胞はキメラ胚形成能以外のnaïveの特徴を持一つであるTbx3の発現量が上昇していた他、他の培養条件で

iPS細胞は未だに確立

培養した場合と詳細に比較したところ、発現量に変動の見られされた技術ではなく、キメラ胚形成能といった評価法が適用でつ幹細胞ということになる。ヒトnaïve

た遺伝子のパターンがある種のnaïve ES/iPS細胞のものとよきないため、作製方法によってヒトnaïve iPS細胞には多くのく似ているという結果が得られた（図2）。

特集 再 生 医 療

ない。なぜなら、naïveであることを示す重要な要素の一つがバリエーションが存在する。作製方法としては、当初作製されたように2種類の阻害剤とLIFを培地に加えるとともに、Oct4
やKlf4等の一過的な強発現によってnaïveへと移行させる方
法や、ERK1/2阻害剤、GSK3阻害剤にさらに骨形成タンパク質(BMP)シグナル阻害剤を加えLIFを添加した培地でOct4やKlf4等の一過的な強発現を伴わずにnaïveへと移行させる方
法、さらにこれらを発展させて、複数のMAPK阻害剤を加える方法等がある。もちろん、いずれのnaïve iPS細胞においてもドーム状のコロニー形成やLIFシグナル依存的な多能性維持等のnaïveであることを示す特徴は持っているが、遺伝子の発現量を網羅的に解析するトランスクリプトーム解析等の高分解能を有する解析方法を用いると非常に多くのバリエーションが存在することがわかる。
実際にいくつかのRNA-seqデータ 14)-19)を用いてトランス
クリプトーム解析を行うと、naïve ES/iPS細胞の中にもややprimedに近い遺伝子発現パターンを持つものと大きく異なる遺伝子発現パターンを持つものが存在している。筆者も公開されているRNA-seqデータを用いて解析を行ったところ、Theunissenらの作製したnaïve ES細胞とTakashimaらの作製したnaïve ES細胞が特にprimedと異なる遺伝子発現パ
ターンを有していることが確認できた
（図1）
。

図2

様々なnaïve、rs幹細胞およびAKIT培養ES細胞の発現変動遺伝子のヒートマップ primedの細胞と比較して発現変動のあった遺伝子について、その変動パターンをヒートマップを用いて比較した。緑の点線で囲んだ遺伝子群がnaïveに特異的な遺伝子群であると思われる。また、AKIT
培養ES細胞の発現変動パターンはnaive3と似ていることが確認できる。

このことと、培養条件を変えることで遺伝子の一過的な強発現を伴わずにprimedからnaïveへと移行させることができる
ことを併せて考えると、naïveとprimedの間にはある程度の可逆的な連続性があるのかもしれない。
さらに、従来のprimedやnaïveとは異なる特徴を有する新しい状態が見つかってきている。その一つが領域選択型多能性幹細胞（region-selective pluripotent stem cell: rsPSC）
である19)。この多能性幹細胞はマウスのエピブラストをFGF2とwnt阻害剤であるIWR1を添加した培地で培養することで得られた。このrsPSCは基本的にはprimedの特徴を有していたが、単一細胞での継代に対する耐性や、やや早い増殖速度を示した
他、特殊なキメラ胚形成能を有していた。すなわち、
マウスエピ
ブラストの後極側に移植した場合にのみ生着し、キメラ胚を形
図1様 々 な n a ï v e 、p r i m e d 、r s 幹 細 胞 の 主 成 分 分 析
AKITは筆者らのグループが作製した新しい培地で培養したES細胞。左側にnaïveのクラスターが、右側にprimedのクラスターが形成されている。rsはprimedの一部であることが確認できる。

成したのである。同様に、FGF2とIWR1を添加した培地でヒト
ES細胞を培養したところヒトrsPSCが得られ、これをマウスエピ
ブラストの後極側に移植したところ生着し、三胚葉のいずれにも寄与していたことから、rsPSCには異種間キメラ形成能があることが示された。

同様の結果は他の論文でも報告されており20)、現時点では彼

このように、
ヒト多能性幹細胞の未分化状態には様々な状態

ら2グループのnaïve ESCがよりnaïveらしい状態にあるのだが存在し、細胞の遺伝的背景や組織的背景、樹立時の遺伝子改

ろうと思われる。

変だけではなく、培養方法によって大きく特徴が変化すること逆に、primedに属する細胞でありながら、naïveに近い遺伝が示されてきた。このことは目的にあわせて最適な培養方法を

子発現パターンを持つものも見出された。筆者らのグループ

選択、あるいは開発する必要があることを示している。例えば、が作製したFGF2等の増殖因子を含まない新しい培地で培養し遺伝子改変を行うのであれば、単一細胞から効率よく増殖する

たES/iPS細胞である。この培地で培養されたES/iPS細胞は平naïveやrsが適しているし、短期間で多量の細胞を必要とする
9

THE CHEMICAL TIMES

特集 再 生 医 療のであれば、naïveやrsの増殖速度の速さも魅力的だろう。その一方で、naïveやrsを作製・維持するための培地は高価であり、長期培養下でのゲノムの安定性が低いことも報告されている21)。また、前述のStemFitやE8では、細胞はnaïveと同等の増殖も可能である。このため、現在まで、特別な理由がなければ従来のprimedの培養方法を選択することが無難である。

05

応用利用に向けた培養方法の開発

では、応用利用に適した培養方法とはどのようなものだろう
なければならない。高品質であるということは、分化した細胞や死細胞がほとんど含まれていないことはもちろんだが、ロット間の差がなく、同一の処理に対して同一の応答性が維持されている必要がある。安定供給を行うためには発酵工学でいう回分培養や流加培養あるいは連続培養のような大容量での培養が必要となる。これらを満たし、市場に広く供給するためには培地
成分に高価なものを使用しない等のコストカットも必要となる。
まず高品質を実現するためには、現在の培養方法に存在する不安定性の原因を取り除く必要がある。ヒトiPS細胞の培養における不安定性の最大の要因は生物由来の成分である。フィーダー細胞を用いる培養方法ではフィーダー細胞の状態がヒト
iPS細胞の状態に影響を与えるし、フィーダーフリー培地においても添加されているシグナルタンパク質の安定性の影響を受けることになる。さらに、再生医療への活用においては、安全性の観点から動物由来成分を含まない（Xenoフリー）培地であることも要求される。そこで重要な役割を果たすのが生理活性をもつ低分子化合物である。naïveやrsPSCの作製・維持にもERK1/2阻害剤やGSK3阻害剤、wnt阻害剤といった低分子化合物が用いられているが（表2）、
このような低分子化合物は細胞内のシグナル分子や細胞表面のレセプターに結合すること
で、シグナルを遮断したり強化したりする作用がある。これら低分子化合物を組み合わせることで、培地中から不安定なタンパ
ク質を取り除き、安定的な培地を作製することができると期待される。実際に、筆者らのグループにおいて低分子化合物を組み合わせることでFGF2等の増殖因子を含まない、全く新しいフィーダーフリー・Xenoフリー培地の作製に成功しており、今培養方法・培地

上に、培地交換にも多くのコストがかかる。そこで大容量のタンがらヒトiPS細胞の培養には細胞間接着によるシグナル伝達も重要であるため、単一細胞ではなく一定の大きさの細胞塊を維持しながら培養液中を浮遊させる（浮遊培養）
必要がある。こうした条件を満たすためには、浮遊培養に適した完全合成培地を調製しなければならない。この点についても、筆者らのグルー
プは、2種類のポリマーを利用することで、
ヒトiPS細胞にストレスを与えることのない全く新しい浮遊培養系を開発している。
現在はこの浮遊培養系と、完全合成培地の開発を通して、新たな安価な培養系の開発に着手している。
また、再生医療への応用を考える場合には、これらの安価で安定した培養法に加えて、培養方法によるエピジェネティックな変化やゲノム不安定性にも注意が必要となる。iPS細胞においてはその初期化の過程においてエピジェネティックな状態は完全には初期化されていないことが知られているが、このことが分化後の組織を生体へ移植した際にどのような影響を及ぼすのかは不明である。さらに、他の培養細胞同様、iPS細胞を長く継代していると遺伝子が損傷を受け突然変異が生じたり、エピジェネティックな変化が生じることがある。こうした変化が生じた細胞を再生医療に用いることは出来ないので、こうした変化が起こりにくい培養条件についての検討が今後の大きな課題の一つである。
ここまではヒトiPS細胞を高品質で安価に安定供給する場合に必要となる培養条件を示した。
しかし、培養されたiPS細胞をどのように利用するかによって、その後の要求される培養条件は異なってくる（図3）。例えば、角膜等に分化させ患者に移植を行うことを目的とする場合であれば、大量培養の必要性は低くなり高い安全性が求められることから、均質性の高い浮遊培養よりも小スケールで個別に管理できる従来のプレート上での接着培養や特殊なメンブレン上での培養の方が適していると思われる。この場合においては、
ヒトiPS細胞を播種する基底膜
マトリックスに何を用いるかも重要な選択となる。前述のように
増殖因子

KSR + MEF

ゼラチンおよびMEF細胞発現基質

含む

FGF2およびMEF細胞発現物質

TeSR15)

ラミニン

XenoフリーFGF2、TGFβ 他

ビトロネクチン

XenoフリーFGF2、TGFβ

ラミニン

XenoフリーFGF2

2iL13)

ゼラチンおよびMEF細胞発現基質

含む

LIFおよびMEF細胞発現物質

ERK1/2阻害剤、GSK３阻害剤、フォルスコリンt2iL+Gö17)

ゼラチンおよびMEF細胞発現基質

含む

LIF、FGF2およびMEF細胞発現物質

ERK1/2阻害剤、GSK３阻害剤、PKC阻害剤

5i/L/A18)

ゼラチンおよびMEF細胞発現基質

含む

LIF、FGF2、アクチビン

ERK1/2阻害剤、GSK３阻害剤、ROCK阻害剤、
BRAF阻害剤、SRC阻害剤

ゼラチンおよびMEF細胞発現基質
又はマトリゲル

含む

FGF2

IWR1

StemFit AK03N

7)

rs19)

