ナノ炭素材料の安全性試験総合手順書
ナノ炭素材料の試料調製と特性評価、培養細胞試験および動物試験の手順
2017 年

技術研究組合 単層 CNT 融合新材料研究開発機構(TASC)
国立研究開発法人 産業技術総合研究所 安全科学研究部門

NEDO 委託事業 P10024「低炭素社会を実現するナノ炭素材料実用化プロジェクト」

ナノ炭素材料の安全性試験総合手順書
ナノ炭素材料の試料調製と特性評価、培養細胞試験および動物試験の手順

2017 年

技術研究組合 単層 CNT 融合新材料研究開発機構（TASC）
国立研究開発法人 産業技術総合研究所 安全科学研究部門

改訂記録
1.

初版制定日 2017 年 2 月 15 日

本書は、国立研究開発法人 新エネルギー・産業技術総合開発機構(NEDO)から委託した「低炭素社会を実現するナノ炭素材料実用化プロジェクト」(P10024)による研究成果です。

本書について
近年、カーボンナノチューブ（CNT: Carbon nanotube）やグラフェン等のナノ炭素材料を用いた工業製品の開発、さらにこれらを使った情報通信、環境、エネルギー等における応用が世界的な規模で精力的に進められている。技術研究組合単層 CNT 融合新材料研究開発機構（TASC：Technology Research Associationfor Single Wall Carbon Nanotubes）および（国研）産業技術総合研究所（以下、産総研）は、（国研）新エネルギー・産業技術総合開発機構（NEDO）による委託事業により、単層 CNT やグラフェンの実用化を目
指し、基盤研究および応用用途開発に取り組んできた。
一方、ナノ炭素材料は、超微細なサイズや形状などの物理的な特性によって、これまでの化学物質にはない有害性影響が引き起こされる懸念が広がっている。技術革新が速く、安全性に関する知見も構築途上の状況では、事業者は予防的な考えに基づき、自主的な安全管理に取り組むことが重要である。しかし、事業者が自主的にナノ炭素材料の安全性を確認することは容易ではないため、公的研究機関による事業者
への自主安全管理の支援が必要と考える。そこで NEDO 委託事業「低炭素社会を実現する革新的カーボンナ
ノチューブ複合材料開発プロジェクト」（2010～2014 年度）において、TASC と産総研は、CNT を取り扱う事業者や試験機関の自主安全管理を支援するために、より簡易で迅速な安全性評価方法を開発し、2013 年に「カーボンナノチューブの安全性試験のための試料調製と計測、および細胞を用いたインビトロ試験の手順」（以下、安全性試験手順書）を作成公開した。これは、CNT を対象に事業または研究開発の目的で取り扱う事業者が、自主安全管理の一助として利用できるよう安全性試験のための試料調製と計測、および細胞を用いたインビトロ試験に関する手順をまとめたものである。また、実施例として、TASC と産総研が開発した単層 CNT を対象に、これらの手順に基づいて得られた評価結果や知見について収載した。
さらに、NEDO 委託事業「低炭素社会を実現するナノ炭素材料実用化プロジェクト」（2014～2016 年度）
では、これまでの知見を活用し、対象材料をナノ炭素材料に拡張して最低限必要な安全性評価手法を設定し、動物試験によるデータ補完も含めた自主安全性評価手順の構築を図ることとした。本書「ナノ炭素材
料の安全性試験総合手順書」は、ナノ炭素材料の試料調製と特性評価、さらに培養細胞試験だけでなく、培養細胞試験を補完する動物試験の手順を取りまとめたものである。また、TASC と産総研が開発した単層
CNT のみならず、多層 CNT や、半導体型および金属型分離単層 CNT、グラフェンを対象に、試料調製や特性評価、培養細胞試験、動物試験について実施例を収載し、事業者や関連する試験機関が利用しやすいように構成した。
TASC では、作業環境等における気中ナノ炭素材料の計測手法の開発やその事例の集積にも取り組んでおり、その成果は、「ナノ炭素材料の排出・暴露評価の手引き」としてとりまとめ公開している。また、TASC、産総研から提供しているスーパーグロース単層 CNT、eDIPS-単層 CNT、剥離グラフェンに関して、安全性に関する既存情報、産総研から提供された情報、および TASC 独自で実施した評価結果を「ケーススタディ報告書」として作成公開している。本書「ナノ炭素材料の安全性試験総合手順書」を、「安全性試験手順書」、「ナノ炭素材料の排出・暴露評価の手引き」、「ケーススタディ報告書」と併せてナノ炭素材料の自主安全管理の参考としてご活用頂ければ幸甚である。なお、これらは、産総研、安全科学研究部門 WEB サイト(http://www.aist-riss.jp/)より無償でダウンロード可能である。
2017 年 2 月

執筆担当者（所属は、2017 年 2 月現在。執筆担当順）

藤田

克英 ＊

国立研究開発法人産業技術総合研究所

安全科学研究部門

技術研究組合単層 CNT 融合新材料研究開発機構（兼）遠藤茂寿

技術研究組合単層 CNT 融合新材料研究開発機構

丸順子

技術研究組合単層 CNT 融合新材料研究開発機構

岡崎俊也

国立研究開発法人産業技術総合研究所

ナノチューブ実用化研究センター

技術研究組合単層 CNT 融合新材料研究開発機構（兼）田島奈穂子

技術研究組合単層 CNT 融合新材料研究開発機構

篠原直秀

国立研究開発法人産業技術総合研究所

安全科学研究部門

技術研究組合単層 CNT 融合新材料研究開発機構（兼）内野加奈子

技術研究組合単層 CNT 融合新材料研究開発機構

小原

佐和枝

技術研究組合単層 CNT 融合新材料研究開発機構

森本泰夫

産業医科大学

産業生態科学研究所

和泉弘人

産業医科大学

産業生態科学研究所(＊監修者)

目

次

第Ⅰ章

はじめに......................................................................1

第Ⅱ章

汚染・暴露防止対策............................................................4

第Ⅲ章

ナノ炭素材料の分散液試料の調製................................................6

第Ⅳ章

ナノ炭素材料の分散液試料の特性評価...........................................14

Ⅳ-１ ゼータ電位の評価.............................................................14
Ⅳ-２ 動的光散乱法による粒子径および粒子径分布の評価...............................18
Ⅳ-３ 微分型遠心沈降による粒子径および粒子径分布の評価.............................24
Ⅳ-４ 吸光度によるナノ炭素材料濃度の評価...........................................30
第Ⅴ章

動物組織中のナノ炭素材料の分析...............................................36

Ⅴ-１ 紫外可視吸収スペクトルによる分析.............................................36
Ⅴ-２ 炭素分析.....................................................................43
第Ⅵ章

ナノ炭素材料の分散液試料を用いた培養細胞試験.................................48

第Ⅶ章

ナノ炭素材料の分散液試料を用いた動物試験.....................................58

Ⅶ-１ 気管内投与試験...............................................................58
Ⅶ-２ 遺伝毒性試験.................................................................75

第Ⅰ章

第Ⅰ章

はじめに

はじめに

目的
本書は、ナノ炭素材料を取り扱う事業者が自主的に安全管理を実施するための簡易で迅速な安全性評
価手法としての培養細胞試験、および培養細胞試験を補完する動物試験の手順について述べたものである。また、暴露の可能性が最も高いのは、ナノ炭素材料の製造に関わる労働者と想定されるため、本書の試験手順は、ナノ炭素材料の製造または加工関連施設内において、これらを吸入暴露する可能性がある作業者の安全衛生管理、特に吸入経路を対象としたヒト健康影響評価に繋がるものである。
背景
ナノ炭素材料は、ナノスケールの構造から、超軽量・高強度・高機能な応用材料の開発が期待される
一方、ヒトへの健康影響が懸念されている。しかしながら、ナノ炭素材料が重大な影響を及ぼしたという明白な事例はこれまでなく、事業者は自主的に安全管理を施し、ナノサイズであるが故の漠然とした不安や風評被害を事前に防ぐことが必要と考える。安全性に関する法規制を待っていては、国際競争に敗れてしまうといった現状からも、こうした「自主安全管理」の考えは、技術革新が速いナノ炭素材料において有効である。さらに肯定的に捉えると、自主的に安全性評価を実施し、製品の安全性をアピールできれば、大きなセールスポイントを得ることができる。また、ナノ炭素材料に携わる事業者が、「自主安全管理」として有害性評価情報を示すことは、事業者内や利害関係者、さらには一般市民への要請に応える社会的責任（CSR: corporate social responsibility）とも考えられる。
では、「自主安全管理」として事業者は、どのようにナノ炭素材料の安全性評価を実施すればよいのであろうか。通常の化学物質の場合、安全性・有害性の判断は各種動物試験により行われるが、動物試験は多大な費用と時間が必要である。物理的、化学的特性を用途に応じて変化させた多様なナノ炭
素材料それぞれに対して、長期間かつ高コストな動物実験を実施することは現実的ではない。さらに、動物実験に関する３Ｒ（代替：Replacement、削減：Reduction、苦痛の軽減：Refinement）原則に基
づき、世界的にもできるだけ動物実験に依存しない簡易な培養細胞試験での安全性評価が求められている。
培養細胞試験においては、ナノ炭素材料を細胞培養する培地に添加する必要がある。しかしながら、
ナノ炭素材料は、液体培地中で凝集・凝塊を作り（２次粒子）、細胞に直接沈降する性質をもつ。それを解決する手段として主に界面活性作用を持つ分散剤が用いられるが、分散剤の中にはそれ自身が細胞毒性を持つ場合も多い。したがって、ナノ炭素材料独自の特性を反映した細胞影響評価を行うためには、分散剤の使用を制限し、なおかつ、ナノ炭素材料を安定的に分散させる調製方法を開発することが極めて重要である。加えて、ナノ炭素材料の物理化学的な特性評価（液中粒子径、濃度、イオン
濃度、および培地や添加剤に含まれるタンパク成分や無機塩類等のナノ炭素材料への吸着に伴う細胞維持成分の枯渇）は、安定的に分散しているかを確認することはもとより、どのようなパラメーター
が培養細胞に与えるかを把握するために、適切な評価手法を用いなければならない。ナノ炭素材料の生体に対する毒性発現メカニズムは、未知の部分が多く、依然として情報が十分ではない。したがっ

1

第Ⅰ章

はじめに

て、従来の手法による細胞への生体影響を見極めることはもとより、ナノ炭素材料の影響を正しく反映する新たな評価項目（エンドポイント）の選定と、これに基づく測定が必要である。また、ナノ炭
素材料間の生体影響や、同じナノ炭素材料に対する細胞種間の比較検討を行うための解析手法の開発、さらには、こうした培養細胞試験で得られた安全性試験の結果から生体への影響を予測することへの妥当性について、動物試験による検証を実施することも重要と考える。
概要
本試験法の特徴は、（１）安定かつ均一なナノ炭素材料の分散液を調製し、その液中分散状態および特性を計測していること、（２）培養細胞試験の細胞培地または動物試験の投与液中に添加されたナノ炭
素材料の分散状態・特性を評価していること、（３）ナノ炭素材料が細胞あるいは動物組織に与える影
響すなわち生体指標（エンドポイント）を抽出し、その検出についてナノ炭素材料に由来する妨害を可能な限り排除した試験方法を選択していること、（４）動物に投与した後の生体組織中のナノ炭素材
料を定量分析していることである。ナノ炭素材料の安全性試験のための試料調製と特性評価、培養細胞および動物試験の概要を図Ⅰ-1 に示す。
１．ナノ炭素材料の試料調製および液中分散試料の特性評価
本手順書では、ナノ炭素材料の培養細胞試験および動物試験を実施するために、高精度の測定技術を用いた細胞培地中または投与液中に安定分散する調製技術を示す。ナノ炭素材料の原粉体の物理化学的な成分組成データを確保した後、ナノ炭素材料を細胞培地中に均一かつ安定的に分散させ、かつ細胞や動物生体組織への影響をできるだけ排除するために分散剤の使用を最小限にした調製原液の調製を行う（図Ⅰ-1、①）。さらに、調製原液を細胞培地に希釈して培地調製液、あるいは媒体に希釈して動物への投与液を得る。ナノ炭素材料の調製原液または培地調製液中、動物投与液の二次的な特性（ナノ炭素材料の粒子径や濃度、イオン濃度、培地中のタンパクや無機塩類等の吸着）を適切に計測して、安定した分散の確認を行う（図Ⅰ-1、②）。これらの試験結果により、ナノ炭素材料の安全性試験として培養細胞試験および動物試験を実施する判断とする。
２．ナノ炭素材料安全性試験のための培養細胞試験
上記１.で調製・特性評価した培地調製液を用いて、吸入暴露による呼吸器への健康影響を想定し、各種の関連した培養細胞による細胞の生存や分化能を見極めると共に、炎症性マーカーや、酸化ストレス、アポトーシス等のエンドポイントを選定して測定を行ない、ナノ炭素材料の有害性を評価する培養細胞試験を実施する（図Ⅰ-1、③）。
３．ナノ炭素材料安全性試験のための動物試験
上記１.で調製・特性評価した動物投与液を用いて、吸入暴露による呼吸器への健康影響を想定し、BALF 中の細胞数や炎症性マーカー、肺病理観察、肺組織の遺伝子発現等のエンドポイントを選定して測定を行ない、ナノ炭素材料の有害性を評価する動物試験を実施する。また、肺組織等に存在するナノ炭素材料を定量また定性分析を行い、動物に投与したナノ炭素材料の組織内分布や組織外への移行や経時変化を解析する（図Ⅰ-1、④）。
４．安全性試験総合手順書の公開
国際機関との連携活動やナノ炭素材料を取り扱う事業所における自主安全管理に役立てるため、以上の試験手順と、これらの手順に基づいて実施した例を付属して取りまとめた本書を作成して公開す

2

第Ⅰ章

はじめに

る（図Ⅰ-1、⑤）。
なお、ここでの安全性評価とは、ナノ炭素材料製造に関わる労働者の安全衛生管理を想定とする吸入経路を対象にしたもので、経口や経皮を対象にしたものではない。また、本書に準拠して得られた試験結果は、急性炎症を中心とした呼吸器への影響や、遺伝毒性を評価するものであり、安全性全て
について保証するものではないことをご留意願いたい。

図Ⅰ-1

ナノ炭素材料の試料調製と特性評価、培養細胞および動物試験の概要

第Ⅰ章の執筆担当者
藤田克英

3

第Ⅱ章

第Ⅱ章

汚染・暴露防止対策

汚染・暴露防止対策

1．滅菌操作培養細胞試験では、細菌類の混入を防ぐための滅菌操作が必要不可欠である。原末、分散媒、分散試
料に接触するかくはん子、ビーズ等の器具、容器類は、可能な限りオートクレーブで滅菌する。オートクレーブ滅菌が不可能なものはエタノールで洗浄し、紫外線で 3 分殺菌する。
参考規格 JIS T 7322 医療用高圧蒸気滅菌装置
2．エンドトキシン対策
エンドトキシンは、白血球の活性化を引き起こすなど、生体および培養細胞系と反応することがある。
試験に用いる分散液にエンドトキシンが混入すると、誤った有害性評価を導く恐れがあるため、試料調製では、エンドトキシン混入を予防する対策が必要である。特に、細胞が直接反応するインビトロ
試験では重要である。例えば、分散媒に用いる水は、エンドトキシン除去フィルタで処理したイオン
交換水（超純水または滅菌水）を用いる。エンドトキシンは、通常環境中に存在しており、イオン交
換水を長時間貯留すると混入しやすい。したがって、できるだけ使用時に必要量を調製することが望ましい。
ナノ炭素材料の分散液の調製過程において、エンドトキシンが混入しているかどうかを試験することによって、混入をできるだけ防ぐ対策を講じることができる。試験方法としては、例えば、ISO 29701
として採択された Limulus amebocyte lysate（LAL）試験のゲル化法（Gel-clot 法）等が適している。
これは、ライセート試薬がエンドトキシンの作用によってゲル化するのを指標とする方法である。
参考規格 ISO 29701 Nanotechnologies -- Endotoxin test on nanomaterial samples for in vitro
systems -- Limulus amebocyte lysate (LAL) test
3．ナノ炭素材料暴露対策
ヒトに対するナノ炭素材料の健康影響は現時点では明らかになっていないが、予防原則に乗っ取り、できるだけ暴露しないよう、取扱いに注意する。
粉体の秤量、前処理など、乾燥状態でナノ炭素材料を扱う場合、粉体の飛散によって暴露する可能性がある。これを防止するため、作業は、グローブボックス等の密閉した装置内で行うか、高性能フ
ィルタ付きドラフトチャンバ等で適切に局所排気を施した上で行う。ただし、秤量中に排気ファンを運転すると、飛散することもあるので、作業中はファンを停止し、容器取出し時や清掃時に運転すると良い場合がある。また、防じんマスク、保護手袋、保護眼鏡、白衣等の保護具を装着する。湿式分散等の作業においても分散液が飛散する可能性があるので、試験室内に飛散しないように、クリーンベンチ内や局所排気装置内で作業する。この場合も、保護具を装着しておくことが望ましい。
グローブボックスおよび局所排気装置の排気方法、保護具の選択方法、廃棄物の処理方法について
は、関係機関の通知、ガイドライン等を参考にする。保護具は、細菌汚染防止対策やエンドトキシン

4

第Ⅱ章

汚染・暴露防止対策

混入防止対策としても有効である。
参考規格 厚生労働省基発第 0331013 号「ナノマテリアルに対するばく露防止等の予防的対応について」（平成 21 年 3 月 31 日）
第Ⅱ章の執筆担当者
藤田克英

5

第Ⅲ章

第Ⅲ章

ナノ炭素材料の分散液試料の調製

ナノ炭素材料の分散液試料の調製

序文
本書、第Ⅴ章「ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた培養細胞試験」および第Ⅵ章「ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた動物試験」で用いるナノ炭素材料の分散液試料の調製手順を示す。界面活性剤
や高分子電解質を用いることなく生体由来材料によってナノ炭素材料を液中分散することを特徴とする。培養細胞試験においては、細胞への分散液試料の添加から３日間にわたり有害性の評価試験を行う。その間、ナノ炭素材料が安定に懸濁していることが重要である。ここでは、試験期間を通じて安定な試料の調製方法を示す。また、調製した試験用試料のナノ炭素材料濃度およびエンドトキシンに関する評価方法についても示す。なお、当該方法は、気管内投与試験や遺伝毒性試験などによる動物試験に用いる投与試料の調製方法としても用いることができる。
1.

適用範囲

培養細胞試験に用いるナノ炭素材料の分散液試料の調製は、ウシ血清アルブミン (BSA: Bovine Serum
Albumin)水溶液中においてナノ炭素材料の凝集体の分散を超音波照射によって行う。また、ナノ炭素
材料の液中濃度は、吸光度によって測定する。
この方法は実験動物への気管内注入による動物試験の試料調製に用いることができる。
2.

引用規格および規制

この手順書では以下の規格および規制を参照している。
第十六改正日本薬局方におけるエンドトキシン試験法（ライセート試薬によるゲル化法）
厚生労働省基発 0331013 号「ナノマテリアルに対するばく露防止等のための予防的対応について」（平
成 21 年 3 月 31 日）
3.

用語および定義

3.1

調製原液（Stock suspension）

BSA 水溶液でナノ炭素材料を分散した懸濁液。
3.2

培地調製液（Working solution）

培養細胞試験で使用するナノ炭素材料懸濁液。試験で用いる培地によって調製原液を所定の濃度に希釈して調製する。
3.3

遠心強度

遠心加速度と重力加速度（g）との比。遠心分離の操作条件を与える。遠心強度が x である場合、xg と
表記する。
3.4

ウシ血清アルブミン (BSA: Bovine Serum Albumin)

牛の血清から精製したタンパク質。界面活性剤の代替としてナノ炭素材料の水中への分散を図るために使用する。

6

第Ⅲ章

3.5

ナノ炭素材料の分散液試料の調製

エンドトキシン微生物から放出される毒素。
4.

装置および器具

4.1

分散装置

ナノ炭素材料を液中分散するために用いる装置で、超音波照射によって凝集状態の粒子を分散する。
ホーン（プローブ）を直接懸濁液に挿入し超音波照射する超音波ホモジナイザーまたは容器外の超音波発信子から液体を介して超音波照射する超音波バスを用いる。
4.2

試料容器

50 mL のガラスビーカーまたは滅菌された 100 mL のガラス製バイアルで、分散操作での容器として用
いる。
4.3

遠心分離機

遠心分離によってナノ炭素材料分散液から粗大な凝集体および／または微細な粒子を除くために用いる。遠心分離後の上清または沈下物を回収する。
4.4

遠沈管（遠心管）

容量 50 mL の滅菌済みチューブ。
4.5

セルストレーナー

分散が不十分である場合に残存する粗大なナノ炭素材料の凝集体を確認するために用いる。
4.6

ナノ炭素材料濃度測定装置

ナノ炭素材料濃度を評価するために用いる紫外—可視域（UV-Vis）での吸光度測定装置。
4.7

懸濁ナノ炭素材料二次粒子径測定装置

動的光散乱（DLS: Dynamic light scattering）または微分型遠心沈降（DCS: Differential Centrifugal
Sedimentation)を原理とする粒子径測定装置を用いる。
4.8

ナノ炭素材料観察装置

ナノ炭素材料の分散状態および形状の観察または画像解析法による形状測定に用いる。透過型電子顕微鏡（TEM: Transmission Electron Microscope）または走査型電子顕微鏡（SEM: Scanning Electron
Microscope）の他、個々の粒子が観察できる顕微鏡。
5.

