カルボン酸を対象とした高感度LC-MS分析用誘導体化試薬

福岡大学薬学部教授

吉田 秀幸（薬品分析学研究室）

2024年5月28日
1

福岡大学薬学部 薬品分析学研究室• 構成員（R6年度）：教授2名、助教2名、大学院生0名、学部生11〜13名/4〜6年生• 研究の内容：生体に関連する物質の超高感度分析
健康・医療に貢献する分析化学• 研究の方法：「（多次元）HPLC」×「蛍光・MS・吸光度」、「分光学的手法」• 研究の対象：「生体成分、医薬品、食品、環境成分等」中の「有機低分子化合物」
2

近年の研究テーマ
赤色文字：分析対象等 青色文字：分析方法等

••

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•

•
•

A Pyridinium Derivatization Reagent for Highly Sensitive Detection of Poly(carboxylic acid)s Using Liquid Chromatography-Electrospray IonizationTandem Mass Spectrometry; J. Am. Soc. Mass Spectrom., 33 (2022) 1492.
Quantification of Casein in Baked Food Products by Selective Analysis of
Phosphorylated Peptides Using Fluorous Derivatization with Liquid
Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Method; Chem. Pharm.
Bull., 70 (2022) 19.
陽イオン選択性電極を用いたアセチルコリン関連化合物のセンシング; 分析化学,70 (2021) 261.
Multi-dimensional HPLC Analysis of Metabolic Related Chiral Amino Acids Method Development and Biological/Clinical Applications-;
Chromatography, 40 (2019) 1.
エキサイプレックス蛍光現象を利用する多環芳香族炭化水素のHPLC分離分析; 分析化学, 65 (2016) 729.
Liquid Chromatographic Determination of Microcystins in Water Samples
Following Pre-column Excimer Fluorescence Derivatization with 4-(1Pyrene)butanoic Acid Hydrazide; Anal. Chim. Acta, 755 (2012) 93.
3

近年の研究テーマ
赤色文字：分析対象等 青色文字：分析方法等•A Pyridinium Derivatization Reagent for Highly Sensitive Detection of Poly(carboxylic acid)s Using Liquid Chromatography-Electrospray IonizationTandem Mass Spectrometry; J. Am. Soc. Mass Spectrom., 33 (2022) 1492.

LC-ESI-MS/MSによるポリカルボン酸類の高感度検出のためのピリジニウム型試薬の開発

本技術に関する知的財産権• 発明の名称：• 出 願 番 号：
• 出 願 人：• 発 明 者：

質量分析用誘導体化試薬
特願 2022-079047学校法人 福岡大学
坂口 洋平、川末 慎葉、古賀 鈴依子、
吉田 秀幸、能田 均

4新技術の紹介
LC-MSにおける短鎖脂肪酸分析の問題点
 短鎖脂肪酸は極性が高く，LC-ESI-MSでの分析が困難→ 問題点を克服するために多くの誘導体化試薬が開発

Anal.Biochem., 537 (2017) 26.

Anal. Chem., 93 (2021) 10075.

Anal. Chem., 90 (2018) 3512.

Anal. Chem., 80 (2008) 9042.

しかし，これらの誘導体化試薬は複数のカルボキシ基を持つ化合物への有効性が確認されていない

本技術の概要 短鎖脂肪酸の高感度分析→ カルボキシ基の数に影響を受けることなく，ポリカルボン酸の高感度分析が可能な誘導体化試薬の開発

他のカルボン酸類への適用
5新技術の紹介
誘導体化試薬の設計〜3つのコンセプト〜(1) カルボキシ基との反応部位• アミノ基(カルボキシ基との反応部位)の構造(2) LC-ESI-MSにおける高感度化部位• 構造内永久電荷の有無• 化合物の疎水性(3) 高感度化部位と反応部位を結ぶリンカー• リンカーの構造(芳香環，アルキル鎖)+
Fatty acids
TPP-AEP
6

新技術の紹介
誘導体化試薬(1) カルボキシ基との反応部位

一級アミン，二級アミン(ピペリジン骨格)のカルボキシ基に対する反応性を比較+
10 µM マロン酸

MW : 99.17
1~100 mM 4-メチルピペリジン

MW : 99.17
10~100 mM シクロへキシルアミン

最大反応状態に達するアミン濃度の違いで、反応性の比較を行った

相対ピーク強度 (%)

