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July-2019 / Ver 2.52.1

IN VITRO Transcription / Translation SYSTEM
BCF4050

取扱説明書

NUProtein
本書の一部または全部を無断転載することを禁じます。

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本取扱説明書は BCF4050 の使用方法、これを使用するための準備に関わる解説をしています。

BCF4050

All in one Kit (PCR, Transcription, Translation)

保存温度-70°C-20°C

PCR DNA Polymerase T7 RNA Polymerase Wheat Germ Extract
10x PCR Buffer

Transcription Buffer

2 mM dNTPs
25 mM MgSO4

25 mM NTP Mix

Amino Acid Mix
prod.#SB5055

100 mM DTT

2nd PCR Product50 reaction

無細胞タンパク質合成試薬キットを用いたタンパク質合成は、次の 3 段階から構成されています。

鋳型 DNA

2 段階 PCR
転写鋳型 DNA

転写用試薬

転写→

1. 転写鋳型 DNA の作製
BCF4050

mRNA

翻訳

翻訳用試薬

⇒

page 3タンパク質10 kDa - 150 kDa

→

2. 転写

3. 翻訳

⇒
page 9

TLS4050

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特長
鋳型となる DNA に、転写/翻訳用に設計された塩基配列を 2 段階 PCR により付加します。
これにより N 末端、C 末端へ自由に、多様なタグの付け替えが可能となっています。
各試薬およびプロトコルの最適化により、PCR からタンパク質発現まで 24 時間以内に実施可能です。

本取扱説明書、Primer List および 1st PCR Primer 設計支援ツールは弊社ホームページからダウンロードできます。

https://nuprotein.jp/knowledge-base/https://nuprotein.jp/blog でメールアドレスをご登録頂くと新しいプロトコル等、ニュースレターとしてご案内いたします。是非 ご登録お願いいたします。

安全上の注意
本製品は研究用試薬です。診断および臨床検査試薬として使用しないでください。また、本製品の使用にあたり実験室での一般注意事項を尊守し、安全に留意してください。関係する実験において、人体に有害な試薬を扱う場合も予想されます。必要に応じて適切な保護具をご使用いただきますようお願いいたします。

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1. 転写鋳型 DNA の作製
N 末端タグ鋳型 DNA の構造
N 末端タグ鋳型 DNA の構造および各パートの配列は下のとおりです。
tag sequence は下表からいずれか 1 つを選んでください。または任意の配列を用意してください。
Linker_N は適当なプロテアーゼ認識配列に変更可能です。
5' UTR
ATG

5'T7 promoter
Sequences / PartRegion

SiteT7 promoter

5'UTR

EnhancerStart codon

tag sequence
Translated RegionLinker_N
ORF
Stop codon
3'UTR

3' UTR

Tail sequence

Enhancer

Stoptagsequence
Linker_N

Tailsequence

ORF

3'DNA Sequence
CCCGCGAAAT TAATACGACT CACTATA
GGGCTCACCT ATCTCTCTAC ACAAAACATT TCCCTACATA CAACTTTCAACTTCCTATTATG no-tag の場合は除く

tagno-tag
6 x HisFLAG
HAstrepⅡ

CAT CAT CAT CAT CAT CAT
GAC TAC AAG GAT GAC GAT GAC AAGTAT CCT TAT GAC GTG CCT GAC TAT GCC
TGG TCC CAC CCT CAA TTC GAG AAG
CTC CAG CAG GGA GGT ACT ( Leu-Gln-Gln-Gly-Gly-Thr )ATG + NNNNN ・・・ ・・・NNNNN
TAA, TAG, TGA
AAAAAAAAAA GAGCTCTTGG ATCCGGCCAT AAGGGCCTGA
TCCTTCGAGG GGGGGCC

N 末端タグ鋳型 DNA
転写鋳型は 1st PCR, 2nd PCR の 2 段階で作製します。

1st PCR プライマー（N 末端タグ用）の設計要領
下のとおり、遺伝子特異的な配列を挿入して、1st PCR プライマーを作製してください。
Reverse primer は stop codon を除く逆相補鎖 18 mer を挿入します。

1st_ORF_NF

→
10 μM
ATG

5'
T7 promoter

Enhancer3'

Stoptagsequence
Linker_N

Tailsequence

ORF

10 μM

3'5'

←
1st_ORF_NR
1st PCR Primer_N
Primer namePrimer sequence 5' to 3'

1st_ORF_NFCCAGCAGGGAGGTACT+

1st_ORF_NR

CCTTATGGCCGGATCCAAGAGCTCTTTTTTTTTTTTA+ORFRRRRRRRRRRRRRRRRRR(R=18)

