JAIMA Season 20
2020
機器分析が支える、豊かな暮らしと産業のフロンティア

ドーピング検査No.9

株式会社 LSI メディエンス

１．はじめにJAIMA60 周年記念特集

アンチドーピングラボラトリー

岡野雅人

質を検出するいわゆるドーピング検査における検体分析はアンチ・ドーピング活動の中で、重近年は病気になってから治療する医療から、生要な位置を占めている。ドーピング検査におけ活習慣病や介護の予防を通じて健康寿命の延伸やる検体分析は世界 30 カ所（2020 年５月現在）の医療費抑制を期待する予防医療の重要性が増してWADA 認定試験所で実施される。世界各国の認いる。最近のジョギング・ランニングブームのよ

定試験所は大学もしくは国家機関を母体として運うに、スポーツは私たちの心身の健康の保持増進営されているが、我が国においては筆者の所属すにも不可欠となっている。2019 年のラグビーワー

る民間企業である株式会社 LSI メディエンスがルドカップでは、アスリートが定められたルール唯一の分析機関であり、1985 年以来、国内外のに従い、フェアプレー精神、優れたチームワーク、ドーピング検査における検体分析を担っている。

最善を尽くす姿から私たちは多くの感動や勇気をWADA の認定を受けるためには使用する認証得ることができた。しかし、こうしたスポーツの標準物質、分析法、校正方法を ISO/IEC17025 の価値に反する競技力向上を意図したアスリートに試験所認定範囲内に収める必要がある。さらには、よる薬物不正使用、いわゆるドーピングは、近年WADA の各規程に遵守し、定期的な精度管理プ

では一般青少年の憧れの存在でもあるトップアス

ログラムにパスしなければ WADA 認定試験所のリートにまで広がりを見せ、いまやスポーツ界の資格は一時停止もしくは剥奪される。2017 年の問題だけではない公衆衛生上の大きな社会問題のWADA の統計２）によれば全世界で 245,232 検体ひとつとなっている。このようなドーピングを防が分析され、そのうち 1,459 件（うち我が国は５止する活動はアンチ・ドーピングと呼ばれ、その件）がドーピング違反とされた。競技会時、もし活動目標は、スポーツ固有の価値を保護すること

くはトレーニング中に採取された尿検体もしくはにある。現在、アンチ・ドーピング活動は世界ア

血液検体は、WADA 認定試験所に搬入された後、ンチ・ドーピング機構（WADA）を中心に展開低分子から高分子薬物など多岐にわたる物質を分されている。我が国では 2018 年 10 月に「スポー析するために、表１に示したように液体ならびにツにおけるドーピング防止活動の推進に関する法

ガスクロマトグラフィー質量分析、イムノアッセ

律」が施行され、アスリートによる禁止薬物の使イ、フローサイトメトリー、電気泳動、リアルタ

用、所有、取り引き、コーチ等のアスリート支援

イム PCR といった多岐にわたる分析手法が用い者によるアスリートへのドーピングほう助は罰則られ、さまざまな分析機器が活躍している３）。

規定がないものの違法行為とされている。
WADA はドーピング禁止物質および禁止方法を、競技力向上、健康上の危険性、スポーツ精神に反するなどの要件により禁止リストに収載し、少なくとも毎年 1 回更新している 1）。アスリートの尿試料もしくは血液試料からドーピング禁止物

JAIMA Season 2020 Summer3

表 -1. ドーピング検査における検体分析法
禁止薬物および禁止方法

検査試料

分析法

S0. 無承認薬
S1. タンパク同化薬
S3. β 2 刺激薬

尿網羅分析：ガスクロマトグラフィー高分解能質量分析 (GC-Oribitrap MS)
ターゲット分析：ガスクロマトグラフィートリプル四重極質量分析 (GC-MS/MS)

S0. 無承認薬
S1. タンパク同化薬
S3. β 2 刺激薬
S4. ホルモン調節薬および代謝調節薬
S5. 利尿薬および隠蔽薬
S6. 興奮薬S7. 麻薬S8. カンナビノイド
S9. 糖質コルチコイド
P1. β遮断薬

尿S1. タンパク同化薬 ( 外因的に投与した場合の内因性蛋白同化薬 )尿ガスクロマトグラフィー安定同位体比質量分析（GC-IRMS)

