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モダンメディア

50巻３号 2004〔新しい検査法〕

LAMP 法を用いた SARS コロナウイルス核酸増幅検査
Genetic detection for SARS coronavirus by LAMP method

田代 眞 人Masato TASHIROの再出現・再流行が危惧されていた。SARS の初期

要

旨

症状は発熱と呼吸器症状であり，臨床的にはインフルエンザウイルスとの区別は難しい。そのため，両SARS の再出現・再流行が危惧される中，SARS者の正確な鑑別診断が極めて重要である。

コロナウイルス感染を簡易，迅速，高感度に検出で発症初期において SARS コロナウイルス感染を診

き，潜伏期から発症早期にかけて信頼性のある診断断する方法としては，鼻腔・咽頭拭い液，血清，便方法の開発が SARS 対策の緊急課題になっていた。などの患者検体からウイルス遺伝子を取り出し，こそこで，国産遺伝子技術である LAMP（Loop-medi-れを増幅して検出する RT-PCR 法が実用化されていated Isothermal Amplificatio）法を測定原理として，る。しかし，検査に要する時間は半日以上であり，SARS コロナウイルス遺伝子を特異的に検出する検目の前の患者の緊急診断には十分に対応できない。

査試薬キット Loopamp® SARS コロナウイルス検出

しかも，検出感度は 50 〜 70％と満足いくものでは

試薬キットを開発し，諸外国の協力により臨床検体なく，たとえ検査結果が陰性であっても，ウイルスを用いた性能評価試験を行った。その結果，昨年感染を否定できないのが現状である。一方，2 時間

12 月 18 日に体外診断用医薬品として承認，保険適程度で診断可能な real-time RT-PCR 法も開発されて用された。本キットは迅速かつ特異的に SARS コロいるが，感度は同程度であり，また高額な特殊機器

ナウイルス遺伝子を検出することができ，SARS 診を必要とするため，一般的な普及は難しい。した断の補助として空港の検疫所，衛生研究所や医療機がって，SARS コロナウイルス感染を短時間に簡単

関等での SARS に対する水際の防御，感染拡大阻止に診断できるような，より感度が高く信頼性のあるに役立つものと期待される。

診断方法の開発が SARS 対策の緊急課題になっていた。

はじめに我々のグループは，長崎大学熱帯医学研究所の森田公一教授，栄研化学と協力して，国産遺伝子技術

SARS（重症急性呼吸器症候群：Severe Acute Re-である LAMP 法１） を測定原理として，特殊な機器

spiratory Syndrome）の患者発生は，東アジアを中を必要とせず，１時間以内に SARS コロナウイルス

心に 32 カ国から報告され，2002 年 11 月 1 日よりの遺伝子を検出できる，感度の良い簡易診断法を開2003 年 7 月 31 日 ま で に， 感 染 者（ 可 能 性 例 を 含発した。この診断法による Loopamp® SARS コロナむ）は 8,098 人，死者 774 人，その致死率は 9.6％

ウイルス検出試薬キットが昨年 12 月 18 日，体外診と な っ た（WHO 報 告 2003 年 9 月 26 日 改 訂 ）。

断用医薬品としての製造承認を得て，保険適用されSARS の病原体は冬季に流行する可能性の高いコロるに至ったので，その概要を紹介する。

ナウイルスの１種であり，低温条件下ではその感染性は予想以上に安定であることから，今冬の SARS
国立感染症研究所 ウイルス第３部〠 208-0011 東京都武蔵村山市学園４−７−１

Department of Virology Ⅲ, National Institute of Infectious Diseases(4-7-1, Gakuen, Musashimurayama-shi, Tokyo)（ 12 ）

モダンメディア63

50巻３号 2004〔新しい検査法〕

Ⅰ．SARS コロナウイルス

他のコロナウイルスとのホモロジーが低く，逆に既存遺伝子データベースに登録されている 47 種類の昨年の２月から東アジアを中心に世界中へ流行がSARS コロナウイルスでは比較的に保存された領域拡大した SARS に対しては，WHO を中心に各国のである。しかも６カ所に対する６種類のプライマー

研究機関が協力して懸命に原因微生物の特定に努力を用いるために，LAMP 法により極めて特異的にした結果，新型のコロナウイルスとして分離された

SARS コロナウイルスが検出可能である。ただし，SARS コロナウイルスが病原ウイルスであることがAY304488 株はプライマー設定領域の 3同定された。このウイルスは，エンベロープを有箇所の変異が存在するため，本キットでの検出感度し，表面に王冠の形をした突起（スパイク）を有すを低下させる可能性がある。

