オルガネラゾーン―総 説―

小胞体-ミトコンドリア接触領域の形成因子と
細胞機能
熊本大学

山本 真寿・山口 知也―注目の研究―

低分子蛍光色素によるミトコンドリアリソソーム間相互作用の観察
株式会社同仁化学研究所

新 製 品

田尻 智巳

細胞膜染色試薬 P.8
エンドサイトーシス検出試薬 P.9
エクソソーム染色キット P.10
細菌二重染色キット P.12
バイオフィルム形成阻害測定キット・
バイオフィルム薬剤効果測定キット P.13

No.174(2020)

2020 No.174

表紙撮影：熊本県宇土市住吉町
海苔の種付け毎年 10 月末に海苔の種付けが行われ、漁業者によって異なる赤や青、緑色などのノリ網が浮かび上がり、海面を鮮やかに彩っている。
photo：永島俊介氏

ドージンニュース

CONTENTS
Review
小胞体-ミトコンドリア接触領域の形成因子と細胞機能
熊本大学

●

［1］

山本 真寿・山口 知也

Topics on Chemistry
低分子蛍光色素による
ミトコンドリア-リソソーム間相互作用の観察 ●株式会社同仁化学研究所

［6］

田尻 智巳

Commercial
［5］
［13］

ミトコンドリア染色試薬 ●微生物増殖アッセイキット ●新製品
細胞膜染色試薬 ●［8］［9］エンドサイトーシス検出試薬 ●エクソソーム染色キット ●細菌二重染色キット ●

［10］
［12］

バイオフィルム形成阻害測定キット・バイオフィルム薬剤効果測定キット ●お役立ち
用途で選ぶ細胞膜関連試薬 ●

［13］

［7］

フェロトーシスの検出 ●［11］

フォーラム・イン・ドージン延期のご連絡2020 年 11 月に開催を予定しておりました第 31 回フォーラム・イン・ドージンは、
新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の感染拡大の防止という観点から、開催の延期を決定いたしましたことをお知らせいたします。
今後の日程につきましては、決まり次第ホームページ等でご案内いたします。
何卒ご理解をいただきますよう、よろしくお願いいたします。
ツイッター※希望納入価格には消費税等は含まれておりません。

＠dojindoinfo

No.174(2020)

小胞体-ミトコンドリア接触領域の形成因子と細胞機能
The composition and cellular function of ER-mitochondria contact sites

Abstract山本

真寿

Eukaryotic cells contain various organelles which arecompartmentalized by the intracellular membrane to maintaintheir identity and specialize biological process. These organelles
are not only individual entities but also communicated between
other organelles to perform their appropriate function. Suchinter-organelle communication is achieved by canonical vesiculartrafficking and physical associations between multiple organellar
membranes. Here, we briefly review recent findings on thecomposition of ER-mitochondria contact sites and their cellularfunction.

熊本大学
大学院生命科学研究部
がん生物学講座
助教

山口

知也

熊本大学
大学院生命科学研究部
がん生物学講座
准教授

1. はじめに
真核細胞内のオルガネラは、生体膜や相分離によって細胞質から区切られ個々の機能に特化した組成・構造を維持している細胞
内コンパートメントである。このことは、オルガネラ間の物質輸送には大きな物理化学的障壁が存在することを意味しており、効率的な物質輸送には自由拡散に依存しない物質輸送経路が必要であると考えられる。このような細胞内輸送経路として「小胞輸送経路」が知られているが、ミトコンドリアなど明確な小胞輸送経路を持たないオルガネラの存在から、それ以外の経路の存在が考えられてきた。この小胞輸送に依存しない輸送経路のひとつとして考えられているのが「オルガネラ接触領域」を介した物質輸送が近年注目されている。二つのオルガネラが物理的に近接した接触領域では、イオンなど親水性分子が効率的に輸送されるだけでなく、リン脂質の様な疎水性分子も接触領域の繋留タンパク質を

図1

介して輸送されていると考えられている。さらに近年、オルガネ
ラ接触領域は物質輸送だけでなく、オルガネラの形成やオルガネ
ラの形態・動態を制御していることも明らかになってきた。本稿ではこれらオルガネラ接触領域の中でも特に研究の進んでいる「小胞体-ミトコンドリア接触領域」に注目し、現在までに明らかにされた形成機構や生理機能について概説したい。

2. オルガネラ接触領域
オルガネラ接触領域の定義については議論が進んでいるものの、厳密な定義は定まっていない。現時点における多くの研究者の認識は「繋留タンパク質を介して 2 つのオルガネラ膜が 10 〜
30 nm 程度に近接した領域」といえるだろう。オルガネラ接触
領域は「接触」や「Contact」という言葉が用いられているが、オルガネラ同士の接触は繋留タンパク質を介した相互作用に限定
1）

細胞内の小胞体接触領域とミトコンドリア接触領域1No.174(2020)