10

レート上での平面的な培養では空間当たりの培養効率が悪い

動物由来成分Essential8

表2完全合成培地の開発は、均質で安定供給可能な大容量の培養を行うためにも重要である。現在一般的に行われているプ

基質

6)

naïve

完全合成培地の開発を目指したい。

ク質で3次元的に培養することが求められるが、当然のことなか。それはまず高品質で安価に安定供給が可能な培養方法でprimed後さらなる改良を進めることで、タンパク質を全く添加しない

主な培養方法・培地とその特徴

低分子化合物

他

THE CHEMICAL TIMES

6) Chen G, Gulbranson DR, Hou Z, Bolin JM, Ruotti V, Probasco MD,
Smuga-Otto K, Howden SE, Diol NR, Propson NE, Wagner R, Lee GO,
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図3 応用利用と培養条件 iPS細胞を応用利用する場合には、その目的にあわせて培養方法を開発・選択する必要がある。再生医療への応用を目的とする
場合には
（上段）
、高い安全性が要求される。創薬研究や病理研究などへの応用を目的とする場合には（下段）、コストの低さや、安定供給体制がより重要となる。いずれの場合においても生理活性を持つ低分子化合物を用いることで培地から高価で不安定なタンパク質を取り除き、安全で安価な培養方法が開発できる他、シグナルのコントロールによるnaïveやrsPSCの作製・維持および分化誘導などにおいても重要であり、今後様々な生理活性を持つ低分子化合物が開発されることで、多くの問題が解決できるものと期待される。

基底膜マトリックスの種類によっては増殖速度や継代の効率、分化効率が変化するほか、生体に移植した際に残留していると激しい免疫応答（拒絶反応）を起こす場合もあることにも注意が必要である。一方で、創薬における候補化合物のスクリーニ
ングや薬効・毒性評価への応用を目的とする場合には、Xenoフリー培地であることは必須ではなくなり、コストの低さや安定供給体制といった要素がより重要となる。また、病態モデルの作製や病理研究に利用する場合には遺伝子改変が必要になる場合もあり、
このような場合には遺伝子改変効率が高いと思われるnaïveやrsPSCを作製・維持する培地を選択することも考慮
しなければならない。

06

おわりに

ヒトES/iPS細胞の様々な特徴とその特徴を引き出す、あるいは変化させる培養条件について概説した。
しかしながら、ヒト
ES/iPS細胞においてその状態を維持するためのシグナル経路
については完全には明らかになっておらず、また、既知である領域においてもそのシグナルを遮断又は増幅することができる生理活性を持つ低分子化合物が網羅されているわけではな
い。今後、
ヒトiPS細胞の基礎的研究の進展と並行して、新たに生理活性を持つ低分子化合物が発見・合成されることでより応用利用に適した培養方法が開発されていくものと期待したい。

9) Brons IG, Smithers LE, Trotter MW, Rugg-Gunn P, Sun B, Chuva deSousa Lopes SM, Howlett SK, Clarkson A, Ahrlund-Richter L, Pedersen
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11

特集

再生医療

ヒトiPS細胞の分化誘導プロセスにおける細胞の構造構築段階の重要性−ヒトiPS細胞の心筋細胞分化に及ぼす胚様体の大きさの影響

Importance of the structuration of cells in the differentiation process of human induced
pluripotent stem (hiPS) cells: Effect of the size of embryoid body on cardiomyocyte
differentiation of hiPS cells.
山梨大学大学院総合研究部 生命環境学域 助教

大貫 喜嗣

Ph.D. Yoshitsugu Ohnuki (Assistant Professor)
Faculty of Life and Environmental Sciences, Graduate Faculty of Interdisciplinary Research, University of Yamanashi

山梨大学大学院総合研究部 生命環境学域 教授

黒澤 尋

Ph.D. Hiroshi Kurosawa (Professor)
Faculty of Life and Environmental Sciences, Graduate Faculty of Interdisciplinary Research, University of Yamanashi

キ ーワード01

hiPS cells, embryoid body, cardiomyocytes

はじめにら心筋細胞への分化効率に及ぼす影響について検討した。

究されてきた胚性幹細胞（embryonic stem cells; ES細胞）

02

は胚から樹立されるため、倫理的な問題が不可避であった。
し（１）胚様体とは

2007年、山中らはヒト人工多能性幹細胞（human induced
pluripotent stem cells; hiPS細胞）を樹立した1)。それまで研かし、iPS細胞は体細胞から樹立されるため、ES細胞が抱える課
題を解決した。加えて、
ヒトiPS細胞はドナーの遺伝的背景およ胚様体の特徴と形成方法

胚様体(embryoid body; EB)とは、多能性幹細胞を浮遊培養することによって形成される三次元の細胞凝集塊である。EBび疾患的背景が既知であるため、自家細胞による移植治療だけ

は、神経細胞などに分化する胚体外胚葉と中・内胚葉に分化す

でなく創薬や遺伝子疾患の研究などへの応用が期待されている原始内胚葉の二層構造をとる。そのため、EBは三胚葉に由来る。その材料となる目的細胞はできる限り一定の品質水準を維するすべての細胞を形成する能力を持つものと定義されてい持している必要があるため、
ヒトiPS細胞から目的細胞への分化

る2)。多能性幹細胞の分化過程において重要なことは、分化の誘導法には高い再現性と頑強性が求められている。
ヒトiPS細胞の分化誘導プロセスは、細胞の継代・維持と必要

初期段階から内胚葉、中胚葉、外胚葉への細胞運命の決定が始まっているということである。たとえば、心筋細胞へ分化誘導をな細胞を確保するために細胞増殖を行う「維持増幅」、分化誘導

行う場合は、
まず中胚葉へ分化を誘導しなければならない。す前に細胞の単層化や三次元に構造化する「構造構築」、そして液

なわち、心筋細胞へ効率的に分化誘導をするためには、EB形成

性因子などを用いて積極的に分化誘導を行う「分化誘導」の3の段階から中胚葉への分化の方向性を与えて、EBを構成する

つの段階に分けられる。その中でも構造構築段階は、初期三胚細胞の多くが中胚葉系列の細胞となるようにしなければならな葉への分化が決定する重要な段階である。この段階で目的細い。マウスES細胞では、EB形成時の初期条件がその後の分化胞とは異なる系列の胚葉に分化すると、その後の分化誘導プロ

したがって、EB
方向性に影響を与えることが示されている3),4)。

セスは成功しないため、この段階の細胞集団の品質を管理するの形成条件を目的細胞に対して最適化することが重要である。

ことは非常に重要である。構造構築段階では、三次元細胞集塊である胚様体を形成するのが一般的である。通常、
ヒトiPS細胞の胚様体形成は、培養したヒトiPS細胞のコロニーを剥離し、自（２）胚様体形成方法の種類

胚様体形成方法には、ハンギングドロップ法、バクテリアル

然発生的に凝集体を形成させるため胚様体の大きさが不均一

ディッシュ（細胞非接着性培養皿）
上での浮遊培養によるEB形になりやすい。そのため、実験をするたびに胚様体の品質が異成法（以下、
バクテリアルディッシュ法: BD法）
、そして細胞非接なる可能性があり、十分な再現性が得られないという問題があ

着性96-well丸底プレートによる胚様体形成法（96-well法）
が

る。

ある。

本研究では、細胞非接着性96-well丸底プレートを使用する12らかにした。さらに、形成した胚様体の大きさがヒトiPS細胞かハンギングドロップ法はディッシュのフタに細胞懸濁液の懸ことによって胚様体の大きさの制御を試みた。そして、胚様体滴を作り、その中でEBを形成する方法である。
しかし、
この方法

の大きさの違いが、その後の分化の方向性に与える影響を明は培地交換が困難であるため、未分化維持因子の添加が必要

THE CHEMICAL TIMES

BD法はヒトiPS細胞をコロニーもしくは小集塊で剥離し、組（２）方法

ヒトiPS細胞（201B7株、RIKEN BRC）
はマイトマイシンCに織細胞の接着性が低い細菌培養用のディッシュ上で浮遊培養より不活化したSNL細胞（76/7株）と共培養したものを用いた。

する方法である（図1左）。この方法は、一度に大量のEBを形成BD法では、共培養下のヒトiPS細胞をCTK解離液にてSNL細胞できるため、大量の目的細胞が要求される場合に適している。

を剥離および除去した。ヒトiPS細胞のコロニーを剥離し、180

この利点を生かしたバイオリアクターによる胚様体形成法の開xgにて遠心した。6mLのb-FGF不含ヒトES培地により緩やかに

しかし、個々のEBは形態が不揃いで、大きさ発が進んでいる 。

再懸濁し、2mLの細胞懸濁液を細菌培養用の6-wellプレート

も均一にはならないことから、
ヒトiPS細胞から目的細胞への分に播種した。一方、96-well法では、CTK解離液にてSNL細胞を5)化誘導効率と再現性が低下することが懸念される。

剥離および除去後、10µMのY-27632を添加したAccutaseに

96-well法は細胞非接着性96-well丸底プレートに分散しよってシングルセルに分散した。分散したhiPS細胞を10 µMのた細胞懸濁液を加え、ウェルの中央に単一のEBを形成する方Y-27632を含むb-FGF不含ヒトES培地によって懸濁し、300,

法である
（図1右）
。ウェル内に規定の細胞数を播種することに1000, 3000, 9000, 30000 cells/wellとなるように細胞よって、形成するEBの大きさを制御することができる。ただし、低接着性Lipidure plate (A-U96; NOF Co.)に播種し、4, 8,

