革新的インフルエンザウイルス創薬プロジェクト

研究概要集

平成 29 年 3 月 13 日

プロジェクトリーダー

公益財団法人朴三用

神奈川科学技術アカデミー

目次
1. はじめに ���������������������������������������� （1）2. 基本構想 ���������������������������������������� （1）3. 研究成果 ���������������������������������������� （3）(1) 化合物の探索 ������������������������������������� （3）(2) RNA ポリメラーゼによるモノクローナル抗体作製��������������������� （4）4. 今後の展望 ��������������������������������������� （4）5. 業績 ������������������������������������������ （6）6. プロジェクト参加者一覧 ��������������������������������� （9）＜研究報告＞
抗体を用いた抗インフルエンザウイルス薬の開発�����������������������

1

インフルエンザウイルス RNA ポリメラーゼ PA-PB1 サブユニット間結合阻害剤の開発 �������

7

宇宙の微小重力環境を利用した高品質タンパク質結晶の作製と創薬への応用�����������

15

インフルエンザウイルス RNA ポリメラーゼ複合体の核移行に関する構造生物学的研究 �������

23

総 括
1. はじめに
インフルエンザウイルスには、抗原性の大きな違いからウイルス粒子の外被表面のタンパク質である HA(ヘマグルチニン)16 種類と NA(ノイラミニダーゼ)9 種類の組み合わせにより、144 通りの亜型が存在し得る。20 世紀に入り人類は３回の新型インフルエンザの登場を経験した。1918 年に出現したスペイン型インフルエンザ（H1N1）は、世界中で 2,000〜
4,000 万人の死者を出した。このウイルスは様々な変異を引き起こしつつ、流行が 39 年間続き、1957 年からは新型アジア型（H2N2）と香港型（H3N2）へ姿を変えた。新型インフル
エンザが出現すれば、人類は過去にこの新型ウイルスの感染を受けたことがないため当然
体内に中和抗体は存在せず、また対応するワクチンの開発にも時間がかかるため、新型ウ
イルスの感染者が一時的に増加し、世界規模での大流行（パンデミック）となることは容易に予想される。
新型インフルエンザを始め、鳥インフルエンザ H5N1 は世界的な大流行が懸念され、日本を含め、世界的な規模による具体的な対策が必要とされている。我が国も新型インフルエ
ンザウイルスの対策を昨年度から本格的に打ち出しており、 新型インフルエンザに変異する可能性が高い鳥インフルエンザ（H5N1）をもとにすでに製剤化されているプレ・パンデ
ミックワクチンや、抗ウイルス剤であるタミフルやリレンザなどの備蓄をしている。厚労省の報告によると日本でパンデミックが起きた場合、感染者 3200 万人、死者最大 64 万人と予想されている。しかし、インフルエンザは非常に変異を起こしやすいため、次のパンデミックを引き起こす亜型を予測するのは困難であり、その際に現在備蓄しているワクチンや薬剤が有効であるかは不透明である。このような観点から、変異をほとんど起こさな
いインフルエンザウイルスの RNA ポリメラーゼが全世界の製薬会社をはじめ各研究機関か
ら重要な創薬ターゲットとして注目されている。

2. 基本構想
インフルエンザ RNA ポリメラーゼは、ウイルスの複製(増殖)に中心的な役割を担っている事から、創薬のターゲットとして注目されている。また、新型インフルエンザ H1N1 と鳥
インフルエンザ（H5N1、H7N9）などのそれぞれインフルエンザウイルスの RNA ポリメラー
ゼのアミノ酸配列は 96%以上が同じであり、他のインフルエンザウイルスのタンパク質より、変異が非常に起こりにくいことが知られている。このような観点から、RNA ポリメラーゼをターゲットとした阻害剤が開発されると普遍的にインフルエンザウイルスの増殖を抑える事が出来る。
（1）

近年、世界中に広がりを見せている鳥インフルエンザ（H5N1,H7N9）は深刻である。特に、東南アジアやエジプトでは鳥における H5N1 ウイルスの流行は毎年起きており、偶発的にヒトへ感染した数も数百人を超え毎年増加している。昨年では中国で発生した H7N9 によるヒトへの感染報告が続いており、確認された感染者が 664 人を超えた。国内でも、野鳥から鶏への感染事例は年々増え続けており、経済的損失や健康面での不安など社会へ深刻な影響を与えている。ただ、宿主となる生物種が亜型により異なるため、鳥型ウイルスはヒトにも感染できる型へ大きく変異しておらず、今のところ大流行を起こす状態には至っていない。しかし、ヒト型に変異する危険性は確実に存在しており、すでに、免疫システムが人と似ているフェレットの感染実験で、HA に３カ所の変異を入れた結果、次々とフェレッ
ト同士で感染が確認された（Nature, 2012）。この研究は、鳥インフルエンザ H5N1 ウイル
スが人に容易に感染するようになり、世界的パンデミックを起こす可能性があると報告している。また、この研究結果は世界保健機関（WHO）とアメリカ政府の要請で、生物テロに悪用されるとの懸念から、科学雑誌社（Nature, 2012）に対して公表を差し止めるなど異例の対応が求められた。現在でも持続的に感染の広がりを見せている中国では、鳥インフ
ルエンザ H7N9 のヒトへの感染報告が続いており、確認された感染者が数百人を超え、WHOによる警戒が続いている。今後、別の亜型の新型インフルエンザウイルスが出現する可能性はあるが、どのように変異を繰り返してどのような亜型が出現するのかを予測することは不可能に近い。
インフルエンザウイルスゲノム（vRNA）は８本に分節化された一本鎖 RNA であり、その極性は mRNA（プラス鎖）と逆の極性（マイナス鎖）RNA である。このマイナス鎖ゲノム RNA
を鋳型にして、プラス鎖 cRNA（complementary RNA）が合成される。子孫 vRNA は cRNA を鋳型とした複製により増幅される。これらの反応は、ウイルスにコードされている RNA 依存
性 RNA ポリメラーゼとヌクレオキャプシドタンパク質（NP）の結合した vRNP 複合体（viralribonucleoprotein complex）によって行われている。
本研究プロジェクトでは、インフルエンザ RNA ポリメラーゼが持つ 3 つのサブユニット(PA, PB1, PB2)のうち、どれか１つのサブユニットでも欠けるとウイルスの増殖機構が失われる事に注目し、PA-PB1 と PB1-PB2 サブユニット複合体の構造解析に世界で初めて成功
した（Nature, 2008; EMBO J, 2009）。その知見を基に本研究では、これらの RNA ポリメ
ラーゼの構造情報に基付きイン・シリコ（in-silico）手法による抗ウイルス剤の開発を目
指す。

（2）

図. インフルエンザウイルス RNA ポリメラーゼ PA-PB1 の構造に基着くイン・シリコ手法
コンピュータ上で化合物をドッキングさせ、化合物の探索を行う。

3. 研究成果
本プロジェクトでは、創薬の基盤になる RNA ポリメラーゼの PA-PB1 と PB1-PB2 サブユニット複合体の構造解明に世界で初めて成功しており、その構造情報に基づき、イン・シリ
コ手法により、新規抗インフルエンザ剤の開発を行った。また、各インフルエンザウイル
ス亜型における RNA ポリメラーゼのタンパク質は、96%以上アミノ酸が保存されている事から、宿主細胞内でインフルエンザウイルスの増殖を阻害できる RNA ポリメラーゼを標的としたモノクローナル抗体を開発し、RNA ポリメラーゼタンパク質と抗体の立体構造解明を行った。このような抗インフルエンザ阻害剤や、ウイルス増殖を阻害する抗体は、インフル
エンザウイルスの変異に強く、既存の抗インフルエンザウイルス剤やワクチンでは対応できないどんな新型インフルエンザにも対応できる画期的なものになることが期待される。

(1) 化合物の探索
インフルエンザ RNA ポリメラーゼが持つ 3 つのサブユニット(PA, PB1, PB2)のうち、どれか１つのサブユニットでも欠けるとウイルスの増殖機構が失われる。この事から、PA-PB1
サブユニット複合体の構造から探索される、PA と PB1 サブユニットの結合を阻害する化合物は、抗ウイルス剤の創薬につながると考えられる。PA-PB1 サブユニット複合体の構造を基にイン・シリコ手法により 200 万個の化合物の中から、有効な化合物数個を発見する事に成功した。現在までに有効性化合物の in-vitro での探索方法は確立しており、さらに有（3）効性化合物の開発を行った。上に示した図は、PA サブユニットの構造に 200 万個の化合物を結合させ、もっとも安定に結合する化合物の探索を行った手法を示している（イン・シ
リコ手法）。最終的に 200 万個の化合物から、化合物の分子量 300-500 の範囲で、4261 個の化合物を得る事ができた。イン・シリコ手法により探索された 4 千個あまりの化合物の中から、200 個程度の化合物で in-vitro によるより詳細な探索を行った。PA タンパク質と化合物との結合実験方法は、すでに確立している。その方法によりさらに、3 個の有効性化合物を見つける事ができた。また、ヒトの細胞による in-vivo 系によりウイルスの増殖を阻害する事も確認した。この方法に基づき、多くの化合物との結合を調べるスクリーニング
を迅速に行うことが可能にした。また、化合物が PA タンパク質と PB1 タンパク質の結合を選択的に阻害する事を確認するための、ITC 測定や GST を用いた共沈殿法による技術も確立した。今後、化合物の最適化を行い、さらに有効性化合物の開発を目指す。

(2) RNA ポリメラーゼによるモノクローナル抗体作製
これまでタンパク質の精製すら困難であった RNA ポリメラーゼを標的としたモノクロー
ナル抗体を作製し、宿主細胞内でインフルエンザウイルスの増殖を阻害する抗体開発を行った。さらに、抗体を応用したヒト宿主細胞内でのウイルス増殖メカニズムの解明、抗体とのタンパク質複合体の構造解明を行った。このようなアプローチは、新たな抗ウイルス剤の開発手法であり、今までの抗インフルエンザウイルスの阻害剤開発と全く異なる試みである。
PA-PB1 タンパク質（A/H1N1 由来）を抗原としたマウスモノクローナル抗体を作製した。
さらに精製抗体を蛍光ラベル化し宿主細胞へ簡便に導入する方法やウイルスの増殖を簡便に確認する技術を開発しながら、阻害抗体の樹立に成功した。宿主細胞である MDCK 細胞に
インフルエンザウイルス（A/H3N2）を感染させ、８時間後、ウイルスの増殖を観察すると、抗体が導入された細胞では、ウイルスの増殖は観察されなかった。一方、抗体が導入されていない細胞やコントロール抗体導入細胞では、ウイルスが増殖していることが確認された。また、抗体は、強毒性である H5N1 の PA-PB1 タンパク質とも強く結合することを確認しており、汎用性の高い阻害抗体であることが示唆された。また、PB2 の RNA 結合部位から作製した２個の抗体において、抗原タンパク質（PB2）との結合が認められた。その中から、PB2 3-1.6 抗体は分子生物学的研究ツールでの診断試薬に使用可能なものとして特許出願(特願 2014-068824)をしており、民間会社へのライセンス契約に成功した。

4.

