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May-2021 / Ver. 3.00

IN VITRO Transcription / Translation SYSTEMPSS 5100
取扱説明書

NUProtein
本書の一部または全部を無断転載することを禁じます。

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本取扱説明書は次の製品ラインナップの使用方法、これを使用するための準備に関わる解説をしています。

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PSS 5100
Transcription/Translation Kit

保存温度

T7 RNA Polymerase Wheat Germ Extract-70°C-20°C 以下

Transcription Buffer
25 mM NTP Mix

Amino Acid Mix
prod.#SB5055V

100 mM DTT

2nd PCR Product100 reaction

TLS 5100

AAMX 005
for Dialysis

Translation Set
Wheat Germ Extract

Amino Acid Mix
prod.#SB5055V

Amino Acid Mix
prod.#SB5055V

5 reaction

100 reaction

無細胞タンパク質合成試薬キットを用いたタンパク質合成は、次の 3 段階から構成されています。

鋳型 DNA

2 段階 PCR
転写

転写鋳型 DNA

転写用試薬→

1. 転写鋳型 DNA の作製

翻訳用試薬

⇒

翻訳

mRNA

→

2. 転写

PSS 5100

タンパク質

10 kDa - 150 kDa

⇒

3. 翻訳
TLS 5100
AAMX005

特長
鋳型となる DNA に、転写/翻訳用に設計された塩基配列を 2 段階 PCR により付加します。
これにより N 末端、C 末端へ自由に、多様なタグの付け替えが可能となっています。
各試薬およびプロトコルの最適化により、PCR からタンパク質発現まで 24 時間以内に実施可能です。

本取扱説明書、Primer List および 1st PCR Primer 設計支援ツールは弊社ホームページからダウンロードできます。

https://nuprotein.jp/knowledge-base/https://nuprotein.jp/blog でメールアドレスをご登録頂くと新しいプロトコル等、ニュースレターとしてご案内いたします。是非 ご登録お願いいたします。
安全上の注意
本製品は研究用試薬です。診断および臨床検査試薬として使用しないでください。また、本製品の使用にあたり実験室での一般注意事項を尊守し、安全に留意してください。関係する実験において、人体に有害な試薬を扱う場合も予想されます。必要に応じて適切な保護具をご使用いただきますようお願いいたします。
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目次2021 年 5 月よりキット内容、プロトコルを大幅に変更しています。主な変更点は次のとおりです。
・ キット構成を 110 μL 翻訳系 50 回から 100 回に変更
・ 転写鋳型の 5'UTR 側を短縮することにより、鋳型設計の簡素化を実現
旧バージョンの鋳型と同等以上の性能です。

・ 転写プロトコルの簡素化
旧シリーズをご使用の方も新しい転写プロトコルを参照して下さい。

1. 転写鋳型 DNA の作製
N 末端タグ鋳型 DNA の構造

page 04
page 04

1st PCR プライマー（N 末端タグ用）の設計要領

page 04

2nd PCR プライマー（N 末端タグ用）の設計要領

page 05

C 末端タグ鋳型 DNA の構造

page 06

1st PCR プライマー（C 末端タグ用）の設計要領

page 06

2nd PCR プライマー（C 末端タグ用）の設計要領

page 07

PCR 反応溶液およびプログラム

page 08

PCR 産物の確認

page 092. 転写

page 10

転写プロトコル

page 10mRNA の確認

page 11

3. 翻訳page 12

翻訳プロトコル

page 12タンパク質の確認

page 13（旧プロトコル）転写鋳型 DNA の作製要領

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1. 転写鋳型 DNA の作製
N 末端タグ鋳型 DNA の構造
N 末端タグ鋳型 DNA の構造および各パートの配列は下のとおりです。
tag sequence は下表からいずれか 1 つを選んでください。または任意の配列を用意してください。
Linker_N は適当なプロテアーゼ認識配列に変更可能です。
Promoter

