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モダンメディア

68 巻 10 号 2022［医学検査のあゆみ］

医学検査のあゆみ ─ 42

腸管感染症検査の進歩
こ小まつ松まさる

方Masaru KOMATSU

され、様々な種類の色を集落に着色させる培地も広Ⅰ. 腸管感染症検査法の変遷く利用されつつある。一方、これまで同定検査のために、小試験管培地に充填した様々な生化学的性状

腸管感染症は細菌、ウイルス、および寄生虫によっ試験は、自動分析器の普及により、マイクロプレーて引き起こされる。主訴は腹痛、下痢、嘔吐、発熱

トやカード内で数十種類の性状を一度に検査する事などであり、時に敗血症や溶血性尿毒素症症候群にが 可 能 と な っ た。 現 在、 こ の 同 定 検 査 は MAL-進展し死亡するケースも存在する。現在、病院検査

DI-TOF MS を原理とした同定検査に置き換わろう

室や登録衛生検査所における腸管感染症検査は、細としている。さらに、免疫拡散法や遺伝子検査法も菌の検出を目的とした場合は、糞便を用いた分離培導入され、細菌の病原因子やウイルスの抗原や核酸養・同定法が主として実施されている。ウイルスはを迅速に検出することが可能となった。

核酸増幅法や免疫拡散法が普及したことで、検出率わが国においては、日本臨床微生物学会が「腸管が格段に向上している。寄生虫は形態学的検査が今

感染症検査ガイドライン」の初版を 2010 年に刊行、もなお主流な検査法であるが、一部においては核酸2021 年には第 2 版が刊行され、表 1 に示す病原微増幅法も適応されている。

生物の検査法が掲載された 。このガイドラインが1）

1876 年、ドイツの細菌学者であるロベルト・コッホ（Robert Koch）は炭疽菌の純培養に成功し、炭疽の表 1 腸管感染症検査ガイドライン第 2 版に記載されている感染症（病原体）病原体であることを証明した。1881 年にはロンドンで開催された国際学会において、現在の寒天平板を用いた分離培養法の礎である平板培養法を供覧、1883 年にはインドでコレラ菌を発見した。以来数十年にわたり、多くの研究者により寒天平板を用いた細菌の分離培養法が研究された。1965 年、Taylor らに よ り 報 告 さ れ た キ シ ロ ー ス － リ ジ ン 寒 天：XL（Xylose - Lysine）寒天は、赤痢菌（Shigella）やサルモネラ（Salmonella）の集落と他の腸内細菌科細菌あった。本培地が報告されてから早 60 年が経過しようとしているが、今なおこの検出原理は様々な病原寄生虫性腸管感染症
原虫性腸管感染症

細菌の分離培地に応用されている。近年、CHROM
agarのように合成発色基質を添加した培地も利用

天理医療大学 医療学部 臨床検査学科〠632 - 0018 奈良県天理市別所町80 - 1

Listeria monocytogenes
ウェルシュ菌ボツリヌス菌Providencia alcalifaciens
Klebsiella oxytoca
Brachyspira属
抗菌薬関連下痢症
腸結核
Helicobacter pylori

ウイルス性腸管感染症
ノロウイルス
A型肝炎ウイルス
ロタウイルス
E型肝炎ウイルス
アデノウイルス
その他のウイルス（サポウイルス、アストロウイルス等）の集落を色調による違いで区別する画期的な培地でTM

細菌性腸管感染症
サルモネラ
赤痢菌
下痢原性大腸菌
エルシニア
カンピロバクター
Vibrio属
Aeromonas属
Plesiomonas属
黄色ブドウ球菌
セレウス菌

蠕虫性腸管感染症（文献 1）
を参考に作成）

Department of Clinical Laboratory Science, Division of Health Science
Tenri Health Care University(80-1 Bessho-cho, Tenri, Nara 632- 0018)

