バイオフィルム
ケミカルバイオロジー―総 説―

バイオフィルムを知る―レジオネラバイオフィルムの評価―
麻布大学

古畑 勝則

Methionine-Selective Protein Bioconjugation
North Carolina State University
Yvonne D. Hall Elizabeth J. Gross

Hisham M. El-Shaffey

Jun Ohata―注目の研究―

蛍光色素による細胞間 H2O2 シグナル伝搬の可視化
株式会社同仁化学研究所

岩下 秀文

新 製 品

試験片用バイオフィルム形成能測定キット P.14

関連製品

バイオフィルム形成阻害測定キット・
バイオフィルム薬剤効果測定キット P.15
微生物増殖アッセイキット P.15

No.177(2021)

表紙撮影：熊本県 阿蘇市 米塚
阿蘇神話では、主人公である健磐龍命（たけいわたつのみこと）が 阿 蘇 中 の米を積み上げたので「米塚」と呼ばれ、頂のくぼみは、米を掌ですくって人々

2021 No.177に与えた跡と伝えられています。
photo：永島俊介氏

ドージンニュース

CONTENTS
Review
バイオフィルムを知る―レジオネラバイオフィルムの評価―
麻布大学

［1］

●

古畑 勝則

Methionine-Selective Protein Bioconjugation
North Carolina State University［8］●

Yvonne D. Hall
Elizabeth J. Gross
Hisham M. El-Shaffey
Jun Ohata

Topics on Chemistry
蛍光色素による細胞間 H2O2 シグナル伝搬の可視化 ●株式会社同仁化学研究所

［13］

岩下 秀文

Commercial［16］

細胞増殖毒性測定キット ●関連製品
バイオフィルム形成阻害測定キット・バイオフィルム薬剤効果測定キット ● ［15］［15］

微生物増殖アッセイキット ●新製品
試験片用バイオフィルム形成能測定キット ●

［14］

お知らせ
学会発表のご案内 ●

［7］
［12］

細胞死セミナーのご案内 ●31st Forum in DOJIN 細胞内膜系のダイナミズム－オルガネラが織りなす細胞のドラマ－ ●

［18］

お役立ち
知ろう！学ぼう！これからはじめる微生物実験 ●細胞増殖・毒性測定－試薬の選び方－ ●動画コンテンツのご案内 ●

［14］
［16］

［17］
ツイッター

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No.177(2021)

バイオフィルムを知る―レジオネラバイオフィルムの評価―
Let's learn about biofilms ―Evaluation of Legionella biofilm―

古畑

勝則

麻布大学
生命・環境科学部
教授

Abstract
As a preventive measure against Legionella disease, which isa respiratory infection, it is important to take measures against
the source of infection. To date, the effectiveness of bactericidal
agents, etc. against Legionella pneumophila, which is thecausative agent of Legionellosis, has been evaluated via an
experimental system in which floating cells come into contact

1．はじめにバイオフィルムの発生は特殊な現象のように考えられるが、それは我々人間の視点であり、この現象を微生物生態学的に微生物の視点でとらえると、ごく自然な現象であって、バイオフィルム
は “ 微生物のすみか ” ともいえる。身近な環境において、分野、領域を問わず、水分が存在する場所ではバイオフィルムが発生すると考えてほぼ間違いない。
本稿では、一般的なバイオフィルムについて概説し、さらにレジオネラによるバイオフィルムの評価方法についても言及した。

2．実は身近なバイオフィルム
近年、環境衛生や食品などの製造分野において「バイオフィル
ム」という言葉を見聞きする機会が多くなった。一方、医学や医療の分野では古くからバイオフィルム感染症として知られていたが、易感染者の増大により難治感染症としてクローズアップされている 1）。また、バイオフィルムは、製紙工業や衛生工学などの特定の分野ではスライムと称され、さらに一般にはヌメリ、ヌル
ヌルなどと言われている。
製紙業界でのスライム（バイオフィルム）の発生は古くから大きな課題となっていた。1966 年（昭和 41 年）には上谷と長谷川によって「製紙工場におけるスライムとスライムコントロール剤について」と題する論文がすでに発表されている 2）。この論文の冒頭には、「今日、製紙工場において発生する障害として、第一にスライムを挙げなければならないほど重要な問題となっている。」という記述があり、この分野では半世紀以上も前からすでにスライムの発生が問題視されていたのである。
一方、住環境においても特に湿度が高い浴室や洗面所、台所等の水周りではピンク色を呈するヌルヌルしたバイオフィルムが以前から問題視されていた 3）。人々の生活水準の向上にともない、
アメニティー、すなわち「快適性」という概念が広まり、限られwith a chemical agent. However, an evaluation system in an
attached state has been anticipated when hypothesizing L.
pneumophila's “home”. Therefore, a basic examination was
experimentally conducted based on the conditions the biofilm of
this bacteria are known to form. In other words, L. pneumophila
was allowed to form a biofilm by changing the strain, the materialof the carrier, and the reaction temperature in order to compare
the amount of biofilm formation by the CV method（crystal violet
method）. As a result, the optimum conditions for biofilm
formation of L. pneumophila were considered to be the use one
serogroup strain which is allowed to stand for 7 days on a carrierof silicon and processed at 30℃. Furthermore, upon confirming
the reaction state, using the Biofilm Viability Assay Kit via the
WST method（water-soluble tetrazolium salt method）, whichwas newly developed as an evaluation method after bactericide
treatment, it was believed that it could be used to measure theMBEC（minimum biofilm eradication concentration）, due to thefact that the WST method enabled the cell activity of L.
pneumophila.

た居住空間でできるだけ気持ちよく、清潔に生活したいとの意識が高まってきた。こうした居住者の意識変化を反映して居住環境で発生したバイオフィルムの外観や感触から不快感を生じ、設計・施工者を相手に訴訟問題にまで発展した事例もある。

3．バイオフィルムの正体
バイオフィルムは、細菌をはじめ、真菌、藻類、原生動物など
多種多様な微生物から構成される高次構造体であることが知られている 4）。図 1 に示した通り、バイオフィルムは、「細胞外多糖
類マトリックス内に閉じこめられた細菌のミクロコロニーが点在し、その間を水が比較的自由に動ける water channels を含む密度の低いポリマーマトリックスが埋めている」というバイオフィ
ルムの三次元構造が明らかにされている 5）。
微生物はバイオフィルムを形成することによって、好ましい生育環境に滞留し、お互い情報交換しながら自らの役割を果たしつ
つ、様々な外的攻撃から身を守っている。例えば、バイオフィル
ムを形成した緑膿菌では、抗生物質に対する耐性が浮遊細胞に比べて数百倍も上昇し、薬剤治療を困難にしている 6）。

Costerton, 1995

図1

バイオフィルムの構造概念図 5）1

No.177(2021)

水之江ら 7）は、黄色ブドウ球菌のバイオフィルムから細胞外マトリクス（ECM）タンパク質を単離・同定した。ECM には、多糖体や DNA、タンパク質などが含まれていることは知られていたが、彼らのセリンプロテアーゼ（Esp）を用いた解析によって、約 130 種類のタンパク質が存在することが明らかにされ、その64％が細胞質タンパクであり、12％が分泌タンパク質、6％が膜タンパク質であった 8）。

