プロトコル

その他

NO を測定したい
使用製品

解析装置

・NO2 /NO3 Assay Kit-C II(Colorimetric) ～ Griess Reagent Kit ～・NO2 /NO3 Assay Kit-FX(Fluorometric) ～ 2,3-Diaminonaphthalene Kit ～I. 比色法にて測定する場合−

1. はじめに
最近、一酸化窒素(NO)が情報伝達物質として多くの生理的現象に関与していることが明らかとなり、NO に関する研究が盛んに行われている。これまで開発された NO の測定法には、
NO をオゾン酸化したときに発生する発光を利用する化学発光法、オキシヘモグロビン(O2Hb)が酸化されて生じる metHb の吸収スペクトルを測定する方法、電極を組織に差し込み酸化されるときに流れる電流で定量する方法、および Griess 法などがある。
この章では小社 NO2/NO3 Assay Kit - C II (Colorimetric) ～Griess Reagent Kit～(Code: NK05) を用いた方法について記載する。Griess 法は NO の簡便な測定法としてよく用いられて−いる。Griess 法は NO が酸化されて生じる NO2 によるジアゾニウム塩化合物とナフチルエチレンジアミンのアゾカップリングを利用して検出する方法(下図)であるため、NO を直接測−定するものではなく NO が変化した NO2 を測定するという間

1) 96 穴マイクロプレートに次のように NaNO2 標準溶液を調製する。
well NaNO2 標準溶液 ( μl ) 緩衝溶液 ( μl ) NO2 濃度 (μmol/l )A10800B1206025C1404050D1800100※ 検量線作成のためのスポット数は、必要に応じて追加する。
2) 各ウェルに緩衝溶液 20 μl を加え全量を 100 μl とする。
3) 試薬 A 50 μl を加えよく混和し 5 分間放置する。試薬 B50 μl を加え混和し、室温で 10 分間反応後マイクロプレー
トリーダーで 540 nm の吸光度を測定する。(540 nm のフィルターがない場合は 530～580 nm の最も適当なフィルターを用いて測定する )4) 得られた値とブランク値(A1 の値) との差を求める。
5) 横軸に NaNO2 の濃度、縦軸に吸光度をとり、この結果をプロットする。

接的な方法ではあるが、特別な装置や技術を必要としないという利点がある。
NO2-+

H2 N

SO2NH2H+

N N+

0.8

SO2NH20.6

Sulfanilamide

機能性有機材料

HN
H2 N
1-Naphthylethylenediamine[NK05][NK08]

3. [NO2 ] 検量線の作成

HN

N N

SO2NH2H2 N

Absorbance細 胞
増殖 / 毒性酸化ストレス分 子生物学
細 胞 内蛍光プローブ細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用
試薬膜タンパク質可 溶 化 剤
ラベル化 剤
二価性試 薬イオン
電 極0.40.2Azo Dye (λmax = 540nm)−

しかしながら、Griess 法は NO2 としか反応できないのに対−し、NO は水中で以下のように加水分解され最終的に NO2 と−NO3 になる。
NO+ 1/2O2
2 NO2

N2O4 + H2O
NO+NO2

N2O3 + H2O

NO2(1)

N2O4(2)NO2- + NO3- + 2H+(3)N2O3(4)2NO2- ++−･NaNO2 標準溶液 (100 μmol/l)･NaNO3 標準溶液 (100 μmol/l)･ 緩衝溶液 (20 mmol/l, pH7.6)･ 還元酵素 ( 緩衝溶液 1.2 ml に溶かして使用する )･ 補酵素 ( 緩衝溶液 1.2 ml に溶かして使用する )･ 試薬 A
･ 試薬 B

204060−[NO2 ] (μmol/l)80100

図 1 NaNO2 の検量線の例−−1) 96 穴マイクロプレートに次のように NaNO3 標準溶液を調製する。

−

本キットは還元酵素を含んでおり、[NO2 ] と [NO3 ] の両方が測定できる。10～100 μmol/l の濃度領域に適している。

2. キット内容04. [NO2 + NO3 ] 検量線の作成(5)

