C18で分離できない時の2nd Choice:
C28・C30・PFPがおもしろい

クロマニックテクノロジーズ
長江徳和 塚本友康
Email: info@chromanik.co.jp
http://chromanik.co.jp

分離を変えるには・・
疎水性相互作用相互作用の異なるカラムに交換する

アルキル基
親水性相互作用
イオン交換相互作用
陰イオン
交換基
π-π相互作用
フェニル基

N+

陽イオン
交換基
OO-S

水素結合
ジオール基
OHO

アミド基
OHCH3

カラム充填剤基材NO

CH32

分離を変えるには・・2
疎水基 (主効果)
吸着性基(二次効果相互作用)

既存の分離剤
主効果(疎水基)

二次効果相互作用
制御型分離剤
主効果
(疎水基)

二次効果
(吸着等)

第二主効果を持つ
二足型分離剤
主効果
(疎水基)

制御された
二次効果

第二の主効果3

本日の内容• C28カラムの紹介(C30)– 100%水系移動相で使用で来る理由– 親水性化合物の分離への適用• PFPカラムの紹介(ペンタフルオロフェニル)– PFPカラムの分離の特長– PFPカラムでHILIC？イオン交換？

4オクタコシル(C28)• 疎水性相互作用が主な相互作用• 水系の移動相での保持の安定性が高い• 立体選択性が高い• 極性基導入型ODSより、耐久性が高い

CH3

H3C

5

C18とC28の標準試料の分離
23Sunniest C18

1Column: Sunniest C18, 5mm 150 x 4.6 mm
Sunniest RP-AQUA, 5m m 150 x 4.6 mm
Sunniest C18, 5mm 150 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=75/25
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Pressure: 5.4 MPa
Sample: 1 = Uracil,
2 = Caffeine,
3 = Phenol,
4 = Butylbenzene, (N=15,700)
5 = o-Terphenyl, (N=15,000)
6 = Amylbenzene, (N=15,300)
7 = Triphenylene, (N=14,500)%C=!6%
576423Sunniest RP-AQUA

1551076

40%C=16%15202530

35Retention time/min

6ODSとの比較1
1

Conventional C18%C=18%

Column size: 4.6x250 mm
Mobile phase: 97/3=CH3OH/H2O
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 25 ºC2, 3
4C18Detection: UV at 295nm
05101520retention time / min

2530Sample: 1=δ-Tocopherol
HOO

Sunrise C28%C=18%

2=γ-Tocopherol

1C28HOO

3=β-Tocopherol

2HO43O

4=α-Tocopherol
HO05101520
retention time / min

253035O

固定相容量は同じ
7

ODSとの比較2
C181 2

12Column size: 4.6x250 mm
Mobile phase:80/20=CH3CN/CHCl3
Flow rate: 1.0 mL/min

Conventional
C18 %C=18%

C28

Temperature: 30 ºC
Detection: UV at 450nm
Sample: 1=a-Carotene

Sunrise C28 %C=18%

2=b-Carotene
05101520253035Retention time / min

固定相容量は2倍8ODSカラムの保持挙動（水100%）
条件カラム：ODS 4.6 x 150 mm移動相：水
カラム圧力：6.0MPa
カラム出口以降： 1.7MPa
１時間通液停止後再度通液し測定

流速: 1.0 mL/min
温度: 40 ℃
検出: RI
試料: 1. 亜硝酸ナトリウム
2. 2-プロパノール

N. Nagae, T. Enami and S. Doshi, LC/GC North America October 2002.

保持時間：5.40minから0.41minに減少

再現性がない9SunShell RP-Aqua(C28) の40 oCでの保持
核酸塩基の分離

25 ºC

123421（ポンプ送液1時間停止毎に測定）

5

Relative retention of thymine
(%)

