糖の使い分け技術・代謝制御添加剤を駆使した微生物発酵生産

神戸大学

大学院工学研究科 応用化学専攻
准教授 田中 勉
2021年5月28日

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低炭素社会の構築に向けて
第二百三回国会における菅内閣総理大臣所信表明演説（R2.10.26.）

2050年までに温室効果ガスの排出をゼロに

環境省HPより様々な取り組み
・パリ協定に基づく基本戦略
・エネルギー基本計画
・地球温暖化計画など

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バイオテクノロジーによる脱炭素社会への寄与
・再生可能資源であるバイオマスを利用したものづくり（カーボンニュートラルの実現）

CxHy

CO2

化学製品
CO2

オイルリファイナリー
バイオリファイナリー
バイオマス変換技術

燃料
CO2

CxHyOz・バイオリファイナリーの大きな課題
生産速度・収率が低い→既存プロセスと比較して高コスト
3従来技術とその問題点
微生物を用いた有用化合物生産において・遺伝子組換えが必要
・遺伝子組換え後は増殖ばかりで目的生産物の収率と生産性が低い

4

全く新しいコンセプト：

細胞の「外」をエンジニアして細胞「内」の代謝を改変

5

全く新しいコンセプト：

BGL提示により菌体内のPEPが蓄積する

6

全く新しいコンセプト：
BGL提示PEP蓄積技術を多様な化合物へ展開
Ph e ⽣産量& 収率

12L-フ ェ ニルア ラ ニン ⽣産量（ g /L）

収率（ g -Ph e /g -グルコ ース ）0.40

100.3080.20

640.1020.00

00 12 24 36 48 60 72
培養時間（ h ）PEP蓄積によりフェニルアラニン、チロシンおよびムコン酸の生産量も向上！！！
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基礎研究から導かれる新しいメカニズム：

BGLをペリプラズムに局在化させるとシキミ酸経路が強化される
微生物表層にBGLを提示するとグルコースを炭素源としてフェニルアラニンの生産量が上がる
1. グルコースはPTSを介して細胞内にとりこまれてグルコース６リン酸（G6P）となる
2. そのG6Pのごく一部がEIIBCを介してペリプラズムに汲み出される
3. G6PがペリプラズムでBGLと相互作用することにより細胞内の代謝が変化し、PEPが蓄積
4. 蓄積したPEPがシキミ酸経路に流れ、フェニルアラニンの生産量が向上する
PTS（Phosphotransferase system）

代謝

①④
PEP蓄積

③②8

メカニズムの実用化への応用：

G6Pと相互作用するタンパク質でもよいのでは？
G6Pと相互作用可能なタンパク質（G6P-capturing Protein）をペリプラズムに局在化させると同じ現象が起こるのでは？
G6Pと結合力を持つ
代
謝G6Pと親和性を持たない→G6Pをペリプラズムに蓄積できない

G6Pと反応してしまう→G6Pを消費しペリプラズムに蓄積できない9

メカニズムの実用化への応用：

AT

C

C

31

88

2

G6Pと相互作用するタンパク質でもよいv

Control

Nativeprotein(Light)

BD0

GFP

Pgi

Zwf

PhoA

P
GFiPgf
Zwo
Ph

GP1

PP1

ZP1

AP1(Control)

Inactivate
mutant(Dark)iHPg

386A

A
24
S1HwfoA
PhZP2AP2Z

PP2Culture conditions
37℃c ult ure

L5m

M9YP minimal medium+ 20 g/L Glucose+ 10mM pyruvate+ 5g/L
Yeast extract+ 40mg/L Tyrosine+ 40mg/L Tryptophan+ Antibiotics

PreMedium

9A
23

A

Initial OD600 = 0.10220rpm

G6Pと親和性を持つタンパク質（不活性型）を局在化させてもシキミ酸経路が強化されフェニルアラニンの生産量が増加する
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社会実装に向けて：

遺伝子組換えを用いない代謝制御添加剤の開発

11社会実装に向けて：「外」から「中」を変えて社会を変える

12これまでの代謝改変技術：

増殖と物質生産はトレードオフ
野生株

従来のアプローチ

グルコース

グルコース

増殖と物質生産はトレードオフ

目的化合物

菌体増殖

目的化合物

菌体増殖

炭素源は主に微生物の増殖に使われ、菌体増殖が低下するためトータルの目的化合物の生産量は低い

生産量が低くなる13

新しい代謝改変技術：

Parallel Metabolic Pathway Engineering (PMPE)
Parallel Metabolic Pathway Engineering (PMPE)
物質生産と増殖の代謝経路を完全に分離し、それぞれ独立に（Parallelに）制御する
PMPE strain

