プロテオミクス関連試薬

プロテオミクス関連試薬
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プロテオミクス関連試薬
ヒトゲノムの完全配列が解読されプロテオミクス解析が注目を集めている。なかでも細胞膜に存在する膜タンパク質は、細胞内外のエネルギー交換や情報伝達などの役割を担い、その機能解析は非常に重要な研究分野である。
小社では、膜タンパク質を抽出・精製する際に使用する界面活性剤を多種取り揃えており、近年、トレハロース型の新規界面活性TM剤や二次元電気泳動用タンパク質溶解剤 SpotRight シリーズも発売した。
タンパク質定量キットとそれぞれのプロトコルとともに、プロテオミクス関連試薬を紹介する。

製品紹介

3. 陰イオン性界面活性剤
コール酸タイプ ………………………………………………… 7
Sodium cholate (purified)
Sodium deoxycholate (for protein crystallization)

1. Detergent Screening Set … …………………………………… 2
Detergent Screening Set (first choice-II)
Detergent Screening Set (for crystallization)
2. 非イオン性界面活性剤

トレハロース ( エステル）タイプ ……………………………… 3
Trehalose C8
Trehalose C10
Trehalose C12
Trehalose C14
Trehalose C16グルコースタイプ ……………………………………………… 4n -Octyl- β -D-glucoside
n-Octyl- β -D-thioglucosiden -Heptyl- β -D-thioglucoside
マンノースタイプ ……………………………………………… 4
3-Oxatridecyl- α -D-mannoside
マルトースタイプ ……………………………………………… 5
n -Decyl- β -D-maltoside
n -Octyl- β -D-maltosiden -Dodecyl- β -D-maltosiden -Nonyl- β -D-thiomaltoside
n-Undecyl- β -D-maltoside
グルコンアミドタイプ ………………………………………… 6
BIGCHAP
deoxy-BIGCHAP
グルカミンタイプ ……………………………………………… 6
MEGA-8MEGA-9MEGA-10

4. 両性界面活性剤

コールアミドタイプ
CHAPS
CHAPSO
応用例…………………………………………… 7… ………………………………………………………… 8

プロトコル

膜タンパク質等を可溶化したい。 …………………………… 12

5. 二次元電気泳動用タンパク質溶解剤
SpotRightTM …………………………………………………… 14
6. タンパク質定量キット… ……………………………………… 17-Proteostain- Protein Quantification Kit-Rapid-Proteostain- Protein Quantification Kit-Wide Range
7. タンパク質蛍光標識試薬 … ………………………………… 18
IC3-OSu special packaging
IC5-OSu special packaging
FITC-I
Sulforhodamine 101 acid chloride
プロトコル
タンパク質を蛍光標識したい。 ……………………………… 19

デタージェントとは脂質二分子膜は、細胞膜の基本的構成成分である。細胞の最も重要な役割は、細胞膜を介した物質の輸送やエネルギー交換、情報伝達である。これらの機能は、細胞膜に存在する膜タンパク質が行っている。
細胞膜に関する研究においては、膜タンパク質を分離してその構造や機能を調べることが行われている。細胞膜に存在しているタ
ンパク質は、疎水部分と親水性部分を持ち、通常、疎水性部分は、脂質二分子膜に埋もれており、親水性部分は、細胞膜外へ突き出している構造をとる。デタージェントは、親水性部分と疎水性部分を持つため、膜タンパク質の疎水性部分をデタージェントの疎水性部分が重なり合って覆い隠すことで、膜タンパク質が水に可溶化されると考えられている。デタージェントが存在しないと、膜タ
ンパク質はその疎水性部分で会合し、不溶化してしまう。不溶化した膜タンパク質は高次構造が壊れるため、本来の機能を失ってしまう場合がある。また、膜タンパク質の分離には、各膜タンパク質に適したデタージェントを選択し、分離条件を見出す必要がある。
デタージェントには、陰イオン ( アニオン ) 性デタージェント、陽イオン ( カチオン ) 性デタージェント、中性 ( 非イオンおよび両性 )デタージェントがある。膜タンパク質の抽出には、中性のデタージェントが用いられる場合が多い。求められるデタージェントの性質を下記に示す。
・タンパク質溶解容量が大きいこと
・タンパク質を変性や不活性化しないこと
・タンパク質活性に影響しないこと
・4℃ で沈殿を生じないこと
・適当な臨界ミセル濃度 ( Critical Micelle Concentration : cmc) とミセルサイズであること
1プロテオミクス関連試薬
・紫外領域に吸収を持たないこと
・毒性が無いこと・測定方法や検出手段があること
・中性分子（非イオン性分子、あるいは、Zwitter 型分子）であること
これまで、ポリオキシエチレン – アルキル型のデタージェントが広く使用されてきたが、タンパク質が変性したり cmc が低すぎたりといった問題があった。cmc が低すぎると、透析によるデタージェントの除去が難しくなる。そのため、近年では、糖ヘッドやコー
ル酸ヘッドのデタージェントが用いられるようになってきた。これらのデタージェントは、中性分子でタンパク質の変性を起こしにくく、cmc 値も高いため、希釈と透析で容易に除去することができる。また、タンパク質の吸収がある 280 nm 付近の吸収がないため、
280 nm の吸光度を測定することにより、タンパク質量の測定やモニタリングを行うことができる。膜タンパク質からデタージェント
を除く場合、適当量のデタージェントが存在しないとタンパク質が不溶化するため、除去方法も重要である。
デタージェントは膜タンパク質の抽出や分離以外に、酸素の安定化や生体サンプルの前処理などにも利用されている。
臨界ミセル濃度について
デタージェントは、両親媒性化合物で、親水性部分と疎水性部分とからなり、ミセルを形成する。ミセルの形成はその化合物の濃度に依存し、ミセルを形成する最小濃度を臨界ミセル濃度 (Critical Micelle Concentration) と呼ぶ。デタージェントの可溶化能力は、
cmc を境にして急激に変化する。cmc 値以上であればミセルが形成され、cmc 以下であればミセル構造とならない。そのため、希釈することによりミセルを壊すことができる。
BC

d-BC DDM

DM

NTM

OG

OM

HTG

OTG

M-8

M-9

M-10 CHO

タンパク質変性作用

CHAPS CHAPSO
—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

Triton

低温での水溶性

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋ /—

＋

＋

＋

ー

＋

測定に対する妨害性

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

＋ /—

280 nm の吸収

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

＋

cmc(mmol/l)

8

8

2.9

1.4

0.17

1.8

2.4

25

23.4

30

9

55 〜 67

25

7

14

0.24

透析による除去

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

毒性

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

イオン交換処理の可否

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

—

＋

—

BC : BIGCHAP
d-BC : deoxy-BIGCHAP DDM : n-Dodecyl- β -D-maltoside DM : n-Decyl- β -D-maltoside
NTM : n-Nonyl- β -D-thiomaltoside
OG : n-Octyl- β -D-glucoside OM : n-Octyl- β -D-maltoside
HTG : n-Heptyl- β -D-thioglucoside
OTG : n-Octyl- β -D-thioglucoside
M-8 : MEGA-8
M-9 : MEGA-9
M-10 : MEGA-10
CHO : Sodium cholate
Triton : triton X-100[ 土屋友房著 ," 膜タンパク質の可溶化と界面活性剤 ", 化学と生物実験ライン 5, 廣川書店 , 1990. より一部引用 ]1.1.遺伝子導入試薬
Detergent Screening Set
現在のところ、すべての膜タンパク質の可溶化に有効な万能の界面活性剤は知られていない。試行錯誤を繰り返しつつ選ばれているのが現状である。そのため小社では少量ずつの各種界面活性剤を揃えたスクリーニングセットを準備している。
また、界面活性剤の使用条件の最適化、例えば界面活性剤の濃度、界面活性剤と膜の比率、緩衝液の種類、pH、共存イオン、脂質添加の可否、温度等について考慮検討する必要がある。
ー可溶化用ー