ヒトiPS細胞は分散によるアポトーシスを抑制するため、ROCK12, 16日間の浮遊培養によってEBを形成した。以後、上記の阻害剤を添加しなければならない 。一方では、ROCK阻害剤で6)あるY-27632がヒトiPS細胞由来EBの凝集性に影響を与える
ことが報告されており 、その最適化もまた重要である。ヒトES7)細胞の分化誘導においては、Eirakuらが96-well法を応用した
SFEBq法を用いて胎児神経組織への分化誘導に成功している
8)。96-well法は１ウェルに１個、1プレートに最大で96個のEBを形成することができる。BD法のように一度に大量のEBは得られないが、ウェル間のEBに質的なバラツキが少なく再現性が高い。さらに、ウェル毎にEB形成条件を設定することが可能であるため、小規模実験においては利用性の高い胚様体形成法

初期播種細胞数で形成したEBをそれぞれ300-EB、1000-EB、
3000-EB、9000-EBおよび30000-EBと表記する。形成したEBの形態学的特徴および、EBの未分化・初期分化関連遺伝子の発現量を定量RT-PCRによって解析した。
EBの大きさは顕微鏡画像から投影面の面積を計測し、（1）式により算出した。
EBの大きさ＝2× EBの投影面積π（1）

EBの大きさは、EBの短径と長径の平均により算出するのがと考えられている。
Bacterial dish method

特集 再 生 医 療なヒトiPS細胞には適さない。

96-well method

一般的であるが、実験者間差を生じやすい。ここでは、投影面の面積から大きさを求めることによって、誤差を生じにくくした。
（３）胚様体の大きさの制御BD法により形成したEB（BD法-EB）と96-well法により形成したEBの大きさをヒストグラムにより比較した（図2）。BD法-EB の大きさは50〜450µmの広い範囲に分布しており、その分布幅は約400µmであった。一方、96-well法で形成したEB
は、BD法-EBに比べて、いずれの初期播種細胞数においても大きさの分布範囲が狭く、その分布幅は150µm以下であった。
図1胚様体形成法の種類と特徴
BD法：コロニーを剥離した後、自然発生的にEBが形成されるため、大きさが不均一となる。一度に大量の胚様体を形成できる。96well法：細胞を酵素分散し、計数後に規定の細胞数を播種するため、大きさを制御できる。1ウェルに1つの胚様体が形成される。

03

特に、3000 cells/wellで形成したEBの分布幅は100µm以下となり、最も高い均一性を示した。さらに、3000 cells/well以上の初期播種細胞数でEB形成を行うと、BD法では形成できない大きさのEBを形成できることがわかった。

胚様体の大きさの制御と分化方向性に及ぼす影響（１）概要

96-well法はBD法と比較して個々のEBの大きさを均一にできる方法である。96-well法で形成されるEBの大きさは、初期
播種細胞数に依存するが、どの程度均一化できるのかについては詳細に検討されてこなかった。本報告では、様々な初期播種
細胞数で96-well法によるEB形成を行い、BD法で形成したEBと比較して大きさの制御が可能かどうかを明らかにした。さらに、未分化維持因子非存在下で分化誘導を行い、初期播種細胞数の違いがヒトiPS細胞の分化方向性に与える影響を明らかにした。

図2 BD法および96-well法によって形成した胚様体の大きさ分布
BD法-EBと96-well法により初期播種細胞数300, 1000, 3000, 9000,
30000 cells/well（300, 1000, 3000, 9000, 30000-EB）
にて形成した培
養8日目のEBの大きさをヒストグラムで示した。曲線はEBの大きさの正規曲線。

13

THE CHEMICAL TIMES

特集 再 生 医 療

ヒトiPS細胞から形成したEBの顕微鏡写真および大きさの経時的変化を示した（図3）。各ウェルに単一のEBが形成された。初期播種細胞数300-9000 cells/wellで形成したEBは、形成期間中に大きくなっていき、培養16日目の大きさは初期播種細胞数に依存して増大した。
しかし、30000 cells/wellで形成したEBの大きさは培養４日目から16日目までの間あまり変化せず、
培養16日目の大きさは9000 cells/wellで形成したものと生に方向づけられていることが示唆された。300-EBでは他の条件と比較して全ての分化関連遺伝子の発現量が全体的に低かった。この結果は、未分化関連遺伝子（OCT3/4、NANOG）の発現量が比較的維持されていたという結果とも整合性があることから、300 cells/wellで形成したEBは分化が進みにくい状態にあるといえる。

ほぼおなじであった。

図3

96-well法による胚様体の形態的変化と大きさの推移（４）胚様体の大きさの違いが遺伝子発現に及ぼす影響

形成期間中のEBの未分化関連遺伝子の相対発現量を図4に示した。EB形成前のヒトiPS細胞と比較した場合、未分化関連遺図5 初期播種細胞数がEBの分化方向性に及ぼす影響
初期播種細胞数300, 1000, 3000, 9000, 30000 cells/wellで形成したEBの培養16日目における三胚葉分化関連遺伝子、内胚葉（SOX17、AFP）、中胚葉系（GATA4、T）、外胚葉（PAX6、MAP2）の相対発現量。ACTINβにより正規化し、1000 cells/wellで形成したEBの相対発現量により標準化。

（５）まとめ96-well法では、初期播種細胞数を規定することによってEB伝子の発現量は初期播種細胞数の違いに関わらず経時的に減の大きさを制御でき、比較的均一な大きさのEBを形成するこ少した。
しかし、その発現量には初期播種細胞数によって差が見とができた。EBの大きさの違いは、三胚葉分化の方向性に影響られた。特に300-EBと30000-EBの未分化性は他の条件と比を与えた。300-EBでは、未分化性が維持される傾向があり、特較してあまり消退しておらず、これらは分化が進みにくいEBで定の胚葉への分化の偏りは見られなかった。一方、1000-EBかあることが示唆された。EBの未分化性を効率的に消退させる

ら9000 cells-EBでは外胚葉への、30000-EBでは内・中胚葉

ためには、適切な初期播種細胞数の設定が必要であると考えらへの分化方向性を示した。
したがって、
ヒトiPS細胞の分化誘導れる。

プロセスでは、構造構築段階においてEBの大きさを制御できる96-well法が有用である。

04

胚様体の大きさの違いが心筋分化誘導に与える影響（１）概要

前項では、自然発生的に分化誘導を行うことによって胚様体の大きさが、その後のヒトiPS細胞の分化方向性に影響を与えることを明らかにした。
しかし、実際の分化誘導では、様々な化合物やサイトカイン等を用いて目的細胞への分化誘導を行う。
図4

初期播種細胞数が胚様体の未分化性に及ぼす影響
初期播種細胞数300（□）, 1000（△）, 3000（●）, 9000（▲）, 30000（■）
cells/wellで形成したEBにおけるOCT3/4（左）およびNANOG（右）の相対発現量の推移を示した。ACTINβにより正規化し、同時に調製した分化誘導前のヒトiPS細胞により標準化。

各初期播種細胞数でのEB形成培養16日目の分化関連遺伝系において、EBの大きさの違いが心筋細胞への分化効率に及ぼす影響について検討した。
（２）心筋細胞への分化誘導方法

ヒトiPS細胞から各種細胞への分化誘導では、
フィーダー細子、すなわち内胚葉（SOX17、AFP）、中胚葉（GATA4 、T）、お

胞非存在下にて培養したヒトiPS細胞を用いるのが一般的でよび外胚葉（PAX6、MAP2）の相対発現量をレーダーチャート

フィーダー細胞の残存による異種細胞の混入ある9)。これは、

で示した
（図5）
。30000-EBでは、内胚葉関連遺伝子の発現量を防ぐことが目的である。本報告においてもPluriSTEMTMが著しく高く、内胚葉の発生に方向づけられていることが示唆

Human ES/iPS medium（Merck millipore社、以下された。1000-、3000-および9000-EBでは、外胚葉関連遺伝

PluriSTEM）
による無フィーダー培養を行ったヒトiPS細胞を使子の発現量が他の条件よりも高かった。PAX6およびMAP2は用した。

神経関連遺伝子であるため、
この3条件のEBは神経細胞の発14本報告では、心筋分化誘導試薬にて積極的な分化誘導を行う

分化誘導法の概要を図6に示した。Vitronectinコート上

THE CHEMICAL TIMES

特集 再 生 医 療

図6 ヒトiPS細胞から心筋細胞への分化誘導方法

でPluriSTEMにより培養したhiPS細胞を10 µM Y-27632
含有Accutaseにより分散した。300 xgで遠心し、10 µM（３）胚様体の大きさが心筋細胞の分化に及ぼす影響

接着培養期間中に拍動が発生したEBの割合を拍動率として

Y - 2 7 6 3 2 含 有 P l u r i S T E Mにて懸 濁した。細 胞 非 接 着 性

図7を示した。300-EBでは、心筋細胞の拍動をほとんど確認

Lipidure plate (A-U96)に300、1000、3000、9000 cells/

できなかった。3000-EB及び9000-EBと比較し、1000-EBは

w e l lにて播 種し、4日間 の 培 養によりE Bを形 成した。P S C

拍動率が低く、拍動が出る時期も遅かった。以上の結果より、cardiomyocytes differentiation kit（Thermo社、以下PSC

拍動性心筋細胞の分化誘導においては、初期播種細胞数を

kit）
medium Aを加えたLipidure plate (A-U96)へ1個の3000 cells/well以上に設定してEB形成を行うのが望ましい

EBを移し、2日間浮遊培養した。PSC kit medium Bを加えたといえる。

Lipidure plate (A-U96)へ1個のEBを移し、2日間浮遊培養し拍動性心筋細胞の発生が見られた1000、3000、9000

た。PSC kit maintenance mediumを加えたゼラチンコート

cells/wellで形成したEBにつて、培養24日目の心筋細胞特異プレートへ1個のEBを移し、16日間の接着培養を行った。接着的遺伝子に関する遺伝子解析を行った（図8）。

培養期間中に拍動性心筋細胞が発生したEBの割合を拍動率として算出した。培養終了後には、心筋細胞関連遺伝子の相対発

1001000 cells

現量を定量RT-PCRにより解析した。
EBの形態を評価するにあたり、本項では大きさに加えて円形度を採用した。円形度は（２）
式により算出した。
EBの円形度＝4π(EBの投影面積)（2）
2（EBの周長）また、本項の統計解析にはEZR（自治医科大学埼玉医療セン
Statistical Computing, Vienna, Austria)に基づいている。
EZRはこのRに生物統計学で頻繁に使用される統計処理を加えたR commanderの修正版である。