Advantages

炭素源A

炭素源B

・高収率：炭素源Aはほぼ全て物質生産に使われる・糖の有効利用:

物質生産に適した炭素源からモノを作り、それ以外の炭素源は増殖に使う
グルコース / キシロース
グリセロール / 酢酸

グリセロール / メタノール
・ハンドリング：共培養に比較して培養しやすい
目的化合物

菌体増殖

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新しい代謝改変技術：

PMPEのデザイン
GlucosegalP
GalPPTSPEP

GlucoseptsH, ptsI

Pyruvate

glk

G6P

PPP

GlycolysisedapykA, pykF

E4P

Pyruvate

PEP

MA synthesis Pathway(via Shikimate pathway)

ppsA
pckA
Oxaloacetate
ppc

TCA
CycleMalate

MABiomass

E. coliE. coliE. coli
E. coliE. coli

物質生産と増殖の経路を完全に分離する
15新しい代謝改変技術：

PMPEを用いたムコン酸生産
培養条件の最適化
GX1xMA strain（PMPE株）…GX1 harboringpZE12-x and pSAK-MA

MediumMedium

M9 minimal medium+ 20 g/L Sugar(s)+ 5 g/L
Yeast extract+ 40mg/L Tyrosine+ 40mg/L Tryptophan+ 100mg/L Phenylalanine+ Antibiotics

M9 minimal medium+ 20 g/L Sugar(s)+ 5 g/L
Yeast extract+ 40mg/L Tyrosine+ 40mg/L Tryptophan+ 100mg/L Phenylalanine+ Antibiotics+ CaCO3

Cultural condition
37℃

Titer 4.26 g/L
Yield 0.31 g/g-glucose

10 mL
Initial OD600 = 0.10220rpm

Fujiwara et al., Nature Communications, 202016

新技術の特徴・従来技術との比較• 遺伝子組み換えを用いずに、培地に添加するだけで目的化合物の生産性を向上させる技術を開発• 主要中間体とその経路を強化するため、目的生産物を明らかにしなくても使用可能• 増殖経路と生産経路を完全に分離するため、培養制御が不要
ワンポットでの増殖連動型の物質生産が可能
細胞と目的物質の収率の制御が容易
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想定される用途• 微生物を用いた環境に優しく低炭素なものづくり• 培地に添加することで生産量を向上できる添加剤• バイオマス成分の有効利用（C5糖、C６糖の混合糖）• 廃棄物の効率的な有価物転換（廃グリセロールなど）

18実用化に向けた課題• 現在、とある化合物で添加剤としての効果を確認済み。しかし、毒性や効果の点で改善の余地あり• G6Pキャプチャー効果のある添加剤の探索• 企業から要望のある微生物での適用性確認19

企業への期待• 化合物ライブラリー等を持つ企業との共同研究を希望。
特に、これまでボツになった化合物群に本技術で使えるものがある可能性あり• 実バイオマス処理技術を持つ企業との共同研究を希望。
本技術は実バイオマスでも適用可能なことは予備検討で実証済み• 微生物培養、生産の実績が無い企業でも「添加剤」として自社化合物等の新規分野開拓の可能性• 糖含量の高い廃棄物を持つ企業での廃棄物の有効利用
20本技術に関する知的財産権• 発明の名称 ：グルコース６リン酸を捕捉する物質を用いた芳香族化合物の製造方法• 出願番号 ：特願2020-112989• 出願人：神戸大学/理化学研究所• 発明者：藤原良介、野田修平、田中勉

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本技術に関する知的財産権• 発明の名称 ：糖代謝経路が改変された微生物• 出願番号 ：特願2020- 082823• 出願人：神戸大学/理化学研究所• 発明者：藤原良介、野田修平、田中勉

22産学連携の経歴• 2017年-現在 JST未来社会創造事業に採択• 2020A社と共同研究実施• 2021B社と共同研究実施

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お問い合わせ先
神戸大学
産官学連携本部 産学連携・知財部門
ＴＥＬ ０７８−８０３−５９４５
ＦＡＸ ０７８−８０３−５３８９e-mail：oacis-sodan@office.kobe-u.ac.jp20