1 set ; 同仁品コード (DS06)

Detergent Screening Set (first choice-II)

本製品は、よく使われている代表的な Detergent 5 種類の組み合わせである。
セット内容 : CHAPS, n -Dodecyl- β -D-maltoside, n -Octyl- β -D-glucoside, Sodium cholate(purified), MEGA-8
以上 5 種類の各 200 mg 包装
ー結晶化用ー

1 set ; 同仁品コード (DS05)

Detergent Screening Set (for crystallization)

本製品は、タンパク質の構造解析のための結晶化に用いられた実績のある 5 種類の Detergent を組み合わせたタイプである。
セット内容 : n-Decyl- β -D-maltoside, n-Dodecyl- β -D-maltoside, n-Octyl- β -D-glucoside, n-Octyl- β -D-maltoside, MEGA-10
以上 5 種類の各 200 mg 包装
取扱注意 1. 保存方法 : 冷蔵

2. 吸湿注意21.2.遺伝子導入試薬
非イオン性界面活性剤
トレハロース ( エステル）タイプ
Trehalose C8 ; 同仁品コード (T459)

Trehalose C10 ; 同仁品コード (T460)

Trehalose C12 ; 同仁品コード (T461)

α -D-Glucopyranosyl- α -D-

α -D-Glucopyranosyl- α -D-

α -D-Glucopyranosyl- α -D-

glucopyranoside monooctanoate
C20H36O12=468.49
cmc=5.6 mmol/l
CAS No. 64622-90-8

glucopyranoside monodecanoate
C22H40O12=496.55
cmc=3.0 mmol/l
CAS No. 924885-56-3

Trehalose C16 ; 同仁品コード (T465)

Trehalose C14 ; 同仁品コード (T464)
O

O

O
HO
HO

glucopyranoside monododecanoate
C24H44O12=524.60
CAS No. 64622-91-9
cmc=0.15 mmol/l

O
O

OH O

HO
HO
HO
O

OH
OH

O
OH O

HO
O

HO

OH
OH

HO

α -D-Glucopyranosyl- α -D-

α -D-Glucopyranosyl- α -D-

glucopyranoside monomyristate
C26H48O12=552.65
cmc=0.012 mmol/l
CAS No. 64622-92-0

glucopyranoside monopalmitate
C28H52O12=580.71
cmc=0.0061 mmol/l
CAS No. 42939-93-5

規格(1) 性状 : 白色粉末
(2) 純度 (GC) : 95.0% 以上(3) 水溶状：試験適合 0.100 以下 (260 nm)
100 mg/10 ml ( 水 )：Trehalose C8, C10, C12
溶解例
100 mg/10 ml ( 熱水 )、100 mg/10 ml( メチルアルコール）: Trehalose C14, C16
取扱注意 1. 保存方法 : 冷蔵 2. 吸湿注意

【実験例】 トレハロース型デタージェントを用いた膜タンパク質結晶化① 膜タンパク質結晶化剤として知られている n-Decyl- β-D-maltoside と Trehalose C8 を混合して使用することにより、1.55Å の分解能を持つ X 線解析像を得ることができた。
（未発表データ）② Trehalose C12 を用いて、12 回膜貫通型膜タンパク質を可溶化し、結晶化する事に成功している。

( ユーザー様よりご提供 )結晶化条件
膜タンパク質ウシ心筋チトクロム酸化酵素

Detergentn-Decyl- β -D-maltoside ＋ Trehalose C8

分解能

1.55Å

( 兵庫県立大学理学部 教授 吉川 信也先生よりご提供 )3プロテオミクス関連試薬
グルコースタイプn -Octyl- β -D-glucoside ; 同仁品コード (O001)

n -Octyl- β -D-thioglucoside ; 同仁品コード (O003)

n -Octyl- β -D-glucopyranoside
C14H28O6=292.37
CAS No. 29836-26-8

n -Octyl- β -D-thioglucopyranoside
C14H28O5S=308.44
CAS No. 85618-21-9

cmc=25 mmol/l

規格(1) 性状 : 白色粉末
(2) 純度 (GC) : 98.0% 以上(3) 水溶状 : 試験適合 0.025 以下 (400 nm)
0.300 以下 (280 nm)(4) 比旋光度 (20℃) : -32.0 〜 -29.0°cm2deg-1(5) IR スペクトル：試験適合
1 g/5 ml ( 水 )溶解例取扱注意 保存方法 : 冷蔵

cmc=9 mmol/l

規格(1) 性状 : 白色粉末
(2) 純度 (GC) : 98.0% 以上(3) 水溶状 : 試験適合 0.120 以下 (280 nm)(4) 吸光度 : 0.130 以下 (400 nm)(5) 比旋光度 (20℃) : -46.0° cm2 deg-1 以下(6) IR スペクトル：試験適合
1 g/5 ml ( 水 )溶解例取扱注意 保存方法 : 冷蔵

n -Heptyl- β -D-thioglucoside ; 同仁品コード (H015)

n -Heptyl- β -D-thioglucopyranoside
C13H26O5S=294.41
CAS No. 85618-20-8

規格

cmc=30 mmol/l
溶解例
取扱注意

(1) 性状 : 白色粉末又はワックス状固体(2) 純度 (GC) : 98.0% 以上(3) 水溶状 : 試験適合 0.050 以下 (280 nm)(4) 吸光度 : 0.040 以下 (400 nm)(5) 比旋光度 (20℃) : -50.0°cm2deg-1 以下(6) IR スペクトル：試験適合

マンノースタイプ

1 g/5 ml ( 水 )保存方法 : 冷蔵

3-Oxatridecyl- α -D-mannoside ; 同仁品コード (O401)

3-Oxatridecyl-- α -D-mannopyranoside
cmc=0.63 mmol/l
C18H36O7=364.47
規格(1) 性状 : 白色粉末
(2) 純度 (GC) : 95.0% 以上(3) メチルアルコール溶状 : 試験適合
(4) 水分 : 1.0% 以下(5) 比旋光度 (20℃) : 43.0 〜 49.0°cm2deg-1(6) IR スペクトル：試験適合
0.5 g/25 ml( メチルアルコール )溶解例
取扱注意 1. 保存方法 : 冷蔵 , 2. 吸湿注意4

マルトースタイプ

n -Decyl- β -D-maltoside ; 同仁品コード (D382)

n -Octyl- β -D-maltoside ; 同仁品コード (O393)

n -Decyl- β -D-maltopyranoside
C22H42O11=482.57
CAS No. 82494-09-5

n -Octy- β -D-maltopyranoside
C20H38O11=454.51
CAS No. 82494-08-4

cmc=1.8 mmol/l

規格(1) 性状 : 白色粉末
(2) 純度 (GC) : 98.0% 以上(3) 水溶状 : 試験適合 0.150 以下 (260 nm)(4) 水分 : 1.0% 以下(5) 比旋光度 (20℃) : 46.0 〜 53.0°cm2deg-1(6) IR スペクトル：試験適合
1 g/10 ml ( 水 )溶解例取扱注意 1. 保存方法 : 冷蔵 , 2. 吸湿注意

