No.2

No.2 Dec.

Dec.

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報 告

無菌コモンマーモセットの作出
井上 貴史 植野 昌未 野津 量子（公益財団法人実験動物中央研究所）
要 旨：無菌霊長類を用いた腸内微生物叢研究の展開をめざして，我々は小型の霊長類種のコモンマーモセッ
トにおいて無菌動物の作出とその研究応用のための技術開発を進めている．妊娠個体の準備からビニールアイ
ソレータ内の無菌環境下での帝王切開による産仔獲得，人工哺育，育成までの一連の技術確立を進めて無菌マーモセットの作出を試みた．その結果，糞便の培養検査により生菌が検出されない無菌マーモセット個体の作出に成功し，最長で 24 ヶ月齢まで培養検査陰性の維持に至った．獲得したマーモセット個体では，糞便中の二次胆汁酸の欠如や，分泌型 IgA の低濃度，糞便・血漿のプロテオーム解析での免疫関連のタンパク質の低発
現，造影レントゲン検査のよる盲腸拡大が観察され，無菌動物としての特性が示唆された．今後は，作出した無菌マーモセットの繁殖を試みるとともに，作出技術を洗練させて研究利用のための安定供給体制を確立していきたい．
キーワード：無菌動物，マーモセット，非ヒト霊長類，実験動物

I. 目的
近年の腸内微生物叢研究の発展において，無菌マウスを用いた実験系は欠かすことのできないものとして貢献している．その一方で，マウスでの研究成果をヒトへ外挿するには，ヒトとげっ歯類との代謝，免疫，中枢神経系などの生体機能の違いや，宿主との共進化により形成されてきたとされる腸内微生物叢の定着性の差異が障壁となることがある．これらの差異を埋めるべく，ヒトに近縁な霊長類を用いた実験系が期待されるが，現在，利用可能な無菌霊長類は存在しない．そこで，我々は，無菌霊長類を用いた腸内微生物叢研究の展開をめざして，アイ
ソレーター内での飼育・取り扱いに適する小型の霊長類種のコモンマーモセットにおいて無菌動物の作出とその研究応用のための技術開発を進めている．

の１歳までの育成期間中の体重増加は，通常環境で育成された個体と差異は認められなかった．また，性成熟に達した無菌個体においてメ
スでは性周期，オスでは運動精子の射出が観察された．
獲得した無菌個体の糞便の代謝物解析では，腸内細菌が生成する短鎖脂肪酸の濃度は通常飼育個体と比較して低く，二次胆汁酸は検出されなかった．また，腸管免疫の活性化の指標である
糞便中の分泌型 IgA の濃度が低く，糞便および血漿のプロテオーム解析においては免疫関連のタンパク質の発現が低いことが観察された．さらに，下部消化管の造影 X 線撮影により，無菌維持個体において無菌マウスと同様に盲腸が著しく拡張していることが観察された．

III. 考察
本検討において，生菌が検出されない無菌マー
II. 方法・結果
モセット個体を作出し，性成熟に達する 2 歳以
妊娠個体の準備からビニールアイソレータ（VI） 上までの維持に成功した．また，獲得したマー
内での無菌環境下での帝王切開による産仔獲得
モセット個体においては，無菌マウス等で知らから人工哺育，育成までの技術を確立して無菌れている腸内細菌叢の欠如による特性を有してマーモセットの作出を試み，その結果，糞便のいることが示唆された．今後は，作出した無菌培養検査により生菌が検出されないマーモセッ
マーモセットの繁殖を試みるとともに，作出技
ト個体を獲得した．現在までに 10 頭の産子が離術を洗練させて研究利用のための安定供給体制
乳し，そのうち 8 頭では 2 ヶ月齢以上まで培養を確立していきたい．また，ノトバイオート実
検査で生菌（細菌・真菌）が検出されず，最長験を行い，霊長類モデル動物としての無菌マーで 24 ヶ月齢まで培養検査陰性を維持している． モセットの有用性について検証を進める予定で獲得した生菌が検出されない個体（無菌個体）
ある．
（会員外共同研究者：岡原則夫*, 岡橋伸幸**, 佐藤賢哉*, 上田政広***, 新 幸二****, 諫山 純***,青戸良賢***,川島祐介*****, 菊池理加*,黒滝陽子*, 峰重隆幸*, 圦本晃海*, 板谷佳織*, 田之上 大*, 中畑*龍俊*,塩田 淳***, 有田 誠**, 本田賢也****, 佐々木えりか*， 実験動物中央研究所，**理化学研究所***
生命医科学研究センター, JSR・慶應義塾大学医学化学イノベーションセンター,****慶應義塾大学
医学部,*****かずさ DNA 研究所）

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無菌生物

J.germfree life gnotobiol.

A trial of developing germ-free common marmosets
TAKASHI INOUE*, MASAMI UENO* and RYOKO NOZU**

Central Institute for Experimental Animals, Kawasaki

Germ-free mice have contributed indispensably to the advance of gut microbiota research. On theother hand, extrapolation of mouse studies to human medicine can be hampered by differences inbiological functions such as metabolism, immunity, and central nervous system between humans androdents, as well as differences in the colonization of gut microbiota, which is believed to have been
formed by coevolution with the host. To bridge these gaps, experimental systems using nonhumanprimates (NHPs) are expected, but there are currently no germ-free NHPs available. Therefore, wehave been developing technologies for the production of germ-free animals in common marmosets, asmall NHP suitable for rearing and handling in an isolator. A series of techniques for germ-freemarmoset production including preparation of full-term pregnant animals, aseptic caesarean section,
hand-rearing of neonates and long-term maintenance of animals under sterile conditions weredeveloped. To date, we succeeded obtaining 8 germ-free marmosets in which no viable bacteria andfungi were detected in culture and maintained them for a long period of up to 24 months. The weightgain in the obtained germ-free individuals was not different from that in conventional ones. In thesexually mature individuals, a sexual cycle in a female and the ejection of motile sperm in a male wereobserved. Germ-free marmosets exhibited low levels of faecal short-chain fatty acids, bile acidmetabolites, plasma and faecal immunoglobulins, and enlarged caecum in contrast-enhanced X-ray.
These germ-free marmosets can serve as novel models that reveal the interaction between microbiota
and primate hosts.
Keywords：germ-free animal, marmoset, nonhuman primate, laboratory animal(Non-member collaborators: NORIO OKAHARA*, NOBUYUKI OKAHASHI**, KENYA SATO*, MASAHIROUEDA***, KOJI ATARASHI****, JUN ISAYAMA***, YOSHIMASA AOTO***, YUSUKE KAWASHIMA*****,
RIKA KIKUCHI*, YOKO KUROTAKI*, TAKAYUKI MINESHIGE*, TERUMI YURIMOTO*, KAORI ITAYA***,
TAKESHI TANOUE****, TATSUTOSHI NAKAHATA*, ATSUSHI SHIOTA***, MAKOTO ARITA**, KENYAHONDA****, ERIKA SASAKI*. **RIKEN Center for Integrative Medical Sciences, Yokohama, ***JSR-Keio
University Medical and Chemical Innovation Center, Tokyo, ****Keio University School of Medicine, Tokyo,*****
Kazusa DNA Research Institute, Kisarazu)

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第 55回

日本無菌生物ノ ー ト バ イ オ ロ ジ ー 学 会 総 会（承前）The Fifty-fifth Annual Meeting of
The Japanese Association of Germfree Life and Gnotobiology
January 22-23, 2022
SendaiPresident Hitoshi Shirakawa

無菌生物52̲本文.indb 3

会

長

白

会

期

2022年（令和 4 年） 1 月22日（土）・22日（日）会場

東北大学・青葉山コモンズ・オンライン開催併用

川仁

2022/08/30

鹿毛 11:02

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J.germfree life gnotobiol.

