プロトコル

蛍光色素を標識したい
利用製品< 少量抗体 (10μ g) 標識用 >- アミノ基標識用 ※Ab-10 Rapid Fluorescein Labeling Kit
TM※
Ab-10 Rapid HiLyte Fluor 555 Labeling Kit
TM※
Ab-10 Rapid HiLyte Fluor 647 Labeling Kit※
Ab-10 Rapid R-Phycoerythrin Labeling Kit< 抗体・タンパク質 (50-200μ g) 標識用 >- アミノ基標識用 Fluorescein Labeling Kit- NH2
TM
HiLyte Fluor 555/647/750 Labeling Kit - NH2

ICG Labeling Kit- NH2[LK32][LK35][LK36][LK34]

R-Phycoerythrin Labeling Kit - NH2
Allophycocyanin Labeling Kit- NH2- SH 基標識用 R-Phycoerythrin Labeling Kit - SH
Allophycocyanin Labeling Kit - SH

[LK31][LK23][LK21][LK26][LK24]

解析装置[LK01][LK14/15/16]※ 本製品の標識操作により、抗体中のアミノ基に標識体が結合します。そのため抗体によっては抗原認識能が失われる場合があります。
ご不明な点は小社カスタマーサポート (Tel:0120-489548) へお問合せ下さい

I はじめに

蛍光タンパク質

蛍光法は比色法に比べると、1) 検出感度が高い、2) 広いダ
イナミックレンジでの定量が可能、であることから、生化学の領域で普及している。中でも蛍光標識抗体を用い特異的に染色した部位の顕微鏡観察や、フローサイトメトリーによる細胞の情報解析等に汎用されるようになっている。標識に用いられる蛍光色素は、FITC、Sulforhodamine 101 acid chloride、Cy dyeおよび Alexa Fluor のような化学合成物質と、phycoerythrin(PE) や allophycocyanin (APC) のような蛍光タンパクに大別される。前者は化学合成品でありかつ低分子化合物であることから、比較的安価に入手できかつ標識後の精製が簡単である。一方後者は、蛍光強度が化学合成物質より数十倍高いため、抗原量の少ない場合の定量が可能である。いずれの場合も、蛍光標識基が過剰に標的化合物に導入されると蛍光消光 ( クエンチング ) が起こるため、標識条件の最適化が必要である。
小社では、試薬を混ぜるだけで 30 分以内に標識体を得るこ
TMとのできる Ab-10 Rapid Fluorescein, HiLyte Fluor 555/647,

R-Phycoerythrin

R-Phycoerythrin Labeling Kit 及び、前処理－反応までを一つのフィルトレーションチューブ上で行い、3 時間以内に目的の標識体を得ることができる Fluorescein Labeling Kit TMTMNH2、HiLyte Fluor 555 Labeling Kit - NH2、HiLyte FluorTM647Labeling Kit - NH2、HiLyte Fluor 750 Labeling Kit - NH2、ICG Labeling Kit-NH2、Phycoerythrin Labeling Kits およびAllophycocyanin Labeling Kits を製品化している。これらのキットを使用した蛍光色素標識体の作製法について紹介する。

蛍光色素Fluorescein
10 μg ᢠయ-NH2

Ab-10 Rapid FluoresceinLabeling Kit

50-200 μg ᢠయ䞉䝍䞁䝟䜽㉁-NH2Fluorescein Labeling Kit -NH2

10 μg ᢠయ-NH2

Ab-10 Rapid HiLyte FluorTM
555 / 647 Labeling Kit

50-200 μg ᢠయ䞉䝍䞁䝟䜽㉁-NH2HiLyte FluorTM 555 / 647 / 750
Labeling Kit -NH2

HiLyte FluorICG
50-200 μg ᢠయ䞉䝍䞁䝟䜽㉁10 μg ᢠయ50-200 μg ᢠయ䞉䝍䞁䝟䜽㉁-NH2 Ab-10 Rapid R-Phycoerythrin
Labeling Kit-NH2 R-Phycoerythrin Labeling Kit -NH2-SHR-Phycoerythrin Labeling Kit -SH

