販売中止のお知らせ
お客様各位

いつも小社製品をご愛顧頂きありがとうございます。
2020 年 2 月 1 日より下記製品は販売中止となりますため、本冊子に記載の製品に関してご注意頂きますようよろしくお願い申し上げます。
販売中止品目
製品コード

製品名

容量

B036

Br-DMEQ

10

mg

B301

Biotin-(AC5)2-hydrazide

10

mg

B302

Biotin-AC5-hydrazide

10

mg

B303

Biotin-hydrazide

10

mg

D034

DDB

50

mg

D049

DMEQ-COCl

10

mg

LK16

HiLyte Fluor 750 Labeling Kit-NH2

3

samples

LK31

ICG Labeling Kit - NH2

1sample

LK32

Ab-10 Rapid Fluorescein Labeling Kit

1sample

LK33

Ab-10 Rapid Peroxidase Labeling Kit

1sample

LK34

Ab-10 Rapid R-Phycoerythrin Labeling Kit

1sample

LK35

Ab-10 Rapid HiLyte FluorTM 555 Labeling Kit

1sample

LK36

Ab-10 Rapid HiLyte FluorTM 647 Labeling Kit

1sample

LK37

Ab-10 Rapid Biotin Labeling Kit

1sampleM029

Aminobenzyl-EDTA

25

mg

N018

NAM

10

mg

ご不明点等がございましたら、小社カスタマーサポートまでお問い合わせ下さい。フリーダイヤル 0120-489548

タンパク質架橋剤、ラベル化剤

タンパク質架橋剤、ラベル化剤
http://www.dojindo.co.jp

http://www.dojindo.co.jp

目
1. ビオチンラベル化剤
Biotin-SS-Sulfo-OSu
Biotin-HPDP
Biotin-OSu
Biotin-AC5-OSu
Biotin-(AC5)2-OSu
Biotin Sulfo-OSu
Biotin-AC5 Sulfo-OSu...............................................5...............................................6...............................................7...............................................8次
3. タンパク質標識試薬............................................ 20
CFSE
IC3-OSu special packaging
IC5-OSu special packaging
FITC-I................... 21
Sulforhodamine 101 acid chloride
ICG-Sulfo-OSu............................................ 22
プロトコル

Biotin-(AC5)2 Sulfo-OSu
Biotin-PE-maleimide

Biotin-PEAC5-maleimide

Biotin-hydrazide
Biotin-AC5-hydrazide
Biotin-(AC5)2-hydrazide
ARP
プロトコル

...............................................9.............................................10

2. 二価性試薬

4. HPLC 用誘導体化試薬
NBD-F
ABD-F
NAM
SBD-F
DDB
MDB
Br-DMEQ

DMEQ-COCl

HMCS

5. 関連試薬

KMUS.............................................15
Sulfo-EMCS
Sulfo-GMBS
Sulfo-HMCS
Sulfo-KMUS
Sulfo-SMCC.............................................16
SPDP
Sulfo-AC5-SPDP＜ Homo-bifunctional Reagents ＞
BS3
DTSSP
.............................................17
DSP
Dithiobis(succinimidyl undecanoate)
Dithiobis(succinimidyl octanoate)
Dithiobis(succinimidyl hexanoate).............................................18
プロトコル............................................ 24

Br-Mmc＜ Hetero-bifunctional Reagents ＞.............................................14
EMCS
GMBS

............................................ 23............................................ 25
DTPA anhydride
BABE
FeBABE
AB-NTA free acid............................................ 26
Aminobenzyl-EDTA
Isothiocyanobenzyl-EDTA
Maleimido-C3-NTA
Isothiocyanobenzyl-NTA
Dithiobis(C2-NTA)

タンパク質架橋剤、ラベル化剤
Spacer length 一覧表
ビオチン試薬類品コード

品名

二価性試薬類Spacer length
品コード
(Å)

構造式
O
HN

B572 Biotin-SS-Sulfo-OSu

NH

S
O

H 16.6-17.6Å
S
N
S

O
O

16.6-17.6

O
N

O

品

名
O

HN

G005 GMBS

H
N

S

O

21.9-22.9Å

N
H

O

S

S

N

21.9-22.9

B304 Biotin-OSu

S

O

N

H257 HMCSNH
15.3-16.3Å H
NS

15.3-16.3

O

O

O

O

N

K214 KMUS

B306 Biotin-(AC5)2-OSu

H
N

S

O

24.5-25.5Å

O

N
H

O

O

O
N

24.5-25.5

B319 Biotin Sulfo-OSu

S025 Sulfo-GMBS

6.1-7.1Å

6.1-7.1

O

O
O

N

O

S

SO3Na

O

O

15.3-16.3Å H
N

NO

S026 Sulfo-HMCS

7.2-8.2
ON

9.8-10.8

O

SO3Na
O

O
O

O

O

O

O

12.4-13.4Å

N

HN

NH
H
N

S

24.5-25.5Å

O

O

N
H

O

O

O
HN

B300 Biotin-PE-maleimide

24.5-25.5

O
NO

S250 Sulfo-KMUS

O

O

SO3Na

16.5-17.5Å

NO

16.5-17.5

O

HCl

N

S330 Sulfo-SMCC

O

O

8.6-9.6Å

O

O

NH

O

H
N

S
O

N
25.3-26.3Å

HCl

N

O

N

25.3-26.3

S291 SPDP

8.7-9.7

S359 Sulfo-AC5-SPDP

17.9-18.9

B574 BS3

N

S

O

SO3Na

O

3.5-4.5Å O
S

8.6-9.6

NO

B299 Biotin-PEAC5-maleimide

O

O

O
HN

O

B303 Biotin-hydrazideNHHN

8.7-9.7Å

S

O

NH2

N

O

S

S

O

12.6-13.6Å

O

N
H

O

O
HN

B302 Biotin-AC5-hydrazideNHO

17.9-18.9Å H
N

S

N
H

O

NH2

O
N

O

B301 Biotin-(AC5)2-hydrazide

HN

NH
H
N

S

27.1-28.1Å

O

H
N

N
H

O

O

NH2

O

NaO3S

27.1-28.1

O

D630 DTSSP

N

O

HN
S

NH
13.9-14.9Å H
N
O

O
N
H

O

NH2

13.9-14.9

OD629 DSP

O

N

O

D539

D538

D537

1

Dithiobis(succinimidyl
hexanoate)
Dithiobis(succinimidyl
octanoate)
Dithiobis(succinimidyl
undecanoate)

O

O

N

O

O

O

O

O
N

O

29.7-30.7Å

O
O

S

O

S

S

O

8.7-9.7O

SO3Na

8.7-9.7

NO

O
O

8.7-9.7

N
O

O

O
N

O

O

O

O

N

O

O
S

12.6-13.6

SO3Na
N

O

8.7-9.7Å
SS

16.6-17.6Å
S
S

SO3Na

O

O

21.8-22.8Å

O

N

O

O

O
N

O

O

8.7-9.7Å
S
SO

A305 ARP(Aldehyde Reactive Probe)

O

O

O
O

NaO3S

8.7-9.7Å

O

3.5-4.5

N

O

O

HN

16.4-17.4

N

O

SO3Na

N

N

N

S

SO3Na

O

O

16.4-17.4Å

ONH

12.4-13.4

NO

B321 Biotin-(AC5)2 Sulfo-OSu

16.4-17.4

SO3Na

O

O
O

15.3-16.3

NO

9.8-10.8Å

SO3Na

NH

O

N

S024 Sulfo-EMCS

O

B320 Biotin-AC5 Sulfo-OSu

O

O

O

O
O

NH

S

HN

7.2-8.2Å
N

O

O
HN

N

O
O

O

NH

O

O

N

O

12.4-13.4

NO

16.4-17.4Å

O
HN

O

O
O

O

9.8-10.8

O

O

O
HN

O

N

12.4-13.4Å

N

O

O

O

N

O

6.1-7.1OO

7.2-8.2

OO

NH
6.1-7.1Å

ON

9.8-10.8Å

E018 EMCS

O
HN

O

O

O

O

NH

B305 Biotin-AC5-OSu

7.2-8.2Å
N

SO3Na

O

B573 Biotin-HPDP

Spacer length
(Å)

構造式

O

O
O

N
O

16.6-17.6

21.8-22.8

29.7-30.7

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はじめに
概

要

標識したタンパク質は、抗原抗体反応などとの組み合わせにより、多くの分析に用いられる。原理的には様々な化合物をタンパク質に標識することができるが、抗体への標識に限ると、蛍光やビオチン、キレート、酵素等がよく用いられる。タンパク質に標識する場
合は、アミノ基（NH2）、スルフヒドリル基（SH）、カルボキシル基（COOH）、還元糖末端や過ヨウ素酸酸化により生じるアルデヒド基（CHO）等が標識部位として利用できる。
アミノ基に対しては、一般的に N - ヒドロキシスクシンイミドエステル（NHS）、SH 基に対してはマレイミド基、アルデヒド基に対してはヒドラジド（NHNH2）が用いられる。カルボキシル基は、NHS を用いて活性化して、アミノ基を持つ標識試薬と結合させることができるが、タンパク質にはアミノ基が数多く存在し自己カップリングするため、通常使用されることはない。アルデヒド基は、糖タンパク質の糖鎖を過ヨウ素酸で酸化することにより生じる。一級アミノ基と反応しシッフ塩基としたのち、還元して安定な結合を形成する。
それぞれの標識方法は、目的に応じて使い分けることになる。アミノ基への標識は、部位を特定できないため、場合によっては、タ
ンパク質の活性に大きく影響を与える場合があるが、標識方法が極めて単純なので抗体などのタンパク質標識に利用される。スルフヒ
ドリル基への導入は、システインを導入した組換タンパク質に用いられることが多く、部位を特定した標識になる。糖鎖を酸化し調製したアルデヒド基を用いる場合は、一級アミノ基を持つ化合物よりも安定な構造を形成するヒドラジド化合物あるいはアミノオキシ基の方が還元操作を必要としない分、有利である。以下に、タンパク質標識に一般的に用いられるアミノ基およびスルフヒドリル基への反応についてまとめた。

タンパク質のアミノ基への標識
アミノ基（NH2 基）へ結合できる反応基は、上記の NHS 以外に、イソチオシアノ基（ITC）、スルホン酸クロリド、カルボン酸クロリド、
エチレンオキシド、アルキルクロリド、アルデヒド基、カルボン酸無水物など、数多く知られている。しかしながら、タンパク質のアミノ基を介して目的とする標識化合物を共有結合的に付加させる場合には、水系での反応が必須で、反応溶液の pH が中性～弱アルカ
リ性領域にあること、氷冷下から 37℃ 程度の反応温度で短時間に反応が進むことなど、反応化合物を使用できる条件が限られており、NHS や ITC が用いられる場合が多い。
NHS や ITC は中性の条件で、遊離一級アミノ基と反応する。アルキルアミンは弱塩基性で遊離アミノ基となるため、反応時の pH は 8.5～ 9 が一般的である。タンパク質などの高分子への反応では、普通アミノ基が複数個あり pK a が低いアミノ基が存在するため、pH7程度の pH 領域でも反応できる。アミノ基との反応は、加水分解との競争反応でもあるので、加水分解を抑えるには、低い pH や低温での反応が望ましい。
標識試薬の水溶性が低い場合には、普通、ジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解して、反応バッファーに加え、均一溶液として反応させる。溶解しにくい化合物を付加すると、タンパク質が不溶化することもあり、付加する分子数を必要以上に上げないことが求められる。また、蛍光試薬を結合させる場合には、蛍光試薬同士が近接すると蛍光消光が起こり、分子あたりの蛍光量が大きく減少する
ため、導入量のコントロールが極めて重要である。

R N C SH
R N

R' NH2

+

H
N R'
S

図1

R

O

O

イソチオシアノ基と一級アミノ基の反応

O N

O

O

X
+

R' NH2RONH

X = H, SO3Na
図2

NHS 基と一級アミノ基の反応

2

R'

