総
１．

括

基本構想

生命科学研究の流れは、従来の平均化された細胞集団の情報解析研究からさらに歩を進め、個々の細胞や細胞の空間的
ネットワーク配置に蓄えられた情報を如何に解析するかを競う段階にきている。ここで鍵となるのは、個々の細胞の分子発現状態や「個性」を如何に高感度かつ定量的に計測できるかという、技術の開発となる。本プロジェクトは 2008 年 4
月に創造展開プロジェクトとして発足し、この間、1 細胞の個性を定量計測する技術開発に取り組んできた。その結果、多数の細胞の中に微量存在する目的細胞を、細胞の形状情報を指標として検出し回収することが可能なオンチップ・イメ
ージングセルソータ技術、回収した細胞の遺伝情報を高速解析することができる超高速遺伝子解析技術、1 細胞が発現する分子を、空間分布情報を保持したまま網羅的に無増幅検出するための 1 細胞分子発現情報計測技術など、1 細胞の個性や機能を解析するための様々な要素技術開発に成功してきた。2012 年 4 月からは創造展開プロジェクトに引き続く短期集中型実用化プロジェクトとして新たに出発し、創造展開プロジェクトの間に開発してきた 1 細胞計測要素技術の具体的な応用用途として、血中循環がん細胞（Circulating tumor cells, 以下 CTC）の検出技術開発を主な目的とし、技術の改良と最適化を進めてきた。がんは現在、日本において 2 人に 1 人が生涯のうちに罹患する病気であり、その発症や転移メカニズムの研究と共に、生存率を向上させるための早期発見技術の開発や、がん手術後の再発有無の診断技術開発が急務となっている。現在のがん診断方法の主流は、細い針を患部に挿入して一部の組織を採取し解析を行う生検法（バイオプシー）となっているが、組織採取のために手術が必要など患者の身体的負担が大きい上、体内深部の組織には適用不可
能という問題がある。また、PET や MRI に代表される画像診断法は早期がんの発見に対して有効性が高いことが示されているが、コスト面の観点から、健診目的のための定期的な大規模診断は難しいのが現状である。そのような中、現在注目されている診断方法のひとつに血液採取による診断（リキッドバイオプシー）があり、これは患者から微量の血液を採取してその中に悪性の転移がん細胞が含まれているかを解析する技術で、患者の身体的負担が少なくまたコストも相対的に安価に抑えられるため、日常の定期健診で実施できる可能性があるなどという観点から、現在盛んに研究が進められている。血液採取によるがん診断法の現在の主流は、がん細胞が発現する分子マーカーに対して標識を行い、標識された細胞の有無をもって CTC の存在有無を決定するものであるが、がん細胞の種類や分子発現状態が極めて多様であるため、特定のがんには有効であるが別のがんは検出不可能など検査に対する擬陽性・擬陰性の可能性が問題となっている。そこで本プロジェクトでは、従来のがん分子マーカー標識による検出に加えて、細胞の形状情報、「イメージングバイオマーカー」
を指標とした検出を新たに開発することで、多角的な視点から CTC を高感度かつ網羅的に検出し回収解析するための技術開発を行ってきたので、ここではその詳細について報告する。

２．

全体計画と遂行方針

本プロジェクトは 2008 年 4 月から 2012 年 3 月まで推進した 4 年間の創造展開プロジェクトに引き続いて 2012 年 4 月に発足したものであり、創造展開プロジェクトの期間中に開発した要素技術を、CTC 診断技術開発のために改良し最適化
することを目的とした。具体的には 4 つの研究課題、①標的細胞前処理技術の開発、②標的細胞画像ベース識別・回収技術の開発、③標的細胞機能解析技術の開発、④組織切片中の１細胞の機能情報を分子レベルで解析するためのマルチラベ
ル技術と電顕技術の開発を設定し、それぞれについて技術開発を推進してきた。最終目標は血液前処理から CTC 検出回収、解析までが行える統合型 CTC 診断技術の開発と社会普及であるが、個々の要素技術についてもそれぞれ独立に技術の実用化橋渡しを目指して、神奈川県下の医療機関や企業などを中心に共同研究開発を推進してきた。

３．

研究体制及び組織

本プロジェクトは当初、創造展開プロジェクト期間中の研究体制に引き続き、2012 年度からかながわサイエンスパー
ク（KSP）東棟の研究室にて、実験と装置試作評価を推進した。2012 年度開始当初のメンバー構成は常勤研究員 2 名、非常勤研究員 4 名、研究補助員 5 名であった。その後、本プロジェクトの主目的のひとつであるがん診断技術の開発、特に臨床サンプルを用いた測定と検証を推進する目的で、2013 年度に京浜臨海地区の殿町に新たに研究室を設置し、さらに文部科学省地域イノベーション戦略支援プログラム採択と共に研究体制を増強し、常勤研究員 4 名、研究補助員 1 名を新たに追加して研究を推進した。

４． 研究成果の概要
４．１ 標的細胞前処理技術の開発
本研究課題は、血液中に存在する CTC など、微量の細胞を取りこぼすこと無く効率的に選択標識して発見することが可
能な、サンプル前処理プロトコルを開発することを目的とした。ここでは特に、我々のオリジナル技術としてこれまでに開発してきた、アプタマーを酵素処理により積極的に分解することで可逆的な標識・脱標識を行う技術について、具体的ないくつかの種類の標的細胞に対して適用し、技術の検証と問題点の抽出、改良を行うことを主な目的として実験を推進した。また、血液中の CTC を効果的に検出し回収するために、不要な細胞を取り除く技術、測定に最適な溶媒組成の検討と選択について評価を行った。
アプタマー標識技術では、これまでに従来の Cell SELEX 法を改良し、不要な核酸分子の混入を防ぐ目的でアプタマー
精製時に細胞をプロテアーゼ処理して細胞表面分子（とそれに結合したアプタマー）のみを回収する技術を開発したが、この技術をがん細胞等に適用することで、開発技術が目的とする細胞のみを選択的に回収精製できるか実証するための実験を推進した結果、想定通りの結果を得ることができた。
次に、血液中の CTC を効果的に検出し回収するための血液前処理技術として、不要な赤血球を取り除くための溶血処理を行った後に細胞を再懸濁する溶媒組成の最適化を推進した。溶媒組成に必要な条件としては、CTC を含む細胞にダメー
ジを与えないことに加えて、オンチップ・イメージングセルソータを用いた電圧印加により細胞回収を効率的に行えるよう電気伝導率が低いことが要求される。いくつかの溶媒について細胞の生存率や細胞回収率を定量的に調べた結果、本測定に最適な溶媒の開発に成功し、これにより計測スループットと細胞回収効率を飛躍的に向上させることに成功した。

４．２

標的細胞画像ベース識別・回収技術の開発

本研究課題は、従来の蛍光標識による細胞の検出に加えて、細胞に全く標識を施すこと無くインタクトな状態のまま、細胞の形状情報に基づいて CTC を検出する技術を開発することを目的とした。我々はこれまでに、超高速カメラを用いて測定サンプル中の細胞ひとつひとつの画像を取得した後、得られた画像から細胞の形状情報、「イメージングバイオマー
カー」をリアルタイムで抽出して、回収を望む細胞の特徴と合致した細胞に対してパルス電圧を印加することで目的細胞を回収することができる、オンチップ・イメージングセルソータシステムを開発してきた。このシステムをさらに改良する目的で、明視野画像と蛍光画像（細胞核形状像）を同時取得できるマルチビューシステムを組み合わせることにより、細胞全体の形状と細胞核の形状双方のイメージングバイオマーカーを同時抽出し組み合わせて、より高精度に目的細胞を特定・回収することができる「オンチップ・マルチイメージングセルソータシステム」へと発展させることに成功した。
さらに、取得した画像中から目的細胞の位置や輪郭をより正確に抽出可能な画像処理アルゴリズムの開発、測定ノイズを減らすことで効率的に細胞を回収可能なマイクロチップ形状の検討と試作を推進することにより、細胞の検出・回収効率を向上させることに成功した。
この開発したシステムを用いた上で、ラットに対して前立腺がん由来がん細胞株を移植した後に採取した血液や、ヒト臨床血液に対する測定を行った。サンプル準備、および得られた結果の詳細な解析に関しては、県内医療機関をはじめとする各研究機関と協力体制を構築した上で推進した。サンプル血液中の全細胞画像を取得できる長所を活かし、がん細胞移植モデルラット血液中に含まれる細胞をくまなく調べた結果、正常ラット血液中にはばらばらの単一細胞しか含まれていないのに対し、がん細胞移植ラット血液中にはクラスターを形成している細胞が一部含まれていることを発見した。
我々はこのクラスターを形成している細胞に着目し、開発システムを用いてがん細胞移植ラット血液中から細胞クラスタ
ーをソーティングにより回収した上で遺伝子解析を行った結果、これら細胞クラスターの中に移植したがん細胞、すなわ
ち CTC が含まれることを突き止めた。

４．３

標的細胞機能解析技術の開発

本研究課題は、回収した微量の細胞に対して、遺伝子発現やマーカー分子発現、生理機能などの解析を行うことにより、回収した細胞の種類や機能的特徴を特定する技術開発を行うことを目的とした。我々はこれまでに、液体を高速に循環させることでサンプル温度を高速に変換することが可能な、液体環流型超高速 PCR 装置の原理技術を開発してきた。本装置
技術を用いて、がん細胞をはじめとする様々なサンプル中の遺伝子について実際に増幅検出実験を繰り返し検証と課題抽出を行った結果、反応温度や時間などについて適切な条件を設定することにより、従来 PCR 技術と全く同様に増幅検出を行うことができるという結果が得られ、これにより従来技術に対して我々が開発した技術の測定時間に対する優位性を実証することができた。さらに、同時増幅可能なサンプル数の増加や、複数サンプルの反応進行に伴う蛍光輝度増幅を高速に検出する検出系の開発などを推進することにより、より実用的な装置システムの試作に成功した。

４．４

組織切片中の１細胞の機能情報を分子レベルで解析するためのマルチラベル技術と電顕技術の開発

本研究課題は、組織切片中でヘテロに分布する細胞集団中からターゲット細胞の空間分布を、細胞表面に発現している
多数の蛋白質の構成の組み合わせや、細胞内発現遺伝子の組み合わせから、１細胞レベルで詳細に解析する技術を開発することを目的とした。我々はこれまでに、真空蒸着法を応用して鋳型ポリスチレン球に金属薄膜を複層形成することで、粒径・元素が異なる 500 種類以上の微粒子の作製に成功し、さらに FE-SEM 反射電子計測を応用することで、これら粒子を高速かつ高分解能で識別できる技術開発に成功した。FE-SEM 計測による粒子の識別では、作製した微粒子の金属材質の他に観察時の入射電子エネルギーや粒径などが識別分解能に寄与することがこれまでに明らかになっていたが、それに加えて金属薄膜の膜厚が粒子識別に与える寄与について評価を行った結果、膜厚が厚くなるにつれて反射電子像中での輝度が向上し、予め規格化を行うことで定量識別することができることを明らかにした。
また、これまで微粒子の作製と FE-SEM による識別技術は、1 細胞内に発現する分子を網羅的に標識して空間分布情報を保ったまま無増幅検出する目的で開発を進めてきたが、微粒子を作製する技術を検討していた際にカップ形状の特徴的な微粒子作製に成功したため、この新規微粒子に機能を付加した新たな応用用途について検討を行うこととした。具体的には、磁性体薄膜で構成され、細胞と同程度の粒径のカップ形状微粒子「magcup」を新たに開発し、magcup 内部に細胞を捕獲して回収する技術開発を推進した。様々な粒径の magcup を作製して細胞捕獲回収実験を行った結果、magcup 内径が細胞直径より小さな場合は細胞が一切回収されず、magcup が厳密なサイズフィルタとして機能することを確認できた。
このサイズ選択性の厳密さは粒径が均一な magcup を作製できたことに由来し、真空蒸着を応用した粒子作製法を用いたため実現できたことである。さらに、magcup で回収した細胞を培養培地中で再培養したところ、細胞は通常通り分裂増殖したため magcup による回収は細胞に対するダメージがほぼ無いこと、magcup 内への細胞捕獲は排除体積効果に基づいたエントロピー由来の駆動力が寄与しているらしいことを明らかにした。

５．

課題及び今後の展望

本プロジェクトでは以上のとおり、特に CTC を高速かつ高精度に検出診断するための要素技術開発に取り組み、その結果、一部の CTC が血液中でクラスターを形成し循環している可能性を発見するなど、今後の次世代リキッドバイオプシー
開発につながる成果を得ることができた。また、開発した各要素技術はがん診断のみでなく、様々な生命科学研究や診断技術に応用可能であるため、広範囲での社会的普及が期待できる。
最後になりましたが、創造展開プロジェクトから続く本プロジェクトで得られた多数の成果は、研究補助員、事務補助
員皆様の努力とご協力があったために得られたものです。ここに感謝申し上げます。

６．

業績

【原著論文（査読有）】
1. Hyonchol Kim, Hiroyuki Takei, Tsutomu Negishi, Masato Kudo, Hideyuki Terazono, Kenji Yasuda, Contributionof Metal Layer Thickness for Quantitative Backscattered Electron Imaging of Field Emission Scanning Electron
Microscopy, e-Journal of Surface Science and Nanotechnology, 10, 301-304 (2012)
2. Hideyuki Terazono, Hyonchol Kim, Masahito Hayashi, Akihiro Hattori, Fumimasa Nomura, Tomoyuki Kaneko, Kenji
Yasuda, A Non-destructive Culturing and Cell Sorting Method for Cardiomyocytes and Neurons Using a Double
Alginate Layer, PLoS ONE, 7 (8), e442485 (2012)
3. Kenji Yasuda, Akihiro Hattori, Hyonchol Kim, Hideyuki Terazono, Masahito Hayashi, Hiroyuki Takei, Tomoyuki
Kaneko, Fumimasa Nomura, Non-Destructive On-Chip Imaging Flow Cell-Sorting System for On-Chip Cellomics,
Microfluidics and Nanofluidics, 14 (6), 907-931 (2013)
4. Hideyuki Terazono, Akihiro Hattori, Hyonchol Kim, Hiroyuki Takei, Fumimasa Nomura, Tomoyuki Kaneko, Kenji
Yasuda, Temperature-Shift Speed Dependence of Nonspecific Amplificationof Polymerase Chain Reaction

Examined by 1480 nm Photothermal Transition Speed Controllable High-Speed Polymerase Chain Reaction System,
Japanese Journal of Applied Physics, 52 (6), 06GK02 (2013)
5. Hyonchol Kim, Hideyuki Terazono, Hiroyuki Takei, Kenji Yasuda, DNA Hybridization Efficiency on Concave Surface
Nano-Structure in Hemispherical Janus Nano-Cups, Langmuir, 30 (5), 1272-1280 (2014)
6. Hyonchol Kim, Hideyuki Terazono, Hiroyuki Takei, Kenji Yasuda, Fabrication of Multilayered Superparamagnetic
Particles Based on Sequential Thermal Deposition Method, Japanese Journal of Applied Physics, 53 (6S), 06JJ01(2014)
7. Akihiro Hattori, Hyonchol Kim, Hideyuki Terazono, Masao Odaka, Mathias Girault, Kenji Yasuda, Identificationof Cells Using Morphological Informationof Bright Field/Fluorescent Multi-Imaging Flow Cytometer Images,

Japanese Journal of Applied Physics, 53 (6S), 06JL03 (2014)
8.Hideyuki Terazono, Kenji Matsuura, Hyonchol Kim, Hiroyuki Takei, Akihiro Hattori, Fumimasa Nomura, Kenji Yasuda,
Homogenous Measurement During a Circulation-Water-Based Ultrahigh-Speed Polymerase Chain Reaction andMelting Curve Analysis Device, Japanese Journal of Applied Physics,53 (6S), 06JM08 (2014)
9. Hyonchol Kim, Hideyuki Terazono, Yoshiyasu Nakamura, Kazuko Sakai, Akihiro Hattori, Masao Odaka, Mathias
Girault, Tokuzo Arao, Kazuto Nishio, Yohei Miyagi, Kenji Yasuda, Development of On-Chip Multi-Imaging Flow
Cytometry for Identification of Imaging Biomarkers of Clustered Circulating Tumor Cells, PLoS ONE, 9 (8),e104372 (2014)
10. Hyonchol Kim, Hideyuki Terazono, Hiroyuki Takei, Kenji Yasuda, Cup-Shaped Superparamagnetic Hemispheres forSize-Selective Cell Filtration, Scientific Reports, 4, 6362 (2014)
11. Masao Odaka, Hyonchol Kim, Mathias Girault, Akihiro Hattori, Hideyuki Terazono, Kenji Matsuura, Kenji Yasuda,
Evaluation of Imaging Biomarkers for Identification of Single Cancer Cells in Blood, Japanese Journal ofApplied Physics, 54 (6S1), 06FN04 (2015)12. Hyonchol Kim, Hideyuki Terazono, Hiroyuki Takei, Kenji Yasuda, Depletion Effect on Concave Microstructure
upon Size-Specific Target Particle Collection, Japanese Journal of Applied Physics, 54 (6S1), 06FL02 (2015)
13. Mathias Girault, Akihiro Hattori, Hyonchol Kim, Kenji Matsuura, Masao Odaka, Hideyuki Terazono, Kenji Yasuda,
Algorithm for the Precise Detection of Single and Cluster Cells in Microfluidic Applications, Cytometry partA, in press.

【口頭発表】〈招待講演〉
1. Hyonchol Kim, Hideyuki Terazono, Hiroyuki Takei, Kenji Yasuda, Nano-Cups: Fabrication and Application of
Cup-Shaped

Functional

Nano-Particles

forCell

Biology,

1st

International

SymposiumonNanoparticles/Nanomaterials and Applications, 2014.1.20
2.