試料および試薬5.1 ナノ炭素材料
乾燥状態が良いが、特に加熱処理は必要ない。
5.2
5.2.1

分散媒とその調製
分散剤

分散剤としてウシ血清アルブミン（BSA）を用いる。
5.2.2

分散媒

ナノ炭素材料を懸濁するための媒液。BSA を 10 mg/mL で蒸留水中に溶解する。この BSA 水溶液を 0.22
m 滅菌フィルタに通して除菌したものを分散媒として用いる。
注記

水として、純水製造装置で精製した後、エンドトキシン除去フィルタを通過した純水を用いる

7

第Ⅲ章

ナノ炭素材料の分散液試料の調製こともできる。
5.3

ライセート試薬

調製原液中のエンドトキシンを凝固反応に基づいて検出（ゲル化法）するために用いる。
6.

前処理

6.1

器具の滅菌処理

オートクレーブによって 121℃で 20 分間、試料容器を滅菌する。
超音波ホモジナイザーのホーンは、70％エタノール水溶液で消毒後、3 分間 UV 照射し滅菌する。
その他の器具については、70％エタノール水溶液で消毒する。
6.2

ナノ炭素材料の前処理および滅菌所定濃度の分散液試料を調製するのに必要なナノ炭素材料を秤量・採取する。
原料のナノ炭素材料が例えば、シート状である場合など、その状態に応じて、ピンセットおよび／または、はさみによってナノ炭素材料を小片にする。
採取した所定量のナノ炭素材料を試料容器に入れ、 UV 照射を 3 分間行う。
注記

超音波バスによる分散の場合、遠心分離などの調製操作を行わずに得られた分散液を調製原液とすることができる。そのため、分散時の濃度が有害性試験におけるそれになるように採取したナノ炭素材料をバイアルに仕込む。

警告

ナノ炭素材料の秤量および前処理にあたっては、厚生労働省基発 0331013 号「ナノマテリアル
に対するばく露防止等のための予防的対応について」に従い、局所排気装置の中で行い、ナノ炭素材料による暴露を回避する。また、マスクおよび手袋の個人用保護具を使用して作業する。

7.

調製原液の調製手順

7.1

ナノ炭素材料分散液の準備

調製原液におけるナノ炭素材料濃度は、最大、1 mg/mL とする。
6.2 に従って採取・滅菌したナノ炭素材料を入れた試料容器（ビーカーまたはバイアル）に、5.1.2 で調製した所定量の分散媒（例えば、50 mL）を加える。
ナノ炭素材料を分散媒に馴染ませる。
警告

大気からのコンタミを避けるため、スターラーでの撹拌はクリーンベンチ内で行う。また、マスクおよび手袋の個人用保護具を使用して作業する。

7.2
7.2.1

分散
概略

ナノ炭素材料の液中分散は、超音波照射による。超音波ホモジナイザーまたは超音波バスを用いる。
7.2.2

超音波ホモジナイザーによる分散

7.1 で準備した分散前のナノ炭素材料が懸濁する分散媒（BSA 水溶液）に、超音波ホモジナイザーの超音波発信ホーンを直接挿入する。超音波を発信させ、ナノ炭素材料に分散媒を馴染ませるとともに、ビーカー内の液が最も循環する様にホーン位置を調整する。
超音波を所定の時間、連続照射し、ナノ炭素材料を分散する。
超音波照射の間、分散液の温度上昇を抑えるため、適宜、ビーカーを氷で冷却する。

8

第Ⅲ章

注記

ナノ炭素材料の分散液試料の調製

超音波の出力については、ナノ炭素材料の分散効果とともに、容器およびホーンの破損・摩耗
ならびにナノ炭素材料の損傷を含めて、あらかじめ検討しておく。

警告

大気からのコンタミおよび懸濁液の飛散による暴露を避けるため、超音波処理はクリーンベン
チ内で行う。また、マスクおよび手袋の個人用保護具を使用して作業する。

7.2.3

超音波バスによる分散

7.1 で準備したバイアルを超音波バスの所定の位置に設置する。超音波バスの液高さをバイアル中の懸濁液の液面で最も強い共振が得られるように調整する。
所定の時間、超音波照射を行い、分散する。
注記 1

超音波照射を効果的にするためは、バイアルを超音波バスの水が最も激しく振動している超音波発信子のほぼ直上に設置する。

注記 2

容器の破損・摩耗について注意する。

注記 3

超音波バスの場合、7.3 および 7.4 の調整操作を行わずに調製原液を得ることができる。

7.3

遠心分離

7.2 で得た分散液を 50 mL の遠沈管に分取する。
所定の条件（遠心強度および分離時間）で遠心分離し、上清を回収する。
7.4

濃度の調整

7.3 で回収した分散液を目開き 40 m のセルストレーナーに通し、粗大な凝集体の存在を確認する。
もし、ろ材上で凝集体が確認された場合には、再度、調製し直す。
ろ液を 8.1 に従って濃度評価し、必要な濃度調整を分散媒によって行い、調製原液とする。
注記

セルストレーナーは、粗大な凝集体の確認が可能な目開きのものを用いる。

7.5

ナノ炭素材料の状態を変化させた調製原液の調製

上記の調製のほか、目的とする懸濁ナノ炭素材料の状態（二次粒子径など）に応じて、次の手順で調製することができる。
(a) 超音波照射時間を調整して得た分散液を、適当な遠心分離条件（遠心強度および分離時間）のもとで遠心分離し、上清を回収する。
(b) 回収した上清を、(a)より大きな遠心加速度で長い時間、遠心分離し、沈下物を回収する。
(c) 沈下物に 5.1.2 で調製した分散媒を添加してからボルテックスおよび超音波バスによって再分散を行う。
(d) 7.4 に従ってろ過し、ろ液を回収する。
(e) ろ液を 8.1 に従って濃度評価し、必要な濃度調整を分散媒によって行い、調製原液とする。
8.

分散液の評価8.1

調製原液中のナノ炭素材料濃度の評価

本書、第Ⅳ章「ナノ炭素材料の分散液試料の特性評価」、Ⅳ-4「吸光度によるナノ炭素材料濃度の評価」
に従い、紫外—可視 UV-Vis 領域における吸光度測定に基づいて評価する。
8.2

ナノ炭素材料の分散状態および形態の測定(a) 透過型電子顕微鏡 TEM などによりナノ炭素材料の分散状態を観察して評価する。
(b) 本書、第Ⅳ章「ナノ炭素材料の液中分散液試料の特性評価」のⅣ-2「動的光散乱法による粒子径

9

第Ⅲ章

ナノ炭素材料の分散液試料の調製および粒子径分布の評価」またはⅣ-3「微分型遠心沈降による粒子径および粒子径分布の評価」
に従い、懸濁しているナノ炭素材料の二次粒子径を平均粒子径等で評価する。
(c) 形状は、TEM 写真などの画像計測によって評価する。
8.3

エンドトキシン試験

第十六改正日本薬局方におけるエンドトキシン試験法であるゲル化法に従う。培養細胞試験における最大の CNT 濃度に調製原液を希釈した分散液（培地調製液）に対してエンドトキシン検出試験を行う。
ライセート試薬の凝固反応に基づく限度試験法において、エンドトキシン濃度が試薬の感度以下であることを確認する。
ライセート試薬の検出感度は 0.03 EU/mL 以下であることが望ましい。
9.

培地調製液の調製

培養細胞試験の場合、試験に使用する培地で調製原液を希釈し、所定のナノ炭素材料濃度の培地調製液を調製する。ここで、希釈では、培地調製液における BSA 濃度が 1 mg/mL である様にあらかじめ調
製した培地を使用する。
10
10.1

報告
調製方法および評価方法a)

ナノ炭素材料に関する情報（材料名、製造者、製造方法、組成など）b)

分散剤および分散媒を特定する情報（試薬名、生産者、ロット番号など）

c)

培地を特定する情報（培地調製液を調製する場合；試薬名、生産者、ロット番号など）

d)

試料の分散に関する情報（調製日時、調製者名および機関名、分散装置名、分散条件など）

e)

遠心分離に関する情報（遠心機名、遠心強度、遠心時間など）f)

セルストレーナーに関する情報（製品名、目開き、製造者）

g)

試料評価方法に関する情報（濃度測定機器名および濃度検量線の作成方法、二次粒子径測定原理
および機器名、分散状態の画像観察機器名など）h)

エンドトキシン評価方法（ライセート試薬名、感度、製造者）

10.2

調製原液

a)

調製原液 IDb)

濃度およびその標準偏差c)

二次粒子径の計算方法および結果（測定原理および基準、平均粒子径、多分散指数など）

d)

分散状態の画像e)

分散状態の形状（長さ、幅の平均および標準偏差、または分布）f)

エンドトキシン評価結果

10.3

培地調製液（培地調製液を調製する場合）

a)

培地調製液 ID

b)

希釈倍率

10

第Ⅲ章

ナノ炭素材料の分散液試料の調製

附属書 A

実施例：単層 CNT の分散液試料の調製
A.1

概要

eDIPS 法で作製した単層 CNT（eDISP—CNT）から分離精製した金属型単層 CNT および半導体型単層 CNTの動物試験および培養細胞試験で用いる CNT 分散液試料を手順書に従い調製した例を示す。ここでは、
超音波ホモジナイザーを用いて 単層 CNT 濃度が 1 mg/mL である調製原液を調製した。
A.2

分散媒の調製分散剤である BSA には、ナカライテスク（株） 08587-42 を用いた。
蒸留水（ThermFisher SCIENTIFIC、gibco®）に BSA を溶解し、濃度 10 mg/mL の BSA 水溶液を調製した。上記の BSA 水溶液を孔径 0.22 m の滅菌フィルタ（メルク社、GP0.22 m）に通したものを分散
媒とした。
A.3
A.3.1

単層 CNT 分散液の調製
超音波処理

超音波分散には、超音波ホモジナイザーを用いた。
金属型単層 CNT および半導体型単層 CNT を、分散操作時の CNT 濃度が 1.5 mg/mL になるように秤量・採取し、50 mL のビーカーに入れ、滅菌処理した。
A.2 で調製した分散媒（BSA 10 mg/mL 水溶液）50 mL を上記のビーカーに加え、CNT を分散媒に馴染ませた。
7.2 に従い、超音波分散した。ここでは、超音波ホモジナイザーとして Branson SONIFIER 250 を用いた（図 A.1(a)）。
超音波ホモジナイザープローブを上記の CNT 懸濁液に挿入し、ホモジナイザーの出力コントロールを4 に設定し、5 時間、連続で超音波処理を行った（図 A.1(b)）。

(b)

(a)

図 A.1
A.3.2

使用した超音波ホモジナイザー(a)および分散操作(b)

遠心分離およびろ過(a) 遠心強度 6000g で 15 分間遠心分離し、上清を回収した。
11

第Ⅲ章

ナノ炭素材料の分散液試料の調製(b) 目開き 40 m のセルストレーナーに(a)の上清を通過させた。凝集体が無いことを確認し、ろ液を回収した。ここでは、BD FalconTM 製セルストレーナーを用いた。
A.4

調製原液の特性評価

A.4.1

CNT 濃度の評価

本書、第Ⅳ章「ナノ炭素材料の分散液試料の特性評価」のⅣ-4「吸光度によるナノ炭素材料濃度の評価」に従い、金属型単層 CNT および半導体型単層 CNT の分散液の波長 600 nm〜800 nm における平均吸光度から、CNT 質量濃度 CCNT と分散液の吸光度 Aav との関係（検量線）を求めた（図 A.2）。

図 A.2

金属型および半導体型単層 CNT 懸濁液の CNT 濃度と吸光度との関係

A.3 で作製した調製原液の原料の波長 600 nm〜800 nm における平均吸光度を求め、検量線から CNT 濃度を算出した。表 A.1 に示すように、金属型単層 CNT および半導体型単層 CNT 分散液の濃度はそれぞれ、1.38 mg/mL および 1.24 mg/mL であった。有害性試験における調製原液の濃度が 1 mg/mL になる
ように A.2 の分散媒でそれぞれ、濃度調整を行った。
A.4.2

CNT の二次粒子径DLS 法（マルバーン社、ゼータサイザーナノ）で測定したキュムラント平均粒子径 xDLS を表 A.1 に示
す。
表 A.1

CNT 濃度

平均粒子径

CCNT [mg/mL]

xDLS [nm]lg [nm]sg [-]

金属

1.38

786

573

2.32

半導体

1.24

656

533

2.49

ID

単層 CNT

140604-03
140603-03
A.4.3

調製された懸濁液の特性
CNT 長さCNT の長さ分散した CNT の TEM 写真を図 A.3 に示す。使用した TEM は日本電子製 JEM-1010 である。

12

第Ⅲ章

(a) 金属型(b) 半導体型

図 A.3

分散した単層 CNT の TEM 写真

ナノ炭素材料の分散液試料の調製

TEM 写真から、約 1,000 本の CNT に対して長さ l の分布を測定した。個数基準の長さの積算分布 Q0(l)を図 A.4 に示す。また、幾何平均 lg および幾何標準偏差 sg を表 A.1 示す。

図 A.4

A.4.5

分散した単層 CNT の長さ分布

エンドトキシンの確認

第十六改正日本薬局方ゲル化法の限度試験によって調製原液におけるエンドトキシン検出試験を行った。調製原液を 10 倍に希釈した分散液 0.2 mL を感度 0.03 EU/mL であるパイロテル ®(Associates of
CAPECOD Inc.)のシングルテストバイアルに加えよく混合した後、バイアルを恒温槽（水浴）内に入れ、37±1℃で 60±2 分間静置した。恒温槽から取り出したバイアルを 180 度転倒し、ゲル形成について観察した。その際、ゲル形成がないことが確認され、エンドトキシン濃度がパイロテル ®の感度以下であることを確認した。
A.5

培地調製液の調製

BSA 濃度が 1 mg/mL である所定の培地によって調製原液を希釈し、培養細胞試験で使用する培地調製液を調製した。
第Ⅲ章の執筆担当者
遠藤茂寿、丸

順子

13

第Ⅳ章

第Ⅳ章

ナノ炭素材料の分散液試料の特性評価

ナノ炭素材料の分散液試料の特性評価
Ⅳ-１

ゼータ電位の評価

序文
ナノ炭素材料の有害性試験で用いる分散液中における粒子の安定性にとって、粒子表面の帯電状態は非常に重要な特性である。一般に、水溶液中の粒子の帯電状態はゼータ−電位によって評価される。ここでは、ゼータ電位の測定方法を示す。なお、本書、第Ⅳ章の詳細は、「安全性試験手順書」第Ⅳ章「細胞を用いたインビトロ試験のための液中分散試料の特性評価」を参照のこと。
1.

適用範囲

ナノ炭素材料が分散した懸濁液を対象とする。ここでは、電場中における粒子の泳動速度を光散乱によって測定し、懸濁粒子のゼータ−電位を評価する方法について示す。
2.

引用規格および規制

この手順書では以下の規格および規制を参照している。
厚生労働省基発 0331013 号「ナノマテリアルに対するばく露防止等のための予防的対応について」（平
成 21 年 3 月 31 日）
3.

用語および定義

3.1

ゼータ電位

懸濁粒子が液中を移動する時、表面近傍に形成されたイオンの空間分布によって液体が粒子表面に対して滑る面での電位。粒子表面の帯電状態を表す指標として用いられる。
3.2

電気泳動および電気泳動移動度

外部電場の印加に伴う液中での帯電粒子の移動および単位電場あたりの帯電粒子の移動速度。
3.3

電気泳動光散乱（ELS： Electorophorertic Light Scattering）

液体中における粒子の電気泳動による散乱光のドップラーシフトから求めた電気泳動移動度に基づいてゼータ電位を算出する測定方法。
4.

原理

溶媒中に懸濁している粒子またはその凝集体は、表面に正または負の電荷を持つ。こうした帯電粒子が懸濁する系に電場を印加すると、粒子はその帯電状態に応じて移動する。この現象を電気泳動といい、その時の移動速度を単位電場あたりに変換した値が電気泳動移動度である。電気泳動移動度を BEとすると、ゼータ電位は次のスモルコフスキーの式によって求めることができる。



 BE


(1)

14

第Ⅳ章

ナノ炭素材料の分散液試料の特性評価

ここに、および はそれぞれ、溶媒の粘度および誘電率である。従って、帯電状態に分布がある場合には、移動度にも分布があるので、得られるゼータ電位は平均的な値となる。
5.

ＥＬＳ装置

5.1

装置の種類および要件

この手順書は市販のＥＬＳ装置を使用することを前提としている。
ELS 測定として求められる温度制御並びに電気移動度、分散液電導度およびゼータ電位に関するデー
タ出力の機能については、「安全性試験手順書」第Ⅳ章 5.2.3、5.2.4 に従う。
5.2 妥当性確認
標準物質などを使用して装置の妥当性を「安全性試験手順書」第Ⅳ章 5.2.2 に従って確認する。よく値づけされた標準物質を測定し、認証値と測定値とが不確かさの範囲内で一致するかどうかを評価する。認証値または参考値のゼータ電位が提示されている認証標準物質、例えば AIST CRM5702 等を使用
して、装置の妥当性を評価することが推奨される。測定値の認証値からの偏りは±10 ％以内で、繰り返しの再現性は相対実験標準偏差（変動係数）で 10％以下が望ましい。特に電極を直接分散液に液浸させるタイプの ELS では、電極が容易に汚染され測定値に影響を与えるため、頻繁に当操作を実施す
ることが望まれる。
6.

試薬および器具

試薬、洗浄用の溶媒および校正用の標準物質に関しては、本書、第Ⅲ章「ナノ炭素材料の分散液試料の調製」、5 および「安全性試験手順書」第Ⅳ章 6.1、6.2 を参照する。
試料用の容器、試料の観察に使うデジタルカメラおよび粘度計の関しては、「安全性試験手順書」第Ⅳ章 6.3～6.5 を参照する。
7.

操作

7.1

ELS 測定の準備装置の設置および器具の洗浄については、「安全性試験手順書」第Ⅳ章 7.2 を参照する。
試料調製を行う。調製した分散液での沈殿を目視で確認し沈降の度合いを記録する。
測定された電気泳動移動度からゼータ電位の算出に必要な物性値である粘度の測定および分散媒でブ
ランク測定が必要であるが、これらに関しては、「安全性試験手順書」第Ⅳ章 7.2 を参照する。
7.2

測定

7.2.1

技能および測定環境

測定者の技能および測定環境については、「安全性試験手順書」第Ⅳ章 7.2.7.1 および 7.2.7.2 に準
ずる。
7.2.2

ELS 装置の準備「安全性試験手順書」第Ⅳ章 7.2.7.3 に従い、装置の暖機運転をする。
測定を開始する前に測定セルはあらかじめ設定した温度に達していなければならない。また、測定中も温度は規定した温度範囲に収まらなければならない。温度範囲としては±0.3℃以内が推奨される。
7.2.3

測定と解析

装置の手順書に従って測定し解析する。測定の繰り返し精度を評価するため、最低 3 回の繰り返し測

15

第Ⅳ章

ナノ炭素材料の分散液試料の特性評価定を実施することが望ましい。
7.2.4

記録

「安全性試験手順書」第Ⅳ章 7.2.7.4 に従い、測定日時、固体試料および分散液の情報、ELS 装置の情報などの実験条件ならびにゼータ電位や電気移動度などの結果を記録する。
8.

データの解析

報告するゼータ電位の値の算出および不確かさの評価については、「安全性試験手順書」第Ⅳ章 8 に従
う。
9.

報告

9.1

一般的事項並びに装置および実験・解析条件「安全性試験手順書」第Ⅳ章 9.1 および 9.2 に従い、試料に関する情報、ELS 装置に関する情報、並びに ELS の測定条件および解析方法について報告する。
9.2

結果

ゼータ電位およびその繰り返し標準偏差または不確かさを報告する。

16

第Ⅳ章

ナノ炭素材料の分散液試料の特性評価

附属書 A

実施例：ゼータ電位の測定例
A.1

概要

スーパーググロース法で作製した単層 CNT（SG 単層 CNT）を本書、第Ⅲ章「ナノ炭素材料の分散液試料の調製」に従い液中分散した CNT のゼータ電位を評価した。
A.2

分散液試料の調製

調製した分散液は、本書、第Ⅳ章「ナノ炭素材料の分散液試料の特性評価」のⅣ-2「動的光散乱法による粒子径および粒子径分布の評価」、附属書 B で調製したものと同一である。
A.3

ゼータ電位の測定

A.2 で調製した CNT 分散液およびそれを冷蔵庫に 8 日間放置した場合のゼータ電位の変化を求めた例
を図 A.1 に示す。
ELS 測定には、マルバーン社、ゼータサイザーナノを用いた。測定温度は、25℃、測定液体積は 1 mLであった。
また、CNT 濃度が 1 mg/mL の場合、散乱光強度が高いため、超純水によって 20 倍に希釈して測定した。測定回数は 3 回であり、図中のエラーバーは、その標準偏差を示している。

図 A.1

ゼータ電位の測定例

Ⅳ-１の執筆担当者
遠藤茂寿

17

第Ⅳ章

Ⅳ-２

ナノ炭素材料の分散液試料の特性評価

動的光散乱法による粒子径および粒子径分布の評価

序文
ナノ炭素材料の有害性評価において、固体試料の一次粒子径は重要な物理・化学特性であるが、更に、ナノ粒子は一般に、凝集体を形成していることから、その凝集状態を表す二次粒子径も重要な特性である。そこでここでは、有害性試験で用いる分散液中における個体試料の二次粒子径を動的光散乱法
によって評価する方法を示す。なお、この手順書に記載されている事項の詳細は、「 安全性試験手順書」
第Ⅳ章「細胞を用いたインビトロ試験のための液中分散試料の特性評価」を参照のこと。
1.

