分離選択の大幅な改善：高温/長鎖アルキル基の知られざる能力㈱ クロマニック テクノロジーズ
長江 徳和
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Jaima2009 新技術説明会9月3日

1

高耐熱性SUNARMOR C18の開発• 近年，2µm以下の微小粒子径充填剤を充填した超高速HPLCカラムが市販されはじめている• 微粒子化は高性能化の有効な手段ではあるが，装置側のリスクが大きく，また，汎用HPLCではその能力を十分に引き出すことはできない• 高温下で使用することができれば拡散係数を大きくでき，高分解能を得ることができるが，一般的なシリカ系逆相固定相は50ºC以上での長期使用は不可能である• クロマニックテクノロジーズは，シリカ系逆相固定相の耐熱性向上を目的として，エチレン基をC18シリル化試薬に結合した新規試薬を開発し，60°Cで十分に使用可能なC18カラムであるSunArmor C18を開発した
Jaima2009 新技術説明会9月3日2酸性/アルカリ性下でのシリカゲルの分解
R

H3C

CH3CH3Si

R
Si

O

O

H3C

R

O

O

OO

R
Si

H3C+H

Si
OO

O

CH3CH3Si

官能基の切断

O
H
HO

Si

Si
O求電子反応CH3CH3SiO

OSi
Oin Acid

R

R
Si

O

O

O

SiSi
O

O

O

O

in Alkaline
基材の切断
H3C

O

CH3CH3Si

R
Si

O

O

Si

Si

O

O

求核反応

R

O

OH

H3C-SiO

OO

Si

Si

OSi
O

O

CH3CH3Si

CH3CH3 R
Si
HO

O

H3C

R

O

OO

O

R

R

H

SiOO
Si

O

HO

O

3Jaima2009 新技術説明会9月3日

新規開発C18試薬 特許出願中(SunArmor C18)
シリカゲルに結合XXSiXH2COSi2X X

Si OSiOX X
SiXH2C2H2CX X

シリカの物性値

Si XX

2SiX

HOX
XTMS化

H2COHOH2HO2SiOHOHSiC
H2 O OH2OOSiSiOOOCC
2 SiSi2O
2 Si
SiSiOOH2H2OOOOOCCOOOSiO
SiSi
2 Si
2OSiO
O O
O O O
OSiO
SiSiOOOSiSiOSiOO
Si
Si O
OOSiO
O OSiOOOOO SiOOOOSiO比表面積：340m2/g，細孔容積：1.0mL/g，細孔径：12nm
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O480ºC-pH 2.0における理論段数と保持時間の変化
120

相対理論段数（ ）相 対 保 持 時 間 （ ）/ %1008060Conditions
SunArmor C18, 5μm 150 mm x 4.6 mm i.d..

40Mobile phase: ACN/ 0.1% trifluoroacetic acid pH2.0=40:60
Flow rate: 1.0 mL/min, Temperature: 80 oC

2000100200300
通液時間 / hour

Jaima2009 新技術説明会9月3日

400500600

580ºC-pH 8.0における理論段数と保持時間の変化
120

相対理論段数（ ）相 対 保 持 時 間 （ ）/ %1008060Conditions
SunArmor C18, 5μm 150 mm x 4.6 mm i.d..

40Mobile phase:
ACN/ 20 mM Ammonium acetate + TEA pH8.0=40:60

20Flow rate: 1.0 mL/min, Temperature: 80 oC

00100200300
通液時間 / hour

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4005006カラム温度を上げるとどうなるか？
★溶質の拡散係数が上がる★吸脱着速度が速くなる★移動相の粘度が下がる
三環系抗うつ剤のような比較的分子量の大きく拡散係数の低い試料はNHN

CH3ノルトリプチリン

CH3CH3アミトリプチリン

理論段数が上昇，更に対称性も向上
高粘度有機溶媒も10MPa以下の低圧で使用可能になる

溶出順序が逆転することもあり，分離が改善
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7各温度における線流速と理論段高との関係
108H/dp

2倍6420204060

80100

udp/Dm,25F.D.Antia and C. Horvath, J. Chromatogr., 436, 1-15 (1988).
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8温度と粘度および拡散係数との関係
η = α exp(β/T)η25TDm = Dm,25・ η
298
η:粘度，T:絶対温度， D：拡散係数
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9温度と分析時間の関係
カラム圧，段数を一定となる条件
1.0

tR/ tR,25

0.8

0.6

0.4

0.2

50

100150Temperature (°C)