+

HO N
O

X

タンパク質架橋剤、ラベル化剤
タンパク質のスルフヒドリル基への標識
スルフヒドリル基（SH 基）は、通常、タンパク質中ではジスルフィド（S-S）となっており、SH 基として存在する場合には、金属イオンと結合した構造をとり反応の活性中心となっているなど、タンパク質機能に大きく影響する。このような SH 基は、標識部位としては使用できない。そのため、タンパク質の SH 基を標識部位として用いるには、ジスルフィド構造を還元し、SH 基として使うことになる。ジスルフィドの還元には、ジチオスレイトール（DTT）や、β - メルカプトエタノール（β -ME）などが使用される。タンパ
ク質中のジスルフィドを全て還元して SH とすると、タンパク質機能が失われてしまう可能性があるため、一部の SH 基を還元し標識部位として使用する。
SH 基への標識にはマレイミド基やブロモアセトアミド基などが一般的に用いられる。いずれも pH6 ～ 7.5 の中性条件で使用でき、加水分解も受けにくいため、タンパク質標識に広く用いられている。但し、タンパク質によっては還元で活性がなくなってしまうものもあり、どのタンパク質にでも使用できる標識方法ではないが、抗体の場合は、還元が特異性を出す部分に与える影響は比較的少ない
ため、よく使用されている。還元によって失活する危険性はモノクローナル抗体の方がポリクローナル抗体の場合よりも高いと考えられるが、モノクローナル抗体の場合も還元剤の量を加減することにより、還元による活性低下を防ぐことができるため、適当な還元剤によって抗体のジスルフィドを SH としマレイミド基やブロモアセトアミド基を使って目的化合物を導入することが一般的に行われている。抗体のヒンジ部位にあるジスルフィドが還元され SH となった部分に目的化合物が付加することが理想的であるが、それ以外の部位のジスルフィドも還元されるため、還元剤の使用量を必要以上に用いないことが重要である。
また、マレイミド基は中性の状態では安定であるが、pH7.5 を超えると加水分解によりマレイン酸構造となるため、あまり pH を上げすぎないようにする。SH 基を介して標識した抗体は、アミノ基を介して標識した抗体に比べ一般的に抗体の抗原認識活性が高い。
これは、抗体への結合が部位特異的であるためと考えられる。しかしながら、還元操作を加えることによって抗体の構造変化が起こり、非特異的吸着の度合いも高くなることが観察される場合もある。シグナル／ノイズ比（S/N 比）を向上させる目的としては、ブロッキ
ング剤やバッファーの検討も必要である。

O

O
+

R N

R' SH

R N

O

O
図3

H
R N

SR'

X

+

O

マレイミド基と SH 基の反応

H
R N

R' SH

SR'
O

X = I, Br
図4

ブロモ（ヨード）アセトアミド基と SH 基の反応

弊社では、その他、フルオレセインや Sulforhodamine 101、インドシアニン色素を標識するための試薬、HPLC 分析用のラベル化剤、種々のリンカーを持つビオチン標識試薬および二種類のタンパク質を架橋するための二価性試薬を取り揃えている。
また、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、蛍光タンパク質、蛍光色素およびビオチンをタンパク質に標識するためのキットも取り揃えている。これらの試薬には、あらかじめ活性エステル基あるいはマレイミド基が導入されており、タンパク質のアミノ基あるいはスルフヒドリル基を介して標識することができる。反応条件はすでに最適化されており、標識に必要な試薬やバッ
ファー類などが全て含まれているため、本キットを用いて簡便に標識タンパク質を調製することができる。
詳しくは、小社 HP をご参照されたい。(http://dominoweb.dojindo.co.jp/goodsr7.nsf/ByItemLInfo/09)3http://www.dojindo.co.jp

表 . ラベル化剤の特性一覧表
対象官能基
タ
ン
パ
ク
質
標
識
試
薬
H
P
L
C
用
誘
導
体
化
試
薬

ビ
オ
チ
ン
ラ
ベ
ル
化
剤

品

名

検 出
蛍 光
〃

λex
496
495

λem
516
520

備 考
細胞質標識剤
タンパク質等のアミノ基ラベル化剤

IC3-OSu special packaging

〃

550

570

アミノ酸やペプチド中のアミノ基用のラベル化剤

ア ミ ノ 基 IC5-OSu special packaging

〃

640

660

Sulforhodamine 101
acid chloride

〃

568

590 〜
630 タンパク質等のアミノ基ラベル化剤

〃

768

807

CFSE
FITC-IICG-Sulfo-OSu

ア ミ ノ 基 NBD-F
ABD-F
S

H

カルボン酸
水酸基

アミノ基

Br-DMEQ

〃

365

蛍

〃
光
〃

385
338
367

530 HPLC のプレカラムラベル化剤
513 HPLC のプレカラムラベル化剤
435 〜 HPLCのプレカラムラベル化剤
440
515
〃
402 芳香族アルデヒドの検出445 α - ケト酸の HPLC プレカラムラベル化剤

蛍

光

410
500

370

450

〃
蛍 光

360
400

Biotin-AC5-OSu

〃

ー

ー

アミノ基へのビオチン導入剤、AC 基の数でビオチンと被標識分子の距離を調整する。

〃

ー

ー

アミノ基へのビオチン導入剤、AC 基の数でビオチンと被標識分子の距離を調整する。水に溶け易い。

〃

ー

ー

アミノ基へのビオチン導入剤。スペーサーのジスルフィド結合は還元剤で切断可能。

〃

ー

ー

SH 基へのビオチン導入剤、AC 基の数でビオチンと被標識分子の距離を調整する。

〃

ー

ー

アルデヒド基、カルボン酸へのビオチン導入剤、AC基の数でビオチンと被標識分子の距離を調整する。

DTPA anhydride

ー

ー

ー

アミノ基へのキレート残基の導入剤。

SPDP

ー

ー

ー

SH 化合物標識用。

Sulfo-AC5-SPDP

ー

ー

ー

SH 化合物標識用。水に溶け易い。

Biotin-(AC5)2-OSu
Biotin Sulfo-OSu
Biotin-AC5 Sulfo-OSu
Biotin-SS-Sulfo-OSu
Biotin-PE-maleimide
Biotin-PEAC5-maleimide
Biotin-HPDP
Biotin-hydrazide

アミノ基

HPLC のプレカラムラベル化剤

Br-MmcDMEQ-COCl
Biotin-OSu

アルデヒド基Biotin-AC5-hydrazide
カルボン酸
Biotin-(AC5)2-hydrazide
そ
の
他

470
389

Biotin-(AC5)2 Sulfo-OSu

SH 基

〃

蛍 光
蛍 光

基 NAM

SBD-F
DDB
アルデヒド基MDB〃

4〃HPLC のプレカラムラベル化剤

タンパク質架橋剤、ラベル化剤

1. ビオチンラベル化剤
対象反応基、蛍光波長は 4 ページ ( 表． ラベル化剤の特性一覧表 ) を参照下さい。

Biotin-SS-Sulfo-OSu

100 mg ; 348-09091 同仁品コード (B572)

N-[[2-Biotinylamino)ethyl]dithiopropionyloxy]sulfosuccinimide, sodium salt
[CAS No. 325143-98-4］
規格

溶解例
取扱注意

(1) 性状：白色〜殆ど白色粉末(2) 純度 (HPLC): 80.0% 以上(3) ジメチルスルホキシド溶状 : 試験適合
15 mg/ml( 水 ), 10 mg/ml( ジメチルスルホキシド )1. 保存方法 : 冷凍 , 2. 吸湿注意

構造式

C19H27N4NaO9S4=606.69
Spacer length：16.6-17.6Å
性 質 Biotin-SS-Sulfo-OSu は分子内に N- ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基を持つため、抗体や酵素等のタンパク質のアミノ基にビオチンを導入することができる。Biotin Sulfo-OSu または Biotin-AC5 Sulfo-OSu 等のリンカーにアルキル鎖のみを有するビオ
チン標識剤とは異なり、リンカー部位に導入されたジスルフィド基は還元剤により容易に還元されるためリンカー部位の切断が可能である。
Biotin-SS-Sulfo-OSu を用いて標識した分子をアビジンあるいはストレプトアビジンの固定化カラムへ捕捉後、還元操作によるリンカー部位の切断により回収することができる。

5

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Biotin-HPDP

50 mg ; 341-09101 同仁品コード (B573)

N -[6-(Biotinamide)hexyl]-3’-(2’-pyridyldithio)propionamide［CAS No. 129179-83-5］
規格

溶解例
取扱注意

(1) 性状：白色〜殆ど白色粉末(2) 純度 (HPLC): 90.0% 以上(3) ジメチルホルムアミド溶状 : 試験適合
2 mg/ml( ジメチルホルムアミド )保存方法 : 冷蔵

構造式

C24H37N5O3S3=539.78

Spacer length：21.9-22.9Å

性 質 Biotin-HPDP は、分子内にビオチンおよびピリジルジスルフィド基を有するため、SH 基にビオチンを導入することができる。
ピリジルジスルフィド基は還元剤により容易に還元でき、また、タンパク質などの SH 基と交換反応することが可能である。BiotinSS-Sulfo-OSu と同様、還元操作によるリンカー部位が切断可能な特徴を有しているが、Biotin-HPDP は対象のタンパク質の SH 基と反応するため、ジスルフィド基を還元した後に現れる SH 基は元のタンパク質由来の SH 基に戻すことができる。
Biotin-HPDP を用いて標識した分子をアビジンあるいはストレプトアビジンの固定化カラムへ捕捉後、還元操作によるリンカー部位の切断により回収することができる。

6

タンパク質架橋剤、ラベル化剤
Biotin-OSu

Biotin N -hydroxysuccinimide ester［CAS No. 35013-72-0］(1) 性状：白色～微黄色粉末(2) 純度 (HPLC): 95.0% 以上(3) ジメチルスルホキシド溶状 : 試験適合
溶解例		 10 mg/ml( ジメチルスルホキシド )取扱注意 保存方法 : 冷凍規格

10 mg ; 346-06351 同仁品コード (B304)
構造式

C14H19N3O5S=341.38
Spacer length：6.1-7.1Å

性 質 ビオチンはアビジンと強く結合することが知られており、その性質を利用して高感度分析に広く利用されている。ビオチンとアビジンの結合安定度定数は 1015 で、抗原 - 抗体反応よりも 3 ～ 4 桁高いため、一旦アビジンと結合したビオチンは生理的条件下では外れない。また、ビオチンはカルボキシル基を持つ低分子であり、容易に化学修飾することができ、タンパク質等の活性をほとんど損なうことなく標識することができる。したがって、抗体を用いた免疫分析のための標識剤として、数多くのビオチン化合物が開発されてきた。タンパク質のアミノ基 (NH2 基 ) との結合には、通常、活性エステル基を持つビオチンが用いられ、スルフヒドリル
基 (SH 基 ) には、マレイミド基を持つビオチンが用いられる。
目的に応じて、アビジンが認識するビオチンヘッドと反応基の間のスペーサーの長さを選択する必要があるが、一般にスペーサーが長い方が、アビジンを結合させた際の抗体への抗原認識活性への影響が少ないと考えられている。ただし、スペーサー部分が非特異的吸着を起こす場合もあり、測定の際のバックグラウンドが高くなることもあるため、測定感度を向上させるには、S/N( シグナル・
ノイズ比 ) を見て、適当な長さのスペーサーを選択する必要がある。
スペーサーには通常、アミノカプロン酸が用いられ、アミド結合でビオチンに一分子のアミノカプロン酸を導入した化合物と二分子導入した化合物がある。カプロン酸スペーサーが長くなると水溶性が乏しくなるため、ビオチン標識試薬を DMSO に溶解し、タンパク質を含むバッファー溶液に添加する方法が一般的である。
タンパク質のアミノ基標識の際に有機溶媒が使用できない場合には、スルホン酸基を持つ活性エステル化合物が利用できる。また、スルフヒドリル基への反応に際しては、同様に DMSO で調整した溶液が用いられるが、スペーサー部分にピペラジン構造を持つため、中性領域では、プロトン化されることにより、水溶性を示す。
還元糖に用いられるビオチンヒドラジド化合物は、水溶性が低く DMSO 溶液での調整が必要となる。
ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) では、ビオチン標識した抗体に対して、酵素標識ストレプトアビジンを結合させる方法が一般的である。ストレプトアビジンに比べ、アビジンは安価であるが ELISA などに用いられるケースは極めて少ない。理由は、バックグラウンドが極めて高くなるためで、PI が高いことが原因であると考えられている。カラムによるビオチン結合タンパク質などの分離目的には一般的にアビジンが用いられる。

