２０１３年度両生類研究施設研究活動及び研究成果報告書	
 

	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 
	
 

平成２６年８月１日	
 	
 広島大学大学院理学研究科附属両生類研究施設	
 

	
 

目	
 次	
 
	
 

I.	
 	
 	
 施設概要………………………………………………	
 	
 	
 ３	
 
II.	
 	
 教育活動………………………………………………	
 	
 	
 ６	
 
III.	
 研究活動と研究内容現況……………………………	
 	
 	
 ７	
 
IV.	
 社会活動	
 ………………………………………………	
 １９	
 
V.	
 	
 国際交流活動	
 …………………………………………	
 ２２	
 
VI.	
 その他（特記事項）	
 …………………………………	
 ２４	
 
VII.	
 各研究グループの研究内容と研究業績	
 	
 …………	
 ２６	
 
	
  	
  	
  	
 発生研究グループ	 	
 ………………………………	
 ２６	
 
	
  	
  	
  	
 遺伝情報・環境影響研究グループ………………	
 ４４	
 
	
  	
  	
  	
 進化多様性・生命サイクル研究グループ………	
 ６５	
 
	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 リーディングプログラムによる特任教員………１１１	
 
	
  	
  	
  	
 生理生態学研究部門（客員部門）	
 
	
  	
  	
 	
 	
 プロジェクト研究①………………………………１１４	
 
	
  	
 	
 	
 	
 	
 プロジェクト研究②………………………………１１８	
 
	
  	
  	
 	
 	
 プロジェクト研究③………………………………１２４	
 
	
  	
  	
  	
 プロジェクト研究④………………………………１２７	
 

2

	
 
I.	
 施設概要	 	
  両生類研究施設は，元広島大学長の川村智治郎先生が在職中に挙げられた業
績を基礎にして，昭和 42 年６月に創設された，世界で類例のない研究施設である。	
 	
  創設時の第１研究部門「発生遺伝学」は，定員が教授１，助教授１，助手２，
その他職員２であったが，昭和 49 年４月に系統維持班の附設が認められた。
従来から実験動物飼育に従事していた教務員１に加え，新たな飼育要員として
一般職員２（行一技官）の増員，技能補佐員３，臨時職員２の予算化が認められた。昭和 51 年４月に系統維持班の強化のために助教授１の増員，臨時職員
１の予算化が認められた。その後，行一技官１の教務員１への振替が行なわれ，充実した系統維持体制が整った。	
 	
  昭和 56 年４月，第２研究部門「生理生態学」が客員部門として増設された。
昭和 59 年４月，第３研究部門「進化生化学」が増設された。平成元年４月，第４研究部門「形質発現機構」が新たに増設され，増員が認められた。平成２年 11 月末には，東広島市の新キャンパスに，４つの研究部門の研究棟，飼育棟および野外飼育場が完成した。新キャンパスへの移転は，平成３年２月から始まり，平成４年１月末に完了した。	
 	
  平成６年６月，10 年時限が到来した進化生化学研究部門に代わり，種形成機
構研究部門が新設され，増員が認められた。また，平成 11 年４月からは形質発現機構研究部門に代わり，分化制御機構研究部門が，平成 16 年４月からは種形成機構研究部門に代わり，多様化機構研究部門が固定部門として新設された。	
 	  しかし，平成 17 年度に系統維持班の助教授が定員削減の対象となり，発生遺伝学研究部門の助教授が兼任することで，定員削減による影響を最少に留めるよう努力し続けている。平成 19 年度に助手２と教務員２から助教４への振替が行われた。平成 21 年度に定年退職した助手のポストで,平成 22 年度には２名の特任助教が採用された。また、平成 24 年４月から NBRP 再建のために、学長裁量経費により特任教授が採用された。また、今年度４月からリーデイン
グプログラムによる特任准教授が配置された。	
 	
  今年度から研究の活性化と構成員の流動化を目的に、従来の３部門制を廃して３グループ制へと改組した。また、これに伴い従来、発生遺伝学部門に属していた系統維持班は、施設長直属とすることとした。平成 25 年度における施設教員の構成は教授２（矢尾板芳郎、住田正幸：施設長），特任教授１（柏木昭彦）,	
 准教授４（鈴木厚、古野伸明、三浦郁夫、高瀬稔），特任准教授１（高橋秀治）,	
 助教４（中島圭介、倉林敦、花田秀樹、田澤一朗），特任助教２（竹林公子、柏木啓子），客員教授２（Miguel	
 Vences,	
 Kelly	 Zamudio）,	
 研究員（Hasan	
 Mahmudul）、契約一般職員（中島妙子）である。系統維持班は技術員
１（宇都武司），契約技能員２（難波ちよ、玉城淳子），契約用務員２（水戸妙子、渡辺八重子）、である。事務室には契約一般職員 1（島田歩稀）がいる。	
 	
  系統維持班では，両生類200	
 種500	
 系統、約３万匹の野外系統及び突然変異
系統等の特殊系統を保存している。確立されている系統には，自然・人為色彩
突然変異系統，野外種育成系統（近交系），絶滅危惧種系統,	
 遺伝子組換え系

3統,などがある。系統維持班では平成25年度には，系統維持している8	
 系統
1,427	
 個体を研究・教育材料として大学および高等学校，中学校，小学校に配布した。特に、系統維持班とNBRPからは広島県教育バザールへ参加し、生物教材としてネッタイツメガエル、アホロートルを62件183匹、およびフタホシコ
オロギ2,000匹を提供した。また，日本や世界各地から昭和51年より約30年あまりかけて野外収集した９科27属112種320集団12,600匹及び実験的に作製された特殊系統100系統４千匹のカエルがマイナス80度に凍結保存されている。	
 	
  平成 14 年度より文部科学省の第 1 期と第 2 期のナショナルバイオリソース
プロジェクト（NBRP）の中核的拠点整備プログラム「ネッタイツメガエル」の中核機関としての事業は、一昨年度末で一旦終了した。昨年度６月から、第３期 NBRP の新規採択課題として、あらたに「ネッタイツメガエル」の中核機関として「ネッタイツメガエルの近交化・標準系統の樹立・提供」を行っている。
課題管理者として住田正幸、課題協力者として柏木昭彦、鈴木厚、古野伸明、
倉林敦、中島圭介、花田秀樹、田澤一朗、柏木啓子、竹林公子、彦坂暁（総合科学院）が参加している。また、今年度からこのプロジェクトには 3 名の契約
技術職員（小林里美,	
 竹中純子,	
 玉城ゆうな<平成 25 年５月から>）が従事している。第３期 NBRP の運営委員会を 12 月４日に神戸商工会議所会館で開催した。この委員会には、運営委員６名（基礎生物学研究所・教授	
 上野直人：委
員長、東京大学大学院理学系研究科・准教授	
 平良眞規、東北大学大学院生命科学研究科・教授	
 田村宏治,広島大学大学院理学研究科・教授、木下勉	
 立教大学理学部・教授、前野貢	
 新潟大学理学部・教授、住田正幸:代表機関課題管理者）、オブザーバー１名（情報・システム研究機構国立遺伝学研究所・准教授	
 山崎由紀子）、NBRP 事務局２名（事務局長	
 佐藤清、事務局員	
 平田裕美）、
課題協力者３名（柏木昭彦、鈴木厚、花田秀樹）が参加し、昨年度の事業概要説明を行なったあとで、事業に対するコメントや助言をいただいた。また、９月 28 日には第 84 回日本動物学会で NBRP ネッタイツメガエル主催のシンポジ
ウム「生物実験材料としてのネッタイツメガエルの長所と有用性」を開催（参加者 150 名）した。さらに、12 月３日〜５日には第 36 回日本分子生物学会で本リソースの実物つきパネル展示を行い、2014 年３月３日〜５日には本施設で実験技術講習会を開催した。今年度の保存実績は 89 系統 7,683 匹、提供実績
は 124 件 7,056 匹、論文実績は（当施設で把握している限りで）10 編であった。	
 	
  平成 21 年度より特別教育研究経費「先端的両生類研究の展開－両生類の絶滅危惧種の保全と標的遺伝子破壊方法の開発－」(平成 26 年３月まで)が５年
プロジェクトとして展開されてきた。今年度も、２名の特任助教（井川武、Islam	
 Mohammed	 Mafizul）が採用され研究に従事してきた。今年が最終年であるため、総括として国際シンポジウム	
 ”Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology:	
 Endangered	 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing”を行なった。本シンポジウムには，日本を含め 11 カ国から合計 93 名の参加者があり，多様な国からの参加者に対し，両生類研究施設の最新研究成果をアピールできた。	
 	
  平成 23 年 10 月から資格審査によって助教以上 10 名の教員が学部教育担当になっており、今年度は「教養ゼミ」	
 「生物の世界」	
 「自然科学概説 A」「動物の系統と進化」、教養教育科目「カエルから見た生命システム」、「実習」、
学部生チューター、教務委員などを担当している。また、今年度も STEP10(国4立 10 大学大学院理学研究科等学生交流推進プログラム)として、10 大学学生のための集中講義「両生類を用いた先駆的研究」を開講した。	
 	
  昨年度から総合博物館の理学研究科サテライト館のオープンスペースを玄関ロビーに開設し、一般公開を行なっている。今年度の施設見学者/施設訪問者は 52 件 985 人で、その中には、山内昌之先生（東京大学名誉教授）、ジョア
ン・グランジノ・ロダス先生（サンパウロ大学長）、二宮正人先生（サンパウロ大学教授）などもある。	
 	
  一昨年度から研究活動の活性化を目指して、研究員体制をはじめた。今年度は、学内から 16 名の研究員、学外海外から 33 名の客員研究員が推薦され、学内外および海外とも共同研究を展開している。共同研究相手先は、国内では東京大学、京都大学、九州大学、名古屋大学、北海道大学、東京工業大学、岡山大学、徳島大学、島根大学、新潟大学、鹿児島大学、琉球大学、自治医科大学、
札幌医科大学、県立広島大学、福岡教育大学、長浜バイオ大学、奈良先端大学、
沖縄科学技術大学院大学、兵庫県立大学、いわき明星大学、芝浦工業大学、北里大学、立教大学、帝京大学、玉川大学、基礎生物学研究所、遺伝学研究所、
産業技術総合研究所、東京都医学総合研究所、JT 生命誌研究館、中外製薬、広島大学（原医研、理学研究科、医歯薬保健学研究科）、海外ではヴァージニア
大学（米国）、UCLA バークレー（米国）、米国エネルギー省 DOE	 Joint	 Genome	 Institute（米国）、レンヌ１大学（フランス）、キャンベラ大学（豪州）、成都
生物学研究所（中国）、バングラデシュ農業大学（バングラシュ）、ブラビジャ
ヤ大学（インドネシア）、ガードン研究所（英国）、ポーツマス大学（英国）、
ウッズホール海洋生物学研究所（米国）、ブラウンシュバイク工科大学（ドイツ）、日米 Xenopus	
 laevis	 gemome	 consortium、米国カリフォルニア州立大学、
スウェーデン Ludwig	
 Institute	
 for	
 Cancer	 Research 等がある。	
 	
  今年度は、８月２日、10月16日、12月17日、１月23日に両生類研究施設運営委員会を開催し、施設の活動実績と活動計画報告、今年度の活動方針及び平成
25年度の客員教員と研究員/客員研究員の承認などを行った。	
 

5

II.	
 教育活動	 	
  両生類研究施設は，生物科学専攻で両生類発生遺伝学演習，両生類多様化機
構学演習，両生類分化制御機構学演習を開講し，細胞と生命，形態形成，性の起源，分類・進化の授業やスロー生物学演習,社会実践生物学特論,生物科学特別研究や生物科学研究セミナーに携わっている。今年度，博士課程前期１年に２名，後期１年に２名（そのうち１名は国費留学生），２年に２名（そのうち１名は学振特別研究員 DC２）で合計６名の院生が在学しており，当施設で大学
院研究に励んでいる。博士課程前期学生の国際学会発表は１件，国内学会発表は１件であり，博士課程後期学生の国際学会発表は３件，国内学会発表は２件である。原著論文発表は博士課程後期学生で３編である。大学院生による RA
２件、TA は４件である。	
 	
  学部教育科目として「教養ゼミ」「生物の世界」「生物科学概説 A」「基礎生物科学 B」「カエルから見た生命システム」「HUSA」「動物の系統と進化」
を分担または担当し、さらに、生物科学基礎実験 I,	
 II,	
 III、情報活用演習、学部生チューターや教務委員を担当している。	
 	 	  大学院生の教育活動の一環として，月に２回，教員，ポスドク，博士課程後期の大学院生が研究活動報告を両生類研究施設公開セミナーとして行ってい
る。	
 
	
 
	
  柏木昭彦特任教授は、山陽女子短期大学臨床検査学科客員教授及び安田女子
短期大学非常勤講師を務めている。三浦郁夫准教授は放送大学面接授業	
 “生
物と性の進化”（放送大学広島学習センター11 月 26−27 日広島市）を行なった。
住田正幸教授は、山口大学大学院理工学研究科講師（H25.4.1〜H26.3.31）と
して環境共生生物科学特別講義（両生類進化遺伝学）（大学院生用１単位後期）を行なった。鈴木厚准教授は、名古屋大学医学部非常勤講師（発生学）（平成25 年 12 月）として講義を、三重県立松阪高校のキャリア教育と理数科課題研
究指導（平成 25 年 7 月）を、さらに第一学習社編集部で高等学校教科書（生物）に関する助言を行なった。高橋秀治特任准教授は放射線災害復興を推進するフェニックスリーダー育成プログラムを担当した。矢尾板教授は、平成 25
年 8 月 10 日（土）19 時～19 時 44 分 NHK 教育テレビ放送で放映されたー地球
ドラマチック	
 「生きものはなぜ姿を変えるのか」—の監修をした。	
 6

III.	
 研究活動と研究内容現況	
 発生研究グループ	 構成員：矢尾板芳郎（教授），高瀬	  稔（准教授），中島圭介（助教）
，田澤一朗
（助教）	
 
○研究活動の概要	
 	
  本研究グループは「種々の両生類を材料として，遺伝学と発生学との新領域を開拓する。」ことを目標として，昭和４２年６月に最初の両生類研究施設の研究部門として創設された。それから４０年余りの間に古典的遺伝学的手法や実験動物学的手法に重きを置く研究から，次第に遺伝子工学的手法，細胞生物学的手法なども取り入れて，両生類の発生を分子生物学的視点から考察する研究へと進んでいる。研究内容は以下の通りである。	
 １）生殖細胞特異的なゲノム編集法の開発	
 	
  本研究は両生類において TALEN を用いて生殖細胞特異的にゲノム編集を行う方法を開発するものである。目的の遺伝子変異が発生異常、致死もしくは不妊を誘導する場合、F0 でそのような異常が生じ、それ以降の解析が不可能になる。
しかし、この方法が確立すれば発生、成長、変態、性成熟、生殖等に関わる重要な遺伝子でも破壊されたホモ個体を F1 で得ることができるようになり、遺伝子の機能解析が可能となる。	
 	  germ	 plasm を含む卵割球が将来生殖細胞に分化していくことがアフリカツ
メガエルで知られている。germ	
 plasm で発現している遺伝子の mRNA の 3’UTRを、緑色蛍光蛋白質 mRNA に付加すると緑色蛍光蛋白質の mRNA が生殖細胞に限局し、緑色蛍光蛋白質そのものも生殖細胞に局在するようになる。この遺伝子の 3’UTR を付加した TALEN	
 mRNA を受精卵に注入すれば TALEN	
 mRNA は生殖細胞に限局し TALEN タンパク質も生殖細胞に局在すると考えられる。	
 	  ネッタイツメガエルのこの遺伝子の 3’UTR をクローニングする。メラニン
色素の合成に関わるチロシナーゼを標的とする TALEN	
 mRNA にこの遺伝子の3’UTR を付加してネッタイツメガエルの受精卵に注入する。この時、体細胞でチロシナーゼの破壊が行われない程度まで注入する mRNA の量を減少させる。
その個体を成熟後にアルビノネッタイツメガエルと交配させる。得られる F1の染色体の一組はアルビノ由来なので、インジェクションを行った F0 の生殖細胞におけるチロシナーゼの破壊された割合が F1 のアルビノの割合と等しくなると考えられる。	
 ２）TALEN 法の効率を初期胚において向上させる方法の開発	 	
  母親由来ではない胚自身の遺伝子の発現が始まる mid-blastula	 transition	 (MBT)よりも早い発生段階で 100%の変異導入効率を得られる方法を開発する。
100%近く変異が導入された F0 で観察することで、標的遺伝子の変異による形質の予測が可能となる。その結果、性成熟を待ち、次の世代を得る必要がなくなり、研究のスピードが格段に上がることが期待できる。また、初期発生に重要な遺伝子でノックアウトが可能になる。	
 	
  アフリカツメガエルの卵母細胞を取り出し、TALEN	
 mRNA を注入する。プロゲ
ステロンで成熟させ、他の雌の腹腔に戻して産卵させ、受精させる。この方法
では TALEN を卵母細胞で発現させ数日間おくことができるので、TALEN の発現7量が高いときに受精させることが可能となり、高い変異導入効率を得ることが可能であると考えられる。	
 	  この方法により MBT 以前で 100%の効率で変異を導入することができた。しかし、卵母細胞での TALEN の発現量は低く、受精後にタンパク合成が盛んに行われることが新たに分かった。	
 ３）ツメガエル幼生の変態での尾の退縮における ouro 遺伝子の機能の再評価	
 	  井筒らが 2009 年に PNAS に発表した「Ouro 蛋白質を発現している尾が免疫系により拒絶されて退縮する。」という説は斬新なものであった。当時は私たちの研究室等は「変態クライマックス初期では尾の筋細胞が直接に甲状腺ホルモンに反応してアポトーシスをおこし、後半はそれに加えて細胞外基質分解酵素が甲状腺ホルモン反応遺伝子として誘導され、細胞が足場を失い、死んでいき、尾が退縮する。」と考えていた。本研究は、この２つの説が共に正しいのか、
またその時は、どちらの効果が大きいのかを明らかにすることを目的とする。	
 ouro	
 1 遺伝子と ouro	
 2 遺伝子のどちらか一方のノックダウンで変態時の尾の退縮が抑制されると報告されている。ouro	
 1 遺伝子と ouro	
 2 遺伝子に対する
TALEN を作成して、その mRNA をネッタイツメガエルの受精卵に注入しノックア
ウトカエルを作製し、変態時の尾の変化を観察する。	
 	
  ouro	 1 遺伝子と ouro	
 2 遺伝子が破壊されたカエルを作製した。今後、そのカエルの交配により多数の F1 を生じさせ、それらの ouro 遺伝子変異ガエルを解析して、各々に対応する表現型を観察する。	
 ４）レチノイド処理による無尾両生類幼生の尾部切断部におけるホメオティッ
ク肢の誘導の再現	 	
  ２０年程前、脊椎動物のホメオティック変異が報告された。インドの無尾両生類の幼生の尾部を切断しレチノイドで処理すると、尾ではなく、後肢の様な構造が生じた。この現象は、実験によく使われる種では再現されなかったので、分子レベルでは全く解析されてこなかった。我々はこの現象を研究するために、本邦で容易に入手可能な無尾両生類を用いてホメオティック肢形成の再現を
試みた。	
 
	
  様々なカエルの幼生を用い、尾部を切断し、レチノイド溶液に移し、ホメオ
ティック肢形成が起こるか否かを確かめた。また、ホメオティック肢におけるマーカーの遺伝子発現を RT-PCR でしらべた。	
 	
  処理したニホンアカガエル、ヤマアカガエル、およびアマミアカガエルの一部で尾部切断端に過剰な肢芽が認められた。これらのホメオティック肢は尾部退縮中も成長し、皮膚と筋肉は成体型のマーカー遺伝子を発現していた。	
 	
  本研究における遺伝子発現解析は、本来変態に伴い死滅する予定だった尾部の一部の細胞の運命が変化し、成体型器官として成長したことを示す。したがって、内因性レチノイドと変態後の細胞の運命制御との関係が示唆される。	
 ５）性転換機構の解析：ツチガエルおよびトノサマガエルの生殖腺に対する環
境化学物質およびエストロゲンの影響	
 両生類では性ホルモン処理により性転換が誘導されることが古くから知られている。しかし、そのメカニズムに関してはほとんど解明されていない。一方、内分泌かく乱作用を持つ環境化学物質が生殖腺や生殖細胞の分化に影響することが知られている。これまで、ツチガエル（Rana	 rugosa）を用いて環境

8

化学物質投与による生殖腺および生殖細胞への影響を組織学的に解析してきた。今回は、環境化学物質投与によるツチガエル精巣卵形成過程における遺伝
子発現について解析した。また、トノサマガエル（Pelophylax	
 nigromaculata）
を用いたこれまでのエストロゲン曝露実験の結果、雌化が起こっている可能性が考えられた。今回、再現性を確認するためのエストロゲン曝露実験を行った。	
 ６）両生類生殖腺分化機構の解析：ネッタイツメガエルの全雄幼生集団作製の試みと予想される性決定機構	
 性転換機構や性分化機構を解析する場合、性に関して汎用性のある遺伝子マーカーが得られていない種においては、全て雄または全て雌からなる幼生集団が有用なツールになる。ネッタイツメガエル幼生にエストロゲンを投与すると、ほとんどが雌からなる集団が得られることから、雄から雌への性転換が誘導されることが考えられる。性決定機構が ZZ/ZW 型の場合、その雌（遺伝的雄の性転換個体）を用いた戻し交配により、全雄幼生集団が得られることが期待される。しかし、これまでの HU 系統を用いた戻し交配の結果、雄が有意に多い幼生集団は得られたが、ほぼ全てが雄からなる幼生集団は得られなかった。そこで今回、アイボリー系統を用いてエストロゲン投与および戻し交配を行った。	
 ７）ネッタイツメガエルの肝臓と尾における甲状腺ホルモン受容体遺伝子発現	 	 	  これまで、弱いエストロゲン作用を持つ環境化学物質ビスフェノールＡ（BPA）が甲状腺ホルモン T3 による尾の退縮および尾の甲状腺ホルモン受容体（TR）遺伝子発現に対して阻害作用を持つことが報告されている。また、尾以外の器官も TR 遺伝子を発現していることが報告されている。両生類のライフサイクルにおける環境化学物質影響を考えると、幼生と成体に共通して存在す
る TR 遺伝子発現器官に注目する必要があると考えた。そこで、幼生期および変態完了後の肝臓に着目し、甲状腺ホルモン作用に対する BPA およびエストロ
ゲンの影響について調べた。	
 9

遺伝情報・環境影響研究グループ	 構成員：柏木昭彦（特任教授），古野伸明（准教授），三浦郁夫（准教授），花田秀樹（助教），柏木啓子(特任助教)	
 
○研究活動の概要	
 	
  遺伝情報・環境影響研究グループは，卵の分化，生殖腺，体色を決定する機構，環境と内分泌撹乱などについて分子細胞生物学的な手法を用いて研究している。平成２５年度には本研究グループでは、原著論文５編、著書・総説２編、国際学会での一般講演９件、国内学会での招待講演１件、国内学会での一般講
演１５件、研究助成金の受入は３件である。研究内容は以下の通りである。	
 １）両生類における TALEN 技術を用いた標的遺伝子の破壊	 	
  両生類は多くの独特な特徴を備えていることから、長期にわたって伝統的に重要な実験動物として用いられてきた。変態や再生といった現象の解明は生命科学にブレークスルーをもたらすことは明々白々である。無尾両生類の変態時における、尾部短縮を含む大掛かりな体の作り変えは、ほとんどの動物種では見られない。こうした興味深い出来事の分子機構を明らかにするための方策の一つとして、個体レベルでの遺伝子破壊技術を駆使して、関与する遺伝子の機能を調べることが大切である。学内共同研究を行い、TALENs を用いてツメガエ
ルの標的遺伝子破壊を試みている。	
 ２）両生類の対する内分泌かく乱化学物質の影響評価	
 内分泌かく乱化学物質が世間の耳目を集めたのは、1996 年にシーア・コルボーン等の自著『奪われし未来』が出版されてからである。EDCs とは内在性ホルモンの正常な作用をかく乱する物質のことであって、それらはヒトを含む動物
種の個体レベルでの発生・成長や性分化、脳の発達、行動、恒常性等に悪影響を及ぼすばかりでなく、種の存続にも打撃を与えることも懸念されている。内分泌かく乱化学物質の多くは化学的に安定で脂溶性が高いため、曝露個体内における生物蓄積をもたらす。私達は今、生活関連物質や医薬品の生物影響についてツメガエルを用いて調べている。	
 ３）トランスジェニックガエルを用いた甲状腺ホルモンかく乱物質スクリーニ
ングシステムの開発	 	
  環境中の化学物質の生物に対する悪影響（例えば、内分泌かく乱作用）が危
惧されている。両生類の変態は甲状腺ホルモン(TH)に支配されている。変態中のオタマジャクシからカエルへの体の作り変えは無尾両生類が最も顕著であるという点で、この動物は甲状腺ホルモンかく乱作用を持つ化学物質の生体影
響の試験評価系として非常に優れている。私達は、甲状腺ホルモンアゴニスト
またはアンタゴニストである化学物質を高感度に検出するためのトランスジ
ェニック系統を開発中である。その一例として、TH により活性化される TRβ遺伝子のプロモーター/エンハンサーとホタルルシフェラーゼ遺伝子を連結させてつくったレポーターベクターを導入して作出されたアフリカツメガエルのトランスジェニック(Tg)系統について紹介する。この系統を利用した TH かく乱物質を評価する試験系の確立を目指し、F1 世代の TH 反応性や化学物質の影響をルシフェラーゼ活性を通して評価する方法を検討した。	
 ４）NBRP ネッタイツメガエルの研究目的のための提供と、このカエルを用いた
研究提案	
 

10

	
  両生類は強い興味をそそられる特質を備えていることから、17 および 18 世
紀のヨーロッパではすでに重要な実験動物としての地位を確立していた。20
世 紀 半 ば か ら は サ ハ ラ 砂 漠 以 南 に 生 息 す る ア フ リ カ ツ メ ガ エ ル(Xenopus	
 laevis)が医学・生物学研究の重要なモデル生物として世界中の研究機関で用いられてきた。ところがこのカエルの場合、複数種の雑種からの倍数体進化によって生じた異質４倍体であり、また生活環も 1.5～2 年と長いといった欠点を有するため、今日の生命科学、特に遺伝学の研究にはもはや用をなさないのだ。これに対して、最近では①２倍体でゲノムサイズが小さい、②発生が速くて世代時間が短い（雄６ヶ月、雌８ヶ月）、③ゲノム配列の解読が終了したな
どの理由から、西アフリカ低地の熱帯雨林に生息するネッタイツメガエル(Xenopus	 (Silurana)	
 tropicalis)がポストゲノム時代の有用な実験動物として注目を集めている。	
 	
  両生類研究施設は、2012～2016 年にかけて、文部科学省の主催するナショナ
ルバイオリソースプロジェクト(NBRP)に参加、研究者や教育関係者にネッタイ
ツメガエルを提供するわが国で唯一の中核機関に指名されている。ネッタイツ
メガエルを用いて、私達はすでに環境中化学物質の内分泌かく乱影響を調査、あるいは遺伝子機能の解析のための遺伝子改変ガエルを作製している。今後は、簡便で確実な配偶子凍結法の開発、雌性発生法による近交化の促進・遺伝子組
成が斉一なホモ接合体の作出、ミュータジェネシスなどを計画中である。	
 ５）ネッタイツメガエル Myt-1 遺伝子のクローニングと初期発生における機能解析	 	
  生物の細胞周期（G1→S→G2→M→G1…）は CDK/サイクリン複合体により調節されている。CDK/サイクリン複合体が G1 期、G2 期で活性化されることにより細胞周期が S 期、M 期にそれぞれ進行する。ツメガエル卵母細胞は G2 期で停止しており、ホルモン刺激により CDK/サイクリン複合体が活性化され、M 期に進行し卵成熟を起こす。タンパク質リン酸化酵素である Myt1 は、ホルモン刺激を受けるまで CDK をリン酸化することで活性を抑制し、細胞周期（卵成熟）を抑制すると考えられている。	
 	
  Myt1 遺伝子は卵母細胞だけでなく初期胚でも発現しているが、初期発生での機能は知られていない。また近年利用が増大しているネッタイツメガエルのMyt1 遺伝子はまだクローニングされていない。そこで本研究では、ネッタイツ
メガエル Myt-1 遺伝子のクローニングと初期発生における機能解析を行った。	
 ６）卵形成における卵特異的細胞周期調節遺伝子の発現調節機構と機能解析	 	
  卵の分化機構を研究する為には、卵特異的に発現する遺伝子に着目し、その卵特異的な発現調節機構を解明する事がきわめて重要であると考えられる。卵は、減数分裂や受精後に特殊な細胞分裂を行う。例えば、減数分裂では、DNA
複製をスキップした２回の連続した分裂をするが、そのために、Mos という卵特異的な細胞周期調節因子を発現しており、この発現が DNA 複製のスキップのため必須である事を報告した。また、受精後、卵は最初の一回を除き、G１,G2
期のない細胞分裂（卵割）を中期胞胚まで行うが、そのためには、卵特異的な細胞周期調節因子である Wee1A の発現が必須である。もし、体細胞特異的な
Wee1B が発現すれば受精後の卵割は失敗する。よって、これらの卵特異的な細胞周期調節因子の発現調節機構の解明は、卵への決定・分化の機構解明につな

11

がる。	
 
７）卵成熟および初期発生におけるサイクリン B2 の２極紡錘体形成における機能	 	  MPF はサイクリン B と Cdc2 の複合体であり、M 期を引き起こす普遍的な因子である。MPF が活性化すると核膜崩壊、染色体凝縮、紡錘体の形成が起こり、M期が開始する。サイクリン B は MPF の調節サブユニットであり、多くの種でサブタイプが複数存在し、また、それぞれのサブタイプの細胞内局在も違っている。しかしながらその機能に違いがあるかどうか報告はほとんどない。この研究ではサイクリン B1 と B2 の機能の違いについて研究している。	
 ８）アフリカツメガエル初期胚に対する過重力の影響	 	
  将来、人類が宇宙へ進出して行くためには地球とは異なった重力環境下でヒトを含めた動植物が正常で健康な子孫を作れるかどうかを知る事が重要であり、もし、正常な子孫が作れないようなら、どのようにすれば異なった重力環
境で正常に生活環が回るかどうか調べる事が重要である。両生類をモデル生物
として過重力が発生にどのような影響を与えるかを調べ、その分子的な機構を調べる。	
 ９）XY 型と ZW 型生決定システムにおける生殖腺性差構築機構のちがい	 	  ツチガエルには性決定機構が XX/XY 型と ZZ/ZW 型の地域集団が存在する。それゆえ、２つの性決定メカニズムの違いおよび、両者間における生殖腺性差構築機構の違いを調べる上で優れた研究材料である。本種の ZW 型集団では、その性染色体上に SOX３遺伝子が存在する。この遺伝子は真獣類の精巣決定遺伝
子 SRY の元祖遺伝子として知られているが、ツチガエルの幼生生殖腺では逆にZW メスにおいて高い発現が観察されており、卵巣決定機能が示唆されている。
そこで、SOX３遺伝子の卵巣決定機能を検証するため、TALEN 法によるゲノム編
集を用いて機能阻害実験を行った。その結果、mutation を確認した 7 個体が変態した。ZW 個体４個体のうち１個体は精巣を形成し、性分化関連遺伝子もオス
特異的発現パターンを示した。一方、３個体の ZZ はすべて正常な精巣を形成した。ただし、そのうち２個体は卵巣分化に関連する Cyp19 と Foxl2 遺伝子の発現が正常雄よりも有意に高かった。以上の結果から、SOX3 は ZW 型集団において卵巣決定の初期因子として機能することが示唆される。	
 	
  一方、XY 型集団では、ZW 型と異なり、SOX3 遺伝子の発現は XY 雄幼生の生殖腺において高く、真獣類と同様のパターンを示した。TALEN 法による機能阻害実験を行ったところ、生殖腺の表現型に変化は見られなかった。さらに、機能誘導実験を行うため、Y-SOX3 遺伝子コンストラクトを作成し、２個体の F０個体を得た。今後、F１を作成し、その機能を検証する。	
 １０）XY 型から ZW 型へ性決定機構の進化	 	  ツチガエルの地域集団には XY 型と ZW 型の地域集団が存在している。これまでの研究成果をもとに、本種の XY 型から ZW 型へ性決定機構が進化した要因について考察した。それには、１）東西に存在する２つの元祖型集団の遺伝的な違い、２）両者の交雑による性比の偏り、３）日本列島の地質学的歴史において生じた地理的変動による集団の融合や隔離、そして４）一つないし、少数遺伝子の発現量の微小なバランスによる性決定機能の変化、の４点が性決定機構の頻繁な変化を引き起こしたものと推測した。	
 12１１）甲状腺ホルモン誘導による無尾両生類オタマジャクシ尾部短縮の機構	
 	
  筋細胞アポトーシスを通じて起こるオタマジャクシ尾部短縮は変態期における無尾両生類の最も劇的な現象のうちの一つである。多くの研究はミトコン
ドリア膜透過性遷移（MPT）がアポトーシスの重要な役割を果たしていることが示してきた。これまで我々はサイクロスポリン A（CsA）が、甲状腺ホルモン（T３）によって誘導されるミトコンドリアの膨潤と、それに伴って起こる MPTからのサイトクロム c（Cyt.c）漏出を抑制することを報告した。オタマジャク
シの変態機構のさらなる解明を目的として、T3 誘導尾部短縮におけるサイクロ
スポリンの効果を調べた。低濃度の T3 によってオタマジャクシ尾部は短縮し、それに伴う caspase-3 と-9 様酵素の活性増加、DNA 断片化およびラダー形成の増加が起こった。CsA はこれらの T3 の効果を抑制した。より高濃度の T3 とカル
シウムイオンは成体のカエル肝臓から単離したミトコンドリアの膨潤の誘導とその膨潤に伴ったアポトーシス関連物質の放出を起こし、その放出された物
質を含むフラクションは dATP の存在下において caspase-3 様酵素を活性化させた。この結果は T3 の直接的間接的作用を通じ、T3 によってミトコンドリアから Cyt.c が放出されたことを示す。これらの結果とこれまでの研究データから、ミトコンドリア MPT は T3 誘導による尾部アポトーシスにおいて重要な役割を担っており、CsA はそれらの T3 の効果を抑制すると結論づけた。	
 １２）除草剤パラコートによって誘起される培養カエル白血球細胞の染色体損傷に対するビタミン E の坑酸化機能のかく乱	
 	
  培養カエル白血球細胞を用いて、本研究はビタミン E の抗酸化機能のかく乱のメカニズムを調べている。	
 	
  活性酸素を誘発させることで、除草剤パラコートは培養細胞に染色体異常を誘発させることが知られている。そこで、培養カエル白血球細胞に対して、次の４種類の処理を行った、1）10-6	
 M パラコート処理のみ、２）10-7〜10-5	
 M ビ
タミン E 処理のみ、３）10-6	
 M	
 パラコート＋10-7〜10-5	
 M ビタミン E、４）無処理。その結果、無処理およびビタミン E 処理細胞において染色体異常を持った細胞の発生率はいずれも 10％未満であった。それに対して、パラコート処理のみの場合、染色体異常を持った細胞の発生率は 23%であった。さらに 10-6	
 M パ
ラコート＋10-5	
 M ビタミン E 処理の場合、染色体異常を持つ異常な細胞の割合
が 50％近くまでに達した。これらの結果から、ビタミン E はパラコートの細胞遺伝毒性を抑制するのではなく、むしろ強めることがわかった。	
 １３）ブチル化ヒドロキシトルエンはパラコートによって誘起される培養カエ
ル白血球細胞の染色体損傷を抑制しない	 	  化学物質が複合的反応し、それらの化学的変化が生物に与える影響はよくわ
かっていない。ビタミン E の合成アナログである抗酸化物質のブチル化ヒドロ
キシトルエンはビタミン E と同様に脂質過酸化を抑制する。しかしながら、パラコートによって誘起された培養カエル白血球細胞の染色体損傷を抑制する
ことはず、むしろ染色体損傷を増加させる結果となった。このようなことから、
ビタミン E 同様に、パラコートの共存下にあるヒドロキシトルエンは本来の働きである坑酸化作用をかく乱され、パラコートの電子ドナーとなることがわかった。化学物質が単独で働く場合と、複合的に作用する場合とではその働きが異なる一つの例である。	
 13

進化多様性・生命サイクル研究グループ	 構成員：住田正幸（施設長，教授），鈴木	  厚（准教授），倉林	  敦（助教），竹林公子（特任助教），井川	  武（特任助教），Islam	
 Mohammed	
 Mafizul（特任助教），Hasan	
 Mahmudul（研究員）	
 
○研究活動の概要	
 	
  進化多様性・生命サイクル研究グループでは，分子生物学的手法や交雑実験に基づいて両生類における種の多様性やゲノム構造の分子進化プロセスを究明するとともに，人工繁殖と精子凍結保存による絶滅危惧種の効率的な保全方法の確立を目指した研究や，光る透明ガエルの作製を進めている。また，両生類初期胚を用いた形態形成の研究も展開している。平成２５年度には本研究部
門では、原著論文９編、総説・解説など１編、国際会議での一般講演１９件、国際会議での招待講演２件、国内学会での一般講演２０件、研究助成金の受入は７件である。研究内容は以下の通りである。	
 １)絶滅危惧種アマミハナサキガエルとイボイモリの飼育下繁殖の試み	 	  アマミハナサキガエル(Odorrana	 amamiensis)は、奄美大島と徳之島に固有のカエルである。生息面積が少ないことに加え、昨今の環境破壊による個体数減少から、環境省レッドリストにおいて、絶滅危惧種 B1 類にリストされ、さらに、鹿児島県の天然記念物に指定されている。また、中央琉球に分布するイボイモリは、奄美大島や徳之島や沖縄島北部に分布しており、鹿児島県と沖縄県の天然記念物に、環境省レッドリストの絶滅危惧 II 類に指定されるなど、早急な保護対策が求められている。本研究では、これらの絶滅危惧種について
効率的な域外保全に資することを目的に、実験室での適切な人工繁殖・飼育維
持方法を確立した。	
 ２）絶滅危惧種イボイモリにおける集団構造及び遺伝的多様性の解明	
 イボイモリ Echiinotriton	
 andersoni は、奄美大島、請島、徳之島、沖縄島、
瀬底島、渡嘉敷島の 6 島に生息する西南諸島固有種である。しかしながら、他の絶滅危惧種と同様に、生息地の消失や、環境改変、ジャワマングースによる食害により個体数が激減しており、本種は IUCN レッドリストにおける絶滅危惧 IB 類に指定されている。本種の包括的かつ、効率的な保全には種内の遺伝的多様性に関する知見が不可欠である。マイクロサテライト遺伝子座は共優性であり、さらに多型性の高い分子マーカーであり、保全遺伝学の分野で広く用いられているが、すでに我々は本種に有効なマイクロサテライト遺伝子座、10座の開発を昨年度に完了している(Sugawara	
 et	
 al.,	 2012)。そこで本研究ではこれらを利用して、本種の最も詳細な種内の遺伝的構造と、集団内の遺伝的多様性を評価することを目的として、集団遺伝学的解析を行った。	
 ３）バングラデシュ産トラフガエル類における遺伝的多様性と繁殖隔離機構および飼育下繁殖	 	 	
  バングラデシュでは乱獲等によりトラフガエル H.	
 tigerinus が野外で激減しており、本種の採集は法律で禁止されている。一方、最近、著者らはバング
ラデシュの南東沿岸域から近縁種ハマトラフガエル H.litoralis を新種として記載した(Hasan	
 et	
 al.,	 2011)。本研究では、バングラデシュ全域における本種群の遺伝的多様性を明らかにするとともに、これら 2 種間の交配後隔離機構を明らかにすることを目的に、野外から採集した個体を使って、ミトコンドリ

14

ア DNA の Cytb 遺伝子を解析するとともに、人工受精法によって交雑実験を行った。さらに、本種の域外保全を目的に、野外から採集した個体を使って飼育下繁殖を試みた。	
 ４）カエル亜目における SINE の探索：SINE2-1XT ホモログおよびサブファミリーの系統的起源	 	  カエル亜目（Neobatrachia）は、現生両生類種の 95％を含む巨大な分類群である。本分類群のサブグループ（科〜亜科レベル）の多くは、大陸移動に伴い分布拡大と系統分岐を生じたとされる一方で、従来の分子系統解析では解決できない系統額上の問題が数多く残っており、正確な生物地理学的な考察が困難な状況であった。そこで、本研究では、従来法にはない利点を持つ、転移因子
SINE の挿入に基づく系統解析によって、これらの問題を解決することを最終目的として研究を行った。ただし、これまでにカエル亜目からは SINE 配列が発見されていなかったため、SINE（Short	
 INterspred	
 Element）マーカーによる系統解析を実施するためには、まず、SINE を探索し、単離・同定を行う必要があった。SINE 探索に加え、本研究では以下の点を目的として研究を実施した。
（1）両生類における SINE の起源と系統的分布の解明。(2)ゲノム内の SINE の存在比の解明と SINE 法実施可能性の検討。(3)カエルミトゲノムにおいて配置変化が生じやすい遺伝子の周辺に、SINE/LINE(Long	
 INterspred	
 Element)で共通してみられる LINE 逆転写酵素蛋白質の認識配列が存在するかの検討を行なった。	
 ５）透明ガエル「スケルピョン」の遺伝様式と真皮色素細胞の組織学的観察	 	  ニホンアカガエルには、灰色眼と黒色眼の２つの色彩突然変異があり、別々の遺伝子座の劣性ホモ接合体で発現することが分っている。本研究の目的は、これらの色彩突然変異を用いて、皮膚が透明で内臓が透けて見える透明ガエルを効率的に作製し、その遺伝様式を明らかにすることである。透明ガエルの作
製には、灰色眼、黒色眼、野生型（ヘテロ）の雌雄を用いた。人工受精法により、灰色眼♀×黒色眼♂、野生型（ヘテロ）同士、灰色眼♀×野生型（ヘテロ）♂、透明ガエル同士の４組で交配を行った。また、透明ガエルの皮膚の微細構造を調べるため、野生型、黒色眼、灰色眼および透明ガエルの真皮色素細胞を電子顕微鏡で観察した。その結果、野生型では黄色、虹色、黒色の３種類の色素細胞が層状に観察された。灰色眼には黄色素胞と虹色素胞が存在し、虹色素胞には異常な丸い反射小板が観察された。黒色眼には黄色素胞と黒色素胞が存在し、黄色素胞には未熟なプテリノソームやカロテノイド小胞が観察されたが、虹色素胞は観察されなかった。透明ガエルでは色素細胞の数が少なく、未熟な
黄色素胞様の細胞が見られ、その中にはメラノソーム様の構造も観察された。	
 ６）絶滅危惧種における精子凍結保存法の確立	 	
  絶滅危惧種の域外保全を行う上で、精子凍結保存は有効な手法である。両生類では、ツメガエルで精子凍結保存法が一般化されており、また、陸上性ガエ
ルでも、精子凍結保存後の受精率を観察した例がある。しかし、絶滅危惧両生類において、精子凍結保存を用いた域外保全法は確立されていない。本研究では、絶滅危惧両生類において精子凍結保存と人工授精を組み合わせた簡便な域外保全法を確立することを目的とした。ツメガエル類で確立されている精子凍結保存法は、液体窒素を使わず、-80℃のディープフリーザーを用いる。また、

15高価な試薬が不要という利点があり、きわめて低コストで実施が可能である。
本研究では、この方法を絶滅危惧種のアマミイシカワガエル、アマミアカガエ
ル及びアマミハナサキガエルに適用した。凍結精子（２４時間から１年、-80℃で凍結）を解凍し、運動能を調べた結果、凍結した精子のかなりが、運動能を喪失していた。しかし、この精子を用いて人工授精を行った結果、イシカワガ
エルとアマミアカガエル及びアマミハナサキガエルのいずれにおいても、正常卵割する卵が観察でき、-80℃保存精子にも受精能が残っていることが明らかになった。受精率は保存期間や卵の状態によって変動した。	
 ７）バングラデシュのヒメアマガエルに２種の新種記載	
 ヒメアマガエルは 519 種からなり、ヒメアマガエルは基準属である。この属はいろいろな外部形態によって特徴つけられる。この属のカエルはアジア全域に広く分布しており、バングラデシュには３種(Microhyla	
 ornata,	
 M.	
 berdmorei	
 
and	
  M.	
  rubra) が 知 ら れ て い る 。 最 近 、 私 た ち は Chittagong と	 Mymensingh-Sylhet	
 からミトコンドリア DNA の 16S	 rRNA 遺伝子の塩基配列情報に基づいて従来の３種とは異なるハプログループを見つけた。分子データは
これらのハプログループが他のヒメアマガエル属とは明らかに遺伝的に分化していて、形態的にも従来のものとは異なることから、バングラデシュのヒメ
アマガエル属に２種の新種を記載した。	
 	 ８）胚発生初期に背腹と頭尾のパターン形成が調和する機構	
 	
  初期発生過程において、背腹と頭尾の体軸が形成されると初めて胚の３次元座標が精確に決まり、基本的な体の体制（ボディープラン）が確立する。近年の研究から、様々な細胞増殖因子によって体軸形成が制御されることが知られており、背腹軸は腹側化因子（Bone	
 Morphogenetic	
 protein,	
 BMP）によって、頭尾軸は後方化因子（Wnt・FGF・レチノイン酸）によって、それぞれ決定されている。胚が正常に発生するためには、背腹と頭尾の体軸形成が互いに調和しながら形成される必要があるが、この調和機構については、ほとんど理解が進んでいなかった。また、数学者 Thompson をはじめとする研究者によって、生物の多様な形態を、背腹軸と頭尾軸の調和機構の変化で説明しようとする試みがなされている。最近、私達の発見を含めて、体軸形成の調和機構に関する知見が得られつつある（Fuentealba	
 et	
 al.	
 Cell	
 131,	
 980-993,	
 2007;	
 Eivers	
 et	
 
al.	
  Science	  Signaling	  4,	  ra68,	
  2011;	
  Takebayashi-Suzuki	  et	
  al.	 Developmental	
 Biology	 360,	
 11-29,	 2011）。本研究では、アフリカツメガエ
ル胚を用いた機能スクリーニングにより新たに単離した Biz(BMP	 inhibitory	
 zinc-finger)が、背腹軸と頭尾軸の制御に関わることから、Biz の機能解析を通じて体軸形成の調和機構を明らかにすることを目的とした。	
 ９）アフリカツメガエルのゲノム解析	 	
  アフリカツメガエル（Xenopus	
 laevis）は、医学生物学研究において長年使われており、膨大な研究成果を生んできた。近年のゲノム科学の進展に伴い、アフリカツメガエルのゲノムを解読して、これまでの研究成果を活用・展開させる機運が高まり、米国エネルギー省・カリフォルニア大学・テキサス大学、
および東京大学・遺伝学研究所・広島大学などによる国際共同研究が開始されている。先にゲノムが解読されたネッタイツメガエル（Xenopus	
 (Silurana)	
 tropicalis）との比較解析を行い、ゲノム・遺伝子進化のメカニズムを明らか16

にすることを目的としている。	
 １０）国際ツメガエルリソース拠点ネットワークの構築	 	
  実験モデル動物として優れた特徴を持つネッタイツメガエルおよびアフリ
カツメガエルのバイオリソースを国際的な枠組みで保存・提供するために、英国・米国のツメガエルリソース拠点と両生類研究施設が連携を始めている。特に、ネッタイツメガエルについては、文部科学省ナショナルバイオリソースプ
ロジェクト(NBRP)の平成 24 年度新規採択課題としてサポートを受けている。
両生類研究を推進するため、および両生類研究施設が国際的に貢献するために、積極的な取り組み・連携を行なうことを目的としている。	
 １１）アフリカツメガエル初期発生過程における神経誘導の保証機構にはたらく遺伝子ネットワークの解明	 	
  生物は遺伝的・環境的変化にうまく適応して生息圏を拡大している。両生類の胚は羊膜や卵殻を持たず様々な影響を受けやすいにも関わらず、正常に発生することができる。これは、両生類が遺伝的・環境的変化に適応する仕組み、
すなわち発生生物学者 C.H.Waddington により提唱されたキャナリゼーションを発達させてきたことを示唆する。初期胚は様々な遺伝的・環境的変化にさらされながらも、発生過程で背腹と前後の軸が形成され、初めて胚の３次元座標が精確に決まり、基本的な体の設計図（ボディープラン）が確立される。背腹軸は腹側化因子 BMP によって、前後軸は後方化因子 Wnt、FGF やレチノイン酸
によって、それぞれ決定されている。従来から、背腹軸と頭尾軸は互いに調和しながら形成されると考えられているが、体軸形成の調和に働く遺伝子の同定は進んでいなかった。近年になり、いくつかの知見が報告され始めたが、背腹軸と頭尾軸の個々の制御機構の理解が大幅に進んでいるのに比べ、背腹軸と頭尾軸の調和機構は、ほとんど未解明である。これまでに、私達の研究グループで同定した FoxB1 転写因子が、腹側化因子 BMP のシグナルを抑制して神経を誘導（背側化）し、後方化因子 Wnt・FGF のシグナルを活性化して胚を後方化することを明らかにしている(Takebayashi-Suzuki	
 et	
 al.,	 Dev.	 Biol.	
 2011)	
 。
すなわち、FoxB1 は、胚の背腹軸と頭尾軸の形成を制御し、これらの軸形成シ
ステムを調和させてボディープランの成立に働く。最近、FoxB1 転写因子が背腹軸と頭尾軸の調和だけでなく、神経誘導の保証機構にも重要な働きを示すこと が 分 か っ た 。 さ ら に FoxB1 転 写 因 子 と 同 様 に Biz	  (BMP	  inhibitory	
 zinc-finger)遺伝子も、腹側化因子 BMP のシグナルを抑制して神経誘導を引き起こすこと、Wnt シグナルと協調して頭尾軸形成を調節し、体軸形成の調和機構に関わることがわかった。	
 17

リーディングプログラムによる特任教員	
 構成員：高橋秀治（特任准教授）	
  	
 
○研究活動の概要	
 	  放射線災害復興を推進するフェニックスリーダー育成プログラムを担当している。平成２５年度には、原著論文２編、国際会議での一般講演１件、国内学会での一般講演２件、研究助成金の受入は５件（内１件代表）である。研究内容は以下の通りである。	
 １）アフリカツメガエル（Xenopus	
 laevis）ゲノム解読及びネッタイツメガエ
ル（Xenopus	
 tropicalis）を用いた初期発生に関与する遺伝子の解析	 	  Xenopus	
 laevis は異質倍数体（４倍体）であるためゲノムが複雑であり、最も利用され多くの発見に寄与してきたにもかかわらず全ゲノムが解読されていない。これを解読して倍数化後におこる現象を明らかにすることと、ポストゲノムの研究においても研究に寄与できる環境を整えることを目的とし日米ゲノムコンソーシアムが組織され解読を行っている。このゲノムには次世代シーケンサでは解読不可能な領域が含まれておりこれらを明らかにすることも本研究の目的としている。また、初期発生は誘導、細胞分化、細胞の移動など多彩な現象が見られ、そこでおこる遺伝子発現ネットワークの解読は幹細胞を利用した再生医療研究に大きく寄与している。本研究では初期発生の詳細な遺伝子ネットワークを明らかにすることを目的にしている。	
 

18

IV.	
 社会活動	
 ○見学研修等	 中島圭介、中島妙子	
 ・施設訪問者見学者に遺伝子破壊ネッタイツメガエルの概要説明（2013 年４月〜2014 年４月）	
 柏木昭彦、柏木啓子	
 ・	
 施設訪問者見学者にネッタイツメガエルリソースの概要説明（2013 年４月〜2014 年 3 月）	
 ・個別指導の開催：ネッタイツメガエルの飼育方法等について大阪大学や愛知教育大学から教員、ポスドク研究員、大学院生等を指導	
 柏木昭彦、田澤一朗	
 ・「第７回 NBRP データベース研究会」参加（2014 年３月、国立遺伝学研究所、三島）	
 柏木昭彦，鈴木	
  厚，古野伸明，柏木啓子，花田秀樹，田澤一朗，倉林	  敦，
中島圭介，竹林公子，小林里美，竹中純子，住田正幸	
 ・「新しい実験動物としてのネッタイツメガエル」第 60 回日本実験動物学会（2013 年 5 月、つくば国際会議場、つくば）	
 柏木昭彦，柏木啓子，花田秀樹，田澤一朗，小林里美，竹中純子，鈴木	  厚，竹林公子，古野伸明，倉林	  敦，中島圭介，住田正幸	
 ・「動物学ひろば：ツメガエルを知っていますか？」第 84 回日本動物学会	
 （2013年 9 月、玉野市立玉野海洋博物館、玉野）	
 柏木	 昭彦，柏木	 啓子，花田	 秀樹，鈴木賢一，鈴木	
  厚，竹林	
 公子，倉林	
  敦，
中島	
 圭	
 介，田澤	
 一朗，井川	
  武，小林	
 里美，竹中	 純子，玉城	
 ゆうな	
 ，
古野	
 伸明，山本	  卓，住田	
 正幸	
  	
 
・	
 「ネッタイツメガエルの近交化・標準系統の樹立・提供」第 36 回日本分子生物学会	
 	 (2013 年 12 月、神戸国際展示場	
  神戸)	
 住田正幸	 ・淡水魚水族館アクアトトロギフ「イモリ」特別展	
 2014 年 3 月〜6 月（イボ
イモリの繁殖個体展示）	
 ・オープンキャンパス 2013 年８月７日〜８日	
 研究施設紹介（7 日 45 名、8 日
34 名）	
 鈴木厚、竹林公子	
 ・	
 施設訪問者見学者に NBRP オープンラボの概要説明（2013 年４月〜2014 年３月）	
 ・日本生物学オリンピック 2013 本選（広島大会）最先端研究室訪問・実験実
習（平成 25 年 8 月）	
 ・	
 高校教員研修会「カエルの発生と中胚葉誘導・神経誘導」（講義・実験実習）の主催した（平成 25 年 11 月）。	
 ・NBRP ネッタイツメガエル技術講習会開催した（平成 26 年 3 月）。	
 
	
 
	
 
○セミナー講演会講師等	
 
高瀬	
  稔	
 

19

・平成２５年度	
 広島県科学オリンピック科学セミナー（生物分野）21 人参加	 「カエルの解剖」広島大学理学部 2013 年 7 月 31 日	
 
三浦郁夫	
 
・
“科学と芸術のカエル三昧	
 –新種発見、そして遺伝子音楽–	
 “	
  広島大学大学
院理学研究科サイエンスカフェ	
 ６月１５日（土）中国新聞ホール（中国新聞社７階）広島市	 ・“性決定機構の進化	
  〜XY 型と ZW 型のバトルと相互変換〜	
 動植物に共通	 	  するアロ認証機構の解明“	  第８回領域会議 2014 年１月９日	
 名古屋市	
 ・“カエルの性決定とその進化機構”	
 広島大学大学院生物圏科学研究科シンポジウム	  生物学の基礎的研究から水・畜産業へのトランスレーション 2014
年１月２９日	
 東広島	
 
古野伸明	
 
・河合塾での生物担当講師への講演会の講師
住田正幸	
 ・東広島市立河内西小学校「夢・感動推進事業」講師	
 2013 年 11 月 18 日	 鈴木厚	
 ・「ゲノム・遺伝子から見た発生の仕組み～ゲノム学・発生学が支える私たちの健康～」広島市教育センター	
 高校教員研修会・講演会(2013 年 7 月；招待・依頼講演)	
 ・広島市安佐北中学・高等高校	
 広島市立高等学校公開研究授業・講演（平成25 年 10 月）	
 ・「カエルの発生と中胚葉誘導・神経誘導」高校教員研修会・実験実習（2013年 11 月 23－24 日、広島県東広島市；招待・依頼講演）	
 ・インドネシア Brawijaya	
 University にて招待講演と講義（平成 25 年 10 月）	
 鈴木厚、田澤一朗、花田秀樹、竹林公子、柏木啓子、宇都武司、難波ちよ、小林里美ほか
・広島県立教育センター主催の「第 17 回生物教材バザール」に参加、教材の提供を行う（2013 年 5 月）	
 
	
 
	
 
○各種役員、委員等（学外のみ）	
 
古野伸明	
 
・広島工業大学入試委員	
 
三浦郁夫	
 
・（財）染色体学会・理事、学会誌編集委員	
 ・Editorial	 Board	 of	
 Asian	 Herpetological	
 Research	
 ・	
 豪州キャンベラ大学非常勤准教授	
 
花田秀樹	
 
・日本動物学会中四国支部	
 会計監査役員	 住田正幸	
 ・生物遺伝資源委員会委員（国立遺伝学研究所）	
 	
 ・ナショナルバイオリソースプロジェクト運営委員会委員長会議委員	
 ・日本動物学会支部代表委員･学会賞等選考委員会委員	
 20

・国際両生爬虫類学会・執行委員	
 鈴木厚	
 ・日本ツメガエル研究集会	
 組織委員	
 倉林敦	
 ・ISRN	 Genomics	
 編集委員	
 井川武	
 ・Journal	
 of	
 Tropical	
 Life	
 Science	
 編集委員	 高橋秀治	 ・XCIJ 日本ツメガエル研究集会（XCIJ-JXM）運営委員	
 ・Xenopus ゲノムプロジェクト（XGP）推進委員	
 

21

V.	
 国際交流活動	 ○国際共同研究	
 矢尾板芳郎	
 ・ヴァージニア大学（米国）	
 	
  研究テーマ：「ネッタイツメガエルの遺伝子変異作製について」	
 
中島圭介	
 
・ヴァージニア大学（米国）	
 	
  研究テーマ：「Pax	 6	
 遺伝子の解析」	
 古野伸明	
 ・レンヌ I 大学（フランス）Prof.	
 Claud	 Prigent	
 	 	
  研究テーマ：「サイクリン B の紡錘体形成に対する関与」	
 
三浦郁夫	
 
・キャンベラ大学（豪州）Dr.	
 Tariq	
 Ezaz	
 	 	 	 	
  研究テーマ：「両生類・爬虫類の性決定と性染色体の進化」	
 ・成都生物学研究所（中国）Dr.	
 Xiaomao	
 Zeng	
 	 
	
  研究テーマ：「ツチガエルの系統進化」	
 
住田正幸	
 
・バングラデシュ農業大学（学部間協定締結校）Mollah,	
 M.	
 F.	
 A.教授、Khan,	
 	
 
M.	
 M.	
 R.	
 教授	
 
	
  研究テーマ：「バングラデシュのカエル類の種多様性と遺伝的多様性に関す
る研究」	
 
鈴木厚	
 
・米国エネルギー省ほか	
  	 	
  研究テーマ：「アフリカツメガエルゲノムプロジェクト」	
 ・英国ポーツマス大学および米国ウッズホール海洋生物学研究所	
  	
 	
  研究テーマ：「国際ツメガエルリソースの国際拠点形成」	
 ・英国ガードン研究所	
  	 	
  研究テーマ：「ツメガエルリソースの系統解析」	
 倉林敦	
 ・ビショップ博物館（米国）：	
 	
  研究テーマ：「パプアニューギニア両生類インベントリー」	
 
	
  	
  	
  	
 	
  	
  「ヘビからカエルへの遺伝子水平伝播」	
 ・ブラウンシュバイク工科大学（ドイツ）	
  	
 	
  研究テーマ：「ヘビからカエルへの遺伝子水平伝播」	
 
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 「SINE 法による両生類系統解析」	
 ・中国科学院成都生物研究所（中国）	
 	
  研究テーマ「無尾類のミトコンドリアゲノムの進化」	
 
高橋秀治	
 
・Xenopus	 laevis	 gemome	 consortium（日米）	
 	
  研究テーマ：「Xenopus	
 laevis のゲノム解読」	
 ・カリフォルニア州立大学（米国）Prof.	
 Ken	
 Cho	
 
	
  研究テーマ：「初期発生期の転写制御機構の網羅的解析」	
 ・Ludwig	
 Institute	
 for	
 Cancer	 Research（スウェーデン）	
 Prof.	
 Jan	
 M.	
 Stenman	 22	
  研究テーマ：「新規 WNT シグナル制御因子の解析」	
 
	
 
	
 
○研究員受入れ	
 
住田正幸	
 
・	
 Alam	 Mohammad	
 Shafiqul	
 2013 年 4 月 1 日〜2013 年 4 月 31 日	
 ・	
 Hasan	
 Mahmudul	
 2013 年 4 月 1 日〜2014 年 3 月 31 日	
 	
 ○外国人留学生の受入れ	
 
住田正幸	
 
・文部科学省国費留学生（Sultana	
 Nasrin,	
 バングラデシュ）（D1）	
 

23

VI.	
 その他（特記事項）	
 ・ 両 生 類 研 究 施 設 国 際 シ ン ポ ジ ウ ム － Frontiers	  in	  Amphibian	  Biology:	 Endangered	
 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing－開催（委員長：住田正幸教授、庶務幹事：倉林敦助教、実行委員：矢尾板芳郎教授、中島圭介
助教、田澤一朗助教、井川武特任助教、Islam,	
 M.	
 M.	
 特任助教、島田歩希
契約一般職員）平成 26 年 3 月 27〜28 日、（1）施設所属研究者 4 名プロジェ
クトの成果発表、（2）関連分野のトップサイエンティストによる招待講演（アメリカ 1 名/イギリス 2 名/ドイツ 1 名/香港 1 名/日本 3 名）、および、（3）国内外から両生類研究者のポスター発表 46 件を行った。本事業では、生物学分野の中でも発展著しく、かつ、社会的関心の高い、「絶滅危惧種の保全」と「ゲノム編集」研究の国内外のトップサイエンティストを招聘した。招待
講演者の発表から、最先端研究の動向と解析技法など多くの新規知見を学ぶことができた。本シンポジウムには、日本を含め 11 カ国から合計 93 名の参加者があり、多様な国からの参加者に対し、両生類研究施設の最新研究成果をアピールすることができた。	
 ・	
 文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクト(NBRP)「ネッタイツメ
ガエルの近交化・保存・提供」第３期２年目は、以下の事業を行った。第 84回日本動物学会シンポジウム「生物実験材料としてのネッタイツメガエルの
長所と有用性」（2013 年 9 月、岡山大学、岡山）の開催。３学会での展示説
明（第 60 回日本実験動物学会 H25 年 5 月、第 84 回日本動物学会「動物学ひろば」H25 年９月、第 36 回日本分子生物学会 H25 年 12 月）。ネッタイツメガ
エル技術講習会開催（H25 年３月３日〜５日）。これらの事業は、前記９名の課題協力者による献身的な奉仕により達成された。NBRP ネッタイツメガエル
事業の成果は両生類研究施設の紹介記事として、日本経済新聞『春秋』欄（H25
年５月６日）に取り上げられた。また、NBRP リソースニュース「世界でオン
リーワンの両生類研究・リソースセンター」BioResource	
 Now!	
 vol.	
 9,	
 No.	
 
