HIV 薬剤耐性検査推奨法
第3版

平成 28 年度 日本医療研究開発機構エイズ対策実用化研究事業

国内流行 HIV 及びその薬剤耐性株の長期的動向把握に関する研究
研究協力者：吉田繁 北海道医療大学研究代表者：吉村 和久，菊地 正 国立感染症研究所エイズ研究センター

2018 年 8 月 29 日
HIV 薬剤耐性検査標準化 WG 作製
第3版【推奨法とその活用について】
HIV 薬剤耐性検査推奨法は本検査の外部精度評価に参加した施設が実施する方法をもとに，プロテアーゼ（PR）・逆転写酵素（RT）領域の増幅プライマー（表 1）とシーケンスプライマー（表 2）を推奨したものです．2010 年に JEQS_RM2010，2014 年に JEQS_RM2014B と JEQS_RM2014C，2015 年に推奨するシーケ
ンスプライマーが設定されました．2016 年度外部精度評価に参加した 11 施設中 3 施設が JEQS_RM2010，2
施設が JEQS_RM2014B を使用しています．推奨法では，既報の耐性変異が生じる塩基配列を含まず，サブタ
イプ B の HIV 株間で比較的保存されている塩基配列に設定されたプライマーを選択していますが，全てのHIV に適しているわけではありません．したがって，増幅不良や解析困難などの不具合に対応するために複数の方法により検査を進めることが望まれます．推奨法は主検査法として，もしくは不具合時に実施する第 2，第3 選択の検査法として活用することを推奨します．
【シーケンスプライマーの選択について】シーケンスプライマーの種類と数は使用するシーケンサーの種類と解析条件に依存するため，その選択は施設で検討する必要があります．ただし，原則としてフォワードプライマーとリバースプライマーにより同一塩基配列をカバレッジが 2 以上で決定できるシーケンスプライマーを選択することが望まれます．また，PR 上流には indel（insertion/deletion）変異がしばしば見られることから，推奨法で設定したフォワードプライマー（DRPR05, DRPR01M）でも質の高いエレクトロフェログラムを得ることが困難な場合があります．この場
合，現時点では 2 つのリバースプライマー（B2, DRPR02L），もしくは，それらに加えて PR の 5’側に設定されたフォワードプライマーPRO4（表 4）の使用が対策として考えられます．ただし，PRO4 では PR の 10, 11番耐性変異に関与する塩基配列の判読はできません．
【反応条件の設定について】
推奨法はプライマーのみを推奨するものであるため，各施設で使用する試薬や機器に適した条件を設定する必要があります．条件検討の参考として推奨法設定の検討で使用した方法（参考資料 1），ならびに 2016 年度外部精度評価において良好な成績で，かつ，推奨法を使用している施設の方法（参考資料 2）を記載しました．
【インテグラーゼ領域の薬剤耐性検査について】
インテグラーゼ領域の HIV 薬剤耐性検査には推奨法の設定はありませんが，2016 年度外部精度評価に参加した
11 施設中 10 施設が同じ増幅プライマーを使用しています．したがって，現時点ではこれらの増幅プライマーの使用を推奨します（参考資料 4）．
【精度管理について】
検査の質の管理には内部精度管理と外部精度評価が重要です．本検査には市販のコントロールが供給されていないため，各施設で同一ロットの患者血漿を保管し，定期的に解析することで内部精度管理を実施することが望まれます．また，術者が代わることでの技術的質の低下や術者間差を防止するために，標準業務手順書（SOP, standard operating procedure）の作製と遵守が重要です．内部精度管理や技術評価を実施するにあた
りコントロールとして外部精度評価サンプル（合成 RNA）が必要な際には連絡をお願い致します（連絡先：吉田繁 e-mail: shiyoshi@hoku-iryo-u.ac.jp）． 外部精度評価については定期的に実施していきます．実施の際に1