5' UTR

Coding sequence

3' UTR

ATG

5'
T7 promoter

Stop

tag
sequence
Linker_N

Enhancer3'
Tailsequence

ORF

Sequences / Part
RegionPromoterSite
T7 promoter

DNA Sequence
CCCGCGAAAT TAATACGACT CACTATA

Description

5'UTR

Enhancer

GGGAATTCCC ATCTGCTCCT CCAACTCCAA TCCAATCRNK15FH

Start codon

ATG
GAA CAT CAT CAT CAT CAT CAT GAG
GAC TAC AAG GAT GAC GAT GAC AAGTAT CCT TAT GAC GTG CCT GAC TAT GCC
TGG TCC CAC CCT CAA TTC GAG AAGGAA AAC CTG TAT TTT CAG AGC ( E-N-L-Y-P-Q / S )6 x HisFLAG
HA
strepⅡTEV

tag sequence
Coding Sequence
Linker_N
ORF

3'UTR

(ATG) + NNNNN ・・・ ・・・NNNNN

Stop codon

TAG, TAA, TGA

Tail sequence

AATAAGTGCT CGGGCGGGCC AAAAAAAAAA AAAAAN 末端タグ鋳型 DNA
転写鋳型は 1st PCR, 2nd PCR の 2 段階で作製します。

1st PCR プライマー（N 末端タグ用）の設計要領
下のとおり、遺伝子特異的な配列を 18-35 mer 挿入して、1st PCR プライマーを作製してください。
Reverse primer は stop codon を除く逆相補鎖を挿入してください。
長鎖ターゲットではラップ長 25 mer 程度以上で設計してください。Tm ≧ 63°C
1st_ORF_NF_T

→
10 μM
ATG

5'
T7 promoter
3'

EnhancerStoptagsequence
Linker_N

3'
Tailsequence

ORF

5'
10 μM

←
1st_ORF_NR_T
1st PCR Primer_N
Primer namePrimer sequence 5' to 3'

1st_ORF_NF_T

GAAAACCTGT ATTTTCAGAG C+ ORF(ATG) NNNNNNNNNNNNNNNNNN(N=18-35)

1st_ORF_NR_T

GGCCCGCCCG AGCACTTATT CTA+ ORFRRRRRRRRRRRRRRRRRR(R=18-35)* ORF に ATG ガない、または必要ない場合は ATG を除いてください。
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2nd PCR プライマー（N 末端タグ用）の設計要領挿入するタグが下表にある場合、特に設計する必要はありません。以下のとおりのプライマーを用意します。
3 種類のプライマーが必要になります。
各種プライマー濃度は、下図のとおりに調整してください。

2nd_NCF_U01

→
10 μM

2nd_tag_NF1_T→
100 nM
ATG

5'
T7 promoter
3'

Enhancer

1st PCR Producttagsequence
Linker_N

3'
Tails equence

ORF

Stop
5'
2nd_NCR_U01

←
10 μM

Forward Primer NCF_U00（N/C 共通）
Primer name
2nd_NCF_U01

Forward Primer NF1
Primer namePrimer sequence 5' to 3'

CCCGCGAAAT TAATACGACT CACTATAGGG AATTCCCATC TGCTCCTCCA ACTCCAAT

2nd_His_NF1_T

Primer sequence 5' to 3'
TGCTCCTCCA ACTCCAATCC AATCATGGAA CATCATCATC ATCATCATGA GGAAAACCTG
TATTTTCAG

2nd_FLAG_NF1_T

TGCTCCTCCA ACTCCAATCC AATCATGGAC TACAAGGATG ACGATGACAA GGAAAACCTG
TATTTTCAG

2nd_HA_NF1_T

TGCTCCTCCA ACTCCAATCC AATCATGTAT CCTTATGACG TGCCTGACTA TGCCGAAAAC
CTGTATTTTC AG

2nd_strepⅡ_NF1_T

TGCTCCTCCA ACTCCAATCC AATCATGTGG TCCCACCCTC AATTCGAGAA GGAAAACCTG
TATTTTCAG

2nd_XXX-tag_NF1_T*

TGCTCCTCCA ACTCCAATCC AATCATG NNN---NNN GAAAACCTG TATTTTCAG* 任意のタグを挿入する場合、2nd_XXX-tag_NF1 の NNN---NNN 部分を変更してください。

Reverse Primer NCR_U01（N/C 共通）
Primer name
2nd_NCR_U01

Primer sequence 5' to 3'