6,	
 1-2	
 (2013)にも紹介された。	
 ・	
 総合博物館サテライトとして玄関ロビーを一般公開した。展示には系統維
持班の職員が日常の維持を行なっている。また、田澤一朗助教は展示に関わるウェブサイトの運営を行なっている。今年度の施設見学者は 52 件 985 名であった。	
 ・国立大学協会（国大協広報誌 31 巻：2013 年 12 月）において両生類研究の研
究活（系統維持や NBRP など）が紹介された。	
 ・矢尾板芳郎教授は NHK 教育地球ドラマチック	
 「生きものはなぜ姿を変えるのか」（2013 年８月 10 日放映）を監修した。	
 ・	
 柏木昭彦特任教授は、ＪＴ生命誌研究館の表現スタッフ日記「採れる！撮れる！語り合う」（2014 年４月５日）及び「自然を知る新たな知を求めて」～映像で語る生命誌研究館の 20 年～」（2013 年 DVD ディスク）で紹介された。	
 ・	
 三浦郁夫准教授が 2013 年度染色体学会賞を受賞した。	
 ・三浦郁夫准教授は公開講演会「サドガエルが辿った進化と佐渡の自然」を開催した（2013 年７月 28 日佐渡市朱鷺交流センター）。	
 ・住田正幸教授と井川武助教は、沖縄テレビ「OTV 報道スペシャル	
 地球の宝が棲む島	 −沖縄・奄美の生き物たち−」(2013 年 9 月 1 日放送)	
 で取材協力を行24なった。	
 ・鈴木厚准教授は平成 25 年度「日本学術振興会・科学研究費補助金審査委員
表彰」（2013 年 11 月）を受けた。	
 ・倉林敦助教はBMC	
 Evolutionary	 Biology誌、Mitochondrial	
 DNA誌などの国際雑誌７誌８件のにおいて、論文レビューサービスを行った。	
 ・	
 HasanMahmudul 研究員の Hoplobatrachus	
 litoralis	
 新種記載の記事がバングラデシュ新聞（2013 年 6 月 14 日）に紹介された。	
 ・	
 小巻翔平君（学振特別研究員 D２）が Zoological	
 Science	
 Award	 2013	
 及び	
 Fujii 賞を受賞した。	
 25

VII.各研究グループの研究内容と研究業績	
 [発生研究グループ]	
 	
 教授･矢尾板芳郎（Yaoita	 Yoshio）	
 
	
 
研究内容	
 
１.	
 生殖細胞特異的なゲノム編集法の開発	
 The	
 exploitation	
 of	
 germ-line-specific	
 genome	 editing	
 
	
 
[目的]	
 
	
  本研究は両生類において TALEN を用いて生殖細胞特異的にゲノム編集を行う方法を開発するものである。目的の遺伝子変異が発生異常、致死もしくは不妊を誘導する場合、F0 でそのような異常が生じ、それ以降の解析が不可能になる。
しかし、この方法が確立すれば発生、成長、変態、性成熟、生殖等に関わる重要な遺伝子でも破壊されたホモ個体を F1 で得ることができるようになり、遺伝子の機能解析が可能となる。	
 	 [材料･方法]	
 	  germ	 plasm を含む卵割球が将来生殖細胞に分化していくことがアフリカツ
メガエルで知られている。germ	
 plasm で発現している遺伝子の mRNA の 3’UTRを、緑色蛍光蛋白質 mRNA に付加すると緑色蛍光蛋白質の mRNA が生殖細胞に限局し、緑色蛍光蛋白質そのものも生殖細胞に局在するようになる。この遺伝子の 3’UTR を付加した TALEN	
 mRNA を受精卵に注入すれば TALEN	
 mRNA は生殖細胞に限局し TALEN タンパク質も生殖細胞に局在すると考えられる。	
 	  ネッタイツメガエルのこの遺伝子の 3’UTR をクローニングする。メラニン
色素の合成に関わるチロシナーゼを標的とする TALEN	
 mRNA にこの遺伝子の3’UTR を付加してネッタイツメガエルの受精卵に注入する。この時、体細胞でチロシナーゼの破壊が行われない程度まで注入する mRNA の量を減少させる。
その個体を成熟後にアルビノネッタイツメガエルと交配させる。得られる F1の染色体の一組はアルビノ由来なので、インジェクションを行った F0 の生殖細胞におけるチロシナーゼの破壊された割合が F1 のアルビノの割合と等しくなると考えられる。	
 
	
 
[成果]	
 
	
  本研究により外見はほとんど野生型の外見を持つ F0 とアルビノネッタイツ
メガエルとの交配から高い効率でアルビノの F1 を得ることができた。	
 	
 [考察・将来の展望]	
 	
  標的遺伝子の変異を高率に生殖細胞に導入する事が可能となった。今後、生殖細胞以外の組織における変異導入率を調べる必要があると考えられる。	
 （共同研究者：中島圭介）	
 
	
 
２.	
 TALEN 法の効率を初期胚において向上させる方法の開発	
 

26

The	
 development	
 of	
 the	
 TALEN	 method	 to	
 improve	
 the	
 efficiency	
 of	
 the	
 target	 gene	
 disruption	
 
	
 
[目的]	
 
	
  母親由来ではない胚自身の遺伝子の発現が始まる mid-blastula	 transition	 (MBT)よりも早い発生段階で 100%の変異導入効率を得られる方法を開発する。
100%近く変異が導入された F0 で観察することで、標的遺伝子の変異による形質の予測が可能となる。その結果、性成熟を待ち、次の世代を得る必要がなくなり、研究のスピードが格段に上がることが期待できる。また、初期発生に重要な遺伝子でノックアウトが可能になる。	
 	 [材料･方法]	
 	  アフリカツメガエルの卵母細胞を取り出し、TALEN	
 mRNA を注入する。プロゲ
ステロンで成熟させ、他の雌の腹腔に戻して産卵させ、受精させる。この方法
では TALEN を卵母細胞で発現させ数日間おくことができるので、TALEN の発現量が高いときに受精させることが可能となり、高い変異導入効率を得ることが可能であると考えられる。	
 
	
 
[成果]	
 
	
  この方法により MBT 以前で 100%の効率で変異を導入することができた。しかし、卵母細胞での TALEN の発現量は低く、受精後にタンパク合成が盛んに行われることが新たに分かった。	
 
	
 
[考察]	
 
	
  卵母細胞で TALEN の発現量を上げれば、さらに早い段階や活性の弱い TALEN
でも確実に 100%の変異導入効率を得られるようになると考えられる。このために polyA の付加等の工夫を行う。	
 	
 [将来の展望]	 	  この方法が確立すれば F0 での遺伝子機能の解析が可能となり、研究スピードが格段に早くなるものと思われる。	
 （共同研究者：中島圭介）	
 
	
 
３.	
 ツメガエル幼生の変態での尾の退縮における ouro 遺伝子の機能の再評価	
 Reexamination	
 of	
 ouro	 gene	
 function	
 in	
 tail	 regression	
 during	
 Xenopus	 metamorphosis	
 
	
 
[目的]	
 
	
  井筒らが 2009 年に PNAS に発表した「Ouro 蛋白質を発現している尾が免疫系により拒絶されて退縮する。」という説は斬新なものであった。当時は私たちの研究室等が「変態クライマックス初期では尾の筋細胞が直接に甲状腺ホルモンに反応してアポトーシスをおこし、後半はそれに加えて細胞外基質分解酵素27

が甲状腺ホルモン反応遺伝子として誘導され、細胞が足場を失い、死んでいき、尾が退縮する。」と考えていた。本研究は、この２つの説が共に正しいのか、
またその時は、どちらの効果が大きいのかを明らかにすることを目的とする。	
 	
 [材料･方法]	 	  ouro	 1 遺伝子と ouro	
 2 遺伝子のどちらか一方のノックダウンで変態時の尾の退縮が抑制されると報告されている。ouro	
 1 遺伝子と ouro	
 2 遺伝子に対す
る TALEN を作成して、その mRNA をネッタイツメガエルの受精卵に注入しノッ
クアウトカエルを作製し、変態時の尾の変化を観察する。	
 	
 [成果･考察･将来の展望]	 	
  ouro	 1 遺伝子と ouro	
 2 遺伝子が破壊されたカエルを作製した。今後、そのカエルの交配により多数の F1 を生じさせ、それらの ouro 遺伝子変異ガエルを解析して、各々に対応する表現型を観察する。	
 
	
 
４.	
 レチノイド処理による無尾両生類幼生の尾部切断部におけるホメオティ
ック肢の誘導の再現	
 Reproduction	
 of	
 homeotic	
 limb-induction	
 on	
 the	
 amputated	
 tails	 of	
 anurans	 by	
 retinoid	
 treatment	
 
	
 
[目的]	
 
２０年程前、脊椎動物のホメオティック変異が報告された。インドの無尾両生類の幼生の尾部を切断しレチノイドで処理すると、尾ではなく、後肢の様な構造が生じた。この現象は、実験によく使われる種では再現されなかったので、分子レベルでは全く解析されてこなかった。我々はこの現象を研究するために、本邦で容易に入手可能な無尾両生類を用いてホメオティック肢形成の再現を
試みた。	
 
	
 
[材料と方法]	
 様々なカエルの幼生を用い、尾部を切断し、レチノイド溶液に移し、ホメオテ
ィック肢形成が起こるか否かを確かめた。また、ホメオティック肢におけるマーカーの遺伝子発現を RT-PCR でしらべた。	
 
	
 
[成果]	
 
処理したニホンアカガエル、ヤマアカガエル、およびアマミアカガエルの一部で尾部切断端に過剰な肢芽が認められた。これらのホメオティック肢は尾部退縮中も成長し、皮膚と筋肉は成体型のマーカー遺伝子を発現していた。	
 	 [考察・将来の展望]	
 本研究における遺伝子発現解析は、本来変態に伴い死滅する予定だった尾部の一部の細胞の運命が変化し、成体型器官として成長したことを示す。したがって、内因性レチノイドと変態後の細胞の運命制御との関係が示唆される。	
 （共同研究者：田澤一朗）	
 

28

	
 
研究業績	
 
①	
 原著論文	
 1.	
 K.	
 Nakajima	
 and	
 Y.	
 Yaoita	 (2013)	
 Comparison	
 of	
 TALEN	 scaffolds	
 in	
 Xnopus	 tropicalis.	
 Biology	
 Open,	
 2:	
 1364-1370.	
 
	
 
2.	
 K.	
 Nakajima,	
 Y.	
 Nakai,	
 M.	
 Okada	 and	
 Y.	
 Yaoita	 (2013)	
 Targeted	 gene	
 disruption	
 in	
 the	
 Xenopus	 tropicalis	
 genome	 using	 designed	
 TALE	
 nucleases	
 Zoological	
 Science,	
 30(6):	
 455-460.	
 Most	
 Read	 Articles	
 (Previous	 Month)	
 of	
 Zoological	
 Science.	
 
	
 
3.	
 Morihiro	
 Okada,	
 Ichiro	
 Tazawa,	
 Keisuke	 Nakajima	
 and	
 Yoshio	
 Yaoita	
 (2013)	
 The	
 expression	
 of	
 the	
 amelogenin	
 gene	 in	
 the	
 skin	 of	
 Xenopus	 tropicalis	 Zoological	
 Science	
 30(3),	
 154-159.	
 	
 ②	
 総説･著書	
 
該当なし	
 
	
 
③学会発表	
 
国内学会	
 
1.	
 中島	
  圭介、矢尾板	
  芳郎「Xenopus	
 tropicalis	
 における各種	
 TALEN	 の比較」	
 第 36 回日本分子生物学会年会	
 神戸市(2013,	
 12)	
 
	
 
2.	
 中島	
  圭介、矢尾板	
  芳郎「Xenopus	
 tropicalis	
 における各種	
 TALEN	 の比較」第 84 回日本動物学大会、岡山市(2013,	
 9)	
 
	
 
3.	
 田澤一朗、矢尾板芳郎「本邦産無尾両生類の尾部におけるレチノイドによるホメオティック肢形成」第 84 回日本動物学会大会、岡山市（2013,9）	
 
	
 
4.	
 中島	
  圭介、矢尾板	
  芳郎「Xenopus	
 tropicalis	
 における各種	
 TALEN	 の比較」XCIJ	
 研究集会、美祢市(2013,	
 9)	
 
	
 
5.	
 髙瀬	
  稔、田澤一朗、矢尾板芳郞、井口泰泉	
  「甲状腺ホルモンより誘導されるネッタイツメガエル甲状腺ホルモン受容体遺伝子発現に対する化学物
質抑制作用の肝臓と尾における違い」	
  環境ホルモン学会、12/12-13、2013、
東京.	
 
	
 
国際学会	
 
1.	
 Keisuke	 Nakajima	
 and	
 Yoshio	
 Yaoita“The	 exploitation	
 of	 genome	 editing	 in	
 Xenopus	 tropicalis”International	
 Symposium	
 Frontiers	
 in	
 Amphibian	 29Biology:	
 Endangered	
 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing”	
 Hiroshima,	 Japan	 (2014,	
 3.27-28,	
 100)	 
	
 2.	
 Takuya	
 Nakayama,	 Margaret	
 B.	
 Fish,	
 Marilyn	
 Fisher,	 Keisuke	 Nakajima,	 Yoshio	 Yaoita	 and	
 Robert	 M.	
 Grainger“Xenopus	
 tropicalis,	
 a	
 model	 organism	
 
for	
 the	
 new	
 genetics	
 era:	
 from	
 forward	
 to	
 reverse	
 genetics	
 and	
 now	
 to	
 gene	
 targeting”International	
 Symposium	
 Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology:	 Endangered	
 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing,	
 Hiroshima,	
 Japan	 (2014,	
 3.27-28,	
 100)	
 招待講演	 	
 3.	
 Ichiro	
 Tazawa,	
 Yoshio	
 Yaoita	 “Induction	
 of	
 homeotic	
 limbs	 by	 retinoid	 treatment	  on	
  the	
  amputated	  tails	  of	  Japanese	  anurans”International	
 Symposium	
 Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology:	
 Endangered	
 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing,	
 Hiroshima,	
 Japan	 (2014,	
 3.27-28,	
 100)	
 	
 ④科研費等の受け入れ状況	
 1.	
 文部科学省特別教育研究経費—国際的に卓越した教育研究拠点機能の充実	
 先駆的両生類研究の展開—両生類絶滅危惧種の保全	
  11,740 千円	
 （担当	
 住田
正幸、矢尾板芳郎）	
 2. 科学研究費助成事業（基盤研究 C）ノックアウト効率の改善による初代完全ノックアウト動物の作製技術開発（100 千円）

30

	
 
准教授・髙瀬	  稔（Minoru	
 Takase）	
 
	
 
研究内容	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 	
 
１．性転換機構の解析：ツチガエルおよびトノサマガエルの生殖腺に対する環
境化学物質およびエストロゲンの影響	
 Analysis	
 of	
 mechanism	
 of	
 sex	
 reversal	
 in	
 amphibians:	
 Influences	 of	
 environmental	
 chemicals	
 and	
 estrogen	
 on	
 the	
 gonads	
 of	
 the	
 frogs、	 Rana	 rugosa	 and	
 Pelophylax	
 nigromaculata	
  	
 
	
 
[目的]	
 	
 
両生類では性ホルモン処理により性転換が誘導されることが古くから知られている。しかし、そのメカニズムに関してはほとんど解明されていない。一方、内分泌かく乱作用を持つ環境化学物質が生殖腺や生殖細胞の分化に影響することが知られている。これまで、ツチガエル（Rana	 rugosa）を用いて環境
化学物質投与による生殖腺および生殖細胞への影響を組織学的に解析してきた。今回は、環境化学物質投与によるツチガエル精巣卵形成過程における遺伝
子発現について解析した。また、トノサマガエル（Pelophylax	
 nigromaculata）
を用いたこれまでのエストロゲン曝露実験の結果、雌化が起こっている可能性が考えられた。今回、再現性を確認するためのエストロゲン曝露実験を行った。	
 	
 [材料･方法]	
 広島県ツチガエルの TK ステージ X の幼生の飼育水にノニルフェノール（NP）
およびビスフェノール A（BPA）、エストラジオールベンゾエイト（EB）を添加した。曝露後の生殖腺から RNA を抽出し、ディファレンシャル・ディスプレイ
法により得られた PCR 産物のシークエンス解析を行った。	
 また、富山県トノサマガエルの受精後 10 日目の幼生の飼育水にエチニルエ
ストラジオール（EE2）を昨年度よりは低い終濃度も用いて添加し、TK ステー
ジ XX 幼生の生殖腺を組織学的に解析した。	
 
	
 
[成果]	
 
	
  得られた PCR 産物を電気泳動し、対照群と BPA 曝露群との間で発現が異なる
25 個のバンドを回収して塩基配列を解析したところ、	
 ビテロゲニン（Vtg）A1
遺伝子と高い相同性を持つ PCR 産物が含まれていることが確かめられた。	
 	
  また、トノサマガエルに対して EE2 曝露を行ったところ、曝露した濃度に依存して雌化が誘導されることが再度確かめられた。	
 
	
 
[考察]	
 
	
  これまでのネッタイツメガエル（Silurana	
 tropicalis）肝臓を用いた研究から、エストロゲン応答遺伝子として Vtg	 A および Vtg	 B をコードする遺伝子を同定してきた。しかし、ネッタイツメガエル幼生へのエストロゲン曝露による肝臓での遺伝子発現を解析したところ、Vtg	
 B とは異なり Vtg	 A はエストロ
ゲン応答性が低いことを確かめている。また、これまでの曝露実験から、ツチ

31

ガエルの NK ステージ X 幼生における精巣卵形成は BPA 曝露では誘導されたが、エストロゲン曝露では誘導されなかったことを確かめている。従って、エスト
ロゲンとは異なる作用経路による BPA の精巣卵形成に Vtg	 A1 様遺伝子が関わっている可能性が考えられる。	
 	  また、富山県トノサマガエルでは、エストロゲンによる雌化が誘導されることが再確認された。トノサマガエルではアンドロゲンにより雌から雄への性転換が誘導されることが良く知られているため、ツチガエルと同様に性転換および性分化を解析するための有用な材料になることが期待される。	
 	
 [将来の展望]	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 
	
  ツチガエル Vtg	 A1 遺伝子発現について、リアルタイム PCR 法および in	
 situ
ハイブリダイゼーション法によりさらに詳しく解析する必要がある。また、トノサマガエルの雌化について、富山県とは異なり野外個体で精巣卵が見られなかった広島県トノサマガエルを用いた曝露実験は有意義であると考える。	
 	
 ２．両生類生殖腺分化機構の解析：ネッタイツメガエルの全雄幼生集団作製の試みと予想される性決定機構	
 Analysis	
 of	
 mechanism	
 of	 gonad	 differentiation	
 in	
 amphibians:	
 Generation	 of	
 male-tadpole	
 population	
 and	
 possible	
 sex-determining	 mechanism	
 of	
 Silurana	
 tropicalis	
 
	
 
[目的]	
 
性転換機構や性分化機構を解析する場合、性に関して汎用性のある遺伝子マーカーが得られていない種においては、全て雄または全て雌からなる幼生集団が有用なツールになる。ネッタイツメガエル幼生にエストロゲンを投与すると、ほとんどが雌からなる集団が得られることから、雄から雌への性転換が誘導されることが考えられる。性決定機構が ZZ/ZW 型の場合、その雌（遺伝的雄の性転換個体）を用いた戻し交配により、全雄幼生集団が得られることが期待される。しかし、これまでの HU 系統を用いた戻し交配の結果、雄が有意に多い幼生集団は得られたが、ほぼ全てが雄からなる幼生集団は得られなかった。そこで今回、アイボリー系統を用いてエストロゲン投与および戻し交配を行った。	
 	
 [材料･方法]	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 	
 	
 	
 	
 
	
  ネッタイツメガエルのアイボリー系統 NF ステージ 48-50 の幼生に対して終濃度 100	
 nM のエストラジオールベンゾエイト（EB）を NF ステージ 66（変態完了期）まで曝露し、さらに飼育を続けて成熟個体を得た。その EB 曝露成熟個
体の雌を用いて戻し交配を行い、得られた F1 の性比を調べた。	
 
	
 
[成果]	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 
	
  EB 曝露成熟個体の雌を用いて戻し交配を行ったところ、得られた F1 は雄が33 匹に対して雌が 12 匹であった。従って、雄の出現率は 73.3%であった。一方、EB 曝露に用いた対照群では、雄が 19 匹に対して雌が 25 匹であり、雄の出
現率は 43.2%であった。	
 

32

	
 
[考察]	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 
	
  HU 系統と同様にアイボリー系統においても、エストロゲン処理により雌化は誘導され、戻し交配により雄の出現率が高い EB 処理個体が見られた。しかし、ほとんど雄からなる幼生集団は得られなかった。戻し交配に用いた個体が性転
換雄（遺伝的雌）である確証はないが、ネッタイツメガエルのアイボリー系統の性決定機構に関しても HU 系統と同様に XX/XY 型である可能性も考えられた。	
 	
 [将来の展望]	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 
	
  ネッタイツメガエルの性決定機構に関して、卵核二倍発生法によって発生させた幼生の性比を調べるなど、さらに詳しく解析する必要がある。また、遺伝的な雄または雌を同定するための遺伝子マーカーを開発し、性転換個体を識別する必要もある。	
 	
 ３．ネッタイツメガエルの肝臓と尾における甲状腺ホルモン受容体遺伝子発現に対する環境化学物質およびエストロゲンの影響	
 Effects	
 of	
 environmental	
 chemicals	
 and	
 estrogen	
 on	
 thyroid	 hormone-inducible	 thyroid	
 hormone	 receptor	
 gene	
 expression	
 in	
 the	
 liver	 and	
 tail	 of	
 Silurana	
 tropicalis	
 
	
 
[目的]	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 
	
  これまで、弱いエストロゲン作用を持つ環境化学物質ビスフェノールＡ（BPA）が甲状腺ホルモン T3 による尾の退縮および尾の甲状腺ホルモン受容体（TR）遺伝子発現に対して阻害作用を持つことが報告されている。また、尾以外の器官も TR 遺伝子を発現していることが報告されている。両生類のライフサイクルにおける環境化学物質影響を考えると、幼生と成体に共通して存在す
る TR 遺伝子発現器官に注目する必要があると考えた。そこで、幼生期および変態完了後の肝臓に着目し、甲状腺ホルモン作用に対する BPA およびエストロ
ゲンの影響について調べた。	
 	 [材料･方法]	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 	
 	
 	
 	
 
様々な発生段階のネッタイツメガエル幼生および変態完了個体の肝臓と尾から RNA を調整した。また、NK ステージ 52-54 の幼生および変態完了個体を用いて、T3 および BPA、17a-エチニルエストラジオール（EE2）の単独投与または共投与を 5 日間行い、処理後の肝臓または尾から RNA を調整した。調整したRNA を用いてリアルタイム PCR 法により TRb 遺伝子発現またはエストロゲン受
容体（ER）遺伝子発現を解析した。	
 
	
 
[成果]	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 
ネッタイツメガエル幼生の変態過程の進行と共に肝臓と尾における TRb 遺伝
子発現量は増加した。そこで、幼生に T3 を曝露したところ、濃度依存的に肝臓および尾における TRb 遺伝子発現量は増加した。一方、変態完了後の肝臓においても高い発現量が維持されていたが、T3 曝露による発現量の増加は認めら

33

れなかった。次に、T3 および BPA、EE2 を用いた曝露実験の結果、幼生の肝臓と尾における T3 誘導 TRb 遺伝子発現は BPA により有意に阻害された。しかし、EE2 は肝臓においてのみ有意に阻害した。変態完了個体の肝臓における TRb 遺伝子発現はいずれの曝露によっても有意な影響はなかった。さらに、ER 遺伝子
発現量は、変態完了個体の肝臓では高かったが、幼生の尾および肝臓では共に低く、両器官の間に有意差はなかった。	
 
	
 
[考察]	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 
幼生の肝臓は尾に比べて環境化学物質に対する感受性が高いことが示唆され、変態後の肝臓では甲状腺ホルモンによる TRb 遺伝子発現誘導も見られなかった。従って、ライフサイクルを通した環境評価を行う場合には、標的器官や発達段階を慎重に選ぶ必要があると考えられた。また、BPA の抑制作用はエス
トロゲンの作用経路とは異なる事が推察された。	
 	
 [将来の展望]	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 
	
  今後さらに、TRb 遺伝子を発現している他の器官に対する化学物質影響を調べる必要がある。	
 
	
 
研究業績	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 	
 
①原著論文	
 
該当なし	
 
	
 
②総説･著書	
 
該当なし	
 
	
 
③学会発表	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
 	
 	
 	
 	
 	
  	
 
国内学会	
 
1.小林	
  亨、髙瀬	  稔、熊倉雅彦、山本	  潤、長坂洋光、大西悠太、井口泰泉	
 「トノサマガエルの生殖腺分化におけるエチニルエストラジオールの影響」	
 環境ホルモン学会、12/12-13、2013、東京.	
 
	
 
２.髙瀬	
  稔、田澤一朗、矢尾板芳郞、井口泰泉	
  「甲状腺ホルモンより誘導されるネッタイツメガエル甲状腺ホルモン受容体遺伝子発現に対する化学物
質抑制作用の肝臓と尾における違い」	
  環境ホルモン学会、12/12-13、2013、
東京.	
 
	
 
国際学会	
 
1.	
 Minoru	
 Takase	 “Sex	 reversibility	
 in	
 amphibian	
 and	
 its	
 applications:	
 sex-hormone-inducible	
 sex	
 reversal	
 in	
 Rana	
 rugosa,	
 sex	
 determination	
 in	
 Silurana	
 tropicalis,	
 and	
 model	 amphibians	
 as	
 environmental	
 indicator”	
 International	
 Symposium	
 Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology:	
 Endangered	 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing.	
 Hiroshima,	
 Japan,	
 27-28th	
 March.	
 

34

	
 
④科研費等の受け入れ状況	 １．科学研究補助金	
  基盤研究（Ｃ）「カエル精巣卵形成に対する内分泌かく
乱物質のエストロゲン作用とは異なる遺伝子発現」代表者：髙瀬	  稔	
  1,000
千円.	
 

35

	
 
助教・中島圭介	
 (Keisuke	 Nakajima)	
 
	
 
研究内容	
 
１.	
 生殖細胞特異的なゲノム編集法の開発	
 The	
 exploitation	
 of	
 germ-line-specific	
 genome	 editing	
 
	
 
[目的]	
 
	
  本研究は両生類において TALEN を用いて生殖細胞特異的にゲノム編集を行う方法を開発するものである。この方法が確立すれば発生、成長、変態、性成熟、生殖等に関わる“子孫を残すために重要な”遺伝子が破壊されたホモ個体を F1で得ることができるようになる。これまで F0 が致死もしくは不妊のためにリバースジェネティックスを用いた解析が不可能であった遺伝子の機能解析がF1 で可能となる。これらの新たな知見は様々な病因の解明につながるものであり、人類の健康の増進に大きく寄与する。	
 	  近年まで標的遺伝子を破壊するノックアウト法は胚性幹細胞が樹立されていたマウスやラットなどのごく一部のモデル動物でのみ可能であった。しかしここ数年の間に ZFN や TALEN、CRIPR/Cas9 といった標的遺伝子破壊を可能とす
る新しいツールが次々と開発されてきた。これらのツールは RNA を受精卵に注入するだけで標的遺伝子破壊が可能であり、胚性幹細胞が樹立されていない両生類や魚類、昆虫など極めて多くの実験動物で有効に機能することが示されてきた。	
 	
  本研究室でも ZFN を用いて色素を合成する遺伝子を破壊することにより、世界初のアルビノネッタイツメガエルを作出した。また TALEN 法がネッタイツメ
ガエルでも有効に機能することを示し、次々と開発される TALEN の新技術の中でどれが最も有効であるかを示してきた。	
 	  TALEN 法はネッタイツメガエルにおいて極めて有効に機能するツールであり、ほぼ完全に標的遺伝子を破壊することも可能である。しかし、この方法では全身の細胞の遺伝子を破壊しているという保証はなく、遺伝子の機能を科学的に証明するためには全ての対立遺伝子が破壊された子孫である F1 のホモ個体を取らなければならない。もしも標的とする遺伝子が発生、成長、変態、性成熟、生殖等に関わる“子孫を残すために重要な”遺伝子であった場合、完全に標的遺伝子が破壊された個体は次の世代を残すことはできない。かといって活性を弱めて一部の細胞だけで標的遺伝子を破壊した場合には F1 で両方の対立遺伝子が破壊されたホモ個体を得ることは困難となる。この問題を解決するためには親の発生、成長、変態、性成熟を妨げずに生殖細胞の標的遺伝子のみを破壊しなければならない。そこで本研究では親の生殖細胞のみで TALEN を働かせる
方法の開発を行う。	
 	
 [材料･方法]	 	  TALEN を生殖細胞のみで働かせるためにはいくつかの方法が考えられるが、これまでの知見や技術的な制限から二つの方法が有効であると考えられる。一つは生殖細胞でのみ mRNA の転写が行われるようにする方法であり、二つ目は36

生殖細胞のみでタンパク質の翻訳を行わせる方法である。一つ目の方法を行う
ためには生殖細胞のみで発現が行われる遺伝子のプロモーター領域を同定し、TALEN の上流に組み込み、これをトランスジェニックの技術を用いてゲノムに組み込む。しかし、この方法では標的遺伝子ごとにトランスジェニック動物を作出する必要があり、多くの時間と労力を必要とする。二つ目の方法を実現するにあたり、ある遺伝子の 3’UTR が役に立つと考えられる。この遺伝子は germ	 plasm と呼ばれる場所で発現しており、germ	
 plasm を含む卵割球が将来生殖細胞に分化していくことがアフリカツメガエルで知られている。この遺伝子の発現部位を決めているのは mRNA の 3’UTR であり、緑色蛍光蛋白質の mRNA にこの遺伝子の 3’UTR を付加すると緑色蛍光蛋白質の mRNA が生殖細胞に限局し、緑色蛍光蛋白質そのものも生殖細胞に局在するようになる。この遺伝子の3’UTR をコードする配列を TALEN 発現ベクターに付加すれば、TALEN の mRNAはこの遺伝子の 3’UTR を持つことになる。この mRNA を受精卵にインジェクシ
ョンすれば TALEN	
 mRNA は生殖細胞に限局し TALEN タンパク質も生殖細胞に局在すると考えられる。	
 	  この方法の有効性を確認するために、まずはネッタイツメガエルのこの遺伝
子の 3’UTR をクローニング後、緑色蛍光蛋白質の mRNA に付加し、アフリカツ
メガエルと同様に生殖細胞に緑色蛍光蛋白質が限局することを確認する。次に色素の合成に関わるチロシナーゼを標的とする TALEN	
 mRNA にこの遺伝子の3’UTR を付加してネッタイツメガエルの受精卵にインジェクションを行う。この時、体細胞でチロシナーゼの破壊が行われない程度までインジェクションする mRNA の量を減少させ、その個体を成熟後にアルビノネッタイツメガエルと交配させる。得られる F1 の染色体の一組はアルビノ由来なので、インジェク
ションを行った F0 の生殖細胞におけるチロシナーゼの破壊された割合が F1 のアルビノの割合と等しくなる。このようにチロシナーゼを標的とすることで極めて容易にこの手法の有効性を確認することが可能となる。	
 
	
 
[成果]	
 
	
  本研究により外見はほとんど野生型の外見を持つ F0 から高い効率でアルビノの F1 を得ることができた。	
 
	
 
[考察]	
 
	
  本研究は標的遺伝子としてチロシナーゼを狙い、アルビノ個体と交配させる
ことにより、簡便に生殖細胞への変異導入率を知ることができる。今後はさらに例数を増やし、実験結果を確実なものとするとともに生殖細胞以外の組織における変異導入率を調べる必要があると考えられる。	
 	
 [将来の展望]	
 	  本研究は発生、成長、変態、性成熟、生殖等に関わる“子孫を残すために重要な”遺伝子を破壊した個体を得る為に生殖細胞のみに変異を導入する手法であり、今後このような遺伝子の機能を解析するにあたり様々な動物種で参考とされうる研究成果となることが期待される。	
 
	
 

37

２.	
 TALEN 法の効率を初期胚において向上させる方法の開発	
 The	
 development	
 of	
 the	
 TALEN	 method	 to	
 improve	
 the	
 efficiency	
 of	
 the	
 target	 gene	
 disruption	
 
	
 
[目的]	
 
	
  母親由来ではない胚自身の遺伝子の発現が始まる mid-blastula	 transition	 (MBT)よりも早い発生段階で 100%の変異導入効率を得られる方法を開発する。
この方法が開発されれば胚自身の遺伝子の働きを完全に抑えた場合の形質をF0 で観察することが可能となる。その結果、性成熟を待ち、次の世代を得る必要がなくなり、研究のスピードが格段に上がることが期待できる。	
 	
 [材料･方法]	
 	  アフリカツメガエルの卵母細胞を取り出し、濾胞細胞を除去する。この卵母細胞に TALEN をインジェクションした後、プロゲステロンで成熟させ、他の雌の腹腔に戻して産卵させ、受精させる。この方法では TALEN を卵母細胞で発現させ数日間おくことができるので、TALEN の発現量が高いときに受精させることが可能となり、高い変異導入効率を得ることが可能であると考えられる。	
 
	
 
[成果]	
 
	
  この方法により MBT 以前で 100%の効率で変異を導入することができた。しかし、卵母細胞での TALEN の発現量は低く、受精後にタンパク合成が盛んに行われることが新たに分かった。	
 
	
 
[考察]	
 
	
  卵母細胞で TALEN の発現量を上げれば、さらに早い段階や活性の弱い TALEN
でも確実に 100%の変異導入効率を得られるようになると考えられる。このために polyA の付加等の工夫を行う。	
 	
 [将来の展望]	 	  この方法が確立すれば F0 での遺伝子機能の解析が可能となり、研究スピードが格段に早くなるものと思われる。	
 
	
 
３.	
 ツメガエル幼生の変態での尾の退縮における ouro 遺伝子の機能の再評価	
 Reexamination	
 of	
 ouro	 gene	
 function	
 in	
 tail	 regression	
 during	 metamorphosis	
 of	
 Xenopus	
 tadpole	
 
	
 
[目的]	
 
	
  井筒らが 2009 年に PNAS に発表した「Ouro 蛋白質を発現している尾が免疫系により拒絶されて退縮する。」という説は斬新なものであった。当時は私たちの研究室等が「変態クライマックス初期では尾の筋細胞が直接に甲状腺ホルモンに反応してアポトーシスをおこし、後半はそれに加えて細胞外基質分解酵素が甲状腺ホルモン反応遺伝子として誘導され、細胞が足場を失い、死んでいき、38

尾が退縮する。」と考えていた。本研究は、この２つの説が共に正しいのか、
またその時は、どちらの効果が大きいのかを明らかにすることを目的とする。	
 	
 [材料･方法]	 	  ouro	 1 遺伝子と ouro	
 2 遺伝子のどちらか一方のノックダウンで変態時の尾の退縮が抑制されると報告されている。ouro	
 1 遺伝子と ouro	
 2 遺伝子に対す
る TALEN を作成して、その mRNA をネッタイツメガエルの受精卵にノックアウ
トカエルを作製し、変態時の尾の変化を観察する。	
 	
 [成果･考察･将来の展望]	 	
  ouro	 1 遺伝子と ouro	
 2 遺伝子が破壊されたカエルを作製した。今後、そのカエルの交配により多数の F1 を生じさせ、それらの ouro 遺伝子を解析して、各々に対応する表現型を観察する。	
 
	
 
研究業績	
 
①	
 原著論文	
 1.	
 K.	
 Nakajima	
 and	
 Y.	
 Yaoita	 (2013)	
 Comparison	
 of	
 TALEN	 scaffolds	
 in	
 Xnopus	 tropicalis.	
 Biology	
 Open,	
 2:	
 1364-1370.	
 
	
 
2.	
 K.	
 Nakajima,	
 Y.	
 Nakai,	
 M.	
 Okada	 and	
 Y.	
 Yaoita	 (2013)	
 Targeted	 gene	
 disruption	
 in	
 the	
 Xenopus	 tropicalis	
 genome	 using	 designed	
 TALE	
 nucleases	
 Zoological	
 Science,	
 30(6):	
 455-460.	
 Most	
 Read	 Articles	
 (Previous	 Month)	
 of	
 Zoological	
 Science.	
 	
 ②	
 総説・著書	 	  該当なし	 	 ③	
 学会発表	
 
国内学会	
 
1.	
 中島	
  圭介、矢尾板	  芳「Xenopus	
 tropicalis	
 における各種	
 TALEN	 の比較」	
 第 36 回日本分子生物学会年会	
 神戸市(2013,	
 12)	
 
	
 
2.	
 中島	
  圭介、矢尾板	
  芳郎「Xenopus	
 tropicalis	
 における各種	
 TALEN	 の比較」第 84 回日本動物学大会、岡山市(2013,	
 9)	
 
	
 
3.	
 中島	
  圭介、矢尾板	
  芳郎「Xenopus	
 tropicalis	
 における各種	
 TALEN	 の比較」XCIJ	
 研究集会、美祢市(2013,	
 9)	
 
	
 
4.	
 柏木昭彦，柏木啓子，花田秀樹，鈴木賢一，鈴木	
  厚，竹林公子，倉林	  敦，
中島圭介，田澤一朗，井川	  武，小林里美，竹中純子，玉城ゆうな	
 ，古野伸明，
山本	
  卓，住田	 正幸	
 「ネッタイツメガエルの近交化・標準系統の樹立・提供」
	
 39

第 36 回日本分子生物学会、神戸市(2013,	
 12)	
 
	
 
5.	
 柏木昭彦，柏木啓子，花田秀樹，田澤一朗，小林里美，竹中純子，鈴木	  厚，竹林公子，古野伸明，倉林	  敦，中島圭介，住田正幸	
 「ツメガエルを知っていますか？」第 84 回日本動物学会	
  動物学ひろば、玉野市(2013,	
 9)	
 
	
 
6.	
 柏木昭彦，鈴木	  厚，古野伸明，柏木啓子，花田秀樹，田澤一朗，倉林	  敦，
中島圭介，竹林公子，小林里美，竹中純子，住田正幸	
  「新しい実験動物としてのネッタイツメガエル」第 60 回日本実験動物学会、つくば市(2013,	
 5)	
 
	
 
国際学会	
 
1.	
 Keisuke	 Nakajima	
 and	
 Yoshio	
 Yaoita“The	 exploitation	
 of	 genome	 editing	 in	
 Xenopus	 tropicalis”International	
 Symposium	
 Frontiers	
 in	
 Amphibian	 Biology:	
 Endangered	
 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing”	
 Hiroshima,	 Japan	 (2014,	
 3.27-28,	
 100)	 
	
 2.	
 Takuya	
 Nakayama,	 Margaret	
 B.	
 Fish,	
 Marilyn	
 Fisher,	 Keisuke	 Nakajima,	 Yoshio	 Yaoita	 and	
 Robert	 M.	
 Grainger“Xenopus	
 tropicalis,	
 a	
 model	 organism	
 
for	
 the	
 new	
 genetics	
 era:	
 from	
 forward	
 to	
 reverse	
 genetics	
 and	
 now	
 to	
 gene	
 targeting”International	
 Symposium	
 Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology:	 Endangered	
 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing,	
 Hiroshima,	
 Japan	 (2014,	
 3.27-28,	
 100)	
 招待講演	 	
 3.	
 Akihiko	
 Kashiwagi,	 Keiko	 Kashiwagi,	
 Hideki	 Hanada,	 Atsushi	 Suzuki,	 Kimiko	 Takebayashi,	 Atsushi	
 Kurabayashi,	 Kenichi	
 Suzuki,	
 Nubuaki	 Furuno,	 Ichirou	
 Tazawa,	
 Keisuke	 Nakajima,	
 Takashi	
 Yamamoto	
 and	
 Masayuki	
 Sumida	 “National	
 BioResource	 Project	
 (NBRP)	
 Xenopus	 (Silurana)	
 tropicalis:	 Standard	
 High	 Quality	
 Inbred	
 Strain	
 for	
 Biological	
 Research”	
 International	
 Symposium	
 Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology:	
 Endangered	 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing,	
 Hiroshima,	
 Japan	 (2014,	
 3.27-28,	
 
100)	
 
	
 
4.	
 Akihiko	
 Kashiwagi,	 Keiko	 Kashiwagi,	
 Hideki	 Hanada,	 Kenichi	
 Suzuki,	 Atsushi	 Suzuki,	
 Kimiko	
 Takebayashi,	 Keisuke	 Nakajima,	
 Nubuaki	 Furuno,	 Ichirou	
 Tazawa,	
 Atsushi	
 Kurabayashi,	 Takashi	
 Yamamoto	
 and	
 Masayuki	
 Sumida	 “National	
 BioResource	 Project	
 (NBRP)	
 Xenopus	 tropicalis	
 Mass	
 Production	 of	
 High	 Quality	
 Standard	
 Inbred	
 Strains”The	 5th	
 ANRRC	 International	 Meeting,	
 Hayama,	 Japan	 (2013,	
 10.30-11.1)	
 	
 ④科研費等の受け入れ状況	
 科学研究費助成事業（基盤研究 C）平成２５〜２７年度（１９５０、１３００、
２０８０千円）課題番号 25430089	
 研究課題名：ノックアウト効率の改善による初代完全ノックアウト動物の作製技術開発	
 研究代表者氏名：中島圭介	
 

40

	
 
助教・田澤一朗（Ichiro	
 Tazawa）	
 
	
 
研究内容	
 
レチノイド処理による無尾両生類幼生の尾部切断部におけるホメオティック
肢の誘導の再現	
 Reproduction	
 of	
 homeotic	
 limb-induction	
 on	
 the	
 amputated	
 tails	 of	
 anurans	 by	
 retinoid	
 treatment	
 
	
 
[目的]	
 
２０年程前、脊椎動物としては世界初と言われるホメオティック変異が報告された。インドの無尾両生類の幼生の尾部を切断しレチノイドで処理すると、尾ではなく、後肢の様な構造が生じたのである。この現象は、脊椎動物のパターン形成機構を理解する鍵となると期待されたが、インドとヨーロッパの限られた無尾類でのみ再現され、アフリカツメガエルやウシガエルといった、世界中で実験によく使われる種では再現されなかった。この状況が、研究者（特に、インドとヨーロッパ以外の地域の研究者）がこの現象の研究をすることを甚だしく困難にしているものと思われる。そして、ホメオティック肢形成が分子レ
ベルでは全く解析されてこなかったことの大きな理由の一つであろう。我々は
この現状を改善し、自らもこの現象を研究するために、本邦で容易に入手可能な無尾両生類を用いていろいろな条件でホメオティック肢形成の再現を試み
た。	
 
	
 
[材料と方法]	
 アフリカツメガエル，ネッタイツメガエル、ニホンアカガエル、ヤマアカガエ
ル、タゴガエル、エゾアカガエル、およびアマミアカガエルの幼生を用いた。
尾部を切断し、レチノイド溶液に移し、最長２日間飼育した。尾部が退縮し始めるまでの経過を観察し、ホメオティック肢形成が起こるか否かを確かめた。
また、得られたホメオティック肢における変態関係マーカーの遺伝子発現を	 RT-PCR	
 でしらべた。	
 
	
 
[成果]	
 
処理したニホンアカガエル、ヤマアカガエル、およびアマミアカガエルの一部で尾部切断端に過剰な肢芽が認められ、ホメオティック肢形成を再現することに成功したことが判明した。アカガエル類としては過去の例より早い発生段階
で尾切断を行うことが本現象を起こすのに重要だった。これらのホメオティッ
ク肢は尾部退縮中も成長し、皮膚と筋肉は成体型のマーカー遺伝子を発現して
いた。	
 
	
 
[考察]	
 
本研究により、本邦では初めてホメオティック肢形成に成功した。このような明白なホメオティック変異は脊椎動物では現在まで世界に例がない。したがって、本研究グループは、脊椎動物の形態形成に関する新たな知見を得る１つの41

ユニークな可能性を得たことになる。本研究における発現解析は、本来変態に伴い死滅する予定だった尾部の一部の細胞の運命が変化し、成体型器官として成長したことを示す結果だった。したがって、内因性レチノイドと変態後の細胞の運命制御との関係が示唆される。	
 	
 [将来の展望]	
 レチノイドのシグナルがどのような過程で変態機構に影響を及ぼすか調べることで、両生類における幼生型のまま消滅する領域と成体型に変換される領域とを決定する機構の解明に繋がることが期待される。	
 
	
 
研究業績	
 
①	
 原著論文	
 Kurabayashi,	
 A.,	
 R.	
 Kakehashi,	
 I.	
 Tazawa,	
 Y.	
 Haramoto,	
 T.	
 Oshima,	
 Y.	
 Ito,	
 M.	
  Sumida	  (2014)	
  Improved	  transport	  of	  the	
  model	  amphibian,	  Xenopus	
 tropicalis,	
 and	
 its	
 viable	 temperature	
 for	
 transport.	
 Curr.	
 Herpetol.,	
 33:75-87.	
 
	
 
	
 
②	
 総説・著書	
 
該当なし	
 
	
 
③	
 学会発表	
 
国内学会	
 
1.	
 田澤一朗（発表者）、矢尾板芳郎「本邦産無尾両生類の尾部におけるレチノ
イドによるホメオティック肢形成」日本動物学会第 84 回大会、岡山市、2013
年 9 月	
 
	
 
2.	
 髙瀬	
  稔、田澤一朗、矢尾板芳郞、井口泰泉	
  「甲状腺ホルモンより誘導されるネッタイツメガエル甲状腺ホルモン受容体遺伝子発現に対する化学物
質抑制作用の肝臓と尾における違い」	
  環境ホルモン学会、12/12-13、2013、
東京.	
 
