環境DNA分析を用いた河川調査における地点間隔設定の最適化に向けた検討
A STUDY OF THE APPROPRIATE SAMPLING INTERVAL FOR
RIVER SURVEYS USING ENVIRONMENTAL DNA ASSAY

北川哲郎1･村岡敬子2･天羽 淳3･堀江隆生4･岡本祐司5･中村圭吾6
Tetsuro KITAGAWA1, Keiko MURAOKA2, Jun AMOU3, Takao HORIE4,Yuji OKAMOTO5 and Keigo NAKAMURA6
1非会員

博（農） 国立研究開発法人 土木研究所 水環境研究グループ（現：株式会社建設環境研究所 環境1部・環境DNA室）
2正会員 国立研究開発法人 土木研究所 水環境研究グループ
3非会員 国土交通省 水管理・国土保全局 河川環境課
4非会員 国土交通省 中部地方整備局 三重河川国道事務所 調査課
5非会員 国土交通省 中部地方整備局 三重河川国道事務所 調査課（現：国土交通省 中部地方整備局 河川環境課）
6正会員 博（工） 国立研究開発法人 土木研究所 水環境研究グループ※各著者の所属は原稿投稿時点に基づく

河川水辺の国勢調査（水国調査）

2

水国調査：国土交通省が平成２年から継続実施している日本最大規模の環境調査事業
成果は日常の河川管理や多自然川づくりから科学研究まで幅広く活用される① 多くの河川･ダムでの定期的な直接採捕等に要する経済･労働コスト【課題】② 各河川の調査地点数が少なく、データ密度の向上（地点数増加）

eDNA分析技術に関する流域生態チームの取り組み
区分

2017年度

2018年度

2019年度流域生態ﾁｰﾑ
独自研究

2020年度3

2021年度～

2017年度～ 継続実施中

民間ｺﾝｻﾙﾀﾝﾄ
共同研究2018年度～2021年度

2022年度～
新規枠組みで継続

関東技術事務所
共同研究
国土交通省
水国ﾃｰﾏ調査2018～2021年度
情報提供・技術協力

2019年9月～2025年頃予定【各取り組みでの主な検討項目】

独自研究：eＤＮＡ分析を用いた生物調査のマニュアル化に向けた技術的な配慮事項
民間ｺﾝｻﾙﾀﾝﾄ(共同)： eＤＮＡ分析を活用した、目的に応じた河川調査計画の立案方法☞2022年度からは「民間ｺﾝｻﾙﾀﾝﾄ」「農業・食品産業技術総合研究機構」「港湾空港技術研究所」「土木研究所」による新たな枠組みで共同研究を発展継続
関東技術(共同)：技術事務所が使えるeＤＮＡ調査マニュアルの作成とサンプル保管方法
水国ﾃｰﾏ調査：魚類調査での直接採捕とeＤＮＡ分析の併用に向けた課題抽出・対応方針

環境DNA（eDNA）分析技術

4①特定分類群のＤＮＡ情報を網羅的に検出するﾒﾀﾊﾞｰｺｰﾃﾞｨﾝｸﾞ解析（ＭＢ解析）？

環境水中のＤＮＡ含有物を採取・分析②目的生物のＤＮＡ情報を特異的に増幅する種特異的解析●採水物の分析から生物の情報が得られる 効率的かつ安価な手法として注目●技術的進展によって とりわけ魚類については実用段階に近づいている？
●環境DNA分析の活用で 水国の課題解消＋精度高い環境評価 ができる可能性

eDNA分析の活用に関するテーマ調査

5（http://www.nilim.go.jp/lab/fbg/ksnkankyo/kankyoDNA_200110.pdf）① 現状の技術水準で魚類の確認がどの程度まで可能？

