第四版
版

目次

かる！
わ
で
真
写

−細胞数の測定−
検出方法

目的

製品名

ページ

Cell Counting Kit -83吸光度
細胞増殖･毒性を測りたい

蛍光Cell Counting Kit -F

測定方法の特徴−細胞の染色−
目的

染色対象
生細胞

対象毎に細胞
を染めたい

死細胞

核

製品名
-Cellstain-Cellstain-Cellstain--Cellstain- Calcein-AM solution-Cellstain- CytoRed solution
BCECF-AM special packaging-Cellstain--Cellstain- DAPI solution-Cellstain--Cellstain- PI solution-Cellstain- AO solution-Cellstain- Hoechst 33258-Cellstain- Hoechst 33342

ミトコンドリア -Cellstain生細胞と死細胞を染め分けたい

生細胞
死細胞

ページ

-Cellstain--Cellstain- Double Staining Kit

1123

細胞増殖・毒性を測りたい
はじめに細胞数の測定方法には、コロニー形成法、クリスタルバイオレット法、[ 3 +] チミジン取り込み法、
077 法および :67 法などが利用されている。
コロニー形成法は、細胞の増殖能力を指標として顕微鏡によりコロニー数を計測する手法である。また、[ 3 +] チミジン取り込み法は、放射性同位元素 (5,) で標識したチミジンを細胞中の '1$ に取り込ませて、5, 標識のチミジン量をシンチレーションカウンター等で定量する手法である。一方、077 法や:67 法は、還元発色試薬と生細胞中の脱水素酵素活性を利用して、吸光度測定により細胞数を計測する方法である。これらは、測定の手軽さ、安全性、再現性などの点において、前者に比べ優れた測定方法であり、細胞増殖試験や薬剤感受性試験など幅広く利用されている。そのため、これから実験を始めようとする方にも、お勧めの測定方法である。その他、発色試薬よりも高感度な測定ができる蛍光試薬を用いた方法もある。以下に、発色および蛍光試薬を用いた各測定方法の特徴を紹介する。

製品の特徴&\WRWR[LFLW\/'+$VVD\.LW:67㐟㞳㻸㻰㻴άᛶ

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ྜ䛜䛒䜛

製品形態





単！





感度が高い！

操作が最も簡2

8 を用いる測定- 細胞増殖･毒性を測りたい -8を用いる測定

Cell Counting Kitはじめにlg

8 は、吸光度法による細胞数測定用キットで、細胞増殖試験や薬剤感受性試験等に利用することができる。水溶性のホルマザンを生成するテトラゾリウム塩、8 を使用しているため、のようにホ ルマザンを溶解する操作が不要である。
「検体への試薬添加」、「発色反応」、「吸光度測定」の 3 ステップで結果が得られる。マイクロプレートを用いた High-Throughput Screening にも適用できる。また、は細胞透過性が極めて低く細胞に対する毒性も低いため、 CellCounting
8 で評価した後、その細胞を他の試験に使用することも可能である。
以下に、96 穴マイクロプレートを用いた Cell Counting
試験法について紹介する。
【用途】 ・細胞数測定
・細胞毒性試験

8 の細胞数測定法ならびに薬剤感受性

・細胞増殖試験・薬剤感受性試験

準備するもの
装置・器具
・マイクロプレートリーダー
吸光度測定用フィルター Cell Counting Kit-8 : 450 〜 490 nm

・96 ウェルマイクロプレート（細胞培養用）
・マルチピペット（8 または 12 チャンネル : 10 〜 100 μl 対応）
・炭酸ガスインキュベーター
・クリーンベンチ・血球計算盤またはセルカウンター
試薬・ Cell Counting Kit -8［同仁品コード：
・細胞培養用培地

04］

調製
Cell Counting Kit-8

溶液調製は不要。

操作が簡単！

4℃保存 , 12 ヶ月間安定!
!

長期保存する場合は、測定に必要な量を分注して 20℃で保存する。
凍結融解は、繰り返さないようにする。

3

8 を用いる測定- 細胞増殖･毒性を測りたい -測定条件の設定lg

8 を用いて細胞増殖試験や細胞毒性試験等を行う際は、得られる吸光度と生細胞数が比例関係である必要がある。そこで、あらかじめ細胞数を計測し、測定する細胞数や発色反応時間l Counting Kit-8 を用いた測定条件の設定について紹介する。
の目安をつけることが望ましい。以下に、

操作注意点・コツ・測定対象の細胞を培養用フラスコから回収する。

・付着性細胞の場合、トリプシン処理やセル
スクレイパー等により回収する。

・細胞を計測して、濃度を決定した細胞懸濁液を調製する。
cells /ml)
（細胞濃度 :

・血球計算盤またはセルカウンターなどを用いて計測する。

・96 ウェルマイクロプレートの各ウェルに、段階希釈法により細胞・段階希釈法により細胞懸濁液を調製すると簡便である。
懸濁液を 100 μl ずつ入れる。バックグラウンド測定用のウェルには、（次ページ「実験例」を参照）

培地のみ入れる。

・炭酸ガスインキュベーターで、24 〜 48 時間前培養する。
（開始時間
:
〜終了時間
:
)

・96 ウェルマイクロプレートの各ウェルに、・培養後、ウェル当りの細胞数は、計測時の細胞数を上回っていることに注意する。細
胞数と吸光度の関係を得る場合、細胞が増殖しない時間内に試薬を添加し、吸光度を測定する。

・96 ウェル以外のプレートやシャーレを用いる場合、培地量の 1 10 量の試薬を加えCell Counting Kit-8 溶液を 10 μl ずつ加える。

・炭酸ガスインキュベーターで、1 〜 4 時間反応させる。
（開始時間
:
〜終了時間
:
)

る。
・試薬の添加量が少ないため、ウェルの側壁にチップの先を当てて加えると良い（下図）。試薬がウェルの側壁に付着した場合、プレートを軽く叩いて培地と混合させる。
・気泡は、測定値のバラツキの原因となるため、気泡を生じないようにする。

Check！

・マイクロプレートリーダーで、吸光度を測定する。
測定用フィルター
Cell Counting Kit-8 : 450 〜 490 nm

4・細胞種により生成するホルマザンの量が異なるため、試薬添加後の発色時間が同じで細胞も吸光度は異なる（次ページの60 細胞の図を参照）。
と

8 を用いる測定- 細胞増殖･毒性を測りたい -実験例

60 細胞（前骨髄球性白血病細胞）の浮遊液を、下図細胞（ヒト子宮頸癌細胞）および/の要領で 96 穴マイクロプレートの各ウェルに 2 5 × 104 , 1 25 × 104 , 6 2 × 103 ・・・0
l となるように段階的に希釈、分注した。前述の操作方法に従い、
lg8 を用い、細胞数を測定した。

≪段階希釈の方法≫
操作に注意！
8 チャンネルマルチピペットを用いて、96 ウェルマイ
クロプレートの各ウェルに培地 100 μl を入れて、次に、
5 × 105に調製した細胞懸濁液 100 μl を細胞数細胞が入った最後のウェルから
は、100 μlを取 って廃棄する。
100 μl 100 μl 100 μl
が最大となるウェルに加えてピペッティングする。その後、細胞濃度が半分となった浮遊液 100 μl を次のウェ 細胞浮遊液 100 μl細胞が存在しない
ウェルに、入れな培地 100 μl
いように注意！
ルに移して、同様にピペッティングにて混合する。以降、ウェル当りの細胞数 2.5 x 10 4 1.2 x 10 4 6.2 x 10 3 3.1 x 10 30 cells / well
この操作を繰り返す。

細胞数が同じ場合でも、細胞（下左図）と60 細胞（下右図）との間で吸光度の値に違いがある。

そのため、予備実験を実施して、細胞種毎に最適な細胞濃度（各ウェルに加える細胞数）や発色時間を設定することが望ましい。また、薬剤を用いた試験を行う際には、薬剤の性質（細胞増殖を促進するか、毒性のあるものか、還元性がないか）や暴露時間なども、予め考慮して設定することを
勧める。

60

培地 : DMEM (10% FBS)
発色反応 : 37℃ , 3 hr
5% CO2 インキュベーター内
測定波長 : 450 nm

培地 : RPMI1640 (10% FBS)
発色反応 : 37℃ , 3 5 hr
5% CO2 インキュベーター内
測定波長 : 450 nm* 参考 *
Cell Counting Kit-8 と 3

チミジン 取込み法との相関性

細胞の浮遊液を段階的に希釈したものを測8と 3定試料とした。Cell Counting
チミジ
ン 取込み法との間には、良好な相関性が得られた。

5

8 を用いる測定- 細胞増殖･毒性を測りたい -細胞増殖・毒性試験法
操作注意点・コツ・測定対象の細胞を培養用フラスコから回収する。

・付着性細胞の場合、トリプシン処理やセル
スクレイパー等により回収する。

・細胞を計測して、濃度を決定した細胞懸濁液を調製する。
cells /ml)
（細胞濃度 :

・血球計算盤、セルカウンターなどを用いて計測する。

・96 ウェルマイクロプレートの各ウェルに、細胞懸濁液を 100 μl ず ・浮遊細胞の場合、V 底プレートを使用してもよい。
つ入れる。バックグラウンド測定用のウェルには、培地のみ入れる。
Check！

・炭酸ガスインキュベーターで、24 〜 48 時間前培養する。
（開始時間
:
〜終了時間
:
)

・細胞数が多すぎる場合、マイクロプレート
リーダーの測定上限を超えてしまうことがある。被験物質 ( 薬剤 ) の性質（細胞増殖を促進するか抑制するか）、発色時間、細胞種等は重要な要因であるため、予備実験を実施して最適な細胞濃度（各ウェルに加える細胞数）を設定する。
・細胞培養開始から測定まで、48 時間以上培養する際は、培地交換を行う。

・必要に応じて培地交換を行う。

細胞を除かないように培地を除去した後、新しい培地を 100 μl ずつ入れる。バックグラウンド測定用のウェルには、培地のみ入れる。

・培地除去の際は、細胞にパスツールピペッ
トやチップの先端が接触しないように、下図のようにプレートを傾けると良い。
○

×・浮遊細胞の場合、V 底プレートを遠心して細胞を沈殿させた後、培地を除去する。

・培地を用いて任意の濃度に調製した被験物質液を 10 μl ずつ加える。 ・バックグラウンド測定用のウェル（細胞を入れていないウェル）にも同量の被験物質( 薬剤 ) を加える。一方、陰性対照のウェルには、被験物質を含まない培地 10 μl を加える。
・被験物質の溶解には、培地の他に、PBS
等の生理食塩水溶液も使用することができる。

・炭酸ガスインキュベーターで、一定時間 (6, 12, 24, 48 時間 ) 培養 ・被験物質への暴露時間は、任意に設定する。
する。
（開始時間
:
〜終了時間
:
)

6

8 を用いる測定- 細胞増殖･毒性を測りたい -操作

注意点・コツ・96 ウェルマイクロプレートの各ウェルに、・96 ウェル以外のプレートやシャーレを用いる場合、培地量の 1 10 量の試薬を加える。

Cell Counting Kit-8 溶液を 10 μl ずつ加える。

・試薬の添加量が少ないため、ウェルの側壁にチップの先を当てて加えると良い（下図）。
試薬がウェルの側壁に付着した場合、プレー
トを軽く叩いて培地と混合させる。
・気泡は、測定値のバラツキの原因となるため、気泡を生じないようにする。

・炭酸ガスインキュベーターで、1 〜 4 時間反応させる。
（開始時間
:
〜終了時間
:
)

・マイクロプレートリーダーで、450 nm の吸光度を測定する。

細胞生存率の算出

各ウェルの吸光度の値を下記の式に代入して、細胞生存率を算出する。
の場合

（

）

（

）

細胞生存率

検体の吸光度高

被験物質濃度

細胞生存率（％）＝

・浮遊細胞の場合、V 底プレートの溶液を別途用意した平底プレートにマルチピペットを用いて移した後、測定する。

＋

細胞 ＋ 被験物質
試薬溶液

低
細胞 ＋

被験物質濃度（対数表示）

試薬溶液
試薬溶液

陰性対照 吸光度
ブランク 吸光度

ブレイク！

Cell Counting Kit- 8 は、還元性物質が苦手？
細胞毒性試験では、「被験物質を加えた細胞を顕微鏡観察すると死んでいるのに発色する！？」
8 を還元している可能ということがある。この場合、被検物質が還元性を示す物質で、性がある。そこで、試験を行う前に、細胞が無い状態で培地と被検物質とlg8溶液を混合して発色を確認してみると良い。発色する場合には毒性試験の際、Cell Counting
8溶液を加える前に、細胞を培地やで洗浄して、被検物質を除去すると良い。洗浄工程が入るため、ウェル間のバラつきを抑えるよう慎重な操作を心がける。

7

8 を用いる測定- 細胞増殖･毒性を測りたい -トラブルシューティング
トラブル

考えられる原因

解決方法

吸光度が高く、機器の測定上限を超えてしまう。

ウェル当りの細胞数が多い。

細胞種毎に細胞数と吸光度の関係を測定する（「測定条件の設定」の項に従ってください）。前培養の時間が長くなり細胞が分裂を起こすと、ウェル当りの細胞数は初めに調製した数よりも増加するため注意が必要です。

細胞毒性試験において、細胞はダメージを受けているにもかかわらず、発色が起こってしまう。

被験物質（薬剤）が WST を還元している。

Cell Counting Kit- 8 溶液と被験物質のみを混合して、発色するか確認する。発色が起こる場合は、次のいずれかの方法により測定します。
1）Cell Counting Kit-8 溶液を加える前に、培地を用いて洗浄し、被験物質を除去する。
2）被験物質の還元性に影響を受けない Cell Count ing Kit-F(p. 30 ）を用いる。

