がんと代謝
総説

がんと代謝 ～多細胞連関からオルガネラレベルの解像度での解析を目指して～
Cancer Metabolism ~understanding cell-cell to organelleorganelle metabolic interactions~

東京大学

187

2023 No.

ISSN 0385-1516

大澤 毅

生命科学の最前線～熊本大学若手研究者の現場から～動的構造解析による酵素反応機構の解明
Structural dynamics in enzymatic reaction

熊本大学

中村 照也

注目の研究

低酸素下におけるミトコンドリア-リソソーム間相互作用

株式会社同仁化学研究所

連載

抗酸化キットを使う前のサンプル前処理法〈第 3 回〉 P.14

小松 恭佳

No.187（2023）

2023 No.187 ドージンニュース

CONTENTS
Review
がんと代謝 ～多細胞連関からオルガネラレベルの解像度での解析を目指して～
Cancer Metabolism ~understanding cell-cell to organelle-organelle
metabolic interactions~
東京大学 大澤 毅

1

Topics on Chemistry
低酸素下におけるミトコンドリア-リソソーム間相互作用
株式会社同仁化学研究所

小松 恭佳

9

Review
動的構造解析による酵素反応機構の解明
Structural dynamics in enzymatic reaction
熊本大学 中村 照也

11
表紙:小国町連載
抗酸化キットを使う前のサンプル前処理法 〈第3回〉
株式会社同仁グローカル

山口 勝則

14

鍋ヶ滝

冬場にマイナス 5 度以下が約
1 週間続くと滝にツララが現れる。その季節を待って撮影に出かけた。滝の裏側に廻って岩の中からツララを撮影した。
photo:永島 俊介氏

Commercial

細胞内代謝関連製品………………………………………………………… 6
酸素消費プレートアッセイキット………………………………………… 8
細胞数ノーマライゼーションキット

…………………………………… 8

リソソーム染色試薬………………………………………………………… 10
リソソームpH検出試薬 …………………………………………………… 10
リソソームpH検出キット ………………………………………………… 10
抗酸化能測定キット………………………………………………………… 15
脂質過酸化関連製品………………………………………………………… 16
バイオフィルム関連製品…………………………………………………… 17

お役立ち「食品機能評価 微生物検出」冊子リニューアル ………………………… 11
抗酸化能セミナー

アーカイブのご案内………………………………… 16※希望納入価格には消費税は含まれておりません。
※記載価格は本誌発行時における希望納入価格です。
予告なしに変更する場合がございますのでご注意ください。
※掲載製品は試験・研究用のみに使用するものです。医療用その他の目的には使用できません。

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No.187（2023）

がんと代謝～多細胞連関からオルガネラレベルの解像度での解析を目指して～

Cancer Metabolism ~understanding cell-cell to organelle-organelle metabolic interactions~

Abstract
大澤 毅
東京大学
先端科学技術研究センター
准教授

Recently, integrative multi-omics analyses that link organs,
cells and even organelles has been extensively studied
and are attracting attention. In solid tumors, because of
microenvironments such as hypoxia, malnutrition, and acidic
pH caused by impaired vascular structures, cancer cells
promote metastasis and invasiveness contributing resistanceto chemotherapy and poor prognosis. Not only changes in theomics of cancer cells themselves, but also interactions between
cells and organelles play an important role in cancer malignancy,
attention as a target. Therefore, in this review, I would liketo provide an overview from the perspective of multi-omics
analysis that links cells, multicellular spaces, and organelles,
which can be the essential cause of diseases such as cancer.

1. はじめに

近年、疾患生物学研究において、臓器間や細胞間を連関するオ
ミクス統合解析が盛んに行われている。また最近では、疾患オミ
クス解析がオルガネラレベルの解像度で明らかになってきており注目を浴びている。固形がんでは、不完全な血管構築や血流不全により生じる低酸素、低栄養、低 pH などのがん微小環境が存在し、エピゲノム、トランスクリプトーム、プロテオーム、メタボロー
ムなど様々な階層のオミクス変動を介して、転移・浸潤能などを促進し、治療抵抗性や再発・転移などにより、予後不良のがん悪性化に寄与することが知られてきた。この粗悪ながん微小環境では、がん細胞自身のオミクス変動のみならず、細胞間の相互作用
やオルガネラ間の相互作用もがん悪性化に重要な役割を果たすた
め、オルガネラ制御が新しい癌治療標的として注目を集めている。
そこで本項では、がんなど疾患の本質的な原因となり得る細胞―
多細胞間―オルガネラ間を連関するマルチオミクス解析の視点から概説したい。

栄養
酸素 (pO2)
pH

pH7.4

pH7.4-6.8

pH6.8>

血管
解糖系

+++
+++

+
+

++

脂質代謝

+

++

+++

+/-

+++

+/-

++

血管新生
がん幹細胞

+/-

2. がんと代謝研究におけるマルチオミクス研究の必要性

がんや生活習慣病などの克服には、多階層オミクスを統合した疾患の病態解明から治療戦略の確立が重要と考えられる。がん組
織内には、酸素や栄養状況が時空間的に変化するがん微小環境に起因する細胞不均一性（ヘテロジェナイティー）が存在する。固形がんでは、不完全な血管構築や血流不全により生じる低酸素、
低栄養、低 pH などのがん微小環境が、細胞間の相互作用やオルガネラ間の相互作用を介して、エピゲノム、遺伝子発現、タンパ
ク質の相互作用、エネルギー代謝変動など、各階層における膨大な多次元要素が有機的に繋がって、がん細胞の転移や浸潤能の促進を引き起こし、がんの悪性化に寄与するが知られている。また、
このような粗悪ながん微小環境に適応したがん細胞は、しばしば細胞死耐性を獲得し、免疫寛容や薬剤耐性を示すことで再発や患者の予後不良に関与することが報告されている。このことから、酸素や栄養の供給が不足したがん微小環境で生存するがん細胞に対する創薬標的を探索することが重要であると考えられる。本総説では、近年一般的になってきた、エピゲノム、トランスクリプ
トーム、メタボロームのマルチオミクス解析から新たに見えてきた、粗悪ながん微小環境で中心的な役割を果たす細胞―多細胞―オルガネラレベルのマルチオミクス解析の視点から最近の知見を紹介したい。

図1

不完全な血管網の構築により腫瘍微小環境が確立される栄養素と酸素は、血管から遠く離れた細胞に利用できない。ワールブルグ効果
としても知られる解糖系の亢進は、乳酸を排出により微小環境の pH を酸性にします。脂質代謝は、低栄養で亢進される可能性がある。極端な微小環境におけるがん細胞特異的な代謝変化は、がんの幹細胞性の維持、血管新生の誘導、および転移にも関与する。

1

No.187（2023）

A

低pH
chr14

低酸素
chr2

5kb

FAIRE (Con) 100

FAIRE (Con) 120

FAIRE (Con) 50
0K27ac (Con) 10010FAIRE (pH) 0
10
K27ac (pH) 0
FAIRE (H) 100
K27ac (H) 100
10
FAIRE (NS) 0
10
K27ac (NS) 050

FAIRE (pH) 070

K27ac (pH) 0
FAIRE (H) 50
0
K27ac (H) 70
050

FAIRE (NS) 070

K27ac (NS) 0

オープンクロマチン領域
低酸素

低栄養
低栄養
Top p-value
11107
2000 peaks

低酸素
2963

7195

9674
1485

B

LCN2

低pH 特異的モチーフ
low pH specific (2000 peaks)

低+,
低pH

pH7.4

130,915 kb

PDK1

8833

5305

5kb
130,910 kb

K27ac (Con) 25
012FAIRE (pH) 025
K27ac (pH) 0
FAIRE (H) 120
K27ac (H) 25
0
12
FAIRE (NS) 025
K27ac (NS) 0

K27ac (Con) 70
0

ARG2

図2

低栄養
chr9

5kb

P-valueAP-1

6.89E-132

TP53

1.07E-44

ZNF143

2.58E-26

SREBP

1.52E-18

pH6.8

がん微小環境に対するエピゲノム・代謝調節機構（A）がん微小環境における、低 pH（pH）
・低酸素（H）
・低栄養（NS）では、異なったエピゲノム状態（ヒストン修飾（活性化遺伝子 H3K27Ac）及び、ヌクレオソー
ムフリーな（FAIRE））の遺伝子が存在する。（B）通常状態（左、細胞外 pH 7.4）では、SREBP2 は ER（小胞体）に局在し不活性型である。低 pH 環境にがん細胞が陥ると（右、細胞外 pH 6.8）、細胞内の pH が低下し、SREBP2 がゴルジ体を経由して核内に移行し活性化する。その結果、コレステロール生合成や酢酸代謝に関連する酵素群の発現を誘導することで、がんの生存や進展に寄与する。

3.1 オミクス統合解析からみたがん細胞の悪性化機構

正常細胞と比べてがん細胞では解糖系に依存した代謝に変化することが古くから知られている。オット・ワーブルグ博士（18831970）により 1920 年代に提唱された有名な事象であるが 1）、酸素の有無に関わらずがん細胞は、エネルギー産生としては非効率な経路（酸化的リン酸化が 1 分子のグルコースから 38ATP 産生するのに対し、解糖系からは 2ATP しか産生しない）である解糖系を中心的に利用するというものである。また、増殖期や低酸素のがん細胞において解糖系は、主要なエネルギー産生系であり、さらに、解糖系から核酸合成、アミノ酸合成、タンパク合成、細胞膜合成など細胞増殖のために必要な分子が制御される。また、グルタミン（グルタミノリシス）やロイシン、イソロイシン、リジンなどの分岐鎖アミノ酸（BCAA）を利用した経路が、がん幹細胞維持に重要であるということが注目されている 2）,3）。また、増殖期の細胞における解糖系の亢進は、低酸素で活性化する
HIF1a を介した一連の解糖系酵素群の発現誘導（転写制御）や、

2

低酸素応答性ヒストンメチル化・脱メチル化酵素群（エピゲノム制御）が関与していることが報告されている。さらに、最近では、タンパク質のリン酸化や複合体形成のみならず、RNA 修飾や RNA―タンパク質の結合を介したエピトランスクリプトーム
制御が 4）、増殖期のがん細胞における多階層オミクスが解糖系を制御することが報告されている。
これまで単なる低酸素や解糖系の結果として考えられてきた
低 pH がん微小環境においても、酢酸代謝の中心代謝酵素である
ACSS2 が発現誘導されることを明らかとした 5）,6）。我々の研究グループは、がんにおける酸性状態を模した培養系を用い、がん細胞に対しトランスクリプトーム、エピゲノムなどのオミクス統
合解析を行なった。その結果、コレステロール代謝におけるマス
ターレギュレーターとして知られる SREBP2 を、低 pH で機能する転写因子として見出した 7）（図２）。マルチオミクス解析が一般化されつつある現在、これまで知られていない多次元を連関する
フィードバック制御機構が次々と発見されることが期待できる。

