No.93_'09.qx 09.4.21 14:52 ページ 6

本シリーズは、市販のノウハウ本や実施例集ではカバーできなかったようなライフサイエンス実験のコ
ツなどについて、弊社研究員の実験ノートなども参考に、生の事例を交えながら紹介させていただいています。Vol.5から、最もリクエストの多かったPCR関連技術を更に深くご紹介する目的で、「PCR実戦技術編」をお届けしています。
さて前号では、Sリーダーからまたまた難問が出題され、その問題をめぐって A子さんとライバルのN代さんの間でバトルの予感が漂っていましたが…。
皆さんも、是非、前号で2人の考えた解答を確認してから、本号を読み進めてください。

題
の課 ト
号
ス
前
ジェ
イ
ダ

●課題：大腸菌のDHFR（ジヒドロ葉酸還元酵素）を発現するベクターがあります。そのDHFRのN末端にタグ配列を付加するにはどのようなプライマーを設計すれば良いですか？

〈条件〉¡インバースPCR法を用いること。
¡タグのアミノ酸配列は以下のとおり。
Leu-Ⅰle-Arg-Arg-Ⅰle （L-Ⅰ-R-R-Ⅰ）
タグは開始コドンの隣りに挿入すること。
¡発現は大腸菌で行います。

図1

図2

！
注意！

coli DHFRDHFR発現ベクター

図3

A子さんの解答

上の二人の解答には間違いが含まれている可能性があります。

N代さんの解答（ループで示してある部分をプライマー中央に挿入）

今までの
登場人物

本シリーズは、弊社ウェブサイト
（http://www.toyobo.co.jp/bio）の「実験お助けコーナー」でご覧いただけます。

N代さん
A子さん
Sリーダー
冷静沈着なライフ 今年入社4年目 今年入社3年目になる研究員サイエンスグルー になる研究員（A子さんのライバル）
プのリーダー

S本さん
アシスタント

私 にも！
できた ラ イ フ サ イ エ ン ス 実 験 シ リ ー ズ

1No.93_'09.qx 09.4.21 14:52 ページ 7

変異導入実験いろいろ

1

遺伝子組換え技術が発達し、変異を導入してタンパク質の機能を改変したり、タグを付加したりするような実験がとても簡単にできるようになりました。今回は、そのような変異導入技術とそれに関連したトピックスをご紹介いた
します。

1-1

網羅的変異導入法と生物の進化

現在のような分子生物学的な手法が発展する以前から、様々な方法を用いて変異実験が行われてきました。例えば、細菌やシPCR時のマグネシウムイオンをマンガンに変更したり、dNTP中の各ヌクレオチドのバランスを崩したりすることにより、DNAポョウジョウバエなどに紫外線やX線を照射することによって、様々な変異体が取得されてきたこともその一つです。これらのリメラーゼの正確性を低下させて変異を導入します。
ところで、様々な生物で働いているDNAポリメラーゼは大きく

方法は、DNAが紫外線やX線によって損傷を受け、その修復段階

分けて7種に分類されますが、Yファミリーに属するDNAポリメ

で変異が導入されることを利用します。よって、遺伝子のどこに変異が導入されるかをあらかじめ知ることはできませんが、様々

ラーゼの正確性（忠実度）が低いことが最近分かってきました。
この酵素は、多くの生物に存在することが知られており、実際にな領域にまんべんなく変異を導入できるという特徴があります。
また近年、PCRを用いて網羅的に変異導入する方法（エラー

進化の原動力の一つになったのではないかと考えられているようです。

プローンPCR）が頻繁に行われるようになりました。この方法は、

1-2 部位特異的変異導入 −生体成分であるが故の宿命？−
DNAポリメラーゼによる変異導入プライマーの伸長反応を利いる酵素は、最大の力を発揮できないように進化してきた節があ用して特定の塩基を置換するような技術も次々と開発されていります。おそらく、酵素の過剰な活性は逆に生体に不利に働くため、生体にとってちょうど良い活性を発揮するように進化段階でます。これらの技術は、タンパク質の機能を解明したり、タンパク質に新しい機能を付加するような実験に応用されています。実際

調節されていったのでしょう。いわゆる、自動車やバイクなどでに、活性中心と思われる部位に変異を導入してアミノ酸を変異させ酵素活性の変化を調べたり、酵素の耐熱性や反応性や基質

