癌特異的な細胞内小器官異常を制御する低毒性低分子抗癌剤
福岡大学

医学部医学科准教授

角田俊之

2021年5月20日

1

１．背景＆概要
KRASは癌の増生において鍵となる分子であるが、直接の阻害剤はない
KRASとは？

癌において最も重要な癌遺伝子

患者数(本邦）

世界の現状★変異KRAS(G12C)の阻害剤(AMG510)が登場し、治験にて良好な成績を収めているが、G12C変異は全KRAS変異の１０％であり、変異KRASは依然としてundruggableである。

膵臓癌-KRAS 95%
大腸癌-KRAS 45%

９万人

肺癌-KRAS 35%

７万人

悪性黒色腫-KRAS 15%

G12C Non G12C
★肺癌ではイレッサ等の分子標的薬はKRASに変異がある患者には効果なく保険適用外。
★変異KRAS制御分子関連の癌はさらに多い
変異KRASを直接標的とすることは非共有結合性の化合物では難易度が高いと考え
変異KRASの下流の関連シグナルを幅広く抑える化合物を３次元浮遊培養システムにて施行
自動化による効率化

標的分子同定HKe3
HKe3+変異KRAS +野生型KRAS
癌モデル 正常モデル

Control化合物X

プレ毒性試験もできるスクリー
ニングシステムの確立

磁性ビーズによる
プルダウン

リード化合物同定

Voltage-dependentanion-selective channel 1(VDAC1)KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu)receptor 1(KDELR1)

さらにリード化合物の一つ（STAR2）の炭素の一部を窒素置換したSTAR2N1等を標的タンパク構造情報に基づき合成し、物質特許出願
2

従来技術とその問題点
現在開発が進んでいる変異KRASを直接標的出来るAMG510はG１２C変異にのみ効果を示す。
G12CはKRAS変異の１０％に過ぎない。

BRAF、MEK阻害剤などの効果は高いが一時的でありすぐに耐性化(再発)が出現する。最近では
AMG５１０の耐性化も問題になっている。
多くの抗癌剤は強い副作用を有する。
3

2.STAR2の効果について
方法：3次元浮遊培養(3DFC)；Day 0にSTAR2投与、 Day6に断面積計測
KRAS変異（＋）
HCT116

KRAS変異（－）
HKe3

control
15 μM
45 μM
毒性無縮小

KRAS変異有り無しにかかわらず、KRAS関連シグナルが活性化する癌細胞株の増殖を抑制する
方法：3次元浮遊培養(3DFC)；Day 0にSTAR2投与、 Day6に断面積計測
KRAS変異（-）
KRAS変異（＋）

BRAF

PTEN

Calu-6 SW620 SK-MEL28 MDA-MB-231 LNCaP(prostate)(colon) (colon) (melanoma) (breast)

CTNNB1
HeLa(cervix)

KRAS関連シグナルの変異（＋）

HepG2(liver)control

45 μM

KRAS関連シグナルを幅広く抑制

4

方法：患者由来のメラノーマ細胞親株(BRAFV600E変異有）とベムラフェニブ(BRFFV600E阻害剤）耐性細胞株を樹立し、3次元浮遊培養(3DFC)；Day 0にSTAR2投与、 Day6に断面積計測。
Growth suppression by STAR2 on
vemrafenib-resistant melanoma spheroids
親株

