TS-01

第24回FMO研究会
FMOデータベースの最新機能紹介と実践チュートリアル-COVID-19関連タンパク質の分⼦認識機構解析2021.10.25<チュートリアル> FMODBを活⽤したタンパク質-タンパク質間相互作⽤解析渡邉 ⼀樹
千葉⼤学⼤学院薬学研究院

本⽇の内容1• FMO計算によるタンパク質-タンパク質間相互作⽤解析の例〜SARS-CoV-2 RBD-Class1 抗体間の相互作⽤解析• FMODBを活⽤した相互作⽤解析• 1:1の相互作⽤解析・デモ• N:1の相互作⽤解析・デモ• N:Mの相互作⽤解析・デモ↑本⽇の解析・デモの題材
K. Watanabe et al, J. Phys. Chem. Lett.
2021, 12, 4059-4066

本⽇の内容2• FMO計算によるタンパク質-タンパク質間相互作⽤解析の例〜SARS-CoV-2 RBD-Class1 抗体間の相互作⽤解析• FMODBを活⽤した相互作⽤解析• 1:1の相互作⽤解析・デモ• N:1の相互作⽤解析・デモ• N:Mの相互作⽤解析・デモ↑本⽇の解析・デモの題材
K. Watanabe et al, J. Phys. Chem. Lett.
2021, 12, 4059-4066

3

SARS-CoV-2の宿主細胞内への侵⼊機構
Walls, A. C. et al., Cell (2020)

SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 受容体結合部位(RBD, seq #: 333-527)

Viral binding

Spike protein(S-protein,三量体)

Endocytosis
ACE2受容体
Replication

ACE2受容体

Spike protein上のRBDと宿主細胞表⾯のACE2受容体の相互作⽤を契機に、ウイルスの宿主細胞内への侵⼊が促進される。

4

SARS-CoV-2 治療薬へのヒント〜中和抗体
中和抗体: 回復期患者の⾎漿中から単離、SARS-CoV-2治療薬のヒントとして期待されている。
Class 2Class 1Class 3

RBDを標的とした有⼒な医薬品候補

Barnes, C. O. et al. Nature (2020)

ACE2Class 4RBD

ACE2-bindingsite overlap

RBD-Class 1抗体間の結合様式の理解が、治療薬開発に新たな知⾒をもたらすことが期待される。

5

本研究の⽬的⼤規模分⼦間の精密な相互作⽤解析を⾏える
FMO法を⽤いて、WT RBD - Class 1抗体間の相互作⽤解析を⾏う。

Spike RBD

12種の複合体について、
1. 結合エネルギーと阻害活性の相関の確認

MonoclonalAntibody(12種類)

2. 界⾯付近の重要残基の決定と結合様式の理解

既存のClass 1抗体をもとにした抗体医薬品開発に有益な情報獲得に向けて、WT RBD-Class 1抗体間のFMO計算を⾏う。

WT RBD-Class 1抗体間の相互作⽤解析〜計算準備
単量体RBD-抗体複合体の切り出し (例. 6XCN)
⽬的構造の切り出し

C105 FabHeavy chain

⽔素付加・⽋損構造の補填(MOE 2019.01)

構造最適化

C105 FabLight chain

⽔素→側鎖→主鎖の順に最適化(⼒場: Amber10:EHT)

フラグメント分割プログラム (FMOeプログラム)

FMO計算[FMO2-MP2/6-31G]
S-protein

計算プログラム: ABINIT-MP
計算機: Oak-forest-PACS(東⼤・筑波⼤)RBD(T333-P527)

6XCN

上記の⼿順で構造作成を⾏い、WT RBD-中和抗体複合体間の相互作⽤解析を⾏った。

67WT RBD-Class 1抗体間の相互作⽤エネルギー
FMO計算により得られたWT RBD全体-Class 1抗体全体間の相互作⽤エネルギー
PDB ID

Antibody

pIC50

ES
EX
CT+mixDI
IFIE-sum(kcal/mol) (kcal/mol) (kcal/mol) (kcal/mol) (kcal/mol)

7JZL

LCB1(peptide)

10.60-914.95

204.57-89.19-151.11-950.68

7JZN

LCB3(peptide)