No.187（2023）

A
がん幹細胞

血管
（血管内皮細胞）

？
？

がん細胞

？
細胞間代謝相互作用

がん関連繊維芽細胞

免疫細胞
炎症細胞

周皮細胞

浸潤性がん細胞B

発現増加遺伝子発現低下遺伝子

がん

がん

474

311

56

24

414

7

43

繊維芽細胞

18
456

380

免疫細胞

0

5

34

394

繊維芽細胞

免疫細胞

Upregulated Pathways under Hypoxia
免疫細胞

0

がん

HIF-1 Independent Pathways

HIF-1-alpha network

HIF-1-alpha network

Clear cell renal cell carcinoma HIF-1-alpha network

Terpenoid biosynthesis

Collagen formation

5

10

15

-log (q-value)
図3

繊維芽細胞

0

2

4

6

-log (q-value)

Glycolysis

Clear cell renal cell carcinoma

0

5

10

15

-log (q-value)

腫瘍組織は、がん細胞、がん関連線維芽細胞（CAF）、免疫細胞、血管内皮細胞など様々な細胞で構成される（A）がん細胞は、隣接する間質細胞または免疫細胞の代謝リプログラムし、がん細胞の増殖に利用できるアミノ酸などの栄養素を提供し、また、免疫寛容するシ
グナル伝達物質を分泌する。（B）低酸素腫瘍微小環境は、がん細胞、線維芽細胞、および単球 / マクロファージにおいて異なる遺伝子発現系を誘導する。低酸素
下では HIF1 α を介した解糖系は様々な細胞で共通して亢進されるが、単球 / マクロファージでは HIF1 αに非依存的経路も亢進することが明らかとなってきた。

3.2 がん微小環境における細胞間代謝相互作用

がん組織内の腫瘍微小環境は、栄養素や酸素、pH のみならず、さまざまな種類の細胞間の相互作用によって形成される 8）。例えば、がん細胞は、腫瘍微小環境で最も豊富な細胞の一つであるがん関連線維芽細胞（CAF）からのアラニンやグルタミンといった代謝物質を利用して増殖する。また、免疫細胞もがんの進行に関与しており、がん細胞から分泌される乳酸やキヌレニンなどの代謝物質が免疫細胞の免疫抑制機能を増強することが知られている 9）。さらに、T 細胞の代謝異常は、がん細胞に対する免疫応
答を抑制することが報告されている 10）。当研究室においても、がん細胞単独、あるいは多細胞連関モデルを用いた腫瘍形成実験を行ったところ、がん細胞－ CAF －免疫細胞の代謝相互作用が腫
瘍形成に大きく寄与することを見出している。
これらの代謝相互作用を介した細胞間連関は、がん細胞の遺伝子やエピジェネティックな変化を誘導することが知られており、がんの進行や治療耐性に影響を与える可能性がある。例えば、

3

No.187（2023）A

分裂
PM

オルガネラ間接触

ER
EE

Mitochondria

代謝物
PI(4)P

Lysosome

A
ER

LE

代謝物

Golgi

Nucleus

図4

分裂
代謝物

融合

融合

細胞間および細胞内の代謝相互作用でオルガネラが中心的な役割を果たす（A）オルガネラ間代謝相互作用は、互いの機能を協調的に制御することで生体恒常性に重要な役割を果たしている。オルガネラ間代謝相互作用の理解は、がんを含む疾患の病態生理学の解明し、生体における代謝ロバストネス制御に繋がる新しい疾患治療戦略となることが期待される。（B）オルガネラ代謝相互作用によるミトコンドリア融合メカニズムは未だに解明されていない。（C）PIP 代謝物がミトコンドリア外膜に作用することでミトコンドリア融合が開始される。

CAF はがん細胞の増殖を促進するサイトカインを分泌すること
で、がん細胞の遺伝子発現プロファイルを変化させることが報告されている。また、腫瘍微小環境に存在する酸素の欠乏は、がん細胞の遺伝子発現や代謝プロセスを変化させ、治療抵抗性を引き起こすことが報告されている。したがって、腫瘍微小環境における細胞間相互作用の理解は、新しい治療法の開発に重要な役割を果たすことが期待される。

3.3 オルガネラ - オルガネラ代謝相互作用を介した疾患制御

近年、疾患オミクス解析が臓器間や細胞間、さらにはオルガネ
ラレベルの解像度で明らかになってきており、組織や細胞間相互作用だけでなく、オルガネラレベルでの代謝相互作用が注目されている。オルガネラは、時々刻々とその形態や局在を変化させ、局所的な生体物質の調節やシグナル伝達の場として機能し、多様な生理学的プロセスを調節することで、積極的に細胞機能を制御4している。近年、超解像度顕微鏡をはじめとしたイメージング技
術の飛躍的な向上により、個々のオルガネラが直接的な接着を介して互いに連関し、オルガネラ相互作用（ネットワーク）を形成していることが明らかになってきた。あるオルガネラの機能や形態変化が他のオルガネラにも影響するように、このネットワーク
は物理的な繋がりに留まらず、代謝物やシグナル伝達、オルガネ
ラ形態制御など互いの機能を協調的に制御することで生体恒常性に重要な役割を果たしている 11）。我々は、腫瘍微小環境下におけるゴルジ体と小胞体（ER）の融合が起因となり転写因子が活性化し、コレステロール生合成を促進することを発見し、オルガネ
ラの形態変化を介したがんや生活習慣病の新たな転写調節メカニズムとして注目している。また、ミトコンドリアの分裂が小胞体
やゴルジ体との相互作用によって調節されていることが報告されているが 12）,13）、我々も他のオルガネラを介した PIPs の代謝変換により制御される、新たなミトコンドリア外膜融合機構を見出している（図４）。さらに、PIPs 代謝酵素 KO マウスはミトコンド

No.187（2023）

リア形態の異常を示し、循環機能不全を呈することから、オルガ[ 参考文献 ]1）Warburg O, Science, 1956, 123, 309-314.
ネラの独自構造が生体恒常性の維持は密接に関連しており、細胞
2）McKeehan WL, Cell Biol. Int. Rep., 1982, 6, 635-650.
内の正常な機能とバランスを維持するために重要な要素であるこ3）Hattori et al., Nature, 2017, 545（7655）, 500-504.
とが示唆される。
4）Esteller and Pandolfi, Cancer Discov., 2017, 7（4）, 359-368.
がんでは、オルガネラが腫瘍微小環境への適応を調節する上で
5）DeNicola GM & Cantley LC, Mol Cell, 2015, 60（4）, 514-523.
重要な役割を果たし、細胞内でのミトコンドリア、ゴルジ体、小6）Shug ZT et al., Cancer Cell, 2015, 27（1）, 57-71.
胞体、オルガネラの機能の変化は、がんの増殖、浸潤、そして転
7）Kondo et al., Cell Rep, 2017, 18（9）, 2228-2242.
移や生活習慣病に関与すること報告されている 14）。最近では、ミ8）Dey P et al., Cancer Discov., 2021, 11（5）, 1067-1081.
9）CM Sousa et al., Nature, 2016, 536, 479-83.
トコンドリアが STING 活性化に関与していることが示唆されて
10）Madden MZ et al., Cancer Discov., 2021, 11（7）, 1636-1643.
おり、ミトコンドリア由来小胞からの DNA の放出やミトコンド
11）Jain A et al., Mol Metab., 2022, 60, 101481.
リアのストレス応答が STING を刺激し、免疫応答を誘導するこ12）JR Friedman et al., Science, 2011, 334, 358-362.
とが報告されている 15）。さらに、従来ミトコンドリアは細胞内で13）Nagashima et al., Science, 2020, 367, 1366-1371.
生成・維持されるものと考えられてきたが、細胞間でミトコンド
14）A Saminathan et al., Nat. Rev. Mater., 2022, 7（5）, 355-371.
リア輸送を行う細胞間ミトコンドリア転送も観察され、オルガネ
15）Zecchini V et al., Nature, 2023, 615, 499-506.
ラを介した細胞間連関という、新たな階層の細胞間オルガネラ相
16）Liu D et al., Signal Transduct Target Ther., 2021, 6（1）, 65.
互作用の存在も示唆されている 16）。細胞間ミトコンドリア転送は、細胞の生存や代謝に重要な役割を果たす可能性があり、疾患の理解に新たな展望を提供する研究領域となり得る。細胞は、環境の ［著者プロフィール］
変化やストレスに応じてオルガネラの形態を調節し、適切な機能
氏名：大澤 毅（Tsuyoshi Osawa）を維持する仕組みを有しており、腫瘍微小環境下に晒されたがん
所属：東京大学 先端科学技術研究センター
細胞では、劇的なオルガネラ構造変化が起こり、オルガネラ相互
ニュートリオミクス・腫瘍学分野
作用が変動すると考えられる。これら病態の克服には、細胞内代〒 153-8904 東京都目黒区駒場 4-6-1
謝適応の要となるミトコンドリアをはじめとしたオルガネラ間の東京大学先端科学技術研究センター
代謝物を介した相互作用の理解が必須であり、がんや生活習慣病
Tel：03-5452-5025の新たな治療法の開発に繋がることが期待される。
E-mail : osawa@lsbm.org
出身学校：英国ロンドン大学（UCL）大学院 腫瘍学専攻
学位：（博士（腫瘍学））
4. おわりに
専門分野：がん代謝学、ニュートリオミクス
生命は核酸、糖質、脂質、タンパク質などの複雑な有機化合物
現在の研究テーマ：オミクスデータを統合し、がん微小環境におから構成されている。近年、次世代シークエンサー、質量分析器
けるがん悪性化機構の研究に取り組んでいる。
やクライオ電子顕微鏡などの普及により、ゲノム配列、転写、翻訳、代謝、タンパク質複合体、などの生命現象が網羅的に解析されてきており、従来の多細胞間相互作用、あるいは 1 細胞解析では捉えきれない、オルガネラレベルの代謝相互作用の解析へと展開され、がんの病態の研究はさまざまなスケールでの組織微小環
境における代謝相互作用の評価が可能となってきている。本項では、（1）がん細胞自身は、がん代謝を変化させることにより、低酸素、栄養飢餓、酸性 pH などの腫瘍微小環境に適応する。これは、治療に抵抗性を持つがん細胞が存在する理由の一つであり、適応がんが創薬の新たな標的になる可能性がある。（2）がん細胞と異なる細胞間の代謝相互作用は、がんの進行と生存に不可欠な栄養素を供給する。CAF は、腫瘍微小環境内で最も豊富な細胞であり、腫瘍の形成に必要な栄養素の供給源である。したがって、CAF を標的とした治療法の開発が期待される。（3）オルガネラ間相互作
用は、がんや生活習慣病における細胞増殖・老化、生存、転移、
環境適応など本質的な特徴に関与している可能性がある。オルガ
ネラを標的としたがんの治療は、細胞内での特定の代謝経路やオ
本総説の大澤毅先生の編集による新刊
ルガネラを制御のみならず生体における代謝ロバストネス制御に「マルチオミクス データ駆動時代の疾繋がる新しいがん治療戦略となることが期待される。
患研究」（羊土社）は、オミクス解析の概説から疾患研究の例までまとめられています。これからこの分野の研究を始める方はもちろん、新たなヒントを得たい
方におすすめです。