ベムラフェニブ耐性株

control
5μM
15μM
45μM

結果：薬剤耐性株により増殖抑制効果あり。

52.STAR2の効果について
Growth suppression by STAR2 on several types of cancer spheroids
Tissuecolorectal
colorectal
colorectal
colorectal
colorectal
colorectal
colorectal
colorectal
colorectal
colorectal
colorectal
colorectal
colorectal
lung
lung
lung
pancreaspancreaspancreas (meta)melanomastomach metaliverkidneybladder
prostate
prostate
breastbreastbreastbreastbreastbreastbreastcervixcervixcervix
endometrium
endometrium
ovarianCell line
Type of RAS mutation
HCT 116KRAS(G13D)
HKe3-mtKRAS KRAS(G13D)
DLD-1
KRAS(G13D)
SW 620KRAS(G12V)
SW 837KRAS(G12C)
CCK-81
WT
HCT-15KRAS(G13D)
LoVo
KRAS(G13D)
SW 48
WT
COLO 201WT
COLO 205
WT
LS 180KRAS(G12D)
WiDr
WT
A549
KRAS(G12S)
Calu-6
KRAS(Q61K)
A-427
KRAS (G12D)MIA PaCa2
KRAS(G12C)
Hs 766T
KRAS(Q61H)
Hs 700T
WT
SK-MEL-28
WT
Hs 746T
WT
Hep G2
NRAS(Q61L)
A-498
WT
J82
WT
LNCaP
WT
DU145
WT
MCF-7
WT
BT549
WT
MDA-MB-468 WT
MDA-MB-231 KRAS(G13D)
Hs 578T
KRAS(G13D)
BT-20
WTHCC1937
WTHeLaWTC-33A
WTSiHaWT
HEC-1-B
KRAS(G12D)
AN3 CAKRAS(G12D)
Caov-3
WTother sequence variations (ExSPASy)
ACVR2A, BRCA2, CDKN2A, CTNNB, EP300, PIK3CA, TGFBR2
ACVR2A, APC, B2M, EP300, PIK3CA, TGFBR2, TP53
APC, TP53
APC, FBXW7, TP53FBXW, PIK3CA, TP53
APC, B2M, BRCA2, PIK3CA, TP53
ACVR2A, APC, B2M, SMAD, TGFBR2
ACVR2A, APC, B2M, CTNNB, TGFBR2APC, BRAF , CTNNB1APC, BRAF, CTNNB, TP53
ACVR2A, CTNNB1, PIK3CA, TGFBR2APC, BRAF, PIK3CA, SMAD4, TP53
STK11TP53
CTNNB1
CDKN2A, TP53
SMAD4TP53
BRAF, CDK4, EGFR, PTEN, TERT, TP53
TERTVHLPIK3CA, PTEN, RB, TP53
AR, MEN1, PIK3R, PTEN
CDKN2A, RB, STK1, TP53
CDKN2A, PIK3CA
CLTC-VMP, PTEN, RB, TP53
PTEN, RB, TP53
BRAF, CDKN2A, TERT, TP53
BRAF, CDKN2A, TERT, TP53
CDKN2A, PIK3CA, RB, TP53
BRCA, PTEN, RB, TP53

TP53
MAPK3, PIK3R, PTEN, TP53
TP53

The effect of STAR2positive
positive
positive(high conc)
positive
positive(high conc)
positive
positive(high conc)
Positive
Positive
Positive
Positive
positive
positive
positive(high conc)
positive
positive
positive(high conc)
positive(high conc)
positive
positive
positive
positive
positive
positive(high conc)
positive
positive(high conc)
positive(high conc)
positive(high conc)
positive
positive(high conc)
positive(high conc)
positive
positive
positive
positive
positive
positive(high conc)
positive
positive(high conc)

これまで試した癌細胞株の全てに効果を示す。

6

2.STAR2の効果についてIn vivoでの有効性および毒性マウスにおいても副作用なく抗腫瘍効果示す
方法：ヌードマウス皮下にマトリゲルに懸濁した1.5x106細胞播種し、腫瘍長径が5mmを超えた時点から、STAR2を腹腔内へ一日一回投与

Volume (mm3)3000

結果・GI50 (50%増殖阻害濃度 ）=7.7 mg/kg

control
STAR2 (10mg/kg)
STAR2 (40mg/kg)

2500

STAR2 (80mg/kg)
2000

・80 mg/kgでも毒性無

1500

1000

・4週間投与でも毒性無500＊Gefitinib(イレッサ）のGI50= 12.5 mg/kg (＞ 7.7 mg/kg)

0D0

D1

D2D3

D4

Days of treatment

D5

D6

D7 (Cancer Research, 62, 5749-54,2002)

AMG 510は100mg/kg投与により腫瘍が一旦縮減するが再増殖する。

7

方法：ヌードマウス皮下にマトリゲルに懸濁した1.5x106細胞を播種し、腫瘍長径が5mmを超えた時点から、STAR2を腹腔内へ一日一回投与。Day8に採血

血液学的検査（Day8)
WBC (102/µl)

RBC(104/ul)

HGB(g/dl)

80120010008006004002000206040200cont

151050cont

STAR2(40mg/kg)

STAR2(40mg/kg)

HCT(%)

MCV(fL)

MCH(pG)

60504030201005520501545cont

STAR2(40mg/kg)

cont

STAR2(40mg/kg)

1040535030cont

STAR2(40mg/kg)

MCHC(g/dl)

PLT(104/ul)

402003015020100

1050cont

STAR2(40mg/kg)

contSTAR2(40mg/kg)

00contSTAR2(40mg/kg)