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J.germfree life gnotobiol.

新生仔の鼻腔炎症に起因する腸内細菌叢の変動と脳組織損傷
石井 さなえ*三島 由祐子*
浅野 妃南**
大﨑 敬子***(*杏林大学保健学部臨床検査技術学科,**杏林大学大学院保健学研究科，***杏林大学医学部感染症学）

I. 背景と目的妊娠後期の母体感染に伴う胎児の炎症応答は，生後自閉症などの精神疾患を患う危険因子となる．しかし，胎児期に起こる炎症応答により，生後の脳機能が持続的に障害される機構については不明である．私たちは，胎児/新生児期という生体形成の重要な時期に炎症が起こると，腸内細菌叢の正常な形成が妨げられ，腸内細菌叢の構成が乱れることで通常の脳腸連関が構築されず，脳機能が阻害されるのではないかと考えた．
胎児への感染経路としては，子宮内細菌感染に起因して胎盤経由で全身性炎症反応を起こす経路と，感染した羊水を口腔及び鼻腔から吸引する経路がある．本研究では後者の経路を模倣し，マウス新生仔の鼻腔炎症がその後の腸内細菌叢の構成と脳組織にどのような影響を及ぼすかを明らかにすることを目的とした．
II. 対象と方法
生後 7 日齢から週に 2 回ずつ 3 週間(P7, P10, P14,
P17, P21, P24)，雌雄マウスの両側鼻腔にリポ多糖(LPS)もしくは生理食塩水を投与し，鼻腔炎症モ
デル及び対照群とした．最終投与終了後（P24），
またその 6 週間後（10 週齢）に便を採取し，腸内細菌叢の 16SrRNA メタゲノム解析を行った．
同時期にマウスを灌流固定し，脳の凍結切片を作製，免疫染色を行った．投与開始から 1 週間毎に体重を測定した．

III. 結果と考察
投与終了時の P24 における腸内細菌叢は，門レ
ベルではいずれの群も Firmicutes と Bacteroidetesが優勢であったが，オスの LPS 投与群では占有比が変動していた細菌(門)を認めた．科，属のいずれのレベルにおいても，オスでは LPS 投与群と対照群との間に有意な違いが見られた．しかしながら，メスでは LPS 投与群と対照群の間に違いは見られなかった．P24 の時点でオスの LPS
投与群において変動していた細菌は，10 週齢では対照群と同程度であったが，別の種類の細菌(科，属)の占有比が有意に変動した．脳の免疫染色を行った結果，オスの LPS 投与群では鼻腔の嗅上皮中にまだ炎症が続いている部分があり，嗅球のミクログリア及びアストロサイトは顕著に活性化していた．嗅球以外の領域におけるグリア細胞の活性化，神経炎症の有無，及びメスの脳組織については現在解析中である．また，オスの LPS 投与群は，P35 以降に対照群と比べて体重の有意な低下が認められたが，メスではこのような違いは見られなかった．これらの結果から，新生仔期の鼻腔炎症は，長期にわたって腸内細菌叢と脳組織に変化をもたらし，特にオスマウ
スにおいて顕著な差となると考えられた．

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Neonatal nasal inflammation-induced perturbation of gut microbiota andthe brain tissue changes
SANAE HASEGAWA-ISHII*, YUKO MISHIMA*, HINAMI ASANO** andTAKAKO OSAKI**** Faculty of Health Sciences, Kyorin University, Tokyo** Graduate School of Health Sciences, Kyorin University, Tokyo***Department of Infectious Diseases, Kyorin University School of Medicine, Tokyo
Maternal infections and resulting inflammatory responses are risk factors for neuropsychiatricdisorders in offspring. But the mechanisms underlying sustained impairment of the brain function after
birth remain elucidated. We hypothesized that inflammation during fetal and neonatal periods may
disturb the gut microbiota development and alter the gut-brain axis, leading to brain diseases. We
aimed to reveal how the neonatal nasal inflammation affects the gut microbiota and the brain. From
postnatal day 7 (P7), neonatal mice received bilateral nasal administration of lipopolysaccharide (LPS)
as a nasal inflammation model or saline as a control twice a week for 3 weeks (at P7, P10, P14, P17,
P21 and P24). At P24 and at 10 weeks (10w) of age, feces were used for 16SrRNA metagenome
analysis. At the same time points, mice were fixed and frozen sections of the brain were analyzed
immunohistochemically. The body weight was measured every 1 week from P7. In LPS-treated malemice, gut microbiota was perturbed in the phylum, family and genus levels at P24, while it did notchange in LPS-treated female mice. The abundances of bacteria were similar at 10w, but some werechanged in LPS-treated male mice. In the olfactory bulb, glial cells were still activated in LPS-treatedmale mice at 10w. The body weight was significantly lower in LPS-treated male, but not female micethan in control later than P35. These results suggest that neonatal nasal inflammation causes long-term
perturbation of gut microbiota and the brain and that male mice seemed to be more affected.

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無菌生物

J.germfree life gnotobiol.

個別換気ケージによる無菌マウスの自発運動量測定法の検討
小島 圭介

何 裕遥 野津 量子 富山 香代 植野 昌未 小倉 智幸 高橋 利一（公益財団法人実験動物中央研究所）【背景】
無菌マウス( GF ) を用いた動物実験は，従来した状態で 127℃40 分，水は 127℃90 分で滅菌した．また測定用センサー類はホルマリン殺菌

ビニールアイソレータ（VI)が用いられてきたが， 装置（メディエート社）で処理した．作業者は
我々はバイオバブルクリーンルーム

無塵衣を着用してバブルに入室し，ケージ交換（bioBUBBLE 社，以下，バブル）と個別換気ケ等はバブル内に設置したクリーンベンチ内で実ージ（IVC）システムを組み合わせることで，コ施した．測定期間は 5 日間の順化後 17 日間とンベンショナル環境下において GF マウスの維

し，ケージ交換時には無菌検査を実施した．ま持が可能なシステムを構築した（Ka Y, et al.

た，EX-GF マウスの実験においては，SPF マウ

2020）．本報告では，これまで VI では事例を見

スの糞便を給水瓶に混濁させる方法で FMT をない動物実験として自発運動量のデータ取得を行い，FMT の前後 1 週間の自発運動量を測定し試みた．IVC トップに回転かごを装着できるよ

た．それぞれ得られた回転かごデータの解析は

うに改造を行い，測定値を無線接続することで，明期と暗期に分け，群間で比較した．

無菌状態を維持しながらマウスの自発運動量を連続的にモニターできることを目標とした．さ

【結果と考察】らに，GF マウスに SPF マウスの糞便を投与（以本実験で構築した実験プロトコルにおいて，

下，FMT）して腸内細菌叢を再構成したマウス

無菌を維持した状態で自発運動量を測定するこ（以下， EX-GF)と SPF マウスの自発運動量もとができた．しかし，自発運動量はマウスの個比較した．

体差があり，現在まで GF マウスと SPF マウスの比較において有意差は見いだせていない．本

【材料と方法】

検討において無菌環境下でのマウスを用いた自コンベンショナル飼育環境下にバブル

発運動量評価が可能となったことで，腸内細菌（bioBUBBLE, Inc）を設置した．IVC システム

が自発運動量に与える影響を経時的かつ総量的に評価できる手法となることが期待できる．

は日本クレア(株)を用い，IVC ケージに適合する
よう回転かご付ケージトップ（(有)メルクエスト）を改良した．測定データは無線にてバブル外のパソコンに転送した．飼育機材は IVC にセット

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Establishment of running-wheel activity test using germ-free mice
KEISUKE KOJIMA，YUYO KA, RYOKO NOZU, KAYO TOMIYAMA, MASAM
I UENO, TOMOYUKI OGURA and RIICHI TAKAHASHI
Central Institute for Experimental Animals, Kawasaki
We have developed a system that can maintain Germ-free mice in a conventional environment. by combining abioBUBBLE clean room with an individual ventilation cage (IVC) system in a conventional environment. (Ka Y, etal. 2020）
In this study, we tried to acquire data on running-wheel (RW) activity by modifying the RW mounted on the IVC
cage and monitoring its tally counter by wireless.
In addition, we also observed changes in the running-wheel activity of EX-GF mice whose intestinal bacterial flora
was reconstituted by fecal transplantation (FMT) from SPF mice.