適用範囲

ナノ炭素材料が水溶液中に分散した懸濁液を対象とする。ここでは、分散液中の一次粒子径および二次粒子径を動的光散乱法によって評価する方法を示す。
2.

引用規格および規制

この手順書では以下の規格および規制を参照している。
JIS Z 8819-1
JIS Z 8828

粒子径測定結果の表現 -第 1 部：図示方法
粒子径解析 - 動的光散乱法

厚生労働省基発 0331013 号「ナノマテリアルに対するばく露防止等のための予防的対応について」（平
成 21 年 3 月 31 日）
3.

用語および定義並びに記号

3.1

用語および定義

3.1.1

粒子径

粒子の形を球に仮定した場合の直径。粒子が真の球であれば、まさにその直径となる。
3.1.2

二次粒子径

強くまたは弱く凝集した粒子、すなわち凝集体の粒子径。
3.1.3

ストークス−アインシュタインの式

ランダムな熱運動よる粒子のブラウン拡散とステークス抵抗とを結び付けた関係。粒子径とブラウン
拡散係数との関係を与える。
3.1.4

動的光散乱法（DLS: Dynamic light scattering）

ブラウン運動する粒子群に照射された光の散乱光の時間的揺らぎから粒子の拡散係数を決定し、ストークス−アインシュタインの式に基づいて粒子径を評価する方法。
3.1.5

キュムラント法DLS において得られる散乱光電場の自己相関関数の対数を級数展開して平均粒子径および多分散指数を求める方法。級数展開で、一次および二次の係数がそれぞれ、平均粒子径および多分散指数に対応する（附属書 A 参照）。
3.1.6

平均粒子径

動的光散乱現象における散乱光強度の変動の相関にもとづいて得られる二次粒子の平均径。

18

第Ⅳ章

3.1.7

ナノ炭素材料の分散液試料の特性評価

多分散指数

粒子径分布の広がりを示す無次元指標。
3.1.8

不確かさ

測定結果の信頼性の低さに関する指標。
3.1.9

変動分率

散乱強度（光子量）の初期の値に対する変化率。
3.2

記号

DBM

粒子の並進拡散係数（ブラウン拡散係数）m2/sg(1)()散乱光電場の相関関数

無次元

PI

多分散指数

無次元

ΔQint,i 粒子径 xi の散乱光強度基準で重みづけた粒子の分率

無次元

x
xDLS

m、nm

粒子径。球形粒子の直径

散乱光強度基準粒子径分布から求められる平均粒子径またはキュムラント法
で求められる平均粒子径

m、nm

Γ

減衰定数

s-1

Γ

減衰定数の散乱光強度基準の平均値

s-1

2

散乱光強度基準の粒子径分布をキュムラント展開したときの 2 次の係 数
s-2


4.

相関時間

s、s

原理

DLS 法は、粒子のブラウン運動を光学的に検出する手法である。ブラウン運動をしている粒子から散乱された光は、時間的に変動する位相（時間変動位相）を含む。長時間にわたる散乱光の位相の時間な変動から、粒子の不規則な運動を表す粒子の拡散係数 DBM が得られ、次のストークス－アインシュ
タインの式から粒子の大きさ x を決定する。
x

k BT
3 DBM(1)

ここに、 kB はボルツマン定数、 T は絶対温度、はその温度における分散媒の粘度である。
5.

平均粒子径および多分散指数の計算

散乱光強度基準による調和平均粒子径（直径）で、次の定義による。
N 1
xDLS   Qint,i i1 xi

1 Qint,i 

i1
N

(2)

ここに、Qint,i は粒子径区間 i における散乱光強度基準の粒子の分率、xi は区間 i に対する粒子径の代表値、 N は全粒子径区間の数である。キュムラント法で求めた値と異なる場合もある。その他、体積基準平均の粒子径 xv、または個数基準（または、数）平均粒子径 xn も装置によって計算される。
粒子径分布の広がりを示す多分散指数 PI は、次の定義による。

19

第Ⅳ章

ナノ炭素材料の分散液試料の特性評価(3)
キュムラント法で求めた値と異なる場合もある。
6.

動的光散乱式粒子径解析装置

6.1

装置の種類および要件

この手順書は市販の DLS 装置を使用することを前提としている。
DLS 測定として求められる温度制御ならびに平均粒子径および粒子径分布の計算、時間相関関数および/またはパワースペクトルのデータ出力については、「安全性試験手順書」第Ⅳ章 5.1.3、5.1.4 に従
う。
6.2

妥当性確認

標準物質などを使用して装置の妥当性を「安全性試験手順書」第Ⅳ章 5.1.2 に従って確認する。例えば、よく値づけされたポリスチレンラテックス標準物質を測定し、認証値と測定値とが不確かさの範囲内で一致するかどうか評価をする。平均粒子径が 100 nm の単分散ポリスチレンラテックス標準物
質を使って装置の妥当性を評価することが推奨される。認証値からの測定値の偏りは±2％以内で、繰り返しの再現性は相対実験標準偏差（変動係数）で 2％以下が望ましい（JIS Z 8828 参照）。
7.

試薬および器具

試薬、洗浄用の溶媒および校正用の標準物質に関しては、本書、第Ⅲ章「ナノ炭素材料の分散液試料の調製」5 および「安全性試験手順書」第Ⅳ章 6.1、6.2 を参照する。
試料用の容器、試料観察に使うデジタルカメラおよび粘度計に関しては、「安全性試験手順書」第Ⅳ章
6.3～6.5 を参照する。
8.

操作

8.1

DLS 測定の準備装置の設置および器具の洗浄については、「安全性試験手順書」第Ⅳ章 7.1.1、7.1.5 に従う。
粒子径の算出に必要な物性値である粘度の測定および分散媒でのブランク測定は、「安全性試験手順書」第Ⅳ章 7.1.4、7.1.6 に従う。
8.2

分散液試料の保管・取扱

事前にナノ粒子が調製された分散液試料の保管および取扱は、「安全性試験手順書」第Ⅳ章 7.1.2、
7.1.3 に従う。
分散試料の入手時および DLS 測定の前後に沈殿の生成の有無を目視で確認し、沈降の度合いを記録する。可能であればデジタルカメラなどを用いて画像として記録する。
8.3
8.3.1

測定
技能および測定環境

測定者の技能および DLS の測定環境については、「安全性試験手順書」第Ⅳ章 7.1.7.1、7.1.7.2 に従

20

第Ⅳ章

ナノ炭素材料の分散液試料の特性評価

う。
8.3.2

DLS 装置の準備「安全性試験手順書」第Ⅳ章 7.1.7.3 に従い、装置の暖機運転をしておかなければならない。
測定を開始する前に測定セルはあらかじめ設定した温度に達していなければならない。また、測定中も温度は規定した温度範囲に収まらなければならない。温度範囲としては±0.3℃以内が推奨される。
8.3.3

測定および解析

各装置の手順書に従って測定し解析する。測定の繰り返し精度を評価するため、最低３回の繰り返し測定を実施することが望ましい。
8.3.4

記録

「安全性試験手順書」第Ⅳ章 7.1.7.4 に従い、実験条件および結果を記録する。
9.

データの解析

9.1値の算出

平均粒子径の報告値は繰り返しの平均値とする。平均値の算出方法は選択できるが、どのように算出したかを報告しなければならない。
9.2

不確かさ評価評価法の妥当性を示すため、「安全性試験手順書」第Ⅳ章 8.2 に従い報告値に対して不確かさを評価することが推奨される。
注記
10.

不確かさの評価の詳細は、「安全性試験手順書」第Ⅳ章、附属書 B を参照する。
報告「安全性試験手順書」第Ⅳ章 9 に従い、試料に関する情報、DLS 装置に関する情報、ならびに DLS 測
定条件および解析方法について報告する。
粒子径測定の結果に関しては以下の報告をする。
a)

散乱強度平均粒子径およびその繰り返し標準偏差または不確かさ

b)

体積基準平均粒子径または個数基準平均粒子径およびその繰り返し標準偏差または不確かさ

c)

散乱強度およびその変動分率並びにその繰り返し標準偏差または不確かさ

21

第Ⅳ章

ナノ炭素材料の分散液試料の特性評価

附属書 A

キュムラント法
動的光散乱現象において、懸濁粒子に照射された光の散乱は粒子のブラウン運動のため、ランダムな位相変化、すなわち、時間変動位相を起こす。
単分散粒子の場合、散乱光電場の変動に関する相関関数 g(1)()は、相関時間 に対して指数減衰をする。

g (1) ( )  exp  



(A-1)

ここに、減衰定数は拡散係数 DBM と比例し、ストークス−アインシュタインの式に基づいて粒子径が求められる。
多分散粒子の場合、相関関数 g(1)()は粒子径分布で重みづけられた相関関数の組み合わせと考えることができる。キュムラント法では電場の相関関数 g(1)()の対数を二次の項まで級数展開近似する。

ln g (1) ( )    

2
2

2

(A-2)

一次の係数  は平均の減衰定数であり、平均粒子径が求められる。また、二次の係数 2 から多分散指
数 PI が次式によって求まる。
PI  2 2  2

(A-3)

22

第Ⅳ章

ナノ炭素材料の分散液試料の特性評価

附属書 B

実施例：単層 CNT の粒子径の評価
B.1

概要

本書、第Ⅲ章「ナノ炭素材料の分散液試料の調製」に従い調製した分散液試料中のスーパーググロー
ス法で作製した単層 CNT（SG 単層 CNT）の粒子径を評価した。
B.2
B.2.1

分散液試料の調製
分散媒

蒸留水（ThermFisher SCIENTIFIC、gibco®）に BSA を溶解し、濃度 10 mg/mL の BSA 水溶液を調製し、分散媒とした。
B.2.2

超音波分散

50 mL のビーカーに秤量・採取した 70 mg の SG 単層 CNT に B.2.1 で調製した分散媒（BSA 10 mg/mL
水溶液）50 mL を加え、本書、第Ⅲ章 7.2.2 に従って分散し、分散液を作製した。CNT 濃度は 1mg/mL である。
B.3

DLS 測定DLS 測定には、マルバーン社、ゼータサイザーナノを用いた。DLS 測定温度は 25℃で、測定液体積は700 L であった。ここで調製した分散液の CNT 濃度は 1 mg/mL であり、散乱光強度が高いため、超純水によって希釈した試料に対して測定を行った。図 B.1 に、B.2 で調製した CNT 分散液およびそれを冷蔵庫に 8 日間放置した試料におけるキュムラント法により求めた平均粒子径(a)および多分散指数(b)の測定結果を示す。DLS の測定回数は 3 回であり、図にはその平均をキーで、その標準偏差を
エラーバーで示してある。

図 B.1

平均粒子径および多分散指数の測定例

Ⅳ-２の執筆担当者
遠藤茂寿
23

第Ⅳ章

Ⅳ-３

ナノ炭素材料の分散液試料の特性評価

微分型遠心沈降による粒子径および粒子径分布の評価

序文
液体中に分散されたナノ炭素材料の特性を評価する手順を示す。ここで評価する特性とは、粒子径分布を指す。また本手順書における測定法は、微分型遠心沈降法とする。

1. 適用範囲
測定の対象は液体中に分散されたナノ炭素材料凝集体である。

2. 引用規格
この手順書では以下の規格を参照、または引用している:
JIS Z8823-1 :2001 液相遠心沈降法による粒子径分布の測定方法-第 1 部：測定原理および指針
JIS Z8823-2：2016 液相遠心沈降法による粒子径分布の測定方法-第 2 部：光透過式遠心沈降法

3. 用語、定義、および記号
3.1 用語、および定義(計測法)
3.1.1 微分型遠心沈降(DCS: Differential Centrifugal Sedimentation)
ある密度の溶液の表面に粒子試料を積層したとき、試料中の粒子の沈降速度が粒子径に依存すること
よりサイズ分離を行う方法。
3.1.2 校正物質装置で試料を測定する際に、あらかじめ粒子径が既知の標準物質を使用して装置で測定される粒子径の補正を行う。その補正に使用する標準物質を校正物質と呼ぶ。
3.1.3 終末沈降速度
粒子に作用する遠心力と流体抗力が釣り合った状態で、静止液中を移動する粒子の速度。
3.1.4 粒子径(ストークス径) D
実際に沈降する粒子と同一の密度、沈降速度をもちストークスの法則を満たす球形粒子に相当する径。
3.1.5 粒子径分布、およびメジアン径
粒子径分布は粒子径に対する質量分布である。メジアン径は得られた質量分布を積算し、頻度の累積が 50％になる粒子径である。
3.1.6 ディスク
DCS 装置において試料を遠心沈降速度によりサイズ分離を行うチャンバー。
3.1.7 密度勾配液

24

第Ⅳ章

ナノ炭素材料の分散液試料の特性評価

ディスク内の溶液よりも密度の大きい試料粒子をディスクに積層すると、粒子はストークスの法則どおり沈降せず、試料全体が均一な溶液となって沈降する現象が起こる。試料をストークスの法則どおりに沈降させるため、ディスク内の溶液に密度勾配をつける。この溶液を密度勾配液と呼ぶ。

3.2 記号

D

粒子径(ストークス径) µm

D 50

メジアン径 µm

4 原理
液中に分散された ナノ炭素材料 分散液において、粒径の大きいものは遠心力による沈降速度が大きく、粒径の小さな粒子は沈降速度が小さい。この現象を利用し、DCS 回転ディスクチャンバー内において粒子径に依存したディスク底部付近の検出部までの移動時間の違いが現れ粒径分級することができる。 この時の粒子の速度 v は Stokes 式の重力加速度を遠心加速度に置き換えることにより、以下の式で表すことができる。
⁄/18

ここで、 D は試料の粒径、R は半径方向の距離、 t は時間、 ρ、 ρ 0 はそれぞれ粒子および液体密度、 ωは角速度、η は液体粘度である。この式より、粒子が液体表面（R = R0） から検出部（R =Rf）まで移動するのに要する時間から粒径を求めることができる。
18 ln

⁄

⁄

/

5. 装置
5.1. 装置の種類
本手順書は市販の DCS 装置を使用することを前提としている。
5.2 妥当性確認
標準物質などを使用して装置の妥当性をあらかじめ確認する。たとえば、よく値づけされたポリ塩化
ビニルラテックスやポリスチレンラテックス標準物質を測定し、認証値と測定値が不確かさの範囲内で一致するかどうか評価をする。例えば平均粒子径が 500nm 程度 の単分散ポリ塩化ビニルラテック
ス標準物質を使って装置の妥当性を評価することが推奨される。測定値の認証値からの偏りは±10%以内で、繰り返しの再現性は相対実験標準偏差で 10%以下が望ましい。
5.3 出力データ
装置は、質量基準粒子径分布および質量基準メジアン径が計算でき、その結果を出力する機能を持たなければならない。

25

第Ⅳ章

ナノ炭素材料の分散液試料の特性評価

6. 試薬と器具
6.1 試薬ディスクを洗浄したり、希釈したりするための溶媒は微粒子、特に分散試料中の粒子よりも大きな微粒子を含まない清浄なものでなければならない。例えば、分散に使う溶媒を水にするのであれば、フィルタによりろ過されたいわゆる超純水を使用するとよい。
備考:この手順書では「超純水」を、「イオン交換フィルタや 0.2 μm 以下のフィルタで精製された、電気抵抗率 18 MΩ･cm 以上で有機炭素濃度が 5 ppb 以下の微粒子を含まない清浄な水」と定義しておく。
6.2 標準物質
標準物質の特性値に対してトレーサビリティーが明言されているものを使用することが望ましい。
粒径標準物質として水に分散された 500 nm 程度のポリスチレンラテックスを使用することが推奨される。ただし、ポリスチレンラテックスは比重が低く、ナノ炭素材料凝集体の測定に用いる条件では測定できない。そのため、測定条件を合わせる場合は、トレーサビリティーが明言されている粒子により値付けされている、ポリ塩化ビニルラテックスを使用する。どちらの標準物質も、凍らせたりして会合や沈殿が起きないように注意すべきである。
備考:この標準物質は測定時の校正物質としても使用する。
備考: ポリスチレンラテックスを標準物質として使用する際は、密度勾配液の条件を変えて行うとよい。
6.3 密度勾配液
ディスク内の溶液として密度勾配液を作製し、ディスク内の溶液密度を試料の沈降方向に向かって連続的に増加させる。密度勾配液としてショ糖水を使用する。
6.4 器具通常の容器を使用してよい。測定時の分散試料のディスクへの注入は、通常市販のシリンジを利用することで問題ない。

7. 操作
7.1 装置の設置
装置は、清浄な環境に設置されるべきである。また、電気ノイズ、機械的振動、または直射日光などを避けなければならない。
警告: DCS 装置は光源として目に障害を与えうるレーザー光を使用している。入射光を直接見ない
ように、また、反射光が目に入らないようにしなければならない。設置されている場所に適用される安全規定を遵守しなければならない。
7.2 DCS 測定に用いる器具の洗浄

26

第Ⅳ章

ナノ炭素材料の分散液試料の特性評価

通常の使い捨て(ディスポーザブル)のシリンジを使用することが推奨される。汚染が確認された測定器具などは使用しない。
7.3 測定7.3.1 技能DCS 装置は、よく訓練され適切に操作できる者によって操作されなければならない。測定技量の有無は、例えば粒子径標準物質の認証値と一致する値を報告できるかどうかなどであらかじめ評価しておくべきである。
7.3.2 測定環境
装置は清浄な環境に設置されることはもちろん、器具を取り扱う環境、試料調製を行う環境、または測定者の実験衣なども清浄であることが推奨される。特に水は測定の邪魔をする塵埃を取り込みやすいので注意が必要である。
7.3.3 DCS 装置の準備
安定したデータを取得するため測定前に装置の暖機運転をしておかなければならない。レーザーの安定度はレーザー装置の種類によって大きく変わるが、レーザー強度を安定させるため、通常は 15 ～30 分間の暖機運転が必要とされる。
7.3.4 測定と解析
分散試料は測定前、冷蔵（4℃） で静置保存して撹拌を避ける。測定時は、遠沈管を振らずに液面
1cm 程度の部分から分散試料をシリンジで採取する。
装置の手順書に従って測定し解析する。
7.3.5 記録
以下の実験条件を記録する:分散試料の情報、測定時刻、測定時間、装置の回転速度、使用密度勾配
液、使用校正物質など。
以下の結果を記録する: 装置の測定結果(時間 vs. 吸光度)から、解析により算出された粒子径分布（粒径 vs.質量）および積算粒子径分布曲線より求められたメジアン径

8. 報告
以下の事項を報告する。:
8.1 一般a) 分散試料を特定するための詳細情報(例:粒子試料の情報、分散試料の入手日、搬送方法)b) 測定日、測定者名、および測定機関名c) 装置の妥当性確認に用いた標準物質の情報(生産者名も含む)、および妥当性確認を実施した日付
d) 分散試料の保存条件(例:保存温度、保存場所、保存期間)
8.2 装置および実験・解析条件

27

第Ⅳ章

a) 装置名、型式、および製造者名b) 妥当性確認に用いた粒子径標準物質等と確認の結果
c) ディスク等の洗浄条件
d) 希釈した場合は希釈に用いた試薬の情報e) 可能な場合は分散試料中の粒子試料濃度f) 分散液の屈折率 (文献値の場合は、文献情報)g) ディスクに入れた分散試料の容量h) 報告値の算出方法(例:平均の方法)
8.3 結果a) 質量基準粒子径分布および質量基準メジアン径28ナノ炭素材料の分散液試料の特性評価

第Ⅳ章

ナノ炭素材料の分散液試料の特性評価

附属書 A

実施例: 単層 CNT 試料における DCS 計測結果例

図 A.1 に eDIPS 単層 CNT の培地分散試料における DCS による粒子径分布例を示す。メジアン径は0.028μm となった。

40(0.028, 50.1)

20

50Integrated Y3

Weight (g/m)

100(0.235, 0.014)

0

0
0.01

0.1

1

10

Diameter (m)

図 A.1

eDIPS 単層 CNT の培地分散試料における DCS による粒子径分布

Ⅳ-３の執筆担当者
岡崎俊也、田島奈穂子

29

第Ⅳ章

Ⅳ-４

ナノ炭素材料の分散液試料の特性評価

吸光度によるナノ炭素材料濃度の評価

序文
有害性試験における重要な特性の一つである分散液試料中の粒子濃度の評価方法を示す。また、詳細に関しては、「安全性試験手順書」第Ⅴ章「カーボンナノチューブ分散液試料中の濃度評価」を参照の
こと。
1.

適用範囲

有害性試験に用いるナノ炭素材料が分散した懸濁液を対象とする。懸濁液中のナノ炭素材料の濃度を可視域での吸光度によって評価する方法について示す。
2.

引用規格および規制

この手順書では以下の規格および規制を参照している。
厚生労働省基発 0331013 号「ナノマテリアルに対するばく露防止等のための予防的対応について」（平
成 21 年 3 月 31 日）
3.

用語および定義3.1

吸光度

試料液に照射された光が吸収媒体によってどの程度減衰するかを示す量。波長λの光が強度 I0 で試料に照射された時、透過光の強度が I である場合の吸光度 Aλは、次の定義による。

A  log I I 0(1)

ここに、対数は常用対数である。吸光度はランバート−ベールの法則に従い、吸収媒体の濃度に比例する。
3.2

紫外可視吸収分光（UV-Vis absorption Spectroscopy）

吸収媒体に分光した紫外光および可視光を照射したとき、観測されたその透過光からランバート−ベールの法則に従って吸光度を算出する測定方法。
3.3

試料分散液

ナノ炭素材料が分散した懸濁液。
3.4

標準分散液

ナノ炭素材料の濃度が既知である懸濁液。検量線の作成に用いる。
3.5

分散媒

ナノ炭素材料を懸濁するための媒液。ナノ炭素材料を分散するための分散剤を含む。また、試料分散液の希釈にも用いる。
4.