10.30-710.16184.14-91.00-148.18-765.20

6XCM
7JMO
7CH4
7C01
7BZ5
7CH5
7K8M
6XC4
6XC26XE1

C105
COVA2-04
BD-604
CB6B38
BD-629C102
CC12.3CC12.1
CV30

9.26
8.33
9.63
9.13
8.43
9.89
9.15
9.39
9.41
9.19

-483.10-440.55-547.12-448.19-540.93-634.10-373.89-370.63-514.82-334.32

212.13255.57246.16232.43309.41
303.33234.51210.50325.21
194.81-103.20-121.64-115.03-111.38-142.59-132.60-110.14-97.78-141.15-95.50-150.25-177.23-166.85-170.43-200.65-186.59-162.75-145.58-233.30-146.96-524.41-483.85-582.85-497.58-574.75-649.97-412.27-403.50-564.06-381.96*IFIE-sum: RBD全フラグメント-抗体全フラグメント間のIFIEの和計算値であるIFIE-sumと実測値であるpIC50の相関の確認を⾏った。

8

相互作⽤エネルギーと阻害活性の相関の確認

7JZL

LCB1(peptide)

10.60-950.68

7JZN

LCB3(peptide)

10.30-765.20

6XCM
7JMO
7CH47C01
7BZ57CH57K8M
6XC46XC26XE1C105COVA2-04BD-604
CB6B38BD-629C102CC12.3
CC12.1
CV309.26
8.33
9.63
9.13
8.43
9.89
9.15
9.39
9.41
9.19-524.41-483.85-582.85-497.58-574.75-649.97-412.27-403.50-564.06-381.96

R 2 = 0.540
IFIE-sum [kcal/mol]

Antibody

結合エネルギー

pIC50

IFIE-sum(kcal/mol)

PDB ID

pIC50

阻害活性

IFIE-sumとpIC50の間に良好な相関を確認
では、結合エネルギーに⼤きく寄与しているアミノ酸残基は?

9Class 1抗体との相互作⽤に重要なRBD上の残基Class 1抗体との相互作⽤に重要なRBD上の残基 (フラグメント) を次の⼿順で検出* Watanabe, C. et al. Chemical Science (2021)

2. ES < -3 kcal/mol or
CT+mix < -3 kcal/mol or
DI < -3 kcal/mol ?
1.

! 𝑰𝑱 ≠ Δ𝑬𝑬𝑺
Δ𝑬
𝑰𝑱 ?

(抗体と近接相互作⽤を形成しているか?)

sYe

Yes

(基準は先⾏研究*を参照)

?

NoNo

Important Residue!

Not important…
RBD

12構造中での検出回数をRBD表⾯上にカラーマッピング

エネルギー成分の基準を設けて、⽬視ではなく計算値から重要残基を検出
結果の可視化のために、検出回数をRBD上にカラーマッピング

10

RBD表⾯上の重要残基のカラーマッピング
RBD上の52残基が少なくとも1構造でImportant Residueとして検出※⽩⽂字の9残基は12構造全てでImportant Residueとして検出

F486
A487
A475
F456
Y421
T415

90°
rotation

K417
Y505 N501

A487
Y421

F486
K417Y505

T415

Importantinteraction
region9残基が全構造でImportant Residueとして検出された。
これらの残基の活性への寄与の度合いは?

N501

012The frequencies ofthe selected residues

RBD 9残基-Class 1抗体の計算値と実測値の相関
pIC50

IFIE-sum(kcal/mol)

6XCM

LCB1(peptide)
LCB3(peptide)
C105

7JMO

COVA2-04

8.33-213.46

7CH4
7C01
7BZ5
7CH5
7K8M
6XC4
6XC2
6XE1

BD-604
CB6B38BD-629
C102
CC12.3CC12.1
CV30

9.63
9.13
8.43
9.89
9.15
9.39
9.41
9.19-265.81-252.93-270.11-336.00-168.66-250.00-283.65-219.39

7JZL
7JZN

10.60-355.05

10.30-365.32

9.26-216.99

R 2 = 0.555
IFIE-sum [kcal/mol]

