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高成功率PCR酵素『KOD FX』を用いた
毛根サンプルからの簡便な増幅例
東洋紡績（株） 敦賀バイオ研究所 杉山 明生
はじめ に『KOD FX』は、様々な優れた特性を有するPCR酵素『KOD DNA Polymerase』をベースに開発された高性能PCR試薬です。
本酵素は、優れた「増幅成功率」、「増幅効率」、「伸長性」を示し、様々な増幅実験において確実にPCR産物を得ることができます。特に、その優れた「増幅成功率」については、クルードなサンプルを鋳型に用いる場合においても十分に発揮されます。
例えば、全血や培養細胞を直接PCR反応液に添加した場合においても、良好な増幅が得られることを確認しています。また、マウステールや植物サンプル（葉、米粒）の場合は、簡便な前処理にて調製したライセートをPCR反応液に添加するだけで、確実に増幅産物が得られます。つまり、従来、サンプルからDNAを一旦精製してから行っていたようなPCR実験も、『KOD FX』を用いることによって、DNAの精製が不要になったり、簡単な前処理のみでPCR増幅が可能になります。
今回は、クルードかつ微量サンプルからの実施例として、毛根サンプルからの簡便なPCR増幅を試みました。毛根サンプルは、非侵襲的に取得できることから、法医学の分野のみでなく、分子生物学実験にも用いられることがあります。しかし、毛根サンプルは、微量なためDNA含量が少なく、かつ毛髪中の色素メラニンはPCR阻害物質であることから、DNAを精製するには高度な技術と労力が要求されます。そこで、
ここでは、『KOD FX』とアルカリ抽出法を組み合わせることによって、毛根サンプルからDNAを精製することなく、簡便にPCR増幅を行うことを試みました。その方法および結果をご紹介いたします。

方法（1）アルカリ溶解法による毛根ライセートの調製
毛根は、ヒト毛髪の根元から約2mm程度のところで切断し、毛根を含む部分をサンプルとしました。これを5本使用し、図1に示すアルカリ溶解法にてライセートを調製しました。なお、本方法では、毛根は完全に溶解しませんのでご注意ください（完全に溶解させる必要はありません）。また、溶解液の核酸濃度は測定できませんでした。
（2）PCR反応
PCR反応は、（ 1）で調製したライセート2μlを直接PCR反応液に添加し、以下の条件にて実施しました。
①反応液組成PCR grade water

9μl

2x PCR buffer for KOD FX

25μl

2mM dNTPs

10μl

10pmol /μl Primer ＃1

1.5 μl10pmol /μl Primer ＃2

1.5 μl

毛根ライセート2μl

毛根（上図ご参照）5本KOD FX（1.0U/μl）

1μl↓←50mM NaOH 18μlを加え、Vortexにて良く攪拌

Total reaction volume50μl↓95℃ 10min インキュベート

ヒト毛髪の根元から約2mm程度を使用↓←1M Tris-HCl（pH8.0）2μlを加え、Vortexにて良く攪拌

Target：ヒトβ-globin 1.3kb↓12,000rpm 5min

Primer ＃1：TTAGGCCTTAGCGGGCTTAGAC

上清2μlをPCR反応に使用

Primer ＃2：CCAGGATTTTTGATGGGACACG（※熱アルカリ溶液の取り扱いに十分ご注意ください。）②PCRサイクル※1
図1. 毛根ライセートの調製方法（アルカリ溶解法）

94℃, 2min.
98℃, 10sec.
68℃, 1.5min※240 cycles※1 プライマーのTm値が73℃未満の場合は、Tm-5℃、30sec.のアニーリングステップを加えた3ステップのサイクルをお薦めします。
※2 1 min./kbを目安に設定します。

また、比較のためTaqベースの他社PCR酵素を用いて、取り扱い説明書推奨の条件にてPCRを実施し（サイクルは同じく40サイクル）、比較を行いました。

200915

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結果および考察TaqベースPCR酵素

KOD FX
1234A社高効率PCR酵素
5 M 123

B社LongPCR酵素

4 5 M

1234 5

1.3 kb

1, 2：毛根ライセート
3, 4：Negative Control（毛根を入れずに調製したライセート）
5：Positive Control（鋳型として精製ヒトゲノムDNA 5ngを使用）
M：1kb DNA Ladder
図2. 毛根ライセートの直接PCR結果

PCR産物を、1％アガロースゲルに5μlアプライして解析を行いました（図2）。その結果、KOD FXを用いた場合のみ、明瞭な増幅が確認できました。一方、比較に用いたTaqベースのPCR酵素では、精製したゲノムDNAを用いたポジティブコントロールでは増幅が確認できるものの、毛根ライセートをサンプルとした場合には、ほとんど増幅が見られませんでした。
毛根サンプルに存在するDNA量はごく微量であるため、そのDNAを増幅する場合、細胞中でのコピー数が多いミトコンドリアDNAをターゲットとするのが一般的です。しかし今回、KOD FXでは、簡便な「アルカリ溶解法」で調製したライセートを鋳型に、核DNA上の1.3kbという比較的長いターゲットでも増幅が可能でした。これは、従来のTaqベースのPCR酵素と比較して、KOD FXがクルードサンプルに強いことに加え、増幅効率の点においても圧倒的に優れていることによるものと考えられました。

まとめ
毛根等の微量サンプルからのDNA精製は、高度な技術が必要であり、かつ大変神経を使う作業を伴います。さらに、DNA抽出におけるステップが増えるほど、クロスコンタミネーションの危険も高まり、多検体処理も困難になります。一方、上述の「アルカリ溶解法」
は短時間でPCR用のサンプルを調製可能であり、KOD FXと組み合わせることで、簡便・迅速に微量サンプルからの遺伝子増幅を実現することができます。微量生体サンプルを用いるPCR実験をされる際は、是非、本方法をお試しください。

マウステールや植物サンプル実施例はこちら！

品名および内容
KOD FX
KOD FX（1U/μl）
2×PCR Buffer for KOD FX
2mM dNTPs
2×PCR Buffer for KOD FX

1

弊社ウェブページwww.toyobo.co.jp/bio

包装

2KOD FXコーナー

保存温度

Code No.

価200U×1本［200回用＊］-20℃

KFX-101￥35,000

格（200U×1本）
× 5［1,000回用＊］-20℃

KFX-101X5￥140,000（200U×1本）
×10［2,000回用＊］-20℃

KFX-101X10￥260,000

1.7ml×3本-20℃

KFX-1B￥5,000＊50 μl反応を行った時の反応回数を表示しています。
※KOD FXで増幅されたDNA断片は平滑化されているため、通常のTAクローニングはできません。TArget Clone™ -Plus-をお使いください。

品名および内容
KOD用高効率TAクローニングキット

TArget Clone™ -Plus-

装

保存温度

Code No.

価

10回用-20℃

TAK-201￥16,000

包16格2009