モダンメディア

50巻12号 2004〔ニューテクノロジー〕 293

腸管感染症における LAMP 法の応用
Detection and identification of enteropathogenic bacteria by LAMP method

松下尾形秀

Shigeru MATSUSHITA

和Kazue OGATA１）：加恵 １）： 倉藤

Rei KATOH園貴玲 １）
至 ２）

Takayuki KURAZONO

筆者らは，この「Loopamp サルモネラ検出試薬はじめにキット」の有用性を明確にする目的で，標的としている病原遺伝子 invA の各種血清型サルモネラ属菌

わが国で開発された新規遺伝子増幅法である Lo１）における保有について，本キットと従来の PCR 法

op-mediated Isothermal Amplification（LAMP）法

３）を測定原理として，栄研化学より「Loopamp SARSト」に関しては，従来の PCR 法４）およびラテック

コロナウイルス検出試薬キット」が市販され，世界

ス 凝 集 法 ５） により同 定され た 腸 管出 血 性 大 腸 菌的に注目されている SARS（重症急性呼吸器症候（EHEC）菌株を用いて，その特異性の確認を行っ群）診断の補助，ならびに検疫所，衛生研究所，医た。これらの成績について紹介する。

療機関等での本症に対する水際防御，感染拡大阻止で検討した。「Loopamp VT タイピング試薬キッ

なお，LAMP 反応原理の詳細については，栄研化

２）に役立つものと大きな期待が寄せられている 。ま学 か ら の 解 説 書 や ウ ェ ブ サ イ ト（http://loopamp.

た，同じく LAMP 法による腸管感染症起因菌の食eiken.co.jp/）を参照されたい。

品・環境からの検出キットとして，現在のところⅠ．検出試薬キットと操作手順「Loopamp サルモネラ検出試薬キット」，「Loopamp
腸管出血性大腸菌検出試薬キット」および「Loopamp ベロ毒素（VT）タイピング試薬キット」が栄LAMP 法による３種類の検出試薬キットを写真１

研器材を通じて販売されている。に示す。キットは 48 回（VT タイピング試薬キット
では 24 回）用で，内容は表１に示したように，基本的に⑴Extraction Solution for Foods，⑵Reaction
Mix（VT タイピング試薬キットでは２種類），⑶
Bst DNA Polymerase， ⑷Control DNA（VT タ イ ピ
ング試薬キットでは２種類）の４種類からなり，反応チューブは別売となっている。操作手順の概略を「Loopamp サルモネラ検出試薬キット」を用いた場
表１

写真１

LAMP 法による腸管感染症起因菌の検出試薬キット

写真は「Loopamp サルモネラ検出試薬キット」。ほかに「Loopamp
腸管出血性大腸菌検出試薬キット」，「Loopamp ベロ毒素（VT）タイピング試薬キット」が市販されている。

１）東京都健康安全研究センター 多摩支所
〠 190-0023 東京都立川市柴崎町３-16-25
２）埼玉県衛生研究所〠 338-0824 埼玉県さいたま市上大久保 639-1

LAMP 法による検出試薬キットの内容（48 回用 )⑴ Extraction Solution for Foods⑵ Reaction Mix.
⑶ Bst DNA polymerase⑷ Control DNA
反応チューブは別売

1)Tokyo Metropolitan Institute of Public Health(3-16-25 Shibasaki-cho Tachikawa-city Tokyo)
2)Saitama Institute of Public Health(639-1 Kamiokubo Saitama-city Saitama)（ 15 ）

1.8mL × 2tubes
0.5mL × 2tubes
60μL × 1tube
0.1mL × 1tube

294

合を例に，従来の培養法と比較して図１に示す。従来の培養法では，１日目に検査材料を前増菌培地で培 養， ２ 日 目 に そ の 培 養 液 を 選 択 増 菌 培 地 に 移植，３日目に選択分離平板に分離培養，４日目に疑わしいコロニーが認められたら各種確認培地に移植，５日目に判定となり，その結果を得るまで４〜５日を要する。一方，LAMP 法では直接前増菌培養液を用いて実施するので２日目には結果が得られる。LAMP 法の実施手順は，指定された前増菌培養液を用い（VT タイピング試薬キットの場合は，被写真２Loopamp リアルタイム濁度測定装置