TTTTTTTTTT TTTTTGGCCC GCCCGAGCAC

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C 末端タグ鋳型 DNA の構造
C 末端タグ鋳型 DNA の構造および各パートの配列は下のとおりです。
tag sequence は下表からいずれか 1 つを選んでください。または任意の配列を用意してください。
Linker_C は適当なプロテアーゼ認識配列に変更可能です。

Promoter

5' UTR

Coding sequence
ATG

5'
T7 promoter

Enhancer

3' UTR

Stop
3'
tag
Tail
sequence
sequence
Linker_C

ORF

Sequences / Part
RegionPromoterSite
T7 promoter

DNA Sequence
CCCGCGAAAT TAATACGACT CACTATA

Description

5'UTR

Enhancer

GGGAATTCCC ATCTGCTCCT CCAACTCCAA TCCAATCRNK15FH

ORF
Linker_C

Stop codon

GAA AAC CTG TAT TTT CAG AGC ( E-N-L-Y-P-Q / S )GAA CAT CAT CAT CAT CAT CAT GAG
GAC TAC AAG GAT GAC GAT GAC AAGTAT CCT TAT GAC GTG CCT GAC TAT GCC
TGG TCC CAC CCT CAA TTC GAG AAG
TAG, TAA, TGA

Tail sequence

AATAAGTGCT CGGGCGGGCC AAAAAAAAAA AAAAA

Coding Sequence
tag sequence

3'UTR

ATG + NNNNN ・・・ ・・・NNNNN
TEV
6 x HisFLAG
HA
strepⅡC 末端タグ鋳型 DNA
転写鋳型は 1st PCR, 2nd PCR の 2 段階で作製します。

1st PCR プライマー（C 末端タグ用）の設計要領
下のとおり、遺伝子特異的な配列を 18-35 mer 挿入して、1st PCR プライマーを作製してください。
Reverse primer は stop codon を除く逆相補鎖を挿入してください。
長鎖ターゲットではラップ長 25 mer 程度以上で設計してください。Tm ≧ 63°C
1st_ORF_CF_T

→
10 μM
ATG

5'
T7 promoter

Enhancer

Stop
3'
tag
Tail
sequence
sequence
Linker_C
5'
10 μM

ORF

3'

←
1st_ORF_CR_T
1st PCR Primer_C
Primer namePrimer sequence 5' to 3'

1st_ORF_CF_T

CTGCTCCTCC AACTCCAATC CAATC+ ORFATG NNNNNNNNNNNNNNNNNN(N=18-35)

1st_ORF_CR_T

GCTCTGAAAA TACAGGTTTT C+ ORFRRRRRRRRRRRRRRRRRR(R=18-35)
ORF に ATG がない場合、必ず ATG を加えてください。
ORF 部分に Stop Codon を挿入しないでください。
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2nd PCR プライマー（C 末端タグ用）の設計要領挿入するタグが下表にある場合、特に設計する必要はありません。以下のとおりのプライマーを用意します。
3 種類のプライマーが必要になります。
各種プライマー濃度は、下図のとおりに調整してください。

2nd_NCF_U01

→
10 μM
ATG

5'
T7 promoter

En hancer

Linker_C

Stop
3'
tag
Tail
sequence
sequence

ORF
1st PCR Product3'5'
2nd_tag_CR1_T←
100 nM←

10 μM
2nd_NCR_U01

Forward Primer NCF_U00（N/C 共通）
Primer name
2nd_NCF_U01

Reverse Primer CR1
Primer namePrimer sequence 5' to 3'

CCCGCGAAAT TAATACGACT CACTATAGGG AATTCCCATC TGCTCCTCCA ACTCCAAT

2nd_His_CR1_T

Primer sequence 5' to 3'
GGCCCGCCCG AGCACTTATT CTACTCATGA TGATGATGAT GATGTTCGCT CTGAAAATAC
AGGTTTTC

2nd_FLAG_CR1_T

GGCCCGCCCG AGCACTTATT CTACTTGTCA TCGTCATCCT TGTAGTCGCT CTGAAAATAC
AGGTTTTC

2nd_HA_CR1_T

GGCCCGCCCG AGCACTTATT CTAGGCATAG TCAGGCACGT CATAAGGATA GCTCTGAAAATACAGGTTTT C

2nd_strepⅡ_CR1_T

GGCCCGCCCG AGCACTTATT CTACTTCTCG AATTGAGGGT GGGACCAGCT CTGAAAATAC
AGGTTTTC

2nd_XXX-tag_CR1_T*

GGCCCGCCCG AGCACTTATT CTA RRR---RRR GCTCTGAAAA TACAGGTTTT C* 任意のタグを挿入する場合、2nd_XXX-tag_CR1_T の RRR---RRR 部分を変更してください。
RRR---RRR は逆相補鎖を挿入します。

