プロトコル

酵素 (POD,ALP) を標識したい
細 胞
増殖 / 毒性
利用製品
酸化< 少量抗体 (10μ g) 標識用 >ストレスAb-10 Rapid Peroxidase Labeling Kit[LK33]
分 子< 抗体・タンパク質 (50-200μ g) 標識用 >Peroxidase Labeling Kit-NH2[LK11]
生物学
Peroxidase
Labeling
Kit-SH[LK09]
細 胞 内Alkaline Phosphatase Labeling Kit - NH2[LK12]
蛍光プローブ
Alkaline Phosphatase Labeling Kit - SH
[LK13]細胞 プロトコル染色
I はじめにミトコンドリア
酵素 (POD,ALP) を標識したい
Peroxidase (POD) および alkaline phosphatase (ALP) は、
関連試薬
基質特異性が高くかつ分光法、蛍光法、発光法用の検出試薬も
利用製品
細菌研究用
豊富に揃っていることから、酵素免疫測定 ( E I A ) で汎用され< 少量抗体 (10μ g) 標識用 >試薬ている。一般には、PO D またはA L PKit
を標的分子 [LK33]( 抗原、抗Ab-10 Rapid peroxidase
Labeling
膜タンパク質体等 ) に標識し、その標識体を用いて抗原－抗体反応を行う。
< 抗体・タンパク質 (50-200μ g) 標識用
標識体は、標的分子のアミノ基またはS H 基に、P [LK11]
O D また
Peroxidase Labeling Kit-NH2
可 溶 化 剤
Peroxidase Labeling Kit-SH[LK09]
は ALP を反応させることで、安定な共有結合体として得ら
ラベル
Alkaline Phosphatase
Labeling
Kit -Alkaline
NH2[LK12]れる。Peroxidase
Labeling Kits
および
Phosphatase
化 剤
Alkaline
Phosphatase
Labeling
Kit
SH[LK13]
Labeling kit は、PO D または A L P を標的分子のアミノ基また
二価性
は S H 基に標識するためのキットである。P O D および A L P
試 薬
I はじめには、あらかじめスクシンイミジルエステル基やマレイミド基でイオン活性化されているため、標的分子と混合するだけで標識体を得Peroxidase (POD) および alkaline phosphatase (ALP) は、ることができる。
基質特異性が高くかつ分光法、蛍光法、発光法用の検出試薬も
電 極
その他
機能性
有機材料

豊富に揃っていることから、酵素免疫測定 ( E I A ) で汎用され小社では、サンプルの種類や量に応じて試薬を混ぜるだ
Dる
または
Pき
を標的分子
け で 30ている。一般には、P
分 以 内 に 標 識 体 をO得
こ とAのLでる Ab-10( 抗原、抗
Rapid
体等
)
に標識し、その標識体を用いて抗原－抗体反応を行う。
Peroxidase Labeling Kit 及び、前処理－反応までを一つの標識体は、標的分子のアミノ基または S H 基に、P O D また
フィルトレーションチューブ上で行い、3 時間以内に目的のは ALP を反応させることで、安定な共有結合体として得られ標識体を得ることができる Peroxidase Labeling Kit - NH2/SH、る。Peroxidase Labeling Kits および Alkaline PhosphataseL a
Alkaline Phosphatase Labeling Kit – NH2/SH を製品化している。
b e l i n g K i t s は、PO D または A L P を標的分子のアミノ基
これらのキットを使用した酵素標識体の作製法について紹介
または S H 基に標識するためのキットである。P O D およびする。 A L P は、あらかじめスクシンイミジルエステル基やマレイミ
ド基で活性化されているため、標的分子と混合するだけで標識a)NH2 標識体を得ることができる。 b)SH 標識
サンプル

