上原記念生命科学財団研究報告集, 30 (2016)

172. 高 HDL コレステロール血症新規原因分子の網羅的探索
多田隼人

金沢大学附属病院 救急部
Key words：エクソームシークエンシング，HDL コレステロール緒言

当研究室で 30 年以上にわたり蓄積した、脂質異常症のデータベースの中で、高 LDL コレステロール血症を呈する
家族性高コレステロール血症（FH）では約 2,000 例中、約 80 %の症例で原因分子を同定した１）。しかしながら、高HDL コレステロールを呈する原発性（家族性）高 HDL コレステロール血症ではこれまで、本邦において高頻度で認められるコレステリルエステル転送蛋白（CETP ）遺伝子の２つの変異のスクリーニングにより、 382 例の症例の中143 例（37 %）に遺伝子変異が同定されたが、残る 239 例（63 %）で原因分子の同定には至っていなかった。

方法

このように原発性高 HDL コレステロール血症を呈しながら CETP 遺伝子高頻度変異が認められなかった症例に対して次世代シークエンサーを用いた網羅的遺伝子解析により、新規原因分子の同定を試みた。その中で、3 世代に渡り詳細な臨床像を追跡し得た家系のうち 4 名（図 1）に対して全エクソームシークエンシング解析を行った。ゲノム DNAを末梢血白血球より抽出し、アジレント社 SureSelectXT Target Enrichment System を用いて断片化された DNA にアダプターを付加し、同社の SureSelectXT Human All Exon 50 Mb Kit にてエクソーム領域のキャプチャーを行った。産物をイルミナ社 HiSeq2000 にてシークエンス反応を行い解析した。

図 1． ABCA6 及び ABCA10 遺伝子変異による高 HDL コレステロール血症家系

CETP 遺伝子変異に加えて ABCA6 及び ABCA10 遺伝子変異による高 HDL コレステロール血症家系。このうちカラー表示の 4 名（平均 HDL コレステロール 138 mg/dl）について、全エクソームシークエンシング解析を行った。

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結果

4 名において同定された 117,930 個の遺伝子変異の中から、研究協力機関である、米国マサチューセッツ総合病院
Sekar Kathiresan 博士の協力を得て、低 HDL コレステロール集団において認められた約 300,000 の遺伝子変異と照合し、それらと同一の変異は排除した。これにより残った 54,777 個のうち、4 名ともに、1 個以上の変異を有する変異は1,335 個 で あ っ た 。 こ れ ら の 中 か ら 、 大 規 模 な 公 共 デ ー タ ベ ー ス Exome Variant Server や 、 ExAC （ ExomeAggregation Consortium）遺伝子変異の頻度のうち、1 %以上であると報告されているものを除外した。これらのフォルターリングにより、結果として 69 個の候補遺伝子変異に絞り込んだ（図 2）。

図 2． エクソームシークエンシング後の変異絞込み
家系内で認められた全変異のうち疾患に関連が薄いと思われるものを徐々に除外した。
この中で、コレステロール代謝との関連を照合した結果、ABC トランスポーターの 1 つである ABCA10 にフレームシフト変異の複合型へテロ接合体変異（c.1331_1334delACAG, c.4515_4516delGA）、及び隣接する ABC トランスポーターである ABCA6 遺伝子にミスセンス変異（c.212T > C/p.N71S）が最終候補として絞り込まれた。両蛋白ともにマクロファージにおけるコレステロール輸送に関与することが知られており２,３）、これらのいずれか、ないしは両者に起因する原発性高 HDL コレステロール血症であることが強く示唆された。それぞれの遺伝子変異については、サンガー法での直接塩基配列決定法（図 3）により確認された４）。

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図 3． サンガー法による変異確認
サンガー法により、変異を確認した。

考察

血清 HDL コレステロールについてはこれまで疫学研究の結果から冠動脈疾患との逆相関関係にあり、「善玉」コレステロールと呼ばれてきた。しかし、近年、HDL コレステロールを上昇させ、冠動脈疾患の抑制を目指した大規模臨床試験はその期待された効果が得られず終了している。従って、冠動脈疾患抑制を視野に入れた全く新たな HDL 関連分子の同定が期待されるところである。これらの知見により新たな視座からの HDL 上昇作用を有する新規創薬につながる可能性があり、さらなる機能解析を予定している。

共同研究者
本研究の共同研究者は米国マサチューセッツ総合病院の Sekar Kathiresan 博士である。最後に、ご支援賜りました
上原記念生命科学財団に深く感謝いたします。

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Genotypic and phenotypic features in homozygous familial hypercholesterolemia caused by proprotein
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doi: 10.1016/j.atherosclerosis.2014.06.005. PMID: 25014035
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van Duijn CM. Genome of The Netherlands population-specific imputations identify an ABCA6 variant
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4） Tada H, Kawashiri MA, Nohara A, Inazu A, Mabuchi H, Kathiresan S. Yamagishi M. Whole exome
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HDL-cholesterolemia. Eur Heart J Vol 36 (suppl 1) : 2823