染色体を伸長解析する

バイオチップの微細加工と応用

群馬大学 大学院理工学府 知能機械創製部門

教授

鈴木孝明

大学 MEMSSMALLs make big g als!

検索遺伝子解析の未開拓分野へのアプローチ

2

核染色DNAシーケンサ、DNAアレイ
DNA配列の断片化による情報取得
分解能

細かい
1bp = 0.34nm•遺伝性疾患•遺伝的多型•エピジェネティクス

1kbp 10kbp

DNAの観察部位が非観察部位に重なる

1Mbp 10Mbp

DNA伸張技術

粗い細胞から直接取り出し観察

DNAの伸張によって特異的部位の観察を容易とする

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als!

DNAを伸張することで高分解能化
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Takaaki SUZUKI

染色体伸張技術の従来法

3

処理能力
操作性
ターゲット領域
複数サンプルの評価・操作の簡単化

Meniscuson a glass slide

制御性

X. Michalet et al., Science,1997

EOF+−K. Terao et al.,J. Physics. Condensed. Matter. , 2006

Nanochannel
H. Barseghyan et al., Genome Medicine, 2017

Laser
K. Hirano et al., Appl. Phys. Lett., 2002

STM
C. Bustamante, Annu. Rev. Biophys. Chem., 1991

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Takaaki SUZUKI

提案方法：遠心力で染色体を伸ばす

4

Point
マイクロ凹凸構造（レコード盤の溝）
直径3cm

レコード盤によるイメージ映像
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Takaaki SUZUKI

細胞固定・染色体伸張固定の原理
末梢血細胞固定取り出し5伸張固定

可視化

顕微鏡

1. 細胞懸濁液の滴下
2. 遠心力により細胞を固定構造に固定
3. 溶解液による染色体の取り出し
回転中心

4. 遠心力（せん断力）により伸張
5. メッシュ構造上に物理吸着固定

細胞の固定から染色体の伸張までを1チップ上で実現

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マイクロ構造上に染色体を液中懸架させる

6
基板の回転によって複数の染色体を簡単な操作で伸張従来法における問題点
スライドガラス浸漬法
伸張染色体

スライドガラス

均等に整列

V字構造に固定された染色体

高い結合効率メッシュ構造の間をプローブが拡散
DNAの構造自由度が高い

プローブ DNAブロック

染色体全体が基板に張り付くため、DNAプローブの結合が難しい

特異的結合のみを検出

顕微鏡の焦点深度を用いた観察
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提案技術：3次元リソグラフィ

73Dリソグラフィ法

半導体製造

機械加工

（2次元10μm以下）（3次元100μm以上）

３Dマイクロ構造・ハイスループット・大面積加工
日本特許第5458241号、US Patent 8871433
文部科学大臣表彰・若手科学者賞（2015年）

1mm

1mm

100µm

50µm

1mm

50µm

20µm

50µm

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5µm

5µm

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微細構造のSEM像

850µm
細胞固定構造開口径：24μm

20µm
1mm

メッシュ構造
メッシュ高さ：25µm

射出成型で大量生産可能な別形状も設計済み
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回転数・濃度に対する細胞固定数の変化

9HeLa細胞 直径 10~15μm （DiI染色）
蓋なし

蓋なし蓋あり

固定構造
200µm

80

Number of trapped sample

Number of trapped sample

20
固定数減少

1002001000

Fluorescent beads (with cover)slope:0.035

1.7倍に上昇40

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Fluorescent beads
slope:0.0209

201.9倍に上昇
01000

Cell (without cslope:0.0078
2000

Sample concentration [number/ µl]

Spin speed [rpm]
回転数が大きいと遠心力が強くなり固定構造の上をビーズが通過しやすくなる

Cell (with cover)slope:0.0152

60

蓋によりデバイス回転時の流れが固定構造の穴部を通過しやすくなり固定数が上昇

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固定細胞数に対する伸張染色体バンド数10

メッシュ構造伸張染色体
固定構造 10µm

△○
蓋あり△

蓋なし

●

速度勾配が急になりせん断力が大きくなる
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als!

Chromosome stretching efficiency ［%］○新技術説明会 2021/9/14150

伸張染色体30µm○：At trapped structures with a cover●：At trapped structures without a cover△：At mesh structures with a cover

100

5030%増加
04000
5000
6000
7000
Spin speed for stretching ［rpm］
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チップ全体での伸張染色体

11HeLa細胞より抽出した染色体を、YO-PRO-1染色液により蛍光染色
滴下台

バンド間隔

伸張方向

1mm

チップの回転のみで複数染色体を同時に伸張固定
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染色体解析（FISH）による伸張長さ評価

12伸張染色体（DAPI染色）
U励起

CENプローブ
B励起

MYCプローブ
G励起

マージ像

myc遺伝子
全長：291kbp (98.94 µm)
役割：遺伝子情報の転写を抑制する
特徴：変異すると細胞が癌化する
プローブ結合時間：1時間

MYC/CEN-8 FISH Probe Mix （Dako社）
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als!