The mice were acclimatized for 5 days and their locomotor activity was monitored for 2 weeks. Confirmation ofmaintenance of GF condition by culture inspection was carried out by collecting feces and bedding at the time ofweekly cage changing.
In the EX-GF mice experiment, FMT was performed by suspending the feces of SPF mice in a water bottle, and wemeasured the locomotor activity for one week before and after FMT.
We divided each rotating wheel data into a diurnal period and a nocturnal period and compared the groups.
In this experiment, it was possible to measure locomotor activity while maintaining sterility. However, to date, wefind no significant difference in comparing GF and SPF ,EX-GF mice.
Therefore we expect that it will be a method for assessing the effect of intestinal bacteria on locomotor activity overtime and in a total amount.

（Non-member collaborators : Norio Okahara*, Nobuyuki Okahashi**, Kenya Sato*, Masahiro Ueda***, Koji
Atarashi****, Jun Isayama***, Yoshimasa Aoto***, Yusuke Kawashima*****, Rika Kikuchi*, Masami Ueno*,
Ryoko Nozu*, Yoko Kurotaki*, Takayuki Mineshige*, Terumi Yurimoto*, Kaori Itaya***,Takeshi Tanoue****,
Tatsutoshi Nakahata*, Atsushi Shiota***, Makoto Arita**, Kenya Honda****, Erika Sasaki＊＊；Central Institutefor Experimental Animals, Kawasaki **RIKEN Center for Integrative Medical Sciences,Yokohama,***JSR-Keio
University Medical and Chemical Innovation Center, Tokyo, ****Keio University School of Medicine, Tokyo,***** Kazusa DNA Research Institute, Kisarazu）

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無菌生物 J.germfree life gnotobiol.

無菌コモンマーモセットの作出
井上貴史(公益財団法人実験動物中央研究所)

近年の腸内微生物叢研究の発展において，無菌マウスを用いた実験系は欠かすことのできないものとして貢献している．その一方で，マウスでの研究成果をヒトへ外挿するには，ヒトとげっ歯類との代謝，免疫，中枢神経系などの生体機能の違い
や，宿主との共進化により形成されてきたとされる腸内微生物叢の定着性の差異が障壁となることがある．これらの差異を埋めるべく，ヒトに近縁な霊長類を用いた実験系が期待されるが，現在，利用可能な無菌霊長類は存在しない．そこで，我々は，無菌霊長類を用いた腸内微生物叢研究の展開をめざして，アイソレーター内での飼育・取り扱
いに適する小型の霊長類種のコモンマーモセット
において無菌動物の作出とその研究応用のための技術開発を進めている．
これまでに，妊娠個体の準備からビニールアイ
ソレータ（VI）内での無菌環境下での帝王切開による産仔獲得から人工哺育，育成までの技術を確立して無菌マーモセットの作出を試み，その結果，糞便の培養検査により生菌が検出されない無菌マーモセット個体の作出に成功している．現在までに 10 頭の産子が離乳し，そのうち 8 頭では 2 ヶ月
齢以上まで培養検査で生菌（細菌・真菌）が検出されず，最長で 24 ヶ月齢まで培養検査陰性を維持している．獲得した生菌が検出されない個体（無菌個体）の１歳までの育成期間中の体重増加は，通常環境で育成された個体と差異は認められなかった．また，性成熟に達した無菌個体においてメ
スでは性周期，オスでは運動精子の射出を観察しており，生殖機能を有することが示唆された．
獲得した無菌個体の糞便の代謝物解析では，腸内細菌が生成する短鎖脂肪酸の濃度は通常飼育個体と比較して低く，二次胆汁酸は検出されなかった．また，腸管免疫の活性化の指標である糞便中の分泌型 IgA の濃度が低く，糞便および血漿のプ
ロテオーム解析においては免疫関連のタンパク質の発現が低いことが観察された．さらに，下部消化管の造影 X 線撮影により，無菌維持個体において無菌マウスと同様に盲腸が著しく拡張していることが観察された．これらの所見から，獲得した
マーモセット個体の無菌動物としての特性が示唆された．
今後は，作出した無菌マーモセットの繁殖を試みるとともに，作出技術を洗練させて研究利用のための安定供給体制を確立していきたい．また，
ノトバイオート実験を行い，霊長類モデル動物としての無菌マーモセットの有用性について検証を進める予定である．

(会員外共同研究者：岡原則夫*, 岡橋伸幸**, 佐藤賢哉*, 上田政広***, 新 幸二****, 諫山 純***, 青戸
良賢***,川島祐介*****, 菊池理加*, 植野昌未*, 野津量子*, 黒滝陽子*, 峰重 隆幸*, 圦本晃海*, 板谷佳織*, 田之上 大*, 中畑龍俊*,塩田 淳***, 有田 誠**, 本田賢也****, 佐々木えりか*； *公益財団法
人実験動物中央研究所，**理化学研究所生命医科学研究センター, ***JSR・慶應義塾大学医学化学イノ
ベーションセンター, ****慶應義塾大学医学部, *****かずさ DNA 研究所）

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A trial of developing germ-free common marmosets
TAKASHI INOUE
Central Institute for Experimental Animals, Kawasaki
Germ-free mice have contributed indispensably to the development of gut microbiota research. On the other hand,
extrapolation of mouse studies to human medicine can be hampered by differences in biological functions such as
metabolism, immunity, and central nervous system between humans and rodents, as well as differences in thecolonization of gut microbiota, which is believed to have been formed by coevolution with the host. To bridge thesegaps, experimental systems using nonhuman primates (NHPs) are expected, but there are currently no germ-free
NHPs available. Therefore, we have been developing technologies for the production and application of germ-freeanimals in common marmosets, a small NHP suitable for rearing and handling in an isolator. A series of techniques
for germ-free marmoset production including preparation of full-term pregnant animals, aseptic caesarean section,
hand-rearing of neonates and long-term maintenance of animals under sterile conditions were developed. To date, we
succeeded obtaining 8 germ-free marmosets in which no viable bacteria and fungi were detected in culture andmaintained them for a long period of up to 24 months. The weight gain in the acquired germ-free individuals was
similar to that in conventional ones. In the sexually mature individuals, a sexual cycle in a female and the ejection of
motile sperm in a male were observed. Germ-free marmosets exhibited low levels of faecal short-chain fatty acids,
bile acid metabolites, plasma and faecal immunoglobulins, and enlarged caecum in contrast-enhanced X-ray. These
stable germ-free marmosets can serve as novel models that reveal the interaction between microbiota and primate
hosts.

*（Non-member collaborators : Norio Okahara , Nobuyuki Okahashi**, Kenya Sato*, Masahiro Ueda***, Koji Atarashi****,
***

*****

Jun Isayama , Yoshimasa Aoto***, Yusuke Kawashima
*

*

*

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, Rika Kikuchi , Masami Ueno*, Ryoko Nozu*, Yoko Kurotaki ,***Takayuki Mineshige , Terumi Yurimoto , Kaori Itaya ,Takeshi Tanoue

****

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***

, Tatsutoshi Nakahata , Atsushi Shiota , Makoto

Arita**, Kenya Honda****, Erika Sasaki＊＊；Central Institute for Experimental Animals, Kawasaki **RIKEN Center for Integrative
Medical Sciences,Yokohama,***JSR-Keio University Medical and Chemical Innovation Center, Tokyo, ****Keio University Schoolof Medicine, Tokyo, ***** Kazusa DNA Research Institute, Kisarazu）

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無菌生物

J.germfree life gnotobiol.

