プロトコル

タンパク質の SH 基の数を知りたい
使用製品

解析装置

-SulfoBiotics- Protein Redox State Monitoring Kit[SB11]-SulfoBiotics- Protein Redox State Monitoring Kit Plus [SB12]-SulfoBiotics- PEG-PCMal[SB20]I はじめに-SulfoBiotics- Protein Redox State Monitoring Kit（Code: SB11）
および -SulfoBiotics- Protein Redox State Monitoring Kit Plus

（Code: SB12）は、ゲル電気泳動を用いてタンパク質中の遊離の SH 基数を可視化するためのキットである。キット付属のProtein-SHifter（SB11 付属）および Protein-SHifter Plus（SB12付属）は、マレイミド基を有する高分子ラベル化剤であり、タンパク質のチオール基に特異的に結合する ( 図 1)。ProteinSHifter（あるいは Protein-SHifter Plus）でラベル化したタンパク質をゲル電気泳動に適用すると、タンパク質チオール基 1個当たり分子質量が約 15 kDa 増加したバンドとして分離・検出することが可能である ( 図 2)。
一方、-SulfoBiotics- PEG-PCMal（Code:SB20）が 1 分子結合することで、タンパク質は分子質量約 5 kDa 増加したバンドとして分離検出される。

Protein-SHifter Plus（Code: SB12、SB20 付 属 ）+PEGPCMal は光分解能を有するため、電気泳動のゲルに UV を照射することで、ラベル化したタンパク質から切り離すことができる。そのため、ラベル化していないタンパク質と同様にウエスタンブロットに適用することが可能である（図 1）。
-SulfoBiotics- Protein Redox State Monitoring Kit (Code: SB11)
は精製タンパク質の解析に、-SulfoBiotics- Protein Redox State
Monitoring Kit Plus (Code: SB12) は細胞中の特定タンパク質の解析に、-SulfoBiotics- PEG-PCMal（Code：SB20）は、細胞や動物、植物組織の特定タンパク質の解析に適している。

SHSH

その他

S

藭藭㈫ による
Protein-SHifter
ラベル化

Protein-SHifter Plus
Protein-SHifter Plus藭藭藭薯傟またはPEG-PCMal による
ラベル化

図1

藭藭㈫

機能性有機材料

藭藭㈫

S

SH

S

UV光切断

転写

Protein-SHifter( 上段 ) および Protein-SHifter Plus( 下段 ) の解析原理

図2

細 胞
増殖 / 毒性酸化ストレス分 子生物学
細 胞 内
蛍光プローブ細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用
試
薬
膜タンパク質可 溶 化 剤ラベル化 剤
二価性
試 薬
イオン
電 極

電気泳動によるタンパク質の SH 基数の可視化

技術的な内容に関するお問い合わせ先：カスタマーサポート Free Fax:0120-021557 Free Dial:0120-489548
在庫や価格(記載容量以外もしくは request)に関するお問い合わせ：マーケティング部 Tel:096-286-1515 Fax:096-286-1525(株)同仁化学研究所

28プロトコル
細 胞
増殖 / 毒性酸化ストレス分 子生物学
細 胞 内蛍光プローブ細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用
試薬
膜タンパク質可 溶 化 剤
ラベル
化 剤
二価性
試 薬
イオン
電 極
その他
機能性
有機材料

II キット内容(1) -SulfoBiotics- Protein Redox State Monitoring Kit(Code: SB11)
・Protein-SHifter・Reaction Buffer A・Reaction Buffer B(2) -SulfoBiotics- Protein Redox State Monitoring Kit Plus
(Code: SB12)・Protein-SHifter Plus
・Reaction Buffer A・Reaction Buffer B
・Lysis Buffer
キット以外に必要なもの
・200, 10 μl マイクロピペッター
・電気泳動関連試薬類 [ ゲル、Loading Buffer、タンパク質染色試薬（CBB:Coomassie Brilliant Blue など）
・インキュベーター（37℃）
・PBS（サンプル希釈用）
・マイクロチューブ・10 (w/v) % TCA( トリクロロ酢酸 ) 水溶液
・70 (v/v) % エタノール水溶液
・アセトン
・ウェスタンブロット関連試薬類 [PVDF 膜、転写装置、光切断装置（トランスイルミネーター）など
・遠心装置（サンプル調製用）