Reverse Primer NCR_U01（N/C 共通）
Primer name
2nd_NCR_U01

Primer sequence 5' to 3'

TTTTTTTTTT TTTTTGGCCC GCCCGAGCAC

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PCR 反応溶液およびプログラム
PCR 酵素キットは、2 ステップ PCR プログラム対応の酵素キットを推奨します。
以下のプロトコルは KOD-Plus-Neo 同等キットに対応しています。
温度上昇/下降速度の遅いサーマルサイクラーでは、正常に増幅が確認できない場合があります。

1st PCR
1st PCR の反応液組成およびプログラムは下表のとおりです。
Plasmid DNA 濃度は 1 ng/μL に調整してください。

1st PCR 反応液

Reagents
10x PCR buffer
2 mM dNTPs
25 mM MgSO4
10 μM 1st_ORF_F
10 μM 1st_ORF_R
Plasmid DNA
PCR DNA Polymerase
Ultra pure water
Total

1st PCR Program

Volume
5 μL
5 μL
3 μL
1 μL
1 μL
1 μL
1 μL
33 μL
50 μL

Seg.
Temp.
Time
1
94°C
2 min
2-1
98°C
10 sec2-2
68°C
30 sec/kb*
320°C* 1 kb 以下のものは、1 min にしてください。

Cycle
1
30
-

2nd PCR
2nd PCR の反応液組成およびプログラムは下表のとおりです。

2nd PCR 反応液 N 末端タグ

Reagents
10x PCR buffer
2 mM dNTPs
25 mM MgSO4
10 μM 2nd_NCF_U01
100 nM 2nd_NF1_T
10 μM 2nd_NCR_U01
1st PCR product
PCR DNA Polymerase
Ultra pure water
Total

2nd PCR 反応液 C 末端タグ

Volume
5 μL
5 μL
3 μL
1 μL
1 μL
1 μL
1 μL
1 μL
32 μL
50 μL

Reagents
10x PCR buffer
2 mM dNTPs
25 mM MgSO4
10 μM 2nd_NCF_U01
100 nM 2nd_CR1_T
10 μM 2nd_NCR_U01
1st PCR product
PCR DNA Polymerase
Ultra pure water
Total

Volume
5 μL
5 μL
3 μL
1 μL
1 μL
1 μL
1 μL
1 μL
32 μL
50 μL

2nd PCR Program ① 通常プログラム

2nd PCR Program ② 増幅に異常がある場合

Seg.
Temp.
Time
Cycle
1
94°C
2 min
1
2-1
98°C
10 sec30
2-268°C
30 sec/kb*
320°C* 1 kb 以下のものは、1 min にしてください。

Seg.
Temp.
Time
Cycle
1
94°C
2 min
1
2-1
98°C
10 sec
2-2
60°C
1 min
5
2-3
68°C
30 sec/kb*
3-1
98°C
10 sec30
3-2
68°C
30 sec/kb*
4
20°C* 1 kb 以下のものは、1 min にしてください。
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PCR 産物の確認〇 アガロースゲル電気泳動による 1st PCR product, 2nd PCR product の確認

1 μL - 2 μL の PCR 産物を確認します。
各サンプル共、DNA の精製は必要ありません。
1st PCR product
完全なシングルバンドであるか確認します。多少の濃淡差は問題ありません。

2nd PCR product
完全なシングルバンドで、はっきりと確認できるものを使用してください。

確認例#1, #2 は種類の違う 鋳型 DNA の 1st PCR 産物。
#3-#8, #9-#14 はそれぞれ #1, #2 の 1st PCR 産物で 2nd PCR を行ったもの。
bp
1500
1000
500
100
#