言うところのリミッターのイメージです。よって、機能改良のための変異導入は、このリミッターを外す作業といえるのかも知れま

特異性を改善したりする研究が行われています。
また、研究が進むにつれて、ほんの一つのアミノ酸の変異が、せん。

生体成分であるが故の宿命？

タンパク質全体の機能に多大なる影響を及ぼすような事例が次々と報告されるようになりました。その変異で、タンパク質の機能が失われることもあれば、タンパク質の機能が飛躍的に向上

リミッターさえなければ…

する場合もあるようです。現在、産業用や研究用として用いられている酵素の多くは、この手法を用いて改良されたものが少なくありません。
しかし、考えようによっては不思議な話です。生体中で働いて

1-3 様々な変異導入法における利点と欠点
1-2のような置換に加え、特定の配列を削ったり、挿入したりすが、インバースPCR法では問題なく行うことができます。よって

るような変異導入も頻繁に行われています。しかし、このような変異導入は、方法によってかなり効率が異なるようです。

この方法は点突然変異ライブラリーなどの作製に適しているといえます。

部位特異的変異導入法は、相補的なプライマーを用いる方法とそうでない方法に大きく分けることができますが（図4）、遺伝子配列の欠失や挿入には、相補的なプライマーを用いない「インバースPCR法」などの方法が効果的であるといえます。相補的なプライマーを用いる方法では、図4に示すように、プライマーがアニーリングする際にDNAがかなり不自然な構造をとる必要があり、効率が下がってしまうようです。近年、ヒスチジンタグなどを用いることが増えましたが、インバース
PCR法はそのようなタグ配列の挿入にも力を発揮します。

欠
イ
ン
バ
ー
ス
P
C
R
法

用相
い補
る的
方プ
法ラ
イ
マ
ー
を

失

挿

入

高正確性PCR酵素DNA（環状プラスミド）

熱サイクル
（PCR）
リン酸化
ライゲーション
大腸菌の
形質転換
※

DNA
（環状プラスミド）

熱サイクル（伸長反応）

高正確性PCR酵素

また、相補的なプライマーを用いる変異 導 入 法 で は 、原 理 上 、ミックス 塩 基（NNNなど）を導入することが困難です

2 ラ イフ サ イ エ ン ス 実 験 シリー ズ

私 にも
！
できた

図4 各変異導入法の原理（欠失と挿入）※相補的プライマーを用いる方法では、
リン酸化・ライゲーションのステップは必要ありません。

No.93_'09.qx 09.4.21 14:52 ページ 8

2

実戦−その4−

A子さんとN代さんはT社バイオ研究所のライフサイエンス試薬開発グループの研究員です。先ほどからなにやら、Sリーダーの前で火花を散らしているようです。実は、つい先ほど2人に問題が出され、その解答がSリーダーに提出されたところなのです（ライフサイエンス実験シリーズの表紙参照）。

2-1 N代さんの落とし穴
まず、Sリーダーは、N代さんに向かって、「このプライマーペア
でPCRができるの？」という疑問を投げかけました。N代さんはうです。
また、欠損変異体を作製する場合においても、インバースPCR
法は有利なようです。表2は、同様にSリーダーが以前行った

ポカンとしています。
N代さんは学生時代にインバースPCR法とは異なる方法を用いて変異導入実験を行っていました（図4 相補的プライマーを用いる方法）。今回、N代さんはその方法の規則に従ってプライマー

90bpの欠損変異体の作製効率を二つの方法で比較したものです。
表1 各方法におけるヒスチジンタグ（18bp）挿入効率の比較を設計してしまったのです。

配列確認を目的の変異を有して 目的とした
試みたクローン数
いたクローン数
変異体の割合増幅の機構を図に描いてみると分かるのですが、このような相補的なプライマーではいわゆる連鎖的
増 幅 は 起こりませ ん（ P C R できません！）。N代さんはとっさに、「 はっ！」と気づいて、頭を抱えてしまいました。課
題では、「インバースPCR法を用いてインバースPCR法＊1