4．バイオフィルムの形成過程
身近な環境におけるバイオフィルムの形成は、ある種の細菌が浴室の床や台所のシンクなどの担体に付着することから始まり、付着した細菌は汚れや洗剤などを栄養源に高温、多湿の条件下で短時間に増殖し、粘液物質を産生しつつさらに成熟していくもの「付着」と考えられている 9）。微生物の側に視点を移してみれば、は微生物の生活様式の一つであり、担体への付着に続くバイオフィルムの形成は微生物にとって大変安定した状態であり、彼らの生き残りに関して重要な意味を持っている。
一見、清浄にみえる物質表面でも多少の有機物や無機物が付着しており、いわゆるコンディショニングフィルムを形成している。このコンディショニングフィルムは、微生物にとって濃縮された栄養源であるばかりでなく、表面の物理化学的性質を変化させている。こうした物質表面に細菌が付着するためには、まず鞭毛や線毛を介して物質表面に可逆的付着状態と呼ばれるように緩く付着する。この状態は、浮遊状態と付着状態の中間の状態であり、一部の細胞は再び浮遊状態へと移行するが、ある細胞はバイ
オフィルム形成の前段階である不可逆的付着状態へと移行し、初期付着が完了する。その後、付着細胞の増殖や細胞外ポリマー（EPS: Extracellular polymeric substances）の産生によりバイオフィルムはキノコ状構造物の集合体へと成熟していく。EPS は菌体同士を互いに結びつけ、物質表面との付着を強固にし、バイオフィルムの構造を維持する働きを担っている。バイオフィルム
内部には EPS がみられない細長い空洞が観察されており、水路のような構造によりバイオフィルム内部の物質循環に寄与していると考えられている 10）（図 2）。
こうしたバイオフィルムの一連の形成過程において、常にそれを阻止する脱離作用が働いており、バイオフィルムの構造、組成、機能は変化し続けている。バイオフィルムからの脱離には、外部環境からの力による「受動的脱離」と、運動性の活性化や EPSの分解による「能動的脱離」がある。脱離によりバイオフィルムが新しい環境へと移動して新しいバイオフィルムの形成基盤となる 10）。

図2

2

5．支持固体（担体）の材質とバイオフィルム
形成
バイオフィルム形成に関する細胞レベルあるいは遺伝子レベル
でのメカニズムについては、かなり理解が進んできたが、支持固体の材質と細胞の初期付着やバイオフィルム形成との関係については不明な点が多い。
松村の解説 11）では、一般的に微生物細胞表面は負に帯電した
親水性の表面で覆われていると考えられていることから、正電荷に帯電した表面ではバイオフィルムが形成されやすいと記述されている。しかし、微生物細胞の初期付着に影響を及ぼす表面特性には、表面電荷や表面の親水性・疎水性だけではなく、表面粗さ、表面硬さ、表面張力、表面自由エネルギーなどが関与している可能性を指摘している。
藤澤らは、台所排水口から分離した菌株を用いて、ステンレス、
アクリル、塩化ビニル、ポリエチレン、シリコン、ガラスの 6
種類の担体を対象に、バイオフィルム形成量を ATP 値で比較した 12）。バイオフィルム形成量は供試菌株によって異なったが、Klebsiella pneumoniae が最も多く、担体別ではガラス、ステン
レス、シリコンの順に多かったが、三者に大差はなかった。
Piao らは、レジオネラ属菌 51 株について、ガラス、ポリスチ
レン、ポリプロピレンを用いて 25℃、37℃、42℃の温度条件でバイオフィルムの形成状況を比較している 13）。その結果、ガラスとポリスチレンでは、25℃よりも 37℃か 42℃の方が 2 倍から7 倍多かった。また、ポリプロピレンでは、37℃や 42℃よりも25℃の方が 2 倍から 16 倍多かった。
森川 14）は、細胞が担体に付着する力は、疎水結合やイオン結
合、水素結合、分子間力結合などの複合作用であると考えた。すなわち、細胞表層の構造や極性などが異なる細菌の種類ごとにバ
イオフィルムを形成しやすい担体の材質が異なると予想した。ところが、実験の結果、予想に反して細菌種を越えてシリコンやポ
リウレタン、あるいはポリエチレンやポリプロピレンで高いバイオフィルム形成が確認された。実験に使用した樹脂シートのゼー
タ電位や接触角を測定したが、バイオフィルムを形成しやすいこ
れらの材質に共通する物理化学的特性は認められず、細胞表層と支持固体表面との相互作用は解明されていない。

バイオフィルム形成の模式図 10）

No.177(2021)

関連性についてはまだまだ解明されていない点も多い。

7．バイオフィルムの解析・評価
7.1 バイオフィルムの構造解析

赤丸：シグナル物質：AHL（アシル化ホモセリンラクトン）

図3

図4

16）
微生物間情報伝達機構（Quorum Sensing）

細菌が用いているシグナル物質の一例 15）6．細菌の情報伝達機構（クオラムセンシング）
細菌にとって、環境変化に呼応した遺伝子発現の調整は、自らの生き残りを左右する重要な現象である。環境中における栄養素の欠乏、温度変化、急激な pH 変動などへ適応することは必須である。細菌は環境の変化、特に自身の存在環境における密度を的確に感知し、その濃度変化に応じて遺伝子の発現を巧妙に制御していることがわかってきた。近年、Autoinducer と呼ばれる細菌が産生するホルモン様物質（シグナル物質）を介しての情報伝達機構、クオラムセンシング（Quorum-sensing、QS）が注目されている。この “quorum” とは、会議などの成立に必要な定足数の意味であり、生体内などで細菌が自らの数が優位な状況になったということを感知し、病原因子などの発現を一斉に開始するシス
テムとして理解することができる 15）（図 316））。
細菌の種類によって産生されるシグナル物質の構造は様々であり、グラム陰性菌ではアシル化ホモセリンラクトン（AHL）や
AI-2 をはじめとする S- アデノシルメチオニン（SAM）誘導体が知られている。また、グラム陽性菌ではペプチドが、放線菌では（図 4）。
A ファクターなどがシグナル物質として同定されている 15）
バイオフィルム中では細胞が密集していることから、代謝産物
や分泌物だけではなく、シグナル物質も高濃度に蓄積すると考えられる。バイオフィルムはしばしば精巧な立体構造を示すが、その構造決定にも QS の関与が示唆されている。このように、バイ
オフィルム形成と細胞間コミュニケーションの間には重要な関連性が認められるが、その影響は培地などの実験条件によって大きく異なる。また、多くの細菌は細胞間コミュニケーションを欠いていてもバイオフィルムを形成することが知られており、両者のバイオフィルムはさまざまな機能を有した構造体であり、環境によって多様な生態を示すことがわかってきた。こうした発見はバイオフィルムの解析技術の発展に伴うものであり、バイオフィ
ルム解析技術の開発・改良は非常に重要である 14）。
バイオフィルムは微細な構造をもった複合体であり、その構造を知るために走査型電子顕微鏡を用いた観察が古くから行われてきた。しかし、こうした方法では生きた状態のバイオフィルムを観察することができなかったため、近年、これに代わり共焦点
レーザー走査型電子顕微鏡を用いた解析手法が広く利用されるようになった。この方法を用いることにより、バイオフィルムが環境条件などに応じて、マッシュルーム状の立体構造になることやバイオフィルム内部に水路状の構造空洞が存在することなどが明らかになった 5）（図 1）。
さらに、蛍光タンパク質を用いた共焦点レーザー走査型電子顕微鏡による解析が盛んに行われるようになり、バイオフィルムが付着、成熟、脱離のサイクルをもつことなどが明らかにされ、バイオフィルムの形成過程の経時的解析が進んだ（図 2）。ここで重要な役割を果たしたのがフローセル法である 17）。フローセル
法は、次に示すようなマイクロプレート法のように多条件を比較する場合には適さないが、バイオフィルムの立体構造について経時的な解析を行うには優れた手法であった。
さ ら に 近 年 で は、反 射 顕 微 鏡 法 を 基 礎 と し た Continuousoptimizing confocal reflection microscopy（COCRM）が 開 発 され 18）、物体からの反射光をシグナルとして利用する点が特徴であり、菌体の形質転換や染色を行わずに 3 次元構造を可視化することができ、そのバイオマス量を定量することも可能になった
9）。