＊

解析装置

II Ab-10 Rapid Peroxidase Labeling Kit によるアミノ基への Peroxidase 標識 (Code: LK33)
1.
キット内容
解析装置
・Reactive Peroxidase
・Reaction Buﬀer
・Stop Solution
2. キット以外に必要なもの
・20 μ l,200 μ l マイクロピペッタ－ 、マイクロチューブ（サンプル及び Working buﬀer 調製用）
インキュベーター
（37℃）
3. 操作
1) 抗体量が 10 μ g に相当する量の 0.5 ～ 1 mg/ml に調製した
3. 操作
抗体溶液をマイクロチューブに入れる。
1) 抗体量が 10 μ g に相当する量の 0.5 ～ 1 mg/ml に調製した
2) 抗体溶液をマイクロチューブに入れる。
操作 1 の抗体溶液に Reaction Buffer を加え、ピペッティン
グにより混合する。
2) 操作 1 の抗体溶液に Reaction Buffer を加え、ピペッティン
3) グにより混合する。
操作 2 の溶液を Reactive Peroxidase に加え、ピペッティン
3) グにより混合する。
操作 2 の溶液を Reactive Peroxidase に加え、ピペッティン
グにより混合する。
4) 37℃で
10 分間反応する。
4) 37℃で分間反応する。
5)
操作 4 10の溶液にStop Solution を加え、ピペッティングによ5) 操作 4 の溶液に Stop Solution を加え、ピペッティングにより混合する。
り混合する。
6) 室温で 10 分間反応する。
6) 室温で 10 分間反応する。
7)
操作 6 の標識抗体を実験に用いる。または、冷蔵で保存する。
7) 操作 6 の標識抗体を実験に用いる。または、冷蔵で保存する。

※
抗体溶液に含まれる添加剤は、その濃度が高い場合に標識反応を※ 抗体溶液に含まれる添加剤は、その濃度が高い場合に標識反応を妨害することがあります。詳細は取扱い説明書参照
妨害することがあります。詳細は取扱い説明書参照

抗体サンプル小社では、サンプルの種類や量に応じて試薬を混ぜるだ

け で 30 分 以 内 に 標 識 体 を 得 る こ と の で き る Ab-10 Rapid
Peroxidase Labeling Kit 及び、前処理－反応までを一つのフィルトレーションチューブ上で行い、3 時間以内に目的の遠心（バッファー交換）
標識体を得ることができる Peroxidase
Labeling Kit - NH2/SH、
NHAlkaline-Reactive reagent
Phosphatase Labeling KitReducing– NHAgent
2/SH を製品化している。

Antibody +Reaction Buffer

Stop Solution

標識抗体を実験に使用

遠心（バッファー交換）

2

10 分

10 分

O

これらのキットを使用した酵素標識体の作製法について紹介
C O N
O
する。 O

酵素
37℃で 10 分静置

H2N（標識反応）

PeroxidaseOC O

遠心（バッファー交換）

10 μg ᢠయ37℃で 30 分静置（還元反応）

HS
HS

O
N

O

遠心（バッファー交換）-NH2

Ab-10 Rapid Peroxidase

SH reactive
reagent Kit
Labeling
O

標識抗体を回収50-200 μg ᢠయ䞉䝍䞁䝟䜽㉁H
C NO

Alkaline
Phosphatase-NH2

N
Peroxidase
Labeling Kit -NH2

-SH

Peroxidase Labeling Kit -SH

O

37℃で 30 分静置（標識反応）

ON

50-200 μg ᢠయ䞉䝍䞁䝟䜽㉁HS

Alkaline PhosphataseO-NH
2
遠心（バッファー交換）
Labeling Kit -NH2
Alkaline Phosphatase-SH
標識抗体を回収Labeling Kit -SH
O

S

N
O

II Ab-10 Rapid Peroxidase Labeling Kit による(Code:
LK33)
標識lgG
図アミノ基への1 Labeling KitsPeroxidase
による酵素標識の作製法
1. キット内容（＊ヒンジ部分以外のSS が還元される場合もある）
・Reactive Peroxidase
・Reaction Buffer

図 1 蛍光タンパク質標識の操作

図 2 酵素標識の操作

4. Peroxidase 標識抗体での検出例< ミトコンドリアの免疫染色>
4.
Peroxidase 標識抗体での検出例
1) μ - スライド 8 ウェル（ibidi 社製）に HeLa 細胞を播種し、< ミトコンドリアの免疫染色 >37℃、5%CO2 インキュベーター内で一晩培養した。

