FMODBを活用したリガンド-タンパク質間相互作用解析
半田佑磨
星薬科大学

FMODB上での操作

PIEDA成分の描画

PIEDA成分の解釈

BVを⽤いた結果の確認

チュートリアルの⽬的と内容
⽬的・メインプロテアーゼ-リガンド複合体の相互作⽤解析
n 内容①
・FMO計算によるタンパク-低分⼦複合体の解析例
n 内容②
・FMODB上での計算結果の確認
・FMODBからPIEDAデータのダウンロード
・PIEDA成分の解釈
・BioStation Viewerを⽤いた結果の確認
n実際の解析例FMODB上での操作

BSVを⽤いた結果の確認

PIEDA成分の解釈

チュートリアルの⽬的と内容
⽬的・メインプロテアーゼ-リガンド複合体の相互作⽤解析
n 内容①
・FMO計算によるタンパク-低分⼦複合体の解析例
n 内容②
・FMODB上での計算結果の確認
・FMODBからPIEDAデータのダウンロード
・PIEDA成分の解釈
・BioStation Viewerを⽤いた結果の確認
n実際の解析例FMODB上での操作

BSVを⽤いた結果の確認PIEDA成分の解釈

COVID-19関連タンパク質•

COVID-19の治療薬の探索•

SARS-CoV-2の増殖におけるMproの機能
ウイルスRNA

From the FMODATABASE

阻害剤デザインの主なターゲットタンパク質

翻訳ポリペプチド

Main ProteasenMain Protease(Mpro)

ウイルスの複製・翻訳に関わる
機能性タンパク質ウイルスの複製に間接的に関与

研究背景と⼿法• Mpro阻害剤候補化合物
Nelfinavir

Lopinavir
Nelfinavir

lopinavir

1.13

5.73

EC50(μM)

bioRxiv (2020), https://doi.org/10.1101/2020.04.06.026476⇒これらの阻害剤とMproとの複合体の結晶構造は解かれていない• フラグメント分⼦軌道法(FMO法)
Total Energy and IFIE

𝐸𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 = ' 𝐸′𝐼 + ' ∆𝐸,𝐼𝐽
𝐼

フラグメント間相互作⽤
エネルギー(IFIE)𝐼>𝐽PIEDA (Pair Interaction Energy Decomposition Analysis)

ΔE＝ΔEES＋ΔEEX＋ΔECT＋mix ＋ΔEDI

静電⼒(ES)、交換反発⼒(EX)電荷移動(CT)、分散⼒(DI)

ESやCTに基づく⽔素結合、DIに基づくCH/π相互作⽤などが解析可能

O

R1H
N

H2N
O

R3O
H
NN
H
R2O

R5N
H

R4OH
O

タンパク質のフラグメント分割

1.ドッキング

4.FMO計算

3.MD計算2.FMOスコアリング

研究⽅法
1.ドッキング

30構造

Nelfinavir・MOE(CCG)
・Force field:AMBER10:EHT
・Refinement : Induced fit
・Tether:1

Mpro

2.FMOスコアリング

Oakforest-PACS
・Program : ABINIT-MP・Level: MP2/6-31G*
・Computer :Oakforest-PACS, 富岳

FMOエネルギーを⽤いた
スコアリング
3.MD計算TSUBAME3.0

4構造
100pose4.サンプリング構造に対するFMO計算

100pose100
pose100pose

富岳
400構造に対してFMO計算を実⾏。
(100×4=400構造)・heat:50ps(0K-300K)
・equalization:50ps(300K)
・Productionrun:100ns
・Force field:Amber10:EHT
・Solvent:water・Periodic boundary condition
・Program : ABINIT-MP・Level: MP2/6-31G*
・Computer :Oakforest-PACS, 富岳
・FMOe、abmptools、
BioStation Viewer

1.ドッキング

3.MD計算2.FMOスコアリング

4.FMO計算

静的構造のIFIE vs. 動的構造のIFIE
LigandのRMSD
後半50nsに対しFMO計算を⾏った

RMSD 平均 3.99
RMSD 分散 0.02

Pose3

ドッキングPose3

MDにより得られた構造

Gln189

Met165
Glu166
Glu166
Asn142

Glu166

Asn142

Met165

Gln189

1.ドッキング3.MD計算

2.FMOスコアリング

4.FMO計算

NelfinavirとMproの主な相互作⽤
RMSD of Ligand

Pose3

RMSD Average 3.99
RMSD variance 0.02

Residue Name
Asn142
Met165
Glu166
Gln189IFIE-4.18±3.50→-14.63±4.94-12.87±2.33-49.56±10.92-45.19±4.57