Antibody

結合エネルギーPDB ID※ RBD全体-Class 1抗体全体
R 2 = 0.540

pIC50

阻害活性

先のRBD全体の相関とほぼ同程度の相関がみられた。
着⽬した9残基は結合エネルギーに⼤きく寄与している。

11129残基の中で特に重要な相互作⽤ (例 RBD-BD-629 Fab)①. K417, N501 (変異報告のあるアミノ酸残基): ⽔素結合G100H

K417spike
D101H
Y102H

検出されなかった芳⾹族アミノ酸残基: π軌道相互作⽤

G54H

変異 (K417T/N)による

OD1OG

Y99H

F456spikeY421spike

抗体からのescapeのY52H

報告あり
Y33H

(β株、γ株)

N501spike

Luan, B. et al., JPCL(2020)②. 関連研究 (分⼦動⼒学 (MD) 法) では

L455spike

Y33H: ⽔素結合
F32L

変異 (N501Y) による感染⼒増強の報告あり(α、β、γ株で共通)

S30L

野⽣型で重要であったことから、変異の影響は⼤きいと思われる。

S30L

Y106H

F486spikeY505spike

G28L

DI項によりπ軌道相互作⽤を精密に評価することができた。

V29L

本⽇の内容13• FMO計算によるタンパク質-タンパク質間相互作⽤解析の例〜SARS-CoV-2 RBD-Class1 抗体間の相互作⽤解析• FMODBを活⽤した相互作⽤解析• 1:1の相互作⽤解析・デモ↑本⽇の解析・デモの題材• N:1の相互作⽤解析・デモ• N:Mの相互作⽤解析・デモ

そもそも何を表しているのか?

K. Watanabe et al, J. Phys. Chem. Lett.
2021, 12, 4059-4066

FMO計算の解析の基本単位 (例: RBD-BD-629 Fab)
① 1:1解析② N:1解析③ N:M解析

着⽬フラグメントと着⽬フラグメント群と着⽬フラグメント群とその他のフラグメントとの間のある1フラグメントとの間のその他のフラグメント群の相互作⽤解析

相互作⽤解析

相互作⽤解析

例. RBD K417-抗体 H鎖 D101

例. RBD-抗体 H鎖 D101

例. RBD-抗体

Lys417spike？

？

？

Asp101H

Asp101H

抗体
RBD

RBD

(紫: H鎖、⽔⾊: L鎖)

14

本⽇の内容15• FMO計算によるタンパク質-タンパク質間相互作⽤解析の例〜SARS-CoV-2 RBD-Class1 抗体間の相互作⽤解析• FMODBを活⽤した相互作⽤解析• 1:1の相互作⽤解析・デモ• N:1の相互作⽤解析・デモ• N:Mの相互作⽤解析・デモ

⽬標: 着⽬フラグメントと強く相互作⽤
しているフラグメントの決定↑本⽇の解析・デモの題材
K. Watanabe et al, J. Phys. Chem. Lett.
2021, 12, 4059-4066

フラグメント間の相互作⽤解析 (該当構造の検索)

16

FMODB HOMEでID Searchを選択①

Download Filesを選択③→ All Calculation Data (zip)

解析対象のPDB or FMODB IDを⼊⼒

解析構造をダウンロード (7ch5_wt_optall.cpf、FMODB IDを選択②

PDB ID: 7CH5FMODB ID: JM5M9

後でBiostation Viewerでの解析の際に利⽤)①②③

フラグメント間の相互作⽤解析 (重要な相互作⽤の検出)Interactive modeの設定•Base fragment(s) of PIEDA/IFIEでSingle fragmentを指定④•

真下の欄で着⽬残基を選択(今回はK417 or N501) ➄•Distance from base fragment(s) [Å]で4.5と⼊⼒⑥ → Submit

着⽬残基との最近接原⼦間距離が4.5 Å以内にある残基についての相互作⽤
エネルギーの積み上げ棒グラフが表⽰される。

④➄
⑥17

18

フラグメント間の相互作⽤解析 (重要な相互作⽤の検出)
7CH5 (Distance from fragment 509 (417:Lys) < 4.5 Å)
Tyr52H
Tyr

Tyr

Asp101H

Asp
抗体 H鎖

Lys417spike
Tyr102H

RBD

7CH5 (Distance from fragment 591 (501:Asn) < 4.5 Å)
Ser30L
SerSerAsn501spike
抗体 L鎖

