自然共生システム学講座
環境生命機能学分野

Environmentally Benign Systems

マイクロ・ナノ電極を利用する環境・医工学バイオセンサデバイスおよび材料評価システムの開発
Development of Environmental/Biomedical Sensors and Visualization Systems
for Material Functions with Micro/Nano Electrodes

教授 珠玖 仁准教授 伊野 浩介

准教授 井上 久美

准教授 熊谷 明哉

助教 梨本 裕司

（工学研究科 兼任）
Professor（工学研究科 兼任）
Associate Professor（山梨大学 兼任）
Associate Professor（材料科学高等研究所、物質・材料研究機構 兼任）
Associate Professor（学際科学フロンティア研究所、 （学際科学フロンティア研究所、工学研究科 兼任）
材料科学高等研究所 兼任）
Assistant Professor
Assistant Professor

Hitoshi Shiku

現在、微小なデバイスのバイオ応用・環境モニタリングに大きな期待が寄せられている。これらのデバイスを用いることで、これまで難しかった生体現象を観察することや、簡便かつ迅速な環境評価・医療用検査が可能になっている。また、生体を模倣した微小な細胞チップを作製することで、再生医療応用や生体内での化学物質のモニタリングが可能になる。このような目的のために、我々はマイクロ・ナノシステムを組み込んだ電気化学デバイスの開発を行った。

Kosuke Ino

Kumi Y. Inoue

Akichika Kumatani

電気化学デバイスを用いた、血管化スフェロイド、がんスフェロイドの酸素代謝計測
これまでに開発してきた電気化学計測ツールのうち、Bio-LSI、走Micro/nano devices have continuing demands on biological science, engineering, and accurate analytical information. We have developed micro/nanoelectrochemical systems for environmental/biomedical applications and evaluation of battery materials. We are also investigating the role of the tissue
microenvironment, utilizing a microfluidic device and scanning probe microscopy. These devices are useful in environmental monitoring, medical, andengineering applications.

査型電気化学顕微鏡（SECM）を用いて、血管網を有する繊維芽細胞スフェロイドの酸素代謝機能の評価を行った。Bio-LSI を用いた酸素代謝の計測結果は、これまで研究室が知見を蓄積してきた SECM による結果と傾向がよく一致し、Bio-LSI による計測の妥当性が再確認された。さらに、血管化の有無で抗がん剤の投与時の酸素代謝の低下の程度に相違があることが確認できた。これは、薬剤効果におけるバイポーラー電極を用いた細胞活性評価、および新規バイオイメージング技術の開発
電解質中に置いた導電性材料に電場を付与すると両端において酸化・還元反応が誘導され、その導電性材料をバイポーラー電極（BPE）と呼ぶ。BPE は電気化学発光と組み合わせると、一端で起きる目的の電気化学反応を他端で生じる電気化学発光シグナルとしてモニタリングすることができる。
これを利用して、三次元的に培養された細胞凝集体（スフェロイド）作製し、乳がん細胞スフェロイドの酸素代謝活性を識別することに成功した（ACS Sens., 5, 740 (2020)）。本成果は、当該雑誌のカバーに選ばれた（図 5）。
さらに、配線が不要という BPE の特徴を最大限に生かし、「バイポーラー電気化学顕微鏡」を開発した。無電解析出を利用し、多孔膜の各孔の内部に金を析出させることで、平均の電極間隔が 41 μm と近藤 朋子ンのイメージングを行ったところ、100 ms の時間分解能で、フェリシアン化物イオンの拡散を可視化できた。また、呼吸活動に伴うスフェロイド周囲の酸素濃度減少をイメージとして捉えることにも成功した（Analyst , 145, 6895 (2020)）。

Development of bipolar electrode arraysfor cell analysis and bioimaging

血管の影響の大きさを示しており、新たな薬剤評価プラットフォーム

When an electric field is applied to conductive materials placed in anelectrolyte solution, oxidation/reduction reactions are induced at both endsof the materials. The conductive materials are called “bipolar electrodes”(BPEs). By combining BPEs with electrochemiluminescence, the target
electrochemical reaction at one end of a BPE can be monitored byquantifying a luminescence at the opposite end.