原理

液体中に分散されたナノ粒子またはその凝集体に光を照射すると、物質に応じた特定波長の光が吸収され、透過光は入射光とは異なる波長分布を持つ。このとき、吸収される光強度はランバート−ベール

30

第Ⅳ章

ナノ炭素材料の分散液試料の特性評価の法則に従い、物質の濃度と比例的な関係をもつ。そこで透過光強度と入射光強度から吸光度を測定
し、次のランバート−ベールの式から粒子濃度 C が決定される。

A  Cl(2)

ここに、 は吸光係数、 l は光路長である
5.

装置および器具

5.1

ナノ炭素材料濃度測定装置

5.1.1

紫外−可視吸収分光器

吸光度からナノ炭素材料濃度を評価する装置で、紫外—可視域（UV-Vis）吸収分光器が用いられる。この手順書は市販の UV-Vis 吸収分光器を使用することを前提としている。
5.1.2

妥当性の確認「安全性試験手順書」第Ⅴ章、5.1.2 を参照する。
5.1.3

温度制御

「安全性試験手順書」第Ⅴ章、5.1.3 を参照する。
5.2

分散装置

ナノ炭素材料の濃度が既知である標準分散液の調製に用いる。この場合、ナノ炭素材料を分散媒中に十分に分散する必要があり、超音波ホモジナイザーが適する。
5.3

器具

通常の容器や分注器を使用してよい。ただし、分散試料の物理化学的状態（例えば pH）を変化させる
容器や器具を使用しない。例えば、通常のソーダガラス器具が pH を変化させる可能性があるため、石英製を使用することが望ましい場合がある。
6.

試薬

6.1

分散剤

ナノ炭素材料の有害性試験試料の調製に使用するウシ血清アルブミン（BSA）を分散剤として用いる。
6.2

分散媒とその調製

BSA を 10 ㎎/mL で蒸留水中に溶解する。この BSA 水溶液を 0.22μm 滅菌フィルタに通して除菌したものを分散媒として用いる。
注記

蒸留水の他、純水製造装置で精製した後、エンドトキシン除去フィルタを通過した純水を用いることもできる。

6.3

標準物質

標準物質の特性値に対してトレーサビリティーが明言されているものを使用することが望ましい。校正用フィルタならば、たとえば JCSS で校正証明書が発行されているフィルタ、且つ、測定する波長付
近を校正できるフィルタを選択することが推奨される。
7.

操作

7.1

装置の設置

「安全性試験手順書」第Ⅴ章、7.1.1 を参照する。

31

第Ⅳ章

7.2

ナノ炭素材料の分散液試料の特性評価

標準分散液の調製「安全性試験手順書」第Ⅴ章、7.1.3 を参照し、以下の手順で調製する。
a)

所定量のナノ炭素材料を入れたビーカーに、6.2 で調製した分散媒を所定量、加える。

b)

ナノ炭素材料を分散媒に十分、馴染ませる。

c)

ナノ炭素材料を BSA 水溶液に懸濁した分散液に超音波ホモジナイザーの超音波発信ホーンを直接挿入する。この時、ビーカー内の液が最も循環する様に目視によって確認しつつホーン位置を
調整する。

d)

超音波を所定の時間、連続照射し、ナノ炭素材料を十分、分散する。

e)d)で得た標準懸濁液を分散媒により適当な比率で希釈し、濃度の異なる一群の標準懸濁液を作製
する。

注記 1

分散操作における最適な超音波の出力については、ナノ炭素材料の分散効果とともに、容器およびホーンの破損・摩耗並びにナノ炭素材料の損傷を考慮して、あらかじめ検討しておく。

注記 2

超音波処理の間、分散液の温度上昇を抑えるため、適宜、ビーカーを氷で冷却する。

警告

大気からのコンタミおよび懸濁液の飛散による暴露を避けるため、超音波処理はクリーンベ
ンチ内で行う。また、マスクおよび手袋の個人用保護具を使用して作業する。

7.3

測定に用いる器具の洗浄「安全性試験手順書」第Ⅴ章、7.1.4 を参照する。
7.4

測定

7.4.1

一般

測定者の技能および測定環境は、「安全性試験手順書」第Ⅴ章、7.1.6.1 および 7.1.6.2 を参照する。
測定の繰り返し精度を評価するため、最低 3 回の繰り返し測定を実施することが望ましい。また、試料分散液の測定は校正用の標準分散液と同一の測定条件（たとえばバンド幅）で行う。
7.4.2

装置の起動およびブランク測定

測定装置の起動・操作は、装置マニュアルに従う。
a)

ナノ炭素材料濃度測定装置を起動する。

b)「安全性試験手順書」第Ⅴ章、7.1.6.3 を参照し、装置を安定な状態にする。

c)「安全性試験手順書」第Ⅴ章、7.1.5 を参照しブランク測定を行う。分散媒を用いて測定波長域における装置のベースラインを調整する。また、シングルビームの場合には、分散媒を参照試料として I0 を測定する。

7.5

検量線の作成7.2 で調製した一群の標準分散液の可視域における吸光スペクトルをナノ炭素材料濃度測定装置で測定する。検量線に用いる吸光度は、次の手順で求める。
a)

任意の標準分散液に対して、紫外から可視域（波長 : 200 nm〜800 nm）における透過光強度 Iを測定する。200 nm〜800 nm における I/I0 から、その吸光度 Aを求める。

b)

分散媒の吸光の影響がない波長範囲、 1〜2 における平均の吸光度 Aav を算出する。ここで、平均の吸光度は次による。
Aav 

1

2  1

2

  A d 

(3)

1

32

第Ⅳ章

ナノ炭素材料の分散液試料の特性評価

c)

一群の標準分散液のナノ炭素材料濃度と吸光度 Aav との関係から検量線を作成する。

7.6

試料分散液中のナノ炭素材料濃度の評価

濃度が未知であるナノ炭素材料懸濁液試料中のナノ炭素材料濃度は、紫外—可視 UV-Vis 領域における吸光度に基づいて評価する。測定は次による。
a)

波長範囲 1〜2 における懸濁液の吸光度が 3 未満であることを確認する。3 以上の場合には、分散媒によって試料を希釈する。

b)

濃度測定装置によって測定試料の吸光スペクトルを測定し、波長範囲、1〜 2 における平均の吸光度 Aav を式(2)によって算出する。

c)6 で作成したナノ炭素材料の質量濃度と懸濁液の吸光度との関係（検量線）から、ナノ炭素材料濃度を算出する。希釈した場合は、原液の濃度に換算する。

7.7

記録

a)

以下の実験条件を記録する：分散試料の情報、測定時刻、測定時間、分散試料の温度など。

b)

以下の結果を記録する：装置等により計算された UV-Vis 吸収スペクトルなど。

8

データの解析

試料分散液の濃度値の算出および不確かさの評価については、「安全性試験手順書」第Ⅴ章 8.に準じ、「安全性試験手順書」第Ⅴ章、附属書 C を参照のこと。
9.

報告

9.1

一般的事項並びに装置および実験・解析条件「安全性試験手順書」第Ⅴ章、9.1 および 9.2 に準じて、一般的事項並びに装置および実験・解析条
件を報告する。
9.2

結果

算出濃度およびその繰り返し標準偏差または不確かさを報告する。

33

第Ⅳ章

ナノ炭素材料の分散液試料の特性評価

附属書 A

実施例：CNT 濃度の測定
A.1

概要

eDIPS 法で作製した単層 CNT（eDISP—CNT）の有害性試験のために調製する試料の濃度評価に用いる検量線の作成例を示す。
A.2

分散媒の調製分散剤である BSA にはナカライテスク（株）、08587-42 を用いた。
蒸留水（ThermoFisher SCIENTIFIC、gibco®）に BSA を溶解し、濃度 10 ㎎/mL の BSA 水溶液を調製した。
上記の BSA 水溶液を孔径 0.22μm の滅菌フィルタ（メルク社、GP0.22μm）に通したものを分散媒とし
た。
A.3
A.3.1

標準分散液の調製および検量線の作成
超音波分散

単層 CNT は eDISP—CNT（B033）である。eDISP-CNT、 5 mg を 50 mL のビーカーに採取した。
A.2 で調製した分散媒（BSA 10 mg/mL 水溶液）50 mL をビーカーに入れ、7.2 の手順で一群の標準分散液を作製した。
分散には超音波ホモジナイザーBranson SONIFIER 250 を用いた。
超音波ホモジナイザープローブを上記の CNT 懸濁液に挿入し、ホモジナイザーの出力コントロールを4 に設定して超音波処理を行った。
A.3.2

CNT 濃度評価の検量線の作成

0.1 mg/mL の CNT 濃度で調製した標準分散液を 10 mg/mL の BSA 水溶液によって適宜希釈した標準分散液の UV-Vis 吸光スペクトルを図 A.1 に示す（島津製作所、UV-2550 で測定）。

図 A.1

eDIPS-CNT 懸濁液の UV-Vis 吸光スペクトル
34

第Ⅳ章

ナノ炭素材料の分散液試料の特性評価

波長 600 nm〜800 nm における平均吸光度から、CNT 質量濃度と懸濁液の吸光度との関係（検量線）を求めた（図 A.2）。

図 A.2

CNT 質量濃度と懸濁液の吸光度との関係（検量線）

eDISP-CNT の質量濃度 CCNT と波長 600 nm〜800 nm における平均吸光度 Aav との間に図の様な原点を通る直線関係が得られ、CNT の質量濃度は次の関係で与えられた。

CCNT  18.1Aav(A-1)

上の式（A-1）を用い、濃度未知である eDISP-CNT の懸濁液の濃度を評価した。
Ⅳ-４の執筆担当者
遠藤茂寿、丸

順子

35

第Ⅴ章

第Ⅴ章
Ⅴ-１

動物組織中のナノ炭素材料の分析

動物組織中のナノ炭素材料の分析
紫外可視吸収スペクトルによる分析

序文
呼吸器などから動物の体内に侵入したナノ炭素材料が生体組織に残存・排出する挙動を把握すること
はナノ炭素材料の安全性を検討する上で重要である。そのためには主要な侵入経路である呼吸器官におけるナノ炭素材料を定量的に検出・評価することが必要である。
ここでは、実験動物の吸入暴露や気管内注入による動物試験で肺内に入ったナノ炭素材料や肺以外の生体組織に移行したナノ炭素材料を分光学的に測定する手法を記載する。定量においては、酵素による生体組織の分解を超音波照射によりさらに促進することで、有機炭素など夾雑物からの影響を除き、ナノ炭素材料だけを定量する。
1.

適用範囲

動物試験でラットの肺内に投与されたナノ炭素材料を、肺などの生体組織を酵素反応によって分解した後、分解液の吸光度から測定する手法を示す。また、生体組織の酵素反応・分解を超音波照射によって促進する方法も示す。この方法は、気中吸入暴露試験における生体組織のナノ炭素の定量に対しても適用可能である。
2.

引用規格および規制

この手順書では以下の規格および規制を参照している。
厚生労働省基発 0331013 号「ナノマテリアルに対するばく露防止等のための予防的対応について」（平
成 21 年 3 月 31 日）
3.

用語

3.1

タンパク質分解酵素

生体組織を分解するために使用する酵素。
3.2

界面活性剤

生体組織の酵素分解において、タンパク質を酵素溶液に溶解し、酵素反応を促進するための溶媒。
4.

装置

4.1

超音波バス

生体組織を酵素分解するために用いる装置で、超音波照射によって酵素分解反応を促進する。
4.2

容器

50 mL のガラス製バイアルで、酵素分解操作での試料容器として用いる。
4.3

紫外—可視域（UV-Vis）吸光度測定装置

36

第Ⅴ章

動物組織中のナノ炭素材料の分析

分解液の紫外—可視域（UV-Vis）での吸光スペクトル（吸光度）からナノ炭素材料濃度を測定する。
4.4

メスシリンダー

生体組織分解液中のナノ炭素濃度から含有量を算出するために分解液の体積を測定する。生体組織の体積によって、5〜50 mL のものを使用する。
5.
5.1

分解用試薬
界面活性剤

ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を純水製造装置で精製した純水中に適当な濃度（100 mg/mL）で溶解した水溶液を調製する。
5.2

タンパク質分解酵素

Proteinase K を用いる。水溶液状であれば酵素活性が 600 U/mL 以上を用いる。粉末状の場合、酵素活性が 30 U/mg 以上のものを水に溶解して用いる。
6.

生体組織の前処理−小片化

対象とする生体組織の秤量後、バイアルに肺を入れ、はさみなどで小片化する。
警告

大気からのコンタミや飛散を避けるため、操作はクリーンベンチ内で行う。また、マスクおよび手袋の個人用保護具を使用して作業する。

7.
7.1

生体組織の分解
酵素および分散剤添加

6.で準備したバイアルに、所定量の酵素液および界面活性剤を添加する。それぞれは、分解対象である組織の質量に対してあらかじめ決めた量を添加する（附属書参照）。
バイアルの蓋を強く閉める。
7.2

超音波バスによる分解

バイアルを超音波バスの所定の位置に設置する。超音波バスの液高さをバイアル中の懸濁液の液面で最も強い共振が得られるように調整してから超音波照射によって所定の時間、酵素分解する。
超音波照射により浴液の温度上昇が起きる。酵素反応速度と酵素失活との関係を考慮し、37℃〜50℃になるように浴温を制御する。
分解後、バイアル内に固体状の組織が残存するかを目視で確認する。もし、固体状の組織が残る場合には、固体が確認できなくなるまで超音波照射を継続する。
注記 1 超音波照射を効果的にするためには、バイアルを超音波バスの水が最も激しく振動している超音波発信子のほぼ直上に設置する。
注記 2 超音波照射中、バイアルの蓋が取れないように注意を払う。また、容器の破損・摩耗について
注意する。
7.3

分解液体積の測定

生体組織中のナノ炭素含有量を算出するため、分解液体積 V をメスシリンダーにより測定する。
8.

ナノ炭素量の測定

37

第Ⅴ章

8.1

動物組織中のナノ炭素材料の分析

概要

以下の 8.2 および 8.3 の操作は、総合手順書「ナノ炭素材料の液中分散液試料の特性評価(3)—吸光度によるナノ炭素材料濃度の評価（以下、濃度評価手順書）」、 7.4 に記述する UV-Vis 領域における吸光度の測定に従う。
8.2

バックグランドの確認

生体組織におけるナノ炭素の評価に先立って、ナノ炭素を含まない生体組織を 7 の手順に従って分解
し、分解液の吸光スペクトルを UV-Vis 吸光度測定装置によって手順 8.4 に従って測定する。分解液
中のナノ炭素以外の夾雑物由来である吸光度 Ab を求める。
8.2

ナノ炭素量に関する検量線の作成

生体組織分解液中のナノ炭素量を評価するため、分解液における吸光度 AC とナノ炭素濃度 CC との検量線をあらかじめ作成する。検量線測定に用いるナノ炭素濃度が既知である標準分散液の作製は、濃度評価手順書、 7.2 に従う。
検量線は、濃度評価手順書、7.5 に従って作成し、次の関係を得る。

CC  kAC(1)

ここに、 k は、ナノ炭素に依存した比例係数である。
8.3

分解液中のナノ炭素量の測定対象とする生体組織を 7 の手順に従って分解し、分解液の吸光度 A を UV-Vis 吸光度測定装置によって次の手順 8.4 に従って測定する。
8.4

吸光度の測定手順

分解液の可視域における吸光スペクトルを UV-Vis 吸光度測定装置で測定する。
（ 濃度評価手順書、7.4参照。）
吸光度の測定は、次の手順による。なお、測定装置の操作は、装置マニュアルに従う。
a)

装置を起動する。

b)

純水を用いて測定波長域における装置のベースラインを調整する。また、シングルビームの場合には、分散媒を参照試料として I0 を測定する。

c)

紫外から可視域（波長 : 200 nm〜800 nm）における透過光強度 I を測定する。200 nm〜800 nm
における I/I0 から、その吸光度 Aλ を求める。

d)

分散剤の吸光の影響がない波長範囲、 1〜2 における平均の吸光度 Aav を算出する。ここで、平均の吸光度は次による。
Aav 

2
1
A d


2  1 1 (2)

ここに、 1=700 nm、 2=800 nm である。
e)

式(2)で算出した平均吸光度 Aav を 8.1 および 8.3 の吸光度 Ab および A とする。

8.5

ナノ炭素濃度の評価8.4 で求めたナノ炭素を含む分解液の吸光度 A からバックグラウンド Ab を差し引いた吸光度

AC=A-A b(3)

を、式(1)に代入し、ナノ炭素濃度を求める。更に、生体組織中のナノ炭素含容量 MC は、分解液体積から次式で推定する。

38

第Ⅴ章

MC =C CV

動物組織中のナノ炭素材料の分析

(4)

9.

報告

9.1

一般

a)

生体組織試料を特定するための詳細情報（例：生体組織試料の情報、動物試験の概要、生体組織試料の入手日、搬送方法）b)

生体組織試料の保存条件（例：保存温度、保存場所、保存期間など）c)

生体組織試料に関する目視観察の結果（例：デジタルカメラによる画像）

9.2

組織の分解および実験・解析条件a)

超音波発生装置名、型式および製造者名b)

分解に用いた酵素の情報（酵素名、酵素活性、添加量）

c)

酵素活性向上に用いた界面活性剤の情報（界面活性剤名、濃度、添加量）

d)

酵素分解反応に関する情報（分解時間、温度）e)

組織質量およびその分解液体積9.3

ナノ炭素濃度測定装置および実験・解析条件a)

装置名、型式および製造者名b)

妥当性確認に用いた標準物質等および確認の結果

c)

測定セルの情報d)

希釈した場合は希釈に用いた試薬の情報e)

バックグラウンドの吸光度および 700 nm〜800 nm における平均吸光度e)

分解液の吸光度および 700 nm〜800 nm における平均吸光度f)

報告値の算出方法（例えば、ナノ炭素濃度の算出方法）g)

不確かさの算出方法または必要に応じて資料の出典

h)測定繰返し回数

9.4

結果

a)

ナノ炭素含有量およびその繰り返し標準偏差または不確かさ

39

第Ⅴ章

動物組織中のナノ炭素材料の分析

附属書 A

生体組織の分解および組織内ナノ炭素量の測定例
A.1

概要

eDIPS 法で作製した単層 CNT（eDISP—CNT）をラットの気管内に投与した試験において採取された肺内の CNT を手順書に従い測定した例を示す。
A.2

界面活性剤の調製

界面活性剤には SDS（和光純薬）を用いた。
純水製造装置（Millipore 社、Milli-Q）で精製した純水を用いて濃度 100 ㎎/mL の SDS 水溶液を調製した。
A.3

タンパク質分解酵素

Proteinase K（関東化学）を用いた。酵素活性は、700 U/mL（酵素質量濃度では 20 mg/mL）であった。
A.4
A.4.1

肺組織の酵素分解
肺組織および小片化

気管内投与された 9 週齢である Wistar ラット（雄）の左右肺一対を対象とした。
あらかじめ、対象の肺を秤量し、質量 L を求めた。
肺を 50 mL のバイアルに入れ、はさみによって小片化した（図 A.1）。

図 A.1
A.4.2

分解前の CNT が気管内投与されたラットの肺酵素および分散剤の添加

A.3 の酵素の添加量 E (mL)は、肺質量 L (g)に対して次によった。

E  L6(A.1)

A.2 で調製した SDS 濃度 100 mg/mL である界面活性剤の添加量 D (mL)は、次によった。

DE/4

(A.2)

上記の量の酵素溶液および分散剤溶液をバイアルに添加した。
A.4.3

肺組織の超音波—酵素分解

あらかじめ、水の高さを調整した超音波バス（BRANSON 5510-MT、70 W、42 kHz）に A.4.2 のバイアル
40

第Ⅴ章

動物組織中のナノ炭素材料の分析を設置し、超音波を 5 時間、照射し、肺を酵素分解した（図 A.2）。この時、温度が 37〜50℃になるよ
うに制御した。

図 A.2
A.5

超音波—酵素分解後の肺分解液

CNT 濃度の評価

分解液の UV-Vis の吸収スペクトルを島津製作所製 UV-2550 で測定した。図 A.3 (a)に気管内投与されていない肺分解液の吸収スペクトル（標本数３）を示す。分解液では未分解の組織は認められなかった。また、700 nm〜800 nm における平均吸光度は、0.01 程度で非常に低い。図 A.3 (b)に、高用量および低用量で気管内投与された肺分解液の吸収スペクトルを示す。何れの分解液においても、未分解の組織は認められず、組織由来の固形物による吸光は無視できると考える。390 nm〜400 nm の吸収は、肺に残留した血液（ヘモクロビンのヘム錯体）由来の吸収と考えられる。その吸光度と CNT 含有量評価に用いた 700 nm〜800 nm の平均吸収度との間で相関関係は認められなかった。700 nm〜800 nm の
平均吸収度から分解液中における CNT 濃度を、あらかじめ求めておいて検量線から求め、各肺での CNT含有量に換算した。

図 A.3

肺分解液の吸収スペクトル(a): 気管内投与されていない肺; (b): 気管内投与された肺投与後の時間経過に伴う肺内の CNT 残存量を、上記の手順で評価した結果を図 A.4 に示す。ここに、エラーバーは、標本数５での標準偏差を示す。

41

第Ⅴ章

図 A.4

気管内投与後の肺内における CNT 含有量の推定値

Ⅴ-１の執筆担当者
遠藤茂寿、丸動物組織中のナノ炭素材料の分析

順子

42

第Ⅴ章

Ⅴ-２

動物組織中のナノ炭素材料の分析

炭素分析

序文
動物組織中の CNT 濃度を評価する手順について示す。本手順には、グルコース等を用いて作成した検量線による炭素量の濃度測定と、対象の CNT を用いて作成した検量線による CNT 量の濃度測定がある。
1.