規格(1) 性状 : 白色粉末
(2) 純度 (GC) : 98.0% 以上(3) 水溶状 (10%) : 試験適合
(4) 水溶状 (4%) : 試験適合 0.150 以下 (260 nm)(5) 水分 : 3.0% 以下(6) 比旋光度 (20℃) : 55.0 〜 57.0°cm2deg-1(7) IR スペクトル：試験適合
1 g/10 ml ( 水 )溶解例取扱注意 1. 保存方法 : 冷蔵 , 2. 吸湿注意

n -Dodecyl- β -D-maltoside ; 同仁品コード (D316)

n-Dodecyl- β -D-maltopyranoside
C24H46O11=510.62
CAS No. 69227-93-6

cmc=23.4 mmol/l

n -Nonyl- β -D-thiomaltoside ; 同仁品コード (N373)

n-Nonyl- β -D-thiomaltopyranoside
C21H40O10S=484.60
CAS No. 148565-55-3

cmc=0.17 mmol/l

規格

cmc=2.4 mmol/l(1) 性状 : 白色粉末
(2) 純度 (GC) : 98.0% 以上(3) 水溶状 : 試験適合 0.220 以下 (280 nm)(4) 吸光度 : 0.070 以下 (400 nm)(5) 比旋光度 (20℃) : 34.0 〜 36.0°cm2deg-1(6) IR スペクトル：試験適合
1 g/5 ml ( 水 )溶解例取扱注意 保存方法 : 冷蔵

規格(1) 性状 : 白色粉末
(2) 純度 (GC) : 98.0% 以上(3) 水溶状 (0.1%) : 試験適合
(4) 水溶状 (1%) : 試験適合 0.100 以下 (260 nm)(5) 比旋光度 (20℃) : 46.0 〜 50.0°cm2deg-1(6) 水分 : 1.0% 以下(7) IR スペクトル：試験適合
100 mg/10 ml ( 水 )溶解例取扱注意 保存方法 : 冷蔵

n -Undecyl- β -D-maltoside ; 同仁品コード (U214)

n-Undecyl- β -D-maltopyranoside
C23H44O11=496.59
CAS No. 253678-67-0
規格

cmc=0.55 mmol/l(1) 性状 : 白色粉末
(2) 純度 (GC) : 99.5% 以上(3) α 体 (GC) : 0.1% 以下(4) 水溶状 (1%) : 試験適合0.050 以下 (260 nm)(5) 水分 : 1.0% 以下(6) 比旋光度 (20℃) : 46.0 〜 52.0°cm2deg-1(7) IR スペクトル : 試験適合
100 mg/10 ml ( 水 )溶解例取扱注意 1. 保存方法 : 冷蔵 2. 吸湿注意
5

プロテオミクス関連試薬
グルコンアミドタイプ

BIGCHAP ; 同仁品コード (B043)

deoxy-BIGCHAP ; 同仁品コード (D045)

N,N -Bis(3-D-gluconamidopropyl)cholamide

N,N -Bis(3-D-gluconamidopropyl)deoxycholamide

C42H75N3O16=878.06
CAS No. 86303-22-2

C42H75N3O15=862.06
CAS No. 86303-23-3

cmc =2.9 mmol/l

規格(1) 性状 : 白色粉末
(2) 純度 (HPLC) : 95.0% 以上(3) 水溶状 : 試験適合
(4) 吸光度 (1%): 0.100 以下 (260 nm)(5) IR スペクトル：試験適合
溶解例 0.5 g/10 ml ( 水 )cmc=1.4 mmol/l

規格(1) 性状 : 白色粉末
(2) 純度 (HPLC) : 95.0% 以上(3) 水溶状 : 試験適合
(4) 吸光度 (1%): 0.100 以下 (260 nm)(5) IR スペクトル：試験適合
溶解例 1 g/20 ml ( 水 )グルカミンタイプ

MEGA-8 ; 同仁品コード (M014)

MEGA-9 ; 同仁品コード (M015)

n -Octanoyl-N -methyl-D-glucamine
C15H31NO6=321.41
CAS No. 85316-98-9

n -Nonanoyl-N -methyl-D-glucamine
C16H33NO6=335.44
CAS No. 85261-19-4

cmc=55 〜 67 mmol/l

規格

cmc=25 mmol/l(1) 性状 : 白色粉末
(2) 純度 (HPLC) : 98.0% 以上(3) 水溶状 : 試験適合 0.020 以下 (280 nm)(4) 融点 : 85 〜 92℃(5) pH(25℃) : 5.0 〜 8.0(6) IR スペクトル：試験適合
溶解例 0.5 g/50 ml ( 水 )規格(1) 性状 : 白色粉末
(2) 純度 (HPLC) : 98.0% 以上(3) 水溶状 : 試験適合 0.020 以下 (280 nm)(4) 融点 : 80 〜 90℃(5) pH(25℃) : 5.0 〜 8.0(6) IR スペクトル：試験適合
溶解例 0.5 g/50 ml ( 水 )MEGA-10 ; 同仁品コード (M016)

n -Decanoyl-N -methyl-D-glucamine
C17H35NO6=349.46
cmc=7 mmol/l
CAS No. 85261-20-7
規格(1) 性状 : 白色粉末又は顆粒
(2) 純度 (HPLC) : 98.0% 以上(3) 水溶状 : 試験適合 0.020 以下 (280 nm)(4) 融点 : 88 〜 95℃(5) pH(25℃) : 5.0 〜 8.0(6) IR スペクトル：試験適合
溶解例 0.5 g/50 ml ( 水 )6

1.3.遺伝子導入試薬
陰イオン性界面活性剤
コール酸タイプ

Sodium cholate (purified) ; 同仁品コード (C321)

Sodium deoxycholate (for protein crystallization); 同仁品コード (D520)

Cholic acid, sodium salt, monohydrate
C24H39NaO5・H2O=448.57
CAS No. 361-09-1
cmc=14 mmol/l

Deoxycholic acid, sodium salt, monohydrate
C24H39NaO4・H2O=432.57
cmc=5 mmol/l
CAS No. 145224-92-6

規格
		
		

(1) 性状 : 白色粉末
(2) 純度 (HPLC) : 98.0% 以上(3) 水溶状 : 試験適合 0.052 以下 (280 nm)(4) 水分：3.5 〜 5.0%
		(5) IR スペクトル：試験適合
0.3 g/10 ml( 水 )溶解例取扱注意 吸湿注意

規格
		
		
		
		

(1) 性状 : 白色粉末
(2) 純度 (HPLC) : 98.0% 以上(3) 水溶状 : 試験適合
(4) 吸光度 : 0.065 以下 (280 nm)(5) 水分 : 3.0 〜 6.0%
(6) IR スペクトル：試験適合
0.3 g/10 ml( 水 )溶解例取扱注意 吸湿注意

1.4.遺伝子導入試薬
両性界面活性剤
コールアミドタイプ
CHAPS ; 同仁品コード (C008)

CHAPSO ; 同仁品コード (C020)

3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonate
C32H58N2O7S=614.88
cmc=8 mmol/l
CAS No. 75621-03-3

3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxypropanesulfonate
C32H58N2O8S=630.88
cmc=8 mmol/l
CAS No. 82473-24-3

規格

規格(1) 性状 : 白色粉末
(2) 純度 (HPLC) : 97.0% 以上(3) 水溶状 (20%) : 試験適合
(4) 水溶状 (3%) : 試験適合 0.220 以下 (280 nm)(5) 水分 : 3.0% 以下(6) IR スペクトル：試験適合
溶解例 1 g/5 ml( 水 )(1) 性状 : 白色粉末
(2) 純度 (HPLC) : 96.0% 以上(3) 水溶状 : 試験適合
(4) 水分 : 3.0% 以下(5) IR スペクトル：試験適合
溶解例 1 g/20 ml( 水 )7プロテオミクス関連試薬
応用例
細胞

Detergent

ラット肝細胞ミクロソーム
BIGCHAP

CHAPS

タンパク質
11β- ヒドロキシシステロイドデヒド 抽出
ロゲナーゼ (11-HSD)

2)

マウス肝細胞ミクロソーム電気泳動

3)

哺乳類の培養細胞

繊維芽細胞成長因子

抽出・精製

4)

ウシ肝細胞

T3 結合性タンパク質

抽出・精製

5)

NG108-15, Hybrid cell

Opiate recepters

抽出・精製

6)

リンパ球

5'- ヌクレオチダーゼ

抽出・単離・精製7)-----------

anti-GST antibody, etc.