Kenji

Yasuda,Hyonchol

Kim,

HideyukiTerazono,

Hiroyuki

Takei,

Two-DimensionallyIndexedPrecise-Size-Controlled Multi-Metal Nano-Particle Probe Set with Adaptive-Electron Microscopy for
Identification of Genome/Proteome Expression Profiles, 1st International Symposium on Nanoparticles/
Nanomaterials and Applications, 2014.1.20

〈国際会議発表〉
1. Kenji Yasuda, Hyonchol Kim, Hideyuki Terazono, Tokuzo Arao, Takashi Ohtsu, Yoshiyasu Nakamura, Yohei Miyagi,
Kazuto Nishio, Development of on-chip imaging flow cytometry technology for circulating tumor cell, The 71th
Annual Meeting of the Japanese Cancer Association, 2012.9.21
2. Hideyuki Terazono, Masahito Hayashi, Hyonchol Kim, Akihiro Hattori, Tomoyuki Kaneko, Kenji Yasuda, A
Non-destructive Culturing and Cell Sorting Method for Cardiomyocytes and Neurons Using an Alginate Layer,
The 50th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan, 2012.9.24
3. Hyonchol Kim, Hiroyuki Takei, Hideyuki Terazono, Kenji Yasuda, Fabrication of Superparamagnetic Janus
Particles Having Various Size and Its Application for Non-Destructive Cell Sorting, The 50th Annual Meetingof the Biophysical Society of Japan, 2012.9.24
4. Hideyuki Terazono, Masahito Hayashi, Hyonchol Kim, Akihiro Hattori, Tomoyuki Kaneko, Kenji Yasuda, Toward
Quasi-In Vivo from In Vitro Assay (V): Noninvasive Precise Purification of Ventricular Cells from Mixtureof Differentiated Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Using Spot Digestion of Double Alginate Layers on
a Multielectrode Array Chip, SPS2012, 2012.10.2
5. Hideyuki Terazono, Masahito Hayashi, Hiroyuki Takei, Akihiro Hattori, Tomoyuki Kaneko, Kenji Yasuda, Ultra
high-speed microdroplet polymerase chain reaction system forthree-step reverse transcription of single cells
usingon-chip

three-channel

switchinghigh-speed

liquidcirculating

module,25th

International

Microprocesses and Nanotechnology Conference, 2012.11.1
6. Hyonchol Kim, Hideyuki Terazono, Hiroyuki Takei, Kenji Yasuda, Fabrication of Superparamagnetic Nano-Particles
Having Various Diameters by Strict Controlling of Magnetic Material Thickness, 25th International
Microprocesses and Nanotechnology Conference, 2012.11.1
7. Hideyuki Terazono, Hyonchol Kim, Akihiro Hattori, Fumimasa Nomura, Tomoyuki Kaneko, Kenji Yasuda,
Non-invasive/destructive single cell purification method for re-cultivation of functionally identified
specific cells using spot digestion of double alginate sol layers on a multi-electrode array chip, 2012
American Society for Cell Biology Annual Meeting, 2012.12.17
8. Hyonchol Kim, Hideyuki Terazono, Hiroyuki Takei, Kenji Yasuda, Development of "Adaptive SEM"Technology for
Genome/Proteome Expression Analysis in Single Cell Level, 57th American Biophysical Society Annual Meeting,2013.2.6
9. Hideyuki Terazono, Hyonchol Kim, Akihiro Hattori, Tomoyo Hamada, Fumimasa Nomura, Kenji Yasuda, Toward Quasi-In
Vivo from In Vitro Assay (III): Noninvasive Identification and Purification Method of Target Cardiomyocyte
Cells Using Nuclease Digestive Magnet-Beads-Attached ssDNA Aptamers, Safety Pharmacology Society 13th Annual
Meeting, 2013. 9.17
10. Hideyuki Terazono, Hyonchol Kim, Akihiro Hattori, Fumimasa Nomura, Tomoyo Hamada1, Kenji Yasuda, Toward
Quasi-In Vivo from In Vitro Assay (IV): Fabrication of Direction-Controlled Artificial Neuronal Networks
Using Agarose-Microetching Method and Single-Cell-Electrodes for Quantitative Evaluation of Neuropsychiatric
Disorders, Safety Pharmacology Society 13th Annual Meeting, 2013.9.17
11. Hyonchol Kim, Hideyuki Terazono, Hiroyuki Takei, Kenji Yasuda, Fabrication of Superparamagnetic Metal Cups
for Size-Selective Cell Collection, The 51th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan, 2013.10.28
12. Akihiro Hattori, Hyonchol Kim, Hideyuki Terazono, Masao Odaka, Mathias Girault, Kenji Yasuda, Developmentof On-chip Flow Cytometer using Real-time Bright Field/Fluorescent Dual Image Analysis, The 51th Annual
Meeting of the Biophysical Society of Japan, 2013.10.28
13. Mathias Girault, Hisayuki Arakawa, Gerald Gregori, Fuminori Hashihama, Hyonchol Kim, Masao Odaka, Kenji Yasuda,
Flow cytometry identification of nanocyanobacteria and their limiting factors in the North Pacific
Subtropical Gyre, The 51th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan, 2013.10.28
14. Masao Odaka, Mathias Girault, Hyonchol Kim, Hideyuki Terazono, Akihiro Hattori, Kenji Yasuda 、Real time
image analysis technology for identification and collection of clustered cells using on-chip multi-imaging
cell sorter, The 51th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan, 2013.10.28
15. Hideyuki Terazono, Hyonchol Kim, Fumimasa Nomura, Kenji Yasuda, Non-invasive identification and purification
method of target cardiomyocyte cells using cell-surface-binding ssDNA aptamers, The 51th Annual Meeting of
the Biophysical Society of Japan, 2013.10.30
16. Hyonchol Kim, Hideyuki Terazono, Hiroyuki Takei, Kenji Yasuda, Fabrication of Cup-Shaped Superparamagnetic
Metal Hemispheres for Size-Selective Target Cell Collection, 26th International Microprocesses andNanotechnology Conference, 2013.11.6
17. Akihiro Hattori, Hyonchol Kim, Kenji Yasuda, Development of On-chip Flow Cytometry System based on Bright
Field/Fluorescent Dual-image Analysis, 26th International Microprocesses and Nanotechnology Conference,
2013.11.8
18. Kenji Matsuura, Akihiro Hattori, Fumimasa Nomura, Tomoyo Hamada, Hideyuki Terazono, Kenji Yasuda,
Quantitative Evaluation of Origin of Changes in Electrophysiological Properties of Cells on Micro Electrodes
using Impedances Analysis Measurement Setup, 26th International Microprocessesand Nanotechnology Conference,
2013.11.8
19. Hideyuki Terazono, Hyonchol Kim, Hiroyuki Takei, Akihiro Hattori, Kenji Yasuda, Development of
Ultra-high-speed Microfluidic Submicron-droplet PCR Device using Circulating Water System and a photodetector, 26th International Microprocessesand Nanotechnology Conference, 2013.11.8
20. Hideyuki Terazono, Akihiro Hattori, Hyonchol Kim, Hiroyuki Takei, Fumimasa Nomura, Kenji Yasuda,
Temperature-Shift Speed Dependence of Nonspecific Amplification of Polymerase Chain Reaction by 1480 nm
Photothermal Transition Speed Controllable Ultra-High-Speed Polymerase Chain Reaction System, 2013 American
Society for Cell Biology Annual Meeting, 2013.12.17
21. Hyonchol Kim, Hideyuki Terazono, Hiroyuki Takei, Kenji Yasuda, Application of Cup-Shaped Superparamagnetic
Hemispheres for Size-Selective Cell Purification, American Biophysical Society 58th Annual Meeting, 2014.2.18
22. Hyonchol Kim, Hideyuki Terazono, Hiroyuki Takei, Kenji Yasuda, Development of "Adaptive SEM" Technology forin situ Genome/Proteome Expression Analysis in Single Cell Level, International Microscopy Congress 2014,2014.9.10
23.Hyonchol Kim, Hideyuki Terazono, Akihiro Hattori, Masao Odaka, Mathias Girault, Kenji Yasuda, Imaging
biomarkers for identification of target cells: Identification of clustered circulating tumor cells as an
example, The 52th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan, 2014.9.26
24. Masao Odaka, Mathias Girault, Hyonchol Kim, Akihiro Hattori, Kenji Matsuura, Hideyuki Terazono, Kenji Yasuda,
Development of the cell imaging biomarker identification algorism for on-chip multi imaging cell sorter system,
The 52th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan, 2014.9.26
25. Mathias Girault, Akihiro Hattori, Hyonchol Kim, Kenji Matsuura, Masao Odaka,

Hideyuki Terazono, Kenji Yasuda,

Optimization of the single cell encapsulation in the water droplet using 3D microfluidic structure, The 52th
Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan, 2014.9.26
26. Kenji Matsuura, Akihiro Hattori, Fumimasa Nomura, Hideyuki Terazono, Kenji Yasuda, Non-firing impedance-based
electrophysiological analysis of single cells on micro-electrode arrays, The 52th Annual Meeting of the
Biophysical Society of Japan, 2014.9.26
27.

Akihiro Hattori, Hideyuki Terazono, Kenji Matsuura, Hyonchol Kim, Masao Odaka, Mathias Girault, Kenji Yasuda,
Investigation of wide range optical set-up for simultaneous real-time analysis of 96-well SBS formatted
samples, The 52th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan, 2014.9.26

28. Hyonchol Kim, Hideyuki Terazono, Yoshiyasu Nakamura, Kazuko Sakai, Akihiro Hattori, Masao Odaka, Mathias
Girault, Kazuto Nishio, Yohei Miyagi, Kenji Yasuda, Development of On-Chip Multi-Imaging Cell Sorter System
for Identification of Clustered Circulating Tumor Cells, Advanced Circulating Tumor Cells 2014, 2014.10.10
29. Masao Odaka, Hyonchol Kim, Mathias Girault, Akihiro Hattori, Hideyuki Terazono, Kenji Matsuura, Kenji Yasuda,
Development of the algorithm for recognition and identification of target cells using imaging biomarkers
for on-chip multi-imaging cell sorter, 27th International Microprocesses and Nanotechnology Conference,
2014.11.6
30. Mathias Girault, Akihiro Hattori, Hyonchol Kim, Susumu Kawada, Kenji Matsuura, Masao Odaka, Hideyuki Terazono,
Kenji Yasuda, Studies on size control of pressure-driven micro-droplet formation in microfluidic system,
27th International Microprocesses and Nanotechnology Conference, 2014.11.6
31. Kenji Matsuura, Hideyuki Terazono, Hyonchol Kim, Akihiro Hattori, Fumimasa Nomura, Kenji Yasuda,
High-throughput nano-droplet array polymerase chain reaction system with fast and homogeneous temperature
control for 24/96/384 sample plate, 27th International Microprocesses and Nanotechnology Conference,
2014.11.6
32. Hyonchol Kim, Hideyuki Terazono, Hiroyuki Takei, Kenji Yasuda, Size-Specific Target Cell Purification
Exploiting Depletion Effect on Cup-Shaped Superparamagnetic Hemispheres, 27th International Microprocesses
and Nanotechnology Conference, 2014.11.7

33. Mathias Girault, Hyonchol Kim, Kenji Matsuura, Masao Odaka, Akihiro Hattori, Hideyuki Terazono, Kenji Yasuda,
Target imaging droplet sorting system: a shape identification method for recognition and sort target droplet
with cell in real time, The 53th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan, 2015.9.13
34.Hyonchol Kim, Hideyuki Terazono, Hiroyuki Takei, Ahikiro Hattori, Kenji Matsuura, Fumimasa Nomura, Kenji
Yasuda, Contribution of depletion effect to size-specific target cell purification using mirometer-sized
concave structures, The 53th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan, 2015.9.14
35. Masao Odaka, Hyonchol Kim, Mathias Girault, Akihiro Hattori, Hideyuki Terazono, Kenji Matsuura, Fumimasa
Nomura, Kenji Yasuda, Evaluation of imaging biomarkers for identification of single cancer cells in bloodby on-chip multi imaging cell sorter system, The 53th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan,
2015.9.14
36. Kenji Matsuura, Fumimasa Nomura, Akihiro Hattori, Hiromi Kurotobi, Masao Odaka, Hyonchol Kim, Hideyuki
Terazono, Kenji Yasuda, Development of impedance measurement system for identification of cells, The 53th
Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan, 2015.9.14
37.

Akihiro Hattori, Hyonchol Kim, Hideyuki Terazono, Masao Odaka, Kenji Matsuura, Mathias Girault, Kenji Yasuda,
Studies on identification of cells using visible morphological information using bright field/fluorescentmulti-imaging flow cytometer, The 53th Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan, 2015.9.15

38. Hyonchol Kim, Masao Odaka, Mathias Girault, Hideyuki Terazono, Akihiro Hattori, Kenji Yasuda, Bright
Field/Fluorescent Dual Imaging Cell Sorter System for Precise Purification of Circulating Tumor Cells, 28th
International Microprocesses and Nanotechnology Conference, 2015.11.12
39. Mathias Girault, Akihiro Hattori, Hyonchol Kim, Susumu Kawada, Kenji Matsuura, Masao Odaka, Hideyuki Terazono,
Kenji Yasuda, Morphology Imaging Microdroplet Sorting System for Identification and Acquisition of Target
Objects in Droplets, 28th International Microprocesses and Nanotechnology Conference, 2015.11.12
40. Masao Odaka, Hyonchol Kim, Mathias Girault, Akihiro Hattori, Hideyuki Terazono, Kenji Matsuura, Fumimasa
Nomura, Kenji Yasuda, Identification of Cell Clusters in Cancer Cell-implanted Rat Bloods Based on
Measurements of Imaging Biomarkers Using on-Chip Multi-Imaging Flow Cytometry System, 28th International
Microprocesses and Nanotechnology Conference, 2015.11.12
41. Akihiro Hattori, Fumimasa Nomura, Hyonchol Kim, Hideyuki Terazono, Kenji Matsuura, Masao Odaka, Mathias
Girault, Kenji Yasuda, Predictive Human Cardiotoxicity Measurement Assay Using a Lined-Up Thousand
Cardiomyocyte Cell Network, 28th International Microprocesses and Nanotechnology Conference, 2015.11.13
42. Mathias Girault, Akihiro Hattori, Hyonchol Kim, Kenji Matsuura, Masao Odaka, Hideyuki Terazono, Kenji Yasuda,
Automatic sorting system and incubation at single cell level using microfluidic devices, The 16th
Japanese-French Oceanography Symposium, 2015.11.20
43. Hyonchol Kim, Hideyuki Terazono, Hiroyuki Takei, Kenji Yasuda, Contribution of Depletion Effect for
Size-Selective Target Cell Acquisition in Cup-Shaped Microstructures, 60th American Biophysical Society
Annual Meeting, 2016.2.28〈国内会議発表〉
1. 金賢徹、竹井弘之、寺薗英之、安田賢二、1 細胞 in situ ゲノムプロテオーム計測のための FE-SEM 定量反射電子分析法の開発、日本顕微鏡学会第 68 回学術講演会、2012.5.14
2. 金賢徹、竹井弘之、寺薗英之、安田賢二、様々な粒径・材質のヤヌス粒子に対する機能付加法の検討、第 73 回応用物
理学会学術講演会、2012.9.13
3. 金賢徹、竹井弘之、寺薗英之、安田賢二、金ナノ粒子標識と FE-SEM 計数計測を組み合わせた生体分子高感度検出法の開発、日本顕微鏡学会第 69 回学術講演会、2013.5.20
4. 金賢徹、寺薗英之、竹井弘之、安田賢二、超常磁性カップの作製とサイズ選択的細胞回収、第 75 回応用物理学会学術講演会、2014.9.19
5. 金賢徹、寺薗英之、竹井弘之、安田賢二、様々な元素で作製された機能的微粒子の 1 細胞計測技術への応用、日本応用物理学会有機分子・バイオエレクトロニクス分科会研究会、2015.5.28【特許】
国内特許出願 7 件
1. 特願 2012-207517、「イメージングセルソータ— 」、安田

賢二、金

賢徹、寺薗

英之、2012.9.20

2. 特願 2013-543025、「磁気ナノ粒子」、安田賢二、金

3. 特願 2012-272009、「微小体の配列方法」、安田

賢徹、寺薗

賢二、金

英之、2012.11.8

賢徹、寺薗英之、2012.12.13

4. 特願 2013-556096、「イメージングセルソータ— 」、安田

賢二、金

賢徹、寺薗

英之、2013.3.29

5. 特願 2013-188879、「高速遺伝子増幅検出装置」、安田

賢二、寺薗

英之、金

6. 特願 2013-213169、「イメージングセルソータ— 」、安田

賢二、金

賢徹、寺薗

英之、2013.10.10

7. 特願 2014-214671、「イメージングセルソータ— 」、安田

賢二、金

賢徹、寺薗

英之、2013.3.29

賢徹、2013.9.11

国際特許出願 15 件
1. US14/355731、「磁気ナノ粒子」、安田

賢二、金

賢徹、寺薗

2. CA2857146、「液体環流型高速遺伝子増幅装置」、安田

英之、2012.11.8

賢二、寺薗

3. CN201280067750、「液体環流型高速遺伝子増幅装置」、安田

英之、2012.11.27

賢二、寺薗

英之、2012.11.27

4. EP12853365、「液体環流型高速遺伝子増幅装置」、安田賢二、寺薗

英之、2012.11.27

5. US14/360741、「液体環流型高速遺伝子増幅装置」、安田賢二、寺薗

英之、2012.11.27

6. CA2870521、「高速遺伝子増幅検出装置」、安田

賢二、寺薗

英之、金

賢徹、2013.3.5

7. CN104245915、「高速遺伝子増幅検出装置」、安田

賢二、寺薗

英之、金

賢徹、2013.3.5

8. EP13757236、「高速遺伝子増幅検出装置」、安田

賢二、寺薗

英之、金

賢徹、2013.3.5

9. US14/382638、「高速遺伝子増幅検出装置」、安田

賢二、寺薗

英之、金

賢徹、2013.3.5

10. PCT/JP2013/059172、「細胞配置装置および方法」、寺薗

英之、安田

賢二、金

賢徹、2013.3.28

11. PCT/JP2013/059173、「細胞機能制御方法」、安田

賢二、寺薗

英之、金

賢徹、2013.3.28

12. EP13769361、「イメージングセルソータ— 」、安田

賢二、金

賢徹、寺薗

英之、2013.3.29

13. US14/388154、「イメージングセルソータ— 」、安田

賢二、金

賢徹、寺薗

英之、2013.3.29

14. PCT/JP2014/73937、「高速遺伝子増幅検出装置」、安田賢二、寺薗

15. PCT/JP2014/77198、「イメージングセルソータ— 」、安田

賢二、寺薗

英之、金
英之、金

賢徹、服部
賢徹、服部

【共同研究】
契約 7 件【記者発表・取材】
1. 日本経済新聞「がん再発・転移 血液で早期診断」、2012.9.20
2. 化学工業日報「血液検査で転移がん早期発見」、2013.6.25
3. テレビかながわ「Love かわさき」、2013.8.17【展示】
1. 「複層構造の機能的金属ナノ粒子作製技術」NanoTech2013、2013.1.30-2.1
2. 「1 細胞レベルでの超高速超高精度機能解析技術の開発」BioTech2013、2013.5.8-5.10
3. 「血中循環がん細胞診断システムの開発」NanoTech2014、2014.1.29-1.31