今後の展望
本プロジェクト研究は、新型インフルエンザウイルス用薬剤開発の構造基盤である RNA（4）ポリメラーゼの構造に基づき、イン・シリコ手法による創薬を目指す研究である。世界中の製薬会社や研究機関において、普遍的にインフルエンザウイルスの増殖を抑えることができる化合物や、ワクチンなどの開発が行われており、世界的な競争になっている。本プ
ロジェクトのリーダーによる RNA ポリメラーゼの構造解明の国内外での反響は大きく、各種メディアにも取り上げられ、社会的に大きな期待が集まっており、社会的に貢献できる成果である事を示している。本研究により新たな抗ウイルス薬が開発されれば、それは国内だけではなく全世界の医療への貢献が期待され、経済的な効果は計り知れない。その反面、厳しい競争になると予想される。そこで、より品質の高い研究データを得るために、
独立行政法人宇宙航空研究開発機構（ＪＡＸＡ）のＪＥＭ利用高品質タンパク質結晶生成
実験（第２期第１回実験、第２期第２回実験に参加し、国際宇宙ステーション「きぼう」
日本実験棟の実験装置を使用したタンパク質結晶生成実験を行った。地上で作製するタン
パク質の結晶と、宇宙環境で作製するタンパク質の結晶を比較し研究・実験を行うことにより、今後の抗ウイルス剤の創薬研究の発展に大いに期待が持てる。

（5）

5. 業績
原著論文
1. Sugiyama K, Iyori M, Sawaguchi A, Akashi S, Tame JR, Park SY, Yoshida S. The crystal
structure of the active domain of Anopheles anti-platelet protein, a powerfulanti-coagulant, in complex with an antibody. J Biol Chem. 289(23):16303-16312.
2014.
2. Yoshida H, Park SY, Oda T, Akiyoshi T, Sato M, Shirouzu M, Tsuda K, Kuwasako K,
Unzai S, Muto Y, Urano T, Obayashi E. A novel 3' splice site recognition by thetwo zinc fingers in the U2AF small subunit. Genes Dev. 29(15):1649-60. 2015.
3. Ohki M, Sugiyama K, Kawai F, Tanaka H, Nihei Y, Unzai S, Takebe M, Matsunaga S,
Adachi S, Shibayama N, Zhou Z, Koyama R, Ikegaya Y, Takahashi T, Tame JR, Iseki
M, Park SY. Structural insight into photoactivation of an adenylate cyclase froma photosynthetic cyanobacterium. Proc Natl Acad Sci U S A. 113(24):6659-64. 2016.
4. Hirano T, Sugiyama K, Sakaki Y, Hakamata W, Park SY, Nishio T.Structure-based
analysis of domain function of chitin oligosaccharide deacetylase from Vibrio

parahaemolyticus.FEBS Lett. 589(1), 145-151. 2015.
5. Shibayama N, Sugiyama K, Tame JR, Park SY.Capturing the hemoglobin allosterictransition in a single crystal form.J Am Chem Soc. 136(13), 5097-5105, 2014.
6. Kikuchi J, Shibayama N, Yamada S, Wada T, Nobuyoshi M, Izumi T, Akutsu M, Kano
Y, Sugiyama K, Ohki M, Park SY, Furukawa Y. Homopiperazine derivatives as a novel
class of proteasome inhibitors with a unique mode of proteasome binding. PLoS

One. 8(4), e60649, 2013

総説
1. Yoshida H, Park SY.「宇宙における高品質タンパク質結晶化技術の伝承と可能性」Int.

J. Microgravity Sci. Appl. 34(1). 2017
2. 杉山佳奈子.「血小板凝集阻害蛋白質 AAPP の構造と機能」日本血栓止血学会誌, 27(3),358-364,2016
3. 平野貴子, 杉山佳奈子, 坂木祐太, 上原理絵, 白石春香, 袴田航, 朴三用, 西尾俊幸.
「Vibrio 属細菌由来キチンオリゴ糖脱アセチル化酵素の諸性質・構造及び生成糖の生理機能」 応用糖質科学, 5(2), 113-119, 2015（6）

口頭発表(招待講演)
1. Park S-Y. 「The structural basis for an essential subunit interaction in influenza
virus RNA polymerase」 MISSCA 2013 (MEETING OF THE ITALIAN, SPANISH AND SWISSCRYSTALLOGRAPHIC ASSOCIATIONS) Sep. 10, 2013, Como Italy.
2. Sugiyama K., Park S-Y. 「The crystal structure of the Active domain of AAPP, apowerful anti-coagulant, in complex with an antibody」 IUCR 2014 (CONGRESS AND
GENERAL ASSEMBLY OF THE INTERNATIONAL UNION OF CRYSTALLOGRAPHY, Aug. 9. Montreal,
Canada.
3. 朴三用、「新規抗ウイルス薬の開発基盤となる RNA ポリメラーゼの構造解析」CBI 学会
2013 年大会-生命医薬情報学連合大会、タワーホール船堀、2013 年 10 月 31 日.

口頭発表(一般講演)
1. 吉田尚史 「インフルエンザ RNA ポリメラーゼ PB1-imporitnα 複合体の試料調製と結晶化」 高品質蛋白質結晶化技術の宇宙科学研究拠点形成事業 技術プラットフォーム
形成研究会 （株）丸和栄養食品（奈良県）、2015 年 9 月 15 日
2. 吉田尚史 「インフルエンザ RNA ポリメラーゼ PB1-imporitnα 複合体の試料調製と結晶化：検討事例と適応例」 高品質蛋白質結晶化技術の宇宙科学研究拠点形成事業 技術プラットフォーム形成研究会 東京大学弥生講堂（東京都）、2016 年 2 月 22 日
3. 吉田尚史「RNA 結合タンパク質の結晶化の精製と結晶化:スプライシング関連蛋白質

U2AF の立体構造解析」 高品質蛋白質結晶化技術の宇宙科学研究拠点形成事業 関東チーム若手向け研究会 神奈川サイエンスパーク（神奈川県）、2016 年 8 月 26 日
4. 杉山佳奈子. 「光活性化アデニル酸シクラーゼの構造解析」
術の宇宙科学研究拠点形成事業

関東チーム若手向け研究会

高品質蛋白質結晶化技
神奈川サイエンスパー

ク（神奈川県）、2016 年 8 月 26 日
5. Sugiyama K, Yoshida H, Park SY. 「Structural and functional study of influenza
viruses' RNA polymerase for develop a new medicine」 2nd international symposiumon space science of high quality protein crystallization technology, Oct. 21, 2016,
Young scientist 5 in Finding fruit of research -young scientist-, Japan

ポスター発表
1. 吉田尚史、朴三用「メチシリン耐性黄色ブドウ球菌由来ペニシリン結合タンパク質 3 のX 線結晶構造解析」、 日本蛋白質科学会、ワークピア横浜／横浜産貿ホール（横浜市）
2014 年 6 月 27 日
（7）

2. Sugiyama K, Yoshida H, Urano T, Park SY.
Structural and functional study of the antibody against influenza viruses' RNApolymerase to discover a new medicine for the influenza disease.
The 30th European Crystallographic Meeting, 28th August - 1st September 2016,
MS5-P9, Switzerland
3. Ohki M, Sugiyama K, Kawai F, Matsunaga S, Iseki M, Park SY.
Structural basis for photoactivation of a light-regulated adenylate cyclase fromthe photosynthetic cyanobacterium Oscillatoria acuminate
The 30th European Crystallographic Meeting, 28th August - 1st September 2016,
M13-P5, Switzerland
4. Yoshida H, Sugiyama K, Park SY.
The structural basis for an essential subunit interaction in influenza virus RNA
polymerase.
The 27th European Crystallographic Meeting, MS5-P50, August 2015, Croatia
5. Sugiyama K, Iyori M, Sawaguchi A, Akashi S, Tame R.H.J, Yoshida S, Park SY.
The crystal structure of the active domain of Anopheles anti-platelet protein(AAPP), a powerful anti-coagulant, in complex with an antibody.
The

23rd

Congress

and General

Assembly of theInternational

Union of

Crystallography (IUCr), MS53.P40, August 2014, Canada
6. Yoshida H, Sugiyama K, Park SY.
The structural basis for the essential PA-PB1 subunit interaction in influenza
RNA polymerase.
The 47th crystallographic course at Ettore Majorana Centre, Erice, May 30 to June
8 2014, Italy

記者発表・取材
1. 2013 年 4 月 20 日（土）付けの読売新聞朝刊に掲載;
タイトル：「インフル新薬に取り組む」
2. 独立行政法人宇宙航空研究開発機構（ＪＡＸＡ）から取材を受け、同機構発行の機関誌「ＪＡＸＡ’Ｓ」に掲載
タイトル：「人類とウイルスの総力戦に挑む タンパク質結晶生成実験 in cosmo」
3. 2013 年 11 月 7 日 NHK おはよう日本、“新型インフル進む新薬研究—宇宙実験開始”
4. 2014 年 1 月 24 日 神奈川新聞 “新たな薬開発へ弾み”（8）特許 国内出願 2 件（うち未公開 1 件）
インフルエンザウイルスの RNA 依存性 RNA ポリメラーゼの PB2 サブユニットに対するモノクローナル抗体（特願 2014-68824）

