プロトコル

抗体を精製したいI はじめに4. 操作

腹水、培養組織上清または血清から得た抗体は、硫安塩析法、ゲルろ過法、イオンクロマト法あるいは protein A/G クロマト法
等により精製される。protein A/G クロマト法は、IgG の protein
A または protein G に対する親和性を利用した精製法である。短時間、かつ高い精製効率で粗製 IgG を精製できることから汎用されており、また簡易精製キットとしても市販されている。IgGの protein A または protein G に対する親和性は動物種により異なるため、精製する IgG によりその選択が必要である。
IgG Puriﬁcation Kit - A および IgG Puriﬁcation Kit - G は、シリカゲルにそれぞれ protein A および protein G を固定化した担体を用いる。操作は全てスピン法により行なわれるため、30分以内に目的の IgG を精製することができる。スピン後、サンプル溶液はほとんど残存しないため、IgG を失うことなく単離することができる。表 P-5-1 に動物種毎の IgG の protein Aおよび protein G への結合性を示す。
本稿では IgG Puriﬁcation Kit - A および IgG Puriﬁcation Kit G の操作法を解説する。

1

IgG を含むサンプル溶液 50 μlに Washing Buffer 50 μl を加え混合する。

2

操作 1) の溶液を Protein A Cartridge tube ま た は Protein G
Cartridge tube のカップに加える( キャップを閉めないこと )。

3

カップを指で回転させ、溶液とa)ゲルをよく混合させる 。その後、 室温 に 2 分 間 静 置し、IgGを Protein A または G へ吸着させる。

4

キャップを閉め、30 秒間遠心する。ろ液を再びカップに移し、操作 3) を繰り返す。キャップを閉め、30 秒間遠心する。ろ液はマイクロチューブに移し保存しb)ておく 。

5

Washing Buffer 200 μl をカップに加える ( キャップを閉めないこと )。カップを指で回転させ、溶a)液とゲルをよく混合させる 。

表1IgG の protein A および protein G への結合性

動物種
ヒト
マウス
ラット
ウサギ
ヤギ
ヒツジ
ニワトリ
ブタ
ウマ
ウシ
ハムスター

protein A
◎
◎
△
◎
△
△
×
◎
△
△
△

protein G
◎
◎○◎
◎
◎
×○
◎
◎
△

6

キャップを閉め、30 秒間遠心する。ろ液を捨てる。再び操作 5)を繰り返す。キャップを閉め、30 秒間遠心する。ろ液は捨てる。

7

キット添付の 1.5 ml Microtube
へ Catching Buffer を 60 μl 加
え た 後、Protein A ま た は G
Cartridge tube のカップを取り付c)
ける 。

8

Elution Buffer 70 μl をカップに加える。キャップは閉めずにカップを指で回転させ、溶液とゲルa)をよく混合させる 。

9キ ャ ッ プ を 閉 め、30 秒 間 遠 心する。再び操作 8) を繰り返す。
キャップを閉め、30 秒間遠心する。ろ液はそのままにしておく( このろ液中に IgG が含まれている )。

10

カップを取り除き、キャップを閉める。ボルテックスミキサーd)で混合し、0 〜 5℃で保存する 。

◎：非常に強い、○：強い、△：弱い、×：非常に弱い

II IgG Purification Kit - A および IgG Purification Kit - G を使用した IgG の精製
1. キット内容(1) IgG Puriﬁcation Kit - A(Code: AP01)
・Protein A Cartridge tube
・Washing Buffer
・Elution Buffer・Catching Buffer
・1.5 ml Microtube(2) IgG Puriﬁcation Kit - G(Code: AP02)
・Protein G Cartridge tube
・Washing Buffer
・Elution Buffer
・Catching Buffer
・1.5 ml Microtube

2. 適用量血清 50 μl または 200 μg IgG 溶液

3. キット以外に必要なもの
・200 μl マイクロピペッター
・遠心機 ( マイクロチューブ用 )・マイクロチューブ・ボルテックスミキサー

技術的な内容に関するお問い合わせ先：カスタマーサポート Free Fax:0120-021557 Free Dial:0120-489548
在庫や価格(記載容量以外もしくは request)に関するお問い合わせ：マーケティング部 Tel:096-286-1515 Fax:096-286-1525(株)同仁化学研究所

110

細 胞
増殖 / 毒性酸化ストレス分 子生物学
細 胞 内蛍光プローブ細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用試薬
膜タンパク質可 溶 化 剤
ラベル
化 剤
二価性
試 薬
イオン
電 極
その他
機能性有機材料

プロトコル
細 胞
増殖 / 毒性酸
化
ストレス
分 子
生物学
細 胞 内蛍光プローブ細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用
試
薬
膜タンパク質可 溶 化 剤
ラベル
化 剤
二価性
試 薬
イオン
電 極