求核性の高いピペリジン構造

カルボキシ基との高い反応性
アミン濃度 (mM)

S. Kawasue, et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom., 33 (2022) 1492.

7新技術の紹介
誘導体化試薬(2) LC-ESI-MSにおける高感度化部位
誘導体化試薬+100マロン酸

1,2-PP

相対ピーク強度
Relativepeak area(%)(%)

相対ピーク強度
Relative peak area(%)
(%)

酪 酸

酪 酸acid
Butyric

500

TMP-TBAPC100

TPP-TBAPC

マロン酸acidMalonic

5001,2-PP

TMP-TBAPC

永久電荷構造TPP-TBAPC+ 高い疎水性

1,2-PP

TMP-TBAPCTPP-TBAPC

ESI-MSにおける検出感度の向上
S. Kawasue, et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom., 33 (2022) 1492.

8新技術の紹介
誘導体化試薬(3) 高感度化部位と反応部位を結ぶリンカー+
1 nmol マロン酸

TPP-AEPTPP-TBAPC

2, 50 nmol 誘導体化試薬5050 nmolnmol Derivatization
誘導体化試薬 reagent
相対ピーク強度
Relativepeak area (%)(%)

相対ピーク強度Relative
peak area(%)(%)

22 nmol
nmol Derivatization
誘導体化試薬 reagent

100806040200TPP-AEP

TPP-TBAPC

立体障害を回避するリンカー

100806040200

TPP-AEPTPP-TBAPC

優れたポリラベル化率
S. Kawasue, et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom., 33 (2022) 1492.

9新技術の紹介
最適な誘導体化試薬• カルボキシ基との反応性が高いピペリジン構造を持つ

優れた誘導体化効率• 永久電荷を持つにも関わらず，疎水性が高い

優れたESI効率

TPP-AEP• 永久電荷構造とピペリジン構造の間にリンカーを導入することで立体障害を回避

優れたポリラベル化率
ピーク強度

1～4個のカルボキシ基を持つ化合物を完全にラベル化できることを確認しており，カルボキシ基の数に関わらず高感度分析が可能である。
01530
保持時間 (min)S. Kawasue, et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom., 33 (2022) 1492.

10新技術の紹介
短鎖脂肪酸の分析
測定対象
酢酸 (AA)

プロピオン酸 (PA)誘導体化操作
Sample酪酸 (BA)

1価カルボン酸

マロン酸 (MA)

コハク酸 (SA)クエン酸 (CA)↓
3価カルボン酸

2価カルボン酸
15 µL
5 µL
20 µL
50 µL
50 µL

IS in 95% DMSO
4-Dimethylaminopyridine in DMSO
50 mM TPP-AEP in DMSO
100 mM DMT-MM1) in 90% DMSOStand at 40˚C for 60 min
5 mM Ammonium bicarbonate in 50% CH3CN
200 µL
Reaction mixture
InjectintoLC-MS(5 µL)
Load toSPE
cartridge(Monospin CBA)
Wash with 5 mM Ammonium bicarbonate in 50% CH3CN 400 µL
Elute with 200 mM Ammonium formate in 50% CH3CN
150 µLEluate

必要に応じて，過剰試薬の除去を容易に行える

1) 4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride11

新技術の紹介
短鎖脂肪酸のSRMクロマトグラム
Derivatized AA 461.25>308.20 CE -40.0

Peak intensity

Derivatized PA 475.35>308.20 CE -41.0

親イオンを1価で検出

Derivatized BA 489.35>308.20 CE -45.0
Derivatized MA 453.40>308.20 CE -35.0
Derivatized SA 460.25>308.20 CE -40.0

親イオンを2価で検出- 親イオンを3価で検出15 min

Derivatized CA 465.55>308.20 CE -35.0

LC-MS条件

0Column : XSelectTM CSH C18

Gradient program : 1-5 min 20% B, 5-25 min 20%→80% B
25-30 min 20% B(50×2.1 mm i.d., 2.5 µm, Waters)
Mobile phases : A 0.1% ギ酸（水溶液）
B 0.1% ギ酸（アセトニトリル溶液）

Flow rate : 0.2 mL/min

Column temperature : 60˚C
Mass spectrometer : LCMS-8050 triple quadrupole (Shimadzu)

Ionization : ESI (+)
S. Kawasue, et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom., 33 (2022) 1492.

