免疫・代謝―総 説―

代謝制御による腫瘍免疫の向上
岡山大学

西田 充香子・鵜殿 平一郎―注目の研究―

セリン代謝酵素応答性蛍光プローブの開発
株式会社同仁化学研究所

平川 哲央

新 製 品

エクソソーム蛍光染色キット P.7
バイオフィルム形成阻害測定キット・
バイオフィルム薬剤効果測定キット P.11
細胞周期測定試薬 P.12

開 発 中グルコース細胞内取り込み検出用蛍光プローブ P.7
菌二重染色キット P.10

No.173(2020)

2020 No.173

表紙撮影：菊池市 菊池渓谷 水天宮横菊池渓谷は東西に延びる渓谷で夏の朝日が神秘的な光芒を魅せてくれる。
photo：永島俊介氏

ドージンニュース

CONTENTS
Review
代謝制御による腫瘍免疫の向上
岡山大学

［1］

●

西田 充香子・鵜殿 平一郎

Topics on Chemistry
セリン代謝酵素応答性蛍光プローブの開発 ●株式会社同仁化学研究所

［6］

平川 哲央

Commercial［8］

細胞内代謝測定キット ●ミトコンドリア膜電位測定キット

［9］

●

［12］

細胞増殖・細胞毒性測定キット ●［13］

細胞機能解析－マイクロプレートリーダーで測定－ ●新製品
エクソソーム蛍光染色キット ●［7］

バイオフィルム形成阻害測定キット・バイオフィルム薬剤効果測定キット ● ［11］細胞周期測定試薬 ●

［12］

開発中
グルコース細胞内取り込み検出用蛍光プローブ ● ［7］菌二重染色キット ●

［10］

関連製品
微生物増殖アッセイキット ●お役立ち
がんとグルタミン代謝 ●

［10］

［5］
［9］

ミトコンドリア機能低下を測定する ●最新試薬・実験例をまとめた冊子
教材としても人気のプロトコル集 ●

［4］

ツイッター
※希望納入価格には消費税等は含まれておりません。

＠dojindoinfo

No.173(2020)

代謝制御による腫瘍免疫の向上
Metabolic intervention facilitates anti-tumor immunity

Abstract
西田

充香子

岡山大学
大学院医歯薬学総合研究科
免疫学分野
助教

鵜殿

平一郎

岡山大学
大学院医歯薬学総合研究科
免疫学分野
教授

1. はじめに腫瘍局所は低酸素、高乳酸による低 pH に加え、低栄養な環境である。免疫細胞がその機能を発揮するためには栄養とくにグルコースを必要としている。皮肉なことに腫瘍細胞も大量にグルコースを消費し、増大する。このように腫瘍微小環境においてはエフェクター免疫細胞と腫瘍との間にグルコースの奪い合い、すなわち代謝競合が起こっている。競合に負けたエフェクター免疫細胞は次第にその機能を失い、腫瘍は増大へと向かう。このように代謝が腫瘍の運命を決定付けているということは興味深い知見である。見方を変えれば、個々の細胞の代謝を上手く制御することができれば腫瘍退縮へと導くことが可能となり、代謝制御は新
たな免疫治療のターゲットとなりうる可能性がある。
本稿では腫瘍免疫に関わる細胞群の代謝について概説し、個々の細胞の代謝を制御する手段や免疫療法への応用についても紹介する。

2．免疫細胞の代謝細胞は大きく分けて解糖系と酸化的リン酸化（OXPHOS）、脂質酸化（FAO）経路を駆動させることによってエネルギーを得ている 1）。細胞がどの代謝に依存してエネルギーを得るかによって細胞の種類や機能が変化する 2）。この章では個々の細胞の代謝について説明する。

1）
CD8 T 細胞
未感作な CD8 T 細胞は FAO、OXPHOS に依存しているが、抗原提示細胞である樹状細胞より抗原刺激を受けると、T 細胞受容体（TCR）および副刺激受容体 CD28 の下流の PI3K-Akt-mTOR経路が活性化する。mTOR は様々な代謝経路を調節し、特にmTOR の下流に存在する IRF4 分子がエフェクター CD8 T 細胞を誘導する転写因子である T-bet、Blimp-1 の発現を誘導し、さTumor microenvironment is a special place characterized bylow oxygen, low pH, low nutrient, and high lactate concentration.
The unique condition generates metabolic competition between
effector immune cells and growing cancer cells, because bothcell populations require particularly glucose to survive and exert
their function. In this context, the metabolic intervention elevation of glycolysis of immune cells while decreasing that oftumor cells, would bring about significant shrink of tumors. In
this special review, we at first overview the energy metabolism ofeach immune cell as well as tumor cell, and then present ourrecent finding with metformin, a first line drug for type 2 diabetes
mellitus (T2DM), which might provide useful metabolic
intervention in tumors to achieve more effective anti-tumor
effects along with the currently ongoing cancer immunotherapy.

ら に mTORC1 は 糖 代 謝 関 連 因 子 を 調 節 す る 転 写 因 子 で あ る
c-Myc、HIF1αの発現を介して、CD8 T 細胞膜上にグルコースト
ランスポーターである Glut-1 を誘導し、その結果、グルコース
代謝が亢進し、CD8 T 細胞の活性化、分化、増殖を促す 3）4）。この解糖系の亢進は CD8 T 細胞がエフェクター機能を発揮する上では重要であり、実際に解糖系の律速酵素であるヘキソキナーゼ2（HK2）をグルコースの類似体である 2- デオキシ -D- グルコース（2-DG）で阻害するとエフェクター機能が低下する 5）。また、解糖系の中間代謝産物であるホスホエノールピルビン酸（PEP）
は小胞体内へのカルシウムの再流入を抑制し、細胞外からのカル
シウムの流入を亢進させ、転写因子 NFAT を核内へと移行させてサイトカイン産生を誘導する 6）。さらに 3- ホスホグリセリン酸（3-PG）はアミノ酸であるセリンへ変換され、核酸合成に使われる 7 ）。そして解糖系から派生するペントースリン酸化経路は、核酸合成に必要なリボース 5 リン酸そして脂質合成に必要なNADPH を合成する。また N ADPH には抗酸化物質である G SH
を還元状態に保つ働きがあり、GSH は NFAT、mTOR 活性化の維持に関与し Myc を介して解糖系を誘導するとの報告もある 8 ）。
また、解糖系酵素である GAPDH はグルコース非存在下すなわち解糖系が抑制された状況では IFNγの翻訳を抑制する 9 ）。このよ
うにエフェクター CD8 T 細胞は解糖系に依存して機能し、増殖する。また、二次応答の際に重要な記憶 CD8 T 細胞においては局所で抗原に対して速やかに応答するエフェクター メモリー
CD8 T 細胞は解糖系に依存しており 10）、二次リンパ組織に存在して長期的に 抗 原 に 応 答 す る セントラルメモリー C D 8 T 細 胞
は FAO、OXPHOS に依存している 11）。また、近年同定された末梢組織へ移行後、体内循環せず組織に存在し、抗原に応答する
レジデントメモリーCD8 T 細 胞（TRM）は 脂 質 の取り込みが高く
F A O 、 O X P H O S に 依 存 し て い る 。またTRM ではFatty acidbinding protein 4,5（FABP4、FABP5）の発現が亢進しており、

