モダンメディア

60 巻 7 号 2014［医学検査のあゆみ］211

医学検査のあゆみ ─ 23

LAMP（Loop-mediated isothermal ampliﬁcation）法の原理と応用
Loop-mediated isothermal ampliﬁcation（LAMP）; Principle and applications.

たか

の

ひろし

高 野

さか

弘：酒

Hiroshi TAKANO

い

井

えい

栄

Eiichi SAKAI

いち

さ

さ

き

やす

一：佐 々 木 泰

はる治

Yasuharu SASAKI

鎖置換反応を利用して一定温度で反応させることをはじめに特徴とします。対象遺伝子を DNA とした場合、サンプルとなる遺伝子、プライマー、鎖置換型 DNA

LAMP（Loop-mediated Isothermal Amplification；

合成酵素、基質等を一緒に、一定温度（60 ～ 65℃

ループ介在等温増幅）法は、栄研化学が独自に開発付近）で保温することにより、遺伝子の増幅反応かした国産の遺伝子増幅技術です。1980 年代 PCR（ポら検出までを 1 ステップの工程で行うことができま

リメラーゼ連鎖反応）法の登場により、栄研化学はす。対象遺伝子を RNA とした場合には、逆転写酵

臨床検査分野において遺伝子診断は重要かつ不可欠

素を試薬に最初から追加することで、DNA と同様にな検査になると考え、研究所においてその根幹とな

1 ステップで増幅・検出を行うことができます（RT-る遺伝子増幅技術の新規開発に取り組みました。そLAMP 法）。

し て、 試 行 錯 誤 の 末、60 ℃ 付 近 で 働 く 鎖 置 換 型

LAMP 法では標的遺伝子について、3’末端側からDNA 合成酵素と、自己の配列を鋳型とする連続的F3c、F2c、F1c と い う 3 つ の 領 域 を、5’末端側でな DNA 伸長反応のために工夫されたプライマーの

B1、B2、B3 という領域を規定し、この 6 領域に対し、利用による、新しい遺伝子増幅技術 LAMP 法の開4 種 類 の プ ラ イ マ ー（FIP、F3 プ ラ イ マ ー、BIP、発に至りました 。

B3 プライマー）を設計します。FIP は標的遺伝子の1）

栄研化学は、この LAMP 法を広く普及させるた

F2c 領域と相補的な F2 領域を 3’
末端側に持ち、5’め 2000 年 5 月に技術公開し、その技術の斬新さと末端側に標的遺伝子の F1c 領域と同じ配列を持つ実現の可能性を示すため、2002 年 3 月に第一号製品

ように設計し、F3 プライマーは標的遺伝子の F3cを発売しました。こ領域と相補的な F3 領域を持つように設計します。

の試薬を発売してからすでに 10 年以上を経過する中逆鎖側の BIP、B3 プライマーも同様に設計します

で、さまざまな国の多くの研究者が LAMP 法の特徴

（図 1）。最適なプライマー設計が LAMP 法によるである牛胚性判別試薬キット

2, 3）を活かして、多様な分野での応用を図っています。
本稿では、LAMP 法について原理および特徴、そして各分野における LAMP 法の応用例、新規周辺技術の開発についてご紹介します。

Ⅰ. LAMP 法の原理と特徴
LAMP 法は、図 1 に示すとおり標的遺伝子の 6箇所の領域に対して 4 種類のプライマーを設計し、
栄研化学株式会社営業統括部
マーケティング推進室MKT三部〠114 - 8408 東京都台東区台東4 - 19 - 9

図 1 LAMP 法のプライマー設計領域

MKT Department - III, Marketing Office, Sales Division,
Eiken Chemical Co., Ltd(4-19-9 Taito, Taito-ku, Tokyo)

（1）

212

増幅を成功させる必要不可欠な条件ですが、栄研化プを持ったダンベル様構造をした一本鎖 DNA が生学では富士通株式会社と共同で、PrimerExplorer

成され、この構造が LAMP 法増幅サイクルの起点®

という LAMP 法専用のプライマー設計支援ソフト構造となります（図 2a（8））。次のステップとして、を、無償で利用できるよう Web 上でサービスを提ダンベル構造の 3’
末端側の一本鎖ループ部分に FIP

供しています（http://primerexplorer.jp/）。

がアニールして、先の反応で合成された二本鎖を剥

上記 4 種類のプライマーを含む試薬を 60 ～ 65℃

がしながら DNA の伸長・合成反応が進み、新たにの一定温度で反応させることで、鋳型 DNA の 3’
末

一本鎖部分の 3’末端側にループ構造を作り出し、自端部分にループ構造を作らせ、自己アニールによる己を鋳型とする鎖置換型 DNA 合成反応により両端3’末端からの自己を鋳型とした DNA 合成反応が可に一本鎖ループ部分をもつダンベル構造の裏返し構

能となります（図 2a, b）。形成されたループ構造に造（図 2b（11））ができます。そして、この図 2b（11）もプライマーがアニール可能で、3’末端を起点としの構造から（8）の構造が作り出され、増幅サイクル

た DNA 合成反応が生じます。その結果、両端にルーが回り出します。この増幅サイクルの結果、両端に

a

3’
5’

F3

3’

(5)

65℃

5’

DNA Polymerasewith strand displacement activity

B1 B2 B3B1c B2c B3cF3c F2c F1cB1 B2 B3

F3
F2 F1
F1c

B1c B2c B3cF3c F2c F1cB1 B2 B3

5’5’

F3 F2 F1

F2

(7)

5’
3’

5’
3’

5’
3’

5’
3’

B1c B2c B3c+F1c F2 F1

3’B1c B2c B3cB1c B2c B3c

F1

(6)

5’
3’

B1 B2 B3F3c F2c F1c

3’

(4)

B1c B2c B3c

5’ F2 F1
F1c

3’

(3)

F3 F2 F1

5’ F2 3’
F1c

FIP

(2)

Target DNA B1 B2 B3F3c F2c F1c

3’

(1)

F3c F2c F1c

3’
B3 B3
3’B2
B1c 5’

5’
F1c

BIP

F1c F2 F1B1c B2c B3cF1 F2c F1cB1 B2 B3

F2c

(8)

+

F1c

5’

3’

B1
5’
B1c

F1 3’

B2

b
(13)
(8)
F2c F1c
F2
F1 3’
F1c

B1
5’
B1c

B2

F1 F2c F1cB1F1c F2 F1 F1cF2F1c F1B1cB2c
B1
B1c

(9)
F2

F1

B1c B2c B1

F1 F2c F1cB1

F2cF1cB1c B1 B2 B1c
B2c
B1F1c F2 F1 F1cF2c
F1B1cB2c
B1

F1
F1c

F2

F1

B1c B2c B1

F2cF1cF1

B1c B1 B2 B1c
B2
B1 B1c

F1c

F2

(12)

B1c B2c
B2

F1
5’
F1c

3’ B1

(11)

B1c

(10)

図 2 LAMP 法の増幅原理

（2）

B2

B1
B1c

B2

213

ループを持ったダンベル様構造の増幅産物や、互い

a. 濁度目視検出例に相補的な配列が交互に繰り返された増幅産物がい

副産物ピロリン酸Mgの白濁を目視可能

ろいろなサイズで生成されます。この増幅サイクル

b. 蛍光目視検出例（UVランプ下で目視可能）
キレート剤存在下

蛍光インターカレーター存在下は、理論上、基質またはプライマーがすべて消費されるまで継続します。詳細は原理の動画も視聴可
能な Eiken GENOME SITE（http://loopamp.eiken.
−co.jp）を参照してください。

＋

−

＋

−

Ⅱ. LAMP 法の特徴＋

鋳型：PSA
インターカレート剤：
Ethidium Bromide（0.5 μg/mL)＋ Methlene Blue（20 μM/L）

鋳型：SARS CoV
キレート剤：Calcein（0.127 μg/mL）

鋳型：サルモネラ属菌

図 4 LAMP 法における目視検出例

LAMP 法は以下の特徴を有しています。
1 ）鋳型 2 本鎖 DNA の 1 本鎖への変性ステップを含6）検出までを 1 ステップで行うことができる簡易

めて増幅、検出のすべての反応を等温で行うこな遺伝子検査が可能です。鋳型が RNA でも逆転とができる簡易な反応系です。

写酵素を添加することにより、1 ステップ、一2 ）増幅反応は連続的に速やかに進行するため増幅

定温度で増幅が可能です。

効率が高く、微量の遺伝子を短時間に検出でき

7）増幅反応が強く、阻害物質の影響を受け難いた

る迅速な反応系です。更にループプライマー

め、核酸抽出の簡易化が可能です。

（Loop primer；図 3）というプライマーを追加設

Ⅲ. LAMP 法の応用

計することで、増幅時間をより短縮させることが可能です 。
4）3 ）4 つのプライマーを使用して 6 つの領域を認識

PubMed で検索される LAMP 法関連論文数は 2013

させることから、極めて高い特異性を有してい

年 12 月末現在で 1100 以上となります（図 5）。近年ます。原理的には設定した 6 つの領域がその順

は、日本以外の海外研究者が LAMP 法の特徴を活番に並んでいないと増幅反応が起こりません。

かした遺伝子検査技術を多様な分野に応用していま増幅産物はすべて標的遺伝子となるため、増幅す。特にここ 3 年間は中国人研究者の論文が最も多の有無により標的遺伝子の検出が可能となりまいようです。これまでの論文内容を分野別に分類しす。更に高い増幅効率のため増幅産物が桁外れてみると、図 6 に示すとおり医療分野が約 40％をに大量に産生され、蛍光インターカレーター、あ占めていますが、畜産、水産、食品、植物、環境な

