SIID000000

細菌 Premium 報告書

シリアル番号XXXXXxx

管理番号 SIID

000000

作業完了日

202x 年 xx 月 xx 日

発

202x 年 xx 月 xx 日

行

日

極秘資料

本報告書の使用にあたっての確認事項
1.

本報告書は株式会社テクノスルガ・ラボ 技術責任者による承認済みです。

2.

研究発表 (論文投稿) や特許明細書への転用を除き、本報告書の一部または全部をそのままあるいは改変して第三者へ転用などされた場合には、株式会社テクノスルガ・ラボは一切の責任を負いかねます。

3.

当社受託サービス等は、試験・研究用途を目的として販売しております。当社受託サービス等を医療や臨床診断などの試験・研究目的以外へご使用される場合、これに起因する損失・損害等については、当社では一切の責任を負いかねます。

生理・性状

遺伝子解析

印

印

株式会社テクノスルガ・ラボ 研究センター 技術部〒424-0065

静岡県静岡市清水区長崎 388 番地の 1

TEL：054-349-6211

FAX：054-349-6121

Mail：tsl-contact@tecsrg.co.jp

1 / 15R0

SIID000000

検体情報
検体名SAMPLE

SIID

受取日

00000

202x 年 xx 月 xx 日

備考

目的
16S rRNA 遺伝子 (16S rDNA) 塩基配列解析、形態観察および生理・生化学性状試験 (以下、細菌第一段階試験および細菌第二段階試験) の結果から、検体の帰属分類群を推定します。
方法
1. 培養条件・培地

BD BBL Trypticase Soy Agar (Becton Dickinson, USA)

・培養温度

30°C

・培養確認時間

24 時間

・その他条件好気培養

2. 16S rDNA 塩基配列解析
・ DNA 抽出シカジーニアス DNA 抽出試薬 ST (Kanto Chemical, Japan)

・ PCR 増幅

Tks Gflex DNA Polymerase (Takara Bio, Japan)・ サイクルシーケンス

BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems, USA)・ 使用プライマー1)

PCR 増幅: 9F, 1510R
シークエンス (約 1,500 bp): 9F, 515F, 1099F, 536R, 926R, 1510R

・ シーケンス

ABI PRISM 3500xL Genetic Analyzer System(Applied Biosystems)

・ 塩基配列決定

ChromasPro 2.1 (Technelysium, AUS)

・BLAST 相同性検索 2)

・ 簡易分子系統解析

解析ソフトウェア: ENKI v3.2 (TechnoSuruga Laboratory, Japan)
データベース
DB-BA17.0 (TechnoSuruga Laboratory)
国際塩基配列データベース (DDBJ/ENA/GenBank)
検索日: 202x 年 xx 月 xx 日
系統樹の推定: 近隣結合法 3)
塩基置換モデル: Kimura-2-parameter4)
樹形の信頼性評価: ブートストラップ法 5) (1,000 反復)

2 / 15R0SIID000000

3. 細菌第一段階試験
実体顕微鏡によるコロニー観察、光学顕微鏡による形態観察および Barrow & Feltham 6) の方法に基づき、カタラーゼ反応、オキシダーゼ反応、ブドウ糖からの酸/ガス産生、ブドウ糖の酸化/発酵(O/F) について試験を行いました。
・ グラム染色フェイバーG「ニッスイ」(Nissui Pharmaceutical, Japan)

・ 顕微鏡

光学顕微鏡 BX50F4 (Olympus, Japan)・ 実体顕微鏡

SMZ800N (Nikon, Japan)

4. 細菌第二段階試験
細菌第二段階試験には以下のキットを用いました。
・ 使用キット

API 50 CHB (bioMérieux, FRA)

5. 追加試験
追加試験は英国 NCIMB Ltd.との技術提携事項および分類・同定の関連文献に従い実施しました。

＊ 塩基配列は、シーケンサーからの生データ (エレクトロフェログラム) を当社技術者が目視により確認し、修正を行った後に決定しています。
＊ 会社名、製品名は一般に各社の日本および各国での商標または登録商標です。

