ウイルス性下痢症研究会第 30 回学術集会プログラム
2018 年 10 月 27 日（土）平成 30 年度

総会

開場 12：30

開始 13：00

13：00­13：15
司会：勢戸 祥介（大阪府立大学）、岡 智一郎（国立感染症研究所）

特別講演

13：15

­

14：15

座長：勢戸 祥介（大阪府立大学）

1. 「富山県衛生研究所における下痢症ウイルス研究」

滝澤 剛則先生（富山県衛生研究所）

2. 「計算科学と下痢症ウイルス研究の橋渡し」

佐藤 裕徳先生（国立感染症研究所）

特別企画

座長：岡 智一郎（国立感染症研究所）

14：20

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15：20

「下痢症ウイルスの効率的スクリーニング」
1. 「シークエンス解析を考慮した Probe 非依存下痢症ウイルス検出法」
田村 務先生（新潟県保健環境科学研究所）
2. 「核酸精製不要な one-step リアルタイム PCR-ノロウイルスを中心に」
左近 直美先生（大阪健康安全基盤研究所）
3. 「主要下痢症ウイルスを網羅する multiplex real-time PCR に関する情報提供」
森 功次先生（東京都健康安全研究センター）
4. 「核酸処理、検出一体型病原因子検出システム-FilmArray」
斎藤 博之先生（秋田県健康環境センター）

話題提供

15：30

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16：20

座長：上間 匡（国立医薬品食品衛生研究所）

1. 「ネコノロウイルス感染症」

高野 友美先生（北里大学）

2. 「今だからこそのウイルス細胞培養；株化培養細胞活用術について」 高木 弘隆先生（国立感染症研究所）

トピックス

16：30 ­17：30

座長：津川 毅（札幌医科大学）

1. 「小児のウイルス性胃腸炎について」

家原 知子先生（京都府立医科大学）

2. 「第 59 回 日本臨床ウイルス学会報告」

津川 毅先生（札幌医科大学）

3. 「パレコウイルス A」

渡邉 香奈子先生（新潟大学）

4. 「第 6 回国際食品・環境ウイルス学会」

閉会挨拶

佐野 大輔先生（東北大学）

17：30­17：35

代表幹事：岡 智一郎（国立感染症研究所）

1

抄録

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特別講演 1

富山県衛生研究所における下痢症ウイルス研究
富山県衛生研究所
滝澤剛則
当所では、下痢症ウイルスに関する調査研究として、環境水サーベイランス、感染性胃腸炎、食中毒の原因ウイルス調査を主に行ってきた。
環境水サーベイランスでは、河川水、下水流入水を用いて、ポリオウイルス（PoV）、PoV
以外のヒトエンテロウイルス（HEV）、ノロウイルス（NoV）、サポウイルス（SaV）などを対象とした。
PoV は、生ワクチンが投与される時期に、環境水からワクチン株が検出されたが、1993~5
年には 3 型の変異株が検出され、病原性を有することを検証した。
HEV は主に B 群が検出され、血清型によっては特定の期間にのみ検出される傾向が認められた。この原因を探るために血清疫学調査を行ったところ、エコーウイルス 13 型では、流行後に若年層の抗体保有率が顕著に増加しており、若年層の多くが不顕性感染により抗体を獲得していたことが推定された。
下水流入水からは、事例報告の少ない夏季にも NoV や SaV が検出され、これらのウイル
ス感染が通年で持続していることが推定された。
次世代シークエンサー（NGS）を用いたメタゲノム解析では、NoV や SaV の検出結果がPCR の結果と必ずしも一致しなかった。HEV では，培養困難なウイルスが NGS により検出可能であったが，培養の方が検出率の高い場合も認められた．
感染性胃腸炎、食中毒では、NoV、SaV、ロタウイルスなどを対象とした。
2006 年の食中毒事例では、1 か月以上 NoV が便に検出され、経過中にカプシド遺伝子に変化が認められる症例を経験した。2013 年の原因の特定されなかった老人保健施設の事例
では、NGS を用いたメタゲノム解析により SaVGV.2 が検出された。これは、2012 年に名古屋市の原因不明事例から検出された SaV と同じであった。SaVGV.2 は、2011 年の下水流入水からも検出され、以前から感染があったものと推定された。
複数の遺伝子群、型が検出された集団事例のメタゲノム解析では、解析結果が PCR の結果と一致する事例と、一致せず解釈の困難な事例があった。
食肉検査所で採取したブタ糞便を調査したところ、新たな遺伝子型の SaV が検出された。
少数のヒト NoV 遺伝子も検出されたが、由来は不明であった。
調査研究では、厚生科研西尾班、竹田班、野田班、清水班、黒田班の援助を得た。班員の皆様、下痢症ウイルス研究会会員の皆様の長い間のご支援に、改めて感謝したい。
8





