プロトコル

抗体に標識したい(架橋剤)
利用製品
GMBS
EMCS
HMCS
KMUS

[G005][E018][H257][K214]

Sulfo-GMBS
Sulfo-EMCS
Sulfo-HMCS
Sulfo-KMUS[S025][S024][S026][S250]I はじめにIII Heterobifunctional Reagent

生体サンプル中の特定の物質 ( ホルモン、基質、抗体、タンパク質、ペプチド等 ) を検出および定量するバイオアッセイは、臨床分析をはじめ、組織学、分子生物学、免疫学等の分野で欠くことのできない分析法である。なかでも、目的の分子の認識に抗原 - 抗体反応を利用したイムノアッセイは、高感度で特異性の高い方法として、バイオアッセイの中心的な位置を占めている。
イムノアッセイには、様々な手法が開発されているが、なかでも ELISA、イムノブロッティング、免疫組織化学法が最もよく用いられる。これらの方法は、いずれも固相に保持された、あるいは捕捉された標的物質を、何らかのリポーター分子で標識した抗体で検出するステップを含む。従って、これらの方法の成否は、どのような標識抗体を用いるかに大きく依存している。リポーター分子としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質などが用いられ、これを用いた手法をそれぞれ、ラジオイム
ノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイと呼ぶ。このうち、ラジオイムノアッセイは、最も早くから開発された手法であり、高感度を特徴とするが、放射性同位元素を利用するため、危険性が高い。また、標識抗体の保存安定性の低さや、廃棄などの取扱が容易ではないなどの欠点がある。
抗体に直接蛍光分子を標識して検出に用いる蛍光イムノアッ
セイは、感度的には他の 2 者に劣るが、分解能が非常に高いため、組織学や分子生物学の分野で用いられる。
一方、酵素標識抗体を用い、酵素反応により色素、発光、蛍光シグナルを発生させて目的物質を検出、定量するエンザイム
イムノアッセイは、標識抗体の安定性も高く、感度もラジオイムノアッセイに匹敵し、危険性が低いことから、広く用いられている。ここでは、エンザイムイムノアッセイで中心的な役割を演じる抗体 - 酵素ラベル法を中心に、抗体への標識法について述べる。

前述のヒンジ法では、架橋剤が中心的役割を演じるため、その選択が非常に重要である。SH 基を利用する方法としてマレイミド法と、ピリジルジスルフィド法に大別できる。マレイミド法は SH 基選択的な反応基としてマレイミドを有する架橋剤を用いる方法で、温和な条件で選択的な架橋ができ、生成する結合の安定度も高い優れた架橋法である。
マレイミドヒンジ法では、マレイミドとアミン反応性基を有する架橋剤 (Heterobifunctional Reagent) を用いる。
この方法は、まず標識したいタンパク質 ( 酵素など ) と、この種の架橋剤を反応させ、タンパク質にマレイミド末端を導入する。その後、還元型抗体や Fab' フラグメントと反応して標識抗体を得る。
アミン反応性基としては一般に N - ヒドロキシスクシンイミド
活性化エステル (NHS エステル ) が用いられる。NHS エステルは、アミンと中性以上の pH で効率よく反応し、非常に安定なアミド結合を形成するため、アミン反応性基として適してい1)る 。タンパク質上のα - アミノ基とリジン側鎖のε - アミノ基が利用できる。特にε - アミノ基が、NHS エステルのターゲットとなる。ただし、このアミノ基は、中性ではプロトン化しているため、反応は pH8 前後で行う方が効率がよい。これ以上の pH では、NHS エステル自身の加水分解を生じ効率が低くなる。この場合、Tris やグリシンは NHS エステル反応化合物であるので、バッファーとして使用できない。NHS エステル型試薬は、一般的に DMSO やエタノール等の水に混和可能な溶媒に溶かし、タンパク質のバッファー溶液に最終体積の 0.5～ 10% 添加する。有機溶媒の使用が許されない場合は、水溶性型のスルホ NHS エステルを使用する。
SH 基と反応するマレイミド基は、抗体標識に適した次に示す利点を有する。
○反応条件が温和で、反応収率も高い。
○反応が SH 基選択的で、中性ではアミンに比べ、SH 基とは約 1,000 倍速く反応する。
○架橋が安定。中性下、4℃ではこの方法で作製した標識抗体の架橋は数年安定。
ただし、マレイミドは加水分解され易いため、反応時の pHは必ず中性付近で行い、pH を上げることは極力避ける。SH基との反応は pH6 ～ 7 で、充分進行する。加水分解は、SH 基と反応した後でも起こる。また、高 pH では、加水分解の他、アミンとの反応速度が上昇し、SH 基との反応を妨害する。マ
レイミドは、比較的酸化され易いので、これが問題となる場合
2)
は、系に EDTA を加えておけば安定化できる 。
分子内に活性エステル基とマレイミドをもつ heterobifunct3)
ional reagent として、まず、MBS が開発され、次いで、その改良型として、HMCS(Code: H257)、KMUS(Code: K214)、GMBS(Code: G005)、HMCS(Code: H257)、KMUS(Code:K214) が開発された。また、小社ではこれらの水溶性アナログである Sulfo-EMCS(Code: S024)、Sulfo-GMBS(Code: S025)、Sulfo-HMCS(Code: S026)、Sulfo-KMUS(Code: S250) も商品5)化している 。これらは、水溶性が向上しており、有機溶媒の使用が困難なときに有用である。
（表 1）

