プロトコル
細 胞
増殖 / 毒性酸化
ストレス分 子生物学
細 胞 内蛍光プローブ
細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用
試
薬
膜タンパク質可 溶 化 剤ラベル化 剤
二価性
試 薬
イオン
電 極

DNA の塩基損傷部位の数を測定したい
使用製品

解析装置

-Nucleostain- DNA Damage Quantiﬁcation Kit-AP Site Counting-[DK02]I はじめに-Nucleostain- DNA Damage Quantiﬁcation Kit -AP Site Counting-

生 物 の 遺 伝 情 報 を 保 持 し て い る DNA は、 複 製 時 の DNA
polymerase のエラーに加えて、環境中の放射線や紫外線、またはアルキル化剤等の化学物質、生体内における活性酸素等の代謝産物により損傷を受ける。これらのエラーや損傷が正しく修復されなければ突然変異を誘発し、これが癌や老化の原因となる。
DNA 損傷部位には修復機構が働き、その一つとして塩基除去修復がある。この時 AP site (apurinic / apyrimidinic site) と呼ばれる塩基除去部位が出現する。つまり AP site の検出はDNA 損傷部位を測定し得る有効な方法となる。

(Code: DK02) は、AP site と 特 異 的 に 結 合 す る ARP ( N 'Aminooxy methylcarbonylhydrazino-D-biotin) を用いて DNA をビオチン化し、96 穴マイクロプレートに固相化して試料 DNA中の AP site を簡便に定量できるキットである。
本キットには、AP site 数が既定された標準 DNA が含まれており、既存のビオチン検出法を用いることによって AP site の定量ができる。本プロトコールではこのキットを用いた DNA中の塩基損傷部位定量方法を紹介する。

OO-OObaseOOOOO-O P OOHOHOOその他

NHHNSOP O-OHNbaseOObase-OO

OO

base

NH2-O

O

O
P OOHOO

P O

O

機能性有機材料NHOARPHOP OOOO-Obase

HOOOO

N

P ObaseO

O

HN
NHH
NNH
SO

O

AP siteBiotin-tagged abasic site

図1

AP site と ARP との反応

II キット内容

III DNA の精製[20 samples 用 ]本キットによる DNA の AP site 数検出は、混在する RNAおよびタンパクにより測定誤差を生じる可能性があるので、RNase A 処理後、フェノール / クロロホルムもしくは市販のDNA 精製キット等により精製した DNA を使用することを推奨する。フェノール / クロロホルムによる精製方法は一般的な方法であり、多くの成書があるので詳細はそれを参考にされたい。
また近年、数多くの DNA 精製キットが市販されるようになり、簡便に DNA を単離精製することが可能となった。小社でも各種 DNA 精製キットを販売している。(Code: GK03)
DNA の純度は吸光度比 (A260/A280) により検定できる。
A260/A280 ≧ 1.8 の DNA を使用することを推奨する。

ARP-DNA standard solution
各 250 μl×1
(0, 2.5, 5.0, 10, 20, 40 AP sites / 100,000 bp)
ARP solution
250 μl×1
DNA binding solution
10 ml×1
Washing buffer
×1
HRP-streptavidin
25 μl×1
TE buffer
Substrate solution
Filtration tube
96-well Microplate/U bottom※ キット以外に必要なもの
・10 μl、200 μl マイクロピペッター
・8 連マイクロピペッター (50 〜 200 μl)
・低温恒温槽 (37℃ )・マイクロプレートリーダー・0.5 ml、1.5 ml 遠心チューブ・遠心機

4540 ml×1
10 ml×120 tubes×1IV 操作方法
1. 試料 DNA の ARP 標識(1) 試薬・TE buffer (500 ml)：純水 500 ml 弱に Tris を 606 mg (10 mmol/l)、3NA(EDTA・3Na)(Code：N002) を 206 mg (1 mmol/l) 溶解し、6 mol/l の塩酸で pH を 7.5 とした後、液量を 500 ml に調製する。オートクレーブ滅菌して使用する。添付の TE buffer
は ARP 標識 DNA の調製に使用する。試料 DNA の調製・精製に別途 TE buffer が必要である。