1) μ - スライド 8 ウェル（ibidi 社製）に HeLa 細胞を播種し、2) 培地を取り除き、PBS で 3 回洗浄後、4% パラホルムアルデ
37℃、5%CO2 インキュベーター内で一晩培養した。
ヒド / PBS 溶液を添加した。
2)3) 培地を取り除き、PBS
室温で 1 時間静置した。 で 3 回洗浄後、4% パラホルムアルデ
ヒド/ PBS 溶液を添加した。
4) 上清を取り除き、1%
Triton-X / PBS 溶液を添加した。
3)
1 時間静置した。
5) 室温で
室温で 30
分間静置した。
6) 上清を取り除き、1%
上清を取り除き、PBS でTriton-X
3 回洗浄後、PBSで調製したブロッ
4)/ PBS
溶液を添加した。
キング溶液を添加した。
5) 室温で30 分間静置した。
7) 上清を取り除き、冷蔵で 1 時間静置した。
6)
PBS で 3 回洗浄後、PBS で調製したブロッ
8) ペルオキシダーゼ標識 - 抗ミトコンドリア抗体をブロッキン
キング溶液を添加した。
グ溶液で 50 倍希釈した。
7) 冷蔵で 1 時間静置した。
※抗ミトコンドリア抗体（商品コード : ab3298）
は abcam 社から購入。
8)- 抗ミトコンドリア抗体をブロッキン
9) ペルオキシダーゼ標識
上清を取り除き 8 の溶液を添加した。
50 倍希釈した。
10.グ溶液で冷蔵で一晩静置した。

（商品コード: ab3298）は7.5）でabcam 社から購入。
11.※抗ミトコンドリア抗体
上清を取り除き、50 mmol/l
トリス緩衝液（pH3回洗浄した。

12. 上清を取り除き、0.2
mg/mlDial:0120-489548
DAB（Code：D006）、0.003%
技術的な内容に関するお問い合わせ先：カスタマーサポート
Free
Fax:0120-021557 Free・Stop Solution
H2O2、50 mmol/l トリス緩衝液(pH 7.5) を添加した。
在庫や価格(記載容量以外もしくは request)に関するお問い合わせ：マーケティング部
Tel:096-286-1515
Fax:096-286-1525
2. キット以外に必要なもの(株)同仁化学研究所
13. 室温で 10 分間静置した。
121
・20 μ l,200 μ l マイクロピペッタ－ 、マイクロチューブ（サンプル及び Working buffer 調製用）
インキュベーター（37℃）

14. 上清を取り除き、50 mmol/l トリス緩衝液（pH 7.5）で 3 回洗浄した後、50 mmol/l トリス緩衝液（pH 7.5）を添加した。

プロトコル

9) 上清を取り除き 8) の溶液を添加した。
10) 冷蔵で一晩静置した。
11) 上清を取り除き、50 mmol/l トリス緩衝液（pH 7.5）で 3 回洗浄した。
12) 上清を取り除き、0.2 mg/ml DAB（Code：D006）、0.003%
H2O2、50 mmol/l トリス緩衝液 (pH 7.5) を添加した。
13) 室温で 10 分間静置した。
14) 上清を取り除き、50 mmol/l トリス緩衝液（pH 7.5）で 3 回洗浄した後、50 mmol/l トリス緩衝液（pH 7.5）を添加した。
15) 染色細胞を顕微鏡で観察した。

4. 使用上の注意
本キットは分子量 50,000 以上および 5,000 以下のタンパク質を対象としています。
標識するタンパク質溶液に分子量 10,000 以上の物質が含まれる場合は、あらかじめ精製を行なって下さい。( 抗体を精製したいを参照 )。また、タンパク質溶液に不溶性の低分子物質が含まれる場合は、遠心して上清のみを標識反応に用いてください。
一回の標識操作に必要なタンパク質量は 50 〜 200 μg です。冷蔵保存中もしくは室温に戻した際に、フィルトレーションチューブに水滴様の液粒が見られることがあります。これはメンブレンの乾燥防止剤が液粒化したもので、製品の性能に問題はありません。

5. 操作
1) Immunoglobulin G (IgG) への標識

1

IgG 50 〜 200 μg を含むサンプルa)
溶液 と、Washing Buffer 100 μl
を Filtration Tube に入れる。

8,000 x g で 10 分間遠心する 。
Washing Buffer 100 μl を加え、もう一度遠心する。

3

Reaction Buffer 10 μl を NH2Reactive Peroxidase に加え溶解
c)
させる 。

図 3 HeLa 細胞のミトコンドリアの免疫染色画像

FAQ
Q : 抗体溶液中に含まれる添加剤は標識反応に影響しますか ?
A : 抗体溶液中の添加剤によっては影響を受ける場合がございますので、ご使用前に必ず取り扱い説明書中の注意事項をご確認ください。
Q : 使用可能な抗体のクラスには、どのようなものがありますか ?
A : 本製品は IgG 抗体へ標識するよう最適化しています。IgG
以外のクラス（IgM や IgA 等）では標識実績はございません。
最新の測定データやアプリケーション、論文情報を小社 HP にて掲載。ご興味のある方は、
小社 HP にて最新情報をご確認下さい。
Ab-10 同仁

