研究課題名In silico 解 析 に よ る ヒ ト チ ト ク ロ ー ム P450 2A6 を 介 し た 2,3’,4,4’,5pentachlorobiphenyl の代謝能評価

共同研究者名平川 周作（代表、福岡県保健環境研究所）

堀 就英（分担、福岡県保健環境研究所）

岩田 久人（拠点構成員、愛媛大学沿岸環境科学研究センター）

野見山 桂（拠点構成員、愛媛大学沿岸環境科学研究センター）

水川 葉月（拠点構成員、愛媛大学沿岸環境科学研究センター）

研究目的
2022 年度までの 共同研究プロジェクト において示されたヒト薬物代謝
酵素チトクローム

P450 （ CYP ） 2A6 分 子 種 を 介 し た 2,3’,4,4’,5-pentachlorobiphenyl（CB118）の代謝産物を特定するため、ガスクロマトグ
ラ フ 二 重 収 束 型 高 分 解 能 質 量 分 析 装 置 （ HRGC-HRMS ） に よ る 分 析 と
Molecular Operating Environment（MOE）ソフトウェアによる in silico シミュレーション解析を実施した。
1968 年、米ぬか油への polychlorinated biphenyls（PCBs）やダイオキシン類の混入による油症事件が福岡県を含む西日本地域で発生した。現在もこれらの化学物質は油症患者の体内に高濃度に残留していること、また、209 種存在する PCB 異性体のなかでも CB118 が一般人と比較して低く2,3,3’,4,4’,5-hexachlorobiphenyl（ CB156）が高いという特徴的な蓄積パターンを示すことが明らかになって おり、油症診断基準の一つとして用いられてきた。さらに、我々は Hirakawa et al.（2018）（Environ. Sci. Pollut. Res. 25,16455-16463）で実施した解析において、一般人と比べて油症患者において代謝または蓄積されやすい PCB 異性体が他にも存在すること、またその特徴について報告した。このような PCB 異性体の蓄積パターンは、PCB やダイオキシン類に曝露した油症患者の体内で CYP 酵素が誘導され、そ の働きによって一部の PCB 異性体が優先的に代謝されたためと考えられている。しかし、多種存在する CYP 分子種のうち、どの CYP 分子種がどのような代謝産物を生成するのかなど、PCB の代謝経路に関する詳細は明らかになっていない。
2021 年度の LaMer 共同研究において、CB118 とヒト CYP2A6 を in vitro系で反応させ代謝試験を実施した結果、脱塩素反応を伴った 4 塩素化体の水酸化 PCB の生成が確認された。ヒトや動物において検出頻度の高い水酸化 PCB の異性体については合成標準品を準備し、それらを同時に測定することで生成された水酸化 PCB の同定を行っている。しかし、CB118ヒト CYP2A6 で生成した水酸化 PCB は同時測定した標準品と一致するものは無かった。生成した代謝産物を同定できなかったこと、また in vitro 代謝 試 験 の 緩 衝 液 条件 に よ っ て 代 謝 活 性が異 な る こ と も 報 告され て い る ため、2022 年度に緩衝液及び NADPH regenerating system を変えて再試験を実施した。その結果、2021 年度と同じ 4 塩素化体の水酸化 PCB が生成され、異なる条件下でも同じ代謝産物が生成される再現性の確認がとれた。
この CB118 代謝経路に関しては、これまでに報告されてない事例であることから、本研究の進展により新たな知見が得られる可能性がある。
2023 年度は、新たに入手した水酸化 PCB 標準品（6-OH-CB77）の測定とフラグメントイオンの解析を行うとともに、CB118-ヒト CYP2A6 の insilico シミュレーションのドッキング様式を再解析し算出されたパラメーターから代謝産物の構造解明を試みた。

研究内容【6-OH-CB77 と未同定水酸化 PCB 異性体のクロマトグラムの比較 】
これまでに、太田ら（ 2005） （福岡医誌、96、232-240）が実施したモルモット肝ミクロゾームを用いた CB118 の in vitro 代謝試験においても塩素が 1 つ脱離した4 塩素代謝産物の生成が報告されている。また、この報告ではフラグメントイオンの情報から、ortho-位 への水酸基 の置換が推測されていたが、代謝産物の特定はできていなかった。我々の共同研究でも未同定の CB118 代謝産物が確認されたことから、上記研究を含めた PCB 代謝研究を先駆的に実施されている中村学園大学の古賀名誉教授と太田准教授のもとに相談に伺い、CB118 の代謝に関DQ Main View

