平成２3 年度

金沢大学がん進展制御研究所

共同研究成果報告書

２０１2.４

金沢大学がん進展制御研究所

金沢大学がん進展制御研究所共同研究成果報告書

平成２４年４月４日提出
対象研究テーマ：幹細胞あるいはがん幹細胞の特定・可視化に関する研究
研
研

究
究

期
題

間：2011 年 4 月 1 日～2012 年 3 月 31 日
目：分子イメージングによる組織幹細胞可視化法の開発と応用

研 究 代 表 者：公益財団法人がん研究会がん研究所

部長

原

英二

研究成果の概要：
幹細胞性の維持に重要な役割を果たしていることが知られているBmi-1 とその標的分子であり、細胞老化の重要な誘導因子であるp16INK4aの関係解明を通して細胞老化と個体老化および発癌との関係解明を目指した。p16INK4a遺伝子の発現をインビボ・イメージング出来るマウスと
Bmi-1 ノックアウトマウスとを交配させることにより、Bmi-1 非存在下での p16INK4a遺伝子の発現動態を調べた。その結果、Bmi-1 非存在下では生後間もない時期から体の殆ど全ての組織においてp16INK4aの発現が著しく上昇していたが、加齢と伴にp16INK4aの発現が更に上昇することが分かった。このため、加齢の過程で起こるp16INK4aの発現とそれに伴う細胞老化の誘導には
Bmi-1 はあまり関与していないものと考えられる。また、細胞老化に伴いSASPと呼ばれる発癌促進作用が有る様々な分泌性蛋白質を高発現する現象が如何にして起こるかについて解析を行った。その結果、DNAダメージシグナルのよりDNAメチル化酵素 (DNMT1) 及びヒストンメチ
ル化酵素 (G9a/GLP) の発現レベルが低下することによりクロマチンリモデリングが起きることでSASPが起こることを見出した。今後、加齢に伴って起こるSASPの誘導機構を特異的に阻害できる方法の開発へとつながることが期待される。
研究分野：がん生物学
キーワード： 細胞老化、インビボ・イメージング、DNA ダメージ
１．研究開始当初の背景
哺乳動物の正常な細胞にテロメアの短小化や癌遺伝子の活性化など、発癌の危険性がある異常が生じるとp16INK4a などのサイク
リン依存性キナーゼ(CDK) 阻害因子が発現し、不可逆的な増殖停止状態である細胞老化が誘導されることが知られている。細胞老化は異常細胞の増殖を防ぐ重要な癌抑制機構として働く一方で、組織幹細胞を枯渇させ個体老化を進行させる原因になっていることも明らかになりつつある。また、最近では細胞老化を起こした細胞（老化細胞）
は炎症性サイトカインや細胞外マトリック
ス分解酵素など炎症や発癌を促進する様々な 分 泌 性 蛋 白 質 を 高 発 現 す る Senescence
Associated Secretory Phenotypes (SASP) と呼ばれる現象を引き起こすことも明らかに成り、細胞老化には生体のホメオスタシスを維持する作用と破綻させる作用の両方が存在していると考えられるようになってきた。
我々はこれまで発癌過程における細胞老化と組織幹細胞の関係解明を目指して金沢大学がん進展制御研究所の平尾教授との共同研究を行い、細胞老化誘導遺伝子である

p16INK4a の発現を発光シグナルとしてマウスの生体内でリアルタイムに可視化・計測（イメージング）出来るトランスジェニックマウ
スの開発を行ってきた（Yamakoshi et al. J.
Cell Biol. 2009）。更にこのマウスを用いて、加齢の過程で細胞老化を起こす組織を特定することに成功し、加齢の過程で起こる細胞老化の作用機序とその役割の解明に努めてきた。
２．研究の目的
本研究では生体内で起こる細胞老化の誘
導と組織幹細胞の枯渇がどのように関係しているのかを明らかにすることを通して個
体老化と発癌との関係を明らかにすることを目的とした。
３．研究の方法(1) p16INK4a 発現イメージングマウスと
組織幹細胞の未分化性の維持に係わる
Bmi-1 遺伝子を欠損したBmi-1 ノックア
ウトマウスを交配させることでBmi-1 遺伝子を欠損した状態でのp16INK4a 遺伝子の発現動態を加齢の過程で解析すること
により、生体内での幹細胞性の維持と細胞老化の誘導がどのような関係になっているのかを明らかにすることを試みた。
(2) 細胞老化の負の側面である SASP が起こる分子機構を明らかにするために、細胞老化の原因である DNA 損傷ストレスにより発現が変化する転写調節因子を
DNA マイクロアレイを用いた解析によて絞り込んだ。更に RNAi によるノックダウンとクロマチン免疫沈降法を組み合わせることで SASP の制御に係わる転写因子の同定を試みた。
(3) p16INK4a イメージングマウスを用いることで加齢の過程で細胞老化を起こす組織を特定し、その組織でSASPが起こっているかどうかを調べると同時に(2)で解析したSASP誘導機構が働いているかどうかについても検討を行った。
４．研究成果1) p16INK4aイメージングマウスを用いることでBmi-1 遺伝子を欠損した状態でのp16INK4a遺伝子の発現動態を加齢の過程で解析した。
その結果、生後直後から体の殆ど全ての部位でp16INK4aの発現が 10 倍以上高くなることが明らかに成り、Bmi-1 は殆ど全て組織でp16INK4a遺伝子の発現が高くなり過ぎないよ
うにすることで組織幹細胞が細胞老化を起こさないように働いていることが示唆された。また興味深いことに、Bmi-1 遺伝子を欠損した状態でも加齢と伴に、p16INK4aの発現が更に上昇したことから、Bmi-1 はp16INK4a遺伝子の発現を抑制する重要な遺伝子であることに間違いないが、加齢の過程で起こる
p16INK4a遺伝子の発現誘導にはあまり関与しておらず、Bmi-1 の機能低下以外のメカニズ
ムでp16INK4a遺伝子の発現レベルが上昇する可能性が示唆された。
2) DNA 損傷ストレスにより発現が変化する転写調節因子を DNA マイクロアレイにより探索した結果、遺伝子発現を負に制御することが知られている DNA メチル化酵素の一つである DNMT1 の発現レベルが顕著に低下していることを見出した。更に増殖中の細胞で DNMT1 の発現を RNAi によりノックダウ
ンするとそれだけで SASP 因子の発現レベルが上昇したことから DNA ダメージにより
DNMT1 の発現レベルが低下することがSASP の誘導を引き起こすことを見出した。
興味深いことに DNMT1 の発現低下は DNA
損傷シグナルを更に活性化させることでヒストンメチル化酵素である G9a/GLP の発現低下を引き起こし、このためにクロマチンリ
モデリングが起こり SASP 遺伝子の発現が誘導されることが明らかになった。
3) p16INK4aイメージングマウスを用いることで加齢の過程で肺、脾臓、小腸などの組織が細胞老化を起こすことを見出した。それらの組織ではDNAダメージシグナルの亢進、
G9a/GLP発現レベルの低下とSASP遺伝子の発現レベルの亢進が認められ、2)で見出した
SASP誘導機構が生体内でも働いていることが明らかになった。
５．主な発表論文等（研究代表者、研究分担者及び連携研究者には下線）〔雑誌論文〕（計２件）

Takahashi, A., Imai, Y., Yamakoshi, K.,
Kuninaka, S., Ohtani, N., Yoshimoto, S.,
Hori, S., Tachibana, M., Anderton, E.,
Takeuchi, T., Shinkai, Y., Peters, G., Saya,
H. and Hara E.
DNA damage signaling triggers
degradation of histone methyltransferases
through APC/CCdh1 in senescent cells.
Mol. Cell, 45: 123-131. (2012)
Fukuyo,Y., Takahashi, A., Hara, E.,
Horikoshi, N., Pandita, T.K. andNakajima, T.
E2FBP1 antagonizes the p16INK4A-Rb
tumor suppressor machinery for growth
suppression and cellular senescence byregulating promyelocytic leukemia protein
stability.
Int. J. Oral Sci. 4: 200-208. (2011)〔学会発表〕（計４件）
原 英二
細胞老化の癌抑制と発癌促進における役割
日本分子生物学会春季シンポジウム
2011 年 5 月 25～26 日（金沢）原 英二
細胞老化の癌抑制と発癌促進における役割
国際癌治療増感研究会
2011 年 6 月 24～25 日（仙台）原 英二
細胞老化の癌抑制と発癌促進における役割
光老化研究会
2011 年 7 月 22 日（大阪）Takahashi, A and Hara, E.
The roles and mechanisms regulating
cellular senescence in aging andcancer.
日本分子生物学会シンポジウム
2011 年 12 月 13~16 日（横浜）

〔図書〕
（計０件）
〔産業財産権〕○出願状況（計０件）○取得状況（計０件）〔その他〕
なし
６．研究組織(1)研究代表者
公益財団法人がん研究会がん研究所・部長
原 英二(2)研究分担者
公益財団法人がん研究会がん研究所・主任研究員 大谷直子
公益財団法人がん研究会がん研究所・主任研究員 高橋暁子
公益財団法人がん研究会がん研究所・嘱託研究員 山越貴水（現：国立長寿医療研究セン
ター・室長）
公益財団法人がん研究会がん研究所・嘱託研究員 吉本 真公益財団法人がん研究会がん研究所・研究生
佐藤正大(3)本研究所担当者
遺伝子・染色体構築・教授

平尾敦

金沢大学がん進展制御研究所共同研究成果報告書

平成２４年４月２５日提出
対象研究テーマ：マウスモデルを用いた消化器がんの発がん分子機序に関する基礎研究
研
研

究
究

期
題

間：2011 年 4 月 1 日～2012 年 3 月 31 日
目：がん抑制遺伝子 p53 機能喪失を伴った新規悪性胃がん病体モデルの作製と解析

研 究 代 表 者：国立がん研究センター研究所

研究員

大木理恵子

研究成果の概要：
大島正伸教授が作製した消化器がんモデルマウス(K19-Wnt1/C2mE transgenic mouse)は、100%の頻度で胃がん(adenocarcinoma)を発症する。また、この際に生じた癌は、p53 遺伝子は野生型である事がこれまでに判明している。そこで、本研究ではこのマウスを p53 欠損マウスと掛け合わせ、胃がんにおいて p53 遺伝子が持つ機能を解明する。p53 喪失により、がんの悪性化が予測されるが、その悪性化にどのような p53 標的遺伝子群が関わるのか、明らかにしたいと考えている。これまでに p53 を欠損した消化器がんモデルマウス(K19-Wnt1/C2mE
transgenic mouse)の作製に成功し、現在詳細な解析を行っている所である。
研究分野：腫瘍生物学
キーワード：消化器がん、p53、癌の悪性化
１．研究開始当初の背景
日本人の死因第一位は「癌」であり、癌の克服を目指した研究は大きな社会貢献につながる。分子生物学やゲノム解析の進展を足場に、癌化のメカニズムの解明を目指した癌
関連遺伝子（癌抑制遺伝子、癌遺伝子）の研究は大きく進み、多くの重要な遺伝子が明らかにされてきた。しかしながら、肺癌や乳癌のように、研究の比較的進んでいるものでさえ、これまでに明らかにされた遺伝子異常などで説明できるのは一部にとどまっており、大部分のものについては未解決のままである。これからも地道な研究が必要とされるゆえんである。
癌抑制遺伝子 p53 は、ヒトの癌で最も高頻度に変異が認められており、p53 による癌抑制機能の解明と p53 研究の癌治療及び診断への応用は、癌克服を考えた上でも、最も重要な到達目標の一つである。p53 は転写因子であり、標的遺伝子を転写誘導することにより、細胞にアポトーシスや細胞周期停止、DNA 修
復などを引き起こし、癌化を抑制している。
癌では高頻度に p53 の DNA 結合ドメインに変異が検出され、発癌過程において、p53 の転写因子としての機能欠損が重要である事を物語っている。転写因子としての p53 の機能を解明することは癌研究のさらなる進展につながると考え、研究を進めている。
申請者はこれまでに Noxa、Reprimo、AEN
や PHLDA3 という新規 p53 標的遺伝子を同定した。機能未知であったそれぞれの遺伝子の機能を初めて明らかにする事により、p53 がいかにして癌化を抑制するのか明らかにしてきた。p53 機能喪失はがんの悪性化と関わる事が知られるが、その分子的なメカニズムは明らかにされていない。また、特に胃がんにおいて p53 機能喪失がどのような悪性質の獲得につながるのかは未解明である。
２．研究の目的
本研究により、悪性胃がんの良いモデルマ
ウスを作製するとともに、胃がんの悪性化メ
カニズムを解明し、胃がん患者と死亡者を減らす事につながる新しい胃がん治療薬／診断薬の開発につながる研究成果を得たいと考えている。
大島正伸教授が作製した消化器がんモデル マ ウ ス (K19-Wnt1/C2mE transgenic
mouse) は 、 100% の 頻 度 で 胃 が ん(adenocarcinoma)を発症する。また、この際に生じた癌は、p53 遺伝子は野生型である事がこれまでに判明している。そこで、本研究ではこのマウスを p53 欠損マウスと掛け合わ
せ、胃がんにおいて p53 遺伝子が持つ機能を解明する。p53 喪失により、がんの悪性化が予測されるが、その悪性化にどのような p53
標的遺伝子群が関わるのか、明らかにしたいと考えている。
本研究により、p53 標的遺伝子群の中から、がんの悪性化を抑制する遺伝子を同定する

事で、それらの遺伝子を標的とした癌治療や診断への応用が期待できる。
３．研究の方法① 消 化 器 が ん モ デ ル マ ウ ス(K19-Wnt1/C2mE transgenic mouse)と p53
欠損マウスを掛け合わせる。p53 を野生型で持つマウス、p53 を持たないマウスから生じたがん組織を採取する。
② p53 を野生型で持つマウス、p53 を持たないマウスから生じたがん組織を採取する。
③ 病理解析、X 線 CT 解析、および免疫不全マウスへの移植実験などを行い、悪性胃がんの新規病体モデルとなるこのマウスの組織を詳細に解析する。p53 喪失に伴ったがんの性質の変化を明らかにする。
④ 得られた癌組織より、mRNA を精製し、マイクロアレイ発現解析により、p53 依存性に発現する遺伝子群を同定する。
⑤ 申請者は、ゲノムワイドな p53 結合部位
を ChIP-chip 解析により同定している。そこで、p53 依存性に発現する遺伝子の中から、
p53 結合が認められる遺伝子、すなわち p53の直接の標的遺伝子を同定する。
⑥ 同定した遺伝子が、胃がんの発生及び悪性化とどのように関わるか解析する。
４．研究成果これまでに消化器がんモデルマウス(K19-Wnt1/C2mE transgenic mouse)及びp53 欠損マウスを導入し、マウスの掛け合わせを行った。その結果、p53 欠損の消化器がんモデルマウスの作製に成功し、現在詳細な解析を進めている。また、消化器がんモデル
マウスが発症した胃がんの p53 は野生型であり、正常な機能を持っている事が明らかになった。さらに、p53 欠損の消化器がんモデル
マウスでは、より悪性度が高い胃がんが発症する事が明らかになりつつある。
５．主な発表論文等（研究代表者、研究分担者及び連携研究者には下線）〔雑誌論文〕（計１件）

Chikako Ozeki, Tatsuhiro Shibata, Takashi
Kohno, Yuichiro Sawai, Koji Okamoto, Jun
Yokota,Fumio
Tashiro,SeiichiTanuma, Ryuichi Sakai, Tatsuya Kawase,
Issay Kitabayashi, Yoichi Taya and Rieko
Ohki#. (#corresponding author) Cancer
susceptibility polymorphism of p53 atcodon 72 affects phosphorylation anddegradation of p53 protein. Journal of
Biological Chemistry, Vol. 286, pp.
18251-18260, 2011.
〔学会発表〕（計０件）
〔図書〕
（計０件）
〔産業財産権〕○出願状況（計０件）○取得状況（計０件）〔その他〕
なし
６．研究組織(1)研究代表者
国立がん研究センター研究所・研究員
大木理恵子(2)研究分担者
なし(3)本研究所担当者
腫瘍遺伝学・教授 大島正伸

金沢大学がん進展制御研究所共同研究成果報告書

平成２４年４月２４日提出
対象研究テーマ：HGF-Met 系を中心とするがん転移・薬剤耐性のメカニズムと制がん研究
研
研

究
究

期
題

間：2011 年 4 月 1 日～2012 年 3 月 31 日
目：HGF-Met の活性化機構に基づく分子創薬研究

研 究 代 表 者：大阪府立大学大学院理学系研究科

准教授

木下誉富

研究成果の概要：
HGFβ・ベンゼン誘導体阻害剤複合体の X 線構造の再精密化を行なった。明らかとなった相互作用様式は、これまでに合成された 100 誘導体についての構造活性相関を矛盾なく説明できる。誘導体から 3 ～ 5 Å 離れたところに、正電荷及び負電荷サブポケットが存在していることがわかり、これらのポケットを狙った Structure-Based Drug Design を行ったところ、カルボン酸誘導体に顕著な活性向上が認められた。この化合物のカルボン酸部分は正電荷サブポケッ
トにあるアルギニン残基側鎖と相互作用しているものと推測される。これまでの構造活性相関を整理し、さらに高活性 HGF アンタゴニストの創出を目指す。
研究分野：構造生物学、創薬化学
キーワード：X 線結晶構造解析、Structure-Based Drug Design (SBDD)
１．研究開始当初の背景
HGF（肝細胞増殖因子）は Met 受容体を介して多彩な生理機能を発揮する。HGF は
肝臓をはじめ、腎臓、心血管系、脳神経系など複数の組織において再生や保護を担う生理活性タンパク質であり、HGF を投与・補充することが、肝硬変、腎不全、脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症、皮膚潰瘍など様々な疾患の治癒・改善につながることが明らかにされている。一方、悪性腫瘍の本態といえるのが、がん細胞のもつ高い浸潤・転移能である。
HGF は様々ながんに対して、浸潤・転移を強力に促すことから、HGF-Met 受容体系はがんの浸潤・転移阻止につながる分子標的になると考えられている。したがって、
HGF-Met 受 容 体 系 を 阻 害 す る 分 子（HGF-Met アンタゴニスト）は、がんの浸潤・転移・成長阻害につながる新規制がん分子になる。また、矢野ら（金沢大学がん研究所）により、肺がんのイレッサ耐性獲得に
HGF 依存的な Met 受容体の活性化が関与すること、イレッサと HGF-Met 阻害の併用療法がイレッサ耐性の克服につながることが示された。さらに、平尾ら（金沢大学がん研究所）により脳腫瘍（グリオブラストーマ）
モデルでの腫瘍幹細胞の浸潤性成長に
HGF-Met 系の活性化が関与することが明らかにされた。これらの背景をふまえ、