S2. 成長ホルモン分泌刺激薬

尿マイクロフロー LC-MS/MS

S2. ゴナドトロピン (hCG)

尿酵素免疫法（EIA)S2. 成長ホルモン

血清EIA、ラジオイムノアッセイ (IRMA)、LC-MS/MS

S2. エリスロポエチン (EPO)

尿、血漿、血清Sarcosyl-PAGE 法とウエスタンブロッティング（化学発光検出）、LC-MS/MS

S4. ホルモン調節薬および代謝調節薬 ( インスリン）

尿、血漿、血清ナノフロー LC-Oribitrap MS

M1.

血液および血液成分の操作 ( 輸血）

全血フローサイトメトリー

M2.

化学的および物理的操作

尿、全血

リアルタイム PCR（個人識別）M3.

遺伝子および細胞ドーピング

全血リアルタイム PCR

網羅分析：液体クロマトグラフィー高分解能質量分析 (LC-Oribitrap MS)
ターゲット分析：液体クロマトグラフィートリプル四重極質量分析 (LC-MS/MS)

２．アンチ・ドーピングを支える分析機器の進歩リーンアップを必要とすることも少なくない。
近年、飛行時間型質量分析計やオービトラッブ

2-1．
分析精度を向上させる高分解能質量分析計

質量分析計のように精密質量精度、質量分解能がドーピング検査における検出物質は筋肉増強効著しく向上した分析機器が開発された。図１には果を期待したタンパク同化ステロイドホルモンがタンパク同化ステロイドホルモンの一つボルデ最も多い。その検出にはドーピング検査においてノンの尿中代謝物（5 β -androst-1-en-17 β -ol-3-は主としてガスクロマトグラフシングル四重極型one）のプロダクトイオンマスクロマトグラムを質量分析計により分析が行われてきた。その後、示した。上段に示した低分解四重極型質量分析計

四重極、コリジョンセルおよび四重極を直列に配による測定の場合、薬物服用のないブランク尿試置したトリプル四重極型質量分析計が開発され、m/z 432>194料においても溶出位置近辺に夾雑ピークが観測さプリカーサイオンから得られるフラグメントイオれる。一方、下段に示したように高分解能オービン測定することにより、選択性、特異性、検出感トラップ型質量分析計による測定の場合は夾雑度の非常に高い測定が可能となった。一方、四重ピークを限りなく抑えたクロマトグラムを得るこ

極型質量分析では、質量分解能が低く夾雑物質のとができる。

m/z 432>206

影響を受けるため、試料の前処理操作によるク

低分解能m/z 432>194m/z 432>206

高分解能

陽性尿m/z 432.2874 > 194.1121
m/z 432.2874 > 206.1121

ブランク尿図―1 尿中ボルデノン代謝物 (10ng/mL)のプロダクトイオンマスクロマトグラムの⽐較
図１ 尿中ボルデノン代謝物（10 ng/mL）のプロダクトイオンマスクロマトグラムの比較
左：ガスクロマトグラフトリプル四重極型質量分析（低分解能, ShimadzuTQ8050）
m/z 432.2874 > 194.1121
上段：ガスクロマトグラフトリプル四重極型質量分析計（低分解能,Shimadzu TQ8050)
右：ガスクロマトグラフ高分解能質量分析計（分解能60000,
ThermoQ-ExactiveGC）
m/z 432.2874 > 206.1121
下段：ガスクロマトグラフ⾼分解能質量分析計（分解能60000,
Thermo Q-Exactive GC)

4

JAIMA Season 2020 Summerまた、ドーピングする側は、検査法が開発され同時取得が可能であり、数年後に過去のデータをている薬物の分子構造を改変することで、質量分再解析することを可能とし、ドーピング検査に大析によるターゲット分析を行うドーピング検査をきな進歩をもたらしている。図２にナンドロロン回避することを狙ったデザイナードラッグを使用代謝物（19-norandrosterone）をモデル化合物とするようになった。四重極型質量分析でのターしてそのシミュレーションを示した。検査数年後

ゲット分析で得られた分析データを遡及的に再解に新たに発見された新規ステロイドの推定分子量

析しても過去に分析対象外だった薬物を検索するから、± 5ppm でマスクロマトグラムを抽出し、ことは不可能である。高分解能質量分析では精密そのマススペクトルから検出・同定が可能となる。