るいは副生成物ピロリン酸マグネシウムの白濁

ど多岐に渡ります。

を利用することで、目視検出が可能です （図 4）。

誌面の都合上、すべてをご紹介することはできま

4）特別な検出機器、試薬を用いなくても標的遺伝

せんが、LAMP 法の特徴を活かした応用例を以下に

5）子配列の増幅の有無を確認できます。

ご紹介します。

5）増幅産物は同一鎖上で互いに逆向きの配列が連200結した繰り返し構造です。

180

191

196

160
140
120

131

100
80
60

0

118

72

40
20

140

107

1

2

2000 2001

2

7

2002 2003

22

2004

30

2005

35

2006

48

2007

2008

2009

2010

2011

2012

2013

2014

2014年7月現在

図 5 PubMed で検索される LAMP 法関連論文数の推移

図 3 ループプライマーの設計領域

（3）

214

1. 医療分野での応用例
2.9%性、迅速性という特長を活かした感染症、特に新興、

医療

8.8%

39.5%

7.4%
7.4%

医療分野への応用として、まず LAMP 法の簡易9.4%

再興感染症への応用があげられます。新興感染症の

動物
（畜産）
水産

定義は「かつては知られていなかった、この 20 年間

植物

24.6%

食品

に新しく認識された感染症で、局地的に、あるいは

環境

国際的に公衆衛生上の問題となる感染症」
（WHO）

基礎

ですが、その 1 つが 2002 年 11 月中国広東省における重篤な非定型肺炎の流行に端を発し、世界的規模

2014年7月現在

で流行した SARS コロナウイルスです。LAMP 法は

図 6 PubMed で検索される LAMP 法関連論文
内容の内訳

この SARS コロナウイルス検出に応用され、本

6 ～ 9）

邦においては検出キットが体外診断用医薬品として
厚労省より承認されています。表 1 に示すとおり、

表1 新興感染症、再興感染症へのLAMP法の応用
疾患

病原体

主なLAMP応用例報告
Poon LL, et al. 2004 6）, Hong TC, et al. 2004 7）,田口文広 他 2004 8）, 田代眞人 2004 9）
Imai M, et al. 2006 10）, Imai M, et al. 2007 11）,
Imai K, et al. 2007 12）, Jayawardena S, et al. 2007 13）,
鳥インフルエンザ
H5N1亜型、
H7N9亜型インフルエンザウイルス
Yoshida H, et al. 2011 14）, 国立感染症研究所インフルエン
ザ研究センター 2013 15）
ウエストナイル熱
ウエストナイルウイルス
Parida M, et al. 2004 16）, Shukla J, et al. 2012 17）
エボラ出血熱エボラウイルス
Kurosaki Y, et al. 2007 18）
Karanis P, et al. 2007 19）, Bakheit MA, et al. 2008 20）,
クリプトスポリジウム症
クリプトスポリジウム
Inomata A, et al. 2009 21）
クリミア・コンゴ出血熱
クリミア・コンゴ出血熱ウイルス
Osman HA, et al. 2013 22）
後天性免疫不全症候群（HIV） ヒト免疫不全ウイルス（HIV）
Curtis KA, et al. 2008 23）, Hosaka N, et al. 2009 24）
重症熱性血小板減少症候群
重症熱性血小板減少症候群ウイルス
Yang G, et al. 2012 25）, Xu H, et al. 2013 26）
腸管出血性大腸菌感染症
O26、
O111、
O157等のベロ毒素を産生する大腸菌 Hara-Kudo Y, et al. 2007 27, 28）
ニパウイルス感染症
ニパウイルス
日本紅斑熱
日本紅斑熱リケッチア
バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌
バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（VRSA）（VRSA）感染症
マールブルグ病
マールブルグウイルス
Kurosaki Y, et al. 2010 29）
ラッサ熱ラッサウイルス
Poon LL et al. 2006 30）, Han ET, et al. 2007 31）,
マラリア
マラリア原虫Polley SD, et al. 2010 32）, Sirichaisinthop J, et al. 2011 33）,
Polley SD, et al. 2013 34）
ペスト
ペスト菌
ジフテリア
ジフテリア菌Iwamoto T, et al. 2003 35）, Boehme CC, et al. 2007 36）,
結核
結核菌
Mitarai S, et al. 2011 37）
百日咳
百日咳菌
Kamachi K, et al. 2006 38）
サルモネラ感染症
サルモネラ（Salmonella enterica）
Hara-Kudo Y, et al. 2005 39）
コレラ
コレラ菌
Yamazaki W, et al. 2008 40）, Okada K, et al. 2010 41）
狂犬病
狂犬病ウイルス
Boldbaatar B, et al. 2009 42）, Saitou Y, et al. 2010 43）
デング熱
デングウイルス
Parida MM, et al. 2005 44）
黄熱病
黄熱ウイルス
Kwallah Ao, 2013 45）
Poon LL, et al. 2005 46）, Ito M, et al. 2006 47）,
インフルエンザ
インフルエンザウイルス
納富継宣 他 2009 48）, Kubo T, et al. 2010 49）,
重本直樹 他 2010 50）, Nakauchi M, et al. 2011 51）
住血吸虫症
ビルハルツ住血吸虫、インターカラーツム住血吸虫、
Xu J, et al. 2010 52）
Schistosomiasis
日本住血吸虫、
マンソン住血吸虫、メコン住血吸虫
トキソプラズマ症
トキソプラズマ（Toxoplasma gondii）
Sotiriadou I, et al. 2008 53）, Krasteva D, et al. 2009 54）
リーシュマニア症
リーシュマニア
Takagi H, et al. 2009 55）, Adams ER, et al. 2010 56）
エキノコックス症
エキノコックス
Salant H, et al. 2012 57）（2014年7月現在）
SARS（重症急性呼吸器症候群） SARSコロナウイルス

新興感染症

主な再興感染症（4）

215

この SARS コロナウイルスに限らず、主な新興感染

種高リスクヒトパピローマウイルス（HPV）ゲノムの症、再興感染症の病原体に対して LAMP 法の応用

検出と型判別（高リスク HPV 感染診断の補助に使例があります。

用される）試薬（積水メディカル社クリニチップ

6 ～ 57）®

栄研化学では、この SARS コロナウイルス検出試

HPV）が製品化されています 。一方、海外においとして発売した後、ては、抗生物質の長期使用により下痢症や腸炎を引、H1pdm2009

き起こし、院内感染を引き起こす菌として重要な、A 型インフルエン

Clostridium difficile や、A 群レンサ球菌、B 群レンサ

、マイコプラズマ・ニューモニエ

球菌、マイコプラズマ、百日咳菌の検出試薬が製品薬を最初の体外診断用医薬品

58）

H5 亜型インフルエンザウイルス
インフルエンザウイルス
ザウイルス

75）

10, 11, 47）

50, 59 ～ 62）

50, 59 ～ 62）、レジオネラ属菌

63 ～ 64, 66 ～ 70）、そして結核菌群化（Meridian Bioscience Inc.）されています

65 ～ 67）。

76 ～ 80）

を体外診断用医薬品

表 2 の他、栄研化学における医療分野の応用例

として厚生労働省より承認を受け、発売しています。

としては、臨床研究用途の製品として百日咳菌検出

いずれもすべて保険適用になっています（表 2）。

81）
試薬キット 、単純ヘルペスウイルス（HSV-1/2）を検出する試薬キット

36, 67, 71 ～ 72）

検出試薬キット

また、栄研化学から LAMP 法特許を許諾されたが発売され、海外向け製品として、

82）

TM

Trypanosoma brucei Detection Kit 83）、

TM

MALARIA Pan/Pf Detection Kit

企業から、体外診断用医薬品として、摘出された乳Loopamp癌、大腸癌又は胃癌所属リンパ節中の CK19 mRNA

Loopampの検出（乳癌、大腸癌又は胃癌におけるリンパ節転品化されています。また、一部 LAMP プライマー

移診断の補助に用いる）試薬（シスメックス社リノも臨床研究用として発売しています（表 3）。

31）

が製

、LAMP 法と電流検出型

更に、医療分野での LAMP 応用例としては、中DNA チップ法を組み合わせた子宮頸部細胞中の 13山らによる麻疹、おたふく風邪、RSV、風疹に対す

アンプ BC、OSNA 法）

73, 74）

表2 医療分野への応用（体外診断用医薬品；栄研化学）
製品名

保険
剤型
適用
液状
2003/12/18 有
試薬
製造承認日

Loopamp SARSコロナウイルス
検出試薬キット
®

核酸抽出

対象検体種

QIAGEN法

糞便、
鼻腔拭い液
咽頭拭い液

Loopamp H5亜型インフルエンザ
ウイルス検出試薬キット

2008/9/19

有

液状
試薬

QIAGEN法

Loopamp H1pdm2009
インフルエンザウイルス試薬キット

2010/6/2

有乾燥
試薬

専用抽出試薬乾燥
試薬

専用抽出試薬®

®

Loopamp® A型インフルエンザ
ウイルス検出試薬キット

2010/10/5

有Loopamp® マイコプラズマP検出
試薬キット

2010/5/24

有2010/5/24

有2011/4/18

有Loopamp® レジオネラ検出試薬キットC
Loopamp® 結核菌群検出
試薬キット

鼻腔拭い液
咽頭拭い液

咽頭拭い液
液状 QIAGEN法又は（鼻咽頭拭い液
試薬 SR DNA抽出キット
を含む）
、
喀痰
液状
QIAGEN法
喀痰
試薬
乾燥
PURE法
喀痰
試薬

反応
プライマー設計領域 参考文献
時間
ゲノムRNAの8, 9, 57）
62～63℃ 45分
Replicase 1B領域内
ゲノムRNAの10, 11, 47）
60～63℃ 35分
ヘマグルチニン
領域内
ゲノムRNAの50, 58～61）
62.5℃ 35分
ヘマグルチニン
領域内
ゲノムRNAの50, 58～61）
マトリックス
62.5℃ 35分
プロテイン領域内

反応温度

65℃

60分

SDC1遺伝子内65℃

60分

16SrRNA

67℃

40分

GyrB、
IS611062, 63,65～69）
63～66）
36, 66,70, 71）（2014年7月現在）

表3 臨床研究用途のLAMPプライマー製品
製品名

核酸抽出

Loopamp プライマーセット WNVQIAGEN法

Loopamp プライマーセット Avian Flu H7

QIAGEN法

LAMP法用プライマーセット Measles Virus

MagExtractor－Viral RNA－LAMP法用プライマーセット Mumps Virus

QIAGEN法®

®

TM

反応温度 反応時間 プライマー設計領域 参考文献
販売
ゲノムRNAの
15）
63℃
35分
栄研化学
envelope領域内
ゲノムRNAの62.5℃35分
ヘマグルチニン
栄研化学
領域内
ゲノムRNAの84）
ニッポンジーン
63℃
40分
ヘマグルチニン
領域内
ゲノムRNAの85）
ニッポンジーン
63℃
40分
マトリックスプロテイン
領域内（2014年7月現在）

（5）

216

る LAMP 系 84 ～ 87）、吉川らによる一連のヘルペスウ

図 7 に示すとおり、これまでの PCR 法を用いた判、森田らによる熱帯地

別技術は、作業が煩雑で時間がかかり、高価な設備域で流行している感染症に対する検出系

95 ～ 97）、槇が必要でしたが、LAMP 法の試薬キットを用いた検村らによる PCP、真菌に対する検出系、関らに

査は約 40 分と短時間で、高い特異性があり、雄特に対する検異的および雌雄共通プライマーで誤判定の可能性をイルスに対する検出系

よる肺炎球菌88 ～ 94）、インフルエンザ菌

100）

98, 99）101）

極力排除しています（図 7）。

出系があります。以上の他にも多くの医療分野への応用例

102 ～ 129）があり、主なものをまとめて表 4 に示

この試薬キットを当時、乳牛を増産して国民に牛します。

乳を十分に飲ませる政策を実施していた中国に積極的に紹介したことが契機となり、中国では家畜の疾

2. 畜産分野での応用例

病診断に LAMP 法が盛んに応用され、家畜の疾病

製品化された応用例としては、栄研化学が北海道

による畜産農家の経済的損失の低減および疾病のま

畜産試験場と共同で開発した牛の受精卵の性判別をん延防止に貢献すべく、公的な研究機関がかなりのする Loopamp 牛胚性判別試薬キットがあります

研究費を投じて研究開発しています。

。

2, 3）

表4 医療分野における主なLAMP法の応用（表 1 の応用例を除く）
検出対象の微生物
主なLAMP法の応用報告
Measles virus
Fujino M, et al. 2005 84）
Okafuji T, et al. 2005 85）
Mumps virus
Ushio M, et al. 2005 86）
Respiratory syncytial virus
Mori N, et al. 2006 87）
Rubella virus
Enomoto Y, et al. 2005 88）
HHV-1（HSV-1）
Enomoto Y, et al. 2005 88）
HHV-2（HSV-2）
Okamoto S, et al. 2004 89）
HHV-3（VZV：varicella zoster virus）
Iwata S, et al. 2006 90）
HHV-4（EBV：Epstein-Barr virus）
Suzuki R, et al. 2006 91）
HHV-5（CMV：cytomegalovirus）
Ihira M, et al. 2004 92）
HHV-6
Yoshikawa T, et al. 2004 93）
HHV-7
HHV-8
（KSHV：Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus）Kuhara T, et al. 2007 94）
Parida MM, et al. 2006 95）
Japanese encephalitis virus
Parida MM, et al. 2007 96）
Chikungunya virus
Le Roux CA, et al. 2008 97）
Rift Valley fever virus
Yoneyama T, et al. 2007 102）
HAV
Notomi T, et al. 2000 1）, Cai Z, et al. 2011 103）
HBVYang J, et al. 2011 104）
HCV
Zhang LQ, et al. 2012 105）
HEV
Wakabayashi T, et al. 2004 106）
Adenovirus
Iizuka I, et al. 2009 107）
Monkeypox virus
Hagiwara M, et al. 2007 108）
Human papillomavirus
Mycoplasma pneumoniae
吉野 学, 他 2008 63）, 山口 恵三, 他 2007 64）
Legionella ssp.
安中 敏光, 他 2003 63）, 山口 恵三, 他 2007 64）
Streptococcus pneumoniae
Seki M, et al. 2005 100）
Haemophilus influenzae
Torigoe H, et al. 2007 101）
Chlamydophila pneumoniae
Kawai Y, et al. 2009 109）
Coxiella burnetii
Pan L, et al. 2013 110）Chlamydia trachomatis
保坂 憲光, 他. 2008 111）
Neisseria gonorrhoeae
保坂 憲光, 他. 2008 111）
Clostridium difficile
Kato H, et al. 2005 112）, Lalande V, et al. 2011 113）
Helicobacter pylori
Minami M, et al. 2006 114）
Neisseria meningitidis
McKenna JP, et al. 2011 115）
Vibrio vulnificus
根本 二郎, 他 2008 116）
Yersinia pseudotuberculosis
Horisaka T, et al. 2004 117）
Prevotella intermedia
Miyagawa J, et al. 2008 118）
Actinobacillus actinomycetemcomitans
Osawa R, et al. 2007 119）, Miyagawa J, et al. 2008 118）
Treponema denticola
Miyagawa J, et al. 2008 118）
小島 禎, 他 2006 120）
メタロ-β-ラクタマーゼ産生菌
Misawa Y, et al. 2007 121）, Hanaki K, et al. 2011 122）
MRSA
Pneumocystis jirovecii
Uemura N, et al. 2008 98）
Aspergillus fumigatus
鈴木 渉, 他 2005 99）
Trypanosoma brucei
Kuboki N, et al. 2003 123）, Njiru ZK, et al. 2011 83）
検出対象の癌関連遺伝子、
項目
主なLAMP法の応用報告
cytokeratin19（CK19）mRNA
Horibe D, et al. 2007 124）, Visser M, et al. 2008 125）
Morishita S, et al. 2009 126）
Wilms’tumor gene（WT1）mRNA
Ikeda S, et al. 2007 127）
EGFR
神田 秀俊, 他 2001 128）, Iwasaki K, et al. 2003 129）
SNPs ; P450 CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6