12新技術の紹介
果実中ポリカルボン酸の分析
測定対象（構造異性体or幾何異性体）Citric acid

Isocitric acid

Citraconic acid

Mesaconic acid

Itaconic acidcis-Aconitic acidtrans-Aconitic acid

Maleic acid

Fumaric acidMalonic acid

Succinic acid

Malic acid

Glutaric acid

Adipic acid

Pimelic acid

2-Hydroxyglutaric acid 3-Hydroxyglutaric acid

Tartaric acid

Citramalic acid

2-Hydroxymalonic acid

3-Hydroxy-3-methylglutaric acid13

新技術の紹介
果実中ポリカルボン酸の分析
2-Hydroxyglutaric acid

Malic acid

Tartaric acid

Citramalic acid
3-Hydroxyglutaric acid

2-Hydroxymalonic acidMalonic acidPeak intensity

Peak intensity

Glutaric acid

Succinic acid

Maleic acid

Mesaconic acid
Itaconic acid

Citraconic acid

3-Hydroxymethyl glutaric acid

Adipic acid

Fumaric acidcis, trans-aconitic acid

Pimeric acid

Citric acid
Isocitric acid

512.5

Citric acid(mg/kg)Isocitric acid(mg/kg)Fumaric acid(mg/kg)
Maleic acid(mg/kg)Aconitic acid(mg/kg)Succinic acid(mg/kg)
Tartaric acid(mg/kg)Malic acid(mg/kg)

20 min512.5AppleAAppleB

GrapeA

GrapeB

OrangeA

OrangeB

PineappleA

PineappleB

GrapefruitA

GrapefruitB

137

104

826

391

1990

2100

207

182

2260

2170

20.4

15.7

133

60.3

287

352

419

496.3

837

552

12.8

20.5

27.9

8.03

17.2

11.3

6.99

14.13.53

5.45

567

512

572

342

211

476

478

496

122

393

31.5

27.1

140

63.7

557.3

543

548

537

551

570

3.70

38.7

16.6

177

73.7

46.3

26.2

23.2

12.3

128

N.D.

N.D.

883

375

N.D.

N.D.

N.D.

N.D.

0.124

174

853

798

712

577

465

771

764

789

389

563

20 min

A：搾りたて果汁
B：市販濃縮還元飲料
川末ら, 第29回クロマトグラフィー
シンポジウム (2022年6月).
14新技術の紹介
長鎖脂肪酸の分析
測定対象

15

新技術の紹介
長鎖脂肪酸分析の前処理及び誘導体化
20 mg Residue (A part of Sample F)

Minced fish

7.5 mL

Hydrolysis

CHCl3 : CH3OH＝1 : 2Vortex for 1 min
Centrifuge at 800 g for 5 min
Supernatant

7 mL

CHCl35 mL

8% NaCl

2.5 mL

Vortex for 1 min
Centrifuge at 800 g for 5 min

Sample F or T
1 mM HCl in CH3CN20 μL

Vortex for 1 min

10 mM TPP-AEP in CH3CN

50 µL

Stand at 80ºC for 30 min

50 mM DMT-MM1) in 90% CH3CN 50 µL

3 M NaOH

2.5 mL4 M HCl

2.5 mL

Stand at 25ºC for 90 min
1% formic acid in H2O

Vortex for 2 min
CHCl3

2.5 mL

Reaction mixture
Load to SPE cartridge(MonoSpin C18, GL Sciences)

200 µL

Vortex for 1 min
Centrifuge at 2000 g for 5 min

Wash with 5 mM AF in 40% CH3CN

200 µL

Remove upper phase

Elute with 1% formic acidin 90% 2-propanol

200 µL

Remove upper phase
Evaporate and dry up
under reduced pressure
Residue

130 µL

Evaporate and dry up
under reduced pressure

Sample F (Free)
Residue

EluateInject into LC-MS/MS2 µL

Sample T (Total)

蘇木ら, 日本薬学会第143年会 (2023年3月). 16

新技術の紹介

ピーク強度

ピーク強度

ピーク強度

ピーク強度

長鎖脂肪酸のSRMクロマトグラム

EPA
アラキドン酸
DHA
リノレン酸
オレイン酸
アラキジン酸EPA
アラキドン酸
DHA
リノレン酸
オレイン酸
アラキジン酸蘇木ら, 日本薬学会第143年会 (2023年3月). 17

