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液体クロマトグラフィーの基礎技術（1）Fundamental Techniques of Liquid Chromatography─逆相クロマトグラフィーとカラムの選び方 その1─
─ How to select the appropriate column for your reversed phase chromatography ( I ) ─
関東化学株式会社 草加工場 生産技術部

酒井 芳博

YOSHIHIRO SAKAI
Production Technique Dept, Soka Factory, Kanto Chemical Co., Inc.

高速液体クロマトグラフィー（HPLC）は、現在ではなくてはならない重要な分析方法の一つであるが、その実施にあたっては、一般的に「固定相（カラム）の選択」、「移動相の選択」、「検出方法の決定」が三要素として重要視されている。
今回は、その中から「固定相（逆相及び順相）の選択」及び「移動相の選択」の二つの要素についてそれぞれポc）親水性相互作用クロマトグラフィー（Hydrophilic Interaction Chromatography）
d）サイズ排除クロマトグラフィー（Size Exclusion Chromatography）
e）
イオン交換クロマトグラフィー（Ion Exchange Chromatography）
f）
アフィニティークロマトグラフィー（Affinity Chromatography）

イントなるいくつかの基礎技術をとらえてやさしく解説する。などがある。したがって、これら分類の手法を踏まえて分
1．液体クロマトグラフィーとその特徴

析しようとする試料の物性と分離機構を考慮することで、変化に富んだ分離・分析が可能となる。

本論に入る前に、液体クロマトグラフィーの概要を説明する。

2．カラムと充填剤について

液体クロマトグラフィーには、いろいろな分類方法があるが、一般的には、固定相と移動相の関係から逆相クロ

現在HPLC用カラムは、内径0.3mmほどのキャピラリーマトグラフィー（Reversed Phase Chromatography）と順相タイプのカラムから内径1m程度の大口径を有する分取クロマトグラフィー（Normal Phase Chromatography）に大用のカラムまで種々のサイズのカラムが使用されている。

別される。
「逆相クロマトグラフィーとは、非極性の固定普通、これらカラムは、その内径により50mm以上のカ相に極性の移動相を使用して行うクロマトグラフィー」のこ

ラムを大量分取用、10〜50mmをセミ分取用カラム、2〜とであり、「順相クロマトグラフィーとは、極性の固定相に4.6mmのカラムを汎用カラム、1〜2mmのカラムをセミミク非極性の移動相を使用して行うクロマトグラフィー」のこと

ロカラムそして1mm以下のカラムをミクロカラムと分類さである。

れている。

最近では、この逆相、順相クロマトグラフィーという二その中でも分析用として主に使用される代表的なカラつの分類だけでなく、分離機構を基にした分類も一般的

ムサイズは、内径が4.6mm、カラム長が150mmと250mmであり、その代表的なものとして、であり、充填剤の粒子径は5μmが中心となっている。

a）分配クロマトグラフィー（Partition Chromatography）
b）吸着クロマトグラフィー（Adsorption Chromatography）

しかしながら、近年検出器に質量分析計（ＭＳ）を使用したLC/MSが普及してきたこともあり、内径2mmのカラムの需要増加と共に、充填剤の粒子径も3μmと小さくなっている。

THE CHEMICAL TIMES 2007 No.3
（通巻205号）

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充填剤は、球状シリカゲルを基本材料とした化学結合相（Reversed Phase）
クロマトグラフィー用充填剤が多用さ型充填剤が多く使用されているが、最近、シリカゲル骨れていることは周知の事実であるが、このほかにもオクチル格にメチル基を組み込んだハイブリッドシリカゲルも開発

シランを化学結合させたC8充填剤をはじめC22充填剤、され、シリカゲルとポリマーの長所を生かした耐薬品性

C30充填剤等、逆相充填剤も種類が豊富になっている。に優れた充填剤として期待されている。

現在ODSシリカゲル充填剤が多用されている理由とし

この他、シリカゲル以外の素材も多く使用されているが、て、ODSシリカゲル充填剤が物理的、化学的に安定でその代表的なものが、ポーラスポリマーと総称されているあること、また有機溶媒と水の混合液を溶離液に使用す樹脂を加工した充填剤である。