出版物のご案内

実験医学 増刊

マルチオミクス

データ駆動時代の疾患研究

大澤 毅 編発行：羊土社
2023 年 9 月 5 日発行 B5 判ISBN 978-4-7581-0413-5

222 ページ5

No.187（2023）

細胞内代謝関連製品
細胞内の代謝システム（解糖系や TCA 回路、ペントース - リン酸経路等）の解析は、細胞状態を理解する上で重要であり、グルコ
Hなどのエネルギーおよび代謝産物を指標に評価されています。既存の市販製品よりも高い操作性をースや乳酸、NAD（P）＋/NAD（P）
実現した小社製品は、測定に必要な試薬やコンポーネントも同梱しています。

＜細胞内代謝マップ＞
細胞内の代謝システムである、解糖系や TCA 回路、ペントース - リン酸経路の解析は、細胞状態を理解する上で重要であり、グル＋/NAD（P）H などのエネルギーおよび代謝産物を指標に評価されています。
コースや乳酸、NAD（P）

NADPH

Glutamine

Fatty acid

GlucoseNADP+

Amino acid

CystineCystineCy stinne

Glutamate

Glucose-6P
Gluc

Fatty acid

Cy
Cy

Ribulose-5P

ATP

GlycineG
lyci

Ketone bodies

Glycolysis

NAD+
NADH

OxphosCitrateTC A c yc le
LactateO2α-KG
AcetylCoA

Pyruvatee

β- oxidation

ADP

O2

GSH
GSSG

H2O

ADP
ATP

p.14

p.11ROSOxaloacetate

Glycolysi s /OXPHOS

p.17

mitochondrial
membrane potentialより詳しい情報はこちら
これから
品名
Glucose Assay Kit-WST

比色：450 nm

Lactate Assay Kit-WST

比色：450 nm

NAD/NADH Assay Kit-WST

比色：450 nm

100 tests

61,400N509

NADP/NADPH Assay Kit-WST

比色：450 nm

100 tests

59,700N510

Glutamine Assay Kit-WST

比色：450 nm

100 tests

58,900

G268

Glutamate Assay Kit-WST

比色：450 nm

100 tests

53,500G269

α-Ketoglutarate Assay Kit-Fluorometric

蛍光：Ex.530-560 nm
Em. 580-600 nm

100 tests

68,500

K261

ATP Assay Kit-Luminescence

発光

50 tests
200 tests

26,80048,200A550

Glycolysis/OXPHOS Assay Kit

比色：450 nm
発光

50 tests

51,400G270

発光100 tests

53,500A552

比色：450 nm
蛍光：Green : Ex. 480-490 nm
Em.525-545 nm
Red : Ex. 530-540 nm
Em.585-605 nm

50 tests

48,000G272

Glycolysis/JC-1 MitoMP Assay Kit

6

検索

同仁

容量
50 tests
200 tests
50 tests
200 tests

ADP/ATP Ratio Assay Kit-Luminescence

検出系

代謝

希望納入価格（￥） メーカーコード
19,900G264
41,90033,000L256
77,200No.187（2023）

細胞内代謝関連製品
グルコース取り込み検出キット

アミノ酸取り込み検出キット

蛍光標識グルコース誘導体 Glucose Uptake Probe は、高感度に細胞のグルコース取り込み能力を測定することができます。
さらに、本キットに含まれる Washing and Imaging（WI）
Solutionを用いることで細胞からのプローブの漏出を抑制し、再現性の高いデータを取得することが可能です。

増殖が活発ながん細胞において、アミノ酸はタンパク質や核酸の合成に必須な栄養素です。また、がん細胞では解糖系からのア
セチル CoA の供給が低下するため、TCA サイクルの栄養源としてアミノ酸を積極的に利用しています。そのため、がん細胞ではアミノ酸トランスポーター LAT1
（L-type amino acid transporter 1）の発現量を増やして、多くのアミノ酸を取り込んでいることが明らかとなっています。
本キットは、蛍光イメージング、プレートリーダー測定、フロー
サイトメトリーに対応しているため、細胞のアミノ酸取り込み能力を可視化、数値化することが可能であり、アミノ酸取り込み能力の評価やアミノ酸トランスポーター阻害剤のスクリーニングに有用です。

Glucose Uptake Assay Kit-Blue,Green,Red

Amino Acid Uptake Assay Kit

蛍光顕微鏡
2-NBDG

Glucose Uptake
Probe-Green

50 µm

50 µm

アミノ酸類似体取込

フローサイトメーター

プレートリーダー※

Probe

細胞外

アミノ酸類似体

60000

Fluorescence Intensity（a.u.）

Step 2. Probe を添加し、BPA と結合して発蛍光（Boronophenylalanine : BPA）

アミノ酸トランスポーター

Unstained

Probe 発蛍光（Ex= 355 , Em= 464nm）

40000

count

BPA

20000

Glucose Uptake
Probe-Green

2-NBDG

BPA

BPA

細胞内

+

細胞内

FITC

0

2-NBDG

Glucose Uptake
Probe-Green※ プレートリーダーでの検出は、Green、Red のみ対応しています。

※ 本キットは大阪府立大学の切畑光統先生から技術指導および情報提供をいた
だき開発した製品です。

シスチン取り込み検出キット

脂肪酸取り込み検出キット

キットに含まれる Cystine Analog（CA）は、シスチンと同様に xCT を経由して細胞に取り込まれます。細胞内に取り込まれた CA を抽出した後、還元剤存在下で検出用プローブ FOdA と反応させることによって、CA 量に応じた蛍光シグナルを得ることができます。
[ 特許出願中 ]本キットには、脂肪酸トランスポーターを介して細胞に取り込まれる Fatty acid analog を同梱しており、脂肪酸の取り込みを蛍光法にて検出できます。Quenching Buffer により洗浄操作の手間と時間を省いた検出が可能です。

Step 1. シスチンアナログの取り込み
シスチンアナログ（CA）（Selenocystine）

Fatty Acid Uptake Assay Kit

Step 2. 洗浄、メタノール抽出後に FOdA を添加し発蛍光
発蛍光Fluorescein O,O’-diacrylate（FOdA）
OH（Ex= 490 , Em= 535 nm）

O

Se Se

H2N

CA

NH2

O

HO
O

OH
O
O

H2N

Se Se

NH2

O

O

-

O

Se

O

O

O

O

Se
O

O

HO

O

OH

H2N
O

NH2

O

O

CA

O

蛍光顕微鏡

O

HO
O

O
O

O

-

O

Se

O

O

2

O
HO

OH

CA

H2N

細胞外
NH

O

O

HO

O

細胞内
O

O

O

COO

-

H2N

Se

-

CA

O

O
OH

O

O

OH
O
O

Se

O

O

O

プレートリーダー
Fluorescence Intensity（a.u.）

Cystine Uptake Assay Kit

CB-2 未処理の HepG2 細胞

フローサイトメーター

6000
5000
4000

Unstained

3000

0 µmol/l CB-2
20 µmol/l CB-2

2000
1000
0

0 µmol/l CB-2

20 µmol/l CB-2

O

品名
Glucose Uptake Assay Kit-Blue

容量
1 set

希望納入価格（¥） メーカーコード
42,800
UP01

Glucose Uptake Assay Kit-Green

1 set

40,700

UP02

Glucose Uptake Assay Kit-Red

1 set

42,800UP03

Amino Acid Uptake Assay Kit

17,10048,20019,30053,500UP04

Cystine Uptake Assay Kit

20 tests
100 tests
20 tests
100 tests

Fatty Acid Uptake Assay Kit

100 tests

32,000

UP07

UP05

7

No.187（2023）

酸素消費プレートアッセイキット
Extracellular OCR Plate Assay Kit

OCR 測定が初めての方にも最適！

＜特徴＞
・細胞の酸素消費速度をプレートアッセイで測定可能※・プレートリーダーの蛍光モードでの測定が可能※
・専用のプレートや培地の必要がない

2.5
2.5

Relative OCR

2.0
1.5

Relative OCR＜フラックスアナライザーとの比較＞
フラックスアナライザー（XFe24）と本キットを、同条件（細胞種・細胞数・FCCP 濃度）
にて、同日測定しました。その結果、XFe24 と本キットで相関する酸素消費速度変化のデータが得られました。
※ 本製品は、群馬大学 吉原 利忠 先生のご指導の下、製品化しました。

untreated

2.0

untreated
1.5

FCCP

FCCP

1.0

1.0

0.5

0.5

0

0

細胞

：HepG2細胞数：HepG2：5×10 cells/well細胞：5×104：FCCP
細胞数 薬剤
cells/well
薬剤濃度
薬剤：FCCP：2 µmol/l
薬剤濃度 ：2 µmol/l
4

本キット

XFe24

XFe24

本キット

＜本キットで OCR の算出まで＞
本キットには、培地中の酸素濃度が高いほどりん光が弱くなる特性を持つ Oxygen Probe と、Well 内に空気中の酸素流入を遮断するための Mineral Oil を同梱しています。細胞外の酸素濃度に応じたりん光強度を蛍光マイクロプレートリーダーで測定後、Stern-Volmer の関係式より細胞の OCR を算出（自動計算シート）します。

（37℃, 30 min）

Oxygen Probe Mineral Oil（37℃, 5 min）

（37℃, 30 min）

Oxygen Probe Mineral Oil（37℃, 5 min）

実験操作と OCR 算出（37℃, 200 min）

160
140

160
140
120
100

（37℃, 200 min）

120

（自動計算シート）
100
80
60

80

40

60

20

40

OCR の算出（自動計算シート）

OCR の算出
OCR（pmol/min）

OCR（pmol/min）

測定
薬剤処理
Oxygen Probe
インキュベーション
Mineral Oil を添加 インキュベーション （Ex=500 nm/ Em=650 nm）
を添加
測定
薬剤処理
Oxygen Probe
インキュベーション
Mineral Oil を添加 インキュベーション （Ex=500 nm/ Em=650 nm）
を添加