II 抗体へのラベル化法
タンパク質の架橋法として、原理的には 2 つのタンパク質の SH 基あるいはアミノ基のいずれかを利用することが可能である。しかし、抗体標識の場合、アミノ基を利用すると、抗原認識部分への修飾が起こり、特異性が低下すると共に、非特異的吸着も増加することがある。よってこのような特異性の低下を防ぐためには、SH 基を修飾基として利用した方がよい。抗体は、分子内にジスルフィド結合を有し、これを還元すればSH 基が得られるので、この SH 基を利用する事ができる。特に、ヒンジ部のジスルフィドを開裂させた SH 基は、抗原認識部分とは無関係であるため、SH 基を修飾しても抗体の特異性が損なわれない利点がある。この様なヒンジ部由来の SH 基を有する Fab' などを用いた架橋法をヒンジ法という。この方法は最も実用的な抗体修飾法である。Fab' の調製法は V で説明する。
これに対し、抗体のアミノ基を利用する架橋法は、ノンヒンジ法と呼ばれるが、抗体活性が損なわれることがあるため、Fab' が得られない場合に用いられることが多い。

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細 胞
増殖 / 毒性酸
化
ストレス
分 子
生物学
細 胞 内
蛍光プローブ細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用
試
薬
膜タンパク質可 溶 化 剤
ラベル
化 剤
二価性
試 薬イオン
電 極
その他
機能性有機材料

プロトコル
細 胞
増殖 / 毒性酸化ストレス分 子
生物学
細 胞 内
蛍光プローブ細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用
試
薬
膜タンパク質可 溶 化 剤
ラベル
化 剤
二価性
試 薬
イオン
電 極
その他
機能性
有機材料

表1
品コード

品名

G005

使用製品および関連製品の構造式

構造式

品コード

品名

GMBS

S025

Sulfo-GMBS

E018

EMCS

S024

Sulfo-EMCS

H257

HMCS

S026

Sulfo-HMCS

K214

KMUS

S250

Sulfo-KMUS

IV 酵素標識V Fab' の調製法

抗体に酵素を標識して検出系に用いると、高感度な手法が構築できる。この場合、用いられる酵素としては、ペルオキシダー
ゼ、アルカリホスファターゼ、β - ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等が知られている。どの酵素を用いたらよいかは、用いるサンプルとプロトコールに依存している。例えば、ペルオキシダーゼは、一般的な検出用酵素で、ELISA やイムノブロッティングなど、多くの手法に用いられ、特に免疫組織化学的手法に適している。アルカリホスファターゼは、非常に高感度で、定量性がよい測定を構築することができる。特に、イムノブロッティングに適している。 β - ガラクトシダーゼは、内在性の酵素活性が非常に低いのが特徴で、イムノアッセイ全般に使用できる。グルコースオキシダーゼは、微生物由来の酵素であり、ほ乳類サンプルに内在性酵素活性がないのが特徴で、免疫組織化学的手法などに用いられる。しかし、有用な検出用基質のバリエーションが少ないという欠点がある。以下、抗体標識時に必要な Fab' の調製法の紹介をした後、抗体への標識法について述べる。