ることができる等、使いやすさを第一にあげることができまた、アルミナ、ガラス、チタニア、カーボン等様々な素る。また、最近では、水系100％の溶離液を使用しても、材がHPLC用の充填剤として使用され、それぞれ特徴の溶出時間が変化しない再現性に優れた親水性ODSシリある効果を出している。

カゲル充填剤も一般的となってきている。
順相クロマトグラフィー用充填剤では、シリカゲルが代3．検出方法について表的な充填剤であるが、アミノプロピルシリカゲル、シアノプロピルシリカゲルなども順相クロマトグラフィー用充填剤

HPLCの検出方法では、現在吸光光度法（UV／VIS）

として使用されている。

が最も多く使用されているが、近年では検出感度や選択

現在、これら順相系充填剤は、親水性相互作用クロ性が優れている質量分析計（MS）も検出器として急速にマトグラフィー（HILIC）3）にも使用できることが解り再び注普及している。

目されている。

この他、示差屈折率（RI）検出、蛍光（FL）検出、電気化学検出（ECD）、電導度検出（CD）、光散乱検出5．逆相系カラムの選択に関して（ELS）、NMR検出等、目的に応じさまざまな検出手法が採用されている。

ODSシリカゲル充填剤は、前述のように、大変使いやこれら検出器の使用方法を含めた詳細については成すい充填剤ではあるが、一方で、残存シラノールが原因

1）、2）となる不可逆的な二次相互作用にも悩まされてきたとい書を参照願いたい。

う歴史がある。
4．固定相について

しかしながら、1980年代後半、高純度シリカゲルを基材としたHPLC用逆相充填剤が市場に登場し、かつエ14

液体クロマトグラフィーの原点は、1906年、Twettが炭ンドキャッピング技術が進歩したこと及び充填剤の評価

酸カルシュウム（チョークの粉）の固定相に葉緑素のエー方法の進歩もあり、それまで分析者を悩ませていた不可テル溶液を流し、クロロフィルを分離したことが始まりとい逆的な二次相互作用に起因する充填剤の品質の課題われている。

が劇的に改善されている。4）

し かしな がら 、近 代 的な H P L C は 、1 9 6 9 年 に

例えば、塩基性化合物や配位性化合物など、ODSシ

J.J.Kirklandらが開発した球状シリカゲルの出現を契機にリカゲル充填剤を使用する逆相クロマトグラフィーでは溶に始まりを見るが、さらにシリカゲルにシラン化合物を化出が困難であった化合物も容易に分析できるようになり、学結合させたパーマネントフェーズ充填剤が登場して以益々その有用性は増しているといえよう。

降、現在ではシリカゲルにアルキルシランを化学結合させ弊社では、高純度シリカゲルを採用したODSシリカゲた逆相充填剤、特にオクタデシルシリルシリカゲル、通称ル充填剤Mightysil RP‐185）を1995年に発売したが、これODSシリカゲル充填剤がHPLCを広く普及させることになを改良したMightysil RP‐18GP6）を1997年に上市し現在った。に至っている。また2000年には、水系100％の溶離液でHPLC用カラムには、現在オクタデシルシリル（ODS）シリもHPLCを可能とする、親水性ODSシリカゲル充填剤7）をカゲル充填剤（C18）を中心とした逆相分配、いわゆる逆使用したMightysil RP-18GP Aquaのシリーズを上市し、THE CHEMICAL TIMES 2007 No.3
（通巻205号）