	
 
国際学会	
 
1.Kashiwagi	
 A,	
 Kashiwagi	
 K,	
 Hanada	 H,	
 Suzuki	
 A,	
 Takebayashi	
 K,	
 Kurabayashi	 A,	
 Suzuki	
 K,	
 Furuno	 N,	
 Tazawa	
 I,Nakajima	
 K,	
 Yamamoto	
 T	
 and	
 Sumida	 M.	
 National	
 BioResource	 Project	
 (NBRP)	
 Xenopus	 (Silurana)	
 tropicalis:	 Standard	
 High	 Quality	
 Inbred	
 Strain	
 for	
 Biological	
 Research.	
 International	
 Symposium,	
 Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology:	
 Endangered	 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing.	
 March	 27-28,	 2014.	
 Higashihiroshima,	
 Japan	 	
 2.Ichiro	
 Tazawa,	
 Yoshio	
 Yaoita.	
 Induction	
 of	
 homeotic	
 limbs	 by	 retinoid	 treatment	
 on	
 the	
 amputated	
 tails	 of	
 Japanese	 anurans.	
 International	
 42Symposium,	
 Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology:	
 Endangered	
 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing.	
 March	 27-28,	 2014.	
 Higashihiroshima,	 Japan	 	
 ④	
 科研費等の受け入れ状況	 	  該当なし	 43	 [遺伝情報・環境影響研究グループ]	
 特任教授・柏木昭彦(Akihiko	
 Kashiwagi	
 )	
 
	
 
研究内容	
 
１．NBRP ネッタイツメガエルの研究目的のための提供と、このカエルを用いた
研究提案	
 Supplying	 NBRP	
 Xenopus	 (Silurana)	
 tropicalis	
 for	
 research	
 purposes	
 and	
 proposed	
 research	
 using	 such	
 frogs	 	 [目的]	
  両生類は強い興味をそそられる特質を備えていることから、17 および18 世紀のヨーロッパではすでに重要な実験動物としての地位を確立していた。
20 世紀半ばからはサハラ砂漠以南に生息するアフリカツメガエル(Xenopus	
 laevis)が医学・生物学研究の重要なモデル生物として世界中の研究機関で用いられてきた。ところがこのカエルの場合、複数種の雑種からの倍数体進化によって生じた異質４倍体であり、また生活環も 1.5～2 年と長いといった欠点を有するため、今日の生命科学、特に遺伝学の研究にはもはや用をなさないのだ。これに対して、最近では①２倍体でゲノムサイズが小さい、②発生が速くて世代時間が短い（雄６ヶ月、雌８ヶ月）、③ゲノム配列の解読が終了したな
どの理由から、西アフリカ低地の熱帯雨林に生息するネッタイツメガエル(Xenopus	 (Silurana)	
 tropicalis)がポストゲノム時代の有用な実験動物として注目を集めている。	
 	
  両生類研究施設は、2012～2016 年にかけて、文部科学省の主催するナショナ
ルバイオリソースプロジェクト(NBRP)に参加、研究者や教育関係者にネッタイ
ツメガエルを提供するわが国で唯一の中核機関に指名されている。	
  	
 
	
 
	
 [将来の展望]	
  ネッタイツメガエルを用いて、私達はすでに環境中化学物質の内分泌かく乱影響を調査、あるいは遺伝子機能の解析のための遺伝子改変ガエルを作製している。今後は、簡便で確実な配偶子凍結法の開発、雌性発生法
による近交化の促進・遺伝子組成が斉一なホモ接合体の作出、ミュータジェネ
シスなどを計画中である。	
 
	
 
	
 
２．トランスジェニックスクリーニング法を用いた化学物質による甲状腺ホルモンかく乱作用の評価	 	
 Evaluating	 chemical	
 related-thyroid	
 hormone	 disruption	
 using	 transgenic	 screening	 techniques	 	 	 [目的]	
  環境中に存在する、天然もしくは人工の化学物質が正常な内分泌機能をかく乱することにより、ヒトや野生生物のホメオスタシスや発生、生殖、性分化、行動に悪影響を及ぼし、さらにはガンの発症をも惹起することが懸念されている。また、個体発生の初期段階における内分泌かく乱化学物質(EDCs)への曝露影響は特に顕著で次世代にも伝わると考えられる。EDCs の作用メカニ44

ズムには、ホルモンレセプターとの相互関係はもとより、ホルモンの合成・移動・代謝の阻害、レセプターのリン酸化などが含まれる。多くの EDCs は非常に安定で親脂性であるから、曝露個体内に生物濃縮される。無尾両生類の変態現象は甲状腺ホルモンに負うところが大きく、そのシステムはヒトへの EDCs
曝露リスクを推定するのに有用である。本研究では、甲状腺ホルモンアゴニス
トまたはアンタゴニストである化学物質を高感度に検出するためのトランス
ジェニック系統を開発する。	
 
	
 
[方法]	
  甲状腺ホルモン応答レセプター依存性 EGFP 遺伝子を発現するトラン
スジェニックツメガエルの F1 幼生を用いて、甲状腺ホルモン[T3；対照群]および T3+生活関連物質・医薬品[実験群；(Pharmaceuticals	
 and	
 Personal	
 Care	
 Products;	
 PPCPs)]に曝露した。	
 	
 [結果と考察]	
  対照群に幼生の EGFP 活性は甲状腺ホルモン濃度に依存して増加した。これに対して、実験群では減少したため、被験物質は甲状腺アンタゴ
ニストであることがわかった。これらの結果から、本研究で開発したこのトラ
ンスジェニックガエル系統を使うと化学物質と甲状腺ホルモン受容体との相互作用を簡単で迅速にしかも高感度で in	
 vivo バイオアッセイできることがわ
かった。	
 
	
 
[将来の展望]	  このトランスジェニック系統を用いて、各種多様な化学物質の単品はもとより混合物のかく乱作用を調べる。	
 	
 ３．TALENs を用いたノックアウトアフリカツメガエルの作製	 The	
 production	
 of	
 knockout	
 Xenopus	 laevis	
 using	 TALENs	
 
	
 
[目的]	
  本研究の目的は、DNA 結合ドメインの Transcription	
 activator-like	 effectors	
 (TALEs)と切断ドメインの制限酵素 FokI を連結させた人工ヌクレア
ーゼ TALENs を用いた標的遺伝子破壊法がアフリカツメガエルで効率的に適用できるかどうかを調べることである。	
 
	
 
[方法]	
  メラニン合成に関わるチロシナーゼ遺伝子(try)、および眼の形成に必要なマスター制御遺伝子 pax6 を標的とする TALEN をアフリカツメガエル受
精卵に導入した。	
 	
 [結果と考察]	
  DNA２本鎖の切断が生じたのち、非相同末端再結合による塩基の置換・欠失・挿入が起こり try および pax6 両遺伝子のノックアウトが誘起されたため、前者では白化現象、後者では無眼症・小眼症が高頻度で見られた。
TALEN 標的遺伝子破壊法は遺伝子改変ツメガエルを作製するのに非常に優れた技術であることが証明された。	
 	
 [将来の展望]	
  TALEN 法や CRISPR/Cas9 法の開発によって両生類逆遺伝学は新たな段階に突入している。	
 

45

	
 
研究業績	
 
①	
  原著論文	  	 1.Hanada	
 ,H.,	
 Kobuchi,	
 H.,	
 Yamamoto,	
 M.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Katsu,	
 K.,	
 Utsumi,	 T.,	
  Kashiwagi,	  A.,	
  Sasaki,	  J.,	
  Inoue,	  M.	
  and	
  Utsumi,	  K.	
  (2013)	
 Acetyl-L-carnitine	
 suppresses	
 thyroid	
 hormone-induced	
 and	
 spontaneous	 anuran	 tadpole	 tail	 shortening.	
 Hereditas,	
 150:	
 1-9.	 	
 2.Suzuki,	
 K.,	
 Isoyama,	
 Y.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Sakuma,	
 T.,	
 Ochiai,	
 H.,	
 Sakamoto,	
 N.,	
 Furuno,	
 N.,	
 Kashiwagi,	
 A.	
 and	
 Yamamoto,	
 T.	
 (2013)	
 High	
 efficiency	 TALENs	  enable	  F0	
  functional	  analysis	
  by	
  targeted	  gene	  disruption	  in	
 Xenopus	 laevis	 embryos.	
 Biology	
 Open	
 2:448-452	
 	
 3.Sakane,Y.,	
  Sakuma,T.,	
  Kashiwagi,K.,	
  Kashiwagi,A.,	
  Yamamoto,T.	
  and	
 	 Suzuki,	 K.(2014)	
 Targeted	 mutagenesis	
 of	
 multiple	
 and	
 paralogous	 genes	 in	
 Xenopus	 laevis	
 using	 two	
 pairs	 oftranscription	
 activator-like	 effector	
 nucleases.	
 	
 Dev.	
 Growth	
 Diff.,	 56:108-114.	
 	 ②	
 総説・著書	 1.	
 Hanada	
 ,H.,	 Kashiwagi,	
 K.,	
 Suzuki,	
 K.,	
 Yamamoto,	
 T.	
 and	
 Kashiwagi,	
 A.	
 (2013)	
 Suppression	
 of	
 anuran	 metamorphosis	
 by	
 synthetic	
 chemicals.	
 (in	 press)	
 	
  Frogs:	
 Genetic	
 Diversity,	
 Neural	 Development	
 and	
 Environmental	
 Influences.	
 (NOVA,	
 Sweden)	
 pp.73-88	 	
 ③学会発表	
 国内学会	 1.柏木昭彦，鈴木	  厚，古野伸明，柏木啓子，花田秀樹，田澤一朗，倉林	  敦，
中島圭介，竹林公子，小林里美，竹中純子，住田正幸「新しい実験動物としてのネッタイツメガエル」第 60 回日本実験動物学会（2013 年 5 月、つくば国際会議場、つくば）	
 	
 2.柏木昭彦，柏木啓子，花田秀樹，田澤一朗，小林里美，竹中純子，鈴木	  厚，竹林公子，古野伸明，倉林	  敦，中島圭介，住田正幸	
  「動物学ひろば：
ツメガエルを知っていますか？」	
  第 84 回日本動物学会	
 （2013 年 9 月、
玉野市立玉野海洋博物	 館、玉野）	
 	
 3.オーガナイザー：加藤尚志（早稲田大）、柏木昭彦（広島大）；講演者：山本	 卓（広島大）、加藤尚志（早稲田大）、田村宏治（東北大）、入江直樹（東京大）、鈴木賢一（広島大）「生物実験材料としてのネッタイツメガエルの
長所と有用性」第 84 回日本動物学会シンポジウム（2013 年 9 月、岡山大学、岡山）	
 46

4.花田秀樹、小渕	
 浩嗣、柏木啓子、内海俊彦、井上正康、佐々木順三、勝賢
二郎、佐藤英介、内海耕慥、柏木昭彦	
  「アセチル-L-カルニチンによる
無尾両生類幼生尾部短縮の抑制」日本動物学会	
  第 84 回大会	  （2013 年	
 9 月	  岡山大学、岡山）	
 5.	
 柏木啓子、鈴木賢一、佐能正剛、花田秀樹、山本	
  卓、新海	  正、古野伸明、太田	  茂、柏木昭彦	
 	
 「両生類を用いた甲状腺ホルモン作用	
 かく乱化学物質の評価」	
  	
  第 84 回日本動物学会	
  （2013 年 9 月、岡山
大学、岡山）	
 
	
 
6.	
 柏木	
 昭彦，柏木啓子，花田秀樹，鈴木賢一，鈴木	
  厚，竹林公子，倉林	
  敦，
中島圭	
 介，田澤一朗，井川	  武，小林里美，竹中純子，玉城ゆうな	
 ，古野伸明，山本	
  卓，住田正幸	  「ネッタイツメガエルの近交化・標準系統の樹立・提供」第 36 回日本分子生物学会	
 	 (2013 年 12 月、神戸国際展示場	
  神
戸)	
 
	
 
7.	
 中出翔太、	
 鈴木賢一、佐久間哲史、	
 重田美津紀、	 柏木昭彦、	
 柏木啓子、	
 山本卓、	
 小原政信「TALEN を用いたツメガエル発生過程におけるサイトグ
ロビンの機能解析」第 36 回日本分子生物学会（2013 年 12 月、神戸市）	
 
	
 
8.	
 鈴木賢一、山本卓、柏木昭彦	
  WS（動物のメタモルフォーゼ：個体のライ
フスタイルの劇的変容を支える分子・細胞基盤に関する研究の最前線）「ツメガエル変態における甲状腺ホルモン受容体やその標的遺伝子の特徴」第
36 回日本分子生物学会（2013 年 12 月、神戸市）	
 
	
 
国際学会	
 
1.	
 Kashiwagi	
 A.,	
 Kashiwagi	
 K.,	
 Hanada	 H.,	
 Suzuki	
 K.,	
 Suzuki	 A.,	
 Takebayashi	
 K.,	
 	 Nakajima	
 K.,	
 Furuno	 N.,	
 Tazawa	
 I.,	
 Kurabayashi	
 A.,	
 Yamamoto	
 T.	
 and	
 	
 Sumida	 M.	
 	
 「National	
 BioResource	 Project	
 (NBRP)	
 Xenopus	 tropicalis	
 Mass	
 Production	
 of	
 High	 Quality	
 Standard	
 Inbred	 Strains.」The	 5th	
 ANRRC	 International	
 Meeting	 (October	
 30-November	
 1,	
 
2013	
 in	
 Shonan	
 Village	 Center,	
 Hayama,	 Japan)	
 	
 2.	
  Isoyama,	  Y.,	
  Kashiwagi,	
  K.,	
  Kashiwagi,	  A.,	  Yamamoto,	  T. 	
  「 Gene	 knockout	 in	
 Xenopus	 using	 TALENs.」46th	
 Annual	 Meeting	
 of	
 JSDB,	
 5th	
 May,	
 Matsue,	 Japan.	
  (2013,	
 5th	
 May,	 Matsue,	 Japan.)	
 	
 3.	
 Kashiwagi	
 A.,	
 Kashiwagi	
 K.,	
 Hanada	 H.,	
 Suzuki	
 A.,	
 Takebayashi	
 K.,	
 Kurabayashi	
 A.,	
 Suzuki	
 K.,	
 Furuno	 N.,	
 Tazawa	
 I.,	
 Nakajima	
 K.,	
 Yamamoto	 T.	
  and	
  Sumida	  M. 	
  	
  「 National	  BioResource	  Project	  (NBRP)	
  Xenopus	
 (Silurana)	
  tropicalis:	
  Standard	  High	  Quality	  Inbred	  Strain	  for	
 Biological	
 Research」International	
 Symposium	 	
 Frontiers	
 in	
 Amphibian	 Biology:	
 Endangered	
 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing	 (March	 47

27-28,	 2014	 Institute	 for	
 Amphibian	
 Biology,	
 Graduate	
 School	 of	
 Science,	 Hiroshima	
 University,	
 Higashihiroshima,	
 Japan)	
 	
 4.	
 Watanabe	
 A.,	
 Igawa	 T.,	
 Kashiwagi	
 A.,	
 Suzuki	
 A.,	
 Kurabayashi	
 A.,	
 Fujii	
 T.	
 and	
 Sumida	 M.「Inbreeding	 coefficient	
 and	
 genetic	
 relationship	
 of	
 seven	 strains	
 of	
 Xenopus	 tropicalis	 inferred	
 from	 genome	 wide	
 genotyping	
 of	
 54	
 microsatellite	 loci」International	
 Symposium	 	
 Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology:	
 Endangered	
 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing	 (March	 27-28,	 2014	 Institute	 for	
 Amphibian	
 Biology,	 Graduate	
 School	 of	
 Science,	
 Hiroshima	
 University,	
 Higashihiroshima,	 Japan)	
 	
 5.	
 Suzuki,	
 A.,	
 Kashiwagi	
 A.,	
 Kashiwagi	
 K.,	
 Hanada	 H.,	
 Takebayashi-Suzuki	
 K.,	
 Tazawa	
 I.,	
 Furuno	 N.,	
 Kurabayashi	
 A.,	
 Kobayashi	
 S.,	
 Takenaka	
 J.,	
 Tamaki	
 Y.,	
 Igawa	
 T.,	
 Uto	
 T.,	
 Nanba	 C.,	
 Watanabe	
 A.,	
 Yoshida	
 H.,	
 Shimada	
 
A.	
 and	
 Sumida	 M.「International	
 Xenopus	 Resource	 Network	 and	
 Educational	
 Activities	
 at	
 Institute	 for	
 Amphibian	
 Biology」
International	
 Symposium	 	
 Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology:	
 Endangered	 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing	 (March	 27-28,	 2014	 Institute	
 for	
 Amphibian	
 Biology,	
 Graduate	
 School	 of	
 Science,	
 Hiroshima	
 University,	
 Higashihiroshima,	
 Japan)	
 	
 ④	
 科研費等の受け入れ状況	
 1.	
 平成 24 年度	
  EXTEND2010 基盤的研究「ツメガエル変態アッセイを用いた甲状腺ホルモンかく乱化学物質のスクリーニングシステムの開発」2000 千円（代表）	
 ２．平成 25 年度	
  芝浦工業大学システム理工学部大学院重点研究	  「アミオ
ダロン暴露による水生両生類の甲状腺への影響」500 千円(分担)	
 

48

	
 
准教授・古野伸明（Nobuaki	 Furuno）	
 
	
 
研究内容	
 
１.	
 ネッタイツメガエル Myt-1 遺伝子のクローニングと初期発生における機能
解析	
 Molecular	 cloning	
 of	
 the	
 myt1	 and	
 the	
 analysis	
 of	
 the	
 myt1	
 function	
 in	
 early	
 Silura	
 (Xenopus)	
 tropicalis	
 embry	 	 	  生物の細胞周期（G1→S→G2→M→G1…）は CDK/サイクリン複合体により調節されている。CDK/サイクリン複合体が G1 期、G2 期で活性化されることにより細胞周期が S 期、M 期にそれぞれ進行する。ツメガエル卵母細胞は G2 期で停止しており、ホルモン刺激により CDK/サイクリン複合体が活性化され、M 期に進行し卵成熟を起こす。タンパク質リン酸化酵素である Myt1 は、ホルモン刺激を受けるまで CDK をリン酸化することで活性を抑制し、細胞周期（卵成熟）を抑制すると考えられている。	
 	
  Myt1 遺伝子は卵母細胞だけでなく初期胚でも発現しているが、初期発生での機能は知られていない。また近年利用が増大しているネッタイツメガエルのMyt1 遺伝子はまだクローニングされていない。そこで本研究では、ネッタイツ
メガエル Myt-1 遺伝子のクローニングと初期発生における機能解析を行った。	
 	
 ［目的と結果］	
 作成したネッタイツメガエル cDNA ライブラリーを鋳型として Myt1 遺伝子に対するプライマーを作製し PCR を行った。増幅された DNA をプラスミドにクロー
ニングし塩基配列を決定したところ、Myt-1 遺伝子であることを確認した。次に Myt1 遺伝子の初期発生における機能解析のため、Myt１にさまざまなアミノ酸変異を導入し、活性化型、ドミナントネガティブ型および機能欠失型の変異体を作成した。野生型およびこれらの変異体から mRNA を合成し、ツメガエル
初期胚へ顕微注射し初期卵割のパターンや初期発生に対する影響を調べた。その結果、野生型や機能欠失型の場合はほとんど影響が見られなかったが、活性化型、ドミナントネガティブ型の場合は初期卵割の遅れ（=細胞周期の抑制）が観察された。この結果は、卵成熟における Myt-1 遺伝子の機能と一致する。
したがって Myt-1 遺伝子は、ツメガエルの卵成熟だけでなく初期発生の過程でも、細胞周期の抑制因子として機能していることが示唆された。	
 	
 ２.卵形成における卵特異的細胞周期調節遺伝子の発現調節機構と機能解析	
 Analysis	
 of	
 the	
 regulatory	
 mechanisms	
 of	
 oocyte	 specific	
 cell	
 cycle	 gene	
 expression	
 and	
 function	
 during	
 Xenopus	
 oogenesis	 	 	  卵の分化機構を研究する為には、卵特異的に発現する遺伝子に着目し、その卵特異的な発現調節機構を解明する事がきわめて重要であると考えられる。卵は、減数分裂や受精後に特殊な細胞分裂を行う。例えば、減数分裂では、DNA
複製をスキップした２回の連続した分裂をするが、そのために、Mos という卵49

特異的な細胞周期調節因子を発現しており、この発現が DNA 複製のスキップのため必須である事を報告した。また、受精後、卵は最初の一回を除き、G１,G2
期のない細胞分裂（卵割）を中期胞胚まで行うが、そのためには、卵特異的な細胞周期調節因子である Wee1A の発現が必須である。もし、体細胞特異的な
Wee1B が発現すれば受精後の卵割は失敗する。よって、これらの卵特異的な細胞周期調節因子の発現調節機構の解明は、卵への決定・分化の機構解明につな
がる。	
 
	
 
［目的と結果］	
 	
  細胞周期調節因子に母性型があると分かって来たのは最近であり、その発現調節機構の研究は今までに行われていない。現在、ニシツメガエルの Mos とWee1A のプロモ−タ−領域と思われる部分（翻訳開始点より１０kbo 上流まで）をクローニングし、GFP の上流に挿入した transgenic	
 ガエル作製用のベクターを構築した。このコンストラクトや、プロモーターにいろんな欠失を導入したコンストラクトで transgenic	 ガエルを作製し、卵特異的な発現に必要な領域を特定する。また、これらの遺伝子のノックアウトも行いたい。昨年は ZNFを用いて、mos の遺伝子破壊を試みて positive な結果を得ている。このようにして卵特異的な細胞周期調節因子の発現調節機構と機能の解析を行う。	
 	
 ３.卵成熟および初期発生におけるサイクリン B2 の２極紡錘体形成における機
能	
 
The	
 role	 of	
 the	
 cyclin	
 B2	
 in	
 the	
 bipolar	 spindle	 formation	
 during	 oocyte	 maturation	
 and	
 early	 embryogenesis	 	 	  MPF はサイクリン B と Cdc2 の複合体であり、M 期を引き起こす普遍的な因子である。MPF が活性化すると核膜崩壊、染色体凝縮、紡錘体の形成が起こり、M期が開始する。サイクリン B は MPF の調節サブユニットであり、多くの種でサブタイプが複数存在し、また、それぞれのサブタイプの細胞内局在も違っている。しかしながらその機能に違いがあるかどうか報告はほとんどない。この研究ではサイクリン B1 と B2 の機能の違いについて研究している。	
 	
 ［目的と成果］	
 ツメガエルの卵母細胞や胚ではサイクリン B1 とサイクリン B2 が主に発現しており、機能差を解析する良い系である。今までに、この系を用いて、サイクリン B１でなくサイクリン B２が正常な紡錘体の形成に関与することを明らかにした。また、サイクリン B2 の N 末端から約９０アミノ酸から１２０アミノ酸までに２極の紡錘体を形成するのに働く領域があることがわり、この領域がNES	
 (Nuclear	
 export	 signal)として働くことや、その NES の機能と２極の紡錘体の形成能が関係していることが明らかになった。最近、正常はサイクリン
B２が紡錘体の極を作る領域に局在する事、また、その局在がサイクリン B２のNES を過剰発現させる事で乱され、これが CRS 過剰発現による２極紡錘体の形
成異常を引き起こす原因であると推定された。さらに、２極紡錘体形成に必要
な Eg5	
 50

が関与していることを示唆する結果をえている。	
 	
 ４.アフリカツメガエル初期胚に対する過重力の影響	
 Effects	
 of	 hypergaravity	
 on	
 gene	
 expression	 and	
 molecular	
 analysis	
 of	
 head-deffects	
 in	
 early	
 Xenopus	 embryos	 	 	  将来、人類が宇宙へ進出して行くためには地球とは異なった重力環境下でヒトを含めた動植物が正常で健康な子孫を作れるかどうかを知る事が重要であり、もし、正常な子孫が作れないようなら、どのようにすれば異なった重力環
境で正常に生活環が回るかどうか調べる事が重要である。両生類をモデル生物
として過重力が発生にどのような影響を与えるかを調べ、その分子的な機構を
調べる。	
 
	
 
[目的と成果]	
 
両生類であるアフリカツメガエルをモデル生物として、初期発生や変態期に焦点を絞って過重力の影響を調べる。その結果、過重力に感受性が高い時期は、受精後から卵割が始まるまでである事が判明した。WISH を用いた実験から、過重力は頭部形成に特異的な影響を与える事が明らかになった。また、RT-PCRを用いる事より、過重力は、少なくとも Wnt のシグナルを弱めるように作用して、頭部形成に影響を及ぼしている事が明らかになった。また、変態は甲状腺ホルモンの支配によって起こるが、過重力環境下では甲状腺の成長が抑制され、微小重力環境下（地上においても、強磁場を用いると微小重力環境がえられる）においては、逆に甲状腺の成長が促進される事がわかった。このことから、ヒトも地球外環境下では甲状腺に影響が出る事が示唆される。	
 
	
 
研究業績	
 
①	
 原著論文	
 1.	
 Suzuki,	
 K.,	
 Isoyama,	
 Y.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Sakuma,	
 T.,	
 Ochiai,	
 H,	
 Sakamoto,	
 N.,	
 Furuno,	
 N.,	
 Kashiwagi,	
 A.	
 and	
 Yamamoto,	
 T.	
 High	
 efficiency	
 TALENS	 enable	 F0	
 functional	
 analysis	
 by	
 targeted	 gene	
 disruption	
 in	
 Xenopus	 laevis.	
 Biologiy	
 Open	 (2013)	
 448-452	
 	
 2.	
 Sekiguchi,	
 T.,	
 Kamada,	
 Y.,	
 Furuno,	
 N.,	
 Funakoshi,	
 M.	
 and	
 Kobayashi,	 H.	
  Probing	  the	
  amino	  acid	  residues	  required	  for	
  Gtr1p-Gtr2p	
  complex	 formation	
 and	
 its	
 interactions	 with	 the	
 Ego1p-Ego3p	
 complex	
 and	
 TORC1	 components	
 in	
 yeast.	
 Gene	 to	
 Cell	 (2014)	
 in	
 press	 	 ②	
 総説・著書	 サイクリン B2 の細胞内局在と紡錘体形成	  吉留賢、古野伸明	
  生体の科学	 (2013),	
 64,	
 360-365	 	
 ③学会発表	
 
国内発表	
 

51

1.	
 柏木昭彦，鈴木	  厚，古野伸明，柏木啓子，花田秀樹，田澤一朗，倉林	  敦，
中島圭介，竹林公子，小林里美，竹中純子，住田正幸「新しい実験動物としてのネッタイツメガエル」第 60 回日本実験動物学会（2013 年 5 月、つくば国際会議場、つくば市）	
 
	
 
2.	
 Yoshitame,	
 S.,	
 Furuno,	
 N.,	
 Prigent,	
 C.	
 and	
 Hashimoto,	
 E.	
 “The	
 subcellular	
 localization	
 of	
 cyclin	 B2	
 is	
 required	
 for	
 bipolar	 spindle	 formation	
 during	
 Xenopus	
 oocyte	 maturation”	
 The	
 46th	
 annual	 meeting	
 of	
 the	
 
JSDB	
 (2013,)	
 May	
 27-31,	 Matue,	 Japan.	
 	
 3.	
 柏木昭彦，柏木啓子，花田秀樹，田澤一朗，小林里美，竹中純子，鈴木	  厚，竹林公子，古野伸明，倉林	  敦，中島圭介，住田正幸「ツメガエルを知っていますか？」第 84 回日本動物学会	
  動物学ひろば（2013 年 9 月、玉野市立玉野
海洋博物館、玉野市）	
 
	
 
4.	
 柏木啓子、藤原好恒、古野伸明「重力と磁場によるニシツメガルの甲状腺への影響」第 84 回日本動物学会	
  2013 年９月	
  岡山	
 
	
 
5.	
 柏木啓子、鈴木賢一、佐能正剛、花田秀樹、山本卓、新海正、古野伸明、
太田茂、柏木昭彦	
 「両生類を用いた甲状腺ホルモン撹乱化学物質の評価」第
84 回日本動物学会	
 2013 年９月	
 岡山	
 
	
 
6.	
 古野伸明、関口猛「ネッタイツメガエルの wee1A,	
 mos のプロモーター領域のクローニングとその遺伝子構造」日本ツメガエル研究集会	
  2013 年９月２４
日、山口	
 
	
 
7.	
 柏木昭彦，柏木啓子，花田秀樹，鈴木賢一，鈴木	
  厚，竹林公子，倉林	  敦，
中島圭介，田澤一朗，井川	  武，小林里美，竹中純子，玉城ゆうな	
 ，古野伸明，
山本	
  卓，住田	 正幸	
 「ネッタイツメガエルの近交化・標準系統の樹立・提供」	
 第 36 回日本分子生物学会	
 (2013 年 12 月、神戸国際展示場	
  神戸市)	
 
	
 
国際学会	
 
1.	
 Kashiwagi	
 A.,	
 Kashiwagi	
 K.,	
 Hanada	 H.,	
 Suzuki	
 K.,	
 Suzuki	
 A.,	
 Takebayashi	
 K.,	
 Nakajima	
 K.,	
 Furuno	 N.,	
 Tazawa	
 I.,	
 Kurabayashi	
 A.,	
 Yamamoto	
 T.	
 and	
 
Sumida	 M.	
 “National	
 BioResource	 Project	
 (NBRP)	
 Xenopus	 tropicalis	
 Mass	
 Production	
 of	
 High	 Quality	
 Standard	
 Inbred	
 Strains”	
 The	
 5th	
 ANRRC	 International	
 Meeting	 (October	
 30-November	 1,	
 2013	
 in	
 Shonan	
 Village	 Center,	 Hayama,	 Japan)	
 	
 2.	
 Kashiwagi	
 A.,	
 Kashiwagi	
 K.,	
 Hanada	 H.,	
 Suzuki	
 A.,	
 Takebayashi	
 K.,	
 Kurabayashi	
 A.,	
 Suzuki	
 K.,	
 Furuno	 N.,	
 Tazawa	
 I.,	
 Nakajima	
 K.,	
 Yamamoto	
 
T.	
 and	
 Sumida	 M.	
 “National	
 BioResource	 Project	
 (NBRP)	
 Xenopus	 (Silurana)	
 tropicalis:	
 Standard	
 High	 Quality	
 Inbred	
 Strain	
 for	
 Biological	
 Researc”	
 52

International	  Symposium	  Frontiers	  in	  Amphibian	  Biology:	  Endangered	 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing	 (March	 27-28,	 2014	 Institute	
 for	
 Amphibian	  Biology,	  Graduate	  School	  of	  Science,	  Hiroshima	  University,	 Higashihiroshima,	
 Japan)	
 	
 3.	
 Kurabayashi,	
 A.,	
 Furuno,	
 N.,	
 Sumida,	
 M.,	
 Mizuho,	
 H.,	
 Ohshima,	
 K.	
 and	
 
Vences,	
 M.	
 “Discovery	 and	
 phylogenetic	
 distribution	
 of	
 a	
 short	 interspred	 nuclear	 element	
 (SINE)	
 subgroup	
 in	
 neobatrachian	 frogs.	
 International	
 Symposium	
 Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology:	
 Endangered	
 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing”	
 (March	 27-28,	 2014	 Institute	 for	
 Amphibian	
 Biology,	 Graduate	  School	  of	  Science,	  Hiroshima	  University,	  Higashihiroshima,	 Japan)	
 	
 4.	
 Yoshitome,	
 S.,	
 Prigent,	
 C.,	
 Hashimoto,	
 E.	
 and	
 Furuno,	
 N.	
 “Bipolar	 Spindle	 formation	
 during	 meiosis	 I	 required	
 the	
 proper	
 localization	
 of	
 cyclin	  B2	
  in	  Xenopus	
  oocytes”	  International	  Symposium	  Frontiers	  in	
 Amphibian	
 Biology:	
 Endangered	
 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing.	
 (March	 27-28,	 2014	 Institute	 for	
 Amphibian	
 Biology,	
 Graduate	
 School	 of	
 Science,	
 Hiroshima	
 University,	
 Higashihiroshima,	
 Japan)	
 	
 5.	
  Suzuki,	  A.,	
  Kashiwagi,	  A.,	
  Kashiwagi,	
  K.,	
  Hanada,	  H.,	
 Takebayashi-Suzuki,	  K.,	
  Tazawa,	  I.,	
  Furuno,	
  N.,	
  Kurabayashi,	  A.,	
 Kobayashi,	
 S.,	
 Takenaka,	
 J.,	
 Tamaki,	
 Y.,	
 Igawa,	
 T.,	
 Uto,	 T.,	 Nanba,	
 C,	
 Watanabe,	  A.,	
  Yoshida,	
  H.,	
  Shimada,	
  A.	
  and	
  Sumida,	
  M.	
 “International	 Xenopus	  Resource	  Network	  and	
  Educational	  Activities	  at	
  Institute	  for	
 Amphibian	  Biology”	
  International	  Symposium	  Frontiers	  in	  Amphibian	 Biology:	
 Endangered	
 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing.	
 (March	 27-28,	 2014	
  Institute	  for	
  Amphibian	  Biology,	  Graduate	  School	  of	  Science,	 Hiroshima	
 University,	
 Higashihiroshima,	
 Japan)	
 	
 ④科研費等の受け入れ状況	 	  該当なし	 53	 准教授･三浦郁夫（Ikuo	
 Miura）	
 
	
 
研究内容	
 
１. XY 型と ZW 型生決定システムにおける生殖腺性差構築機構のちがいThe	 differences	
 in	
 the	
 establishment	
 mechanisms	
 of	
 gonadal	 sex-differences	
 between	
 XY	
 and	
 ZW	
 sex-determining	 systems	 	 	  ツチガエルには性決定機構が XX/XY 型と ZZ/ZW 型の地域集団が存在する。それゆえ、２つの性決定メカニズムの違いおよび、両者間における生殖腺性差構築機構の違いを調べる上で優れた研究材料である。本種の ZW 型集団では、その性染色体上に SOX３遺伝子が存在する。この遺伝子は真獣類の精巣決定遺伝
子 SRY の元祖遺伝子として知られているが、ツチガエルの幼生生殖腺では逆にZW メスにおいて高い発現が観察されており、卵巣決定機能が示唆されている。
そこで、SOX３遺伝子の卵巣決定機能を検証するため、TALEN 法によるゲノム編
集を用いて機能阻害実験を行った。その結果、mutation を確認した 7 個体が変態した。ZW 個体４個体のうち１個体は精巣を形成し、性分化関連遺伝子もオス
特異的発現パターンを示した。一方、３個体の ZZ はすべて正常な精巣を形成した。ただし、そのうち２個体は卵巣分化に関連する Cyp19 と Foxl2 遺伝子の発現が正常雄よりも有意に高かった。以上の結果から、SOX3 は ZW 型集団において卵巣決定の初期因子として機能することが示唆される。	
 	
  一方、XY 型集団では、ZW 型と異なり、SOX3 遺伝子の発現は XY 雄幼生の生殖腺において高く、真獣類と同様のパターンを示した。TALEN 法による機能阻害実験を行ったところ、生殖腺の表現型に変化は見られなかった。さらに、機能誘導実験を行うため、Y-SOX3 遺伝子コンストラクトを作成し、２個体の F０個体を得た。今後、F１を作成し、その機能を検証する。	
 	
 ２.XY 型から ZW 型へ性決定機構の進化	 Evolutionary	 mechanism	
 of	
 sex	
 determination	
 from	
 XY	
 to	
 ZW	
 
	
 
	
  ツチガエルの地域集団には XY 型と ZW 型の地域集団が存在している。これまでの研究成果をもとに、本種の XY 型から ZW 型へ性決定機構が進化した要因について考察した。それには、１）東西に存在する２つの元祖型集団の遺伝的な違い、２）両者の交雑による性比の偏り、３）日本列島の地質学的歴史において生じた地理的変動による集団の融合や隔離、そして４）一つないし、少数遺伝子の発現量の微小なバランスによる性決定機能の変化、の４点が性決定機構の頻繁な変化を引き起こしたものと推測した。	
 
	
 
研究業績	
 
①原著論文	
 1.Miura	 I,	
 Ogata	 M	
 (2013)	
 Change	 of	
 heterogametic	
 sex	
 from	 male	 to	
 female:	
 
Why	
 so	
 easy	
 in	
 the	
 frog?	
 Chromosome	
 Science	
 16:	
 3-9.	 	
 54

②総説・著書	
 
該当なし	
 
	
 
③学会発表	
 国内学会	 1. 三浦郁夫、尾形光昭	
  ツチガエルのヘテロな性はなぜ容易に変化するのか？	
 日本遺伝学会第８５回大会	
  ９月１９日	
  横浜	
 
	
 
2.	
 尾形光昭、三浦郁夫	
  ツチガエルの	
 XY	
 型と	
 ZW	
 型集団の	
 接触地帯における性決定機構の進化	  日本進化学会第１４回大会	
  ８月２１日	
  東京	
 
	
 
3.	
 三浦郁夫、尾形光昭	
  ツチガエルの性決定機構はなぜ変化するのか？	
 日本爬虫両生類学会第５２回大会	
  １１月２日	
  札幌	
 
	
 
4.	
 尾形光昭、百崎孝男、三浦郁夫	
  ツチガエルの XY 型と ZW 型集団の交雑	
 日本爬虫両生類学会第５２回大会	
  １１月３日	
  札幌	
 
	
 
国際学会	
 	
 
1.Miura	 I,	
 Ogata	 M,	
 Hasegawa	
 Y,	
 and	
 Ohtani	 H	
 2014	
 Functional	
 analysis	
 of	
 
the	
 sex-linked	
 gene	 SOX3	 for	
 female	 determination	
 in	
 the	
 frog.	
 International	
 symposium	
 Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology:	
 Endeangered	 species	 conservation	
 and	
 genome	 editing.	
 	
 27-28	
 March	 2014,	
 Higashi-Hiroshima,	
 Japan	 	 2.	
 Miura	 I,	
 Ogata	 M,	
 Sekiya	 K,	
 and	
 Ohtani	 H	
 2014	 Evolution	
 of	
 the	
 Sado-frog,	 a	
 newly	 described	
 species,	
 in	
 the	
 small	 Japanese	 island.	
 International	
 symposium	
 Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology:	
 Endeangered	 species	 conservation	
 and	
 genome	 editing.	
 	
 27-28	
 March	 2014,	
 Higashi-Hiroshima,	 Japan	
 
	
 
招待講演	
 
1.	
 三浦郁夫	
  カエルの性決定と性染色体の進化	  一般財団法人染色体学会第６４回年会	
  （学会賞受賞記念講演）	
  １１月９日、２０１３年	
  富山市	 	
 2.三浦郁夫	  サドガエル研究の１４年	
  公開講演会	
  「サドガエルが辿った進化と佐渡の自然」	
  ７月２８日（日）	
  2013 年	
  朱鷺交流センター	  佐渡市	 	 3.	
 三浦郁夫	
  性決定機構の進化	
  〜XY 型と ZW 型のバトルと相互変換〜	
 動植物に共通するアロ認証機構の解明	
  第８回領域会議	
 １月９日，２０１４
年	
  名古屋市	 	
 4.	
 三浦郁夫	
  カエルの性決定とその進化機	 	
 広島大学大学院生物圏科学研究55

科シンポジウム	  生物学の基礎的研究から水・畜産業へのトランスレーション	 １月２９日	
  ２０１４年	
  東広島市	 	 	
 ④科研費等の受け入れ状況	
 1.	
 科学研究費新学術領域研究（公募、代表）４,５００千円	
  「XY 型と ZW 型システムにおける生殖腺性差構築機構の違い」	
 2. 科学研究費挑戦的萌芽研究（代表）	
  １，２００千円	
  	
  「XY 型から ZW
型へ性決定機構の進化	
 

56

	
 
助教・花田秀樹（Hideki	 Hanada）	
 
	
 
研究内容	
 
１.甲状腺ホルモン誘導による無尾両生類オタマジャクシ尾部短縮の機構	 Mechanism	
 for	
 thyroid	
 hormone-induced	
 shortening	
 of	
 anuran	 tadpole	 tail	 	
 	
  筋細胞アポトーシスを通じて起こるオタマジャクシ尾部短縮は変態期における無尾両生類の最も劇的な現象のうちの一つである。多くの研究はミトコン
ドリア膜透過性遷移（MPT）がアポトーシスの重要な役割を果たしていることが示してきた。これまで我々はサイクロスポリン A（CsA）が、甲状腺ホルモン（T３）によって誘導されるミトコンドリアの膨潤と、それに伴って起こる MPTからのサイトクロム c（Cyt.c）漏出を抑制することを報告した。オタマジャク
シの変態機構のさらなる解明を目的として、T3 誘導尾部短縮におけるサイクロ
スポリンの効果を調べた。低濃度の T3 によってオタマジャクシ尾部は短縮し、それに伴う caspase-3 と-9 様酵素の活性増加、DNA 断片化およびラダー形成の増加が起こった。CsA はこれらの T3 の効果を抑制した。より高濃度の T3 とカル
シウムイオンは成体のカエル肝臓から単離したミトコンドリアの膨潤の誘導とその膨潤に伴ったアポトーシス関連物質の放出を起こし、その放出された物
質を含むフラクションは dATP の存在下において caspase-3 様酵素を活性化させた。この結果は T3 の直接的間接的作用を通じ、T3 によってミトコンドリアから Cyt.c が放出されたことを示す。これらの結果とこれまでの研究データから、ミトコンドリア MPT は T3 誘導による尾部アポトーシスにおいて重要な役割を担っており、CsA はそれらの T3 の効果を抑制すると結論づけた。	
 	
 ２.除草剤パラコートによって誘起される培養カエル白血球細胞の染色体損傷に対するビタミン E の坑酸化機能のかく乱	 Disruption	  of	  Vitamin	  E-antioxidant-function	  in	  response	  to	  paraquat	 (herbicide)-induced	  structural	  chromosomal	  damage	  in	
  cultured	  anuran	 leukocytes	 	 	  培養カエル白血球細胞を用いて、本研究はビタミン E の抗酸化機能のかく乱のメカニズムを調べている。	
 	
  活性酸素を誘発させることで、除草剤パラコートは培養細胞に染色体異常を誘発させることが知られている。そこで、培養カエル白血球細胞に対して、次の４種類の処理を行った、1）10-6	
 M パラコート処理のみ、２）10-7〜10-5	
 M ビ
タミン E 処理のみ、３）10-6	
 M	
 パラコート＋10-7〜10-5	
 M ビタミン E、４）無処理。その結果、無処理およびビタミン E 処理細胞において染色体異常を持った細胞の発生率はいずれも 10％未満であった。それに対して、パラコート処理のみの場合、染色体異常を持った細胞の発生率は 23%であった。さらに 10-6	
 M パ
ラコート＋10-5	
 M ビタミン E 処理の場合、染色体異常を持つ異常な細胞の割合
が 50％近くまでに達した。これらの結果から、ビタミン E はパラコートの細胞遺伝毒性を抑制するのではなく、むしろ強めることがわかった。	
 

57

	
 
３.ブチル化ヒドロキシトルエンはパラコートによって誘起される培養カエ
ル白血球細胞の染色体損傷を抑制しない	 Butylated	
 hydroxytoluene	 does	 not	
 inhibit	 paraquat-induced	
 structural	 chromosomal	 damage	
 in	
 cultured	 anuran	 leukocytes	
 	 	  化学物質が複合的反応し、それらの化学的変化が生物に与える影響はよくわ
かっていない。ビタミン E の合成アナログである抗酸化物質のブチル化ヒドロ
キシトルエンはビタミン E と同様に脂質過酸化を抑制する。しかしながら、パラコートによって誘起された培養カエル白血球細胞の染色体損傷を抑制する
ことはず、むしろ染色体損傷を増加させる結果となった。このようなことから、
ビタミン E 同様に、パラコートの共存下にあるヒドロキシトルエンは本来の働きである坑酸化作用をかく乱され、パラコートの電子ドナーとなることがわかった。化学物質が単独で働く場合と、複合的に作用する場合とではその働きが異なる一つの例である。	
 
	
 
研究業績	
 
①原著論文	
 Hanada,	
 H.,	
 Kobuchi,	
 H.,	
 Yamamoto,	
 M.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Katsu,	
 K.,	
 Utsumi,	
 T.,	
 Kasahiwagi,	
 A.,	
 Sasaki,	
 J.,	
 Inoue,	 M.,	
 Utsumi,	
 K.	
 2013.	
 
Acetyl-L-carnitine	
 suppresses	
 thyroid	
 hormone-induced	
 and	
 spontaneous	 anuran	 tadpole	 tail	 shortening.	
 Hereditas,	
 150,	
 1-9.	 	
 ②総説･著書	 Hanada,	  H.	
  2013.	
  Herbicide	  paraquat	  genotoxicity-enhancement	
  by	
  the	
 phenolic	
 antioxidants	
 dl-α-tocopherol	
 and	
 2,6-di-tert-butyl-p-cresol:	
 In	
 Kobayashi	
 D,	
 Watanabe	
 E	
 (Eds),	
 Handbook	 on	 Herbicides:	
 Biological	
 Activity,	 Classification	  and	
  Health	
  &	  Environmental	
  Implications.	
  Nova	  Science	 Publishers,Inc,	
 New	
 York,	
 pp.191-211.	
 
	
 
	
 
③学会発表	
 
国内発表	
 
1.	
 花田秀樹、小渕	
 浩嗣、柏木啓子、内海俊彦、井上正康、佐々木順三、勝賢
二郎、佐藤英介、内海耕慥、柏木昭彦。アセチル-L-カルニチンによる無尾両生類幼生尾部短縮の抑制。日本動物学会	
  第８４回大会	
  2013 年	
  9 月	
  26日	
  岡山大学、岡山。	
 
	
 
2.	
 柏木昭彦，鈴木	  厚，古野伸明，柏木啓子，花田秀樹，田澤一朗，倉林	  敦，
中島圭介，竹林公子，小林里美，竹中純子，住田正幸 「新しい実験動物としてのネッタイツメガエル」第 60 回日本実験動物学会（2013 年 5 月、つくば国際会議場、つくば市）
	
 

58

3.	
 柏木昭彦，柏木啓子，花田秀樹，田澤一朗，小林里美，竹中純子，鈴木	  厚，竹林公子，古野伸明，倉林	  敦，中島圭介，住田正幸 「ツメガエルを知っていますか？」第 84 回日本動物学会	
  動物学ひろば（2013 年 9 月、玉野市立玉野海洋博物館、玉野市）
4.	
 柏木昭彦，柏木啓子，花田秀樹，鈴木賢一，鈴木	
  厚，竹林公子，倉林	  敦，
中島圭介，田澤一朗，井川	  武，小林里美，竹中純子，玉城ゆうな	
 ，古野伸明，
山本	
  卓，住田	 正幸	
 「ネッタイツメガエルの近交化・標準系統の樹立・提供」
第 36 回日本分子生物学会	
 	 (2013 年 12 月、神戸国際展示場	
  神戸市)	
 
	
 
国際学会	
 
1.	
 Kashiwagi	
 A.,	
 Kashiwagi	
 K.,	
 Hanada	 H.,	
 Suzuki	
 K.,	
 Suzuki	
 A.,	
 Takebayashi	
 
K.,	
 	
 Nakajima	
 K.,	
 Furuno	 N.,	
 Tazawa	
 I.,	
 Kurabayashi	
 A.,	
 Yamamoto	
 T.	
 and	
 	
 
Sumida	 M.	
 “National	
 BioResource	 Project	
 (NBRP)	
 Xenopus	 tropicalis	
 Mass	
 Production	
 of	
 High	 Quality	
 Standard	
 Inbred	
 Strains”	
 The	
 5th	
 ANRRC	 International	
 Meeting	 	 (October	
 30-November	 1,	
 2013	
 in	
 Shonan	
 Village	 Center,	 Hayama,	 Japan)	
 	
 2.	
 Kashiwagi	
 A.,	
 Kashiwagi	
 K.,	
 Hanada	 H.,	
 Suzuki	
 A.,	
 Takebayashi	
 K.,	
 Kurabayashi	
 A.,	
 Suzuki	
 K.,	
 Furuno	 N.,	
 Tazawa	
 I.,	
 Nakajima	
 K.,	
 Yamamoto	
 
T.	
 and	
 Sumida	 M.	
 “National	
 BioResource	 Project(NBRP)Xenopus	
 (Silurana)	
 tropicalis:	
 Standard	
 High	 Quality	
 Inbred	
 Strain	
 for	
 Biological	
 Research”	
 International	  Symposium	  	  Frontiers	  in	  Amphibian	  Biology:	  Endangered	 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing	 (March	 27-28,	 2014	 Institute	
 for	
 Amphibian	  Biology,	  Graduate	  School	  of	  Science,	  Hiroshima	  University,	 Higashihiroshima,	
 Japan)	
 	
 ④科研費等の受け入れ状況	
 1.	
 平成 25 年度	
  芝浦工業大学システム理工学部大学院重点研究	  「両生類に対する過重力・磁場の影響」500 千円(分担)	
 2. 平成 25 年度	
  EXTEND2010 基盤的研究「ツメガエル変態アッセイを用いた甲状腺ホルモンかく乱化学物質のスクリーニングシステムの開発」2000 千円
（分担）

59

	
 
特任助教・柏木啓子（Keiko	
 Kashiwagi）	
 
	
 
研究内容	
 
１．両生類における TALEN 技術を用いた標的遺伝子の破壊	 Targeted	 gene	
 disruption	
 by	
 TALENs	 in	
 amphibians	
 
	
 
[目的]	
 
	
  両生類は多くの独特な特徴を備えていることから、長期にわたって伝統的に重要な実験動物として用いられてきた。変態や再生といった現象の解明は生命科学にブレークスルーをもたらすことは明々白々である。無尾両生類の変態時における、尾部短縮を含む大掛かりな体の作り変えは、ほとんどの動物種では見られない。こうした興味深い出来事の分子機構を明らかにするための方策の一つとして、個体レベルでの遺伝子破壊技術を駆使して、関与する遺伝子の機能を調べることが大切である。数理分子生命理学専攻の山本	
  卓教授、鈴木賢
一特任講師、佐久間哲史特任助教と共同研究を行い、TALENs を用いてツメガエ
ルの標的遺伝子破壊を試みている。	
 
	
 
[方法]	
 
	
  外来性遺伝子の破壊効果を調べるために、CMV:eGFP アフリカツメガエルトラ
ンスジェニック系統と野生型のカエルを交配させて得られた受精卵(F1)に
eGFP	
 TALEN	 mRNA を顕微注入した。さらに内在性遺伝子の破壊効果については、
メラニン合成に関わるチロシナーゼ遺伝子(try)、および眼の形成に必要なマスター制御遺伝子 pax6 を標的とする TALENs をアフリカツメガエル受精卵に導入した。標的遺伝子の破壊を EGFP 蛍光観察、Cel-1	
 アッセイ、及びシークエ
ンス解析により検証した。	
 	
 [成果と考察]	
 外来性遺伝子の破壊効果を調べるために、CMV:eGFP アフリカツメガエルトラ
ンスジェニック系統と野生型のカエルを交配させて得られた受精卵(F1)に
eGFP	
 TALEN	 mRNA を顕微注入した。さらに内在性遺伝子の破壊効果については、
メラニン合成に関わるチロシナーゼ遺伝子(try)、および眼の形成に必要なマスター制御遺伝子 pax6 を標的とする TALENs をアフリカツメガエル受精卵に導入した。標的遺伝子の破壊を EGFP 蛍光観察、Cel-1	
 アッセイ、及びシークエ
ンス解析により検証した。さらに、EGFP 遺伝子とチロシナーゼ遺伝子を多重破壊したところ、両遺伝子の発現が著しく抑えられることもわかった。	
 TALEN 標的遺伝子破壊法は、外来性、外来性を問わず遺伝子の改変を行うのに非常に優れた技術であることがわかった。	
 	
 [将来の展望]	
 今後、TALEN 技術を用いて変態等に重要な遺伝子の破壊を行い、遺伝子機能を解析していく予定である。	
 
	
 

60

２．両生類の対する内分泌かく乱化学物質の影響評価	
 Assessment	
 of	
 the	
 effects	
 of	
 endocrine	 disrupting	 chemicals	
 on	
 amphibians	
 	
 	
 
	
 
[目的]	
 
内分泌かく乱化学物質が世間の耳目を集めたのは、1996 年にシーア・コルボーン等の自著『奪われし未来』が出版されてからである。EDCs とは内在性ホルモンの正常な作用をかく乱する物質のことであって、それらはヒトを含む動物
種の個体レベルでの発生・成長や性分化、脳の発達、行動、恒常性等に悪影響を及ぼすばかりでなく、種の存続にも打撃を与えることも懸念されている。内分泌かく乱化学物質の多くは化学的に安定で脂溶性が高いため、曝露個体内における生物蓄積をもたらす。	
 	
  私達は今、生活関連物質や医薬品の生物影響についてツメガエルを用いて調べている。	
 
	
 
[方法]	
 
	
  被検物質の各種濃度液にいろんな発生段階のツメガエル個体を曝露した。	
 	
 [成果と考察]	
 	  発生や成長、変態などへの影響が認められ、両生類は生活関連物質や医薬品に対する感受性が高く、有用な評価ツールになることが明らかになった。	
 	
 [将来の展望]	 	  内分泌かく乱化学物質の特徴は、女性ホルモン作用の他に抗女性ホルモン、
男性ホルモン、抗男性ホルモン、副腎皮質ホルモン作用を示すなど多岐にわたるといわれている。両生類への影響を通して、生活関連物質や医薬品の実体は何かを明らかにしていく。	
 	
 ３．トランスジェニックガエルを用いた甲状腺ホルモンかく乱物質スクリーニ
ングシステムの開発	 Development	
 of	
 a	
 screening	 system	
 for	
 thyroid	
 hormone	 disrupting	 chemicals	 using	
 transgenic	
 Xenopus	
 
	
 
[目的]	
 
	
  環境中の化学物質の生物に対する悪影響（例えば、内分泌かく乱作用）が危
惧されている。両生類の変態は甲状腺ホルモン(TH)に支配されている。変態中のオタマジャクシからカエルへの体の作り変えは無尾両生類が最も顕著であるという点で、この動物は甲状腺ホルモンかく乱作用を持つ化学物質の生体影
響の試験評価系として非常に優れている。私達は、甲状腺ホルモンアゴニスト
またはアンタゴニストである化学物質を高感度に検出するためのトランスジ
ェニック系統を開発中である。その一例として、TH により活性化される TRβ遺伝子のプロモーター/エンハンサーとホタルルシフェラーゼ遺伝子を連結させてつくったレポーターベクターを導入して作出されたアフリカツメガエルのトランスジェニック(Tg)系統について紹介する。この系統を利用した TH か61

く乱物質を評価する試験系の確立を目指し、F1 世代の TH 反応性や化学物質の影響をルシフェラーゼ活性を通して評価する方法を検討した。	
 
	
 
[方法]	
 
	
  すでに樹立している TRpromoter/enhancer/Luciferase	
 Tgβ系統の F1 幼生に様々な濃度の TH(T3)を加え、個体レベルでのルシフェラーゼ活性をルミノメー
ターにより測定した。また、オリンパス LV200 発光顕微鏡を用いて in	
 vivo ルシフェラーゼイメージング解析も行った。	
 	
 [成果と考察]	
 	  in	
 vivo ルシフェラーゼイメージング解析の結果、TH に高い反応性を示すことが知られている幼生の脳や四肢において、強いルシフェラーゼ活性の誘導を確認した。また、TH 曝露された Tg 幼生のホモジェネートを用いてルシフェラーゼ活性を測定した結果、濃度依存的なレポーター活性の増大も確認された。
以上の結果により、この Tg 系統を用いて、TH 応答性をルシフェラーゼ活性に基づいてモニターすることが可能であることが証明された。	
 	
 [将来の展望]	 	  非常に多くの人工化学物質が環境中に放出されており、その中には正常な TH作用をかく乱するものが含まれことが知られている。TH は成長や発生を調節し、代謝ホメオスタシスの維持に重要な役割を果たしている。現在使われている 10万種類以上の化学物質のうちで、ヒトを含む生物への安全性が確認されているものは僅かである。安全性に関する情報を得るための優れた in	
 vivo 試験法は少なく、その開発が喫緊の課題である。本研究課題で開発したルシフェラーゼ
遺伝子を導入したアフリカツメガエル Tg 系統は、TH の働きをかく乱すると危惧される化学物質を簡単・迅速・高感度に調べられるツールとして極めて有用である。今後、私たちはこのカエル系統を用い、TH 作用をかく乱する化学物質をスクリーニングしていく予定である。内分泌かく乱物質の生物に及ぼす影響についてのメカニズムを解明していく。	
 
	
 
研究業績	
 
①	
  原著論文	  	
 1.	
 Hanada	
 ,H.,	
 Kobuchi,	
 H.,	
 Yamamoto,	
 M.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Katsu,	
 K.,	
 Utsumi,	
 T.,	
 Kashiwagi,	
 A.,	
 Sasaki,	
 J.,	
 Inoue,	 M.	
 and	
 Utsumi,	
 K.	
 (2013)	
 Acetyl-L-carnitine	
 suppresses	
 thyroid	
 hormone-induced	
 and	
 spontaneous	 anuran	 tadpole	 tail	 shortening.	
 Hereditas,	
 150:	
 1-9.	 	
 2.Suzuki,	
 K.,	
 Isoyama,	
 Y.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Sakuma,	
 T.,	
 Ochiai,	
 H.,	
 Sakamoto,	
 N.,	
 Furuno,	
 N.,	
 Kashiwagi,	
 A.	
 and	
 Yamamoto,	
 T.	
 (2013)	
 High	
 efficiency	 TALENs	 enable	
 F0	
 functional	
 analysis	
 by	
 targeted	 gene	
 disruption	
 in	
 Xenopus	 laevis	 embryos.	
 Biology	
 Open,	
 2:448-452.	
 