Biotin-AC5-OSu

10 mg ; 343-06361 同仁品コード (B305)

6-(Biotinylamino)hexanoic acid N -hydroxysuccinimide ester［CAS No. 72040-63-2］(1) 性状 : 白色～微黄色粉末(2) 純度 (HPLC): 95.0% 以上(3) ジメチルスルホキシド溶状 : 試験適合
10 mg/ml( ジメチルスルホキシド )溶解例
取扱注意 保存方法 : 冷凍

規格

構造式

C20H30N4O6S=454.54
Spacer length：15.3-16.3Å

Biotin-(AC5)2-OSu

6-[6-(Biotinylamino)hexanoylamino]hexanoic acid N -hydroxysuccinimide ester［CAS No. 89889-52-1］(1) 性状 : 白色～微黄色粉末(2) 純度 (HPLC): 90.0% 以上(3) ジメチルスルホキシド溶状 : 試験適合
(4) IR スペクトル : 試験適合
(5) NMR スペクトル : 試験適合
溶解例		 10 mg/ml( ジメチルスルホキシド )取扱注意 保存方法 : 冷凍規格

10 mg ; 340-06371 同仁品コード (B306)

構造式

C26H41N5O7S=567.70
Spacer length：24.5-25.5Å

7

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Biotin Sulfo-OSu

10 mg ; 345-06821 同仁品コード (B319)

Biotin N -hydroxy-sulfosuccinimide ester［CAS No. 119616-38-5］(1) 性状：白色～淡赤褐色粉末(2) 純度 (HPLC): 95.0% 以上(3) 水溶状 : 試験適合
(4) IR スペクトル : 試験適合
溶解例		 10 mg/ml( 水 )取扱注意 保存方法 : 冷凍
規格

構造式

C14H18N3NaO8S2=443.43
Spacer length：6.1-7.1Å

Biotin-AC5 Sulfo-OSu

10 mg ; 348-06811 同仁品コード (B320)

6-(Biotinylamino)hexanoic acid N -hydroxy-sulfosuccinimide ester［CAS No. 109940-19-4］(1) 性状 : 白色～淡赤褐色粉末(2) 純度 (HPLC): 95.0% 以上(3) 水溶状 : 試験適合
(4) NMR スペクトル : 試験適合
溶解例		 10 mg/ml( 水 )取扱注意 保存方法 : 冷凍
規格

構造式

C20H29N4NaO9S2=556.59
Spacer length：15.3-16.3Å

Biotin-(AC5)2 Sulfo-OSu

10 mg ; 341-06801 同仁品コード (B321)

6-[6-(Biotinylamino)hexanoylamino]hexanoic acid N -hydroxy-sulfosuccinimide ester［CAS No. 180028-78-8(free acid)］(1) 性状：白色～淡赤褐色粉末(2) 純度 (HPLC): 95.0% 以上(3) 水溶状 : 試験適合
(4) NMR スペクトル : 試験適合
溶解例		 10 mg/ml( 水 )取扱注意 保存方法 : 冷凍

規格

構造式

C26H40N5NaO10S2=669.75
Spacer length：24.5-25.5Å

Biotin-PE-maleimide

10 mg ; 347-06381 同仁品コード (B300)

N -Biotinyl-N ’-[2-(N -maleimido)ethyl]piperazine, hydrochloride(1) 性状：白色～微黄色粉末(2) 純度 (HPLC): 90.0% 以上(3) ジメチルスルホキシド溶状 : 試験適合
溶解例		 10 mg/ml( ジメチルスルホキシド )取扱注意 保存方法 : 冷凍
規格

構造式

C20H30ClN5O4S=472.00
Spacer length：16.5-17.5Å

Biotin-PEAC5-maleimide

10 mg ; 344-06391 同仁品コード (B299)

N -6-(Biotinylamino)hexanoyl-N ’-[2-(N -maleimido)ethyl]piperazine, hydrochloride(1) 性状：白色～微黄色粉末(2) 純度 (HPLC): 90.0% 以上(3) ジメチルスルホキシド溶状 : 試験適合
10 mg/ml( ジメチルスルホキシド )溶解例
取扱注意 保存方法 : 冷凍
規格

構造式

C26H41ClN6O5S=585.16
Spacer length：25.3-26.3Å

8

タンパク質架橋剤、ラベル化剤
Biotin-hydrazide

10 mg ; 347-06401 同仁品コード (B303)

Biotin hydrazide［CAS No. 66640-86-6］(1) 性状：白色～微黄色粉末(2) 純度 (HPLC): 95.0% 以上(3) ジメチルスルホキシド溶状 : 試験適合
10 mg/ml( ジメチルスルホキシド )溶解例
取扱注意 保存方法 : 冷凍
規格

構造式

C10H18N4O2S=258.34
Spacer length：8.7-9.7Å

Biotin-AC5-hydrazide

10 mg ; 344-06411 同仁品コード (B302)

6-(Biotinylamino)hexanoylhydrazine［CAS No. 109276-34-8］(1) 性状：白色～微黄色粉末(2) 純度 (HPLC)：95.0% 以上(3) ジメチルスルホキシド溶状 : 試験適合
10 mg/ml( ジメチルスルホキシド )溶解例
取扱注意 保存方法 : 冷凍
規格

構造式

C16H29N5O3S=371.50

Spacer length：17.9-18.9Å

Biotin-(AC5)2-hydrazide

10 mg ; 341-06421 同仁品コード (B301)

6-[6-(Biotinylamino)hexanoylamino]hexanoylhydrazine(1) 性状：白色～微黄色粉末(2) 純度 (HPLC): 95.0% 以上(3) ジメチルスルホキシド溶状 : 試験適合
溶解例		 10 mg/ml( ジメチルスルホキシド )取扱注意 保存方法 : 冷凍
規格

構造式

C22H40N6O4S=484.66
Spacer length：27.1-28.1Å

ARP(Aldehyde Reactive Probe)

10 mg ; 340-07611 同仁品コード (A305)

N -(Aminooxyacetyl)-N’ -biotinyl-hydrazine［CAS No.139585-03-8］
規

格

溶解例
取扱注意

(1) 性状 : 白色粉末
(2) 純度 (HPLC) : 95.0% 以上(3) 水溶状 : 試験適合
(4) IR スペクトル : 試験適合
(5) NMR スペクトル : 試験適合
10 mg/ml( 水 )保存方法 : 冷凍

構造式

C12H21N5O4S=331.39
Spacer length：13.9-14.9Å

9

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プロトコル
Ⅰ

細胞表面タンパク質のビオチンラベル化１）

1. 使用試薬・ビオチンラベル化剤 Biotin-SS-Sulfo-OSu (Code: B572)
・Quench buffer (50 mmol/l Tris-HCl (pH8.0), 0.1 mmol/l EDTA,
150 mmol/l NaCl)
・Lysis Buffer (50 mmol/l Tris-HCl (pH8.0), 150 mmol/l NaCl,
0.2% NaN3, 0.1% SDS, 100 μg/ml phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 μg/ml aprotinin, 1% Triton X-100, 0.5% sodium deoxycholate(Code: D520))

5) 100 μl の Lysis Buffer を添加し、30 分間氷上でインキュベート
して細胞を溶解する。
6) 4℃ で遠心し、上清を新しいチューブに取る。タンパク質濃度を測定する。
（2）細胞表面タンパク質の分離精製
1) タンパク質量 200 〜 250 μg（200 μl Lysis Buffer）にStreptavidin 固定ビーズを添加し、4℃ で一晩振とうしながら反応させる。
2) 遠心してビーズを沈殿させながら、Lysis Buffer で 5 回洗浄する。

・Streptavidin 固定ビーズ
・Loading dye (60 mmol/l Tris-HCl(pH 6.8), 25% glycerol, 2%
SDS, 350 mmol/l β-mercaptoethanol, 0.1% bromophenol blue)3) 55 μl の Loading Dye を沈殿ビーズに添加し、37℃ で 30 分間

インキュベートする。
4) 遠心して得られた上清を新しいチューブに移す。
5) 4 〜 15% SDS- ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行う。

2. タンパク質のビオチンラベル化の操作方法(1) 細胞表面タンパク質のビオチンラベル化方法
1) 薬剤で処理をした細胞を準備する (T-75 フラスコ )。
2) 冷 PBS で 2 回洗浄した後、1 mg/ml Biotin-SS-Sulfo-OSu (inPBS) を添加し、4℃ で 30 分間、振とうしながら反応する。
3) 反応後、冷 Quench buffer で 2 回洗浄後、冷 PBS にて 1 回洗＜参考文献＞
1) Scott R. Witting et al., J. Biol. Chem., 2003, 278, 40121.

浄する。
4) 細胞をフラスコ上からかき取り、遠沈管に移した後、遠心して細胞を沈殿させる。

II アミノ基標識用ビオチンラベル化剤を用いたビオチンラベル化
1. 使用試薬(2) タンパク質のビオチンラベル化方法
1) タンパク質を 10 mmol/l Bicine Buffer(pH8.5) に溶解する。
2) タンパク質とビオチンラベル化剤の混合モル比が 1：2 〜 1：10

・10 mmol/l Bicine Buffer(pH8.5)
・ビオチンラベル化剤
Biotin-OSu (Code: B304), Biotin-AC5-OSu (Code: B305),
Biotin- (AC5)2-OSu (Code: B306), Biotin Sulfo-OSu (Code: B319),
Biotin-AC5 Sulfo-OSu (Code: B320),
Biotin-(AC5)2Sulfo-OSu (Code: B321)
・DMSO ( ジメチルスルホキシド , Code: SP10)
・NAP-5 (GE ヘルスケア社 )・PBS (pH7.4) (NaCl 8.0 g/l, KCl 0.2 g/l, Na2HPO4 1.15 g/l,
KH2PO4 0.2 g/l)となる様に (1) で調製したビオチンラベル化剤溶液を、1) のタ
ンパク質溶液に添加する。
3) よく混和した後、振とうしながら恒温槽（25℃）中で 2 ～ 4
時間インキュベートする。

(3) ラベル化したタンパク質のゲルろ過精製
1) NAP-5 の上部キャップを外し、充填液を捨てる。
2) 流出口のキャップを外し、PBS を数 ml ずつピペットで取りカラムへロードする。1 カラム当たり総量として 10 ml を流し、

2. タンパク質のビオチンラベル化の操作方法

ゲルを平衡化させる。
3) (2) でラベル化したタンパク質溶液のサンプルチューブから
500 μl をマイクロピペッターで測り取りカラムへロードする。

(1) ビオチンラベル化剤溶液を、以下を参考に調製する (50 mmol/l)。

ビオチンラベル化剤
Biotin-OSu
Biotin-AC5-OSu
Biotin-(AC5)2-OSu
Biotin Sulfo-OSu
Biotin-AC5 Sulfo-OSu
Biotin-(AC5)2 Sulfo-OSu

溶解方法 (50 mmol/l)

この時の流出液は廃棄する。
4) カラムの流出口に試験官などを置き、1.0 ml の PBS をマイク

3.4 mg/DMSO 200 μl
4.5 mg/DMSO 200 μl
5.7 mg/DMSO 200 μl
4.4 mg/ 純水 200 μl
5.6 mg/ 純水 200 μl
6.7 mg/ 純水 200 μl

ロピペッターでカラムにロードし、ビオチン標識したタンパク
質を溶出する。

＊ビオチンラベル化剤は加水分解しやすいので、溶解後の操作は手早く行い、速やかに (2) の操作に移る。

10

タンパク質架橋剤、ラベル化剤
III SH 基標識用ビオチンラベル化剤を用いたビオチンラベル化
1. 使用試薬3) (1) で調製した抗体溶液のサンプルチューブから 500 μl をマイ・10 mmol/l HEPES Buffer (pH8.0)
・1,4-Dithiothreitol (DTT)・ビオチンラベル化剤
Biotin-PE-maleimide (Code: B300), Biotin-PEAC5-maleimide(Code: B299)
・DMSO ( ジメチルスルホキシド , Code: SP10)
・NAP-5 (GE ヘルスケア社 )・NAP-10 (GE ヘルスケア社 )・PBS (pH7.4) (NaCl 8.0 g/l, KCl 0.2 g/l,Na2HPO4 1.15 g/l,
KH2PO4 0.2 g/l)

