ゴシュユと緑膿菌におけるキノロンアルカロイド生合成研究と機能改変酵素を用いた物質生産系の確立
申 請 代 表 者
所内共同研究者

森森田貴裕
洋行

東京大学大学院薬学系研究科天然物化学教室
天然物化学分野

助教教授【報告セミナー要旨】【目的】
生薬呉茱萸の基原植物であるミカン科のゴシュユ（Euodia ruticarpa）はキノロンアルカロイドのエボカルピン類を生成する。エボカルピンは、カルシウムチャネル拮抗作用を有する有用天然物である。一方、キノロンアルカロイドは緑膿菌からも単離されている。このうち、Pseudomonas
aeruginosa が生産する 4-hydroxy-2-alkylquinolines（HAQ）は、FabH 様酵素である PqsB、PqsC、及び PqsD により生合成されることが報告されている。しかし、植物においては、FabH 様酵素の関与により生合成されるアルカロイドは報告されていない。一方、Ⅲ型ポリケタイド合成酵素（PKS）
であるキノロン合成酵素はキノリノンアルカロイドを生合成する。また、ウコンのクルクミンは、Ⅲ型 PKS であるジケタイド CoA 合成酵素が feruloyl-CoA と malonyl-CoA から diketide-CoA を生成し、その加水分解産物である b-keto acid を、同じくⅢ型 PKS であるクルクミノイド合成酵素が feruloylCoA と縮合することで生成する。このことから、エボカルピン類は N-methylanthraniloyl-CoA、長鎖脂肪酸 CoA、malonyl-CoA の 3 種の基質から 2 種のⅢ型 PKS の触媒によって生合成されると予想される。本研究では、本作業仮説のもと、ゴシュユが生産するエボカルピン類の生合成酵素を明らかとし、さらにエボカルピン類生合成酵素と HAQ 生合成酵素の触媒メカニズムの詳細を解明することで、植物と微生物間でのキノロンアルカロイド生合成の相違を明らかにすることを目指した。
【結果、考察】ゴシュユの蕾から得た total RNA を鋳型とし、RT-PCR 法を行うことにより 2 種のゴシュユ由来新規Ⅲ型 PKS、ADS と AQS を得た。次に、大腸菌に異種発現させ精製した ADS と AQS の共反応液にN-methylanthraniloyl-CoA、decanoyl-CoA、malonyl-CoA を基質として作用させた。その結果、エボカルピン類縁体の生成が確認された。さらに詳細に機能解析を進めたところ、ADS は decanoylCoA と malonyl-CoA を縮合して diketide-CoA への変換を触媒する新規Ⅲ型 PKS であることが判明した。一方、AQS は N-methylanthraniloyl-CoA と diketide-CoA の加水分解産物である b-keto acidを縮合させることで、エボカルピン類縁体へと変換する新規Ⅲ型 PKS である事が明らかとなった。
ADS と AQS の立体構造を 2.02 Å と 2.20 Å の分解能で取得し、得られた立体構造情報をもとに変異導入実験を行ったところ、ADS では活性中心キャビティー構成アミノ酸である Trp332 が、AQS では活性中心キャビティーと蛋白質表面を結ぶ CoA 結合トンネルの構成アミノ酸、Tyr215 が各酵素の基質特異性と生成物特異性を制御していることが示された。現在、AQS に基質アナログを作用させることによる新規化合物の創出が進行中である。
一方、緑膿菌の PqsB、PqsC の複合体構造を取得するため、両酵素を個々に大腸菌に異種発現、同一菌内に発現、あるいは融合タンパク質としての発現等を試みた。しかし、いずれも封入体を形成し可溶性酵素として得ることが出来なかった。現在、分子シャペロンとの共発現や、酵母での発現を試みているところである。

