下⽔中の新型コロナウイルス検出
マニュアル

ver 1.1

令和 3（2021）年 6 ⽉

⽬次
1. 本マニュアルの位置づけ .............................................................. 1
2. 全体のフロー ............................................................................. 2
3. 検体の採⽔⽅法 .......................................................................... 3
3.1 機器.................................................................................... 3
3.2 プロトコル ........................................................................... 34. 陰電荷膜法によるウイルス回収・濃縮⽅法 ....................................... 3
4.1 試薬・機器 ........................................................................... 3
4.1.1 試薬 .............................................................................. 3
4.1.2 機器・消耗品 .................................................................. 4
4.2 準備.................................................................................... 4
4.3 プロトコル ........................................................................... 5
5. RNA 抽出⽅法 ............................................................................ 6
5.1 RNeasyPower Soil Total RNA Kit による RNA 抽出 ....................... 6
5.1.1 試薬・機器 ..................................................................... 6
5.1.2 準備 .............................................................................. 8
5.1.3 プロトコル .................................................................... 10
5.2 QlAamp UltraSens Virus Kit による RNA 抽出 ............................ 15
5.2.1 試薬・機器 .................................................................... 15
5.2.2 準備 ............................................................................. 16
5.2.3 プロトコル .................................................................... 176. 新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）ゲノムの検出⽅法 ..................... 19
6.1 試薬・機器 .......................................................................... 19
6.2 プロトコル .......................................................................... 19
6.2.1 陽性コントロールの希釈 ................................................... 19
6.2.2 反応液の調製 ................................................................. 19
6.2.3 ABI 7500 Fast による検出 ................................................ 20
7. PMMoV 検出⽅法 ....................................................................... 22
7.1 機器・試薬 .......................................................................... 22
7.1.1 機器 ............................................................................. 22
7.1.2 試薬 ............................................................................. 23
7.2 リアルタイム PCR 法による PMMoV 検出 ................................... 25ii

7.2.1 2-Step 試薬を⽤いた⽅法 .................................................. 25
7.2.2 1-Step 試薬を⽤いた⽅法 .................................................. 28
7.3 ポジティブコントロール DNA 調製 ........................................... 29
8. 参考資料 ................................................................................. 30
9. 執筆者⼀覧............................................................................... 30

改訂履歴
バージョン

作成⽇・改訂⽇

備考

0.12020 年 9 ⽉ 28 ⽇

第 1 回班会議資料

0.22020 年 10 ⽉ 26 ⽇

第 7 章修正

1.0

2021 年 2 ⽉ 26 ⽇

第 3 回班会議資料

1.1

2021 年 5 ⽉ 17 ⽇

ウエブ公開⽤iii

1. 本マニュアルの位置づけ
本マニュアルは、令和２年度厚⽣労働⾏政推進調査事業費補助⾦（新興・再興感染症及び予防接種政策推進研究事業）「研究課題︓環境⽔を⽤いた新型コ
ロナウイルス監視体制を構築するための研究」において実施した下⽔中の新型
コロナウイルス検出の暫定的なマニュアルである。
下⽔中の新型コロナウイルス検出⽅法は国内外で様々な報告があるが、本マニュアルはわが国で実施しているポリオ環境⽔サーベイランス（感染症流⾏予測調査事業における感染源調査）と併⽤して実施できるよう検討した⼿法であることに留意されたい。
（参考）感染症流⾏予測調査事業実施要領
https://www.niid.go.jp/niid/ja/pr/670-yosoku-procedure.html
ポリオウイルス感染症の実験室診断マニュアル
https://www.niid.go.jp/niid/images/lab-manual/polio.pdf
本マニュアルは、以下の項⽬で構成される。
n

検体の採⽔⽅法【3 章】

n陰電荷膜法によるウイルス濃縮⽅法【4 章】

n

RNA 抽出⽅法【5 章】

n

新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）ゲノムの検出⽅法【6 章】

n

PMMoV 検出⽅法【7 章】

1

2. 全体のフロー
下⽔の沈渣（沈殿物）と濃縮物から SARS-CoV-2 ゲノムを検出する全体のフローは以下に⽰すとおりである。各ステップの詳細は、3 章〜7 章に整理する。