【研究目的】 ② 解析結果から読み取れる調査計画時の留意事項は？
③ ＭＢ解析の河川調査に対する利用性はどのくらい？

昨年度までに得られた主な調査・検討結果

6① 北川哲郎，村岡敬子，山田拓也，中村圭吾（2020）河川水辺の国勢調査（魚類）における環境DNAメタバーコーディング解析の試行事例分析．河川技術論文集，26: 319–324．
☞ 環境DNA分析では総確認種(taxa)の76.3 %水国確認種(taxa)の67.2%が検出される☞ 環境DNA分析で採捕に匹敵する種(taxa)数のリストが得られる☞ 感潮域での調査では、潮汐の影響を加味した調査計画が必要② 北川哲郎，村岡敬子，天野 聡，岡本祐司，中村圭吾（2021）河道内で検出された海産魚類を指標とした環境DNA含有物質の有効検出範囲の推定．河川技術論文集，27: 295–300．
☞ 河道内での海産魚類のeDNA含有物質の検出距離は >200－5,600 m☞ 全体の60.8 %は流下範囲が> 200 mで > 1,600 mまでが99 % 信頼区間※※Smirnov-Grubbs‘ test, p<0.01に含まれる☞ MB解析での検出範囲は1,600 m程度で、eDNA含有物質の供給量が少ない場合には200 m程度で未検出、供給量が多い場合や流況次第では5,000 m以上に達し得ると示唆

Ｒ２年度調査・検討項目
Ⅰ．分析検体の取り扱い条件の標準化に関する検討
使用検体：全国１０河川７ダムから収集された河川・ダム水199検体

検討内容：標準手法として適切なサンプリング・一次処理法の検討

Ⅱ．魚類の生態に応じた検出特性に関する検討
ⅰ．広域調査使用検体：全国６河川５ダムから収集された河川・ダム水147検体 / 水国調査結果
検討内容：採捕された漁法・環境の別に魚類を類型化し、eDNA検出結果と照合
魚類調査に対する定期水質調査地点の活用性を検討

Ⅲ．環境DNAの検出傾向と水質特性に関する検討
使用検体：全国１０河川７ダムから収集された河川・ダム水112検体
検討内容：採水地点の水質特性とeDNA検出結果と照合

Ⅳ．環境DNA含有物質の有効検出範囲に関する調査・検討
調 査 地：三重県雲出川 国土交通省大臣直轄区間 0.0～16.2km区間
調査内容：区間内から200m間隔で河川水をサンプリングしMB解析を実施
検討内容：魚類相の変化や代表種の検出傾向から有効範囲を推定

7

Ｒ２年度調査

8
流下範囲検討のねらい
流況・環境・水質などに川の中の環境DNA含有物質はよって変化するとされるが、どこまで流れている？
実証的な研究例数は少ない

山口ほか（2018）：小河川➡約80 m下流までに50%程度へ減少➡eDNA含有物質の到達距離は1～2km
Nakagawa et al.(2018)：小河川中・上流域➡直接採捕とよく相関する魚類リストが得られるのは約6km下流のeDNAリスト
Pont et al. (2019)：水理学的検討➡中規模河川での流下範囲は数km程度➡大河川では10～100 km程度に達する？

北川ほか（2021）：中規模河川➡海産魚のeDNAの流下傾向から、中・下流域での検出範囲は1.6km程度
etc・・・① 流下方向に対する高密度なデータ取得に基づく実証的検討【ねらい】② 流況に応じた流下範囲の延長の変化に関する検討

調査を実施した河川➢ 三重県津市を流れ伊勢湾に注ぐ雲出川➢ 雲出古川、支川を除く国土交通省直轄区間16.2 km➢ 河口から200 m間隔で採水（82サンプル，流路右岸側から採水）➢ 2020年11月2～6日の期間中に実施（水国調査と同一期間）

9調査実施時の環境

10

水温（℃）
ｾｸﾞﾒﾝﾄ318

濁度（NTU)pH

ｾｸﾞﾒﾝﾄ2ｾｸﾞﾒﾝﾄ1

ｾｸﾞﾒﾝﾄ3

ｾｸﾞﾒﾝﾄ1

100
平均河床高（T.P.m, 第1軸[左]）1515

流速（cm/s, 第2軸[右]）1212

ｾｸﾞﾒﾝﾄ21850

996

河口からの距離（km）

016 - 1715 - 16

14 - 15

13 - 1412 - 13

11 - 1210 - 11

9 - 10

8-9

7-8

6-7

5-6

4-5

3-4

2-3

1-2-500-1

16 - 1715 - 16

14 - 15

13 - 1412 - 13

11 - 1210 - 119 - 108-97-86-75-6-34-503-402-331-230-16

河口からの距離（km）➢ MB解析の解析精度ならびに読み取りリード数と降水ないし水質項目に見られた傾向との直接的な関連性は検出されず（11月2日にのみ降水を確認）➢ 各採水地点における流速の全区間平均値は9.8 ± 19.1 cm / sであった➢ 調査地区全体の平均勾配は約1 / 900で、勾配の変化と流速の変化傾向は一致せず。本研究では流心部から離れた岸際の採水地点で流速を測定しており，水際環境や流路形状といった，勾配以外の要因から強い影響を受けた結果を反映した可能性