液体クロマトグラフィーの基礎技術（1）ODSシリカゲルの利用範囲の拡大を図ってきた。

り、塩基性化合物との不可逆的な二次相互作用を生じ

ODSシリカゲルカラムは、従来ベンゼン、ナフタレン、アることがよく知られている。この不可逆的な二次相互作

ントラセン等、固定相と二次相互作用しない化合物を使用の影響を除くためにエンドキャッピングと呼ばれるトリメ用して理論段数を中心としたカラムの性能試験データをチルシリル化（TMS化）が行われているのである。

添付して販売されていたが、Mightysil RP-18GPシリーズ

ODSシリカゲル充填剤にTMS化の処理が必要な理由の充填カラムでは、これ等芳香族炭化水素に加え、塩基であるが、シリカゲルの表面の構造的な特徴を理解する性化合物、配位性化合物等の6種類の溶離試験を行い、と大変分り易い。
シリカゲルの表面は、図1に示すように三種類のシラノ全ての項目に適合していることが保証されている。
逆相系カラムの選択に関しては、ODSシリカゲル充填ールが存在しているといわれており、この状態は、図2の剤の物性が極めて重要なポイントとなるので、ここでは29

Mightysil RP-18 GPシリーズ製品の溶離試験の特徴を中いる。

Si CP/MAS NMRスペクトルにより具体的に証明されて心にして説明を進めることとした。
5-1 Mightysil RP-18 GP 充填剤の物理特性
Mightysil RP-18 GP充填剤の基本物性を表−1に示した。Mightysil RP-18 GPシリーズは、平均細孔径12nmの真球状シリカゲルを使用し、一反応性（モノファンクショナ

図1 シリカゲル表面に存在するシラノール2）ル）ODSを化学結合した炭化水素量20%の充填剤を中

図2中のaで示されるピークは、ジェミナール型シラノー心に15%、25%の充填剤が用意されている。粒子径は5ルであるが、bで示されるピークはシングルシラノールに属μmと3μｍの2種類だが、高精度に分級され粒度分布のしている孤立シラノールと会合型シラノールを示している。

幅が極めて狭く圧力損失が小さいことが特徴である。

cで示されるピークは、シロキサン（−Si−O−Si−）結合に表1 主なMightysil RP-18GP の基本物性相当している。

粒子径（μｍ）

比表面積（m2/g） 平均細孔径（nm） 炭化水素量（％）

結合官能基53401220

一反応性

52701315

一反応性

33501220

一反応性

Mightysil RP-18GPシリーズは、平均細孔径12nmのシリカゲルに一反応性ODSを化学結合した充填剤である
が、メーカーによっては平均細孔径が8nm、10nmのシリカゲルを採用している場合もある。
またODS基も二反応性、三反応性のODSを結合したポリファンクショナルODSシリカゲル充填剤も供給されてい図2 シリカゲル表面の29Ｓ
ｉCP/MAS NMRスペクトルるが、これら充填剤はそれぞれ特徴のある溶離特性を示すことも知られている。

シリカゲルのODS化では、シリカゲルの表面に存在してしたがって、ODSシリカゲル充填剤のこれら基本的ないるこれらシラノールにODS基を化学結合させるのである

物性を知ることは、カラムの選定にあたり大変重要となるが、ODS基の立体障害のため、未反応のシラノールが残ので、これらODSシリカゲル充填剤の基本物性に基づく存し易くなるのである。この残存シラノールが塩基性化合

溶離特性の違いは、5−3項で詳しく述べる。

物や配位性化合物と不可逆的な二次相互作用を引き起こすため溶出が乱れて検出されるピークがテーリングし、5-2 ODSシリカゲル充填剤のエンドキャッピング（ＴＭＳ化）

また極端な場合では、溶出しなくなることがある。

ODSシリカゲル充填剤は、シリカゲル及び反応試薬で

図3は、モノファンクショナルODSシリカゲルのエンドキあるアルキルシリル化剤由来の残存シラノールの影響によャッピングの進行の様子を29Si CP/MAS NMRスペクトル