Allophycocyanin

50-200 μg ᢠయ䞉䝍䞁䝟䜽㉁-NH2 Allophycocyanin Labeling Kit -NH2-SH

Allophycocyanin Labeling Kit -SH
TMII Ab-10 Rapid Fluorescein, HiLyte Fluor555/647, R-Phycoerythrin Labeling Kit によるアミノ基への蛍光色素および蛍光タンパク質標識(Code: LK32/34/35/36)
1. キット内容
・Reactive reagent
・Reaction Buﬀer
・Stop Solution

2. キット以外に必要なもの
・ 20 μ l,200 μ l マイクロピペッタ－ 、マイクロチューブ（サンプル及び Working buﬀer 調製用）インキュベーター（37℃）
3. 操作
1) 抗体量が 10 μ g に相当する量の 0.5 ～ 1 mg/ml に調製した抗体溶液をマイクロチューブに入れる。
2) 操作 1 の抗体溶液に Reaction Buffer を加え、ピペッティングにより混合する。
3) 操作 2 の溶液を Reactive reagent に加え、ピペッティングにより混合する。
4) 37℃で 10 分間反応する。
5) 操作 4 の溶液に Stop Solution を加え、ピペッティングにより混合する。
6) 室温で 10 分間反応する。
7) 操作 6 の標識抗体を実験に用いる。または、冷蔵で保存する。
※ 抗体溶液に含まれる添加剤は、その濃度が高い場合に標識反応を妨害することがあります。詳細は取扱い説明書参照。
※ 本製品の標識操作により、抗体中のアミノ基に標識体が結合しま-NH2

ICG Labeling Kit -NH2す。そのため抗体によっては抗原認識能が失われる場合があります。
ご不明な点は小社カスタマーサポート (Tel:0120-489548) へお問合せ下さい

技術的な内容に関するお問い合わせ先：カスタマーサポート Free Fax:0120-021557 Free Dial:0120-489548
在庫や価格(記載容量以外もしくは request)に関するお問い合わせ：マーケティング部 Tel:096-286-1515 Fax:096-286-1525(株)同仁化学研究所
127

HiLyte FluorTM
beling Kit

TM 555 / 647 / 750-NH25) 操作 4 の溶液に Stop Solution を加え、ピペッティングにより混合する。

プロトコル

6) 室温で 10 分間反応する。
7) 操作 6 の標識抗体を実験に用いる。または、冷蔵で保存する。
※ 抗体溶液に含まれる添加剤は、その濃度が高い場合に標識反応を妨害することがあります。詳細は取扱い説明書参照
Antibody +Reaction Buffer

Stop Solution

標識抗体を実験に使用

g Kit -NH210 分10 分

図 1 蛍光タンパク質標識の操作
図 1 蛍光色素、タンパク質標識の操作

タマーサポート Free Fax:0120-021557 Free Dial:0120-489548
関するお問い合わせ：マーケティング部 Tel:096-286-1515 Fax:096-286-1525
4. 蛍光色素標識抗体での検出例(株)同仁化学研究所

126< アクチン及びミトコンドリアの免疫染色 1>Ab-10 Rapid Fluorescein Labeling Kit
TM
Ab-10 Rapid HiLyte Fluor 555 Labeling Kit1) μ - スライド 8 ウェル（ibidi 社製）に HeLa 細胞を播種し、37℃、5%CO2 インキュベーター内で一晩培養した。
2) 培地を取り除き、PBS で 3 回洗浄後、冷メタノール ( 脱水 ,100%) を添加し、直ちに冷凍した。
3) -30℃で 15 分間静置した。
4) 上清を取り除き、PBS で 3 回洗浄後、PBS で調製したブロッキング溶液を添加した。
5) 4℃で 1 時間静置した。
6) Fluorescein 標識 - 抗ミトコンドリア抗体をブロッキング溶
TM液で 100 倍希釈及び HiLyte Fluor 555 標識 - 抗アクチン抗体をブロッキング溶液で 500 倍希釈し、1:1 で混合した。
7) 上清を取り除き 6 の溶液を添加した。
8) 4℃で一晩静置した。
9) 上清を取り除き、PBS-T で 3 回洗浄後、2 μ g/ml となるように DAPI 溶液を添加し、室温で遮光下 1 時間静置した。
10) 上清を取り除き、PBS-T で 3 回洗浄後、PBS-T を添加した。
11) 染色細胞を顕微鏡で観察した。

