Microb. Resour. Syst. 32
June
（1）
：39
2016─ 47, 2016

Vol. 32, No. 1

技 術 報 告農業生物資源ジーンバンクが保有する植物ウイルス株の外被タンパク質遺伝子の検出とその利用
一木（植原）珠樹1）＊，藤 晋一2），杉本るり子1），大橋美保1），
薮中恭子1），北谷桃子2），山下一夫3），花田 薫1），青木孝之1）
国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 遺伝資源センター〒305-8602 茨城県つくば市観音台 2-1-2

1）

秋田県立大学生物資源科学部 〒010-0195 秋田県秋田市下新城中野街道端西 241-438
青森県産業技術センター野菜研究所 〒033-0071 青森県上北郡六戸町大字犬落瀬字柳沢 912）3）

農業生物資源ジーンバンク微生物部門は，ウイルスの外被タンパク質をコードする領域の塩基配列を解析し，遺伝資源データベースで公開している．解析に使用した 60 対以上のプライマーと実験条件を報告する．これらのプライマー対では，
特に分類の基準や検出の標的となることが多い外被タンパク質のコーディング領域を増殖させることができるため，感染の確認や増殖量の解析，他のウイルスとの識別，ウイルスゲノムの塩基配列解析等に利用できると考えられる．また塩基配列の解析結果を基に，Necrovirus, Tobamovirus および Fabavirus に属する複数株について再分類を行った．

1．はじめにしたものを−80℃で保存し，申請に応じて冷蔵便で配布している（花田，2012）．

国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構の農業生物資源ジーンバンク微生物部門は，食料・農ウイルス株の配布申請時にユーザーが記入するウイ

業に係る微生物遺伝資源を扱う機関の中で，国内で唯ルスの利用目的の内訳は，病害診断や検定，次いで，一植物ウイルスの収集・保存・配布を担っている（花

耐病性を目的とした新品種開発や遺伝子解析が多く，田，2012，Tomioka et al., 2012）．本部門では，2015

いずれの目的においても，ユーザーはウイルスを受領

年時点で，植物病原ウイルスのうち機械的接種が容易

後，使用する前に，適切な緩衝液を用いて十分に磨砕にできるウイルス 12 科 26 属 330 点を公開しており，し，感受性の高い植物に付傷接種することによりウイ

日本で初めて発見されたアマゾンユリ微斑ウイルス

ルスを増殖させることが必要である．また対象とする

Amazon lily mild mottle virus（Fuji et al., 2013），キュ

ウイルスの病原性や宿主範囲などの性状解析を行う際

ウリ斑紋ウイルス Cucumber mottle virus（Orita etには，目的に応じてウイルスの感染確認，増殖量や動al., 2007），メロン黄化えそウイルス Melon yellow

態を明らかにすることが必要である．

spot virus（Kato et al., 2000），リンドウモザイクウ

そこで，ジーンバンクに登録されている植物ウイル

イ ル ス Gentian mosaic virus（Kobayashi et al.,ス株について，解析を行う際の一助となる情報を提供

2005），ソテツえそ萎縮ウイルス Cycas necrotic stunt

するために，ウイルスの外被タンパク質を構成する主virus（Hanada et al., 1986），コンニャクモザイクウ

要タンパク質のコーディング領域部分の塩基配列を解イルス Konjac mosaic virus（下山ら，1992），アマゾ

読し，得られた塩基配列の公開を開始した．今回はそンユリモザイクウイルス Amazon lily mosaic virusの過程で設計し，ウイルスゲノムの外被タンパク質領（Terami et al., 1995），メロンえそ斑点ウイルス

域の cDNA 化と増幅に成功した特異的プライマー情

Melon necrotic spot virus（ 岸，1966），Lisianthus

報を提供することで，ユーザーがジーンバンクから入

necrotic ringspot virus（Shimomoto et al., 2014）な

手した植物ウイルス株の性状解析をする際の一助としども保存している．これらは，ガラスアンプルに格納

たい．

Corresponding author

2．解析に供試したウイルス株＊

本部門において 2015 年 12 月時点で登録，公開されE-mail: tuehara@affrc.go.jp
─ 39 ─

農業生物資源ジーンバンクが保有する植物ウイルス株の外被タンパク質遺伝子の検出

表1

一木（植原）珠樹ら

Scientific names, nature of the genome, and MAFF accession numbers of plant viruses preserved in the NARO
Genebank
Nature of the genome

MAFF accession Nos.