1

2

3

4

5

6

7

8

2nd PCR product #1

9

10 11 12 13 14
2rd PCR product #2〇 トラブルシューティング

2 ステップサイクル PCR プログラム専用
トラブル

段階
全く何もない増幅産物が少ない

1st
わずかに確認できる

2nd
1st
エキストラバンドが確認される

改善ポイント共通 プライマー、試薬類の確認

2nd伸長反応時間を長くする。*1
サイクル数を増やす。
3 step プログラム ( 2nd PCR Program ② )に変更
3 step プログラムのアニーリング温度を下げる。
プライマーの再設計*2
3 step プログラム ( 2nd PCR Program ② )に変更
3 step プログラムのアニーリング温度を下げる。

＊1

伸長反応時間は 30 sec/kb を推奨していますが、増幅効率の悪い場合は 1 min/kb にしてください。
1 kbp までの DNA に対しては 1 min の伸長反応時間が確実です。

＊2

2 ステップサイクル PCR で、このトラブルが発生した場合のほとんどがプライマーの設計に問題があります。Tm 値が低い場合におこりやすくなります。
Forward/Reverse Primer の Tm 値を近づける設計をしてください。Tm > 60°C
弊社ホームページ上の 1st PCR Primer 設計支援ツールをご利用ください。
https://nuprotein.jp/knowledge-base/ からダウンロード可能です。

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2. 転写
転写プロトコル〇 転写反応溶液の調製

次のとおり、転写反応溶液を 1.5 mL チューブ中で調製して下さい。
2nd PCR Product は未精製物を使用します。

転写反応溶液Reagents
10x Transcription Buffer
25 mM NTP Mix
T7 RNA Polymerase
100 mM DTT
2nd PCR Product
RNase free water
Total

最小反応単位

Volume2.5 μL
1.5 μL
1 μL
1.25 μL
2.5 μL
16.25 μL
25 μL

2nd PCR Product は 10x Transcription Buffer と直接混合しないように注意して下さい。
この転写系から得られる mRNA 量は 2 翻訳に使用します。

〇 転写反応1.

調製した転写反応溶液の容器を軽くタッピングし、溶液の攪拌後、卓上遠心機で軽く遠心する。

2.

溶液の蒸発防止の為、容器の蓋をしっかりとキャップする。

3.

37°C で 3 時間、ブロックヒーター等によりインキュベートする。

〇 mRNA の精製

1.

転写終了後、25 μL 溶液に対し 4 M 酢酸アンモニウムを 10 μL 加えて混合する。

2.

100 μl の 100 % エタノールを加え混合する。

3.

卓上遠心機により軽く遠心した後、-20°C ～ -80°C で 10 分 静置する。

4.

遠心分離する。（15000 G, 15 min, 4°C）

5.

上清を除去後、軽くフラッシュし、再度上清を除去する。

6.

沈殿物が半乾燥状態になるまで放置する。マイクロチューブの蓋をあけておくため、不純物が混入しないように注意する。

7.

80 μL の超純水を加えて mRNA ペレットを溶解する。

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page 11

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mRNA の確認〇 アガロースゲル電気泳動による mRNA の確認

1 μL サンプルの電気泳動で、はっきりとシングルバンドが出ているのを確認します。
エキストラバンドがでているものは正しく PCR ができていない可能性があります。

〇 最適 mRNA 量の調整
最小翻訳溶液量 110 μL に対する最適 mRNA 量は次のとおりです。

25 μL 転写から得られる 80 μL mRNA 溶液のうち 40 μL を使用します。

金属イオン、補酵素等で翻訳液をカスタマイズする場合、次ページの MilliQ 部分を調製してください。

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page 12

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3. 翻訳
翻訳プロトコル〇 通常翻訳

1.

最適 mRNA 量/ 80 μL に調整された mRNA solution を用意する。（前ページ参照）

2.

次のとおり、翻訳反応溶液を 1.5 mL チューブ中で調製する。
翻訳反応溶液最小反応単位

Reagents
Wheat Germ Extract
Amino Acid Mix
MilliQ
mRNA solution
Total

3.

Volume
10 μL
20 μL
40 μL
40 μL
110 μL

16°C で 10 時間 ブロックヒーター等によりインキュベートする。
やむを得ない場合、16 時間まで延長可能です。

〇 透析翻訳
通常翻訳よりも収量を増やしたい場合や、発現しにくいタンパク質に対する方法です。
下図のような装置が必要となります。

1.