Rate of contracting EBs (％)

9000 cells

10

1

ター）
を使用した10)。このソフトはR (The R Foundation for

0.1

NKX2.5

MYH6

GATA4

MLC2a

MLC2v

TnnT2

図8 初期播種細胞数が胚様体の分化方向性に及ぼす影響
初期播種細胞数1000, 3000, 9000 cells/wellで形成したEBの培養24日目における心筋分化関連遺伝子の相対発現量。
TBPにより正規化し、1000 cells/wellで形成したEBの相対発現量により標準化。*はP<0.05。

一元分散分析およびTukey検定の結果、3000-EBと9000-

100

EBでは、
1000-EBに対してMLC2vの遺伝子発現量が有意に高80300 cells

601000 cells
40

3000 cells
9000 cells

2003000 cells

8

10

図7

12

14
16
18
20
Culture time (day)22

心筋分化誘導時の拍動率の推移

24

かった（P<0.05）。MLC2vは成熟した心室系心筋細胞に特異的に発現するため(15)、3000及び9000 cells/wellで形成したEBは心室系心筋細胞を発生しやすいと考えられる。
以上の結果は、
ヒトiPS細胞を心筋細胞などの特定の細胞へ分化誘導する場合においても、EB形成時の初期播種細胞数が分化誘導効率に影響することを強く示唆している。このことは、初期播種細胞数を規定することによってEBの大きさを制御できる96-well法が有用であることを示している。

15

THE CHEMICAL TIMES

特集 再 生 医 療（４）EBの円形度と拍動性心筋細胞の発生の関係

文献用して行っているため、培養４日目のEBにおいて分化が進行

2) E. Coucouvanis, G. R.Martin, Cell . 83 (2), 279-287 (1995).

この実験では、EB形成は未分化維持を目的とした培地を使しているとは考えにくい。我々は、この時点でのEBの円形度に着目した。EB形成4日目の円形度と培養24日目の拍動率の関係を図式化（図９）し、これをもとに考察をした。ヨンクヒー
ル-タプストラ検定による傾向解析の結果、円形度と拍動率はいずれも細胞数に対して正の相関があることが明らかとなった（P<0.01）。このことは、試薬による積極的な分化誘導を行う
以前、
すなわち構造構築直後にEBの円形度（形状）を調べれば、
拍動性心筋細胞の発生確率を推測できることを示唆している。

培養24日目の拍動率 (％)4) Y. Ohnuki, H. Kurosawa, J . Biosci. Bioeng. 115 (5), 571-574 (2013).
5) K. Matsuura, M. Wada, T. Shimizu, Y. Haraguchi, F. Sato, K. Sugiyama,
K. Konishi, Y. Shiba, H. Ichikawa, A. Tachibana, U. Ikeda, M. Yamato, N.
Hagiwara, T. Okano, Biochem . Biophys. Res. Commun. 425 (2), 321327 (2012).
6) K .Watanabe, M. Ueno, D. Kamiya, A. Nishiyama, M. Matsumura, T.
Wataya, J.B. Takahashi, Satomi Nishikawa, Shin-ichi Nishikawa, K.
Muguruma, Y. Sasai, Nat. Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
7) A. Horiguchi, K. Yazaki, M. Aoyagi, Y. Ohnuki, H. Kurosawa, J. Biosci.
Bioeng. 118 (5), 588-592 (2014).

9) J. Zhang, M. Klos, G.F. Wilson, A.M. Herman, X. Lian, K.K. Raval,
M.R. Barron, L. Hou, A.G. Soerens, J. Yu, S.P. Palecek, G.E. Lyons, J.A.
Thomson, T.J. Herron, J. Jalife, TJ. Kamp, Circ. Res. 111 (9), 11251136 (2012).

806010) Y. Kanda, Bone Marrow Transplant. 48 (3), 452-458 (2013).

300 cells

401000 cells
203000 cells
9000 cells

0
0.8

0.85

図9

0.9

0.95

1

胚様体の円形度と拍動率の関係

おわりに

細胞構造体であるEBは分化誘導の起点であり、その品質は
ヒトiPS細胞のその後の分化方向性を決定づける大きな要因である。
しかし、これまでEBの大きさや形状といった様相ベースの品質指標についてさえ、
分化誘導効率との関連性について詳しい検討は行われていなかった。
本報告では、96-well法を用いて規定の初期播種細胞数からEBを形成し、その大きさを制御することによって、その後の分化に一定の方向性を与えられることを示した。さらに、EBの円形度が拍動性心筋細胞の発生確率を予測するための指標として有効であることを見いだした。ヒトiPS細胞の分化誘導においては、そのプロセスの主要な段階おいて、細胞構造体の大きさや形状などの様相と、未分化性や分化方向性を反映する遺伝
子発現の状態を関連づけた評価を行うことが、再現性と分化誘導効率の向上につながると考える。
本研究の実施にあたっては、山梨大学大学院矢崎こゆき氏（現ジャパンティッシュエンジニアリング）、大澤慎太郎氏、その他関係各位から多大なご助力を賜りました。この場を借りて深謝申しあげます。

163) M. Koike, H. Kurosawa, Y. Amano, Cytotechnology. 47 (1-3), 3-10
(2005).

8) M. Eiraku, K. Watanabe, M. Matsuo-Takasaki, M. Kawada, S.
Yonemura, M. Matsumura, T. Wataya, A. Nishiyama, K. Muguruma, Y.
Sasai, Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).

100

05

1) K. Takahashi, K. Tanabe, M. Ohnuki, M. Narita, T. Ichisaka, K. Tomoda,
S. Yamanaka, Cell . 131(5), 861-872 (2007).

特集

再生医療

細胞シート工学研究の基礎と医療への発展
The foundation of cell sheet technology
and development for clinical application.

東京女子医科大学 先端生命医科学研究所 助教

関谷 佐智子Sekiya Sachiko (Accistant Professor)
Institute of Advanced Biomedical Engineering and Science, Tokyo Women's Medical University

東京女子医科大学 先端生命医科学研究所 教授

清水 達也

Tatsuya Shimizu (Professor)
Institute of Advanced Biomedical Engineering and Science, Tokyo Women's Medical University

キ ーワード01

細胞シート、温度応用性培養皿、再生医療

はじめに胞培養皿と同様に細胞が接着・増殖するが、32℃以下にすると細胞を培養皿から剥離し、回収することができる1)。細胞培養の際の剥離回収に用いるタンパク質分解酵素（Trypsinや「細胞シート工学」
は1990年前後から研究がスタートし、
このDispase）
を用いることなく、回収できるので、細胞の底面に存数十年の間に小規模グループの基礎研究から、多くの様々な在する細胞外マトリックスおよび接着因子・細胞間接着は分解分野の研究者・技術者が関わり、最終的に医師による臨床応用

されること無く保持されて回収できる（図１）。

が実現、疾病に苦しむ方々に新しい治療の技術として還元されこのような細胞の回収法の研究を開発当時東京女子医科大ている。その結果、論文の報告だけでなく、メディアでの紹介等

学に所属していた菊池・坂井らが岡野のもと確立した2)。この細が著しく増加し、2016年の現在専門家だけでなく、多くの方の

胞脱着システムにより、温度応答性培養皿にコンフルエントま耳に入る単語となっている。現在の大木のような研究技術に至で37℃にて細胞を培養し、その後32℃以下に温度を低下させるまでには、当該研究分野の開拓者の努力が根を張り、周辺のるだけで、細胞が細胞間接着を維持したまま、２次元のシート状

技術を改革する方々の苦労が幹を強靭にし、治療の困難な疾病に回収されることになる。研究当初、温度応答性培養皿は少数に立ち向かう医師たちの強い信念が枝に実を成している。本稿

を手作業で試行錯誤して作製し、最適化が検討された。現在では細胞シート工学の芽生えから、各方面での細胞シート工学のはセルシード社がUpCell®として大量に作製・販売を行ってい

医療応用、さらに今後の未来医療への発展応用について紹介しる(http://www.cellseed.com/product/upcell/)。現在まていく。

でに様々な細胞が培養され、細胞シートとしての回収が可能と02なっている。また、継代培養に際して、トリプシン等のタンパク

温度応答性培養皿

分解酵素による細胞の性質の変化を避けるために温度応答性
培養皿を用いることも可能であり、
これまでに様々な研究者によって使用されている。

温度応答性培養皿は温度応答性高分子であるポリ（N-イ
ソプロピルアクリルアミド、PIPAAm）
をポリスチレン製の通常の細胞培養皿に固定化し、作成される。温度応答性高分子
PIPAAmは32℃の相転移温度を境に、水和・脱水和変化を起こす刺激応答性高分子である。モノマーのIPAAm溶液を培養皿へ入れ、電子線照射することによって細胞培養基材の表面に重合されるのであるが、nmオーダーの薄い層として重合されるには非常に厳密な設定が必要である。このようにして作成された温度応答性培養皿は37℃の通常の細胞培養の温度では疎水性の性質を示し、細胞接着の可能な表面である。
しかし、32℃以下になると親水性の性質へと変化し、細胞非接着性の表面となる。従って、細胞を37℃で培養している間は通常の細図1

温度応答性培養皿での細胞シート回収17

THE CHEMICAL TIMES

特集 再 生 医 療

03-1

組織工学

温度応答性培養皿を用いて、線維芽細胞、上皮細胞、血管内

04

細胞シートのマニピュレーション技術

細胞シートは一枚を移動する際の操作は、浸水している薄皮細胞、また、平滑筋細胞、自律拍動する心筋細胞など様々ない紙の状態を想像して頂けるとわかりやすいが、鋭利なもの