共同研究 7 機関 4 件

6. プロジェクト参加者一覧
氏名

役職

在籍期間

朴 三用

非常勤プロジェクトリーダー

平成 25 年 4 月〜平成 29 年 3 月

横浜市立大学生命医科学研究科 教授 兼任
杉山 佳奈子

常勤研究員

平成 25 年 4 月〜平成 29 年 3 月

吉田 尚史

常勤研究員

平成 26 年 4 月〜平成 29 年 3 月

浦野 健

非常勤研究員平成 25 年 4 月〜平成 29 年 3 月

島根大学医学部 教授 兼任
西村 善文

非常勤研究員平成 26 年 4 月〜平成 29 年 3 月

横浜市立大学生命医科学研究科 教授 兼任
平成 26 年 10 月〜平成 29 年 3 月

中平 徹

研究補助員

大木 規央

研究協力員（横浜市立大学大学院） 平成 25 年 10 月〜平成 29 年 3 月

長部 勇希

研究協力員（横浜市立大学大学院） 平成 26 年 4 月〜平成 28 年 3 月

小川 洋司

研究協力員（横浜市立大学大学院） 平成 27 年 4 月〜平成 29 年 3 月

北村 美佳

研究協力員（横浜市立大学大学院） 平成 27 年 4 月〜平成 29 年 3 月

唐沢 朱音

研究協力員（横浜市立大学大学院） 平成 28 年 8 月～平成 29 年 3 月

鎌田 健一

研究協力員（横浜市立大学大学院） 平成 28 年 8 月～平成 29 年 3 月

田口 千絵子

事務補助員

平成 26 年 1 月〜平成 29 年 3 月（9）研 究 報 告抗体を用いた抗インフルエンザウイルス薬の開発
杉山佳奈子・浦野健
1. はじめに間でも 90%以上に保たれている。これは、インフルエンザはインフルエンザウイル

RNA ポリメラーゼがウイルス遺伝子の複スが感染することによって発症する人畜共製と転写を行う、ウイルスの生存には必須

通感染症である。ウイルスが感染すると、なタンパク質であるためだと考えられてい発熱、咳、関節の痛みなどの症状が現れ、る。よって、このタンパク質を阻害するこ

たいていの場合は 3 日～1 週間程度で完治とで、ウイルスの増殖を高確率で阻害するする。通常の季節性インフルエンザであれことができ、また、その阻害剤はどのタイば、感染範囲も想定の範囲内でおさまってプのウイルスに対しても同様の効果を発揮

おり、多くの死者を出すこともなく数ヶ月することができると期待されている。

程度で感染は終息する。時折、非常に感染

本研究ではタンパク質の阻害方法として、力や病原性の強いウイルスが出現し、世界

モノクローナル抗体を用いた。RNA ポリメ

的な大流行(パンデミック)を起こすことがラーゼを抗原として結合する抗体を作成し、ある。近年、高病原性の鳥インフルエンザ

その抗体が細胞内において RNA ポリメラ

ウイルスの人への感染や、これまで用いらーゼの活性を阻害すれば、抗体そのものがれてきた薬剤に対して耐性を持つウイルス薬剤となり得るし、また、その結合部位がの存在が確認されており、多数の死者を出明らかになれば RNA ポリメラーゼと抗体すようなパンデミックを引き起こすウイルとの結合に関与しているアミノ酸を用いたスの登場が危惧されている。[1][2] 起こり

ペ プ チ ド 創 薬 研究 や 低分 子 化 合 物 の in

うるパンデミックに対応するため、これまsilico の構築も考えられるためである。活性でに用いられてきた薬剤とは作用機序の異を阻害しなかった場合であっても、結合がなる新規の薬剤の開発が求められており、確認できればウイルスの検知や RNA ポリ

本研究室では、そのターゲットとしてインメラーゼを用いた分子生物学的なマーカー

フルエンザウイルスの RNA ポリメラーゼとして研究に大いに役立つ抗体を手に入れに注目した。

ることができるため、非常に有効な手段だ

インフルエンザウイルスは遺伝子としてと考えている。

1 本鎖 RNA を持つウイルスであるため、非常に変異を起こしやすい。実際に、現在の2．実験及び結果

薬剤のターゲットとなっている表面タンパ

2-1.抗体の作成
抗原になる RNA ポリメラーゼとしては、

ク質では、A 型インフルエンザウイルスの亜種の中でもその相同性は 30%程度である。 本 研 究 グ ル ー プ で 構 造 解 析 を 行 っ た
一方で、RNA ポリメラーゼの相同性は亜種

PA-PB1[3]及び PB1-PB2 のサブユニット―1―結合部位[4]に加え、PA の Endonuclease

超遠心分析を行った。超遠心分析によってドメイン[5]、
PB2 の C 末端側ドメイン[6]、結合が確認できたサンプルはゲル濾過に通Cap 結合ドメイン[7]を用意した。

し、結合及び分子量の確認を行った。

精製した RNA ポリメラーゼをアジュバ

超遠心分析、ゲル濾過の結果、PA-PB1

ンドと共にマウス(BALB/c、８週齢メス)にでは 1 つ、Cap 結合ドメインでは 2 つの抗注射し、抗体価が上がってきたところで脾

体と抗原の結合が確認できた。Cap に結合臓を回収した。抗体を生産する B 細胞はそする抗体は H1N1 型に限らず多くのタイプのままでは増殖できないため、増殖能を持のインフルエンザウイルスの Cap 結合部位

つ細胞と融合させ、HAT 培地で選択するこに結合することも明らかにしている。

とで抗体生産細胞を作成し、希釈法および
ELISA、免疫沈降法を用いて、抗原に結合2-2.活性阻害能の確認する抗体を生産する単一クローンを分離し得られた抗体が RNA ポリメラーゼの活た。分離した抗体生産細胞をマウス腹腔内性を阻害できるかどうか確認するために、に注射することで、抗体を含んだ腹水を得抗体を細胞に導入し、ウイルスの感染を確た。結果として、PB1-PB2 や PB2 の Cap認した。

結合ドメインの抗体を得ることはできなか

まず、抗体そのものでは細胞に導入する

ったが、PA-PB1 に結合する抗体 13 個、PB2には大きすぎるため、抗原結合部位(Fab)の C 末端ドメインからは 7 個の抗体が得らだけを切り出しビーズ法により物理的に傷れた。

をつけた細胞に混ぜることで抗体を細胞内に導入した。その後、インフルエンザウイ
ルスを感染させ、ウイルスの表面タンパク質である HA を認識する抗体を用いて、ウ
イルスを検出した。
その結果、抗体を組み込んでいない細胞と、Cap 結合ドメインから作成した抗体を導入した細胞ではウイルスが増殖したが、
PA-PB1 に結合する抗体を導入した細胞では、ウイルスの増殖がみられなかった。このことからこの PA-PB1 結合抗体は RNA

図 1. 抗体作成過程イメージ図

ポリメラーゼの活性を阻害し、ウイルスの増殖を防ぐことが明らかになった。そこで、得られた腹水から、陰イオン交換カラム、

PA-PB1 結合抗体によるウイルス増殖阻害

ハイドロキシアパタイトカラムなどを用い機構を明らかにすべく、
PA-PB1 および Fabて抗体を精製した。得られた抗体と抗原のの複合体の構造解析を目指した。なお、Cap

結合を確認するために、各々精製したタン

結合ドメインに結合する抗体に関しては、

パク質をモル比で 1:1 になるように混ぜ、ウイルス検出や研究に用いる特異的抗体と―2―

図 2. 増殖実験結果
ウイルス感染 8 時間後に撮影
PA-PB1 抗体を緑、HA 抗体を赤で染色してある。
緑色の細胞の周囲には赤色のウイルスが出てきていない事がわかる。

して特許を取得し、コスモ・バイオ株式会

乱実験を行ったところ、PA の head ドメイ

社とのライセンス契約を締結している。

ン側に抗体が結合していることが明らかになった。
（図 3） このことから、head ドメ

2-3.PA-PB1-Fab 結合部位の同定

インのみを作成して複合体構造を解析する

2-3-1.結晶化ことを試みたが、残念ながら head ドメイ

これまでの実験で得られたウイルスの増ンを安定かつ大量に得ることができなかっ殖を阻害する抗体が、実際にどのようにた。

PA-PB1 に結合し、その活性を抑えている

H1N1 型 PA-PB1 および Fab を用いた結晶のかを解明するため、PA-PB1 および Fab化では、粗結晶が得られても再現性がない、の複合体の構造解析を目指し、実験を行っ

構造解析に用いるに適した単結晶が作成でた。

きない等の問題を解決することができなか

H1N1 型 PA-PB1 結合部位と Fab の複合った。この原因として、Fab のループ部位

体を用いて結晶化を行った結果、25%(w/v)

が自由に動いて均一ではないフォームを取PEG4,000、0.2M AmSO4 を含む溶液中でり得ることと、PA-PB1 に多くのループ部結晶が得られたが、結晶中に含まれていた位が含まれることが考えられる。そこで、のは Fab のみであり、結合部位は明らかに

まず、PA-PB1 のループ部位を短くしたもできなかった。しかしながら、Fab の構造のをいくつか作成してみたが、head ドメイ

及び、抗原認識部位に位置するアミノ酸のンと同じく、WT に比べて非常に不安定で候補を特定することができた。

あり、結晶化に用いるには至らなかった。

また、PA-PB1-Fab 複合体の X 線小角散

次に Fab のうち、抗原結合部位(Fv)のみを―3―

作成し PA-PB1 との複合体の結晶化を試み

2-3-2．変異体を用いた結合部位の同定

た。Fv の作成としては、大腸菌発現系を用

PA-PB1-Fab および Fv の結晶化が難し

いて作成した不溶性蛋白質のリフォールデいことから、PA-PB1 のどの部位が抗体にィング法と、ブレビバチルス発現系を用い結合しているのかを同定するため、変異体

た可溶化 Fv の作成を行った。どちらも安定実験を行った。前述の通り、X 線小角散乱

な Fv を 1L 培養あたり 0.5mg ほど得るこ

実験および PA 断片を用いた結合実験の結とができたため、PA-PB1 との複合体を作果から、抗体が PA の head ドメインに結合成し、結晶化を行ったが、結晶化溶液中ですることはすでに明らかにしている。X 線

は非常に沈殿しやすく、良質な結晶を得る

小角散乱実験の結果、図 3 で示したようにことができなかった。しかしながら、これ平面的に結合することがわかっていたこと

らの実験の過程において、結晶化におけるから、head ドメイン上部で表面に露出して沈殿のしやすさが Fab よりも PA-PB1 に起いるアミノ酸をアラニンに置換した変異体