検菌株の培養液あるいは寒天培地上のコロニーから菌液を調製），その 50μL と⑴50μL と混合，95℃各ブロックごとに増幅，判定，結果の表示が可能で５分間加熱後遠心，その上清 5μL を⑵と⑶を混合ある。写真 3 にその例を示す。写真 3 の A ブロッ（１件当たり前者 20μL，後者 1μL）したマスター

クは各反応チューブごとにリアルタイムで測定，グミックス 20μL と反応チューブ内で混合，反応を行ラフで示した増幅画面である。写真３の B ブロッう。核酸増幅の検出は，反応副産物であるピロリン

クは，測定値を移動平均微分法で演算した結果をグ酸マグネシウム（白色沈殿物）による濁度の増加にラフで示した判定画面である。写真３の C ブロッ６）

よる 。この濁度の測定は，濁度測定器内蔵恒温装

クは，その結果画面で，反応後１時間以内に濁度が置とパソコンからなる「Loopamp リアルタイム濁一定基準以上に上昇した場合「陽性」，上昇が認め度測定装置」（写真２）を用いて行う。使用キットられない場合「陰性」と判定される。反応終了後自に合わせてプログラムを選択し，表示温度が規定温動的に酵素失活処理がなされるので，それを確認後度に達していることを確認後，調製した試料をセッ装置から反応チューブを取り外し，そのままキャット（ ８ 連 の チ ュ ー ブ が ４ ブ ロ ッ ク に セ ッ ト で き

プを開けずに廃棄する。なお，DNA 産物を電気泳る），測定を開始する。なお，陽性コントロールと動する必要はない。検出感度は，反応当たり菌体

陰性コントロールの濁度上昇の有無により，増幅反60cfu と報告されている７，８）。

応が正常に進行しているか否か確認できる。さらにの詳細は，各キットの添付文書を参照されたい。

1 日目 食材 25g ＋前増菌培地 225mL

操作および判定法：培養法

培養：36℃± 1℃

2 日目 前増菌培養液：LAMP 法

0.5mL

選択増菌培地

50μL

Extraction Solution for Foods 50μL

培養：42℃± 0.5℃

3 日目 選択増菌培養液

95℃，5 分間

熱処理済み培養液 5μL＋ LAMP 法マスターミックス 20μL

分離平板培地
リアルタイム濁度測定装置
1 時間

4 日目 生化学性状試験
判定
5 日目 判定

感度：60cfu/test

LAMP 法なら 2 日目で判定が可能

図 1 「Loopamp サルモネラ検出試薬キット」を用いた場合の LAMP 法と培養法の検査工程比較（ 16 ）

295（Ａ〜Ｃのデータは，同一データについて表示方法を変えたものです。
）

写真３表２サルモネラ属菌 invA 遺伝子の検出法と供試菌株

LAMP 法 Loopamp サルモネラ検出試薬キット（栄研化学）
invA 遺伝子検出用 Primer Set SIN-1,2
PCR 法（TaKaRa）
供試菌株：Salmonella enterica subsp. enterica
19 種 O 群，100 種血清型 568 株
血清型不明 35 株
Salmonella enterica subsp. salamae
5株
Salmonella enterica subsp. arizonae
4株
Salmonella enterica subsp. diarizonae
4株
Salmonella enterica subsp. houtenae
2株

Ⅱ．各種血清型サルモネラ属菌におけるの保有判定画面例な存在である 10）。
サルモネラ属菌は，哺乳類，鳥類，爬虫類などが保菌，さらには下水等の環境にも広く生息分布している。近年のわが国におけるサルモネラ属菌による食中毒は，本菌で汚染された禽獣肉や鶏卵を主な原因として発生している 10）。その予防・制御のためには，これら食品におけるサルモネラ属菌汚染の有無をできるだけ早期に認識することが重要である。
しかし従来の培養法では，本菌の検出に日時を要することより，迅速かつ高感度な検出法の開発が急がれていた。