た際に内部に形成される壊死コアの形成時の酸素代謝の変化を調査しBy using this BPE-electrochemiluminescence system, the oxygen
metabolic activity of three-dimensionally cultured cells (spheroids) wasevaluated. The device with 32 BPEs successfully provided the oxygen
metabolic activity of breast cancer cell spheroids (ACS Sens., 5, 740(2020)). The figure in the project was featured on the cover of the journal(Fig. 5).
Because BPE does not need any direct electrical connection, a large
number of BPEs can be easily integrated into a single platform and isapplicable to bioimaging, namely, “bipolar electrochemical microscopy”(BEM). The average interval between BPEs in our platform was 41 µm. By
using BEM for the imaging of ferricyanide ions in a solution, the diffusionof ferricyanide ions was visualized with a time resolution of 100 ms. In
addition, the decrease of the oxygen concentration near a tumor spheroid
was visualized, which reflects the respiration activity of the tumor
spheroid (Analyst, 145, 6895 (2020)).

Fig.2 Electrochemiluminescence analysis

Fig.3 Oxygen consumption rate analysis using
scanning electrochemical microscopyとしての活用が期待される（Electrochimica Acta , 340, 135979(2020)）。一方、がんスフェロイドの評価では、スフェロイドが成長した（Analyst , 145, 6342 (2020)）。壊死コアの形成は、腫瘍においては、腫瘍微小環境の低酸素の程度を示す指標となる。壊死コア（図 6）が形成されるようなスフェロイドの大きさになると、体積あたりの細胞の酸素消費量に減少が見られた。これは、スフェロイド中心部の細胞が呼吸できなくなっていることを示し、壊死コアの形成を非侵襲的に予測可能であることを示した。

その他の研究活動
バイオ用の 3D プリンターへの応用を目指し、糖を鋳型として、アルギン酸カルシウムの立体的なゲルを構築する技術を開発した（J.

Biosci. Bioeng., 130 539 (2020)）。また、電気化学デバイスを用Yuji Nashimoto

助教 井田 大貴Hiroki Ida

Oxygen consumption rate analysis of avascularized spheroid and a tumor spheroid
We evaluated the oxygen consumption rates (OCRs) of a vascularized
fibroblast spheroid using Bio-LSI and scanning electrochemical
microscopy (SECM). The OCRs determined using Bio-LSI fairlycorresponded to those using SECM, a conventional OCR measurement
tool used for more than 20 years. The result indicates that Bio-LSI can be
another analytical tool for OCR, with advantages in rapid detection.
Furthermore, we found that vascularization enhanced anti-cancer drug
effects in a spheroid culture, suggesting that vascularization should beconsidered in the drug-screening platform (Electrochimica Acta, 340,135979 (2020)). For the analysis of a tumor spheroid, we investigatedwhether the formation of a necrotic core (Fig. 6) affected oxygen
metabolism. The OCR per spheroid volume decreased with increased
spheroid radius, indicating the limitation of the oxygen supply to the coreof the tumor spheroid. OCR analysis using SECM noninvasively monitors
the change of oxygen metabolism in tumor spheroids. The approach ispromising to evaluate various three-dimensional culture models (Analyst,145, 6342 (2020)).

OthersWe developed a new method using sacrificial templates of sugar structures
to fabricate three-dimensionally (3D) designed Ca-alginate hydrogels (J.
Biosci. Bioeng., 130 539 (2020)). In addition, two review papers related tobiofabrication (Adv. Biosyst., 4, 1900234 (2020)) and electroluminescence(Micromachines, 11, 530 (2020)) using electrochemical devices were also
published. Furthermore, a new concept to detect a DNA duplex was
proposed using a droplet array device in Bunsekikagaku.

いたバイオ材料の加工技術（Adv. Biosyst ., 4, 1900234 (2020)）、Department of Frontier Sciences for Advanced Environment

いう BPE アレイを得た。これを用いて溶液内のフェリシアン化物イオ

44 Coexistence Activity Report 2020

高野 聡美

電気化学発光を用いた細胞計測に関する総説論文（ Micromachines ,11, 530 (2020)）を出版した。さらに、多点液滴デバイスを用いたDNA の検出技術を和文誌へ発表した（分析化学 、採択）。

Fig.4 Enzymatic assay in a bio-safety hoodFig.5 Our research featured on the
cover of ACS Sensors

先端環境創成学専攻の酸素代謝活性を評価した。32 本の BPE が集積されたデバイスをFig.1 Lab members 2020

秘書
研究補佐員

Environmental Bioengineering

Fig.6 Tumor spheroid with a necroticcore evaluated in our study

Coexistence Activity Report 202045