プロトコル

ミトコンドリアの鉄イオンを検出したい
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Mito-FerroGreen[M489]I はじめにII キット内容

鉄は、生体内で最も多く存在する遷移金属元素であり、様々な生理活性を示すことが報告されている。近年、タンパク非結合型の鉄イオン ( 自由鉄 ) としての存在が注目されており、その高い反応性は細胞損傷や細胞死にも関与していることが示唆されている。自由鉄は安定な化学種である鉄 (II) イオン及び鉄 (III) イオンとして存在するが、生細胞内において、細胞内還元的環境、水溶性、トランスポーターの存在等を考慮すると鉄 (III) イオンよりも鉄 (II) イオンの挙動を知ることが重要であると考えられている。
Mito-FerroGreen は、FeS クラスターやヘム合成の場として知られるミトコンドリア内の鉄 (II) イオンと選択的に反応し強い蛍光 ( λ ex : 505 nm, λ em : 535 nm) を発する試薬であり、細胞内鉄 (II) イオンのライブセルイメージングに利用することが可能である。
本製品は、岐阜薬科大学薬化学研究室 永澤秀子先生、平山祐先生のご指導の下、製品化している。

Mito-FerroGreen 50 μg×2

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಍ཝ৔
2+FeF
e2+಍ཝཝჍ්ૌ
Ⴭ්ૌ಍ཝჍ්ૌMito-FerroGreenreen঑ॺ॥থॻজ॔

Fluorescence Intensity(1) 溶液調製
5 μmol/l Mito-FerroGreen working solution の調製
Mito-FerroGreen 50 μg を含むマイクロチューブに 53 μl のDMSO を 加 え ピ ペ ッ テ ィ ン グ に よ り 溶 解 し、1 mmol/l
MitoFerro-Green 溶液を調製する。調製した溶液を HBSS で希釈し 5 μmol/l working solution とする。
※ 1 mmol/l Mito-FerroGreen DMSO 溶液及び 5 μmol/l workingsolution は不安定なため、細胞試料に添加する直前に調製し、直ちに染色に使用すること。試薬溶液は分解によりバックグラウンドが上昇するため、余った試薬溶液の保存はできない。尚、DMSO の代わりに Ethanol も使用可能。Ethanol の場合は冷凍で 2 週間の保存安定性を確認している。
※希釈に用いる HBSS は無血清培地に変更可能。

40206) 細胞を蛍光顕微鏡で観察する。

Mito-FerroGreen によるミトコンドリア鉄 (II) の検出80ບ㉳㉳ἼEx (505 nm)⺯ගἼ㛗Em (535 nm)

60※刺激の条件に応じてインキュベート時間を設定すること。

0400500

IV 実験例600

Mito-FerroGreen を用いたミトコンドリアの鉄 (II) の検出
1) μ- スライド 8 ウェル（ibidi 社製）に HeLa 細胞を播種し、37℃、5% CO2 インキュベーター内で一晩培養した。
2) HBSS で 3 回洗浄し、培地成分を取り除いた。
3) 調製した 5 μmol/l Mito-FerroGreen working solution 200 μl

Wavelength (nm)図2Mito-FerroGreen の励起、蛍光スペクトル

908070(535 nm)

III Mito-FerroGreen の操作方法(2) 操作
1) 細胞をディッシュに播種し、37℃、5% CO2 インキュベーター内で培養する。
2) 培地を取り除き、HBSS で 3 回洗浄する。
3) 調製した5 μmol/l Mito-FerroGreen working solution を添加し、37℃、5% CO2 インキュベーター内に 30 分間静置する。
4) 溶液を取り除き、HBSS で 3 回洗浄する。
5) 刺激剤を含む培地を添加し、37℃、5% CO2 インキュベーター内に静置する。