細胞：HeLa 細胞
ミトコンドリア（緑）：Fluorescein 標識抗体
アクチン（黄）：TMHiLyte Fluor 555 標識抗体
核（青）：DAPI< フローサイトメトリー測定例 >51) HL60 細胞の細胞懸濁液を 5.0 × 10 cells/tube となるようにマイクロチューブに分注した。
2) 1,000 × g で 2 分間、遠心分離を行い、上清を取り除いた。
3) Suspension buffer [1% FBS ( ウ シ 胎 児 血 清 ) , Hanks’
HEPES balanced buﬀer] を 50 μ l 添加した。
4) 本キットで標識した Fluoresceine 標識抗 CD44 抗体 若しくは R-Phycoerythrin 標識抗 CD13 抗体を 1 μ g ( 抗体量として )添加し、ボルテックスにより再懸濁した。
5) 氷上で 30 分間静置した。
6) 1,000 × g で 2 分間、遠心分離を行い、上清を取り除いた。
7) Suspension Buﬀer を 0.5 ml 添加した。
8) ボルテックスにより再懸濁し、フローサイトメーターにより蛍光強度を測定した。
200Number of Cells

Labeling Kit -NH2により混合する。
4) 37℃で 10 分間反応する。

ࢥࣥࢺ࣮ࣟࣝ150100< アクチン及びミトコンドリアの免疫染色 2>
TMAb-10 Rapid HiLyte Fluor 555 Labeling Kit
TMAb-10 Rapid HiLyte Fluor 647 Labeling Kit
アクチン及びミトコンドリアの免疫染色 1 に従って操作する。

細胞：HeLa 細胞
ミトコンドリア（赤）：TM
HiLyte Fluor 647 標識抗体
アクチン ( 黄 )：TM
HiLyte Fluor 555 標識抗体
核（青）：DAPI

図 2 HeLa 細胞のアクチン及びミトコンドリアの免疫染色画像 2＜フィルター＞
Ex : 488 nm
Em: 515-545 nm

0102103
104
Fluorescent Intensity

105

250200ࢥࣥࢺ࣮ࣟࣝ

R-Phycoerythrinᶆ㆑ᢠయ

150100＜フィルター＞
Ex : 488 nm
Em: 564-606 nm

500

図 2 HeLa 細胞のアクチン及びミトコンドリアの免疫染色画像 1Fluoresceinᶆ㆑ᢠయ50

Number of Cells

Fluorescein

102103104105
Fluorescent Intensity

図 3 Fluoresceine 標識抗体 および R-Phycoerythrin 標識抗体を用いた HL60 細胞の蛍光染色

FAQ
Q : 抗体溶液中に含まれる添加剤は標識反応に影響しますか ?
A : 抗体溶液中の添加剤によっては影響を受ける場合がございますので、ご使用前に必ず取り扱い説明書中の注意事項をご確認ください。
Q : 使用可能な抗体のクラスには、どのようなものがありますか ?
A : 本製品は IgG 抗体へ標識するよう最適化しています。IgG以外のクラス（IgM や IgA 等）では標識実績はございません。
最新の測定データやアプリケーション、論文情報を小社 HP にて掲載。ご興味のある方は、小社 HP にて最新情報をご確認下さい。
Ab-10 同仁