（6）

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わが国の臨床微生物検査室における腸管感染症検査

その後、1977 年の Skirrow らの報告以降、基礎培法の最新版である。

地は肉エキスを含むブルセラ寒天、発育支持性を高めるために血液あるいは溶血液の添加、選択剤は抗Ⅱ. 腸管感染症原因細菌検出のための分離培地開発の変遷

菌薬であるトリメトプリム、バンコマイシン、ポリミキシン B が添加され、これが現在検査室で使用されている Skirrow 寒天培地の組成となった。その1965 年、Taylor により報告された XL 寒天培地は、後、血液成分が必ずしも C. jejuni を検出するため培地中にキシロースと L -リジンを含有している培に必要ないことが知られるようになり、1983 年に地であり、分離を目的とする集落性状に一定の特徴

Bolton らによって血液成分の代わりに活性炭を添加を持たせる選択分離培地として注目された。その反した CCD（Charcoal-Cefoperazone-deoxycholate）

応原理は、腸管内常在性の多くの腸内細菌科細菌が培地が報告された。この成分をベースとした改良培

キシロースを発酵し、培地上では酸性集落（黄色）

地が国内のいくつかのメーカーから販売されていを形成するが、Shigella はこれを発酵せずにアルカる。選択剤として入っているセフォペラゾンは第三リ性集落（赤色）を形成する。本培地に含まれる乳世代セファロスポリンである。

糖や白糖の両者が非分解である腸内細菌科細菌は、1993年、CHROM agar （https://www.chromagar.

Shigella と同一のアルカリ性集落を形成するが、キシcom/）がパリに設立された。本培地は多くの検査ロースの添加によって Shigella との鑑別がより行い室で様々な材料の微生物検査に汎用されている。腸やすくなる。さらに、本培地にはチオ硫酸塩とクエン管感染症病原細菌の検出用としては、Yersinia en-酸鉄アンモニウムが含まれているため、Salmonella

terocolitica、Salmonella、腸管出血性大腸菌（EHEC）、

や Citrobacter のような硫化水素産生菌は集落の色Campylobacter、Clostridioides difficile 用の培地があ調が硫化鉄の生成により黒色化する。これら両者は、る。詳細な組成は明らかにされていないが、選択剤キシロースを分解するため集落上では理論上区別すと様々な色に着色する合成基質を含有している。現ることができないが、Salmonella はリジンを脱炭酸在、CHROM agarにより分解するため、その生成物である強アルカリ耐性菌を検出する事を目的としたさまざまな培地も性のカダペリン（アミン系物質）が、キシロース分解開発している。MRSA はその筆頭格であり、最近でにより産生された酸を中和することから、結果的には基質拡張型βラクタマーゼ（ESBL）産生菌、カアルカリ性集落（赤色で中心部黒色）を形成し、リルバペネマーゼ産生菌、バンコマイシン耐性腸球菌

ジンを分解しない Citrobacter（黄色で中心部黒色）（VRE）などの臨床的にも重要な薬剤耐性菌検出用と区別することが可能となる。このように、XL 寒培地が開発され、糞便中の保菌検査にも利用されて天培地は複数の生化学的性状を同時に確認することいる。耐性菌検出用の培地は CHROM agarができるが、さらにデオキシコール酸塩を添加するにもいくつかのメーカーからも市販されている。

TMTMは医療関連感染上重要な薬剤TM以外

ことにより Escherichia coli などの腸管内常在性のⅢ. 腸管感染症原因細菌の同定法の変遷

腸内細菌科細菌の発育を抑止し、高効率に Shigellaや Salmonella の集落検索を行える XLD 寒天培地として改良された。XLD 寒天培地で使用されている病原細菌の同定は、生化学的性状検査（糖分解性、デオキシコール酸塩は、現在多くの検査室で使用さアミノ酸分解性等）を用いた方法が今なお多くの検れているマッコンキー寒天培地、DHL 寒天培地、査室で実施されている。例えば、腸内細菌科細菌のSS 寒天培地、TSBS 寒天培地等にも含有している。