新技術の紹介
魚ミンチ中の脂肪酸蘇木ら, 第30回クロマトグラフィーシンポジウム (2023年6月). 18

従来技術とその問題点（１）
従来から普及しているカルボン酸類を対象としたLC-MS測定法の多くは、誘導体化を伴わないもので、・MSのネガティブイオン検出は感度不十分
・試料マトリクスに起因する精度の不備等の問題があり、内部標準物質を伴わない形でのLC-MSの定量結果に対して、絶対的な信頼性は得られていない。
19

従来技術とその問題点（２）誘導体化LC-MS法によるカルボン酸類の分析も世界各地で試みられているが、「世界標準」となる試薬・方法はいまだ開発されていない。

Anal.Biochem., 537 (2017) 26.

Anal. Chem., 93 (2021) 10075.

Anal. Chem., 90 (2018) 3512.

Anal. Chem., 80 (2008) 9042.

［日本］

［中国］

［中国］

［オランダ］

20

新技術の特徴・従来技術との比較• 永久電荷構造誘導体化でカルボン酸のポジティブイオン検出が可能となり、MS検出における感度向上につながった。
• 誘導体化部位にピペリジン構造を用いることで、カルボン酸との反応性が改善した。
• 誘導体化後の固相抽出で、マトリクス効果の回避に成功し、分析精度が向上した。
• 同概念に基づく他の官能基を対象とした新規MS用誘導体化試薬への展開が期待される。
21

想定される用途• 食品中カルボン酸分析への適用
脂肪酸、有機酸 等 → 品質評価、食の安心安全• 生体中カルボン酸分析への適用
TCA回路構成酸、アミノ酸 → 生体機能の解明• カルボン酸系医薬品分析への適用
NSAIDs 等 → 血中濃度の把握・追跡• 他の反応性官能基（アルコールやチオール等）を対象とした永久電荷構造誘導体化試薬の開発
22

実用化に向けた課題• 開発した試薬での食品（果実中の有機酸や魚類中の脂肪酸等）及び生体成分（代謝物等）の分析例は検討済み。医薬品分析へ展開中。
• 今後、対象をカルボキシ基に限定しない形での複数のLC-MS用永久電荷構造誘導体化試薬を新規に開発していく予定である。
• 多成分の網羅的計測への展開に向けて、複数の反応性官能基を対象とした新規LC-MS用誘導体化試薬を合成・評価する必要がある。
23

企業への期待• まだ合成・調達できていない新規誘導体化試薬については、企業との連携で解決したい。
• 有機化合物の精密合成や高度な試薬精製の技術を持つ企業との共同研究を希望している。
• カルボン酸系化合物のLC-MS分析を実施中の企業には、本技術の導入が有効と思われる。
• また、LCを用いて各種成分を計測している企業には、多方面での技術指導が可能と考える。
24

企業への貢献、PRポイント• 本分析技術は有機酸や脂肪酸等の高感度・高精度計測を可能とするため、食の安心安全に関係する企業に貢献できると考えている。
• 新規試薬の合成を通して、実用的なLC用誘導体化試薬の開発・評価、使用方法等に関するノウハウを提供できる。
• 本格導入にあたっての技術指導や合成試薬の提供だけでなく、LCが関連する広い分野での技術協力へ展開できる。
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本技術に関する知的財産権• 発明の名称：質量分析用誘導体化試薬• 出 願 番 号：特願 2022-079047• 出 願 人：学校法人 福岡大学
• 発 明 者：坂口 洋平、川末 慎葉、
古賀 鈴依子、吉田 秀幸、
能田 均
26産学連携の経歴• 2000年-2002年 製薬企業と共同研究*• 2001年-2002年 (財)福岡県産業･科学振興財団
テーマ探索･シーズ発掘事業に採択• 2004年-2004年 薬学研究奨励財団 研究助成金• 2011年-2012年 JST A-STEP事業に採択• 2012年-2013年 受託分析企業と共同研究*• 2022年-2023年 福岡県立農業高校と共同研究** 共同研究は、研究室として実施

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お問い合わせ先
福岡大学

研究推進部
産学官連携センター〒814-0180 福岡市城南区七隈8-19-1
ＴＥＬ 092-871-6631
e-mail sanchi@adm.fukuoka-u.ac.jp28