16

15

94％

相補的プライマーを用いる方法＊2

16

0

0％

表2 各方法における欠損変異体（90bp）作製効率の比較行う」となっていましたので、N代さん

配列確認を目的の変異を有して 目的とした
試みたクローン数
いたクローン数
変異体の割合の答えは課題の条件を満たしていないことになってしまいます。
続けて、Sリーダーは、確かにこの原理を用いても変異導入は可能なのですが、今回のように途中に長い挿入のあるようなプライマーではうまくいかないことが多いことをN代さんにアドバイスしました。Sリーダーは、以前行ったヒスチジンタグ配列挿入実
験における比較結果を見せてくれました（表1）。確かに、18bpともなると、相補的プライマーを用いる方法では、問題があるよ

インバースPCR法＊1

16

14

88％

相補的プライマーを用いる方法＊2

16

7

44％

＊1 部位特異的変異導入キット「KOD -Plus- Mutagenesis Kit（CodeNo. SMK-101）」を用いました（図4上参照）。
＊2 相補的プライマーを用いる方法（図4下）にて実施。
※＊1、＊2ともに、増幅反応の後に制限酵素DpnⅠを用いて鋳型プラスミドの分解を行っています（図7参照）。
※実験に用いたプラスミドの全長は7.3kbです。

2-2 A子さんの落とし穴
今回、A子さんは慎重でした。原理は完璧なはずです。Sリーダーは、N代さんを呼んで、A子さんの解答を見せつつ解説を始めました。
まず、プライマーの設計は、変異の種類によって様々であり、以下のようなコツがあります。
●変異導入部位は、プライマーの5 末端、あるいは5 末端付近に設計します（欠失の場合は変異部位の導入は必要ありません）。
●3 末端側には、鋳型DNAと相補性のある領域が少なくとも20塩基以上（望ましくは25塩基以上）になるようにプライマーを設計します。
●プライマーが50塩基を超えるような場合は、精製度の高いプライマーを用います（プライマーが長くなるほど、5 末端の欠落した
不完全なプライマーの混入が増える傾向にあります）。
●プライマーをあらかじめリン酸化しておくか、PCR産物をリン酸化する必要があります。
※KOD -Plus- Mutagenesis Kit（Code No.SMK-101）を用いる場合、あらかじめプライマーをリン酸化しておく必要はありません。PCR後にPCR産物をリン酸化するステップが設定されています。
右が、3種類の変異を導入する場合の典型的なプライマー設計例です。

置 換

欠 失

挿 入

（図5）

図5 プライマー設計

私 にも！
できた ラ イ フ サ イ エ ン ス 実 験 シ リ ー ズ

3No.93_'09.qx 09.4.21 14:52 ページ 9

前述の、
KOD -Plus- Mutagenesis Kit（Code No. SMK-101）は、
インバースPCRで用いる高正確性PCR酵素『KOD -Plus-』
をはじめ、変異導入に必要な試薬をすべて含んでいます。更に、DpnⅠ処理工程などの実験の効率を高める工夫もなされているため、初めて変異導入実験をされるような場合にはとても便利です。以下に、このキットを用いるインバースPCR法による部位特異的変異導入フローをA子さんの解答を元に示します（図6、図7）。また、プロトコール＃1に具体的な実験方法を示します。

【プロトコール＃1】
インバースPCR法を用いる部位特異的変異導入（KOD -Plus- Mutagenesis Kitを使用）

プライマー
プラスミド

1. PCR＊

PCR（高正確性PCR酵素：KOD -Plus- ）
DNA
Ⅰ

＊＊

滅菌蒸留水
10×Buffer for iPCR
2 mM dNTPs
プライマー1（10 pmol/μl）
プライマー2（10 pmol/μl）
Plasmid DNA（50ng/μl）
KOD -Plus-（1 U/μl）
Total Volume
94℃
98℃
68℃
4℃

P
P
＊＊

2 min
10 secX min＊1Hold35（μl ）
5
5
1.5
1.5
1
1
50μl

Y（4〜10）サイクル＊2＊1

増幅するサイズ（kb）
を基に、1min./kbを目安に設定します。例えば、5kbのPlasmidの全周を増幅したい場合には、5min.に設定します。

＊2

増幅するサイズ（kb）
を基に、1サイクル/kbを目安に設定します。但し、最終的に得られるコロニー数は、用いるコンピテントセルの形質転換効率等によっても変動します
ので、実験に余裕がある場合には、反応液を2分割し、二通りのサイクル数にて実施します（例えば、5サイクルと10サイクル）。

