核内受容体を介したビタミン D による脂質代謝遺伝子発現調節機構の解明
京都府立大学生命環境科学研究科分子栄養学研究室：亀井康富

要旨
本研究では、GPAT1 遺伝子に関する解析をモデルとして、胎仔期（妊娠期）～新生仔期（授乳期）～成獣期の仔マウスの肝臓における GPAT1 遺伝子の発現制御の分子機構を検討した。その結果、GPAT1 遺伝子は DNA メチル化を介して転写因子 SREBP1cによる発現制御を受け、かつ母マウスの栄養条件によって DNA メチル化が変動することが示された。さらに、胎仔期～新生仔期においてビタミン D などの影響により確立された肝臓の DNA メチル化状態が成獣期まで維持されるのか否か、これが栄養環境により変化するのか否かを検討するため、妊娠期〜授乳期の母マウスにビタミン Dを投与したところ、母マウスの体重減少および産仔の食殺が生じた。そこで新生仔肝臓の初代培養を用いてビタミン D 投与により発現変動および DNA メチル化変動する遺伝子を網羅的に解析した。複数の遺伝子の DNA メチル化変動が認められ、ビタミン D による新たな遺伝子発現制御機構の存在が示唆された。しかし、DNA メチル化変化と遺伝子発現変化に明らかな相関は認められず、これまで考えられて来た様式に加え、何らかの付加的な制御機構が存在することが示唆された。
緒言
幼年期のビタミン D の不足は骨機能に長期的な悪影響を与える可能性が指摘されているが、それ以外の疾患についての情報は少ない。乳製品はビタミン D 強化に最適な食品である。そのため、ビタミン D 強化牛乳を妊娠・授乳期の母親が摂取する、あるいはビタミン D を強化した粉ミルクを乳幼児期に摂取することの、子供の長期的な疾患予防に対する効果を検証することは意義あるものである。
我々はマウスビタミン D 受容体の遺伝子クローニングを世界に先駆けて行なった１）。
また、活性型ビタミン D3 によりビタミン D 受容体の発現量の増加とともに前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化過程が顕著に抑制することを見出した２）。さらに、ビタミ
ン D 受容体をはじめとした核内受容体の作用機序に、核内受容体とタンパク質—タンパク質相互作用をする転写共役因子が重要であることを明らかにした３）。そして、この転写共役因子は脂質代謝（脂肪酸分解）に重要であり、活性化により高脂肪食摂取によるマウスの肥満が予防できることを明らかにした４）。一方、ビタミン D 受容体をはじめとした核内受容体とタンパク質—タンパク質相互作用することが知られるチミン DNA グリコシラーゼは DNA 脱メチル化に必須であることが最近判明し、核内受容体を介した DNA メチル化制御の可能性が示唆されるが詳細は不明である。

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ビタミン D は核内受容体を介して生理作用を発揮するが、近年核内受容体と DNA メチル化の関係が報告されている。DNA メチル化は長期的な遺伝子発現のメモリーに寄与するため、本研究では、ビタミン D の長期的な影響に関して、DNA メチル化に着目した検討を試みるものである。また、合わせて他の栄養素で活性化される核内受容体についても検討する。特に、これまでの検討で肝臓の脂質代謝遺伝子は乳児期にDNA メチル化制御を受ける可能性が示唆されるため、脂質代謝関連疾患と幼年期のビタミン D 摂取に着目する。
従来、エピジェネティクスの概念は、個体発生におけるインプリンティング遺伝子の片親性発現パターンの成立や発がんにおけるがん抑制遺伝子の不活性化において注目されてきたが、肥満や生活習慣病のような成人期に発症する慢性疾患における病態生理的意義は不明である。我々は既に、離乳前後に GPAT1 遺伝子のプロモーター領域の DNA メチル化のダイナミックな変動を確認しており、脂肪蓄積におけるエピジェネティクス制御の具体的な分子機序として DNA メチル化を想定するものである。
すなわち、胎仔期あるいは個体の成長が著しい新生仔期は全身臓器の可塑性が高い時期であり、胎生期や離乳前後の急激な栄養環境の変化が特定の遺伝子の DNA メチル化を制御し、成獣期に発症する肥満や脂肪肝に対する疾患感受性を決定する可能性を示唆するものである。
本研究が成功した場合、肝臓における de novo 脂肪合成をモデルとして、新生児期の栄養環境の変化によりどのようなメカニズムで成人期の疾患感受性が付与されるのかが明らかになる。本研究は、詳細が不明なエピジェネティクス制御の分子機構を新生児期において明らかにするものであり、特に、母体の栄養状態に左右される胎生期と比較して新生児期は人工乳のビタミン D 添加による栄養学的介入が容易であり、新しい栄養環境づくりや食品由来成分による、肝臓の de novo 脂肪合成のエピジェネティクス制御により、DNA メチル化を標的とする「疾患になりにくい体質づくり」が可能となる。以上より、根本的な肥満や生活習慣病の新しい予防戦略の手掛かりになる。さらに、本研究により、食品成分と胎生期・新生児期のエピジェネティクスの関係が明らかになると、女性（妊娠の可能性のある女性～妊娠女性）の栄養補給を目的とした健康食品の開発が可能となり、次世代を担う人達の健康を左右することから社会に大きなインパクトを与えると考えられる。