されており、オルガネラ膜の融合は通常見られない。このことは
2 つのオルガネラが混ざり合うのではなく、個を維持したまま物
理的に近接し、効率的に物質の輸送を行う「ゾーン」を形成する
ことに接触領域の生理的な意義があるものと考えられる。
近年、細胞膜を含め様々なオルガネラ膜間に接触領域が存在することが相次いで報告されている。その多くは小胞体と他のオルガネラとの接触であり、細胞内の膜を有するオルガネラとの接触のほか 2）-5）、ストレス顆粒や P 体（processing body）など相分離によって形成される膜を持たないオルガネラとの接触も報告さ（図 1 左）。このことは小胞体が膜を構成するリン脂れている 6）質分子を合成する場であることから、様々なオルガネラへ生体膜の材料となる脂質分子を効率的に輸送することを反映しているのかもしれない。また、ミトコンドリアも小胞体 7），8）やペルオキ
シソーム 9）、エンドソーム 10）、脂肪滴 11）など様々なオルガネラとの接触が報告されており、これらは脂肪酸やトランスフェリンを介した鉄イオンのミトコンドリアへの取り込みなどに関与していると考えられている（図 1 右）。
このように様々なオルガネラ接触領域が報告されるに伴い、そのオルガネラ接触領域を形成する因子群の同定も進められてきた。後述する小胞体-ミトコンドリア接触領域に関しては複数の繋留分子や調節因子の関与が見出されており、構成分子の異なる接触領域間での機能的な違いなどにも関心が向けられつつある。
その一方で、他のオルガネラ間接触領域の形成因子の同定はあま
り進んでおらず、詳細がほとんど不明なままの接触領域もある。
これらの新たに発見された接触領域については、単離精製法の開発と形成因子の同定、細胞・個体レベルでの生理的機能の解析が待たれる。

3. 小胞体-ミトコンドリア接触領域（ER-Mitochondria Contact Sites, EMCSs）
小胞体とミトコンドリアの接触領域は歴史的に最も早く見出された接触領域であり、1950 年代にラット肝細胞の電子顕微鏡解
析において小胞体膜とミトコンドリア外膜の近接が報告された
12）
（図 2）
。
しかし当初は、この小胞体とミトコンドリア膜同士の近接に何らかの機能があるとはあまり考えられておらず、接触領域を単離精製する技術的な困難もあり長らく形態学的な解析に留まっていた。転機となったのは 1990 年の Vance による報告であり、ラットの肝臓から精製した粗ミトコンドリア画分に小胞体を主成分とするミクロソーム画分が含まれていること、この画分を Percoll
密度勾配遠心によって単離精製できることを示した 7）。この画分は現在 MAM（Mitochondria-Associated Membrane）画分と呼ばれるミトコンドリアと近接した小胞体膜画分であり、この発見により EMCSs の生化学的な解析が可能となった。この MAM 画分にはリン脂質 13）やトリアシルグリセロール 14）、ステロール 15）など様々な脂質合成酵素群が多く含まれていることから、MAM
はミトコンドリアと接触した滑面小胞体画分であり、小胞体からミトコンドリアへの脂質輸送を担っていることが予想された。他方、粗面小胞体も EMCSs を形成することが電子顕微鏡で観察されており 16），17）、リボソームを含むためか膜間の近接距離は 50
nm 以上と滑面小胞体の場合よりも大きいということはわかっているが、機能については不明な点が多く残されている。

2

図2

小胞体-ミトコンドリア接触領域（EMCSs）

4. EMCSs の形成機構と細胞機能
細胞内に存在する EMCSs は細胞種により多少の違いがある
が、小胞体とミトコンドリアのそれぞれ 10％程度が接触領域を形成している場合が多い。ミトコンドリアを基準に見てみると、
HeLa 細胞では表面積の 10 〜 20％が 8），18）、マウス肝臓では 4 〜
10％程度が小胞体と近接していると報告されている 19）。逆に小胞体は全体の 15％程度がミトコンドリアと近接していることが
HeLa 細胞において報告されている 18）。このように細胞内では、想像以上に多くの小胞体とミトコンドリアが接触領域を形成しており、様々な細胞機能にとって重要な場となっていることが予想される。
EMCSs の形成機構は依然として不明な点が多いが、2 つの膜に存在するタンパク質間の相互作用によって形成されていると考えられている。これまでにイオンチャンネルやミトコンドリア融合に関与するタンパク質など、様々な分子が小胞体とミトコンド
リア間の相互作用を担う形成因子として同定されている。哺乳動物ではこれら形成因子の 1 つを破壊・抑制しても EMCSs の個数や面積は部分的な減少に留まることが多いため、EMCSs は一様な構造ではなく、複数の繋留複合体によって形成された多様性のある構造であることが予想される。以下では細胞内においてEMCSs の関与が報告されている機能毎に形成分子を概説したい。

4.1. 小胞体-ミトコンドリア間のCa2＋イオン輸送
細胞内における Ca2 ＋イオンは非常に重要なセカンドメッセン
ジャーであり、Ca2 ＋イオン濃度の変動は細胞のエネルギー代謝や細胞死、筋肉の収縮や神経伝達物質の放出など様々な生命現象に重要である。小胞体とミトコンドリアはともに細胞内における
Ca2 ＋イオン貯蔵庫であり、刺激に応じて小胞体から放出された
Ca2 ＋イオンをミトコンドリアが取り込むことで局所的な ATP 合成を促すとともに、過剰な Ca2 ＋イオンの流入は細胞死を誘導す
ることが知られている 20）。この小胞体からミトコンドリアへのCa2 ＋ イオンの効率的な輸送が EMCSs の生理的意義の一つであると考えられている 8）。
そのことを裏付けるように、小胞体から Ca2 ＋イオンを放出す
るチャネルであるイノシトール三リン酸受容体（IP3R）自体が、ミトコンドリア外膜のチャネルである VDAC と細胞質の GRP75
を介して 2 つのオルガネラを繋留する複合体として機能するこ（図 3）。さらに IP3R のシャペロンとしてとが見出されている 21）
安 定 化 に 寄 与 す る Sigma-1 受 容 体 も MAM に 濃 縮 さ れ て お り22）、間接的に EMCSs の形成に寄与している。Mitofusin2（MFN2）