HGF-Met 系阻害分子、とりわけ、阻害分子としての独自性、医薬品としての汎用性、チ
ロシンキナーゼ阻害剤に対する耐性出現を考慮すると、HGF と Met 受容体の相互作用を細胞外で阻害する低分子化合物医薬は、独
自性、汎用性、耐性出現が生じ難い点において優れた抗がん剤になる。
２．研究の目的
これまでの研究において、このシードとなる化合物と HGFβ鎖の X 線構造解析に基づいた Structure-Based Drug Design (SBDD)を行い、ベンゼン骨格を有する新規化合物群を創出している。これらの化合物は活性が減弱するものの最適化探索つまり合成展開上有利になる。これら誘導体と HGFβ鎖との複合体の X 線結晶構造情報に基づいた
SBDD 創薬研究を進めて、HGF 阻害活性が飛躍的に向上した医薬品候補化合物を得ることを目指す。
３．研究の方法
HGFβ-ベンゼン誘導体阻害剤複合体の立体構造を再精密化し、その構造に基づいて
HGFβ鎖‐Met 相互作用面を遮断する HGF ア
ンタゴニストを設計、合成した。得られた誘導体は HGFβ鎖‐Met の結合阻害活性、HGF
依存的細胞 Scattering 作用に対する阻害活性、

HGF 依存的 Met リン酸化活性阻害、及びがん細胞の浸潤阻害活性により評価した。HGF 分
子内ドメインであるβ鎖の蛋白質サンプルを結晶化用に高純度精製し、各種阻害化合物との複合体の結晶を調製した。この結晶を用いて、高エネルギー加速器研究機構において X
線回折データ測定を行い、構造解析を行った。
４．研究成果ベンゼン誘導体の HGFβへの結合様式に基づき、新たに疎水性相互作用および水素結合を形成するように誘導体を設計した。特にベンゼン骨格からそれぞれ 3 Å と 5 Å 離れたところに正電荷サブポケット（図 1 青）と負電
荷サブポケット（図１赤）を作用する置換基を導入した化合物を合成した。誘導体のほとんどは期待されたほどの活性向上を示さな
いものの、活性を保持していた。一方、カルボン酸基を導入した誘導体は顕著な活性向上を示した。この化合物はこれまで最強であった化合物と同等の生物活性を示す。

2.

and Anti-cancer Approach. Current Signal
Transduction Therapy 6, 191-199, 2011.
Kinoshita, T., Sekiguchi, Y., Fukada, H.,
Nakaniwa, T., Tada, T., Nakamura, S., Kitaura,
K., Ohno, Y., Suzuki, Y., Hirasawa, A.,
Nakanishi, I., Tsujimoto, G.. A detailed
thermodynamic profile of cyclopentyl andisopropyl derivatives binding to CK2 kinase.
Moll. Cell. Biochem. 356, 97-105, 2011.

〔学会発表〕（計８件）
1. 立体構造を基盤としたシグナル伝達メカ
ニズムの解明とドラッグディスカバリー、
木下誉富、プロテイン・モール関西情報交流セミナー・第 11 回日本蛋白質科学会年
会共催
〔図書〕
（計０件）
〔産業財産権〕○出願状況（計０件）○取得状況（計０件）〔その他〕
1. HGF-Metの活性化機構に基づく分子創薬研
究、木下誉富、平成 23 年度金沢大学がん進展制御研究所共同利用・共同研究拠点
研究成果報告会（2011 年 12 月、金沢）
2. SBDDによる毒性回避－パラレルSBDD－、木下誉富、SAR News No.21、7-12,2011.

図１

HGF（橙）とベンゼン誘導体（緑）の結合様式

この活性向上した化合物のカルボン酸部
分は正電荷サブポケットにあるアルギニン
側鎖と相互作用しているもと推定される。この化合物の結合様式などの構造情報とこれまでの合成化合物の構造活性相関を整理し、結合ポケットで適切に相互作用するように、
Structure-Based Drug Design 研究を展開し、さらなる高活性化合物の創出を目指す。

５．主な発表論文等（研究代表者、研究分担者及び連携研究者には下線）〔雑誌論文〕（計７件）
1. Sakai, K., Nakamura, T., Kinoshita, T.,
Nakamura, T., and Matsumoto,K. HGF-Antagonists: Structure, Activities,

６．研究組織(1)研究代表者
大阪府立大学大学院理学系研究科・准教授
木下誉富(2)研究分担者
大阪大学大学院工学研究科・教授(3)本研究所担当者
腫瘍動態制御・教授

松本邦夫

南方聖司

金沢大学がん進展制御研究所共同研究成果報告書

平成２４年４月２０日提出
対象研究テーマ：中皮腫の同所移植モデルを用いた進展機構解明と標的分子の探索
研
研

究
究

期
題

間：2011 年 4 月 1 日～2012 年 3 月 31 日
目：癌細胞と脂肪細胞の接触による相互作用の検討

研 究 代 表 者：徳島大学大学院ヘルスバイオサイエンス研究部

准教授

上原久典

研究成果の概要：
様々な腫瘍の進展過程において癌細胞の脂肪組織への浸潤が認められる。近年、脂肪組織は
中性脂肪の貯蔵だけでなく、炎症性サイトカインを含む多くの活性物質を放出する内分泌器官としても重要あることが明らかになってきている。従って、脂肪組織に浸潤した癌細胞と脂肪細胞の間には何らかの相互作用が働いている可能性があるが、それについてはこれまで十分な検討が行われていない。本研究では脂肪細胞と癌細胞の共培養モデルを確立し、脂肪細胞との接触による癌細胞の遺伝子発現の変動を cDNA マイクロアレイによって解析した。その結果、乳癌細胞が成熟脂肪細胞と接触することによって secreted protein acidic and rich in cysteine(SPARC)や乳癌の進展との相関が報告されているいくつかの遺伝子の発現上昇を示すこと、および脂肪細胞で脂肪分化マーカーの発現が低下することがわかった。また、脂肪前駆細胞の培
養上清が乳癌や前立腺癌細胞の浸潤を促進すること、および脂肪細胞から分泌される FABP4が前立腺癌細胞の浸潤を促進することが明らかになった。以上より、乳癌細胞が脂肪細胞に接触した際には脂肪細胞を幼若化し、浸潤に有利な環境を形成すること、および脂肪細胞が分泌する FABP4 が腫瘍浸潤を促進する可能性が示唆された。
研究分野：癌の微小環境
キーワード：脂肪細胞、癌の浸潤、細胞接触、網羅的遺伝子発現解析
１．研究開始当初の背景
これまでに金沢大学がん研究所腫瘍内科
矢野聖二教授との共同研究において、前立腺癌、肺癌、乳癌などの細胞株を用いて癌細胞と骨芽細胞の直接接触による相互作用を検索するための共培養モデルを確立し、癌細胞の遺伝子発現の変動を cDNA マイクロアレ
イによって解析することによって、PC3 ヒト
前立腺癌細胞では骨芽細胞からの液性因子のみでは有意な遺伝子発現の変動はみられず、骨芽細胞と接触することによってはじめて IL-1β, COX-2, IL-6 など代表的な破骨細胞誘導関連遺伝子の発現が上昇し、これにcadherin-11 や N-cadherin が 部 分 的 に 関
与 し て い る こ と を 明 ら か に し た (Br J
Cancer 104: 505-513, 2011)。
２．研究の目的
様々な腫瘍の進展過程において癌細胞の脂肪組織への浸潤が認められる。腹腔内、縦隔、皮下などには多量の脂肪組織が含まれており、例えば消化器癌は腹腔内脂肪組織に、肺癌や胸膜中皮腫は縦隔の脂肪組織に、乳癌や皮膚癌は皮下脂肪組織にそれぞれ浸潤する。近年、脂肪組織は中性脂肪の貯蔵だけでなく、炎症性サイトカインを含む多くの活性物質を放出する内分泌器官としても重要あることが明らかになってきている。従って、脂肪組織に浸潤した癌細胞と脂肪細胞の間には何らかの相互作用が働いている可能性があるが、それについてはこれまで十分な検討が行われていない。
本研究では脂肪細胞と癌細胞との共培養モデルを確立し、脂肪細胞との接触による癌細胞の遺伝子発現の変動を cDNA マイクロアレイによって解析し、癌細胞の増殖、浸潤への脂肪細胞の関与を明らかにすることを目的とし、これによって新しい分子標的治療の開発に貢献できると考えられる。
３．研究の方法
1) cDNA マイクロアレイを用いた脂肪細胞との接触による乳癌細胞の遺伝子発現の網
羅的解析
女性の胸部脂肪組織から採取された脂肪前駆細胞を脂肪分化培地で２週間培養することにより得られた成熟脂肪細胞とヒト乳癌細胞株 MCF7 を用いた。MCF7 細胞を蛍光色素でラベルした後、cell culture insertを用いた癌細胞と脂肪細胞の二層培養（癌細胞と脂肪細胞の相互作用が液性因子のみ）、
および癌細胞と脂肪細胞を混合して培養する接触培養（癌細胞と脂肪細胞の相互作用が液性因子と直接接触の２つ）を行った。培養は無血清状態で 48 時間行い、接触培養については培養終了後にソーティングを行い、脂肪細胞と癌細胞を分離した。コントロールとして単独で培養した MCF7 細胞を用いた。
培養終了後に得られた MCF7 細胞からmRNA を抽出し、cDNA マイクロアレイを行った。また、脂肪細胞を色素で標識し、同様の方法で培養を行い、得られた脂肪細胞を用いたマイクロアレイも行った。
2) 成熟脂肪細胞、および脂肪前駆細胞の培養
上清が癌細胞の浸潤に及ぼす影響
マイクロアレイの結果から、MCF7 細胞と成熟脂肪細胞が接触することにより脂肪細胞の分化が抑制されることが分かったので、この現象が癌細胞にとって有利であるかどうかを調べるために、成熟脂肪細胞、および脂肪前駆細胞の培養上清を用いて invasion
assay を 行 っ た 。 MCF7 細 胞 は invasion
assay に 適 さ な い た め 、 ヒ ト 乳 癌 細 胞 のMDA-MB-231, お よ び ヒ ト 前 立 腺 癌 細 胞
PC-3 を用いた。
3) Fatty acid binding protein 4 (FABP4)が癌細胞の浸潤に及ぼす影響
脂肪細胞から分泌される FABP4 が癌の浸潤に及ぼす影響を調べるためにヒト前立腺癌 細 胞 PC-3, DU145 を 用 い て invasionassasy を行った。
また、アラキドン酸が PC-3細胞の浸潤を促進し、ドコサヘキサエン酸(DHA)がその効果を抑制することが分かっているが、このモデルに FABP4 が及ぼす影響についても検討した。
４．研究成果1) ヒト乳癌細胞 MCF7 とヒト成熟脂肪細胞を用いて二層培養、および接触培養を行い、単独で培養した乳癌細胞、あるいは成熟脂肪細胞をコントロールとした。それぞれの培養システムにおける MCF7 細胞の遺伝子発現を cDNA マイクロアレイを用いて比較した
ところ、10 倍以上の発現の変動がみられた遺伝子は、二層培養と接触培養間で 12 個（いずれも接触培養により発現上昇）あったが、単独培養と二層培養間では認められなかった。接触培養によって最も高い発現上昇を示したのは、脂肪細胞の分化を抑制することがしられている secreted protein acidic andrich in cysteine (SPARC) で、約 52 倍であっ た 。 続 い て 、 decorin, microfibrillar
associated protein 5, MMP 2, periostin が
いずれも 15 倍以上の発現上昇を示していた。
Decorin 以下の４つの遺伝子についてはいずれも乳癌の進展と相関するという報告があり、乳癌細胞と脂肪細胞が接触することで腫瘍浸潤が促進される可能性を示唆する結果であった。SPARC については、SPARCが結合する受容体の１つである stabilin-1 を分泌するように遺伝子導入を行った MCF7細胞をヌードマウス皮下に移植し、SPARCが捕捉されることで腫瘍増殖が抑制されるかどうかを現在検討している。
一方、脂肪細胞については、接触培養におい て 脂 肪 分 化 マ ー カ ー で あ る FABP4,PPARγ, C/EBPαの発現がそれぞれ 0.03 倍、0.15 倍、0.29 倍と低下していたことから、癌細胞との接触によって脂肪細胞の分化が抑制されることが示唆された。
2) 癌細胞との接触による脂肪細胞分化の抑制が癌細胞に及ぼす影響を調べるために、成熟脂肪細胞、および脂肪前駆細胞の培養上清を用いて invasion assay を行った。ヒト乳癌細胞の MDA-MB-231, およびヒト前立腺
癌細胞 PC-3 はいずれも脂肪前駆細胞の培養
上清によって有意に浸潤が促進されたことから、癌細胞は脂肪分化を抑制することによって浸潤に有利な環境を形成していると考えられた。
3) 脂肪細胞は血中に FABP4 を放出していることが知られているが、FABP4 が腫瘍に及ぼす影響についてはほとんどわかっていな
い。FABP4 を添加して invasion assay を行
うと、用量依存的にヒト前立腺癌細胞の浸潤が促進された。また、FABP4 はアラキドン酸の PC-3 細胞に対する浸潤促進効果には影響を及ぼさなかったが、DHA の浸潤抑制効
果を阻害した。FABP4 と脂肪酸の結合を阻害する薬剤を添加することによって FABP4の作用は減弱した。これらの結果から、
FABP4 が特定の脂肪酸と結合することによってその脂肪酸の癌細胞への作用を阻害している可能性が示唆された。
以上より、乳癌細胞が脂肪細胞に接触した
際には脂肪細胞を幼若化し、浸潤に有利な環境を形成すること、および脂肪細胞が分泌す
る FABP4 が腫瘍浸潤を促進する可能性が示唆された。
５．主な発表論文等（研究代表者、研究分担者及び連携研究者には下線）〔雑誌論文〕（計
論文作成中

0 件）

〔学会発表〕（計 2 件）
上原 久典、泉 啓介 FABP4 が前立腺癌細胞の増殖・浸潤に及ぼす影響 第 20 回日本
がん転移学会学術総会
上原 久典、高橋 徹行、渡邉 俊介、泉 啓
介 FABP4 が前立腺癌の運動性と浸潤性に及ぼす影響 第 70 回日本癌学会学術総会

〔図書〕
（計

0 件）

〔産業財産権〕○出願状況（計0 件）○取得状況（計

0 件）

〔その他〕
なし
６．研究組織(1)研究代表者
徳島大学ヘルスバイオサイエンス研究部
環境病理学分野・准教授 上原久典
(2)研究分担者
なし(3)本研究所担当者
腫瘍内科・教授 矢野聖二