Protein A および G pack のキャップにゲルが付着している場
合は、チューブの底を軽くたたくか、遠心によりゲルをカップ内に落とすこと。

0.2 % ゼ ラ チ ン を 含 む 0.2 mg/ml IgG 溶液 1 ml に、酵素処理用バッファー（100mmol/l HEPES, pH7.4, 0.36 mmol/l CaCl2含有）420 μ l と酵素処理用バッファーで調製 し た 3.5 CDU/ml Collagenase（Sigma,# C7926）希釈溶液 80 μ l を加えて混合した。37℃ , 3 時間 インキュベートした後、IgG Puriﬁcation Kit – G(Code: AP02) を 用
いて IgG を単離した。

a) チューブを傾け、カップを指で 10 〜 20 回回転させる。
b) IgG の回収量が低い場合は、ろ液をカップに移し、操作 3以降に従い回収する。
c) Protein A または G Cartridge tube は、再度精製操作を行う
際に使用するので、リザーバーは保管しておくこと。
d) –20℃保存する場合は、同量のグリセロールを添加する。

注）IgG Puriﬁcation Kit-G では、抗体を Protein G

血清 50 μl を使用した場合の、IgG Puriﬁcation Kit - A およびIgG Purification Kit - G による動物種毎の IgG の回収量を表 2に示す。
図 1 には、IgG Puriﬁcation Kit - A および IgG Puriﬁcation Kit

固定化担体に保持させる際の抗体溶液量を一回当たり 200 μ l としている。しかし、上記の操作でコラゲナーゼ処理した抗体溶液量は、1.5 ml となるため、IgG を担体に保持させる操作を 8 回（200- G で精製した rabbit IgG の SDS-PAGE の例を示す。

123μ l×7 回 , 100 μ l×1 回）に分けて行った。
※上記の方法で得られる抗体の回収率：45 ～ 50 %1. rabbit serum
2. IgG Puriﬁcation Kit - A で精製した
rabbit IgG
3. IgG Puriﬁcation Kit - G で精製した
rabbit IgG
電気泳動条件：6% acrylamide gel、Tris-glycine buffer

図 2 ゼラチン除去精製前後の SDS-PAGE
1: ゼラチン含有 IgG 溶液
2: 精製後の IgG 溶液

その他
機能性有機材料(2) 300K 限外濾過チューブを用いたゼラチン除去
図1

IgG Puriﬁcation Kit - A および IgG Puriﬁcation Kit - G
で精製した rabbit IgG の SDS-PAGE

表2IgG Puriﬁcation Kit - A および IgG Puriﬁcation Kit - Gによる IgG の回収量
ウシ
ウマ
マウス
ラット
ヤギ
ヒト
ウサギ
ヒツジ

protein A (μg)
200 〜 300
150 〜 250
150 〜 250
50 〜 100
50 〜 100
150 〜 250
200 〜 300
50 〜 100

protein G (μg)
250 〜 350
200 〜 300
150 〜 250
100 〜 200
150 〜 250
200 〜 300
150 〜 250
150 〜 250

1 2 3 40.1% ゼラチンを含む 0.2 mg/ml IgG 溶液
1 ml を 300K フィルトレーションチューブ2 本に分けて限外濾過を行った（1 本につき 200 μ l×2 回 , 100 μ l×1 回 ; 13,500 x gcentrifuge)。
そ の 後、 回 収 溶 液 500 μ l を IgG
Puriﬁcation Kit - G(Code: AP02) を 用 い てIgG を単離した。
注）回収溶液 500 μl に対し、IgG Puriﬁcation Kit G の Washing Buffer 50 μl を添加し、精製を行った。
ゲルへの吸着操作を繰り返し行った。
※上記の方法で得られる抗体の回収率 : 35 〜 45 %＊血清 50 μl 使用

III 市販のゼラチン含有抗体の精製
市販されている抗体には、安定化剤としてゼラチンを含むものがある。ゼラチンを含む抗体に小社 Labeling Kits を用いて酵素や蛍光物質を標識する際、ゼラチンは抗体と各 Reactive体との反応を妨害する。また、ゼラチン自体がゲル化しやすいという特徴を持つため、Labeling Kit シリーズで用いるフィルトレーションチューブの目詰まりを引き起こす。そのため、ゼラチン含有の抗体を用いて標識操作を行う前には、ゼラチンを除去して抗体を単離することが必要となる。
ここでは、IgG Puriﬁcation Kit - G を活用したゼラチン除去
例を二種類紹介する。
(1) Collagenase( コラゲナーゼ ) によるゼラチン分解111

図 3 ゼラチン除去精製前後の SDS-PAGE
1: IgG
2: ゼラチン含有 IgG 溶液
3: 300K 限外濾過のみの IgG 溶液
4: 300K 限外濾過＋ IgG Puriﬁcation Kit - G で精製後の IgG 溶液

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