7.2 バイオフィルムの定量解析
マイクロプレートを用いてバイオフィルムを実験的に生成させ、染色法（CV 法）によりバイオフィルム形成量を定量的に評価する方法は、以前から広く行われてきた 17）。この方法は比較的手技が簡単であり、様々な条件を同時に比較しやすい反面、バイオフィルムの形成段階で経時的に検討するには適さず、また純粋な分離株を用いた測定法であった。
一方、近年、多検体のバイオフィルムを効率よく作成し、抗菌薬や消毒薬の作用を評価できるマイクロプレート法を応用したデバイスが開発され、カルガリー・バイオフィルムデバイス法といわれる 19）。この方法は、ペグと呼ばれる突起物があるマイクロプレートの蓋を利用し、このペグにバイオフィルムを生成させてから、次にこのペグを供試物質に入れて反応させ、その効果を判定するものである 17）（図 5）。こうした方法により細菌が付着した状態での抗菌活性等を測定することが可能になり、「最小バイオフィルム除去濃度、MBEC」として定量的に評価することもできる。この方法を利用して薬剤感受性試験での抗菌活性を測定した報告もみられる 20，21）。また、ペグの材質を変えてバイオフィ
ルムを生成させ、CV 法により供試菌の付着特性を検討することも容易である。さらに、蓋から取外した個々のペグについて走査型電子顕微鏡や共焦点レーザー顕微鏡によりバイオフィルム構造の解析もできる 22）。いずれも 96 穴のプレート内で実験できることから、培地や薬剤等の条件を変えて経時的にバイオフィルム構3

No.177(2021)

polystyrene

serogroup13

siliconserogroup1
3

カルガリー・バイオフィルム
デバイス（ペグ）

図5

Minimum Biofilm Eradication Concentration（MBEC）の 測 定
方法 17）造の観察や菌数の定量が可能である。
図6

7.3 レジオネラ属菌の実験的バイオフィルム形成条件
近年、浴槽水などを原因として呼吸器系の日和見感染症である
レジオネラ症の発生が各地で報告され、4 類感染症である本感染症の報告件数は年間 1,500 件を超えており、患者数は毎年増加傾向である 23）。
レジオネラ属菌は、元来、土壌中に生息しているといわれ、これらが人工的な水環境に侵入し、そこで増殖したレジオネラ属菌がヒトへ飛沫核感染（空気感染）すると考えられている 24）。こうしたレジオネラ症の感染経路から、その感染源となる水環境の消毒が重要であると考えられている。しかし、浴槽水等の消毒だ
けでは一時的なものに過ぎず、根本的な対策にはならない。そこで、“ レジオネラ属菌のすみか ” となるバイオフィルムを除去することがレジオネラ症対策として必須である 25）。
これまで Legionella pneumophila に対する殺菌剤等の効果を評価するには、細胞を浮遊させた状態での接触による実験系が用
いられており 26）、付着状態での評価系は確立されていなかった。
そこで、L. pneumophila を担体に付着させたままの状態で殺菌効果を評価することを最終目的として、歯科領域などの研究で用いられている Calgary Biofilm Device19）を用いた MBEC（最小バイオフィルム除去濃度）assay に着目し、本菌のバイオフィルムを形成させるための条件について基礎的検討を行った 27）。また、薬剤処理後の評価方法として、従来は生菌数の測定や電子顕微鏡
による付着状態の比較であったが、今回は、㈱同仁化学研究所によって開発された WST 法 28，29）による Biofilm Viability Assay Kitを使用し、その反応状態を確認した。

CV 法によるバイオフィルム生成量の比較（30℃）

1μm
CV 法

図7

走査型電子顕微鏡像

ペグに形成されたバイオフィルム

37℃、5 日間培養後、マイクロプレートの各穴に 200μl ずつ分注した。これにペグ付き蓋をして 30℃で 3 日間付着させた。なお、この時のペグは半分が本来のポリスチレン、半分はシリコン加工したものを使用した（㈱同仁化学研究所）。
その後、新しい BCYEα液体培地にペグ付き蓋を移動させて30℃あるいは 37℃で 7 日間静置した。
2）バイオフィルム産生量の測定（Crystal violet: CV 法）常法によりバイオフィルムを 0.5％クリスタルバイオレット液で染
1010

109

CFU/well

7.3.1 供試材料
1）菌株：温泉浴槽水由来 L. pneumophila 血清群 1 群および 3
群の各 1 株2）増菌培地：BCYEα液体培地（㈱日研生物医学研究所）
3）ペグ付き蓋：Nunc-TSP、No. 445497
4）マイクロプレート：96F Without Lid Si Microwell Plate、No.
269787、Thermo Fisher Scientific・Nunc A/S5）活性測定試薬：Biofilm Viability Assay Kit（B603）（㈱同仁化学研究所）

7.3.2 実験方法
1）バ イ オ フ ィ ル ム 形 成 実 験

4

両 菌 株 を BCYEα液 体 培 地 で

図8

レジオネラ浮遊細胞の生物活性（WST 法，30℃，6 時間）

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色し、滅菌蒸留水で 2 回リンスしてから 95％エタノールで色素を溶出させ、波長 570 nm で OD 値を測定した。
3）微生物活性の測定（Water-soluble tetrazolium salt: WST 法）L.
pneumophila 血清群 1 群の培養菌液を希釈して 2 枚のマイク
ロプレートに 200μl ずつ分注した。次に、仕様書に準拠して調製した試薬を 20μl ずつ添加した。これらを 30℃と 37℃にそれぞれ放置し、2、4、6、8、24 および 48 時間後に波長450 nm で OD 値を測定した。

表1

新規バイオフィルムコントロール剤（BFC 剤）

7.3.3 成績および考察
1）バイオフィルム形成量の比較（n ＝ 12）①菌株：シリコン加工の担体に 30℃で形成させた場合、1 群は2.043 ± 0.336 であったが、3 群は 0.417 ± 0.155 と低く、
約 5 倍の差があった（図 6）。このことは、1 群と 3 群では増殖速度に差があり、前者の方が増殖速度が速いため
BF 産生量に反映したものと考えられた。
②担体：1 群を 30℃でポリスチレンとシリコンに形成させた場合、前者では 1.458 ± 0.183 であったが、後者では 2.043 ±0.336 と後者の方が良好であった（図 6）。この差を検討するために、両担体の表面を走査型電子顕微鏡で確認した
ところ、シリコンの方がスムースな表面であった。また、元素分析の結果では、ポリスチレンは炭素のみであったのに 対 し、シ リ コ ン は 炭 素（45.7 Mass％）、酸 素（24.1
Mass％）、シリカ（11.3 Mass％）などの複合であり、こうした相違が担体への付着に影響したものと考えられた。
③培養温度：1 群をシリコン加工で実験した場合、37℃では 0.999± 0.501 で あ っ た が、30℃ で は 2.043 ± 0.336 と 約 2 倍の吸光度であった。通常の L. pneumophila の検査では、培養温度を 37℃に設定して行うが、自然環境では 30℃前後で生息していることが多く、こうした温度に対する感受性が BF 産生量の増加に関係したものと推察された。
以上の結果から、L. pneumophila のバイオフィルム形成には、
血清群 1 群株を用い、シリコンの担体で 30℃、7 日間静置することが最適条件と考えられた。この条件でペグに形成した本菌のバイオフィルムを CV 法と走査型電子顕微鏡により確認したところ、図 7 のように良好な付着状態であり、今後の殺菌剤等の評
価実験に十分に利用できるものであった。

図9

図 10

バイオフィルム形成の抑制効果（星光 PMC 株式会社）

2）微生物活性（n ＝ 16）
図 8 に 示 し た よ う に、1010 CFU/well の 菌 量 で 比 較 す る と、
30℃では 6 時間後で最高の 1.825 ± 0.031 に達し、その後、OD
値は徐々に減少した。一方、37℃では、8 時間後で最高の 2.227± 0.095 となり、30℃の場合よりわずかに高い吸光度であった。
このように、L. pneumophila の細胞活性を WST 法で評価することが可能であり、MBEC の測定に利用することができると判断した。なお、これらの結果から、今後の OD 値の測定は 37℃で
6 時間後と 24 時間後の 2 回実施することを基本とした。

バイオフィルムコントロール剤（BFC 剤）の作用メカニズム 34）

5

No.177(2021)