5 倍に薄めた Amino Acid Mix (AAMX005) を 2 mL タイタープレートへ分注する。

2.

タイタープレートの蓋をして、透析カップをセットする。

3.

通常翻訳で調整した 110 μL 溶液を透析カップ内へ分注する。

4.

内液と外液の水面を同レベルに微調整する。

5.

16°C で 10 時間 インキュベートする。

透析装置加工例

24 well titer plate

φ 9 - 9.5 mm 孔空け加工

反応層 : 110 μL

基質交換層 : 2 mL

Slide-A-Lyzer™ Mini
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page 13

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タンパク質の確認〇 タンパク質の処理
翻訳溶液中に Wheat Germ Extract 由来の浮遊成分が混入しています。
SDS PAGE へ使用するサンプルとして、特にこれを取り除く必要はありません。
翻訳完了後溶液の長時間 4°C 保存は好ましくありません。
液体窒素凍結等、適切な処理を行い保存してください。

〇 ウエスタンブロットによるタンパク質の検出
確実にタンパク質合成がされているかどうか、ウェスタンブロットでの確認を推奨します。
検出例

VEGF165 C-His

BMP4 128 aa N-His

kDa

kDa

75
63
48

35

35
25
20

C 末端タグのみ発現する

右 : dimer

25
20

シグナルは自動切断

17

17
11

左: monomer

11

FGF2 146 aa N-His
kDa

OGT1
kDa

75

135

1 N-FLAG no-signal
2 N-FLAG Full Length
3 C-FLAG Full Length

100
75

20
17
11

25
未精製で細胞増殖活性あり

1

2

3

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page 14MEMO

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MEMO

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製品・技術に関するお問い合わせsupport@nuprotein.jp（旧プロトコル）転写鋳型 DNA の作製要領

2021年4月までの転写鋳型作製要領です。

N 末端タグ鋳型 DNA の構造
N 末端タグ鋳型 DNA の構造および各パートの配列は下のとおりです。
tag sequence は下表からいずれか 1 つを選んでください。または任意の配列を用意してください。
Linker_N は適当なプロテアーゼ認識配列に変更可能です。
Promoter

5' UTR

T7 promoter

Site
T7 promoter

5'UTR

EnhancerStart codon

tag sequence
Translated Region
Linker_N
ORF

3'UTR

3' UTR

ATG

5'

Sequences / Part
RegionCoding sequence
Stop

tag
sequence
Linker_N

Enhancer3'
Tailsequence

ORF

DNA Sequence
CCCGCGAAAT TAATACGACT CACTATA
GGGCTCACCT ATCTCTCTAC ACAAAACATT TCCCTACATA CAACTTTCAACTTCCTATTATG no-tag の場合は除く

Description

no-tag
6 x HisFLAG
HA
strepⅡCAT CAT CAT CAT CAT CAT
GAC TAC AAG GAT GAC GAT GAC AAGTAT CCT TAT GAC GTG CCT GAC TAT GCC
TGG TCC CAC CCT CAA TTC GAG AAG
CTC CAG CAG GGA GGT ACT ( Leu-Gln-Gln-Gly-Gly-Thr )ATG + NNNNN ・・・ ・・・NNNNN

Stop codon

TAG, TAA, TGA

Tail sequence

AATAAGTGCT CGGGCGGGCC AAAAAAAAAA AAAAAN 末端タグ鋳型 DNA
転写鋳型は 1st PCR, 2nd PCR の 2 段階で作製します。

1st PCR プライマー（N 末端タグ用）の設計要領
下のとおり、遺伝子特異的な配列を挿入して、1st PCR プライマーを作製してください。
Reverse primer は stop codon を除く逆相補鎖 18 mer を挿入します。

1st_ORF_NF

→
10 μM
ATG

5'
T7 promoter
3'

EnhancerStoptagsequence
Linker_N

3'
Tailsequence

ORF

5'
10 μM

←
1st_ORF_NR_01
1st PCR Primer_N
Primer namePrimer sequence 5' to 3'