因しており、構造解析に用いてきた H1N1

を複数作成し、抗体との結合実験を行った。

型 PA-PB1 よりも H5N1 型および H7N9 型

変異体の部位と結合実験の結果を図 4 に示の方が安定で沈殿しにくいという傾向が得す。

られた。そこで、H7N9 型 PA、および図で示したように、表面に位置するアミ

PA-PB1 を作成し Fab、Fv との共結晶を作

ノ酸のほぼ全ての変異体を作成し、結合実成した。(図 3) H1N1 型を用いていたとき験を行ったが、全ての変異体において抗体には結晶が得られなかった複数の条件におが結合するという結果が得られ、PA-PB1

いて結晶が得られたが、結果としては同様の抗体結合部位を明らかにすることは未だに再現性が乏しく、また非常に小さいことにできていない。

から、構造解析を行うことはできていない。

図 3：PAPB1 と Fab の結晶化
―4―

WT

Mut1 2

3

IgG ‐ + ‐+ ‐ + ‐ +45‐ + ‐+

HeavyChain
PA
LightChain

図 4：変異体 PA-PB1 と IgG の結合実験
リボン図で色分けした範囲ごとにアミノ酸をアラニンに置換し、His-Tag による IgG のプルダウン実験を行った。
左のゲルがループ部位、右がヘリックス部位の変異体の結果を示している。

3.まとめと今後の予定

PA-PB1 の抗体結合部位を同定し、結合部

新規抗インフルエンザウイルス薬のター

位と Fab との複合体構造の解析を目指すこ

ゲットとして RNA polymerase とその抗体とで、抗体を用いた抗インフルエンザウイに注目して研究を行った結果、ウイルスのルス薬の開発を推進してきたいと考えてい増殖阻害能を持つ抗体を得ることができた。

る。

この抗体と PA-PB1 との結合部位を特定し、抗体がどのように RNA polymerase の機能を阻害しているのかを明らかにすることを目的として上記のような実験を行ってきたが、残念ながら、詳細を明らかにすることはできなかった。
しかしながらこれまでの研究と、2014 年
度ドイツのグループから発表された B 型インフルエンザウイルスの RNApolymerase

図 5：B 型インフルエンザウイルス RNAの立体構造から、今回得られた PAPB1 結

polyemrase の立体構造

合抗体は図 5 で示したように、RNA とPA を赤、PB1 を青、PB2 を黄色で示してRNApolymerase の結合部位付近に結合すいる。

ると考えられ、PA と PB1、PB2 との結合

A 型インフルエンザウイルスの PAPB1 結にはおそらく影響せず、RNA の結合阻害も合部位の構造を緑で重ね合わせて示した。

しくは宿主蛋白質との結合を阻害すること

本研究で作成した抗体はオレンジの丸で示によって、RNA polymerase の機能を阻害した範囲に結合すると考えられている。

していると推測される。
今後は、これまでの研究の継続として、
―5―

1.

農林水産省インフルエンザ情報ページ
http://www.maff.go.jp/j/syouan/doue
i/tori/2.

厚生労働省インフルエンザ情報ページ
http://www.mhlw.go.jp/stf/seisakuni
tsuite/bunya/kenkou_iryou/kenkou/
kekkaku-kansenshou/infulenza/

3.

Obayashi, E., et al., The structural

basis for an essential subunit
interaction in influenza virus RNA
polymerase.

Nature,2008.

454(7208): p. 1127-31.
4.

Sugiyama, K., et al., Structural

insight into the essential PB1-PB2
subunit contact of the influenza
virus RNA polymerase. EMBO J,
2009. 28(12): p. 1803-11.
5.

Mochalkin, I., et al., Discovery ofantibacterial

biotincarboxylase

inhibitors by virtual screening andfragment-based approaches. ACS
Chem Biol, 2009. 4(6): p. 473-83.
6.

Tarendeau,

F.,

et

al.,

Host

determinant residue lysine 627 lieson the surface of a discrete, folded
domainofinfluenza

virus

polymerase PB2 subunit. PLoS
Pathog, 2008. 4(8): p. e1000136.
7.

Guilligay, D., et al., The structural

basis for cap binding by influenza
virus polymerase subunit PB2. Nat
Struct Mol Biol, 2008. 15(5): p.
500-6.

―6―

インフルエンザウイルス RNA ポリメラーゼ
PA-PB1 サブユニット間結合阻害剤の開発
吉田尚史・朴三用

出現した際の対策の有効性は不透明であり、新たな1. 研究背景

対策が世界中で求められている。

インフルエンザは、毎年冬季に流行する人間にと

インフルエンザウイルスは RNA とタンパク質かって身近な感染症である。人間が感染すると、高熱らなる単純な構造で、ウイルス自身では自己増殖すや関節痛、倦怠感などの全身症状や、喉の痛み、咳ることができない。そのため宿主の細胞に感染し、などの呼吸器系の症状を示す。さらに、インフルエ

その増殖機構を利用してウイルスの複製を行う。こンザは時にパンデミックと呼ばれる世界的大流行をれに対し、ウイルスの増殖を抑えるには、①ウイル引き起こし、多数の死者を出してきた。これまでに、スの感染を防ぐ、②ウイルスの増殖を防ぐ、③ウイ

スペイン風邪(A/H1N1)やアジア風邪(A/H2N2)、香ルスの拡散を防ぐ、
これら 3 つの方法が挙げられる。

港風邪(A/H3N2)などのパンデミックが発生し、特に①について効果的なのは、ワクチンである。しかし、1918 年のスペイン風邪での犠牲者は 4 千万人とも言変異を起こしやすく多様なタイプを持つインフルエ

われている。

ンザウイルスに対して、ワクチンはタイプが違うウ

最近では、2009 年 4 月にメキシコで発生した新型

イルスには効果がない欠点がある。すなわち、新たインフルエンザは瞬く間に広がり、世界中で脅威となタイプのウイルスが出現すると、それを基にワクなっている。日本では幸い、新型インフルエンザ対チンは生成されなければならず、またそれには数ヶ策として備蓄されてきたタミフルやリレンザといっ月という期間を要することから、流行前に新型のワた薬剤がこのウイルスには有効ということが確認さクチンを備蓄するのは不可能である。実際に、ワクれ、この新型ウイルスが上陸してもそれほど大きなチンが主に標的とするウイルス表面に存在する HA

被害を及ぼさないだろうと予想されている。しかし、（ヘマグルチニン）、NA（ノイラミニダーゼ）とい

さらに深刻な問題は、インドネシアやタイの豚の多うタンパク質は頻繁に変異を起こし、それぞれ 16 種

くが強毒型のトリインフルエンザ(H5N1)を保有し類、9 種類ものタイプが存在しており、今後どのタイているという、最近の調査により明らかになった事

プが流行するのか予想することは困難である。また、実である。豚型から人型へと変異を遂げて新型ウイ③については、現在有効なタミフルなど抗インフルルスが発生した今、この豚の持つ強毒型がいつ人にエンザ薬による対処法があげられる。しかしこの方感染するような新型インフルエンザとなって現れる

法では、ウイルスが一度増殖して体内で感染が広がのか、もはや時間の問題という見方もある。さらに、ってしまった後では、その効果は低くなってしまう

タミフル耐性型トリインフルエンザも出現している

ため、感染後早い時期での投与が必要という時間的ことから、実際にそのような新型インフルエンザが制限がある。さらに、タミフルが標的とする NA（ノ―7―イラミニダーゼ）も変異が起こりやすく、既にタミていない。その理由として、構造解析を行うためにフル耐性ウイルスも確認されている。

は多量のタンパク質が必要であるが、RNA ポリメラ

一方で、②のようなウイルスの増殖を直接阻害するーゼは 3 つのサブユニットから成る複合体であるこ

薬剤はこれまでに開発されていない。インフルエンと、またそれぞれが高分子量であることから、十分

ザウイルスの増殖サイクルの中心であるウイルスゲ

量のタンパク質を得ることが困難であることがあげ

ノムの複製と転写を行うのは、インフルエンザが保られる。そこで、本研究では RNA ポリメラーゼの活有する RNA ポリメラーゼであり、さらに RNA ポリ性部位を中心とした部分的な構造解析を目指した。

メラーゼは HA や NA と比べて変異の度合いが極端

実際には、インフルエンザ RNA ポリメラーゼの 2に少ないため、このインフルエンザ RNA ポリメラー

つのサブユニット PA-PB1 間結合部位構造を X 線結ゼが理想的な新規薬剤ターゲットとして注目されて晶構造解析により解明した。インフルエンザウイル

きた。薬剤設計を行うためには、その標的部位の立スの RNA ポリメラーゼの 3 つのサブユニット、PA、

体構造情報を得ることが近道であるため、本研究でPB1 と PB2 はポリメラーゼ活性に重要な役割をもっは新規薬剤開発に向けてインフルエンザ RNA ポリているだけでなく、3 つの複合体形成なしでは効果的メラーゼの構造解析を行った。

に働くことができないため、本研究で明らかになっ

これまでに世界中でインフルエンザ RNA ポリメ

たサブユニット間結合部位は、効果的な抗インフルラーゼの構造解析が試みられてきたが、薬剤設計にエンザ薬のターゲットとなり、本研究の成果は新規要求される高分解能での構造解析は未だに成功され薬剤開発に向けて非常に有用なものとされた。

図 1. PA-PB1 複合体構造
PA の 3 本のαヘリックス（赤色）でつくられるトンネルの中に、PB1（青色）が入り込むようにして結合している。
数多くの疎水性アミノ酸残基が結合に関与している。

―8―

α13 の 3 つのαへリックスでつくられるトンネルのPB1 が結合すると安定になることを発見した。この中に PB1 サブユニットの N 末端が入り込むようにしことを利用して、PA の C 末端ドメイン(239-716)とて結合していた。このとき、PB1 は 3-10 へリックス

PB1 の N 末端部位(1-81)の共発現系を構築し、安定と呼ばれる構造をとっており、これはタンパク質間な PA-PB1 複合体を精製することに成功した。これ結合としては非常に珍しい様式であった。また、PAが本研究を進める上での突破口になり、PA-PB1 複と PB1 の結合部位には疎水性アミノ酸残基が多く存

合体の構造を X 線結晶構造解析法により、原子レベ在しており、各原子のファンデルワールス半径につルで明らかにした。PA サブユニットの立体構造は、いて調べたところ、疎水性残基どうしが隙間なく疎Binding
GST
GST

