相分離生物学
総説

相分離生物学の先へ
Beyond Phase-Separation Biology

筑波大学白木 賢太郎

生命科学の最前線

186

2023 No.

ISSN 0385-1516～熊本大学若手研究者の現場から～

次世代プロテオミクス技術の開発と展開

Development and application of next-generation proteomics technologies

慶應義塾大学

増田 豪、熊本大学

大槻 純男

注目の研究

神経変性疾患と LLPS の関わり

株式会社同仁化学研究所

連

載

新 製 品

抗酸化キットを使う前のサンプル前処理法〈第 2 回〉P.12
死細胞標識試薬

P.7

末永 元輝

No.186（2023）

2023 No.186 ドージンニュース

CONTENTS
Review
相分離生物学の先へ
Beyond Phase-Separation Biology
筑波大学 白木 賢太郎

1

Topics on Chemistry
神経変性疾患と LLPS の関わり
株式会社同仁化学研究所

Review

生命科学の最前線

末永 元輝

5～熊本大学若手研究者の現場から～

次世代プロテオミクス技術の開発と展開
Development and application of next-generation proteomics technologies
慶應義塾大学 増田 豪、 熊本大学 大槻 純男

8

連載
抗酸化キットを使う前のサンプル前処理法 〈第2回〉
株式会社同仁グローカル

山口 勝則

表紙:玉名郡和水町

12

Commercial

エクソソーム膜・タンパク質 蛍光染色キット …………………………… 4
脂肪滴染色蛍光試薬………………………………………………………… 6
脂肪滴測定キット…………………………………………………………… 6

白石堰の鷺

夏の時期、夕陽が正面から川へ射し込む時間帯は川が黄金色に染まる。その美しい流れを表現
する為、ND フィルターを装着してシャッタースピードを 1.6に設定。鳥が動くか動かないかの絶妙なシャッタースピードで流れを表現して撮影した。
photo:永島 俊介氏

DPPH抗酸化能測定キット ……………………………………………… 13
バイオフィルム形成量・形成阻害測定キット ………………………… 14
試験片用バイオフィルム形成能測定キット…………………………… 14
バイオフィルム薬剤効果測定キット…………………………………… 15
微生物増殖アッセイキット……………………………………………… 15
細菌二重染色キット……………………………………………………… 16
新製品
死細胞標識試薬……………………………………………………………… 7
お役立ち
学会展示のご案内………………………………………………………… 11
細胞機能解析冊子リニューアル………………………………………… 11
製品取扱説明書 変更のお知らせ ……………………………………… 11−アプリケーション紹介−……………………………………………… 17※希望納入価格には消費税は含まれておりません。
※記載価格は本誌発行時における希望納入価格です。
予告なしに変更する場合がございますのでご注意ください。
※掲載製品は試験・研究用のみに使用するものです。医療用その他の目的には使用できません。

X（旧ツイッター）
小社製品の最新情報や使用文献などを投稿しています。

No.186（2023）

相分離生物学の先へ
Beyond Phase-Separation Biology

Abstract
白木 賢太郎
筑波大学数理物質系教授

Liquid-liquid phase separation (LLPS) is currently a hot topic
in cell biology. In this manuscript, I first present the finding on
several topics that led to the emergence of Phase-Separation
Biology. The relevance of LLPS to amyloid and anticancer drugs
is an important issue for this area. Finally, Protein-Solution
Science will be introduced as a comprehensive view of theapplication of a protein science for industry.

1. はじめにタンパク質の液 - 液相分離に関して、はじめて講演したのは2018 年夏のことだった。翌年にこの分野の概要を整理した『相分離生物学』を出版したが、この頃はたくさんの講演の機会をいただいた。当時は、いったいどういう仕組みでタンパク質が相分離するのか、凝集とは何が違うのか、界面はどのようになっているのか、細胞内で実測するにはどのような方法があるのかなど、初歩的な質問も多かった。それから 5 年が過ぎているが、この分野に興味を持つ研究者も増えてきている 1）。タンパク質の機能を理解するためには、タンパク質の立体構造だけではなく、タンパ
ク質の溶液状態を理解する必要がある、というコンセプトは今では共通認識になってきている。本稿では、相分離生物学の成り立
ちと、これから期待される応用の可能性について整理してみたい。

和性が高いので、これだけ高濃度の ATP は不要である。ではなぜ、細胞内には過剰量の ATP があるのだろうか？
この論文では ATP が FUS タンパク質のドロプレットを溶かすことが示されている。ATP の濃度が薄いときには FUS はドロプ
レットを形成するが、10 mM の ATP が含まれているとドロプレットを形成しないのである。つまり、ATP が細胞内にこれだけ高濃度あるのは、FUS のように液 - 液相分離しやすいタンパク質を分散した状態に保つために働いているのだというのが、この論文の主張である。
この結果から筋萎縮性側索硬化症の発症について次のように考察できるだろう 4）。FUS タンパク質はアミロイドを形成し、筋萎
縮性側索硬化症を発症するとされるタンパク質である。細胞内にATP が少ない場合、FUS はドロプレットを形成して濃縮された状態になり、アミロイドを形成しやすい。他方、細胞内に ATP が
2. 相分離生物学の原郷
たくさん含まれていると FUS はドロプレットを形成しないので、相分離生物学の分野の歴史を辿ってみると、細胞の中の構造のアミロイドにもなりにくいだろう。すなわち、FUS のドロプレッ
研究に行き着くだろう。卵細胞の中にある核小体の研究であれば、 トの形成を抑制することで、この疾患の発症を抑制できる可能性
すでに 19 世紀初頭には行われていたような古くからあるテーマがある。
である。一方、液 - 液相分離という現象は、水と油のような身近
ATP の化学構造をあらためて見てみると、確かに疎水性の高いな例としても知られており、高分子の液 - 液相分離も 1940 年代
領域を構成する核酸塩基と、親水性の高い領域を構成するリン酸には統計力学で厳密に議論できるようになっていた。だが、この基とが糖を介してつながっていることがわかる。ミセルを形成す
両者が結び付けられたのは 21 世紀に入ってからのことであった。 るほど大きな疎水性領域は持っていないが、疎水性物質と相互作
相分離生物学の原典となる成果に、マックス・プランク研究所
用して溶解度を上げる働きがあってもおかしくはない。こうしての Anthony A. Hyman らが報告した 2009 年の論文がある 2）。線 「タンパク質は液 - 液相分離する」ということを仮定して考えると、虫の受精卵には P 顆粒があり、受精後に卵割が進むにつれて片ATP のような著名な分子が細胞内の溶液環境でどのような影響を側に集まることが知られていた。このような非対称性が生まれるおよぼしているのかについて、新たな見え方をするのは興味深い。
のはなぜかというと、P 顆粒が液体の性質を持つからだというのこの論文を初めて読んだときのそのような印象を今もよく覚えてがこの論文での発見であった。すなわち、この非膜性構造体をドおり、その後、こういう見方を「相分離メガネをかける」などとロプレットとみなし、細胞内に物理学の世界を改めて持ち込ん称している 1）。
だのがこの論文であった。この論文の第一著者である Clifford P.
Brangwynne は、その後、プリンストン大学に研究室を持ち、こ
4. 薬の効果を見直すの見方をさらに発展させている。
創薬は相分離生物学の時代によって見方が変わる分野である。
研究が盛んに行われているテーマのひとつに、アミロイドと神経
3. ATP はドロプレットを溶かす
変性疾患の関係がある 1）。アミロイドとはタンパク質が主鎖の分Hyman らの研究グループは、この成果以外にも、相分離に関子間にできる水素結合によって安定化された線維状の凝集体で、連する魅力的な仮説をいくつも提唱している。そのひとつに、 アルツハイマー病やパーキンソン病、プリオン病などに関わると『ATP は生物学的ハイドロトロープである』という 2017 年の論されてきた。先述の FUS や、パーキンソン病の原因になるとさ文がある 3）。ハイドロトロープとは疎水性分子を溶かす物質とれるα - シヌクレインなど 5）、アミロイドの形成の途中にドロプいう意味である。細胞内には数 mM の ATP があるとされるが、 レットを形成することが発見されてきていた。すなわち、アミロ
ATP を「エネルギー通貨」として利用している酵素は ATP と親イドの途中にあるドロプレットが、創薬の新しいターゲットにな1

No.186（2023）

るのである。
低分子の薬の効果も相分離の見方によって変わるだろう。もしレセプターがドロプレットを形成するならば、そのドロプレット
への薬の溶けやすさによって薬効が異なるからである。すなわち、
ドロプレットによく溶けるなら少量の薬でも効果を発揮するが、溶けないのならいくらその薬を導入しても効果はない。このような見方による最初の報告として、リチャード・ヤングらの研究チームによる抗がん剤の研究がある 6）。これまでに報告されている抗がん剤は、その種類によって、核内に何種類か存在しているドロプレットへの溶けやすさが異なるのである。すなわち、標的となるドロプレットによく溶けることが薬の効果を高めることにもな
り、副作用を減らすことにもなるだろう。

5. タンパク質の液 - 液相分離を再現する

タンパク質の液 - 液相分離は、試験管で簡単に再現できる。ありふれたタンパク質を用いてデモンストレーションをしてみたい。卵白の主成分であるオボアルブミンと、リゾチームをおよそ
1 mg/ml 程度の溶液を準備し、薄い緩衝液の中で混ぜると白濁した状態になる（図 1）。これが現在、広く言われている「タンパク質の液 - 液相分離」の一種であり、白く濁ったものが「ドロプレット」と呼ばれるものである。ドロプレットは凝集体とは異なり溶媒を含み流動性があるので、この例のようにタンパク質分子が静電相互作用によって集まっているのであれば、塩水を加えるだけで透明な状態に戻る。水に溶けたイオンによる静電遮蔽効果
によって、溶質が分散するからである。一方、ここで作らせたドロプレットは時間と共に少しずつ成熟する性質があり、白濁した状態で 30 分も置いておけば、同じ濃度の塩水を入れても溶けな
くなる。つまり時間とともに疎水性相互作用が強まっていき、イ
オンでは溶けなくなるのである。要するに、分散したタンパク質を混ぜると液滴になり、時間とともに凝集体へと成熟するのであ
る。

図 1.

