プロトコル
細 胞
増殖 / 毒性酸化
ストレス分 子生物学
細 胞 内蛍光プローブ
細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用
試
薬
膜タンパク質可 溶 化 剤ラベル化 剤
二価性
試 薬
イオン
電 極
その他
機能性
有機材料

マイトファジ―を検出したい
使用製品

解析装置

Mitophagy Detection Kit[MD01]I はじめにミトコンドリアはエネルギー産生の場として知られ、細胞内で重要な機能を持つオルガネラの一つです。近年では、アルツ
ハイマー病やパーキンソン病の原因の一つに不良化したミトコンドリアの蓄積が報告され、マイトファジ― がその中で重要な役割をもった機構であることが明らかになってきています。マイトファジ― は酸化ストレスや DNA 損傷等により不良化したミトコンドリアを選択的に除去するシステムであり、不良ミトコンドリアはオートファゴソームにより隔離され、リソソームと融合し消化されます。
࣑ࢺࢥࣥࢻࣜ࢔Autophagosome
ᙧᡂ本キットはマイトファジ― を検出する Mtphagy Dye と LysoDye で構成されています。Mtphagy Dye は細胞内の正常なミトコンドリアに集積し、化学結合により固定化されますが、その状態では蛍光強度は低くなっています。一方、マイトファ
ジ― が誘導されミトコンドリアがリソソームと融合すると、Mtphagy Dye の蛍光強度が増大します。またリソソーム選択的な染色試薬である Lyso Dye との共染色により、マイトファ
ジーを検出することが可能です。

Lysosome ࡜ࡢ⼥ྜෆᐜ≀ࡢศゎ

Mtphagy Dye ࡢ࣑ࢺࢥࣥࢻࣜ࢔࡬ࡢ㞟✚ࠊᅛᐃ໬: Mtphagy Dye㸦ᙅ࠸⺯ග㸧 ࣑ࢺࢥࣥࢻࣜ࢔ࡀࣜࢯࢯ࣮࣒࡜⼥ྜࡋࠊ㓟ᛶ᮲௳ୗ࡟ ࠾ ࠿ ࢀ ࡓ Mtphagy Dye ࡢ ⺯ ග ᙉ ᗘ ࡀ ቑ ኱ࠊ ᭦ ࡟: Mtphagy Dye㸦ᙉ࠸⺯ග㸧 Lysosome ᰁⰍヨ⸆ Lyso Dye ࡟ࡼࡿඹᰁⰍII 製品以外に必要なもの
・Dimethyl sulfoxide (DMSO)
・Hanks’Balanced Salt Solution (HBSS)
又は 無血清培地（フェノールレッド不含）
・マイクロピペット(2) 染色操作細胞※ を準備（操作 1~2）

III マイトファジ―の検出(1) 溶液調製
100 µmol/l Mtphagy Dye DMSO stock solution の調製
Mtphagy Dye 5 µg を含むチューブに 50 µl の DMSO を加えピペッティングにより溶解する。
※ 調製後は -20℃で保存する。調製後 1 か月間安定。

1 mmol/l Lyso Dye DMSO stock solution の調製
Lyso Dye 30 µg を含むチューブに 55 µl の DMSO を加えピペッティングにより溶解する。
※ 調製後は -20℃で保存する。調製後 1 か月間安定。

100 nmol/l Mtphagy Dye working solution の調製
最終濃度が 100 nmol/l になるように Mtphagy Dye DMSO stocksolution を Hanks’HEPES buffer または無血清培地（フェノールレッド不含）で希釈する。
※本試薬は血清成分と干渉するため、無血清培地または Hanks’HEPESbuffer で希釈する。

1 µmol/l Lyso Dye working solution の調製
最終濃度が 1 µmol/l になるように Lyso Dye DMSO stock solution
を Hanks’HEPES buffer または無血清培地（フェノールレッド不含）で希釈する。
※ 本 試 薬 は 血 清 成 分 と 干 渉 す る た め、 血 清 不 含 培 地 ま た は Hanks’
HEPES buffer で希釈する。

