Ⓡ日本語マニュアル(Version A1, 2024 年 9 月 12 日版)
最新の英語版プロトコルも必ずご確認ください。

※キットの構成品は、それぞれ保管温度が異なります。商品到着後、適切な温度で保管してください。

Copyright 2024 Active Motif, Incactivemotif.com

目次
概要 ............................................................................................................... 1
実験工程の流れ ............................................................................................. 2
キットの構成と保管温度 .................................................................................. 3
その他必要な試薬・機器 .................................................................................. 5
DNA Library Prep Kit for Illumina® プロトコル ................................................. 6
サンプル・試薬の準備 ..................................................................................... 6
サンプル ...................................................................................................... 6
試薬 ............................................................................................................ 7
One-Tube End Repair.................................................................................... 8Illumina Adapter Ligation .............................................................................. 9ライゲーション DNA の精製 ............................................................................. 9PCR Enrichment ......................................................................................... 10ライブラリーの精製 ...................................................................................... 11クオリティーチェック、下流解析について ......................................................... 11Appendix ..................................................................................................... 12
プライマー・インデックス配列 ....................................................................... 12
備考と参考結果 ........................................................................................... 14トラブルシューティングガイド ........................................................................... 15
関連製品 ........................................................................................................ 16
テクニカルサポート ......................................................................................... 17

概要
DNA Library Prep Kit for Illumina®は、Illumina®プラットフォームでシーケンス解析を行うために設計された DNA ライブラリー調製キットです。ChIP-Seq kit、ChIC/CUT&RUN Assay kit、MBD
Capture kit などの各種アッセイで濃縮されたゲノム DNA 断片 (dsDNA) を用いて、高品質な DNAライブラリーを調製します。
まず断片化または酵素消化したゲノム DNA の両末端を修復し、イルミナ用アダプターとライゲーションを行います。ライゲーションした DNA を付属の SPRI ビーズを用いて精製し、インデックスを付加する PCR により、P5 および P7 を含む完全⾧配列を生成します。最後に、再度 SPRI ビーズを用いて精製することで、シーケンス用ライブラリーが完成します。
本キットは断片化した二本鎖 DNA に最適化されています。800 bp を超える DNA 断片は、Illumina®
Sequencer でのシーケンスの質に大きな影響を与えるため推奨していません。また、一本鎖 DNA(ssDNA）はこの製品には対応していません。
推奨する二本鎖 DNA の量:500 pg ~ 10 ng
推奨する二本鎖 DNA のサイズ:150 bp ~ 600 bp
Dual Index Primers Set 1 for Illumina®および Dual Index Primers Set 2 for Illumina®には、それぞれ 48 サンプルのマルチプレックスに対応するデュアルインデックスが含まれています。2 つを組み合わせることで、最大 96 サンプルのマルチプレックスにも対応することが可能です。
製品

Catalog No.
®
®
®

実験工程の流れ

キットの構成と保管温度
DNA Library Prep Kit for Illumina®は、ドライアイスと常温の 2 つの箱に分かれて出荷されます。
お手元に届きましたら、ドライアイスの箱は-20℃、もう一つの箱は 4℃で保管してください。
重要:SPRI Beads は凍らせないように４℃で保管すること!
Dual Index Primers Set 1 for Illumina®および Dual Index Primers Set 2 for Illumina®はドライアイスを同梱して出荷します。お受け取り後は、-20℃で保管してください。
各構成品は以下の温度で保管してください。適切に保管された場合、受領後 6 ヶ月間安定であることを保証します。

DNA Library Prep Kit for Illumina® (Catalog No. 53220)
試薬

容量

保管温度

室温

関連製品
DNA Index Primers Set 1 for Illumina® (Catalog No. 53221)
試薬

濃度

容量

保管温度

DNA Index Primers Set 2 for Illumina® (Catalog No. 53222)
試薬濃度

容量

保管温度

その他必要な試薬・機器
断片化された DNA サンプル（150-600 bp の推奨サイズ）
サーマルサイクラー
滅菌水（DNase フリー）
10 mM Tris-HCl, pH8.0 または TE Buﬀer, pH8.0 (Low EDTA)
80%エタノール（用時調製）
マグネットバーまたは 0.2 mL チューブ用マグネットラック/スタンド
1.5 mL または 2 mL 微量遠心チューブ
0.2 mL PCR チューブ
遠心用 PCR チューブアダプター