9

特別講演 2


計算科学と下痢症ウイルス研究の橋渡し
国立感染症研究所

病原体ゲノム解析研究センター
佐藤 裕徳

ナノサイズのウイルスが細胞・個体・集団レベルで引き起こす「感染現象」は、病原体の発見当初から物理、化学、数学分野の研究者の関心を引き、その参入により発展してきた。
ウイルス研究は、その発祥の直後から学際研究を促進してきたと言える。
我々は、2005 年の病原体ゲノム解析研究センター発足時に、新しい学際研究の枠組みを作ることを着想した。当時、第三の科学の形態として目覚ましい発展を遂げつつあった「計算科学」に着目し、生体分子の立体構造シミュレーション技術をハブとして基礎・開発研究が結びつく、独自性の高い感染症研究を指向した連携研究基盤の開発に着手した。幸い、この構想は多くの先生方に関心を持っていただいた。これまでに 70 以上の共同研究によりウイルスの謎解き、サーベイランス、リスク評価、創薬シーズ探索などを支援し、計算科学の有用性と汎用性を実証してきた。
この基盤開発の黎明期に、下痢症ウイルス研究を先導される多くの先生方と出会った。まだ感染症分野の先生方の多くが計算科学に懐疑的な見方をしていた頃でもあり、共同研究の申し出はたいへんありがたかった。本講演では、下痢症ウイルス研究との出会いと想い出に触れながら、我々の研究構想、研究基盤、代表的な活用例、そして今後の展望を紹介したい。




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Reference
1) Hainian YAN et al. J Virol Methods. 114(1) ò37-44, 2003.
2) Hainian YAN et al. J.J.A. Inf. D. 78ò699-709, 2004.
3) Sakon N, et al . J Med Virol. 61ò125-131, 2000.
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特別企画「下痢症ウイルスの効率的スクリーニング」2

核酸精製不要な one-step リアルタイム PCR ‒ノロウイルスを中心に
大阪健康安全基盤研究所
左近直美
ノロウイルスによる国内食中毒患者数は毎年 1 万人以上報告されており、調理従事者による食品の汚染が食中毒の原因の 1 つとされている。ノロウイルスは少数で感染を成立させ胃腸炎を発症させるため、ノロウイルス陽性の調理従事者に対しては感度の高い遺伝子検査を実施し、ウイルス陰性化をもって調理現場への復帰の指標にしなければならない。感染者がいた場合は、現場内にノロウイルス感染が広まるリスクも高まる。したがって、リスク対象者に対してノロウイルス遺伝子検査を実施することが望ましい。また、ノロウイルス検査として 10５コピー/便 1g オーダー以上の検査感度であることが大量調理施設衛生管理マニュア
ルで明記され、10 月から 3 月までのノロウイルス流行期にはノロウイルス検査に努めることとなっている。
このような背景から、日本ではノロウイルス遺伝子検査を実施し、調理従事者による食中毒の発生を防ぐ取り組みが今後、積極的になされていくことが予想されるが、検査にかかるコストや時間などを改善すればより積極的な検査を実施できるのではないかと考えた。そこ
で、われわれは繁雑な核酸精製が不要であり簡便短時間で検査が可能な遺伝子検出系の評価を実施した。この方法は、10%乳剤作製後、上清を変性剤に添加し熱処理を行うことで核酸を抽出する方法である。さらに GI と GII 及びインターナルコントロールを同時反応系で測定する。結果、従来法と同様の感度を持ち、簡便で迅速性が高かった。処理能力が高いことから、大規模食中毒の発生時に効果をより発揮するものと考えられた。
この方法を用い、健康成人における定期検査を 1 年間実施するなど、当所では不顕性感染調査等に使用している。
現在、10%乳剤作製後、乳剤上清を試薬に添加するだけでリアルタイム PCR が可能となっており、その結果についてもあわせて報告する。
参考：日本食品微生物学雑誌 34(2):135-139.2017