このような試験管内で簡単に再現できるような現象が、なぜ細胞内にあるタンパク質の働きと関連づけて理解されてこなかったのは不思議である。その理由のひとつとして、タンパク質は固有の構造を形成して働き、構造形成に役立たない天然変性領域には注意が向けられてこなかったことが考えられる。事実、ヒトのタンパク質の場合、30 残基以上の天然変性領域を持つものは半数以上あると試算されており 7）、この領域は液 - 液相分離を制御していると考えられるが、どういうアミノ酸配列を持つと相分離しやすいのかについては、ホットなテーマとなっている。現在では、
アミノ酸配列と天然変性領域のほか、アミノ酸配列と相分離性を理解するためのデータベースの整理も進んできている。

6. タンパク質は多様な状態を取る

タンパク質は固有の立体構造を形成して働くが、他方で多様な立体構造を形成し、多様な溶液状態を作り出す（図２）。先ほどの図 1 で示した結果のように、時間とともにタンパク質の立体構造が変化することもあるので、タンパク質の溶液状態は多様である。例えば、タンパク質の溶液を加熱すると凝集体ができる。しかし凝集といっても多様であり、濃縮すれば均質に全体が濁った
オパレッセンスと呼ばれる状態になるし、高濃度のタンパク質溶液を加熱すると分子間のネットワークができることでゲルになる
し、低濃度のタンパク質溶液を加熱すると粒の揃った白濁した凝集体になる。他にも、油を含ませた溶液を混ぜるとタンパク質は構造変化して両親媒性の構造になって乳化剤にもなるし、空気を含めてふり混ぜると泡立つこともある。このような性質は食品加工の分野では積極的に使われることもあるし、バイオ医薬品の開発やタンパク質科学の基礎研究からは嫌がられる特徴にもなっている。
このようにタンパク質が多様な状態をとりうるのは、タンパク質の分子が構造変化し、水やイオン、他のタンパク質や溶質との相互作用が多様に変わるからである。つまり、タンパク質の一次オボアルブミンとリゾチームを混合した溶液。オボアルブミン溶液にリゾチーム溶液を加えると白濁する。その直後に塩化ナトリウムを加えると透明な溶液になるが、30 分後に塩化ナトリウムを加えても白濁した状態は変化しない。

2

No.186（2023）

fibrillization

dissociation

aggregation

dissolution

emulsiongelationdegradation

precipitation

refoldingdissociation
unfoldingredissolution
complexation

stabilization
coaggregation
dissolution

association
liquid-liquid
phase separation

elutionadsorption
dispersion

desorption

Protein Solution Landscape
Shiraki Lab,Univ.Tsukuba
図 2.

タンパク質がとりうる多様な溶液状態のイメージ図。

配列を明らかにし、水溶液中で形成するネイティブ構造を明らかにしても、タンパク質の可能性の世界からはごく一部しか見ていないことになる。タンパク質を、分子そのものではなく、水分子を含めた「溶液系」としてとらえなおすとき、液 - 液相分離した状態もそのひとつとして研究者が意識するようになり、その見方によって相分離生物学という新しい分野が出てきたのである。

7. 蛋白質溶液学へ

タンパク質の分子の研究は 20 世紀半ば以降、広く興味の持たれた分野である。現在では、分子生物学や生化学、酵素学、構造生物学などの分野として各国に学会があり、教科書が書かれている。一方、タンパク質溶液を研究対象とする分野は、不思議なことに確立してはいない。相分離生物学は、細胞内にあるタンパク質溶液を対象とした分野であり、ようやく 2010 年代後半になって意識されてくるようになったものである。ここでさらに一般的に見方を広げ、タンパク質の溶液状態の全体を扱う分野を、仮に蛋白質溶液学と名づけてみたい。タンパク質を原子レベルの分解能で観察し、物理量に還元して理解するのではなく、タンパク質集合物を現象論的に扱う分野である。
例えば、アルギニンは天然アミノ酸の一種であり、いわばありふれた分子である。しかし、アルギニンをタンパク質溶液に入れると、タンパク質の凝集が抑制できることが知られている 8）。今ではアルギニン溶液は、タンパク質の精製や難溶性分子の分散剤など、さまざまな使い方がされてきている。これらの仕組みは全て同じように理解でき、少し専門的になるが、タンパク質などの分子間の π-π 相互作用をアルギニンが弱めることで、凝集をふせ
いだり、よく溶かしたりするということである。アルギニンの他に、静電相互作用や疎水性相互作用、水素結合などに影響をおよぼす多様な添加剤が開発され、凝集や相分離の制御に応用されてきている 9）。
タンパク質の凝集や相分離は、産業に目を向けると広いテーマに関連している。例えば、私たちが関係している研究例だけでも、卵白の加熱凝集の抑制や 10）、大豆タンパク質の乳化剤としての応用 11）、食肉の溶解度の改良 12）、高濃度の抗体溶液に見られる相分離の抑制 13）、インスリン 14）やポリグルタミン 15）などのアミロイドの形成の制御、髪の毛のようなタンパク質の凝集抑制などの多様な課題がある 16）。これらの課題を持つ業界は食品や医薬品、美容品などに及ぶが、全てタンパク質溶液という見方では共通している。ここでは、どのようにしてタンパク質の溶液状態が保たれているのかという理解と、どのようにすれば制御できるのかという技術の開発が期待されている。
このような多様なタンパク質の溶液状態のひとつが液 - 液相分離であり、細胞内にあるタンパク質の溶液状態の統一的な理解のために相分離生物学が誕生した。これを含めたタンパク質一般の見方が蛋白質溶液学になる。広くタンパク質の溶液状態を扱うた
めには解像度は低い方がよく、できるだけ多様な状態をつなげる
ような見方をすると価値がある。卵白を加熱したときのゲル化をふせぐ分子を、髪の毛の安定化に応用したり、その知見をアミロイドの形成の抑制につなげたりするなど、タンパク質溶液でつながる世界は広い。
これまで産学連携の共同研究をしてきた皆様と、研究室で一緒に研究してきた学生の皆様に感謝したい。

[ 参考文献 ]1）白木賢太郎（編）『相分離生物学の全貌』東京化学同人、2021 年
2）C. P. Brangwynne, et al., Science, 2009, 324, 1729 ‐ 1732.
3）A. Patel et al., Science, 2017, 356, 753-756.
4）A. Patel et al., Cell, 2015, 162, 1066-1077.
5）S. Ray et al., Nat. Chem., 2020, 12, 705-716.
6）A. Klein et al., Science, 2020, 368, 1386-1392.
7）R. Lee et al., Chem. Rev., 2014, 114, 6589-6621
8）H. Hamada et al., Curr. Pharm. Biotechnol., 2009, 10, 400-407.
9）K. Shiraki et al., Biophys Rev., 2020, 12, 587-592
10）T. Hong et al., Food Res. Int., 2017, 97, 272-279.
11）H. Kano et al., Food Chem. X, 2023, 17, 100567.

3

No.186（2023）

12）E. Takai et al., Int. J. Biol. Macromol., 2013, 62, 647-651.
13）Y. Nakauchi et al., Mol. Pharm., 2022, 19, 1160-1167.
14）W. Mori et al., Sci. Rep., 2022, 12, 8556.
15）E. Minakawa et al., Brain, 2020, 143, 1811-1825.
16）K. Shiraki et al., Curr. Pharm. Biotechnol., 2016, 17, 116-125.

出版物のご案内
本総説の白木賢太郎先生の著書、「相分離生物学」は細胞内の液ｰ液相分離の成果を整理し、細胞生物学と分子生物学の間に生まれつつある新しい分野を紹介する書籍です。これからこの分野での研究を始める方ばかりでなく、生命科学分野の幅広い読者におすすめです。

［著者プロフィール］
氏名：白木 賢太郎（Kentaro Shiraki）
所属：筑波大学数理物質系〒 305-8573 茨城県つくば市天王台 1-1-1
Tel：029-853-5306
E-mail : shiraki.kentaro.gb@u.tsukuba.ac.jp
出身学校：大阪大学
学位：博士（理学）
専門分野：蛋白質溶液学、相分離生物学
現在の研究テーマ：タンパク質の凝集や分散の理解

相分離生物学白木 賢太郎 著
東京化学同人2019 年 8 月 2 日発行 A5 判 176 ページ
ISBN 978-4-8079-0965-0

エクソソーム膜・タンパク質 蛍光染色キット① Red
細胞外で凝集しない
ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Green/ Red/ Deep
ExoSparkler Exosome Protein Labeling Kit-Green/ Red/ Deep Red

本製品 Deep Red
（紫）
と製品 P
（緑）
の共染色

本製品 Deep Red（紫）と製品 P（赤）

細胞外の蛍光輝点＜特長＞
・色素が細胞外で凝集しない・本キットだけで蛍光標識から精製まで可能
・標識体はエクソソームの性質にほとんど影響しない

細胞外の蛍光輝点

ExoSparkler シリーズは、精製済みのエクソソーム膜またはタンパク質を染色し、細胞に取り込まれるエクソソームをイメージング
することができます。既存の試薬に比べて①細胞外で凝集せず、②標識体はエクソソームの性質にほとんど影響しません。また、キットに同梱のフィルトレーションチューブで染色後の精製が可能です。
① 細胞外で凝集しない②標識体は性質にほとんど影響しない
本製品 Deep Red
（紫）
と製品 P
（赤）
の共染色

細胞外の蛍光輝点

細胞外の蛍光輝点

観察条件
本製品 Deep Red（紫）：Ex = 640 nm / Em = 640-760 nm
S 社 製品 P（緑）：Ex = 561 nm / Em = 560-620 nm
S 社 製品 P（赤）：Ex = 640 nm / Em = 650-700 nm

10.0

粒子数（x106 particles / ml）

本製品 Deep Red（紫）
と製品 P
（緑）
の共染色

未染色のエクソソーム
Mem-Green

7.5

Mem-Red
Mem-Deep Red

5.0

2.5

0

0

200

400

600

800

1000

粒子径（nm）

本製品によるエクソソーム染色前後での粒子径比較

HeLa 細胞へ本キット (Membrane, Deep Red) または他社製品 P( 緑または赤 ) で染色したエクソ②標識体は性質にほとんど影響しない
ソームを添加し、細胞内へ取り込まれるエクソソームを蛍光顕微鏡で確認しました。その結果、粒子数（x106 particles / ml）