適用範囲

測定の対象は動物組織中に存在している CNT である。
2.

引用規格および規制

本書では、参照、または引用している規格および規制はない。
3.

用語、および定義

3.1 非分散型赤外線吸収分析法（Non Dispersive infrared spectrometry）
二酸化炭素を赤外線吸収により計測する手法。
4

装置・器具

4.1 ホットプレート
酸処理用容器中の酸液を加熱することのできるもので、±10℃程度の温度調整能を有し、最高温度
200℃まで達する能力のあるもの。
4.2 マイクロ波分解装置
マイクロ波を照射して、容器内の試料を加圧下で直接加熱することで、試料中の有機炭素成分を分解するための装置。
4.3 酸処理用容器
石英ガラス製などの耐熱性かつ耐酸性を有する 100 mL のビーカーと蓋としての時計皿。もしくは、ガラス製などの耐熱性かつ耐酸性を有するマイクロ波分解装置に使用可能な容器。（PTFE 製のチューブなどは、CNT が吸着し、脱離が困難なため、使用は望ましくない）
4.4 ホモジナイザー
動物組織を粉砕撹拌して均一なホモジネートを作製するための器具。
4.5 石英ガラス管
内部にろ過用の石英ウールを充填した石英ガラス管で、900℃までの燃焼に耐えうるもの。ステンレス（SUS）製のものを用いた場合には、SUS 由来の無機炭素によりバックグランドが上昇し、分析の定量下限が高くなる。
4.6

燃焼装置

試料に含まれる有機炭素や CNT を酸素気流中、触媒存在下で燃焼させ、二酸化炭素を生成する装置。
4.7

二酸化炭素測定装置

試料の 燃焼 時に発 生す る二酸 化炭 素を測 定す るため の装 置。非 分散 型赤外 線分 析計（ NDIR:Non-

43

第Ⅴ章

動物組織中のナノ炭素材料の分析

Dispersive Infrared）等が用いられるが、二酸化炭素を定量出来る分析装置であれば、特に限定されない。
4.8 遠心管臓器の保存やホモジネートに用いる容量 15mL もしくは 50mL のチューブ。
5 試薬
5.1 硝酸
重金属分析用の高純度分析用規格またはこれと同等以上の純度のものを用いる。有機炭素成分の分解に用いる。
5.2 硫酸
重金属分析用の高純度分析用規格またはこれと同等以上の純度のものを用いる。有機炭素成分の分解に用いる。
5.3 超純水
蒸留、イオン交換したもので、JIS K 0557 に規定する微量分析用に用いるものを使用する。炭素成分が不純物として含まれないこと。
5.4 グルコース
超純水に溶解、希釈後に、炭素量測定のための検量線作成に用いる。特級以上のものが望ましい。
5.5 プロテアーゼ K
タンパク質の分解用の酵素。
6. 試料溶液中の CNT 分析手順
6.1 炭素濃度についての検量線の作成
6.1.1 標準液の作製
グルコースを一定量秤取し、メスフラスコ中で各濃度に希釈し、検量線作成用の標準液を作製する。
6.1.2 石英ガラス管への添加
6.1.1 で作製した各濃度の標準液を、シリンジを用いてそれぞれ別の石英ガラス管中の石英ウール部に 10μL 打ち込む。80℃で 8 時間以上乾燥させる。
6.1.3 炭素濃度の測定
6.1.2 で作製した石英管を燃焼装置に掛け、昇温させることで燃焼させ、NDIR 装置により、二酸化炭
素濃度を測定する。この時、CNT 試料を分析するときと同じ昇温速度で燃焼を行う。
6.1.4 検量線の作成
横軸に添加したグルコース中の炭素量[g]、縦軸に NDIR で得られたピークの面積(Vs)を取り、検量線を作成する。
6.2 CNT 濃度についての検量線の作成
6.2.1 CNT の石英ガラス管への添加
測定対象の CNT を一定量秤取し、石英ガラス管へ添加する。本作業は、静電気を除去しつつ、静電気によるロスが起こらないようにする。
6.2.2 炭素濃度の測定

44

第Ⅴ章

動物組織中のナノ炭素材料の分析

6.2.2 で作製した石英管を燃焼装置に掛け、昇温させることで燃焼させ、NDIR 装置により、二酸化炭
素濃度を測定する。一定温度（例えば 400℃）以上で燃焼した成分を CNT 成分と考える。
6.1.4 検量線の作成
横軸に添加した CNT 量[g]、縦軸に NDIR で得られたピークの面積(Vs)を取り、検量線を作成する。
6.3 動物組織試料の前処理
6.3.1 ホモジネートの作製
動物組織試料に重量比約 3 倍の超純水を加え、ホモジナイザーによりホモジナイズする。
6.3.2 酵素処理
6.3.1 で作製したホモジネートの一部を秤取し、プロテアーゼ K を一定量加えて、壁面についた試料を少量の水で洗い落とし、50℃で一晩程度放置する。
6.3.3 硝酸処理
酵素処理した液に硝酸を一定量加えて、ホットプレートまたはマイクロ波分解装置で分解する。
6.3.4 ろ過・水洗
パスツールピペットと注射筒を用いて、石英ウールの充填された石英ガラス管に硝酸を一定量流通させた後、6.3.3 の酸液を流通させてろ過する。ガラス製容器、および該ガラス製容器から石英ガラス管に移す際に使用したガラス製のパスツールピペットなどに付着・残留する単層 CNT を脱離・回収するために、純水、エタノールの順で洗い、それぞれ石英ガラス管に流通させる。最後に、石英ガラス
管に純水を流通させて水洗ろ過する。
6.3.5 硫酸処理
石英ガラス管に硫酸を一定量入れてろ過部を硫酸で含浸させ、一定時間静置する。その後、石英ガラ
ス管に純水を流通させて水洗ろ過する。
6.3.6 燃焼・分析
6.3.5 で水洗したろ過した石英ガラス管をマッフル炉中で 80℃にて乾燥させて水を飛ばし、その後、石英ガラス管に、酸素ガスを供給しながら一定速度で昇温させながら加熱して燃焼させて、二酸化炭
素濃度の測定により、炭素濃度もしくは CNT 濃度を求める。
6.4 ブランクの分析
コントロール群用の CNT を含まない動物試料に対して、6.3 と同様の操作により酸処理・分析を行ない、ブランクの測定も併せて行う。ブランクを 5 回以上測定した変動（標準偏差）の 10 倍を定量下限値として求める。

45

第Ⅴ章

動物組織中のナノ炭素材料の分析

附属書 A

実施例：ラット臓器中の CNT の分析
A.1

概要

各種 CNT（単層 CNT： eDips 半導体型、eDips 金属型、名城ナノカーボン EC1.5-P、SG；多層 CNT：
VGCF）について検量線を作成し、ラット肺に添加した試料に対して前処理および分析を行った。
A.2

検量線の作成各種 CNT（単層 CNT： eDips 半導体型、eDips 金属型、名城ナノカーボン EC1.5-P、SG；多層 CNT：
VGCF）を一定量ずつ秤取し、石英ガラス管に充填後、燃焼装置にて燃焼させ、400℃以上で燃焼した成分に対して NDIR で得られたピーク面積から検量線を作成した。燃焼時の昇温条件は、100℃⇒（3℃/分）⇒400℃（120 分）⇒（3℃/分）⇒900℃（60 分）とした。
A.3

前処理

A.3.1 酸液の準備
金属分析用超純水（超純水 超微量分析用、和光純薬工業(株) ）、硝酸（硝酸 1.42 Ultrapur-100、関東化学㈱）、硫酸（硫酸 有害金属測定用、和光純薬(株)）を用いた。
A.3.2 試料中の有機炭素成分の分解
ラット肺ホモジネートに CNT を加えた試料 0.4mL を石英ガラス容器に入れ、プロテアーゼ K 200μL を追加し、超純水 500μL で石英ガラス容器壁面に付着したホモジネートを洗い落とした。50℃で一晩静置後、硝酸 10mL を加え、マイクロ波分解装置（Speedwave 4; Berghof、Germany）により 100℃で 60分間の分解を行った。パスツールピペットと注射筒を用いて、石英ウールの充填された石英ガラス管に硝酸を一定量流通させた後、サンプルを分解した酸液を流通させてろ過した。ガラス製容器、および該ガラス製容器から石英ガラス管に移す際に使用したガラス製のパスツールピペットなどに付着・残留する単層 CNT を脱離・回収するために、純水で洗浄してその液を石英ガラス管に流通させた後、エタノールでも洗浄してその液を石英ガラス管に流通させた。最後に、石英ガラス管に純水を流通させて水洗ろ過した。
A.3.3 ろ過
酸処理後の酸溶液を、パスツールピペットで石英ガラス管に移しながら注射筒で吸引・ろ過した。ガラス製容器をエタノールおよび水で順に洗浄し、石英ガラス管に通してろ過した。
A.3.4 追加酸分解
A.3.3 の石英ガラス管に硫酸を入れて静置し、ろ過部を 1 時間硫酸で含浸させた。石英ガラス管に純水を流通させて水洗・ろ過した。
A.3.4 分析
石英ガラス管をマッフル炉中で 80℃にて乾燥させて水を飛ばし、その後、石英ガラス管に、酸素ガスを供給しながら一定昇温させながら加熱して燃焼させて、二酸化炭素濃度の測定により、炭素濃度も
46

第Ⅴ章

動物組織中のナノ炭素材料の分析

しくは CNT 濃度を導出した。昇温条件を 100℃⇒（3℃/分）⇒400℃（120 分）⇒（3℃/分）⇒900℃（60 分）として、分析を行った。

図 A.1

各種 CNT の昇温・燃焼時のピーク

300

250

250

ｸﾞﾙｺｰｽ(0～100)

150
100

200

y = 1.9111x
R² = 0.9997

150

100

50

50

0

30

60

90

50

300

100

150

0

400℃以上のﾋﾟｰｸ面積

y = 2.3961x
R² = 0.9951

150
100

150
100

0

0

50

100

150

秤量値 [μg]y = 2.8379x
R² = 0.9938

250
200
150
100
50
0

0

50

100

150

0

秤量値 [μg]

図 A.2

150

VGCF

300

y = 2.8802x
R² = 0.9967

200

50

100

350

SG

250

50

0

50

秤量値 [μg]

300

名城ナノカーボンEC‐P

200

100

秤量値 [μg]

C量[μg]

250

y = 2.2058x
R² = 0.992

150

0
0

120

200

50

0

0

400℃以上のﾋﾟｰｸ面積

eDIPS‐金属型

400℃以上のﾋﾟｰｸ面積

面積

200

400℃以上のﾋﾟｰｸ面積

y = 2.728x
R² = 1

400℃以上のﾋﾟｰｸ面積250

eDIPS‐半導体型

グルコースおよび各種 CNT の検量線

Ⅴ-２の執筆担当者
篠原直秀、内野加奈子

47

50

100

秤量値 [μg]

150

第Ⅵ章

第Ⅵ章

ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた培養細胞試験

ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた培養細胞試験

序文
本書第Ⅲ章「ナノ炭素材料の試料調製」により調製したナノ炭素材料の液中分散試料を被験材料として、ヒトの吸入暴露による肺の炎症を反映する培養細胞、および生体指標（エンドポイント）を試験
項目に選択し、かつ、細胞培地中に分散調製したナノ炭素材料に阻害されずに適切に測定可能な培養
細胞試験方法について示す。
1.

適用範囲

培養細胞試験用に分散したナノ炭素材料の培地調製液を用いて、その安全性評価を行うための培養細胞試験方法を示す。
2.

引用規格

特になし。
3.

用語、定義及び記号

3.1

培養細胞試験

試験管内、シャーレ中等の人工的に構成した条件下、すなわち、各種の試験条件を培養細胞培地等の人為的にコントロールした試験環境。ヒト培養細胞や動物培養細胞を用いた試験がこれに当たる。
3.2

抗菌抗真菌剤

ヒト培養細胞や動物培養細胞の培養において、細菌や真菌の汚染を防ぐ目的で、培地に加える抗生物質及び抗真菌物質の混合液。濃縮液が市販されており、培地に添加して用いる。多くの場合、抗生物質としてペニシリン及びストレプトマイシン等を、抗真菌物質としてアムホテリシン B 等を用いる。
3.3

細胞培地

ヒト培養細胞や動物培養細胞の培養に適した生育環境を提供する液体。培養細胞の生育に必要なアミノ酸、ビタミン類、塩類等を含む。pH も培養細胞の成育に最適な中性付近に調製してある。多くの場
合、上記基礎培地に、さらに、培養細胞の成育に必要な牛胎児血清を 10 %程度加えて用いる。イーグ
ル基礎培地、ダルベッコ変法イーグル培地、RPMI1640 培地等、いくつかの代表的な処方が確立されて
いる。
3.4

調製原液

BSA 水溶液等の媒体でナノ炭素材料を分散した懸濁液。
3.5

培地調製液

培養細胞試験で使用するナノ炭素材料の懸濁液。培養細胞試験で用いる細胞培地によって調製原液を所定の倍率に希釈して調製する。

48

第Ⅵ章

4.

試験方法

4.1

細胞株

ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた培養細胞試験

ナノ炭素材料の簡易で迅速な安全性評価を対象とする呼吸器のモデルとなる細胞株を用いる。例えば、
II 型肺胞上皮細胞のモデルとしてヒト肺胞基底上皮腺癌細胞（A549）（Fujita et al, 2013）や、マ
クロファージのモデルとしてラットマクロファージ細胞（NR8383）（Fujita et al, 2015）等を利用する。細胞株の保存及び準備は、所定の方法に準じ行う。
4.2

細胞培養

対数増殖期の培養細胞を所定の濃度で、試験項目に合わせたウェル数のマルチウェルプレートに植える。１試料につき、４ウェル程度を使用して試験を行うことが望ましい。最適な温度、湿度、二酸化炭素濃度条件下で一晩程度培養後、倒立顕微鏡等細胞の状態を観察し、適切に生育したことを確認後、アスピレータや遠心分離で細胞培地を吸引除去し、培地調製液を置換もしくは添加する。培地調製に用いる分散剤は、細胞生存等に大きく影響するので、あらかじめ予備試験により、その種類や濃度等を確認することが望ましい（Horie et al, 2014）。この際の培地調製液をナノ炭素材料処理群とするが、その他、陰性対照群および陽性対照群を用意する。陰性対照群は、ナノ炭素材料を含まない調製
原液を細胞培地に添加して培養した細胞を用いる。陽性対照群は、それぞれのエンドポイントの指標となるものを選択し、これを細胞培地に添加して培養した細胞を用いる。陰性対照群および陽性対照群の細胞試験の結果は、それぞれの細胞試験系の信頼性およびナノ炭素材料の影響の相対的な評価の指標となる。その後、所定の培養時間後に、それぞれの下記に示す試験を行う。
4.3

細胞生存能力試験

細胞生存能力試験には、生細胞中のミトコンドリア脱水素酵素によるテトラゾリウム塩のホルマザン
色素への変換を発色測定するもの（例：WST-1 法 (WST：Water soluble Tetrazolium salts)等）、コ
ロニー形成能による細胞増殖能力を測定するものがあり、適宜これらを選択して利用する。培地調製液で培養した所定の時間毎に測定を行う。カーボンナノチューブは、ミトコンドリアの酵素活性をエンド ポイ ン トと す る MTT 法(3-(4,5-di-methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,
yellow tetrazole）において、比色定量を阻害するので注意が必要であることが報告されている（Wörle-Knirsch et al, 2006）。
4.4

細胞内反応性酸素種活性測定試験

ナノ炭素材料により、活性酸素種（ROS: reactive oxygen species）が発生し、酸化ストレスを誘導することが報告されている（Fujita et al, 2013）。このため、ROS 用細胞浸透性蛍光プローブ（例：DCFH-DA (2’, 7’-Dichlorodihydrofluorescin diacetate)）を使い、培地調製液で培養した所定の時間に、細胞中に取り込んだこれらの蛍光プローブ（例：DCFH (2’, 7’-Dichlorodihydrofluorescin)）の蛍光強度を細胞内反応性酸素種活性として測定する。
4.5

細胞周期解析

ナノ炭素材料により、特定の細胞周期への阻害が報告されている（Sargent et al, 2009）。このため、
DNA 二重らせんに対するインターカレーターする蛍光プローブを使い、培地調製液で培養した所定の時間に、細胞中に取り込んだこれらの蛍光プローブを測定し、細胞周期のどの状態であるかを明らかにして、特定の細胞周期への阻害を解析する。
4.6

炎症性サイトカイン測定

49

第Ⅵ章

ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた培養細胞試験

ナノ炭素材料により、炎症性サイトカインが産生されることが報告されている（Herzog et al, 2009）。
炎症性サイトカインは、生体内における様々な炎症症状を引き起こす原因因子として関与するため、有用な指標となる。また、これら炎症性サイトカインは、ラットなどのげっ歯類を使った動物試験による安全性評価手法の妥当性の検証において、共通のバイオマーカーとして利用できる。炎症性サイ
トカインは、動物種（ヒト、ラット用等）に応じて、数種類（例：IL-1a、MCP-1、MIP-1a、IL-1b、IFNg、IL-18、GRO/KC/CINC、TNF-α、SPP-1 等）あるが、これらから最適なものを選択し、1 種類あるいは複数のサイトカインを単独あるいは同時に、培地調製液で培養した所定の時間の細胞培養上清液を用いて、BALF 中の各種炎症性サイトカイン測定を測定する。
4.7

遺伝子発現解析

ナノ炭素材料により誘導もしくは抑制される遺伝子は、エンドポイントの推定に役立つと考えられ、またラットなどのげっ歯類を使った動物試験による安全性評価手法の妥当性の検証においても、共通のバイオマーカーとして使用できる。培地調製液で培養した所定の時間の細胞を用いて、トータル RNAを抽出し、これを基に、定量 PCR（qRT-PCR: Quantitative polymerase chain reaction）や DNA マイ
クロアレイにより、特定もしくは網羅的な遺伝子発現を解析する。
4.8

電子顕微鏡による細胞試料観察

ナノ炭素材料の細胞への取り込みや、取り込まれたナノ炭素材料の形状等の特性は、各々のエンドポ
イントを考察する際の有効なデータとなると考える。培地調製液で培養した所定の時間の細胞を用い、リン酸緩衝液等による洗浄、グルタールアルデヒド等による前固定、洗浄、四酸化オスミウム等による後固定、細胞の脱水処理、細胞の樹脂包埋、超薄切片の調製、超薄切片の染色及び補強を行う。その後、これらの細胞試料を用いて電子顕微鏡による観察を行う。
5.報告
以下の事項を報告する。
5.1

一般

a)

培養細胞試験のための分散ナノ炭素材料試料を特定する詳細情報（例：粒子試料の情報、分散調製法、分散媒の情報、分散試料の入手日、搬送方法、液中分散試料の特性評価）b)

測定日、測定者名、および測定機関名

c)

装置の妥当性確認を実施した日付

d)

分散試料の保存条件（例：保存温度、保存場所、保存期間）e)沈澱生成に関する目視観察の結果（例：デジタルカメラによる画像）

5.2

装置および測定試薬、実験・解析条件a)

装置名、型式、および製造者名b)

妥当性確認に用いた陽性対照物質等と確認の結果

c)

測定試薬名、および製造者名

d)

解析に用いたソフトウェアー名、および製造者名

5.3

結果

5.3.1

細胞生存能力試験

陰性対照群と比較したナノ炭素材料処理群の細胞生存割合とその繰り返し標準偏差を算出する。

50

第Ⅵ章

5.3.2

ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた培養細胞試験

細胞内反応性酸素種活性測定試験

全ての群における細胞 ROS レベルの絶対値（例：DCF 値）あるいは、陰性対照群と比較したナノ炭素
材料処理群の細胞 ROS レベルとその繰り返し標準偏差を算出する。
5.3.3

細胞周期解析

全ての群における各細胞周期（G1 期、S 期、G2 期、M 期）の割合とその繰り返し標準偏差を算出する。
5.3.4

炎症性サイトカイン測定

全ての群における各炎症性サイトカイン産生の値とその繰り返し標準偏差を算出する。
5.3.5

遺伝子発現解析

陰性対照群と比較したナノ炭素材料処理群の遺伝子発現変動比を算出。場合により、発現遺伝子の機能グループ解析等の有意差解析や、階層クラスタリング等のクラスタリング、あらにはパスウェーデ
ータベース等とのネットワーク解析等を行う。
5.3.6

電子顕微鏡による細胞試料観察

全ての群における細胞試料の観察記録。

51

第Ⅵ章

附属書 A

安全性評価のための培養細胞試験方法の体系図

52

ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた培養細胞試験

第Ⅵ章

ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた培養細胞試験

附属書 B

実施例：ラット肺胞マクロファージ細胞を用いた単層 CNT の培養細胞試験
B.1

概要

ラット肺胞マクロファージ細胞（NR8383）を用いた培養細胞試験の事例を示す。NR8383 細胞株に対して、スーパーグロース単層 CNT（SG 単層 CNT)の培地調製液（濃度：0.1 mg/mL）を、24 時間暴露させ、細胞生存能力試験、細胞内反応性酸素種活性測定試験、網羅的遺伝子発現解析、透過型電子顕微鏡を用いた細胞形態観察を行った（Fujita et al, 2015）。
B.2

使用試料の調製および特性評価

培地調製液は、本手順書のⅢ.ナノ炭素材料の試料調製手順により、短尺（幾何平均：約 0.36μm）に調製した SG 単層 CNT 培地調製液および長尺（幾何平均：約 1.52μm）に調製した SG 単層 CNT 培地調
製液を使用した。調製原液および培地調製液中のそれぞれの試料の特性評価については、本手順書のⅣ.ナノ炭素材料の液中分散試料の特性評価に準拠した。
B.3