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特別企画「下痢症ウイルスの効率的スクリーニング」3
主要下痢症ウイルスを網羅する multiplex real-time PCR に関する情報提供
東京都健康安全研究センター
森 功次
集団胃腸炎の発生時にその病原因子を同定することは食中毒事例、感染症事例ともに重要である。ノロウイルスの検出には感度と特異性の高さから real-time PCR 法がひろく実施されている。ウイルス性胃腸炎にはノロウイルスをはじめサポウイルス、ロタウイルス、さらにはアストロウイルス、アデノウイルスなど多くのウイルスが関与しており、複数のウイルスを迅速に同時検出する手法として multiplex PCR 法や、multiplex real-time PCR 法もい
くつか構築されている。
本報告では演者が実際に使用し得られた結果をもとに、主要下痢症ウイルスを網羅する
multiplex real-time PCR 法に関する情報提供をはかりたい。
multiplex real-time PCR 法を実際に導入する場合は、まず、検出を目的とする病原体の範囲、具体的にはノロウイルス、サポウイルス、ロタウイルスに加え、それ以外のウイルスをどこまで検出対象に加えるか、を決める必要がある。次に、既報の real-time PCR 法のプ
ライマー、プローブを単純に同一のウェルに混合しても期待する反応性が得られない場合がある。また、使用する機器の光源により検出に選択できる蛍光色素が限定される点にも注意が必要である。現在のところ複数のメーカーの機器において同時に 4 色まで測定可能であるが、上記の理由により 1 ウェルで検出できるウイルスの種類はある程度の物理的制限がかかる。
東京都健康安全研究センターにおいて下痢症ウイルス検索を試みた結果の一例を示す。
2008 年度に細菌検査と並行して搬入された集団胃腸炎関連の 666 事例由来、2776 件の糞便試料について、ノロウイルス検出用ウェル、サポウイルス/A 群ロタウイルス検出用ウェ
ルと C 群ロタウイルス/アストロウイルス/アデノウイルス検出用ウェルの組み合わせにより multiplex real-time PCR 法を用いて網羅的に下痢症起因ウイルスの検索を試みたところ、ウイルス検出事例数は 330 事例（49.5%）であった。ウイルス検出事例数の内訳はノロウ
イルスのみが検出された事例が 279 事例、ノロウイルスと他のウイルスが検出された事例
が 31 事例、その他のウイルスのみが検出された事例が 20 事例であった。2776 件における検出ウイルスの内訳はノロウイルス 1406 件（50.6 %）、サポウイルス 33 件（1.19%）、A
群ロタウイルス 12 件（0.43%）、C 群ロタウイルス 6 件（0.22%）、アストロウイルス 17
件（0.61%）、F 亜群アデノウイルス 6 件（0.22%）および検索対象ウイルス非検出 1314
件（47.3％）であった。下痢症ウイルス陽性検体のうち、21 件（0.84%）で同一検体から複数のウイルスが検出された。ノロウイルスのみが検出された事例が多かったことは調理従事者の関与が推定される食中毒事例の割合が高いこととの関連が考えられた。一方、二枚貝類の喫食歴のある集団胃腸炎事例では複数のウイルスが陽性となる事例が多くみられた。
real-time PCR の迅速性という利点をいかし、ノロウイルスと同時検索でない場合でも他の胃腸炎ウイルスの検索は意義あることと考えられる。
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特別企画「下痢症ウイルスの効率的スクリーニング」4