検体の採⽔（3章）

沈渣

粗遠⼼
3,000rpm以
上,30min

RNA抽出（5.1章）

上清【RNeasyPower Soil
Total RNA Kit】

SARS-CoV-2ゲノム検出（6章）

ウイルス回収・濃縮（4章）

PMMoV検出
（7章）

結果まとめ

SARS-CoV-2, PMMoVのGC量/L

濃縮物（1st誘出液）

ポリオ分離に利⽤RNA抽出（5.2章）【QIAamp UltraSens
Virus Kit】

2nd誘出液SARS-CoV-2ゲノム検出（6章）

PMMoV検出
（7章）

結果まとめ

ポリオ分離に利⽤

SARS-CoV-2, PMMoVのGC量/L2

3. 検体の採⽔⽅法
採⽔⽅法はポリオ環境⽔サーベイランスに準じた流⼊下⽔を⽤いる⽅法である。
3.1 機器1) 採⽔⽤ボトル（0.5 L 程度の容量）
2) 保冷容器（採⽔ボトルが⼊るもの）
3.2 プロトコル(1) ⽉ 1 回流⼊下⽔（0.5 L 強を⽬安）を採取、実験室へ輸送（4〜8℃）する。
(2) 即⽇濃縮を⾏わない場合は、凍結保存する（－30℃）(3) 3,000rpm 以上で 30min 粗遠⼼する。

4. 陰電荷膜法によるウイルス回収・濃縮⽅法（注記）ポリオウイルスの場合は陰電荷膜法にて効率よく濃縮できる。流⼊下
⽔を遠⼼後、得られた沈殿物と上清を⽐較した結果、沈殿物から効率よく新型
コロナウイルスゲノムが検出できる。令和２年度の研究班では２種類の材料を⽤いて⽐較調査を⾏ったところ、陰電荷膜法の場合も効率よく検出できるとした結果も得られたため（今後の検討課題）、本マニュアルでは本法も記載する。
4.1 試薬・機器
4.1.1 試薬
1) 塩化マグネシウム（6 ⽔和物）
2) ビーフエキストラクト
3) 塩酸

3

4.1.2 機器・消耗品
1) ガラスビーカー（500mL,1000mL）（滅菌済み）
2) 50ml 遠⼼チューブ（滅菌済み）
3) 15mL 遠⼼チューブ（滅菌済み）
4) 2mL チューブ（滅菌済み）
5) ハサミ（滅菌済み）
6) ピンセット（滅菌済み）
7) ピペット（10, 50ml）（滅菌済み）
8) シャーレ（滅菌済み）
9) シリンジフィルター（0.45μm）
10) pH 試験紙⼜は pH メーター11) プラスティクスホルダー（参考︓アドバンテック PP47）
12) 混合セルロースエステルタイプ陰電荷膜（参考︓アドバンテック A045A047A,孔径 0.45μm、サイズ 47mm）13) 100ml ディスポーザルシリンジ
14) 必要に応じてグラスファイバーフィルター（1μm）

4.2 準備1) 3% ビーフ液l

3g ビーフエキストラクトを 100ml の滅菌⽔に溶解しオートクレーブ滅菌（121℃, 20 分）する。
4

2) 2.5M MgCl2 溶液
l

塩化マグネシウム（6 ⽔和物）50.8g をミリ Q ⽔に溶解し 100ml に調整。オートクレーブ滅菌（121℃, 20 分）する。

3) 0.5N HCl を準備する。
4) フィルターの準備l

プラスティクスホルダーに混合セルロースエステルタイプ陰電荷膜を装着
しアルミホイル等で覆い、オートクレーブ滅菌（121℃, 20 分）後、乾燥させる。

※100ml 当たりフィルターを約 1 枚使⽤する。500ml を濃縮する場合、前述の滅菌フィルターを 5 組程度準備する。

プラスティクスホルダーに混合セルロースエステルタイプ陰電化膜を装着

4.3 プロトコル(1) 試料を 50ml 遠⼼チューブ等を⽤いて粗遠⼼（3000rpm 以上、30 分、4℃）する。
(2) 上清を 500ml のビーカーに移す。
(3) (2)のビーカーに攪拌⼦を⼊れ、マグネティックスターラー上に設置する。
(4) 1/50 量の 2.5M MgCl2 溶液を添加し（試料 500ml の場
合、10ml）攪拌する（最終濃度 0.05M）。
(5) 0.5N HCl を⽤いて攪拌しながら pH3.5 に調整する。
(6) 100ml シリンジで液を吸い上げ、ゆっくりろ過する。廃液は 1000ml ビーカーで受ける。
(7) プラスティクスホルダーから陰電荷膜を取り出しシャーレに移す。