金沢大学がん進展制御研究所共同研究成果報告書

平成２４年４月５日提出
対象研究テーマ：マウスモデルを用いた消化器がんの発がん分子機序に関する基礎研究
研
研

究
究

期
題

間：2011 年 4 月 1 日～2012 年 3 月 31 日
目：消化器がん幹細胞制御因子のマウス発がん過程における制御機構

研 究 代 表 者：国立がん研究センター研究所

分野長

岡本康司

研究成果の概要：
ヒト大腸がん検体より大腸がん幹細胞の継代培養が可能となるスフェロイド培養法を確立したが、この培養系において、がん幹細胞マーカーCD44 の発現が、がん幹細胞としての特質維持に重要である事を明らかにした。樹立した CD44 陽性がん幹細胞において、幹細胞性の維持に重要な役割を果たす候補制御因子、及び CD4４バリアントフォームを同定しつつある。これ
らのがん幹細胞制御因子は、発がん過程において重要な役割を担うと予想される。従って、がん幹細胞制御因子の消化器発がんにおける役割を明らかにする目的で、胃がんモデルマウスにおける発現プロフィールを検討すべく準備を進めている。
研究分野：分子腫瘍学
キーワード：がん幹細胞、大腸がん、CD44
１．研究開始当初の背景
CD44 は大腸がんのみならず、膵がん、乳がん、前立腺がん等、さまざまな種類のがん幹細胞に特異的なマーカーである。モデルマ
ウス（K19-Wnt1/C2mE）における胃がんの発がん過程においても SCJ 領域に存在する幹細胞様細胞に特異的な発現を示す事が明らかになってきており、消化器がん幹細胞の形成過程に普遍的な役割を果たす事が予想される。又、CD44（とりわけそのバリアン
トフォーム）のがん幹細胞の成立における機能的な重要性も報告されている。
研究代表者のグループは、最近の研究により、ヒト大腸がん検体より大腸がん幹細胞の継代培養が可能となるスフェロイド培養法を確立した。さらに各種マーカーの発現、分化能の検討、免疫不全マウスにおける造腫瘍性の検討等により、スフェロイド中の CD44
陽性細胞が典型的ながん幹細胞としての形質を有する事を明らかにした。
２．研究の目的
本共同研究においては、消化器がん幹細胞の成立に重要な役割を果たすと予想される CD44 経路の解析を行う事により、胃がん
発生過程におけるがん幹細胞の成立機序を明らかにする事を目的とする。
がん幹細胞制御における CD44 を介した制御機構を明らかにする目的で、がん幹細胞の in vitro 培養系を用いて、CD44 により発現制御をうける遺伝子群の同定を進める。
同定された CD44 関連因子の機能解析を行う
一方、これら新規因子の消化器発がん過程における発現様式の解明をマウス胃発がん
モデルの系で行う。これらの研究で得られる CD44 経路の新たな知見を統合解析する事
により、消化器発がんにおけるがん幹細胞の発生及び進展過程を明らかにする事を目的とする。
３．研究の方法
申請者らが樹立した複数の大腸がん幹細胞をフローサイトメトリーにより CD44 高発
現細胞と低発現細胞に分け、CD44 高発現細胞において有意に上昇ないし低下している遺伝子群を同定する。同定した遺伝子に対応する shRNA のプールを構築し、がん幹細胞の増殖、転移に対する各遺伝子の発現抑制の効果を検証する。
CD44 にはスタンダードフォームの他に幾つかのバリアントフォームの存在が知られている。バリアントフォームのがん化における重要性が示唆されている事から、これらのアイソフォームをレンチウイルスベクターを用いた遺伝子導入によりがん幹細胞に高発現させ、がん幹細胞の増殖、転移能に対する影響を検討する。
４．研究成果ヒト大腸がん由来がん幹細胞を含むスフェロイド in vitro 培養系を用い、スフェロイ
ド中の CD44 陽性細胞と陰性細胞を、フロー
サイトメトリーを用いて分離し、両細胞よりRNA を抽出後、遺伝子発現マイクロアレイ
を用いて陽性細胞又は陰性細胞に特異的に発現する遺伝子群の同定を行った。同定したがん幹細胞制御因子の役割を、対応する
shRNA の細胞導入による機能解析により検討中である。又、スフェロイド細胞、マウス
xenograft 等における発現解析により、同定した候補因子の CD44 依存的な発現パターンの検証を行っている。さらに、これらの CD44
関連因子の、マウス胃発がんモデルの系における検証の準備を行っている。
５．主な発表論文等（研究代表者、研究分担者及び連携研究者には下線）〔雑誌論文〕（計５件）
K. Okamoto, T. Ishiguro, Y. Midorikawa, H.
Ohata, M. Izumiya, N. Tsuchiya, A. Sato, H.
Sakai, H. Nakagama: miR-493 induction
during carcinogenesis blocks metastatic
settlement of colon cancer cells in liver.
EMBO J. doi: 10.1038/emboj.2012.25 (2012)
T. Ishiguro, A. Sato, H. Ohata, H. Sakai, H.
K.
Okamoto:Differential
Nakagama,
expression of nanog1 and nanogp8 in coloncancer cells. Biochem. Biophys. Res.
Commun. 418, 199-204 (2012)
M. Izumiya, N. Tsuchiya, K. Okamoto, H.
Nakagama:
Systematic
explorationofcancer-associatedmicroRNA
throughfunctional screening assays. Cancer Sci. 102,
1615-21 (2011)
N. Tsuchiya, M. Izumiya, H. Ogata-Kawata, K.
Okamoto, Y. Fujiwara, M. Nakai, A. Okabe,
A.J. Schetter, E.D. Bowman, Y. Midorikawa, Y.
Sugiyama, H. Aburatani, C.C. Harris, H.
Nakagama:
Tumor-suppressor
miR-22determines p53-dependent cellular fatethrough post-transcriptional regulation of p21.
Cancer Res. 71, 4628-4639 (2011)
C. Ozeki, Y. Sawai, T. Shibata, T. Kohno, K.
Okamoto, J. Yokota, F. Tashiro, S. Tanuma, R.
Sakai, T. Kawase, I. Kitabayashi, Y. Taya, R.
Ohki: Cancer Susceptibility Polymorphism of
p53 at Codon 72 Affects Phosphorylation and
Degradation of p53 Protein. J. Biol Chem.
286,18251-18260 (2011)〔学会発表〕（計４件）
岡本康司、大畑広和、石黒竜也、緑川泰、中釜斉「大腸がん肝転移を抑制する新規因子の同定及び解析」
第 70 回日本癌学会学術総会（名古屋市、2011
年 10 月）大畑広和、石黒竜也、岡本康司、中釜斉「大腸がん幹細胞における分化可塑性の解析」
第 70 回日本癌学会学術総会（名古屋市、2011
年 10 月）石黒竜也、大畑広和、岡本康司、中釜斉「新たな卵巣癌スフェロイド培養法の確立」
第 70 回日本癌学会学術総会（名古屋市、2011
年 10 月）岡本康司「大腸がん転移を抑制する新規マイクロＲＮＡの同定及び解析」
第 26 回発癌病理研究会（札幌市、2011 年 8
月）
〔図書〕
（計０件）
〔産業財産権〕○出願状況（計０件）○取得状況（計０件）〔その他〕
なし
６．研究組織(1)研究代表者
国立がん研究センター研究所 ・分野長
岡本康司
(2)研究分担者
国立がん研究センター研究所 ・研究員
大畑広和
国立がん研究センター研究所 ・リサーチ
レジデント 石黒達也
(3)本研究所担当者
腫瘍遺伝学 ・教授

大島正伸

金沢大学がん進展制御研究所共同研究成果報告書

平成２４年４月２７日提出
対象研究テーマ：in vitro がん幹細胞モデル系の開発に関する研究
研
研

究
究

期
題

間：2011 年 4 月 1 日～2012 年 3 月 31 日
目：がん幹細胞の脂質代謝における Rb がん抑制遺伝子と SREBP-1 遺伝子の関係

研 究 代 表 者：筑波大学医学医療系

教授

島野

仁

研究成果の概要：SREBP の発がん・悪性進展における役割を探索するために、SREBP を欠損する様々な発がんマウスの樹立を目指す。共同研究期間中に、我々が本来着目していた Rb と SREBP-1,2 の転写・プロセッシングにおける関係に加え、変異 p53 が SREBP-2 と直接に結合し、その転写活性を促進するという報告がなされた。mTORC1 と SREBP-1,2 との関係も 2010 年に報告があり、がん化シグナルの標的としての SREBP の役割に益々注目が集まっている。クリーニングを終えた REBP-1 KO マウスと Rb+/-; p53+/-マウスとの交配を開始した。PTENflox, Rbflox
マウスとの交配も間もなく開始する。また、SREBP-1 KO 細胞あるいは SREBP-2 ノックダウ
ン細胞において様々ながん化シグナルを亢進させ、その帰結（トランスフォーム、がん幹細胞様の挙動、糖代謝、脂質代謝）を観察している。現時点において、結果の観察には行き着いていないが、研究計画の遂行に必要なマテリアルは着々と揃ってきた。
研究分野：内分泌学、代謝学
キーワード：SREBP、Rb
１．研究開始当初の背景

共同研究者の金沢大学がん進展制御研究所の高橋らは、Rb がん抑制遺伝子の不活性化が Ras プロトがん遺伝子産物の膜輸送と活性化を制御する経路を探索し、Rb による
E2F 依存的な SREBP ファミリー遺伝子発現調 節 機 構 を 発 見 し た （ Shamma et al.,Cancer Cell 15: 255-269, 2009）。Rb が不活性化すると、SREBP-1,2 の転写制御を介してあるいは直接に E2F-1,3 によって多数のイソプレニル化関連酵素の発現が誘導されるために、Ras 蛋白質の成熟と活性化が加速される。この経路によって、Rb 不活性化は、腫瘍の分化能や転移・浸潤能を制御、また、細胞によっては、逆に細胞をがん化から守る生体防御機構を誘導する。更に、この経路は、Ras のみならず、様々な CAAX
蛋白質の活性制御にも関わる。一方、Rb とSREBP ファミリーの関係は、蛋白質イソプ
レニル化のみならず、Fatty acid synthaseなど、脂質代謝やがんの悪性形質の生成において重要な役割をはたす遺伝子の制御にも関わると思われる。実際、Rb ヘテロ型マウスには、脂肪肝が生じる。また、Fatty
acid synthase 阻害剤は、臨床がんへの効
果が強く期待されている化合物である。がんの代謝異常には、ふたつある。よく知られている Warburg 効果は、解糖系の亢進であり、近年、p53 がん抑制遺伝子がこの系を制御することが知られつつある。もう一つは、lipogenic phenotype と呼ばれる脂質代謝の異常である。これは、脂質二重膜を構成する脂質の合成の亢進がその本態であり、盛んな細胞分裂に追いつくための膜
脂質合成亢進、あるいは、膜脂質によって制御される PI3K/AKT シグナル等の制御に関与すると思われる。実際、高橋らは、Rb
不活性化が、AKT シグナルを亢進させることを見出し、我々との共同研究によって、その機構を探索する。そして、Rb が腫瘍の
lipogenic phenotype を制御する可能性を探索する。
２．研究の目的

本研究では、Rb と SREBP ファミリー遺伝子を同時欠損する複合変異マウスを作製、Rb 不活性化によって生じる表現型（胎性致
死、分化異常、細胞周期異常、細胞死異常、細胞老化、DNA 損傷応答、エピジェネティ
ック異常、腫瘍、転移、薬剤耐性、がん幹細胞）の生成において SREBP ファミリー遺伝子の果たす役割を遺伝学的に確立する。
そして、SREBP ファミリーに依存した Rb の新規機能を同定する。また、Rb 不活性化によって生じる脂質あるいはメタボローム異常を網羅的に探索する。SREBP を含め、Rb

不活性化によって機能亢進する転写因子や酵素を見出し、その阻害剤が Rb 不活性化腫
瘍の挙動に与える影響を探索する。
３．研究の方法
Rb ヘテロ欠損マウスと SREBP-1 ヘテロ欠損マウスと交配し、これによって得られる
ダブルヘテロ型マウスどうしを更に交配し、様々な遺伝型のマウスを得る。Rb ホモ型は、完全に胎性致死、SREBP-1 ホモ型は、部分的に胎性致死であるので、理論的には、Rb+/-;SREBP-1-/-マウスを得ることができる。このマウスに生じる下垂体腺癌と甲状腺 C 細胞
腺腫の組織像や腫瘍細胞の性質を解析する。
また、timed pregnancy によって、胎生 12.5
日付近の胚を得、これを観察する。これまでに、高橋や米国 MIT の Tyler Jacks 博士らによって、Rb ホモ型欠損と同時に様々な関連遺伝子を欠損する複合変異マウスに生じる
様々な表現型が、非常に詳細に調べられており、これらの知見との対比に於いて、Rb ホ
モ型表現型に SREBP-1 同時欠損が与える影響を解釈する。
４．研究成果SREEBP-1 KO マウスを筑波大学から金沢大学に輸送した。マウスの観察を SPF 環
境下で行うために、学際科学実験センター実験動物研究施設において、浅野雅秀教授の協力の下、SREBP-1 KO マウスのクリーニングを行った。所期の SPF 化マウスを得た後、これを同上角間分室に移動。Rb+/-; p53+/-マ
ウスとの交配を開始した。共同研究期間中に我々が着目していた Rb と SREBP-1,2 のプ
ロセッシングの関係に加え、変異 p53 がSREBP-2 と直接に結合し、その転写活性を促進するという報告がなされた。mTORC1と SREBP-1,2 との関係も 2010 年に報告があり、がん化シグナルの標的としての SREBPの役割に益々注目が集まっている。現在、
SREBP-1 KO 細胞あるいは SREBP-2 ノック
ダウン細胞において様々ながん化シグナルを亢進させ、その帰結（トランスフォーム、
がん幹細胞様の挙動、糖代謝、脂質代謝）を観察している。結果の観察には行き着いていないが、研究計画の遂行に必要なマテリアル
は着々と揃ってきた。
５．主な発表論文等（研究代表者、研究分担者及び連携研究者には下線）〔雑誌論文〕（計６件）
1. Kumadaki S, Karasawa T, Matsuzaka T,
Ema M, Nakagawa Y, Nakakuki M, Saito R,
Yahagi N, Iwasaki H, Sone H, Takekoshi K,
Yatoh S, Kobayashi K, Takahashi A,

SuzukiH,
Takahashi
S,
YamadaN, Shimano H. Inhibition of ubiquitin
ligaseF-box
andWD
repeatdomain-containing 7 α (Fbw7 α ) causes
hepatosteatosis
throughKrüppel-likefactor5(KLF5)/peroxisome
proliferator-activated receptor γ2 (PPARγ2) pathway but not SREBP-1c protein inmice. J Biol Chem. 286(47):40835-46, 2011.
2. Saito R, Matsuzaka T, Karasawa T,
Sekiya M, Okada N, Igarashi M,
Matsumori R, Ishii K, Nakagawa Y,
Iwasaki H, Kobayashi K, Yatoh S,
Takahashi A, Sone H, Suzuki H, Yahagi N,
Yamada N, Shimano H. Macrophage Elovl6
deficiency ameliorates foam cell formation
and reduces atherosclerosis in low-density
lipoprotein
receptor-deficientmice.
Arterioscler
Thromb
Vasc
Biol.
31(9):1973-9, 2011.
3. Karasawa T, Takahashi A, Saito R,
Sekiya M, Igarashi M, Iwasaki H,
Miyahara S, Koyasu S, Nakagawa Y, Ishii
K, Matsuzaka T, Kobayashi K, Yahagi N,
Takekoshi K, Sone H, Yatoh S, Suzuki H,
Yamada N, Shimano H. Sterol regulatory
element-binding
protein-1
determines
plasmaremnant
lipoproteinsandaccelerates atherosclerosis in low-density
lipoprotein
receptor-deficientmice.
Arterioscler
Thromb
Vasc
Biol.
31(8):1788-95, 2011.
4. Amemiya-Kudo M, Oka J, Takeuchi Y,
Okazaki H, Yamamoto T, Yahagi N,
Matsuzaka K, Okazaki S, Osuga J,
Yamada N, Murase T, Shimano H.
Suppression of the pancreatic duodenal
homeodomaintranscription
factor-1(Pdx-1) promoter by sterol regulatory
element-binding protein-1c (SREBP-1c). J
Biol Chem. 286(32):27902-14, 2011.
5. Iwasaki H, Naka A, Iida KT, Nakagawa
Y, Matsuzaka T, Ishii KA, Kobayashi K,
Takahashi A, Yatoh S, Yahagi N, Sone H,
Suzuki H, Yamada N, Shimano H. TFE3
regulates
musclemetabolicgene
expression, increases glycogen stores, andenhances insulin sensitivity in mice. Am J
Physiol Endocrinol Metab. 302(7): E896 –
902, 2012.
6. Heianza Y, Hara S, Arase Y, Saito K,
Fujiwara K, Tsuji H, Kodama S, Hsieh SD,

Mori Y, Shimano H, Yamada N, Kosaka K,
Sone H. HbA1c 5·7-6·4% and impaired
fasting plasma glucose for diagnosis ofprediabetes and risk of progression todiabetes in Japan (TOPICS 3): alongitudinal cohort study. Lancet. 378(9786):147-55.
〔学会発表〕（計５件）

1. 島野 仁 動脈硬化戦略における脂質管理の新しい視点：臓器脂質の量的制御と質的制御 第
54 回日本糖尿病学会年次学術集会（札幌）2011
年 5 月 20 日
2. 島 野 仁 飢 餓 応 答 肝 臓 特 異 的 転 写 因 子
CREBH の糖脂質代謝制御 第 84 回日本内分泌学会年次学術集会（神戸）2011 年 4 月 21 日

3. Rie Matsumori, Takashi Matsuzaka,
Tsuyoshi Yamazaki, Haruna Shinozaki,
Daida Hiroyuki, Yukio Nagasaki, Hitoshi
Shimano. A novel bile salt sequestering
agent_”PEGylated
andquaternizedpolyamine nanogel" reduces VLDL and
LDL cholesterol, raises HDL cholesterol,and prevents atherosclerosis in mice.
第84 回米国心臓協会学術集会（AHA Scientific
Sessions 2011）フロリダ
4. Rie Matsumori, Takashi Matsuzaka,
Tsuyoshi Yamazaki , Haruna Shinozaki,
Hiroyuki Daida, Yukio Nagasaki, Hitoshi
Shimano. PEGylated and quaternizedpolyamine nanogel" a novel bile salt
sequestering
agent,
ameliorates
dyslipidmia through reduction of VLDL
and LDL cholesterol, and induction of HDLcholesterol. 第 43 回日本動脈硬化学会学術集会（ロイトン札幌）
5. Haruna Shinozaki, Takashi Matsuzaka,
Rie Matsumori, Tsuyoshi Yamazaki, Yukio
Nagasaki, Hitoshi Shimano. A novel bile
salt sequestering agent_”PEGylated andquaternized polyamine nanogel" reduces
VLDL and LDL cholesterol, raises HDLcholesterol, and prevents atherosclerosis inmice.
第 34 回日本分子生物学会年会（パシフィコ横浜）〔図書〕（計０件）〔産業財産権〕○出願状況（計０件）○取得状況（計０件）

〔その他〕
なし
６．研究組織(1)研究代表者
筑波大学医学医療系・教授(2)研究分担者
筑波大学医学医療系・准教授(3)本研究所担当者
腫瘍分子生物学・教授

島野

松坂

高橋智聡

仁

賢

金沢大学がん進展制御研究所共同研究成果報告書

平成２４年４月２日提出
対象研究テーマ：in vitro がん幹細胞モデル系の開発に関する研究
研
研

究
究

期
題

間：2011 年 4 月 1 日～2012 年 3 月 31 日
目：ＳＭＳ抑制による細胞死誘導セラミド・シグナル増強を介したＲｂ遺伝子欠損マウスにおけるリンパ腫発症機構の制御

研 究 代 表 者：金沢医科大学血液免疫内科学

教授

岡崎俊朗

研究成果の概要：
スフィンゴ脂質セラミドを介した細胞死誘導が、Ｒｂ遺伝子欠損状態で発症する腫瘍に対して抗腫瘍効果を持つかについて検討したが、Ｒｂ欠損ＫＯマウスにおける腫瘍発症効率の低さとＳＭＳ１−ＫＯマスの出生率の低さによって、当初予想した、セラミド産生増加によってＲｂ
欠損時の腫瘍に対して抗腫瘍効果を認めるかについては、最終的な結論が出ず、今後の実験モデルの再構築が必要となる。
研究分野：脂質生物学、脂質腫瘍学
キーワード：スフィンゴ脂質、発癌機構
１．研究開始当初の背景
申請者は、スフィンゴ脂質セラミドは細胞死誘導脂質として、細胞膜の解剖学的成分として機能するのみでなく細胞機能を制御する
メディエーターであることを報告した（Okazaki T., et al.J. Biol. Chem., 264:
19076-19080, 1989）。スフィンゴ脂質セラミドの調節機構として産生系であるスフィンゴ
ミエリン（SM）加水分解酵素スフィンゴミエ
リナーゼ（SMase）そして代謝系であるSM産生酵素（SMS）とグルコシルセラミド産生酵素（ＧＣＳ）が知られており、これらを介したセラ
ミド・シグナル制御機構を“セラミド・バイ
オスタット”と呼んでいる。これまで様々な細胞死誘導刺激によってSMaseの活性化とSMSの抑制が誘導され、セラミドが増加することで細胞死が惹き起こされることが知られている。申請者は、近年、ＳＭＳの遺伝子クロー
ニングに成功して（Yamaoka S., Miyaji M.,
Kitano T., Umehara H., and Okazaki T. J.
Biol. Chem., 279, 18688-93, 2004），ＳＭＳの機能制御の解析により腫瘍細胞の生死におけるセラミドの意義について明らかにする研究を進めている。