2018 年 8 月 29 日
HIV 薬剤耐性検査標準化 WG 作製
第3版

は過去に参加していただいた施設には事前連絡をいたしますが，初めて参加される際にはご連絡をお願い致します（連絡先：吉田繁 e-mail: shiyoshi@hoku-iryo-u.ac.jp）．
また，検体の保存や取扱に関しましては「遺伝子関連検査 検体品質管理マニュアル MM5-A1」（ JCCLS 日
本臨床検査標準協議会）を参考にして下さい．
表 1. 推奨法 JEQS_RM2010, 2014B, 2014C の増幅プライマー
Primers for 2nd PCR

Primers for RT-PCR
MethodForward

ReverseLength (bp)

Forward

ReverseLength (bp)

JEQS_RM2010

K1

U13

1773

K4

U12

1584

JEQS_RM2014B

SK38

RT20de1919

DRPRO5

DRRT4L

1352

JEQS_RM2014C

KL1S

RT20de1716

KL2S

DRRT4L1368

表 2. 推奨するシーケンスプライマー
Primers for sequencing
Protease - forward

DRPRO5

DRPR01M

－

－

－

－

Protease - Reverse

B2

DRPR02L

－

－

－

－

RT - Forward

T12

DRRT3

DRRT14

DRRT16

DRRT26

DRRT27

RT - Reverse

DRRT4LDRRT10

DRRT13

DRRT15L

DRRT28

DRRT29名古屋医療センターの松田先生より情報提供して頂いたシーケンスプライマー（下線）

表 3. プライマーの配列と位置
PrimerPolarity

Sequences 5’-3’

Position

SK38

F

ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT

1544-1571

RT20deR

CTGCCAGTTCTARYTCTGCTTC

3462-3441

DRPRO5FAGACAGGYTAATTTTTTAGGGA

2074-2095

DRRT4LR

TACTTCTGTTAGTGCTTTGGTTCC

3425-3402

KL1S

F

ACCTTGTTGGTCCAAAATGCGA

1747-1768

KL2SFGAAAGATTGTACTGAGAGACAGGCTAA

2058-2084

K1

F

AAGGGCTGTTGGAAATGTGG

2020-2039

U13

R

CCCACTCAGGAATCCAGGT

3792-3774

K4F

GAAAGGAAGGACACCAAATGA

2039-2059

U12

R

CTCATTCTTGCATATTTTCCTGTT

3622-3599

DRPR01MF

AGAGCCAACAGCCCCACCAG

2148-2167

B2

R

CTAGGTATGGTAAATGCAGT

2950-2931

DRPR02LR

TATGGATTTTCAGGCCCAATTTTTGA

2716-2691

T12 (DRRT12)F

CCAGTAAAATTAAAGCCAG

2574-2592

DRRT3

F

ACTGCATTTACCATACCTAGT

2931-2951

2

2018 年 8 月 29 日
HIV 薬剤耐性検査標準化 WG 作製
第3版

DRRT10R

CAGTCCAGCTGTCTTTTTCTG

3309-3289

DRRT13R

AGGTATGGTAAATGCAGTATA

2948-2928

DRRT14F

ATATCAGTACAATGTGCTTCC

2978-2998

DRRT15LR

TCCCACTAACTTCTGTATGTCATTG

3335-3311

DRRT16FGAATCTGTGGACATAAAGCTA

2446-2466

DRRT26F

CAAAAATTGGGCCTGAAAATCC

2692-2713

DRRT27F

AACTCAAGACTTCTGGGAAGT

2798-2818

DRRT28RTGGAATATTGCTGGTGATCC

3031-3012

DRRT29R

GGCTCTAAGATTTTTGTC

3058-3041

リファレンス配列：HXB2, K03455

3

2018 年 8 月 29 日
HIV 薬剤耐性検査標準化 WG 作製第3版【参考資料 1】推奨法設定の検討に使用した試薬と反応条件
推奨法 JEQS_RM2014B，JEQS_RM2014C の設定の検討に使用した試薬と反応条件を記します．
2nd PCR 終了後の増幅産物をアガロースゲル電気泳動で確認した際，目的サイズ（約 1.3-1.6 kb）よりも大きい
サイズのバンド（約 1.7-1.9 kb）が観察される場合があります．これは RT-PCR 由来のバンドであり，原因としてはウイルス量が高いこと，増幅効率が高い RT-PCR 試薬を使用していることが考えられます．そのまま操作を継続しても塩基配列の決定は可能です．
1.