測定値にバラツキが多い。

培地の水分蒸発により試薬濃度が変化している。

一番外側のウェルは、水分蒸発が起こりやすいため、測定には利用せず、培地のみを入れる。

Cell Counting Kit - 8 溶液が培地と混合していない。

プレートの側面を指で軽く叩き、ウェルの内壁に付着している Cell Counting Kit- 8 溶液を培地中に落とす。

培地の表面に気泡がある。

シリンジや注射針などの先端で、気泡を除去する。

発色反応を停止させる際、塩 培地の緩衝能により pH が低下せ酸を加えても反応が停止せず、 ず、細胞が生存している。
吸光度が増加してしまう。

8

プレートを叩く際は、ウェル中の培地が飛び出さない程度にする。

加える塩酸の濃度を高くする。または、1 w/v % SDS溶液などの界面活性剤を用いて発色反応を停止する。
(p. 10 Q&A 参照 )

8 を用いる測定- 細胞増殖･毒性を測りたい -Ｑ＆Ａ
試薬に関する質問

Ｑ：Cell Counting Kit- 8 の発色メカニズムを教えて下さい。
8 が電子メディエーター存在下、Ａ：
細胞中の脱水素酵素により還元され、橙色の生成物（ホルマザン）を生じます。細胞内脱水素酵素活性に応じて産出される NADH,NADPH
は、1-Methoxy PMS を介して WST-8 をホルマザンに還元します。このホルマザンの色素の量は、生細胞数に比例します。

脱水素酵素
↓

（還元体）

酸化体

基質

8 や 1-Methoxy PMS は、細胞膜を透過して細胞内まで浸透しますか？
Ｑ：
8 は細胞膜を透過しません。細胞は染まらず、細胞外液だけが着色します。
Ａ：
1-Methoxy PMS に関しては、細胞膜近傍で働いていると考えられてますが、中まで透過しているのか、細胞外のみに存在しているかの具体的機構は分かっておりません。

Ｑ：Cell Counting Kit-8 はと比較して、どの程度毒性が低いのですか？
8 の場合、試薬添加後 24 時間経過しても細胞生存率 90 以上であるのに対して、
Ａ：
8 での評価後、その細胞を他の試験に使用の場合、細胞生存率 0 です。そのため、することも可能です。ただし、細胞表面などに色素が残らないよう十分洗浄を行ってから、使用してください。

細胞培養に関する質問

Ｑ：Cell Counting Kit- 8 の測定対象となる細胞は何ですか？
Ａ：対数増殖期にある動物細胞が対象です。
Ｑ：対数増殖期に入るための前培養はどのくらいの期間行えばよいですか？
Ａ：細胞により異なりますが、12 時間から 48 時間程度行ってください。
Ｑ：Cell Counting Kit- 8 は、浮遊細胞・付着細胞ともに使用できますか？
Ａ：両方とも使用できます。ただし、付着細胞に比べ、浮遊細胞は発色が弱い傾向にあるため、呈色時間を長くしたり、細胞数を増やすといった検討が必要となります。
Ｑ：Cell Counting Kit- 8 を用いる場合、どの位の細胞数が適当でしょうか？
Ａ：ウェル当りの細胞数および発色時間が同じ場合でも、細胞種によって吸光度は異なります。96 ウェルマイクロプ
レートを使用する場合、1000 〜 10000 cells/well を目安に細胞数と吸光度の関係を確認してください。
Ｑ：前培養は、必ず行わなければならないのですか？
Ａ：付着細胞では前培養を推奨しております。トリプシン処理等により培養用フラスコから回収する際に、細胞はダメージを受けます。そのため、対数増殖期の状態にするために細胞の前培養が必要になります。浮遊細胞の場合は、省略しても構いません。
Ｑ：浮遊細胞でV底プレートを使用するのはなぜですか？
Ａ：浮遊細胞では遠心して底部に細胞を集約させたり、測定上清を回収するためです。
測定では平底プレートを使用してください。

9

- 細胞増殖･毒性を測りたい -Cell CountingKit-8 を用いる測定測定時に関する質問

Ｑ：24 well や 12 well のプレートで測定を行うことができますか？ その場合には試薬の添加量はどのようにすれば良いですか？
Ａ：96 well プレート以外でも測定できます。試薬の添加量は使用培地の 10 分の 1 を目安にして下さい。( 培地が 1 ml
であれば試薬を 100 μl など )Ｑ：発色反応を途中で止めたいのですが、どうすればいいでしょうか？
Ａ：下記の方法があります。いずれかの方法を行なって下さい（添加量は 96 well の場合）。
① 1 w/v% SDS を 10 μl 添加する。
注）添加する場合には、泡立たないようにしてください。液面の気泡は測定値がばらつく原因となります。
② 0.1 mol/ l 塩酸などの酸を (10 μl) 添加する。
注）反応停止後は、24 時間以内に測定して下さい。

※緩衝能の高い培地をご使用の場合には、より濃度の高い塩酸を添加してください。また、アルカリ溶液による反応停止は、生成したホルマザン色素が青色に変色してしまうため、定量性が失われます。

Ｑ：発色時間は、何時間がよいのか教えて下さい。
Ａ：通常、1 〜 4 時間としています。しかし、ウェル当りの細胞数および発色時間が同じ場合でも、細胞種によって吸光度は異なります。発色時間は、細胞数と吸光度が比例関係となるような条件に設定してください。
Ｑ：Cell Counting Kit- 8 の発色に影響を与えるような物質はありますか？
Ａ：還元性を示す物質が共存する場合、WST- 8 と反応して誤発色を生じることがあります。
また、フェノールレッドは測定波長付近に吸収があるため、フェノールレッド不含の培地に比べて 5% 程度のブラ
ンク値の上昇は見られますが、使用上は問題ありません。
Ｑ：ブランクを測定する場合、どのような条件で行えばよいでしょうか？
Ａ：状況に応じて、以下の吸光度を測定してください。
○細胞を含む培地に濁りがある場合「細胞」と「培地」を入れたウェルの吸光度（600 nm 以上）を測定してください。
得られたブランク測定値を各サンプルの測定値から差し引いてください。
* 濁りが存在すると、光の散乱が生じて測定誤差の原因となります。
還元された WST- 8 の吸収が存在しない 600 nm 以上の吸光度を測定してください。

ただし、濁りがない、又は殆ど無視できる程度の濁りであれば、測定する必要はありません。

○細胞や被験物質を含む培地に発色後の WST- 8 と同じ波長域の吸収がある場合「細胞」と「培地」および「被験物質（状況に応じて）」を入れたウェルの吸光度（450 nm）を測定してください。
得られたブランク測定値を各サンプルの測定値から差し引いてください。
* 培地の色が黄〜赤褐色となる場合は、測定波長域が重なる可能性があります。上記の方法に従って、 Cell Counting Kit- 8溶液を含まないウェルの吸光度を測定してください 。

○培地中の成分に Cell Counting Kit-8 溶液と反応する物質が存在する場合「培地」と「 Cell Counting Kit-8 溶液」を入れたウェルの吸光度（ 450 nm）を測定してください。
得られたブランク測定値を各サンプルの測定値から差し引いてください。
* 細胞を含まないウェルの吸光度を測定してください。培地中に還元性を示す物質が含まれると、WST- 8 が発色します。
吸光度が高く無視できない場合 、培地中の還元物質を除くか 、原因成分を含まない培地の使用を検討してください。

○被験物質が Cell Counting Kit-8 溶液と反応する場合「培地（被験物質を含む） と「 C e ll C o u n tin g K it- 8 溶液」を入れたウェルの吸光度（450 nm）を測定してください。
得られたブランク測定値を各サンプルの測定値から差し引いてください。
* 細胞を含まないウェルの吸光度を測定してください。被験物質が還元性を示す場合、 WST- 8が発色します。吸光度が高く無視できない場合、Cell Conting Kit-8溶液を加える前に、培地による細胞洗浄を行い、被験物質を除去してください。

10

Cell Counting Kit-8 報告論文
Cell Line7
7/
$$Alexander cell$02
$5$52$V3&%)
%%09(&%($6%
%006&
&$
&+2

Description
human kidney carcinoma
mouse embryonic fibroblast
human epithelial carcinoma cell

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FRUWLFDO QHXURQV,
PRXVH
SULPDU\&26

African green monkey kidney cell&9

African green monkey kidney cell'DR\human medulloblastoma

'DXGL
'/'
'7

human burkitt lymphoma
human colorectal adenocarcinoma
chicken B-lymphocyte cell'8

human prostate carcinoma

*
*&,<
+
+&&
+(.

human melanoma cell
human gastric carcinoma
human pulmonary adenocarcinoma
human breast cancer cell
human embryonic kidney cell

+H/Dhuman cervical carcinoma+HS%

human hepatocellular carcinoma+HS*

Human hepatocellular liver carcinoma

Hippocampal
from Wistar rat embryos
neuron, primary
K06&

human mesenchymal stem cell,/7+RG

7FHOO-XUNDW

human 7 cell

.DVXPL.06

acute myeloid leukemia cell
multiple myeloma.<6(esophageal squamous cell carcinoma

/
/.
/1&D3
0DFURSKDJH
0'&.
0LD3D&D

mouse fibroblast
human lung adenocarcinoma
human prostate carcinoma
PRXVH
canine kidney epithelial cellpancreatic cancer cell

07

7FHOO

1,+7
171

mouse fibroblast
human embryonal carcinoma

3$1&

pancreatic cancer cell

3&
3&1
361
5$W 26453
6+7&
6+6<<6.16+

human lung small-cell carcinoma
primary cortical neuron
pancreatic cancer cellmouse macrophage
B lymphoblastoid cell
human gastric cancer cell
human neuroblastoma
human neuroblastoma0 Ikonen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003, 100 , 13042.
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Cell Counting Kit-8( メーカーコード：CK04) は細胞毒性試験や薬剤感受性試験などに数多く使用されております。
上記に使用細胞種の一例を報告論文とともに示します。今後もご研究にご活用ください。

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-Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST 僸⏝傪僱

ᐃ-

Cytotoxicity
LDH
Assayを用いる測定
Kit-WST 僸⏝傪僱 ᐃ
Cytotoxicity
LDH Assay
Kit-WST

僕傾僧僑
Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST 僕傎 ⣽⬊傱僯ᇵᆅ୰僑ᨺฟ傻僲僅ங㓟⬺Ỉ⣲㓝⣲ (LDH) άᛶ僸 ᐃ傿僱傹僎僑僮僰⣽⬊യᐖ僸 ᐃ傿僱儑儧儬働储僱傏 LDH 僕⣽⬊㉁僑Ꮡᅾ傿僱㓝⣲働傎 ㏻ᖖ僕⣽⬊㉁僑␃僤僉僌傪僱傲傎 ⣽⬊⭷傲യᐖ僸ཷ傷僱僎ᇵᆅ୰僑ᨺฟ傻僲僱傏 ᨺฟ傻僲僅 LDH 僕Ᏻᐃ僐僅僧傎 Ṛ⣽⬊僤僅僕⣽⬊⭷僑യᐖ僸ཷ傷僅⣽⬊ᩘ僸 僱ᣦᶆ僎傽僌ᗈ債 ᐃ傻僲僌傪僱傏 LDH 僕傎 NAD 凚儯儗儥兗儆元儭儆儫儯兗儜儰儓児儎儥儭凛 僸⿵㓝⣲僎傽僌ங㓟僔⬺Ỉ⣲໬僸ゐ፹傽傎 儸兏儷兗㓟僎 NADH 僸⏕ᡂ傿僱傏 ḟ僑傎 ⏕傾僅 NADH 僕傎 㟁Ꮚ充儫儇儌兠儣兠僸௓傽僌優儬免儢兎儊兄ሷ 凚↓Ⰽ凛 僸儿兏兂儚兗 凚ᶳⰍ凛 僑㑏ඖ傿僱傏 ⏕ᡂ傽僅儿兏兂儚兗僔㔞僕傎 ᨺฟ傻僲僅 LDH άᛶ僑ẚ౛傿僱僅僧傎 യᐖ僸ཷ傷僅⣽⬊ᩘ僔ᣦᶆ僎僐僱傏 以下に、96 穴マイクロプレートを用いた Cytotoxicity LDH As-

say Kit-WST の細胞数測定法ならびに薬剤感受性試験法について紹介する。
【用途】

・細胞毒性試験・薬剤感受性試験‽ഛ傿僱≀⿦⨨ 兟 ჾල兟 兂儈儓兑儻児兠儬兎兠儤兠 凚490 nm 僔྾ග儹儇兏儣兠凛兟 96 ✰兂儈儓兑儻児兠儬 * 凚⣽⬊ᇵ㣴⏝凛兟 ᐃ⏝兂儈儓兑儻児兠儬 凚儲兗儿兆儜儯儆儝儆儧償儈僔僥凛兟 兂兏儥儸儾儧儬 凚8 僤僅僕 12 儥兇兗儱兏 : 10 到 200 μlᑐᛂ凛兟 Ⅳ㓟儐儝儈兗儑光儽兠儣兠兟 儓兎兠兗儽兗儥兟 ⾑⌫ィ⟬┙僤僅僕償兏儏儊兗儣兠* 儿兆儜儯儆儝儆儧償儈僔ሙྜ傎 ᾋ㐟⣽⬊僨ᖹᗏ僸౑⏝傿僱傏 儲兗儿兆儜儯儆儝儆儧償儈僔ሙྜ傎 ᾋ㐟⣽⬊僕୸ᗏ僤僅僕 V ᗏ僸౑⏝傿僱傏ヨ⸆兟 Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST 刍ྠோရ儗兠儭 凬 䣅䣍䢳䢴刏兟 ᇵ㣴ᇵᆅ