非特異的吸着防止 (SPR) 8)-----------

Hepatic RHE

単離9)-----------

bacteriorhodospin

抽出

10)

マウス肝細胞プロラクチンレセプター

抽出

11)

COS-1 細胞FLAG-tagged HAS 1

抽出

12)

酵母

Inositolphosphorylceramide(IPC)

精製

13)

溶解

14)

-----------

大腸菌

CYP27B1

溶解

15)

大腸菌 BL21

NAPD-PLD-GSH, NAPD-PLD

抽出・溶解

16)

溶解

17)

抽出

18)

LFA-1(leukocyte function-assosiate 溶解
antigen-1

19)

IP3R

溶解

20)

MBP
(3[H]Mepyramine Binding Protein)

溶解

21)

Hepatic RHE

単離

9)

マウス肝細胞プロラクチンレセプター

抽出

11)

グラム陰性菌β-lactamase

抽出

22)

HEK293T 細胞

ほうれん草の葉緑体

結晶化

23)

大腸菌

β- ガラクトシダーゼ EBNA 融合タン 溶解パク
PUR sterase(polyesterpolyurethanede 溶解・精製・抽出
grading enzyme)---------------------

CD3-LGL 細胞 , YT 細胞
マウス小脳
ウィスターラット肝臓(Cytochrome P450 2D1)-----------

n-Decyl-β-Dmaltoside

1)

溶解

ラット胚

deoxy-BIGCHAP

文献

マウス肺組織のミクロソーム画分 カルシウム非依存性 -PAFAT

ラット肝臓CHAPSO用途

プラスチック分解菌 TB-35

シナプス後肥厚部

24)
25)

ウシ心臓

cytochrome c oxidase

結晶化

26)

グラム陰性菌tetracyclin cation/proton antiporter

結晶化

27)

HEK293 細胞

FLAG-tagged TRP C3

溶解・精製28), 29)

HEK293 細胞

TRPM2(transient receptor potential 抽出・電気泳動
melastatin type 2)
ABCA 1
抽出・精製(ATP-binding cassette protein 1)
Paraoxonase(PON 1)
精製

Sf9 細胞
ヒト血清

8

30)
30)
31)

細胞

Detergentn-Dodecyl-β-Dmaltoside

MEGA-8MEGA-9

文献

tetracyclin cation/proton antiporter

抽出・精製

27)

ウシ心臓ミトコンドリア

ATP synthase

結晶化

32)

Paracoccus denitrificans

nitricoxide reductase BC comples

抽出・精製

33)

大腸菌

NA+/H+ antiporter

抽出・精製

34)

sf9 細胞His-rTRPV4

溶解

35)

express SF+

CXCR4

抽出・溶解

36)

sf9 細胞Trichoplusia ni(HighFiveTM)
大腸菌 BL21(DE3), Sf9 細胞

YMOR

溶解

37)

溶解・精製・抽出38)

Sf9 細胞LoICDE, Pal-LoICDE complex,
LoIA and LoICDE, DHHC protein
DHHC protein

抽出・精製

39)

大腸菌 JM83

LoICDE

溶解・精製

40)

HEK293 細胞

28)

C. acidovorans TB-35

FLAG-tagged TRPC3
溶解(canonical transient receptor potential
subtype 3)
PUR esterase
抽出ミトコンドリア

Cytochrome c oxidase

抽出

83)

大腸菌
腸炎ビブリオ

H+ 輸送性 ATPase メリビオース輸送 抽出・再構成
担体
膜結合性 5'- ヌクレオチダーゼ
抽出・精製

ブタ好中球

Cytochrome b558, FAD

結晶・抽出・精製

43)

Photosystem II

抽出

44)

抽出

45)

ブタ好中球

recombinant 3OST
(3-O-sulfotransferase)protein
Cytochrome b558

溶解・精製46), 47)

好中球

Flavocytochrome b558

溶解

48)

ブタ肺

Phospholipase D

抽出

49)

S. acidocaldarius strain 7

acid PPace

溶解

50)

Trypanosoma cruzi

Trypanothione reductase

結晶化

51)

Hi5

Mgm 1

抽出・精製

52)

RBL 2H3 細胞

human FKAG-tagged GPV 1

精製

53)

S. acidocaldarius strain 7

aacid PPace

溶解50), 54)

メタン精製菌ATPase溶解55)

Sulfobus

cytochromes

溶解

56)

B. stearothermophilus K1041

novel oxidase

溶解

57)

K17q8 cell

Cytochrome bo3

溶解・精製

58)

Thermophilic bacterium PS3

Quinol oxidase

溶解

59)

Bacillinovel oxidase

溶解

60)

ウシ心臓ミトコンドリア

ubiquinol-cytochrome c reductase

結晶化

61)

sf21 細胞( グラム陽性芽細胞形成好熱性細菌 )（バクテリア細胞膜）( グラム陽性芽細胞形成好熱性細菌 )（バクテリア細胞膜）

MEGA-10

用途

グラム陰性菌----------n-Heptyl-β-Dthioglucoside

タンパク質

9

25)

41)
42), 81)プロテオミクス関連試薬

細胞

Detergent

MEGA-10n-Octyl-β-Dglucoside

n-Octyl-β-Dthioglucoside

タンパク質

用途

文献

Sulfobus

cytochromes

溶解

56)

B. stearothermophilus K1041

novel oxidase

溶解

57)

K17q8 細胞

Cytochrome bo3

溶解

58)

ラット肝臓（メス）

microsomal 25-hydroxylase

溶解・精製

62)

Trypanosoma cruzi

Trypanothione reductase

精製

51）

Rhodobacter sphaeroids

reaction center

結晶化

63)

Thermus thermophilus HB8

DNA excision repair enzyme UvrB

結晶化

64)

ヒト

結晶化

65)

大腸菌

17β-hydroxysteroid dehydrogenase(17β-HSD1)
SecE

結晶化

66)

大腸菌

ラクトース輸送担体

抽出・精製67), 81)

HL-60, HL-60R

PKC

抽出

68)

ラット細胞

SP-A, SP-D

抽出

69)

COS-7 細胞NAPE-PLD

精製

16)

Wistar ラット心臓細胞 , COS-7 細 NAPE-PLD
胞
Wistar ラット肺組織
NAAA

抽出・精製

70)

精製

71)

R. oligospoeus

Chirinase I

精製

72)

大腸菌 , BL21(DE3)pLysS

抽出

73)