5

(8) ピンセットとハサミで陰電荷膜を細切し、50ml 遠⼼チューブに移す。
(9) 3% ビーフ液 5ml を加え 5 分間振とう、或いは 1〜3 分間ボルテックス攪拌する（100 倍濃縮の場合）。
(10) 上清を 15ml 遠⼼チューブに移す（1 回⽬誘出）。
(11) 再び 3% ビーフ液 5ml を 50ml 遠⼼チューブに加え 5 分間振とう、あるいは 1〜3 分間ボルテックス攪拌する。
(12) 上清を 15ml 遠⼼チューブに移す（2 回⽬誘出）。
(13) 1 回⽬及び 2 回⽬の誘出液を⼊れた 15ml 遠⼼チューブを遠⼼（3000rpm、15 分、4℃）する。
(14) 上清を 0.45μm のシリンジフィルターでろ過する。ろ液を保管⽤チュー
ブに移し－20℃で保管する。
5. RNA 抽出⽅法
沈渣（沈殿物）から RNA を抽出する場合は、RNeasy Power Soil Total RNA
Kit を⽤いる。濃縮物から RNA 抽出する場合は、QIAamp UltraSens Virus Kit
を⽤いる。それぞれの⽅法は以下に⽰すとおりである。
5.1 RNeasyPower Soil Total RNA Kit による RNA 抽出
5.1.1 試薬・機器
1) RNeasy® PowerSoil® Total RNA Kit【QIAGEN】※Kit の内容は以下のとおり。

6

出所︓RNeasy® PowerSoil®Total RNA Kit Handbook（June 2017）p.3

RNeasy PowerSoil Total RNA Kit (QIAGEN)

Cat. No. 12866-25

2) 15ml チューブを利⽤可能な遠⼼分離機（2500 x g minimum）
3) マイクロ遠⼼分離機（13,000 x g）
4) ピペット（20 μl–1000 μl）
5) ⾎清ピペット（1 ml and 10 ml）
6) ボルテックス（Vortex-Genie® 2）7) ボルテックスアダプター4（15 ml）チューブ⽤ （cat. no. 13000-V1-15）
78) RNase-free gloves（cat. nos. 1556-S, 1556-M and 1556-L）
9) RNase 除去⽤のラボクリーナー（cat. no. 12095-500）
10) フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール溶液
11) Heat block set at 45°C（オプション）
5.1.2 準備
(1) 粗遠⼼を⾏い、静置後上澄みを除く。

8

9

5.1.3 プロトコル(1) 試料（最⼤ 2g）を 15ml PowerBead Tube（付属）に⼊れる。
(2) 2.5 ml の PowerBead Solution、0.25 ml の Solution SR1、0.8 ml の
Solution IRS を追加。
(3) 3.5 ml のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール溶液（pH 6.5〜
8.0）を追加。 PowerBead Tube にフタをしてボルテックスし、層が消えるまで混合。

(4) PowerBead Tube をボルテックスアダプターに置き、最⾼速度で 15 分間
ボルテックスする。

10

(5) PowerBead Tube を取り外し、2,500 x g で 10 分間遠⼼する。
(6) 上部の⽔相（中間相と下部のフェノール層を避ける）を清潔な 15 ml
Collection Tube（付属）に移し、フェノール/クロロホルム/イソアミルア
ルコール溶液を捨てる。

11

(7) 1.5 ml の Solution SR3 を⽔相に加え、ボルテックスして混合する。2〜
8℃で 10 分間インキュベートし、室温で 2,500 x g で 10 分間遠⼼する。
(8) ペレット（存在する場合）を乱さないようにして、上清を新しい 15 ml
Collection Tube（付属）に移す。
(9) Collection SR の上清に 5 ml の Solution SR4 を加え、転倒またはボルテックスして混合する。室温で 30 分間インキュベートする。
(10) 2500 x g で 30 分間遠⼼する。
(11) 上清をデカントし、15 ml の Collection Tube をペーパータオルの上で 5分間反転する。
(12) Solution SR5 を振って混合し、1 ml を 15 ml Collection Tube に加える。繰り返しピペッティングまたはボルテックスすることにより、ペレットを完全に再懸濁する。
注︓ペレットの再懸濁が困難な場合は、チューブをヒートブロックまたは45℃のウォーターバスに 10 分間⼊れ、ボルテックスする。ペレットが再懸濁するまで繰り返す。
(13) RNA 分離サンプルごとに 1 つの JetStar Mini Column（付属）を準備する。
13a