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128

プロトコルIII Fluorescein Labeling Kit - NH2、HiLyte FluorTM
Labeling Kit - NH2(555, 647, 750) によるアミノ基への標識 (Code: LK01, LK14, LK15, LK16 )1. キット内容
・NH2-Reactive Fluorescent Dye
・WS Buﬀer
・Reaction Buﬀer
・Filtration Tubeb)

28,000 x g で 10 分間遠心する 。

3

NH2-Reactive Fluorescent Dye に
10 μ l の DMSO を加え、ピペッc)
ティングにより溶解する 。

4

Reaction Buffer 100 μl を加えた後、NH2-Reactive Fluorescentd)
Dye を含む DMSO 溶液 8 μl をFiltration Tube のメンブレン上に加える。

5ピペッティングによりメンレブレン上のタンパク質と混合した
後、37℃で 10 分間反応させる。

6

WS Buffer 100 μl を Filtration
Tube に入れ、8,000 x g で 10 分b)
間遠心する 。遠心後、ろ液を捨てる。

7

WS Buffer 200 μl を Filtration
Tube に入れ、8,000 x g で 10 分b)
間遠心する 。 この操作をもう一度繰り返す。

8

WS Buffer 200 μl を Filtration
Tube に入れ、10 回程度ピペッe)ティングし、標識体を回収する 。
マイクロチューブに移し、0 ～5℃で保存する。

2. キット以外に必要なもの
・10 μ l, 200 μ l マイクロピペッタ－
・インキュベーター (37℃ )・マイクロチューブ ( 標識体保存用 )・遠心機 ( マイクロチューブ用 )・DMSO

3. 保存条件
0 ～ 5℃で保存する。NH2-Reactive Fluorescent Dye はあらかじめ窒素封入をしているので、外装袋を一旦開封後は、再度窒素封入をして、-20℃で保存する。
OFluorescein
or
HiLyte Fluor

C O N
OO+

NH2-Reactive Fluorescent Dye

H2NIgG
Fluorescein
or
HiLyte Fluor

HC NOConjugate

図1IgG への蛍光色素標識反応

4. 使用上の注意
・分子量が 50,000 以上で、反応性のアミノ基を有するサンプルへ標識することができます。
・試料溶液中に標識対象以外の分子量 10,000 以上の物質が含まれる場合は、標識反応を阻害する恐れがあります。あらかじめ試料溶液を精製してから、使用する。特に安定化剤としてゼラチンや血清アルブミンなどの高分子が添加されている抗体では、標識反応が阻害されます。このような抗体を使用する場合は、あらかじめアフィニティーカラムなどにより精製を行なって下さい ( 抗体を精製したいを参照 )。
・タンパク質溶液に不溶性の低分子物質が含まれる場合は、遠心して上清のみを標識反応に用いて下さい。
冷蔵保存中もしくは室温に戻した際に、フィルトレーションチューブに水滴様の液粒が見られることがあります。これはメンブレンの乾燥防止剤が液粒化したもので、製品の性能に問題はありません。
5. 操作

Immunoglobulin G (IgG) への標識例

1

タンパク質 50 〜 200 μ g を含むサンプル溶液と WS Buffer 100μ l を Filtration Tube に入れ、ピペッティングにより軽く混合すa)る 。

a) サンプル溶液量は 100 μl 以下で使用する。タンパク質濃度が 0.5 mg/ml 未満である場合は、操作 1 と 2 を繰り返し、タンパク質量が 50 〜 200 μg となるようにする。
b) 溶液がメンブレン上に残っている場合は、さらに 5 分間遠心する。
c) NH2-Reactive Fluorescent Dye はチューブの底に入っている
ため、DMSO を加える際はチューブの底に入れ、軽くピペッティングして溶解させる。また、NH2-Reactive Fluorescent
Dye は DMSO 中 の 水 分 に よ り 加 水 分 解 し や す い の で、DMSO に溶解後は直ちに操作 4 へ進む。
d) タンパク質 200 μg に標識する場合、NH2-Reactive Fluore
scent Dye 溶液は 10 μl 全量を加える。
e) 標識体を回収する際は WS Buﬀer を使うことを推奨するが、必要に応じて各種の溶液の使用も可能である。

