ナノグラフェンにおける蛍光回復

有機・炭素ナノ材料ユニット 准教授 成田 明光

グラフェンとナノグラフェン
グラフェン

ナノグラフェン

グラフェンナノリボン(GNR)
擬1次元材料

２次元材料

Eg = 0 eV
Eg: エネルギーギャップ(HOMO–LUMOギャップ 又は バンドギャップ)

ナノグラフェン分子/グラフェン量子ドット（GQD）
擬０次元材料

Eg > 0 eV(量子閉じ込め効果)

多環芳香族炭化水素 (PAHs)

2

赤色蛍光性ナノグラフェン「DBOV」の合成

単結晶X線構造解析

DBOV

J. Am. Chem. Soc. 2019, 141, 16439.

DBOV: Dibenzo[hi,st]ovaleneAngew. Chem. Int. Ed., 2017, 56, 6753; 有機合成化学協会誌, 2020, 78, 1094.

3

超解像バイオイメージングに使用可能な水溶性DBOV誘導体の合成
水中での紫外可視吸収・発光スペクトルba

リソソームの時系列超解像イメージング

生細胞イメージング
cd
ConventionaleSMLM

1235 µm

10-150 fs

0-30 s30-60 s60-90 s90-120 s

120-150 s

5 µm

SMLM: Single-Molecule Localization Microscopy

200 nmJ. Am. Chem. Soc. 2024, 146, 5195.
4クリックケミストリーによる標的化のためのアジド基を有する水溶性DBOV誘導体の合成
末端アルキンを有するピューロマイシン誘導体（OPP）を用いたクリック反応で新生タンパク質を標識aribosome

新生タンパク質b

SMLM of neuron in PBS

cd
Marco Terenzio教授(OIST)との共同研究
J. Am. Chem. Soc. 2024, 146, 5195.
SMLM

5

クリックケミストリーによる標的化のためのアジド基を有する水溶性DBOV誘導体の合成
クリック反応を用いた標識による神経細胞内の新生タンパク質の超解像（SMLM）イメージングbb

SMLM of SMLM
neuronin PBSof neuron
in PBScc 従来のイメージングとSMLMの比較
dd
SMLM

SMLM

Conventionale 新生タンパク質分布の可視化とボロノイ図
fConventional

eccg

low
Axonal segment

fhigh
local densityhiBranching pointpuncta

SMLM: Single-Molecule Localization
Microscopy
low
highg

Axonal segment

local density

hJ. Am. Chem. Soc. 2024, 146, 5195.

i6

蛍光色素として高い光安定性
Fluorescence retention (%)

1008060
40200DBOV
Alexa 647
0100200300400

Time [s]褪色防止剤なしの環境でのナノグラフェン(例: DBOV)と有機蛍光色素(例: Alexa 647)の光安定性をイメージ
ング時間の関数として示したもの(532 nm, レーザー強度: 25.59 W/cm2)

DBOV

ナノグラフェンは、通常の有機蛍光材料よりも光安定性が高い
しかし、ナノグラフェンの蛍光も励起レーザー/ビームの影響で次第に減衰する

7新技術：蛍光の回復
ナノグラフェンの蛍光は、失活後に長波長（例: 近赤外域）の光により100％回復される
共焦点顕微鏡像300

3D confocal z-stack

失活前

3D STED z-stack

回復後

ROI 1
ROI 2

100

ROI 1

失活後

Scales: 2 µm

ROI1: Excitation (561 nm) scanned area
ROI2: STED beam (775 nm) scanned area

Confocal: 共焦点顕微鏡
STED: 誘導放出抑制顕微鏡 (Stimulated Emission Depletion Microscopy)
8ナノグラフェンの励起光による蛍光失活 及び近赤外レーザーによる蛍光回復のメカニズム考察

ナノグラフェンDBOV-Mes（蛍光オン状態）の吸収・発光スペクトルとDBOV-Mes•+（失活/蛍光オフ状態）の吸収スペクトル
ナノグラフェン（例：DBOV-Mes）の蛍光失活および回復のメカニズム
ナノグラフェンDBOV-Mesの分子状態（基底状態DBOV-Mes、蛍光励起状態DBOV-Mes*、蛍光失活状態DBOV-Mes•+）を示す
9Pre

D1

Confocal imaging

D2

Post-Confocal

STED imaging

D2…

5 µm
140

D1

PostSTED

Fluorescence retention ratio
F(t)/F0 x 100 [%]800

共焦点顕微鏡 及び STED観察におけるDBOV-Mesの蛍光保持率
Confocal
STED

1008060402000204060 80 100
Frames300

Submitted

10

STEDイメージング中に蛍光回復可能

Fluorescence retention (%)

蛍光回復／再活性化は様々な環境で実現
Post deactivation
Post reactivation

150100500Air

H2OPBS

空気中、H2O中およびPBS緩衝液中で測定した失活後 及び 回復後のDBOV-Mesの蛍光保持率11応用１ 蛍光ミクロスフィア
以下のようなライフサイエンスを中心とした幅広い用途で使用：➢ 血流測定➢ トレース➢ in vivo イメージング➢ イメージング校正➢ フローサイトメーターの校正

12新技術：ナノグラフェンを利用した蛍光ビーズ
31245Intensity [a.u.]