核酸処理、検出一体型病原因子検出システム-FilmArray
秋田県健康環境センター
熊本県保健環境科学研究所

斎藤博之
原田誠也

全自動遺伝子解析装置「FilmArray システム」（ビオメリュー・ジャパン）は、その名のごとく薄い透明フィルムで構成された一体型パウチの中で、核酸抽出・逆転写・PCR の全工程を行うユニー
クな検査機器である。パウチには血液培養パネル、呼吸器パネル、髄膜炎・脳炎パネル、消化管パネルがあり、対象検体に合わせて機器本体にセットして用いる。この内、消化管パネルでは、細菌 13種、寄生虫 4 種、ウイルス 5 種（ノロウイルス GI/GII、サポウイルス、A 群ロタウイルス、アデノウイルス 40/41 型、アストロウイルス）を nested PCR で同時検出できるようにデザインされている。糞便検体を用いる場合には、乳剤を調製し、遠心せずにパウチの開口部に挿入する。パウチはいくつかの区画に分かれており、それぞれに核酸抽出、逆転写、1st. PCR、2nd. PCR のための試薬が充填されて反応プロセスが進行する。1st. PCR は各病原体のプライマーを混合して行い、2nd.
PCR は病原体ごとの小区画で別々に行う仕組みになっている。最終 PCR 産物を融解曲線分析することによって陽性・陰性の判定がなされる。
FilmArray の最大の特長は、糞便検体の乳剤をパウチに挿入するだけで、病原体の検出（重感染も含む）まで完全自動で行われることである（約 70 分）。全ての反応は密閉された状態で行われる
ためコンタミの危険はほとんどない。一方、一度に 1 検体しか処理できないため、集団感染事例において活用するには運用面で工夫する必要がある。
個 別 の 糞 便 検 体 に つ い て 、 FilmArray と 、 日 常 的 に サ ー ベ イ ラ ン ス に 用 い ら れ て い る 手 法（real-time PCR、及び conventional PCR）を比較したところ、PCR でノロウイルスが検出された
17 検体中、14 検体において FilmArray でノロウイルス GI/GII と判定された（14/17 と表記）。他の主な病原体としてサポウイルスは 9/11、A 群ロタウイルスは 5/5、病原大腸菌（EPEC）は 5/5であり、同一検体から複数の病原体が検出されることもあった。
集団感染事例においては、検体搬入時に原因病原体が細菌かウイルスか判明していない場合が多く、同時に検査を開始せざるを得ないことがほとんどである。また、限られた時間において PCR 実
施の優先順位をどうするかなどの判断を強いられる。そこで、搬入された検体のいくつか（有症者）
をプールして FilmArray にかけることで何らかの結果が得られれば、その後の（本来の）検査方針を決める手がかりとなることが期待できる。集団感染事例 12 例について実際に使用してみたところ、10 例においてノロウイルス GI/GII と判定され、検体個別に行った real-time PCR の結果と一致した。残りの 2 例は、プールすることによって希釈され過ぎて不検出となったケースと、EPEC と判定されたケースであった。
FilmArray は事例対応の初動時において有用である一方で、ノロウイルス GI と GII が区別されず、判定項目に黄色ブドウ球菌等毒素型の食中毒菌が入っていないなどの課題（要望事項）もある。本
演題では、このユニークな機器を実際に検査に用いた経験を元に紹介する。

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話題提供 1

ネコノロウイルス感染症
北里大学 獣医学部 獣医伝染病学研究室
高野友美

ノロウイルスはヒトのウイルス性胃腸炎の病原体として広く知られている。ヒト以外の動物においてもノロウイルスの感染が報告されている。演者の知る限り、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ライオン、アザラシ、アカゲザルでノロウイルスの感染が確認されている。北里大学獣医伝染病学研究室では 2013 年からネコのノロウイルスに関する研究を行っており、これまでにいくつかの知見を得ている。今回、それらに関する内容と共に、最近新たに得られた知見についてもウイルス性下痢症研究会の皆様にご紹介したい。
ネコノロウイルスは、2012 年に米国の保護施設で飼養されていたネコから初めて検出された。その後、日本およびイタリアでネコノロウイルス感染が相次いで確認された。現在、ネコノロウイルスは VP1 タンパク質の推定アミノ酸配列に基づき、GIV と GVI の二つの遺伝子群に分類されている。我々はネコに対する GVI ネコノロウイルスの病原性を調べるた
め、SPF ネコに GVI ネコノロウイルス陽性糞便乳剤を経口接種し、臨床症状の有無を確認した。GVI ネコノロウイルスを接種したネコでは糞便中にウイルスの排泄が認められるとともに軟便や嘔吐などの胃腸炎症状を引き起こすことが明らかとなった (Takano et al.,2015. Vet Microbiol, 178:201-207)。次に、GVI ネコノロウイルスの再感染の成立の有無について調べた。
即ち、GVI ネコノロウイルスを猫に経口接種(初回接種)して 3 ヶ月半後に、最初に接種したウイルスと同一の株を再接種した。GVI ネコノロウイルスを初回接種したネ
コでは胃腸炎症状が明瞭に認められたものの、再接種したネコでは初回接種のネコと比較して症状が緩和された。また、血中の抗 GVI ネコノロウイルス VP1 IgG が上昇すると臨床症状および糞便へのウイルス排泄量が低下する傾向が認められた (Takano et al., 2018. Arch
Virol, 163:1503-1510)。
以上を踏まえると、ネコを用いた GVI ネコノロウイルス感染実験系は、ノロウイルス感
染に伴う宿主の胃腸炎症状を再現できる動物疾患モデルとして有用であると思われる。また、胃腸炎症状の発症予防を目的としたノロウイルスワクチン開発のモデルとしても応用できるのではないかと考えられる。最近、我々は日本国内のネコから GIV ネコノロウイルスを新たに得ることができた。こちらについてもネコに対する病原性および増殖性を確認しているところである。