PA

Input
PB1

PA

GST-PB1

PA

GST

Δ

W

T
65
Δ 7
61
V6 9-63 3
L6 6 S 0
4
L6 0D
66
W D
70
6A

本研究において、PA が単体では非常に不安定で、

PA

図 2. 変異体を用いた結合実験
結合に関わるアミノ酸の 1 残基の変異によって、PA-PB1 の相互作用がなくなる。

Activity

図 3. 変異体を用いた活性測定実験
結合に関わるアミノ酸の 1 残基の変異によって、WT と比べ極端に活性が減少する。

これまでに解明されているタンパク質にはない新規

水性相互作用していることが確認された。すなわち、の構造であり、13 個のαへリックスと 9 個のβシー

PA と PB1 の結合は主に疎水性相互作用で構成されトで構成されていた。また、PA と PB1 の結合は鍵ていることが明らかとなった。続いて、PA-PB1 サと鍵穴の関係のようになっており、PA のα10、α11、

ブユニット間の結合において重要なアミノ酸残基を―9―特定するために、解析した立体構造をもとに、PA ののターゲットとして注目されてきたが、未だにその変異体を調製し、PB1 との相互作用を調べた。そのような薬剤は開発されていない。これまでの薬剤開結果、Val636、Leu640、Leu666 と Trp706 を置換

発は、細胞に対してランダムに化合物を投与しそのした変異体は、PB1 と結合することができなくなっ効果を調べていく方法で、候補化合物を探索するだていた。さらに、同様の変異体 PA を用いて RNA ポ

けで長期間を必要としてしまう。現在、新型インフ

リメラーゼの活性を調べたところ、どの変異体 RNA

ルエンザが大流行となるのも時間の問題との見方もポリメラーゼについてもその活性が 40%以下に減少あり、従来よりも迅速な方法での薬剤開発が求めらした。これらの結果から、本研究で特定した PA のアれている。さらに、本研究が目的とする PA-PB1 サ

ミノ酸残基(Val636、Leu640、Leu666、Trp706)が、ブユニット間の結合阻害剤は、PA に結合するだけでPB1 との結合だけでなく RNA ポリメラーゼの活性なく PB1 との結合を阻害できる必要があり、阻害剤においても重要な役割を果たしていることが明らかの PA への結合部位特異性や、PA との高い親和性がとなった。

求められる。また、化合物を実際に薬剤として使用するためには、化合物の血液中での溶解性が高いこ

これまでに開発されている抗インフルエンザ薬は、とや細胞内でのウイルスの増殖を実際に抑えること、ウイルスの拡散を防ぐものであり、直接その複製を細胞に対して毒性がないことなど、これらの点を解阻害するものではない。そのため、感染後時間経過決しなければならない。

してしまうとその効果が薄れてしまうことが問題とこれまでに本研究において、RNA ポリメラーゼのなっている。また、効果が大きいとされるタミフル

サブユニット間の立体構造を明らかにしたことは、の備蓄に日本も非常に多額の予算をつぎ込んでいる

ウイルス複製に必須な部位を創薬ターゲットにするが、すでにタミフル耐性型のインフルエンザが発見ことを可能にし、抗インフルエンザ創薬が抱える問されており、異なる視点から新薬開発に取り組む必題点や解決すべき点に対応できる大きな成果と考え要が出てきている。インフルエンザウイルスの保有ている。そこで、この構造を利用して PA-PB1 サブ

する RNA ポリメラーゼは、増殖サイクルの中心であユニット間結合阻害剤の探索及び設計を行った。

る複製と転写を行うため、新規抗インフルエンザ薬

図 4. 結合阻害の概要図
PA の結合ポケットに薬剤が入り込むことで、PB1 の結合を阻害する。

―10―

2.

の結合比や結合定数など結合に関する情報を求めた。

実験方法

化合物の研究開発はいくつかの段階にわけて進め

さらに、細胞内でのウイルスの増殖に対する化合物られた。まず、解明した PA-PB1 の立体構造から、の効果や、細胞に対する化合物の毒性について調べ

in-silico スクリーニングを行い、PA-PB1 サブユニッた。最終的には、得られた情報を参考にし、PA と化ト間の結合阻害剤として可能性のある化合物を算出

合物との結合様式を明らかにするために、効果的にした。次に、計算によって求められた化合物についウイルスの増殖を阻害する化合物と PA との複合体て、実際にサブユニット間の結合阻害に効果があるの X 線結晶構造解析を行った。PA と化合物との立体か、溶液中でタンパク質との相互作用の確認を行っ

構造情報をはじめ、これら結合に関わる情報は、以た。また、その化合物が実際にウイルスの増殖に対後、化合物を改良し、さらに効果的な阻害剤を設計して阻害効果があるか、細胞内でのウイルスの増殖

していく上で非常に有用な情報である。

について調べた。最終的に、効果が確認された化合物について、さらなる改良を行い、有効な阻害剤を

3.

設計した。

本研究はインフルエンザウイルスに対する新規薬

具体的には、PA-PB1 立体構造をもとに in-silico

研究成果

剤開発を目指し、ウイルス増殖の中心的役割を果た

スクリーニングによって、200 万種類の化合物ライ

しているインフルエンザ RNA ポリメラーゼのブラリーから数千種類の候補化合物を算出した。こPA-PB1 サブユニットに対して、結合阻害剤のスクれら膨大な数の候補化合物のうち、上位 200 種類のリーニングを行ってきた。研究計画通り、①コンピ

化合物について、溶液中でのタンパク質との相互作ューターレベル、②タンパク質レベル、③細胞レベ用の有無の確認をおこなった。溶液中での生化学的

ルの 3 段階に分けて研究を進めてきた。まず、上記な実験は、これまでに明らかにしてきたタンパク質①として in-silico スクリーニングを行い、PA-PB1の性質を利用した。PA 単体は PB1 との結合部位がサブユニット間結合阻害剤として可能性のある候補

溶媒中に露出しているため不安定化し、室温で容易化合物の探索を行った。その結果、約 200 万個の化に沈殿してしまうが、PA に PB1 を結合させると安合物ライブラリーの中から、約 4 千種類の化合物が定化される。そこで、この PA 単量体と PA-PB1 複阻害剤候補として算出された。

合体の性質の違いを利用して、溶液中での化合物の次に、コンピュータによって算出された 4 千種類

結合能を調べた。すなわち、PA の PB1 との結合部の化合物のうち上位 200 種類の化合物について、溶位に化合物が結合すれば沈殿しないことが予想され、液中において②タンパク質レベルでの結合阻害作用

PA への化合物の結合が容易に確認できる。この方法の有無を調べた。溶液中での生化学的な実験は、こは他の方法と比べて、PA タンパク質の性質を利用しれまでに明らかにしてきたタンパク質の性質を利用た迅速なスクリーニング方法である。沈殿の有無にした。PA 単体は PB1 との結合部位が溶媒中に露出

より、PA に結合したと考えられる化合物に対しては、しているため不安定化し、室温で容易に沈殿してしPA と PB1 の結合実験を化合物存在下で行うことで、まうが、PA に PB1 を結合させると安定化される。

その結合阻害効果を調べた。さらには、等温滴定型

そこで、この PA 単量体と PA-PB1 複合体の性質のカロリーメータ（ITC）装置によって、PA と化合物違いを利用して、溶液中での化合物の結合能を調べ―11―た。すなわち、PA の PB1 との結合部位に化合物がが PA の沈殿抑制効果が確認された。さらには、化合結合することでタンパク質が沈殿しないことが予想

物存在下での結合阻害実験を GST プルダウンによされるため、沈殿の有無を調べることで PA への化合って行い、これら 2 種類の化合物が PB1 との結合を物の結合が容易に確認できる。この方法は他の方法阻害することが確認された。続いて、ITC（等温滴定と比べて、PA タンパク質の性質を利用した迅速なス型カロリーメータ）を用いて、PA と化合物との結合

クリーニング方法である。このスクリーニング法に比や解離定数を算出することができた。

よって、200 種類の化合物の中から 2 種類の化合物

図 5. in-silico スクリーニングの結果例
200 万種類の化合物ライブラリーから、4 千種類の化合物を検索した。

―12―

PA

#A #B PA+PB1

PA#C PA+PB1

図 6. PA の沈殿による化合物の結合スクリーニング
化合物#A、#B を加えると PA の結合が抑えられるのに対し、#C では沈殿が生じる。

図 7. 化合物存在下でのプルダウンアッセイ
化合物の濃度上昇にともない、PA のバンドが消失する。すなわち化合物が PA と PB1の相互作用を阻害していることが確認された。

続いて、③細胞内でのウイルスの増殖に対する化

GST プルダウン法による結合阻害の程度と ITC（等合物の効果や、細胞に対する化合物の毒性について

温滴定型カロリーメータ）による PA と化合物との解調べた。その結果、2 種類の候補化合物は細胞毒性を

離定数を算出した。この結果、2 種類の候補化合物か有することが確認され、ウイルスの増殖阻害剤とし

ら 13 種類の化合物を新たに見いだすことができ、さて適していないことが分かった。そこで、これら 2らに 13 種類のうち数個については、細胞毒性が低く、種類の候補化合物を基に再度 in-silico スクリーニン

細胞内でのウイルス増殖を抑えられることが確認さグを行い、2 種類の候補化合物の誘導体として細胞毒れた。すなわち、これらの化合物がこれまでと異な性のない阻害剤の設計を試みた。in-silico スクリー

る作用機序をもつウイルス増殖阻害剤として非常にニングから算出された化合物について、これまでと有力であることが分かった。

同様に溶液中において PA との結合の有無を調べ、

―13―

図 8.

ITC による化合物と PA の相互作用実験

これらの結果を踏まえ、X 線結晶構造解析法による4.

PA タンパク質と化合物との結合様式の解明を試み

1)

E. Obayashi, et al.: Nature, 454 (2008) 1127.

た。複合体構造の解析には、PA 単体の結晶に化合物

2)

K. Sugiyama, et al.: EMBO, 28 (2009) 1679.

を浸漬し結合させる方法と、PA と化合物を混合し、

3)

G. Muratore, et al.: Proc. Natl. Acad. Sci.

結晶化する方法の 2 通りが考えられた。そこで結晶

U.S.A., 109 (2012) 6247.