キット内容
キット内容

0

untreated

20

FCCP

0

untreated

FCCP

実験操作と OCR 算出

品名Extracellular OCR Plate Assay Kit

容量100 tests

希望納入価格（¥） メーカーコード
48,000E297

関連製品
細胞数ノーマライゼーションキット
Cell Count Normalization Kit＜特長＞
・試薬を添加するだけの簡単操作
・蛍光強度から細胞数を簡便に評価することができる
マイクロプレートを用いた細胞の解析では、得られる結果がウェル中の細胞数によって変化する場合があります。その際には、細胞数のカウントやトータルタンパク質量の確認により、得られた測定値の補正（ノーマライゼーション）が必要となります。
本キットでは、試薬を細胞培養液に添加するだけで、細胞内の核が染色され、得られる蛍光強度から細胞数を簡便に評価することができます。

試薬をウェルに加えるだけ細胞数による補正

目的実験の補正データ

補正後

目的実験での測定値

補正前

目的の実験

本キットによるノーマライゼーション

ROS、細胞内代謝、オートファジー、
細 胞老化などマイクロプレートを使った評価目的の実験で評価した細胞に試薬を加え、30 分後に再びプレートリー
ダーで測定（ノーマライゼーション）

低

高

低

薬剤濃度

品名
Cell Count Normalization Kit

8高薬剤刺激など薬剤濃度

容量200 tests
1000 tests

プレートリーダー測定
（蛍光、
吸光度）

試薬追加

30分

蛍光測定

希望納入価格（￥） メーカーコード
9,000
C544
22,000No.187（2023）

Topics on Chemistry

低酸素下におけるミトコンドリア - リソソーム間相互作用
株式会社同仁化学研究所

細胞内に存在するオルガネラは、それぞれの役割を担いながら他のオルガネラと相互作用して細胞内の様々な機能を維持している。中でもミトコンドリアとリソソームは密接に関係しており、ミトコンドリアは物理的および機能的にリソソームと相互作用して細胞の代謝を調節し、細胞の恒常性を維持する。その一例
として、正常な細胞にはマイトファジーと呼ばれる不良ミトコン
ドリア分解機構が備わっている。また、リソソームは鉄の恒常性を調節することでミトコンドリアの代謝をサポートすることが報告されている 1, 2）。ミトコンドリア - リソソーム間の相互作用は細胞機能の重要な決定要因であるにも関わらず、根本的な機構はほとんど不明のままである。本稿では、最近報告された、低酸素下におけるオートファゴソーム非依存的なミトコンドリア分解（mitochondrial self-digestion）に関連したミトコンドリア - リソ
ソーム間相互作用について紹介する 3）。
ミトコンドリアの機能に重要な内膜のクリステ構造をつく
る MICOS 複合体の枯渇は、ミトコンドリア分裂の停止とミト
コンドリア内膜組織の障害により、巨大な球状ミトコンドリア（megamitochondria）の形成をもたらす 4, 5）。この巨大ミトコン
ドリアは特定の病理学的細胞において観察されており、様々な疾患に関連していることが報告されているが 6, 7, 8）、巨大ミトコンド
リアの生理学的機能についてはほとんど理解されていない。Hao
らは、HeLa 細胞を低酸素下に曝すとミトコンドリア融合の割合が増加し、巨大な球状ミトコンドリアが形成されることを示した（図 1）。

Hao ら は こ の 現 象 を megamitochondria engulfing lysosome（MMEL）と名付けており、MMEL にはミトコンドリア融合を介した巨大ミトコンドリアが必要であり、断片化したミトコンドリアや正常なミトコンドリアはリソソームを飲み込むことができないことを確認している。また、リソソームの酸性化を阻害した場合や、リソソー
ム膜タンパク質をノックダウンした場合には、低酸素下において巨
大ミトコンドリアは形成されるが、MMEL が減少することが分かった。これらの結果は、低酸素誘発性 MMEL にはミトコンドリアの融合とリソソームの成熟が必要であることを示唆している。
低酸素状態は多くのミトコンドリアプロテアーゼを活性化し、ミトコンドリアタンパク質の分解を引き起こす（図 3）。低酸素下では巨大ミトコンドリアが形成され、MMEL を介してミトコンドリアとリソソームは相互作用していることが示された。この現象に対してリソソームがどのような働きをしているのか、リソソームプロテ
アーゼに焦点を当てて確認したところ、巨大ミトコンドリアに飲み込まれたリソソームはミトコンドリア内でリソソームプロテアーゼ（cathepsin）を活性化することが分かった。低酸素状態において
このリソソームプロテアーゼを枯渇させた結果、ミトコンドリアタン
パク質の分解が著しく阻害されることから（図 3）、リソソームは低酸素下におけるミトコンドリアタンパク質の分解に寄与していることを明らかにした。この時、オートファゴソームの形成を阻害してもミトコンドリアタンパク質は大幅に減少したことから、MMELを介したリソソームによるミトコンドリアタンパク質の分解は、オー
トファゴソーム依存性マイトファジーとは独立して行われ、ミトコン
ドリアを自己消化していることを示唆した。

図3

図1

正常酸素下および低酸素下におけるミトコンドリア形態 3）

巨大ミトコンドリアの形成が誘導された HeLa 細胞では、ミトコンドリアとリソソームの接触が促進することが確認され、正常酸素下の場合、リソソームと接触したミトコンドリアは分裂するが、巨大ミトコンドリアが形成される低酸素下ではリソソームがミトコンドリアに飲み込まれている様子が観察された（図 2）。

図2

リソソームがミトコンドリアに飲み込まれる様子 3）小松 恭佳

低酸素下におけるミトコンドリアタンパク質の変化 3）

今回紹介した報告では、低酸素下におけるミトコンドリア - リ
ソソーム間相互作用の様式が明らかとなっている。老化、がん、神経変性疾患などに関与するミトコンドリアの品質管理という点で、ミトコンドリアの自己消化は 1 つの重要な経路となる可能性がある。今回得られた知見から、ミトコンドリア - リソソーム間相互作用の機構解明がさらに進むことを期待している。
[ 参考文献 ]1）C. E. Hughes, et al., Cell, 2020, 180, 296-310.
2）R. A. Weber, et al., Mol. Cell, 2020, 77, 645-655.
3）T. Hao, et al., Nat. Commun., 2023, 14, 4105.
4）F. Jian, et al., Cell Rep., 2018, 23, 2989-3005.
5）H. Li, et al., Cell Death Differ., 2016, 23, 380-392.
6）A. Wieczorek, et al., Clin. Exp. Hepatol., 2017, 3, 169-175.
7）T. Wakabayashi, J. Cell Mol. Med., 2002, 6, 497-538.
8）T. Yamada, et al., iScience, 2022, 25, 103996.
Fig. 1, 2 and 3 were reprinted from Reference 3).
Copyright © 2023, T. Hao et al. / CC BY 4.0.

9

No.187（2023）

正確な局在

鋭敏な pH 検出感度
CTRL
pHLys Red

リソソーム染色試薬

pHLys Red

既存色素

Merged with LAMP1

Merged with LAMP1

Baf. A1,10 nmol/l

LysoPrime Green - High Specificity and pH Resistance
LysoPrime Deep Red - High Specificity and pH Resistance＜リソソームの pH 変化に強い染色試薬＞

既存のリソソーム試薬は、リソソームの正確な局在に課題がありました。本製品は高いリソソーム指向性を持ち、リソソーム pH 変動を受けにくい蛍光強度を維持するため、正確なリソソームの位置や量を観察することができます。
正確な局在

リソソーム pH 依存性比較
LysoPrime Deep Red

既存色素 Red

LysoPrime Deep Red

既存色素 Red

Merged with LAMP1

Merged with LAMP1CTRL

LysoPrime Green

既存色素 Green
Merged with LAMP1

Baf. A1
50 nmol/l

LysoPrime Green
Merged with LAMP1

リソソーム酸性度阻害剤 Bafilomycin A1（Baf. A1）で処 理 後 も 鮮 明 な 蛍 光 が 観 測 で き た（ 左 図 ）。 ま た、
LAMP1-GFP または RFP 発現 HeLa 細胞を本製品で染色したところ既存色素よりも局在性が高いことがわかった（右図）。
LysoPrime Green:
Ex = 488 nm, Em = 500-600 nm
LysoPrime Deep Red:
Ex = 633 nm, Em = 640-700 nm

リソソーム pH 検出試薬
pHLys Red - Lysosomal Acidic pH Detection＜リソソームの pH を高感度に検出＞

既存のリソソーム pH 検出試薬は、リソソームの正確な局在と感度に課題がありました。本製品はリソソーム pH の変動に鋭敏に応答
して蛍光強度を変化させます。さらに高いリソソーム指向性から得られる蛍光輝度は正確なリソソーム pH を表すことができます。
正確な局在

鋭敏な pH 検出感度
CTRL
pHLys Red

Baf. A1,10 nmol/l

pHLys Red

既存色素

Merged with LAMP1

Merged with LAMP1

低濃度のリソソーム酸性度阻害剤 Bafilomycin A1（Baf. A1）で処理した HeLa 細胞を用いて本製品にて染色した（左図）。また、本製品のリ
ソソーム局在性をリソソームマーカータンパク LAMP1-GFP 発現 HeLa細胞を用いて既存色素と比較した（右図）
Ex = 561 nm, Em = 560 - 650 nm

リソソーム pH 検出キット
リソソーム pH 依存性比較

rime Green

正確な局在

Red
Lysosomal 既存色素
AcidicpH Detection Kit
Lysosomal Acidic pH Detection Kit-Green/Deep Red

LysoPrime Deep Red

LysoPrime Deep Red

既存色素 Red

Merged with LAMP1

Merged with LAMP1＜正確なリソソーム染色と pH 検出のオールインワンキット＞

リソソーム染色色素と pH 検出試薬、リソソームのpH 酸性化阻害剤を組み合わせた、初めての利用におすすめの構成のキットです。
LysoPrime Green
既存色素 Green
色の異なる 2 種類のキットをご用意しております。
Merged with LAMP1
Merged with LAMP1
品名
LysoPrime Green– High Specificity and pH Resistance
LysoPrime Deep Red– High Specificity and pH Resistance
pHLys Red - Lysosomal Acidic pH Detection