細胞がこれまでに培養され、シート化されている。細胞によってなどに脆弱なため難易度が高い。以前はPVDF膜やニトロは、シート化するにあたり、培地のコンディションの調製、培養

セルロース膜などでの回収も試みられていたが、現在では、

期間、播種密度をコントロールする必要がある。温度応答性培（セルシード社）という回収支持体が販売もされ、CellShifterTM

養皿のため、観察を長く室温で行うと観察行為が細胞剥離を起簡便になっている。また、フィブリンゲル等を支持体として、スタこす原因になるために長期に観察したい場合は、37℃で保温

ンプのように細胞シートを保持・回収移動できるデバイスも開した状態での観察が必要な場合もある。こうして作成される細発されている（図２）。

胞シートは前述したように細胞間接着であるタイトジャンクショ

支持体としてゼラチンゲルを用いることにより、再びゼラチ

ンやギャップジャンクションが保持されており、またシート底面

ンゲルを溶解させることで移植後にシートのみにすることも可に接着因子や細胞自身が分泌した細胞外基質が維持されてい能になる。スタンプは手動で行える他、自動で数枚積層化できる。従って細胞シートは移植の際、すぐに底面が移植先へ接着る自動積層化装置の開発も行われている4)。また、大阪大学工

し、縫合の必要がない。この性質は、細胞シートと細胞シートを学部と東京女子医科大学の共同研究にて細胞シートを瞬時に積層化することで、３次元方向に厚みをもつ組織構築の加工を回収して別の部位へ移動させる回収装置5)も開発されており、可能にしている。

工学系の科学者との交流により、医学、生物学のみでは実現で03-2細胞シートを利用した３次元心筋組織の構築きなかった高い水準のマニピュレーション技術が完成している。このような周辺機器の発展は、汎用性を向上させ、より一般的な治療への近道となる非常に重要な研究となっている。

温度応答性培養皿を用いた様々な研究がある中、東京女子医科大学の清水らはまず初代培養した新生児ラット心室筋細胞
を用いて、２次元の心筋組織を作製した。心筋細胞はそれまで、個々の拍動などが各々の細胞レベルで解析されていたが、隣り合う細胞の接着が続いた細胞シートの状態での解析は研究
開発当時他に類を見なかった。心筋細胞シートは自律拍動を行い、肉眼でもフィブリンゲル上に積層化することで肉眼でも拍動が観察でき、また拍動のリズムの異なる２枚の細胞シートを積層化させると、細胞間で情報を受け渡す役割をもつギャップ
ジャンクションがシート間にも作製され、２枚のシートが同期して拍動を行うようになることが明らかにされた。さらに清水らは厚みを増すために数枚を積層化した心筋シートを移植するが、生体内ではあまり厚みのあるものを一気に移植すると血管新生が間に合わずに移植組織の壊死を起こし、厚みのある組織が作製できなかった。そこで、まず血管のソースとするべく、血管内皮細胞や線維芽細胞を含む心筋シートを作製し、培養期間中に血管内皮細胞の網状構造をもつ細胞シートを作製、
これを３

図2

05

細胞シートとマニュピレーション技術の例とその必要性

角膜再生臨床試験

枚積層化して移植すると移植後素早くホスト血管とシート内部

眼の構造の中で、角膜は眼球を外部から保護する役割と光の新生血管が連絡し血流を作れることが明らかになった。そこの屈折をおこし、視覚情報を網膜に結像させる役割を持つ。角で、血流が生じたところで再び３枚の積層化心筋シートを移植

膜は個人差があるが、およそ厚み500µm程度である。角膜のするという繰り返し移植を行うことで厚みのある組織を生体内

構造は角膜上皮、角膜実質、および角膜内皮によって構成されで作成することに成功している。さらには、生体外にて、３次元ている。最外部の角膜上皮は角膜周辺の輪部上皮の基底細胞組織を構築するバイオリアクターを開発、厚みのある心筋組織

が幹細胞となり新しく細胞が産生され、２週間毎に新しく作られをヒトiPS細胞より分化誘導した心筋細胞を用いることで、作製ている。そのため、輪部の上皮細胞が熱傷や、アルカリや酸によこのような心筋シートをチューブ可能となっている3)。一方で、る腐食、Stevens-Jonson症候群、眼類天疱瘡などが原因で消状に成形し、拍動保持する培養も行っており、今後臨床応用に失すると角膜上皮が血管を含む結膜に置き換わり、角膜混濁に向けた本格的組織再生が期待されている。

より視力が失われる。これまではアイバンクによる角膜組織の同種他家移植が行われてきたが免疫拒絶により、治療効果が得られにくいことが課題だった。患者本人の細胞から角膜上皮が再生され、移植可能になることが理想的であるが、タンパク分
解酵素を用いない限り、培養皿からの回収が難しかった。
このような問題点を克服するために、東京女子医科大学の大和ら、
ま18THE CHEMICAL TIMESの予防に頭を悩ます中、東京女子医科大学の大木医師は大和

皮シートの開発を行い、角膜再生治療の臨床応用を目指した研らのもと、眼科領域での細胞シートの治療効果からヒントを得究を行った6)。輪部より角膜上皮幹細胞を回収できる場合はこて、食道ESD後の自己口腔粘膜シート移植による狭窄予防効果

れを用い、難しい場合は口腔粘膜上皮細胞を用いて細胞シートを検討した。食道上皮細胞も口腔粘膜上皮細胞も同じ扁平上を作製し、角結膜上皮疾患部位への移植を行ったところ、患者

皮細胞であり、非常に的を射た検討であった。大型動物での検視力の回復・維持といった良好な成績が得られている。現在で討を行った結果、経内視鏡的細胞シートの移植に成功し、また、は、大阪大学にてiPS細胞より誘導した角膜上皮、内皮細胞によFBSを用いない培養法としてセルカルチャーインサートによる

る細胞シートでの再生医療の開発が取り組まれている。

口腔粘膜上皮細胞シートの作製にも成功し、臨床試験へと進ん06でいった8),9)。2011年までに10例が終了、良好な成績が得られ心筋再生臨床試験

本邦において、平成２１年に臓器移植法が改正され、臓器提供の増加に伴い、移植数が増加し、また補助人工心臓の開発

ている。

07-2

細胞シート・デリバリーも発展しているが、合併症の課題があり、次世代のよりよい治

細胞シートを成す細胞は、患者もしくはボランティア由来で療法の開発が望まれている。移植を必要とするような重症心あり、また体内に戻すために、細胞シートの作製工程は医薬不全治療として、近年再生医療が注目されている。2008年に品の製造管理および品質管理規則（Good Manufacturing

発表された欧州における骨格筋由来細胞のdirect needle

Practice: GMP）
を遵守したものが要求される。これは、安全性

injection法での移植臨床試験が大規模に行われたが、プラセなどの患者保護のための医薬品の臨床試験の実施に関する基ボに対して有効性が認められず、早期終了されている。このよ準（Good Clinical Practice: GCP）に基づいた規制である。
こ

うな中、前述したように東京女子医科大学では清水らによって、のGCPおよびGMP遵守のためには、細胞シートの作製をCell

心筋細胞を用いた細胞シートが作成され、3次元組織構築研究

processing center (CPC)にて行う必要がある。このCPCはが行われていた。一方で大阪大学・澤らはinjection法による細空調、温度、機器等が高度に管理された細胞培養施設であり、胞移植の効率の悪さに頭を悩ませていた。清水の人工臓器学

必ず2名で入室、作業者と記録者が必要で、取り違えを排除す会での講演を目にした澤教授はこの細胞シート工学の細胞移るため一区域1検体しか培養できず、細かく厳密な管理が要求

植効率の高さに着目し、injection法ではなく、骨格筋芽細胞をされる。そのためCPCが無い施設の場合は細胞シートを用い細胞シートとして重症心不全患者に移植し、治療効果を確認す

た治療が難しくなるという問題がある。そこで、CPCが無くてもることに挑戦をした。その結果、移植細胞シートによるリモデリ

細胞シートの移植治療可能なことを実証することも含め、東京ング抑制と、心機能の有意な改善効果を得ることができた。治

女子医科大学のCPCを用いて作製した患者由来口腔粘膜細胞

療効果のメカニズムは移植した細胞シートによる心筋内のサイシートを、遠隔地の長崎大学にて食道ESDを受けた患者へ狭窄

トカイン発現上昇、また再生に関わると考えられる幹細胞によ予防のための移植治療をしようという臨床試験が東京女子医く見られる因子を発現した細胞の集積が確認されている。従っ科大学と長崎大学・医学部、移植・消化器外科の江口らによってて、移植細胞が移植部位で心筋になるのではなく、移植細胞に遂行された。患者由来組織を空輸で東京へ輸送し、その後およより、サイトカイン分泌が促進され、これにより心臓内で再生にそ2週間かけ、細胞シートが作成され、長崎に再び空輸され、厳関わる細胞が誘引され、心機能が改善すると考えられている。

密な品質と安全性試験をクリアした結果、無事患者へ移植されこのような基礎研究を経て、自己骨格筋芽細胞シート移植治療た。10例の臨床研究を終え、好成績が得られており、離島でのを人工心臓の要する末期的拡張型心筋症へ臨床応用する試験

治療などへの今後の展望が開ける結果となっている。

を行ったところ、人工心臓を外し、退院するまで回復がみられた7)。現在は虚血性心筋症への移植も行い、本治療法はテルモ社より「ハートシート」という名称により販売承認を獲得、保険適用の治療へと発展している(https://www.terumo.co.jp/
pressrelease/detail/20150918/196)。現在は、より多くの患者へ治療を行えるように治験が行われている

07-1

特集 再 生 医 療

た大阪大学・眼科・西田らは温度応答性培養皿を用いた角膜上08

歯周組織再生臨床試験

歯周病は歯周組織に発症する疾患の総称で細菌によって生じる炎症疾患である。可逆的な病態であり、自己での適切な管理と専門のメンテナンスにて改善可能であるが、放置して病態