末端に１る直径 100 nm の球形のウイルス粒子であり，ウイ

本 キ ッ ト を 用 い た 検 査 で は， 初 め に ウ イ ル ス

ルス遺伝子は約 3 万塩基のゲノムサイズを持つプラ

RNA 分離用試薬を用いてヒト由来検体中の RNA をス鎖で 1 重鎖 RNA であることが判明した

２〜５）。現抽出し，サンプル溶液を調製する。このサンプル溶

時点では，この genome RNA を特異的に増幅して液と 6 種類の SARS コロナウイルス特異的プライ検出することで SARS コロナウイルスの感染を判定

マー，4 種類のデオキシヌクレオチド 3 リン酸，逆することが，早期診断として唯一の方法である。

転写酵素，鎖置換型 DNA 合成酵素，蛍光・目視検出用試薬（カルセイン）を混合し 62 〜 63℃でイン

Ⅱ．Loopamp® SARS コロナウイルス
検出試薬キット

キュベートする。サンプル溶液中の SARS コロナウ
イルス RNA を基に逆転写酵素により cDNA が合成される。さらに，この cDNA から鎖置換型 DNA 合

本キットは，栄研化学が独自に開発した LAMP成酵素により二重鎖 DNA が複製される。この反応法を測定原理として利用している。LAMP 反応機構

は，基質が消費され尽くされるまで同一温度で限りの 詳 細 は， 栄 研 化 学 の ゲ ノ ム サ イ ト（http://な く 繰 り 返 さ れ，DNA 増 幅 反 応 が 進 行 す る。

loopamp.eiken.co.jp/）を参照されたい。本キット

LAMP 法の大きな特徴は，すべての反応が単一温度はリアクションミックス SARS（6 種類の LAMP 用により進行するので，通常の PCR に用いるサーマ

プライマーと dNTPs の混液）
，蛍光・目視検出試

ルサーキュラーを必要としないことである。核酸増薬，エンザイムミックス（鎖置換型合成酵素と逆転

幅の検出は，反応副産物であるピロリン酸マグネシ

写酵素の混液）， 陽 性 コ ン ト ロ ー ル SARS（SARSウム（白色沈殿物質）による濁度を測定することにRNA），蒸留水から構成されている（図 1）。リアクより行う６）。DNA 産物を電気泳動する必要はない。

ションミックス中に含有される LAMP 用のプライ

また，紫外線照射装置を用いることにより，より明

マーは，多くの RT-PCR と同様に SARS コロナウイ確に目視で判定することも可能である。なお，試薬

ルス genome RNA の Replicase 1B 領域内で設計さ� ��れている（図 2）。プライマーが設計された領域はレプリカーゼ ��（����������）��������������������

レプリカーゼ ��（�������������）F3RNAcDNA

B1cF2
Loop F

F1cB2
B3

図１ Loopamp® SARS コロナウイルス検出試薬キット

図２ LAMP 用プライマーの設計位置（ 13 ）

�����64 モダンメディア

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３）試薬の調製中に含まれているカルセインは，反応前にはマンガンイオンと結合して消光しているが，LAMP 反応がまず，試薬キットに含まれるリアクションミック

進行すると，生成するピロリン酸イオンにマンガン

ス，エンザイムミックスなどの各試薬を室温で解凍

７）イオンを奪われるため蛍光を発するようになる 。

し，解凍後直ちに氷上に保存する。次に，本キットの添付文書に従い，別途用意したマスターミックス

１．操作および判定方法

調製用滅菌チューブに 1 テスト当たりリアクション操作および判定方法の概略を示す。詳細は本キットの添付文書

８）

ミックス SARS 20lL，蛍光・目視検出用試薬 1lL とおよび本キットに関する栄研の専

エ ン ザ イ ム ミ ッ ク ス 1lL を 分 注， 混 合 す る。 な用ウェブサイト（http://loopamp.eiken.co.jp/j/sars/

お，調製したマスターミックスはすぐに使用する。

index.html）を参照されたい。

４）操作，判定

１）検査対象，試験材料の調製方法① マスターミックスとサンプル溶液の混合（氷検査対象は SARS が疑われる有症状者で，検体は上）：まず反応チューブにマスターミックス 20lL

糞便を第一選択とし，鼻腔咽頭拭い液についても検を分注する。次に，サンプル溶液 5lL を添加し，体とすることが可能である。国内では対象検体とし全量 25lL とする。なお，コントロール反応用に，ての承認は見送られたが，海外での検討では，血漿サンプル溶液の代わりに陽性コントロール SARSや血清を用いても，高い検出率が示されている。