（6）

217

日本での畜産分野での応用例としては、絵野澤ら

愛好家や国内外の錦鯉等の流通業者にとっても重要、山崎らによる口蹄疫

な問題であり、この方面でも LAMP 法は実社会のによるヨーネ病への応用への応用があります130）。山崎らは、国際獣疫事務役に立っています。

131）

局（OIE）が基本とする PCR 法では、判定までに約

この他、コイ春ウイルス血症、海老（えび）の白

5 時間を要するのに対し、アジアで感染拡大する 4斑病にも LAMP 法が検討されています

その他の水産分野における主な応用例

タイプの口蹄疫を、最短 45 分で診断できる LAMP

144 ～ 147）

をまとめて表 6 に示します。

法を用いた検出系を検討しています。
畜産分野における主な応用例。

141 ～ 143）をまとめて表 5

132 ～ 138）

4. 植物分野での応用例に示します。

この分野は福田ら、平田らの研究により LAMP

3. 水産分野での応用例

法の応用が進んでいる分野の 1 つです。福田らは139 ～ 140）

栄研化学では、コイヘルペスウイルス（KHV）

LAMP 法をトマト黄化葉巻ウイルス、シンビジウム（図 8）とアユ冷水病について LAMP 用プライマー

モザイクウイルス、タバココナジラミのバイオタイ

セット を製品化しました。特に、KHV は錦鯉等のプ Q 等の検出へ応用しています。主な応用例#

148 ～ 161）をまとめて表 7 に示します。和歌山県農業協同組#：2014年 3月末発売中止。

合 連 合 会 の 植 物 バ イ オ セ ン タ ー で は、 平 田 ら の
牛胚性判別試薬キット

前処理；サンプル溶液の調製

反応混液

25μＬ

（サンプル溶液 5μＬ＋マスターミックス 20μＬ）

LAMP
増

幅

検

出

00 : 00
雄特異的
プライマー

結 果 判 定40 : 00

Loopamp エンドポイント濁度測定装置
1台で増幅・検出・判定が可能

結
果

雌雄共通
プライマー

判定

＋

＋

雄

−

＋

雌

＋

−

−

−

再検査
エンドポイント濁度測定装置（LA-100）

図 7 LAMP 法による牛の受精卵の性判別
表5 畜産分野における主なLAMP法の応用
検出対象の微生物、項目、疾患等
Bovine Embryo Sexing
Avian Inﬂuenza Viruses

主なLAMP法の応用報告
副島隆浩, 他 2003 2）, 陰山聡一, 他 2003 3）
Imai M, et al. 2006 10）, Imai M, et al. 2007 11, 12）,
Jayawardena S, et al. 2007 13）, Yoshida H, et al. 2011 14）
Enosawa M, et al. 2003 130）

Johne’
s disease－paratuberculosis（Mycobacterium avium subsp. Paratuberculosis）
Yamazaki W, et al. 2013 131）
Foot-and-mouth disease
Alhassan A, et al. 2007 132）
Equine piroplasmosis
Nemoto M, et al. 2010 133）
Equine rotavirus
Nemoto M, et al. 2011 134）
Equine herpesvirus
Pham HM, et al. 2005 135）
Newcastle disease virus
Komiyama C, et al. 2009 136）
Bovine leukemia virus
Brucella spp.
Ohtsuki R, et al. 2008 137）
Ehrlichia ruminantium
Nakao R, et al. 2010 138）（2014年7月現在）

（7）

218

担当

検査チャート
（1）
疫学調査

検

都道府県

（3）
剖検

市販のDNA抽出試薬

（4）
①
（ア）
PCR検査
（または）
（4）
①
（イ）
LAMP法

（＋，±）

体

（鰓、
腎臓、
脾臓）

（2）
臨床検査

鰓

マスターミックスの調製

LAMP法簡易抽出試薬（EX F）

サンプル
（−）

養殖研究所

（4）
②
（ア）
培養細胞によるウイルス検査

・・・

サンプルまたはコントロールの添加

反応チューブへ分注

リアルタイム濁度測定装置

（4）
②
（イ）
PCR検査

LAMP反応（65℃，60分）
判定 （＋）

（−）

（−）

蛍光検出

出典；農林水産省 消費・安全局 特定疾病等対策ガイドライン 病性鑑定指針より
平成17年10月（平成18年12月最終校正）

リアルタイム濁度測定

図 8 KHV 検査の流れと LAMP の操作概略
表6 水産分野における主なLAMP法の応用
検出対象の微生物、項目、疾患等
主なLAMP法の応用報告
Koi herpesvirus（KHV）
吉野 学, 他 2006 139）, Yoshino M, et al. 2009 140）
Fujiwara-Nagata E, et al. 2009 141）
冷水病（Cold water disease）（Flavobacterium psychrophilum）
Shivappa RB, et al. 2008 142）
コイ春ウイルス血症（SVC : Spring Viremia of Carp）
Kono T, et al. 2004 143）
White spot syndrome virus（WSSV）
Mekata T, et al. 2006 144）
Yellowhead Virus（YHV）
Savan R, et al. 2004 145）
Edwardsiellosis（Edwadsiella tarda）
Infectious hematopoietic necrosis virus（IHNV） Gunimaladevi I, et al. 2005 146）
Caipang CM, et al. 2004 147）
Iridovirus disease of red sea bream（RSIV）（2014年7月現在）

表7 植物分野（農林業分野を含む）
における主なLAMP法の応用
検出対象の微生物、項目、疾患等
トマト黄化葉巻ウイルス Tomato yellow leaf curl virus（TYLCV）

主なLAMP法の応用報告 受託検査項目※
Fukuta S, et al. 2003 148）,
福田 至朗, 他 2003 149）※
Peng J, et al. 2012 150）
キュウリモザイクウイルス Cucumber mosaic virus（CMV）※
Fukuta S, et al. 2004 151）
トマト黄化えそウイルス Tomato spotted wilt virus（TSWV）※
インパチェンスネクロティックスポットウイルス Impatiens Necrotic Spot Virus（INSV）※
キク茎えそウイルス Chrysanthemum stem necrosis virus（CSNV）※
ラズベリーブッシュドワーフウイルス Raspberry bushy dwarf virus（RBDV）※
プルヌスネクロティックリングスポットウイルス Prunus necrotic ringspot virus（PNRsV）※
ウンシュウ萎縮ウイルス Satsuma dwarf virus（SDV）
カンキツモザイクウイルス Citrus mosaic virus（CiMV）※
リンゴステムグルービングウイルス Apple Stem Grooving Capillovirus（ASGV）※
152）
横浜植物防疫所，
2009
プラムポックスウイルス Plum pox virus（PPV）
福田 至朗, 他 2003 153）
シンビジウムモザイクウイルス Cymbidium mosaic virus（CyMV）
竹内 良彦, 他 2006 154）
メロン黄化えそウイルス Melon Yellow Spot Virus（MYSV）
Okuda M, 2010 155）
ウリ類退緑黄化 ウイルス Cucurbit chlorotic yellows virus（CCYV）
キクわい化ウイロイド Chysanthemum stunt viroid（CSVd）※
キククロロティックモトルウイロイド（CChMVd）※
ホップわい化ウイロイド Hop stunt viroid（HSVd）※
コリウスブルメイウイロイド Coleus blumei Viroid（CbVd）※
トマトクロロティックドワーフウイロイド Tomato chlorotic dwarf viroid（TCDVd）※
ポテトスピンドルチューバ-ウイロイド Potato spindle tuber viroid（PSTVd）※
カンキツエキソコーティスウイロイド Citrus Exocortis Viroid（CEVd）※
Okuda M, et al. 2005 156）
カンキツグリーニング病（黄龍病（Huanglongbing,HLB）
竹内 良彦, 他 2006 157）
タバココナジラミバイオタイプQ（Bemisia tabaci Q biotype）
福田 至朗, 他 2009 158）
イチジク株枯病菌（Ceratocystis fimbriata）
Sugawara K, 2012 159）
アジサイ葉化病ファイトプラズマ（Candidatus Phytoplasma asteris,
Candidatus Phytoplasma japonicum）
岸根 雅宏, 他 2011 160）
コシヒカリとコシヒカリ以外の品種判別
Kikuchi T, et al. 2009 161）
マツノザイセンチュウ（Bursaphelenchus xylophilus）※：和歌山県農業協同組合連合会の植物バイオセンターにおける病害検定の受託項目（8）（2014年7月現在）

219

LAMP 法を用いた研究成果を用いて病害検定として

5. 食品検査分野での応用例

表 7 に※で示すウイルス、ウイロイドで受託検査しています。

近年、食品の品質要求に対しては厳しさが増して製品としては、株式会社ニッポンジーンからトマ

おり、「農場から食卓」まで一貫した安全確保が求ト黄化葉巻ウイルス検出用など、福田ら、奥田らのめられています。食品の製造、加工関連企業では製研究成果が表 8 に示す試薬キットとなって発売さ品の安全性管理はもとより、迅速なクレーム対応やれています。これら製品の多くはサンプルを爪楊枝

素早い工程の修正・改善を行うため、検査のスピーで突いて検査溶液に浸す方法と蛍光目視判定が採用

ド化や検査数の増加に伴う労力を軽減する検査法がされており（図 9）、検査現場で取り扱いやすい試要望されています。しかし、従来の食品の微生物検

薬形態になっています。

査は培養法が基本であり、増菌培養、分離培養およ

表8 植物分野（農林業分野を含む）の LAMP製品
製品名

検出対象

抽出方法

反応
温度

反応
検出方法 参考文献
時間

トマト黄化葉巻病検出キット

トマト黄化葉巻ウイルス（TYLCV）

爪楊枝法

63℃

60分 蛍光目視

148, 149）

ウリ類退緑黄化ウイルス検出キット

ウリ類緑黄化ウイルス（CCYV）

チューブキャプチャー法
又は爪楊枝法63℃

60分 蛍光目視

155）

カンキツグリーニング病診断キット

Candidatus Liberibacter asiaticus

HLB抽出液65℃

60分 蛍光目視

156）

タバココナジラミバイオタイプQ検出キット

タバココナジラミのバイオタイプQ

爪楊枝法（WF摩砕液）60℃

60分 蛍光目視

157）

コシヒカリLAMP判別キット

コシヒカリとコシヒカリ以外の品種

コメDNA抽出キット

63℃

40分 蛍光目視

160）

マツ材線虫病診断キット

マツノザイセンチュウ（Bursaphelenchus xylophilus）

Bx抽出液

63℃

60分 蛍光目視

161）

プラムポックスウイルス検出キット

プラムポックスウイルス（plum pox virus）

爪楊枝法

63℃

60分 蛍光目視

162, 163）

アジサイ葉化病ファイトプラズマ
Ca. P.asteris ; 61℃（Candidatus Phytoplasma asteris及び Phytoplasma抽出液
60分 蛍光目視
Ca.P.japonicum; 63℃
Candidatus Phytoplasma japonicum）