3 / 15R0SIID000000

結果・考察
1. SII000000
表 1-1. SII000000 の DB-BA に対する BLAST 検索結果
相同性スコアで上位 30 に検索された 16S rDNA 塩基配列データ
登録名
Bacillus licheniformis
Bacillus haynesii
Bacillus paralicheniformis
Bacillus cabrialesii
Bacillus inaquosorum
Bacillus swezeyi
Bacillus halotolerans
Bacillus aerius
Bacillus sonorensis
Bacillus mojavensis
Bacillus vallismortis
Bacillus subtilis
Bacillus atrophaeus
Bacillus stercoris
Bacillus spizizenii
Bacillus nakamurai
Bacillus siamensis
Bacillus amyloliquefaciens
Bacillus capparidis
Bacillus stratosphericusBacillus aerophilus
Bacillus acidicola
Bacillus tequilensis
Bacillus xiamenensis
Bacillus zhangzhouensis
Bacillus aquimaris
Bacillus australimaris
Bacillus camelliae
Falsibacillus albus
Bacillus carboniphilus

株名DSM13NRRLB-41327
KJ-16
TE3
DSM22148
CCUG70177
DSM880224K
BCRC17416
IFO15718
DSM11031
DSM10
JCM9070
D7XPN1
DSM15029
CCUG68786
PD-A10
NBRC15535
EGI6500252
41KF2a
28K
105-2
10b
MCCC1A00008
MCCC1A08372
TF-12
MCCC1A05787
7578-1
GY10110
JCM9731

Accession No.
AE017333
MRBL01000076
KY694465
MK462260
AMXN01000021
MRBK01000096
AM747812
AJ831843
EF433411
AB021191
AB021198
AJ276351
AB021181
MN536904
MN536905
KU836854
GQ281299
AB255669
KY003162
AJ831841
AJ831844
AF547209
HQ223107
JX680066
JX680133
AF483625
JX680098
KT438835
MH135316
AB021182

相同率
1548/1548 (100.0%)1503/1508 (99.7%)
1499/1508 (99.4%)
1519/1546 (98.3%)
1517/1544 (98.3%)
1492/1508 (98.9%)
1512/1541 (98.1%)
1484/1494 (99.3%)
1461/1468 (99.5%)
1498/1527 (98.1%)
1500/1531 (98.0%)
1490/1518 (98.2%)
1487/1516 (98.1%)
1482/1509 (98.2%)
1481/1509 (98.1%)
1481/1509 (98.1%)
1481/1520 (97.4%)
1444/1473 (98.0%)1480/1539 (96.2%)
1478/1535 (96.3%)
1478/1535 (96.3%)
1484/1549 (95.8%)
1427/1457 (97.9%)
1460/1517 (96.2%)
1454/1515 (96.0%)
1448/1507 (96.1%)
1453/1515 (95.9%)1475/1550 (95.2%)
1463/1533 (95.4%)
1450/1509 (96.1%)

BSL

注 1) BSL（バイオセーフティレベル）はレベル 1* (日和見病原体) 以上を表記し、空欄はレベル 1 を意味します (参照 補足 7)。
注 2) 株名中の“ _ (アンダ―バー) ”は、スペースを意味します。
注 3) 網掛けは、簡易分子系統解析に供した配列データを示します。

4 / 15R0SIID000000

表 1-2. SII000000 の国際塩基配列データベースに対する BLAST 検索結果
相同性スコアで上位 30 に検索された 16S rDNA 塩基配列データ
登録名
Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformisBacillus licheniformis
Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis
Bacillus sp.

株名
SRCM103583
NCTC10341
SCDB 34
BL1202LBMAE-JZ-B3OK12ATCC 14580; DSM 13
DSM 13
P8_B2
ATCC 14580
MCC 2514
SRCM103529
0DA23-1
ATCC 9789
BL-010
SRCM100027
SRCM100141
SCCB 37
CP6ATCC 14580; DSM 13
KNU11
PB3
MT-B06
SRCM103608
H2
FDAARGOS_923
LCDD6KS28
PAMC28748

