プロトコル

サルフェン硫黄を系の中に加えたい
使用製品

解析装置

-SulfoBiotics- Sodium disulfide (Na2S2)[SB02][SB03][SB04][SB13][SB10]-SulfoBiotics- Sodium trisulfide (Na2S3)-SulfoBiotics- Sodium tetrasulfide (Na2S4)-SulfoBiotics- Sodium Polysulfide Set-SulfoBiotics- SSP4

I はじめに一般的な還元物質であるシステインやグルタチオンよりも還近年、硫黄原子が連結したパースルフィドやポリスルフィ 元能が非常に高いため、抗酸化物質として機能している可能
ドのようなサルフェン硫黄（Sulfane Sulfur；硫黄原子にの性も示唆されている。
み共有結合した硫黄の総称）を含む分子種が生体内に多く存
Sodium polysulfide (Na2S n) は、サルフェン硫黄を含む
1)在していることが明らかにされている 。このような分子種 分子として最も単純な構造を有するサルフェン硫黄ドナー
は、硫化水素の産生や貯蔵、放出だけでなく、S- スルフヒ であり、水溶液中では各 pKa に応じて Hydrogen polysulfide
ドリル化などのタンパク質内チオールをターゲットとしたシ (anion) として存在する。本試薬類は、パースルフィドやポグナル伝達にも関与していることが示唆されており、非常にリスルフィドのようなサルフェン硫黄 (Sulfane Sulfur) を含2-3)注目されている 。また、パースルフィドやポリスルフィドは、 む分子種の生体内機能の解明や解析に有用である。

Na+ ‑‑

S ‑ S Na+Na+ ‑S

S

S‑Na+

Sodium disulfide (Na2S2) Sodium trisulfide (Na2S3)
pKa1 = 5
pKa2 = 9.7

pKa1 = 4.2
pKa2 = 7.5

図1Na+ ‑SSS

S ‑ Na+Sodium tetrasulfide (Na2S4)
pKa1 = 3.8
pKa2 = 6.3※ pKa 値は参考文献 4) を参照

Sodium polysulfide の構造

II 使用方法

5) 20 μmol/l SSP4 Working Solution 100 μl をウェルに添加
1) Na2Sn を秤量し、超純水（窒素バブリング処理済）を添加し、し、CO2 インキュベーター（37℃）内で 15 分間静置した。
100 mmol/l Na2Sn 水溶液を調製する。
※ 20 μmol/l SSP4 Working Solution の調製法は、（例：100 mmol/l Na2Sn 水溶液；Na2S2 11 mg/ml,「サルフェン硫黄を蛍光検出したい」の項を参照。
Na2S3 14.2 mg/ml, Na2S4 17.4 mg/ml ）6) 上清を除去した後、PBS で細胞を 2 回洗浄した。
2) この溶液を実験に応じて超純水（窒素バブリング処理済） 7) PBS 100 μl をウェルに添加した後、蛍光顕微鏡を用いて細で希釈し、ご使用ください。
胞を観察した。
＜実験例＞
Sodium trisulfide (Na2S3) 添加による細胞内サルフェン硫黄量変化41) 96-well black clear bottom plate に CHO 細胞 を 1.0×10
cells/well (DMEM) となるように播種し、CO2 インキュベー
ター（37℃）内で一晩培養した。
2) 上清を除去した後、無血清培地（DMEM）で細胞を 2 回洗浄した。
3) 100 μmol/l Sodium trisulfide (Na2S3) を含む無血清培地（DMEM）100 μl を各ウェルに添加し、CO2 インキュベー
ター（37℃）内で 15 分間静置した。
4) 上清を除去した後、無血清培地（DMEM）で細胞を 2 回洗浄した。

未処理100 μmol/l Na2S3 処理（露光時間 1000 msec）

図 2 Sodium trisulfide (Na2S3) 添加による細胞内サルフェン硫黄の増加（SSP4 を用いた細胞内イメージング）

III 注意事項※ 使用する超純水は使用前に 30 分間以上、窒素バブリングを行ってください。溶存酸素によって酸化される可能性があります。
※ 調製した Na2Sn 水溶液は、保存できません。溶液調製後、すぐにご使用ください。

参考文献
1) T. Ida, T. Sawa, H. Ihara, Y. Tsuchiya, Y. Watanabe, Y.
Kumagai, M. Suematsu, H. Motohashi, S. Fujii, T, Matsunaga, M. Yamamoto, K. Ono, N. O. Devarie-Baez, M. Xian,J. M Fukuto and T. Akaike, “Reactive cysteine persulfidesand S-polythiolation regulate oxidative stress and redoxsignaling”, Proc Natl Acad Sci U S A., 2014, 111, 7606.
2) Y. Kimura, Y. Mikami, K. Osumi, M. Tsugane, J. Oka and H.
Kimura, “Polysulfides are possible H2S-derived signaling
molecules in rat brain”, FASEB J., 2013, 27, 2451.
3) S. Koike, Y. Ogasawara, N. Shibuya, H. Kimura and K. Ishii,“Polysulfide exerts a protective effect against cytotoxicity
caused by t-butylhydroperoxide through Nrf2 signalingin neuroblastoma cells”, FEBS Lett., 2013, 587, 35484) J. Gun, A. D. Modestov, A. Kamyshny Jr., D. Ryzkov, V.
Gitis, A. Goifman, O. Lev Email author , V. Hultsch, T.
Grischek, E. Worch, “Electrospray Ionization Mass Spectrometric Analysis of Aqueous Polysulfide Solutions”, Microchim. Acta, 2004, 146, 229.

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