ファイトプラズマ検出キット

フィグモザイクウイルス（ﬁg mosaic virus）

イチジクモザイク病診断キット

爪楊枝法

62℃

60分 蛍光目視

164）

165）

（2014年7月現在）

1

検査溶液を必要量まとめて作製する。

4

前工程の爪楊枝を検査溶液に浸す。

5

ミネラルオイルを入れる。

検査溶液

氷上

2

検査溶液を分注する。

ミネラルオイル

検査溶液
氷上

3

サンプル溶液を爪楊枝で突く。

6

63℃、1時間（検査反応）

7

80℃、、2分間（反応停止）

8

判定※株式会社ニッポンジーンの製品パンフレットより許諾を得て掲載

図 9 LAMP 法によるトマト黄化葉巻病診断の概略

（9）

220

び確認試験の実施で、検出までの日数と多くの労力されています（例えば、ビール増殖菌の工程チェッを要するため、培養法に代わる簡易・迅速な微生物ク

検査法として遺伝子増幅法が食品検査分野に応用されつつあります。

6. 環境衛生検査分野での応用例

栄研化学はこの分野では表 9 に示す製品を発売
しています

）。

178）

環境衛生検査分野での応用例として、栄研化学は
環境水（温泉水、浴槽水、冷却塔水等）のレジオネ。

39, 166 ～ 175）

特に、富山県での 2011 年の食中毒事件を契機に、

ラ属菌 65, 179, 180）を、環境水（水道水等）のクリプトス
を高感度、迅速、簡

腸管出血性大腸菌については、2012 年 5 月にこれポリジウム、ジアルジアまであった各種通知が統合され（食安監発 0515 第便に検出する試薬キットを製品化して発売していま

3 号） 、更に 2012 年 12 月の通知（食安監発 1217

す（表 10）。

176）

181, 182）

第 3 号） において、対象に食肉を含めた検査法と2012 年 3 月に「水道に関するクリプトスポリジ

して遺伝子検査法が収載されています。この通知にウム等の検出のための検査方法の見直し等についは LAMP 法も収載され、通知収載の抽出法が実施でて」（健水発 0302 第 2 ～ 4 号 厚生労働省健康局水

きるように試薬キットの構成も変更されています。

道課長）にて、「水道における指標菌及びクリプト

海外（米国）においても、サルモネラ、O157 のスポリジウム等の検査方法について」（平成 19 年 3

LAMP 系が AOAC の認証を得ることができ、食品

月 30 日健水発第 0330006 号 厚生労働省健康局水道検査分野においても LAMP 法が社会貢献できる場

課長通知）が一部改正されて遺伝子検査法として面が増えつつあります。

LAMP 法も収載され、クリプトスポリジウム検出用、

177）

また、LAMP 法は簡易な操作で遺伝子検査ができる利点があり、食品、飲料工場の品質管理にも利用

およびジアルジア検出用の試薬キットが適用されることになりました。

表9 食品検査分野のLAMP製品
製品名

使用目的

核酸抽出

反応 反応
温度 時間

検出方法

参考文献

サルモネラ検出試薬キット

食品又は環境由来検体中のサル
モネラ属菌の検出

簡易抽出法

65℃ 60分

リアルタイム
濁度測定

39, 166～168）

腸管出血性大腸菌検出試薬キット

食品又は環境由来検体中の腸管
出血性大腸菌の検出

簡易抽出法又は厚労省通知収載法

65℃ 60分

リアルタイム 166, 168～170）
濁度測定

腸管出血性大腸菌検出試薬キット 食品又は環境由来検体中の腸管（外因性コントロール入り）
出血性大腸菌の検出

厚労省通知収載法

65℃ 60分

リアルタイム
濁度測定

169, 170）

食品微生物検査で腸管出血性大ベロ毒素（VT）
タイピング試薬キット 腸菌と疑われた菌株の菌希釈液を検体としたVT1，
VT2のタイピング

簡易抽出法

65℃ 60分

リアルタイム
濁度測定

168, 169）

大腸菌O157検出試薬キット

食品又は環境由来検体中の大腸
菌0157の検出

簡易抽出法

65℃ 60分

リアルタイム
濁度測定

171）

L.monocytogenes検出試薬キット

食 品 又は環 境 由 来 検 体中のL.monocytogenesの検出

簡易抽出法

65℃ 60分

リアルタイム
濁度測定

172）

カンピロバクター検出試薬キット

食 品 又は環 境 由 来 検 体中のC .
jejuni及びC. coliの検出

簡易抽出法

65℃ 60分

リアルタイム
濁度測定

173～175）（2014年7月現在）

表10 環境衛生検査分野のLAMP製品
製品名

使用目的

核酸抽出

検出方法 参考文献

レジオネラ検出試薬キットE

環境水（温泉水、浴槽水、冷却塔水
等）の検水をろ過濃縮法又は冷却遠心濃縮法で処理した100倍濃縮検水を検体としたレジオネラ属菌の検出

反応 反応
温度 時間

アルカリ熱抽出法

65℃ 60分

リアルタイム 65, 179, 180）
濁度測定

クリプトスポリジウム検出
試薬キット
ジアルジア検出試薬キット

免疫磁気ビーズ濃縮法によるビーズ/オー
リアルタイムシスト・シスト複合体（磁気ビーズと結合し塩 63℃ 60分 濁度測定
181, 182）
酸解離前の状態）を用意。DNA抽出方法
リアルタイムについては別途「Loopamp
ク
リ
プ
ト
スポ
リ
ジ
環境由来検体中のGiardia属の検出
63℃ 60分
濁度測定
ウム/ジアルジア操作マニュアル」
を参照。
（2014年7月現在）
環境由来検体中
Cryptosporidium属の検出（ 10 ）

221

7. その他の分野での応用例

Ⅳ. 周辺技術の開発

栄研化学は研究用途としてノロウイルスの Genogroup Ⅰ、Genogroup Ⅱを検出する試薬キットを製品化し発売しています

1. 乾燥試薬化と簡易抽出技術。

175 ～ 183）

1 ）H1pdm2009 インフルエンザウイルス検出試薬

その他、2012 年には産業用試薬として、化粧品
や医薬品の製造工程における品質管理に利用いただ

キットでの簡易化の取り組み

けるよう、資生堂と共同開発を実施した特定微生物

LAMP 法は検体中の阻害物質の影響を比較的受け、検体からの核酸抽出は従来通り

検査試薬キット 2 種類を製品化して発売しました。

難いものの

この試薬キットは LAMP 法を用いて日本薬局方（日の方法が利用されることが多く、検査の簡易化、迅局）収載の特定微生物試験で規定されている細菌項

速化の大きな障害になっています。そこで、遺伝子目［Escherichia coli（大腸菌）、Pseudomonas aerugi-

検査を特殊な検査ではなく普通の検査として普及さ

nosa（緑膿菌）、Salmonella spp.（サルモネラ属菌）、せていくためには簡易な前処理技術が不可欠であ

Staphylococcus aureus（黄色ブドウ球菌）］を検出す

り、インフルエンザウイルス検出をモデル系としてる試薬キット（細菌マルチ 4）と真菌を検出する試

簡易抽出法の検討を進めました。対象検体種が鼻腔薬キット（真菌カンジダ）です。 これら試薬キット

あるいは咽頭拭い液であれば、非常に簡単に操作では、栄研化学の最新技術である乾燥試薬化と簡易抽きる抽出法を開発することに成功しました

66, 185, 186）。

48, 59, 62）

出技術を組み合わせることで、化粧品・医薬品原料

鼻腔あるいは咽頭拭い液を専用抽出試薬に入れ、等における品質管理現場でも LAMP 法を用いた遺10 回ほど攪拌するだけで、インフルエンザウイル

伝子検査が簡易、迅速に実施できるようにしていま

スから核酸（RNA）を抽出することができます。試。
す （図 10）

薬キット中にある H1pdm2009 インフルエンザウイ

184）

50μL

100倍希釈前増菌培養液

15μL
加熱

or
PM M4

95℃・20分

PM CanPM：プライマーミックス
M4：細菌マルチ４
Can：真菌カンジダ

200μL

フタをする

15μL

EX C

LAMP
反応
（60分）

【測定結果例】
転倒
3分放置
乾燥試薬を溶解

スピンダウン
転倒混和を繰り返す（5回）

図 10 特定微生物検査試薬キットの操作概略（ 11 ）

222

ルス検出用の LAMP プライマーミックスと、この抽チューブを PURE 法専用の吸着剤チューブに装着

出検体液を、蓋の内側に乾燥増幅試薬が固定されてし、激しく振って LAMP 反応阻害物を吸着剤に吸いる反応チューブに分注し、溶解・転倒混和後、増着させます。そして、この吸着剤チューブに PURE

幅装置にセットするだけで、操作は非常に簡単、迅法専用の滴下注入キャップを取り付けて、チューブ速に終わります。62.5℃、35 分間のインキュベーショ

側面を押すことにより、核酸抽出液を蓋の内側に乾ン後、増幅の検出は上述のリアルタイム濁度測定装

燥増幅試薬が固定されている反応チューブに分注し置を用いた濁度検出法、あるいは目視による蛍光検ます。乾燥試薬を溶解・転倒混和後、反応チューブ

出のいずれも可能です（図 11）。ここで試薬を乾燥を増幅装置にセットし、67℃、40 分間インキュベー

化し、抽出検体液で乾燥試薬を溶かすことで試薬調ト後、増幅の検出は上述のリアルタイム濁度測定装製の手間をほぼ省き、試薬の保存温度も 2 ～ 8℃を置を用いた濁度検出法、あるいは目視による蛍光検可能にしました。

出のいずれも可能です。喀痰の採取から約 1 時間で前処理操作を上述の通り簡易、迅速化しても測定判定が可能となりました（図 13）。なお、乾燥増幅

系の検出感度は 80 コピーで、その臨床成績は国立

試薬が固定されている反応チューブの保存温度は室感染症研究所の病原体検出マニュアル H1N1 新型イ

温です。

ンフルエンザ（2009 年 11 月 ver.2）に従ったリアル

PURE 法と LAMP 法を組み合わせた結核菌群のタイム RT-PCR 法（TaqMan Probe 法）と同等でし

検出系は、NALC-NaOH 処理しない喀痰から簡易、た。

迅速に結核菌群を検出でき、その最小検出感度は

60, 61）

2）PURE 法の開発と LAMP 法による結核菌群検出0.38 ゲノム相当 / テストでした。そして結核菌群のとの組み合わせ検出率は NALC -NaOH 処理をした検体による従来

上記 H1pdm2009 インフルエンザウイルス検出試の遺伝子検査法と同等でした。

37, 188, 189）

薬キットで用いた簡易前処理技術はマイクロピペッ

すなわち、PURE 法により複雑な細胞壁を持つグ

ト操作を伴います。栄研化学では非営利団体 FIND

ラム陽性菌でも簡易な操作で核酸抽出が可能とな（Foundation for Innovative New Diagnostics）と組り、その簡易な操作と室温保存が可能な試薬により、んで、途上国における結核撲滅に貢献するため、途

検査現場での使用と、海外、特に途上国での遺伝子上国の検査環境でも実施可能な、LAMP 法による簡検査法の使用を容易にするものと考えます。

易、迅速な結核菌群検出試薬キットを開発してきま

この PURE 法は、結核菌群の検出だけではなく。この試薬キット開発においても大きな障単純ヘルペスウイルス（HSV-1/2）検出のための検害は対象検体である喀痰からの核酸（DNA）抽出で体（子宮頚管又は外陰部拭い液）からの核酸抽出にし た。 喀 痰 か ら の 結 核 の 遺 伝 子 検 査 は、 通 常も利用できます 。

NALC-NaOH 処理をした後、それぞれ所定の核酸抽

3）SR DNA 抽出キットの開発と LAMP 法によるマ出操作を行うため、煩雑な操作と時間を要します。そイコプラズマ・ニューモニエ検出との組み合わせのような操作を途上国の検査環境で実施することは®
2011 年 10 月に保険収載された Loopamp マイコ