製品10.0P で染色したエクソソームは、色素の凝集が疑われる細胞外の蛍光輝点が確認されました。
未染色のエクソソーム
7.5

Mem-Green
Mem-Red

品名
Mem-Deep Red
ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Green
5.0

2.5

容量
5 samples

希望納入価格（￥） メーカーコード
26,800
EX01

ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Red

5 samples

26,800EX02

0
ExoSparkler
ExosomeMembraneLabeling Kit-Deep Red
0
200
400
600
800
1000

5 samples

26,800

EX03

粒子径
（nm）

ExoSparkler Exosome Protein Labeling Kit-Green

5 samples

21,400

EX04

ExoSparkler Exosome Protein Labeling Kit-Red

5 samples

21,400

EX05

ExoSparkler Exosome Protein Labeling Kit-Deep Red

5 samples

21,400EX06

本製品によるエクソソーム染色前後での粒子径比較4染色前後で、NTA とゼータ電位を測定した結果、ほとんど影響を及ぼさないことが確認されました。

No.186（2023）

Topics on Chemistry

神経変性疾患と LLPS の関わり
株式会社同仁化学研究所

LLPS 研究分野と神経変性疾患
近年、生命現象を解き明かす新たな研究として、細胞内で生じる液‐液相分離（liquid – liquid phase separation: LLPS）が注目を浴びている。LLPS は細胞内で RNA やタンパク質などの高分子が局所的に集まり、水と油のように細胞質から分離して液滴を形成する現象である。それは核小体に代表されるような、生体膜を持っていない（膜で区切られていない）固有の働きをもつ集合体（droplet）であり、オルガネラのように様々な生理現象を担う場となっている。ほぼすべての細胞内現象で LLPS が関与しているとも言われており、神経変性疾患に関わる研究も盛んに行われている。例えば、細胞内でのタンパク質凝集が病因となる疾患（ミスフォールディング病）のうち、パーキンソン病や前頭側頭葉変性症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症においては、それらの原因タンパク質である α - シヌクレイン、FUS、タウ、TDP43 が droplet を形成することにより、凝集体形成が促進される 1）。
LLPS は生体現象を解明するための新たな糸口であり、神経変性
疾患と LLPS の関与を明らかにすることで病態の理解、新規治療法の開発に繋がることが期待されている。
Droplet か凝集体か
ミスフォールディング病の病態を明らかにしていく上で、タン
パク質凝集過程における droplet と凝集体の境目を見分けることは重要である。LLPS を評価する実験において、試験管内や細胞内に形成された droplet と凝集体をどうやって見分けているのだ
ろうか。タンパク質凝集が原因とされる疾患では、in vitro 環境
下でタンパク質を凝集させる実験が古くから行われてきたが 2）、
蛍光プローブや蛍光タンパク質を利用して観察しただけでは蛍光の集合が何を示すのか判断できない。そこで、droplet を判断する手法の一つとして、分子動態を観察できる FRAP（光褪色後蛍光回復法）が使用されている 3）。レーザーにより褪色させた領域の蛍光回復の程度をもとに、「蛍光の集合に流動性があるか」を確認することで、droplet かどうかを判断できる（図 1）。Droplet を細胞内で観察するためには標的タンパク質に GFP を発現させてFRAP によって評価するが、最近では羽澤らによりピレン化合物を応用した LLPS に応答する低分子プローブも報告されており 4）、LLPS の検出手法についても盛んに研究が進められている。
部分的にレーザーを集光し褪色させる

時間経過で蛍光が回復⇒分子流動性がある

時間経過

元輝

ン（TTR）に関して、凝集過程における LLPS の関与が報告されている 5）6）。しかし、アミロイドーシスの原因タンパク質は細胞外タンパク質であり、生じるアミロイド線維も細胞外に沈着するため、そこに細胞内の現象である LLPS がどのように関与するかは不明である（図 2）。また、細胞外（細胞外のマトリックス、または血中など）において線維形成を促進するような LLPS が生じるかも確認されていない。したがって、原因タンパク質がどのように細胞内外を移行するのか、細胞外において LLPS 形成が起きているのか、患者病態において実際に LLPS が観察されるのか、などまだまだ解明すべき点は多い。
①TTR のアミロイド形成モデル（細胞外）

TTR 四量体②細胞内で LLPS 形成？
細胞内

解離、変性

？

解離、変性、LLPS 形成

凝集、オリゴマー化

線維化、細胞外組織沈着？
凝集、オリゴマー化③細胞外で LLPS 形成？

？
TTR 四量体

解離、変性、
LLPS 形成

凝集、オリゴマー化

線維化、細胞外組織沈着

図2 . TTR のアミロイド形成モデルとLLPS関与の仮説

今後の LLPS 研究
LLPS 研究の広がりの観点から、神経変性疾患に関する最近の知見を紹介したが、これらの研究は人工的な LLPS 形成や細胞株を使った in vitro 実験系での検証が多い。今後どのように実際の患者病態に近づけるか、あるいは有用な細胞モデル、in vivo モデルをどう作製していくかが課題である。さらに、真に病態との関連を示すためには、患者生体内や生体サンプルでの観察手段が不可欠になってくる。今後、LLPS 研究分野が発展し、多くの疾患の原因究明に貢献していくことを期待する。

蛍光が回復しない

凝集体

発蛍光領域

末永

droplet図１. FRAP（光褪色後蛍光回復）法の原理

LLPS はアミロイドーシスにも関与しているのか
次に、同じくミスフォールディング病に分類されるアミロイドーシスと LLPS との関連についても焦点を当ててみる。前述の通り、細胞内にタンパク質凝集が生じる疾患と LLPS の関与が示唆されているが、一方でアミロイドーシスと LLPS との関連を証明するには気を付けなければならない点もある。例えば、アルツハ
イマー病の原因タンパク質である アミロイド β、家族性アミロイ
ドポリニューロパチーの原因タンパク質であるトランスサイレチ[ 参考文献 ]1）A. Zbinden et al.,“Phase Separation and Neurodegenerative Diseases: A
Disturbance in the Force”, Dev Cell, 2020, 55, 45-68.
2）W. Colon and J. W. Kelly,“Partial denaturation of transthyretin is sufficient
for amyloid fibril formation in vitro”, Biochemistry, 1992, 31, 8654-60.
3）N. O. Taylor et al.,“Quantifying Dynamics in Phase-Separated Condensates
Using Fluorescence Recovery after Photobleaching”, Biophys. J., 2019,
117, 1285-1300.
4）M. Hazawa et al.,“A light-switching pyrene probe to detect phaseseparated biomolecules”, iScience, 2021, 24, 102865.
5）X. Gui et al.,“Liquid-liquid phase separation of amyloid- β oligomers
modulates amyloid fibrils formation”, J. Biol. Chem., 2023, 299, 102926.
6）G. Duan et al.,“The Regulatory Mechanism of Transthyretin Irreversible
Aggregation through Liquid-to-Solid Phase Transition”, Int. J. Mol. Sci.,
2023, 24, 3729.

5

No.186（2023）

脂肪滴染色蛍光試薬
Lipi-Blue / Green / Red / Deep Red＜特長＞※
・脂肪滴への高い選択性
・4 色のラインナップでフィルターの選択性が高い
・細胞内滞留性が高い

滞留性のデータや参考文献はこちら
脂肪滴

同仁

検索

※

既存の Nile Red との比較

Lipi シリーズは、脂肪親和性の高い低分子蛍光試薬で疎水性環境下で蛍光が増強します。
＜実験例：脂肪細胞の脂肪滴イメージング＞
脂肪前駆細胞 3T3-L1 細胞由来の脂肪細胞を本製品群で染色したところ、脂肪細胞中の脂肪滴が明瞭に検出されました。

3T3-L1 細 胞（1.5 x 104 cells/well） に 各 色 素 のWorking solution を添加後 37 ℃で 24 時間インキ
ュベートし、蛍光顕微鏡にて観察した。
※色素濃度：各 2.5 µmol/l

Lipi-Blue

品名

容量10 nmol

希望納入価格（￥） メーカーコード
19,900LD01

Lipi-Green

10 nmol

19,900LD02

Lipi-Red

100 nmol

19,900LD03

Lipi-Deep Red

10 nmol

19,300LD04

脂肪滴測定キット
Lipid Droplet Assay Kit Blue / Deep Red

Deep Red のデータ、製品の詳細はこちら
脂肪滴キット＜特長＞
・脂肪滴の量的変動を数値化することが可能

同仁

検索

本製品は、試薬を添加するだけで生細胞および固定化細胞中の脂肪滴をイメージングまたは量的変動を数値化することができます。
マイクロプレートリーダーやフローサイトメーターの使用が可能です。
プレートアッセイ

フローサイトメトリー

2.5

1.5

1.0

オレイン酸

Control

0.5

06

Triacsin C

2.0

count

Relative lipid droplets expression

3.0

102
Control

オレイン酸

Triacsin C

103

104

Pacific-Blue

105＜実験例 : Lipid Droplet Assay Kit - Blue ＞
HeLa 細胞（プレートアッセイ）と A549 細胞（フローサイトメトリー）に、オ
レイン酸または脂肪滴形成阻害剤 Triacsin C を添加して脂肪滴の量的変化を数値化しました。
その結果、コントロールと Triacsin C 添加の場合と比較して、オレイン酸添加の場合に脂肪滴の量が増加していることを確認しました。
プレートアッセイ：
Ex = 376-386 nm, Em = 435-455 nm
フローサイトメトリー：
Ex = 405 nm, Em = 425-475 nm

品名Lipid Droplet Assay Kit - Blue

容量
1 set

Lipid Droplet Assay Kit - Deep Red

1 set

希望納入価格（￥） メーカーコード
26,800LD05
26,800LD06

No.186（2023）

新製品
死細胞染色色素
Dead Cell Makeup Blue – Higher Retention than PI
Dead Cell Makeup Deep Red – Higher Retention than PI※

詳細はこちら＜特長＞
・細胞の固定化・膜透過処理後に色素が漏れ出ない
・フローサイトメトリーで死細胞を明確に識別できる※・ストック溶液の長期保存が可能

C555 または C556

検索

同仁

死細胞染色色素として Propidium Iodide (PI) が広く使用されていますが、細胞の固定化・膜透過処理により細胞からの漏れ出しが起きることが知られています。漏れ出た PI は生細胞も染色してしまうため、偽陽性の結果をもたらす可能性があります。本製品は、細胞膜非透過性のため生細胞には入り込まず、死細胞の損傷した膜を通って入り込み、細胞内のタンパク質と安定な共有結合を形成します。そのため、細胞の固定化・膜透過処理後に細胞から色素が漏れ出しません 。
＜ PI の課題を解決＞
本製品はタンパク質と安定な共有結合を形成するため、細胞の固定化・膜透過処理を行った後も色素が漏れ出さず、死細胞を明確に識別でき、データから除外することができます。
死細胞を染色固定化・膜透過処理

生・死細胞の確認

FCM 解析
死細胞を除かずに解析すると ...

250

674

200

重なり

506

固定化・膜透過処理

生・死細胞の確認

PI
Live Cell

Live Cell

Dead Cell

FCM 解析
337

100

死細胞を除かずに解析すると ...

