プロトコル

一重項酸素を検出したい
使用製品

解析装置

Si-DMA for Mitochondrial Singlet Oxygen Imaging[MT05]I はじめにIII 生細胞中の一重項酸素の検出

活性酸素種の一つであり非常に強い酸化力を持つ一重項酸素は、皮膚のシミやシワの原因となることが知られており、化粧品分野では、この一重項酸素を消去する化合物の探索が進められております。一方、医学分野、特に癌の治療においては、光感受性物質とレーザー照射により発生した一重項酸素の酸化力により癌細胞を破壊する光線力学的治療の研究が進められており、細胞内における一重項酸素レベルをモニターできる試薬が望まれております。しかしながら既存の一重項酸素検出試薬は細胞膜を透過しない為、細胞内の一重項酸素を検出できません。
真嶋らが開発した一重項酸素検出試薬 Si-DMA は、Silicon
Rhodamine (SiR) 骨格を蛍光団とし、一重項酸素反応部位と1)してアントラセンを有した構造を持つ蛍光プローブです 。この Si-DMA は、容易に細胞膜を透過しミトコンドリアに集積後、選択的に一重項酸素と応答して強い蛍光を発します。また、Si-DMA は 5-Aminolevulinic acid (5-ALA) で処理した細胞内のミトコンドリアで生成されるプロトポルフィリン IX 由来の一重項酸素をイメージングすることが可能です。このことから Si-DMA は、細胞内一重項酸素のイメージングが可能な蛍光色素として今後の研究への応用が期待されます。

(1) 溶液調製
100 µmol/l Si-DMA DMSO stock solution の調製
Si-DMA 2 µg を含むチューブに 36 µl の DMSO を加え、ピペッティングにより溶解する。
※ Si-DMA DMSO stock solution は遮光し、-20℃以下で保存する。

Si-DMA working solution の調製
Si-DMA DMSO stock solution を HBSS 等で希釈し、濃度が25 - 200 nmol/l になるよう調製する。
※ Si-DMA working solution は遮光しその日の内に使用する。

(2) 染色操作
1) 細胞をディッシュまたはチャンバーに播種し、培養する。
2) 培地を取り除き、HBSS で 2 回洗浄する。
3) 調製した Si-DMA working solution を添加する。
4) 5% CO2 インキュベーター (37℃ ) にて 45 分間インキュベー
トする。
5) 上澄みを除去し HBSS で 2 回洗浄する。
6) HBSS を加え蛍光顕微鏡で観察する。

IV 5-Aminolevulinic acid (5-ALA) で処理した
HeLa 細胞を用いた一重項酸素の検出例

その他

51) HeLa 細胞 (2.4×10 cells/ml) 200 µl を µ-slide 8 well(ibidi)に DMEM 培地 (10% fetal bovine serum、1% penicillinstreptomycin) で播種し、5% CO2 インキュベーターで 37℃、一晩培養した。
2) 培地を取り除き HBSS で細胞を 2 回洗浄した。
3) HBSS で調製した 150 µ g/ml の 5-ALA 溶液を添加し、5%CO2 インキュベーター (37℃ ) にて 4 時間インキュベートした。
4) 上澄みを除去し HBSS で 2 回洗浄した。
5) Si-DMA working solution (40 nmol/l) を添加し、5% CO2 インキュベーター (37℃ ) にて 45 分間インキュベートした。
6) 上澄みを除去し HBSS で 2 回洗浄した。
7) HBSS を加え、蛍光顕微鏡で観察した。

λex : 640 nm
λem: 665 nm

1

図 1 Si-DMA が O2 と反応後に生じた Si-DMEP の励起（青）, 蛍光（赤）スペクトル

II 製品以外に必要なもの
・Dimethyl sulfoxide (DMSO)
・Hanks’Balanced Salt Solution (HBSS)・マイクロピペット

図2

5-ALA で処理した HeLa 細胞の Si-DMA による一重項酸素の検出

励起光 (575-625 nm) の照射により、5-ALA で処理した HeLa細胞で蛍光強度が増大した。よって、Si-DMA は 5-ALA により生成したプロトポルフィリン IX に観察光が照射されたことにより発生する一重項酸素の検出が可能である。
＜フィルター＞蛍光イメージング : 575-625 nm (Ex), 660-710 nm (Em)

技術的な内容に関するお問い合わせ先：カスタマーサポート Free Fax:0120-021557 Free Dial:0120-489548
在庫や価格(記載容量以外もしくは request)に関するお問い合わせ：マーケティング部 Tel:096-286-1515 Fax:096-286-1525(株)同仁化学研究所

細 胞
増殖 / 毒性酸化ストレス分 子生物学
細 胞 内蛍光プローブ細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用
試薬
膜タンパク質可 溶 化 剤
ラベル化 剤
二価性試 薬イオン電 極20

機能性有機材料

プロトコルV H2O2 / NaOCl で刺激した HeLa 細胞におけるミトコンドリア染色色素との共染色例
51) HeLa 細胞 (2.4×10 cells/ml) 200 µl を µ-slide 8 well (ibidi)に MEM 培地 (10% fetal bovine serum、1% penicillinstreptomycin) で播種し、5% CO2 インキュベーターで 37℃、一晩培養した。
2) 培地を取り除き HBSS で細胞を 2 回洗浄した。
3) Si-DMA working solution (100 nmol/l) と MitoBright Green(Code：MT06) (25 nmol/l) を細胞に添加し、5% CO2 インキュベーター (37℃) にて 30 分間インキュベートした。
4) 上澄みを除去し HBSS で 2 回洗浄した。
5) H2O2 (100 µmol/l) および NaOCl (100 µmol/l) を添加し 30 秒後に蛍光顕微鏡にて観察した。
MitoBright Green

Merged

刺激なし

Si-DMA

刺激あり

細 胞
増殖 / 毒性酸化
ストレス分 子生物学
細 胞 内蛍光プローブ細胞染色
ミトコンドリア
関連試薬
細菌研究用
試
薬
膜タンパク質可 溶 化 剤
ラベル
化 剤
二価性
試 薬
イオン
電 極
その他
機能性有機材料

図 3 ミトコンドリア染色試薬との共染色例

参考文献
1) S. Kim, T. Tachikawa, M. Fujitsuka, T. Majima, “Far-Red
Fluorescence Probe for Monitoring Singlet Oxygen during
Photodyanamic Therapy”, J. Am. Chem. Soc., 2014, 136 (33),11707.

FAQ
Q : Si-DMA の反応特異性について教えてください。
A : Si-DMA は一重項酸素に選択的に応答を示します。他の活性酸素種に比べ 8 倍以上高い選択を示すことが確認されています。反応特異性に関するデータは小社 HP にてご確認ください。
Q : 推奨のフィルターを教えてください。
A : 励起フィルターは 630-650 nm、蛍光フィルター 660-680 nmを推奨します。
最新の測定データやアプリケーション、論文情報を小社 HP にて掲載。ご興味のある方は、小社 HP にて最新情報をご確認下さい。

Si-DMA 同仁

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