2010 年度両生類研究施設研究活動及び研究成果報告書

平成 23 年 10 月 1 日	
 広島大学大学院理学研究科附属両生類研究施設

目次

I.

施設概要	
 

	
  	
  ３	
 

II.

教育活動	
 

	
  	
  ４	
 

III. 研究活動と研究内容現況	
 

	
 	
  ５	
 

IV.

社会活動	
 

	
  １５	
 

V.

国際共同研究	
 

	
  １６	
 

VI.

その他（特記事項）	
 

	
  １７	
 

VII. 各部門の研究内容と研究業績	
 

	
 １８	
 

発生遺伝学研究部門	
 １８分化制御機構研究部門	
 

３６	
 

多様化機構研究部門	
 

５０	
 

生理生態学研究部門（客員部門）	
 プロジェクト研究①	
 ７９

プロジェクト研究②	
 

８１	
 

プロジェクト研究③	
 

８７	
 

プロジェクト研究④	
 

９０	
 

プロジェクト研究⑤	
 

９４	
 

	
 

2

I.	
 施設の概要	 	
  両生類研究施設は，元広島大学長の川村智治郎先生が在職中に挙げられた業
績を基礎にして，昭和 42 年６月に創設された，世界で類例のない研究施設である。	
 	
  創設時の第１研究部門「発生遺伝学」は，定員が教授１，助教授１，助手２，
その他職員２であったが，昭和 49 年４月に系統維持班の附設が認められた。従来から実験動物飼育に従事していた教務員１に加え，新たな飼育要員として一般職員２（行一技官）の増員，技能補佐員３，臨時職員２の予算化が認められた。昭和 51 年４月に系統維持班の強化のために助教授１の増員，臨時職員１の予算化が認められた。その後，行一技官１の教務員１への振替が行なわれ，充実した系統維持体制が整った。	
 	
  昭和 56 年４月，第２研究部門「生理生態学」が客員部門として増設された。
昭和 59 年４月，第３研究部門「進化生化学」が増設された。平成元年４月，第４研究部門「形質発現機構」が新たに増設され，増員が認められた。平成２年
11 月末には，東広島市の新キャンパスに，４つの研究部門の研究棟，飼育棟および野外飼育場が完成した。新キャンパスへの移転は，平成３年２月から始まり，平成４年１月末に完了した。	
 	
  平成６年６月，10 年時限が到来した進化生化学研究部門に代わり，種形成機
構研究部門が新設され，増員が認められた。また，平成 11 年４月からは形質発現機構研究部門に代わり，分化制御機構研究部門が，平成 16 年４月からは種形成機構研究部門に代わり，多様化機構研究部門が固定部門として新設された。	
 	
  しかし，平成 17 年度に系統維持班の助教授が定員削減の対象となり，発生遺伝学研究部門の助教授が兼任することで，定員削減による影響を最少に留めるよう努力し続けている。平成 19 年度に助手２と教務員２から助教４への振替が行われた。平成 21 年度に定年退職した助手のポストで、平成 22 年度には２名の特任助教が採用された。平成 22 年度における施設教員の構成は教授２（矢尾板芳郎、住田正幸），准教授４（鈴木厚、古野伸明、三浦郁夫、高瀬稔），助教
４（中島圭介、倉林敦、花田秀樹、田澤一朗），特任助教２（竹林公子、柏木啓子），客員教授２（松井正文、倉本満）,	
 研究員（Alam	
 Mohammad	
 Shafiqul）、
契約一般職員（中島妙子）である。系統維持班の人員の構成は准教授１（高瀬稔、兼任），助教２（花田秀樹、田澤一朗、いずれも兼任），技術員１（宇都武司），契約技能員２（難波ちよ、玉城淳子），契約用務員２（水戸妙子、渡辺八重子）、である。事務室には契約一般職員 1（脇早耶佳）がいる。	
 	
  系統維持班では、両生類 50 種 170 系統２〜３万匹の野外系統及び突然変異系
統等の特殊系統を保存している。これまでに確立されている系統には，自然・
人為色彩突然変異系統，野外種育成系統（近交系），四肢形成異常系統，癌多発系統，遺伝子組換え系統，遺伝子連鎖群解析系統，人工新種系統，核細胞質雑種系統および人為倍数体系統などがある。突然変異系統は約 50 系統にのぼる。
系統維持班では平成 22 年度には、交配系統数：40 系統、飼育幼生数：2,941 匹、

3

新しい系統数：20 系統、新しい系統の飼育幼生数：971 匹を系統保存しており、
5 系統 970 個体を研究材料として大学研究所に配布した。系統維持班には 17 件
約 200 人の見学者があった。広島県教育バザールへの参加し、生物教材を提供した。また，日本や世界各地から昭和 51 年より約 30 年あまりかけて野外収集した９科 27 属 112 種 320 集団 12,600 匹及び実験的に作製された特殊系統 100
系統４千匹のカエルがマイナス 80 度に凍結保存されている。	
 	
  平成 14 年度より文部科学省のナショナルバイオリソースプロジェクト（NBR）の中核的拠点整備プログラム「ネッタイツメガエル」の中核機関として選定されて，ネッタイツメガエルの収集，人工増殖，近交系の開発，研究者への提供を行った。平成 19 年度より第２期ナショナルバイオリソースプロジェクトが始
まり，ネッタイツメガエルの中核機関として同様の事業を継続している。このプロジェクトには３名の契約技術職員（小林里美,	
 榎本美香、西口祐子）が従事している。	
 	  平成 21 年度より特別教育研究経費「先端的両生類研究の展開‐両生類の絶滅危惧種の保全と標的遺伝子破壊方法の開発‐」が５年に渡り展開されることとなった。それにより２名の特任助教（井川武、Islam	
 Mohammed	
 Mafizul）が採用され研究に従事している。	
 
	
 

II.	
 教育活動	 	
  両生類研究施設は，生物科学専攻で両生類発生遺伝学演習，両生類多様化機
構学演習，両生類分化制御機構学演習を開講し，細胞と生命，形態形成，性の起源，分類・進化の授業や生物科学特別研究や生物科学研究セミナーに携わっている。今年度，博士課程前期１年に５名，２年に２名，後期１年に１名，２
年に２名，３年に２名で合計 1２名の院生が在学しており，当施設で大学院研究に励んでいる。博士課程前期学生の国内学会発表は５件であり，博士課程後期
学生の国内学会発表は３件，国際学会での発表は２件である。原著論文発表は博士課程後期で４編である。今年度，博士課程後期３年の１名が，以下の学位論文により博士号を取得している。	
 
	
 Nia	
 Kurniawan	 Genetic	 divergence,	
 phylogenetic	
 relationship,	
 and	
 taxonomic	
 status	
 in	
 the	
 
Fejervarya	
 cancrivora	
 complex	
 from	
 Indonesia	
 and	
 other	 Asian	 countries	 based	 on	
 allozyme	 and	
 molecular	 techniques,	
 morphological	
 observations	 and	
 crossing	 experiments	 「インドネシアとアジア諸国のカニクイガエル類における遺伝的分化と系統関
係と分類学的	 	  位置付け	 :	 アロザイムと mtDNA 分析、外部形態観察および交雑実験よる解明」
	 	
 	 平成 22 年 9 月 27 日	
 	 	  大学院生の教育活動の一環として，月に２回，教員，ポスドク，博士課程後4

期の大学院生が研究活動報告を両生類研究施設公開セミナーとして行っている。
	
 
	
 
	
  スーパーサイエンスハイスクールでの教育活動に関しては，三浦准教授が理
数ゼミ（生物）の講師として広島県立広島国泰寺高等学校において，生徒に研究および教育の指導をしている。今年度は、クラブアシスタンスとして「遺伝子と生物学研究	
 −何を調べ、どう使うか	 −」という題名で模擬授業を行っている。（2010 年 12 月 19 日（日）：広島市）	
 	
  三浦准教授は，その他にも SSH 課題研究「生命科学基礎」講義として「ヒトがヒト／動物たる由縁」を岡山清心女子高校において行っている。
（2011 年 2 月
1 日（月）：倉敷市）	
 	
 	  鈴木准教授は名古屋大学医学部において非常勤講師を担当している。百数十名程度の医学部生を対象に「両生類の初期胚を用いた発生生物学研究」について講義を行い，臨床医学における基礎研究の重要性などについて解説し，基礎
生物学および先端医療への理解を促している。	
 
	
 

III.	
 研究活動と研究内容現況	
 	
  発生遺伝学研究部門，分化制御機構研究部門,	
 多様化機構研究部門に分けて記載する。	
 	
 発生遺伝学研究部門	
 ○研究活動の概要	
 	
  本研究部門は「種々の両生類を材料として，遺伝学と発生学との新領域を開拓する。」ことを目標として，昭和 42 年６月に最初の両生類研究施設の研究部門として創設された。それから 40 年余りの間に古典的遺伝学的手法や実験動物学的手法に重きを置く研究から，次第に遺伝子工学的手法，細胞生物学的手法なども取り入れて，両生類の発生を分子生物学的視点から考察する研究へと進んでいる。平成 22 年度には本研究部門では、原著論文３編、総説・解説１編、国内学会での一般講演６件、研究助成金の受入は４件である。研究内容は以下の通りである。	
 １）甲状腺ホルモン受容体の発現量の違いによる甲状腺ホルモン感受性の制御	
 	
  両生類の変態（メタモルフォシス）は、幼生から成体へと体の作り替えが起きる現象である。特に無尾両生類の変態は劇的であり、四肢の発生、成長と尾の退縮が連続して起きる。変態における全身の体内器官の形態変化は決まった順序で起きる。形態変化のタイミングを決めている要因を調べるために、組織ごとに安定して発現していると想定されている甲状腺ホルモン受容体alphaに注目して研究を押し進めた。甲状腺ホルモンの合成を阻害し，メタモルフォシスを抑制した幼生の尾部筋細胞において甲状腺ホルモン受容体の強制発現を行

5い，通常では反応できない低濃度の甲状腺ホルモン（T4）でも細胞死が誘導されることを、昨年度に確認した。	
 	
  甲状腺ホルモン受容体の高発現下での低濃度の甲状腺ホルモン（T4）による筋細胞死が甲状腺ホルモン活性化酵素阻害物質イオパニ酸により抑制された。
つまり、甲状腺ホルモン活性化酵素の発現誘導を介して細胞死が起きていることが示唆された。実際、尾の筋細胞に甲状腺ホルモン受容体を過剰発現させて低濃度の甲状腺ホルモン処理した時に甲状腺ホルモン活性化酵素mRNAの誘導が観察された。	
 	  甲状腺ホルモン活性化酵素遺伝子のプロモーターを解析すると、甲状腺ホルモン認識塩基配列（TRE）が存在していた。Gel	 retardation	
 assayによって、甲状腺ホルモン受容体beta遺伝子のプロモーターのTREより甲状腺ホルモン受容体への親和性が低いTREであることを示した。したがって、甲状腺ホルモン活性化酵素のTREが甲状腺ホルモンにより制御されるためには甲状腺ホルモン受容体の高発現が必要であることが示唆された。	
 	
  上記の実験結果により、甲状腺ホルモン受容体alphaが高発現している後肢や過剰発現させた尾の筋細胞では、変態前期の少量の甲状腺ホルモン前駆体（T4）でも甲状腺ホルモン活性化酵素遺伝子のプロモーターを弱く刺激して甲状腺ホルモン活性化酵素を誘導してT4を活性型甲状腺ホルモン（T3）に変換し、そのうちに、より安定的に甲状腺ホルモン活性化酵素を発現させ、数日後には高い
甲状腺ホルモン活性化酵素遺伝子の安定的発現によりT4が効率にT3に活性化され、形態変化が起きるものと考えられる。したがって、変態における形態変化のタイミングの決定機構として、この「甲状腺ホルモン受容体alpha高発現によるpositive	 feed-forward説」を提唱する。これによれば、器官の甲状腺ホルモン受容体alphaの発現が高い程、変態のより早い時期に器官の再構成が起きることになる。	
 ２）性転換機構の解析：両生類への性ホルモンおよび化学物質影響の基盤的研究	 	  ツチガエル（Rana	 rugosa）およびトノサマガエル（R.	
 nigromaculata）、ネ
ッタイツメガエル（Xenopus	
 tropicalis）を用いて、性ホルモン投与または環
境化学物質投与による性転換効果に関する基盤的データの収集を目的として行った。アンドロゲンによる性転換がほとんど誘導されないツチガエル地方集団とほぼ 100％性転換が誘導されるツチガエル地方集団を用いた雑種幼生にアン
ドロゲン処理を行ったところ、性転換が有意に誘導された。従って、性転換抑制機構ではなく性転換誘導機構の存在が示唆された。さらに、変態後のトノサマガエルでは NP および BPA の投与により精巣卵形成が誘導され、エストロゲン投与では誘導されなかったが、今回、変態後のネッタイツメガエルではいずれの処理においても精巣卵形成は見られなかった。従って、精巣卵形成はエスト
ロゲン作用とは異なる作用により誘導され、その誘導作用には種差があることが明らかになった。	
 6３）性分化関連遺伝子の探索：マイクロアレイを用いた網羅的解析	 	
  性分化後の NF ステージ 58 および変態完了期の NF ステージ 66 のネッタイツ
メガエルの精巣および卵巣における遺伝子発現をマイクロアレイ法により網羅的に解析した。精巣で発現量が多い遺伝子に着目したところ、細胞間結合に関するいくつかの遺伝子が含まれていた。そこで、それらの遺伝子発現を RT-PCR
法により解析したところ、Claudin 遺伝子がネッタイツメガエルの精巣において高い発現を示した。さらに、in	
 situハイブリダイゼーション解析を行ったとこ
ろ、ネッタイツメガエルおよびツチガエル共に精巣の生殖細胞が強い陽性を示した。	
 ４）両生類脳におけるニューロステロイド生合成：アカハライモリの脳におけるシトクロム	 	  	  P450scc 遺伝子発現	 	  アカハライモリからシトクロムP450scc遺伝子を単離し、脳における遺伝子発現を解析したところ、様々な脳領域において遺伝子発現が見られた。さらに、
in	
 vitroでの脳のプレグネノロン生合成も解析した。ほ乳類および鳥類、無尾
両生類においてニューロステロイド生合成が報告されていることから、ニューロステロイド生合成は脊椎動物において広く見られる生理的な現象であることが考えられた。	
 ５）坑酸化剤（phenolic	  antioxidant）は除草剤パラコートによって誘起された培養カエル白血球細胞の染色体損傷を強める	 	  代表的な phenolic	
 antioxidant の一つにビタミン E（VE）がある。VE の本来の機能はヒトや動物体内で起こる脂質過酸化の抑制であるが、イニシエーター
によって活性化された VE はヒト低密度リポタンパクの酸化を促進することが知られている。これは、VE の脂質過酸化物に対する抑制反応が常に起こるものではなく、ある種の条件が揃うと、VE 坑酸化機能はかく乱され、逆に酸化ストレスを強めることを意味する。	
 	
  除草剤パラコート（PQ）の毒性は無尾両生類の胚やオタマジャクシに対して致死性および催奇性が認められ、いずれも PQ から発生する活性酸素が原因であると考えられている。このことから、PQ によって誘導される活性酸素に対して無尾両生類は感受性が高いことがわかる。さらに、PQ によって発生する活性酸
素はチャイニーズハムスター由来の培養細胞に対して染色体異常の誘起に関わっていると考えられ、その機構は①PQ による NADPH からの電子の奪取、②スーパーオキシドの発生、③スーパーオキシドジスムターゼによる H2O2 への代謝、④フェントン反応によるヒドロキシラジカルの発生、⑤脂質過酸化、⑥染色体異常発生である。本研究は、培養カエル白血球細胞を用い、脂質過酸化抑制物
質 phenolic	  antioxidant による PQ 遺伝毒性の強化機構を調べた。その結果、PQ 共存下の phenolic	
 antioxidantは本来の役割である脂質過酸化の抑制をせず、PQ の電子ドナーとなって、細胞遺伝毒性を増幅することがわかった。	
 ６）変態前後のツメガエルにおけるHox遺伝子の発現	
 7	  両生類変態における	
 Hox	
 遺伝子の機能について研究している。平成２２年度
は、ネッタイツメガエル変態期の全	
 Hox	
 遺伝子の発現等、両生類変態期における	
 Hox	
 遺伝子の発現を詳しく調べた。これにより、無尾類幼生で	
 Hox	
 遺伝子
が尾芽胚期とよく似た発現パターンを示すことを明らかにした。	
 	
 分化制御機構研究部門	
 ○研究活動の概要	
 	
  分化制御機構研究部門は，卵の分化，生殖腺，体色を決定する機構，環境と内分泌撹乱について分子細胞生物学的な手法を用いて研究している。平成 22 年
度には本研究部門では、原著論文６編、総説・解説２編、国内学会での招待講
演３件、国内学会での一般講演９件、研究助成金の受入は２件である。研究内
容は以下の通りである。	
 １）卵形成における卵特異的細胞周期調節遺伝子の発現調節機構と機能解析	 	
  卵の分化機構を研究する為には、卵特異的に発現する遺伝子に着目し、その卵特異的な発現調節機構を解明する事がきわめて重要であると考えられる。卵は、減数分裂や受精後に特殊な細胞分裂を行う。例えば、減数分裂では、DNA 複製をスキップした 2 回の連続した分裂をするが、そのために、Mos という卵特異的な細胞周期調節因子を発現しており、この発現が DNA 複製のスキップのため必須である事を報告した。また、受精後、卵は最初の一回を除き、G１,G2 期のない細胞分裂（卵割）を中期胞胚まで行うが、そのためには、卵特異的な細胞
周期調節因子である Wee1A の発現が必須である。もし、体細胞特異的な Wee1Bが発現すれば受精後の卵割は失敗する。よって、これらの卵特異的な細胞周期
調節因子の発現調節機構の解明は、卵への決定・分化の機構解明につながる。	
 	
  細胞周期調節因子に母性型があると分かって来たのは最近であり、その発現調節機構の研究は今までに行われていない。現在、ニシツメガエルの Mos と Wee1Aのプロモ−タ−領域と思われる部分（翻訳開始点より 10kbo 上流まで）をクロー
ニングし、GFP の上流に挿入した transgenic	
 ガエル作製用のベクターを構築した。このコンストラクトや、プロモーターにいろんな欠失を導入したコンストラクトで transgenic	 ガエルを作製し、卵特異的な発現に必要な領域を特定する。
また、これらの遺伝子のノックアウトも行いたい。このようにして卵特異的な細胞周期調節因子の発現調節機構と機能の解析を行う。	
 ２）両生類を用いた生活環に対する過重力および強磁場の影響に関する研究	 	
  人類はいずれ火星などの惑星探査に本格的に乗り出すと思われる。しかし、地球とはまるで異なる重力・磁場などの環境下での長期滞在はヒトの身体に大きなストレスをもたらすと考えられる。これまでに両生類は、重力変化に関す
る地上および宇宙実験によく用いられ相当量のデータが集積されている。一方、両生類には磁気受容能力があるとの報告もあるが、磁場影響に関する研究は少ない。私たち宇宙環境利用委員会研究チームのテーマである「両生類の生活環に対する過重力および強磁場の影響」は、平成16年度から今年度に至るまでJAXA

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で採択されている。主として、アフリカツメガエルを実験材料として用い、その生活環に対する過重力・強磁場影響について研究を続けている。初期発生、特に受精直後の卵の感受性は著しく高く、この時期に過重力や強磁場を印加した場合、いろいろな奇形が出現する。胚やオタマジャクシの発生・成長は阻害
され、脳や眼の細胞にアポトーシスが亢進され、さらには頭部マーカー遺伝子やセメント腺マーカー遺伝子の発現が低下することなどが分かった。過重力や強磁場に対する感受性の高い時期の同定や発生・性分化への影響を簡潔かつ迅
速に調べるため遺伝子レベルでの解析方法の開発も予定している。	
 ３）アフリカツメガエルの発生におけるＩ型ケラチンの新規遺伝子の特徴	
 ケラチンは脊椎動物の上皮性細胞骨格繊維である中間径フィラメントの構成
タンパク質で、生化学的性質の違いにより I 型と II 型に区別される。アフリカ
ツメガエルのケラチン遺伝子は自然変態中に幼生型から成体型へと変化すること、遺伝子の中には尾部再生中に誘起されるも、肢芽では不活性化されるものがあること、などがこれまでの私たちの研究等で明らかになっている。しかし、その制御機構についてはよくわかっていない。ごく最近、私たちは、アフリカ
ツメガエル尾部の再生中に傷ついた上皮細胞で誘導される I 型ケラチンの新規遺伝子（Tazaki ら,	
 2005；クローン名：XL073g19）に関する研究結果を公表した。まず、この遺伝子の 4.2-kb 上流域と連結させた EGFP レポーター遺伝子を持つトランスジェニックアフリカツメガエルを作製し、その F1 の胚およびオタ
マジャクシを用いて生体内における遺伝子の転写調節を調べた。自然変態の場
合、EGFP 遺伝子発現は St.40 オタマジャクシの尾鰭、嗅上皮、外鰓、鰓弓で、外鰓の縮小した St.44 オタマジャクシでは鰓弓で見られたが、変態開始時の鰓吸収に伴い急速に消えた。変態前期のオタマジャクシに甲状腺ホルモン(TH)を投与した場合、TH 曝露５日目に強烈な EGFP 蛍光が無処理対照群の内鰓で見られたのに対し、処理群では急速に消えていった。同様のことは鰓弁でも観察された。一方、レポーター発現は TH 投与によって発達中の前後肢でアップレギュレートされた。上述の如く、トランスジェニックガエル系統は各種器官の形成、発生、吸収を客観的に明らかにするための有用な研究材料となりうる。	
 ４）両生類に対する化学物質の影響	
 	
  環境省の調査によると、アトピーやぜんそく、肥満、ADHD（注意欠陥多動性障害）などの疾患をもつ子どもの数が年々増えている。それには遺伝的要因のみならず化学物質曝露による環境要因も関係しているものと推測されている。
私たちは、甲状腺受容体遺伝子（TRbetaA1）の上流域とEGFP遺伝子を連結させて作ったプラスミドDNAを導入したトランスジェニックツメガエルを用いるな
どしてBPAとその関連化合物、UVフィルター、４-OH-TCBなどの影響を調べてきた。現在、脳神経系に対する影響について研究中である。	
 ５）ZNF による甲状腺ホルモン受容体 b 遺伝子の破壊	 	  ノックアウトによる特定の遺伝子破壊は、その遺伝子の機能を探る上で非常に有効な手段である。この技術は、マウスでは ES 細胞を用いて確立されてポピ

9ュラーにつかわれるようになっているが、それ以外の動物では ES 細胞が確立されていない事で不可能である。しかしながら、最近、ZNF	
 (Zinc	 finger	
 nuclease)を使用すると、特定の配列に突然変異が入れられる事がわかり、コオロギやラットなどで応用されて来た。この技術をカエルで確立する事は、カエルの実験動物として有用性を飛躍的に高める。今回、カエルで ZNF が応用可能かどうか実験を行った。選んだ遺伝子は甲状腺ホルモン受容体 b 遺伝子である。この結果、TRb の遺伝子に変異を入れられる事がわかった。この変異を入ったカエルを育て、子孫をとったり、他の遺伝子を ZNF で破壊したい。	
 ６）Nramp ファミリーの新規バナジウム／プロトン共役輸送体	
 	
  海産動物のホヤは体内に高濃度のバナジウムをもっている。これは、海中のバナジウムから濃縮されたもので、ホヤはバナジウムを高濃度に濃縮する機構を持っている。その機構を研究している。その結果、Nramp/DCT ファミリーは、
二価金属イオンの輸送に関わる膜輸送体である。我々はバナジウムを高度に濃縮する海産動物ホヤ類の血球から Nramp ファミリーの新規膜輸送体遺伝子を同定した。この遺伝子 AsNramp はヒトの Nramp1 および 2 と、アミノ酸レベルで約60%の相同性があった。アフリカツメガエルの卵母細胞による発現系を用いて金属輸送活性を検証したところ、プロトンとの共役輸送によって四価バナジウムを取り込む共役輸送体であることがわかった。さらに、四価バナジウムの輸送
は Na による阻害を受けること、AsNramp は血球の液胞膜画分に局在することも明らかになった。	
 ７）mTOR 情報伝達系の解析	 	
  炎症は、生体の損傷に対する組織の反応であり、その反応の一部には mTOR	 (mammalian	 target	 of	
 rapamycin の略。ほ乳類などの動物の細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質キナーゼ。最初に rapamycin の標的タンパク質として見つかったのでこの名前がついた)情報伝達系が関与している。この情報伝達系の研究を進めている。その結果、炎症に関与する mTOR 情報伝達系に関与するタンパク質や、その相互作用を調べる事でこの情報伝達系の全貌を解明しようとしている。その結果、mTOR 伝達系に Ego1,	
 Ego3と Gtr1,Gtr2 のタンパク質が関与していることがわかった。	
 	 ８）性決定と生殖腺の性分化	 	 	  性という仕組みは、生物に多様性を生み出し、個体や種の維持、そして進化に貢献する重要な機能のひとつである。本研究では、性決定や性分化の普遍性と多様性の分子基盤を解明するため、我が国に生息するツチガエルに着目した。
本種は、地域集団ごとに、性決定や性分化機構の著しい多様性を有する、世界に類を見ない特徴をもつ。2010 年度は以下の成果を挙げた。	
 (i) 生殖腺性分化の多様性機構の解明	
 	
  脊椎動物では、性ステロイドホルモンが生殖腺の性分化に重要な役割を担っている。哺乳類の真獣類は外部から投与した性ホルモンに全く感受性を示さな
いが、有袋類はエストロゲンによって遺伝的雄に性転換が生じる。また、他の脊椎動物では、性ホルモンに対する感受性は種によって異なる。ツチガエルは10遺伝的に大きく 4 つの地域グループに分けられるが、それぞれの集団において性転換の感受性が異なることを明らかにした。性染色体が未分化な西日本と東
日本はテストステロンとエストロゲンによって完全に性転換を生じる。一方、性染色体が分化した ZW 集団では雄から雌への性転換に感受性を示すが、雌から雄へは性転換しない。さらに、XY 集団では、いずれの方向にも性転換が生じな
いことがわかった。さらに、エストロゲンによる雄から雌への性転換について
は、生殖腺性分化の開始時期とホルモン投与による性転換の感受期（これを窓とよぶ）との時間的相互関係が決定的に重要であることを実証した。	
 	 	 (ii)佐渡島に新種ガエルを発見	 	
  ツチガエルの新潟県佐渡島の集団は、形態学的に本土集団と著しく異なることを発見した。そこで、外部形態、遺伝および生殖について詳細に調べた。外部形態では佐渡集団は小柄であり、特に腹側が強い黄色を呈すること、皮膚全体が滑らかであること、約 6 割の個体に本土では見られない細い背中線が存在することがわかった。ミトコンドリア遺伝子の解析から、佐渡黄腹集団は、東日本（関東）の集団と共通性があることがわかった。それゆえ、佐渡黄腹は、
古くから東日本全域に生息していた東日本集団に起源を発し、その後、佐渡島に孤立し、独自に分化したと推測された。さらに同島の南部に生息する新潟由来の集団との交雑実験、鳴き声解析、詳細な外部形態の解析を行っている。	
 	 ９）色彩発現	
 
	
  	
 (i)	
 ニホンアカガエルの卵の色を決定する突然変異の同定	
 	
  両生類の色彩を担う色素細胞には 3 種類存在し、主に皮膚、眼、卵に存在する。これまで、同一つの遺伝子突然変異体において、眼と皮膚の色彩が異なる例が発見されていることから、眼と皮膚では色彩遺伝子の発現制御が異なることが知られていた。今回、つくば市でニホンアカガエルの白色卵塊が発見されたので、それを成熟親まで飼育し、さらに兄妹同士の F１を作成した。その結果、白色卵とその F１はいずれも野生型の皮膚と眼の色彩をもつ成体に成熟した。ところが、F１の約 1／4 の雌に、卵の色だけが白色である個体が見つかった。以上から、卵の色彩だけを制御する遺伝的仕組みの存在することが明らかになっ
た。	
 
(ii)	
 ナゴヤダルマガエルの遺伝的地域分化	 	  西日本に生息するナゴヤダルマガエルは生息数が減少しており、近年とくに保全が叫ばれているカエルのひとつである。本種は、古典的に名古屋集団と岡山集団の大きく 2 つに分けられ、鳴き声、外部形態が異なり、遺伝的な違いも指摘されている。本研究では、2 つの集団の遺伝的分化の違い、分布の広まりと、
特に境界集団の同定を行った。その結果、ミトコンドリア遺伝子の配列は両集団で明らかな違いがあり、その境界は兵庫県西端部付近であった。一方、核遺伝子のひとつ Sox3 の解析では、名古屋集団の遺伝子型が岡山集団の中央部まで到達していることがわかった。以上から、2 つの集団の間を構成する、岡山東部
から名古屋西部に掛けて分布する集団では、核と細胞質の由来がことなる雑種から構成されることが示唆された。	
 

11

	
 	
 	
 (iii)アカハライモリの秋交配の証明	 	  アカハライモリは一般に春から初夏に掛けて交配、産卵、繁殖することが知られている。しかし、一方で、秋にも雄の婚姻食や求愛が観察されることから、秋からの繁殖（交配）の開始が示唆されてきた。そこで本研究は、イモリの生殖腺と生殖器官における成熟の年周期変化を観察し、とくに、雌貯精嚢内への秋の精子の取り込みについて調べた。その結果、生殖腺と生殖器官は春に成熟して夏には退化的になり、秋から再び成熟が開始すること、秋にはいずれの雌の貯精嚢にも十分な精子がとりこまれていること、そして、その秋精子は春の精子と共に、春から初夏にかけての産卵に使用されていることを明らかにした。
よって、アカハライモリの繁殖（交配）は秋（10月）から開始し、冬眠の冬を挟んで初夏まで至る。従来考えられていた期間より6ヶ月早く開始すると結論し
た。	
 
	
 
多様化機構研究部門	
 ○研究活動の概要	
 	
  多様化機構研究部門では，分子生物学的手法や交雑実験に基づいて両生類における種の多様性やゲノム構造の分子進化プロセスを究明するとともに，人工繁殖による絶滅危惧種の効率的な保全方法の確立を目指した研究や，透明ガエ
ルの作成を進めている。また，両生類初期胚を用いての形態形成の研究も展開している。平成22年度には本研究部門では、原著論文7編、総説・解説3編、国際会議での招待講演１件、国際会議での一般講演７件、国内学会での招待講演
１件、国内学会での一般講演１０件、研究助成金の受入は４件である。研究内
容は以下の通りである。	
 	 １）繁殖隔離機構に基づく種の多様性	 	  カニクイガエルは、アジアに広く分布する種の一つであり、中国からインド
までと、フィリピンおよびインドネシアに棲息することが知られている。従来
単一種 Fejervarya	
 cancrivora とされていたが、最近の研究から、形態学的にも遺伝学的にも分化した複数のタイプの存在が知られてきた。本研究では、形態観察、mtDNA 分析及び交雑実験によって、アジアに広範に分布するカニクイガ
エル類について、どのような種多様性があるのか、どの程度の遺伝的また形態的分化が起っているのか、どのような繁殖隔離機構が確立しているのか、それらは分類学的にどのように位置付けられるのか、を明らかにした。その結果、（1）
アジア産のカニクイガエル類は外部形態および遺伝的特徴からマングローブ型、
大型、プランラト/スラベシ型の大きく 3 つに分けられること、(2)これらは互いに生殖的に隔離された別種であること、(3)	
 大型は F.	
 cancrivora、マングロ
ーブ型は F.	
 moodiei に該当し、スラベシ型は未記載種の可能性があること、(4)	
 従来の F.	
 raja は F.	
 cancrivora のシノニムの可能性があること、が明らかに
なった。	
 

12

２）ヒメアマガエル科の高次系統関係と生物地理	 	
  両生類は海を渡れないため、大陸を跨いだ両生類の分布は、中生代に生じた超大陸の分断に沿って生じたと考えられている。今年度の研究では、世界のほとんどの大陸に分布するヒメアマガエル科について分子系統学的手法を用いて、大陸間の分類群の系統関係と分岐年代の推定を行った。その結果、ヒメアマガ
エルの中でもアフリカに分布するグループが、本科の原始的なグループである
可能性が示唆され、本科はアフリカに起源すると考えられた。また、大陸間分類群の分岐年代は、古地理学的に各々の大陸が分かれたとされている時代よりも若いものであった。このことは、古地理学的知見よりも長い間各大陸間に陸橋が存在したとする仮説を支持する。さらに、オセアニア地域に分布するオセ
アニアヒメアマガエル亜科は、南極とオーストラリアが地続きであった時代に、南極を通って分布を広げたと考えられていた。しかし本研究によって、アジアのみに分布する亜科所属不明属	
 Gastrophrynoides	
 は、アジア産のヒメアマガ
エル亜科よりもむしろオセアニアヒメアマガエル科の最も原始的な系統的位置を有することが明らかになった。さらに分岐年代推定の結果を合わせると、オ
セアニアヒメアマガエル亜科の分布域拡大ルートはこれまでに考えられていた
南極経由ではなく、むしろ東南アジアの島々が隆起した2000万年前頃に、アジアからニューギニアに渡った可能性がきわめて高いことを示した。	
 ３）絶滅危惧種の保全と分類学的位置付け	 	  イシカワガエルは、奄美大島と沖縄島北部に分布する日本で最も美しいとされるカエルで、鹿児島県と沖縄県では天然記念物に、環境省レッドリストでは絶滅危惧IB類に指定されるなど、早急な保護対策が求められている。本研究は、（1）実験室での人工繁殖・飼育維持方法を確立し、効率的な保全に資する（2）
集団間及び集団内の遺伝的多様性を調べ、人工繁殖下でも遺伝的多様性を評価する（3）種内の遺伝的及び形態的分化を解明するとともに、交配後隔離の程度を明らかにすることによって、各集団の分類学的な位置付けを明らかにする、ことを目的に行った。昨年の繁殖期には、人工繁殖によって生まれた6年齢の人
工繁殖個体から、完全飼育下での自然繁殖によって、多数の2代目を得ることに成功した。また、形態計測に基づく主成分分析の結果、奄美産と沖縄産とは形態的に明瞭な相違があること、アロザイム分析及びmtDNA解析から、両集団は遺伝的にも明瞭に分化していることがわかった。さらに、交雑実験の結果、沖縄産雌と奄美産雄との雑種は発生初期ですべて致死になること、奄美産雌と沖縄
産雄の雑種は正常に発育するが、成熟期に達した雑種の雄は精子形成が異常であることがわかった。奄美産と沖縄産は遺伝的にも形態的にも明瞭に分化しており、生殖的にも明確な交配後隔離が成立していることから、両集団は別種とするのが妥当であると考えられた。イシカワガエルの基準産地は沖縄本島であることから、奄美産のイシカワガエルを新種「アマミイシカワガエル」Odorrana	 splendidaとして記載した。	
 ４）絶滅危惧種イシカワガエル及びアマミイシカワガエルにおけるマイクロサ13

テライトマー	  	  	 カーを用いた遺伝的多様性の解明	 	
  西南諸島は両生類に限らず動植物全般における生物多様性のホットスポット
であると同時に、島嶼という限定的な生息域によって絶滅の危険性も孕んでおり、具体的な保全活動を行う上で種内の遺伝的多様性を解明しておく必要がある。しかしながら、従来の研究では島間の遺伝的関係にのみ焦点が置かれ、島内の微細な集団構造についてはほとんど明らかになっていない。特に、日本産両生類における最美麗種と言われることも多い、イシカワガエルについては、
すでに沖縄島の集団の一部が失われた可能性が高く、速やかに研究に着手する必要があった。そこで、本研究では、まず、共優性かつ多型性に富んだ遺伝マーカーであるマイクロサテライト（以下、STR）遺伝子座を単離し、さらに、これらを用いてイシカワガエル・アマミイシカワガエルにおける遺伝的多様性と微細集団構造を解明した。本研究の結果、磁気ビーズ法及び、二重抑制 PCR 法によって単離された STR を含む 542 クローンから、安定的に増幅され、かつ多型性が確認された 12 遺伝子座が単離された。ハーディ・ワインベルグ平衡（HWE）
及び、連鎖平衡について、統計テストを行ったところ、一部の遺伝子座で HWEからの逸脱と連鎖不平衡が確認されたが、概ね常染色体上の中立的な遺伝子座であった。さらに、STRUCTURE を用いた集団構造解析の結果、イシカワガエルについては、階層的構造は見られなかったが、アマミイシカワガエルにおいては、
5 あるいは 6 個の遺伝的クラスターに分けられることが分かった。また、遺伝距離に基づく系統解析を行ったところ、アマミイシカワガエルの集団は地理的距
離が単系統を形成した。これらの集団構造を形成した環境的要因を探索するため、現在利用可能なほぼすべての地形データ（高度、植生、土壌、流水量、土壌水分含有量）を用いて、生息適地モデルを構築し、これに基づくコスト距離と遺伝距離を比較したところ、高度及び土壌を変数として構築したモデルと高い相関が見られた。したがって、アマミイシカワガエルの集団構造は、奄美大島における起伏の激しい複雑な地形と、それに依存した生息適地の連続性によって形成されたことが考えられた。	
 ５）透明ガエル「スケルピョン」の量産化	 	
  ニホンアカガエルにおいては、黒色眼と灰色眼の二つの色彩突然変異系統があり、これらの突然変異系統を用いて、2007 年には両生類で初となる体が透明で内臓が透けて見える「透明ガエル」（スケルピョン）を誕生させることに成功
し、「透明ガエルおよびその作製方法」	
 については特許を取得している。本研
究では、有用な実験動物の実用化を目的に、透明ガエルの量産化を行った。
「透明ガエル」の雌雄の組合せで交配を行い、2 代目「透明ガエル」の系統確立を試みるとともに、黒色眼と灰色眼の二つの色彩突然変異遺伝子をヘテロ接合に持つ雌雄を用いて、種々の組合せで交配を行うことによって、これらの遺伝子をホモ接合に持つ「透明ガエル」を飼育維持して、量産化に成功した。これらは、内臓透視のできる新しい実験動物として、環境、医学、生物学の分野において実験材料や教材として利用価値が高いと思われ、すでに国内外から需要があり、動物愛護の伝統がある欧米では、特に「透明ガエル」への関心は高い。	
 ６）両生類の初期発生過程における形態形成の分子機構	
 

