プロトコル
細 胞
増殖 / 毒性酸化
ストレス分 子生物学
細 胞 内蛍光プローブ細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用
試
薬
膜タンパク質可 溶 化 剤ラベル化 剤
二価性
試 薬
イオン
電 極

硫化水素を系の中に加えたい
使用製品-SulfoBiotics- Sodium sulfide (Na2S)-SulfoBiotics- GYY4137-SulfoBiotics- H2S donor 5a-SulfoBiotics- H2S donor 8l-SulfoBiotics- H2S donor 8o[SB01][SB06][SB07][SB08][SB09]I はじめに近年、硫化水素（H2S）が、血管拡張や細胞保護、インスリン分泌や神経伝達調節など様々な生理活性を示すことが明らかにされ、一酸化窒素 (NO) や一酸化炭素 (CO) に続く重要なシグナル分子として注目されている。硫化水素は、NO や CO と同様にガス状分子として認知されているが、その pKa は約 7 であり、生理的 pH では約 80% が硫化水素イオン (HS-) の状態で存在する。また、硫化水素イオンは生体内で様々な結合形態や構造をとるため、その作用機序の詳細は未だ不明であり、硫化水素を中心とした硫黄の生体内機能の解明が待ち望まれている。
硫化ナトリウム (Na2S) は、最も一般的に使用されている硫化水素ドナーであり、水に溶解すると速やかに分解して硫化水素を放出する1), 2)。
GYY4137 は、P. K. Moore らによって開発された徐放型の硫化水素ドナーであり、加水分解によって持続的に硫化水素を放3)出する試薬である 。そのため、硫化ナトリウムや硫化水素ナトリウム添加のような一過性の刺激では観察されない血圧降下4-7)作用や抗がん作用などの効果を示すことが確認されている 。
H2S donor 5a, 8l, 8o は、M.Xian らが開発した新規の硫化水素ドナーであり、生体内に存在する還元物質（グルタチオンや8-9)システインなど）に応答して硫化水素を発生する 。水溶液
中では安定であるが、血液や組織、細胞に添加するとチオール10)を有する還元物質によって分解され、硫化水素を放出する 。

表 1 各 H2S ドナー類の特徴
ドナー

基本骨格

放出機構

H2S 発生場所

放出パターン

参考データ

Na2S

無機質-

細胞外

即座に-

その他

GYY4137

ローソン試薬加水分解反応細胞外

ゆっくりと持続的に 数時間～数日間持続

機能性
有機材料

H2S donor 5aN-(Benzoylthio)
benzamide

グルタチオンやシステインとの反応

細胞内グルタチオンやシス 放出ピーク時間 20 分※
テインの濃度に依存

H2S donor 8l

N-Acetyl-DLpenicillamine

グルタチオンやシステインとの反応

細胞内グルタチオンやシス 放出ピーク時間 15 分※
テインの濃度に依存

H2S donor 8o

N-Acetyl-DLpenicillamine

グルタチオンやシステインとの反応

細胞内グルタチオンやシス 放出ピーク時間 40 分
※テインの濃度に依存

3)※ H2S donor 5a, 8l, 8o のピーク時間は、100 μmol/l の各 H2S donor が 5 mmol/l グルタチオンと反応した場合の値を示す。

II Sodium Sulfide (Na2S) を用いた硫化水素の検出
1. 使用方法
1) 本試薬 7.8 mg を秤量し、超純水 ( 窒素バブリング処理済 )1 mlを添加して溶解し、100 mmol/l Na2S 水溶液とする。
2) この溶液を実験に応じて超純水（窒素バブリング処理済）で希釈し、ご使用ください。

5) 30 分間室温でインキュベートした後、96 穴マイクロプレー
トに各溶液を 200 μl ずつ添加した。
6) マイクロプレートリーダーで、516 nm の蛍光強度 (Ex: 491 nm)を測定した。
45000※ 本試薬は溶解すると有毒な硫化水素を発生します。ご使用になる前に SDS をご参照ください。

※ 調製した Na2S 水溶液は、保存できません。溶液調製後、すぐにご使用ください。

2. HSip-1 を用いた硫化水素の検出
1) 100 mmol/l Na2S 水溶液 20 μl に、超純水 980 μl を添加して2 mmol/l Na2S を調製した。
2) 1) で調製した溶液 100 μl に、超純水 900 μl を添加して 200μmol/l Na2S 溶液を調製した。
3) 2) で調製した溶液を順次 2 倍希釈し、Na2S 標準液 (200,100, 50, 25, 12.5, 6.3, 3.2, 0 μmol/l) を調製した。
4) 調製した Na2S 標準液 300 μl に、200 μmol/l HSip-1 working
solution 350 μl を添加し、ボルテックスにより混合した ( 全量 650 μl)。

Fluorescence Intensity (a.u.)※ 超純水は使用前に 30 分間以上、窒素バブリングを行ってください。
溶存酸素によって酸化される可能性があります。

R² = 0.998

40000
35000
30000
25000
20000
15000
10000
5000
0050100150200

Na2S (μmol/l)

図 2 硫化水素濃度に依存した 516 nm の蛍光強度変化

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プロトコル

III GYY4137 を用いた硫化水素の放出

2) 20 mmol/l H2S donor Stock Solution を実験に応じてバッファーや培地などに希釈してご使用ください。
※本試薬はグルタチオンやシステインなどの還元物質と反応すると有毒な硫化水素を発生します。ご使用になる前に SDS をご参照ください。

図 3 GYY4137 の加水分解による硫化水素放出
1. 使用方法
1) 本試薬 3.8 mg を秤量し、超純水 0.5 ml を添加した後、ピペッティングにより溶解し、20 mmol/l GYY4137 Stock Solutionとする。