1

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FABP4、FABP5 が欠損すると脂肪酸の取り込みが低下し TRM の生存が阻害され、数が減少する 12）。

2）
CD4 T細胞CD4 T 細胞は周囲のサイトカインの環境の違いによって異なるサブセットに分化する。IL-12、IFNγ存在下では CD4 T 細胞
は転写因子 T-bet を発現し IL-2、IFNγを産生する 1 型ヘルパー
T 細胞（TH1 細胞）へと分化する。TH1 細胞はマクロファージ、
細胞傷害性 T 細胞（CTL）を活性化し細胞内の病原菌排除に関与しており、解糖系に依存している 13）。次に IL-4 存在下では転写因子 GATA-3 を発現し、IL-4、IL-5、IL-13 を産生する 2 型ヘルパー
T 細胞（TH2 細胞）へと分化する。TH2 細胞は寄生虫の排除や B細胞の抗体産生を刺激、アレルギー反応にも関与しており、解糖系に依存している 13）。また、IL-6、TGFβ存在下では転写因子
RORγt を発現し IL-17A、IL-17F、IL-22 を産生するヘルパー T
細胞である TH17 細胞へと分化する。TH17 細胞は好中球の活性化、炎症性腸疾患などの自己免疫疾患の発症に関与し、解糖系に依存しており、IL-17 の産生を維持している 13）。さらに、TH17細胞への分化においては脂肪酸合成の律速酵素である ACC1 の活性が重要とされており、ACC1 を阻害すると実験的自己免疫性
脳脊髄炎（EAE）において TH17 細胞の分化が抑制され、症状が改善するとの報告もある 14）15）。次にナイーブ CD4 T 細胞は、
TGFβ、IL-2 存在下では転写因子 Foxp3 を発現し TGFβ、IL-10を産生する制御性 T 細胞（Treg）へと分化する。Treg は免疫抑制に関与し、腫瘍免疫においても重要な細胞である。Treg はマスター遺伝子である Foxp3 を発現しており、Foxp3 がミトコン
ドリアの電子伝達系を活性化し、ミトコンドリア機能を高め、Treg の代謝を OXPHOS、FAO の方向へとシフトさせる 16）。さらに Foxp3 は c-Myc の発現を抑制し、解糖系を抑制している。逆に Treg の 解 糖 系 が 亢 進 す る と mTOR 経 路 の 活 性 化 依 存 的 に
Foxp3 の発現は低下し、腫瘍内での数も減少する 17）。このように代謝とマスター転写因子 Foxp3 には密接な関係が存在する。
また Foxp3 による OXPHOS の誘導は細胞内の NAD ＋ /NADH の割合を増加させ、乳酸をピルビン酸に変換して、腫瘍局所の高乳酸条件下において乳酸による機能抑制効果から免れている 18）。
このように Treg は解糖系を抑制し、OXPHOS を亢進させること
で腫瘍微小環境に適応している。

する。その活性化は解糖系阻害剤である 2-DG 処置によって抑制される 21）。NK 細胞も抗腫瘍免疫に重要な細胞で解糖系亢進によって IFNγ、グランザイム B を産生し、その機能を発揮する
22）23）。

3．腫瘍の代謝
腫瘍細胞は有酸素下でも解糖系に依存してエネルギーを得ている（ワールブルグ効果）24）。さまざまながん原遺伝子はグルコー
ストランスポーターの発現、そして解糖系酵素誘導し解糖系を上昇させる方向へ導いていることからも腫瘍の解糖系への依存度は大きく 25）、腫瘍細胞が大量のグルコースを消費するため腫瘍微小環境は他の組織と比較してグルコース濃度が極端に低い 6）。
Rathmell らの報告によるとがん抑制遺伝子である VHL 遺伝子に変異のある腎細胞癌では HIF1αが過剰発現し、腫瘍細胞の解糖系を亢進させるが、その一方で腫瘍に浸潤する CD8 T 細胞の解糖系は抑制され、さらに PD-1 の発現が上昇し、増殖や機能が低下していることを見出している 26）。さらに Chang らは主要な拒絶抗原を有する腫瘍（Regressor：R 腫瘍）と拒絶抗原を有さない腫瘍（Progressor：P 腫瘍）を用いて CD8 T 細胞と P 腫瘍を共培養すると CD8 T 細胞の IFNγの産生量が低下し、この作用はグルコースを添加すると解消されることを明らかにした。グル
コース消費速度は、P 腫瘍のほうが R 腫瘍よりも高いことも証明している 27）。これらの報告から悪性度の高い腫瘍は解糖系がより亢進しており、低グルコースの腫瘍微小環境下ではエフェク
ター細胞が十分にグルコースを利用できず、解糖系が抑制され、疲弊状態に陥っていることが示唆されている。また解糖系によって生じた乳酸は免疫細胞を抑制するだけでなく、腫瘍細胞自身がモノカルボン酸トランスポーターである MCT1 を介して乳酸を取り込み、乳酸からピルビン酸へ変換して TCA 回路を回して増3）
骨髄球性細胞（マクロファージ、
MDSC）
炎症型の M1 マクロファージは TNFα、IL-12 の産生を介した抗腫瘍効果の発揮に重要な細胞であり、LPS や IFN の刺激によって HIF1α、mTOR の活性化を介して代謝を OXPHOS、FAO から解糖系へとシフトさせる。その一方で免疫抑制に働く非炎症型（創傷治癒型）の M2 マクロファージは FAO、OXPHOS に依存しており、免疫抑制性サイトカインである IL-4、IL-10 を産生する
19）。さらに腫瘍局所に存在し、免疫抑制に働く M2 型腫瘍関連マ
クロファージ（M2-like TAM）や骨髄由来抑制細胞（MDSC）はOXPHOS、FAO に依存しており、それぞれの代謝が解糖系優位になると M2-like TAM は M1-like TAM に分化し、MDSC はその数が減少し、それぞれ本来の機能を失う 20）。