明弘 2014.9.10
明弘 2014.10.10

4. 「ナノカップを用いた細胞精製、in situ ゲノム・プロテオーム解析技術の開発」、安田賢二、BioTech2014、2014.5.15

プロジェクト参加者一覧

〔氏名〕
安田
金

〔役職〕

賢二
賢徹

寺薗

英之

プロジェクトリーダー（東京医科歯科大学教授） 2012 年 4 月～2015 年 11 月

常勤研究員・サブリーダー

2012 年 4 月～2016 年 3 月

常勤研究員

2012 年 4 月～2013 年 3 月

非常勤研究員（東京医科歯科大学
服部〔在籍期間〕

助教）

2013 年 4 月〜2016 年 3 月

明弘

常勤研究員

2013 年 8 月～2016 年 3 月

Mathias Girault

常勤研究員

2013 年 8 月〜2016 年 3 月

松浦

賢志

常勤研究員

2013 年 9 月〜2016 年 3 月

尾高

正朗

研究補助員

2013 年 4 月〜2013 年 8 月

常勤準研究員2013 年 9 月〜2016 年 3 月

竹井弘之

非常勤研究員（東洋大学生命科学部

教授）

2012 年 4 月～2016 年 3 月

金子智行

非常勤研究員（東京医科歯科大学准教授）

2012 年 8 月～2013 年 3 月

野村典正

非常勤研究員（東京医科歯科大学

助教、准教授） 2012 年 8 月～2016 年 3 月

Babak Gharizadeh

非常勤研究員（Stanford 大学）

2012 年 9 月〜2013 年 2 月

三神

裕美

研究補助員

2012 年 4 月～2015 年 12 月

麻生

くみ

研究補助員

2012 年 4 月～2016 年 2 月

細川

ゆり子

研究補助員

2012 年 6 月〜2016 年 1 月

長沼

麻衣

研究補助員

2012 年 6 月〜2016 年 2 月

研究補助員

2014 年 5 月〜2015 年 9 月

長谷川

雅美

川田

前

研究補助員

2012 年 4 月～2016 年 3 月

山本

弘子

事務補助員

2012 年 4 月～2015 年 5 月

川村

以子

事務補助員

2015 年 5 月〜2016 年 3 月

細胞表面特異的結合 DNA アプタマーの開発
寺薗

１．

はじめに

英之、金

賢徹、安田 賢二質と反応するため細胞表面以外のアプタマーも回収してしまう。そのため、我々は SELEX による精製過程においてアプタマーは DNA あるいは RNA、プロテイン等の一本鎖細胞をつぶさずにタンパク分解酵素で細胞表面のタンパからなる物質で、自身の高次構造により様々な物質に特異

ク質を分解するだけで細胞表面に結合した DNA アプタマ

的に結合し、抗体に似た性質を示す。

ーを回収する作業を行い、SELEX を行った。さらに、SELEX

アプタマーの大きな特徴として、①人工核酸で合成可能なため、抗体に比べ品質が安定で大量に生産可能なこと、の工程を終えたあと、回収した DNA アプタマーの塩基配列をその工程を以下に示す。

②核酸分解酵素（DNase/RNase）によって分解すること、③人工合成により様々な修飾が簡便であることが挙げられる。②の核酸分解酵素による分解はアプタマーを薬剤として使用する場合など効果の持続を目的した用途としては分解されにくい処理を施されるが、逆に、細胞を特定する標識剤として利用する場合などにおいては、細胞への障
害性が少ない可逆的な細胞標識方法として利用することが出来る。抗体など一度ラベリングしてしまえば細胞を生かしたまま剥がすことが難しく、細胞へ障害を与える。
我々はこれまでに②の性質を活かして一度標識した細胞に負荷を与えることなく脱標識する新規の技術を開発した[1]。
近年、iPS 細胞、ES 細胞、がん幹細胞の研究領域において、細胞集団は同じ性質を持った細胞集まりではなく一細胞毎に個性を持った細胞の集まりであり、それぞれの細胞

After round 10

周期や分化程度は異なることが明らかとなってきた。また、集団の中で鍵となる極少数の細胞が極めて重要な役割を果たすことが近年明らかになりつつある[2,3]。
そこで、我々は様々な種類が混在する細胞集団から特定

次世代シークエンスの細胞を非侵襲的に回収するため細胞表面特異的に結合する一本鎖 DNA アプタマー(ssDNA アプタマー)の作製を試みた。

図 1. Cell-surface-SELEX の方法。アプタマースープと呼ばれる核酸ライブラリーをターゲット細胞に暴露させ結合してない
アプタマーを除いた後、タンパク分解酵素にて細胞表面のタンパ

２． 実験と結果
２．１ Cell-surface-SELEX 法による細胞表面結合性 ssDNA アプタマーの作製

ク質のみ消化し、結合アプタマーを回収する。その後、遺伝子増幅を行い、増幅したアプタマーを改めてターゲット細胞に暴露する。この一連の流れを 1 ラウンドとして 10 ラウンド繰り返すことで細胞表面に結合した ssDNA アプタマーを精製する。精製した細胞表面結合性 ssDNA アプタマーを作製する手法として細胞に対し約 10^24 種類の人工合成した核酸ライブラ

アプタマーを次世代シークエンスで網羅的に読みとることで細胞表面アプタマーの配列を解析する。

リーを混ぜ、結合した物だけを回収する試験管内進化法（ Systematic Evolution of Ligands by EXponential
enrichment:

結果としてターゲットになる細胞が様々な細胞の種類

SELEX 法）を用いて行われる。対象物が細から構成されること、また、細胞表面にも様々なターゲッ

胞であり細胞表面物質をターゲットにした場合で行う事

ト物質が存在することから、次世代シークエンスで読み取を Cell-SELEX と呼んでいる。通常の Cell-SELEX 法は核酸

った配列は数十万種類の配列を読み取ることが出来た。得

ライブラリーと細胞を反応させた後、結合したアプタマー

られた配列を元にバイオインフォマティックス技術を利と細胞を丸ごと回収し、精製作業を行っていた。しかしな

用した独自のアルゴリズムを構築し、特徴的な配列をクラがらこの作業は核酸ライブラリーが細胞内部のタンパクスター化した。その結果、数百種類の特徴的な配列を導き出すことに成功した。

Round 10 のアプタマーにより特定の細胞を回収できることに成功し“DNA アプタマーによるセルソーティング”技

２．２

次世代シークエンスによるアプタマー解析術を開発できる可能性が示唆された。
Beads(Negative control

Aptamer library

Round 10 aptamer

Cell SELEX により得られた ssDNA アプタマー配列を次世代シークエンスにより網羅的に解析した。
その結果を図２に示す。その結果、ラウンドを重ねる毎Collected cells
by MACSに、配列のバリエーションが少なくなり精製過程が進んでいることが明らかになった(図 2-a)。また、ラウンドを重ねる毎に相同性が高い配列が濃縮されている様子も確認

Supernatant

できた(図 2-b)。また、相同性はおおよそラウンド９でプラトーに達成していることが明らかとなった(図 2-b)。さ

120.0

らに、ラウンド 10 における配列の相同性を解析し、代表
Collec&on ra&o by MACS

配列を生物進化の研究で使われる系統樹作製法を応用し、配列解析を行った。その結果、大きく分けて 7 種類の配列に区別できることが明らかとなった(図 2-c)。

b
Number of clusters

Variety numbera
3.5E+06
3.0E+06
2.5E+06
2.0E+06
1.5E+06
1.0E+06
5.0E+05
0.0E+00

5000
4000

Round

80.0
60.0
40.0
20.0
0.0
beads only

3000

Aptamerlibrary

Round 102000

図 3. Cell-surface-SELEX を用いて取得した細胞表面結合性

1000

ssDNA アプタマーによる細胞回収結果。Round10 で回収した ssDNA0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10100.0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Round

c

アプタマーによりターゲット細胞の回収が可能であることが確認された。

手法として合成 DNA の 5’側に biotin 標識を施し、スト
レプトアビジンコートした磁性ビーズと結合させる事により Round 10 アプタマーを磁性標識しその上でターゲッ
ト細胞に暴露した。その結果、Round 10 のアプタマーにより特定の細胞を回収できることに成功し“DNA アプタマーによるセルソーティング”技術を開発できる可能性が示
唆された。

３．

考察及び今後の展望今回行った方法により、細胞表面をターゲットにしたDNA アプタマーを作製出来る事に成功した。
DNA アプタマーは人工的に簡便に医療に応用することが
図 2. Cell-surface-SELEX を用いて取得した細胞表面結合性出来る。これは、動物を用いて作製する抗体とは異なりロssDNA アプタマーによる細胞回収結果。Round10 で回収した ssDNA

ット差が少なく安定的に供給できるという点で優位であアプタマーによりターゲット細胞の回収が可能であることが確る。また、前年度報告したとおり、アプタマーは核酸分解認された。

酵素で簡便に分解することができ、精製前の細胞表面状態に戻すことが出来る。これは抗体では出来ない技術である。
我々が開発した技術を組み合わせることで、特定の細胞を非侵襲的に精製することが可能になる。本技術はこれから

２．３

DNA アプタマーによる細胞回収

Cell SELEX により得られた ssDNA アプタマー配列を用
いてターゲット細胞表面に結合するか検討した。

発展していく再生医療に欠かせない技術なる。
【参考文献】
1. H. Terazono, J. Nanobiotech., 8:8 (2010)

その結果を図 3 に示す。手法として合成 DNA の 5’側に

2. P. B. Dirks, Nature, 444, 687 (2006)

biotin 標識を施し、ストレプトアビジンコートした磁性

3. J. E. Dick, Nat. Biotech., 27, 44 (2009)

ビーズと結合させる事により Round 10 アプタマーを磁性標識しその上でターゲット細胞に暴露した。その結果、

画像認識型オンチップ細胞精製技術開発と血中循環がん細胞診断への応用
金
１．

賢徹、尾高

正朗、Mathias Girault、服部明弘、寺薗英之、安田 賢二

はじめに溶液中に存在する多数の細胞中から目的の細胞を発見

高齢化社会が進んだ現在の日本において、がんは 2 人にし精製する技術のうち、フローサイトメトリーを利用する

1 人がかかる病気となっており、その対策が急務となって方法は大量の細胞を高速に全量検査できるという観点かいる。具体的に対応すべき課題としては、がん早期発見のら優れている。一般的なフローサイトメトリーでは目的のための診断法開発、転移の有無の判定法開発、適切な抗が細胞を蛍光色素で選択的に標識し検出するのが主流であん剤選択方法の開発、がん切除後再発有無の診断法開発なるが、先述のとおり CTC は由来する臓器の種類や獲得した

ど多岐に渡るが、いずれも開発状況が十分であるとは言い

遺伝子変異の種類に依存してバラエティが極めて豊富で難いのが現状であり、その原因のひとつは、がん細胞の多あるため、全種類の CTC の画一的な蛍光染色は難しい。そ様なバラエティによるものである [1]。例えばがん早期発

こで我々は、従来の蛍光輝度計測に加えて、マイクロチッ

見の診断方法としてはがん細胞表面に発現するマーカー

プ中で細胞の画像情報を高速カメラで取得し、リアルタイ

分子を標的とする方法があるが、あるがんには効果的であム画像処理により細胞の形態的特徴を抽出した上で、がんるのに別のがんは検出できないなど、全てのがんに対して細胞の特徴と一致した場合（あるいは正常な血球細胞の特網羅的に適用できるわけではないことが課題となってい徴と一致しなかった場合）にフィードバック制御によりそる。また PET（Positron emission tomography）検査でもの細胞を回収する原理技術開発と試作機の制作を行った。

発見が難しいがんの種類や炎症との誤認の問題などが分

図 1 は開発した試作機とマイクロチップである [3]。マイ

かっており、検査費用も高く現状では普遍的であると言いクロチップには直径数十ミクロンの微細流路が作製され難い。検査を受ける患者の心理的、身体的負担が少なく、ており、試料導入口に血液を挿入した後、加圧によりマイ安価であり、かつ由来臓器に依存せず網羅的にがんを発見

クロチップ中に血液が導入されるようになっている。微細できる次世代がん診断技術の開発が待ち望まれている。

流路中流部には蛍光計測用の励起レーザと明視野画像計

そのような中で注目を集めている技術のひとつが、血中測用の LED パルス光が照射されており、チップ下方にセッ

循環がん細胞（Circulating tumor cells, 以下 CTC）診トした対物レンズを通して蛍光は蛍光検出器で、明視野画断である。原発巣で変異を獲得し別の部位へと転移する悪像は高速 CCD カメラでそれぞれ検出する。得られた蛍光輝

性がんは、転移する際に血流中を移動して別の臓器へと漂度情報と明視野画像情報は全て 10,000fps の頻度でリア着し転移することに着目して、患者から数 mL 程度の少量の血液を採取し、その中にがん細胞が含まれているかを調(a)

べる診断技術で、従来法に比べて患者への侵襲性が低いため身体的負担が少なく、また大掛かりな装置も不要である
ことから検査費用も抑制できる可能性が高いなどの特長がある。本技術の実用化と普及にあたり、要となるのが血液中の正常細胞と CTC の判別であるが、現状ではいくつかのがんマーカー分子を標的として CTC のみを染色し発見する方法が採用されているため、ある種のがん発見には大きな威力を発揮する一方、別の種類のがんは見落とされてしまうといった問題点があった。そこで我々はこれまでに(b)

開発を進めてきた画像認識型オンチップ細胞精製技術[2]を応用し、がんマーカー分子標識でのがん診断に加えて、血液中の細胞画像情報から CTC を発見する新たなアプ
ローチについて検討を進めており、以下ではその開発進捗状況について報告する。

２．
２．１

実験と結果
画像認識型オンチップ細胞精製技術

5cm
4cm
図 1 画像認識型オンチップ細胞精製システム試作機(a)と搭載するマイクロチップ(b) [3]。

ルタイム処理され、目的の細胞の条件と一致した場合は微２．２

マルチビュー計測によるがん細胞の検出

細流路中流部の蛍光・明視野画像検出領域の下流に配置した電極に電圧が印加され、直流パルス電圧を細胞に印加し以上の新規試作改良した細胞精製システムを用いて、がて微細流路中での流路進行方向を変化させることにより、ん細胞を選択的に検出するための原理検討を行った。正常

目的細胞を回収口へと導き回収する。試作機には現在 3な血球細胞と比べた場合のがん細胞の形態的特徴を明ら

本の蛍光励起レーザ（375nm, 488nm, 515nm）と高速カメ

かにするために、まずはヒト白血病細胞株（HL60）を用い

ラが同時に設置されており、それぞれの蛍光輝度値と画像てがん細胞の画像情報取得を行った。明視野画像情報に加パラメータ値（細胞面積や周囲長など）の組み合わせからえて細胞核の形状情報取得を行うために、HL60 細胞を 10目的細胞を複合的に判定回収できるようになっている。

μg/mL 濃度の Hoechst33258 で 5 分間処理することにより

また我々は、細胞の明視野画像情報に加えて細胞内小器

細胞核を蛍光染色した上で、マイクロ流路中に細胞を流し、官（細胞核やミトコンドリアなど）の形状情報を合わせて明視野像と蛍光像（細胞核像）の同時取得を行った。図 3

取得し、細胞全体の情報と細胞内微細構造情報を組み合わはマルチビュー計測により得られた細胞画像の代表的な

せてより複合的な視点から目的細胞を同定するために、マ例である。がん細胞は無限増殖能の獲得により細胞核形状

ルチビュー計測システムの開発を推進した。図 2 はそのシに異常をきたしている場合があるが [5]、計測の結果、一ステムの原理図である [3,4]。これは、ある波長（例えば般的な形状に加えて 1 細胞内に細胞核が複数個存在する赤色）の画像情報と別の波長（例えば青色）の画像情報の多核細胞（図 3b）が存在することが確認された。また、光を共に高速 CCD カメラ方向に導き、カメラ前方に取り付

従来の蛍光輝度計測や蛍光画像のみの計測では識別する

けたミラーユニット内でふたつの波長の光をそれぞれ別

ことが困難である、1 細胞内に複数個の核が存在する多核の光路へと分けた後、反射ミラーの角度を調節して最終的細胞（図 3b）と、単核の 2 つの細胞が単に近接しているにふたつの波長の画像が CCD カメラ素子の異なる部分に場合（図 3c）を容易に識別することができた。これは蛍それぞれ投影されるよう調整することにより、ふたつの波光画像と同時に明視野画像を同時取得して 1 対 1 対応で確長の画像情報を同時取得できるようにしたシステムであ認することができるため実現できたことである。以上のとる。現在、我々が開発した試作機では赤色 LED 光源によるおり、マルチビュー計測によりがん細胞の明視野画像情報