2. H2S donor 5a、8l、8o のグルタチオン (GSH) 添加による硫化水素放出例
1) 20 mmol/l H2S donor Stock Solution 10 μl を PBS 2 ml に添加して 100 μmol/l H2S donor(PBS) 溶液とした。
2) GSH を終濃度が 5 mmol/l となるように添加した後、密栓して室温でインキュベートした。
3) 各時間で溶液を分取し、メチレンブルー法によって硫化水素量を測定した。

※ この溶液を少量小分けし、-20℃以下で保存ください。約 2 ヶ月間は安定です。

2) 20 mmol/l GYY4137 Stock Solution を実験に応じて中性バッファーや培地などに希釈してご使用ください。
※ 中性バッファーや培地に添加すると有毒な硫化水素を発生します。
ご使用になる前に SDS をご参照ください。

2. GYY4137 の PBS 中における硫化水素放出例
1) 20 mmol/l GYY4137 Stock Solution 10 μl を PBS 2 ml に添加して 100 μmol/l GYY4137 (PBS) 溶液とした後、密栓して室温でインキュベートした。
2) 各時間で溶液を分取し、メチレンブルー法によって硫化水素量を測定した。

細 胞
増殖 / 毒性酸化ストレス分 子生物学
細 胞 内
蛍光プローブ細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用
試薬
膜タンパク質可 溶 化 剤ラベル化 剤
二価性
試 薬
イオン電 極その他機能性有機材料

図 4 GYY4137(100 μmol/l) の PBS 中における硫化水素放出パターン

IV H2S donor 5a、8l、8o を用いた硫化水素の放出

図 6 100 μmol/l H2S donor 5a（上図）、8l、8o（下図）の5mmol/l GSH 添加による硫化水素放出パターン

参考文献
1) R. Greiner, Z. Palinkas, K. Basell, D. Becher, H. Antelmann,
P. Nagy and T. P. Dick, “Polysulfides link H2S to protein thioloxidation”, Antioxid. Redox Signal., 2013, 19, 1749.
2) N. S. Lawrence, J. Davis and R. G. Compton, “Analytical

図 5 H2S donor 5a、8l、8o の還元物質による硫化水素放出
1. 使用方法
1) H2S donor 10 mg に DMSO (5a: 1.95 ml, 8l: 1.56 ml, 8o: 1.38 ml)を添加した後、ピペッティングによって溶解し、20 mmol/l
H2S donor Stock Solution とする。
※この溶液を少量小分けし、-20℃以下で保存ください。約 2 ヶ月間は安定です。

strategies for the detection of sulfide: a review”, Talanta,
2000, 52, 771.
3) L. Li, M. Whiteman, Y. Y. Guan, K. L. Neo, Y. Cheng, S.
W. Lee, Y. Zhao, R. Baskar, C-H. Tan, and P. K. Moore,“Characterization of a Novel, Water-Soluble Hydrogen SulfideReleasing Molecule (GYY4137): New Insights Into the Biologyof Hydrogen Sulfide”, Circulation, 2008, 117, 2351.
4) M. Whiteman, L. Li, P. Rose, C-H. Tan, D. B. Parkinson, andP. K. Moore, “The Effect of Hydrogen Sulfide Donors of
Lipopolysaccharide-Induced Formation of Inflammatory Mediators
in Macrophages”, Antioxid. Redox Signal., 2013, 19, 1749.

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細 胞
増殖 / 毒性酸化ストレス分 子生物学
細 胞 内蛍光プローブ細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬細菌研究用試薬
膜タンパク質可 溶 化 剤ラベル化 剤
二価性試 薬イオン電 極5) Z. W. Lee, J. Zhou, C-S. Chen, Y. Zhao, C-H. Tan, L. Li, P.
K. Moore, and L-W. Deng, “The Slow-Releasing Hydrogen
Sulfide Donor, GYY4137, Exhibits Novel Anti-Cancer Effects
In Vitro and In Vivo”, PLos One, 2011, 6, e21077.
6) L. Li, B. Fox, J. Keeble, M. Salto-Tellez, P. G. Winyard, M. E.
Wood, P. K. Moore, and M. Whiteman, “The complex effectsof the slow-releasing hydrogen sulfide donor GYY4137 ina model of acute joint inflammation and in human cartilagecells”, J. Cell. Mol. Med., 2013, 17, 365.
7) Z. Liu, Y. Han, L. Li, G. Meng, X. Li, M. Shirhan, M. T. Peh,L. Xie, S. Zhou, X. Wang, Q. Chen, W. Dai, C-H. Tan, S.
Pan, P. K. Moore and Y. Ji, “The hydrogen sulfide donor,
GYY4137, exhibits anti-atherosclerotic activity in high fat fed-/apolipoprotein E mice”, Br. J. Pharmacology, 2013, 169, 1795.
8) Y. Zhao, H. Wang and M. Xian, “Cysteine-Activated Hydrogen
Sulfide (H2S) Donors”, J. Am. Chem. Soc., 2011, 133, 15.
9) C-T. Yang, Y. Zhao, M. Xian, J-H. Li, Q. Dong, H-B. Bai, J-D.
Xu, M-F. Zhang, “A Novel Controllable Hydrogen SulfideReleasing Molecule Protects Human Skin Keratinocytes
Against Methylglyoxal-Induced Injury and Dysfunction”, Cell.
Physiol. Biochem., 2014, 34, 1304.
10) Z. W. Lee, J. Zhou, C-S. Chen, Y. Zhao, C-H. Tan, L. Li, P.
K. Moore, and L-W. Deng, “The Slow-Releasing Hydrogen
Sulfide Donor, GYY4137, Exhibits Novel Anti-Cancer Effects
In Vitro and In Vivo”, PLos One, 2011, 6, e21077.

その他
機能性有機材料

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