わが国では，サルモネラ属菌に起因する疾病のう

近年，サルモネラ属菌の迅速・高感度検出法としち，チフス菌およびパラチフス A 菌を原因とするて，本菌が特異的に保有するとされる侵入性関与遺２類感染症である腸チフスとパラチフスは，近年激伝子 invA，あるいはエンテロトキシン産生性関与遺９）減を見るに至った 。一方，いわゆる非チフス性菌

伝子 stn を標的とした，遺伝子増幅法を利用した検による細菌性食中毒あるいは感染性胃腸炎（下痢出方法が開発されている７，11，12）。しかしながら，こ症）として扱われる疾病は，食生活の欧米化，外食の両遺伝子の保有に関しては，一部の血清型菌しか産業の隆盛などとも関連して，毎年多数の集団発生検討されておらず，Salmonella enterica subspecies

事例や散発例が報告されており，依然として食品衛

enterica だけでも 1,400 種類以上の血清型に分類さ生上あるいは公衆衛生上対策が求められている重要れる本菌が，普遍的にこれらの遺伝子を保有してい（ 17 ）

296

表 3 各種血清型サルモネラ属菌における invA の保有保有率％
O群

血清型保有率％

供試株数

LAMP

PCR

O群
92

Paratyphi A

8100

100

4AgonaBrandenburg
Chester
Derby
Eppendorf
Haifa
Heidelberg
Indiana
Lagos
Paratyphi B
ReadingSaintpaul
Sandiego
Schwarzengrund
Stanley
Typhimurium
Untypable

1325151151122522102113100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100

100
100100100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100

Bareilly
Branderup
Colindale
Hartford
Infantis
IsangiMbandaka
Mikawasima
Montevideo
Ohio
Othmarschen
Potsdam
Richmond
RissenSingapore
Tennessee
Thompson
Virchow
Untypable

911
1
1
52
518
32
32
8
1
9
5
12
5

100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100

100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100

AlbanyAltonaBellevue
Blockley
Bovismorbificans
Breda
Corvallis
Duesseldorf
Emek
Hadar
Kentucky
Kottbus
Litchfield
Manhattan
Muenchen
NagoyaNarashinoNewport
Untypable

311132132548
137133188100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100

100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100

78

供試株数

LAMP

PCR

DublinEastbourne
Enteritidis
JavianaMiyazakiPanama
Typhi

22101
2
1
5
3

100
100
99.0
100
100
100
100

100
100
99.0
100
100
100
100

3,10

AmagerAmsterdam
AnatumGive
Lekke
Lexington
LondonMuensterNewbrunswick
Orion
UgandaWeltevreden
ZanibarUntypable

2236
11915112229
1
4

100
100100100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100

100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100

1,3,19Krefeld
Liverpool
Senftenberg

117

100
100
100

100
100
100

11Rubislaw

1100

100

13

CubanaHavanaIdikanKedougou
Poona
Telelkebir
Untypable

14
12
1
1
2

100
100
100
100
100
100
100

100
100
100
100
100
100
100

6,14

Lindern
Madelia
Sundsvall

12
1

100
100
100

100
100
100

16

Gaminara
Hivttingfoss
Orientalis

12
2

100
100
100

100
100
100

18

Cerro

2

100

100

21

Ruiru

1100

100

28

Pomona

1100

100

30

Urbana

1100

100

35

Adelaide
Untypable1110010010010038Lansing
Untypable

2110010010010039

Chanpaign
Wandworth
Untypable

41110010010010010010040

Johannesburg

3100100（ 18 ）

血清型

297

るか否かは不明である。筆者らはこのことを明確に

表４ Salmonella enterica
各 subsp. における invA の保有する目的で，近年分離された各種血清型サルモネラ保有率（％）

属菌，すなわち通常ヒトから分離される大半の血清

subsp.