明視野画像と青色蛍光による蛍光画像（細胞内小器官形状と細胞核形状情報を同時取得することで、多核化といった像）を同時取得できるようになっており、ソフトウェアも異常な細胞核形状を持つ細胞を選択的に検出回収するこ試作機に最適化して新規製作したためふたつの画像の組とが、血液中から CTC を選択的に回収するための新たな指み合わせから目的細胞をリアルタイム選別でき、さらには標候補のひとつとなり得ることを実証できた。

ミラーユニットを拡張することで 3 つ以上の異なる色のOP

画像も同時取得できるよう改良を進めている。

FL

(a)





(b)
-, )
,. *78+ * 78+
!&$#%'( ,
 " .
.
(c)


1/05/20346 1/05/20346

10µm
図 2 マルチビューユニット計測による多数の画像情報同時取得の原理 [3]。図では 2 画像同時取得の例を示している。

図 3 マルチビュー計測による HL60 細胞の明視野像と蛍光像の同時取得。(a)一般的な核形状の細胞、(b)多核細胞、(c)単核の 2細胞。左(OP)：明視野像、右(FL)：細胞核染色像。

３．

考察および今後の展望

CTC 診断は実現した場合の恩恵の大きさから期待値が極めて高いにもかかわらず、研究進捗としては CTC が血液
循環中にどのような細胞生物学的特徴を持つのか、がんのどのステージから CTC が何細胞程度流れるのかなど、ほとんど明らかになっていないのが実情である。その原因の一
端は CTC の豊富なバラエティにあり、様々な臓器由来のがん細胞を網羅的に検出することを一層困難にしている。今回の研究推進により、血中を流れる細胞の核形状を指標とすることが CTC 発見の有効なパラメータとなり得ることが示唆されたが、全ての CTC が細胞核形状に特徴的な異常をきたしているわけではなく、従来のがんマーカー検出やその他のパラメータと共に組み合わせて複合的な視点から計測してこそ、網羅的な CTC 検出技術になり得ると考えている。その観点から、我々が試作した装置システムは複数の画像情報と蛍光輝度情報を全て同時に取得でき、かつリアルタイム処理によるフィードバック制御で回収まで可能となっているため、まさに CTC 網羅的検出回収に向けたシステムとしてふさわしいものであると考えている。すでにいくつかのモデル動物を使用した CTC 検出回収実験
評価にも着手しており[3]、今後はより複雑な未知の性質のがん細胞を血中から効率的に発見回収すべく、技術評価を進めていく予定である。
【参考文献】[1] N. Sethi, Y. Kang, Nat. Rev. Cancer, 11, 735 (2011)[2] K. Yasuda, A. Hattori, H. Kim, H. Terazono, M. Hayashi, T.
Kaneko, F. Nomura, Microflu. Nanoflu., 14, 907 (2013)[3] H. Kim, H. Terazono, Y. Nakamura, K. Sakai, A. Hattori,
M. Odaka, M. Girault, T. Arao, K. Nishio, Y. Miyagi, K.
Yasuda, PLoS ONE,9, e104372 (2014)[4] K. Kinosita Jr., H. Itoh, S. Ishiwata, K. Hirano, T.
Nishizaka et al., J. Cell Biol., 115, 67 (1991)[5] F. Abdalla, J. Boder, R. Markus, H. Hashmi, A. Buhmeida,
Y. Collan, Anticancer res., 29, 1771 (2009)明視野・蛍光デュアルイメージングによるオンチップ・マル
チイメージングセルソーターの開発
服部

１．

明弘、金

賢徹、松浦 賢志、尾高

はじめに正朗、Mathias Girault、安田 賢二

樹脂を 25µm の均一な厚さになるよう塗布し、紫外線を流人体から血液を採取して、血中に異常な細胞等が存在し路パターンの形に照射して硬化させ、流路形状以外の部分

ないか調べることは、がんや免疫などの診断において非侵の紫外線硬化樹脂を取り除き、マイクロ流路の鋳型となる

襲な健康診断法として広く普及している。例えば、血中循基板を作製した。次に、マイクロ流路チップの本体の基材

環腫瘍細胞(CTC)は、腫瘍が体内のどこかで成長する前兆となる熱可塑性樹脂のペーストを先の鋳型基板上に滴下と考えられており、血中から CTC を定量的に検出できれした後に加熱・硬化させ、マイクロ流路の形状が転写されば従来の生検法に代わり、人体への侵襲を最小限にするがた樹脂シートを作製した。最後に、この樹脂シートに対しん診断を確立できるものと期待されている。異常細胞を検てサンプルやバッファーの注入口や排出口となる穴を開出する代表的なアプローチとしては、細胞表面の特定の分

け、バッファー類を蓄えておくリザーバとするためのプラ子に抗体を吸着させ目印として利用する方法がある。しかスチックパイプを樹脂シート上に取り付けてマイクロ流しながら、この方法では標的とする細胞における分子発現路チップを作製した。なお、2014 年度は明視野と蛍光のの多様性が原因で、正しく検出できないことがある。

デュアルイメージングによる細胞識別の検討用に下流側

この課題を解決するために、本プロジェクトではマイクの流路が一本のみのフローサイトメトリー用チップを用

ロ流路チップと明視野・蛍光デュアルイメージングを用いいたが、2015 年度はソーティング機能を実装するためにたオンチップ・イメージングセルソーターの開発を行った。

ゲル電極用流路を追加し、下流側が回収用と廃棄用に枝分この装置システムでは、細胞試料を、マイクロ流路チップかれした設計のマイクロ流路チップを作製して実験に用内に作製されたマイクロ流路に流しながら高速カメラにいた。

よって細胞の画像を撮影し、細胞の面積や周囲長といった形状的な特徴によって標的細胞を識別するものである。これら形状的なパラメーターは、標的細胞を識別する新たな指標（以後、「イメージング・バイオマーカー」と呼ぶこととする）となる。例えば、巨大化した細胞はいくつかのがん細胞の特徴を示し、また通常細胞と比べて巨大な核を持つものは、がん細胞であることを示す一つの特徴的な表現系であることが知られている。したがって、特に細胞の大きさや核の形態といったイメージング・バイオマーカーを用いた標的細胞の探索は、がん細胞の識別において有用である。本稿では、細胞全体の形状情報を反映する明視野
画像と、核の形状情報を反映する蛍光画像の同時処理を行い、イメージング・バイオマーカーとしてリアルタイム解
析するオンチップ・マルチイメージングセルソーター、および血液サンプルにおける異常細胞、特に細胞塊の識別について評価した結果について報告する。

２．
２．１

実験と結果
マイクロ流路チップ

図 1 に、マイクロ流路チップの概要を示す。実験に用いたマイクロ流路チップは、これまでの研究[1-3]と同様に、
以下のような手順で作製した。ガラス基板上に紫外線硬化

図 1 マイクロ流路チップの概要。(a)チップの模式図。チップの大きさは、50mm 開ける 40mm。(b)チップ全体の鳥瞰図。(c)チップの断面図。

２．２

血液サンプルの精製本研究では、がんのモデル細胞としてラット前立腺がんの細胞株である MAT-LyLu を用いた。血中にがん細胞を含んだサンプルとするために、まず 5×106 個の MAT-LyLu

有するため明るく解像度の高い画像を撮影することがで細胞を 200µL 調製し、月齢 6 週間の雄コペンハーゲンラ

きる。装置には蛍光励起用光源として 375nm レーザを搭

ットの脊髄皮下組織に移植した。移植して 2 週間後にラッ

載し、さらにホトマルを組み込んだ。これにより、画像だトの鎖骨下動脈から血液を回収し、溶血処理を行った。次

けでなく蛍光信号も検出でき、従来のバイオマーカーを用にリン酸バッファー溶液で洗浄した後、核染色試薬を用いいての蛍光検出にも用いることができるようにした。制御て細胞核を染色し、再度洗浄した上で 5%グルコース溶液

系としては、2 つの独立したコンピュータを用い、ひとつ中に懸濁して血液サンプルとした。

は蛍光信号の演算用で 10,000 回/秒の処理が、そしてもうひとつはマルチビュー光学系で得られたイメージング・バ

２．３

フローサイトメトリー

イオマーカーの処理用で、細胞を 200 フレーム/秒で明視野ならびに蛍光像として撮影し、リアルタイム画像処理に調製後の血液サンプル 50µL をマイクロ流路チップのサよって明視野像からは細胞の面積と周囲長を、そして蛍光ンプル注入口に分注し、血液サンプルの調製で用いた 5%像からは核の面積と個数を算出できるようになっている。

グルコース溶液をシースバッファーとして、マイクロ流路

図 2(b)はマルチビュー光学系によって細胞の明視野ならチップ上のシースバッファー用注入口に分注した。次に、びに蛍光像が同時に得られる原理を示したもので、光学系

シリンジポンプを用いてサンプル注入口およびシースバ

内のダイクロイックミラーによって明視野像と蛍光像をッファー注入口に対して圧縮空気によって同時加圧する構成する波長成分を分割し、高速カメラのイメージセンサと、マイクロ流路が上記溶液で満たされて細胞が流路中をー上に並べて投影することで実現している。

流れるので、流路中の流速を 3mm/秒に調整し、200 フレーム/秒で高速撮影した。

２．４
ター

２．５ 明視野・蛍光デュアルイメージングによる細胞の同時画像取得

オンチップ・マルチイメージングセルソー
図 4 に、実際にオンチップ・マルチイメージングセル
ソーターで撮影された様々な形態の核染色された HeLa 細胞の明視野ならびに蛍光画像の例を示した。これらの画像
は、3 種類の典型的な細胞像を含んでいる。すなわち、一つの核を持った単一細胞（図 4(a)）、複数の核を持った単一細胞（図 4(b)）、そして凝集した複数細胞（図 4(c)）の 3種である。

図 2 オンチップ・マルチイメージングセルソーターの構成。(a)
装置全体の模式図。 (b)明視野/蛍光マルチイメージングの原理。
マルチビュー光学系内のダイクロイックミラーによって明視野像の光路（赤）と蛍光像の光路（青）が分離され、高速カメラのイメージセンサー上に並べて投影される。

２．６ イメージング・バイオマーカーによるがん移植ラットの血中細胞塊の識別
イメージング・バイオマーカーによる標的細胞の識別を定量的に評価するため、ラット前立腺がんの細胞株である

図 2(a)に、オンチップ・マルチイメージングセルソータ

MAT-LyLu を移植したラットの血液をモデルサンプルとーの概要を示す。明視野観察用照明光源は、波長 625nm

して実験を行った。図 3 および図 4 は、がん細胞を移植しの LED がマイクロ流路チップの上方に配置し、流路中をたラットの血液サンプル（N=4375）、および健常ラットの流れる細胞に対して透過照明を行えるようにした。LED

血液サンプル（N=1599）における細胞の合計面積（ S）、の波長が核染色された細胞からの蛍光波長と大きく離れおよび核の合計面積（Sn）のヒストグラムである。これらているために、明視野と蛍光の同時観察を行っても蛍光画の結果から、2 つのしきい値が設定できることがわかった。

像に影響が及ばないようになっている。装置には、倍率

すなわち、細胞の面積が 140µm2 より大きいもの、そして20 倍の対物レンズが組み込まれており、0.75 の開口数を核の面積が 80µm2 より大きいものは細胞塊であった。また、細胞の面積が 200µm2 を超えるもの、そして核の面積というイメージング・バイオマーカーを定義して評価を行が 90µm2 を超えるものは、がん移植ラットの血液サンプった。R は、細胞の実際の周囲長と、細胞と同じ面積を持ルにのみ見られ、多くの場合、4 個以上の細胞で構成されつ円の周囲長との比を取ったものとして定義した。低い Rる特徴を持つことが分かった。

の値は、細胞の形が真円からより歪んでいることを意味する。このことはすなわち、細胞塊であることが期待される。
図 6 は、がん移植ラットの血液サンプルにおける R の平均値と細胞塊の大きさの関連性を示したものである。単一細胞では R が 0.9 より大きく、R が 0.9 未満の場合は細胞数が 2 個以上の細胞塊であった。以上の結果から、4 個以上の細胞で構成され、4 個以上の核を持つ大きな細胞塊はがん移植ラットの血液サンプルにのみ含まれ、R が 0.9 未満であることが明らかになった。

図 3 がん移植ラットと健常ラットの血液サンプルにおける細胞の合計面積（S）のヒストグラム。
図 5 核の個数（Nn）についてのまとめ。(a)がん移植ラットおよび健常ラットの血液サンプルにおける Nn のヒストグラム。(b)Nnと細胞塊の大きさとの関係。

３．

考察及び今後の展望

本研究では、明視野像および蛍光像の同時イメージング
によりソーティング可能なオンチップ・マルチイメージン
グセルソーターの開発を行い、4 つのイメージング・バイ
オマーカー、すなわち、細胞の面積、核の面積、核の個数、そして周囲長比について、ラット血液中に含まれる細胞塊の識別評価を実施した。その結果、これらイメージング・
バイオマーカーが血中のがん細胞塊の識別に有効である
ことが確認出来た。今後の展望としては、識別した細胞塊
図4

がん移植ラットと健常ラットの血液サンプルにおける核の合計面積（Sn）のヒストグラム。

に発現している遺伝子を詳しく調べると共に、がん細胞塊が巨大化するダイナミクスを明らかにするために、がん細胞を移植してからの経時的な計測に取り組む予定である。

一方、システムで撮影された細胞画像を、そこに含まれる核の個数（Nn）に着目して詳細に解析した結果、図 5(a)に示すように、健常ラットの血液サンプルにおいて 99%を超える画像では核は 1 つのみであり、4 個以上の核を持つものは含まれていなかった。そして、図 5(b)に示すように、がん移植ラットの血液サンプルでは細胞塊が大きくなるほど多くの核が含まれていることが分かった。このように核の個数は、細胞塊を識別するための有力なイメージン
グ・バイオマーカーとなることが分かった。しかしながら、がん移植ラットの血液サンプル中には、単一細胞で複数の核を有するものも存在するため、核の個数のみで細胞塊を判定するには不十分である。そこで新たに周囲長比（R）【参考文献】
1. A. Hattori, K. Yasuda, J. Appl. Phys., 49, 06GM04,(2010).
2. A. Hattori, H. Kim, H. Terazono, M. Odaka, M.
Girault, K. Matsuura, K. Yasuda, Jpn. J. Appl. Phys.,
53, 06JL03, (2014).
3. F. Nomura, T. Kaneko, A. Hattori, K. Yasuda, J.

Bioprocess. Biotech., S3, 003 (2011).

血液中の単一がん細胞を認識するためのオンチップ・マルチイメージングバイオマーカーの評価
尾高 正朗、金 賢徹、Girault Mathias、服部 明弘、
松浦 賢志、寺薗 英之、安田 賢二

１．

はじめに

ストレプトマイシン、10％ウシ胎児血清存在下の RPMI
1640 中で、37℃、5％CO 2 で培養した。

血液中を循環しているがん細胞は、循環血中腫瘍細胞

健康ラットと培養がん細胞を移入したラットの血液（通（Circulating tumor cell、CTC）と呼ばれ、転移が進む

常血液、または培養がん細胞移入血液）は、神奈川県立ががんでは、細胞は血液やリンパ液の流れに乗って循環し、んセンターの動物実験委員会によって承認された手順に離れた臓器にまで転移をおこすと考えられている[1]。し従って、採血された血液を利用した。これらの血液サンプ

たがって、末梢血液中のがん細胞を正確に同定することでルを溶解試薬で赤血球を溶血し、1％ウシ血清アルブミン

低侵襲性がん診断が可能になると考えられている。この目を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で懸濁したものを利的のために、既に多数のアプローチ方法が開発され、実際用した。オンチップ・マルチイメージングフローサイトメに診断に用いられ始めている。例えば、標的分子バイオマ

トリーシステムで細胞核を可視化するためにヘキスト染ーカーの検出です。しかしながら、この方法では既知とな

色試薬で細胞核を染色した。

ったバイオマーカーのみに有効である[2]。
一方、我々は細胞自身を検出するオンチップ・マルチイ
メージングフローサイトメトリーシステムを開発し、形態学的特徴をイメージングバイオマーカーにより細胞を視覚的パラメータで同定する技術を開発中である[3]（図１a、b）。この技術は従来の分子バイオマーカーだけでは同定できないクラスタリングした細胞を見出すことでき、実際に、このオンチップ・マルチイメージングフローサイト
メトリーシステムで、ラット前立腺がん細胞株（MAT-LyLu）
を移入したがん転移のモデルラットの血液中からクラスタリングした細胞の同定に成功している[4]。
本研究では、この研究成果を補完するため、血液中の単一細胞の同定方法を 3 つのサンプル（通常血液 : Normal、
培養がん細胞 : Cancer、および培養がん細胞移入血液 :Cancer-implanted）で比較して評価した。

２．
２．１

実験と結果
マイクロチップの試作

図 1 オンチップ・マルチイメージングフローサイトメ

本研究で利用したオンチップ・マルチイメージングフロ

トリーシステムの概要 （a）光学系システムの概要、（b）ーサイトメトリーシステムのためのマイクロチップは、高マルチビューモジュールの光路図、（c）マイクロチップのさ 25μm のマイクロ流路が転写し、硬化したポリジメチル

流路のデザイン、（d）実際のマイクロチップの写真。

シロキサン（PDMS)をカバーガラスに貼り付けて作成した（図１c、d）。

２．３
２．２

マイクロチップの試作

フローサイトメトリーの手順

シース緩衝液として 1％BSA/PBS を用いて、調製したサ用いた培養がん細胞は、ダニング R3327 腫瘍から確立さンプルをマイクロチップに注入した。その後、空気圧を上れた MAT-LyLu を利用した。この細胞をペニシリンおよびげてサンプルをマイクロ流路に流し込み、測定を行った。

測定は、明視野（BF）及び蛍光（FL）画像の両方を取得す

また、マルチイメージングバイオマーカーの有力な候補るために、マルチビューユニットを通して 200 FPS のカメである SN/SC、D、RC、RN について 3 つのサンプルのヒスト