トリプトファンの微生物代謝産物トリプタミンは発酵米糠の炎症抑制機能性に重要な役割を果たす
Afifah Zahra Agista 大崎 雄介 駒井 三千夫 白川 仁
（東北大学大学院農学研究科栄養学分野）【背景】
まれる成分を HPLC により分析した．
麹カビと乳酸菌によって二段階発酵された米糠(FRB)の摂取はデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘発性大腸炎に対して炎症抑制効果を有 【結果】FRB を熱水で抽出した後，逆相カラムで固相抽することが示されている．しかし，FRB に含まれる炎症を抑制する成分は不明である．本研究では 出した画分にに抗炎症成分が含まれることが明らマウス由来マクロファージ様細胞を用い，FRB の かになった．この画分を HPLC 分析したところ，
分画物に含まれる炎症抑制成分の分離・同定を行 トリプトファンやトリプトファンの微生物代謝産物であるトリプタミンが多量に含まれていた．トリった．
プタミンを RAW264.7 細胞で評価したところ，
LPS 誘導による IL-6 mRNA 量を有意に低下させ【方法】
マウス由来マクロファージ様細胞 RAW264.7 細 た．更に，野生型，および芳香族炭化水素受容体
胞をリポ多糖（LPS）で処理したときの炎症性サイ (AHR)欠損マウスからマクロファージを採取して，トカインの mRNA 量の変化を指標として，FRB の トリプタミン，および FRB 画分の抗炎症性を調べ分画物を評価した．FRB を二段階の分画によって たところ，AHR 欠損マウス由来細胞では抗炎症性
いくつかの画分に分けた．第一段階では溶媒抽出法 が消失した．以上のことから，FRB のもつ抗炎症を用い，最も炎症性サイトカイン mRNA の発現を 活性は，トリプトファンやトリプトファンの微生物抑制する画分を選択した．第二段階では，固相抽出 代謝産物，トリプタミン等によるものであり，AHR
法で分画し，各画分を評価した．これらの画分に含 を介して機能性が発揮されると推定された．

（会員外共同研究者：小関卓也；山形大学農学部）

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Tryptamine, a microbial metabolites in fermented rice bran reduced LPSinduced inflammation in murine macrophage
AFIFAH ZAHRA AGISTA, YUSUKE OHSAKI, MICHIO KOMAI andHITOSHI SHIRAKAWA

Laboratory of Nutrition, Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University,
Sendai【Introduction】: Dual fermented rice bran with Aspergillus kawachii and a mixture of lactic acidbacteria (FRB) was able to ameliorate dextran sodium sulfate-induced inflammation in miceintestine. Yet, it is still unknown which of FRB’s bioactive compounds plays a key role in its
anti-inflammatory effect. This research aimed to reveal this bioactive compound and its
mechanism of action by using macrophages.
【Methods】: FRB was separated into different fractions with a series of extraction processes.
The first stage of extraction was conducted with solvent-based extraction, followed by the second
stage, solid-phase extraction. The produced fractions were screened for their anti-inflammatory
activity by using RAW 264.7 cells which were activated with lipopolysaccharide (LPS). Reversephase HPLC analysis was used to determine the content of FRB fractions.
【Results】: The screening process showed that FRB fractions E (FRBE) has prominent antiinflammatory properties. HPLC analysis showed that FRBE was rich in tryptophan andtryptamine, a microbial metabolite of tryptophan. Tryptamine was also revealed to have an Il-6
mRNA suppressing effect in LPS-induced RAW 264.7 cells. Furthermore, FRBE and tryptamine
were able to lower the expression of LPS-induced Il-6 in intraperitoneal macrophage from wild
type, but not Ahr deficient mice. Tryptamine in FRB was potentially able to suppress the LPSinduced inflammatory response in cells by modulating Ahr activity.

（Non-member collaborators：Takuya Koseki. Faculty of Agriculature,Yamagata University）

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無菌生物

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難治性下痢症発症牛に対する糞便移植の有効性評価
Jahidul Islam 野地 智法（東北大学大学院農学研究科食と農免疫国際教育研究センター）
子牛の下痢症は，感染性および非感染性の両方の Selenomonas が同定された．また，メタゲノム及要因に起因し，感染性の場合，複数の腸内病原体（ウ びメタボローム解析間の相関の有無を検討するた
イルス，細菌，原生動物など）が発症に関与してい めのプロクラステス解析により，FMT の有効群でる．感染性の下痢症に対する抗菌剤の乱用は薬剤耐 は，2 つの解析結果間に強い正の相関が認められた．
性菌の発生を助長することから，抗菌剤に依存しな さらには，千葉県内で飼育されている計 158 頭のい新たな治療戦略の構築が求められている．そこで， 健康牛および下痢症発症牛より糞便をさらに採材
本研究では，難治性下痢症に対する新たな治療法と し，機械学習による糞便移植の最適ドナーを選択す
して，糞便移植（Fecal microbiota transplantation: るための基準の確立を試みたところ，Sporobacter
FMT）の有効性について評価した．具体的には，令 が糞便移植を成功に導く可能性を有した微生物属
和元年度に難治性下痢症発症牛（20 頭）に対し糞 として特定された．加えて，メタボローム解析から，
便移植を実施し，その有効性を臨床評価および， ドナーおよび FMT 実施前のレシピエントの糞便中
16S rRNA 遺伝子を標的とした糞便メタゲノム解 の 特 定 の 代 謝 物 （ 例 ： glycerol 3-phosphate,析，さらには，CE-TOFMS を用いた糞便メタボロ dihydroxyacetone phosphate and isoamylamine）
ーム解析により検証した．その結果，20 回の試験 の濃度が低値であることが，FMT の有効性を期待のうちの 14 回（70％）で下痢症状が大幅に改善さ する上で重要であることが示された．以上の通り，
れ，難治性下痢症に対する糞便移植の優れた有効性 FMT の成否に関わる微生物および代謝物の探索にが臨床的に実証された．糞便移植の有効区（70％） 成功した本研究を通して，子牛の難治性下痢症を治と無効区（30％）を比較した詳細解析から，FMT 療することを目的とした FMT を獣医療として技術
治療の有効群においてドナーからレシピエントへ 開発する上で必要とされる要素が見出された．
の移 植による適合 性を示す 微生物属とし て，（会員外共同研究者：谷水優江**，清水優**，五島可祥**，大谷夏輝**，大谷夏輝**，舘崎恵理子**，
佐藤茉純**，牧野英司**，島田亘**，上田千世**，田中秀和**；*東北大学大学院農学研究科食と農免疫国際教育研究センター，**千葉県農業共済組合）