1st_ORF_NF

CCAGCAGGGAGGTACT+ ORFATG NNNNNNNNNNNNNNNNNN(N=18)

1st_ORF_NR_01

GGCCCGCCCGAGCACTTATTCTA+ORFRRRRRRRRRRRRRRRRRR(R=18)

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製品・技術に関するお問い合わせsupport@nuprotein.jp（旧プロトコル）2nd PCR プライマー（N 末端タグ用）の設計要領挿入するタグが下表にある場合、特に設計する必要はありません。以下のとおりのプライマーを用意します。
3 種類のプライマーが必要になります。
各種プライマー濃度は、下図のとおりに調整してください。

2nd_NF2→
10 μM

2nd_tag_NF1→
100 nM
ATG

5'
T7 promoter
3'

Enhancer

1st PCR Producttagsequence
Linker_N

3'
Tails equence

ORF

Stop
5'
2nd_NCR_U01

←
10 μM

Forward Primer NF2
Primer name
2nd_NF2

Forward Primer NF1
Primer namePrimer sequence 5' to 3'
CCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAG

2nd_no-tag_NF1

Primer sequence 5' to 3'
CGACTCACTATAGGGCTCACCTATCTCTCTACACAAAACATTTCCCTACATACAACTTTCAACTTCCTATTCTCCAGCAGGGAGGTACTATG

2nd_His_NF1

CGACTCACTATAGGGCTCACCTATCTCTCTACACAAAACATTTCCCTACATACAACTTTCAACTTCCTATTATGCATCATCATCATCATCATCTCCAGCAGGGAGGTACTATG

2nd_FLAG_NF1

CGACTCACTATAGGGCTCACCTATCTCTCTACACAAAACATTTCCCTACATACAACTTTCAACTTCCTATTATGGACTACAAGGATGACGATGACAAGCTCCAGCAGGGAGGTACTATG

2nd_HA_NF1

CGACTCACTATAGGGCTCACCTATCTCTCTACACAAAACATTTCCCTACATACAACTTTCAACTTCCTATTATGTATCCTTATGACGTGCCTGACTATGCCCTCCAGCAGGGAGGTACTATG

2nd_strepⅡ_NF1

CGACTCACTATAGGGCTCACCTATCTCTCTACACAAAACATTTCCCTACATACAACTTTCAACTTCCTATTATGTGGTCCCACCCTCAATTCGAGAAGCTCCAGCAGGGAGGTACTATG

2nd_XXX-tag_NF1*

CGACTCACTATAGGGCTCACCTATCTCTCTACACAAAACATTTCCCTACATACAACTTTCAACTTCCTATTATG NNN---NNN CTCCAGCAGGGAGGTACTATG* 任意のタグを挿入する場合、2nd_XXX-tag_NF1 の NNN---NNN 部分を変更してください。

Reverse Primer NCR_U01（N/C 共通）
Primer name
2nd_NCR_U01

Primer sequence 5' to 3'

TTTTTTTTTTTTTTTGGCCCGCCCGAGCAC

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製品・技術に関するお問い合わせsupport@nuprotein.jp（旧プロトコル）C 末端タグ鋳型 DNA の構造
C 末端タグ鋳型 DNA の構造および各パートの配列は下のとおりです。
tag sequence は下表からいずれか 1 つを選んでください。または任意の配列を用意してください。
Linker_C は適当なプロテアーゼ認識配列に変更可能です。

Promoter

5' UTR
ATG

5'
T7 promoter

Sequences / Part
RegionSite
T7 promoter

5'UTR

Enhancer
ORF
Linker_C

Enhancer

3' UTR

Stop
3'
tag
Tail
sequence
sequence
Linker_C

ORF

DNA Sequence
CCCGCGAAAT TAATACGACT CACTATA
GGGCTCACCT ATCTCTCTAC ACAAAACATT TCCCTACATA CAACTTTCAACTTCCTATT

Stop codon
Tail sequence

AATAAGTGCT CGGGCGGGCC AAAAAAAAAA AAAAA

tag sequence

Description

ATG + NNNNN ・・・ ・・・NNNNNGGT CTC CAG CAG GGA GGT ACT ( Gly-Leu-Gln-Gln-Gly-Gly-Thr )CAT CAT CAT CAT CAT CAT
GAC TAC AAG GAT GAC GAT GAC AAGTAT CCT TAT GAC GTG CCT GAC TAT GCC
TGG TCC CAC CCT CAA TTC GAG AAG
TAG, TAA, TGA