4) TE Buffer [50 mmol/l Tris-HCl (pH 7.5)、1 mmol/l EDTA] 100μl を操作 3) のチューブに加えて混合し、7,500 x g で 15 分遠心し、ろ液を除去した。
5) 操作 4 の作業をもう一度繰り返した。
6) TE Buffer 50 μl を操作 5 のチューブに加え、良く混合した。
（0.2 mg/ml GAPDH）
7) Reaction Buffer A 4 μl を Protein-SHifter に加え、良く混合した。
8) 操作 6 の溶液 2 μl を操作 7 のチューブに加え、良く混合した。
9) Reaction Buffer B 4 μl を操作 8 のチューブに加え、良く混合した。
10) 操作 9) のチューブを 37℃、30 分間反応した。
11) 操作 10) で反応する溶液に、Loading Buffer [10 (w/v) %sodium dodecyl sulfate, 50 (v/v) % glycerol, 0.2 mol/l TrisHCl (pH 6.8) , 0.05 (w/v) % bromophenol blue] を 2 μl 加え、良く混合した。
12) 操作 11 で調製する溶液全量を用いて電気泳動を行った。
13) CBB で染色し、マルチイメージャーにより画像を取得した。
分子質量 /kDa

SH基数95-SH x372-SH x2554336
Marker	 1	 2	 III -SulfoBiotics- Protein Redox State Monitoring Kit(Code: SB11) の操作方法

GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,-Lane 1: GAPDH, Lane 2: Labeled GAPDH-15% SDS-polyacrylamidegel

1) Protein-SHifter に Reaction Buffer A を 4 μl 加え、ピペッティングでよく混合する。
2) 操作 1 の溶液にサンプル 2 μl を加え、ピペッティングでよく混合する。

図 3 GAPDH タンパク質の SH 基数の検出※ サンプルのタンパク質濃度は 0.1 〜 1 mg/ml、またはチオール濃度として 100 μmol/l 以下を推奨する。推奨範囲を超える場合には十分なラベル化ができない可能性がある。

GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

V -SulfoBiotics- Protein Redox State Monitoring
Kit Plus (Code: SB12) の操作方法
サンプル調製方法 ( 付着細胞用 )53) 操作 2 の溶液に Reaction Buffer B を 4 μl 加え、ピペッティングでよく混合する。

1) 細胞数として 5 〜 10 x10 cells/well (6-well プレート ) を用意する。

※ Reaction Buffer B を混合することで白濁することがある。
その場合、40-50℃で加温溶解すること。
※ 溶液が泡立った場合は、7,000×g、1〜2 分間遠心して消泡すること。

※ サンプルのタンパク質濃度は 0.1 〜 1 mg/ml、またはチオール濃度
として 100 μmol/l 以下を推奨する。推奨範囲を超える場合には十4) 37℃、30 分間反応する。
※ラベル化したサンプルはすぐに電気泳動実験に使用する。

5) 操作 4 のサンプルを電気泳動に使用する。
6) ゲルをタンパク質染色試薬で染色し、タンパク質を検出する。

IV 実験例GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)
タンパク質中の SH 基数の検出
1) 1 mg/ml GAPDH (36 kDa、SH 基数 3)( PBS 溶液 )10 μlを1.5ml マイクロチューブに入れ、100 mmol/l DTT (Dithiothreitol)水溶液を 1 μl 加え、良く混合した。
2) 操作 1 のチューブを 37 ℃、10 分間インキュベートした。
3) 操作 2 の溶液全量を 10 K フィルトレーションチューブに移し、7,500 x g で 15 分間遠心した。