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129

プロトコル

6. 標識率の決定
タンパク 1 分子あたりに標識された蛍光色素の数 ( 標識率 )を算出したい場合は蛍光標識タンパク質溶液を中性の緩衝液で 5 倍に希釈し、280 nm と各蛍光試薬の極大吸収波長の吸光度を測定する。標識率は次式で計算できる。IgG の場合はεとして 216,000 を使用すること。蛍光試薬の WS Buffer 中でのモル吸光係数は表 1 を参照いただきたい。また、蛍光試薬の励起および蛍光スペクトルを図 2 に示す。
Fluorescein/ タンパク質の標識率 =A500/60,000(A280-A500 × 0.22)/ ε

A500: 500 nm の吸光度
A280: 280 nm の吸光度
ε : タンパクの 280 nm のモル吸光係数
HiLyte Fluor

TM555/ タンパク質の標識率 =2. キット以外に必要なもの
・10 μl, 200 μl マイクロピペッタ－・インキュベーター (37℃ )・マイクロチューブ ( 標識体保存用 )・遠心機 ( マイクロチューブ用 )
・DMSO
・PBS
3. 保存条件
NH 2-R e a cti ve IC G は ア ル ミ ラ ミ ジ ッ プ に 入 っ て お り、
一旦開封した後の未使用の NH 2-Reactive ICG は、アルミラミジップに入れたままチャックをしっかりと閉め、–20℃で保存する。NH2-Reactive ICG 以外は、0 ～ 5℃で保存する。

A555/150,000(A280-A555 × 0.1)/ εOC OO
N

SO 3Na＋ H2N

O

A555: 555 nm の吸光度
A280: 280 nm の吸光度
ε : タンパクの 280 nm のモル吸光係数

NH2-Reactive ICGOHiLyte Fluor

TM647/ タンパク質の標識率 =CA655/250,000(A280-A655 × 0.05)/ ε

ICG Labeled IgG

A655: 655 nm の吸光度

A280: 280 nm の吸光度
ε : タンパクの 280 nm のモル吸光係数
HiLyte Fluor

TM750/ タンパク質の標識率 =A760/270,000(A280-A760 × 0.05)/ εA760: 760 nm の吸光度
A280: 280 nm の吸光度
ε : タンパクの 280 nm のモル吸光係数
表1Fluorescein
TM
HiLyte Fluor 555
TM
HiLyte Fluor 647
TMHiLyte Fluor 750

蛍光色素の蛍光特性
極大吸収 (nm)500555655760

モル吸光係数 ( ε )60,000150,000
250,000
270,000HN

図3IgG のアミノ基への蛍光タンパク標識反応

4. 使用上の注意
・分子量が 50,000 以上で、反応性のアミノ基を有するサンプルへ標識することができます。
・試料溶液中に標識対象以外の分子量 10,000 以上の物質が含まれる場合は、標識反応を阻害する恐れがあります。
あらかじめ試料溶液を精製して下さい。
・タンパク質溶液に不溶性の低分子物質が含まれる場合は、遠心して上清のみを標識反応に用いて下さい。
・冷蔵保存中もしくは室温に戻した際に、フィルトレーション
チューブに水滴様の液粒が見られることがあります。これは、メンブレンの乾燥防止剤が液粒化したもので、製品の性能に問題はありません。
5. 操作

Immunoglobulin G (IgG) への標識タンパク質 50 ～ 200 μ g を含むサ
1ンプル溶液と WS Buffer 100 μ l をFiltration Tube に入れ、ピペッティa)ングにより軽く混合する 。

図2

各蛍光標識体の励起・蛍光スペクトルb)