３．研究の方法（１）Ｒｂ欠損細胞におけるセラミド・シ
グナルの変化（２）Ｒｂノックアウトマウスの作成とその予想表現型（３）SMS または２—KO マウスとＲｂ—KO のダブルＫＯマウスの作成とＲｂ欠損腺癌発症における SMS 欠損によるセラミド産生増強の影響を検討（４）ＳＭＳ／ＲｂダブルＫＯマウス由来
MEF を用いてセラミド産生機構の分子制御の検討

２．研究の目的
本 共 同 研 究 の 課 題 と し て ataxia
telangiectasia mutated (ATM)遺伝子欠損による腫瘍発生時のセラミド・シグナルの関与を 申 請 し 検 討 し た 。 ATM 欠 損 マ ウ ス に
p16/Ink4a 欠損マウスを交配することでダブル KO マウスを作成し悪性リンパ腫発生を試みたが、発生効率が非常に低く、このダブル４．研究成果Ｒｂ欠損細胞では、セラミド産生機構が抑制されており、Ｒｂ−ＫＯマウスにおける腺癌発症にセラミド／スフィンゴミエリン系の関与が示唆させる。Ｒｂ—ＫＯマウスでの腫瘍形成にＳＭＳ１—ＫＯマウスを掛け合わせて、ＳＭＳ抑制によるセラミド増加による抗腫瘍効果を検討する予定であった

ＫＯマススにＳＭＳ１−ＫＯマスを掛け合
わせて、トリプルＫＯマウスを作成することが困難なことが判明した。その後、マウス腫瘍発生モデルとしてＲｂ遺伝子欠損マ
ウスにおいて、効率的に腺癌が発症するモデルを作成できたため、今後、このマウスの系に関してＳＭＳ１欠損マウスを掛け合わせることで、セラミド産生の抑制が誘導され腺癌腫瘍細胞の増大を阻害できるかについて検討する。

が、ＳＭＳ１−ＫＯマウスが発症率、生存率ともに非常に脆弱で有り、解析できる個体数を得ることができなかった。したがって、今後のマウスＫＯ個体の増加によって、Ｒｂ欠損状態による腫瘍増生をＳＭＳ１欠損が抑制す
るかについて結論を出す必要がある。

セラミドとがん、岡崎俊朗、セラミド：基礎と応用、１７１−１７９，２０１１〔産業財産権〕○出願状況（計０件）○取得状況（計０件）

５．主な発表論文等（研究代表者、研究分担者及び連携研究者には下線）〔雑誌論文〕（計５件）
1. Elodie Lafont, Kazuyuki Kitatani, Bruno Ségui
and Toshiro Okazaki Regulation of death and growthsignals at the plasma membrane by sphingomyelin
synthesis: implications for hematological malignancies.
Recent Patents on Anti-Cancer Drug Discovery
6(3):324-33, 2011
2. Mitsutake S., Zama K., Yokota H., Yoshida T., Tanaka
M., Mitsui M., Tanaka T., Yamashita T., Takemoto
H., Okazaki T., Watanabe K., and Igarashi Y.
Sphingomyelin synthase 2 is responsible for obesity andlipid droplet formation in liver and is a novel regulator ofmembranemicrodomain.
J.
Biol.
Chem.
12;286(32):28544-55, 2011
3. Abdel Shakor A.B., Taniguchi M., Kitatani K.,
Hashimoto M., Asano A., Bielawski J., Bielawska A.,
Watanabe K., Kobayashi T., Igarashi Y., Umehara H.,
Tkakeya H. and Okazaki T. SMS1-generated
sphingomyelin plays an important role in transferrin
trafficking and cell proliferation. J. Biol. Chem.,
286(41):36053-62., 2011
4. Yano M., Watanabe K., Yamamoto T., Ikeda K.,
Senokuchi T., Lu M., Kadomatsu T., Tsukano H., Ikawa
M., Okabe M., Yamaoka S., Okazaki T., Umehara H.,
Gotoh T., Song W-J., Node K., Taguchi T., Yamagata K.
and Oike Y. Mitochondrial dysfunction and increased
reactive oxygen species impair insulin secretion in
sphingomyelin synthase 1 null mice. J. Biol. Chem,
286(5); 3992–4002, 2011
5. Fujiwara K., Kitatani K., Fukushima K., Yazama H.,
Kikuchi M., Igarashi Y., Kitano H., and Okazaki
T. Inhibitory effects of dietary glucosylceramide on
squamous cell carcinoma of the head and neck in
NOD/SCID mice. Int. J. Clin. Oncol. 16(2):133-40, 2011

〔学会発表〕（計２件）
1.

Okazaki T., Role of SMS in cell proliferationandmigration.-transferrin
trafficandCXCL12/CXCR4 system- Naito International
Symposium, Sapporo, Japan, June 28-July ,2011 (invited)2.

Okazaki T., Asano S., Kitatani K., Taniguchi
M., Hashimoto M., Zama K., Mitsutake S.,
Igarashi Y., Kiyokawa E., Matsuda M., Takeya
H., ICBL, Warsaw, Sep. 2011

〔図書〕
（計１件）
セラミド：基礎と応用(食品化学新聞社)セラミ
ドの細胞内機能概論—スフィンゴミエリン合成酵
素ファミリィー、北谷和之、岡崎俊朗、５０−５５，
２０１１

〔その他〕
なし
６．研究組織(1)研究代表者
鳥取大学医学部・教授、金沢医科大学血液免疫内科学・教授 岡崎俊朗
(2)研究分担者
鳥取大学医学部付属病院・助教 北谷和之
鳥取大学医学部・研究員 谷口真
鳥取大学医学部・研究員 橋本真由美
鳥取大学医学部・研究員 浅野智志
(3)本研究所担当者
腫瘍分子生物学・教授

高橋智聡

金沢大学がん進展制御研究所共同研究成果報告書

平成２４年４月２４日提出
対象研究テーマ：Pim キナーゼを分子標的とした治療法の開発
研
研

究
究

期
題

間：2011 年 4 月 1 日～2012 年 3 月 31 日
目：Pim キナーゼ阻害剤の抗腫瘍剤としての開発研究

研 究 代 表 者：東京大学創薬オープンイノベーションセンター

特任教授

岡部隆義

研究成果の概要：
Pim キナーゼ阻害剤プロジェクトにおいて、Pim-3 キナーゼを強力に阻害する化合物を見出した。本阻害剤は Pim-3 が高発現しているヒト膵臓がん細胞株の増殖を in vitro で抑えただけでなく、in vivo でも増殖抑制効果を示した。
研究分野：がん分子標的治療
キーワード：Pim-1 キナーゼ、Pim-3 キナーゼ、膵臓がん
１．研究開始当初の背景
Pim-1 キナーゼはある種の白血病や前立腺癌で高発現しており、アポトーシスや細胞周期制御に関わるタンパク質をリン酸化する
ことにより、細胞の癌化やがん細胞の増悪、抗がん剤への抵抗性などを促進するセリン/
ス レ オ ニ ン ･ キ ナ ー ゼ で あ る (Cell, 37,
pp.141-150,
1984;
EMBO
J., 4,
pp.1793-1798, 1985; The International
Journal of Biochemistry & Cell Biology, 37,
pp.726-730, 2005; European Journal ofCancer, 44, pp.2144-2151, 2008)。
一方 Pim-3 キナーゼは肝臓がんや膵臓がんで恒常的に発現していることが知られており、アポトーシスを抑制していると考えられている（Int J Cancer, 114, pp20-218, 2005、
Cancer Res.66, pp6741-6747, 2006, Cancer
Sci.,98, pp321-328, 2007）。
Pim キナーゼ阻害剤はこれまでに欧米のバイオベンチャー、メガファーマよりいくつかの化合物が発表されている。しかしながらいずれの化合物も阻害活性の強さ、選択性の点から充分ではない。また現時点で臨床治験段
階にある薬剤はない（SuperGen の SGI-1776
は PhI にあったが、2010 年 11 月心毒性のためドロップした）。
膵臓がんは極めて予後が悪く、難治療腫瘍の代表である。標準治療薬はゲムシタビンであるがその奏功率は 10-20%と低く、新しい治療薬の開発が求められている。このような現況下、Pim-3 キナーゼ阻害という新しい切り
口で膵臓がんをはじめとする各種腫瘍の治療薬を開発することには社会的要請がある。
２．研究の目的
本研究は上述の Pim-1 および Pim-3 の特徴的な作用から、Pim キナーゼを抗腫瘍剤開発のターゲットとしてとらえ、その選択な阻害剤を合成、評価することにより治療薬の開発を目指すものである。
３．研究の方法
こ れま で我 々は Pim キナ ーゼ 阻害 剤を
Pim-1 キナーゼ阻害の観点から白血病を治療
ターゲットとして評価を進めてきた。本研究では Pim-3 阻害剤/膵臓がん治療薬の観点か
ら、以下のように研究を進めた。
①化合物の Pim-1、Pim-3, FLT3（ref.）キナ
ー ゼ に 対 す る 酵 素 阻 害 活 性 を mobility
shift assay を用いて評価する。
②代表的な化合物についてキナーゼプロファイリングを行う。
③代表的な化合物について代謝安定性、CYP阻害、経口吸収性などを評価する。
④Pim-3 阻害活性を有する化合物について

L3.pl6、MiaPaca-2 などのヒト膵臓がん細胞株のin vitroでの細胞増殖を検討し、それぞれの化合物のIC 50 を決定する。
⑤ヒト膵臓がん細胞株を接種したヌードマ
ウスに対して、上記の検討で細胞増殖抑制効
果が認められた化合物を IC50 を勘案した用量で投与した時の、マウス個体内での細胞増殖抑制作用を検討する。
⑥上記の検討時において、マウスの血液を採取し、血液学的ならびに血液生化学的に検査するとともに、脳・心臓・肺臓・肝臓・腎臓

などの臓器を採取し、病理組織学的に検査し、副作用の有無を検討する。

〔その他〕
なし

４．研究成果新規に合成した化合物を含め、44 化合物について Pim-3 阻害活性を測定した。IC50 値は0.6nM から 2000ｎM 超であった。Pim-3 阻害
活 性 の 強 か っ た 化 合 物 の 1 つ 、 TPC-053(IC50： 4.5nM)がヒト膵臓がん細胞株 PCI66の増殖を in vitro で抑制したので、大量に合成し、ヌードマウス内での増殖抑制効果を検討した。TPC-053 は 20mg/kg 及び 30mg/kgの投与量で、毒性を示すことなく PCI66 細胞の増殖を有意に抑制した。
今後は、化合物の最適化合成を進めるとともに、vivo での投与方法の検討も行い、膵臓
がん治療薬の開発に向けて、さらに研究を進めて行く予定である。

６．研究組織(1)研究代表者
東京大学創薬オープンイノベーションセン
ター・特任教授 岡部隆義

５．主な発表論文等（研究代表者、研究分担者及び連携研究者には下線）〔雑誌論文〕（計２件）
1.Keiko Tsuganezawa, Hisami Watanabe,
Lorien Parker, Hitomi Yuki,
Shigenao
Taruya, Yukari Nakagawa, Daisuke Kamei,
Masumi Mori, Naoko Ogawa, Yuri Tomabechi,
Noriko Handa, Teruki Honma, Shigeyuki
Yokoyama, Hirotatsu Kojima, Takayoshi
Okabe, Tetsuo Nagano, Akiko Tanaka
A Novel Pim-1 Kinase Inhibitor Targeting
Residues That Bind the Substrate Peptide.
Journal of Molecular Biology. 417(3),240-252 (2012).
2.Hirofumi Nakano, Nae Saito, Lorien
Parker, Yukio Tada, Masanao Abe, Keiko
Tsuganezawa, Shigeyuki Yokoyama, Akiko
Tanaka, Hirotatsu Kojima, Takayoshi Okabe,
and Tetsuo Nagano
Rational evolution of a novel type of
potent and selective PIM1 kinase inhibitor
from a screening-hit compound. Journal of
Medicinal Chemistry, in press〔学会発表〕（計０件）
〔図書〕
（計０件）
〔産業財産権〕○出願状況（計１件）
WO 2011/136319 「抗がん剤」○取得状況（計０件）(2)研究分担者
東京大学創薬オープンイノベーションセン
ター・特任研究員 中野浩史
東京大学創薬オープンイノベーションセン
ター・特任研究員 齊藤奈英
(3)本研究所担当者
分子生体応答・教授 向田直史

金沢大学がん進展制御研究所共同研究成果報告書

平成２４年４月１９日提出
対象研究テーマ：ケモカインを分子標的とした治療法の開発
研
研

究
究

期
題

間：2011 年 4 月 1 日～2012 年 3 月 31 日
目：ケモカイン CXCL14/BRAK による発癌と転移の抑制機構の研究：CXCL14/BRAKの NK 細胞の活性制御の分子機構

研 究 代 表 者：神奈川歯科大学 特任教授

畑隆一郎

研究成果の概要：
ウイルスベクターを用いてドキシサイクリン存在下でのみ CXCL14/BRAK を発現する B16
メラノーマ細胞を作成し、メラノーマ細胞における CXCL14/BRAK の発現が、転移に及ぼす影響を種々の遺伝的背景を持つマウスを用いて調べた。野生型 C57BL/6 マウス、および T 細胞と B 細胞を欠損する SCID マウスの場合、ドキシサイクリンを飲料水に添加してメラノーマ細胞に BRAK を発現させると、肺への転移がドキシサイクリンを添加しない場合より有意(P<0.01)に抑制された。一方、NK 細胞を欠損する NOG マウスの場合は、転移巣の数が野生型マウスの 10倍に上昇し、さらに BRAK の発現は転移巣の数に影響を与えなかった。昨年度の結果を含めて、BRAK の発現レベルが、腫瘍を移植される宿主のマウスで高くても、メラノーマ細胞で高くても、腫瘍の肺転移が抑制され、この抑制は NK 細胞に依存している事が明らかにされた。
研究分野：癌の分子標的治療
キーワード：癌抑制性ケモカイン•CXCL14/BRAK•転移抑制
１．研究開始当初の背景
我々が作製したケモカイン CXCL14/BRAK
トランスジェニックマウス(Tg)は移植腫瘍の抑制ばかりでなく B16 メラノーマ細胞および LLC 細胞の肺への実験的転移を抑制し、かつ、マウスの寿命の延長がみられた。
Anti-asialo GM1 抗体、あるいは anti-NK1.1
抗体でマウスを前処理することによりナチュラルキラー(NK)細胞を除去するとこの抑制はみられなくなることから、腫瘍抑制と転移抑制には NK 細胞が関与していることが示された。また、Tg マウスにα-Galactosylceramide であらかじめ処理し、NKT 細胞を活性化すると、肺への転移抑制作用と寿命延長作用はさらに顕著となった。
２．研究の目的
今年度は癌細胞（B16 メラノーマ細胞）にケ
モカイン CXCL14/BRAK を発現させた時に癌細胞のマウス肺への実験的転移が抑制されるかどうか、および抑制する場合は NK 細胞が関与するかどうかを明らかにする。
３．研究の方法
ウイルスベクターを用いてドキシサイクリ
ン存在化でのみ CXCL14/BRAK を発現する
B16 メラノーマ細胞を作成し、この細胞を種々の遺伝的背景を持つマウスの尾静脈より注入し、転移巣の数をかぞえた。

４．研究成果野生型 C57BL/6 マウスではドキシサイクリン
を飲料水に添加してメラノーマ細胞に BRAKを発現させると、肺への転移がドキシサイク
リンを添加しない場合より有意(P<0.01)に抑制された。T 細胞および B 細胞を欠損する
SCID マウスの場合、転移巣の数はともに上昇
したが、やはり、BRAK の発現により転移が抑制された。一方、NK 細胞を欠損する NOG マウスの場合は、転移巣の数が野生型マウスの 10倍に上昇し、さらに BRAK の発現は転移巣の数に影響を与えなかった。以上のことから、BRAK の発現レベルが、腫瘍を移植される宿主のマウスで高くても、メラノーマ細胞で高くても、腫瘍の肺転移が抑制され、この抑制は
NK 細胞に依存している事が明らかにされた。
５．主な発表論文等（研究代表者、研究分担者及び連携研究者には下線）〔雑誌論文〕（計２件）
1) 畑 隆一郎：MAPキナーゼのサブタイプ特異的シグナルクロストークによるがん抑制性
ケモカインCXCL14/BRAKの発現制御. 生化
学 83(8):731-736, 2011.
2) Ikoma T., Ozawa S., Suzuki K., Kondo T.,
Maehata Y., Lee MC., Hata R., Kubota E.:

Calcium-calmodulin signaling induced byepithelial cell differentiation upregulates
BRAK/CXCL14 expression via the bindingof SP1 to the BRAK promoter region.
Biochemical
BiophysicalResearch
Communications: 420(2):217-22,2012. Feb
20. [Epub ahead of print].
〔学会発表〕（計１４件）[受賞講演]
1) Ryu-Ichiro Hata, Kazuhito Izukuri, Yasumasa
Kato：Production of transgenic mice resistant tocancer cell growth and metastasis -Toward
Cancer Therapy using Endogenous Tumor
Suppressing Chemokines-. 2nd International
Conference on Cancer Immunotherapy and
Immunomonitoring, Budapest, Hungary, 2011,
5.2-5. (Outstanding Abstract and Selected Oral
Presentation Award)[一般発表•国際学会]
2) Ryu-Ichiro Hata, Kazuhito Izukuri, Yasumasa
Kato: NK cell-dependent suppression of tumor
growth and metastasis in CXCL14/BRAK
transgenic mice. Roche/Nature Medicine
Symposium on Cancer Immunology and
Immunotherapy, Nutley New Jersey, USA.
2011.9.11-13.
3) Miyamoto C., Maehata Y., Ozawa S., Ikoma
T., Komori R., Hata R.
-I., Lee M-C: Fasudil, a specific inhibitor of ROC
K, stimulates secretion of CXCL14/BRAK andsuppresses tumor growthin vivo. The EMBO meeting, Vienna, Austria. 20
11.9.10-13.
[一般発表•国内学会]
4) 畑 隆一郎. 佐藤—楠畑かおり. 小澤重幸.
加藤靖正. 古江—楠田美保：ケモカイン
CXCL14/BRAKは幹細胞分化因子か？ 第 43 回
日本結合組織学会学術大会•第 58 回マトリックス研究会大会合同学術集会. 別府ビーコンプラザ. 2011.6.10.～6.11.
5) Ryu-Ichiro Hata, Kaori Sato-Kusubata,
Shigeyuki Ozawa, Yasumasa Kato, Miho Kusuda
Furue: Chemokine CXCL14/BRAK stimulates
differentiation of cancer stem cells. Connective
Tissue 53(1). 70-71,2012.
6) 畑 隆一郎. 居作和人. 加藤靖正. 小澤
重幸. 鈴木健司. 生駒丈晴. 前畑洋次郎.
宮本千央. 椎木直人. 矢島伸之. 久保田英朗. 李昌一. 槻木恵一：癌に強いマウスを作
るー副作用のない癌の治療法を目指してー.
バイオアカデミックフォーラム. 東京ビッグサイト 2011 6.29-7.1.