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■背景・目的
生薬呉茱萸の基原植物であるミカン科のゴシュユ（Euodia ruticarpa）はキノロンアルカロイドのエボカルピン類を生成する（図１）．エボカルピンは，カルシウム拮抗作用，強心作用，子宮収縮作用を有する有用天然物である．また，ゴシュユからはエボカルピン以外にも脂肪酸の炭素鎖長や飽和・不飽和の位置と数が異なるアルキル基がキノロン骨格に結合したアルキルキノロンアルカロイドも単離されている（図１）．一方，アルキルキノロンアルカロイドは緑膿菌からも単離されている．このうち，Pseudomonas aeruginosa が生産する 4- ハイドロキシ -2- アルキルキノロン（HAQ）は，FabH 様酵素である PqsB，PqsC，及び PqsD により生合成されることが報告されている．しかし，植物においては，FabH 様酵素の関与により生合成されるアルカロイドは報告されていない．一方，Ⅲ型ポリケタイド合成酵素（PKS）であるキノロン合成酵素はキノリノンアルカロイドを生合成する．また，ウコンのクルクミンは，Ⅲ型 PKS であるジケタイド CoA 合成酵素がフェルロイル CoA とマロニルCoA からジケタイド CoA を生成し，その加水分解産物である β- ケト酸を，同じくⅢ型 PKS であるクルクミノイド合成酵素がフェルロイル CoA と縮合することで生成する．このことから，エボカルピン類は N- メチルアントラニロイル CoA，長鎖脂肪酸 CoA，マロニル CoA の 3 種の基質から 2 種のⅢ型 PKS の触媒によって生合成されると予想された．そこで，今回我々は，本作業仮説のもと，ゴシュユが生産するエボカルピン類の生合成酵素を明らかとし，さらにエボカルピン類生合成酵素と HAQ生合成酵素の触媒メカニズムの詳細を解明することで，植物と微生物間でのキノロンアルカロイド生İïǖǓǙ
合成の相違を明らかにすることを目指した．

V 02CDno')F.F.;GH■結果・考察

富山大学薬用植物園で採取したゴシュユ Evodia rutaecarpa の蕾から，グアニジンチオシアネート法を用いて total RNA を抽出し，これを鋳型としてオリゴ d(T) プライマーを用いて逆転写反応を行うことにより，１本鎖 cDNA ライブラリーを作成した．次に，これを鋳型として，Ⅲ型 PKS のアミノ酸配列の中でも特に保存された領域をもとに設計・作成した縮重入りプライマーを用いて 1st PCRおよび nested PCR を行うことにより，ゴシュユ由来Ⅲ型 PKS 遺伝子のコア配列２種を取得した．そこで，各々のコア配列に対して特異的なプライマーを作成し，5’RACE 法にて，コア配列の 5’ 末端の配列を得，次いで 5’ 末端に特異的なプライマーを用いて 3’RACE 法を行うことにより，２種のゴシュ
ユ由来新規Ⅲ型 PKS 遺伝子，アルキルジケタイド合成酵素（ErADS）とアルキルキノロン合成酵素（ErAQS）遺伝子の取得に成功した（図２）．ErADS と ErAQS は，それぞれ 397 と 390 アミノ酸をコー－ 58 －V 02CDno')F.F.;GHV 02CDpeW  "?E1.,=0B2

 P%UZg  $)>;N$i Ê PKS /ǘ(/ƖÖĶÌǒCys-His-Asn EƧƅ+ǒ Ê PKS /ĲſÒİûEļ;A/.ƹƓ+A,BAGpcƸĶÌEǅƅ+š$ǔİïǖǓǙV @5F)H8E:G+F  7-;+F  P%=G:F  (X}"  "   $LQ_nam ƷŮµúŐýŌ/£ǃ.0 ODS-80Tsǐ4.6φ x 150 mmǒToshoǑEŒ 0.1% TFA E¿: CH3CN-H2O ŬŇÖEŒ$QvVLz^ĥǐ0-5 minǞ20% CH3CNǒ5-45 minǞ20-100% CH3CNǑ.*®»ŌEŇ¢!$ǔ®»Ō/¼Û0ǒLC-MS/£×ƻ>2ºıÃ,/Ĺƪ.>@Ǝ'$ǔ

ドした．これらは互いに 61% のアミノ酸相同性を示した．さらに，ErADS と ErAQS は，Ⅲ型 PKSの 3 つの触媒残基 Cys，His，Asn を保存した．ErADS は，Ⅲ型 PKS の基質特異性と生成物特異性を決めるのに重要であるとされるアミノ酸残基のうち，191 番目と 259 番目，及び 332 番目が Cys，Tyr，Trp，ErAQS は，それらが Tyr，Leu，Gly に置換されていた．他のⅢ型 PKS と相同性比較を行った結果，ErADS はカルコンを生合成する Medicago sativa CHS（MsCHS）と 63%，ErAQS はキノロンを生合成する Citrus microcarpa QNS（CmQNS）と 60% の最も高い配列相同性を示した．