環境DNA MB解析フロー（～1st PCR）
１．採11水採 水 量：新品のポリエチレン製容器へ表層水を1 ℓ（+予備1 ℓ ）ずつ採水

２．運搬

DNA保存処理：各検体（+陰性検体）終濃度0.01 % で塩化ベンザルコニウム溶液を添加保管・運搬：クーラーボックスで保冷、採水後48時間以内に濾過作業

３．濾過作業・保管
使用濾紙：Ⅰ・Ⅱ・Ⅲ・Ⅳ試料：メンブレンフィルター（0.45μm, 47 mm, ADVANTEC 社）
Ⅰ・Ⅲ試料：メンブレンフィルター_アイソポア（0.6μm, 47 mm, Merck 社）
濾過作業：真空ポンプを利用した陰圧濾過（目詰まり時も濾紙を交換し1 ℓ ぶんを濾過）
保管：プラスチック製ケースに小分けし、-80 ℃で保管

４．DNAの抽出抽精
検出：Dneasy Blood & Tissue Kit（Qiagen 社）
製：One Step_PCR Inhibitor Removal Kit（ZYMO Research 社）
量：Qbit Fluorometer（Thermo Fisher Scientific 社）

５．1stPCR
プレミックス試薬：Ex Taq Hot Start Version（TaKaRa 社）
プライマーセット：MiFish-U、MiFish-U2、MiFish-E、MiFish-ULを混合して使用➡混合比は２：１：１：０.５➡プライマーの中間にワイルドカード（N）を6基程度追加
反復試験：１検体につき8反復区を設け、反応液を混合・調製した溶液を2ndPCR

環境DNA MB解析フロー(～リスト作成)
６．1st PCR溶液の精製
精製：AMPure XP(BECKMAN COULTER)
濃度測定：Synergy H1 (Bio Tek)、QuantiFluor dsDNA

System (Promega)

７．ライブラリ作成（定量・品質確認）
作
成：2 step tailed PCR法
濃度測定：Synergy H1、QuantiFluor dsDNA System
品質確認：Fragment Analyzer、dsDNA 915 Regent Kit (Advanced Analytical Technologies)

８．シーケンス
解析条件：MiSeq（Reagent Kit v3; 2x300 bp）

９．リードの抽出
抽出：F-プライマと起点一致する配列 fastaq_barcode_splitter (Fastex toolkit, 0.0.14)

１０．ノイズ除去
ソ ート：群衆解析ツール(Qiime 2.0; dada2)でプライマ配列、3’末端120bp、ノイズ除去
系統推定：データベース (MitoFish、Miya et al [2015])と照合

１１．魚類名の判別➡リスト化
Blast 処理：DDBJ、NCBI
名称決定：配列の一致率が最大を示したtaxonを採用。複数一致の場合は分類群止め12

解析結果：検出ＯＴＵｓ

13➢ 魚類のDNA情報は 79 / 82 検体から検出※ 11/3, 4の陰性検体から微量のDNAを検出➢ 魚類との相同性98％ 以上を示した 364 OTU sを検出（総検出：998 OTUs）➡結合リード数は12,388ー24,424 (19,246.5±2438.3; 最小-最大 [平均±標準偏差])：解析不調➢ 陰性検体で検出された8 OTUsを除く356 OTUsに基づき149 taxaに整理➡海産/汽水性魚類：７７ taxa，