80312456

Mean intensity [a.u.]

DBOV-Mesビーズ (5μm)
561 nmレーザー
共焦点60

蛍光強度の均一性

402006Line 1Line 2Line 3Line 4Line 5Line 602468Distance [mm]8010ROI 1
ROI 2
ROI 3
ROI 4
ROI 5ROI 66040

蛍光スペクトルの均一性

200600650700
Wavelength [nm]75013安定性
保存安定性2D image, z-stack
5日

3D view of z-stack

930日

5日

930日

光安定性
連続スキャン500フレーム (～21分)
最初のフレームに対する500番目のフレームの蛍光保持率

Fluorescence retention (%)

DBOV-Mesビーズ (5μm)
561 nmレーザー
共焦点1209060
3000510ROI

1514

多色ナノグラフェン（紫外～近赤外）

DBOV-Mes

Abs. -DDBP-Mes
Fluo. -DDBP-Mes
Abs. - DBOV-Mes
Fluo. - DBOV-Mes

1.2

Abs. - DBDNC
Fluo. - DBDNC
Abs. - TBDNP
Fluo. - TBDNP

0.9

1.2
0.9

0.6

0.6

0.3

0.3

0.00.0

400

600
800
Wavelength (nm)1000

Normalized PL Intensity (a. u.)

DDBP-Mes

Normalized Absorbance (a. u.)

EX 405, 458, 531/561, 633/642, 750 nm

DBDNC

TBDNP
15

ナノグラフェンによる多色ビーズ（紫外～近赤外）
EX: 8 LEDs: 390, 440, 475, 510, 555, 575, 635, 747 nm, wide field

ナノグラフェンのPSビーズ, 5 µm
16

市販の蛍光ビーズとの比較
市販のTetraSpeck, 0.1 µm

ナノグラフェンPSビーズ, 0.1 µm

市販のビーズと同等の性能

633, 561, 458, 405 レーザー17

蛍光ビーズの輝度の最適化
ナノグラフェン

λabs a[nm]

λema
[nm]

ΦPLa,bExtinction[M-1 cm-1 ]Brightness[M-1 cm-1 ]DDPB-Mes

394, 423

4500.4433000@405

14520

DBOV-Mes

564, 610614, 666

0.7951000@561 nm

40290

DBDNC

374, 580, 635643, 698

0.54

57000@633 nm

30780

TBDNP

402, 442, 805820, 910

0.14

2000@750 nm

280

a トルエン中10-5 Mの濃度で測定; b 絶対PLQY

輝度は調節可能18

新技術の特徴・従来技術との比較

1) アジ化ナトリウム等の安定剤が不要で、通常のバッファ中での使用が可能
2) 低温保管（2～8℃等）が不要で、常温保存可能
3) 市販ビーズは近赤外がない等の制限があるが、本技術では紫外～近赤外に幅広く対応

19

応用２ バイオミメティックリポソーム
Biomimetic liposomes imaging (1): sample preparation

真菌感染症

ワクチン

癌

鎮痛眼疾患

細菌感染症

リポソームの臨床応用
Biomedicines 2023, 11, 435.

20

ナノグラフェン標識リポソームの調製

Egg PC

Cholesterol

DOPE

PC: phosphatidylcholine
DOPE: dioleoylphosphatidylethanolamine

DBOV-Mes

動的光散乱方による平均サイズ: 279 nm

Svenja Morsbach博士, Katharina Landfester教授 (マックス・プランク高分子研究所)との共同研究
21

ナノグラフェン標識リポソームのSTED超解像イメージング
Confocal

STED

Confocal

STED

ConfocalConfocal

STED

STED

スケールバー: 500 nm➢ PBS中でのイメージング（褪色防止剤は不要）➢ サンプルをPBSに15ヶ月間保存しても、ナノグラフェンは依然として非常によく機能
22

応用３ 単一光子エミッター• 量子情報通信を含む量子光技術に必要な単一光子パルスを生成する
量子光源• 従来技術の問題– レーザー光の減衰: 光子数を一定にするのが困難– 半導体量子ドット: 物性が欠陥状態に大きく依存• ナノグラフェンを利用し、真の単一光子エミッターを提供できる可能性（cf. Nat. Commun. 2018, 9, 3470.）• 蛍光回復により安定・長期の単光子発光を実現できる可能性

23

実用化に向けた課題
バイオイメージング用の蛍光プローブとしての実用化には、細胞膜透過や特定の部位をターゲットできる誘導体群のライブラリーを確立する必要あり24

企業への期待• 新たなバイオイメージング用の蛍光プローブや次世代発光デバイスの開発を考えている企業様には本技術が有用と思われる• このような分野に興味がある企業様との共同研究を希望

25

本技術に関する知的財産権
発明の名称：FLUORESCENCE RECOVERY IN NANOGRAPHENE
出願番号 ：EP24165695.8
出 願 人：沖縄科学技術大学院大学学園、マックス・プランク学術振興協会
発 明 者：成田 明光、嘉部 量太、Xiaomin Liu、Qiqi Yang、
Mischa Bonn26

お問い合わせ先

沖縄科学技術大学院大学

技術移転セクション E-mail： tls@oist.jp.

27