Page 1
DqData : C:\Diok\Shinzato\OH-PCB ŽÀƒTƒ“ƒvƒ‹\2023.12.17 •½ì‚³‚ñ 6OH-CB77 STD\2023.12.18 Hrakawa_OH-PCB_Std\2023.12.18OH-PCB-Std
Injection : Hirakawa-1

する助言をいただいた。

OH-TeCBSample 1

800

CYP2A6+CB118(NADPH +)Intensity2023 年度の共同研究では、CB118 代
謝産物の候補物質である 6-OH-CB77 のUnknown OH-TeCB
RT：17.73

1200400

標 準 品 を新 たに入 手し、トリメチルシリルジアゾメタンを用いて 6-OH-CB77 を 6-0Page 1
13141516ŽÀƒTƒ“ƒvƒ‹\2023.12.17
1718
1920
21STD\2023.12.18
2223 Hrakawa_OH-PCB_Std\2023.12.18OH-PCB-Std2425
DqData : C:\Diok\Shinzato\OH-PCB•½ì‚³‚ñ 6OH-CB77
Retention Time (min)Injection : Hirakawa-2

DQ Main View

Calculated Retention TimeOH-TeCB

800

CYP2A6 in vitro 代謝試験の反応液を0Page 1
DqData : C:\Diok\Shinzato\OH-PCB•½ì‚³‚ñ 6OH-CB77
13141516ŽÀƒTƒ“ƒvƒ‹\2023.12.1717181920
21 STD\2023.12.18
2223 Hrakawa_OH-PCB_Std\2023.12.18OH-PCB-Std
2425
Injection : Hirakawa-3
Retention Time (min)
12000

16000
DQ Main
View

OH-TeCB Retention Time
Calculated
8000

Sample 3

同時に測定し、クロマトグラムを比較

1200
4000した。

800 13【CB118-CYP2A6 in silico シミュレ

CYP2A6+CB118(NADPH+)16 171415181920
Retention Time (min)3CB66

Intensity

0400

21222324

25

4CB70

2022 年 度 に 処 理 し た CB118- ヒ ト

400

13C-OH-TeCB

Intensity

HRGC-HRMS により測定した。また、

CYP2A6+CB118(NADPH +)4CB70

染・毒性解析部門水川准教授のもとでSample 23CB66

1200

Intensity

CH 3 O-CB77 に誘導体化した後、化学汚

13C-OH-TeCB
0Page 1
DqData : C:\Diok\Shinzato\OH-PCBŽÀƒTƒ“ƒvƒ‹\2023.12.17•½ì‚³‚ñ 6OH-CB77
13141516171819
20
21STD\2023.12.18
22
23 Hrakawa_OH-PCB_Std\2023.12.18OH-PCB-Std
2425
Injection
Retention Time (min)12000: Hirakawa-4ーションの再解析】

OH-TeCB
Calculated Retention Time
8000
1200

CYP のアミノ酸の相互作用についてLigand獲得を試みた。

181920Retention Time (min)3CB66

Intensity

1712000 13

14151617181920
Retention Time (min)2122232425

4000

13C-OH-TeCB
DQ Main View
Page 10
DqData : C:\Diok\Shinzato\OH-PCB ŽÀƒTƒ“ƒvƒ‹\2023.12.17 •½ì‚³‚ñ 6OH-CB77 STD\2023.12.18 Hrakawa_OH-PCB_Std\2023.12.18OH-PCB-Std
Injection : 13
AN1-3 14151617181920212223242516000
Retention Time (min)OH-TeCB
12000
Calculated
Retention Time
30000

4-OH-CB70
RT:18.01

8000
25000

13141516171415161718
1920
Retention Time (min)
3CB66

10000

21222324252122232425

4CB70

Intensity

01500013C-OH-TeCB013181920
Retention Time (min)Intensity

Calculated
800Retention Time

Fig. 1 Chromatogram of hydroxylated
tetraCB metabolites of CB118 by human
CYP2A640001415161713C-OH-TeCB
20000

