プロトコル
細 胞
増殖 / 毒性酸化
ストレス分 子生物学
細 胞 内蛍光プローブ細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用
試
薬
膜タンパク質可 溶 化 剤ラベル化 剤
二価性
試 薬
イオン
電 極
その他
機能性
有機材料

タンパク質を定量したい
解析装置

使用製品
-Proteostain- Protein Quantification Kit-Rapid[PQ01]-Proteostain- Protein Quantification Kit-Wide Range[PQ02]I はじめに

4. BCA 法

試料中のタンパクの定量法としてこれまで様々な方法が開発され、また実用化されている。例えばタンパク質濃度を直接吸光度から求める吸光光度法、Biuret 試薬を用いた Biuret 法、
フェノール試薬と Biuret 法を組み合わせた Lowry 法、1 級アミンと反応する蛍光試薬を用いた蛍光法、色素のメタクロマジーを利用した Bradford 法などが知られている。まずそれぞれについてその原理および長所短所について概説する。

1. 吸光光度法
原理：タンパク質は主にチロシンやトリプトファンに起因して280 nm 付近に吸収極大を示す。その吸収からタンパク質濃度を算出する。タンパク質の種類によりチロシンやトリプトファンの含量が異なるので 280 nm における吸光度 (A280) は変動するが、一般に 1 mg/ml の濃度の時、A280 は 1.0 として概算する。A280/A260 ＜ 1.5 の時は核酸の混入が考えられるので他の方法を検討する必要がある。
長所：操作が簡便であり、測定後サンプルの回収が可能である。
また、クロマトによる精製時に検出器を連結しておくと、連続的にタンパク質の溶出をモニターすることができる。
短所：タンパク質の種類により吸光度が変わる。また 280 nmに吸収を持たないタンパク質(コラーゲン、ゼラチンなど) は測定できない。紫外部に吸収を持つ物質の混入は定量を妨害する。

2. Biuret 法

2+原理：タンパク質をアルカリ性条件下で Cu 溶液と反応させ2+ると、赤紫色を呈する。これはアルカリ条件下で Cuがポリペプチド鎖中の窒素原子と錯体を形成することで発色する、いわゆる Biuret 反応を利用したものである。
硫酸銅と酒石酸カリウムナトリウム塩をアルカリ溶液に溶かした試薬 (Biuret 試薬) を試料に加え 540 nm の吸光度を測定する。
長所：タンパク質の種類による発色率の差が少ない。操作が簡単である。
短所：感度が低く、低濃度試料には向かない。高濃度のトリス、アミノ酸やアンモニウムイオンなどは発色に影響を与える。

3. Lowry 法
原理：リンモリブデン酸とリンタングステン酸を酸性溶液に溶解したフェノール試薬 (Folin 試薬とも言う) は、アルカリ性でタンパク質中のチロシン、トリプトファンおよびシステインと反応して青色を呈する (A750)。この反応にBiuret 反応を加えたものが Lowry 法である。ペプチド結合に由来する発色効果が強く表れるため Biuret 法よりはるかに感度が高く、5～100 μ g/ml の範囲で測定することが可能と言われている。
長所：感度が高く、最も一般に使用されている方法である。
短所：還元反応によって呈色しているので、還元物質により発色が妨害される。操作が煩雑で測定までに時間がかかる。タンパク質によって発色率に差がある。

141

プレート
プレート
リーダー
リーダー

2＋

原理： Cu はアルカリ性溶液中で、タンパク質の量に応じて＋＋Cu に還元される。ビシンコニン酸は還元された Cuと選択的に錯体を形成して赤紫色に呈色するため、この錯体の 560nm 吸光度を測定することによって間接的にタンパク質を定量することができる。測定範囲は 1 ～2,000 μg/ml である。
長所：操作が簡便であり、高感度である。また界面活性剤や緩衝剤の影響を受けにくいため、汎用性が高い。
短所：還元物質やキレート剤の影響を受けやすい。