8

3.STAR2が結合する分子の同定

STAR2標的タンパク質の同定
STAR2

磁性ナノビーズ
HCT116細胞溶解液を用いてプルダウン
銀染色

MS解析
競合阻害されるバンドが２本

93.STAR2が結合する分子の同定
ビーズそのものにはタンパク質はほとんど結合しない。

30kD以上の以下のSTAR2ビーズに結合するタンパク質の銀染色におけるSTAR2によって競合阻害を受けるタンパク質の探索
Free
STAR2—

タンパク質の大きさ+Free
STAR2

DMSO 1 mM++—+DMSO 1 mM++STAR2-fixed
STAR2ビーズに結合するタンパク質が大きさ別にバンドとしてプルダウン（回収）される。

(kD)

190
135
100

細胞溶解液を前もって過剰量のSTAR2（Free STAR2)で処理することで、STAR2ビーズに結合するタンパク質量が減少する（競合阻害）

75
58

46

VDAC

32

markerHKe3-wtKRASmarker

HKe3-mtKRAS＊濃度の薄い（７％）ゲルにタンパク質をロードすることにより、大きなサイズのものがみれる。

Competition binding assay. Free STAR2 (1mM) were added to HKe3-wtKRAS cell extracts or HKe3mtKRAS cell extracts. After 1 hr, the extracts were incubated with STAR2-fixed (+) or empty (-)
beads. STAR2-binding proteins were purified and detected by silver staining. Mass spectrometry
analysis identified VDAC1 and VDAC 2 as an STAR2-binding protein.

10

3.STAR2が結合する分子の同定

STAR2はVDACに直接結合する
Free STAR2

Free STAR2DMSO

0.21DMSO

0.21(mM)

銀染色で減少していたバンドをVDAC特異的な抗体を用いたウェスタンブロットで確認した

Immunoblot bypan-VDAC antibody

HKe3-wtKRAS
lysateHKe3-mtKRASlysate

Competition binding assay. The indicated concentrations of free
STAR2 were added to HKe3-wtKRAS cell extracts or HKe3-mtKRAS
cell extracts. After 1 hr, the extracts were incubated with STAR2fixed beads. STAR2-binding proteins were purified and detected byimmunoblotting with an anti-pan VDAC antibody.

11

3.STAR2が結合する分子の同定
30kD以下のSTAR2ビーズに結合するタンパク質の銀染
色における、STAR2によって競合阻害を受けるタンパク質の探索
Free STAR2Free STAR2—タンパク質の大きさ

1DMSO

0.2++ +—1(mM)

DMSO

0.2++ + STAR2-fixed(kD)

ビーズそのものにはタンパク質はほとんど結合しない。

2522KDELR11711marker

HKe3-wtKRAS

HKe3-mtKRAS

Competition binding assay. The indicated concentrations of free STAR2
were added to HKe3-wtKRAS cell extracts or HKe3-mtKRAS cell extracts.
After 1 hr, the extracts were incubated with STAR2-fixed (+) or empty (-)
beads. STAR2-binding proteins were purified and detected by silver
staining. Mass spectrometry analysis identified KDELR1 as an STAR2binding protein.

細胞溶解液を前もって過剰量のSTAR2（Free STAR2)で処理することで、STAR2ビーズに結合するタンパク質量が減少する（競合阻害）＊濃度の濃い（１５％）ゲルにタンパク質をロードすることにより、小さなサイズのものがみれる。

123.STAR2が結合する分子の同定

STAR2はKDELR1に直接結合する
Free STAR2

Free STAR2DMSO

0.21DMSO

0.21(mM)

銀染色で減少していたバンドをKDELR1特異的な抗体を用いたウェスタンブロットで確認した。

Immunoblot byKDELR1 antibody
HKe3-wtKRAS
lysatesHKe3-mtKRAS
lysatesCompetition binding assay. The indicated concentrations offree STAR2 were added to HKe3-wtKRAS cell extracts orHKe3-mtKRAS cell extracts. After 1 hr, the extracts wereincubated with STAR2-fixed beads. STAR2-binding proteins
were purified and detected by immunoblotting with an antiKDELR1 antibody.

13

3.STAR2が結合する分子の同定

STAR2-N派生物とVDACまたはKDELR1との結合確認
競合阻害 0.9mM
STAR2-fixed
input－＋SATR2- STAR2DMSO
STAR2
N1-Bｒ
N1control