15 ml コレクションチューブ（付属）のキャップを外し、その中にJetStar Mini Column を置く。カラムが Collection Tube にぶら下がる。

13b

JetStar Mini カラムに Solution SR5 2 ml を追加する。重⼒でカラムに流し、15 ml の Collection Tube に集める。
注︓RNA 分離サンプルをロードする前にカラムを乾燥させないこと。

12

(14) ステップ 12 の RNA 分離サンプルを JetStar Mini Column に加え、カラムを介して 15 ml Collection Tube に重⼒で流し込む。
(15) 1 ml の Solution SR5 を JetStar Mini Column に加え、15 ml
Collection Tube に完全に⾃然落下させる。
(16) JetStar Mini Column を新しい 15 ml Collection Tube（付属）に移す。
Solution SR6 を振って混合し、JetStar Mini Column に 1 ml を加えて、結合した RNA を溶出する。 Solution SR6 を 15 ml Collection
Tube に⾃然落下させる。

13

(17) 溶出した RNA を 2.2 ml Collection Tube（付属）に移す。Solution
SR4 を 1ml 加える。少なくとも 1 回転倒混和し、–15°C から–30°C で
最低 10 分間インキュベートする。
(18) 2.2 ml Collection Tube を 13,000 x g で 15 分間遠⼼して、RNA をペレット化する。
(19) 上清をデカントし、2.2 ml Collection Tube をペーパータオルの上に 10
分間置き、ペレットを⾵乾する。

(20) RNA ペレットを 100 µl の Solution SR7 で再懸濁する。

14

5.2 QlAamp UltraSens Virus Kit による RNA 抽出
5.2.1 試薬・機器
5.2.1.1 試薬
1) QlAamp UltraSens Virus Kit 【QIAGEN】
2) 1.5ml チューブ【Thermo/ 1.5ml クリア/ #3448】
3) 2ml エッペンチューブ【Eppendorf / safe-Lock Tubes 2.0ml / 0030
120.094】4) エタノール（99.5） 【Wako /Ethanol (99.5)500ml / 057-00456】（新しくキットを開けた時、Buffer AB、AW1、AW2 の調整に必要。）※QlAamp UltraSens Virus Kit (QIAGEN)の外観

Protocol (13)で使⽤する
QlAamp スピンカラムと 2ml コレクションチューブ

1.5ml チューブと 2ml のエッペンチューブ（別売）
1.5ml チューブ︓5.2.2 で Buffer AR の分注に使⽤
2ml エッペンチューブ︓5.2.3 のプロトコル(1)で使⽤

15

5.2.1.2 機器
1) ミキサーインキュベーター 2 台（Eppendorf thermomixer comfort -1.5ml- ）※ミキサーインキュベーター（Eppendorf thermomixer comfort -1.5ml-）︓
5.2.2 と 5.2.3 のプロトコル(11)で使⽤

ヒーティングブロックあるいは⽔浴によるインキュベートに代⽤できる。

5.2.2 準備lキャリア RNA、Buffer AB・AW1・AW2 を調整しておく。

l

ミキサーインキュベーターを 40℃と 60℃に設定する。

l

1 サンプルあたり 330μl として、Buffer AR を 1.5ml チューブに分注し、60℃に温めておく（5.2.3 のプロトコル (9)でサンプル数＋α のマスター
ミックスを作成）。Buffer AR を温めることでペレットが溶解しやすくな
り、proteinase K の活性が増す。

16

5.2.3 プロトコル(1) 2ml エッペンチューブにサンプル※1 を 1ml 加える。
※１︓陰電荷膜による濃縮物(2) サンプルに Buffer AC を 0.8ml 加える。
(3) (1)のチューブのフタにキャリア RNA を 5.6μl のせる。
(4) フタを閉め 2ml チューブを転倒混和する。
(5) 10 秒間ボルテックスする。
(6) 室温で 10 分間インキュベートする。
(7) 1200×g で 5 分間遠⼼※2。室温。
※２︓3 分間では沈ペレットが柔らか過ぎるので、5 分に変更した。
沈殿が不⼗分の場合、遠⼼時間をさらに⻑くする。