5. 蛍光法

原理：フルオレスカミン (Fluorescamine) はそれ自体では蛍光を発しないが、1 級アミンと反応することにより 495nm に蛍光を発する (励起 : 395 nm)。その蛍光強度を測定することによりタンパク量を求めることが出来る。
長所：試料が少量でよい。また試料にフルオレスカミンの溶液を添加するだけで良いので非常に操作が簡単である。
短所：濃度が濃い場合、蛍光のクエンチングが起こり正確な値が出ない場合がある。また、トリスなどのアミン系試薬により測定が妨害される場合がある。

6. Bradford 法
原理：Bradford 法は、酸性溶液中、トリフェニルメタン系青色色素の Coomassie Brilliant Blue G-250(図 1) がタンパク質と結合することで、最大吸収波長が 465 nm から595 nm にシフトすること(メタクロマジー) を利用してタンパク質を定量する方法である。吸収波長のシフトは色素とタンパク質との疎水性相互作用およびイオン相互作用に基づいている。
長所：操作が非常に簡単である。
短所：タンパク質の種類により発色率に差がある。また界面活性剤の混入により発色が妨害される。

7. WST 法
原理：還元発色剤である水溶性テトラゾリウム塩を用いた方法である。WST-8 は小社が開発した水溶性テトラゾリウム塩であり、タンパク質によって容易に還元され、WST-8 formazan を生成する。このホルマザンはアルカリ水溶液中で青色に呈色するため、このホルマザンの650nm 吸光度を測定することによってタンパク質を定量することができる。測定範囲は 50 ～ 5,000µg/ml である。
長所：操作が簡便であり、測定範囲が広い。界面活性剤の影響を受けにくい。
短所：タンパク質の種類により発色率に差がある。また還元物質の影響を受けやすい。
+

その他タンパク質によって還元されて生じた Cu を Bicinchoninicacid で定量する BCA 法や、糖タンパク質によるテトラゾリウム塩からホルマザンへの還元反応を利用した定量方法などがある。
次に、具体的な方法として小社タンパク定量キットの使用方法について示す。

技術的な内容に関するお問い合わせ先：カスタマーサポート Free Fax:0120-021557 Free Dial:0120-489548
在庫や価格(記載容量以外もしくは request)に関するお問い合わせ：マーケティング部 Tel:096-286-1515 Fax:096-286-1525(株)同仁化学研究所

プロトコル6) 各ウェルの吸光度からブランク (BSA : 0 μ g/ml) の吸光度を差し引く。
7) 横軸に BSA の濃度を取り、BSA 希釈溶液の吸光度から検量線を作成する(図 4)。
8) 検量線を基にサンプルのタンパク質濃度を算出する。

ONHNa+-O S
3+SO3-NN

図 1 Coomassie Brilliant Blue G-250 の構造

II Protein Quantification Kit-Rapid (Code: PQ01)を使用した方法

0.8b)

0.6
0.40.2c) CBB solution 300 μl を各ウェルに加える。

0500600700800

図 2 Coomassie Brilliant Blue G-250 の吸収スペクトルa) タンパク質なし b) BSA (500 μ g/ml) 存在下
本キットは Bradford 法を応用した方法であり、高感度かつ迅速にタンパク質を定量することが可能である。
Coomassie Brilliant Blue G-250 はタンパク質に作用し、酸性条件で青色に呈色する(λmax =595 nm)(図 2)。しかも呈色反応は 1 分以内に終了し、生じた色素は 30 分以上安定である。従ってこの方法を使うことにより数分でタンパク質の定量を行うことができる。
定量できるタンパク質の濃度範囲は Standard 法で 10 μ g/ml～2,000 μ g/ml、Micro 法で 1 μ g/ml～50 μ g/ml である。

1. キット内容

CBB solution
Standard BSA solution (4,000 μ g/ml)

2. 操作方法(1) Standard 法
1) Standard BSA solution を純水で順次 1/2 に希釈して 0～2,000 μ g/ml の BSA 希釈溶液を調製する(図 3)。
100 μ l100 μ l100 μ l0.80.6