ORF

ATG NNNNNNNNNNNNNNNNNN(N=18)

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2nd PCR プライマー（N 末端タグ用）の設計要領挿入するタグが下表にある場合、特に設計する必要はありません。以下のとおりのプライマーを用意します。
4 種類のプライマーが必要になります。
各種プライマー濃度は、下図のとおりに調整してください。

2nd_NF2→
10 μM

2nd_tag_NF1→
100 nM
ATG

5'
T7 promoter

Enhancer3'

1st PCR Producttagsequence
Linker_N

Tails equence

ORF

3'

Stop
2nd_NR15'←

100 nM
10 μM
2nd_NCR2←

Forward Primer NF2Primer name
2nd_NF2

Forward Primer NF1
Primer namePrimer sequence 5' to 3'
CCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAG

2nd_no-tag_NF1

Primer sequence 5' to 3'
CGACTCACTATAGGGCTCACCTATCTCTCTACACAAAACATTTCCCTACATACAACTTTCAACTTCCTATTCTCCAGCAGGGAGGTACTATG

2nd_His_NF1

CGACTCACTATAGGGCTCACCTATCTCTCTACACAAAACATTTCCCTACATACAACTTTCAACTTCCTATTATGCATCATCATCATCATCATCTCCAGCAGGGAGGTACTATG

2nd_FLAG_NF1

CGACTCACTATAGGGCTCACCTATCTCTCTACACAAAACATTTCCCTACATACAACTTTCAACTTCCTATTATGGACTACAAGGATGACGATGACAAGCTCCAGCAGGGAGGTACTATG

2nd_HA_NF1

CGACTCACTATAGGGCTCACCTATCTCTCTACACAAAACATTTCCCTACATACAACTTTCAACTTCCTATTATGTATCCTTATGACGTGCCTGACTATGCCCTCCAGCAGGGAGGTACTATG

2nd_strepⅡ_NF1

CGACTCACTATAGGGCTCACCTATCTCTCTACACAAAACATTTCCCTACATACAACTTTCAACTTCCTATTATGTGGTCCCACCCTCAATTCGAGAAGCTCCAGCAGGGAGGTACTATG

2nd_XXX-tag_NF1*CGACTCACTATAGGGCTCACCTATCTCTCTACACAAAACATTTCCCTACATACAACTTTCAACTTCCTATTATG NNN---NNN CTCCAGCAGGGAGGTACTATG* 任意のタグを挿入する場合、2nd_XXX-tag_NF1 の NNN---NNN 部分を変更してください。

Reverse Primer NR1, NCR2（N/C 共通）
Primer namePrimer sequence 5' to 3'

2nd_NR1

CCCTCGAAGGATCAGGCCCTTATGGCCGGATCCAA

2nd_NCR2

GGCCCCCCCTCGAAGG

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C 末端タグ鋳型 DNA の構造
C 末端タグ鋳型 DNA の構造および各パートの配列は下のとおりです。
tag sequence は下表からいずれか 1 つを選んでください。または任意の配列を用意してください。
Linker_C は適当なプロテアーゼ認識配列に変更可能です。
5' UTR

3' UTR
ATG

5'
T7 promoter

Sequences / PartRegion

Site
T7 promoter

5'UTR

Enhancer
ORF
Linker_C

Translated Region
tag sequence
Stop codon
Tail sequence

3'UTREnhancer

Stop3'tag
Tailsequence
sequence
Linker_C

ORF

DNA Sequence
CCCGCGAAAT TAATACGACT CACTATA
GGGCTCACCT ATCTCTCTAC ACAAAACATT TCCCTACATA CAACTTTCAACTTCCTATTtag

ATG + NNNNN ・・・ ・・・NNNNNGGT CTC CAG CAG GGA GGT ACT ( Gly-Leu-Gln-Gln-Gly-Gly-Thr )CAT CAT CAT CAT CAT CAT
GAC TAC AAG GAT GAC GAT GAC AAGTAT CCT TAT GAC GTG CCT GAC TAT GCC
TGG TCC CAC CCT CAA TTC GAG AAG
TAA, TAG, TGA
AAAAAAAAAA GAGCTCTTGG ATCCGGCCAT AAGGGCCTGATCCTTCGAGG GGGGGCC