(8) 1ml ピペットマンを⽤いて、上清を除去する。

ペレットを壊さないように可能な限り取り除く。1ml ロ
ングチップ（ART 1000 REACH BF / 2079-HRPK）推奨。

(9) 60℃に温めた Buffer AR に proteinase K※5 を加え、マスターミックスとする。
※5︓1 サンプル 22μl として加える。

(10) ペレットに(9)のマスターミックス 320μl を加えてボルテックスし、ペレットを完全に溶かす。
(11) ミキサーインキュベーターを最⼤スピード（14000rpm）にセットし、40℃で 10 分間インキュベートし、スピンダウン。ヒーティングブロッ
クあるいは⽔浴の場合は、5 分間インキュベート後に 5 秒間ボルテック
ス、さらに 5 分間インキュベート後に 5 秒間ボルテックスし、スピンダ
ウン。
(12) Buffer AB を 300μl 加える。ボルテックスでよく混ぜスピンダウン。
(13) カラムの縁を濡らさないように QlAamp スピンカラム※6 に全量※7 を移す。
17

※6︓付属の QlAamp スピンカラムがセットされた 2ml コレクションチューブ※7︓付属のプロトコルには 700μl とあるが、700μl ない場合が多い(14) キャップを閉めて 3000×g で 1 分間遠⼼（室温）。

回転数に注意する(15) QlAamp スピンカラムを新しい 2ml コレクションチューブにセットする。
（ろ過液の⼊ったチューブは捨てる）(16) Buffer AW１を 500μl 加える。
(17) 6000×g で 1 分間遠⼼（室温）。

回転数に注意する(18) QlAamp スピンカラムを新しい 2ml コレクションチューブにセットする。
（ろ過液の⼊ったチューブは捨てる）(19) Buffer AW2 を 500μl 加える。
(20) 20，000×g（14000rpm）で 3 分間遠⼼（室温）。回転数に注意する(21) QlAamp スピンカラムを新しい 1.5ml コレクションチューブにセットする。
（ろ過液の⼊ったチューブは捨てる）(22) QlAamp スピンカラムに Buffer AVE を 30μl 加える。
(23) カラムのふたを閉めて 6000×g で 1 分間遠⼼（室温）。
回転数に注意する(24) QlAamp スピンカラムに Buffer AVE を 30μl 加える。
ろ過液を捨てないように気を付ける。

(25) カラムのふたを閉めて 6000×g で 1 分間遠⼼（室温）。
(26) -20℃で凍結保存。
※ ⻑期保存の場合はー80℃で保存する

18

6. 新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）ゲノムの検出⽅法
6.1 試薬・機器
1) SARS-CoV-2 Realtime RT-PCR（NIID N2）
2) SARS-CoV-2 Realtime RT-PCR（CDC N1N2）
3) Takara RR600A One Step PrimeScript III RT-qPCR Mix
4) Takara XD0008 Primer/Probe N2（2019-nCoV）
5) Takara XA0142 Positive Control RNA Mix（2019-nCoV）
6) Takara RC300A SARS-CoV-2 Direct Detection RT-qPCR Kit
6.2 プロトコル
6.2.1 陽性コントロールの希釈(1) Positive Control RNA（US N1/N2）と Positive Control RNA Mix（2019-nCoV）を希釈（⽤時調製）(2) いずれも 107 ストックから 100 倍希釈で 105、以下、EASY Dilution 45µL で 100 まで段階希釈(3) （103,） 102, 101, 100 の 4 つを 5 µL ずつ陽性コントロールとして使⽤（5 x 103〜5 x 100）
6.2.2 反応液の調製
6.2.2.1 SARS-CoV-2 Realtime RT-PCR（CDC N1N2）l

クリーンベンチ内で調製（40 µL ⽤作って N=2 で半分に分ける）
40 µL x (+N+S)
RT-qPCR Mix (2×)

20 µL

Primer/Probe mix (pink)

4 µL

ROX Reference Dye II*(50×) (brown)

0.8 µL

RNase Free H2O

5.2 µLTotal

30 µL プレートに分注

6.2.2.2 SARS-CoV-2 Realtime RT-PCR（NIID N2）l

クリーンベンチ内で調製 40 µL x (+N+S)
19

One Step PrimeScript III RT-qPCR Mix (2×)

20 µL

5×NIID_2019-nCOV_N_ Primer/Probe mix

8.0 µLROX Reference Dye or Dye II*(50×)

