ミルクオリゴ糖（乳中少糖）の比較生化学(XI)
Comparative Biochemistry of Milk Oligosaccharides (XI)─ヒトミルクオリゴ糖のHPLCによる定量分析─
─Quantitative Analysis of Human Milk Oligosaccharides (HMO) by HPLC─
国立大学法人東北大学大学院農学研究科

教授

農学博士

齋藤 忠夫

TADAO SAITO Dr. Agric.

Graduate School of Agricultural Science, TOHOKU University
国立大学法人

帯広畜産大学大学院畜産学研究科教授

農学博士

浦島匡

TADASU URASHIMA Dr. Agric.

Graduate School of Food Hygiene, OBIHIRO University of Agriculture and Veterinary Medicine

1．はじめに哺乳動物の泌乳初期に分泌される初乳には、ラクトース（乳糖）以外に多種類のオリゴ糖が含まれており、これらをミルクオリゴ糖（MO）と呼んでいる。著者らのミルクオリゴ糖研究を紹介する本シリーズでは、ヒトを初めとした各種哺乳動物におけるミルクオリゴ糖の構造解析をトピックス的に概説した18-27）。ヒトミルクオリゴ糖にはすでに93種類の化学構造が報告されており、それらは基本骨格（コア）に基づ
1）いて13の系列に分類されている（図１）。また最近、（財）

野口研究所の天野純子博士により、ラクト-N-デカオースおよびラクト-N-ネオデカオースをコアとする新規な20種類のオリゴ糖の化学構造が報告された2）。1950年代から現在に至るまで、ミルクオリゴ糖の化学構造に関する研究が多く報 告されているが、人乳に含まれるヒトミルクオリゴ 糖（HMO）の定量分析は未実施であった。近年、糖鎖の化学 的 標 識 化 法が 進 展し、高 速 液 体クロマトグラフィー

図1 ヒトミルクオリゴ糖における13系列のコア構造（HPLC）による分離技術とリンクして、代表的な中性ならびに酸性オリゴ糖の各種の泌乳時期における定量分析が実施されるようになった。今回は浦島らの研究グループに料1mLに対し、内標準物質として1mgのイソマルトトリオース

よる中性および酸性ヒトミルクオリゴ糖の定量分析についおよびイソマルトペンタオースを添加した。最終的にHPLC3）, 4）, 5）て紹介する。

上の各オリゴ糖と内標準オリゴ糖のピーク面積比から正確な定量分析を行うため、乳試料に予め内標準物質を添加

2．日本人女性における中性ヒトミルクオリゴ糖の定量分析 3）しておくことがかぎである。ついで、4倍量のクロロホルム/メタノール（2:1, v/v）抽出により糖質画分を調製してから、Bio

泌乳開始後1〜3日の12人の健康な日本人女性から提供

Gel P-2カラムによるゲルろ過によりオリゴ糖の分離を行い、された初乳において、表１に示したような10種類の代表的図２に示したように2つのピークを回収した。各ピーク中のオな中性ヒトミルクオリゴ糖を定量分析対象とした。各乳試

リゴ糖は1-methyl-3-phenyl-5-pyrazolone（PMP）
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3

aminopyridine（PA）
により化学的に標識した。PMP化はHPLCに供して分析した。ピーク１におけるPMP標識化オリHondaらの方法 6）に基づき、オリゴ糖画分に対して0.5M

ゴ糖は1mL/minの流速で60分間16%アセトニトリルを含む

PMPのメタノール溶液と0.6M NaOH 溶液を添加し、70℃

100mMリン酸buffer（pH 7.0）で溶出した。ピーク２におけで30分間反応させた。反応液に0.1M 塩酸とクロロホルるPMP標識化オリゴ糖は、10%および25%アセトニトリルをムを 添 加し 、攪 拌 後 、上 層を取り出した 。 PA 化 は含む100mM酢酸アンモニウムbuffer（pH 4.5）
（各々buffer