4）樹状細胞、NK細胞
抗原提示細胞である樹状細胞は TLR からのシグナルを受けると PI3K-Akt 経路を駆動させ、解糖系が亢進すると、IL-12 の産生や活性化マーカーである CD86 や MHC class Ⅱの発現が上昇

2

図1

免疫細胞の種類と代謝経路
エフェクター細胞とよばれる種々の細胞種集団は解糖系に依存する。その一方、免疫寛容や創傷治癒に関係する細胞集団は脂肪酸酸化（クエン酸回路と酸化的リン酸化（OXPHOS））に依存する。

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図2

腫瘍微小環境における腫瘍細胞とエフェクター細胞の代謝競合
腫瘍微小環境下は低グルコースに加え、腫瘍細胞のワールブルグ効果によってグルコースを奪われ、腫瘍内のエフェクター細胞は次第にその機能を失う。

殖 維 持 に 使 用 し て い る 28）。興 味 深 い こ と に 腫 瘍 の 転 移 に はOXPHOS、FAO が関与しており転移細胞は PGC1αの発現が高く、ミトコンドリア機能を亢進させて OXPHOS に依存してエネルギーを得ており、腫瘍細胞は置かれた状況に応じて代謝を使い分けることで生存を図っている 29）。
さらに腫瘍組織に存在する脂肪細胞からペプチドホルモンであるレプチンが産生され、このレプチンが CD8 T 細胞の STAT3 を活性化し、代謝を解糖系から FAO へとシフトさせ、IFNγ産生を抑制し、腫瘍モデルにおける CD8 T 細胞を介した抗腫瘍効果を消失させる 30）。
このように腫瘍組織を構成する脂肪細胞も免疫細胞の代謝に影響を与えているという知見は大変興味深い。
ここまで免疫細胞と腫瘍細胞における代謝について概説したが、個々の細胞を代謝で大きく分類すると抗腫瘍効果に必要な細胞（エフェクター細胞）は解糖系、免疫抑制すなわち免疫寛容を起こさせる細胞は OXPHOS、FAO に大部分は依存していることが分かる（図 1）。
周知のように腫瘍細胞も解糖系に依存しており、抗腫瘍効果に必要なエフェクター細胞との間ではグルコースを巡る代謝競合は必然である（図 2）。しかし、腫瘍局所は粗雑な血管である腫瘍
血管が多く造成しており物質交換がうまく機能しない。よってグルコースを始めとした各種の栄養素、および酸素が腫瘍局所に到達できない。さらに、多くの免疫細胞の浸潤も十分にできない。
すなわちエフェクター免疫細胞の浸潤、樹状細胞（B7 を発現し、T 細胞の CD28 と会合）の浸潤も低下する 31）。従い、腫瘍内で如何に効率的にエフェクター免疫細胞がグルコースを利用し解糖系を亢進させることができるか、また、正常な腫瘍血管を構築できるかが抗腫瘍効果の発揮には重要な鍵となってくる。次に代謝制御による抗腫瘍効果の向上について説明する。

3. 代謝制御による治療
これまで述べてきた背景から腫瘍細胞の解糖系を阻害するため
2- デオキシグルコース（2-DG）などの解糖系阻害剤を用いたがん治療研究も行われてきた 32）。しかしエフェクター細胞も解糖系を利用しており、腫瘍だけでなくエフェクター細胞の解糖系も低下させてしまう可能性があり、その選択性が問題となった。そのような中、2018 年に単糖類の D- マンノースがホスホマンノー
スイソメラーゼ（PMI）の発現が高い腫瘍に限り、その解糖系を抑制するといった報告がなされ、ある特徴を持つ腫瘍に特異的な治療法も出てきた 33）。さらに腫瘍血管内皮の代謝制御も重要との報告もある。腫瘍血管内皮は解糖系活性化酵素の PFKFB3 の

図3

メトホルミンによる腫瘍微小環境の代謝改変と抗腫瘍免疫の活性化
参考文献（20）を一部改変
メトホルミンは腫瘍微小環境に存在する免疫細胞の代謝を解糖系へと変化させ、抗腫瘍効果の発揮に優位な方向へ導く。

発現が高く、解糖系の亢進により血管内皮のバリア機能を低下させ、腫瘍の浸潤・転移を促進する。事実、PFKFB3 の阻害剤を処置すると血管内皮のバリア機能も正常化し、転移も抑制される
34）。腫瘍の制圧には腫瘍細胞や免疫細胞だけでなく、腫瘍組織を構成する細胞集団を含めて考える必要がある。
このようにさまざまな代謝制御法が報告される中、免疫細胞の解糖系を上昇させ、その一方で、腫瘍細胞の解糖系を抑制し、腫瘍微小環境全体の代謝を改変させるような代謝制御法は未だ確立されていない。我々はこれまでに 2 型糖尿病治療薬メトホルミンの誘導する抗腫瘍効果の研究からメトホルミンによる解糖系の亢進が、腫瘍局所の CD8 T 細胞の機能を高め 35）、Treg、MDSC
においては数、機能を低下させ、さらに M2-like TAM を M1-like。しTAM へとシフトさせることを明らかにしてきた 17）20）（図 3）かしメトホルミンが腫瘍細胞の代謝に及ぼす影響についてはまだ不明な点が多く、現在、検討中であるがこれまでに明らかになってきたことを一部、紹介したい。

