プロトコル細 胞
増殖 / 毒性酸化
ストレス
分 子
生物学
細 胞 内蛍光プローブ細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用
試
薬
膜タンパク質可 溶 化 剤ラベル化 剤
二価性
試 薬
イオン
電 極
その他
機能性有機材料

DNA を取り出したい3) 室温に 2 分間静置後、RNase solution 2μl を加える。直ちに 10 秒間 vortex もしくは転倒混和し、室温に 2 分間静置する。
(写真 C)

使用製品
Get pure DNA Kit-Cell,Tissue[GK03]I はじめにゲノム解析法の一つであるサザンブロット法、ゲノムライブラリーの作製および PCR には、高純度のゲノム DNA を簡便かつ短時間に抽出することが求められる。Get pure DNA Kit-Cell,
Tissue は、①細胞・動物組織細胞を溶解する、②溶解液からRNA およびタンパク質を除く、③エタノール沈殿により DNA を回収する、という 3 ステップで、培養細胞および動物組織から高純度のゲノム DNA を簡便に抽出できる。また、多量のサンプルからゲノムを抽出する際は、各試薬を比例倍量使用することにより対応可能である。本キットは、フェノール / クロロホルム、スピンカラムを必要としない。抽出した DNA は制限酵素反応、PCR 反応等にそのまま使用できる。

C4) Precipitation solution I 100 μl を加え、転倒混和もしくは 5 秒間 vortex する。
Precipitation solution I を添加すると溶液は白濁する。
(写真 D)

D
5) Precipitation solution II 100 μl を加え転倒混和もしくは 5 秒間 vortex 後、室温に 2分間静置する。
Precipitation solution II を添加すると溶液はさらに白濁する。
(写真 E)

II 細胞または動物組織からの DNA 抽出
1. キット内容・Lysis buffer・Proteinase K solution
・RNase solution
・Precipitation solution I
・Precipitation solution II110 ml×1
1.05 ml×2
0.5 ml×1
22 ml×122 ml×1

2. キット以外に必要な試薬・機器類
・エタノール (100%、70%)
・PBS( 細胞サンプルを処理する場合 )・1.5 ml 遠心チューブ・マイクロピペット及びチップ・遠心分離機
・ボルテックスミキサー
・65℃恒温槽
・ホモジナイザー ( 動物組織を処理する場合 )3. 操作方法

6EFG

7

細胞 3 × 10 ～ 1 × 10 cells を処理する場合
1) 細胞懸濁溶液を 1.5 ml 遠心チューブに入れる。200 x g、5 分間遠心分離後上澄みを除く。
PBS 500 μl で細胞を懸濁洗いした後、200x g、5 分間遠心分離し上澄みを除去する。
細胞ペレットを一旦 vortex(5 秒間 ) すると次の溶解操作が容易になる。
(写真 A)A 2) Lysis buffer 500 μl および Proteinase K

Bsolution 10 μl を添加し、細胞ペレットが溶解するまでピペッティングする。細胞ペレットが完全に溶解したら 65℃で 10分間インキュベートする。ピペッティン
グ開始直後、サンプル溶液の粘度が上昇するが、ピペッティング操作を続けることで粘度は減少する。高粘度状態がなくなるまでピペッティング操作を続ける (3～ 5 分程度)。(写真 B)

6) 13,000 x g 以上で 5 分間遠心分離し、上澄
みをピペットで新しい 1.5 ml チューブに移す。
不溶物をピペットで吸引しないよう注意する。上澄みに沈殿物が混入している場合は、再度遠心操作を行って下さい。
(写真 F)
7) 上澄みと同量のエタノールを加え転倒混
和もしくは 5 秒間 vortex する。
(写真 G)

8) 2,500 x g で 2 分間遠心分離し、上澄みをピペットで除去する。
高回転、長時間の遠心は、DNA ペレットの溶解に長時間を要する原因となる。上澄みをピペットで除去する際に、DNA ペレットを吸い込まないよう注意する。
(写真 H)

H

9) DNA ペレットに 70% エタノールを 1 ml加え転倒混和もしくは vortex 後、2,500 x
g で 2 分間遠心分離し上澄みをピペットで除去する。
高回転、長時間の遠心は、DNA ペレットの溶解に長時間を要しますので注意する。
上澄みをピペットで除去する際に、DNAペレットを吸い込まないよう注意する。
I(写真 I)
10) DNA ペレットを TE buffer (10 mmol/lTris、1 mmol/l EDTA) 等に溶解する。
(写真 J)

J73

技術的な内容に関するお問い合わせ先：カスタマーサポート Free Fax:0120-021557 Free Dial:0120-489548
在庫や価格(記載容量以外もしくは request)に関するお問い合わせ：マーケティング部 Tel:096-286-1515 Fax:096-286-1525(株)同仁化学研究所