28,000 x g で 10 分間遠心する 。

3N H 2 - R e a c t i v e I C G に 10 μ l のDMSO を加え、ピペッティングにc)より溶解する 。

4

Filtration Tube のメンブレン上にReaction Buﬀer 100 μ l を加えた後、
NH2-Reactive ICG を含む DMSO 溶d)
液 8 μ l を加える。

IV ICG Labeling Kit-NH2 によるアミノ基への標
識 (Code: LK31)
1. キット内容
・NH2-Reactive ICG
・WS Buﬀer
・Reaction Buﬀer
・Filtration Tube

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130

プロトコル

7. ICG ラベル抗体を用いたマウス皮下腫瘍の蛍光観察

5ピペッティングによりメンブレン上のタンパク質と混合した後、37℃で 10分間反応させる。

6WS Buffer 100 μ l を Filtration Tube にb)
入れ、8,000 x g で 15 分間遠心する 。
遠心後、ろ液を捨てる。

7

WS Buffer 200 μ l を Filtration Tube にb)
入れ、8,000 x g で 15 分間遠心する 。
この操作をもう一度繰り返す。

図 5 尾静注により ICG ラベル抗体 50 μ g 投与
（投与 48 時間後に測定 )in vivo 光イメージング装置 (Clairvivo OPT; 島津製作所 ) を用いて蛍光観察。

PBS 200 μ l を Filtration Tube に入れ、10 回程度ピペッティングし、標識体をe)回収する 。
マイクロチューブに移し、0 ～ 5℃で保存する。

マウス ：BALB/c nu/nu ( 雌 11 週齢 )腫瘍細胞：HeLa( 右腋皮下移植 , 移植後 4 週 )抗 体 ：抗インテグリンα 2 抗体
測定条件：励起波長 785 nm
蛍光波長 845/55 nm( 中心波長 / 帯域波長 )露光時間 10 秒8a) 100 μ l 以下の液量を使用すること。タンパク質濃度が 0.5mg/ml 未満である場合は、操作 1 と 2 を繰り返し、タンパク質量が 50 ～ 200 μ g となるようにする。
b) 溶液がメンブレン上に残っている場合は、さらに 5 分間遠心する。
c) NH2-Reactive ICG はチューブの底に入っているので DMSOを加える際はチューブの底に入れ、軽くピペッティングして溶解する。また、NH2-Reactive ICG は DMSO 中の水分により加水分解しやすいので、DMSO に溶解後は直ちに操作4 へ進むこと。
d) タンパク質 200 μ g に標識する場合、NH2-Reactive ICG 溶液は 10 μ l 全量を加える。
e) 標識体を回収する際は PBS の他、必要に応じて各種の溶液を使用すること。

V R-Phycoerythrin Labeling Kit - NH2、Allophycocyanin Labeling Kit - NH2 によるアミノ基への標識 (Code: LK23, LK21)
1. キット内容

・NH2-Reactive Phycobiliprotein
・WS Buﬀer
・Reaction Buﬀer
・Filtration Tube

2. キット以外に必要なもの
・10 μl, 200 μl マイクロピペッタ－
・インキュベーター (37℃ )・マイクロチューブ ( 標識体保存用 )・遠心機 ( マイクロチューブ用 )3. 保存条件

6. 標識率の決定
ICG/ タンパク質の標識率 =A800/147,000(A280 − A800 × 0.075)/ ε

A800: 800 nm の吸光度
A280: 280 nm の吸光度
ε：タンパクの 280 nm のモル吸光係数＊ IgG の場合はεとして 216,000 を使用すること。
λex=774 nm, λem=805 nm0 ～ 5℃で保存する。NH2-Reactive Phycobiliprotein は外装
袋を一旦開封後は -20℃で保存する。