15当初の実験計画：
１）肝脂肪合成律速酵素・GPAT1 遺伝子プロモーターに関する解析
本研究では、先行している GPAT1 遺伝子に関する解析をモデルとして、胎仔期（妊娠期）～新生仔期（授乳期）～成獣期の仔マウスの肝臓における GPAT1 遺伝子の発現制御の分子機構を検討する。マウスにビタミン D を与え、GPAT1 を制御する転写因子 SREBP1c や、ビタミン D 受容体などが相互作用して DNA メチル化制御する可能性を検討する。
２）肝臓における DNA メチル化パターンの網羅的解析
本研究では、DNA メチル化の網羅的解析法である MIAMI 法（Microarray-based
Integrated Analysis of Methylation by Isoschizomers）（Oncogene 25: 3059-3064, 2006）５）により、妊娠・授乳期の母獣へのビタミン D 投与により、経母乳的にビタミン D を摂取した胎仔期～新生仔期マウスの肝臓における DNA メチル化状態の変化を網羅的に解析する。cDNA 発現マイクロアレイ法により、発現が変化する遺伝子との比較を行なう。
３）マウスモデルを用いた病態生理的意義の検討
胎仔期～新生仔期においてビタミン D などの影響により確立された肝臓の DNA メチ
ル化状態が成獣期まで維持されるのか否か、これが栄養環境により変化するのか否かを検討する。更に、離乳後の仔マウスの生活習慣病に関連する表現型（体重、脂肪蓄積、糖脂質代謝、エネルギー消費、肝臓代謝関連の組織像など）を解析する。また骨密度などのパラメーターに関しても同時に検討する。