Dead Cell

250

150

SSC-A

死細胞を染色

50

674

168

200

0

PI

PI

104

重なり10

3

150

105
0

0

103

104

細胞集団が複数に分かれる
0

104

103

生細胞のみ解析105

細胞集団が複数に分かれる

解析が困難
Live Cell
250

未染色

Dead Cell

200

SSC-A

250

Live Cell

未染色

Dead Cell

100

200

Dead Cell

誘導あり
168

50

Dead Cell

150

誘導あり

337

誘導なし

506

Live Cell
SSC-ALive Cell

誘導なし

506

生細胞のみ解析
150

674

本製品

105

解析が困難
674

漏れ出た PI が生細胞に入り込む

104

105

PI

死細胞の核と相互作用

103

337

100

漏れ出た50PI が生細胞に入り込む 168
死細胞の核と相互作用
Live Cell
Dead Cell
Dead Cell

Live Cell

337

100

Live Cell

Dead Cell

Dead Cell
LiveMakeup
Cell0

死細胞内・膜表面の死細胞内・膜表面の タンパク質に結合色素が死細胞からタンパク質に結合

103

104

105
0

168

50

Dead Cell

色素が死細胞から漏出しない生・死細胞を
0

Dead Cell Makeup

漏出しない

103

104

105
0

103

生・死細胞を
明確に区別
104

105

103

104

105

対象を正確に検出

対象を正確に検出

明確に区別

＜実験例＞
Ionomycin (500 ng/ml) と PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate, 50 ng/ml) を含む RPMI 培地で 48 時間刺激を行った MOLT-4 細胞を、本製品を用いて死細胞を染色し、PD-1 の発現を免疫染色法にて検出しました。その結果、死細胞と生細胞を明確に区別でき、生生・死細胞確認
PD-１検出細胞のみゲーティングを行った解析結果では、刺激を行った細胞群で優位に生・死細胞確認
PD-１検出 PD-1 発現量の上昇が認められました。

Live Cell

Live Cell

250

Dead Cell

Dead Cell

未染色
Live Cell

100

100

103

104
BV421-A

Ex = 405 nm, Em = 450/50 nm
337(Paciﬁc Blue, Brilliant Violet 421, Alexa Fluor 405)
Deep Red: Ex = 640 nm, Em = 670/30 nm(APC, Alexa Fluor 647, Cy5)
168

50
105

0

0

103

103
104
Alexa-Fluor-647-A

104
BV421-A

105

105

誘導あり

506

Blue:

337

168

100

50

50
0

150

SSC-A

150

150

SSC-A

SSC-A

SSC-A

150

50

誘導あり

200

200

100

誘導なし
Dead Cell

506

200

200

674
一次抗体
: 抗 PD-1 マウス抗体
未染色
誘導なし
二次抗体
: 抗マウス抗体-Alexa 488

SSC-A

Live Cell

674

250

250Cell
Dead

生細胞をゲーティング後に解析Dead生細胞をゲーティング後に解析
Cell Makeup Deep Red

Dead
Cell Makeup
Dead Cell
MakeupBlue Deep Red

Dead Cell Makeup Blue
250

SSC-A

本製品

SSC-A

506

0

103

104

105

Alexa-Fluor-488-A

0

103
104
Alexa-Fluor-647-A

105

品名
Dead Cell Makeup Blue – Higher Retention than PI

容量100 tests

Dead Cell Makeup Deep Red – Higher Retention than PI

100 tests

0

103

104

105

Alexa-Fluor-488-A

希望納入価格（￥） メーカーコード
39,000C555
39,000C556

7

No.186（2023）

連載

生命科学の最前線～熊本大学若手研究者の現場から～本号より小社が立地する熊本県の生命科学研究最前線を、熊本大学の若手研究者が連載（8 回）でお届けします。

次世代プロテオミクス技術の開発と展開
Development and application of next-generation proteomics technologies

Abstract

熊本大学大学院
生命科学研究部教授

Proteomics is a method for comprehensively quantifying
p ro t e i n s p re s e n t i n a s a m p l e . I n t h e p a s t , p ro t e o m i c stechnologies had low protein coverage and sensitivity. In recent
years, the development of related technologies has been
tremendous, and it is now possible to quantify 10,000 different
proteins in a single shot of liquid chromatography tandem mass
spectrometry (LC-MS/MS) by using the developed MS methodand data analysis software. In addition, it possible to obtained
proteomic information even from a single cell by developed
sample preparation methods. Recent developments enable toobserve not only protein-protein interactions but also proteinsmall molecule interactions. Protein observation is indispensable
for life science research. In this article, we hope researchers
will find that proteomics a useful technology and apply theproteomic techniques into their own research to help clarify theirquestions.

1. はじめにタンパク質は生命活動にとって重要な分子群である。タンパク質は単独で機能することは少なく、タンパク質や代謝物、DNA など
その他生命分子と相互作用することで特有な機能を発動する。また、細胞内外で発生したシグナルを伝達するためにタンパク質群が複雑なネットワークを形成している。プロテオミクスは試料中に存在するタンパク質を網羅的に観察する方法であり、タンパク質の役割を明らかにするために生命科学分野で多く用いられている。

プロテオミクスは前処理、質量分析およびデータ解析の 3 工程に大きく分かれている（図 1）。前処理工程では、試料からタンパク質を抽出し消化酵素でペプチドにする。質量分析工程では、前処理工程で得られたペプチドを液体クロマトグラフィータンデ
ム質量分析（LC-MS/MS）に導入し、ペプチドの配列を質量情報として取得していく。データ解析工程では、分析工程で得られた質量情報からソフトウェアを用いてペプチドおよびタンパク質の増田 豪
慶應義塾大学大学院
政策・メディア研究科
先端生命科学研究所
特任講師

大槻 純男

ペプチド

.........
........
.......
......
.....
....
...
..
.

量

消化

.........
........
.......
......
.....
....
...
...

タンパク質

m/z（質量情報）

前処理工程
試料から抽出したタンパク質をペプチドに消化する。

質量分析工程LC-MS/MS でペプチドの質量情報を取得する。

図18

データ解析工程
ペプチド質量情報をデータベースと照合しタンパク質を同定する。

No.186（2023）

Data dependent acquisition（DDA）

✓

✓

ペプチド①

ペプチド②

ペプチド②

ペプチド①

量

量

ペプチド③は量が少ないため存在していてもペプチド配列
情報を取得できない。

量

×
ペプチド③

m/z（質量情報）m/z（質量情報）

量の多いペプチドのみを選択（✓）

m/z（質量情報）

ペプチド配列情報を取得する。

Data independent acquisition（DIA）

✓✓✓✓✓
ペプチド①

ペプチド①

ペプチド②

ペプチド③

ペプチド②

量が少なくてもペプチド配列情報を取得できる。

量

量

ペプチド③

m/z（質量情報）

全領域を選択（✓）

m/z（質量情報）

ペプチド配列情報を取得する。

図2

定性および定量を行う。これら各工程に用いられる手法は年々改良・開発され、20 年前に比べてプロテオミクスの用途は大きく広がった。特に網羅性や高感度性能は飛躍的に向上している。本稿では近年のプロテオミクスの発展に寄与したこれら２つの技術について主に紹介する。

2. 網羅性の改善
ヒトの遺伝子は約 20000 種類あるとされ、そのうち約 1 万数
千種類がタンパク質として発現していると考えられている 1）。プ
ロテオミクスはかつて、同定できるタンパク質の網羅性の低さが課題だった。以前は質量分析計でペプチドを測定する場合、data
dependent acquisition（DDA）でペプチドの配列情報を取得することが一般的だった。DDA は、検出量が多い順にペプチドを選択し、それらについてペプチド配列情報を取得する方法である（図2 上段）。LC-MS/MS では一度に複数のペプチドが同時に検出されるため、質量分析計の処理スピードが追い付かない場合は配列情報を取得できないペプチドが出てくるため同定結果の再現性が低かった。そこでこれまで、タンパク質やペプチドをその生化学的特性にしたがって分画 2）3）したり LC の分離能を上げる 4）こと
で問題を解決しようとしてきた。これらの方法を用いることで大幅に同定数は増加したものの、それでもプロテオミクス結果の低い再現性は解決できなかった。
現在は data independent acquisition（DIA）で測定することでこの問題を解決できている。DIA はペプチドの検出量情報に依存せず、質量分析計に導入された全てのイオンについて配列情報を取得する方法である（図 2 下段）。そのため、DIA は DDA モードに比べてデータ間で同定されるタンパク質の再現性が高くなる。

一方で、DIA では正しくペプチドを同定するために DDA データと照らし合わせる必要があったため、同定できるタンパク質の数はDDA データに依存していた。近年、ニューラルネットワークなどを用いて過去の質量分析データを学習させることで、アミノ酸配列からペプチド配列情報を高精度に予測できるようになった 5）。
このことから、DDA データが不要となり FASTA ファイルで DIA
データの正確な解析が可能となった。LC-MS の高度化も合わさ
り、DIA で測定することで 1 回の分析で 10000 種類を超えるタン
パク質を定量できることが報告されている 6）。
DIA は現在、プロテオミクスの一般的な質量分析方法となった。
一方で翻訳後修飾解析やマルチプレックス解析など DDA が得意とする部分もあり、使い分けることで目的に即したデータを取得することが求められる。

3. 高感度化
一般的なプロテオミクスでは 200 ~ 1000 ng の消化したペプチ
ドを LC-MS/MS に導入する。これだけの量のペプチドを調製す
るには初期試料として 1 万個程度の細胞が必要である。一方で、疾患組織片やセルソートした希少細胞集団など、1 万個の細胞に満たない微量試料についてもプロテオミクスを行いたいといった需要も多い。微量試料を高感度に分析するために、これまで LC
部分を中心に改良されてきた 7）。近年では、1 細胞プロテオミク
スへの展開が期待され、さらなる高感度分析が必要とされてきた。
質量分析計自体は 1 細胞に含まれるほとんどのタンパク質を検出できるほど十分に高感度であることが知られている 8）。一般的な前処理方法で 1 細胞のプロテオミクスを行うとタンパク質はほぼ同定できないことから、現在は前処理方法の高感度化が行われて

9

No.186（2023）

従来法

容器

油中液滴法
（Water droplet-in-oil digestion, WinO 法）

容器

ペプチド

タンパク質

油

試料
水滴

試料溶液

消化

前処理工程
試料溶液と容器が触れている接面
接面積が小さい WinO 法では吸着損失が抑えられ回収率が向上する。
図3

いる。1 細胞プロテオミクスにおける一般的な前処理方法の問
題点は、1 細胞から抽出した極微量のタンパク質が吸着損失してしまうことである（図 3）。タンパク質は遺伝子のようにそれを鋳型に増幅することができないため、いかに損失することな
く LC-MS/MS に導入するかが重要となる。1 細胞プロテオミク
スを可能とするために前処理方法がこれまでいくつか報告されている 9）10）。1 細胞プロテオミクスの前処理技術には高回収率でありマルチウェルプレートを用いて 1 度に複数の 1 細胞を同時に処理できることが求められる。さらに 1 細胞プロテオミク
ス研究領域の間口を広げるためには誰もが使用できるような簡便な手法が必要であり、開発した研究チームしか持っていない
ような特殊な装置を使わない技術が望ましいと筆者は考えている。筆者らはこれら要件を満たす前処理技術として油中液滴法（Water droplet-in-oil digestion, WinO）を開発した（図 3）11）。
WinO 法は油の中に形成した微小な水滴でプロテオミクスの前処理を行う方法である。WinO 法では、試料溶液の形状が球体に近づきチューブとの接面積が大幅に縮小し回収率が従来の消化方法に比べて 10 倍向上した。セルソーターで細胞をマルチウェルプレート中の油中液的に直接導入でき、液体ハンドリング
ロボットで前処理を行える。また、質量分析計で検出されたペプチドイオンの由来細胞を見分けられるタグとなる安定同位体
標識試薬を用いることで最大 16 個の 1 細胞を混合して１回のLC-MS/MS でデータを取得できる。1 個の細胞から約 800 種類のタンパク質を定量できる WinO 法は 1 細胞プロテオミクスに有用な簡便な方法である。