ᐃἲ僔㑅ᢥᮏ儑儧儬僕 䢴 僊僔ᐃἲ僑ᑐᛂ傽僌傪僱僅僧傎 ᐇ㦂≧ἣ僑ᛂ傾僌儿兆儜儯儆儝儆儧償儈ᐃ᪉ἲ僸㑅ᢥ傿僱傹僎傲働傳僱傏儲兗儿兆儜儯儆儝儆儧償儈ୖΎ

Working Solution⣽⬊ᇵ㣴ᾮ僔ධ僉僅ྛ儊儋兏僑┤᥋ Working Solution僸ῧຍ傽傎 ⓎⰍ཯ᛂ僸⾜催傏 ᇵ㣴ୖΎ僸⛣傽ኚ傮僱᧯స僨僐債⡆༢僐᧯స働 ᐃ傲働傳僱傏ᮏ儆儧償儈ἲ僔᧯స僕傎 P.13 僸ཧ↷傏Working Solution⣽⬊ᇵ㣴ᾮ僔ୖΎ僸௚僔儻児兠儬僑⛣傽 ᐃ傿僱僅
僧傎 儆儧償儈働౑⏝傽僅⣽⬊ 凚㧗儗兗儬兑兠兏僸㝖債凛 僕
Cell Counting Kit-8 僪 MTT 僸⏝傪僅⏕Ꮡ⣽⬊僔ヨ㦂僪⣽⬊ᰁⰍ僐像௚僔ᐇ㦂僑౑⏝働傳僱傏ᮏ儆儧償儈ἲ僔᧯స僕傎 P.16 僸ཧ↷傏Cell Counting Kit-8 僎僔ే⏝ᐇ㦂౛僕傎 P.20 僸ཧ↷傏

12

-Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST 僸⏝傪僱

ᐃ-

僔ㄪ〇
䷵

䷶

䷷

䷸

㌿ಽΰ࿴

1. 㐺㔞僔㌿ಽΰ࿴僸儥光兠儺僑ຍ傮僱傏僔
500 tests ཪ僕 2000 tests 凬

僸ຍ傮僱傏
僔

100 tests 凬

2. ㌿ಽΰ࿴僑僮僰ෆᐜ≀僸᏶඲僑⁐ゎ傿僱傏
3. 儝優儧儻 2 働ㄪ〇傽僅⁐ᾮ඲㔞僸僸ຍ傮僱傏僔兀儬兏僑⛣傿傏

4. ㌿ಽΰ࿴僑僮僰ෆᐜ≀僸ΰྜ傿僱傏ㄪ〇ᚋ僕㐽ගୗ傎 0 到 5 䰳働ಖᏑ傿僱 (6 党᭶㛫Ᏻᐃ )傏

儿兆儜儯儆儝儆儧償儈ᐃ᮲௳僔タᐃ
⣽⬊ෆ僔 LDH 㔞僕⣽⬊✀僑僮僉僌␗僐僱僅僧傎 ಙ㢗ᛶ僔储僱⤖ᯝ僸ᚓ僱僅僧僑僕஦๓僑ᐇ㦂᫬僔᭱㐺僐⣽⬊ᩘ僸☜ㄆ傿僱ᚲせ傲储僱傏 ௨ୗ僔᪉ἲ僑ᚑ傪傎 㧗儗兗儬兑兠兏傎 ప儗兗儬兑兠兏ཬ僙儴儧儓儔免儊兗儭儗兗儬兑兠兏僔྾ගᗘ್傱僯ᐇ㦂⣔僑储僉僅᭱㐺僐⣽⬊ᩘ僸☜ㄆ傿僱傹僎傲働傳僱傏

᧯స傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍ὀពⅬ 兟 儗儨• ⣽⬊僸ᇵᆅ働Ὑί傽傎 ᇵᆅ僸⏝傪僌 5×105
傿僱傏
• ᇵᆅ

僔⣽⬊ᠱ⃮ᾮ僸ㄪ〇兟 ⾑⌫ィ⟬┙僤僅僕償兏儏儊兗儣兠僐像僸⏝傪僌⣽⬊ᩘ僸ィ 傿僱傏兟 ྍ⬟僐㝈僰⃰傪⃰ᗘ僔⣽⬊ 105-106僸‽ഛ傿僱傏 ⣽⬊ᩘ傲ᑡ僐傪ሙྜ儴免儨儑僔ཎᅉ僎僐僱傹僎傲储僱傏兟ᇵᆅ୰僔⾑Ύ僑 LDH 傲ྵ僤僲僌傪僱ሙྜ傎 儴儧儓儔免儊兗儭傲㧗債僐僱傹僎傲储僱傏 僃僔ሙྜ傎 ⾑Ύ⃰ᗘ僸 5% ௨ୗ僑僌᳨ウ傿僱傏

僸 96 ✰兂儈儓兑儻児兠儬僔ྛ儊儋兏僑ຍ傮僱傏• 兂兏儥儥兇兗儱兏儸儾儧儬僸⏝傪僌⣽⬊ᠱ⃮ᾮ僔 2 ಸᕼ㔘⣔ิ僸ㄪ〇傿僱傏 㧗儗兗儬兑兠兏傎 ప儗兗儬兑兠兏ཬ僙儴儧儓儔免儊兗儭儗兗儬兑兠兏 ( ᇵᆅ僔僥 ) 僸 3 儊儋兏僀僊‽ഛ傿僱傏 凚P14 僔儻児兠儬㓄⨨ᅗ僸ཧ↷凛Ӑẁ㝵ᕼ㔘ࡢ᪉ἲӑ
8 ࢳࣕࣥࢿ࣐ࣝࣝࢳࣆ࣌ࢵࢺࢆ⏝࠸࡚ࠊ96 ࢙࣐࢘ࣝ࢖
ࢡࣟࣉ࣮ࣞࢺࡢྛ࢙࢘ࣝ࡟ᇵᆅ 100 P ࢆධࢀ࡚ࠊḟ࡟ࠊ

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᧯స僑ὀព

5 × 105࡟ㄪ〇ࡋࡓ⣽⬊ᠱ⃮ᾮ 100 P ࢆ⣽⬊ᩘࡀ᭱኱࡜࡞ࡿ࢙࢘ࣝ࡟ຍ࠼࡚ࣆ࣌ࢵࢸ࢕ࣥࢢࡍࡿࠋࡑࡢ
ᚋࠊ⣽⬊⃰ᗘࡀ༙ศ࡜࡞ࡗࡓᾋ㐟ᾮ 100 P ࢆḟࡢ࢙࢘ࣝ࡟⛣ࡋ࡚ࠊྠᵝ࡟ࣆ࣌ࢵࢸ࢕ࣥࢢ࡟࡚ΰྜࡍࡿࠋ௨㝆ࠊࡇࡢ᧯సࢆ⧞ࡾ㏉ࡍࠋ• 37䰳僔 CO2 儈兗儑光儽兠儣兠働ᇵ㣴傿僱傏兟 傹僔᫬僔ᇵ㣴᫬㛫僕ẘᛶヨ㦂᫬僔⸆๣ᭀ㟢᫬㛫僎ྠ傾僑傿僱傏兟 ⸆๣僔ᭀ㟢᫬㛫傲 24 ᫬㛫僸㉸傮僱ሙྜ傎 ⸆๣僑僮僰඲僌僔⣽⬊傲Ṛ價僆≧ែ働僨⣽⬊യᐖᛶ傲 100% 僑㐩傽僐傪傹僎傲储僱僅僧ὀព傲ᚲせ働储僱傏 ヲ⣽僕儬免儺兏儛光兠優儇兗儔僸ཧ↷傏

13

-Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST 僸⏝傪僱ᐃ-

᧯స傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍ὀពⅬ 兟 儗儨
• 㧗儗兗儬兑兠兏⏝僔儊儋兏僑僸ຍ傮僱傏兟ヨ⸆僔ῧຍ㔞傲ᑡ僐傪僅僧傎 儊儋兏僔ഃቨ僑儥儧儻僔ඛ僸ᙜ僌僌ຍ傮僱僎Ⰻ傪 凚ୗᅗ凛傏 ヨ⸆傲儊儋兏僔ഃቨ僑௜╔傽僅ሙྜ傎 儻児兠儬僸㍍債྇傪僌ᇵᆅ僎ΰྜ傻僁僱傏• 37䰳傎 30 ศ㛫 CO2 儈兗儑光儽兠儣兠ෆ働儈兗儑光儽兠儛克兗傿僱傏• ඲僌僔儊儋兏僑㛫࿊Ⰽ཯ᛂ僸⾜催傏• ඲僌僔儊儋兏僑僸ຍ傮僱傏 㐽ගୗ傎 ᐊ

働 30 ศ兟 ẼἻ僕傎 ᐃ್僔儴免儨儑僔ཎᅉ僎僐僱僅僧傎ẼἻ僸⏕傾僐傪僮催僑傿僱傏ῧຍᚋ傎 㐽ගୗ働 3 ᫬㛫僕兟྾ගᗘ್僑ኚ໬傲僐傪傹僎僸☜ㄆ傽僌傪僱傏僸ຍ傮僱傏• 儻児兠儬兎兠儤兠僸⏝傪僌 490 nm 僔྾ගᗘ僸ᐃ傿僱傏傍᭱㐺僐⣽⬊ᩘ僔⟬ฟᚓ僯僲僅྾ගᗘ僸⦪㍈僑傎 ⣽⬊ᩘ僸ᶓ㍈僑儻兑儧儬傽傎 ୗグ僔Ⅼ僸⪃៖傽᭱㐺僐⣽⬊ᩘ僸Ỵᐃ傿僱傹僎僸傰່僧傿僱傏- ⣽⬊ᩘ僎྾ගᗘ働儻兑儧儬傽┤⥺ᛶ傲储僰傎 ྾ගᗘ傲 2.0 ௨ୗ僔⣽⬊ᩘ僸㑅ᢥ傿僱傏- 㧗儗兗儬兑兠兏僎ప儗兗儬兑兠兏僔྾ගᗘᕪ傲 0.2 ௨ୖ僎僐僱⣽⬊ᩘ僸㑅ᢥ傿僱傏

儻児兠儬僔㓄⨨ᅗ1

-Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST 僸⏝傪僱ᐃ-⣽⬊ẘᛶヨ㦂
᧯స傍傍

ὀពⅬ 兟 儗儨• ணഛᐇ㦂働☜ㄆ傽僅儊儋兏ᙜ僅僰僔᭱㐺僐⣽⬊ᩘ僔 2 ಸ⃰ᗘ僑僐僱僮催ᇵᆅ働⣽⬊ᠱ⃮ᾮ僸ㄪ〇傽傎 ᖹᗏ 96 ✰兂儈儓兑儻児兠儬僑僸ຍ傮僱傏兟 ௜╔⣽⬊僔ሙྜ傎 ⣽⬊僸୍ᬌ儈兗儑光儽兠儛克兗傽僌傎 ᪂傽傪ᇵᆅ䢢50 僑஺᥮傽僅ᚋ僑ḟ僔᧯స僑㐍僦傏• ᇵᆅ働┠ⓗ僔⃰ᗘ僑ㄪ〇傽僅⿕㦂≀㉁⁐ᾮ僸ᐇ㦂儙兗儻兏僔儊儋兏僑傎 兟 ⿕㦂≀㉁୰僑ᙉ傪㑏ඖᛶ僸ᣢ僊≀㉁傲ྵ僤僲僌傪僱僎傎 Ⰽ⣲傲ㄗⓎⰍ傽僌儴儧儓儔免儊兗儭僸ᇵᆅ僸ྛ儗兗儬兑兠兏僔儊儋兏ຍ傮僱傏凚ୗグ傘ྛ儊儋兏僔⁐ᾮ㔞備僸ཧ↷凛ୖ傸僤傿傏 ⣽⬊僸ྵ僤僐傪ᇵᆅ傰僮僙⿕㦂≀㉁僸⏝傪ヨ⸆儺免兗儓僸 ᐃ傽僌☜ㄆ傿僱傏兟 ⸆๣僔ᭀ㟢᫬㛫傲 24 ᫬㛫僸㉸傮僱ሙྜ傎 ⸆๣僑僮僰඲僌僔⣽⬊傲Ṛ價僆≧ែ働僨⣽⬊യᐖᛶ傲 100% 僑㐩傽僐傪傹僎傲储僱僅僧ὀព傲ᚲせ働储僱傏 ヲ⣽僕儬免儺兏儛光兠優儇兗儔僸ཧ↷傏• 37䰳働㐺ษ僐᫬㛫 CO2 儈兗儑光儽兠儣兠ෆ働ᇵ㣴傿僱傏僸ຍ傮傎 37䰳傎 30 ศ㛫 CO2 儈兗• 㧗儗兗儬兑兠兏儊儋兏僑儑光儽兠儣兠ෆ働儈兗儑光儽兠儛克兗傿僱傏• ྛ儊儋兏僑

