37 (2023)
上原記念生命科学財団研究報告集,
上原記念生命科学財団研究報告集, 37（2023）

62. 癌間質転移関連機序の解明と新規治療法開発
山下 継史
北里大学 医学部 新世紀医療開発センター 先進外科腫瘍学
Key words：癌転移，癌関連線維芽細胞，SPARC，CSF1，コラーゲン

緒 言
外科手術療法あるいは周術期療法の進歩により癌患者の予後は大きく改善してきたが、進行癌の治療成績は満足するものとはなっていない。それは、癌の再発や転移が現代の最新医療をもってしても十分に制御できていないからである。
この状況を破るためには癌転移の分子機序を明らかにしその原因に対する対処法を解明する以外に方法はない。癌の予後因子に関しての報告は多数あるが十分に検証されたといえる予後因子は明らかでない。例えば、我々はこれまでにリンパ節転移や遠隔転移に関連があると報告されている遺伝子（c-myc、Ascl2、PRL3、CD44、lnRNA-MALAT1、H19、HOTAIR 等）について同じ結腸癌組織を用いて組織 mRNA の定量的 PCR で精密にその発現を調べ臨床病理学的因子との相関を解析し過去の報告の検証を行った。これらの遺伝子はいずれも癌で過剰発現していたが、驚いたことに癌悪性度との関連を示す遺伝子は一つもなかった［1，2］。その後、それまでの研究［3］から再び注目した間質マーカー

secreted protein acidic and rich in cysteine（SPARC ）の発現解析を行い初めてリンパ節転移や遠隔転移との関連を確認できた（図 1）。

図 1．結腸癌における SPARC mRNA 発現と転移の関連
Microdissection による SPARC 発現は癌間質特異的に確認され（左図）、結腸癌 bulk 組織における発現は高度リンパ節転移（N2、N3）（左中図）、遠隔転移（M1）（右中図）、転移臓器（右図）で有意に高値であった（t 検定）。cS/E ratio (cancer stroma／epithelium expression ratio).

近年の TCGA をはじめとした public database の充実により、客観的な包括的発現解析データの利用が可能となっている。そこで、本研究においては結腸癌のマイクロダイセクションによるマイクロアレイデータベースとバルク組織を用いたマイクロアレイデータと予後の結果を交えて、癌関連線維芽細胞（Cancer-Associated Fibroblast：CAF）における SPARC 発現の臨床的意義および機能的意義を統合的に論じた。
本研究において、CAF 細胞 YS1 の SPARC ノックダウンにより癌転移能の低下（gel contraction 抑制、癌浸潤能の低下、癌生着能の低下）が確認できた。これらを説明する分子的機序を明らかにするために YS1 の SPARC ノックダウンにより発現が低下する遺伝子を、イクロアレイを用いて包括的に検索した。その結果、SPARC 下流の標的遺伝子

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として collagen family、補体 C1 family、IFN-stimulated gene（ISG）、HLA class I familly、あるいは多数の分泌因子の発現低下が確認できた。このうち、collagen family と補体 C1 family は癌間質特異性が高く、特に collagen familyは強い予後因子であった。一方、癌間質特異性が低い癌細胞とのクロストークに関連する遺伝子候補として CSF1 がSPARC 下流遺伝子候補として同定された。遺伝子ノックダウンの実験により、SPARC 誘導癌細胞浸潤能がCSF1-CSF1R axis により制御されていることが明らかとなった。