Alfalfa mosaic virus
Alstroemeria mosaic virus
Alstroemeria virus X
Amazon lily mild mottle virus
Amazon lily mosaic virus
Arabis mosaic virus
Asparagus virus 2
Asparagus virus 3
Barley stripe mosaic virus
Bean common mosaic virus
Bean yellow mosaic virus
Beet necrotic yellow vein virus
Broad bean wilt virus 2

Scientific namessRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)

Butterbur mosaic virus
Carnation mottle virus
Carnation vein mottle virus
Cauliflower mosaic virus
Clover yellow vein virus
Cocksfoot mottle virus
Cucumber green mottle mosaic virus

ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
dsDNA
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)

Cucumber mosaic virus

ssRNA(＋)

Cucumber mottle virus
Cycas necrotic stunt virus
Gentian mosaic virus
Grapevine algerian latent virus
Iris yellow spot virus
Konjac mosaic virus
Kyuri green mottle mosaic virus
Lettuce mosaic virus
Lisianthus necrotic ringspot virus
Melon necrotic spot virus
Narcissus mosaic virus
Nerine virus X
Odontoglossum ringspot virus
Olive latent virus 1
Olive mild mosaic virus
Papaya ringspot virus
Peanut mottle virus
Peanut stunt virus

ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(−)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(−)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)

Pepper mild mottle virus
Potato mop-top virus
Potato virus A
Potato virus S
Potato virus X
Potato virus Y
Radish mosaic virus

ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)

104001,104002, 104069, 260125, 260126
104102～104105, 104120
104109104118104117104003, 307006
715030715029307038, 307039
104042, 104043, 105007, 715049
104054307054104049, 104050, 104080, 104111, 260092～260098, 307009,
307015, 715032
104006104008, 260191
104009104018～104022
104075, 715041～ 715043
104072, 104073, 307042, 307049, 307050, 307051
104026, 260018, 260019, 260026, 260078, 307029, 307056,
307057104010～104014, 104016, 104058～104062, 104070, 104081,
104087～104089, 104106～104108, 104113～104116, 260099～
260118, 260151～260167, 260188, 260189, 307008, 307040,
307041, 715038～715040, 715050, 715053, 715055～715058,
715064260144260063, 307036, 307037
104068104126260179104056104024, 104025, 715061
715025260170104044, 104045, 104094, 104097, 104125, 260030
307001104121260142, 260143
260086, 307005, 307013
307011
260090, 260091
307044104041, 260119, 260120～260122, 260168, 260169, 260187,
715037, 715044
104032, 104086, 104099, 715065
260141307028307026260048, 307022, 307023, 715063
104046, 104074, 104077, 307024, 307025
104028
─ 40 ─

Microb. Resour. Syst. June 2016

Vol. 32, No. 1

Ryegrass mottle virus
Sikte waterborne virus
Sorghum mosaic virus
Soybean mosaic virus
Squash mosaic virus
Sugarcane mosaic virus
Tobacco mild green mosaic virus
Tobacco mosaic virus

ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)

Tobacco necrosis virus A
Tobacco ringspot virus
Tomato aspermy virus
Tomato mosaic virus

ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)

Tomato ringspot virus
Tomato spotted wilt virus
Turnip mosaic virus
Wasabi mottle virus
Watermelon mosaic virus
Youcai mosaic virus
Zucchini yellow mosaic virus

ssRNA(＋)
ssRNA(−)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)
ssRNA(＋)

307043260150260088, 260089
104029, 104030, 104063～104067, 260049, 260139
260055, 260127
260177, 260087
104036
260014, 260015, 260025, 260031, 260053, 260054, 260056,
260061, 260064～260066, 260069, 307032
260085, 307007
104031104038, 260123, 260124, 715036
104034, 260001, 260002, 260004～260013, 260017, 260022,
260023, 260051, 260052, 260062, 260067, 260068, 260072,
260073, 260075～260077, 307019, 715016, 715017, 715051,
715052307002104085, 260050, 260145～260149
104047, 260133～260137, 715027, 715054, 715062, 715066
104033104039, 260138, 307031, 715059
104110, 260003, 260058, 260172
104048, 104057, 104071, 260020, 260027, 715045～715048

たは 1.0％のアガロースゲルに泳動して行った．

ている植物ウイルス 330 点のうち，解析中の株とサブバンクで保存されている株以外の植物ウイルス株 285

3．各ウイルス株の外被タンパク質遺伝子の増幅

点 を 用 い た（ 表 1）
． こ れ ら は Cauliflower mosaic
virus を除いてすべてゲノムを RNA にもつ，いわゆ

各ウイルスの特異的プライマー配列，反応条件，おる RNA ウイルスである．配布用にアンプル化して保よび予想される増幅断片のサイズを表 2 に示した．ウ

存されている凍結乾燥サンプルから RNeasy Plant

イルス株間での変異が大きい場合は，縮重プライマー

Mini Kit（QIAGEN）を用いてプロトコールに従いを設計した．供試したすべてのウイルスにおいて予測

total RNA を精製し，濃度を計測した後，供試するま

したサイズの増幅断片が得られ，バンドが薄かった複−20℃で保存した．プライマーは，既報のユニバーサ

数 の ウ イ ル ス 株（Arabis mosaic virus, Butterbur

ルプライマーあるいは GenBank から対象ウイルスのmosaic virus, Lettuce mosaic virus, Potato virus S）

複数系統の塩基配列情報を取得後，GENETYX 上のについても，PCR 反応数を 5 サイクル程度増やすこ

プ ロ グ ラ ム あ る い は Oligo Evaluator（Sigmaとで増幅が改善された．増幅の程度に差が現れた理由

Aldrich）を用いて特異的なプライマー対を設計した．

として鋳型となるウイルス由来の RNA 量が少量で使用した試薬と反応条件は以下の二通りの方法を採用あった可能性や，宿主成分による反応阻害が考えられした．1. PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver. 2

