細胞の接着と脱離を光制御できる細胞培養基材
東京大学

先端科学技術研究センター
准教授 山口 哲志
2021年5月28日

1

アウトライン 従来の光応答性細胞培養基材の問題点
 新技術（光応答性PEG脂質基材）の特徴

 想定される用途• 画像ベースの細胞ソーティング技術• 多種類細胞の迅速配置技術• その他
 実用化に向けた課題

 企業への期待
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従来技術（光応答性培養基材）の問題点⚫ 細胞自身の接着性を利用している
•
•
光配置技術
接着性

接着細胞にしか使えない（×：血球や細菌、ウイルス）
時間がかかる（← 洗浄で差がでる強さの接着に半日程度）

細胞

光培養
（～半日）

生物学的な接着

非接着性

光回収技術

接着性非接着細胞を洗浄除去

培養
（～半日）

生物学的な接着光

非接着表面の細胞を回収

非接着性3

新技術（光応答性PEG脂質基材）の特徴⚫ 細胞膜との相互作用で固定化する接着性に関わらず任意の細胞を瞬時に光配置第1世代

光

光分解性PEG脂質“光でとれる”Yamguchi et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 128

特願2019-550500

第2世代

光

光活性化PEG脂質“光でくっつく”
Yamahira et al., submitted

特願2017-509496

第3世代

光

光異性化PEG脂質“光でくっついたりとれたり、繰り返し”
Izuta et al, ACS Appl. Bio Mater., 2019, 2, 33-38

特願2018-105068
4新技術（光応答性PEG脂質基材）の特徴
光分解性PEG脂質表面（特許②）⚫ 光照射表面だけに、任意の細胞を固定化できなくする
光分解性PEG脂質OO
HNOOONHNO2OOnONOO

脂質PEG（細胞とくっつく） 光分解性リンカー （細胞とくっつかない）

光照射細胞固定光*

光* : 360～405 nm細胞細胞脱離光*Yamguchi et al., Angew. Chem. Int. Ed. 51, 128 (2012)5新技術（光応答性PEG脂質基材）の特徴
光分解性PEG脂質表面（特許②）⚫ 光照射表面だけに、任意の細胞を固定化できなくする
非照射スポットサイズの最適化により1細胞アレイ構築

非照射スポット(大きい)

非照射スポット(小さい)Yamahira et al., Macromol. Biosci. 14, 1640 (2014)
細胞占有スポットの割合（%）

割合 (%)

細胞占有スポット中の1細胞スポットの割合（%）
1細胞スポットの割合（%）

非照射スポットの直径 (μm)

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新技術（光応答性PEG脂質基材）の特徴
光分解性PEG脂質表面（特許②）⚫ 光照射表面だけに、任意の細胞を固定化できなくする
光照射によって選択的に細胞を脱離できる
光照射前

マイクロ流路内で
光照射

線流速15 cm/sec

シリンジポンプ

マイクロチューブ

光照射後光照射
365 ±10 nm
5.2 J/cm2

選択性 非照射スポット( n = 69)の固定化細胞の 95%が残る。
生体適合性 光照射で回収した細胞の生存率 (90 ± 6.4%)は、光を照射せずにピペッティングで回収した細胞の生存率 (90 ± 6.7%)とほぼ同じ。
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新技術（光応答性PEG脂質基材）の特徴
光異性化PEG脂質表面（特許③）⚫ 紫外光で細胞を固定化し、可視光で細胞を固定化できなくする
光異性化PEG脂質
Oleyl

Spiropyran

S. Izuta et al., ACS Appl. Bio
Mater. 2, 33 (2019)

PEG chain
OffVisible
520 nmOnUV
360 nmOffVisible
520 nm

100 μm8

新技術（光応答性PEG脂質基材）の特徴
光異性化PEG脂質表面（特許③）⚫ 紫外光で細胞を固定化し、可視光で細胞を固定化できなくする
光異性化PEG脂質
Oleyl

Spiropyran

PEG chain

S. Izuta et al., ACS Appl. Bio
Mater. 2, 33 (2019)9

想定される用途
画像ベースの細胞ソーティング技術
1細胞アレイを用いた細胞選別
・ 細胞を高密度に並べて解析し、目的の細胞を分取する
・ 多角的なイメージングを指標に正確に識別できる (形態学的特徴, 分子動態, など)
染色などの処理の前後で同一細胞を比較

多角的イメージング

形態学的変化染色などの処理

分子動態の変化 etc

マイクロマニュピレーター

回収

用途によっては、細胞の回収操作に時間がかかる
10想定される用途
画像ベースの細胞ソーティング技術
1細胞アレイを用いた細胞選別
・ 細胞を高密度に並べて解析し、目的の細胞を分取する
・ 多角的なイメージングを指標に正確に識別できる (形態学的特徴, 分子動態, など)
染色などの処理の前後で同一細胞を比較