8．バイオフィルムの形成防止・除去
現状、バイオフィルムの発生防止のポイントは、以下の 3 点である 30）。一つは、細菌の担体への付着防止である。バイオフィ
ルムの形成は、細菌が担体に付着することからスタートするた
め、これを防止することは理にかなっている。しかし、細菌の付着は担体の表面構造のみならず、細菌と担体との物理化学的相互関係などによって起こるため、細菌の活動を停止し、付着を阻止することは簡単ではない。二つ目は、付着は容認したとして、増殖させないことである。細菌がコンディショニングフィルムに付着しただけではバイオフィルムは形成されないが、増殖してマイクロコロニーを形成することで進展する。そこで、細菌の増殖を抑制するために、担体表面の水分を残さない超撥水の発想や、担体に抗菌性を持たせる 31）等の策があるが、なかなか完璧なものはない。そして三つ目は、バイオフィルムが成熟し、認識される前の段階で物理的に除去することである 31）。まさに清掃である。清掃後に殺菌剤等を使用して次のマイクロコロニーの形成をできるだけ遅らせることが現状での得策であろう。
2018 年 3 月に発行された日経サイエンスにおいて、「バイオフィルムを退治する、The War on Slime」と題する記事が掲載されている 32）。この記事は、ニューヨーク州立大学の Sauer 教授が書かれたものであり、彼女は、ビンガムトン・バイオフィルム
研究センターで副所長を務め、長年にわたりバイオフィルムの形
成や脱離、抗菌薬耐性のメカニズムについて研究している。内容
は、いかにしてバイオフィルムを攻略するか、その戦術についてまとめられたものである。彼女は最後に「何より重要な問題は、
バイオフィルムがみな同じではない点だ」と指摘し、バイオフィ
ルム対策の重要性と、これを完全に制御することの難しさに言及している。

8.1 クオラムセンシングによるバイオフィルムの形成抑制
ト ピ ッ ク ス と し て、池 田 と 諸 星 に よ り 紹 介 さ れ て い る
Quorum-sensing 制御に基づくバイオフィルム形成抑制について
ふれる 33）。QS は既述したとおり、細胞間情報伝達機構であるが、これがバイオフィルムの形成に関与していることが明らかにされてきた。そこで、この QS を制御することによりバイオフィルムの形成を抑制しようという新しい手法の開発である。彼らは、QS のシグナル物質の 1 種であるアシル化ホモセリンラクトン（AHL）分解酵素によるバイオフィルムの形成阻害や AHL 構造類
似体によるバイオフィルムの形成阻害について検討している 33）。
また、久保と五十嵐の解説 34）では、細菌の細胞間シグナル伝達を介したバイオフィルム形成を阻害する安価で実用的な物質を利用した新規バイオフィルム形成抑制・剥離剤（バイオフィルム
コントロール剤：BFC 剤）を開発し（表 1）、RO 膜のバイオファ
ウリングの抑制について検討している。この BFC 剤は、QS を阻害してバイオフィルムの形成を抑制する物質と界面活性剤を主としたバイオフィルムの剥離に有効な物質の複合剤である。その作用機序は図 9 に示した。たとえば、これを RO 膜に用いるとバイオファウリングを抑制し（図 10）、膜モジュールの洗浄や交換頻度を抑えることができたとしている 34）。

8.2 Legionella pneumophila のバイオフィルム対策における電解次亜塩素酸水による1例
前述のように、Calgary Biofilm Device を用いて実験的にレジオネラ症の原因菌である L. pneumophila のバイオフィルムを形成させることができた。そこで、この実験系により本菌のバイオ6

フィルムに対する電解次亜塩素酸水の形成阻害と不活化について検討した 35）。

8.2.1 供試材料
電解次亜塩素酸水（以下、電解次亜水、日本ヘルシーシステム
協会）および市販の微酸性電解水（微酸研）を用い、対照として
次亜塩素酸ナトリウム溶液（以下、次亜水、富士フイルム和光純薬）を使用した。

8.2.2 実験方法
1）バイオフィルム形成阻害試験
温泉浴槽水由来 L. pneumophila 1 群のバイオフィルム形成途中において、供試消毒剤と 30 分間接触させたのち、バイオフィ
ルム形成量を CV 法により測定した。
2）バイオフィルム不活化試験
バイオフィルム形成後に供試消毒剤と 60 分間接触させたのち、
WST 法 により微生物活性を測定した。

8.2.3 成績
1）バイオフィルム形成阻害（n ＝ 24）
各 OD 値は、電解次亜水（13.2 mg/l）が 0.145 ± 0.064、次亜水（11.8 mg/l）が 0.150 ± 0.065、微 酸 性 電 解 水（10.1 mg/l）
が 0.451 ± 0.375 の順であった。なお、無処理（対照）の OD 値
は、2.579 ± 0.429 であった。
2）バイオフィルムにおける不活化（n ＝ 24）
各 OD 値は、電解次亜水（11.4 mg/l）が 0.563 ± 0.158、微酸性 電 解 水（10.3 mg/l）が 0.590 ± 0.129、次 亜 水（12.0 mg/l）
が 0.631 ± 0.215 の順であった。なお、無処理（対照）の OD 値
は、0.708 ± 0.253 であった。
このように、電解次亜水は L. pneumophila のバイオフィルム
に対して形成阻害および不活化に有用であると考えられた。

9．おわりに2019 年 2 月から新しいレジオネラ症の診断薬「リボテスト
レジオネラ」が市販され、保険点数も付与された。今後、レジオ
ネラ症の届出件数はさらに増加するものと予想される。また、これに伴い、現場でのレジオネラ属菌対策が一層求められることになる。そこで重要なことは、従来の水環境に浮遊するレジオネラ
属菌だけを殺菌・消毒するのでは不十分であり、その「すみか」となるバイオフィルム対策が必須となる。
概して、バイオフィルムの発生防止に対する特効薬はない。既述したとおり、バイオフィルムはライフサイクルによって形成されるため、少しでもこの形成を先送りするための努力が必要である。相手が様々な微生物の集合体であるだけにバイオフィルムの発生を制御することは容易ではなく、微生物と人間との永遠の課
題かもしれない。
なお、本稿の内容は、第 46 回建築物環境衛生管理全国大会のシンポジウムでの講演内容に加筆したものである。また、内容の一部は、すでに日本防菌防黴学会第 45 回年次大会（東京）および第 35 回日本環境感染学会総会・学術集会（神奈川）において発表した。
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次亜塩素酸水の有用性 ”，P48-2, p. 259，第 35 回日本環境感染学会総会・学術集会抄録集（2020）［著者プロフィール］
氏名：古畑 勝則（FURUHATA Katsunori）
所属：麻布大学 生命・環境科学部〒 252-5201 神奈川県相模原市中央区淵野辺 1-17-71
Tel：042-754-6215
Fax：042-754-6215
E-mail：furuhata@azabu-u.ac.jp
出身学校：筑波大学大学院修士課程環境科学研究科
学位：博士（獣医学）
専門分野：環境微生物学、微生物生態学、微生物制御学
現在の研究テーマ：バイオフィルムやレジオネラに関する研究

学会発表のご案内
日本防菌防黴学会にて、小社の技術部門から試験片用バイオフィルムキットのポスター発表を行ないます。詳細に関して
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日本防菌防黴学会第 48 回年次大会
会期：2021 年 9 月 8 日（水）～ 9 日（木）会場：オンライン開催

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No.177(2021)

Methionine-Selective Protein Bioconjugation

Yvonne D. Hall

Hisham M. El-Shaffey

Department of Chemistry,
North Carolina State University
Undergraduate Researcher

Department of Chemistry,
North Carolina State University
Graduate Student

Elizabeth J. Gross

Jun Ohata

Department of Chemistry,
North Carolina State University
Undergraduate Researcher

Department of Chemistry,
North Carolina State University
Assistant Professor

Abstract
Despite significant advances of protein bioconjugation
strategies targeting a variety of amino acid residues, chemicaltagging of methionine residues have been extremely limited.
Recent approaches leverage unique reactivity of the thioether

1. Introduction
Chemical functionalization of natural proteins has become an
essential technology in a wide variety of protein-based research
fields and applications. Protein modification technology provides

group of the methionine residue through redox and alkylation
reaction pathways with the suppression of cross reactivity
toward other nucleophilic amino acid side chains. This Review
Article highlights the development and applications of the three
distinct chemical probes recently reported for selective
modification of methionine residues of natural proteins.

opportunities for the increase of stability, addition of new
functionality, and structural changes. One important aspect ofprotein modification is the development of therapeutic agents;for example, antibody-drug conjugates（ADCs）are targetPhotoredox alkylation

Figure 1. Chemoselective methionine modification in natural proteins. Left top（orange）: Redox-Activated Chemical Tagging（ReACT）
method to selectively form a sulfimide group on methionine residue with oxaziridine reagents. Left bottom（green）: Sulfonium
formation with hypervalent iodine regents. Right（blue）: Radical alkylation with electron-poor alkene and lumiflavin photocatalyst.