4

NH2-Reactive Peroxidase を含む

5

ピペッティングによりメンブレン
上の IgG と混合させた後、37℃
で 2 時間反応する。

6

Washing Buffer 100 μl を Filtration Tube に加える。

7

8,000 x g で 10 分間遠心する 。

8

Storage Buffer 200 μl を加え 、ピペッティングにより標識体を溶解させる。溶液をマイクロチュー
e)ブに移し、0 〜 5℃で保存する 。

検索

III Peroxidase Labeling Kit - NH2 によるアミノ基への POD 標識 (Code: LK11)
1. キット内容
・NH2-Reactive Peroxidase
・Washing Buﬀer
・Reaction Buﬀer
・Storage Buﬀer
・Filtration Tube
2. キット以外に必要なもの
・10 μl、200 μl マイクロピペッタ－
・インキュベーター (37℃ )・マイクロチューブ ( 標識体保存用 )・遠心機 ( マイクロチューブ用 )3. 保存条件
0 〜 5℃で保存すること。NH2-Reactive Peroxidase は窒素封入されているので、外装袋を一旦開封後は、再度窒素封入し、-20℃で保存する。

b)2

溶液を、IgG が濃縮されている
Filtration Tube のメンブレン上に
添加する。

b)

技術的な内容に関するお問い合わせ先：カスタマーサポート Free Fax:0120-021557 Free Dial:0120-489548
在庫や価格(記載容量以外もしくは request)に関するお問い合わせ：マーケティング部 Tel:096-286-1515 Fax:096-286-1525(株)同仁化学研究所

d)

122

細 胞
増殖 / 毒性
酸
化
ストレス
分 子
生物学
細 胞 内
蛍光プローブ細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用
試
薬
膜タンパク質可 溶 化 剤
ラベル
化 剤
二価性
試 薬
イオン
電 極
その他
機能性
有機材料

プロトコル
細 胞
増殖 / 毒性
酸
化
ストレス
分 子
生物学
細 胞 内
蛍光プローブ細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用
試
薬
膜タンパク質可 溶 化 剤
ラベル
化 剤
二価性
試 薬
イオン
電 極
その他

a) 100 μl 以下の液量で使用する。IgG 濃度が 0.5 mg/ml 以下である場合には、操作 1 と操作 2 を繰り返し、IgG 量が 50 〜
200 μg となるように調整する。溶液に他のタンパク質やアミノ基を有する化合物が混在する場合は、精製により除去していただきたい。
b) 溶液がメンブレン上に残っている場合は、更に 8,000 x g で
5 分間遠心する。
c) NH2-Reactive Peroxidase は Reaction Buﬀer 中では不安定である。溶解後は直ちに操作 4 に進む。
d) 1 〜 3 分子の POD が IgG 1 分子に標識される。通常、未反応の POD は EIA に影響を及ぼさない。必要に応じて、ゲルろ過
カラムあるいはアフィニティーカラム等により精製すること。
e) 長期保存する場合は、同量のグリセロールを添加し、–20℃で保存する。

2) アミノ基を有する低分子化合物 ( 分子量＜ 5,000) への標識
Reaction Buﬀer で調製した 1 mmol/la)
サ ン プ ル 溶 液 50 μl を 、NH2Reactive Peroxidase に加える。ピ
ペッティングにより NH2-Reactive
Peroxidase を溶解した後、37℃
で 1 時間反応する。

12Washing Buffer 100 μl を反応溶液に加え、マイクロピペットでFiltration Tube に移す。

3

8,000 x g で 10 分間遠心する 。ろ液 を 捨 て た 後、Washing Bufferb)
200 μl を加え、遠心する 。この操作をもう一度繰り返す。

4

Storage Buﬀer 200 μl を加え 、ピペッティングにより標識体を溶解させる。溶液をマイクロチューブに移し、0 〜 5℃で保存する。

b)

機能性
有機材料

IV Peroxidase Labeling Kit - SH による SH 基への POD 標識 (Code: LK09)
1. キット内容
・SH-Reactive Peroxidase
・Reducing Agent・Solution A
・Solution B
・Reaction Buﬀer
・Storage Buﬀer
・Filtration Tube
2. キット以外に必要なもの
・10 μl、200 μl マイクロピペッタ－
・インキュベーター (37℃ )・マイクロチューブ ( 標識体保存用 )・遠心機 ( マイクロチューブ用 )3. 保存条件
0 〜 5℃で保存する。SH-Reactive Peroxidase は外装袋を一旦開封後は、–20℃で保存する。