4．メトホルミンによる免疫細胞と腫瘍細胞の代謝改変
メトホルミンを処置したマウスの腫瘍塊から CD8 T 細胞と腫瘍細胞を回収し、解糖能を評価するためグルコースのトランスポーターである Glut-1 の発現そしてグルコースのアナログである 2-NBDG の取り込み能を検討したところ、興味深いことにメ
トホルミン処置によって CD8 T 細胞の Glut-1、2-NBDG の取り込みは上昇していたが、腫瘍細胞においては Glut-1、2-NBDGの取り込みはむしろ低下するということが分かった。さらにメト
ホルミンと抗 PD-1 抗体併用治療においてはさらにその傾向が強く、驚くべきことにメトホルミンは免疫不全マウスに移植した腫瘍細胞の解糖能には影響を及ぼさないことも明らかとなってきた。すなわちメトホルミンによる腫瘍細胞の代謝改変には免疫系が必要であることを示唆しており、そのメカニズムについては検討中であるが、メトホルミンが如何にして免疫細胞と腫瘍細胞に

3

No.173(2020)

おいて代謝を逆に制御することが可能なのか、この謎を解明できれば、細胞選択的代謝制御法の開発に繋げることが可能になり、腫瘍を制圧する方法を見出すことができるのではないかと考えている。

5. おわりに
腫瘍局所における免疫細胞の機能不全は従来、慢性的な抗原刺激によるものとされていたが、それに加え、腫瘍微小環境での免疫細胞と腫瘍細胞の代謝競合も重要な一つの理由と考えられる。
腫瘍微小環境に存在する異なる細胞集団の代謝を腫瘍退縮に有意な方向へ代謝を制御できれば腫瘍免疫の向上にもつながり、さらに細胞の代謝状態を評価することで免疫療法の効果判定や予後予測にも応用できる可能性がある。また、あらゆる組織、臓器においては、これを構成する細胞集団の代謝はある一定の規律と方向性をもって制御されているはずである。逆にいえば疾患とその病因は、個々の細胞代謝変化（異常）とリンクしているはずである。
その意味で腫瘍免疫だけではなく、あらゆる疾患病態を代謝という新たな尺度で見直すという作業は、今後ますます重要になってくると考えられる。
［参考文献］

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2） E. L. Pearce and E. J. Pearce, Immunity, 2013, 38(4), 633-643.
3） S. Yao et al., Immunity, 2013, 39, 833-845.
4） A. L. Doedens et al., Nat. Immunol., 2013, 14, 1173-1182.
5） M. Sukumar et al., J. Clin. Invest., 2013, 123, 4479-4488.
6） P. C. Ho et al., Cell, 2015, 162(6), 1217-1228.
7） E. H. Ma et al., Cell Metab., 2017, 25(2), 345-357.
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9） C. H. Chang et al., Cell, 2013, 153(6), 1239-1251.
10）P. M. Gubser et al., Nat. Immunol., 2013, 14(10), 1064-1072.
11）G. J. van der Windt et al., Immunity, 2012, 36(1), 68-78.
12）Y. Pan et al., Nature, 2017, 543(7644), 252-256.
13）R. D. Michalek et al., J. Immunol., 2011, 186(6), 3299-3303.
14）L. Berod et al., Nat. Med., 2014, 20(11), 1327-1333.
15）Y. Endo et al., Cell Rep., 2015, 12(6), 1042-1055.
16）D. Howie et al., JCI Insight, 2017, 2(3), e89160.
17）Y. Kunisada et al., EbioMedicine, 2017, 25, 154-164.
18）A. Angelin et al., Cell Metab., 2017, 25(6), 1282-1293.
19）S. Galván-Peña L. A. O'Neill, Front. Immunol., 2014, 5, 420.
20）T. Uehara et al., Int. Immunol., 2019, 31(4), 187-198.
21）B. Everts et al., Nat. Immunol., 2014, 15(4), 323-332.
22）I. Terrén et al., Front. Immunol., 2019, 10, 2278.
23）R. P. Donnelly et al., J. Immunol., 2014, 193(9), 4477-4484.
24）M. G. Vander Heiden et al., Science, 2009, 324(5930), 1029-1033.
25）C. Muñoz-Pinedo et al., Cell Death Dis., 2012, 3(1), e248.
26）P. J. Siska et al., JCI Insight, 2017, 2(12), 93411.
27）C. H. Chang et al., Cell, 2015, 162, 1229-1241.
28）B. Faubert et al., Cell, 2017, 171(2), 358-371.
29）V. S. LeBleu et al., Nat. Cell Biol., 2014, 16(10), 992-1003, 1-15.
30）C. Zhang et al., Cell Metab., 2020, 31(1), 148-161.
31）M. Mazzone and G. Bergers, Annu. Rev. Physiol., 2019, 81, 535-560.
32）H. Pelicano et al., Oncogene., 2006, 25(34), 4633-4646.
33）P. S. Gonzalez et al., Nature, 2018, 563(7733), 719-723.
34）A. R. Cantelmo et al., Cancer Cell, 2016, 30(6), 968-985.
35）S. Eikawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2015, 112(6), 1809-1814［著者プロフィール］
氏名：西田 充香子
所属：岡山大学
大学院医歯薬学総合研究科 免疫学分野〒 700-8558
岡山県岡山市北区鹿田町 2-5-1
Tel：086-235-7188
E-mail：m-nishida@okayama-u.ac.jp
出身学校：岡山大学
学位：博士（医学）
現在の研究テーマ：メトホルミンによる腫瘍微小環境の代謝改変メカニズムの解明
氏名：鵜殿 平一郎
所属：岡山大学
大学院医歯薬学総合研究科 免疫学分野〒 700-8558
岡山県岡山市北区鹿田町 2-5-1
Tel：086-235-7187
E-mail：udono@cc.okayama-u.ac.jp
出身学校：長崎大学
学位：博士（医学）
現在の研究テーマ：代謝から読み解く腫瘍免疫学

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4No.173(2020)

がんとグルタミン代謝
がん細胞では、グルタミンを基質にα- ケトグルタル酸を供給する経路である「グルタミノリシス」の亢進が知られており、これに関連して種々の報告がされています。
例えば、がん遺伝子である KRAS はグルコースとグルタミン代謝を制御しているとされ 1）、また、膵臓腺がんの亢進には低酸素状
態がグルコースおよびグルタミン代謝の活性化に関係し 2）、更には、グルタミン代謝が乳がん細胞の侵襲性を促進させる 2）など、グ
ルタミン代謝とがんの関わりを解明する研究が盛んに行われています。
下記に、がん細胞におけるグルタミン代謝と「低酸素」「オートファジー］に関する報告例を紹介します。