8No.177(2021)

Figure 2. Applications of methionine-selective labeling with first generation oxaziridine reagents.（a）Chemical structure of first generation
oxaziridine reagents with an acyclic alkyl moiety.（b）Activity-based protein profiling（ABPP）for oxidation sensitive methionine
residues in cell lysate with alkyne-tagged first generation oxaziridine（Ox4）. ENO1: enolase 1（dark orange）.（c）Methionine
proximity-activated imaging reporter（Met-PAIR）method for reactive oxygen species（ROS）and calcium imaging. CaM:
calmodulin. Green ball: an antibody-recognizable handle such as biotin and Oregon Green.

specific proteins covalently labeled with potent small moleculebased drugs.1） Traditionally, protein modifications target highly
nucleophilic amino acid sites such as lysine（primary amine）andcysteine（thiol）. However, because of lysine's high abundance,
targeted reactions are prone to heterogenous labeling of multiple
sites, impairing reproducibility and structural/functional
characterization. In this context, cysteine modification benefits
from its lower abundance, but the formation of the disulfide
bonds and other various post-translational processes greatly
decrease their accessibility. Thus, a significant need fordevelopment of novel protein modification technologies to target
different amino acid residues remains.
Due to its unique reactivity and low natural abundance,
methionine offers the opportunity for the selective labeling ofproteins. The sulfur atom of the methionine provides its
functional diversity in living systems such as sulfoxide formation
under the oxidative stress and coordination to various metal
ions. The scarcity and hydrophobicity of methionine is beneficial
for the development of new site-specific labeling technologies,
as those attributes limit the number of surface-exposed residues
accessible for the modification process. Despite the promising
attributes, however, selective chemical modification ofmethionine residues still remains underdeveloped, in part due tothe presence of the plethora of other nucleophilic functionalgroups in proteins. Alkyl halide and cyanogen bromide are theclassical examples of methionine-targeting reagents, thoughthose approaches suffer from various issues such as harshconditions, side reactions, and/or limited substrate scopes.2）- 4）
In this Review Article, we focus on three recently reported
methionine-specific bioconjugation methods and theirapplications for biological studies（Figure 1）. The seminal workof the modern methionine labeling strategies is the sulfimide
formation reaction with the oxaziridine reagent termed RedoxActivated Chemical Tagging（ReACT）method developed by the
Chang and Toste laboratories in 2017（Figure 1, left top inorange）. 5） Inspired by the native biological oxidation ofmethionine thioether to methionine sulfoxide, this sulfimideforming reaction involves the nucleophilic attack of the sulfur

atom to the nitrogen atom of the oxaziridine labeling probe
through release of a benzaldehyde group. In the following year,
Gaunt and co-workers reported hypervalent iodine-based diazo
sulfonium forming reaction on methionine residue, which
introduces diazo ester group onto the sulfur atom throughgeneration of the aryl iodide side product（Figure 1, left bottom
in green）. 6） More recently, Macmillan and co-workers
demonstrated radical alkylation reaction of the methionine withelectron-deficient alkene and a lumiflavin photocatalyst throughthe formation of the radical species on the terminal carbon of themethionine side chain（Figure 1, right in yellow）.7） The following
sections will highlight the unique applications of each methionine
labeling technology.

2. Oxaziridine reagents
2.1. First-generation oxaziridine for proteomics andimaging applications
An early success of the Redox-Activated Chemical Tagging（ReACT）technique was in its application as a chemical probe
for activity-based protein profiling（ABPP）to elucidate
relationships between protein activity and the reversible
oxidation of methionine residues, an emerging physiologicallyimportant class of redox post-translational modifications.5） One
notable example of methionine oxidation is in the regulation ofactin polymerization; Terman and co-workers demonstrated that
actin assembly and disassembly are controlled by the oxidation
and reduction of the Met44 and Met47 residues by MICAL, an
intracellular flavoprotein monooxygenase. 8） The current
understanding of the physiological roles played by methionine
residue oxidation has lagged behind other amino acid oxidations
such as cysteine, whose impacts on disease progression is well
documented,9） due to a lack of suitable chemical probes. In thiscontext, ABPP provides a chemoproteomic approach that
determines the functional state of proteins through chemicallabeling.10） As the oxaziridine labeling of a methionine residue
cannot proceed on a methionine sulfoxide group, the labelingefficiency of a methionine residue on a protein in a biologicalsample would be inversely correlated to its oxidation status.

9No.177(2021)

Indeed, owing to its high chemoselectivity for methionine andmethionine residues upon oxidation（i.e. methionine sulfoxide
compatibility with cellular conditions, the ReACT method wasformation）in actin, the dual labeling by methionine-selective
successfully employed as an ABPP tool to mammalian cell
oxaziridine compound and PLA technique can sense ROS levels（HeLa cells）lysates with varying doses of oxaziridine used toin live cell samples. This technique termed methionine proximityidentify proteins with oxidatively sensitive methionine residues.
activated imaging reporter（Met-PAIR）is a unique application of
Validating oxaziridine-based ABPP and demonstrating
chemoselective protein modification in living systems to visualize
applicability of the ReACT method to complex biomolecule
the intracellular amount of a biological analyte, which would not
mixtures, the proteomics results identified the actin Met44 andbe easily accomplished by traditional protein labeling reagents
Met47 residues mentioned above at the lower dose levels ofsuch as iodoacetamide for cysteine residues due to their highoxaziridine reagents. Importantly, the oxaziridine-based ABPP
cytotoxicity. More recently oxaziridines have been employed byalso identified the Met 169 residue of enolase, near the protein's
researchers at Bristol-Myers Squibb for developing novel 18F
active site, as a highly reactive target. Subsequent experiments
PET imaging agents as well（Section 3）.12）with site-specific mutagenesis and kinetic measurement revealed
2.2. Second-generation oxaziridine for preparation ofthat the oxidation of enolase Met 169 residue is a crucial
stapled peptides and antibody-drug conjugatesmodulator of enolase's enzymatic activity. This study
In order to modulate the stability of the modification linkage
demonstrates the practical utility of the oxaziridine reagents for
between proteins and installed functionalities, the tunability ofunderstanding biological roles of methionine oxidation.5）
The excellent stability and selectivity of oxaziridine reagentsthe sulfimide linkage was investigated to facilitate wider adoption
allow for their use in protein labeling in vivo, which has beenof the oxaziridine labeling technique.13） Toste, Chang, and coworkers probed the physical parameters of a library ofutilized for calcium and reactive oxygen species（ROS）imaging
oxaziridine reagents, with varying functional groups attached to
together with proximity ligation assay（PLA）in a collaboration
the urea moiety（Figure 3a,b）. Among the various physicalbetween the Chang, Miller, and Toste laboratories.11）Reactivitiesof methionine residues in a particular protein can be significantly
parameters of oxaziridine compounds with different electronic
altered in response to cellular small molecules, and the reactivity
and steric functional groups including the urea's dipole moment
alteration has been applied for calcium imaging through chemical （μ）and sulfimide's natural bond order（NBON）, the vibrationallabeling of calcium binding protein calmodulin（CaM, Figure 2c）.
constant of the urea C=O stretch（νC=O）yielded the best
correlation with the experimental decomposition rate of sulfimide
Because of the conformational change and exposure ofhydrolysis. In other words, the carbonyl stretching frequency
methionine residues in the presence of calcium, the chemical
provided a predictive platform for the design of next generation
labeling efficiency of the oxaziridine toward those methionine
oxaziridine with the linkage stability. With piperidine as aserves as a proxy for the amount of calcium in the biologicalsubstitution group, the next generation of oxaziridine displayedsamples such as cultured mammalian cells（e.g. HEK293T,
significantly increased sulfimide linkage stability. Stability
Jurkat, and hippocampal neuron cells）as well as zebrafish.
comparisons, under physiologically relevant conditions（pH 7.4
Although the methionine-selective reaction itself cannot function
and 37 ℃ in phosphate buffered saline）demonstrated that 59％
as a calcium reporter due to off-reactivity toward otherof sulfimide linkages produced by the second-generation
methionine-containing proteins, PLA with antibodies against
oxaziridine remained even after 5 days while sulfimide linkages
CaM and chemical tag（green ball in Figure 2c）as well as
produced by the first-generation oxaziridine had completely
secondary antibodies bearing corresponding DNA strands
decomposed. As a further demonstration of the enhanced utility
provide fluorescence signals only from oxaziridine-labeled CaMof the second-generation oxaziridine, bis-oxaziridine compounds
through consecutive DNA hybridization processes（Figure 2c）.
were synthesized and reacted with several peptides to prepare a
Furthermore, taking advantage of the reactivity decrease of