マイトファジーを誘導（操作 53）Mtphagy Dye添加（操作 3）

Lyso Dye添加（操作 6）

30分間インキュベート（操作 3）

30分間インキュベート（操作 6）

蛍光を観察（操作 7）※ 固定化した細胞では、Mtphagy Dye がミトコンドリアに集積することができません。また染色後に細胞を固定化すると、リソソームと融合したミトコンドリアは酸性に保たれず、Mtphagy Dye の蛍光は増大しません。

1) 細胞をディッシュに播種し培養する。
2) 培地を除去後、Hanks’HEPES buffer または血清不含培地で 2 回洗浄する。
3) 調製した 100 nmol/l Mtphagy Dye working solution を添加し、37℃で 30 分間インキュベートする。
4) 上澄みを除去後、Hanks’HEPES buffer または血清不含培地で 2 回洗浄する。
5) マイトファジー誘導刺激剤を含む培地を加え 37℃で適切な時間インキュベートする。蛍光顕微鏡にて誘導を確認する。
6) Mtphagy Dye と Lysosome の共局在を観察するため、1 µmol/l
Lyso Dye working solution を加え 37℃で 30 分間インキュベートする。
7) 上澄みを除去後、Hanks’HEPES buffer または無血清培地
で 2 回洗浄し、蛍光顕微鏡にて観察する。

技術的な内容に関するお問い合わせ先：カスタマーサポート Free Fax:0120-021557 Free Dial:0120-489548
在庫や価格(記載容量以外もしくは request)に関するお問い合わせ：マーケティング部 Tel:096-286-1515 Fax:096-286-1525(株)同仁化学研究所99

プロトコルIV Parkin 発現および未発現の HeLa 細胞でのマイトファジー検出例

4) Hanks’HEPES buffer で 2 回洗浄後、10 µmol/l CCCP(carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone) を含む培養培地で 24 時間培養した。
5) 蛍光顕微鏡でマイトファジーが起きていることを確認後、CCCP 含有培地を取り除き、1 µmol/l Lyso Dye working1) µ-slide 8 well (ibidi) に HeLa 細胞を播種し 37℃、CO2 イン
キュベーターにて一晩培養した。
2) HilyMax (Code : H357) を用いて Parkin プラスミドを細胞に導入し、さらに一晩培養した。
3) Hanks’HEPES buffer で 2 回洗浄後、100 nmol/l MitoBright
Deep Red (Code : MT08) を含む Mtphagy Dye working solutionを添加し 30 分インキュベートした。
Mtphagy Dye（マイトファジー染色）

solution を加え 30 分インキュベートした。
6) Hanks’HEPES buffer で 1 回洗浄後、共焦点レーザー顕微鏡で測定した。

Lyso Dye（リソソーム染色）

MitoBright Deep Red（ミトコンドリア染色）

重ね合わせBCDEFGH

Parkin (-)

Parkin (+)

A

その他

Parkin 発現 HeLa 細胞（上段写真）と未発現 HeLa 細胞（下段写真）を用いたマイトファジー観察A, E) Mtphagy Dye の蛍光画像、B, F) Lyso Dye の蛍光画像、C, G) MitoBright Deep Red の蛍光画像、D, H) 共染色蛍光画像
・Mtphagy Dye: 561 nm (Ex)、LP 650 nm (Em)・Lyso Dye: 488 nm (Ex)、502-554 nm (Em)・MitoBright Deep Red: 640 nm (Ex)、656-700 nm (Em)V 飢餓誘導条件下での検出例

Lyso Dye

機能性有機材料

重ね合わせControl1) µ-slide 8 well (ibidi) に HeLa 細胞を播種し 37℃、CO2 インキュベーターにて一晩培養した。
2) Hanks’HEPES buffer で 2 回洗浄後、100 nmol/l Mtphagy
Dye working solution を添加し 30 分インキュベートした。
3) Hanks’HEPES buffer で 2 回洗浄後、各飢餓誘導条件下にて 6 時間培養した。