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そこで，ErADS と ErAQS を，６残基のヒスチジンとの N 末融合タンパク質として大腸菌に異種発İïǖǓǙ現し，Ni-NTA アフィニティーカラムを用いて精製した．次に，N- メチルアントラニロイル CoA，デカノイル CoA，及び，マロニル CoA を基質として ErADS と ErAQS の共反応を行い，その生成物について LC-MS を用いて解析を行った．その結果，m/z 286 [M+H]+ を示す未知の化合物を生成することが確認された（図３）．本化合物と標品 1-methyl-2-nonyl-4(1H)-quinolone（C9 アルキルキノロン）の保持時間，UV スペクトル及びマススペクトルを比較したところ，これらは互いによく一致した．このことから，m/z 286 [M+H]+ を示す未知化合物は C9 アルキルキノロンであることが判明した．
本結果は，アルキルキノロンが当初の作業仮説のように，2 種のⅢ型 PKS によって生成したことを示す．そこで，各々の酵素のアルキルキノロンの生成における役割を明らかとすることを目的に，まず，ErADS と ErAQS の酵素反応の一部を HPLC に供して解析を行った（図４）．その結果，ErADSの反応液中に，C9 アルキルジケタイド -CoA と C9 アルキル -β- ケト酸が生成していることが明らかとなった．
V @5F)H8E:G+F  7-;+F  P%=G:F  (X}"  "   $LQ_nam 

クルクミン生合成においては，フェルロイル -β- ケト酸がフェルロイルジケタイド CoA から非酵素ƷŮµúŐýŌ/£ǃ.0 ODS-80Tsǐ4.6φ x 150 mmǒToshoǑEŒ 0.1% TFA E¿: CH3CN-H2O ŬŇÖEŒ$Q的に加水分解して生じることが明らかになっている．そこで C9 アルキル -β- ケト酸を，酵素を含まな