平均SD
新技術説明会 2021/9/1430µm

伸張長さ [μm] 伸張長さ割合[%]
858661628384
40407373
68
69
16.6
16.9
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分析時間

13FISHプローブミックスを用いて染色体の特異部位の観察
Number of hybridization site

6Meshcell

510μm

MYC4mesh3CEN210wall

135

Hybridization time [hour]

flat

細胞の固定から染色体解析までを1チップ上で短時間で行うことが可能

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想定される用途

14

当該技術の特徴• DNAを断片化せず（インタクト）に、染色体の特定部位の長さを可視化• ゲノム全体の配列決定ではなく、特定遺伝子の迅速検出• 使い捨て可能なチップを卓上遠心するだけの簡易操作想定される用途• 染色体異常検出：転座• テロメア長計測：遺伝子年齢、老化• その他：ウイルス特定、食品衛生管理、生態系保全・・・
転写成型使い捨てチップ
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想定される用途①15

臨床診断における特異部位（転座）の観察

myc遺伝子：291kbp (98.94µm)

従来法：nuc ISH遠い（転座）
理想 陰性
正常な細胞核高尤度 陽性例 腫瘍細胞中のMyc 遺伝子

提案法：ファイバー FISH

偽陰性

遠い!
陽性だった！

DNA fiber
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als!

近い? 遠い?

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想定される用途②

16

テロメア長（ヒト：5～15 kbp, 1.7～5.1 μm）測定（遺伝子年齢、老化、ガン化）
Q-FISH法

サザンブロット法

Harley,C.B et al.,Nature,345,458-460,1990.

フローサイトメトリー法

Lansdorp,P.M et al.,Hum.Mol.Genet.,5, 685-691,1996.

T.Nishimura et al.,Cell Stem Cell.,12,114-126,2013.

サザンブロット法

Q-FISH法

フローサイトメトリー法

提案法

△×○○

簡易性（測定・評価）（画像解析）（蛍光画像解析）（蛍光画像解析）（蛍光画像解析）

再現性

×○

○

○

正確性×○

○

○

必要細胞数

106個以上105個程度

105個程度

105個程度

評価方法

絶対評価

相対評価

相対評価

絶対評価

簡易性や再現性において信頼できる絶対評価法が求められている

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実用化に向けた課題と企業の皆様への期待

17

再現性向上
•
•

チップ構造の最適化
親水化処理（材料検討）

材料メーカー、加工メーカーとの新材料や表面処理に関する共同研究

応用例の構築（基礎医学研究⇒臨床応用検討）•••

染色体異常検出：転座
テロメア長計測：遺伝子年齢、老化、ガン化
その他応用探索：ウイルス特定、食品衛生管理、生態系保全・・・
遺伝子検査関連企業（製造・販売・受託試験）との共同研究やライセンス想定ユーザー（基礎実験ツール、応用探索）との共同研究

キットの開発• 様々な種類のサンプルからのDNA抽出と精製（迅速・簡易）• DNAプローブなどのラベリング• データ収集と解析• 製造、販売（ラボツールレベル～）バイオ・検査機器・実験機器の製造メーカーとの共同研究やライセンス

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本技術に対する知的財産権

18

・発明の名称 ： 直鎖状化合物伸長用基板および方法
・特許登録番号： 特許第5661984号
・特許権利者 ： 群馬大学
・発明者

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SMALLsmakebig
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： 鈴木孝明、福家有子

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産学連携の経歴（公的助成に関係した例のみ）
年
度

2004

職歴

京都大学
助手・助教

科研費
以
外の公的助成20052006

20072008

2009201020
11201220
132014

香川大学
准教授

JST育成研究

NEDO

19201520162017

群馬大学
准教授

産業技術研究助成

MEXT
ﾅﾉﾃｸﾌﾟﾗｯﾄ

20182019202020212022

群馬大学
教授

JST
さきがけ

JST
CREST

JST
ｼｰｽﾞ発掘

A社
バイオマイクロデバイス
共同開発

B社
露光技術
共同研究

C社
MEMS材料
材料評価研究実施中

複数社
D社
MEMS加工MEMS加工研究開発支援＆技術相談/相談 共同研究

微細加工、MEMSデバイス開発：共同研究、ライセンス、支援、相談、いずれも経験あり

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お問い合わせ先20

群馬大学 産学連携・知的財産活用センター〒376-8515 群馬県桐生市天神町１－５－１
TEL 0277－30－1171～1175
FAX 0277－30－1178
e-mailtlo@ml.gunma-u.ac.jp

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