クロピペッターで測り取り、カラムへロードする。この時の流出液は廃棄する。
4) カラムの流出口に試験官などを置き、1.0 ml の PBS をマイクロ
ピペッターでカラムにロードし、還元した抗体を溶出する。
(3) ビオチンラベル化方法
1) Biotin-PE-maleimide を DMSO に溶解する (50 mmol/l, 4.7 mg/200 μl
または 10 mg/424 μl)。

＊ Biotin-PEAC5-maleimide の場合は 5.9 mg/200 μl または 10 mg/342 μl。

2) 抗体とビオチンラベル化剤のモル比が 1：10 程度となるように(3)-1) で調製したビオチンラベル化剤溶液を、(2) の抗体溶液

2. 抗体のビオチンラベル化操作方法に添加する。
3) よく混和した後、振とうしながら恒温槽（25℃）中で一晩(1)SH 基を持つ抗体の調製方法
1) DTT を 200 mmol/l になるように PBS に溶解する。
2) タンパク質 1.0 ～ 5.0 mg を精秤 ( 秤量値を記録 ) し、マイクロピペッターにて HEPES Buffer を 500 μl 添加し溶解する。
3) 2) のタンパク質溶液に 1) の DTT 溶液を 2 μl 添加し、よく混

インキュベートする。
(4) ラベル化した抗体のゲルろ過精製
1) NAP-10 の上部キャップを外し、充填液を捨てる。
2) 流出口のキャップを外し、PBS を数 ml ずつピペットで取りカ和する。

ラムへロードする。1 カラム当たり総量として 15 ml を流し、ゲルを平衡化させる。
3) (3) でラベル化した抗体溶液のサンプルチューブから 1 ml をマ
イクロピペッターで測り取りカラムへロードする。この時の流出液は廃棄する。
4) カラムの流出口に試験官などを置き、1.5 ml の PBS をマイク
ロピペッターでカラムにロードし、ビオチン標識した抗体を溶出する。

(2) ゲルろ過精製
1) NAP-5 の上部キャップを外し、充填液を捨てる。
2) 流出口のキャップを外し、PBS を数 ml ずつピペットで取り、カラムへロードする。1 カラム当たり総量として 10 ml を流し、ゲルを平衡化させる。

表

各種タンパク質に対するラベル化率
タンパク質溶液の濃度
5 mg/500 μl
rProtein A(MW=42,000)

2.5 mg/500 μl
1.25 mg/500 μl

BSA(MW=68,000)

2.5 mg/500 μl

IgG(MW=150,000)

2.5 mg/500 μl

ビオチン試薬溶液添加量
濃度
添加量 (μl)
5.7
14.3
28.6
2.9
10 mg/355 μl
7.1
14.3
1.4
3.6
7.1
2.9
10 mg/567 μl
7.1
14.3
2.9
10 mg/1,218 μl
7.1
14.3

混合比 a)
2.0
5.0
10.1
2.0
5.0
10.1
2.0
5.1
10.0
2.1
5.1
10.2
2.1
5.2
10.5

ラベル化率 b)(mol/mol)
1.8
4.5
7.5
1.5
4.3
8.1
1.8
3.7
7.3
1.6
3.6
6.4
1.3
3.6
6.6

上記結果は、小社での実測データであり、条件により若干変動する可能性がある。また、ラベル化率の算出は、V の HABA 法により行った。
a) タンパク質 1 mol に対して混合したビオチン試薬のモル数b) タンパク質 1 mol に結合したビオチンのモル数11http://www.dojindo.co.jp

Ⅳ アルデヒド基 ( 還元糖末端 ) 標識用ビオチンラベル化剤を用いたビオチンラベル化
1. 使用試薬3) (1) で調製したタンパク質溶液のサンプルチューブから 500 μl

・150 mmol/l NaCl 含有 10 mmol/l MES Buffer (pH5.5)・過ヨウ素酸ナトリウム溶液 (100 mmol/l NaClO4; 上記 MES
buffer で用時調製 )・Biotin-hydrazide(Code: B303), Biotin-AC5-hydrazide(Code: B302),
Biotin-(AC5)2-hydrazide(Code: B301)
・DMSO ( ジメチルスルホキシド ) (Code: SP10)
・NAP-5(GE ヘルスケア社 )・NAP-10(GE ヘルスケア社 )をマイクロピペッターで測りとりカラムへロードさせる。この時の流出液は廃棄する。
4) カラムの流出口に試験管などを置き、1.0 ml の PBS をマイク
ロピペッターにてカラムにロードし、還元したタンパク質を溶出する。

(3) タンパク質のビオチンラベル化方法

1) ビオチン試薬 Biotin-hydrazide (50 mmol/l, 2.6 mg/200 μl)
を DMSO に溶解する。(Biotin-AC 5 -hydrazide の場合は 3.7
mg/200 μl, Biotin-(AC5)2-hydrazide の場合は 4.7 mg/200 μl)2) 目的とするモル比になるように 1) で作製したビオチン試薬溶・PBS(pH7.4)

2. タンパク質のビオチンラベル化の操作方法(1) アルデヒド基 ( 還元糖末端 ) を持つタンパクの調製方法

液を、(2) で得られたタンパク質溶液に添加する。
3) よく混和し、振とうしながら恒温槽 (25℃) 中で 4 時間インキュ

1) タンパク質 1.0 ～ 5.0 mg を精秤 ( 秤量値を記録 ) し、MES
buffer を 500 μl 添加する。溶解後、氷浴上に冷却する。
2) 1) のタンパク質溶液に過ヨウ素酸ナトリウム溶液を 2 μl 添加
し、よく混和して 0℃ で 20 ～ 30 分反応させる。

ベートする。

(4) ラベル化したタンパク質のゲルろ過精製

NAP-10 を使用し、(2) を参照して精製を行なう。

(2) タンパク質のゲルろ過精製

1) NAP-5 の上部キャップを外し、充填液を捨てる。
2) 流出口のキャップを外し、PBS を数 ml ずつピペットでとり、カラムへロードする。1 カラム当り総量として 10 ml を流し、ゲルを平衡化させる。

V HABA 法によるタンパクのラベル化率の算出
1. 原理3)	ミクロセル ( 容量 1 ml ×セル長 1 cm) に、上記 2) の HABAAvidin 溶液 900 μl をマイクロピペッターを用いて入れ、500
nm の吸光度を測定する。3 回繰り返し測定し、3 回の平均値
を AbsA とする。このときの吸光度の値は AbsA = 約 1.5 になる。

タ ン パ ク 質 へ の ビ オ チ ン 試 薬 の ラ ベ ル 化 率 は、HABA(4Hydroxy-azobenzene-2’-carboxylic acid) を用いた方法で調べることができる。
HABA は ア ビ ジ ン に 取 り こ ま れ 500 nm に 吸 収 を 持 つ。 一方、ビオチンは HABA よりアビジンに対する親和性が高いため、
HABA-Avidin 溶液に、ビオチンラベル化したタンパク質を添加す
ると、HABA に代わってビオチンがアビジンと結合する。アビジ
ンから HABA が解離すると 500 nm の吸光度が減少するため、その減少からビオチンのラベル化率を算出することができる。

4)	2 ml サンプルチューブに、2) の HABA-Avidin 溶液 900 μl を

マイクロピペッターを用いて入れる。これにゲル濾過精製を行なったビオチン化タンパク質溶液 100 μl をマイクロピペッ
ターを用いて添加し、キャップを閉めた後、ボルテックスで攪拌する。
5)	5 分間以上静置した後、マイクロピペッターを用いてセルに移し変え 500 nm の値を読む ( この値を Abs B とする )。タン

2. 使用試薬

パク濃度が高い場合、系中のビオチンがアビジンよりも多くなるため、タンパク質に結合した正確なビオチン数が、HABA
法では算出できなくなることがある。このため、AbsB=0.7 以下の場合には、タンパク質溶液を適宜希釈 ( 希釈倍率：Z) した後、HABA-Avidin 溶液に添加してラベル化率を算出したほうが良い。
6)	Abs A と Abs B の値より、下記の式に従いサンプル中のビオチ
ン濃度 B (mol/l) を算出する。
B (mol/l) = Z × [10-2 × (0.9 × AbsA − AbsB) / 34 ]7)	タンパク質 1 分子に結合したビオチンの数を算出する。
	例えば、分子量 MWprotein のタンパク質 X g を標識したとす
ると、ゲルろ過精製後のタンパク濃度 A (mol/l) は、A (mol/l) = (X / MWprotein) × 103
	と表される。これから、B / A = タンパク質 1 分子に結合したビオチン数 (mol/mol)・Avidin from Egg White：(nacalai tesque 035-53) 10 mg
・HABA：( 東京化成 H0586) 14 mg
・DMSO：(Sp)DMSO (Code: SP10) 500 μl
・PBS(pH7.4) 20 ml
NaCl 8.0 g/l, KCl 0.2 g/l,
Na2HPO4 1.15 g/l, KH2PO4 0.2 g/l

3. 測定及び算出方法1)	2 ml サンプルチューブに HABA 14.0 mg を精秤し、マイクロピペッターを用いて DMSO 500 μl を添加し溶解する。
2)	20 ml メスフラスコに Avidin 10.0( ± 0.1) mg を精秤し、PBS
15 ml を入れ溶解する ( この時点では、20 ml 全量は添加しない )。これに上記 1) で調製した HABA-DMSO 溶液 200 μl をマ
イクロピペッターで添加し、PBS で 20 ml に調整しよく混和
する。

を得る。

12

タンパク質架橋剤、ラベル化剤
参考文献
1)
2)
3)
4)

M. Wilchek, E. A. Bayer, Ed., "Methods Enzymol., Vol. 184 - Avidin-biotin technology" , Academic Press, 1990.
N. M. Green, Avidin, Adv. Protein. Chem. , 1975, 29 , 85.
M.Wilchek, E. A. Bayer, “Applications of avidin-biotin technology Literature survey”, Methods Enzymol. , 1990, 184 , 14.
N. M. Green, L. Konieczny, E. J. Toms R. C. Valentine,”The use of bifunctional biotinyl compounds to determine the arrangement of subunits in avidin”,
Biochem. J. , 1971, 125 , 781.