大変難しく、この課題を解決するため栄研化学ではプラズマ P 検出試薬キットは、LAMP 法によって超簡易前処理技術である PURE（Procedure for Ultra

咽頭拭い液（鼻咽頭拭い液を含む）又は喀痰検体中

Rapid Extraction）法を開発しました （図 12）。

の Mycoplasma pneumoniae 遺伝子を検出するもの

した

36, 37）

187）

78）

PURE 法は専用容器を用いることにより、従来のです。検体採取から判定まで約 2 時間で終了し、核酸抽出・精製に必要とされた煩雑なピペット操作

M. pneumoniae のみを特異的に検出することが可能

や高速遠心分離操作を行わずに、簡易かつ迅速に核でしたが、市販の核酸抽出キットを用いているため酸を抽出できるように開発された核酸抽出法です。

核酸抽出ステップが煩雑で、検査現場への負担が少

抽出操作は、アルカリ変性剤を含む PURE 法専用

なくありませんでした。市販の核酸抽出キットは核の検体処理チューブに検体（結核の場合は喀痰）を酸を高度に精製・濃縮できる反面、操作ステップが添加し 90℃、5 分加熱により、喀痰中の結核菌を死多く、約 1 時間要し、高速遠心機を必要とします。

滅させ、核酸を抽出させます。次に、この検体処理

そこで、当社は操作数を数ステップで 10 分以内（ 12 ）

223

図 11 インフルエンザ核酸検出における操作の簡易化
検体添加

溶菌

混和

処理液滴下

前処理容器
多孔質吸着体精製処理容器DNA
LAMP 反応

図 12 PURE（Procedure for Ultra Rapid Extraction）法

喀痰
DNA
抽出

約10分

DNA
増幅
・
検出
約40分

喀痰40〜60μL

混和

加熱（90℃,5分）
検体処理
チューブ

吸着剤
チューブ
（多孔質体入り）

滴下注入
キャップ

← 35μL← 25μL

DNA抽出液30μLの注入
乾燥試薬の溶解または

LAMP反応 リアルタイム濁度検出（67℃, 40分）

LAMP試薬（乾燥剤型）
蛍光目視検出図 13 PURE 法とLAMP 法を組み合わせた結核菌群検出（ 13 ）

224

SR DNA抽出キットの試薬構成
または鼻咽頭拭い液

咽頭拭い液

フロックスワブで検体採取

Solution 1

Solution 2

Solution 3

溶菌用

阻害成分
共沈用

中和用

生理食塩水
（300μL）
懸濁
20μL

Solution 1

20μL

50μL

20μL

上清を
LAMP反応へ

Solution 3

サンプル液

Solution 2＋ 混和、
スピンダウン＋ 95℃、5分間加熱＋ 氷上冷却

マイクロチューブ
（1.5mL）＋ 混和＋ スピンダウン（30秒間）

3試薬を混ぜるだけ、10分以内に終了
図 14 SR DNA 抽出キットの操作概略に核酸抽出が終了する簡易核酸抽出キットの開発に

クールには毎回 10 名以上の出席者があり、参加者

着手し、2013 年 10 月に SR DNA 抽出キットを発売

は LAMP 法のプライマー設計を学んで、LAMP 法

しました。この抽出キットは図 14 に示すとおり、を活用したご研究、実用化を検討していただいてい高速遠心機を必要とせず、3 試薬をピペット操作で

ます。

。これに

しかし、遺伝子検査の操作工程上で増幅技術だけ

より、病院検査室において Loopamp マイコプラズ

が簡易、迅速化されても十分とは言えず、検査現場

マ P 検出試薬キットが導入し易くなり、マイコプに遺伝子検査が浸透していくためには、抽出、試薬

ラズマ肺炎の治療開始早期の段階での診断に大きく

調製等の前処理段階の簡易、迅速化が望まれていま貢献できるものと考えられます。

す。この工程が煩雑で、時間を要している間は、遺混ぜるだけで、10 分以内に終了します

190）

®

伝子検査は特殊検査の域を出たとは言えないと思わまとめれます。試薬の乾燥化、PURE 法等の簡易抽出法の開発により、LAMP 法による遺伝子検査は格段に簡

遺伝子検査は特殊な検査と考えられていました

易、迅速になりつつあります。

が、国産の遺伝子増幅技術 LAMP 法により、増幅・

栄研化学では、新規周辺技術を多くの製品に適用

検出ステップは簡易、迅速化されてきました。そのするとともに、関連企業、研究者の方々と協力して、LAMP 法の特長を生かした応用例が医療分野のみな各分野へ LAMP 法による遺伝子検査が浸透していらず、畜産、水産、植物、食品など多くの分野で応用

くよう今後も努めていきたいと考えています。

され、実用化されています。年 1 回開催されている

そのために今後も遺伝子検査を実施する、あるいLAMP 研究会においては、さまざまな分野での LAMPは実施したいと考えている検査現場のご要望、ご意法の応用例について研究者から報告され、研究会参見を拝聴しながら、使いやすく高精度な遺伝子検査

加者との間で活発な討議がなされています。更に、法を提供するため、定量技術、多項目同時検出など

近畿 LAMP 研究会（K-LAMP）でも臨床応用例が研も視野に入れて全社一丸となって LAMP 法および究発表され、臨床現場からの課題や要望が提起されその周辺技術に創意工夫を続けていきたいと考えてています。また、年 3 回開催されている LAMP 法

います。

のプライマー設計の仕方を説明する e-Loopamp ス（ 14 ）

225

文

献1 ）Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, et al.. loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res
2000 ; 28 : E63.
2 ）副島隆浩, 渡辺恵子：新しい遺伝子増幅法（LAMP 法）の原理と性判別への応用 . 日本胚移植学雑誌 . 2003 ; 25
（2）:92-98.
3 ）陰山聡一 , 平山博樹：新しい遺伝子増幅法（LAMP 法）によ る 牛 胚 の 性 判 別 . 日 本 胚 移 植 学 雑 誌 . 2003 ; 25
（3）:
136 -140.
4 ）Nagamine K, Hase T, Notomi T : Accelerated reaction byloop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 2002 ; 16 : 223-229.
5 ）Mori Y, Nagamine K, Tomita N et al.: Detection of loopmediated isothermal amplification reaction by turbidity
derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem Biophys Res Commun. 2001 ; 289 : 50 -154.
6 ）Poon LL, Leung CS, Tashiro M, Chan KH, et al.: Rapid
detection of the severe acute respiratory syndrome（SARS）
coronavirus by a loop-mediated isothermal amplification assay. Clin Chem. 2004 ; 50（6）: 1050 -1052.
7 ）Hong TC, Mai QL, Morita K, et al.: Development andevaluation of a novel loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus. J Clin Microbiol. 2004 ; 42（5）:1956-1961.
8 ）田口文広, 田代眞人 , 納富継宣：SARS ウイルス迅速診断 .
日本小児科医会会報 . 2004 ; 27 : 43- 46.
9 ）田代眞人：LAMP 法を用いた SARS コロナウイルス核酸
増幅検査. モダンメディア . 2004 ; 50 : 12-17.
10）Imai M, Ninomiya A, Minekawa H, et al.: Development of
H5-RT-LAMP（loop-mediated isothermal amplification）
system for rapid diagnosis of H5 avian influenza virus infection. Vaccine. 2006 ; 10 ; 24（44-46）: 6679-6682.
11）Imai M, Ninomiya A, Minekawa H, et al.: Rapid diagnosisof H5N1 avian influenza virus infection by newly developed influenza H5 hemagglutinin gene-specific loop-mediated isothermal amplification method. J Virol Methods.
2007 ; 141（2）: 173-180.
12）Imai K, Nakamura K, Mase M, et al.: Partial protection
against challenge with the highly pathogenic H5N1 influenza virus isolated in Japan in chickens infected with the
H9N2 influenza virus. Arch Virol. 2007 ; 152（7）: 13951400.
13）Jayawardena S, Cheung CY, Barr I, at al.: loop-mediatedisothermal amplification for influenza A（H5N1）virus.
Emerg Infect Dis. 2007 ; 13（6）: 899-901.
14）Yoshida H, Sakoda Y, Endo M, et al.: Evaluation of the reverse transcription loop-mediated isothermal amplification（RT-LAMP）as a screening method for the detectionof influenza viruses in the fecal materials of water birds. J
Vet Med Sci. 2011 ; 73（6）: 753 -758.

15）国立感染症研究所インフルエンザウイルス研究セン
ター：鳥インフルエンザ A（H7N9）ウイルス検出マニュ
アル（第 2版）. http://www.nih.go.jp/niid/images/flu/
H7N9manual/h7n9_manual_v2.pdf, 2013.
16）Parida M, Posadas G, Morita K, et al.: Real-time reverse
transcription loop-mediated isothermal amplification for
rapid detection of West Nile virus. J Clin Microbiol. 2004 ;42（1）: 257-263.
17）Shukla J, Saxena D, Rathinam S, et al.: Molecular detection and characterization of West Nile virus associatedwith multifocal retinitis in patients from southern India.
Int J Infect Dis. 2012 ; 16（1）: e53-59.
18）Kurosaki Y, Takada A, Ebihara H, et al.: Rapid and simple
detection of Ebola virus by reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification. J Virol Methods. 2006 ;
141（1）: 78 -83.
19）Karanis P, Thekisoe O, Kiouptsi K, et al.: Development
and preliminary evaluation of a loop-mediated isothermal
amplification procedure for sensitive detection of cryptosporidium oocysts in fecal and water samples. Appl Environ Microbiol. 2007 ; 73
（17）
: 5660-5662.
20）Bakheit MA, Torra D, Palomino LA, et al.: Sensitive andspecific detection of Cryptosporidium species in PCRnegative samples by loop-mediated isothermal DNA amplification and confirmation of generated LAMP products
by sequencing. Vet Parasitol. 2008 ; 158（1-2）: 11-22.
21）Inomata A, Kishida N, Momoda T, et al.: Development
and evaluation of a reverse transcription-loop-mediatedisothermal amplification assay for rapid and high-sensitive detection of Cryptosporidium in water samples. Water Sci Technol. 2009 ; 60
（8）
: 2167-2172.
22）Osman HA, Eltom KH, Musa NO et al.: Development andevaluation of loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Crimean Congo hemorrhagic fever virus in Sudan.J Virol Methods. 2013 ; 190（1-2）: 4-10.
23）Curtis KA, Rudolph DL, Owen SM.: Rapid detection of
HIV-1 by reverse-transcription, loop-mediated isothermal
amplification（RT-LAMP）. J Virol Methods. 2008 ; 151（2）: 264-270.
24）Hosaka N, Ndembi N, Ishizaki A, et al.: Rapid detection ofhuman immunodeficiency virus type 1 group M by a reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification assay. J Virol Methods. 2009 ; 157（2）: 195 -199.
25）Yang G, Li B, Liu L, et al.: Development and evaluation ofa reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of a new SFTS bunyavirus. Arch Virol. 2012 ; 157（9）: 1779-1783.
26）Xu H, Zhang L, Shen G, et al.: Establishment of a novel
one-step reverse transcription loop-mediated isothermal
amplification assay for rapid identification of RNA fromthe severe fever with thrombocytopenia syndrome virus.
J Virol Methods. 2013 ; 194（1-2）: 21-25.
27）Hara-Kudo Y, Nemoto J, Ohtsuka K, et al.: Sensitive andrapid detection of Vero toxin-producing Escherichia coli
using loop -mediated isothermal amplification. J Med（ 15 ）