技術的な内容に関するお問い合わせ先：カスタマーサポート Free Fax:0120-021557 Free Dial:0120-489548
在庫や価格(記載容量以外もしくは request)に関するお問い合わせ：マーケティング部 Tel:096-286-1515 Fax:096-286-1525(株)同仁化学研究所

プロトコル

400 μl の反応溶液
TE buffer 380 μl
加える

試料 DNA 溶液 :10 μl
ARP solution:10 μl
37℃、1 時間インキュベーション

遠心遠心2,500 x g、15分2,500 x g、15分

TE buffer 200 μl 加え、フィルター上に付着した DNA を溶解させた後、1.5 mlチューブに移す。
この操作を 2 回繰り返す。

ろ液を捨て、400 μl のTE buffer を加える

メンブランを TE buffer 100 μl で2 回洗浄する

ARP-DNA の調製法

(2) 操作
1) 精製した試料 DNA を TE buffer に溶解し、溶液の吸光度 (260nm) を測定する。吸光度から濃度を算出して (DNA 濃度は50 μg/ml の時の吸光度を 1.0 として算出 )、100 μg/ml の濃度になるように TE buffer で希釈調製する。
2) 試料 DNA 溶液 10 μl に ARP solution 10 μl を 0.5 ml チューブ中で混合する。
3) 37℃で 1 時間反応させる。
4) 380 μl の TE-buffer を添加後、溶液を Filtration tube に入れる ( 図 2 を参照 )。※ 15) 遠心分離 (2,500 x g、15 分間 ) 後、ろ液を捨てる。※ 26) 400 μl の TE buffer を Filtration tube に加え、フィルター上に付着した DNA をピペッティングにより溶解させる。
7) 遠心分離 (2,500 x g、15 分間 ) 後、ろ液を捨てる。※ 28) 200 μl の TE buffer を Filtration tube に加え、フィルター上に付着した DNA をピペッティングにより溶解させる。溶解さ

1) DNA 溶液 10 μl に ARP solution 10 μl を 0.5 ml を加え、37℃で１時間インキュベージョンする。

せた DNA 溶液を 1.5 ml チューブに移す。更に 200 μl の TE
buffer を Filtration tube に加え、この操作をもう一度繰り返す。
9) DNA 溶液を 1.5 ml チューブに移し、0 ～ 5℃で保存する。※ 3※ 1 Filtration tube の替わりにエタノール沈殿による精製も可能である。
※ 2 溶液がメンブラン上に残っている場合は、更に 2,500 x g 、5 分間遠心分離する。
※ 3 Filtration tube を使用した場合、DNA の回収率は 90% である。よって溶液中の ARP 標識 DNA 濃度は 2.25 μg/ml となる。

1234

A

0 ARP DNA Std.

B

2.5 ARP DNA Std.

C567891011Sample 5Sample 13Sample 6Sample 145 ARP DNA Std.

Sample 7Sample 15

D10 ARP DNA Std.

Sample 8

Sample 16

E20 ARP DNA Std.

Sample 9

Sample 17

F40 ARP DNA Std.

Sample 10

Sample 18

Sample 3

Sample 11

Sample 19

Sample 4

Sample 12

Sample 20

GH

Sample 1・酢酸ナトリウム溶液：3 mol/l 酢酸ナトリウム水溶液を酢酸でpH 5.2 に調整する。
・RNase 溶液：市販の RNase A を滅菌水で希釈し、10 mg/mlに調整する。
・75% エタノール

Sample 2

図212プレート配置例

2) TE-buffer を添加後、溶液をFiltration tube に入れ、遠心分離する。これを繰り返し行い、ARP 標識 DNA を精製する。

3) ARP-DNA standard solution お
よび ARP 標識 DNA 溶液を各ウェルに入れ、DNA binding
solution を添加して室温で一夜静置する。

4) 溶液を除去し、Washing bufferをウェルに加え除く洗浄操作を 5 回繰り返す。

5) 希釈 HRP-streptavidin 150 μl 6) 溶液を除去し、Washing bufferをウェルに加え除く洗浄操作を各ウェルに添加し、37℃、を 5 回繰り返す。
1 時間インキュベートする。