	
 
3.	
 Sakane,Y.,	
 Sakuma,T.,	
 Kashiwagi,K.,	
 Kashiwagi,A.,	
 Yamamoto,T.	
 and	
 	
 

62

Suzuki,	 K.(2014)	
 Targeted	 mutagenesis	
 of	
 multiple	
 and	
 paralogous	 genes	 in	
 Xenopus	 laevis	
 using	 two	
 pairs	 oftranscription	
 activator-like	 effector	
 nucleases.	
 Dev.	
 Growth	
 Diff.,	
 56,	
 108-114.	
 	 ②	
 総説・著書	 1.	
 Hanada	
 ,H.,	 Kashiwagi,	
 K.,	
 Suzuki,	
 K.,	
 Yamamoto,	
 T.	
 and	
 Kashiwagi,	
 A.	
 (2013)	
 Suppression	
 of	
 anuran	 metamorphosis	
 by	
 synthetic	
 chemicals.	
 (in	 press)	
 	
  Frogs:	
 Genetic	
 Diversity,	
 Neural	 Development	
 and	
 Environmental	
 Influences.	
 (NOVA,	
 Sweden)	
 pp.73-88	 	
 ③学会発表	
 
国内学会	
 
1.	
 柏木昭彦，鈴木	  厚，古野伸明，柏木啓子，花田秀樹，田澤一朗，倉林	  敦，
中島圭介，竹林公子，小林里美，竹中純子，住田正幸「新しい実験動物としてのネッタイツメガエル」第 60 回日本実験動物学会（2013 年 5 月、つくば国際会議場、つくば	 	 2.柏木昭彦，柏木啓子，花田秀樹，田澤一朗，小林里美，竹中純子，鈴木	  厚，竹林公子，古野伸明，倉林	  敦，中島圭介，住田正幸	
  「動物学ひろば：ツメ
ガエルを知っていますか？」	
  第 84 回日本動物学会	
  （2013 年 9 月、玉野市
立玉野海洋博物	 館、玉野）	
 	
 3.	
 柏木啓子１、鈴木賢一１、佐能正剛 2、花田秀樹１、山本	  卓１、新海	  正 3、
古野伸明 1、太田	  茂 2、柏木昭彦１	 	
 「両生類を用いた甲状腺ホルモン作用	
 かく乱化学物質の評価」	
  	
  第 84 回日本動物学会	
  （2013 年 9 月、岡山大学、
岡山）	
 
	
 
4．花田秀樹、小渕	
 浩嗣、柏木啓子、内海俊彦、井上正康、佐々木順三、勝賢
二郎、佐藤英介、内海耕慥、柏木昭彦	
  「アセチル-L-カルニチンによる無尾
両生類幼生尾部短縮の抑制」日本動物学会	
  第 84 回大会	  （2013 年	
  9 月	
  岡
山大学、岡山）	
 
	
 
5.柏木	
 昭彦，柏木	 啓子，花田	 秀樹，鈴木賢一，鈴木	
  厚，竹林	
 公子，倉林	 敦，中島	 圭	
 介，田澤	
 一朗，井川	
  武，小林	
 里美，竹中	 純子，玉城	
 ゆうな	
 ，
古野	
 伸明，山本	  卓，住田	 正幸	
  「ネッタイツメガエルの近交化・標準系統の樹立・提供」第 36 回日本分子生物学会	
 	 (2013 年 12 月、神戸国際展示場	
  神
戸)	
 
	
 
6.	
 中出	
 翔太、	
 鈴木	
 賢一、佐久間哲史、	
 重田美津紀、	 柏木昭彦、	
 柏木啓子、	
 山本卓、	
 小原政信「TALEN を用いたツメガエル発生過程におけるサイト
グロビンの機能解析」第 36 回日本分子生物学会（2013 年 12 月、神戸市）	
 
	
 
国際学会	
 

63

1.Kashiwagi	
 A.,	
 Kashiwagi	
 K.,	
 Hanada	 H.,	
 Suzuki	
 K.,	
 Suzuki	
 A.,	
 Takebayashi	
 
K.,	
 	
 Nakajima	
 K.,	
 Furuno	 N.,	
 Tazawa	
 I.,	
 Kurabayashi	
 A.,	
 Yamamoto	
 T.	
 and	
 	
 
Sumida	 M.	
 	
 「National	
 BioResource	 Project	
 (NBRP)	
 Xenopus	 tropicalis	
 Mass	
 Production	
 of	
 High	 Quality	
 Standard	
 Inbred	
 Strains.」The	 5th	
 ANRRC	 International	
 Meeting	 (October	
 30-November	 1,	
 2013	
 in	
 Shonan	
 Village	 Center,	 Hayama,	 Japan)	
 	
 2.	
 Isoyama,	
 Y.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Kashiwagi,	
 A.,	
 Yamamoto,	
 T.	
 「Gene	 knockout	
 in	
 Xenopus	 using	 TALENs.」46th	
 Annual	 Meeting	
 of	
 JSDB,	
 5th	
 May,	 Matsue,	 Japan.	
  (2013,	
 5th	
 May,	 Matsue,	 Japan.)	
 	
 3.	
 Kashiwagi	
 A.,	
 Kashiwagi	
 K.,	
 Hanada	 H.,	
 Suzuki	
 A.,	
 Takebayashi	
 K.,	
 Kurabayashi	
 A.,	
 Suzuki	
 K.,	
 Furuno	 N.,	
 Tazawa	
 I.,	
 Nakajima	
 K.,	
 Yamamoto	
 
T.	
 and	
 Sumida	 M.	
  	
 「National	
 BioResource	 Project	
 (NBRP)	
 Xenopus	 (Silurana)	
 tropicalis:	
 Standard	
 High	 Quality	
 Inbred	
 Strain	
 for	
 Biological	
 Research」International	
 Symposium	 	
 Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology:	 Endangered	
 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing	 (March	 27-28,	 2014	
 Institute	 for	
 Amphibian	
 Biology,	
 Graduate	
 School	 of	
 Science,	
 Hiroshima	
 University,	
 Higashihiroshima,	
 Japan)	
 
	
 
4.	
 	
 Suzuki,	
 A.,	
 Kashiwagi	
 A.,	
 Kashiwagi	
 K.,	
 Hanada	 H.,	
 Takebayashi-Suzuki	
 K.,	
 Tazawa	
 I.,	
 Furuno	 N.,	
 Kurabayashi	
 A.,	
 Kobayashi	
 S.,	
 Takenaka	
 J.,	
 Tamaki	 Y.,	
 Igawa	
 T.,	
 Uto	
 T.,	
 Nanba	 C.,	
 Watanabe	
 A.,	
 Yoshida	
 H.,	
 Shimada	
 A.	
 and	
 
Sumida	 M.「International	
 Xenopus	 Resource	 Network	
 and	
 Educational	 Activities	
 at	
 Institute	 for	
 Amphibian	
 Biology」International	
 Symposium	 	
 Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology:	
 Endangered	
 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing	 (March	 27-28,	 2014	 Institute	 for	
 Amphibian	
 Biology,	 Graduate	
 School	 of	
 Science,	
 Hiroshima	
 University,	
 Higashihiroshima,	 Japan)	
 	
 ④	
 科研費等の受け入れ状況	
 1.	
 平成 25 年度	
  EXTEND2010 基盤的研究「ツメガエル変態アッセイを用いた甲状腺ホルモンかく乱化学物質のスクリーニングシステムの開発」2000 千円（分担）	
 ２．平成 25 年度	
  芝浦工業大学システム理工学部大学院重点研究	  「アミオ
ダロン暴露による水生両生類の甲状腺への影響」500 千円(分担)	
 

64

	
 
[進化多様性･生命サイクル研究グループ]	
 	
 教授･住田正幸（Masayuki	
 Sumida）	
 
	
 
研究内容	
 
１.	
 絶滅危惧種アマミハナサキガエルとイボイモリの飼育下繁殖の試み（継続）	
 Attempts	
 at	
 artificial	
 breeding	 and	
 natural	 reproduction	
 for	
 endangered	 amphibian	 species	
 Odorrana	 amamiensis	
 and	
 Echinotriton	
 andersoni	
 from	 the	
 Central	
 Ryukyus	
 
	
 
[目的]	
 
	
  アマミハナサキガエル(Odorrana	 amamiensis)は、奄美大島と徳之島に固有のカエルである。生息面積が少ないことに加え、昨今の環境破壊による個体数減少から、環境省レッドリストにおいて、絶滅危惧種 B1 類にリストされ、さらに、鹿児島県の天然記念物に指定されている。また、中央琉球に分布するイボイモリは、奄美大島や徳之島や沖縄島北部に分布しており、鹿児島県と沖縄県の天然記念物に、環境省レッドリストの絶滅危惧 II 類に指定されるなど、早急な保護対策が求められている。本研究では、これらの絶滅危惧種について
効率的な域外保全に資することを目的に、実験室での適切な人工繁殖・飼育維
持方法を確立した。	
 	 [材料・方法]	
 	  アマミハナサキガエルは鹿児島県で天然記念物に指定されているため、採集には県の許可申請が必要であるが、著者らは、この種について、既に天然記念物現状変更許可申請を得ている。奄美大島産アマミハナサキガエル 4 個体（雄
親 2、雌親 2）を用いて、人工受精法により、人工交配を行い、その後の発生過程における生活力を調べた。また、イボイモリについても、鹿児島県と沖縄県から、既に天然記念物現状変更許可申請を得ている。沖縄島産と奄美大島産と徳之島産のイボイモリについて、それぞれ飼育下繁殖を試みるため、野外の産卵場所を確認し、その状況をもとに飼育装置を作製して、飼育下で自然繁殖を試みた。	 	
 [結果・考察]	
 	  奄美大島産アマミハナサキガエル 2 ペアから、およそ 70 個体の変態個体を得て飼育中である。生存率は、およそ 25％であった。イボイモリでは、沖縄産と徳之島と奄美大島産のそれぞれについて、実験室に作製した飼育装置の中で自然産卵に成功した。産卵行動は 2 月下旬から 6 月上旬まで行われ、産卵場所
は野外における産卵と同様に、水辺付近の直接水に浸らない斜面であった。実験室で自然繁殖した 1〜3 年齢 150 個体が順調に生育している。	
 	
 [将来の展望]	
 	  アマミハナサキガエルは現在飼育中の人工繁殖および自然繁殖した子孫の65

飼育を継続し、性成熟を待って飼育下で２世代を得ることにより、これらの絶滅危惧種の飼育法と繁殖法を確立させる予定である。将来的には必要に応じてリリースも考慮に入れ、これらの絶滅危惧種について飼育下繁殖と域外保全を行い、「両生類ノアの方舟」を目指している。	
 
	
 
２.	
 バングラデシュ産トラフガエル類における遺伝的多様性と繁殖隔離機構
および飼育下繁殖（継続）	
 Genetic	 diversity,	
 postmating	 isolation	
 and	
 artificial	
 breeding	
 of	
 the	
 
Indian	 bullfrogs	
 (Hoplobatrachus	
 tigerinus	
 and	
 Hoplobatrachus	 lateralis)	
 from	
 Bangladesh	
 
	
 
[目的]	
 	
 
	
  バングラデシュでは乱獲等によりトラフガエル H.	
 tigerinus が野外で激減しており、本種の採集は法律で禁止されている。一方、最近、著者らはバング
ラデシュの南東沿岸域から近縁種ハマトラフガエル H.litoralis を新種として記載した(Hasan	
 et	
 al.,	 2011)。本研究では、バングラデシュ全域における本種群の遺伝的多様性を明らかにするとともに、これら 2 種間の交配後隔離機構を明らかにすることを目的に、野外から採集した個体を使って、ミトコンドリ
ア DNA の Cytb 遺伝子を解析するとともに、人工受精法によって交雑実験を行った。さらに、本種の域外保全を目的に、野外から採集した個体を使って飼育下繁殖を試みた。	
 	 [材料･方法]	 	  バングラデシュのトラフガエルとハマトラフガエルについて、分布の全域を網羅した 34 集団から 133 個体を採集し、これらの個体の肢指から全ゲノム DNAを抽出精製して、Cytb 遺伝子全長の塩基配列を解析した。また、トラフガエル
7 個体（雌親 3、雄親 4）とハマトラフガエル 5 個体（雌親 1、雄親 4）を用いて、人工受精法によって交雑実験を行い、雑種とそのコントロールの生活力を観察した。また、トラフガエル 3 個体（雌親 2、雄親１）を用いて、人工交配
によって交雑実験を行い、その子孫の生活力を観察した。	
 
	
 
	
 
[成果･考察･展望]	
 	
  Cytb 遺伝子の塩基配列から、バングラデシュでは、本種群は大きく 2 つのグ
ループに分化していること、各グループについては、集団間の分化はきわめて小さいことがわかった。また、2 種間の正逆雑種はコントロールとほぼ同様に正常に発育し、変態後も正常に発育している。変態率は 65％または 20％であった。これら 2 種は配偶子隔離や雑種致死による隔離はないことがわかった。
今後、成熟した個体について、繁殖能力や精子形成などを観察して、雑種不妊や精子形成異常の有無を調べることが必要である。また、2 個体の雌親から得られた合計 10,332 の卵を、１個体の雄の精子で受精させた。初期発生は、23℃のインキュベーターで飼育しながら観察した。受精後 80 分で第一卵割、受精
後 48 時間で尾芽胚、さらに受精後 72 時間後で孵化した。受精後 5 日目から幼66

生にはゆでたホウレンソウを与えた。23℃のインキュベーターで 2 週間飼育した後、ガラス温室の中に設置されているコンクリート水槽で飼育した。変態は、受精後 42 日目ごろから始まった。全体の卵のうち、89%が正常に卵割し、70%が尾芽胚に到達し、56%が正常に孵化し、46%が正常な接餌幼生になった。	
 しかし、わずか 10%が正常に変態した。	
 共食いが幼生の間で観察され、これは変態率の減少の要因となった。これに加えて、未確認の真菌感染と夏場を過ぎての低温も、変態率の減少の原因になった。	
 H.	
 tigerinus の繁殖力は全く正常だったが、 H.	
 tigerinus の子ガエルの大量生産には失敗した。将来、 H.	
 tigerinus の実験で大量生産と保護を確実にするために、変態までのすべての段階で水温の厳しいコントロールが必要であると考えられる。	
 	
 ３.透明ガエル「スケルピョン」の遺伝様式と真皮色素細胞の組織学的観察
Inheritance	
 and	
 dermal	 chromatophore	
 structure	 of	
 see-through	 frogs	
 
	
 
[目的]	
 
	
  ニホンアカガエルには、灰色眼と黒色眼の２つの色彩突然変異があり、別々の遺伝子座の劣性ホモ接合体で発現することが分っている。本研究の目的は、これらの色彩突然変異を用いて、皮膚が透明で内臓が透けて見える透明ガエルを効率的に作製し、その遺伝様式を明らかにすることである。	
 	 [材料･方法]	
 	 	
  透明ガエルの作製には、灰色眼、黒色眼、野生型（ヘテロ）の雌雄を用いた。
人工受精法により、灰色眼♀×黒色眼♂、野生型（ヘテロ）同士、灰色眼♀×
野生型（ヘテロ）♂、透明ガエル同士の４組で交配を行った。また、透明ガエ
ルの皮膚の微細構造を調べるため、野生型、黒色眼、灰色眼および透明ガエルの真皮色素細胞を電子顕微鏡で観察した。	
 	 [成果･考察]	
 	  灰色眼♀×黒色眼♂では全てが野生型(ヘテロ)：野生型(ヘテロ)同士では野生型 53.4%、灰色眼 21.4%、黒色眼 19.3%、透明ガエル 5.9%：灰色眼♀×野生型(ヘテロ)♂では野生型 40.6%、灰色眼 38.7%、黒色眼 11.2%、透明ガエル 9.5%：
透明ガエル同士では全て透明ガエルであったが、生存率は最も低かった。以上の結果から、透明ガエルの作製には灰色眼♀×野生型(ヘテロ)♂の交配が最も効率的であることが分かった。その結果、野生型では黄色、虹色、黒色の３種
類の色素細胞が層状に観察された。灰色眼には黄色素胞と虹色素胞が存在し、虹色素胞には異常な丸い反射小板が観察された。黒色眼には黄色素胞と黒色素胞が存在し、黄色素胞には未熟なプテリノソームやカロテノイド小胞が観察されたが、虹色素胞は観察されなかった。透明ガエルでは色素細胞の数が少なく、未熟な黄色素胞様の細胞が見られ、その中にはメラノソーム様の構造も観察さ
れた。	
 
	
 
[将来の展望]	
 「透明ガエル」は、内臓透視のできる新しい実験動物として、環境、医学、生67

物学の分野において実験材料や教材として利用価値が高いと思われ、すでに需要がある。動物愛護の伝統がある欧米では特に「透明ガエル」への関心は高い。
ただ、２代目の「透明ガエル」は生活力が弱いため、以降の継代飼育がかなり困難であったため、安定した系代飼育のため改良が必要であり、現在、生活力改善のために、改良を試みており、さらに今後は、実用化に向けては、背面の透明度を上げるような工夫（黄色素胞を欠く突然変異を導入）も必要である。
また、今後は、「透明ガエル」に GFP(蛍光蛋白質)遺伝子をつないだベクターをインジェクションすることで、トランスジェニック「光る透明ガエル」を作成する。これにより、遺伝子発現の様子を外部から蛍光によってリアルタイムで観察でき、この方法では、プロモーターの設計を変えることで、さまざまな遺伝子の発現解析への応用が可能となる。	
 
	
 
研究業績	
 
①原著論文	 1.	
 Kakehashi,	
 R.,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 S.	
 Oumi,	
 S.	
 Katsuren,	
 M.	
 Hoso	 and	
 M.	
 Sumida	 (2013)	
 Mitochondrial	 genomes	 of	
 Japanese	
 Babina	 frogs	 (Ranidae,	 Anura):	
 unique	 gene	 arrangements	
 and	
 the	
 phylogenetic	
 position	
 of	
 genus	 Babina.	
 Genes	 Genet.	
 Syst.,	
 88:	
 59-67.	
 	
 2.	
 Kakehashi,	
 R.,	
 T.	
 Igawa,	
 N.	
 Iwai,	
 E.	
 Shoda-Kagaya,	
 and	
 M.	
 Sumida	 (2013)	
 Development	
 and	
 characterization	
 of	
 new	
 microsatellite	 loci	
 in	
 the	
 Otton	 frog	
 (Babina	
 subaspera)	
 and	
 cross-amplification	
 in	
 a	
 congeneric	 species,	 Holst’s	 frog	 (B.	
 holsti).	
 Conser.	
 Genet.	
 Res.,	
 5:	
 1071-1073.	
 
	
 
3.	
 Igawa,	
 T.,	
 H.	
 Sugawara,	
 M.	
 Tado,	
 T.	
 Nishitani,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 M.	
 M.	
 
Islam,	
 S.	
 Oumi,	
 S.	
 Katsuren,	
 T.	
 Fujii	
 and	 M.	
 Sumida	 (2013)	
 An	
 attempt	
 at	
 captive	 breeding	
 of	
 an	
 endangered	 newt,	
 Echinotriton	
 andersoni,	
 from	 the	
 Central	
 Ryukyus	 in	
 Japan.	
 Animals,	
 3:	
 680-692.	
 
	
 
4.	
 Hasan,	
 M.,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 Kuramoto,	
 A.	
 Kurabayashi	
 and	
 M.	
 Sumida	 (2014)	
 Description	
 of	
 two	
 new	
 species	 of	
 Microhyla	
 (Anura:	 Microhylidae)	
 from	
 Bangladesh.	
 Zootaxa,	
 3755:	
 401-418.	
 
	
 
5.	
  Kurabayashi,	  A.	
  and	
  M.	
  Sumida	  (2013)	
  Afrobatrachian	  mitochondrial	
 genomes:	  genome	  reorganization,	  gene	  rearrangement	  mechanisms,	
  and	
 evolutionary	 trends	
 of	
 duplicated	
 and	
 rearranged	
 genes.	
 BMC	
 Genomics,	
 14:	
 
633.	
 
	
 
6.	
 Komaki,	
 S.,	
 T.	
 Igawa,	
 M.	
 Nozawa,	
 S-M.	
 Lin,	 S.	
 Oumi	 and	
 M.	
 Sumida	 (2014)	
 Development	  and	
  characterization	
  of	
  14	
  microsatellite	  markers	  for	 Buergeria	
 japonica	
 (Amphibia,	
 Anura,	 Rhacophoridae).	
 Genes	 Genet.	
 Syst.,	 89:	
 35-39.	
 
	
 

68

7.	
 Kurabayashi,	
 A.,	
 R.	
 Kakehashi,	
 I.	
 Tazawa,	
 Y.	
 Haramoto,	
 T.	
 Oshima,	
 Y.	
 
Ito	
 and	
 M.	
 Sumida	 (2014)	
 Improved	
 transport	
 of	
 the	
 model	 amphibian,	
 Xenopus	 tropicalis,	
 and	
 its	
 viable	 temperature	
 for	
 transport.	
 Curr.	
 Herpetol.,	
 33:75-87.	
 
	
 
8.	
 Hasan,	
 M.,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 M.	
 R.	
 Khan,	
 T.	
 Igawa,	
 M.	
 S.	
 Alam,	
 T.	
 H.	
 Djong,	
 N.	
 Kurniawan,	
 H.	
 Joshy,	
 H.	
 S.	
 Yong,	
 Daicus,	
 M.	
 B.,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 M.	
 Kuramoto	
 and	
 M.	
 Sumida	 (2014)	
 Genetic	
 divergences	
 of	
 South	 and	
 Southeast	 Asian	
 frogs:	 a	
 case	 study	 of	 several	
 taxa	 based	 on	
 16S	
 ribosomal	
 RNA	 gene	 data	
 with	 notes	 on	 the	
 generic	
 name	
 Fejervarya.	
 Turk.	
 J.	
 Zool.,	
 38:	
 in	
 
press.	
 	
 ②総説･著書･その他	
 住田正幸、柏木昭彦、鈴木	  厚	
 「世界でオンリーワンの両生類研究・リソースセンター」	
 BioResource	
 Now!	
 9 巻 6 号 1-2 頁	
 (2013)	
 	
 ③学会発表	
 
国内学会	
 
1.	
 井川	
 武、小巻	
 翔平、Nasrin	
 Sultana、長岡	
 麻衣、野澤	
 昌文、Islam	
 Mohammed	 Mafizul、大海	
 昌平、住田	 正幸「Ion	 PGM を利用した両生類 3 種におけるマイクロサテライトマーカー開発」次世代シークエンサ現場の会	
 第三回研究会
2013/9/3	
 -	
 9/5	
 神戸国際会議場	
 	
 2.	
 住田正幸・井川武・Islam	 M.	
 M.・倉林敦・Alam,	
 M.	
 S.・掛橋竜祐・田戸
美雪・新谷望・菅原弘貴・西谷琢磨・大海昌平・勝連盛輝・藤井保「両生類絶滅危惧種の飼育下繁殖による保全の試み」日本遺伝学会第 85 回大会	  平成 25
年 9 月 19 日、慶応大学、横浜	
 
	
 
3.	
 Hasan,	
 M.,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 Kuramoto,	
 A.	
 Kurabayashi	
 and	
 M.	
 Sumida	 “Description	
 of	
 two	
 new	
 species	 of	
 Microhyla	
 (Anura:	 Microhylidae)	
 from	
 Bangladesh”	
 日本遺伝学会第 85 回大会	  平成 25 年 9 月 20 日慶応大学、横浜	
 
	
 
4.	
 Islam,	
 M.	
 M.,	
 R.	
 Kakehashi,	
 H.	
 Koide,	
 A.	
 Kurabayasi,	
 S.	
 Oumi,	
 S.	
 Katsuren,	
 T.	
 Fujii,	
 and	
 M.	
 Sumida	 “Genetic	
 divergence	
 and	
 postmating	 isolation	
 between	
 endangered	
 Holst’s	 frog	
 and	
 Otton	 frog	
 from	 the	
 Ryukyu	
 Archipelago,	 Japan,	
 elucidated	
 by	 allozyme	
 and	
 mitochondrial	
 gene	 sequence	 analyses,	 crossing	 experiments	
 and	
 cytological	
 observations”	
 日本遺伝学会第 85 回
大会	  平成 25 年 9 月 20 日、慶応大学、横浜	
 
	
 
5.	
 宇野好宣・西田千鶴子・高木知世・井川武・上野直人・住田正幸・松田洋
一「アフリカツメガエルのゲノム倍数化過程に生じた染色体再配列と無尾両生類における性染色体の起源とその進化に関する分子細胞遺伝学的研究」日本遺69

伝学会第 85 回大会	  平成 25 年 9 月 21 日、慶応大学、横浜	
 
	
 
6.	
 住田正幸・井川武・菅原弘貴・田戸美雪・西谷琢磨・倉林敦・Islam	
 M.	
 M.・
7.	
 大海昌平・勝連盛輝・藤井保「絶滅危惧種イボイモリの遺伝的多様性と飼育下繁殖」日本動物学会第 84 回大会	  平成 25 年 9 月 26 日	
 岡山大学、岡山市	
 
	
 
8.	
 小巻翔平・井川武・倉林敦・Mi-Sook	 Min・Si-Min	
 Lin・住田正幸「東アジア産トノサマガエル種群の系統関係と遺伝子浸透」日本動物学会第 84 回大会	 平成 25 年 9 月 26 日	
 岡山大学、岡山市	
 
	
 
9.	
 住田正幸・M.	
 M.	
 Islam・井川	
  武・倉林	  敦・古川友加里・佐野尚美・藤井	  保・吉崎範夫「透明ガエルの遺伝様式と真皮色素細胞の組織学的観察」日
本爬虫両棲類学会第 52 回大会	  平成 26 年 11 月 2 日	  東海大学、札幌	
 
	
 
10.	
 Islam,	
 M.	
 M.,	
 S.	
 Oumi,	
 H.	
 Ida	
 and	
 M.	
 Sumida	 “Genetic	
 divergence	
 and	
 postmating	 isolation	
 among	 several	 brown	 frog	
 species	
 from	
 Honshu	 and	
 Ryukyu	 of	
 Japan,	 and	
 Mongolia	
 elucidated	
 by	
 mitochondrial	
 gene	 sequence	 analyses,	 crossing	 experiments	
 and	
 subsequent	
 cytological	
 observations	
 of	
 their	 hybrids	
 and	
 controls”	
 日本爬虫両棲類学会第 52 回大会	  平成 26
年 11 月 2 日	  東海大学、札幌	
 
	
 
11.	
 掛橋竜祐・井川武・住田正幸「絶滅危惧種ホルストガエルにおける遺伝的集団構造」日本爬虫両棲類学会第 52 回大会	  平成 26 年 11 月 2 日	  東海大学、
札幌	
 
	
 
12.	
 井川	
  武・長岡麻衣・野澤昌文・小巻翔平・藤井	
  保・住田正幸「Ion	
 Torrent	
 PGM	 を用いたハナサキガエルにおけるマイクロサテライト遺伝子座の単離と集団構造解析」日本爬虫両棲類学会第 52 回大会	  平成 26 年 11 月 2 日	  東海大学、札幌	 	
 13.	
 渡辺愛・井川武・鈴木厚・柏木昭彦・倉林敦・藤井	  保・住田正幸「両生類モデル動物ネッタイツメガエル 6 系統における近交度及び遺伝的関係の解明」日本爬虫両棲類学会第 52 回大会	  平成 26 年 11 月 2 日	  東海大学、札幌	
 
	
 
14.	
 倉林敦・古野伸明・住田正幸・水野英明・大島一彦・M.	
 Vences「カエル亜目における SINE(short	
 interspersed	
 nuclear	 elements)の発見と系統分布」
日本爬虫両棲類学会第 52 回大会	  平成 26 年 11 月 2-3 日	  東海大学、札幌	
 
	
 
15.	
 Hasan,	
 M.,	
 N.	
 Kurniawan,	
 A.	
 Soewondo,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 T.	
 Igawa,	
 W.	
 M.	
 
M.	
  Nalley,	  M.	
  Matsui	  and	
  M.	
  Sumida	
  “Evolutionary	  relationships	
  and	
 postmating	  isolation	  among Fejervarya species from Lesser	  Sunda,	 Indonesia and	
 other	 Asian	 countries	
 revealed	
 by	 mtDNA	 Cyt	
 b	 gene	 sequences	 and	
 crossing	 experiments”	
 日本爬虫両棲類学会第 52 回大会	  平成 26 年 1170

月 2-3 日	  東海大学、札幌	
 
	
 
	
 
国際学会	
 
1.	
 Sumida,	
 M.,	
 T.	
 Igawa,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 M.	
 S.	
 Alam,	
 R.	
 Kakehashi,	
 M.	
 Tado,	
 N.	
 Shintani,	
 H.	
 Sugawara,	
 T.	
 Nishitani,	
 S.	
 Oumi,	
 S.	
 Katsuren,	
 and	
 T.	
 Fujii,	 “Captive	 breeding	 of	
 endangered	 amphibian	 species:	
 A	
 case	 study	 of	  ex	
 situ	
  conservation”	
 50th	
 Anniversary	 Meeting	
 of	
 the	
 
Australian	  Society	
  of	  Herpetologists”,	
  January	  30,	
  2014, Greenhills	
 Conference	 Centre,	 Canberra	
 Australia	
 
	
 
2.	
 Hasan,	
 M.,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 Kuramoto,	
 A.	
 Kurabayashi	
 and	
 M.	
 Sumida	 “Description	
 of	
 two	
 new	
 species	 of	
 Microhyla	
 (Anura:	 Microhylidae)	
 from	
 Bangladesh”	
  50th	  Anniversary	  Meeting	  of	  the	
  Australian	  Society	  of	
 Herpetologists”,	
 January	
 31,	
 2014, Greenhills	
 Conference	 Centre,	 Canberra	 Australia	
 
	
 
3.	
 Sumida,	
 M.,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 T.	
 Igawa,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 N.	
 Satou,	
 K.	
 Ukena,	 S.	
 Oumi,	
 S.	
 Katsuren,	
 and	
 T.	
 Fujii	 “A	
 case	 study	 of	
 fauna	 conservation	
 in	
  Japan:	  Current	  conservation	  measures	
  of	  wild	  populations,	
  captive	 breeding,	  genetic	  diversity,	  and	
  potential	  resource	  materials	  in	
  the	
 endangered	  frog	  species	  Odorrana	  ishikawae	
  and	
  O.	
  splendida”	
 International	
 Symposium	
 “Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology”,	
 28	
 March,	 2014,	
 Hiroshima	
 University,	
 Higashihiroshima	
 
	
 
4.	
 Islam,	
 M.	
 M.,	
 T.	
 Igawa,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 R.	
 Kakehashi,	
 N.	
 Satou,	 N.	
 Shintani,	
 M.	
 Tado,	
 H.	
 Sugawara,	
 T.	
 Nishitani,	
 M.	
 Uchida,	
 S.	
 Oumi,	
 S.	
 Katsuren,	
 T.	
 Fujii,	
 and	
 M.	
 Sumida	 “An	
 ex	
 situ	
 conservation	
 effort	 for	
 several	 endangered	
 and	
 near-threaten	 amphibian	 species	
 from	 the	
 Ryukyu	 Archipelago,	  Japan:	  Captive	  breeding	  of	  nine	  anuran	  species	  and	
 cryopreservation	  of	  sperm	  for	
  two	
  of	  them ” 	
  International	  Symposium	 “Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology”,	
 28	
 March,	 2014,	
 Hiroshima	
 University,	 Higashihiroshima	
 
	
 
5.	
 Hasan,	
 M.,	
 N.	
 Kurniawan,	
 A.	
 Soewondo,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 T.	
 Igawa,	
 W.	
 M.	
 M.	
 
Nalley,	
 M.	
 Matsui	
 and	
 M.	
 Sumida	 “Evolutionary	 relationships	
 and	
 postmating	 isolation	
 among Fejervarya species from Lesser	
 Sunda,	
 Indonesia and	
 other	 Asian	
  countries	
  revealed	
  by	  mtDNA	
  Cyt	
  b	
  gene	  sequences	  and	
  crossing	 experiments”	
 International	
 Symposium	
 “Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology”,	
 27-28	 March,	 2014,	
 Hiroshima	
 University,	
 Higashihiroshima	
 
	
 
6.	
 Alam,	
 M.	
 S.,	
 M.	
 M.	
 R.	
 Khan,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 Hasan	 and	 M.	
 Sumida	 “Artificial	
 Breeding	
 of	
 an	
 Indian	 Bullfrog	 (Hoplobatrachus	
 tigerinus):	
 A	
 Case	
 Study	 71on	
 Reproduction	
 and	
 Conservation”	
 International	
 Symposium	
 “Frontiers	 in	
 Amphibian	  Biology”,	  27-28	
  March,	  2014,	  Hiroshima	  University,	 Higashihiroshima	
 
	
 
7.	
 Sumida,	
 M.,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 T.	
 Igawa,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 Y.	
 Furukawa,	
 N.	
 Sano,	
 T.	
 Fujii	 and	 N.	
 Yoshizaki	
 “Translucent	 frogs	 created	 through	 crossbreeding,	
 and	
 their	 inheritance	
 and	
 dermal	 chromatophore	
 structure”	
 International	
 Symposium	
 “Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology”,	
 27-28	
 March,	 2014,	
 Hiroshima	
 University,	
 Higashihiroshima	
 
	
 
8.	
 Kuramoto,	
 M.,	
 N.	
 Satou,	
 S.	
 Oumi,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 and	
 M.	
 Sumida	 “Inter-	
 and	
 intra-island	 divergence	
 in	
 Odorrana	 ishikawae	
 (Anura,	
 Ranidae)	
 of	
 the	
 
Ryukyu	  Archipelago	
  of	  Japan,	  with	  description	
  of	
  a	
  new	
  species”	
 International	
 Symposium	
 “Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology”,	
 27-28	
 March,	 2014,	 Hiroshima	
 University,	
 Higashihiroshima	
 
	
 

9.	
 Djong,	
 H.	
 T.,	
 M.	
 Matsui,	
 M.	
 Kuramoto,	
 M.	
 Nishioka,	
 and	
 M.	
 Sumida	
 “A	
 
new	
 species	
 of	
 the	
  Fejervarya	
 limnocharis	
 complex	
 from	 Japan	 (Anura,	 Dicroglossidae)”	
 International	
 Symposium	
 “Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology”,	
 27-28	 March,	 2014,	
 Hiroshima	
 University,	
 Higashihiroshima	
 
	
 
10.	
 Sultana,	
 N.,	
 T.	
 Igawa,	
 M.	
 Nozawa,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 M.	
 R.	
 Khan,	
 M.	
 Hasan,	 M.	
 S.	
 Alam	 and	
 M.	
 Sumida	 “Development	
 and	
 characterization	
 of	
 27	
 new	
 
microsatellite	  markers	  of	  Indian	  Bullfrog,	  Hoplobatrachus	  tigerinus	 (Daudin,	  1802)	
  and	
  its	
  congeneric	  species ” 	  International	  Symposium	 “Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology”,	
 27-28	
 March,	 2014,	
 Hiroshima	
 University,	 Higashihiroshima	
 
	
 
11.	
 Kakehashi,	
 R.,	
 T.	
 Igawa	 and	 M.	
 Sumida	 “Genetic	
 population	
 structure	
 
of	
 an	
 endangered	 frog	
 species,	
 Babina	 holsti”	
 International	
 Symposium	 “Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology”,	
 27-28	
 March,	 2014,	
 Hiroshima	
 University,	 Higashihiroshima	
 
	
 
12.	
 Komaki,	
 S.,	
 T.	
 Igawa,	
 K.	
 Tojo,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 S.-M.	
 Lin,	
 M.-S.	
 Min,	 and	
 M.	
 Sumida	 “New	
 insights	
 into	
 evolutionary	 history	 among	 Asian	 pond	
 frog	
 species”	
 International	
 Symposium	
 “Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology”,	
 27-28	 March,	 2014,	
 Hiroshima	
 University,	
 Higashihiroshima	
 
	
 
13.	
 Uno,	 Y.,	 C.	
 Nishida,	
 C.	
 Takagi,	
 T.	
 Igawa,	
 N.	
 Ueno,	
 M.	
 Sumida	
 and	
 Y.	
 
Matsuda	 “Molecular	
 cytogenetic	
 studies	
 on	
 the	
 process	 of	
 genomic	
 and	
 chromosomal	 evolution	
 in	
  Xenopus	
 laevis	  after	
 WGD	
 and	
 the	
 origin	
 and	
 evolution	
 of	
 sex	
 chromosomes	
 in	
 anuran	 species”	
 International	
 Symposium	 72

“Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology”,	
 27-28	
 March,	 2014,	
 Hiroshima	
 University,	 Higashihiroshima	
 
	
 
14.	
 Kurabayashi,	
 A.,	
 N.	
 Furuno,	
 M.	
 Sumida,	
 H.	
 Mizuno,	
 K.	
 Ohshima,	
 and	
 M.	
 
Vences	 “Discovery	 and	
 phylogenetic	
 distribution	
 of	
 a	
 short	 interspersed	
 nuclear	 element	
 (SINE)	
 subgroup	
 in	
 neobatrachian	 frogs”	
 International	
 Symposium	
 “Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology”,	
 27-28	
 March,	 2014,	
 Hiroshima	
 University,	
 Higashihiroshima	
 
	
 
15.	
 Watanabe,	
 A.,	
 T.	
 Igawa,	
 A.	
 Kashiwagi,	
 A.	
 Suzuki,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 T.	
 Fujii,	
 and	 M.	
 Sumida	 “Inbreeding	 coefficient	
 and	
 genetic	
 relationship	 of	
  seven	  strains	  of	  Xenopus	
  tropicalis	  inferred	  from	  genome	  wide	 genotyping	
 of	
 54	
 microsatellite	 loci”	 International	
 Symposium	
 “Frontiers	 in	
  Amphibian	  Biology”,	  27-28	
  March,	  2014,	  Hiroshima	  University,	 Higashihiroshima	
 
	
 
16.	
 Kashiwagi,	
 A.,	
 K.	
 Kashiwagi,	
 H.	
 Hanada,	
 A.	
 Suzuki,	
 K.	
 Takebayashi,	 A.	
 Kurabayashi,	
 K.	
 Suzuki,	
 N.	
 Furuno,	
 I.	
 Tazawa,	
 K.	
 Nakajima,	
 T.	
 Yamamoto	
 
and	
 M.	
 Sumida	 “National	
 BioResource	 Project	
 (NBRP)	
 Xenopus	 (Silurana)	
 tropicalis:	
 Standard	
 High	 Quality	
 Inbred	
 Strains	
 for	
 Biological	
 Research”	
 International	
 Symposium	
 “Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology”,	
 27-28	
 March,	 2014,	 Hiroshima	
 University,	
 Higashihiroshima	
 
	
 
17.	
  Suzuki,	  A.,	  A.	
  Kashiwagi,	  K.	
  Kashiwagi,	  H.	
  Hanada,	  K.	
 Takebayashi-Suzuki,	
 I.	
 Tazawa,	
 N.	
 Furuno,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 S.	
 Kobayashi,	
 J.	
 Takenaka,	
 Y.	
 Tamaki,	
 T.	
 Igawa,	
 T.	
 Uto,	 C.	
 Nanba,	
 A.	
 Watanabe,	
 H.	
 Yoshida,	
 A.	
 Shimada,	
 and	
 M.	
 Sumida	 “International	
 Xenopus	 Resource	 Network	 and	
 Educational	
 Activities	
 at	
 Institute	 for	
 Amphibian	
 Biology”	
 International	
 Symposium	
 “Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology”,	
 27-28	
 March,	 2014,	
 Hiroshima	
 University,	
 Higashihiroshima	 	
 ④科研費等の受け入れ状況	
 1.	
 文部科学省特別教育研究経費—国際的に卓越した教育研究拠点機能の充実	
 先駆的両生類研究の展開—両生類絶滅危惧種の保全	
  11,740 千円	
 （担当	
 住田
正幸、矢尾板芳郎）	
 
	
 
2.	
 文部科学省第 3 期 NBRP「ネッタイツメガエルの近交化・標準系統の樹立・提供」中核機関（H25 年度）11,410 千円	
 (課題代表者	
 住田正幸)	
 	
 3.	
 科学研究費補助金	
 基盤研究(B)「絶滅危惧両生類における遺伝的多様性評
価と保全のための包括的研究」3,510 千円（研究代表者	
 住田正幸）	
 
	
 

73

4.	
 科学研究費補助金	
 挑戦的萌芽研究「光る透明ガエルの作出：非モデル両生類への遺伝子導入法の確立と NGS による発現解析」2,340 千円（研究代表者	
 住
田正幸）	
 

74

	
 
准教授・鈴木	  厚（Atsushi	
 Suzuki）	
 
	
 
研究内容	
 
胚発生初期に背腹と頭尾のパターン形成が調和する機構	
 A	
 mechanism	
 coordinating	 the	
 establishment	
 of	
 the	
 dorsal-ventral	
 and	
 anterior-posterior	
 axes	 during	 early	
 Xenopus	 embryogenesis	 （２）アフリカツメガエルのゲノム解析	
 Xenopus	 laevis	 genome	 project	 （３）国際ツメガエルリソース拠点ネットワークの構築	
 International	
 Xenopus	 Resource	 Network	
 
	
 
[目的]	
 
（１）初期発生過程において、背腹と頭尾の体軸が形成されると初めて胚の３次元座標が精確に決まり、基本的な体の体制（ボディープラン）が確立する。
近年の研究から、様々な細胞増殖因子によって体軸形成が制御されることが知られており、背腹軸は腹側化因子（Bone	
 Morphogenetic	
 protein,	
 BMP）によって、頭尾軸は後方化因子（Wnt・FGF・レチノイン酸）によって、それぞれ決定されている。胚が正常に発生するためには、背腹と頭尾の体軸形成が互いに調和しながら形成される必要があるが、この調和機構については、ほとんど理解が進んでいなかった。また、数学者 Thompson をはじめとする研究者によって、生物の多様な形態を、背腹軸と頭尾軸の調和機構の変化で説明しようとする試みがなされている。最近、私達の発見を含めて、体軸形成の調和機構に関する知見が得られつつある（Fuentealba	
  et	
 al.	
  Cell	
 131,	
 980-993,	
 2007;	
 Eivers	 et	
 al.	
 Science	
 Signaling	
 4,	
 ra68,	
 2011;	
 Takebayashi-Suzuki	
 et	
 al.	
 
Developmental	
 Biology	 360,	
 11-29,	 2011）。本研究では、アフリカツメガエ
ル胚を用いた機能スクリーニングにより新たに単離した Biz(BMP	 inhibitory	
 zinc-finger)が、背腹軸と頭尾軸の制御に関わることから、Biz の機能解析を通じて体軸形成の調和機構を明らかにすることを目的とした。	
 （２）アフリカツメガエル（Xenopus	
 laevis）は、医学生物学研究において長年使われており、膨大な研究成果を生んできた。近年のゲノム科学の進展に伴い、アフリカツメガエルのゲノムを解読して、これまでの研究成果を活用・展開させる機運が高まり、米国エネルギー省・カリフォルニア大学・テキサス大学、および東京大学・遺伝学研究所・広島大学などによる国際共同研究が開始されている。先にゲノムが解読されたネッタイツメガエル（Xenopus	
 (Silurana)	
 tropicalis）との比較解析を行い、ゲノム・遺伝子進化のメカニズムを明らかにすることを目的としている。	
 （３）実験モデル動物として優れた特徴を持つネッタイツメガエルおよびアフ
リカツメガエルのバイオリソースを国際的な枠組みで保存・提供するために、
英国・米国のツメガエルリソース拠点と両生類研究施設が連携を始めている。
特に、ネッタイツメガエルについては、文部科学省ナショナルバイオリソース
プロジェクト(NBRP)の平成 24 年度新規採択課題としてサポートを受けている。
両生類研究を推進するため、および両生類研究施設が国際的に貢献するために、

75積極的な取り組み・連携を行なうことを目的としている。	
 	
 [成果と考察]	
 （１）昨年度までの研究により、Biz が腹側化因子 BMP のシグナルを抑制して神経誘導（背側化）を引き起こすこと、および、他の細胞増殖因子シグナル（Wnt）と協調して頭尾軸形成を調節することを明らかにしてきた。すなわち、Biz の過剰発現を行うと頭部構造の形成が阻害され、胴尾部領域の神経マーカーの発現が誘導される。また、Biz 特異的なアンチセンスモルフォリノオリゴ（MO）
をアフリカツメガエル初期胚に注入して機能阻害実験を行うと、前後軸形成については、後方神経マーカーの１つである HoxB9 の発現が著しく低下した。また、背腹軸形成については、神経マーカーNCAM の発現が著しく低下することが分かっている。今年度は、Biz の生化学的な働きを調べるために、カエル胞胚の外胚葉組織片と培養細胞を用いた解析を中心におこなった。Biz をカエル卵の動物極側に過剰発現させると後方の神経が形成されるため、BMP シグナルの抑制、および Wnt シグナルの活性化が起きていることが予想された。BMP リガ
ンドが受容体に結合して細胞内の BMP シグナルが活性化されると、シグナル伝
達因子 Smad1/5/8 の C-末端にリン酸化が引き起こされる。そこで、BMP シグナ
ルの活性化の指標としてリン酸化 Smad1/5/8 の状態を調べたところ、Biz を導入した外胚葉組織片の細胞では、リン酸化 Smad1/5/8 の量が減少しており、Biz
が BMP シグナルを抑制していることが確認された。一方、Wnt シグナルについては、Wnt リガンドが受容体に結合してシグナルが活性化されると、細胞質および核内の beta-Catenin の分解が抑制されて、タンパク質量が増加することが知られている。Biz を導入した培養細胞では、予想どおり細胞質および核内に存在する beta-Catenin の量が増加し、Wnt シグナルが活性化していると考えられた。Biz の生化学的な働きと初期胚での表現型が一致したことから、Biz
が BMP シグナルと Wnt シグナルの制御を介して背腹軸と頭尾軸の形成を調和させる重要な分子であることが明確になった。	
 （２）アフリカツメガエルのゲノム解読は、日米の各担当者が作業を分担・協
力して解析を進めている。昨年度に引き続き国立遺伝学研究所で作製された
BAC ライブラリー（約 135 万個の独立クローンからなるオリジナル）を両生類研究施設において凍結保存・管理することに加えて、今年度は、このライブラリーを基礎生物学研究所・大学連携バイオバックアッププロジェクト（IBBP）
機関へ輸送し、現地に赴いて共同研究者と協力して複製作業を行なった。IBBP
における液体窒素保存用のほか、両生類研究施設から国内外に配布する複製品も作製し、オリジナルと複製品 2 セット（計 3 セット；405 万クローン）を両
生類研究施設へ輸送して凍結保存した。このうち 1 セットは、海外のツメガエ
ル研究者への国際貢献として英国ツメガエルリソース拠点へ凍結状態で輸送・配布を行なった。また、米国エネルギー省・テキサス大学らのグループによって作成された遺伝子モデルの検定作業・修正提案を行ない、大幅な改善を行なうことが出来た。アフリカツメガエル遺伝子モデルの改善は、ネッタイツ
メガエル遺伝子モデルの改善に繋がることも示すことが出来たので、今回の改善作業は、ツメガエルゲノム科学の進展に大きな意味を持つと考えている。この他、ゲノム情報・発現情報を利用して、TGF-beta および FGF シグナル経路の76

解析を共同研究で進めている。	
 （３）両生類研究施設は、平成 24 年度から文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクト（NBRP）に新規採択され、ネッタイツメガエルのリソース拠点として様々な研究支援を開始した。本プロジェクトでは、研究支援の一つとして、海外リソース拠点（英国 European	
 Xenopus	 Resource	 Centre	 (EXRC)と米国 National	
 Xenopus	 Resource	
 (NXR)）との国際連携促進を掲げている。拠点間における有用情報の共有だけでなく、ネッタイツメガエルサンプルの受渡
しなど、有機的な連携を積極的に展開している。今年度は、日英米の 3 拠点による月例ビデオ会議を開催することに加えて米国 NXR で開催された国際ツメガエル研究室主宰者リソース会議へ出席し、NXR、EXRC と並んで NBRP に関する招待講演を行なった。海外の研究室主宰者、ツメガエルデータベース（Xenbase）
担当者、英米リソース拠点担当者との協議をおこない、2014 年版ツメガエル白書を参加者全員で協力して作成した。平成 24 年度から積極的に始めた国際連携活動から、両生類研究施設・NBRP が国際的に広く認知されるようになり、2014年版ツメガエル白書にも掲載されることになった。両生類研究施設・NBRP へのホームページリンクも、EXRC、NXR、Xenbase 等の公式サイトに掲載されている。
また、構築したリソース拠点ネットワークを活かして、英国ガードン研究所・
ガードン教授および英国 EXRC・Guille 教授からネッタイツメガエルサンプルの提供を受けることができた。提供サンプルを用いた系統解析が両生類研究施設において進行しており、解析結果は国内外の研究者に対して公開・論文発表される予定である。	
 	
 [将来の展望]	 	  これまでに行なってきた FoxB1 転写因子の機能解析（2011 年論文発表）、および Biz 転写因子の機能解析（上記）から、背腹軸と頭尾軸の形成を調和させる機構が明らかになりつつある。この調和機構の実体は、BMP シグナルと Wnt
シグナルを統合的に制御する FoxB1 や Biz タンパク質による転写活性やタンパ
ク質分解の制御であると考えられる。今後、生化学的および分子生物学的手法を駆使して、FoxB1 や Biz に結合するタンパク質を同定・解析すれば、体軸形
成や形態の多様性を生み出す分子基盤が明らかにできる可能性がある。また、BMP シグナルと Wnt シグナルは幹細胞の制御にも重要であることから、本研究での知見は、幹細胞制御・再生医療への応用も可能であると予想される。	
 アフリカツメガエルのゲノム解析は、急ピッチで進んでおり、遺伝子モデルの改善がさらに進む予定である。現段階でもニワトリなど他のモデル生物を上回る精度を持つことが分っており、論文発表時までには極めて高い完成度に到達するであろう。上述のように、ネッタイツメガエルのゲノム情報・遺伝子モデルも併せて向上する予定であり、本ゲノム解析は両生類研究の促進に大いに貢献すると考えられる。比較ゲノム解析の観点からも、2 倍体のネッタイツメ
ガエルと擬似 4 倍体のアフリカツメガエルとの比較研究が可能となり、ツメガ
エル研究の重要性が増すと予想される。	
 平成 24 年度から積極的に展開した国際リソース拠点ネットワーク構築は、
過去 3 回にわたる日英米リソース拠点会議、および月例ビデオ会議を経て、緊密な連携関係が構築されている。既に、400 種類以上の cDNA クローンおよび77135 万個の BAC ライブラリークローンの共有、系統解析用カエルサンプルの受渡しなどが行なわれており、3 大リソース拠点が協力して世界中の研究者に貢献している。両生類研究施設・NBRP の活動は、国内だけでなく海外主要研究室の主宰者に認められつつあり、今後、さらに幅広い研究者へ貢献していく予定である。米国で開催された国際ツメガエル研究室主宰者リソース会議では、次世代の人材育成の観点から、若手研究者や学部生・高校生に対する教育活動が非常に高く評価された。その後も引き続き、教育界からの要望に応えて高校教員研修会の開催やカエルを用いた授業方法の指導等を積極的に行なっており、長期的な視点で研究者・教育者の育成に繋がると期待している。	
 
	
 
研究業績	
 
①原著論文	
 
該当なし	
 
	
 
②総説・著書	 住田正幸、柏木昭彦、鈴木	  厚	
 「世界でオンリーワンの両生類研究・リソースセンター」	
 BioResource	
 Now!	
 vol.	
 9,	
 No.	
 6,	
 1-2	
 (2013)	
 	
 ③学会発表等	
 
国内学会	
 
1.	
 Suzuki,	
 A.	
 and	
 Takebayashi-Suzuki,	
 K.	
 “Establishment	
 of	
 vertebrate	 body	
  plan	  via	
  coordinated	  regulation	  of	  dorsal-ventral	  and	
 anterior-posterior	 patterning	
 and	
 developmental	
 canalization”	
 第 46 回
日本発生生物学会,	
 島根	
 (2013 年 5 月 28 日-31 日、30 日；フラッシュトーク・
ポスター発表)	
 
	
 
2.	
 鈴木	
 厚「ナショナルバイオリソースプロジェクト・ネッタイツメガエルの現況」第 46 回日本発生生物学会・日本ツメガエル研究会総会,	
 島根	
 (2013 年
5 月；招待・依頼講演)	
 
	
 
3.	
 鈴木	
 厚「ゲノム・遺伝子から見た発生の仕組み～ゲノム学・発生学が	 支える私たちの健康～」広島市教育センター	
 高校教員研修会・講演会	
 (2013 年 7 月；招待・依頼講演)	
 
	
 
4.	
 鈴木	
 厚、竹林公子「背腹軸と頭尾軸の統合的制御によるボディープラン形
成と形態多様化のメカニズム」第 7 回日本ツメガエル研究集会（2013 年 9 月
24 日、山口県美祢市；口頭発表）	
 
	
 
5.	
 鈴木	
 厚「ナショナルバイオリソースプロジェクト・ネッタイツメガエルの現況と Xenopus	
 PI	
 meeting の報告」第７回	
 日本ツメガエル研究集会	
 （2013年 9 月、山口県美祢市；招待・依頼講演）	
 
	
 

78

6.	
 鈴木	
 厚「カエルの発生と中胚葉誘導・神経誘導」高校教員研修会・実験実習（2013 年 11 月 23－24 日、広島県東広島市；招待・依頼講演）	
 
	
 
7.	
 吉田和史，近藤剛士，五十嵐一衛,	
 竹林公子，鈴木	 厚，塩川光一郎	
 「アフリカツメガエル尾芽胚の組織形成に対するスペルミンの影響」	
 日本ポリアミン学会第 5 回年会、千葉県銚子市,	
 （2014 年 1 月 23、24 日、発表日：2014
年 1 月 23 日）	
 
	
 
国際学会	
 
1.	
 Akihiko	
 Kashiwagi,	
 Atsushi	 Suzuki*,	
 Nobuaki	 Furuno,	 Keiko	 Kashiwagi,	 Hideki	  Hanada,	  Ichiro	  Tazawa,	  Atsushi	
  Kurabayashi,	  Kimiko	 Takebayashi-Suzuki,	 Keisuke	 Nakajima,	
 Satomi	 Kobayashi,	 Junko	 Takenaka,	 Yuuna	 Tamaki	 and	
 Masayuki	
 Sumida	 “National	
 BioResource	 Project	
 (NBRP)	
 for	
 Xenopus:	
 Asian	
 hub	
 for	
 the	
 international	
 Xenopus	 research	
 community”	
 Xenopus	 PI	 meeting,	
 米国 Woods	
 Hole	 Marine	 Biological	
 Laboratory	 (2013年 8 月;	
 招待・依頼講演),	
 *	
 Speaker	
 	
 
	
 
2.	
 Atsushi	 Suzuki	 “Molecular	 mechanisms	
 of	
 frog	
 embryogenesis	
 and	
 its	
 
applications	  to	
  understanding	  human	  diseases	  and	
  advancement	  of	
 regenerative	 medicine”	
 International	 Interdisciplinary	 Studies	
 Seminar	 (IISS	 IV),	 Brawijaya	
 University,	 インドネシア	 (2013 年 10 月;	
 招待・依頼
講演)	
 
	
 
3.	
 Atsushi	 Suzuki,	
 Akihiko	
 Kashiwagi,	 Keiko	 Kashiwagi,	
 Hideki	 Hanada,	 Kimiko	  Takebayashi-Suzuki,	  Ichiro	  Tazawa,	  Nobuaki	  Furuno,	  Atsushi	
 Kurabayashi,	  Satomi	  Kobayashi,	  Junko	
  Takenaka,	  Yuuna	  Tamaki,	  Takeshi	 Igawa,	
 Takeshi	
 Uto,	 Chiyo	
 Nanba,	
 Ai	
 Watanabe,	
 Hitoshi	 Yoshida,	
 Aki	
 Shimada,	 and	
  Masayuki	
  Sumida	
  “International	
  Xenopus	
  Resource	  Network	  and	
 Educational	
 Activities	
 at	
 Institute	 for	
 Amphibian	
 Biology”	
 International	
 symposium	  “Frontiers	  in	  Amphibian	  Biology:	  Endangered	  Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing”,	
 東広島	 (2014 年 3 月 27 日-28 日、27
日；ポスター発表)	
 	
 
	
 
4.	
  Kimiko	  Takebayashi-Suzuki,	  Hidenori	  Konishi	  and	
  Atsushi	  Suzuki	 “Establishment	
 of	
 vertebrate	 body	 plan	 via	
 coordinated	 regulation	
 of	
 dorsal-ventral	
 and	
 anterior-posterior	 patterning	 during	 early	
 Xenopus	 embryogenesis”	
  International	  symposium	  “Frontiers	  in	  Amphibian	 Biology:	
 Endangered	
 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing”,	
 東広島	 (2014 年 3 月 27 日-28 日、27 日；ポスター発表)	
 	
 
	
 
	
 
④科研費等の受け入れ状況	 	
  科学研究費補助金	
  基盤研究（Ｃ）（分担）	
 

79

	
 
助教・倉林	
 敦（Atsushi	
 Kurabayashi）	
 
	
 
研究内容	
 
カエル亜目における SINE の探索：SINE2-1XT ホモログおよびサブファミリーの系統的起源	 Survey	 of	
 SINE	
 retrotransposons	 in	
 neobatrachian	 frogs:	 Phylogenertic	 origins	 of	
 SINE2-1XT	
 homologue	
 and	
 its	
 subfamilies.	
 