同定検査は TSI 培地、SIM 培地、VP 培地などガラ

一方、抗菌薬を選択剤として添加している分離培

ス製の小試験管に培地を充填し、合計 6 ～ 7 本の培地を使用する代表的な細菌に Campylobacter jejuni

地を同時利用している。現在もなお、細菌の簡易同が挙げられる。C. jejuni は酸素分圧が 5％程度の環定法として利用されている方法である。これらの方境下で発育する感染性腸炎の原因細菌であるが、分法で同定が困難な場合、簡易同定キットを使用する。

離培養法は Butzler らにより 1973 年に報告された。

現在は自動化が進み、簡易同定キットの概念がマイ（7）428

表 2 腸管感染症原因細菌と質量分析での同定上の注意点
MALDI BiotyperリファレンスライブラリーVer7.0.0.0での結果表示
Salmonella spp.
Shigella spp.
下痢原性大腸菌
Escherichia albertii
Yersinia spp.
Vibrio cholerae
Aeromonas spp.
Bacillus cereus
Clostridium botulinum
Klebsiella oxytoca

属レベルでのみ同定可能。血清型試験を追加して最終決定する。
E. coliと鑑別不可能。ライブラリに登録なし。
E. coliレベルでのみ同定可能。
1株のみ登録あり。
Y. pseudotuberculosisとY. pestis（ライブラリ登録なし）は鑑別不可。
ライブラリに登録なし。
17菌種の登録があるが菌種間のパターンが類似しているため鑑別不可。
同定可能だが、炭疽菌（ライブラリ登録なし）との鑑別不可。
ライブラリに登録なし。
同定可能だが、Raoultella ornithinolytica/planticola/terrigenaとは鑑別不可。
（文献 1）
より抜粋、一部改変）

クロプレートウェルや小型カード内に充填され、20治療薬選択の情報として利用価値が高まっている。

種類ほどの性状検査が完全自動化で検査できるよう

ただし、本装置の反応原理はリボゾームタンパクをになった。

中心にデータベースが構築されているため、大腸菌以上が現在の検査室で主流の同定検査であるが、や赤痢菌のようにリボゾーム配列が類似している細菌群は鑑別ができない（表 2）。

まれに上記方法でも鑑別ができない場合に遭遇する。その場合、細菌や真菌に共通配列を PCR で増Ⅳ. 遺伝子検査の開発と発展幅し、シークエンスにより同定する方法が普及しつつある。共通配列とは、細菌は 16S rRNA 領域、真菌は 18S rRNA および rRNA 間の 2 つの ITS（Inter-PCR 法を用いた結核菌遺伝子の検出法が開発さnal Transcribed Spacer）領域であり、これら領域はれて以降、本技術は様々な病原体検出法として急速近縁種を分類するのに充分な特異性を持つ。多くのに普及した。「腸管感染症検査ガイドライン第 2 版」

検査室はシークエンサーを保有していないが、自施には、PCR 法を用いた病原体遺伝子や病原因子の設内で PCR まで実施し、シークエンスを外注する運プ ラ イ マ ー 配 列 が 50 種 類 以 上 表 記 さ れ て い る。

用をもつ施設が増えている。シークエンス後のデーPCR プライマーは外注でも千円程度で合成が可能

タ解析は、leBIBI IV 16S Automated ProKaryotes

であり、PCR 装置も安価になっていることから広Phylogeny（https://umr5558 -bibiserv.univ-lyon1.fr/

く検査室で利用することが可能である。市販キットlebibi/lebibi.cgi）等の無償データベースサイトからは、リアルタイム PCR 法、LAMP 法などを使用して、検索できる。

ノロウイルスや Clostridioides difficile の毒素遺伝子

1988 年に、田中により報告された質量分析法の一などの検査キットが普及している。多項目同時測定遺種である Matrix-assisted laser desorption ionization-伝子検査キットである FilmArray （ビオメリュー・time of flight mass spectrometry（MALDI-TOFジャパン株式会社）は 13 種類の細菌、5 種類のウMS、マトリックス支援レーザーイオン化飛行時間型