4. その他のプロテオミクス技術とその利用
上述した技術以外にも、プロテオミクスはいろいろな前処理方
法と組み合わせることで様々な用途に利用されてきている。例えば、抗体などを用いたアフィニティーカラムにより標的を濃縮して、翻訳後修飾情報や相互作用情報を取得することができる。相互作用解析においては近年、近接依存的標識できる酵素を用いた方法が利用されている。標的タンパク質に TurboID12）や APEX213）などの近接依存的標識酵素をフュージョンさせて発現させること
で、弱いもしくは短時間の相互作用タンパク質でも同定できるようになった。また、この方法は細胞内の標的タンパク質が局在している部位で標識が完了するため、標識後の試料調製時に相互作
用してしまう偽陽性タンパク質を減らすことができることが大きな利点である。タンパク質 - タンパク質相互作用以外にも、サーマルシフトアッセイと組み合わせることで、低分子化合物と相互作用するタンパク質候補を網羅的に同定することができる 14）。サーマルシフトプロテオームプロファイリングは、低分子と相互作用するタンパク質の熱安定性が上昇することを利用して、熱変性
温度が上昇したタンパク質を網羅的に探索する手法である。この10

方法は培養細胞、血清や組織など幅広く応用可能されており、またサーマルシフトアッセイ方法を改良することで膜タンパク質と低分子化合物の相互作用解析にも用いられている 15）16）。

5. 今後の展開
プロテオミクスの今後期待される展開として網羅的なプロテオ
フォーム解析手法の確立がある。同じ遺伝子から発現したとしても異なるプロセッシングを受けた多様なプロテオフォームが細胞内には存在する。プロテオフォームはタンパク質の機能を理解するうえで重要であるものの、プロテオミクスではペプチドまで断片化するためプロテオフォーム情報は失われてしまう。プロテオ
フォームを網羅的に解析するために、長いペプチドやタンパク質を測定できる前処理方法、質量分析方法やデータ解析手法の開発が重要になってくるだろう。また、大規模なプロテオームデータ
から生命現象を説明するために必要な解析手法の開発も今後期待される課題の一つである。遺伝子のノックアウトや薬剤投与など
細胞に摂動を与えると多くのタンパク質の発現量が変動する。大規模なプロテオミクスデータから得られる数多くの変動タンパク質からどれを選ぶべきなのか迷ってしまうことは多々ある。プロ
テオミクスを行えば発生している生命現象を簡単に捉えられるわ
けではない。研究課題に沿ったタンパク質を候補群の中から絞り込む解析手段を充実させることでプロテオミクスデータの有用性がさらに向上すると期待している。

6. おわりに
20 年前から考えると今のプロテオミクスは夢のようである。
プロテオミクスのアプローチが多く、網羅性が高い方法もあれば1 個の細胞からでもプロテオミクス情報を取得できる高感度な方法もある。このことを考えると、今のプロテオミクスにできない
ことでも数年後にはできるようになっている可能性は高く、プロ
テオミクスは生命科学研究にますます貢献できる分析技術となるだろう。本稿が生命科学研究者にとってプロテオミクスを積極的に利用していただくきっかけになることを期待している。

[ 参考文献 ]1）M. Wilhelm, J. Schlegl, H. Hahne, A. M. Gholami, M. Lieberenz, M. M.
Savitski, E. Ziegler, L. Butzmann, S. Gessulat, H. Marx, T. Mathieson, S.
Lemeer, K. Schnatbaum, U. Reimer, H. Wenschuh, M. Mollenhauer, J.
Slotta-Huspenina, J. H. Boese, M. Bantscheff, A. Gerstmair, F. Faerber, B.
Kuster, Nature, 2014, 509, 582-587.
2）K. Rezaul, L. Wu, V. Mayya, S. I. Hwang, D. Han, Mol. Cell. Proteomics,
2005, 4, 169-181.
3）T. S. Batth, C. Francavilla, J. V. Olsen, J. Proteome. Res., 2014, 13, 6176-

No.186（2023）

6186.
4）M. Iwasaki, S. Miwa, T. Ikegami, M. Tomita, N. Tanaka, Y. Ishihama, Anal.
Chem., 2010, 82, 2616-2620.
5）V. Demichev, C. B. Messner, S. I. Vernardis, K. S. Lilley, M. Ralser, Nat.
Methods, 2020, 17, 41-44.
6）Y. Kawashima, H. Nagai, R. Konno, M. Ishikawa, D. Nakajima, H. Sato, R.
Nakamura, T. Furuyashiki, O. Ohara, J. Proteome. Res., 2022, 21, 1418-1427.
7）T. Masuda, N. Sugiyama, M. Tomita, Y. Ishihama, Anal. Chem., 2011, 83,
7698-7703.
8）R. D. Smith, Y. Shen, K. Tang, Acc. Chem. Res., 2004, 37, 269-278.
9）Y. Zhu, P. D. Piehowski, R. Zhao, J. Chen, Y. Shen, R. J. Moore, A. K.
Shukla, V. A. Petyuk, M. Campbell-Thompson, C. E. Mathews, R. D. Smith,
W. J. Qian, R. T. Kelly, Nat. Commun., 2018, 9, 882.
10）H. Specht, E. Emmott, A. A. Petelski, R. G. Huffman, D. H. Perlman, M.
Serra, P. Kharchenko, A. Koller, N. Slavov, Genome Biol., 2021, 22, 50.
11）T. Masuda, Y. Inamori, A. Furukawa, M. Yamahiro, K. Momosaki, C. H.
Chang, D. Kobayashi, H. Ohguchi, Y. Kawano, S. Ito, N. Araki, S. E. Ong, S.
Ohtsuki, Anal. Chem., 2022, 94, 10329-10336.
12）K. F. Cho, T. C. Branon, N. D. Udeshi, S. A. Myers, S. A. Carr, A. Y. Ting,
Nat. Protoc., 2020, 15, 3971-3999.
13）V. Hung, N. D. Udeshi, S. S. Lam, K. H. Loh, K. J. Cox, K. Pedram, S. A.
Carr, A. Y. Ting, Nat. Protoc., 2016, 11, 456-475.
14）M. M. Savitski, F. B. Reinhard, H. Franken, T. Werner, M. F. Savitski, D.
Eberhard, D. Martinez Molina, R. Jafari, R. B. Dovega, S. Klaeger, B.
Kuster, P. Nordlund, M. Bantscheff, G. Drewes, Science, 2014, 346,
1255784.
15）F. B. Reinhard, D. Eberhard, T. Werner, H. Franken, D. Childs, C. Doce,M. F. Savitski, W. Huber, M. Bantscheff, M. M. Savitski, G. Drewes, Nat.
Methods, 2015, 12, 1129-1131.
16）J. Perrin, T. Werner, N. Kurzawa, A. Rutkowska, D. D. Childs, M. Kalxdorf,
D. Poeckel, E. Stonehouse, K. Strohmer, B. Heller, D. W. Thomson, J.
Krause, I. Becher, H. C. Eberl, J. Vappiani, D. C. Sevin, C. E. Rau, H.
Franken, W. Huber, M. Faelth-Savitski, M. M. Savitski, M. Bantscheff, G.
Bergamini, Nat. Biotechnol., 2020, 38, 303-308.

［著者プロフィール］
氏名：増田 豪（Takeshi Masuda）
所属：慶應義塾大学大学院政策・メディア研究科 / 先端生命科学研究所〒 997-0017 山形県鶴岡市大宝寺日本国 403-1
TEL : 0235-29-0572
FAX : 0235-29-0536
E-mail : t-masuda.z3@keio.jp
出身大学 : 東京農業大学
学
位 : 博士（生物産業学）
専門分野 : プロテオミクス、分析化学
現在の研究テーマ : 1 細胞プロテオミクス技術の開発とその利用、
多発性骨髄腫の薬剤耐性機構解明
氏名：大槻 純男（Sumio Ohtsuki）
所属：熊本大学大学院生命科学研究部〒 862-0973 熊本県熊本市中央区大江本町 5-1
TEL: 096-371-4323
FAX: 096-371-4329
E-mail : sohtsuki@kumamoto-u.ac.jp
出身大学 : 東京大学
学
位 : 博士（薬学）専門分野 : プロテオミクス、生物薬剤学
現在の研究テーマ : DIA プロテオミクス開発と血液脳関門の機能解明
編集部注
増田豪先生は執筆当時（2023 年 3 月）、熊本大学大学院生命科学
研究部・薬学系に在籍されていました。

学会展示のご案内

製品取扱説明書 変更のお知らせ●第 22 回 ミトコンドリア学会

取扱説明書が PDF 版ダウンロードから Web 版へリニューアル※
します。

会期：2023 年 11 月 14 日 ( 火 ) ～ 15 日 ( 水 )会場：つくば国際会議場●第 46 回 日本分子生物学会年会

会期：2023 年 12 月 6 日 ( 水 ) ～ 8 日 ( 金 )会場：神戸ポートアイランド
展示ブースにて小社担当者がお待ちしております。ぜひお立
ち寄りください。

細胞機能解析冊子リニューアル

5th Edition

Analysis for Cellular Function

細胞増殖 / 細胞毒性

細胞内代謝

ミトコンドリア
酸化ストレス
生体硫黄
細胞老化
脂肪滴

膜動態 / 膜形態

オートファジー
エクソソームオルガネラや細胞内代謝など、細胞機能解析の製品（100製品以上）を集めた冊子「細胞機能解析」は大変ご好評をいただき、第 5 版を発行いたしました。Web からご覧いただけます。
紙媒体でご希望の方は販売店様、お問い合わ
せよりご請求ください。

抗体標識

細胞機能解析同仁

検索

PDF ダウンロード版

Web 版

・全てのデバイスからダウンロード不要で閲覧いただけます。
・操作手順など必要な部分だけを選んで印刷ができます。
・製品ページの「よくあるご質問」や「論文情報」へアクセ
スしやすくなります。（印刷時は、製品ページへの QR コー
ドが記載されます）※ 内容に変更はございません。
※ 取扱説明書のある全製品へ順次変更いたします。

11

No.186（2023）

連載

抗酸化キットを使う前のサンプル前処理法 〈第 2 回〉
株式会社同仁グローカル
今号では、DPPH 測定キットの前処理について進めていきます。
3．DPPH 法について
DPPH 法は、抗酸化能測定法の中で最も簡便な手法と言えます。
DPPH（2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl）は、化合物自体が紫色（λ max= 517 nm）のラジカル物質でありながら比較的安定である
ため、固体の DPPH をエタノール等の溶剤で溶解するだけで使用できます。DPPH 法に類似した測定方法は ABTS 法などがありま
すが、ラジカル物質が DPPH 程安定ではないため、酸化剤を用いてラジカル物質を用時調製する必要があります。

DPPH 法は、試薬調製が簡便であるため、操作によるバラツキ
や誤操作のリスクが小さいと考えることができます。しかしながら、実際の試料で測定を行った場合、データの再現性が良くなかったり、文献等とデータが整合しなかったりする事例が多いようです。その理由を考えると、試料の前処理（目的成分の抽出）方法による要因が大きいと考えられます。
試料の前処理の基本的な流れは、①試料の選定、②抽出溶媒、緩衝剤の選定、③試料の破砕、④試料の抽出、⑤除タンパク、不溶物の除去、になり、プロセス毎に測定値の差異が生じる要因を挙げていきます。
①試料の選定同じ試料であっても、品種、産地、熟成の程度等により、構成成分に差があり、当然、個体差もあるので、できるだけ標準的なものを選定することが望ましいです。