RNA 抽出QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN)，添付マニュアルに従う．

2.

RT-PCR
PrimeScript II High Fidelity One Step RT-PCR Kit (TaKaRa)
試薬

量（μl）

2 x One Step High Fidelity Buffer

12.5

PrimeScript II RT Enzyme Mix

0.5

PrimeSTAR GXL for 1 step RT-PCR

2

Forward primer (10μM)

1

Reverse primer (10μM)

1

Template RNA

5

RNase Free dH2O

Up to 25μl

45℃, 15 min → 94℃, 2 min→{98℃, 10 sec → 52℃, 15 sec → 68℃, 20 sec (10 sec/kb)} 38 cycles
3.

2nd PCR
KOD Plus ver2 (TOYOBO)
試薬

量（μl）

10 x buffer for KOD plus ver2

2.5

2mM dNTPs

2.5

25mM MgSO4

1.5

KOD plus

0.5

Forward primer (10μM)

1

Reverse primer (10μM)

1

Template

1

RNase Free dH2O

Up to 25μl

94℃, 2min→{98℃, 10sec → 54℃, 30 sec → 68℃, 90 sec (1 min/kb)} 30 cycles
42018 年 8 月 29 日
HIV 薬剤耐性検査標準化 WG 作製
第3版

4.

PCR 産物の精製
QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN)，添付マニュアルに従う

5.

シークエンス反応
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher)
シーケンスプライマー：DRPRO5, DRRT4L, T12, B2（詳細は表 3 を参照）
試薬

量（μl）

BigDye terminator v3.1

2

5 x sequencing buffer

4

Sequence primer (1μM)

3.2

Template

1

RNase Free dH2O

Up to 20μl

96℃, 1 min→(96℃, 10 sec → 50℃, 5 sec →60℃, 4 min) 25 cycles
6.

未反応 Dye の除去
FastGene Dye Terminator Removal kit（日本ジェネティクス），添付マニュアルに従う．

7.

Sequencer
ABI 3500 Genetic Analyzer (ABI)
POP7/50cm キャピラリ

8.

Assemble & Editing
SeqScape v2.7
Mix cut-off value 10%52018 年 8 月 29 日
HIV 薬剤耐性検査標準化 WG 作製第3版【参考資料 2】外部精度評価の成績が良好であった施設のプロトコール
施設 1（推奨法 JEQS_RM2010 を使用）
1.

RNA 抽出MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation kit (Roche)，添付マニュアルに従う

2.

RT-PCR
PrimeScript II High Fidelity One Step RT-PCR (TaKaRa)，添付マニュアルに従う
プライマー：K1 / U13
RNA 量 / 反応液量：5 / 25μL
45℃, 10 min → 94℃, 2 min→（98℃, 10 sec → 52℃, 10 sec → 68℃, 15 sec）40 cycles

3.

2nd PCR
PrimeSTAR GXL (TaKaRa)，添付マニュアルに従う
プライマー：K4 / U12
Template 量 / 反応液量：2 / 25μL
（98℃, 10 sec → 55℃, 10 sec → 68℃, 15 sec）40 cycles

4.

PCR 産物の精製
MultiScreen (Millipore)，添付マニュアルに従う

5.

シークエンス反応
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher)，添付マニュアルに従う
シーケンスプライマー：F, B3, L, A2, A3, U12, T, PRO4（詳細は表 4 を参照）

6.

未反応 dye の除去
BigDye Xterminator (Thermo Fisher)，添付マニュアルに従う

7.

Sequencer
3500xL/3500xL Dx Genetic Analyzer (ABI)
POP7/50cm キャピラリ

8.

Assemble & Editing
SeqScape v3.0
Mix cut-off value 10%62018 年 8 月 29 日
HIV 薬剤耐性検査標準化 WG 作製
第3版

施設 2（推奨法 JEQS_RM2014B を使用）
1.

RNA 抽出QIAamp viral RNA mini kit (QIAGEN)，添付マニュアルに従う

2.