Translated Region

3'UTR

Coding sequence

6 x HisFLAG
HA
strepⅡC 末端タグ鋳型 DNA
転写鋳型は 1st PCR, 2nd PCR の 2 段階で作製します。

1st PCR プライマー（C 末端タグ用）の設計要領
下のとおり、遺伝子特異的な配列を挿入して、1st PCR プライマーを作製してください。
Reverse primer は stop codon を除く逆相補鎖 18 mer を挿入します。
1st_ORF_CF

→
10 μM
ATG

5'
T7 promoter

Enhancer

Stop
3'
tag
Tail
sequence
sequence
Linker_C
5'
10 μM

ORF

3'

←
1st_ORF_CR
1st PCR Primer_C
Primer namePrimer sequence 5' to 3'

1st_ORF_CFCACAAAACATTTCCCTACATACAACTTTCAACTTCCTATT+ ORFATG
NNNNNNNNNNNNNNNNNN(N=18)

1st_ORF_CR

AGTACCTCCCTGCTGGAGACC+ ORFRRRRRRRRRRRRRRRRRR(R=18)

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製品・技術に関するお問い合わせsupport@nuprotein.jp（旧プロトコル）2nd PCR プライマー（C 末端タグ用）の設計要領挿入するタグが下表にある場合、特に設計する必要はありません。以下のとおりのプライマーを用意します。
3 種類のプライマーが必要になります。
各種プライマー濃度は、下図のとおりに調整してください。

2nd_CF1

→
10 μM
ATG

5'
T7 promoter

En hancer

Linker_C

Stop

tag
sequence

ORF

3'
Tail
sequence

1st PCR Product3'5'
2nd_tag_CR1_U01←
100 nM←

10 μM
2nd_NCR_U01

Forward Primer CF1
Primer name
2nd_CF1

Primer sequence 5' to 3'
CCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGCTCACCTATCTCTCTACACAAAACATTTCC

Reverse Primer CR1
Primer namePrimer sequence 5' to 3'

2nd_His_CR1_01

GGCCCGCCCGAGCACTTATTCTAATGATGATGATGATGATGAGTACCTCCCTGCTGG

2nd_FLAG_CR1_01

GGCCCGCCCGAGCACTTATTCTACTTGTCATCGTCATCCTTGTAGTCAGTACCTCCCTGCTGG

2nd_HA_CR1_01

GGCCCGCCCGAGCACTTATTCTAGGCATAGTCAGGCACGTCATAAGGATAAGTACCTCCCTGCTGG

2nd_strepⅡ_CR1_01

GGCCCGCCCGAGCACTTATTCTACTTCTCGAATTGAGGGTGGGACCAAGTACCTCCCTGCTGG

2nd_XXX-tag_CR1_01* GGCCCGCCCGAGCACTTATTCTA RRR---RRR AGTACCTCCCTGCTGG* 任意のタグを挿入する場合、2nd_XXX-tag_CR1_01 の RRR---RRR 部分を変更してください。
RRR---RRR は逆相補鎖を挿入します。

Reverse Primer NCR_U01（N/C 共通）
Primer name
2nd_NCR_U01

Primer sequence 5' to 3'

TTTTTTTTTTTTTTTGGCCCGCCCGAGCAC

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製品・技術に関するお問い合わせsupport@nuprotein.jp「KOD®」 ならびに 「KOD-Plus-Neo」 は東洋紡株式会社の登録商標または商標です。
「FLAG®」 は Sigma-Aldrich Co. LLC の登録商標です。
「Slide-A-Lyzer™」 は Thermo Fisher Scientific Inc. の商標です。
その他記載されている会社名・商品名などは、各社の商標および登録商標です。
記載の試薬、製品などには、必ずしも商標表示 ( (R), TM ) を付記しておりません。
本取扱説明書中記載の転写用鋳型 DNA 配列の一部は特許出願済です。

【製造元】
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〒770-0942 徳島市昭和町 3-20-1☎ 088-677-9226

📠 088-677-9227

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