選択的ショットガンプロテオミクス
Targeted Shotgun Proteomics

─ 肝ミクロソーム中P-450の網羅的解析 ── Exhaustive analysis of P-450 in liver microsomes ─
財団法人 化学物質評価研究機構 安全性評価技術研究所

山中 秀徳

武吉 正博

HIDENORI YAMANAKAMASAHIRO TAKEYOSHI

美濃部 安史矢可部 芳州YASUSHI MINOBEYOSHIKUNI YAKABE

高月 峰夫
MINEO TAKATSUKI
Chemicals Assessment Center, Chemicals Evaluation and Research Institute, Japan

1．はじめに

2．選択的ショットガンプロテオミクスの特徴

ヒトを含めた多くの種において、「生命の設計図」でプロテオミクス解析に必要とされる主要な要素として、網あるゲノム構造解析が次々と完了し、その成果が公表

羅性、再現性と定量性が挙げられる。現在、網羅性の点されている。ゲノム情報は動物の生物学の研究に大きで最も強 力なプロテオーム解 析システムは、前 述したな変革をもたらしつつあり、ゲノミクスをはじめトランスクMudPIT法を用いたショットガンプロテオミクスである。ショッリプトミクス、プロテオミクス、メタボノミクスと呼ばれる

トガンプロテオミクスでは、図-1に示したような強カチオン交生体分子の網羅的 解 析 研 究の流れが生まれてきた。

換樹脂および逆相系樹脂を充填したマイクロキャピラリー

これらオミクス研 究の中で個 々の疾 患 発 症メカニズカラム（100μm i.d.）をHPLCに装着し、カラムから直接LC-ム・治療ターゲット・疾患マーカーなどを明らかにするこMSにスプレーする。YatesⅢらの検討では、ラット脳ホモジとを主 眼とした疾 患プロテオミクスが注 目されており、ネートに対してMudPIT法を適用した場合に1,610 種のタン疾病の予防や早期診断・治療への応用が期待されてパク質が同定されたと報告している2）。このうち454のタンいる。スクリプス研 究 所のYa t e sⅢらが提 案した多 次パク質（28.2%）が膜貫通領域を有する膜タンパク質であ

元クロマトとタンデム型 質 量 分 析 装 置とを組み合わせり、これまで二次元電気泳動法などで解析するのが困難た多 次 元タンパク質 同 定 技 術（ M u l t i d i m e n s i o n a lであった膜タンパク質の同定に対してMudPIT法が有効でProtein Identif ication Technology：MudPIT）を利用あることが証明された。しかし、同定された殆どのタンパクしたショットガンプロテオミクスは現在最も強力なプロ質で、ペプチド配列の照合に用した範囲のシークエンスカ

テオーム解析手法だが、定量的な解析には不向きとバー率は20%以下と低かった。MudPIT法は、網羅性に1）いわれている 。MudPIT法に安定同位体ラベル法なおいては優れているが、再現性に難があり定量的な解析どを組み 合わ せた 様 々な改 良が 試みられているが、には不向きである。また、スループット化に関しても、質量マーカー探索のために正確な定量比較を多くの検体分析装置を複数台導入可能な大規模施設以外では多検間で行うことは依然として困難な状況にある。我々は、体の解析は不可能であるなど、バイオマーカー探索のためショットガンプロテオミクスの長所である網羅性を維持のシステムとしてのその使用は限定されたものであった。

したまま、バイオマーカーやマーカーパネル探索に必須の多検体間での正確な定量比較を効率的に実施するシステムとして 選択的ショットガンプロテオミクス を提案している。システムの応用例としてラットおよびヒト肝ミクロソームのP450（CYP）アイソフォームの解析を行った例を紹介する。

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図1 多次元クロマトシステム

選択的ショットガンプロテオミクス

ショットガンプロテオミクス（MudPIT法）の解析フロー
ステップ１：マイクロキャピラリーカラムに、全細胞溶解液

3．選択的ショットガンプロテオミクスによるP450アイソフォームの解析

フラクションである複雑なペプチド混合物をオ

薬物性肝障害の発症機序のひとつとして、P450（CYP）フラインでロード。
ステップ２：ペプチド混合物をロードした後に装置に装着の分子種の遺伝的多型に起因する薬物代謝異常によるし、ソフトウェアによりHPLCとMSを同時に肝障害や薬物相互作用による副作用が注目されている。

コントロール。ロードしたペプチドは、最初にたとえば、CYP3A4で代謝される経口避妊薬（エストロゲ

強カチオン交換樹脂から塩濃度勾配により逆ン製剤）は、CYP3A4を誘導するフェノバルビタールまたは相へ溶離させ、逆相樹脂から直接MSにスプフェニトインとの併用で、効果が減弱する可能性が指摘レー。より高い塩濃度での溶離と逆相によるされている。CYPアイソフォームの解析は、今後、新薬の分離を繰り返す。

臨床試験における薬物相互作用の検討、個々の患者にステップ３：MS/MSデータをアルゴリズムによりタンパク質またはDNAデータベースと照合して同定する。

対するオーダーメード医療における診断等の目的に必須の技術となることが予想されている。CYPの質量分析装置による同定についても近年のプロテオーム解析技術の我々は、強カチオン交換樹脂からの塩濃度勾配による進展により、研究が急激に盛んになってきている。

溶離が、MudPIT法において再現性を低下させている原

現 在 、7 0 0 種 類 以 上 の P 4 5 0アイソフォームが 細因のひとつと考え、この強カチオン交換樹脂による分画の菌 から哺 乳 動 物までさまざまな生 物 で見 つけられ 、部分をより信頼性の高い分画手法にすることでMudPIT法