14

	
  脊椎動物の初期発生では、一個の受精卵が細胞分裂を繰り返し、それぞれの細胞が分化しながら所定の位置に配置されていく。近年、これらの細胞分裂、分化、移動に細胞増殖因子が重要な役割を担うことが明らかにされている。本
研究では、アフリカツメガエルを用いて、初期発生過程における細胞増殖因子の働きを解析し、形態形成の分子機構の解明を試みている。骨形成タンパク質（BMP）は、体の背腹軸形成を制御する細胞増殖因子であり、当研究グループでは、BMPに対する細胞応答を抑制する働きを持つOct-25転写因子を単離している（Takebayashi-Suzuki	
 et	
 al.、	 Mechanisms	
 of	
 Development	 2007）。また、昨年度までに、Oct-25転写因子によって発現が誘導される標的遺伝子としてFoxB1転写因子を単離し、FoxB1がBMP応答を抑制して神経形成を促進すること、
および、他の細胞増殖因子シグナル（FGF、Wnt）と相互作用して中枢神経系の前後軸パターン形成を調節することを明らかにしてきた。平成22年度は、FoxB1
遺伝子の機能阻害実験を行い、初期発生におけるFoxB1の必要性を検討した。また、後方神経形成の促進機構についても解析を行った。特異的なアンチセンス
オリゴにより、FoxB1の機能を阻害すると、後方神経の抑制と前方神経の拡大が観察され、予想通りFoxB1が後方神経の形成に必要であることが確認できた。しかしながら、予想に反して神経組織の誘導自体は、ほぼ正常であることが分かり、FoxB1機能阻害の影響を補う分子が存在すると考えられた。このような機能を持つものとして、FoxB1遺伝子の上流で働くOct-25遺伝子が考えられたため、FoxB1とOct-25の二重阻害を行い、神経誘導が著しく抑制されることを確認した。
したがって、FoxB1とOct-25が機能的に協調して、神経形成の促進に働いている
ことが明らかになった。一方、後方神経形成の促進機構については、FoxB1が、Wnt・FGF経路を活性化して、神経の後方化を導くことが分かった。以上の結果
から、FoxB1は、Oct-25と協調的に働き、BMP応答を抑制することで神経化を引き起こし、またWnt・FGF経路を介して神経の後方化を促進することが分かった。	
 
	
 

IV.	
 社会活動	 	  ○セミナー・講義・講演会講師等	
 花田秀樹，田澤一朗：広島県立教育センター主催の「第13回生物教材バザール」に参加し教材の提供（2010年5月）	
 柏木啓子：第一回開会セミナー講師「北九州市板櫃川における後肢欠損ツチガエ
ルについて考える」2010 年 8 月 3 日	 北九州市役所（北九州市）	
 住田正幸：プレゼンター	
 「生きた化石イボイモリと日本一きれいなイシカワガエ
ルと内臓透視スケルピョン」日本動物学会第81回大会動物学ひろば	
  2010年9月
25日東京大学（東京）	
 住田正幸：科学実験教室講師「日本一きれいなイシカワガエルと透明ガエル	
 スケ
ルピョンのかんさつ教室」2010年11月12日	
  平岩小学校（東広島）	
 倉林	
 敦：長浜バイオ大学・バイオセミナー講師。講義題名「動物ミトゲノムの解15析方法と両生類における実践例：ミトゲノム解析から何を知ることができるのか？」2011年3月	
  長浜バイオ大学（長浜）	
 	
  ○各種役員，委員	
 矢尾板芳郎：文部科学省国立遺伝学研究所・生物遺伝資源委員会委員	
 花田	
  秀樹：日本動物学会中国四国支部・会計監査	 古野伸明：広島工業大学・入試委員	
 三浦郁夫：（財）染色体学会・理事・学会賞選考常任委員・学会誌編集委員	
 三浦郁夫：Editorial	 Board	 of	
 Asian	 Herpetological	
 Research	 柏木啓子：北九州市板櫃川後肢欠損ガエル調査検討委員会・委員	
 住田正幸：国際両生爬虫類学会・執行委員	
 	 鈴木	
  厚：日本ツメガエル研究集会・組織委員	 鈴木	
  厚：ツメガエルゲノムプロジェクト・ワーキンググループ委員	 倉林	
 敦：Gene誌	
 および	
 Zoological	
 Science誌・論文レヴューアー	
 
	
 

V.	
 国際交流活動	 ○国際共同研究	
 三浦郁夫	
 ・成都生物学研究所（中国）Prof.	
 Zeng	
 Xiaomao	 	
  研究テーマ：ツチガエル種族系統進化の起原をもとめて-日本から朝鮮半島、そ
して中国	
 
	
  大陸へ‐	 ・	
 キャンペラ大学（豪州）Prof.	
 Jenny	 Graves,	
 Prof.	
 Tariq	
 Ezaz	
 	
 研究テーマ：爬虫類および両生類における性染色体の進化について	
 
住田正幸	
 
・バングラデシュ農業大学（大学間協定締結校）Khan,	
 M.	
 M.	
 R.	
 教授との共同研
究	
 「生化学的および分子生物学的手法による日本とバングラデシュのカエル類の系
統進化関係」	
 倉林	
 敦	
 ・マラヤ大学	
 BA.	
 Daicus博士・マレーシア国民大学H-S	 Yong	
 教授（共にマレー
シア）、ブラウシュバイク工科大学・ミュンヘン動物博物館のMiguel	
 Vences教
授とFrank	
 Glaw	
 博士（共にドイツ）と共同研究を実施した。	
 	 ○外国人留学生の受入れ	
 
住田正幸	
 
・文部科学省国費留学生（Kurniawan,	
 Nia,	 インドネシア）（Ｄ３）	
 	
 ・文部科学省国費留学生（Hasan,	
 Mahmudul,	 バングラデシュ）（Ｄ２）	
 
	
 

16

○外国人客員研究員	
 
住田正幸	
 
・Alam,	
 Md.	
 Shafiqul（バングラデシュ農業大学）平成22年４月１日から平成22
年5月31日まで「バングラデシュにおける無尾両生類の種多様性と保全に関する
遺伝学的研究」というテーマで，共同研究を行った。	
 ・Agung	 Pramana	
 Warih	 Marhendra（University	
 of	
 Brawijaya,	
 Indonesia）平成22年6月17日から平成22年7月17日まで「ミトコンドリア16S	
 rRNA	 遺伝子の塩基配列に基づくインドネシア産無尾両生類における遺伝的多様性と系統関係に関する研究」というテーマで共同研究を行った。	
 
	
 

VI.	
 その他（特記事項）	
 ・理学部・大学院理学研究科公開（平成 22 年 11 月 5 日）において研究施設を公開し、およそ 150 名が見学した。上記とは別に，平成 22 年度には 17 件総数 200
名程が施設見学をしている。	
 ・花田秀樹助教と田澤一朗助教は附属両生類研究施設で行われている系統保存事
業に従事している。	
 ・NHK番組「クローズアップ現代」の「カエルの磁気浮上実験」（2010年12月13日放映）を藤原准教授（数理分子生命専攻）とともに行った。	
 ・International	
 Symposium	
 on	
 Biodiversity	
 Sciences	 (ISBDS)	
 2010,	
 “Genome,	 Evolution	
 and	
 Environment”	
 (August,	
 2010.	
 Nagoya)	
 において、倉林敦助教がTravel	
 Award を獲得した。	
 ・新種「アマミイシカワガエル」記載（Zootaxa	
 2767:	
 25-40）の成果が、新聞（朝日新聞 2010 年 9 月 16 日、2011 年 2 月 18 日、朝日小学生新聞 2011 年 2 月 27 日、
奄美新聞 2010 年 9 月 16 日、2011 年 2 月 20 日、南海日々新聞 2011 年 2 月 20 日）に掲載された。	
 ・沖縄本島で「青いイシカワガエル」の発見が、報道（日本経済新聞他	
 国内 10
紙 2010 年 4 月 3 日~6 日）された。	
 ・透明カエル「スケルピョン」の量産化が、新聞（読売新聞 2010 年 9 月 27 日、朝日新聞 2011 年 2 月 21 日~22 日、朝日小学生新聞 2011 年 2 月 23 日）やテレビ（TBS 全国放送 2011 年 2 月 21 日~22 日）で取り上げられた。	
 ・	
 イボイモリの実験室での自然繁殖成功が、読売新聞（2010 年 9 月 25 日）で報道された。	
 17

VII.各部門の研究内容と研究業績	
 [発生遺伝学研究部門]	
 	
 教授･矢尾板芳郎（Yoshio	 Yaoita）	
 
	
 
研究内容	
 
１.甲状腺ホルモン受容体の発現量の違いによる甲状腺ホルモン感受性の制御	
 Regulation	
 of	
 thyroid	
 hormone	 sensitivity	
 by	
 differential	
 expression	
 of	
 
the	
 thyroid	
 hormone	 receptor	
 
	
 
[目的]	
 
	
  両生類の変態（メタモルフォシス）は、幼生から成体へと体の作り替えが起きる現象である。特に無尾両生類の変態は劇的であり、四肢の発生、成長と尾の退縮が連続して起きる。体長の２倍以上の長さである尾が数日のうちに完全に消失する。無尾両生類の発生に伴い、前後肢の成長や尾の退縮等、ほとんど全ての体内器官が変化していく。このような体の再構成のメカニズムを分子生
物学的な立場から明らかにするために研究をしている。	
 	
  変態における全身の体内器官の形態変化は決まった順序で起きる。発生過程の血中甲状腺ホルモン濃度の増加に伴い、後肢は変態前期の低濃度の甲状腺ホルモンに反応して分化、成長するのに対して、尾の筋細胞は変態の最盛期の高濃度の甲状腺ホルモンの存在下でのみ細胞死を起こす。この説明として、各器官に異なる、甲状腺ホルモン感受性があるためと考えられているが、その分子基盤に関しては何も報告されていない。	
 	
  形態変化のタイミングを決めている要因を調べるために、組織ごとに安定して発現していると想定されている甲状腺ホルモン受容体alphaに注目して研究を押し進めた。	
 	 [成果･考察]	
 	
  無尾両生類変態の形態変化のタイミングの決定機構のモデルを実験結果に基づいて検討した。	
 １）甲状腺ホルモン受容体alphaとbetaや甲状腺ホルモン活性化酵素と不活性化
酵素の遺伝子発現の変化を様々な器官で調べた。血中甲状腺ホルモン濃度が低い時期に分化･成長している後肢や脳では、甲状腺ホルモン受容体alphaの発現が高く、一方、甲状腺ホルモン濃度が高くなる変態の最盛期で退縮が起きる尾では甲状腺ホルモン受容体alphaの発現は低かった。甲状腺ホルモンの活性化酵
素は組織が形態変化を起こす時に、その組織での発現が高かった。甲状腺ホルモン受容体alphaの発現が高いことが組織の甲状腺ホルモンに対する感受性を高くし、甲状腺ホルモンへの反応が甲状腺ホルモン活性化酵素により促進されると推測した。	
 ２）幼生における甲状腺ホルモンの合成を薬物で阻害して、飼育水に加えた甲18

状腺ホルモン濃度だけが幼生に影響を及ぼす条件下で、尾の筋細胞に甲状腺ホルモン受容体とGFP遺伝子を強制発現させ、低濃度の甲状腺ホルモンの飼育水で処理すると筋細胞のGFP発現が減少した。筋細胞に細胞死抑制遺伝子bclXLを共に強制発現させるとGFP発現の減少が抑制されることから、甲状腺ホルモン受容体の高発現下では低濃度の甲状腺ホルモンに反応して筋細胞が死んでいることが明らかになった。	
 ３）甲状腺ホルモン受容体の高発現下での低濃度の甲状腺ホルモンによる筋細胞死が甲状腺ホルモン活性化酵素阻害物質イオパニ酸により抑制された。つまり、甲状腺ホルモン活性化酵素の発現誘導を介して細胞死が起きていることが示唆された。実際、尾の筋細胞に甲状腺ホルモン受容体を過剰発現させて低濃度の甲状腺ホルモン処理した時に甲状腺ホルモン活性化酵素mRNAの誘導が観察された。後肢では甲状腺ホルモン活性化酵素mRNAが高く発現されていることが知られている。これも、甲状腺ホルモンによって誘導されていることを証明した。	
 ４）甲状腺ホルモン活性化酵素遺伝子のプロモーターを解析すると、甲状腺ホ
ルモン認識塩基配列（TRE）が存在していた。Gel	 retardation	
 assayによって、甲状腺ホルモン受容体beta遺伝子のプロモーターのTREより甲状腺ホルモン受容体への親和性が低いTREであることを示した。したがって、甲状腺ホルモン活性化酵素のTREが甲状腺ホルモンにより制御されるためには甲状腺ホルモン受容体の高発現が必要であることが示唆された。実際、細胞株で甲状腺ホルモン
受容体遺伝子を過剰発現させると甲状腺ホルモン活性化酵素mRNAがより多く誘導された。卵母細胞の系でも甲状腺ホルモン受容体遺伝子を高発現させることが、甲状腺ホルモン活性化酵素のTREが転写活性をコントロールするために必要であることが示された。	
 ５）上記の実験結果により甲状腺ホルモン受容体alphaが高発現している後肢や過剰発現させた尾の筋細胞では、変態前期の少量の甲状腺ホルモン前駆体（T4）でも甲状腺ホルモン活性化酵素遺伝子のプロモーターを弱く刺激してT4を活性型甲状腺ホルモン（T3）に変換し、徐々に安定的に甲状腺ホルモン活性化酵素を発現させ、数日後には高い甲状腺ホルモン活性化酵素発現によりT4が効率にT3に活性化され、弱いTREを有する甲状腺ホルモン応答遺伝子でも誘導され、形態変化が起きるものと考えられる。したがって、変態における形態変化のタイ
ミングの決定機構として「甲状腺ホルモン受容体alpha高発現によるpositive	 feed-forward説」を提唱する。これによれば、器官の甲状腺ホルモン受容体alphaの発現が高い程、変態のより早い時期に器官の再構成が起きることになる。	
 	
 [将来の展望]	
 	  「甲状腺ホルモン受容体alpha高発現によるpositive	 feed-forward説」を証明するためにより生理的な条件下での実験を行う。また、自然変態で甲状腺ホルモン受容体alpha発現と形態変化のタイミングが相関する例を探し求めて示し、より確かのものにする。	
 

19

	
 
	
 
２.ツメガエル甲状腺ホルモン受容体alpha	 mRNAの5ʼ-UTRによる翻訳抑制	 Translational	
 regulation	
 by	
 the	
 5ʼ-UTR	 of	 the	
 Xenopus	 thyroid	
 hormone	 receptor	 alpha	 mRNA	
 
	
 
[目的]	
 
	
  甲状腺ホルモンはヒトの生理・病理病態と関係しているだけでなく様々な生命現象とも関わっており、脊索動物の変態、特に両生類の変態を引き起こす。
その時、甲状腺ホルモン受容体alphaの発現量は各々の器官で各々一定量へ制御されており、その器官のホルモン感受性と関連していると考えられている。つまり、発生中に漸増して行く血中甲状腺ホルモン濃度に反応して形態変化のタ
イミングが決まる訳だが、甲状腺ホルモン受容体alphaの発現量がその主な決定要因になっている可能性がある。	
 	
  甲状腺ホルモン受容体は、発生過程において血中で増加していく甲状腺ホルモンに結合することにより遺伝子発現を調節し、両生類の変態の中で重要な役割を果たしている。甲状腺ホルモン受容体には alpha、beta がある。甲状腺ホルモン受容体 beta は前肢の出芽から尾の退縮までの最盛期と言う時期に、高い血中甲状腺ホルモン濃度に反応して発現する。甲状腺ホルモン受容体 alpha	
 mRNA
は受精後 3 日頃から発現し始め、増加し続ける。頭部と尾では受精後３週間から最盛期後期まで甲状腺ホルモン受容体 alpha	 mRNA は増加し続けるにもかかわらず、細胞当たりの甲状腺ホルモン受容体 alpha 蛋白質分子数が、各々、6000と 2000 と一定であることが知られている。このことから、甲状腺ホルモン受容体 alpha の発現は転写後、強力な調節を受けていると想像されている。	
 	
  したがって、甲状腺ホルモン受容体 alpha	 mRNA の翻訳調節を明らかにして、その細胞内蛋白量の設定機構を知ることは甲状腺ホルモンへの感受性の決定機構を理解することになり、変態における器官変化の順番がどのように決められているかを理解することの一助となる。また、一般的な翻訳制御機構の解明にも寄与する。	
 	
 [成果･考察]	
 １）様々な種の両生類の甲状腺ホルモン受容体alpha	 mRNAの5'-UTRをクローニングして塩基配列を比較した。ツメガエル類では開始コドンの上流、160	
 bpまで保存されていた。	
 ２）開始コドンの上流、160	
 bpがある甲状腺ホルモン受容体発現型ベクターと160	
 bpが無いものを培養細胞にtransfectionしてWesterm	 Blottingして受容体
蛋白質量を比較すると、前者で甲状腺ホルモン受容体蛋白質が数十分の一に抑制されていた。	
 ３）開始コドンの上流、160	
 bpを リ ポ ー タ ー 遺 伝 子 で あ る firefly	
 luciferase遺 伝 子 の 前 に 挿 入 す る こ と に よ り 、luciferase活 性 が 十 分 の20

一 以 下 に 下 が っ た 。 つ ま り 、 構 造 遺 伝 子 が 違 っ て い て も 5'-UTRの翻訳抑制活性が発揮されることが示された。	
 ４）甲状腺ホルモン受容体	
 alpha	 mRNAの5'-UTRを5ʼ側 や 3ʼ側 か ら 欠 失 さ せた DNA断片を luciferase遺 伝 子 の 上 流 に 挿 入 し た 発 現 型 ベ ク タ ー を 培 養
細 胞 にtransfectionさせてluciferase活 性 を 測 定 す る こ と に よ り 、 ５つの翻訳抑制の塩基配列があることが確認された。それらは単独で翻訳抑制活性を有するシスエレメントであった。	
 	
 [将来の展望]	 	  ５つの翻訳抑制のシスエレメントが甲状腺ホルモン受容体 alpha	 mRNA の5'-UTR に見つかった。それぞれのシスエレメントに塩基置換を導入して翻訳抑制活性がどのような影響を受けるのかを調べることによって、より詳細な分子機構について考察できるかもしれない。また、翻訳系の条件を自由に設定できるようにするため、in	
 vitro の翻訳システムを確立することが重要になる。そうなれば想定される翻訳抑制モデルを検証できる。	
 	
 ３.変態前後のツメガエルにおける Hox 遺伝子の発現。	
 Expression	
 of	
 Hox	
 genes	 during	 the	
 Xenopus	 metamorphosis	
 
	
 
[目的]	
 
	
  初期発生においてHox遺伝子群が体の前後軸に沿った位置を規定するという考えは受け入れられているが、変態のような後期発生における役割は何も解析されていない。そこで、本研究において体の再構成が行われる両生類の変態ではHox遺伝子の発現パターンがどうなるかについて調べる。	
 	 [成果･考察]	
 	
  体節ごとに抽出した RNA を用いた real	 time	
 PCR 解析により、初期胚と同様の Hox 遺伝子の発現パターンが変態前のツメガエル幼生にて観察された。	
 	
 [将来の展望]	 	  変態後のツメガエルにおける体節ごとの Hox 遺伝子の発現などを調べて、尾の退縮とともに尾での Hox 遺伝子の発現が消えるのか、それとも、残った体で発現しているのかを調べてみたい。	
 
	
 
研究業績	
 
①原著論文	
 1.Yukiko	 Yamazaki,	
 Ryo	
 Akashi,Yutaka	
 Banno,	 Takashi	
 Endo,	
 Hiroshi	
 Ezura,	 Kaoru	 Fukami-Kobayashi,	 Kazuo	 Inaba,	
 Tadashi	
 Isa,	 Katsuhiko	
 Kamei,	
 Fumie	 Kasai,	
 Masatomo	 Kobayashi,	
 Nori	 Kurata,	
 Makoto	
 Kusaba,	 Tetsuro	
 Matuzawa,	 Shohei	 Mitani,	
 Taro	 Nakamura,	 Yukio	 Nakamura,	
 Norio	 Nakatsuji,	 Kiyoshi	 21

Naruse,	 Hironori	
 Niki,	
 Eiji	 Nitasaka,	
 Yuichi	 Obata,	
 Hitoshi	
 Okamoto,	 Moriya	 Okuma,	 Kazuhiro	
 Sato,	
 Tadao	
 Serikawa,	
 Toshihiko	
 Shiroishi,	 Hideaki	 Sugawara,	
 Hideko	
 Urushibara,	
 Masatoshi	
 Yamamoto,	
 Yoshio	
 Yaoita,	 Atsushi	 Yoshiki,	
 and	 Yuji	
 Kohara	 NBRP	
 databases:	
 databases	
 of	
 biological	
 resources	
 in	
 Japan	 Nucleic	
 Acids	 Research	
 38,	
 D26-D32,	
 2010	 	
 ②総説･著書	 1.Keiko	
 Kashiwagi,	
 Akihiko	
 Kashiwagi,	
 Atsushi	
 Kurabayashi,	 Hideki	 Hanada,	 Keisuke	
 Nakajima,	
 Morihiko	
 Okada,	
 Minoru	
 Takase,	 and	
 Yoshio	
 Yaoita.	
 Xenopus	 tropicalis:	
 an	
 ideal	 experimental	
 animal	 in	 amphibia.	
 Exp	
 Anim.	
 59(4):	
 395-405,	
 2010	
 	
 ③学会発表	
 国内学会	
 1.田沢一朗、石田雄二、吉里勝利、矢尾板芳郎	
 無尾両生類の変態期における Hox 遺伝子の発現	
 社団法人日本動物学会第８１回大会、２０１０年９月２３日、東京大学駒場キ
ャンパス、東京都	
 	
 2.岡田守弘、中島圭介、矢尾板芳郎	
 甲状腺ホルモン受容体 a(TRalpha)	
 mRNA の翻訳抑制の分子機構	
 第８３回日本分子生物学会、２０１０年１２月８日、神戸ポートアイラン
ド、神戸	
 
	
 
3.中島圭介、藤本健太、矢尾板芳郎	
 無尾両生類の変態における甲状腺ホルモンに対する組織感受性の決定機構	
 第８３回日本分子生物学会、２０１０年１２月８日、神戸ポートアイラン
ド、神戸	
 
	
 
国際学会	
 
	
  該当無し	 	
 ④科研費等の受け入れ状況	 科学研究補助金	  基盤研究(C)	
  「甲状腺ホルモン受容体 alpha	 mRNA の uORF による翻訳抑制機構」	
  代表者：矢尾板芳郎	
  1,170 千円	 22

准教授・髙瀬	
  稔（Minoru	
 Takase）	
 
	
 
研究内容	
 
I.性転換機構の解析：両生類へのホルモン様化学物質影響の基盤的研究	
 Analyses	
 of	
 mechanisms	
 of	
 sex	
 reversal:	
 basic	 studies	 on	
 effects	
 of	
 hormonal	
 chemicals	
 on	
 amphibians	
 	
 
	
 
[目的]	
 
両生類では性ホルモン処理により性転換が誘導されることが古くから知られている。しかし、そのメカニズムに関してはほとんど解明されていない。特にすでに分化した生殖腺の性転換現象には①脱分化・リプログラミングからなると思われる分化転換機構②生殖細胞などの生殖腺を形成する細胞の性分化機構の 2 つのメカニズムが働いていると考えている。本研究では、ツチガエル（Rana	 rugosa）およびトノサマガエル（R.	
 nigromaculata）、ネッタイツメガエル（Silurana	 (Xenopus)	
 tropicalis）を用いて、性ホルモン投与または環境化学物質投与による性転換効果の基盤的データの収集を目的として行った。	
 	
 [材料・方法]	
 １）雄と雌の両方に性転換する東広島集団ツチガエルとほとんど性転換が誘導されない浜北集団ツチガエルを用いて種内雑種を作成し、幼生期にテストステ
ロンプロピオネート（TP）を 1 回腹腔内注射した。変態後に生殖腺を取り出し、組織学的に解析した。	
 ２）地域により精巣卵出現率が異なるトノサマガエルおよびエストロゲンにより容易に雌への性転換が誘導されるネッタイツメガエルを用いて、変態後にエストラジオールベンゾエイト（EB）およびノニルフェノール（NP）、ビスフェ
ノール A（BPA）を投与し、精巣卵形成の有無を組織学的に解析した。	
 
	
 
[成果]	
 
１）浜北集団と東広島集団を用いた性逆雑種幼生に TP 処理を行ったところ、精巣を持つ個体が対照群に比べて有意に多かった。	
 ２）トノサマガエルでは NP および BPA の処理で精巣卵形成が誘導されたが、EB処理では誘導されなかった。一方、ネッタイツメガエルではいずれの処理においても精巣卵形成は見られなかった。しかし、EB 処理では精巣の発達阻害が観察された。	
 
	
 
[考察]	
 
１）性転換し易い集団と性転換し難い集団の種内雑種へ性ホルモンを投与した
ところ、性転換が誘導された。従って、東広島集団では性転換機構を持ち、浜北集団では性転換機構を全てもしくは一部を欠いていることが考えられた。	
 ２）トノサマガエルではエストロゲン様作用の弱い環境化学物質により精巣卵23が誘導された。従って精巣卵形成はエストロゲン様作用とは異なる作用により誘導されることが示唆された。一方、ネッタイツメガエルでは未分化生殖腺を持つ雄の幼生へエストロゲン処理すると容易に雌へ性転換することが知られているが、変態後の分化した精巣ではいずれの処理においても精巣卵形成が見られなかった。従って、種により精巣卵形成能が異なることが明らかになった。
	 	 [将来の展望]	
 １）ツチガエルでは性転換の促進機構が働いていることがまずは考えられた。
従って、東広島集団を用いて性転換関連遺伝子の網羅的解析および性ホルモン
作用機序の解析を進め、性転換に関して変異体である浜北集団との比較も行いながら、性転換機構の全容を解明する。一方、性転換抑制機構については今後
さらに検討する必要がある。	
 ２）トノサマガエルやネッタイツメガエルとは異なる性転換様式を示すツチガエルを用いてエストロゲンおよび環境化学物質の投与実験を行い、精巣卵形成機構を解析するための最も良いモデル両生類を選ぶことが必要である。	
 	
 II.性分化関連遺伝子の探索：マイクロアレイを用いた網羅的解析	 Isolation	
 of	 genes	 related	
 to	
 sex	
 differentiation:	
 comprehensive	
 analysis	
 employing	 microarray	
 technique	
 
	
 
[目的]	
 
	
  ネッタイツメガエルはゲノム解析や様々な EST 解析が行われている。そこで、両生類性分化関連遺伝子の探索を目的として、それらデータベースを基にアレイを作成し、性分化後の NF ステージ 58 および変態完了期の NF ステージ 66 の精巣および卵巣における遺伝子発現をマイクロアレイ法により網羅的に解析した。そして、精巣で発現量が多い遺伝子にまず着目し、ネッタイツメガエル
およびツチガエルの精巣における遺伝子発現を解析した。	
 	 [材料・方法]	
 	  ネッタイツメガエルの NF ステージ 58 幼生および変態完了期の NF ステージ 66の生殖腺を取り出して左右に切り分け、片側の生殖腺を組織学的に解析し、精巣および卵巣を確認した。その結果を基にもう片側の生殖腺を精巣と卵巣とに分けた後に全 RNA を抽出し、マイクロアレイ解析を行った。マイクロアレイ解
析には、42,655 個の cDNA を固定したアレイを用いた。次に、精巣において発現量の多い遺伝子に着目し、ネッタイツメガエルの精巣と卵巣を用いて RT-PCR
解析を行った。さらにネッタイツメガエルおよびツチガエルの精巣を用いて in	
 situ ハイブリダイゼーション解析も行った。	
 
	
 
[成果]	
 
	
  ステージ 66 では、183 個の遺伝子が卵巣に比べ精巣において有意に高い発現24を示した。その中には細胞間結合に関するいくつかの遺伝子が含まれていたため、それらの遺伝子発現を RT-PCR 法により解析したところ、ネッタイツメガ
エルの精巣における Claudin 遺伝子発現が卵巣に比べて高かった。さらに、精巣を用いた in	 situ ハイブリダイゼーション解析の結果、ネッタイツメガエル
およびツチガエル共にシスト中の生殖細胞が強い陽性を示した。	
 
	
 
[考察]	
 
	
  Claudin はタイトジャンクションを構成するタンパク質として同定され、これまでいくつものサブタイプが報告されている。精巣では精細管という卵巣には見られない構造が構築され、ほ乳類では精細管内のセルトリ細胞同士がタイトジャンクション（血液-精巣関門）を形成し、精子形成に関して必用な微小環
境（ニッチ）を作っている。ほ乳類では血液-精巣関門に関わる Claudin サブ
タイプが知られている。今回、シスト内の生殖細胞において強い発現が見られたことから、両生類では生殖細胞同士の接着に関与していることが考えられる。
また、Claudin のサブタイプによっては細胞接着以外の機能を持っていることも知られている。そこで、生殖細胞の分化に関与している可能性も考えられる。
	 	
 [将来の展望]	
 	  マイクロアレイで同定された他の性分化関連遺伝子に関しても RT-PCR 法を用いて精巣および卵巣における遺伝子発現の違いを確かめる必用がある。	
 	
  また、Claudin 遺伝子は雄の生殖細胞で高い発現を示すことから、性転換過程
における生殖細胞の分化マーカーとして有用であると考えられる。	
 	 III.両生類脳におけるニューロステロイドの解析：アカハライモリの脳にお	
 けるシトクロム P450scc 遺伝子発現	 Neurosteroids	
 in	
 the	
 brain	 of	 amphibians:	
 expression	
 of	
 cytochrome	 P450scc	 gene	 in	
 the	
 brain	
 of	
 the	
 red	
 bellied	
 newt	
 Cynops	 pyrrhogaster	
 
	
 
[目的]	
 
	
  ニューロステロイド生合成では、まずシトクロム P450scc の酵素活性によりコレステロールからプレグネノロンが生合成される。そして、プレグネノロン
が共通の前駆物質となり、様々なニューロステロイドが生合成される。従って、ニューロステロイドが生合成されるか否かを知るためには、脳におけるシトク
ロム P450scc の発現やプレグネノロンの生合成を確かめることが重要である。
本研究では、アカハライモリからシトクロム P450scc 遺伝子を単離し、脳における遺伝子発現を解析した。さらに、in	
 vitroでの脳のプレグネノロン生合成も解析した。	
 	 [材料・方法]	
 	  アカハライモリの精巣から全 RNA を抽出し、5ʼ/3ʼ-RACE 法により全長シト

25

クロム P450scc	
 cDNA を単離した。そして、脳におけるシトクロム P450scc 遺伝子発現を RT-PCR 法および in	
 situ ハイブリダイゼーション法により解析した。さらに、脳ホモジネートをアイソトープラベルされたコレステロールを含む培養液中でインキュベーションした後に培養液を回収し、HPLC を用いて培養液中に含まれるステロイドを解析した。	
 
	
 
[成果]	
 
	
  有尾両生類では初めて全長シトクロム P450scc	
 cDNAが単離された。RT-PCR 法
により脳における遺伝子発現を解析したところ、終脳および間脳、中脳、小脳において発現が認められた。また、in	
 situ ハイブリダイゼーション法を用いて解析したところ、全ての脳領域において発現細胞が観察された。さらに、HPLC
解析の結果、アイソトープラベルされたプレグネノロンが培養液に含まれてい
た。	
 
	
 
[考察]	
 	
 
アカハライモリの脳は広範囲にシトクロム P450scc 遺伝子を発現していることが明らかになった。また、実際に脳がプレグネノロンの生合成能を持つことが確かめられた。これまで、アカハライモリの脳から 7α-ヒドロキシプレグネ
ノロンがニューロステロイドとして単離され、免疫組織染色によりシトクロム
P450scc タンパク質の発現が示唆されてきた。今回の研究結果から、アカハラ
イモリの脳においてコレステロールからニューロステロイドが生合成される
ことがさらに確かめられた。ほ乳類および鳥類、無尾両生類においてニューロ
ステロイド生合成が報告されていることから、ニューロステロイド生合成は脊椎動物において広く見られる生理的な現象であることが考えられる。	
 	
 [将来の展望]	
 	  無尾両生類では、アンドロゲンおよびエストロゲン、副腎ステロイドがニューロステロイドとして生合成されていることが報告されている。脳における受容体の発現と局在を調べる事は、ニューロステロイドの機能を考えるためにも大変重要である。変温動物であり、水辺において生活または繁殖する両生類は環境から様々なストレスを受けていることが考えられる。そこで、ストレスと関係があると思われる副腎ステロイドの受容体に着目して、その発現や局在を解析する。	
 
	
 
研究業績	
 
①原著論文	
 １．Takase	
 M.,	
 Haraguchi	
 S.,	
 Hasunuma	
 I.,	
 Kikuyama	
 S.,	
 Tsutsui	
 K.	
 (2011)	
 Expression	
 of	
 cytochrome	
 P450	 side-chain	 cleavage	
 enzyme	 mRNA	 and	
 production	
 of	
 pregnenolone	
 in	
 the	
 brain	 of	 the	
 red-bellied	
 newt	
 Cynops	 pyrrhogaster.	
 Gen.	 Comp.	
 Endocrinol.	
 170,	
 468-474.	
 26

２．Katsu	
 Y.,	
 Taniguchi	
 E.,	
 Urushitani	
 H.,	
 Miyagawa	
 S.,	
 Takase	
 M.,	
 Kubokawa	
 K.,	
 Tooi	
 O.,	
 Oka	
 T.,	
 Santo	 N.,	
 Myburgh	
 J.,	
 Matsuno	
 A.,	
 Iguchi	
 T.	
 (2010)	
 Molecular	 cloning	
 and	
 characterization	
 of	
 ligand-	 and	
 species-specificity	
 of	
 amphibian	 estrogen	 receptors.	
 Gen.	 Comp.	
 Endocrinol.	
 168,	
 220-230.	
 ３．Kashiwagi	
 K.,	
 Kashiwagi	
 A.,	
 Kurabayashi	
 A.,	
 Hanada	 H.,	
 Nakajima	
 K.,	
 Okada	 M.,	 Takase	
 M.,	
 Yaoita	
 Y.	
 (2010)	
 Xenopus	 tropicalis:	
 an	
 ideal	 experimental	
 animal	 in	 amphibian.	
 Exp.	
 Anim.	
 59,	
 395-405.	
 	
 ②総説・著書	
 
	
  	
  なし	
 
	
 
③学会発表	 	  国内学会	 	
  １．髙瀬	  稔、井口泰泉	
  「両生類精巣分化過程における claudin	
 5 遺伝子	
 発現」	
  第 33 回日本分子生物学会年会、12/7-10、2010、神戸.	
 	
  ２．髙瀬	  稔	
  「変態後のネッタイツメガエル精巣に対するエストロゲンお	
 よび内分泌かく乱物質の影響」第 13 回環境ホルモン学会研究発表会、	
 12/16-17、2010、東京.	
 