ラ設定で画像を撮影した。3 つのサンプル、通常血液、培グラム分析を図４に行った。 これより SN/SC、D、RC、は 3

養がん細胞、および培養がん細胞移入血液を本装置で、同つのサンプルで有意な差は認められないが、RN は培養がん

一条件可下で測定した。

細胞の一部で 0.9 よりも小さいものが認められた。

２．４

画像データ分析8 つのイメージングバイオマーカーとして、①細胞面積（SC）、②細胞核面積（SN）、③細胞核面積と細胞面積の比（SN/SC）、④細胞重心と細胞核重心の距離（D）、⑤細胞周囲長（PC）、⑥細胞核周囲長（PN）、⑦・⑧細胞と細胞核の面積（SC・SN）から計算される周囲長とそれぞれの実測値（PC・PN）との比率、RC と RN、（ここで、周長比 RX（X = C、N）は、真円度を示す。つまり、RX = 1 粒子が真である場
合に円）を算出し、評価した。3 つのサンプルの測定で、得られた単一細胞のみが認識されている画像を各サンプ
ルについて 100 画像以上を今後の解析に利用した。
得られた単一細胞のみが認識されている画像とそれらのマルチイメージングバイオマーカー値を図２に示す。さらに、3 つのサンプルごとに SC と SN の相関図を図３に示した。これより、培養がん細胞は、細胞面積と細胞核面積の相関図より、通常血液中の細胞から明確に区別が可能となった。
また、詳細検討のため 2 つのカテゴリーに大別した。カテゴリーI は SC ≦58 µm2、 SN ≦ 43 µm2 で、 カテゴリ
ーII は、SC ＞58 µm2、 SN ＞ 43 µm2 （それぞれの数値は
通常血液の細胞の最大値）に分類し、それぞれの統計値を表１にまとめた。

図 ３ 細 胞 面 積 と 細 胞 核 面 積 の 相 関 図 （a）通常血液、（b）培養がん細胞、（c）培養がん細胞移入血液。図２中のID 対応するドットを白色点として示す。

３．

考察及び今後の展望

以上の結果より（１）培養がん細胞は、細胞面積と細胞核面積の相関図より、通常血液中の細胞から明確に区別することができ、（２）細胞核面積と細胞面積の比、細胞重
心と細胞核重心の距離、細胞の真円度を示す比率 RC は 3
つのサンプル間で有意な差はなく、（3）培養がん細胞の一部は RN が 0.9 よりも小さかった。これらの結果は、イメージングバイオマーカーの測定で、血液中のがん細胞を同
図２ 典型的な単一細胞画像とマルチイメージングバ

定できる可能性を示す。したがって、我々はこのマルチイ

イオマーカー値

メージングバイオマーカーは CTC の検出技術に活かされ（a-c）通常血液、（d-j）培養がん細胞、（k-m）培養がん細胞移入血液。白バーは 10μmると確信している。

表1

マルチイメージングバイオマーカー統計値【参考文献】
1. N. Aceto, A. Bardia, D. T. Miyamoto, M. C. Donaldson, B. S.
Wittner, J. A. Spencer, M. Yu, A. Pely, A. Engstrom, H. Zhu, B.
W. Brannigan, R. Kapur, S. L. Stott, T. Shioda, S. Ramaswamy,
D. T. Ting, C. P. Lin, M. Toner, D. A. Haber, and S.
Maheswaran, Cell, 158, 1110 (2014).
2. F. Tanaka, K. Yoneda, N. Kondo, M. Hashimoto, T. Takuwa,
S. Matsumoto, Y. Okumura, S. Rahman, N. Tsubota, T.
Tsujimura, K. Kuribayashi, K. Fukuoka, T. Nakano, andHasegawa S. Clin. Cancer Res., 15, 6980 (2009).
3. A. Hattori, H. Kim, H. Terazono, M. Odaka, M. Girault, K.
Matsuura, and K. Yasuda, Jpn. J. Appl. Phys. 53, 06JL03(2014).
4. H. Kim, H. Terazono, Y. Nakamura, K. Sakai, A. Hattori1,
M Odaka, M. Girault, T. Arao, K. Nishio, Y. Miyagi, and K.
Yasuda, Plos One 9, e104372 (2014)

図４ ヒストグラム分析 （a）細胞核面積/細胞面積の比(SN/SC)、（b）細胞重心と細胞核重心の距離(D)、（c）細胞、（d）核の面積から計算される周囲長とそれぞれの実測値との比

RC と RN 。

Controls of pressure-driven micro-droplet formation and optimum encapsulation in
microfluidic system
Mathias Girault, Akihiro Hattori, Hyonchol Kim, Kenji Matsuura, Masao Odaka, Hideyuki
Terazono, and Kenji Yasuda.
1. Introduction
As a part of the on-chip cellomic project, acomplementary microfluidic method wasinvestigated in order to compartmentalize
sample into constant volume. To reach thisgoal, we examined the creation of reproducible
water-in-oil droplets capable to encapsulate
object such as cell clusters. In the literature, theformation and encapsulation of objects areoften limited to the random case and can bemodelled by using the Poisson’s distribution.
This approach expects that the flow in thechannel prior to encapsulation can carryobjects without sedimentation. However, thisstatement is often violated in the low range ofpressures and contributes to separate
encapsulation and sorting chips to overcome
this phenomenon. Although the sedimentation
was not fully investigated by comparison toother parameters such as droplet speed orsorting mechanisms, it appeared to be crucial
that the development of integrate chip needs abetter characterizing of the range of pressuresand an exploration of the relationships between
parameters monitored in ‘real-time’ and theflow pattern.
In this project, we investigated a method using
a pressure-controlled system in order to create
an emulsion of homogenous micro-droplets
able to contain objects with a diameter size up
to 20 µm. This study also describes thedifferent flow regimes with a particular focus
on the generation of stable droplet flow,needed to develop sorting microfluidic
applications. This detailed approach could leadto find the most suitable experimental setting
capable to control the encapsulation of object
in a stable droplet flow.

droplet formation. This camera was connected tothe computer where LabVIEW 2013® software wasinstalled. The stable droplet flow pattern is defined
as a single droplets flow centred in the
microchannel and moving linearly through thechannel. In contrast, the unstable droplet flow isdefined as multiple flows of droplets which linearlyor not moved in the microchannel.

2. Material and methods
A dual pumps system composed of two
independent compact air cylinders was used togenerate the droplet by flow focusing anaqueous stream with two streams of fluorinatedoil containing a surfactant. All pressures arereported relative to the atmosphere. Inverted
microscope equipped with a CMOS camera
was used to capture digital images during

3. Results and discussion.
3.1 A competition between the inertial and theviscous forces in a fixed geometry
By using the dual pump system, combinations of
400 different pressures were measured and theassociated two-phase flow patterns were recorded.
Flow patterns were discriminated into six different
cases characterizing either droplet types or single
phase flows (Figs. 1, 2). Then, droplet flow types

Figure 1: Schematic drawing of the experimental
devices and pictures of the six different flow
regimes (scale bar 50µm). (a) is the micrograph ofthe channel filled with sample (sample only), (b) anannular flow pattern, (c) the droplet with diametersize higher than the channel width (plug pattern),(d) the unstable droplet pattern where the droplets
are not centred in the channel, (e) the droplet
centred in the channel (stable droplet pattern), (f)shows the channel only fill with oil (oil only).

the Re numbers can not easily describe the change
between the stable and unstable droplet flows,
additional indexes were investigated to better
identify the range of stable droplet domain.

Figure 2: Relationship between droplet shapeand the pressures applied on the sample and oil
inlets. The different flow regimes observed in
the range of pressure used were delimitated by
the black dotted lines.
were categorized into stable and unstable
droplet patterns (Figs. 1d and 1e, respectively).
Among the different flow regimes, theminimum droplet size (≈30 µm) of the chip
was slightly smaller than the flow focusing
contraction width (50 µm) and indicated thestrong geometry dependence in the pressurecontrolled system. Moreover, results showedthat the droplet diameter was limited to ~70µm in the stable droplet regime flow at thefrequency higher than 2 Hz. The specificdiameter of the droplet corresponding to thehalf of the channel could be linked to thechange in dominant force between the inertial
and the viscous forces1). In this context,
calculations of the Re numbers were performed
according to the geometry of the microfluidics
devices in view to verify if any possible
increases of the Re numbers can describe anychange in the flow regimes. With a Re number
lower than 0.5, the flow should be laminar in
the channel and droplets are expected to movestraight through the channel. As unstable flow
was observed, this result suggested that flow
regime can not only depend on the formation
area but also to the subsequent parts of the
microfluidic device. This integrative approach
was in agreement with the study of Lee et al.
(2009)2) which reported that droplet formation
could depend on either the upstream geometry
and associated flow field or the geometry andflow field in the downstream channel.
Consequently, our results indicated that precise
control of the droplet flow type can be reachby taking into account the entire geometry of
the channel and illustrated the complexity of
the flow type prediction based on the single
Reynolds number value calculated at the
droplet formation area. As we observed that

Figure 3: Relation between the droplet to theorifice size of the sample channel and the sample tooil pressures. The cross symbols are the plug flow
regime (fig. 1c), the white circles are the stable
droplet pattern (Fig. 1d) and the black triangles
shows the unstable droplet pattern (Fig. 1e). The
black line is the power regression curve calculatedusing the entire data set (n=382).
3.2 Limit between the stable and unstable
droplet flows
Abrupt change between the stable and the unstableflows is difficult to quantitatively describe in thesmall channel because of the lack of velocimeterthat can measure turbulence in microchannels
without beads addition. This limit is also
particularly important for common microfluidic
applications, where the position of object must
follow a specific path through the channel such as
in sorting experiments3). The figure 4 shows thedroplet speed at different constant oil pressuresdepending on the pressure ratio Psample/Poil. By
fixing the oil pressure and increasing the dispersed
phase fluid, the hydrodynamics of the two phases
flow was characterized by two phases, i) a firstphase, where the droplet speeds were nearly
constant or tended to decrease (up to 200 µm s-1,
oil pressure: 15 kPa), and ii) a second phase, wherea sudden increase of speeds were measured between
Psample/Poil 0.6 and 0.8. Excepted for the oilpressures equalled to 11.5 to 12 kPa, these twophases characterized by a minimum of the droplet
speed mainly ranged between Psample/Poil equal
0.6 and 0.8 correspond precisely to the transition
between the stable and the unstable droplet flow
regimes. The critical value of the minimum of thedroplet speed also suggested that the increaseof pressure on dispersed phase not necessary
led to an increase of droplet speed moving
through the channel.

Figure 4: Droplet speed (mm s-1) at different
constant oil pressures (kPa) depending on thepressure ratio Psample/Poil.
3.3 The suitable flow regime for
encapsulation
The percentage of encapsulation of the 20 µm
beads depending on the pressures ratio
Psample/Poil is shown in Fig. 5. The
percentage of encapsulation is characterized bya drastic increased (0-100 %) in the stable
droplet phase. This rapid increase was found in
the range of pressure lower than 0.1 kPa whichis the detection limit of the pressure sensor.
The limit between the oil-only flow and thestable droplet regimes shows the lower
percentage of droplet encapsulation (0 %)when the oil pressure was maintained either at
5 kPa or 10 kPa.

In contrast, the limit between the stable andunstable droplet regimes was characterized by thehigher encapsulation percentage (~100 %). These
results indicated that the most robust encapsulationof the beads 20 µm (high frequency and the speedof droplets) was found in the higher Psample/Poilratio and suggested that the higher Psample/Poilratio of the stable droplet regime located near thelimit stable-unstable droplet flow regimes appeared
to be the most suitable range of pressures for thesorting experiment using our microfluidic device.
4. Conclusions
By using a pressure-controlled flow focusing device
two single phases and four different multiphaseflow regimes were observed and their conditions
were examined. Although the Reynolds number
was always lower than 1 in the droplet formationarea, unstable droplet regime flow was observed
and suggested that in addition to the viscosity, thechannel geometry in small microfluidics isimportant and should integrate the entire chip
design either than a single section. Results also
highlighted that the limit between the unstable andstable droplet regimes was the most suitable for
sorting application due to the compromise between
the droplet size, frequency, distance between two
consecutive droplets and encapsulation of beads.
The limit can be detected using the drastic changeof the droplet speed found at the threshold between
the two regimes. Finally, our results showed thatthe increase the sample inlet pressure not necessary
increases the droplet speed underlying thedifference in speed between the carrier fluid and thedroplet flow.
References
1. J.F. Edd, J Di Carlo, K. J. Humphry, S. Köster, D.
Irimia, D.A. Weitz, M. Toner, Lab Chip, 8:12621264, (2008).
2. W. Lee, L.M. Walker, S.L. Anna, Phys. Fluids,
21:032103, doi: 10.1063/1.3081407, (2009),
3. L. Mazutis, J. Gilbert, W.L. Urig, D.A. Weitz,
A.D. Griffiths, J.A. Heyman, Nat. Protocols, , 8:
870-891, (2013)

Figure 5: Encapsulation of 20 µm standard
beads (%) depending on the ratio Psample/Poil.
The upper (black dots) and the bottom panels(black crosses) are the encapsulation of beads
when Poil was fixed to 5 kPa and 10 kPa,
respectively. The dotted gray lines show thelimit between the different flow regimes.

Algorithm for the precise detection of single and cluster cells
in microfluidic applications
Mathias Girault, Akihiro Hattori, Hyonchol Kim, Kenji Matsuura, Masao Odaka, Hideyuki
Terazono, and Kenji Yasuda.
1. Introduction
As a part of the on-chip cellomic project, acomplementary microfluidic method wasinvestigated in order to compartmentalize
sample into constant volume. Control ofcreation of each compartment was achieved
within this past year. This stable dual-flow
system opened several opportunities in thefield of the cell biology. However, detection ofcell in each compartment was particularly
difficult without suitable algorithm capable to
track a target in the flow of images1).
To reach this goal, we developed a new and an
original algorithm capable to detect cell in animage. In contrast to currently existingalgorithms,
wehereinproposedtheidentification and reconstruction of cell edges
based on original approaches that overcome
frequent detection limitations such as halos,noise, and droplet boundaries in microfluidic
applications2,3). Reconstructed cells are thendiscriminated between single cells and clustersof round-shaped cells, and cell informationsuch as the area and location of a cell in animage is output.
The method developed in the present study isthe first image processing algorithm designed
to be flexible in use (i.e. independent of thesize of an image, using a microfluidic droplet
system or not, and able to recognize cellclusters in an image) and provides thescientific community with a very accurate
imaging algorithm in the field of microfluidic
applications.
2. Material and methods
The algorithm proposed in this study was
deconstructed into the ten different steps
described in detail in additional notes 1 and 2of the paper (in press). Briefly, these steps
firstly defined the minimum gradient of thelight condition from a background image.
Using this gradient, wavelet decomposition
and fusion were processed on each image
captured with the camera. Three correction
methods were proposed in order to eliminate
the false positive edge caused by a change inlight intensity in the background, undesirable

small particles in the image (size lower than four
pixels), and halos around cells. The detection of cellclusters and possible droplets was computed using
the Hough circular transform. Following thedetection of circular objects, three linking methods
were performed in order to link the different partsof the edge. These methods: i) connected two edge
pixels separated by a pixel undetected as an edge;ii) detected the ends of the existing edges andcontinued them where the smallest distance in theneighboring pixels was found; iii) linearlycontinued the edges in eight different possible
directions based on the angles of the existing edges.
A flood fill algorithm was then added in order tocomplete the cell structure and output
morphological parameters such as the cell area andcluster detection for common microfluidic
applications. In the case of microfluidic
applications with droplets, a comparison of the
distance between the centroids of the cell and thedroplet detected was used to locate and output
morphological information of the cell for each
droplet.

Figure 1. Examples of images of cells encapsulated
in a droplet and the result of the image processing
algorithm developed in this study (scale bars are 30µm, red and blue circles are droplets and cells,
respectively). a is an image of four entire droplets
captured with a camera mounted on a microscope. bshows the result of the algorithm of three dropletsin which the left one is partially masked. c displays
two cells in contact encapsulated in a single droplet.

Figure 2. Relationship between the size area (pixel) of cell(s) encapsulated in a droplet measured
manually and the area calculated using the algorithms tested. The dashed grey line shows thetheoretical line at which the manual count of the area equals the area calculated using the algorithm.
The black line is the linear regression calculated using the data set of 500 droplets.
To test the accuracy of the algorithm a set of
500 images of of human promyelocytic
leukemia cells (HL-60) were captured andtested using our proposed algorithm. Using thetoolbox of the ImageJ software, the area of acell was estimated by manually drawing theedge and counting the number of pixels as partof the cell. Decisions regarding cell edges weremade by visual inspections and the contrast
between the regions of the cell and background.
3. Results and discussion.
Figure 1 shows three common examples ofimages of a cell encapsulated in a droplet. The
large red circles displayed the droplets,
whereas the small blue circles represented thelocations of the cells detected. These examples
showed that the algorithm developed in thisstudy was capable of detecting multiple cells
inside the same droplet and also a cell in apartially masked droplet. Using the Houghtransform, the droplet-sheath boundary was
masked with accuracy and the cell was
correctly isolated (Fig. 1). The small spot
observed in the partial droplet in the bottom
panel also confirmed that the Hough transform
had the ability to correctly identify a cell anddisregard particles with smaller diameters.
When a set of 500 images of cells encapsulated
in droplets was processed, comparisons

between the size areas of the cells calculated using
our algorithm and the manual counting method
showed a significant linear relationship (y=1.01x1.45; R2=0.96, n=500, Fig. 2). The high coefficientof the determination associated with the value of
linear regression close to 1 confirmed the efficiencyof the proposed algorithm to overcome the droplet
boundary
limitation
andreturnaccurate
morphological information.
4. Conclusions
We herein developed a new algorithm capableof detecting the edges of cells with complex
shapes in an image in the presence or absenceof a droplet using the Hough transform andgradient method. Since the gradient method
alone cannot detect a continuous cell wall,
additional linking steps were included in theimage processing algorithm. These linking steps
consisted of exploring the minimum distance ineach neighboring pixel at the end of the alreadydetected edge in order to extend the edge.
Moreover, linking processes using straight lines
appeared to overcome the issue of cell parts
with brightness close to the halo. Comparisonsof the sizes of cell areas with five common edge
detector-based algorithms revealed the highefficiency of the proposed algorithm fordetecting the edge and the linking process in
isolated or droplet encapsulated cells. The

algorithm was also tested on cluster cell
images, and the results obtained showedthat it contributed mathematically todetecting the morphology of round-shaped
cells aggregated in clusters and output a
precise area value. The algorithm proposedin this study may be integrated in an
imaging cell sorter in order to moreaccurately identify targeted cells or clusters
flowing in microfluidic devices afterconversion in a low level programming
language.
Results of this study were accepted for
publication in the journal Cytometry Part A.
References
1. L. Miroslaw, A. Chorazyczewski, F. Buchholz, R.
Kittler. Correlation-based method for automatic
mitotic cell detection in phase contrast microscopy.
In: Kurzynski M, Puchala E, Wozniak M, Zolnierek
A (Eds) Computer recognition systems. Springer,
Berlin, 2005:627–634.
2. S. Chen, M. Zhao, G. Wu, C. Yao, J. Zhang.
Recent advances in morphological cell image
analysis,
Computational and Mathematical
Methods in Medecine, 2012;101536:1-10.
3. M. A. El-Shenawy. Automatic detection andidentification of cells in digital images of day 2 IVF
embryos, PhD thesis, University of Salford, 2013:1260.