40 ºC

40℃でのチミンの保持時間の変化

5340123Retention time/min

4Column: SunShell RP-Aqua, 2.6 μm 75 x 4.6 mm
Mobile phase: 10mM Phosphate buffer pH7.0
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC and 25 ºC
Sample: 1 = Cytosine, 2 = Uracil, 3 = Thymidine,
4 = Uridine, 5 = Thymine

1009080706050403020
100
12345Measurement number every stop flow
緩衝液のみの移動相を用いた場合の保持の再現性を試験しました。
毛管作用により，ポンプを停止し充填剤周りの圧力を大気圧にすると，通常のC18カラムは細孔内からの移動相の抜けだしが起こり，保持時間は大幅に減少しますが，SunShell RP-Aquaほとん
ど細孔内からの抜け出しは起こっておらず，94%以上の再現性を示しました。

10100Relative plate number of thtmine (%)

Relative retetion of ethylbenzene (%)

C28の酸性、塩基性条件下の耐久性
908070605040Sunniest RP-AQUA

3020020406080100120140100908070605040Sunniest RP-AQUA

30200100200300

400

Time (h)Time (h)Durable test conditions

Durable test conditions

Column: Sunniest RP-AQUA, 5mm 150 x 4.6 mm
Mobile phase: 0.5% TFA
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 60 ºC

Column: Sunniest RP-AQUA, 5mm 150 x 4.6 mm
Mobile phase: 20mM Phosphate buffer pH8.0
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC

11保持の減少は細孔からの移動相の抜け出し
内径0.5mmのガラス管

10nm

内径0.5mmのガラス管内で赤インクは6cm上昇する。 6cm上昇時に作用してる圧力は0.006気圧である。内径が1mmでは30m上昇し、3気圧の圧力が作用していることになる。

実際の充填剤の細孔径は約10nmであり，1mmの1/100である。毛管作用で発生する圧力は100気圧以上となる。
カラムを大気圧状態にして、移動相を充填剤の細孔から抜け出させるために必要な圧力は１気圧である。充填剤の細孔の大きさを考慮すると毛管現象によりこの１気圧は簡単に発生する。
12毛細管現象水とテフロン管の場合

水とガラス管の場合
毛管現象の式:h=2g cosq /(rrg): 表面張力: 液体の密度（比重）

q
gr

hrhq

液体が管に濡れる場合

液体が管に濡れない場合

q < 90°q > 90°13撥水性と疎水性
撥水性

水をはじく性質
θ水『液体と物質の表面との接触角が90度より大きくその角度が大きいほど撥水性が強い』

疎水性物質

水と混ざりにくい性質

物質をn-オクタノールに溶解して水と混ぜ合わせ、平衡に達したときの双方での濃度の比、分配係数によって表される。分配係数はしばしば常用対数を用いてLogPと表される。

14

撥水と疎水・違う？同じ？
FFF
Trifluoromethane

OctaneOctadecane

Triacontane

水の接触角(θ)

120°

140°

126°

108°

分配係数(LogP)

0.64

5.18

9.18

14.09

水への溶解度 (mg/L)

4090

0.66

0.006

8.84×10-10

分析化学 Vol.59 No. 3 , P193-205(2010)

疎水性(logP)が高いから撥水性(接触角)が高いわけではない

疎水性の高さ ≠ 撥水性の強さ
15水溶性ビタミンの分離
SunShell RP-AQUA
1Column:N(4)=30,800 SunShell RP-AQUA, 2.6 mm 150 x 4.6 mmMobile phase:N(3)=31,800
40mM Phosphate buffer pH6.8
43Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Detection: UV@250nm
2Sample: 1 = Nicotinic acid,
2 = Pyridoxal,
3 = Pyridoxine,
4 = Nicotinamide

16ヌクレオチドの分離
2 SunShell RP-AQUA
1

N(2)=37,900
Column:N(4)=30,000 SunShell RP-AQUA, 2.6 mm 150 x 4.6 mm
4Mobile phase:
320mM Phosphate buffer pH6.0
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Detection: UV@250nm
Sample: 1 = 5’-GDP,
2 = 5’-ATP,
3 = 5’-ADP,
4 = 5’-AMP17TFAとHFBAを用いた場合のアミノ酸の保持比較
0.1% HFBA