Takemotoらの方法7）により、オリゴ糖画分に対し酢酸にAおよびBとする）を用い、buffer Bの84−64%直線濃度勾PAを溶解した溶液を添加し、90℃で1時間反応させた配で70分間0.4mL/minの流速で溶出した。ピーク２のPA後、酢酸にホウ酸-ジメチルアミンを溶かした溶液を加えて化標識オリゴ糖は、PMP化標識オリゴ糖の分析時と同じカ80℃で50分間還元した。得られたPA誘導体は電気透ラムを使用し、200mMクエン酸buffer（pH 5.0）を溶媒とし析によって精製した。定量分析に供したオリゴ糖の標準て60分間1mL/minの流速で溶出した。

物質（各50, 100,200および400μg）は標準曲線および回収率のデータをえるため同様に標識化を行った。
表1 定量分析を行った中性ヒトミルクオリゴ糖

図3 PMP標識化したPeak 1画分のHPLC(A) 既知量の標準オリゴ糖のHPLC。
(B) ゲル濾過によって回収したPeak 1画分のHPLC。
HPLCは、ODS-3V (4.6×250mm, pore size 100Å, particle size 5μm)カラムを使用し、1mL/minの流速で60分間16%アセトニトリルを含む100mMリン酸buffer (pH 7.0)で溶出した。

図2 泌乳開始1〜3日の人乳から分離した糖質画分のゲルクロマトグラム
Bio Gel P-2カラム(2.6×100cm)を使用した。溶出は蒸留水、流速は15mL/hに調整し、各画分は5mLずつ回収した。
検出はSmart Chrom softwareを用いた示差屈折で行った。

標識化したオリゴ糖画分はDISMIC-13CP膜を通過した後、Inertsil ODS-3VカラムかODS-100Zカラムによる逆相

4

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図4 PMP標識化したPeak 2画分のHPLC(A) 既知量の標準オリゴ糖のHPLC。
(B) ゲル濾過によって回収したPeak 2画分のHPLC。
HPLCは、ODS-100Z (4.6×250mm, pore size 100Å, particle size 5μm)カ
ラムを使用し、10%および25%アセトニトリルを含む100mM酢酸アンモニウ
ムbuffer (pH 4.5)（各々buffer AおよびBとする）を用い、buffer Bの84–64%直線濃度勾配で70分間0.4mL/minの流速で溶出した。

ミルクオリゴ糖（乳中少糖）の比較生化学（XI）

は Campyrobacter jejuniによる新生児の感染に対し、泌乳開始直後の初乳がとくに重要であることを示唆している。
4種類の存在比の高いオリゴ糖のうち、2 -FLを除く3種類はいずれも分子内にGal（β1-3）GlcNAcを含む「タイプⅠ型オリゴ糖」である。筆者らはこれまでに多くの動物種のミルクオリゴ糖の解析を行ったが、ヒトと類人猿以外の動物種ではタイプⅠ型オリゴ糖は発見されず、Gal（β1-4）
GlcNAcを含むタイプⅡ型オリゴ糖とラクトース系列（図１参照）のオリゴ糖しか発見されなかった。類人猿ではゴリラとテナガザルの乳ではタイプⅡ型のオリゴ糖とラクトース系列のオリゴ糖しか発見されず、チンパンジー、ボノボ、オランウータンの乳ではラクトース系列オリゴ糖とともに、タイプⅠ
図5 PA標識化したPeak 2画分のHPLC(A) 既知量の標準オリゴ糖のHPLC。
(B) ゲル濾過によって回収したPeak 2画分のHPLC。
HPLCは、ODS-100Z (4.6×250mm, pore size 100Å, particle size 5μm)カラムを使用し、200mMクエン酸buffer (pH 5.0)を溶媒として60分間1mL/minの流速で溶出した。