超音波放射圧による生体微粒子の非接触マニュピレーション
松浦賢志、野村典正、金賢徹、寺薗英之、服部明弘、安田 賢二

１．

はじめに

体の境界層の厚さｈを考えると、以下の(1)式が成り立つ。

近年関心を集める技術分野の一つとして、光ピンセットℎ=など、光波または超音波などの波動を制御し、微細粒子を!!
!"・・・(1)

μｍオーダーの微小空間サイズで非接触制御する技術の利用が広がっている。そして機械的に直接把持することが例えば 500kＨｚの定在波のとき、微粒子を取り囲む水困難な微小世界の現象の計測、例えばタンパク質 1 分子のの殻の厚さは 0.8μｍ程度である。ただし、ηは水の粘性発生力の計測、或いは微細加工技術で作成された微小構造係数である。

体の移動や精製などに利用されるようになっている。

これは、実験結果（1.5μｍ）に近い値であり、ｍｍサ
イズの大きな微粒子では影響が無視できるが、数μｍ程度

１．１

研究目標

の粒径の微粒子で初めて観察できるものである。従来、超以上述べたように、本プロジェクトの研究目標に必要な

音波放射圧は微粒子の粒径の 3 乗（体積）に比例して急激関連技術の一環として、超音波に着目し、その利用法としに減少するため、μｍ未満の小さな微粒子は捕獲が難しいて、超音波放射圧による生体微粒子マニュピレーション、と考えられていたが、この効果によって超音波放射圧は理

及び超音波放射圧の可視化による計測技術開発を試みる。

論で予測されていた粒径より小さい微粒子を効果的に捕獲することが可能であることが示唆された。また蛍光色素

１．２

研究内容

のような分子量数百程度の小さな分子に対して超音波放最初の段階として、超音波利用技術の再現性を試みる。

射圧がどのような効果をもたらすかも検討され、超音波のまず超音波を発生させるための簡潔な装置を、圧電体素子、放射圧によって蛍光色素のような蛍光高分子も超音波放表面弾性波デバイスなどの超音波発振素子を用いて構築

射圧の力を受けて分散することも明らかにしている。

し、それらの素子の形状をフレキシブルに変化させられる
柔軟なシステムとして構築することを試みる。

２．２

定在波を用いたＤＮＡ濃縮・血球濃縮

そして、次の実験段階として、微小容器内の懸濁液中の超音波定在波中における微粒子捕獲、濃縮技術は超音波

微粒子を超音波の放射圧によって非接触に捕獲したり、あ放射圧を用いた微粒子操作技術の中でも最も特徴的なもるいは特定の方向に配列、配向させる制御ができるようにのの一つである。水中での音速は 1,500ｍ／ｓであることする。そしてさらに超音波の性質の理解を深めるため、から、１ＭＨｚ程度の超音波を用いたときの水中での波長

超音波放射圧の測定を試みる。以上の研究内容となる。

は 1.5ｍｍ、100ＭＨｚの超音波を用いたときに、15μｍ とそして本稿において、本研究における超音波放射圧の生体なる。このようにμｍからｍｍオーダーまでの幅広いポテ

試料への応用の可能性について紹介する。

ンシャル場を選択できることが、超音波を微粒子の単なる捕獲技術として用いるだけでなく、幅広いポテンシャル場

２． 超音波マニュピレーション
２．１ 微粒子が受ける超音波放射圧
定在波中における超音波放射圧は、微粒子の粒径の３乗に比例して減少してゆき、最終的にはブラウン運動のための裾野によって濃縮を効率的に行うことを可能にしている。たとえば、従来は遠心分離で行っていたＤＮＡ分子の捕獲・濃縮も超音波放射圧によってｍｍオーダーの微小な容器内で同様に行うことが可能となる。

に捕獲できなくなってしまうが、果たしてμｍサイズの微

生体物質、とりわけＤＮＡ等の核酸にとって超音波は、粒子の場合においても同様な結果が得られるだろうか。

その破砕の手段として広く使われてきた。また超音波放射

実際にポリスチレン微粒子を用いて一定強度の超音波

圧の捕獲力は微粒子が小さくなると微粒子の粒径の３乗源から照射される超音波に対する超音波放射圧の粒径依に比例して減少してゆき、最終的にはあるサイズまで小さ存性を調べると、興味深いことがわかった。すなわち微粒

くなったところでブラウン運動に打ち勝つことができな

子の粒径がμｍ領域になると、微粒子が受ける力の減少のくなり、捕獲出来なくなってしまう。従って顕微鏡でも割合が減ってきて、一定の値に漸近するのである（図１）。

見ることができないほど小さなＤＮＡ分子を捕獲するた

原因は、粘性流体の効果によって微粒子の粒径がμｍ以下

めにはかなり強力な超音波を照射する必要があると考えになるといわゆる粘性流体の殻が微粒子の受ける超音波られる。しかし、実際には、ＤＮＡなどの微粒子は疎水会

輻射圧の強さを増幅するためと考えられる。例えば粘性流合条件において超音波によって互いに衝突・凝集しながらF!" ∝ R! sin(2kx)
ポリスチレン球

ポリスチレン球

F! = 6πηR ∙ v
トランスデューサ
超音波チャンバー(上面図)

微粒子の挙動(a) 計測方法

粘性シェル厚δ = 1.5µm(b) 最大移動速度と換算粒径との関係

図１ 超音波放射圧を受ける微粒子の周囲を囲む流体の殻。
定在波中での微粒子の移動速度から微粒子が実際にどの程度の粒径に換算されるかを見積もることができる。その結果、水の殻の影響は粒径が小さくなるほど顕著になり、この例では水の殻の厚さδは 1.5μm 程度であると見積もられる。

微粒子が受ける超音波放射圧は、微粒子の密度と圧縮率、超音波放射圧によるＤＮＡ濃縮過程の顕微鏡写真。上図は超音そして粒径の３乗に依存して決定するが、これに電場を加徐々に巨大な塊となっていき、最終的には巨大なＤＮＡ塊

えた場合、微粒子はその表面のゼータ電位と粒径の２乗にとして効率的に濃縮、回収することが可能である。図２

依存した力を拮抗して受けることとなる。従って微粒子はがその例である。この実験では、エタノール溶媒中で分子その密度、圧縮率、表面の状態（ゼータ電位）、粒径の違

量 2.7kbpｐのＤＮＡ分子の凝集条件において、周波数

いによって異なる釣り合いの位置を持つこととなり、異な

500kＨｚの超音波を導入すると、溶液中に分散していたＤる場所に並ぶことで簡単に分離されることになる（図３のＮＡの微小クラスターが定在波の節の位置に進行しなが数式(2)参照）。

ら互いに衝突し、その粒径が徐々に大きくなってゆき、最図３は実際に周波数 500kＨｚの定在波と静電場とを組み終的に定在波の節の位置に濃縮されるのが観察される。ま合わせて粒径 10μｍと粒径 20μｍのポリスチレン球を分た超音波照射後ＤＮＡは損傷を受けていれば分子量の短画した例である。まず超音波のみを照射すると粒径 10μい成分が多数発生するはずであるが、電気泳動の結果からｍと粒径 20μｍのポリスチレン球はともに定在波の節のキャビテーションが発生しない限りＤＮＡなどの核酸は位置に一直線に並ぶ。つぎに超音波を照射しながら静電場

損傷を受けていないことが確認されている（図２）。

を印加すると微粒子は粒径の違いに応じて定在波の節の

この超音波濃縮技術を用いて血液中の赤血球などの生位置から移動し、それぞれの釣り合いの位置に静止する。

体粒子も損傷をほとんど与えることなく定在波の節の位計算より求めた粒径 10μｍのポリスチレン球に対する粒置に濃縮することもできる。５）このときもキャビテーシ

径 20μm のポリスチレン球移動量の比は 0.5 であり、実験

ョンが発生しない条件下では赤血球内の成分はほとんど

結果（0.6）とほぼ同じ結果となっている。

溶出しないことが確認されている。また、定在波に高調波成分を重ね合わせる事で、細胞に損傷を与えること無く濃縮効率を改善することもできる。

２．４ マイクロ加工技術と超音波放射圧とを組み合わせた試料濃縮技術
超音波放射圧による濃縮技術が、もっとも効果的に利用

２．３ 超音波放射圧と静電気力の拮抗を用いた微粒子分離できるのは、マイクロ流体デバイス(チップ)での連続濃縮

微粒子に超音波放射圧を与えるとこれらを濃縮するこ

微粒子に諸々な操作をする上で必須の操作であるにもかとができることを示した。この超音波放射圧にもう一つ異かわらず、従来の濃縮技術手法の主力は遠心分離技術やフなる種類の力を拮抗するように加えると、微粒子を粒径、

ィルター技術であり、マイクロ流路での連続処理に組み込

組成の違いに応じて分離することができるようになる。

むことが困難だったからである。

処理プロセスでの応用である。何故なら濃縮・分離技術は、

まだ構想段階であるが、本研究の一環として、微細加工技術によって作成したマイクロサイズの分岐流路の分岐点に超音波を作用させ、微細粒子試料を選択的に分岐路の超音波ＯＦＦ

１つの流路に濃縮かつ搬送させる機能を持つ流体チップの試作も検討している。

３．考察及び今後の展望
超音波の生体利用の実用化の分野として、微細加工技術と超音波放射圧を組み合わせた濃縮、分離、精製技術の利用が期待されており、キャビテーションが発生しない状況

超音波ＯＮ(照射直後)

では生体試料のような損傷に敏感な試料であっても安全に操作できることが示唆されている。今後は、いかに効率的にキャビテーションを防ぎながら捕獲・操作できる技術が開発できるか、マイクロ流体デバイスの特徴を駆使した
血中白血球の捕獲、精製への応用を検討中である。また、DNA の塊より高精度及び高分解能のでのマニュピレーションを目指すため、超音波放射圧を液晶に照射し、液晶形状変化の可視化による測定方法の確立を目指したい考えである。

超音波ＯＮ(照射３分後)【参考文献】
1. M. Ohtsu, Optoelectronics, 10, 147(1995).
2. P. Debye, H. R. Anderson, H. Brumberger, J. Appl. Phys., 28,
音圧の節

679 (1957).

10 0μm

3. A. Gossler, A. L. Joyner, J. Rossant amd W. C. Skarnes,
図２ 超音波放射圧によるＤＮＡ濃縮過程の顕微鏡写真。
上図は超音波照射前、中図は超音波照射直後、下図は超音波照射
開始３分後のＤＮＡクラスターの分布を示している。超音波照射により定在波の音圧の節に集まったクラスターが会合して大きくなってゆくのが分かる。

0=

!!
!

𝑅 ! 𝑘𝐸!" 𝐴 sin 2𝑘𝑥 − 4𝜋𝜀𝜅𝑅 ! Φ! 𝐸!
超音波放射圧Science, 244, 463 (1989).

・・・(2)

静電力

図３ 超音波放射圧と静電気力とを用いた微粒子分画。
超音波のみを照射したとき粒径 10μm、20μm の微粒子は、ともに定在波の音圧の節に一直線に並ぶ（上写真 a）、右グラフ d)の点線）。さらに電場を加えると微粒子はその粒径に応じて音圧の節から移動する（下写真 b）、
右グラフ d)の実線）。
（図中上の(2)式で R：微粒子の半径、ｋ：超音波の波数、EAC ：超音波のエネルギー密度、A：定数、ｘ：微粒子の位置、ε：溶媒の誘電率、1/κ：微粒子のまわりの電気二重層の厚さ、Φ0：微粒子の表面の電位、EAC：印加する電界強度）

液体循環型高速遺伝子増幅･解析装置の開発
寺薗

１．

英之、松浦

賢志、服部

明弘、竹井

弘之、金

賢徹、安田 賢二

はじめに

ポリメラーゼ連鎖反応 (Polymerase chain reaction: PCR)は細胞が持つ遺伝子情報(DNA, mRNA)を簡易的に調べる手段として有用な計測方法である。その応用範囲は分子生物学といった生命科学の分野に留まるだけでなく、インフ
ルエンザやがん細胞の同定、食品の微生物検査にも及ぶ。
現在、我々は、細胞内で起こる生命現象や疾患メカニズ
ムの解明を推進するため、生命を構成する基本単位である細胞内の生体分子の発現量・空間分布を一細胞レベルから把握することに取り組んできた。我々は現在までに PCRの原理を利用し一細胞単位でターゲット遺伝子の発現を超高速に高精度に解析する装置を開発してきた。具体的には、高温条件下と低温条件下をできる限り迅速に変化し、温度勾配を急激に行う事で非特異的な遺伝子増幅を防ぎ、

図 1.一体型超高速リアルタイム PCR 装置実機。新規に開発した蛍一細胞内の極微量な DNA あるいは mRNA を特異的に高感光検出器を内蔵している。

度検出すること、PCR を高速に行う事により多種類の遺伝
子発現をより多く解析することができることを目的としている。

２．２循環水スピードの違いにおける反応槽での熱安定性の検討我々はこれまでに近赤外線集束光レーザーを利用した

通常の PCR 装置で使用されているペルチエ素子や温風

光加熱型、循環水を利用した超高速 PCR 方法の開発に成を用いた装置に比べ、循環水を用いたタイプは流速に依存

功した［1,2］。さらに簡便に利用しやすいように小型高速して反応槽の熱安定性に影響を及ぼす可能性がある。そこ

PCR 装置を開発してきた。さらに、循環水を用いた超高速で、2 温度型における反応槽での熱安定性について流速をPCR の安定化に関する検討、超高速 PCR 装置の高速性と変えることで確かめた。方法として赤外線カメラを用いていう優位性を高めるためリアルタイム PCR に利用する蛍反応槽を 2 次元的に測定し温度変化における温度分布を光検出装置を独自に開発し一体型の装置を開発した。また、測定した。高温を 94℃、低温を 60℃に設定し流速を新たに遺伝子増幅の応用範囲を広げるため融解曲線分析

2,4,6,8,10mL/秒で検討した。

モジュールの開発を行った結果について報告する。

その結果、流速 10mL/秒の時、測定領域全体が設定温度に急激に変化し、安定的に推移した。一方、流速を落とす

２．

実験と結果

に従い、設定温度に到達するまで時間がかかるようになりさらに測定領域の温度分布にムラが発生した。2mL/秒にお２．１小型超高速リアルタイム PCR 装置の開発

いては設定温度に到達しない領域まで発生した。これらの

これまで開発を進めてきた原理検討の結果を踏まえて、結果によりおおよそ 10mL/秒において安定して超高速 PCR

より熱変換の安定を目指した配管の設計、装置構成の変更ができる事が明らかとなった。

を行った。また、さらなる小型化と実用化を目指し、原理検討機では装置の外部にあった温度コントローラーを装置内に組み込むことで実用に耐える装置構成を目指した。
さらに、本装置の利点である構成を活かすために蛍光色素によるリアルタイム計測が出来るように、今回独自に蛍光検出器を開発し、装置内部に組み込むことに成功した。
結果として、組み上げた装置で原理検討機と同様のスピードで超高速 PCR を行う事に成功した。また、新たな蛍光検出器で検出にも成功した。

c"

b"

100

6000

90

5000
4000

80

3000
70

2000

60
50

0

2

4

Time (s)

d"

6000"

6

c"

100 ˚CFrequency

Frequency)

b"

1000

4000"
2000"

50 ˚C

8

すに従い、設定温度に到達するまで時間がかかるようになりさらに測定領域の温度分布にムラが発生した。6mL/s に

0

10

おいては設定温度に到達しない領域まで発生した。
e"100 ˚C２．３ 超高速 PCR 装置の原理を利用した融解曲線
分析モジュールの開発

3000"
2000"
50 ˚C

1000"

これまで開発を進めてきた循環水型の超高速 PCR 装置

0"
60"

68"

76"

84"

92"

50" 54" 58" 62" 66" 70" 74" 78" 82" 86" 90"Temperature ()100"Temperature)())g"i"

た。この原理を利用すれば、現在市販されているリアルタ

h"

100

6000

90

5000
4000

80

3000
70

2000

60
50

1000
0

2

4

6

8

h"

Frequency)

300"
200"
50 ˚C

100"

線分析も可能になることを示唆している。融解曲線分析とは PCR で増幅した遺伝子産物に対し、温度を低温から徐々に上げていくことで遺伝子の二重鎖が乖離する温度を計測することで、増幅した遺伝子産物の一塩基多型等を測定
j"

2500"

100 ˚C400"

イム PCR 装置の機能の一部として搭載されている融解曲

0

10Time (s)

500"

はサンプル間の温度均一性にすぐれていることがわかっ

Frequency (count)

Temperature () f"Frequency

度に急激に変化し、安定的に推移した。一方、流速を落と

4000"

0"

g"

結果として、流速 8mL/s 以上あれば測定領域全体が設定温Frequency (count)

Temperature () a"

する事ができる分析手法である。

100 ˚C

2000"

!
!