僸ຍ傮僱傏 㐽ගୗ傎 ᐊ

働 30 ศ㛫兟ヨ⸆僔ῧຍ㔞傲ᑡ僐傪僅僧傎 儊儋兏僔ഃቨ僑儥儧儻僔ඛ僸ᙜ僌僌ຍ傮僱僎Ⰻ傪 凚ୗᅗ凛傏 ヨ⸆傲儊儋兏僔ഃቨ僑௜╔傽僅ሙྜ傎 儻児兠儬僸㍍債྇傪僌ᇵᆅ僎ΰྜ傻僁僱傏࿊Ⰽ཯ᛂ僸⾜催傏• ඲僌僔儊儋兏僑僸ຍ傮僱傏• 儻児兠儬兎兠儤兠僸⏝傪僌 490 nm 僔྾ගᗘ僸兟 ẼἻ僕傎 ᐃ್僔儴免儨儑僔ཎᅉ僎僐僱僅僧傎ẼἻ僸⏕傾僐傪僮催僑傿僱傏ῧຍᚋ傎 㐽ගୗ働 3 ᫬㛫僕兟྾ගᗘ್僑ኚ໬傲僐傪傹僎僸☜ㄆ傽僌傪僱傏ᐃ傿僱傏ྛ儊儋兏僔⁐ᾮ㔞 凚儿兆儜儯儆儝儆儧償儈凛兟 㧗儗兗儬兑兠兏僔ᾮ㔞傲傎 ᐇ㦂儙兗儻兏ཬ僙௚僔儗兗儬兑兠兏僮僰僨 10% ከ傪傲 ᐃ್僑僕ᙳ㡪僸୚傮僐傪僔働傎 兀兎光兠兄⿵ṇ僔僅僧僔ᐇ㦂僔ᚲ
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15

-Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST

(3

-

)
‒

(%)

×100

‒

LDH

5×10 5cells/ml•

105-106 cells/ml•

100 μl 96
LDH
5%

•

(

)

3

2

(P17

)

≪段階希釈の方法≫
8 チャンネルマルチピペットを用いて、96 ウェルマイ
クロプレートの各ウェルに培地 100 l を入れて、次に、
5 × 105 cells/ml に調製した細胞懸濁液 100 l を細胞数が最大となるウェルに加えてピペッティングする。その後、細胞濃度が半分となった浮遊液 100 l を次のウェルに移して、
同様にピペッティングにて混合する。以降、この操作を繰り返す。

• 培地 100 l を全てのウェルに加える。
• 37

24

CO 2
100%

16

-Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST 僸⏝傪僱ᐃ-

᧯స傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍傍ὀពⅬ 兟 儗儨
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僸ຍ傮僱傏ᐃ್僔儴免儨儑僔ཎᅉ僎僐僱僅僧傎ẼἻ僸⏕傾僐傪僮催僑傿僱傏ῧຍᚋ傎 㐽ගୗ働 3 ᫬㛫僕兟྾ගᗘ್僑ኚ໬傲僐傪傹僎僸☜ㄆ傽僌傪僱傏• 儻児兠儬兎兠儤兠僸⏝傪僌 490 nm 僔྾ගᗘ僸ᐃ傿僱傏傍᭱㐺僐⣽⬊ᩘ僔⟬ฟᚓ僯僲僅྾ගᗘ僸⦪㍈僑傎 ⣽⬊ᩘ僸ᶓ㍈僑儻兑儧儬傽傎 ୗグ僔Ⅼ僸⪃៖傽᭱㐺僐⣽⬊ᩘ僸Ỵᐃ傿僱傹僎僸傰່僧傿僱傏- ⣽⬊ᩘ僎྾ගᗘ働儻兑儧儬傽┤⥺ᛶ傲储僰傎 ྾ගᗘ傲 2.0
௨ୗ僔⣽⬊ᩘ僸㑅ᢥ傿僱傏- 㧗儗兗儬兑兠兏僎ప儗兗儬兑兠兏僔྾ගᗘᕪ傲 0.2 ௨ୖ僎僐僱⣽⬊ᩘ僸㑅ᢥ傿僱傏儻児兠儬僔㓄⨨ᅗ

17

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᧯స傍傍

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࿊Ⰽ཯ᛂ僸⾜催傏僸ຍ傮僱傏 㐽ගୗ傎 ᐊ• ඲僌僔儊儋兏僑僸ຍ傮僱傏• 儻児兠儬兎兠儤兠僸⏝傪僌 490 nm 僔྾ගᗘ僸働 30 ศ㛫兟 ẼἻ僕傎 ᐃ್僔儴免儨儑僔ཎᅉ僎僐僱僅僧傎ẼἻ僸⏕傾僐傪僮催僑傿僱傏ῧຍᚋ傎 㐽ගୗ働 3 ᫬㛫僕兟྾ගᗘ್僑ኚ໬傲僐傪傹僎僸☜ㄆ傽僌傪僱傏

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18

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ゎỴ᪉ἲᇵᆅ僔⾲㠃僑ẼἻ傲储僱傏儛兎兗儜僪ὀᑕ㔪僐像僔ඛ➃働傎 ẼἻ僸㝖ཤ傿僱傏 儻児兠儬⏝僔㐲ᚰᶵ傲储僱ሙྜ僕傎 1000 x g 働 1 ศ㛫㐲ᚰ傿僱傏ᇵᆅ僔Ỉศ⵨Ⓨ僑僮僰ヨ⸆⃰ᗘ傲ኚ໬傽僌傪僱傏

୍␒እഃ僔儊儋兏僕傎 Ỉศ⵨Ⓨ傲㉳傹僰僪傿傪僅僧傎僕฼⏝僁僀傎 ᇵᆅ僔僥僸ධ僲僱傏ヨ⸆⁐ᾮ傲ᇵᆅ僎ΰྜ傽僌傪僐傪傏儻児兠儬僔ഃ㠃僸ᣦ働㍍債྇傳傎 儊儋兏僔ෆቨ僑௜╔傽僌傪僱ᐃ僑ヨ⸆⁐ᾮ僸ᇵᆅ୰僑ⴠ僎傿傏 儻児兠儬僸྇債㝿僕傎 儊儋兏୰僔ᇵᆅ傲㣕僙ฟ傻僐傪⛬ᗘ僑傿僱傏ṇ☜僐ヨ⸆㔞傲ῧຍ傻僲僌傪僐傪傏౑⏝傿僱儸儾儧儬僸⿵ṇ傿僱傏兂兏儥儥兇兗儱兏儸儾儧儬僸⏝傪僌傰僯

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Q&A ୰僔 傘㡯僸ཧ↷傏ᐃ僑ᙳ㡪僸୚傮僱໬ྜ≀僕储僰僤傿傱凱備 僔&\WRWR[LFLW\/'+$VVD\.LW:67 僸⏝傪僱ᐃQ&A
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- 細胞増殖･毒性を測りたい -MTT を用いる測定を用いる測定はじめに
3
チミジン
法は、Cell Counting Kit -8と同様に吸光度測定を利用して細胞数を測定する方法で、取り込み法のように放射性同位体を使用しない。テトラゾリウム塩化合物であるは、細胞膜を透過後、ミトコンドリア内脱水素酵素により青色の色素 ( ホルマザン ) に還元される。ホルマザンは難溶性の沈澱物として析出するため、吸光度測定前に有機溶媒により溶解させた後、吸光度を測定する。

【用途】 ・細胞数測定
・細胞増殖試験・細胞毒性試験 ・薬剤感受性試験

準備する物
装置・器具
・マイクロプレートリーダー
吸光度測定用フィルター 570 nm （ホルマザンの溶解液が塩酸 / イソプロピルアルコール溶液の場合）
535 nm （ホルマザンの溶解液が・96 ウェルマイクロプレート（細胞培養用）
・マルチピペット（8 または 12 チャンネル : 10 〜 100 μl 対応）
・炭酸ガスインキュベーター
・クリーンベンチ・血球計算盤またはセルカウンター

の場合）

試薬
・
［同仁品コード： 009］
: ダルベッコリン酸緩衝塩類溶液
・・濃塩酸
・イソプロピルアルコール・（溶解液として、塩酸 / イソプロピルアルコールを使用する場合は不要）

調製
2, Mg2 不含）・: ダルベッコリン酸緩衝塩類溶液（
メディウム瓶等に移して、オートクレーブ滅菌したものを使用する。
・溶液
25 mg に PBS(-) 5 ml を加えて溶解する。

!
!
!

溶解し難い場合は、超音波照射、ボルテックスにより溶解する。
必要に応じて、0 22 μm フィルターでろ過滅菌する。
保存する場合は、測定に必要な量ずつ分注して 20℃で保存する。

・ホルマザン溶解液

4 mol/l 塩酸 0 1 ml にイソプロピルアルコールを加えて、10 ml に希釈する。
!

4 mol/l 塩酸：濃塩酸を超純水で希釈して調製する。

塩酸ガスが発生するため、操作はドラフト内で行い、保護手袋・保護メガネを着用する。
超純水に濃塩酸を少しずつ加えて希釈する。

- 細胞増殖･毒性を測りたい -を用いる測定測定条件の設定を用いて細胞増殖試験や細胞毒性試験等を行う際は、得られる吸光度と生細胞数が比例関係である必要がある。そこで、あらかじめ細胞数測定を行い、測定する細胞数や発色反応時間の目安をつけることが望ましい。以下に、を用いた測定条件の設定について紹介する。

操作

注意点・コツ・測定対象の細胞を培養用フラスコから回収する。

・付着性細胞の場合、トリプシン処理やセル
スクレイパー等により回収する。

・細胞を計測して、濃度を決定した細胞懸濁液を調製する。
cells /ml)
（細胞濃度 :

・血球計算盤またはセルカウンターなどを用
いて細胞数を計測する。

・ 96 ウェルマイクロプレートの各ウェルに、・浮遊細胞の場合、V 底プレートを使用してもよい。

段階希釈法により細胞懸濁液を 100 μl ずつ入れる。バックグラウンド測定用のウェルには、培地のみ加える。

・段階希釈法により細胞懸濁液を調製すると簡便である。
（次ページ「実験例」を参照）

・炭酸ガスインキュベーターで、24 〜 48 時
間前培養する。
（開始時間
:
〜終了時間
:
)

・培養後、ウェル当りの細胞数は、計測時の細胞数を上回っていることに注意する。細
胞数と吸光度の関係を得る場合、細胞が増殖しない時間内に試薬を添加し、吸光度を測定する。

・培地交換した後、96 ウェルマイクロプレ

・96 ウェル以外のプレートやシャーレを用いる場合、培地量の 1 10 量の試薬を加える。

ートの各ウェルに、加える。

溶液を 10 μl ずつ

・炭酸ガスインキュベーターで、2 〜 4 時間反応させる。
（開始時間
:
〜終了時間
:
)

・試薬の添加量が少ないため、ウェルの側壁にチップの先を当てて加えると良い（下図）。試薬がウェルの側壁に付着した場合、プレートを軽く叩いて培地と混合させる。
・気泡は、測定値のバラツキの原因となるため、気泡を生じないようにする。

注意！

を 200 μl 加えて、約 1 分
・各ウェル中の溶液を吸引除去後、・培地を除去する際に、細胞がプレート底面
間経過後に、再度ウェル中の溶液を吸引除去する。
から剥がれないよう注意する。
・ホルマザン溶解液 ( 塩酸 / イソプロピルアル

・浮遊細胞の場合、V 底プレートの溶液を別途用意した平底プレートにマルチピペットを用いて移した後、測定する。

・マイクロプレートリーダーで、吸光度を測定する。

・細胞種により生成するホルマザンの量が異なるため、試薬添加後の発色時間が同じでも吸光度は異なる。

) を 200μl ずつ加える。
コール溶液又はホルマザンをピペッティングなどにより、完全に溶解する。

塩酸 / イソプロピルアルコール溶液 : 570 nm: 535 nm- 細胞増殖･毒性を測りたい -を用いる測定実験例
細胞（ヒト子宮頸癌細胞）の浮遊液を、下図の要領で 96 穴マイクロプレートの各ウェルに 2 5/well となるように段階的に希釈、分注した。前述の操作
× 104 , 1 25 × 104 , 6 2 × 103 ・・・0
方法に従い、を用い、細胞数を測定した。
≪段階希釈の方法≫
操作に注意！
8 チャンネルマルチピペットを用いて、96 ウェルマイ
クロプレートの各ウェルに培地 100 μl を入れて、次に、
5 × 10 5に調製した細胞浮遊液 100 μl を細胞
細胞が入った最後のウェルから
は、100 μlを取って 廃棄する。
100 μl 100 μl 100 μl
数が最大となるウェル加えてピペッティングする。その後、細胞濃度が半分となった浮遊液 100 μl を次のウェ 細胞浮遊液 100 μl細胞が存在しない
ウェルに、入れな培地 100 μl
ルに移して、同様にピペッティングにて混合する。以降、
いように注意！
ウェル当りの細胞数 2.5 x 10 4 1.2 x 10 4 6.2 x 10 3 3.1 x 10 30 cells / well
この操作を繰り返す。

炭酸ガスインキュベーターで 24 時間前培養した後、前述の操作方法に従って細胞数とホルマザンの吸光度との関係を確認した。ここでは、
ホルマザンの溶解液として、塩酸 - イソプロピルアルコー
ル、またはを用いた場合の比較を示した。溶解液には、を用いた方が、塩酸 - イソプロ
ピルアルコールに比べて感度が良い結果が得られた。
なお、溶解液によって溶液の極大吸収波長域が変化するため、吸光度測定用フィルターを以下の通り設定して測定した（塩酸 - イソプロピルアルコール : 570 nm、：535 nm）。

ホルマザンの写真
ホルマザンは、水に溶解せず針状結晶となる。
は細胞内に移動した後、ホルマザンを生成するため、試薬自身の毒性も考慮にいれて細胞数と吸光度の関係試験を行う必要がある。

ブレイク！

細胞に優しい！ Cell Counting Kit- 8lg8 溶液に含まれる
8 は、主に細胞の外で還元されて水溶性のホルマザンを
lg
8 を添加して発色反応した後でも、細胞は殆ど形態を変える生成する。このため、ことなく生存し続ける。
lg
8 を使用することで、試薬による細胞へのダメージを与えることなく毒性試験を実施することができる。