29分なラベル化ができない可能性がある。

2) 培地を吸引除去し、冷却した PBS 500 μl/well で 2 回洗浄する。
3) 冷却した 10 % TCA 水溶液 を 500 μl/well 加え、プレートを氷浴上で 30 分間静置する。
4) スクレーパーで細胞を剥がし、チューブに回収する。
5) 1,000 x g、3 分間遠心し、上清を除去する。
6) 冷却したアセトン 500 μl/tube を加え、再度 1,000 x g、3 分間遠心し、上清を除去する。（2 回行う。）
7) 冷却した 70% EtOH 水溶液を 500 μl/tube 加え、再度 1,000 x g、3 分間遠心し、上清を除去する。
8) Lysis Buffer 100 μl/tube を加え、超音波照射により細胞ペレットを溶解する。
※ 細胞溶解に用いる Lysis Buffer は実験系に応じてプロテアーゼインヒビターを加えること。
※ 溶解後のサンプルはすぐに Protein-SHifter Plus によるラベル化反応に使用すること。

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プロトコル

サンプル調製方法 ( 浮遊細胞用 )51) 細胞数として 5 〜 10 x10 cells/tube を用意する。
※ サンプルのタンパク質濃度は 0.1 〜 1 mg/ml、またはチオール濃度として 100 μmol/l 以下を推奨します。推奨範囲を超える場合には十分なラベル化ができない可能性がある。

2) 1,000 x g、3 分間遠心し、上清を除去する。
3) 冷却した 500 μl PBS を加え、ピペッティングで撹拌後 1,000 x g、3 分間遠心し、上清を除去する。
4) 冷却した 10% TCA 水溶液を 500 μl 加え、ピペッティングで撹拌後、チューブを氷浴上で 30 分間静置する。
5) 1,000 x g、3 分間遠心し、上清を除去する。
6) 冷却したアセトン 500 μl を加え、再度 1,000 x g、3 分間遠心し、上清を除去する。（この操作を 2 回行う。）
7) 冷却した 70% EtOH 水溶液を 500 μl/tube 加え、再度 1,000 x g、3 分間遠心し、上清を除去する。
8) Lysis Buffer 100 μl/tube を加え、超音波により細胞ペレットを溶解する。
※細胞溶解に用いる Lysis Buffer は実験系に応じてプロテアーゼインヒビターを加えること。
※溶解後のサンプルはすぐに Protein-SHifter Plus によるラベル化反応に使用すること。

9) 冷却する 70 % EtOH 水溶液を 500 μl/tube 加え、再度 1,000×g、3 分間遠心し、上清を除去した。
10) Lysis Buffer (1% プロテアーゼインヒビター含 )100 μl を加え、超音波により細胞ペレットを溶解した。
11) Protein-SHifter Plus に Reaction Buffer A を 4 μl 加えた。
12) 操作 10 の溶液 2 μl を Protein-SHifter Plus に加えた。
13) Reaction Buffer B を 4 μl を Protein-SHifter Plus に加え、ピペッティングでよく混合した。
14) 37 ℃、30 分間反応させた。
15) Loading Buffer (10 (w/v) % sodium dodecyl sulfate (SDS) ,50 (v/v) % glycerol, 0.2 mol/l Tris-HCl (pH 6.8) , 0.05 (w/v)% bromophenol blue) 2 μl を Protein-SHifter Plus に加え、ピペッティングでよく混合した。
16) 操作 14 の溶液を SDS- ポリアクリルアミドゲル（15%）に使用し、電気泳動を行った。
17) 電気泳動後のゲルを、トランスイルミネーターで 10 分間UV 照射した。
18) ゲル中のタンパク質を PVDF 膜に転写した。
SH基数-SH x3-SH x2

ラベル化方法
1) Protein-SHifter Plus に Reaction Buffer A を 4 μl 加え、ピペッティングでよく混合する。
2) 上記で調製したサンプル 2 μl を加え、ピペッティングでよく混合する。
3) Reaction Buffer B を 4 μ 加え、ピペッティングでよく混合する。
※ Reaction Buffer B を混合することで白濁する場合がある。その場合、40 〜 50℃で加温溶解すること。
※溶液が泡立った場合は、7,000 × g, 1 〜 2 分間遠心にかけて消泡すること。

4) 37℃、30 分間反応させる。
※ラベル化したサンプルはすぐに電気泳動実験に使用すること。

5) 操作 4 のサンプルを電気泳動に使用する。
6) ゲルをトランスイルミネーターで 10 分間 UV (302 nm) 光を照射する。
※ゲルが乾燥しないように、ガラスに挟んだ状態で操作を行うこと。