食道狭窄予防治療・臨床試験が進行すると歯の周囲組織が破壊され、歯が喪失されてしま
い、さらに細菌が血中、呼吸器へ侵入すると心筋梗塞や肺炎を引き起こすなど、全身性の病気にも関わる。現状、破壊された歯

現 在 、食 道 が ん の 早 期 、まだ 粘 膜 下 層 に 癌 がとどまっ

周組織を再生させるために、人工膜や、エナメルマトリックス蛋て いる状 態 ならば 、内 視 鏡にて 粘 膜 下 層を剥 離 する治 療

白の応用などが検討されているが、歯周組織の破壊が著しく進（Endoscopic submucosal dissection:ESD）が広く行われ行している場合には既存の治療では再生が難しい。そこで、東ている。
しかしながら、粘膜下層切除によって生じる潰瘍が治癒

京女子医科大学の石川・岩田らは歯周組織のなかの歯根膜かする際に食道の狭窄を起こし、食物通過障害や摂食障害が生じ

ら細胞を採取、歯根膜細胞シートを作成し、歯周欠損患者へ移る。そのため、従来バルーン拡張術による治療を行わなくては植、歯周組織再生の臨床研究を行った10)。2000年前後に基礎ならず、患者にとって大きな負担となっていた。このような狭窄研究をスタートし、十分に小動物、大型動物などで試験を重ね、19

THE CHEMICAL TIMES

特集 再 生 医 療

有効性が得られた末、患者由来細胞を用いて安全性、品質の安植臨床研究がまさに行われようとしている。肺がんなどで肺が定化試験を重ね、2011年〜2014年で患者10例への臨床試

切除された場合、切除部位が塞がれなければ肺機能が著しく低験が終了している。

09

下する。そのために以前から癒着を促進させるような施術が行われていたが、一時的な肺機能の保持には有効であっても、肺軟骨再生臨床試験の自由な駆動が癒着によって制限されてしまうために、いずれ
また肺機能が低下するおそれがある。また、がん再発時に癒着が発生している場合は癒着剥離に時間を要し、手術時間の延長

人体にはおよそ350箇所の関節が存在し、骨と骨の間を緩衝などが懸念される。そこで、次世代に向けた癒着なしの気漏防する軟骨が関節部で骨を被膜している。外傷などでも軟骨が損止による早期肺機能保持を目指したのが細胞シートの切除部

なわれることがあるが、老化などで誰しも関節軟骨は疲弊し、特位への移植である13)。細胞シートはその性質により縫合なしにに変形性膝関節症は非常に多くの患者が存在する。従来の治術後素早く生着できる。また、移植した細胞シートは肺の伸展療法としては、ステロイドの注射、ヒアルロン酸の注入、人工関

収縮に非常によく適合する。今後、臨床研究が行われ、その効節などが挙げられる。
しかし、近年の再生医療の発展により、不果が得られることに期待が寄せられている。

可能だと考えられてきた軟膏の再生が現在可能になりつつある。日本においては、滑膜由来幹細胞を用いた3次元軟骨組織

その他にも現在までに、動物実験レベルにて細胞シートを用の移植（大阪大学）、
また骨髄由来幹細胞を用いたコラーゲンIいた様々な組織の再生が検討されてきた。肝臓再生においてを支持体にした移植（信州大学）、
そして、
細胞シート工学を応用

は、小動物体内にて細胞シートより分泌するアルブミンが確認した、滑膜細胞との共培養軟骨細胞シートの移植（東海大学）
がまた、膵島細胞シートでは、長期的なインシュリされており14)、

軟骨再生の臨床応用として行われているが、変性膝関節軟骨ン分泌による糖尿病モデルでの高血糖状態の抑制結果が得ら

損傷への適用が認められているのは軟膏細胞シートの移植治れている15)。分泌物による治療効果としては、血友病モデル動

療のみである。患部へ移植された積層化自己軟骨細胞シートは物に対して、欠損遺伝子を導入した細胞シートを移植すること

様々なサイトカインを発現することで組織修復再生効果を示す

により、病態改善を行う研究も行われている16)。さらに、甲状腺。臨床試験を終え、良好な成績を収めており、今後は先進医療

細胞シートを用いた甲状腺切除モデルでの甲状腺ホルモン分として申請を準備している（http://cellsheet.med.u-tokai.

泌の確認が行われ、甲状腺摘出手術後の甲状腺再生治療法開11)ac.jp/project.html）。将来的には、さらに多くの患者を対象と発に繋がる研究が行われている。今後、細胞ソースがiPS細胞

して速やかに治療を行うために、同種他家移植の可能性を考え由来などのヒト細胞になるとさらに臨床応用への道が拓けるとている。骨、軟骨は同種組織移植にて免疫抑制剤の必要のない期待される。また、腎臓に関しては、増え続ける末期腎不全患者

希少な組織であり、一般化すれば多くの患者のQOLを向上さの治療法開発として、透析治療を要する前に、腎機能・腎構造せる優れた治療法となることが期待されている。

10

中耳閉塞予防治療・臨床試験

腎臓内科では、HGF分泌細胞シートを水腎症・線維化モデルへ
移植、腎臓構造崩壊の著しい抑制効果を得ており、今後は細胞
ソース選択を行い、臨床応用への発展が期待されている。最新

聴覚は外耳から入って鼓膜が振動され、中耳に入った振動がの組織構造の再生研究としては、子宮内膜の重度障害におけ耳小骨を振動、内耳の蝸牛にてシグナルとなり、脳に伝達される子宮内膜再生不全による不妊症を想定した子宮内膜再生研る。一連の流れの中で、中耳が重要な役割を担っており、難治性究が行われており、動物実験レベルではあるが、再生した子宮中耳炎である中耳真珠腫や癒着性中耳炎などは聴力の著しい内膜での自然妊娠の成立が示唆される結果が得られており、今低下を招くため、鼓室形成術という手術を行い、真珠腫や癒着

後の不妊症治療への可能性が期待されている17)。このような基を改善し、中耳環境を整える必要がある。
しかし、多くは粘膜再礎研究は主に医師になって間もない若い大学院生が発信源と生が上手くいかず、再発することが懸念され、新しい治療法がなっており、今後も再生医療を発展させてくれることを期待し望まれていた。そこで、慈恵医大の濱らは食道再生研究の上皮たい。

細胞シートから着想し、鼻粘膜細胞シートを用いて中耳腔粘膜の再建を行い、新しい難治性中耳炎治療法の開発を試みている12)。特に中耳粘膜は狭い領域に骨に隣接しているため、薄く、かつ縫合なしに接着する細胞シートは非常に適している。また、微絨毛を有する粘膜上皮細胞は機能的にも癒着や真珠腫再発

12

おわりに

温度応答性培養皿から始まり、細胞ソースの選定、対象疾患

防止に大きく貢献することが期待され、臨床応用が開始されての設定また、移植に際するマニピュレーションおよび輸送のデいる。

バイスなど、化学、生物学、理学、医学、薬学、工学の知識が集学

11

した細胞シート工学は今後さらに進化・発展を遂げていくであ

今後の臨床に向けた検討

現在、東京女子医科大学の呼吸器外科・神崎らによって、肺がん切除後の気漏予防を目的とした自己線維芽細胞シート移20保持を目指した腎への直接的治療法開発が細胞移植法を用いて検討されている。このような背景の中、東京女子医科大学のろう。基材を加工する技術の発展により、より細胞を形態および機能的に制御する技術も開発されており18)、今後の成果が期待されている。

THE CHEMICAL TIMES

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特集 再 生 医 療

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21

トピックスad-MEDビトリゲル®とその創薬,
化学物質安全性試験への応用
ad-MED vitrigel® for the applicationin drug development and alternative method of animal experiments

関東化学株式会社 技術・開発本部 伊勢原研究所

山口 宏之

Hiroyuki Yamaguchi
Isehara Research Laboratory, Technology and Development Division, Kanto Chemical Co.,Inc.

キ ーワード1

ビトリゲル®、足場材料、動物実験代替法て、
コラーゲンビトリゲル ®は架橋剤等を含まない純粋なコ

はじめに

ラーゲン線維でありながら、透明であり患部や細胞の観察が容易である。またピンセットでつまみあげたり引っ張った

コラーゲンビトリゲル は国立研究開発法人

農業生物

り、折り曲げたりしても破れない強度を持つ。さらに、任意

農業・食品産業技術総合研究機構）の竹の形状（膜、糸、管等）に加工でき、乾燥状態で常温保存が®

資源研究所（現澤らが開発した、生体内の結合組織に匹敵する高密度のコ可能である。このような性質を生かして、化学物質の動態・

ラーゲン線維で構成された素材であり、ピンセットなどで毒性の解析に有用な培養モデルの構築、欠損組織を修復容易に取り扱える強度を持ち、透明性に優れ、また高分子する生体適合性素材、細胞移植用担体、
ドラッグデリバリー

タンパク質を含む物質透過性に優れるといった特徴がある

システム等としての応用が進められている3)。

1),2)。本稿では、
このコラーゲンビトリゲル ®膜の特徴を生かした細胞培養用インサート「ad-MEDビトリゲル ®」およびその関連製品の特長とその応用研究について概説する。

2

コラーゲンビトリゲル の特徴®

3ad-MEDビトリゲル®およびその関連製品の開発

3.1. ad-MEDビトリゲル ®
ad-MEDビトリゲル ®はウシ由来Ⅰ型コラーゲンを原料として作製したコラーゲンビトリゲル ®膜を、円筒形の容器の水を大量に含むハイドロゲルを温度、湿度をコントロー

底面に貼りつけた細胞培養用インサートである（図1）。

ルしながら徐々に乾燥させて、自由水だけでなく結合水も除去した後、再水和すると透明性に優れた物性に変換される。この乾燥工程はガラス化（vitrification）と呼ばれ、このガラス化工程を経て作製したゲルが新しい学術用語「ビト®
®
）」と定義されている1)。ビトリゲル®は様々
リゲル（vitrigel