OPhycobiliprotein

C O N
OO

SO3Na+

NH2-Reactive Phycobiliprotein

H2NIgG

Fluorescence Intensity

Phycobiliprotein

HC N
OConjugate

図6

図 4 励起・蛍光スペクトル

IgG のアミノ基への蛍光タンパク標識反応

4. 使用上の注意
・分子量が 50,000 以上で、反応性のアミノ基を有するサンプルへ標識することができます。
・試料溶液中に標識対象以外の分子量 10,000 以上の物質が含まれる場合は、標識反応を阻害する恐れがあります。あらかじめ試料溶液を精製して使用して下さい。特に安定化剤としてゼラチンや血清アルブミンなどの高分子が添加されている抗体では、標識反応が阻害されます。このような抗体を使用する場合は、あらかじめアフィニティーカラムなどによる精製が必要です ( 抗体を精製したいを参照 )。

技術的な内容に関するお問い合わせ先：カスタマーサポート Free Fax:0120-021557 Free Dial:0120-489548
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131

プロトコル

5. 操作
Immunoglobulin G (IgG) への標識例

1

IgG 50 ～ 200 μg を 含 む サ ン プa)
ル溶液 と WS Buffer 100 μl をFiltration Tube に加える。

2

ピペッティングにより軽く混合した後、8,000 x g で 10 分間遠心すb)る 。

3

WS Buﬀer 100μl を Filtration Tubeに加える。

a) サンプルの溶液は 100 μ l 以下で使用すること。IgG 濃度が0.5 mg/ml 以下の場合には、操作 1 と 2 を繰り返して IgG量が 50 ～ 200 μ g となるように濃縮する。
b) 溶液がメンブレン上に残っている場合は、さらに 8,000 x gで 5 分間遠心する。
c) NH2-Reactive Phycobiliprotein は水分により加水分解しやすいので、Reaction Buﬀer に溶解後は直ちに操作 6 に進む。
d) 1 〜 2 分子の Phycobiliprotein が IgG 1 分子に標識される。
未反応の Phycobiliprotein が残るため、フローサイトメト
リーではバックグランドが上昇することがある。必要に応じてゲルろ過カラムやアフィニティカラムで精製する。
e) 冷凍で長期保存する場合には、等量のグリセロールを添加し、-20℃で保存する。

R-Phycoerythrin

Relative ﬂuorescence・タンパク質溶液に不溶性の低分子物質が含まれる場合は、遠心して上清のみを標識反応に用いて下さい。
・冷蔵保存中もしくは室温に戻した際に、フィルトレーション
チューブに水滴様の液粒が見られることがあります。これはメンブレンの乾燥防止剤が液粒化したもので、製品の性能に問題はありません。

400500Allophycocyanin

600

700

800

Wavelength (nm)

4

図7b)

8,000 x g で 10 分間遠心する 。

R-Phycoerythrin および Allophycocyanin の励起・蛍光スペクトル( 注：縦軸は相対蛍光強度で、蛍光タンパク間の蛍光強度の比較したものではありません。同一グラフ上に表すために蛍光強度を変えてプロットしてあります )56Reaction Buffer 10 μl を NH2Reactive Phycobiliprotein に加え、c)ピペッティングにより溶解する 。

NH2-Reactive Phycobiliprotein を含む溶液を IgG が濃縮されている
Filtration Tube のメンブレン上に加える。

7

ピペッティングによりメンブレン 上 の IgG と よ く 混 合 し た 後、37℃で 2 時間反応する。

8

WS Buﬀer 190 μl を加えて、10 回程度ピペッティングし、標識体をd)回収する 。マイクロチューブにe)
移し、0 ～ 5℃で保存する 。

VI R-Phycoerythrin Labeling Kit-SH、
Allophycocyanin Labeling Kit-SH によるSH 基への標識 (Code: LK26, LK24)
1. キット内容
・SH-Reactive Phycobiliprotein
・Reducing Agent・RA Solution
・WS Buﬀer
・Reaction Buﬀer
・Filtration Tube
2. キット以外に必要なもの
・10 μl, 200 μl マイクロピペッタ－
・インキュベーター (37℃ )・マイクロチューブ ( 標識体保存用 )・遠心機 ( マイクロチューブ用 )SH HS