- 細胞増殖･毒性を測りたい -を用いる測定細胞増殖・毒性試験法
操作注意点・コツ・測定対象の細胞を培養用フラスコから回収する。

・付着性細胞の場合、トリプシン処理やセル
スクレイパー等により回収する。

・細胞を計測して、濃度を決定した細胞懸濁液を調製する。
cells /ml)
（細胞濃度 :

・血球計算盤、セルカウンターなどを用いて計測する。

・96 ウェルマイクロプレートの各ウェルに、細胞懸濁液を 100 μl ず ・浮遊細胞の場合、V 底プレートを使用してもよい。
つ入れる。バックグラウンド測定用のウェルには、培地のみ入れる。

・炭酸ガスインキュベーターで、24 〜 48 時間前培養する。
（開始時間
:
〜終了時間
:
)

・細胞数が多すぎる場合、マイクロプレー
トリーダーの測定上限を超えてしまうことがある。薬剤などの被検物質の性質（細胞増殖を促進するか抑制するか）、発色時間、細胞種等は重要な要因であるため、予備実験を実施して最適な細胞濃度（各ウェルに加える細胞数）を設定する。

・必要に応じて培地交換を行う。

・細胞培養開始から測定まで、48 時間以上培養する際は、培地交換を行う。
細胞を除かないように培地を除去した後、新しい培地を 100 μl ずつ
・浮遊細胞の場合、V 底プレートを遠心して入れる。バックグラウンド測定用のウェルには、培地のみ入れる。
細胞を沈殿させた後、培地を除去する。

・培地を用いて任意の濃度に調製した被検物質液を 10 μl ずつ加える。・バックグラウンド測定用のウェル（細胞を・炭酸ガスインキュベーターで、一定時間 ( 6, 12, 24,
させる。
（開始時間
:
〜終了時間
:
)
・96 ウェルマイクロプレートの各ウェルに、添加する。

入れていないウェル）にも同量の被験物質( 薬剤 ) を加える。一方、陰性対照のウェルには、被験物質を含まない培地 10 µ を加える。
・被験物質の溶解には、培地の他に、PBS
48 時間 ) 反応 等の生理食塩水溶液も使用することができる。
・被験物質への暴露時間は、任意に設定する。

溶液を 10 μl ずつ

・96 ウェル以外のプレートやシャーレを用いる場合、培地量の 1 10 量の試薬を加える。
・試薬の添加量が少ないため、ウェルの側壁にチップの先を当てて加えると良い（右図）。試薬がウェルの側壁に付着した場合、プレー
トを軽く叩いて培地と混合させる。
・気泡は、測定値のバラツキの原因となるため、気泡を生じないようにする。

- 細胞増殖･毒性を測りたい -を用いる測定操作

注意点・コツ・炭酸ガスインキュベーターで、2 〜 4 時間培養する。
（開始時間: 〜終了時間 : )・薬剤への暴露時間は、任意に設定する。

・各ウェル中の溶液を吸引除去後、- 200 μl を加え、約 1 分
間経過後に、再度ウェル中の溶液を除去する。

・を加えた細胞は、プレート底面から剥がれやすくなるため、培地を除去する際に注意する。
・浮遊細胞の場合、V 字プレートを遠心して細胞を沈殿させた後、培地を除去する。

Check！

・ホルマザン溶解液 ( 塩酸 / イソプロピルアルコール溶液又は・ピペッティングにより溶解する。生成したホルマザンを完全に溶解することが、測定値のバラつきを抑える上で重要である。

・マイクロプレートリーダーを用いて吸光度を測定する。

・細胞種により生成するホルマザンの量が異なるため、試薬添加後の発色時間が同じでも吸光度は異なる。

DMSO) を 200 μl ずつ加える。ホルマザンをピペッティングなどにより、完全に溶解する。

塩酸 / イソプロピルアルコール溶液 : 570 nm
DMSO: 535 nm

細胞生存率の算出

・浮遊細胞の場合、V 底プレートの溶液を別途用意した平底プレートにマルチピペットを用いて移した後、測定する。

各ウェルの吸光度の値を下記の式に代入して、細胞生存率を算出する。
の場合

（

）

（

）

高

細胞生存率

被験物質濃度

細胞生存率（％）＝

検体の吸光度細胞 ＋ 被験物質
試薬溶液
＋

低

細胞 ＋
被験物質濃度（対数表示）

試薬溶液
試薬溶液

陰性対照 吸光度
ブランク 吸光度

- 細胞増殖･毒性を測りたい -077 を用いる測定

トラブルシューティング
トラブル

考えられる原因

解決方法

試料に濁りがある。

生体試料に濁り成分が含まれている。

650 QP の吸光度を測定し、各サンプルの測定値から培地を吸引除去する際に、077
ホルマザンが除去されている。

浮遊細胞を用いている場合、遠心分離で細胞を沈殿させて下さい。

細胞数が少ない。

細胞種毎に細胞数と吸光度の関係を測定する。（「測定条件の設定」の項に従ってください）

077 が劣化している。

077 溶液を再度調製して、測定してください。

インキュベーションの時間が短い。

2 〜 4 時間で最適なインキュベーション時間を検討下さい。

077 ホルマザンが完全に溶解しホルマザン溶解液（塩酸 / イソプロピルアルコール溶液又は '062）を加え、ホルマザンをピペッティン

色が変化しない。

測定値にバラツキが多い。

ていない。

差し引いてください。

グなどにより、完全に溶解して下さい。
培地の水分蒸発により試薬濃度が変化している。

一番外側のウェルは、水分蒸発が起こりやすいため、測定には利用せず、培地のみを入れる。

077 溶液が培地と混合していな
い。

プレートの側面を指で軽く叩き、ウェルの内壁に付着している 077 溶液を培地中に落とす。プレートを叩く際は、ウェル中の培地が飛び出さない程度にする。

培地の表面に気泡がある。

シリンジや注射針などの先端で、気泡を除去する。



- 細胞増殖･毒性を測りたい -を用いる測定Ｑ＆Ａ
Ｑ：
法の測定原理を教えてください。
：
は細胞膜を透過した後、ミトコンドリア内脱水素酵素により還元されてホルマザンと呼ばれる色素を生成します。このことから、ホルマザンの生成量が生細胞数と比例関係になることを利用して細胞数の測定ができます。但し、の場合、生成するホルマザンは難溶性の沈殿物として析出するために、吸光度を測定する前に有機溶媒により溶解させる必要があります。

ミトコンドリア
脱水素酵素

黄色溶液

難溶性沈殿

Ｑ：ホルマザン溶解液 ( 塩酸 イソプロピルアルコール又は）を加える理由は何ですか？
Ａ：細胞を死滅させて細胞膜を壊し、細胞の中にある
ホルマザンを取り出して、溶解するために用います。
Ｑ：ホルマザン溶解液 ( 塩酸 イソプロピルアルコール又はなぜですか？
Ａ：）を添加する前に、培地を除くのはホルマザンは水に難溶性であり、培地や緩衝液が残っていると、溶解性が下がるためです。

Ｑ：浮遊細胞でV底プレートを使用するのはなぜですか？
Ａ：浮遊細胞では遠心して底部に細胞を集約させたり、測定上清を回収するためです。
測定では平底プレートを使用してください。

- 細胞増殖･毒性を測りたい -を用いる測定Cell Counting Kit-F を用いる測定
はじめに

l
g
は、蛍光測定を利用して細胞数を測定するキットである。
-8や法と同様に細胞数測定等に利用することができる。分子内にエステル構造を有するは、細胞膜を透過した後、細胞内の酵素（エステラーゼ）により加水分解されて、蛍光性を示すを生成する。この蛍光量を測定することで細胞数を測定することができ、
lg8のような吸光度測定よりも高感度な測定ができる。 Cell Counting Kit-8 のように還元物質の存在によって測定に影響が現れる場合に有効である。
lg【用途】 ・細胞数測定

・細胞毒性試験・細胞増殖試験・薬剤感受性試験

準備するもの
装置・器具
・マイクロプレートリーダー
蛍光測定用フィルター 励起波長 : 480 〜 500 nm
蛍光波長 : 500 〜 535 nm

・96 ウェルマイクロプレート（細胞培養用 , 蛍光測定用）
・マルチピペット（8 または 12 チャンネル : 10 〜 100 μl 対応）
・炭酸ガスインキュベーター
・クリーンベンチ・血球計算盤またはセルカウンター

試薬・Cell Counting Kit -F［同仁品コード：CK 06］
・細胞培養用培地
2, Mg2 不含）・: ダルベッコリン酸緩衝塩類溶液（! メディウム瓶等に移して、オートクレーブ滅菌 (121℃、20 分間 ) したものを使用する。

調製
・Cell Counting Kit-F 溶液
マイクロピペットを用いて、Cell Counting Kit-F を! 希釈後は保存ができないため、用時調製する。

で 50 倍に希釈する。

- 細胞増殖･毒性を測りたい -を用いる測定測定条件の設定
Cell Counting Kit-F を用いて細胞増殖試験や細胞毒性試験等を行う際は、得られる蛍光量（蛍光強度）と生細胞数が比例関係である必要がある。そこで、あらかじめ細胞数測定を行い、測定する細胞数や発色反応時間の目安をつけることが望ましい。以下に、Cell Counting Kit-F を用いた測定条件の設定について紹介する。

操作

注意点・コツ・測定対象の細胞を培養用フラスコから回収する。

・バックグラウンドの上昇を防ぐため、蛍光測定用のプレートを用いる。
・付着性細胞の場合、トリプシン処理やセル・細胞を計測して、濃度を決定した細胞懸濁液を調製する。
スクレイパー等により回収する。
（細胞濃度 :)
・血球計算盤またはセルカウンターなどを用いて計測する。
・96 ウェルマイクロプレートの各ウェルに、細胞懸濁液を 100 μl ず ・段階希釈法により細胞懸濁液を調製すると簡便である。
つ入れる。バックグラウンド測定用のウェルには、培地のみ加える。
（次ページ「実験例」を参照）

・炭酸ガスインキュベーターで、24 〜 48 時間前培養する。
（開始時間
:
〜終了時間
:
)

・培地を除去した後、・培養後、ウェル当りの細胞数は、計測時の細胞数を上回っていることに注意する。細
胞数と吸光度の関係を得る場合、細胞が増殖しない時間内に試薬を添加し、吸光度を測定する。

または血清・フェノールレッドを含まな ・培地を除去する際に、細胞がプレート底面から剥がれないよう注意する。培地除去の際は、細胞にパスツールピペットやチップの先端が接触しないように、下図のようにプレートを傾けると良い。

い培地を 100 μl ずつ入れる。

g Kit-F はCell Countin
必要！
が
換
培地交

○

×

・浮遊細胞の場合、 底プレートを遠心して細胞を沈殿させた後、培地を除去する。

・96 ウェルマイクロプレートの各ウェルに、lgを 10 μl ずつ添加し、室温で 15 〜 30 分間反応させる。
（開始時間
:
〜終了時間
:
)

溶液 ・96 ウェル以外のプレートやシャーレを用いる場合、培地量の 1 10 量の試薬を加える。
・試薬の添加量が少ないため、ウェルの側壁にチップの先を当てて加えると良い（下図）。試薬がウェルの側壁に付着した場合、プレートを軽く叩いて培地と混合させる。
・気泡は、測定値のバラツキの原因となるため、気泡を生じないようにする。

・マイクロプレートリーダーで、蛍光を測定する。

励起波長 : 480 〜 500 nm
蛍光波長 : 500 〜 535 nm

・浮遊細胞の場合、V 底プレートの溶液を別途用意した平底プレートにマルチピペットを用いて移した後、測定する。

&HOO &RXQWLQJ .LW) を用いる測定- 細胞増殖･毒性を測りたい -実験例+H/D 細胞（ヒト子宮頸癌細胞）および +/60 細胞（前骨髄球性白血病細胞）の浮遊液を、下図の要領で 96 ウェルマイクロプレートの各ウェルに 25 × 104 , 125 × 104 , 62 × 103 ・・・0
FHOOV/well となるように段階的に希釈、分注した。前述の操作方法に従い、Cell Counting Kit-F を用い、細胞数を測定した。
≪段階希釈の方法≫
操作に注意！
8 チャンネルマルチピペットを用いて、96 ウェルマイ
クロプレートの各ウェルに培地 100 μl を入れて、次に、
5 × 10 5 FHOOVPO に調製した細胞浮遊液 100 μl を細胞
細胞が入った最後のウェルから
は、100 μlを取って廃棄する。
100 μl 100 μl 100 μl
数が最大となるウェル加えてピペッティングする。その後、細胞濃度が半分となった浮遊液 100 μl を次のウェ 細胞浮遊液 100 μl細胞が存在しない
ウェルに、入れな培地 100 μl
ルに移して、同様にピペッティングにて混合する。以降、
いように注意！
ウェル当りの細胞数 2.5 x 10 4 1.2 x 10 4 6.2 x 10 3 3.1 x 10 30 cells / well
この操作を繰り返す。

+H/D 細胞（下左図）と +/60 細胞（下右図）の測定例を示した。Cell Counting Kit-F では、吸光度による測定に比べて、低濃度域まで比例関係が得られるために正確な測定ができる。
下図は、測定値からバックグラウンド蛍光を差し引いた値をプロットした。











  % "!  %





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  % "!  %









 


! 