DNA Library Prep Kit for Illumina® プロトコル
サンプル・試薬の準備サンプル
推奨する二本鎖 DNA の量: 500 pg ~ 10 ng
推奨する二本鎖 DNA の断片サイズ: 150 bp ~ 600 bp
DNA Library Prep Kit for Illumina® では、500 pg ~ 10 ng の二本鎖 DNA 断片からライブラリーを調製できますが、良好な結果を得るためには 5 ng ~ 10 ng を推奨します。また、二本鎖 DNA 断片のサイズは 150 bp ~ 600 bp の範囲であることを推奨します。
サンプルの濃度とサイズについては、TapeStation™ またはアガロースゲル電気泳動で二本鎖 DNA 断片のサイズを確認し、蛍光測定法（Qubit™など）で DNA 濃度を定量することをお勧めします。
DNA サンプルは、One-Tube End Repair 反応の前までに、10 mM Tris-HCl, pH8.0 または TE
Buﬀer, pH8.0 (Low EDTA) で最終容量 39 μL に希釈する必要があります。
アクティブ・モティフ製品との併用
下記の表に示したアクティブ・モティフのキットを使用した場合、DNA 定量およびサイズ分布の測定を省略できる場合があります。クロマチンの断片化が、キットのプロトコルに準じて、クロマチン/DNA 沈殿前に機械的断片化（超音波処理など）や制限消化を用いて断片化されている場合や、キットに内包された溶出試薬を用いて DNA 溶出を実施した場合は、ライブラリー調製に理想的な濃度とサイズ範囲になっています。
参考までに、One-Tube End Repair 反応に使用する最終容量 39 μL を調製するための、各キットで溶出された DNA 溶液の必要量と希釈に使用する 10 mM Tris-HCl, pH8.0 の容量を表に示します。
その他のキットに関しては、アクティブ・モティフまでご連絡ください。

製品

キット溶出液使用量

容量

試薬・Illumina Adapter の希釈
Illumina Adapter は、ライゲーション反応に使用する前に、TT Buﬀer で用時希釈する必要があります。アダプターの希釈は、使用する DNA 量に依存します。DNA サンプルの定量が容易でない場合、または前ページのキットによる DNA 溶出液を使用する場合は、1 ng 未満の DNA に対するアダプター希釈の手順に従うことをお勧めします。
キットには 4 反応ストックを 12 回作製するのに十分な試薬が含まれています。以下のプロトコルに従って、適切な DNA サンプルを調製してください。
Option 1: DNA 量が 1 ng 以上の場合のアダプター希釈
1 ng 以上の DNA サンプルを使用する場合、ライゲーション反応に使用する前に Illumina Adapter の1:7 希釈ストックを作製します。各ライゲーション反応に 2.5 μL の希釈 Illumina Adapter を使用します。以下の希釈例は、異なる反応数に対するもので、余剰分を含んでいます。
DNA サンプルが 1 ng を超える場合の Illumina Adapter の希釈例（1:7 希釈）
試薬

Option 2: DNA 量が 1 ng 未満の場合のアダプター希釈
1 ng 未満の DNA サンプルを使用する場合、ライゲーション反応に使用する前に Illumina Adapter の1:42 希釈ストックを作製します。各ライゲーション反応に 2.5 μL の希釈 Illumina Adapter を使用します。以下の希釈例は、異なる反応数に対するもので、余剰分を含んでいます。
DNA サンプルが 1 ng 未満の場合の Illumina Adapter の希釈例（1:42 希釈）
試薬・SPRI Beads
使用する 30 分前より室温に戻し、ボルテックスで 10 秒程度攪拌して使用してください。
重要:SPRI Beads は凍らせないように４℃で保管すること!

One-Tube End Repair
1.

End Repair 反応用に、200 μL の PCR チューブを準備する。

2.

断片化した二本鎖 DNA を 500 pg ~ 10 ng 準備する。

3.

サンプル準備（6 ページ）のセクションに従い、最終容量 39 μL のサンプル溶液を調製する。
重要:DNA サンプル溶液は 39 μL を超えないようにすること!

4.

表に記載された試薬を各 PCR チューブに添加する。
重要:サンプル、試薬は氷上または冷やしたアルミブロック上で常に冷やすこと!
試薬

容量5.