2H0×1×1×1×1×1×1×1well NaNO3 標準溶液 ( μl ) 緩衝溶液 ( μl ) NO3 濃度 ( μmol/l )E10800F1206025G1404050H1800100※ 検量線作成のためのスポット数は、必要に応じて追加する。
2) 各ウェル に補酵素溶液 10 μl、酵素溶液 10 μl を入れ、よく混和する。
3) そのまま室温(約25℃)にて 2 時間インキュベートする。
4) 試薬 A 50 μl を加えよく混和して 5 分間反応する。試薬 B 50μl を加え混和し、10 分間反応後、マイクロプレートリーダーで 540 nm の吸光度を測定する。（540 nm のフィルターがない場合は、530 〜 580 nm の最も適当なフィルターを用いて測定する）
5) 得られた値とブランク値 (E1 の値) との差を求める。
6) 横軸に NaNO3 の濃度、縦軸に吸光度をとり、この結果をプロットする。

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プロトコル−0.8

Absorbance

0.6

0.40.200204060−−[NO2 +NO3 ] (μmol/l)

80

100

図 2 NaNO2 ＋ NaNO3 の検量線の例−2) このキットは 10～100 μmol/l の [NO2 ＋ NO3 ] の測定に適しています。したがって、100 μmol/l 以上の高濃度のサンプル(3. 及び 4. の検量線の範囲を越えるサンプル) は希釈して測定して下さい。また、サンプル量が 80 μl 以下の場合には緩衝溶液で 80 μl にあわせて測定を行なって下さい。
−−
3) NO2 と NO3 の総量の濃度を測定する場合の検量線 (操作 4) は、酵素−を用いるため感度が若干低下します。そのため、NO2 の濃度のみを測定する場合の検量線 (操作 3) とは一致しないのでご注意下さい。
4) 還元酵素及び補酵素は、使用前に混合して使用しないで下さい。必ず、別々の溶液として調製し、順次添加して下さい。
5) 還元酵素及び補酵素は、凍結乾燥品のため、瓶内部が減圧になっています。溶媒を注入、溶解後開封して下さい。
−−
6) NO2 及び NO3 標準溶液は、開封後、1 ヶ月を越える保存には適しません。
7) アルミの蓋を開けるときは怪我をしないよう気を付けること。

5. サンプルの調製法
培養液あるいは血清などを試料として測定に用いる場合、以下の点に注意して調製すること。
1) MEM あるいは DMEM などの細胞培養液を測定に用いる場合、まず 1,000 x g (15 min, RT) で遠心分離し、その上澄みをとる( 血清を添加している場合は除タンパクを行うこと )。
2) 血清を測定に用いる場合、Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter
Unit with Ultracel-10 menbrane([UFC801008], Millipore 社 )などで除タンパク ( 例えば 7,000 x g、4℃、20 min) を行う。
−
3) 硝酸イオンを多く含む培養液 (RPMI1640 など ) は [NO2 ＋−−NO3 ] の測定はできないが、[NO2 ] のみについては測定可能である。

6. 未知試料の [NO2 ] 測定−

1) 96穴マイクロプレートの A2～H12 の空いているウェルに各ウェル あたり 80 μl のサンプルを入れる。
2) 緩衝溶液 20 μl を加え全量を 100 μl とする。
3) 試薬 A 50 μl を加えよく混和し 5 分間反応する。試薬 B 50 μlを加え混和し、10 分間反応させた後マイクロプレートリー
ダーで測定する。
4) 得られた値とブランク値 (A1) との差を求める。
−
5) 3. で求めた検量線より [NO2 ] 濃度を求める。

7. 未知試料の [NO2 ＋ NO3 ] 測定−−

1) 96 穴マイクロプレートの A2～H12 の空いているウェルに各ウェルあたり 80 μl のサンプルを入れる。
2) 補酵素溶液 10 μl、酵素溶液 10 μl を入れ、よく混和する。
3) そのまま室温(約25℃)にて 2 時間インキュベートする。
4) 試薬 A 50 μl を加えよく混和し、5 分間反応置する。
試薬 B 50 μl を加え混和し、10 分間反応させた後マイクロプレートリーダーで測定する。
5) 得られた値とブランク値 (E1) との差を求める。
−−
6) 4. で求めた検量線より [NO2 + NO3 ] 濃度を求める。