16実験方法
実験１（GPAT1 に関する解析）
１）肝脂肪合成律速酵素・GPAT1 遺伝子プロモーターに関する解析では、DNA メチル化が変動する de novo 脂肪合成酵素遺伝子の代表例として GPAT1 遺伝子のプロモーター領域を解析する。胎仔期～新生仔期～成獣期のマウス初代培養肝細胞において、DNA メチル化酵素を過剰発現あるいはノックダウンして、GPAT1 遺伝子プロモータ
ーにおける DNA メチル化の変化を詳細に検討する。同時に GPAT1 の遺伝子発現と肝細胞の脂肪合成能を検討し、肝細胞における GPAT1 遺伝子プロモーターにおけるDNA メチル化の変動の機能的意義を検討する。２）マウスモデルを用いた病態生理的意義の検討では、DNA メチル化酵素の遺伝子操作マウスを用いて、de novo 脂肪合成酵素の遺伝子発現とプロモーター領域の DNA メチル化の変化を解析し、成獣期に肥満や脂肪肝を誘導し、新生仔期の DNA メチル化状態との関連を検討する。胎仔期（妊娠期）～新生仔期（授乳期）に新生仔マウスあるいは母マウスの栄養環境を変化させ、離乳後の仔マウスの生活習慣病に関連する表現型（体重、脂肪蓄積、糖脂質代謝、エネルギー消費、肝臓代謝関連の組織像など）を解析し、DNA メチル化による肝臓での脂肪蓄積における機能的意義の解析を行なう。
結果
肝臓は、出生前後から離乳までの新生児期の栄養環境の変化に応じて代謝機能がダイナミックに変化する。例えば、マウス肝臓における de novo（新規）脂肪合成は出生直後には強く抑制されているが離乳後に急増する。これは脂質が豊富な母乳から炭水化物が主体の経口摂取に変化するために離乳後には糖質から脂質の合成（新規脂肪合成）が必要であることに関連する。研究代表者らは、離乳後のマウス肝臓において新規脂肪合成の律速酵素であり、核内受容体リガンドの代謝にも重要であることが示唆される glycerol-3-phosphate acyltransferase 1（GPAT1）の遺伝子発現の増加とプロモーター領域の DNA メチル化の著しい減少を見出しており、DNA メチル化の程度は遺伝子発現と逆相関していた。この発現制御には転写因子 SREBP1 の関与が示唆された。
また DNA メチル化の変化は GPAT 遺伝子プロモーターに特異的であり、他の脂肪合成遺伝子には認められなかった。レポーターアッセイの検討により、DNA メチル化により GPAT 遺伝子プロモーター転写活性が抑制され、またクロマチン免疫沈降法により、この DNA メチル化の減少にはプロモーター領域における新規 DNA メチル化酵素 Dnmt3b の結合の減弱が関連することを明らかにした。さらに、妊娠期～授乳期の母マウスを過栄養にすることにより新生仔マウスの肝臓ではプロモーター領域のDNA メチル化の減少とともに GPAT1 遺伝子発現の増加が認められ、肝脂肪蓄積が増加することを明らかにした（図１〜１０参照）。以上の研究成果は、胎仔期あるいは個体の成長が著しい新生仔期は全身臓器の可塑性が高い時期であり、胎生期や離乳前後の急激な栄養環境の変化が DNA メチル化を制御し、成獣期に発症する肥満や脂肪肝に対する疾患感受性を決定する可能性を示唆するものである。

17実験２【方法（当初の予定）】
妊娠した母マウスを 2 群に分け、一方をリガンド投与群(Vitamin D 群)、もう一方をコントロール群(Veh 群)とする。Vitamin D 群には妊娠期 14～18 日、授乳期 2～21 日の間、母マウスに Vitamin D リガンドを 40mg/kg/day および 80mg/kg/day 腹腔内投与する。Veh 群にはリガンドの溶媒である DMSO を腹腔内投与する。そして授乳期 16 日目の仔マウス(d16)を解剖し、肝臓脂質代謝遺伝子の DNA メチル化、遺伝子発現、また組織重量を測定した。離乳後、1 週間普通食で育てリガンドの効果を wash out する。
そして wash out 後の仔マウス(d28)を解剖し、同様に測定する（図１１）。
さらに wash out 後、2 群に分けた親の仔マウスをそれぞれさらに 2 群に分ける。一方 を 高 脂 肪 食 負 荷 群 (High fat) 、 も う 一 方 を 普 通 食 負 荷 群 (Chow) と し て 分 け 、Veh-Chow(VC)、Veh-High fat(VH)、Vitamin D-Chow(DC)、Vitamin D-High fat(DH)の 4群を作った後、10 週間食餌負荷する。そして負荷後の仔マウス(10w)を解剖し、先ほどの項目に加えて肝臓トリグリセリド含有量(LivTG)も測定する。
遺伝子発現は、肝臓から抽出した Total RNA を cDNA に逆転写し、それを RealTime-PCR にかけることで測定した。DNA メチル化は、Bisulfite 反応を施した gDNAから標的遺伝子を PCR による増幅後シークエンス解析し、フリーソフトの QUMA を使用して図として描出することで測定する。重量測定した組織は全身(BW)、肝臓(Liv)と白色脂肪組織(Epi)である。
結果：ビタミン D を投与した。妊娠した母マウスを 2 群に分け、一方をリガンド投与群(Vitamin D 群)(N=4)、もう一方をコントロール群(Veh 群)(N=6)とした。Vitamin D 群には妊娠期 14～18 日、授乳期 2～21 日の間、母マウスに Vitamin D リガンドを40mg/kg/day(N=4)および 80mg/kg/day(N=4)腹腔内投与した。母マウスの体重測定結果を示す。40mg/kg/day の群で投与開始３日目に母マウスが１匹死亡した。40mg/kg/dayおよび 80mg/kg/day 腹腔内投与の両群で、vehicle 投与群に比べ徐々に母マウスの体重減少が認められた（図１２、表１）。ビタミン D 40mg/kg/day および 80mg/kg/day の両群ともに出産がなされたことを確認した。出産２日後、授乳中の母マウスに再びビタミン D の投与を行なったところ、３日令において産仔の死亡が認められた。ここで、予想外に産仔が死亡したため、授乳期のみの影響を調べるために vehicle 群(N=6)のうち２匹について、ビタミン D 40mg/kg/day 投与に切り替えた。その結果、ビタミン D投与により母マウスの体重減少が認められた（図１３、表２）。また、２匹の母マウスともに仔マウスを食殺したため、実験を中止した。