低酸素とがん膵管腺がんにおける低酸素下での解糖系の亢進は、ヘキソサミン生合成および生存を維持
低酸素状態になった膵臓がん細胞は、生存と細胞増殖を維持するため、酸化的リン酸化を促進する遺伝子の阻害を介した解糖系遺伝子の転写を活性化する。
これは、低酸素誘導因子である HIF1 によって促進され、これにより、グルコース消費および乳酸産生が増加する。
また、ヘキソサミン生合成経路（HBP 経路）を活性化させ生存を維持しようとするため、グルタミノリシスが亢進する。グルコースおよびグルタミンを炭素源として使用する
HBP 経路が活性化することで、タンパク質の O-GlcNAc 修飾が増加すること、さらに、低酸素状態下にある膵臓がん細胞が産生する乳酸が、隣接するがん細胞の成長を促進すること
により、がん細胞の生存率および増殖が維持されることが示
唆されている 3）。

グルタミン代謝とオートファジー
BAG3 によるグルタミナーゼの安定化を介したオートファジーとグルタミノリシスの促進
BAG3 は、アポトーシスや細胞分化、マクロオートファジー
等の様々な細胞機能の制御に関与するタンパク質である。
BAG3 が過剰発現した細胞では、グルタミナーゼ（GLS）のスクシニル化が促進されることにより、ユビキチン化とそれに続くプロテアソーム分解が防がれ、GLS が安定化する。
GLS が安定化することで、グルタミン分解が促進されるため、グルタミン消費が亢進し、細胞内グルタミン酸およびグルタ
ミン代謝産物であるα- ケトグルタル酸が増加する。
グルタミン分解の促進により生じる培養液中のアンモニア
は、オートファジーの活性化に寄与する。
グ ル タ ミ ノ リ シ ス が 亢 進 し て い る が ん 細 胞 で は、こ のBAG3 ががん治療の標的になる可能性が示唆されている 4）。

［参考文献］
1）Gaglio, D. et al., Mol. Syst. Biol., 2011, 7, 523.
2）Dornier, E. et al., Nat. Commun., 2017, 8, 2255.
3）Guillaumond, F. et al., PNAS, 2013, 110, 3919.
4）Zhao, S. et al., Cell Death & Disease, 2019, 284(10).

関連製品情報グルタミン測定キット：
P8, P13グルタミン酸測定キット： P8, P13
オートファジー検出キット： P13

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No.173(2020)

Topics on Chemistry
セリン代謝酵素応答性蛍光プローブの開発
株式会社同仁化学研究所
細胞は、外部から栄養（グルコース、アミノ酸、脂質など）を取り込み、さまざまな細胞内の代謝系を介して細胞の維持や増殖のためのエネルギー源や材料に変換し、利用している。また、代謝産物が細胞機能を厳密に制御していることが明らかとなり、細胞内代謝を理解することが重要とされている。近年、メタボロー
ム解析や遺伝子操作などの技術の進歩により、細胞内の複雑な代謝経路が解明されている 1）。さらに、がん特異的な細胞内代謝は注目を浴び、新たな創薬標的候補として日々研究が進められている。
セリンヒドロキシメチル転移酵素（SHMT）は、アミノ酸の一種であるセリンをグリシンに変換する酵素であり、葉酸を介したアミノ酸や核酸合成に関わる One Carbon Metabolism の重要な酵素の一つである。この酵素は細胞増殖に寄与するため、がんやマラリアなど多くの疾病のバイオマーカーや治療薬の標的となっている。しかし、同じく One Carbon Metabolism に関わる重要なジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）やチミジル酸合成酵素（TS）
阻害剤（メトトレキサート、5-FU）は、抗がん剤として長年使用されているのに対し（図 1）2），3），4）、SHMT に関しては、未だ有用な阻害剤が開発されていない。
そこで本稿では、SHMT の酵素活性を簡便にモニタリングできる新規の蛍光プローブを用いた SHMT 阻害剤のスクリーニン
グについて紹介する 5）。
SHMT は上記のように、生化学的、医学的に重要であるにも拘らず、簡便かつ直接的に活性を測る手段が確立していない。その理由として、SHMT の働きは、セリンからグリシンへの単純な反応であることに加え、酵素の基質結合部位が狭く設計可能な分子構造が限られていることが挙げられる。山東らは、SHMTのセリン - グリシンの変換反応には葉酸が必要であるが、芳香族
β- ヒドロキシアミノ酸の変換には不要であることを見出した。
さらに、後者の反応がレトロアルドール反応であること 6），7）を利 用 し て、蛍 光 プ ロ ー ブβ（p-dimethylaminonaphthyl）- serine（図 2）を開発した。
こ の 蛍 光 プ ロ ー ブ 自 体 は 435 nm の 青 色 蛍 光 を 発 す る が、
SHMT と の 反 応 に よ り 535 nm の 緑 色 蛍 光 を 有 す る

未来技術開発部

図2

SHMT 蛍光プローブ（λex ＝ 390 nm）

図3

SHMT 存在下での蛍光スペクトルの変化 5）

平川

p-dimethyamino-naphthaldehyde へと変換される（図 3）。山東らはこの蛍光プローブを用いて、東京大学創薬機構が保有する約21 万種類の化合物ライブラリーの中から、SHMT 阻害剤の候補となる 2 種類の新規化合物を見出すことに成功している。得られた化合物は互いに類似性のないユニークな構造であり、有用な
SHMT 阻害剤開発の手掛かりになると考えられる。さらに山東らは、hydroxycoumarin 骨格の発蛍光型プローブや 19F-NMR 用のプローブを開発し、プローブ設計の柔軟さと蛍光プローブでは適用が困難な in vivo 実験への適用の可能性を示している。今回紹介した SHMT 応答性プローブは、SHMT の作用機序解明や疾患の診断、および新たな抗がん剤や抗マラリア薬の開発への応用が期待される。
［参考文献］
1） Matsumoto, M. et al., Nat. Methods, 2017, 14, 251-258.
2） Locasale, J. W. et al., Nat. Rev. Cancer, 2013, 13, 572-583.
3） Jain, M. et al., Science, 2012, 336, 1040-1044.
4） Paone, A. et al., Cell Death Dis., 2014, 5, e1525.
5） Nonaka, H. et al., Nat. Commun., 2019, 10, 876.
6） Florio, R. et al., Biochim. Biophys. Acta., 2011, 1814, 1489-1496.
7） Webb, H. K. et al., J. Biol. Chem., 1995, 270, 17204-17209.