7) 宮本千央, 前畑洋次郎, 小澤重幸, 生駒丈晴, 小森令賀, 居作和人, 加藤靖正, 畑隆一
郎, 李 昌一： 選択的ROCK阻害剤FasudilによるCXCL14/BRAK細胞外分泌促進を介した抗腫瘍効果の検討． 第 125 回 日本薬理学会関東部会. 日本大学薬学部. 千葉. 2011.10.15
8) 宮本千央, 前畑洋次郎, 小澤重幸, 生駒
丈晴, 小森令賀, 居作和人, 加藤靖正, 畑隆一郎, 李 昌一： ROCK阻害剤(Fasudil)は抗腫瘍性ケモカイン(CXCL14/BRAK) の細胞外分泌促進を介して腫瘍進展を抑制す
る． 第 53 回歯科基礎医学会学術大会・総会．
岐阜, 岐阜．2011.9.30-10.2．
9) 加藤靖正. 前畑洋次郎. 前田豊信. 畑隆一
郎：オステオネクチンノックアウトマウスの肺における遺伝子発現プロファイリン
グ. 第 53 回歯科基礎医学会学術大会・総会．
岐阜, 岐阜．2011.9.30-10.2．
10) 加藤伊陽子. 福西菜穂子. 畑隆一郎.
井川洋二. 倉田俊一：扁平上皮癌での p63 による核内 GSK-3βシグナルを介したβ-cateninの制御. 第 70 回日本癌学会学術総会. 名古屋
国際会議場. 2011.10.3-5.
11) 加藤靖正. 畑隆一郎. 佃守. 宮崎香. 長嶋
洋治：TRPM-5 は. 酸性細胞外pHシグナルに関与し. メラノーマの肺転移に関与する. 第70 回日本癌学会学術総会. 名古屋国際会議場.
2011.10.3-10.5.
12) Ryu-Ichiro Hata, Yasumasa Kato, Kazuyoshi
Takeda, Masaru Taniguchi: NK cell-dependent
suppression of tumor growth and metastasis in
CXCL14/BRAK transgenic mice. 第 70 回日本
癌学会学術総会. 名古屋国際会議場.
2011.10.3-10.5.
13) 宮 本千央, 前畑洋次郎, 小澤重幸, 生駒
丈晴, 居作和人, 畑隆一郎, 李 昌一: ROCK阻害剤 fasudil による CXCL14/BRACK 分
泌促進を介した抗腫瘊効果の検討. 神奈川歯科大学学会 第 137 回 例会. 神奈川, 横須賀. 2011.12.3.
14) 居 作 和 人 , 畑 隆 一 郎 ： ケ モ カ イ ン
CXCL14/BRAK遺伝子トランスジェニックマ
ウスの腫瘍抑制•転移抑制機構の解明. 神奈
川歯科大学学会 第 137 回 例会. 神奈川,横須賀. 2011.12.3.
〔図書〕
（計１件）
畑 隆一郎 (編集代表). 高橋信博. 宇田川信之. 東 俊文. 上條竜太郎. 石崎 明. 加藤靖

正 [編著] 早川太郎. 須田立雄. 木崎治俊[監修]：口腔生化学, pp.1-352. 第５版. 医歯薬出版. 東京. 2011.
〔産業財産権〕○出願状況（計１件）
特願 2010-150125 癌転移抑制剤及び医薬組成物○取得状況（計１件）
特許取得 特許第4805641号
剤および医薬生成物

頭頸部癌抑制〔その他〕
なし
６．研究組織(1)研究代表者
神奈川歯科大学・特任教授

畑 隆一郎(2)研究分担者
神奈川歯科大学歯学部・講師

居作和人(3)本研究所担当者
分子生体応答・教授

向田直史

金沢大学がん進展制御研究所共同研究成果報告書

平成２４年４月２５日提出
対象研究テーマ：ケモカインを分子標的とした治療法の開発
研
研

究
究

期
題

間：2011 年 4 月 1 日～2012 年 3 月 31 日
目：皮膚発がんにおけるケモカインの病態生理学的役割解析

研 究 代 表 者：和歌山県立医科大学

教授

近藤稔和

研究成果の概要：
二段階皮膚腫瘍形成モデルを用いて皮膚発がんにおける，CX3CL1-CX3CR1 の病態生理学的役割を解析した。 8 週齢・雄 C57BL/6 マウス(WT)および CX3CR1 遺伝子欠損マウス(KO)の背部に DMBA（100 µg/200µl acetone）塗布後，TPA(30 µg/200 µl acetone)を週に２回，２０週
連続塗布して腫瘍形成を誘導する。肉眼的に乳頭腫および皮膚腫瘍の形成を観察したところ，
KO マ ウ ス で は 乳 頭 腫 形 成 が 有 意 に 少 な か っ た 。 し た が っ て ， 皮 膚 発 が ん に お け る
CX3CL1-CX3CR1 シグナルの重要性が明らかとなった。
研究分野：皮膚科学，実験病理学，免疫学
キーワード：ケモカイン，皮膚発癌１．研究開始当初の背景炎症とは，生体が内外から有害な刺激（ストレス）を受けたときに生じる生体防御反応であり，これにより誘導される免疫反応と症候あるいは病理組織学的変化のことであり，一過性に生じた後消褪する「急性炎症」とその反応が長期にわたって継続する「慢性炎症」に大別される。近年，慢性炎症が，糖尿病，動脈硬化，神経変性疾患，癌の発症・浸潤・転移と大きく関わっていることが知られてきた。慢性炎症では，長期にわたるストレス応答のために生体防御反応としての炎症が遷延化し，適応の破綻により不可逆的な「組織リモデリング」が生じて臓器の機能不全に陥り，その結果として様々な病態を発症させるものと考えられている。特に，がんの炎症性微小環境では，慢性炎症により組織の恒常性が失われており，実質細胞に由来する
腫瘍細胞と腫瘍組織の間質に浸潤したマク
ロファージの両者において，炎症シグナル経路の活性化されて，がんの発症・進展に関与することが証明されている。具体的には，炎症性サイトカイン・ケモカインなどの炎症性
メディエーター並びにそれら遺伝子発現を調節する転写因子が大きく関わっていることは言うまでもない。申請者は，これまで皮膚の創傷治癒過程における炎症性サイトカ
インやケモカインの病態生理学的役割を解析してきた。
２．研究の目的
皮膚組織は，体の最も外側にあるために，外界から恒常的に物理的または化学的刺激を受けている。それらの刺激が大きい場合は，組織の機能的・構造的破綻，いわゆる「創傷」が生じるが，創傷を受けた組織では，それらの解剖学的な不連続性や破壊された組織・細胞などに対し，修復反応，すなわち Woundhealing(創傷治癒)が起こる。しかしながら，皮膚組織において刺激が継続することにより，正常な創傷治癒機構が破綻した場合，局所における慢性炎症が生じ，皮膚がんが発症する。癌の微小環境においても，創傷治癒と同様に白血球浸潤や線維芽細胞の増殖，血管新生が観 察されることから， Coussens &Werb は，“Tumors are wounds that do notheal(癌は癒えることのない創傷) ”と提唱している。すなわち，創傷治癒過程における微小環境と癌の微小環境には共通点が多い。申請者らは，これまで皮膚の創傷治癒過程における炎症性サイトカイン・ケモカインの病態
生理学的役割を解析してきた。また，炎症性サイトカインやケモカインは，急性，慢性を問わず炎症反応の key molecule であることから，本研究では，ケモカイン・ケモカイン
レセプターの遺伝子欠損マウスを用い，慢性炎症による皮膚がんモデルにおいて，がんの発症・進展におけるケモカインシステムの病態生理学的役割を解析する。さらに，ケモカ
インが，皮膚がんの発症予防や進展抑制の分子標的となり得るか否かの可能性について明らかにすることが本研究の目的である。
３．研究の方法

１）遺伝子欠損マウス
C57BL/6 マ ウ ス を 遺 伝 子 背 景 と す る
CX3C ケモカインレセプタ-1（CX3CR1）の各遺伝子欠損マウスを用いた。

少なかった。

２）２段階皮膚発がんモデル
7,12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA，100µg/200µl acetone)をマウス背部に塗布後，12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate(TPA ，
30µg/200µ)を 20 週連続塗布して腫瘍形成を誘導する。
３）腫瘍形成背部における腫瘍（乳頭腫）形成について，経時的に観察し，遺伝子欠損マウスと野生型
マウスで腫瘍数を比較・検討する。
４）病理組織学的検索
背部皮膚を採取し，パラフィン包埋切片を作成後，ヘマトキシリン・エオジン染色を施して，表皮の厚さを計測し遺伝子欠損マウスと野生型マウスで腫瘍数を比較・検討する。
５）免疫組織化学的検索
背部皮膚を採取し，パラフィン包埋切片を作成後，マクロファージ，Ｔリンパ球，および新生血管を免疫染色し，遺伝子欠損マウスと野生型マウスで腫瘍数を比較・検討する。
４．研究成果１）WT マウスでは，肉眼的に乳頭腫形成が
TPA 塗布 10 週目以降から観察され，20 週目
では薬 80%のマウスに認められたが，KO マ
ウスでは乳頭腫形成が有意に少なく，約半数のマウスでしか乳頭腫がみられなかった（Fig. 1）。
２）病理組織学的検査では，WT マウスでは著明な表皮肥厚が観察されたが，KO マウス
では表皮層の肥厚が有意に減弱していた。さらに，免疫組織化学的検索において，WT マ
ウスでは F4/80 陽性マクロファージおよびCD3 陽性リンパ球浸潤が顕著に観察された。
しかしながら，WT マウスに比べて KO マウ
スでは，マクロファージ，リンパ球ともに有意に減弱していた。さらに，血管新生についても，KO マウスでは腫瘍内血管数が有意に５．主な発表論文等（研究代表者、研究分担者及び連携研究者には下線）〔雑誌論文〕（計４件）
1. Ishida Y, Kimura A, Kuninaka Y, Inui
M, Matsushima K, Mukaida N, Kondo
T. Pivotal role of the CCL5/CCR5
interaction
forrecruitmentofendothelial progenitor cells in mousewound healing. J Clin Invest.
122:711-21, 2012.
2. Nosaka M, Ishida Y, Kimura A,
Kuninaka Y, Inui M, Mukaida N,
Kondo T. Absenceof IFN-γ
accelerates
thrombus
resolution
throughenhanced
MMP-9
and
VEGFexpression in mice. J Clin Invest.
121:2911-20, 2011
3. Inui M, Ishida Y, Kimura A, Kuninaka
Y, Mukaida N, Kondo T. Protectiveroles of CX3CR1-mediated signals in
toxin A-induced enteritis through theinductionofheme
oxygenase-1
expression. J Immunol. 186:423-31,
2011
4. Fujii H, Baba T, Ishida Y, Kondo T,
Yamagishi M, Kawano M, Mukaida N.
Ablation of the Ccr2 gene exacerbates
polyarthritis
ininterleukin-1
receptorantagonist-deficient
mice.
Arthritis Rheum. 63:96-106, 2011

〔学会発表〕（計４件）
1. Nosaka M, Ishida Y, Kimura A,
Kuninaka Y, Mukaida N, Kondo T.
Absence of IFN-γ accelerates thrombus
resolution through enhanced MMP-9
and VEGF expression. Experimental
Biology 2011, Washington D.C., 2011.4
2. Ishida Y, Kimura A, Kuninaka Y,
Nosaka M, Kawaguchi M, Mukaida
N, Kondo T. Essential role of chemokine
receptor CX3CR1 in bleomycin- induced
pulmonary fibrosis through regulationof bone marrow-derived fibrocyte
infiltration. The 10th World Congresson Inflammation, Paris, 2011.6
3.

Kondo T, Ishida Y, Inui M, Kimura A,
Nosaka M, Kuninaka Y, Kawaguchi
M, Mukaida N. Essential roles of CCL3CCR1 axis in the pathogenesis of
antigen-induced arthritis. 9th Joint
Meeting of International Cytokine
Society and International Society forInterferon and Cytokine Research,
Florence, 2011.10

〔図書〕
（計０件）
〔産業財産権〕○出願状況（計０件）○取得状況（計０件）〔その他〕
なし
６．研究組織(1)研究代表者
和歌山県立医科大学・教授

近藤稔和(2)研究分担者
和歌山県立医科大学・講師

石田裕子(3)本研究所担当者
分子生体応答・教授

向田直史

金沢大学がん進展制御研究所共同研究成果報告書

平成２４年４月２３日提出
対象研究テーマ：がん化シグナル伝達系における足場タンパク質 JSAP の役割とその分子機構
研
研

究
究

期
題

間：2011 年 4 月 1 日～2012 年 3 月 31 日
目：がん細胞の増殖における Mnk プロテインキナーゼと JSAP の機能的相互作用の解析研 究 代 表 者：大阪薬科大学薬学部 教授 福永理己郎

研究成果の概要：
ERK および p38 MAP キナーゼによって活性化される Mnk プロテインキナーゼは，翻訳開始因子 eIF4E のリン酸化などを介して翻訳制御に関与すると考えられている。Mnk1/2- DKO
マウスから樹立した MEF 細胞に Mnk1 を発現させ，翻訳制御における mTOR シグナル系とMnk シグナル系のクロストークについて解析した。その結果，mTOR シグナル系の活性化による eIF4G (Ser1108)のリン酸化が Mnk1 シグナル系によって阻害あるいは修飾されることを見出した。これはリン酸化 Ser1108 残基の脱リン酸化ではなく，Ser1105/1106 のリン酸化による可能性が示唆された。他方，Mnk1 の構成的活性化変異体が，標的タンパク質である eIF4Eと比較的安定な複合体を形成することを見出し，これを基質トラップ変異体として標的タンパ
ク質の探索に利用できる可能性が示唆された。
研究分野：分子細胞生物学
キーワード：プロテインキナーゼ，足場タンパク質，翻訳制御
１．研究開始当初の背景
Mnk1及びMnk2は，MAPキナーゼによって活性化されるセリン/スレオニン・プロテイン
キナーゼであり，翻訳開始因子４Ｅ（eIF4E：
mRNAキャップ結合蛋白質）をリン酸化することにより，一群のmRNAの翻訳開始を制御すると考えられている。研究代表者は，Mnk1/Mnk2
ノックアウトマウスを作製することにより，Mnkが生体内でもERKやp38MAPキナーゼによって活性化されてeIF4Eのリン酸化を担うことを明らかにした。翻訳開始の律速因子であるeIF4Eは多くの悪性腫瘍で過剰発現しており，細胞のがん化に伴うタンパク合成促進に重要な役割を果たしている。eIF4Eの活性は
主にmTORとMnkの２つのプロテインキナーゼ
経路で制御されることが近年明らかにされた。mTOR はPI3Kの下流で活性化され，eIF4E
阻害因子である4E-BPをリン酸化して不活化することによって翻訳開始複合体形成を促進し，一方，MnkはeIF4Eを直接リン酸化してmRNAの選択的翻訳に機能すると考えられている。研究代表者らは，mTOR経路を阻害するとフィードバック的機構によってMnk経路が活性化されることを見出した。また，Ｂリン
パ腫・Ｔリンパ腫発症モデルマウスにおいて，Mnk1/2が発がん促進的に作用することを示した。一方，善岡らはストレス応答MAPキナーゼ（JNK, p38）の足場タンパク質として同定したJSAP1がERKのシグナル伝達をも制御することを明らかにし，JSAP/JLPがMnkを介した翻訳制御に関与する可能性を示した。
２．研究の目的
主要な翻訳制御シグナル系である mTOR 経
路と Mnk 経路の相互作用における JSAP1/JLPの機能を明らかにすることを目的として本研究を計画した。近年，タンパク合成の亢進が認められる多くの悪性腫瘍に対して，mTORなどのタンパク合成促進分子を標的とする治療法が試みられ，ラパマイシン類縁体（RAD-001 など）の治験が行なわれている。
本研究では，がん治療において両経路の阻害剤を併用する試みの分子的基盤を提供すると共に，新たな標的分子の探索を目指す。
３．研究の方法
ヒト Mnk1 に種々の点変異や欠失変異を導入して，優勢ネガティブ変異体や構成的活性化型変異体などを作製した。これらの変異体や野生型 Mnk1 をレトロウイルスベクターを用いて Mnk1/2-ダブルノックアウト（DKO）
マウスの不死化胚性線維芽細胞（MEF）に導入し，安定発現細胞株を樹立した。これらの細胞を TPA や FCS で刺激し，翻訳制御に関わる mTOR シグナル系および Mnk シグナル系について，eIF4G(Ser1108 残基)のリン酸