	
 
[目的]	
 
	
  カエル亜目（Neobatrachia）は、現生両生類種の 95％を含む巨大な分類群である。本分類群のサブグループ（科〜亜科レベル）の多くは、大陸移動に伴い分布拡大と系統分岐を生じたとされる一方で、従来の分子系統解析では解決できない系統額上の問題が数多く残っており、正確な生物地理学的な考察が困難な状況であった。そこで、本研究では、従来法にはない利点を持つ、転移因子
SINE の挿入に基づく系統解析によって、これらの問題を解決することを最終目的として研究を行った。ただし、これまでにカエル亜目からは SINE 配列が発見されていなかったため、SINE（Short	
 INterspred	
 Element）マーカーによる系統解析を実施するためには、まず、SINE を探索し、単離・同定を行う必要があった。SINE 探索に加え、本研究では以下の点を目的として研究を実施した。
（1）両生類における SINE の起源と系統的分布の解明。(2)ゲノム内の SINE の存在比の解明と SINE 法実施可能性の検討。(3)カエルミトゲノムにおいて配置変化が生じやすい遺伝子の周辺に、SINE/LINE(Long	
 INterspred	
 Element)で共通してみられる LINE 逆転写酵素蛋白質の認識配列が存在するかの検討。	
 	 	
 [材料・方法]	
 	
  本研究では、世界各地から 50 種以上のアカガエル類やその他の両生類分類群の組織サンプルを研究材料として収集し、分子生物学的実験に用いた。また、以下に主たる研究方法を示す。	
 ・	  ドットブロットハイブリダイゼーション（サザンハイブリゼーション）による、ゲノム内 SINE（および LINE）配列の確認。	
 ・	
  454 次世代シークエンサーによるランダムシークエンス。	
 ・	  RepreatMasker および RepeatModeler	 プログラムによる NGS データからの
SINE/LINE 配列の探索。（その他、Blast、Perl などのプログラムを使ったバイオインフォマティクス解析）	
 ・	
  PCR 法による、SINE/LINE の増幅・サブクローニングと DNA 塩基配列決定。	
 	 	 [結果・考察・成果]	
 (1)カエル亜目における SINE2-1XT ホモログの発見	
 	
  両生類では、これまでムカシガエル亜目に属するピパ科のツメガエル属（Xenopus）のみで SINE の存在が知られており、カエル亜目では SINE の存在は知られていなかった。そこで、カエル亜目に属する、3 科 3 種のカエル	
  -	
 ニ
ホンアカガエル（Rana	 japonica:アカガエル科）、セアカアデガエル（Boophis	 80goudotii:	
 マダガスカルガエル科）、アメフクラガエル（Breviceps	
 adspersus:
フクラガエル科）-	
 のゲノムを、454 次世代シークエンサーを用いて、をラン
ダムシークエンスした。	
 	
  ここで得られた配列情報（それぞれ 48、59、68 メガベース）から、既知のSINE 配列を探索した。その結果、新規 SINE は発見できなかった。一方で、これら３種のゲノムには、ネッタイツメガエルで発見されていた 6 種の SINE のうち、SINE2-1XT と相同な SINE が存在することが明らかとなった。さらに、
SINE2-1XT ホモログの配列がゲノムに占める割合（存在率）は分類群間で大きく異なっていた。具体的には、ニホンアカガエル・フクラガエルでの SINE2-1XTの存在率は、0.13・0.20％と低いが、B.	
 goudotii では、全ゲノム配列（3.9Gbp）の 1.84％が SINE2-1XT ホモログであると推定された。（なお、全ゲノム情報が公開されているネッタイツメガエルゲノムにおける SINE2-1XT の存在率は、0.04％である）。この結果から、カエル亜目内でも SINE 法による系統解析が実施可能であることが初めて明らかとなった。一方で、SINE 法による系統解析の成功率は、SINE の増幅率と増幅時期が大きく影響する。このため、今回の結果は、SINE 法を適用しやすい分類群と適用が難しいグループがあることを示唆するものであった。	
 	
  さらに、本研究によって、B.	
 goudotii とニホンアカガエルとゲノムには、それぞれ典型的な	
 SINE2-1XT	
 とは異なる	
 SINE	 2-1	 サブタイプが存在することが分かった。具体的には、B.	
 goudotii	
 には	
 LINE 逆転写酵素認識部位を含
むおよそ 70bp の領域が 2-5 コピー重複している SINE2-1 が存在し、さらに、
ニホンアカガエルには、同認識部位が大きく変化した SINE2-1 が存在していた。	
 	 （2）SINE2-1XT ホモログとそのサブファミリーの系統的分布と起源系統	
 SINE2-1XT ホモログおよび、これらの SINE2-1 サブタイプが生じた起源系統を明らかにするため、36 種類の両生類についてドットブロットハイブリダイゼー
ションを行った。その結果、今回検査した全ての両生類種（有尾類・無足類を含む）において、SINE2-1XT ホモログは陽性であった。この結果は、同 SINE
は全ての現生両生類の共通祖先系統に由来することを示している。また、ニホ
ンアカガエルで見つかった SINE2-1 サブタイプは、アカガエルかの中でも Rana
属の種にのみ存在することが示され、本サブタイプは本属の共通祖先（またはRana 一部系統の祖先）に由来すると考えられた。また、Boophis ゲノムに存在するリピートを持った SINE サブタイプ（Boophis	
 サブタイプ）は、一部のNatatanura（広義アカガエル科）系統でのみ存在が確認された。さらに、Boophis	 サブタイプは、単系統 Natatanura の中で多系統的に存在していることが示された。このことは、以下 2 点の可能性を示唆している。1)Boophis	
 サブタイプ
SINE は、一部の Natatanura 系統の共通祖先で生じたが、その後、いくつかの系統ではゲノムから消失した。2）現在の Natatanura 内の系統仮説は正しくない（=	 Boophis	 サブタイプ SINE をもったグループが単系統である可能性）。
どちらの仮説が正しいのかについては、更なる研究が必要であるが、2）の仮説が正しい場合は、現行の Natatanura の系統仮説については、大きな改変が必要となる。	
 	 81

（3）カエル亜目ミトゲノムの遺伝子配置変化とレトロポゾン様転移機構	
 一般的に、ミトコンドリアゲノム上で遺伝子が並んでいる順序（遺伝子配置）
は、多細胞動物では保守的で、あまり変化しない。しかし、カエル亜目のミト
ゲノムでは、特定の遺伝子部位（tRNA-His 遺伝子や nad5 遺伝子）の配置変化
が多系統的に頻繁に生じることが分かっており、この配置変化は SINE/LINE な
どのレトロポゾン様の転移メカニズムが作用していることが示唆されていた。
このため、本研究で発見した SINE2-1XT ホモログの逆転写酵素認識配列が、上記のミトゲノム遺伝子近傍に存在するかを検索した。その結果、この SINE の逆転写酵素認識部位類似配列は存在せず、カエル亜目のミトゲノム高頻度配置
変化は、レトロポゾン様の遺伝子転移機構とは無関係か、SINE2-1XT ホモログとは全く別のレトロポゾンがミトゲノムの構造変化に関与していることが示唆された。	 なお、現在、上記（1-3）の成果をまとめた欧文論文を準備中である。	
 	
 [今後の展望]	
 
SINE 法による未解決系統関係へのアプローチ	 上記の研究により、カエル亜目の中でも、SINE 法による系統解析の実施が容易な分類群と、同法の適用が難しい分類群が存在することが示唆された。そこで、
SINE 法の適用が容易と考えられるマダガスカルガエル科において、従来法では解決できない系統学上の問題点（1）マダガスカルガエル３亜科の類縁関係、（2） Tsingymantis 属の亜科帰属問題、（3）マダガスカルガエル亜科内のSpinomantis 属の系統的位置の解決を企図した。現在までに、マダガスカルガ
エル科の全３亜科全属についてのサンプルの収集に成功し、さらに、上記
Boophis	  に 加 え 、 Laliostoma,	  Mantella,	  Mantidactylus,	  Guibemantis,	 Spinomantis,	
 Tsingymantis 属の代表各 1 種について、部分ゲノムシークエンスを行い、多数の SINE 座位を単離した。現在、これらの SINE 座位を増幅する
プライマーを作製している。今後は、PCR 法によって、系統学的に情報のある座位を選別し、最終的に SINE 座位の挿入の有無を形質とした最節約法による系統解析を行い、上述の系統関係問題を解決する予定である。	
 
	
 
研究業績	
 
①	
 原著論文	
 1.Kakehashi,	
 R.,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 S.	
 Oumi,	
 S.	
 Katsuren,	
 M.	
 Hoso,	
 M.	
 Sumida.	
 Mitochondrial	 genomes	 of	
 Japanese	
 Babina	 frogs	 (Ranidae,	 Anura):	
 unique	
 gene	
 arrangements	
 and	
 the	
 phylogenetic	
 position	
 of	
 genus	 Babina.	
 Genes	 Genet	 Syst.	
 88:59-67	
 (2013).	
 	
 2.	
 Igawa,	
 T,	
 H.	
 Sugawara	
 ,	
 M.	
 Tado	 ,	 T.	
 Nishitani,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 M.	
 M.	
 
Islam,	
 S.	
 Oumi,	
 S.	
 Katsuren,	
 T.	
 Fujii,	
 &	 M.	
 Sumida.	
 An	
 Attempt	
 at	
 Captive	 Breeding	
 of	
 the	
 Endangered	
 Newt	
 Echinotriton	
 andersoni,	
 from	
 the	
 Central	 Ryukyus	
 in	
 Japan.	
 Animals	
 3:	
 680-692	
 (2013).	
 	
 3.Kurabayashi,	
 A	
 &	
 M	
 Sumida.	
 Afrobatrachian	 mitochondrial	 genomes:	
 genome	
 82

reorganization,	
 gene	
 rearrangement	
 mechanisms,	
 and	
 evolutionary	 trends	
 of	
 duplicated	
 and	
 rearranged	
 genes.	
 BMC	
 Genomics	
 14:	
 633	
 (2013).	
 	
 4.	
 Hasan,	
 M.,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 M.	
 R.	
 Khan,	
 T.	
 Igawa,	
 M.	
 S.	
 Alam,	
 T.	
 H.	
 Djong,	
 N.	
 Kurniawan,	
 H.	
 Joshy,	
 H.	
 S.	
 Yong,	
 Daicus,	
 M.	
 B.,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 M.	
 Kuramoto	
 &	 M.	
 Sumida.	
 Genetic	
 divergences	
 of	
 South	 and	
 Southeast	 Asian	 frogs:	
 A	
 case	 study	 of	 several	
 taxa	 based	 on	
 16S	
 ribosomal	
 RNA	 gene	 data	
 with	
 notes	 on	 the	
 generic	
 name	
 Fejervarya.	
 Turk.	
 J.	
 Zool.	
 38:1-23	
 (2014).	
 	
 5.	
 Hasan,	
 M.	
 K.,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 Kuramoto,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 and	
 M.	
 Sumida.	
 Description	
 of	
 two	
 new	
 species	 of	
 Microhyla	
 (Anura:	 Microhylidae)	
 from	
 Bangladesh.	
 Zootaxa	
 3755:	
 401–408	
 (2014).	
 	
 6.	
 Kurabayashi,	
 A.,	
 R.	
 Kakehashi,	
 I.	
 Tazawa,	
 Y.	
 Haramoto,	
 T.	
 Oshima,	
 Y.	
 
Ito	
  &	
  M.	
  Sumida.	
  Improved	  transport	  of	  the	
  model	  amphibian,	  Xenopus	
 tropicalis,	
 and	
 its	
 viable	 temperature	
 for	
 transport.	
 Current	
 Herpetology	
 33:	
 75-87	 (2014).	
 	
 ②	
 総説・著書	
 
該当なし	
 
	
 
③	
 学会発表	
 
国内学会	
 
1.	
 倉林	
 敦・住田正幸・水野英明・大島一彦・Miguel	
 Vences「カエル亜目におけるSINE（short	
 interspersed	
 nuclear	 element）の発見と系統的分布」	
 日本爬虫両棲類学会	
 第52回大会（2012年11月、東海大学札幌キャンパス、北
海道）	
 
	
 
2.	
 住田正幸・井川武・Islam	 M.	
 M.・倉林敦・Alam,	
 M.	
 S.・掛橋竜祐・田戸
美雪・新谷望・菅原弘貴・西谷琢磨・大海昌平・勝連盛輝・藤井保「両生類絶滅危惧種の飼育下繁殖による保全の試み」日本遺伝学会第 85 回大会	  平成 25
年 9 月 19 日、慶応大学、横浜	
 
	
 
3.	
 Hasan,	
 M.,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 Kuramoto,	
 A.	
 Kurabayashi	
 and	
 M.	
 Sumida	 “Description	
 of	
 two	
 new	
 species	 of	
 Microhyla	
 (Anura:	 Microhylidae)	
 from	
 Bangladesh”	
 日本遺伝学会第 85 回大会	  平成 25 年 9 月 20 日慶応大学、横浜	
 
	
 
4.	
 Islam,	
 M.	
 M.,	
 R.	
 Kakehashi,	
 H.	
 Koide,	
 A.	
 Kurabayasi,	
 S.	
 Oumi,	
 S.	
 Katsuren,	
 T.	
 Fujii,	
 and	
 M.	
 Sumida	 “Genetic	
 divergence	
 and	
 postmating	 isolation	
 between	
 endangered	
 Holst’s	 frog	
 and	
 Otton	 frog	
 from	 the	
 Ryukyu	
 Archipelago,	 Japan,	
 elucidated	
 by	 allozyme	
 and	
 mitochondrial	
 gene	 sequence	 analyses,	 crossing	 experiments	
 and	
 cytological	
 observations”	
 日本遺伝学会第 85 回
大会	  平成 25 年 9 月 20 日、慶応大学、横浜	
 

83

	
 
5.	
 住田正幸・井川武・菅原弘貴・田戸美雪・西谷琢磨・倉林敦・Islam	
 M.	
 M.・
大海昌平・勝連盛輝・藤井保「絶滅危惧種イボイモリの遺伝的多様性と飼育下繁殖」日本動物学会第 84 回大会	  平成 25 年 9 月 26 日	
 岡山大学、岡山市	
 
	
 
6.	
 小巻翔平・井川武・倉林敦・Mi-Sook	 Min・Si-Min	
 Lin・住田正幸「東アジア産トノサマガエル種群の系統関係と遺伝子浸透」日本動物学会第 84 回大会	 平成 25 年 9 月 26 日	
 岡山大学、岡山市	
 
	
 
7.	
 住田正幸・M.	
 M.	
 Islam・井川	
  武・倉林	  敦・古川友加里・佐野尚美・藤井	  保・吉崎範夫「透明ガエルの遺伝様式と真皮色素細胞の組織学的観察」日
本爬虫両棲類学会第 52 回大会	  平成 26 年 11 月 2 日	  東海大学、札幌	
 
	
 
8.	
 渡辺愛・井川武・鈴木厚・柏木昭彦・倉林敦・藤井	  保・住田正幸「両生類モデル動物ネッタイツメガエル 6 系統における近交度及び遺伝的関係の解明」日本爬虫両棲類学会第 52 回大会	  平成 26 年 11 月 2 日	  東海大学、札幌	
 
	
 
国際学会	
 
1. Kuramoto,	
 M.,	
 N.	
 Satou,	
 S.	
 Oumi,	
 A.	
 Kurabayashi	
 &	
 M.Sumida.	
 Inter-	
 and	
 intra-island	 divergence	
 in	
 Odorrana	 ishikawae	
 (Anura,	
 Ranidae)	
 of	
 the	
 
Ryukyu	 Archipelago	
 of	
 Japan,	
 with	 description	
 of	
 a	
 new	
 species.	
 (IABHU	 International	
 Symposium,	
 Hiroshima	
 University,	 March	 2014).	
 	
 2. Komaki,	
 S.,	
 T.	
 Igawa,	
 K.	
 Tojo,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 S.-M.	
 Lin,	
 M.-S.	
 Min,	 &	
 M.	
 Sumida.	
 New	
 insights	
 into	
 evolutionary	 history	 among	 Asian	 pond	
 frog	
 species.	
 (IABHU	
 International	
 Symposium,	
 Hiroshima	
 University,	 March	 2014).	
 	
 3. 	
 Kurabayashi,	
 A.,	
 N.	
 Furuno,	
 M.	
 Sumida,	
 H.	
 Mizuno,	
 K.	
 Ohshima,	
 &	 Miguel	 Vences.	
 Discovery	 and	
 phylogenetic	
 distribution	
 of	
 a	
 short	 interspersed	
 nuclear	 element	
 (SINE)	
 subgroup	
 in	
 neobatrachian	 frogs.	
 (IABHU	 International	
 Symposium,	
 Hiroshima	
 University,	 March	 2014).	
 	
 4. Watanabe,	
 A.,	
 T.	
 Igawa,	
 A.	
 Kashiwagi,	
 A.	
 Suzuki,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 T.	
 Fujii	 &	 M.	
 Sumida.	
 Inbreeding	 coefficient	
 and	
 genetic	
 relationship	
 of	
 seven	 strains	
 of	
 Xenopus	 tropicalis	 inferred	
 from	 genome	 wide	 genotyping	
 
of	
 54	
 microsatellite	 loci.	
 (IABHU	
 International	
 Symposium,	
 Hiroshima	
 University,	 March	 2014).	
 	 5.	
 Suzuki,A.,	
 A.	
 Kashiwagi,	
 K.	
 Kashiwagi,	
 H.	
 Hanada,	
 K.	
 Takebayashi-Suzuki,	
 I.	
 Tazawa,	
 N.	
 Furuno,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 S.	
 Kobayashi,	
 J.	
 Takenaka,	
 Y.	
 Tamaki,	 T.	
 Igawa,	
 T.	
 Uto,	 C.	
 Nanba,	
 A.	
 Watanabe,	
 H.	
 Yoshida,	
 A.	
 Shimada	
 &	
 M.	
 
Sumida.International	
 Xenopus	 Resource	 Network	
 and	
 Educational	
 Activities	
 

84

at	
 Institute	 for	
 Amphibian	
 Biology.	
 (IABHU	
 International	
 Symposium,	 Hiroshima	
 University,	 March	 2014).	
 	 6.Kashiwagi,	
 A.,	
 K.	
 Kashiwagi,	
 H.	
 Hanada,	
 A.	
 Suzuki,	
 K.	
 Takebayashi,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 K.	
 Suzuki,	
 N.	
 Furuno,	
 I.	
 Tazawa,	
 K.	
 Nakajuma,	
 T.	
 Yamamoto	
 
&	
 M.	
 Sumida.	
 National	
 BioResource	 Project	
 (NBRP)	
 Xenopus	 (Silurana)	
 tropicalis:	
 Standard	
 High	 Quality	
 Inbred	
 Strains	
 for	
 Biological	
 Research	
 
	
 
7.	
 Sumida,M.,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 T.	
 Igawa,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 Y.	
 Furukawa,	
 N.	
 Sano,	
 T.	
 Fujii,	
 N.	
 Yoshizaki,	
 &	 M.	
 Nishioka.	
 Translucent	 frogs	 created	 through	 crossbreeding,	
 and	
 their	 inheritance	
 and	
 dermal	 chromatophore	
 structure.	
 (IABHU	 International	
 Symposium,	
 Hiroshima	
 University,	 March	 2014).	
 	
 8.	
 Islam,M.M.,	
 T.	
 Igawa,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 R.	
 Kakehashi,	
 N.	
 Satou,	 N.	
 	 Shintani,	
 M.	
 Tado,	
 H.	
 Sugawara,	
 T.	
 Nishitani,	
 M.	
 Uchida,	
 S.	
 Oumi,	
 S.	
 Katsuren,	
 T.	
 Fujii	
 &	 M.	
 Sumida.	
 An	
 ex	
 situ	
 conservation	
 effort	 for	
 several	 endangered	
 and	
 near-threaten	 amphibian	 species	
 from	 the	
 Ryukyu	 Archipelago,	
 Japan:	 Captive	 breeding	 of	
 nine	 anuran	 species	
 and	
 cryopreservation	
 of	
 sperm	
 for	
 two	
 of	
 them.	
 	
 9.	
 Sumida,	
 M.,	
 M.M.	 Islam,	
 T.	
 Igawa,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 N.	
 Satou,	
 K.	
 Ukena,	 S.	
 Oumi,	
 S.	
 Katsuren	
 &	 T.	
 Fujii.	
 A	
 case	 study	 of	
 fauna	 conservation	
 in	
 Japan:	
 Current	 conservation	
 measures	
 of	
 wild	
 populations,	
 captive	 breeding,	
 genetic	
 diversity,	
 and	
 potential	
 resource	 materials	
 in	
 the	
 
endangered	 frog	
 species	
 Odorrana	 ishikawae	
 and	
 O.	
 splendida.	
 
	
 
10.	
 Sumida,	
 M.,	
 T.	
 Igawa,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 M.	
 S.	
 Alam,	
 R.	
 Kakehashi,	
 M.	
 Tado,	
 N.	
 Shintani,	
 H.	
 Sugawara,	
 T.	
 Nishitani,	
 S.	
 Oumi,	
 S.	
 Katsuren,	
 and	
 T.	
 Fujii,	 “Captive	 breeding	 of	
 endangered	 amphibian	 species:	
 A	
 case	 study	 of	 ex	
 situ	
 conservation”	
 50th	
 Anniversary	 Meeting	
 of	
 the	
 
Australian	
 Society	
 of	
 Herpetologists”,	
 January	
 30,	
 2014, Greenhills	
 Conference	 Centre,	 Canberra	
 Australia	 	
 11.Hasan,	
 M.,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 Kuramoto,	
 A.	
 Kurabayashi	
 and	
 M.	
 Sumida	 “Description	
 of	
 two	
 new	
 species	 of	
 Microhyla	
 (Anura:	 Microhylidae)	
 from	
 Bangladesh”	
 50th	
 Anniversary	 Meeting	
 of	
 the	
 Australian	
 Society	 of	
 Herpetologists”,	
 January	
 31,	
 2014, Greenhills	
 Conference	 Centre,	 Canberra	 Australia	 	 ④	
 科研費等の受け入れ状況	
 ・科学研究費補助金・若手研究 B	
 	
 	
 	
 
2013 年	
 50 万円（研究代表）	
 ・科学研究費補助金・基盤研究 B	
 	
 	
 	
 
2013 年	  20 万円	
 （分担）	
 	 	 	
 ・科学研究費補助金・挑戦的萌芽研究	  	 2013 年	  10 万円（分担）	
 

85

	
 
特任助教・竹林公子	  (Kimiko	 Takebayashi-Suzuki)	
 
	
 
研究内容	
 
アフリカツメガエル初期発生過程における神経誘導の保証機構にはたらく遺伝子ネットワークの解明	 Establishment	
 of	
 vertebrate	 body	 plan	 via	
 coordinated	 regulation	
 of	
 dorsal-ventral	
 and	
 anterior-posterior	 patterning	 during	 early	
 Xenopus	 embryogenesis	
 	
 
	
 
[目的]	
 
	
  生物は遺伝的・環境的変化にうまく適応して生息圏を拡大している。両生類の胚は羊膜や卵殻を持たず様々な影響を受けやすいにも関わらず、正常に発生することができる。これは、両生類が遺伝的・環境的変化に適応する仕組み、
すなわち発生生物学者 C.H.Waddington により提唱されたキャナリゼーションを発達させてきたことを示唆する。初期胚は様々な遺伝的・環境的変化にさらされながらも、発生過程で背腹と前後の軸が形成され、初めて胚の３次元座標が精確に決まり、基本的な体の設計図（ボディープラン）が確立される。背腹軸は腹側化因子 BMP によって、前後軸は後方化因子 Wnt、FGF やレチノイン酸
によって、それぞれ決定されている。従来から、背腹軸と頭尾軸は互いに調和しながら形成されると考えられているが、体軸形成の調和に働く遺伝子の同定は進んでいなかった。近年になり、いくつかの知見が報告され始めたが、背腹軸と頭尾軸の個々の制御機構の理解が大幅に進んでいるのに比べ、背腹軸と頭尾軸の調和機構は、ほとんど未解明である。これまでに、私達の研究グループで同定した FoxB1 転写因子が、腹側化因子 BMP のシグナルを抑制して神経を誘導（背側化）し、後方化因子 Wnt・FGF のシグナルを活性化して胚を後方化することを明らかにしている(Takebayashi-Suzuki	
 et	
 al.,	 Dev.	 Biol.	
 2011)	
 。
すなわち、FoxB1 は、胚の背腹軸と頭尾軸の形成を制御し、これらの軸形成シ
ステムを調和させてボディープランの成立に働く。最近、FoxB1 転写因子が背腹軸と頭尾軸の調和だけでなく、神経誘導の保証機構にも重要な働きを示すこと が 分 か っ た 。 さ ら に FoxB1 転 写 因 子 と 同 様 に Biz	  (BMP	  inhibitory	
 zinc-finger)遺伝子も、腹側化因子 BMP のシグナルを抑制して神経誘導を引き起こすこと、Wnt シグナルと協調して頭尾軸形成を調節し、体軸形成の調和機構に関わることがわかった（詳細については本研究部門・鈴木准教授の項目も参照のこと）。	
 
本研究では、FoxB1 転写因子と Biz 転写因子を中心に、背腹軸と頭尾軸の調和機構、および神経誘導の保証機構に関する分子メカニズムを解析することを目的とする。	
 	
 [成果と考察]	
 	  昨年度までの研究により、Biz が腹側化因子 BMP のシグナルを抑制して神経
誘導（背側化）を引き起こすこと、および、他の細胞増殖因子シグナル（Wnt）と協調して頭尾軸形成を調節することを明らかにしてきた。すなわち、Biz の86

過剰発現を行うと頭部構造の形成が阻害されて胴尾部領域の神経マーカーの発現が誘導され、Biz の機能阻害実験を行うと、神経マーカーNCAM と後方神経マーカーHoxB9 の発現が著しく低下することが分かった。今年度はさらに解析するマーカー遺伝子の種類と数を増やして、体軸形成における Biz の機能を調べた。Biz	 MO 注入胚では、神経マーカーNCAM に加えて、より後期の神経分化マーカーである N-tubulin の発現も著しく低下することが分かった。さらに興味深いことに、背側と頭部の両方に発現する Pax6 の Biz	 MO 注入胚における発現は、背側で著しく減少する一方で、頭部では逆に拡大していた。したがって、Biz が初期の神経誘導の方向付けよりも、むしろ後期の神経分化段階、および頭部抑制に必要であることが確かめられた。	
 次に、体軸形成の調和機構に関わる FoxB1 と Biz 転写因子が協調するかを調べるために、Biz の単独機能欠損胚で表現型が見られた時よりも MO 量を減らし、FoxB1 と Biz の両方を同時に機能欠損させる実験をおこなった。その結果、それぞれ単独で機能阻害した場合に比べて、神経マーカーNCAM と N-tubulin の両方の発現が、より激しく低下することがわかった。また、Pax6 の背側の発現も著しく減少し、頭部の発現領域は一層強く拡大することがわかった。したがって、FoxB1 と、Biz を同時に機能欠損させると、背腹軸と前後軸パターン形成の両方が影響を受け、互いに協調していることがわかった。昨年度までに、
Oct-25 転写因子が腹側化因子 BMP のシグナルを抑制して神経形成を促進する
こと、および Oct-25 下流遺伝子として同定した FoxB1 転写因子と Oct-25 は外胚葉中で feed-forward	 loop	
 ネットワークを形成して、Oct-25 の働きが低下
しても FoxB1 が神経誘導の保証機構として働くことがわかっている。したがって、Biz 転写因子も FoxB1 と同様、背腹軸と頭尾軸の調和に働くだけでなく、様々な遺伝的・環境的変化に初期胚がさらされても神経が誘導されるように保証する機構として、正常な発生を促している可能性を考えている。	
 さらに、私たちが既にマイクロアレイ解析によって同定した新規 Oct-25 下流因子群が、発生過程において神経誘導が確立される時期に発現するかを調べるため、アフリカツメガエル胚のホールマウント	
 in	
 situ	 ハイブリダイゼーション法をおこなった。その結果、Oct-25 によって発現が上昇する遺伝子の一つは予定神経領域に発現することがわかった。したがって、新規 Oct-25 下流
因子群は、実際の神経誘導期に発現しており、Oct-25/FoxB1	
 feed-forward	 loop
ネットワークとの協調作用（神経誘導保証機構）に働く可能性が考えられた。	
 	
 [将来の展望]	 	
  今年度は、解析するマーカーの種類を増やして Biz 過剰発現と機能阻害の表現型を調べたことによって、頭尾軸と背腹軸の調和機構における Biz の重要性
がさらに強まったうえ、FoxB1 転写因子との協調作用についても明らかになりつつある。現在、Biz の機能解析に加えて、FoxB1 と Biz、および、新規 Oct-25
下流因子群と Oct-25/FoxB1	
 feed-forward	 loop ネットワークとの協調作用（外胚葉内の神経誘導保証機構）を詳細に調べている。また、昨年度確立したネッ
タイツメガエル胚のホールマウント	
 in	
 situ	 ハイブリダイゼーション法を活用し、アフリカツメガエル胚に加えて、ネッタイツメガエル胚における Oct-25
転写因子下流遺伝子の発現についても、さらに詳細な解析をおこなう。これら

87

の研究から、神経誘導の保証機構、および頭尾軸と背腹軸の調和機構の体系的な遺伝子ネットワークの理解が可能になると考えている。	
 
研究業績	
 
①原著論文	 	  該当なし	 	
 ②総説・著書	 	  該当なし	 	
 ③学会発表	
 
国内学会	
 
1.	
  Kimiko	  Takebayashi-Suzuki,	  Hidenori	  Konishi	  and	
  Atsushi	  Suzuki	 “Establishment	
 of	
 vertebrate	 body	 plan	 via	
 coordinated	 regulation	
 of	
 dorsal-ventral	
 and	
 anterior-posterior	 patterning	 during	 early	  Xenopus	
 embryogenesis”	
  International	  symposium	  “Frontiers	  in	  Amphibian	 Biology:	
 Endangered	
 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing”,	
 東広島	 (2014 年 3 月 27 日-28 日、27 日ポスター発表)	
 	
 	
 2.吉田和史，近藤剛士，五十嵐一衛,	
 竹林公子，鈴木厚，塩川光一郎	
 「アフリカツメガエル尾芽胚の組織形成に対するスペルミンの影響」	
 日本ポリアミン学会第 5 回年会、千葉県銚子市,	
 （2014 年 1 月 23、24 日、発表日：2014 年
1 月 23 日）	
 
	
 
3.鈴木	
  厚、竹林公子「背腹軸と頭尾軸の統合的制御によるボディープラン形
成と形態多様化のメカニズム」第 7 回日本ツメガエル研究集会（2013 年 9 月
24 日、山口県美祢市、口頭発表）	
 
	
 
4.	
 Suzuki,	
 A.	
 and	
 Takebayashi-Suzuki,	
 K.	
 “Establishment	
 of	
 vertebrate	 body	
  plan	  via	
  coordinated	  regulation	  of	  dorsal-ventral	  and	
 anterior-posterior	 patterning	
 and	
 developmental	
 canalization”	
 第 46 回
日本発生生物学会,	
 島根	
 (2013 年 5 月 28 日-31 日、30 日フラッシュトーク・
ポスター発表)	
 
	
 
国際学会	
 
該当なし	
 
	
 
④科研費等の受け入れ状況	
 科学研究費補助金	
  基盤研究（Ｃ）「神経誘導の保証機構にはたらく遺伝子
ネットワークの解明」代表者：竹林公子	
  800 千円.	
 

88

	
 
特任助教・井川	
 武（Takeshi	
 Igawa）	
 
	
 
研究内容	
 
絶滅危惧種イボイモリにおける集団構造及び遺伝的多様性の解明	
 Isolation	  and	
  development	  of	  microsatellite	  markers	  and	
  detection	
  of	
 genetic	 diversity	
 for	
 Crocodile	
 Newt,	
 Echinotriton	
 andersoni	
 
	
 
[目的]	
 
	
 イボイモリ Echiinotriton	
 andersoni は、奄美大島、請島、徳之島、沖縄島、
瀬底島、渡嘉敷島の 6 島に生息する西南諸島固有種である。しかしながら、他の絶滅危惧種と同様に、生息地の消失や、環境改変、ジャワマングースによる食害により個体数が激減しており、本種は IUCN レッドリストにおける絶滅危惧 IB 類に指定されている。本種の包括的かつ、効率的な保全には種内の遺伝的多様性に関する知見が不可欠である。マイクロサテライト遺伝子座は共優性であり、さらに多型性の高い分子マーカーであり、保全遺伝学の分野で広く用いられているが、すでに我々は本種に有効なマイクロサテライト遺伝子座、10座の開発を昨年度に完了している(Sugawara	
 et	
 al.,	 2012)。そこで本研究ではこれらを利用して、本種の最も詳細な種内の遺伝的構造と、集団内の遺伝的多様性を評価することを目的として、集団遺伝学的解析を行った。	
 	
 [材料・方法]	
 ① マイクロサテライトマーカーを用いた集団遺伝学的解析	
 	  我々が採集した奄美大島産 12 個体、徳之島産 36 個体、沖縄島産 30 個体に加えて、Honda	
 et	
 al.	
 (2012)においてミトコンドリア DNA の解析に用いられた個体の提供を受け、それらからゲノム DNA を抽出し、Sugawara	
 et	
 al.	
 (2012)	
 において開発したマイクロサテライトマーカーの遺伝子型を決定した。その後、これらの各集団のデータに基づいて集団遺伝学的解析を行った。	
 	
 [結果・考察・成果]	
 	
  今回決定した遺伝子型に基づいて集団間の遺伝的距離を算出したところ、3つの島で遺伝的に大きく異なり、さらに沖縄島、奄美大島内にそれぞれ遺伝的に異なる三つの集団が確認された。Structure	 (Pritchard	
 et	
 al.,	 2000)による解析でも同様の結果が見られ、島内でも遺伝的に異なる集団が存在することが示唆された。特に、沖縄島内北部個体群においては、異なる集団が入れ子状に分布する二重構造が見られた。また、各集団の移動分散の頻度を Migrate	 (Beerli	 &	
 Palczewski,	
 2010)により求めたところ、沖縄島内においては、方向性のある移動分散が見られ、特に二重構造の形成には、氷期等の陸域拡大時期に存在した陸橋を通じて、分布拡大及び移動分散があったと考えられた。本
研究の成果は、当該分野の国際的雑誌に投稿準備中である。	
 
	
 
研究業績	
 
1.Shohei	 Komaki,	 Takeshi	 Igawa*,	
 Masafumi	 Nozawa,	
 Si-Min	
 Lin,	 Shohei	 Oumi,	
 

89

and	
 Masayuki	
 Sumida.	
 Development	
 and	
 characterization	
 of	
 14	
 
microsatellite	 markers	
 for	
 Buergeria	
 japonica	
 (Amphibia,	
 Anura,	 Rhacophoridae).	
 Genes	 &	
 Genetic	
 Systems.	
 89:	
 35-39,	 2014.	
 	
 2.	
 Mahmudul	
 Hasan,	
 Mohammed	
 Mafizul	
 Islam,	 Mukhlesur	
 Rahman	
 Khan,	
 and	
 Takeshi	 Igawa,	
 Mohammad	
 Shafiqul	
 Alam,	
 HonTjong	
 Djong,	
 Nia	
 Kurniawan,	 Hareesh	
 Joshy,	 Yong	 Hoi	
 Sen,	
 Daicus	
 M.	
 Belabut,	
 Atsushi	
 Kurabayashi,	 Mitsuru	
 Kuramoto,	
 Masayuki	
 Sumida.	
 Genetic	
 divergences	
 of	
 South	 and	
 Southeast	 Asian	 frogs	 :	 a	
 case	 study	 of	 several	
 taxa	 based	
 on	
 16S	
 
ribosomal	
 RNA	 gene	 data	
 with	 notes	 on	 the	
 generic	
 name	
 Fejervarya.	
 Turkish	
 Journal	
 of	
 Zoology,	
 38:1-22,	
 2014	 
	 3.	
 Takeshi	 Igawa,	
 Shohei	 Oumi,	
 Sseiki	 Katsuren,	
 and	
 Masayuki	
 Sumida.	
 Population	
 structure	
 and	
 landscape	 genetics	
 of	
 two	
 endangered	 frog	
 species	 of	
 genus	
 Odorrana:	
 different	 scenarios	
 on	
 two	
 islands.	
 Heredity,	 110:46-56,	
 September	 2013.	
 	
 4.Takeshi	
 Igawa,	
 Hirotaka	
 Sugawara,	
 Miyuki	
 Tado,	
 Takuma	
 Nishitani,	 Atsushi	 Kurabayashi,	 Mohammed	
 Islam,	 Shohei	 Oumi,	
 Seiki	 Katsuren,	 Tamotsu	
 Fujii,	 and	
 Masayuki	
 Sumida.	
 An	
 Attempt	
 at	
 Captive	
 Breeding	
 of	
 
the	
 EndangeredNewt	
 Echinotriton	
 andersoni,	
 from	
 the	
 Central	
 Ryukyus	 in	
 Japan.	
 Animals,	
 3:680-692,	
 July	 2013.	
 	
 5.	
 Ryosuke	
 Kakehashi,	
 Takeshi	 Igawa,	 Noriko	
 Iwai,	
 Etsuko	
 Shoda-Kagaya,	
 and	
 Masayuki	
 Sumida.	
 Development	
 and	
 characterization	
 of	
 new	
 
microsatellite	 loci	
 in	
 the	
 Otton	 frog	 (Babina	
 subaspera)	
 and	
 cross-amplification	
 in	
 a	
 congeneric	 species,	
 Holst’s	 frog	 (B.	
 holsti).	
 Conservation	
 Genetics	
 Resources,	
 5(4):1071-1073,	
 June	 2013.	
 	
 6.	
 Kinya	 Yasui,	 Takeshi	 Igawa,	 Takao	 Kaji,	
 and	 Yasuhisa	
 Henmi.	
 Stable	 aquaculture	
 of	
 the	
 Japanese	 lancelet	
 Branchiostoma	 japonicum	
 for	
 7	
 
years.	
 Journal	
 of	
 experimental	
 zoology.	
 Part	
 B,	 Molecular	 and	
 developmental	
 evolution,	
 320B:538-547,	
 September	 2013.	
 	
 ② 総説・著書	
 	 	 	
 該当なし	 	
 ③	 学会発表	
 国内学会	
 1.井川武・小巻翔平・Nasrin	
 Sultana・長岡麻衣・野澤昌文・Islam	
 Mohammed	
 90

Mafizul・大海昌平・住田正幸「Ion	 PGM を利用した両生類 3 種におけるマイク
ロサテライトマーカー開発」NGS 現場の会第三回研究会（2013 年 9 月 4 日、神
戸）	
 
	
 
2.	
 住田正幸・井川武・イスラム	 マフィズル・倉林敦・アラム	
 シャフィクル・
掛橋竜祐・田戸美雪・新谷望・菅原弘貴・西谷琢磨・大海昌平・勝連盛輝・藤井保「両生類絶滅危惧種の飼育下繁殖による保全の試み」日本遺伝学会
第 85 回大会（2013 年 9 月 19 日、横浜）（口頭発表）	
 	
 3.宇野好宣・西田千鶴子・高木知世・井川武・上野直人・住田正幸・松田洋一「アフリカツメガエルのゲノム倍数化過程に生じた染色体再配列と無尾両生類における性染色体の起源とその進化に関する分子細胞遺伝学的研究」
日本遺伝学会第 85 回大会（2013 年 9 月 21 日、横浜）（口頭発表）	
 
	
 
4.	
 住田正幸・井川武・菅原弘貴・田戸美雪・西谷琢磨・倉林敦・Mafizul	
 Islam・
大海昌平・勝連盛輝・藤井保「絶滅危惧種イボイモリの遺伝的多様性と飼育下繁殖」日本動物学会第 84 回大会（2013 年 9 月 26 日、岡山）（口頭発表）	
 	
 5. 小巻翔平・井川武・倉林敦・Min-Sook	 Min・Si-Min	
 Lin・住田正幸「東アジア産トノサマガエル種群の系統関係と遺伝子浸透」日本動物学会第 84 回大会（2013 年 9 月 26 日、岡山）（口頭発表）	
 
	
 
6.	
 住田正幸・Islam	
 M.	
 Mafizul・井川武・倉林敦・古川友加里・佐野尚美・
藤井保・吉崎範夫「透明ガエルの遺伝様式と皮膚色素細胞の組織学的観察」
日本爬虫両生類学会第 52 回大会（2013 年 11 月 2 日、札幌）（口頭発表）	
 	
 7.掛橋竜祐・井川武・住田正幸「絶滅危惧種ホルストガエルにおける遺伝的集団構造」日本爬虫両生類学会第 52 回大会（2013 年 11 月 2 日、札幌）（口頭
発表）	
 
	
 
8.	
 井川武・長岡麻衣・野澤昌文・小巻翔平・藤井保・住田正幸「Ion	
 Torrent	
 PGM を用いたハナサキガエルにおけるマイクロサテライト遺伝子座の単離と集団構造解析」日本爬虫両生類学会第 52 回大会（2013 年 11 月 2 日、札幌）（口頭発表）	
 	
 9.	
 渡辺愛・井川武・鈴木厚・柏木昭彦・倉林敦・藤井保・住田正幸「両生類モデル動物ネッタイツメガエル 6 系統における近交度及び遺伝的関係の解明」日本爬虫両生類学会第 52 回大会（2013 年 11 月 2 日、札幌）（口頭発表）	
 
	
 
10.	
 M	
 Hasan・N	
 Kurniawan・A	
 Sowendo・MM	
 Islam・T	
 Igawa・WMM	
 Nalley・M	
 Matsui・M	 Sumida「Evolutionary	 relationships	
 and	
 postmating	 isolation	
 among	 Fejervarya	 species	
 from	 Lesser	 Sunda,	
 Indonesia	
 and	
 other	 Asian	 countries	
 revealed	
 by	 mtDNA	 Cyt	
 b	 gene	 sequences	
 and	
 crossing	 91

experiments」日本爬虫両生類学会第 52 回大会（2013 年 11 月 2 日、札幌）（ポスター発表）	
 
	
 
国際学会	
 
1.Uno,	
 Y.,	
 Nishida,	
 C.,	
 Takagi,	
 C.,	
 Igawa,	
 T.,	
 Ueno,	
 N.,	
 Sumida,	
 M.,	
 and	
 
Matsuda,	
 Y.	
 “Molecular	
 cytogenetic	
 studies	
 on	
 the	
 process	 of	
 genomic	
 and	
 chromosomal	 evolution	
 in	
 Xenopus	 laevis	 after	 whole-genome	
 duplication	
 
and	
 the	
 origin	
 and	
 evolution	
 of	
 sex	
 chromosomes	
 in	
 anuran	 species.”	
 19th	 International	
 Chromosome	 Conference	 (4th	 September,	 2013.	
 Italia)	
 	
 2.	
 Igawa,	
 T.	
 "Conservation	
 genetics	
 of	
 endangered	 amphibians	
 in	
 Ryukyu	 Archipelago	 towards	
 sustainable	
 conservation	
 of	
 the	
 biodiversity	
 hotspot	 of	
 amphibians"	
 International	
 Symposium,	
 “Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology:	 Endangered	
 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing"	
 (28th	 March,	 2014,	
 Higashi-Hiroshima,	
 Japan)	
 (Oral	 presentation)	
 	
 3.Hasan,	
 M.,	
 Kurniawan,	
 N.,	
 Soewondo,	
 A.,	
 Islam,	 MM.,	
 Igawa,	
 T.,	
 Nalley,	
 WMM.,	 Matsui,	
 M.,	
 and	
 Sumida,	
 M.	
 "Evolutionary	 relationships	
 and	
 postmating	 isolation	
 among	 Fejervarya	 species	
 from	 Lesser	 Sunda,	 Indonesia	
 and	
 other	 Asian	 countries	
 revealed	
 by	 mtDNA	 Cyt	
 b	 gene	 sequences	 and	
 crossing	 experiments"	
 International	
 Symposium,	
 “Frontiers	 in	
 Amphibian	
 Biology:	
 Endangered	
 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing"	
 (27-28th	
 March,	 2014,	
 Higashi-Hiroshima,	
 Japan)	
 	
 4.	
 Sultana,	
 N.,	
 Igawa,	
 T.,	
 Nozawa,	
 M.,	
 Islam	 MM.,	 Khan,	
 MR.,	
 Hasan,	
 M.,	
 Alam,	
 MS.,	
 and	
 Sumida,	
 M.	
 "Development	
 and	
 characterization	
 of	
 27	
 new	
 
microsatellite	 markers	 of	
 Indian	 Bullfrog,	
 Hoplobatrachus	
 tigerinus	 (Daudin,	
 1802)	
 and	
 its	
 congeneric	 species"	
 International	
 Symposium,	 “Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology:	
 Endangered	
 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing"	 (27-28th	
 March,	 2014,	
 Higashi-Hiroshima,	
 Japan)	
 	
 5.	
 Komaki,	
 S.,	
 Igawa,	
 T.,	
 Tojo,	
 K.,	
 Kurabayashi,	
 A.,	
 Lin,	 S.,	 Min,	 M.,	 and	
 Sumida,	 M.,	
 "New	
 insights	
 into	
 evolutionary	 history	 among	 Asian	 pond	
 frog	
 species"	
 International	
 Symposium,	
 “Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology:	 Endangered	
 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing"	 (27-28th	
 March,	 2014,	
 Higashi-Hiroshima,	
 Japan)	
 	 6. Kakehashi,	
 R.,	
 Igawa,	
 T.,	
 and	
 Sumida,	 M.	
 "Genetic	
 population	
 structure	
 
of	
 an	
 endangered	 frog	
 species,	
 Babina	 holsti"	
 International	
 Symposium,	 “Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology:	
 Endangered	
 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing"	 (27-28th	
 March,	 2014,	
 Higashi-Hiroshima,	
 Japan)	
 	
 7.	
 Matsunami,	
 M.,	
 Kishida,	
 O.,	
 Kitano,	
 J.,	
 Nozawa,	
 M.,	
 Igawa,	
 T.,	
 Michimae,	
 

92

H.,	
 Miura,	
 T.,	
 and	
 Nishimura,	
 K.	
 "Eco-evo-devo	
 study	 of	 phenotypic	
 plasticity	
 in	
 the	
 Hokkaido	 salamander	 (Hynobius	
 retardatus)"	
 International	
 Symposium,	
 “Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology:	
 Endangered	 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing"	 (27-28th	
 March,	 2014,	
 Higashi-Hiroshima,	
 Japan)	
 	
 8.Uno,	
 Y.,	
 Nishida,	
 C.,	
 Takagi,	
 C.,	
 Igawa,	
 T.,	
 Ueno,	
 N.,	
 Sumida,	
 M.,	
 and	
 
Matsuda,	
 Y.	
 "Molecular	
 cytogenetic	
 studies	
 on	
 the	
 process	 of	
 genomic	
 and	
 chromosomal	 evolution	
 in	
 X.	
 laevis	 after	
 WGD	
 and	
 the	
 origin	
 and	
 evolution	
 
of	
 sex	
 chromosomes	
 in	
 anuran	 species"	
 International	
 Symposium,	
 “Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology:	
 Endangered	
 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing"	
 (27-28th	
 March,	 2014,	
 Higashi-Hiroshima,	
 Japan)	
 	
 9.	
 Watanabe,	
 A.,	
 Igawa,	
 T.,	
 Kashiwagi,	
 A.,	
 	
 Suzuki,	
 A.,	
 Kurabayashi,	
 A.,	
 Fujii,	
 T.,	
 and	
 Sumida,	
 M.	
 "Inbreeding	 coefficient	
 and	
 genetic	
 relationship	
 of	
 seven	 strains	
 of	
 Xenopus	 tropicalis	 inferred	
 from	 genome	 wide	
 genotyping	
 of	
 54	
 microsatellite	 loci"	 International	
 Symposium,	
 “Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology:	
 Endangered	
 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing"	
 (27-28th	
 March,	 2014,	
 Higashi-Hiroshima,	
 Japan)	
 	
 10.	
 Suzuki,	
 A.,	
 Kashiwagi,	
 A.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Hanada,	 H.,	
 Takebayashi-Suzuki,	
 K.,	
 Tazawa,	
 I.,	
 Furuno,	
 N.,	
 Kurabayashi,	
 A.,	
 Kobayashi,	
 S.,	
 Takenaka,	
 J.,	
 Tamaki,	
 Y.,	
 Igawa,	
 T.,	
 Uto,	 T.,	 Nanba,	 C.,	
 Watanabe,	
 A.,	
 Yoshida,	
 H.,	
 Shimada,	
 A.,	
 and	
 Sumida,	
 M.	
 "International	 Xenopus	
 Resource	 Network	
 and	
 Educational	
 Activities	
 at	
 Institute	
 for	
 Amphibian	
 Biology"	 International	
 Symposium,	
 “Frontiers	
 in	
 Amphibian	 Biology:	
 Endangered	
 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing"	 (27-28th	
 March,	
 2014,	
 Higashi-Hiroshima,	
 Japan)	
 	
 11.	
 Sumida,	
 M.,	
 Islam,	 MM.,	
 Igawa,	
 T.,	
 Kurabayashi,	
 A.,	
 Furukawa,	
 Y.,	
 Sano,	
 N.,	
 Fujii,	
 T.,	
 Yoshizaki,	
 N.,	
 and	
 Nishioka,	
 M.	
 "Translucent	 frogs	 created	 through	
 crossbreeding,	
 and	
 their	 inheritance	
 and	
 dermal	 chromatophore	
 structure"	
 International	
 Symposium,	
 “Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology:	 Endangered	
 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing"	 (27-28th	
 March,	 2014,	
 Higashi-Hiroshima,	
 Japan)	
 	
 12.	
 Islam,	 MM.,	
 Igawa,	
 T.,	
 Kurabayashi,	
 A.,	
 Kakehashi,	
 R.,	
 Satou,	 N.,	
 Shintani,	
 N.,	
 Tado,	
 M.,	
 Sugawara,	
 H.,	
 Nishitani,	
 T.,	
 Uchida,	
 M.,	
 Oumi,	
 S.,	
 Katsuren,	
 S.,	
 Fujii,	
 T.,	
 and	
 Sumida,	
 M.	
 "An	
 ex	
 situ	
 conservation	
 effort	 for	
 several	 endangered	
 and	
 near-threaten	 amphibian	 species	
 from	 the	
 Ryukyu	 Archipelago,	
 Japan:	 Captive	 breeding	 of	
 nine	 anuran	 species	
 and	
 cryopreservation	
 of	
 sperm	
 for	
 two	
 of	
 them"	 International	
 Symposium,	 “Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology:	
 Endangered	
 Species	 Conservation	
 and	
 

93

Genome	 Editing"	 (27-28th	
 March,	 2014,	
 Higashi-Hiroshima,	
 Japan)	
 	
 13.	
 Sumida,	
 M.,	
 Islam,	 MM.,	
 Igawa,	
 T.,	
 Kurabayashi,	
 A.,	
 Satou,	
 N.,	
 Ukena,	
 K.,	
 Oumi,	
 S.,	
 Katsuren,	
 S.,	
 and	
 Fujii,	
 T.	
 "A	
 case	 study	 of	
 fauna	 conservation	
 in	
 Japan:	 Current	 conservation	
 measures	
 of	
 wild	
 populations,	
 captive	 breeding,	
 genetic	
 diversity,	
 and	
 potential	
 resource	 materials	
 in	
 
the	
 endangered	 frog	
 species	
 Odorrana	 ishikawae	
 and	
 O.	
 splendida"	 International	
 Symposium,	
 “Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology:	
 Endangered	 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing"	 (27-28th	
 March,	 2014,	
 Higashi-Hiroshima,	
 Japan)	
 	
 ④	
 科研費等の受け入れ状況	 1.