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Therapeutic efficacy of fecal microbiota transplantation for intractable calf
diarrhea treatment
JAHIDUL ISLAM and TOMONORI NOCHIInternational Education and Research Center for Food and Agricultural Immunology, Graduate
School of Agricultural Science, Tohoku University, Sendai
Calf diarrhea is attributed to both infectious and non-infectious factors and multiple entericpathogens (e.g., viruses, bacteria, and protozoa) are involved in the development of this disease.
Proper treatment of diarrhea represents a therapeutic challenge in livestock production as because
inappropriate diagnosis provokes the overuse of antibiotics and antibiotic resistance germs. Here, we
describe the ability of fecal microbiota transplantation (FMT), to ameliorate intractable diarrhea.
Although establishing FMT to cure diarrhea in calves is difficult because of differences in farmmanagement practices and the lack of optimal donors selection. In this study, the underlying factorsof successful and unsuccessful FMT treatment cases are elucidated, and the potential markers forpredicting successful FMT are identified using fecal metagenomics via 16S rRNA gene sequencing,
fecal metabolomics via capillary electrophoresis time-of-flight mass spectrometry (CE-TOFMS), andmachine-learning approaches. Specifically, 20 FMT treatment cases, in which feces from healthy
donors were intrarectally transferred into recipient diarrheal calves, were conducted with a successrate of 70%. Selenomonas was identified as a microorganism genus that showed significant donor–
recipient compatibility in successful FMT treatments. A strong positive correlation between the
microbiome and metabolome data, which is a prerequisite factor for FMT success, was confirmed by
Procrustes analysis in successful FMT (r = 0.7439, P = 0.0001). Additionally, using another 158
healthy and diarrheal calves, machine learning approach is used to stablish the criteria for donor
selection. In where genus Sporobacter is identified as a potential microorganism in successful donor
selection. Low levels of metabolites, such as glycerol 3-phosphate, dihydroxyacetone phosphate, andisoamylamine, in the donor or recipients prior to FMT are predicted to facilitate FMT. Overall, we
provide the first substantial evidence of the factors related to FMT success or failure; these findings
could improve the design of future microbial therapeutics for curing diarrhea in calves.

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無菌生物

J.germfree life gnotobiol.

ヒト腸内細菌による L-フコースの資化性
田村 彩佳 大坪 和香子（東北大学大学院農学研究科 動物資源化学分野）

I．目的
フコースはヒトや動物の粘液や細胞表面糖タン
パク，乳中オリゴ糖の修飾・構成糖として多様な生態機能に関与していることが知られているが，
ヒト腸内細菌による L-フコース資化性についての知見は少ない．本研究では，乳児および成人健常者の腸内細菌叢の構成細菌の L-フコース資化性を明らかにすることを目的とし，ヒト糞便試料を用いた集積培養と単離資化試験を行った．

また，各培養液から上清を回収し，薄層版にフコースと並べてスポットし，展開溶液（ブタノール：
イソプロパノール：水 = 3：12：4, v/v/v）により複数回展開を行った．乾燥後，発色試薬（硫酸・
メタノール）を噴霧し，加熱により検出された各スポットの濃淡および移動度を測定した．

III．結果および考察
16S rRNA 遺伝子解析の結果，乳児糞便から単離された菌株は Bifidobacterium breve，健常成
人糞便からから単離された菌株は Bacteroides
II．材料と方法
ヒト由来糞便試料のサンプリングおよび使用は， 属が多く特に B. thetaiotaomicron に最も近縁
東北大学大学院農学研究科「ヒトを対象とする研 （>99%）であった．各菌株を L-フコースを炭素究に関する倫理委員会」の規定を遵守して実施し 源として添加した栄養培地で培養し，培養液上清の薄層クロマトグラフィーを行った結果，L-フコ
た．
L-フコースを唯一の糖源として添加した半合成 ースに相当するスポットが培養時間の経過に伴培地および無糖 MRS 培地を調製し，ヒト（乳児・ って薄くなる様子が確認されたことから，各単離
健常成人）由来糞便試料を滅菌注射針で培地に添 菌株が L-フコースを資化して生育したことが示
加し段階希釈後 37℃で嫌気的に集積培養した． されたことから，乳児腸管および成人健常者の腸濁度が上昇した培養液を段階希釈・継代培養し， 内細菌叢の主要な構成細菌が L-フコース資化能
培養液を栄養寒天培地に塗布して生育したコロ を有することが明らかとなった．
ニーを単離した．単離した菌株の 16S rRNA 遺伝子の塩基配列を決定し，BLAST 相同性検索と系統解析により属種名を同定した．

（会員外共同研究者：江田真代，佐子川さやか，北澤春樹；東北大学大学院農学研究科
動物資源化学分野）

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L-fucose utilization by human gut bacteria
AYAKA TAMURA and WAKAKO IKEDA-OHTSUBO

Laboratory of Animal Product Chemistry, Graduate School of Agricultural Science,
Tohoku University
Fucose occurs as a common constituent of human and animal mucus, cell-surface
polysaccharides, as well as of human milk oligosaccharides, but it has not been well known
whether this monosaccharide can be a good nutritional source for intestinal bacteria. In thisstudy, we conducted serial culture enrichments and bacterial colony isolation using media
containing L-fucose as a sole carbon source, which were inoculated by human stool samples.
Bacterial strains isolated from enrichments with infant stool samples were affiliated with
Bifidobacterium breve, while strains from adult human stools were most closely-related to
Bacteroides species such as Bacteroides thetaiotaomicron. Fucose utilization abilities wereconfirmed by thin-layer chromatography of the culture supernatants of each strain, where spots
corresponding to L-fucose disappeared as the incubation periods proceeded. Our current findings
indicate that fucose serves as a common nutritional source for human intestinal bacteria.

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無菌生物

J.germfree life gnotobiol.

Lactobacillus 属乳酸菌の性状に影響を与えるストレス因子の研究
周 冰卉
大坪 和香子（東北大学大学院農学研究科 動物資源化学分野）
I. 目的
グラム陽性菌である乳酸菌は，ヒト腸管内や発酵食品，環境中に広く生息しており，プロバイ
オティクスとして宿主に有益な効果をもたらすことが知られている．生育条件や保存条件は，乳酸菌の特性に様々な面で影響を与えるが，特に高温・低温ストレス，炭素源の違いなどは乳酸菌の分裂増殖に影響を与えるだけでなく，乳酸菌の表層特性を変化させ，宿主細胞への付着
性や免疫調節性に影響を与える．その他，低pH や胆汁酸などのストレスも乳酸菌の細胞分裂，膜形成の生合成，EPS の生合成などプロバ
イオティクス効果に関連する機能に影響を与える可能性がある．本研究では各種ストレス因子
が乳酸菌の性状にどのような影響を与えるかを明らかにすることを目的とし，乳酸菌
Ligilactobacillus salivarius を異なる条件で培養・処理し，生存率や形態変化を比較した．
II. 材料と方法
Ligilactobacillus salivarius をグルコース，ガラクトース，マンノース，フルクトースを含む
MRS 培地または酵素処理したワカメ消化物で24 時間培養し，30 分ごと OD 値を測定した．L.
salivarius の生存率は，25 mg/mL のペプシンを添加した模擬胃液中で評価した．
pH は 0. 1N 塩
酸で 2 に調整した．酵素処理したワカメ溶液を胃液に 1%(v/v)添加して実験を行い，対照として滅菌した MilliQ 水を添加した．細菌の生存率は，0.5，1，2，3，4，5 時間後に MRS 寒天培地プレート上のコロニーカウンティングにより行った．
L. salivarius の胆汁酸中での生存率は，0.3%の胆汁酸塩を用いて上記と同様の方法で評価した．
また，グルタルアルデヒドにより固定した菌体の表層構造を走査型電子顕微鏡により観察した．
III. 結果および考 察
L. salivarius のコロニーは嫌気的な培養で大きくなり，またプレインキュベーションの繰り返しにより，菌体表面の膨張が観察された．模擬胃液などの低pHや消化酵素添加条件は主に細胞表面のタンパク質に物理的なダメージを与え，胆汁酸塩の存在は主に細胞表面を加水分解する化学的なダメージを与えることが知られた．一方，L.
salivarius は 70 ℃で 90 分間加熱させても菌体表面の損傷は最小限に抑えられ，元の形状を維持していた．これらの条件は，乳酸菌を不活化した状態における免疫調節性の評価アッセイなど「イムノポストバイオティクス」の選抜・評価に応用可能と期待された．

（会員外共同研究者：北澤春樹；東北大学大学院農学研究科 動物資源化学分野）

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Research on stress factors affecting characteristics of Lactobacillus
BINGHUI ZHOU and WAKAKO IKEDA-OHTSUBO