ピペットを上下に動かしながら、ピペッティングにより完全に混ぜ合わせる。

6.

PCR チューブにしっかりとキャップをする。

7.

素早くスピンダウンを行い、キャップ、チューブ側面の反応液を底に集める。

8.

下記の反応条件を設定したサーマルサイクラーを用いて反応させる。
重要:設定温度 12℃に到達したことを確認して PCR チューブを入れること!
サーマルサイクラー: 15 min at 12℃
15 min at 37℃
30 min at 72℃
Hold at 4 ℃

9.

直ぐに Illumina Adapter Ligation 反応へ進む。

Illumina Adapter Ligation
1.

素早くスピンダウンを行い、キャップ、チューブ側面の反応液を底に集める。

2.

サンプル準備（7 ページ）のセクションに従い、Illumina Adapter の希釈溶液を調製する。

3.

End Repair Reaction 溶液に、表に記載された試薬を添加する。
Note:PEG は粘性が高いため、PEG 添加後は、次の試薬を加える前に軽く混ぜ合わせます。
試薬容量

4.

ピペットを上下に動かしながら、ピペッティングにより完全に混ぜ合わせる。

5.

PCR チューブにしっかりとキャップをする。

6.

素早くスピンダウンを行い、キャップ、チューブ側面の反応液を底に集める。

7.

サーマルサイクラーを用いて、25℃で 15 分インキュベートする。（リッドの温度設定は OFF）

ライゲーション DNA の精製
55 μL の SPRI Beads を使用して、Illumina Adapter をライゲーションした DNA を精製します。
Note:４℃保管していた SPRI Beads を、使用する 30 分前に室温へ戻し、使用する前にボルテックスで 10 秒程度攪拌して使用します。
80%エタノールは用時調製したものを使用します。
重要:SPRI Beads は凍らせないように４℃で保管すること!
1.

ライゲーション反応液に SPRI Beads を 55 μL 加える。

2.

5~10 回程度、ピペッティングにより混ぜ合わせる。

3.

チューブを５分間、室温で反応させる。

4.

マグネット上にチューブを置き、10 分間ビーズを集める。

5.

上清を取り除き、廃棄する。

6.

下記の Wash 工程を２回くり返す。
a. マグネットスタンドに置いたまま、200 μL の 80%エタノールを加える。
b. 室温で 30 秒間インキュベートする。
c. 上清を吸引し、廃棄する。

7.

残留エタノールを蒸発させるため、チューブを室温で静置する。ビーズが光沢色から艶消し色に変わったら（2～5 分程度）、次のステップへ進む。

8.

PCR チューブをマグネットから外し、22 μL の TT Buﬀer を加えてビーズを再懸濁し、そのまま２分間放置する。

9.

再びマグネットスタンドへ PCR チューブを戻し、さらに 2 分間放置する。

10. ビーズから精製したライゲーション DNA 20 μL を新しい 200 μL PCR チューブへ移す。
Note:精製した DNA は、-20℃で保管することができます。

PCR Enrichment
i5 と i7 の情報については、Appendix を参照してください。また、各サンプルには、i5 と i7 アダプタ
ーの固有の組み合わせを使用してください。
1.

精製したライゲーション DNA 溶液へ、表に記載された試薬を添加する。
試薬容量

2.

5~10 回程度、ピペッティングにより完全に混ぜ合わせる。

3.

PCR チューブにしっかりとキャップをする。

4.

素早くスピンダウンを行い、キャップ、チューブ側面の反応液を底に集める。

5.

下記の反応条件を設定したサーマルサイクラーを用いて反応させる。
（リッド温度:105℃）
サーマルサイクラー: 2 min at 98℃ (LID: 105℃)
10 sec at 98℃
75 sec at 65℃
2 min at 65℃
Hold at 4 ℃

12 cyclesライブラリーの精製
37.5 μL の SPRI Beads を使用して、PCR により増幅した DNA ライブラリーを精製します。
Note:４℃保管していた SPRI Beads を、使用する 30 分前に室温へ戻し、使用する前にボルテックスで 10 秒程度攪拌して使用します。
80%エタノールは用時調製したものを使用します。
重要:SPRI Beads は凍らせないように４℃で保管すること!
1.

PCR 増幅 DNA ライブラリー反応液に SPRI Beads を 37.5 μL 加える。

2.

5~10 回程度、ピペッティングにより混ぜ合わせる。

3.