山口勝則

ホモジナイズというのが一般的ですが、場合によっては液体窒素で凍結させて破砕するというのも有効です。
また、一見乱暴に見えますが、分解酵素の影響を考えると、熱処理を行うのも酵素の影響を考えれば有効な手段の 1 つです。ただし、加熱すれば、ビタミン C がかなり失われるので、肉類のよ
うにビタミン C をあまり含有しない試料やビタミン C の関与を想定しない場合は有効です。
また、酸化防止の目的で、2-ME や DTT の還元剤を使用する場
合がありますが、DPPH 法では影響するので使用は避けるべきです。塩濃度やキレート剤によって酵素活性を抑えられるものもありますが、DPPH 法は高濃度のエタノール溶媒中で行うため、不溶物の析出が懸念されるので避けるべきです。
④試料の抽出破砕後に所定の溶媒条件で抽出を行いますが、アルコール等の溶剤を必要量加えてドライアイスや液体窒素で冷却しながらホモジナイズすることで、分解酵素の活性を低下させ、凍結せず氷点下で処理でき、試料の劣化を抑えられる方法もあります。
DPPH は水分を 50% 以下で維持しないと不溶化するので高濃度のアルコール溶液として抽出しますが、抽出時のアルコール濃度により親水性物質と疎水性物質の回収率のバランスが変化するので、条件は厳密に合わせる必要があります。
⑤除タンパク、不溶物の除去
DPPH 法 の 場 合、 酵 素 に よ る 抗 酸 化 能 は 関 与 し な い の で、DPPH が吸着する等して測定に支障をきたす恐れのあるタンパク質や濁りの原因になる不溶成分は、極力除去しておきたいところです。
遠心分離後にメンブランフィルター等で濾過して不溶物を除去するのは吸光度を正確に測定するため有効ですが、試料の粘性や溶媒の種類によっては濾過が困難な場合があるので、遠心分離後の上澄みの濁りが許容範囲なら濾過操作は省略できます。

【DPPH の反応性について】
DPPH が疎水性であるため、親水性のビタミン C 等より、ビタ②抽出溶媒、緩衝剤の選定
ミン E 等の疎水性成分との相性が良いと考えられます。
溶媒の種類については、エタノールやメタノールのアルコール
そのため、試料を前処理する際は疎水性成分が主体になりがち類が通常使用されますが、アルコール類以外の溶剤では抗酸化能ですが、抗酸化能の評価試験の場合、定量分析的な物質量に比例は低下する傾向にあります。また、緩衝剤では、PBS 等のリンする化学反応ではなく、反応して酸化した抗酸化物質が他の抗酸酸塩よりも Tris-HCl 系の方が高い活性を示し、さらに Tris 濃度に化物質や還元剤によって再生される仕組み 2）があることで、より複雑な様相となってしまいます。
も依存する傾向がみられます。これらの点は、抗酸化物質のフェ
生体試料の場合、抗酸化物質の他に多数の生体由来成分があり、ノール性水酸基（-OH）の電子移動に溶媒のアルコールや緩衝剤
それ自体が DPPH と直接反応しなくても、酸化されたビタミン Eの Tris の複数の隣接した水酸基が関与していると考えられていま等を還元して元の状態に戻す反応を媒介する成分が含まれることす 1）。そのため、再現性が必要な場合、溶媒や緩衝液組成を厳密に合わせる必要があります。
で、ビタミン E の含有量以上の抗酸化能を示すことができます。
α - リポ酸等の両親媒性の抗酸化物質、界面活性剤やシクロデキス
溶媒にケトン類（アセトン）やエステル類、エーテル類等の疎水性溶剤を用いる場合、疎水性の抗酸化成分の抽出に有効ですが、 トリン等の安定化剤によって抽出効率や反応性に差が生じます。
測定に使用する透明のウェル（通常、ポリスチレン製）が白濁して測定に支障が出る場合があるので、アルコール系以外の溶媒を 【まとめ】
DPPH 法は、測定操作が簡便な一方で、疎水性の抗酸化成分が用いる場合は、事前に確認しておくと良いです。
主な対象となるため、使用する溶剤、緩衝剤、抽出条件等で影響を及ぼす因子が多くなり、高い再現性を求める場合は、これらの③試料の破砕
生体試料の場合、細胞が破壊されると、分解酵素や酸化酵素、 条件を厳密に合わせることが必要と考えられます。
等が放出され、自己分解が進み劣化します。野菜や果物の切り口の褐変、魚の切り身の溶解がその一例です。
試料の破砕時、破砕後の自己分解を抑えるためには、より低温で操作するのが望ましいです。冷却方法としては、氷冷しながら12【参考文献】

1）山内良子 , " 酸化防止剤力価評価を目的とした DPPH ラジカル消去におよぼす反応溶媒の影響 ", 日本食品保蔵科学会誌 , 2016, 42（5）.
2）平原文子 , " ビタミン E と抗酸化性 ", 栄養学雑誌 , 1994, 52（4）, 205-206.

No.186（2023）

関連製品
DPPH 抗酸化能測定キット
DPPH

キット内容

TroloxAssay Buffer

調製
吸光度調整 Assay秤量
DPPH秤量Antioxidant
Kit調製
アップ
メス

従来法

秤量

溶解

pH 調整

メス
アップ

約 2 時間

＜特長＞
・試薬調製の手間を大幅に低減
・データの再現性が高い
メス
本キット 溶解 アップ 溶解
・多検体処理が可能

時間と手間を大幅に短縮

DPPH

約 30 分

従来法

秤量

調製

TroloxTroloxAssay Buffer
メス
アップ

吸光度調整

キット内容

DPPH Assay Buffer
Standard Reagent

秤量

調製

秤量

溶解

メス
アップ

pH 調整

高知大学の島村らは、測定施設間差の少ない抗酸化活性評価法として DPPH（2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl）を用いた測定法を報
100 test 容量
DPPH
TroloxAssay Buffer
約 2 時間
告しています 1）。本製品はこの測定法に準拠したマイクロプレート法による評価キットです。
メス
メス
本製品は高知大学農林海洋科学部農芸化学科島村智子先生のご指導の下、製品化しました。
秤量 調製
吸光度調整 アップ 秤量 調製
秤量 溶解
pH 調整
従来法
アップ

本キット

溶解 アップメス

溶解

約 30 分

① 一定品質の試薬 時間と手間を大幅に短縮② 最適化された測定条件

溶解 アップAnal. Sci., 2014, 30, 717-721
1）T. Shimamura et al.,
時間と手間を大幅に短縮

メス

本キット
約 2 時間③ 標準物
標準物質との比較で算出

溶解

TroloxAssay Buffer

DPPH

Reagent
日間・施設間差の問題を Standard
Trolox を基（準とした評価（TEAC）
法により大幅に100 test 容量
改善しました。

測定時の pH や溶媒が抗酸化能の測定誤差となります。影響因子を排除した最適化マニュアルを用意しました。

測定結果に大きく影響する
DPPH の純度
約 30 分と含量を一定品質で提供いたします。

① 一定品質の試薬② 最適化された測定①

一定品質の試薬
測定時の pH や溶媒が抗酸化能
DPPH および Trolox は溶液状態で不安定なため用時調製が必要ですが、特 測定結果に大きく影響する DPPH の純度
DPPH
TroloxAssay
Bufferに測定に影響を与える
DPPH
は、吸光度による含量確認まで行う必要があり、誤差となります。
影響因子を排と含量を一定品質で提供いたします。
測定時の
pH
による影響
サンプル溶媒の影響① 一定品質の試薬② 最適化された測定条件③ 標準物質との比較で算出
メス
メス
秤量 調製
秤量 溶解
pH 調整
試薬調製には長い時間を要していました。本キットでは測定に必要な試薬が 従来法 秤量 調製 吸光度調整 アップ
最適化マニュアルを用意しましアップ
小分けされており、測定前の簡単な準備で、すぐに実験を開始できます。
80
80
約 2 時間測定時の pH や溶媒が抗酸化能の測定
測定結果に大きく影響する
DPPH*DPPHの純度の溶解操作には超音波洗浄機が必要です。
pH 7.4エタノール 60% 日間・施設間差の問題を Trolox を基70
測定溶液中のエタノール
測定溶液中のpH により、
誤差となります。
影響因子を排除した準とした評価（TEAC）
法により大幅にと含量を一定品質で提供いたします。
時間と手間を大幅に短縮
エタノール 100% メス
pH 8.0本キット 溶解 アップ 溶解6060
濃度が、抗酸化能に影響
抗酸化能が変動
最適化マニュアルを用意しました。
改善しました。
70

阻害率（％）

pH 9.0
最適化された測定条件
約 30 分測定時の pH による影響
50
50
これまで施設間差や日間差によるデータの再現性の低さが問題となってい4040ました。本キットでは、試薬品質、プロトコル、解析法を吟味することで、
80
pH 7.430
30
バラツキの抑えられた再現性の高いデータを得ることができるようになりました。
70

阻害率
（％）

070

20

60
50

pH 7.4
40

60

80

100

pH 8.0Trolox 濃度（µg/ml）
pH 9.0測定溶液中の pH により、抗酸化能が変動4030

測定時の pH や溶媒が抗酸化能の測定
6080
誤差となります。影響因子を排除した
測定溶液中のエタノールと含量を一定品質で提供いたします。
最適化マニュアルを用意しました。
Trolox 濃度（µg/ml）

20

0

0

0

測定時の pH による影響
20

40

40

60

80

100

0

Trolox 濃度（µg/ml）

20

60

80

0
サンプル溶媒の影

1000Trolox濃度（µg/ml）
pH 7.4

80

阻害率
（％）

20

pH 8.060

pH 9.0

50

40 40

60

80

測定溶液中の pH により、70

抗酸化能が変動6080

30
Trolox 濃度（µg/ml）

TEAC
IC50
（µg/ml） （µg TE/µg）

③

測定 1

37.24

1.42

IC50
（µg/ml）

サンプル量を反応液全体の1/10（20 μ l）に規定し、
0
0
20
40
60
80
100
サンプルを水やエタノールに溶解しても測定値に差がTrolox 濃度（µg/ml）
出ないよう最適化しています。
10

標準物質との比較で算出
測定 2
39.75
1.44
57.42
サンプルの抗酸化能を IC50 値のみで解析すると、僅かな測定条件の差でデ
測定 3
48.22
1.47
70.95
ータがばらつきます。標準物質（Trolox）をサンプルと同時に測定し、抗酸化能を Trolox 等価活性値（TEAC）として算出することで、再現性の高い測定値
アスコルビン酸
Troloxが得られます。
TEAC（µg
TE/µg）=
Sample IC50（µg/ml）
TEACTrolox IC50
IC（µg/ml）/IC
50
50（µg/ml） （µg TE/µg）（µg/ml）