る．植物ウイルスは人工培地などでの培養ができない（Takara）を用いてプロトコールの組成に従い反応液

ため，それぞれのウイルスに最も適しているとされるを調整後，50℃ 30 min，95℃ 3 min one cycle，94℃

植物に接種し増殖させるが，提供するアンプルのウイ

1 min，50℃ 1 min，72℃ 3 min 35 cycles，72℃ 5 min

ルス量については，現在のところ解析しておらず，今

one cycle で RT-PCR，または 2. One-Step RT-PCR

後ユーザーに提供する情報の一つとして検討する価値

kit（QIAGEN）を用いてプロトコ－ルの組成に従いがあるだろう．今回検討を行ったウイルスのうち唯一反応液を調整後，50℃ 30 min，95℃ 15 min one cycle，

DNA をゲノムとする Cauliflower mosaic virus につ

94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 1 min 30 cycles，72℃

いても 2 の実験方法で予測された増幅断片長が得られ10 min で RT-PCR を行った．得られた PCR 産物の確た．なお RT 反応を省略した PCR のみの増幅は検討

認は，予想される増幅断片長にあわせて，2.0，1.5 ましなかった．
─ 41 ─

Alfalfa mosaic virus (Alfamovirus)
Alstroemeria mosaic virus (Potyvirus)
Alstroemeria virus X (Potexvirus)
Amazon lily mild mottle virus(Bromovirus)
Amazon lily mosaic virus (Potyvirus)
Arabis mosaic virus (Nepovirus)
Asparagus virus 2 (Ilarvirus)
Asparagus virus 3 (Potexvirus)
Barley stripe mosaic virus (Hordeivirus)
Bean common mosaic virus (Potyvirus)
Bean yellow mosaic virus (Potyvirus)
Beet necrotic yellow vein virus (Benyvirus)
Broad bean wilt virus 1 (Fabavirus)
Broad bean wilt virus 2 (Fabavirus)
Butterbur mosaic virus (Carlavirus)
Carnation mottle virus (Carmovirus)
Carnation vein mottle virus (Potyvirus)
Cauliflower mosaic virus (Caulimovirus)
Clover yellow vein virus (Potyvirus)
Cocksfoot mottle virus (Sobemovirus)
Cucumber green mottle mosaic virus(Tobamovirus)
Cucumber mosaic virus (Cucumovirus)
Cucumber mottle virus (Tobamovirus)
Cycas necrotic stunt virus (Nepovirus)
Gentian mosaic virus (Fabavirus)
Grapevine Algerian latent virus(Tombusvirus)
Iris Yellow Spot Virus（Tospovirus）
Konjac mosaic virus (Potyvirus)
Kyuri green mottle mosaic virus(Tobamovirus)
Lettuce mosaic virus (Potyvirus)
Lisianthus necrotic ringspot virus(Tospovirus)
Melon necrotic spot virus (Carmovirus)
840
960
890
830
970
2080
830
840
750
1030
1600
710
2140
1190
1150
1200
1700
1680
960
930
680
950
820
1900
1200
1240
930
1010
680
1000
950
1440

ATGAATTGCAAGAATACCTG/AACAGACGTACAGGAAAATCAGGCGYGAATCTWTDATYCGCCT/CAATACACTGTCGCCACTAATGTCCGGGAGGAGATTTGT/ACCACAAGGTGTTGCAAGCAGAACGGGGTTAAGTTTCC/TGATAGTCTGCTGTGGGAGYTGTTGTTCGACGCTATACTA/CAATACATCTAGTTAAMGCGTA
ARRRCAARRATTGARGARTTRG/CCACACTGAAACTAAAGAGAAC
GGNAAYAAYAGYGGNCARCC/oligo dT
GCGCAAGCTTAAATTCTAACTATTATCTCC/CAGCTAATTGCTATTGTCTTTGCYTCTGATGAGCAAGT/TTAATGGGAGGCTKGCTGCT
AATGARRTKGTNCTCAAYTA/TTAATGGGRGGCTAGTGACCTGAATTAGTAGAAAGTGTGT/CTAACGATAATATTAATAAGATCGAAAGAGCTTGCTATTACAACT/ATGGTTAATATCGATCCATCTY
GGNAAYAAYAGYGGNCARCC/oligo dT
AACCTAAAGAAAAAGGCAAAG/TGAAGCTCTATCTTCTTGTATTAGAAGTGTACAATAAGATC/TAAAACCTCACTTAACATAGAAGCTTGGAGATGGAGCTAA/TGGAGTTAGATTTCCAAGTG
AAGAGATCCCAGTTATAGGTCTA/ACCGTTCGATTTAAGTGAACYASYTTTDRGGTTCAATTCC/GACTGACCATTTTAGCCG
CCGATGTCGTGGTGGGTTCT/TCAAGTCATCACCTTCACAGGACATTTGGGAGCTTTAGAG/CATTCAGATGGATAAGTCGTGCACTACCGCGGCGGACAAGGA/oligo dT
GACTCCGCCGTAGCTTGACC/GGTTTATTGACTTGTTCGTATTCAG