チューブを５分間、室温で反応させる。

4.

マグネット上にチューブを置き、10 分間ビーズを集める。

5.

上清を取り除き、廃棄する。

6.

下記の Wash 工程を２回くり返す。
d. マグネットスタンドに置いたまま、200 μL の 80%エタノールを加える。
e. 室温で 30 秒間インキュベートする。
f.

7.

上清を吸引し、廃棄する。

残留エタノールを蒸発させるため、チューブを室温で静置する。ビーズが光沢色から艶消し色に変わったら（2～5 分程度）、次のステップへ進む。

8.

PCR チューブをマグネットから外し、17 μL の TT Buﬀer を加えてビーズを再懸濁し、そのまま２分間放置する。

9.

再びマグネットスタンドへ PCR チューブを戻し、さらに 2 分間放置する。

10. ビーズから精製した DNA ライブラリー 15 μL を新しい 200 μL PCR チューブへ移す。
Note:精製した DNA は、-20℃で保管することができます。

クオリティーチェック、下流解析について
DNA ライブラリーは、Qubit® dsDNA HS を用いて定量することができます。また、TapeStation®
や、高感度 DNA ScreenTape アッセイにより、DNA ライブラリーのサイズ確認が可能です。
クオリティーチェックの後、イルミナシーケンサーを用いてシーケンスを実施します。シーケンスデータ解析時のデマルチプレックスを正確に行うためには、各サンプルに固有のバーコードが必要となりますのでご注意ください。

Appendix
プライマー・インデックス配列
i5 Index Primer
5´-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3´

i7 Index Primer
5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[i7]GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA*T-3´

DNA Index Primers Set 1 for Illumina® (Catalog No. 53221)

DNA Index Primers Set 2 for Illumina® (Catalog No. 53222)

備考と参考結果
本キット用いたシーケンスデータについては、Bowtie2 や BWA などの通常のアライメントパッケージを使用した解析を行うことができます。また、このキットは他社製品との比較検証などを実施し、良好な再現性を示すことを確認しています。
DNA Library Prep Kit for Illumina は、CUT&RUN や ChIP などの二本鎖 DNA を濃縮する多様なアッセイに互換性を持っており、500 pg ～ 10 ng の低濃度 DNA からシーケンス用 DNA ライブラリーを調製することができます。なお、500 pg 未満のテンプレートを使用することはお勧めしません。
これは、アダプターダイマーや PCR の重複が生じる可能性が高くなり、NGS シーケンスや下流のデータ解析に悪影響を及ぼす可能性があるためです。
本キットは、一本鎖 DNA（例えば、MeDIP 法から得られた DNA 産物など）との互換性はありません
のでご注意ください。

Fig.1
10 ng、1 ng、500 pg の大腸菌ゲノム DNA を超音波処理して得られた TapStation プロファイル

トラブルシューティングガイド
トラブル/疑問対処方法

TapeStation でのライブラリーが予想

150bp のバンドはアダプターの二量体から生じることが多い。インプット外に移動する。

量を増やし、PCR 増幅サイクルを最大 12 サイクルに保つようにする。

DNA が適切に断片化されない。断断片化の確認前に、イソプロパノール精製、ビーズクリーンアップ、カラ片化された DNA のソニケーションプロ

ム精製などの方法で DNA を精製する。

ファイルがブロード（低分子から高分断片化に使用した機器が製造元のパラメーターの範囲内で機能して子まで一様）または高分子である。

DNA の保管についていることを確認する。
ライブラリー作製後、サンプルはシーケンスを行うまで-20℃で保存することができる。

SPRI ステップにおけるエタノール洗浄

完全に再懸濁するためには、ビーズ溶液をピペッティングし続け、凝集後の不十分な懸濁体を分散させること。

関連製品
Dual Index Primers Set 1 (Cat. No. 53221) / Dual Index Primers Set 2 (Cat. No.
53222) for Illumina®
各インデックスプライマーセットは互いに異なる配列を有し、Illumina シーケンサーシステムのフローセルでそれぞれ最大 48 反応までのマルチプレックスが可能なため、合わせて最大 96 反応までのマルチプレックスが可能です。

テクニカルサポート
ご不明な点がございましたら、下記のアクティブ・モティフまで、電話またはメールにてお問い合わChina

日本

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せください。

Toll free:877 222 9543

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