図1

F/F0

製品以外に必要なもの
・Dimethyl sulfoxide (DMSO) または Ethanol
・HBSS
・無血清培地・マイクロピペット

6050403020102+※ Bpy; 2,2'-Bipyridyl※u 2+CFe

図 3 Mito-FerroGreen の金属イオン選択性

py

a 2+C,B

g 2+
Ma+K+

N2+u 2+C3+

Zn2+

Feo 2+

N 2i +FeC

Controln 2+M0を添加し、37℃、5% CO2 インキュベーター内に 30 分間静置した。
4) 溶液を取り除き、10 mmol/l となるように HBSS で調製した
deferoxamine mesylate salt (sigma 社 ) 溶液 を 細胞 に添加し、37℃、5% CO2 インキュベーター内に 30 分間静置した。
5) 溶液を取り除き、HBSS で 3 回洗浄した後、無血清培地に置換した。
6) 10 mmol/l となるように超純水で硫酸アンモニウム鉄 (II) 溶液を調製し、終濃度 100 μmol/l となるように添加し混合した。
7) 37℃、5% CO2 インキュベーター内に 1 時間静置した後、溶液を取り除き、HBSS で 3 回洗浄した。
8) 細胞を共焦点レーザー顕微鏡で観察した（図 4）。

技術的な内容に関するお問い合わせ先：カスタマーサポート Free Fax:0120-021557 Free Dial:0120-489548
在庫や価格(記載容量以外もしくは request)に関するお問い合わせ：マーケティング部 Tel:096-286-1515 Fax:096-286-1525(株)同仁化学研究所

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細 胞
増殖 / 毒性酸
化
ストレス
分 子
生物学
細 胞 内
蛍光プローブ細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用
試
薬
膜タンパク質可 溶 化 剤
ラベル
化 剤
二価性
試 薬イオン
電 極その他
機能性有機材料

プロトコル
細 胞
増殖 / 毒性酸
化
ストレス
分 子
生物学
細 胞 内
蛍光プローブ細胞染色
ミトコンドリア関連試薬
細菌研究用
試
薬
膜タンパク質可 溶 化 剤ラベル化 剤
二価性試 薬イオン電 極その他

ミトコンドリア染色試薬との共染色1) μ- スライド 8 ウェル（ibidi 社製）に HeLa 細胞を播種し、37℃、5% CO2 インキュベーター内で一晩培養した。
2) HBSS で 3 回洗浄し、培地成分を取り除いた。
3) 終濃度 5 μmol/l Mito-FerroGreen 及び 終濃度 200 nmol/l
MitoBright Deep Red (Dojindo, MT08) となるように調製した HBSS 溶液 200 μl を添加し、37℃、5% CO2 インキュベー
ター内に 30 分間静置した。

A4) 溶液を取り除き、HBSS で 3 回洗浄した。
5) 無血清培地 200 μl を添加した後、10 mmol/l となるように超純水で硫酸アンモニウム鉄 (II) 溶液を調製し、終濃度 100μmol/l となるように添加し混合した。
6) 37℃、5% CO2 インキュベーター内に 1 時間静置した後、溶液を取り除き、HBSS で 3 回洗浄した。
7) 細胞を共焦点レーザー顕微鏡で観察した（図 5）。

BC

図 4 Mito-FerroGreen を用いたミトコンドリアの鉄 (II) の検出
A: 未処理の HeLa 細胞

B: 硫酸アンモニウム鉄 (II) 処理のみ

C: 硫酸アンモニウム鉄 (II) 及び Deferoxamine 処理＜フィルター＞
Ex/Em = 488 nm/ 500-550 nm

A

B

C

機能性有機材料

図 5 ミトコンドリア染色試薬との共染色A: Mito-FerroGreen

B: MitoBright Deep Red

C: Merge＜フィルター＞
Mito-FerroGreen (5 μmol/l)
Ex/Em = 488 nm/ 500-550 nm
MitoBright Deep Red (200 nmol/l)
Ex/Em = 640 nm/ 656-700 nm

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