7) 操作 6 のゲルを PVDF 膜に転写する。
8) ウェスタンブロット実験を行い、タンパク質を検出する。

VI 実験例HeLa 細胞中 GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)の酸化剤に対する応答
51) HeLa 細胞を 6-well プレートに 5 x 10 cell/well 播種し、37℃、5% CO2 インキュベーターで一晩培養した。
2) 培地を吸引除去し、PBS（37 ℃）500 μl/well を加え洗浄し、吸引除去した。
3) 1 mmol/l Diamide [1,1-Azobis(N,N-dimethylform amide)] ま
たは H2O2 を 500 μl/well 添加し、37℃で 10 分間静置する。
4) 溶液を吸引除去し、冷却する 10% TCA 水溶液を 500 μl/well加え、プレートを氷浴上で 30 分間静置した。
5) スクレーパーで細胞を剥がし、1.5 ml マイクロチューブに回収した。
6) 1,000 x g、3 分間遠心し、上清を除去した。
7) 冷却したアセトンを 500 μl/tube 加え、1,000 x g、3 分間遠心し、上清を除去した。
8) 操作 7 をもう一度繰り返した。

-SH x1-SH x0

1

図42

1.
2.
3.

未処理、ラベル化
Diamide 酸化、ラベル化
H2O2酸化、ラベル化

3

HeLa 細胞中の GAPDH タンパク質の SH 状態の可視化
一次抗体：ウサギ抗 GAPDH 抗体
二次抗体：ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ抗体
検出方法：化学発光法

その他
機能性
有機材料

VII -SulfoBiotics- PEG-PCMal（Code：SB20）の実験方法
シロイヌナズナの葉に含まれる光応答性タンパク質(ATP 合成酵素 γ サブユニット ) のレドックス状態の解析
1) シロイヌナズナの葉を凍結粉砕するために、乳鉢と乳棒を液体窒素であらかじめ冷却した。
2) 切り離したシロイヌナズナの葉 1 枚 ( 約 50 mg) を、暗所もしくは光環境下に 5 分おき、その環境下で液体窒素で凍結させ、乳鉢にて粉砕した。
3) 粉砕した葉 ( 各サンプル ) に、4 mmol/l PEG-PCMal 溶液
180μl を加え ( 瞬時に凍る )、乳鉢でさらに粉砕した。
※ 4 mmol/l PEG-PCMal 溶液は、PEG-PCMal(1 mg/tube)2 本に、SDS sample buffer【62.5 mmol/l Tris-HCl(pH7.5), 2% SDS, 7.5%
glycerol, 0.01% bromophenol blue】(90 μl/tube) を加えて調製した。

4)1.5 ml マイクロチューブに粉砕物を回収し、遮光下、室温で1 時間静置した。
5) 95℃で 5 分間ボイルした後、15,000 rpm で 10 分間遠心した。
6) 上清をタンパク質サンプルとし、電気泳動に使用した。
7) 電 気 泳 動 後 の ゲ ル を ト ラ ン ス イ ル ミ ネ ー タ ー で 10 分 間UV(302 nm) 照射した。
8) ゲル中のタンパク質を PVDF 膜に転写し、抗体を用いてATP 合成酵素 γ サブユニットを検出した。

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細 胞
増殖 / 毒性酸
化
ストレス
分 子
生物学
細 胞 内蛍光プローブ
細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用
試
薬
膜タンパク質可 溶 化 剤
ラベル
化 剤
二価性
試 薬
イオン
電 極30

プロトコル

その他
機能性
有機材料

D

belfr
ar eekLight

参考文献
Le

細 胞
増殖 / 毒性酸
化
ストレス
分 子
生物学
細 胞 内蛍光プローブ
細胞染色ミトコンドリア関連試薬
細菌研究用
試薬
膜タンパク質可 溶 化 剤ラベル化 剤
二価性
試 薬
イオン
電 極(kDa)150 －100 －75 ーSH 基数