5 / 15

Accession No.
CP035404
LR134392
CP014793
CP017247
MK373278
CP060498
CP000002
AE017333
CP045814
CP034569
CP038186
CP035228
CP031126
CP023729
CP022477
CP021677
CP021669
CP014794
CP049330
NR_074923
CP042252
CP025226
CP032538
CP035405
LR698983
CP065943
CP065647
CP065029
CP043490
CP060192

相同率
1548/1548 (100.0%)
1548/1548 (100.0%)
1548/1548 (100.0%)
1548/1548 (100.0%)
1548/1548 (100.0%)
1548/1548 (100.0%)
1548/1548 (100.0%)
1548/1548 (100.0%)
1547/1548 (99.9%)
1547/1548 (99.9%)
1547/1548 (99.9%)
1547/1548 (99.9%)
1547/1548 (99.9%)
1547/1548 (99.9%)
1547/1548 (99.9%)
1547/1548 (99.9%)
1547/1548 (99.9%)
1547/1548 (99.9%)
1547/1548 (99.9%)1545/1545 (100.0%)1546/1548 (99.9%)
1546/1548 (99.9%)
1546/1548 (99.9%)
1546/1548 (99.9%)
1546/1548 (99.9%)
1546/1548 (99.9%)
1546/1548 (99.9%)
1546/1548 (99.9%)
1546/1548 (99.9%)
1546/1548 (99.9%)

R0

SIID000000

0.0165

Bacillus cabrialesii TE3 T (MK462260)

51

Bacillus inaquosorum DSM22148 T (AMXN01000021)

23

Bacillus subtilis DSM10 T (AJ276351)

55
46

Bacillus stercoris D7XPN1 T (MN536904)
Bacillus spizizenii DSM15029 T (MN536905)

68

69

Bacillus halotolerans DSM8802 T (AM747812)
Bacillus mojavensis IFO15718 T (AB021191)

28

Bacillus vallismortis DSM11031 T (AB021198)
Bacillus nakamurai CCUG68786 T (KU836854)
84

70
99

Bacillus licheniformis DSM13 T (AE017333)
Bacillus aerius 24K T (AJ831843)

74

48

49SIID00000

Bacillus haynesii NRRLB-41327 T (MRBL01000076)
Bacillus sonorensis BCRC17416 T (EF433411)

99

Bacillus paralicheniformis KJ-16 T (KY694465)
Bacillus swezeyi CCUG70177 T (MRBK01000096)
Bacillus atrophaeus JCM9070 T (AB021181)
Bacillus aerophilus 28K T (AJ831844)

図 1-1. SII000000 の 16S rDNA 塩基配列に基づく簡易分子系統樹
左上の線はスケールバー、系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値、
株名の末尾の T はその種の基準株 (Type strain)、BSL はバイオセーフティレベル(BSL1*(日和見病原体)以上を表記) を示します。

6 / 15R0SIID000000

図 1-3. SII000000 のコロニー像

図 1-4. SII000000 のグラム染色像

7 / 15R0

SIID000000

表 1-3. 細菌第一段階試験結果
SII000000

試験項目
培養温度 (°C)

30桿菌(0.8 μm × 1.0-3.0 μm)

細胞形態

グラム染色性＋

芽胞の有無

＋運動性＋

コロニー形態

生育温度試験培地

SCD 寒天培養時間 (hr)

24 hr

直径

1~3 mm

色調

淡黄色

形

円形

隆起状態

レンズ状

周縁

全縁

表面の形状など

スムース

透明度

不透明

粘稠度

バター様

37 (°C)＋45 (°C)＋カタラーゼ反応＋オキシダーゼ反応
グルコースからの酸/ガス産生(酸産生/ガス産生)
O/F テスト(酸化/発酵)－＋/＋＋/－＋ : 陽性、－ : 陰性

8 / 15R0

SIID000000

表 1-4. SIID000000 の第二段階試験結果 (API50CHB)

＋: 陽性

－: 陰性

API50CHB 項目の解説
項目

基質成分

項目

基質成分

項目

基質成分

0.

コントロール21.

-メチル-D-グルコシド*

42.

D-タガトース*

1.

グリセロール*

22.

N-アセチルグルコサミン*

43.

D-フコース*2.

エリスリトール*

23.

アミグダリン*44.

L-フコース*3.