0.8 µL

RNase Free H2O

1.2 µLTotal

30 µL プレートに分注

6.2.3 ABI 7500 Fast による検出(1) ABI 7500Fast を起動(2) PC 起動、USER/PASS ⼊⼒、7500 software 起動、login as guest(3) Advanced Setup(4) 検査名⼊⼒（例 SC2_yymmdd_kitamura）(5) 7500 Fast（96 well、Quantitation - standard curve、Taqman
reagent）(6) Standard（~2hrs to…）に変更(7) Plate Setup(8) Define Target で add new target して Assay, Target, Reporter を⼊⼒
ü SC2_NIID は FAM, SC2_CDCN1N2 は Cy5
ü Quencher は両⽅とも none
(9) Define Samples で必要なサンプル数まで add new sample してサンプル
名⼊⼒(10) Assign Targets and Samples(11) Passive reference は ROX（Takara 製品 ROX Reference Dye II 使⽤）(12) View Plate Layout

ワークシートに基づいて assign 設定(13) 陰性コントロール”N”、陽性コントロール”S”、サンプル”U”を設定、S は
コピー数⼊⼒(14) “U”には step9 で⼊⼒したサンプル名を選択(15) Run Method (Standard mode)
50ºC, 30 min
95ºC, 15 min
45 cycles
95ºC, 15 sec
60ºC, 60 sec, Data Collection20

(16) START RUN をクリック。ファイルの保存（⾃分のフォルダ―>⽇付フォ
ルダ作成）(17) Estimated Time Remaining が表⽰されれば OK
約 3 時間で RUN は完了するので右上の”X”をクリックしファイルをセーブ
（Yes）

21

7. PMMoV 検出⽅法
トウガラシ微斑ウイルス（Pepper Mild Mottle virus, PMMoV）はピーマン
等にモザイク病を引き起こす植物ウイルスである。これをヒトが摂取すると糞便に多量の PMMoV が排泄されることが知られている。また、下⽔中に含まれる動物・植物ウイルスの中でも最もコピー数が⾼いとされている。
本章ではリアルタイム PCR による PMMoV の検出⽅法を⽰した。下⽔濃縮⼯程のバリデーションのほか、糞便汚染の指標として PCR 反応の Internal
control として利⽤可能である。
7.1 機器・試薬
7.1.1 機器
1) マイクロ遠⼼機
2) マイクロピペット
3) RNase-free 滅菌蒸留⽔
4) 滅菌微量遠⼼チューブ（2.0mL、1.5mL、0.5mL）5) リアルタイム PCR 反応プレート（８連ストリップチューブ）6) ８連ストリップキャップ（プレートシール）
7) サーマルサイクラー
8) リアルタイム PCR 装置l

以下の 3 機種が利⽤可能である。
①7500Fast②QuantStudio 5③StepOnePlus

227.1.2 試薬
1) プライマー・プローブ・ポジティブコントロール・逆転写試薬・PCR 試薬l

⼀部の PCR 試薬では、リアルタイム PCR 装置の種類に応じて補正⽤ ROXの濃度を変えたほうがよい。

l以下の逆転写試薬、2-step PCR ⽤試薬、1-step PCR ⽤試薬は、いずれも例⽰であり、類似品を利⽤してもよい。

① プライマー1
PMMV-FP1-rev: GAG
PMMV-RP1: TTG

TGG

TTT GACCTT

TCG GTT GCA ATG

AAC

CAA

GTT TGAGT② プローブ
PMMV-Probe1

FAM-MGB: FAM-CCT ACC GAA GCA AAT G-NFQ-MGB※TAMRA や BHQ などの NFQ-MGB 以外のクエンチャーでは反応性がよくない。
③ ポジティブコントロール
MC1-QC (175bp) 合成⼆本鎖 DNA 断⽚（GeneArt Strings DNA
Fragments）またはプラスミド⼆本鎖 DNA
TTATGGCATACACAGTTACCAGTGGTAATGGTAGCTGTGGTTTCAAATGAG
AGTGGTTTGACCTTAACGTTTGAGAGGCCTACCGAAGCAAATGTCGCACTTGCATTGCAACCGACAATTACATCAAAGGAGGAAGGTTCGTTGAAGATTGTA
CGTGGGCTACAACTCCTTAACC④ 逆転写試薬
High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit【ThermoFisher SCIENTIFIC（4368814）】
SuperScript II Reverse Transcriptase