4. 使用上の注意
本キットは分子量 50,000 以上および 5,000 以下のタンパク質を対象としています。
標識するタンパク質溶液に分子量 10,000 以上の物質が含まれる場合は、あらかじめ精製を行なって下さい。( 抗体を精製したいを参照 )。また、タンパク質溶液に不溶性の低分子物質が含まれる場合は、遠心して上清のみを標識反応に用いて下さい。
一回の標識操作に必要なタンパク質量は 50 〜 200 μg です。冷蔵保存中もしくは室温に戻した際に、フィルトレーションチュー
ブに水滴様の液粒が見られることがあります。これはメンブレンの乾燥防止剤が液粒化したもので、製品の性能に問題はありません。

c)a) サンプルが Reaction Buffer に難溶の場合は、水と混合する
溶媒 (DMSO、DMF、アルコール等 ) で 10 mmol/l サンプル溶液を調製し、この溶液 5 μl と Reaction Buffer 45 μl を混合し、1 mmol/l サンプル溶液とする。被標識化合物以外にアミノ基を有する物質が含まれる場合は、精製により除去していただきたい。
b) 溶液がメンブレン上に残っている場合は、更に 8,000 x g で
5 分間遠心する。
c) POD 1 分子に、1 〜 2 分子の低分子化合物が標識される。
1 μg

100 ng

10 ng

1 ng

0.1 ng5. 操作1) Immunoglobulin G (IgG) への標識

1

IgG 50 〜 200 μg を含むサンプa)ル溶液 と Solution A 100 μl を
Filtration Tube に加える。

2

ピペッティングにより混合した
後、8,000 x g で 10 分 間 遠 心 す
b)

る 。

3

Solution A 150 μl を Reducing Agentに加え、ボルテックスミキサー等
c)で混合し溶解させる 。

4

この溶液 100 μl を IgG が濃縮されている Filtration Tube のメンブ
レン上に加える。

a)b)

図 4 リン酸化チロシン BSA のウエスタンブロットa) PLK - NH2 を用いて作製した HRP 標識抗リン酸化チロシン抗体で検出 ( 直接法 )。
b) 抗リン酸化チロシン抗体 /HRP 標識 2 次抗体で検出 ( 間接法 )。
それぞれ、TMB 発色。

技術的な内容に関するお問い合わせ先：カスタマーサポート Free Fax:0120-021557 Free Dial:0120-489548
在庫や価格(記載容量以外もしくは request)に関するお問い合わせ：マーケティング部 Tel:096-286-1515 Fax:096-286-1525(株)同仁化学研究所
123

プロトコル5

ピペッティングにより IgG と混合した後、37℃で 30 分間反応する。

2

Solution A 100 μl を 反 応 溶 液に 加 え、 マ イ ク ロ ピ ペ ッ ト で
Filtration Tube に移す。

6

Solution B 100 μl を加え、8,000b)x g で 10 分間遠心する 。ろ液を捨てた後、Solution B 200 μlb)を加え、遠心する 。

38,000 x g で 10 分間遠心する 。
ろ液を捨てた後、Solution A 200b)
μl を加え、遠心する 。この操作をもう一度繰り返す。

7

Reaction Buffer 50 μl を SHReactive Peroxidase に加え、ピペッティングにより溶解させる。

4

Storage Buffer 200 μl を加え 、ピペッティングにより標識体を
溶 解 さ せ る。 溶 液 を マ イ ク ロ
チューブに移し、0 〜 5℃で保存する。

8

この溶液を Filtration Tube のメ
ンブレン上にマイクロピペット
で加える。

9

ピペッティングにより混合した
後、37℃で 1 時間反応する。

10

Solution A 100 μl を加え、8,000b)x g で 10 分間遠心する 。

11d)Storage Buﬀer 200 μl を加え 、ピペッティングにより標識体を溶解させる。溶液をマイクロチューブ
e)に移し、0 〜 5℃で保存する 。

a) サンプル溶液量は 100 μl 以下で使用すること。IgG 濃度が0.5 mg/ml 以下である場合には、操作 1 と操作 2 を繰り返し、IgG 量が 50 〜 200 μg となるように調整する。溶液に標識
対象物以外の分子量 10,000 以上の物質が含まれる場合は、精製により除去していただきたい。
b) 溶液がメンブレン上に残っている場合は、更に 8,000 x g で
5 分間遠心する。
c) Reducing Agent がキャップの内側に付着している場合があるので、開封にはご注意いただきたい。
d) 2 〜 4 分子の POD が IgG 1 分子に標識される。通常、未反応の POD は EIA に影響を及ぼさない。必要に応じて、ゲルろ過
カラムあるいはアフィニティーカラム等により精製すること。
e) 長期保存する場合は、同量のグリセロールを添加し、–20℃で保存する。
2) SH 基を有する低分子化合物 ( 分子量＜ 5,000) への標識