科学研究費補助金	
  若手研究(B)	
 「西南諸島に産する両生類絶滅危惧種の遺伝的多様性の解明と飼育繁殖における遺伝的管理」	
  研究課題番号:	
 23710282	  代表者:	
 井川武	
  1,300 千円	
 

94

	
 
Assistant	 Professor・Islam	
 Mohammed	
 Mafizul	 	
 1. Development	 of	
 low-cost	 cryopreservation	
 technique	
 with	 sperm	
 of	
 the	
 
endangered	
 Amami	 Ishikawa	
 Frog	 (Odorrana	
 splendida).	
 	
 Summary:	
 In	
 order	 to	
 achieve	 the	
 goal	
 for	
 conservation	
 of	
 endangered	 anuran	 species,	
 I	
 have	 developed	
 the	
 sperm	 cryopreservation	
 technique	
 for	
 the	
 
endemic	
 Amami	 Ishikawa	 frog	 (Odorrana	
 splendida)	
 from	 Amami	 Island,	
 which	 is	  natural	  monument	  in	
  Kagoshima	  prefecture	  and	
  protected	
  by	
  law.	
 Cryopreservation	
 technique	
 is	
 a	
 famous	 tool	 for	
 ex-situ	
 conservation	
 in	
 other	 animals	
 but	
 there	 is	 limited	 work	
 with	
 frog	 in	
 Japan	 especially	
 with	
 endangered	  species.	
  To	  find	  out	
  a	
  sustainable	  and	
  suitable	 cryopreservation	  technique,	  I	  considered	  a	  low-cost	  and	
  convenient	 technique;	
 thus	 I	
 developed	 a	 method	
 avoiding	
 use	
 of	
 liquid	 nitrogen	
 and	
 expensive	
 capillary	 rather	 I	 preserve	 the	
 sperm	 in	
 -80°C	 freezer	 and	
 preserve	
 them	
 in	
 0.5ml	 tube	
 which	 is	
 common	 in	
 most	
 biology	 laboratory.	
 I	  have	  used	  cryoprotectant	  which	  mixed	  with	  certain	  volume	  of	  sperm	 suspension	 obtain	 by	
 mincing	 the	
 testes	 and	
 preserved	
 in	
 -80C	 freezer.	
 To	
 understand	
 the	
 activeness	
 of	
 the	
 frozen	 sperm	 I	 checked	
 the	
 sperm	 motility	
 under	 microscope	
 as	
 a	
 convenient	 method	 but	
 most	
 importantly	
 I	
 
have	
 confirm	 the	
 degree	 of	
 activeness	
 of	
 the	
 sperm	 by	
 fertilizing	
 the	
 eggs	
 with	
 frozen	 sperm	 of	 different	 frozen	
 period	
 and	
 compare	
 the	
 fertilization	 rate	
 with	 that	
 of	
 fresh	 sperm.	
 I	 have	 found	 a	
 maximum	
 of	
 35%	
 fertilization	 rate	
 with	 24	 h	
 frozen	 sperm	 and	 sperm	 frozen	 for	
 maximum	 1	
 year	
 in	
 the	
 freezer,	
 found	 active	 to	
 fertilize	
 the	
 egg	
 to	
 some	 extent.	
 	 	 Methods:	
 I	
 have	
 used	 both	 male	 and	
 female	 individuals	
 from	 the	
 field,	
 as	
 
well	
 as	
 frogs	 that	
 bred	 and	
 reared	 in	 the	
 laboratory.	
 Prior	 to	
 the	
 sperm	 collection	  I	  prepared	  the	
  cryoprotectant	  solution	
  to	
  be	
  used	  as	
  the	
 preservative	 medium	 of	
 sperm.	
 The	
 cryoprotectant	 solution	
 was	
 prepared	 after	
 mixing	
 40ml	 of	
 Cryoprotectant	 A	
 (consisting	 of	
 Sucrose,	
 Sodium	 Bicarbonate	
 and	
 Pentoxylline)	
 and	
 10	
 ml	
 of	
 Cryoprotectant	 B(	 consisting	
 of	
 same	
 volume	 of	
 fresh	 Egg	
 yolk	
 and	
 Distilled	 water)	
 and	
 after	 centrifuge	
 
only	
 the	
 supernatant	 has	
 been	
 used.	
 The	
 male	 was	
 anaesthetized	
 before	 dissecting	
 the	
 testes	
 and	
 1/3	
 of	
 the	
 testes	 were	 bring	 out	 and	
 transferred	
 
in	
 the	
 Eppendorf	
 tube	 containing	 L-15	
 medium,	
 calf	
 serum	 and	 L-	
 glutamine	
 .	
 
The	
  testes	  were	  minced	  with	  a	  tissue	  homogenizer	
  and	
  same	  volume	  of	
 Cryoprotectant	 solution	
 was	
 mixed.	
 Then	 the	
 solution	
 separated	
 in	
 10	
 thin	
 walled	 500µl	 tubes	 and	
 immediately	
 transferred	
 in	 a	
 Styrofoam	
 box	
 covered	
 by	
 fuel-paper	
 and	
 transferred	 in	
 -80°C	 deep	 freeze.	
 A	
 small	 part	 of	
 the	
 remaining	 sperm	 suspension	
 was	
 used	 for	
 counting	 the	
 sperm	 density	
 and	
 confirm	  the	
  sperm	  motility	  with	  the	
  help	  of	  a	  cell	  counter	  under	
  a	
 

95

microscope.	
 	
 
	
 
I	
 have	
 injected	
 the	
 female	 frog	
 with	 bullfrog	
 pituitary	 and	
 after	 the	
 confirming	
 ovulation	
 I	 have	 prepare	
 the	
 frozen	 sperm	 to	
 fertilize	
 as	
 well	
 fertilize	  them	  with	  fresh	  sperm.	
  The	
  tube	  containing	  frozen	  sperm	 suspension	
 along	 with	 the	
 cryoprotectant	
 was	
 thawing	
 with	 finger	 for	
 less	
 than	
 30	
 seconds	
 and	
 same	
 volume	
 of	
 DDW	
 was	
 added	 and	
 fertilized	
 the	
 eggs	
 immediately	
 as	
 the	
 frozen	 sperm	 lose	 their	 motility	 quickly	
 after	 thawing.	
 The	
 fertilization	
 was	
 took	 place	 on	 glass	 slides	 and	
 they	
 were	 moved	 in	
 the	  petridish	  and	
  submerged	  in	
  the	
  water	  and	
  kept	  in	  a	  controlled	
 temperature	 of	
 18°C.	
 They	
 were	 count	 in	 every	 stage	 such	 as	
 1st	
 cleavage,	
 tail-bud,	
 hatched	
 and	
 feeding	
 tadpoles.	
 The	
 tadepoles	
 were	
 reared	
 in	
 an	
 
incubator	
 and	
 fed	
 with	
 boiled	 spinach.	
 	 Findings:	
 I	
 have	 noticed	
 a	 maximum	
 of	
 24%	
 fertilization	
 rate	
 with	 the	
 cryopreserved	
  sperm	  and	
  they	  go	
  for	
  normal	  cleavage	  and	
  subsequent	 embryonic	
 development.	
 The	
 rate	 is	
 good	
 enough	 as	
 reported	 with	
 other	 amphibians.	
 Although	 I	 have	 noticed	 the	
 efficiency	
 of	
 sperm	 reduced	 with	
 the	
 course	 of	 time	 freezing	
 but	
 I	
 was	
 able	 to	
 fertilize	
 the	
 eggs	 even	
 with	 sperm	
 frozen	 one	
 year	
 before.	
 I	 have	 the	
 frozen	 sperm	 from	 several	 male	
 individual	  which	  I	  can	
  use	
  following	  years.	
  With	  the	
  development	 cryopreservation	
 technique	
 along	 with	 of	
 artificial	
 breeding	
 and	
 captive	 breeding	  technique	  much	  progress	  has	
  been	  carried	
  out	
  for	
  this	  most	 beautiful	 frog	 of	
 Japan.	
 	 2. Cryopreservation	
 of	
 sperm	 for	
 the	
 near	
 threatened	
 species	
 Rana	
 ulma	 from	
 Amamioshima	
 island	 and	
 observation	
 of	
 early	 development	 	
 R.	
 ulma	
 with	
 cryopreserved	
 sperm	 	 Summary:	
 I	
 have	
 conducted	
 cryopreservation	
 experiments	
 to	
 preserve	 the	
 sperm	 of	
 the	
 Amami	 Brown	 frog	 (R.	
 ulma)	
 using	 the	 low	
 cost	
 cryopreservation	 technique.	
 I	
 have	
 used	 a	
 low-cost	 method	
 as	
 describe	
 earlier	
 by	 preserving	
 the	
 sperm	 in	
 -80°C	 freezer	 thus	
 avoiding	
 any	
 use	
 of	
 liquid	 nitrogen.	
 I	
 
have	
 got	
 a	
 maximum	 of	 around	
 86%	
 fertilization	
 rate	
 which	 is	
 rare	
 with	
 cryopreserved	
 sperms.	
 I	
 have	 got	
 success	 with	 the	
 sperm	 preserve	
 for	
 maximum	
 40	
 days	
 by	
 confirming	
 fertilization	
 and	
 successive	
 embryos.	
 The	
 embryos	
 got	
 by	
 using	 the	
 frozen	 sperm	 went	 through	 normal	 development	
 and	
 metamorphosed	
 within	 the	
 similar	 time	 compared	
 to	
 the	
 control.	
 Now	
 they	
 have	
 been	
 reared	 in	
 the	
 frog	 room	 to	
 study	 the	 male-female	 ration	 whether	 to	
 confirm	
 the	
 effect	
 of	 sex	
 ration	
 for	
 the	
 frogs	 produced	
 from	 the	
 frozen	
 sperm.	
 	 Methods:	
 I	
 have	 selected	
 a	
 series	 of	
 male	 and	
 female	 individuals	
 for	
 this	
 96

cryopreservation	
 experiments.	
 At	
 first	 several	 males	 were	 dissected	
 and	
 testes	 were	 brought	
 out	
 to	
 an	
 Eppendorf	
 tube	 containing	 L-15	
 medium	
 and	
 
calf	
 serum	 and	
 L-Glutamine	
 to	
 get	
 the	
 sperm	 suspension	
 and	
 they	
 were	
 immediately	
 mixed	 with	 ice	
 clod	
 Cryoprotectant	
 and	
 the	
 equally	 distributed	
 in	
 several	 thin	 walled	
 500µl	 tube.	
 The	
 tubes	 were	
 then	
 transferred	
 in	
 the	
 
Styrofoam	
 box	
 and	
 immediately	 moved	 to	 a	
 -80°C	 deep	 freeze	
 for	
 further	 use.	
 During	 the	
 breeding,	
 I	
 injected	
 several	 female	 with	
 Bullfrog	
 pituitary	
 
and	
 the	
 ovulated	
 eggs	
 were	
 fertilized	
 with	 the	
 frozen	 sperm	 as	
 well	 as	
 fresh	 sperm	 on	 the	 glass-slide.	
 The	
 degree	 of	
 development	 were	 count	
 at	
 
each	
  stage	  namely	  fertilized	  eggs,	  tail-buds,	  hatchlings,	  feeding	 tadpoles,	  30-days-	  old	
  tadpoles	
  and	
  metamorphosed	  frogs.	
  The	
  water	 temperature	
 was	
 maintained	
 18°C	
 and	
 the	
 tadpoles	
 were	
 feed	
 with	
 boiled	 spinach	 where	 the	 metamorphosed	
 frogs	 were	 fed	
 with	
 small	 cricket.	
 	
 	
 	
 
	
 
Findings:	
 I	
 have	 found	 a	
 maximum	
 of	
 65%	
 fertilization	
 rate	 using	 the	
 frozen	
 sperm	 and	
 I	
 could	 fertilize	
 the	
 eggs	
 with	 the	
 sperm	 frozen	 for	
 24	 hours	 to	
 40-days	 during	
 the	
 breeding	 season.	
 I	
 have	 checked	 the	 motility	
 and	
 physical	 shape	 of	 the	
 sperm	 after	 thawing	
 and	
 noticed	
 they	 are	
 motile	
 and	
 
many	
  of	
  the	
  sperm	  are	
  intact	  shape.	
  Most	  importantly	  to	
  confirm	  the	
 performance	
 of	
 the	
 cryopreserved	
 sperm	 I	
 observed	
 the	
 development	
 of	
 eggs	
 fertilized	
 with	
 frozen	 sperm	 and	 compare	
 them	
 with	 the	
 control.	
 I	 have	
 noticed	  that	  they	  develop	  without	  any	
  abnormalities	  and	
  took	  almost	
 similar	 time	 compare	
 to	
 the	
 control	
 one.	
 Even	 the	
 metamorphosed	
 frogs	 that	
 come	
 from	 the	
 cryopreserved	
 sperm	 go	
 normal	 feeding	
 and	
 grown	 up	
 in	
 similar	 pattern.	
 	
 3. Cryopreservation	
 of	
 the	
 sperm	 of	 endemic	
 Amami	
 Tip-nosed	
 frog	 (Odorrana	 amamiensis)	
 from	 Amamioshima	
 Island	 	
 Summary:	
 I	
 have	
 also	 developed	 sperm	 cryopreservation	
 technique	
 for	
 Amami	 tip-nosed	  frog,	  Odorrana	  amamiensis	  another	  endangered	  frog	  species	
 distributed	
  only	  in	
  Amamioshima	  and	
  Tokunoshima	  Islands	  of	  Ryukyu	 Archipelago.	
 In	
 Amami	 Island	 the	
 species	
 is	
 commonly	 found	 in	 mountain	 streams	 and	
 occasionally	 in	
 mountain	 paths	 in	
 night,	 but	
 is	
 rare	 in	
 lowland.	
 Last	
 year	 I	
 have	 developed	 the	
 artificial	
 breeding	 technique	
 for	
 this	
 frog	
 in	
 the	
 laboratory	
 condition	
 as	
 a	 consequence	
 of	
 the	
 conservation	
 work	
 with	
 this	
 frog	 I	
 worked	 on	 the	
 cryopreservation	
 of	
 its	
 sperm.	
 Compare	
 to	
 O.	
 
splendia	  it	
  has	
  a	
  prolong	  breeding	  season	  which	  allow	  more	  time	  for	
 research	
 thus	 we	
 have	
 conducted	
 several	 breeding	 trial	 from	 March	 to	 late	 May	
 and	
 succeeded	
 to	
 get	
 the	
 fertilized	
 eggs	
 with	 the	
 frozen	 sperm	 even	
 
with	
 the	
 sperm	 that	 was	
 preserved	
 in	
 last	
 year.	
 	 Methods:	
 Sperm	 was	 collected	
 from	 the	
 of	
 mature	 male	
 from	
 after	 dissecting	
 

97

the	
 frog	 and	
 bringing	
 out	
 the	
 one-third	 testes	 and	
 minced	 the	 testes	
 with	 a	
 tissue	 homogenizer	 e	 to	
 obtain	
 a	
 suitable	
 concentration	
 of	
 sperm.	
 The	 sperm	
 suspension	
 was	
 mixed	 with	 same	
 volume	 of	
 cryoprotectant	 as	
 mentioned	
 earlier,	
 mixed	 and	 transferred	 in	
 several	 thin	 walled	
 500µl	 tubes.	
 Then	
 the	
 tubes	 were	
 kept	 in	
 a	
 Styrofoam	
 box	
 and	
 transferred	 immediately	 into	 the	
 –80°C	 deep	 freezer	
 within.	
 I	
 froze	 different	 series	 of	
 sperm	 from	
 the	
 
same	
 testes	 to	
 be	
 used	 as	
 24hrs	 frozen	 sperm	 and	 followed	
 by	
 7	
 days,	
 30	
 
days	
 and	
 1	
 year	
 frozen	 sperm.	
 For	 thawing	
 of	
 the	
 frozen	 sperm,	 it	
 was	
 done	
 by	
 hand	 for	
 30	
 seconds	
 and	
 mixed	 with	
 0.1	 MBS	
 solution	
 and	
 with	 distilled	
 water	
 then	
 immediately	 used	 to	
 fertilize	
 the	
 eggs.	
 At	
 same	
 time,	
 motility	
 of	
 sperms	
 was	
 checked	
 and	
 sperm	 concentrations	
 were	 counted.	
 After	 that	
 fertilized	
 eggs	
 were	
 kept	 in	
 incubator	
 in	
 controlled	
 temperature	
 and	
 their	 developmental	
 capacity	 were	
 observed	
 and	
 compared	
 with	 the	
 eggs	 that	
 were	
 fertilized	
 with	 fresh	 sperm	 	 Findings:	
 Frozen	 sperm	 was	
 found	 to	
 capable	
 to	
 fertilize	
 eggs	
 by	
 this	
 cryopreservation	
 technique	
 in	
 case	 of	 O.	
 amamiensis	
 with	 a	
 maximum	 rate	
 of	
 less	
 than	
 10%	 also	 control	
 was	
 around	
 60%.	 Although	 many	
 efforts	
 have	
 been	
 made	 I	
 cannot	 get	
 very	 high	
 rate	 of	
 fertilization	
 and	
 it	
 was	
 possibly	
 
due	
 to	
 lack	 of	
 good	 female	
 i.e.,	
 good	
 eggs	
 .	
 it	
 was	
 possible	
 to	
 get	
 the	
 
fertilize	
 eggs	
 with	 the	
 frozen	 sperm	 preserved	
 for	
 24	
 hrs,	 1	
 week,	
 10	
 days,	
 40	
 days	
 as	
 well	 as	
 1	 year	 .	
 	 	
 4. Conservation	
 of	
 a	
 near	
 threatened	
 species	 (Odorrana	
 supranarina)	
 from	
 Iriomote	
 Island	 by	 artificial	
 breeding	
 and	
 subsequent	 rearing	
 in	
 the	
 
laboratory.	
 Summary:	
  Greater	  tip-nosed	  frog,	  Odorrana	  supranarina	
  is	
  one	
  of	  the	
 near-threatened	
 frog	
 species	 distributed	
 only	
 in	
 Iriomote	
 and	
 Ishigaki	 Islands	
 of	
 Okinawa	
 prefecture	
 in	
 the	
 Ryukyu	
 Archipelago.	
 Although	 the	
 scientist	
 and	
 local	 government	
 is	
 concern	 about	 the	 status	
 of	
 this	
 frog	 due	 to	
 environmental	
 degradation	 and	
 other	 man	
 made	
 causes	 decline	
 of	
 population	
 is	
 common	 in	
 this	
 frog.	
 Thus	 it	
 was	
 essential	 to	
 develop	 some	
 suitable	 technique	
 of	
 artificial	
 breeding	
 in	
 the	
 laboratory	 to	
 conserve	 the	
 species.	
 Although	 they	
 were	 found	 to	 be	
 bred	
 in	
 prolong	 breeding	 season,	 from	
 January	 to	
 May,	 it	
 was	
 difficult	 to	
 find	 ready	 to	
 breed	 female	
 and	
 
male	
 and	
 we	
 conducted	
 this	
 artificial	
 breeding	 experiment	
 in	
 the	
 end	
 of	
 
February.	
  For	
  this	  species,	  a	  lower	  temperature	  of	  18°C	  was	
  found	 preferable	
 for	
 their	 early	 development	
 and	
 for	
 tadpoles.	
 Among	 total	 eggs,	 more	
 than	 80%	 cleaved	
 normally,	
 more	
 than	
 50%	 hatched	
 normally,	
 and	
 more	 than	
  30%	
  metamorphosed	  normally	  Finally,	  it	
  was	
  possible	  get	
  many	 offspring	 which	 finally	 metamorphosed	
 and	
 now	
 many	
 of	
 them	
 kept	 and	
 reared	
 
in	
 our	
 facility.	
 
	
 

98

Methods:	
 It	
 was	
 possible	
 to	
 breed	 the	 frogs	 in	
 the	
 laboratory	
 by	
 using	 typical	 artificial	
 breeding	 technique	 developed	
 in	
 our	
 laboratory.	
 The	
 female	 frog	 was	
 injected	
 with	 Lithobates	 catesbeianus	
 PG.	
 they	
 were	 found	 to	
 ovulated	 around	 70	
 hours	 after	 injection.	
 As	
 the	
 eggs	
 were	 very	 big	
 in	
 size	
 special	
 care	 was	
 taken	 during	 fertilization.	
 The	
 first	 cleavage	 appear	 almost	 7	
 hours	 after	 fertilization	
 and	
 further	 development	
 took	
 longer	 time	 even	 compared	
 with	 the	
 Ishikawa	 frog.	
 The	
 eggs	
 were	 counted	 at	
 every	 stage	 that	 is	
 during	 first	 cleavage,	
 tail-buds	
 embryos,	
 hatched	 tadpoles,	
 feeding	
 tadpoles	
 and	
 finally	 metamorphosed	
 frogs.	
 The	
 tadpoles	
 
were	
 fed	
 with	
 boiled	 spinach	
 and	
 the	
 metamorphosed	
 one	
 fed	
 with	 cricket.	
 	
 Findings:	
 A	
 better	 fertilization	
 rate	
 (80%)	
 was	
 noticed	
 and	
 more	
 than	
 50%	
 
eggs	
 hatched	
 normally,	
 and	
 more	
 than	 30%	 undergo	 metamorphosed.	
 Throughout	
 this	
 artificial	
 breeding	 technique	
 we	
 have	 found	 a	 number	 of	
 offspring	 which	 can	
 be	
 used	 to	
 produce	 next	 generation	
 in	
 near	
 future	 and	
 most	
 importantly	
 we	
 can	
 do	
 some	 study	 with	
 this	
 frog	
 without	 go	
 back	
 to	
 field	 and	
 without	 disturbing	 their	 natural	 habitat.	
 	 Future	 research	 plan:	 Research	
 is	
 going	 on	 for	
 sustainable	
 in	
 vitro	 conservation	
 technique	 for	
 several	 endangered	 frog	
 species	
 from	 the	
 Ryukyu	
 Archipelago.	
 We	
 have	
 already	  able	  to	
  conduct	  artificial	  and	
  captive	  breeding	  for	
  several	 endangered	 species	 such	 as	
 O.	
 ishikawai,	
 O.	
 splendida,	
 O.	
 amaiensis,	
 O.	
 supranarina,	
 B.	
 holsti,	
 B.	
 subaspera,	 Echinotriton	
 andersoni	  and	 near	
 threatened	
 species	
 Rana	
 ulma	 and	
 R.	
 kobai	 and	
 many	 of	
 their	 off-springs	
 
are	
 now	
 maintained	
 in	
 the	
 laboratory.	
 I	 am	 planning	 developed	 suitable	 technique	
 for	
 their	 sperm	 cryopreservation	
 and	
 I	
 succeed	
 for	
 some	
 species	 and	
 research	
 is	
 going	 on	
 with	
 other	 species.	
 	
 I	
 am	
 rearing	
 many	 mature	 males	 and	
 females	 of	
 these	 species.	
 
	
 
	
 
Research	
 Achievements	 ①	
 Original	 paper	 1.Igawa,	
 T.,	
 H.	
 Sugawara,	
 M.	
 Tado,	
 T.	
 Nishitani,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 M.	
 M.	
 
Islam,	
 S.	
 Oumi,	
 S.	
 Katsuren,	
 T.	
 Fujii	
 and	 M.	
 Sumida	 (2013)	
 An	
 attempt	
 at	
 captive	 breeding	
 of	
 an	
 endangered	 newt,	
 Echinotriton	
 andersoni,	
 from	 the	
 Central	
 Ryukyus	 in	
 Japan.	
 Animals,	
 3:	
 680-692.	
 	
 2.Hasan,	
 M.,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 Kuramoto,	
 A.	
 Kurabayashi	
 and	
 M.	
 Sumida	 (2014)	
 Description	
 of	
 two	
 new	
 species	 of	
 Microhyla	
 (Anura:	 Microhylidae)	
 from	
 Bangladesh.	
 Zootaxa,	
 3755:	
 401-418.	
 	
 3.Hasan,	
 M.,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 M.	
 R.	
 Khan,	
 T.	
 Igawa,	
 M.	
 S.	
 Alam,	
 T.	
 H.	
 Djong,	
 

99

N.	
 Kurniawan,	
 H.	
 Joshy,	
 H.	
 S.	
 Yong,	
 Daicus,	
 M.	
 B.,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 M.	
 Kuramoto	
 and	
 M.	
 Sumida	 (2014)	
 Genetic	
 divergences	
 of	
 South	 and	
 Southeast	 Asian	
 frogs:	 a	
 case	 study	 of	 several	
 taxa	 based	 on	
 16S	
 ribosomal	
 RNA	 gene	 data	
 with	 notes	 on	 the	
 generic	
 name	
 Fejervarya.	
 Turk.	
 J.	
 Zool.,	
 38:	
 in	
 
press	 	
 ②	 Review	 paper	 or	
 Book	
 
None	
 
	
 
③Presentation	
 in	
 conferences	 National	
 conference:	 	
 1.Islam	
 M.	
 M.,	
 Kakehashi	
 R.,	
 Koide	
 H.,	
 Kurabayashi	
 A.,	
 Oumi	 S.,	 Katsuren	
 S.,	
 Fuji	 T.	
 and	
 Sumida	
 M.Genetic	
 divergence	
 and	
 postmating	 isolation	
 between	
 endangered	
 Holst`s	
 frog	
 and	
 Otton	 frog	
 from	 the	
 Ryukyu	
 Archipelago,	 Japan,	
 elucidated	
 by	 allozyme	
 and	
 mitochondrial	
 gene	 sequence	 analyses,	 crossing	 experiments	
 and	
 cytological	
 observations.	
 82nd	 Annual	 meeting	
 of	
 
the	
 Genetics	
 Society	
 of	
 Japan,	 Yokohama,	
 Japan.	
 	 2.Islam	
 M.	
 M.,	
 Oumi	 S.,	 Katsuren	
 S.,	
 Ida	
 H.	
 and	
 Sumida	 M.	
 Genetic	
 divergence	
 and	
 postmating	 isolation	
 among	 several	 brown	 frog	
 species	
 from	
 Honshu	 and	
 Ryukyu	 of	
 Japan,	 and	
 Mongolia	
 elucidated	
 by	
 mitochondrial	
 gene	 sequence	 analyses,	 crossing	 experiments	
 and	
 subsequent	
 cytological	
 observations	
 of	
 their	 hybrids	
 and	
 controls.	
 52nd	 Annual	 meeting	
 of	
 the	
 Herpetological	
 Society	
 of	
 Japan,	
 Hokkaido,	
 Japan.	
 	 3.Hasan	
 M.,	
 Islam	 M.	
 M.	
 Kuramoto	 M,	
 Kurabayashi	
 A.	
 and	
 Sumida	 M.	
 Description	
 of	
 two	
 new	
 species	 of	
 Microhyla	
 (Anura:	 Microhylidae)	
 from	
 Bangladesh	
 82nd	 Annual	 meeting	
 of	
 the	
 Genetics	
 Society	
 of	
 Japan,	 Yokohama,	 Japan.	
 	 4.住田	 正幸、井川	
 武、イスラム	 マフィズル、倉林	
 敦、アラム	 シャフィクル、掛橋	
 竜祐、田戸	 美雪、新谷	 望、菅原	 弘貴、西谷	 琢磨、大海	 昌平、勝連	 盛輝、藤井	 保	
 「両生類絶滅危惧種の飼育下繁殖による	
 保全の試み」	
 日
本遺伝学会第84回大会（2012年9月26日、九州大学、福岡）	
 	
 5.Sumida	
 M.	
 Islam	 M.	
 M.,	
 Igawa	
 T.	
 Kurabayashi	
 A.,	
 Furukawa	
 Y,	
 Sano	 N.,	 	
 Fujii	 T.,	 and	
 Yoshizaki	
 N.	
 Inheritance	
 and	
 dermal	 chromatophore	
 structure	
 of	
 see-through	 frogs.	
 52nd	 Annual	 meeting	
 of	
 the	
 Herpetological	
 Society	
 of	
 Japan,	
 Hokkaido,	
 Japan.	
 	 International	
 conference	 1.Islam	
 M.	
 M.,	
 Igawa	
 T.,	
 Kurabayashi	
 A.,	
 Kakehashi	
 R.,	
 Satou	 N.,	
 Shintani	
 N.,	
 Tado	 M.,	 Sugawara	
 H.,	
 Nishitani	
 T.,	
 Uchida	 M.,	
 Oumi	 S.,	 Katsuren	
 S.,	
 

100

Fujii	
 T.,	
 and	
 Sumida	
 M.	
 An	
 ex	
 situ	
 conservation	
 effort	 for	
 several	 endangered	
 and	
 near-threaten	 amphibian	 species	
 from	 the	
 Ryukyu	 Archipelago,	
 Japan:	 Captive	 breeding	 of	
 nine	 anuran	 species	
 and	
 cryopreservation	
 of	
 sperm	
 for	
 two	
 of	
 them.	
 International	
 Symposium-	 Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology:	
 Endangered	
 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing,	
 Hiroshima,	
 Japan.	
 	 	
 2.Sumida	
 M.,	
 Islam	 M.	
 M.,	
 Igawa	
 T.,	
 Kurabayashi	
 A.,	
 Satou	 N.,	
 Ukena	
 K.,	
 
Oumi	
 S.,	
 Katsuren	
 S.,	
 and	
 Fujii	
 T.	
 A	
 case	 study	 of	
 fauna	 conservation	
 in	
 Japan:	
 Current	 conservation	
 measures	
 of	
 wild	
 populations,	
 captive	 breeding,	
 genetic	
 diversity,	
 and	
 potential	
 resources	 materials	
 in	
 the	
 
endangered	 frog	
 species	
 Odorrana	 ishikawae	
 and	
 O.	
 splendida.	
 International	
 Symposium-	
 Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology:	
 Endangered	 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing,	
 Hiroshima,	
 Japan	 	
 3.Sumida	
 M.,	
 Igawa	 T.,	
 Islam	 M.M.,	
 Kurabayashi	
 A.,	
 Kakehashi	
 R.,	
 Satou	 N.,	
 Shintani	
 N.,	
 Tado	 M.,	 Sugawara	
 H.,	
 Nishitani	
 T.,	
 Uchida	 M.,	
 Oumi	 S.,	 Katsuren	
 S.,	
 Fujii	
 T.	
 Captive	 breeding	 of	
 endangered	 species:	
 a	
 case	 study	 of	 ex	
 situ	
 conservation.	
 	
 50th	 Annual	 Meeting	
 of	
 the	
 Herpetological	
 Society	
 of	
 Australia,	
 Canberra,	 Australia.	
 	
 4.Hasan	
 M.,	
 Islam	 M.	
 M.	
 Kuramoto	 M,	
 Kurabayashi	
 A.	
 and	
 Sumida	 M.	
 Description	
 of	
 two	
 new	
 species	 of	
 Microhyla	
 (Anura:	 Microhylidae)	
 from	
 Bangladesh.	
 50th	 Annual	 meeting	
 of	
 the	
 Herpetological	
 Society	
 of	
 Australia,	 Canberra,	 Australia	 	
 5.Alam	 M.	
 S.	
 Khan	
 M.	
 M.	
 R.	
 Islam	 M	
 .M.,	
 Hasan	 M.	
 and	
 Sumida	 M.	
 Artificial	
 Breeding	
 of	
 the	
 Bullfrog	 (Hoplobatrachus	
 tigerinus):	
 A	
 case	 study	 on	
 reproduction	
 and	
 conservation.	
 International	
 Symposium-	
 Frontiers	 in	
 Amphibian	
 Biology:	
 Endangered	
 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing,	 Hiroshima,	
 Japan	 	
 6.Hasan	
 M.,	
 Kuniawan	
 N.,	
 Soewondo	
 A.,	
 Islam	 M.	
 M.	
 Igawa	 T.,	
 Nalley	
 W.	
 M.	
 
M.	
 Matsui	
 M.	
 and	
 Sumida	 M.	
 Evolutionary	 relationships	
 and	
 postmating	 isolation	
 among	 Fejervarya	 species	
 from	 Lesser	 Sunda,	
 Indonesia	
 and	
 other	 Asian	 countries	
 revealed	
 my	
 mtDNA	 gene	 sequence	
 and	
 crossing	 experiments.	
 International	
 Symposium-	
 Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology:	
 Endangered	 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing,	
 Hiroshima,	
 Japan.	
 	 7.Sultana	
 N.,	
 Igawa	 T.,	
 Nozawa	
 M.,	
 Islam	 M.	
 M.,	
 Khan	
 M.	
 M.	
 R.	
 Hasan	
 M.,	
 
Alam	
 M.	
 S.	
 and	
 Sumida	 M.,	
 Development	
 and	
 characterization	
 of	
 27	
 new	
 
microsatellite	 markers	 of	
 Indian	 Bullfrog,	
 Hoplobatrachus	
 tigerinus	 (Daudin,	
 1802)	
 and	
 its	
 congeneric	 species.	
 International	
 Symposium-	 101

Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology:	
 Endangered	
 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing,	
 Hiroshima,	
 Japan.	
 	
 8.Sumida	
 M.,	
 Islam	 M.	
 M.,	
 Igawa	
 T.,	
 Kurabayashi	
 A.,	
 Furukawa	
 Y.,	
 Sano	 N.,	 Fujii	 T.,	 Yoshizaki	
 N.,	
 and	
 Nishioka	
 M.	
 Translucent	 frogs	 created	 through	 crossbreeding,	
 and	
 their	 inheritance	
 and	
 dermal	 chromatophore	
 structure.	
 International	
 Symposium-	
 Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology:	
 Endangered	 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing,	
 Hiroshima,	
 Japan	 	 ④	
 Grants	
 1.	
 Grants-in-Aid	
 for	
 Scientific	
 Research	
 (B)	
 (No.24310173)（Partaker）.	
 2.	
 Grants-in-Aid	
 for	
 Challenging	 Research	
 (No.	
 25640050)	
 (Partaker).	
 

102

	
 
Researcher.	
 Mahmudul	
 Hasan	 	 1.	
 Genetic	
 divergences	
 of	
 South	 and	
 Southeast	 Asian	 frogs:	 a	
 case	 study	 of	 several	
 taxa	 based	 on	
 16S	
 ribosomal	
 RNA	 gene	 data	
 with	 notes	
 on	
 the	
 
generic	
 name	
 Fejervarya.	
 	 	 Introduction:	
 A	
 species	
 is	
 a	
 fundamental	
 unit	 of	
 biology.	
 Contemporary	 concepts	
 of	
 species	 differ	
 between	 researchers	
 and	
 also	
 between	 objective	
 taxa;	
 thus,	
 the	
 concept	 of	
 what	
 constitutes	
 a	
 species	
 continues	
 to	
 be	
 a	
 vexing	 problem.	
 Although	
 it	
 is	
 not	
 sufficient	 to	
 define	 a	 biological	
 species	
 on	
 the	
 basis	 of	
 molecular	 data	
 alone,	 the	 utility	 of	
 molecular	 data	
 in	
 taxonomic	
 studies,	
 especially	
 in	
 searching	 for	
 cryptic	
 species	 (i.e.,	 2	
 or	
 more	
 species	 sharing	  similar	  external	
  morphology)	
  has	
  been	  demonstrated.	
  One	
  such	 procedure	
 is	
 called	 the	
 “candidate	 species	
 approach”.	
 In	
 the	
 present	
 study,	 the	
 term	
 “candidate	 species”	
 is	
 used	 to	
 denote	 lineages	
 which	 are	 generally	 distinct,	  for	
  instance	
  on	
  the	
  basis	  of	  molecular	  data	  (generally	 mitochondrial	
 [mt]DNA	 genes),	
 but	
 for	
 which	 corroborating	 evidence,	
 such	 as	
 morphology,	
 ecological	
 characteristics,	
 and/or	 nuclear	 gene	 data,	
 is	
 required.	
 In	 this	 study,	 we	
 revealed	 the	
 diversity	
 of	
 Asian	 frogs	 using	 candidate	 species	
 approach	
 and	
 also	
 argues	 the	
 generic	
 allocation	
 of	
 Fejervarya-Minervarya-Zakerana	  complexes	
  on	
  the	
  basis	  of	  sequence	 divergence	
 and	
 our	
 resultant	 phylogenetic	
 tree.	
 	 Materials	
 and	
 Methods:	 A	  total	  of	  159	
  specimens	  from	  81	
  populations	  were	  collected	
  from	  22	
 localities	
 across	
 6	
 Asian	 countries.	
 Total	 genomic	
 DNA	
 was	
 extracted	
 from	
 the	
 clipped	
 toe	
 of	
 each	
 frog	
 specimen	
 using	 a	
 DNA	
 extraction	
 kit	
 (DNeasy	 Tissue	  Kit,	
  Qiagen,	  Valencia,	  CA)	
  according	  to	
  the	
  manufacturer’s	 instructions.	
 The	
 obtained	
 new	 sequences	 that	
 were	 found	 in	 this	 study	 were	
 deposited	
 in	
 the	
 DNA	
 Data	 Bank	 of	
 Japan	 (DDBJ)	
 database	 under	 the	
 accessions	
 numbers	
 AB530548	
 to	
 AB530656.	
 The	
 16S	
 ribosomal	
 RNS	
 gene	 (16S)	
 sequences	
 from	 the	
 159	
 specimens	
 and	
 X.	
 laevis	 were	 aligned	
 using	 the	
 ClustalW	 program.	
 After	 deletion	
 of	
 indel	 and	
 ambiguous	
 sites,	 several	 haplotypes	
 had	
 identical	
 sequences,	
 and	
 the	
 initial	
 109	
 haplotypes	
 were	
 reduced	
  to	
  88	
  haplotypes,	  which	  were	  used	  for	
  a	  phylogenetic	  tree	 reconstruction.	
  The	
  sequence	  divergences	  (uncorrected	
  p	
  values)	
  were	 calculated	  for	
  the	
  88	
  haplotypes	
  and	
  then,	  we	
  constructed	
  maximum	 likelihood	  (ML),	
  maximum	  parsimony	  (MP),	
  neighbour	  joining	  (NJ),	  and	 Bayesian	
 inference	 (BI)	
 trees	 using	 the	
 alignment	 data	
 of	
 the	
 88	
 haplotypes	
 
of	
 our	
 specimens.	
 Further	 phylogenetic	
 analyses	
 of	
 families	
 Rhacophoridae,	 Ranidae,	
 Microhylidae,	 and	
 Bufonidae	
 were	
 performed	
 by	
 ML	
 and	
 BI.	
 	
 

103

	
 
Results	 and	
 Discussion:	 The	  resultant	  phylogenetic	  trees	  showed	  that	  the	
  haplotypes	  of	  each	 species	  formed	  one	
  clade.	
  The	
  average	  sequence	  divergence	  at	
  the	
 individual,	
 population,	
 species,	
 genus,	 and	
 family	 taxonomic	
 levels	 was	
 0.23%,	
 2.2%,	
 7.23%,	
 11.22%,	
 and	
 17.35%,	
 respectively.	
 In	
 general,	
 the	
 low	
 
16S	
 diversity	
 in	
 each	
 species	 clade	 of	 dicroglossid	
 frogs	 indicates	 the	
 absence	 of	
 candidate	 species	
 in	
 the	
 examined	
 dicroglossid	
 specimens.	
 In	
 contrast,	
 the	
 average	 (and	
 range)	
 of	
 16S	
 fragment	
 analysed	
 within	
 each	
 species	
 is	
 as	
 follows:	
 2.1%	
 (0.1–3.1%)	
 in	
 Pseudophilautus	
 wynaadensis,	
 3.6%	
 (2.5–	
 4.5%)	
 in	
 Polypedates	 leucomystax,	
 4.0%	
 (0.7–5.8%)	
 in	
 Hylarana	 erythraea,	
 7.1%	
 in	
 Microhyla	
 okinavensis,	
 8.9%	
 (0.4–15.7%)	
 in	
 M.	
 ornata,	 and	
  5.3%	
  (0.3–7.2%)	
  in	
  Duttaphrynus	  melanostictus.	
  Excluding	  Ps.	
 wynaadensis,	
 all	
 examined	 taxa	 showed	
 >	
 3%	
 16S	
 divergence.	
 Especially,	
 16S	
 divergence	
 is	
 higher	
 in	
 P.	
 leucomystax	
 (between	 the	
 Okinawa,	
 Univ.	
 Malaya	 Campus,	 and	
 Chantaburi	
 populations),	
  H.	
  erythraea	  (between	
 the	
 Langkawi	  Island/Univ.	
  Malaya	  Campus	  and	
  Chantaburi	  populations),	
  M.	
 okinavensis	
 (between	 the	
 Okinawa	
 and	
 Ishigaki	
 populations),	
  M.	
  ornata	
 (between	  the	
  Bajipe,	
  Mudigere,	  and	
  Talapu	
  populations),	
  and	
  D.	
 melanostictus	
 (between	 the	
 Maelippet	
 Siberut,	
 Padil,	 Bajipe,	
 Univ.	
 Malaya	 Campus,	 and	
 Ranong	
 Province	
 populations).	
 These	 high	 16S	 divergence	 values	 suggest	 the	
 presence	
 of	
 many	 candidate	 species	
 in	
 our	
 specimens.	
 In	
 total,	 109	
 haplotypes	
 were	 found,	
 and	
 the	
 concept	
 of	
 a	
 3%	
 difference	
 in	
  16S	
 sequence	  corresponding	  to	  species	  threshold	  was	
  applied	  to	
  define	
 candidate	 amphibian	 species,	
 for	
 which	 corroborating	 evidence,	
 such	 as	
 morphology,	  ecological	
  characteristics,	  and/or	  nuclear	  gene	  data,	  is	
 required.	
 Finally,	
 we	
 showed	 that	
 at	
 least	 6	
 candidate	
 and	
 6	
 possible	
 candidate	 species	
 from	
 our	
 specimens.	
 	
 Findings:	
 Polypedates	
  leucomystax,	  Hylarana	  chalconota,	  and	
  Hylarana	  sp.	
  from	 Chantaburi,	  Maelippet	  Siberut,	  and	
  Langkawi	  Island,	
  respectively,	
 correspond	 to	
 3	
 candidate	 species	
 and	
 H.	
 erythraea	
 from	
 Malaysia/Thailand	
 represents	
 a	
 possible	
 candidate	 species.	
 Hylarana	
 cf.	
 nicobariensis	
 from	
 Muara	 Siberut,	
 Amolops	
 larutensis	
 from	
 Gombak,	
 and	
 Microhyla	
 okinavensis	
 from	
 Ishigaki	
 Island	 showed	 divergences	
 from	
 the	
 topotypic	
 specimen,	 all	
 suggesting	 a	
 relevant	 candidate	 species.	
 Microhyla	
 heymonsi	
 from	
 Malaysia	
 
and	
 M.	
 ornata	 from	 two	
 regions	 (Mudigere	
 and	
 Talapu)	
 India	
 did	
 not	
 fit	
 
any	
 congeneric	 species	 based	 on	 available	
 16S	
 data,	
 suggesting	 3	
 possible	
 candidate	 species	 in	
 total.	
 Two	
 lineages	
 of	
 Duttaphrynus	 melanostictus	
 from	
 Malaysia	
 denote	 2	
 possible	
 candidate	 species.	
 Consequently,	
 this	
 study	 indicates	
 the	
 occurrence	
 of	
 6	 candidate	
 and	
 6	
 possible	
 candidate	
 species,	  and	
  argues	  that	  the	
  generic	  allocation	  of	  the	
 104

Fejervarya-Minervarya-Zakerana	 complex	
 needs	 to	 be	
 studied	
 in	
 detail.	
 	
 
	
 
	
 
2.	
 Description	
 of	
 two	
 new	
 species	 of	
 Microhyla	
 (Anura:	 Microhylidae)	
 from	
 Bangladesh	 	 Introduction:	 Microhylidae	
 is	
 a	
 large	 anuran	 family	 comprising	
 8%	
 of	
 all	
 frogs	 (519	
 species),	
 with	 Microhyla	
 being	 its	
 type	
 genus.	
 This	
 genus	 is	
 characterized	
 by	
 various	 morphological	
 characteristics	
 (e.g.,	 smooth	 or	 warty	 skin,	
 absence	 of	
 vomerine	 teeth,	 a	
 narrow	
 and	
 elliptical	
 tongue,	
 hidden	
 tympanum,	
 free	
 fingers,	
 free	 or	
 webbed	 toes,	
 united	 outer	 metatarsals,	
 dilated	 finger	 and	
 toe	
 tips,	
 absent	
 omosternum,	
 and	
 T-shaped	
 terminal	
 phalanges.	
 Members	  of	  this	  genus	  show	  a	  wide	  distribution	  across	  Asia	  and	  in	
 Bangladesh,	
 only	
 three	 nominal	
 Microhyla	
 species	 (Microhyla	
 ornata,	
 M.	
 berdmorei	
 and	
  M.	
  rubra)	
 are	
 known.	
 Recently,	
 we	
 found	 Chittagong	 and	
 Mymensingh-Sylhet	
 haplogroups	
 of	
 M.	
 cf.	
 ornata	 distinct	
 from	
 these	 three	 species	  based	
  on	
  mitochondrial	  16S	
  ribosomal	  RNA	
  gene	  (16S)	
  data.	
 Molecular	
 analysis	
 shows	 clear	 genetic	
 divergence	
 of	
 these	 haplogroups	
 
from	
 the	
 other	 Microhyla	
 taxa,	
 and	 the	
 morphological	
 characteristics	
 of	
 these	
 groups	
 is	
 inconsistent	
 with	 the	
 descriptions	
 of	
 M.	
 fissipes	
 and	
 other	 known	
 microhylid	
 species.	
 Thus,	
 here	
 we	
 describe	
 two	
 new	
 Microhyla	
 species	
 from	
 Bangladesh.	
 	 	 Materials	
 and	
 methods:	
 Specimens	  of	
  genus	  Microhyla	
  were	  collected	
  from	  five	  localities	  of	
 Bangladesh	
 from	 2003	 to	
 2012.	
 Vouchers	
 were	
 deposited	
 at	
 the	
 Institute	
 for	
 Amphibian	
 Biology,	
 Hiroshima	
 University	 (IABHU),	
 Japan.	
 Total	 DNA	
 samples	 for	
 Cytochrome	 b	
 gene	 (cytb)	
 analysis	
 of	
 the	
 Microhyla	
 specimens	
 were	
 extracted	
 from	 the	
 clipped	
 toe	
 of	
 each	 individual.	
 The	
 obtained	
 cytb	
 sequences	
 were	
 deposited	
 in	
 the	
 DNA	
 Data	 Bank	 of	
 Japan	 (DDBJ)	
 database	 (accession	 numbers:	
 AB819011–AB819033).	
 The	
 resulting	 cytb	 sequences	
 were	 aligned	
  using	  the	
  ClustalW	  program.	
  The	
  sequence	  divergence	  of	
  cytb	 (uncorrected	
 p	 values)	
 was	
 calculated	
 using	 MEGA	 Ver.	
 4.0.	 Phylogenetic	
 analysis	 was	
 performed	
 by	
 the	
 maximum	 likelihood	 (ML),	
 maximum	 parsimony	 (MP),	
 and	
 Bayesian	 inference	 (BI)	 methods.	
 Based	
 on	
 the	
 ML	
 and	
 Bayesian	 tree	
  topology,	  the	
  divergence	  times	  of	  the	
  Microhyla	
  taxa,	  focusing	 especially	
  on	
  the	
  new	
  Microhyla	
  taxa	  of	  interest	  (Chittagong	  and	
 Mymensingh-Sylhet	  haplogroups)	
  from	  Bangladesh	  and	
  M.	
  fissipes,	  were	 estimated	
  by	
  the	
  Bayesian	  relaxed-clock	  method.	
  For	
  morphological	
 comparison,	 	 28	
 measurements	
 were	
 taken	 using	 digital	 calipers	
 to	
 the	
 
nearest	
 0.1	
 mm.	
 Two	
 sexually	
 mature	
 individuals	
 from	 the	
 Mymensingh-Sylhet	 haplogroup	 (from	 Mymensingh;	
 IABHU	
 4005–4006)	
 were	
 used	 for	
 karyological	
 105

studies.	
 	
 
	
 
	
 
Results	 and	
 Discussion:	
 Based	 on	
 phylogenetic	
 analyses,	
 it	
 showed	 that	 all	
 individuals	
 of	
 the	
 
Chittagong	 haplotype	
 (M.	
 sp.	
 C	
 ≈	
 Chittagon	
 haplogroup)	
 formed	 a	 sister	 clade	
 with	
 the	
 topotypic	
 M.	
 fissipes.	
 In	
 addition,	
 all	
 of	
 the	
 individuals	
 from	  Mymensingh,	  Netrokona,	  Sylhet	  and	
  Sunamganj	  (M.	
  sp.	
  M	  ≈	
 Mymensingh-Sylhet	
 haplogroup)	
 formed	 another	 single	 clade	 which	 showed	 the	 sister	 relationships	
 with	
 the	
 M.	
 sp.	
 C	
 +	
 M.	
 fissipes.	
 Microhyla	
 sp.	
 
C	
 and	
 M	
 are	
 greatly	 diverged	
 from	 M.	
 fissipes	
 8.9	
 and	
 10.2%	 for	
 cytb	
 and	
 
3.6	
 and	
 4.2%	 for	
 16S,	
 respectively.	
 The	
 common	 ancestor	
 of	
 these	 taxa	 seems	 to	
 have	
 evolved	 somewhere	
 in	
 East	 or	
 Southeast	 Asia	
 before	 the	
 formation	
 
of	
 the	
 Bangladesh	
 landmass;	
 and	
 M.	
 sp.	
 M	
 and	
 M.	
 sp.	
 C	
 may	
 have	
 independently	
 colonized	
 Bangladesh	
 from	
 these	 areas	 at	 different	 times	 (10.5	
 Mya	
 and	
 
3.4	
 Mya,	
 respectively)	
 following	
 land	
 formation.	
 Morphologically,	
 M.	
 sp.	
 
C	
 and	
 M.	
 are	
 distinguished	
 from	 all	
 of	
 other	 congeners	
 based	 on	 different	 morphological	
 and	
 morphometric	
 characteristics.	
 	 	 Systematics:	 Microhyla	
 mukhlesuri	
 sp.	
 nov.	
 	 Microhyla	
  ornata	  (Bangladesh):	
  Kabir	  et	
  al.	
  (2009),	
  p.	
  25	
  (part).	
 	
 Microhyla	
 cf.	
 ornata	 (Chittagong,	
 Bangladesh):	
 Hasan	 et	 al.	
 (2012),	
 p.	
 
168.	
 	
 
	
 
Microhyla	
 sp.	
 C:	
 above	 discussion	 	
 Holotype.	
  IABHU	  3956,	  adult	  female	  (SVL:	
  17.9	  mm;	
  if	
  not	
  otherwise	 specified,	
 the	
 following	 body	
 parts	 are	 measured	
 in	
 mm)	
 collected	
 from	
 Raozan,	
 Chittagong	 (22º	
 35′	
 N,	
 91º	
 55′	
 E,	
 >	
 9	
 m	
 asl.),	
 Bangladesh	
 on	
 14	
 
November	 2009	
 by	
 M.	
 M.	
 Islam.	
 	 Paratypes.	
 IABHU	
 3878,	
 adult	 female	 (SVL:	
 17.3);	
 IABHU	
 3879,	
 adult	 male	
 (SVL:	
 21.0);	
 IABHU	
 3880,	
 adult	 male	 (SVL:	
 19.3);	
 IABHU	
 3881,	
 adult	 female	 (SVL:	
 17.5);	
 IABHU	
 3882,	
 adult	 male	 (SVL:	
 16.5);	
 IABHU	
 3957,	
 adult	 female	 (SVL:	
 18.4);	
 IABHU	
 3958,	
 adult	 female	 (SVL:	
 17.3);	
 IABHU	
 3959,	
 adult	 male	
 (SVL:	
 16.5);	
 and	
 IABHU	
 3960,	
 adult	 male	 (SVL:	
 16.6)	
 collected	
 from	
 Raozan,	 Chittagong,	
 Bangladesh	
 on	
 14	
 November	 2009	
 by	
 M.	
 M.	
 Islam.	
 	 	 Etymology.	
 We	
 dedicate	 the	
 species	
 name	
 “mukhlesuri”	
 to	
 the	
 late	
 Dr.	
 Md.	
 
Mukhlesur	
 Rahman	
 Khan,	
 Professor	
 of	
 the	
 Department	
 of	
 Fisheries	
 Biology	 &	 Genetics,	
 Bangladesh	
 Agricultural	
 University	
 (BAU).	
 