─ 42 ─CTTAACTAACAATACTG/AGAGCAATCGAGGTATAAAACCTATCTAGACCGTGATGCTAAT/CATGGCAGATAAATACGACTGGTCCCAGTCGTGCTGTACG/TTCGGTAGAAACCGCGTAAGGTTAGAAAAATACATGGAAG/TGCATACATAAACATAAAAGGCCCTTGATTGCCTCAGAAG/GACGAAATCCCTTGCACACACTCTGGCCCCGGGGATTACTC/TACGCCGTAATGGTTAGCC

2

2
1

1
2
2

2
1
2
1
1

2
2
1
1
2
2
1
1
1
1
2
2
1
2
2
2
2

2
2
2
2

(Koenig et al., 2004)(Choi et al., 1999)(Yamamoto & Fuji, 2008)(Kondo et al., 2005)(Yamamoto & Fuji, 2008)(Ehlers et al., 1991)

Reference（善ら，2005）

Approximate
Reactionsize of PCR
condition＊
product (bp)

TGGAGTCCCGAAAGGGTTTAC/TAATCCACCCAGTGGAGGTCAATGGCATTTCAACGCTTATTC/GACATACGGGAAAAACCGATATAGATAATTGCCCGGACACAG/CACACACATAGTATATTA GTGACTTAGCTTCAAAGCCTGAAC/AAGAGCATACCAATGAACCA

Primer pairs sense/antisense

Information on the primer pairs, predicted PCR product of plant viruses preserved in the NIAS Genebank

Scientific name (genus)

表2

農業生物資源ジーンバンクが保有する植物ウイルス株の外被タンパク質遺伝子の検出
一木（植原）珠樹ら─ 43 ─

2
2
2
1
1
1
2
2
2
1
2
2
2
2
2
2
1
1
2
2
1
2
2
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2

840
810
730
950
930
1800
1040
950
640
550
940
990
850
950
1280
860
1240
2140
940
1250
950
630
610
940
1650
950
610
1820
920
1010
630
970
600
950

(Choi et al., 1999)(Yamamoto & Fuji, 2008)(Koenig et al., 2004)(Yamamoto & Fuji, 2008)(Mayo et al., 1996)(Choi et al., 1999)（守川ら，2006）(Yamamoto & Fuji, 2008)

Reaction condition＊ is 1. RT-PCR with PrimeScript One Step RNA PCR Kit Ver. 2 (Takara), and 2. RT-PCR with One-Step RT-PCR kit (QIAGEN). See the materials
and methods for details.