No.174(2020)

はミトコンドリアの融合に関与する分子であるが、EMCSs の形成因子としても広く知られている 23）。MFN2 はその一部が小胞体に局在し、ミトコンドリアに局在する MFN1 及び MFN2 と結合し 2 つのオルガネラを繋留するとされている 24）。Mfn −／−ノッ
クアウトの MEF では EMCSs の間隔が拡がり、ミトコンドリア
への Ca2 ＋ イオン流入の減少がみられたことから Ca2 ＋ イオンの（MFN2 に関輸送を担う EMCSs の形成因子と考えられる 24），25）
しては EMCSs の形成に負に作用するという相反する報告もあり
26），27）、今 後 の 詳 細 な 検 証 が 待 た れ る）。こ の ほ か BAP31FIS128）、VAPB-PTPIP5129）、PDZD818）など様々な分子が EMCSsの形成に関与し、ミトコンドリアへの Ca2 ＋イオン流入を促進することが示されている。一方、EMCSs の形成に阻害的に働く因子として FATE1 が知られている。FATE1 は EMD や MIC60 と結合し小胞体とミトコンドリアの距離を拡げることにより EMCSsの形成を阻害することで、ミトコンドリアへの Ca2 ＋イオン流入を減弱させることが報告されている 30）。
このように小胞体とミトコンドリアの Ca2 ＋イオン輸送能については、多くの形成因子の関与が報告されており、水溶性の小分子である Ca2 ＋イオンの放出や吸収を制御する仕組みとして膜同士の物理的な近接は重要な役割を担っているのかもしれない。

図3

Ca2＋輸送に関与する EMCSs 形成因子

4.2. 小胞体-ミトコンドリア間の脂質輸送
リン脂質合成は主に小胞体で行われるが、いくつかのリン脂質合成酵素はミトコンドリアにも存在しており、例えばホスファチ
ジルエタノールアミン（PE）の合成経路の一つであるホスファ
チジルセリン脱炭酸酵素（PSD）はミトコンドリア内膜に局在している 31）。そのため小胞体で合成したホスファチジルセリン（PS）をミトコンドリアへと輸送し、ミトコンドリアで合成した
PE を小胞体へ送り返していることになるが、前述の通り小胞体とミトコンドリア間には小胞輸送経路がなく、EMCSs を介して脂質輸送が行われていることが予想されていた 7）。
その分子メカニズムの一端が明らかとなったのは、小胞体-ミ
トコンドリアを人工的に繋留するリンカー分子を利用した出芽酵
母の遺伝学的スクリーニングにより、ERMES（ER-Mitochondria
Encounter Structure）と呼ばれるタンパク質複合体が EMCSs の繋留因子として同定されたことによる 32）。ERMES 複合体の欠損
株では、PS → PE → PC という変換反応が有意に減少することが 報 告 さ れ て お り 32）、in vitro に お い て も ERMES 複 合 体 は、ATP などのエネルギーを必要とせずに 2 つのオルガネラ膜間の脂質輸送を担うことが明らかにされている 33）。これら ERMES

複合体を構成する 4 つのタンパク質のうち 3 つ（Mdm12, Mmm1,
Mdm34）は SMP（Synaptotagmin-like Mitochondrial lipid-binding
Profein）ドメインを有しており、疎水性度が高いポケットにリン脂質の炭化水素鎖が結合することが結晶構造解析から推定されている 34），35）。このことからリン脂質は ERMES 複合体によって構成された疎水性環境を介して 2 つのオルガネラ間を行き来しているものと考えられている（図 4）。
ERMES 複合体は長らく哺乳動物など高等真核生物でのホモログ分子が見つかっていなかったが、近年、ERMES 複合体の 1 つである Mmm1 の哺乳類ホモログ分子として PDZD8 が見出された 18）。PDZD8 は EMCSs の形成と Ca2 ＋ イオン輸送能への関与は明らかにされているものの 18）、脂質輸送能については明らかではなく、他の ERMES コンポーネントのホモログ分子の同定などを含めて今後の研究が待たれる。
ま た、酵 母 か ら 哺 乳 類 ま で 遺 伝 的 に 保 存 さ れ た EMC（ERmembrane protein complex）複合体も EMCSs における脂質輸送への関与が報告されている 36），37）。しかし、EMC 複合体には脂質輸送に関与するドメインを持つ構成タンパク質がないことから、その詳細なメカニズムについては不明な点が多く残されている（図 4）。

図4

リン脂質輸送に関する EMCSs 形成因子

4.3. ミトコンドリアダイナミクス
ミトコンドリアは融合と分裂を繰り返す動的なオルガネラであるが、チューブ状の小胞体がミトコンドリアに絡みつくようにして収縮させることで、ミトコンドリアを分裂させていることが報告された 38）。このミトコンドリア分裂開始点に一過的に形成される EMCSs では、まず小胞体に局在する Formin タンパク質の一種 INF2 が集積し 39）、ミトコンドリアに存在する SPIRE1C と結合することでアクチンの重合が促進されることが分かってきた40）。このアクチン繊維が収縮力となり、ミトコンドリアがくびれた部分にダイナミン様タンパク質の DRP1 や DYN2 が重合することで、最終的にミトコンドリアが分裂するというモデルが考えられている 38），41）。