1

Reaction Buffer で 調 製 し た 1
a)mmol/l サンプル溶液 50 μl を 、
SH-Reactive Peroxidase に加える。ピペッティングにより SHReactive Peroxidase を溶解した
後、37℃で 1 時間静置する。

b)c)a) サンプルが Reaction Buffer に難溶の場合は、水と混合する
溶媒 (DMSO、DMF、アルコール等 ) で 10 mmol/l サンプル溶液を調製し、この溶液 5 μl と Reaction Buffer 45 μl を混合し、1 mmol/l サンプル溶液とする。標識対象物以外に SH基を有する物質が含まれる場合は、精製により除去していただきたい。
b) 溶液がメンブレン上に残っている場合は、更に 8,000 x g で
5 分間遠心する。
c) POD 1 分子に、1 〜 2 分子の低分子化合物が標識される。

その他

V Alkaline Phosphatase Labeling Kit - NH2によるアミノ基への ALP 標識 (Code.LK12)

機能性
有機材料

1. キット内容
・NH2-Reactive Alkaline Phosphatase
・Washing Buﬀer
・Reaction Buﬀer
・Storage Buﬀer
・Filtration Tube

2. キット以外に必要なもの
・10 μl、200 μl マイクロピペッタ－
・インキュベーター (37℃ )・マイクロチューブ ( 標識体保存用 )・遠心機 ( マイクロチューブ用 )3. 保存条件
0 〜 5℃で保存する。NH2-Reactive Alkaline Phosphatase は、
外装袋を一旦開封後は、–20℃で保存する。

4. 使用上の注意
本キットは分子量 50,000 以上および 5,000 以下のタンパク質を対象としています。
標識するタンパク質溶液に分子量 10,000 以上の物質が含まれる場合は、あらかじめ精製を行なって下さい。また、タンパ
ク質溶液に不溶性の低分子物質が含まれる場合は、遠心して上清のみを標識反応に用いて下さい。
一回の標識操作に必要なタンパク質量は 50 〜 200 μg です。
冷蔵保存中もしくは室温に戻した際に、フィルトレーション
チューブに水滴様の液粒が見られることがあります。これはメンブレンの乾燥防止剤が液粒化したもので、製品の性能に問題はありません。

技術的な内容に関するお問い合わせ先：カスタマーサポート Free Fax:0120-021557 Free Dial:0120-489548
在庫や価格(記載容量以外もしくは request)に関するお問い合わせ：マーケティング部 Tel:096-286-1515 Fax:096-286-1525(株)同仁化学研究所

細 胞
増殖 / 毒性
酸
化
ストレス
分 子
生物学
細 胞 内
蛍光プローブ細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用
試
薬
膜タンパク質可 溶 化 剤
ラベル
化 剤
二価性
試 薬
イオン
電 極

124

プロトコル
細 胞
増殖 / 毒性
酸
化
ストレス
分 子
生物学
細 胞 内
蛍光プローブ細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用
試
薬
膜タンパク質可 溶 化 剤
ラベル
化 剤
二価性
試 薬
イオン
電 極

1

IgG 50 〜 200 µg を含むサンプa)
ル 溶 液 と、Washing Buffer
100 µl を Filtration Tube に入れる。

28,000 x g で 10 分間遠心する 。
Washing Buffer 100 µl を加え、b)
もう一度遠心する 。

3

Reaction Buffer 10 µ l を NH2Reactive Alkaline Phosphatase にc)
加え溶解させる 。

b)4

N H 2- R e a c t i v e A l k a l i n e
Phosphatase を含む溶液を、IgGが濃縮されている Filtration Tubeのメンブレン上に添加する。

5ピペッティングによりメンブレン
上の IgG と混合させた後、37℃
で 2 時間反応する。

6Storage Buffer 190 µl を加え 、ピペッティングにより標識体を溶解させる。溶液をマイクロチュー
e)ブに移し、0 〜 5℃で保存する 。

その他
機能性
有機材料

c)