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5-3 Mightysil RP-18 GPの溶離特性について
Mightysil RP-18 GPシリーズは、充填剤の製造バッチ毎の品質を一定に保つことを目的に6種類の溶離特性試験を行いバッチ間の再現性を確認し、優れた再現性を保証することを最大の特徴としている。製品に添付されている試験成績表を図4に示す。
図4は、母体シリカゲルの物理特性と代表的な金属不29

図3 一反応性ODSシリカゲル充填剤の Ｓ
ｉCP/MAS NMR スペクトルａ）
エンドキャッピングが不十分なODSシリカゲル充填剤。
ｂ）ａ）
をさらにエンドキャッピングした充填剤（Mightysil RP-18GP（5μm））

純物および6種類の溶離特性試験の実測値及び規格値を示した一覧表と、6種類の溶離特性試験のクロマトグラムを示したものである。
最近のHPLC用充填カラムでは、このような充填剤の基の変化をとらえて示したものである。
図3 a）は反応途中のエンドキャッピングが不十分な状

本性能と溶離試験データが添付されていることが多く、使態のODSシリカゲルであるが、反応の進行と共に図3 b）

用者はこれらのデータ（バッチデータ）が試験方法の妥当のごとくジェミナール型シラノールの消滅と、シングルシラノ性の管理にも利用できるようになっているのでGLP（Goodールが減少している様子がよく分る。

Laboratory Practice）活動の一助となれば幸いである。

エンドキャッピングは、トルエン還流温度でTMS化反応8）、9）、10）が一般的であるが、この方法では完の溶離特性試験は、試験―Ⅰ 疎水性、立体選択性試

全なTMS化が困難であるとの観点から、より完全なエン験、試験―Ⅱ エンドキャッピング試験、試験―Ⅲ 酸性を行う方法

ドキャッピングを目指した気相法
温常圧法12）11）5）、高温高圧法 、高13）、超臨界法 など、改良されたエンドキャッピングの方法が報告されている。

図4 Mightysil RP-18GP（5μm）の充填剤バッチ試験の分析表

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Mightysil RP-18GPシリーズで実施しているこれら6種類

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化合物試験、試験―Ⅳ配位性化合物試験（その1）、試験―Ⅴ 塩基性化合物試験、試験―Ⅵ 配位性化合物試験（その2）により構成されているが、このうち特徴液体クロマトグラフィーの基礎技術（1）的な試験である、試験―Ⅰ、試験―Ⅱ、試験―Ⅳについ造になりやすく、多環芳香族炭化水類の立体選択性にて以下に述べる。

優れているといわれている。
この状況を一反応性充填剤のクロマトグラムと比較す

5-3-1

試験―Ⅰ 疎水性及び立体選択性試験

ると、図6 b）に示される三反応性ODSシリカゲル充填剤

1）ODSシリカゲル充填剤の結合官能基数の違い（ファンの場合、o-ターフェニルとn-アミルベンゼンが接近し分離がクショナリティー）による溶離特性悪いように思われるが、これはo-ターフェニルの溶出時間

ODSシリカゲル充填剤の溶離特性は、化学結合されたが遅れ、n-アミルベンゼンの溶出時間がほとんど変わらなODS基の結合官能基数（ファンクショナリティー）により異なるいことから生じた現象である。前述したように多環芳香族