ES-1.73±2.59→-10.73±6.72-11.38±2.07-54.00±14.66-46.99±7.84

後半50nsに対してFMO計算を⾏った。

DI-3.31±2.24→-11.04±2.74-4.10±1.57-6.59±2.36-14.13±1.47実際の解析例FMODB上での操作

BSVを⽤いた結果の確認

PIEDA成分の解釈

チュートリアルの⽬的と内容
⽬的・メインプロテアーゼ-リガンド複合体の相互作⽤解析
n 内容①
・FMO計算によるタンパク-低分⼦複合体の解析例
n 内容②
・FMODB上での計算結果の確認
・FMODBからPIEDAデータのダウンロード
・PIEDA成分の解釈
・BioStation Viewerを⽤いた結果の確認
n実際の解析例

FMODB上での操作

BSVを⽤いた結果の確認

PIEDA成分の解釈

FMODBのHP
・FMODBのホームページ

・FMODBの構造検索画⾯

Ø ID検索だけでなくキーワード検索も可能
Ø カテゴリー検索も可能
Ø 今回はID検索(6W63)で実⾏する。

FMODB(https://drugdesign.riken.jp/FMODB/）実際の解析例

・DB上でまとめられている情報
ü Modeling method

FMODB上での操作

BSVを⽤いた結果の確認

Web上で解析・DB上で表⽰される相互作⽤グラフ
全て

ü FMO calculation
ü Total energy
ü Ligand binding energy
・DB上で⾏える解析

PIEDA成分の解釈

4.5Å以内4.5Å以内かつ|Total IFIE|>10

実際の解析例FMODB上での操作

BSVを⽤いた結果の確認

PIEDA成分の解釈

データのダウンロード

・DBからデータをダウンロードする⽅法

・ダウンロードしたデータを解凍して得られるもの
ü PDBファイルü AJFファイルü CPFファイルü OUTファイルü LOGファイル(FMODBID).zip
ifie_data.csvの⼆種類をダウンロード

実際の解析例FMODB上での操作

BSVを⽤いた結果の確認

BSVを⽤いた解析-値の取り出し1.BioStation Viewerを⽴ち上げる。デスクトップのアイコンなどから可能。
2.BioStation Viewerに、cpfファイルをドロップ。
※BioStation Viewer Lite Open1.0 rev.23 Binds 017 b006

3.左側「A鎖」を展開して⼀番下にある「X77」をクリック→リガンドが選択される。
4.右側のMonitor>PIEDA Listを選択

PIEDA成分の解釈

実際の解析例FMODB上での操作

BSVを⽤いた結果の確認

PIEDA成分の解釈

BSVから得られたPIEDA情報の解釈
基本的に構造を⾒なければPIEDAの解釈はできない
構造のどの部分に注⽬して解釈をすればよいかが分かる

His41
Glu166
Ø EX成分・⼤きすぎないか確認(30kcal/mol以下)
Ø ES成分・電荷による相互作⽤がある程度確認できる・ESだけが⼤きくCTがないものは⽔素結合とは考えにくいØ CT成分・ESに加えてこの成分があると⽔素結合の可能性が⾼いØ DI成分
・His41→芳⾹環を持つためπ軌道関連の相互作⽤︖
・Met165、Glu166→グラフだけではわからない実際の解析例FMODB上での操作

BSVを⽤いた結果の確認

BSVを⽤いた解析-相互作⽤の可視化-

1.画⾯右のMonitor＞PIEDA(1:1)を選択
2.図に⽰すように選択し、エネルギーの強さによって各成分ごとに⾊の濃淡をつける
3.⾊の濃い残基、あるいは計算結果に基づいて確認したい残基を選択してStick表⽰にする