型オリゴ糖、タイプⅡ型オリゴ糖が共存するものの、タイプⅡ型オリゴ糖の方がタイプⅠ型オリゴ糖よりも優先的であった 9）。このことは、タイプⅠ型オリゴ糖の優先性はあらゆる哺乳動物種の中でヒトだけの特徴であることを示している。この意義については別の機会に言及したい。

PMPまたはPA化標識したピーク１および２中のオリゴ糖のHPLCを図３〜５に示した。内標準オリゴ糖とのピーク

3．サモア人女性における中性ヒトミルクオリゴ糖の定量分析 4)

面積比の比較から、泌乳開始後1〜3日までの初乳における各オリゴ糖の含量を表２に示したように求めた。この

欧米人ドナーには20%くらいの割合で、2 -FLやLNFP

定量分析値に基づいて、これらの代表的なオリゴ糖の中Ⅰなどの非還元末端に存在するFuc（α1-2）残基を持つミでも2 -FL, LNFPⅠ, LNTおよびLNDFHⅠはとくに含有量ルクオリゴ糖を含まない人たちがいる。この人たちを非分の高いことが示された。初乳中におけるオリゴ糖の含有

泌型ドナー（体液に血液型物質を分泌しないという意味）

量は22〜24g/Lと概算されているが、表２の定量値からこといい、2 -FLやLNFPⅠなどを含む人たちを分泌型ドナー

れら4種のオリゴ糖の合計値で全オリゴ糖（130種類以上という。日本人女性のミルクオリゴ糖分析を行ったドナー含まれる）の1/3~ 1/4を占めることが示唆された。

はすべて分泌型ドナーであるが、ミルクオリゴ糖定量値の人種的な違いをみる目的から、サモア人女性乳について

表2 泌乳開始1〜3日の各ヒトミルクオリゴ糖濃度（g/L）
、括弧内は標準偏差の定量分析を行った。
日本人女性のケースと同様の方法によって分画されたオリゴ糖を含む画分に対し、標識化法としてPA化またはPMP化法ではなく、アントラニル酸（AA）により標識化した10）。
標識化試薬はメタノール-酢酸-ホウ酸溶液にAAとシアノホウ素化水素ナトリウムを溶解して調製した。オリゴ糖画分を蒸留水に溶解し、標識化試薬を加えて80℃で50分間反応させた。ついで冷却後、水を加え、クロロホルムを加えて攪拌してから、上層を取り出した。AA標識化され

2 -FLには世界中で乳児に深刻な下痢を引き起こすたオリゴ糖を含む画分は、ODS-100Zカラムを使用した逆Campylobacter jejuni による感染から乳児を守り、下痢を相HPLCで5%アセトニトリルを含む150mMクエン酸ナトリ8）防止する働きが示唆されている 。含有量は泌乳開始1日ウムbuffer（pH 4.5）か7.5%アセトニトリルを含む50 mM酢

目から3日目まで有意に低下することが示されたが、このこと酸アンモニウムbuffer（pH 4.0）で溶出した。

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5プロファイルは非常に単純である。表３には定量されたオリゴ糖の平均値を示したが、初乳、常乳とも日本人の初乳でえられた値と著しく異なっていることが理解されるであろう。すなわち、サモア人の母乳で最も優先的なオリゴ糖はLNFPⅡ およびⅢ、ついでLNTであり、2 -FLやLNFPⅠ は少ない。これはサモア人女性において非分泌型ドナーが優先的であることを意味する。サモア人の多くは非分泌型であり、少数の人はもともとのサモア人に対し後に移住してき図6 AA標識化したヒトミルクオリゴ糖のHPLC（１（4〜6糖画分））(A) 既知量の標準オリゴ糖のHPLC。
(B) LNFPⅠや2 -FLなどのオリゴ糖を含むドナーのHPLC。
(C) LNFPⅠや2 -FLなどのオリゴ糖を含まないドナーのHPLC。
HPLCは、ODS-100Z (4.6×250mm, pore size 100Å, particle size 5μm)カラムを使用し、5%アセトニトリルを含む150mMクエン酸ナトリウムbuffer (pH4.5)で溶出した。

