26 モダンメディア

51巻２号 2005〔感染症〕

第 40 回小島三郎記念文化賞

臨床微生物学の確立と普及に向けた基盤研究
─ 基礎と臨床の接点を求めて ─A fundamental research towards the expansion andestablishment of clinical microbiology.

やまぐちけいぞう

山 口 惠 三Keizou YAMAGUCHI

１．顆粒球減少マウスおよび熱傷マウスモデルを用はじめにいた内因性敗血症の解析

今回の受賞は「感染症領域における基礎と臨床の敗血症は早期に適切な治療を開始しなければしば橋渡し的仕事」を高く評価していただいたものと理しば死に至る予後不良な感染症で，多くは基礎疾患解し， 感染実験モデルを用いた感染症病態の解を有する患者に日和見感染症として発症する。近年

明の優れた抗菌薬の開発により，大腸菌，肺炎桿菌なに関する研究を中心にこれまでの仕事の概略について紹介させていただく。

どによる敗血症の死亡率は著明に低下したものの，緑膿菌敗血症の死亡率は未だに高い施設が多い。こⅠ．微生物学領域における臨床検査医学の向上のような日和見感染症の発症機序を解明することを目的に，臨床上のデータに基づき，ヒトにおける敗血症の病態に極めて類似した白血球減少および熱傷

長崎大学附属病院検査部細菌室の室長時代，微生マウス実験モデルを作製し，種々の検討を加えてき物検査室の近代化を目的に，検査室の自動化と迅速た。その結果，いずれのモデルにおいても内因性敗診断，およびシステム化を完成させた。自動化の一血症を高頻度で発症し，その原因菌としては抗菌薬端としてスパイラルシステムを初めて臨床に応用によって選択され過増殖した腸管内細菌叢の一部のし，定量培養の精度向上と簡易化に貢献，現在では菌，特に緑膿菌が重要な役割を果たしていることを各検査室で広く導入されている。さらに，日常の薬確認した（図 1，2）。内因性緑膿菌敗血症の発症に剤感受性試験に定量的検査法である微量液体希釈法

は，原因菌となる緑膿菌の腸管における定着・増殖を全国に先駆けて導入，これらをルチン検査としてが必須となるが，臨床分離株を用いた実験により，定着させ，結核菌にも応用した。また，検査部を中血液由来株は非血液由来株（主に喀痰由来）に対し心とした院内感染対策ネットワークに着手し，現在定着・増殖率が高いことを明らかにした。そこで，の耐性菌サーベイランスのモデルを構築した。

次のステップとして重要な腸管上皮から血液中への菌の侵入性に関して，緑膿菌鞭毛の運動性を中心にⅡ．動物感染実験モデルを用いた感染症病態の解明検討を加えた。運動性の強い B-16 株を親株として，これから得られた運動性低下変異株を用いてその病原性を比較してみた（図 3）。運動性が活発な院内感染症や市中肺炎を対象とした感染実験モデ

B-16，B-16-52 は，熱傷時敗血症モデルにおいて高ルを作成し，それぞれの病態について基礎的観点かい死亡率を示したのに対して，運動性を低下させたらアプローチを行い，臨床における応用を試みてき

B-16-40，B-16-46 株ではいずれも有意な死亡率の低たので，その主なものについて概説する。

下を示した（図 4）。同様の実験を顆粒球減少マウ

東邦大学医学部 微生物学講座〠 143-8540 東京都大田区大森西 5-21-16

Department of Microbiology, Toho University School of Medicine(5-21-16, Omori-nishi, Ota-ku, Tokyo)

（4）

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抗菌薬投与
抗菌薬投与開始後の日数
セフタジジム（CAZ）
クロキサシリン（MCIPC）

図３

寒天平板上の緑膿菌の運動性

アンピシリン（ABPC）
サイクロホスファマイド（CY）

図１ 各種抗菌薬投与下でのサイクロホスファマイド処理マウスの生残率

図４
図２

死亡した白血球減少マウスの心血と肺からの分離菌とその内訳

P.aeruginosa B-16 およびその変異株による敗血症における熱傷マウスの生残率の比較

末梢血液中の白血球以外に，腸管のリンパ球にも作用していると考えられ，腸管局所の防御機構と敗血スモデルを用いて行ったが，運動性低下変異株の病症発症の関係も今後の研究課題である。さらに，敗原性は熱傷モデル同様明らかに低く，また，抗鞭毛血症の発症や死亡率に関与していると考えられる抗体を投与することによって有意な死亡率の低下がexotoxin A は，種々の免疫系細胞に作用し，エンド観察されたことから，内因性敗血症の発症には緑膿