120.1% TFA

125倍以上の保持の増加

02468Retention time/min

10Column:
Sunrise C28 5mm
150 x 4.6 mm
Mobile phase:
0.1% HFBA and 0.1% TFA
Flow rate: 1.0 mL/min
Detection: RI and UV@210nm
Temperature: 30 ºCdgree C
Sample:1=D-alanine
2=D-alanine-D-alanine12アミノ酸の分離
Column: Sunniest RP-AQUA 5mm, 2.0x 150mm
Mobile phase:A) 5mM HFBA (Heptafluorobutyric acid)B) 5mM HFBA in Acetonitrile/water(9/1)%B 0% to 20% in 20 min
Flow rate: 0.2mL/min
Temperature: 40 oC
Detection: Quattro Micro API (ESI positive) SIM

010Retention time/min

2030

19

アミノ酸のLC/MSm/z
Ala
Arg
AsnAspCysGlnGlu
Gly
HisIle,Leu
LysMetPhe
ProSerThr
Trp
TyrVal010Retention time/min

2090
175
133
134
122
147
148
76
156
132
147
150
166
116
106
120
205
182
118

100%

118

80
60
MW =117Structure of Valine

4020050 65 78 88 102 114 130 140 155 166 181 203 216 231 247
m/z

Mass spectrum of Valine

Column: Sunniest RP-AQUA 5mm, 2.0x 150mm
Mobile phase:A) 5mM HFBA (Heptafluorobutyric acid)B) 5mM HFBA in Acetonitrile/water(9/1)%B 0% to 20% in 20 min
Flow rate: 0.2mL/min
Temperature: 40 oC
Detection: Quattro Micro API (ESI positive) SIM20

アミノ酸の検出限界（LC/MS)
Analyze

Detection
Limit (mmol/L)

Analyze

Detection
Limit (mmol/L)

Ala

3.2

Leu

0.55

Arg

3.7

Lys

3.1

Asn

3.9

Met

1.8

Asp

2.6

Phe

0.89

Cys

6.6

Pro

1.2

Gln

1.8

Ser

2.9

Glu

1.7

Thr

1.6

Gly

3.3

Trp

4.2

His

1.6

Tyr

2.1

Ile

0.57

Val

1.1
Detection Limit: S/N=3紅茶中のアミノ酸のLC/MS

1,2,340561078

920Retention time/min

30Column: Sunniest RP-AQUA 5mm, 2.0x 150mm
Mobile phase:A) 5mM HFBA (Heptafluorobutyric acid)B) 5mM HFBA in Acetonitrile/water(9/1)%B 0% to 20% in 20 min
Flow rate: 0.2mL/min
Temperature: 40 oC
Detection: Quattro Micro API (ESI positive) SIM

AnalyteConcentration(mmol/L)

1

Ser

83.5

2

Asp253

3

Glu

330

4

Pro

42.1

5

His702

6Vai

75.6

7Ile

73.2

8

Leu

33.8

9Phe

97.2

ペンタフルオロフェニル（PFP)FFFFF• 疎水性相互作用• 水素結合性• 双極子相互作用• π-π相互作用• 静電的相互作用• 極性化合物の保持が可能• 立体選択性に優れている• ハロゲン化合物の分離に有効23

標準試料の分離
1524312,31SunShell RP-Aqua

67547

SunShell PFP

6Hydrogen Hydrophobicity
Stericbonding (Amylbenzene/ selectivity

722

SunShell C18 446810(Caffeine/Phenol)

Butylbenzene)(Triphenylene/o-Terphenyl)