5. 操作
1) Immunoglobulin G (IgG) への標識d)4) Storage Buﬀer 200 µl を加え 、ピペッティングにより標識体を溶解させる。溶液をマイクロチューブに移し、0 〜 5℃で保存する。
a) サンプルが Reaction Buffer に難溶の場合は、水と混合する
溶媒 (DMSO、DMF、アルコール等 ) で 10 mmol/l サンプル溶液を調製し、この溶液 5 µl と Reaction Buffer 45 µl を混合し、1 mmol/l サンプル溶液とする。被標識化合物以外にアミノ基を有する物質が含まれる場合は、精製により除去していただきたい。
b) 溶液がメンブレン上に残っている場合は、更に 8,000 x g で
5 分間遠心する。
c) ALP 1 分子に、1 〜 2 分子の低分子化合物が標識される。

IV Alkaline Phosphatase Labeling Kit - SH による SH 基への ALP 標識 (Code：LK13)
1. キット内容

・SH-Reactive Alkaline Phosphatase・Reducing Agent・Solution A
・Solution B
・Reaction Buﬀer
・Storage Buﬀer
・Filtration Tube

2. キット以外に必要なもの

・10 µl、200 µl マイクロピペッタ－
・インキュベーター (37℃ )・マイクロチューブ ( 標識体保存用 )・遠心機 ( マイクロチューブ用 )3. 保存条件

0 〜 5℃で保存する。SH-Reactive Alkaline Phosphatase は
外装袋を一旦開封後は –20℃で保存する。

4. 使用上の注意a) サンプル溶液量は 100 µl 以下で使用すること。IgG 濃度が0.5 mg/ml 以下である場合には、操作 1 と操作 2 を繰り返し、IgG 量が 50 〜 200 µg となるように調整する。溶液に他のタンパク質やアミノ基を有する化合物が混在する場合
は、精製により除去していただきたい。
b) 溶液がメンブレン上に残っている場合は、更に 8,000 x g で
5 分間遠心する。
c) NH2-Reactive Alkaline Phosphatase は Reaction Buﬀer 中では不安定である。溶解後は直ちに操作 4 へ進む。
d) 1 〜 3 分子の ALP が IgG 1 分子に標識される。通常、未反応の ALP は EIA に影響を及ぼさない。必要に応じて、ゲルろ過
カラムあるいはアフィニティーカラム等により精製すること。
e) 長期保存する場合は、そのまま –20℃で保存すること。
(2) アミノ基を有する低分子化合物 ( 分子量＜ 5,000) への標識a)1) Reaction Buﬀer で調製した 1 mmol/l サンプル溶液 50 µl を 、
NH2-Reactive Alkaline Phosphatase に加える。ピペッティ
ングにより NH2-Reactive Alkaline Phosphatase を溶解した
後、37℃で 1 時間放置する。
2) Washing Buffer 100 µl を反応溶液に加え、マイクロピペッ
トで Filtration Tube に移す。
b)3) 8,000 x g で 10 分間遠心する 。ろ液を捨てた後、Washingb)
Buﬀer 200 µl を加え、遠心する 。この操作をもう一度繰り返す。

本キットは分子量50,000以上および5,000以下のタンパク質を対象としています。
標識するタンパク質溶液に分子量10,000 以上の物質が含まれる場合は、
あらかじめ精製を行なって下さい。
また、
タンパク質溶液に不溶性の低分子物質が含まれる場合は、遠心して上清のみを標識反応に用いてください。
一回の標識操作に必要なタ
ンパク質量は50〜200 µgです。
冷蔵保存中もしくは室温に戻した際に、フィルトレーションチューブに水滴様の液粒が見られることがあります。
これはメンブレンの乾燥防止剤が液粒化したもので、製品の性能に問題はありません。

5. 操作
1) Immunoglobulin G (IgG) への標識

1

IgG 50 〜 200 μg を 含 む サ ン プ
a)ル溶液 と Solution A 100 μl を
Filtration Tube に加える。

2

ピペッティングにより軽く混合した後、8,000 x g で 10 分間遠心すb)る 。

技術的な内容に関するお問い合わせ先：カスタマーサポート Free Fax:0120-021557 Free Dial:0120-489548
在庫や価格(記載容量以外もしくは request)に関するお問い合わせ：マーケティング部 Tel:096-286-1515 Fax:096-286-1525(株)同仁化学研究所
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プロトコル