8. 未知試料の [NO3 ] 測定−−

1) S. Archer,“Measurement of Nitric Oxide in Biological Models”,
FASEB. J. , 1993, 7 , 349 .
2) W. R. Tracy, J. Linden, M. J. Prach, and R. A. Johns,“Comparisonof Spectrophotometric and Biological Assays for Nitric Oxide (NO)and Endothelium-Derived Relaxing Factor (EDRF): Nonspecificityof the Diazotization Reaction for NO Failure to Detect EDRF”, J.
Pharmacol. Exp. Ther. , 1990, 252 , 922.
3) J. S. Pollock, U. Forstermann, J. A. Mitchell, T. D. Warner, H. H. H.
Schmidt, M. Nakane, and F. Murad,“Puriﬁcation and Characterization ofParticulate Endothelium-Derived Relaxing Factor Synthase from Cultured
and Native Bovine Aortic Endothelial Cells”, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. ,1991, 88 , 10480.
4) H. H. H. Schmidt, T. D. Warner, M. Nakane, U. Forstermann, F. Murad,“Regulation and Subcellular Location of Nitrogen Oxide Synthases in
RAW264.7 Macrophages”, Mol. Pharmacol. , 1992, 41 , 615.

II. 蛍光にて測定を行う場合
1. はじめに−2,3-Diaminonaphthalene は Griess 試薬と同様に NO2 と−反応し、蛍光を発することから、より高感度に NO2 を定量することができる。この章では小社 NO2/NO3 Assay Kit - FX(Fluorometric)～2,3-Diaminonaphthalene Kit～(Code: NK08) を用いた方法について記載する。
このキットは、2,3-Diaminonaphthalene が酸性条件下で−NO2 と反応しナフタレントリアゾールの蛍光性付加体を形成することを利用して検出する方法を用いている。この反応は
pH2 以下で進行し、生成した付加体は pH10 以上で最も効率よく蛍光を発する。
NH2NO2-NH2NH2,3-DiaminonaphthaleneN
N

Naphthalenetriazole−

未知試料の [NO3 ] 濃度は 6. で得られた [NO2 ] と 7. で得ら−−れた [NO2 + NO3 ] より求められる。
−−−−[NO3 ] = [NO2 + NO3 ] - [NO2 ]9. 使用上の注意

参考文献

1) 酵素溶液、補酵素溶液は氷浴上で使用して下さい。また、溶解後数回に分けて使う場合にはアシストチューブなどに分注し冷蔵保存して下さい。ただし、長期間保存すると高濃度域が測定できなくなることがあるため、2 週間以内に使用して下さい。

−−

発生した NO を測定するためには NO2 と同時に NO3 につい−−ても測定する必要があるので、酵素を用いて NO3 を NO2 に還元しなければならない。本キットは還元酵素を含んでいるので−−[NO2 ] と [NO3 ] の両方が測定できる。1～10 μmol/l の濃度範囲の測定に適している。

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細 胞
増殖 / 毒性酸化
ストレス分 子生物学
細 胞 内蛍光プローブ
細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用
試
薬
膜タンパク質可 溶 化 剤ラベル化 剤
二価性
試 薬
イオン
電 極その他
機能性有機材料

プロトコル

2. キット内容

・Buffer Solution
・NaNO2 Standard Solution (200 μmol/l)・NaNO3 Standard Solution (200 μmol/l)

×1×2×2×2×2×1×1

・NO3 Reductase
・Enzyme Cofactors
・Fluorescence Reagent (DAN) Solution
・Stop Solution

3. 溶液調製

1) NaNO2 Standard Solution 1 本に Buffer Solution (又は培地)
9 ml を加え、20 μmol/l の Standard Solution を調製する。
2) NaNO3 Standard Solution 1 本に Buffer Solution( 又は培地 )9 ml を加え、20 μmol/l の Standard Solution を調製する。
3) NO 3 Reductase 1 本に Buffer Solution 1.2 ml を加え、NO3 Reductase Solution を調製する。
4) Enzyme Cofactors 1 本に Buffer Solution 1.2 ml を加え、Enzyme Cofactors Solution を調製する。

※ 希釈・溶解後の溶液は冷蔵保存の上、2 週間以内に使用する。
−※ NO3 を多く含む培地 (RPMI1640 など) や フェノールレッドを含む培地は使用できない。