1

プライマー、プローブ、コントロールの試薬は、以下の⽂献を参照している。

Haramoto et al.,Appl Environ Microbiol, 79（23）:7413–7418

23

2013

【ThermoFisher SCIENTIFIC（18064022）】
PrimeScript RT Master Mix（Perfect Real Time）【TaKaRa（RR036A,B）】⑤ 2-Step PCR ⽤試薬
Premix Ex Taq（Probe qPCR）*、（Perfect Real Time）【TaKaRa （RR390A）、（RR039A)】* Probe qPCR Mix, with UNG（RR392A）でもよい
TaqMan Universal PCR Master Mix【ThermoFisher SCIENTIFIC（4304437）】
QuantiTect Probe PCR Kit【QIAGEN（204343）】⑥ 1-Step PCR ⽤試薬
One Step PrimeScript III RT-qPCR【TaKaRa（RR600S）】
QuantiTect probe RT-PCR kit【QIAGEN（204443）】

24

7.2 リアルタイム PCR 法による PMMoV 検出
7.2.1 2-Step 試薬を⽤いた⽅法
1) 逆転写lここでは、PrimeScript RT Master Mix（Perfect Real Time）を⽤いた試
薬調製および反応条件について例⽰する。
容量

試薬

l

（µL)

5× Master Mix

2

RNase free Water

3

template RNA

5

Total 容量10

RT 処理条件は以下のとおり
37℃ 30min
85℃

5sec

4℃

25

2) リアルタイム PCRl

ここでは、TaKaRa Premix Ex Taq （Perfect Real Time）(RR039A）を⽤いた試薬調整及び反応条件について例⽰する。

(1) ABI 7500 Fast を⽤いる場合
試薬

容量（µL)

最終濃度

2x Master Mix

10

×1

For. PMMV-FP1-rev(20µM)

0.2

0.2

（µM）

Rev. PMMV-RP1(20µM)

0.2

0.2

（µM）

PMMV-Probe1(5µM)

0.8

0.2

（µM）

ROX Dye II

0.4

×1

RNase free Water

6.4

template cDNA※

2

Total 容量20

※事前調査により⼗分な RNA 量が確認できれば、cDNA を節約するために
RNase DNase free Water、TE バッファー、逆転写試薬に付属する DNA 希
釈液などで 10〜100 倍に希釈して使⽤する。

l

下記の条件でリアルタイム PCR 反応を⾏う。

l

ただし、増幅条件は使⽤機器によって異なるのでそれぞれ最適化を⾏うこと。
95℃

30 sec

95℃

3 sec

60℃

30 sec45cycles※Fast モードより Standard モードの⽅が良好な結果が得られる。

26

(2) QuantStudio 5 を⽤いる場合
試薬

容量（µL)

最終濃度

2x Master Mix

10

×1

For. PMMV-FP1-rev(20µM)

0.2

0.2

（µM）

Rev. PMMV-RP1(20µM)

0.2

0.2

（µM）

PMMV-Probe1(5µM)

0.8

0.2

（µM）

ROX Dye II

0.1

×0.25

RNase free Water

6.7

template cDNA※

2

Total 容量20

※事前調査により⼗分な RNA 量が確認できれば、cDNA を節約するために
RNase DNase free Water、TE バッファー、逆転写試薬に付属する DNA 希
釈液などで 10〜100 倍に希釈して使⽤する。

l

下記の条件でリアルタイム PCR 反応を⾏う。

l

ただし、増幅条件は使⽤機器によって異なるのでそれぞれ最適化を⾏うこと。
95℃

30 sec

95℃

3 sec

60℃

30 sec45cycles27

7.2.2 1-Step 試薬を⽤いた⽅法l

ここでは、TaKaRa OneStep PrimeScript III RT-qPCR Mix with UNG(RR601A)を⽤いた試薬調製及び反応条件について例⽰する。

(1) Quant Studio5 を⽤いる場合
容量

試薬

（µL)

最終濃度

2x Master Mix

10

×1

For. PMMV-FP1-rev(20µM)

0.2

0.2

（µM）

Rev. PMMV-RP1(20µM)

0.2

0.2

（µM）

PMMV-Probe1(5µM)

0.8

0.2

（µM）

ROX Dye II

0.1

×0.25

RNase free Water

3.7

template RNA※

5

Total 容量20

※事前調査により⼗分な RNA 量が確認できれば、RNA を節約するために
RNase DNase free Water で 10〜100 倍に希釈して使⽤する。