226

Microbiol. 2007 ; 56（Pt 3）: 398-406.
28）Hara-Kudo Y, Konishi N, Ohtsuka K, et al.: Detection of
Verotoxigenic Escherichia coli O157 and O26 in food byplating methods and LAMP method : a collaborative
study. Int J Food Microbiol. 2007 ; 122（1-2）: 156 -161.
29）Kurosaki Y, Grolla A, Fukuma A, et al.: Development andevaluation of a simple assay for Marburg virus detection
using a reverse transcription-loop-mediated isothermal
amplification method. J Clin Microbiol. 2010 ; 48（7）:2330 -2336.
30）Poon LL, Wong BW, Ma EH, et al.: Sensitive and inexpensive molecular test for falciparum malaria : detecting Plasmodium falciparum DNA directly from heat-treated bloodby loop-mediated isothermal amplification. Clin Chem.
2006 ; 52（2）: 303 -306.
31）Han ET, Watanabe R, Sattabongkot J, et al.: Detection offour Plasmodium species by genus- and species -specificloop-mediated isothermal amplification for clinical diagnosis. J Clin Microbiol. 2007 ; 45（8）: 2521-2528.
32）Polley SD, Mori Y, Watson J, et al.: Mitochondrial DNA
targets increase sensitivity of malaria detection using
loop-mediated isothermal amplification. J Clin Microbiol.
2010 ; 48（8）: 2866 -2871.
33）Sirichaisinthop J, Buates S, Watanabe R, et al.: Evaluationof loop-mediated isothermal amplification（LAMP）for malaria diagnosis in a field setting. Am J Trop Med Hyg.
2011 ; 85（4）: 594-596.
34）Polley SD, González IJ, Mohamed D, et al.: Clinical evaluation of a loop-mediated amplification kit for diagnosis ofimported malaria. J Infect Dis. 2013 ; 208（4）: 637-644.
35）Iwamoto T, Sonobe T, Hayashi K.: loop-mediated isothermal amplification for direct detection of Mycobacterium
tuberculosis complex, M. avium, and M. intracellulare in
sputum samples. J Clin Microbiol. 2003 ; 41（6）: 26162622.
36）Boehme CC, Nabeta P, Henostroza G, et al.: Operational
feasibility of using loop-mediated isothermal amplification for diagnosis of pulmonary tuberculosis in microscopy centers of developing countries.J Clin Microbiol. 2007
; 45（6）: 1936 -1940.
37）Mitarai S, Okumura M, Toyota E, et al.: Evaluation of asimple loop-mediated isothermal amplification test kit forthe diagnosis of tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis. 2011
; 15（9）: 1211-1217.
38）Kamachi K, Toyoizumi-Ajisaka H, Toda K, et al.: Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid diagnosis of Bordetella pertussis infection. J Clin Microbiol. 2006 ; 44（5）: 1899-1902.
39）Hara-Kudo Y, Yoshino M, Kojima T, etal.: loop-mediatedisothermal amplification for the rapid detection of Salmonella. FEMS Microbiol Lett. 2005 ; 253（1）: 155 -161.
40）Yamazaki W, Seto K, Taguchi M, et al.: Sensitive and rapid detection of cholera toxin-producing Vibrio cholerae
using a loop-mediated isothermal amplification. BMC
Microbiol. 2008 ; 8 : 94.

41）Okada K, Chantaroj S, Taniguchi T, et al.: A rapid, simple,
and sensitive loop-mediated isothermal amplification
method to detect toxigenic Vibrio cholerae in rectal swab
samples. Diagn Microbiol Infect Dis. 2010 ; 66（2）: 135 139.
42）Boldbaatar B, Inoue S, Sugiura N, et al.: Rapid detectionof rabies virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Jpn J Infect Dis. 2009 ; 62
（3）
: 187191.
43）Saitou Y, Kobayashi Y, Hirano S, et al.: A method for simultaneous detection and identification of Brazilian dogand vampire bat-related rabies virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. J Virol
Methods. 2010 ; 168（1 -2）: 13 -17.
44）Parida M, Horioke K, Morita K, et al.: Rapid detection
and differentiation of dengue virus serotypes by a realtime reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification assay. J Clin Microbiol. 2005 ; 43（6）
: 28952903.
45）Kwallah Ao, Inoue S, Muigai AW, et al.: A real-time reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay for the rapid detection of yellow fever virus. J
Virol Methods. 2013 ; 193（1）: 23-27.
46）Poon LL, Leung CS, Chan KH, et al.: Detection of human
influenza A viruses by loop-mediated isothermal amplification. J Clin Microbiol. 2005 ; 43（1）: 427-430.
47）Ito M, Watanabe M, Nakagawa N, et al.: Rapid detection
and typing of influenza A and B by loop-mediated isothermal amplification : comparison with immunochromatography and virus isolation. J Virol Methods. 2006 ; 135（2）:
272-275.
48）納富継宣 , 森 安義 , 冨田憲弘 他：LAMP 法によるインフ
ルエンザの迅速検査 . 細胞 . 2009 ; 41
（14）
: 34 -37.
49）Kubo T, Agoh M, Mai le Q, et al.: Development of a reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification assay for detection of pandemic（H1N1）2009 virus asa novel molecular method for diagnosis of pandemic influenza in resource-limited settings. J Clin Microbiol.
2010 ; 48（3）: 728-735.
50）重本直樹 , 福田伸治 , 高尾信一 , 他：Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification（RT-LAMP）
法による新型インフルエンザウイルスおよび季節性 A
型インフルエンザウイルス（H1N1, H3N2）の迅速検出.
感染症誌 . 2010 ; 84 : 431-436.
51）Nakauchi M, Yoshikawa T, Nakai H, et al.: Evaluation ofreverse transcription loop-mediated isothermal amplification assays for rapid diagnosis of pandemic influenza A/
H1N1 2009 virus. J Med Virol. 2011 ; 83（1）
: 10 -15.
52）Xu J, Rong R, Zhang HQ, et al.: Sensitive and rapid detection of Schistosoma japonicum DNA by loop-mediatedisothermal amplification（LAMP）. Int J Parasitol. 2010 ;
40（3）: 327-331.
53）Sotiriadou I, Karanis P.: Evaluation of loop-mediated isothermal amplification for detection of Toxoplasma gondii
in water samples and comparative findings by polymerase（ 16 ）

227

chain reaction and immunofluorescence test（IFT）. Diagn
Microbiol Infect Dis. 2008 ; 62（4）: 357-365.
54）Krasteva D, Toubiana M, Hartati S, et al.: Development ofloop-mediated isothermal amplification（LAMP）as a diagnostic tool of toxoplasmosis. Vet Parasitol. 2009 ; 162（3 4）: 327-331.
55）Takagi H, Itoh M, Islam MZ, et al.: Sensitive, specific, andrapid detection of Leishmania donovani DNA by loop-mediated isothermal amplification. Am J Trop Med Hyg.
2009 ; 81（4）: 578 -582.
56）Adams ER, Schoone GJ, Ageed AF, et al.: Development ofa reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification（LAMP）assay for the sensitive detection of Leishmania parasites in clinical samples. Am J Trop Med Hyg.
2010 ; 82（4）: 591-596.
57）Salant H, Abbasi I, Hamburger J.: The development of aloop-mediated isothermal amplification method（LAMP）
for Echinococcus granulosus［corrected］coprodetection.
Am J Trop Med Hyg. 2012 ; 87（5）: 883 -887.
58）高野弘, 石塚昌弘：SARSコロナウイルスの遺伝子検査：
Loopamp® SARSコロナウイルス検出試薬キット . 細胞 .
2004 ; 36（4）: 19 -22.
59）森 安義, 仙波晶平 , 富田憲弘 他：LAMP によるインフル
エンザ迅速検査 . BIO Clinica. 2010 ; 25（5）: 82-86.
60）Nakauchi M, Yoshikawa T, Nakai H, et al.: Evaluation ofreverse transcription loop-mediated isothermal amplification assays for rapid diagnosis of pandemic influenza A/
H1N1 2009 virus. J Medical Virology. 2011 ; 83（1）:10 -15.
61）吉川哲史 , 中井英剛 , 菅田 健 他：RT-LAMP 法による A型および新型インフルエンザウイルス（AH1pdm）検出の臨床的検討 . 診療と新薬 . 2011 ; 48（1）: 19-26.
62）仙波晶平, 森 安義 , 冨田憲弘 他：LAMP 法によるインフ
ルエンザの迅速遺伝子検査 . Bio Clinica. 2011 ; 26
（13）
臨
増：85 -88.
63）吉野 学 , 安中敏光 , 小島 禎 , 池戸正成：LAMP（Loop-mediated Isothermal Amplification）法による Mycoplasma
pneumoniaeの高感度迅速検出 . 感染症学会誌 . 2008 ; 82
: 168 -176.
64）山口惠三, 舘田一博 , 中森祥隆 , 他：LAMP 法を用いた
Mycoplasma pneumoniaeと Legionella spp.による呼吸器
感染症の迅速診断薬の評価 . 医学と薬学 . 2007 ; 58 : 565571.
65）安中敏光：LAMP 法による Legionella 属菌の検出 . JARMAM, 2003 ; 14 : 25 -30.
66）百田隆祥, 下條誉幸 , 納富継宣：LAMP 法を用いた Mycoplasma pneumonia と Legionella spp.の高感度迅速検出 .
臨床と微生物 . 2012 ; 39（臨増）: 549 -556.
67）高野 弘：新規に保険収載された検査法 LAMP 法による結核菌群検察検査、マイコプラズマ核酸検出検査、レジ
オネラ核酸検出検査について . モダンメディア . 2012 ;
58（8）: 246 -252.
68）浦山耕太郎 , 坂野 堯 , 青木大地 , 他：肺炎マイコプラズ
マ感染症における loop-mediated isothermal amplification 法の有用性 . 小児科臨床 . 2012 ; 65（12）: 2649-2652.
69）松田親史, 竹谷 健 , 竹内志津枝 , 他：LAMP 法を原理とした Loopamp マイコプラズマ P 検出試薬キットの有用性 . JARMAM. 2013 ; 23（2）
: 53-59.
70）杵渕貴洋 , 加野大樹 , 角谷不二雄 , 他：Mycoplasma 感染症診断における LAMP法を用いた Mycoplasma pneumonia DNA検出の有用性と従来法（培養法・血清学的検査法）の比較検討 . 日本臨床微生物学雑誌 . 2013 ; 23（2）:87-94.
71）御手洗 聡：LAMP 法を使った結核迅速診断キット . 複十字 . 2011 ; 339 : 11-13.
72）副島 隆浩 , 高野 弘：結核菌群核酸検出－ Loopamp® 結核菌群検出試薬キット－. 小児科臨床. 2012 ; 65
（12）
: 27032708.
73）Tamaki Y, Akiyama F, Iwase T, et al.: Molecular detectionof lymph node metastases in breast cancer patients : results of a multicenter trial using the one-step nucleic acidamplification assay. Clin Cancer Res. 2009 ; 15（8）: 2879 2884.
74）Yamamoto H, Sekimoto M, Oya M, et al.: OSNA-based
novel molecular testing for lymph node metastases incolorectal cancer patients : results from a multicenter
clinical performance study in Japan. Ann Surg Oncol.
2011 ; 18 : 1891-1898.
75）Satoh T, Matsumoto K, Fujii T, et al.: Rapid genotyping ofcarcinogenic human papillomavirus by loop-mediated isothermal amplification using a new automated DNA test
（Clinichip HPVTM）. J Virol Methods. 2013 ; 188（1-2）: 83 93.
76）Meridian Bioscience, Inc.: illumigene® C. difficile Package
Insert, REV. 08/13
77）Meridian Bioscience, Inc.: illumigene® Group A Streptoccus（Group A Strep）
DNA Amplification Assay Package Insert, REV. 09/12
78）Meridian Bioscience, Inc.: illumigene® Group B Streptoccus（GBS）Package Insert, REV. 05/12
79）Meridian Bioscience, Inc.: illumigene® Mycoplasma DNA
Amplification Assay Package Insert, REV. 05/13
80）Meridian Bioscience, Inc.: illumigene® Pertussis DNA
Amplification Assay Package Insert, REV. 04/14
81）Kamachi K, Toyoizumi-Ajisaka H, Toda K, et al.: Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid diagnosis of Bordetella pertussis infection. J Clin Microbiol. 2006 ; 44（5）: 1899- 1902.
82）東出誠司 , 保坂憲光 , 太田嘉則 , 他：新しい核酸抽出法を用いた LAMP 法による単純ヘルペスウイルスの検出 . 日
本性感染症学会誌 . 2010 ; 21
（1）
: 120-127.
83）Njiru ZK, Traub R, Ouma JO, et al.: Detection of Group 1
Trypanosoma brucei gambiense by loop-mediated isothermal amplification.J Clin Microbiol. 2011 ; 49（4）:1530-1536.
84）Fujino M, Yoshida N, Nakayama T, et al.: A simple method for the detection of measles virus genome by loop-mediated isothermal amplification（LAMP）. J Med Virol.
2005 ; 76（3）: 406-413.
85）Okafuji T, Yoshida N, Nakayama T, et al.: Rapid diagnostic method for detection of mumps virus genome by loop-（ 17 ）