RP-Aqua

0.52

1.52

1.30

PFP

1.00

1.31

2.38

C180.39

1.60

1.46

5630Column dimension: 150 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=75/25
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Sample: 1 = Uracil, 2 = Caffeine,
3 = Phenol, 4 = Butylbenzene
5 = o-Terphenyl, 6 = Amylbenzene,
7 = Triphenylene

121416Retention time/min

18

20222424

キシレン異性体の分離
3SunShell C18

213SunShell PFPSunShell C18, PFP 2.6 mm 150 x 2.1 mm
Mobile phase:
CH3OH/water=75:25 for SunShell C18
CH3OH/water=60:40 for SunShell PFP
Flow rate: 0.3 mL/min
Temperature: 25 ºC
Detection: UV@250nm
Sample: 1 = o-Xylene
2 = m-Xylene
3 = p-Xylene

21012345SunShell PFPは異性体の分離についてもC18と異なる分離パターンを示します。

Retention time/min25

クレゾール異性体の分離
1,2SunShell C18

3123
SunShell PFP

Column:SunShell C18, 2.6 mm 150 x 4.6 mm
SunShell PFP, 2.7 mm 150 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3OH/H2O=40/60
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 25 ºC
Sample: 1 = p-Cresol
2 = m-Cresol
3 = o-Cresol

C18カラムではp-クレゾールとm-クレゾールは分離不可能ですが、PFP は分離可能です。

26

キサンチン類の分離
3SunShell
1C18

Water
24132SunShell
PFP
SunShell
PFP
SunShell
PFP01

Water

41213432420mMphosphatebuffer pH7

SunShell C18, PFP 2.6 mm 150 x 2.1 mm
Mobile phase: CH3OH/water or buffer=30/70
Flow rate: 0.3 mL/min
Temperature: 25 ºC
Detection: UV@250nm
Sample: 1 = Theobromine
2 = Theophyline
3 = Caffeine
4 = Phenol

50mM
SunShell PFPはC18に比べ極性のphosphate buffer
高いカフェインを強く保持しま
pH7す。また塩濃度の調節で分離を変えることができます

2345Retention time/min27

C18とPFPによる塩基性化合物の保持比較
2,3,4SunShell C18

Column: SunShell C18, PFP, 2.6μm 150 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3CN/10mM Phosphate buffer pH7.0 = 80/20
Flow rate: 1.8 mL/min
Temperature: 25 ºC

1Sample: 1 = Uracil, 2 = Propranolol, 3 = Nortriptyline, 4 =Amitriptyline

1SunShell PFP
23428

PFPでHILIC・イオン交換？
• HILICモード

有機溶媒リッチな移動相

固定相上に形成された水和層と移動相との分配
静電的相互作用、水素結合
水リッチな固定相• イオン交換物質がイオン成分を取り込み、代わりに物質が持っていた他のイオン成分を放出する現象

H3C

R
N+

CH3OHOO29

PFPでHILIC・イオン交換
ペンタフルオロフェニル
pKa―

分配係数(LogP)

3.54

水の溶解度 (㎎/L)

50.8• PFPの化学的特性から水を保持するとは考えにくい• PFP基が電化を持つ構造をしていない• フッ素の強い電気陰性度により、電子の偏りが生じているイオン交換に似た分離機構を示す
30

ウリジンの保持

00.2

0.4

0.6

0.8

11.2

1.4

Retention time/min
Column: SunShell PFP, 2.6μm 150 x 4.6 mm
Mobile phase: CH3CN/10mM Phosphate buffer pH7.0 = 80/20
Flow rate: 1.8 mL/min
Temperature: 25 ºC

ウリジンはPFPカラムに保持されない

Sample: 1 = Uridine

ヒリックモードの分離はしていない
31

まとめ• C28カラムは、水系移動相のみでも保持時間が安定しており、極性化合物の分離に有用である。
• C28カラムは、低極性溶媒を移動相とするとODSとは異なった分離を示す。
• PFPカラムは、優れた立体選択性を示す。
• PFPカラムでは、HILICモード、イオン交換とは異なった相互作用が働いている。
32