研究課題
ゼブラフィッシュ胚を用いた化学物質の発達神経毒性評価法と高感度バイオマーカーの開発

研究代表者

久保田彰

（帯広畜産大学 獣医 学研究部門）

共同研究者

ChenXing（帯広畜産大学 大学院畜産学研究科 ）川合佑典（帯広畜産大学獣医学研究部門 ）野見山桂（愛媛大学沿岸環境科学研究センター）

田上瑠美（愛媛大学沿岸環境科学研究センター）

研 究背 景と 目的
中枢神経系に対する毒性は、致死を含む重大影響に直結しうる。とりわ
け、化学物質に対する感受性の高い胚発生期における曝露は次世代（胚・胎児）の神経発生に影響を及ぼすことがあるため、発達神経毒性は化学物質安全性評価において重要視されている。また、最近では、増加する子どもの発達障害と化学物質曝露の関係性を示唆する疫学知見も増えてきている。
一方 、 動 物を 用 い た 毒性 試 験 に関 す る 世 界的 な 3R（ 代 替 ・ 削減 ・ 改 善）の潮流や試験実施にかかる経費および時間といった観点から 、化学物質の有害性評価において動物実験代替法の利用を促進する活動が拡大している。
2019 年 に は、米国環境保護庁が、哺乳類を用いた動物実験の要請と研究費助 成 を 2025 年までに 3 割削減し、2035 年までに全廃する方針を発表した。
したがって、代替法の開発が難しい発達神経毒性試験においても、昨今の動物福祉の関心の高まりに対応した新たな評価法を開発すべき時にきている。
こうした中で申請者は、動物福祉に配慮し多数の化学物質をハイスループットに評価できるゼブラフィッシュに注目した。ゼブラフィッシュは、ヒトとゲノム相同性が高いばかりでなく、脳や神経回路の保存性も高いことから神経生物学分野でも重用されている。さらに、曝露胚を用いた各種オミクス解析（トランスクリプトーム・メタボロームなど）により、化学物質の毒性発現機序の解析や高感度なバイオマーカーの開発を行うことも可能である。
本研究の目的は、動物福祉に配慮した新たな発達神経毒性の統合的評価手法をゼブラフィッシュ胚で開発するとともに、神経毒性物質の曝露に応答する高感度なバイオマーカーを開発することである。今年度は、新たに複数のネオニコチノイド系殺虫剤と主要な代謝物に加えて 、フェニルピラゾール系殺虫剤 を対象として研究を実施した。

研 究方 法
今 年 度はまず、帯広畜産大学・久保田の研究室で、ジノテフラン（DIN）、クロチアニジン（CLO）、ならびに昨年度の結果を踏まえアセタミプリドおよびイミダクロプリドの主要な代謝物であるデスメチルアセタミプリド（DMAP）およびオレフィン体 イミダクロプリド（IMI-olefin）ついて、ゼブラフィッシュ胚（RIKEN WT 系統）を用いた曝露試験を実施し、行動解析に
供 試 し た 。得られ た 結果を踏まえ、 DMAP 曝露胚については 神経 活性 マー
カ ー 遺 伝 子 c-fos の 発現量解析 も 実施した。また、代表的なフェニルピラゾール系殺虫剤であるフィプロニル（ FIP）について、c-fos 発現量解析を実施し た 。このため、 発達期間を通した曝露に相当する 受精後 4 時間からの継続 曝 露（ 半止水式; 24 時間ごとに全量換水）行い、受精後 5 日齢の稚魚を用い て行 動解析 を実施した。さらに 、同様の曝露試験を実施し回収した 稚魚を用 い て 、c-fos の発現量を リアルタイム PCR 法により 測定した。
次いで、久保田の研究室で 新たに 調製した DMAP、FIP の各曝露胚 の瞬間
凍 結 試 料を用いて、愛媛大学沿岸環境科学研究センター・野見山准教授および田上准教授の研究室で、神経伝達物質に及ぼす影響を評価した。このため、一級アミンに特異的に反応する誘導体化試薬「 Py-Tag」を用いて、チロシン代謝系の 5 物質 （Dopamine、Norepinephrine、Tyramine、Octopamine、3-Methoxytyramine ） お よ び ト リ プ ト フ ァ ン 代 謝 系 の 3 物 質 （ Serotonin 、Tryptamine、5-Methoxytryptamine） の計 8 種を対象とした分析を行った。