200
F.D.Antia and C. Horvath, J. Chromatogr., 436, 1-15 (1988).

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10カラム温度による理論段数と対称性の変化
260

2

アミトリプチリン/メタノール

240

相対理論段数 (%)

200

1

対称性

1.5220トルエン/メタノール
アミトリプチリン/1,4-ジオキサン1800.5160

トルエン/1,4-ジオキサン

1400

アミトリプチリン/メタノール

120-0.5100

アミトリプチリン/1,4ジオキサン

80-11520253035 40 45
温度（℃）

50556065

カラム： SunArmor C18, 5μm 4.6x150 mm
移動相：メタノール/2０mM リン酸緩衝液pH7.5 (80:20)
1,4-ジオキサン/5mM リン酸緩衝液ｐH7.5 (65:35)
流速：1.0 mL/min

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1160 ºCと20 ºCでのクロマトグラム
メタノール/20mM リン酸緩衝液 pH7.5(80:20)

1,4-ジオキサン/5mM リン酸緩衝液 pH7.5(65:35)

552

160 ºC

N=10300
As=1.214

N=8700As=1.192143135230244520 ºC

1N=5700
As=1.5168101214Retention time / min

2401233

N=4700As=1.6245678Retention time / min

カラム: C18, 5μm, 4.6 x150 mm.
カラム温度: 60 ºC, 20 ºC 検出: UV @ 250 nm.
試料: 1=ウラシル, 2=プロプラノロール, 3=トルエン, 4=ノルトリプチリン, 5=アミトリプチリン
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12高粘性溶媒による選択性の変化
82% メタノール

68% 1,4-ジオキサン

η=0.6, 3.7 MPa
δ=12.9, δd=6.2 7

7

η=1.54, 6.5 MPa
δ=9.8, δd=7.85Peak 523424656

10Peak78Retention time / min

10

1. ウラシル
2. カフェイン
3. フェノール
4. ブチルベンゼン
5. o-ターフェニル
6. ｱﾐﾙﾍﾞﾝｾﾞﾝ
7. トリフェニレン

1042324668

10

Retention time / min

カラム: C18, 5μm, 4.6 x 150 mm
カラム温度: 60 ºC, 検出: UV @ 250 nm.
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13高粘性溶媒の使用－選択性のコントロールⅠ
77523
16482% メタノール
η=0.63.7 MPa
δ=12.9
δd= 6.22
1 3547674% アセトニトリル
η=0.37
2.3 MPa
δ=11.8
δd= 6.5752
1 3466,7523102446870% エタノール
η=1.26.1 MPa
δ=11.2
δd= 6.85231758% 2-プロパノール
η=2.318.0 MPa
3
δ=10.22δd= 7.2

10024654 64Jaima2009 新技術説明会9月3日

6867% 1,4-ジオキサン
η=1.54
6.5 MPa
δ= 9.8δd=7.849% THF
η=0.55
5.5 MPa
δ= 9.1δd=7.61014

選択性のコントロールⅡ
263

メタノール/20mM リン酸緩衝液 pH7.5(81:19)

5

142

63

1エタノール/20mM リン酸緩衝液 pH7.5(66:34)

542
163

1,4-ジオキサン/5mM リン酸緩衝液 pH7.5(63:37)

5401234567Retention time / min

カラム: C18, 5μm, 4.6 x 150 mm
カラム温度: 60 ºC
検出: UV @ 250 nm.
試料: 1=ウラシル, 2=プロピルパラベン,
3=プロプラノロール, 4=トルエン, 5=ノルトリプチリン,
6=アミトリプチリン

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15温度，pHの効果
2pH10.0,pHを上げる

40 ºC

635

1
4024

6

N=8500As=1.25
N=6800As=1.4082

5 N=5500
402428Retention time / min

pH＜温度

N=8300As=1.3063

N=10800
As=1.1551

As=1.696

ピーク形状への効果

pH7.0,60 ºC

63

移動相: メタノール/20mMリン酸緩衝液. (80:20)
検出: UV @ 250 nm.
試料: 1=ウラシル, 2=プロピルパラベン,
3=プロプラノロール, 4=トルエン, 5=ノルトリプチリン,
6=アミトリプチリン

12

温度を上げるpH7.0,40 ºC
110カラム: C18, 5μm, 4.6 x 150mm

N=8500As=1.30

410120

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2468101216長鎖アルキル基固定相
炭素数２８のオクタコシル基C28★Sunrise C28: 炭素含有量18%異性体の分離★Sunniest RP-AQUA: 炭素含有量16%
水リッチな移動相で安定 しかも残存シラノール基の影響ほとんどない（シリカ基材： 340m2/g，12nm）
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17ビタミンEの分離比較
C18では不可能な構造異性体の分離達成
Column size: 4.6x250 mm
Mobile phase: 97/3=CH3OH/H2O
Flow rate: 1.0 mL/minTemperature: 25 ºC