方法および結果
1．YS1 細胞の SPARC ノックダウンと結果の検証（real time PCR）
YS1 の SPARC ノックダウンを 3 種類の siRNA-SPARC #1、#2、#3 を用いて行った。3 種類のノックダウンの配列のうち、off-target の有無を Wnt2 の反応性を基に判断した。siRNA-SPARC #3 は off target が確認され、以降の実験は siRNA-SPARC #1（siSPARC-1）、siRNA-SPARC #2（si-SPARC2）を用いて行った。Affymetrix expression
microarray を用いて発現解析を行い、siSPARC-1 で発現が 2 倍以上低下した遺伝子を選択した（2,086 プローベ）。さらに、si-SPARC2 においても 2 倍以上低下を示した 679 プローベ（567 遺伝子）を選択し、さらに癌間質においてSPARC 発現と強い相関を示した遺伝子（R＝0.9 or beyond）のうち、発現量の順に上位 30 個をピックした（図 2）。
。また、30 個
遺伝子発現低下は一部の遺伝子について real time PCR で検証できた（COL8A1、COL1A1、HLA-F ）のうち 4 個の遺伝子が IFN-stimulated gene（ISG）（EPSTI1、IFI44、IFIH1、MX2）であり、また分泌因子（Secretionfactor、図 2 のサークル S マーク）は癌とのクロストークに関わる可能性があると考えた。

図 2．YS1 の SPARC ノックダウンと遺伝子発現低下
YS1 細胞における siSPARC-1、siSPARC-2 により Ctrl に比較して発現が 2 倍以上低下した遺伝子を発現順に列挙（上位 30 位）。

2．YS1 の SPARC ノックダウンと表現型の変化
次に YS1 の SPARC ノックダウンを行い表現型の変化を調べた。
線維芽細胞の癌転移活性を反映する gel contraction
assay を行いゲル収縮が有意に抑制された。癌細胞への影響を見るために癌細胞との共培養による癌浸潤能と nudemouse の移植率を算定した。両者とも SPARC ノックダウンにより抑制された。大腸癌細胞株 SW480、DLD1 を用いた浸潤実験の結果を図 3 に示す。

2図 3．SPARC ノックダウンと強制発現による大腸癌浸潤能の変化
YS1 細胞の SPARC ノックダウン上清は、Ctrl 上清より SW480 の癌浸潤を低下させ（左図）、一方で YS1 細胞の SPARC 強制発現の上清は moc 上清より SW480 の癌浸潤を増強した（左中図）。DLD1 も同様であった（右中図、右図）。統計処理は t 検定で行った。

3．大腸癌 CAF marker 候補遺伝子の同定
癌間質プロファイルの public database（GSE35602）解析を行い、癌間質における SPARC と下流遺伝子の関係を検証した（図 2 には R＝0.9 or beyond の遺伝子をピック）。さらに、包括的遺伝子探索を行い SPARC と関連する CAF
marker 候補をマイクロアレイ遺伝子から抽出し発現の多い 115 個に絞った。115 個の CAF marker 候補遺伝子は、すでに良く知られている CAF markers（FAP、VIM、ACTA2、PDGFRB）に加えて collagen family、補体 C1 family（C1S/C1R）等の SPARC 下流遺伝子候補（図 4）が共通していた。

図 4．SPARC ノックダウンによる collagen family の発現変化
YS1 細胞の SPARC ノックダウンにより発現が低下したコラーゲン（altered）（図 4 左）を示す。

4．大腸癌 CAF marker 候補遺伝子の予後解析
CAF marker 候補遺伝子のうち、発現が高い 76 個について結腸癌の public database を用いて予後解析を行った（GSE17538）。AUC で順位付けを行うと上位に collagen family が enrich された。面白いことにほとんどの候補遺伝
子が予後不良因子であり、有意な差を示した遺伝子が 76 個中 63 個に上った。Top10 の遺伝子を順に列挙すると

PRKCDBP、COL8A1、THBS2、COL5A2、INHBA、SPARC、COL5A1、COL6A3、COL11A1、COL12A1 であった（図 5）。

図 5．大腸癌 CAF markers と悪性予後（GSE17538）
CAF markers の中で強い予後因子となった PRKCDBP、COL8A1、COL3A1、SPARC の結腸癌における予後曲線。

35．SPARC 誘導癌浸潤は CSF1/CSF1R axis を介するSPARC 下流で発現が誘導され、癌間質で SPARC との高い相関を示した CSF1 に注目した（図 6）。注目した理由と。癌とのクロストークにしては、SPARC 下流の分泌因子のうち cS／E ratio が低かったためである（図 6、右パネル）
関連する遺伝子は癌特異性である必要がないと考えた。