以下に各種ビオチンを用いた標識および HABA 法についての文献をリストアップした。
Succinimidyl Biotins(Hydrophilic)
5) J. Wormmeester, F. Stiekema C. Groot, "Immunoselective cell separation", Methods Enzymol. , 1990, 184, 314.
6) J. J. Leary, D. J. Ward, "Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing biotin-labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on
nitrocellulose : Bio-Blots", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, 80, 4045.
7) W. T. Lee, D. H. Conrad, “The murine lymphocyte receptor for IgE. II. Characterization of the multivalent nature of the B lymphocyte receptor for IgE”, J.
Exp. Med. , 1984, 159, 1790.
8) D. R. Gretch, M. Suter, M. F. Stinski, "The use of biotinylated monoclonal antibodies and streptavidin affinity chromatography to isolate herpesvirushydrophobic proteins or glycoproteins", Anal. Biochem., 1987, 163, 270.
9) M. Shimkus, J. Levy, T. Herman, "A chemically cleavable biotinylated nucleotide : Usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin
columns", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82, 2593.
10) W. J. LaRochelle, S. C. Froehner, “Immunochemical detection of proteins biotinylated on nitrocellulose replicas”, J. Immunol. Methods, 1986, 92, 65.
11) P. S. R. Anjaneyulu, J. V. Staros, "Reactions of N-hydroxysulfosuccin-imide active esters", Int. J. Peptide Protein Res. , 1987, 30, 117.
12) H. M. Ingalls, C. M. Goodloe-Holland, E. J. Luna, “Junctional plasma membrane domains isolated from aggregating Dictyostelium discoideum
amebae”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83, 4779.
13) J. Guesdon, T. Ternynck, S. Avrameas, "The use of Avidinbiotin interaction in immunoenzymatic techniques", J. Histochem. Cytochem. , 1979, 27, 1131.
Succinimidyl Biotins (Hydrophobic)
14) P. Kongtawelert, P. Ghosh, "A new sandwich-ELISA method determination of keratan sulfate peptides in biological fluids employing monoclonal
antibody and labeled avidin biotin technique", Clin. Chem. Acta, 1990, 195, 17.
15) G. Paganelli, S. Perves, A. G. Siccardi, G. Rowlinson, G. Deleide, F. Chiolerio, M. Malcovati, G. A. Scassellati, A. A. Epenetos, “Interperitoneal radiolocalization of tumors pretargeted by biotinylated monoclonal antibodies", Int. J. Cancer, 1990, 45, 1184.
16) C. Wagner, U. Kruger, J. E. Shivery, “Selective precipitation of biotin-labeled antigens or monoclonal antibodies by avidin for determining epitope
specificities and affinities in solution- phase assays”, Methods Enzymol. , 1990, 184, 162.
17) D. M. Boorsma, J. VanBommel, E. M. H. VanderRaaij-Helmer, “Simultaneous immunoenzyme double labeling using two different enzymes linked
directly to monoclonal antibodies or with biotin-avidin”, J. Microscopy, 1986, 143, 197.
18) A. Komura, T. Tokushita, T. Nakagawa, A. Sasase, M. Ichihashi, S. Ferrone, Y. Mishima, “Specific killing of human melanoma cells with an efficient
10B-compound on monoclonal antibodies”, Pigment Cell Res. , 1989, 2, 259.
19) R. Rappuoli, P. Leoncini, P. Tarli, P. Neri, “Competitive enzyme immunoassay for human Chorinonic somatornammotropin using the avidin-biotin
system”, Anal. Biochem. , 1981, 118, 168.
Maleimide Biotins
20) S. Hashida, M. Imagawa, S. Inoue, K-H. Ruan, E. Ishikawa, T. Ueno, "More useful maleimide compounds for the conjugation of Fab' to horseradish
peroxidase through thiol groups in the hinge", J. Appl. Biochem. , 1984, 6 , 56.
21) E. Ishikawa, M. Imagawa, S. Hashida, S. Yoshitake, Y. Hamaguchi, T. Ueno, “Enzyme-labeling of antibodies and their fragments for enzyme
immunoassay and immunohistochemical staining”, J. Immunoassay, 1983, 4, 209.
22) H-J. Friesen, P. Hermentin P. Gronski, "Novel maleimidobiotins for the selective biotinylation of sulfhydris", Protides Biol. Fluids, 1987, 34, 43.
23) E. Ishikawa, S. Hashida, T. Kohno, T. Kotani, S. Ohtani, "Modification of monoclonal antibodies with enzymes, biotin and fluorochromes and theirapplications", Immunol. Ser. , 1987, 33, 113.
24) R. B. del Rosalio, R. L. Wahl, "Disulfide bond-targeted radiolabeling : tumor specificity of a streptavidin-biotinylated monoclonal antibody complex",
Cancer Res. (Suppl.), 1990, 50, 804S.
Hydrazide Biotins
25) E. A. Bayer, H. Ben-Hur, M. Wilchek, "Biotin Hydrazide-A selective label for sialic acids, galactose and other sugars in glycoconjugates using avidinbiotin technology", Anal. Biochem. , 1988, 170, 271.
26) N. F. Zaidi, C. F. Lagenaur, R. J. Hilkert, H. Xiong, J. J. Abramson, G. Salama, "Disulfide linkage of biotin identifies a 106-kDa Ca2+ release channel insarcoplasmic reticulum", J. Biol. Chem. , 1989, 264, 21737.
27) M. Wilchek, J. M. Rosenberg, A. Reisfeld, E. A. Edward, "Direct incorporation of biotin into DNA", Methods Enzymol. , 1990, 184, 608.
28) M. R. Deziel, M. M. Mau, "Biotin conjugated reagent as sitespecific probes of membrane protein structure : application to the study of the humanerythrocyte hexose transporter", Anal. Biochem. , 1990,190, 297.
29) D. J. O'Shannessy, "Antibodies biotinylated via sugar moieties", Methods Enzymol. , 1990, 184, 162.
HABA Assay
30) N. M. Green, "Spectrophotometric determination of avidin and biotin", Methods Enzymol. , 1970, 18-A, 418.

13

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2. 二価性試薬
二価性試薬は、一分子内に、アミノ基と反応する活性エステル基や SH 基に反応するマレイミド基を持つ試薬で、タンパク質分子を結合させるのに使用される。
保持する官能基、リンカーの長さ、リンカー部位の種類、水溶性の有無により分類される。

<Hetero-bifunctional Reagents>
EMCS

50 mg ; 344-05051 同仁品コード (E018)
100 mg ; 340-05053 同仁品コード (E018)

N -(6-Maleimidocaproyloxy)succinimide［CAS No. 55750-63-5］
規格		
		
		
		
		
		
溶解例		
取扱注意

(1) 性状 : 白色～微黄白色粉末(2) 純度 (HPLC) : 90.0% 以上(3) ジメチルホルムアミド溶状 : 試験適合
(4) 融点 : 63℃ 以上(5) IR スペクトル : 試験適合
(6) NMR スペクトル : 試験適合
200 mg/ml( ジメチルホルムアミド )保存方法 : 冷蔵

構造式

C14H16N2O6=308.29
Spacer length：9.8-10.8Å

GMBS

50 mg ; 347-05041 同仁品コード (G005)
100 mg ; 343-05043 同仁品コード (G005)

N -(4-Maleimidobutyryloxy)succinimide［CAS No. 80307-12-6］
規格		
		
		
		
		
		
		
溶解例
取扱注意

(1) 性状 : 白色粉末
(2) 純度 (HPLC) : 95.0% 以上(3) クロロホルム溶状 : 試験適合
(4) ジメチルホルムアミド溶状 : 試験適合
(5) 融点 : 124 〜 132℃
(5) IR スペクトル : 試験適合
(6) NMR スペクトル : 試験適合
50 mg/5 ml (クロロホルム)、
50 mg/5 ml (ジメチルホルムアミド)
保存方法 : 冷蔵

構造式

C12H12N2O6=280.23
Spacer length：7.2-8.2Å

HMCS

50 mg ; 342-06191 同仁品コード (H257)

N -(8-Maleimidocapryloxy)succinimide

規格		
		
		
		
溶解例
取扱注意

(1) 性状 : 白色粉末又は結晶性粉末(2) 純度 (HPLC) : 90.0% 以上(3) IR スペクトル：試験適合(4) NMR スペクトル：試験適合
20 mg/ml ( アセトニトリル )保存方法 : 冷蔵

構造式

C16H20N2O6=336.34
Spacer length：12.4-13.4Å

KMUS

50 mg ; 345-06201 同仁品コード (K214)

N -(11-Maleimidoundecanoyloxy)succinimide［CAS No. 87981-04-2］
規格		
		
		
		
溶解例		
取扱注意

(1) 性状 : 白色粉末又は結晶性粉末(2) 純度 (HPLC) : 90.0% 以上(3) IR スペクトル：試験適合(4) NMR スペクトル：試験適合
20 mg/ml (アセトニトリル)、
20 mg/3 ml (メチルアルコール)
保存方法 : 冷蔵

構造式

C19H26N2O6=378.42
Spacer length：16.4-17.4Å

14タンパク質架橋剤、ラベル化剤
Sulfo-EMCS

50 mg ; 340-06011 同仁品コード (S024)

N -(6-Maleimidocaproyloxy)sulfosuccinimide, sodium salt
［CAS No. 103848-61-9(free acid)］
規格		
		
		
		
		
溶解例		
取扱注意

(1) 性状 : 白色～微黄桃色粉末(2) 純度 (HPLC) : 90.0% 以上(3) 水溶状 : 試験適合
(4) IR スペクトル : 試験適合
(5) NMR スペクトル : 試験適合
20 mg/ml (水)保存方法 : 冷蔵

構造式

C14H15N2NaO9S=410.33
Spacer length：9.8-10.8Å

Sulfo-GMBS

50 mg ; 347-06021 同仁品コード (S025)

N -(4-Maleimidobutyryloxy)sulfosuccinimide, sodium salt
［CAS No. 158018-81-6(free acid)］
規格		
		
		
		
		
溶解例
取扱注意

(1) 性状 : 白色～微黄桃色粉末(2) 純度 (HPLC) : 90.0% 以上(3) 水溶状 : 試験適合
(4) IR スペクトル : 試験適合
(5) NMR スペクトル : 試験適合
20 mg/ml (水)保存方法 : 冷蔵

構造式

C12H11N2NaO9S=382.28
Spacer length：7.2-8.2Å

Sulfo-HMCS

50 mg ; 341-06041 同仁品コード (S026)

N -(8-Maleimidocapryloxy)sulfosuccinimide, sodium salt
［CAS No. 211236-35-0］
規格		
		
		
		
溶解例
取扱注意

(1) 性状 : 白色～微黄桃色粉末(2) 純度 (HPLC) : 90.0% 以上(3) 水溶状 : 試験適合
(4) IR スペクトル : 試験適合
20 mg/ml (水)保存方法 : 冷蔵

構造式

C16H19N2NaO9S=438.39
Spacer length：12.4-13.4Å

Sulfo-KMUS

50 mg ; 342-06211 同仁品コード (S250)

N -(11-Maleimidoundecanoyloxy)sulfosuccinimide, sodium salt

［CAS No. 211236-68-9］
規格		
		
		
		
		
溶解例
取扱注意

(1) 性状：白色～微黄桃色粉末(2) 純度 (HPLC) : 90.0% 以上(3) 水溶状 : 試験適合
(4) IR スペクトル : 試験適合
(5) NMR スペクトル : 試験適合
1 mg/ml (水)保存方法 : 冷蔵

構造式

C19H25N2NaO9S=480.47
Spacer length：16.4-17.4Å

Sulfo-SMCC

50 mg ; 349-09141 同仁品コード (S330)

N -[(4-Maleimidomethyl)cyclohexylcarbonyloxy]sulfosuccinimide, sodium salt
［CAS No. 92921-24-9］
規格		
		
		
溶解例		
取扱注意

(1) 性状 : 白色〜殆ど白色粉末(2) 純度 (HPLC) : 90.0% 以上(3) 水溶状：試験適合
10 mg/ml ( 水 )1. 保存方法 : 冷凍 , 2. 吸湿注意

構造式

C16H17N2NaO9S=436.37
Spacer length：8.6-9.6Å15http://www.dojindo.co.jp

SPDP

		

100 mg ; 同仁品コード (S291)

N -Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate[CAS No. 68181-17-9](1) 性状 : 白色～微黄色粉末(2) 純度 (HPLC)：98.0% 以上(3) アセトニトリル溶状 : 試験適合
(4) NMR スペクトル : 試験適合
溶解例		 100 mg/50 ml( アセトニトリル )取扱注意 保存方法 : 冷蔵
規格

構造式

C12H12N2O4S2=312.37
Spacer length：3.5-4.5Å

Sulfo-AC5-SPDP		

50 mg ; 346-09151 同仁品コード (S359)

N -{6-[3-(2-Pyridyldithio)propionamido]hexanoyloxy}sulfosuccinimide, sodium salt
[CAS No. 169751-10-4](1) 性状 : 白色～殆ど白色粉末(2) 純度 (HPLC)：90.0% 以上(3) 水溶状 : 試験適合
溶解例		 95 mg/ml( 水 )取扱注意 1. 保存方法 : 冷凍 , 2. 吸湿注意
規格

構造式

C18H22N3NaO8S3=527.57
Spacer length：12.6-13.6Å

性 質 Sulfo-AC5-SPDP は、分子内に N- ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基を持つため、抗体や酵素等のタンパク質のアミノ基にピリジルジスルフィド基を導入することができる。ピリジルジスルフィド基は還元剤により容易に還元され SH 基とすることができる。また、タンパク質などの SH 基と交換反応するため、ジスルフィド結合を介してカラムの担体やタンパク質などと結合させることができる。本試薬は、SPDP と異なりスルホン酸基を有する活性エステル基が導入されているため、試薬を溶解するための DMF やDMSO など有機溶媒を用いることなく標識反応を行うことが可能である。

<Homo-bifunctional Reagents>
BS3

50 mg ; 348-09111 同仁品コード (B574)