多角的イメージング

形態学的変化染色などの処理

分子動態の変化 etc

回収
並列光照射システム

大量の細胞を高速光回収できる
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想定される用途
多種類細胞の迅速配置技術
Organ on a chip・ マイクロ流路内に各臓器の機能を有する人工組織を配置し、生体内環境を模倣する。
・ 体内での薬物の代謝や薬効を再現し、動物実験の削減や創薬効率の向上に貢献する。
類洞

肝臓組織内皮細胞
肝臓組織化
小葉間静脈
中心静脈
小葉間動脈

肝実質細胞

Lee et al., Biotech. Bioeng., 97, 1340 (2007)https://ars.els-cdn.com/content/image/3-s2.0-B9780128126592000016-f01-09-9780128126592.jpg

世界市場規模は2018年の推計113億ドルから、2023年段階では606億ドルへと急速な拡大が予測

課題：複数種の細胞から成る精緻な組織構造の再現が必要
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想定される用途
多種類細胞の迅速配置技術
1. インクジェットプリンティング

2. ソフトリソグラフィー（contact printing）

DNAで被覆カンチレバーで相補的なDNAを塗布して配置→ 細胞傷害性を低減し、異種多細胞を配置
Park et al., Sci. Rep, 7, 14610 (2017)✓ 任意の表面に簡便、自動化✓ 1細胞レベルの精緻な配置は困難
×✓ 精緻な1細胞吐出は時間とコストがかかる×

Todhunter et al., Nat. Meth., 12, 975 (2015)✓ 任意の表面で細胞種に制限無く配置✓ 1細胞レベルの精度で配置✓ 多種類の細胞選択的なリガンドが必要
××✓ 一か所ずつ塗布するため、数個～数100個程度の量しか現実的に作れない

解像度と細胞の種類数に制限があり、時間とコストもかかる
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想定される用途
多種類細胞の迅速配置技術
Organ on a chip・ マイクロ流路内に各臓器の機能を有する人工組織を配置し、生体内環境を模倣する。
・ 体内での薬物の代謝や薬効を再現し、動物実験の削減や創薬効率の向上に貢献する。
細胞A細胞B空隙

光応答性PEG脂質表面単層組織パターンを調製⚫

複数種の細胞を迅速に（10分以内で）配置できる。

⚫

浮遊系細胞を含む任意の細胞を配置できる。

⚫

配置した細胞を細胞外マトリクスなどに転写できる。

迅速に生体模倣性の高い組織を流路内に作製（転写技術の併用により三次元化も原理的に可能）
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実用化に向けた課題（必要な技術）
画像ベースの細胞ソーティング技術

回収
並列光照射システム⚫ 目的の表現型の細胞を高速で同定する画像解析技術⚫ 同定した目的細胞にのみ自動で並列光照射できる光照射システム（光学系と全自動ステージとを連動したシステム）⚫ 光で脱離した細胞を正確に回収する流路系（1細胞回収系）
多種類細胞の迅速配置技術⚫ 広い面積に光を順次正確に照射できる光照射システム

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企業への期待画像ベースの細胞ソーティング技術

回収
並列光照射システム⚫ 目的の表現型の細胞を高速で同定する画像解析技術⚫ 同定した目的細胞にのみ自動で並列光照射できる光照射システム（光学系と全自動ステージとを連動したシステム）⚫ 光で脱離した細胞を正確に回収する流路系（1細胞回収系）
多種類細胞の迅速配置技術⚫ 広い面積に光を順次正確に照射できる光照射システム
上記の必要技術の提供・我々の技術の有効利用
16本技術に関する知的財産権

特許①• 発明の名称 ：脂質膜含有物を固定化するための化合物、当該化合物で修飾された基材、当該基材上に脂質膜含有物をパターニングする方法及び脂質膜含有物を当該基材上で単離する方法• 出願番号：特願2017-509496• 出願人：国立大学法人東京大学• 発明者：長棟 輝行,山口 哲志,山平 真也
特許②• 発明の名称 ：光分解性細胞固定化剤• 出願番号：特願2019-550500• 出願人：国立大学法人東京大学• 発明者：山口 哲志,岡本 晃充,ヤジェンブスカ・ナタリア・テレサ,泉田 森,山平 真也,長棟 輝行
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本技術に関する知的財産権

特許③• 発明の名称 ：光応答性細胞固定化剤• 出願番号：特願2018-105068• 出願人：国立大学法人東京大学• 発明者：山口 哲志,泉田 森,岡本 晃充
特許④• 発明の名称 ：生体物質固定化材料• 国際出願番号：PCT/JP2020/045492• 出願人：国立大学法人東京大学• 発明者：山口 哲志,上原 廉二朗,岡本 晃充

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お問合せ先株式会社東京大学TLO
シニアアソシエイト 竹埜 友祐
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