図 6．SPARC による CSF1 の誘導と CSF1 の cS/E 比の特有性
YS1 細胞における SPARC ノックダウンにより CSF1 発現は低下し（左図）、SPARC 強制発現により CSF1 発現は増加した（左中図）。癌間質における CSF1 発現は SPARC 発現と強く相関し（右中図）、S／E 比は特有に低かった（右図）。

YS1 細胞の CSF1、CSF1R のノックダウンによる SPARC 誘導癌浸潤能変化（SW480）を調べた（図 7）。

図 7．YS1 に対して SPARC 誘導を行い CSF1-CSF1R axis ノックダウン SW による 480 癌細胞浸潤を評価
YS1 における SPARC 強制発現を CSF1 ノックダウンすると癌細胞 SW480 の浸潤能が低下した。また、SW480 のCSF1R をノックダウンすることでさらに強く癌浸潤が抑制された。

考 察
本研究で SPARC の大腸癌転移に関わる分子機序の一部を解明できた。これまでに SPARC が癌では遺伝子プロモーターの DNA メチル化で発現が低下し、一方癌間質で発現が亢進していることが知られていた。我々は本研究において micorodissection を用いた発現プロファイルの特徴を客観的指標で表現することに成功した。すなはち、
cS／E ratio＝10 or beyond は癌間質特異的発現遺伝子として重要な客観的指標となる。CAF marker の必要条件であった。また、間質マーカーとして知られる SPARC との強い相関（R＝0.9 or beyond）は、もう一つの CAF marker の必要条件でもあった。この両者を満たす遺伝子が FAP、VIM、ACTA2、PDGFRB というよく確立された CAF markerを全て含んでいたことは極めて重要な所見といえる。よって、我々はこの二つの条件を満たす遺伝子は本研究では CAF

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marker と呼ぶこととした。
CAF marker の予後因子解析ではそのほとんどが悪性予後の indicator であり、特に上位にコラーゲンファミリーがenrich された。上位の top10 にコラーゲンファミリーが 6 個上がってきたが、これらの調節をする SPARC がやはり含まれていた（6 位）。SPARC より AUC が高かったコラーゲンファミリー遺伝子は COL8A1 および COL5A2 だけであった。以上から SPARC はコラーゲン産生に重要な役割を果たしていることが明らかとなり、またそれは宿主の防御反応としてよりも癌進展の協力者としての意義が高いことを暗示する結果となった。
今回、SPARC により起こる変化のうち最も目立ったものが ISG の誘導であった。近年の研究で、SPARC はマクロファージにおいて TLR4-IRF3 を介して IFN を誘導する経路を活性化することが報告されている［4］。このようにして誘導された IFN は IRF7、STAT1 の誘導により ISG 発現上昇を起こす positive feedback loop を形成する。IFNAR1の活性変異（SA 変異）では IRF7、STAT1 誘導を伴う NK 細胞や CD8 陽性細胞の誘導が確認されている［5］。このことから、SPARC による免疫細胞誘導が IFN 経路の活性化を介して癌細胞ではなく癌間質細胞に対して起こっていることが理解できる。さらに、SPARC が HLA family（HLA-F だけでなく HLA-A、B、C、D、E も）を誘導することから（data not shown）、CAF に引き寄せられた免疫細胞（特に NK 細胞）が CAF 表面において不活化されることが想定される。以上から、免疫細胞浸潤を伴う線維化はもっとも高い悪性化の特徴といえる。
一方、SPARC は CSF1 を誘導することが明らかとなり癌とのクロストークに関わると考えられた。CSF1 の発現はSPARC との強い相関を示したが（R＝0.94）、cS／E ratio は低かった。CSF1 はもともと癌間質の TAM（tumorassociated macrophage）の活性化に重要な役割を果たすものだが、一定の条件下では癌の浸潤に関わる［6］。我々の検討においても、SPARC により亢進する YS1 による SW480 細胞浸潤亢進は、YS1 の CSF1 ノックダウンもしくは、SW480 の CSF1R のノックダウンにより著明に抑制されることが明らかとなった。このことは、CSF1-CSF1R axis が癌間質の TAM だけではなく大腸癌の浸潤能にも直接影響を及ぼす可能性を示唆するものといえる。
今回の助成金を用いて COL8A1 および C1S ノックダウンの実験も追加している。COL8A1 ノックダウンにより一方で、COL8A1
ISGは逆に誘導されることから COL8A1 は SPARC の下流でnegative feedbackの役割が確認できた。