化や eIF4E(Ser209)のリン酸化を主な指標として解析した。各部位のリン酸化レベルは，リン酸化特異的抗体を用いたウエスタンブ
ロットにより解析した。他方，翻訳開始因子
や JSAP/JLP と Mnk1 の相互作用を解析するために，HA タグや FLAG タグを接続した
組換えタンパク質を HEK293T 細胞で発現させ，免疫沈降法とウエスタンブロットで解析した。
４．研究成果ヒト Mnk1 の野生型および各種変異体を安定に発現する Mnk-DKO-MEF 細胞を用いてmTOR シグナル系および Mnk シグナル系における Rapamycin や Cyclosporin の影響を調べたが，MEF では顕著な差は認められなかった。しかし，この解析の過程で，Mnk1を強制発現させた Mnk-DKO 細胞を血清で刺激すると，リン酸化特異抗体で検出した
eIF4G のリン酸化 Ser1108 レベルが急速かつ劇的に低下することを見出した。そこで，脱リン酸化阻害剤（オカダ酸や Cyclosporin）
および各種の Mnk1 変異体を用いて Ser1108の脱リン酸化について検討した結果，プロテ
インホスファターゼの活性化が関与しているのではなく，Ser1108 近傍の Ser1105 ある
いは Ser1106 残基がリン酸化される可能性が示唆された。このことを検証するために，
現在，Ser1105/1106 が Mnk1 によってリン酸化されるか否かについて検討中である。
他方， eIF4E や eIF4G と Mnk1 との相互作用について免疫沈降法にについて解析
した結果，構成的活性化変異（Thr344Glu 変異）を有する Mnk1 が，基質である eIF4Eと比較的安定な複合体を形成することを見出した。野生型 Mnk1 や他の変異体では安定複合体を形成しないことから，Thr344Glu 変
異体は，いわゆる基質トラップ変異体であると考えられる。今後は，この複合体形成に
JSAP/JLP が関与する可能性について検討するとともに，Thr344Glu 変異体を利用して
Mnk1 の未知の標的タンパク質の同定を試みる予定である。
５．主な発表論文等（研究代表者、研究分担者及び連携研究者には下線）〔雑誌論文〕（計２件）
Joshi, S., Sharma, B., Kaur, S., Majchrzak, B.,
Ueda, T., Fukunaga, R., Verma, A. K., Fish,, E.
N., and Platanias, L. C. Essential role for Mnk
kinases in Type II interferon (IFNγ) - signaling
and its suppressive effects on normal
hematopoiesis. J. Biol.Chem. 286, 6017-6026(2011)

Shi, Y., Frost, P., Hoang, B., Yang, Y., Fukunaga,R., Gera, J., and Lichtenstein, A. MNK kinases
facilitate c-myc IRES activity in rapamycintreated multiple myeloma cells. Oncogene Feb
27 . doi: 10.1038/onc.2012 (2012)〔学会発表〕（計０件）
〔図書〕
（計０件）
〔産業財産権〕○出願状況（計０件）○取得状況（計０件）〔その他〕
なし
６．研究組織(1)研究代表者
大阪薬科大学薬学部・教授

福永理己郎(2)研究分担者
大阪薬科大学薬学部・講師

藤井忍(3)本研究所担当者
シグナル伝達・教授

善岡克次

金沢大学がん進展制御研究所共同研究成果報告書

平成２４年３月２８日提出
対象研究テーマ：GSK3β 阻害によるがん治療法の開発と臨床試験
研
研

究
究

期
題

間：2011 年 4 月 1 日～2012 年 3 月 31 日
目：GSK3β 阻害による新規膵がん化学療法の開発と臨床試験

研 究 代 表 者：金沢医科大学腫瘍内科学

教授

元雄良治

研究成果の概要：
膵癌の難治性の根底には腫瘍細胞の高い増殖能・浸潤能・薬剤耐性などがある。我々は膵癌で glycogen synthase kinase (GSK) 3β の発現と活性が高く、腫瘍細胞の生存と増殖に必須であることを見出した。そして、GSK3β 阻害によるがん治療効果を細胞レベルと担がん動物モデ
ルで実証し、GSK3β が膵癌の新しい治療標的であることを同定した。その機能解析から、がん細胞で異常活性を示す GSK3β が誘導するシグナルが p53 がん抑制分子経路、Rb 細胞周期制御
系や細胞不死化経路に影響を及ぼすことを明らかにした。また、ヒト膵癌細胞移植動物において薬理学的 GSK3β 阻害剤の併用は TP53INP1 (tumor protein 53-induced nuclear protein 1)
を介する DNA 修復機構を制御して、ゲムシタビン(GEM)の抗腫瘍効果を相乗的に増強することを実証した (Shimasaki T, et al. J Gastroenterol 2011 Epub)。本研究では、膵癌の浸潤に伴うがん細胞の形態特性と運動能に着目して GSK3β の機能を多角的に解析した。培養細胞のスクラッチ試験とトランスウェルアッセイにより、GSK3β 阻害剤はがん細胞の遊走と浸潤を抑制した。その効果に伴い、GEM により誘導されるがん細胞の形態変化 (epithelial-mesenchymaltransition)と、がん浸潤を誘引するある種の熱ショック蛋白質の発現や FAK (focal adhesion
kinase)/Rac1/MMP-2 (matrix metalloproteinase-2)機軸経路が抑制された。これらの解析と並行して、GSK3β 阻害効果が科学的に立証された既存医薬品の適応外使用と GEM の併用による進行膵癌治療の医師主導型第Ⅰ/Ⅱ相臨床研究 (UMIN 000005095)を 2011 年に開始した。
研究分野：腫瘍内科学、分子腫瘍学
キーワード：膵癌、GSK3β１．研究開始当初の背景
膵癌の標的分子の探索と同定では、発がん・進展過程で活性化されている細胞シグナ
ル伝達系が注目されている。分子標的治療薬のうち上皮増殖因子受容体(EGFR)の阻害剤
や抗体医薬が、いくつかの癌種では良好な治療効果を示している。一方、膵癌ではerlotinib のみが第Ⅲ相臨床試験で GEM との併用効果が証明されているにすぎず、今後、新たな標的分子の探索と薬剤の開発が望まれている。我々は最近、glycogen synthasekinase (GSK) 3βが膵癌を含む多くの消化器癌に共通する治療標的であることを明らかにしてきた。
GSK3βはインスリン経路で発見され、その基質に応じて細胞周期、増殖・分化、アポトーシス、細胞運動など、基幹的細胞生命現象を司る多機能セリン・スレオニンリン酸化酵素である。疾患との関連では、インスリン経路、神経細胞、造骨細胞への作用から、２型

糖尿病、アルツハイマー病、骨粗鬆症などの創薬標的として注目され、多数の阻害剤が開発されている。GSK3βは正常細胞の Wnt 経路制御作用からがん抑制的に作用すると認識されてきたが、我々は、GSK3βの過剰発現や酵素活性の調節不全ががん細胞の生存や増殖を維持・促進するという Wnt 経路抑制機能とは異なる病的作用を発見した。そして、
GSK3β阻害の抗腫瘍効果を大腸癌や脳膠芽腫で実証し、本酵素が新しいがん治療標的であると提唱した。その機能解析から、がん細胞で異常活性を示す GSK3βが誘導するシグ
ナルが、がん抑制分子 (p53)経路、細胞周期制御(Rb)系や細胞不死化経路に影響を及ぼすことを明らかにした。
膵癌でも同様に GSK3βの発現や活性の亢進に伴う病的作用が観察され、研究代表者ら
は GSK3β阻害により腫瘍細胞の生存・増殖抑制のみならず、gemcitabine (GEM)の感受性を高めることを培養細胞と担がん動物モデ

ルで実証した。また、低濃度の GEM が膵癌細胞の上皮間葉移行（epithelial-mesenchymaltransition: EMT)を誘導して浸潤性を高める
が、GSK3β阻害によりこの EMT 誘導が抑制されることを見いだしている（未発表）。これらの予備結果から、GSK3βが膵癌細胞の浸潤を促進しているのではないかという着想に至った。我々の研究と前後して GSK3βは膵癌の新たな治療標的であること示唆する成果が海外で報告されているが、本研究と同じ発想の研究報告は国内外ではみられない。
２．研究の目的
本研究では、膵癌における GEM による EMT
誘導のメカニズムと GSK3β阻害の作用機序の解明を目的として、下記の到達目標を設定した。(1) 我々が最近、同定した膵癌細胞から分泌される EMT 誘導分子の発現・機能解析を行ない、GEM による EMT 誘導作用機序を明らかにする。(2)この EMT 誘導分子について、
GSK3β阻害による発現や分泌への影響、機能解析を行い、GSK3βによるがん細胞の浸潤抑制機序を明らかにする。(3) 本研究から期待される結果と今までに得た知見を応用して、
GSK3β阻害作用を示すことが報告されている複数の医薬品と GEM の併用による進行・再発膵癌の第Ⅰ/Ⅱ相臨床試験を現在、実施している。これらの臨床試験の結果とともに、同定した EMT 誘導分子が本治療法のバイオマ
ーカーとなるかについて検討する。本研究により、GEM と GSK3β阻害剤の併用による膵がん治療法の作用分子基盤の解明とともに、進行膵癌患者に対する同治療法の安全性と効
果を見極めることができると期待される。
３．研究の方法①我々は、複数の培養ヒト膵癌細胞株において、低濃度の抗がん剤により細胞間接着性が低下し、EMT が誘導されて細胞の遊走と浸潤能が亢進することを発見した。膵癌細胞
PANC-1 の調整培地のプロテオーム解析により、EMT 誘導因子の候補となる 55 種類の分子を同定した。ほとんどの分子は GEM 投与により分泌が低下したが、有意に分泌が上昇した
8 種類の分子のうち、組換え蛋白質の添加により EMT 同様の形態変化を誘導する蛋白質を発見した(EMT-related Protein: EP1～EP3 と略す）。
1）EP1～EP3 の EMT 誘導効果の検証：EP1～EP3 のそれぞれに特異的な抗体、小分子阻害薬、RNAi、cDNA を用いて、膵癌由来培養細胞における EP1～EP3 の機能解析を行う。EP1～EP3 に対する特異抗体、小分子阻害薬、RNA干渉法によるそれぞれの分子の活性や発現の抑制及びそれぞれの遺伝子導入による強制発現を行い、EP1～EP3 の発現量の違いからみた EMT 誘導性について解析する。EMT の評

価は、顕微鏡による形態学的観察と、
N-cadherin, E-cadherin, vimentin, ZO-1 、
snail などの EMT 関連マーカーの発現と細胞内局在の変化を、Western blot 法と免疫蛍光染色法により観察する。
2）EP1～EP3 の細胞内発現条件の検討：
EP1～EP3 がどのような条件で細胞内に発現するかを解析する。具体的には、抗がん剤の種類・濃度を変えて、細胞内発現量に違いがあるか, 組換え EP1～EP3 蛋白を培地に添加した場合に、各分子の細胞内発現量の変化、
小分子 GSK3β阻害剤による EP1～EP3 の細胞内発現抑制効果，を解析する。これらの細胞内発現量は real-time RT-PCR、Western blot
法、免疫蛍光染色法を用いて観察・計測する。
②GSK3β阻害による抗がん剤誘導性 EMT の抑制メカニズムの解明
GSK3β阻害による EMT 抑制効果の作用機序について、EP1～EP3 の発現あるいは機能の抑制によるものであるかを検討する。具体的には、小分子 GSK3β阻害剤や RNA 干渉法を用いて、GSK3β阻害による影響を検討する。EP1～EP3 の蛋白発現量の測定には、Western blot法を用いる。EP1～EP3 の機能抑制であるかど
うかについては、既に EP1～EP3 の機能的な経路は明らかとなっているため、EP1～EP3 関
連経路を構成する分子群を対象にして、
Real-time RT-PCR 法や Western blot 法を用い、mRNA レベルあるいは、蛋白質レベル（発現量やリン酸化解析）における制御であるかなどを明らかにする。
③GSK3β阻害剤の併用による進行膵がん治療の第Ⅰ・Ⅱ相臨床試験の実施 すでに医薬品として処方されているものの中で GSK3β阻害作用を有する複数の薬剤を GEM と併用す
る化学療法により、進行膵癌患者における腫瘍の縮小や良好な QOL を保ちながらの生存期間の延長が得られるかを検証する。すでに金沢医科大学病院倫理審査委員会で承認を受
け、本臨床試験を開始した。
４．研究成果膵癌で glycogen synthase kinase (GSK)
3β の発現と活性が高く、腫瘍細胞の生存と増殖に必須であることを見出した。そして、
GSK3β 阻害によるがん治療効果を細胞レベ
ルと担がん動物モデルで実証し、GSK3β が膵癌の新しい治療標的であることを同定した。
その機能解析から、がん細胞で異常活性を示
す GSK3β が誘導するシグナルが p53 がん抑制分子経路、Rb 細胞周期制御系や細胞不死化
経路に影響を及ぼすことを明らかにした。また、ヒト膵癌細胞移植動物において薬理学的GSK3β 阻害剤の併用は TP53INP1 (tumor
protein 53-induced nuclear protein 1)を介する DNA 修復機構を制御して、ゲムシタビ
ン(GEM)の抗腫瘍効果を相乗的に増強することを実証した。GSK3β 阻害剤はがん細胞の遊走と浸潤を抑制した。その効果に伴い、GEM
により誘導されるがん細胞の形態変化(EMT)と、がん浸潤を誘引するある種の熱ショック蛋白質の発現や FAK/Rac1/MMP-2 機軸経路が抑制された。これらの解析と並行して、GSK3β 阻害効果が科学的に立証された既存医薬品の適応外使用と GEM の併用による進行膵癌治療の医師主導型第Ⅰ/Ⅱ相臨床研究(UMIN 000005095)を 2011 年に開始した。
５．主な発表論文等（研究代表者、研究分担者及び連携研究者には下線）〔雑誌論文〕（計３件）
1. Shimasaki T, Ishigaki Y, Nakamura Y,
Takata T, Nakaya N, Nakajima H,
Sato I, Zhao X, Kitano A, Kawakami K,
Tanaka T, Takegami T, Tomosugi
N, Minamoto T, Motoo Y. Glycogensynthasekinase3βinhibition
sensitizes pancreatic cancer cells to
gemcitabine. J Gastroenterol. 2011
Nov 1. [Epub ahead of print]
2. Ishigaki Y, Nakamura Y, Takehara
T, Shimasaki T, Tatsuno T, Takano F,
Ueda Y, Motoo Y, Takegami T,
Nakagawa H, Kuwabata S, Nemoto N,
Tomosugi N, Miyazawa S. Scanningelectron microscopy with an ionicliquid reveals the loss of mitotic
protrusions of cells during theepithelial-mesenchymal transition.
Microsc Res Tech. 2011 Mar 16.
3. Motoo Y, Shimasaki T, Ishigaki Y,
Nakajima H, Kawakami K, Minamoto
T. Metabolic Disorder, Inflammation,
and Deregulated Molecular Pathways
Converging in Pancreatic Cancer
Development: Implications for New
Therapeutic Strategies. Cancers, 3(1),446-460, 2011.
〔学会発表〕（計９件）
1. Nakaya N, Ishigaki Y, Bian Q, Ma
S, Shimasaki T, Nakajima H, Motoo Y.
Molecular mechanisms of TP531NP1
in the gemcitabine sensitivity. The
International Pancreatic Research
Forum 2011, (Osaka, ’11.11.26).
Y.
Pancreaticcancer:2. Motooexperimental
sensitizationtogemcitabine and patient care withtraditional
Japanese
medicine.
International Conference on Cancer
Prevention, (Seoul, Korea, ’11.8.26).

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

Motoo Y. Chemotherapy for pancreaticcancer: Molecular analysis and clinicalapplication. "Asian Oncology Summit
2011” GI Symposium 3, (Hong Kong
SAR, China, ’11.4.9).
島崎 猛夫, 石垣 靖人, 高田 尊信, 中村
有香, 川上 和之, 舟木 洋, 上田 順彦,
小坂 健夫, 友杉 直久, 源 利成, 元雄 良治. 膵癌細胞におけるgemcitabine誘導
性EMTに関連する新規分子の同定. 第22 回 日 本 消 化 器 癌 発 生 学 会 , ( 佐賀, ’11.11.25).
島崎 猛夫, 川上 和之, 上田 順彦, 小坂 健夫, 源 利成, 元雄 良治. 切除不能進行膵癌に対するGSK3βを標的とした新規治療戦略. 第 53 回日本消化器病
学会大会, (福岡, ’11.10.21).
中谷 直喜、島崎 猛夫、元雄 良治. ゲ
ムシタビン感受性の分子機構における
TP53INP1 の意義. 第 53 回日本消化器病
学会大会, (福岡, ’11.10.21).
島崎 猛夫, 石垣 靖人, 高田 尊信, 中村 由香, 川上 和之, 竹上 勉, 友杉
直久, 源 利成, 元雄 良治. 膵癌の新規
治 療 標 的 と し て の glycogen synthasekinase(GSK)3β: 化学療法戦略の新展
開. 第 70 回日本癌学会学術総会, (名古屋, ’11.10.3).
島崎 猛夫, 石垣 靖人, 高田 尊信, 中村 有香, 川上 和彦, 上田 順彦, 小坂
健夫, 源 利成, 友杉 直久, 元雄 良治.
ゲムシタビン単剤療法の壁への挑戦 :新規標的分子の同定と膵癌化学療法への展望. 第 42 回日本膵臓学会大会, (弘前, ’11.7.29).
高田 尊信, 島崎 猛夫, 石垣 靖人, 元
雄 良治, 友杉 直久. 膵癌培養細胞
PANC-1 に対する塩酸ゲムシタビンの作用についてのプロテオミクス解析. 金沢医科大学医学会第 47 回学術集会, (内灘, ’11.7.9).