4.4. その他の機能
小胞体とミトコンドリアは ER ストレスや ATP 合成などの反応時に ROS を産生することが知られている。FRB-FKBP 二量体化法を用いて ROS センサーを EMCSs に標的化したところ、
EMCSs 周辺は H2O2 が局所的に高濃度になっていることが見出3

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された 42）。これは EMCSs において Ca2 ＋が小胞体からミトコン
ドリアへ流入することが引き金となり、ミトコンドリアに蓄積された H2O2 が細胞質へ放出されることによって形成される 42）。またこのようにして EMCSs 周辺に形成された酸化的環境は、局所的に p38αを活性化し、MIRO/TRAK 複合体を介したミトコンド
リアの移動を阻害することが報告されている 43）。これによりミ
トコンドリアを EMCSs に留めることで、EMCSs を安定化させるという仮説が提唱されている。
さらに EMCSs はオートファジーとの関連についても報告されている。前述の通り MAM は生体膜の主成分であるリン脂質合成の場であり、特にオートファゴソーム膜や隔離膜のソースとしての役割が注目されている。飢餓刺激時にオートファゴソームの形
成に重要な ATG14 や ATG5 が、SNARE タンパク質 STX17 によって EMCSs に 集 積 さ れ る こ と や 44）、EMCSs 形 成 因 子 で あ る
MFN2 や PACS2 45）の発現抑制によって ATG14 の集積が阻害されることから、EMCSs がオートファゴソーム形成の場であることが示唆された 44）。また、出芽酵母においても ERMES 複合体の欠損によって隔離膜の形成が阻害され、マイトファジーが不全になることが報告されている 46）。その一方で、Ca2 ＋輸送に関与
する繋留因子である VAPB と PTPIP51 の結合形成は、恒常的オー
トファジーに対して阻害的に作用することが報告されている
47）。小胞体からミトコンドリアへの Ca2 ＋の輸送を阻害すると、この効果は見られないことから、ミトコンドリアの Ca2 ＋レベルが関与していると思われるが、飢餓誘導によるオートファジーとの違いなど詳細は明らかにされていない。

5. 今後の課題
近年 EMCSs の形成や制御に関わる因子の同定や、様々な細胞機能との関連についての研究が大きく進んだ。しかしその一方で、解決すべき問題も多く残されている。EMCSs をはじめとしたオルガネラ接触領域の研究に言えるのは、オルガネラ全体に与える影響を最小限にしつつ接触領域のみを操作することの困難さである。現在同定されている形成因子の多くは小胞体やミトコン
ドリアに広く分布しており、これらの遺伝子破壊や発現抑制によって得られた表現型が、接触領域の形成不全だけに起因すると断言することは難しい。この問題に対するアプローチとして、人工リンカーの発現によるレスキュー実験が行われることもあるがそ の 解 釈 に は 議 論 の 余 地 が あ る。今 後、EMCSs 形 成 能 やEMCSs への局在能だけを欠損した変異体を探索する必要があると思われる。
また、EMCSs の生成や崩壊の過程などのダイナミクスも興味深い点であるが不明な点が多い。数十 nm の EMCSs を正確に解析するには超解像ライブイメージングが必要と考えられるが、現在は一般的な研究室での実施は困難である。別のアプローチとして
EMCSs のマーカー分子の探索や構築が考えられる。その一例として、最近報告された BRET ベースの EMCSs プローブは EMCSsの定量や動態解析に有効なツールとなる可能性がある 48）。このプ
ローブは、単分子リンカーや二量体化リンカーのように 2 つの膜を人工的に繋留し続けることはなく、より生理的な EMCSs の動態を解析できると考えられる。ただ現時点では光学顕微鏡での観察は感度的に難しく、同報告にある顕微鏡観察用の FRET ベースのプローブは S/N 比が低く今後の改良が期待される 48）。
最後に、疾患など個体レベルの生命現象における EMCSs の意
義の解明も今後の大きな課題である。これまでにアルツハイマー病の患者やモデルマウス由来の線維芽細胞においては野生型より

4も 2 倍以上の EMCSs が形成されることが報告されているほか、Mfn2 欠損によって EMCSs を減少させた細胞ではγ- セクレターゼの活性が半分程度にまで減少する 49）。また、PTEN
51）
や AKT 52）、p53 53）などのがん関連タンパク質が EMCSs に局在していることも知られており、特に小胞体からミトコンドリア
への Ca2 ＋の輸送を制御することでがん細胞の増殖や細胞死を制御していることも報告されている。このほかにもパーキンソン病など様々な疾患との関連が報告されているが、その病態において果たして EMCSs がどこまで重要な役割を担っているかはよく分
かっていない。これまでに蓄積された EMCSs 形成の分子メカニ
ズムや細胞機能の知見を、モデル生物や患者由来サンプルを用いた解析に取り入れることにより EMCSs の生理的な意義について解き明かしていく必要があるだろう。
多様な分野の研究者同士の「接触」がオルガネラ接触領域の謎を解き明かし、新たな発見がなされることを願いたい。
49），50）［参考文献］