Narcissus mosaic virus (Potexvirus)
CCGTGGAACGGGGTTAAGTTT/GTTTATTTTATTGATAGTGG
Nerine virus X (Potexvirus)
TGGTTAACGCGGCTTCAAATC/TGTTAGCACGTGAAAACCCAG
Odontoglossum ringspot virus
GTGTTGTAGATGATATTGTG/GAAAAACCCTTCGATTTAAGT(Tobamovirus)
AGAYWCAAYACATTWCIATC/AGCCTGTTTCCCAGGATCCG
Olive latent virus 1 (Alphanecrovirus)
Olive mild mosaic virus（Alphanecrovirus） AGAYWCAAYACATTWCIATC/AGCCTGTTTCCCAGGATCCG
Papaya ringspot virus (Potyvirus)
GGNAAYAAYAGYGGNCARCC/oligo dT
Peanut mottle virus (Potyvirus)
ACAGATGTAGAACTTGAAGAG/CCAACACACGATAAACATAA
Peanut stunt virus (Cucumovirus)
YASYTTTDRGGTTCAATTCC/GACTGACCATTTTAGCCG
Pepper mild mottle virus (Tobamovirus)
AAGGGAAGCTGTTTGATAAG/AACCCTTCGATTTAAGTGGA
Potato mop-top virus (Pomovirus)
CGGGATCCTATGCACCAGCCCAGCGT/TCGGATCCTCTCGGATACCACCCTT
Potato virus A (Potyvirus)
CAAGTACTGAACTGGAAAAG/AGACAAGGATACTAACAGG
Potato virus S (Carlavirus)
CCGTTGAAGCACCTTTAGGTT/ATAHCCCAGTCGRTRRACACA
Potato virus X (Potexvirus)
TGCAGAAACTATCAGAGCCA/ATTCATACAATCAAACCAG
Potato virus Y (Potyvirus)
GCTTTCACTGAAATGATGGT/GATAAAAGTAGTACAGGAAAAGC
Radish mosaic virus (Comovirus)
GARMCVTCRGCATTTGAAAG/GTACAACTCATTCCACACACC
Ryegrass mottle virus (Sobemovirus)
GGAGTCTGGAAATGGAATTAG/CGAAGTGGCATTGCGTATT
Sikte waterborne virus (Tombusvirus)
GACTCCGCCGTAGCTTGACC/GGTTTATTGACTTGTTCGTATTCAG
Sorghum mosaic virus (Potyvirus)
GGNAAYAAYAGYGGNCARCC/oligo dT
Soybean mosaic virus (Potyvirus)
GTGAGCTACAAAGATATCTTGA/AGTGCAACTACTATATTATAG
Squash mosaic virus (Comovirus)
ACAGTGGTGATAATGAAGTAG/CCATCCAAATTGGATTATAAGT
Sugarcane mosaic virus (Potyvirus)
GGNAAYAAYAGYGGNCARCC/oligo dT
Tobacco mild green mosaic virus
AAGTTGAGGAAATTGAGGA/ACTGCTGATTTTGGTATCA(Tobamovirus)
TAATCGATGATGATTCGGA/AAAAACACTATGCGTTATCG
Tobacco mosaic virus (Tobamovirus)
Tobacco necrosis virus A
AGAYWCAAYACATTWCIATC/AGCCTGTTTCCCAGGATCCG(Alphanecrovirus)
CCCTACAATCCAAACCACG/GGGCTACCAATCCTGGTTAGAAG
Tobacco ringspot virus (Nepovirus)
Tomato aspermy virus (Cucumovirus)
YASYTTTDRGGTTCAATTCC/GACTGACCATTTTAGCCG
Tomato mosaic virus (Tobamovirus)
TTTGATTGAAGATGAAGCCGA/AAAAACACTGTACGTTATC
Tomato ringspot virus (Nepovirus)
CGATAGGACGCAGCAGGGAAC/GAGGCCACCTTTTGGAAGCTG
Tomato spotted wilt virus (Tospovirus)
ACACACTAAGCAAGCACAAGC/AGTTGTACTTTCGCACCTTGA
Turnip mosaic virus (Potyvirus)
CCAGCTCAAGAGGACCTCAC/CCCATAAGCGAGAATACTAACGAG
Wasabi mottle virus (Tobamovirus)
GAAGATTGGAGGAAGGGATGT/ACGCCGTAAGAATACCTCTTC
Watermelon mosaic virus (Potyvirus)
AATTGCAAAAATACCTTGAAG/TATAGAAAACTTGTAACGAC
Youcai mosaic virus (Tobamovirus)
AGTATAGATATAGACCGGAG/ATTACACCGTAAGTATATCTC
Zucchini yellow mosaic virus (Potyvirus)
ACCTACAAGCCCTCCATCAAG/TAGAATTACGTCGGCAGCGA

Microb. Resour. Syst. June 2016
Vol. 32, No. 1

農業生物資源ジーンバンクが保有する植物ウイルス株の外被タンパク質遺伝子の検出

一木（植原）珠樹ら

ジーンバンクのウイルス株を表 3 にまとめた．

本稿で報告したプライマー対は，いずれもジーンバ
ンクで公開中の植物ウイルス株のゲノムのうち，特に例えば 1995 年に発刊された国際ウイルス分類委員

分類の基準や検出の標的となることが多い外被タンパ会（I nt e r na t io na l C o mmit t e o n T a xo no m y of

ク質のコーディング領域を増幅させることができるた

Viruses，ICTV）の 6 次報告において Tombusviridae

め，感染の確認や増殖量の解析，他のウイルスとの識科には Tobacco necrosis virus（TNV）1 種のみが報別，ウイルスゲノムの塩基配列解析等に利用できると告されており，Tobacco necrosis virus A（TNV-A）

考えられる．また得られた RT-PCR 産物の塩基配列を，と Tobacco necrosis virus D（TNV-D）は系統としてダイレクトシーケンス法を用いて解析し，外被タンパ

位置づけられていた．現在ではこれらは別種として扱ク質を構成する主要タンパク質のコーディング領域部

われており，2011 年に発刊された 9 次報告においては，分の塩基配列として順次ジーンバンクの遺伝資源デー

Tombusvirus 属や Necrovirus 属など 8 属と 2 種の暫

タベースで公開している（https://www.gene.affrc.