1500"
50 ˚C

1000"
500"

0"

0"

60" 64" 68" 72" 76" 80" 84" 88" 92" 96"100"!

50" 54" 58" 62" 66" 70" 74" 78" 82" 86" 90"Temperature)())Temperature())図 2.循環水の流速の違いによる反応槽での温度分布安定性 !

a-e までは 10mL/秒での温度分布、f-h までは 2mL/秒における温度分布。b と c は各反応領域内での温度分布をヒストグラムにした物。a は分布のヒストグラムを時系列にまとめたもの。f-h は

!
!

!

2mL/秒における同様の表示。循環水の流速を下げることで温度分

!
(
& !

布にムラが起きることが明らかになった。

また、この温度変化を 2,4,6,8,10 mL/秒で検討した結果

3000

70

2000

60

1000

50 0

0

2

4
6
8
Time (s)

10

6000

90

5000
4000

80

3000

70

2000

60

1000

50 0

2

4
6
8
Time (s)

100

装置の作製を行った。図 4 は開発した装置の模式図を示し

4mL/s'
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0

2

2mL/s'

4
6
8
Time (s)

10

0

5000
4000
3000
2000
1000
0

2

4
6
8
Time (s)

10

0

6000

90

5000
4000

80

3000

70

2000

60

1000

50 0

図3

2

4
6
8
Time (s)

10Frequency (count)

Temperature () 

6mL/s'100ている。
次に、作製した装置の熱分布の安定について検討した。

a 1

2

3

6000
Frequency (count)

100

Frequency (count)

Temperature () 

8mL/s'

循環水を用いた融解曲線分析モジュール

そこで、循環水の原理を利用して、融解曲線分析が可能な

Temperature)(˚C)

80

50

4000

50

5000

Temperature () 
60 70 80 90 100

90

Temperature () 
60 70 80 90 100

6000

Frequency (count)

10mL/s'100

Frequency (count)

Temperature () を図 3 に示す。

図4

100#
90#
80#
70#
60#
50#
40#
30#
20#

3

4

100 ˚C

4

50 ˚C

2
1

0.0#

2.0#

4.0#

6.0#

Time)(min)

図5

融解曲線分析モジュールでの熱応答性

0

循環水の速度の変化による PCR 反応部の熱分布と均一性。

その結果、各設定温度(50,72,85,95℃)に対して均一な熱分布を示すことがわかった。

次に、開発した融解曲線分析モジュールでの分析の均一性を検証した。
各 9 ポイントの場所において同じサンプルを用いて融３．

考察及び今後の展望

解曲線分析を行ったところ、各ポイントともほぼ同じ温度｛82.9 ℃ (standard deviation: 0.4 ℃)｝において今回の改良により、安定した超高速 PCR 装置の実用化

ピークを有することがわかり、融解曲線分析モジュールとの可能性、測定できる遺伝子の種類を拡大できる可能性をしての機能を高精度に持っていることが明らかとなった。

明らかにした。今後の取り組みとして、1 細胞内の生体分子の発現量を迅速に検出できる感度を向上させるキャリa

ブレーション技術の実用化に向けた具体的な装置開発を目指す。近年、PCR の高速検出はトピックになりつつあり、
1

4

7

2

5

8

3

6

9

装置だけではなく、高速 PCR に対応した試薬も開発されつつある。これら試薬との相乗効果によりより応用範囲の広い装置の開発を目指す。

10mm

Fluorescence*dF/dT*b2.5%

Point1%
Point%2%2%

Point%3%

1.5%

Point%4%

1%

Point%5%
Point%6%

0.5%

Point%7%0%Point%8%

!0.5%
50%

60%

70%

80%

90%

100%

Point%9%

Temperature*(˚C)*

図6

融解曲線分析モジュールの反応安定性の検討【参考文献】
1. H. Terazono, A. Hattori, H. Takei, K. Takeda and K. Yasuda,
Jpn. J. Appl. Phys. 47 no. 6 5212 (2008)
2. H. Terazono, H. Takei, A. Hattori, K. Yasuda, Jpn. J. Appl.
Phys. 49 no. 6 06GM05 (2010)

薄膜状金属ナノ粒子の FE-SEM 反射電子像コントラストに対する膜厚と曲率の寄与
金

１．

はじめに

賢徹、竹井

弘之、寺薗

英之、安田 賢二

表面に真空蒸着により金属を堆積させた後、有機物分解処理を行いポリスチレン球を分解除去することで作製した生命を構成する基本単位である細胞は多数のタンパク[2]。ポリスチレン球はサイズ校正用として用いられる粒質や核酸分子などで構成されており、それらが自己組織化

径 200nm と 300nm の市販品を利用しており、変動係数（CVや選択的分子認識を繰り返す結果が細胞の応答として反値）は 3%以下である。それらの表面に Au を 5, 10, 15 ま映される。例えばがん細胞では、正常細胞と比較した場合

たは 20nm 堆積させたものをそれぞれ作製した上で UV-オに特徴的ながんマーカー分子の発現数が顕著に増加もしゾン処理を行いポリスチレン球を分解除去した。それによくは減少しており、このことからも細胞を構成する各分子り、粒径が 200nm または 300nm、膜厚が 5, 10, 15 またはの発現数や分布、それらの働きが細胞の性質を特徴付ける

20nm の、合計 8 種類の半球カップ状 Au 薄膜ナノ粒子をことは明らかである。したがって、分子認識や分子間の選作製した。作製した薄膜状 Au ナノ粒子は一旦水中に分散

択的結合と細胞応答の関係という生命の基本過程を理解させた上で平坦な Si 基板上に滴下し再度乾燥させた上でするためには、細胞を構成する多数の生体分子の結合・解FE-SEM 計測を行った。また比較のために、平坦な Si 基板

離状態、さらにそれら分子の数と空間局在分布を個々の細上に Au 薄膜を同様の膜厚で堆積させた物（以下、Au 平

胞単位で定量計測することが必須となる。

坦膜）を作製し、半球カップ状薄膜ナノ粒子と反射電子輝

我々は、生体分子の空間局在分布を 1 細胞単位で網羅的に計測するために、様々な粒径・元素の微粒子状標識プロ度を比較することにより、ナノ立体構造の反射電子輝度への寄与を評価した。

ーブを作製して標的分子を網羅的に標識し、電界放出形走査電子顕微鏡（FE-SEM）でその存在位置と微粒子状標識

２．２

FE-SEM 反射電子像の輝度定量化方法の材質を高空間分解能で計測する方法の開発を進めてきた。その結果、ポリスチレン球表面に金属を真空蒸着によ作製した薄膜状金属ナノ粒子はそれぞれ加速電圧 5kVり堆積させることで様々な粒径・元素のナノ粒子を作製での条件で FE-SEM 反射電子計測を行った。画像は 8 ビット

きること[1]、作製したナノ粒子に対してさらに有機物分

グレースケールとして得られ、画像解析ソフトを利用して解処理を行うことにより、カップのような形状をした薄膜

背景の Si 基板や Au 薄膜ナノ粒子の輝度値をそれぞれ定量

状中空金属ナノ粒子を作製できること[2]、これら薄膜状化した。各反射電子像中の Au ナノ粒子輝度コントラスト

金属ナノ粒子に対して FE-SEM 反射電子計測を行うことを比較する際、装置の設定条件や試料表面の帯電状態など

により、像中の輝度コントラストの差として金属の種類を各測定条件間での差を排除するために、次の様な規格化を識別可能（一般に原子番号が大きい元素ほど電子を多く反行った上で、同じ粒径で異なる膜厚の Au ナノ粒子（と射するため明るくなる）であること[3]を明らかにしてきAu 平坦膜）間での輝度値の定量的比較を行った[3]。

た。これまでの研究では FE-SEM 反射電子計測により薄膜

まず、反射電子像中で最も明るい 20nm 膜厚の Au 薄膜

金属の種類を識別特定できることが分かったが、同じ種類の輝度実測値を Imax、最も暗い背景の Si 基板部分の輝度値の金属で薄膜ナノ粒子の膜厚が異なる場合、FE-SEM 反射を Imin とし、任意の膜厚（この実験では 5, 10 または 15nm）

電子輝度コントラストにどのような影響が表れるか定量の Au 薄膜輝度実測値を IZ とした上で、次の式から任意の的な評価が為されていなかったため、本研究では金属薄膜

膜厚の Au 薄膜の相対輝度値 ĨZ を計算した。

の膜厚と FE-SEM 反射電子像コントラストの関係の定量評価を行った。

２．

実験と結果ĨZ ≡ (IZ - Imin) / (Imax - Imin)
得られた ĨZ は規格化補正されたものであり、異なる膜厚間の ĨZ を膜厚の関数としてプロットし、膜厚増加に対す

２．１

薄膜状金属ナノ粒子の作製

金属ナノ粒子は、基板上に単層配置したポリスチレン球

る FE-SEM 反射電子コントラストの変化を求めた。

２．３

薄膜状金属ナノ粒子の膜厚と FE-SEM 反射電子像輝度の関係

により、反射電子輝度には 15%の誤差が生じることが分かった。以上をまとめると、FE-SEM 反射電子像コントラス

以上のような試料作製と解析方法の検討を行った上で、トにおいて、薄膜状ナノ構造体の膜厚が増加すると輝度が膜厚が 5, 10, 15, 20nm の Au 平坦膜、粒径 200nm の Au ナ

概ね線形に増加すること、ナノ構造体のサイズが 1.5 倍にノ粒子、粒径 300nm の Au ナノ粒子それぞれの FE-SEM 反なると輝度が約 15%変化することが分かった。
110

であるが、Au 膜厚が 5nm から 20nm へ増加するにつれて100

反射電子像中の輝度が明るくなる様子が観察された[4]。

90これらを定量比較するために各粒径、各膜厚のナノ粒子お80

よび平坦膜の ĨZ を計算し、Au 膜厚の関数としてプロット70した。図 2 はその結果をグラフとしてまとめたものであり、同時に線形近似直線を示した[4]。図 2 が示すように、Au
膜厚が増加するにつれて相対的反射電子輝度 ĨZ もほぼ線

Ĩ Z / %

射電子計測を行った。図 1 は得られた各試料の反射電子像60

Grad = 2.58 (300nm)
R² = 0.99439

50
40

Grad = 3.61 (Film)
R² = 0.93452

200nm
300nm

30

Film

形に増加（R >0.93）し、その輝度の増加の傾きは Au 平坦

20

膜が 3.61%/nm、200nmAu ナノ粒子が 2.24%/nm、300nmAu

10

ナノ粒子が 2.58%/nm であった。

02Grad = 2.24 (200nm)
R² = 0.95463

Line fitting (200nm)
Line fitting (300nm)
Line fitting (Film)
0

5

10

15

20

25

Au layer thickness / nm(a)

図 2 薄膜状 Au ナノ粒子および平坦膜の FE-SEM 反射電子相対輝度 Ĩ Z と Au 膜厚の関係[4]。

(b) 

20nm
15nm

３．
10nm
5nm
0nm 5nm

(c)

(d)

考察及び今後の展望

15nm
Au
200  300nm
10nm 5, 10, 15  20nm

(e)

(f)

FE-SEM 反射電子計測において、様々な粒径、元素で作製した薄膜状金属ナノ粒子を生体分子に対する標識として同時利用することを想定した場合、同一条件（同粒径、同元素）のナノ粒子は全て同じ輝度コントラストである必要があり、同一粒子の輝度ばらつきを抑えることが標識のバラエティ増加につながる。本研究の結果から、Au を例とした場合、1nm の膜厚差が約 2.4%の反射電子輝度誤差

(g)

(h)

(i)

(j)

となり、また 1.5 倍の粒径差が約 15%の反射電子輝度誤差となることが明らかになったことから、標識ナノ粒子を作製する際に、如何に粒径や金属膜厚を均一にするかが鍵と図 1 作製した薄膜状 Au ナノ粒子および平坦膜の FE-SEM 反射電子計測像[4]。(a) Si 基板（0nm）上に作製した 5, 10, 15, 20nmの Au 平坦膜。Bar, 50μm。(b) 作製した中空状薄膜 Au ナノ粒子の模式図。(c-j) 粒径 200nm の膜厚 5nm (c), 10nm (d), 15nm (e),20nm (f)、および 300nm の膜厚 5nm (g), 10nm (h), 15nm (i), 20nm(j)の薄膜 Au ナノ粒子。Bar, 500nm。

はじめに、200nm 粒子と 300nm 粒子の輝度増加分の平なることが明確になった。我々のナノ粒子作製法では、真空蒸着を利用してサブナノメートルレベルで膜厚を制御しつつ金属薄膜を作製しており、またサイズ校正用として利用されているポリスチレン球を鋳型として利用しているため粒径誤差は 3%以下と均一であることから、まさにFE-SEM 反射電子計測における標識用ナノ粒子を作製するのに適したプロセスであることが確認された。今後はこ均 値 （ 2.41%/nm ） に 対 し て 、 平 坦 膜 の 輝 度 増 加 分の利点を生かして、同時識別使用が可能なナノ粒子標識の（3.61%/nm）は 1.5 倍大きかったが、この差は Au ナノ粒

バラエティを一層増やしていく予定である。

子の内部空洞の影響によると考えることができる。図 1 に示したとおり、作製した Au ナノ粒子は半球状で内部に空洞を有するカップ状構造をしているが、FE-SEM 反射電子
計測では計測した領域に入射電子が侵入してそこから反射された電子量の平均値が輝度として反映されるため、中空状の構造体を計測した場合は空洞部分の存在が反射電子輝度コントラストに寄与し、その結果平坦膜との差として表れたと考えられる。次に、200nm 粒子と 300nm 粒子
間の輝度増加分の差は 15%であったが、これらは共に空洞を有する同等の構造体から得られた結果であることから、輝度増加分の差はナノ粒子曲率の差を反映したものであると考えることができる。即ち、粒径が 1.5 倍異なること【参考文献】
1. H. Kim, K. Yasuda, H. Takei, Sens. Actuators B, 142, 1(2009).
2. H. Kim, H. Takei, K. Yasuda, Jpn. J. Appl. Phys., 49,
048004 (2010).
3. H. Kim, T. Negishi, M. Kudo, H. Takei, K. Yasuda, J. Electr.
Microsc., 59, 379 (2010).
4. H. Kim, H. Takei, T. Negishi, M. Kudo, H. Terazono, K.
Yasuda, e-J. Surf. Sci. Nano Technol., 10, 301 (2012).

細胞回収用途を想定したカップ形状磁性構造体の物性評価
金

１．

はじめに

賢徹、寺薗

英之、竹井

弘之、安田 賢二した。磁性体膜を 1 粒子あたり複数層形成する場合は、Ni を真空蒸着した後に絶縁体を真空蒸着し、さらに Ni を

ヘテロな細胞集団の中から目的の細胞のみを選択的に再度蒸着することで二つの Ni 層を分離した積層構造を作

回収精製する前処理技術は、生命科学研究において最も基製した。本研究では絶縁体として二酸化ケイ素（SiO2）を本的工程のひとつである。目的細胞を回収するための代表

用い、二つの Ni 層を分離させる場合にはその間に 15nm

的な方法のひとつはフィルタ膜を使用した濾過法であり、の SiO2 層を形成した。この工程を数回繰り返すことによ

特定直径の穴が開いたフィルタ膜に細胞懸濁液を通過さり、Ni 層と SiO2 層が交互に堆積した積層構造をポリスチせることで、穴の直径より大きな細胞を濾しとる方法であレン球上に作製した。また、magcup 内部にプローブ分子る。簡便な方法であるため広く利用されているが、フィルを固定化する場合は、最初にチオール基を標的としてプロ

タ膜を通過させる際に細胞懸濁液に対して加圧をする必ーブ分子を容易に固定化できる金（Au）を 5nm の膜厚で要があり、そのためフィルタ膜上で多数の細胞が破砕され予め真空蒸着しておき、その後 Ni と SiO2 を順次蒸着した。

てしまうという問題点がある。一方、別の方法としては磁最後に Ni と SiO2（および必要に応じて Au）層を形成した気微粒子を用いた細胞回収法があり、直径数ミクロン程度

ポリスチレン球を高温電気炉内に配置し、温度 500℃下での磁気微粒子表面を抗体など目的細胞と結合するプロー

17 時間処理し、ポリスチレン球を熱融解除去することにブ分子でコートした後に細胞懸濁液と混合することで、磁より、Ni 層と SiO2 層で構成された半球状の magcup を得

気微粒子が目的細胞表面に結合する。その後、細胞懸濁液

た（図 1）。

に磁場を印加すると磁気微粒子が付着した目的細胞が回収精製されるという仕組みである。回収特異性が高く手順も簡便であることから広く利用されているが、選択的に結合するプローブ分子が特定されていない細胞に対しては(a)

Ni/SiO2	Si(Ni SiO2)

適用不可能である。
本研究では上記フィルタ濾過法と磁気微粒子精製法の長所を兼ね揃えた、新しい細胞精製法に関する開発を目指し、お椀のようなカップ形状の磁気微粒子（以下、"magcup"（マグカップ））を作製する方法、magcup 材質と磁場応答

SiO2 (15 nm) Ni (2 nm)(b)性の関係、magcup 内部へのプローブ分子を固定化する際の固定化密度と magcup 直径の関係について研究を行ったので、祖の結果を報告する。

２．
２．１

実験と結果
magcup の作製方法

Ni

図 1 magcup の作製方法。(a)ポリスチレン球を鋳型として Ni とSiO2 を交互に真空蒸着して複層構造の magcup を作製する手順の概要。(b)作製した magcup の走査型電子顕微鏡写真。Bar, 10µm。

magcup の作製では、これまでの研究[1]に倣い、ポリス

本作製方法の特長はポリスチレン球を鋳型として用いチレン球を鋳型として真空蒸着法を応用した方法で作製ている点であり、市販ポリスチレン球は様々な粒径のものした。はじめに作製を望む直径のポリスチレン球をシリコが容易に入手可能であるのみならず、粒径精度が変動係数