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話題提供 2o3&>=_JĄčĴķÕĴĄčáìĒ%
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トピックス 1

小児のウイルス性胃腸炎について
京都府立医科大学小児科学教室
家原知子
ウイルス性胃腸炎は小児の感染症としてはよく見られる疾患である。特に保育園等の集団生活を送っている乳幼児の間では、毎年 12 月頃になると嘔吐下痢を主症状とするウイルス性胃腸炎が流行する。特に、ノロウイルスは 12 月をピークとし、1〜3 月にかけてロタウイ
ルスの流行がみられ、他にもアデノウイルス、アストロウイルス等の流行は年間を通じてみられる。また、衛生管理が行き届いている我が国においても、医療施設におけるアウトブレ
イクや、学校給食等を介しての集団感染は毎年散見されている。これらのウイルスの流行状
況と感染経路について概説する。
ウイルス性胃腸炎は悪心嘔吐で始まり、下痢、発熱、腹痛を伴う症状を呈する。また、小児特有の合併症としての胃腸炎関連けいれんや脳症、腸重積症があり、その病態について述べる。
臨床現場での診断は便中ウイルス迅速抗原検査が広く用いられているが、一部ノロウイル
ス検査では 3 歳未満に保健適応が限られるなどの制限がある。また、新生児や浣腸便では検査に適さないなどの注意点についても概説する。
さらに、近年ロタウイルスワクチンが普及しつつあり、その種類と実施方法、効果についても近年明らかとなってきた、最近の動向を含めて説明する。





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トピックス 2

第 59 回 日本臨床ウイルス学会報告
札幌医科大学 小児科学講座
津川 毅
第 59 回日本臨床ウイルス学会は、国際医療福祉大学大学院 医療福祉研究科 教授 沼﨑啓
会長の下、2018 年 6 月 9 日〜10 日、大宮ソニックシティにて「臨床ウイルス学の現代的課題〜次世代に語り継ぐべきもの〜」をテーマに開催された。
■一般演題（37 演題）
・若手奨励賞候補演題（8 演題）
ウイルス性下痢症関連は以下の 11 演題であった
１）臨床疫学関連（国内）〜5 演題
・2009 年 7 月〜2017 年 6 月の京都における下痢症ウイルスの臨床症状の比較検討
・Vesikari score による外来でのロタウイルスワクチンの有効性評価
・ロタウイルス脳炎・脳症分離株の分子疫学的解析
・北海道で地域的な流行を認めた Equine-like G3P[8]の臨床的特徴
・ロタテック（RV5）接種後の便中ワクチンウイルス株排泄の解析（若手奨励賞）
２）臨床疫学関連（海外）〜3 演題
・2015-2016 年 ノロ・サポの流行状況とノロ GII.P16/GII.2 株の出現（タイ）・小児急性胃腸炎患者のロタ・ノロ RT-PCR と IC 法の比較（ベトナム）
・2017 年 小児急性胃腸炎患者のロタ・ノロの分子疫学（ベトナム）
３）環境関連〜3 演題
・下水におけるノロウイルスサーベイランス手法の確立
・環境中の腸管ウイルスの検討（その 2）̶雨水・塵埃を介しての感染の可能性­
・遊離塩素への繰り返し曝露条件下におけるロタウイルス集団の適応進化■特別講演・教育講演「札幌医大小児科の臨床ウイルス研究」 堤 裕幸
「変わりゆく術語（ことば）と変わらない本質〜ロタウイルスの研究から〜」■ランチョンセミナー「ロタウイルスの多様性とロタウイルスワクチンによる防御能」