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［著者プロフィール］
氏名：山本 真寿（YAMAMOTO Masatoshi）
所属：熊本大学 大学院生命科学研究部 がん生物学講座〒 860-8556 熊本市中央区本荘 1-1-1
Tel：096-373-5107
Email：myamamoto@kumamoto-u.ac.jp
出身学校：京都大学 大学院生命科学研究科
学位：博士（生命科学）
専門分野：細胞生物学 オルガネラ間相互作用

氏名：山口 知也（YAMAGUCHI Tomoya）
所属：熊本大学 大学院生命科学研究部 がん生物学講座〒 860-8556 熊本市中央区本荘 1-1-1
Tel：096-373-5107 FAX：096-373-5108
Email：tyamaguchi@kumamoto-u.ac.jp
出身学校：名古屋大学 大学院医学系研究科
学位：博士（医学）
専門分野：がん生物学、細胞生物学

ミトコンドリア染色試薬
MitoBright LT Green, Red, Deep Red＜特長＞
・ミトコンドリアを長期間観察可能
・血清入り培地中で染色可能
・コラーゲンコートプレート上で培養した細胞のミトコンドリアを低バックグラウンドで検出可能

ミトコンドリアを長期間観察
HeLa 細胞を各 MitoBright LT または既存試薬で染色し、4 日間培養後ミトコンドリアを観察しました。その結果、既存試薬の蛍光強度は大きく低下したのに対し、MitoBright LT は蛍光強度が維持され、ミトコンドリアを明瞭に観察できました。
既存試薬（T 社）

MitoBright LT
Green

Red

Deep Red

Green

Red

Deep Red

染色直後＜検出条件＞
MitoBright LT Green、
既存試薬（T 社）Green：
Ex 488 nm / Em 500-560 nm

染色後 4 日間培養

MitoBright LT Red、
既存試薬（T 社）Red：
Ex 561 nm / Em 560-620 nm
MitoBright LT Deep Red、
既存試薬（T 社）Deep Red：
Ex 640 nm / Em 650-700 nm
スケールバー：20μm

品名
MitoBright LT Green

MitoBright LT Red

MitoBright LT Deep Red

容量
希望納入価格（￥） メーカーコード
20 μl × 1
6,000
400 μl × 1
12,000MT10400 μl × 3
30,00020 μl × 1
6,000
400 μl × 1
12,000MT11400 μl × 3
30,00020 μl × 1
6,000
400 μl × 1
12,000MT12400 μl × 3
30,000

さらに詳細な情報は小社 HP で！
MitoBright LT

同仁

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No.174(2020)

Topics on Chemistry
低分子蛍光色素によるミトコンドリア-リソソーム間相互作用の観察
株式会社同仁化学研究所

田尻智巳

真核生物の細胞内には、膜構造を持つ細胞小器官（オルガネラ）が存在している。オルガネラは、それぞれの役割を担いながら他のオルガネラと相互作用して、細胞内の様々な機能を維持している。その一例として、正常な細胞では、マイトファジーと呼ばれる不良ミトコンドリア消去機構が維持されており、不良ミトコン
図 1 MitoBlue の構造
ドリアが二重の膜構造により周囲から隔離され、リソソームとの融合により消化される。ミトコンドリアの恒常性の破綻は、アルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性疾患、がん、老化の原因となる。このように、ミトコンドリアの品質と恒常性の維持が疾患や老化と密接に関わっていることから、ミトコンドリアの動的プロセス（分裂、融合、オルガネラ間相互作用）を研究するためのプローブは生物学的研究において重要である。
本稿では、Sánchez らが開発した、ミトコンドリア-リソソー
ム間相互作用を観察できる低分子蛍光色素 “MitoBlue” について紹介したい 1）。
MitoBlue は、蛍光ビスアミジン骨格を有するカチオン性の色素である（図 1）。この色素は既存のミトコンドリア染色色素
Rhodamine123 とは異なり、膜電位に依存することなくミトコン
ドリアを染色し、細胞固定後もミトコンドリアに保持されるという特徴がある。また、ミトコンドリア膜タンパク質マーカーのTom20 抗体や、ミトコンドリアマトリックスマーカーの PDH 抗
図 2 時間依存的に変化する MitoBlue の局在 1）
体との共染色を行うと、MitoBlue のシグナルは PDH と共局在することから、MitoBlue はミトコンドリアマトリックスを染色す
る色素となっている。興味深いことに、MitoBlue で細胞を長時
間 染 色 し 続 け る と、小 胞 状 に 染 色 さ れ る 様 子 が 観 察 さ れ、Rhodamine123 と は 異 な る 染 色 パ タ ー ン と な る。こ れ は、
MitoBlue とリソソーム染色試薬である LysoTracker を共染色させた結果、MitoBlue と LysoTracker の局在が一致してくることから、MitoBlue がミトコンドリアからリソソームに移動することが示唆された。そこで、MitoBlue を既存のミトコンドリア染
図 3 MitoBlue のミトコンドリアからリソソームへの移動メカニズム 1）
色色素 MitoTracker Deep Red（MTDR）とリソソームマーカーの Lamp1 抗体で共染色し、時間変化を確認したところ、染色直後の MitoBlue は MitoTracker Deep Red と局在が一致していたが、イメージングで使用されるプローブの多くは、目的のオルガネ
30 分 後 に は Lamp1 の シ グ ナ ル と 重 な り 始 め る こ と か ら、
ラのみをターゲットとして染色するため、動的プロセスを直接分
MitoBlue は時間依存的にミトコンドリアからリソソームに移動
析することは難しい。しかし、MitoBlue はミトコンドリアの状することが観察された（図 2）。
態に依存することなくミトコンドリアを染色し、その後のミトコ
MitoBlue がミトコンドリアからリソソームへ移動するメカニ
ンドリアの動的プロセスを追跡することが可能である。このようズムを解明するため、mRFP-GFP-LC3 を発現 A541 細胞を用いなミトコンドリアとリソソーム間の相互作用をモニタリングできて解析を行った。MitoBlue で染色した細胞をオートファジー誘る化合物により、これまで実態の明らかとなっていないオルガネ
導 剤 で あ る ラ パ マ イ シ ン で 処 理 す る と、LC3 の シ グ ナ ル とラ間相互作用を今後解明することが期待される。
MitoBlue のシグナルが一部共局在することが分かった。このことから、MitoBlue はオートファジーを介してミトコンドリアか ［参考文献］
らリソソームに移動することが示唆された。また、MitoBlue で
1） M. I. Sánchez et al., Sci. Rep., 2020, 10, 3528.
染色した細胞を、ミトコンドリア電子伝達系を阻害し、ミトコン
ドリア小胞（MDVs）の形成を誘導する Antimycin A で処理すると、MitoBlue のシグナルはリソソームの局在と一致した。このことから、MitoBlue はミトコンドリア小胞によってもリソソームに移動することが確認された。
上記のように、MitoBlue は時間依存的にミトコンドリア小胞やオートファジー、マイトファジーを介してリソソームに移動する（図 3）。これにより、ミトコンドリア-リソソーム間相互作用だけでなく、ミトコンドリアの動的プロセスを観察することに成功している。