ノックダウンにより IL6ST／STAT3 経路や PTN などの癌転移促進因子の抑制が確認された。一方、C1S ノックダウンにより COL5A2、COL5A1、COL6A3 の低下に加え、PTGS2 やケモカイン（CXCL5、CXCL10 ）などの発現低下が確認された。癌転移の CAF 治療標的同定にはさらなる詳細な分子機序の解明が望まれる。

共同研究者・謝辞
本研究の共同研究者は北里大学大学院医学系研究科先進外科学研究室の贄裕介亮医師、奥野晃太医師、藤山芳樹医師、大木慶子医師、渡部晃子医師であり、多大なる研究の協力に対して深く謝辞を表する。

文 献1） Yokota K, Tanaka Y, Harada H, Kaida T, Nakamoto S, Soeno T, Fujiyama Y, Yokota M, Kojo K, Miura H,Yamanashi T, Sato T, Nakamura T, Watanabe M, Yamashita K. WiNTRLINC1/ASCL2/c-Myc Axis
Characteristics of Colon Cancer with Differentiated Histology at Young Onset and Essential for Cell Viability.
Ann Surg Oncol. 2019 Dec;26(13):4826-4834. doi: 10.1245/s10434-019-07780-3. Epub 2019 Sep 23. PMID:31549316.
2） Kaida T, Fujiyama Y, Soeno T, Yokota M, Nakamoto S, Goto T, Watanabe A, Okuno K, Nie Y, Fujino S, Yokota
K, Harada H, Tanaka Y, Tanaka T, Yokoi K, Kojo K, Miura H, Yamanashi T, Sato T, Sasaki J, Sangai T, Hiki N,
Kumamoto Y, Naitoh T, Yamashita K. Less demand on stem cell marker-positive cancer cells may characterizemetastasis of colon cancer. PLoS One. 2023 Apr 25;18(4):e0277395. doi: 10.1371/journal.pone.0277395. PMID:
37098074; PMCID: PMC10128954.

53） Yamashita K, Upadhay S, Mimori K, Inoue H, Mori M. Clinical significance of secreted protein acidic and richin cystein in esophageal carcinoma and its relation to carcinoma progression. Cancer. 2003 May 15;97(10):24129. doi:10.1002/cncr.11368. PMID: 12733139.
4） Ryu S, Sidorov S, Ravussin E, Artyomov M, Iwasaki A, Wang A, Dixit VD. The matricellular protein SPARC
induces inflammatory interferon-response in macrophages during aging. Immunity. 2022 Sep 13;55(9):16091626.e7. doi: 10.1016/j.immuni.2022.07.007. Epub 2022 Aug 12. PMID: 35963236; PMCID:PMC9474643.
5） Katlinski KV, Gui J, Katlinskaya YV, Ortiz A, Chakraborty R, Bhattacharya S, Carbone CJ, Beiting DP,Girondo MA, Peck AR, Puré E, Chatterji P, Rustgi AK, Diehl JA, Koumenis C, Rui H, Fuchs SY. Inactivationof Interferon Receptor Promotes the Establishment of Immune Privileged Tumor Microenvironment. Cancer
Cell. 2017 Feb 13;31(2):194-207. doi: 10.1016/j.ccell.2017.01.004. PMID:28196594; PMCID: PMC5313042.
6） Patsialou A, Wang Y, Pignatelli J, Chen X, Entenberg D, Oktay M, Condeelis JS. Autocrine CSF1R signaling
mediates switching between invasion and proliferation downstream of TGFβ in claudin-low breast tumor cells.
Oncogene. 2015 May 21;34(21):2721-31. doi: 10.1038/onc.2014.226. Epub 2014 Aug 4. PMID:25088194;
PMCID: PMC4317382.

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