なハイドロゲルから作製できるが、このうちコラーゲンゲルから作製したものをコラーゲンビトリゲル®と呼ぶ。
コラーゲンを原料とした医療器具や細胞培養用担体に

22

図1

ad-MEDビトリゲル用いられる素材は従来から存在するが、それらは透明ではインサートとは、培地などを透過する膜を底面に貼りつなく白色である。そのため医療器具として用いた場合、患けたカップ状の容器であり、マルチウェルプレート内に設置部の観察が難しかった。また、細胞培養用担体として用いした状態で細胞をインサート内に播種して使用する。ad-

た場合は、光学顕微鏡による観察が困難であった。さらに、

MEDビトリゲル ®で使用しているコラーゲンビトリゲル ®膜

それらの素材自体の強度が低いため、プラスチック等の裏は、従来のインサートで使われているプラスチック製フィル

打ち材や、化学物質による架橋を必要とした。それに対し

ムや不織布等と比べ細胞が迅速に接着・伸展する。また、膜THE CHEMICAL TIMESの透明性が高く、自家蛍光が低いことから位相差顕微鏡お

製できる
（図3）
。

よび蛍光顕微鏡で鮮明な観察像を取得することが可能で

ad-MED
ビトリゲル2ある。

ad-MED
ビトリゲル

PET膜
インサート

通常の培養皿で細胞を培養した場合、細胞の下面はプ
ラスチックなどの固相に接触しており、培地の栄養成分や酸素は細胞の上方からのみ供給される。一方、ad-MEDビ
コラーゲンビトリゲル ®膜が高トリゲル ®で培養した場合は、インサート中央部の位相差顕微鏡観察像

分子タンパク質を含む培地の栄養成分や酸素を透過する
ため、細胞の上方だけでなく、膜を介した下方も培養液と接触（液相-液相）
させて、上下両方向から栄養成分等を供

インサートを上方から見た写真

給することができる。さらに、ad-MEDビトリゲル®ではインサート内外に入れた培地を保持できることから、
インサート

インサート周辺部の位相差顕微鏡観察像

内外に異なる組成の培地を入れる、インサート内外のどち

図3 インサート内に播種したHepG2細胞の分布

らか一方にのみ培地を入れ、もう一方は空気に晒す（気相-

3.2. オプションリング

液相）
といった培養を行うこともできる（図2）。

生体内では、ある細胞が分泌した物質がその近傍にある別の細胞に作用し、その細胞を活性化する現象（パラクライン効果）が様々な場面でみられる。例えば、皮膚の表皮A：
インサート内外に同 一 の 培 地を入れた液相液相培養

B：
インサート内外に異 なる培 地を入れた液相液相培養

C：
インサート外にのみ培地を入れた気相-液相
培養

D：
インサート内にのみ培地を入れた液相-気相培養

図2 ad-MEDビトリゲルを用いた培養方法

角化細胞や繊維芽細胞が分泌した神経成長因子（nerve
growth factor, NGF）が神経細胞の神経突起伸長を誘導することが知られている5) 。このパラクライン効果をinvitro で再現するため、インサート内で2種類の細胞を同時に培養すること（共培養）が行われてきた。
しかし、インサー®

トを用いた一般的な共培養では、一方の細胞をインサー内に播種し、
インサート外にのみ培地を入れ、細胞の上方をト内、もう一方の細胞をマルチウェルプレートのウェル底

空気に晒した気相-液相界面培養を行うと、生体と同様の多面で培養する。そのため、細胞同士が離れており、パラク層化した上皮細胞層を形成される。このように、ad-MEDビ

ライン効果が現われにくい場合がある。そこで、ad-MED

トリゲル は天然の組織・器官を再現した高度な培養モデ

ビトリゲル ®の底面に細胞を播種するためのリング状の部

ルの構築に適している 。

品「オプションリング」を開発した。ad-MEDビトリゲル ®に

例えば、皮膚や角膜の上皮細胞をad-MEDビトリゲル®

4)

従来のad-MEDビトリゲル ®はコラーゲンビトリゲル ®膜

オプションリングを装着し、リングを装着した側が上方になが培地で膨潤すると、インサート底面に弛みを生じるため、るようにad-MEDビトリゲル ®を設置してリング内に細胞を接着性の弱い一部の細胞では、播種した細胞が中心部に播種する。そして細胞が接着したらリングを取り外し、ad-

偏ってしまう傾向が見られた。最近、弛みを低減した改良

MEDビトリゲル®をひっくり返して、マルチウェルプレートにを開発した。ad-MEDビトリゲ
品「ad-MEDビトリゲル ®2」

設置し、インサート内部に細胞を播種する
（図4）
。この操作

ル 2では従来品で接着性が弱い細胞も、迅速に接着、伸展によってコラーゲンビトリゲル®膜の両面に細胞を播種する

し、細胞の偏りが無い均一な細胞層を失敗することなく作ことが可能になる。一例としてL929細胞が産生するNGF®

①：ピンセットを使ってオプションリングを
ad-MEDビトリゲル裏面に取り付ける。

②：細胞を播種する。

図4

オプションリングの使用手順③：細胞接着後、リングを取り外したadMEDビトリゲルを、12wellマルチウェ
ルプレートに設置する。

23

でPC-12細胞の神経突起伸長を誘導する実験系を示す。
従来法である、
インサート内にPC-12細胞、マルチウェルプ
レートの底面にL929細胞を培養した系（底面培養）と比べ、オプションリングを用いて、ad-MEDビトリゲル ®のコラー
ゲンビトリゲル®膜の一方の面にPC-12細胞、もう一方の面にL929を培養した系（両面培養）の方が、神経突起伸長が促進されることが認められた
（図5）
。

図6

TEER測定装置

PC-12

4

L929
両面培養

医薬品や化粧品の原料として使われる化学物質の効能

底面培養

A： オプションリングを使って膜の両面に細胞を播種する
培養法（両面培養）とインサート内およびウェル底面で細胞を播種する方法（底面培養）の模式図。

ad-MEDビトリゲル2 ad-MEDビトリゲル2
両面培養
底面培養

ad-MEDビトリゲル®の創薬・動物実験代替法への応用

PET膜インサート
底面培養および安全性は、従来、実験動物にそれらの物質を投与して動物の反応を観察することで試験されてきた。
しかし、近年、動物実験に対する倫理的な問題に注目が集まり、また、それらの物質が動物に及ぼす作用が、必ずしもヒトに及ぼすそれと一致しないことが明らかになってきている。それを受けて、EUではいち早く2009年から動物実験を行った
原料を使った化粧品の販売を禁止し、動物の代わりに培養細胞や微生物などを使う試験法（動物実験代替法）
への置換を進めている9) 。また、国内でも大手化粧品メーカーがB： 抗ニューロフィラメントL抗体（赤）およびヘキスト33342（青）で染色したPC-12細胞の蛍光顕微鏡観察像。
スケールバーは20μmを表す。

図5

原料の試験に動物実験を行わないことを表明しており、また、医薬品メーカーも動物実験の削減と動物実験代替法の導入を進めている。このように、世界的に動物実験を代替法に置き換えていこうという動きがある一方で、現在でL929細胞とPC-12細胞の共培養も、化粧品の試験に利用できる動物実験代替法は皮膚刺激性試験、光毒性試験、眼刺激性試験など一部の試験に限3.3. TEER測定装置

られており、医薬品・医薬部外品に利用できる試験法はさ

皮膚、角膜、腸、気管、血液等、生体で面を形成している部

らに少なく、承認申請を動物実験無しでは行うことができ分では上皮細胞が層状構造を形成し、また、細胞間に密着ない。このように動物実験代替法の開発が進まない原因と結合（tight junction）を形成することによって外部から物して、一つはヒトの体内で化学物質の動態に関与する組織質の流入を制御している。この仕組みを上皮のバリア機能や器官を構成する細胞と同等の機能を持つ培養細胞が入といい、このバリア機能の評価には経上皮電気抵抗（trans

手困難であったことが挙げられる。そして二つ目の原因とepithelial electronical resistance, TEER）の測定が広しては、その細胞を適切に配置してその機能を発現させる。TEER値は組織毎に異なり、例えばための足場材料がなかったことである。一つ目の課題であく用いられている6), 7), 8)

強固なバリア機能を持つ皮膚では1000Ω・cm 以上、バリる細胞に関して、従来の細胞ソースとしては、無限増殖能

ア機能が比較的弱い物質透過性の高い血管内皮では10を持った単一クローンである株化細胞や、ヒトから採取して～20Ω・cm である。TEER値の測定は、細胞を培養したイ

きた初代細胞が主に用いられてきた。しかし、前者は不死ンサート内外の培地中に測定用の電極を挿入することで行化していることで、生体内にある正常な細胞とは機能が大う。その際、電極の位置がわずかでもずれるとTEER値が変きく異なることが問題であった。また、後者は、採取できる

動し正確な値が測定できない。そこでad-MEDビトリゲル

細胞数が限られる、細胞の純度が低い場合がある、
ドナーにしっかり固定できる専用の電極と、応答速度の速い抵抗の個体間差によって実験再現性が低下するといった問題

計を組み合わせたTEER測定装置を新たに開発した（図6）。

があった。一つの光明となったのが山中らによるヒトiPS細この電極をad-MEDビトリゲル 組み合わせて使用するこ胞の発見である10) 。ヒトiPS細胞を様々な薬剤で処理し分とで微細なTEER値の変化を正確に測定することが可能で化を促すことで、心筋、肝臓、小腸など様々なヒト由来細胞ある。

を誘導することができる。また、患者由来のiPS細胞を用い

2

2

®

®

24

THE CHEMICAL TIMESることで、疾患特異的な性質をもつ体細胞が得られること

（EIT）
法」
が開発された13),「Vitrigel ®-Eye Irritancy Test
。ad-MEDビトリゲル®内にヒト角膜上皮由来の株化細胞から、創薬への応用に関して研究が進められている。一方、

14)

二つ目の課題に関しては、生体内において、多くの細胞はであるHCE-T細胞を播種すると細胞はビトリゲル ®膜に速単独で機能しているわけではなく、同一種類の細胞が規則