供試株数型菌株について，「Loopamp サルモネラ検出試薬

LAMP

PCRキット」を用いた LAMP 法７）及び従来の PCR 法３）

enterica

603

99.8

99.8

salamae

5100100の両者で invA の保有を検討した。

arizonae

4100100diarizonae

4100100houtenae

2100100

表２に示したように，供試菌株は 1995〜2003 年に東京においてヒト散発例および集団事例から分離13）
され，ドルセット卵培地に保存されていた S. ente-種血清型５株），O18 群（１種血清型２株），O21 群

rica subsp. enterica の 19 種 O 群 に 属 す る 100 種 血（１種血清型１株），O28 群（１種血清型３株），

清型菌 568 株と血清型不明 35 株，計 603 株，およO30 群（１種血清型１株），O35 群（１種血清型２びその他の subsp. に属する salamae ５株，arizonae株），O38 群（１種血清型３株），O39 群（２種血清４株，diarizonae ４株，houtenae ２株，合計 618 株型６株），O40 群（１種血清型３株）では，いずれのサルモネラ属菌である。なお，集団事例由来株にの O 群とも全株が保有していた。全体 603 株ではついては代表１株を供試した。

１株を除く 602 株（99.8％）が保有していた。

subsp. enterica の 19 種 O 群に属する 100 種血清

subsp. enterica 以外の salamae ５株，arizonae ４型および血清型不明の計 603 株における invA の保株，diarizonae ４株および houtenae ２株について有率を，O 群別・血清型別に表３にまとめた。O2

invA の保有について検討した結果，表４に示した群の ParatyphiA（パラチフス A 菌）８株では全株ように全株（100％）が保有していた。これらのが 保 有 し て い た。O4 群 の Agona，Chester，subsp. はヒトからの検出はまれで，主として爬虫類

Derby，Heidelberg，Saintpaul，Stanley，などの冷血動物から分離され，その病原性に関してTyphimurium な ど 16 種 血 清 型（ 血 清 型 不 明 を 除は不明確であったが，遺伝子の面からみたかぎりでく：以下同様）101 株（血清型不明を含む：以下同は病原性を有すると考えられる。

様）では，全株が保有していた。O7 群の Bareilly，全体を通して LAMP 法によるキットと PCR 法に

Braenderup，Infant-is，Mbandaka，Montevideo，

よる成績は完全に一致しており，サルモネラ属菌はOranienburg，Ri-ssen，Tennessee，Thompson，本質的に invA を保有していることが確認された。

Virchow など 20 種血清型 106 株では，全株が保有
し て い た。O8 群 の Blockley，Emek，Hadar，Litchfield，Newport など 18 種血清型 114 株では，Ⅲ．「Loopamp ベ ロ 毒 素（VT） タ イ ピ ン グ
試薬キット」の検討

全 株 が 保 有 し て い た。O9 群 で は Enteritidis，Panama，Typhi（チフス菌）など７種血清型 116 株

ベ ロ 毒 素（VT） を 産 生 す る 腸 管 出 血 性大 腸 菌のうち，１株が LAMP 法および PCR 法とも陰性，（EHEC）は，出血性腸炎や溶血性尿毒症症候群のすなわち invA 非保有であった。この非保有株は原因菌である。本菌は，1990 年に埼玉県の幼稚園

101 株検討した Enteritidis のうちの 1996 年分離株で発生した２名の死亡者を含む，血清型 O157：H（散発例由来）であった。他の本血清型 100 株は保７による集団事例 14）を契機に広く認識されるよう有していることより，この菌株も分離当初は invAになり，その重要性に鑑み，腸管出血性大腸菌感染を保有していたが，保存中に変異あるいは脱落が起症は３類感染症に指定されている。毎年多数の集こったものと推 察され た。O3，10 群 の Anatum，団・散発下痢症例より本菌の検出が報告されてきてLexington，London，Weltevreden など 13 種血清型いる 15）が，その同定には VT 産生性あるいは VT 遺106 株では，全株が保有していた。その他，検出頻伝子の保有確認が必須である。今回，EHEC の同度の低い O 群である O1，3，19 群（３種血清型９定・毒素型別用に市販されている LAMP 法８） によ株），O11 群（１種血清型１株），O13 群（６種血清る「Loopamp ベロ毒素（VT）タイピング試薬キッ型 12 株），O6，14 群（３種血清型４株），O16 群（３ト」の特異性の確認を行った。