容量※
10 µl x 1 ※ 1
10 µl x 3 1※
1 tube ※ 1
3 tubes 1※
1 tube ※ 2
3 tubes 2

Lysosomal Acidic pH Detection Kit

1 set

Lysosomal Acidic pH Detection Kit-Green/Deep Red

1 set

※2

希望納入価格（¥） メーカーコード
13,900L261
28,90015,000L264
30,00028,000L265
48,00038,000L266

38,000

L268〈使用回数の目安〉*1 10 μl あたり、35 mm dish 10 枚、μ-Slide 8 well 10 枚、*2 1 tube あたり、35 mm dish 10 枚、μ-Slide 8 well 10 枚、96-well Plate 2 枚

10No.187（2023）

連載

生命科学の最前線～熊本大学若手研究者の現場から～ ②
小社が立地する熊本県の生命科学研究最前線を、熊本大学の若手研究者が連載（8 回）でお届けします。

動的構造解析による酵素反応機構の解明
Structural dynamics in enzymatic reaction

Abstract
中村 照也
熊本大学大学院
生命科学研究部 ( 薬学系 )准教授

1. はじめに酵素は、生命現象における様々な化学反応を担うタンパク質であり、基質、補酵素や金属イオンを自身の活性部位に結合し、活性化エネルギーを低下させることで化学反応を触媒する。このような酵素反応機構を理解するには、酵素反応の速度論解析はもちろん、酵素の構造解析が必要不可欠となる。構造解析においては、反応過程における酵素 - 基質複合体や酵素 - 反応生成物複合体の立体構造を決定するだけでなく、反応中間体の立体構造も捉えて、反応開始から終了までの構造変化を明らかにすることが求められる。タンパ
ク質構造解析法の一つである X 線結晶構造解析は、結晶状態となったタンパク質の立体構造、すなわち静的なタンパク質の立体構造を決定する手法である。タンパク質の結晶は、溶媒含有率が高く（～
40% 以上が溶媒）、結晶状態であっても自身の酵素活性を保持しているケースも少なくない。実際、我々は DNA 合成酵素である DNA
ポリメラーゼが結晶状態でも酵素活性を保持していることに着目することで、X 線結晶構造解析を用いた DNA ポリメラーゼの動的構造解析を行った。その結果、DNA ポリメラーゼが行うヌクレオ
チド転移反応において、DNA 末端とヌクレオチド（dNTP）の間に共有結合が形成される過程を観察することに成功し、DNA ポリメ
ラーゼの新規反応機構を提案した 1）, 2）。さらに近年、突然変異原の酸化ヌクレオチドを加水分解する酵素 MutT の動的構造解析も行い、その新規反応機構を提案した 3）。本稿では、X 線結晶構造解析を用いた酵素の動的構造解析法と、本手法によって最近明らかにした MutT の酵素反応の新規機構について紹介する。

Enzymes are responsible for essential chemical reactions
in biological phenomena and catalyze reactions by binding
substrates, coenzymes and metal ions to the active site andreducing the activation energy. To understand the mechanismsof enzymatic reactions, it is essential not only to determine
the structures of the enzyme-substrate and enzyme-reaction
product complexes, but also to capture the intermediate
structures and observe the structural changes during thereaction processes. X-ray crystallography is a methodology for
determining the three-dimensional structure of proteins in a
crystalline state, and in many cases, enzyme activity is retainedeven in a crystalline state. Here we present the dynamic
structure analysis of enzymes using X-ray crystallography anda new enzymatic reaction mechanism of MutT, an enzyme thathydrolyzes a mutagenic oxidized nucleotide.

2. 大腸菌 MutT タンパク質
細胞内で生じる活性酸素種は、遺伝情報物質である DNA だけでなくその前駆体であるヌクレオチドも酸化する。dGTP の酸化により生じた 8-oxo-dGTP が DNA ポリメラーゼによって DNA 中に取り込まれた際、酸化塩基部位の 8- オキソグアニンはシトシンだけ
でなくアデニンともミス塩基対を形成できるため突然変異の原因となる（図 1）
。1992 年、当時九州大学の真木と関口は、本研究対
象の大腸菌 MutT が 8-oxo-dGTP を分解することで 8-oxo-dGTP のDNA への取り込みを防ぎ、突然変異を抑制することを明らかにした 4）。これは、遺伝情報エラーの回避が DNA レベルだけでなくヌ

図 1 8-oxo-dGTP が関与する DNA ミス塩基対と MutT の機能

11

No.187（2023）

図 2 X 線結晶構造解析を用いた動的構造解析の実験手順

クレオチドレベルでも行われていることを示した大きな発見であ
3. X 線結晶構造解析を用いた動的構造解析
った。
酵素は結晶状態であっても活性を保持しているという特徴を利
8-oxo-dGTP を加水分解する。 用して、反応中間体を低温（~100 K）で捕捉する低温トラップ法を
MutT は Mg2+ もしくは Mn2+ 存在下、その際、8-oxo-dGTP の β- リン原子への水分子の求核攻撃によって、 用いた X 線結晶構造解析により、MutT の動的構造解析を行った。
8-oxo-dGTP は一リン酸型の 8-oxo-dGMP とピロリン酸（PPi）へとMutT や DNA ポリメラーゼなど、金属イオン存在下で反応を触媒
加水分解される（図 1）。MutT は、大きな加水分解ファミリーであする酵素については、以下の①～④の手順で実験を行った（図 2）。
る Nudix/MutT ファミリー（ヌクレオシド二リン酸を加水分解する 「①酵素 - 基質複合体結晶を反応の起こらない状態で調製する。②酵素群）に属し、ファミリー名からもわかる通り、MutT はこのフ反応開始となる金属イオンを結晶に浸漬させて結晶内反応を開始
ァミリーにおいて最も古くから研究されてきた酵素である。MutTさせる。③結晶を目的の反応時間インキュベートした後、急速凍結の酵素反応機構は、核磁気共鳴や反応速度論解析などにより研究して反応を完全に停止させる。④反応時間毎の中間体構造を X 線
されており 5）, 6）、MutT は 2 つの Mg2+/Mn2+ イオンを介して加水分
結晶構造解析により決定する。
」という手順である。本動的構造解
解反応を触媒すること（two-metal-ion mechanism）が提案されてい析を行うにあたっては、1）反応の起こらない状態で酵素 - 基質複
た。一方、これまでに我々が決定した MutT と反応生成物と Mn2+合体構造（ES、反応開始前構造）を決定できる、2）追跡可能なタイの複合体の X 線結晶構造（MutT-8-oxo-dGMP-Mn2+）では、MutT がムスケールで反応を進行できる、3）反応中に結晶の状態を維持で3 つの Mg2+/Mn2+ イオンを介して反応を触媒すること（three-metalきる（結晶が崩壊すると X 線回折データを収集できないため）、な
ion mechanism）が示唆されていた 7）。また、他の Nudix ファミリ
どといった条件を満たす必要があるため、結晶化条件のみならず、ー酵素においても、加水分解反応の触媒には 2 つもしくは 3 つの金属イオン濃度、pH、反応時間、反応温度といった条件を検討し、金属イオンが必要であることが報告されており、統一的な知見は得反応過程を追跡できる結晶内反応条件を酵素に応じて見出す必要
られていない。これは、Nudix ファミリーはわずか 23 残基というがある。実際、DNA ポリメラーゼと MutT については、それぞれ加水分解モチーフのアミノ酸配列で定義されているため、反応機構
100 以上の結晶内反応条件を検討することで、最終的に反応開始かに多様性がみられると考えることもできる。しかし一方で、酵素反ら終了までの全過程を追跡することが可能となった 1）, 3）。DNA ポ
リメラーゼの場合は、pH 7.0 で反応時間が 40~300 秒で酵素反応過応機構の推定に用いられている結晶構造のほとんどは、基質類縁体程を観察できたが、MutT の場合は、pH を 5.8 にして反応速度を下や活性を示さない金属イオンなどとの複合体であることや結晶化
げ、反応時間を数十分から数時間とすることで反応過程を観察する
条件の pH も様々であることにより、酵素反応の活性化状態を反映ことができた。
していない可能性も考えられる。このような MutT を含めた Nudix
ファミリーの金属イオンを介した酵素反応機構を解明するために、
X 線結晶構造解析を用いた MutT の動的構造解析を行った。

図 3 MutT による 8-oxo-dGTP 加水分解反応の中間体構造（上段）と反応機構（下段）12No.187（2023）

4. 酵素反応過程の観察と新規反応機構[ 参考文献 ]MutT の動的構造解析により、ES（MutT-8-oxo-dGTP 複合体）
、 1）T. Nakamura, Y. Zhao, Y. Yamagata, Y. J. Hua, W. Yang, Nature, 2012, 487,
196-201.
EP（MutT-8-oxo-dGMP 複合体）を含む合計 6 つの中間体構造を決2）T. Nakamura, Y. Zhao, Y. Yamagata, Y. J. Hua, W. Yang, Biophysics, 2013, 9,
定し、MutT による 8-oxo-dGTP の加水分解反応過程を原子レベル
31-36.
で観察した（図 3）。なお本稿では、これらのうち 4 つの構造を示
3）T. Nakamura and Y. Yamagata, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2022, 119,している。反応開始前の ES では、8-oxo-dGTP の三リン酸部位がe2203118119.
MutT 活性部位の Gly37、Glu57、Glu53 に水分子と Na+ イオンを介4）H. Maki and M. Sekiguchi, Nature, 1992, 355, 273–275.
して結合しているが（図 3 の ES）、三リン酸部位では、活性部位に
5）J. Lin, C. Abeygunawardana, D. N. Frick, M. J. Bessman, A. S. Mildvan,
Biochemistry, 1997, 36, 1199–1211.
近づいている配座 A と活性部位から遠ざかった配座 B の 2 つの状
6）T. K. Harris, G. Wu, M. A. Massiah, A. S. Mildvan, Biochemistry, 2000, 39,
態がみられた。これは、酵素活性に必須の Mg2+/Mn2+ イオンのな
1655–1674.
い時は、三リン酸部位が活性部位に引きつけられない、すなわち、
7）T. Nakamura, S. Meshitsuka, S. Kitagawa, N. Abe, J. Yamada, T. Ishino,2+
活性状態にはないことを示唆している。結晶を Mn 溶液に浸漬さ
H. Nakano, T. Tsuzuki, T. Doi, Y. Kobayashi, S. Fujii, M. Sekiguchi, Y.
せることで結晶内反応を開始した。反応の開始と共に、まず 1 つ
Yamagata, J. Biol. Chem., 2010, 285, 444–452.
2+2+
2+の Mn （Mn A）が Gly37、Glu57、三リン酸に配位し、この Mn Aの配位によって三リン酸部位は活性部位に引きつけられる（図 3 のState 1 の矢印）
。反応時間が経過すると、さらに 2 つの Mn2+（Mn2+B ［著者プロフィール］
2+と Mn C）が活性部位に配位する（図 3 の State 2）。これら 3 つの
氏名：中村 照也（NAKAMURA Teruya）
Mn2+ が活性部位に配位した後、Mn2+B と Mn2+C に架橋する水分子
所属：熊本大学大学院生命科学研究部（薬学系）が現れる。このように、MutT の活性部位に 3 つの Mn2+ が配位す
〒 862-0973 熊本市中央区大江本町 5-1
ることで、8-oxo-dGTP の三リン酸部位が活性部位に引きつけられ
TEL : 096-371-4638
るとともに、水分子が 8-oxo-dGTP の β- リン原子を求核攻撃する
E-mail : tnaka@gpo.kumamoto-u.ac.jp
ために適した位置に配置される。この水分子が β- リン原子を求核
出身学校：大阪大学大学院薬学研究科博士前期課程
攻撃することで、8-oxo-dGTP が 8-oxo-dGMP へと加水分解され学
位：博士（薬学）（熊本大学）
ることが明らかとなった。反応時間が経過すると、8-oxo-dGTP は
専門分野：構造生物学
8-oxo-dGMP へと加水分解され、PPi と Mn2+B と Mn2+C は活性部位
現在の研究テーマ：ゲノム安定性、細胞シグナル伝達に関わる構造から遊離する（図 3 の EP）。また、構造解析での電子密度図から、生物学
State 2 で現れた水分子は、ES と State 1 において Glu53 と結合していた水分子が、State 2 にて Mn2+B と Mn2+C に架橋するように移動したことが示唆された。過去の反応速度論解析において、この
Glu53 が反応における一般塩基となることが報告されていることから 6）、現段階では、図 3 の下段に示したように Glu53 が Mn2+ の配位子として、さらには一般塩基として働くという酵素反応機構を提案している。また、Mg2+ を用いた酵素反応過程の追跡も行ったが、Mn2+ の場合と同様、MutT は 3 つの Mg2+ を介して反応を触媒する
ことが明らかとなった。