Mtphagy Dye

Krebs-Ringer-HEPES buffer (pH=7.4) (115 mmol/l NaCl, 5 mmol/l KCl, 1mmol/l KH2PO4, 1.2 mmol/l MgSO4, 2 mmol/l CaCl2, 25 mmol/l HEPES) に
1.0 µmol/l Glucagon, 7.5 µmol/l Pepstatin A を添加する（表示は終濃度）
。

誘導条件①

誘導条件①：
Krebs’Buffer（Pepstatin A 及び Glucagon 含有）

誘導条件②：µmol/l E-64d を添加する（表示は終濃度）。

4) 蛍光顕微鏡でマイトファジーが起きていることを確認後、1µmol/l Lyso Dye working solution を加え 30 分インキュベートした。
5) Hanks’HEPES buffer で 1 回洗浄後、共焦点レーザー顕微鏡で測定した。

誘導条件②DMEM（アミノ酸不含、Pepstatin A 及び E-64d 含有）
DMEM（和光純薬工業、code: 048-33575) に 7.5 µmol/l Pepstatin A、1.0

HeLa 細胞の飢餓誘導条件下での検出例
・Mtphagy Dye: 561 nm (Ex)、LP 650 nm (Em)・Lyso Dye: 488 nm (Ex)、502-554 nm (Em)

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細 胞
増殖 / 毒性
酸化ストレス分 子生物学
細 胞 内蛍光プローブ細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用試薬
膜タンパク質可 溶 化 剤ラベル化 剤
二価性試 薬イオン
電 極100

プロトコル
細 胞
増殖 / 毒性酸化
ストレス分 子生物学
細 胞 内蛍光プローブ細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用
試薬
膜タンパク質可 溶 化 剤ラベル化 剤
二価性
試 薬
イオン
電 極
その他
機能性有機材料

参考文献
1) J. Koniga, C.Otta, M. Hugoa, T. Junga, A. L. Bulteaub, T. Grunea
and A. Hohna, “Mitochondrial contribution to lipofuscin formation”,
Redox Biology., 2017, 11, 673.
2) Kazuhisa Kameyama, “Induction of mitophagy-mediatedantitumor activity with folate-appended methyl-β-cyclodextrin”,
International Journal of Nanomedicine., 2017, 12, 3433-3446.
3) E. F. Fang, T. B. Waltz, H. Kassahun, Q. Lu, J. S. Kerr, M.
Morevati, E. M. Fivenson, B. N. Wollman, K. Marosi, M. A.
Wilson, W. B. Iser, D. M. Eckley, Y. Zhang, E. Lehrmann, I.
G. Goldberg, M. S. Knudsen, M. P. Mattson, H. Nilsen, V. A.
Bohr, and K. G. Becker., “Tomatidine enhances lifespan andhealthspan in C. elegans through mitophagy induction via
the SKN-1/Nrf2 pathway”, Scientific Reports., 2017, 7, 46208,
DOI: 10.1038/srep46208.
4) H. Iwashita, S. Torii, N. Nagahora, M. Ishiyama, K. Shioji, K.
Sasamoto, S. Shimizu, and K. Okuma, “Live Cell Imagingof Mitochondrial Autophagy with a Novel Fluorescent SmallMolecule”, ACS Chem. Biol., 2017, 12 (10), 2546.

FAQ
Q : 既存法に対する利点を教えてくださいA : pH センサー Keima タンパク質を用いた検出方法と比較して、本キットは低分子蛍光試薬を用いるため、蛍光タンパク質を発現させる必要がありません。また、一般的なライブセルイメージング用の蛍光試薬と同様の操作方法で染色、観察することができます。
Q : 蛍光顕微鏡の推奨フィルターを教えてください。
A : 各試薬に応じて以下のフィルターを推奨します。
Mtphagy Dye: 励起（500-560nm）、蛍光（670-730nm）
Lyso Dye: 励起（350-450nm）、蛍光（500-560nm）
Q : 染色前に細胞を固定化できますか？
A : 染色前に固定化すると、試薬のミトコンドリア集積能が失われるため、固定化はできません。
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