HEK293T 細胞

VAMP-2(vesicle-associated membraneprotein-2)
ほうれん草の葉緑体

結晶化

23)

硫黄細菌

チトクロム c オキシダーゼ

抽出・精製

74)

大腸菌

H+ 輸送性 ATPase メリビオース輸送 抽出・再構成( グラム陽性芽細胞形成好熱性細菌 ) （バクテリア細胞膜）

担体
Halobacterium salinarium strain bacteriorhodopsin
JW3
Translocon, SecTEG and its mutans
大腸菌

41)

抽出

75)

精製

76)

ブタ肺

Phospholipase D (PLD)

精製

49)

E. tarda NUF806

antigenic proteins of E. tarda

溶解

77)

C. acidovorans TB-35

PUR esterase

抽出

25）

HEK293T 細胞

精製

78)

精製

79)

ウシ心臓組織POMT 1, POMT 2(O-mannosyltransferase)
M2 mAchR(M2 muscarinic acetylcholine
receptor)
Bovine mitochondrial complex 1

精製

80)

deoxy cholate

大腸菌

ATP synthase(F0F1)

溶解81), 82)

Sodium cholate+
deoxy cholate

好熱菌

アラニン輸送担体

溶解81), 84)

sf9 細胞Sodium cholate

10

参考文献

1) V. Lakshmi, et al., Steroid Biochem., 1985, 22, 331.

45) H. Michizuki, et al., J. Biol. Chem., 2008, 283, 31237.

3) G. H. Perdew, et al., Anal. Biochem., 1983, 135, 453.

47) S. Hashida, J. Biol. Chem., 2004, 279, 26378-26386.

5) R. Horiuchi, et al., Eur. J. Biochem., 1989, 183, 529.

49) S. Okamura, et al., J. Biol. Chem., 1994, 269, 31207.

7) M. T. Lehto, et al., Biochem. J., 1998, 332, 101.

51)R. L. Krauth-Siegel, et al., FEBES Lett., 1993, 317, 105.

9) R. Scindler, et al., Eur. J. Biochem., 1998, 251, 863.

53) D. Locke, et al., J. Biol. Chem., 2003, 278, 15441.

11) D. S. Liscia, et al., J. Biol. Chem., 1982, 257, 9401.

55) K. Inatomi, et al., J. Bacteriol., 1993, 175, 80.

13) K. Sato, et al., Mol. Biol. Cell., 2009, 20, 4444-4457.

57) J. Sakamoto, et al., J. Biochem., 1997, 122, 764.

15) K. Yamamoto, et al., J. Biol. Chem., 2005, 280, 30511.

59) N. Sone, et al., J. Biol. Chem., 1987, 262, 15386.

17) N. Ueda, et al., J. Biol. Chem., 2001, 276, 35552.

61) W. Yue, et al., Biochemistry, 1991, 30, 2303.

19) K. Sugie, et al., J. Immunol., 1995, 154, 1691.

63) J. P. Allen, Proteins, 1994, 20, 283.

21) H. Fukui, et al., J. Biochem., 1995, 117, 993.

65) S-X. Lin, et al., J. Endocrinol., 1996, 150, S13.

2) T. Harayama, et al., J. Biol. Chem., 2008, 283, 11097.

46) H. Fujii, et al., J. Biol. Chem., 1995, 270, 12685.

4) Y. Matuo, et al., Cytotechnology, 1988, 1, 309.

48) S. Nishida, et al., Infect. Immun., 2005, 73, 235.

6) W. F. Simods, et al., Proc. Natl. Acad Sci., 1980, 77, 4623.

50) K. Ito, et al., J. Biochem., 1992, 112, 88.

8) K. Andersson, et al., Anal. Chem., 1999, 71, 2475.

52) R. M. DeVay, et al., J. Cell Biol., 2009, 186, 793.

10) J. Cladera, et al., Eur. J. Biochem., 1997, 243, 798.

54) T. Amano, et al., J. Biochem., 1993, 114, 329.

12) M. Yoshida, et al., J. Biol. Chem., 2000, 275, 497.

56) T. Iwasaki, et al., J. Biol. Chem., 1995, 270, 30893.

14) A. Yamashita, et al., J. Biol. Chem., 2003, 278, 30382.

58) N. Sone, et al., J. Biochem., 2000, 127, 551.

16) J. Wang, et al., J. Biol. Chem., 2006, 281, 12325.

60) T. Tanaka, et al., J. Biochem., 1996, 119, 482.

18) K. Satoh, et al., Genes Cells, 2002, 7, 187.

62) T. Yamasaki, et al., J. Biol. Chem., 2004, 279, 22848.

20) J. Hirota, et al., J. Biol. Chem., 1995, 270, 19046.

64) A. Shibata, et al., Acta Cryst., 1999, D55, 704.

22) T. Aeai, et al., 15th International Congress of Chemotherapy,66) H. Tokuda, et al., Fed. Eur. Biochem. Soc., 1991, 279, 233.

23) C. Miyake, et al., Plant Cell Physiol., 1993, 34, 881.

68) M. Nishikawa, et al., Canser Res., 1990, 50, 621.

25) Y. Akutsu, et al., Appl. Envir. Microbiol., 1998, 64, 62.

70) Y. Okamoto, et al., J. Biol. Chem., 2004, 279, 5298.

27) C. Yin, et al., Molecular Mocrobiology, 2000, 38, 482.

72) N. Takaya, et al., Microbioligy, 1998, 144, 2647.

29) Y. Maruyama, et al., J. Biol. Chem., 2007, 282, 36961.

74) M. Kai, et al., J. Biochem., 1992, 112, 816.

31) J. F. Teiber, et al., J. lipid Res., 2004, 45, 2260-2268.

76) H. Mori, et al., J. Bacteriol., 2003, 185, 405.

33) J. Hendriks, et al., Biochemistry, 1998, 37, 13102.

78) K. Akasaka-Manya, et al., J. Biol. Chem., 2006, 281, 19339.

35) H. Shigematsu, et al., J. Biol. Chem., 2010, 285, 11210.

80) I. M. Fearnley, et al., J. Biol. Chem., 2001, 276, 38345.

1987, 19.

67) M. J. Newman, et al., J. Biol. Chem., 1981, 256, 11804.

24) N. Inoue, et al., J. Clin. Microbiol., 1992, 30, 1442.

69) J. R. Wright, et al., Am. J. Physiol., 1999, 276, 650.

26) T. Tsukihara, et al., Science, 1995, 269, 1069.

71) K. Tsuboi, et al., J. Biol. Chem., 2005, 280, 11082.

28) K. Mio, et al., J. Electron Microsc.(Tokyo), 2007, 56, 111.

73) S. Kozaki, et al., Infect. Immun., 1998, 66, 4811.

30) K. Takahashi, et al., J. Biol. Chem., 2006, 281, 10760.

75) K. Takeda, et al., J. Mol. Biol., 1998, 283, 463.

32) R. Lutter, et al., Biochem. J., 1993, 295, 799.

77) T. Sakai, et al., J Vet Diagn Invest, 2009, 21, 504.

34) K. A. Williams, et al., The EMBO J., 1999, 18, 3558.

79) H. Furukawa, et al., Mol. Pharmacol., 2002, 62, 778.

36) Y. Kofuku, et al., J. Biol. Chem., 2009, 284, 35240.

81) 土屋友房 ," 膜タンパク質の可溶化と界面活性剤 ", 化学と生物

38) S. Okuda, et al., PNAS, 2009, 106, 5877.