! $#

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! $#







- 細胞増殖･毒性を測りたい -を用いる測定細胞増殖・毒性試験法
操作注意点・コツ・測定対象の細胞を培養用フラスコから回収する。

・付着性細胞の場合、トリプシン処理やセル
スクレイパー等により回収する。

・細胞を計測して、濃度を決定した細胞懸濁液を調製する。
cells /ml)
（細胞濃度 :

・血球計算盤、セルカウンターなどを用いて計測する。

・96 ウェルマイクロプレートの各ウェルに、細胞懸濁液を 100 μl ず ・浮遊細胞の場合、V 底プレートを使用してもよい。
つ入れる。バックグラウンド測定用のウェルには、培地のみ加える。

・細胞数が多すぎる場合、マイクロプレー
トリーダーの測定上限を超えてしまうことがある。薬剤などの被検物質の性質（細胞増殖を促進するか抑制するか）、発色時間、細胞種等は重要な要因であるため、予備実験を実施して最適な細胞濃度（各ウェルに加える細胞数）を設定する。

・炭酸ガスインキュベーターで、24 〜 48 時間培養する。
（開始時間
:
〜終了時間
:
)

・細胞培養開始から測定まで、48 時間以上培養する際は、培地交換を行う。
細胞を除かないように培地を除去した後、新しい培地を 100 μl ずつ ・培地除去の際は、細胞にパスツールピペッ
入れる。バックグラウンド測定用のウェルには、培地のみ入れる。 トやチップの先端が接触しないように、下図のようにプレートを傾けると良い。

・必要に応じて培地交換を行う。

○

×・浮遊細胞の場合、V 底プレートを遠心して細胞を沈殿させた後、培地を除去する。

・培地を用いて任意の濃度に調製した被験物質液を 10 μl ずつ加える。・バックグラウンド測定用のウェル（細胞を入れていないウェル）にも同量の被験物質( 薬剤 ) を加える。一方、陰性対照のウェルには、被験物質を含まない培地 10 μl を加える。
・被験物質の溶解には、培地の他に、PBS
等の生理食塩水溶液も使用することができる。

・炭酸ガスインキュベーターで、一定時間 ( 6, 12, 24, 48 時間 ) 培養 ・被験物質への暴露時間は、任意に設定する。
する。
（開始時間
:
〜終了時間
:
)

- 細胞増殖･毒性を測りたい -を用いる測定操作
・培地を除去した後、注意点・コツまたは血清・フェノールレッドを含まない培地を 100 μl ずつ入れる。

・96 ウェルマイクロプレートの各ウェルに、溶液を 10 μl ずつ添加する。

・室温で、15 〜 30 分間反応させる。
（開始時間
:
〜終了時間
:

l

g

・96 ウェル以外のプレートやシャーレを用いる場合、培地量の 1 10 量の試薬を加える。
・試薬の添加量が少ないため、ウェルの側壁にチップの先を当てて加えると良い（下図）。試薬がウェルの側壁に付着した場合、プレートを軽く叩いて培地と混合させる。
・気泡は、測定値のバラツキの原因となる
ため、気泡を生じないようにする。

)

・マイクロプレートリーダーで、蛍光を測定する。

励起波長 : 480 〜 500 nm
蛍光波長 : 500 〜 535 nm

・浮遊細胞の場合、V 底プレートの溶液を別途用意した平底プレートにマルチピペ
ットを用いて移した後、測定する。

細胞生存率の算出

各ウェルの蛍光強度を下記の式に代入して、細胞生存率を算出する。

の場合

（

）

（

）

高

細胞生存率

被験物質濃度

細胞生存率（％）＝

検体の蛍光強度＋

細胞 ＋ 被験物質
試薬溶液

低
細胞 ＋
被験物質濃度（対数表示）

試薬溶液

陰性対照 蛍光強度

試薬溶液

ブランク 蛍光強度

- 細胞増殖･毒性を測りたい -&HOO &RXQWLQJ .LW) を用いる測定

トラブルシューティング
トラブル

考えられる原因

解決方法

感度が低い。
（バックが高い）

細胞数が少ない。

細胞種毎に細胞数と蛍光量の関係を測定する（「測定条件の設定」の項に従ってください）。また、細胞の種類により &DOFHLQ$0 の細胞膜への透過性が異なります。

試薬が劣化している。

&HOl &RXQWLQg .LW) 溶液（&DOFHLQ$0 は、3%6  に
希釈後、非常に不安定になります。希釈溶液は、用時調製して下さい。

測定値にバラツキが多い。

洗浄が不足している。

血清成分およびフェノールレッドの影響を受けるので、&HOl &RXQWLQg .LW) 溶液を添加する前に、十分洗浄を行って下さい。

透明プレートを使用している。

蛍光用の黒色または白色のプレートを使用して下さい。

培地の水分蒸発により試薬濃度が変化している。

一番外側のウェルは、水分蒸発が起こりやすいため、測定には利用せず、培地のみを入れて下さい。

Cell Counting .LW) 溶液が培地とプレートの側面を指で軽く叩き、ウェルの内壁に付着している Cell Counting .LW) 溶液を培地中に落として下さい。プレートを叩く際は、ウェル中の培地が飛び出さない程度にして下さい。

混合していない。

培地の表面に気泡がある。

シリンジや注射針などの先端で、気泡を除去して下さい。

- 細胞増殖･毒性を測りたい -を用いる測定Ｑ＆Ａ
Ｑ：Cell Counting Kit-F に用いられている Calcein-AM (Calcein) は細胞内外において安定ですか？
Ａ：
は細胞内外に関わらず安定ですが、は不安定です。細胞外に余分なが残っていると、その一部が分解して蛍光を出し、誤差要因となりますので、洗浄による除去が必要です。また、が変動すると蛍光強度に影響を与えますので、条件は一定にして下さい。
Ｑ：通常の透明な培養プレートでも測定出来ますか？
Ａ：白色または黒色のプレートを使用してください。透明な培養プレートでは測定時の照射した光が散乱してしまい、
正確な測定が行えません。正確な測定を行うためにも、白色及び黒色の蛍光用プレートをご使用下さい。
Ｑ：培養時間を長くすると蛍光はさらに増えますか？
Ａ：培養時間を長くしてもそれほど蛍光強度は高くなりません。逆に減少していく可能性があります。使用しているは細胞膜に浸透して、細胞内で加水分解され、となり蛍光を発します。
は細胞内では異物となりますので、細胞外に放出されます。そのため蛍光は徐々に減少していきます。
Ｑ：Cell Counting Kit-F を用いた測定で、血清が入っていると使用できないのはなぜですか？
Ａ：培地中に血清が存在することにより、細胞外での分解が引き起こされます。
少ない細胞数からの測定を可能とするために、蛍光ブランクの要因となるものをとり除く必要があります。
Ｑ：血清、フェノールレッドは前培養段階でも入ってはいけませんか？
Ａ：前培養の段階であれば、特に問題はありません。Cell Counting Kit-F 添加時の培養液に血清、フェノールレッドが入っていなければ問題ありませんので、添加前に培養液の交換をしてください。

Ｑ：フェノールレッド含有培地の交換ができない場合、他にどのような方法がありますか？
Ａ：Cell Counting Kit-8 をお勧めします。蛍光法と吸光度法の違いがあり、感度は低くなりますが、フェノールレッドを含む培地でも測定できます。
Ｑ：浮遊細胞でV底プレートを使用するのはなぜですか？
Ａ：浮遊細胞では遠心して底部に細胞を集約させたり、測定上清を回収するためです。
測定では平底プレートを使用してください。
Ｑ：Cell Counting Kit-F の測定原理を教えて下さい。

Ａ：分子内にエステル構造を有するは、細胞膜を透過した後、細胞内の酵素（エステラーゼ）により加水分解されて、蛍光性を示すを生成します。この蛍光量を測定することで、細胞数を測定することができます。
また、加水分解されたは、細胞膜の透過性が低くなり、細胞外に放出されにくくなります。

無蛍光

蛍光

測定方法の特徴- 測定方法の特徴 -細胞数の測定には、種々の方法が存在する。
各測定方法において測定原理が異なる場合、生細胞とする指標が違うことから、同じ実験を実施しても得られる結果に差が現れることがある。各測定方法の特徴を理解した上で、研究の目的に適した測定方法を採用することをお勧めする。
ここでは、代表的な測定方法の原理とその用法について紹介する。

酵素・呼吸活性を指標とした測定法
細胞内に存在する種々の酵素活性を指標とした手法である。
- 還元発色試薬や酵素基質部位を有する試薬などを用いた測定方法。
- 操作が簡便なため、マイクロプレートによる多検体処理に適している。
- 細胞増殖測定、毒性試験などの薬物スクリーニング等に利用されている。
ミトコンドリア内脱水素酵素活性を指標とした方法
代表的な試薬（還元発色色素）

細胞内のエステラーゼ活性を指標とした方法
代表的な試薬（エステル部位が切断されることで蛍光性を示す色素）
Calcein-AM

細胞全体の脱水素酵素活性を指標とした方法
代表的な試薬（還元発色色素）

エステラーゼ原理・操作は非常に似ていますが・・・、使用する試薬によって得られる結果が異なる場合があることに注意が必要！

細胞膜に損傷を受けた細胞から漏出する乳酸脱水素酵素
活性を測定する方法。
前述の生細胞数測定法とは異なり、細胞が損傷した死細胞を測定する。
生細胞数を測定方法とは指標が違うため、細胞毒性試験などで異なる結果が得られる。
細胞膜に損傷を受けた細胞を死細胞とする方法である。
試薬の種類により、比色および蛍光の検出方法がある。
法など測定が困難な 細胞による死細胞測定などに便利である。

（比色）

細胞内から遊離した
遊離

活性を測定

活性測定方法の場合、死細胞の数に応じて吸光度または蛍光強度が増大する。

- 測定方法の特徴 -ヌクレオシド取り込み量測定法
細胞分裂に伴う'1$の複製を、細胞増殖の指標とした手法
検出方法の違いにより、取り込ませるヌクレオシドの種類が異なる。

>+@チミジン取り込み法>+@チミジンを'1$複製時に取り込ませた後、放射性物質であるトリチウム量を計測する。
放射性物質のため、高感度な測定が可能であるが、特別な施設にて計測する必要がある。

%UG8取り込み法%UG8を'1$複製時に取り込ませた後、酵素標識抗%UG8モノクロナール抗体を用いて%UG8を定量する。非ラジオアイソトープ法として普及している。酵素標識抗体を用いるため、細胞を固定化する必要がある。
核内
&*
$7
$7
7$
&*
& *
$
7
* &
$
$ 7

細胞

&*
$7
$7
7$
&*
&*
$7
*&
$7
$7

>+@チミジンまたは%UG8が核内に取り込まれた細胞が増える。

7 RU8>+@チミジンまたは%UG8が細胞分裂に伴う'1$合成過程
において取り込まれる。

>+@チミジン取り込み法と%UG8取り込み法は、基本的な原理が同じため、相関性が高い。

⣽⬊ෆ$73㔞ᐃ

細胞内に存在する$73量を指標とした手法である。
ホタルルシフェラーゼによる$73検出法に基づいた発光量を計測する。
 測定時間が短い（約分間）。
 酵素活性を指標とした比色法（077法:67法）や蛍光法（&DOFHLQ$0）に比べて高感度な測定ができる。
 測定時、$73を細胞外に出すために細胞膜を破壊する必要がある。
 発光測定用の検出機器が必要となる。

$73
$73

&HOO/\VLV
$73

$73

$73

$73

$73

$73

$73

$73

細胞内から遊離した$73量を計測
R[\OXFLIHULQ33L$03&2OLJKW$73'OXFLIHULQ2

細胞の染色- 細胞の染色 -はじめに
Calcein-AM 、Fluorescein diacetate (FDA) や CFSE 等の蛍光色素は、細胞内に移行後、細胞内エステラー
ゼにより加水分解を受けることで蛍光性を示す。この性質を利用して、これらの ﬂuorescein 系の色素
類は、生細胞を染色する色素として利用できる。
Propidium iodide (PI)、Ethidium bromide (EB) や DAPI など高い水溶性を持つ蛍光色素は、一般的に生細胞の場合は細胞膜を透過せず、死細胞の損傷を受けた細胞膜を透過する。細胞膜を透過した色素は、DNA に結合することで、より強い蛍光を発するようになる。この性質を利用して死細胞染色用の蛍光色素として利用できる。
また、生細胞染色用色素、及び死細胞染色用色素を同時に用いることで、生死細胞を染め分けることも可能である。

【用途】 ・蛍光顕微鏡観察
・電気泳動（核酸検出）

色素の特徴

・フローサイトメトリー

- 細胞の染色 - 対象毎に細胞を染めたい

細胞を染色したい
準備するもの装置・器具
・炭酸ガスインキュベーター
・クリーンベンチ
・蛍光顕微鏡・血球計算盤またはセルカウンター・遠心機
・スライドガラス、カバーガラス またはチャンバースライド
試薬
生細胞染色用色素-Cellstain- Calcein-AM-Cellstain- Calcein-AM solution-Cellstain- FDA

BCECF-AM-Cellstain- CFSE

-Cellstain- CytoRed solution

死細胞染色用色素-Cellstain- DAPI

その他

・DMSO
・滅菌水
・PBS(-)-Cellstain- DAPI solution-Cellstain- PI-Cellstain- PI solution

核染色用色素-Cellstain- Hoechst 33258-Cellstain- AO solution-Cellstain- Hoechst 33342

ミトコンドリア染色用色素-Cellstain- MitoRed-Cellstain- Rh 123

調製
染色溶液の調製は、試薬の性質によって溶媒などが異なるため、目的の試薬に応じた調製を行う必要がある。また、同じ試薬についても性状 ( 粉末・溶液）が異なる場合があるため、購入した製品に応じて調製を行う。表中の染色溶液の色素濃度は目安である。測定に用いる細胞種や染色条件に応じて、最適化を行う必要がある。
生細胞染色用色素
固体の製品は、DMSO を用いて調製してください。
液体の製品は、予め保存溶液の濃度に調製されているため、粉末を秤量する必要がなく飛散による汚染を防ぎやすいため便利です。
製品名-Cellstain- Calcein-AM-Cellstain- Calcein-AM solution-Cellstain- CFSE
-Cellstain- CytoRed solution-Cellstain- FDA
BCECF-AM Special packging!