6 x HisFLAG
HAstrepⅡ

C 末端タグ鋳型 DNA
転写鋳型は 1st PCR, 2nd PCR の 2 段階で作製します。

1st PCR プライマー（C 末端タグ用）の設計要領
下のとおり、遺伝子特異的な配列を挿入して、1st PCR プライマーを作製してください。
Reverse primer は stop codon を除く逆相補鎖 18 mer を挿入します。
1st_ORF_CF→
10 μM
ATG

5'
T7 promoter

Enhancer

Stop
3'tag
Tailsequence
sequence
Linker_C
5'
10 μM

ORF

3'

←
1st_ORF_CR
1st PCR Primer_C
Primer name
1st_ORF_CF

Primer sequence 5' to 3'
CACAAAACATTTCCCTACATACAACTTTCAACTTCCTATT+ ORFATGNNNNNNNNNNNNNNNNNN(N=18)

1st_ORF_CR

AGTACCTCCCTGCTGGAGACC+ ORFRRRRRRRRRRRRRRRRRR(R=18)

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2nd PCR プライマー（C 末端タグ用）の設計要領挿入するタグが下表にある場合、特に設計する必要はありません。以下のとおりのプライマーを用意します。
3 種類のプライマーが必要になります。
各種プライマー濃度は、下図のとおりに調整してください。

2nd_CF1

→
10 μM
ATG

5'
T7 promoter

En hancer

Linker_C

Stop
3'
tag
Tail
sequence
sequence5'
2nd_tag_CR1

ORF
1st PCR Product3'←100 nM

10 μM←
2nd_NCR2

Forward Primer CF1
Primer name
2nd_CF1

Reverse Primer CR1Primer namePrimer sequence 5' to 3'
CCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGCTCACCTATCTCTCTACACAAAACATTTCC

2nd_His_CR1

Primer sequence 5' to 3'
CCCTCGAAGGATCAGGCCCTTATGGCCGGATCCAAGAGCTCTTTTTTTTTTTTAATGATGATGATGATGATGAGTACCTCCCTGCTGG

2nd_FLAG_CR1

CCCTCGAAGGATCAGGCCCTTATGGCCGGATCCAAGAGCTCTTTTTTTTTTTTACTTGTCATCGTCATC
CTTGTAGTCAGTACCTCCCTGCTGG

2nd_HA_CR1

CCCTCGAAGGATCAGGCCCTTATGGCCGGATCCAAGAGCTCTTTTTTTTTTTTAGGCATAGTCAGGCACGTCATAAGGATAAGTACCTCCCTGCTGG

2nd_strepⅡ_CR1CCCTCGAAGGATCAGGCCCTTATGGCCGGATCCAAGAGCTCTTTTTTTTTTTTACTTCTCGAATTGAGGGTGGGACCAAGTACCTCCCTGCTGG

2nd_XXXX-tag_CR1*

CCCTCGAAGGATCAGGCCCTTATGGCCGGATCCAAGAGCTCTTTTTTTTTTTTA RRR---RRR
AGTACCTCCCTGCTGG* 任意のタグを挿入する場合、2nd_XXX-tag_CR1 の RRR---RRR 部分を変更してください。
RRR---RRR は逆相補鎖を挿入します。

Reverse Primer NCR2（N/C 共通）
Primer name
2nd_NCR2

Primer sequence 5' to 3'

GGCCCCCCCTCGAAGG

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PCR プロトコル
BCF4050 付属の PCR DNA Polymerase は 2 ステップサイクル対応、伸長時間 30 sec/kb の酵素です。
このプロトコルは BCF4050 付属の PCR キットと同等キットの使用が条件となります。

1st PCR
1st PCR の反応液組成およびプログラムは下表のとおりです。
Plasmid DNA 濃度は 1 ng/μL に調整してください。
1st PCR 反応液

Reagents
10x PCR buffer
2 mM dNTPs
25 mM MgSO4
10 μM 1st_ORF_F
10 μM 1st_ORF_R
Plasmid DNA
PCR DNA Polymerase
Ultra pure waterTotal

Volume
5 μL
5 μL
3 μL
1 μL
1 μL
1 μL
1 μL
33 μL
50 μL

1st PCR ProgramSeg.
Temp.
Time
194°C
2 min
2-198°C
10 sec2-268°C
30 sec/kb*
320°C* 1 kb 以下のものは、1 min にしてください。

Cycle
130-

2nd PCR
2nd PCR の反応液組成およびプログラムは下表のとおりです。
2nd PCR 反応液 N 末端タグ

Reagents
10x PCR buffer
2 mM dNTPs
25 mM MgSO4
10 μM 2nd_NF2
100 nM 2nd_NF1
100 nM 2nd_NR1
10 μM 2nd_NCR2
1st PCR product
PCR DNA Polymerase
Ultra pure waterTotal