5lL を添加した陽性コントロールと，蒸留水 5lL

検 体 は， 糞 便 の 場 合， 約 10 〜 30 倍 量 程 度 のを添加した陰性コントロールをそれぞれ作製する。

0.89％ NaCl 溶液に懸濁し，4000 × g で 20 分遠心後，② リアルタイム濁度検出を行う場合の増幅反応お上清を 0.22lm のフィルターで濾過し，140lL をウよび判定（標準法）（図３）：Loopamp® リアルタ

イルス分離用試薬（QIAamp Viral RNA Mini Kit）

イム濁度測定装置（LA-320C または RT-160C）（図の AVL buffer 560lL と混合し，試験材料液とする。

４）のプログラムを本キット用にあわせる。次に表咽頭鼻腔拭い液の場合は 140lL を AVL buffer と混0.5合し，試験材料液とする。なお，検体を採取する

0.4

際，ならびに採取した患者検体を取り扱う際は通常0.3の病原体に対する臨床検査に準じた十分なバイオハ

濁度

ザード対策を取る必要がある。取り扱う場所，器具

0.2等については施設の安全規定に従って実施する。

0.1２）サンプル溶液の調製

0−0.1

試験材料液 140lL から QIAamp Viral RNA Mini

010152025

Nagative Control

リア RNA 量は 1 検体（1 カラム）当たり 3lg とし，3540SARS RNA 10copies

SARS RNA 400copies

図３

リアルタイム濁度検出による判定

図４ Loopamp® リアルタイム濁度測定装置。左：LA-320C，右：RT-160C（ 14 ）

30Time (min)Kit を使用して RNA 抽出液を得る。この際，キャ溶出は 60lL の AVE buffer で 1 回行う。

545

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示温度が 62.5℃に達していることを確認した後，調ストの各濃度の検体を作製し，複数回測定したとこ製した試料をセットし測定を開始する。陽性コント

ろ，最小検出感度（50％以上の検出率）は 2.3 〜 9.2

ロールと陰性コントロールの濁度の上昇の有無より

コピー / テストであり，100％の検出率を示す検出増幅反応が正常に進行しているか否か確認する。次感度は，10 コピー / テストと考えられた。に，各検体の判定を行う。増幅反応時間内（45 分

また，WHO による盲検検体を用いた SARS 検査間）に濁度の上昇が認められた場合を「陽性」，濁性能評価においては，本検査キットによる結果は，度の上昇がみられない場合を「陰性」とする。最後すべての項目において高い感度と特異性を示したとに酵素失活処理（Loopamp リアルタイム濁度測定の報告を受けている。

装置では自動処理される）が終了していることを確

３．交差反応性認した後，装置から反応チューブを取りだし，そのままキャップを開けずに廃棄する。

SARS コロナウイルスと同じ科に属する他のコロ③ 蛍光目視検出を行う場合の増幅方法および判定

ナウイルス（Serogroup 1 のヒトコロナウイルス，（図 5）：インキュベーター（温度精度が± 0.5℃以

犬コロナウイルス，Serogroup 2 の牛コロナウイル内：ホットボンネット付）を 62 〜 63℃に設定し，ス，ラットコロナウイルスなど）および SARS との表示温度が設定温度に達していることを確認する。

鑑別を要する発熱性疾患の病因ウイルス（インフル

次 に 調 製 し た 試 料 を セ ッ ト し， 増 幅 反 応（62 〜エンザウイルス，RS ウイルス，パラインフルエン

63℃，45 分間）を行う。45 分後にヒートブロックザウイルス，黄熱ウイルスなど）について測定したを用いて酵素失活操作（80℃，5 分間または 95℃，ところ，結果はすべて陰性であり，交差反応は認め2 分間）を行う。判定は，紫外線照射装置を用いてられなかった（表 1）。

反 応 チ ュ ー ブ 底 面 よ り 紫 外 線 を 照 射 し て， 反 応
チューブ側面より目を眼鏡等で保護した状態で観察

４．妨害物質，抗凝固剤して行う。陽性コントロール SARS と同様に緑色の遊離型ビリルビン（10.2mg/dL），抱合型ビリル

蛍光を発すれば陽性で，陰性コントロールと同様にビ ン（19.8mg/dL）， 乳 ビ（ ホ ル マ ジ ン 濁 度 2,470

蛍光を発しなければ陰性と判定する。

度）による測定への影響は認められなかった。
ヘパリンは 12.5U/mL では，増幅反応開始時間の２．最低検出感度遅延をもたらし，50U/mL では陽性検体の陰性化が陽性検体 3 検体を希釈して 74 〜 0.49 コピー / テ
表１ 交差反応性
ヒトコロナウイルス（SerogroupG1）