ES成分
DI成分

PIEDA成分の解釈

実際の解析例

BSVを⽤いた結果の確認

FMODB上での操作

PIEDA成分の解釈

FMO計算によるタンパク-低分⼦複合体の解析例

・Ligand周辺の相互作⽤
His41

His41

His163

Glu166

・Ligand周辺の相互作⽤(平⾯図)
His41
Glu166
His163
Glu166

His163

では実際にやってみましょうBioStation Viewerの基本操作
n環境
nn

BioStation Viewer
n https://fmodd.jp/biostationviewer-dl/

基本操作
nn

n

分⼦の回転
n 左クリックを押しながらカーソルを動かす
分⼦の平⾏移動n 右クリックを押しながらカーソルを動かす
分⼦の拡⼤
n 中央ボタンを押しながらカーソルを上下に動かす

n

その他操作
nnn

nn

選択したリガンドをstick表⽰にn 選択した状態で右クリック>Model/Color
選択した原⼦を中⼼に設定
n Tool>Set Center
IFIE(PIEDA)で⾊付け
n Monitor > PIEDA(1:1)
アミノ酸残基をstick表⽰
n 選択した状態で右クリック>Model/Color
タンパク質のリボンを表⽰
n Model＞Structure＞Solid Ribbon

チュートリアルまとめü

PIEDA分割による相互作⽤が視覚的に理解できる

ü

分⼦間相互作⽤が具体的な数値に基づいて議論できる

His41

His163

Glu166

＜チュートリアル＞
FMODBデータを対象とした相互作用クラスタリング解析

n ターゲット
エストロゲン受容体 (Estrogen Receptor : ER) βERのサブタイプのひとつであり、17β-Estradiol (EST) との親和性は ERαと同等であるが、 Genistein (GEN) などの植物エストロゲンとの親和性が高い。
ERα IC50（nM）

ERβ IC50（nM）

17β-Estradiol

3.2±1.0

3.6±1.6

Genistein395±18110±4LigandMalamas, M.S., Manas, E.S., McDevitt, R.E., Gunawan, I., Xu, Z.B., Collini, M.D., Miller, C.P.,
Dinh, T., Henderson, R.A., Keith Jr., J.C., Harris, H.A. J.Med.Chem. 47: 5021-5040 (2004)
OHO

17β-Estradiol (EST)O

OH

リガンド結合ポケット
M336(ERα L384)

OH

Genistein (GEN)Ø リガンドのサブタイプ選択性を解析する。
FMODBに登録されたデータを用いて、受容体ーリガンドの相互作用パターンに基づくクラスター解析を行う。

I373(ERα M421)

n ERβの複合体としてPDB (Protein Data Bank) に登録されているリガンドが23個ある。

2QTU

1YY43OLS

1L2J

1U3Q

1QKM

1X7B

1X78

2NV7

2GIU

1U9E

1X76

1U3S

1ZAF

2JJ3

2YJD2Z4B

4ZI1

3OMO

1YYE

1U3R

3OMP

3OMQ

サブタイプへのselectivityが異なる多数のリガンドをクラスタリングによって網羅的に解析する。

n VISCANA(Visualized Cluster Analysis of Protein-Ligand-Interaction)
相互作用エネルギー (IFIE) に基づいたクラスター解析により、受容体結合におけるリガンドの類似性を抽出する手法である。
• リガンド―アミノ酸残基間相互作用の類似性を距離として定義し、階層的クラスター解析を行うことができる。
• リガンド同士の類似性の距離が近いほどフラグメントとの結合の類似性が高い。

•

サンプル例題のERβ複合体をターゲットとし、ソフトに BioStationViewer を、手段に VISCANA を用いて解析することで、リガンドを受容体との相互作用パターンによって分類する。
S. Amari et al., J. Chem. Inf. Model. 46 (2006) 221-230.

n FMO計算結果の一括ダウンロードの手順
I.

計算結果のファイルをまとめておくための新しいディレクトリを作成しておく。

II. FMODBより、Category – X-ray All Entries– Nuclear receptor: ERb を選択する。

III. SortでRegistration data: ↑Oldest to Newestを指定する① → Submit②①②

上から登録の新しい順にソートされる。

https://drugdesign.riken.jp/FMODB/

n FMO計算結果の一括ダウンロードの手順
IV. Displaying results: 10を指定しデータを10個表示にする①。
V. Check Point File (checked items up to 10 data)にチェックをつける② → Submit③③②①
表示中のデータ10個が一括でダウンロードされる。