14）ことから、田中試験 で知られている評価方法を試験―Ⅰと化合物に対して特異な働きを示していることがわかる。

して採用することで充填剤の疎水性と立体選択性を評価

これに対し、図6 a）に示す二反応性ODSシリカゲル充填剤し、ODSシリカゲル固定相が均質であることを確認している。

は、一反応性充填剤と三反応性充填剤の中間の性質を有し

一 反 応 性 O D Sシリカゲル充 填 剤が充 填されているているといわれているが、実際は使用されている例が少ないこ

Mightysil RP-18GP（5μm）（4.6mmΦ×150mm）のクロマともありこれといった特徴が見出されていないのが実情である。

トグラムを図5に示す。

図5 Mightysil RP-18GPを使用した溶離試験
―Ⅰのクロマトグラム
溶離条件 カラム サイズ ： 4 . 6 m mΦ×150mm、溶離液：メタノール／
水＝8 0 ／ 2 0 、流 速 ： 1 m l ／m i n . 、カラム 温 度：4 0℃、検出：UV254nm, 0.16AUFS
試料 ①ウラシル、②カフェイン、③フェノール、④n-ブチルベンゼン、⑤o-ターフェニル、⑥n-アミルベン
ゼン、⑦トリフェニレン（溶出順）

表2 ODSシリカゲル充填剤の分離係数の比較
k'AM/k'BU
一反応性 ODS
1.49
二反応性 ODS
1.48
三反応性 ODS
1.49

k'TR/k'TE
1.441.621.64＊）AM：Amylbenzen、BU：Butylbenzene、TR：Triphenylene、TE：o-Terphenyl

表2は図5の溶離条件で測定した際のアルキルベンゼンと多環芳香族炭化水素の分離係数（α）
を示したものである。アルキルベンゼンの分離係数は各充填剤共、ほとんど差は見られないが、多環芳香族炭化水素の分離係数は、それぞれ特徴的な結果を示している。

これに対して、ポリファンクショナルODSシリカゲル充填剤

このように、ODS基のファンクショナリティーが異なると溶を使用した場合の溶離挙動を図6ａ）（二反応性ODS）、図

離特性も違ってくることから、分析しようとする試料の性質

6ｂ）（三反応性ODS）に示す。一反応性ODSシリカゲルにもあわせ、充填剤を選定することが重要となる。

比べ、溶出時間も長く特徴のある溶離挙動を示している。

（次号に続く）参考文献
1）Lloyd R.Snyder,Joseph J.Kirkland,Joseph L.Glajch, "PRACTICAL HPLCMETHOD DEVELOPMENT" 2nd EDITION, JOHN WILEY & SONS INC
2）日本分析化学会関東支部編,"改訂2版ブック",丸善（2000）
3）中村洋監修

高速液体クロマトグラフィーハンド

液クロ虎の巻 ,p54,筑波出版会（2003）

4）Y.Ohtsu, Y.Shiojima, Y.Okuyama, J.Koyama, K.Nakamura, K.Kimata,N.Tanaka, J.Chromatogr., 481,147（1989）
5）細田誠、酒井芳博 Chromatography, 17, 39（1996）
6）酒井芳博 THE CHEMICAL TIMES 171, 17（1999）
7）US Patent No. US6713033 B2
8）C.H.Lochmueller, D.B.Marshall, Analitica Chimica Acta, 142,63（1982）
9）K.Jinno,S.Shimura,N.Tanaka,J.C.Fetze,R.Biggs, Chromatographia, 27, 285（1989）
図6 ポリファンクショナルODSシリカゲル充填剤の溶離試験―1のクロマトグラムａ）
二反応性ODSシリカゲル、ｂ）
三反応性ODSシリカゲル
溶離条件及び試料は図―5と同じ

一般的に、ポリファンクショナルODSシリカゲル充填剤のうち、三反応性ODS充填剤は、ポリメリックな表面構

10）N.Nagae, Y.Hatano, D.Ishii, Chromatography, 14, 45R（1993）
11）特許第2611545号）
12）酒井芳博、浜川大爾、太田鈴枝 第2回LCテクノプラザ講演要旨集、BP2 51（1997）13）槍田孝、井原俊英、堀本能之、野村明）集、BP2 36（1999）

第4回LCテクノプラザ講演要旨

14）K.Kimata, K.Iwaguchi, S.Onishi,K.Jinno, R.Eksteen, K.Hosoya.M.Arai,
N.Tanaka, J.Chromatogr.Sci., 721, 27（1989）

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