5. おわりに
酵素の動的構造解析により、反応開始から終了までの酵素反応過程を観察することで、MutT が 3 つの金属イオンを介して 8-oxodGTP を加水分解すること（three-metal-ion mechanism）を解明し、新規反応機構を提案することができた。本研究により、Nudix ファ
ミリーの中には three-metal-ion mechanism で加水分解反応を触媒する酵素も存在することが示唆された。図 3 の下段に示した酵素
反応機構では、求核攻撃を行う水分子の脱プロトン化も含め、水素原子を含んだ酵素反応機構を議論している。しかしながら、X 線結晶構造解析では水素原子を観察することが極めて難しいため、提案した反応機構における水素原子の位置と動きは、今回の動的構造解析の結果とこれまでの反応速度論解析の結果から推測している。
反応におけるプロトン化 / 脱プロトン化を含めた水素原子の位置および動きを明らかにすることは、タンパク質の機能を原子レベルで議論する上で極めて重要であるが、タンパク質構造解析の現状としては、多くの場合、水素原子の位置は推測するにとどまっている。
今後は水素原子を高感度で検出できる中性子構造解析も組み合わせることで、反応機構を水素原子レベルで議論できるような酵素反応の物理化学的研究を展開したいと考えている。

「食品機能評価 微生物検出」
冊子リニューアル

食品機能評価微生物検出
Food functional evaluation
Microbial detectionon
3 rd Edition

酸化ストレス
食品機能評価微生物検出

食品機能評価同仁

食品の機能評価と微生物検出に役立
つ製品を集めた冊子「食品機能評価
微生物検出」は大変ご好評を頂き、このたび第 3 版を発行いたしました。
リニューアルにより、旧版には紹介されなかった製品も掲載しております。本冊子は小社 Web からご覧いただ け ま す。 紙 媒 体 を ご 希 望 の 方 は、
販売店様、お問い合わせよりご請求
ください。

検索

13

No.187（2023）

連載

抗酸化キットを使う前のサンプル前処理法 〈第 3 回〉
株式会社同仁グローカル
今号は、SOD Assay Kit-WST についてです。
4．SOD Assay Kit-WST について
SOD 活性の測定には、Nitroblue tetrazolium (NBT) 法が以前は用いられてきましたが、発色成分が疎水性で有機溶剤による抽出が必要なことや、NBT が Xanthine oxidase と反応し、100% 阻害率が求められないなどの難点がありました。SOD Assay KitWST は、水溶性の WST-1 を用いて改良した方法です。
O3S
H
N
N
N N

O2N

xanthine
O2

2O2

SO3-

WST-1 formazanIxanthine oxidase

uric acid
H2O2

-

O 2N

O3 S

N
N
N N

2O2-

Na+

SO 3-

WST- 1I
SOD

inhibition reaction

O2 + H2O2

図 4-1：SOD キットの反応式の図

本題の前処理に入りますが、抽出試料の状態としては、①目的成分が適切に抽出されていること、②サンプルに濁りや着色が生じないこと、③ SOD や Xanthine oxidase の酵素反応を妨害しな
いこと、④目的成分以外で WST-1 と反応しないことなどが必要と考えられます。

山口勝則

非加熱の動植物試料の場合、細胞破砕後は各種の分解酵素が放出され、急速に分解が進むため、低温・短時間で破砕・ホモジナ
イズ・分離処理を行い、速やかに使用するべきです。
試料の個体差や部位の差、抽出条件によって結果に差が出るのは当然ですし、極論を言えば、同じサンプルは再現できないので、失敗の無いよう目的にあった調製を行うことが大切です。
② サンプルに濁りや着色が無いこと
SOD Assay Kit-WST は吸光度法で測定するため、測定試料に濁りや着色があれば、吸光度が嵩上げされ、ダイナミックレンジ
が狭くなり、吸光度のバラツキも大きくなるので、どうしても濁りの影響を排除できない場合、IC50 を求めるための希釈系列の希釈倍率を小さくするようにして、50％阻害率付近のデータがうまく取れるようにすべきでしょう。
ブルーベリーなどの濃い色素を含んだ試料の場合、試料中の色素（アントシアニンなど）の吸収スペクトルパターンを把握し、測定波長付近に吸収が無いこと、発色系の pH や溶媒環境（SOD
ならほぼ水系）で変色、不溶化しないことなどの確認をしておくべきです。また、着色した試料の場合は、測定波長（SOD なら
450 nm）に影響が無いか確認し、影響がある場合は希釈系列ごとに試料ブランク（blank 2）を作成して補正が必要です。
③ SOD や Xanthine oxidase の酵素反応を妨害しないこと
細胞内や血液の SOD は、活性中心に Cu/Zn を含んでおり、ミトコンドリアの SOD は Mn を含んでいるので、強力なキレート
試薬や金属をマスキングする成分が共存すれば、影響を受けます。
SOD Assay Kit-WST では EDTA は 2 mmol/l までは許容できますが、活性部位に EDTA のような大きな分子が侵入できないような高次構造があるためと考えられます。
Cu/Zn-SOD の酵素反応を阻害する成分としては、シアン化カ
リウムや Diethyldithiocarbamate がありますが、これらはサイズ
が EDTA のように大きくなく、酵素の活性部位に容易に侵入でき、金属イオンと結合することで阻害すると考えられます。ところが Mn-SOD に対しては阻害しないため、これらを最終濃度で1 mmol/l になるよう添加することで、Cu/Zn-SOD を失活させ、
Mn-SOD の活性を測定できます。
ま た、Xanthine oxidase が 妨 害 さ れ れ ば、SOD の 基 質 で ある superoxide（O2.-）の供給量が減少し、測定に影響が出ます。
Xanthine oxidase の阻害要因としては、高濃度の溶剤成分、米ぬかやとうもろこし、植物の種子などに含まれるフィチン酸 2）などがあります。事前に予測するのは難しいですが、データの再現性が悪い時の検証の際は要因の 1 つとして考えていいと思います。

① 目的成分が適切に抽出されていること
本法での目的成分（SOD 酵素、抗酸化成分など）の大部分は水溶性ですが、ビタミン E、ポリフェノール類などの疎水性成分も含むため、SOD 活性全体を評価したい場合、水による抽出と80％前後の親水性溶剤による抽出の併用が有効です。
総ポリフェノール類の測定法であるフォーリン - チオカルト法やフォーリン - デニス法 1）の抽出操作がよく用いられますが、現状で公定法となるような手法はありません。
実際のところ、抽出を行う場合、試料中の全ての抗酸化能を評価することは不可能で、あくまでも決められた条件での抽出成分のみを評価しているに過ぎません。水抽出物と溶剤抽出物を混合して測定するか、個別の測定値を合計するかでも値が一致するとは限りません。文献や各種資料でデータが整合しないのは、実験誤差ももちろんありますが、厳密に同じ方法で抽出されていない
要因が大きいと考えるべきです。
④ 目的成分以外で WST-1 と反応しないこと
実験目的が、「手持ちの試料間の相対的な違いを評価」であれタンパク質の安定化のため 2- メルカプトエタノール（2-ME）ば抽出条件は自由に設定できますが、厳密に同じ条件で抽出操作
やジチオスレイトール（DTT）などの還元剤はよく使われますが、を行う必要があります。「文献の条件で評価する」ことが目的な
これらは WST-1 と直接反応し、WST-1 formazan を形成しプラス
ら文献での抽出条件を厳密に調べて再現する必要があります。
試料の前処理は、通常、試料の破砕・溶剤などによる抽出操作、 誤差になるので、SOD Assay Kit-WST では使用できません。逆に酸化剤はマイナス誤差になります。抽出処理後は経時変化しな不溶物の分離操作を行い、透明な液体の状態にする必要がありま
いよう手早い操作が求められます。またアスコルビン酸（ビタミす。目的成分が疎水性の場合、80％前後のエタノールなどで抽出を行いますが、疎水性成分が多いと測定試料が濁る恐れがあり、 ン C）はそれ自体が抗酸化物質であるため、当然影響するので使考慮しておくべきです。また、アセトンはウェル（ポリスチレン） 用は避けるべきです。
を白濁させる恐れがあるので避けるべきです。
試料の粘性が高かったり、懸濁粒子を含む場合などでは、抽出 【参考文献】
1）金谷建一郎 , ”ポリフェノール類”, 食品分析法（Ⅱ）, 光琳 , 2006，68.
物が不均一になりやすく、希釈系列を作成する際の再現性を低下
2）三浦俊明 , 日本薬学会年会要旨集 , 2003, 123（3）, 113.
させます。充分ホモジナイズして、高回転の遠心分離で除くことが望ましいです。