Figure 3. Applications of methionine-selective labeling with second-generation oxaziridine reagents.（a）Chemical structure of second
generation oxaziridine reagents with a cyclic alkyl moiety.（b）Physical chemistry approach to discover the optimal oxaziridine
reagent for the stable sulfimide linkage.（c）Cartoon of a peptide stapled with bis-oxaziridine reagent with the piperzyl motif forthe higher stability.（d）Schematic description of the systematic screening process for the preparation of antibody（Herceptin）－
drug conjugates. Site-specific mutagenesis was used to identify the optimal sites from the various locations（red balls depicted inwild-type Herceptin）for the drug installation with the second generation oxaziridine reagent.

10No.177(2021)

Figure 4. Applications of hypervalent iodine- and photoredox alkylation-based methionine labeling.（a）Secondary modification process ofthe sulfonium product generated by the hypervalent iodine reagent. M = RuCl 2 or Ir.（b）Description of the incorporation offluorine-18 radioisotope onto a methionine amino acid, peptide, or protein with the hypervalent iodine or first generation
oxaziridine reagent.（c）Installation of the poly（arginine）tag on a methionine-containing protein（green fluorescence protein,
GFP）through the photoredox alkylation reaction.

series of stapled peptides, and indeed the stapled peptides
demonstrated improved cellular uptake with human embryonickidney cell lines（HEK293T）using confocal microscopy and flow
cytometry.
The second generation oxaziridine with the increased
modification linkage stability was also utilized for production of
antibody-drug conjugates（ADCs）in combination with sitespecific mutagenesis（Figure 3d）.14） The study led by Wells andco-workers focused on the identification of the optimal
modification site of anti-Her2 antibody（trastuzumab orHerceptin）through systemic approaches. Of the 95 potential
m u t a t i o n s i t e s o f a n t i g e n - b i n d i n g f r a g m e n t （F a b ）o f
trastuzumab, 56 mutants were identified satisfying the ADC
production criteria including high expression level throughE. coli, high binding affinity, thermal stability, and efficientlabeling with first generation oxaziridine reagents. Alongside thesecond generation oxaziridine reagents, further investigation
revealed 4 sites on the Fab region can generate suitableconjugates with enhanced stability（＞ 85％ conservation of theoxaziridine label after 3 days at 37 ℃）.
Conjugation of the mutated antibody fragment with thesynthetic peptide-based tubulin inhibitor monomethyl auristatin
F（MMAF）produced potent ADCs toward breast cancer celllines such as BT474-M1. By taking advantage of the structural
homology between Fab and Fc regions of the antibody, thescreening process was extended to discover the optimal
conjugation sites in the Fc region as well. With the ideal
modification sites identified for both Fab and Fc regions, mutantsof the whole trastuzumab were produced（e.g. LC.T74M/
HC.S21M）and tested on multiple breast cancer cells lines and a
BT474-xenograft mouse model, showing the promoted efficacyof the ADCs compared to the unmodified antibody andunconjugated MMAF. In addition to the practical success of thisapproach to generate the potent ADCs, this study also illustrated
the potential utility of the methionine as bioconjugation sites by
suppression of the nonspecific reactivity such as that of lysine
and cysteine.

3. Applications of hypervalent iodine
S -alkylation and photoredox alkylation
The versatile reactivities of the diazo sulfonium species formedby the hypervalent iodine reagent allowed for secondaryfunctionalization on the methionine residue, including thesubsequent radioisotope incorporation（Figure 4）.6） While thesulfonium product possesses remarkable stability in water（halflife ＞ 100 h）, the inherent reactivity of the diazo group enables
attachment of various groups through a photocatalytic reduction
as well as phosphine-based reduction to cleave the entire
modification from the residue（Figure 4a）. By leveraging thestability increase of the photocatalytically reduced sulfonium
group, Bonacorsi and co-workers demonstrated successful
incorporation of 18F radioisotope through copper-catalyzed
azide-alkyne cycloaddition reaction. 12） Thus, the sulfonium
linkage is of great use for the modulation of the stability andsubsequent addition of a new functionality through thephotoredox catalysis.
The photoredox alkylation reaction facilitates the incorporationof diverse chemical functionalities to a methionine residue of aprotein（Figure 4c）. 7） Despite the generation of the putative
methionine radical species through single-electron transfer（SET）process during the modification, this photoredox
modification exhibited excellent functional group tolerability
toward a variety of functional groups including primary amines,
azides, alkynes, and ketones. Conservation of native proteinfunctions was confirmed on the alkyne-labeled enhanced green
fluorescence protein （eGFP）. The modified eGFP was amenable
to the subsequent copper-catalyzed azide-alkyne reaction toappend biotin and poly（arginine）tags, which displayed
increased cellular uptake in the confocal microscope experiment（Figure 4c）.

4. Conclusion
The three classes of methionine-selective chemical reagentsdeveloped for protein bioconjugation presented here possess
potential for a broad range of applications largely due to rapid
reaction kinetics. Although good selectivity has been achieved,
particularly in the Redox-Activated Chemical Tagging（ReACT）
method, combining approaches that can circumvent the11No.177(2021)

14）S. K. Elledge, H. L. Tran, A. H. Christian, V. Steri, B. Hann, F. D. Toste, C. J.
problems of undesired side reactions, including cysteine-capping
6
Chang and J. A. Wells, “Systematic Identification of Engineered
andstrategies with a maleimide reagent（hypervalent iodine）
Methionines and Oxaziridines for Efficient, Stable, and Site-Specificuse of inert atmosphere to curtail methionine oxidation
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（photoredox alkylation）, can augment this selectivity evenfurther. 7） Indeed, three independent research programs
developed vastly different chemical approaches to form distinct ［Contact］
product structures, reflecting the diverse chemical and biological
Yvonne D. Hall
reactivity of methionine: 1）sulfimide formation（oxaziridine
ydhall@ncsu.edu
labeling）/methionine sulfoxide（oxidation of methionine）, 2）
ORCID iD: 0000-0001-9405-4867
sulfonium formation（hypervalent iodine）/S-adenosyl methionine
Elizabeth Gross（SAM, S-alkylation of methionine）, and 3）C-C bond forming
ejgross@ncsu.edu
modification（photoredox catalysis）/intact methionine. The
ORCID iD: 0000-0003-2153-5381
diverse achievements of those chemical probes are indicative of
Hisham El-Shaffey
their exceptional utility for the elucidation of undiscovered
helshaf@ncsu.edu
biological roles of methionine as well as the novel protein
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conjugates preparation.
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Jun Ohata ( 大畠潤 )johata@ncsu.edu
ORCID iD: 0000-0002-3614-7472
North Carolina State University
Department of Chemistry
2620 Yarbrough Drive
527A Dabney Hall
Raleigh, NC 27695-8204