図16葉酸回路と各酵素の役割

哲央

No.173(2020)

開発中
グルコース細胞内取り込み検出用蛍光プローブ
GLucose Uptake Probe - Green（GLUP-G）細胞の重要なエネルギー源であるグルコースの細胞内への取り込み能力は、細胞の代謝活性の指標の一つとして利用されています。一般的にグルコースの細胞内取り込みをイメージングする試薬として 2-NBDG（2-deoxy-2［（7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl）amino］-D-glucose）が、広く用いられています。しかし、蛍光強度が弱く、感度が低いという課題がありました。そこで小社では高感度にグルコースの細胞内取り込みを可視化できる新規の蛍光試薬 GLUP-G を開発しました。GLUP-G は 2-NBDG に比べ蛍光強度が強く、グルコースの細胞内取り込みを明瞭にイメージングすることができます。またプレートリーダーを用いた測定も可能です。

＜蛍光強度の比較＞＜蛍光顕微鏡による観察＞＜プレートリーダーによる測定＞

365 nm 励起

細胞：A549
使用培地：DMEM（0, 25 mmol/l Glucose）
色素濃度：100 μmol/l
Ex / Em：488 / 520 nm
測定：下方励起、下方検出

2-NBDG
GLUP-G
色素濃度：10 μmol/l（PBS）

Ex: 470 / 40 nm, Em: 525 / 50 nm
スケールバー：50 μm

ご興味のある方は小社カスタマーサポート（E-mail: info@dojindo.co.jp

Free Dial: 0120-489548）までご連絡ください。

新製品
エクソソーム蛍光染色キット
ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Green, Red, Deep Red
ExoSparkler Exosome Protein Labeling Kit-Green, Red, Deep Red

既存製品との比較
細胞外輝点

ExoSparkler シリーズは、精製されたエクソソームの膜またはタンパク質を染色し、細胞に取り込まれるエクソソームをイメージングすることができます。また、一般的なエクソソーム
染色試薬の課題である色素自体の凝集を起こさず、染色前後でのエクソソームのサイズ分布や
表面電荷状態を変化させないため、より正確にエクソソームの動態を可視化できます。

＜細胞へのエクソソーム取り込み実験例＞

紫：小社 Mem Dye-Deep Red
緑：S 社製品 P＜実験条件＞
超遠心法で精製したエクソソーム（タンパク質量として 10 μg）を各色素で染色し HeLa 細胞（1.25 × 104 cells）に添加、24 時間インキュベートし、洗浄後の蛍光を観察した。
＜検出条件＞
Green: Ex 488 nm / Em 490 - 540 nm 、Red: Ex 561 nm / Em 570 - 640 nm
Deep Red: Ex 640 nm / Em 640 - 760 nm＊ Mem Dye: ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit

品名ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Green
ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Red
ExoSparkler Exosome Membrane Labeling Kit-Deep Red
ExoSparkler Exosome Protein Labeling Kit-Green
ExoSparkler Exosome Protein Labeling Kit-Red
ExoSparkler Exosome Protein Labeling Kit-Deep Red

容量
希望納入価格（￥） メーカーコード
5 samples
25,000EX01
5 samples
25,000EX02
5 samples
25,000EX03
5 samples
20,000EX04
5 samples
20,000EX05
5 samples
20,000EX06

既存試薬との性能の違いや実験例は
小社 HP よりご覧いただけます。
エクソソーム同仁

検索7

No.173(2020)

細胞内代謝測定キット
細胞内の代謝システムである解糖系や TCA 回路、ペントース - リン酸経路の解析は、細胞状態を理解する上で重要であり、グルコー＋/NAD（P）H、グルタミン、グルタミン酸などのエネルギーおよび代謝産物を指標に評価されています。
スや乳酸、NAD（P）
論文増えてます !! 学術情報も随時更新
実際に役立つ学術情報をマップや図式、
引用文献を交えてご紹介します。
主な掲載情報・低酸素とがん・糖尿病疾患：高血糖状態によるポリオール代謝の亢進
・老化関連疾患と乳酸、NAD＋の関係
・がんとグルタミン代謝
・オートファジーとグルタミン代謝
・グルタミン代謝と細胞老化
詳しくは Web で！

これから代謝測定操作

品名
Glutamine Assay Kit-WST
Glutamate Assay Kit-WST
Glucose Assay Kit-WST
Lactate Assay Kit-WST
NAD/NADH Assay Kit-WST
NADP/NADPH Assay Kit-WST

8

容量
希望納入価格（￥） メーカーコード
100 tests
55,000G268
100 tests
50,000G269
50 tests
18,000G264
200 tests
38,00050 tests
29,000L256
200 tests
68,000100 tests
54,000N509
100 tests
54,000
N510

同仁

検索

No.173(2020)

ミトコンドリア機能低下を測定する
薬剤刺激によるミトコンドリア膜電位と細胞内代謝の変化
ミトコンドリア電子伝達系の阻害実験
エネルギー産生の場として重要な役割を果たしているミトコンドリアですが、下記実験ではミトコンドリアの機能阻害剤である
Antimycin（50 nmol/l）を Jurkat 細胞に添加し、ミトコンドリア膜電位と解糖系の変化を確認しました。

ミトコンドリア膜電位測定キット
JC-1 MitoMP Detection Kit
ミトコンドリアは、ATP 等のエネルギー産生の場であり、その活性の変化や機能障害ががんや老化、神経変性疾患などと密接に関連しています。そのため、ミトコンドリアの状態を把握することは重要であり、その指標としてエネルギー産生に伴い生じる膜電位差が評価されています。

＜測定原理＞
ミトコンドリアが正常で膜電位が保たれた状態では JC-1 が凝集し赤色の蛍光を発し、膜電位が低下すると JC-1 が単量体として存在し緑色の蛍光を発します。この赤色と緑色の蛍光強度比により、ミトコンドリア膜電位の変化を評価することができます。