Laboratory of Animal Product Chemistry, Tohoku University, Graduate School of Agricultural
Science, Tohoku University, Sendai
Lactobacilli is gram-positive bacteria, commonly inhabited in the human body, fermented foodand environment, which proved to have a beneficial effect on the host when colonized on thegastrointestinal tract.
Growth and preservation conditions would affect the properties of lactobacilli in many aspects.
Higher or lower temperature could cause low enzymic activity, which leads to difficulty in fission.
One of the most important ingredients in broth, carbon sources not only affect the growth oflactobacilli by fission but also result in the change of properties of biosynthetic, reflecting thedifferent performance of adhesion ability and immunomodulatory to cells, related to the surface
layer of lactobacilli. On the other hand, stress such as low pH and bile acid environment could
have effects on performances of lactobacilli relating to the bacterial cell division, biosynthesis of
the membrane-forming, or the biosynthesis of EPS and in this study, we will find out if it may beobserved by the morphology of lactobacilli.
Different culture media resulted in growth change of Lactobacillus, leading to the various
performance of lactobacilli when apply to further research. This research aims to investigate
tolerance and morphological changes under different growth conditions and treatment, todetermine the optimal growth condition of Lactobacillus applying to various further research.
Ligilactobacillus salivarius were incubated in MRS with glucose, galactose, mannose, fructose
and enzyme-treated wakame broth for 24 h. OD values were measured every 30 min. Survival of
L. salivarius was evaluated in the simulated gastric juice, which contained 25 mg/mL of pepsin.
The pH was adjusted to 2, with 0.1N HCl. Wakame solution with enzyme treatment was added
to gastric juice (1%(v/v)) for the experiment and sterilized MilliQ water was added as the control.
Bacterial viability was performed by plate counting on MRS agar plates after 0.5, 1, 2, 3, 4, and5 hours. Survival of L. salivarius in bile salt was evaluated by the method as above with 0.3% ofbile salt.
Bigger colonies of L. salivarius were observed when incubated anaerobically. Surface of bacteria
were plump by three-times pre-incubation. Low pH cause mainly physical damage to the proteinof cell surface and presence of bile salt cause mainly chemical damage by hydrolyzing cell surface.
When the L. salivarius were heat killed at 70℃ for 90 min, bacteria surface was minimallydamaged with the original shape, indicating this inactivate condition for the lactobacilli could
apply to further immunoassay to evaluate properties of immunobiotics.

(Non-member collaborators：Haruki Kitazawa. Laboratory of Animal Product Chemistry,
TohokuUniversity, Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University）

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無菌生物 J.germfree life gnotobiol.

ビオチン欠乏が腸管免疫系を介した免疫修飾に関与する
細野 朗* 津田 真人* 岡田 開* 大崎 雄介** 白川 仁** 駒井 三千夫**（*日本大学生物資源科学部食品生命学科食品生命機能学研究室，**東北大学大学院農学研究科栄養学分野）

Ⅰ.目的
水溶性ビタミンとして生体内の代謝 （糖代謝・脂肪酸代謝・アミノ酸代謝・脂肪酸合成など）に関与しているビオチンは，経口摂取する食品から栄養素として生体内で利用されるほか，腸内細菌によっても産生されている．ビオチン欠乏は様々な生体内炎症に関与していることが報告されているが，腸管免疫系においてどのように機能するのかは不明な点が多い．本研究は，腸内細菌の影響を顕著に受けている大腸部位の腸管関連リンパ組織の細胞応答に与えるビオチンの影響を解析することをめざした．
Ⅱ．材料と方法
通常および無菌の飼育環境下にある BALB/c マウス（雌性 9-12 週齢）に対して，それぞれに標準食（AIN-93G）またはビオチン欠乏食を 8 週間自由摂取させた．その後，各マウスから脾臓（SPL），腸間膜リンパ節（MLN），パイエル板（PP），盲腸リン
パ節（CeP），結腸リンパ節（CoP）を採取し，単一細胞を調製した．調製した各細胞画分は細胞フェノタイプに注目した細胞機能解析をフローサイトメ
トリーにより行い，さらに，それぞれの細胞画分を
CD3/CD28 刺激下で 60 時間培養を行い，上清中のサイトカイン（IFN- ，IL17A，IL-10）量を酵素免疫測定法（ELISA 法）法にて定量した．加えて，血清，腸粘膜組織中の抗体（IgA，IgG1，IgG2a，IgG2b，
IgG3，IgM）量を ELISA 法で定量した．

Ⅲ．結果・考察・結論
通常，無菌マウスともビオチン欠乏食の摂取によってパイエル板および結腸リンパ節中の胚中心 B細胞（B220+CD95+GL-7+）の割合がそれぞれの標準
食群に比べて低値を示し，さらに，無菌マウスのCoP 細胞においてはナイーブ （CD3+CD4+CD44CD62L+） が標準食群よりも減少しエフェクターT
細胞（CD3+CD4+CD44lowCD62L-）が増加した．しかし，通常マウスではビオチン欠乏食によってこれらの T 細胞フェノタイプの影響はみられなかった．
このとき，無菌マウスにビオチン欠乏食を与えると，
CoP 細胞の T 細胞応答は IL-4 産生応答が高くなる
特徴がみられた．したがって，無菌マウスにビオチ
ン欠乏食を給餌することで誘導される真性ビオチ
ン欠乏が，大腸部位の CoP 中の T 細胞分化の誘導を介して炎症反応に関与する可能性が考えられた．

（会員外共同研究者：池田大貴*，古川凱斗*，久古鈴香**；*日本大学生物資源科学部食品生命学科食品生命機能学研究室，**東北大学大学院農学研究科栄養学分野）

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Biotin deficiency is involved in immune modulation by the intestinal immune
systemAKIRA HOSONO*, MASATO TSUDA*, HIRAKU OKADA*, YUSUKE OHSAKI**,MICHIO KOMAI** and HITOSHI SHIRAKAWA***Department of Food Bioscience and Biotechnology, College of Bioresource Sciences, Nihon University,

Isehara**Laboratory of Nutrition, Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University, Sendai
Biotin, a water-soluble vitamin, is an essential nutrient for body as well as one of the metabolites byintestinal commensal bacteria. It is known that the biotin deficiency induces the inflammatory responses
in the body, but the immunomodulatory effects of biotin on the intestinal immune system have not been
fully elucidated. In this study, we aimed to analyze the effect of biotin on the cellular responses of lymphoidtissues in the large intestine, which is significantly affected by intestinal bacteria.
We utilized BALB/c mice bred on a biotin-containing (control) or a biotin-deficient diet underconventional (CV) or germ-free (GF) condition to investigate the immunomodulatory effect of biotin derived
from both dietary components and intestinal commensal bacteria. The phenotype of B or T cells in spleen(SPL), Peyer’s patches (PP), cecal patches (CeP), colonic patches (CoP) were analyzed. Each cells fraction
form gut-associated lymphoid tissues was cultured under CD3/CD28 stimulation, and the amount ofcytokines in the supernatant was measured by enzyme immunoassay (ELISA).
In CoP cells of GF mice, dietary biotin deficiency decreased naive CD4+ T cells and increased effector
CD4+ T cells compared with the standard diet group. CoP T cells in biotin-deficient GF mice werecharacterized by a higher IL-4 production than that of GF mice on the standard diet. Therefore, wehypothesized that a genuine biotin deficiency induced by feeding a biotin-deficient diet to GF mice may be
involved in the inflammatory responses through the induction of T-cell differentiation on CoP in the gut.

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無菌生物

J.germfree life gnotobiol.