性状
白色〜微黄色固体
無色液体
白色〜微黄色固体
橙黄色液体
白色結晶
橙色〜橙褐色固体

保存方法
遮光・冷凍
遮光・冷凍
遮光・冷凍
遮光・冷凍
遮光・冷凍
遮光・冷凍

分子量
994.86994.86557.64313.31
416.38688.59

製品形態 保存溶液 (DMSO 使用 )
1 mg
1 ml
1 mg
1 ml
1 mg
50 µg x 8

PBS(-) に溶解した色素は分解しやすいため、染色溶液は用時調製する。

0.5 - 1mmol/l
1mmol/l
0.5 - 1mmol/l ※
1mmol/l
0.5 - 1mmol/l
0.5 - 1mmol/l ※染色溶液
1 - 20 µmol/l( 保存溶液を PBS(-)
で希釈 )※溶液での保存を避ける。

- 細胞の染色 - 対象毎に細胞を染めたい

死細胞染色用色素
固体の製品は、滅菌水を用いて調製してください。
液体の製品は、予め保存溶液の濃度に調製されているため、粉末を秤量する必要がなく飛散による汚染を防ぎやすいため便利です。
製品名

性状

保存方法

分子量

製品形態

保存溶液 (H 2 O 使用 )-Cellstain- DAPI

黄色固体

遮光・冷凍

350.25

1 mg

1 mg/ml-Cellstain- DAPI solution

微黄〜黄色液体-Cellstain- PI-Cellstain- PI solution

赤褐色固体
橙〜赤色液体

遮光・冷蔵
遮光・冷蔵
遮光・冷凍

350.25668.39668.39

1 ml

1 mg
1 ml

1 mg/ml of Buﬀer
1 mg/ml
1 mg/ml

染色溶 液
1 - 10μg/ml( 保存溶液を PBS(-)
で希釈 )変異原性物質であるため、手袋・保護眼鏡・マスク等を着用して扱う。万一、皮膚に付着した場合は、直ちに大量の水で洗い流す。

!

廃棄に関しては、発癌性の恐れがありますので、使用した器具の洗浄液などの廃液は各機関独自の取り扱いガイドラインに従い処理してください。

核染色用色素固体（粉末）の製品は、滅菌水を用いて調製してください。
液体の製品は、予め保存溶液の濃度に調製されているため、粉末を秤量する必要がなく飛散による汚染を防ぎやすいため便利です。
製品名

性状

保存方法

分子量

製品形態

保存溶液 (H 2 O 使用 )-Cellstain- AO solution-Cellstain- Hoechst 33258 solution-Cellstain- Hoechst 33342 solution

橙〜黄色液体
黄色液体
黄色液体

遮光・冷凍
遮光・冷蔵
遮光・冷蔵

301.81533.88561.93

1 ml
1 ml
1 ml

1 mg/ml
1 mg/ml
1 mg/ml

染色溶 液

1 - 10 µg/ml( 保存溶液を PBS(-)
で希釈 )変異原性物質であるため、手袋・保護眼鏡・マスク等を着用して扱う。万一、皮膚に付着した場合は、直ちに大量の水で洗い流す。

!

廃棄に関しては、発癌性の恐れがありますので、使用した器具の洗浄液などの廃液は各機関独自の取り扱いガイドラインに従い処理してください。

ミトコンドリア染色用色素

DMSO を用いて調製してください。

製品名

性状

保存方法

分子量

製品形態

-Cellstain- MitoRed-Cellstain- Rh 123

紫褐〜赤紫色固体
赤〜赤褐色粉末

遮光・冷蔵
遮光・冷蔵

637.17380.8250 μg × 8
1 mg!

生細胞のミトコンドリアを染色する。死細胞は染色されない。

保存溶液 (DMSO 使用 )1 mmol/l ※1 mg/ml

染色溶液

20 - 200 nmol/l
20 - 100 nmol/l※溶液での保存を避ける。

励起スペクトル
蛍光スペクトル- 細胞の染色 - 対象毎に細胞を染めたい

染色方法
細胞を染色する際には、実験の目的に応じた染色をする必要があります。また、目的に応じて細胞密度や試薬濃度、イ
ンキュベーション時間などについて、詳細な条件を検討する必要もあります。下記に一般的に行われている染色方法として 3 つの染色方法をご紹介します。

1. 培養プレート上で生細胞、死細胞を観察
色素：生細胞染色用色素、死細胞染色色素、核染色色素全て使用可。
用途：培養プレート上で、付着細胞の形態を維持したまま観察。
2. プレパラート上で生細胞、死細胞を観察
色素：生細胞染色用色素、死細胞染色色素、核染色色素全て使用可。
用途：浮遊細胞の観察。
プレパラート上で高倍率観察が可能。
3. 細胞を固定化し観察
色素：核染色用色素、死細胞染色色素が使用可。生細胞染色色素は、使用不可。
用途：免疫染色時の核染色。
核染色用色素、死細胞染色色素の何れを用いても、全細胞が染色される。

1. 培養プレート上で生細胞、死細胞を観察
操作

注意点・コツ・測定対象の細胞 104 〜 105 cells を 24 ウェルマイクロプレート
へ播種し 24 時間培養する。

・増殖培地を除去して、各ウェルへ PBS(-)1 ml を添加する。

・PBS(-) を除去して、各ウェルへ染色溶液 0.2 ml を添加する。

・遮光下にて、37℃で 15 〜 30 分間インキュベートする。
・染色溶液を除去して、各ウェルに PBS(-)0.5 ml を添加する。

・蛍光顕微鏡にて蛍光染色像を観察する。

・シャーレ又はマイクロプレート上で細胞密度が 30 〜 50% コンフルエントになるよう細胞数をコントロールする。
・血球計算盤やセルカウンターなどを用いて細胞数を計測する。
・ガラスボトムプレートを用いると、高倍率かつ鮮明な画像を取得できる。

・最適な蛍光染色像を得るために、細胞種に応じて試薬濃度や染色時間の検討が必要である。
・生細胞染色試薬の場合、培地中に含まれるエステラーゼが残存すると、各色素のエステル部位が切断されて蛍光性を示す。これは、バックグラウンド上昇の原因となるため、必要に応じて数回洗浄を行う。

- 細胞の染色 - 対象毎に細胞を染めたい

2. プレパラート上で生細胞、死細胞を観察
操作

注意点・コツ・測定対象の細胞を培養用フラスコから回収して、細胞懸濁液を準備する。

・付着性細胞の場合、トリプシン処理やセル
スクレイパー等により回収する。

・細胞懸濁液を遠心分離する（1,000 rpm, 3 分間）。

・上清の培地を除去して、PBS(-) を添加する。
この際、細胞数が、105 〜 106 cells/ml となるよう調整する。

・マイクロチューブに細胞懸濁液 30 µl を添加する。

・生細胞染色試薬の場合、培地中に含まれるエステラーゼが残存すると、各色素のエステル部位が切断されて蛍光性を示す。これは、バックグラウンド上昇の原因となるため、必要に応じて数回洗浄を行う。
・血球計算盤やセルカウンターなどを用いて計測する。
・細胞にダメージを与えないように、ピペッ
ティングは穏やかに行う。

・これに染色溶液 15 µl を添加する。

・遮光下にて、37℃で 15 〜 30 分間インキュベートする。

・最適な蛍光染色像を得るために、細胞種に応じて試薬濃度や染色時間の検討が必要である。

・スライドガラスの上に細胞染色液 10 µl を滴下し、これにカバー
ガラスを重ねる。

・蛍光顕微鏡にて蛍光染色像を観察する。



- 細胞の染色 - 対象毎に細胞を染めたい

3. 細胞を固定化し観察
操作

注意点・コツ・測定対象の細胞 104 〜 105 cells を 24 ウェルマイクロプレート
へ播種し 24 時間培養する。

・増殖培地を除去して、各ウェルへ PBS(-)1 ml を添加する。

・PBS(-) を除去して、70%EtOH 1.0 ml を細胞へ添加する。

・シャーレ又はマイクロプレート上で細胞密度が 30 〜 50% コンフルエントになるよう細胞数をコントロールする。
・血球計算盤やセルカウンターなどを用いて細胞数を計測する。
・ガラスボトムプレートを用いると、高倍率かつ鮮明画像を取得できる。

・固定溶液として、70-100% EtOH や 100%
MeOH が一般的に使われる。また、細胞内分子を維持するために、-20℃に冷却したアルコールを用い、-20℃下で染色する場
合もある。

・室温にて 15 分間インキュベートする。
・70%EtOH 溶液を除去して、PBS(-)1 ml を添加する。

・PBS(-) を除去して、各ウェルへ染色溶液 0.2 ml を添加する。

・遮光下にて、37℃で 15 〜 30 分間インキュベートする。
・染色溶液を除去して、各ウェルに PBS(-)0.5 ml を添加する。

・蛍光顕微鏡にて蛍光染色像を観察する。

・最適な蛍光染色像を得るために、細胞種に応じて試薬濃度や染色時間の検討が必要である。

- 細胞の染色 - 対象毎に細胞を染めたい

実験例
培養細胞を用いた蛍光染色例 - １
HeLa 細胞を用いて、『1. 培養プレート上で生細胞、死細胞を観察』に示した方法に従い、生細胞を各色素にて染色した。

生細胞染色試薬
細胞内の加水分解により蛍光を発する色素による染色

BCECF-AM (x200, B 励起 )Calcein-AM (x400, B 励起 )CytoRed (x200, G 励起 )ミトコンドリア染色試薬
ミトコンドリア集積能を持った色素による染色
蛍光像

CFSE (x400, B 励起 )FDA (x400, B 励起 )位相差像

MitoRed(x200, G 励起 )Rh123
(x200, B 励起 )核染色用色素
生細胞・死細胞の核に結合し蛍光を発する色素による染色AO (x200, B 励起 )Hoechst 33258 (x200, U 励起 )- 細胞の染色 - 対象毎に細胞を染めたい

培養細胞を用いた蛍光染色例 -2
HeLa 細胞を用いて、『3. 細胞を固定化し観察』に示した方法に従い、細胞を固定化後に核染色試薬にて全細胞の核を染色した。

死細胞染色用試薬
死細胞選択性のある核染色用色素を用い、固定化した全細胞を染色

DAPI (x 200, U 励起 )PI (x 200, G 励起 )フローサイトメトリー測定例

Cell Number

培養細胞を用いた蛍光染色例 -33% グルタルアルデヒドで固定化した NIH3T3 細胞を核染色試薬 Hoechst 33258 を用いて染色した。また、ア
クチンフィラメントをビオチン標識ファロイジンおよび
HyLite Fluor TM555 標識抗ビオチン抗体を用いて二重染色した。

Fluorescent Intensity
HL60 細胞を生細胞染色用色素 Calcein-AM を用いて染色した後、フローサイトメトリー（488nm 励起）にて測定した。未染色の細胞 ( 白線）に対して、染色後の生細胞は蛍光強度が増大した（青線）。

* 参考 *
細胞の固定化法
核染色色素は、低分子かつ染色対象の核酸が安定であることから、一般的な固定化方法であれば何れの方法を用いても染色は可能である。しかし、免疫染色などのようにターゲット ( 抗原など ) 分子がタンパクや低分子、未確認物質である場合には、最適な固定化法を選択する必要がある。
①アルコール固定

脱水および脂質溶解により、細胞内のタンパクを凝固させ、同時に細胞膜の脱脂により膜透過性をもたせる。アルデヒド
固定法に比べ、抗原性の維持に優れているが、固定化後は細胞膜が収縮硬化するため細胞の微細構造や膜構造への影響が大きい。固定化時は、エタノール又はメタノールにて固定化後、更に膜透過性を上げる際は 0.5%Triton X-100 処理を行う。

②ホルムアルデヒド固定

アルデヒド基をもった化学物質は、タンパク中のアミノ基と結合し、さらに架橋反応を起こすことにより細胞内の組織を固定化することができる。アルコール固定法に比べ、細胞の形態維持に優れているが、架橋形成により抗原性や酵素活性が失われる場合がある。一般的には、3 〜 4% パラホルムアルデヒドが用いられ、細胞内を固定化後は、膜に透過性持たせるために 0.5%Triton X-100 処理を行う。

- 細胞の染色 -生細胞と死細胞を染め分けたい
はじめに- Cellstain - Double Staining Kit ( セルステイン 細胞二重染色キット ) は、生細胞染色用蛍光色素

Calcein-AM と、死細胞染色用蛍光色素 PI (Propidium Iodide) を組み合わせたもので、生細胞及び死細胞を同時に染色することができます。

準備するもの装置・器具
・炭酸ガスインキュベーター
・クリーンベンチ
・蛍光顕微鏡・血球計算盤またはセルカウンター・スライドガラス、カバーガラス
・マイクロピペット

試薬- Cellstain - Double Staining Kit ［同仁品コード：CS 01］（キット内容）A 液 : Calcein-AM stock solution ( 1 mmol/l)
B 液 : PI stock solution ( 1.5 mmol/l)!

4 vials
1 vialキットは密閉して、-20℃以下で遮光、冷凍保存する。
A 液（Calcein-AM）は水分により加水分解する恐れがあるため、吸湿しないように注意する。

・PBS(-)

調製・染色溶液

A 液および B 液を室温に戻す。
5 ml の PBS(-) に、A 液 10 µl と B 液 15 µl を加えて混合する。
!