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No.174(2020)

用途で選ぶ細胞膜関連試薬
細胞膜は細胞の内側と外側を区分する境界としての役割だけでなく、物質の選択的な透過や伝達系などの重要な役割も担っています。また、細胞膜はエンドサイトーシスや神経細胞の軸索など動的な変化も大きいことから、細胞膜の動態を捉えることは様々な研究分野で有用です。

＜細胞膜関連試薬のラインアップ＞
同仁化学研究所が販売している細胞膜関連試薬と、期待される用途を紹介致します。

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No.174(2020)

新製品
細胞膜染色試薬
PlasMem Bright Green
PlasMem Bright Red＜特長＞
・生細胞で使用できる、染色後に固定できる・低毒性で色素の滞留性が高い・培地に色素を加えるだけ

PlasMem Bright シリーズは低毒性で色素の細胞膜滞留性が高く、生細胞や固定化細胞を用いた様々な実験でご利用いただくことが可能です。既存の細胞膜染色試薬に対して特に多かった不満を PlasMem Bright シリーズが解決します。
製品名

細胞毒性※

滞留性

染色後の洗浄血清入り培地の使用

染色後の固定化

低

24 時間

不要

可

可（PFA）−−
高

0.5 時間以下
0.5 時間以下
1.5 時間

必要
必要
必要

不可
可
可

可
不可
可（PFA）

PlasMem Bright（Green, Red）
S 社 製品 P
T 社 製品 D
T 社 製品 C※各染色試薬で染色後、神経細胞の形態変化（凝集）を比較した場合＜細胞膜の鮮明な可視化：神経細胞の形態と軸索内のミトコンドリア局在観察＞

観察条件

PlasMem Bright Green: Ex 488 nm / Em 500-600 nm

観察条件

PlasMem Bright Red: Ex 561 nm / Em 560-700 nm＜細胞膜への長期滞留性＞
各細胞膜染色試薬で染色した細胞を 24 時間培養したのち、それぞれの蛍光画像を比較しました。結果、PlasMem Bright シリーズ
は既存試薬と比較して長時間、膜に滞留することが確認されました。

品名
PlasMem Bright Green
PlasMem Bright Red

容量100 μl × 1
100 μl × 1

希望納入価格（￥） メーカーコード
25,000P504
25,000
P505※〈使用回数の目安〉100μl あたり、35 mm dish 10 枚、μ-Slide 8 well 10 枚製品の詳細や他社製品と比較した実験例などは、小社 HP をご覧ください。

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膜染色

同仁

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No.174(2020)

新製品
エンドサイトーシス検出試薬
ECGreen-Endocytosis Detection＜特長＞
・より正確にエンドサイトーシスを可視化できる・生細胞でエンドサイトーシスを追跡できる・pH 変化に対する応答性が高い
ECGreen-Endocytosis Detection は小胞膜に局在し、pH に依存して蛍光を発する試薬です。そのため、蛍光アナログよりも直接的にエンドサイトーシスを可視化することができます。また、本品は従来用いられてきた蛍光標識デキストランと比較して、pH 変化に対する応答性に優れています。そのため、初期エンドソームも高感度に検出することが可能です。

染色原理の模式図

各試薬の pH に対する蛍光強度変化＜実験例：細胞内小胞輸送系を鮮明に可視化＞
Wortmannin はエンドソームのリサイクリングやリソソームへの移行を阻害し、エンドソームの肥大化を惹起することが知られています。Wortmannin によるこれらの変化を ECGreen と初期エンドソームマーカータンパク質 Rab5-RFP（蛍光蛋白質）との共染色、および ECGreen とリソソーム染色試薬との共染色で確認しました。その結果、Wortmannin 添加時には ECGreen は肥大化したエンド
ソーム（Rab5-RFP）と共局在（左図：Merge）し、リソソームとは共局在しない（右図：Merge）ことが確認できました。上記の結果から、ECGreen は細胞内小胞輸送系の変化を可視化することができます。