4. [NO2 ] 検量線−1) 96 穴マイクロプレートの検量線作成用の各ウェルに Buffer
Solution (又は培地) 80 μl を 分 注 す る。20 μmol/l NaNO2Standard Solution 80 μl を プ レ ー ト 上 で 系 列 希 釈 し、Standard を調製する(図 3 参照)。
2) 各ウェルに Buffer Solution 20 μl を加え、全量を 100 μl とする。
3) 各ウェルに Fluorescence Reagent (DAN) Solution 10 μl を加えよく混和する。
4) 室温にて 15 分間反応した後、各ウェルに Stop Solution 40 μlを加えよく混和する。
5) マイクロプレートリーダーで蛍光強度 (λex = 360〜365 nm,λem= 450〜465 nm) を測定する。

※ NO3 Reductase 及び Enzyme Cofactors は、凍結乾燥品のため瓶内部が減圧になっている。減圧のまま開封すると中身が飛散する恐れがあるので、必ず Buffer Solution をシリンジで注入し、溶解後開封すること。

a)

1ABCDEFGH

その他
機能性有機材料2b)31) マイクロピペットを用いて 96 穴マイクロプレートの各ウェルに 80 μl の Buffer Solution( または培地 ) を分注する。

10 μmol/l2) 20 μmol/l に希釈した Standard Solution 80 μl を 10 μmol/l の用のウェルに添加する。

5 μmol/l2.5 μmol/l3) よくピペッティングして 80 μl を取り隣のウェル (5 μmol/l 用 )に添加する。

1.25 μmol/l
0.63 μmol/l4) 同様に 80 μl を取り隣のウェルに添加する操作を繰り返す。

0.31 μmol/l
0.16 μmol/l5) 最後に 80 μl 捨てると、2 倍希釈系列で Standard を調製することができる。

0 μmol/l
図3検量線作成方法の例a) 96 穴プレートでの検量線レイアウト例b) Standard Solution の希釈方法b)a)

蛍光強度

蛍光強度

細 胞
増殖 / 毒性酸化ストレス分 子生物学
細 胞 内蛍光プローブ細胞染色
ミトコンドリア関連試薬
細菌研究用
試薬
膜タンパク質可 溶 化 剤ラベル化 剤
二価性
試 薬
イオン
電 極

NO2NO - + NO -NO2NO - + NO 20376823310012246824

図4NO2/NO3 Assay Kit - FX を用いて測定した [NO2 ] と [NO2 + NO3 ] の検量線a) Buffer Solution 中、b) 培地 (DMEM) 中[NO2-] or [NO2-] + [NO3-] (μmol/l)−10[NO2-] or [NO2-] + [NO3-] (μmol/l)−

12−

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プロトコル−−−

5. [NO2 + NO3 ] 検量線1) 96 穴マイクロプレートの検量線作成用の各ウェルに Buffer
Solution(又は培地) 80 μl を 分 注 す る。20 μmol/l NaNO3Standard Solution 80 μl を プ レ ー ト 上 で 系 列 希 釈 し、Standard を調製する(図 3 参照)。
2) 各ウェルに Enzyme Cofators Solution 10 μl を加える。
3) 各ウェルに NO3 Reductase Solution 10 μl を加え、よく混和する。
4) マイクロプレートに蓋をし、37℃で 30 分間インキュベートする。
5) 室温まで放冷後、各ウェルに Fluorescence Reagent (DAN)
Solution 10 μl を加えよく混和する。
6) 室温にて 15 分間反応した後、各ウェルに Stop Solution 40μl を加えよく混和する。
7) マイクロプレートリーダーで蛍光強度 (λex = 360〜365 nm,λem = 450〜465 nm) を測定する。
−−−−※ [NO2 +NO3 ] 検量線は、酵素反応を利用して NO3 を NO2 に還元して測定する。本プロトコールでは NaNO3 Standard Solution を用いているが、NaNO2 Standard Solution を用いた場合も同じ検量線が得られる。
−−−※ [NO2 ＋ NO3 ] 検量線は、酵素等の影響により [NO2 ] 検量線とはかならずしも一致しない。
※ 蛍光光度計で測定する場合は Stop Solution 添加後の溶液を 100 μl 取り、純水で 4 ml に希釈し蛍光強度を測定すること。