	
  	
 
	
 国際学会	
 
	
  	
  なし	
 
	
 
④科研費等の受け入れ状況	 	
  １．基礎生物学研究所個別共同利用研究 2010 年度	
  22 万 4 千円（旅費・他機	
 27

助教・中島圭介	
 (Keisuke	 Nakajima)	
 
	
 
研究内容	
 
	
  アフリカツメガエル変態期における甲状腺ホルモンに対する組織感受性決定機構の解明	
 	  The	
 analysis	
 of	
 thyroid	
 hormone	 sensitivity	
 regulation	
 mechanisms	
 during	 Xenopus	 laevis	 metamorphosis	
 
	
 
[目的]	
 
	
  無尾両生類の変態は水中生活を行っていた幼生が陸上生活を行う成体に成長するために全身の器官を変化させる劇的なものである。中でも尾の退縮は、体長の２倍以上の長さがあった器官が数日のうちに無くなってしまうもので、古くから注目されてきた。両生類の変態は甲状腺ホルモンによって引き起こされ、定められた順序で定められた器官が順番に変化していくことが重要である。例
えば後肢は変態前期の低濃度の甲状腺ホルモンに反応して成長するのに対し、尾の筋細胞は変態最盛期の高濃度の甲状腺ホルモンでないと細胞死を起こさないことが知られているが、その分子機構はこれまで明らかになっていなかった。
血液に乗って全身を巡る甲状腺ホルモンに対してこのような反応性の違いを生み出す機構として組織感受性に注目し、組織感受性を生み出す機構を解明することを目的とした。	
 	 [材料・方法]	
 １）	
 変態期のアフリカツメガエル	
 (Xenopus	
 laevis)	
 の様々な組織から	
 RNA	
 を抽出し、甲状腺ホルモンシグナルに関わる甲状腺ホルモン受容体α、β、レチノイド X 受容体α、細胞内で甲状腺ホルモンを活性型に変換する２型脱ヨード化酵素、甲状腺ホルモンを分解する３型脱ヨード化酵素の発現量をリアルタイム	
 PCR	
 を用いて定量化した。	
 ２）	
 リアルタイム	 PCR	
 の結果、甲状腺ホルモン感受性の高い後肢において甲状腺ホルモン受容体αと２型脱ヨード化酵素の発現量が多かったことから、これらが甲状腺ホルモン感受性に深く関わっていると考えた。この考えを証明するために甲状腺ホルモン受容体αを甲状腺ホルモン感受性の低い
尾の筋細胞において強制発現させたところ、後肢と同程度の高い感受性で細胞死を引き起こすことを確認した。	
 ３）	
 上記の細胞死において２型脱ヨード化酵素の活性が必要であることを
２型脱ヨード化酵素の抑制剤であるイオパノ酸を用いることで証明した。	
 ４）	
 内在性の甲状腺ホルモンの合成を抑えるメチマゾールで幼生を処理、さらに甲状腺と甲状腺ホルモン放出ホルモンを分泌する下垂体を除去する
ことによって後肢における２型脱ヨード化酵素の高い発現はほとんどが甲状腺ホルモンによって誘導されていることを示した。	
 ５）	
 甲状腺ホルモンによる２型脱ヨード化酵素の発現誘導の機構を調べる

28

ために２型脱ヨード化酵素のプロモーター領域のクローニングを行い、ここに甲状腺ホルモン応答配列があることを見つけた。	
 ６）	
  上記甲状腺ホルモン応答配列が甲状腺ホルモン受容体αと弱い結合を示すことをゲルモビリティーシフトアッセイを用いて示した。	
 ７）	
  レポーター遺伝子の上流に上記甲状腺ホルモン応答配列を組み込み、卵母細胞で甲状腺ホルモン受容体α、レチノイド X 受容体αと共に発現させ、この配列が弱い活性を持つことを示した。	
 	
 [成果と考察]	
 	  上記の結果から甲状腺ホルモンに対する組織感受性の決定機構として甲状腺ホルモンを活性化する２型脱ヨード酵素に制御される以下のモデルを提唱する。
後肢は変態初期に甲状腺ホルモン受容体を多量に発現しているために、弱い甲状腺ホルモン応答配列しか持たない２型脱ヨード酵素でさえ、この時期の低濃度の甲状腺ホルモンに反応して発現が弱く誘導される。一旦２型脱ヨード酵素の発現が起こると甲状腺ホルモンが活性化され、さらに２型脱ヨード酵素の発現が強まり、この正のフィードバックによって甲状腺ホルモンシグナルが増強
され、急激な成長を示す。一方、尾は変態期を通して甲状腺ホルモン受容体αのタンパクレベルが低いので甲状腺ホルモン受容体αと弱い結合しかできない
２型脱ヨード酵素の甲状腺ホルモン応答配列からは転写が起らない。さらに甲状腺ホルモンを不活性化させる３型脱ヨード酵素の発現によって変態前期の甲状腺ホルモンシグナルが抑制されている。変態最盛期に甲状腺ホルモン濃度が上昇すると強い甲状腺ホルモン応答配列を持つ甲状腺ホルモン受容体βの発現が誘導され、甲状腺ホルモンシグナルが伝わり、２型脱ヨード酵素による正のフィードバックが引き起こされる。その結果様々な甲状腺ホルモン応答遺伝子が活性化され、尾の退縮が起こる。	
 	
  以上の結果および考察を論文にまとめ、投稿中である。	
 	
 [将来の展望]	
 	  変態期における形態変化の順序を決める機構についてはこれまでほとんど研究されてこなかった。本研究はこの問題の答えを様々な方法で実験的に示しており、いわば長年にわたった大きな命題に終止符を打つものである。	
 
	
 
研究業績	
 
①	
 原著論文	 1.K.	
 Kashiwagi,	
 A.	
 Kashiwagi,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 H.	
 Hanada,	
 K.	
 Nakajima,	
 M.	
 Okada,	
 M.	
 Takase	 and	
 Y.	
 Yaoita	 Xenopus	 tropicalis:	
 An	
 Ideal	 Experimental	
 Animal	 in	
 Amphibia	
 Experimental	
 Animals	 2010	
 July;	
 59(4):	
 395-405	
 	 ②	
 総説･著書	 29

該当なし	
 	
 ③学会発表	 	  国内学会	 １.中島圭介、藤本健太、矢尾板芳郎	
 無尾両生類の変態における甲状腺ホルモンに対する組織感受性の決定機
構	
 
The	
 mechanism	
 of	
 thyroid	
 hormone	 sensitivity	
 regulation	
 during	 anuran	 metamorphosis	
 第３３回日本分子生物学会、	
  神戸(2010,	
 12.8)	
 ２.岡田守弘、中島圭介、矢尾板芳郎	
 甲状腺ホルモン受容体α(TRα)mRNA の翻訳抑制の分子機構の解析	
 第３３回日本分子生物学会、	
  神戸(2010,	
 12.8)	
 	 	
  国際学会	 	  	  該当なし	 	
 ④科研費の受け入れ状況	
 
	
 	
 	
 該当なし	
 30

助教・花田秀樹（Hideki	 Hanada）	
 
	
 
研究内容	
 
	
  無尾両生類は、甲状腺ホルモンによってオタマジャクシ尾部アポトーシスを誘導できること、またそれを時系列に外部形態の変化として捉えることができることなどから、アポトーシス研究には最適な研究材料の一つと考えられている。さらには、化学物質、過重力および強磁場に対するカエルの感受性の高さから、卵、胚，オタマジャクシおよびカエルを様々な研究に用いてきた。現在研究中の下記項目について述べる。	
 

	
 
①	
  甲状腺ホルモン誘導による無尾両生類オタマジャクシ尾部短縮の機構	 Mechanism	
 for	
 thyroid	
 hormone-induced	
 shortening	
 of	
 anuran	 tadpole	 tail	 	 	 	
  筋細胞アポトーシスを通じて起こるオタマジャクシ尾部短縮は変態期における無尾両生類の最も劇的な現象のうちの一つである。多くの研究はミトコンド
リア膜透過性（MPT）がアポトーシスの重要な役割を果たしていることが示してきた。これまで我々はサイクロスポリン A（CsA）が、甲状腺ホルモン（T３）によって誘導されるミトコンドリアの膨潤と、それに伴って起こる MPT からのサ
イトクロム c（Cyt.c）漏出を抑制することを報告してきた。オタマジャクシの変態機構のさらなる解明を目的として、T3 誘導尾部短縮におけるサイクロスポ
リンの効果を調べた。低濃度の T3 によってオタマジャクシ尾部は短縮し、それに伴う caspase-3 と-9 様酵素の活性増加、DNA 断片化およびラダー形成の増加が起こった。CsA はこれらの T3 の効果を抑制した。より高濃度の T3 とカルシウ
ムイオンは成体のカエル肝臓から単離したミトコンドリアの膨潤の誘導とその膨潤に伴ったアポトーシス関連物質の放出を起こし、その放出された物質を含むフラクションは dATP の存在下において caspase-3 様酵素を活性化させた。この結果は T3 の直接的間接的作用を通じ、T3 によってミトコンドリアから Cyt.cが放出されたことを示す。これらの結果とこれまでの研究データから、ミトコ
ンドリア MPT は T3 誘導による尾部アポトーシスにおいて重要な役割を担っており、CsA はそれらの T3 の効果を抑制すると結論づけた。	
 	
 ②	
  除草剤パラコートによって誘起される培養カエル白血球細胞の染色体損傷に対して崩壊した坑酸化剤の機能	
 Disrupted	
 function 	
 of 	
 phenolic 	
 antioxidant 	
 protection 	
 against	
 paraquat-induced	
 structural 	 chromosomal 	 damage 	
 in 	
 cultured 	 anuran	 leukocytes	
 	 	  両生類が世界的にその数を急激に減らしている。その原因の一つに考えられるのが農薬などの化学物質の影響といわれている。農薬のうちの一つである除31

草剤パラコート（PQ）の毒性は、無尾両生類のオタマジャクシや胚に対して致死性および催奇性があり、いずれも PQ から発生する活性酸素が原因であると考えられている。このように、無尾両生類は PQ 毒性に対して感受性が高いことがわかる。一方、PQ の遺伝毒性の発生機構は、多くの研究者によって次のことがこれまでにわかっている。（１）PQ による NADPH からの電子の奪取、（２）スーパーオキシドの発生、（３）スーパーオキシドジスムターゼによる H2O2 への代謝
（４）フェントン反応によるヒドロキシラジカルの発生（５）染色体異常発生。	
 	
  本研究は、培養カエル白血球細胞を用い、脂質過酸化抑制物質 phenolic	
 antioxidant による PQ 遺伝毒性の強化機構を調べた。その結果、PQ 共存下のphenolic	
 antioxidant は本来の役割である脂質過酸化の抑制をせず、PQ の電子
ドナーとなって、細胞遺伝毒性を増幅することがわかった。	
 
	
 
研究業績	
 
①	
 原著論文	
 1.Kashiwagi,	
 K.,	
 Kashiwagi,	
 A.,	
 Kurabayashi,	
 A.,	
 Hanada,	
 H.,	
 Nakajima,	
 K.,	
 Okada,	
 M.,	
 Takase,	
 M.	
 and	
 Yaoita,	
 Y.	
 (2010)	
 Xenopus	 tropicalis:	
 An	
 ideal	 experimental	
 animal	 in	
 Amphibia.	
 Exp.	
 Anim.	
 59(4):	
 395-405.	
 	
 ②総説･著書	
 
該当なし	
 
	
 
③学会発表	
 国内学会	
 1.花田秀樹	  パラコートによって誘起される培養カエル白血球細胞の染色体異常はブチル化ヒドロキシトルエンでさらに増加する。生物教育学会九州支部会（2010 年 11 月、福岡）。	
 
	
 
国際学会	
 
	
  該当なし」	
 	
 ④科研費等の受け入れ状況	 	  	  該当なし	 32

助教・田澤一朗（Ichiro	
 Tazawa）	
 
	
 
研究内容	
 
無尾両生類の変態期尾退縮に於ける Hox 遺伝子の機能	 The	
 function	
 of	
 the	
 Hox	
 genes	 during	 anuran	 tail	
 resorption	
 
	
 
[目的]	
 
	
  両生類の変態は甲状腺ホルモンによって引き起こされる。血中の甲状腺ホルモン濃度は体中で差が無いと考えられるにもかかわらず、甲状腺ホルモンに対する応答性は体の部域ごとに異なる。無尾両生類幼生の皮膚、筋および脊髄は体の前後軸に沿って連続した組織であるが、胴部と尾部とでは変態後の運命が全く異なる。変態期に両部域でプログラム細胞死が活発に起こるが、胴部でのみ活発な細胞増殖が起こり、結果として尾部のみが消失する。この予定消失域を決定する機構は全く解明されていない。	
 	
  幼生の尾部を切断しレチノイドで処理すると、本来尾が再生されるところに成体の器官である後肢が生じる。このことは、胴部にだけではなく尾部にも変態後も生き残り成体の細胞となり得る細胞が存在することを示す。Hox 遺伝子群
は初期発生の動物の細胞に体軸に沿った位置価を与えると考えられている。また、Hox 遺伝子による細胞死調節の報告もあることから、私は「無尾両生類幼生期に発現する Hox 遺伝子が消失域を決定する」という仮説（以下、仮説）を立てた。本研究の目的はこの仮説の検証である。	
 	
 [材料と方法]	
 	
  本研究では、最初の段階として、変態期における Hox 遺伝子群の詳細な発現パターンを明らかにし、発現する細胞を同定する。次いで、幼生胴部または尾部特異的に発現する Hox 遺伝子の強制発現および機能阻害実験を生体の胴部および尾部にて行う。これらの実験による変態現象に与える影響を、形態、細胞増殖、および細胞死などに関して明らかにする。同様の遺伝子機能検定は、甲状腺ホルモン処理した培養細胞（幼生由来）を用いても行う。さらに、幼生生体をレチノイド処理することで Hox 遺伝子群の発現を変化させ、Hox コードと変態後の予定運命との関連を調べる。主な実験材料としてアフリカツメガエル
Xenopus	 laevis およびネッタイツメガエル Xenopus	
 tropicalis を用いる。	
 	
 [２０１０年度までに得られた結果と考察]	
 	
  幼生の Hoxa13	
 mRNA は脊椎動物胚で一般的に見られるのと同様、体の後方に局在し、特に脊髄での発現が高かった。	
 	
  共同研究者が予備段階的実験として、脊髄の組織培養系を用いて Hoxa13 機能阻害実験を行った。この実験では Hoxa13 が正常な甲状腺ホルモン誘導性細胞死に必要であることが示唆された。一方、幼生生体尾部の筋管での Hoxa13 機能阻害実験では、Hoxa13 が正常な甲状腺ホルモン誘導性細胞死に必ずしも必要が無33

いことが示唆された。	
 	
 [２０１０年度内に得られた結果と考察]	
 	
  両生類変態期に注目して Hox 遺伝子ファミリーの発現を調べた研究はこれまでに無い。無尾両生類の Hox 遺伝子発現パターンは、発生が進んだ尾退縮間近の幼生でも尾芽胚期とよく似ていることが本研究から明らかになった。そして腰部から前側では、変態完了に至るまで基本的にそれまでの発現パターンが保持されていた。以上のことから Hox 遺伝子が胚期だけではなく幼生期以降の部域性決定にも関わっているものと推測される。この発現解析から、尾部特異的発現をする Hox 遺伝子は Hoxa13 の他にもあることが判明した。これらの遺伝子間には機能の冗長性がある可能性があり、１つの Hox 遺伝子の阻害だけでは甲状腺ホルモン誘導性細胞死に影響を与えられないかもしれない。前述の筋管での Hoxa13 機能阻害実験でその影響が認められなかったのは、このことが原因である可能性がある。	
 	
  なお、幼生の Hox ファミリーの発現パターンはレチノイド処理によって変化させることができた。	
 
	
  	
 
[これからの展開]	
 	
  脊髄での Hoxa13 の機能検定を in	
 vivo で行い、前述の予備段階的 in	 vitro
実験結果を確認する。また、Hoxa13 以外の Hox 遺伝子についてもこの実験系で機能検定を行う。筋管については尾部特異的発現をする複数の Hox 遺伝子を同時に機能阻害する実験が、仮説を証明する上でも棄却する上でも必要である。
また、前述の通り、幼生をレチノイド処理することで Hox コードを変化させることができた。したがって、この処理による Hox コードの変化と変態期細胞死との関係を調べることは仮説検証のための補足的実験として期待できる。以上の実験を行い、仮説検証作業を進めることを予定している。	
 
	
 
研究業績	
 
①	
 原著論文	
 
なし	
 
	
 
②	
 総説・著書	
 
なし	
 
	
 
③	
 学会発表	
 国内学会	
 1.田澤一朗，石田雄二，吉里勝利，矢尾板芳郎（２０１０）無尾両生類の変態期における	
 Hox	
 遺伝子の発現，日本動物学会	
 
	
 
国際学会	
 

34

なし	
 
	
 
④科研費等の受け入れ状況	
 
なし	
 

35

	
 [分化制御機構部門]	
 准教授・古野伸明（Nobuaki	 Furuno）	
 
	
 
研究内容	
 
[1]卵形成における卵特異的細胞周期調節遺伝子の発現調節機構と機能解析	
 Analysis	
 of	
 the	
 regulatory	
 mechanisms	
 of	
 oocyte	 specific	
 cell	
 cycle	 gene	
 expression	
 and	
 function	
 during	
 Xenopus	
 oogenesis	 	 	  卵の分化機構を研究する為には、卵特異的に発現する遺伝子に着目し、その卵特異的な発現調節機構を解明する事がきわめて重要であると考えられる。卵は、減数分裂や受精後に特殊な細胞分裂を行う。例えば、減数分裂では、DNA 複製をスキップした２回の連続した分裂をするが、そのために、Mos という卵特異的な細胞周期調節因子を発現しており、この発現が DNA 複製のスキップのため必須である事を報告した。また、受精後、卵は最初の一回を除き、G１,G2 期のない細胞分裂（卵割）を中期胞胚まで行うが、そのためには、卵特異的な細胞
周期調節因子である Wee1A の発現が必須である。もし、体細胞特異的な Wee1Bが発現すれば受精後の卵割は失敗する。よって、これらの卵特異的な細胞周期
調節因子の発現調節機構の解明は、卵への決定・分化の機構解明につながる。	
 	
 ［目的と結果］	
 	
  細胞周期調節因子に母性型があると分かって来たのは最近であり、その発現調節機構の研究は今までに行われていない。現在、ニシツメガエルの Mos と Wee1Aのプロモ−タ−領域と思われる部分（翻訳開始点より１０kbo 上流まで）をクロー
ニングし、GFP の上流に挿入した transgenic	
 ガエル作製用のベクターを構築した。このコンストラクトや、プロモーターにいろんな欠失を導入したコンストラクトで transgenic	 ガエルを作製し、卵特異的な発現に必要な領域を特定する。
また、これらの遺伝子のノックアウトも行いたい。このようにして卵特異的な細胞周期調節因子の発現調節機構と機能の解析を行う。	
 	 [2]両生類の生活環に対する過重力の影響	 The	
 effect	
 of	 the	
 hypergaravity	
 on	
 the	
 life	
 cycle	 of	 amphibians	 	 将来、人類が宇宙へ進出して行くためには地球とは異なった重力環境下でヒトを含めた動植物が正常で健康な子孫を作れるかどうかを知る事が重要であり、もし、正常な子孫が作れないようなら、どのようにすれば異なった重力環境で正常に生活環が回るかどうか調べる事が重要である。我々は、両生類をモデル生物として過重力が成長や内分泌系にどのような影響を与えるかを調べ、その改善方法を探っている。	
 	
 [目的と成果]	
 36

両生類をモデル生物として、生活環の重要な時期（初期発生や減数分裂など）に焦点を絞って過重力の影響を調べたり、長期にわたる過重力暴露におけるホルモン分泌を含む生理的影響を追跡する。また、過重力で生じた異常を正常に戻す手段を探索する。それらの実験を通じて、地上とは異なった重力環境下でヒトを含めた動植物の世代交代が可能かどうかを調べることを目標とする。その結果、過重力に感受性が高い時期は、受精後から卵割が始まるまでである事が判明した。また、卵減数分裂に影響を与える事がわかった。また、長期に渡る過重力曝露によって、甲状腺ホルモンによって支配されている変態が遅れる
事がわかり、内分泌系にも影響を与える事が明らかになった。	
 	 [3]両生類の生活環に対する強磁場の影響	
 The	
 effct	 of	 strong	 static	
 magnetic	
 field	 (SMF)	
 on	
 the	
 life	
 cycle	 of	 amphibians	 	 	  現在、携帯電話や高圧送電線、家電製品などから磁場にさらされる機会が多くなってきた。それにもかかわらず、脊椎動物の発生および遺伝子発現に対する強磁場の影響に関する研究は少ない。両生類を用いて、その生活環に対する影響を調べる。	
 	
 [目的と成果]	
 	  カエル胚は、体外受精を行うので胚の観察が容易で、発生も早いことから、磁場の影響を調べるには有用と考えられる。アフリカツメガエルやニシツメガ
エルを用いて、卵減数分裂から変態までの磁場の影響を調べた。その結果、卵成熟過程において卵の色素の分布に影響を与える事や、初期発生にさまざまな影響を与える事が明らかになった。	
 	 [4]ZNF による甲状腺ホルモン受容体 b 遺伝子の破壊	 Targeted	 mutagenesis	
 of	
 htyroid	
 hormone	 receptor	
 beta	 gene	
 by	
 ZNF	
 in	
 
amphibian	 embryo	 	 	  ノックアウトによる特定の遺伝子破壊は、その遺伝子の機能を探る上で非常に有効な手段である。この技術は、マウスでは ES 細胞を用いて確立されてポピ
ュラーにつかわれるようになっているが、それ以外の動物では ES 細胞が確立されていない事で不可能である。しかしながら、最近、ZNF	
 (Zinc	 finger	
 nuclease)を使用すると、特定の配列に突然変異が入れられる事がわかり、コオロギやラットなどで応用されて来た。この技術をカエルで確立する事は、カエルの実験動物として有用性を飛躍的に高める。	
 	
 [目的と成果]	
 カエルで ZNF が応用可能かどうか実験を行った。選んだ遺伝子は	 37

甲状腺ホルモン受容体 b 遺伝子である。この結果、TRb の遺伝子に変異を入れられる事がわかった。この変異を入ったカエルを育て、子孫をとったり、他の遺伝子を ZNF で破壊したい。	
 	 [5]化学物質による両生類内分泌機構のかく乱	 Disturbance	
 of	
 the	
 endocrine	
 system	 by	
 chemical	
 substances	
 in	
 amphibians	 	 重大な地球環境問題の１つは世界中にばら撒かれた人工化学物質の存在である。それら中には、生体の内分泌系をかく乱し、悪性腫瘍を引き起こす可能性のあるものも含まれていると指摘されている。人工化学物質のどのような物が内分泌かく乱活性を持つのか調べる事は重要である。	
 	
 ［目的と成果］	 	  多くの化学物質は甲状腺ホルモン機能を阻害する。甲状腺ホルモンは、ヒトを含むすべての脊椎動物において成長や発生、生体内部環境の恒常性維持、代謝などで重要な役割を果たしている。典型的な甲状腺ホルモン依存性発生過程である両生類オタマジャクシの変態は、化学物質の影響を受けやすいため、かく乱作用をもつと疑われる環境汚染物質の個体レベルでのスクリーニングに役立てることができる。甲状腺ホルモン受容体遺伝子を導入したトランスジェニ
ックアフリカツメガエルを用いるなどして、さまざまな化学物質について形態学、生化学および分子細胞学レベルでの反応態様を解析したり、生殖機能に対する影響についても調べる。その結果、多くの人工化化学物質について、甲状腺ホルモンにたいして、アゴニスト、アンタゴニスト活性がある事が明らかに
なった	
 
	
 
[6]卵成熟および初期発生におけるサイクリン B2 の２極紡錘体形成における機
能	
 
The	
 role	 of	
 the	
 cyclin	
 B2	
 in	
 the	
 bipolar	 spindle	 formation	
 during	 oocyte	 maturation	
 and	
 early	 embryogenesis	 	 	  MPF はサイクリン B と Cdc2 の複合体であり、M 期を引き起こす普遍的な因子である。MPF が活性化すると核膜崩壊、染色体凝縮、紡錘体の形成が起こり、M期が開始する。サイクリン B は MPF の調節サブユニットであり、多くの種でサブタイプが複数存在し、また、それぞれのサブタイプの細胞内局在も違っている。しかしながらその機能に違いがあるかどうか報告はほとんどない。この研究ではサイクリン B1 と B2 の機能の違いについて研究している。	
 	
 ［目的と成果］	
 ツメガエルの卵母細胞や胚ではサイクリン B1 とサイクリン B2 が主に発現しており、機能差を解析する良い系である。今までに、この系を用いて、サイクリ

38

ン B１でなくサイクリン B２が正常な紡錘体の形成に関与することを明らかにした。この系を用いてサイクリン B のサブタイプの機能を解析する事を目標とする。その結果、サイクリン B2 の N 末端から約９０アミノ酸から１２０アミノ酸までに２極の紡錘体を形成するのに働く領域があることがわかった。	
 	 [7]Nramp ファミリーの新規バナジウム／プロトン共役輸送体	
 A	
 novel	 vanadium/proton	 antiporter	 of	 a	
 Nramp	 family	 	 	  海産動物のホヤは体内に高濃度のバナジウムをもっている。これは、海中のバナジウムから濃縮されたもので、ホヤはバナジウムを高濃度に濃縮する機構を持っている。その機構を研究している。	
 	
 [目的と成果]	
 Nramp/DCT ファミリーは、二価金属イオンの輸送に関わる膜輸送体である。我々はバナジウムを高度に濃縮する海産動物ホヤ類の血球から Nramp ファミリーの新規膜輸送体遺伝子を同定した。この遺伝子 AsNramp はヒトの Nramp1 および 2と、アミノ酸レベルで約 60%の相同性があった。アフリカツメガエルの卵母細胞による発現系を用いて金属輸送活性を検証したところ、プロトンとの共役輸送
によって四価バナジウムを取り込む共役輸送体であることがわかった。さらに、
四価バナジウムの輸送は Na による阻害を受けること、AsNramp は血球の液胞膜画分に局在することも明らかになった。	
 	 [8]mTOR 情報伝達系の解析	
 Analysis	
 of	
 the	
 mTOR	 signal	
 transduction	 	 	  炎症は、生体の損傷に対する組織の反応であり、その反応の一部には mTOR	 (mammalian	 target	 of	
 rapamycin の略。ほ乳類などの動物の細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質キナーゼ。最初に rapamycin の標的タンパク質として見つかったのでこの名前がついた)情報伝達系が関与している。この情報伝達系の研究を進めている。	
 	
 ［目的と成果］	
 炎症に関与する mTOR 情報伝達系に関与するタンパク質や、その相互作用を調べる事でこの情報伝達系の全貌を解明しようとしている。その結果、mTOR 伝達系に Ego1,	
 Ego3 と Gtr1,Gtr2 のタンパク質が関与していることがわかった。	
 
	
 
研究業績	
 
①原著論文	
 1.Furuno,	
 N.,	
 Futsuki,	
 D.,	
 Kawasaki,	
 T.,	
 Shiraga,	
 M.,	
 Tanimoto,	
 Y.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Yamashita,	
 M.,	
 Suzuki,	
 K.	
 and	
 Kashiwagi,	
 A	
 (2010)	
 Effect	
 

39

of	
 strong	 static	
 magnetic	
 fields	
 on	 the	
 amphibian	 life	
 cycle	 -Effect	 on	
 oocyte	 maturation	
 of	
 Silurana	
 tropicalis-.	
 Space	 Utiliz.	
 Res.,	
 26,	
 228-231	 	
 2.Keiko	
 Kashiwagi,	 Yoshihisa	
 Fujiwara,	
 Satomi	 Sakao,	 Nobuaki	 Furuno,	 Makoto	 Yanagisawa,	
 Hideki	 Hanada,	 Yoshifumi	 Tanimoto,	
 Masamichi	 Yamashita,	 Minoru	 Watanabe,	
 Tadashi	 Shinkai,	 Satoshi	 Yoshitome,	
 Hideki	
 Kubo,	
 Masao	 Sakai,	
 Fujii,	
 Tomio	 Naitoh,	 Ken-ichi	
 Suzuki,	
 Akihiko	
 Kashiwagi.	
 (2010	 )	
 Effect	 of	 strong	 static	
 magnetic	
 fields	
 on	
 amphibian	 life	
 cycle-morphogical	 and	
 molecular	
 biological	
 analyses	
 of	
 early	 development-.	
 Spce	
 Utiliz.	
 Res.	
 26,	 232-235	 	
 3.Tatsuya	
 Ueki,	
 Nobuaki	 Furuno,	
 Hitoshi	
 Michibata.	
 (2011)	
 A	
 novel	 vanadium	 transporter	
 of	
 the	
 Nramp	 family	 expressed	
 at	
 the	
 vacuole	
 of	
 vanadium-accumulating	 cells	 of	 the	
 ascidian	
 Ascidia	 sydneiensis	
 samea.	
 BBA	
 -	 General	 Subjects	
 1810,	
 457-464	 	
 4.Yanagisawa,	
 M.,	
 Furuno,	
 N.*,	 Watanabe,	
 M.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Hanada,	 H.,	
 Shinkai,	
 T.,	
 Yoshitome,	
 S.,	
 Kubo,	
 H.,	
 Sakai,	
 M.,	
 Fujii,	
 H.,	
 Suzuki,	 K.,	
 Yamashi,	
 M.	
 and	
 Kashiwagi,	
 A.	
 (2011)	
 Molecular	
 analysys	
 of	
 the	
 head-defects	
 
in	
 the	
 Xenopus	 embyos	 rased	 hyper	 gravity	
 condition.	
 II	 Space	 Utili.	
 Res.	 27,	 198-200	 (*	 Corresponding	 author)	
 
	
 
	
  	
  ②総説･著書	
 
	
  	
  	
  	
  該当なし	 	
 ③学会発表	
 国内学会	
 1.古野伸明、夫津木大輔、川崎大志、白神聖也、谷本能文、柏木啓子、山下雅
道、柏木昭彦	  両生類の生活環に対する強磁場の影響−卵成熟に対する影響—	
 第２６回宇宙利用シンポジウム	  ２０１０年１月２６日	
  相模原市	  神奈川	 	
 2.柏木昭彦、柏木啓子、坂尾智美、古野伸明、藤原好恒、谷本能文、山下雅道、
渡部稔、新海正、吉留賢、久保英夫、坂井雅夫、藤井博匡、柳澤誠、花田秀樹、
内藤富夫	
  両生類の生活環に対する強磁場の影響—初期発生の形態学的および分子生物学的解析—	  第２６回宇宙利用シンポジウム	  ２０１０年１月２６日	
 相模原市	
  神奈川	 	
 3.関口猛、舟越稔、古野伸明、小林英紀	
  ヘテロ２量体 G タンパク質の Gtr１、Gtr2 は単独で相互作用タンパク質 Ego3、Ego1 に結合する。日本遺伝学会	
  第82 回大会、札幌市	
  北海道大学	  ２０１０年	
  9 月	
 40

	
 4.関口猛、舟越稔、古野伸明、小林英紀	
  Tor シグナル伝達系のヘテロ２量体
Gtr1-Gtr2 の Gtr1 と Gtr2 の働きの違いの解析	  日本分子生物学会、第 33 回大会、神戸市	
  ポートアイランドホテル	  ２０１０年１２月	
  	
 
	
 
5.佐能正剛、柏木啓子、花田秀樹、古野伸明、松原加奈、柏木昭彦、杉原数美。
北村繁幸、太田茂	  ツメガエルにおけるエストラジオールとビスフェノール Aの生物蓄積、および発生に対する影響	  第１３回環境ホルモン学会	
  東京大学、
東京	
  ２０１０年１２月１６日	
 	
 6.柳澤誠、古野伸明、渡部稔、柏木啓子、花田秀樹、新海正、吉留賢、久保英夫、坂井雅夫、藤井博匡、鈴木賢一、山下雅道、柏木昭彦	
  過重力によって生じたアフリカツメガエル初期胚の頭部形成異常の解析	  II	
 第２７回宇宙利用
シンポジウム	  ２０１１年	
  １月２５日	
  相模原市	  神奈川	
 
	
 
国際学会	
 
	
  該当なし	 	
 ④科研費等の受け入れ状況	
 宇宙環境利用科学委員会研究班ワーキンググループ（２０１０）両生類の生活環に対する過重力の影響、１０万円、研究分但者	 41

准教授･三浦郁夫（Ikuo	
 Miura）	
 
	
 
研究内容	
 
[1]性決定と生殖腺の性分化	
 	
 
Sex	
 determination	 and	
 gonadal	 sex	
 differentiation	 	  性という仕組みは、生物に多様性を生み出し、個体や種の維持、そして進化に貢献する重要な機能のひとつである。本研究では、性決定や性分化の普遍性と多様性の分子基盤を解明するため、我が国に生息するツチガエルに着目した。
本種は、地域集団ごとに、性決定や性分化機構の著しい多様性を有する、世界に類を見ない特徴をもつ。２０１０年度は以下の成果を挙げた。	
 
	
 
１）	
 
生殖腺性分化の多様性機構の解明	
 Diversity	
 in	
 the	
 sensitivity	
 of	
 sex	
 steroid	
 hormones	
 to	
 sex-reversal	
 	
  脊椎動物では、性ステロイドホルモンが生殖腺の性分化に重要な役割を担っている。哺乳類の真獣類は外部から投与した性ホルモンに全く感受性を示さな
いが、有袋類はエストロゲンによって遺伝的雄に性転換が生じる。また、他の脊椎動物では、性ホルモンに対する感受性は種によって異なる。ツチガエルは遺伝的に大きく４つの地域グループに分けられるが、それぞれの集団において性転換の感受性が異なることを明らかにした。性染色体が未分化な西日本と東
日本はテストステロンとエストロゲンによって完全に性転換を生じる。一方、性染色体が分化した ZW 集団では雄から雌への性転換に感受性を示すが、雌から雄へは性転換しない。さらに、XY 集団では、いずれの方向にも性転換が生じな
いことがわかった。さらに、エストロゲンによる雄から雌への性転換について
は、生殖腺性分化の開始時期とホルモン投与による性転換の感受期（これを窓とよぶ）との時間的相互関係が決定的に重要であることを実証した。	
 
	
 
２）	
 
佐渡島に新種ガエルを発見	 Identification	
 of	
 a	
 new	
 morphotype	 of	
 Rana	
 rugosa	 in	
 Sado	 Island,	 Japan	 	  ツチガエルの新潟県佐渡島の集団は、形態学的に本土集団と著しく異なることを発見した。そこで、外部形態、遺伝および生殖について詳細に調べた。外部形態では佐渡集団は小柄であり、特に腹側が強い黄色を呈すること、皮膚全体が滑らかであること、約６割の個体に本土では見られない細い背中線が存在することがわかった。ミトコンドリア遺伝子の解析から、佐渡黄腹集団は、東日本（関東）の集団と共通性があることがわかった。それゆえ、佐渡黄腹は、
古くから東日本全域に生息していた東日本集団に起源を発し、その後、佐渡島に孤立し、独自に分化したと推測された。さらに同島の南部に生息する新潟由来の集団との交雑実験、鳴き声解析、詳細な外部形態の解析を行っている。	
 	 [2]色彩発現	
 ニホンアカガエルの卵の色を決定する突然変異の同定	 42

Identification	
 of	 a	 gene	 mutation	
 controlling	
 egg	
 color	 of	 the	
 frog	
 Rana	
 japonica	 	 	  両生類の色彩を担う色素細胞には３種類存在し、主に皮膚、眼、卵に存在する。これまで、同一つの遺伝子突然変異体において、眼と皮膚の色彩が異なる例が発見されていることから、眼と皮膚では色彩遺伝子の発現制御が異なることが知られていた。今回、つくば市でニホンアカガエルの白色卵塊が発見されたので、それを成熟親まで飼育し、さらに兄妹同士の F１を作成した。その結果、白色卵とその F１はいずれも野生型の皮膚と眼の色彩をもつ成体に成熟した。ところが、F１の約１／４の雌に、卵の色だけが白色である個体が見つかった。以上から、卵の色彩だけを制御する遺伝的仕組みの存在することが明らかになっ
た。	
 
	
 
①原著論文	
 1. Sekiya	
 K,	
 Ohtani	 H,	
 Ogata,	
 M,	
 and	
 Miura	 I	
 (2010)	
 Phyletic	
 diversity	
 in	
 
the	
 frog	
 Rana	
 rugosa	 (Anura:	
 Ranidae)	
 with	
 special	
 reference	
 to	
 a	
 unique	 morphotype	 found	 from	
 Sado	 Island,	 Japan.	
 Current	
 Herpetology	 29(2):	
 69-78.	
 	
 2. 尾形光昭、三浦郁夫	
  (2011)	
 ツチカガエルの日本国内における生息場所について	  爬虫両棲類学報	
 2011(1):	
 24-25.	
 	
 ②総説･著書	 	  	  該当なし	 	
 ③学会発表	
 
国内学会	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 	
 	
 	
 	
 	
  	
 
1. 秋山繁治、小泉雄紀、三浦郁夫	
  アカハライモリの秋から春をまたぐ多重交配について	 ‐両季節の精子が受精に利用されている遺伝学的証拠‐	
 日本爬虫両生類学会第４９回大会	
  １０月９日−１０日	  横浜（神奈川）	
 	
 2. 長井悠佳里、土井敏男、湯浅義明、藤谷武史、伊藤邦夫、小泉雄紀、三浦郁夫	
  ナゴヤダルマガエルの遺伝的地域分化	  −とくに岡山集団と名古屋集団が接する境界領域について−	  日本爬虫両生類学会第４９回大会	
  １
０月９日−１０日	
  横浜（神奈川）	
 	
 3. 小泉雄紀、森淳、三浦郁夫	
  ニホンアカガエルの新規色彩変異	
  ‐体色と眼は正常だがメスのもつ卵だけが白い‐	  日本爬虫両生類学会第４９回大会	
  １０月９日−１０日	  横浜（神奈川）	
 
	
 

43

4.
	
 
5.

	
 
6.