＜各種機器による解析例＞
Jurkat 細胞をアポトーシス誘導剤（Staurosporine）で処理し、本キットを用いて染色した後、蛍光顕微鏡、フローサイトメーター、
プレートリーダーにより解析しました。
蛍光顕微鏡によるイメージング

フローサイトメーターによる解析〈検出条件〉
スケールバー：80μm
Green: Ex 488 nm / Em 500-550 nm
Red: Ex 561 nm / Em 560-610 nm

品名JC-1 MitoMP Detection Kit

容量
1 set

〈検出条件〉
Green: Ex 488 nm / Em 515-545 nm
Red: Ex 488 nm / Em 564-604 nm

希望納入価格（￥） メーカーコード
23,000
MT09

プレートリーダーを用いたアッセイ〈検出条件〉
Green: Ex 485 nm / Em 525-545 nm
Red: Ex 535 nm / Em 585-605 nm

キットを使用した最新論文は小社 HP よりご覧いただけます。

JC-1

同仁

検索

9

No.173(2020)

開発中
菌二重染色キット
試薬を加えるだけで殺菌効果を複数の指標で評価できるキットを開発中です。

＜なぜ複数の指標で評価するのか＞
抗菌剤等の菌に対する効果を評価する場合、培養法によるコロニー形成単位（CFU）の確認や蛍光染色試薬を用いた多重染色法が広く用いられています。近年では特に感染症における薬剤耐性菌の出現や損傷菌が引き起こす食中毒等の問題を受けて、抗菌性評価の信頼性を高めることを目的に、単一指標ではなく複数の指標で薬剤等の抗菌性を評価する必要性が高まっています。
また、日本国内では 2020 年の 6 月から食品を扱う全事業者が対象となる HACCP（危害分析重要管理点）を義務化する法案が施行され、1 年の猶予期間を経て完全制度化されることから、特に飲食料品の製造分野では菌検査の簡素化ならびに迅速化の需要が高まっています。

＜キットの特長＞
・菌懸濁液に染色試薬を添加するだけ
・菌の酵素活性や呼吸活性など、複数の指標で薬剤効果を評価することが可能
・培養法と比較して菌の検出に大幅な時間短縮が可能＜染色例＞

大腸菌の染色例
酵素活性有（緑）、膜損傷有（赤）大腸菌の染色例
呼吸活性有（赤）、全菌（青）

黄色ブドウ球菌の染色例
呼吸活性有（赤）、全菌（青）黄色ブドウ球菌の染色例
膜損傷有（赤）、全菌（青）ご興味がございましたら小社カスタマーサポートまでお問い合わせください（E-mail: info@dojindo.co.jp Free Dial: 0120-489548）

関連製品
微生物増殖アッセイキット
Microbial Viability Assay Kit-WST＜特長＞
・評価にかかる時間を大幅に短縮
・生菌の活性評価を濁度から色の変化へ

従来法との比較・相関データを追加しました

M439＜従来法との比較＞＊菌種によって最適条件は異なります。

本キットに含まれる還元発色剤 WST-8 は、電子メディエーター
を介して微生物内で生成する NAD（P）H によって還元され発色します。還元された WST-8 ホルマザン量は微生物の代謝活性に比例しており、吸光度を測定することで、微生物の生存率や活性度合いを簡便に測定することができます。

＜操作＞
96 well プレートに菌懸濁液を準備し、試薬を添加。

従来法
所要
時間

特徴

10

インキュベーター
内で発色反応

吸光度検出

本方法

コロニー形成法

濁度法

24 時間以上

18-24 時間・標準法
・操作が煩雑品名

微生物懸濁液に試薬を添加

検索

同仁化学

WST 法
約 8 時間＊6 時間（培養
発色 2 時間 ）・短時間でのマイク・マイクロプレート
ロプレートアッセ
アッセイが可能
イが可能
・代謝活性は見れな・代謝活性を指標といする

容量
希望納入価格（￥） メーカーコード
100 tests
6,000
Microbial Viability Assay Kit-WST
M439
500 tests
21,300No.173(2020)

新製品
バイオフィルム形成阻害測定キット・バイオフィルム薬剤効果測定キット
Biofilm Formation Assay Kit
Biofilm Viability Assay Kit＜特長＞・マイクロプレートの蓋に固定したピンにバイオフィルムを形成させる手法で、洗浄・染色・発色操作が簡便
・バイオフィルムが剥がれ難く均一に形成可能
・多検体処理が可能
Biofilm Formation Assay Kit はクリスタルバイオレット（CV）染色法によりバイオフィルム形成量および薬剤のバイオフィルム形
成阻害を測定することができます。また、Biofilm Viability Assay Kit はバイオフィルム内の生菌の代謝活性を測定することで、バイオフィルム内微生物に対する薬剤の殺菌効果を確認することができます。
既存法はマイクロプレートの底にバイオフィルムを形成するため、菌の培養に伴う培地交換や、染色工程前後の洗浄作業に多くの手間を要し、バラツキの問題がありました。本キットは蓋に固定されたピン上にバイオフィルムを形成させるため、培地交換や染色工程が蓋を移すだけで完了し、操作が非常に簡便です。

既存法

キット法

既存法はバイオフィルムが剥がれている箇所があるが、キット法では、均一に形成されている。

品名
Biofilm Formation Assay Kit
Biofilm Viability Assay Kit

クリスタルバイオレット法によるばらつきの比較

容量100 tests
100 tests

希望納入価格（￥）
16,30018,700

菌種：S. aureus
各 n ＝ 8 の平均メーカーコード
B601
B603

11

No.173(2020)

新製品
細胞周期測定試薬
Cell Cycle Assay Solution Blue
Cell Cycle Assay Solution Deep Red＜特長＞
・細胞の固定化、RNase 処理が不要で試薬を添加するだけ
・405 nm、633 nm のレーザーで励起が可能
一般的に使用される Propidium Iodide（PI）を用いた手法と比較して、本製品は高い細胞膜透過性と DNA 選択性を有する色素を使用しているため、細胞懸濁液に試薬を添加するだけで測定が
可能です。