質量情報を有するフルスキャンマススペクトルの

図２ 高分解能フルスキャンデータからの遡及的データ解析のシミュレーション
高分解能質量分析計（分解能 120000, Thermo Q-Exactive GC）

今後は、標準試料と比較しなくてもフルスキャう必要がある。

ンデータから AI 人工知能などを用いて可能性のあるドーピング禁止物質もしくは代謝物を検索する解析技術も期待される。

2-2．
アスリートの負担を軽減する分析機器の進歩
分析計の高感度化はドーピング検査におけるア一方、このような分析機器の精度向上に伴い、スリートの負担を軽減する効果をもたらしている。

検体中の微量成分が検出可能になり、食肉、サプドーピング検査では主に尿試料が分析に供されてリメント、医薬品への微量のコンタミネーションきたが、採尿時に尿のすり替えなどを防止する目が原因による意図せぬドーピング違反を問われる的で、ドーピング検査官の監視下での採尿が実施ケースが増加する傾向にある。そのため、ドーピされる。特に女性アスリートの精神的負担になる

ング違反を確定する前に、検査主催機関はアスことが指摘されてきた。また、スポーツ後は発汗リートへのヒアリングや事後調査も十分におこなにより尿が出にくいことから、規定の採尿量を確JAIMA Season 2020 Summer

5保するための長時間の拘束によるアスリートのコ

DBS を試料とする場合、通常はスポットされたンディショニング悪化も問題視されてきた。正中乾燥ろ紙を切り抜き、抽出、精製など煩雑な前処

皮静脈からの採血によるドーピング検査も行われ理工程を必要とするが、近年の分析計の高感度化ているが、採血には医療従事者の支援が必要なこと自動化によりスループットが大幅に向上していとから、採尿のように十分普及できていない。最る。図 3 に筆者らが推進している前処理操作なく、近は、低侵襲かつ迅速な自己採血が可能であり、DBS カードをオートサンプラーにセットするだ

省保管スペースと輸送において利点のある乾燥血けでドーピング禁止興奮薬・麻薬 64 成分の測定液スポット（Dried Blood Spot: DBS）を試料とを可能とする全自動オンライン液体クロマトグラ

するドーピング禁止物質の分析が試みられている。

フィー質量分析法を示した。今後、競技会検査に

DBS は新生児スクリーニング検査や創薬の分野おいて指先や上腕部からの数十μ L の採血でドーでは古くから用いられてきているが、静脈採血とピング検査が可能となれば、アスリートへの負担異なり毛細血管からの僅か数十μ L の微量採血の大幅な削減と分析コスト、分析所要時間の大幅となるため、分析の高感度化も課題であったため、な削減が期待できる。

ドーピング検査では実施されていなかった。また、

図３ 乾燥血液スポットによる全自動オンライン LC-MS/MS フロー装置写真：Spark DBS Autosampler coupled to Thermo TSQ Altis

62-3．新たなドーピング検査：生体パスポートと点では確立されていない。このように、分析機器

オミックス解析の感度が向上しても「微量の禁止物質やもともと上述のようなドーピング検査は、検体中に存在体内に存在するものの使用を検出する」手法だけする禁止物質もしくは代謝物を検出することが目では完全なドーピング検査体制を維持するには限的である。血液ドーピングは、遺伝子組換えエリ界もある。

スロポエチン製剤（EPO）の使用や輸血のように、近年、新しいドーピング検査方法として、ア酸素運搬能力の向上を期待して、持久力系競技な

ス リ ー ト 生 体 パ ス ポ ー ト（Athlete Biological

どで行われている。この場合、EPO 使用の直接Passport, ABP）が導入された。これは、アスリー検出法は表１に示したように電気泳動、ウエスタ

ト個人の血液中のヘモグロビン量や赤血球数、尿ンブロッティングにより実施されるが、検査の目中の内因性ステロイドホルモンの変化を経時的にをかいくぐる微量投与（マイクロドージング）でモニタリングし、その変動からドーピング違反をは感度上困難な場合がある。また、アスリート自摘発したり、さらなる追加検査立案の参考情報を身が自身の血液をあらかじめ貯血しておき、競技得たりするシステムである４）。EPO を使用する

