Customer review: TruSeq ™ Genotype Ne Kit

魚類ゲノム研究におけるターゲットリシーケンス法の有用性の検証
はじめに

１ ハイブリダイゼーション
カスタムオリゴパネルのターゲット領域への結合次世代シーケンサー（NGS）の普及とそのコスト低下により、従来マイクロアレイの設計が必要であった用途でも NGS を用いたジェノタイピング、GBS（Genotyping by Sequencing）法が使われるようになった。

1 日目

TruSeq Genotype Ne（エニー）Kit は、動植物のあらゆる生物種を対象としてターゲットリシーケンスを行うことができる、カスタム仕様の GBS キッPre-PCRトである。国立研究開発法人水産研究・教育機構 須田 亜弥子先生、藤原篤志先生のご協力のもと、重要な食用魚のゲノム解析における本キットの有用性について検証を行った。

2 非結合オリゴの除去
DNA の洗浄

3 伸長とライゲーション
DNA ポリメラーゼとリガーゼで結合オリゴ同士を結合

4 増幅

TruSeq Genotype Ne Kit の特長インキュベーション

TruSeq Genotype Ne Kit は、イルミナ Concierge によるカスタムパネル

PCR で増幅とインデックス付加（Overnight）設計、ライブラリー調製試薬、シーケンス試薬までがキットに含まれ、絞られた多型セットの低コスト解析に対応する。TruSeq Genotype Ne Kit のワー
クフローを図 1 に示す。本キットでは、5,000 マーカーまでのターゲット領域に対応したカスタムオリゴパネルを設計することができ、以下のような特長を持つ。

5 ライブラリークリーンアップ
PCR 産物の精製
2 日目
Post-PCR• 一塩基多型（SNP）、挿入欠失（indels）などの複数種のマーカーを1 つのパネルに含めることができる

6 ノーマライゼーション
ライブラリーのノーマライゼーション

7 ライブラリーのプール
同一ランで解析するライブラリーの1 チューブでの混合• 完全なリファレンスゲノムがない生物種でもパネルを設計できるライブラリー調製は、アンプリコン生成法を採用している。カスタム設計後製造されたオリゴプールをサンプルであるゲノム DNA にハイブリダイゼーションさせ、そこから DNA を伸長、ライゲーションによってターゲット領域を含む一本鎖 DNA を合成する。それを鋳型として PCR 増幅し、同時にインデックス付加を行ってライブラリーを作成する。本キットには 384 種類のインデックスが含まれるため、最大 384 サンプルのマルチプレックス解析が可能である。

図 2：ライブラリー調製のフロー 二日以内に完了。

作成されたライブラリーを、キットに含まれるシーケンス試薬を用いて、NextSeq™ システム、MiSeq™ システムもしくは MiniSeq™ システムで解析し、ターゲットシーケンスを実施する。

TruSeq Genotype Ne Kit

デ ー タ 解 析 には、BaseSpace™ Sequence Hub の TruSeq Amplicon
App を利用することができる。

パネル設計

ライブラリー調製

シーケンス

データ解析

イルミナ Concierge
サービス

TruSeq Genotye Ne キット

NextSeq、MiSeq、MiniSeq システム

BaseSpace
Sequnce Hub

図 1：TruSeq Genotype Ne Kit のワークフロー カスタムオリゴパネルはイルミナ Concierge サービスにより設計。設計、ライブラリー調製試薬、シーケンス試薬（NextSeq、MiSeq、MiniSeq 対応）までがキットに含まれる。

Customer review: TruSeq ™ Genotype Ne Kit

結果本カスタムパネルでは、ゲノム上の 104 SNP に対して 100 アンプリコンを生成するプローブを設計した。このパネルを用いて、48 個体のゲノム DNA をそれぞれテクニカルレプリケート（n=2）で合計96 サンプル、ライブラリー化した。これらの個体は、全ゲノムリシーケンスによるジェノタイプ結果が既に得られているものを用いた。
シーケンスでは 96 ライブラリーをプー ルし、キットに含まれるNextSeq 500/550 Mid Output Kit を用いて NextSeq 500 システ
ム 1 ランで解析した。

NextSeq FASTQ

48サンプル
平均93万リードデ ータ解 析 のフローを図 3 に示 す。トリミング（Trimmomaticv0.36）、 マ ッ ピ ン グ（BWA v0.7.17）、SNP コ ー ル（GATKv4.0.12.0）、フィルタリング（VCFtools v0.1.13、サンプル共有率70%、最小カバレッジ x20）の処理を経て、104 SNP 中 96 SNPが検出された。表 1 に結果の概要を示す。

48サンプル
平均120万リードS

リシーケンスデータとの SNP コール再現性が高く、精確性（SNPコールの一致率）は 98% 以上を示しているため、以降の解析に十分なデータを取得することができた。
図 3：データ解析のフロー

表 1：96 サンプル（48 個体、テクニカルレプリケート（n=2））の結果

レプリケート 1
レプリケート 248 サンプルの平均リード数

104 SNP 中の欠測率（%）

93 万
120 万

1.40.7

リシーケンスデータとのレプリケート間のSNP コールの一致率（%）

SNP コールの一致率（%）

98.5
98.198.90

お客様の声
近年では次世代シーケンサーの進出により、様々なゲノム解析手法が利用されています。水産魚類の集団構造の解明や養殖魚のゲノミックセレクションを目的とした研究の場合は、ゲノムワイドな大量 SNP が必要となり、この場合は、全ゲノムリシーケン
スや GRAS-Di 法 1 などが有効です。
一方、系群判別や親子判別を目的とした場合は、数百の既知領域を正確にかつ安定的に取得できる手法が必要となり、この場合は、Genotype Ne や Custom Ampliseq が適していると言えます。今回、試験的に Genotype Ne を利用した印象として、ライブラリ作成はシンプルかつ容易であり、シーケンスデータも以降の解析に十分な高精度データが取得できました。
今後も目的に合わせた手法を取り入れていきたいと思います。

1. 関連情報次世代シーケンサーを利用した新規 genotyping 技術 GRAS-Di の開発【イルミナ iSchool プロフェッショナル】 https://jp.illumina.com/events/webinar/2017/pro_webinar_170622_j.html

謝辞
製品性能検証にあたり国立研究開発法人水産研究・教育機構

須田 亜弥子先生、藤原 篤志先生に多大なるご協力を賜りました。ここにあらためて感謝の意を表します。

イルミナ株式会社

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Pub. No. 5025-191001-01