3

Solution A 150 μl を Reducing
Agent に加え、ピペッティングにc)
より溶解させる 。

4

この溶液 100 μl を IgG が濃縮されている Filtration Tube のメンブ
レン上に加える。

5

ピペッティングにより IgG と混合した後、37℃で 30 分間反応する。

6

Solution B 100 μl を加え、8,000b)x g で 10 分間遠心する 。ろ液を捨てた後、Solution B 200 μl を加b)
え、遠心する 。

7

Reaction Buffer 50 μl を SHReactive Alkaline Phosphatase に加え、ピペッティングにより溶解
d)
させる 。

8

9

10

この溶液を還元 IgG が濃縮されている Filtration Tube のメンブレ
ン上に加える。

ピペッティングにより混合した
後、37℃で 1 時間反応する。

Storage Buﬀer 150 μl を加え、ピペッティングにより標識体をe)
溶解させる 。溶液をマイクロチューブに移し、0 〜 5℃で保存
f)
する 。

2) SH 基を有する低分子化合物 ( 分子量＜ 5,000) への標識a)(1) Reaction Buﬀer で調製した 1 mmol/l サンプル溶液 50 μl を 、
SH-Reactive Alkaline Phosphatase に加える。ピペッティン
グにより SH-Reactive Alkaline Phosphatase を溶解した後、37℃で 1 時間反応する。
(2) Solution A 100 μl を反応溶液に加え、マイクロピペットでFiltration Tube に移す。
b)(3) 8,000 x g で 10 分間遠心する 。ろ液を捨てた後、Solutionb)
A 200 μl を加え、遠心する 。この操作をもう一度繰り返す。
c)(4) Storage Buﬀer 200 μl を加え 、ピペッティングにより標識体を溶解させる。溶液をマイクロチューブに移し、0 〜 5℃d)で保存する 。
a) サンプルが Reaction Buffer に難溶の場合は、水と混合する
溶媒 (DMSO、
DMF、
アルコール等) で 10 mmol/l サンプル溶液を調製し、この溶液 5 μl と Reaction Buffer 45 μl を混合し、1 mmol/l サンプル溶液とする。被標識化合物以外に SH 基を有する物質が含まれる場合は、除去してすること。
b) 溶液がメンブレン上に残っている場合は、更に 8,000 x g で
5 分間遠心する。
c) ALP 1 分子に、1 〜 2 分子の低分子化合物が標識される。
d) 長期保存する場合は、そのまま –20℃で保存する。
50 ng

10 ng

2 ng

52 kDa細 胞
増殖 / 毒性
酸
化
ストレス
分 子
生物学
細 胞 内
蛍光プローブ細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用
試
薬
膜タンパク質可 溶 化 剤
ラベル
化 剤
二価性
試 薬
イオン
電 極
その他

33 kDa←標的タンパク質

21 kDa
図 5 ALP 標識一次抗体を用いたウェスタンブロット
ALP 標識一次抗体の 25,000 倍希釈液で染色し、ALP 発
光基質 (Bold APB chemiluminescent substrate, Molecular
Probes) を反応させ、20 秒間露光した。

a) サンプル溶液量は 100 μl 以下で使用すること。IgG 濃度が0.5 mg/ml 以下である場合には、操作 1 と操作 2 を繰り返し、IgG 量が 50 〜 200 μg となるように調整する。溶液に他のタンパク質や SH 基を有する化合物が混在する場合は、精製により除去していただきたい。
b) 溶液がメンブレン上に残っている場合は、更に 8,000 x g で
5 分間遠心する。
c) Reducing Agent がキャップの内側に付着している場合があるので、開封にはご注意いただきたい。
d) SH-Reactive Alkaline Phosphatase は Reaction Buﬀer 中では不安定なので、溶解後は直ちに操作 8 を行う。
e) 2 〜 4 分子の ALP が IgG 1 分子に標識される。通常、未反応の ALP は EIA に影響を及ぼさない。必要に応じて、ゲルろ過
カラムあるいはアフィニティーカラム等により精製する。
f) 長期保存する場合は、そのまま –20℃で保存する。

技術的な内容に関するお問い合わせ先：カスタマーサポート Free Fax:0120-021557 Free Dial:0120-489548
在庫や価格(記載容量以外もしくは request)に関するお問い合わせ：マーケティング部 Tel:096-286-1515 Fax:096-286-1525(株)同仁化学研究所

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機能性
有機材料