VI. ダウンロードしたzipファイルを開き、解凍する。
VII. Next＞をクリックし2ページ目の10個のデータを表示したら、同様に手順V. VI.の操作で10個のデータをダウンロード後zipファイルを解凍する。

n FMO計算結果の一括ダウンロードの手順
VIII. 再度Next＞をクリックし3ページ目の10個のデータを表示したら、上から3個のデータ(PDB ID: 1U3Q, 1QKM, 1L2J)にチェックをつける。

チェックしたデータは背景が青色になる。

n FMO計算結果の一括ダウンロードの手順
IX. DownloadでChecked itemsを指定し①、Check Point File (up to 10 IDs)にチェックをつける② → Submit③②①③
選択したデータ3個が一括でダウンロードされる。

X. ダウンロードしたzipファイルを開き、解凍する。

XI. 解凍したファイル内の.cpfファイル計23個を、手順 I. で作成したディレクトリに移動させ一つにまとめる。

n VISCANAの操作手順
I.

Monitor → VISCANA を選択する。

II. CPF Data Directory… で cpfファイルをまとめたディレクトリを指定① → Load②①
VISCANAのウインドウが開く。
正常に Load されればCluster Analysis の Apply が表示される。

②

n VISCANAの操作手順
III. Data Select でクラスタリングに用いる相互作用エネルギーを指定する。
今回は IFIE-MP2 を指定する①。
IV. Cluster Analysis で以下の指定をする。
ü Base Fragment をリガンドのフラグメント番号にする②。
ü Data Selectで設定したエネルギーの○ 範囲○ 合計の範囲②③を指定する③。
①→ Apply④④

結果の図が表れる。

n VISCANAの見方
17β-Estradiol

リガンド
O

Genistein
HOOOHOH残基※ 各クラスターの一番上に表記されたリガンドがクラスターセンター

選択性のない17β-Estradiolと選択性のあるGenisteinは別のクラスターに含まれる。

n 図の整理
Viewer Filter で Base Fragment からの距離を指定する① → Filter②①②

指定した距離内のフラグメントとの相互作用バンドのみを表示することができる。

n クラスタリングの結果の詳細な解析I.

Data を Analysis に変え①、Cluster No の On にチェックをつける②。
①②

黄色の破線はカーソルを動かすと連動する。
破線の位置でクラスター分割したときに割り当てられるクラスター番号がリガンド名左に表記される。

n クラスタリングの結果の詳細な解析
II. Cluster #1 にチェックをつけ③、クラスターの分岐に破線を置き白線との交点をクリック④。
④

クラスター1 のリガンド名がマゼンタになる。

③
III. 同様にCluster #2 にチェックをつけ⑤、白線と破線の交点をクリックする⑥

クラスター2のリガンド名が緑になる。

⑥⑤⑦→ Apply⑦（次頁）n クラスタリングの結果の詳細な解析
Result(fragment#, value) の欄に、クラスタリングに寄与したフラグメント番号 (#) と寄与の度合いを示す値 (value) が表れる。
寄与フラグメントを選択すると①、そのフラグメントとの相互作用バンドの列が黄色になる。

①

n 結果の図の保存
File①から Save Image を選ぶ。
①A) Save In: 保存先ディレクトリ
B) File Name: ファイル名.png
C) File of Type: Image file (.jpg, .tif, .png)
を指定→ Save②AB
C②
VISCANAの図がファイルとして保存される。

n クラスタリング結果をもとに相互作用を確認
I.

リガンドと fragment: 210 との相互作用バンドを指定し①(黄色が消える)、再度AnalysisをDataに変える②。

①②
II. 3D Model View ③。
Viewer に複合体構造が読み込まれる。
③

Ligand clustering for ERβ
E305

R346

F356

H475

EST

*19.3

GEN

*32.3
*IC50比 (α/β)の平均

H475 との相互作用の有無
1QKMⅠ3OLS
H475

M336
O

E305

H475 との相互作用の強さ

OH

M336

E305

NSⅡSH475

O

HO

R346

F
F

N
H

O

HO

I373

HN

HO

R346

I373

HN

NH

NH

NH

F356

F

N

N

O

NH
NH

O
S

O

OH

I373

HN

H475

M336

E305

N

O

O

Ⅲ

N
H

N
H

O

OH

3OMP

NH

F356

R346

F356