Bis(sulfosuccinimidyl)suberate, disodium salt
［CAS No. 82436-77-9］
規格		
		
		
溶解例		
取扱注意

(1) 性状 : 白色〜殆ど白色粉末(2) 純度 (HPLC) : 93.0% 以上(3) 水溶状：試験適合
10 mg/ml ( 水 )1. 保存方法 : 冷蔵 , 2. 吸湿注意

構造式

C16H18N2Na2O14S2=572.43
Spacer length：8.7-9.7Å
性 質 アミノ基同士の架橋反応が可能な試薬である。N- ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを分子の両端に有しており、アミノ基に対して選択的に反応するため、酵素標識体の調製や単純ハプテンを担体タンパク質に結合することが可能である。BS3 はリンカー
部分にアルキル鎖を有する化学構造をとる。一方、DSP および DTSSP は、リンカー部位にジスルフィド基が導入されていることで還元剤により容易に還元されリンカー部位の切断が可能である。また、BS3 および DTSSP は、スルホン酸基を有する活性エステル基が導入されているため、試薬を溶解する際に DMF や DMSO など有機溶媒を用いることなく標識反応を行うことが可能である。

DTSSP

50 mg ; 342-09131 同仁品コード (D630)

Dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate), disodium salt
［CAS No. 81069-02-5］
規格		
		
		
溶解例		
取扱注意

(1) 性状 : 白色〜殆ど白色粉末(2) 純度 (HPLC) : 80.0% 以上(3) 水溶状：試験適合
10 mg/ml ( 水 )1. 保存方法 : 冷蔵 , 2. 吸湿注意

構造式

C14H14N2Na2O14S4=608.51
Spacer length：8.7-9.7Å

16タンパク質架橋剤、ラベル化剤
DSP

1 g ; 345-09121 同仁品コード (D629)

Dithiobis(succinimidyl propionate)［CAS No. 57757-57-0］
規格		
		
		
溶解例		
取扱注意

(1) 性状 : 白色〜殆ど白色粉末(2) 純度 (HPLC) : 95.0% 以上(3) ジメチルホルムアミド溶状：試験適合
10 mg/ml( ジメチルホルムアミド )1. 保存方法 : 冷蔵 , 2. 吸湿注意

構造式

C14H16N2O8S2=404.42
Spacer length：8.7-9.7Å

Dithiobis(succinimidyl undecanoate)

10 mg；同仁品コード (D537)
50 mg；同仁品コード (D537)

Dithiobis(succinimidyl undecanoate)
略名 (DSU)(1) 性状 : 白色粉末
(2) 純度 (HPLC): 90.0% 以上(3) NMR スペクトル：試験適合
10 mmol/l 以上（ジメチルスルホキシド )溶解例
取扱注意 1. 保存方法 : 冷蔵 , 2. 吸湿注意 , 窒素置換
規格

構造式

C30H48N2O8S2=628.84
Spacer length：29.7-30.7Å

Dithiobis(succinimidyl octanoate)

10 mg ; 同仁品コード (D538)
50 mg ; 同仁品コード (D538)

Dithiobis(succinimidyl octanoate)
略名 (DSO)(1) 性状 : 白色粉末
(2) 純度 (HPLC): 90.0% 以上(3) NMR スペクトル：試験適合
10 mmol/l 以上（ジメチルスルホキシド )溶解例
取扱注意 1. 保存方法 : 冷蔵 , 2. 吸湿注意 , 窒素置換
規格

構造式

C24H36N2O8S2=544.68
Spacer length：21.8-22.8Å

Dithiobis(succinimidyl hexanoate)

10 mg ; 同仁品コード (D539)
50 mg ; 同仁品コード (D539)

Dithiobis(succinimidyl hexanoate)
略名 (DSH)(1) 性状 : 白色粉末
(2) 純度 (HPLC): 90.0% 以上(3) NMR スペクトル：試験適合
10 mmol/l 以上（ジメチルスルホキシド )溶解例
取扱注意 1. 保存方法 : 冷蔵 , 2. 吸湿注意 , 窒素置換
規格

構造式

C20H28N2O8S2=488.58
Spacer length：16.6-17.6Å

17http://www.dojindo.co.jp

プロトコル
I Fab’ の調製法 6)
1. F(ab’)2 の調製(1) 試薬 ( 緩衝液については本稿末尾を参照 )・0.1 mol/l 2-メルカプトエチルアミン溶液(11.36 mg の 2-メルカプトエチルアミン塩酸塩を緩衝液 D
1 ml に溶解する。)

・lgG
・ブタ胃ペプシン・緩衝液 A、緩衝液 B・Sephacryl S-200HR(GE ヘルスケア社製 )(2) 操作

1) 0.1 ～ 3 mg の F(ab’)2 を含む緩衝液 C 0.45 ml に、2-メルカプトエ
チルアミン溶液 50 μl を添加する。
2) 37℃ で 90 分間インキュベートする。
3) Ultrogel AcA44 カラムで、緩衝液 D を用いて 0.35 ml/min でゲル(2) 操作1) lgG 5 mg/0.5 ml を緩衝液 A で透析する。
2) 透析液にブタ胃ペプシン 0.1 ～ 0.2 mg を溶解し、37℃ で 15 ～20 時間インキュベートする。
3) pH7 に調整して、Sephacryl S-200HR で、緩衝液 B を用いて 0.35
ml/min でゲル濾過する。
4) F(ab’) 2 分画をとり、濃縮する。280 nm での吸光度を測定し、100 mg/ml のナトリウムアジドを 1％添加して保存する。
5) MW=92,000、E280 nm=1.48 g-1・L・cm-1 を用いて濃度を決定する。
蛋白濃度 (mg/ml)=A280 nm/(1.48 × MW) × MW=A280 nm/1.48
または、モル濃度 (mol/l)= A280 nm/(1.48 × MW) で求める。
※IgG のペプシンによる消化時間は、動物種によリ異なる。例えば、ウサギ IgG では 6 時間だが、ヤギでは 1 ～ 2 日、ラット・マウスの lgG 2b では、F(ab’)2 とはならない。

2. Fab’ の調製濾過する。
4) Fab’ 分画をとり 280 nm の吸光度を測定し、MW=46,000、E280 nm=1.48 g-1・L・cm-1 を用いて濃度を決定する。
さらに、後述の方法で、SH 基を定量する。

3. SH 基の定量法 6, 8)(1) 試薬 ( 緩衝液については本稿末尾を参照 )・5 mmol/l 4-PDS 溶液(4-PDS(Code: P017)1.1 mg/ 緩衝液 B 1 ml)(2) 操作1) Fab’(3 ～ 14 μmol/l、A280 nm=0.1 ～ 1.0) の緩衝液 D 溶液

0.5 ml に 4-PDS 溶液 20 μl を添加する。
2) 30℃ で 10 分間インキュベートする。
3) 324 nm の吸光度を測定し、4-PDS より遊離した 4- チオピリ

6, 8)(1) 試薬 ( 緩衝液については本稿末尾を参照 )ドンを、そのモル吸光係数ε324 nm=19,800 を用い定量する。
※Fab’ の SH 基は、EDTA 存在下では、還元型 IgG の SH 基よりも格段に安定で取り扱い易い 8)。

・F(ab’)2
・緩衝液 C、緩衝液 D

II 仔ウシ小腸由来アルカリホスファターゼ Fab’ ヘの標識 1)
1. 仔ウシ小腸由来アルカリホスファターゼへのマレイミ
ドの導入(1) 試薬 ( 緩衝液については本稿末尾を参照 )2) 4℃ で 20 時間インキュベートする。
3) 10 mmol/l 2- メルカプトエチルアミン溶液 10 μl を添加し、Ultrogel AcA44 カラムでゲルろ過する。溶離液には緩衝液 Gを用い、0.35 ml/min で流す。
4) アルカリホスファターゼ活性 (II-4) を測定し、100 mg/ml BSAと 100 mg/ml のナトリウムアジドをそれぞれ 1％添加し保存する。

・仔ウシ小腸由来アルカリホスファターゼ
・緩衝液 E、緩衝液 F
・EMCS(Code: E018)
・Sephadex G-25(GE ヘルスケア社製 )3. マレイミドの定量法 6)(2) 操作

1) アルカリホスファターゼ (2 mg)/ 緩衝液 E 0.5 ml を同じ緩衝液

EMCS や GMBS によりアルカリホスファターゼに導入されたマレイミドの導入数は、以下の方法で算出する。
(1) 試薬 ( 緩衝液については本稿末尾を参照 )E を用い透析する。
2) 透析液に EMCS(0.17 mg)/DMF 10 μl を添加して、30℃ で 30
分間インキュベーションする。
3) Sephadex G-25 カラム (1 × 45 cm) で、緩衝液 F によりゲル・マレイミド導入アルカリホスファターゼ
・緩衝液 C・0.5 mmol/l 2-メルカプトエチルアミン溶液(I-2 で調製した 0.1 mol/l の 2-メルカプトエチルアミン塩酸
塩溶液 10 μl と 50 mmol/l EDTA (pH6.0) 2 ml を混合し調製する。50 mmol/l EDTA 溶液 100 ml 調製時には小社 2NA(Code:N001) 1.86 g を溶解し 1 mol/l NaOH で pH6.0 に調製する。)
・5 mmol/l 4-PDS 溶液(4-PDS(Code: P017)1.1 mg/ 緩衝液 B 1 ml)(2) 操作1)	マレイミドを導入したアルカリホスファターゼ ( 約 10 μmol/l)/ 緩衝液 C 0.45 ml に、0.5 mmol/l 2- メルカプトエチルアミン溶液 50 μl を添加する。
2) 30℃ で 20 分間インキュベートする。
3) 5 mmol/l の 4-PDS 溶液 20 μl を加える。

濾過し、濃縮する。
4) マレイミド量 (II-3) とアルカリホスファターゼ活性 (II-4) を測定する。

2. マレイド導入アルカリホスファターゼの Fab’ への標識
(1) 試薬 ( 緩衝液については本稿末尾を参照 )・マレイミド導入アルカリホスファターゼ Fab’・緩衝液 D, 緩衝液 G, 緩衝液 F
・10 mmol/l 2-メルカプトエチルアミン ( 緩衝液 D 溶液 )・ナトリウムアジド(2) 操作

1) マレイミド導入アルカリホスファターゼ 1 mg(10 nmol) を緩衝液 F 0.25 ml に溶解し、Fab’ 2.3 mg (50 nmol)/ 緩衝液 D 溶液
0.25 ml を混合する。

18

タンパク質架橋剤、ラベル化剤
4) 30℃ で 10 分インキュベートする。
5) 324 nm の吸光度より、ε=19,800 M-1・cm-1 を用いて計算する。

2) 酵素希釈溶液 0.5 ml を 30 ～ 37℃ で 5 分間インキュベーショ
ンする。
3) 5.5 mmol/l PNPP/ 緩衝液 H 0.5 ml を添加する。

4. アルカリホスファターゼ活性の測定

4) 30 ～ 37℃ で 10 ～ 100 分間インキュベーションする。
5) 1 mol/l NaOH 0.5 ml を加えて、反応を停止させ、405 nm の吸比色法および蛍光法があるが、ここでは最も一般的な比色法として、PNPP(4- ニトロフェニルリン酸 ) による方法を紹介する 8)。
(1) 試薬 ( 緩衝液については本稿末尾を参照 )光度を測定する。
予め既知濃度のアルカリホスファターゼを用い同一法で活性を測定し、作製しておいた酵素濃度 - 吸光度の検量線から定量2する。また、酵素量は、280 nm の吸光度より、ε=0.99 cm ・-1
mg と MW=100,000 よリ計算する。

・緩衝液 H・5.5 mmol/l PNPP/ 緩衝液 H
・1 mol/l NaOH

(2) 操作タンパク濃度 (mg/ml)=A280 nm / (0.99 × MW)×MW=A280 nm/ 0.99 またはモル濃度 (mol/l)=A280 nm / (0.99 × MW) で求める。

1) 酵素溶液を、緩衝液 H で希釈する。

III GMBS を用いたβ - ガラクトシダーゼの IgM モノクローナル抗体への標識 9)3) Sephadex G-25 カラム (1.4 × 16 cm) を用い、4℃、緩衝液 J(1) 試薬 ( 緩衝液については本稿末尾を参照 )・緩衝液 I 、緩衝液 L、緩衝液 J 、緩衝液 M、緩衝液 K、
		 緩衝液 N