l

下記の条件でリアルタイム PCR 反応を⾏う。

l

ただし、増幅条件は使⽤機器によって異なるのでそれぞれ最適化を⾏うこと。
25℃

10 min

52℃

5min

95℃

10sec

95℃

5sec

60℃

30sec

45cycles28

7.3 ポジティブコントロール DNA 調製
l定性の場合、検出感度として 102 コピー/well が検出できれば良い。

l

定量する場合は、105、104、103、102 コピー/2µL or 5µL の 4 段階を⽤いてスタンダードとする。

l

合成⼆本鎖 DNA 断⽚の MC1-QC175（GeneArt Strings DNA
Fragments）またはプラスミド⼆本鎖 DNA を⽤いる。

※溶解⽅法の例
塩基⻑が 175 bp、収量が 650 ng のとき、1 bp あたりの分⼦量を 660 Daとすると、モル数が 650×10-9/175×660 mol
アボガドロ数を 6.02×1023 とすると、コピー数は、(650×10-9)×(6.02×1023)/175×660 copies
これを 100μL（⽔または TE buffer 使⽤）で溶解すると、(650×10-9×6.02×1023)/(175×660×100)=3.39×1010 copies/μLl

凍結乾燥品を添付書に従い DNase RNase free Water で調製する。

l

107 コピー/2 or 5µL を⼩分けして－70℃以下に保存するとよい。

l

⽤時調製を⾏うこととする。

29

8. 参考資料
lOccurrence of Pepper Mild Mottle Virus in Drinking Water Sources inJapan, Haramoto et al., Appl Environ Microbiol, 79（23）:7413–
7418

l

2013

Efficient detection of SARS-CoV-2 RNA in the solid fraction ofwastewater, Kitamura et al., Science of The Total Environment
Volume 763, 1 April 2021, 144587

9. 執筆者⼀覧
⽒ 名
吉⽥

弘

所 属

職 名

国⽴感染症研究所ウイルス第⼆部

主任研究官

喜多村 晃⼀

国⽴感染症研究所ウイルス第⼆部

主任研究官

濱﨑 光宏

福岡県保健環境研究所病理細菌課

病理細菌課⻑

⼩澤 広規

横浜市衛⽣研究所微⽣物検査研究課

研究員

北島 正章

北海道⼤学院⼯学研究院

助教

原本

⼭梨⼤学⼤学院総合研究部附属国際流域環境 教授

英司

研究センター⽥隝 淳

国⼟交通省国⼟技術政策総合研究所下⽔道研 室⻑
究部下⽔処理研究室

貞升 健志

東京都健康安全研究センター 微⽣物部

部⻑

⾼橋 雅輝

岩⼿県環境保健研究センター 保健科学部

上席専⾨研究員

藤森 亜紀⼦岩⼿県環境保健研究センター 保健科学部

主査専⾨研究員

植⽊ 洋

宮城県保健環境センター 微⽣物部

総括研究員

渡部 徹

⼭形⼤学農学部⾷料⽣命環境学科

教授

北川 和寛

福島県衛⽣研究所 微⽣物課（ウイルス）

主任医療技師

坂 恭平

⻘森県環境保健センター微⽣物部

技師

筒井 理華

⻘森県健康福祉部保健衛⽣課

感染症対策 G 主幹

濱島 洋介

和歌⼭県環境衛⽣研究センター 衛⽣研究部 微 副主査研究員
⽣物グループ

⽊⽥ 浩司

岡⼭県環境保健センター

ウイルス科⻑

望⽉ 靖

岡⼭県環境保健センター

所⻑

30

⽒ 名

所 属

⼩川 貴史

千葉県衛⽣研究所ウイルス・昆⾍医科学研究室

藤沼 裕希

千葉県衛⽣研究所ウイルス・昆⾍医科学研究室

伊藤 雅

愛知県衛⽣研究所⽣物学部ウイルス研究室

職 名

室⻑

⽣物学部ウイルス研究室
⼤⽯ 和徳

富⼭県衛⽣研究所所⻑

⾕ 英樹

富⼭県衛⽣研究所

ウイルス部⻑

板持 雅恵

富⼭県衛⽣研究所

主任研究員

佐賀 由美⼦

富⼭県衛⽣研究所

主任研究員

稲崎 倫⼦

富⼭県衛⽣研究所

主任研究員

嶌⽥ 嵩久

富⼭県衛⽣研究所

研究員

五⼗嵐 笑⼦

富⼭県衛⽣研究所

研究員

葛⼝ 剛

岐⾩県保健環境研究所

主任専⾨研究員

⼩川 泰卓

埼⽟県衛⽣研究所ウイルス担当

主任

宮下 広⼤

埼⽟県衛⽣研究所ウイルス担当

技師

⻑島 真美

東京都健康安全研究センター ウイルス研究科

主任研究員

31