Anti VDAC
antibody

Anti KDELR1
antibody

STAR2-N1はVDACとKDELR1に結合する

14

3.STAR2が結合する分子の同定

表１

Mass spectrometry (MS)解析の結果

Results
Sample Name

Protein

gene

MW

Score

PeptideCoverage

Accession

Note*

20kDa

1

ER lumen protein-retaining receptor 1

KDELR1
ERD2.1

24,542881

8P24390

NP_006792.1

30kDa

1

Voltage-dependent anion-selective channelprotein 1

VDAC1
VDAC

30,7733701359P21796

NP_003365.1

2

Voltage-dependent anion-selective channelprotein 2

VDAC2

31,56799519P45880

NP_003366.2

Note* : Accession in Mascot Search Results

15

VDAC１に対する予想される作用

4.VDAC1について
STAR2（★）の結合部位

フラグメント分子軌道(FMO)法によりSTAR2とVDAC1の結合位置を探索し、N末端αヘリックスへの結合が判明

機能ドメインへのアフィニティの改変
STAR2の基本構造が有する４つの炭素を窒素に置換し、STAR2N1～4(炭素-窒素置換体）（★）
を作製

ミトコンドリア外膜

VDAC1(top view)

VDAC1

VDAC1

Side view

Top view

STAR2の作用
アポトーシスの誘導

VDAC1

HK

アポトーシスの阻害
Journal of Cell Science 122,
1906-1916,2009

FMO法によるタンパク質-リガンド複合体の結合エネルギーの計算により、最も結合親和力の高いものを選択
HexokinaseやTubulinなどがVDAC1のN末端に結合

STAR2はアポトーシスを誘導する

官能基置換によりさらなる親和性の向上を試行中
16

5.KDELR1について

KDELR1に対する予想される作用
KDELR1についてFMO法により、STAR2（★）とKDELR1の結合部位探索し、KDEL配列認識部位に結合することが判明

KDELR1

Cytosol

機能ドメインへのアフィニティの改変
STAR2N1～4のうちSTAR2N1はKDELR1に対しても高い結合親和力を有していた

KDELR1(side view)

順行性輸送

KDEL

ER membrane

ER lumen

逆行性輸送
Ｃ末にＫＤＥＬ配列を持つシ
ャペロン分子Endoplasmic Reticulum (ER)KDELR1は逆行性輸送に関与し、タンパク質の品質管理に関与する●KDELR1の阻害はERストレスの誘導とMAP kinase シグナルの阻害をもたらす（
JBC,278, 34525-32,2003)●ERストレスはHIF-1の活性化をもたらす（JBC, 289, 3352-64, 2014)

KDELR1の下流のMAPK-HIF axisを抑制する可能性

STAR2N1（★）
官能基置換によりさらなる親和性の向上を試行中

17

6. STAR2の作用機序
STAR2は浮遊培養にてROSを抑制する。

Signal/noise ratio

HKe3-wtKRAS or HKe3-mtKRAS in 3DF
culture at Day6 with STAR2 (30µM)
ROS Assay Kit -Highly Sensitive DCFH-DA-使用
98765432
10mt DMSO

mt STAR

wt DMSO

wt STAR

STAR2は癌で高いレベルのROSを抑制する。
18

6. STAR2の作用機序

癌とROSの関係

関連論文

19

6. STAR2の作用機序

HIF-1に対するSTAR2の効果

方法：3次元浮遊培養(3DFC)；Day 0にSTAR2投与、 Day6に蛋白回収し、ウェスタンブロット。

HIF-1αSTAR2(30μM）

Control

STAR2(30μM）

ControlSTAR2(30μM）

ControlSTAR2(30μM）

Control

発現高い

HIF-1βActin

Actin
HKe3-wtKRAS

HKe3-mtKRAS

HKe3-wtKRAS

HKe3-mtKRAS

RNA-seqのdata上ではどちらもmRNAの大きな変化は認められない。

20

6. STAR2の作用機序

HIF-1βに対するSTAR2N1の効果

STAR2N1(11μM）

Control

STAR2N1(11μM）

Control

方法：3次元浮遊培養(3DFC)；Day 0にSTAR2N1(11 μM:25%阻害濃度）投与、Day6に蛋白回収し、ウェスタンブロット。

HIF-1βActin
HKe3-wtKRAS

HKe3-mtKRAS

21

6. STAR2の作用機序
ＳＴＡＲ2投与により発現低下するHIF-1標的遺伝子（嫌気性解糖関連分子）

3次元浮遊培養 D6のRNA回収しRNA-seq施行。mRNAの発現をＩＧＶにて表示。
Ｙ軸が発現量を示す。それぞれのピークはエクソンを示す。
HexisoKinase 2MYC

LDHAHK2

GlucoseTransporter
type I
GLUT1

PDK1

mtKRAS

mtKRAS+STAR2

wtKRAS

wtKRAS+STAR2

GeneStructure

ＳＴＡＲ２投与により発現低下（HKe3-mtKRASでのみ。HIF-1の標的）
22

6. STAR2の作用機序

ＳＴＡＲ2投与により発現低下するHIF-1標的遺伝子（嫌気性解糖関連分子）
３次元浮遊培養においてSTAR2(7.5µM)
投与し、培養上清中の乳酸をDay3およびDay6に計測した。