2. DpnⅠ処理

図6 インバースPCRを用いる部位特異的変異導入フロー（挿入）＊PCR産物の末端が平滑化される高正確性PCR酵素が適しています。
＊＊KOD -Plus- Mutagenesis Kitでは、
リン酸化とライゲーションのステッ
プを同時に行います。
※ライゲーション反応には5'末端のリン酸基が必要です。通常使われているプライマーはリン酸化されていません。

PCRの終了した反応液
DpnⅠ（10U/μl）
Total Volume↓
37℃、1h反応（全量50μl）
2μl
52μl

3. リン酸化、
ライゲーション

DpnⅠ処理済みPCR産物
2μl
滅菌蒸留水
7
Ligation high5
T4 Polynucleotide Kinase（5U/μl） 1
Total Volume
15μl↓
16℃、1h反応 ⇒ 形質転換

イン バ ー ス P C Rにお ける増 幅 は 、K O D - P l u s -（ C o d e
No. KOD-201）のような高正確性PCR酵素を用いる必要があります（前号参照）。これは、PCR産物の末端をライゲーションによって結合するため、平滑末端でなくてはならないからです。また、変異導入部位以外にPCRエラーによる変異が導入されないようにする目的もあります。よって、この用途には正確性が極めて高いKOD -Plus-が適していると言えます。さらにこの方法でⅠは、末端をライゲーションにより結合することから、PCR産物をリン酸化する必要があります。
Sリーダーは更に、以前、実際に実験に使用したことのある、プ
ライマーペア（ヒスチジンタグ：図8、アミノ酸点変異ライブラリー：図9）を示して説明してくれました。皆さんも、これらのプライ
Ⅰ

Ⅰ

マーペアを用いて変異実験をシミュレーションしてみてください。このようにNNNというような配列を導入できるのは、インバースPCR法の利点でもあります。

図7 制限酵素DpnⅠによる鋳型プラスミドの分解
一般的な大腸菌（JM109やDH5αなど）で調製されたプラスミドはDpnⅠで切断を受けます。
Damメチラーゼでメチル化されているため、一方、PCR産物はメチル化されていないため、切断を受けません。そのため、変異の導入されていない鋳型プラスミ
ドを消去し、
バックグラ
ウンドを抑えることができます。

4 ラ イフ サ イ エ ン ス 実 験 シリー ズ

私 にも
！
できた

ワンポイントメモ ①
Dpn Ⅰは4塩基認識の制限酵素で、Damメチラーゼでメチル化さm
れたGATC配列を認識して、切断するという珍しい性質を有しています。

No.93_'09.qx 09.4.21 14:52 ページ 10と、
ここまで来て、SリーダーがボソッとA子さんにつぶやきました。
「ところでA子さん。
コドンユーセージ（Codon usage）って知っている？」。A子さんは目をパチパチしています。
「Codon usageとは、確か特定の生物におけるコドンの使用頻度…」。とそのとき、A
PCR/

子さんは同じタグ配列なのに、A子さんの選んだタグの塩基配列がN代さんの選んだものとはかなり異なることに気づきました。
インバースPCRの原理ばかり考えていたA
子さんは、そのことにまで気が回っていませ

図8 ヒスチジンタグ配列挿入例んでした。確か、遺伝子は大腸菌で発現させなくてはならないはずです。A子さんは、念のためインターネットで大腸菌K12株におけるコドンの使用頻度を調べてみました（表3）。
そして、愕然としました。何と、A子さんの選んだコドンは、あろうことか大腸菌における低頻度（レア）コドンばかりでした。逆に、N代さPCR/んの選んだ配列は使用頻度のとても高いものばかりでした（図10）。

図9 アミノ酸点変異ライブラリー作製例

表3 大腸菌K12株におけるコドンの使用頻度●A子さんの設計したタグ配列(コドンの使用頻度)●N代さんの設計したタグ配列(コドンの使用頻度)

図10 2人の選択したコドンと各コドンの大腸菌における使用頻度

Sリーダーからは以下のような解説がありました。
mRNAのコドンの使われ方は、翻訳速度に大きく影響します。現在までに、高頻度コドンに対応するtRNAは細胞内に高濃度で存在
し、低頻度コドンに対応するtRNAは低濃度でしか存在しないことが確かめられています。発現させようとする遺伝子に低頻度コドンが多く含まれている場合、対応するtRNAが少ないので翻訳速度が低下し、発現量が少なくなることが調べられています。特に、N末端付
近にレアコドンが連続するような場合、発現量に大きく影響する可能性が高いという報告もあるようです。よって、A子さんの配列では、
このタンパク質全体の発現量が大きく低下する恐れがあります。