トキシンショックの主要なメディエーターである菌の運動性が重要な役割を果たしていることが確認

TNF などのサイトカインの産生性等の変化を起こされた。

すことが近年報告されている。内因性敗血症モデル

抗菌薬の投与により，腸管内で選択的に過増殖をにおけるこれらのサイトカインとの関係についても引き起こした細菌群の一部は，腸管より門脈血中に今後検討を行わなければならない。以上のように，侵入するが，大部分は肝臓の Kupffer 細胞で捕捉さ緑膿菌による内因性敗血症は，幾つものステップをれ循環血中には侵入し難いのに対して，緑膿菌はこ経て発症に至る。したがって，本感染症のコントのような異物排除機構に抵抗し，容易に全身性敗血ロールには，抗菌薬の投与のみでは十分な効果が期症を引き起こす。また，敗血症を起こしやすい緑膿待出来ないことは明らかであり，発症機構を正しく菌は exotoxin A および alkaline protease の産生性が解明し，それに基づいた適切な予防・治療法の確立高い。このような菌体外酵素と腸管における緑膿菌が必要となる。の定着・増殖性，あるいは Kupffer 細胞によるクリ

２．呼吸器感染症

アランスに対する抵抗性との関係に関しては未だ不１）肺炎球菌性肺炎

明の部分が多く，今後解明されるべき点の１つである。また，サイクロホスファマイド（CY）投与は肺炎球菌性肺炎は，市中肺炎の最も重要な原因菌（5）

28であり，敗血症や髄膜炎を併発しやすく，しばしばの形で関っているものと考えられた。なお，病態悪重篤な経過をとる。特に近年，ペニシリン耐性肺炎化への TNF-a の関与も示唆されたが，詳細は明ら球菌（PRSP）が問題となっているが，ペニシリン系

かになっていない。

以外にもマクロライド系やテトラサイクリン系抗菌

次に，PRSP 肺炎に対する効果的な抗菌薬療法に薬などにも耐性を示す多剤耐性化が急速に進んでいついて，CBA/J マウス肺炎モデルを用いて検討しることから，治療法の再検討が強く求められている。

た。各種抗菌薬を 1 日 2 回，6 日間皮下投与して生PRSP 感染モデルを作製するにあたり，ヒトの病存率を観察した。無投与群ではすべてが約 1 週間以態に類似したモデルを作製するためにはマウスの系内で死亡したが，バンコマイシン 40mg/kg あるいの選択が重要となる。種々の検討を重ねた結果，はイミペネム 40mg/kg を投与した場合には約 90％PRSP 感染モデルの作製には CBA/J マウスが適切の優れた生存率が得られた。また，ペニシリン G

で あ る こ と を 見 出 し た（ 図 5）
。CBA/J マ ウ ス

40mg/kg を投与した場合には約 10 日ですべてが死

PRSP（19 型）肺炎モデルにおける肺内菌数と生存亡したが，4 倍量の 160 mg/kg を投与した場合には率の関連をみると，肺内菌数の増加に伴い 4 〜 5 日約 40％が生存した（図 8）。この成績は，「PRSP 肺目頃から死亡するマウスが観察されるようになり，炎に対してはペニシリンの増量によって効果を期待

約 1 週間後には敗血症や髄膜炎を合併し死に至るできる」とする臨床成績とよく合致するものであっが，この病態はまさにヒトにおける経過と類似してた。さらに，イミペネムにゲンタマイシン 10mg/いる（図 6，7）。本モデルを用いて病態形成に関わる因子について検討した結果，PRSP（19 型）に対して CBA/J マウスが高い感受性を示すのは，マウスにおける補体や一酸化窒素の反応性の低下が何らか

図７
図５

CBA/J マウスでみられる PRSP 肺炎

CBA/J マウスは PRSP（19 型）に特異的に感受性が高い

バンコマイシン（VCM）
イミペネム（IPM）

図６

CBA/J マウス肺炎モデルにおける肺内細菌と生残率の関連

図８（6）ペニシリンG（PCG）
セフォタキシム（CTX）

CBA/J マウス肺炎モデルを用いた抗菌薬有効性の評価

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kg を併用することで，極めて優れた相乗的臨床効断されており，潜在的患者はかなりの数にのぼるも果が得られており，b ラクタム剤とアミノ配糖体とのと推察される（図 10）。本肺炎は，市中肺炎としの併用による治療効果の可能性が示されたものであてみられることが多いが，胸部 X 線写真所見に比り，実際の臨床の場での応用が期待される（図 9）。