D-アラビノース*24.

アルブチン*

45.

D-アラビトール*

4.

L-アラビノース*25.

エスクリン*

46.

L-アラビトール*

5.

リボース*

26.

サリシン*

47.

グルコネート*6.

D-キシロース*27.

セロビオース*48.

2-ケトグルコネート*

7.

L-キシロース*

28.

マルトース*

49.

5-ケトグルコネート*

8.

アドニトール*29.

ラクトース*

ONPG

-ガラクトシダーゼ**9.

-メチル-D-キシロース*

30.

メリビオース*

ADH

アルギニンジヒドロラーゼ**

10.

ガラクトース*31.

サッカロース*LDC

リシンデカルボキシラーゼ**

11.

グルコース*

32.

トレハロース*

ODC

オルニチンデカルボキシラーゼ**12.

フラクトース*

33.

イヌリン*

CIT

クエン酸の利用性**13.

マンノース*

34.

メレチトース*

H2S

H2S 産生**14.

ソルボース*

35.

ラフィノース*URE

ウレアーゼ**

15.

ラムノース*

36.

でんぷん*

TDA

トリプトファンデアミナーゼ**16.

ズルシトール*37.

グリコーゲン*

IND

インドール産生**

17.

イノシトール*38.

キシリトール*

VP

アセトイン産生(VP) **18.

マンニトール*39.

ゲンチオビオース*

GEL

ゼラチナーゼ**19.

ソルビトール*

40.

D-ツラノース*

NIT

硝酸塩還元**

20.

-メチル-D-マンノシド*

41.

D-リキソース**発酵性試験、**生化学試験

9 / 15R0SIID000000

表 1-5. SIID000000 の第二段階試験 (追加試験) 結果
試験項目

試験結果

55°C での生育＋メチルレッドテスト－5% NaCl での生育＋7% NaCl での生育－＋: 陽性、－: 陰性

10 / 15

R0

SIID000000

SIID000000
BLAST 検索により最も高い相同性を示した基準株: 表 1-2, 1-3
登録名

株名

Accession No.

相同率(%)

Bacillus licheniformis

DSM 13

AE017333

100

考察: 16S rDNA 塩基配列解析

SIID000000 は Bacillus 属が構成するクラスター内に含まれ、Bacillus licheniformis DSM 13T(AE017333) と同一の分子系統学的位置を示しました (図 1-1)。よって、16S rDNA 塩基配列解析の結果からは、SIID000000 を B. licheniformis と同定いたします。
考察: 細菌第一・第二段階試験

細菌第一段階試験の結果、SIID00000 は運動性を持つグラム染色陽性の桿菌で、グルコースを酸化及び発酵し、カタラーゼ反応は陽性を示し、オキシダーゼ反応は陰性を示しました（図 1-2,
図 1-3 及び表 1-3）。これらの性状は、16S rDNA 部分塩基配列の結果において帰属が示された、Bacillus 属の性状と一致しました 6)。
API キットをもちいて行った細菌第二段階試験の結果、SIID00000 は L-アラビノースやリボース、マンニトールを発酵し、エスクリンやラクトース、ならびにトレハロースを発酵しませんでした(表 1-4）。また追加試験の結果、SIID00000 は 50°C で生育し、メチルレッドテストは陰性を示し、5%NaCl 添加培地では生育し、7% NaCl 添加培地では生育しませんでした(表 1-5）。これらの性状は、16S rDNA 遺伝子解析の結果において帰属が示唆された B. licheniformis とほぼ一致しました6)。よって、生理・生化学性状試験の結果からは、SIID00000 を B. licheniformis と同定いたします。
総合考察
16S rDNA 塩基配列解析および生理・生化学性状試験共に、検体の B. licheniformis への帰属を支持しました。よって、SIID00000 を B. licheniformis と同定します。
同定結果
Bacillus licheniformis

11 / 15

R0

SIID000000

まとめ
検体名

SIID

帰属分類群

バイオセーフティ
レベル

SAMPLE

000000

Bacillus licheniformis

レベル 1

バイオセーフティレベルについて(日本細菌学会バイオセーフティ指針より)
レベル

内容

1

ヒトに疾病を起こし、或いは動物に獣医学的に重要な疾患を起こす可能性のないもの(日和見感染を含む)