定種が記載されている．そこでジーンバンクで登録・

go.jp/databases.php）．このデータベースでは，個々

公開あるいは未公開株の Necrovirus 属として保存さの株に付与されている MAFF 番号を検索することで，れてきた MAFF260085，MAFF260086，MAFF307005，

その来歴や宿主，採取された時期，また株に関する文

MAFF30007，MAFF307011 および MAFF307013 の献を知ることができる．

各ウイルス株について，外被タンパク質の遺伝子配列の解析を行い，ICTV の新分類と比較検討した結果，

4．外被タンパク質遺伝子の塩基配列解析とウイルス

MAFF260085 と MAFF307007 は Necrovirus 属 の株の学名変更TNV-A に，MAFF260086，MAFF307005 お よ び

植物ウイルス研究の初期においては，形状や宿主範

MAFF307013 は Necrovirus 属の Olive latent virus 1

囲等から分類がなされていたが，遺伝子解析技術の進（OLV1）に，MAFF307011 は Necrovirus 属の Olive

歩によりウイルスゲノムの塩基配列の解析が行われ，mild mosaic virus（OMMV）に再分類され登録・公それに伴いウイルスの分類も変更を重ねてきている．

開されている（藤ら，2011）．
Tobacco mosaic virus として登録，公開されていた塩基配列の解析結果から学名変更が必要と判断された
表3

Reclassified plant viruses by the analysis of viral capsid/coat protein
genes

MAFF accession
Nos.
104049104050104068307009307015715032260017
260067
260068260070104033104036260003260008260058260085260086307005307007307011307013Formerly indicatedscientific nameBroad bean wilt virus 1
Broad bean wilt virus 1
Broad bean wilt virus 1
Broad bean wilt virus 1
Broad bean wilt virus 1
Broad bean wilt virus 1
Tobacco mosaic virus
Tobacco mosaic virus
Tobacco mosaic virus
Tobacco mosaic virus
Tobacco mosaic virus
Tobacco mosaic virus
Tobacco mosaic virus
Tobacco mosaic virus
Tobacco mosaic virus
Tobacco necrosis virus
Tobacco necrosis virus
Tobacco necrosis virus
Tobacco necrosis virus
Tobacco necrosis virus
Tobacco necrosis virus
─ 44 ─

Corrected scientific nameBroad bean wilt virus 2
Broad bean wilt virus 2
Gentian mosaic virus
Broad bean wilt virus 2
Broad bean wilt virus 2
Broad bean wilt virus 2
Tomato mosaic virus
Tomato mosaic virus
Tomato mosaic virus
Tomato mosaic virus
Wasabi mottle virus
Tobacco mild green mosaic virus
Youcai mosaic virus
Tomato mosaic virus
Youcai mosaic virus
Tobacco necrosis virus A
Olive latent virus 1
Olive latent virus 1
Tobacco necrosis virus A
Olive mild mosaic virus
Olive latent virus 1

Microb. Resour. Syst. June 2016

Vol. 32, No. 1

要な基本情報を提供する重要な作業である．

ウイルスの外被タンパク質遺伝子の塩基配列についても検討した結果，一部は別の種であることが示唆されこれまでに配布された植物ウイルス株のうち，特にたため，河野ら（2005）による血清学的分類検証の結

配布希望の多かったウイルス株は Cucumovirus 属，

果 も 参 考 に し て MAFF104033 は Wasabi mottle

Potyvirus 属，Tobamovirus 属に属するウイルスであっvirus，104036 は Tobacco mild green mosaic virus，

た．また最近の傾向として，近年問題となっている

MAFF260003 および MAFF260058 は Youcai mosaic

Tomato spotted wilt virus の配布申込も増えている．

virus，また MAFF260008，MAFF260017，MAFF

今後，農業生産環境の変化，農作物の流通の増加，外260067，MAFF260068 および MAFF260070 は Tomato

国産農作物や種苗の輸入の拡大等に伴い，新たなウイ

mosaic virus と し て 再 分 類 し た（ 一 木 ら，2015）．

ルス病害や再興ウイルス病害が発生，増加する傾向がTobacco mosaic virus が属するトバモウイルスの分類ある（Tsuda & Sano, 2014）．このような農業生産にについては，大木（2005）によって概説されているよ

関する懸案に対応するためにも，登録株の受け入れをうに，かつて Wasabi mottle virus はタバコモザイク

積極的に行い，公開配布するウイルス株を充実するとウイルス-ワサビ系，Tobacco mild green mosaic virus

ともに，遺伝子解析に基づいた各ウイルス株について

はタバコモザイクウイルス-U 系統，Youcai mosaicの正確な情報を提供していくこととしている．

virus は タ バ コ モ ザ イ ク ウ イ ル ス-ア ブ ラ ナ 科 系，
Tomato mosaic virus はタバコモザイクウイルス-ト

文

マト系として分類されていたこと，またジーンバンク

Choi, S.K., Choi, J.K., Park, W.M. & Ryu, K.H. 1999.

において保存維持されていた株は 1970 年から 1980 年

RT-PCR detection and identification of three

代という，遺伝子解析による分類が現在ほど進んでい

species of cucumoviruses with a genus-specific

ない時期に分離されていたことから，今回のような結

single pair of primers. J. Virol. Methods 83: 67-73.