	
 

106

Diagnosis.	
 The	
 new	
 species	
 is	
 small	 frog	
 with	 SVL	
 of	
 16.5–21.0	
 mm	
 in	
 males	 and	
 17.3–18.4	
 mm	
 in	
 females.	
 Head	 length	 subequal	
 head	
 width,	 finger	 formula	
 1	
 <	
 4	
 <	
 2	
 <	
 3,	
 toe	
 formula	
 1	
 <	
 2	
 <	
 5	
 <	
 3	
 <4,	
 fingers	
 free	 and	
 slender,	
 
tips	
 of	
 fingers	 and	
 toes	 not	
 widened,	
 rudimentary	
 web	
 between	 toes	 and	
 subarticular	 tubercles	 relatively	
 prominent.	
 TIL/SVL	
 ratio	 was	
 0.54	 ±	
 0.03,	
 whereas	 this	
 value	 was	
 0.57	 ±	
 0.04	 in	
 M.	
 mymensinghensis,	
 and	
 0.50	 ±	
 0.02	
 in	
 M.	
 fissipes	
 from	
 Taiwan.	
 Tibiotarsal	
 articulation	
 reaches	 between	
 the	
 
eyes	
 to	
 tip	
 of	
 snout,	 whereas	 it	
 reaches	
 near	
 the	
 eye	
 in	
 M.	
 fissipes.	
 Phylogenetically,	
 it	
 appears	
 to	
 closer	
 to	
 “M.	
 ornata”	
 from	 Myanmar	 plus	
 “M.	
 fissipes”	
 from	 Laos	 and	
 Thailand	
 and	
 to	
 be	
 sister	 respectively	
 with	
 Taiwanese	 topotypic	
 M.	
 fiissipes	
 with	 significant	 genetic	
 divergences.	
 	 Distribution.	
 The	
 known	 occurrence	
 of	
 M.	
 mukhlesuri	
 is	
 Raozan,	 Chittagong	 District,	
 southeastern	 corner	 of	
 Bangladesh.	
 	 	 Microhyla	
 mymensinghensis	
 sp.	
 nov.	 Microhyla	
  ornata	  (Bangladesh):	
  Kabir	  et	
  al.	
  (2009),	
  p.	
  25	
  (part).	
 	
 Microhyla	
 cf.	
 ornata	 (Mymensingh,	 Bangladesh):	
 Hasan	 et	 al.	
 (2012),	
 p.	
 
168.	
 Microhyla	
 cf.	
 ornata	 (Sylhet,	
 Bangladesh):	
 Hasan	 et	 al.	
 (2012),	
 p.	
 
168.	
 
	
 
	
 Microhyla	
 sp.	
 M:	
 above	 discussion	 	
 Holotype.	
  IABHU	  4116,	  adult	  female	  (SVL:	
  21.3	  mm,	
  if	
  not	
  otherwise	 specified,	
 the	
 following	 body	
 parts	 are	 measured	
 in	
 mm)	
 collected	
 from	
 Bangladesh	
 Agricultural	
 University	 Campus	 (24º	
 44′	
 50″	
 N,	
 90º	
 24′	
 24″	
 E,	
 
>	
 18	
 m	
 asl.),	
 Mymensingh,	 Bangladesh	
 on	
 June	 25,	 2012	 by	
 M.	
 Hasan.	
 	 Paratypes.	
 IABHU	
 4004,	
 adult	 male	 (SVL:	
 14.8);	
 IABHU	
 4117,	
 adult	 female	 (SVL:	
 20.2);	
 and	
 IABHU	
 4120,	
 adult	 female	 (SVL:	
 20.5)	
 collected	
 from	
 Bangladesh	
 Agricultural	
 University	 Campus,	 Mymensingh,	 Bangladesh	
 on	
 9	
 
June	
 2011	 and	
 25	 June	 2012	 by	
 M.	
 Hasan.	
 IABHU	
 3947,	
 adult	 male	 (SVL:	
 17.6);	
 IABHU	
 3948,	
 adult	 male	 (SVL:	
 17.3);	
 and	
 IABHU	 3899,	
 adult	 female	 (SVL:	
 16.7)	 collected	
 from	 Golapganj,	
 Sylhet	 on	 6	
 June	 2011	 by	
 M.M.R.	
 Khan.	
 	
 Etymology.	
 The	
 specific	
 name	
 refers	 to	
 Mymensingh,	
 the	
 type	 locality	
 of	
 
this	
 species.	
 	
 Diagnosis.	
 In	
 conclusion,	
 this	 new	
 species	
 is	
 small	 frog	
 with	 SVL	
 of	
 14.2–17.6	
 mm	
 in	
 males	 and	
 15.2–21.3	
 mm	
 in	
 females.	
 Head	 length	 subequal	 head	
 width,	 finger	 formula	
 1	
 <	
 4	
 <	
 2	
 <	
 3,	
 toe	
 formula	
 1	
 <	
 5	
 <	
 2	
 <	
 3	
 <	
 4,	
 
fingers	
 free	 and	
 slender,	
 tips	
 of	
 fingers	 and	
 toes	 not	
 widened,	
 rudimentary	
 web	
 between	 toes	
 and	
 subarticular	 tubercles	 distinct.	
 TIL/SVL	
 ratio	
 was	
 

107

0.57	 ±	
 0.04,	
 whereas	 this	
 value	 was	
 0.54	 ±	
 0.03	 in	
 M.	
 mukhlesuri,	
 and	
 0.50	 ±	
 0.02	
 in	
 M.	
 fissipes	
 from	
 Taiwan.	
 Tibiotarsal	
 articulation	
 extends	
 from	
 between	 the	
 eyes	
 to	
 the	
 tip	
 of	
 the	
 snout,	 while	 it	 reaches	
 near	
 the	
 eye	
 
in	
 M.	
 fissipes	
 and	
 in	
 front	 of	 the	
 shoulders	
 in	
 M.	
 ornata.	
 Phylogenetically,	 it	
 shows	 sister	 relationship	
 with	 M.	
 mukhlesuri	
 plus	 M.	
 fissipes	
 with	 high	
 genetic	 divergences.	
 	 Distribution.	
 The	
 known	 occurrence	
 of	
  M.	
  mymensinghensis	
 includes	
 the	
 Mymenisngh,	
 Netrokona,	
 Sylhet	 and	
 Sunamganj	 districts	
 in	
 the	
 northern	
 and	
 northeastern	 regions	
 of	
 Bangladesh.	
 	 	 Findings:	
 
The	
 DNA	
 sequences	
 of	
 the	
 mitochondrial	
 cytb	 gene	
 from	
 these	 new	 species	 are	
 substantially	 diverged	
 from	 M.	
 fissipes	
 (8.9	
 and	
 10.2%	
 [3.6	 and	
 4.2%	 for	
  16S]	
  uncorrected	
  pairwise	  divergence,	  respectively),	  and	
  the	 estimated	  phylogenetic	  splits	  from	  their	  closest	  relative	
  is	
  in	
  the	 Pliocene	 (3.4	 Mya)	
 and	
 middle	 Miocene	 (10.5	 Mya).	
 The	
 first	 new	
 species	 (Microhyla	
 mukhlesuri	
 sp.	
 nov.)	
 can	
 be	
 diagnosed	
 from	 its	
 nearest	
 congener	 (M.	
 fissipes)	
 by	
 the	
 following	 characteristics:	
 SVL:	
 16.5–21.0	
 mm,	
 finger	 length	
 1	
 <	
 4	
 <	
 2	
 <	
 3,	
 tips	
 of	
 finger	 and	
 toes	 not	
 swollen,	
 subarticular	 tubercles	 distinct,	
 an	
 inverse	
 U-shaped	
 mark	 on	
 the	
 anus,	
 and	 a	
 distinct	
 X-shaped	  marking	
  on	
  the	
  dorsum.	
  Although	  the	
  second	  new	
  species	  (M.	
 mymensinghensis	
 sp.	
 nov.)	
 shares	 some	 morphological	
 characteristics	
 with	 the	
 first	 new	
 species,	
 it	
 can	
 be	
 readily	 diagnosed	
 from	 its	
 close	 congeners	
 
by	
 its	
 longer	 hindlimbs	
 (HLL/SVL),	
 tibia	 (TIL/SVL)	
 and	
 forearm	
 width	 (FAW/SVL),	
 in	
 addition	
 to	
 a	
 combination	
 of	
 the	
 following	 characteristics:	
 SVL:	
 14.2–21.3	
 mm,	
 snout	 truncate,	
 a	
 crescent-shaped	
 marking	
 on	
 the	
 anus,	
 and	 an	
 X-shaped	
 marking	
 on	
 the	
 dorsum.	
 The	
 tibio-tarsal	
 articulation	
 extends	
 to	
 the	
 eye	
 in	
 M.	
 fissipes	
 but	
 ranges	 from	
 the	
 eye	
 to	
 the	
 tip	
 of	
 
the	
 snout	
 in	
 the	
 two	
 new	
 species.	
 	 	 Future	 Research	
 Plan:	 At	
 present,	
 I	 am	
 working	
 on	
 the	
 evolutionary	 relationships	
 and	
 postmating	 isolation	
 among	 Fejervarya	 species	
 from	
 lesser	 Sunda,	
 Indonesia	
 and	
 other	 Asian	 countries	
 revealed	
 by	 mtDNA	 cytb	 gene	 sequences,	
 crossing	 experiment,	
 histology	  and	
  spermatogenesis.	
  Further,	
  I	
  am	
  working	
  on	
  to	
  describe	 Hylarana	  sp,	
  Microhyla	
  sp.,	
  Fejervarya	  sp.	
  and	
  Euphlyctis	
  sp.	
  from	 Bangladesh	
  using	  multiple	  datasets	  i.e.	
  morphology,	  acoustic	  and	
 molecular	 data.	
 	 	 Research	
 Achievements:	 ①	
 Original	 paper	 1.Igawa,	
 T.,	
 H.	
 Sugawara,	
 M.	
 Tado,	
 T.	
 Nishitani,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 M.	
 M.	
 

108

Islam,	
 S.	
 Oumi,	
 S.	
 Katsuren,	
 T.	
 Fujii	
 and	 M.	
 Sumida	 (2013)	
 An	
 attempt	
 at	
 captive	 breeding	
 of	
 an	
 endangered	 newt,	
 Echinotriton	
 andersoni,	
 from	 the	
 Central	
 Ryukyus	 in	
 Japan.	
 Animals,	
 3:	
 680-692.	
 	
 2.Hasan,	
 M.,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 Kuramoto,	
 A.	
 Kurabayashi	
 and	
 M.	
 Sumida	 (2014)	
 Description	
 of	
 two	
 new	
 species	 of	
 Microhyla	
 (Anura:	 Microhylidae)	
 from	
 Bangladesh.	
 Zootaxa,	
 3755:	
 401-418.	
 	
 3.Hasan,	
 M.,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 M.	
 R.	
 Khan,	
 T.	
 Igawa,	
 M.	
 S.	
 Alam,	
 T.	
 H.	
 Djong,	
 N.	
 Kurniawan,	
 H.	
 Joshy,	
 H.	
 S.	
 Yong,	
 Daicus,	
 M.	
 B.,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 M.	
 Kuramoto	
 and	
 M.	
 Sumida	 (2014)	
 Genetic	
 divergences	
 of	
 South	 and	
 Southeast	 Asian	
 frogs:	 a	
 case	 study	 of	 several	
 taxa	 based	 on	
 16S	
 ribosomal	
 RNA	 gene	 data	
 with	 notes	 on	 the	
 generic	
 name	
 Fejervarya.	
 Turk.	
 J.	
 Zool.,	
 38:	
 in	
 
press	 	
 ②	 Review	 paper	 or	
 Book	
 
None	
 
	
 
③	
 Presentations	 in	
 Conferences:	 National	
 Conference	
 1.M.	
  Hasan,	
  M.	
  M.	
  Islam,	  M.	
  Kuramoto,	  A.	
  Kurabayashi	  and	
  M.	
  Sumida.	
 Description	
 of	
 two	
 new	
 species	 of	
 Microhyla	
 (Anura:	 Microhylidae)	
 from	
 Bangladesh.	
 85th	 Annual	 Meeting	
 of	
 the	
 Genetic	
 Society	
 of	
 Japan,	
 Keio	
 University,	
 Yokohama,	
 Kanagawa	
 Prefecture,	 	
 September	
 18	
 –	
 September	
 20,	
 2013.	 	
 International	 Conference	 M.	
  Hasan,	
  M.	
  M.	
  Islam,	  M.	
  Kuramoto,	  A.	
  Kurabayashi	  and	
  M.	
  Sumida.	
 Description	
 of	
 two	
 new	
 species	 of	
 Microhyla	
 (Anura:	 Microhylidae)	
 from	
 Bangladesh.	
  Australian	  Herpetological	
  Society,	  Greenhills	
  Conference	 Centre,	 Canberra,	
 ACT,	 January	
 29	
 –	
 February	
 01,	 2014.	
 	 	 2.Alam	 M.	
 S.	
 Khan	
 M.	
 M.	
 R.	
 Islam	 M	
 .M.,	
 Hasan	 M.	
 and	
 Sumida	 M.	
 Artificial	
 Breeding	
 of	
 the	
 Bullfrog	 (Hoplobatrachus	
 tigerinus):	
 A	
 case	 study	 on	
 reproduction	  and	
  conservation.	
  International	  Symposium-	  Frontiers	  in	
 Amphibian	
 Biology:	
 Endangered	
 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing,	 Hiroshima,	
 Japan	 	
 3.Hasan	
 M.,	
 Kuniawan	
 N.,	
 Soewondo	
 A.,	
 Islam	 M.	
 M.	
 Igawa	 T.,	
 Nalley	
 W.	
 M.	
 
M.	
 Matsui	
 M.	
 and	
 Sumida	 M.	
 Evolutionary	 relationships	
 and	
 postmating	 isolation	
 among	 Fejervarya	 species	
 from	 Lesser	 Sunda,	
 Indonesia	
 and	
 other	 Asian	 countries	
 revealed	
 my	
 mtDNA	 gene	 sequence	
 and	
 crossing	 experiments.	
 109

International	  Symposium-	  Frontiers	  in	  Amphibian	  Biology:	  Endangered	 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing,	
 Hiroshima,	
 Japan.	
 	
 4.Sultana	
 N.,	
 Igawa	 T.,	
 Nozawa	
 M.,	
 Islam	 M.	
 M.,	
 Khan	
 M.	
 M.	
 R.	
 Hasan	
 M.,	
 
Alam	
 M.	
 S.	
 and	
 Sumida	 M.,	
 Development	
 and	
 characterization	
 of	
 27	
 new	
 
microsatellite	  markers	  of	  Indian	  Bullfrog,	  Hoplobatrachus	  tigerinus	 (Daudin,	  1802)	
  and	
  its	
  congeneric	  species.	
  International	  Symposium-	 Frontiers	  in	  Amphibian	  Biology:	  Endangered	  Species	  Conservation	  and	 Genome	 Editing,	
 Hiroshima,	
 Japan.	
 	 ④	 Grants	 	
 None	 110

	
 [リーデイングプログラムによる特任教員]	
 特任准教授・高橋秀治(Shuji	 Takahashi)	
 
	
 
研究内容	
 
アフリカツメガエル（Xenopus	
 laevis）ゲノム解読及びネッタイツメガエル（Xenopus	 tropicalis）を用いた初期発生に関与する遺伝子の解析	 	 Analysis	  of	  Xenopus	  laevis	  whole	  genome	  and	
  genes	  involving	  early	 developmemt	
 in	
 Xenopus	 tropicalis	
 
	
 
[目的]	
 
	
  （１）Xenopus	
 laevis は異質倍数体（４倍体）であるためゲノムが複雑であり、最も利用され多くの発見に寄与してきたにもかかわらず全ゲノムが解読されていない。これを解読して倍数化後におこる現象を明らかにすることと、ポストゲノムの研究においても研究に寄与できる環境を整えることを目的とし
日米ゲノムコンソーシアムが組織され解読を行っている。このゲノムには次世
代シーケンサでは解読不可能な領域が含まれておりこれらを明らかにすることも本研究の目的としている。（２）また、初期発生は誘導、細胞分化、細胞の移動など多彩な現象が見られ、そこでおこる遺伝子発現ネットワークの解読
は幹細胞を利用した再生医療研究に大きく寄与している。本研究では初期発生の詳細な遺伝子ネットワークを明らかにすることを目的にしている。	
 
	
 
	
 
	
 [材料・方法]	
 	
  本研究の（１）では、ゲノム解読に利用している Xenopus	
 laevis	
 J 系統（近交系）の直接の子孫を研究室で維持・継代し使用している。（２）では Xenopus	
 tropicalis のゲノムを読まれた系統（Nigerian 系統）を研究室で維持・継代し使用している。	
 （１）Xenopus	
 laevis ゲノム解析	
 ・	  ゲノムシーケンス、RNA-seq、FISH 用サンプル提供。	
 ・	  Fosmid	 library 作製。	
 ・	  シークエンスおよび FISH 解析。	
 ・	  ClustalW や Blast を用いた詳細な Gene	 model の validation。	
 ・	  PCR 法による重要領域の増幅・クローニングと DNA 塩基配列決定。	
 ・	
  メス及びオス特異的ゲノム領域探索のための W 及び WW 個体作製	
 ・	  次世代シーケンサでは解読できない難関領域の Fosmid スクリーニング。	
 （２）初期発生に関与する遺伝子の解析	 ・	
  DNA アレイ、Whole-mount	
 in	
 situ	
 hybridization 解析を用いた発現パターン等から候補とした Xenopus	
 tropicalis の遺伝子のクローニング。	
 	 	
 [結果・考察・成果・今後の展望]	
 （１）Xenopus	
 laevis ゲノム解析	
 

111

	
  両生類では、これまで２倍体の Xenopus	
 tropicalis	
 のゲノムが解読されている。Xenopus	
 laevis は異質倍数化して時間がさほどたっていないことからゲノム上の２つの遺伝子は 94％程度の相同性を持ち解読自体が難しい。日米のコンソーシアムでは次世代シーケンサで 100b	
 paired	
 end からの情報をもとにアセンブルを行い、Scaffold を構築した。さらに Bac や Fosmid ライブラリーを構築しこれらのエンドシーケンスデータ及びこれらを用いた FISH データから
Scaffold の検証を行ってきた（当研究室分担）。さらに Gene	 model の作成及び同祖遺伝子の網羅的発現レベル解析を行うため各発生ステージや各組織から RNA を抽出し、次世代シーケンサを用いて RNA-seq（100b	
 paired	 end）を進めてきた（当研究室担当）。これらのゲノム・遺伝子発現解析には日本で開発され、当研究室で維持されている Xenopus	
 laevis 純系 J 系統を使用している。
その他にも Gene	 model の検証、３番染色体２セットの検証、W 及び WW 個体の作製も担当した。ホモロジーの非常に高い遺伝子のリピート構造で構成され次世 代 シ ー ケ ン サ で は 解 読 が 不 可 能 で あ る nodal 遺 伝 子 領 域 （ Xenopus	
 tropicalis でも解読されていない）についても担当し、Fosmid	 library を作製してスクリーニングを行い、サンガー法で解析している。今年度、nodal3
領域については全貌が解明した。nodal5 領域に関してはタンデムリピート構造の両端の配列を明らかにした。現在、日米コンソーシアムの努力により、全ゲ
ノムと Gene	 model 構築がほぼ完成している。今後は生物学的解析を行い倍数化ゲノムの進化などの理解にもつなげたい。また担当している、難関領域である nodal クラスターも構造を明らかにその生物学的意味を明らかにすることを計画している。	
 （２）初期発生に関与する遺伝子の解析	 	
  両生類初期胚は初期発生を理解する上で、他の動物胚に無い利点を持っている。卵のサイズが大きく操作が行いやすいことや大量の胚を集めることが可能であること等である。この特徴を生かし、初期発生に関与する遺伝子の解析を行っている。本年度は DNA アレイ、Whole-mount	
 in	
 situ	
 hybridization 解析を用いた発現パターン等から候補とした Xenopus	
 tropicalis の遺伝子のHigh-fidelity	
 KOD	
 Polymerase を用いて RT-PCR を行い、クローニングを行った。約 15 個の遺伝子の過剰発現用のベクターにクローニングを完了した。これらの遺伝子はツメガエル胞胚の表面に存在する細胞の分化に関与していると考えられるものである。特に胞胚内胚葉領域の表層に存在する細胞は原腸陥入後、原腸の表面をおもに構成する細胞である。原腸表面の細胞は消化管形成に貢献するだけでなく消化管から出芽する内胚葉性器官すべての元となる細胞であり、これらの解析を行うことで内胚葉分化の正確な理解が得られると考えられる。米国との共同研究で ChIP-seq のためのサンプル大量調整の条件検討を行い良好な結果を得ている。今後は過剰発現により遺伝子を選択し、検討した条件を用いて次世代シーケンサを用いた大規模解析を行う予定である。また共同研究で ChIP-seq、RNA-seq を用いた頭部形成に関わる遺伝子の解析を行った。この研究により頭部形成の初期遺伝子発現メカニズムが明らかになった。	
 
	
 
研究業績	
 
①	
 原著論文	 112

1. Morita	
 M,	
 Yamashita	
 S,	
 Matsukawa	 S,	
 Haramoto	 Y,	
 Takahashi	
 S,	
 Asashima	 M,	
 Michiue	
 T.	
 Xnr3	 affects	
 brain	 patterning	
 via	
 cell	 migration	
 in	
 the	
 
neural-epidermal	
 tissue	 boundary	 during	 early	
 Xenopus	 embryogenesis.	
 Int	
 
J	
 Dev	
 Biol.	
 2013;57(9-10):779-86.	
 doi:	
 10.1387/ijdb.130161tm	
 2. Nejigane	
 S,	
 Takahashi	
 S,	
 Haramoto	
 Y,	
 Michiue	 T,	
 Asashima	
 M.	
 Hippo	 signaling	 components,	
 Mst1	
 and	
 Mst2,	
 act	
 as	
 a	
 switch	 between	 self-renewal	
 and	
 differentiation	
 in	
 Xenopus	 hematopoietic	
 and	
 endothelial	
 progenitors.	
 
Int	
 J	
 Dev	
 Biol.	
 2013;57(5):407-14.	
 doi:	
 10.1387/ijdb.130010st.	
 	
 ②	
 総説・著書	 	 	
 該当なし	 	
 ③	 学会発表	
 国際学会	
 1.Yoshikazu	
 Haramoto,	
 Shuji	 Takahashi,	 Yasuko	
 Onuma,	 Yuzuru	
 Ito,	
 Makoto	 Asashima.	
 Functional	
 analyses	
 of	
 a	
 novel	
 Insulin-like	
 factor.	
 (IABHU	 International	
 Symposium,	
 Hiroshima	
 University,	 March	 2014).	
 
	
 
国内学会	
 
1. 原本悦和、高橋秀治、小沼泰子、伊藤弓弦、浅島誠	
  「新規インスリン様因子の機能解析」第７回ツメガエル研究集会（2013年9月25日、秋吉台国際芸術村、山口県）	
 2. 本田裕樹，桐ヶ谷嘉章，安岡有理，鈴木	
 穣，高橋	
 秀治，浅島	 誠，菅野	
 純
夫，平良	
 眞規	
  「転写因子Siamois	
 のChIP-Seq	
 解析による頭部オーガナイザ
ー形成機構の解明」第３６回分子生物学会（2013年12月3〜5日）	
 	
 ④	 科研費等の受け入れ状況	 1.科学研究費補助金・基盤研究 C 2013 年	
  100 万円 （研究代表）
2.科学研究費補助金・基盤研究 B	 	 	
 2013 年	  100 万円	 （分担）	
 3.科学研究費補助金・基盤研究 C	  	 2013 年	  15 万円	
 （分担）	
 4.科学研究費補助金・基盤研究 C	  	 2013 年	  15 万円	
 （分担）	
 5.国立大学改革強化推進補助金	
 	
 2013 年	  175 万円	 （分担）	
 113

プロジェクト研究① 	
 
	
 
I.	
  ネッタイツメガエルを用いた研究提案	
 Proposed	
 research	
 using	 Xenopus	 (Silurana)	
 tropicalis	 	 柏木啓子（広島大学）、山本	
  卓（広島大学）、鈴木賢一（広島大学）、成瀬	 清（基礎生物学研究所）、笹土隆雄（基礎生物学研究所）、花田秀樹（広島大学）、柏木昭彦（広島大学）	
 	 	  ネッタイツメガエルを用いて、私達は現在、化学物質の内分泌かく乱作用を調査、あるいは TALENs による遺伝子改変動物を作製中である。近い将来、簡便で確実な精子凍結法の開発、雌性発生法による近交系作出の促進、さらにはミュータジェネシスなどを計画している。	
 
	
 
II.	
  トランスジェニックスクリーニング法を用いた化学物質による甲状腺ホ
ルモンかく乱作用の評価	 	
 Evaluating	 chemical	
 related-thyroid	
 hormone	 disruption	
 using	 transgenic	 screening	 techniques	 	 	  柏木昭彦（広島大学）、鈴木賢一（広島大学）、花田秀樹（広島大学）、柏木啓子（広島大学）、山本	
  卓（広島大学）、太田	  茂（広島大学）	
 	
 世界規模でしかも地球生命史上前例のない速度で両生類個体群が減少していると報じられている。その原因として、生息場所の消失、紫外線量の増加、
気候変動の他に残留性の高い化学物質による環境汚染が挙げられる。両生類は、透過性の高い皮膚を有していること、水陸双方に生息すること、発生過程で草食性オタマジャクシから肉食性カエルへと食物網が変化することなどから、いろいろな経路を通して環境汚染物質に曝露される可能性が高い。両生類にとって有害な要因がヒトにも健康被害を及ぼすことは多くの研究者の一致するところである。	
 	
  工業製品の原材料や PPCPs など多数の化学物質が世界の環境中から見つかっている。その中には、脂質との親和性が顕著で、生物蓄積し、甲状腺機能障害を含めいくつかの悪影響を及ぼすものもある。無尾両生類の変態現象は甲状腺ホルモンに負うところが大きく、そのシステムは正常な甲状腺ホルモン作用に対する化学物質の曝露リスクを推定するのに有用である。本研究では、甲状腺ホルモンアゴニストまたはアンタゴニストである化学物質を高感度に検出するためのトランスジェニック系統を開発し、環境中化学物質の内分泌かく乱作
用の判定に役立てたいと考えている。	
 
	
 
III.	
  ミトコンドリア膜透過遷移と無尾両生類における尾部アポトーシスのメカニズム	
 Mitochondrial	 membrane	 permeability	 transition	
 and	
 the	
 mechanism	
 for	
 tail	
 apoptosis	
 in	
 anurans	
 

114

	
  柏木昭彦（広島大学）、花田秀樹（広島大学）、柏木啓子（広島大学）、内海俊彦（山口大学）、井上正康（宮城大学）、佐々木順三（岡山大学）、勝	  賢二郎（熊本大学）、佐藤英介（鈴鹿医療科学大学）、内海耕慥（高知大学）	
 
	
  	
 
無尾両生類の変態時に見られるオタマジャクシの尾部消失にミトコンドリ
ア膜透過遷移(MPT)が重要な役割を果たしている。L－カルニチンがβ酸化およびエネルギー生成のために遊離脂肪酸(FFAs)をサイトゾルからミトコンドリ
アマトリックスに移動させることはよく知られている。以前に私達が行った研究から L－カルニチン処理は FFAs レベルは減少させて T3 および FFA によって誘導された MPT を抑制することがわかった。昨年度の研究では、L－カルニチ
ンと同じく脂肪酸酸化に関与するアセチル－L－カルニチン(ALC)に焦点を当てて、ツチガエルオタマジャクシの T3 誘導による尾部短縮、およびアフリカ
ツメガエルオタマジャクシの自然状態での尾部短縮の影響を調べた。	
 	
  T3 処理されたオタマジャクシの尾部アポトーシスの指標である DNA ラダー
像の形成およびカスパーゼ－３、カスパーゼ－９活性の増加が ALC を添加する
ことによって抑えられることがわかった。また、ALC はアフリカツメガエルオ
タマジャクシの内在性甲状腺ホルモンによって制御される自然変態を抑制し、同時にカスパーゼやフォスフォリパーゼ A2 活性、DNA ラダー像の形成を減少させることも明らかになった。	
 	
  以上の結果は、FFAs 活性の増加が MPT 開始を促し、無尾両生類の変態時におけるオタマジャクシ尾部のアポトーシスによる細胞死を制御するシグナル伝
達を活性化するという、私達がこれまでに得てきた結論を支持するものである。	
 	
  今後も引き続いて、両生類の変態におけるオタマジャクシ尾部アポトーシスの分子機構を調べていく予定である。	
 
	
 
研究業績	
 
①	
  原著論文	  	 １.Hanada	
 ,H.,	
 Kobuchi,	
 H.,	
 Yamamoto,	
 M.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Katsu,	
 K.,	
 Utsumi,	 T.,	
  Kashiwagi,	  A.,	
  Sasaki,	  J.,	
  Inoue,	  M.	
  and	
  Utsumi,	  K.	
  (2013)	
 Acetyl-L-carnitine	
 suppresses	
 thyroid	
 hormone-induced	
 and	
 spontaneous	 anuran	 tadpole	 tail	 shortening.	
 Hereditas,	
 150:	
 1-9.	
 2.	
  Suzuki,	  K.,	
  Isoyama,	  Y.,	
  Kashiwagi,	
  K.,	
  Sakuma,	  T.,	  Ochiai,	
  H.,	
 Sakamoto,	
 N.,	
 Furuno,	
 N.,	
 Kashiwagi,	
 A.	
 and	
 Yamamoto,	
 T.	
 (2013)	
 High	
 efficiency	  TALENs	
  enable	  F0	
  functional	  analysis	
  by	
  targeted	  gene	 disruption	
 in	
 Xenopus	 laevis	 embryos.	
 Biology	
 Open,	
 2:448-452	
 3.	
  Sakane,Y.,	
  Sakuma,T.,	
  Kashiwagi,K.,	
  Kashiwagi,A.,	
  Yamamoto,T.	
  and	
 	 Suzuki,	 K.(2014)	
 Targeted	 mutagenesis	
 of	
 multiple	
 and	
 paralogous	 genes	 in	  Xenopus	  laevis	  using	  two	
  pairs	  oftranscription	  activator-like	 effector	 nucleases.	
 	
 Dev.	
 Growth	
 Diff.,	
 56:	
 108-114.	
 	 ②	
 総説・著書	 1.	
 Hanada	
 ,H.,	 Kashiwagi,	
 K.,	
 Suzuki,	
 K.,	
 Yamamoto,	
 T.	
 and	
 Kashiwagi,	
 A.	
 (2013)	
  Suppression	  of	  anuran	  metamorphosis	
  by	  synthetic	  chemical	
 115

compounds.	
  Frogs:	
  Genetic	
  Diversity,	  Neural	  Development	  and	
 Environmental	
 Influences.	
 (NOVA,	
 Sweden)	
 pp.	
 73-88	 	 ②	
 学会発表	
 
国内学会	
 
1.	
 柏木昭彦，鈴木	  厚，古野伸明，柏木啓子，花田秀樹，田澤一朗，倉林	  敦，
中島圭介，竹林公子，小林里美，竹中純子，住田正幸「新しい実験動物としてのネッタイツメガエル」第 60 回日本実験動物学会（2013 年 5 月、つくば国際会議場、つくば）	
 2.	
 柏木昭彦，柏木啓子，花田秀樹，田澤一朗，小林里美，竹中純子，鈴木	  厚，竹林公子，古野伸明，倉林	  敦，中島圭介，住田正幸	
  「動物学ひろば：
ツメガエルを知っていますか？」	
  第 84 回日本動物学会	
 （2013 年 9 月、
玉野市立玉野海洋博物	 館、玉野）	
 3.	
 オーガナイザー：加藤尚志（早稲田大）、柏木昭彦（広島大）；講演者：山本	
  卓（広島大）、加藤尚志（早稲田大）、田村宏治（東北大）、入江直樹（東京大）、鈴木賢一（広島大）「生物実験材料としてのネッタイツメガエ
ルの長所と有用性」第 84 回日本動物学会シンポジウム（2013 年 9 月、岡
山大学、岡山）	
 4.	
 花田秀樹、小渕	
 浩嗣、柏木啓子、内海俊彦、井上正康、佐々木順三、勝賢
二郎、佐藤英介、内海耕慥、柏木昭彦	
  「アセチル-L-カルニチンによる
無尾両生類幼生尾部短縮の抑制」日本動物学会	
  第 84 回大会	  （2013 年	
 9 月	  岡山大学、岡山）	
 5.	
 柏木啓子１、鈴木賢一１、佐能正剛 2、花田秀樹１、山本	  卓１、新海	  正 3、
古野伸明 1、太田	  茂 2、柏木昭彦１	 	
 「両生類を用いた甲状腺ホルモン作用	
 かく乱化学物質の評価」	
  	
  第 84 回日本動物学会	
  （2013 年 9 月、岡山
大学、岡山）	
 
	
 
6.	
 柏木	
 昭彦，柏木	 啓子，花田	 秀樹，鈴木賢一，鈴木	
  厚，竹林	 公子，倉林	
  敦，中島	 圭	
 介，田澤	
 一朗，井川	
  武，小林	
 里美，竹中	 純子，玉城	
 
ゆうな	
 ，古野	
 伸明，山本	  卓，住田	 正幸	
  「ネッタイツメガエルの近交化・標準系統の樹立・提供」第 36 回日本分子生物学会	
 	 (2013 年 12 月、神戸国際展示場	  神戸）	
 
7.	
 中出	
 翔太、	
 鈴木	
 賢一、佐久間哲史、	
 重田美津紀、	 柏木昭彦、	
 柏木啓子、	
 山本卓、	
 小原政信「TALEN を用いたツメガエル発生過程におけるサイ
トグロビンの機能解析」第 36 回日本分子生物学会（2013 年 12 月、神戸市）	
 8.	
 鈴木賢一、山本卓、柏木昭彦	
  WS（動物のメタモルフォーゼ：個体のライ
フスタイルの劇的変容を支える分子・細胞基盤に関する研究の最前線）「ツメガエル変態における甲状腺ホルモン受容体やその標的遺伝子の特徴」第
36 回日本分子生物学会（2013 年 12 月、神戸市）	
 
	
 

116

国際学会	 1.	
 Kashiwagi	
 A.,	
 Kashiwagi	
 K.,	
 Hanada	 H.,	
 Suzuki	
 K.,	
 Suzuki	 A.,	
 Takebayashi	
 K.,	
 Nakajima	
 K.,	
 Furuno	 N.,	
 Tazawa	
 I.,	
 Kurabayashi	
 A.,	
 Yamamoto	
 T.	
 and	
 	
 Sumida	 M.	
 	
 「National	
 BioResource	 Project	
 (NBRP)	
 Xenopus	 tropicalis	
 Mass	
 Production	
 of	
 High	 Quality	
 Standard	
 Inbred	 Strains.」The	 5th	
 ANRRC	 International	
 Meeting	 (October	
 30-November	
 1,	
 
2013	
 in	
 Shonan	
 Village	 Center,	
 Hayama,	 Japan)	
 2.	
  Isoyama,	  Y.,	
  Kashiwagi,	
  K.,	
  Kashiwagi,	  A.,	  Yamamoto,	  T. 	
  「 Gene	 knockout	 in	
 Xenopus	 using	 TALENs.」46th	
 Annual	 Meeting	
 of	
 JSDB,	
 5th	
 May,	
 Matsue,	 Japan.	
 (2013,	
 5th	
 May,	 Matsue,	 Japan.)	
 3.	
 Kashiwagi	
 A.,	
 Kashiwagi	
 K.,	
 Hanada	 H.,	
 Suzuki	
 A.,	
 Takebayashi	
 K.,	
 Kurabayashi	
 A.,	
 Suzuki	
 K.,	
 Furuno	 N.,	
 Tazawa	
 I.,	
 Nakajima	
 K.,	
 Yamamoto	 T.	
  and	
  Sumida	  M. 	
  	
  「 National	  BioResource	  Project	  (NBRP)	
  Xenopus	
 (Silurana)	
  tropicalis:	
  Standard	  High	  Quality	  Inbred	  Strain	  for	
 Biological	
 Research」International	
 Symposium	
 Frontiers	
 in	
 Amphibian	 Biology:	
 Endangered	
 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing	 (March	 27-28,	
 2014	 Institute	 for	
 Amphibian	
 Biology,	
 Graduate	
 School	 of	
 Science,	 Hiroshima	
 University,	
 Higashihiroshima,	
 Japan)	
 4.	
 Watanabe	
 A.,	
 Igawa	 T.,	
 Kashiwagi	
 A.,	
 Suzuki	
 A.,	
 Kurabayashi	
 A.,	
 Fujii	
 T.	
 and	
 Sumida	 M.「Inbreeding	 coefficient	
 and	
 genetic	
 relationship	
 of	
 seven	
  strains	  of	  Xenopus	
  tropicalis	  inferred	  from	  genome	  wide	 genotyping	
  of	
  54	
  microsatellite	  loci 」 International	  Symposium	 Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology:	
 Endangered	
 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing	 (March	 27-28,	 2014	 Institute	 for	
 Amphibian	
 Biology,	 Graduate	
 School	 of	
 Science,	
 Hiroshima	
 University,	
 Higashihiroshima,	 Japan)	
 5.	
 Suzuki,	
 A.,	
 Kashiwagi	
 A.,	
 Kashiwagi	
 K.,	
 Hanada	 H.,	
 Takebayashi-Suzuki	
 K.,	
 Tazawa	
 I.,	
 Furuno	 N.,	
 Kurabayashi	
 A.,	
 Kobayashi	
 S.,	
 Takenaka	
 J.,	
 Tamaki	
 Y.,	
 Igawa	
 T.,	
 Uto	
 T.,	
 Nanba	 C.,	
 Watanabe	
 A.,	
 Yoshida	
 H.,	
 Shimada	 A.	
  and	
  Sumida	  M. 「 International	
  Xenopus	
  Resource	  Network	  and	
 Educational	  Activities	  at	
  Institute	  for	
  Amphibian	  Biology 」
International	
 Symposium	 	
 Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology:	
 Endangered	 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing	 (March	 27-28,	 2014	 Institute	 for	
  Amphibian	  Biology,	  Graduate	  School	  of	  Science,	  Hiroshima	
 University,	
 Higashihiroshima,	
 Japan)	
 117

プロジェクト研究②	 	 古野伸明（広島大学）、吉留賢（鳥取大学）、渡部稔（徳島大学）、柏木啓子（広島大学）、花田秀樹（広島大学）、新海正（芝浦工業大学）、久保英夫（東京都
医学総合研究所）、坂井雅夫（鹿児島大学）、藤井博匡（札幌医科大学）、山下
雅道（JAXA）、柏木昭彦（広島大学）、谷本能文（大阪大谷大学）、藤原好恒（広島大学）、山本卓（広島大学）、鈴木賢一（広島大学）、植木龍也（広島大学）、
関口猛（九州大学）、小林英紀（岡山大学）、小原政信（広島大学）	
 
	
 
研究内容	
 
［１］両生類の生活環に対する過重力の影響	 The	
 effect	
 of	 the	
 hypergaravity	
 on	
 the	
 life	
 cycle	 of	 amphibians	 	 	  将来、人類が宇宙へ進出して行くためには地球とは異なった重力環境下でヒトを含めた動植物が正常で健康な子孫を作れるかどうかを知る事が重要であり、もし、正常な子孫が作れないようなら、どのようにすれば異なった重力環
境で正常に生活環が回るかどうか調べる事が重要である。我々は、両生類をモデル生物として過重力が成長や内分泌系にどのような影響を与えるかを調べ、その改善方法を探っている。	
 	
 目的と成果	 	
  両生類をモデル生物として、生活環の重要な時期（初期発生や減数分裂など）に焦点を絞って過重力の影響を調べたり、長期にわたる過重力暴露におけるホルモン分泌を含む生理的影響を追跡する。また、過重力で生じた異常を正常に戻す手段を探索する。それらの実験を通じて、地上とは異なった重力環境下でヒトを含めた動植物の世代交代が可能かどうかを調べることを目標とする。その結果、過重力に感受性が高い時期は、受精後から卵割が始まるまでである事が判明した。WISH を用いた実験から過重力は頭部形成に特に影響を与える事が明らかになった。また、卵減数分裂に影響を与える事がわかった。また、長期に渡る過重力曝露によって、甲状腺ホルモンによって支配されている変態が遅れる事がわかった。さらに甲状腺を詳しく調べると、甲状腺の成長が抑制されている事もわかった。このことから、内分泌系にも影響を与える事が明らかに
なった。	
 
	
 
［２］両生類の生活環に対する強磁場の影響	
 The	
 effect	
 of	
 strong	 static	
 magnetic	
 field	 (SMF)	
 on	
 the	
 life	
 cycle	 of	 amphibians	 	 	  現在、携帯電話や高圧送電線、家電製品などから磁場にさらされる機会が多くなってきた。それにもかかわらず、脊椎動物の発生および遺伝子発現に対する強磁場の影響に関する研究は少ない。両生類を用いて、その生活環に対する影響を調べる。	
 
	
 

118

目的と成果	 	  カエル胚は、体外受精を行うので胚の観察が容易で、発生も早いことから、磁場の影響を調べるには有用と考えられる。アフリカツメガエルやニシツメガ
エルを用いて、卵減数分裂から変態までの磁場の影響を調べた。その結果、卵成熟過程において卵の色素の分布に影響を与える事や、初期発生にさまざまな影響を与える事が明らかになった。また、オタマジャクシを強磁場に曝露すると、行動に異常が生じる事もわかった。また、甲状腺の成長も促進されていた。
この事は、磁場が、内分泌系に影響を与える事を示唆する。	
 	 ［３］TALEN によるアフリカツメガエルの F0 における遺伝子破壊	 Targeted	 mutagenesis	
 of	
 genes	 by	
 TALEN	 in	
 Xenopus	 embryos	 	 	  ノックアウトによる特定の遺伝子破壊は、その遺伝子の機能を探る上で非常に有効な手段である。この技術は、マウスでは ES 細胞を用いて確立されてポピュラーにつかわれるようになっているが、それ以外の動物では ES 細胞が確立されていない事で不可能である。しかしながら、最近、ZNF	
 (Zinc	 finger	 nuclease),	
 さらに TALEN(Transcription	
 activator-like	
 feector	 nuclease)を使用すると、特定の配列に突然変異が入れられる事がわかり、コオロギやラットなどで応用されて来た。この技術をカエルで確立する事は、カエルの実験動物として有用性を飛躍的に高める。	
 	
 目的と成果	 	  昨年、カエルで ZNF が応用可能かどうか実験を行い、良い結果をえていたが、ZNF は作成が複雑である。その点、TALEN は（難しいとはいえ）ZNF よりは操作が容易である。また、破壊の効率が高く、次世代を待たずに、目標となる遺伝子を破壊し F0 でその効果を見れる可能性が出て来た。今回、いろいろ TALENを改良して、Xenopus を使って、F0 で有効かどうかを調べた。使った遺伝子は、
既に遺伝子の機能が報告されている tyrosinase と pax6 を用いた。祖の結果、
TALEN を使ってそれぞれの遺伝子を破壊した結果、高効率で今まで報告されている表現形が観察され、TALEN が F0 でも有効である事が示された。	
 
	
 
研究内容	
 
［	
 ４	
 ］卵成熟および初期発生におけるサイクリン B2 の２極紡錘体形成にお
ける機能	
 
The	
 role	 of	
 the	
 cyclin	
 B2	
 in	
 the	
 bipolar	 spindle	 formation	
 during	 oocyte	 maturation	
 and	
 early	 embryogenesis	 	 	  MPF はサイクリン B と Cdc2 の複合体であり、M 期を引き起こす普遍的な因子である。MPF が活性化すると核膜崩壊、染色体凝縮、紡錘体の形成が起こり、M期が開始する。サイクリン B は MPF の調節サブユニットであり、多くの種でサブタイプが複数存在し、また、それぞれのサブタイプの細胞内局在も違っている。しかしながらその機能に違いがあるかどうか報告はほとんどない。この研究ではサイクリン B1 と B2 の機能の違いについて研究している。	
 

119

	
 
［目的と成果］	
 	  ツメガエルの卵母細胞や胚ではサイクリン B1 とサイクリン B2 が主に発現しており、機能差を解析する良い系である。今までに、この系を用いて、サイクリン B１でなくサイクリン B２が正常な紡錘体の形成に関与することを明らかにした。この系を用いてサイクリン B のサブタイプの機能を解析する事を目標
として研究を行っている。その結果、サイクリン B２が何処に局在するか、また、どういうモータータンパク質と共同して２極の紡錘体を形成しているかが明らかになっている。	
 
	
 
［	
  ５	
 ］Nramp ファミリーの新規バナジウム／プロトン共役輸送体	
 A	
 novel	 vanadium/proton	 antiporter	 of	 a	
 Nramp	 family	 	 	  海産動物のホヤは体内に高濃度のバナジウムをもっている。これは、海中のバナジウムから濃縮されたもので、ホヤはバナジウムを高濃度に濃縮する機構を持っている。その機構を研究している。	
 	
 目的と成果	
 Nramp/DCT ファミリーは、二価金属イオンの輸送に関わる膜輸送体である。我々はバナジウムを高度に濃縮する海産動物ホヤ類の血球から Nramp ファミリーの新規膜輸送体遺伝子を同定した。この遺伝子 AsNramp はヒトの Nramp1 および 2と、アミノ酸レベルで約 60%の相同性があった。アフリカツメガエルの卵母細胞による発現系を用いて金属輸送活性を検証したところ、プロトンとの共役輸送によって四価バナジウムを取り込む共役輸送体であることがわかった。さらに、四価バナジウムの輸送は Na による阻害を受けること、AsNramp は血球の液胞膜画分に局在することも明らかになった。	
 
	
 
	
 
［	
 ６	
 ］mTOR 情報伝達系の解析	
 Analysis	
 of	
 the	
 mTOR	 signal	
 transduction	 	 	  炎症は、生体の損傷に対する組織の反応であり、その反応の一部には mTOR	 (mammalian	 target	 of	
 rapamycin の略。ほ乳類などの動物の細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質キナーゼ。最初に rapamycin の標的タンパク質として見つかったのでこの名前がついた)情報伝達系が関与している。この情報伝達系の研究を進めている。	
 	
 ［目的と成果］	
 	  炎症に関与する mTOR 情報伝達系に関与するタンパク質や、その相互作用を調べる事でこの情報伝達系の全貌を解明しようとしている。その結果、mTOR
伝達系に Ego1,	
 Ego3 と Gtr1,Gtr2 のタンパク質が関与していることがわかっ
た。	
 
	
 

120

［	
 ７	
 ］サイトグロビンやアンドログロビンの初期胚における機能解析	
 Functional	
 analysis	
 of	
 the	
 cytoglobin	
 and	
 andoroglobin	
 in	
 Xenopus	 embryos	 	 	  サイトグロビンはミオグロビンやヘモグロビンの仲間で、グロビンタンパク質の一種であり、酸素の運搬に関わっているタンパク質であるが初期胚における機能はわかっていない。また、アンドログロビンは最近のゲノム解析の結果から見つかってきたタンパク質で、最近、オスの精巣で特異的に発現している事が分って来たが、その機能は不明である。	
 	
 ［目的と成果］	
 	  サイトグロビンの初期発生における機能を調べるため、この遺伝子を過剰発現させて、どのような表現系がでるか調べる。また、アンドログロビンの発生における機能をアフリカツメガエルやニシツメガエルを用いて調べる。	
 
	
 
	
 
研究業績	
 
①	
 原著論文	
 1.	
 Suzuki,	
 K.,	
 Isoyama,	
 Y.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Sakuma,	
 T.,	
 Ochiai,	
 H,	
 Sakamoto,	
 N.,	
 Furuno,	
 N.,	
 Kashiwagi,	
 A.	
 and	
 Yamamoto,	
 T.	
 High	
 efficiency	
 TALENS	 enable	 F0	
 functional	
 analysis	
 by	
 targeted	 gene	
 disruption	
 in	
 Xenopus	 laevis.	
 Biologiy	
 Open	 (2013)2:	
 448-452	
 	
 2.	
 Sekiguchi,	
 T.,	
 Kamada,	
 Y.,	
 Furuno,	
 N.,	
 Funakoshi,	
 M.	
 and	
 Kobayashi,	 H.	
  Probing	  the	
  amino	  acid	  residues	  required	  for	
  Gtr1p-Gtr2p	
  complex	 formation	
 and	
 its	
 interactions	 with	 the	
 Ego1p-Ego3p	
 complex	
 and	
 TORC1	 components	
 in	
 yeast.	
 Gene	 to	
 Cell	 (2014)	
 in	
 press	 	 ②	
 総説・著書	 サイクリン B2 の細胞内局在と紡錘体形成	  吉留賢、古野伸明	
  生体の科学	 (2013),	
 64,	
 360-365	 	
 ③学会発表	
 
国内発表	
 
1.	
 柏木昭彦，鈴木	  厚，古野伸明，柏木啓子，花田秀樹，田澤一朗，倉林	  敦，
中島圭介，竹林公子，小林里美，竹中純子，住田正幸「新しい実験動物としてのネッタイツメガエル」第 60 回日本実験動物学会（2013 年 5 月、つくば国際会議場、つくば市）	
 
	
 
2.	
 Yoshitame,	
 S.,	
 Furuno,	
 N.,	
 Prigent,	
 C.	
 and	
 Hashimoto,	
 E.	
 “The	
 subcellular	
 localization	
 of	
 cyclin	 B2	
 is	
 required	
 for	
 bipolar	 spindle	 formation	
 during	
 Xenopus	
 oocyte	 maturation”	
 The	
 46th	
 annual	 meeting	
 of	
 the	
 
JSDB	
 (2013,)	
 May	
 27-31,	 Matue,	 Japan.	
 
	
 

121

3.	
 柏木昭彦，柏木啓子，花田秀樹，田澤一朗，小林里美，竹中純子，鈴木	  厚，竹林公子，古野伸明，倉林	  敦，中島圭介，住田正幸「ツメガエルを知っていますか？」第 84 回日本動物学会	
  動物学ひろば（2013 年 9 月、玉野市立玉野
海洋博物館、玉野市）	
 
	
 
4.	
 柏木啓子、藤原好恒、古野伸明「重力と磁場によるニシツメガルの甲状腺への影響」第 84 回日本動物学会	
  2013 年９月	
  岡山	
 
	
 
5.	
 柏木啓子、鈴木賢一、佐能正剛、花田秀樹、山本卓、新海正、古野伸明、
太田茂、柏木昭彦	
 「両生類を用いた甲状腺ホルモン撹乱化学物質の評価」第
84 回日本動物学会	
 2013 年９月	
 岡山	
 
	
 
6.	
 古野伸明、関口猛「ネッタイツメガエルの wee1A,	
 mos のプロモーター領域のクローニングとその遺伝子構造」日本ツメガエル研究集会	
  2013 年９月２４
日、山口	
 
	
 
7.	
 柏木昭彦，柏木啓子，花田秀樹，鈴木賢一，鈴木	
  厚，竹林公子，倉林	  敦，
中島圭介，田澤一朗，井川	  武，小林里美，竹中純子，玉城ゆうな	
 ，古野伸明，
山本	
  卓，住田	 正幸	
 「ネッタイツメガエルの近交化・標準系統の樹立・提供」	
 第 36 回日本分子生物学会	
 (2013 年 12 月、神戸国際展示場	
  神戸市)	
 
	
 
国際学会	
 
1.	
 Kashiwagi	
 A.,	
 Kashiwagi	
 K.,	
 Hanada	 H.,	
 Suzuki	
 K.,	
 Suzuki	
 A.,	
 Takebayashi	
 
K.,	
 	
 Nakajima	
 K.,	
 Furuno	 N.,	
 Tazawa	
 I.,	
 Kurabayashi	
 A.,	
 Yamamoto	
 T.	
 and	
 	
 
Sumida	 M.	
 “National	
 BioResource	 Project	
 (NBRP)	
 Xenopus	 tropicalis	
 Mass	
 Production	
 of	
 High	 Quality	
 Standard	
 Inbred	
 Strains”	
 The	
 5th	
 ANRRC	 International	
 Meeting	 (October	
 30-November	 1,	
 2013	
 in	
 Shonan	
 Village	 Center,	 Hayama,	 Japan)	
 	
 2.	
 Kashiwagi	
 A.,	
 Kashiwagi	
 K.,	
 Hanada	 H.,	
 Suzuki	
 A.,	
 Takebayashi	
 K.,	
 Kurabayashi	
 A.,	
 Suzuki	
 K.,	
 Furuno	 N.,	
 Tazawa	
 I.,	
 Nakajima	
 K.,	
 Yamamoto	
 
T.	
 and	
 Sumida	 M.	
 “National	
 BioResource	 Project	
 (NBRP)	
 Xenopus	 (Silurana)	
 tropicalis:	
 Standard	
 High	 Quality	
 Inbred	
 Strain	
 for	
 Biological	
 Researc”	
 International	  Symposium	  	  Frontiers	  in	  Amphibian	  Biology:	  Endangered	 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing	 (March	 27-28,	 2014	 Institute	
 for	
 Amphibian	  Biology,	  Graduate	  School	  of	  Science,	  Hiroshima	  University,	 Higashihiroshima,	
 Japan)	
 	
 3.	
 Kurabayashi,	
 A.,	
 Furuno,	
 N.,	
 Sumida,	
 M.,	
 Mizuho,	
 H.,	
 Ohshima,	
 K.	
 and	
 
Vences,	
 M.	
 “Discovery	 and	
 phylogenetic	
 distribution	
 of	
 a	
 short	 interspred	 nuclear	 element	
 (SINE)	
 subgroup	
 in	
 neobatrachian	 frogs.	
 International	
 Symposium	
 Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology:	
 Endangered	
 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing”	
 (March	 27-28,	 2014	 Institute	 for	
 Amphibian	
 Biology,	 122

Graduate	  School	  of	  Science,	  Hiroshima	  University,	  Higashihiroshima,	 Japan)	
 	
 4.	
 Yoshitome,	
 S.,	
 Prigent,	
 C.,	
 Hashimoto,	
 E.	
 and	
 Furuno,	
 N.	
 “Bipolar	 Spindle	 formation	
 during	 meiosis	 I	 required	
 the	
 proper	
 localization	
 of	
 cyclin	  B2	
  in	  Xenopus	
  oocytes”	  International	  Symposium	  Frontiers	  in	
 Amphibian	
 Biology:	
 Endangered	
 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing.	
 (March	 27-28,	 2014	 Institute	 for	
 Amphibian	
 Biology,	
 Graduate	
 School	 of	
 Science,	
 Hiroshima	
 University,	
 Higashihiroshima,	
 Japan)	
 	
 5.	
  Suzuki,	  A.,	
  Kashiwagi,	  A.,	
  Kashiwagi,	
  K.,	
  Hanada,	  H.,	
 Takebayashi-Suzuki,	  K.,	
  Tazawa,	  I.,	
  Furuno,	
  N.,	
  Kurabayashi,	  A.,	
 Kobayashi,	
 S.,	
 Takenaka,	
 J.,	
 Tamaki,	
 Y.,	
 Igawa,	
 T.,	
 Uto,	 T.,	 Nanba,	
 C,	
 Watanabe,	  A.,	
  Yoshida,	
  H.,	
  Shimada,	
  A.	
  and	
  Sumida,	
  M.	
 “International	 Xenopus	  Resource	  Network	  and	
  Educational	  Activities	  at	
  Institute	  for	
 Amphibian	  Biology”	
  International	  Symposium	  Frontiers	  in	  Amphibian	 Biology:	
 Endangered	
 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing.	
 (March	 27-28,	 2014	
  Institute	  for	
  Amphibian	  Biology,	  Graduate	  School	  of	  Science,	 Hiroshima	
 University,	
 Higashihiroshima,	
 Japan)	
 	
 ④科研費等の受け入れ状況	 	  該当なし	 123

プロジェクト研究③	 	 [1]アセチル−L−カルニチンは甲状腺ホルモン誘導および変態期のオタマジャ
クシ尾部短縮を抑制する	
 
Acetyl-L-carnitine	
 suppresses	
 thyroid	
 hormone-induced	
 and	
 spontaneous	 tadpole	 tail	 shortening	 	 	  花田秀樹（広島大学）、柏木昭彦（広島大学）、柏木啓子（広島大学）、内海俊彦（山口大学）、井上正康（宮城大学）、佐々木順三（岡山大学）、勝	  賢二郎（熊本大学）、佐藤英介（鈴鹿医療科学大学）、内海耕慥（高知大学）	
 	 	  無尾両生類の変態時に見られるオタマジャクシの尾部消失にミトコンドリ
ア膜透過遷移(MPT)が重要な役割を果たしている。L－カルニチンがβ酸化およびエネルギー生成のために遊離脂肪酸(FFAs)をサイトゾルからミトコンドリ
アマトリックスに移動させることはよく知られている。以前に私達が行った研究から、L－カルニチン処理は FFAs レベルを減少させ、T3 および FFA によって誘導された MPT を抑制することがわかった。昨年度の研究では、L－カルニチ
ンと同じく脂肪酸酸化に関与するアセチル－L－カルニチン(ALC)に焦点を当てて、ツチガエルオタマジャクシの T3 誘導による尾部短縮、およびアフリカツ
メガエルオタマジャクシの自然状態での尾部短縮の影響を調べた。	
 	
  T3 処理されたオタマジャクシの尾部アポトーシスの指標である DNA ラダー像の形成およびカスパーゼ－３、カスパーゼ－９活性の増加が ALC を添加することによって抑えられることがわかった。また、ALC はアフリカツメガエルオタ
マジャクシの内在性甲状腺ホルモンによって制御される自然変態を抑制し、同時にカスパーゼやフォスフォリパーゼ A2 活性、DNA ラダー像の形成を減少させることも明らかになった。	
 	
  以上の結果は、FFAs 活性の増加が MPT 開始を促し、無尾両生類の変態時におけるオタマジャクシ尾部のアポトーシスによる細胞死を制御するシグナル伝
達を活性化するという、私達がこれまでに得てきた結論を支持するものである。	
 	
  今後も引き続いて、両生類の変態におけるオタマジャクシ尾部アポトーシスの分子機構を調べていく予定である。	
 	 [2]無尾両生類の生活環に対する過重力および強磁場の影響	
 Effects	
 of	 hypergravity	
 environments	
 and	
 strong	 static	
 magnetic	
 fields	 on	
 amphibian	 life	
 cycle	 	 	
  花田秀樹（広島大）、柏木昭彦（広島大、三陽女子短期大）、古野伸明（広島大）、柏木啓子（広島大）、山下雅道（宇宙研）、谷本能文（大阪大谷大）、藤原
好恒（広島大）、	 	 	  地球温暖化、化学物質による汚染、一日当り３桁に及ぶ生物の絶滅、人口爆
発，食料不足など、将来への不安要因は増大している。そんな中でヒトを含めた生物種の他惑星への移住は重要な選択肢の一つとして取り上げられている。	
 

124

	
  私は、「宇宙環境利用化学委員会研究チーム」の一員として研究活動に参加している。我々は、地球とは異なる、宇宙空間における重力および磁場の生物種に与える悪影響を想定しながら、アフリカツメガエルの生物環について調べてきた。これまでに得られた研究結果から、過重力・強磁場の両生類に対する影響は著しく、特に発生のごく初期は感受性の非常に高いポイントで、この時期に印加された受精卵から発生した胚では、発生率は大きく後退、いろいろな奇形が出現し、そのような異常個体の遺伝子発現は抑えられていること、などが明らかになった。今後も、多くの情報を発信していきたいと考えている。	
 
	
 
研究業績	
 
①	
 原著論文	 1.	
 Hanada,	
 H.,	
 Kobuchi,	
 H.,	
 Yamamoto,	
 M.,	
 Kashiwagi,	
 K.,	
 Katsu,	
 K.,	
 Utsumi,	 T.,	
  Kasahiwagi,	  A.,	
  Sasaki,	  J.,	
  Inoue,	  M.,	
  Utsumi,	
  K.	
  2013.	
 Acetyl-L-carnitine	
 suppresses	
 thyroid	
 hormone-induced	
 and	
 spontaneous	 anuran	 tadpole	 tail	 shortening.	
 Hereditas,	
 150,	
 1-9.	 	
 ②総説･著書	 Hanada,	  H.	
  2013.	
  Herbicide	  paraquat	  genotoxicity-enhancement	
  by	
  the	
 phenolic	
 antioxidants	
 dl-α-tocopherol	
 and	
 2,6-di-tert-butyl-p-cresol:	
 In	
 Kobayashi	
 D,	
 Watanabe	
 E	
 (Eds),	
 Handbook	 on	 Herbicides:	
 Biological	
 Activity,	 Classification	  and	
  Health	
  &	  Environmental	
  Implications.	
  Nova	  Science	 Publishers,Inc,	
 New	
 York,	
 pp.191-211.	
 	