谷口孝喜■シンポジウム１「新興・再興ウイルス感染症の流行状況と対策」「ロタウイルス」 津川 毅



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小林宣道

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トピックス 3

パレコウイルス A
新潟大学大学院保健学研究科 検査技術科学分野
渡邉 香奈子
ピコルナウイルス科パレコウイルス属を構成する種は、当初はヒトパレコウイルス(HPeV)とユンガンウイルスの 2 つであったが、現在はパレコウイルス A, B, C, D の 4 つとなっている。種名については、ヒトパレコウイルスはパレコウイルス A、ユンガンウイルス
はパレコウイルス B に改称された。
パレコウイルス A は、約 7,300 塩基のプラス一本鎖 RNA をゲノムに持つウイルスである。ゲノムには 3 つの蛋白質コード領域が存在し、P1 は構造蛋白質（カプシド蛋白質: VP0,
VP3, VP1）、P2 および P3 は非構造蛋白質をコードしている。構造蛋白質である VP1 の塩基配列に基づきパレコウイルス A は、現時点で 19 の型（血清型／遺伝子型）（HPeV1−19）に分類されている。
パレコウイルス A のうち今までに国内で検出された型は、HPeV1, 2, 3, 4, 6 であるが、HPeV1 と HPeV3 が大半を占めている。パレコウイルス A は主に乳幼児に感染し、症状は胃腸炎、上・下気道炎、発疹、筋痛、髄膜炎など多岐にわたる。パレコウイルス A による感染症は一般的であり、概して不顕性感染もしくは軽度の感染性胃腸炎や呼吸器感染症である。その一方で、HPeV3 は新生児あるいは早期乳児に感染すると敗血症、髄膜脳炎などの重症感染症を引き起こすことがある。また、HPeV3 は流行を繰り返し、流行時には新生児の重症感染症が急増するため、小児科領域では注目すべき感染症となっている。
今回はパレコウイルス A の検出系と検出状況、抗体保有状況、胃腸炎との関連性などについて新潟県のデータも交えながら紹介したい。

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トピックス 4

第６回食品・環境ウイルス学会
The 6th Food and Environmental Virology Conference (ISFEV2018)2018 年 10 月 7-10 日
Memorial Union at Arizona State University

東北大学大学院環境科学研究科
佐野大輔
第６回食品・環境ウイルス学会（ISFEV2018）が、アリゾナ州立大学において、2018 年 10 月 7日から 10 日までの会期で行われる。本学会は、国際水協会（International Water Association: IWA）
内の研究委員会である Health-Related Water Microbiology (HRWM) study group に関わる研究者のうちウイルスの専門家によって設立され運営されているものであり、２年に１回国際会議が開催
され、水や食品中からのウイルス検出方法、検出事例、リスク評価および制御方法等に関する情報交換が行われている。
今回の発表数は、Plenary lecture が１件、Keynote Speech が 6 件, Oral presentation が 45 件、
Poster presentation が 40 件であった。この中で下痢症ウイルスに関わるものを中心に発表内容を紹介する。
ワークショップ・セッションプログラム：
10 月 7 日：

Workshops:
How much virus reduction do we need for wastewater intended for recycling?
Measurement of virus infectivity - where do we stand?

10 月 8 日：

Plenary lecture:
Professor Albert Bosch, University of Barcelona「Hep A is here to stay」
Session 1: Viruses in Food & Water & their Public Health Impacts
Session 2: Analytical Methods for Virus Detection & Quantification

10 月 9 日：

Session 3: Risk Assessment & Viral Occurrence
Session 4: Viral Structure, Stability, Fate & Transport
Session 5: Emerging Technologies for Viral Disinfection & Treatmen

10 月 11 日：

Session 6: Virus Outbreaks, Epidemiology, & Source Tracking
Session 7: Emerging Issues




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