14No.187（2023）

関連製品
抗酸化能測定キット
SOD Assay Kit-WST
Superoxide dismutase（SOD）は、生体内に存在する抗酸化酵素であり、活性酸素種（ROS）の一つであるスーパーオキシド（O2.-）を消去する働きがあります。本キットは 96 well マイクロプレートを使い SOD 様活性を簡便に測定することができます。
＜測定操作＞
96 well プレートを用い、サンプル調製から測定まで約 1 時間で完了します。

サンプル調製

37 ℃で 20 分間インキュベート

キット添付の試薬を添加

マイクロプレートリーダーで測定（450 nm）＜測定例＞（1）生体サンプルの測定例
各サンプルを本製品で測定し、WST 法でユニットを規定した場合の測定例です。
前処理方法については同仁化学 HP（下記）をご参照下さい。
SOD

検索

同仁

(2) 食品サンプルの測定例
高知大学の島村らは碁石茶（ゴイシチャ）の製造工程毎に SOD 様活性をキットで測定しています。
製造工程中で微生物が関与する好気的発酵、および嫌気的発酵で SOD 様活性が大きく増加し、発酵工程中の茶抽出成分の変化による抗酸化能の変化を報告しています。
島村 ,“碁石茶製造工程におけるカテキン含量とスーパーオキシドアニオン消去活性の変化”, 日本食品科学工学会誌 , 55(12), 640

DPPH 法との比較 ～複数の指標でより詳しく理解する～
DPPH ラジカル消去活性と併用することで、異なる指標で抗酸化能を確認することができます。
測定法

原理

反応溶媒

標準物質

特徴

水

不要

・生体内ラジカル（O2.-）が指標
・水溶性サンプルに適応・還元能のあるサンプルは測定が難しい.2

SOD 様活性系中で発生させた O と被検物質を反応後、残存する O2.- を WST-1 により比色測定（450nm）する。

紫色に吸収のある DPPH ラジカルを被検DPPHラジカル
水 / エタノール
物質が還元することで、低下する吸光度
消去活性（517 nm）を測定する。

Trolox・食品サンプルの測定報告例が多い
・水溶性の低いサンプルにも適応
・生体内に存在しないラジカルが指標※上記内容は、同仁化学研究所の製品概要です。

品名
SOD Assay Kit – WST
DPPH Antioxidant Assay Kit

容量100 tests
500 tests
100 tests
500 tests

希望納入価格（¥） メーカーコード
10,100S311
26,000
7,100
D678
21,10015

No.187（2023）

脂質過酸化関連製品
活性酸素種（ROS）は脂質を酸化して過酸化脂質を生成し、細胞機能を障害します。また、過酸化脂質が分解されると ROS が産生され細胞傷害をさらに進める可能性があります。このように ROS と過酸化脂質は相互に関係しており、老化や疾患の原因となる可能性があります。小社では、これらの脂質の過酸化現象や最終代謝物のマロンジアルデヒド（MDA）を検出する製品をご用意しております。
※略語説明
各製品の詳細は、小社 Web からご確認下さい。 ROS による脂質過酸化の過程

・OH

LH：LipidL・：Lipid radical2※略語説明 ※略語説明
ROS による脂質過酸化の過程
ROS による脂質過酸化の過程：Hydroxyl radical
LH ・OH：LipidLH：Lipid・OH
LOO・：LipidL・radical：Lipidradicalperoxide radical
L・：LipidLH
O2 LH
O2：Lipidradical
peroxide・OHLOOH：Hydroxyl
・OH ：Hydroxyl
radical
脂質の過酸化
マロンジアルデヒドの検出
脂質過酸化物の検出
LLOO
・ ・ LOO・LOOH LOOH
MDA MDA LOO・ ：Lipid
LOO・：Lipidperoxide radical
MDA：Malondialdehyde
peroxide
radical

LH ・OH L・
LH
L・
LH 脂質の酸化

O

LH

LOO・

LOOH

MDA

LOOH ：Lipid peroxide

LOOH ：Lipid peroxide
マロンジアルデヒドの検出
脂質過酸化物の検出
脂質の過酸化脂質の過酸化
脂質の酸化 脂質の酸化
マロンジアルデヒドの検出
脂質過酸化物の検出
MDA ：Malondialdehyde
MDA ：Malondialdehyde

脂質過酸化検出試薬
Lipid Peroxidation Probe -BDP 581/591 C11-

マロンジアルデヒド測定キット
MDA Assay Kit

Lipid Peroxidation Probe は脂質周辺の ROS 発生状況を確認する試薬で、脂質過酸化現象を高感度に検出することができます。

本キットは、TBARS 法により、発色した MDAとチオバルビツール酸付加体の測定から細胞内もしくは組織中の MDA を検出できます。

**** 1.3
**

1.2

1.2
1.1
1.0
0.9

1.1
1.0
0.9

1.1

**
**

1.0
0.9

control H2O2 ・OH

**

6
5 **
4
3
2
1

O2-

NO ONOO ROO・0
O2- ROO・・OH
NO ONOO ROO・
2
Control
O2O
control H2O2 control
・OH H活性酸素種に対する反応選択性
NO ONOO
2-

7

6
5

6

Controlt-BHP-treatedControlt-BHP-treated

5

44
33
22
1
0

1
0

Controlt-BHP-treated Control

フェロトーシスを誘導した HepG2 細胞内の MDA 量

フェロトーシスを誘導した HepG2 細胞内の MDA 量
0.7
フェロトーシスを誘導した
HepG2 細胞内の MDA 量0.7
MDA（nmol/mg protein）**

Controlt-BHP-treatedGreen / Red**

Relative Fluorescence Intensity
Relative Fluorescence
Green / RedIntensity

1.2

7

Relative Fluorescence Intensity
Green / Red

t-BHP-treated

S/N

1.3

1.3

1.4

S/N

1.4

Control

Controlt-BHP-treated

t-BHP-treatedControl

Green

1.5

0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2

t-BHP-treated
0.1

t-BHP-treated

プレートリーダー検出 0
活性酸素種に対する反応選択性 プレートリーダー検出
プレートリーダー検出
活性酸素種に対する反応選択性

品名
Lipid Peroxidation Probe -BDP 581/591 C11-

容量
※1200 tests

MDA Assay Kit

100 tests※2

MDA（nmol/mg protein）

7

1.5

Red

S/N

Green
Red

MDA（nmol/mg protein）

t-BHP 処理した HepG2 細胞の脂質過酸化の検出

t-BHP 処理した HepG2 細胞の脂質過酸化の検出
Green
Red
1.5
t-BHP 処理した
HepG2 細胞の脂質過酸化の検出
1.4

0.6

0.6

0.5

0.5

0.4

0.4

0.3

0.3

0.2
0.1
0

0.2
0.1
0

Control

Control
Control
Erastin

Erastin

Erastin

希望納入価格（¥） メーカーコード
29,800L267

31,000M496※1:〈使用回数の目安〉96-well plate 2 枚 ※2:〈使用回数の目安〉96-well plate 1 枚

お役立ち
抗酸化能セミナー アーカイブのご案内
抗酸化能の測定や予測についてのセミナーを、各分野で専門とされている先生方をお招きして開催しました。今回のセミナー後半では、異なる分野で抗酸化能へアプローチされている先生方のパネルディスカッションを行い、大変好評を頂きました。この度、先生方のご厚意におりアーカイブ配信をいたします。視聴ご希望の方は、小社 Web よりお申し込み下さい。
セミナー

同仁

検索

【講演】
1.『抗酸化評価法の標準化の試み - キット開発までの道のり -』DPPH 法はその簡便さから食品の抗酸化活性評価に広く利用されてきた方法であるが、変法が多く、共通のプロトコールが存在しない状況にあった。今回は、室間共同試験による
DPPH 法の妥当性確認、及びその後のキット化の経緯について紹介する。

講師：
高知大学
農林海洋科学部 農芸化学科
教授
島村 智子 先生

2.『食品成分の構造から考える抗酸化能』
抗酸化作用は食品の第 7 の栄養素としても注目されており、この抗酸化作用を試験管内の測定により推定することは食品科学分野で 30 年来行われている。私達の研究室では、フェノール類の包括的な抗酸化能予測モデルの作成を目指している。講演では、研究背景や予測方法の概略について紹介する。

講師：
横浜国立大学
化学生命系学科 化学 EP准教授
五東 弘昭 先生

【パネルディスカッション】
テーマ：食品と化合物の抗酸化測定と機械学習の未来
パネリスト
高知大学 農林海洋科学部 農芸化学科 教授 島村 智子 先生
横浜国立大学 化学生命系学科 化学 EP 准教授 五東 弘昭 先生

16コーディネーター：
立命館大学
薬学部
教授
井之上 浩一 先生

No.187（2023）

既存法 : ウェルにバイオフィルムを形成
洗浄 → クリスタルバイオレット染色 → 洗浄

バイオフィルム関連製品

ウェルに菌液を加え、ウェル内壁にバイオフィルムを形成させる。

ク

各ウェル毎にバイオフィルムを剥がさないように注意深く洗浄する。

既存法 : ウェルにバイオフィルムを形成
キット法 : ピンプレートにバイオフィルムを形成

バイオフィルム関連製品群は、バイオフィルムの形成量や生存率を測定することで、バイオフィルムの形成を抑制する薬剤や素材の洗浄 → クリスタルバイオレット染色 → 洗浄クリスタルバイオレット抽出 → 測定
開発、殺菌剤の検討に利用することができます。既存法の課題であった均一なバイオフィルム形成をピンプレートや試験片に形成させ
！
だけ！
す
すだけ
移
既存法 : ウェルにバイオフィルムを形成
蓋を蓋を移ることで、簡便に培養や形成量の測定、バイオフィルム中の微生物の生存率を、精度よく多検体で測定することができます。
洗浄 → クリスタルバイオレット染色 → 洗浄クリスタルバイオレット抽出 → 測定

ウェルに菌液を加え、ウェル内壁菌液にピンプレートを浸し、ピン表面キット法 : ピンプレートにバイオフィルムを形成
各ウェルにエタノールを加えた後、にバイオフィルムを形成させる。
吸光度を測定する。