尾形光昭、関谷國男、三浦郁夫	
  佐渡島産ツチガエルの外部形態について	
 日本爬虫両生類学会第４９回大会	
  １０月９日−１０日	  横浜（神奈川）	
 北本光、佐々木健、三浦郁夫	
  オタマジャクシの性を色で見分ける	
  −山口
県産ツチガエルの性に連鎖した色彩変異遺伝子の同定−	  日本爬虫両生類学会第４９回大会	
  １０月９日−１０日	  横浜（神奈川）	
 小泉雄紀、大谷浩己、三浦郁夫	
  XY 型と ZW 型の遺伝子発現のちがい	  染色体学会第６１回年会	
  １１月５日−７日	  習志野（千葉）	
 

	
 
招待講演	
 
1. 三浦郁夫	  ツチガエルの地域集団における生殖腺性差構築機構の解明	  文部科学省：新学術領域研究「性差構築の分子基盤」	
  第２回領域会議・公開研究会	
  １２月１５日−１７日	  逗子（神奈川）	
 	
 2. 佐渡島で新種発見！	
  お腹まっ黄色のカエル	
  染色体学会公開シンポジウ
ム	  「カエル・トカゲの生物学」	
  	
  １１月５日	
  ２０１０年	  習志野（千
葉）	
 
	
 
高大連携	
 
1. 「ヒトがヒト／動物たる由縁」	
 岡山清心女子高校	
  SSH 課題研究「生命科学基礎」講議	
  ２月１日（月）倉敷市	
 	
 2. 「遺伝子と生物学研究	
  -何を調べ、どう使うか-」	
  広島国泰寺高校	
  ク
ラブアシスタンス	  １２月１９日（日）広島市	
 
	
 
国際学会	
 
	
  該当なし	 	 ④	
 科研費等の受け入れ状況	
 
	
 	
 	
 科学研究費基盤 C（代表）1,400 千円「性決定元祖遺伝子の双方向進化	
 	
 
	
 	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  ̶ 精巣および卵巣決定」	
 44

特任助教・柏木啓子（Keiko	
 Kashiwagi）	
 
	
 
研究内容	
 
I.	
 両生類における編集 ZFN による甲状腺ホルモン受容体(TRb)遺伝子の標的突
然変異誘発	
 Targeted	 mutagenesis	
 of	
 thyroid	
 hormone	 receptor	
 beta	 gene	
 by	
 engineered	 zinc-	 finger	
 nuclease	 in	
 amphibian	 embryos	
 
	
 
[目的]	
  	
 
両生類の変態および再生は魅力的な生物現象であり、オタマジャクシの発生過程における体の作り替えに関する分子機構を解明するための有用なモデルとなりうる。この現象に関与する遺伝子の機能を明らかにするために遺伝子を標的にした研究方法の確立は長年の願望であった。私たちは、ニシツメガエル胚特異的なゲノムサイトに突然変異を導入するため、編集ジンクフィンガーヌレアーゼ(ZFN)による遺伝子標的突然変異誘発法を採用した。	
 
	
 
[方法]	
  	
 
甲状腺ホルモン受容体（TRb）遺伝子のターゲット配列を認識するように合成された ZFN の mRNA をニシツメガエルの受精卵に顕微注入した。二本鎖切断(DSB)が導入されているかを調べるために Cel-1	
 アッセイとシークエンス解析を行っ
た。	
 
	
 
[成果と考察]	
  	 
ZFN は、ジンクフィンガードメインと、II 型制限酵素である FoKI 由来の DNA 切断ドメインから成る人工酵素であって、標的とする遺伝子シークエンスに DSBを導入するよう編集されている。誘導された DSB が非相同末端結合によって修復されるときに挿入や欠失が起こり、その結果、ヌル接合体や、正常なものに比べ機能の劣る突然変異遺伝子(hypomorphic	 alleles)を生じる。	
 TRb 遺伝子は両生類オタマジャクシ変態の調節に重要な役割を演じていると考えられている。ZFN を注入した受精卵から発生した胚のヌクレアーゼ標的領域
をシークエンスしたところ、挿入や欠失が認められた。	
 	
 [将来の展望]	  	
 私たちは TRb	
 遺伝子を標的にした ZFN をつくり、ニシツメガエル TRb 遺伝子内に突然変異を誘導するのに成功した。突然変異が次世代に伝えられることを想定し、現在、ホモ接合の突然変異体(TRb-/-)を含む系統の確立を目指している。	
 
	
 
II.	
 アフリカツメガエルの器官形成過程における新規 I 型ケラチン遺伝子の特徴	 Characterization	
 of	
 a	
 novel	 type	 I	
 keratin	
 gene	 in	
 Xenopus	 laevis	 during	 45

ontogenesis	
 
	
 
[目的]	
  	
 
ケラチンは等電点などの生化学的特徴に基づき I 型と II 型に分けられ、両者のヘテロ二量体が重合してフィラメントが構成される。ケラチン遺伝子の発現は細胞特異的で、その様式は細胞分化や、感染による形質転換に関係する。アフ
リカツメガエルでは個体発生中の発現状況によりいろいろなケラチン遺伝子が同定されたが、遺伝子の調節メカニズムは不明である。新規 I 型ケラチン遺伝
子（クローン名：XL073g19）の転写産物発現および上流域プロモーター/エンハ
ンサー活性が胚の尾鰭と内外鰓に強く見られるため、この遺伝子を鰭鰓ケラチン(FGK)遺伝子とよぶことにする。	
  	 	  私たちは、FGK 遺伝子のプロモーター/エンハンサーと EGFP または DsRed2 遺伝子を連結させてつくったベクターを導入したアフリカツメガエルのトランス
ジェニック系統を確立している。トランスジェニック F1 世代を用いて FGK 遺伝子の特徴を調べた。	
 
	
 
[方法]	
  	
 
FGK 遺伝子の cDNA クローニングは Tazaki ら(2005)に従った。ゼノパスの I 型ケラチン遺伝子の同定には Xenobase	
 BLAST	 systemを用いた。FGK 遺伝子の全上流域、およびそれをいろいろな長さに削除してつくったコンストラクトを pEGFP-1
または pDsRed2-1 の中にサブクローンした。トランスジェニックガエルは、Krollと Amaya(1996)に従って作製した。	
 	
 [成果と考察]	  	 まず、オタマジャクシの鰓に特徴的なレポーター遺伝子発現が起こるためには
プロモーター近位部位の存在が必要であった。次に、自然変態および甲状腺ホルモン誘導による変態オタマジャクシにおいて、レポーター発現は嗅上皮、四肢、レンズのほか、特に内鰓において強烈であった。変態開始に伴い鰓は吸収されるが、その過程で内鰓でのレポーター発現は急速に失われた。トランスジ
ェニック系統に導入された蛍光レポーター遺伝子の発現は、カエルの生活環の中で起こる様々な器官の形成、発生、吸収を動物を生かしたままの状態で可視化しモニターできるという利点を備えている。	
 	
 [将来の展望]	  	
 非常に多くの人工化学物質が環境中に放出されており、その中には正常な甲状腺ホルモン(TH)作用をかく乱するものが含まれることが知られている。TH は成長や発生を調節し、代謝ホメオスタシスの維持に重要な役割を果たしている。
現在使われている 10 万種類以上の化学物質のうちで、ヒトを含む生物への安全性が確認されているものは僅かである。安全性に関する情報を得るための優れた試験法がないのが現状である。オタマジャクシの変態過程における鰓の消長46

は TH によって誘起・支配されている発生プロセスである。蛍光レポーター遺伝子を内蔵したアフリカツメガエルトランスジェニック系統は TH の働きをかく乱すると危惧される化学物質を簡単・迅速に調べられるツールとして極めて有用である。今後、私たちはこのカエル系統を用い、TH 作用をかく乱する化学物質
をピックアップしていく予定である。	
 
	
 
III.	
 両生類を用いた生活環に対する過重力および強磁場の影響に関する研究	
 Effects	
 of	 hypergravity	
 environments	
 and	
 strong	 static	
 magnetic	
 fields	 on	 	 amphibian	 life	
 cycle	
 
	
 
[目的]	
 	
 
私たちは、両生類（主としてアフリカツメガエル）を実験材料として、その生活環に対し過重力や強磁場がいかなる影響を与えるかについて研究を続けている。これまでに得られた研究結果は以下の通りである。過重力については、①
影響は受精直後に最もよく現われ、小頭症・小眼症などの奇形を引き起こすこと、②プログラム細胞死が増えること、③奇形個体では頭部マーカーである
Xotx2（前脳、中脳、眼の形成に関係する）,	
 Xag1（セメント腺マーカー）の発現低下が見られ、また頭部形成異常は Wnt シグナルの活性化抑制が原因であること、④卵減数分裂で白班や紡錘体の形成が異常になること、⑤視床下部̶下垂体̶標的器官系の異常で体の成長や器官分化に遅延が生じるが、その症状は甲状腺ホルモンの投与によって改善されること、などがわかった。その他にも、予備実験から過重力が生殖腺に影響を与えることも示唆されている。強磁場については、①処理受精卵から発生した胚には生存率の大幅低下や、頭部・セメン
ト腺の形成異常、頭部-胴部-尾部の比率の変化、②Xotx2 や Xag1 の発現抑制、③卵母細胞の色素分布の異常、などが見られた。	
  	
 
	
 
[方法]	
  	
 
発生に対する過重力影響は、媒精後 10 分、20 分の未分割卵や、２細胞期の胚、原腸胚に、2G，5G の過重力を印加して調べた。強磁場に関しては、11T(-1400T2m-1)、
15T(0T2m-1)、12T(+1200T2m-1)を印加した。プログラム細胞死については Hensey	
 and	
 Gautier	 (1998)	
 の TUNEL 染色法で調べた。遺伝子発現は、尾芽胚において
whole-mount	
 in	
 situ	
 hybridization(WISH)により調べた。	
 	
 [成果と考察]	
  	 上述のごとく、私たちは、過重力・強磁場下に置いた両生類胚には小頭症・小眼症などの頭部形成異常を含め、様々な奇形が生じることを報告してきた。また、Xotx2 や Xag1 の発現も過重力に曝露した胚では抑制されることも示した。
しかし、頭部のどの部分が過重力に対して感受性があるのか、つまり影響を受けやすいのかについてはわかっていない。昨年度は、Xotx2 や Xag1,	
 En2（中脳と後脳の中間域に発現する）の遺伝子発現に対する影響を、アフリカツメガエ

47

ル胚において WISH で調べた。5G に曝された胚を用いて Xotx2 と Xag1 の二重染色行ったところ、Xotx2 の発現は抑えられたが,	
 Xag1 の発現に変動は見られなかった。また、En2 発現にも影響はなかった。これらの結果から、眼、前脳、中脳は感受性が高く、後脳の後部には影響しないことが示唆された。	
 	
 [将来の展望]	 	 	
 発生・性分化に対する重力・磁場の影響を簡潔かつ迅速に調べるため遺伝子レベルでの解析を試みている。	
 
	
 
研究業績	
 
① 原著論文	 1．Kashiwagi,	
 K.,	
 Fujiwara,	
 Y.,	
 Sakao,	
 S.,	
 Furuno,	
 N.,	
 Yanagisawa,	
 M.,	
 Hanada,	
 H.,Tanimoto,Y.,	
 Yamashita,	
 M.,	
 Watanabe,	
 M.,	
 Shinkai,	
 T.,	
 Yoshitome,	
 S.,	
 Kubo,	
 H.,	
 Sakai,	
 M.,	
 Fujii,	
 H.,	
 Naitoh,	
 T.,	
 Suzuki,	
 K.	
 
and	
 Kashiwagi,	
 A.	
 (2010)	
 	 	
 Effect	
 of	
 strong	 static	
 magnetic	
 fields	
 on	
 
the	
 amphibian	 life	
 cycle	 -	 morphological	 and	
 molecular	
 biological	
 analyses	 of	
 early	 development.	
 Space	 Utiliz.	
 Res.	
 26,232-235.	
 2.	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Kashiwagi,	
 A.,	
 Kurabayashi,	
 A.,	
 Hanada,	
 H.,	
 Nakajima,	
 K.,	
 Okada,	
 M.,	
 Takase,	
 M.	
 and	
 Yaoita,	
 Y.	
 (2010)	
 Xenopus	 tropicalis:	
 An	
 ideal	 experimental	
 animal	 in	 amphibia.	
 	
 Exp.	
 Anim.	
 59(4),	
 395-405.	
 	
 3．Suzuki,	
 K.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Ujihara,	
 M.,	
 Marukane,	
 T.,Tazaki,	 A.,Watanabe,	
 K.,	
 Mizuno,	
 N.,	
 Ueda,	
 Y.,	
 Kondoh,	
 H.,	
 Kashiwagi,	
 A.	
 and	
 
Mochii,	 M.	
  (2010)	
  Characterization	
 of	
 a	
 novel	 type	 I	
 keratin	
 gene	 and	
 generation	
 of	
 transgenic	
 lines	 with	
 fluorescent	 reporter	 genes	 driven	
 
by	
 its	
 promoter/enhancer	
 in	
 Xenopus	 laevis.	
  Dev.	
 Dyn.	
 239,3172-3181.	
 4.	
 Furuno,	
 N.,	
 Futsuki,	
 D.,	
 Kawasaki,T.,	
 Shiraga,	
 M.,Tanimoto,Y.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Suzuki,K.,Yamashita,	
 M.	
 and	
 Kashiwagi,	
 A.	
 (2010)	
 	
 Effect	
 of	
 strong	 static	
 magnetic	
 fields	
 on	 the	
 amphibian	 life	
 cycle	 -	 Effect	 on	
 oocyte	 maturation	
 of	
 Silurana	
 tropicalis.	
 	
 Space	 Utiliz.	
 Res.	
 26,	 228-231.	
 5.	
 Yanagisawa,	
 M.,	
 Furuno,	
 N.,	
 Watanabe,M.,	
 Kashiwagi,K.,	
 Hanada,	 H.,	
 Shinkai,	
 T.,	
 Yoshitome,S.,	
 Kubo,H.,	
 Sakai,M.,	
 Fujii,H.,	
 Suzuki,	 K.,	
 Yamashita,M.	
 and	
 Kashiwagi,A.	
 (2011)	
 Molecular	
 analysis	
 of	
 the	
 
head-defects	
 in	
 the	
 Xenopus	 embryos	 raised	 under	 hypergravity	 conditions.	
 II.	
 	 Space	 Utiliz.	
 Res.	 27,	 198-200.	
 
	
 

②

③

総説・著書	
 
なし	
 
	
 
学会発表	
 

48

	
 国内学会	
 １．佐能正剛、	
 柏木啓子、花田秀樹、	
 古野伸明、	
 松原加奈、	
 柏木昭彦、杉原数美、北村繁幸、	
 太田	
  茂.	
  Estradiol	
 and	
 bisphenol	
 A	 bioaccumulation	 and	
 effect	
 on	
 development	
 in	
 clawed	 frogs（ツメガエルにおけるエスト
ラジオールとビスフェノール A の生物蓄積、および発生に対する影響）。	
  第13 回環境ホルモン学会発表会	
  (2010 年 12 月、東京大学山上会館	
  東京)	
 ２．柏木昭彦、柏木啓子、坂尾智美、古野伸明、藤原好恒、谷本能文、山下雅
道、渡部稔、新海正、吉留賢、久保英夫、坂井雅夫、藤井博匡、柳澤誠、花田秀樹、内藤富夫.	
  両生類の生活環に対する強磁場の影響ー初期発生の形
態学的および分子生物学的解析―第 26 回宇宙利用シンポジウム	  2010 年 1
月 26 日	  相模原市	  神奈川	
 ３．古野伸明、夫津木大輔、川崎大志、白神聖也、谷本能文、柏木啓子、山下
雅道、柏木昭彦.	
  両生類の生活環に対する強磁場の影響―卵成熟に対する影響ー第 26 回宇宙利用シンポジウム	  2010 年 1 月 26 日	
  相模原市	  神奈川	
 ４．柳澤誠、古野伸明、渡部稔、柏木啓子、花田秀樹、新海正、吉留賢、久保英夫、坂井雅夫、藤井博匡、鈴木賢一、山下雅道、柏木昭彦.	
 過重力によって生じたアフリカツメガエル初期胚の頭部形成異常の解析 II	 	
 第 27 回宇宙利用シンポジウム	  2011 年 1 月 25 日	
  相模原市	  神奈川	
 
	
 
国際学会	
 
	
  該当なし	 	
 ④ 科研費等の受け入れ状況	 	  	 宇宙環境利用科学委員会研究班ワーキンググループ 2010 年	
 100 千円（分担）	
 	
 ⑤ その他	 	  	
 北九州市板櫃川後肢欠損ガエル調査検討委員会委員	
 	
  	
 第一回開会（2010 年 8 月 3 日	 北九州市役所）セミナー	 「北九州市板櫃川における後肢欠損ツチガエルについて考える」柏木啓子	
 

49

	
 [多様化機構研究部門]	
 	
 教授･住田正幸（Masayuki	
 Sumida）	
 
	
 
研究内容	
 
1.	
 アジア諸国のカニクイガエル類における遺伝的分化と系統関係	
 Genetic	 divergences	
 and	
 phylogenetic	
 relationships	
 in	
 the	
 Fejervarya	 cancrivora	
 complex	
 from	 Asian	 countries	
 	
 
	
 
[目的]	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 
カニクイガエルは、アジアに広く分布する種の一つであり、中国からインドまでと、フィリピンおよびインドネシアに棲息することが知られている。従来単一種 Fejervarya	
 cancrivora とされていたが、最近の研究から、形態学的にも遺伝学的にも分化した複数のタイプの存在が知られてきた。本研究の目的は、アジアに広範に分布するカニクイガエル類について、どのような種多様性があるのか、どの程度の遺伝的また形態的分化が起っているのか、どのような繁殖隔離機構が確立しているのか、それらは分類学的にどのように位置付けられるのか、を明らかにすることである。	
 	 [材料･方法]	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 	
 	
 	
 	
 
インドネシア、マレーシア、タイ、フィリピンおよびバングラデシュから 24 集団の計 131 個体のカニクイガエルを用いて、アロザイム分析およびミトコンド
リア DNA 分析、形態計測および交雑実験を行なった。	
 
	
 
[成果]	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 
アロザイム分析の結果、カニクイガエル類は大きく 2 つのグループに大別され、これらの遺伝距離は 0.535 であった。また、16S	
 rRNA遺伝子と Cytb 遺伝子の塩基配列に基づく系統解析でも、大きく 2 つのグループに分かれ、そのうち一つはさらに 2 つのサブグループに分かれた。タイ、フィリピンおよびバングラデ
シュはマングローブ型、インドネシアとマレーシアは大型、スラベシはプラン
ラト/スラベシ型に属することが分った。形態計測に基づく判別分析の結果、これら 3 つのタイプは各々明瞭に識別でき、交雑実験でも、これら 3 つのタイプの間には配偶子隔離または雑種精子形成異常のいずれかの隔離機構が成立していることが分った。	
 
	
 
[考察]	
  	
  	
 
本研究により、（i）アジア産のカニクイガエル類は外部形態および遺伝的特徴からマングローブ型、大型、プランラト/スラベシ型の大きく 3 つに分けられること、(ii)これらは互いに生殖的に隔離された別種であること、(iii)	
 大型はF.	
 cancrivora、マングローブ型は F.	
 moodie に該当し、スラベシ型は未記載種の可能性があること、(iv)	
 従来の F.	
 raja は F.	
 cancrivora のシノニムの可能50

性があること、が明らかになった。	
 
	
 
2.	
 絶滅危惧種イシカワガエルの保全と遺伝的多様性に関する研究	
 Studies	
 on	 conservation	
 and	
 genetic	
 diversity	
 in	
 an	
 endangered	 frog	
 species	 Odorrana	
 ishikawae	
  	
 
	
 
[目的]	
 
イシカワガエルは、奄美大島と沖縄島北部に分布する日本で最も美しいとされるカエルで、鹿児島県と沖縄県では天然記念物に、環境省レッドリストでは絶滅危惧 IB 類に指定されるなど、早急な保護対策が求められている。本研究は、（1）実験室での人工繁殖・飼育維持方法を確立し、効率的な保全に資する（2）
集団間及び集団内の遺伝的多様性を調べ、人工繁殖下でも遺伝的多様性を評価する（3）種内の遺伝的及び形態的分化を解明するとともに、交配後隔離の程度を明らかにすることによって、各集団の分類学的な位置付けを明確にする、ことを目的に行った。	
 	
 [材料･方法]	
 （1）奄美大島と沖縄島からイシカワガエルを採集し、人工受精法により人工交配系を確立するとともに、実験室での自然繁殖と飼育維持を試みる。（2）野外から採集した沖縄、奄美大型、奄美普通の各集団の個体を用いて、集団間で交雑実験を行ない、雑種の生存率と繁殖能力を調べ、集団間の繁殖隔離の有無とその程度を調べる。（3）野外集団について、アロザイム分析及び mtDNA 解析を行ない、本種の各集団における遺伝的多様性と集団間の遺伝的分化の程度を把握する。（4）野外集団について、31 部位の外部形態計測を行ない、主成分分析に基づき、集団間の形態的な差異を明らかにする。	
 	
 [成果･考察]	
 2010年の繁殖期には、人工繁殖によって生まれた6年齢の人工繁殖個体から、完全飼育下での自然繁殖によって、多数の2代目を得ることに成功した。また、形態計測に基づく主成分分析の結果、奄美産と沖縄産とは形態的に明瞭な相違があること、アロザイム分析、mtDNA解析から、両集団は遺伝的にも明瞭に分化していることがわかった。さらに、交雑実験の結果、沖縄産雌と奄美産雄との雑種は発生初期ですべて致死になること、奄美産雌と沖縄産雄の雑種は正常に発育するが、成熟期に達した雑種の雄は精子形成が異常であることがわかった。
以上、奄美産と沖縄産は遺伝的にも形態的にも明瞭に分化しており、生殖的にも明確な交配後隔離が成立していることから、両集団は別種とするのが妥当であると考えられた。イシカワガエルの基準産地は沖縄本島であることから、奄美産のイシカワガエルを新種「アマミイシカワガエル」Odorrana	
 splendidaとして記載した。	
 	
 51

3.沖縄産と奄美大島産の準絶滅危惧種リュウキュウアカガエルの遺伝的分化	 Genetic	 divergences	
 in	
 Rana“okinavana”	
 a	
 near	
 threatened	
 species	
 from	
 Okinawa	
 and	
 Amami	 	 	 [目的]	 	  南西諸島のカエルの多くは、島嶼間で種分化していることが報告されており、奄美大島産と沖縄島産の間でも、別種に分化しているものも少なくない。リュウキュウアカガエルについては、これまで両島間の分化に関する詳細な研究はない。本研究では、リュウキュウアカガエルの２集団間に、どの程度の遺伝的差異があるか、またどの程度の交配後隔離があるのかを明らかにすることを目的に行った。	
 	 	 [材料･方法]	
 奄美大島産と沖縄産のリュウキュウアカガエルを用いて、アロザイム・mtDNAの分析を行うとともに、人工受精法によって、交雑実験を行い、雑種の生存率と繁殖能力を調べた。	
 	
 [成果･考察]	
 アロザイム分析の結果、沖縄と奄美は明瞭	
 (D=0.155)に分化していた。両者間にはLDH-A座で対立遺伝子に完全な置換	
 (Fst=1.000)	
 があった。mtDNA解析では、沖縄と奄美は明瞭に区別できた（塩基置換率	
 12S=5.2%,	
 16S=3.1%）。交雑実験の結果、2集団間には雑種致死による隔離はなく、雑種は正常に発育するが、生育した雑種の雄の精巣には、減数分裂で相同染色体の対合がうまく行かないで、精子形成の異常が見られた。沖縄と奄美は遺伝的に明瞭に分化しており、精子形成異常により生殖的にもある程度隔離が見られた。他の無尾類を考慮すると両集団は亜種以上の分化であると考えられる。	
 	
 [将来の展望]	
 両集団間の交配実験については、正逆での繁殖隔離を調べるとともに、沖縄と奄美について詳細な外部形態観察を行い、その形態的な違いも明らかにして、両者の分類学的関係を明らかにする。さらに、リュウキュウアカガエルは久米島と徳之島にも分布していることから、今後はこれらの島のサンプルも加えて、本種の分化の全貌を明らかにし、生物地理学的な考察も行う。	
 
	
 
4.	
 透明ガエル「スケルピョン」の量産化	
 Mass	
 production	
 of	
 see-through	 frogs	 “Sukerupyon”	
 
	
 
[目的]	
 
ニホンアカガエルにおいては、黒色眼と灰色眼の二つの色彩突然変異系統があり、これらの突然変異系統を用いて、2007 年には両生類で初となる体が透明で52

内臓が透けて見える「透明ガエル」（スケルピョン）を誕生させることに成功し、「透明ガエルおよびその作製方法」	
 については特許を取得している。本研究では、有用な実験動物の実用化を目的に、透明ガエルの量産化を行った。	
 	
 [材料･方法]	
 「透明ガエル」の雌雄の組合せで交配を行い、2 代目「透明ガエル」の系統確立を試みるとともに、黒色眼と灰色眼の二つの色彩突然変異遺伝子をヘテロ接合に持つ雌雄を用いて、種々の組合せで交配を行うことによって、これらの遺伝子をホモ接合に持つ「透明ガエル」を飼育維持して、量産化を試みた。	
 	
 [成果･考察]	
 「透明ガエル」を 200 個体にふやし、今後も量産の目途をたてることに成功した。これらは、内臓透視のできる新しい実験動物として、環境、医学、生物学の分野において実験材料や教材として利用価値が高いと思われ、すでに需要がある。動物愛護の伝統がある欧米では特に「透明ガエル」への関心は高く、海外からの需要もあり、多様な可能性を秘めた「透明ガエル」の活躍の場は今後、世界へと広がって行きそうである。	
 	
 [将来の展望]	
 	
 ２代目の「透明ガエル」は生活力が弱いため、以降の継代飼育がかなり困難であったため、安定した系代飼育のため改良が必要であり、現在、生活力改善のために、改良を試みている。これとは別に、今後は、実用化に向けては、さらに背面の透明度を上げるような工夫（黄色素胞を欠く突然変異を導入）も必要である。また、今後は、「透明ガエル」にGFP(蛍光蛋白質)遺伝子をつないだベ
クターをインジェクションすることで、トランスジェニック「光る透明ガエル」を作成する計画である。これにより、遺伝子発現の様子を外部から蛍光によってリアルタイムで観察でき、この方法では、プロモーターの設計を変えること
で、さまざまな遺伝子の発現解析への応用が可能である。	
 
	
 
研究業績	
 
①原著論文	
 1.Kotaki,	
 M.,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 M.	
 Matsui,	
 M.	
 Kuramoto,	
 T.	
 H.	
 Djong	
 and	
 M.	
 
Sumida	 (2010)	
 Molecular	 phylogeny	
 for	
 the	
 diversified	 frogs	 of	
 genus	 Fejervarya	
 (Anura:	
 Dicroglossidae).	
 Zool.	
 Sci.,	
 27：386-395.	
 	
 2.Kurabayashi,	
 A.,	
 N.	
 Yoshikawa,	
 N.	
 Sato,	
 Y.	
 Hayashi,	
 S.	
 Oumi,	
 T.	
 Fujii	
 and	
 M.	
 Sumida	 (2010)	
 Complete	 mitochondrial	 DNA	 sequence	
 of	
 the	
 endangered	
 frog	
 Odorrana	 ishikawae	
 (family,	
 Ranidae)	
 and	
 unexpected	
 diversity	
 of	
 mt	
 
gene	
 arrangements	
 in	
 ranids.	
 Mol.	 Phylogenet.	
 Evol.,	
 56：543-553.	
 
	
 

53

3.Alam	
 M.	
 S.,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 Y.	
 Hayashi,	
 N.	
 Sano,	
 M.	
 M.	
 R.	
 Khan,	
 T.	
 Fujii	
 and	
 M.	
 Sumida	 (2010) Complete	 mitochondrial	 genomes	 and	
 novel	 gene	
 rearrangements	
 in	
 two	
 dicroglossid	
 frogs,	 Hoplobatrachus	
 tigerinus	
 and	
 Euphlyctis	
 hexadactylus,	
 from	 Bangladesh.	
 Genes	 &	
 Genet.	
 Syst.,	
 85:	
 219-232.	
 	
 4.Kurniawan,	
 N.,	
 T.	
 H.	
 Djong,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 T.	
 Nishizawa,	
 Daicus,	
 M.	
 B.,	
 
H.	
 S.	
 Yong,	
 R.	
 Wanichanon,	
 I.	
 Yasir	 and	 M.	
 Sumida	 (2011)	
 Taxonomic	
 status	
 of	
 three	 types	 of	
 Fejervarya	
 cancrivora	
 from	
 Indonesia	
 and	
 other	 Asian	 countries	
 based	 on	 morphological	
 observations	 and	
 crossing	 experiments.	
 Zool.	
 Sci.,	
 28:	
 12-24.	
 	
 5.Kuramoto,	
 M.,	
 N.	
 Satou,	
 S.	
 Oumi,	
 A.	
 Kurabayashi	
 and	
 M.	
 Sumida	 (2011)	
 Inter-	
 and	 intra-island	 divergence	
 in	
 Odorrana	 ishikawae	
 (Anura,	
 Ranidae)	
 
of	
 the	
 Ryukyu	
 Archipelago	
 of	
 Japan,	
 with	 description	
 of	
 a	
 new	
 species.	
 Zootaxa,	
 2767:	
 25-40.	
 	
 6.	
 Iwakoshi-Ukena,	
 E.,	
 K.	
 Ukena,	
 A.	
 Okimoto,	
 M.	
 Soga,	
 G.	
 Okada,	
 T.	
 Fujii,	 Y.	
 Sugawara	
 and	
 M.	
 Sumida	 (2011)	
 Identification	
 and	
 characterization	
 of	
 antimicrobial	
 peptides	
 from	 the	
 skin	 of	
 the	
 endangered	 frog	
 Odorrana	 ishikawae.	
 Peptides,	
 32:	
 670-676.	
 
	
 
	
 
②総説･著書	
 
該当なし	
 
	
 
③学会発表	
 国際学会	 1.Sumida,	
 M.	
 “Artificial	
 breeding	 and	
 genetic	
 diversity	
 in	
 an	
 endangered	
 frog	
 Odorrana	 ishikawae:	
 Case	 study	 of	
 fauna	 conservation	
 from	 Japan.”	
 2010	 International	
 Meeting	
 of	
 the	
 Association	
 for	
 Tropical	
 Biology	 and	
 Conservation	
 (Jul.,	
 2010.	
 Bali,	
 Indonesia)	
 	
 2.Igawa,	
 T.,	
 M.	
 Okuda,	
 S.	
 Oumi,	
 S.	
 Katsuren,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 T.	
 Umino	 and	
 M.	
 Sumida.	
 “Development	
 of	
 microsatellite	 markers	
 and	
 population	
 genetic	
 analysis	
 of	
 the	
 endangered	 frog,	
 Odorrana	 ishikawae	
 (Anura:	
 Ranidae).”	
 2010	 International	
 Meeting	
 of	
 the	
 Association	
 for	
 Tropical	
 Biology	 and	
 Conservation	
 (Jul.,	
 2010.	
 Bali,	
 Indonesia)	
 	
 3.Kurniawan,	
 N.,	
 T.	
 H.	
 Djong,	
 T.	
 Igawa,	
 M.	
 Kotaki	 and	
 M.	
 Sumida	 “Geographic	
 54

distribution	
 and	
 phylogenetic	
 relationship	
 of	
 genus	 Fejervarya	
 from	
 Indonesian	 Sunda	 Land	
 inferred	
 from	 16S	 rRNA	 gene.”	
 2010	
 International	 Meeting	 of	 the	
 Association	
 for	
 Tropical	
 Biology	
 and	
 Conservation	
 (Jul.,	 2010.	 Bali,	
 Indonesia)	
 	
 4.Kurabayashi,	
 A.,	
 N.	
 Yoshikawa,	
 N.	
 Sato,	
 Y.	
 Hayashi,	
 S.	
 Oumi,	
 T.	
 Fujii,	
 
and	
 M.	
 Sumida.	
 “Mitochondrial	 genome	 of	 the	
 endangered	 frog	
 Odorrana	 ishikawae	
 and	
 unexpected	
 diversity	
 of	
 mt	
 genomic	
 arrangements	
 in	
 the	
 family	 Ranidae.”	
 International	
 Symposium	
 on	
 Biodiversity	
 Sciences	 (ISBDS)	
 2010,	
 “Genome,	 Evolution	
 and	
 Environment.”	
 (Aug.,	
 2010.	
 Nagoya,	 Japan)	
 	
 5.Sumida,	
 M.	
 “Attempt	
 at	
 artificial	
 breeding	 for	
 conservation	
 and	
 analyses	
 of	
 genetic	
 divergences	
 and	
 postmating	 isolation	
 mechanisms	
 in	
 an	
 endangered	
 frog	
 Odorrana	 ishikawae	
 from	 Japan.”	
 Internatinal	
 Congress	
 of	
 BioSystematics	
 Berlin	 2011	 (Feb.,	 2011,	
 Berlin,	
 Germany)	
 	
 6.Hasan,	
 M.,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 T.	
 Igawa,	
 Md.	
 M.	
 R.	
 Khan,	
 M.	
 S.	
 Alam,	
 T.	
 H.	
 Djong,	
 N.	
 Kurniawan,	
 M.	
 Kuramoto,	
 and	
 M.	
 Sumida.	
 “Genetic	
 divergences	 and	
 phylogenetic	
 relationships	
 in	
 the	
 frogs	 from	 South	 to	
 East	 Asia.”	
 Internatinal	
 Congress	
 of	
 BioSystematics	
 Berlin	 2011	 (Feb.,	 2011,	
 Berlin,	 Germany)	
 
	
 
国内学会	
 
1.Hasan,	
 M.・M.	
 M.Islam・Md.	
 M.	
 R.	
 Khan・M.	
 S.	
 Alam・T.	
 H.	
 Djong・T.	
 Igawa・N.	
 Kurniawan・M.	
 Kuramoto・M.	
 Sumida“Genetic	
 divergences	
 and	
 phylogenetic	 relationships	
 in	
 the	
 frogs	 from	
 south	 to	
 east	 Asia.”日本学会動物学会第62 回中国四国支部大会	
 (2010 年 5 月,	
 山口)	
 
	
 
2.Alam,	
 M.	
 S.・A.	
 Kurabayashi・Y.	
 Hayashi・N.	
 Sano・M.	
 M.	
 R.	
 Khan・T.	
 Fujii・M.	
 Sumida	 “Complete	 mitochondrial	 genomes	 and	
 novel	 gene	
 rearrangements	
 in	
 
two	
 dicroglossid	
 frogs,	 Hoplobatrachus	
 tigerinus	
 and	
 Euphlyctis	
 hexadactylus,	
 from	 Bangladesh.”	
 日本遺伝学会第82回大会	
  (2010年9月,札幌)	
 	
 3.Hasan,	
 M.・M.	
 M.	
 Islam・M.	
 M.	
 R.	
 Khan・M.	
 S.	
 Alam・T.	
 Igawa・M.	
 Kuramoto・M.	
 Sumida	 “Species	
 diversity	 and	
 phylogenetic	
 relationships	
 among	 frogs	 from	 Bangladesh	 revealed	
 by	 nucleotide	 sequences	 of	
 mitochondrial	
 16S	
 rRNA	
 gene.”	 日本遺伝学会第82回大会	
  (2010年9月,	
 札幌)	
 
	
 
4.井川武・奥田優・大海昌平・勝連盛輝・倉林敦・海野徹也・住田正幸	
 「マイクロサテライトマーカーを用いた絶滅危惧種および天然記念物イシカワガエル

55

の遺伝的集団構造の解明」	
 日本遺伝学会第 82 回大会	  (2010 年 9 月,	
 札幌)	
 
	
 
5.住田正幸・佐藤直樹・M.	
 M.	
 Islam・井川武・吉川夏彦・倉林敦・大海昌平・
勝連盛輝・福庭博子・新谷望・藤井保・倉本満	
 「絶滅危惧種イシカワガエルにおける飼育下繁殖の試みと交配後隔離機構の解明」日本遺伝学会第82回大会	
 (2010年9月,	
 札幌)	
 
	
 
6.住田正幸・西谷拓磨・菅原弘貴・倉林敦・勝連盛輝・大海昌平	
 「絶滅危惧種
イボイモリの飼育下繁殖の試みとミトコンドリアゲノムの解析」	
 日本動物学会
第81回大会	  (2010年9月,	
 東京)	
 
	
 
7.Islam,	
 M.	
 M.・M.	
 M.	
 R.	
 Khan・M.	
 Kuramoto・M.	
 Sumida	 “Reproductive	 isolating	 mechanisms	
 among	 frogs	 of	
 genus	 Fejervarya	
 elucidated	 by	 crossing	 experiments,	
 histological	
 and	
 spermatogensis	
 observations.”	
  日本動物学会第81回大会	  (2010年9月,	
 東京)	
 
	
 
8.小巻翔平・倉林敦・Mohammed	
 Mafizul	
 Islam・住田正幸・東城幸治	
  「中部
日本のトノサマガエル種群の交雑帯における遺伝子浸透」	
 日本爬虫両棲類学会
第81回大会	  (2010年10月,	
 横浜)	
 
	
 
④科研費等の受け入れ状況	 1.科学研究補助金	
  基盤研究(C)「絶滅危惧種イシカワガエルの保全と遺伝的多様性に関する研究」代表者：住田正幸	
  1,040 千円	
 	
 2.奨学寄付金	  500 千円	 56

准教授・鈴木	  厚（Atsushi	
 Suzuki）	
 
	
 
研究内容	
 
	
  両生類の初期発生過程における形態形成の分子機構	 	  Molecular	 mechanisms	
 of	
 morphogenesis	
 during	 early	 amphibian	 embryogenesis	
 	
 
	
 
[目的]	
 
脊椎動物の初期発生では、一個の受精卵が細胞分裂を繰り返し、それぞれの細胞が分化しながら所定の位置に配置され、形態形成が進行する。近年、形態形成にともなう細胞の分裂、分化、移動に細胞増殖因子が重要な役割を担うことが明らかにされている。本研究では、アフリカツメガエルを用いて、初期発
生過程における細胞増殖因子の働き、および細胞増殖因子に対する細胞応答の制御機構を解析し、形態形成の分子機構を解明することを目的としている。本
年度は、細胞増殖因子に対する細胞応答が、発生過程の時期および胚領域に応じてダイナミックに変化することに着目し、背腹軸形成の制御因子である骨形
成タンパク質（BMP）に対する細胞応答の制御機構を解析した。また、背腹軸に沿った細胞の分化は、頭尾軸の形成と連携していることから、BMP 応答の制御機
構を切り口として、頭尾軸形成との関連についても解析を行った。	
 	
 [成果と考察]	
 私達の研究グループでは、XOct-25 転写因子が BMP 応答を抑制することを見出し、神経形成の促進に働くことを明らかにしている。昨年度までに、XOct-25 転
写因子の過剰発現によって発現誘導される遺伝子として FoxB1 転写因子を同定することに成功し、FoxB1 が BMP 応答を抑制して、神経誘導を促進することを明らかにしている。また、FoxB1 は神経誘導因子と協調して、後方神経の形成に働くことを示した。本年度は、FoxB1 遺伝子の機能阻害実験を行い、初期発生における FoxB1 の必要性を検討した。また、後方神経形成の促進機構について解析を行った。	
 特異的なアンチセンスオリゴにより、FoxB1 の機能を阻害すると、後方神経の抑制と前方神経の拡大が観察され、予想通り FoxB1 が後方神経の形成に必要であることが確認できた。しかしながら、予想に反して神経組織の誘導自体は、ほぼ正常であることが分かり、FoxB1 機能阻害の影響を補う分子が存在すると考えられた。このような機能を持つものとして、FoxB1 遺伝子の上流で働く XOct-25
遺伝子が考えられたため、FoxB1 と XOct-25 の二重阻害を行い、神経誘導が著しく抑制されることを確認した。したがって、FoxB1 と XOct-25 が機能的に協調して、神経形成の促進に働いていることが明らかになった。一方、後方神経形成の促進機構については、FoxB1 が、Wnt・FGF 経路を活性化して、神経の後方化を導くことが分かった。以上の結果から、FoxB1 は、XOct-25 と協調的に働き、BMP 応答を抑制することで神経化を引き起こし、また Wnt・FGF 経路を介して神57

経の後方化を促進することが分かった。	
 	
 [将来の展望]	
 FoxB1 は、神経化（すなわち背側化）と後方化を促進することから、胚の背腹軸と頭尾軸の形成を制御する重要な遺伝子であると考えられる。従来から、背腹軸と頭尾軸は互いに連携をとりながら形成されると考えられているが、体軸形成の連携に働く遺伝子の同定は進んでいなかった。近年になり、いくつかの知見が報告され始めたが、背腹軸と頭尾軸の個々の制御機構の理解が大幅に進んでいるのと比べ、背腹軸と頭尾軸の連携機構は、ほとんど未解明である。私達
は、BMP 応答の制御機構を探求する過程で、FoxB1 の他に Biz と命名した細胞内タンパク質が、背腹軸と頭尾軸の制御に働くことを見出している（特任助教・
竹林公子の項を参照）。これらの知見を総合すると、背腹および頭尾軸形成の時空間的な連携を可能にする複雑な制御機構の存在が予想されるが、今後の研究により、その一端が明らかになると期待している。また、神経誘導についても FoxB1 と XOct-25 が制御ネットワークを形成して働いていることが明らかになり、様々な環境変化に対応して、安定的に正常発生を行うために機能している可能性が考えられた。この点は、従来から知られている調節的発生機構の分子メカニズムに迫る重要な課題であることから、今後、実験的な裏付けをして、
FoxB1 を構成因子とする制御ネットワークが調節的発生に重要な役割を担っていることを実証していきたい。	
 
	
 