1. F(ab')2 の調製O

O
O

NO

O

O

O
N

O

O

GMBSO
O
OO

N

N

O

SO3Na

O

O

Sulfo-EMCS

heterobifunctional reagents

SSHHNNO

135

OO

EnzymeEMCS による Fab' の酵素標識体

NOSO3Na6)(1) 試薬 ( 緩衝液については本稿末尾を参照 )・lgG・ブタ胃ペプシン・緩衝液 A、緩衝液 B・Sephacryl S-200HR(GE ヘルスケア社製 )(2) 操作1) lgG 5 mg/0.5 ml を緩衝液 A で透析する。
2) 透析液にブタ胃ペプシン 0.1 ～ 0.2 mg を溶解し、37℃で 15～ 20 時間インキュベートする。
3) pH7 に調整して、Sephacryl S-200HR で、緩衝液 B を用いて 0.35ml/min でゲル濾過する。
4) F(ab')2 分画をとり、濃縮する。280 nm での吸光度を測定し、100 mg/ml のナトリウムアジドを 1％添加して保存する。
-1-15) MW=92,000、E280 nm=1.48 g ・L・cm を用いて濃度を決定する。
蛋白濃度 (mg/ml)=A280 nm/(1.48×MW)×MW=A280 nm/1.48 またはモル濃度 (mol/l)= A280 nm/(1.48×MW) で求める。
※ IgG のペプシンによる消化時間は、動物種によリ異なる。
例えば、ウサギ IgG では 6 時間だが、ヤギでは 1 ～ 2 日、ラット・マウスの lgG 2b では、F(ab')2 とはならない。

2. Fab' の調製
OO

図2OO

Sulfo-GMBS

図1ON

EMCS

ONO

N

構造式6, 8)(1) 試薬 ( 緩衝液については本稿末尾を参照 )・F(ab')2・緩衝液 C、緩衝液 D・0.1 mol/l 2-メルカプトエチルアミン溶液(11.36 mg の 2-メルカプトエチルアミン塩酸塩を緩衝液 D 1ml に溶解する。)(2) 操作
1) 0.1 ～ 3 mg の F(ab')2 を含む緩衝液 C 0.45 ml に、2-メルカプト
エチルアミン溶液 50 μl を添加する。
2) 37℃で 90 分間インキュベートする。
3) Ultrogel AcA44 カラムで、緩衝液 D を用いて 0.35 ml/min でゲル濾過する。
4) Fab' 分画をとり 280 nm の吸光度を測定し、MW=46,000、-1-1
E280 nm=1.48 g ・L・cm を用いて濃度を決定する。さらに、後述の方法で、SH 基を定量する。

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プロトコル

3. SH 基の定量法

6, 8)(1) 試薬 ( 緩衝液については本稿末尾を参照 )・5 mmol/l 4-PDS 溶液 (4-PDS(Code: P017)1.1 mg/ 緩衝液 B1 ml)(2) 操作1) Fab'(3 ～ 14 μmol/l、A280 nm=0.1 ～ 1.0) の緩衝液 D 溶液 0.5ml に 4-PDS 溶液 20 μl を添加する。
2) 30℃で 10 分間インキュベートする。
3) 324 nm の吸光度を測定し、4-PDS より遊離した 4- チオピリドンを、そのモル吸光係数ε324 nm=19,800 を用い定量する。
※ Fab' の SH 基は、EDTA 存在下では、還元型 IgG の SH 基よりも格8)段に安定で取り扱い易い 。

VI 仔ウシ小腸由来アルカリホスファターゼ Fab'
1)ヘの標識
1. 仔ウシ小腸由来アルカリホスファターゼへのマレイミドの導入(1) 試薬 ( 緩衝液については本稿末尾を参照 )・仔ウシ小腸由来アルカリホスファターゼ
・緩衝液 E、緩衝液 F・EMCS(Code: E018)
・Sephadex G-25(GE ヘルスケア社製 )(2) 操作
1) アルカリホスファターゼ (2 mg)/ 緩衝液 E 0.5 ml を同じ緩衝液 E を用い透析する。
2) 透析液に EMCS(0.17 mg)/DMF 10 μl を添加して、30℃で 30分間インキュベーションする。
3) Sephadex G-25 カラム (1×45 cm) で、緩衝液 F によりゲル濾過し、濃縮する。
4) マレイミド量 (VI-3) とアルカリホスファターゼ活性 (VI-4)を測定する。

2. マレイド導入アルカリホスファターゼの Fab' への標識
(1) 試薬 ( 緩衝液については本稿末尾を参照 )・マレイミド導入アルカリホスファターゼ Fab'・緩衝液 D, 緩衝液 G, 緩衝液 F

・10 mmol/l 2-メルカプトエチルアミン ( 緩衝液 D 溶液 )・ナトリウムアジド(2) 操作
1) マレイミド導入アルカリホスファターゼ 1 mg(10 nmol) を緩衝液 F 0.25 ml に溶解し、Fab' 2.3 mg (50 nmol)/ 緩衝液 D溶液 0.25 ml を混合する。
2) 4℃で 20 時間インキュベートする。
3) 10 mmol/l 2- メルカプトエチルアミン溶液 10 μl を添加し、Ultrogel AcA44 カラムでゲル濾過する。溶離液には緩衝液
G を用い、0.35 ml/min で流す。
4) アルカリホスファターゼ活性 (VI-4) を測定し、100 mg/mlBSA と 100 mg/ml のナトリウムアジドをそれぞれ 1％添加し保存する。