染色溶液中の試薬濃度
Calcein-AM: 2 µmol/l, PI: 4 µmol/l

染色溶液は用時調製すること。
PI は変異原性物質の疑いがあるため、手袋・保護眼鏡・マスク等を着用して扱う。
万一、皮膚に付着した場合は、直ちに大量の水で洗い流す。

廃棄に関しては、発癌性の恐れがありますので、使用した器具の洗浄液などの廃液は各機関独自の取り扱いガイドラインに従い処理してください。

- 細胞の染色 -生細胞と死細胞を染め分けたい

染色操作（蛍光顕微鏡観察用サンプルの調製）
HeLa 細胞を用いた場合の染色操作を示す。染色条件は、細胞の種類・濃度などの条件により変化するため、注意が必要である。条件に応じて、細胞の固定化や試薬濃度の調整など最適化が必
要である。

操作

注意点・コツ・測定対象の細胞を培養用フラスコから回収して、細胞懸濁液を準備する。

・付着性細胞の場合、トリプシン処理やセル
スクレイパー等により回収する。

・細胞懸濁液を遠心分離する（1,000 rpm, 3 分間）。

・上清の培地を除去して、PBS(-) を添加する。
この際、細胞数が、105 〜 106 cells/ml となるように調製する。

・マイクロチューブに細胞懸濁液 200 µl を添加する。

・生細胞染色試薬の場合、培地中に含まれるエステラーゼが残存すると、各色素のエステル部位が切断されて蛍光性を示す。これは、バックグラウンド上昇の原因となるため、必要に応じて数回洗浄を行う。
・血球計算盤やセルカウンターなどを用いて計測する。
・細胞にダメージを与えないように、ピペッ
ティングは穏やかに行う。

・これに染色溶液 100 µl を添加する。

・遮光下にて、37℃で 15 〜 30 分間インキュベートする。

・スライドガラスの上に細胞染色液 10 µl を滴下し、これにカバー
ガラスを重ねる。

・最適な蛍光染色像を得るために、細胞種に応じて試薬濃度や染色時間を調整する検討が必要である。

- 細胞の染色 -生細胞と死細胞を染め分けたい

・蛍光顕微鏡にて蛍光染色像を観察する。

・49010 nm の励起フィルターを用いること
で、黄緑色に染色された生細胞が観察される。また、赤色に染色された死細胞も同時に観察することができる。
・545 QP の励起フィルターを用いると、赤色に染色された死細胞のみを蛍光観察することができる。

色素の最適濃度
Calcein-AM 及び PI の最適濃度は、細胞種に依存するため、染色する細胞毎に最適色素濃度を求める必要がある。以下の操作により、細胞毎の最適濃度を求めることを勧める。
① PI の最適濃度
目的の細胞を、0.1 〜 10 µmol/l の PI 溶液を用いて染色し、細胞質を染めることなく核のみを赤色に染色する濃度域を目安とする。
必要に応じて染色前に、以下に示した何れかの固定処理を行うとよい。
・0.1% サポニンまたは 0.1 〜 0.5% ジギトニンで 10 分間処理する。
・70% エタノールで 30 分間処理する。
② Calcein-AM の最適濃度①の死細胞を使用して、0.1 〜 10 µmol/l の Calcein-AM 溶液を用いて染色し、死細胞の細胞質を染色しない濃度域を決定する。次に、生細胞を用いて、その濃度域で細胞が十分染色されることを確認する。染色が十分に行われない場合は、Calcein-AMの濃度を上げていくことで最適濃度を決定する。

実験例-Cellstain- Double Staining Kit を使用した二重染色例
MHD-1 細胞を用いた二重染色像 (480 nm 励起フィルター使用）[ 写真提供 ] 広島大学医学部 山本正夫先生

- 細胞の染色 - 対象毎に細胞を染めたい

トラブルシューティング
トラブル

考えられる原因

解決方法

細胞が上手く染まらない。

色素を長期間保存していた。

長期間保存すると、色素は劣化します。長期保存を避け、長期保存していた色素は使用しない。

（生細胞染色色素の場合）
PBS で希釈した染色溶液を保存し、その溶液を使用した。

生細胞染色色素は水溶液に希釈後、非常に不安定になります。
希釈溶液は、用時調製して下さい。

色素を直射日光に当てた。

直射日光により色素は劣化します。直射日光を避けて保存して下さい。

使用している細胞の種類が、色素を取り込み難いものである。

試薬濃度を高くして下さい。界面活性剤
R(Pluronic F-127 ) を使用する方法もあります。

細胞に対して試薬量が少ない。

試薬濃度を高くして下さい。

細胞から色素が漏れてしまう。

細胞は自分にとって余計なものである色素を自然に排出する機能があるため。

出来るだけ早く観察して下さい。
陰イオントランスポーター阻害材（Probenecid) を使用する方法、または、細胞の膜に結合する -CellstainCFSE を使用する方法があります。

細胞に色素が取り込まれているのに、見えない。

使用しているフィルター（励起・蛍光）及び光源が違う。

使用しているフィルターの波長および光源が色素とあっているか、確認して下さい。

色素の排出が早く起きている。

取り込み後、出来るだけ早く観察して下さい。

色素が劣化している。

既定の調製量で溶解していても溶け残りが生じる場合
は、色素が劣化している可能性があります。
保管期間が著しく長いものや、所定の条件で保存していなかった場合は、色素全体が分解することがありますので、再調製して下さい。

溶かす溶媒を間違えている。

使用する溶媒を染色溶液調製の項目で確認して下さい。
それ以外の溶媒では、色素が劣化したり、溶けない可能性があります。

溶かす濃度を間違えている。

溶かす溶媒を調製の項目で確認して下さい。色素が完全に溶解すると、溶液は透き通った状態に見えます。濁りがある場合は、溶け残りがある可能性があります。

色素が完全に溶けていない。

1mg の粉末製品は遠心濃縮で小分けを行っている為、チューブの底にフィルム上に固まっております。ボルテッ
クスミキサーや超音波照射で十分混合して下さい。

色素が細胞に取り込まれない。

色素が上手く溶けない。

色素が溶けているかどうか分
からない。



- 細胞の染色 - 対象毎に細胞を染めたい

Ｑ＆Ａ
生細胞染色試薬
Q: 粉末で購入した場合、何に溶解すれば良いですか？
A: DMSO に溶解してください。開封後時間がたった DMSO には、空気中の水分が溶け込んでいることがあります。生細胞染色試薬は水分で劣化しますので、DMSO は出来るだけ未開封のものをご使用ください。
Q: 生細胞染色試薬の中で細胞内に長く留まるのはどれですか？
A: CFSE が比較的細胞の中に長くとどまることが出来ます。論文では、8 週間細胞の中に蛍光色素が残っていることが確認されています。また、Calcein-AM、BCECF-AM では、3 日間細胞中での蛍光が観察されています。詳細は下記の文献を参照してください。
ES. A. Weston, et al., J. Immunol.Methods, 1990, 133 , 87.
EH. P. Zhong, et al., Hum. Immunol., 1993, 37 , 264.
Q: 生細胞染色試薬の中で細胞障害活性が低いのはどれですか？
A: Calcein-AM、BCECF-AM は、細胞への影響が低いと言われております。
詳細は下記の文献を参照してください。
EL. S. D. Clerck, et al., J. Immunol. Methods, 1994, 172 , 115.
Q: 生細胞染色色素の特徴は？
A: 製品ごとの特徴は下記の通りです。
BCECF-AM：元々細胞内の pH を測定する試薬として利用されていたものであり、生細胞を染色する色素としても利用されます。
Calcein-AM： 細胞機能への影響が一番少ないといわれています。
C F S E ： 細胞内に導入後、細胞質内（細胞膜）のアミノ基と結合するため他の色素に比べ細胞外への漏出が少ないといわれています。
C y t o R e d ： 小社にて開発した化合物で、Calcein-AM よりも高い蛍光強度を示します。
F D A ： 一番古くから知られている色素ですが、細胞からの漏出が早いといわれています。

Q: 色素の細胞毒性について報告されている論文はありますか？
A: Calcein-AM、BCECF-AM、CFDA、CFSE が細胞に与える障害活性を比較した論文がありますので参照してください。
L. S. D. Clerck, et al., J. Immunol. Methods, 1994. 172 , 115.
Q: 細菌の染色をしたいのですが、どの色素を使えば可能でしょうか？
A: 細菌は、細胞壁を持つため、その細胞壁を通過できない色素が多くあります。例えば、Calcein-AM
や BCECF-AM は細胞膜は通過しますが、細胞壁は通過できません。細菌の染色目的に使用できる色
素としては、AO がマラリア原虫の染色として使われています。死菌の場合には、PI、EB、DAPI なども使用できます。生菌の場合には、FDA を使用した報告があります。詳細は下記の文献を参照してください。
Appl. Microbiol. Biotechnol., 1992, 38 , 268.

- 細胞の染色 - 対象毎に細胞を染めたい

Ｑ＆Ａ
核染色試薬 (生 死細胞)
Q: 核染色に使用される色素の違いは何ですか？
A: 蛍光波長以外の違いは以下の点があります。
A O ：2 重鎖にインターカレーションしたときと、単鎖のリン酸に結合したときでは蛍光波長が異なることを利用して、2 重鎖と単鎖を区別して検出できます。生細胞の細胞膜を透過します。
Hoechst 33258、Hoechst 33342：
基本的には DNA のアデニン - チミジン部に特異的に結合します。
生細胞の膜を透過し、生細胞の DNA も染色できる色素です。膜の透過率は「Hoechst33342」のほうが若干高いと言われています。
Q: 使用後の廃液の処理方法を教えてください。
A: 核染色試薬は、発癌性の恐れがあります。使用した器具の洗浄液などの廃液は各機関独自の取り扱いガ
イドラインに従い処理してください。あるいは下記処理方法を参考にして分解後廃棄してください。
・UV 照射や日光にさらし分解する。
・次亜塩素酸ナトリウムにより酸化分解後、中和処理する。

核染色試薬 (死細胞)
Q: 核染色に使用される色素の違いは何ですか？
A: 蛍光波長以外の違いは以下の点があります。
P I ：塩基特異性はありませんが、インターカレーションした時の蛍光強度が高いため、広く使用される色素です。
DAPI ：2 重鎖の副溝 (minor groove)と結合、アデニン - チミジン配列に高い結合性を持っています。

ミトコンドリア染色試薬
Q: MitoRed と Rh 123 はなぜミトコンドリア染色用なのですか？
A: MitoRed、Rh 123 はともに Rhodamine（ローダミン）と呼ばれる化学構造を有しています。この Rho damine は 細胞の中に入ると、ミトコンドリアに集積していく特性があるためミトコンドリア染色色素として使用されます。多量に細胞内に導入すると他の部分も染色されてしまいますので、濃度をご検討の上適量をご使用ください。

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- 細胞の染色 -生細胞と死細胞を染め分けたい

Ｑ＆Ａ-Cellstain- Double Staining Kit
Q: どのような原理で細胞は染色されるのですか？
A: 生細胞を Calcein-AM が、死細胞を PI が染色します。Calcein-AM は、蛍光色素 Calcein の四つのカ
ルボキシル基をアセトキシメチル (AM) 化して脂溶性を高め細胞膜透過性としたものです。CalceinAM 自体は蛍光を示しませんが、生細胞の細胞膜を透過して細胞内に入ると、細胞内各種エステラー
ゼにより AM 基が加水分解されて黄緑色の強い蛍光を示します。一方、PI は核酸染色色素の一つで、細胞膜が破壊されている死細胞内に入り込み、細胞内の DNA の二重らせん構造にインターカレート
することにより特有の強い赤色蛍光を示します。PI は生細胞の細胞膜を通過しません。この作用の異なる二つの色素を用いることにより、生細胞は黄緑色に、死細胞は赤色に染め分けることができます。
Q: 蛍光観察するときの波長について教えてください。
A: 490 ± 10 nm の波長で励起して観察すると、黄緑色に染色された生細胞、及び赤色に染色した死細胞を同時に観察することが出来ます。更に 545 nm の波長で励起することにより赤色に染色した死細胞だけを観察することができます。
Q: 全ての細胞に対して染色は可能でしょうか？
A: 基本的には、エステラーゼ活性を持つ動物細胞です。植物は細胞壁があるため、Calcein-AM での染色は原理的に難しいです。細胞壁を除いたプロトプラストであれば、染色は可能です。
Q: 動物細胞であれば、どの細胞にも一定の濃度の色素で染色できるのでしょうか？
A: どの細胞にも一定という訳ではありません。使用する Calcein-AM 及び PI の最適濃度は、細胞の種類に大きく依存します。使用する細胞毎に最適色素濃度を求めるようにしてください。方法は本書 33
ページを参照してください。
Q: Calcein-AM 自体に細胞毒性はありませんか？
A: Calcein-AM の細胞毒性は、他の細胞染色色素に比べ非常に低いと報告されております。
詳細は、下記の文献を参照してください。
L. S. D. Clerck, et al., J. Immunol. Methods, 1994. 172, 115.
Q: キットの保存方法について教えてください。
A: 密封して -20℃以下で保存してください。Calcein-AM は水分により加水分解する恐れがありますので、吸湿しないようにして下さい。緩衝液や培養液などに希釈した染色溶液は、用時調製してください。
PI 溶液は -20℃保存で 1 年間安定です。
Q: 使用後の廃液の処理方法を教えてください。
A: PI は発癌性の恐れがあります。使用した器具の洗浄液などの廃液は各機関独自の取り扱いガイドライ
ンに従い処理してください。

〒861-2202 熊本県上益城郡益城町田原 2025-5
熊本テクノ・リサーチパーク

URL: https://www.dojindo.co.jp/〒105-0012 東京都港区芝大門2-1-7朝川ビル7F