Biofilm Formation Assay Kit

各ウェル毎にバイオフィルムを剥がさないように注意深く洗浄する。

！
す だけ
蓋を移

キット法 : ピンプレートにバイオフィルムを形成
！
すだけ

！
すだけ
蓋を移

既存法

！
すだけ

蓋を移

蓋を移

菌液にピンプレートを浸し、ピン表面にバイオフィルムを形成させる。

Absorbance at 460 nm

菌液にピンプレートを浸し、ピン表面にバイオフィルムを形成させる。

洗浄液にピンプレートを浸し、バイオフィルムを洗浄する。

洗浄液にピンプレートを浸し、バイオフィルムを洗浄する。

洗浄液にピンプレートを浸し、バイオフィルムを洗浄する。

既存法

エタノールを入れたウェルにピンプレートを浸し、吸光度を測定する。

エタノールを入れたウェルに 1.4
ピンプレートを浸し、吸光度を測定する
1.2

Absorbance at 590 nm

ウェルに菌液を加え、ウェル内壁にバイオフィルムを形成させる。

各ウェルにエタノールを加えた後、吸光度を測定する。

各ウェル毎にバイオフィルムを剥がさないように注意深く洗浄する。

にバイオフィルムを形成させる。

█バイオフィルムの形成条件や形成量の測定用キット

キット法

Absorbance at 590 nm

1.2
Absorbance at 590 nm

0.4

1.2

キット法

Biofilm Viability Assay Kit

0.6

0

1.4

1.4

Biofilm Viability Assay Kit

0.8

0.2

既存法
従来のマイクロプレート底面に形成させる方法では難しかった均一なバイオフィル
ムをピンプレートに形成させ測定することで、ばらつきの少ないデータを精度よく測定できます。バイオフィルム形成条件の検討にご利用できます。
Minocycline Concentration（μg/ml）

キット法█バイオフィルム中の微生物生存率の測定用キット

1.0

1.0

1.0
0.8
0.6
0.4
0.2

0.8

0

0.6

既存法

キット法

0.4
0.2
0

既存法 : ウェル底部に試験片を沈める
既存法

キット法

洗浄 → クリスタルバイオレット染色 → 洗浄

素材
（試験片）

け！
移すだ

蓋を

ウェルに菌液と試験片を加え、試験片にバイオフィルムを形成させる。

96 穴マイクロプレートに菌を播種し各ウェル毎にバイオフィルムを剝がさないように注意深く洗浄する。

本キット法 : キット付属の TestPiece Holder に試験片を固定
WST 溶液にて発色、洗浄・薬剤処理

ピンプレートを浸漬し培養測定（440-480 nm） TestPiece Holder

洗浄→クリスタルバイオレット染色→洗浄

Holder を移すだけ！

Holder を移すだけ！
ピンプレートに形成させたバイオフィルム中の微生物生存率を WST 法によって測定できます。バイオフィルム内微生物に対※ Biofilm Formation Assay Kit（製品コード :B601）では、事前検討が必要です。詳しくは、製品 HP をご覧ください。

※ バイオフィルムの形成条件は菌種や株によって異なります。まず、形成条件の検討に Biofilm Formation Assay Kit をご利用ください。

する抗菌剤の検討などに利用できます。
※既存法
本キットは福岡県工業技術センター生物食品研究所との共同開発品です。
: ウェル底部に試験片を沈める

洗浄 → クリスタルバイオレット染色 → 洗浄

素材
（試験片）

クリスタルバイオレット抽出 → 測定

素材（試験片）24-well Plate

TestPiece Holder に試験片を固定後菌液に浸し、試験片にバイオフィルムを形成させる。
各ウェルにエタノールを加えた後、吸光度を測定する。

█抗菌素材の開発に役立つ試験片用の測定キット
各ウェル毎にバイオフィルムをウェルに菌液と試験片を加え、剝がさないように注意深く洗浄する。

独自の TestPiece Holder

洗浄→クリスタルバイオレット染色→洗浄

クリスタルバイオレット抽出 → 測定

1.0

TestPiece Holder

Holder を移すだけ！

Holder を移すだけ！

Absorbance at 595 nm

試験片にバイオフィルムを形成させる。

Biofilm TestPiece Assay Kit
本キット法 : キット付属の TestPiece Holder に試験片を固定

クリスタルバイオレット染色後、洗浄液に試験片を浸し、バイオフィルムを洗浄する。

素材
（試験片）

素材（試験片）24-well Plate

TestPiece Holder に試験片を固定後菌液に浸し、試験片にバイオフィルムを形成させる。

試験片固定具に素材（試験片）を固定した状態

1.0

（試験片）
Biofilm Formation素材
Assay
Kit

推奨サイズ : 20×10×1~3mm（タテ×ヨコ×厚み）

Biofilm Viability 試験片固定具に素材
Assay Kit （試験片）を固定した状態
Biofilm TestPiece Assay Kit

Absorbance at 595 nm

品名

バラツキ低減

0.8
0.6
0.4
0.2
0.0

容量
96 tests

既存法

96 tests

希望納入価格（¥） メーカーコード
17,400
B601
Biofilm TestPiece
Assay Kit

菌種：Staphylococcus aureus NBRC13276

24 tests

各n=8の平均

20,000B603

26,800

B606

0.4
0.2

菌種：S

試験片素材をホルダーに固定して均一なバイオフィルムを形成させ、クリスタルバイオレット法で測定することで、抗菌性素材の開発に利用できます。独自の TestPiece Holder
TestPiece Holder

0.6

0.0

推奨サイズ : 20×10×1~3mm（タテ×ヨコ×厚み）
厚み）

エタノールを加えたウェルに試験片を浸し、吸光度を測定する。

クリスタルバイオレット染色後、洗浄液に試験片を浸し、バイオフィルムを洗浄する。

0.8

17

No.187（2023）

第 33 回フォーラム・イン・ドージン開催後記「相分離メガネで見る非膜オルガネラのダイナミクス～ザ・相分離生物学ビッグバン～」
今年のフォーラムもオンライン開催の形式をとったが、演者の先生方には熊本にお越しいただき、液－液相分離の最新のご研究
内容を熊本より発信していただいた。本フォーラム代表世話人の熊本大学富澤一仁先生から、「近年のホットな話題である液－液相分離研究は生物学、診断、治療の分野で大変注目されている。
今回は、本フォーラムでご講演いただく白木先生が造語された、“相分離生物学”および“相分離メガネ”をフォーラムの表題に採用させていただいた。相分離研究が世界をリードする研究に発展することを期待して本フォーラムを開催する」と述べられ、午前のセッションがスタートした。
最初の演者である筑波大学白木賢太郎先生は、相分離研究のス
タートとなった細胞内の P 顆粒に液体の性質があるという研究紹介から、タンパク質の凝集と相分離および凝集抑制剤についての概要を説明された。リゾチームとアルブミンの水溶液を混ぜると即座に相分離を起こすことで白濁し、塩水を加えると相分離が解消され透明になるという相分離現象の例を示された。アルギニンは分子内のグアニジウム基がタンパク質中のチロシンの芳香族とカチオンーπ相互作用により凝集を防ぐ。RGG と YGG のアミノ酸配列は相分離を起こしやすい構造と説明された。細胞内で見えないことを試験管内で現象を起こさせることで、細胞内で起きている現象を説明できるのではないかと締めくくられた。続いてUniversity of Texas Southwestern Medical Center の加藤昌人先生は、RNA 結合タンパクの hnRNP タンパク質は可逆性の cross
β繊維を形成するが、その low-complexity domain（LCD）に保存されたアスパラギン酸が変異すると不可逆性の cross β繊維となり凝集する。TDP-43 は LCD 領域にあるメチオニンの変異により、FUS は LCD 領域にあるグリシンの変異によりそれぞれ安定な cross β構造となり凝集する。以上のことから神経変性疾患を引き起こす LCD 内の gain-of-function（機能獲得）変異の分子メ
カニズムの一端が明らかになったと説明された。大阪大学廣瀬哲郎先生は、非膜オルガネラ骨格として働く lncRNA を発見され、architectural RNA（arcRNA） と 命 名 さ れ た。 そ し て NEAT1_2
lncRNA は核内非膜オルガネラのパラスペックルの構造骨格として働くことを見出され、パラスペックルはブロック共重合体の高分子ミセルとして振る舞うことを提唱された。さらに arcRNA を骨格に相分離形成される非膜オルガネラの作動として提唱されている、「るつぼ機能」、「スポンジ機能」、「ハブ機能」についての詳細を説明された。

合しゾルーゲル相転移を起こすことを報告された。大阪大学甲斐歳恵先生は、動物の生殖細胞にある非膜オルガネラで RNA- タン
パク質複合体であるヌアージュの構築原理とその機能について講演された。トランスポゾン抑制に働く piRNA はヌアージュで合成されるが、そのヌアージュ形成に Tejas（Tej）が重要な役割を果たすことを明らかにされた。また piRNA 産生過程においては
Tej が Vas、Spn-E と協働的に働き、piRNA 前駆体のプロセシン
グに重要な役割を果たしていることを解明された。
コーヒーブレークの後、京都大学吉村成弘先生は、電荷ブロッ
ク駆動型液－液相分離とリン酸による制御機構について発表された。リン酸化による「電荷ブロック」の増強・減弱が液－液相分離を亢進・抑制することを突き止められ、1）特定のアミノ酸残基のリン酸化ではなく、ブロックの電荷変化が重要、2）
正・負両方のブロックが存在すると相分離は促進される、3）ブ
ロックの大きさは数十アミノ酸、とまとめられていた。北海道大学藤岡優子先生は、オートファジーの開始に形成される preautophagosomal structure（PAS） が 液 ― 液 相 分 離 状 態 で あ ることを明らかにされた。栄養豊富な条件下では、TORC1 によりAtg1 複合体中の Atg13 がリン酸化されることで PAS の形成が阻害され、飢餓状態では Atg13 が脱リン酸化され他の Atg タンパ
ク質と液－液相分離を起こし、液滴からオートファゴソームが形成されることを解明された。
世話人である熊本大学三隅将吾先生は、「分子集合物が如何にして働くのかがかなりのレベルで分かってきた。相分離がきちんと起こらなければ細胞恒常性の機能破綻が起こり、最終的には疾患を発症するという流れが見えてきている。今回参加していただ
いた方と第 34 回フォーラムでお会いできることを楽しみにしている。」とフォーラムを締めくくられた。
最後にあたり、フォーラムに関するご意見、今後フォーラムに取り上げてもらいたいテーマ等あれば当社マーケティング部までご連絡いただきたい（https://www.dojindo.co.jp/contact/）。
（石山宗孝）

午後のセッションは熊本大学塩田倫史先生のご講演から始まった。塩田先生は、グアニンリッチ配列の伸長によるリピート病において、G4 の異常形成が神経変性疾患に関与することを説明された。脆弱 X 随伴振戦 / 失調症候群（FXTAS）では FMR1 遺伝子の 5’非翻訳領域に CGG リピート伸長が見られ、RNA 毒性が観察される。α -synuclein は G4RNA と結合することでゾルーゲル
相御転移経由後凝集体を形成し、tau タンパク質も G4RNA に結

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No.18718

次号テーマ

相分離生物学②

ドージンニュース No.187 令和 5 年 12 月 1 日発行
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