その他

0.4

機能性
有機材料

0.200500

1,000

1,500

2,000

Concentration of BSA ( μ g/ml)
図 4 Standard BSA solution で作成した検量線 (standard 法)(2) Micro 法[この方法は精製されたタンパク質にのみ適用される。]
1) Standard BSA solution を純水で順次 1/2 に希釈して 0～50μ g/ml の BSA 希釈溶液を調製する(図 5)。100 μ g/ml BSA はStandard BSA solution (4,000 μ g/ml) 30 μ l を純水で 300 μl に希釈し (400 μ g/ml)、更にその溶液 250 μ l を純水で 1 mlに希釈して調製する。
500 μ l500 μ l1/41/8500 μ l500 μ l100 μ l100 μ g/ml BSA 500 μ l

4,000 μ g/ml BSA 100 μ l

ddH2O 500 μ l

ddH2O 100 μ l

1/21/21/41/81/16

4,000 μg/ml の Standard BSA solution を純水で順次 1/2 に希釈し、2,000、1,000、500、250、125、63、32、0 μ g/ml の BSA 希釈溶液を調製する。

図3d) プレートリーダーを使用して吸光度を測定する。

1.0

Wavelength/ nm

Absorbance at 595 nm

Absorbancea) Standard BSA solution より b) CBB solution をリザーバーに移す (8 連ピペッター使用時 )。
BSA 希釈溶液を調製する。

a)Standard BSA の調製法

2) 1) で調製した各濃度の検量線用 BSA 希釈溶液、またはサンプ
ル 6 μ l を各ウェルに加える。n=3 で測定することが望ましい。
3) CBB solution 300 μ l を各ウェルに加える。O.D. 測定時に影響するので加える際には液が泡立たないように注意する。
4) 室温で 1 分間静置する。
5) プレートリーダーを使用して 570〜600 nm の吸光度を測定する。

細 胞
増殖 / 毒性酸化ストレス分 子生物学
細 胞 内蛍光プローブ細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用
試薬
膜タンパク質可 溶 化 剤ラベル化 剤
二価性
試 薬
イオン
電 極

1/16

100 μ g/ml の Standard BSA solution を純水で順次 1/2 に希釈し、50、25、12.5、6.3、3.2、1.6、0.8、0 μ g/ml の BSA 希釈溶液を調製する。

図5

Standard BSA の調製法

2) 1) で調製した各濃度の検量線用 BSA 希釈溶液、またはサンプル 150 μ l を各ウェルに加える。n=3 で測定することが望ましい。
3) CBB solution 150 μ l を各ウェルに加え混合する。
4) 室温で 30 秒～1 分間プレートを揺り動かし、良く混合する(プレートリーダーに振とう機能がついていればそれを利用しても良い)。

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142

プロトコル

その他
機能性
有機材料

1.0
2.00.8Absorbance at 595 nm

Absorbance at 595 nm

細 胞
増殖 / 毒性
酸化
ストレス
分 子
生物学
細 胞 内
蛍光プローブ細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用
試
薬
膜タンパク質可 溶 化 剤
ラベル
化 剤
二価性
試 薬
イオン
電 極

0.60.40.20020406080

100

Concentration of BSA ( μ g/ml)

5) プレートリーダーを使用して 570 〜 600 nm の吸光度を測定する。
6) 各ウェルの吸光度からブランク (BSA : 0 μ g/ml) の吸光度を差し引く。
7) 横軸に BSA の濃度を取り、BSA 希釈溶液の吸光度から検量線を作成する。(図 6)8) 検量線を基にサンプルのタンパク質濃度を算出する。
＊ Micro 法では界面活性剤の影響を大きく受けるので、表 1 にある阻害物の影響を十分考慮し、阻害作用が大きい場合には、その除去操作を施す。

(3) セル法[分光光度計を用いて測定を行う場合は以下のプロトコールに従って測定する]
1) Standard BSA solution を純水で順次 1/2 に希釈して 0～2,000 μ g/ml の BSA 希釈溶液を調製する。(図 7)
150 μ l1.00.500500150 μ l

150 μ l4,000 μ g/ml BSA 150 μ l

ddH2O 150 μ l1/41/8

1/16

4,000 μg/ml の Standard BSA solution を純水で順次 1/2 に希釈し、2,000、1,000、500、250、125、63、32、0 μ g/ml の BSA 希釈溶液を調製する。