化前に、PA 単体と化合物との複合体それぞれについて、超遠心分析を行った。その結果、PA 単体と化合物複合体ではピークの変化が観測されたことから、化合物が結合することにより分子の構造が大きく変化することが示唆された。すなわち、化合物を浸漬する方法では、化合物の結合に伴い分子構造が変化
してしまい、結晶が壊れてしまう可能性があり、この方法は不適であると考えられた。そのため、PA と化合物をモル比 1:1 で混合し、共結晶化を行った結果、いくつかの条件で結晶が得られ、放射光施設、
高エネルギー加速器研究機構において X 線回折実験を行ったところ、最高 8Å付近までの反射を確認する
ことができた。

―14―

参考文献

宇宙の微小重力環境を利用した
高品質タンパク質結晶の作製と創薬への応用
吉田尚史・中平徹・朴三用

1. 研究背景

メラーゼの結晶化をおこない、高分解能での構造決

近年、タンパク質立体構造を基にした薬剤開発が定を目指し研究を進めてきた。

盛んにおこなわれており、それに向けて高分解能でのタンパク質立体構造解析の需要が高まっている。
これまでに、高品質な結晶を作製し高分解能データ

2. 宇宙環境下での結晶化を取得するために、様々な方法が提案されてきた。

タンパク質や核酸などの生体高分子立体構造を明その中で、微小重力環境を利用した宇宙での結晶作

らかにすることは、生体内で起こる様々な生命現象

製は、最も強力な方法の 1 つであると考えられていを理解する上で非常に重要である。近年、数多くのる。微小重力環境では、密度差対流が抑制されるたタンパク質、さらには複合体の立体構造が決定されめ、結晶への不純物の取り込みが減少し、ゆっくりており、タンパク質のもつ機能や相互作用に関すると結晶成長が起こるため、良質な結晶生成が期待で情報、生体反応メカニズムの解明が進んでいる。まきる。実際に、今までに実施されてきた宇宙環境でた、タンパク質の立体構造に基づいた医薬品の分子のタンパク質結晶化実験では、回折分解能の向上や設計（SBDD ;Structure-Based Drug Design）も盛

結晶学的統計値の改善、さらには結晶のクラスター

んにおこなわれており、タンパク質の立体構造情報化の抑制など様々な好影響が確認されている。しかの需要は高まっている。このような生体反応の解明

し、地上での結晶化方法をそのまま宇宙環境での結や新規医薬品の開発に向けては、ターゲットとする晶化へと適用することができないため、宇宙実験にタンパク質の構造を原子分解能レベルで解析するこ向けた結晶化技術が必要となる。さらに、宇宙実験とが必須であり、その方法として X 線結晶構造解析の機会は限られており、確実に良好な結晶を作製す法があげられる。X 線結晶構造解析は近年の技術開るためには、良好なタンパク質試料と最適化された発によりめざましい発展をとげており、分解能 1 Å

結晶化条件の確立が必須である。これまでに我々の付近での構造決定も珍しいものではなくなっている。

研究グループは、インフルエンザウイルスの新規薬

一方で、X 線結晶構造解析のデータはそのタンパク剤開発を目指し、インフルエンザ RNA ポリメラーゼ

質結晶の質に依存するため、高分解能データの収集の結晶構造解析をおこなってきた。インフルエンザには高品質結晶の作製が必要不可欠である。

RNA ポリメラーゼは、ウイルス増殖の中心的な役割

これまでに、高品質結晶を作製するための様々なを担っており、創薬ターゲットとして注目されてき方法が提案されており、その中で宇宙での微小重力た。我々は宇宙環境下でのインフルエンザ RNA ポリ環境を利用したタンパク質の結晶生成が有効である―15―

ことが示されている。微小重力環境では、溶液の密エンザウイルスの人への感染により、以前に世界で度差対流や沈降効果が抑制されるため、成長中の結数千万人単位の死者を出したような世界的大流行が晶の周辺にタンパク質及び不純物濃度の薄い層がで起こることが懸念されており、日本でも抗インフルきる。その結果、結晶表面の過飽和度が低下し、不エンザ薬であるタミフルなどの備蓄に大変な金額が純物の付着が減少するため、結晶周辺に理想的な拡注がれている。しかし、既にタミフル耐性型の鳥イ散場が形成され緩やかに結晶が成長する。微小重力

ンフルエンザウイルスが発見されるなど、ウイルス環境での結晶化において期待される効果として、分の変異は頻繁に起こりうるため、このような新型ウ

解能の向上や結晶学的統計値の改善、クラスター化

イルスに対するワクチンや新薬の開発が世界中で積の抑制があげられる。回折データセットの質は、結極的に行われている。
インフルエンザウイルスの RNA ポリメラーゼは、晶中のタンパク質分子の配向の乱れが少ないほど向上するため、微小重力環境下において分子を規則正ウイルスの複製(増殖)に中心的な役割を担っている

しく配向させることで、より高品質なデータ収集がため、新規薬剤ターゲットとしてこれまで注目され期待される 2) 3)。また、単結晶が集まったようなクラてきた。また、これまでの薬剤ターゲットとは異なスターになりやすい試料は、結晶表面が 2 次核とな

り、RNA ポリメラーゼは変異を起こしにくい特徴をって別の結晶が成長し始めるが、宇宙実験ではこのもっていることから、鳥インフルエンザなど新型イ

ような 2 次核形成が抑制され、クラスター化を抑え

ンフルエンザに対する理想的な薬剤ターゲットとさることができる。構造解析で大きな問題となるツイれている。我々の研究グループは、インフルエンザ

ン結晶についても、宇宙環境下で結晶化をおこなう

ウイルスの持つ RNA ポリメラーゼの 3 つのサブユことで解消された事例がある 4)。以上のように、宇ニット（PA、PB1、PB2）のうち、どれか１つのサ宙環境下での結晶化はタンパク質の結晶化に様々な

ブユニットでも欠けるとその働きを失うことに注目好影響があると考えられ、地上での結晶化実験が抱し、サブユニット間結合阻害剤が、新規抗インフルえる問題を解決するための選択肢の 1 つとして大きエンザ薬として有望であると考えて研究を進めた。

な可能性をもっている。

このような阻害剤を設計するためには、その部位の立体構造情報を得ることが近道である事から、インフルエンザの RNA ポリメラーゼの 2 つのサブユニ

3.

インフルエンザウイルス RNA ポリメ

ット PA-PB1 結合部位構造を X 線結晶構造解析により解明した 1)。

ラーゼの結晶構造解析
インフルエンザは、ウイルスの感染によって引きPA-PB1 複合体の立体構造は、地上での結晶化実起こされる病気である。ヒトが感染すると、高熱や験によって分解能 2.3 Åで解析された（図 1）。PA

関節痛、倦怠感などの全身症状や、喉の痛みや咳なの 3 本のαヘリックスで形成されるトンネルに、PB1

どの呼吸器系の症状を示す。特に深刻なのは乳幼児の N 末端 14 残基が入り込んでおり、鍵と鍵穴の関や高齢者が感染した場合であり、インフルエンザ脳係のように結合していた。さらに、その結合部位で症や重度の肺炎などの合併症を起こし、死に至るこ

は、PA と PB1 の疎水性アミノ酸残基が隙間なく相とさえある。近年では、高病原性である鳥インフル

互作用していることから、PA と PB1 は主に疎水性相互作用によって結合していることが明らかとなっ―16―

た。これら疎水性アミノ酸残基の変異体を作製し、晶化実験を成功させるためには、宇宙実験向けの結PA と PB1 の結合を調べたところ、変異体では PA

晶化条件検討が必要である。以下に、良好なタンパと PB1 が結合できなくなることが明らかとなった。

ク質試料の調製方法と宇宙環境下での結晶化方法を

また、同様の変異体を用いて RNA ポリメラーゼの活紹介する。

性を調べると、変異体ではポリメラーゼ活性が劇的に低下することが確認された。すなわち、PA と PB14.1の結合に関わるアミノ酸残基は、サブユニット間の高品質なタンパク質結晶を生成するのに最も重要結合だけでなく RNA ポリメラーゼの活性にも影響な技術の 1 つに、タンパク質試料の精製があげられを与えることから、この結合部位に対する新規薬剤

る。精製にあたっては、結晶化試料に含まれる不純結晶化試料の成分分析

図 1. PA-PB1 複合体構造
PA の 3 本のαヘリックス（赤色）でつく
られるトンネルの中に、PB1（青色）が入り込むようにして結合している。

は非常に有望な抗インフルエンザ薬となり得ること物の排除だけでなく、試料の均一度が結晶品質の向がわかった。現在までに、立体構造情報を基にした上の要となる。 以下の方法で、タンパク質試料の品

PA-PB1 サブユニット間結合阻害剤の探索を進めて質確認をおこなっている。まず、SDS-PAGE（SDS-

きており、PA-PB1 結合阻害能及びウイルス増殖に

ポリアクリルアミドゲル電気泳動）で目的以外の成対する抑制効果をもつ化合物の開発に成功している。

分が夾雑していないことを確認する。次に、また、阻害剤の開発と同時進行で、宇宙環境下でのNative-PAGE によりゲル中で想定通りの移動をす

PA-PB1 複合体の結晶化実験を進めており、PA-PB1

るか、スメアバンドやマルチバンドになっていない

立体構造について高分解能データを収集し、より効かを確認する。必要があれば、2 次元電気泳動を行い、果的な阻害剤を設計すること目指している。

タンパク質の電荷が均一であるかを調べる。さらにDLS（粒径分布測定）をおこない、タンパク質分子の粒径が想定の大きさであるか、大粒径成分が多く

4.