3. マレイミドの定量法

6)

EMCS や GMBS によりアルカリホスファターゼに導入されたマレイミドの導入数は、以下の方法で算出する。
(1) 試薬 ( 緩衝液については本稿末尾を参照 )・マレイミド導入アルカリホスファターゼ
・緩衝液 C・0.5 mmol/l 2-メルカプトエチルアミン溶液(V-2 で調製した 0.1 mol/l の 2-メルカプトエチルアミン塩酸塩溶液 10 μl と 50 mmol/l EDTA (pH6.0) 2 ml を混合し調製する。50 mmol/l EDTA 溶液 100 ml 調製時には小社
2NA(Code: N001) 1.86 g を溶解し 1 mol/l NaOH で pH6.0に調製する。)
・5 mmol/l 4-PDS 溶液 (4-PDS(Code: P017)1.1 mg/ 緩衝液
B 1 ml)(2) 操作
1) マレイミドを導入したアルカリホスファターゼ ( 約 10 μmol/l)/ 緩衝液 C 0.45 ml に、0.5 mmol/l 2- メルカプトエチルアミン溶液 50 μl を添加する。
2) 30℃で 20 分間インキュベートする。
3) 5 mmol/l の 4-PDS 溶液 20 μl を加える。
4) 30℃で 10 分インキュベートする。
-1-1
5) 324 nm の吸光度より、ε=19,800 M ・cm を用いて計算する。

4. アルカリホスファターゼ活性の測定
比色法および蛍光法があるが、ここでは最も一般的な比色法と8)して、PNPP(4- ニトロフェニルリン酸 ) による方法を紹介する 。
(1) 試薬 ( 緩衝液については本稿末尾を参照 )・緩衝液 H・5.5 mmol/l PNPP/ 緩衝液 H
・1 mol/l NaOH
(2) 操作1) 酵素溶液を、緩衝液 H で希釈する。
2) 酵素希釈溶液 0.5 ml を 30 ～ 37℃で 5 分間インキュベーションする。
3) 5.5 mmol/l PNPP/ 緩衝液 H 0.5 ml を添加する。
4) 30 ～ 37℃で 10 ～ 100 分間インキュベーションする。
5) 1 mol/l NaOH 0.5 ml を加えて、反応を停止させ、405 nm の吸光度を測定する。
予め既知濃度のアルカリホスファターゼを用い同一法で活性を測定し、作製しておいた酵素濃度 - 吸光度の検量線から定量する。また、酵素量は、280 nm の吸光度より、 ε2-1=0.99 cm ・mg と MW=100,000 よリ計算する。
タンパク濃度 (mg/ml)=A280 nm / (0.99×MW)×MW=A280 nm /0.99 またはモル濃度 (mol/l)=A280 nm / (0.99×MW) で求める。

VII GMBS を用いた β - ガラクトシダーゼの IgM
9)モノクローナル抗体への標識(1) 試薬 ( 緩衝液については本稿末尾を参照 )・緩衝液 I 、緩衝液 L、緩衝液 J 、緩衝液 M、緩衝液 K、緩衝液 N
・ β - ガラクトシダーゼ
・GMBS(Code: G005)
・SephadexG-25(GE ヘルスケア社製 )・DEAE-TOYOPEARL( 東ソー社製 )(2) 操作1) lgM(1 mg、1.1 nmol)/ 緩衝液 I 1.0 ml に、GMBS(33 μg、117 nmol)/dioxane 50 μl を添加する。
2) 20℃で 40 分間インキュベーションする。
3) Sephadex G-25 カラム (1.4×16 cm) を用い、4℃、緩衝液 Jでゲル濾過する。280 nm の吸光度が 0.41(0.87 nmol のタンパク質に相当 ) を含むフラクション 2.5 ml を得る。
4) これに、 β - ガラクトシダーゼ (2.62 nmol)/ 緩衝液 K 1.0 mlを添加する。
5) 30℃で 30 分間インキュベートする。
6) 緩衝液 L 0.1 ml を添加する。
7) こ の 溶 液 500 μl を、 緩 衝 液 M で 平 衡 に 達 し た DEAETOYOPEAL カラム (1.2×15 cm) にアプライする。緩衝液 Nを用い、NaCl を 0.1 mol/l から 0.5 mol/l にグラディエント