228

mediated isothermal amplification. J Clin Microbiol. 2005
; 43（4）: 1625-1631.
86）Ushio M, Yui I, Nakayama T, et al.: Detection of respiratory syncytial virus genome by subgroups-A, B specificreverse transcription loop-mediated isothermal amplification（RT-LAMP）. J Med Virol. 2005 ; 77（1）: 121-127.
87）Mori N, Motegi Y, Nakayama T et al.: Development of a
new method for diagnosis of rubella virus infection by reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification. J Clin Microbiol. 2006 ; 44（9）: 3268 -3273.
88）Enomoto Y, Yoshikawa T, Ihira M, et al.: Rapid diagnosisof herpes simplex virus infection by a loop-mediated isothermal amplification method. J Clin Microbiol. 2005 ; 43（2）: 951-955.
89）Okamoto S, Yoshikawa T, Ihira M, et al.: Rapid detectionof varicella-zoster virus infection by a loop-mediated isothermal amplification method. J Med Virol. 2004 ; 74（4）:677-682.
90）Iwata S, Shibata Y, Yoshikawa T, et al.: Rapid detection of
Epstein-Barr virus DNA by loop-mediated isothermal amplification method. J Clin Virol. 2006 ; 37（2）: 128 -133.
91）Suzuki R, Yoshikawa T, Ihira M, et al.: Development of
the loop-mediated isothermal amplification method for
rapid detection of cytomegalovirus DNA. J Virol Methods. 2006 ; 132（1-2）: 216 -221.
92）Ihira M, Yoshikawa T, Enomoto Y, et al.: Rapid diagnosisof human herpesvirus 6 infection by a novel DNA amplification method, loop-mediated isothermal amplification. J
Clin Microbiol. 2004 ; 42（1）: 140-145.
93）Yoshikawa T, Ihira M, Akimoto S, et al.: Detection of human herpesvirus 7 DNA by loop-mediated isothermal amplification. J Clin Microbiol. 2004 ; 42（3）: 1348-1352.
94）Kuhara T, Yoshikawa T, Ihira M, et al.: Rapid detection ofhuman herpesvirus 8 DNA using loop-mediated isothermal amplification. J Virol Methods. 2007 ; 144（1-2）: 7985.
95）Parida MM, Santhosh SR, Morita K, et al.: Development
and evaluation of reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification assay for rapid and real-time detection of Japanese encephalitis virus.J Clin Microbiol. 2006 ;44（11）: 4172-4178.
96）Parida MM, Santhosh SR, Morita K, et al.: Rapid and realtime detection of Chikungunya virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. J Clin
Microbiol. 2007 ; 45（2）: 351-357.
97）Le Roux CA, Kubo T, Morita k, et al.: Development andevaluation of a real-time reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of
Rift Valley fever virus in clinical specimens. J Clin Microbiol. 2008 ; 47（3）: 645-651.
98）Uemura N, Makimura K, Onozaki M, et al.: Developmentof a loop-mediated isothermal amplification method for
diagnosing Pneumocystis pneumonia.J Med Microbiol.
2008 ; 57（Pt 1）: 50-57.
99）鈴木 渉 , 藤崎竜一, 槇村浩一 , 他：LAMP 法を用いた As-

pergillus fumigatus 特異的検出系の構築 . 第 49回日本医真菌学会総会 , 2005
100）Seki M, Yamashita Y, Torigoe H, et al.: loop-mediated isothermal amplification method targeting the lytA gene fordetection of Streptococcus pneumoniae. J Clin Microbiol.
2005 ; 43（4）: 1581-1586.
101）Torigoe H, Seki M, Yamashita Y, et al.: Detection of Haemophilus influenzae by loop-mediated isothermal amplification（LAMP）of the outer membrane protein P6 gene.
Jpn J Infect Dis. 2007 ; 60（1）: 55-58.
102）Yoneyama T, Kiyohara T, Shimasaki N, et al.: Rapid andreal-time detection of hepatitis A virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. J
Virol Methods. 2007 ; 145（2）: 162-168.
103）Cai Z, Lou G, Cai T, et al.: Development of a novel genotype-specific loop-mediated isothermal amplification technique for Hepatitis B virus genotypes B and C genotyping
and quantification. J Clin Virol. 2011 ; 52（4）: 288-294.
104）Yang J, Fang MX, Li J, et al.: Detection of hepatitis C virus by an improved loop-mediated isothermal amplification assay. Arch Virol. 2011 ; 156（8）: 1387-1396.
105）Zhang LQ, Zhao FR, Liu ZG, et al.: Simple and rapid detection of swine hepatitis E virus by reverse transcription
loop-mediated isothermal amplification. Arch Virol. 2012 ;157（12）: 2383-2388.
106）Wakabayashi T, Yamashita R, Kakita T, et al.: Rapid andsensitive diagnosis of adenoviral keratoconjunctivitis byloop-mediated isothermal amplification（LAMP）method.
Curr Eye Res. 2004 ; 28（6）: 445-450.
107）Iizuka I, Saijo M, Shiota T, et al.: Loop-mediated isothermal amplification-based diagnostic assay for monkeypox
virus infections. J Med Virol. 2009 ; 81（6）: 1102-1108.
108）Hagiwara M, Sasaki H, Matsuo K, et al.: Loop-mediatedisothermal amplification method for detection of humanpapillomavirus type 6, 11, 16, and 18. J Med Virol. 2007 ;79（5）: 605 -615.
109）Kawai Y, Kishi F, Ouchi K, et al.: Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method
for the rapid detection of Chlamydophila pneumoniae. Eur
J Clin Microbiol Infect Dis. 2009 ; 28（7）
: 801-805.
110）Pan L, Zhang L, Fan D, et al.: Rapid, simple and sensitive
detection of Q fever by loop-mediated isothermal amplification of the htpAB gene. PLoS Negl Trop Dis. 2013 ; 7（5）: e2231.
111）保坂憲光 , 細部高英 , 近藤秀弥 , 他：LAMP法を用いた
Chlamydia trachomatisと Neisseria gonorrhoeae検出法の開発 . 日性感染症会誌 . 2008 ; 19（1）
: 103 -109.
112）Kato H, Yokoyama T, Kato H, et al.: Rapid and simple
method for detecting the toxin B gene of Clostridium difficile in stool specimens by loop-mediated isothermal amplification. J Clin Microbiol. 2005 ; 43（12）
: 6108-6112.
113）Lalande V, Barrault L, Wadel S, et al.: Evaluation of aloop-mediated isothermal amplification assay for diagnosis of Clostridium difficile infections. J Clin Microbiol.
2011 ; 49（7）: 2714-2716.

（ 18 ）

229114）Minami M, Ohta M, Ohkura T, et al.: Use of a combination of brushing technique and the loop-mediated isothermal amplification method as a novel, rapid, and safe system for detection of Helicobacter pylori. J Clin Microbiol.
2006 ; 44（11）: 4032-4037.
115）McKenna JP, Fairley DJ, Shields MD, et al.: Development
and clinical validation of a loop-mediated isothermal amplification method for the rapid detection of Neisseria
meningitidis. Diagn Microbiol Infect Dis. 2011 ; 69（2）:
137-144.
116）根本二郎 , 小島 禎 , 草場耕二 , 他：Loop-mediated isothermal amplification（LAMP）法を用いた Vibrio vulnificusの迅速検出 . 感染症誌 . 2008 ; 82（5）: 407-413.
117）Horisaka T, Fujita K, Hayashidani H, et al.: Sensitive andspecific detection of Yersinia pseudotuberculosis by loopmediated isothermal amplification. J Clin Microbiol. 2004
; 42（11）: 5349-5352.
118）Miyagawa J, Maeda H, Murauchi T, et al.: Rapid and simple detection of eight major periodontal pathogens by theloop-mediated isothermal amplification method. FEMS
Immunol Med Microbiol. 2008 ; 53（3）: 314 -321.
119）Osawa R, Yoshida A, Masakiyo Y, et al.: Rapid detectionof Actinobacillus actinomycetemcomitans using a loopmediated isothermal amplification method. Oral Microbiol Immunol. 2007 ; 22（4）: 252-259.
120）小島 禎 , 柴田尚宏 , 池戸正成 , 他：Loop-mediated isothermal amplification（LAMP）法によるメタロ-β-ラクタ
マーゼ遺伝子の迅速・簡易検出の検討 . 感染症学雑誌 .
2006 ; 80（4）: 405- 412.
121）Misawa Y, Yoshida A, Saito R, et al.: Application of loopmediated isothermal amplification technique to rapid anddirect detection of methicillin-resistant Staphylococcus
aureus（MRSA）in blood cultures. J Infect Chemother.
2007 Jun ; 13（3）: 134 -140.
122）Hanaki K, Sekiguchi J, Shimada K, et al.: Loop-mediatedisothermal amplification assays for identification of antiseptic- and methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J
Microbiol Methods. 2011 ; 84（2）: 251-254.
123）Kuboki N, Inoue N, Sakurai T, et al.: Loop-mediated isothermal amplification for detection of African trypanosomes. J Clin Microbiol. 2003 ; 41（12）: 5517-5524.
124）Horibe D, Ochiai T, Shimada H, et al.: Rapid detection ofmetastasis of gastric cancer using reverse transcription
loop-mediated isothermal amplification.Int J Cancer. 2007
; 120（5）: 1063 -1069.
125）Visser M, Jiwa M, Horstman A, et al.: Intra-operative rapid diagnostic method based on CK19 mRNA expression
for the detection of lymph node metastases in breast cancer. Int J Cancer. 2008 ; 122（11）: 2562-2567.
126）Morishita S, Tani H, Kurata S, et al.: Real-time reverse
transcription loop-mediated isothermal amplification for
rapid and simple quantification of WT1 mRNA. Clin Biochem. 2009 ; 42（6）: 515-520.
127）Ikeda S, Takabe K, Inagaki M, et al.: Detection of genepoint mutation in paraffin sections using in situ loop-me-

diated isothermal amplification. Pathol Int. 2007 ; 57（9）:594-599.
128）神田秀俊 , 納富継宣：新しい遺伝子増幅法 . ファルマシ
ア . 2001 ; 37
（10）
: 889-893.
129）Iwasaki K, Notomi T, Kanda H, et al.: Validation of the
Loop-Mediated Isothermal Amplification Method for Single Nucleotide Polymorphism Genotyping with Whole
Blood. Genome Letters. 2003 ; 2 : 119 -126.
130）Enosawa M, Kageyama S, Sawai K et al.: Use of loop-mediated isothermal amplification of the IS900 sequence for
rapid detection of cultured Mycobacterium avium subsp.
paratuberculosis. J Clin Microbiol. 2003 ; 41（9）: 43594365.
131）Yamazaki W, Mioulet V, Murray L, et al.: Development
and evaluation of multiplex RT-LAMP assays for rapid
and sensitive detection of foot-and-mouth disease virus. J
Virol Methods. 2013 ; 192（1-2）: 18-24.
132）Alhassan A, Thekisoe OM, Yokoyama N, et al.: Development of loop-mediated isothermal amplification（LAMP）
method for diagnosis of equine piroplasmosis. Vet Parasitol. 2007 ; 143（2）: 155 -160.
133）Nemoto M, Imagawa H, Tsujimura K, et al.: Detection ofequine rotavirus by reverse transcription loop-mediatedisothermal amplification（RT-LAMP）. J Vet Med Sci. 2010
; 72（6）: 823-826.
134）Nemoto M, Ohta M, Tsujimura K, et al.: Direct detectionof equine herpesvirus type 1 DNA in nasal swabs by loopmediated isothermal amplification（LAMP）. J Vet Med
Sci. 2011 ; 73
（9）
: 1225-1227.
135）Pham HM, Nakajima C, Ohashi K, et al.: Loop-mediatedisothermal amplification for rapid detection of Newcastle
disease virus. J Clin Microbiol. 2005 ; 43
（4）
: 1646 -1650.
136）Komiyama C, Suzuki K, Miura Y, et al.: Development ofloop-mediated isothermal amplification method for diagnosis of bovine leukemia virus infection. J Virol Methods.
2009 ; 157（2）: 175-179.
137）Ohtsuki R, Kawamoto K, Kato Y, et al.: Rapid detection of
Brucella spp. by the loop-mediated isothermal amplification method. J Appl Microbiol. 2008 ; 104（6）: 1815 -1823.
138）Nakao R, Stromdahl EY, Magona JW, et al.: Developmentof loop-mediated isothermal amplification（LAMP）
assaysfor rapid detection of Ehrlichia ruminantium. BMC
Microbiol. 2010 ; 10 : 296.
139）吉野 学 , 渡 一 , 小島 禎 , 他：LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）
法によるコイヘルペスウイルスの高感度迅速検出 . 魚病研究 . 2006 ; 41
（1）
: 19 -27.
140）Yoshino M, Watari H, Kojima T, et al.: Rapid, sensitiveand simple detection method for koi herpesvirus using
loop-mediated isothermal amplification. Microbiol Immunol. 2009 ; 53
（7）
: 375 -383.
141）Fujiwara-Nagata E, Eguchi M.: Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for
rapid and simple detection of Flavobacterium psychrophilum. J Fish Dis. 2009 ; 32（10）: 873-881.
142）Shivappa RB, Savan R, Kono T, et al.: Detection of spring（ 19 ）