研究業績	
 
①原著論文	 	  該当なし	 	
 ②総説・著書	 1．鈴木	
  厚（2011）	
 「骨形成タンパク質のシグナル伝達と形態形成における役割」実践	
  柔道整復学シリーズ	
  細胞生物学,	
 オーム社,	
 in	
 press	 	
 ③学会発表	
 （国内学会）	
 1．竹林-鈴木公子・喜多山篤・上野直人・鈴木	
  厚	
 “A	
 mechanism	
 coordinating	 the	
 establishment	
 of	
 the	
 dorsal-ventral	
 and	
 anterior-posterior	
 axes	 during	 early	
 Xenopus	 embryogenesis”第 43 回	
 日本発生生物学会・ワークショップ	
 (2010 年 6 月、京都）	
 	
 2．竹林-鈴木公子・喜多山篤・上野直人・鈴木	  厚	
 「胚発生初期に背腹と前後のパターン形成が調和する機構」	
 	
 第 33 回	 日本分子生物学会	
 (2010 年 12 月、
神戸）	
 
	
 

58

3．竹林-鈴木公子・喜多山篤・寺坂-飯岡	
  知恵・上野直人・鈴木	
 厚	
 「胚発生
初期に背腹と頭尾のパターン形成が連動するしくみ」	
 日本動物学会中国四国支部	
  広島県例会	
 (2011 年 3 月、東広島)	
 	
 （国際学会）	
 １．Takebayashi-Suzuki,	
 K.,	
 Kitayama,	
 A.,	
 Ueno,	
 N.	
 and	
 Suzuki,	
 A.	
 “A	
 
mechanism	
 coordinating	 the	
 establishment	
 of	
 the	
 dorsal-ventral	
 and	
 anterior-posterior	
 axes	 during	 early	
 Xenopus	 embryogenesis”	
 The	
 16th	 International	
 Society	
 of	
 Differentiation	
 Conference	
 (Nov.,	
 2010.	
 Nara,	
 Japan)	
 	
 2．Takebayashi-Suzuki,	
 K.,	
 Kitayama,	
 A.,	
 Ueno,	
 N.	
 and	
 Suzuki,	
 A.	
 “A	
 
mechanism	
 coordinating	 the	
 establishment	
 of	
 the	
 dorsal-ventral	
 and	
 anterior-posterior	
 axes	 during	 early	
 Xenopus	 embryogenesis.”	
 13th	 International	
 Xenopus	 Conference	 (Sep.,	
 2010.	
 Calgary,	
 Canada)	
 	
 ④科研費等の受け入れ状況	 １．新学術領域研究（課題提案型）	
  2010 年	
  120 万円（分担）	
 59

助教・倉林	
 敦（Atsushi	
 Kurabayashi）	
 
	
 
研究内容	
 
ヒメアマガエル亜科間の系統関係および分岐年代に基づく大陸間分布形成プロセスの解明	
 Molecular	 phylogeny	
 and	
 divergence	
 age	
 estimation	
 of	
 microhylid	
 subfamilies:	
 Implications	 on	 a	
 formation	
 process	 of	
 their	 inter-continental	
 distributions	 	 	 [目的]	
 ヒメアマガエル科は、すべての無尾両生類の 8％に相当する 487 種を含む巨大な分類群である。 ヒメアマガエル科は、11	 の亜科に分類され、それぞれの亜科がゴンドワナ超大陸由来の陸地に分布している。また、アジアと南米には亜科の所属が不明な属が数多く残っている。これまでにヒメアマガエル亜科間の系統関係と大陸間分布の形成プロセスを明らかにすることを目的とした研究がいく
つか行われてきているが、どちらについてもコンセンサスは得られていない。
本研究では、（1）ヒメアマガエル類の亜科間の系統関係と各分岐年代を再推定すること、（2）大陸間の分布がどのように成立したのかについてより詳細な知見を得ること、（3）亜科所属不明のアジア産 2 属 Gastrophrynoides と Phrynellaの系統学的位置を明らかにすることを目的とし、これまでで最大の分子データを用いて分子系統解析と分岐年代推定を行った。	
 	 	
 [材料・方法]	
 全部で 11	
 のヒメアマガエル亜科のうち、8 亜科 22	
 種を新たに解析に用いた。
これらのサンプルから、2 つのミトコンドリアコード遺伝子（cox1・16SrRNA）と 6 つの核遺伝子（bdnf,	
 cxcr4,	
 ncx1,	
 rag1,	
 rag2,	
 and	 tyr）、合計およそ 8	
 kbp を PCR 増幅し、塩基配列を決定した。このデータと先行研究（主に Van	 Bocxlaer	
 et	
 al.	
 2006 と van	 der	
 Meijden	
 et	
 al.	
 2007）のデータを合わせ、系統解析と分岐年代推定を行った。系統解析には ML 法と Bayes 法、分岐年代推定は Bayesian	 relaxed	
 clock	 法を用いた。	
 	 [結果・考察・成果]	
 今回の解析から、アジア産の	
 Microhylinae	
 亜科とマダガスカル産の	 Dyscophinae	
 亜科が単系統になり、オーストラリアとパプアニューギニアに分布する	 Asterophryninae	
 亜科がその姉妹群になることが明確になった。しかし、それ以外の亜科間の系統関係は不明瞭であった。この原因は、ヒメアマガエルの亜科は、白亜紀後期から新生代初期（8500~6600 万年前）に素早く放散した
結果、系統関係を示す塩基置座位が殆ど残っていないためと推定された。所属不明亜科のうち、Phrynella	
 属はアジア産亜科の	 Microhylinae	
 に含まれるが、
Gastrophrynoides	
 属は、Asterophryninae 亜科の最も初期に分岐したグループ
であることが本研究の結果明らかになった。これまでに、Asterophryninae 亜科は、オーストラリア-ニューギニアや一部の東南アジアの島からしか知られてお60

らず、マレーシアに産する Gastrophrynoides は、本亜科のユーラシア大陸からの初の記録である。なお、これまでに Asterophryninae 亜科は、南極を渡ってオーストラリアに定着したと考えられていた。しかし、今回の研究では、Gastrophrynoides	
 と他の Asterophryninae グループは、未だオーストラリアとユーラシアは離れ、かつ東南アジアの島々も形成されていない時期（およそ 5000
万年）に系統分岐したことが明らかになった。さらに、Gasterphrynoides	
 以外の Asterophryninae の分類群は、比較的最近（2500 万年前から）分岐し始めた
ことも分かった。この結果は、Asterophryninae 亜科の祖先は、南極を渡ってきたのではなく、アジア経由で比較的最近にオーストラリア-ニューギニア地域に分布を広げたことを強く示唆するものである。この成果を BMC	 Evolutionary	 Biology 誌に発表した（2011）。	
 
	
 
研究業績	
 
①	
 原著論文	
 1.	
 Kotaki	
 M.,	
 Kurabayashi	
 A.,	
 Matsui	
 M.,	
 Kuramoto	 M.,	
 Djong	
 T.H.,	
 Tandon	
 
M.,	
 and	
 Sumida	 M.	
 (2010)	
 Molecular	 phylogeny	
 for	
 the	
 diversified	 frogs	 of	
 genus	 Fejervarya	
 (Anura:	 Discoglossidae).	
 Zool	 Sci	 27,	 386–395.	
 2.	
 Kurabayashi	
 A.,	
 Yoshikawa	
 N.,	
 Sato	 N.,	 Hayashi	
 Y.,	
 Oumi	 S.,	 Fujii	
 T.,	
 
and	
 Sumida	 M.	
 (2010)	
 Complete	 mitochondrial	 DNA	 sequence	
 of	
 the	
 
endangered	 frog	
 Odorrana	 ishikawae	
 (family	
 Ranidae)	
 and	
 unexpected	
 diversity	
 of	
 mt	
 gene	 arrangements	
 in	
 ranids.	
 Mol	
 Phylogenet	
 Evol	 56,	 543-553.	
 3.	
 Kashiwagi	
 K.,	
 Kashiwagi	
 A.,	
 Kurabayashi	
 A.,	
 Hanada	 H.,	
 Nakajima	
 K.,	
 Okada	 M.,	 Takase	
 M.,	
 and	
 Yaoita	
 Y.	
 (2010)	
 Xenopus	 tropicalis:	
 An	
 ideal	 experimental	
 animal	 in	 amphibia.	
 Experimental	
 Animal	
 59,	
 395-405.	
 4.	
 Alam	 M.S.,	
 Kurabayashi	
 A.,	
 Hayashi	
 Y.,	
 Sano	 N.,	 Khan	
 M.M.R.,	
 Fujii	
 
T.,	
 and	
 Sumida	 M.	
 (2010)	
 Complete	 mitochondrial	 genomes	 and	
 novel	 gene	
 rearrangements	
 in	
 two	
 dicroglossid	
 frogs,	 Hoplobatrachus	
 tigerinus	
 and	
 Euphlyctis	
 hexadactylus,	
 from	 Bangladesh.	
 Genes	 Genet	 Syst	 85,	 219-232.	
 5.	
 Kuramoto	
 M.,	
 Satoh	 N.,	
 Oumi	 S.,	 Kurabayashi	
 A.,	
 and	
 Sumida	 M.	
 (2011)	
 Inter-	
 and	 intra-island	 divergence	
 in	
 Odorrana	 ishikawae	
 (Anura,	 Ranidae)	
 of	
 the	
 Ryukyu	
 Archipelago	
 of	
 Japan,	
 with	 description	
 of	
 a	
 new	
 
species.	
 Zootaxa	
 2767:	
 25-40	
 (2011	
 Feb).	
 	 ②	
 総説・著書	
 
	
 	
 	
 なし	
 
	
 
③	
 学会発表	
 
国際学会	
 
1.	
 Igawa	 T.,	
 Okuda	 M.,	
 Oumi	 S.,	 Katsuren	
 S.,	
 Kurabayashi	
 A.,	
 Umino	
 T.,	
 
and	
 Sumida	 M.	
 “Development	
 of	
 microsatellite	 markers	
 and	
 population	
 genetic	
 analysis	
 of	
 the	
 endangered	 frog,	
 Odorrana	 ishikawae	
 (Anura:	 61

Ranidae).”	
 2010	
 International	
 Meeting	
 of	
 the	
 Association	
 for	
 Tropical	
 Biology	 and	
 Conservation	
 (Jul.,	
 2010.	
 Bali,	
 Indonesia)	
 2.	
 Kurabayashi,	
 A.,	
 Yoshikawa	
 N.,	
 Sato	 N.,	 Hayashi	
 Y.,	
 Oumi	 S.,	 Fujii	
 
T.,	
 and	
 Sumida	 M.	
 “Mitochondrial	 genome	 of	 the	
 endangered	 frog	
 Odorrana	 ishikawae	
 and	
 unexpected	
 diversity	
 of	
 mt	
 genomic	
 arrangements	
 in	
 the	
 
family	 Ranidae”.	
 International	
 Symposium	
 on	
 Biodiversity	
 Sciences	 (ISBDS)	
 2010,	
 “Genome,	
 Evolution	
 and	
 Environment	 (Aug.,	
 2010.	
 Nagoya,	 Japan)	
 	 	 	
 （Travel	
 Award	
 獲得）	
 
	
 
国内学会	
 
1.	
 Alam	 M.S.,	
 Kurabayashi	
 A,	
 Hayashi	
 Y.,	
 Sano	 N.,	 Khan	
 M.M.R.,	
 Fujii	
 T.,	
 
and	
 Sumida	 M.「Complete	 mitochondrial	 genomes	 and	
 novel	 gene	
 rearrangements	
 in	
 two	
 dicroglossid	
 frogs,	 Hoplobatrachus	
 tigerinus	
 and	
 Euphlyctis	
 hexadactylus,	
 from	 Bangladesh」日本遺伝学会第82回大会(2010
年9月,札幌)	
 2.	
 井川武,	
 奥田優,	
 大海昌平,	
 勝連盛輝,	
 倉林敦,	
 海野徹也,	
 住田正幸	 「マイクロサテライトマーカーを用いた絶滅危惧種および天然記念物イシ
カワガエルの遺伝的集団構造の解明」	
 日本遺伝学会第 82 回大会(2010 年 9
月,	
 札幌)	
 
3.	
 住田正幸,	
 佐藤直樹,	
 Islam	 M.M.,	
 井川武,	
 吉川夏彦,	
 倉林敦,	
 大海昌平,	
 勝連盛輝,	
 福庭博子,	
 新谷望,	 藤井保,	 倉本満	 「絶滅危惧種イシカワガエ
ルにおける飼育下繁殖の試みと交配後隔離機構の解明」日本遺伝学会第82回大会	
 (2010年9月,	
 札幌)	
 
4.	
 住田正幸,	
 西谷拓磨,	
 菅原弘貴,	
 倉林敦,	
 勝連盛輝,	
 大海昌平	
 「絶滅危惧種イボイモリの飼育下繁殖の試みとミトコンドリアゲノムの解析」	
 日本
動物学会第81回大会（2010年9月,	
 東京）	
 
	
 
④	
 科研費等の受け入れ状況	 	  	 日本学術振興会科学研究費補助金・基盤研究（C）2010 年	
  10 万円（分担）	
 62

特任助教・竹林公子	  (Kimiko	 Takebayashi-Suzuki)	
 
	
 
研究内容	
 
	
  胚発生初期に背腹と前後のパターン形成が調和する機構	 	  A	 mechanism	
 coordinating	 the	
 establishment	
 of	
 the	
 dorsal-ventral	
 and	
 anterior-posterior	
 axes	 during	 early	
 Xenopus	 embryogenesis	
 
	
 
[目的]	
 
	
  初期発生過程において、背腹と前後の軸が形成されると初めて胚の３次元座標が精確に決まり、基本的な体の設計図（ボディープラン）が確立される。近年の研究から、様々な細胞増殖因子によってボディープランの形成が制御されることが知られており、背腹軸は腹側化因子 BMP によって、前後軸は後方化因子 Wnt、FGF やレチノイン酸によって、それぞれ決定されている。胚が正常に発生するためには、背腹と前後の体軸形成が互いに調和しながら形成される必要があるが、この調和機構については未だにわかっていない。	
 	
  私達は、機能スクリーニングで単離した Biz(BMP	 inhibitory	
 zinc-finger)
転写因子が体軸形成の調和機構に関わる可能性を見出した。本研究では、この可能性を検証するために Biz の詳細な機能解析を行った。	
 	
 [成果と考察]	
 	  本年度までに、Biz が腹側化因子 BMP のシグナルを抑制して神経を誘導（背側化）することと、その一方で、後方化因子 Wnt のシグナルを活性化して後方化を引き起こすことを明らかにしている。さらに、Biz が BMP のシグナルを抑制するメカニズムの一つとして、BMP シグナル伝達因子 Smad1/5/8 の C 末リン酸化型
タンパク質の発現量を抑制することもわかっている。	
 	
  本年度は、Biz 特異的なアンチセンスモルフォリノオリゴ（MO）を３種類作成
し、Biz 機能阻害実験をおこなった。まず、アフリカツメガエル初期胚で Biz 転
写因子を過剰発現させて、それぞれの MO が効率的に Biz	 mRNA の翻訳を阻害す
るかをイムノブロッティング法で確認した。その結果、翻訳阻害効果に若干の差はあるが、３種類の MO 全てが Biz	 mRNAの翻訳を阻害できることがわかった。
さらに、初期胚の片側に Biz 特異的 MO を注入し、後方神経マーカーの１つである HoxB9 転写因子の発現が低下することを明らかにした。これらの結果から、Biz が後方神経の形成（前後軸形成）に必要な可能性が示唆された。	
 	
  この他、Biz 以外にも、同様に体軸形成の調和に関与する FoxB1 転写因子について機能解析を行っている（詳細については本研究部門・鈴木准教授の項目を
参照）。	
 
	
 
[将来の展望]	 	  今後は、さらに多くの前方・後方神経マーカーや神経・表皮マーカーの発現を解析して、これらに対する Biz	 MO の影響を検討し、前後軸および背腹軸形成

63における Biz の働きを解析する。また、腹側化因子 BMP や後方化因子 Wnt が体軸形成を制御する際に Biz を必要とするのか、その場合は各々のシグナル経路のどの段階で Biz が働いているのかについても解析をおこなう予定である。前後軸および背腹軸形成における Biz の役割と、腹側化因子 BMP や後方化因子 Wnt
に対する Biz の作用機序を解析することが、複雑な体軸形成調和機構の解明につながると考えている。	
 
	
 
研究業績	
 
①原著論文	 	  該当なし	 	
 ②総説・著書	 	  該当なし	 	
 ③学会発表	
 （国内学会）	
 1．竹林-鈴木公子・喜多山篤・上野直人・鈴木	
  厚	
 “A	
 mechanism	
 coordinating	 the	
 establishment	
 of	
 the	
 dorsal-ventral	
 and	
 anterior-posterior	
 axes	 during	 early	
 Xenopus	 embryogenesis”第 43 回	
 日本発生生物学会・ワークショップ	
 (2010 年 6 月、京都）	
 	
 2．竹林-鈴木公子・喜多山篤・上野直人・鈴木	  厚	
 「胚発生初期に背腹と前後のパターン形成が調和する機構」	
 	
 第 33 回	 日本分子生物学会	
 (2010 年 12 月、
神戸）	
 
	
 
3．竹林-鈴木公子・喜多山篤・寺坂ー飯岡	
  知恵・上野直人・鈴木	 厚	
 「胚発生初期に背腹と頭尾のパターン形成が連動するしくみ」	
 日本動物学会中国四国支部	
  広島県例会	
 (2011 年 3 月、東広島)	
 	
 （国際学会）	
 1．Takebayashi-Suzuki,	
 K.,	
 Kitayama,	
 A.,	
 Ueno,	
 N.	
 and	
 Suzuki,	
 A.	
 “A	
 
mechanism	
 coordinating	 the	
 establishment	
 of	
 the	
 dorsal-ventral	
 and	
 anterior-posterior	
 axes	 during	 early	
 Xenopus	 embryogenesis”	
 The	
 16th	 International	
 Society	
 of	
 Differentiation	
 Conference	
 (Nov.,	
 2010.	
 Nara,	
 Japan)	
 	
 2．Takebayashi-Suzuki,	
 K.,	
 Kitayama,	
 A.,	
 Ueno,	
 N.	
 and	
 Suzuki,	
 A.	
 “A	
 
mechanism	
 coordinating	 the	
 establishment	
 of	
 the	
 dorsal-ventral	
 and	
 anterior-posterior	
 axes	 during	 early	
 Xenopus	 embryogenesis.”	
 13th	 International	
 Xenopus	 Conference	 (Sep.,	
 2010.	
 Calgary,	
 Canada)	
 

64

	
 
④科研費等の受け入れ状況	 	  該当なし	
 65

特任助教・井川	
 武（Takeshi	
 Igawa）	
 
	
 
研究内容	
 
絶滅危惧種イシカワガエル及びアマミイシカワガエルにおけるマイクロサテラ
イトマーカーを用いた遺伝的多様性の解明	
 	
 Detection	
 of	 genetic	
 diversities	
 of	
 endangered	 frogs,	
 O.	
 ishikawae	
 and	
 
O.	
 splendida	
 based	 on	 polymorphism	 of	
 microsatellite	 markers	 	 	 [目的]	
 西南諸島は両生類に限らず動植物全般における生物多様性のホットスポットであると同時に、島嶼という限定的な生息域によって絶滅の危険性も高い。実際、日本の両生類相における絶滅危惧種（環境省レッドリスト・IA、IB、および IIB類）の半数は西南諸島固有種である。したがって、早急にこれらの種における種内の遺伝的多様性を解明しておく必要がある。しかしながら、従来の研究では島間の遺伝的関係にのみ焦点が置かれ、島内の微細な集団構造についてはほ
とんど明らかになっていない。特に、日本産両生類における最美麗種と言われることも多い、イシカワガエルについては、最近、奄美大島集団が O.	
 splendida（アマミイシカワガエル）として新種記載されたが(Kuramoto	 et	
 al.,	 2011)、
島内における遺伝的多様性については不明確なままであった。そこで、本研究では、まず、(1)共優性かつ多型性に富んだ遺伝マーカーであるマイクロサテラ
イト(以下、STR)遺伝子座を単離し、さらに、(2)これらを用いてイシカワガエ
ル・アマミイシカワガエルにおける遺伝的多様性と微細集団構造を解明することを目的とした。	
 	 	 [材料・方法]	
 (1)イシカワガエルのメス個体及び、アマミイシカワガエルの♂個体をサンプルとして、磁気ビーズハイブリダイゼーション法(Glenn	
 and	
 Schable	 2005)と二重抑制 PCR 法(Lian	
 and	
 Hogetsu	
 2002)を用い、STR 領域を含む遺伝子座のクローンを得た。これらの塩基配列に基づいて特異的なプライマーを設計し、イシカワガエルとアマミイシカワガエルの両集団内における多型性の程度を検討し
た。	
 
(2)	
 現存する生息域を網羅したイシカワガエル 6 集団 33 個体、アマミイシカワ
ガエル 12 集団 127 個体について、	
 (1)で単離した遺伝子座のうち多型性の見られた 12 遺伝子座の遺伝子型を決定し、集団構造解析を行った。さらに、GIS を用いて景観生態学的解析を応用し、集団構造の形成要因を探索した。	
 	 	 [結果・考察・成果]	
 (1)	
 磁気ビーズ法及び、二重抑制 PCR 法によって単離された STR を含む、542 ク
ローンから、安定的に増幅され、かつ多型性が確認された 12 遺伝子座が単離された。ハーディ・ワインベルグ平衡(HWE)及び、連鎖平衡について、統計テストを行ったところ、一部の遺伝子座で HWE からの逸脱と連鎖不平衡が確認されたが、概ね常染色体上の中立的な遺伝子座であった。	
 

66

(2)	
 STRUCTURE	
 (Pritchard	
 et	
 al.,	 2000)を用いた集団構造解析の結果、イシカワガエルについては、階層的構造は見られなかったが、アマミイシカワガエ
ルにおいては、5 あるいは 6 個の遺伝的クラスターに分けられることが分かった。
また、遺伝距離に基づく系統解析を行ったところ、アマミイシカワガエルの集団は地理的距離が単系統を形成した。さらに現在利用可能なほぼすべての地形データ（高度、植生、土壌、流水量、土壌水分含有量）を用いて、生息適地モ
デルを構築し、これに基づくコスト距離と遺伝距離を比較したところ高い相関が見られた。したがって、アマミイシカワガエルの集団構造は、奄美大島における複雑な地形と、それに依存した生息適地の連続性によって形成されたことが考えられた。	
 
	
 
研究業績	
 
①原著論文	 Kim	
 H.L*.,	
 Igawa	
 T*.,	
 Kawashima	
 A.,	
 Satta	 Y.,	
 Takahata	
 N.	
 (2010)	
 Divergence,	
 demography	
 and	
 gene	 loss	
 along	 the	 human	 lineage.	
 Philos.	
 Trans.	
 R.	
 Soc.	
 Lond.	
 B.	
 Biol.	
 Sci.	 365	 (1552),	
 2451–2457.	
 	 	 *The	
 first	 two	
 authors	
 contributed	
 equally.	
 	
 ②	
 総説・著書	
 
	
 	
 	
 なし	
 
	
 
③	
 学会発表	
 
国際学会	
 
1.	
 Igawa	 T.,	
 Okuda	 M.,	
 Oumi	 S.,	 Katsuren	
 S.,	
 Kurabayashi	
 A.,	
 Umino	
 T.,	
 and	
 
Sumida	 M.	
 “Development	
 of	
 microsatellite	 markers	
 and	
 population	
 genetic	
 analysis	
 of	
 the	
 endangered	 frog,	
 Odorrana	 ishikawae	
 (Anura:	
 Ranidae).”	
 2010	 International	
 Meeting	
 of	
 the	
 Association	
 for	
 Tropical	
 Biology	 and	
 Conservation	
 (Jul.,	
 2010.	
 Bali,	
 Indonesia)	
 
	
 
2.	
 Kurniawan,	
 N.,	
 T.	
 H.	
 Djong,	
 T.	
 Igawa,	
 M.	
 Kotaki	 and	
 M.	
 Sumida	 “Geographic	 distribution	
 and	
 phylogenetic	
 relationship	
 of	
 genus	 Fejervarya	
 from	
 Indonesian	 Sunda	 Land	
 inferred	
 from	 16S	 rRNA	 gene.”	
 2010	
 International	 Meeting	 of	 the	
 Association	
 for	
 Tropical	
 Biology	
 and	
 Conservation	
 (Jul.,	 2010.	 Bali,	
 Indonesia)	
 
	
 

3.	
 Hasan,	
 M.,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 T.	
 Igawa,	
 Md.	
 M.	
 R.	
 Khan,	
 M.	
 S.	
 Alam,	
 T.	
 H.	
 Djong,	
 N.	
 Kurniawan,	
 M.	
 Kuramoto,	
 and	
 M.	
 Sumida.	
 “Genetic	
 divergences	 and	
 phylogenetic	
 relationships	
 in	
 the	
 frogs	 from	 South	 to	
 East	 Asia.”	
 Internatinal	
 Congress	
 of	
 BioSystematics	
 Berlin	 2011	 (Feb.,	 2011,	
 Berlin,	 Germany)	
 
	
 
	
 

67

国内学会	
 1.Hasan,	
 M.・M.	
 M.Islam・Md.	
 M.	
 R.	
 Khan・M.	
 S.	
 Alam・T.	
 H.	
 Djong・T.	
 Igawa・N.	
 Kurniawan・M.	
 Kuramoto・M.	
 Sumida“Genetic	
 divergences	
 and	
 phylogenetic	 relationships	
 in	
 the	
 frogs	 from	
 south	 to	
 east	 Asia.”日本学会動物学会第62 回中国四国支部大会	
 (2010 年 5 月,山口)	
 	
 2.Hasan,	
 M.・M.	
 M.	
 Islam・M.	
 M.	
 R.	
 Khan・M.	
 S.	
 Alam・T.	
 Igawa・M.	
 Kuramoto・M.	
 Sumida	 “Species	
 diversity	 and	
 phylogenetic	
 relationships	
 among	 frogs	 from	 Bangladesh	 revealed	
 by	 nucleotide	 sequences	 of	
 mitochondrial	
 16S	
 rRNA	
 gene.”	 日本遺伝学会第82回大会	
 (2010年9月,札幌)	
 	
 3.井川武・奥田優・大海昌平・勝連盛輝・倉林敦・海野徹也・住田正幸	
 「マイクロサテライトマーカーを用いた絶滅危惧種および天然記念物イシカワガエルの遺伝的集団構造の解明」日本遺伝学会第 82 回大会	  (2010 年 9 月,札幌)	
 	
 4.住田正幸・佐藤直樹・M.	
 M.	
 Islam・井川武・吉川夏彦・倉林敦・大海昌平・
勝連盛輝・福庭博子・新谷望・藤井保・倉本満「絶滅危惧種イシカワガエルにおける飼育下繁殖の試みと交配後隔離機構の解明」日本遺伝学会第82回大会	
 (2010年9月,札幌)	
 
	
 
	
 
④	
 科研費等の受け入れ状況	
 
	
  	
 なし	
 

68

Assistant	 Professor・Islam	
 Mohammed	
 Mafizul	 	
 Title	 Genetic	 divergence	
 and	
 reproductive	 isolating	 mechanisms	
 among	 frogs	 of	 the	 genus	 Fejervarya	
 from	 several	
 Asian	 countries.	
 	
 Summery:	
 In	
 order	 to	
 elucidate	
 the	
 genetic	
 divergences	
 and	
 reproductive	 isolating	 mechanisms	
 among	 different	 frogs	 of	 the	
 genus	 Fejervarya,	
 I	
 have	
 conducted	
 mtDNA	 gene	 sequence	 analyses,	 crossing	 experiments,	 spermatogenesis	
 and	
 histological	
 observations	
 using	 the	
 Fejervarya	 frogs	 from	 Bangladesh,	 India,	
 Sri	
 Lanka,	
 Thailand,	
 Malaysia,	
 Indonesia,	
 the	 Philippines	
 and	
 Japan.	
 Molecular	
 analyses	
 showed	 that	
 there	 were	
 four	
 groups	 among	 the	 frogs	 within	 the	
 genus	 Fejervarya;	
 the	
 cancrivora	
 group,	
 limnocharis	
 group,	
 iskandari	 group	
 and	
 Indian	 group.	
 Based	 on	 the	
 crossing	 experiments,	 spermatogenesis	 and	
 histological	
 observations,	
 we	
 also	 found	 the	 same	
 four	 isolated	
 groups,	 among	
 which	 the	
 cancrivora	
 group	 was	
 isolated	
 from	 the	
 iskandari	 group	 by	
 gametic	
 isolation,	
 the	
 Indian	 group	 was	
 also	 isolated	
 from	
 others	
 by	
 complete	 hybrid	 inviability,	
 although	 the	
 iskandari	
 and	
 limnocharis	
 groups	
 
were	
 not	
 completely	 reproductively	
 isolated	
 from	 each	
 other,	 but	
 they	
 showed	 significant	 abnormalities	
 in	
 spermatogenesis	
 suggested	
 hybrid	 sterility.	
 Frogs	 belonging	
 to	
 the	
 limnocharis	
 group	 showed	 no	 isolation	
 among	 different	
 localities	
 from	 Japan	 but	
 isolated	
 by	
 abnormality	
 in	
 spermatogenesis	
 between	
 Japan	 and	
 Malaysia.	
 Within	 the	
 iskandari	 group,	 Bangladesh	
 large	 type	 was	
 not	
 isolated	
 from	 Thailand	
 or	
 Kota	
  Kinabalu	
 of	
 Malaysia	
 ones,	
 but	
 isolated	
 from	
 Indonesian	
 F.	
 iskandari.	
 Within	
 the	
 Indian	 group,	
 Bangladesh	
 small	 type	 showed	 no	 isolation	
 with	 Sri	
 Lanka	
 one	
 or	
 
Indian	 F.	
 caperata,	
 but	
 was	
 isolated	
 from	 Bangladesh	
 medium	
 type	 by	
 hybrid	 sterility	
 and	
 characterized	
 by	
 extremely	
 abnormal	
 spermatogenesis.	
 The	 present	
 studies	
 suggest	 that	 many	
 frogs	 of	 the	
 genus	 Fejervarya	 are	
 wrongly	
 named	
 as	
 F.	
 limnocharis,	
 and	
 that	
 there	 are	 several	 cryptic	
 and	
 possible	 undescribed	
 species	
 in	
 this	
 genus.	
 	 Methods:	 	 To	
 understand	
 the	
 genetic	
 divergences	
 and	
 reproductive	 isolation,	
 I	
 have	 utilized	
 the	
 following	 methods-	 Mitochondrial	
 16S	
 rRNA	 gene	 sequence	 analyses:	
 Direct	 sequencing	 of	
 mitochondrial	
 16s	
 rRNA	 gene	
 were	
 conducted	
 and	
 resultant	 sequences	
 were	
 analyzed	 with	
 other	 known	 species	 of	
 Fejervarya	
 from	 DDBJ.	
 	
 Crossing	 experiments:	
 A	
 total	 of	
 35	
 frogs	 of	 the	
 genus	 Fejervarya	 were	
 used	
 69

for	
 crossing	 experiments	
 consisting	
 of	
 16	
 male	 and	
 19	 female	 frogs	 of	
 four	
 types	
 from	 Bangladesh.	
 Also	 7	
 female	 and	
 10	
 male	
 frogs	 of	 the	
 genus	 Fejervarya	 were	
 used	
 from	 different	
 Asian	 countries.	
 Mature	 female	 frogs	 were	
 injected	
 with	
 Rana	 catesbeiana	
 pituitary,	
 whereas	 a	 sperm	 suspension	
 was	
 made	
 by	
 crushing	
 the	
 testes	 of	
 mature	 male	 individual.	
 The	
 tadpoles	
 were	
 feed	
 with	
 boiled	 spinach	
 and	
 the	
 metamorphose	
 frogs	 were	
 feed	
 with	
 live	
 cricket.	
 Histological	
 observations:	
 Testes	 of	
 mature	 male	
 frogs	 of	 all	
 hybrids	
 and	
 their	 controls	 were	 collected	
 from	 the	
 live	
 frog	
 and	
 were	
 fixed	 in	
 Novashin	 fixative.	
 After	 subsequent	 tissue	 processing,	
 embedding,	
 and	
 microsectioning,	
 slides	 were	 prepared	
 and	
 slides	 were	 stained	 with	 Heidenhain’s	
 iron	 hematoxylin	
 for	
 histological	
 observation.	
 	 	
 Spermatogenesis	
 observations:	
 Meiotic	
 chromosomes	
 were	 prepared	
 according	
 
to	
 the	
 technique	
 described	
 by	
 Schmid	 et	
 al.	
 (1979)	
 with	
 some	 modification.	
 The	
 chromosomes	
 were	 stained	 with	 a	
 1.2%	
 Geimsa	 solution	
 for	
 5	
 minutes.	
 Chromosome	 analyses	
 were	
 carried	
 out	
 using	 only	
 diploid	 cells	
 at	
 the	
 
diakinesis	 and	
 metaphase	
 of	
 the	
 first	 reduction	
 division,	
 when	
 bivalent	
 and	
 univalent	 chromosomes	
 could	 be	 easily	 distinguished	
 from	 each	
 other.	
 	
 	
 
	
 
Results:	
 Mitochondrial	
 16S	
 rRNA	 gene	 sequence	 analyses:	
 From	 the	
 molecular	 data,	
 I	
 have	 found	 four	 major	 clades	 among	 the	 frogs	 of	 the	
 genus	 Fejervarya	 representing	 four	
 groups;	
 these	 four	
 groups	
 are	
 the	
 cancrivora	
 group,	 limnocharis	
 group,	
 iskandari	 group	 and	
 Indian	 group.	
 	
 Crossing	 experiments:	 	
 After	 conducting	 crossing	 experiment	
 with	 different	 frogs	 from	
 genus	 Fejervarya	
 from	 Bangladesh	
 and	
 other	 Asian	 countries	
 I	
 have	 found	 different	
 types	 of	
 isolation.	
 Crossing	 experiments	
 within	 the	
 genus	 Fejervarya	
 from	 Bangladesh	
 indicated	
 three	 types	 of	
 reproductive	 isolating	 mechanisms,	
 i.e.,	
 gametic	 isolation	
 between	 large	 and	
 mangrove	
 types,	
 hybrid	 inviability	
 between	 large	 and	 other	 two	
 types,	 and	
 hybrid	 sterility	
 between	 medium	
 and	
 small	 types,	 which	 indicated	
 that	
 four	 types	 can	 be	
 considered	 as	
 four	 different	 species.	
 Crossing	 experiments	
 among	 different	
 Asian	 Fejervarya	 species	
 indicated	
 that	
 Bangladesh	
 large	 type,	
 Fejervarya	
 from	 Bangkok	
 of	
 Thailand,	
 Kota	 Kinabalu	
 of	
 Malaysia,	
 and	
 also	 F.	
 iskandari	
 of	
 Indonesia	
 produced	
 viable	 hybrids	
 with	 each	
 other	 i.e.,	
 these	 frogs	 belongs	 to	
 iskandari	 group.	
 Among	 this	 group	 Bangladesh	
 large	 type	
 and	
 Fejervarya	
 of	
 Thailand	
 is	
 most	 closely	 related.	
 On	
 the	
 other	 hand	 Bangladesh	
 small	 type,	
 medium	
 type,	
 Sri	
 Lankan	
 and	
 Indian	
 Fejervarya	
 produced	
 viable	 hybrids	
 among	 each	
 other	 indicated	
 that	
 they	 belong	 to	
 Indian	
 Fejervarya.	
 	