私 にも！
できた ラ イ フ サ イ エ ン ス 実 験 シ リ ー ズ

5No.93_'09.qx 09.4.21 14:52 ページ 11

ワンポイントメモ ②
mRNAのコドンの使われ方は、生物種によってかなり異なるようです。よって、他の生物種の発現系を用いて発現実験を行う場合には、注意が必要です。以下の表はコドンの使用頻度を千分率で表したものです。下表には、便宜上6以下の低頻度コドン（stopコドンを除く）
を黄色で示しています。これでみると、大腸菌のK12株とB株では低頻度コドンの分布はほぼ等しいのですが、ヒトやシロイヌナズナなどとは低頻度コドンが重なっていな
いところもあるようです。例えば、真核生物の遺伝子を大腸菌で発現させるような場合、注意が必要です。
実際、低頻度コドンは生物における発現制御にも用いられているようです。例えば、大腸菌におけるrpoDシストロン産物がdnaGシストロン産物より多く合成されるのはこのメカニズムによっていると考えられています。
表4 各生物におけるコドンの使用頻度の比較

B

K12

今回のバトル、痛みわけという感じでしょうか。それにしても、今回のバトルもお互い大変良い勉強になったようです。
（それからしばらくして…）
A子さんの1年間を通した活動も終わりを迎えました。高成功率PCR酵素『KOD FX』を用いたクルードサンプルや難ターゲットの増幅に関するノウハウもかなり集まりましたし、高正確性PCR酵素『KOD -Plus-』を用いた様々な遺伝子加工技術もSリーダーからの（意地悪な？）質問を通して驚くほど身につきました。何より、実験前にすべての可能性を疑ってみる癖が2人には身についたようです。
新しい年度を向かえ、A子さんとN代さんはますます張り切っているようです。いつの間にか、ここ北陸の長い冬も終わり、暖かな春がやってきたようです。
さて、このシリーズ、そろそろ予定していた紙面を埋め尽くしてしまったようです。この続きは、また機会のあるときにお届けいたしま
す。今後の、皆様方のご活躍を期待しております。

6 ラ イフ サ イ エ ン ス 実 験 シリー ズ

私 にも
！
できた

No.93_'09.qx 09.4.21 14:52 ページ 12

KOD FX活 動 報 告 4.

植物ライセートからのPCR

高成功率PCR酵素『KOD FX（Code No.KFX-101）』は、
クルードサンプルを用いるPCRにおいて高い効率を示します。前回は、マウステールライセートをサンプルとして用いるPCR法ご紹介しました。そこで今回は、植物ライセートをサンプルとしたPCRについて検討を行いました。
この方法を用いることによって、煩雑なDNA精製操作なしで、高効率に植物体からのPCRが可能になると思われます。
●植物組織の前処理方法【プロトコール＃2】KOD FXの基本反応条件

ワンステップ法

マイクロ
チューブへ

葉（3mm角） 精米（1粒）

1

Buffer A
100μl添加Vortexにて良く攪拌

2
Buffer A:
100mM Tris-HCl（pH9.5）
1M KCl10mM EDTA

試薬
添加量(μl)2×PCR buffer for KOD FX
25102mM dNTPs
1.5
10pmol/μl Primer #1
1.5
10pmol/μl Primer #2
X

Template DNA
PCR grade water
KOD FX（1.0 U/μl）
Total

終濃度
1×
0.4 mM each
0.3 μM
0.3 μM
Genomic DNA : 〜200 ng/50μl
Plasmid DNA : 〜50 ng/50μl
cDNA: 〜200 ng（RNA相当量）/50 μl
ワンステップ法からのサンプル : 〜1μl

Y
11.0 U / 50 μl
50（μl）

2ステップサイクル

3ステップサイクル

3

95℃・10 min.