オンライン開催（無料） 細胞死セミナー（全 4 回）
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第 1 回 6/25（金）第 2 回 7/21（水）第 3 回 8 月上旬
第 4 回 9 月上旬

細胞死についてネクロプトーシスについて
パイロトーシスについて
フェロトーシスについて

同仁化学研究所では細胞死研究のサポートを目的に専門の先生方をお招きし、全 4 回にわたるセミナーを予定しています。
細胞死は生体の恒常性維持に必要であり、古くから知られているアポトーシスやネクローシスだけでなく、近年多くの種類の非アポトーシス細胞死が発見され、がんや免疫、老化、発生などの様々な研究分野で注目を集めています。そのため、「細胞死」研究を専門としていない研究者や学生にとっても大変有意義なセミナーになると考えています。
第 1 回 6/25（金）講師：三浦 正幸 教授

第 3 回 8 月上旬予定
講師：須田 貴司 教授

東京大学大学院 薬学研
究科遺伝学教室

金沢大学 免疫炎症制御研究分野

第 2 回 7/21（水）講師：中野 裕康 教授

第 4 回 9 月上旬予定
講師：今井 浩孝 教授

東邦大学 生化学講座生
化学分野

北里大学 薬学部・大学
院薬学研究科

No.177(2021)

Topics on Chemistry
蛍光色素による細胞間 H2O2 シグナル伝搬の可視化
株式会社同仁化学研究所

岩下秀文

過酸化水素（H2O2）は活性酸素の一種で、酸化ストレスと密る。ミクログリアとニューロンを用いた細胞間でのレドックスシ
グナルの可視化は序章であり、PG1-FM を用いた詳細な研究に接に関係しており長い間研究の対象となってきた。H2O2 は酸化ストレス因子としてだけではなく、化学的安定性と高い膜透過性より神経細胞障害などの病態解明に寄与できるだろう。また、さから、細胞内で重要な働きをするシグナル分子として注目されてらに複雑な細胞集団での H2O2 シグナルの役割を明らかにする
ツールとしての活躍も期待したい。
おり、細胞増殖、分化、移動、細胞死など多くのシグナル経路の制御に関わっている。シグナル分子としての H2O2 の研究は、一
過的かつ反応性の高さがゆえに主に細胞内でのイベントに注目されてきた。一方で H2O2 の細胞間でのシグナル伝搬は十分に理解されていない。なぜならば、発生した H2O2 シグナルの空間的情報が時間と共に変化するため、シグナルを正確に可視化するための化学的アプローチに制約があるためである。本稿では、ある瞬間の空間的な情報を記録することで細胞間での H2O2 のやり取りを可視化した蛍光色素について紹介したい 1）。
今回筆者らはこれまで報告してきたボロン酸エステルを H2O2
反応性部位に持つ色素（PF2）2）にフルオロメチル基を付与した
蛍光色素、PG1-FM を開発した（図 1A）。フルオロメチル基はH2O2 と反応後生成するキノンメチドを介して近接する分子と共
有 結 合 す る こ と が 可 能 で あ る（図 1B）。つ ま り PG1-FM は、（A） PG1-FM と PF2 の化学構造、（B）PG1-FM のキノンメチド
発生とそれを介したタンパク質との結合
H2O2 発生箇所で H2O2 シグナル捕捉し可視化する。浦野らによる先行研究において、キノンメチドを発生する蛍光色素を用いることで 1 細胞レベルで標的分子を有する細胞を見分けることからも、キノンメチドを介した周辺分子との結合により色素の拡散を抑 制 す る こ と が 期 待 で き る 3，4）。RAW264.7 細 胞 を 用 い て
phorbol 12-myristate 13-acetate（PMA）刺激により細胞内でスーパーオキシドを介して H2O2 を発生させると、細胞内で PG1-FM
由 来 の 蛍 光 が 顕 微 鏡 に よ り 確 認 さ れ た。ま た、
diphenyleneiodonium（DPI）や Ebselen などの阻害剤を共存させた場合、細胞内の蛍光が低下したことから、PG1-FM は H2O2 を選択的に検出していることが確認できた。さらに、H2O2 と反応した PG1-FM は細胞内滞留性が飛躍的に向上しているため、顕微鏡を用いた蛍光イメージングだけでなくフローサイトメトリーによる定量解析にも適応できる。フルオロメチル基を導入することで色素の拡散防止、それによる細胞内滞留性の向上により、細胞内 H2O2 シグナルを高感度に検出することが可能となった。次に、細胞間でのレドックスシグナルを可視化するため、異なる
2 種類の細胞、ミクログリアとニューロンを用いた共培養系へ応用した。ミクログリアは lipopolysaccharide（LPS）刺激により細胞内で H2O2 を生成する一方で、ニューロンは H2O2 を生成することができない。この性質の違いを利用し、ミクログリアと
図 2 ミクログリアからニューロンへの H2O2 シグナル の伝搬をニューロンを共培養しながら LPS 刺激によりミクログリアのみ
PG1-FM により検出（スケールバー：20 μm）
H2O2 を発生させた。長時間刺激による H2O2 の発生後、PG1-FMを添加し、H2O2 を保持した細胞を検出した。期待通り、H2O2 を生成したミクログリアだけでなくミクログリアに接触している［参考文献］
ニューロンにおいても PG1-FM の蛍光が観測された（図 2）。一
1） Iwashita, H. et al., “A tandem activity-based sensing and labeling strategy
方、ミクログリア内でスーパーオキシドと H2O2 発生に必須のenables imaging of transcellular hydrogen peroxide signaling”, Proc. Natl.
p47（p47phos-/-）をノックアウトしたミクログリアを用いた場合、Acad. Sci. U.S.A., 2021, 118, e2018513118.
2） Dickinson, B. C. et al., “A palette of fluorescent probes with varying
ニューロン内では PG1-FM の蛍光は観測されなかった。これら
emission colors for imaging hydrogen peroxide signaling in living cells”, J.
の結果は、ミクログリアで発生した H2O2 シグナルがニューロン
Am. Chem. Soc., 2010, 132, 5906-5915.
に伝搬し、ニューロン内で PG1-FM の蛍光が観測されたことを
3） Doura, T. et al., “Detection of lacZ-positive cells in living tissue with
示唆している。
single-cell resolution”, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2016, 55, 9620-9624.
本稿で紹介した PG1-FM は、H2O2 の感知、キノンメチドを介
4） Chiba, M. et al., “Activatable photosensitizer for targeted ablation of lacZした近傍分子への標識と連携して機能することで H2O2 シグナル
positive cells with single-cell resolution”, ACS Cent. Sci., 2019, 5, 1676を記録すると共に 1 細胞レベルで H2O2 シグナルを可視化してい
1681.