研究成果
DIN、CLO、DMAP、IMI-olefin（それぞれ 1.0×10 -6 、1.0×10 -5 、1.0×10 -4M）を対象に発達期間を通した 曝露試験を行い、行動解析を実施した。その結果、稚魚の活動性を評価する連続明期試験およびストレス環境での行動への影響を評価する明暗切り替え試験 において、DIN、CLO、IMI-olefin の曝露胚では 有意な 変化は認められなかった。一方、DMAP の 1.0×10 -6 M 曝
露 群において、明暗切り替え 試験の明期 10 分間における総移動距離は有意に減少し、暗期 10 分間の総移動距離 も減少傾向を示した（ Fig. 1）。行動への影響が示唆された DMAP 曝露 胚で c-fos の発現量 を解析したところ、10 -6M で は有意な 変化はみられ なかったものの、濃度依存的に 発現量が減少 する 傾向が認められた 。また、DMAP 曝露胚（1.0×10 -4 、3.0×10 -4 、1.0×10 -3M）において、測定した すべての 神経伝達物質・前駆体・代謝物の濃度は低下傾向を示し、そのうち Tyramine と 5- Methoxytryptamine は有意な低下を示 し た。
次 い で 、FIP の神経系に対する影響を評価した。現時点までに 得られたデータについて報告する。上記ならびに昨年度までのネオニコチノイド系殺虫 剤の 結果より、曝露胚中の c-fos 発現量および神経伝達物質濃度が発達神経毒性のバイオマーカーとして有用と考えられたことから、FIP についてはそ れ らパラメーター の測定から実施した。 受精後 5 日における曝露胚中のc-fos 発 現量を測定したところ（Fig. 2）、 55 分間の曝露では濃度依存的な 発現 量の 増加が認 められ た。一方、受精後 4 時間からの 長時間 曝露では、試験した最低濃度である 0.3 µM で有意な発現増加がみられたものの、高濃度では発現量はむしろ低下する傾向がみられた。また 、FIP の短時間曝露胚では低 濃 度 側（0.3、1、3 µM） で Dopamine、 Serotonin、3-Methoxytyramine、5Methoxytryptamine、 Tyramine の有意な 上昇あるいは 上昇 傾 向が み られた。
これに対 し、FIP の 長時間 曝 露胚では 同 等の濃度 レベル（ 3 µM）においてDopamine、Serotonin、5-Methoxytryptamine の有意な低下または低下傾向が
み ら れ た。また、長時間 曝露胚において Tyramine、Octopamine、Tryptamine、Norepinephrine の濃度は有意に上昇した。

2000

DMSO
DMSO

ACE_high_time
ACE_high_time-4-4 M
IM-2-1
ACE
1010
M

1500
1500

-5IM-2-1 10M
DMSO
DMSO
ACE
10-5 M
DMSO(mm/10min)

Total distance(mm)traveled
Distance Traveled

2000
2000-6IM-2-1 10-4 M

ACE_high_time

1000
1000-6 M-6 M
ACE 10-4
DMAP:
ACE
101.0×10
M-5-5 M
ACE 10-5M
DMAP:
ACE 101.0×10
M
DMSO

500
500

1500-6

ACE 10-4-6 M
-4 M
DMAP:
1.0×10
ACE10
10
ACE
MM
ACE 10-5 M

00
00 15

1000

2535455055 50 65
75Time (min)Time (min)8595105100

ACE 10-6 M

100Time (min)Fig. 2. DMAP の曝露によるゼブラフィッシュ稚魚の行動量の経時変化 （平5005050100
100

均±SEM、n=3）。連続明期試験、明暗切り替え試験の順で実施した。図中のTime (min)Time (min)
白色部分のプロットは明期、灰色部分のプロットは暗期における10 分間
50100Time (min)の総移動距離を示す。各曝露群につき、正常な浮袋の膨張が確認できた受精 後 5 日齢の稚魚 12 匹を 48 穴プレートの各ウェルに 1 匹ずつ投入し、行動 解 析 装置 Zantiks-MWP を用いてデータを取得した。これを 3 プレート用意してデータを取得し、 平均±SEM で図示 した。

Short term exposure
(A)

15***
***

105***

02.0***

1.5
1.00.50.0DFi MS
p_ O0.
3
Fi μM
p_1
Fi μM
p_Fi 3μ
p_ M
1
Fi 0μ
p_ M
30μM

20

Long term exposure(B)
c-fos mRNA expression(normalized to eef1a1l1)

0DFi MSp_ O
0.
3Fi μM
p_1Fi μM
p_Fi 3μp_ M
1Fi 0μp_ M
30μM

0c-fos mRNA expression(normalized to eef1a1l1)

Distance Traveled(mm/10min)00

ACE_high_time IM-2-1_high_time

Fig. 1. FIP を短時間または発達期間を通して 曝露したゼブラフィッシュ 胚に お け る c-fos 発現量（ 平均±SEM、n=4、*** p < 0.001、Dunnett’s test）。
A：短時間曝露、B：発達期間を通した長時間曝露 。各曝露群につき、受精後 4 時 間 の胚 20 個をペトリ皿に入れて水性曝露し、受精後 5 日で回収した稚魚から総 RNA を抽出して c-fos 発現量解析用のサンプルとした。

以上の結果は、昨年度明らかにしたアセタミプリドやイミダクロプリドに 加 え、アセタミプリドの主要な代謝物である DMAP についても、親化合物ほどではないものの発達期ゼブラフィッシュの神経系に影響を及ぼすことを示している。さらに、GABA 受容体介在性の殺虫剤 であるフィプロニルについても発達期ゼブラフィッシュに神経毒性を示す可能性が考えられた。
フィプロニル曝露胚では短時間曝露で c-fos 発現量の顕著な増加がみられた
ものの、発達期間を通した長時間曝露では低濃度におけるわずかな増加がみられたのみであった。これに対し、一部の神経伝達物質の前駆体では長時間曝露群で顕著な上昇を示した。殺虫剤においては、事故などによる高濃度・短時間曝露だけでなく低濃度・長期 間曝露も想定する必要があることから、本研究で明らかにしたような長時間曝露に応答するバイオマーカーの開発は有用と考えられる。

今後の課題
今後は、これまでに対象としたネオニコチノイド系殺虫剤とフェニルピラゾール系殺虫剤 について、稚魚の行動、神経活性マーカーの発現、神経伝達物質の濃度のうち不足しているデータセットをすべて収集し、発達神経毒 性 の態様と バイオマーカーについて 統合的な理解を試みる。また、今年度実施予定であったジアミド系殺虫剤（クロラントラニリプノール）についても取り組む予定である。得られた成果をまとめ、発達神経毒性試験の代替法としてゼブラフィッシュが活用可能であるか、またその際のメリットだけでなくデメリットや制限事項などについても考察する。得られた成果を学会等で発表するとともに、国際学術誌に英文として投稿する予定である。