図7

Standard BSA の調製法

2) 1) で調製した各濃度の検量線用 BSA 希釈溶液、またはサンプル 100 μ l を加え、混合する。
3) CBB solution 2.5 ml を試験管に入れる。
4) 室温で 30 秒～1 分間試験管を振って、良く混合する。
5) 反応溶液を分光光度計用のセル (1 cm × 1 cm) に移し替え、600 nm の吸光度を測定する。
6) 測定された吸光度からブランク (BSA : 0 μ g/ml) の吸光度を差し引く。
7) 横軸に BSA の濃度を取り、BSA 希釈溶液の吸光度から検量線を作成する ( 図 8)。
8) 検量線を基にサンプルのタンパク質濃度を算出する。

143

1,500

2,000

3. タンパク種による変動

このキットは検量線用のタンパク質として BSA を用いているが、すべてのタンパク種に対し、この検量線を使うことはできない。タンパク種による感度の変動を下に示す。

Protein

BSA
Chymotrypsinogen A
Transferrin
Human IgG

Protein/BSA
10.67
1.020.96a)a) 各検量線の傾きの比を示す

4. 阻害物質の影響
このキットの測定原理はタンパク質の疎水性部位との相互作用を利用しているため、界面活性剤は正の誤差を生じ、その他の物質も高濃度であれば誤差を生じる。表 1 に標準法においての測定に影響を及ぼさない阻害物質の最大濃度を示す。
表1

1/2

1,000

Concentration of BSA ( μ g/ml)
図 8 Standard BSA solution で作成した検量線(セル法)

図 6 Standard BSA solution で作成した検量線(micro 法)

150 μ l1.5

測定に影響を及ぼさない阻害物質の最大濃度 *Chemical
Detergent
Brij 35
Brij 56
Brij 58
Triton X-100
Triton X-114
Tween 20
Tween 80SDS
CHAPS
CHAPSOMEGA 10Octyl- β -D-glucoside
Organic sovent
Ethanol
Isopropanol
DMSO
Chelating agent
EDTA
DTPA

Concentration
0.125%
0.025%
0.005%
0.125%
0.125%
0.25%
0.1%
0.1%
4%
4%
4%
0.5%
10%
10%
10%

ChemicalConcentration
Salt
Sodium chloride
2 mol/lPotassium chloride
2 mol/lSodium acetate
0.4 mol/l
Sodium bicarbonate
0.1 mol/l
BufferCitrate pH 5.0MES pH 6.1
Tris pH 7.4
PBSHEPES pH 7.5
CHES pH 9.0
Reducing agent
GlucoseGlutatione
Ascorbic acid
Dithiothreitol

0.125 mol/l
0.125 mol/l
0.0625 mol/l
Undiluted
0.125 mol/l
0.125 mol/l
2 mol/l
0.04 mol/l
0.4 mol/l
0.01 mol/l

0.4 mol/l
0.4 mol/l* 無添加の BSA による検量線との誤差が 5% 以内のサンプル中の濃度を示す。

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プロトコル

III Protein Quantification Kit-Wide Range(Code: PQ02) を使用した方法

本キットは塩基性条件でのテトラゾリウム塩の還元反応を利用したものである。テトラゾリウム塩は、タンパク質により容易に還元されホルマザンを生成する。WST-8 formazan は中性域では黄色であるが、高 pH 域では青色を呈し、pH12.5 以上では 650 nm に極大吸収を持つ。本キットの測定レンジは 50 μ g/ml～5,000 μ g/ml (BSA) である (図 9、図 10)。

-O2N
N

SO3-O3S

N-O S
3H N
N

O2NNa+reducing+
N NN

OCH3SO3-N
OCH3O2NO2N

WST-8 formazan

WST-8

図 9 WST-8 とその formazan の構造式a) Buffer solution 180 μ l を各ウェルに加える。

b) BSA 希釈溶液またはサン プ ル を 加 え、WST-8solution を加える。

c) プレートにアルミホイルでカバーをしてインキュベーションする。

d) プレートリーダーを使用して吸光度を測定する。

b)

0.8

Absorbance

インキュベーションする。Buffer solution との混合後のWST-8 は光安定性が低下し、バックグラウンドの吸光度が上昇する恐れがあるので、インキュベーションの間は遮光しておくこと。
6) プレートリーダーを使用して 650 nm の吸光度を測定する。
7) 各 well の吸光度からブランク (BSA : 0 μ g/ml) の吸光度を差し引く。
8) 横軸に BSA の濃度を取り、BSA 希釈溶液の吸光度から検量線を作成する(図 12)。
9) 検量線を基にサンプルのタンパク質濃度を算出する。