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No.177(2021)

新製品
試験片用バイオフィルム形成能測定キット
Biofilm TestPiece Assay Kit
詳細情報は、＜特長＞
・任意の素材（試験片）を簡便に評価できる
・浸漬面積が均一なので再現性の良いデータが取得できる・多検体をまとめて簡便に処理することができる（最大 24 片）

B606

同仁

検索

バイオフィルムは医療器具内の細菌汚染やう蝕・歯周病の感染の要因とされ、医科領域や歯科領域など様々な分野で問題視されています。そのため、抗バイオフィルム活性を有する素材の開発や薬剤の探索が注目を集めています。Biofilm TestPiece Assay Kit は任意の素材（試験片）を付属のデバイスに取り付け、試験片に触れることなくバイオフィルム形成能の評価を行うことができます。

＜既存法との比較＞
既存法ではバイオフィルムの剥離や形成ムラが見られるのに対して、本製品では試験片が均一に培養液に浸漬されるため、ムラのないバイオフィルムが形成されました。また、バイオフィルムを形成した試験片をクリスタルバイオレットで染色し、エタノールに抽出後、プレートリーダーで測定（595 nm）した結果、既存法よりもバラツキの少ない結果が得られました。

品名
Biofilm TestPiece Assay Kit ※容量24 tests

希望納入価格（￥） メーカーコード￥25,000

B606

24-well Plate

8 plates

RequestB608※ 24-well プレートは同梱しておりません。別途、推奨品もしくは、24-well プレートをご購入ください。

これから微生物を実験される方向けに
微生物実験に関する基礎をまとめた情報を公開中

詳細な情報はWeb にて公開中！
目次（各項目に移動します）
1. 微生物とは2 分で解説1-1. 微生物ってなんだ？
1-2. 微生物の大きさ
2. 微生物に関連した注目の話題
2-1. バイオフィルム
2-2. 損傷菌
2-3. HACCP（ハサップ）

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4 分で解説3. 微生物を用いた実験例
3 分で解説3-1. 培養法
3-2. ①グラム染色②蛍光染色法
4. お問合せ・試薬に関するお問合せ
・実験のご依頼に関するお問合せNo.177(2021)

関連製品
バイオフィルム形成阻害測定キット・バイオフィルム薬剤効果測定キット
Biofilm Formation Assay Kit
Biofilm Viability Assay Kit

分かりやすい説明動画はこちら＜特長＞
・測定の手間を大幅に低減
・バラツキを抑えた多検体処理が可能

B601

B603

既存法はマイクロプレートの底にバイオフィルムを形成するため、菌の培養に伴う培地交換や、染色工程前後の洗浄作業に多くの手間を要し、バラツキの問題がありました。本キットは蓋に固定されたピン上にバイオフィルムを形成させるため、培地交換や染色工程が蓋を移すだけで完了し、操作が非常に簡便です。

品名
Biofilm Formation Assay Kit

容量96 tests

Biofilm Viability Assay Kit

96 tests

希望納入価格（￥） メーカーコード￥16,300
B601￥18,700

小社製品を使った論文を追加しました。

バイオフィルム

B603

同仁

検索

微生物増殖アッセイキット
菌種毎と使用論文を掲載しています。

Microbial Viability Assay Kit-WST

M439
＜特長＞
・評価にかかる時間を大幅に短縮
・生菌の活性評価を濁度から色の変化へ

検索

同仁＜従来法との比較＞＊菌種によって最適条件は異なります。
既存法

本キットに含まれる小社の開発品である還元発色剤 WST-8 は、
電子メディエーターを介して微生物内で生成する NAD(P)H によって還元され発色します。還元された WST-8 ホルマザン量は
微生物の代謝活性に比例しており、吸光度を測定することで、微生物の生存率や活性度合いを簡便に測定することができます。

＜操作＞

コロニー形成法
所要時間

特徴

24 時間以上

・標準法
・操作が煩雑96 well プレートに菌懸濁液を準備し、試薬を添加する。
品名

本方法
濁度法

18-24 時間

WST 法
約 8 時間＊6 時間（培養
発色 2 時間 ）・短時間でのマイク・マイクロプレート
ロプレートアッセ
アッセイが可能
イが可能
・代謝活性は見れな・代謝活性を指標といする

容量

希望納入価格（￥） メーカーコード

100 tests ￥6,000
Microbial Viability Assay Kit-WST
500 tests ￥21,300
微生物懸濁液に試薬を添加

インキュベーター
内で発色反応

M439

吸光度測定

※ 14、15 ページの 4 製品は、福岡県工業技術センター生物食品研究所との共同開発品です。

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No.177(2021)

細胞増殖・毒性測定－試薬の選び方－
細胞増殖・毒性試験には様々な測定方法がありますが、測定する指標から細胞増殖能力、細胞生存能力、細胞毒性の大きく 3 つに分類されます。中でも細胞生存能力は、細胞内の酵素活性を指標とし、操作の簡便性や特殊な装置を必要とせず、また増殖能力や細胞毒性を間接的に測定できることから最も汎用されています。細胞生存能力を指標とした測定法について指標や特長をご紹介します。
指標

ミトコンドリア内脱水素酵素活性細胞内脱水素酵素活性エステラーゼ活性

検出装置
（検出）

プレートリーダー（吸光度）

プレートリーダー（吸光度）

プレートリーダー、
FCM、蛍光顕微鏡
（蛍光）

メリット

・価格が安い・操作が簡便：ミスが少ない
・試薬安定性が高い

・様々な装置に対応
・反応時間が短い（15 分）

注意点・酸化還元物質の影響有・反応後に試薬溶解が必要

・酸化還元物質の影響有・血清によるバックグラウンド上昇
・試薬の漏れ出しに注意が必要

・コスト重視の方・これからはじめる方
・96 well プレートで測定される方・イメージングや FCM 測定する方・酸化還元物質を使う方［CK04］
Cell Counting Kit-8［CK06］
Cell Conting Kit-F［C320］［C396］
Calcein-AM

こんな方に
オススメ！

［メーカーコード］ ［M009］
製品名
MTT

これから実験を始める方へ
細胞増殖・毒性測定の意義から、試薬選定のポイント、併用実験までわかりやすく解説しています！（次ページ p.17, 1 番目の動画）

細胞増殖毒性測定キット
Viability/Cytotoxicity Multiplex Assay Kit

CK17 同仁

検索

細胞傷害性を確認する際、生細胞のみ又は死細胞のみを指標とした評価では、データの信頼性が十分でない場合もあることから、測定原理の異なる複数の指標で評価することで実験の裏付けを行うケースが増えています。
本キットは、それぞれ指標となる Cell Counting Kit-8（CCK-8）と Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST（LDH Assay Kit）がセットになった製品です。

［測定原理］

品名Viability/Cytotoxicity Multiplex Assay Kit

16

容量500 tests

希望納入価格（￥） メーカーコード￥29,800
CK17

No.177(2021)

動画コンテンツのご案内
小社では試薬の選び方や技術に関するオンラインセミナーを随時開催しております。
下記は、お客様から特に好評だったセミナーです。キット操作のコツなども盛り込まれた内容になっておりますので、是非ご視聴ください。今後もオンラインセミナーを継続して行なってまいりますので、事前案内をご希望の方は右の案内から登録をご検討ください。

－試薬の選び方－細胞増殖・毒性試験
WST 法（Cell Counting Kit-8）を 用 い た
細胞増殖アッセイの基礎から、実験例までを幅広くご紹介します。

－試薬の選び方－

細胞内代謝測定
細胞内代謝測定で利用されている測定手法の比較、測定意義について実験例を交えてご紹介します。

－試薬の選び方－ミトコンドリア
ミトコンドリア解析法から特に重要な指標と測定意義について、実験例を交えてご紹介します。

－試薬の使い方－

1 サンプルで複数代謝指標を測定するコツ
細胞内代謝キットを用いたミトコンドリ
ア活性、酸化ストレスの複数指標を、一つのサンプルで効率よく測定する方法を紹介します。

グルコース取り込み検出キット
グルコース取り込み検出の目的から、従来測定法との比較・実験例を交え本製品の特徴を解説します。

リンク先は変更の可能性もございます。ご視聴できない場合には小社カスタマーサポート（info@dojindo.co.jp）
までお問合せください。

17No.177(2021)

ホームページアドレス
URL：https://www.dojindo.co.jp/
E-mail：info@dojindo.co.jp

No.17718

フリーファックス
フリーダイヤル
ドージンニュース No.177

0120-021557
0120-489548

9：00 ～ 17：00（ 受付時間：平日）
土・日・祝日は除く

令和 3 年 6 月 18 日発行

株式会社同仁化学研究所 DOJINDO LABORATORIES
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発行責任者 松野寛明 編集責任者 岩永竜弥 年４回発行 許可なくコピーを禁ず