18実験３
新生仔初代培養に対するビタミン D 投与、網羅的な DNA メチル化解析、発現パターン変化
網羅的 DNA メチル化法の確立
本研究では、網羅的な DNA メチル化解析法である MIAMI 法（Microarray-based
Integrated Analysis of Methylation by Isoschizomers）（Oncogene 25:3059-3064, 2006）を用いた。ゲノム DNA をメチル化感受性酵素 HpaII および非感受性酵素 MspI で処理、アダプター添加後、PCR 増幅し、プロモーターゲノム DNA アレイとハイブリさせて、DNA メチル化の有無によるシグナルの変化を比較した（図１４）。
マイクロアレイによる発現パターンの変化
1,25(OH02 ビタミン D3 添加または vehicle を添加したマウス新生仔肝臓初代培養より RNA を調製した。逆転写反応および Cy3-CTP の取り込み後、マウス cDNA アレイとハイブリし、遺伝子発現変化を計測した。得られた結果はバイオインフォマティクスの手法を用いて解析した。すなわち、新生仔肝臓初代培養における遺伝子発現プロフィールを検討し、プロモーター領域の DNA メチル化の変動と遺伝子発現の変化が逆相関する「DNA メチル化標的遺伝子」の同定を試みた。

方法、Methylation profiling by the MIAMI method ５）
The MIAMI method was performed using 1 µg of genomic DNA. The complete
experimental procedure is available at
http://grc.dept.med.gunma-u.ac.jp/~gene/image/MIAMI20Protocol20V4.pdf. In brief, toexamine the changes in DNA methylation, we analyzed the sample differences between
methylation-sensitive HpaII cleavage and methylation-insensitive MspI cleavage. Adaptors
were ligated and PCR-amplified, and the products were hybridized with microarrays
containing 41,332 probes. Transcriptional start sites for the genes were characterized on thebasis of the Ensembl database annotation (MGSCv37, dated Sept. 17, 2011) using theBioMart program. The MIAMI probes were mapped on MGSCv37 using Bowtie 0.12.5 toyield their chromosomal positions, and the distances to the MIAMI probes from thetranscription start sites of the nearest genes were calculated.
発現アレイは Takahashi らの論文６）で述べられている方法に従って行なった。