細胞および培養条件

培養細胞試験には、NR8383 細胞株（ATCC）を用いた。10%FBS（FBS：Fetal Bovine Serum、ウシ胎児血清）添加した F-12K 培地中、5%CO2 下 37℃で培養し、上記の培地調製液を置換し、これを暴露 0 時間とし、その後 24 時間培養を行った。各試料のコード名称を以下に略す。

B.4

＃

試料

コード

1

短尺・SG 単層 CNT 培地調製液

CNT-1

2

長尺・SG 単層 CNT 培地調製液

CNT-2

3

陰性対照培地（含 BSA）

Control

細胞生存能力試験

SG 単層 CNT による細胞生存への影響 による細胞生存への影響（暴露 24 時間） を、生細胞のミトコ
ンドリア脱水素酵活性を指標とする WST-1（タカラバイオ株式会社）により測定を行った。WST-1 による各群の細胞生存能を測定した結果、CNT-1 群の NR8383 細胞は、Control に対して有意な低下は認められなかったが、CNT-2 群では、Control に対して有意に低下した。なお、いずれの試験にても 100μM Mitomycin C 等の陽性対照群を設け、その試験系の確認を行った結果、問題なく試験系は成立した。
B.5

細胞内反応性酸素種活性測定試験

SG 単 層 CNT に よ る 酸 化 ス ト レ ス 誘 導 へ の 影 響 （ 暴 露 24 時 間 ） を 、 DCFH （ 2',7'-

Dichlorodihydrofluorescin diacetate）法により、フロ-サイトメトリー（Merck Millipore）を用いて、細胞内 ROS の産生レベルの測定により行った。この結果、暴露 6 時間および 24 時間において、
53

第Ⅵ章

ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた培養細胞試験

Control と比較して ROS 産生レベルの上昇が有意に認められた。また、その結果は CNT-1 群に比べてCNT-2 群の方が顕著であった。
B.6

炎症性サイトカイン

タンパク質多項目同時測定システム（Merck Millipore: Luminex 200 xPONENT）により、暴露 24 時間後の細胞懸濁液の炎症性サイトカインの 1 種である MIP-1a を測定し、SG 単層 CNT による炎症惹起について検討した。この結果、暴露 6 時間の CNT-1 群において、Control と比較して MIP-1a の増加が有意に認められた。また、暴露 6 時間および 24 時間の CNT-2 群において、Control と比較して MIP-1aの増加が有意に認められた。これらの増加の程度は CNT-1 群に比べて CNT-2 群の方が顕著であった。
B.7

網羅的遺伝子発現解析

SG 単層 CNT による網羅的遺伝子発現への影響（暴露 24 時間）を、DNA マイクロアレイにより解析を行なった。培養後、市販のキット（Qiagen）により細胞のトータル RNA を抽出し、その後、NanoDrop
2000(Thermo)および Bioanalyzer (Agilent)により、これらの分解等の品質について確認した。トー
タル RNA を基に、ラット DNA マイクロアレイ(Agilent)により、網羅的遺伝子発現解析を行なった。
この結果、炎症や、酸化ストレス、細胞外分解酵素等に関連する主な遺伝子の有意な発現が認められた。これらの増加の程度は CNT-1 群に比べて CNT-2 群の方が顕著であった。結果の詳細については、
米国国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information、NCBI）の遺伝子
発現情報データベース GEO（Gene Expression Omnibus）の Accession #:GSE61319 に収めている。
B.8

電子顕微鏡による細胞試料観察

透過型電子顕微鏡（TEM、日立製作所 H-7000） により、暴露後の細胞内の形状や SG 単層 CNT の取り込みなどへの影響（暴露 24 時間）を検討した。この結果、CNT-1 群および CNT-2 群の暴露 24 時間い
ずれにおいても、SG 単層—CNT の取り込みが認められた（図 B.1）。SG 単層 CNT と考えられる細い束状が数個の塊状になり、ライソソーム（lysosome）や細胞質と考えられる箇所に局在した。これらの SG
単層 CNT の形状は、透過型電子顕微鏡により観察した調製原液中のそれぞれの SG 単層 CNT （CNT-1 お
よび CNT-2）の形状と大きな相違は認められなかった。また、全ての群において、細胞の異常な形態は認められなかった。

図 B.1 透過型電子顕微鏡による 24 時間暴露した NR8383 内の SG 単層—CNT（左図：CNT-1 暴露群；右図：CNT-2 暴露群）

54

第Ⅵ章

ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた培養細胞試験

B.9

引用文献

1.

Fujita K, Fukuda M, Endoh S, Kato H, Maru J, Nakamura A, Uchino K, Shinohara N, Obara
S, Nagano R, Horie M, Kinugasa S, Hashimoto H, Kishimoto A. Physical properties ofsingle-wall carbon nanotubes in cell culture and their dispersal due to alveolar
epithelial cell response. Toxicol Mech Methods. 2013, 23(8):598-609.

2.

Fujita K, Fukuda M, Endoh S, Maru J, Kato H, Nakamura A, Shinohara N, Uchino K, Honda
K. Size effects of single-walled carbon nanotubes on in vivo and in vitro pulmonary
toxicity. Inhal Toxicol. 2015, 27(4):207-223.

3.

Horie M, Nishio K, Kato H, Endoh S, Fujita K, Nakamura A, Hagihara Y, Yoshida Y, Iwahashi
H. Evaluation of cellular effects of silicon dioxide nanoparticles. Toxicol Mech Methods.
2014, 24(3):196-203.

4.

Wörle-Knirsch JM, Pulskamp K, Krug HF. Oops they did it again! Carbon nanotubes hoax
scientists in viability assays. Nano Lett. 2006, 6(6):1261-1268.

5.

Sargent LM, Shvedova AA, Hubbs AF, Salisbury JL, Benkovic SA, Kashon ML, Lowry DT,
Murray AR, Kisin ER, Friend S, McKinstry KT, Battelli L, Reynolds SH. Induction of
aneuploidy by single-walled carbon nanotubes. Environ Mol Mutagen. 2009, 50(8):708-717.

6.

Herzog E, Byrne HJ, Casey A, Davoren M, Lenz AG, Maier KL, Duschl A, Oostingh GJ. SWCNT
suppress inflammatory mediator responses in human lung epithelium in vitro. Toxicol
Appl Pharmacol. 2009, 234(3):378-390.

55

第Ⅵ章

ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた培養細胞試験

附属書 C

実施例：ラット肺胞マクロファージ細胞を用いた剥離グラフェンの培養細胞試験
C.1 概要ラット肺胞マクロファージ細胞（NR8383）を用いた培養細胞試験の事例を示す。NR8383 細胞株に対して、剥離グラフェンの培地調製液（濃度：0.001 mg/mL）を、24 時間暴露させ、細胞生存能力試験、透過型電子顕微鏡を用いた細胞形態観察を行った。剥離グラフェンは、溶媒によりその物理化学特性が異なる。そのため、異なる２種類の溶媒を用いて分散処理を行って調製液を作製し、それぞれ用いて培養細胞試験を行った。
C.2 使用試料の調製および特性評価
溶媒 A0 ならびに溶媒 B0 により、それぞれ溶解し分散させた剥離グラフェンを調製液 Grp-A0 および Grp-B0とし、さらにこれを 10%FBS に添加した F-12K 培地中に 1/10 希釈した培地調製液 Grp-A および Grp-B を使用した。調製液中の剥離グラフェンの安定性評価として、調製後 72 時間まで経時的に、レーザー回折式粒子
径分布測定装置（SALD-2300、島津製作所）を用い、剥離グラフェンの粒度分布の測定を行った。この結果、作製 72 時間まで Grp-A0 および Grp-B0 の粒度分布は同等であったことから、両者は安定性があるものと判断した。
C.3 細胞および培養条件
培養細胞試験には、NR8383 細胞株（ATCC）を用いた。10%FBS 添加 DMEM 培地中、5%CO2 下 37℃で培養し、上記の培地調製液を置換し、これを暴露 0 時間とし、その後 24 時間培養を行った。各試料のコード名称
を以下に略す。
＃

試料

コード

1

剥離グラフェン培地調製液（含溶媒 A0）

Grp-A

2

剥離グラフェン培地調製液（含溶媒 B0）

Grp-B

3

陰性対照培地（含溶媒 A0 または溶媒 B0）Control

C.4 細胞生存能力試験
剥離グラフェンによる細胞生存への影響（暴露 24 時間） を、生細胞のミトコンドリア脱水素酵活性を指標とす
る WST-1（タカラバイオ株式会社）により測定を行った。WST-1 による各群の細胞生存能を測定した結果、0.001mg/mL における Grp-A 群および Grp-B 群の NR8383 細胞は、Control に対して有意な低下は認められなかった。なお、いずれの試験にても 100μ M Mitomycin C 等の陽性対照群を設け、その試験系の確認を行った結果、問題なく試験系は成立した。
C.5 電子顕微鏡による細胞試料観察
56

第Ⅵ章

ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた培養細胞試験

透過型電子顕微鏡（TEM、日立製作所 H-7000） により、24 時間暴露後の細胞内の形状や剥離グラフェンの取り込みを検討した。この結果、暴露 24 時間の Grp-A 群および Grp-B 群のいずれにおいても、剥離グラフェンと考えられるいくつかの塊状物質が、細胞質に認められた（図 C.1、矢印）。

図 C.1 透過型電子顕微鏡による 24 時間暴露した NR8383 細胞（Grp-A 暴露群）
C.6 引用文献
1. Fujita K, Fukuda M, Endoh S, Kato H, Maru J, Nakamura A, Uchino K, Shinohara N, Obara S, Nagano R,
Horie M, Kinugasa S, Hashimoto H, Kishimoto A. Physical properties of single-wall carbon nanotubes incell culture and their dispersal due to alveolar epithelial cell response. Toxicol Mech Methods. 2013,23(8):598-609.
第Ⅵ章の執筆担当者
小原佐和枝、藤田克英

57

第Ⅶ章

第Ⅶ章

ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた動物試験

ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた動物試験
Ⅶ-１

気管内投与試験序文
本書、第Ⅲ章「ナノ炭素材料の試料調製」により調製したナノ炭素材料の液中分散試料を被験材料として、ヒトの吸入暴露による肺の炎症を反映する動物、および生体指標（エンドポイント）を試験項目に選択し、かつ、投与液中に分散調製したナノ炭素材料に阻害されずに適切に測定可能な気管内投与試験方法について示す。
1.

適用範囲

動物を用いた気管内投与試験用に分散したナノ炭素材料の投与液を用いて、その安全性評価を行うための気管内投与試験方法を示す。
2.

引用規格

特になし。
3.

用語、定義および記号

3.1

気管内投与試験

麻酔処置を施した動物の口腔から気管に投与器具を差し込み、単回あるいは複数回、液中に分散したナノ炭素材料を投与し、投与後、主に肺組織や生体への影響評価を行うことを目的とする試験。吸入暴露試験と比較して、大型の機器設備やこれらのメンテナンス等が必要なく、低コストで比較的容易にできる試験である。但し、強制的にナノ炭素材料を注入するので、非吸入性粒子が混入しないよう
サイズの確認が必要である。
3.2

投与液

BSA 水溶液等の媒体でナノ炭素材料を分散した懸濁液。所定の濃度に希釈して調製する。
4.

試験方法

4.1

動物

ナノ炭素材料の吸入暴露による肺の炎症を評価するモデルとなるげっ歯類を用いる。安全性試験で広く利用され、既知の化学物質に対する感受性や感性性疾患に対する抵抗性、遺伝的安定性、入手のし易さ等から、例えば、CD(SD)系や Wistar 系のラット（Kobayashi et al, 2010; Fujita et al, 2016）
等を利用する。動物の取り扱いは、所定の動物実験関連規則に準じ行う。
4.2

気管内投与

気管内投与は、十分な麻酔処置を施したラット等のげっ歯類に対して、液中に懸濁したナノ炭素材料を経口ゾンデまたはスプレーゾンデを介し、直接注入する。

58

第Ⅶ章

4.3

ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた動物試験

動物一般状態観察

気管内投与後、動物観察期間中、1 日 1 回の一般状態を観察する。
4.4

動物体重測定気管内投与前および投与後、観察期間中、毎日または毎週 1 回、動物体重測定を行い記録する。剖検
を実施する動物については、剖検日に、また頓死および死亡動物については、発見時に体重測定を行い記録する。
4.5

気管支肺胞洗浄液（BALF）検査

4.5.1

BALF の採取

気管内にカニューレを挿入固定し、約 37°C に加温した生理食塩水やリン酸緩衝液等を注入・吸引することを数回繰り返し、その回収液を気管支肺胞洗浄液（BALF：Bronchoalveolar lavage fluid）とする。この操作を数回繰り返し、得られた BALF を合わせて回収量を記録する。採取後の BALF は氷冷下で取り扱う。
4.5.2

BALF 中の細胞検査採取した BALF を遠心し、その沈殿物を細胞検査に用いる。沈殿物に測定試薬を加え、定容後懸濁し、
総合血液学検査装置等を用いて BALF 中の有核細胞数を測定する。細胞比率算定用に分取し得られた沈殿物にリン酸緩衝液等を加え定容後、懸濁し塗抹標本を作製する。メイ・グリュンワルド・ギムザ
染色等を行った後、鏡検し、好中球やリンパ球、マクロファージ、好酸球、好塩基球等の細胞比率や各細胞数を算出する。
4.5.3

BALF 中の生化学的検査採取した BALF を遠心し、上清を生化学的検査に用いる。
4.5.3.1

総タンパク測定BALF 中の総タンパクは、肺組織における様々な炎症の有用な指標となる。Lowry 法等による比色分析
や赤外線分析装置等を用いて、BALF 中の総タンパクを測定する。
4.5.3.2

乳酸脱水素酵素活性

BALF 中の乳酸脱水素酵素（LDH：Lactate Dehydrogenase）活性は、肺組織における様々な細胞傷害の有用な指標となる。比色分析等を用いて、BALF 中に遊離する LDH を測定する。
4.5.3.3

炎症性サイトカイン測定

ナノ炭素材料により、炎症性サイトカインが産生されることが報告されている（Herzog et al, 2009）。
炎症性サイトカインは、生体内における様々な炎症症状を引き起こす原因因子として関与するため、有用な指標となる。また、これら炎症性サイトカインは、ラットやマウスなどのげっ歯類由来する培養細胞試験による安全性評価手法の妥当性の検証において、共通のバイオマーカーとして利用できる。
炎症性サイトカインは、動物種に応じて、数種類（例：IL-1a、MCP-1、MIP-1a、IL-1b、IFN-g、IL-18、
GRO/KC/CINC、TNF-α、SPP-1 等）あるが、これらから最適なものを選択し、1 種類あるいは複数のサ
イトカインを単独あるいは同時に、BALF 中の各種炎症性サイトカイン測定を測定する。
4.6
4.6.1

胸腔洗浄液（PCLF）検査
PCLF の採取

横隔膜の胸骨側を一部切開し、カニューレを用いて約 37°C に加温したリン酸緩衝生理食塩液を、胸腔内に注入・吸引し、その回収液を気管支肺胞洗浄液（PCLF：Pleural cavity lavage fluid）とする。

59

第Ⅶ章

ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた動物試験得られた PCLF の回収量を記録する。採取後の PCLF は氷冷下で取り扱う。得られた PCLF から、有核細胞数測定用に 1 mL 分取、残りを細胞比率算定用とした．
4.6.2

PCLF 中の細胞検査採取した PCLF を遠心し、その沈殿物を細胞検査に用いる。沈殿物に測定試薬を加え、定容後懸濁し、
総合血液学検査装置等を用いて PCLF 中の有核細胞数を測定する。細胞比率算定用に分取し得られた沈殿物にリン酸緩衝液等を加え、定容後懸濁し、塗抹標本を作製する。メイ・グリュンワルド・ギム
ザ染色等を行った後、鏡検し、好中球やリンパ球、マクロファージ、肥満細胞、好酸球、好塩基球等の細胞比率や各細胞数を算出する。
4.6.3

PCLF 中の生化学的検査採取した BALF を遠心し、上清を生化学的検査に用いる。
4.6.3.1

総タンパク測定PCLF 中の総タンパクは、肺組織における様々な炎症の有用な指標となる。Lowry 法等による比色分析
や赤外線分析装置等を用いて、PCLF 中の総タンパクを測定する。
4.6.3.2

乳酸脱水素酵素活性

PCLF 中の乳酸脱水素酵素（LDH：Lactate Dehydrogenase）活性は、肺組織における様々な細胞傷害の有用な指標となる。比色分析等を用いて、PCLF 中に遊離する LDH を測定する。
4.6.3.3

炎症性サイトカイン測定

ナノ炭素材料により、炎症性サイトカインが産生されることが報告されている（Herzog et al, 2009）。
炎症性サイトカインは、生体内における様々な炎症症状を引き起こす原因因子として関与するため、有用な指標となる。また、これら炎症性サイトカインは、ラットやマウスなどのげっ歯類由来する培養細胞試験による安全性評価手法の妥当性の検証において、共通のバイオマーカーとして利用できる。
炎症性サイトカインは、動物種に応じて、数種類（例：IL-1a、MCP-1、MIP-1a、IL-1b、IFN-g、IL-18、
GRO/KC/CINC、TNF-α、SPP-1 等）あるが、これらから最適なものを選択し、1 種類あるいは複数のサ
イトカインを単独あるいは同時に、PCLF 中の各種炎症性サイトカイン測定を測定する。
4.7

病理学的検査病理学的検査として、動物の器官および組織の肉眼的観察（剖検）や、器官重量測定および病理組織学的検査を実施する。計画解剖動物は、麻酔下で腹大動脈を切断、放血安楽死させた後に剖検を行う。
肺組織等を対象にした病理組織標本作製は、常法に従ってパラフィン包埋し、薄切後、ヘマトキシリ
ン・エオジン（HE: Hematoxylin-Eosin）染色を行う。病理組織学的検査は、これらの標本を使って、病変の種類および程度を含む各所見について記録する。
4.8

遺伝子発現解析

ナノ炭素材料により誘導もしくは抑制される遺伝子は、肺組織の炎症等に関わるバイオマーカーの推定に役立つと考えられる。脱血処理を行った肺組織を用いて、トータル RNA を抽出し、これを基に、定量 PCR（qRT-PCR: Quantitative polymerase chain reaction）や DNA マイクロアレイにより、特定もしくは網羅的な遺伝子発現を解析する。
4.9

電子顕微鏡による生体組織や細胞試料観察

ナノ炭素材料の肺等の生体組織や肺胞中の細胞への取り込み、またこれらに取り込まれたナノ炭素材
料の形状等の特性は、ナノ炭素材料の安全性評価を検討する際の有効なデータとなる。生体組織や、

60

第Ⅶ章

ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた動物試験

BALF および PCLF 中の細胞を用い、リン酸緩衝液等による洗浄、グルタールアルデヒド等による前固定、洗浄、四酸化オスミウム等による後固定、細胞の脱水処理、細胞の樹脂包埋、超薄切片の調製、
超薄切片の染色および補強を行う。その後、これらの生体組織や細胞試料を用いて電子顕微鏡による観察を行う。
5.

報告

以下の事項を報告する。
5.1

一般

a)

気管内投与試験のための分散ナノ炭素材料試料を特定する詳細情報（例：粒子試料の情報、分散

調製法、分散媒の情報、分散試料の入手日、搬送方法、液中分散試料の特性評価）b)

測定日、測定者名、および測定機関名

c)

装置の妥当性確認を実施した日付

d)

分散試料の保存条件（例：保存温度、保存場所、保存期間）e)沈澱生成に関する目視観察の結果（例：デジタルカメラによる画像）

5.2

装置および測定試薬、実験・解析条件a)

装置名、型式、および製造者名b)

妥当性確認に用いた陽性対照物質等と確認の結果

c)

測定試薬名、および製造者名

d)

解析に用いたソフトウェアー名、および製造者名

5.3.
a)

動物一般状態観察
気管内投与後、観察期間中、1 日 1 回の一般状態を観察記録。

5.4.

動物体重測定a)

気管内投与前および投与後、観察期間中、毎日または毎週 1 回の体重測定記録。

b)

剖検を実施する動物については、剖検日に、また頓死および死亡動物については、発見時に体重測定を行い記録する。
5.5.

BALF 検査a)

総合血液学検査装置等を用いた BALF 中の有核細胞数。

b)

メイ・グリュンワルド・ギムザ染色等を行った塗抹標本を鏡検による、好中球やリンパ球、マク

ロファージ、好酸球、好塩基球等の細胞比率や各細胞数。
c)

Lowry 法等による比色分析や赤外線分析装置等を用いた BALF 中の総タンパク。

d)

比色分析等を用いた BALF 中に遊離する LDH。

e)

BALF 中の各種炎症性サイトカイン産生。

5.6.

PCLF 検査a)

総合血液学検査装置等を用いた PCLF 中の有核細胞数。

b)

メイ・グリュンワルド・ギムザ染色等を行った塗抹標本を鏡検による、好中球やリンパ球、マク

ロファージ、肥満細胞、好酸球、好塩基球等の細胞比率や各細胞数。
c)

Lowry 法等による比色分析や赤外線分析装置等を用いた PCLF 中の総タンパク。

d)

比色分析等を用いた BALF 中に遊離する LDH。

61

第Ⅶ章

e)

ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた動物試験

PCLF 中の各種炎症性サイトカイン産生。

5.7.

病理学的検査

病理組織標本を使った病変の種類および程度を含む各所見についての記録。
5.8.