でゲルろ過する。280 nm の吸光度が 0.41(0.87 nmol のタンパ
ク質に相当 ) を含むフラクション 2.5 ml を得る。
4) これに、β - ガラクトシダーゼ (2.62 nmol)/ 緩衝液 K 1.0 ml を添加する。
5) 30℃ で 30 分間インキュベートする。
6) 緩衝液 L 0.1 ml を添加する。
7) こ の 溶 液 500 μl を、 緩 衝 液 M で 平 衡 に 達 し た DEAE-・β - ガラクトシダーゼ
・GMBS(Code: G005)
・SephadexG-25(GE ヘルスケア社製 )・DEAE-TOYOPEARL( 東ソー社製 )(2) 操作TOYOPEAL カラム (1.2 × 15 cm) にアプライする。緩衝液 Nを用い、NaCl を 0.1 mol/l から 0.5 mol/l にグラディエントをかけながら溶出する。
8) 280 nm の吸光度を測定し、緩衝液 L 0.1 ml の入ったチューブ
にとって酵素活性を測定する。

1) lgM(1 mg、1.1 nmol)/ 緩衝液 I 1.0 ml に、GMBS(33 μg、117nmol)/dioxane 50 μl を添加する。
2) 20℃ で 40 分間インキュベーションする。

緩衝液一覧
本稿で用いた緩衝液の組成の一覧を下記に示す。
緩衝液 A：0.1 mol/l 酢酸ナトリウム緩衝液 (pH4.5、0.1 mol/l NaCl を含む )緩衝液 B：0.1 mol/l リン酸ナトリウム緩衝液 (pH7.0)
緩衝液 C：0.1 mol/l リン酸ナトリウム緩衝液 (pH6.0)
緩衝液 D：0.1 mol/l リン酸ナトリウム緩衝液 (pH6.0, 5 mmol/l EDTA を含む )(EDTA-2Na 塩を緩衝液作製途中で終濃度が 5 mmol/l となるよ
うに加え、希釈してリン酸濃度が 0.1 mol/l にする。すなわち 100 ml 調製時は小社 2NA(Code: N001) を 186 mg 用いる )緩衝液 E：50 mmol/l ホウ酸ナトリウム緩衝液 (pH7.6、1 mmol/l MgCl2、0.1 mmol/l ZnCl2 を含む )緩衝液 F ：0.1 mol/l Tris-HCl 緩衝液 (pH7.0、1 mmol/l MgCl2、0.1 mmol/l ZnCl2 を含む )緩衝液 G：10 mmol/l Tris-HCl 緩衝液 (pH6.8、0.1 mol/l NaCl、1 mmol/l MgCl2、0.1 mmol/l ZnCl2 を含む )緩衝液 H：0.1 mol/l グリシン -NaOH 緩衝液 (pH10.3、1 mmol/l MgCl2、0.25 g/l 卵白アルブミンを含む )緩 衝 液 I：0.1 mol/l リン酸ナトリウム緩衝液 (pH7.0、50 mmol/l NaCl を含む )緩衝液 J ：10 mmol/l リン酸ナトリウム緩衝液 (pH6.3、10 mmol/l MgCl2、50 mmol/l NaCl を含む )緩衝液 K：0.1 mol/l リン酸ナトリウム緩衝液 (pH7.0、10 mmol/lMgCl2、5 mmol/l EDTA を含む )緩衝液 L ：60 mmol/l リン酸ナトリウム緩衝液 (pH7.4、10 mmol/l EDTA、1 mmol/l MgCl2、0.1% BSA、0.1% ナトリウムアジドを含む )緩衝液 M：20 mmol/l Tris-HCl 緩衝液 (pH7.5、0.1 mol/l NaCl を含む )緩衝液 N：20 mmol/l Tris-HCl 緩衝液 (pH7.5)

参考文献

1)	P. Cuatrecasas, I. Parikh, Biochemistry , 1972,11 (12), 2291.
2)	S. Yoshitake, Y. Yamada, E. Ishikawa, R. Masseyeff, Eur. J. Biochem. , 1979, 101 , 395.
3)	M. J. O’Sullivan, E. Gnemmi, D. Morris, G. Chieregatti, A. D. Simmonds, M. Simmons, J. W. Bridges, V. Marks, Anal.Biochem. , 1979, 100 , 100.
4)	S. Yoshitake, M, Imagawa, E. Ishikawa, Anal. Lett. , 1982, 15 (132), 147.
5)	J. V. Staros, Biochemistry , 1982, 21 , 3950.
6)	E. Ishikawa, M. Imagawa, S. Hashida, S. Yoshitake, Y. Hamaguchi, T. Ueno, J. Immunoassay , 1983, 4 , 209.
7)	S. Yoshitake, Y. Hamaguchi, E. Ishikawa, Scand. J. Immunol. , 1979, 10 , 81.
8)	石川榮治、河合忠、宮井潔、酵素免疫測定法第三版 (1987 医学書院 ).
9)	K. Fujiwara, N. Matsumoto, S. Yagisawa, H. Tanimori, T. Kitagawa, M. Horita, K. Hiratani, K. Fukushima, A. Tomonaga, K. Hara, K. Yamamoto,J. Immunol. Methods , 1988, 112 , 77.

19http://www.dojindo.co.jp

3. タンパク質標識試薬
対象反応基、蛍光波長は 4 ページ ( 表． ラベル化剤の特性一覧表 ) を参照下さい。

CFSE

10 mg ; 341-06443 同仁品コード (C309)

5- or 6-(N -Succinimidyloxycarbonyl)-fluorescein 3’,6’-diacetate［CAS No. 150347-59-4］(1) 性状：白色～微黄色粉末(2) 純度 (HPLC): 95.0% 以上(3) ジメチルスルホキシド溶状 : 試験適合
(4) NMR スペクトル : 試験適合
溶解例		 10 mg/ml( ジメチルスルホキシド )取扱注意 保存方法 : 冷凍
規格

構造式

C29H19NO11=557.46

IC3-OSu special packaging

20 μg × 3 ; 同仁品コード (I271)

N -Ethyl-N ’-[5-(N ”-succinimidyloxycarbonyl)pentyl]indocarbocyanine iodide
規格

溶解例		
取扱注意

(1) 性状：濃赤色固体(2) 純度 (HPLC): 80.0% 以上(3) ジメチルスルホキシド溶状 : 試験適合
(4) モル吸光係数 : 80,000 以上 (545 nm 付近 )20 μg/40 μl ( ジメチルスルホキシド )1. 保存方法：冷凍 , 2. 吸湿注意

構造式

C35H42IN3O4=695.63

IC5-OSu special packaging

20 μg × 3 ; 同仁品コード (I272)

N -Ethyl-N’-[5-(N ”-succinimidyloxycarbonyl)pentyl]-3,3,3’,3’tetramethyl-2,2’-indodicarbocyanine iodide

規格

溶解例
取扱注意

(1) 性状：濃青色固体(2) 純度 (HPLC): 80.0% 以上(3) ジメチルスルホキシド溶状 : 試験適合
(4) モル吸光係数 : 110,000 以上 (640 nm 付近 )(5) NMR スペクトル : 試験適合
20 μg/40 μl ( ジメチルスルホキシド )1. 保存方法：冷凍 , 2. 吸湿注意

構造式

C37H44IN3O4=721.67

FITC-I

100 mg ; 349-03661 同仁品コード (F007)
500 mg ; 343-03664 同仁品コード (F007)

Fluorescein-4-isothiocyanate［CAS No. 3326-32-7］(1) 性状：黄橙色粉末(2) 純度 (HPLC): 95.0% 以上(3) アセトン溶状 : 試験適合
(4) モル吸光係数 : 80,000 以上 (492 nm 付近 )(5) IR スペクトル : 試験適合
溶解例		 100 mg/10 ml( アセトン )取扱注意 保存方法 : 冷蔵
規格

構造式

C21H11NO5S=389.38

20

タンパク質架橋剤、ラベル化剤
Sulforhodamine 101 acid chloride

10 mg ; 345-05221 同仁品コード (S016)

1H, 5H, 11H, 15H -Xantheno[2,3,4-ij:5,6,7-i’j’]diquinolizin-18-ium,9-(2-sulfo-4-chlorosulfophenyl)-2,3,6,7,12,13,16,17-octahydro-,inner salt
[CAS No. 82354-19-6](1) 性状：紫色結晶性粉末(2) 純度 (TLC): 85.0% 以上
溶解例		 1 mg/ml( クロロホルム )取扱注意 保存方法 : 冷凍 , 遮光規格

構造式

※本製品は、二種類のスルホニルクロライド化合物を含む混合物です。

C31H29ClN2O6S2=625.16

試作品

ICG-Sulfo-OSu

1 mg ; 同仁品コード (I254)

2-[7-[1,3-Dihydro-1,1-dimethyl-3-(4-sulfobutyl)-2H-benzo[e]indol-2-ylidene]-1,3,5heptatrienyl]-1,1-dimethyl-3-[5-(3-sulfosuccinimidyl)oxycarbonylpentyl]-1H-benzo[e]indolium, inner salt, sodium salt
取扱注意

1. 保存方法：冷凍 , 2. 吸湿注意

構造式

C49H52N3NaO10S2=930.07

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プロトコル
タンパク質を蛍光標識したい
2. 方法

I IC-Dye を使用したタンパク質標識例

1) タンパク質をリン酸緩衝液に溶解する (2 mg/ml)。
2) 1) の溶液 25 μl ( タンパク質 50 μg) をチューブに入れる。
3) 1 mmol/l グアニジン塩酸塩 25 μl を 2) のチューブに入れる。
4) 98℃ で 3 分間加熱する。
5) IC3（もしくは IC5）OSu special packaging 20 μg を DMSO
80 μl に溶解する。→（試薬溶液）
6) 4) のチューブに 5) の試薬溶液 1 μl を添加し、混合する。
7) 氷上で 1 時間反応させる。
8) 10 mmol/l リジン溶液を 2 μl 添加し、氷上で 15 分静置する。
9) 反応液をゲルろ過もしくは TCA 沈殿を行い、未反応の色素

1. 試薬
・50 mmol/l リン酸緩衝液 (pH8.0)
・1 mmol/l グアニジン液

・（Lu)DMSO (Code. LU08)
・10 mmol/l リジン溶液を除去する。

2. 操作手順

II BSA への IC3(IC5) の標識例

1) BSA を炭酸緩衝液に溶解する。(1.2 mg/ml)。→（BSA 溶液）
2) IC3( もしくは IC5) OSu special packaging 20 μg を DMSO
6 μl に溶解する。 → （試薬溶液）
3) BSA 溶液 125 μl に試薬溶液 3 μl を加える。（試薬量は BSAに対して約 7.2 倍量となる。）
4) 30℃ で 1 時間インキュベートする。
5) 反応液をゲルろ過もしくは TCA 沈殿を行い精製し、未反応

1. 試薬・100 mmol 炭酸緩衝液 (pH8.5)
・Dulbecco's PBS(-)
・(Lu)DMSO (Code. LU08)の色素を除去する。

III FITC-I を使用した抗体標識例

3) ついで蛋白溶液 B ml にあらかじめ生理食塩水 F ml(D- (B+E)=Fml) を加え、これに FITC 溶液を加える。（ここで蛋白液は、はじめて 2% になる）
4) この場合、両液とも 1 〜 2℃ に保っておく。pH9.5 である
ことを確かめてから、7 〜 9℃ の温度で泡立てないように 4＊「免疫の生化学」, 蛋白質核酸酵素編集部編 , 共立出版発行より引用

1) 抗体蛋白液の蛋白量を屈折計で計り (A mg/ml) ついで液量を測定 (B ml) し、総蛋白量を計算する (AxB=C mg)。
2) 総蛋白量の 1/100 〜 1/150 量の FITC を秤量し ( 蛋白液量により加減する）、2% の蛋白液 (C/20=D ml) の 1/10 量(D/10=E ml) に相当する 0.5 mol/l 炭酸緩衝液 (pH9.5) で時間撹拌する。
※ 室温で 1 〜 2 時間程度の反応でも結構です。抗体の性質にあわせてください。
5) 反応液を Sephadex カラムろ過し、未反応の色素を除去する。
(PBS pH7 使用）
6) 必要があれば、更に、DEAE カラムで分離精製する。