Volume
5 μL
5 μL
3 μL
1 μL
1 μL
1 μL
1 μL
1 μL
1 μL
31 μL
50 μL

2nd PCR Program

2nd PCR 反応液 C 末端タグ

Reagents
10x PCR buffer
2 mM dNTPs
25 mM MgSO4
10 μM 2nd_CF1100 nM 2nd_CR1
10 μM 2nd_NCR2
1st PCR product
PCR DNA Polymerase
Ultra pure waterTotal

Seg.
Temp.
Time
194°C
2 min
2-198°C
10 sec2-260°C
1 min
2-368°C
30 sec/kb*
3-198°C
10 sec3-268°C
30 sec/kb*
472°C
2 min
520°C
* 1 kb 以下のものは、1 min にしてください。

Volume5 μL
5 μL
3 μL
1 μL
1 μL
1 μL
1 μL
1 μL
32 μL
50 μL

Cycle
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PCR 産物の確認〇 アガロースゲル電気泳動による 1st PCR product, 2nd PCR product の確認

1 μL の DNA サンプルを Load して PCR 産物を確認します。
薄めに作製したゲルを使用することで、より異常が発見しやすくなります。

1st PCR product
完全なシングルバンドが好ましいが、多少の濃淡差は問題ありません。

2nd PCR product
完全なシングルバンドで、はっきりと確認できるものが好ましい。

確認例#1, #2 は種類の違う 鋳型 DNA の 1st PCR 産物。
#3-#8, #9-#14 はそれぞれ #1, #2 の 1st PCR 産物で 2nd PCR を行ったもの。
bp
1500
1000
500
100
#

12

34 5 6 7 8
2nd PCR product #1910 11 12 13 14
2rd PCR product #2〇 トラブルシューティング

トラブル

段階
全く何もない増幅産物が少ない

1st
わずかに確認できる

2nd
1st
エキストラバンドが確認される

スメアが確認される

改善ポイント共通 プライマー、試薬類の確認

2nd1st2nd

伸長反応時間を長くする。*1
サイクル数を 35 に増やす。
伸長反応時間を 2 および 3 Seg とも 1st と同じにする。

3 Seg. のサイクル数を 35-40 にする．
プライマーの再設計*2
Seg.2-2 のアニーリング温度を 55°C にする。
Seg.2-3 および Seg.3-2 の伸長反応時間の短縮
伸長反応時間、サイクル数の短縮＊1伸長反応時間は 30 sec/kb を推奨していますが、増幅効率の悪い場合は 1 min/kb にしてください。
1 kbp までの DNA に対しては 1 min の伸長反応時間が確実です。

＊2

2 ステップサイクル PCR で、このトラブルが発生した場合のほとんどがプライマーの設計に問題があります。

Forward/Reverse Primer の Tm 値を近づける設計をしてください。
弊社ホームページ上の 1st PCR Primer 設計支援ツールをご利用ください。
https://nuprotein.jp/knowledge-base/ からダウンロード可能です。

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2. 転写転写プロトコル〇 転写反応溶液の調製

次のとおり、転写反応溶液を 1.5 mL チューブ中で調製する。

転写反応溶液Reagents
10x Transcription Buffer
25 mM NTP Mix
T7 RNA Polymerase
100 mM DTT
2nd PCR Product
RNase free waterTotal

最小反応単位

Volume2.5 μL
2.5 μL
1 μL
1.25 μL
2.5 μL
15.25 μL
25 μL

2nd PCR Product は 10x Transcription Buffer と直接混合しないように注意する。

〇 転写反応1.

調製した転写反応溶液の容器を軽くタッピングし、溶液の攪拌後、卓上遠心機で軽く遠心する。

2.

溶液の蒸発防止の為、容器の蓋をしっかりとキャップする。

3.

37°C で 3 時間、ブロックヒーター等によりインキュベートする。

〇 mRNA の精製

1.

転写終了後、25 μL 溶液に対し 4 M 酢酸アンモニウムを 10 μL 加えて混合する。

2.

100 μl の 100 % エタノールを加え混合する。

3.

卓上遠心機により軽く遠心した後、-20°C ～ -80°C で 10 分 静置する。

4.

遠心分離する。（12000 rpm, 15 min, 4°C）

5.

上清を除去後、軽くフラッシュし、再度上清を除去する。

6.

沈殿物が半乾燥状態になるまで放置する。マイクロチューブの蓋をあけておくため、不純物が混入しないように注意する。

7.