6. サンプルの調製法
培養液あるいは血清などを試料として測定に用いる場合、以下の点に注意して調製すること。
1) MEM あるいは DMEM などの細胞培養液を測定に用いる場
合、1,000 x g (15 min, RT) で遠心分離し、その上澄みを試料とする。フェノールレッドは測定を妨害するため、培地はフェノールレッド不含のものをご使用する。
2) 血清を測定に用いる場合、Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter
Unit with Ultracel-10 menbrane (UFC801008), Millipore 社 )などで除タンパクを行う。
−
3) 硝酸イオンを多く含む培養液 (RPMI1640 など) は [NO2 ＋−−
NO3 ] の測定はできないが、[NO2 ] のみについては測定可能である。

−

8. 未知試料の [NO2 + NO3 ] 測定

1) 96 穴マイクロプレートに試料 80 μl を加える。
2) 各 ウ ェ ルに Enzyme Cofators Solution 10 μl を加える。
3) 各 ウ ェ ルに NO3 Reductase Solution 10 μl を加え、よく混和する。
4) マイクロプレートに蓋をし、37℃で 30 分間インキュベートする。
5) 室温まで放冷後、各 ウ ェ ルに Fluorescence Reagent (DAN)
Solution 10 μl を加えよく混和する。
6) 室温にて 15 分間反応した後、各 ウ ェ ルに Stop Solution
40 μl を加えよく混和する。
7) マイクロプレートリーダーで蛍光強度 (λex =360〜365 nm,−−λem= 450〜465 nm) を測定し、[NO2 ＋ NO3 ] の検量線から濃度を求める。

9. 未知試料の [NO3 ] 測定−−
3

本 Kit では [NO ] のみの値は直接的には得られない。測定試−−−−
料中の [NO3 ] は [NO2 ] と [NO2 ＋ NO3 ] を用いて、下記の計算式により求めることができる。
−−−−[NO3 ] = [NO2 ＋ NO3 ] - [NO2 ]※ 蛍光光度計で測定する場合は Stop Solution 添加後の溶液を 100 μl 取り、純水で 4 ml に希釈し蛍光強度を測定すること。

参考文献
1) T. P. Misco, R. J. Schilling, D. Salvemini, W. M. Moore, and M. G.
Currie,“A Fluorometric Assay for the Measurement of Nitrite inBiological Samples”, Anal. Biochem. , 1993, 214 , 11.
2) D. Salvemini, K. Seibert, J. L. Masferrer, T. P. Misko, M. G.Currie, andP. Needleman,“Endogenous Nitric Oxide Enhances Prostaglandin
Production in a Model of Renal Inﬂammation”, J. Clin. Invest. , 1994,
93 , 1940.
3) A. H. Cross, T. P. Misko, R. F. Lin, W. F. Hickey, J. L. Trotter, and R.
G. Tilton,“Aminoguanidine, an Inhibitor of Inducible Nitric Oxide
Synthase, Ameliorates Experimental Autoimmune Encephalomyelitis
in SJL Mice”, J. Clin. Invest. , 1994, 93 , 2684.
4) R. G. Tilton, K. Chang, J. A. Corbett, T. P. Misko, M. G. Currie,N. S.
Bora, H. J. Kaplan, and J. A. Williamson,“Endotoxin-Induced Uveitis Rat is Attenuated by Inhibition of NitricOxide Production”, Invest. Opthalmol. Vis. Sci. , 1995, 35 , 3278.
5) P. Damiani and G. Burini,“Fluorometric Determination of Nitrite”,
Talanta , 1986, 33 , 649.

7. 未知試料の [NO2 ] 測定−

1) 96 穴マイクロプレートに試料 80 μl を加える。
2) 各ウェルに Buffer Solution 20 μl を加え、全量を 100 μl とする。
3) 各 ウ ェ ルに Fluorescence Reagent y(DAN) Solution 10 μl を加えよく混和する。
4) 室温にて 15 分放置した後、各ウェルに Stop Solution 40 μlを加えよく混和する。
5) マイクロプレートリーダーで蛍光強度 (λex =360〜365 nm,−λem =450〜465 nm) を測定し、[NO2 ] の検量線から濃度を求める。

技術的な内容に関するお問い合わせ先：カスタマーサポート Free Fax:0120-021557 Free Dial:0120-489548
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細 胞
増殖 / 毒性
酸
化
ストレス
分 子
生物学
細 胞 内
蛍光プローブ細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用
試薬
膜タンパク質可 溶 化 剤ラベル化 剤
二価性
試 薬
イオン
電 極その他
機能性
有機材料