 Among	 them,	
 Bangladesh	
 small	 type	
 70

is	
 most	 closely	 related	
 to	
 Sri	
 Lankan	
 Fejervarya.	
 My	
 findings	
 also	 noticed	
 that	
 frogs	 from	 Japan	 and	
 Malaysia	
 which	 is	 belongs	
 to	
 limnocharis	
 group	 is	
 isolated	
 from	 Bangladesh	
 large	 type	 or	
 Thailand	
 one	
 (iskandari	 group)	
 by	
 less	
 viability	
 of	
 their	 hybrids	
 Histological	
 observations:	
 Histological	
 studies	 have	
 confirmed	
 several	 relationships	
 and	
 isolations	
 among	 different	 frogs	 of	 the	
 genus	 Fejervarya.	
 Among	
 them,	
 I	
 found	 the	 testes	 of	 reciprocal	
 hybrids	
 between	
 Bangladesh	 Large	
 type	 and	
 Thailand	
 are	
 completely	 normal	 in	
 inner	 structure	 with	 bundle	 of	
 normal	 spermatozoa,	
 where	 those	 with	 Hiroshima	
 and	
 Sarawak	
 of	
 Malaysia	
 have	
 little	 bit	
 abnormal.	
 Testes	 of	
 hybrids	
 between	
 Bangladesh	
 large	 type	 and	
 F.	
 iskandari	
 are	
 completely	
 abnormal	
 which	 indicated	
 that	 although	 they	 are	
 of	
 same	
 group	 but	
 they	 are	
 distinctly	
 different	 species.	
 The	
 testes	 of	
 hybrids	
 between	
 Bangladesh	
 small	 and	
 Sri	
 Lanka	 were	 completely	 normal	
 
but	
 it	
 was	
 extremely	
 abnormal	
 in	
 hybrid	 between	
 Bangladesh	
 small	 and	
 medium	
 
type	
 as	
 well	 as	
 triploid	 with	 F	
 caperata	
 indicating	 that	
 existence	
 of	
 at	
 
least	
 3	
 species	 among	 the	 frogs	 studied	
 here	
 from	
 Indian	 group.	
 In	
 case	 of	
 Japanese	 Fejervarya,	
 the	
 testes	 of	
 hybrids	
 between	 Hiroshima	
 and	
 Okinawa	 were	
 completely	 normal,	
 but	
 those	 with	 Ishigaki	
 and	
 Iriomote	
 were	 little	 bit	
 abnormal	
 but	
 with	 Kuala	 Lumpur	 of	
 Malaysia	
 were	 completely	
 abnormal,	 which	 indicates	
 that	
 there	 is	
 negligible	
 variation	
 within	
 Japan	 but	 Japanese	
 Fejervarya	
 is	
 different	 species	
 from	
 Malaysian	 Fejervarya	 which	 is	 considered	 very	 close	 with	
 topotypic	
 F.	
 limnocharis	
 of	
 Indonesia.	
 The	 testes	 of	 the	
 hybrids	
 between	
 Bangladesh	
 large	 type	
 and	
 Kuala	 Lumpur	 of	
 Malaysia	
 having	 very	
 large	 spermatozoa	
 indicating	 they	 are	
 triploid,	
 which	 clarified	
 again	 difference	 among	 limnocharis	
 and	
 iskandari	 group.	
 Spermatogenesis	
 observations:	
 Almost	 similar	
 results	
 with	
 histology	
 were	 found	
 after	 spermatogenesis	
 observation.	
 Hybrids	
 between	
 Bangladesh	
 large	 type	
 with	 Thailand	
 and	
 Kota	 Kinabalu	
 of	
 Malaysia	
 one	
 showed	 comparatively	 normal	 spermatogenesis	
 which	 indicating	 their	 close	 relationships	
 as	
 found	 in	
 previous	
 works.	
 In	
 contrast	
 hybrid	 between	
 Bangladesh	
 small	 and	
 medium	 types	 showed	 complete	
 abnormalities	
 by	
 means	 of	
 both	
 number	
 of	
 rod	
 shaped	 chromosomes	
 and	
 number	 of	
 univalent,	
 which	 indicating	 although	 they	
 produce	 viable	 hybrid	 they	 are	
 of	
 different	 species.	
 But	
 hybrid	 between	
 Bangladesh	 small	
 type	
 and	
 Sri	
 Lankan	
 Fejervarya	
 showed	 quite	 normal	 spermatogenesis,	 which	
 reflect	 their	 close	 relationship	
 as	
 found	 in	 previous	
 works.	
 Among	 the	
 Japanese	 Fejervarya,	
 the	
 hybrids	
 and	
 their	 controls	
 showed	 normal	 spermatogenesis	
 but	
 the	
 hybrid	 between	 Hiroshima	
 of	
 Japan	 and	
 the	
 Malaysia	
 
one	
 had	
 abnormal	
 spermatogenesis	
 which	 again	 confirmed	
 their	 different	 specific	
 entity.	
 	 After	 completion	
 of	
 all	
 molecular,	 crossing	 experiments	
 and	
 subsequent	
 71histology	
 and	
 spermatogenesis	
 observations,	
 I	
 have	
 confirmed	
 the	
 existence	
 
of	
 4	
 groups	
 of	 frogs	 from	 the	
 genus	 Fejervarya	 which	 are	
 reproductively	 isolated	 from	 each	
 other;	
 these	 four	
 groups	
 are	
 the	
 cancrivora	
 group,	 limnocharis	
 group,	
 iskandari	 group	 and	
 Indian	 group.	
 cancrivora	
 group	 is	
 isolated	 from	
 iskandari	 group	 by	 gametic	 isolation,	
 limnocharis	
 group	 is	
 isolated	 from	
 iskandari	 group	 by	
 incomplete	 hybrid	 inviability	 and	
 abnormalities	
 in	
 spermatogenesis	
 and	
 Indian	 group	 is	
 isolated	
 from	
 others	
 by	
 complete	 hybrid	 inviabilty.	
 Bangladesh	
 four	
 types	 of	 frogs	 were	
 reproductively	
 isolated	
 from	 each	
 other,	
 which	 confirmed	
 the	
 existence	
 of	
 
four	
 different	 species	
 of	
 the	
 genus	 Fejervarya	
 in	
 Bangladesh	
 territory.	
 Present	
 study	 also	 indicated	
 that:	
 within	
 iskandari	 group-	
 Bangladesh	
 large	
 
type	
 is	
 closely	 related	 to	
 Fejervarya	
 from	 Bangkok	
 but	
 surely	 different	 species	 from	 F.	
 iskandari;	
 within	
 Indian	 group-	
 Bangladesh	
 small	 type	 is	
 closely	 related	
 to	
 Sri	
 Lankan	
 Fejervarya	
 but	
 different	 species	
 from	
 Bangladesh	
 medium	
 type	
 and	
 Indian	 one.	 Within	
 limnocharis	
 group	 frogs	 from	 Japan	
 are	
 of	
 the	
 same	
 species	 but	
 different	
 with	
 Malaysia	
 one	
 which	 resemble	
 with	
 topotypic	
 F.	
 limnocharis.	
 	 Discussion：	
 Frogs	 belonging	
 to	
 the	
 genus	 Fejervarya	 are	
 most	
 commonly	 misidentified	
 
due	
 to	
 their	 poor	 differences	
 in	
 morphology	
 in	
 all	
 over	 the	
 Asian	 countries.	
 As	
 these	 frogs	 are	
 widely	 distributed	
 and	
 occurred	 sympatrically	 or	
 parapatrically,	
 scientists	 have	
 often	 misunderstood	
 one	
 population	
 with	 another	 even	 one	
 species	
 with	 another.	
 Using	 only	 a	
 single	 method	 like	
 morphology,	 molecular	 data	 or	
 breeding	
 call	
 sometime	 cannot	 confirm	
 the	
 identity	
 of	 certain	
 Fejervarya	 species.	
 That	
 is	
 why	
 combinations	
 of	
 these	 techniques	
 are	
 very	
 useful.	
 Although	 several	 species	 still	 have	 been	
 describing	 from	 their	 genus	 more	
 there	 is	 scope	 for	
 taxonomic	
 revision	
 of	
 
this	
 genus.	
 Also	 I	
 like	 to	
 suggest	 that	 it	
 is	
 high	
 time	 to	
 reconsider	
 about	 the	
 taxonomic	
 status	
 of	
 the	
 Indian	 group,	
 whether	 they	
 will	 be	
 included	
 in	
 genus	 Fejervarya	
 or	
 considered	
 as	
 different	
 genus	 -due	 to	
 their	 wide	 differences	
 with	
 other	 Fejervarya	 frogs.	
 	 	 Future	 research	 plan:	 Research	
 is	
 going	 on	 to	
 identify	
 the	
 specific	
 entity	 of	
 each	
 Fejervarya	 frogs	
 from	 Bangladesh	
 as	
 well	 to	
 describe	
 new	
 Fejervarya	 species.	
 Also	 I	 am	
 collecting	
 more	
 Fejervarya	 frogs	 from	 different	
 Asian	 countries.	
 Due	
 
to	
 minor	 differences	
 in	
 morphology	
 and	
 sometime	 molecular	 data	
 are	
 not	
 
sufficient	
 to	
 make	
 conclusion	
 about	 different	
 population	
 of	
 Fejervarya	 frogs,	
 detailed	
 reproductive	 isolation	
 study	 with	 maximum	
 number	
 and	
 

72

diversified	
 population	
 will	 clarify	
 it,	
 and	
 I	
 am	
 working	
 for	
 that	
 achievement.	
 	
 Research	
 Achievements:	 Journal	 paper:	 1. Kurniawan	
 N,	
 Islam	 MM,	
 Djong	 TH,	
 Igawa	 T,	
 Daicus	
 MB,	
 Yong	 HS,	 Wanichanon	
 R,	
 Khan	 MMR,	 Iskandar	
 DT,	
 Nishioka	
 M	
 and	
 Sumida	 M	
 (2010)	
 Genetic	 divergence	
 and	
 Evolutionary	 relationship	 in	
 Fejervarya	
 cancrivora	
 from	
 Indonesia	
 and	
 other	 Asian	 countries	
 inferred	
 from	
 allozyme	
 and	
 mtDNA	 sequence	 analyses.	
 Zoological	
 Science,	
 27:	
 222-233.	
 	
 Presentations	 in	
 Conference:	 (National	
 Meetings)	
 1. Islam	
 MM,	
 Khan	 MMR,	 Kuramoto	
 M	
 and	
 Sumida	 M	
 (2010)	
 Reproductive	 isolating	 mechanisms	
 among	 the	 frogs	 of	 the	
 genus	 Fejervarya	
 elucidated	 by	
 crossing	 experiments,	
 histological	
 and	
 spermatogenesis	
 observations.	
 Presented	
 in	
 the	
 81st	 Annual	 Meeting	
 of	
 Zoological	
 Society	
 of	
 Japan	
 in	
 Tokyo	
 University,	
 Tokyo,	 Japan.	
 	 	 2. Hasan	 M,	
 Islam	 MM,	
 Khan	 MMR,	 Alam	 MS,	 Igawa	 T,	
 Kuramoto	
 M	
 and	
 Sumida	 M	 (2010)	
 Species	 diversity	 and	
 phylogenetic	
 relationships	
 among	 frogs	 from	 Bangladesh	 revealed	
 by	 nucleotide	 sequences	 of	
 mitochondrial	
 15S	
 
rRNA	
 gene.	
 Presented	
 in	
 the	
 82nd	
 annual	 meeting	
 of	
 The	
 Genetics	
 Society	
 of	
 Japan	 in	
 Hokkaido	
 University,	
 Hokkaido,	
 Japan.	
 	 3. Hasan	 M,	
 Islam	 MM,	
 Khan	 MMR,	 Alam	 MS,	 Djong	 TH,	
 T	 Igawa,	
 Kurniawan	
 N,	
 Kuramoto	 M	 and	
 Sumida	 M	
 (2010)	
 Genetic	
 divergences	
 and	
 phylogenetic	 relationships	
 in	
 the	
 frogs	 from	 South	 to	
 East	 Asia.	
 Presented	
 in	
 the	
 
annual	 meeting	
 of	
 Chugoku	
 Shikoku	 branch	 of	
 The	
 Zoological	
 Society	 of	 Japan,	
 Yamaguchi	
 University,	
 Yamaguchi,	
 Japan.	
 	 4. Komaki	
 S,	
 Kurabayashi	
 A,	
 Islam	 MM,	
 Sumida	 M	  and	
 Koji	
 Tojo	 (2010)	
 Introgression	
 in	
 the	
 hybrid	 zone	 of	
 the	
 Japanese	 pond	
 frog	
 species	 in	
 central	 Japan.	
 Presented	
 in	
 the	
 49th	 Annual	 Meeting	 of	
 Herpetological	
 Society	
 of	
 Japan	 in	
 Keio	
 University,	
 Yokohama,	
 Japan.	
 	 (International	 Conferences)	
 1. Hasan,	
 M,	
 Islam	 MM,	
 Igawa	 T,	
 Khan	 MMR,	 Alam	 MS,	 Djong	
 TH,	
 Kurniawan	
 N,	
 Kuramoto	 M	 and	
 Sumida	 M	
 “Genetic	
 divergences	
 and	
 phylogenetic	
 73

relationships	
 in	
 the	
 frogs	 from	 South	 to	
 East	 Asia.”	
 Internatinal	
 Congress	 of	
 BioSystematics	
 Berlin	 2011	 (Feb.,	 2011,	
 Berlin,	
 Germany)	
 74

Researcher・Alam	
 Mohammad	
 Shafiqul	 	
 Title	
 	 Reproductive	 Isolating	 Mechanisms	
 and	
 Genetic	
 Divergences	
 in	
 the	
 Genus	 Hoplobatrachus	
 (Anura,	 Dicroglossidae)	
 Based	 on	 Crossing	
 Experiments,	 Chromosomal	
 and	
 Histological	
 Observations,	
 and	
 Allozyme	
 and	
 Mitochondrial	 Analyses	 	 Introduction	
 We	
 studied	
 detailed	 species	
 composition,	
 genetic	
 relationships	
 and	
 phylogeographic	
 patterns	
 among	 Hoplobatrachus	
 and	
 Euphlyctis	
 genera	 (Anura,	 Dicroglossidae)	
 from	 Bangladesh	
 and	
 neighboring	 countries	
 and	
 discovered	 several	 cryptic	
 species	
 in	
 this	
 region	
 and	
 identified	 underestimation	
 of	
 richness	 of	
 amphibian	 fauna	 (Alam	 et	 al.,	 2008).	
 Later	 we	
 described	
 several	 new	
 species	 (e.g.	
 E.	
 aloysii,	
 E.	
 mudigere)	
 on	
 the	
 basis	 of	
 our	
 findings	
 (Joshy	 et	 al.,	 2009).	
 We	
 also	 studied	
 and	
 determined	
 the	
 complete	 nucleotide	
 sequences	 of	
 mitochondrial	 genomes	 of	
 Hoplobatrachus	
 tigerinus	 (Indian	 Bullfrog)	
 and	
 Euphlyctis	
 hexadactylus	 (Indian	
 Green	 frog)	
 and	
 we	
 found	 novel	 gene	
 rearrangements	
 among	 them	 (Alam	 et	 al.,	 2010).	
 	
 Interesting	 results	
 found	 among	 these	 two	
 genera	
 inspired	
 us	
 to	
 do	
 more	
 research	 with	 these	
 groups.	
 However,	
 the	
 post	 mating	 isolating	 mechanisms	
 (i.e.	
 genomic	 incompatibility,	
 hybrid	 inviability	 or	
 sterility	
 etc.)	
 among	 Hoplobatrachus	
 and	
 related	 genera	
 were	 not	
 studied	
 yet.	 	 	
 Materials	
 and	
 Methods	
 The	
 available	
 live	
 frogs	 from	 the	
 genera	
 Hoplobatrachus,	
 Euphlyctis	
 and	
 Fejervarya	 were	 collected	
 from	 Bangladesh	
 and	
 Thailand;	
 and	
 artificial	 insemination	
 was	
 conducted	
 for	
 crossing	 experiments.	
 Developmental	
 capacity	
 of	
 the	
 hybrids	
 and	
 control	 were	 recorded	
 for	
 further	 comparison.	
 The	
 hybrid	
 sex	
 and	
 karyotype	
 were	 checked	
 by	
 chromosomal	
 and	
 histological	
 observations.	
 Furthermore,	
 the	 genetic	
 makeup	 of	
 the	
 hybrids	
 and	
 control	 were	
 studied	 by	 allozyme	
 and	
 mitochondrial	
 gene	
 analyses.	
 	
 Results	 The	
 developmental	
 capacity	
 of	
 the	
 intergenus	
 hybrids	
 between	 Hoplobatrachus	
 and	
 Euphlyctis	
 with	
 Fejervarya	
 showed	 gametic	 isolation.	
 The	
 intergenus	
 hybrids	
 between	
 H.	
 tigerinus	
 with	 E.	
 cyanophlyctis	
 were	
 inviable	
 at	
 tadpole	 stage	 whereas	 hybrids	
 between	
 H.	
 chinensis	
 with	 E.	
 cyanophlyctis	
 were	
 inviable	
 at	
 hatching	 stage.	
 The	 interspecific	
 hybrids	
 between	
 H.	
 tigerinus	
 and	
 H.	
 chinensis	
 become	 metamorphosed	
 and	
 three	 of	
 75

them	 become	 matured.	
 The	
 morphology	
 of	
 the	
 hybrids	
 was	
 similar	
 to	
 H.	
 
tigerinus.	
 	
 
	
 
We	
 found	 underdeveloped	 or	
 abnormal	
 testis	 in	
 hybrids	
 compared	
 with	 control	 after	 studying	 testis	 morphology.	
 In	
 fact,	
 these	 are	 the	
 first	 report	 of	
 hybrids	
 between	
 H.	
 tigerinus	
 and	
 H.	
 chinensis.	
 Interestingly,	
 we	
 found	 39	 chromosomes	
 (3n=	 39)	 in	
 hybrids	
 whereas	
 26	
 chromosomes	
 (2n	 =26)	
 were	 found	 in	
 H.	
 tigerinus	
 and	
 H.	
 chinensis.	
 Thus,	
 we	
 confirmed	
 the	
 hybrids	
 were	 the	
 allotriploid	 between	 female	 H.	
 tigerinus	
 and	
 male	 H.	
 chinensis.	
 Furthermore,	 we	
 could	 not	 find	
 normal	 sperm	 bundles	 in	
 hybrids	
 by	
 histological	
 observation,	
 suggesting	 these	 allotriploids	 become	 sterile	
 as	
 it	
 could	 not	
 produce	 normal	 sperm.	
 Actually,	
 spermatogonium	 (2N)	 of	
 hybrids	
 could	 not	
 proceed	 for	
 further	 sperm	 maturation	
 process	
 and	
 the	
 cell	 can	
 be	
 treated	 as	
 undifferentiated	
 cell.	
 	 	
 There	 are	
 15	
 enzymes	 were	 studied	 by	 allozyme	
 analyses	
 whereas	 6	
 diagnostic	
 enzymes	 were	 found	 in	 the	 control	 of	
 H.	
 tigerinus	
 and	
 H.	
 chinensis	
 with	 their	
 hybrids.	
 The	
 allozyme	
 data	 suggests	
 that	 two	 genomes	
 came	
 from	 maternal	
 origin	
 and	
 other	 genome	 from	
 paternal	
 origin.	
 We	
 hypothesized	 that	 more	
 similar	 biological	
 reproduction	
 process	 between	 these	 two	
 species	 allowed	 further	 survival	
 of	
 their	 hybrids	
 than	
 other	 distantly	
 mating	 species	 through	 the	
 production	
 of	
 triploid	
 as	
 we	
 could	 not	 find	 any	
 diploid	 hybrids.	
 The	
 spontaneous	
 production	
 of	
 triploids	
 due	
 to	
 the	
 over	
 ripening	
 of	
 eggs	
 and	
 temperature	 during	 fertilization	
 and	
 thus	 the	
 inclusion	
 of	
 second	 polar	 body	
 and	
 finally	 formation	
 of	
 triploid	 frogs	 is	
 also	 possible.	
 The	
 mitochondrial	
 Cyt	
 b,	
 12S	
 and	
 16S	
 rRNA	 genes	 were	 studied	
 using	 hybrids	
 and	
 control	 to	
 recheck	 the	
 maternal	
 inheritance	 nature	 of	
 mitochondrial	
 genes	 and	
 100%	
 nucleotide	 sequences	
 observed	
 in	
 the	
 mother	 and	
 their	 offspring	 confirm	 the	
 maternal	
 inheritance	 nature	 of	
 mitochondrial	
 genes.	
 Furthermore,	
 we	
 could	 not	 observe	
 any	
 nucleotide	 sequence	 divergences	
 in	
 
our	
 present	
 samples	 of	
 H.	
 chinensis	
 from	 Thailand	
 (Chachoengsao)	
 by	
 our	
 
mitochondrial	 data	
 analyses.	
 We	
 found	 our	 present	
 data	 was	
 most	 similar	
 with	
 coastal	
 type	 H.	
 chinensis	
 from	 Phang	 Nga,	 Thailand	 (Alam	 et	 al.,	 2008)	
 by	
 comparing	 gene	 bank	 database.	
 	 	 Conclusion	
 
In	
 the	
 present	 crossing	 experiments,	
 we	
 found	 gametic	 isolation	
 between	 Fejervarya	
 and	
 Hoplobatrachus,	
 and	
 Fejervarya	
 and	
 Euphlyctis	
 genera	
 from	 the	
 family	
 Dicroglossidae.	
 By	
 contrast,	
 complete	 hybrid	 inviability	
 at	
 embryonic	
 or	
 tadpole	 stages	 were	 found	 between	
 Hoplobatrachus	
 and	
 

76

Euphlyctis	
 genera.	
 The	
 interspecific	
 hybrids	
 between	 female	 H.	
 tigerinus	
 and	
 male	 H.	
 chinensis	
 became	 inviable	
 at	
 tadpole	 stage,	 but	 a	 small	 number	
 
of	
 the	
 hybrids	
 developed	 normally	
 and	
 matured	 only	
 three	 individuals.	
 These	 mature	 hybrids	
 were	 found	 to	 be	
 triploid	
 and	
 sterile	
 by	
 the	
 chromosomal	
 and	
 histological	
 observations.	
 These	 results,	
 suggest	
 incomplete	 hybrid	 inviability	
 between	 these	 two	
 species.	
 The	
 allozyme	
 study	 showed	 9	
 diagnostic	 loci	 among	 24	
 loci	 investigated	
 in	
 H.	
 tigerinus	
 and	
 H.	
 chinensis,	 and	
 parental	
 allele	 constitutions	
 at	 these	 loci	
 in	
 the	
 triploid	 hybrids.	
 The	
 maternal	
 inheritance	
 of	
 mitochondrial	 genomes	
 was	
 retained	
 in	
 the	
 
hybrids.	
 	 	 Future	 research	 plan	
 	 We	 could	 not	
 include	 inland	 type	 H.	
 chinensis	
 in	
 our	
 crossing	 experiments	
 at	
 present	
 and	
 in	
 future	 studies	
 we	
 have	 plan	 to	
 collect	
 and	
 to	
 check	 their	 post	
 mating	 isolating	 mechanisms	
 with	
 related	 species.	
 However,	
 presently	
 
we	
 are	
 also	 doing	 crossing	 experiments	
 among	 different	 cryptic	
 species	 of	
 Euphlyctis	
 genus	 to	
 know	 their	 reproductive	 isolating	 mechanisms.	
 	
 Original	 Paper	 1.	
 Alam	 MS,	 Kurabayashi	
 A,	
 Hayashi	
 Y,	
 Sano	 N,	 Khan	 MMR,	
 Fuji	 T	
 and	
 Sumida	 M.	
 Complete	 mitochondrial	 genomes	 and	
 novel	 gene	
 rearrangements	
 in	
 two	
 
dicroglossid	
 frogs,	 Hoplobatrachus	
 tigerinus	
 and	
 Euphlyctis	
 hexadactylus,	
 from	
 Bangladesh.	
 Genes	 and	
 Genet.	
 Syst.	
 85	
 (3):219-232,	
 2010.	
 	 	
 Meeting	 or	
 conferences	 (National	 Conference)	
 1.	
 Alam	 MS,	 Kurabayashi	
 A,	
 Hayashi	
 Y,	
 Sano	 N,	 Khan	 MMR,	
 Fuji	 T	
 and	
 Sumida	 M.	
 Complete	 mitochondrial	 genomes	 and	
 novel	 gene	
 rearrangements	
 in	
 two	
 
dicroglossid	
 frogs,	 Hoplobatrachus	
 tigerinus	
 and	
 Euphlyctis	
 hexadactylus,	
 from	
 Bangladesh.	
 The	
 82nd	 Genetic	
 Society	
 of	
 Japan,	
 Hokkaido,	
 Sep.	
 20-22,	 2010.	 	 	
 2.Hasan	 M,	
 Islam	 MM,	
 Khan	 MMR,	 Alam	 MS,	 Igawa	 T,	
 Kuramoto	
 M	
 and	
 Sumida	 M	 (2010)	
 Species	 diversity	 and	
 phylogenetic	
 relationships	
 among	 frogs	 from	
 Bangladesh	 revealed	
 by	 nucleotide	 sequences	 of	
 mitochondrial	
 15S	
 rRNA	 gene.	
 Presented	
 in	
 the	
 82nd	
 annual	 meeting	
 of	
 The	
 Genetics	
 Society	
 of	
 Japan	 in	
 Hokkaido	
 University,	
 Hokkaido,	
 Japan.	
 	 3.Hasan	 M,	
 Islam	 MM,	
 Khan	 MMR,	 Alam	 MS,	 Djong	 TH,	
 T	 Igawa,	
 Kurniawan	
 N,	
 Kuramoto	 M	 and	
 Sumida	 M	
 (2010)	
 Genetic	
 divergences	
 and	
 phylogenetic	
 77

relationships	
 in	
 the	
 frogs	 from	 South	 to	
 East	 Asia.	
 Presented	
 in	
 the	
 annual	 meeting	
 of	
 Chugoku	
 Shikoku	 branch	 of	
 The	
 Zoological	
 Society	
 of	
 Japan,	 Yamaguchi	
 University,	
 Yamaguchi,	
 Japan.	
 	 (International	 Conferences)	
 1.Hasan,	
 M,	
 Islam	 MM,	
 Igawa	 T,	
 Khan	 MMR,	 Alam	 MS,	 Djong	
 TH,	
 Kurniawan	
 N,	
 Kuramoto	 M	 and	
 Sumida	 M	 	 “Genetic	
 divergences	
 and	
 phylogenetic	 relationships	
 in	
 the	
 frogs	 from	 South	 to	
 East	 Asia.”	
 Internatinal	
 Congress	 of	
 BioSystematics	
 Berlin	 2011	 (Feb.,	 2011,	
 Berlin,	
 Germany)	
 78

プロジェクト研究①	 	 内海耕慥（岡山大）、佐々木順造（岡山大）、竹原良記（岡山学院大）、柏木昭彦（三陽女子短期大）、花田秀樹（広島大）	
 	
 1.無尾両生類オタマジャクシ尾部アポトーシスの分子機構	
 Molecular	 mechanism	
 for	
 tadpole	 tail	
 apoptosis	
 in	
 anurans	
 	
 
	
 
	
  アポトーシスは、形態形成、神経ネットワーク形成、免疫システムの確立お
よび器官の恒常性維持の過程で一役を担っている。アポトーシスの特徴として、細胞や細胞核の縮小および DNA の断片化があげられる。多くの研究によって、いくつかのアポトーシスは活性酸素が引き金となって起こることが明らかにされており、アンチアポトーシス遺伝子である bcl-2 の発現はその活性酸素の発生を抑制することが示されている。変態期のオタマジャクシ尾部アポトーシス
および甲状腺ホルモン誘導による尾部アポトーシスも同様に、活性酸素の発生を通じて起こると考えられている。私は、甲状腺ホルモンによって誘導される
尾部アポトーシス機構の解明を目的とした研究グループの一員として、研究活動に参加している。我々のこれまでの研究結果から、1.	
 甲状腺ホルモン誘導による活性酸素の発生、2.ミトコンドリアの膨潤、3.ミトコンドリア MPT の開口、4.MPT 開口に伴うサイトクロム c の細胞質内への漏出、5.caspase 様酵素群の活性化、6.DNA の断片化が起こることが明らかとなった。今後も、多くの情報を発信していきたいと考えている。	
 
	
 
	
 
柏木昭彦（三陽女子短期大）、古野伸明（広島大）、柏木啓子（広島大）、山下雅道（宇宙研）、谷本能文（大阪大谷大）、藤原好恒（広島大）、花田秀樹（広島大）
	 	
 2.無尾両生類の生活環に対する過重力および強磁場の影響	
 Effects	
 of	 hypergravity	
 environments	
 and	
 strong	 static	
 magnetic	
 fields	
 on	
 amphibian	 life	
 cycle	 	 	  地球温暖化、化学物質による汚染、一日当り３桁に及ぶ生物の絶滅、人口爆
発，食料不足など、将来への不安要因は増大している。そんな中でヒトを含めた生物種の他惑星への移住は重要な選択肢の一つとして取り上げられている。	
 
	
  私は、
「宇宙環境利用化学委員会研究チーム」の一員として研究活動に参加している。我々は、地球とは異なる、宇宙空間における重力および磁場の生物種に与える悪影響を想定しながら、アフリカツメガエルの生物環について調べてきた。これまでに得られた研究結果から、過重力・強磁場の両生類に対する影響は著しく、特に発生のごく初期は感受性の非常に高いポイントで、この時期

79

に印加された受精卵から発生した胚では、発生率は大きく後退、いろいろな奇形が出現し、そのような異常個体の遺伝子発現は抑えられていること、などが明らかになった。今後も、多くの情報を発信していきたいと考えている。	
 	
 原著論文：	 1.	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Fujiwara,	
 Y.,	
 Sakao,	
 S.,	
 Furuno,	
 N.,	
 Yanagisawa,	
 M.,	
 Hanada,	  H.,	
  Tanimoto,	  Y.,	  Yamashita,	  M.,	
  Watanabe,	  M.,	
  Shinkai,	  T.,	
 Yoshitome,	
 S.,	
 Kubo,	
 H.,	
 Sakai,	
 M.,	
 Fujii,	
 H.,	
 Naitoh,	
 T.,	
 Suzuki,	
 K.	
 and	
 
Kashiwagi	  ,A.	
  (2010)	
  Effect	  of	  strong	  static	  magnetic	  fields	
  on	
  the	
 amphibian	 life	
 cycle	 -	 morphological	 and	
 molecular	
 biological	
 analyses	
 of	
 early	 development.	
 Space	 Utiliz,	 Res.	 26,	 232-235.	
 	
 	
 
	
 
国内発表：	
 1.佐能正剛、	
 柏木啓子、花田秀樹、	
 古野伸明、	
 松原加奈、	
 柏木昭彦、杉原
数美、北村繁幸、	
 太田	
  茂。Estradiol	
 and	
 bisphenol	
 A	 bioaccumulation	
 and	
 effect	 on	 development	
 in	
 clawed	 frogs（ツメガエルにおけるエストラジオー
ルとビスフェノール A の生物蓄積、および発生に対する影響）。	
  第 13 回環境ホルモン学会発表会	
  (2010 年 12 月、東京大学山上会館	
  東京)	 。	
 	
 2.柏木昭彦、柏木啓子、坂尾智美、古野伸明、藤原好恒、谷本能文、山下雅道、
渡部稔、新海正、吉留賢、久保英夫、坂井雅夫、藤井博匡、柳澤誠、花田秀樹、内藤富夫。両生類の生活環に対する強磁場の影響ー初期発生の形態学的および分子生物学的解析ー	
  第 26 回宇宙利用シンポジウム（2010 年 1 月、相模原市	
 神奈川）。	
 80

プロジェクト研究②	
 
	
 
（１）

（２）
（３）
（４）
（１）
（５）
古野伸明、
吉留賢	
  （３）植木龍也、
道端薺、
渡部稔、
柏木啓子、
（６）
花田秀樹、
新海正、（７）久保英夫、（８）坂井雅夫、（９）藤井博匡、（１０）山下雅道、（１１）
柏木昭彦、（１２）谷本能文、（１３）藤原好恒、（１4）関口猛、（１６）小林英紀、（１３）
山本卓、（１８）鈴木賢一	
 
	
 
（１）	
  広島大学大学院理学研究科附属両生類研究施設分化制御機構部門	
 （２）	
  鳥取大学医学部生命科学科医化学講座	
 （３）	
  広島大学大学院理学研究科生物科学専攻情報生理学講座	
 （４）	
  徳島大学大学院ソシオ・アーツ・アンド・サイエンス研究部	 （５）	
  広島大学大学院理学研究科附属両生類研究施設発生遺伝学部門	
 （６）	
  東京都健康長寿医療センター研究所	 （７）	
  東京都医学総合研究所がん治療研究室	 （８）	
  鹿児島大学理学部・鹿児島大学院理工学研究科生命科学科	 （９）	
  札幌医科大学・医療人育成センター	
 （１０）ISAS/JAXA	
 （１１）山陽女子短期大学臨床検査学科	
 （１２）大阪大谷大学薬学部	
 （１３）広島大学大学院理学研究科数理分子理学専攻生命理学	
 （１４）九州大学医学研究院生命科学研究科細胞工学講座	
 （１５）岡山大学教育開発センター教育システム部門	
 （１６）愛媛大学沿岸環境科学研究センター	
 
	
 
研究内容	
 
［１］両生類の生活環に対する過重力の影響	 The	
 effect	
 of	 the	
 hypergaravity	
 on	
 the	
 life	
 cycle	 of	 amphibians	 	 将来、人類が宇宙へ進出して行くためには地球とは異なった重力環境下でヒトを含めた動植物が正常で健康な子孫を作れるかどうかを知る事が重要であり、もし、正常な子孫が作れないようなら、どのようにすれば異なった重力環境で正常に生活環が回るかどうか調べる事が重要である。我々は、両生類をモデル生物として過重力が成長や内分泌系にどのような影響を与えるかを調べ、その改善方法を探っている。	
 	
 [目的と成果]	
 
両生類をモデル生物として、生活環の重要な時期（初期発生や減数分裂など）に焦点を絞って過重力の影響を調べたり、長期にわたる過重力暴露におけるホルモン分泌を含む生理的影響を追跡する。また、過重力で生じた異常を正常に81戻す手段を探索する。それらの実験を通じて、地上とは異なった重力環境下でヒトを含めた動植物の世代交代が可能かどうかを調べることを目標とする。その結果、過重力に感受性が高い時期は、受精後から卵割が始まるまでである事が判明した。また、卵減数分裂に影響を与える事がわかった。また、長期に渡る過重力曝露によって、甲状腺ホルモンによって支配されている変態が遅れる
事がわかり、内分泌系にも影響を与える事が明らかになった。	
 	 ［２］両生類の生活環に対する強磁場の影響	
 The	
 effct	 of	 strong	 static	
 magnetic	
 field	 (SMF)	
 on	
 the	
 life	
 cycle	 of	 amphibians	 	 	  現在、携帯電話や高圧送電線、家電製品などから磁場にさらされる機会が多くなってきた。それにもかかわらず、脊椎動物の発生および遺伝子発現に対する強磁場の影響に関する研究は少ない。両生類を用いて、その生活環に対する影響を調べる。	
 	
 [目的と成果]	
 	  カエル胚は、体外受精を行うので胚の観察が容易で、発生も早いことから、磁場の影響を調べるには有用と考えられる。アフリカツメガエルやニシツメガ
エルを用いて、卵減数分裂から変態までの磁場の影響を調べた。その結果、卵成熟過程において卵の色素の分布に影響を与える事や、初期発生にさまざまな影響を与える事が明らかになった。	
 	 ［３］ZNF による甲状腺ホルモン受容体 b 遺伝子の破壊	 Targeted	 mutagenesis	
 of	
 htyroid	
 hormone	 receptor	
 beta	 gene	
 by	
 ZNF	
 in	
 
amphibian	 embryo	 	 	  ノックアウトによる特定の遺伝子破壊は、その遺伝子の機能を探る上で非常に有効な手段である。この技術は、マウスでは ES 細胞を用いて確立されてポピ
ュラーにつかわれるようになっているが、それ以外の動物では ES 細胞が確立されていない事で不可能である。しかしながら、最近、ZNF	
 (Zinc	 finger	
 nuclease)を使用すると、特定の配列に突然変異が入れられる事がわかり、コオロギやラットなどで応用されて来た。この技術をカエルで確立する事は、カエルの実験動物として有用性を飛躍的に高める。	
 	
 [目的と成果]	
 カエルで ZNF が応用可能かどうか実験を行った。選んだ遺伝子は	 甲状腺ホルモン受容体 b 遺伝子である。この結果、TRb の遺伝子に変異を入れられる事がわかった。この変異を入ったカエルを育て、子孫をとったり、他の遺伝子を ZNF で破壊したい。	
 82

［４］化学物質による両生類内分泌機構のかく乱	 Disturbance	
 of	
 the	
 endocrine	
 system	 by	
 chemical	
 substances	
 in	
 amphibians	 	 重大な地球環境問題の１つは世界中にばら撒かれた人工化学物質の存在である。それら中には、生体の内分泌系をかく乱し、悪性腫瘍を引き起こす可能性のあるものも含まれていると指摘されている。人工化学物質のどのような物が内分泌かく乱活性を持つのか調べる事は重要である。	
 	
 ［目的と成果］	 	  多くの化学物質は甲状腺ホルモン機能を阻害する。甲状腺ホルモンは、ヒトを含むすべての脊椎動物において成長や発生、生体内部環境の恒常性維持、代謝などで重要な役割を果たしている。典型的な甲状腺ホルモン依存性発生過程である両生類オタマジャクシの変態は、化学物質の影響を受けやすいため、かく乱作用をもつと疑われる環境汚染物質の個体レベルでのスクリーニングに役立てることができる。甲状腺ホルモン受容体遺伝子を導入したトランスジェニ
ックアフリカツメガエルを用いるなどして、さまざまな化学物質について形態学、生化学および分子細胞学レベルでの反応態様を解析したり、生殖機能に対する影響についても調べる。その結果、多くの人工化化学物質について、甲状腺ホルモンにたいして、アゴニスト、アンタゴニスト活性がある事が明らかに
なった	
 
	
 
［	
 ５	
 ］卵成熟および初期発生におけるサイクリン B2 の２極紡錘体形成におけ
る機能	
 
The	
 role	 of	
 the	
 cyclin	
 B2	
 in	
 the	
 bipolar	 spindle	 formation	
 during	 oocyte	 maturation	
 and	
 early	 embryogenesis	 	 	  MPF はサイクリン B と Cdc2 の複合体であり、M 期を引き起こす普遍的な因子である。MPF が活性化すると核膜崩壊、染色体凝縮、紡錘体の形成が起こり、M期が開始する。サイクリン B は MPF の調節サブユニットであり、多くの種でサブタイプが複数存在し、また、それぞれのサブタイプの細胞内局在も違っている。しかしながらその機能に違いがあるかどうか報告はほとんどない。この研究ではサイクリン B1 と B2 の機能の違いについて研究している。	
 	
 ［目的と成果］	
 ツメガエルの卵母細胞や胚ではサイクリン B1 とサイクリン B2 が主に発現しており、機能差を解析する良い系である。今までに、この系を用いて、サイクリン B１でなくサイクリン B２が正常な紡錘体の形成に関与することを明らかにした。この系を用いてサイクリン B のサブタイプの機能を解析する事を目標とする。その結果、サイクリン B2 の N 末端から約９０アミノ酸から１２０アミノ酸までに２極の紡錘体を形成するのに働く領域があることがわかった。	
 

83

［6	
 ］Nramp ファミリーの新規バナジウム／プロトン共役輸送体	
 A	
 novel	 vanadium/proton	 antiporter	 of	 a	
 Nramp	 family	 	 	  海産動物のホヤは体内に高濃度のバナジウムをもっている。これは、海中のバナジウムから濃縮されたもので、ホヤはバナジウムを高濃度に濃縮する機構を持っている。その機構を研究している。	
 	
 [目的と成果]	
 Nramp/DCT ファミリーは、二価金属イオンの輸送に関わる膜輸送体である。我々はバナジウムを高度に濃縮する海産動物ホヤ類の血球から Nramp ファミリーの新規膜輸送体遺伝子を同定した。この遺伝子 AsNramp はヒトの Nramp1 および 2と、アミノ酸レベルで約 60%の相同性があった。アフリカツメガエルの卵母細胞による発現系を用いて金属輸送活性を検証したところ、プロトンとの共役輸送
によって四価バナジウムを取り込む共役輸送体であることがわかった。さらに、
四価バナジウムの輸送は Na による阻害を受けること、AsNramp は血球の液胞膜画分に局在することも明らかになった。	
 	 ［７］mTOR 情報伝達系の解析	
 Analysis	
 of	
 the	
 mTOR	 signal	
 transduction	 	 	  炎症は、生体の損傷に対する組織の反応であり、その反応の一部には mTOR	 (mammalian	 target	 of	
 rapamycin の略。ほ乳類などの動物の細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質キナーゼ。最初に rapamycin の標的タンパク質として見つかったのでこの名前がついた)情報伝達系が関与している。この情報伝達系の研究を進めている。	
 	