RT-PCR
PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2 (TaKaRa)，添付マニュアルに従う
プライマー：SK38 / RT20de
RNA 量 / 反応液量：4 / 25μL
50℃, 30 min → 94℃, 2 min→（94℃, 30 sec → 50℃, 30 sec → 72℃, 2 min）35 cycles

3.

2nd PCR
EmeraldAmp PCR Master Mix (TaKaRa)，添付マニュアルに従う
プライマー：DRPRO5 / DRRT4L
Template 量 / 反応液量：1 / 25μL
98℃, 15 sec→（98℃, 10 sec → 54℃, 30 sec → 72℃, 1 min 30 sec）30 cycles

4.

PCR 産物の精製
ゲル切り出し→凍結→遠心→上清をシークエンス反応のテンプレートに用いる

5.

シークエンス反応
BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher)，添付マニュアルに従う
シークエンスプライマー：Prots10, Prots20, RT12, RT3R, DRRT4L（詳細は表 4 を参照）

6.

未反応 dye の除去
BigDye Xterminator (Thermo Fisher)，添付マニュアルに従う

7.

Sequencer
3130 Genetic Analyzer(ABI)
POP7/50cm キャピラリ

8.

Assemble & Editing
4PeaksMix cut-off value 25%

72018 年 8 月 29 日
HIV 薬剤耐性検査標準化 WG 作製第3版

表 4. 施設 1, 2 で使用されているシーケンスプライマーの配列と位置
PrimerPolarity

Sequences 5’-3’

PositionF

R

AGTATTGTATGGATTTTCAGGC

2723-2702

B3

R

CTGGCTTTAATTTTACTGGTA

2592-2572

L*

R

TGATCCTTTCCATCCCTG

3017-3000

A2F

TTAAAGCCAGGAATGGATG

2583-2601

A3

F

ATACTGCATTTACCATACC

2929-2947

U12

R

CTCATTCTTGCATATTTTCCTGTT

3622-3599

T**

F

ACAGAAATGGAAAAGGAAGG

2664-2683

PRO4

F

TCACTCTTTGGCAACGACCC

2260-2279

Prots10FTCAGAGCAGACCAGAGCCAACAGC

2136-2159

Prots20R

TTCTGTCAATGGCCATTGTTTAAC

2633-2610

RT12

F

CCAGTAAAATTAAAGCCAG

2574-2592

RT3R

R

ACTAGGTATGGTAAATGCAGT

2951-2931

DRRT4LR

TACTTCTGTTAGTGCTTTGGTTCC

3425-3402* 配列内に RT 151 番耐性変異が含まれる** 配列内に RT 40, 41 番耐性変異が含まれる【参考資料 3】使用が好ましくない PR-RT 増幅用プライマー
今までの外部精度評価ならびに配列情報から，使用が好ましくないプライマーを表 5 に示します．耐性変異が生じることで反応性が低下することが考えられます．
表 5. 使用が好ましくない PR-RT 増幅用プライマー
Primer理由

Sequences 5’-3’