Reducing Agent
IgGO
Phycobiliprotein
Phycobiliprotein

ONNOO

SH-Reactive Phycobiliprotein

図8SConjugate

IgG の SH 基へのへの蛍光タンパク標識反応＊( ＊ヒンジ部分以外の SS 結合が還元される場合もある。)

技術的な内容に関するお問い合わせ先：カスタマーサポート Free Fax:0120-021557 Free Dial:0120-489548
在庫や価格(記載容量以外もしくは request)に関するお問い合わせ：マーケティング部 Tel:096-286-1515 Fax:096-286-1525(株)同仁化学研究所

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プロトコル

3. 保存条件
0 ～ 5℃で保存する。SH-Reactive Phycobiliprotein は外装袋を一旦開封後は –20℃で保存する。
4. 使用上の注意
・分子量が 50,000 以上で、ジスルフィドまたは SH 基を有するサンプルへ標識することができます。 SH 基を有するサンプルでは、還元操作 ( 操作 3- 操作 6) を省略できます。
・試料溶液中に標識対象以外の分子量 10,000 以上の物質が含まれる場合は、標識反応を阻害する恐れがあります。あらかじめ試料溶液を精製してから、使用して下さい。特に安定化剤としてゼラチンや血清アルブミンなどの高分子が添加されている抗体では、標識反応が阻害されるので、あらかじめアフィニティーカラムなどによる精製を行って下さい ( 抗体を精製したいを参照 )。
・タンパク質溶液に不溶性の低分子物質が含まれる場合は、遠心して上清のみを標識反応に用いて下さい。
・冷蔵保存中もしくは室温に戻した際に、フィルトレーション
チューブに水滴様の液粒が見られることがあります。これはメンブレンの乾燥防止剤が液粒化したもので、製品の性能に問題はありません。
5. 操作
Immunogloblin G (IgG) への標識 ( 反応は図 3 参照 )IgG 50 ～ 200 μg を 含 む サ ン プ
1ル 溶 液 と WS Buffer 100 μg をa)
Filtration Tube に加える 。

26RA Solution 100 μl を加え、8,000b)
x g で 10 分間遠心する 。ろ液を捨てた後、RA Solution 200 μl をb)加え、さらに遠心する 。

7R e a c t i o n B u ff e r 50 μl を S H Reactive Phycobiliprotein に加え、c)ピペッティングにより溶解する 。

8操作 7 の溶液を還元 IgG が濃縮されている Filtration Tube のメンブレン上に加える。

9

ピペッティングによりメンブレン上の還元 IgG と混合した後、37℃で 1 時間反応する。

10WS Buﬀer 150 μl を加え、10 回程度ピペッティングし、標識体を回d)収する 。溶液をマイクロチューe)ブに移し、0 ～ 5℃で保存する 。

ピペッティングにより軽く混合した後、8,000 x g で 10 分間遠心すb)る 。

3

WS Buffer 150 μl を Reducing
Agent に加え、ボルテックスして溶解する。

4操 作 3 の 溶 液 100 μl を IgG が 濃縮されている Filtration Tube のメンブレン上に加える。

5ピペッティングによりメンブレン
上 の IgG と 混 合 し た 後、37 ℃ で30 分間反応する。

a) サンプルの液量は 100 μl 以下で使用すること。IgG 濃度が0.5 mg/ml 以下の場合には、操作 1 と 2 を繰り返して IgG 量が 50 〜 200 μg となるように濃縮する。
b) 溶液がフィルター上に残っている場合は、さらに 8,000 x gで 5 分間遠心する。
c) SH-Reactive Phycobiliprotein は Reaction Buﬀer 中で不安定である。溶解後は直ちに操作 8 に進む。
d) 1〜 2 分子の Phycobiliprotein が IgG 1 分子に標識される。
未反応の Phycobiliprotein が残るため、フローサイトメトリーではバックグランドが上昇することがある。必要に応じ、精製を行うこと。
e) 長期保存する場合には、標識体溶液に等量のグリセロールを添加し、50% グリセロール溶液として、–20℃で保存する。

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