vVLz^ĥǐ0-5 minǞ20% CH3CNǒ5-45 minǞ20-100% CH3CNǑ.*®»ŌEŇ¢!$ǔ®»Ō/¼Û0ǒLC-MS/£×ƻ>2ºıÃ,/Ĺƪ.>@Ǝ'$ǔV 7-;+F  "=G:F  (X}"  "   Rno'jl`OSmƷŮµúŐýŌ/£ǃ.0 Octyl-80Tsǐ4.6φ x 150 mmǒToshoǑEŒ CH3CN-25 mM KPB ŬŇÖEŒ$QvVLz^ĥǐ0-5 minǞ30% CH3CNǒ5-21 minǞ30-42% CH3CNǒ21-26 minǞ42-80% CH3CNǒ26-40 minǞ80% CH3CNǑ.*®
»ŌEŇ¢!$ǔ®»Ō/¼Û0ǒºıÃ,/Ĺƪ.>@Ǝ'$ǔV)F.F3/4+9  $[\`ƷŮµúŐýŌ/£ǃ0]NcIx CoA ,oyax CoA EÌƦ,$ ErADS , ErAQS º ŐőAĻŇû®»Ō/ƕĨ/Î»,¼}.*Ǝ'$－ 60 －い pH の異なる溶液に加え，37 ˚C で 16 時間放置した．その結果，pH の上昇に伴い，C9 アルキルジケタイド -CoA は C9 アルキル -β- ケト酸へと変換することが示された（図５）．このことから，ErADSの反応液中に確認された C9 アルキル -β- ケト酸は C9 アルキルジケタイド CoA の加水分解により生じた産物であり，ErADS の生成物はその CoA 体であることが示唆された．一方，ErAQS と煮沸により失活させた ErAQS のジケタイド CoA と β- ケト酸の消費量について比較したところ，CoA 体の消費量に変化はみられないのに対して，CoA 体の加水分解産物である C9 アルキル -β- ケト酸は，ErAQSの反応に伴い，95% が消費されて，C9 アルキルキノロンへと変換されていることが明らかとなった（図６）．また，予想生合成経路に基づき，C9 アルキルジケタイド -CoA を化学合成し，これと N- メ
チルアントラニロイル CoA を ErAQS に作用させ，C9 アルキルキノロンの生成における各々の酵素の役割について検討した結果，ErAQS は C9 アルキルキノロンを生成することが判明した（図７）．
ErAQS はジケタイド CoA の加水分解活性を欠損し，基質として β- ケト酸を用いることが強く示唆された．以上のことから，ErADS は脂肪酸 CoA とマロニル CoA を縮合し，ジケタイド CoA への変換を，ErAQS は N- メチルアントラニロイル CoA とジケタイド CoA の加水分解によって生じた β- ケト酸を縮合させることで，アルキルキノロンへと変換する新規Ⅲ型 PKS であることが判明した（図８）．
İïǖǓǙV   $X}$T\ƷŮµúŐýŌ/£ǃ0]NcIx CoA ,oyax CoA EÌƦ,$ ErADS , ErAQS º ŐőAĻŇû®»Ō/ƕĨ/Î»,¼}.*Ǝ'$V)F.F3/4+9  " @5F)H8E:G+F  (X}"  "   R$tQ_namƷŮµúŐýŌ/£ǃ0 N-r[xGz^vayIx CoAǒ]NcIx CoAǒ´2oyax CoA EÌƦ,$ ErADS ,ErAQS /µúŐýŌ/ƕĨ/Î»,¼}.*Ǝ'$－ 61 －V   $X}$T\ƷŮµúŐýŌ/£ǃ0]NcIx CoA ,oyax CoA EÌƦ,$ ErADS , ErAQS º ŐőAĻŇû®»Ō/ƕĨ/Î»,¼}.*Ǝ'$
そこで，各々の酵素の基質特異性と生成物特異性に関するメカニズムの解明を目指し，ErADS とErAQS の結晶構造解析を行った．その結果，2.10 Å の分解能で ErADS と CoASH の複合体 X 線結晶構造を，2.20 Å の分解能で，ErAQS のアポ型結晶構造の取得に成功した．いずれの酵素においても，他のⅢ型 PKS の全体構造を共有した．一方，ErADS の活性中心キャビティーと，MsCHS の活性中心キャビティーを比較した結果，ErADS は，332 番目のアミノ酸残基がより嵩高い Trp に置換されていることにより，MsCHS よりも小さな容積の活性中心キャビティーを有し，また形状も異なっていることが示された（図９）．そこで，ErADS の Trp332 を Asn に置換した変異酵素を作成し，デカノイル CoA とマロニル CoA を基質とし場合の酵素反応生成物について解析を行ったところ，C9 ア
ルキルジケタイド CoA の生成が劇的に減少し，代わりに野生型において副生成物として確認されていた C9 アルキルパイロンを主生成物とすることが確認された（図 10）．さらに，ErADS W332N 変V  )F.F3/4+9  " @5F)H8E:G+F  (X}"  "   R$tQ_nam
異体の結晶構造を取得し，その活性中心キャビティーについて検討したところ，W332N変異体でƷŮµúŐýŌ/£ǃ0CoAǒ]NcIx CoAǒ´2oyax CoA EÌƦ,$ ErADS ,は，332番目の Trp を N-r[xGz^vayIx
Asn に置換したことにより，キャビティーの容積が拡大していることが示され
ErAQS /µúŐýŌ/ƕĨ/Î»,¼}.*Ǝ'$V   "   #&'  )F.F.;GH$b\nSau~İïǖǓǙV M{z  !$   $  wvdh"   " $k`K^.A<6*J$i－ 62 －V M{z  !$   $  wvdh"   "V  7-;+F  "=G:F  (X}" $k`K^.A<6*J$i  "   Yqt$tQ_namƷŮµúŐýŌ/£ǃ0]NcIx CoA ,oyax CoA EÌƦ,$ ErADS , ErAQS º ŐőAĻŇû®»Ō/ƕĨ/Î»,¼}.*Ǝ'$İïǖǓǙV   "   Yqt$k`K^.A<6*J$i