遺伝子発現解析

陰性対照群と比較したナノ炭素材料処理群の遺伝子発現変動比を算出。場合により、発現遺伝子の機能グループ解析等の有意差解析や、階層クラスタリング等のクラスタリング、あらにはパスウェーデ
ータベース等とのネットワーク解析等を行う。
5.9.

電子顕微鏡観察

全ての群における生体組織や細胞試料の観察記録。
6.

引用文献

1. Kobayashi N, Naya M, Ema M, Endoh S, Maru J, Mizuno K, Nakanishi J. Biological response
and morphological assessment of individually dispersed multi-wall carbon nanotubes in
the lung after intratracheal instillation in rats. Toxicology. 2010, 276(3):143-53.
2. Fujita K, Fukuda M, Endoh S, Maru J, Kato H, Nakamura A, Shinohara N, Uchino K, Honda
K. Pulmonary and pleural inflammation after intratracheal instillation of short singlewalled and multi-walled carbon nanotubes. Toxicol Lett. 2016, 257(22):23-37.
3. Herzog E, Byrne HJ, Casey A, Davoren M, Lenz AG, Maier KL, Duschl A, Oostingh GJ. SWCNT
suppress inflammatory mediator responses in human lung epithelium in vitro. Toxicol
Appl Pharmacol. 2009, 234(3):378-390.

62

第Ⅶ章

附属書 A

気管内投与の概略

63

ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた動物試験

第Ⅶ章

附属書 B

気管内投与に使用する装置a) 喉頭鏡b) 挿管チューブc) ボードd) 小動物実験用簡易吸入麻酔装置e) 導入麻酔用ボックス

64

ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた動物試験

第Ⅶ章

ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた動物試験

附属書 C

実施例：肺への影響における気管内投与手技の検討
C.1

概要

工業用ナノ材料を含めた吸入性化学物質の有害性評価のゴールドスタンダード試験は、吸入暴露試
験であるが、大規模な装置や熟練者が必要であること、経費が高額であることから、すべての工業用ナノ材料の有害性試験を吸入暴露試験で実施することは、現実的ではない。一方、気管内投与試験は、既知量の物質を、気管を介して肺に直接注入するため、用量依存関係を見出すことができることから、工業用ナノ材料の有害性評価のスクリーニングとして、その有用性が期待されている。しかし、気管内投与試験の投与手法には気管内に留置するカニューラでも経口ゾンデやスプレー式など様々であり、これらが肺内の分布に影響すること、また投与時の動物の体位なども肺内分布に影響することが考えられるため、カニューラや体位の差異が気管内投与したナノ材料の肺内炎症に差異があるかについて
検討した。
C.2

試験方法

C.2.1

試料

BSA 等を用いて液中に懸濁した多層 CNT を用いた。重量濃度は、1.0 mg/mL、2.5 mg/mL とした。
C.2.2

動物

実験動物として 12 週齢 Fischer344 雄性ラット（ウィルス抗体 free(SPF)）を用いた。環境馴化させるために投与 2 週間前に購入して、動物施設内の滅菌ケージで飼育した。施設内の温度は、24 ±1 ℃、
湿度 50 + 20％であった。照明に関しては、タイマーによる自動調節が行われ、明暗周期は、明期、暗期とも 12:12 の比率で行った。
C.2.3

気管内投与

小動物実験用簡易吸入麻酔装置にイソフルランを注入し、Fischer344 雄性ラットを導入麻酔用ボック
スに入れ、導入麻酔用ボックスにイソフルランを流入させて、十分に麻酔が効いていることを確認した。
気管内投与のアプローチとして、（１）通常のゾンデでボードを垂直にして注入、（２）スプレーゾ
ンデでボードを垂直して注入、（３）スプレーゾンデでボードを 45 度傾斜にして注入の３つの方法を用いた。ボードにラットをセットした後、喉頭鏡により開口し、喉頭蓋の下にある声門を確認し、多層 CNT の懸濁液を、経口ゾンデまたはスプレーゾンデを挿入し、ゾンデを介して工業用ナノ材料の懸濁液を注入した。注入量は、ラットあたり 0.04 mg と 0.2 mg の２用量とした。陰性対照として、10%BSA 溶液を用いた。麻酔から回復後、ゲージに戻した。注入 1 日後、3 日後に解剖した。
気管内投与する当日に、懸濁液に凝集物がないことを確認し、投与直前に、超音波処理を数分間行
った。

65

第Ⅶ章

図 C.1
C.2.4

ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた動物試験

投与手技の異なる気管内投与方法

解剖

ラットに麻酔薬を腹腔内注入し、痛覚刺激などで十分な麻酔深度であることを確認し、脱血死させる。
横隔膜に穴をあけて、5 mL の生理食塩水を入れたシリンジに装着した経口ゾンデを左右の胸腔内に注入し、同じ経口ゾンデをとおして胸腔内から生理食塩水を回収した。回収率は、９割前後である。その後、肺を摘出し、クリーニングを行った。左肺の気管支をクランプし、右肺に対して気管支肺胞洗浄（BAL: bronchoalveolar lavage）を行った。計 15 mL の生理食塩水を 2 回から 3 回にわけて注入（25 cm 水中圧）し、回収した。左肺は、10％ホルマリン溶液を、25 cm 水柱程度の高さから滴下し、定圧固定する。肺組織を肺胞が自然と広がった状態で観察することができる。固定液を注入後、気管を結紮し、24 時間固定液中に置き浸透させた。回収した気管支肺胞洗浄液（BALF: bronchoalveolar
lavage fluid）を、1,500 回転にて 15 分間遠心し、上清を回収した。セルペレットは、PBS

1 mL に再浮遊して、総細胞数をセルカウンターにて計測した。
C.2.5

BALF 検査

再浮遊液 100 µL を、サイトスピン（1,300 回転にて５分間遠心）を用いて塗抹標本を作製し、ディフクィック染色を行い、細胞分画を算定した。回収した胸膜洗浄液も同様に、1,500 回転にて 15 分間遠
心し、上清を回収した。セルペレットは、PBS1mL に再浮遊して、総細胞数をセルカウンターにて計測した。また、再浮遊液 100 µL を、サイトスピン（1,300 回転にて５分間遠心）を用いて塗抹標本を作製し、ディフクィック染色を行い、細胞分画を算定した。
a) 総細胞数
肺毒性の強い粒子では、一般的に増加する。但し、肺毒性が強すぎて細胞ダメージが強い場合は、細胞数の増加を認めない場合があるので注意する。その場合は、好中球比率が高いことが多いので参考にする。
b) 好中球細胞数
肺毒性の強い粒子では、一般的に増加する。但し、溶解性が高い粒子では、毒性にかかわらず急性期に増加するので注意が必要である。毒性の強さは、好中球増加の持続性に係わっているので、慢性期（注入後３から６ヶ月）まで観察する。
c) 好中球比率
肺毒性の強い粒子では、一般的に比率が増加する。但し、溶解性が高い粒子では、毒性にかかわらず
急性期に増加するので注意が必要である。毒性の強さは、好中球比率の増加の持続性に係わっているので、慢性期（注入後３から６ヶ月）まで観察する。

66

第Ⅶ章

C.2.6

ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた動物試験

肺病理所見

肺の病理組織標本の作製のために、固定された標本は、固定液を洗い流した後、エタノール等で脱水・脱脂を行う。その後パラフィン浸透のため、媒介剤（キシレン、クロロホルム等）で脱アルコールを行い、パラフィン浸透し、ブロックとして包埋する。パラフィン包埋された肺組織から、3-5 μm 厚
切片をプレパラートに載せ、キシレン・アルコールを用いて脱パラフィンを行った後に、HE 染色を行う。
末梢気道を中心とした肺胞領域に好中球や肺胞マクロファージを主体として炎症細胞浸潤を認める。但し、BALF の好中球数や好中球比率と同様に、溶解性が高い粒子では、毒性にかかわらず急性期に増加するので注意が必要であること、および毒性の強さは、炎症の持続性に係わっているので、慢性期（注入後３から６ヶ月）まで観察する。
BALF と肺病理の所見を総合的に判断して、気管内注入のアプローチ方法による肺内炎症の差異、アプローチ法による基礎データが確立後に、対象となるナノ材料の有害性を評価することが可能と考え
る。
C.2.7

気管支肺胞洗浄や病理所見における注意事項

これらの気管内投与試験の炎症所見は、あくまでも気管内投与というアプローチ内での反応が類似していることで、吸入暴露試験の結果との類似性があるということを示しているわけではない。吸入暴
露試験と比較して、気管内投与試験では、急性反応が生じやすく、かつ非吸入性粒子の影響がでやすい。よって、気管内投与試験を行う上で、注入する懸濁液中の粒子が吸入可能かどうかを判断し、生理的投与量にて注入し慢性期に評価すると、より吸入暴露試験の結果を反映できると考えられる。
３つのアプローチの内、スプレーゾンデを用いると、注入１日後から胸膜まで到達していたナノ材料を認める。よって、スプレーの陽圧によって、ナノ材料が胸腔内に侵入する可能性は否定できない。
胸腔内の反応に関しては、アプローチによる差異が生ずる可能性があるため改めて検討する必要であ
る。
C.3

試験結果

C.3.1 BALF 中の好中球細胞比率
BALF の好中球比率は、３つのアプローチとも１日後に増加したが、３日後には、陰性対照よりは有意に高いであったが、１日後より低下傾向を示した。よって、３つのアプローチとも好中球比率のパターンは、類似傾向を示し、アプローチ間で、著明な差異は認めなかった。
C.3.2 肺の病理所見
３つのアプローチにおける肺の病理所見としては、１日後に末梢気道を中心とした好中球やマクロファージなどの炎症細胞浸潤を認め、周囲の間質も軽度肥厚していた。３日後も同様の傾向を示した。
肺内分布に関しては、通常のゾンデでボードを垂直にして多層 CNT を注入されたラットでは、胸膜付
近までは到達していなかったが、上肺も下肺も均等に分布していた。一方、スプレーゾンデでボートを垂直または 45 度にして多層 CNT を注入されたラットでは、注入方向の肺胞にのみ多層 CNT が沈着し、１日後から胸膜まで到達した。
通常のゾンデでボードを垂直にして多層 CNT を注入されたラット、スプレーゾンデのボードを垂直および 45 度傾斜にして多層 CNT を注入されたラットにおいて、BALF の総細胞数は、３つのアプロー

67

第Ⅶ章

ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた動物試験

チとも１日後に増加した。３日後にも３つのアプローチとも 1 日後よりは低下傾向を示した。よって、３つのアプローチとも総細胞数の増加のパターンは類似傾向を示し、アプローチ間で、著明な差異は認めなかった。
C.4

結論

通常ゾンデでボードを垂直にしてナノ材料を投与したラット、スプレーゾンデでボードを垂直または45 度の傾斜をしてナノ材料を投与したラットにおいて、肺胞腔の炎症細胞の差異は認められなかった。
よって３つの手技による肺内炎症反応の差異は認めないと考える。
C.5

関連文献

1.

長谷川也須子、久保田久代、吉田緑、宮川宗之：気管内投与時の手技は肺における投与剤の分布に影響を与える 2013 年 05 月 14 日 | 日本産業衛生学会講演集(CD-ROM) 86th 519

2.

長谷川也須子、久保田久代、吉田緑、宮川宗之：気管内投与時の手技(体位・注入速度)の違いが投与
剤の呼吸器内分布に与える影響 2013 年 03 月 | 日本衛生学雑誌 68 Supplement S212

3. Morimoto Y, Izumi H, Yoshiura Y, Fujishima K, Yatera K, Yamamoto K. Useful of
intratracheal

instillation

studiesforestimating

nanoparticle-induced

pulmonary

toxicity. Int J Mol Sci 2016, 27:17(2)4. Morimoto Y, Izumi H, Yoshiura Y, Tomonaga T, Lee BW, Okada T, Oyabu T, Myojo T, Kawai
K, Yatera K, Shimada M, Kubo M, Yamamoto K, Kitajima S, Kuroda E, Horie M, Kawaguchi K,
Sasaki T. Comparison of pulmonary inflammatory responses following intratracheal
instillation and inhalation of nanoparticles. Nanotoxicology. 2016, 10(5):607-618.
5. 森本泰夫、堀江祐範、北島信一、福島昭治、武林亨
内投与試験と吸入ばく露試験の所見の比較.

工業用ナノ材料の有害性評価に向けた気管日本衛生学雑誌68

2013, 3:161-167.

第Ⅶ章

ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた動物試験

付属書 D

実施例：ラットを用いた単層 CNT および多層 CNT の気管内投与試験
D.1

概要

単層 CNT および多層 CNT の投与液を被験材料としたラット気管内投与試験の事例を示す。単層 CNT お
よび多層 CNT の投与液（濃度：低用量 0.08 mg/mL；高用量 0.8 mg/mL）を、ラット気管内に投与し、投与後 90 日目までの BALF 検査、PCLF 検査、肺の病理学的検査、肺の遺伝子発現解析、縦隔リンパ節の電子顕微鏡観察を行った（Fujita et al, 2016）。
D.2

試験方法

D.2.1

試料

BSA 等を用いて液中に懸濁した単層 CNT および多層 CNT を用いた。投与液は、本書、第Ⅲ章「ナノ炭
素材料の試料調製」に示した方法に従い調製した。それぞれの特性評価の結果を、表 D.1 に示す。気管内投与の Vehicle 群に CNT を調製した同じ濃度の BSA 溶液を使用した。
表 D.1 気管内投与液の特性評価(nm)

CNT幾何平
CNT口径
均長さ
(nm)
(µm)

NT

NT

NT

1.7-2.1

10.7

49

557

0.5

NT

0.08

NT

NT

NT

NT

60-100

0.84

8.8

3.9

622

1.81

NT

CNT濃度
(mg/mL)

G/D 比

単層CNT、低用量

0.08

NT

単層CNT、高用量

0.81

多層CNT、低用量
多層CNT、高用量

試料

Fe (μg/mL)

粒子径

NT: not tested.

D.2.2

動物

実験動物として 9 週齢 Wistar 雄性ラットを用いた。施設内の温度は、22.5±0.6 ℃、湿度 45.5-65.9％であった。照明に関しては、タイマーによる自動調節が行われ、明暗周期は、明期、暗期とも 12:12の比率で行った。
D.2.3

気管内投与

イソフルラン麻酔後に、ディスポーザブルシリンジおよび気管内投与用ゾンデを用いて、速やかに被験材料の投与を行った。投与量は、動物 1 匹あたり 0.4 mL とした（低用量：約 0.15 mg/kg；高用量：
約 1.5 mg/kg）。気管内投与する当日に、懸濁液に凝集物がないことを確認し、投与開始直前に、超音波処理を数分間行った。また、投与液の採取時に、泡立てないように回転させ撹拌を行った。
D.2.4

気管内投与

気管内投与後、90 日間の飼育し、1 日、3 日目、7 日目、30 日目、90 日目にそれぞれ剖検し、BALF 検
69

第Ⅶ章

ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた動物試験

査、PCLF 検査、肺の病理学的検査、肺の遺伝子発現解析、縦隔リンパ節の電子顕微鏡観察を行った。
D.3

試験結果

D.3.1 BALF 検査
単層 CNT の低用量群および高用量群において、好中球およびマクロファージを主体とした有核細胞数が増加を示したことから、異物に対する炎症反応と考えられた。好酸球の増加、リンパ球およびマク
ロファージ数が投与後 30 日目以降に増加する傾向にあり、遅延型の免疫応答が加わった可能性が示唆された。また、高用量群において Vehicle 群と比較して MIP-1a、MCP-1、IL-18、SPP-1 の有意な上昇が認められた。多層 CNT の低用量群および高用量群において、総有核細胞および好中球の有意な上昇は認められず、リンパ球応答型の免疫反応である可能性が考えられた。また、多層 CNT の高用量群において Vehicle 群と比較して SPP-1 の有意な上昇が認められたが、MIP-1a、MCP-1 の顕著な上昇は認められなかった。
D.3.2 PCLF 検査
PCLF 中の総有核細胞、リンパ球、好中球は、単層 CNT の低用量群および高用量群において Vehicle 群と比較して有意な上昇が認められなかった。総有核細胞、リンパ球、好中球、マクロファージは、多層 CNT の低用量群および高用量群において Vehicle 群と比較して有意な上昇が認められた。単層 CNTの高用量群において総タンパク、IL-18、SPP-1 の有意な上昇が認められなかった。多層 CNT の高用量群においてこれらの有意な上昇が認められた。
D.3.3 肺の病理学的検査
単層 CNT の高用量群において、投与 7 日目以降、局所的炎症性変化（肺胞内の炎症性細胞浸潤、周囲肺胞壁の線維化・肥厚など）や肺胞内での好中球浸潤、血管周囲の好酸球浸潤、泡沫状マクロファー
ジ、肉芽腫（Granuloma）が認められ、投与 90 日目まで減衰しなかった。また、投与 30 日目以降、泡沫状マクロファージが観察された。多層 CNT の高用量群においては、投与 3 日目まで、肺胞炎（局所的な炎症）や肺胞での好中球の浸潤は認められたが、その後減衰した。投与 7 日目以降、泡沫状マク
ロファージは認められたが、肉芽腫は認められなかった。
D.3.4 肺の遺伝子発現解析
単層 CNT の高用量群において、投与後、炎症反応（Ccl2、Ccl7、Ccl9、Ccl12）や細胞外マトリックス
分解酵素（Mmp7、Mmp12、Spp1）に関する各種遺伝子が高発現し、経日的にその増加が認められた。多層 CNT の高用量群においては、投与後 3 日目まで、これらの遺伝子は高発現したが、その後、緩やかに減少していった。
D.3.5 縦隔リンパ節の電子顕微鏡観察
単層 CNT および多層 CNT の高用量群において、投与後 90 日目に、縦隔リンパ節にこれらの局在が認
められた。
D.4

結論

同じ重量濃度、またほぼ同程度の短尺に調製した単層 CNT および多層 CNT をラット気管内投与し、その後 90 日目まで BALF 検査、PCLF 検査、病理学的検査、肺の遺伝子発現解析、縦隔リンパ節の電子顕微鏡観察を実施した。この結果、単層 CNT はその投与から、経日的に異物反応による肺の炎症の亢進

70

第Ⅶ章

ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた動物試験が認められた。胸腔での炎症は小さいと考える。一方、多層 CNT においては投与直後に肺の炎症が認められるものの経日的に緩やかな回復が認められた。また、胸腔での炎症の亢進が認められた。これより、短尺に調製した単層 CNT および多層 CNT は、異なるメカニズムにより吸入影響をもたらすものと考える。単層 CNT および多層 CNT は、投与後、縦隔リンパ節に局在したことから、肺からリンパを介して他器官へ移行することが示唆された。
D.5

引用文献

1. Fujita K, Fukuda M, Endoh S, Maru J, Kato H, Nakamura A, Shinohara N, Uchino K, Honda
K. Pulmonary and pleural inflammation after intratracheal instillation of short singlewalled and multi-walled carbon nanotubes. Toxicol Lett. 2016, 257(22):23-37.