果が生じたと考えられる．

Ehlers, U., Commandeur, U., Frank, R., Landsmann,

またソラマメウイルトウイルス（Broad bean wilt

J., Koenig, R. & Burgermeister, W. 1991. Cloning ofvirus，BBWV）が，血清学的特性が異なる Broadthe coat protein gene from beet necrotic yellow

bean wilt virus 1（BBWV-1）および Broad bean wilt

vein virus and its expression in sugar beet hairy

virus 2（BBWV-2）という二つの異なるウイルス種にroots. Theor. Appl. Genet. 81: 777-782.

分類されるようになったことから（Goldbach et al.,Fuji, S., Kikuchi, S., Ueda, S., Toda, T., Furuya, H.,

1995），ジーンバンクのウイルス株についても外被タ

Fukumoto, F. & Hanada, K. 2013. Characterization

ン パ ク 質 遺 伝 子 の 塩 基 配 列 を 解 析 し た 結 果，

of a new anulavirus isolated from Amazon lily

M A F F104049，M A F F104050，M A F F307009，
MAFF307015，MAFF715032 は BBWV-2 に再分類された（藤ら，2013）．また BBWV-1 として登録されてplants. Arch. Virol. 158: 201-206.
藤祐介，福本文良，藤永真史，大段隆史，

武，古屋廣光，花田

薫 2013．日本産ソラマメウイルトウイルス 2（BBWV2）の遺伝的多様性．

（Gentian mosaic virus，GeMV） に 分 類 さ れ た

日本植物病理学会報
藤79：224．

晋一，大段隆史，花田薫 2011．農業生物資源

ジーンバンクに保存されているタバコネクロシスウ

5．まとめ
ジーンバンクにおいてウイルスの保存，配布が開始

晋一，原

戸田

い た MAFF104068 は リ ン ド ウ モ ザ イ ク ウ イ ル ス（Kobayashi et al., 2005）．

献イルスの分子分類．日本植物病理学会報77：227．

Goldbach, R., Martelli, G.P. & Milne, R.G. 1995.

されたのは 1985 年であり，それ以前に分離されたウ

Family Comoviridae, In Murphy, F.A., Fauquet,

イルスも多数保存している．そのため，分離後再分類

C.M., Bishop, D.H.L., Ghabrial, S.A., Jarvis, A.W.,が提案されたウイルスについては，今回の塩基配列解

Martelli, G.P., Mayo, M.A., Summers, M.D. (eds.),

析により改めて新しい学名に修正されるべき株が複数存在する．遺伝子解析による分類検証は，ジーンバン

Virus Taxonomy, p. 341-347, Springer, Wien.
花田クで公開されているウイルスの正確な学名を周知する

薫 2012．植物ウイルスの特性とその保存について．微生物遺伝資源利用マニュアル

31：1-66．

だけでなく，抵抗性品種の育種や検出法の開発等，植H a n a d a , K . , K u s u n o k i , M . & I w a k i , M . 1986.

物ウイルスの防除や利用に関する研究を始める際に必Properties of virus particles, nucleic acid and coat─ 45 ─

農業生物資源ジーンバンクが保有する植物ウイルス株の外被タンパク質遺伝子の検出

一木（植原）珠樹らprotein of cycas necrotic stunt virus. Ann.

jp/okuda_wiki/manuals．最終訪問日 2015 年 11 月

Phytopath. Soc. Japan 52: 422-427.

25 日．

一木（植原）珠樹，花田薫，薮中恭子，大橋美保，

大木

理 2005．日本に発生するトバモウイルスの再分類の経緯．植物防疫

杉本るり子，青木孝之，澤田宏之，永井利郎，根本

59：25-28．

博 2015．農業生物資源ジーンバンクが保有する植Orita, H., Sakai, J., Kubota, K., Okuda, M., Tanaka, Y.,

物 ウ イ ル ス 株の特性評価─塩基配列解析に よ る

Hanada, K., Imamura, Y., Nishiguchi, M., Karasev,

Tobacco mosaic virus の登録学名変更─．日本植物

A.V., Miyata, S. & Iwanami, T. 2007. Molecular

病理学会報and serological characterization of cucumber

81： 281．

mottle virus, a new cucurbit infecting tobamo-like

Kato, K., Hanada, K. & Kameya-Iwaki, M. 2000.

virus. Plant Dis. 91: 1574-1578.

Melon yellow spot virus: a distinct species of the

Shimomoto, Y., Kobayashi, K. & Okuda, M. 2014.

Genus Tospovirus isolated from melon (Cucumis
melo L.). Phytopathology 90: 422-426.

Identification and characterization of Lisianthus

河野敏郎，高橋幸吉，高橋義行 2005．旧タバコモザ

necrotic ringspot virus, a novel distinct tospovirus

イクウイルス保存株の血清学的な検証．関東東山病

species causing necrotic disease of lisianthus

害虫研究会報岸52：13-18．

(Eustoma grandiflorum). J. Gen. Plant Pathol. 80:

国平 1966．メロンえそ斑点病．日本植物病理学
会報169-175.