〔図書〕
（計１件）
Motoo Y, Xia QS, Nakaya N, Shimasaki
T, Nakajima H, Ishigaki Y. Stressresponses of pancreatic cancer cells andtheir significance in invasion andmetastasis. In: Kwang-Sup Soh, Kyung A
Kang, David K. (eds), The Primo Vascular
System: Its Role in Cancer andRegeneration, Springer, New York, etc.
213-217, 2012.
〔産業財産権〕○出願状況（計０件）○取得状況（計０件）

〔その他〕
なし
６．研究組織(1)研究代表者
金沢医科大学腫瘍内科学・教授 元雄良治
(2)研究分担者
金沢医科大学腫瘍内科学・准教授
中島日出夫
金沢医科大学総合医学研究所・准教授
石垣靖人
金沢医科大学腫瘍内科学・講師 島崎猛夫
金沢医科大学腫瘍内科学・助教 中谷直喜
(3)本研究所担当者
腫瘍制御・教授 源利成

金沢大学がん進展制御研究所共同研究成果報告書

平成２４年４月２５日提出
対象研究テーマ：ヒト消化器・呼吸器がんの分子病態の解明と臨床応用
研
研

究
究

期
題

間：2011 年 4 月 1 日～2012 年 3 月 31 日
目：大腸がん個別化医療のためのバイオマーカー探索

研 究 代 表 者：金沢医科大学一般・消化器外科学

教授

小坂健夫

研究成果の概要：
大腸がん症例を対象に、がん関連遺伝子の異常を多角的に検索した。得られた遺伝子特性と大腸がんの臨床病理学的諸因子と対比した。大腸がん患者 500 例を対象として microsatellite
instability (MSI) と CpG island methylator phenotype (CIMP)の両表現型の解析分類および K-ras とB-raf 遺伝子の変異を解析した。その結果、本邦の大腸がん症例では MSI および CIMP 表現型を示すがんは、海外からの報告と同様に複数の分子病理学的特徴を示すことが明らかになった。
右側結腸では MSI および CIMP の表現型を示すがんの頻度は高く、臨床応用を目的に、予後や治療感受性との関連などをさらに検討する価値があると考えられた。
研究分野：腫瘍外科学，分子腫瘍学
キーワード：大腸がん、バイオマーカー
１．研究開始当初の背景
近年、進行・再発大腸がん薬物治療の奏効率と安全性は向上してきているが、いまだに無効例や治療不耐例を経験する。この化学療法の効
果および有害事象の不均一性を克服すること、
すなわち大腸がんの薬物治療を個別化することが実地臨床では求められつつある。本邦の大腸がん治療ガイドラインで推奨される薬剤の
うち capecitabine に対する dihydropyrimidine
dehydrogenase 欠失、cetuximab や panitumumabに対する epidermal growth factor receptor 発現とK-ras 変異、
irinotecan に対するuridine diphosphateglucuronosyltransferase 1A1 遺伝子多型などが有効なバイオマーカーとされている。これらのバ
イオマーカーは実臨床で用いられているものの、症例によっては当該薬剤の効果が不充分であったり、重篤な有害事象が発生したりすることがまれでない。また、これらのバイオマーカ
ーのほとんどは海外で実施された臨床試験から見出されたものであり、本邦の大腸がんの特性や治療効果・有害事象の予測を必ずしも反映するものではない。
２．研究の目的
本研究では、大腸がん切除標本から組織検体を収集し、がん関連遺伝子や分子の異常をジェネティック・エピジェネティックな側面
から多角的に検索を行う。そして、得られる遺伝子・分子特性と大腸がんの臨床病理学的
諸因子や標準的な薬物治療にともなう臨床情報を対比することにより、本邦における大腸がん個別化医療のためのバイオマーカーを探索することをおもな目的とする。
３．研究の方法
金沢大学がん進展制御研究所がん組織バンクに集積されている組織検体のうち 500 例の大腸がん組織より DNA を調整し、K-ras,
B-raf の遺伝子変異および IGF2, CACNA1G,
NEUROG1, RUNX3, SOCS1 のプロモーター
メチル化を検出、測定した。また、5 つの異なる microsatellite locus marker の解析によりmicrosatellite instability (MSI) と MS stability(MSS) の表現型を判定した。これらの解析結果と大腸がんの臨床病理学的諸因子との関連を統計学的に比較検討した。
４．研究成果解析したプロモーターメチル化から CpG
island methylator phenotype (CIMP) を判定した。MSI と CIMP の表現型の有無により大腸がんは 4 群に分類され、CIMP+/MSI、CIMP+/MSS、CIMP-/MSI、CIMP-/MSS はそれぞれ 19
例 (3.8%)、27 例 (5.4%)、16 例 (3.2%)、438
例 (87.6 %) であった。K-ras 変異は 166 例(33.2%)、B-raf 変異は 45 例 (9%) に認めた。
CIMP+/MSI 群では K-ras はすべて野生型であった。一方、B-raf は CIMP+/MSI 群の全例とCIMP+/MSS 群の 12 例 (44.4%) に変異を認めた。このように、大腸がんの表現型と遺伝子変異型は強く相関した。
腫瘍の発生部位別に検討すると、CIMP+/MSI
群と CIMP+/MSS 群が右側結腸に高頻度に発生し、左側結腸がんではこれらの遺伝子型を示 す 腫 瘍 は 5% 以 下 で あ っ た 。 一 方 、
CIMP-/MSI 群と CIMP-/MSS 群は左側結腸に高頻度に発生していた。大腸がんの組織型別に検討した結果、CIMP+/MSI 群では分化度の低い腫瘍を多く認めた。今回検討した遺伝子異常の頻度は大腸がん症例の性別、腫瘍深達度、あるいはリンパ節転移の有無とは有意な相関は認められなかった。
以上の結果から、本邦の大腸がん症例ではMSI および CIMP 表現型を示すがんは、海外からの報告と同様に複数の分子病理学的特徴を示すことが明らかになった。右側結腸では MSI および CIMP の表現型を示すがんの頻度は高く、臨床応用を目的に、予後や治療感受性との関連などをさらに検討する価値があると考えられた。
５．主な発表論文等（研究代表者、研究分担者及び連携研究者には下線）〔雑誌論文〕（計７件）(杉山 貢), 國崎主税, 加藤広行, 今田敏夫,
島田英昭, 平田公一, 小坂健夫, 吉田 昌, 北島政樹, 愛甲 孝：胃切除後の骨代謝障害に対するアレンドロネートの有用性の検討，日消外会誌，44:361-373，2011．
上田順彦, 澤 敏治, 小坂健夫：左葉型肝内胆管癌のリンパ節転移様式および郭清の意義，
金医大誌，36:19-24，2011．
上田順彦, 澤 敏治, 小坂健夫：肝門部胆管癌の外科的治療成績向上のための課題，金医大誌，36:77-82，2011．
M.Noguchi,
M.Inokuchi,
Y.Ohno,M.Yokoi-Noguchi, Y.Nakano, T.Kosaka ：Oncological and cosmetic outcome in breast
cancer patients undergoing "moving window"
operation ， Breast Cancer Res. Treat. ，
129:849-856，2011．
(藤村 隆), 木下 淳, 尾山勝信, 伏田幸夫,
太田哲生, 木南伸一 ：ラジオアイソトープ（RI）・色素併用法による胃癌センチネルリ
ンパ節生検手技と臨床応用，手術，65:433-440，
2011．
Mi.Noguchi, Ma.Noguchi, Y.Nakano, Y.Ohno,
T.Kosaka ： Axillary reverse mapping using afluorescence imaging system in breast cancer，J.
Surg. Oncol.，105:229-234，2012．
Ma.Noguchi, Y.Nakano, Mi.Noguchi, Y.Ohno,
T.Kosaka：Local therapy and survival in breast
cancer with distant metastases，Breast Cancer.，
105:104-110，2012．
〔学会発表〕（計１２件）
T. Kosaka, D. Kaida, T. Ohnishi, Y. Tomita, Y.
Ohno, M. Noguchi, H. Funaki, S. Kinami, K.
Omote, Y. Nakano, N. Ueda, M. Noguchi.: S-1

and cisplatin regimen followed by conversion
gastrectomy for borderline resectable AGC. 9thInternational gastric cancer congress2011 年
4 月、Seoul
島崎猛夫, 石垣靖人, 高田尊信, 中村有香,
川上和彦, 上田順彦, 小坂健夫, 源 利成, 友杉直久, 元雄良治 ゲムシタビン単剤療法の壁への挑戦: 新規標的分子の同定と膵癌化学
療法への展望 第 42 回日本膵臓学会大会、2011 年 7 月、弘前
木南伸一, 表 和彦, 甲斐田大資, 大西敏雄,
大野由夏子, 富田泰斗, 野口美樹, 舟木 洋,
上田順彦, 中野泰治, 小坂健夫．：ICG蛍光法による胃癌センチネルリンパ節生検を指標とした、腹腔鏡下機能温存胃癌根治手術．第73 回日本臨床外科学会総会、2011 年 11 月、
東京
島崎猛夫, 石垣靖人, 高田尊信, 中村有香,
川上和之, 舟木 洋, 上田順彦, 小坂健夫, 友杉直久, 源 利成, 元雄良治．膵癌細胞におけるgemcitabine誘導性EMTに関連する新規分子の同定．第 22 回日本消化器癌発生学会、
2011 年 11 月、佐賀
上田順彦, 中野達夫, 高仲 強, 小坂健夫．：
進行・再発膵癌に対する定位放射線を用いた
化学放射線療法の有用性．第 42 回日本膵臓
学会大会、2011 年 7 月、弘前
小坂健夫, 甲斐田大資, 大西敏雄, 大野由夏
子, 富田泰斗, 野口美樹, 舟木 洋, 木南伸一,
表 和彦, 中野泰治, 上田順彦．
：治癒切除境界 進 行 胃 癌 に 対 す る SP 療 法 の 有 用 性 とConversion Gastrectomy．JDDW2011、第 9 回
日本消化器外科学会大会、2011 年 10 月、福岡
小坂健夫, 甲斐田大資, 大野由夏子, 大西敏雄, 富田泰斗, 野口美樹, 舟木 洋, 木南伸一,
表 和彦, 中野泰治, 上田順彦．
：治癒切除境界 の 進 行 胃 癌 に 対 す る SP 療 法 と 胃 切 除 は
NAC後の胃切除およびConversion胃切除のいずれにおいても安全で有用である．第 73 回
日本臨床外科学会総会、2011 年 11 月、東京
富田泰斗, 小坂健夫．
：高度進行直腸癌に伴う
DICにCetuximabが著効した一例．第 66 回日
本大腸肛門病学会学術集会、2011 年 11 月、
東京
富田泰斗．：大腸がん個別化療への応用に向けたジェネティック・エピジェネティック解析．第 23 回臨床外科フォーラム、2011 年 11月、金沢

上田順彦, 甲斐田大資, 大西敏雄, 富田泰斗,
大野由夏子, 野口美樹, 舟木 洋, 木南伸一,
表 和彦, 中野泰治, 小坂健夫．：化学放射線療法施行後切除した進行膵体尾部癌の 1 例．
第 122 回北陸肝胆膵勉強会・年度末大会、2011
月 12 月、金沢
小坂健夫, 甲斐田大資,大野由夏子, 大西敏雄,
富田泰斗, 野口美樹, 舟木 洋, 木南伸一, 表：腹腔内遊離がん
和彦, 中野泰治, 上田順彦．
細胞診断の意義と問題点，第 76 回大腸癌研究会、2012 年 1 月、宇都宮
小坂健夫, 甲斐田大資,大野由夏子, 大西敏雄,
富田泰斗, 野口美樹, 舟木 洋, 木南伸一, 表：胃癌に対するS-1
和彦, 中野泰治, 上田順彦．
を含む化学療法の効果と有害事象の予測．第84 回日本胃癌学会総会、2012 年 2 月、大阪
〔図書〕
（計０件）
〔産業財産権〕○出願状況（計０件）○取得状況（計０件）〔その他〕
なし
６．研究組織(1)研究代表者
金沢医科大学一般・消化器外科学・教授
小坂健夫(2)研究分担者
金沢医科大学一般・消化器外科学・准教授
表 和彦
金沢医科大学一般・消化器外科学・准教授
木南伸一
金沢医科大学一般・消化器外科学・大学院
大西敏雄
金沢医科大学一般・消化器外科学・大学院
富田泰斗(3)本研究所担当者
腫瘍制御・教授 源 利成
腫瘍制御・准教授 川上和之

金沢大学がん進展制御研究所共同研究成果報告書

平成２４年４月１０日提出
対象研究テーマ：がんの発症・悪性化におけるヒストンのメチル化制御に関する研究
研 究
研 究期 間：2011 年 4 月 1 日～2012 年 3 月 31 日
題 目：ヒストン修飾解析ツールの開発とがんのエピゲノム解析

研 究 代 表 者：東京工業大学バイオフロンティアセンター

特任准教授

野崎直仁

研究成果の概要：
がんの発症や悪性化に関与するヒストンのメチル化・脱メチル化酵素群の細胞生物学的機能を解析するために、メチル化・脱メチル化酵素および様々なメチル化修飾ヒストンに特異的なモノクローナル抗体の開発を進めた。作製した抗体を用いた ChIP 解析によって、ヒストン H3の K4（4 番目のリジン残基）脱メチル化酵素である PLU1 が、その標的遺伝子 KAT5/Tip60 の発現をエピジェネティックに制御することにより、がん細胞の細胞浸潤能を亢進することを見
いだし、がんの悪性進展過程における酵素の新しい役割を明らかにした。
研究分野：分子生物学
キーワード：エピジェネティクス, ヒストン, 翻訳後修飾, がん１．研究開始当初の背景
がんの発症や悪性化の分子メカニズムの解明には、原因遺伝子の同定が重要である。
レトロウイルス感染発がんモデルマウスでは、ウイルスがゲノムへ挿入することで、挿入部位の遺伝子変異や周辺遺伝子の発現異常を誘導し、がんを発症する。そのため、ウイルス挿入部位を解析することで、原因遺伝子を容易に同定することができる。ウイルス
挿入変異の標的として高頻度に同定される
宿主因子として、ヒストンのメチル化酵素・脱メチル化酵素の多くがこれまでに同定されてきた。ヒストンの翻訳後修飾（アセチ
ル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化等）は、転写制御、DNA 複製、ヘテロクロ
マチン形成など様々な生物学的現象に関与している。ヒトのがんでは、ヒストンのアセチル化酵素の変異や脱アセチル化酵素の発現異常が観察されており、脱アセチル化酵素の阻害剤（Trichostatin A, SAHA 等）が抗がん剤として開発されている。一方、ヒストンのメチル化と発がんの関係は、まさに現在解析が進んでいる注目される研究分野である。
２．研究の目的
がんに関与するヒストンのメチル化・脱メ
チル化酵素群の細胞生物学的機能を解析し、エピゲノム異常によるがんの発症と悪性化の分子機構を解明することを目的とする。そのために、ヒストンの翻訳後修飾の詳細な解析に必要な修飾特異的、修飾部位特異的なモノクローナル抗体や、メチル化・脱メチル化
酵素自身に対する抗体の開発を進行する。また、開発した抗体を用いた ChIP 法などによって、エピゲノム変化を解析し、がん細胞の悪性進展過程における遺伝情報発現異常の本質を明らかにする。さらに、ヒストンのメチル化制御酵素を標的とする阻害剤のスクリーニングシステムの構築を目指した抗体の活用法を検討する。
３．研究の方法
ヒストン H3 の重要なメチル化修飾部位である K4（４番目のリジン残基）、K9、K27、
K36、K79 等について、それぞれモノメチル、
ジメチル、トリメチル修飾、あるいは未修飾の状態を特異的に認識するマウスモノクローナル抗体の作製を進行する。また、ヒスト
ンのメチル化制御酵素の発現異常によるがんの発症と悪性化の分子機構を解明するた
めに、作製した抗体を用いた ChIP 法などによって、がん細胞のエピゲノムを解析する。
さらに、大規模 DNA シークエンスによる転写開始点決定を利用したデジタル発現プロ
ファイリングの結果とあわせて、がん細胞における遺伝情報の発現異常のメカニズムを調べる。
４．研究成果ヒストン H3 の重要なメチル化修飾リジン残基（K4, K9, K27, K36, K79）について、さまざまなメチル化修飾状態（mono-,di-, tri-）

を特異的に認識するモノクローナル抗体の作製を進行し、多くの場合において、特異性の高い抗体の作製に成功した。また、他の翻訳後修飾（アセチル化、リン酸化など）とメ
チル化修飾が併存する状態を特異的に認識する抗体に関しても、重要な組み合わせについて抗体作製を完了しつつある。
本共同研究においては、乳がんや前立腺がんで高発現が見られるがん遺伝子 PLU1 脱メチル化酵素が、がんの発症だけでなく、がん細胞の細胞浸潤能を亢進する活性をもつことを示し、がんの悪性化における酵素の新たな役割を見つけた。さらに、デジタル発現プ
ロファイルを用いて PLU1 酵素によるがん細胞の浸潤の重要な標的 KAT5/Tip60 ヒストン
アセチル化酵素とその下流の標的である
CD82/ KAI1 遺伝子を同定した。作製した抗体を用いた ChIP 解析等から、PLU1 が KAT5の発現をエピジェネティックに制御することを見いだし、PLU1 の制御する遺伝子発現
カスケードが、がんの悪性進展過程に重要な役割を果たしていることを明らかにした。
現在、発がんに関与するヒストンのメチル化・脱メチル化酵素自身（ JMJD3, LSD1,
PLU1, Suv39h1, etc.）に対する抗体についても、
ハイブリドーマのスクリーニングを順調に進行している。
５．主な発表論文等（研究代表者、研究分担者及び連携研究者には下線）

single-stranded DNA inhibits MCM4/6/7 helicase.
J Biochem., 151, 129-37, 2011.
Kokabu Y, Murayama Y, Kuwabara N, Oroguchi
T, Hashimoto H, Tsutsui Y, Nozaki N, Akashi S,
Unzai S, Shimizu T, Iwasaki H, Sato M, Ikeguchi
M. Fission yeast Swi5-Sfr1 protein complex, anactivator of Rad51 recombinase, forms anextremely elongated dogleg-shaped structure. J
Biol Chem., 286, 43569-76. 2011.
Brookes E, de Santiago I, Hebenstreit D, Morris
KJ, Carroll T, Xie SQ, Stock JK, Heidemann M,
Eick D, Nozaki N, Kimura H, Ragoussis J,
Teichmann SA, Pombo A. Polycomb associates
genome-wide with a specific RNA polymerase IIvariant, and regulates metabolic genes in ESCs.
Cell Stem Cell., 10, 157-70, 2012.
〔学会発表〕（計３件）
木村 宏、林 陽子、山縣 一夫、若山 照彦、
海沼 嵩、胡桃坂 仁志、野崎 直仁 FabLEMを用いたヒストン H3 のメチル化とアセチ
ル化の生細胞ダイナミクス. 第 5 回 日本エピジェネティクス研究会年会, 2011.5.熊本
Bando M, Saito K, Minamino M, Itoh T, Hirota
T, Nozaki N, Deardorff M, Krantz I, Shirahige K.
HDAC8, and SMC3 deacetylase, is required forthe recycling of cohesion complex. 第３４回日
本分子生物学会年会, 2011.12. 横浜〔雑誌論文〕（計６件）
Yoshida M, Ishimura A, Terashima M,
Enkhbaatar Z, Nozaki N, Satou K and Suzuki T.
PLU1 histone demethylase decreases theexpression of KAT5 and enhances the invasive
activity of the cells. Biochemical J., 437,
555-564, 2011.