やかに接着する。その後、液相培養を2日間、続いて、イン的に配列した「組織」
や、2種類以上の細胞が複合した「器

サート内の培養液を取り除き、細胞の上方を空気に晒した官」を形成し、近傍に存在する細胞同士が相互作用するこ

状態での培養（気相‐液相界面培養）を4日間行う。すると、とで機能を発現している。また、組織や器官において、細HCE-T細胞は多層化し、ヒト角膜上皮と同等の約6層の細胞は一定の方向性（極性）を保って存在している。例えば、胞層を形成し、かつ、上皮バリア機能を有したヒト角膜上皮

生体が外界と接する部分を覆っている上皮細胞は、密着モデルが構築できる
（図7）
。

結合
（tight junction）
・接着結合（adherens junction）
・接 着 斑（ d e s m o s o m e ）からなる接 着 複 合 体（ a p i c a ljunction complex）
で区分された、頂端側（apical）と側

0日目 ad-MEDビトリゲルにHCE-T細胞を播種
2日目 気相-液相界面培養
6日目 完成Day 0

底側（basolateral）という極性を持っている。細胞がこの1極性に従って、物質の吸収・輸送・代謝・分泌を行うことが、気など細胞の周囲環境であると言われている。ad-MEDビ

3

4

5

6

気相-液相界面培養

HCE-T

組織・器官の機能を発現させるうえで非常に重要である。
この細胞の極性を規定するのは細胞外マトリクス、血液、空

1

液相培養

A： ヒト角膜上皮モデルの作製手順
HE

ZO-1

Claudin 1

Connexin-43

Cytokeratin 3

MUC1

トリゲル ®を用いて、気相-液相界面培養、液相-液相界面培養など細胞の周囲環境を適切に維持した培養を行うこと
で、創薬や安全性試験に有用な極性を持った培養モデルを構築できると考えている。その一例として、角膜上皮モデルを用いた眼刺激性試験法、および、肝代謝毒性試験用モデルの構築について説明する。

B： ヒト角膜上皮モデル（6日目）のHE染色像および免疫染色像。
スケールバーは20μmを表す。

図7 ヒト角膜上皮モデル

4.1. 眼刺激性試験法

このモデルに培養液と混和した化学物質を曝露し、滴下

眼刺激性試験とは、化学物質が眼に付着することによっ

直後から3分間TEER値の経時変化を測定する。このとき、て惹起される傷害の重篤さを評価するための試験法であ

眼刺激性のない物質ではTEER値は3分間全く変化しなる。従来はウサギの眼に被験物質を滴下し、障害の程度をい。一方、弱い眼刺激性物質では、TEER値は最初変化せ観察する動物実験（ドレイズ試験）によって行われてきたず、一定時間経過後に徐々に減少する。そして中程度からが、近年の動物実験削減の流れを受け、ウサギの代わりに

強い眼刺激性物質では曝露直後からTEER値が低下し、か食肉用のウシやニワトリから摘出した眼球、培養細胞、3次つ、眼刺激性が強い物質ほど大きく低下する（図8）。

元培養モデルなどを用いた動物実験代替法 が開発され
11

確認する目的で使用されるため、偽陰性の少ない高感度な試験法が求められている。
そこで着目したのが角膜上皮のバリア機能である。眼刺激性の化学物質が眼に触れると、最初に上皮バリア機能が破壊され、次いで、化学物質が角膜内部に侵入し、角膜上皮
細胞死や角膜実質の浮腫などのより重篤な障害を引き起

眼刺激性

TEER
（% of initial）ている。
しかし、眼刺激性試験は主に化学物質の安全性を

角膜モデル①角膜モデルに被験物質を曝露する。

無
弱
中
強
曝露時間
（sec）

②TEER値の経時変化を3分間測定する。

図8 Vitrigel-EIT法の試験手順

こす。そのため、上皮バリア機能は化学物質による眼刺激性の早期マーカーとして知られている12)。そこで、ad-MED

この T E E R 値 の 変 化パターンを、曝 露してからT E E R

ビトリゲル 内で角膜上皮由来の細胞を培養することによっが 低 下し始 めるまで の 時 間 差（ T i m e l a g ）、低 下 速 度て、ウサギの眼の代わりとなる、上皮バリア機能を持つ角（Intensity）、終点での低下率（Plateau level）の3種類

膜上皮モデルを構築した。そのモデルに化学物質が触れたのパラメータで数値化し、その数値から化学物質の眼刺激

際のTEER値の変化を測定することで、化学物質の上皮バ性の有無を判定する。Vitrigel ®-EIT法で118種類の化学

リア機能への障害の有無を判定する新しい眼刺激性試験法

物質を判定し、その結果を動物実験の結果に基づいた分類®

25

法であるGHS分類と比較したところ、一致度は80.5%、偽

また、HepG2細胞の細胞間に毛細胆管用構造を形成し陰性率9.9%、偽陽性率34.1%となり、本試験法は偽陰性ている様子が確認された15)。このように、ad-MEDビトリゲ

が少なく、眼刺激性物質と非刺激性物質との判別に適してル ®を用いて、細胞の上下の環境を変えて細胞を培養するいることが示唆された14)。

ことで、ヒトにおけるADMEDの解析に有用な培養モデル

Vitrigel ®-EIT法を国際的な公定法であるOECDテストの開発が期待できる。

ガイドラインに登録することを目指して、代替試験法国際協力（ICATM）の協力を得て結成された国際的なバリデー
ション実行員会のもと、日本動物実験代替法評価センター

5

おわりに

（JaCVAM）主導で本試験法のバリデーション試験が実施された。国内3施設において、試験法の技術譲渡性、施設

本稿ではビトリゲル ®に関する研究開発のうち主にad-

内・施設間再現性、および、予測性を試験し、良好な結果がMEDビトリゲル ®とその応用研究について説明した。それ得られている。

以外にもビトリゲル®は医療器具、移植用担体など様々な応用が研究されており、今後の用途の拡大が期待できる。

4.2. 肝代謝毒性試験

本稿で紹介したad-MEDビトリゲル ® 、Vitrigel ® -EIT法、

医 薬 品 リード 化 合 物 の 効 能 の 評 価 や 安 全 性 の 確
認 を 行う上 で 、肝 臓 に お け る 吸 収（ A b s o r p t i o n ）・「アグリ・ヘルス実用化研究促進プロジェクト（現

分 布（ D i s t r i b u t i o n ）・代 謝（ M e t a b o l i s m ）・排 泄

作物、医療用素材等の開発）」の支援を受けた。また、「ビト（Excretion）
・毒性（Toxicity）のいわゆるADMETを解は国立研究開発法人
リゲル ® 」

析することは非常に重要である。
しかし、
ヒトと動物とでは

農業・食品産業技術総合研究機構）の登録商標である。

ADMETに種差があるため、薬剤をヒトに投与した際、動物実験では予測できない副作用が現われる場合があることが問題となっている。そこで、様々なヒトの肝臓由来細胞を
ヒトでのADMETを予測する試用いたin vitro 試験法で、みが進められている。ここで使われる細胞としては、初代凍結肝細胞、iPS由来肝細胞、および、肝ガン由来の細胞株であるHepG2細胞やHepaRG細胞などがある。これらの細胞にはそれぞれ長所と短所がある。凍結肝細胞は高価であり、ドナーの違いによるロット間差が大きい。iPS由来肝細胞は、ヒト由来の細胞を大量に得られるが、高価であり、また肝臓に特徴的なCYP等の代謝酵素活性が低い。そして、肝ガン由来細胞株は、無限増殖能があり大量の細胞が容易に得られるが、比較的代謝酵素活性が高いHepaRG細胞は高価であり、一方、比較的安価なHepG2細胞は代謝酵素活性が低いことが知られている。このHepG2細胞をシリコン処理PET膜（固相）上においたad-MEDビトリゲル ®
に播種し2日間培養（液相‐固相界面培養）
した後、空のマル
チウェルプレートに設置し、細胞の上側を培地（液相）、膜を介した下側を空気（気相）に晒した液相‐気相界面培養を1日間行うことで、HepG2細胞のアルブミン産生能、尿素合
成能、およびCYP3A4活性が向上することが見いだされた
（図9）
。

HepG2

培地
液相-固相
界面培養
2日間

液相-気相
界面培養
1日間

図9 肝代謝毒性試験用モデルの作製手順

26および肝代謝毒性試験用モデル等の研究は、農林水産省
医薬品

農業生物資源研究所（現THE CHEMICAL TIMES

参考文献
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10.1002/jat.3254. (2015). [Epub ahead of print]16) A. Oshikata-Miyazaki, T. Takezawa, Cytotechnology doi: 10.1007/
s10616-015-9934-1. (2015). [Epub ahead of print]27

キ ーワード解 説
ES細胞
胚性幹細胞
（Embryonic Stem cell）とは、受精後6,7日の初期胚（胚盤胞）から将来胎児になる細胞集団（内部細胞塊）の細胞を取り出し、それを培養することにより作製される多能性幹細胞の１つである。あらゆる組織の細胞に分化できる能力（全能性）をもっている。

iPS細胞
人工多能性幹細胞（induced Pluripotent Stem cell）とは、人間やマウスなどの体細胞に特定因子を導入し、培養することによって作製されるES細胞に類似した多能性幹細胞である。2006年に世界で初めて、山中教授らの研究グループによりマウス体細胞を用いて作製された。受精卵を破壊する必要がなく、自分自身の細胞から作製することも可能なため、免疫拒絶が起きる可能性が低いと期待されている。

ビトリゲル
農業生物資源研究所（現

農業・食品産業技術総合研究機構）の竹澤主席研究員らが開発した、ハイドロゲルをガラス化および再水和することで作製した素材。このうち、コラーゲンゲルから作製したものをコラーゲンビトリゲルと言い、再生医療用材料、薬物送達システムの担体、および、三次元培養に適した細胞培養担体としての応用研究が進展している。

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編集責任者：猪瀬真人
平成 28 年 7 月発行