15000

10000

5000

0181920
Retention Time (min)4CB70133CB66す。標準品と未同定の CB118-CYP2A6258000

Intensity

謝産物のクロマトグラムを Fig. 1 に示

2416000
01200

CB77 および CB118-CYP2A6 in vitro 代

236-OH-CB77
RT:18.19

Standard

4000
20000

5000

今 回 新 た に 入 手 し た 標 準 品 6-OH-

22

Retention Time (min)OH-TeCB8000
Calculated
Retention Time24000

400020000

研究成果

21Page 1
DqData12000: C:\Diok\Shinzato\OH-PCB ŽÀƒTƒ“ƒvƒ‹\2023.12.17 •½ì‚³‚ñ 6OH-CB77 STD\2023.12.18 Hrakawa_OH-PCB_Std\2023.12.18OH-PCB-Std
Injection : 13
Std-25ppb
141516171819202122232425

Interaction

Fingerprints）を計算して新たな情報の

16

DQ Main View
0Intensity

PLIF （ Protein

15

4CB70

し、基質結合ポケット内の CB118 と14400

Intensityら得られたドッキング様式を再解析

13600

200
13C-OH-TeCB

Intensity

CYP2A6 in silico シミュレーションかCYP2A6+CB118(NADPH -)

0800

4CB70

生成された未同定の水酸化 PCB 異性体 の 構 造 を 推 定 す る た め 、 CB118-Control

4000
1000

3CB66

CB118-CYP2A6 in vitro 代謝試験でIntensity

16000
DQ MainView

2122232425

in vitro 代謝産物はリテンションタイムが一致せず、 6-OH-CB77 とは異なる物質であることがわかった。今後、愛媛大学水川准教授もとでフラグメントイオンの測定を実施し、水酸基が 付加されている位置について情報獲得を試みる。
HOOH

Cl

Cl

Cl
Cl

Cl

Cl

5-OH-CB77

Cl HOCl
Cl

Cl

6-OH-CB77

ClCl

Cl

3’4OH

Cl

2’-OH-CB74

Cl2Cl

Cl
Cl

3’-OH-CB74

Cl4’● Predicted target site by in silico
simulation of CB118-CYP2A6

Cl

CB1185Cl
HOCl

Cl

Cl
ClCl

3-OH-CB70

ClCl

HOCl
Cl

4-OH-CB70

ClClClCl

Cl

5’-OH-CB67

OHClOHCl4’-OH-CB67

Fig. 2 Metabolic target sites of CB118 predicted from CB118 -CYP2A6 in silico simulations andpossible hydroxylated tetraCB isomers that may be produced (grey: confirmed not to match standard).

A

B

C

Distance:
4.59

Distance:
4.77

D

Distance:
3.86

E

Distance:
4.87

Distance:
4.66

Fig. 3 Two-dimensional view of PLIF in the CB118-CYP2A6 docking pattern (A: no interaction, B :arene attraction, C: arene attraction and backbone hydrogen bond donor, D: backbone hydrogen bonddonor, E: arene attraction)

CB118-CYP2A6 in silico シミュレーションのドッキング様式から 予測された代謝標的部位の情報に基づき、脱塩素反応を介して生成される可能性がある 4 塩素化体の水酸化 PCB 異性体（8 種類）を Fig. 2 に示した。本年度までに、入手・測定できた標準品 3 異性体（6-OH-CB77、3’-OH-CB74、4-OH-CB70）ではないことが明らかとなった。
また、MOE ソフトウェアを用いて CB118-CYP2A6 のドッキング様式を
in silico シミュレーションの PLIF（Protein Ligand Interaction Fingerprints）によって推定した。これまでの共同研究により、ヘム鉄と代謝標的部位の距離が 5Å 未満となり代謝の可能性が示唆された 5 パターンのドッキング様式のうち 4 パターンにおいて CYP2A6 アミノ酸と基質 CB118 の相互作用が認められた（Fig. 3）。その種類は、アレーン接触（arene attraction）または主鎖水素結合のドナー（backbone hydrogen bond donor）の 2 つであった。相互作用を示したアミノ酸の働きについては、情報収集と解析を進める。

今後の課題
今後、未同定の水酸化 PCB 異性体のフラグメントイオン分析による水酸基置換部位の特定を行うとともに PLIF から得られた相互作用について解析を進め、CB118 代謝産物の絞り込みを行う。
CB118 は一般人に比 べて油症患者におけ る 優先的 な代謝が 考 えられている特徴的な異性体である。そのため、その代謝経路に関する知見はヒトにおける PCB 曝露後の体内挙動の把握において極めて重要である。一連の研究を通して、油症患者における PCB やダイオキシン類の代謝・排泄に関連した治療に寄与していきたい。