2

ヒト或いは動物に病原性を有するが、実験室職員、地域社会、家畜、環境等に対し、重大な災害とならないもの、実験室内で曝露されると重篤な感染を起こす可能性はあるが、有効な治療法、予防法があり、伝播の可能性は低いもの。

3

ヒトに感染すると重篤な疾病を起こすが、他の個体への伝播の可能性は低いもの。

12 / 15R0SIID000000

検体の近縁となった既知種の分離源情報
SII000000
近縁菌種
分離源

引用文献
BSLBacillus licheniformis
土壌、海水、食品、香辛料、コンポスト、羊のルーメン など
Colin R. Harwood (1989). Isolation and identification of aerobic endosporeforming bacteria. In Bacillus / Biotechnology Handbooks, Volume 2, pp27-56,
Plenum Press, New York.
レベル 1

備考

13 / 15R0

SIID000000

本報告書に付随する電子データ一覧
データ内容

形式

塩基配列テキストファイル

txt

エレクトロフェログラム

ab1

写真

JPG

補足
1. 本報告書で示す検体の同定結果は、16S rDNA 塩基配列解析および生理・生化学性状に基づき推定された帰属分類群です。分類学に基づく同定 (最終的な種の異同の決定) には、形態観察や生理・生化学性状試験、DNA 塩基配列に基づく分子系統解析、化学的性状試験、DNA-DNA ハイブリッド形成試験などの試験結果から総合的に判断することが重要です。
2. 細菌の同定では、分類の基準となる基準株 (種・亜種の命名基準) と比較することが重要とされています。本報告書では、各菌種・亜種の基準株の 16S rDNA 塩基配列との比較および解析の結果から、検体の帰属分類群を推定しています。
3. 本報告書で示す学名 (菌種) に関する情報は、以下のウェブサイトにてご確認ください。
LPSN-List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature (http://www.bacterio.net/)
4. DB-BA は、弊社と国立遺伝学研究所との共同開発品です。分類学的に細菌の同定を行う際は基準株との比較を行うことが重要であることから、当データベースは基準株に由来する 16S rDNA塩基配列データのみを収録しています。
5. 国際塩基配列データベース (DDBJ/ENA/GenBank) に対する相同性検索の結果は、検索を実施した時点の情報です。国際塩基配列データベースの登録情報は常に更新されており、論文などを投稿する前には、再度相同性検索することをお勧めします。
6. 簡易分子系統解析は、論文などの投稿を前提としたアライメント結果の編集および系統樹の作成は行っておりません。
7. 本報告書で示すバイオセーフティレベル (BSL) は、日本細菌学会バイオセーフティ指針「病原細菌の BSL レベル」に従います。BSL はレベル 1 が最も低いものの、レベル 1 であっても日和見感染が報告されている種があり、その安全性を保障するものではありません。また、検体の帰属種または近縁種の BSL がレベル 2 以上である場合には、検体は同等の取扱いをされることをお勧めします。なお、本報告書では、日和見病原体については「BSL1*」と表記しています。
8. 本報告書に関するご質問等につきましては、株式会社テクノスルガ・ラボ 技術部までお問合わせください。

14 / 15R0SIID000000

引用文献1) 中川恭好, 川崎浩子. 遺伝子解析法 16S rRNA 遺伝子の塩基配列決定法. 日本放線菌学会編集.

放線菌の分類と同定. 東京: 日本学会事務センター; 2001. pp. 88–117.
2) Altschul SF, Madden TF, Schäffer AA, Zhang J, Zhang Z et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a newgeneration of protein database search programs. Nucleic Acids Res 1997;25:3389–3402.
3) Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol
Biol Evol 1987;4:406–425.
4) Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative
studies of nucleotide sequences. J Mol Evol 1980;16:111–120.
5) Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap. Evolution 1985;39:783–791.
6) Barrow GI, Feltham RKA. Cowan and Steel’s Manual for the Identification of Medical Bacteria, 3rd ed.
Cambridge: Cambridge University Press; 1993.

15 / 15R0