 ③学会発表	
 
国内発表	
 
1.	
 花田秀樹、小渕	
 浩嗣、柏木啓子、内海俊彦、井上正康、佐々木順三、勝賢
二郎、佐藤英介、内海耕慥、柏木昭彦。アセチル-L-カルニチンによる無尾両生類幼生尾部短縮の抑制。日本動物学会	
  第８４回大会	
  2013 年	
  9 月	
  26日	
  岡山大学、岡山。	
 
	
  	
 
2.	
 柏木昭彦，鈴木	  厚，古野伸明，柏木啓子，花田秀樹，田澤一朗，倉林	  敦，
中島圭介，竹林公子，小林里美，竹中純子，住田正幸	
 「新しい実験動物としてのネッタイツメガエル」第 60 回日本実験動物学会（2013 年 5 月、つくば国際会議場、つくば市）	
 3. 柏木昭彦，柏木啓子，花田秀樹，田澤一朗，小林里美，竹中純子，鈴木	  厚，竹林公子，古野伸明，倉林	  敦，中島圭介，住田正幸 「ツメガエルを知っていますか？」第 84 回日本動物学会	
  動物学ひろば（2013 年 9 月、玉野市立玉野海洋博物館、玉野市）
4.	
 柏木昭彦，柏木啓子，花田秀樹，鈴木賢一，鈴木	
  厚，竹林公子，倉林	  敦，
中島圭介，田澤一朗，井川	  武，小林里美，竹中純子，玉城ゆうな	
 ，古野伸明，
山本	
  卓，住田	 正幸	
 「ネッタイツメガエルの近交化・標準系統の樹立・提供」
第 36 回日本分子生物学会	
 	 (2013 年 12 月、神戸国際展示場	
  神戸市)	
 	
 125

国際学会	 1.	
 Kashiwagi	
 A.,	
 Kashiwagi	
 K.,	
 Hanada	 H.,	
 Suzuki	
 K.,	
 Suzuki	
 A.,	
 Takebayashi	
 
K.,	
 	
 Nakajima	
 K.,	
 Furuno	 N.,	
 Tazawa	
 I.,	
 Kurabayashi	
 A.,	
 Yamamoto	
 T.	
 and	
 	
 
Sumida	 M.	
 “National	
 BioResource	 Project	
 (NBRP)	
 Xenopus	 tropicalis	
 Mass	
 Production	
 of	
 High	 Quality	
 Standard	
 Inbred	
 Strains”	
 The	
 5th	
 ANRRC	 International	
 Meeting	 	 (October	
 30-November	 1,	
 2013	
 in	
 Shonan	
 Village	 Center,	 Hayama,	 Japan)	
 	
 2.	
 Kashiwagi	
 A.,	
 Kashiwagi	
 K.,	
 Hanada	 H.,	
 Suzuki	
 A.,	
 Takebayashi	
 K.,	
 Kurabayashi	
 A.,	
 Suzuki	
 K.,	
 Furuno	 N.,	
 Tazawa	
 I.,	
 Nakajima	
 K.,	
 Yamamoto	
 
T.	
 and	
 Sumida	 M.	
 “National	
 BioResource	 Project(NBRP)Xenopus	
 (Silurana)	
 tropicalis:	
 Standard	
 High	 Quality	
 Inbred	
 Strain	
 for	
 Biological	
 Research”	
 International	  Symposium	  	  Frontiers	  in	  Amphibian	  Biology:	  Endangered	 Species	 Conservation	
 and	
 Genome	 Editing	 (March	 27-28,	 2014	 Institute	
 for	
 Amphibian	  Biology,	  Graduate	  School	  of	  Science,	  Hiroshima	  University,	 Higashihiroshima,	
 Japan)	
 	
 ④科研費等の受け入れ状況	
 
該当なし	
 

126

プロジェクト研究④ 	 	
 先駆的両生類研究の展開	  −両生類絶滅危惧種の遺伝的多様性の解明と保全、および新規有用アプリケーションの開発-	
 
	
 
1)	
 
住田正幸,	 1)	 倉林敦，1)	
 井川武，1)	
 Islam	
 M.	
 Mafizul,	 1)	
 Alam	 M.	
 Shafiqul,	
 
2)	
 
倉本満,	
 3)	
 大海昌平,	
 4)	
 勝連盛輝,	
 5)	
 海野徹也,	
 6)	
 浮穴和義,	
 7)	
 藤井保,	
 8)	
 井
鷺裕司	
 
1）
広島大学大学院理学研究科附属両生類研究施設	
 2）
宗像市ひかりが丘 3-6-15	
 3）
奄美市農林課	 4）
沖縄県環境衛生研究所	
 5）
広島大学大学院生物圏科学研究科	
 6）
広島大学大学院総合科学研究科	
 7）
広島県立大学人間文化学部	
 8）
京都大学大学院農学研究科	
 
	
 
研究内容	
 
[	
 １	
 ]	
 絶滅危惧種アマミイシカワガエルの飼育下における温度条件と遺伝的要因が個体生存率に与える影響（継続）	
 	
 Influence	
 of	
 temperature	
 condition	
 and	
 genetic	
 factors	
 on	
 survival	
 rates	 of	
 captive	 breeding	
 populations	 of	
 Odorrana	
 splendida	
 
	
 
[目的]	
 
	
  西南諸島は両生類に限らず動植物全般における生物多様性のホットスポッ
トであると同時に、島嶼という限定的な生息域によって絶滅の危険性も高い。
実際、日本の両生類相における絶滅危惧種（環境省レッドリスト・IA、IB、および IIB 類）の半数は西南諸島固有種である。特に、日本産両生類における最美麗種といわれることも多い、イシカワガエルについては、最近、奄美大島集団が O.	
 splendida（アマミイシカワガエル）として新種記載された	
 (Kuramoto	
 et	
 al.,	 2011)。また、これらの種については、すでに人工交配と継代飼育に成功しており(Sumida	
 et	
 al.,	
 211)、島内における遺伝的多様性についても、
マイクロサテライト遺伝子座を利用して、遺伝的多様性と微細集団構造が解明されている(Igawa	
 et	
 al.,	 2013)。	
 	
  遺伝的多様性と表現型との相関関係は、生物の保全を考える上で非常に重要であり、これらの正の相関は様々な分類群で報告されている。特に絶滅危惧種
においては、個体数の減少と合わせて絶滅への負の連鎖を引き起こすことが知られている。本研究では、飼育条件及び遺伝的要因が与える影響を検証すると
ともに、各世代の遺伝的指標の変化を予測し、遺伝的多様性を維持した効率的な継代飼育の方策を検討することを目的として、（1）定量的な条件下での個体生存率の調査、（2）シミュレーターによる継代後の遺伝的多様性変化の検証を127行った。	 	
 [材料・方法]	
 (1)については、一腹卵を 3 分割し、血縁度の異なる 3 個体のオスの精子と受精させ、それぞれ 18℃、20℃、22℃の温度条件で飼育し、変態段階まで正常生存率を観察した。
（2）については、各世代の作出に任意のペアを用いるランダ
ムモデル、アリル共有率が最も低いペアを用いる Minimal	
 Kinship	 （MK）モデ
ルを C 言語により実装し、シミュレーションを行った。各世代の親数は 2～16個体とし、10 世代まで試行した。	
 	
 [結果・考察]	
 	
 (1)については、温度条件における生存率は 18℃が最も高く、20℃では劣り、22℃では、孵化段階でほぼ全個体が死亡した。遺伝的影響については、18℃では近親交配となる交配が最も生存率が低く、マイクロサテライト遺伝子座における子孫の予測ヘテロ接合度との間に正の相関がみられた。（2）については、親数が一定数以下の場合、MK 交配を行うことにより、ヘテロ接合度の減少が軽減されることが分かった。以上の結果から、本種の正常発生には温度条件が大きく影響し、近親交配一世代目においても近交弱勢の影響が示唆された。また、遺伝的影響の指標には、子孫の予測ヘテロ接合度が有効であり、本種の継代維
持には MK 交配法が望ましいと考えられた。	
 
	
 
[	
 ２	
 ]	
 絶滅危惧種オットンガエルとホルストガエルの人工繁殖の試みと繁殖隔離機構の解明（継続）	
 Artificial	
 breeding	
 and	
 postmating	 isolation	
 in	
 endangered	 frog	
 species	 Babina	 subaspera	
 and	
 B.	
 holsti	
 from	 Southwestern	
 Islands	
 
	
 
[目的]	
 
	
  オットンガエル（Babina	
 subaspera）とホルストガエル（Babina	
 holsti）
は、前足に５本の指を持つという無尾両生類としては特異な形態を持つことで広く知られている。両種は、それぞれ奄美大島（加計呂麻島含む）と沖縄島（渡嘉敷島含む）固有のカエルである。生息面積が少ないことに加え、昨今の環境破壊による個体数減少から、IUCN レッドリストにおいて、絶滅危惧種 B1 類にリストされ、さらに、鹿児島県および沖縄県の天然記念物に指定されている。
これらの種を絶滅から防ぐ一つの方法として、飼育下繁殖を目指した研究を継続している。また、同胞種としての交配後隔離機構についての研究も継続して
いる。	
 
	
 
[材料・方法]	
 以前に交配を行った、オットンガエル 6 個体（雌親 3、雄親 3）、ホルストガエ
ル 4 個体（雌親 2、雄親 2）の人工交配によって生じた子孫（コントロールと正逆雑種）については、繁殖能力を調べるため、成熟期まで飼育を継続してい

128

る。	
 
	
 
[結果・考察]	
 	  オットンガエルとホルストガエルのペアから得た 3 年齢の子孫（コントロー
ルと正逆雑種）（およそ 320 個体と 110 個体）を飼育中である。コントロール
も正逆雑種も正常に発育しており、生存率は、いずれも変態数のうちおよそ20％で、雑種致死による隔離はみられなかった。なお、ヤエヤマハラブチガエ
ル（雄）との交雑では、どちらの種も卵も卵割は見られるものの、孵化まではいたらず、ヤエヤマハラブチガエルとオットン・ホルストガエル（狭義の Babina
属）の間には、完全な交配後隔離が発達していることが示されている。	
 	 	 [将来の展望]	
 	
  現在飼育中の人工交配子孫の飼育を継続し、性成熟を待って飼育下 2 世代目を得ることにより、絶滅危惧種であるオットンガエルとホルストガエルの飼育法と繁殖法を確立させる予定である。また、両種の正逆雑種については、成熟
させて、繁殖能力や精子形成について調べて、雑種不妊による隔離があるかど
うかを明らかにする予定である。これによって、両種の間の交配後の繁殖隔離機構を解明できる。	
 
	
 
	
 
[	
 ３	
 ]	
 絶滅危惧種イボイモリにおける飼育下繁殖と繁殖行動および行動の季
節変化の観察（継続）	
 Captive	 breeding,	
 reproductive	
 behaviors	
 and	
 seasonal	
 behavioral	
 changes	
 of	
 crocodile	 newt,	
 Echinotriton	
 andersoni	
 
	
 
[目的]	
 
	
  生物種の保全において、最も優先すべきは野外集団の保護、およびその周辺環境の維持である。しかしながら、多くの絶滅危惧種においては種生態学的知見が不足しており、具体的にどの時期に、どのような環境を利用しているのか
不明確な場合が多い。特に、イボイモリは側溝などの人工構造物などによって行動範囲が制限されるなど、移動能力に乏しいと考えられ、生息域における環
境利用の実態の解明が求められている。したがって、本研究では、集団の飼育
下繁殖を試みるとともに、存続に最も重要な繁殖行動、特に有尾両生類に特徴的な求愛・産卵行動および、行動の季節変化を観察することを目的として研究を行った。	 	
 [材料・方法]	
 ①	
 イボイモリにおける飼育下繁殖	 	
  昨年に続き、徳之島・三京産の野外個体について、繁殖装置での飼育下繁殖の試みを継続した。	
 ②求愛行動と行動の季節変化の観察	
 

129

	
  徳之島・三京産 9 個体を飼育しているケージに、赤外線ネットワークカメラ
および、赤外線 LED ライトを設置し、継続して録画を行った。求愛行動については、可能性の高い時間帯と時期を考慮し、5 分ごとに区切られた 55000 個のビデオ映像を目視により精査し、観察した。また、行動の季節変化については、
毎日の 2 時、8 時、14 時、20 時の 5 分間の映像を確認し、飼育ケージ内のシェルターから出てきた個体数をカウントした。	
 	
 [結果・考察]	
 ①今年度も昨年に続いて、徳之島のもので、飼育下繁殖に成功した。変態率は83％、2 ヶ月幼体で 61％であった。環流式の幼生飼育システムを確立して、共食いをさけて安定して幼生を飼育することが可能になった。	
 ②求愛行動については、近縁種であるチンハイイボイモリで観察された行動パ
ターン(Sparreboom	
 et	
 al.,	 2001)とよく似た行動を観察できた。具体的な行
動は、まず、オスがメスに接近して体側面にアプローチし、メスが逃げるのをオスが追いかけることから始まる。その後、オスが再度メスに接触し、今度は雌雄が同円周状に回転するというパターンであった。一周が 5 分から 10 分と非常にゆっくりとしたペースであり、この回転の途中でオスが総排出腔付近を震わせる姿が確認できた。また、雌雄が回転している場所はケージ内の水辺に近い湿度のある地面でのみ行われていた。また、行動が活発化していた時期も、
2 月下旬から 3 月上旬、5 月上旬と 7 月上旬で、シェルターから出ている個体が増えており、求愛行動が観察された時期と一致していた。	
 	
  産卵行動については、メスが障害物の下に潜り込み、円周状に動きながら卵を産み落とす行動が観察できた。イボイモリの卵は、野外において落ち葉の下に見つかること、卵は塊状にまとまって確認されることが知られており(又吉ら	
 1978)、観察された行動は野外においても同様の行動パターンであると考え
られる。	
 
	
  本研究によりイボイモリの繁殖行動が初めて明らかになった。特に、イボイ
モリの繁殖行動には地表面の湿度および、適当な遮蔽物が必要であることが示唆された。したがって、イボイモリは普段は比較的乾燥した場所に生息するが、繁殖行動を行う上では、生息地周辺に適度な大きさの水辺が必要であり、生息域の景観の維持が個体群の存続に重要であると考えられた。	
 
	
 
[	
 ４	
 ]	
 絶滅危惧種アマミハナサキガエルの飼育下繁殖の試み（継続）	
 Artificial	
 breeding	
 for	
 endangered	 frog	
 species	
 Odorrana	 amamiensis	
 from	
 Amami	 Island	
 
	
 
[目的]	
 
	
  アマミハナサキガエル(Odorrana	 amamiensis)は、奄美大島と徳之島に固有のカエルである。生息面積が少ないことに加え、昨今の環境破壊による個体数減少から、IUCN レッドリストにおいて、絶滅危惧種 B1 類にリストされ、さらに、鹿児島県の天然記念物に指定されている。この種を絶滅から防ぐ一つの方法として、人工受精法による飼育下繁殖の確立を目指している。	
 

130

	
 
[材料・方法]	
 	  奄美大島産アマミハナサキガエル 4 個体（雄親 2、雌親 2）を用いて、人工受精法により、人工交配を行い、その後の生活力を調べた。	
 	
 [結果・考察]	
 	  アマミハナサキガエルの 2 ペアから得た子孫（およそ 70 個体）を飼育中である。生存率は、およそ 25％であった。	
 	 	 [将来の展望]	
 	
  現在飼育中の人工交配子孫の飼育を継続し、性成熟を待って飼育下 2 世代目を得ることにより、絶滅危惧種であるアマミハナサキガエルの飼育法と繁殖法を確立させる予定である。	
 
	
 
[	
 ５	
 ]バングラデシュ産トラフガエル類における遺伝的多様性と繁殖隔離機
構	
 
（継続）	
 
Genetic	 diversity	
 and	
 postmating	 isolation	
 of	
 the	
 Indian	 bullfrog	 (Hoplobatrachus	
 tigerinus	
 and	
 Hoplobatrachus	 lateralis)	
 from	 Bangladesh	
 
	
 
[目的]	
 	
 
	
  バングラデシュでは乱獲等によりトラフガエル H.	
 tigerinus が野外で激減しており、本種の採集は法律で禁止されている。一方最近、バングラデシュの南東沿岸域から近縁種ハマトラフガエル H.litoralis が新種として記載された(Hasan	 et	
 al.,	 2011)。本研究では、バングラデシュ全域における本種群の遺伝的多様性を明らかにするとともに、これら 2 種間の交配後隔離機構を明らかにすることを目的に、野外から採集した個体を使って、ミトコンドリア DNA の
Cytb 遺伝子を解析するとともに、人工受精法によって交雑実験を行った。	
 	
 [材料･方法]	
 バングラデシュのトラフガエルとハマトラフガエルについて、分布の全域を網羅した 34 集団から 133 個体を採集し、これらの個体の肢指から全ゲノム
DNA を抽出精製して、Cytb 遺伝子全長の塩基配列を解析した。また、トラフ
ガエル 7 個体（雌親 3、雄親 4）とハマトラフガエル 5 個体（雌親 1、雄親 4）を用いて、人工受精法によって交雑実験を行い、雑種とそのコントロールの生活力を観察した。	
 	 [成果･考察]	
 Cytb 遺伝子の塩基配列から、バングラデシュでは、本種群は大きく 2 つのグループに分化していること、各グループについては、集団間の分化はきわめて小さいことがわかった。また、2 種間の正逆雑種はコントロールとほぼ同様に正常に発育し、変態後も正常に発育している。変態率は 65％または 20％であった。これら 2 種は配偶子隔離や雑種致死による隔離はないことがわかった。今131

後、成熟したもので、繁殖能力や精子形成などを観察することが必要である。	
 
	
 
[	
 ６	
 ]	
 絶滅危惧種における精子凍結保存法の確立（継続）	
 Establishment	  of	  the	
  sperm	  cryopreservation	  method	  in	
  the	
  endangered	 species	
 
	
 
[目的]	
 
	
  絶滅危惧種の域外保全を行う上で、精子凍結保存は有効な手法である。両生類では、ツメガエルで精子凍結保存法が一般化されており、また、陸上性ガエ
ルでも、精子凍結保存後の受精率を観察した例がある。しかし、絶滅危惧両生類において、精子凍結保存を用いた域外保全法は確立されていない。本研究では、絶滅危惧両生類において精子凍結保存と人工授精を組み合わせた簡便な域外保全法を確立することを目的とした	 	
 [材料・方法]	
 	  	  ツメガエル類で確立されている精子凍結保存法は、液体窒素を使わず、-80oCのディープフリーザーを用いる。また、高価な試薬が不要という利点があり、きわめて低コストで実施が可能である。本研究では、この方法を絶滅危
惧種のイシカワガエルと、普通種のニホンアカガエル（ただし、広島県では絶滅危惧種）に適用した。	
 	
 [成果･考察]	
 
凍結精子（27 時間から 1 ヶ月、-80oC で凍結）を解凍し、運動能を調べた結果、凍結した精子のほとんどは、運動能を喪失していた。しかし、この精子を用いて人工授精を行った結果、イシカワガエルとニホンアカガエルのどちらにおいても、正常卵割する卵が観察でき、-80℃保存精子にも受精能が残っていることが明らかになった。受精率は保存期間や卵の状態によって変動し、27 時間保存では受精率は 5.0～36.8％であり、1 週間保存では、2.3～9.0％、1 ヶ月保存では 1.7％～4.6％であった。また、イシカワガエル・ニホンアカガエルの双方で、尾芽胚期以降の発生は見られなかったが、これは凍結していない通常の精子を用いた人工授精コントロール胚でも同様であった。このため、本年度用いた卵の状態が悪く、発生が進行しなかったと考えられる。	
 
	
 
[	
 ７	
 ]絶滅危惧種イシカワガエルの皮膚に存在する抗菌ペプチドの解析（継続）	
 Minimal	 inhibitory	
 concentration	
 of	
 antimicrobial	
 peptides	
 in	
 the	
 skin	 of	
 an	
 endangered	 frog	
 Odorrana	 ishikawae	
 
	
 
[目的]	
 
日本で最も美しいといわれるイシカワガエル(Odorrana	 ishikawae)は、奄美大島と沖縄本島の固有種である。近年個体数が減少しており、環境省レッドリス
トでは絶滅危惧ⅠB 類に分類されており、沖縄県と鹿児島県では天然記念物に指定されている。一方、本種は人工繁殖に成功しており、飼育室では感染症に132

対する抵抗性を示すことが分かっている。このことから絶滅危惧に瀕している
原因の一つに、野生環境下での自然免疫システムの低下の可能性が考えられる。
水辺という微生物の攻撃を受けやすい環境にいるカエルにとって、皮膚から分泌される抗菌ペプチドは重要な生体防御因子であり、自然免疫システムの要となっている。先行研究により、イシカワガエルの皮膚から生化学的手法により10 種類の抗菌ペプチドが単離・同定されている。さらに、分子生物学的手法により 12 種類の分泌ペプチドが推定され、これらの中には既存の抗菌ペプチド
ファミリーとは全く異なる構造を持つ新奇なペプチドが含まれている。本研究では、これら 22 種類のペプチドのグラム陰性菌・グラム陽性菌・真菌に対する最小発育阻止濃度（Minimal	
 inhibitory	
 concentration	
 ;	 MIC）を測定し、有効菌種のレパートリーを示す抗菌スペクトルを評価することを目的とした。	
 	 [材料・方法]	
 最小発育阻止濃度測定は、96 穴プレートの各ウェルに培地 49 レー、接種菌液
50 種菌、ペプチド 1 ペプ（2 倍希釈系列で 7 段階の濃度）を加え 100 濃度とし、37℃で 1 晩静置培養した。培養後、マイクロプレートリーダーで吸光度の測定を行うとともに、ウェルに白濁や沈殿がないかを目視することにより、効果を判定した。評価菌種は、グラム陰性菌の大腸菌(E.	
 coli)、グラム陽性菌の黄色ブドウ球菌(S.	
 aureus)・メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)・枯草菌(B.	
 subtilis)、真菌のカンジダ菌(C.	
 albicans)の計 5 種類を用いた。	
 	
 [結果と考察]	
 全体的な傾向として、細菌の E.	
 coli や S.	
 aureus には強い抗菌活性を示すペプチドが多く確認されたが、真菌の C.	
 albicans に対する抗菌活性は弱かった。
これらのペプチドの中には MRSA に対して強い抗菌活性を示すものもあった。
また、皮膚から単離・同定されたペプチドは抗菌活性が強く、抗菌作用の有効菌種が多いことから広域の抗菌スペクトルを持つと考えられる。これに対して、遺伝子解析から推定された既存の抗菌ペプチドファミリーとは全く異なる構造を持つ新奇なペプチドには抗菌活性は認められなかったが、今回使用しなかった菌種に対し抗菌活性を持つ可能性も考えられる。以上の研究により、イシカワガエルは多種多様の抗菌ペプチドを備えており、人工繁殖された本種では抗菌ペプチドによる自然免疫システムは正常に働いていると考えられる。今後
は野生環境下のイシカワガエルや他の Odorrana 属・Rana 属のカエルの遺伝子
発現レベルや抗菌活性と水質悪化や環境ホルモンなどとの関係を解析することで、野生環境におけるイシカワガエルの絶滅危惧の要因を解明していきたいと考えている。	
 
	
 
[	
 ８	
 ]	
 光る透明ガエル「スケルピョン」の作製（継続）	
 (Production	
 of	
 illuminating	 see-through	 frogs)	
 
	
 
[目的]	
 
これまでに、2 種の色素細胞を欠き、皮膚が透けて見えるニホンアカガエル「透明ガエル」（通称・スケルピョン）の作出と継代維持に成功している。透明ガ133

エルは、実験的に生み出された内臓透視可能な唯一の四足動物であり、実験動物としてのポテンシャルは高い。一方で、アカガエルは非モデル動物であるため、透明ガエルを研究界に導入するためには、実験手法の確立・基礎データの収集・実験の成功例の明示というステップが必須である。本研究では、透明ガエルの有用実験動物化の第一ステップとして、ニホンアカガエルへの遺伝子導入方法を構築し、「光る透明ガエル」の作出を目的として研究を開始した。	
 	 [材料・方法]	
 ニホンアカガエル野生型を実験に用いた。顕微注入の前段階として、受精卵のゼリーを除去する方法を検討した。また、顕微注入の条件検討を行うために、
mCherrymRNA	
 をマーカとして用いた。さらに、ツメガエルのプロモーターがニ
ホンアカガエルでも機能するかを検討するために、アフリカツメガエルカルディアックアクチンプロモーター連結 EGFP ベクターをニホンアカガエル幼生尾部の体節に顕微注入し、EGFP の発現を蛍光顕微鏡で確認した。	
 	
 [結果と考察]	
 	  ニホンアカガエル受精卵ゼリー層の除去を、ツメガエルで行われている方法
で行った所、卵が変形し、死亡した。このため、多数の試薬条件を検討した結果、チオグリコール酸ナトリウム 5％・pH9 の条件で、卵を生かしたまま脱ゼリーが可能であることが分かった。	
 	
  アフリカツメガエルカルディアックアクチンプロモーター連結 EGFP ベクタ
ーを、ニホンアカガエル幼生尾部に顕微注入した。その後、注入部位を蛍光顕微鏡で観察した所、EGFP の発光が見られた。この結果から、アフリカツメガエ
ルカルディアックアクチンプロモーターがニホンアカガエルの筋組織でも機能することが確認された。	
 	
  ゼリー除去アカガエル受精卵に、mCherry	 mRNA	
 を顕微注入し、３日後に蛍光顕微鏡下で	 mCherry の発現を観察した。その結果、mCherry 溶液(107ng/ul)
を 20・200nl 注入した胚で、mCherry の発現が見られた。これら mCherry 発現
胚は、胞胚以降の発生が進まなかったが、ゼリーを除去せず顕微注入も行っていないコントロール胚も同じステージ以降の発生が進まなかった。このため、胚の発生停止は、ゼリー除去や顕微注入が原因ではなく、本年度に準備できた受精卵の状態が悪かった（実験開始時期が、通常の繁殖シーズンより 3 ヶ月程遅かった）と考えられた。	
 	
  本年度の研究により、卵ジェリーを取り除く溶液、インジェクション時の針の太さ、インジェクション時のガス圧、注入 DNA、I-SceI（あるいは蛍光色素
タンパク質 mRNA）の濃度と容量、インジェクション時とその後の受精卵維持水の水質と至適温度など、顕微注入実験に必要な条件を大幅に絞り込むことができた。今後は、繁殖シーズンに状態の良い受精卵を用いてあわせて、実験を行う必要がある。	
 
	
 
	
 
研究業績	
 
①原著論文	 134

1.	
 Kakehashi,	
 R.,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 S.	
 Oumi,	
 S.	
 Katsuren,	
 M.	
 Hoso	 and	
 M.	
 Sumida	 (2013)	
 Mitochondrial	 genomes	 of	
 Japanese	
 Babina	 frogs	 (Ranidae,	 Anura):	
 unique	 gene	 arrangements	
 and	
 the	
 phylogenetic	
 position	
 of	
 genus	 Babina.	
 Genes	 Genet.	
 Syst.,	
 88:	
 59-67.	
 	
 2.	
 Kakehashi,	
 R.,	
 T.	
 Igawa,	
 N.	
 Iwai,	
 E.	
 Shoda-Kagaya,	
 and	
 M.	
 Sumida	 (2013)	
 Development	
 and	
 characterization	
 of	
 new	
 microsatellite	 loci	
 in	
 the	
 Otton	 frog	
 (Babina	
 subaspera)	
 and	
 cross-amplification	
 in	
 a	
 congeneric	 species,	 Holst’s	 frog	 (B.	
 holsti).	
 Conser.	
 Genet.	
 Res.,	
 5:	
 1071-1073.	
 
	
 
3.	
 Igawa,	
 T.,	
 H.	
 Sugawara,	
 M.	
 Tado,	
 T.	
 Nishitani,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 M.	
 M.	
 
Islam,	
 S.	
 Oumi,	
 S.	
 Katsuren,	
 T.	
 Fujii	
 and	 M.	
 Sumida	 (2013)	
 An	
 attempt	
 at	
 captive	 breeding	
 of	
 an	
 endangered	 newt,	
 Echinotriton	
 andersoni,	
 from	 the	
 Central	
 Ryukyus	 in	
 Japan.	
 Animals,	
 3:	
 680-692.	
 
	
 
4.	
 Hasan,	
 M.,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 Kuramoto,	
 A.	
 Kurabayashi	
 and	
 M.	
 Sumida	 (2014)	
 Description	
 of	
 two	
 new	
 species	 of	
 Microhyla	
 (Anura:	 Microhylidae)	
 from	
 Bangladesh.	
 Zootaxa,	
 3755:	
 401-418.	
 
	
 
5.	
  Kurabayashi,	  A.	
  and	
  M.	
  Sumida	  (2013)	
  Afrobatrachian	  mitochondrial	
 genomes:	  genome	  reorganization,	  gene	  rearrangement	  mechanisms,	
  and	
 evolutionary	 trends	
 of	
 duplicated	
 and	
 rearranged	
 genes.	
 BMC	
 Genomics,	
 14:	
 
633.	
 
	
 
6.	
 Komaki,	
 S.,	
 T.	
 Igawa,	
 M.	
 Nozawa,	
 S-M.	
 Lin,	 S.	
 Oumi	 and	
 M.	
 Sumida	 (2014)	
 Development	  and	
  characterization	
  of	
  14	
  microsatellite	  markers	  for	 Buergeria	
 japonica	
 (Amphibia,	
 Anura,	 Rhacophoridae).	
 Genes	 Genet.	
 Syst.,	 89:	
 35-39.	
 
	
 
	
 
7.	
 Kurabayashi,	
 A.,	
 R.	
 Kakehashi,	
 I.	
 Tazawa,	
 Y.	
 Haramoto,	
 T.	
 Oshima,	
 Y.	
 
Ito	
 and	
 M.	
 Sumida	 (2014)	
 Improved	
 transport	
 of	
 the	
 model	 amphibian,	
 Xenopus	 tropicalis,	
 and	
 its	
 viable	 temperature	
 for	
 transport.	
 Curr.	
 Herpetol.,	
 33:75-87.	
 
	
 
8.	
 Hasan,	
 M.,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 M.	
 R.	
 Khan,	
 T.	
 Igawa,	
 M.	
 S.	
 Alam,	
 T.	
 H.	
 Djong,	
 N.	
 Kurniawan,	
 H.	
 Joshy,	
 H.	
 S.	
 Yong,	
 Daicus,	
 M.	
 B.,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 M.	
 Kuramoto	
 and	
 M.	
 Sumida	 (2014)	
 Genetic	
 divergences	
 of	
 South	 and	
 Southeast	 Asian	
 frogs:	 a	
 case	 study	 of	 several	
 taxa	 based	 on	
 16S	
 ribosomal	
 RNA	 gene	 data	
 with	 notes	 on	 the	
 generic	
 name	
 Fejervarya.	
 Turk.	
 J.	
 Zool.,	
 38:	
 in	
 
press.	
 	
 ②総説･著書･その他	
 135

住田正幸、柏木昭彦、鈴木	  厚	
 「世界でオンリーワンの両生類研究・リソースセンター」	
 BioResource	
 Now!	
 9 巻 6 号 1-2 頁	
 (2013)	
 	
 ③学会発表	
 
国際学会	
 
1.	
 Sumida,	
 M.,	
 T.	
 Igawa,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 M.	
 S.	
 Alam,	
 R.	
 Kakehashi,	
 M.	
 Tado,	
 N.	
 Shintani,	
 H.	
 Sugawara,	
 T.	
 Nishitani,	
 S.	
 Oumi,	
 S.	
 Katsuren,	
 and	
 T.	
 Fujii,	 “Captive	 breeding	 of	
 endangered	 amphibian	 species:	
 A	
 case	 study	 of	  ex	
 situ	
  conservation”	
 50th	
 Anniversary	 Meeting	
 of	
 the	
 
Australian	  Society	
  of	  Herpetologists”,	
  January	  30,	
  2014, Greenhills	
 Conference	 Centre,	 Canberra	
 Australia	
 
	
 
2.	
 Hasan,	
 M.,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 Kuramoto,	
 A.	
 Kurabayashi	
 and	
 M.	
 Sumida	 “Description	
 of	
 two	
 new	
 species	 of	
 Microhyla	
 (Anura:	 Microhylidae)	
 from	
 Bangladesh”	
  50th	  Anniversary	  Meeting	  of	  the	
  Australian	  Society	  of	
 Herpetologists”,	
 January	
 31,	
 2014, Greenhills	
 Conference	 Centre,	 Canberra	 Australia	
 
	
 
3.	
 Sumida,	
 M.,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 T.	
 Igawa,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 N.	
 Satou,	
 K.	
 Ukena,	 S.	
 Oumi,	
 S.	
 Katsuren,	
 and	
 T.	
 Fujii	 “A	
 case	 study	 of	
 fauna	 conservation	
 in	
  Japan:	  Current	  conservation	  measures	
  of	  wild	  populations,	
  captive	 breeding,	  genetic	  diversity,	  and	
  potential	  resource	  materials	  in	
  the	
 endangered	  frog	  species	  Odorrana	  ishikawae	
  and	
  O.	
  splendida”	
 International	
 Symposium	
 “Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology”,	
 28	
 March,	 2014,	
 Hiroshima	
 University,	
 Higashihiroshima	
 
	
 
4.	
 Islam,	
 M.	
 M.,	
 T.	
 Igawa,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 R.	
 Kakehashi,	
 N.	
 Satou,	 N.	
 Shintani,	
 M.	
 Tado,	
 H.	
 Sugawara,	
 T.	
 Nishitani,	
 M.	
 Uchida,	
 S.	
 Oumi,	
 S.	
 Katsuren,	
 T.	
 Fujii,	
 and	
 M.	
 Sumida	 “An	
 ex	
 situ	
 conservation	
 effort	 for	
 several	 endangered	
 and	
 near-threaten	 amphibian	 species	
 from	 the	
 Ryukyu	 Archipelago,	  Japan:	  Captive	  breeding	  of	  nine	  anuran	  species	  and	
 cryopreservation	  of	  sperm	  for	
  two	
  of	  them ” 	
  International	  Symposium	 “Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology”,	
 28	
 March,	 2014,	
 Hiroshima	
 University,	 Higashihiroshima	
 
	
 
5.	
 Hasan,	
 M.,	
 N.	
 Kurniawan,	
 A.	
 Soewondo,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 T.	
 Igawa,	
 W.	
 M.	
 M.	
 
Nalley,	
 M.	
 Matsui	
 and	
 M.	
 Sumida	 “Evolutionary	 relationships	
 and	
 postmating	 isolation	
 among Fejervarya species from Lesser	
 Sunda,	
 Indonesia and	
 other	 Asian	
  countries	
  revealed	
  by	  mtDNA	
  Cyt	
  b	
  gene	  sequences	  and	
  crossing	 experiments”	
 International	
 Symposium	
 “Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology”,	
 27-28	 March,	 2014,	
 Hiroshima	
 University,	
 Higashihiroshima	
 
	
 

136

6.	
 Alam,	
 M.	
 S.,	
 M.	
 M.	
 R.	
 Khan,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 Hasan	 and	 M.	
 Sumida	 “Artificial	
 Breeding	
 of	
 an	
 Indian	 Bullfrog	 (Hoplobatrachus	
 tigerinus):	
 A	
 Case	
 Study	 on	
 Reproduction	
 and	
 Conservation”	
 International	
 Symposium	
 “Frontiers	 in	
 Amphibian	  Biology”,	  27-28	
  March,	  2014,	  Hiroshima	  University,	 Higashihiroshima	
 
	
 
7.	
 Sumida,	
 M.,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 T.	
 Igawa,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 Y.	
 Furukawa,	
 N.	
 Sano,	
 T.	
 Fujii	 and	 N.	
 Yoshizaki	
 “Translucent	 frogs	 created	 through	 crossbreeding,	
 and	
 their	 inheritance	
 and	
 dermal	 chromatophore	
 structure”	
 International	
 Symposium	
 “Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology”,	
 27-28	
 March,	 2014,	
 Hiroshima	
 University,	
 Higashihiroshima	
 
	
 
8.	
 Kuramoto,	
 M.,	
 N.	
 Satou,	
 S.	
 Oumi,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 and	
 M.	
 Sumida	 “Inter-	
 and	
 intra-island	 divergence	
 in	
 Odorrana	 ishikawae	
 (Anura,	
 Ranidae)	
 of	
 the	
 
Ryukyu	  Archipelago	
  of	  Japan,	  with	  description	
  of	
  a	
  new	
  species”	
 International	
 Symposium	
 “Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology”,	
 27-28	
 March,	 2014,	 Hiroshima	
 University,	
 Higashihiroshima	
 
	
 

9.	
 Djong,	
 H.	
 T.,	
 M.	
 Matsui,	
 M.	
 Kuramoto,	
 M.	
 Nishioka,	
 and	
 M.	
 Sumida	
 “A	
 
new	
 species	
 of	
 the	
  Fejervarya	
 limnocharis	
 complex	
 from	 Japan	 (Anura,	 Dicroglossidae)”	
 International	
 Symposium	
 “Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology”,	
 27-28	 March,	 2014,	
 Hiroshima	
 University,	
 Higashihiroshima	
 
	
 
10.	
 Sultana,	
 N.,	
 T.	
 Igawa,	
 M.	
 Nozawa,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 M.	
 R.	
 Khan,	
 M.	
 Hasan,	 M.	
 S.	
 Alam	 and	
 M.	
 Sumida	 “Development	
 and	
 characterization	
 of	
 27	
 new	
 
microsatellite	  markers	  of	  Indian	  Bullfrog,	  Hoplobatrachus	  tigerinus	 (Daudin,	  1802)	
  and	
  its	
  congeneric	  species ” 	  International	  Symposium	 “Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology”,	
 27-28	
 March,	 2014,	
 Hiroshima	
 University,	 Higashihiroshima	
 
	
 
11.	
 Kakehashi,	
 R.,	
 T.	
 Igawa	 and	 M.	
 Sumida	 “Genetic	
 population	
 structure	
 
of	
 an	
 endangered	 frog	
 species,	
 Babina	 holsti”	
 International	
 Symposium	 “Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology”,	
 27-28	
 March,	 2014,	
 Hiroshima	
 University,	 Higashihiroshima	
 
	
 
12.	
 Komaki,	
 S.,	
 T.	
 Igawa,	
 K.	
 Tojo,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 S.-M.	
 Lin,	
 M.-S.	
 Min,	 and	
 M.	
 Sumida	 “New	
 insights	
 into	
 evolutionary	 history	 among	 Asian	 pond	
 frog	
 species”	
 International	
 Symposium	
 “Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology”,	
 27-28	 March,	 2014,	
 Hiroshima	
 University,	
 Higashihiroshima	
 
	
 
13.	
 Uno,	 Y.,	 C.	
 Nishida,	
 C.	
 Takagi,	
 T.	
 Igawa,	
 N.	
 Ueno,	
 M.	
 Sumida	
 and	
 Y.	
 
Matsuda	 “Molecular	
 cytogenetic	
 studies	
 on	
 the	
 process	 of	
 genomic	
 and	
 chromosomal	 evolution	
 in	
  Xenopus	
 laevis	  after	
 WGD	
 and	
 the	
 origin	
 and	
 

137

evolution	
 of	
 sex	
 chromosomes	
 in	
 anuran	 species”	
 International	
 Symposium	 “Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology”,	
 27-28	
 March,	 2014,	
 Hiroshima	
 University,	 Higashihiroshima	
 
	
 
14.	
 Kurabayashi,	
 A.,	
 N.	
 Furuno,	
 M.	
 Sumida,	
 H.	
 Mizuno,	
 K.	
 Ohshima,	
 and	
 M.	
 
Vences	 “Discovery	 and	
 phylogenetic	
 distribution	
 of	
 a	
 short	 interspersed	
 nuclear	 element	
 (SINE)	
 subgroup	
 in	
 neobatrachian	 frogs”	
 International	
 Symposium	
 “Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology”,	
 27-28	
 March,	 2014,	
 Hiroshima	
 University,	
 Higashihiroshima	
 
	
 
15.	
 Watanabe,	
 A.,	
 T.	
 Igawa,	
 A.	
 Kashiwagi,	
 A.	
 Suzuki,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 T.	
 Fujii,	
 and	 M.	
 Sumida	 “Inbreeding	 coefficient	
 and	
 genetic	
 relationship	 of	
  seven	  strains	  of	  Xenopus	
  tropicalis	  inferred	  from	  genome	  wide	 genotyping	
 of	
 54	
 microsatellite	 loci”	 International	
 Symposium	
 “Frontiers	 in	
  Amphibian	  Biology ” ,	  27-28	
  March,	  2014,	  Hiroshima	  University,	 Higashihiroshima	
 
	
 
16.	
 Kashiwagi,	
 A.,	
 K.	
 Kashiwagi,	
 H.	
 Hanada,	
 A.	
 Suzuki,	
 K.	
 Takebayashi,	 A.	
 Kurabayashi,	
 K.	
 Suzuki,	
 N.	
 Furuno,	
 I.	
 Tazawa,	
 K.	
 Nakajima,	
 T.	
 Yamamoto	
 
and	
 M.	
 Sumida	 “National	
 BioResource	 Project	
 (NBRP)	
 Xenopus	 (Silurana)	
 tropicalis:	
 Standard	
 High	 Quality	
 Inbred	
 Strains	
 for	
 Biological	
 Research”	
 International	
 Symposium	
 “Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology”,	
 27-28	
 March,	 2014,	 Hiroshima	
 University,	
 Higashihiroshima	
 
	
 
17.	
  Suzuki,	  A.,	  A.	
  Kashiwagi,	  K.	
  Kashiwagi,	  H.	
  Hanada,	  K.	
 Takebayashi-Suzuki,	
 I.	
 Tazawa,	
 N.	
 Furuno,	
 A.	
 Kurabayashi,	
 S.	
 Kobayashi,	
 J.	
 Takenaka,	
 Y.	
 Tamaki,	
 T.	
 Igawa,	
 T.	
 Uto,	 C.	
 Nanba,	
 A.	
 Watanabe,	
 H.	
 Yoshida,	
 A.	
 Shimada,	
 and	
 M.	
 Sumida	 “International	
 Xenopus	 Resource	 Network	 and	
 Educational	
 Activities	
 at	
 Institute	 for	
 Amphibian	
 Biology”	
 International	
 Symposium	
 “Frontiers	
 in	
 Amphibian	
 Biology”,	
 27-28	
 March,	 2014,	
 Hiroshima	
 University,	
 Higashihiroshima	
 
	
 
国内学会	
 
1.	
 井川	
 武、小巻	
 翔平、Nasrin	
 Sultana、長岡	
 麻衣、野澤	
 昌文、Islam	
 Mohammed	 Mafizul、大海	
 昌平、住田	 正幸「Ion	 PGM を利用した両生類 3 種におけるマイクロサテライトマーカー開発」次世代シークエンサ現場の会	
 第三回研究会
2013/9/3	
 -	
 9/5	
 神戸国際会議場	
 	
 2.	
 住田正幸・井川武・Islam	 M.	
 M.・倉林敦・Alam,	
 M.	
 S.・掛橋竜祐・田戸
美雪・新谷望・菅原弘貴・西谷琢磨・大海昌平・勝連盛輝・藤井保「両生類絶滅危惧種の飼育下繁殖による保全の試み」日本遺伝学会第 85 回大会	  平成 25
年 9 月 19 日、慶応大学、横浜	
 
	
 

138

3.	
 Hasan,	
 M.,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 M.	
 Kuramoto,	
 A.	
 Kurabayashi	
 and	
 M.	
 Sumida	 “Description	
 of	
 two	
 new	
 species	 of	
 Microhyla	
 (Anura:	 Microhylidae)	
 from	
 Bangladesh”	
 日本遺伝学会第 85 回大会	  平成 25 年 9 月 20 日慶応大学、横浜	
 
	
 
4.	
 Islam,	
 M.	
 M.,	
 R.	
 Kakehashi,	
 H.	
 Koide,	
 A.	
 Kurabayasi,	
 S.	
 Oumi,	
 S.	
 Katsuren,	
 T.	
 Fujii,	
 and	
 M.	
 Sumida	 “Genetic	
 divergence	
 and	
 postmating	 isolation	
 between	
 endangered	
 Holst’s	 frog	
 and	
 Otton	 frog	
 from	 the	
 Ryukyu	
 Archipelago,	 Japan,	
 elucidated	
 by	 allozyme	
 and	
 mitochondrial	
 gene	 sequence	 analyses,	 crossing	 experiments	
 and	
 cytological	
 observations”	
 日本遺伝学会第 85 回
大会	  平成 25 年 9 月 20 日、慶応大学、横浜	
 
	
 
5.	
 宇野好宣・西田千鶴子・高木知世・井川武・上野直人・住田正幸・松田洋
一「アフリカツメガエルのゲノム倍数化過程に生じた染色体再配列と無尾両生類における性染色体の起源とその進化に関する分子細胞遺伝学的研究」日本遺伝学会第 85 回大会	  平成 25 年 9 月 21 日、慶応大学、横浜	
 
	
 
6.	
 住田正幸・井川武・菅原弘貴・田戸美雪・西谷琢磨・倉林敦・Islam	
 M.	
 M.・
大海昌平・勝連盛輝・藤井保「絶滅危惧種イボイモリの遺伝的多様性と飼育下繁殖」日本動物学会第 84 回大会	  平成 25 年 9 月 26 日	
 岡山大学、岡山市	
 
	
 
7.	
 小巻翔平・井川武・倉林敦・Mi-Sook	 Min・Si-Min	
 Lin・住田正幸「東アジア産トノサマガエル種群の系統関係と遺伝子浸透」日本動物学会第 84 回大会	 平成 25 年 9 月 26 日	
 岡山大学、岡山市	
 
	
 
8.	
 住田正幸・M.	
 M.	
 Islam・井川	
  武・倉林	  敦・古川友加里・佐野尚美・藤井	  保・吉崎範夫「透明ガエルの遺伝様式と真皮色素細胞の組織学的観察」日
本爬虫両棲類学会第 52 回大会	  平成 26 年 11 月 2 日	  東海大学、札幌	
 
	
 
9.	
 Islam,	
 M.	
 M.,	
 S.	
 Oumi,	
 H.	
 Ida	
 and	
 M.	
 Sumida	 “Genetic	
 divergence	
 and	
 postmating	 isolation	
 among	 several	 brown	 frog	
 species	
 from	
 Honshu	 and	
 Ryukyu	 of	
 Japan,	 and	
 Mongolia	
 elucidated	
 by	
 mitochondrial	
 gene	 sequence	 analyses,	 crossing	 experiments	
 and	
 subsequent	
 cytological	
 observations	
 of	
 their	 hybrids	
 and	
 controls”	
 日本爬虫両棲類学会第 52 回大会	  平成 26
年 11 月 2 日	  東海大学、札幌	
 
	
 
10.	
 掛橋竜祐・井川武・住田正幸「絶滅危惧種ホルストガエルにおける遺伝的集団構造」日本爬虫両棲類学会第 52 回大会	  平成 26 年 11 月 2 日	  東海大学、
札幌	
 
	
 
11.	
 井川	
  武・長岡麻衣・野澤昌文・小巻翔平・藤井	
  保・住田正幸「Ion	
 Torrent	
 PGM	 を用いたハナサキガエルにおけるマイクロサテライト遺伝子座の単離と集団構造解析」日本爬虫両棲類学会第 52 回大会	  平成 26 年 11 月 2 日	  東海大学、札幌	
 

139

	
 
12.	
 渡辺愛・井川武・鈴木厚・柏木昭彦・倉林敦・藤井	  保・住田正幸「両生類モデル動物ネッタイツメガエル 6 系統における近交度及び遺伝的関係の解明」日本爬虫両棲類学会第 52 回大会	  平成 26 年 11 月 2 日	  東海大学、札幌	
 
	
 
13.	
 倉林敦・古野伸明・住田正幸・水野英明・大島一彦・M.	
 Vences「カエル亜目における SINE(short	
 interspersed	
 nuclear	 elements)の発見と系統分布」
日本爬虫両棲類学会第 52 回大会	  平成 26 年 11 月 2-3 日	  東海大学、札幌	
 
	
 
14.	
 	
 
Hasan,	
 M.,	
 N.	
 Kurniawan,	
 A.	
 Soewondo,	
 M.	
 M.	
 Islam,	
 T.	
 Igawa,	
 W.	
 M.	
 M.	
 Nalley,	 M.	
  Matsui	  and	
  M.	
  Sumida	
  “Evolutionary	  relationships	
  and	
  postmating	 isolation	
 among Fejervarya species from Lesser	
 Sunda,	
 Indonesia and	
 other	 Asian	
  countries	
  revealed	
  by	  mtDNA	
  Cyt	
  b	
  gene	  sequences	  and	
  crossing	 experiments”	
 日本爬虫両棲類学会第 52 回大会	  平成 26 年 11 月 2-3 日	  東海大学、札幌	
 	
 ④科研費等の受け入れ状況	
 1.	
 文部科学省特別教育研究経費—国際的に卓越した教育研究拠点機能の充実	
 先駆的両生類研究の展開—両生類絶滅危惧種の保全	
  11,740 千円	
 （担当	
 住田
正幸、矢尾板芳郎）	
 
	
 
2.	
 文部科学省第 3 期 NBRP「ネッタイツメガエルの近交化・標準系統の樹立・提供」中核機関（H25 年度）11,410 千円	
 (課題代表者	
 住田正幸)	
 	
 3.	
 科学研究費補助金	
 基盤研究(B)「絶滅危惧両生類における遺伝的多様性評
価と保全のための包括的研究」3,510 千円（研究代表者	
 住田正幸）	
 	
 4.	
 科学研究費補助金	
 挑戦的萌芽研究「光る透明ガエルの作出：非モデル両生類への遺伝子導入法の確立と NGS による発現解析」2,340 千円（研究代表者	
 住
田正幸）	
 
	
 

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