＜測定例＞
アポトーシス誘導による DNA の断片化
ア ポ ト ー シ ス を 誘 導 す る こ と が 知 ら れ て い る Etoposide を
HL-60 細 胞 へ 添 加 後、ア ポ ト ー シ ス の 進 行 を Annexin V, FITC
Conjugate お よ び -Cellstain Ⓡ - PI solution（メ ー カ ー コ ー ド：P378）でイメージングし、DNA の断片化を本製品によるフロー
サイトメトリーで確認しました。

細胞増殖・細胞毒性測定キット
Cell Counting Kit-8＜特長＞
・試薬を添加するだけの簡単な操作
・低毒性
・試薬の安定性が高い
Cell Counting Kit-8（CCK-8）は、細胞内代謝活性を指標に生細胞を測定するキットです。同仁化学研究所が開発した色素
WST-8 を採用したことにより、簡便な操作性、高い試薬の安定性、細胞への低毒性を実現しました。これにより従来より使われている MTT 法に代わる試薬として、世界中の研究で広く使われ
ています。

＜操作＞
試薬を直接培養液に加えるだけで、生細胞数に応じた培地の色の変化がみられます。

▲

製品情報 P13

Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST＜特長＞
・測定毎の試薬調製が不要
・試薬の安定性が高い
・2 種の測定法が選べる

アポトーシス誘導コントロールEtoposide 添加に伴うアポトーシスの進行＜測定法の選択＞

製品情報 P13▲

品名
容量
希望納入価格（￥） メーカーコード
Cell Cycle Assay Solution Blue 50 tests
13,000
C549
Cell Cycle Assay Solution Deep Red 50 tests
13,000
C548

Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST は、細胞から培地中に放出された乳酸脱水素酵素（LDH）活性を測定することにより細胞傷害を測定するキットです。
LDH は細胞質に存在する酵素で、細胞膜が傷害を受けると培地中に放出されます。放出された LDH は安定であるため、死細胞または細胞膜に傷害を受けた細胞数を測る指標として広く測定されています。

Viability/Cytotoxicity Multiplex Assay Kit
Cell Counting Kit-8, Cytotoxicity LDH Assay Kit-WSTのセット品▲

製品情報 P13

12

No.173(2020)

細胞機能解析ーマイクロプレートリーダーで測定ー
細胞機能の理解は疾病の解明や予防、治療薬の開発や機能性物質の特定などにおいて重要であり、医療、化粧品、機能性食品など多岐にわたる分野で注目されています。また、近年の解析技術の進歩により、細胞機能解析のための手法に対する要望も変わっています。例えば、顕微鏡による目視判定での評価から、定量化・数値化したい、多くのサンプルを一度に解析したい、等といった要望が増えています。
今回は、小社でラインナップしている、マイクロプレートリーダーによる測定に対応した製品をご紹介します。

品名

検出

細胞内代謝測定キット
LactateAssay Kit-WST
GlucoseAssay Kit-WST
NAD/NADH
吸光
Assay Kit-WST（450 nm）
NADP/NADPH
Assay Kit-WST
Glutamine
Assay Kit-WST
Glutamate
Assay Kit-WST
細胞増殖・毒性測定キット

Cell Counting Kit-8

吸光（450 nm）

Cytotoxicity LDH
Assay Kit-WST

吸光（490 nm）

容量

希望納入
価格

50 tests
200 tests
50 tests
200 tests￥29,000￥68,000￥18,000￥38,000

100 tests￥54,000

N509

100 tests￥54,000

N510

100 tests￥55,000

G268

100 tests￥50,000

G269

100 回用500 回用2500 回用
5000 回用
10000 回用
100 tests
500 tests
2000 tests

Viability/
吸光
500 tests
Cytotoxicity（450, 490 nm）
Multiplex Assay Kit
蛍光Cell Counting Kit-F （Ex: 490 nm/
500 回用Em: 515 nm）
細胞数補正キット
蛍光200 tests
Cell Count（Ex: 350 nm/
Normalization Kit
Em: 461 nm） 1000 tests

メーカー
コード
L256
G264

￥5,400￥13,600￥37,800 CK04
￥70,000￥102,000￥9,800￥26,200 CK12
￥39,200￥29,800￥14,400￥8,000￥20,000

CK17

CK06

C544

品名

検出

ミトコンドリア膜電位検出キット
蛍光（Green: Ex 485 nm/
JC-1 MitoMPEm 525-545 nm
Detection Kit
Red: Ex 535 nm/
Em 585-605 nm）
オートファジー検出キット
DAPGreen 蛍光
Autophagy（Ex: 450 nm/
Detection
Em: 535 nm）
細胞老化検出キット
Cellular
蛍光
Senescence Plate（Ex: 535 nm/
Assay Kit Em: 580 nm）
SPiDER-βGal
脂肪滴検出キット
蛍光
Lipid Droplet Assay（Ex: 360, 380 nm/
Kit - Blue
Em: 430, 460 nm）
蛍光（Ex: 590 nm/
Lipid Droplet Assay
Em: 635, 670 nm
Kit - Deep Red
Ex: 620 nm/
Em: 670 nm）
抗酸化測定キットSOD Assay Kit
吸光- WST（450 nm）
GSSG/GSH
吸光
Quantification Kit （405, 415 nm）
鉄（Fe2＋）検出キット
蛍光FerroOrange（Ex: 543 nm/
Em: 580 nm）

容量

希望納入
価格

メーカー
コード

1 set

￥23,000

MT09

5 nmol￥36,000

D676

20 tests￥11,000

100 tests￥32,000

1 set￥25,000

LD05

1 set

￥25,000

LD06

100 tests
500 tests￥8,800￥22,900

S311

200 tests￥54,800

G257

1 tube￥14,000

3 tubes￥32,000

SG05

F374

13

No.173(2020)

ホームページアドレス
URL：https://www.dojindo.co.jp/
E-mail：info@dojindo.co.jp

No.17314

フリーファックス
フリーダイヤル
ドージンニュース No.173

0120-021557
0120-489548

9：00 ～ 17：00（ 受付時間：平日）
土・日・祝日は除く

令和 2 年 6 月 19 日発行

株式会社同仁化学研究所 DOJINDO LABORATORIES
熊本県上益城郡益城町田原 2025-5 〒 861-2202
発行責任者 松野寛明 編集責任者 金子詩織 年４回発行 許可なくコピーを禁ず