40 μL の RNase free 水を加えて mRNA ペレットを溶解する。

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mRNA の確認と濃度調整
以下の手順は酢酸アンモニウム中和によるエタノール沈殿精製物に対応しています。
転写溶液精製後に得られる 40 μL mRNA solution の確認および濃度調整をします。
翻訳反応溶液へ加える mRNA には最適量があります。
〇 mRNA の濃度測定による確認

40 μL mRNA solution の濃度測定値が次の範囲内にあるか、確認します。
濃度範囲1500 ng/μL ± 400 ng/μL

測定濃度が 1000 ng/μL 以下 2000 ng /μL 以上は正常に PCR, 転写または精製ができていない可能性があります。

〇 mRNA の電気泳動による確認

1 μL サンプルの電気泳動で、はっきりとシングルバンドが出ているのを確認します。
エキストラバンドがでているものは正常に PCR ができていない可能性があります。

〇 最適 mRNA 量の調整
最小翻訳溶液量 110 μL に対する最適 mRNA 量は次のとおりです。
最適 mRNA 量

35 μg ± 5 μg

最適 mRNA 量を 35 μg として測定 sample #4 を例にとると

35 μg / 1631.7 ng/μL = 21.45 μL ≒ 21 μL
NanoDrop による濃度測定例#
1234ng/μL1752.01345.0
1585.01631.7▼

A260/A280
2.13
2.12
2.07
2.05

A260/A230
2.67
2.57
2.63
2.60

40 μL mRNA solution 21 μL を 80 μL に Fill up して、翻訳反応溶液へ加える。（次ページ 3. 翻訳 パート参照）

参考
下限値 30 μg / 1631.7 ng/μL = 18.38 μL→ 40 μL mRNA solution から 2 翻訳溶液の調製が可能。
合成実績のある mRNA は 40 μL mRNA solution を 2 分割して、2 翻訳反応溶液を調製しても良い。

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3. 翻訳
翻訳プロトコル〇 通常翻訳

1.

最適 mRNA 量/ 80 μL に調整された mRNA solution を用意する。（前ページ参照）

2.

次のとおり、翻訳反応溶液を 1.5 mL チューブ中で調製する。
翻訳反応溶液最小反応単位

Reagents
Wheat Germ Extract
Amino Acid MixmRNA solutionTotal
3.

Volume10 μL
20 μL
80 μL
110 μL

16°C で 10 時間 ブロックヒーター等によりインキュベートする。

〇 透析翻訳
通常翻訳よりも収量を増やしたい場合や、発現しにくいタンパク質に対する方法です。
下図のような装置が必要となります。

1.

4 倍に薄めた Amino Acid Mix (AAMX004 : 別売品) を 2 mL タイタープレートへ分注する。
AAMX004 は透析基質交換層専用 Amino Acid Mix です。

2.

タイタープレートの蓋をして、透析カップをセットする。

3.

通常翻訳で調整した 110 μL 溶液を透析カップ内へ分注する。

4.

内液と外液の水面を同レベルに微調整する。

5.

16°C で 10 時間 インキュベートする。

透析装置加工例

24 well titer plate

基質交換層 : 2 mL

φ 9 - 9.5 mm 孔空け加工

反応層 : 110 μL
Slide-A-Lyzer™ Mini

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タンパク質の確認〇 タンパク質の処理
翻訳溶液中に Wheat Germ Extract 由来の浮遊成分が混入しています。
翻訳完了後溶液（そのままの状態）の 4°C 保存は好ましくありません。

1.

遠心分離する。（Max spin, 15 min, 4°C）

2.

上清を回収して同量の Glycerol を加え -20°C 保存する。
または、上清を回収して液体窒素凍結の後 -80°C 保存する。
その他、目的に応じた適切な処理をする。

〇 ウエスタンブロットによるタンパク質の検出
確実にタンパク質合成がされているかどうか、ウェスタンブロットでの確認を推奨します。
no-tag の場合でも何らかのタグを一度付加してからの発現確認をお勧めします。

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製品・技術に関するお問い合わせsupport@nuprotein.jp「KOD®」 ならびに 「KOD-Plus-Neo」 は東洋紡株式会社の登録商標または商標です。
「FLAG®」 は Sigma-Aldrich Co. LLC の登録商標です。
「Slide-A-Lyzer™」 は Thermo Fisher Scientific Inc. の商標です。
その他記載されている会社名・商品名などは、各社の商標および登録商標です。
記載の試薬、製品などには、必ずしも商標表示（（R）、TM）を付記しておりません。

【製造元】

製品・技術に関するお問い合わせ :NUProtein 株式会社 本店

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