82) D. L. Foster, et al., J. Biol. Chem., 1979, 254, 8230.

40) N. Taniguchi, et al., J. Biol. Chem., 2008, 283, 8538.

84) H. Hirata, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1976, 69,37) A. J. Kuszak, et al., J. Biol. Chem., 2009, 284, 26732.
39) B. C. Jennings, et al., J. Lipid Res., 2009, 50, 233.

実験ライン 5, 廣川書店 (1990).

83) T. Vanaken, et al., Methods in Enzymol., 1986, 125, 27.
665.

41) T. Shimamoto, et al., J. Biochem., 1989, 105, 785.
42) H. Itami, J. Biochem., 1989, 105, 785.

43) T. Miki, et al., J. Biol. Chem., 1992, 267, 18695.

44) Y. Kashino, et al., Plant Cell Physiol., 1996, 37, 976.

11

プロテオミクス関連試薬

プロトコル

膜タンパク質等を可溶化したい
界面活性剤ミセル

リン脂質可溶化した膜タンパク

膜タンパク11) 1 ml のタンパク質抽出液 ( 約 300 μg のタンパク質を含む )を、前もって準備した DEAE-Sepharose カラムにて精Ⅰ n -Octyl-β -D-glucoside を用いた大腸菌ラク
トース輸送担体の可溶化

1,4)

製する。
溶出液：10 mmol/l リン酸カリウム、pH5.8、1 mmol/l DTT、
20 mmol/l ラクトース、0.25 mg リン脂質 /ml、1.25% (w/v) n -Octyl-β -D-glucoside

1. 試薬・lac Y 組み換え大腸菌 T206 より調製した膜小胞・n - Octyl-β -D-glucoside(Code.O001)
・Sodium cholate(Code.C321)
・Dithiothreitol(DTT)・大腸菌由来リン脂質 (Avanti Polar Lipids 社、もしくは参考
文献 5)参照)・DEAE-Sepharose CL-6B(GE ヘルスケア社)

II n- Heptyl-β-D-thioglucosideを用いた腸炎ビブリオの膜結合性 5’- ヌクレオチダーゼの可溶化 1,6)

1. 試薬

・フレンチプレス法にて調製した反転膜小胞・n- Heptyl-β -D-thioglucoside (Code.H015)
・EDTA-2K (Code.K001)

・リン酸カリウム・ラクトース・尿素(生化学用)
・リン酸

・Dithiothreitol(DTT)・Tricine (Code.GB19)
・MOPS (Code.GB13)

2. 方法

以下の操作は、特にことわらない限り 4℃ で行った。また、ほとんどの攪拌には Vortex mixer を用いた。
1) 別に調製した反転膜小胞 12.5 mg を 10 mg タンパク質 /mlとなるように緩衝液 (50 mmol/l リン酸カリウム、pH7.5、0.5
mmol/l DTT、10 mmol/l ラクトース) に懸濁する。
2) 等量の尿素溶液 (10 mmol/l) を室温下で攪拌しながら滴下する。
3) 氷浴中で 10 分間放置し、175,000 x g で 1 時間遠心する。
4) 沈殿を 1.75 ml の緩衝液 (50 mmol/l リン酸カリウム、pH7.5)に懸濁し、Sodium cholate が終濃度で 6% となるように
Sodium cholate 溶液 (20% w/v、pH7.8) を攪拌しながら加える。
5) 氷浴中で 20 分間放置後、26,000 x g で 15 分間遠心する。
(これまでの操作で、膜の不要タンパク質が除去されている)
6) 沈殿を 5 ml の緩衝液 (10 mmol/l リン酸カリウム、pH5.8) に懸濁し、遠心を繰り返す。
7) 沈殿を 1.45 ml の緩衝液 (10 mmol/l リン酸カリウム、pH5.8)に懸濁し、DTT 溶液 (100 mmol/l)17.5 μl、ラクトース 13
mg、リン脂質溶液 (50 mg/ml)131 μl を加え攪拌する。
8) これに、n -Octyl-β -D-glucoside の終濃度が 1.25% となるよ
うに、n -Octyl-β -D-glucoside 溶液 (15% w/v、10 mmol/l リン酸カリウム、pH5.8)146 μl を加える。このとき、タンパク質 / リン脂質 / 界面活性剤の比率は、1：3：10 となる。
9) これを泡立たないように注意してよく攪拌し、氷浴中で 10分間放置してからさらに攪拌した後、175,000 x g で 1 時間

・Tris( トリスヒドロキシメチルアミノメタン）
・塩化ナトリウム・硫酸マグネシウム
・2-Mercaptoethanol
・DEAE-Sepharose CL-6B(GE ヘルスケア社)

2. 方法

以下の操作は、特にことわらない限り 4℃ で行う。
1) 腸炎ビブリオの反転膜小胞 (タンパク質 145 mg を含む) を緩衝液 (3 mmol/l Tricine-Tris、pH8.0、0.5 mmol/l EDTA-2K、
1 mmol/l 2-Mercaptoethanol)30 ml に懸濁し、約 30 分間氷
浴中でゆるやかに攪拌した後、105,000 x g で 1 時間遠心する。
2) タンパク質濃度が 1 mg/ml となるように n- Heptyl-β-Dthioglucoside 40 mmol/l を含む緩衝液 (20 mmol/l MOPSTris、pH7.5、5 mmol/l 硫酸マグネシウム、1 mmol/l DTT) に懸濁し、氷浴中で 15 分間ゆるやかに振とうする。
3) 105,000 x g で 1 時間遠心して、5-'ヌクレオチダーゼが可溶化された上清を得る。
4) これを、前もって準備した DEAE-Sepharose カラムにて精製する。
溶出液：50 mmol/l MOPS-Tris、pH8.0、5 mmol/l 硫酸マグ
ネシウム、1 mmol/l DTT、40 mmol/l n- Heptyl-β-Dthioglucoside、100 → 400 mmol/l (グラジェント) 塩
化ナトリウム

遠心する。
10) 上清を取り、リン酸 (10 mmol/l リン酸 ,1.25% の n- Octyl-β -D-glucoside を含む) で pH5.8 に合わせる。

12

III CHAPS を用いたマクロファージの細胞骨格の＊ 3 CHAPS の溶液量の目安は、13.5 mmφ のカバースリップ
1 枚につき 6 ml 以上である。
＊ 4 振とうが強すぎると、細胞がはがれてしまうので注意する。

露出(参考文献７の改良法)7-9)

1. 試薬

・S. typhimurium LPS (Difco 社)
・ウシ胎児血清 (FBS)・ヘパリン
・Dulbecco's MEM(DMEM)
・プラスチックカバースリップ (住友ベークライト社、セル
デスク)
・PIPES (Code.GB15)
・HEPES (Code.GB10)・GEDTA (Code.G002)
・Phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA、Sigma 社)
・塩化マグネシウム
・CHAPS (Code.C008)(シリカゲルデシケーター中で 2 週間ほど乾燥させて使用)

IV CHAPS を用いたプロトプラストからの液胞の
単離 8)

1. 試薬

・Atriplex gmelini の緑葉から調製したプロトプラスト(1.2 mol/l Sorbitol 中で単離)・CHAPS (Code.C008)
・GEDTA(EGTA) (Code.G002)
・HEPES (Code.GB10)
・Sorbitol
・Tris