Sugiyama T, Chino M, Tsurimoto T, Nozaki N,
Ishimi Y. Interaction of heliquinomycin withsingle-strand DNA inhibits MCM4/6/7 helicase.
第３４回日本分子生物学会年会, 2011.12. 横浜Hayashi-Takanaka Y, Yamagata K, Wakayama T,
Stasevich TJ, Kainuma T, Tsurimoto T, Tachibana
M, Shinkai Y, Kurumizaka H, Nozaki N, Kimura
H. Tracking epigenetic histone modifications insingle cells using Fab-based live endogenous
modification labeling. Nucleic Acids Res., 39,
6475-88, 2011.

〔産業財産権〕○出願状況（計０件）○取得状況（計０件）

Ishikawa K, Ohsumi T, Tada S, Natsume R,
Kundu LR, Nozaki N, Senda T, Enomoto T,
Horikoshi M, Seki M. Roles of histone chaperone
CIA/Asf1 in nascent DNA elongation during
nucleosome replication. Genes Cells., 16,1050-62. 2011.
Sugiyama T, Chino M, Tsurimoto T, Nozaki N,
Ishimi Y. Interaction of heliquinomycin with

〔図書〕
（計０件）

〔その他〕
なし
６．研究組織(1)研究代表者
東京工業大学バイオフロンティアセンター・特任准教授 野崎直仁
(2)研究分担者
なし(3)本研究所担当者
機能ゲノミクス・教授

鈴木健之

金沢大学がん進展制御研究所共同研究成果報告書

平成２４年４月２７日提出
対象研究テーマ：ヒト消化器・呼吸器がんの分子病態の解明と臨床応用
研
研

究
究

期
題

間：2011 年 4 月 1 日～2012 年 3 月 31 日
目：アミノレブリン酸投与後の腫瘍特異的ポルフィリン蓄積メカニズムの細胞レベルでの解明

研 究 代 表 者：東京工業大学フロンティア研究機構

特任准教授

小倉俊一郎

研究成果の概要：

がん患者にアミノレブリン酸(ALA)を投与すると、腫瘍特異的にポルフィリンが蓄積されることが知られており、この現象を利用したがんの蛍光診断・がんの光線力学治療が臨床で用いられている。しかしながら、腫瘍特異的なポルフィリン蓄積の分子メカニズムは未だ解明されていない。そこで本研究は ALA 投与後の腫瘍特異的なポルフィリン蓄積メ
カニズムの解明を目的とし、特異的なポルフィリン蓄積に関わる生体内物質を同定する。
その結果、腫瘍特異的なポルフィリン蓄積メカニズムには ALA 取り込みに関わるトラン
スポーターである PEPT1 ならびにポルフィリン汲み出しにかかわるトランスポーターである ABCG2 が深く関与していることを細胞レベルで示唆することができた。
本研究で得られる知見は、ポルフィリン蓄積能を指標としたがんの個性診断を可能とするものであり、光線力学治療の効果を予測できるバイオマーカーを提供し、光線力学治療のオーダーメイド化を実現するものである。
研究分野：分子生物学、腫瘍診断学
キーワード：アミノレブリン酸・ポルフィリン・光線力学治療・光線力学診断
１．研究開始当初の背景
ALA を投与すると生合成経路を経てポルフ
ィリンが生成する。この反応は腫瘍において亢進しており、ALA 投与によって腫瘍特異的なポルフィリンの蓄積が観察されている。さらに、悪性グリオーマなど悪性度の高いがんは多くのポルフィリンが蓄積する興味深い所見が得られている。しかしながら、がん細胞への特異的なポルフィリン蓄積の分子メ
カニズムは未だ解明されていない。
２．研究の目的
ALA 投与後の腫瘍特異的なポルフィリン蓄
積メカニズムの解明を目的とし、特異的なポルフィリン蓄積に関わる生体内物質を同定する。本研究で得られる知見は、ポルフィリ
ン蓄積能を指標としたがんの個別診断を可能とするものであり、光線力学治療の効果を予測できるバイオマーカーを提供し、光線力学治療のオーダーメイド化を実現するものである。
３．研究の方法
種々の細胞株に対して、ポルフィリン蓄積に関与していると予想される分子のたんぱ
く質の発現量ならびにその mRNA の発現量の解析を行う。候補としてはポルフィリン生合成に関与する 6 種類の酵素と ALA 取り込みに関わる PEPT1 および PEPT2、ポルフィリン輸送に関わる ABCG6 および ABCG2 などの分子があげられる。これらの分子のたんぱく質の発現量は Western blot 解析により、mRNA の発
現量は定量的 PCR で評価する。さらにこれらの分子の変異の有無について詳細に検討する。また、ALA 投与によってこれらの mRNA・
たんぱく質の発現量が変化することが考えられるため、ALA 投与群と非投与群の比較も行う。これらのデータをポルフィリンの蓄積量と併せて考察する。
４．研究成果ポルフィリン生合成に関連する 12 遺伝子の mRNA 配列に特異的な RT-PCR 用プライマーを設計した。5 種類のヒト胃がん由来細胞株
を用いて、RT-PCR 法で各遺伝子の発現解析を行った。その結果、ALA 投与後にポルフィリ
ンを多く蓄積する細胞と蓄積しない細胞を比較した結果、ポルフィリン生合成酵素発現量はほぼ同一であることが分かった。しかしながら、ペプチドトランスポーターPEPT1 お
よび ATP-binding cassette (ABC)トランスポーターABCG2 の顕著な発現変化が認められ、ポルフィリン蓄積にはトランスポーターの発現が大きく関わることが強く示唆された。
これらのトランスポーターは ALA の取り込み
並びにポルフィリン排出に関わっていると推測される。現在、これらの過剰発現株・発現抑制株を樹立し、その機能の解析を行って
いる。

3.

4.
５．主な発表論文等（研究代表者、研究分担者及び連携研究者には下線）〔雑誌論文〕（計２件）
1. Hagiya Y, Endo Y (equal contribution),
Yonemura Y, Okura I, Ogura S: Tumor
Suppressor Protein p53-dependent
Cell
Death
Inducedby
5-Aminolevulinic Acid (ALA)-based
Photodynamic Sensitization of Cancer
cells in Vitro. ALA-Porphyrin Science,
December 08, 2011, accepted.
2. Hagiya Y, Endo Y (equal contribution),
Yonemura Y, Takahashi K, Ishizuka M,
Abe F, Tanaka T, Okura I, Nakajima M,
Ishikawa T, Ogura S: Pivotal Roles ofPeptide Transporter PEPT1 and
ATP-Binding Cassette (ABC)Transporter ABCG2 in 5-Aminolevulinic
Acid (ALA)-Based Photocytotoxicity of
Gastric Cancer Cells in Vitro.
Photodiagnosis and Photodynamic
Therapy, in press, available online 4
January 2012 (December 06, 2011,
accepted)〔学会発表〕（計４件）
1.
Yuichiro Hagiya, Yoshio Endo, Yutaka
Yonemura, Kiwamu Takahashi, Masahiro
Ishizuka, Fuminori Abe, Motowo
Nakajima,
Toshihisa
Ishikawa, Shun-ichiro Ogura:Pivotal
Role of PEPT1 and ABCG2 on
5-Aminolevulinic Acid (ALA)-based
Photodynamic
Sensitizationof
Gastric Cancer Cells in Vitro. 第 70回日本癌学会学術総会 2011 年 10 月
（名古屋、大阪国際会議場）
遠藤 良夫, 小倉 俊一郎, 萩谷 祐一郎,
2.
米村 豊, 石塚 昌宏, 井上 克司, 高
橋 究, 中島 元夫：5-アミノレブリン酸を用いるがんの光線力学的療法感受性と膜輸送系の関連性 日本薬学会第131 年会 2011 年 3 月（静岡、ツイン
メッセ静岡）

Yoshio Endo, Shun-ichiro Ogura,Yuichiro Hagiya, Yutaka Yonemura,
Masahiro Ishizuka, Tohru Tanaka,
Katsushi inoue, Kiwamu Takahashi,
Motowo Nakajima: Role of membranetransporters in determining ALA-PDT
sensitivity in human cancer cells日
本分子生物学会第 11 回春季シンポジウ
ム 2011 年 5 月（金沢、石川県立音楽堂）
Yoshio Endo, Shun-ichiro Ogura,Yuichiro Hagiya, Yutaka Yonemura,
Masahiro Ishizuka, Tohru Tanaka,
Katsushi inoue, Kiwamu Takahashi,
Motowo Nakajima, Masashi Kimura:Significanceof
membranetransporters in determining the
ALA-PDT sensitivity in human cancer
cells第 70 回日本癌学会学術総会 2011年 10 月（名古屋、大阪国際会議場）

〔図書〕
（計０件）
〔産業財産権〕○出願状況（計０件）○取得状況（計０件）
６．研究組織(1)研究代表者
東京工業大学フロンティア研究機構・特任准教授 小倉俊一郎(2)研究分担者
東京工業大学フロンティア研究機構・特任准教授 田畠健治
東京工業大学生命理工学部・４年
松本健太郎
東京工業大学生命理工学部・４年
伊藤謙介(3)本研究所担当者
中央実験施設・准教授

遠藤良夫

金沢大学がん進展制御研究所共同研究成果報告書

平成２４年４月２４日提出
対象研究テーマ： MT1-MMP の機能解析と分子標的治療法の開発
研
研

究
究

期
題

間：2011 年 4 月 1 日～2012 年 3 月 31 日
目：ヒトがん細胞を用いた抗転移性制癌剤の開発

研 究 代 表 者：徳島大学大学院ソシオテクノサイエンス研究部

准教授

宇都義浩

研究成果の概要：
本研究では、我々の有するケミカルライブラリーについて種々のヒト癌細胞に対する細胞増殖抑制作用および MMP 阻害活性を有する分子を探索した。その結果、低酸素サイトトキシン類の TX-2137 および TX-2282 が高い細胞増殖抑制作用と MMP-9 産生抑制作用を有することを見出した。両化合物は VEGF 誘導性の血管新生阻害と深く関係する Akt に対する強力な阻害剤でもあるので MMP 阻害とは別の経路での血管新生阻害活性が期待され、抗転移性制癌剤のリード化合物として創出した。
研究分野：創薬化学
キーワード： hypoxic cytotoxin、MMP inhibition
１．研究開始当初の背景
がんはがん細胞だけでなく、血管や結合組
織、免疫担当細胞といったがん周囲組織との相互作用の上で成り立っている。このがん環境をがんの発育に適しないように変えることががん治療上有効と考えられ、治療戦略としてがんの縮小ではなく再燃抑制期間の延長という観点から考えられた新しいがん治
療法である「がん休眠療法（tumor dormancy
therapy）」が提唱され研究が進められている。
我々はこれまで種々の血管新生阻害剤の開発研究を精力的に進めており、がん休眠療法
においてがん転移を抑制できる血管新生阻害剤は最適な制癌剤であるとの考えに至っている。がんの転移は微小転移の段階からランダムな現象ではなく、システム的に連携された連続した段階を伴う現象であり、「がん転移の成立」を左右する最も初期の重要な段
階が血管新生である。血管新生阻害性の制癌剤は、がんの転移を抑制しつつ抗腫瘍作用による制癌活性をもつ多機能性薬剤として大変有効であると考えられる。
２．研究の目的
本研究の目的は、種々のヒトがん細胞を用いた in vitro スクリーニング系を用いて、抗転移活性を有する TX-1877 をリードとして
分子設計・合成した新規放射線増感剤、ホウ素含有クルクミン誘導体、低酸素サイトトキシンについて抗がん活性を評価し、選出された候補薬剤について MMP に対する阻害活性を評価し、最終的に in vivo 試験に進めるリード化合物を創出することを目的とする。
３．研究の方法
本研究では、B16F10 メラノーマ細胞、ヒト
線 維 肉 腫 細 胞 HT-1080 、 ヒ ト 胃 癌 細 胞 株
MKN-45・NKPS・NUGC-4・KKLS を用いて、WST-8
アッセイ法により 24 時間および 72 時間持続接触における細胞増殖抑制効果を評価し、抑制効果が確認された化合物についてザイモグラフィー法により MMP 阻害活性を評価した。
供試した化合物（TX-2123, 2137, 2140, 2141,
2244, 2258, 2272, 2281, 2282, UTX-42,
44,47,50,51, 73, 74）は、我々が以前に開発した合成法に従って有機合成し、純度 95％
以上のものを用いた。
４．研究成果抗転移活性を有するTX-1877 とグルコースをハイブリッドしたTX-2141 およびTX-2244
は、100 micro-Mまでの濃度範囲で細胞増殖抑制効果を示さなかった。また、ホウ素含有
クルクミン誘導体（UTXシリーズ）は、UTX-44,
50, 51 が 複 数 の ヒ ト 癌 細 胞 に 対 し て 数
micro-M オ ー ダ ー の IC 50 値 を 示 し 、 特 に 、UTX-51 は< 1.6 micro-Mとクルクミンよりも強い抑制効果を示したが、MMP阻害活性については観察されなかった。一方、低酸素サイ
トトキシン類については、TX-2137、TX-2258、TX-2282 が 複 数 の ヒ ト 癌 細 胞 に 対 し て 数
micro-MオーダーのIC 50 値を示し、TX-2137 およびTX-2282 についてはMMP-9 産生の抑制効
果が認められた。MMP-9 産生には転写因子
AP-1, NFkBが関わるのでそちらの抑制効果の可能性がある。また、TX-2137 およびTX-2282
はVEGF誘導性の血管新生阻害と深く関係するAktに対する強力な阻害剤であることが以前の研究より明らかであるので、MMP阻害とは別の経路での血管新生阻害活性が期待され、抗転移性制癌剤のリード化合物として創出された。

日本癌学会学術総会（2011 年 10 月、名
古屋）
〔図書〕
（計１件）
1. 発育鶏卵を利用した創薬研究と将来展
望、安部千秋、宇都義浩、遠藤良夫、堀均、放射線生物研究、46、221-233、2011.
〔産業財産権〕○出願状況（計０件）

５．主な発表論文等（研究代表者、研究分担者及び連携研究者には下線）○取得状況（計０件）〔雑誌論文〕（計２件）
1. Miyake K, Nishioka M, Imura S,
Batmunkh E, Uto Y, Nagasawa
H, Hori H, Shimada M, The novel
hypoxic
cytotoxin,
TX-2098has
antitumor effect in pancreatic cancer;
possible mechanism through inhibiting
VEGF and hypoxia inducible factor-1αtargeted gene expression, Exp. CellRes., in press, 2012.
2. Abe C, Uto Y, Nakae T, Shinmoto Y,
Sano K, Nakata H, Teraoka M, Endo Y,
Maezawa H, Masunaga S, Nakata
E, Hori H, Evaluation of the in vivo
radiosensitizing activity of etanidazole
using tumor-bearing chick embryo, J.
Radiat. Res. 52, 208-14, 2011.

６．研究組織(1)研究代表者
徳島大学大学院ソシオテクノサイエンス
研究部・准教授 宇都義浩

〔学会発表〕（計４件）
1. 腫瘍移植鶏卵における低酸素腫瘍の同定とetanidazoleのin vivo放射線増感活性の評価、田中大地、宇都義浩、安部千秋、
遠藤良夫、前澤 博、原田 浩、増永慎
一郎、堀 均、日本薬学会第 132 年会（2012 年 3 月、札幌）
2. 発育鶏卵を用いた低酸素細胞放射線増感剤 お よ び ラ ジ カ ル 含 有 ナ ノ 粒 子 の invivo評価法の開発、宇都義浩、バイオイ
ンダストリー協会 大学発・選り抜きセミナー 徳島大学研究者との集い・第 3 回東京編（2011 年 12 月、東京）
3. Development of an in vivo screening
system for radiosensitizers andantioxidants using a chick embryomodel、Uto Y、 4th Japan-Korea Joint
Symposiumon
Bio-microsensing
Technology（2011 年 10 月、北九州）
4. Evaluation
of
the
In
vivo
Radiosensitizing
Activityof
Etanidazole Using Tumor-bearing Chick
Embryo、安部千秋、宇都義浩、遠藤良夫、
前澤 博、増永慎一郎、堀 均、第 70 回

〔その他〕

(2)研究分担者
徳島大学大学院ソシオテクノサイエンス
研究部・教授 堀 均
徳島大学先端技術科学教育部 博士後期課
程・３年 安部千秋
徳島大学先端技術科学教育部 博士後期課
程・１年 田中 涼(3)本研究所担当者
細胞機能統御・教授 佐藤 博
中央実験施設・准教授 遠藤良夫