7) Substrate solution 100 μl を各ウェルに添加し、37℃、1 時間インキュベートする。

8) マイクロプレートリーダーにより吸光度を測定する。

図4

AP site 検出操作

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その他
機能性有機材料

Blank

図3

細 胞増殖 / 毒性酸化ストレス分 子生物学
細 胞 内蛍光プローブ細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用試薬
膜タンパク質可 溶 化 剤ラベル化 剤
二価性試 薬イオン電 極46

プロトコル

その他
機能性
有機材料

2. AP site 数の検出
(1) 試薬・洗浄用 PBST：Washing buffer 粉末をイオン交換水 1 L に溶解する。
・希釈 HRP-streptavidin：HRP-streptavidin を洗浄用 PBST で4,000 倍希釈する ( 用時調製 )。
(2) 操作
1) ARP 標識 DNA 90 μl に TE buffer 310 μl を加える。
2) 各 ARP-DNA standard solution を 1 ウェル当たり 60 μl ずつ3 ウェルに添加する ( 図 3 参照 )。
3) ARP 標識 DNA を 1 ウェル当たり 60 μl ずつ 3 ウェルに添加する。
4) DNA binding solution 100 μl を DNA の入ったウェルに添加し、数回 ピペッティングにより攪拌後、室温にて一夜静置※1する。
5) ウェル中の溶液を吸引等により除去し、洗浄用 PBST でウェ※2ルを 5 回洗浄する。
6) 希釈 HRP-streptavidin 150 μl を各ウェルに添加し、37℃、1時間インキュベーションする。
7) ウェル中の溶液を吸引等により除去し、洗浄用 PBST でウェ※2ルを 5 回洗浄する。
8) Substrate solution 100 μl を各ウェルに添加し、37℃、1 時間インキュ ベートする。
9) マイクロプレートリーダーにより吸光度を測定する。630～ 670 nm の波長フィルターが使用可能である。
10) DNA 中の AP site 数を検量線から算出する ( 図 5)。

V 注意事項1) キットは 0 ～ 5℃で保存し、凍結させないで下さい。
2) AP-DNA は一般に不安定ですので、測定対象 DNA を単離精製後は直ちに ARP 反応を行って下さい。
3) Filtration tube での遠心分離後は、直ちに TE buffer を添加し DNA を溶解させて下さい。長時間 DNA をメンブラン上で放置しておくと、DNA のメンブランへの吸着が起こり回収率にバラツキを生じる可能性があります。
4)γ 線滅菌のチューブは DNA の吸着を生じる可能性があるので、チューブを使用の際は非滅菌チューブを必要に応じてオートクレーブ滅菌して使用することを推奨します。
5) 630 ～ 670 nm のフィルターを持ち合わせていない場合は、発色反応後、各ウェルより 50 μl 抜き取り新しいプレートに移します。同量の 1 mol/l 硫酸を添加後、450 nm の吸光度で測定することができる。硫酸添加後、速やかに測定する。
6) ウェル洗浄後、残存する洗浄液により測定誤差を生じることがあるので完全に除いて下さい。

参考文献
1) A. Sancar and G. B. Sancar, Annu. Rev. Biochem. , 1988, 57 , 29.
2) T. Lindahl and B. Nyberg, Biochemistry, 1972, 11 , 3610.
3) M. Liuzzi and M. Talpaert-Borle, J. Biol. Chem. , 1985, 260 , 5252.
4) M. Weinfeld, M. Liuzzi, and M. C. Paterson, Biochemistry, 1990, 29 ,1737.
5) B. X. Chen, K. Kubo, H. Ide, B. F. Erlanger, S. S. Wallace, and Y. W.
Kow, Mutat. Res. , 1992, 273 , 253.

※ 1 あらかじめチューブ中で標準 ARP-DNA および ARP 標識 DNA とDNA Binding Solution を 3：5 の体積比で混合調製し、その溶液をウェ
ルに各々 160 μl 添加しても良い。
※ 2 洗浄後はペーパータオルなどの上でプレートを叩いてウェル中の洗浄用 PBST を完全に除く。

1.00.8Absorbance at 650 nm

細 胞
増殖 / 毒性
酸化ストレス分 子生物学
細 胞 内蛍光プローブ細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用
試薬
膜タンパク質可 溶 化 剤ラベル化 剤
二価性
試 薬
イオン
電 極

0.60.40.2

0102030
Number of AP sites/100,000 bp
図 5 ARP-DNA standard solution を用いて作成した
検量線の例

47040

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