2. 方法

2. 方法

1) プロトプラスト 1 ml を Babcock bottle に入れる＊ 1。
2) これに緩衝液 (1.0 mol/l Sorbitol、1 mmol/l GEDTA、0.5 mmol/l
CHAPS、20 mmol/l HEPES-Tris、pH8.0)50 ml を加え、120x g で 3 分間遠心する。
3) 上清中の液胞を集め (約 1.2 ml ＊ 2)、Babcock bottle に入れる。
4) これを緩衝液 (1.0 mol/l Sorbitol, 20 mmol/l HEPES-Tris,
pH8.0) で 20 倍に希釈し、120 x g で 3 分間遠心して、上清

1) S. typhimurium LPS を 200 μg/ml に滅菌蒸留水で調製し、マウス (SLC-ICR、7〜10 週齢)1 匹あたり 0.25 ml 腹腔内に注射する。
2) 5〜6 日後に 10% FBS、10 U/ml ヘパリンを添加した 10
mmol/l HEPES 含有 DMEM(pH7.1) で腹腔洗浄し、細胞を採取する。
3) この付着性腹腔細胞を 4℃ の DMEM で 3 回遠心洗浄 (1000rpm、10 分間) する。
4)10% FBS 含有 DMEM で 10 6 cells/ml となるように調製し、中に浮遊している液胞を回収する。

＊ 1 プロトプラストを 0.5 mol/l Sorbitol で単離する場合は、10％ Ficoll 400 等を添加して、プロトプラストを浮遊させる。
＊ 2 プロトプラストが上清に濃縮されない場合は、Ficoll 400
等で溶液の比重を高める。

シャーレに移す。
5) 4℃ で一夜 FBS コートしたプラスチックスリップを DMEM
6
で 10 分間洗浄し、10 cells/ml に調製されたシャーレに入れ、37℃ で 20 分間 CO 2 インキュベーターで培養する (スリップ 1 枚に細胞液 1 ml)。
6) 4℃ の DMEM を入れたシャーレに細胞の付着したプラス
チックスリップを 1 枚ずつ入れ、パスツールピペットで非

参考文献

1) 土屋友房 ,“ 膜タンパク質の可溶化と界面活性剤 ”, 化学と生物実験ライ
ン 5, 廣川書店 , 1990.
2) 笠原道弘 , 有機物の膜輸送系の再構成と精製 , 蛋白質核酸酵素 , 1979 ,24 ,1077.
3) 広瀬茂久 , 血管作動性ホルモン受容体の研究と界面活性剤 , Dojin
News , 1987, 39 , 3.
4) M. J. Newman, D. Foster, T. H. Wilson, H. R. Kaback, J. Biol. Chem. ,1981, 256, 11804.
5) G. F. Ames, J. Bacteriol. , 1968, 95 , 833.
6) H. Itami, Y. Sakai, T. Shimamoto, H. Hama, M. Tsuda, T. Tsuchiya, J.
Biochem. , 1989, 105 , 785.
7) 本田秀明 , 斎藤卓也 , 山口淳二 , 両性界面活性剤による細胞骨格露出
法 , 細胞 , 1990, 22 (11), 451.
8) J. Yamaguchi, M. Shibano, T. Saito, ICEM , 1994, 13 , 43.
9) T. Matoh, J. Watanabe, E. Takahashi, Plant Physiol. , 1987, 84 , 173.

付着細胞を取り除く。
7) 希釈した PMA を添加した 10% FBS 含有 DMEM で、37℃
で 20 分間 CO2 インキュベーターで培養する。
8) 得られた細胞付着スリップを室温の DMEM で 10 分間洗浄する。
9) さらに室温の PHEM buffer(60 mmol/l PIPES、25 mmol/l
HEPES、10 mmol/l GEDTA、2 mmol/l 塩化マグネシウム、pH6.9) で 10 分間、2 回洗浄する。
10) あらかじめ、37℃ にした PHEM buffer に細胞付着スリッ
プを移し、5 分程度なじませる。
11) 6 cm のガラスシャーレに PHEM buffer で 0.5% に調製し2,34た CHAPS 溶液＊ を 15 ml 程度入れ＊ 、ふたを逆さまにのせ、溶液温度を 37℃ にする。
これに、細胞付着スリップを入れ (1 枚のシャーレに 2 枚程度のスリップ )、3 分間骨格を露出する。この時、45〜
60 秒間に一度軽くシャーレを揺り動かす。
12) 37℃ の PHEM buffer で 3 回洗浄する (2〜3 分、10 分、10分 )。後は室温の PHEM buffer に戻し、細胞骨格試料とする。
＊ 1 この洗浄が十分でないと、細胞骨格の露出率が低下する。
＊ 2 CHAPS 溶液は使用前 1 時間以内に調製し、泡立たないように注意して混和する。また、CHAPS の濃度は正確に 0.5%(8.132 mmol/l) とする。濃度が高すぎると、カバー
スリップからはがれ落ちる細胞が増え、一部細胞骨格が溶出されることがある。また濃度が薄ければ、細胞膜の可溶化がうまくいかない。
13

1.6.遺伝子導入試薬
タンパク質定量キット-Proteostain- Protein Quantification Kit-Rapid

500 tests ; 同仁品コード (PQ01)
2,500 tests ; 同仁品コード (PQ01)-Proteostain- Protein Quantification Kit-Wide Range[PQ01]
キット内容[500 tests]
・CBB solution
・Standard BSA solution (4,000 μg/ml)[2,500 tests]
・CBB solution
・Standard BSA solution (4,000 μg/ml)
取扱注意
1. 安衛法 , 2. 保存方法：冷蔵500 tests ; 同仁品コード (PQ02)
2,500 tests ; 同仁品コード (PQ02)[PQ02]
キット内容[500 tests]
・WST-8 solution
・Buffer solution
・Standard BSA solution (10,000 μg/ml)[2,500 tests]
・WST-8 solution
・Buffer solution
・Standard BSA solution (10,000 μg/ml)
取扱注意
1. 保存方法：遮光 , 冷蔵

100 ml × 2
1.5 ml × 1
1,000 ml × 1
1.5 ml × 2

10 ml × 1
100 ml × 1
1.5 ml × 1
50 ml × 1
500 ml × 1
1.5 ml × 2

キット以外に必要なもの
10 μl, 200 μl マイクロピペッター、インキュベーター、プレートリーダー性質タンパク質濃度の定量法としては Lowry 法、Bicinchoninate 法 (BCA法)、Biuret 法、Bradford 法などがある。Protein
Quantification Kit-Rapid は、高感度で反応が早いタンパク質検出用試薬 Coomassie Brilliant Blue G(CBB) を用いており、
Bradford 法として知られている。CBB はタンパク質に作用し、酸性条件下で青色に呈色する (λmax= 595 nm)。しかも呈色は 1 分以内に終了し、数分でタンパク質の定量を行うことができる。
Protein Quantification-Wide Range は、塩基性条件での tetrazolium salt の還元反応を利用したものである。Tetrazolium
salt はタンパク質により容易に還元され formazan dye を生成する。WST-8 の formazan dye は中性域では黄色を示すが、高 pH 域では青色を示す。還元反応を利用しているため界面活性剤は測定に影響を及ぼしにくい。
測定範囲は、それぞれ以下の通りである。
Protein Quantification Kit-Rapid: BSA 換算 10 〜 2,000 μg/ml
Protein Quantification Kit-Wide Range : BSA 換算 100 〜 5,000 μg/ml-Proteostain- Protein Quantification Kit-Rapid [PQ01]-Proteostain- Protein Quantification Kit-Wide Range [PQ02]