プロトコル

動物組織 25 ～ 30 mg を処理する場合
1) 動物組織 25 ～ 30 mg を秤量し 1.5 ml 遠心チューブに入れ、Lysis buffer 400 μl および Proteinase K solution 10 μl を添加する。
2) 55℃で組織が完全に溶解するまでインキュベートする。30分毎にサンプル溶液をピペッティングもしくは vortex する。
完全に溶解するのに 2 ～ 3 時間要する。溶解時間は使用する組織により異なるが、通常 2 ～ 3 時間である。30 分毎にサンプル溶液をピペッティング、あるいは vortex することにより、溶解時間を短縮できる。ホモジナイザーを使用する場合は、Step1 でサンプルに Lysis buffer 400 μl およびProteinase K solution 10 μl を添加後ホモジナイズし、65℃、10 分間インキュベートする。
3) サンプル溶液を室温に 2 分間静置後、RNase solution 2 μlを加える。直ちに 10 秒間 vortex もしくは転倒混和し、室温に 2 分間静置する。
4) Precipitation solution I 80 μl を加え、転倒混和もしくは 5 秒間 vortex する。Precipitation solution I を添加すると溶液は白濁する。
5) Precipitation solution II 80 μl を加え、転倒混和もしくは5 秒間 vortex し、室温に 2 分間静置する。Precipitation
solution II を添加すると溶液はさらに白濁する。
6) 13,000 x g 以上で 5 分間遠心分離し上澄みをピペットで新しい 1.5 ml 遠心チューブに移す。不溶物をピペットで吸引しないよう注意する。上澄みに沈殿物が混入している際は、再度遠心操作を行う。
7) 取り出した上澄みと同量のエタノールを加え、転倒混和もしくは 5 秒間 vortex する。
8) 2,500 x g で 2 分間遠心分離し、上澄みをピペットで除去する。高回転、長時間の遠心は、DNA ペレットの溶解に長時間を要する原因となる。上澄みをピペットで除去する際に、DNA ペレットを吸い込まないよう注意する。
9) DNA ペレットに 70% エタノールを 1 ml 加え転倒混和もし
くは 5 秒間 vortex 後、2,500 x g で 2 分間遠心分離し上澄みをピペットで除去する。高回転、長時間の遠心は、DNA ペレットの溶解に長時間を要する原因となる。上澄みをピペットで除去する際に、DNA ペレットを吸い込まないよう注意する。
10) DNA ペレットを、TE buffer (10 mmol/l Tris、1 mmol/lEDTA) 等に溶解する。
表 1 に上記操作によって得られる例を示す。図 1 に抽出した DNAとその制限酵素消化反応後の電気泳動の例を示す。
表 1 細胞、組織からの DNA 回収量とその純度の例
サンプル回収量 ( μ g)
A 260/A280
7HeLa cell
(1×10 cells)
80 〜 120
1.7 〜 1.98
HeLa cell(1×10 cells) 1,000 〜 1,500 1.7 〜 1.97
HL60 cell(1×10 cells)
40 〜 60
1.7 〜 1.9
8
HL60 cell(1×10 cells)
500 〜 900
1.7 〜 1.9
mouse liver(25 〜 30 mg)
40 〜 100
1.7 〜 1.9
mouse brain(25 〜 30 mg)
20 〜 40
1.7 〜 1.9
mouse kidney (25 〜 30 mg)
50 〜 60
1.7 〜 1.9
mouse heart(25 〜 30 mg)
20 〜 25
1.7 〜 1.9
mouse tailrat liverrat brain
rat kidney
rat heart
rat tail(25 〜 30 mg)
(1 g)
(1 g)
(1 g)
(0.8 〜 0.9 g)(10 cm)40 〜 60
2,000 〜 2,500
600 〜 800
1,800 〜 2,300
600 〜 800
2,500 〜 3,5001

図2

2 3 4 5 6 7 8 9

マウス組織から抽出した DNA とその制限酵素消化反応
後の電気泳動写真
Lane 1: λ /Hin d III
Lane 6-9: mouse kidney
Lane 3, 7: Bam H I digested
Lane 5, 9: Pst I digested

Lane 2-5: mouse heart
Lane 2, 6: undigested
Lane 4, 8: Eco R I digested

4. 注意事項
1) Precipitation solution I は、多少濁っている場合もあります
が、DNA の抽出には影響ありません。
2) Precipitation solution I および II は、一旦開封するとボトルの口に白い結晶が析出する場合がありますが、DNA の抽出操作には影響ありません。また、RNase solution も濁っている場合がありますが、そのまま使用しても影響はありません。
3) 遠心チューブの種類により、10,000 x g 以上の遠心が不可能な場合は、遠心時間を延長し、その遠心チューブの許容最高速度で遠心分離して下さい。
4) Lysis buffer は 20℃以下になると 2 層に分離、あるいは沈殿を生じることがあります。沈殿が生じた場合は 40 〜50℃で加温し、完全に溶解してから使用して下さい。また、開封後は室温で保存し、使用前に転倒混和して下さい。
5) エタノール沈殿後など完全に上澄みを除去するために、除去の最終段階では、最小容量マイクロピペット (＜ 20 μl) をご使用下さい。
6) 細胞からの抽出の際、Lysis buffer, Proteinase K solution を添加後、インキュベートする前に細胞ペレットが完全に溶解するまでピペッティングして下さい。
7) 組織からの抽出の際、ホモジナイザーを使用する場合は、サンプルに Lysis buffer, Proteinase K solution を添加後、ホモジナイズして、65℃、10 分間インキュベートして下さい。

1.7 〜 1.9
1.7 〜 1.9
1.7 〜 1.9
1.7 〜 1.9
1.7 〜 1.9
1.7 〜 1.9

技術的な内容に関するお問い合わせ先：カスタマーサポート Free Fax:0120-021557 Free Dial:0120-489548
在庫や価格(記載容量以外もしくは request)に関するお問い合わせ：マーケティング部 Tel:096-286-1515 Fax:096-286-1525(株)同仁化学研究所

74

細 胞
増殖 / 毒性酸化
ストレス
分 子
生物学
細 胞 内
蛍光プローブ細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用
試
薬
膜タンパク質可 溶 化 剤
ラベル
化 剤
二価性
試 薬
イオン
電 極
その他
機能性
有機材料