36 (2022)
上原記念生命科学財団研究報告集,上原記念生命科学財団研究報告集, 36（2022）

149. 精神行動を制御する非シナプス性接着分子の網羅的探索
髙野 哲也
慶應義塾大学 医学部 生理学教室
Key words：ドーパミン神経細胞，BioID，Split-TurboID，シナプス，非シナプス性接着構造

緒 言
神経細胞はシナプスと呼ばれる細胞接着構造を形成することで、脳高次機能を担う様々な神経回路網を構築する。さ
らに、近年では神経細胞間や非神経細胞間にシナプスではない接着構造が存在し、複雑な脳内情報伝達を生み出していることも分かってきた。しかしながら、従来までの方法では特定のシナプス及び非シナプス性接着部位の構成分子を同定することが困難であった為、分子機序やその生理的意義については依然として不明のままであった。本研究では、独自の化学遺伝学的技術（Split-TurboID 法）を用いて［1］、脳内の腹側被蓋野から側坐核において長距離に投射されるドーパミン作動性神経細胞の非シナプス性細胞接着構造を制御する構成分子群の網羅的探索を行うことを目的に解析を進めた。まず、Split-TurboID を腹側被蓋野から側坐核において長距離に投射されるドーパミン作動性神経細胞に遺伝子導入したところ、非シナプス性細胞接着部位においてビオチン標識が誘導されることがわかった。そこで、これらのビオチン標識分子を精製し、質量分析を行った。その結果、ドーパミン作動性神経細胞の非シナプス性細胞接着部位を構成する分子として、194 もの分子を同定した（図 1）。興味深いことに、これらの分子はシナプス関連分子が非常に多く含まれており、非シナプス性細胞接着部位はシナプスとよく似た分子機能によって制御されている可能性が考えられた。

図 1．Split-TurboID 法を用いたドーパミン作動性神経細胞接着部位の構成分子の網羅的探索
本研究のワークフロー。Split-TurboID の断片 N TurboID を腹側被蓋野に、もう一方の断片
C TurboID を側坐核にアデノ随伴ウィルス（AAV）を用いて遺伝子導入した。3 週間後にビオチン投与を行い、ビオチン標識を誘導した。その後に、ドーパミン作動性神経細胞特異的 Cre マウス（dopamine transporter 遺伝子-Cre マウス）を用いて同様の実験を行った。Split-TurboID によるビオチン標識を免疫組織染色、sliver staining にて検討し、また質量分析を用いてビオチン標識分子を探索した。

1結果および考察
1.

Split-TurboID 法を用いたドーパミン作動性神経細胞の非シナプス性細胞接着部位の標識
Split-TurboID 法を用いて生体内の腹側被蓋野から側坐核へのドーパミン作動性神経細胞の非シナプス性接着構造の構成分子群をビオチン標識する為に、Split-TurboID のそれぞれの断片を発現誘導する細胞種特異的アデノ随伴ウィルスを用いて成体マウス脳に遺伝子導入した。3 週間後にビオチン投与を行い、ビオチン標識を誘導した。その結果、腹側被蓋野から側坐核へのドーパミン作動性神経細胞の細胞接着部位においてビオチン標識が観察された。しかしながら、ドーパミン作動性神経細胞以外の神経細胞の標識も観察され、AAV-TH-Cre を用いた実験系ではドーパミン作動性神経細胞特異的に Split-TurboID 法を発現することができなかった。
そこで、Split-TurboID をドーパミン作動性神経細胞特異的に遺伝子導入する為に、DAT（dopamine transporter 遺伝子）-Cre マウスを The Jackson Laboratory より入手し、DAT-Cre マウスに Split-TurboID のアデノ随伴ウィルスを用いて遺伝子導入した。具体的には、Split-TurboID の N TurboID を腹側被蓋野に遺伝子導入し、C TurboID を側坐核に遺伝子導入した（図 2A）。その結果、側坐核（NAc）において観察されていた非特異的なビオチン活性化が消失し、Split-TurboID によって特異的にビオチン活性の再構成が検出された（図 2B）。一方、腹側被蓋野（VTA）ではこの様なビオチン標識分子は検出されなかった。以上の結果より、マウス脳内において、腹側被蓋野から側坐核において長距離に投射されるドーパミン作動性神経細胞の非シナプス性細胞接着部位において Split-TurboID 法によりビオチン標識されることが示唆された。

図 2．Split-TurboID は脳内の非シナプス性細胞接着部位をビオチン標識するA) 実験のワークフロー。Split-TurboID を DAT-Cre マウス脳内の腹側被蓋野（VTA）と側坐核（NAc）に遺伝子導入し、ビオチンを投与した。
B) 側坐核’（NAc）の非シナプス性細胞接着部位においてのみビオチン標識が観察された（スケールバー：200μm）。

2.