37.24

1.42

52.98

測定 2

39.75

品名
1.44

57.42

3
48.22
DPPH 測定
Antioxidant
Assay Kit 1.4770.95

エタノール 100%

50
40
30

10
0
0

20

容量
100 tests
500 tests

測定 1

アスコルビン酸

TroloxTEAC
IC50（µg/ml） （µg TE/µg）

IC50（µg/ml）

37.24

1.42

アスコルビン酸

測定 2

39.75

測定 3

（µg/ml） （µg 1.47
TE/µg）
48.22

1.44

52.98
Trolox

IC50

TEAC

測定 1

37.24

1.42

52.98

測定 2

39.75

1.44

57.42

40

60

Trolox 濃度（µg/m＜標準物質との比較＞

52.98

測定 1

エタノール 60%

2020

製品添付の Assay Buffer により、一定の pH で測定
Troloxが行えます。アスコルビン酸

40 日間
準と
30 改善

10

0

70

0

③標

50

20

10

30

10

濃度が、
抗酸化能に影響

20

40

10

40

エタノール
30 100%

50

20

60

② 最適化された測定条件

測定結果に大きく影響する DPPH の純度
エタノール
40 60%

6020①
pH一定品質の試薬
9.0

50

70

抗酸化能が変動

阻害率
（％）

0

80

10
80
0
700

測定溶液中の pH により、

阻害率
（％）

10

サンプ
80

pH 8.020
サンプル溶媒の影響
60 ＜サンプル溶媒の影響＞
阻害率（％）

測定時の pHによる影響
pH の影響＞
＜測定時

20

阻害率
（％）

阻害率（％）

②

57.42

IC50
（µg/ml）
70.95

希望納入価格測定 348.22 （¥）
1.47 メーカーコード
70.95
7,100
D678
21,00013

既存法 : ウェルにバイオフィルムを形成
洗浄 → クリスタルバイオレット染色 → 洗浄クリスタルバイオレット抽出 → 測定

No.186（2023）

既存法 : ウェルにバイオフィルムを形成

バイオフィルム関連製品

洗浄 → クリスタルバイオレット染色 → 洗浄クリスタルバイオレット抽出 → 測定
各ウェルにエタノールを加えた後、ウェルに菌液を加え、
ウェル内壁

各ウェル毎にバイオフィルムを剥にバイオフィルムを形成させる。

がさないように注意深く洗浄する。

吸光度を測定する。

キット法 : ピンプレートにバイオフィルムを形成
ウェルに菌液を加え、
ウェル内壁

各ウェル毎にバイオフィルムを剥各ウェルにエタノールを加えた後、にバイオフィルムを形成させる。

がさないように注意深く洗浄する。

吸光度を測定する。

バイオフィルム形成量・形成阻害測定キット

！
すだけ
蓋を移

！
すだけ
蓋を移

キット法 : ピンプレートにバイオフィルムを形成
！
すだけ
蓋を移

Biofilm Formation Assay Kit

！
すだけ
蓋を移

バイオフィルム形成量の測定に最適

菌液にピンプレートを浸し、ピン表面にバイオフィルムを形成させる。

洗浄液にピンプレートを浸し、バイオフィルムを洗浄する。

エタノールを入れたウェルにピンプレートを浸し、吸光度を測定する。

既存法ではマイクロプレートの底にバイオフィルムが形成するため、培地交換や洗浄作業の手間、剥離しやすさによる測定値のバラ
既存法
菌液にピンプレートを浸し、ピン表面洗浄液にピンプレートを浸し、エタノールを入れたウェルにツキが課題でした。本製品は蓋に固定されたピン上にバイオフィルムを形成させるため、手間なくバラツキの少ないデータが得られます。
にバイオフィルムを形成させる。
バイオフィルムを洗浄する。
ピンプレートを浸し、吸光度を測定する。
既存法 : ウェルにバイオフィルムを形成
洗浄 → クリスタルバイオレット染色 → 洗浄

既存法

クリスタルバイオレット抽出 → 測定

1.4

キット法

ウェルに菌液を加え、ウェル内壁にバイオフィルムを形成させる。

各ウェルにエタノールを加えた後、吸光度を測定する。

各ウェル毎にバイオフィルムを剥がさないように注意深く洗浄する。

キット法 : ピンプレートにバイオフィルムを形成

1.0
0.8
1.4
0.6
1.2
0.4

Absorbance at 590 nm

Absorbance at 590 nm

1.2

0.2

キット法

0

す
蓋 を移

だけ！

す
蓋 を移

だけ！

1.0
0.8

既存法 0.6

キット法

0.4

クリスタルバイオレット法による
0.2
バラツキの比較
菌種：S. aureus,0 各 n=8 の平均
既存法

菌液にピンプレートを浸し、ピン表面にバイオフィルムを形成させる。

洗浄液にピンプレートを浸し、バイオフィルムを洗浄する。

エタノールを入れたウェルにピンプレートを浸し、吸光度を測定する。

既存法 : ウェル底部に試験片を沈める
既存法

キット法

品名

容量
96 tests

Biofilm Formation Assay Kit

洗浄 → クリスタルバイオレット染色 → 洗浄

希望納入価格（¥） メーカーコード
17,400B601

素材（試験片）ウェルに菌液と試験片を加え、試験片にバイオフィルムを形成させる。

1.4

試験片用バイオフィルム形成能測定キット

各ウェル毎にバイオフィルムを剝がさないように注意深く洗浄する。

Absorbance at 590 nm

1.2

キット法

TestPiece Holder

0.8

0.6
既存法 : ウェル底部に試験片を沈める

Biofilm TestPiece Assay Kit

素材
（試験片）

本キット法 : キット付属の TestPiece Holder に試験片を固定

1.0

クリスタルバイオレット抽出
→ 測定
だけ！

材質へのバイオフィルム形成評価に最適

0.4

Holder を移すだけ！

素材（試験片）0.2
0

洗浄→クリスタルバイオレット染色→洗浄

Holder を移す

洗浄 → クリスタルバイオレット染色 → 洗浄

既存法

キット法

本キットはクリスタルバイオレット染色法により、素材毎のバイオフィルム形成量の違いを測定することができます。任意の素材を各ウェルにエタノールを加えた後、各ウェル毎にバイオフィルムをウェルに菌液と試験片を加え、
24-well Plate
固定できる独自開発の蓋 (TestPiece Holder)を使用することで、洗浄・染色操作によりバイオフィルムが剝がれることなく、複数サン
吸光度を測定する。
剝がさないように注意深く洗浄する。
試験片にバイオフィルムを形成させる。
クリスタルバイオレット染色後、
TestPiece Holder に試験片を固定後菌液に浸し、プルを簡便に測定することが可能です。また、水に浮くような浮力の高い素材に対しても
TestPiece Holder で固定することで、他の素洗浄液に試験片を浸し、バイオフィルムを洗浄する。
試験片にバイオフィルムを形成させる。
本キット法:キット付属の
TestPiece
Holderに試験片を固定材と同様に評価することができます。
既存法 : ウェル底部に試験片を沈める

洗浄→クリスタルバイオレット染色→洗浄

Holder を移すだけ！

洗浄 → クリスタルバイオレット染色 → 洗浄

素材（試験片）クリスタルバイオレット抽出 → 測定

クリスタルバイオレット抽出 → 測定

Holder を移すだけ！

独自の TestPiece Holder

24-well Plate

各ウェルにエタノールを加えた後、クリスタルバイオレット染色後、吸光度を測定する。
洗浄液に試験片を浸し、バイオフィルムを洗浄する。

各ウェル毎にバイオフィルムを
TestPiece Holder に試験片を固定後菌液に浸し、剝がさないように注意深く洗浄する。
試験片にバイオフィルムを形成させる。

TestPiece Holder

推奨サイズ : 20×10×1~3mm（タテ×ヨコ×厚み）
厚み）

洗浄→クリスタルバイオレット染色→洗浄

クリスタルバイオレット抽出 → 測定

試験片固定具に素材（試験片）を固定した状態

r を TestPiece Holder
独自の
Holde
移すだけ！
TestPiece Holder

Holder を移すだけ！

24-well Plate

クリスタルバイオレット染色後、洗浄液に試験片を浸し、バイオフィルムを洗浄する。

TestPiece Holder に試験片を固定後菌液に浸し、試験片にバイオフィルムを形成させる。

エタノールを加えたウェルに試験片を浸し、吸光度を測定する。

素材（試験片）本キット法 : キット付属の TestPiece Holder に試験片を固定

素材（試験片）エタノールを加えたウェルに試験片を浸し、吸光度を測定する。

1.0
Absorbance at 595 nm

ウェルに菌液と試験片を加え、試験片にバイオフィルムを形成させる。

試験片固定具に素材（試験片）を固定した状態※本キットに 24-well Plate、試験片は同梱されておりません。

バラツキ低減

0.8
0.6
0.4
0.2
0.0

推奨サイズ : 20×10×1~3mm（タテ×ヨコ×厚み）

既存法

Biofilm TestPiece
Assay Kit

菌種：Staphylococcus aureus NBRC13276

各n=8の平均

独自の TestPiece Holder

Biofilm TestPiece Assay Kit

これ
これからはじめる
じめる
じめ

1.0

TestPiece Holder

素材
（試験片）

推奨サイズ : 20×10×1~3mm（タテ×ヨコ×厚み）

Absorbance at 595 nm

品名

容量
24 tests

0.8
0.6

希望納入価格（¥） メーカーコード
26,800B606

0.4

小社 Web ではバイオフィルムの基礎から、
0.0
既存法
Biofilm TestPiece
キットの選択ガイドまでお役立ち情報を掲載しています。
Assay Kit

（試験片）を固定した状態
検出
バイオフィルム試験片固定具に素材
バイオフィルム検出

同仁

検索

菌種：Staphylococcus aureus NBRC13276

14

バラツキ低減0.2

各n=8の平均

1.0

TestPiece Holder

素材（試験片）Absorbance at 595 nm

TestPiece Holder

0.8
0.6
0.4
0.2
0.0

菌種：StaAbsorbance at 460 nm

No.186（2023）

バイオフィルム薬剤効果測定キット
Biofilm Viability Assay Kit

バイオフィルム内の生菌の代謝活性測定に最適※

本キットはピンプレートに形成 させたバイオフィルム内の生菌の代謝活性を測定することで、バイオフィルム内微生物に対する薬
Minocycline Concentration（μg/ml）
剤効果を確認するキットです。エネルギー代謝の補酵素の 1 つである NAD（P）Hは電子メディエーターを介して WST 色素を橙色へと発色させます。この発色の程度により微生物の代謝活性を検出します。ピンは蓋に固定されているため、洗浄・発色操作によりバイオフィルムが剥がれることがなく、多検体を簡便にバラツキを押さえて測定することが可能です。
※本キットご利用前にピンプレートへのバイオフィルム形成条件をご検討ください。
Biofilm Viability Assay Kit