50 －37 －ー

R（-SH×3）

ーO（-SH×1）
R : 還元型、O : 酸化型

25 ー

図 5 シロイヌナズナ中の光応答性タンパク質のレドックス状態の可視化
技術指導

東京工業大学科学技術創成研究院
化学生命科学研究所 久堀徹教授
東京工業大学科学技術創成研究院
化学生命科学研究所 吉田啓亮助教
東京工業大学
生命理工学院

原怜助教

VIII 実験方法 HeLa 細胞中 TRX(Thioredoxin) のレドックス状態の解析
51) HeLa 細胞を 96-well プレートに 1x10 cell/well 播種し、37℃、5% CO2 インキュベーターで一晩培養した。
2) 培地を吸引除去し、PBS (37℃ ) 500 μl を加え洗浄し、吸引除去した。
3) PEG-PCMal 1 mg を含むチューブに Lysis buffer 360μl を加え、ピペッティングにより溶解した (1 mmol/I PEG-PCMal)。
4) 1 mmol/I PEG-PCMal 溶液 10 μl を操作 2 の well に加え、ピペッティングでよく混合し、細胞を溶解した。
5) 操作 4 の溶液 10 μl を 1.5ml マイクロチューブに入れ、37℃で 30 分間静置した。
6) 操作 5 のサンプル溶液に Loading buffer 2 μl を加え、よく混合した。
7) 操作 6 の溶液を SDS- ポリアクリルアミドゲル (15%) 電気泳動に使用した。
8) 電気泳動後のゲルをトランスイルミネーターで 10 分間 UV(302 nm) 照射した。
9) ゲル中のタンパク質を PVDF 膜に転写し、抗体を用いてTRX を検出した。

1) T. Ida, T. Sawa, H. Ihara. Y. Tsuchiya, Y. Watanabe,
Y. Kumagai, M. Suematsu, H. Motohashi, S. Fujii, T,Matsunaga, M. Yamamoto, K. Ono, N. O. Devarie-Baez,
M. Xian, J. M Fukuto and T. Akaike, “Reactive cysteine������
and S-polythiolation regulate oxidative stress andredox signaling”, Proc Natl Acad Sci U S A., 2014, 111, 7606.
2) Y. Kimura, Y. Mikami, K. Osumi, M. Tsugane, J. Oka andH. Kimura, �������
are possible H2S-derived signaling
molecules in rat brain”, FASEB J., 2013, 27, 2451.
3) S. Koike, Y. Ogasawara, N. Shibuya, H. Kimura and K. Ishii,“Polysulfide exerts a protective effect against cytotoxicity
caused by t-butylhydroperoxide through Nrf2 signaling inneuroblastoma cells”, FEBS Lett., 2013, 587, 3548
4) W. Chen, C. Liu, B. Peng, Y. Zhao, A. Pacheco and M.
Xian, “New fluorescent probe for sulfane sulfurs and theapplication in bioimaging”, Chem. Sci., 2013, 4, 2892.
5) E. Marutani, M. Sakaguchi, sW. Chen, K. Sasakura, J. Liu, M.
Xian, K. Hanaoka, T. Nagano and F. Ichinose, “Cytoprotective
effects of hydrogen sulfide-releasing N-methyl-D-aspartate
receptor antagonists mediated by intracellular sulfane sulfur”,
Med. Chem. Commun., 2014, 5, 1577.
6) M. Sakaguchi, E. Marutani, H-S. Shin, W. Chen, K. Hanaoka,
M. Xian and F.Ichinose, “Sodium Thiosulfate Attenuates
Acute Lung Injury in Mice”, Anesthesiology. 2014,121, 1248.
7) Satoshi Hara, Tatsuya Nojima, Kohji Seio, Masasuke
Yoshida and Toru Hisabori, “DNA-maleimide: An improved
maleimide compound for electrophoresis-based titration ofreactive thiols in a ����protein”, Biochim. Biophys. Acta,2013, 1830.4. 3077.
8) Satoshi Hara, Yuki Tatenaka, Yuya Ohuchi and Toru
Hisabori, “Direct determination of the redox status ofcysteine residues in proteins in vivo”, Biochem. Biophys.
Res. Commun., 2015, 456.1. 339.

SH 基数
-SH×5

一次抗体：ウサギ抗 TRX 抗体
二次抗体：ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ抗体
検出方法：化学発光法

Lane1. TRX
Lane2. TRX, ラベル化

図 6 Hela 細胞の TRX のレドックス状態の可視化

31

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