品名
ECGreen-Endocytosis Deteciton

容量40 μl × 1

希望納入価格（￥） メーカーコード
45,000
E296※＜使用回数の目安＞

40 μl あたり、35 mm dish 20 枚、μ-Slide 8 well 20 枚製品の詳細や他社製品と比較した実験例などは、小社 HP をご覧ください。

エンドソーム同仁

検索9

No.174(2020)

新製品
エクソソーム染色キット
エクソソーム膜 蛍光染色キット
ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Green, Red, Deep Red
エクソソームタンパク質 蛍光染色キット
ExoSparkler Exosome Protein Labeling Kit-Green, Red, Deep Red＜特長＞
・細胞外で凝集しない・キットだけで蛍光標識から精製まで可能
・エクソソームの性質にほとんど影響しない製品の詳細や他社製品と比較した実験例などは、
小社 HP をご覧ください。

エクソソーム同仁

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ExoSparkler シリーズは、精製されたエクソソームの膜またはタンパク質を選択的に染色し、細胞に取り込まれるエクソソームを
イメージングすることができます。
（1）ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Deep Red または S 社製品 P（緑または赤）で染色したエクソソームを HeLa 細胞へ添加し、細胞内へ取り込まれるエクソソームを蛍光顕微鏡で確認した結果、製品 P（緑または赤）で染色したエクソソームにおいては、色素の凝集が疑われる細胞外の蛍光輝点が確認されました。

■観察条件
ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Deep Red（紫）:Ex 640 nm / Em 640-760 nm
S 社 製品 P（緑）:Ex 488 nm / Em 490-540 nm
S 社 製品 P（赤）:Ex 561 nm / Em 570-640 nm（2）ExoSparkler シリーズは、エクソソームの標識に最適化したプロトコルに加え、蛍光標識後の未反応色素を除去できるフィルト
レーションチューブを同梱しているため、簡単な操作で蛍光標識エクソソームを調製できます。
ExoSparkler シリーズにおける染色工程

精製手法（未反応色素の除去）と回収率の比較（3）ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit（Green, Red, Deep Red）で染色する前後のエクソソームについて、NTA（ナノ粒子トラッキング解析）とゼータ電位を測定した結果、小社製品は、エクソソームの性質にほとんど影響を及ぼさないことが確認されました。比較データは製品 HP に掲載しています。
品名
ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Green
ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Red
ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Deep Red
ExoSparkler Exosome Protein Labeling Kit-Green
ExoSparkler Exosome Protein Labeling Kit-Red
ExoSparkler Exosome Protein Labeling Kit-Deep Red

10

容量
希望納入価格（￥） メーカーコード
5 samples
25,000EX01
5 samples
25,000EX02
5 samples
25,000EX03
5 samples
20,000EX04
5 samples
20,000EX05
5 samples
20,000EX06

No.174(2020)

フェロトーシスの検出
ネクローシスやアポトーシス、オートファジーは細胞死関連プロセスとして知られています。2012 年にフェロトーシスは新しい細胞死の 1 つとして提案されました。フェロトーシスは、鉄イオン依存性脂質過酸化物の蓄積によって引き起こされる非アポトーシス
細胞死として研究されています 1）。フェロトーシスに関わる指標と関連製品を紹介します。
1）豊國 伸哉 , DOJIN News, 2017, 162, 1-3

フェロトーシス研究に関連するさまざまな指標と小社製品群
品名
指標

Liperfluo
脂質過酸化

MitoPeDPP
脂質過酸化

Mito-FerroGreen
鉄イオン（Fe2＋）

鉄イオン（Fe2＋）

検出（Ex/Em）
局在

蛍光
524 nm / 535 nm
細胞内
蛍光顕微鏡
フローサイトメーター
生細胞
L248

蛍光
452 nm / 470 nm
ミトコンドリア

蛍光505 nm / 580 nm
ミトコンドリア蛍光543 nm / 580 nm
細胞内

装置
サンプル
メーカーコード
品名
指標
検出
装置
サンプル
メーカーコードGSSG/GSH
Quantification Kit
GSSG/GSH
比色
412 nmプレートリーダー
細胞
組織
血漿
赤血球
G257

蛍光顕微鏡
生細胞
M466

蛍光顕微鏡
プレートリーダー
生細胞
M489

FerroOrange

蛍光顕微鏡
生細胞
F374

Glutamine Assay Kit- Glutamate Assay KitWST
WST
グルタミン
グルタミン酸比色
比色
450 nm
450 nmプレートリーダー
プレートリーダー
細胞
細胞培養液

細胞
細胞培養液

G268

G269

掲載した製品の詳細や文献などの情報は、
小社 HP をご覧ください。

メーカーコード

同仁

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11

No.174(2020)

新製品
細菌二重染色キット-Bacstain- Bacterial Viability Detection Kit-DAPI/PI-Bacstain- Bacterial Viability Detection Kit-CTC/DAPI-Bacstain- Bacterial Viability Detection Kit-CFDA/PI＜特長＞
・蛍光二重染色に最適化したプロトコルで試薬を添加するだけ
・複数の指標で薬剤効果や菌の状態を評価できる・培地法と比較して評価にかかる時間を大幅に短縮できる