STAR2(30μM）

PDK1
GLUT1**

4
Relative ratio of lactate

Control

STAR2(30μM）

Control

方法：3次元浮遊培養(3DFC)；Day 0にSTAR2投与、Day6に蛋白回収し、ウェスタンブロット。

3.5*

32.52*

1.510.5

Hexokinase 20DMSO STAR2 DMSO STAR2 DMSO STAR2 DMSO STAR2
HKe3-wtKRAS

HKe3-mtKRAS HKe3-wtKRAS

HKe3-mtKRAS

Actin
Day3
HKe3-wtKRAS

HKe3-mtKRAS

Day6* :P<0.05 ** :P<0.0123

6. STAR2の作用機序

HKe3-wtKRAS or HKe3-mtKRAS in 3DF culture at Day6 withSTAR2 (30µM)

Signal/noise ratio

Glucose Uptake Assay Kit -Green使用
1201008060
40200wt DMSO

wt STAR

mt DMSO

mt STAR24

6. STAR2の作用機序
正常と癌細胞の違い

Cancer cell

Normal cell

ゴルジ体
ER

ゴルジ体
小胞体小胞体

癌特異的な腫瘍増殖性小胞体ストレス

KDELR

KDELRVDAC

VDAC
Ca2+

Mitochondria

Mitochondria
癌特異的な腫瘍増殖性
酸化ストレス

低酸素誘導因子（HIF-1）
糖の取り込み25

6. STAR2の作用機序
STAR2の作用点
Cancer cell

Normal cell

ゴルジ体
ER

ゴルジ体
小胞体

小胞体

癌特異的な腫瘍増殖性小胞体ストレス

KDELR

KDELR
VDAC

Ca2+
Mitochondria

VDAC

Mitochondria
癌特異的な腫瘍増殖性
酸化ストレス

癌細胞のみに作用
低酸素誘導因子（HIF-1）
糖の取り込み26

まとめSTAR2の疾患への有用性

HIF-1 ↑
STAR2

ERMAM

老化癌
骨粗鬆症

肥満

動脈硬化症

痴呆
27

新技術の特徴・従来技術との比較• 多くの変異KRAS陽性癌に効果あり、耐性化が出現しにくい。
• 従来の抗癌剤が活性酸素種を誘導することで殺細胞効果を示すので、正常細胞も影響が出るが、STAR2は癌の増殖を刺激する活性酸素種を抑制するため、副作用が少ない。

• 癌特異的な糖代謝を抑制するので、変異に関係なく多くの癌種に適応可能。
• 癌以外にも、活性酸素種に関連する老化や肥満などに効果を示す可能性がある。

28

想定される用途• 全ての癌種に対して効果を示し、副作用が少ないので、濃度を高めて短期間で使用したり、低濃度で長期間の予防的な使用も可能。
• 上記以外に、抗加齢、抗肥満等、血管性疾患予防の効果が得られることも期待される。

29

実用化に向けた課題• 現在、化合物の鏡像異性体を精製し、より作用点への作用が高まるところまで確認済み。
さらなる効果増強のための官能基改変、今後の臨床応用へ向けた体内動態などの検査がまだなされていない。

30

企業への期待• 製剤開発、臨床治験移行までの開発能力が高い製薬企業との共同研究を希望。

31

本技術に関する知的財産権• 発明の名称 ：ピラゾール誘導体及び医薬組成物• 出願番号 ：特願2020-017307• 出願人：学校法人福岡大学 [100%]• 発明者：白澤専二 、角田俊之＊＊＊

福岡大学 医学部 医学科 細胞生物学：大嶋孝志＊ 、矢崎亮＊＊＊＊
九州大学 薬学部 環境調和創薬化学分野：末永正彦＊＊＊
九州大学 理学部 化学科＊：教授、＊＊：准教授、 ＊＊＊ ：講師、＊＊＊＊ ：助教

32

産学連携の経歴• 2020年‐国内薬品会社と新規PDE4阻害剤共同研究開始、今後STAR２に関しても自然免疫への影響を中心に解析(秘密保持契約締結済）• 2020年-

JSTの特許協力条約(PCT)に基づく出願支援事業に採択

33

お問い合わせ先
福岡大学 産学官連携センター
ＴＥＬ 092－871 － 6631
ＦＡＸ 092－866 － 2308
e-mail sanchi＠adm.fukuoka-u.ac.jp34