O

-O S
3

O2N

NH

N

SO3-

N

Na+

+
N N

Na+
-

O3S

+

reducing

N

OCH3

SO3-

N

N

-O S
3
H N
N

O2N

N
OCH3

O2N

O2N

WST-8 formazan

WST-8

Coomassie Brilliant Blue G

SO3-

2.0

Absorbance at 650 nm

0.8

Absorbance

0.6
0.4
0.2
0
0

500

1,000

1,500

1.5
1.0
0.5
0

2,000

Concentration of BSA (µg/ml)

3,000a) タンパク質無しb) タンパク質あり(BSA 500 μg/ml)

0.4

4,000

a) タンパク質無し

0.6
0.4

b) タンパク質あり(BSA 2,000 g/ml)

a)

0.2

0.2

500

600

700

5,000

b)

0.8

b)

0.6

0

2,000

Standard BSA solutionで作成した検量線の例

AbsorbanceAbsorbance

a)

1,000

Concentration of BSA (µg/ml)

Standard BSA solutionで作成した検量線の例

0.8

0

0

800

400

500

600

700

Wavelength/ nm

Wavelength/ nm

WST-8 の吸収スペクトル

Coomassie Brilliant Blue G の吸収スペクトル17プロテオミクス関連試薬

1.7.遺伝子導入試薬
タンパク質蛍光標識試薬
IC3-OSu special packaging

20 μg×3 ; 同仁品コード (I271)
規格(1) 性状 : 濃赤色固体(2) 純度 (HPLC) : 80.0% 以上(3) ジメチルスルホキシド溶状 : 試験適合
(4)NMR スペクトル：試験適合
溶解例 20 μg/40 μl( ジメチルスルホキシド )取扱注意 保存方法：吸湿注意 , 冷凍
N-Ethyl-N’-[5-(N”-succinimidyloxycarbonyl)pentyl]
indocarbocyanine iodide
C35H42IN3O4=695.63

IC5-OSu special packaging

N-Ethyl-N’-[5-(N”-succinimidyloxycarbonyl)pentyl]3,3,3’,3’-tetramethyl-2,2’-indodicarbocyanine iodide
C37H44IN3O4=721.67

蛍光特性

λex/em=550/570 nm

20 μg×3 ; 同仁品コード (I272)
規格(1) 性状 : 濃青色固体(2) 純度 (HPLC) : 80.0% 以上(3) ジメチルスルホキシド溶状 : 試験適合
(4)NMR スペクトル：試験適合
溶解例 20 μg/40 μl( ジメチルスルホキシド )取扱注意 保存方法：吸湿注意 , 冷凍
蛍光特性

FITC-I

λex/em=640/660 nm

100 mg ; 349-03661 同仁品コード (F007)
500 mg ; 343-03664 同仁品コード (F007)
規格

Fluorescein-4-isothiocyanate
CAS No. 3326-32-7
C21H11NO5S=389.38(1) 性状 : 黄橙色粉末(2) 純度 (HPLC) : 95.0% 以上(3) アセトン溶状 : 試験適合
(4) モル吸光係数 : 80,000 以上 (492 nm 付近 )(5)IR スペクトル：試験適合
溶解例 100 mg/10 ml( アセトン )取扱注意 保存方法：冷蔵
蛍光特性 λex/em=495/520 nm

Sulforhodamine 101 acid chloride

10 mg ; 345-05221 同仁品コード (S016)

規格(1) 性状 : 紫色結晶性粉末(2) 純度 (TLC) : 85.0% 以上
溶解例 1 mg/ml( クロロホルム )取扱注意 保存方法：遮光 , 冷凍
蛍光特性

λex/em=568/590 〜 630 nm※本製品は、二種類のスルホニルクロライド化合物を含む混合物です。
1H,5H,11H,15H-Xantheno[2,3,4-ij:5,6,7-i'j']diquinolizin18-ium,9-(2-sulfo-4-chlorosulfophenyl)-2,3,6,7,12,13,16,17octahydro-,inner salt
CAS No. 82354-19-6
C31H29ClN2O6S2=625.16

18

プロトコル

タンパク質を蛍光標識したい

I IC-Dye を使用したタンパク質標識例

III FITC-I を使用した抗体標識例＊「免疫の生化学」, 蛋白質核酸酵素編集部編 , 共立出版発行より引用

1. 試薬
・50 mmol/l リン酸緩衝液 (pH8.0)1) 抗体蛋白液の蛋白量を屈折計で計り (A mg/ml) ついで液量を測定 (B ml) し、総蛋白量を計算する (A×B=C mg)。
2) 総蛋白量の 1/100 〜 1/150 量の FITC を秤量し ( 蛋白液量により加減する）、2% の蛋白液 (C/20=D ml) の 1/10 量(D/10=E ml) に相当する 0.5 mol/l 炭酸緩衝液 (pH9.5) で・1 mmol/l グアニジン液

・（Lu)DMSO (Code. LU08)
・10 mmol/l リジン溶液

2. 方法

1) タンパク質をリン酸緩衝液に溶解する (2 mg/ml)。
2) 1) の溶液 25 μl ( タンパク質 50 μg) をチューブに入れる。
3) 1 mmol/l グアニジン塩酸塩 25 μl を 2) のチューブに入れる。
4) 98℃ で 3 分間加熱する。
5) IC 3（もしくは IC5）OSu special packaging 20 μg を DMSO
80 μl に溶解する。→（試薬溶液）
6) 4) のチューブに 5) の試薬溶液 1 μl を添加し、混合する。
7) 氷上で 1 時間反応させる。
8) 10 mmol/l リジン溶液を 2 μl 添加し、氷上で 15 分静置する。
9) 反応液をゲルろ過もしくは TCA 沈殿を行い、未反応の色素を除去する。

II BSA への IC3(IC5) の標識例

溶解する。
※ 緩衝溶液中で FITC は徐々に分解していきます。速やかにご使用ください。また、DMSO やアセトンなどに FITC-I を溶

解後、反応時に緩衝液に添加する方法もあります。
3) ついで蛋白溶液 B ml にあらかじめ生理食塩水 F ml(D−(B ＋ E)
＝F ml) を加え、これに FITC 溶液を加える。
（ここで蛋白液は、はじめて 2% になる）
4) この場合、両液とも 1 〜 2℃ に保っておく。pH9.5 である
ことを確かめてから、7 〜 9℃ の温度で泡立てないように 4
時間撹拌する。
※ 室温で 1 〜 2 時間程度の反応でも結構です。抗体の性質にあわせてください。
5) 反応液を Sephadex カラムろ過し、未反応の色素を除去する。
(PBS pH7 使用）
6) 必要があれば、更に、DEAE カラムで分離精製する。

1. 試薬・100 mmol 炭酸緩衝液 (pH8.5)
・Dulbecco's PBS(-)
・(Lu)DMSO (Code. LU08)

2. 操作手順

1) BSA を炭酸緩衝液に溶解する。(1.2 mg/ml)。→（BSA 溶液）
2) IC3( もしくは IC5) OSu special packaging 20 μg を DMSO
6 μl に溶解する。 → （試薬溶液）
3) BSA 溶液 125 μl に試薬溶液 3 μl を加える。（試薬量は BSAに対して約 7.2 倍量となる。）
4) 30℃ で 1 時間インキュベートする。
5) 反応液をゲルろ過もしくは TCA 沈殿を行い精製し、未反応の色素を除去する。

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19

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Tel.03-3578-9651（代表） Fax.03-3578-9650

25. 06. 18