４株 陰性ヒト腸コロナウイルス（SerogroupG1）

１株 陰性

猫コロナウイルス（SerogroupG1）

３株 陰性

牛コロナウイルス（SerogroupG2）

３株 陰性

犬コロナウイルス（SerogroupG1）

２株 陰性

ウサギコロナウイルス

１株 陰性

ラットコロナウイルス（SerogroupG2）

１株 陰性

マウス肝炎ウイルス（SerogroupG2）

１株 陰性

鶏伝染性気管支炎ウイルス（SerogroupG3） １株 陰性−＋SARS RNA図５

蛍光目視検出による判定（ 15 ）

豚伝染性胃腸炎ウイルス（SerogroupG1）

１株 陰性

猫伝染性腹膜炎ウイルス（SerogroupG1）

１株 陰性

インフルエンザウイルスA

８株 陰性インフルエンザウイルス

Ｂ

４株 陰性

ＲＳウイルス（呼吸器合胞ウイルス）２株 陰性麻疹ウイルス

１株 陰性

デング熱ウイルス

１株 陰性黄熱ウイルス

１株 陰性

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50巻３号 2004〔新しい検査法〕認められた。EDTA（7.5mg/mL）およびクエン酸る臨床評価について，WHO の症例定義に従った臨Na（1.26％）による測定への影響は認められなかっ

床診断，および検体の種類別に，本キットによる判た。したがって，血漿を検体とする場合には，ヘパ定結果を集計した結果の一部を表 2 に，さらに検リンは用いないほうがよい。

体の採取時期別の陽性率を糞便，鼻腔咽頭拭い液について表 3 に示す。

Ⅲ．臨床成績

発症当時の WHO の症例定義に従って SARS 可能性例とみなされた症例から得られた検体について，本キットを用いて，国立感染症研究所を中心とす

リアルタイム濁度検出による陽性率は，検体別に糞る香港，ベトナム，シンガポール，台湾等との国際便：81.0 ％（64/79）， 鼻 腔 咽 頭 拭 い 液：56.3 ％協力による臨床評価と長崎大学熱帯医学研究所によ（9/16），鼻腔咽頭うがい液，吸引液，喀痰：42.9％

表２ 臨床性能試験の総集計
臨床診断

SARS ＃１

検体の種類

本キット
（蛍光目視）

陽性

陰性

陽性

陰性

7964156118

鼻腔咽頭拭い液169797

鼻腔咽頭うがい液，吸引液，喀痰

1468410血清
SARS 疑い例

本キット（リアルタイム濁度）

糞便

合計
＃2ｎ78

21571444187

100878879

血清91818

SARS 可能性例＃ 2 血清103737

接触者

血清1431512816117

不明＃ 3

血清，血漿315262281932416922160

糞便

50505

鼻腔咽頭拭い液20202

鼻咽腔，気管吸引液

30303

合計

非 SARS 患者

血清30030

不明＃ 4

血漿10010010

健常人

血清，血漿

4704704797097067

合計

注１）＃ 1：発症当時の WHO の症例定義に従って SARS 可能性例とみなされ，さらに血清学的に感染が確認された例。
＃2：発症当時の WHO の症例定義に従って判定された例。
＃3：施設がおそらく SARS と考えている、あるいは他の PCR で陽性であった例。
＃4：施設がおそらく非 SARS 患者と考えている例。
注２）リアルタイム濁度判定と蛍光目視判定で母数が異なるのは、蛍光目視で検討が行われなかった検体が含まれる。

表３ 検体採取時期による陽性率
臨床診断

検体本キット（由来）判定
糞便SARS
鼻腔咽頭ｎ

検体採取日：発症日からの日数
発症当日 １〜７日 ８〜14日 15〜21日 22〜66日

陽性643121617陰性

1514262

陽性率

81.0％

75.0％

75.0％

88.9％

73.9％

88.9％

陽性

916110陰性

724001

陽性率

56.3％

33.3％

60.0％

100.0％

100.0％

0.0％（ 16 ）

16

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6750巻３号 2004〔新しい検査法〕（6/14），血清：26.9％（21/78）であった。また，