32：138-144．

下山

Kobayashi, Y.O., Kobayashi, A., Hagiwara, K., Uga,淳，亀谷満朗，花田薫，郡司孝志 1992．コ

ンニャクモザイクウイルス-コンニャクに発生した

H., Mikoshiba, Y., Naito, T., Honda, Y. & Omura, T.

新 potyvirus について．日本植物病理学会報2005. Gentian mosaic virus: A new species in the706-712．

58：

Genus Fabavirus. Phytopathology 95: 192-197.

Terami, F., Honda，Y. & Fukumoto, F. 1995．

Koenig, R., Verhoeven, J.T., Fribourg, C.E.,

Amazon Lily Mosaic Virus，a New Potyvirus

Pfeilstetter, E. & Lesemann, D.E. 2004. Evaluation

Infecting Amazon Lily（Eucharis grandiflora）．日

of various species demarcation criteria in attempts

本植物病理学会報

to classify ten new tombusvirus isolates. Arch.

61：1-6．

Tomioka, K., Sato, T., Hanada, K., Yamasaki, F.,

Virol. 149: 1733-1744.

Nagai, T., Sawada, H., Takeya, M. & Aoki, T. 2012.

Kondo, T., Fuji, S., Yamashita, K., Kang, D.K. &Plant viruses and viroids released from the NIAS

Chang, M.U. 2005. Broad bean wilt virus 2 inGenebank Project, Japan. Microbiol. Cult. Coll. 28:

yams. J. Gen. Plant Pathol. 17: 441-443.

35-40.

Mayo, M.A, Torrance, L., Cowan, G., Jolly, C.A.,

Tsuda, S. & Sano, T. 2014. Threats to JapaneseMacintosh, S.M., Orrega, R., Barrera, C. & Salazar,

agriculture from newly emerged plant viruses and

L.F. 1996. Conservation of coat protein sequenceamong isolates of potato mop-top virus fromviroids. J. Gen. Plant Pathol. 80: 2-14.
Yamamoto, H. & Fuji, S. 2008. Rapid determination

Scotland and Peru. Arch. Virol. 141: 1115-1121.
守川俊幸，多賀由美子，向井司，棚橋of the nucleotide sequences of potyviral coat

環，堀井香織，兼松誠

protein genes using semi-nested RT-PCR with恵，大木健広，津田新哉 2006．チュー

リップから分離されるネクロウイルスの種類と病原

universal primers. J. Gen. Plant Pathol. 74: 97-100.
善正二郎，奥田充，海老原克介，植松清次，花田薫，

力．http://www.naro.affrc.go.jp/org/narc/seika/

岩波 徹，中島貞彦 2005．タマネギ（Allium cepa）

kanto18/14/18_14_13.html．最終訪問日 2015 年 11から分離された Iris yellow spot virus（IYSV）の月 25 日．

遺伝的特性および IYSV2 系統のタマネギおよびネ奥田充 2015．ウイルス病検定マニュアル Ver．3（更新 2015 年 9 月 30 日）．https://ml-wiki.sys.affrc.go.

─ 46 ─

ギ（Allium schoenoprasum）に対する病原性．日
本植物病理学会報71：123-126．

Microb. Resour. Syst. June 2016

Vol. 32, No. 1

Detection and application of viral capsid/coat protein genes of plant viruses preserved in the NARO Genebank (MAFF)
Tamaki Uehara-Ichiki1), Shin-ichi Fuji2), Ruriko Sugimoto1), Miho Ohashi1), Kyoko Yabunaka1), Momoko Kitaya2),
Kazuo Yamashita3), Kaoru Hanada1) and Takayuki Aoki1)
Genetic Resources Center, National Agriculture and Food Research Organization,

1)

Bioresource Sciences, Akita Prefectural University,

2)

Vegetable Research Institute, Aomori Prefectural Industrial Technology Research Center

3)

The Genebank Project at the National Agriculture and Food Research Organization (NARO) is working to conserveand promote agrobiological genetic resources. The Microorganism section of the Genebank collects, characterizes, preserves, and distributes microorganism genetic resources such as fungi, bacteria, and plant viruses. These resources,
which are assigned descriptors called MAFF numbers, totaled about 32,500 strains as of 2016. Plant virus strains in theMicroorganism section have been classified on the basis of scientific data from depositors and their experimental characterization in comparison with reports of the International Committee on Taxonomy of Viruses. To improve the convenience of use and reliability of virus strains, we are working on determining and providing the base sequences of thecapsid/coat protein (CP) genes of virus strains. Here, we demonstrate the successful use of over 60 gene-specific primer
pairs for sequence definition of viral CP genes, as well as the experimental conditions used for RT-PCR.
By using these primer pairs we were able to completely amplify the CP genes of the target virus strains. We also
report several virus strains belonging to Necrovirus, Tobamovirus, and Fabavirus that were re-identified on the basis of
their CP gene sequences.

─ 47 ─