 ［目的と成果］	
 炎症に関与する mTOR 情報伝達系に関与するタンパク質や、その相互作用を調べる事でこの情報伝達系の全貌を解明しようとしている。その結果、mTOR 伝達系に Ego1,	
 Ego3 と Gtr1,Gtr2 のタンパク質が関与していることがわかった。	
 
	
 
研究業績	
 
原著論文	
 
1.Furuno,	
 N.,	
 Futsuki,	
 D.,	
 Kawasaki,	
 T.,	
 Shiraga,	
 M.,	
 Tanimoto,	
 Y.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Yamashita,	
 M.,	
 Suzuki,	
 K.	
 and	
 Kashiwagi,	
 A	
 (2010)	
 Effect	
 of	
 strong	 static	
 magnetic	
 fields	
 on	 the	
 amphibian	 life	
 cycle-Effect	
 on	
 oocyte	 maturation	
 of	
 Silurana	
 tropicalis-.	
 Space	 Utiliz.	
 Res.,	
 26,	
 228-231	 	
 2.Keiko	
 Kashiwagi,	 Yoshihisa	
 Fujiwara,	
 Satomi	 Sakao,	 Nobuaki	 Furuno,	 Makoto	 Yanagisawa,	
 Hideki	 Hanada,	 Yoshifumi	 Tanimoto,	
 Masamichi	 Yamashita,	 84

Minoru	
 Watanabe,	
 Tadashi	 Shinkai,	 Satoshi	 Yoshitome,	
 Hideki	
 Kubo,	
 Masao	 Sakai,	
 Fujii,	
 Tomio	 Naitoh,	 Ken-ichi	
 Suzuki,	
 Akihiko	
 Kashiwagi.	
 (2010	 )	
 Effect	 of	 strong	 static	
 magnetic	
 fields	
 on	
 amphibian	 life	
 cycle-morphogical	 and	
 molecular	
 biological	
 analyses	
 of	
 early	 development-.	
 Spce	
 Utiliz.	
 Res.	
 26,	 232-235	 	
 3.Tatsuya	
 Ueki,	
 Nobuaki	 Furuno,	
 Hitoshi	
 Michibata.	
 (2011)	
 A	
 novel	 vanadium	 transporter	
 of	
 the	
 Nramp	 family	 expressed	
 at	
 the	
 vacuole	
 of	
 vanadium-accumulating	 cells	 of	 the	
 ascidian	
 Ascidia	 sydneiensis	
 samea.	
 BBA	
 -	 General	 Subjects	
 1810,	
 457-464	 	
 4.Yanagisawa,	
 M.,	
 Furuno,	
 N.	
 *,	
 Watanabe,	
 M.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Hanada,	 H.,	
 Shinkai,	
 T.,	
 Yoshitome,	
 S.,	
 Kubo,	
 H.,	
 Sakai,	
 M.,	
 Fujii,	
 H.,	
 Suzuki,	 K.,	
 Yamashi,	
 M.	
 and	
 Kashiwagi,	
 A.	
 (2011)	
 Molecular	
 analysys	
 of	
 the	
 head-defects	
 
in	
 the	
 Xenopus	 embyos	 rased	 hyper	 gravity	
 condition.	
 II	 Space	 Utili.	
 Res.	 27,	 198-200	 (*	 Corresponding	 author)	
 
	
 
学会発表	
 
1.古野伸明、夫津木大輔、川崎大志、白神聖也、谷本能文、柏木啓子、山下雅
道、柏木昭彦	  両生類の生活環に対する強磁場の影響−卵成熟に対する影響—	
 第２６回宇宙利用シンポジウム	  ２０１０年１月２６日	
  相模原市	  神奈川	 	
 2.柏木昭彦、柏木啓子、坂尾智美、古野伸明、藤原好恒、谷本能文、山下雅道、
渡部稔、新海正、吉留賢、久保英夫、坂井雅夫、藤井博匡、柳澤誠、花田秀樹、
内藤富夫	
  両生類の生活環に対する強磁場の影響—初期発生の形態学的および分子生物学的解析—	  第２６回宇宙利用シンポジウム	  ２０１０年１月２６日	
 相模原市	
  神奈川	 	
 3.関口猛、舟越稔、古野伸明、小林英紀	
  ヘテロ２量体 G タンパク質の Gtr１、Gtr2 は単独で相互作用タンパク質 Ego3、Ego1 に結合する。日本遺伝学会	
  第82 回大会、札幌市	
  北海道大学	  ２０１０年	
  9 月	 	
 4.関口猛、舟越稔、古野伸明、小林英紀	
  Tor シグナル伝達系のヘテロ２量体
Gtr1-Gtr2 の Gtr1 と Gtr2 の働きの違いの解析	  日本分子生物学会、第 33 回大会、神戸市	
  ポートアイランドホテル	  ２０１０年１２月	
  	
 
	
 
5.佐能正剛、柏木啓子、花田秀樹、古野伸明、松原加奈、柏木昭彦、杉原数美。
北村繁幸、太田茂	  ツメガエルにおけるエストラジオールとビスフェノール Aの生物蓄積、および発生に対する影響	  第１３回環境ホルモン学会	
  東京大学、
東京	
  ２０１０年１２月１６日	
 

85

	
 
6.柳澤誠、古野伸明、渡部稔、柏木啓子、花田秀樹、新海正、吉留賢、久保英夫、坂井雅夫、藤井博匡、鈴木賢一、山下雅道、柏木昭彦	
  過重力によって生じたアフリカツメガエル初期胚の頭部形成異常の解析	  II	
 第２７回宇宙利用
シンポジウム	  ２０１１年	
  １月２５日	
  相模原市	  神奈川	
 	
 科研費等の受け入れ状況	
 宇宙環境利用科学委員会研究班ワーキンググループ（２０１０）両生類の生活環に対する過重力の影響、１０万円、研究分但者	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 

86

プロジェクト研究③	
 三浦郁夫、土井敏男 1)、湯浅義明 2)、藤谷武史 3)、伊藤邦夫 4)	
 （１）神戸市環境局	
  	 （２）姫路水族館	
 （３）東山動物園	
 （４）川崎医科大学附属高等学校	
 １）	
  ナゴヤダルマガエルの遺伝的地域分化	
 Genetic	
 differentiation	
 of	
 Japanese	
 Daruma	 frog	
 Rana	 porosa	 brevipoda	
 	
  西日本に生息するナゴヤダルマガエルは生息数が減少しており、近年とくに保全が叫ばれているカエルのひとつである。本種は、古典的に名古屋集団と岡山集団の大きく２つに分けられ、鳴き声、外部形態が異なり、遺伝的な違いも指摘されている。本研究では、２つの集団の遺伝的分化の違い、分布の広まりと、特に境界集団の同定を行った。その結果、ミトコンドリア遺伝子の配列は両集団で明らかな違いがあり、その境界は兵庫県西端部付近であった。一方、核遺伝子のひとつ Sox3 の解析では、名古屋集団の遺伝子型が岡山集団の中央部まで到達していることがわかった。以上から、２つの集団の間を構成する、岡山東部から名古屋西部に掛けて分布する集団では、核と細胞質の由来がことなる雑種から構成されることが示唆された。	
 
	
  	
 
２）	
  アカハライモリの秋交配の証明	
 Evidence	
 for	
 true	
 fall-mating	 in	
 Japanese	 newt	
 Cynops	 pyrrhogaster	 	 三浦郁夫、秋山繁治１）、岩尾康宏２）	
 （１）	
  岡山清心女子高等学校	 （２）	
  山口大学理学部	
 	  アカハライモリは一般に春から初夏に掛けて交配、産卵、繁殖することが知られている。しかし、一方で、秋にも雄の婚姻食や求愛が観察されることから、秋からの繁殖（交配）の開始が示唆されてきた。そこで本研究は、イモリの生殖腺と生殖器官における成熟の年周期変化を観察し、とくに、雌貯精嚢内への秋の精子の取り込みについて調べた。その結果、生殖腺と生殖器官は春に成熟して夏には退化的になり、秋から再び成熟が開始すること、秋にはいずれの雌の貯精嚢にも十分な精子がとりこまれていること、そして、その秋精子は春の精子と共に、春から初夏にかけての産卵に使用されていることを明らかにした。
よって、アカハライモリの繁殖（交配）は秋（１０月）から開始し、冬眠の冬を挟んで初夏まで至る。従来考えられていた期間より６ヶ月早く開始すると結
論した。	
 
	
 
原著論文	
 
1.Sekiya	
 K,	
 Ohtani	 H,	
 Ogata,	
 M,	
 and	
 Miura	 I	
 (2010)	
 Phyletic	
 diversity	
 in	
 
the	
 frog	
 Rana	
 rugosa	 (Anura:	
 Ranidae)	
 with	
 special	
 reference	
 to	
 a	
 unique	 87morphotype	 found	 from	
 Sado	 Island,	 Japan.	
 Current	
 Herpetology	 29(2):	
 69-78.	
 	
 2.尾形光昭、三浦郁夫	
  (2011)	
 ツチカガエルの日本国内における生息場所について	  爬虫両棲類学報	
 2011(1):	
 24-25.	
 
	
 
学会発表	
 
1.秋山繁治、小泉雄紀、三浦郁夫	
  アカハライモリの秋から春をまたぐ多重交
配について	
 ‐両季節の精子が受精に利用されている遺伝学的証拠‐	
  日本爬虫両生類学会第４９回大会	
  １０月９日−１０日	  横浜（神奈川）	
 	
 2.長井悠佳里、土井敏男、湯浅義明、藤谷武史、伊藤邦夫、小泉雄紀、三浦郁夫	  ナゴヤダルマガエルの遺伝的地域分化	  −とくに岡山集団と名古屋集団が接する境界領域について−	  日本爬虫両生類学会第４９回大会	
  １０月９日−１０日	
  横浜（神奈川）	
 	
 3.小泉雄紀、森淳、三浦郁夫	
  ニホンアカガエルの新規色彩変異	
  ‐体色と眼は正常だがメスのもつ卵だけが白い‐	  日本爬虫両生類学会第４９回大会	
  １
０月９日−１０日	
  横浜（神奈川）	
 	
 4.尾形光昭、関谷國男、三浦郁夫	
  佐渡島産ツチガエルの外部形態について	  日
本爬虫両生類学会第４９回大会	
  １０月９日−１０日	  横浜（神奈川）	
 	
 5.北本光、佐々木健、三浦郁夫	
  オタマジャクシの性を色で見分ける	
  −山口県産ツチガエルの性に連鎖した色彩変異遺伝子の同定−	  日本爬虫両生類学会第４９回大会	
  １０月９日−１０日	  横浜（神奈川）	
 	
 6.小泉雄紀、大谷浩己、三浦郁夫	
  XY 型と ZW 型の遺伝子発現のちがい	  染色体学会第６１回年会	
  １１月５日−７日	  習志野（千葉）	
 
	
 
招待講演	
 
1.三浦郁夫	  ツチガエルの地域集団における生殖腺性差構築機構の解明	  文部科学省：新学術領域研究「性差構築の分子基盤」	
  第２回領域会議・公開研究会	
  １２月１５日−１７日	  逗子（神奈川）	
 	
 2.佐渡島で新種発見！	
  お腹まっ黄色のカエル	
  染色体学会公開シンポジウム	 「カエル・トカゲの生物学」	
  	
  １１月５日	
  ２０１０年	  習志野（千葉）	
 
	
 
高大連携	
 
1.「ヒトがヒト／動物たる由縁」	
 岡山清心女子高校	
  SSH 課題研究「生命科学基礎」講議	
  ２月１日（月）倉敷市	
 

88

	
 
2.「遺伝子と生物学研究	
  -何を調べ、どう使うか-」	
  広島国泰寺高校	
  クラ
ブアシスタンス	  １２月１９日（日）広島市	
 89

プロジェクト研究④	
 
	
 
Ｉ.	
 両生類における編集 ZFN による甲状腺ホルモン受容体(TRb)遺伝子の標的突
然変異誘発	
 Targeted	 mutagenesis	
 of	
 thyroid	
 hormone	 receptor	
 beta	 gene	
 by	
 engineered	 zinc-	 finger	
 nuclease	 in	
 amphibian	 embryos	 	 山本	
  卓（広島大学）、古野伸明（広島大学）、鈴木賢一（愛媛大学）、落合	
  博（広島大学）、柏木昭彦（山陽女子短期大学）、坂本尚昭（広島大学）、柏木啓子（広島大学）	
 	
 変態、再生いずれも両生類に見られる特異的現象であるが、それに関与する遺伝子を標的にして突然変異を誘発する手段はこれまでになかった。ところが近年になって、いろいろな生物種の標的遺伝子をノックアウトするのにジンク
フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)によるゲノム編集が利用されている。ZFN は、ジンクフィンガードメインと、II 型制限酵素である FoKI 由来の DNA 切断ドメインから成る人工酵素であって、標的とする遺伝子シークエンスに二本鎖切断(DSB)を導入するよう編集されている。ZFN により誘導された DSB が内因性の DNA 修復
機構によって修復される際に挿入や欠失ができ、ヌル接合体や、正常なものより機能の劣る突然変異遺伝子(hypomorphic	 alleles)を生じる。Ochiai ら(2010)
は、大腸菌の one-hybrid スクリーニングと培養細胞を用いた SSA アッセイとを組み合わせて３個のジンクフィンガーをもつ機能的な ZFN を選別するシステム
を開発している。私たちの最近の研究で、甲状腺ホルモン受容体（TRb）遺伝子を標的とする ZFN を利用することによって破壊された対立遺伝子をもつ個体をつくりだすことが可能になった。私たちは、ZFN 誘発 TRb 遺伝子変異をコードす
る mRNA をニシツメガエルの受精卵に顕微注入した。その卵から発生した胚のヌクレアーゼ標的領域をシークエンスしたところ、挿入や欠失が認められた。この変異が生殖細胞系列を通して次世代にも伝えられるか否かを確かめるため、
現在、ホモ接合の突然変異体(TRb-/-)を含む F1 作出を試みている。	
 
	
 
II.	
 アフリカツメガエルの発生におけるＩ型ケラチンの新規遺伝子の特徴	
 Characterization	
 of	
 a	
 novel	 type	 I	
 keratin	
 gene	 in	
 Xenopus	 laevis	 during	 ontogenesis	 	 鈴木賢一（愛媛大学）、柏木昭彦（山陽女子短期大学）、柏木啓子（広島大学）	
 	
 ケラチンは脊椎動物の上皮性細胞骨格繊維である中間系フィラメントの構成
タンパク質で、生化学的性質の違いにより I 型と II 型に区別される。ヒトゲノ
ムの場合、I 型遺伝子は 17 番染色体、II 型遺伝子は 12 番染色体に存在しクラ90

スターを形成している。ニシツメガエルでも I 型および II 型ケラチン遺伝子がゲノム上にクラスターをなす。アフリカツメガエルのケラチン遺伝子は自然変態中に幼生型から成体型へと変化すること、遺伝子の中には尾部再生中に誘起されるも、肢芽では不活性化されるものがあること、などが私たちの研究等で明らかになっている。しかし、その制御機構についてはよくわかっていない。	
 ごく最近、私たちは、アフリカツメガエル尾部の再生中に傷つけた上皮細胞で誘導される I 型ケラチンの新規遺伝子（Tazaki ら,	
 2005；クローン名：
XL073g19）に関する研究結果を公表した。まず、4.2-kb 上流域と連結させた EGFP
レポーター遺伝子を持つトランスジェニック創始アフリカツメガエルを作製し、次いで F1 の胚およびオタマジャクシを用いて生体内における遺伝子の転写調節を調べた。この遺伝子の転写産物は胚発生中の鰭や外鰓に限定されるため、便宜上、鰭鰓ケラチン(FGK)遺伝子と名づけた。自然変態の St.	
 40 オタマジャク
シでは、EGFP 遺伝子発現は尾鰭、嗅上皮、外鰓、鰓弓で観察された。外鰓縮小
後には強い EGFP 蛍光が St.	
 44 オタマジャクシの鰓弓で見られるようになった。
しかし、レポーター発現は変態開始時の鰓吸収に伴って急速に消えていった。
次に、甲状腺ホルモン(TH)によって変態を誘起された変態前期の F1 オタマジャ
クシにおける EGFP 発現変化について調べ、生体内での FGK プロモーター/エンハンサー活性の TH に対する反応性を明らかにした。TH 暴露後５日目に強烈なEGFP 蛍光が無処理対照群の内鰓で見られたが、一方、処理群では急速に弱まった。EGFP はよく発達した鰓弁にも強く発現したが、TH 誘導中に完全に消えてしまった。これに対して、レポーター発現は TH 投与によって発達中の前後肢でアップレギュレートしていた。	
 上述の如く、トランスジェニックガエル系統は鰓などいろいろな器官の形成、発生、吸収を客観的に明らかにするための有用な研究材料となりうる。	
 
	
 
III.	
 両生類を用いた生活環に対する過重力および強磁場の影響に関する研究	
 Effects	
 of	 hypergravity	
 environments	
 and	
 strong	 static	
 magnetic	
 fields	
 on	
 amphibian	 life	
 cycle	 	 柏木昭彦（山陽女子短期大学）、古野伸明（広島大学）、花田秀樹（広島大学）、
坂井雅夫（鹿児島大学）、渡部	
  稔（徳島大学）、吉留	
  賢（鳥取大学）、藤井博匡（札幌医科大学）、新海	  正（東京都老人総合研究所）、久保英夫（東京都臨床医学総合研究所）、藤原好恒（広島大学）、谷本能文（大阪大谷大学）、山下雅道（宇宙航空研究開発機構）、柏木啓子（広島大学）	
 	
 地球とは異なる重力および磁場環境下に長期間留まったとき、ヒトを含め各生物種は果たして健康な生活を営むことができるであろうか、子孫はどうなるのか、などといった質問に対する正解はない。両生類は、重力変化に関する地
上および宇宙実験によく用いられてきたため、かなりのデータが蓄積されている。一方、両生類には磁気受容能力があるとの報告もあるが、磁場影響に関す91

る研究は少ない。私たち宇宙環境利用委員会研究チームのテーマである「両生類の生活環に対する過重力および強磁場の影響」は、平成 16 年度から今年度に至るまで JAXA で採択されている。主として、アフリカツメガエルを実験材料として用い、その生活環に対し過重力や強磁場がいかなる影響を与えるかについて研究を続けている。初期発生、特に受精直後の卵の感受性は著しく高く、この時期に過重力や強磁場を印加した場合、いろいろな奇形が出現し、頭部マー
カーやセメント腺マーカーの遺伝子の発現が低下することなどが分かった。過重力や強磁場に対する感受性の高い時期の同定や発生・性分化への影響を簡潔かつ迅速に調べるため遺伝子レベルでの解析方法の開発も予定している。	
 
	
 
研究業績	
 
原著論文	
 
1．Kashiwagi,	
 K.,	
 Fujiwara,	
 Y.,	
 Sakao,	
 S.,	
 Furuno,	
 N.,	
 Yanagisawa,	
 M.,	
 Hanada,	
 H.,Tanimoto,Y.,	
 Yamashita,	
 M.,	
 Watanabe,	
 M.,	
 Shinkai,	
 T.,	
 Yoshitome,	
 S.,	
 Kubo,	
 H.,	
 Sakai,	
 M.,	
 Fujii,	
 H.,	
 Naitoh,	
 T.,	
 Suzuki,	
 K.	
 
and	
 Kashiwagi,	
 A.	
 (2010)	
 	 	
 Effect	
 of	
 strong	 static	
 magnetic	
 fields	
 on	
 
the	
 amphibian	 life	
 cycle	 -	 morphological	 and	
 molecular	
 biological	
 analyses	 of	
 early	 development.	
 Space	 Utiliz.	
 Res.	
 26,232-235.	
 2.	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Kashiwagi,	
 A.,	
 Kurabayashi,	
 A.,	
 Hanada,	
 H.,	
 Nakajima,	
 K.,	
 Okada,	
 M.,	
 Takase,	
 M.	
 and	
 Yaoita,	
 Y.	
 (2010)	
 Xenopus	 tropicalis:	
 An	
 ideal	 experimental	
 animal	 in	 amphibia.	
 	
 Exp.	
 Anim.	
 59(4),395-405.	
 	
 3．Suzuki,	
 K.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 	 Ujihara,	
 M.,	
 Marukane,	
 T.,Tazaki,	 A.,Watanabe,	
 K.,	
 Mizuno,	
 N.,	
 Ueda,	
 Y.,	
 Kondoh,	
 H.,	
 Kashiwagi,	
 A.	
 and	
 
Mochii,	 M.	
  (2010)	
  Characterization	
 of	
 a	
 novel	 type	 I	
 keratin	
 gene	 and	
 generation	
 of	
 transgenic	
 lines	 with	
 fluorescent	 reporter	 genes	 driven	
 
by	
 its	
 promoter/enhancer	
 in	
 Xenopus	 laevis.	
  Dev.	
 Dyn.	
 239,3172-3181.	
 4.	
 Furuno,N.,	
 Futsuki,D.,	
 Kawasaki,T.,	
 Shiraga,	
 M.,Tanimoto,Y.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Suzuki,K.,Yamashita,	
 M.	
 and	
 Kashiwagi,	
 A.	
 (2010)	
 	
 Effect	
 of	
 strong	 static	
 magnetic	
 fields	
 on	 the	
 amphibian	 life	
 cycle	 -	 Effect	 on	
 oocyte	 maturation	
 of	
 Silurana	
 tropicalis.	
 	
 Space	 Utiliz.	
 Res.	
 26,	 228-231.	
 5.	
 Yanagisawa,M.,	
 Furuno,N.,	
 Watanabe,M.,	
 Kashiwagi,K.,	
 Hanada,	 H.,	
 Shinkai,T.,	
 Yoshitome,S.,	
 Kubo,H.,	
 Sakai,M.,	
 Fujii,H.,	
 Suzuki,	 K.,	
 Yamashita,M.	
 and	
 Kashiwagi,A.	
 (2011)	
 Molecular	
 analysis	
 of	
 the	
 
head-defects	
 in	
 the	
 Xenopus	 embryos	 raised	 under	 hypergravity	 conditions.	
 II.	
 Space	 Utiliz.	
 Res.	 27,	 198-200.	
 	
 総説・著書	
 
なし	
 
	
 

92

学会発表（国内）	
 １．佐能正剛、	
 柏木啓子、花田秀樹、	
 古野伸明、	
 松原加奈、	
 柏木昭彦、杉原数美、北村繁幸、	
 太田	
  茂.	
  Estradiol	
 and	
 bisphenol	
 A	 bioaccumulation	 and	
 effect	
 on	
 development	
 in	
 clawed	 frogs（ツメガエルにおけるエスト
ラジオールとビスフェノール A の生物蓄積、および発生に対する影響）。	
  第13 回環境ホルモン学会発表会	
  (2010 年 12 月、東京大学山上会館	
  東京)	
 ２．柏木昭彦、柏木啓子、坂尾智美、古野伸明、藤原好恒、谷本能文、山下雅
道、渡部稔、新海正、吉留賢、久保英夫、坂井雅夫、藤井博匡、柳澤誠、花田秀樹、内藤富夫.	
  両生類の生活環に対する強磁場の影響ー初期発生の形
態学的および分子生物学的解析―第 26 回宇宙利用シンポジウム	  2010 年 1
月 26 日	  相模原市	  神奈川	
 ３．古野伸明、夫津木大輔、川崎大志、白神聖也、谷本能文、柏木啓子、山下
雅道、柏木昭彦.	
  両生類の生活環に対する強磁場の影響―卵成熟に対する影響ー第 26 回宇宙利用シンポジウム	  2010 年 1 月 26 日	
  相模原市	  神奈川	
 ４．柳澤誠、古野伸明、渡部稔、柏木啓子、花田秀樹、新海正、吉留賢、久保英夫、坂井雅夫、藤井博匡、鈴木賢一、山下雅道、柏木昭彦.	
 過重力によって生じたアフリカツメガエル初期胚の頭部形成異常の解析 II	 	
 第 27 回宇宙利用シンポジウム	  2011 年 1 月 25 日	
  相模原市	  神奈川	
 	
 科研費等の受け入れ状況	
 宇宙環境利用科学委員会研究班ワーキンググループ 2010 年	
 100 千円（分担）
	
 
	
 
その他	
 
	
  	
 北九州市板櫃川後肢欠損ガエル調査検討委員会委員	
 	
  	
 第一回開会（2010 年 8 月 3 日	 北九州市役所）セミナー	 	  	
  「北九州市板櫃川における後肢欠損ツチガエルについて考える」	
 93

プロジェクト研究⑤ :	
 先端的両生類研究の展開‐	
 
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 	
 	
 	
 	
 両生類絶滅危惧種の効率的保存と遺伝的多様性の解明	
 
	
 
1)	
 
住田正幸,	 1)	 倉林敦，1)	
 井川武，1)	
 Islam	
 M.	
 Mafizul,	 1)	
 Alam	 M.	
 Shafiqul,	
 2)	
 
倉本満,	
 3)	
 大海昌平,	
 4)	
 勝連盛輝,	
 5)	
 海野徹也,	
 6)	
 浮穴和義,	
 7)	
 藤井保,	
 8)	
 井鷺
裕司	
 
1）
広島大学大学院理学研究科附属両生類研究施設	
 2）
宗像市ひかりが丘 3-6-15	
 3）
奄美市農林課	 4）
沖縄県環境衛生研究所	
 5）
広島大学大学院生物圏科学研究科	
 6）
広島大学大学院総合科学研究科	
 7）
広島県立大学人間文化学部	
 8）
京都大学大学院農学研究科	
 
	
 
1.	
 絶滅危惧種イシカワガエル人工繁殖法の確立	
 Establishment	
 of	
 stable	 artificial	
 breeding	 method	
 for	
 an	
 endangered	
 frog	
 species	
 Odorrana	 ishikawae	
 
	
 
[目的]	
 
近年国内において乱獲や自然破壊のため野外から激減が報告されており、環境省レッドリストで絶滅危惧 IB 類、かつ、沖縄県と鹿児島県では天然記念物に指定されている「イシカワガエル」について、重点的に効率的保全を試みる。これを達成するために、本研究施設の設備と４０年以上に渡り蓄積されたノウハ
ウを駆使することによって、実験室での効率的な人工繁殖・飼育維持方法の確立に取り組む。なお本種については、すでに予備実験によって人工繁殖に成功しているので、経代飼育法の確立を重点的に行う。	
 	
 [材料・方法]	
 奄美大島と沖縄島からイシカワガエルの成体の雌雄を採集（許可取得済）し、これらを用いて、人工受精法による人工交配系を確立する。排卵はウシガエルの脳下垂体懸濁液を腹腔内に注射することによって誘導する。排卵した雌から、卵をスライドグラス上に絞り出す。絞り出した卵に雄から摘出した精巣の懸濁液を速やかにかけ、媒精する。媒精の 20 分後、飼育水に移し、18℃で管理する。
孵化後、徐々に温度を 22℃まで上げ、1 ヶ月目以降は温室の水槽に移し、変態期まで室温で飼育した。餌には茹でたホウレン草を与えた。変態後は 25℃の飼育室に移し、コオロギを餌に飼育した。	
 
	
 
[結果]	
 
イシカワガエルについては、上記の方法によって、人工繁殖・飼育維持法を確立することができた。さらに、実験室での完全飼育下で自然繁殖により、２代

94目を得ることに成功した。幼生の生活力は全体的に強くない。特に 60 日幼生から変態期にかけての死亡率が高かった。夏場の高水温期に感染症が発生しやす
いので、この時期にできるだけ低めの水温、きれいな水質を保つことが重要である。変態直後に死亡率が特に高い。死亡した個体の多くは、変態が長引いて尾が完全に消失していないものや、痩せたものだった。この時期には、飼育容器を流れる水道水に含まれるカルキの影響が、考えられるため、飼育水には特に細心の注意を払う必要がある。	
 	
 [考察と将来の展望]	
 	
 本研究で得られた人工繁殖や自然繁殖および幼生の飼育に関する知見は、既に飼育下にあるイシカワガエルの維持増殖に有用だけでなく、野外のイシカワガ
エルの保全にも応用が期待できる。自力での将来的には、存続が困難なほどの個体数の減少や生息環境の悪化が起こった地域集団の一時的な保護に応用できる。しかしこの場合、事前にその集団の遺伝的多様性の評価や、人工繁殖個体の放逐による周辺の生態系への影響などについても検討が不可欠である。	
 
	
 
2.	
 絶滅危惧種イシカワガエルの島嶼間の形態的分化・遺伝的分化・交配隔離の有無の解明と新種記載	
 Morphological	
 and	
 genetic	
 divergences	
 and	
 reproductive	 isolation	
 among	 inter-island	
 populations	
 of	
 an	
 endangered	 frog	
 species	
 Odorrana	 ishikawae	
 with	 description	
 of	
 a	
 novel	 species	
 
	
 
[目的]	
 
イシカワカエル（Odorrana	 ishikawae）は、奄美大島集団と沖縄島集団間で、形態・産卵生態・核型などに若干の分化があることが知られていた。両島嶼集
団間の分類学的ステータスを明確にすることを目的として研究を行った。奄美大島内では、大型で他と区別される集団が存在することが知られていたため、この集団についても解析を行った。	
 	
 [材料・方法]	
 本研究では、26 個体の奄美大島産個体（普通集団 14 個体、大型集団 12 個体）、20 個体の沖縄島産個体の計 46 個体のイシカワガエルを材料に用いた。研究は以下の方法で進めた。（1）外部形態比較を行うために、31 カ所の部位を測定し、計測値を統計学的に処理した（Mann-Whitney	
 U-test および主成分分析）。（2）遺伝的分化を調べるために、ミトコンドリア 16SrRNA 遺伝子のおよそ 560	
 bp の部位を PCR 増幅・シークエンスし、得られた塩基配列に基づき系統解析を行った（ML と Bayes 法）。
（3）交配後隔離の有無と程度を調べるために、奄美大島産
13 個体（大型個体 7、普通個体 6）と沖縄島産 6 個体を用いて、人工交配を行い、子孫の生活力（生存率）を測定した。島間雑種と島内の F1 個体について、精子形成異常と減数分裂時の染色体について比較を行った。	
 
	
 
[結果]	
 
外部形態の比較から、奄美大島内の普通集団と大型集団は、大きさ以外にいく

95

つかの部位に差が見られるものの、全体としては非常に良く似たプロポーショ
ンを持っていた。一方で、奄美集団と沖縄集団間では、頭部の長さと体長の比など、8 つの部位で相違が見られ、体型が異なっていることが分かった。主成分分析の結果は、奄美普通、奄美大型、沖縄の 3 つの全ての集団が明確に区別された。	
 	
  16SrRNA 遺伝子に基づく解析では、奄美大型と奄美普通集団は、それぞれがク
レードを作らず、系統学的には両集団は区別できなかった。一方で、奄美大島
集団と沖縄島集団はそれぞれが明確なクレードを形成し、系統的に分かれたグ
ループであることが明らかになった。	
 	
  人工交配の結果、奄美普通と奄美大型集団間には明確な交配後隔離は見られなかった。しかし、奄美と沖縄集団では、沖縄♀ 奄美♂の掛け合わせの子孫（F1）は、胞胚期~神経胚期に異常が生じ、1 匹も孵化には至らず、明確な交配後隔離が見られた。奄美♀ 沖縄♂の掛け合わせでは、F1 の生存率はコントロールと違わなかった。しかし、この子孫の精巣では、異常な凝集精子核が多数観察された。さらに減数分裂時の染色体対合像においても、正常なリング構造
ではなく、ロッド構造や未対合の染色体が散見され、奄美♀沖縄 ♂の組み合
わせでも、ある程度の交配後隔離が存在することが示された。	
 
	
 
[考察]	
 
本研究の結果は、奄美大島内の普通集団と大型集団は、交配後隔離も無く、遺伝的にも区別できないことから、両者は同種であると考えられた。しかし、両者の外部形態には明瞭な違い（特に体長）があるため、大型集団は奄美集団のヴァリエーションの一つとして扱うことが妥当と考えられた。	
 	
  奄美集団と沖縄集団間では、外部形態に明瞭な違いがあり、遺伝的にも区別でき（分化の程度はやや少ない）、さらに、明瞭な交配後隔離があることが示された。このことから、これまでにイシカワガエルとされていた奄美集団と沖縄
集団は、それぞれ別種に相当することが妥当であると言える。さらに両者から、背面の斑紋のパターン、腹部の暗色模様の有無、中足の瘤の大きさ、頭部の形状など、区別が可能な表徴形質が見いだされた。イシカワガエル(O.	
 ishikawae)の基準産地は沖縄であるので、奄美大島集団を別種とするのが妥当であった。	
 
	
 
[成果]	
 
今回の結果に基づき、奄美大島集団を、Odorrana	
 splendida	
 sp.	
 nov	
 として新
種記載した（Zootaxa	
 2767:	
 25-40）が、この成果は新聞（朝日新聞 2010 年 9月 16 日、2011 年 2 月 18 日、朝日小学生新聞	
  2011 年 2 月 27 日、奄美新聞	
  2010年 9 月 16 日、2011 年 2 月 20 日、南海日々新聞	  2011 年 2 月 20 日）に掲載された。今回の研究から、琉球列島の両生類相には未解明の種多様性が残っており、現状以上の調査と、種多様性保全を行う上での単位の見直しが必須である
ことが明確になった。	
 	
 [将来の展望]	
 この研究自体はよくまとまっており、完結した研究であるが、今後、イシカワ
ガエルを研究する上では、沖縄島産と奄美大島産を別種として明確に区別する

96必要がある。	
 	
 3.	
 絶滅危惧種イシカワガエル・アマミイシカワガエルにおける新規マイクロサ
テライトマーカーの開発と景観遺伝学的手法による遺伝的多様性の解明	
 Development	
 of	
 new	
 microsatellite	 markers	
 and	
 elucidation	
 of	 genetic	 diversities	
 based	 on	 landscape	 genetics	
 of	
 endangered	 frogs,	 Odorrana	 ishikawae	
 and	
 O.	
 splendida.	
 	 	 [目的]	 イシカワガエル（及び、アマミイシカワガエル）については、島間の分化はこれまでも知られてきたが、島内における遺伝的多様性については不明確なままであった。そこで、共優性かつ多型性に富んだ遺伝マーカーであるマイクロサ
テライトマーカーを開発し、これらを用いてイシカワガエル・アマミイシカワ
ガエルにおける島内の遺伝的多様性を探索することを目的とした。	
 	 [材料・方法]	
 マイクロサテライトマーカーの開発については、イシカワガエル、アマミイシ
カワガエル各 1 個体を材料として、磁気ビーズハイブリダイゼーション法(Glenn	
 and	
 Schable	 2005)と二重抑制 PCR 法(Lian	
 and	
 Hogetsu	
 2002)によって、マイクロサテライト領域を含む DNA 断片を単離した。その後、これらに特異的なプライマーを設計した。両種の遺伝的多様性の解明については、イシカワガエル 6
集団 33 個体、アマミイシカワガエル 18 集団 127 個体、計 160 個体について、遺伝子型を決定し集団遺伝学的解析を行うとともに、景観遺伝学的手法により集団構造の説明要因を探索した。	
 
	
 
[結果]	
 
磁気ビーズ法及び、二重抑制 PCR 法によって単離されたマイクロサテライト領域を含む、542 クローンから、両種において安定的に増幅され、かつ多型性が確認された 12 遺伝子座をマイクロサテライトマーカーとした。ハーディ・ワイン
ベルグ平衡(HWE)及び、連鎖平衡について、統計テストを行ったところ、一部の遺伝子座で HWE からの逸脱と連鎖不平衡が確認された。	
 計 160 個体のイシカワガエルこれら 12 遺伝子座の遺伝子型 STRUCTURE	 (Pritchard	
 et	
 al.,	 2000)を用いた集団構造解析の結果、イシカワガエルについては、階層的構造は見られなかったが、アマミイシカワガエルにおいては、5あるいは 6 個の遺伝的クラスターに分けられることが分かった。また、遺伝距離に基づく系統解析を行ったところ、アマミイシカワガエルの集団は地理的距
離が単系統を形成した。さらに現在利用可能なほぼすべての地形データ（高度、植生、土壌、流水量、土壌水分含有量）を用いて、生息適地モデルを構築し、これに基づくコスト距離と遺伝距離を比較した。その結果、高度と土壌に関する環境変数を当てはめた場合に遺伝距離と高い相関が見られた。	
 
	
 
	
 
	
 [考察]	 97

イシカワガエルは遺伝的には単一の集団として見なせるのに対して、アマミイ
シカワガエルは階層的な集団構造を形成されていることが分かった。さらに、
アマミイシカワガエルにおける集団構造は奄美大島の起伏に富んだ地形と、土壌の保水量に関連した生息適地の不連続性により、遺伝子流動が妨げられ、その結果、集団構造が形成されていると考えられた。一方で、イシカワガエルの現存集団は、沖縄島北部のヤンバルと呼ばれる原生林地帯に限られており、この地域は山脈が中央を貫く単純な地形である。このため遺伝子流動は制限されず、アマミイシカワガエルとは対照的に単一集団を形成していると考えられる。
またイシカワガエルは、過去には山脈が分断された名護、本部といった地域にも生息していたことから、現在の集団構造は遺伝的多様性が一部喪失した状態であるとも考えられる。	
 	 	 [成果]	
 新規マイクロサテライトマーカー開発については、概ね中立的で集団解析・個体識別に適用できる有用なマーカーが作成できた。集団構造解析の結果、イシカワガエル・アマミイシカワガエルの島内の遺伝的多様性が明確になり、さらに、その形成要因についても明らかになった。	
 	 	
 [将来の展望]	
 マイクロサテライトマーカーの一部は他の近縁種においても利用できる可能性がある。また、個体認識にも利用可能なことから、生態学的研究を行う上でも有用である。今回明らかになった集団構造とその形成要因については、周囲の生態系を含む包括的な保全活動を行う上での具体的な指針となり得る。	
 
	
 
4.	
 イシカワガエル青色突然変異体の組織学・遺伝学的研究	
 Histological	
 and	
 genetic	
 studies	 on	 a	
 “blue-colored”	
 mutation	
 of	
 Odorrana	 ishikawae	
 
	
 
[目的]	
 