230

viraemia of carp virus（SVCV）by loop-mediated isothermal amplification（LAMP）in koi carp, Cyprinus carpio L. J
Fish Dis. 2008 ; 31（4）: 249-258.
143）Kono T, Savan R, Sakai M, et al.: Detection of white spot
syndrome virus in shrimp by loop-mediated isothermal
amplification. J Virol Methods. 2004 ; 115（1）: 59-65.
144）Mekata T, Kono T, Savan R, et al.: Detection of yellow
head virus in shrimp by loop-mediated isothermal amplification（LAMP）. J Virol Methods. 2006 ; 135（2）: 151-156.
145）Savan R, Igarashi A, Matsuoka S, et al.: Sensitive and rapid detection of edwardsiellosis in fish by a loop-mediatedisothermal amplification method. Appl Environ Microbiol.
2004 ; 70（1）: 621- 624.
146）Gunimaladevi I, Kono T, Lapatra SE, et al.: A loop mediated isothermal amplification（LAMP）method for detectionof infectious hematopoietic necrosis virus（IHNV）
in rainbow trout（Oncorhynchus mykiss）. Arch Virol. 2005 ; 150（5）: 899 -909.
147）Caipang CM, Haraguchi I, Ohira T,et al.: Rapid detectionof a fish iridovirus using loop-mediated isothermal amplification（LAMP）. J Virol Methods. 2004 ; 121（2）: 155-161.
148）Fukuta S, Kato S, Yoshida K, et al.: Detection of tomato
yellow leaf curl virus by loop-mediated isothermal amplification reaction. J Virol Methods. 2003 ; 112（1-2）, 35 -40.
149）福田至朗, 吉田桂子 , 他：LAMP 法によるトマト黄化葉巻ウイルス検出技術の開発 . ブレインテクノニュース .
2003 ; 100 : 28 -31.
150）Peng J, Shi M, Xia Z, et al.: Detection of cucumber mosaic
virus isolates from banana by one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Arch Virol.
2012 ; 157（11）: 2213-2217.
151）Fukuta S, Ohishi K, Yoshida K, et al.: Development of immunocapture reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for the detection of tomato spotted wilt
virus from chrysanthemum. J Virol Methods. 2004 ; 121（1）: 49-55.
152）横浜植物防疫所：RT-LAMP 法を用いた Plum pox virusの検出について. 植物防疫所病害虫情報 . 2009 ; No.88 :8.
153）福田至朗, 加藤晋朗, 吉田桂子 , 他：Reverse Transcription Loop-mediated Isothermal Amplification（RT-LAMP）
法によるシンビジウムモザイクウイルス（CyMV）の検出 .
日本植物病理學會報 . 2003 ; 69（4）, 411-414.
154）竹内良彦, 福田至朗 , 大矢俊夫：RT-LAMP 法によるメロン黄化えそウイルス（MYSV）の検出 . 愛知農総試研報 .
2006 ; 38 : 57- 63.
155）Okuda M, Okazaki S, Yamasaki S, et al.: Host Range andComplete Genome Sequence of Cucurbit chlorotic yellows virus, a New Member of the Genus Crinivirus. Phytopathology. 2010 ; 100（6）: 560-566.
156）Okuda M, Matsumoto M, Tanaka Y, et al.: Characterization of the tufB-secE-nusG-rplKAJL-rpoB gene cluster ofthe citrus greening organism and detection by Loop-mediated isothermal amplification. Plant Disease. 2005 ; 89 :705.

157）竹内良彦 , 福田至朗 , 大矢俊夫：タバココナジラミのバ
イオタイプ Q を LAMP 法により迅速に識別できる . 平成
18年度関東東海北陸農業研究成果情報 , 2006.
158）福田至朗 , 三宅律幸 , 間下なぎさ , 他：Loop-mediatedisothermal amplification（LAMP）
法によるイチジク株枯病菌の検出 . 愛知農総試研報 . 2009 ; 41 : 1-6.
159）Sugawara K, Himeno M, Namba S, et al.: J. Gen. Plant
Pathol. 2012 ; 78 : 389 -397.
160）岸根雅宏 , 奥西智哉：LAMP 法を利用したコシヒカリの高精度・迅速識別 . 日本食品化学工学会誌 . 2011 ; 58（12）
: 584-589.
161）Kikuchi T, Aikawa T, Oeda Y, et al.: A rapid and precise
diagnostic method for detecting the Pinewood nematode
Bursaphelenchus xylophilus by loop-mediated isothermal
amplification. Phytopahology. 2009 ; 99
（12）
: 1365-1369.
162）Maejima K, Hoshi H, Namba S, et al.: First report of plumpox virus infecting Japanese apricot（Prunus mume Sieb.
et Zucc.）in Japan. J Gen Plant Pathol. 2010 ; 76
（3）
: 229231.
163）Maejima K, Himeno M, Namba S, et al.: Molecular epidemiology of plum pox virus in Japan. Phytopathology. 2011
; 101
（5）
: 567-574.
164）Namba S, Kato S, Iwanami S, et al.: Detection and differentiation of plant pathogenic mycoplasmalike organisms
using polymerase chain reaction. Phytopathology. 1993 ;83（7）: 786 -791.
165）Walia JJ, Salem NM, Falk BW.（2009）
Partial sequenceand survey analysis identify a multipartite, negative-sense
RNA virus associated with fig mosaic. Plant Dis. 93（1）: 4166）小島 禎：新規遺伝子増幅法 LAMP 法の基礎と食品微生物検査への応用 . 食品工業 8月 30日号 . 2003 ; 39 - 47.
167）山田尊士：新規遺伝子増幅法 LAMP 法による食中毒起因菌の迅速検査 . ジャパンフードサイエンス . 2004 ; 43 :43-50.
168）松下 秀 , 加藤 玲 , 尾形和恵 , 他：腸管感染症におけるLAMP 法の応用 . モダンメディア. 2004 ; 50（12）: 293-299.
169）根本二郎 , 百田隆祥 , 砂田亜津子 , 他：LAMP 法を用いた
腸管出血性大腸菌の検出 . 第 23回日本食品微生物学会学術総会講演要旨集 p40（2002）
170）Hara-Kudo Y, Nemoto J, Ohtsuka K, et al.: Sensitive andrapid detection of Vero toxin-producing Escherichia coli
using loop -mediated isothermal amplification. J Med
Microbiol. 2007 ; 56
（Pt 3）: 398- 406.
171）砂田亜津子 , 他：第14回日本臨床微生物学会講演要旨集.
2003 ; 193.
172）吉野 学 , 他：第 25回日本食品微生物学会学術総会講演
要旨集 . 2004 ; 22.
173）百田隆祥 , 他：第 26回日本食品微生物学会学術総会講演
要旨集 . 2005 ; 82.
174）百田隆祥：LAMP 法（Loop-mediated Isothermal Amplification）を用いたカンピロバクターの高感度迅速検出 . 農
産物・食品検査法の新展開 . 2010 ; 97-105.
175）高野 弘：LAMP 法を用いたノロウイルス・カンピロバ
クターの検出試薬キット . 月刊フードケミカル . 2011 ; 1: 67-71.

（ 20 ）

231176）厚生労働省医薬食品局食品安全部監視安全課長：腸管出血性大腸菌 026、0111 及び O157 の検査法について . 食
安監発 0515 第 3号 , 平成 24 年 5 月 15 日177）厚生労働省医薬食品局食品安全部監視安全課長：腸管出血性大腸菌 026、0111 及び O157 の検査法について . 食
安監発 1217 第 3号 , 平成 24 年 12 月 17 日
178）Tsuchiya Y, Ogawa M, Nakakita Y, et al.: Identification ofBeer-Spoilage Microorganisms Using the Loop-mediated
Isothermal Amplification Method. J. Am. Soc. Brew.
Chem. 2007 ; 65（2）: 77- 80.
179）安中敏光, 他：日本臨床微生物学雑誌 . 2003 ; 13,（1）: 1925.
180）井上浩章, 野田晃子 , 縣 邦雄 , 他：LAMP 法 , PCR 法を用いた浴槽水レジオネラ属菌の迅速検査に関する調査研
究 . 防菌防黴誌 . 2004 ; 32（10）: 481-487.
181）遠藤卓郎, 他：LAMP-MPN 法の検討・平成 18 年度 厚生労働科学研究費補助金（地域健康危機管理研究事業）最近の科学的知見に基づく水質基準の見直し等に関する研究（主任研究者：眞柄泰基）より、分担研究報告書
182）百田隆祥, 小島 禎 , 池戸正成 , 他：LAMP 法（Loop-mediated Isothermal Amplification）を用いたクリプトスポリ
ジウムおよびジアルジアの高感度迅速検出 . 水環境学会誌. 2009 ; 32（6）: 321-324.
183）福田伸治 , 高尾信一 , 桑山 勝 , 他：LAMP 法による糞便からのノロウイルスの検出 . 第 52 回日本ウイルス学会学術集会プログラム・講演要旨集 . 2004 ; 272.
184）保坂憲光 , 吉野 学 , 横田江利子 , 他：LAMP 法の化粧品
微 生 物 限 度 試 験 へ の 応 用 . FRAGRANCE JOURNAL.
2012 ; 7 : 69-73.
185）Kaneko H, Iida T, Aoki K, et al.: Sensitive and rapid detection of herpes simplex virus and varicella-zoster virus
DNA by loop-mediated isothermal amplification. J Clin
Microbiol. 2005 ; 43（7）
: 3290-3296.
186）Kaneko H, Kawana T, Fukushima E, et al.: Tolerance ofloop-mediated isothermal amplification to a culture medium and biological substances. J Biochem Biophys Methods. 2006 ; 70
（3）
: 499-501.
187）幸 保孝：核酸増幅検査法の進歩 . 保健師・看護師の結核
展望 . 2011 ; 97 : 85-89.
188）斎藤武文 , 鶴崎聡俊 , 恩田直美 , 他：臨床検体におけるPURE-LAMP とコバス TaqManMTBの比較検討. 結核.
2013 ; 88（2）: 262.
189）吉多仁子 , 小野原健一 , 田澤友美 , 他：塗抹陰性・MGIT
法陽性検体での結核菌群核酸増幅迅速診断におけるコ
バス® TaqMan 法と LAMP法の有用性の比較検討. 結核.
2013 ; 88（11）: 727-733.
190）東出誠司：LAMP 法による迅速診断肺炎マイコプラズ
マの検出 . 第 20回日本臨床微生物学会教育セミナー .
2013.

（ 21 ）