4

Vortexにて良く攪拌

ステップダウンサイクル
上清1μlをPCR反応液に添加（植物組織は完全には溶解しません）
左：葉

右：精米

5

【参考文献】BioTechniques, 19: 394（1995）※プライマーのTm値が73℃未満の場合は、3ステップサイクルをお薦めします。

図11 ワンステップ法フロー【ターゲット】
ribulose-1.5-bisphosphate carboxylase / oxygenase large subunit（rbcL）の1.3kb【プライマー】
Primer F1 : 5 -ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC-3（トマト＆タバコ用）
Primer R1 : 5 -AAGCAGCAGCTAGTTCCGGGCTCCA-3（トマト＆タバコ用）
Primer F2 : 5 -ATGTCACCACAAACAGAAACTAAAGC-3（イネ用）
Primer R2 : 5 -AAGCTGCGGCTAGTTCAGGACTCCA-3（イネ用）
上記プライマーを用い、2ステップサイクル（伸長時間1.5 min、
30サイクル、
サンプル1μl使用）
にてPCRを実施しました。

●結果
従来、植物サンプルからのPCRでは、DNAサンプルの調製に大変な時間を要していましたが、本方法を用いることで、ト
マト、タバコ、イネの葉、及び精米のライセートをサンプルとして、短時間で解析することができました。一方、今回用いた
他のPCR酵素では増幅は認められませんでした。よって、ワンステップ法とKOD FXを組み合わせることが重要であると考えられました。
TaqベースPCR酵素
KOD FXは、夾雑物による阻害に
A社高効率PCR酵素
B社Long PCR酵素
KOD FX
大変強いという特性を有しており、今1 2 3 4 5 M 1 2 3 4 5 M 1 2 3 4 5回の例以外にも、マウステールライセ
ートや酵母などのサンプルにおいても良好な増幅結果が得られています。
実施例を弊社ウェブサイトでご確認いただけます。

1：トマト葉
2： タバコ葉
3： イネ葉
4： 精米
5： イネ精製ゲノムDNA
M：1kb DNA ラダー

1.3 kbwww.toyobo.co.jp/bio
図12 植物ライセートを用いたPCRの結果

私 にも！
できた ラ イ フ サ イ エ ン ス 実 験 シ リ ー ズ

7

No.93_'09.qx 09.4.21 14:52 ページ 13

Taq DNAポリメラーゼを使ってインバースPCR
法による変異導入実験を行いたいのですが、どうしたら良いですか？

KOD FXを用いて、植物ライセートからPCRを行う際に何かコツなどありますか？
今回ご紹介したワンステップ法（前ページ参照）を用いて行う場合、植物ライセートを持ち込み過ぎないようにすることが大切です。50μlの反応系に対して、最大 1μlまで
としてください。また、本方法でサンプル調製を行う場
合、サンプルとした植物体がすべて溶解してしまうことはありません。上清を用いてください。

Taq DNAポリメラーゼには、ターミナルトランスフェラー
ゼ活性があり、
そのPCR産物を用いると3 末端のdAがライゲーションの邪魔をするため、効率が極端に下がってしまいます。よって、校正活性（Proof reading活性）を有するKOD -Plus-（Code No.KOD-201）やKOD FX（Code No.KFX-101）などで増幅した平滑末端を有す
るPCR産物を用いる必要があります。本文中でもご紹介しましたが、KOD -Plus- Mutagenesis Kit（CodeインバースPCR法を用いて変異導入する際のプライマーについて、何かアドバイスはありますか？

No.SMK-101）を用いると大変便利ですので、お薦めします。

最終的に、増幅産物の末端を結合させるような形となりますので、それをイメージしながらプライマーを設計することをお薦めします。基本的に2つのプライマーにオーバー
ラップ部分は生じることはありませんので、注意してください。また、長い配列を挿入するような場合は、プライマーの両方に均等に挿入部分を配置するような配慮も必要です。とにかく、
インバースPCRといえどもPCRなので、
日常の経験を踏まえて、PCRがうまく行くようにプライマーを設計することが重要です。
また、本文中にも出ていますが、プライマーの特異的な部分（鋳型DNAと相補性のある領域）が少なくとも20塩基、好ましくは25塩基必要です。よって、多くの場合Tm値は73℃を超えることから、2ステップサイクルを用いてPCRを行うと便利です。しかし、プライマーのTm値が73℃より低くなるような場合は、アニーリング温度をTm値より5〜10℃程度低く設定した3ステップサイクルをお薦めします。

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〃

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できた

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