Split-TurboID 法によりビオチン標識された分子の精製
上記 1）より検出されたビオチン標識分子を質量分析によって同定する為に、Streptavidin ビーズによるアフィニテ

ィー精製にビオチン標識分子を単離した（図 3A）。具体的には、コントロールマウス（Cont）、TurboID 発現マウス（TurboID）、TurboID-surface 発現マウス（TurboID-surface）、Split-TurboID 発現マウス（Split-TurboID）をそれぞ2れ 2 匹分の側坐核からタンパク質を抽出した。その結果、それぞれの側坐核より抽出したタンパク質量は約 10 mg であることを確認した（図 3B）。これらのタンパク質を steraptavidin ビーズにより精製したところ、TurboID によって89、45.2μg、TurboID-surface によって 76.7、48.5μg、Split-TurboID によって 50.7、48μg ものビオチン標識タンパク質が単離された（図 3B）。これらのタンパク質量は十分に質量分析解析できるタンパク量である為に、さらに質量分析を行った。

図 3．Split-TurboID によるビオチン標識タンパク質の精製
A) 実験のワークフロー。TurboID、TurboID-surface、Split-TurboID を DAT-Cre マウ
ス脳内の腹側被蓋野（VTA）と側坐核（NAc）に遺伝子導入し、ビオチンを投与した。
その後、streptavidin ビーズを用いてビオチン標識タンパク質を精製し、質量分析を行った。
B) 精製したビオチン標識タンパク質を silverstaining により検討した。側坐核’（NAc）
では、コントロールに比べて、TurboID、TurboID-surface、Split-TurboID では顕著にビオチン標識分子が増加していた。

3.

質量分析解析によるドーパミン神経細胞の非シナプス細胞接着部位の構成分子の同定
上記 1）、2）より、マウス脳内において、腹側被蓋野から側坐核において長距離に投射されるドーパミン作動性神経細胞の非シナプス性細胞接着部位において Split-TurboID 法によりビオチン標識を確認し、これらのビオチン標識分子の精製に成功した為、質量分析を行った。その結果、コントロールマウスに比べて 1.5 倍以上濃縮している分子として
194 分子が同定された。これらの分子群を、GO term 解析により局在別に分類したところ、興味深いことにシナプスに関連している分子やシナプス近傍に局在する分子が非常に多く含まれていることがわかった（表 1）。さらに、分子機能別に分類したところシナプス形成分子、シナプス小胞輸送関連分子が非常に多く含まれていた（表 1）。これらの結果から、腹側被蓋野から側坐核において長距離に投射されるドーパミン作動性神経細胞の非シナプス性細胞接着部位にはシナプスと非常によく似た構成分子が存在し、シナプスと類似した分子機能により細胞間相互作用が制御されている可能性が示唆された。実際に、先行研究においてドーパミン作動性神経細胞の非シナプス性細胞接着部位にはシナプス前部において伝達物質種放出に関わるアクティブゾーンタンパク質 CAST、シナプス接着分子ニューレキシン、ニューロリジン、シナプス足場タンパク質ゲフィリンが存在していることが報告されており［2］、これらの知見は私達の質量分析のデータを支持していると考えられる。

3

表 1．同定された非シナプス性細胞接着部位の構成分子群の GO term 解析

A）は GO term 解析により局在別に分類したものである。B）は GO term 解析により分子機能別に分類したものである。

共同研究者・謝辞
本研究の共同研究者は、慶應義塾大学医学部生理学の柚﨑通介教授、山崎世和助教、京都大学の浜地格教授、田村朋則講師である。この場をお借りしまして、深く御礼申し上げます。

文 献1） Takano T, Wallace JT, Baldwin KT, Purkey AM, Uezu A, Courtland JL, Soderblom EJ, Shimogori T, ManessPF, Eroglu C, Soderling SH. Chemico-genetic discovery of astrocytic control of inhibition in vivo. Nature. 2020
Dec;588(7837):296-302. doi: 10.1038/s41586-020-2926-0. Epub 2020 Nov 11. PMID: 33177716
2） Motokazu Uchigashima, Toshihisa Ohtsuka, Kazuto Kobayashi, Masahiko Watanabe. Dopamine synapse is aneuroligin-2-mediated contact between dopaminergic presynaptic and GABAergic postsynaptic structures.
Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Apr 12;113(15):4206-11. doi: 10.1073/pnas.1514074113. Epub 2016 Mar 25.
PMID: 27035941

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