イルス、および 4 種類の寄生虫の核酸を 1 時間以内

質量分析）が、2011 年に同定装置として国内承認に同時に検出できる（表 3）。 本装置は、糞便をキッされた。本装置は 2 種類が販売されており、1 つはトに充填後、装置内で核酸抽出、核酸増幅および検ブルカー・ダルトニクス社の「MALDI Biotyper」、出が全自動で行われる。

TM

もう 1 つは島津製作所の「AXIMA 微生物同定シス

Ⅴ. 下痢原性大腸菌検査についてテム」である。後者は、ビオメリュー・ジャパン社から「VITEK MS」としても販売されている。現在
国内のおよそ 300 施設に導入されている。同定に要下痢原性大腸菌は病原性の違いから 5 つのカテゴする時間は、集落をプレートに塗布し装置に充填後、リーに分類されている。一般の検査室で行われてい1 ～ 2 分程度である。従来の生化学的性状検査よりる検査フローは、分離培養で大腸菌を検出した株に検査所要日数が 1 日短縮され、感染症の迅速診断や対して O 抗原の血清型別を行う。しかし、血清型

（8）

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表 3 FilmArray

TM

消化管パネルで検出可能な病原微生物

細菌

ウイルス

Campylobacter属
Clostridioides difficile toxin A/BPlesiomonas shigelloides
Salmonella属
Vibrio属（V. parahaemolyticus, V.vulnificus及びV.cholerae）
V.cholerae
Yersinia enterocolitica
Enteroaggregative Escherichia coli（EAEC）
Enteropathogenic Escherichia coli（EPEC）
Enterotoxigenic Escherichia coli（ETEC）tl/st
Shiga-like toxin-producing Eschericghia coli（STEC）stx1/stx2
E. coli O157
Shigella/Enteroinvasive Escherchia coli（EIEC）

寄生虫

Adenovirus F40/41
Cryptosporidium
Astrovirus
Cyclospora cayetanensis
Norovirus GI/GII
Entamoeba histolytica
Rotavirus A
Giardia lamblia
Sapovirus（Genogroups I, II, IV及びV）

別のみで本菌を同定することは出来ず、病原因子のべられずに、血清型別試験結果を報告する場合には、確認が必要となる。伊藤ら（https://www.niid.go.

医師に誤解を与えないよう、「大腸菌血清型群○○をjp/niid/ja/diseases/ka/ecoli/849-idsc/iasr-topic/検出した。下痢原性大腸菌の疑いはあるが、病原因

iasr-topic-related/965 -dj3831.html）は、病原大腸菌子の確認試験が必要である。
」等のコメントをつける血清型（EPEC）および他の下痢原性大腸菌血清型必要があるとの注意喚起の文言が記載されている。の病原因子の保有状況を IASR に報告した。EPEC

Ⅵ. 抗菌薬関連下痢症とClostridioides difficile の検査

血清型としての報告数は 590 件であったが、血清型の種類は O1 が最も多く、O18 がこれに次ぐが、これらの株のほとんどは EPEC 主要病原因子である eae遺伝子を保有しておらず、eae 遺伝子陽性であった

抗菌薬関連下痢症（Antibiotic-associated diarrhea,血清型は OUT（O antigen untypable）、O55、O128、AAD）の原因細菌として C. difficile、MRSA、細胞O119、O8 の順であった。伊藤らの結論として、下痢

毒性産生 Klebsiella oxytoca などが知られているが、原性大腸菌を鑑別するため古くから血清型が使われこれらの中で検査法が確立できているのは C. difficileてきたが、病原因子が遺伝子検査で簡単に調べるこだけである。C. difficile は 1935 年に Bacillus difficilisとができるようになり、血清型の意義は薄れてきたととして登録され、途中 Clostridium difficile に学名述べている。磯崎らも、大腸菌血清型別は EHEC

変更後、2016 年に現在の学名となっている。1979 年、O157 や O26 の検出等、ある程度の精度を有する確George らによって報告された CCFA（Cycloserine-立された検査法ではあるが、下痢原性大腸菌の検査Cefoxitin-Fructose-Egg Yolk）培地は現在多くの検査を血清型別を主たる報告体系とすると、非病原性株室で使用されている選択分離培地である。C. difficile