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結果
MIAMI 法による DNA メチル化変化の解析
コントロールと比較し、ビタミン D3 処理により 50 個の遺伝子で DNA メチル化の減少(0.8 倍以下)が観察された。さらに 31 個の遺伝子で 1.5 倍以上 DNA メチル化が増加した。この結果から、ビタミン D 処理により、ある特定の遺伝子群が DNA メチル化制御を受けることが示唆された。また、バイオインフォマティクス解析により、これらには MAPK signaling pathway, Sphingolipid metabolism（メチル化減少）、Arginine
and proline metabolism（メチル化増加）に関わる遺伝子が多く含まれることが判明した。（図１５、表３、４）
ビタミン D により発現増加した遺伝子のマイクロアレイ解析
ビタミン D 添加により多数の遺伝子の発現増加が認められた。(2.5 倍以上、116 遺伝子)。また、ビタミン D 受容体 mRNA の発現が 15 倍増加しており、これは我々の以前の結果と一致しており、マイクロアレイデータの信頼性を確認した。バイオインフォマティクス解析（GO 解析）を行なったところ、表に示すように免疫系に関する遺伝子の発現増加が認められた。ビタミン D により免疫系が活性化されている可能性がある。（図１６〜１８、表５、６）ビタミン D 添加による遺伝子発現変化（リアルタイム PCR 解析）
マイクロアレイで見られたビタミン D 添加による遺伝子発現変動をリアルタイム
PCR 法により確認した。マイクロアレイの結果と一致して、ビタミン D 添加によりビタミン D 受容体の遺伝子発現の顕著な増加が認められた。脂肪酸酸化酵素に関連する遺伝子 Acox, Cpt1 に関しては、やや減少する結果になった。また、DNA 脱メチル化に関与するといわれる遺伝子類の発現を検討した。その結果、Tet や DNA グルコシラーゼ Tdg, Mbd4）は発現減少する傾向が見られた。（図１９）
新生仔肝臓におけるビタミン D による DNA メチル化標的遺伝子の同定と機能解析
本研究では、ビタミン D 処理によりに DNA メチル化が著しく減少した遺伝子に焦点を当てて、DNA メチル化標的遺伝子の絞り込みを試みた。すなわち、cDNA 発現マ
イクロアレイ法により、新生仔肝臓におけるビタミン D による遺伝子発現プロフィー
ルを検討し、プロモーター領域の DNA メチル化の変動と遺伝子発現の変化が逆相関する「DNA メチル化標的遺伝子」の同定を試みた。しかしながら、DNA メチル化変化と、遺伝子発現変化には明らかな相関（正あるいは負）は観られなかった。これまで考えられてきた「DNA メチル化＝遺伝子発現減少」という単純な図式に加え、何らかの付加的な制御機構が存在することが示唆された。

20文献１）Y. Kamei, T. Kawada, T. Fukuwatari, T. Ono, S. Kato, and E. Sugimoto, Cloning
and sequencing of the mouse vitamin D receptor Gene 152: 281-282, 1995.
２）Y. Kamei, T. Kawada, R. Kazuki, T. Ono, S. Kato, and E. Sugimoto. Vitamin D
receptor gene expression is up-regulated by 1, 25-dihydroxyvitamin D3 in 3T3-L1
preadipocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications
193:948-955,1993.
３）Y. Kamei, L. Xu, T. Heinzel, J. Torchia, R. Kurokawa, B. Gloss, S.C. Lin, R.A.
Heyman, D.W. Rose, C.K. Glass, and M.G. Rosenfeld. A CBP Integrator complex
mediates transcriptional activation and AP-1 inhibition by nuclear receptors. Cell 85:403-414, 1996.
４）Y. Kamei, H. Ohizumi, Y. Fujitani, T. Nemoto, T. Tanaka, N. Takahashi, T. Kawada,
M. Miyoshi, O. Ezaki, and A. Kakizuka, PPARgamma coactivator 1beta/ERR ligand 1
is an ERR protein ligand, whose expression induces a high-energy expenditure andantagonizes obesity. Proceedings of National Academy of Sciences USA
100:12378-12383, 2003.
５）I. Hatada, M. Fukasawa, M. Kimura, S. Morita, K. Yamada, T. Yoshikawa, S.
Yamanaka, C. Endo, A. Sakurada, M. Sato, T.Kondo, A. Horii, T.Ushijima, and H. Sasaki,
Genome-wide profiling of promoter methylation in human. Oncogene 25: 3059-3064,
2006６）M. Takahashi, Y. Kamei, T Ehara, X Yuan, T Suganami, T Takai-Igarashi, I Hatada,Y. Ogawa. Analysis of DNA methylation change induced by Dnmt3b in mouse
hepatocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications 434, 873-8,
2013.

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