ン基板上に単層配置した。粒径としては、magcup を細胞5%以下と均一であるため、それを鋳型とした magcup も同回収用途として用いる場合は約 10µm から 100µm、細胞内様に直径が均一であり、その結果、厳密なサイズ依存的細小器官など微小な物質捕獲を目指す場合は約 100nm から胞回収が可能となった。また真空蒸着法を用いることによ

1µm 径の物を用いた。次に、基板上に配置したポリスチレ

り、Au や Ni、SiO2 といった異なる元素で構成された積層

ン球を真空蒸着装置内に入れ、半球部分のみ磁性体金属を薄膜を容易に作製でき、さらに膜厚を精度 1nm 以下で厳望む膜厚だけ堆積させた。磁性体金属としてはニッケル密に制御できるため、それにより作製された magcup の物（Ni）を用い、膜厚は 2nm から 20nm の範囲で、1nm 単位性（強磁性や超常磁性）を制御できる点も特長である。

で厳密制御した上で磁性体膜をポリスチレン球上に作製

２．２

magcup 薄膜層状構造と磁場応答性の関係
全く持たない超常磁性となる。細胞回収用途に用いる場合作製した magcup は Ni と SiO2 が交互に積層した複数層

は、反応後に粒子が再分散する超常磁性であると都合が良構造となっているが、電磁気学におけるガウスの法則によいため、本研究では超常磁性と強磁性の境界となる Ni 膜

ると Ni 層数が増えるにつれて 1 カップ当たりの磁性体含厚を明らかにすることを目的とした。先の積層評価実験と有量が増加し磁場応答性が線形的に向上することが期待

同様に magcup を水系溶媒に懸濁した後、ネオジウム磁石されるため、手始めに各カップの Ni 層数と磁場応答性のを用いて磁場を 30 秒間印加し、その後磁場印加を止めて関係について評価を行った[2]。Ni と SiO2 の膜厚はそれぞ

分散液を十分に撹拌した。その分散液をガラス基板に滴下れ 2nm と 15nm に固定し、Ni 層数が 1、2、3、4、5 の magcup

し、顕微鏡観察により粒子のクラスター化状態を評価した。

をそれぞれ作製した上で、水系溶媒に分散させた状態でガ粒子がばらばらの単一状態で分散しているときは超常磁ラス基板上に分散液を滴下した。ガラス基板底面からネオ性、寄り集まってクラスター化しているときは強磁性であジウム磁石（620mT）を近づけると、作製した magcup がることを示唆している。図 3 は単一状態で分散している粒磁場に応答し磁石方向へ吸い寄せられるが、溶媒の粘性抵子の割合と Ni 層膜厚の関係である。膜厚が 3nm 以下であ抗と釣り合うことによりほぼ一定の速度となり磁石方向ればほぼ全ての粒子が単分散状態で存在するが、4nm 以上へ移動する。この時、磁場による magcup の引力 F は釣りとなると単分散粒子に加えて凝集クラスターが出現しは合った粘性抵抗力とほぼ等しいと見なせるため、以下の式

じめることが明らかになった。以上の結果、magcup の物より求まる。

性を超常磁性とするためには Ni 層膜厚が 3nm 以下である
必要があると明らかになり、本研究では以降の評価で Ni（1）

F = 6πηrv

膜厚を 2nm に設定した上で実験を進めた。

ここ η は溶媒の粘性係数、r は粒子半径、v は粒子速度で100ある。すなわち、粒子移動速度を CCD カメラ動画から見	は以下のクーロンの法則から見積もることができる。

80

[%]

積もることにより F が求まり、その結果、粒子の磁荷 qm（2）qm = 4πμR2F / Qm

6040

ただし μ は透磁率、R は粒子と磁石間の距離、Qm は磁石20の磁荷である。図 2 は上記計算式を用いて見積もった 1 粒子あたりの磁荷と Ni 層数の関係である。Ni 層数が増える

01

につれ磁荷が線形的に増加（傾き 2.1、R2=0.93）したこと

2

3

4
Ni

5

10

20

[nm]

から、積層構造とし Ni 層数を増やすことにより、理論通
り磁場応答性の高い magcup を作製できることが明らかに

図3

単分散粒子の割合と Ni 膜厚の関係[2]。

なった。
次に、1 層あたりの Ni 膜厚と作製される magcup 物性の２．３

magcup 凹面曲率と分子固定化密度の関係

関係について調べた[2]。Ni は磁性体であり一般的には強磁性的性質を示すが、Ni 構造体体積をナノサイズまで小作製した magcup は内部空洞の形状を利用してサイズ選

さくすると構造体内に磁区が一つしかできず、その結果磁択的に目的細胞を回収できるが、それに加えてカップ内部

場を印加した時のみ強磁性的性質を示し、ヒステリシスをにプローブ分子を固定化すると従来の磁気微粒子精製法

10"と同様に標的分子を認識して細胞を選択的に捕捉できる
ので、さらに回収細胞の選択性が増す。このサイズと分子![10%9!Wb]

8"

認識の 2 段階細胞選択回収を実現するための基礎検討として、カップ内部にプローブ分子を固定化する際の分子固6"定化密度に対する magcup 凹面曲率の寄与について評価を行った[3]。本評価を行うにあたっては凹面曲率の寄与が4"より顕著に表れ易い微小なカップ（直径 1μm 以下）を用いた上で、カップ内面を Au、カップ外面を Ni とし、5'末

2"端にチオール基を有するターゲット DNA をカップ内面に選択的に固定化した。次に、カップ内に固定したターゲッ

0"
1"

図2

2"

3"
Ni

4"

1 粒子あたりの磁荷と Ni 積層数の関係[2]。

5"ト DNA と相補的配列を持つプローブ DNA で表面を被覆した直径 20nm の金ナノ粒子を同カップと反応させた後、カップ内部（のターゲット DNA）と結合した金ナノ粒子

の数密度を走査型電子顕微鏡（FE-SEM）で計数した（図（3）Dθ = D0 sin2θ / 2(1 - cosθ)4）。この計数評価を直径 140nm から 800nm までのカップに対して行い、カップ内部での DNA 結合反応のし易さ（すだけ低下すると予想され、その結果、D100%と D25%の比はなわちカップ内部でのターゲット DNA 固定化密度）と凹

カップ全体では 57%になると予想される。これらを考慮し面曲率の関係について考察を行った。

た上で図 6 を解析すると 3 つの領域に分けられることが明らかになった。すなわち、領域 1：カップ全体にわたりDNA 結合反応が均一である領域（カップ直径 140-200nm）、
領域 2：カップ側面での DNA 結合反応が徐々に低下する遷移状態（200-400nm）、領域 3：カップ側面での反応効率が式（3）に従い中央からの立体角に依存して低下する領域（400-800nm）である。この結果はまず、我々の予測通
りカップ側面部分では立体角に応じて DNA 結合反応効率が低下することを示している。さらに、領域 1 に相当する
微細な凹状構造（DNA 結合反応では直径 20nm の金ナノ粒子を作用させているため、カップ内にアプローチする物

図 4 magcup 内部に固定化したターゲット DNA に対し、プローブ
DNA を固定化した金ナノ粒子を作用させた後に得た FE-SEM 写真の例[3]。左はターゲット DNA に対して相補的なプローブ DNA を金ナノ粒子に固定化して反応を行った場合、右は相補的でないプロ
ーブ DNA を用いた場合。左の写真ではハイブリダイゼーション反応により結合した金ナノ粒子が白い輝点として観察されている。
カップ直径は 800nm、Bar, 200nm。

質直径の 10 倍以下）では、側面での反応効率低下がほとんど表れず、カップ内全体で均一な反応が起こることを示している。後者については、magcup 内へプローブ分子を均一に固定化できることが明らかになったのみならず、例
えば平坦基板上に微細な凹状構造を製作することにより、マクロな視点での投影表面積を増やした上でさらにプロ

図 5 は FE-SEM 計測結果から得られた金ナノ粒子密度とーブ分子も結合密度が低下すること無く均一に高密度固

magcup 直径の関係を示したものである。グラフ中には比1

較として平坦基板上で同様の DNA 結合反応を行った際の金ナノ粒子密度を示した。粒径が 200nm 以下の小さなカ

我々はこの結果がカップ側面での DNA 結合反応効率低

100%

80

D100% / D25% [%] 

最終的に平坦基板の約半分となることが明らかになった。

3

100

ップでは、DNA 結合反応密度が平坦基板とほぼ同様であったが、カップ直径が大きくなるにつれて密度が低下し、

2

60

57%

40

下に起因するのではないかと予測し、それを検証するためにカップ底面中央部 25%の金ナノ粒子数密度 D25%を計算した上でカップ全体の数密度 D100%との比較を全カップ粒径に対して行った[3]。図 6 は D100%と D25%の比に対するmagcup 直径の関係を示したものである。D100%と D25%の比が 1 であれば、カップ全体で DNA 結合反応が斑無く起こっていることを意味する。また、もし DNA 結合反応がカップ中心からの立体角 θ に依存して低下するのであれば、
θ での密度 Dθ はカップ中央部での密度 D0 に比べ、 [µm-2]

0
0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

	
 [nm]
Nano-cup diameter[nm]

図 6 カップ底面中央部 25%の金ナノ粒子数密度 D25%とカップ全体の数密度 D100%との比と、カップ直径の関係[3]。3 つの領域、および D25%と D100%の比が 1 になる場合（100%）と式（3）に従い低下した場合（57%）を点線で示している。

定化できることが明らかになったため、DNA マイクロア

600

レイなど分子を捕捉するチップ基板を設計する上でも有

500

20

益な情報となる。

400

３．

考察及び今後の展望

300

本研究では、従来のフィルタ濾過法と磁気微粒子精製法

200の長所を兼ね揃えた、新しい細胞回収法の開発を想定し、100

カップ形状の磁性構造体 magcup の開発とその物性評価を行った。magcup はポリスチレン球を鋳型とした上で真空

0
0

200

400
600
  [nm]

800

1000
	

蒸着法を応用した技術で作製しているため、低価格で大量の粒子を提供することが可能である。またカップ内部へプ

図 5 magcup 内部に固定化したターゲット DNA と結合したプロー
ブ金ナノ粒子密度とカップ直径の関係[3]。

ローブ分子を固定化し、従来の磁気微粒子精製法と同様な分子認識による回収も可能であることを示した。まさにフィルタ濾過法と磁気微粒子精製法の長所を合わせ持った、新たな次世代細胞回収技術につながる微細構造体の作製に成功した。
今後の計画としては、magcup 作製技術の改良を行うと共に、産業化を見据えた低コスト化や作製方法の効率化に取り組む予定である。
【参考文献】
1. H. Kim, H. Takei, K. Yasuda, Jpn. J. Appl. Phys., 49,
048004 (2010).
2. H. Kim, H. Takei, K. Yasuda, Jpn. J. Appl. Phys., 53, 06JJ01,(2014)
3. H. Kim, H. Terazono, H. Takei, K. Yasuda, Langmuir, 30,
1272, (2014)

カップ形状超常磁性微粒子"magcup"を用いた
サイズ選択的細胞回収技術の開発
金

１．

賢徹、寺薗

英之、竹井

弘之、安田 賢二

はじめに

様々な種類の細胞が混在する集団の中から目的の細胞のみを回収する作業は、生命科学研究において最も基本的かつ重要な前処理工程のひとつである。ここでは、フィル
タ濾過法のサイズ選択性と磁気微粒子精製法の簡便性の両者を兼ね揃えた、新しい細胞回収技術の開発について紹介する。具体的には、お椀のようなカップ形状の超常磁性微粒子（以下、"magcup"）を作製した上で、magcup 内部の凹面空間に目的細胞をサイズ選択的に捕獲し、磁場を印加することで細胞を回収する技術開発について紹介する。
magcup の作製方法と物性については前項で詳しく紹介したため割愛し、magcup によるビーズと細胞のサイズ選択
的な回収、および回収細胞の再培養結果について報告する。

２．
２．１

実験と結果
magcup によるビーズのサイズ選択的回収

はじめに、サイズ校正用として広く一般的に利用されているポリスチレンビーズ（CV 値 5%以下）を回収対象のモデルとし、magcup による標的回収のサイズ選択性について評価を行った。図 1 は直径 7µm から 80µm の magcupを作製した上で直径 10µm のポリスチレンビーズと混合し、回収率（magup 内部にビーズが捕獲された割合）をまとめ図1たものである[1]。ビーズの直径が 10µm であるのに対して、的回収結果。
（a）直径 20µm の magcup によりビーズを回収した例

ビーズ直径より小さい、もしくは同じ大きさの直径 7µm、の走査型電子顕微鏡像。Bar, 5µm。
（b）直径 7µm から 80µm の magcup

10µm の magcup を用いて回収実験を行った際にはビーズを用いてビーズを回収した場合の回収率。

が全く回収されず、ビーズ直径より magcup 直径が大きく

magcup による直径 10µm ポリスチレンビーズのサイズ選択

なるにつれて、徐々に回収率が向上するという結果が得ら

ンビーズそれぞれに対して回収率（magcup 内部にビーズれた。すなわち、magcup の内部空間が回収標的に対してが捕獲された割合）をまとめたものである[1]。はじめに、

サイズフィルタとして機能することが確認された。図 1（b）

magcup 直径より大きなビーズは全く回収されないというに示したとおり、magcup のサイズフィルタ機能は極めて結果が、図 1 の場合と同様に得られたことから、magcup

厳密であることが分かる。これは、magcup 作製においてのサイズフィルタとしての機能が再確認された。次に、両やはりサイズ分布が均一（CV 値 5%以下）なポリスチレ

方のビーズが回収される条件の場合（すなわち magcup 直ン球を鋳型として用いているので、作製された magcup のサイズ分布も同様に均一であるためである。
図 2 は直径 20µm から 50µm の magcup を作製した上で直径 10µm と 40µm（図 2a）、20µm と 40µm（図 2b）、30µmと 40µm（図 2c）の、それぞれ 2 種類のポリスチレンビー
ズ混合物と magcup をさらに混合し、各直径のポリスチレ

径が 50µm の場合）、magcup 直径により近いビーズ（すな
わち 40µm ビーズ）がより高頻度に回収されることが明らかになった。この理由についてはさらなる検討が必要であるが、ひとつの可能性として排除体積効果の寄与が考えられる[2]。

図 3 magcup による CCRF-CEM 細胞のサイズ選択的回収結果。
（a）
直径 15µm の magcup によりビーズを回収した例の走査型電子顕微
鏡像。Bar, 2µm。（b）直径 7µm から 80µm の magcup を用いて細胞を回収した場合の回収率。

Magcup による細胞回収では、magcup 表面を抗体で修飾し細胞を強固に結合させることなどは一切せず、凹面の構造を使って細胞を物理的に回収しているため、回収後も細胞に対するダメージが少ないことが期待される。このことを確かめるために、直径 15 µm の magcup で細胞を回収した後、回収細胞を magcup に捕獲された状態のまま培養液中に移して経時観察を行いつつ、再培養を行った。図 4 は、細胞回収直後から 10 分間隔で経時的に観察を行いつつ、
図2

magcup を用いて直径 10µm と 40µm（a）、20µm と 40µm（b）、再培養を行った結果である[1]。図 4 中の細胞はたまたま分

30µm と 40µm（c）の、2 種類のポリスチレンビーズ混合物を回収

裂期に入る直前であったと考えられるが、回収 80 分後にした場合の回収率。

自発的に magcup の外に抜け出した後、120 分後に分裂する様子が確認された。この結果から、magcup による細胞

２．２

magcup による細胞のサイズ選択的回収

回収、および細胞回収後に magcup 共存下で再培養を行う
ことによる細胞ダメージは無いことが明らかになった。

ポリスチレンビーズをモデルとして用いた基礎検討結
果を踏まえた上で、次に magcup を用いて細胞をサイズ選

３．

考察及び今後の展望

択的に回収することが可能であるか評価を行った。培養ヒ
ト血球系細胞（CCRF-CEM、平均直径 12±2µm）を回収の本研究では、フィルタ濾過法のサイズ選択性と磁気微粒モデル標的とし、ビーズの場合と同様、まずは直径 7µm

子精製法の簡便性の両者を兼ね揃えた、新しい細胞精製技から 80µm の magcup を作製した上で細胞と混合し、各直術の開発を推進し、その結果、magcup の作製と目的細胞

径 magcup の回収率を評価した。図 3 はそれをまとめた結のサイズ選択的回収、さらに回収細胞の再培養に成功した。

径より magcup 直径が大きくなるにつれて、徐々に回収率本技術を用いれば、標的細胞に対して一切の化学処理を行が向上するという結果が得られた。すなわち、細胞を回収

わずインタクトな状態のまま回収を行い、さらに再培養を標的として用いた場合でも、magcup の内部空間がサイズ行うことで細胞数を増やし、その後の解析を円滑に行うこフィルタとして機能することが確認された。

とが可能となる。今後の計画としては、様々な種類の細胞が混在した集団の中から目的細胞のみを精度良く回収す図4

magcup を用いて回収した細胞の再培養結果。30 µm 径のチャンバ（白い円形の外枠）内に magcup と細胞の複合体を閉じ込めた上で、10 分毎に画像を取得しつつ培養を行った。Bar, 20µm。

ることが可能であるか、引き続き評価を進める予定である。
本研究は、村上麻希補助員、長沼真衣補助員の多くの研究補助をいただき推進されました。また、本研究は、科学研究費補助金若手研究（A）のご支援をいただき行
われました。ここに感謝申し上げます。
【参考文献】
1. H. Kim, H. Terazono, H. Takei, K. Yasuda, Sci. Rep., 4,6362 (2014).
2. S. Asakura, F. Oosawa, J. Chem. Phys., 22, 1255 (1954).