ビオチン水摂取による脳の認知機能関連遺伝子の発現への影響
塩沢 浩太
大崎 雄介
白川 仁
（東北大学大学院農学研究科栄養学分野）
要 旨：ビオチンは補酵素としての機能のほかに非補酵素作用が知られており，認知機能への影響も示唆されている．Wistar 系雄性ラットに飲水により高用量のビオチンを 2 週間または 8 週間摂取させた
ところ，コントロール群と比較して 2 週間で血中のエストラジオールが増加した．飼育 8 週間で海馬の脳神経由来栄養因子（BDNF）のプロセシングが誘導され，pro-BDNF の減少および mature-BDNF の増加がみられた．PKA-CREB 経路のタンパク質発現量を測定したところ，飼育 2 週間では cAMP 応答配列
結合タンパク質（CREB）のリン酸化比が増加したが，飼育 8 週間ではリン酸化 CREB は減少した．以上の結果より，慢性的なビオチン摂取は海馬での性ホルモン産生量を増加させ，PKA-CREB 非依存的経路を介した海馬での BDNF のプロセシングを誘導し，mature-BDNF への変換を促進する可能性が示唆された．
キーワード：ビオチン，認知機能，脳，性ホルモン，脳神経由来栄養因子（BDNF）

Ⅰ．目的
ビオチンは食事および腸内細菌により供給される水溶性ビタミンである．糖代謝，脂質代謝，アミノ酸代謝に関わるカルボキシラーゼの補酵素として機能する．我々の研究室は，無菌マウスを用いたビオチン欠乏モデルにより胎仔奇形や発育不全が起こることを報告した．一方で，高用量のビオチン摂取には非補酵素作用が示されており，糖尿病，高血圧症の改善や抗炎症作用が明らかにされている．
近年，中枢神経系における性ホルモンや脳神経由来
栄養因子（BDNF）の認知機能改善への貢献が注目されている．特に脳内で生産される性ホルモンは「ニューロステロイド」としても知られている．本
研究では，ラットに高用量のビオチンを慢性的に摂取させ，血中，大脳，海馬中の性ホルモン濃度，および大脳，海馬中の認知機能関連タンパク質の発現量を解析した．
Ⅱ．方法
Wistar 系ラット（雄，8 週齢）を１週間馴化後，コントロール群（蒸留水）と，ビオチン群（3.3 mg/L
ビオチン水）に分け，それぞれ自由摂水として 2 週間，または 8 週間飼育した．飼料は市販固型飼料（F-2，フナバシファーム）を自由摂食とした．体重と摂食量，飲水量は 2 日毎に測定し，飼育終了時に血清，海馬を採取した．ビオチン濃度は LCMS/MS 法により測定した．また，性ホルモン濃度
は ELISA 法により測定した．認知機能関連タンパ
ク質の発現量はウエスタンブロット法により解析した．

Ⅲ．結果と考察
飲水量（蒸留水，ビオチン水）および摂食量（飼料中のビオチン含量）から各群のビオチンの摂取量を算出すると，コントロール群に対して，ビオチ
ン群では約 15-30 倍のビオチンを摂取していた．2
週間飼育，8 週間飼育ともにビオチン群で血清中の遊離ビオチン濃度が増加した．2 週間飼育のビオチ
ン群で血清中のエストラジオール（E2）濃度は上昇
したが，8 週間飼育では変化がみられなかった．ビ
オチン群の海馬の E2 濃度は 2 週間飼育では減少
し，8 週間飼育では増加傾向が見られた．海馬の認知機能関連タンパク質の発現量を解析したところ，
海馬の BDNF は 8 週間飼育ではビオチン群で，mature-BDNF は増加し，pro-BDNF は減少した．次に PKA（cAMP 依存性リン酸化酵素）およびその下流因子 CREB を解析したところ，2 週間飼育のビオチン群でリン酸化 CREB(p-CREB)，および pCREB/CREB 比の上昇がみられた．一方で，8 週間
飼育のビオチン群で p-CREB は減少した．
以上の結果から，慢性的なビオチン摂取は海馬での性ホルモン産生量を増加させる可能性が示唆された．また，PKA-CREB 非依存的経路を介して海馬での BDNF のプロセシングを誘導し，matureBDNF への変換を促進する可能性が示唆された．

(会員外共同研究者：久古鈴香*，前川正充**；*東北大学大学院農学研究科栄養学分野，**東北大学病院・薬剤部）

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Effect of biotin ingestion on the expression of genes associated with cognitive ability
KOTA SHIOZAWA, YUSUKE OHSAKI and HITOSHI SHIRAKAWA
Laboratory of Nutrition, Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University, Sendai
Biotin is a member of B group vitamin that is supplied from daily diet and the product by gut microbiota. Its wellknown function is a coenzyme of carboxylase involved in glucose, lipid, and amino acid metabolisms. Beside these
physiological functions, pharmacological dose of biotin shows novel functions; improvement of diabetes andhypertension, and anti-inflammatory effects. However, there are few reports regarding effect of biotin on brain,
specially cognitive function. In this paper, we analyzed the effect of biotin supplementation on the gene expression in
the hippocampus in rats. Wistar rats (male, 8 weeks old) were divided into a control (distilled water) and a biotin (3.3
mg /biotin solution ) groups and were bred for 2 or 8 weeks. Estradiol levels in hippocampus were decreased in biotin
treatment for 2 weeks but increased in 8 weeks treatment. On the other hand, blood estradiol levels were increased in
2 weeks of biotin treatment, but not changed in 8 weeks treatment. These results indicated that hippocampus
steroidogenesis altered by biotin treatment is not correlated with its synthesis in gonad tissue and peripheral metabolism.
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF), a nerve growth factor, has an important role in neurogenesis andimprovement of cognitive function. Hippocampus BDNF was increased in biotin administered group for 8 weeks.
Protein kinase A (PKA) and CREB, which regulate the expression of BDNF, were decreased in biotin treatment for 8
weeks. These results suggested that BDNF expression is enhanced by biotin via PKA-CREB independent manner.

Keywords: biotin, cognitive ability, brain, sex hormone, brain-derived neurotrophic factor (BDNF)
References
1. Zempleni, J., Wijeratne, S. S. K. & Hassan, Y. I. : Biotin. Biofactors, 35, 36–46, 2009.
2. Mock, D. M. Biotin: From Nutrition to Therapeutics. J. Nutr., 147, 1487–1492, 2017.
3. Sasaki, Y., Sone, H., Kamiyama, S, Shimizu, M., Shirakawa, H., Kagawa, Y., Komai, M. & Furukawa, Y. :Administration of biotin prevents the development of insulin resistance in the skeletal muscles of Otsuka
Long-Evans Tokushima Fatty rats. Food Funct., 3, 414–419, 2012.
4. Watanabe-Kamiyama, M., Kamiyama, S., Horiuchi, K., Ohinata, K., Shirakawa, H., Furukawa, Y. & Komai,
M. : Antihypertensive effect of biotin in stroke-prone spontaneously hypertensive rats. Br. J. Nutr., 99, 756–
763, 2008.
5. Kuroishi, T., Endo, Y., Muramoto, K. & Sugawara, S. : Biotin deficiency up-regulates TNF-alpha production inmurine macrophages. J. Leukoc. Biol. 83, 912–920, 2008.
6. Compagnone, N. A. & Mellon, S. H. Neurosteroids : biosynthesis and function of these novel
neuromodulators. Front. Neuroendocrinol. 21, 1–56, 2000.
7. Moraga-Amaro, R., van Waarde, A., Doorduin, J. & de Vries, E. F. J. Sex steroid hormones and brain function :PET imaging as a tool for research. J. Neuroendocrinol. 30, 2018.
（Non-member collaborators: Suzuka Kyuko *, Masamitsu Maekawa **, *Laboratory of Nutrition, Graduate School of
Agricultural Science, Tohoku University, **Department of Pharmaceutical Sciences, Tohoku University Hospital）

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無菌生物

J.germfree life gnotobiol.