71

第Ⅶ章

ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた動物試験

付属書 E

実施例：ラットを用いた半導体型および金属型分離単層 CNT の気管内投与試験
E.1

概要NEDO 委託事業「低炭素化社会を実現する革新的カーボンナノチューブ複合材料開発プロジェクト」（P10024）では、「金属型及び半導体型分離単層 CNT を効率的に分離する技術」をテーマに掲げ研究開発を行った。これは、産総研で開発した全く新しい単層 CNT の分離法である、ゲルカラムクロマトグ
ラフィー分離法を礎とした技術により、半導体型および金属型分離単層 CNT を高純度に高収率で、かつ安価に大量に分離する技術を開発し、世界最先端材料技術を確立することを目的としている。これ
により、純粋な半導体型分離単層 CNT はトランジスタやセンサの原料に、純粋な金属型分離単層 CNTは透明導電膜に利用可能で、特にプリンタブルエレクトロニクスへの適用により、大幅な省エネルギ
ー・省資源化を実現することが期待されている。
一方、半導体型および金属型分離単層 CNT それぞれの有害性に関する情報は、現在のところ世界的にもごく僅かである(Wang et al, 2016)。産業利用を安心して進めるために、半導体型および金属型
分離単層 CNT の有害性の相違を早期に確認することは、社会の要請に対する回答の１つであると共に、製品開発メーカー等の事業者のイノベーションに役立つと考える。
ここでは、半導体型および金属型分離単層 CNT の投与液を被験材料としたラット気管内投与試験の事例を示す。半導体型および金属型分離単層 CNT の投与液（濃度：1.0 mg/mL）を、ラット気管内に投与し、投与後 180 日目までの BALF 検査、PCLF 検査、肺の病理学的検査、肺の遺伝子発現解析、縦隔リンパ節の電子顕微鏡観察を行った。
E.2

試験方法

E.2.1

試料

BSA 等を用いて液中に懸濁した半導体型および金属型分離単層 CNT を用いた。投与液は、本書、第Ⅲ章「ナノ炭素材料の試料調製」に示した方法に従い調製した。それぞれの特性評価の結果を、表 E.1に示す。気管内投与の Vehicle 群に CNT を調製した同じ濃度の BSA 溶液を使用した。

金属型

半導体型

図 E.1 調製前の半導体型および金属型分離単層 CNT

72

第Ⅶ章

表 E.1

気管内投与液の特性評価

粒子サイズ

CNT幾何平均
長さ

(nm)

(µm)

44

533

0.927

1.7-2.1

33

361

0.547

NT

1）

CNT濃度
(mg/mL)Fe (μg/mL)

金属型・単層CNT

1.0

半導体型・単層CNT

1.0

試料

ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた動物試験

CNT口径
(nm)

1: 散乱基準によるモード径

E.2.2

動物

実験動物として 9 週齢 Wistar 雄性ラットを用いた。施設内の温度は、22.5±0.6 ℃、湿度 45.5-65.9％であった。照明に関しては、タイマーによる自動調節が行われ、明暗周期は、明期、暗期とも 12:12の比率で行った。
E.2.3

気管内投与

イソフルラン麻酔後に、ディスポーザブルシリンジおよび気管内投与用ゾンデを用いて、速やかに被験材料の投与を行った。投与量は、動物 1 匹あたり 0.4 mL とした（用量：約 1.8 mg/kg）。気管内投与する当日に、懸濁液に凝集物がないことを確認し、投与開始直前に、超音波処理を数分間行った。
また、投与液の採取時に、泡立てないように回転させ撹拌を行った。
E.2.4

気管内投与

気管内投与後、180 日間の飼育し、1 日、3 日目、7 日目、30 日目、90 日目、180 日目にそれぞれ剖検
し、BALF 検査、PCLF 検査、肺の病理学的検査、肺の遺伝子発現解析を行った。
E.3

試験結果

E.3.1 BALF 検査
半導体型および金属型分離単層 CNT 投与群において、Vehicle 群と比較した結果、経日的に総タンパクの増加が認められた。また、炎症性サイトカインが どちらの投与群においても高値を示した。以上の結果より、投与後 180 日目まで持続的な影響を及ぼすと考える。
E.3.2 PCLF 検査
陰性対照群、半導体型および金属型分離単層 CNT 投与群において、好中球比率が他の検査日に比べて投与後 1 日目でわずかに増加した。陰性対照群と比較した結果、半導体型および金属型分離単層 CNT
投与群において、投与後 1～30 日目にかけてマクロファージ数の高値が認められた。
E.3.3 肺の病理学的検査
半導体型および金属型分離単層 CNT 投与群では、共通して局所的炎症性変化（肺胞内の炎症性細胞浸潤、周囲肺胞壁の線維化・肥厚等）、肺胞内の好中球浸潤および血管周囲の好酸球浸潤、肺胞内マクロ
ファージの増加、泡沫マクロファージの集簇および細胞残屑ならびに被験物質貪食マクロファージが観察された。局所的炎症性変化は、全剖検日の全例に認められ、時間の経過とともに程度が増強した。
肺胞内の好中球浸潤および血管周囲の好酸球浸潤は、投与後 1～7 日目の投与後初期で 1～全例に認められた。被験物質貪食マクロファージはほとんどが投与後 3 日目以降、肺胞内マクロファージの増加

73

第Ⅶ章

ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた動物試験はほとんどが 7 日目以降、泡沫マクロファージの集簇および細胞残屑は 30 日目以降の剖検日で観察された。
E.3.4 肺の遺伝子発現解析
いずれの CNT 群において、炎症反応（Ccl2、Ccl7、Ccl9、Ccl12、Cxcl2、Cxcl6、Cxcl10 など）や細胞
外マトリックス分解酵素（Mmp7、Mmp12、Spp1）に関する遺伝子の高発現が認められた。半導体型および金属型分離単層 CNT に、大きな発現パターンの差異はないと考える。
E.4

結論

同じ重量濃度、またほぼ同程度の長さに調製した半導体型および金属型分離単層 CNT をラット気管内投与し、その後 180 日目まで BALF 検査、PCLF 検査、病理学的検査、肺の遺伝子発現解析を実施した。
この結果、半導体型および金属型分離単層 CNT 投与により、これまで実施した単層 CNT と同様、経日的に異物反応による肺の炎症の亢進が認められた。
E.5

引用文献

1. Wang X, Mansukhani ND, Guiney LM, Lee JH, Li R, Sun B, Liao YP, Chang CH, Ji Z, Xia T,
Hersam

MC,

Nel

AE.

Toxicological

ProfilingofHighlyPurified

Metallic

andSemiconducting Single-Walled Carbon Nanotubes in the Rodent Lung and E. coli., ACS Nano.
2016,10(6):6008-6019.

Ⅶ-１ の執筆担当者
森本泰夫、和泉弘人、藤田克英

74

第Ⅶ章

Ⅶ-２

ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた動物試験

遺伝毒性試験

序文
2016 年、多層 CNT である MWNT-7 および NT-7K が他の CNT と区別されて、「労働安全衛生法第 28 条第3 項の規定に基づき厚生労働大臣が定める化学物質による健康障害を防止するための指針」（いわゆる「がん原性指針」）の対象物質に追加された。「がんその他の重度の健康障害を労働者に生ずるおそれのあるもの」と判断されている一つは、2014 年行われた国際がん研究機構の発がん性評価により、MWNT-7 および
NT-7K がクラス 2B（発がん性の恐れがある）、他の CNT がクラス３（発がん性について分類できない）とされたことであり（Grosse et al, 2014）、もう一つは、2015 年に厚生労働省の検討会において発表された、高濃度の MWNT-7 雰囲気下で 2 年間飼育したラットの一部が肺がんを発症したという研究報告である（Kasai et al,2016）。このように、特定の多層 CNT に関しては、ヒトへの影響は定かではないものの、発がん性について注意すべきというコンセンサスが形成されてきた状況と言えるが、その他の CNT やナノ炭素材料に関しては未だ研究データが不十分である。
化 学 物 質 等 の発 がん性 の検 査 として、様 々な遺 伝 毒 性 試 験 が開 発 されている。経 済 協 力 開 発 機 構（OECD： Organization for Economic Co-operation and Development)では、国際的に共通な化学物質の安全性評価試験法をガイドライン化しており、そのうち遺伝毒性に関する試験方法を十数種類規定している（http://www.oecd.org/env/ehs/testing/）。それぞれの遺伝毒性試験は、異なる生物種やエンドポイントを用いて実施されているため、個別の試験だけで全ての遺伝毒性を判定することはなく、いくつかの遺伝毒性試
験を組み合わせて、化学物質の遺伝毒性を検出することが一般的である（バッテリー試験と称する）。ここでは、標準的なバッテリー試験として、OECD テストガイドラインにある細菌復帰突然変異試験（Ames 試験）、哺乳類培養細胞による染色体異常試験、および哺乳類を用いた小核試験を選択し、ナノ炭素材料の液中分散
試料を被験材料とする遺伝毒性試験を示す。なお、細菌復帰突然変異試験（Ames 試験）は、培養細胞試験の一種であるが、構成の都合上、第Ⅶ章ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた動物試験の中で記載したことをご了承願いたい。
1. 適用範囲
分散調製したナノ炭素材料の投与液を用いて、その安全性評価を行うための細菌復帰突然変異試験方法、哺乳類培養細胞による染色体異常試験方法、および哺乳類を用いた小核試験方法を示す。
2. 引用規格
細菌復帰突然変異試験は OECD テストガイドライン 471、哺乳類培養細胞による染色体異常試験は OECD テ
ストガイドライン 473、哺乳類を用いた小核試験は OECD テストガイドライン 474 に準拠する。
3. 用語、定義および記号
3.1 調製液
媒体でナノ炭素材料を分散した懸濁液。所定の濃度に希釈して調製し遺伝毒性試験に用いる。
4. 試験方法75

第Ⅶ章

ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた動物試験

4.1 細菌復帰突然変異試験（Ames 試験）
OECD テストガイドライン 471 に準拠して試験を行う（OECD Guideline for the Testing of Chemicals 471 (21July 1997: Bacterial Reverse Mutation Test, DOI: 10.1787/9789264071247-en)。11.10.
4.2 哺乳類培養細胞による染色体異常試験
OECD テストガイドライン 473 に準拠して試験を行う（OECD Guideline for the Testing of Chemicals 473 (26Sep. 2014: In vitro Mammalian Chromosome Aberration Test, DOI: 10.1787/9789264224223-en)。
4.3 哺乳類を用いた小核試験
OECD テストガイドライン 474 に準拠して試験を行う（OECD Guideline for the Testing of Chemicals 474 (26thSep. 2014: Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test, DOI: 10.1787/9789264224292-en)。
5. 報告OECD テストガイドラインに準拠して報告する。
6. 引用文献
1.

Grosse Y, Loomis D, Guyton KZ, Lauby-Secretan B, El Ghissassi F, Bouvard V, Benbrahim-Tallaa L,
Guha N, Scoccianti C, Mattock H, Straif K; International Agency for Research on Cancer MonographWorking Group. Carcinogenicity of fluoro-edenite, silicon carbide fibres and whiskers, and carbon
nanotubes. Lancet Oncol. 2014 15(13):1427-1428.

2.

Kasai T, Umeda Y, Ohnishi M, Mine T, Kondo H, Takeuchi T, Matsumoto M, Fukushima S. Lung
carcinogenicity of inhaled multi-walled carbon nanotube in rats. Part Fibre Toxicol., 2016 13:54.

76

第Ⅶ章

ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた動物試験

附属書 A

実施例：剥離グラフェンの細菌復帰突然変異試験
A.1 概要TASC 開発の剥離グラフェンを被験材料として、これらの遺伝子突然変異誘発性を検討するため、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）TA100、TA1535、TA98 および TA1537 株ならびに大腸菌（Escherichia coli）
WP2uvrA 株を用いた復帰突然変異試験の事例を示す。試験は、OECD テストガイドライン 471 に準拠し、ラット肝 S9 による代謝活性化系非存在下（–S9 処理）および代謝活性化系存在下（+S9 処理）の両処理のプレイ
ンキュベーション法により行った。剥離グラフェンは、溶媒によりその物理化学特性が異なる。そのため、異なる２種類の溶媒を用いて分散処理を行って調製原液を作製し、それぞれ用いて復帰突然変異試験を行った。
A.2 使用試料の調製および特性評価
溶媒 A0 ならびに溶媒 B0 により、それぞれ溶解し分散させた剥離グラフェン調製液（Grp-A0 および Grp-B0）
を、細菌復帰突然変異試験に使用した。剥離グラフェン調製液の安定性評価として、調製後 72 時間まで経
時的に、レーザー回折式粒子径分布測定装置（SALD-2300、島津製作所）を用い、剥離グラフェンの粒度分
布の測定を行った。この結果、作製 72 時間まで Grp-A0 および Grp-B0 の粒度分布は同等であったことから、両者は安定性があるものと判断した。
A.3 試験方法
OECD テストガイドライン 471 に準拠して試験を行った。用量設定試験（予備試験）として、適宜異なる濃度に調製した剥離グラフェン調製液（Grp-A0 および Grp-B0）、および溶媒 A0 ならびに溶媒 B0 を被験材料として、それぞれの菌株における生育阻害作用を見極め、この結果から剥離グラフェンおよび溶媒の適切な用量を決定し、本試験を行った。試験成立条件として、（１）陰性対照群および陽性対照群の平均復帰変異コロニー
数は、背景データから求めた基準値内であること、（２）陽性対照群の平均復帰変異コロニー数は、陰性対照
群の平均復帰変異コロニー数の２倍を超えることとし、上記の（１）（２）の条件を満たした場合に、試験が成立すると判断した。復帰変異コロニー数の平均値が陰性対照群の２倍以上に増加し、かつ、その増加に用量依
存性あるいは再現性が認められた場合に陽性と判定した。
A.3.1 菌株
以下の 5 種類の菌株を使用した。
＃

菌株

変異タイプ

１

ネズミチフス菌TA100 株

ヒスチジン要求性の塩基対置換型

２

ネズミチフス菌TA1535 株

ヒスチジン要求性の塩基対置換型

３大腸菌

WP2uvrA 株

トリプトファン要求性の塩基対置換型

４

ネズミチフス菌TA98 株

ヒスチジン要求性のフレームシフト型

５

ネズミチフス菌TA1537 株

ヒスチジン要求性のフレームシフト型

77

第Ⅶ章

ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた動物試験

A.3.2 陽性対照
あらかじめ調製した以下の陽性対照物質溶液を使用した。AF-2，9-AA および 2-AA 溶液は、ジメチル・スル
ホキシド（DMSO：Dimethyl sulfoxide）を用いて調製し、NaN3 溶液は、注射用水を用いて調製した。各調製液を 0.5 mL ずつ分注した後，凍結保管（–80°C）し、有効性が確認されている期間以内のものを試験に用いた。
代謝活性化系非存在下：–S9 処理
＃
１

陽性対照
AF-2

濃度（µg/plate）

菌株

0.01

ネズミチフス菌：TA100

2-(2-ﾌﾘﾙ)-3-(5-ﾆﾄﾛ－2－ﾌﾘﾙ) ｱｸﾘﾙｱﾐﾄﾞ

２

NaN3

ｱｼﾞ化ﾅﾄﾘｳﾑ

0.5

ネズミチフス菌：TA1535

３

AF-2

2-(2-ﾌﾘﾙ)-3-(5-ﾆﾄﾛ－2

0.01

大腸菌：WP2uvrA

0.1

ネズミチフス菌：TA98

80

ネズミチフス菌：TA1537－ﾌﾘﾙ) ｱｸﾘﾙｱﾐﾄﾞ
４AF-22-(2-ﾌﾘﾙ)-3-(5-ﾆﾄﾛ－2－ﾌﾘﾙ) ｱｸﾘﾙｱﾐﾄﾞ

５

9-AA

9-ｱﾐﾉｱｸﾘｼﾞﾝ塩酸塩

代謝活性化系存在下：+S9 処理＃

陽性対照濃度（µg/plate）

菌株

１

2-AA

2-ｱﾐﾉｱﾝﾄﾗｾﾝ

1

ネズミチフス菌：TA100

２

2-AA

2-ｱﾐﾉｱﾝﾄﾗｾﾝ

2

ネズミチフス菌：TA1535

３

2-AA

2-ｱﾐﾉｱﾝﾄﾗｾﾝ

10

大腸菌：WP2uvrA

４

2-AA

2-ｱﾐﾉｱﾝﾄﾗｾﾝ

0.5

ネズミチフス菌：TA98

５

2-AA

2-ｱﾐﾉｱﾝﾄﾗｾﾝ

2

ネズミチフス菌：TA1537

A.4 試験結果
10.0 µg／プレートを最高用量に設定し、0.313～10.0 µg／プレートの 6 用量で用量設定試験を行った。溶媒
A0 ならびに溶媒 B0 で分散した剥離グラフェンは、ともに–S9 および+S9 処理のいずれにおいても陰性対照群の２倍以上の復帰変異コロニー数の増加は認められなかった。この結果を基に、いずれの菌株について、
0.625～10.0 µg／プレートの 5 用量で本試験を行った。本試験の結果、–S9 および+S9 処理のいずれにおいても、陰性対照群の２倍以上の復帰変異コロニー数の増加は認められず、試験結果の再現性が確認された。
陽性対照物質は、各試験菌株に対し、明確な突然変異誘発作用を示した。以上の結果から、当該試験条件下において、溶媒 A0 ならびに溶媒 B0 で分散した剥離グラフェン（Grp-0A および Grp-B0）は、細菌に対して遺伝子突然変異誘発性を示さない（陰性）と判定した。

78

第Ⅶ章

ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた動物試験

附属書 B

実施例：剥離グラフェンのマウス赤血球小核試験
B.1 概要グラフェン関連物質(GRM: Graphene and Related Materials)は、新たな光学的・熱学的特性を持ち、産業への応用が期待される一方、CNT と同様に、その安全性について懸念されている。毒性発現メカニズムについて
は、細胞膜への直接作用の他、ROS 上昇や DNA への直接的な作用等が挙げられる等が提案されているが、依然として不明な点が多い。その中、げっ歯類赤血球を用いた in vivo 小核試験により、酸化グラフェンの遺伝毒性が報告された（Liu et al. 2013）。ISO/TS 12901-2:2014 は、ナノ物質および 100nm 以上のナノ物質の凝集塊と凝集体への職業暴露に付随するリスクを、毒性や定量的な暴露量推定の知見が限定的あるいは欠如している場合にも用いることができるコントロールバンディングの手法によって管理するためのガイドライ
ンであるが、in vivo での遺伝毒性試験において陽性が出た場合、ハザード区分（Hazard Group Allocation）が「非常に危険」のカテゴリーとなり、さらにこれに応じてコントロールバンディングが CB4（完全封じ込め）あるい
は CB5（完全封じ込めおよび専門家による検査）となることから、推奨使用環境が極めて厳しくなる。このため、
TASC グラフェン事業部で開発した剥離グラフェン分散調製液を被験材料として、OECD テストガイドライン 474に準拠し、マウス骨髄細胞における小核誘発性を指標とする被験物質の生体内における染色体損傷誘発性の有無を確認した。剥離グラフェンは、溶媒によりその物理化学特性が異なる。そのため、異なる２種類の溶媒を用いて分散処理を行って調製原液を作製し、それぞれ用いてマウス赤血球小核試験を行った。
B.2 使用試料の調製および特性評価および
溶媒 A0 ならびに溶媒 B0 により、それぞれ溶解し分散させた剥離グラフェン調製液を投与液 Grp-A0 ならびに投与液 Grp-B0 として、マウス赤血球小核試験に使用した。剥離グラフェン調製液の安定性評価として、調製後７２時間まで経時的に、レーザー回折式粒子径分布測定装置（SALD-2300、島津製作所）を用い、剥離グラフェンの粒度分布の測定を行った。この結果、作製 72 時間まで Grp-A0 および Grp-B0 の粒度分布は同等であったことから、両者は安定性があるものと判断した。
B.3 試験方法
OECD テストガイドライン 474 に準拠して試験を行った。予備試験として、溶媒 A0 ならびに溶媒 B0 をマウスに投与し、死亡例または重篤な毒性症状を確認した。被験物質液から投与可能な最大用量である 10 mg/kg
を高用量とし、公比２で除した 5 および 2.5 mg/kg の計 3 用量を被験物質処理群として設定した。剥離グラフ
ェン分散調製液として使用した溶媒 A0 ならびに溶媒 B0 を陰性対照群とした。さらに無処置対照群、また陽性対照として、Cyclophosphamide monohydrate（CP）の１用量群（50mg/㎏)単回投与を設定した。静脈注射による投与により、１日１回、5 日間行い、最終投与後 24 時間に骨髄塗抹標本を作製し、検鏡することにより小核多染性赤血球（MNPCE: micronucleated polychromatic erythrocyte）を観察、解析ならびに体重測定を観察した。各群におけるマウス数を雌雄それぞれ５匹とした。以上、用量設定試験（予備試験）被験物質においては、毒性作用の性差を確認するため、雌雄の動物を用いて実施した。予備試験での用量を決定した後、投
79

第Ⅶ章

ナノ炭素材料の液中分散試料を用いた動物試験

与液 Grp-A0 群ならびに Grp-B0 群、無処置対照群、陰性対照群（溶媒 A0 ならびに溶媒 B0）、陽性対照群（CP）を設け、雄マウスで本試験を行った。
試験は、以下の試験成立条件を満たした場合に成立したものと判断した。（１）無処理対照群における小核
幼若赤血球出現頻度が、陰性対照群の背景データから求めた基準値内であること。（２）陽性対照群の小核
幼若赤血球出現頻度が、無処理対照群の出現頻度と比較して、統計学的に有意な増加が認められること。
小核多染性赤血球出現頻度の陰性対照群と被験物質処理群との比較において、統計学的有意差が認められた場合に、陽性と判定した。
B.3.1 試験動物
マウス Crl:CD1(ICR)［SPF］を使用した。被験物質の投与は９週齢に開始した。
B.3.2 陽性対照
CP を、生理食塩液を用いて 5 mg/mL 液を調製し、用量 50 mg/kg で投与した。
B.4 試験結果
投与液 Grp-A0 または Grp-B0 を投与したいずれの群（2.5、5、10 mg/kg）においても各陰性対照群と比較して統計学的に有意な MNPCE の出現頻度の増加は認められなかった。多染性赤血球（PCE: polychromaticerythrocyte）の割合についても、投与液 A、B ともに各陰性対照群と比較して統計学的に有意な減少は認められなかった。無処理対照群の MNPCE 出現頻度は、陰性対照群の背景データから求めた基準値内であり、かつ、陽性対照群における MNPCE は，無処理対照群と比較して統計学的に有意な増加がみられたことから、
当該試験は適切に実施されたものと判断した。以上の結果から、当該試験条件下において、剥離グラフェン
材料（投与液 Grp-A0 および Grp-B0）はマウス骨髄細胞に対して小核誘発性を示さないものと判定した。
B.5 引用文献
1.

Liu Y, Luo Y, Wu J, Wang Y, Yang X, Yang R, Wang B, Yang J, Zhang N. Graphene oxide can induce invitro and in vivo mutagenesis. Sci. Reports. 2013 11; 3: 346915.

Ⅶ-２の執筆担当者
藤田克英

80

ナノ炭素材料の安全性試験総合手順書
ナノ炭素材料の試料調製と特性評価、培養細胞試験および動物試験の手順
初版第一刷

技術研究組合単層 CNT 融合新材料研究開発機構（TASC）〒305-8565

茨城県つくば市東 1-1-1

2017 年 2 月 15 日（国研）産業技術総合研究所つくば中央第五事業所内
国立研究開発法人〒305-8569

産業技術総合研究所、安全科学研究部門

茨城県つくば市小野川 16-1

本書は、ナノ炭素材料の試料調製と特性評価、および培養細胞試験および動物試験の手順を収載したものです。本書の複製・転載、および記載内容に関するご意見・ご要望は、（国研）産業技術総合研究所、安全科学研究部門までお問い合わせください。
＜お問い合わせ＞

E-mail： tasc3-ml@aist.go.jp

本書は、(国研)新エネルギー・産業技術総合開発機構(NEDO)から委託した「低炭素社会を実現する
ナノ炭素材料実用化プロジェクト」(P10024)による研究成果です。

本書は、(国研)新エネルギー・産業技術総合開発機構(NEDO)から委託した「低炭素社会を実現する
ナノ炭素材料実用化プロジェクト」(P10024)による研究成果です。