1Sunrise C28
234Detection: UV at 295nm
Sample: 1=δ-tocopherol
HO05101520253035O
retention time / minConventional C18

12=γ-tocopherol
HO2, 3O4

3=β-tocopherol
HOO

4=α-tocopherol051015202530

HOretention time / min

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O18

α, β−カロテンの分離比較
22
11Column size: 4.6x250 mm
Mobile phase:80/20=CH3CN/CHCl3
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 30 ºC

ConventionalC18Detection: UV at 450nm
Sample: 1=α-carotene

Sunrise C2805101520252=β-carotene

3035Retention time / min

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19核酸塩基の分離
40 ºC 125340℃でのチミンの保持時間の変化（ポンプ送液1時間停止毎に測定）

25 ºC

1523402468Retention time/min

101214

チ ミン の 相 対 保 持 時 間 (%)

41009080706050403020100

12345

ポンプ停止毎の保持時間測定回数
Column: Sunniest RP-AQUA, 5μm
4.6x150 mm
緩衝液のみの移動相を用いた場合の保持の再現性を試
Mobile phase: 10mM Phosphate
験しました。毛管作用により，ポンプを停止し充填剤周りのbuffer pH7.0
圧力を大気圧にすると，通常のC18カラムは細孔内からのFlow rate: 1.0 mL/min
移動相の抜けだしが起こり，保持時間は大幅に減少しま
Temperature: 40 ºC and 25ºC
すが，Sunniest RP-AQUAはほとんど細孔内からの抜け出
Sample: 1 = Cytosine 2 = Uracil
しは起こっておらず，97%以上の再現性を示しました。
3 = Thymidine 4 = Uridine
5 = Thymine
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20緩衝液のみの移動相での分離例◆ヌクレオチド◆水溶性ビタミン
13423215
N=19,800

4012345678910111213140

1234567891011121314

Retention time/min

Retention time/minColumn: Sunniest RP-AQUA, 5μm 4.6x150 mmMobile phase: 40mM Phosphate buffer pH6.8Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Detection: UV@250nm
Sample: 1 = Nicotinic acid，2 = Pyridoxal，3 =Pyridoxine，4 = Nicotinamide

Column: Sunniest RP-AQUA, 3μm 4.6x150 mm
Mobile phase: 20mM Phosphate buffer pH6.0
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Detection: UV@250nm
Sample: 1 = 5’-GDP, 2 = 5’-GMP,
3 = 5’-ATP, 4 = 5’-ADP, 5 = 5’-AMP

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21カテキンおよびうまみ成分の分離
Column: Sunniest RP-AQUA 5 μm,250 x 4.6 mm i.d.
Mobile phase: A) H2O/H3PO4 (99.9:0.1)
B) CH3CNTime (min) 0 20 60%B (%) 00 50
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Detection: UV@210 nm
Injection volume: 10 μL
Sample: Oolong tea
1 = (-)-Epigallocatechin
2 = (+)-Catechin
3 = (-)-Epigallocatechin gallate
4 = (-)-Epicatechin
5 = (-)-Epicatechin gallate

カフェイン

グアニル酸

シュウ酸
テアニン

341520510152025303540455055

Retention time (min）Jaima2009 新技術説明会9月3日

22水溶性ビタミンの分離例 Ⅱ1320mM Phosphate buffer pH7.042502468610 12 14 16 18
Retention time (min)202224314220mM Ammonium acetate
56024681012 14 16 18
Retention time (min)202224Column: Sunniest RP-AQUA 5 mm,
150 x 4.6 mm i.d.
Mobile phase:A) 20mM Ammonium acetateB) Acetonitrile/ A solution (20:80)
Time (min)
05 20
25%B (%)
00 100 100
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: 40 ºC
Detection: UV@250 nm
Sample: 1= Nicotinic acid
2 = Pyridoxine HCl Vitamin B6
3 = Nicotinamide
4 = Thiamine HCl Vitamin B1
5 = Folic acid
6 = Riboflavin Vitamin B2

26

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23まとめ• カラム温度を60°Cに設定するだけで，理論段数が上がり，対称性が向上する• さらに，高粘度有機溶媒をカラム圧力を気にすることなく使用でき，選択性を大きく変化させることが可能となる• C28オクタコシル基は異性体の分離や水の多い条件で分離を可能とする

Jaima2009 新技術説明会9月3日

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