Position

DRRT1L

配列内にプロテアーゼ 46,47,48,50,53 番耐性変ATGATAGGGGGAATTGGAGGTTT

2388-2410

GACCTACACCTGTCAACATAATTGG

2485-2509

配列内にプロテアーゼ 82,83,84,85 番耐性変異

TAGGACCTACACCTGTCAACATAAT

2482-2510

が含まれる

TGGA

反応性が低いTAATCCCTGCATAAATCTGACTTGC

異が含まれる
DRRT7L

配列内にプロテアーゼ 82,83,84,85 番耐性変異が含まれる

MS2510F

DRRT6L

リファレンス配列：HXB2, K03455

83372-3348

2018 年 8 月 29 日
HIV 薬剤耐性検査標準化 WG 作製第3版【参考資料 4】インテグラーゼ領域の薬剤耐性検査
2016 年外部精度評価に参加した 11 施設中 10 施設が使用する増幅プライマーを表 6 に示します．増幅プライマ
ーは施設によってプライマー名が異なるため，便宜的な名前を付けています．表 7 には使用されている全シー
ケンスプライマーを示します．施設により使用するシーケンスプライマーの種類と数は異なり，2ndPCR のフォワードプライマー（C_INT-2nd_F）とリバースプライマー（D_INT-2nd_R）のみ使用している施設が 5/11，それらを含む 4 種類のシーケンスプライマーを使用している施設が 5/11，5 種類以上が 1/11 施設あります．
PCR の条件は各施設で使用している試薬に最適化が必要です．参考として参加施設で採用しているアニーリン
グ温度を示します（表 9）．【参考資料 2】の施設 1,2 では PR-RT と同じ条件（プライマー以外）で実施しています．
表 6. インテグラーゼの増幅プライマー
Primers for 2nd PCR

Primers for RT-PCR
MethodJEQS_RM_INT

Forward

ReverseA_INT-

B_INT-

1st_F

1st_R

Length (bp)1226

Forward

ReverseC_INT-

D_INT-

2nd_F

2nd_R

Length (bp)1073

表 7. インテグラーゼのシーケンスプライマー
Primers for sequencing (使用施設数)
Forward

ReverseINT-2ndF_C (10)IN07 (1)

DRIN03 (2)IN11 (2)

INT-F1 (2)DRIN13 (1)IN313S (1)IN-F3 (1)

DRIN17 (1)

－

－

－

INT-2ndR_D (9)IN536A (1)IN14 (2)R-4769 (1)INT-R1 (2)DRIN12 (1)表 8. プライマー配列と位置
PrimerPolarity

Sequences 5’-3’

Position

A_INT-1st_F

F

CAGACTCACAATATGCATTAGG

4039-4060

B_INT-1st_R

R

CCTGTATGCAGACCCCAATATG

5264-5243

C_INT-2nd_F

F

CTGGCATGGGTACCAGCACACAA

4146-4168

D_INT-2nd_R

R

CCTAGTGGGATGTGTACTTCTGAACTTA

5219-5192

IN07

F

CATGGGTACCAGCACACAAAG

4150-4170

DRIN03F

TGGAGGAAATGAACAAGTAGATAAATTAG

4175-4203

IN11

F

ATGCATGGACAAGTAGACTG

4377-4396

INT-F1F

AGCCAGTGGATATATAGAAGCAGAAGT

4466-4492

DRIN13F

CATGTAGCCAGTGGATATATAGA

4461-4483

IN313SFGCAGGAAGATGGCCAG

4542-4557

IN-F3

F

ATGGCAGTATTCATCCACAATT

4761-4782

IN536AR

GCCATTTGTACTGCTGTCTTAA

4765-4744

IN14

R

TGAATACTGCCATTTGTACTG

4773-4753

R-47696R

TACTGCCATTTGTACTGCTG

4769-4750

9

2018 年 8 月 29 日
HIV 薬剤耐性検査標準化 WG 作製
第3版

INT-R1RTGTCTACTATTCTTTCCCCTGCACT

4836-4812

DRIN17F

GTGCAGGGGAAAGAATAGTAGAC

4813-4835

DRIN12R

ACTACTGCCCCTTCACCTTTCC

4978-4957

表 9. インテグラーゼ増幅 PCR のアニーリング温度
Annealing temp (℃)
Average

SD

MedianRange

RT-PCR

53.1

1.9

52

50-55

2nd PCR

55.9

2.4

54

55-60

【参考資 5】使用が好ましくない INT 増幅用プライマー
配列情報から，使用が好ましくないプライマーを以下に示します．耐性変異が生じることで反応性が低下することが考えられます．
表 10. 使用が好ましくない INT 増幅用プライマー
Primer理由

Sequences 5’-3’

