研究課題名
化学物質による脳機能攪乱の高感度検出
Highly sensitive detection of brain function disturbance by chemicalsubstances
研究代表者
平井 杏梨
北海道大学大学院 獣医学院

D3

研究分担者
池中 良徳
北海道大学大学院 獣医学研究院 附属動物病院トランスレーショナルリサーチ推進室教授

拠点構成員
野見山 桂

研究目的
一部の神経受容体モジュレーターは情報伝達に影響を及ぼすが、病理学的変化を伴わないこうした変化は検出が困難であり、現行の毒性評試験法はその評価法として不十分である。情動認知行動などの高次脳機能は情報伝達攪乱の指標として使用されるが、これには神経細胞やグリア細胞、神経伝達物質など複数の素因が複雑に関与しあっているため、細胞系などの単純な in vitro 試験系では評価は困難であり、in vivo の評価系を構築する必要がある。
注意欠如・多動性障害（ADHD）などのいくつかの神経疾患は、農薬などの化学物質への曝露との関連性が示唆されており (Nilsen et al., 2020) 、広く使用される農薬であるネオニコチノイド（NNs）について、本来毒性影響が認められない用量である無 毒性 量に曝露された マウ スで 不 安様行 動の増加 (Hirano et al.,2018)や脳神経活動の変化 (Hirai, Sugio, et al., 2022) 、カテコールアミンの変

動 (Hirai, Yamazaki, et al., 2022) が観察されることが知られている。こうした背景から近年、より適切な神経毒性影響評価 が求められ始めている。
そこで本研究では、 NNs などの nAChRs アゴニストをモデル化合物とし、未だ毒性学分野で一般的に使用されていない手法 に着目して in vivo 曝露試験を実施することによって、神経受容体モジュレーターが情動認知行動に影響を与える機序を解明 し、これらの情報伝達攪乱を高感度に検出できる試験系を確立する ことを目的とする。

研究方法
C57BL/6 マウスを対照群と曝露群の二つに分け、曝露群には NNs の一つである ア セ タ ミ プ リ ド (ACE) を 経 口 投 与 し た 。 ACE の 投 与 濃 度 は 、 マ ウ ス に お け る
NOAEL で あ る 20mg/kg 体 重 と し た 。 投 与 か ら 30 分 後 に 高 架 式 0 字 迷 路(EZM)を実施し、脳を採材して、 LC/MS/MS によりモノアミン濃度を分析した。
さらに、行動試験と同様の方法および濃度でマウスに ACE を投与し、30 分後に脳を採 材して、 凍 結切片を 作製した 。 この切片 を抗セロ ト ニン抗体 を用いて 染色し、共 焦点顕微 鏡 で観察す ることで 、 不安に関 するセロ ト ニン系に おいて 重 要な脳部位である縫線核(RN)でのセロトニン活性を 調べた。
また 、 Arc-Cre/ ER T 2 ;Ai14 ト ラン ス ジ ェニ ック マウ ス に つ いて 、行 動試 験と同 様 の 投 与 方法およ び濃度を用い て化学 物質を投与した後、 投与 1 時間後に 4OHT を投与した。マウス脳内における蛍光タンパク質の発現を約 1 ヶ月間待った後、脳を採材して凍結切片を作製し、蛍光顕微鏡によって観察した。

研究成果
成果 1：ACE 誘発性不安様行動における脳内モノアミンの関与
ACE の投与 30 分後に、不安様行動が増加する傾向にあり (p=0.057)、迷路内での活動性は有意に低下した（図 1）。また、海馬と線条体において、ドーパミンとその代謝産物である 3-MT 、セロトニンが増加した。 縫線核を含む脳部位である脳幹では、セロトニンの増加が観察された。
これらのモノアミン濃度は EZM 直後に採材した脳サンプルを用いて分析してい る た め 、 EZM に お け る 結 果 と モ ノ ア ミ ン 濃 度 に つ い て 相 関 解 析 を 行 っ た 。
Spearman の順位相関係数が有意な相関は対照群と ACE 群で異なり、特に海馬セロトニンは、ACE 投与群のみにおいて、不安様行動の指標であるオープンアームでの滞在時間と有意に相関した（図２）。また、線条体ドーパミンにおいても同様の有意な相関が観察された。
セロトニン 1A 受容体アゴニストを海馬にマイクロインジェクションすると不安様行動が増加することが知られており (File et al., 2000) 、海馬セロトニンがACE 誘発性の不安様行動においても重要な役割を果たす可能性が示唆された。

図 1. EZM における行動変化. (a)オープンアームでの滞在時間、(b)総移動距離

図 2. 海馬における(a)ドーパミン、(b)3-MT、(c)セロトニンの濃度.

図 3. (a)対照群および(b)ACE 群における、行動と海馬モノアミン濃度の相関 .
成果２：ACE による縫線核セロトニン活性の変化
前脳に投射するセロトニン神経の 50％以上は縫線核に起始し、主要なドーパミン経路は 縫線核作 動 性神経に よって支 配 されてい る。また 、 縫線核の セロトニ ン作動性神 経を直接 刺 激すると 、海馬セ ロ トニンの 放出を介 し て不安様 行動が増 加することが知られている (Abela et al., 2020; Ohmura et al., 2014) 。
成果 1 とこれらの先行研究から、縫線核のセロトニンが ACE 誘発性の不安様行動に関 与してい る 可能性が 示唆され た ため、抗 セロトニ ン 染色によ り縫線核 のセロトニ ン活性を 調 べた。 共 焦点顕微 鏡 で背側縫 線核を観 察 し、赤色 蛍光によ って標識された細胞数を ImageJ を用いてカウントしたところ、ACE 投与群において染色原性を示す細胞数が有意に増加した（図 4）。
縫 線 核は 、前 述の通 り 海馬セ ロト ニンの 放出を介 して 不安を 誘発 する ほか 、 恐怖に対す る防御反 応 の一つと して知ら れ るすくみ 行動が、 縫 線核 から 下丘とい う脳領域へ のセロト ニ ン作動性 経路の活 性 化によっ て引き起 こ されるこ とも報告 されている (da Silva Soares et al., 2019) 。本研究では、EZM において総移動距離の減少が観 察された が、縫線核 でのセロ トニン活性 が増加し たことをふ まえると 、これは活動性の減少だけではなく、すくみも反映している可能性があ る。

図 4. 背側縫線核におけるセロトニン活性. (a)観察領域、(b)染色原性を示した細胞数、(c)対照群および(d)ACE 群の鏡検画像の一例. DRN: 背側縫線核、Aq：中脳水道

今後の課題
Arc-Cre/ ER T 2 ;Ai14 ト ラン ス ジェ ニッ クマ ウス を用 いた 実 験に つい て、 自家繁殖による 系統維持 が上手くい かず、今 年度は成果 をあげる ことが出来 なかった 。
来年度に The Jackson Laboratory から親ペアを新しく導入する予定なので、抗セロトニン抗体による染色も併用しながら研究を続けていく。
ま た 、現 在は 単一の 投与濃度 での み実験 を行って いる が、 複 数の濃度 段階 における神経毒性影響も調べる必要がある。
本成果から、ACE による不安様行動にはセロトニン系への影響が重要であることが示唆 された 。 神 経毒性影 響の機序 を より詳細 に解明す る ため、 ブ レインス ラ
イサーを用いた縫線核におけるセロトニン濃度の測定や、MSI による網羅的な解析などについて検討する。