（ 19 ）

298

表 5 供試 EHEC 菌株の血清型と毒素型
血清型
O26 : H11: NM
O111: NMO119 : H2: H21
O121 : H19
O128 : H2O157 : H7: NM
OUT : H2: HUT

毒素型（PCR)
VT1
VT1+VT2VT1VT1VT1+VT2VT1VT1VT2VT1+VT2VT2VT1+VT2VT2
VT1+VT2VT1VT2表 6 毒素型および血清型別 LAMP 法検討成績

毒素型（PCR）
VT1株数
171221111133333211VT2VT1+VT2

血清型

株数O 26 : H11: NM
O111 : NM
O119 : H2: H21
OUT : H2O121 : H19O157 : H7: NM
OUT : HUT
O 26 : H11O111 : NM
O128 : H2O157 : H7: NM172211113331111332

LAMP 陽性率 (%)
VT1VT21000100010001000100010000100010001000100100100100100100100100100100100

表 7 VT バリアント株の PCR 法および LAMP 法検討成績

供試菌株は，従来の PCR 法４）およびラテックス凝集法５）により同定された EHEC100 菌株である。

毒素型

株数

それらの血清型と毒素型を表５に示した。血清型はVT2 vpVT2 vhaVT2 vhb
VT2 vf6
1
12

O26：H11（18 株），
O26：NM（２株），
O111：NM（３株），O119：H2（１株），O119：H21（１株），O121：PCR 陽性率（%）
VT1VT201000100010000LAMP 陽性率（%）
VT1VT201000100010000H19（１株），O128：H2（１株），O157：H7（66 株），O157：NM（５株），
OUT：H2（１株），OUT：HUT（１LAMP 法によるサルモネラ属菌検出法の妥当性が立株）で，毒素型では VT １産生 24 株，
VT2 産生 38 株，証された。

VT1&VT2 産生 38 株である。

LAMP 法による「Loopamp ベロ毒素（VT）タイ

PCR 法により確定された毒素型，および血清型ピング試薬キット」の特異性について各種血清型・別に見た LAMP 法での検討成績を表６にまとめた。

毒素型の EHEC 菌株を用いて検討した結果，そのVT1 産生と同定されていた６種血清型 24 株では，成績は従来の PCR 法で確定されていた毒素型と完LAMP 法においても全株 VT1 のみ陽性であった。

全に一致，その有用性が証明された。

VT2 産生の４種血清型 38 株においては，全株 VT2

LAMP 法を応用した検出法は，その特異性に加えのみ陽性であった。VT1&VT2 産生の５種血清型 38て，電気泳動が不要なことなど，手技が簡便で短時株では，全株 VT1 および VT2 両者とも陽性であっ間で成績が得られる利点を持つ。環境水からのレジた。さらに，VT2 のバリアントとして報告されていオネラ属菌検出用として，「Loopamp レジオネラ検る VT2vp，VT2vha，VT2vhb お よ び VT2vf に つ い出試薬キット E」も発売されているが，さらに多くて も 検 討 し た 結 果， 表 ７ に 示 し た よ う に 従 来 のの感染症診断にかかわる検査試薬が開発・発売されPCR 法と一致する成績であった。従来の PCR 法とることを期待する。

LAMP 法の成績は完全に一致，その特異性が確認・証明された。

謝辞：ご協力いただいた国立感染症研究所感染症情報センター伊藤健一郎博士，栄研器材株式会社有田潤史氏に感謝の意を表します。

おわりに文

各種血清型サルモネラ属菌について，病原遺伝子invA の保有について検討した結果，血清型などの違いに関係なく，本質的に本遺伝子を保有していることが確認された。すなわち，invA を標的とした

献１）Notomi T., Okayama H., Masubuchi H., et al.:Loopmediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids
Res 28: e63, 2000.

（ 20 ）

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