溶解する。
※ 緩衝溶液中で FITC は徐々に分解していきます。速やかにご使用ください。また、DMSO やアセトンなどに FITC-I を溶
解後、反応時に緩衝液に添加する方法もあります。

22

タンパク質架橋剤、ラベル化剤
4. HPLC 用誘導体化試薬
対象反応基、蛍光波長は 4 ページ ( 表． ラベル化剤の特性一覧表 ) を参照下さい。

NBD-F

50 mg ; 342-04751 同仁品コード (N020)
100 mg ; 348-04753 同仁品コード (N020)

4-Fluoro-7-nitrobenzofurazan[CAS No. 29270-56-2](1) 性状：淡黄色粉末(2) 純度 (HPLC): 99.0% 以上(3) エチルアルコール溶状 : 試験適合
(4) 融点 : 52 〜 57℃(5) IR スペクトル : 試験適合
溶解例		 10 mg/ml( エチルアルコール )、		 10 mg/ml( アセトニトリル )取扱注意 保存方法 : 冷凍 , 遮光
規格

構造式

C6H2FN3O3=183.10

ABD-F

50 mg ; 341-05441 同仁品コード (A016)
100 mg ; 347-05443 同仁品コード (A016)

4-Fluoro-7-sulfamoylbenzofurazan[CAS No. 91366-65-3](1) 性状：白色～微黄色結晶性粉末(2) 純度 (HPLC): 99.0% 以上(3) アセトニトリル溶状 : 試験適合
(4) 融点 : 140 〜 149℃
(5) モル吸光係数 : 4,500 以上 (315 nm 付近 )(6) IR スペクトル : 試験適合
溶解例		 10 mg/ml( アセトニトリル )取扱注意 1. 保存方法 : 冷凍 , 遮光 , 2. 吸湿注意
規格

構造式

C6H4FN3O3S=217.18

NAM

10 mg ; 343-04764 同仁品コード (N018)

N -(9-Acridinyl)maleimide[CAS No. 49759-20-8](1) 性状：黄色結晶性粉末(2) 純度 (HPLC): 96.0% 以上(3) ジオキサン溶状 : 試験適合
(4) 融点 : 240 〜 275℃( 分解 )(5) モル吸光係数 : 12,600 以上 (362 nm 付近 )(6) IR スペクトル : 試験適合
溶解例		 12.5 mg/50 ml( ジオキサン )取扱注意 保存方法 : 冷蔵
規格

構造式

C17H10N2O2=274.27

SBD-F

50 mg ; 342-05111 同仁品コード (S013)
100 mg ; 348-05113 同仁品コード (S013)

4-Fluoro-7-sulfobenzofurazan, ammonium salt
[CAS No. 84806-27-9](1) 性状：白色～淡黄色結晶性粉末(2) 純度 (HPLC): 98.0% 以上(3) 水溶状 : 試験適合
(4) モル吸光係数 : 4,000 以上 (317 nm 付近 )(5) IR スペクトル : 試験適合
溶解例		 25.5 mg/100 ml( 水 )、		 10 mg/2 ml( ホウ酸 buffer, pH9.5)
取扱注意 保存方法 : 冷凍 , 遮光
規格

構造式

C6H6FN3O4S=235.19

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DDB

50 mg ; 344-05551 同仁品コード (D034)

1,2-Diamino-4,5-dimethoxybenzene, dihydrochloride[CAS No. 131076-14-7](1) 性状：白色～微桃灰白色結晶性粉末(2) 純度 ( 滴定 )：98.0% 以上(3) 水溶状 : 試験適合
(4) IR スペクトル : 試験適合
溶解例		 100 mg/10 ml( 水 )取扱注意 保存方法 : 冷凍 , 遮光
規格

構造式

C8H14Cl2N2O2=241.11

MDB

50 mg ; 347-05541 同仁品コード (M021)
100 mg ; 343-05543 同仁品コード (M021)

1,2-Diamino-4,5-methylenedioxybenzene, dihydrochloride[CAS No. 38608-07-0](1) 性状：白色～微桃白色結晶性粉末
構造式(2) 純度 ( 滴定 ): 98.0% 以上(3) 水溶状 : 試験適合 0.020 以下 (400 nm)(4) メチルアルコール溶状：試験適合 0.040 以下(400 nm)(5) 融点 : 243 〜 261℃( 分解 )(6) IR スペクトル：試験適合
溶解例		 100 mg/10 ml( 水 )、		 100 mg/10 ml( メチルアルコール )取扱注意 保存方法：冷凍 , 遮光
規格

C7H10Cl2N2O2=225.07

Br-DMEQ

10 mg ; 346-05511 同仁品コード (B036)

3-Bromomethyl-6,7-dimethoxy-1-methyl-1,2-dihydroquinoxaline-2-one[CAS No. 100595-07-1]
規格

溶解例		
取扱注意

(1) 性状：黄色針状結晶(2) 純度 (HPLC): 96.0% 以上 ( ラベル化後 )(3) アセトニトリル溶状 : 試験適合
(4) 融点 : 174 〜 183℃( 分解 )(5) ラベル化試験 : 試験適合
(6) IR スペクトル : 試験適合
(7) NMR スペクトル : 試験適合
6.0 mg/5 ml( アセトニトリル )保存方法 : 冷凍

構造式

C12H13BrN2O3=313.15

Br-Mmc

100 mg ; 349-04021 同仁品コード (B023)

4-Bromomethyl-7-methoxycoumarin[CAS No. 35231-44-8](1) 性状：淡黄色～淡黄灰白色結晶性粉末(2) アセトン溶状 : 試験適合
(3) 融点 : 206 〜 216℃
(4) モル吸光係数 : 11,000 以上 (332 nm 付近 )(5) IR スペクトル : 試験適合
溶解例 100 mg/10 ml( 熱アセトン )、16 mg/100 ml( エチルアルコール )

規格

構造式

C11H9BrO3=269.09

DMEQ-COCl

10 mg ; 347-06141 同仁品コード (D049)

3-Chlorocarbonyl-6,7-dimethoxy-1-methyl-2(1H )-quinoxalinone[CAS No. 104077-15-8](1) 性状：橙色～赤橙色粉末(2) 純度 (HPLC): 95.0% 以上 ( ラベル化後 )(3) トルエン溶状： 試験適合
(4) IR スペクトル : 試験適合
(5) NMR スペクトル : 試験適合
溶解例		 8.5 mg/10 ml( トルエン )取扱注意 1. 保存方法 : 冷凍 , 遮光 , 2. 吸湿注意
規格

構造式

C12H11ClN2O4=282.68

24

タンパク質架橋剤、ラベル化剤
5. 関連試薬
DTPA anhydride

1 g ; 344-05171 同仁品コード (D033)
5 g ; 340-05173 同仁品コード (D033)

Diethylenetriamine-N ,N ,N ’,N ”,N ”-pentaacetic acid, dianhydride[CAS No. 23911-26-4](1) 性状：微黄色～微黄褐色粉末(2) 純度 ( 滴定 ): 99.0% 以上 (DTPA として )(3) アルカリ溶状 : 試験適合
(4) 融点 : 175 〜 188℃( 分解 )(5) IR スペクトル : 試験適合
(6) NMR スペクトル : 試験適合
溶解例		 1 g/[3 ml( 水 ) ＋ 2 ml(3 mol/l-NaOH)]、
		 1 mg/ml（ジメチルスルホキシド）
取扱注意 吸湿注意

規格

構造式

C14H19N3O8=357.32

BABE

Request; 同仁品コード (B437)

1-(p -Bromoacetamidobenzyl)ethylenediamine-N,N,N’,N’ -tetraacetic acid
[CAS No. 84256-91-7]
取扱注意

1. 保存方法：冷凍 ,2. 吸湿注意

構造式

C19H24BrN3O9=518.31

FeBABE

1 mg; 同仁品コード (F279)

1-(p -Bromoacetamidobenzyl)ethylenediamine-N,N,N’,N’ -tetraacetic acid, iron(III)
規格		
		
		
溶解例
取扱注意

(1) 性状 : 黄褐色粉末(2) 純度 (HPLC) : 95.0% 以上(3) 水溶状 : 試験適合
緩衝溶液、DMSO に可溶
1. 安衛法 , 2. 保存方法 : 冷凍 , 3. 吸湿注意

構造式

C19H21BrFeN3O9=571.13

AB-NTA free acid		

100 mg ; 340-08071 同仁品コード (A459)

N-(5-Amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid
[CAS No. 129179-17-5](1) 性状 : 白色～淡黄白色粉末(2) 純度 (HPLC)：97.0% 以上(3) 水溶状 : 試験適合
(4) IR スペクトル：試験適合(5) NMR スペクトル : 試験適合
溶解例		 10 mg/ml( 水 )規格

構造式

C10H18N2O6=262.26

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Aminobenzyl-EDTA

25 mg；346-05991 同仁品コード (M029)

1-(4-Aminobenzyl)ethylenediamine-N,N,N’,N’ -tetraacetic acid
[CAS No. 84256-90-6]
規格		 (1) 性状 : 微黄白色〜淡橙白色粉末
		 (2) 純度 (HPLC) : 90.0% 以上
		 (3) IR スペクトル : 試験適合
2 mg/ml (アセトニトリル : 10 mmol/l リン酸 =1 : 1)
溶解例
取扱注意 保存方法 : 冷凍構造式

C17H23N3O8=397.38

Isothiocyanobenzyl-EDTA

10 mg；343-06001 同仁品コード (M030)

1-(4-Isothiocyanatobenzyl)ethylenediamine-N,N,N’,N’ -tetraacetic acid
〔CAS No. 105394-74-9 〕
規格		
		
		
溶解例
取扱注意

(1) 性状 : 微黄褐色粉末(2) 純度 (HPLC) : 90.0% 以上(3) IR スペクトル : 試験適合
2 mg/ml( アセトニトリル : 10 mmol/l リン酸 =1 : 1)
1. 保存方法 : 冷凍 , 2. 吸湿注意

構造式

C18H21N3O8S=439.44

Maleimido-C3-NTA

10 mg；同仁品コード (M035)

N -[5-(3’-Maleimidopropylamido)-1-carboxypentyl]iminodiacetic acid, disodium salt,monohydrate

規格		
		
		
		
		
溶解例
取扱注意

(1) 性状 : 白色～淡黄白色粉末(2) 純度 (HPLC) : 97.0% 以上(3) 水溶状 : 試験適合
(4) IR スペクトル : 試験適合
(5) NMR スペクトル : 試験適合
10 mg/ml (水)1. 保存方法 : 冷蔵 , 2. 吸湿注意

構造式

C18H23N3Na2O9・H2O=489.38

Isothiocyanobenzyl-NTA

10 mg；同仁品コード (I279)

N -[5-(4-Isothiocyanatobenzyl)amido-1-carboxypentyl]iminodiacetic acid
規格		
		
		
		
溶解例		
取扱注意

(1) 性状：白色～微黄色粉末(2) 純度 (HPLC)：90.0% 以上(3) IR スペクトル：試験適合(4) NMR スペクトル：試験適合
DMSO に可溶
1. 保存方法：冷凍 , 2. 窒素置換

構造式

C19H23N3O7S=437.47

Dithiobis(C2-NTA)

10 mg；同仁品コード (D550)
50 mg；同仁品コード (D550)

3,3’-Dithiobis[N -(5-amino-5-carboxypentyl)propionamide-N’,N’ -diacetic acid]dihydrochloride
規格		 (1) 性状 : 白色～微黄色粉末又は結晶
		 (2) 純度 (滴定, 無水物換算) : 95.0% 以上		(3) 水溶状 : 試験適合
		 (4) 水分 : 10.0% 以下		 (5) NMR スペクトル：試験適合
溶解例		 10 mg/ml( 水 )取扱注意 吸湿注意 , 窒素置換

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構造式

C26H44Cl2N4O14S2=771.68* ご注意○掲載内容（製品・包装など）はパンフレット編集時におけるものであり、予告無く変更することがあります。
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