宇宙実験に向けたタンパク質結晶化

ないかを確認する。タンパク質試料の精製度は、SDS-PAGE で単一と評価できても、Native-PAGE

技術
宇宙環境下での結晶化において、地上での結晶化や DLS ではばらつきが出るという試料が散見され方法をそのまま適用しても結晶が生成しないというる。これらは、タンパク質構造のフォールディング

ことが頻繁にみられる。限られた宇宙実験機会で結の違いや化学修飾や部分的な変性などに起因すると―17―

考えられ、タンパク質試料が均一ではないと判断さ晶が単結晶の成分とクラスター状の結晶成分に分離れる。以上の分析から問題がみられた試料についてできた例（図 2）があり、再現性の向上や結晶品質のは、さらなる精製をおこなう必要があり、イオン交向上につながることがある。上記の結晶化試料の成換カラムクロマトグラフィーやゲルろ過クロマトグ

分分析を実施し、均一性に問題がないと判断された

ラフィーを適応する。特に、強陽イオン交換カラム

試料については、蒸気拡散法による結晶化をおこなや強陰イオン交換カラム（ともに GE ヘルスケア社

い結晶生成を確認する。必要があれば、結晶化条件

または東ソー社）などの高分離能カラムを用いるこの最適化をさらに実施する。

とで、タンパク質試料の均一性が向上する例が多く見られる。通常、1 つの成分としてカラムから溶出される試料について、上記のカラムを用いて、緩やか

4.2に塩濃度を上昇させ精製すると異なる成分として溶による結晶化出されることがある。

カウンターディフュージョン（CD）法

宇宙実験での結晶化方法は、従来の蒸気拡散法で実際に、我々の研究対象であるインフルエンザ

はなく、カウンターディフュージョン（CD）法が用

RNA ポリメラーゼ PA-PB1 複合体についても、いられる。CD 法は、キャピラリーの中にタンパク質

(a)

(b)

(c)

図 2. 試料均一度の向上による結晶改善例(a)クラスター状結晶しか生成しない試料を強イオン交換で精製すると、クラスラー結晶の成分(b)と、単結晶の成分(c)に分離することに成功した。

SuperQ カラム（東ソー社）を用いて精製をおこなうと、3 つのピークに分かれて溶出された。これら 3溶液を、外側に結晶化試薬を充填し、それぞれを拡散させておこなう結晶化方法である（図 3）5)。アガ
ロースゲルを介した 2 液は経時的に拡散し、キャピ

つのピークを別々に回収し、それぞれについて結晶化をおこなったところ、これまでの結晶化では再現性が悪く結晶生成確率が低いという問題が解決され、再現性良く結晶が生成できるようになった。また、
この他の試料についても、結晶が生成する成分と生ラリー内で濃度勾配がつくられ、結晶化条件に適した位置で結晶化が起こる。タンパク質溶液と結晶化
試薬を直接混合する蒸気拡散法と比べ、CD 法では徐々に溶液拡散が起こるため、結晶生成までの時間が長く結晶核の形成を抑えることができ、より高品

成しない成分に分離できた例や、クラスター状の結―18―

質な結晶を生成できる可能性がある。さらに、溶液

5.

宇宙環境での結晶化実験の結果が乾燥してしまうことがないため、生成された結晶

我々の研究試料であるインフルエンザ RNA ポリ

はキャピラリー内で長期間安定である。CD 法のキッ

メラーゼ PA-PB1 複合体については、上述の試料分ト（C-Tube Kit）がコンフォーカルサイエンス社か

析と CD 法による結晶生成を確認した後、宇宙環境

ら市販されており、簡便に CD 法による結晶化おこ下での結晶化実験をおこなった。約 3 カ月間、宇宙

なうことができる。宇宙環境下での実験に向けて、環境下で静置された結晶は、地上において取り出し必ず地上において CD 法で結晶が得られることを確作業が実施された（図 4）。その後、シンクロトロン
放射光施設 Photon Factory のビームライン BL17A
での X 線回折実験をおこない、結晶の品質を評価した。宇宙環境下で生成した結晶では、分解能が 1 Å台に到達するような劇的な変化はみられなかったも

capillaryprotein solu on

agarose gel
crystalliza on buffer

図 3. カウンターディフージョン（CD）法による結晶化の模式図

図 4. 宇宙環境下で生成した PA-PB1 結晶

キャピラリーの内側にタンパク質溶液、外側に結晶

キャピラリー内で成長した PA-PB1 結晶。

化試薬を充填すると、アガロースゲルを介した 2 液

大きさは約 200μm。

は徐々に拡散していく。矢印は各溶液の拡散方向を示す。

のの、地上で生成した結晶と比較してモザイク性認しておくべきである。結晶によっては、蒸気拡散法で結晶が得られていた条件をそのまま CD 法に適用しても結晶が得られないことがあり、結晶化条件の検討が必要となる。CD 法で結晶が生成しない場合、
ミクロシーディング等で結晶の核形成を促すことも有効である。

（Mosaicity）の低下や完全性（Completeness）な
どの回折パラメーターが改善されており（表 1）、結果晶の品質が向上していることが確認された。さらに、得られたデータを用いて構造解析をおこなった
ところ、分解能の向上に伴いタンパク質構造の電子密度マップが全体的により明瞭になっていることが確認された（図 5）。

―19―

(b)

(a)

図 5. 電子密度マップの比較
地上で生成した結晶(a)と宇宙で生成した結晶(b)からデータ収集をおこない、得られた電子密度マップについて比較した。地上の結晶と比べ、宇宙環境で生成した結晶からは、より明瞭な電子密度マップを得ることができた。

表 1. 地上及び宇宙環境下で生成した結晶の X 線回折データの比較
Data sets

Ground crystal

Space crystal

Space group

P3221

P3221

Unit cell(Å) a,b,c

101.9, 101.9, 115.0

102.1, 102.1, 114.9

Resolution range (Å)

50.0 - 3.2

50.0 - 2.4

Completeness (Overall/Outer Shell,%)

78.5/70.6

94.8/86.2

Rmerge (Overall/Outer Shell,%)

5.8/13.2

6.7/31.5<I> / sigma<I> (Overall / Outer Shell)

29.2/8.6

21.9/1.6

Mosaicity

1.30 - 1.83

0.41 - 0.64

6.

凍結処理方法などは種々のタンパク質によって様々

今後の展望
宇宙環境下での結晶化実験では、分解能の向上やである。我々の PA-PB1 複合体の結晶化については、

回折データの改善、またはクラスター結晶の抑制な

DTT などの還元剤の添加が結晶化には必須であった。

ど様々な好影響が期待される。一方で、地上での結その他の例としては、グリセロールによってタンパ

晶化方法をそのまま宇宙実験に適用することはできク質が安定化され結晶が生成する試料や、イオン交ず、宇宙実験向けの試料調製や結晶化を検討する必換カラムで精製すると全く結晶が得られなくなる試要がある。タンパク質の性質は、各々のタンパク質料などがあった。タンパク質が安定に存在できる pHによって異なるために一律的な対応策はない。例えや塩濃度などのバッファー条件も結晶化に大きな影

ば、タンパク質の精製や結晶化、さらには結晶の不響を与える。そのため、成分分析を厳密におこなう―20―

ことで個々のタンパク質の性質を見極め、それに応じた対策をとることが宇宙実験を実施する上で最も重要な技術といえる。宇宙実験の機会は限られており、フライト期間は数ヶ月間に渡るため、宇宙実験に向けた試料調製に最善を尽くすこと、加えて、これまでに蓄積されてきた宇宙実験の結果を参考に進めていくことが実験を成功させる近道だといえる。
今後、タンパク質の立体構造に基づいた医薬品の開発がますます盛んにおこなわれることが予想され、高分解能で薬剤とタンパク質の結合様式を明らかにすることは非常に重要である。その際に微小重力環
境下での結晶化が、有力な方法の 1 つとなる可能性がある。また、多数のサブユニットで構成される超分子複合体や膜タンパク質などの取り扱いが難しいとされる試料についても、宇宙環境下での結晶化の有効性を示されることを期待したい。

7 謝辞
本研究を行うにあたりご尽力いただいた、丸和栄
養食品株式会社の伊中浩治博士、コンフォーカルサ
イエンス株式会社の田仲広明博士に謝意を表します。

8.

参考文献

1)E. Obayashi, et al.: Nature., 454 (2008) 1127.
2)H. Tanaka, et al.: J. Synchrotron Rad., 18 (2011)
88.
3)K. Inaka, et al.: Crystal Growth Des., 11 (2011)2107.
4)H. Tanaka, et al.: Acta Crystallogr., F63 (2007)
69.
5)H. Tanaka, et al.: J. Synchrotron Rad., 11 (2004)
45.

―21―

RNA ポリメラーゼ複合体のインフルエンザウイルス RNA
核移行に関する構造生物学的研究
吉田尚史・長部勇希・北村美佳・小川洋司・朴三用

1. はじめに
1.

えられてきたため、立体構造解析など盛んに研究がインフルエンザは、インフルエンザウイルスの感RNA行われてきた。しかし近年、インフルエンザ RNA

染によって引き起こされ、高熱や全身の倦怠感など

PA、PB1、
PB1、
ポリメラーゼ複合体のウイルスタンパク質 PA、の症状を伴い、重症化しやすく伝染性の強い感染症

PB2、NP の核膜の通過性がウイルスの感染に影響を
PB2、NPである。これまで、ウイルスの突然変異による新型与えるという報告がなされている。

インフルエンザウイルスの出現で、1918 年にスペイ

vRNP を構成している 44 つのタンパク質 PA、
vRNP
PA、PB1、PB1、4000 万人)、1957
1957 年にはアジア風邪(同ン風邪(死者約 4000

PB2、
PB2、NPNP の核移行サイクルについて説明する(図 1)。
1)。

200 万人)といったパンデミック (世界的大流行)(世界的大流行)約 200

まず、核内で転写された mRNA
mRNA は、細胞質で翻訳さが起こっている。近年では、抗インフルエンザ薬でれ新たなタンパク質がそれぞれ合成される。新たにあるタミフルに耐性をもったウイルスの出現や、ト合成されたタンパク質 PA、PB1、PB2、NP
PA、PB1、PB2、NP は、それ

リインフルエンザウイルスの人への感染が報告されぞれ異なった経路を経て核に移行する。PB2 は核輸ており、新たなパンデミックが危惧されている。

送体である importinα5
importinα5 と結合して核に運ばれるのインフルエンザウイルスの増殖サイクルは、まずに対し、PA と PB1
PB1 は細胞質でヘテロ二量体を形成

ウイルス表面にあるヘマグルチニン(HA)が、細胞表し、これが RanBP5
RanBP5 と結合することで核に運ばれる。

面のシアル酸に結合することで開始される。結合しすなわち、核内ではじめて 33 つのサブユニットが結たウイルスは細胞内に侵入後、脱核することにより、合して、RNA ポリメラーゼが形成される。一方で、

vRNP(vRNA、NP、RNA ポリメラーゼから構成され
vRNP(vRNA、NP、RNANP
NP は importinα5
importinα5 と結合して核に移行した後、ホモる複合体) が放出され、核内へと運ばれる。核内で三量体を形成することで RNA
RNA 結合活性をもつ。こRNA
RNA ポリメラーゼ(PA 、PB1、PB2 の 33 つのサブユのように別々の経路でタンパク質が核移行し、核内ニットで構成される)の働きにより、ウイルスゲノム

で新たな vRNP
vRNP が形成される。
細胞質の複製と転写が行われる。新たに合成されたウイル

vRNP

複製
転写

vRNA は細胞表面で新たなウイルス
スタンパク質と vRNA
mRNA粒子を形成し、ノイラミニダーゼ(NA)により細胞表

核

PB2

PA

PB1

翻訳

面から切り離され、ウイルスが遊離する。
PA

このような増殖サイクルにおいて、ウイルスが宿NP

主細胞に感染し、増殖するためには①細胞膜と②核

PB1

PB2

PB2

PA

impor n α5NPimpor n β3PB2

2 種類の脂質二重膜を通過しなければならない。
膜の 2

impor n α5

PB1

or

impor n α5

これまで、ウイルスの細胞への感染は、細胞膜表面

PA

PB1

HA のシアル酸への結合が最も重要であると考での HA
1. ウイルスタンパク質の核移行サイクル
図 1.