SARS 患者が発生している中国における速やかな現蛍光目視検出による陽性率はそれぞれ順に，77.2％

地での対応と，WHO および各国関係機関の協力に（61/79），56.3 ％（9/16），28.6 ％（4/14），24.1 ％よ り， 幸 い に も 現 実 化 は し て い な い。 し か し，（14/58）であった。さらに，SARS 疑い例，可能性

SARS の予防に関しては，現時点では積極的手段は例，不明（過去に SARS 陽性と判定された例）と，存在しない。感染予防や発症・重症化阻止に有効な

SARS 患者接触者からの血清，血漿検体では，本医薬品も確立されておらず，ワクチン開発も実用化

キットのリア ル タ イ ム濁 度 検 出に よ る 陽性率はまでには最短でも 2 〜 3 年はかかる。したがって，12.4 ％（24/193），蛍光目視検出による陽性率は依然として早期発見と隔離が重要であることに変わ12.1％（22/182）であった。一方，非 SARS 患者，りなく，本キットが SARS 診断の補助として日本の不明（施設が非 SARS 患者と考えている例），健常水際での防御，感染拡大を防ぐ一助になるものと考人の血清，血漿，その他の 97 検体では，本キットえられる。高価な特殊機器を必要とせず，簡便に短によるリアルタイム濁度検出，蛍光目視検出ともに時間で結果の判定が可能な本キットは，現行の RT-すべて陰性であった。

PCR に 比 べ て 特 異 性 と 感 度 が 高 い こ と と 相 ま っまた，糞便を検体とした場合，陽性率は発症後かて，諸外国においても高い関心が寄せられており，ら高いが 10 日前後が最も高かった。一方，血清・広く普及することが期待されている。

血漿を用いた試験では，発症早期においても 50 〜

また，本キットで用いられた測定原理を応用して，他の多くの新興，再興感染症を簡易，迅速に検80％前後の陽性率が報告されている。
今回の臨床検討に用いた検体は，日本での SARS可能性例の発生がないために，すべて海外研究機関出し，感染拡大阻止に役立つ試薬が開発されることを期待したい。に依存している。SARS 発生初期の混乱と原因病原文体がわからない中で検体も採取されていたため，背献景情報が十分な適切な検体で臨床評価ができたとは言えない。そのため，本キットによる適切な測定時期，血清検体での検討等まだ十分ではない部分がある。検体量を増したり，RNA を濃縮すると更に感度は上昇するが，現行の一般的な方法では，発症早期における陽性率は 80％にとどまっている。そのため，厚生労働省によりさらなる情報収集，血清等での有用性の確立など本キットの性能向上を求める承認条件が付けられている。
SARS 患者では，潜伏期から発症後５日目まではいずれの検体においてもウイルス含有量が極めて低いことが示されており，どのような方法を用いても９）検出できない可能性も存在する 。したがって，こ
こにウイルス遺伝子検出による SARS コロナウイル
ス感染診断の限界があるのかもしれない。今後，栄研化学，および関係機関と協力して本キットのさらなる性能向上を図ることを考えている。

おわりにインフルエンザの流行時期と重なって SARS が再流行するという懸念は，2003 年 12 月から一般の

１）Notomi T., Okayama H., Masubuchi H., et al.: Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res
28: E63, 2000.
２）Ksiazek T.G., Erdman D., Goldsmith C.S., et al.:A novelcoronavirus associated with svere acute respiratory syndrome. N Engl J Med 348:1953-1966,2003.
３）Drosten C., Gunther S., Preiser W., et al.: Identification ofa novel coronavirus in patients with severe acute respiratory syndrome. N Engl J Med 348:1967-1976,2003.
４）Marra MA, Jones SJM, Astell CR, et al. : The genome sequence of the SARS-associated coronavirus. Science 300:
1399-1404, 2003.
５）Holmes KV : SARS-associated coronavirus. N Engl J Med
348:1948-1951,2003.
６）Mori Y., Nagamine K., Tomita N., et al.: Detection of loopmediated isothermal amplification reaction by turbidity
derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem Biophys Res Commun 289: 150-154, 2001.
７）富田憲弘，森安義，納富継宣：第 26 回日本分子生物学会年会プログラム・講演要旨集，2003.
８）栄研化学株式会社 Loopamp® SARS コロナウイルス検
出試薬キット添付文書
９）Peiris JSM, Chu CM, Cheng VCC, et al.: Clinicalprogression and viral load in a community outbreak ofcoronavirus-associated SARS pneumonia: a prospective
study. Lancet 361: 1767-1772, 2003.

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