会直前に再輸血する手法の直接的な検出法は現時と、網状赤血球割合（RET%）は高くなり、続いJAIMA Season 2020 Summer

て赤血球数が上昇し、RET% は減少する。数値の「高い」「低い」には個人差があるので、各ア３．おわりにスリートの複数回の測定値からその変動範囲を設

分析機器の進歩はスポーツにおけるドーピング定し、そこから逸脱することによってドーピングの防止に欠かせないものとなっており、クリーンの痕跡を見出す。自己血輸血ドーピングの場合、なアスリートと健全なスポーツの発展を支えるう

輸血用に採血した時点では、赤血球数の減少に伴えで今後も期待される。一方、高分解質量分析のう低酸素状態により RET% が上昇し、再輸血時ように得られるデータは膨大な情報量であり、筆には赤血球数が上昇するため、輸血ドーピングの者らもしばしばデータの解析に労力を割いている検知が可能になる。

が、そのデータをいかに迅速に有効に解析するか現在は、他に内因性のテストステロン代謝物がポイントとなる。オミックス解析などでは現在などの個人変動をプロファイリングすることにの ABP と比較にならない膨大な情報量を扱うたよりテストステロン製剤によるドーピングの検め、より高速なデータ解析システムの開発ものぞ出率は飛躍的に向上している。これらの ABPまれる。さらには、ドーピング違反を捉えるためデータは、筆者の WADA 認定分析機関を含めには、分析データだけではなく、例えば、水泳ア一部の認定分析機関内に設置されている Athlete

スリートのタイム記録などの競技成績のデータ

Passport Management Unit（APMU） に よ り

ベースとリンクして、不自然な競技成績向上など解析される。高地トレーニングなどの低酸素状も判断材料とすることも効果的と考えられる。こ態、疾病、出血などによる変動も考慮して判断うしたビッグデータ解析のために、人工知能 AIが必要となるため、この APMU は、血液学や内をドーピング検査に取り入れる日もそう遠くはな分泌学専門の医師、さらにアンチ・ドーピングいと考えられる。

に関する高度な知識を持つ専門家（Expert）と新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）の世界的管理スタッフから構成され、分析データは Anti-大流行により東京オリンピック・パラリンピック

Doping Administration & Management System

開催は 2021 年に延期となったが、オリンピック（ADAMS）と呼ばれる WADA の Web システム

成功のひとつにはドーピングのないクリーンな大を介し、アスリートのプライバシーが守られた状会であることがあげられる。こうした中、新たな態で共有される。このように、
ABP はアンチドードーピング検査法の開発、分析機器、データ解析

ピングプログラムにおいて有効なツールとなってシステムの発展はますます重要性を増していくでいる。

あろう。

今後は、メタボローム、トランスクリプトームなどのオミックス解析をドーピング検査に取り入れることが期待される５）。禁止薬物の使用、輸血、遺伝子操作などを行うと血液中ではさまざまな変化が起きる。通常の状態や運動負荷時での血中の代謝物や small RNA などの量を調べ、EPO、成長ホルモンや自己血輸血、遺伝子ドーピングをした場合の変化を捉えることでドーピングの痕跡を捉える可能性がある。これまで、検査する側が後手になりがちなターゲット検査からのブレークスルーとなり、検査する側がドーピングする側に先【参考文献】
１）WAA. Prohibited list 2020.
https://www.wada-ama.org/sites/default/files/wada_2020_
english_prohibited_list_0.pdf
２）WADA. 2017 Anti-Doping Rule Violations（ADRVs）Report.
https://www.wada-ama.org/sites/default/files/resources/
files/2017_adrv_report.pdf
３）岡野雅人 , 池北紋子 . ぶんせき（Bunseki）, 10, 2018, 434.
４）WADA. Athlete Biological Passport （ABP） Operating
Guidelines.
https://www.wada-ama.org/sites/default/files/resources/
files/guidelines_abp_v71.pdf
５）Wang G et al. Next Generation "Omics" Approaches inthe "Fight" against Blood Doping. Med Sport Sci. doi:
10.1159/000470919..

行して網羅的にドーピング不正を監視できる可能性がある。

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