Position

DRIN16

配列内にインテグラーゼ 74 番耐性変異が含ま

GCTACATGAACTGCTACCAGG

4468-4448

CCCTACAATCCCCAAAGTC

4653-4671

ACAATCATCACCTGCCATCTGTT

5069-5047

れる
F-4653

配列内にインテグラーゼ 143, 145, 146, 147,
148 番耐性変異が含まれる

DRIN10

配列内にインテグラーゼ 263 番耐性変異が含まれる

10

2018 年 8 月 29 日
HIV 薬剤耐性検査標準化 WG 作製第3版【参考資 6】Assemble, editing について
本検査の assemble, editing は施設により使用するソフトウェアや条件が異なります（表 11, 12）．一般的にミック
ス塩基の判定基準である mixture cut-off value は 20-25%がデフォルトとして用いられますが，今までの外部精度評価の結果では 10%が適切であると思われます．ただし，エレクトロフェログラムで明かな基線の乱れがなく，QV が 25-30 以上であることが望ましいです．
表 11. 参加施設で使用されている assemble, editing のソフトウェア
ソフトウェア

施設数

Sequencing analysis software (ABI) / GENETYX

1(GENETYX Corporation)*1
SeqScape (ABI)

4

Sequencing analysis software (ABI) / 目視

1

Sequencing analysis software (ABI)

1

4Peaks*2

1

Chromas Pro*3 / MEGA6

1

GENETYX*1 / ATSQ

1

ATGC bundled with GENETYX*1

1*1 https://www.genetyx.co.jp/*2 http://nucleobytes.com/4peaks/*3 http://technelysium.com.au/wp/chromaspro/

表 12. 参加施設で採用しているミックス塩基のカットオフ値
Mixture Cut-Off value

施設数

5%

1

10%

4

20%

1

25%

3

エレクトロフェログラムで主要ピーク高の 1/4

1

設定なし（目視）

1

4Peaks（Mac），MEGA は無料ソフトウェアですが他は有料です．

11

2018 年 8 月 29 日
HIV 薬剤耐性検査標準化 WG 作製第3版【参考資料 7】プライマーの出典，由来
Primer

出典，由来

SK38

Ou CY, et al. (1988) DNA amplification for direct detection of HIV-1 in DNA of peripheral bloodmononuclear cells. Science 239(4837):295-297.

RT20deShafer RW, Eisen JA, Merigan TC, & Katzenstein DA (1997) Sequence and drug susceptibilityof subtype C reverse transcriptase from human immunodeficiency virus type 1 seroconvertersin Zimbabwe. J. Virol. 71(7):5441-5448.

DRPRO5

国立感染症研究所で設計されたプライマー

DRRT4LDRPR01M
DRPR02L
DRRT3DRRT10
DRRT13
DRRT14
DRRT15L
DRRT16
DRRT26
DRRT27
DRRT28
DRRT29KL1S

JEQS program の参加施設で設計されたプライマー

KL2S
K1

Ibe S, Shibata N, Utsumi M, & Kaneda T (2003) Selection of human immunodeficiency virus

U13type 1 variants with an insertion mutation in the p6(gag) and p6(pol) genes under highly active

K4

antiretroviral therapy. Microbiol. Immunol. 47(1):71-79.

U12
T12

相澤佐織, 蜂谷敦子, 井田節子, 立川夏夫, 菊池

嘉, 青木

眞, 岡

慎一 (2000) 抗 HIV 無治療患者に対する Zidovudine/Lamivudine/Indinavir 併用療法の 2 年間の治療経過. 感染症誌 74:128133.

B2

K1，U13，K4，U12 を使用している施設で設計されたプライマー

12

2018 年 8 月 29 日
HIV 薬剤耐性検査標準化 WG 作製
第3版【HIV 薬剤耐性検査標準化ワーキンググループ】
菊地 正，吉村和久，椎野禎一郎（国立感染症研究所）
吉田 繁（北海道医療大学）
蜂谷敦子，松田昌和（国立名古屋医療センター）
岡田清美，伊部史朗，和山行正（北里大塚バイオメディカルアッセイ研究所）
齊藤浩一（LSI メディエンス）加藤真吾（慶応義塾大学）
林田庸総（国立国際医療研究センター）【連絡先】
吉田 繁（北海道医療大学）
002-8072 札幌市北区あいの里 2 条 5 丁目 1
Phone：011-778-9062 Fax：011-778-8941
E-mail：shiyoshi@hoku-iryo-u.ac.jp13