0.60.4a)0.20400500

600

700

Wavelength/ nm

Absorbance at 650 nm

1. キット内容

WST-8 solutionBuffer solution
Standard BSA solution (10,000 μ g/ml)

1.5
1.00.502. 操作方法

0(1) マイクロプレート法
1) Standard BSA solution を純水で順次 1/2 に希釈して 0～5,000μ g/ml の BSA 希釈溶液を調製する(図 11)。
100 μ l100 μ l100 μ l100 μ l10,000 μ g/ml BSA 100 μ l

ddH2O 100 μ l
1/2

1/4

1/8

1/16

10,000 μg/ml の Standard BSA solution を純水で順次 1/2 に希釈し、5,000、2,500、1250、625、313、156、78、0 μ g/ml の BSA 希釈溶液を調製する。

図 11

Standard BSA の調製法

2) Buffer solution 180 μ l を各ウェルに加える。
3) 1) で調製した各濃度の検量線用 BSA 希釈溶液、またはサンプル 20 μ l を各ウェルに加え、混合する。n=3 で測定することが望ましい。
4) WST-8 solution 20 μ l を各ウェルに加え、良く混合する。
5) プレートにアルミホイル等でカバーをして 37℃で 30 分

図 12

その他
機能性
有機材料

2.0

図 10 WST-8 の吸収スペクトルa) タンパク質なしb) タンパク質 (BSA：2,000 μ g/ml) 存在下

細 胞
増殖 / 毒性
酸
化
ストレス
分 子
生物学
細 胞 内
蛍光プローブ細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用
試
薬
膜タンパク質可 溶 化 剤ラベル化 剤
二価性
試 薬
イオン
電 極

1,000
2,000
3,000
4,000
Concentration of BSA ( μ g/ml)

5,000Standard BSA solution で作成した検量線(マイクロプレート法)(2) セル法[分光光度計を用いて測定を行う場合は以下のプロトコールに従って測定する。]
1) マイクロプレート法と同様に Standard BSA solution を純水で順次 1/2 に希釈して 0～5,000 μ g/ml の BSA 希釈溶液を調製する。
2) Buffer solution 2.25 ml を試験管に入れる。
3) 1) で調製した各濃度の検量線用 BSA 希釈溶液、またはサン
プル 50 μ l を加え、混合する。
4) 更に WST-8 solution 250 μ l を加え、良く混合する。
5) 試験管をアルミホイル等で遮光して 37℃で 1 時間インキュベーションする。Buffer solution と混合後の WST-8 は光安定性が低下し、バックグラウンドの吸光度が上昇する恐れがあるので、インキュベーションの間は遮光しておくこと。
6) 反応溶液を分光光度計用のセル (1 cm × 1 cm) に移し替え、650 nm の吸光度を測定する。
7) 測定された吸光度からブランク (BSA : 0 μ g/ml) の吸光度を差し引く。

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144

プロトコル

その他
機能性有機材料

8) 横軸に BSA の濃度を取り、BSA 希釈溶液の吸光度から検量線を作成する(図 13)。
9) 検量線を基にサンプルのタンパク質濃度を算出する。
2.0
Absorbance at 650 nm

細 胞
増殖 / 毒性酸化
ストレス
分 子
生物学
細 胞 内
蛍光プローブ細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用
試
薬
膜タンパク質可 溶 化 剤ラベル化 剤
二価性
試 薬
イオン
電 極

1.5

1.00.50

図 1301,000

2,000

3,0004,0005,000

Concentration of BSA ( μ g/ml)
Standard BSA solution で作成した検量線(セル法)

3. タンパク種による変動
このキットは検量線用のタンパク質として BSA を用いているが、すべてのタンパク種に対し、この検量線を使うことはできない。タンパク種による感度の変動を下に示す。
Protein
BSA
Chymotrypsinogen A
Transferrin
Human IgG

Protein/BSA
10.750.970.37a)a) 各検量線の傾きの比を示す

145

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