を病原性株として報告してしまう可能性があると感染症（CDI）検査法は、これまで糞便中のトキシし、血清型別を前提とした分類法に代わり、PCR

ン B 活性をベロ細胞培養を用いて検出する方法、法を用いた下痢原性大腸菌検査法を採用する必要がトキシン A やトキシン B の抗原検出法、C. difficileあると述べている。の代謝産物であるグルタメートデヒドロゲナーゼ

多くの検査室は診療報酬項目である「大腸菌血清（GDH）検出法、CCFA 培地を用いた分離培養およ型別」（令和 2 年度診療報酬改定で 175 点と設定）のび糞便中のトキシン遺伝子検出法が確立されてい縛りがあるため、本検査法は臨床の現場においてはる。糞便中のトキシン B 活性を細胞培養で検出すいまだ主たる検査法であることには変わりがない。

る方法は感度・特異度ともにすぐれ、CDI 診断のた

EHEC の病原因子であるベロ毒素は、遺伝子検査やめのゴールドスタンダードであるが、ベロ細胞の維抗原検査による検出は普及しているが、他の下痢原持・管理や測定法が煩雑であり、国内検査室にはまっ性大腸菌の遺伝子検査は普及していない。「腸管感たく普及していない。2017 年、日本臨床微生物学

染症検査ガイドライン第 2 版」では、病原因子を調会感染症領域新規検査検討委員会から現在、いくつ（9）430

下痢便（有症患者のみ）
GDH検出法

GDH陽性

GDH陰性
*CDI否定トキシンA&B検出法

トキシン陽性

臨床的に強くCDIを疑う場合はToxigenic cultureまたはトキシン遺伝子検出法の依頼を考慮

トキシン陰性*CDI

Toxigenic cultureあるいは

トキシン遺伝子検出法

陽性陰性*CDI否定*CDI or 保菌者
臨床評価と併せて判定*CDI, Clostridium diﬃcile infec�on

図 1 CDI 検査精度および検査効率を上げるための 3 ステップアルゴリズム（文献 1より転載）

かある CDI 検査法を一定のフローチャート（3 ステッおわりにプアルゴリズム）が公表された（図 1）。3 ステップ
アルゴリズムの特徴は、感度の高い GDH 検出をスクリーニングとし、陰性であれば CDI 否定、陽性

2021 年に日本臨床微生物学会が刊行した「腸管であればトキシン A とトキシン B の検出を行う。

感染症検査ガイドライン第 2 版」の内容が国内検査

トキシン検査は GDH 検査より感度が低いことか室における最新の考え方である。本ガイドラインはら、GDH 陽性トキシン陰性の場合は、高感度検出初版（2012 年）には記載のなかった Brachyspira 属法である Toxigenic culture あるいはトキシン遺伝菌、Escherichia albertii 等が追記された。また、本子検出法を行うことが推奨されている。Toxigenic

項で記載しなかった寄生虫性腸管感染症、原虫性腸culture とは、CCFA 培地に発育した集落から毒素管感染症検査法に加え、回虫や鉤虫などの蠕虫の検を抽出してトキシン検査をあらためて行う方法であ査法、およびフェイヤー肉胞子虫やナナホシクドアる。核酸増幅法（Nucleic Acid Amplification Test、など、新たに食中毒を引き起こす病原体の検査法もNAAT）は専用機器の導入は必要であるが検査室に追記された。本総説に加え、「腸管感染症検査ガイ導入されつつある。Xpert C. difficile「セフィエド」

ドライン第 2 版」もぜひご一読いただきたい。

（ベックマン・コールター株式会社）や BD マック
ス CDIFF（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）
は、先に示した FilmArray と同様に糞便を反応試薬に添加するのみですべての検査工程を自動で行うことが可能である。

（ 10 ）

文献1 ）日本臨床微生物学会検査法マニュアル作成委員会・腸管感染症検査ガイドライン委員会 . 2021. 腸管感染症検査ガイドライン第 2 版 . 日臨微誌 31（Suppl. 2）