し低酸素血症の程度が著明で ARDS を高率に合併し，レスピレーターの使用を余儀なくされる場合が２）レジオネラ肺炎

多く，その際の高酸素療法が急性肺傷害を助長してレジオネラ肺炎の歴史は，1976 年，米国フィラいる可能性もある。そこで，マウスレジオネラ肺炎

デルフィアにおいて在郷軍人の全米大会が開催されモデルを用いて，高酸素投与が生存率に及ぼす影響た際，221 人に原因不明の重症肺炎が発生し，このを検討した。A/J または B6 マウスに L. pneumophi-うち 34 人が死亡したことにさかのぼる。その後の

la を経気管的に接種した後，高酸素投与群（90％調 査 で， 剖 検 肺 か ら 新 し い 細 菌 が 分 離 さ れ，O2，3 日間）と「通常環境下群」に分けて生残率をLegionella pneumophila と命名された。

比較した結果，「高酸素投与群」において著明な死

わが国では，1981 年，レジオネラ肺炎の第 1 例亡率の増加が認められた。一方，肺炎桿菌を用いてが報告された後，本症に対する認識の高まりととも同様の実験を行ってみたが，「高酸素投与群」とに分離頻度も増加してきた。1992 年 10 月〜 2002

「通常環境下群」間の死亡率には差は認められな

年 9 月までの 11 年間に，肺炎の原因が特定できなかった（図 11）。そこで，レジオネラ肺炎モデルマ

いとして当教室に送られてきた 1,146 症例の検査結ウスの肺重量および BALF 中アルブミン量について

果では，239 症例（20.9％）がレジオネラ肺炎と診測定してみたところ，「感染＋高酸素群」で有意に

図９ PRSP 肺炎に対する IPM+GM の併用効果

図 10 レジオネラ肺炎の疫学調査

図 11 高酸素療法のレジオネラ肺炎生存率に及ぼす影響（7）30増加しており，死因には血管透過性の亢進と炎症のらのヒトへの応用に関心を持っている。

関与が示唆された。しかし，肺内菌数に関しては

３）緑膿菌感染症治療への新たなアプローチ「通常環境下」と「高酸素投与群」とでは差が認め

緑膿菌は日和見感染症の原因菌として非常に重要られず，肺内で増殖したレジオネラの菌数が死亡率で，最近では特に多剤耐性化による治療抵抗性が問に直接関連しているものではないと考えられた。急題となっている。そこで，緑膿菌感染症治療への新性肺傷害は，血管内皮傷害，肺胞上皮傷害，好中球たなアプローチの可能性について研究を進めた。

集積・活性化，アポトーシスなどさまざまな要因がa）マクロライドと Quorum-sensing 機構複雑に絡み合って引き起こされると考えられる。そ近年，呼吸器感染症領域ではマクロライド系薬のこで私たちは，急性肺傷害の原因としてアポトーシ

Biological Response Modifier としての新しい作用がスの可能性を検討した。その結果，アポトーシス・明らかにされ，びまん性汎細気管支炎を中心とする

マ ー カ ー と し て 知 ら れ て い る Caspase-3， と His-

慢性気道感染症などに対する少量長期投与の有効性

tone-DNA が，いずれも「感染＋高酸素群」で有意が実証されつつある。一方，私たちは当初より緑膿に高く，アポトーシスが誘導されていることが示唆菌に対するマクロライドの直接的抗菌作用，すなわ

され（図 12），これは病理学的所見によっても確認

ち，バイオフィルムの破壊，菌体毒素・酵素の産生された。今後はアポトーシス亢進メカニズムのさら抑制など別の角度から検討を加えてきたが，その過な る 詳 細 な 検 討 や Caspase 阻 害 剤，HGF，Super程 の 中 で 緑 膿 菌 の Quorum-sensing 機 構 に 注 目 しOxide Dismutase などの予防的有用性，そしてこれた。細菌は autoinducer（AI 蛋白）と呼ばれるホルモン様物質を産生し，それによって増殖環境における自らの菌数を感知し，その菌数に応じて病原因子の 発 現 を 巧 妙 に 調 節 し て い る。 こ の シ ス テ ム はQuorum-sensing 機構と呼ばれ，いわゆる菌同士のcell-to-cell signaling system とも 呼 ばれ ている。 図13 は，緑膿菌の Quorum-sensing 機構を模式的に表したものである。緑膿菌の情報伝達系として las系と rhl 系がよく知られており，I 遺伝子が刺激を受けると AI 合成酵素が活性化され，AI 蛋白を産生し，菌体外へ放出する。一定濃度に達した AI 蛋白を認識した R 遺伝子は R 蛋白を産生して AI/R- 蛋

図 12 高酸素療法のアポトーシス・マーカーに及ぼす影響

白複合体を形成する。そして，この AI/R- 蛋白複合体が病原因子遺伝子群を活性化し，緑膿菌の菌体成図 13 緑膿菌における Quorum-sensing 機構（8）31分や菌体外物質の産生を促す。そこで，マクロライ関連しているものと考えられた。この結果に基づド系薬の緑膿菌 Quorum-sensing 機構に及ぼす影響