！

すだけ

蓋を移

96 穴マイクロプレートに菌を播種し洗浄・薬剤処理

ピンプレート

WST 溶液にて発色、ピンプレートを浸漬し培養測定（440-480 nm）※ Biofilm Formation Assay Kit（製品コード :B601）では、事前検討が必要です。詳しくは、製品 HP をご覧ください。
※ バイオフィルムの形成条件は菌種や株によって異なります。まず、形成条件の検討に Biofilm Formation Assay Kit をご利用ください。

Absorbance at 460 nm※ 本キットは福岡県工業技術センター生物食品研究所との共同開発品です。
＜測定例＞
バイオフィルムに対する MBEC（Minimum Biofilm Eradication Concentrations、最小バイオフィルム撲滅濃度）が指標として用いられています。 Minocycline の S. aureus バイオフ
ィルムに対する薬剤効果を本キットにて測定しました。その結果、MBEC が約 1000 µg/ml
であることが確認できました（右図）。

インキュベーター内で発色反応
Minocycline Concentration（μg/ml）

品名

容量
96
Biofilm Viabilitytests
Assay Kit

Biofilm Viability Assay Kit

Absorbance at 460 nm

微生物懸濁液に試薬を添加
希望納入価格（¥） メーカーコード
20,000
B603
！
すだけ
蓋を移

微生物増殖アッセイキット

Minocycline Concentration（μg/ml）
96 穴マイクロプレートに菌を播種し洗浄・薬剤処理

WST 溶液にて発色、ピンプレートを浸漬し培養測定（440-480 nm）
インキュベーター
吸光度検出
内で発色反応
菌種毎と使用論文を掲載しています。
※ Biofilm Formation Assay Kit（製品コード :B601）では、事前検討が必要です。
詳しくは、製品 HP をご覧ください。

Microbial Viability Assay Kit-WST

微生物懸濁液に試薬を添加※ バイオフィルムの形成条件は菌種や株によって異なります。まず、形成条件の検討に Biofilm Formation Assay Kit をご利用ください。
※ 本キットは福岡県工業技術センター生物食品研究所との共同開発品です。

＜特長＞
・評価にかかる時間を大幅に短縮
Biofilm Viability Assay Kit
・生菌の活性評価を濁度から色の変化へ

M439

検索

同仁

＜従来法との比較＞＊菌種によって最適条件は異なります。
従来法
コロニー形成法

インキュベーター内で本キットに含まれる小社の開発品である還元発色剤 WST-8 は、
電子メディエーターを介して微生物内で生成する 発色反応
NAD(P)H によって還元され発色します。還元された WST-8 ホルマザン量は微
微生物懸濁液に試薬を添加
生物の代謝活性に比例しており、吸光度を測定することで、微生物の生存率や活性度合いを簡便に測定することができます。
96 穴マイクロプレートに菌を播種し＜操作＞
ピンプレートを浸漬し培養
96 well プレートに菌懸濁液を準備し、試薬を添加する。

！
すだけ
蓋を移
所要

時間

特徴

本方法
濁度法

24 時間以上

WST 法
約 8 時間18-24 時間

6 時間
（培養
発色 2 時間 ）

吸光度検出
・標準法
洗浄・薬剤処理・操作が煩雑・短時間でのマイク・マイクロプレート
ロプレートアッセ
アッセイが可能
イが可能
WST 溶液にて発色、・代謝活性は見れな
測定（440-480 nm）
・代謝活性を指標といする※ Biofilm Formation Assay Kit（製品コード :B601）では、事前検討が必要です。詳しくは、製品 HP をご覧ください。

※ バイオフィルムの形成条件は菌種や株によって異なります。まず、形成条件の検討に Biofilm Formation Assay Kit をご利用ください。

品名※ 本キットは福岡県工業技術センター生物食品研究所との共同開発品です。

Microbial Viability Assay Kit-WST
微生物懸濁液に試薬を添加

インキュベーター
内で発色反応容量

希望納入価格（¥） メーカーコード

100 tests

6,800

500 tests

24,200

M439

吸光度検出

※ 14、15 ページに掲載の 4 製品は、福岡県工業技術センター生物食品研究所との共同開発品です。

＜従来法との比較＞＊菌種によって最適条件は異なります。
従来法
所要
時間

本方法

コロニー形成法

濁度法

24 時間以上

18-24 時間

WST 法
約 8 時間（培養 6 時間
発色 2 時間）15No.186（2023）

製品紹介
細菌二重染色キット-Bacstain- Bacterial Viability Detection Kit-DAPI/PI-Bacstain- Bacterial Viability Detection Kit-CTC/DAPI-Bacstain- Bacterial Viability Detection Kit-CFDA/PI

このような方におススメします！

✓これから蛍光染色法による実験を始めたい！
□✓培養法で判定している検査を迅速化したい！
□
VNC 菌を検出したい！
✓損傷菌や
□

＜特長＞
・蛍光二重染色に最適化したプロトコルで試薬を添加するだけ
・複数の指標で薬剤効果や菌の状態を評価できる・培地法と比較して評価にかかる時間を大幅に短縮できる✓菌に対する薬剤効果を正確かつ簡便に評価したい！
□細菌に対する抗菌剤等の効果を評価する場合、培養法によるコロニー形成単位（CFU）の確認や蛍光染色試薬を用いた多重染色法による評価が広く用いられています。近年では特に感染症における薬剤耐性菌の出現や損傷菌が引き起こす食中毒等の問題を受けて、これまで一般的に行われてきた単一指標ではなく、抗菌性評価の信頼性向上を目的として、複数の指標で薬剤等の抗菌性を評価する必要性が高まっています。
また、日本国内では食品を扱う全事業者に対して HACCP（危害分析重要管理点）に沿った衛生管理が制度化されたことから、特に飲食料品の製造分野では菌検査の簡素化ならびに迅速化の需要が高まっています。
試薬を添加するだけの簡単操作

評価にかかる時間を大幅に短縮

顕微鏡
顕微鏡

蛍光染色法による細菌の生死判定などでよく用いられる膜損傷の有無を指標とした蛍光染色に加え、-Bacstain- Bacterial Viability
Detection Kit シリーズでは複数の指標を選んで染め分けすることができるため、細菌の状態を様々な視点から評価できます。

検出対象-Bacstain - Bacterial Viability Deteciton Kit-DAPI/Pl

全菌

膜損傷

✓

✓

呼吸活性

✓

-Bacstain - Bacterial Viability Deteciton Kit-CTC/DAPI

酵素活性

✓
✓

-Bacstain - Bacterial Viability Deteciton Kit-CFDA/PI

✓

呼吸活性

CTC
呼吸活性
CTC
CTC formazan
CTC formazan

CFDA

全菌

NAD（
（P）
P）
H
+
（
P
）
NAD
（P）
NAD
（P）H
+
NAD（P）

DAPI
全菌
DAPI

esterase

Carboxyfluoresceinesterase

Carboxyfluorescein

CFDA

PI
膜損傷

PI

膜損傷

酵素活性

品名
-Bacstain- Bacterial Viability Deteciton Kit-DAPI/Pl

容量

希望納入価格（¥） メーカーコード

1 set

21,400

BS08-Bacstain- Bacterial Viability Deteciton Kit-CTC/DAPI

1 set

38,500

BS09-Bacstain- Bacterial Viability Deteciton Kit-CFDA/PI

1 set

38,500

BS10※＜使用回数の目安＞1 setあたり、約 100 検体分

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16

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No.186（2023）－アプリケーション紹介－
活性化マクロファージにおける ROS 産生のライブセルハイコンテントイメージング
免疫細胞は、炎症反応により異物を分解して体を正常に保つ役割を果たしています。一方で、過剰な炎症は様々な疾病を引き起こす
要因となることから、ミトコンドリアで生産される ROS（Reactive Oxygen Species）を指標にして抗炎症薬のスクリーニングが行われています。ここでは、小社製品を使った ROS 産生のライブセルハイコンテントイメージングのアプリケーションをご紹介します。
＜実験＞
Lipopolysaccharide（LPS）刺激によって誘発される ROS 産生を評価しました。ROS の検出には、ROS Assay Kit -Photo-oxidation
Resistant DCFH-DA-（メーカーコード：R253）を用い、ニコン倒立顕微鏡（Ti2-E）にて細胞の形態と ROS の産生、細胞あたりの ROSの変化を経時的に測定しました。
＜結果＞・細胞形態の観察と細胞数の測定
LPS 刺激により細胞あたりの細胞面積が増加しました（図 1A）。また、コントロール細胞よりも細胞数の増加が抑制される結果が得られました（図 1B）。
(A)
430

面積 (Area/cells μm2)

950

380

850

330

750

280

650

230

550

180

細胞数

(B)

0
0 ng/ml6

12
125 ng/ml

18

24Time (h)250 ng/ml

30

36

42

48

450

0

6

12

18

24

30

36

42

48

Time (h)500 ng/ml

1000 ng/ml

0 ng/ml

125 ng/ml

250 ng/ml

500 ng/ml

1000 ng/ml

図 1. LPS 添加後の細胞数と細胞あたりの細胞面積の変化

・ROS の検出
視野全体の細胞数を測定し細胞あたりの蛍光強度を算出すると、21 時間後では LPS 濃度が高いほど細胞あたりの ROS 産生量が増※加しました 。さらにタイムラプス画像による解析では、細胞分裂による細胞数の増加、マクロファージの貪食による細胞数の減少や
ROS の増加を確認しました（図 2）。
既存の試薬では励起光による色素の自動酸化や再現性に課題がありましたが、小社キットではこれらの課題を解決することで、長時間（48時間）にわたる ROS の経時的な検出が可能となり、低いバックグラウンドで細胞内に色素が結合するため精度の高く再現性の高い解析が可能になりました。

図 2. 活性化マクロファージによる死細胞のファゴサイトーシス
LPS 500 ng/ml を添加したウェルのタイムラプス画像。緑 :ROS, Scale bar: 10 μm。Cell2 はアポトーシスを起こし（B）、
1 時間後に死細胞の形態を示した（C）。Cell1 は死滅した Cell2 と Cell3 を貪食し、ROS を増加させた（C-F）＜使用装置＞
ハイコンテンツアナリシス（HCA）顕微鏡システム（株式会社ニコン）※
染色操作と解析法の詳細は、株式会社ニコン「APPLICATION NOTE : 活性化マクロファージにおける ROS 生産のライブセルハイコン
テントイメージング」よりご覧いただけます。
※

詳しいデータやライブ動画は、
小社 HP の製品ページよりご覧いただけます。

品名
ROS Assay Kit -Photo-oxidation Resistant DCFH-DA-

容量100 tests

R253

同仁

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希望納入価格（¥） メーカーコード
36,000R253

17No.186（2023）

小社へのお問い合わせ等は下記 HP よりお願いします

URL: https://www.dojindo.co.jp/

No.186
18

次号テーマ

がんと代謝

ドージンニュース No.186 令和 5 年 9 月 1 日発行
株式会社同仁化学研究所 DOJINDO LABORATORIES
熊本県上益城郡益城町田原 2025-5 〒 861-2202
発行責任者 松野寛明 編集責任者 岩永竜弥 年 4 回発行 許可なくコピーを禁ず