た人たちが混血して、少量の2 -FLやLNFPⅠを分泌するようになったとも考えられる。これははるか昔、東南アジア地域からサモアに移住してきた人々が、東南アジアの中でも非分泌型ドナーの限られた集団であった可能性を示唆している。最も優先的なピークには、タイプⅠ型のLNFPⅡ とタイプⅡ型のLNFPⅢ が含まれ、現段階までにこの２つのオリゴ糖の分離には成功していない。どちらがより優先的なオリゴ糖であるかわからないが、LNFPⅡのコアであるLNT（タイプⅠ型）とLNFPⅢのコアであるLNnT（タイプⅡ型）
では、LNTの方がはるかに優先的である。これはLNFPⅡの方がLNFPⅢよりも優先的であることを推定させ、サモア人女性の乳でもタイプⅠ型オリゴ糖の方がタイプⅡ型オリゴ糖よりも優先的であると考える方が妥当であろう。

図7 AA標識化したヒトミルクオリゴ糖のHPLC（２（3糖画分））(A) 既知量の標準オリゴ糖のHPLC。
(B) LNFPⅠや2 -FLなどのオリゴ糖を含むドナーのHPLC。
(C) LNFPⅠや2 -FLなどのオリゴ糖を含まないドナーのHPLC。
HPLCは、ODS-100Z (4.6×250mm, pore size 100Å, particle size 5μm)カラムを使用し、7.5%アセトニトリルを含む50mM酢酸アンモニウムbuffer (pH4.0)で溶出した。

表4 定量分析した酸性ヒトミルクオリゴ糖

表3 産後5〜10日とその後の各ヒトミルクオリゴ糖濃度（g/L）

4．日本人女性における酸性ミルクオリゴ糖の定量分析 5)
日本人女性において泌乳開始1〜3日の初乳において、表４に示したような代表的な酸性オリゴ糖の定量分析を行った。乳試料に脱イオン水を添加し、同様にクロロホルム/メタノール（2:1, v/v）抽出を行って糖質画分を得た。得られた画分はBond Elut NH2（1 g/6 mL）
によるアニオン6

図６、図７にHPLCのプロファイル、表３に各オリゴ糖の定交換固相抽出カラムクロマトグラフィーに供して、酸性糖と量分析値を示した。図６、図７にはLNFPⅠや2 -FLなどの中性オリゴ糖およびラクトースに分画した。すなわち脱イオオリゴ糖を含むドナーのパターンと含まないドナーのパターン水に溶解した上の画分を同カラムにのせ、水で洗浄しンを示した。それらのオリゴ糖を含まないドナーのHPLCた後に吸着した酸性オリゴ糖を含む成分を、0.5Mピリジ

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ン酢酸buffer (pH 5.0)で溶出した。溶出液に内標準キシLNTなどの主要中性オリゴ糖よりも低かった。上の結果、ロース溶液(500μg/ml)を加えてから凍結乾燥し、ついで人乳では6 -SLは3 -SLよりも優先的であったが、泌乳開中性オリゴ糖の分析と同様Hondaらの方法によってPMP始1日目ではその含有量はおおよそ等しいことが注目されによる標識化を行った。PMP標識化した酸性オリゴ糖画る。ウシ初乳などにおいては、3 -SLの方が6 -SLよりも優分はDISMIC-13CP膜を通過してから100Vカラムによる逆先的である。現代人は出産時の痛みを和らげるため陣相HPLCに供した。溶出は10%および25%アセトニトリルを痛緩和剤を処置されることの影響で、泌乳の開始が出産含む100mMリン酸buffer (pH 7.0)（各々buffer CおよびD後2〜3日後に遅れることが多い。その間に新生児に人とする）
で、65%から95.7%までのbuffer Dの直線濃度勾工調合乳を与えることが多いが、上のデータはウシ初乳な配で115分間、0.2mL/minの流速で行った。各PMP化標

