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PRODUCT INFOMATION

商品名 : DynaMarker® DIG Labeled Blue Color Marker for Small RNA(旧名称： DynaMarker® Colored DIG Marker for Small RNA)
商品コード : DM270
分子量範囲 : 20 - 100 bases
容量 : 125 μl (5 μl × 25 loadings)
保存温度 : -20℃base

特徴 :本製品は 20～100 bases の分子量範囲の 6 本の色素修飾された DIG 標識核酸バンド(青色)で構成されています。
変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動における泳動のモニタリ
ングやノーザンブロッティングにおける抗 DIG 抗体を用いた検出にご使用いただけます。
各バンドの見かけ分子量は天然 RNA と 95%の精度で一致します(表 1)。本マーカーは変性剤の添加や加熱処理は必要なく、そのまますぐにお使いいただけます。

100－75－50－40－30－20－DynaMarker®

DIG Labeled Blue Color Marker for Small RNA
図 1. 本製品 (5 μl) の電気泳動象(7.5M 尿素含有 15 %ポリアクリルアミドゲル / 1 × TBE)

保存バッファー組成 :2 mM Tris-HCl (pH8.0), 8mM EDTA, 78 % Formamide
品質検定 :
本マーカーを 37℃、24 時間インキュベートし、7.5M 尿素含有 10%アクリルアミドゲル電気泳動にて分解が見られないことを確認しております。
推奨使用量 :

5 - 10 μl

電気泳動条件 :本製品は 10～15%尿素変性アクリルアミドゲル(1×TBE)にてご使用ください。この条件以外では正確な見かけ分子量で各バンドが分離されない可能性があります。
注意 :電気泳動による、より正確な分子量の決定には天然 RNA で構成される以下の分子量マーカーをご使用ください。
DynaMarker®
Small RNA II (code# DM192)DynaMarker®
Small RNA II Easy Load (code# DM197)-1–ver. 1.0

PRODUCT INFOMATION+ 75 base RNA

DynaMarker®

Small RNA II

アクリルアミド濃度

10 %

15 %

100 base

103.9 %

101.3

75*104.8

100.650102.5

101.6

40103.0

100.5

3099.6104.5

20100.0102.8

表 1．DynaMarker® Small RNA II との移動度一致率（*75 base RNA は DynaMarker® Small RNA II に後から添加。DynaMarker® Small RNA II には含まれておりません。）

検出感度 :
本製品は抗 DIG 抗体を用いた化学発光検出（例えば CDP-star®*1 などの発光基質を用いた）にご使用いただけます。検出感度はハイスピードインスタントフィルム、X 線フィルム、化学発光検出器などの検出装置に依存します。次に一例を示します。

125 min

12Film: Fujifilm FP-3000B*2
instant black & white film
露光: 5 - 10 分、室温

Lane 1This Marker (5 μl)

Lane 2

MCF-7 total RNA (5 μg)

10 min15 % acrylamide - 7.5 M Urea / 1 × TBE

図 2. DynaMarker® DIG Labeled Blue Color Marker for Small RNA と hsa-miR-21 の検出
本製品(5 µl)と MCF-7 トータル RNA(5 µg)を電気泳動後、ナイロンメンブレンへブロッティングを行いhsa-miR-21 に対する DIG 標識 DNA プローブ(2.5 nM)をハイブリダイズさせた。その後 DNA プローブをアルカリフォスファターゼ修飾抗 DIG 抗体および CDP-star®で検出した。

*1: CDP-star® is a trademark of Tropix, Inc.
*2: FP-3000B is a product of Fujifilm Corp.

-2–ver. 1.0

PRODUCT INFOMATION

推奨使用方法 :本製品は電気泳動のモニタリングおよびメンブレンへのトランスファー効率の確認に適しています。
以下は実験の一例です。
・電気泳動およびメンブレンへのトランスファー
1) 7.5M 尿素含有 12.5%ポリアクリルアミドゲルの調製
40 % acrylamide : bis solution
Urea
10 × TBE
H2O

6.25 ml
9.0 g
2.0 mlto 20 ml

尿素が完全に溶解したら、TEMED を 20 μl および 10%過硫酸アンモニウム(10% APS)を 160 μl 添加し速やかに混合します。その溶液をスラブゲルガラスプレート間に流し込み、コームをセットします。
2) 電気泳動
ご使用前に本製品が完全に融解していることを確認してください。
変性処理したお手持ちの RNA サンプルおよび本製品を 5µl アプライします。そして 1×TBE を電気泳動バッファーとし、200V で電気泳動を行います。
3) メンブレンへの転写
3-1) ポジティブチャージナイロンメンブレンおよび複数枚のブロッティングペーパーをアクリルアミドゲルよりも少し大きめに用意し、0.5×TBE に浸します。
3-2) ブロッティングペーパー2 枚をブロッティング装置の陽極側に置きます。
3-3) ブロッティングペーパーの上にナイロンメンブレンを重ねます。
3-4) メンブレンの上に泳動したアクリルアミドゲルを載せます。その際、メンブレンとゲルの間の気泡を上から押さえつけるようにして押し出します。
3-5) ブロッティングペーパー2 枚をゲルの上に載せ、ブロッティング装置の陰極をセットします。
3-6) 2 mA/cm2 で 30～60 分通電します。
3-7) マーカーがメンブレンへ転写されていることを確認したのち、メンブレンを 2×SSC バッファーで洗浄します。
3-8) UV クロスリンカーで RNA をメンブレンに固定します。
3-9) ノーザンハイブリダイゼーション実験を行います。

参考文献:
・ Joseph Sambrook, and David W. Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press.
・ Frederick M. Ausubel, Roger Brent, Robert E. Kingston, David D. Moore, J. G. Seidman, John A. Smith,and Kevin Struhl (1994－) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.
・ Sang Woo Kim, Zhihua Li, Patrick S. Moore, A. Paula Monaghan, Yuan Chang, Mark Nichols and BinoJohn (2010) A sensitive non-radioactive northern blot method to detect small RNAs. Nucleic Acids
Research. 38(7): e98-3–ver. 1.0

PRODUCT INFOMATION(1) (2)(3)

Hybridization

Transfer※ハイブリダイゼーションバッファー中でナイロンメンブレン

インキュベーションすると本マーカーの12.5 %尿素変性アクリルアミドゲル

青色バンドは薄くなります。

図 3. 左: 7.5M 尿素含有 12.5%ポリアクリルアミドゲル(1×TBE)電気泳動象(1) 本マーカー, 5 µl (2) Human Breast total RNA, 5 µg
(3) Breast Adenocarcinoma (MCF-7) total RNA, 5 µg
中央: トランスファー後のナイロンメンブレン
右: hsa-miR-21 および has-miR-16 に対する DIG 標識 DNA プローブとハイブリダイゼーショ
ンバッファー中でインキュベーション

Detection

ナイロンメンブレン

miR-21

miR-16(露光: 10 min)

図 4. hsa-miR-21 and hsa-miR-16 の検出
has-miR-21 および has-miR-16 のそれぞれの DNA プローブをアルカリフォスファターゼ修飾抗 DIG 抗体で検出した。

-4–
ver. 1.0