2010 年 3 月、沖縄本島にて、通常は緑色の色彩を呈する皮膚部位が水色に置き換わった「青いイシカワガエル」を発見した（日本経済新聞他 10 国内紙 2010
年 4 月 3 日~6 日報道）。青色の色彩変異個体は、他のカエルにおいても見つかっているが、本種についての色素細胞の研究は皆無である。本研究では、（1）イシカワガエル青色変異体は、どのような組織学的要因によって青色を呈するのか、（2）この色彩変異が遺伝形質であるか否かの２点を明らかにすることを目的とした。	
 	 [材料・方法]	
 イシカワガエル・青色の色彩変異個体（雄）、および通常の色彩の野生個体の皮膚を材料に用いた。皮膚の細胞組織学的観察については、背面皮膚（およそ 1cm2）を固定し、supper 樹脂に包埋し、超薄切片と準超薄切片を作成した。前者を透過型電子顕微鏡で、後者を光学顕微鏡でそれぞれ観察した。遺伝学的研究としては、人工交配法を用いて、青色の色彩変異個体（雄）と、奄美大島産および98

沖縄島産の野生型雌それぞれ 1 個体と交配した。	
 
	
 
[結果]	
 
光学顕微鏡を用いて、皮膚の観察を行った結果、野生型イシカワガエルでは、両生類の基本色素パターンである、黄色素胞、虹色素胞、黒色素胞が層状に重なった真皮色素胞単位が見られた。一方で、青色変異型では、虹色素胞の上にあるはずの黄色素胞が観察できず、虹色素胞の直上に基底膜が存在していた。
超薄切片を電子顕微鏡で観察したところ、野生型では、基底膜下に黄色、虹色、黒色の色素胞が存在し、それぞれの細胞の微細構造を確認することができた。
青色変異型では、黄色素胞自体がなく、プテリノソームやカロテノイドの顆粒も見られなかったが、虹色素胞の反射小板、黒色素胞のメラノソームは野生型のものと同様の微細構造であった。	
 	
  2 対（Amami	
 Wild♀1 Okinawa	
 Blue♂1、Okinawa	
 Wild♀1 Okinawa	
 Blue♂
１）の人工交配を行い、1 代目（F1）を得た。成体の色彩は前肢が出る頃の幼生の時期から現れはじめるため、変態の段階で色彩の判別を行った。その結果、
F1 全ての表現型が野生型と同様の色調を呈した。	
 
	
 
[考察]	
 
人工交配の結果から、青色突然変異は、遺伝的な要因であるとすれば優性形質ではなく、劣性形質であると推定された。また、青色変異個体の皮膚のごく一部に緑色の領域があるようにも見えた。この場合、青色という表現系は、一個体内でモザイク上に現れる環境要因に因る表現型である可能性がある。	
 
	
 
[成果]	
 
光学顕微鏡・電子顕微鏡の観察から、イシカワガエル青色突然変異体は、通常、真皮色素胞単位の最も皮膚側に存在する黄色素胞が欠損しており、これが原因
で、虹色素胞の色だけが表現され結果、通常は緑の皮膚が青く見えることが明らかとなった。	
 	
 [将来の展望]	
 青色突然変異が遺伝的要因に因るものか、さらに、いくつの遺伝子が関与しているかを明らかにするために、今回得られた F1 個体の性成熟を待ち、F2 を得る
必要がある。例えば、F2 に青色個体と野生個体が 3：1 の割合で現れれば、青色突然変異が１遺伝子座に支配される劣勢形質であることが証明できる。	
 
	
 
5.	
 絶滅危惧種イシカワガエルの皮膚に存在する抗菌ペプチドの最小発育阻止濃度決定	
 Minimal	 inhibitory	
 concentration	
 of	
 antimicrobial	
 peptides	
 in	
 the	
 skin	 of	
 an	
 endangered	 frog	
 Odorrana	 ishikawae	
 
	
 
	
 
[目的]	
 
日本で最も美しいといわれるイシカワガエル(Odorrana	 ishikawae)は、奄美大99

島と沖縄本島の固有種である。近年個体数が減少しており、環境省レッドリス
トでは絶滅危惧ⅠB 類に分類されており、沖縄県と鹿児島県では天然記念物に指定されている。一方、本種は人工繁殖に成功しており、飼育室では感染症に対する抵抗性を示すことが分かっている。このことから絶滅危惧に瀕している原因の一つに、野生環境下での自然免疫システムの低下の可能性が考えられる。
水辺という微生物の攻撃を受けやすい環境にいるカエルにとって、皮膚から分泌される抗菌ペプチドは重要な生体防御因子であり、自然免疫システムの要となっている。先行研究により、イシカワガエルの皮膚から生化学的手法により10 種類の抗菌ペプチドが単離・同定されている。さらに、分子生物学的手法により 12 種類の分泌ペプチドが推定され、これらの中には既存の抗菌ペプチドフ
ァミリーとは全く異なる構造を持つ新奇なペプチドが含まれている。本研究では、これら 22 種類のペプチドのグラム陰性菌・グラム陽性菌・真菌に対する最小発育阻止濃度（Minimal	
 inhibitory	
 concentration	
 ;	 MIC）を測定し、有効菌種のレパートリーを示す抗菌スペクトルを評価することを目的とした。	
 [材料・方法]	
 最小発育阻止濃度測定は、96 穴プレートの各ウェルに培地 49 レー、接種菌液
50 種菌、ペプチド 1 ペプ（2 倍希釈系列で 7 段階の濃度）を加え 100 濃度とし、37℃で 1 晩静置培養した。培養後、マイクロプレートリーダーで吸光度の測定を行うとともに、ウェルに白濁や沈殿がないかを目視することにより、効果を判定した。評価菌種は、グラム陰性菌の大腸菌(E.	
 coli)、グラム陽性菌の黄色ブドウ球菌(S.	
 aureus)・メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)・枯草菌(B.	
 subtilis)、真菌のカンジダ菌(C.	
 albicans)の計 5 種類を用いた。	
 	
 [結果と考察]	
 全体的な傾向として、細菌の E.	
 coli や S.	
 aureus には強い抗菌活性を示すペプチドが多く確認されたが、真菌の C.	
 albicans に対する抗菌活性は弱かった。
これらのペプチドの中には MRSA に対して強い抗菌活性を示すものもあった。また、皮膚から単離・同定されたペプチドは抗菌活性が強く、抗菌作用の有効菌種が多いことから広域の抗菌スペクトルを持つと考えられる。これに対して、遺伝子解析から推定された既存の抗菌ペプチドファミリーとは全く異なる構造を持つ新奇なペプチドには抗菌活性は認められなかったが、今回使用しなかった菌種に対し抗菌活性を持つ可能性も考えられる。以上の研究により、イシカ
ワガエルは多種多様の抗菌ペプチドを備えており、人工繁殖された本種では抗菌ペプチドによる自然免疫システムは正常に働いていると考えられる。今後は野生環境下のイシカワガエルや他の Odorrana 属・Rana 属のカエルの遺伝子発現レベルや抗菌活性と水質悪化や環境ホルモンなどとの関係を解析することで、野生環境におけるイシカワガエルの絶滅危惧の要因を解明していきたいと考え
ている。	
 
	
 
	
 
6.	
 絶滅危惧種イボイモリ飼育下繁殖と生殖行動の観察の試み	 Attempt	
 on	
 captive	 breeding	
 and	
 observation	
 of	
 breeding	 behavior	
 in	
 an	
 

100

endangered	 newt,	
 Echinotriton	
 andersoni	
 
	
 
[目的]	
 
イボイモリは南西諸島（奄美大島、請島、徳之島、沖縄島、瀬底島、渡嘉敷島）の固有種であり、イモリ科の中でも特に原始的な形態を残すことから、「生きている化石」と呼ばれる特徴的な種である。しかしながら、他の南西諸島固有種と同様に生息域の縮小により、IUCN レッドリストにおける絶滅危惧 II 類にリストされており、さらに、鹿児島県および沖縄県の天然記念物に指定されている。
本研究では、これらの種を保護するための方策の一つとして、飼育下繁殖を試みるとともに、本種の依存する生態系の解明を目指して生殖行動の観察を行っ
た。	
 
	
 
[材料・方法]	
 イボイモリの飼育水槽として、縦 900	
 mm・横 900	
 mm・高さ 500	
 mm のステンレ
ス水槽を 2 台設置し、それぞれに野外から採集した徳之島産個体、沖縄島産個体を放した。室温は 25℃に設定し、水槽には生息環境を模した土壌を敷き詰め、産卵場所として水道水をかけ流しにした水場を設備した。さらに、それぞれの飼育水槽の直上にネットワークカメラと赤外線灯光器を設置し、パソコンにて終日録画を行った。	
 
	
 
[結果]	
 
飼育下個体における前年度末から今年度初頭（2010 年 2 月〜6 月）にかけて、徳之島産 5 個体、沖縄産 1 個体のメスが飼育水槽内で産卵した。これまでに徳之島産 57 個体、沖縄産 4 個体が変態しており、生活力はおおよそ 25〜50%であった。それ以前に産卵した沖縄産個体の幼生を含めると現在、66 個体の幼生の飼育に成功している。生殖行動観察については、2010 年 10 月〜2011 年 3 月までに 6 ヵ月間のデータを蓄積している。また、2011 年 1 月下旬には、飼育に供する個体を徳之島にて採集中に、産卵を目撃し始終をビデオ撮影に成功した。	
 
	
 
[考察]	
 
昨年度末から今年度にかけて産卵した個体のうち、徳之島産メスは、飼育を開始した時期から考えて、野外にてすでに生殖行動（精包の受け渡し）を終えていたと考えられる。一方、沖縄産メスはすでに飼育開始から 1 年以上の期間が経過しており、飼育下環境において生殖行動を行い、産卵した可能性が高い。
イボイモリの産卵期は通常 1〜5 月であり、野外での繁殖時期とも一致することから、何らかの環境変化を感知し産卵に至ったと考えられる。また、産卵行動を詳細に観察したところ、野外にて発見される落ち葉の下などに隠れて卵を産み落とす行動が確認された。	
 
	
 
[成果]	
 
少数個体ではあるが飼育下繁殖に成功するとともに、受精卵から幼生までの飼育技術を確立した。この成果は、新聞（読売新聞 2010 年 9 月 25 日）で報道された。また、野外における産卵状況を裏付ける産卵行動を明らかにした。	
 

101

	
 
[将来の展望]	
 引き続き飼育下繁殖を試みるとともに、蓄積した映像記録を分析し、生殖行動
のみならず年間を通じたイボイモリの行動周期を解明していく。	
 
	
 
7.	
 絶滅危惧種イボイモリの新規マイクロサテライトマーカーの開発	 	
  Development	
 of	
 new	
 microsatellite	 markers	
 of	
 endangered	 newt,	 Echinotriton	
 andersoni	
 
	
 
[目的]	
 
生物種を絶滅に追い込む要因の一つは、集団サイズの減少とそれに伴う近交弱
勢による悪循環である。したがって、生物種の効率的な保全対策を行う上で、種内の遺伝的多様性を維持する必要があり、近年、種内の遺伝的に異なる集団
を Evolutionary	
 Significant	
 Unit（ESU:	
 進化的に重要な単位）とし、管理区分に適応する動きが高まっている。特に、移動能力が他の両生類に比べて低い
イボイモリでは、島嶼内で複雑な遺伝的集団構造が存在することが考えられる。
そこで、本研究では、イボイモリの島嶼内の遺伝的多様性の探索に用いるのに有効な遺伝マーカーの開発を目的として、マイクロサテライトマーカーの開発を試みた。	 	
 [材料・方法]	
 
奄美産及び、沖縄島産イボイモリ各 1 個体を材料として、磁気ビーズハイブリ
ダイゼーション法(Glenn	
 and	
 Schable	 2005)と二重抑制 PCR 法(Lian	
 and	
 Hogetsu	 2002)によって、マイクロサテライト領域を含む遺伝子座を単離し、それぞれに特異的なプライマーを設計した。その後、徳之島産、沖縄島産の複数個体において、遺伝型決定を試み多型性を検討した。	
 
	
 
[結果]	
 
上記 2 つの方法において、マクロサテライト領域が含まれる遺伝子座を合計 57
単離し、このうち 24 についてプライマーを設計し、複数個体について遺伝子型
決定し多型性を検証した。その結果、5 つの遺伝子座について多型性が確認され、アリル数は 3〜6 で、予測ヘテロ接合度は 0〜0.716 であった。	
 
	
 
[考察]	
 
2 種のマイクロサテライト遺伝子座の単離方法を比較したところ、イボイモリにおいては磁気ビーズを利用した方法がより効率が良い。ただし、これは生物種によるため引き続き検証する必要がある。また、島内でのアリル数とヘテロ接合度を徳之島産と沖縄島産で比較したところ、若干ではあるが沖縄島産 2 集団の方が、より大きな値を示した。これは沖縄島産の方が、有効集団サイズが大きい可能性があるのかもしれない。	
 
	
 
[成果]	
 
一部の集団では多型性のない遺伝子座もあるものの、集団間の解析に用いるの102

に十分な多型性のあるマイクロサテライトマーカーが開発できた。	
 	
 [将来の展望]	
 今回開発できたマイクロサテライトマーカーを用いて、イボイモリの集団構造を明らかにするとともに、さらに遺伝子座の数を増やすために、研究を継続する必要がある。	
 	
 8.	
 絶滅危惧種オットンガエル・ホルストガエルの人工繁殖の試み	 Attempt	 on	 an	
 artificial	
 breeding	
 for	
 endangered	 frog	
 species	
 Babina	 subaspera	
 and	
 B.	
 holsti	
 
	
 
[目的]	
 
オットンガエル（Babina	
 subaspera）とホルストガエル（Babina	
 holsti）は、
前足に５本の指を持つという無尾両生類としては特異な形態を持つことで広く知られている。両種は、それぞれ奄美大島（加計呂麻島含む）と沖縄島（渡嘉敷島含む）固有のカエルである。生息面積が少ないことに加え、昨今の環境破壊による個体数減少から、IUCN レッドリストにおいて、絶滅危惧種 B1 類にリス
トされ、さらに、鹿児島県および沖縄県の天然記念物に指定されている。本研
究では、これらの種を絶滅から防ぐ一つの方法として、人工繁殖法の確立を目指して研究を行った。	
 	
 [材料・方法]	
 オットンガエル 2 個体（♂3、♀3）、ホルストガエル 4 個体（♂2、♀2）を人工交配に用いた。人工交配法は、イシカワガエルの場合に準拠した。ただし、オットンガエルとホルストガエルの場合、脳下垂体懸濁液を腹腔内に注射してから採卵まで 25℃で、それぞれ 29~30 時間と 20~21 時間が適切であった。	
 
	
 
[結果]	
 
オットンガエル 3 ペアとホルストガエル 2 ペアをそれぞれ交配させ、正常卵割
胚をそれぞれ 1113 個、853 個づつ得た。その後飼育を続けたところ、47％、44％
が変態まで進み、2 ヶ月幼体での生存率は、それぞれ 47％と 29％であった。	
 
	
 
[考察]	
 
両種ともに、孵化までには 6〜8 日、変態までには 64〜127 日を要した。ホルス
トガエルでは、変態後に生存率が下がったが、これは細菌の感染が原因であると考えられ、熱湯消毒や抗生剤で死亡数を抑えることができた。	
 
	
 
[成果]	
 
オットンガエル・ホルストガエル共に、人工繁殖によって子孫第１世代を得ることに成功した。現在、オットンガエルとホルストガエル、それぞれおよそ 500
個体、200 個体を飼育中である。	
 [将来の展望]	
 今年度において、オットンガエル・ホルストガエル共に人工繁殖法によって、103

子孫を得ることに成功した。しかし、人工繁殖個体から子孫第二世代を得るま
では実験室内飼育方法が確立したとは言えないので、今後も飼育を続け、性成熟に達した後、再び交配実験を行う予定である。また、沖縄島と奄美大島は、更新世（およそ 100 万年前）までは 1 つの島を形成しており、オットンガエルとホルストガエルは、両島の地理的分断によって系統的に分岐し、それぞれの島で生き残った近縁な遺存種であると考えられている。似たような例に、同じ
く両島固有のイシカワガエルがあるが、最近になり沖縄島と奄美大島のイシカ
ワガエルには交配後隔離があることが証明され、両集団は、外部形態は極めて良く似ているものの別種とされた。一般的に、島嶼間のように地理的に完全に分断された集団間では、交配後隔離の成立は、側所的集団や同所的集団の場合よりも遅れても差し支えないが（後者の場合、交配前隔離が先に成立する傾向にある）、イシカワガエルの場合は、完全に分断された集団間で比較的早く交配
後隔離が進んだグループであるといえる。同じ例が、オットンガエルとホルス
トガエル間にも当てはまるかを明らかにするために、両者間で人工交配を行う
ことを計画している。また、Babina 属に最も近縁な属は何かという点については現在複数の仮説が存在するが、その候補の一つ Nidirana 属（研究者に因っては Babina に含める）のヤエヤマハラブチガエルを用い、属間の交配後隔離の有無の検証も計画している。	
 
	
 
9.	
 絶滅危惧種オットンガエル・ホルストガエルおよび近縁属のミトコンドリア
ゲノム解析	
 Mitochondrial	 genomic	
 analyses	
 in	
 endangered	 species	
 Babina	 subaspera	
 
and	
 B.	
 holsit	
 
	
 
[目的]	
 
種の保全を適切に行うためには、種内集団間の遺伝的多様性を調査し、保全すべき単位（集団）を決める必要がある。この作業を行う上では、分子マーカーが必須であり、進化速度の速いミトゲノムコード遺伝子がしばしばそのマーカ
ーとして選択される。しかし、ミトゲノム遺伝子の中でも、進化速度の速い遺伝子と遅い遺伝子が存在し、また分類群によって、進化速度の速い遺伝子が異なる場合がある。そこで、絶滅危惧種であるオットンガエルとホルストガエルのミトゲノムの種内集団間の遺伝的多様性を調べる上で適切なミトゲノム遺伝
子を調べるために、両者のミトゲノムの全塩基配列を決定した。	
 	
  ミトゲノムにコードされている遺伝子の並んでいる順番（遺伝子配置）は、
一般的にはあまり変化しないが、しばしば変化する。この場合、同じように変化した遺伝子配置を共有するグループは、その配置変化が生じた祖先に由来する単系統群であることが強く示唆される。先行研究において、ホルストガエルのミトゲノムの部分塩基配列が調べられ、本種のミトゲノムは、一般のアカガ
エル型（あるいはネオバトラキア型）の遺伝子配置から変化していることが報告されていた。本研究では、オットンガエルのミトゲノムの遺伝子配置を明らかにし、ホルストガエルで見つかっていた遺伝子配置変化がオットンガエルでも見られるかを明らかにすることを目的とした。	
 
	
 

104

[材料・方法]	
 オットンガエルとホルストガエル各 1 個体を材料に用いた。生体の足指から全DNA を抽出し、その DNA を鋳型に、LA-PCR 法でミトゲノムの全長をカバーする
PCR 断片を増幅し、プライマーウォーキング法を用いて、シークエンスを行った。
また、オットンガエルのコントロール領域はリピートが長く、PCR 産物から直接シークエンスできなかったため、サブクローニングを行った後にシークエンスを完了した。	
 
	
 
[結果]	
 
オットンガエルとホルストガエルのミトゲノムの全塩基配列を決定した。両種のミトゲノムの全長はそれぞれ XXXXX	
 bp と 19113	
 bp であり、一般的な脊椎動
物のミトゲノムよりやや長かった。両ゲノム共に動物ミトゲノムに特有の 37 種類の遺伝子をコードしていた。また、オットンガエルとホルストガエルのミト
ゲノムの遺伝子配置は完全に一致していた。この遺伝子配置をアカガエル一般型と比較すると、tRNA-His/tRNA-Ser/ND5 遺伝子領域と tRNA-Glu 遺伝子の位置が異なっていた。オットンガエルとホルストガエルミトゲノムの ND6 遺伝子の下流には tRNA-Glu の偽遺伝子が、CR の下流（ND5 遺伝子の上流）には tRNA-Hisの偽遺伝子がそれぞれ見いだされた。	
 
	
 
[考察]	
 
ミトゲノムニコードされる 2 種類のリボゾーム RNA 遺伝子と 13 種類のタンパク質遺伝子をオットンガエルとホルストガエル間で比較した所、タンパク質遺伝子の中でも ND1〜5 と ATP6〜8 遺伝子の進化速度が速いことが分かった。さらに、
アミノ酸置換率や、遺伝子の長さを考慮すると、ND2 と ND5 遺伝子がこれらの種の種内マーカーとして使いやすいと考えられた。	
 	  アカガエル一般型から変化した遺伝子配置が、オットンガエルとホルストガ
エルで共有されていたことから、両者で見られた遺伝子配置は少なくとも狭義の Babina 属の共有派生形質になることが分かった。しかし、Nidirana 属の遺伝
子配置が今のところ不明であることから、Nidirana と Babina 両者の共有派生形
質である可能性も捨てきれない。また、両者のミトゲノムで見られた tRNA-Glu
偽遺伝子のゲノム上の位置は、一般的なアカガエル型の遺伝子配置における対応 tRNA-Glu の位置に相当するため、オットンガエルとホルストガエルの遺伝子配置の変化は、一度ゲノム内に遺伝子重複が起こりその片方が欠失した結果である、「重複-ランダムロス型（Duplication	
 &	
 Random	
 Loss）」のプロセスを経て生じたと考えられる。ただし、遺伝子配置の変化は、ゲノム上の離れた場所で起きているため、最も一般的なミトゲノム遺伝子配置変化様式である「縦列重複-ランダムロス型（Tandem	
 D-RL）」では無い可能性が高く、重複が生じたメ
カニズムは、組換えなどによる非縦列重複の生成によるものと考えられた。また、tRNA-His 偽遺伝子の位置は、Odorrana 属に見られる配置変化した tRNA-Hisの位置と相同であることから(CR の下流で LTPFtRNA クラスターの上流)、Babinaと Odorrana 属の祖先で、CR の下流にこの tRNA 遺伝子が重複を起こした可能性
がある。	
 
	
 

105

[成果]	
 オットンガエルとホルストガエルのミトゲノム全長の決定に成功し、種内集団間の解析に適切な遺伝子を推定できた。さらに、アカガエル一般型から変化した遺伝子配置を見いだし、配置変化が生じた系統的位置や配置変化のプロセスを絞り込むことに成功した。	
 	 [将来の展望]	
 オットンガエルとホルストガエルは Babina 属に属するが、本属の最近縁属についてはいくつかの仮説がある。今後は、その候補である	
 Lithobates 属やNidirana 属、Odorrana 属のミトゲノム全情報を加えた大規模な系統解析を行う
ことにより、この問題に決着をつけられると期待される。また、Nidirana 属のミトゲノムを決定することで、ミトゲノムの遺伝子配置変化が生じた系統やその分子進化学的プロセスがより明確にできるだろう。	
 
	
 
研究業績	
 
①原著論文	
 1.	
 Kotaki,	
 M.,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 M.	
 Matsui,	
 M.	
 Kuramoto,	
 T.	
 H.	
 Djong	
 and	
 M.	
 
Sumida	 (2010)	
 Molecular	 phylogeny	
 for	
 the	
 diversified	 frogs	 of	
 genus	 Fejervarya	
 (Anura:	
 Dicroglossidae).	
 Zool.	
 Sci.,	
 27：386-395.	
 
	
 
2.	
 Kurabayashi,	
 A.,	
 N.	
 Yoshikawa,	
 N.	
 Sato,	
 Y.	
 Hayashi,	
 S.	
 Oumi,	
 T.	
 Fujii	
 and	
 M.	
 Sumida	 (2010)	
 Complete	 mitochondrial	 DNA	 sequence	
 of	
 the	
 endangered	
 frog	
 Odorrana	 ishikawae	
 (family,	
 Ranidae)	
 and	
 unexpected	
 diversity	
 of	
 mt	
 
gene	
 arrangements	
 in	
 ranids.	
 Mol.	 Phylogenet.	
 Evol.,	
 56：543-553.	
 
	
 
3.	
 Alam	
 M.	
 S.,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 Y.	
 Hayashi,	
 N.	
 Sano,	
 M.	
 M.	
 R.	
 Khan,	
 T.	
 Fujii	
 and	
 M.	
 Sumida	 (2010) Complete	 mitochondrial	 genomes	 and	
 novel	 gene	
 rearrangements	
 in	
 two	
 dicroglossid	
 frogs,	 Hoplobatrachus	
 tigerinus	
 and	
 Euphlyctis	
 hexadactylus,	
 from	 Bangladesh.	
 Genes	 &	
 Genet.	
 Syst.,	
 85:	
 219-232.	
 	
 4.	
 Kurniawan,	
 N.,	
 T.	
 H.	
 Djong,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 T.	
 Nishizawa,	
 Daicus,	
 M.	
 B.,	
 
H.	
 S.	
 Yong,	
 R.	
 Wanichanon,	
 I.	
 Yasir	 and	 M.	
 Sumida	 (2011)	
 Taxonomic	
 status	
 of	
 three	 types	 of	
 Fejervarya	
 cancrivora	
 from	
 Indonesia	
 and	
 other	 Asian	 countries	
 based	 on	 morphological	
 observations	 and	
 crossing	 experiments.	
 Zool.	
 Sci.,	
 28:	
 12-24.	
 	
 5.	
 Kuramoto,	
 M.,	
 N.	
 Satou,	
 S.	
 Oumi,	
 A.	
 Kurabayashi	
 and	
 M.	
 Sumida	 (2011)	
 Inter-	
 and	 intra-island	 divergence	
 in	
 Odorrana	 ishikawae	
 (Anura,	
 Ranidae)	
 
of	
 the	
 Ryukyu	
 Archipelago	
 of	
 Japan,	
 with	 description	
 of	
 a	
 new	
 species.	
 Zootaxa,	
 2767:	
 25-40.	
 

106

	
 
6.	
 Iwakoshi-Ukena,	
 E.,	
 K.	
 Ukena,	
 A.	
 Okimoto,	
 M.	
 Soga,	
 G.	
 Okada,	
 T.	
 Fujii,	 Y.	
 Sugawara	
 and	
 M.	
 Sumida	 (2011)	
 Identification	
 and	
 characterization	
 of	
 antimicrobial	
 peptides	
 from	 the	
 skin	 of	
 the	
 endangered	 frog	
 Odorrana	 ishikawae.	
 Peptides,	
 32:	
 670-676.	
 	
 ②総説･著書	
 
該当なし	
 
	
 
③学会発表	 	 	
 国際学会	
 1.	
 Sumida,	
 M.	
 “Artificial	
 breeding	 and	
 genetic	
 diversity	
 in	
 an	
 endangered	
 frog	
 Odorrana	 ishikawae:	
 Case	 study	 of	
 fauna	 conservation	
 from	 Japan.”	
 2010	 International	
 Meeting	
 of	
 the	
 Association	
 for	
 Tropical	
 Biology	 and	
 Conservation	
 (Jul.,	
 2010.	
 Bali,	
 Indonesia)	
 
	
 
2.	
 Igawa,	
 T.,	
 M.	
 Okuda,	
 S.	
 Oumi,	
 S.	
 Katsuren,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 T.	
 Umino	 and	
 M.	
 Sumida.	
 “Development	
 of	
 microsatellite	 markers	
 and	
 population	
 genetic	
 analysis	
 of	
 the	
 endangered	 frog,	
 Odorrana	 ishikawae	
 (Anura:	
 Ranidae).”	
 2010	 International	
 Meeting	
 of	
 the	
 Association	
 for	
 Tropical	
 Biology	 and	
 Conservation	
 (Jul.,	
 2010.	
 Bali,	
 Indonesia)	
 
	
 
3.	
 Kurniawan,	
 N.,	
 T.	
 H.	
 Djong,	
 T.	
 Igawa,	
 M.	
 Kotaki	 and	
 M.	
 Sumida	 “Geographic	 distribution	
 and	
 phylogenetic	
 relationship	
 of	
 genus	 Fejervarya	
 from	
 Indonesian	 Sunda	 Land	
 inferred	
 from	 16S	 rRNA	 gene.”	
 2010	
 International	 Meeting	 of	 the	
 Association	
 for	
 Tropical	
 Biology	
 and	
 Conservation	
 (Jul.,	 2010.	 Bali,	
 Indonesia)	
 	
 4.Kurabayashi,	
 A.,	
 N.	
 Yoshikawa,	
 N.	
 Sato,	
 Y.	
 Hayashi,	
 S.	
 Oumi,	
 T.	
 Fujii,	
 
and	
 M.	
 Sumida.	
 “Mitochondrial	 genome	 of	 the	
 endangered	 frog	
 Odorrana	 ishikawae	
 and	
 unexpected	
 diversity	
 of	
 mt	
 genomic	
 arrangements	
 in	
 the	
 family	 Ranidae.”	
 International	
 Symposium	
 on	
 Biodiversity	
 Sciences	 (ISBDS)	
 2010,	
 “Genome,	 Evolution	
 and	
 Environment.”	
 (Aug.,	
 2010.	
 Nagoya,	 Japan)	
 	
 5.Sumida,	
 M.	
 ”Attempt	
 at	
 artificial	
 breeding	 for	
 conservation	
 and	
 analyses	
 of	
 genetic	
 divergences	
 and	
 postmating	 isolation	
 mechanisms	
 in	
 an	
 endangered	
 frog	
 Odorrana	 ishikawae	
 from	 Japan.”	
 Internatinal	
 Congress	
 of	
 BioSystematics	
 Berlin	 2011	 (Feb.,	 2011,	
 Berlin,	
 Germany)	
 	
 6.Hasan,	
 M.,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 T.	
 Igawa,	
 Md.	
 M.	
 R.	
 Khan,	
 M.	
 S.	
 Alam,	
 T.	
 H.	
 Djong,	
 

107

N.	
 Kurniawan,	
 M.	
 Kuramoto,	
 and	
 M.	
 Sumida.	
 ”Genetic	
 divergences	 and	
 phylogenetic	
 relationships	
 in	
 the	
 frogs	 from	 South	 to	
 East	 Asia.”	
 	 Internatinal	
 Congress	
 of	
 BioSystematics	
 Berlin	 2011	 (Feb.,	 2011,	
 Berlin,	 Germany)	
 
	
 
国内学会	
 
1.	
 Hasan,	
 M.・M.	
 M.Islam・Md.	
 M.	
 R.	
 Khan・M.	
 S.	
 Alam・T.	
 H.	
 Djong・T.	
 Igawa・N.	
 Kurniawan・M.	
 Kuramoto・M.	
 Sumida	 “Genetic	
 divergences	 and	
 phylogenetic	
 relationships	
 in	
 the	
 frogs	 from	
 south	 to	
 east	 Asia.”日本学会動物学会第 62 回中国四国支部大会	
 (2010 年 5 月,	
 山口)	
 
	
 
2.	
 Alam,	
 M.	
 S.・A.	
 Kurabayashi・Y.	
 Hayashi・N.	
 Sano・M.	
 M.	
 R.	
 Khan・
T.	
 Fujii・M.	
 Sumida	 “Complete	 mitochondrial	 genomes	 and	
 novel	 gene	
 rearrangements	
 in	
 two	
 dicroglossid	
 frogs,	 Hoplobatrachus	
 tigerinus	
 and	
 Euphlyctis	
 hexadactylus,	
 from	 Bangladesh.”	
 日本遺伝学会第82回大会	
 (2010年9月,札幌)	
 
	
 
3.	
 Hasan,	
 M.・M.	
 M.	
 Islam・M.	
 M.	
 R.	
 Khan・M.	
 S.	
 Alam・T.	
 Igawa・M.	
 Kuramoto・M.	
 Sumida	 “Species	
 diversity	 and	
 phylogenetic	
 relationships	
 among	 frogs	 from	 Bangladesh	 revealed	
 by	 nucleotide	 sequences	 of	
 mitochondrial	
 16S	
 
rRNA	
 gene.”	
 日本遺伝学会第82回大会	
  (2010年9月,	
 札幌)	
 
	
 
4.	
 井川武・奥田優・大海昌平・勝連盛輝・倉林敦・海野徹也・住田正幸	
 「マイクロサテライトマーカーを用いた絶滅危惧種および天然記念物イシカワガ
エルの遺伝的集団構造の解明」	
 日本遺伝学会第 82 回大会	  (2010 年 9 月,	
 札
幌)	
 
	
 
5.	
 住田正幸・佐藤直樹・M.	
 M.	
 Islam・井川武・吉川夏彦・倉林敦・大海昌
平・勝連盛輝・福庭博子・新谷望・藤井保・倉本満	
 「絶滅危惧種イシカワガ
エルにおける飼育下繁殖の試みと交配後隔離機構の解明」日本遺伝学会第82回大会	
  (2010年9月,	
 札幌)	
 
	
 
6.	
 住田正幸・西谷拓磨・菅原弘貴・倉林敦・勝連盛輝・大海昌平	
 「絶滅危惧種イボイモリの飼育下繁殖の試みとミトコンドリアゲノムの解析」	
 日本動物学会第81回大会	
  (2010年9月,	
 東京)	
 
	
 
7.	
 Islam,	
 M.	
 M.・M.	
 M.	
 R.	
 Khan・M.	
 Kuramoto・M.	
 Sumida	 “Reproductive	 isolating	 mechanisms	
 among	 frogs	 of	
 genus	 Fejervarya	
 elucidated	 by	
 crossing	 experiments,	
 histological	
 and	
 spermatogenesis	
 observations.”	
 日本動物学会第81回大会	
  (2010年9月,	
 東京)	
 

108

Euphlyctis	
 genera.	
 The	
 interspecific	
 hybrids	
 between	 female	 H.	
 tigerinus	
 and	
 male	 H.	
 chinensis	
 became	 inviable	
 at	
 tadpole	 stage,	 but	 a	 small	 number	
 
of	
 the	
 hybrids	
 developed	 normally	
 and	
 matured	 only	
 three	 individuals.	
 These	 mature	 hybrids	
 were	 found	 to	 be	
 triploid	
 and	
 sterile	
 by	
 the	
 chromosomal	
 and	
 histological	
 observations.	
 These	 results,	
 suggest	
 incomplete	 hybrid	 inviability	
 between	 these	 two	
 species.	
 The	
 allozyme	
 study	 showed	 9	
 diagnostic	 loci	 among	 24	
 loci	 investigated	
 in	
 H.	
 tigerinus	
 and	
 H.	
 chinensis,	 and	
 parental	
 allele	 constitutions	
 at	 these	 loci	
 in	
 the	
 triploid	 hybrids.	
 The	
 maternal	
 inheritance	
 of	
 mitochondrial	 genomes	
 was	
 retained	
 in	
 the	
 
hybrids.	
 	 	 Future	 research	 plan	
 	 We	 could	 not	
 include	 inland	 type	 H.	
 chinensis	
 in	
 our	
 crossing	 experiments	
 at	
 present	
 and	
 in	
 future	 studies	
 we	
 have	 plan	 to	
 collect	
 and	
 to	
 check	 their	 post	
 mating	 isolating	 mechanisms	
 with	
 related	 species.	
 However,	
 presently	
 
we	
 are	
 also	 doing	 crossing	 experiments	
 among	 different	 cryptic	
 species	 of	
 Euphlyctis	
 genus	 to	
 know	 their	 reproductive	 isolating	 mechanisms.	
 	
 Original	 Paper	 1.	
 Alam	 MS,	 Kurabayashi	
 A,	
 Hayashi	
 Y,	
 Sano	 N,	 Khan	 MMR,	
 Fuji	 T	
 and	
 Sumida	 M.	
 Complete	 mitochondrial	 genomes	 and	
 novel	 gene	
 rearrangements	
 in	
 two	
 
dicroglossid	
 frogs,	 Hoplobatrachus	
 tigerinus	
 and	
 Euphlyctis	
 hexadactylus,	
 from	
 Bangladesh.	
 Genes	 and	
 Genet.	
 Syst.	
 85	
 (3):219-232,	
 2010.	
 	 	
 Meeting	 or	
 conferences	 (National	 Conference)	
 1.	
 Alam	 MS,	 Kurabayashi	
 A,	
 Hayashi	
 Y,	
 Sano	 N,	 Khan	 MMR,	
 Fuji	 T	
 and	
 Sumida	 M.	
 Complete	 mitochondrial	 genomes	 and	
 novel	 gene	
 rearrangements	
 in	
 two	
 
dicroglossid	
 frogs,	 Hoplobatrachus	
 tigerinus	
 and	
 Euphlyctis	
 hexadactylus,	
 from	
 Bangladesh.	
 The	
 82nd	 Genetic	
 Society	
 of	
 Japan,	
 Hokkaido,	
 Sep.	
 20-22,	 2010.	 	 	
 2.Hasan	 M,	
 Islam	 MM,	
 Khan	 MMR,	 Alam	 MS,	 Igawa	 T,	
 Kuramoto	
 M	
 and	
 Sumida	 M	 (2010)	
 Species	 diversity	 and	
 phylogenetic	
 relationships	
 among	 frogs	 from	
 Bangladesh	 revealed	
 by	 nucleotide	 sequences	 of	
 mitochondrial	
 15S	
 rRNA	 gene.	
 Presented	
 in	
 the	
 82nd	
 annual	 meeting	
 of	
 The	
 Genetics	
 Society	
 of	
 Japan	 in	
 Hokkaido	
 University,	
 Hokkaido,	
 Japan.	
 	 3.Hasan	 M,	
 Islam	 MM,	
 Khan	 MMR,	 Alam	 MS,	 Djong	 TH,	
 T	 Igawa,	
 Kurniawan	
 N,	
 Kuramoto	 M	 and	
 Sumida	 M	
 (2010)	
 Genetic	
 divergences	
 and	
 phylogenetic	
 

77

	
 
8.	
 小巻翔平・倉林敦・Mohammed	
 Mafizul	
 Islam・住田正幸・東城幸治	
  「中部日本のトノサマガエル種群の交雑帯における遺伝子浸透」	
 日本爬虫両棲類学会第81回大会	
  (2010年10月,	
 横浜)	
 
	
 
④科研費等の受け入れ状況	
 1.	
 文部科学省特別教育研究経費̶国際的に卓越した教育研究拠点機能の充実	
 先駆的両生類研究の展開̶両生類絶滅危惧種の保全	
  14,900 千円	
  （担当:	 住田正幸、矢尾板芳郎）	
 
	
 
2.	
 日本学術振興会科学研究費補助金・基盤研究(C)「絶滅危惧種イシカワガ
エルの保全と遺伝的多様性に関する研究」1,040 千円	
 （代表者：住田正幸,	
 分
担者:倉林敦）	
  	
 
	
 
3.	
 奨学寄付金	  500 千円（担当:	
 住田正幸）	
 109