どより分離した3 -SL主体のシアリルオリゴ糖を人工調合識した標準オリゴ糖の内標準物質に対するピーク面積の乳に添加することの意義を示していると考えられる。調割合は、各種濃度で予め求めた。各オリゴ糖の定量は、合乳の原料となるウシの常乳においては、シアリルオリゴ内標準物質に対するピーク面積比から求めた。

糖の含有量は極めて低い。
表6 中性ヒトミルクオリゴ糖濃度の文献値（g/L）

表7 酸性ヒトミルクオリゴ糖濃度の文献値（g/L）

図8 PMP標識化した酸性ヒトミルクオリゴ糖のHPLC
ピーク 1: ジシアリルラクト-N-テトラオース (DSLNT); 2: シアリルラクト-N-フコペンタオースⅠ (SLNFPⅠ); 3: 6 -シアリルラクトース (6 -SL); 4: シアリルラ
クト-N-テトラオース b (LSTb); 5: 3 シアリル-3-フコシルラクトース (3 S3FL)+シアリルラクト-N-フコペンタオースⅡ (SLNFPⅡ); 6: シアリルラクト-Nテトラオース c (LSTc); 7: シアリルラクト-N-テトラオース a (LSTa); 8: 3 -シアリルラクトース (3 -SL); 9: ラクトース; 10: キシロース（内標準物質）。
HPLCは、100Vカラムを使用し、10%および25%アセトニトリルを含む100mMリン酸buffer (pH7.0)（各々buffer CおよびDとする）
で、65%から95.7%までのbufferDの直線濃度勾配で115分間、0.2mL/minの流速で溶出した。

5．オリゴ糖定量分析値の方法論による違い
表5 泌乳開始1〜3日の酸性ヒトミルクオリゴ糖濃度（ｍg/L）

表6および表7には、中性および酸性ヒトミルクオリゴ糖の 定 量 分 析 値 につ いて、文 献 的 な 違 いを 示した 。
Chaturvediら12）はメキシコ人女性の乳から中性オリゴ糖画分をO-ベンゾイル誘導体化後、Raininn Microsorb C-8カラムを用いアセトニトリル/イオン交換水を溶出液とする
HPLCによって各オリゴ 糖 の 定 量 分 析を行って いる。
ヒト初乳から抽出した酸性オリゴ糖のHPLCは図8に、Coppaら14）はイタリア人女性のオリゴ糖画分を標識化しなならびに泌乳開始１〜３日間の定量分析値は表５に示し

いで高pHアニオン交換カラムによる分離方法を使用してた。酸性オリゴ糖の中で最も優先的なのは、LSTcであ定量分析した。上の両者とも乳から抽出した糖質画分り、ついでDSLNT, 6’-SL, 3’-SL, LSTaの順であった。各から、ラクトースとオリゴ糖の分離を行っていない。

酸性オリゴ糖の含有量は、2 -FL, LNFPⅠ , LNDFHⅠ ,Baoら17）は45%のメタノールを添加した100mM SDSを

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7

含む200mMリン酸buffer（pH 7.05）
をrunning bufferとするキャピラリー電気泳動法によって、アメリカ人女性の乳について12の酸性オリゴ糖を分離し、定量分析を行った。
他の文献値と比べ、筆者らの定量値に比較的近いが、DSLNTの濃度が異なっている。
これらの文献における各ミルクオリゴ糖の定量分析値の違いは、定量方法による違いか、人種による違いか、泌乳期による違いかは明らかではないが、正確な分析方法を確立するために、同一試料を使用した分析方法の比較検討を行うことが今後の検討課題と考えられる。
また、著者らのこれまでの本シリーズにおけるミルクオリゴ糖研究 18-27）および関連研究 28-38）の紹介も是非参照して頂き、ミルクオリゴ糖の多様性の生物学的意義などについてご興味を持って頂けたら幸いである。

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