RBD

Ser31Lフラグメント間の相互作⽤解析 (必要な相互作⽤のみ表⽰)
先ほどの設定はそのまま

結果を表⽰したい残基番号のみを⼊⼒ → Submit
出⼒される積み上げ棒グラフ•417:Lys•

501:Asn19

フラグメント間の相互作⽤解析 (XH/π相互作⽤の解析)
Tool > CHPI を選択

20② PDB File⼊⼒後、File > Set Default Valueを選択 → ※が⼊⼒される① 該当のPDB※

Fileを選択③ only interに変更④ 実⾏
基本的には⼊出⼒ファイル、Type of interactions以外は変更しない。

フラグメント間の相互作⽤解析 (XH/π相互作⽤の解析)
7ch5_wt_optall.hpiをテキストエディタで開く
中ほどにある**Intermolecular H/pi interactions**を確認

Tyr52H

Asp101H

Lys417spike
NHZ3

Tyr102H

⽬視のみならず、計算結果から根拠を持ってXH/π相互作⽤の有無を判断できる

21

本⽇の内容22• FMO計算によるタンパク質-タンパク質間相互作⽤解析の例〜SARS-CoV-2 RBD-Class1 抗体間の相互作⽤解析• FMODBを活⽤した相互作⽤解析• 1:1の相互作⽤解析・デモ• N:1の相互作⽤解析・デモ• N:Mの相互作⽤解析・デモ↑本⽇の解析・デモの題材
⽬標: 着⽬フラグメント群と強くK. Watanabe et al, J. Phys. Chem. Lett.
2021, 12, 4059-4066

相互作⽤しているフラグメントの決定23

1フラグメント-全フラグメント間の相互作⽤解析
Interactive modeの設定• Base fragment(s) of PIEDA/IFIEで①

Muti fragmentsを指定①②• 抗体 or RBDの全フラグメントを⼊⼒(抗体: 1-426, RBD: 427-606) ②③• Distance from base fragment(s) [Å] で4.5と⼊⼒③ → Submit (少し時間かかる)
Distance from fragments 1-426 (417:Lys) < 4.5 ÅDistance from fragments 427-606 (417:Lys) < 4.5 Å)

GluAsp1フラグメント-全フラグメント間の相互作⽤解析 (結果の可視化)
I.

Model > Structure > Solid Ribbonを選択→デフォルト (Cα[line]) よりも後の結果が⾒やすい。

II.

Monitor > IFIE/PIEDA > N:1①

表⽰する値を選択①
Base Fragmentsに抗体 orRBDの全フラグメントを⼊⼒②②③

抗体: 1-426、RBD: 427-606
可視化の際のMin, Maxの値の指定③④→ Apply④

24

25

1フラグメント-全フラグメント間の相互作⽤解析 (出⼒結果)
リボン上の⾊・濃淡の違いにより、相互作⽤に寄与する残基を判断できる。
-30

30Interaction Energy

Base fragments 1-426

Base fragments 427-606
Glu26H

SARS-CoV-2
S-protein RBD

BD-629 FabSARS-CoV-2

Asp101H

S-protein RBD

BD-629 Fab本⽇の内容26• FMO計算によるタンパク質-タンパク質間相互作⽤解析の例〜SARS-CoV-2 RBD-Class1 抗体間の相互作⽤解析• FMODBを活⽤した相互作⽤解析• 1:1の相互作⽤解析・デモ• N:1の相互作⽤解析・デモ• N:Mの相互作⽤解析・デモ↑本⽇の解析・デモの題材
K. Watanabe et al, J. Phys. Chem. Lett.
2021, 12, 4059-4066

⽬標: RBD-抗体間の相互作⽤

エネルギーと活性値pIC50の相関の確認

N:Mの相互作⽤解析 (12構造のBinding Energy取得)

27① カンマ区切りで使いたいBinding EnergyのFMODB IDを⼊れてGoogle Chrome等のアドレスバーに代⼊
http://drugdesign.riken.jp/fcgibin/fmodbrest/depositor/data/manual/ligand/GQ1L1,1JR2Z,9Y3N2,8JL8Y,N34VQ,JM169,3N63L,JM5M9,V2M81,MM56Z,7J93K,LL1M9