き，気管支肺胞洗浄液中の好中球数とその走化因子を検討するために，アジスロマイシン含有液体培地である MIP-2 を測定してみたところ CD1d 欠損マで 緑 膿 菌 を 培 養 し た の ち，AI 合 成 酵 素 の 発 現 をウスでは野生型マウスに比べて有意に低いことが明b-galactosidase 活性により観察した。その結果，らかになった。このことから，CD1d 欠損マウスでlas-I，rhl-I のいずれも発現が抑えられ，AI 蛋白としは，MIP-2 の産生低下に伴う好中球遊走の抑制によて知られる C12，C4 ホモセリンラクトンの産生量

り，緑膿菌の肺からのクリアランスが抑制されたもも減少していた（図 14）。以上の成績から，マクロのと考えられた。そこで，「NKT 細胞を活性化するライドは緑膿菌の病原因子として重要な Quorum-ことにより緑膿菌感染を防げるのではないか？」とsensing 機構を直接抑制することが明らかとなり，の仮定の下，NKT 細胞を活性化する a ガラクトシ

臨床における治療効果の一因として大きくクローズ

ルセラミド（aGalCer）を投与してみた。その結アップされることになった。一方，ホモセリンラク

果，aGalCer の投与により肺内菌数は著しく低下す

トンはマクロファージや上皮細胞にも作用し，さまることが明らかとなり（図 15），その理由として肺ざまなケモカインを放出させ好中球の遊走を促進す

胞マクロファージ付着・貪食能の亢進などが考えらるとともに，好中球に対してはアポトーシスを誘導れた。今後，aGalCer などの NKT 細胞を活性化すすることも明らかにした。臨床的には，ホモセリン

る 物 質 の Biological Response Modifier（BRM） とラクトンの産生を抑えるマクロライドやホモセリンしての臨床応用に期待が寄せられる。

ラクトン誘導体の開発，およびホモセリンラクトンワクチンの開発などが注目される。
b）緑膿菌感染症における NKT 細胞の役割
Log CFU per gram tissue

最近，特異免疫の成立に，糖脂質断片を抗原として呈示する CD1 分子の関与が明らかになった。
CD1 分子は，抗腫瘍作用や感染症防御効果があることで知られる NKT 細胞と結合し免疫作用を発揮することが知られている。そこで，この CD1d を欠損したマウスの肺内に緑膿菌を接種し，その生残率を観察したところ野生株に比較し明らかに高い到死感受性を示した。肺内菌数を調べてみたところ，
CD1d 欠損マウスでは野生型マウスに比較し約 100倍ほど緑膿菌が多く観察され，これが高い致死率に

図 15 a ガラクトシルセラミド（aGalCer）による肺の緑膿菌クリアランスの増強

図 14 マクロライド剤の緑膿菌 Quorum-sensing 機構に及ぼす影響

（9）

32

C-termⅢ．新規抗菌薬の評価

N-term新規抗菌薬の開発に際しては臨床試験に入る前に基礎的研究が不可欠となる。各種抗菌薬の試験管内抗菌力や小動物を用いた治療効果について検討を加え，これまでに 20 種類以上の新規抗菌薬の評価を行ってきたが，そのうち 2/3 は実用化され，現在臨床で使用されている。

Ⅳ．耐性菌に関する研究

図 16 ESBL

１．薬剤感受性（耐性菌）サーベイランス

TOHO-1 の三次元構造おわりに抗菌薬耐性菌に関する市販後調査の責任者としていくつかの幅広い疫学調査を行い，耐性菌の出現状

このたび，伝統と名誉ある小島三郎記念文化賞を

況を監視するとともに耐性メカニズムの解析にあいただくことになった。この賞はこれまで共に仕事たっている。一方，国の事業として行われている全を続けてきた教室や検査室の仲間を代表して私がい国規模での耐性菌サーベイランス事業においても，ただいたものであり，この喜びを皆で分かち合いた検査部領域の担当者として深く関わっている。

い。また，この場を借りて本賞にご推薦をいただいた東京大学大学院医学系研究科の中原一彦教授に感２．薬剤耐性菌機序の解明謝申し上げるとともに，私たちのこれまでの仕事に院内感染症の原因菌としては，MRSA，PRSP，ご理解いただいた選考委員および関係各位の皆様方

VRE，VRSA そし て extended spectrum beta-lactamaseにも深くお礼申し上げる次第である。

（ESBL）産生菌などの耐性菌が大きな問題となって今回の受賞は，同じ領域で頑張っている若い研究いる。これらの中で，ESBL 産生菌に関する研究に者に対しても大きな勇気と希望を与えるものであは特に力を入れており，私達が遺伝子配列を明らかり，この受賞を機に，さらに臨床微生物学の発展ににした TOHO-1 は本邦で最初に報告された ESBL努力を続け，若手人材の育成に力を注ぎたいと考えとして広く知られている（図 16）。ている。

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