た（図 11）．また，W332N 変異体の活性中心キャビティーの深い場所に位置する Met188 の側鎖が，W332N 変異体では 90°近く傾き，キャビティー底部の反対方向を向くことにより，本変異体の活性中心キャビティーの底部の容積を増大させていることが明らかとなった．C9 アルキルパイロンは，デカノイル CoA に 2 分子のマロニル CoA が縮合することによって生成した化合物である．W332N 酵素は，変異の導入により，活性中心キャビティーの容積が拡大したため，野生型よりもマロニル CoAの縮合回数を増大させて C9 アルキルパイロンを主生成物として生成するようになったと考察される．
このことから，Trp332 は ErADS の基質特異性と生成物特異性を決める重要なアミノ酸であることが判明した．
次に，ErAQS の活性中心キャビティーについて CmQNS と比較することにより解析を行った．その結果，ErAQS と CmQNS はほぼ同程度の大きさの活性中心キャビティーを有するのに対して，ErAQS では，CmQNS の 215 番目の Val が嵩高い Tyr にコードされているために，活性中心キャビティーと蛋白質表面を結ぶ CoA 結合トンネルが CmQNS よりも細くなっていることが確認された（図V M{z  !$   $  wvdh"   "  $k`K^.A<6*J$i

－ 63 －V   "   Yqt$k`K^.A<6*J$i

V M{z  !$   $  wvdh"   "  $k`K^.A<6*J$iİïǖǓǙV @5F)H8E:G+F    )F.F/8P%=G:F  (X}"  "  Yqt$Q_namƷŮµúŐýŌ/£ǃ0 N-r[xGz^vayIx CoAǒ]NcIx CoAǒ´2oyax CoA EÌƦ,$ ADS ,AQS /µúŐýŌ/ƕĨ/Î»,¼}.*Ǝ'$12）．そこで，ErAQS の Y215V 変異体を作成し，N- メチルアントラニロイル，C9 アルキル -β- ケト酸，及びマロニル CoA を基質とした場合の酵素反応生成物について解析を行ったところ，4- ハイドロキシ -1- メチル -2(1H)- キノロンを主生成物として生成することが確認された（図 13）．本結果は，
Y215V 変異の導入により，CoA 結合トンネルが広くなったため，4- ハイドロキシ -1- メチル -2(1H)キノロンを主生成物として生成したと考察できる．このことから，Y215 は ErAQS の基質特異性と生成物特異性を決めるアミノ酸であることが判明した．
一方，緑膿菌の PqsB，PqsC の複合体構造を取得するため，両酵素を個々に大腸菌に異種発現させた．しかし，いずれも封入体を形成し可溶性酵素として得ることはできなかった．また，同一菌内での共発現や様々な融合蛋白質としての発現を試みたが，これらの場合でも可溶性酵素として得ることはできなかった．現在，これらに関しては，分子シャペロンとの共発現や酵母での発現を試みてい－ 64 －るところである．

■結論
PCR 法により，ゴシュユから 2 種類の新規Ⅲ型 PKS，ErADS と ErAQS をクローニングすることに成功した．ErADS は伸長基質であるマロニル CoA を受け入れ，アシル -β- ケト酸を生成するアシルジケチド CoA 合成酵素であった．一方，ErAQS は，ErADS が生成するジケタイド CoA の非酵素的の加水分解生成物である β- ケト酸を伸長基質として受け入れ，アルキルキノロンを生成するアシルキノロン合成酵素であった．アルキルキノロンがⅢ型 PKS により生成することを示したのは本研
究が最初である．しかし，ゴシュユは C15 までの炭素鎖長に加え，不飽和脂肪酸を含む様々なタイプのアルキルキノロンを生産する．ErADS は C6 から C10 までの飽和脂肪酸 CoA への変換を触媒することが既に確認されているが，ErADS と ErAQS の共反応からだけではだけでは生合成が説明できないアルキルキノロンが天然のゴシュユより生産されていることになる．ErADS や ErAQS 以外の類似酵素がゴシュユに含まれていることが十分に予想され，ゴシュユが生産するアルキルキノロンの生合成の解明を解明するためには，これらの酵素についても解析を進めることが必要である．
一方，Ⅲ型ポリケタイド合成酵素の最大の特徴として，酵素としては異例とも言える曖昧な基質特異性が挙げられる．これまで，Ⅲ型 PKS に基質アナログを作用させることで，非天然型新規ポリケタイドやアルカロイドが創出されている．今後，芳香族ジケタイド CoA を産生可能な DCS と ErAQSを組み合わせ，これに基質アナログを作用させていくことによって，非天然アルカロイドの創出にも取り組んでいきたい．

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