ビタミン K 無添加食給餌によるマウスの胆汁酸代謝への影響
錦戸 迪哉 大崎 雄介
駒井 三千夫 白川 仁
（東北大学大学院農学研究科栄養学分野）

要旨：メナキノン-4（MK-4）は，薬物・胆汁酸代謝の制御に関わる核内受容体 PXR のリガンド活性能を有する．日常的に摂取しているビタミン K（VK）は生体内で MK-4 に変換されることから，食餌由来 VK が胆汁酸代謝に影響を与える可能性がある．そこで，VK 無添加食をマウスに 4 週間給餌したところ，肝臓および回腸における胆汁酸代謝関連遺伝子発現量が変化し，肝臓中の胆汁酸濃度も変化した．このことから，食餌由来 VK は胆汁酸代謝に影響を与える可能性が示唆された．
キーワード：ビタミン K，メナキノン－4，胆汁酸，PXR，性差Ⅰ．目的ビタミン K（VK）は天然には植物由来の VK1（フィロキノン）と，主に微生物由来の VK2（メナキノン：MK-n）が存在する．我々の生体内では腸内細菌により VK2 が合成され，その一部は吸収・利用されていると考えられている．VK はγ-グルタミルカルボキシラーゼの補因子として働き，血液凝固や骨形成において重要な役割を果たしている．近年，メナキノン-4（MK-4）が核内受容体 PXR のリガンド活性を示すことが明らかになった．PXR は薬物・糖質・胆汁酸代謝に関与する多くの代謝酵素や輸送体の遺伝子発現を
転写レベルでリガンド依存的に制御している．しかし，MK-4 の PXR を介した研究は主に骨代謝や PXR の発現が見られる培養細胞実験に集中しており，未だその生理的機能については不明な点が多い．我々はヒト型 PXR マウスに MK-4 を単回経口投与すると，肝臓における胆汁酸合成遺伝
子発現量が減少することを見いだした 1．日常的に摂取している VK は生体内で MK-4 に変換されるため（Fig. 1），食事由来の VK が胆汁酸代謝に影響を与える可能性がある．そこで本研究では，
VK 無添加食を給餌しマウスの胆汁酸代謝に及ぼす影響を解析した．

Figure 1. Endogenous synthesis of menaquinone-4
from other vitamin K

Ⅱ．方法
C57BL/6 マウス（14 週齢，雌雄）に，AIN-93M
組成の Control 食（VK1: 0.75 mg/kg 飼料） または VK free 食（VK 無添加）を 28 日間給餌した．
飼育期間中，体重・摂食量の測定を 2 日毎に行った．飼育終了後，6 時間絶食させ，麻酔下で心臓より採血を行い，肝臓・回腸を摘出した．肝臓中のVK 量を蛍光 HPLC 法，胆汁酸量を LC-MS/MS を用いて測定した．また，肝臓および回腸における胆汁酸代謝関連遺伝子の mRNA 発現量を定量 RTPCR 法で解析した．
Ⅲ．結果と考察
試験期間を通して体重は雌に対して雄で有意に高かったが，餌による変化は見られなかった．VK
free 食群の肝臓中 VK1，MK-4 濃度は Control 食群に対して有意に減少した．また雄よりも雌の肝臓中
VK 濃度が高かった．肝臓における胆汁酸合成遺伝
子発現量の減少が VK free 食群で見られた．また，給餌食を問わず雄よりも雌で同発現量が高かった．
肝臓から胆汁酸を排出する輸送体遺伝子の発現量は，VK free 食により雄では増加，雌では減少した．
雌において，VK free 食により肝臓中の二次胆汁酸が変化し，総胆汁酸量も同様の傾向を示した．また，給餌食に関係無く雄に比べて雌の総胆汁酸量が高かった．回腸における胆汁酸輸送遺伝子発現量は性別問わず VK free 食により減少した．これらの結果
より，食餌由来 VK は胆汁酸の合成や排出に関わる
遺伝子発現を変化させ，肝臓中の胆汁酸量に影響を与える可能性が示唆された．また，その作用には性差があると推察された．

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The effect of vitamin K-free diet on bile acid metabolism in mice
MICHIYA NISHIKIDO, YUSUKE OHSAKI, MICHIO KOMAI and HITOSHI SHIRAKAWA

Laboratory of Nutrition, Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University, Sendai
There are two types of naturally occurring vitamin K (VK), plant-derived VK1 (phylloquinone) andmainly microbial-derived VK2 (menaquinone: MK-n). Our intestinal microbiota also synthesized
menaquinones, and a part of them are absorbed and utilized. Menaqinone-4 (MK-4) works as a ligand of
nuclear receptor PXR and can modulate certain gene expression. Previously we reported that orally
administered MK-4 modulated mRNA expression of bile acid synthesis in the liver of humanized PXR
mice. MK-4 is known to be endogenously converted from dietary VK, thus in order to clarify the
relationship between dietary VK and bile acid synthesis we analyzed the effect of the VK-free diet on bile
acid metabolism in mice.
C57BL/6 mice were fed either control or VK-free diets for 28 days, then organs were collected after 6 h
fasting. Hepatic VK and bile acids concentrations were measured by fluorescence HPLC, and LC-MS/MS,
respectively. In addition, the mRNA expression levels of bile acid metabolism-related genes in the liverand ileum were analyzed by quantitative RT-PCR.
Hepatic VK levels were reduced by the VK free diet. In addition, VK concentration in the liver offemales was higher than that of males. The mRNA level of bile acid synthesis genes in the liver was
decreased by the VK free diet. In females, the VK free diet increased secondary bile acids in the liver,and the total bile acid content also tended to increase. These results suggest that dietary VK could affectbile acid metabolism in mice.

Keywords： Vitamin K, Menaquinone-4, Bile acids, PXR, Sex difference

Reference
1. SULTANA, H., WATANABE, K., RANA, M. M., TAKASHIMA, R., OHASHI, A., KOMAI, M., and
SHIRAKAWA, H. : Effects of Vitamin K2 on the Expression of Genes Involved in Bile Acid Synthesis
and Glucose Homeostasis in Mice with Humanized PXR, Nutrients, 10, 982, 2018.

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CONTENTS
REVIEW
A trial of developing germ-free common marmosets
Takashi Inoue et al. ......................................................................................................................... 25
SCIENTIFIC PROCEEDINGS OF THE JAPANESE ASSOCIATION
Neonatal nasal inflammation-induced perturbation of gut microbiota and the brain tissue changes
Sanae Hasegawa-ishii et al ..............................................................................................................30
Establishment of runnig-wheel activity test using Germ-free mice
Keisuke Kojima et al ........................................................................................................................ 32

A trial of developing germ-free common marmosets
Takashi Inoue .......................................................................................................................34
Tryptamine, a microbial metabolites in fermented rice bran reduced LPS-induced inflammationin murine macrophage
Afifah Zahra Agista et al. .................................................................................................................36
Therapeutic efficacy of fecal microbiota transplantation for intractable calf diarrhea
treatment
Jahidul Islam et al.…………………………………………………………………………….…38
L-fucose utilization by human gut bacteria
Ayaka Tamura et al.………………………………………………………………………...…. 40

Research on stress factors affecting characteristics of Lactobacillus
Binghui Zhou et al. …………………………………………………………………………...…42

Biotin deficiency is involved in immune modulation by the intestinal immune system
Akira Hosono et al. ......................................................................................................... 44
Effect of biotin ingestion on the expression of genes associated with cognitive ability
Kota Shiozawa et al. ............................................................................................................ 46
The effect of vitamin K-free diet on bile acid metabolism in mice
Nishikido Michiya et al. ............................................................................................................ 48

GUIDELINE FOR AUTHORS
Guideline for authors………...……………………………………………………………..……...50