―23―

PA、PB1、PB2、NP は、それぞれ亜種間での相同

心分離で上清を回収し、Ni-NTA カラムで精製した。

性が 90%以上で保存性が高いものの、変異が起こる

次に、TEV プロテアーゼを加え His-tag を切断し、ことで、核移行が促進され RNA ポリメラーゼの活

Ni−NTA カラム、陽イオン交換カラム、ゲルろ過カ性が増大する。このように、タンパク質の核移行がラムを用いて精製を行った。

ウイルスの増殖効率に影響するものの、変異の影響

SDS-PAGE の結果から、最終精製標品の NP(図 2など詳細な分子メカニズムは分かっていない。そこ

左)は単一バンドであり、高純度に精製することがでで本研究では、2 つの核移行経路 NP - importinα5 ときた。 また、NP のゲルろ過クロマトグラフィー (図PB1 - RanBP5 について X 線結晶構造解析を行い、そ

3) の結果、野生型 NP の溶出ピークに比べ、NPの詳細な結合様式を明らかにすることを目的として(R416A) は低分子量側に溶出された。すなわち、三研究を行った。

量体を形成する WT に対し、調製した変異体 NP(R416A) が単量体であることが確認された。

2. 実験と結果
2.1

NP - imporitinα5 複合体

図 1 に示すように、NP は細胞質では単量体として存在するのに対し、核内では三量体を形成する。すなわち、NP 単量体が、importinα5 と細胞質で結合するため、複合体の構造解析には単量体 NP の調製が必要となる。しかし、大腸菌を用いて野生型 (WT)
NP を大量発現させると、全て三量体として得られてしまう。過去の研究から、三量体形成に最も重要なアミノ酸残基は Glu339 と、Arg416 で、これらを Alaに置換すると、単量体 NP となることが報告されている。そこで本研究では、変異体 NP (R416A) を用

図 2. NP、importinα5、 複合体の SDS-PAGE 結果

いて複合体を調製することとした。

2.1.1

NP(R416A)の発現と精製

H1N1 インフルエンザウイルス由来 NP の遺伝子を鋳型とし、PCR 法で R416A の変異を導入した。PCR
産物を発現用ベクターpET28a に組み込み、NP の N
末端側に His-tag が付加するように発現系を構築した。作成したプラスミドベクターを用いて、大腸菌
BL21(DE3)codonplusRILP の形質転換を行った。37℃で培養後、OD600≒0.6 に達した時 IPTG(終濃度0.5mM)を加え発現誘導を行い、15℃で一晩培養した。
大量培養で得られた菌体を超音波破砕にかけ、遠―24―

図 3. NP のゲル濾過クロマトグラフィー

2.1.2

importinα5 の発現と精製

2.1.4

NP - importinα5 複合体の結晶化

ヒト由来 importinα5 の 66-512 の遺伝子領域を発次に、タンパク質の結晶化に向けて、NP - importin

現用ベクターpET28a に組み込み、大腸菌発現系を構

α5 の共発現系を構築して、タンパク質の発現・精築した。NP と同様の方法で、importinα5 を発現さ製を行った。importinα5 は単体では不安定であり、せ、タンパク質の精製には Ni-NTA カラムと陰イオ

精製途中で沈殿が生じてしまう。 そこで、NP とン交換カラムを用いた。SDS-PAGE の結果(図 2 中央)

importinα5 を大腸菌内で共発現させ、複合体としてから、importinα5 も高純度に精製することができた。

精製することで結晶化試料の大量調製を試みた。T7
プロモーターの下流に 2 つの RBS (Ribosome Binding

2.1.3

NP-importinα5 の相互作用解析

Site)を配置し、それぞれ His-tag 付き NP (R416A)と精製した NP (R416A)と importinα5 の相互作用を

importinα5 (66 - 512) を発現するように発現系を構調べるため、超遠心分析実験を行った。３種類の試築した。NP と同様の方法でタンパク質を発現させ、料 NP(12μM) 、importinα5 (12 μM)、NP (12 μM)とタンパク質の精製には Ni-NTA カラムとゲルろ過カ

importinα5 (12 μM)の混合物について、超遠心分析

ラムを用いた。精製した NP - importinα5 複合体を、

装置 XL-I (Beckman Coulter 社)を用いた速度法によ

サンプル濃度 7mg/ml に濃縮し、結晶化ロボット

る測定を行った。図 4 に NP と importin α5 の超遠(Mosquito)による結晶化条件スクリーニングを行っ

心分析結果を示す。importinα5 の沈降係数は約 3.3S、た。スクリーニングの結果、微小結晶は得られていNP の沈降係数は約 3.9S であるのに対し、NP とるものの、構造解析を行うにはさらなる結晶化条件

importinα5 の混合試料では沈降係数が約 6S であっの最適化が必要だと考えられる。

た。この結果から、NP -importinα5 複合体の形成が確認された。

2.2

PB1 – RanBP5

複合体

PA と PB1 は、細胞質でヘテロ二量体を形成し、RanBP5 が結合することで核に移行する。RanBP5 との結合には PB1 が関与し、PA は結合に関与しない。
そのため、PB1 の相互作用部位のみを用いて、PB1 RanBP5 複合体の構造解析に向けた研究を行った。

2.2.1

PB1 の発現と精製

H1N1 インフルエンザウイルス由来 PB1 の遺伝子を入手し、RanBP5 との相互作用部位である 182-217の遺伝子領域を PCR で増幅した。PCR 産物を発現用
ベクターpGEX6P-1 に組み込み、PB1 の N 末端側に
図 4. NP と importinα5 の超遠心分析

GST-tag が付加するように発現系を構築した。NP と同様の方法で PB1(182-217)を発現させた。

―25―

大量培養で得られた菌体を超音波破砕にかけ、遠また、精製した PB1 は、単独では溶液中で 2 量体を心分離で上清を回収し、GST カラムで精製した。次形成しているが、RanBP5 と相互作用する際には単量に、陽イオン交換カラムとゲルろ過カラムにかけ、体で結合することが明らかとなった。

GST 融合型 PB1 を精製した。

2.2.2

RanBP5 の発現と精製

ヒト由来 RanBP5 全長の遺伝子領域を発現用ベク
ターpGEX6P-1 に組み込み、NP と同様の方法で発現させた。GST カラムで精製後、プレシジョンプロテ
アーゼを加え GST-tag を切断し、陰イオン交換カラムで精製した。

2.2.3 相互作用解析

図 5.

PB1 と RanBP5 の超遠心分析精製した PB1(182-217)と RanBP5 が結合するか、GST プルダウンアッセイを行った。 調製した GST-

一方、PB1 の濃度を 500 μM、RanBP5 の濃度を 50

PB1(1.5 μM)と RanBP5(1.5 μM)を混合し、1 時間イン

μM に調製し、等温滴定型カロリーメータ(iTC200)

キュベートした後 GST カラムによってプルダウンを用いた熱測定を行った。その結果を図 6 に示す。

した。その後、結合の有無を SDS-PAGE により確認

試料の滴定に伴い熱量変化が観測され、得られた結した。
（図 5）PB1(182-217)とともに、RanBP5 のバン

果を 1:1 結合モデルでフィッティング解析を行った

ドが確認され、 調製した PB1 及び RanBP5 が複合体

ところ、PB1 と RanBP5 の解離定数が 214 nM で算出を形成することが明らかとなった。RanBP5 全長に対することができた。このことから、PB1 と RanBP5

して PB1 の NLS (Nuclear Localization Signal)領域のは結晶化に向けて十分に強い親和性をもっているこ

みで相互作用が確認され、これまでの in vivo での報とがわかった。

告と一致する結果が得られた。
また、超遠心分析と等温滴定型カロリーメータの2 つの生物物理学的手法を用いて、さらなる相互作
用解析を行った。まず、超遠心分析では調製した PB1（20 μM）と RanBP5（20 μM）、混合物（20 μM）の
3 種類の試料を用いて測定を行った。超遠心分析装
置 XL-I (Beckman Coulter 社)を用いた速度法による測定を行った。図 5 に PB1 と RanBP5 の超遠心分析
結果を示す。PB1 の沈降係数は約 2.2 - 3.6S、RanBP5の沈降係数は約 6.5S であるのに対し、混合試料では沈降係数が約 7.2S であった。この結果から、PB1 とRanBP5 が 1:1 の複合体を形成すること確認された。

―26―

図 6.

PB1 と RanBP5 の ITC 測定結果

2.2.4

結晶化

精製した RanBP5 (7mg/ml)に、1.2 倍量になるように PB1 を加えて調製した試料を、結晶化スクリーニ
ングロボットを用いて、結晶化条件の探索を行った。
その結果、0.1M MES(pH5.5)、15% PEG3350 の条件
でタンパク質結晶を得ることに成功した。今後、立体構造解析に向けて結晶化条件の最適化を行い、X
線回折実験を進めていく予定である。

図 7.

3.

PB1 - RanBP5 複合体結晶考察及び今後の展望
NP-importinα5 及び PB1-RanBP5 が in vitro においても、複合体を形成することが明らかとなった。
また、それぞれ結晶構造解析に向けて十分な親和性であると考えられるため、今後結晶化条件の探索を進め、立体構造を明らかにしていく予定である。また、これらの実験と並行して、in vivo での実験系においても、タンパク質の細胞内局在を調べていく予
定である。

4.

参考文献

1. Edward C. Hutchinson et al. Journal of General
Virology 92, 1859 – 1869
2. Qiaozhen Ye et al. Nature 444, 1078 – 1082

―27―

革新的インフルエンザウイルス創薬プロジェクト
研究概要集
平成 29 年 3 月 13 日発行

発 行

公益財団法人 神奈川科学技術アカデミー
川崎市高津区坂戸 3－2－1 ／〒 213－0012
ＴＥＬ（044）819－2034

印 刷

野崎印刷紙器株式会社●無断転載・複製を禁じます。