P 4 5 0 は 遺 伝 子 スーパーファミリーを形 成している。の網羅性を損なわずに、バイオマーカー探索に必要な定ラットおよびヒトについては、U n i g e n eデータベース中量比較が可能なシステムを構築可能と考え、下記に示しに 約 5 0 種 類のP450アイソフォームが登録されているたようなタンパク質同定システムを考案した。ステップ2の逆（http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html）。

相分離以降の処理を同一とし、同一性能の質量分析装P450の各アイソフォームは非常に近い配列を有しており、置を使用し、強カチオン交換樹脂と同程度の分画を実施

この類似した構造を有することがP450の網羅的な解析すればMudPIT法と同レベルの網羅性が得られる。さらに、をこれまで困難にせしめてきたことも事実である。

本システムの利点は、液相等電点分画のような再現性のこれに対して、近年質量分析装置の飛躍的な性能向高い前分画を実施することにより再現性を向上させただ

上に伴い前述したショットガンプロテオミクスの手法を用けでなく、フラクションに対して等電点に関する情報を付いて、P450アイソフォームを直接質量分析装置で解析同加できることである。本手法は、MudPIT法と同程度の網定することが可能になってきている。最も多種類のP450羅性を維持したまま、高い再現性が期待できるシステムでアイソフォームを解析した例として、SDS-PAGEで分離しありバイオマーカー探索などには最適な手法と考える。

たラット肝ミクロソームの分子量48-62kDaの画分のみをLC-MS/MS解析に供することにより24種類のアイソフォー

CERI*の選択的ショットガンプロテオミクス* 財団法人化学物質評価研究機構

ステップ1：全細胞溶解液を液相等電点や溶解性に基づく分画などの手法を用いて前分画する。前分画後のタンパク質を混合物のまま、もしくはSDS-PAGEで分画したものを酵素消化する。
ステップ2：ペプチド混合物を逆相樹脂で分離し直接MSにスプレー。
ステップ3：MS/MSデータをアルゴリズムによりタンパク質またはDNAデータベースと照合して同定する。

ムを同定したことが報告されている3）。しかしながら、この分子量に基づく分画では網羅的な解析には不十分であった。
我々は、このP450が類似した一次構造をもつためにその物理化学的な性状も似てくることを逆に利用してP450の網羅的な解析を試みた。具体的には、肝ミクロソームを溶解性に基づいて5つのフラクションに分画し、各々の分画に対してLC-MS/MSを用いた一斉同定を試みた。この場
合ほとんどのP450が、難溶解性の分画においてのみ検出されることが確認された。
（表-1参照）難溶解性の画分にTHE CHEMICAL TIMES 2007 No.4
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P450が濃縮されることによって、これまで報告されている中4．今後の展望で最も多い計36種類のCYPアイソフォームを同定することに成功した。また同定されたアイソフォームの中で分画の有無によるシークエンスカバー率の比較を図-2に示した。

まだ基礎的検討の段階であるが、プロテオーム解析の応用例としてCYPアイソフォームの解析を紹介した。紹介したプロテオーム解析手法は、網羅性を犠牲にせずに、表1 各フラクションで同定されたCYPアイソフォームの数マーカー探索に必須の定量比較の正確さも追及可能なSolubility
Low

High

Fraction1

Fraction2

Fraction3

Fraction4

Fraction52917400システムに拡張可能である。様々な前分画手法とショットガンプロテオミクス手法の融合（選択的ショットガンプロテオミクス法）を実施することにより、既存の方法と比較してより正確に且つ多くの有意義な情報を得ることが出来る

本同定手法によりこれまでに報告されている中で最もようになると期待される。

多い36種類のCYPアイソフォームを含めて500種類以上の肝ミクロソーム中のタンパク質が同定された。本同定手法と安定同位体ラベル法とを組み合わせて定量比較解析を行うことも可能である。
我々は、正確な定量比較手法として蛍光ディファレン
シャル解析（2D-DIGE; GEヘルスケア社）を用いた詳細なプロテオーム解析も実施している4）。いくつかのCYPアイソフォームに関して、二次元電気泳動上の相当する領域で実際にCYPを同定している。CYPのように、目的に応じて解析したいタンパク質種が決まっている場合には、選択的ショットガン法を利用して全領域のタンパク質を同定し、実際に解析する二次元電気泳動上の領域を絞り込むのが効率的で有効な手法になると考えられる。

参考文献
1）Washburn MP, Wolters D, Yates JR 3rd. Large-scale analysis of
the yeast proteome by multidimensional protein identification
technology. Nat Biotechnol. 2001, 19, 242-247.
2）Wu CC, MacCoss MJ, Howell KE, Yates JR 3rd. A method forthe comprehensive proteomic analysis of membrane proteins. Nat
Biotechnol. 2003, 21, 532-538.
3）Nisar S, Lane CS, Wilderspin AF, Welham KJ, Griffiths WJ,
Patterson LH. A proteomic approach to the identification ofcytochrome P450 isoforms in male and female rat liver bynanoscale liquid chromatography-electrospray ionization-tandem
mass spectrometry. Drug Metab Dispos. 2004, 32, 382-386.
4）Yamanaka, H., Yakabe, Y., Saito, K., Sekijima, M., Shirai, T.
Quantitative proteomic analysis of rat liver for carcinogenicity
prediction in a 28-day repeated dose study. Proteomics 2007, 7,
781-795.

図2 CYP2B1の分画前後のMS/MSデータの検索結果の比較(A) 溶解性に基づく分画後の2B1アミノ酸シークエンスの中で同定されたペプチド（大文字で表記）(B)分画しない場合の2B1アミノ酸シークエンスの中で同定されたペプチド（大文字で表記）12

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