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細 胞
増殖 / 毒性酸
化
ストレス
分 子
生物学
細 胞 内
蛍光プローブ細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用
試
薬
膜タンパク質可 溶 化 剤
ラベル
化 剤
二価性
試 薬
イオン
電 極
その他
機能性
有機材料

プロトコル
細 胞
増殖 / 毒性酸
化
ストレス
分 子
生物学
細 胞 内蛍光プローブ
細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用
試
薬
膜タンパク質可 溶 化 剤
ラベル化 剤
二価性
試 薬
イオン電 極その他
機能性有機材料をかけながら溶出する。
8) 280 nm の吸光度を測定し、緩衝液 L 0.1 ml の入ったチューブにとって酵素活性を測定する。

緩衝液一覧
本稿で用いた緩衝液の組成の一覧を下記に示す。
緩衝液 A：0.1 mol/l 酢酸ナトリウム緩衝液 (pH4.5、0.1 mol/l
NaCl を含む )緩衝液 B：0.1 mol/l リン酸ナトリウム緩衝液 (pH7.0)
緩衝液 C：0.1 mol/l リン酸ナトリウム緩衝液 (pH6.0)
緩衝液 D ：0.1 mol/l リン酸ナトリウム緩衝液 (pH6.0, 5 mmol/l
EDTA を含む )(EDTA-2Na 塩を緩衝液作製途中で終濃度が 5 mmol/l となるよう加え、希釈してリン酸濃度が 0.1 mol/l にする。すなわち 100 ml 調製時は小社 2NA(Code: N001) を 186 mg 用いる )緩衝液 E ：50 mmol/l ホ ウ 酸 ナ ト リ ウ ム 緩 衝 液 (pH7.6、1mmol/l MgCl2、0.1 mmol/l ZnCl2 を含む。)
緩衝液 F ：0.1 mol/l Tris-HCl 緩衝液 (pH7.0、1 mmol/l MgCl2、0.1mmol/l ZnCl2 を含む )緩衝液 G：10 mmol/l Tris-HCl 緩衝液 (pH6.8、0.1 mol/l NaCl、1 mmol/l MgCl2、0.1 mmol/l ZnCl2 を含む )緩衝液 H：0.1 mol/l グリシン -NaOH 緩衝液 (pH10.3、1 mmol/l MgCl2、0.25 g/l 卵白アルブミンを含む )緩 衝 液 I ：0.1 mol/l リ ン 酸 ナ ト リ ウ ム 緩 衝 液 (pH7.0、50mmol/l NaCl を含む )緩衝液 J ：10 mmol/l リ ン 酸 ナ ト リ ウ ム 緩 衝 液 (pH6.3、10mmol/l MgCl2、50 mmol/l NaCl を含む )緩衝液 K：0.1 mol/l リ ン 酸 ナ ト リ ウ ム 緩 衝 液 (pH7.0、10mmol/lMgCl2、5 mmol/l EDTA を含む )緩衝液 L ：60 mmol/l リ ン 酸 ナ ト リ ウ ム 緩 衝 液 (pH7.4、10mmol/l EDTA、1 mmol/l MgCl2、0.1% BSA、0.1%ナトリウムアジドを含む )緩衝液 M：20 mmol/l Tris-HCl 緩衝液 (pH7.5、0.1 mol/l NaClを含む )緩衝液 N：20 mmol/l Tris-HCl 緩衝液 (pH7.5)

参考文献
1) P. Cuatrecasas, I. Parikh, Biochemistry , 1972,11(12), 2291.
2) S. Yoshitake, Y. Yamada, E. Ishikawa, R. Masseyeff, Eur. J. Biochem.,
1979, 101 , 395.
3) M. J. O'Sullivan, E. Gnemmi, D. Morris, G. Chieregatti, A. D.
Simmonds, M. Simmons, J. W. Bridges, V. Marks, Anal.Biochem. ,1979, 100 , 100.
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Ueno, J. Immunoassay , 1983, 4 , 209.
7) S. Yoshitake, Y. Hamaguchi, E. Ishikawa, Scand. J. Immunol. , 1979,10 , 81.
8) 石川榮治、河合忠、宮井潔、酵素免疫測定法第三版 (1987 医学書院 ).
9) K. Fujiwara, N. Matsumoto, S. Yagisawa, H. Tanimori, T. Kitagawa,
M. Horita, K. Hiratani, K. Fukushima, A. Tomonaga, K. Hara, K.
Yamamoto, J. Immunol. Methods , 1988, 112 , 77.

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タンパク質架橋 同仁137

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