試薬を添加するだけの簡単操作

このような方におススメします！
☑ これから蛍光染色法による実験を始めたい！
☑ 培養法で判定している検査を迅速化したい！
☑ 損傷菌や VNC 菌を検出したい！
☑ 菌に対する薬剤効果を正確かつ簡便に評価したい！

評価にかかる時間を大幅に短縮

顕微鏡

蛍光染色法による細菌の生死判定などでよく用いられる膜損傷の有無を指標とした染め分けに加え、-Bacstain- Bacterial Viability
Detection Kit シリーズでは複数の指標を選んで染め分けすることができるため、細菌の状態を様々な視点から評価できます。
全菌

膜損傷-Bacstain- Bacterial Viability Deteciton Kit-DAPI/Pl

検出対象

✓

✓

-Bacstain- Bacterial Viability Deteciton Kit-CTC/DAPI

✓
✓

酵素活性

✓
✓

-Bacstain- Bacterial Viability Deteciton Kit-CFDA/PI
T 社 製品 L

呼吸活性

✓

✓

現在、菌に対する抗菌剤等の効果を評価する場合、培養法によるコロニー形成単位（CFU）の確認や蛍光染色試薬を用いた多重染色法による評価が広く用いられています。近年では特に感染症における薬剤耐性菌の出現や損傷菌が引き起こす食中毒等の問題を受けて、抗菌性評価の信頼性向上を目的にこれまで一般的に行われてきた単一指標ではなく、複数の指標で薬剤等の抗菌性を評価する必要性が高まっています。
また、日本国内では 2020 年の 6 月から食品を扱う全事業者に対して HACCP（危害分析重要管理点）に沿った衛生管理が制度化されることから、特に飲食料品の製造分野では菌検査の簡素化ならびに迅速化の需要が高まっています。

品名-Bacstain- Bacterial Viability Deteciton Kit-DAPI/Pl-Bacstain- Bacterial Viability Deteciton Kit-CTC/DAPI-Bacstain- Bacterial Viability Deteciton Kit-CFDA/PI

容量
希望納入価格（￥） メーカーコード
1 set
20,000BS08
1 set
36,000BS09
1 set
36,000
BS10※＜使用回数の目安＞

12

1 set あたり、約 100 検体分

No.174(2020)

新製品
バイオフィルム形成阻害測定キット・バイオフィルム薬剤効果測定キット
Biofilm Formation Assay Kit
Biofilm Viability Assay Kit

分かりやすい説明動画はこちら＜特長＞
・測定の手間を大幅に低減
・バラツキを抑えることが可能

B601

B603

既存法はマイクロプレートの底にバイオフィルムを形成するため、菌の培養に伴う培地交換や、染色工程前後の洗浄作業に多くの手間を要し、バラツキの問題がありました。本キットは蓋に固定されたピン上にバイオフィルムを形成させるため、培地交換や染色工程が蓋を移すだけで完了し、操作が非常に簡便です。

品名
Biofilm Formation Assay Kit
Biofilm Viability Assay Kit

容量100 tests
100 tests

希望納入価格（￥）
16,30018,700

メーカーコード
B601
B603

小社製品を使った論文を追加しました。

バイオフィルム

同仁

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微生物増殖アッセイキット
Microbial Viability Assay Kit-WST＜特長＞
・評価にかかる時間を大幅に短縮
・生菌の活性評価を濁度から色の変化へ

M439

検索

同仁

＜従来法との比較＞＊菌種によって最適条件は異なります。
従来法本キットに含まれる小社の開発品である還元発色剤 WST-8 は、
電子メディエーターを介して微生物内で生成する NAD(P)H によって還元され発色します。還元された WST-8 ホルマザン量は
微生物の代謝活性に比例しており、吸光度を測定することで、微生物の生存率や活性度合いを簡便に測定することができます。

＜操作＞

コロニー形成法
所要時間

特徴

24 時間以上

・標準法
・操作が煩雑96 well プレートに菌懸濁液を準備し、試薬を添加する。

本方法
濁度法

18-24 時間

WST 法
約 8 時間＊6 時間（培養
発色 2 時間 ）・短時間でのマイク・マイクロプレート
ロプレートアッセ
アッセイが可能
イが可能
・代謝活性は見れな・代謝活性を指標と
い
する

品名

容量
希望納入価格（￥） メーカーコード
100 tests
6,000
Microbial Viability Assay Kit-WST
M439
500 tests
21,300
微生物懸濁液に試薬を添加

インキュベーター
内で発色反応吸光度検出※本ページの上記 3 製品は、福岡県工業技術センター生物食品研究所との共同開発品です。

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No.174(2020)

膜がなが～く染まる

細胞膜染色試薬

PlasMem Bright Green
PlasMem Bright Red

SH-SY5Y より分化誘導した神経細胞（核とミトコンドリアを多重染色）

ホームページアドレス
URL：https://www.dojindo.co.jp/
E-mail：info@dojindo.co.jp

No.17414

フリーファックス
フリーダイヤル
ドージンニュース No.174

0120-021557
0120-489548

9：00 〜 17：00（ 受付時間：平日）
土・日・祝日は除く

令和 2 年 9 月 16 日発行

株式会社同仁化学研究所 DOJINDO LABORATORIES
熊本県上益城郡益城町田原 2025-5 〒 861-2202
発行責任者 松野寛明 編集責任者 岩永竜弥 年４回発行 許可なくコピーを禁ず