この部分に⽤いる
FMODB IDを羅列② 出⼒は下記のように、FMODB IDごとに返ってくる (下記は異なる系の出⼒例)。
“SUM_TOTAL”に対応する数値 (⾚枠内) を何らかの⽅法で抜き出し、pIC50との相関を確認する。
!"#$%&%"'(!")*+,-.,"'"/0123"4"5+6&76&"'!")89:;<=7>$%&=?&$+6<6+&7<,?&?<@+=*?&"'"AB3"4"CD8<8<)=?>*76&<6E*-7=%"'"3F330433GF23H"4"CD8<I<)=?>*76&<6E*-7=%"'"23J"4"K.L:M<CD8<LC"'"F3G3BGGHN"4"K.L:M<CD8<LO"'"HGBNGGG"4"K.L:M<CD8<5P"'"F2JBGHJH"4"K.L:M<CD8<:.<8K0"'"FHQB2G33"4"K.L:M<CD8<R<.S"'"AB03NA"4"CD8<P9PM#"'"F3H3BN2Q3"4".).L<CD8<8K0"'"F3H3BN2Q3"4".).L<CD8<T)"'"FJNB0JGA"4";$6,$6><L67=>U<#?-7V"'"#$>?6,W-$6,$6>W767=>UWX$&Y+E&W%+VZ76&"4"6+&7"'"PY$%WZ?VE7W$%W%E**?&$+6W+@W.).LW-7&X776W=7[7\&+=W?6,WV$>?6,W@=?>*76&%WX$&Y+E&W%+VZ76&W@=?>*76&%B"]]4W・・・!")*+,-.,"'"3S#8^"4"5+6&76&"'!")89:;<=7>$%&=?&$+6<6+&7<,?&?<@+=*?&"'"AB3"4"CD8<8<)=?>*76&<6E*-7=%"'"3F3GG43GNF
2AG"4"CD8<I<)=?>*76&<6E*-7=%"'"2AQ"4"K.L:M<CD8<LC"'"F0HBN3HG"4"K.L:M<CD8<LO"'"0QBN3_A"4"K.L:M<CD8<5P"'"FHBQQQH"4"K.L:M<CD8<:.<8K0"'"F
20B233Q"4"K.L:M<CD8<R<.S"'"ABAA3G"4"CD8<P9PM#"'"FG2BHNH_"4".).L<CD8<8K0"'"FG2BHNH_"4".).L<CD8<T)"'"F33BQQ_0"4";$6,$6><L67=>U<#?-7V"'"#$>?6,W-$6,$6>W
767=>U"4"6+&7"'"=7*+Z7,W&Y7W.).LW+@W5`C3GQW"]]a4"5+E6&"'2]

28

N:M (IFIE-sumと活性値の相関の確認)
The Correlation between pIC50 and SUM_TOTAL

R 2 = 0.540
IFIE-sum [kcal/mol]

SUM_TOTAL [kcal/mol]

-400
-500

R² = 0.5397-600-700-800

SUM_TOTAL [kcal/mol]

-300

-900
-1000
88.5

99.5

pIC50

1010.5

11pIC50

pIC50

N:M (BioStation Viewerでの複合体間のエネルギーの取り出し)

29

Monitor > IFIE/PIEDA > N:M

取得したい種類のエネルギーを選択
抗体 (1-426) とRBD (427-606) の全フラグメント番号をそれぞれ⼊⼒

ウインドウ左下の欄に⼊⼒したフラグメント間のエネルギーが出⼒される(左の例はMP2 (IFIE-sum))30

まとめ• タンパク質-タンパク質間相互作⽤を対象に、FMODBとBioStation Viewerを活⽤して1:1, N:1, N:M等の⽬的に応じた解析を⾏うことが出来る。
• 1:1, N:1解析において、着⽬構造に関する計算結果、構造の可視化や重要残基の検出をスムーズに⾏うことが出来る。
• N:M解析において、複数の計算結果をFMODBからJSON形式で⼀括で取得し、実験値と計算値の相関の確認等、種々の解析をスムーズに⾏うことが出来る。
Lys417spike？

？
Asp101H

Asp101H？
AntiBody

RBD

RBD