回遊性魚類：１８ taxa，

淡水性魚類

海産/汽水性魚類

回遊性魚類

-Taxa

淡水性魚類：４６ taxa，不明：

８ taxa
0%20%

40%

60%

80%

100%

環境DNA含有物質の流下範囲：直接採捕との相関性からの推定 14
着眼点
直接採捕によって得られた個体のリストと200 m間隔のeDNA検出リストの相関係数行列を作成することで、両者が最もよく相関する区間を推定可能
検証方法・条件設定① 河川外由来である可能性が高いOTUを除外➢ 生理的適性から雲出川に生息し得ない魚類➢ 外洋性魚類・潮留堰の上流で検出された海水魚類② 魚類の在・不在情報からピアソンの積率相関係数を算出し行列を作成③ 魚類調査４地区のリストとそれぞれ相関係数が最大に達する範囲を特定

相関係数行列の展開図

解析結果：魚類の検出状況

15■：eDNA検出Taxon，■：水国確認種数←感潮区間

60：eDNA解析不調

40200Taxa

0km

地区A 1km

2km

3km

4km

5 地区Bkm

6km

7km

8km

*河川外由来と推定しeDNA集計から除外：①外洋性魚類、②純淡水域の海産魚類、③生理機能から雲出川に生息し得ない魚類、④国内での出現記録がない外来魚類

6040

20

09km

10 地区Ckm

11km

距

直 接 採 捕：16～22種
eDNA 検出：23～59 taxa

13 地区Dkm

12km

14km

15km

16km

離全体としてeDNA検出数が超過

採水の頻度と検出taxa数の関連性

16➢ 採水頻度（インターバル）に伴う魚類の検出確率の変化について
純淡水区間で検出された64 taxaの検出状況に基づき推定➢ 純淡水区間（3.4～16.2 km, 64 / 65地点*）で得られた魚類リスト群から任意のインターバルに応じた数のリストを無作為抽出して期待値を算出➡使用リストの抽出は疑似乱数**に基づき100回試行
Taxa* １地点欠測（4.6 km）** Microsoft Excel 2019, rand関数を使用

Taxa

706060y = 8.1523ln(x) + 31.758
R² = 0.9918

505040403030eDNA分析: 64地点平均検出taxon数（29.9 種）

2020

水国調査: ３地点平均確認種数（19.3 種）

1010000.0

1.0

2.0

3.0

4.0

インターバル (km)

5.0

6.00

102030405060

検体数⚫ eDNA分析による地区あたりのtaxa検出の期待値は直接採捕より大きい⚫ 検体数あたりのTaxaの増加率は 11 地点（1 地点 / 1,200 m）以上で鈍化

採水頻度と検出taxa数の関連性

1780.5±4.0 % (63.0～87.7 %)51.5±2.6 taxa (41 ～ 57 taxa)% Taxa
100%
80%
60%

検体数:
65 33

40%

2216131198765432
y = 0.0151x2 - 0.1544x + 0.9873
R² = 0.971

20%
0%
0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

インターバル (km)検出頻度

10 taxa

20 taxa

30 taxa

40 taxa

50 taxa

60 taxa51.5±2.6 taxaの検出を期待できる範囲≒検出頻度が3 / 64 (4.7 %)程度のtaxaを安定検出☞本川環境で頻出(直接採捕)する種を網羅
アカザ
ウキゴリ
オイカワ
カマツカ
カワムツ
ギギ
コイ
コクチバス
スゴモロコ類
ニゴイ類
ニホンウナギヨシノボリ属ナマズ
ボウズハゼ
チチブ属1 (チチ)チチブ属2 (ヌマ)
ヤリタナゴ
ニシシマドジョウ
ナマズ属
アブラハヤ
ボラ
ムギツク
タカハヤ
スミウキゴリアユ
カネヒラ
サクラマス類
カマツカ属
ドジョウ
オオクチバス
イトモロコ
ヌマムツ
フナ属
ゴクラクハゼ
ブルーギル
カワヨシノボリ
カワヤツメ属ミナミメダカ
ウグイ
モツゴ
カムルチー
スナヤツメ類
タモロコ
タモロコ属
ハス
マハゼ
スズキ
アブラボテ
シマヨシノボリ
ビワヒガイ
ホトケドジョウ
カマキリ
カワアナゴ
サケ属
ドンコ
ネコギギ
ワカサギ
イワナ属
カダヤシ
カワバタモロコ
クロダイ
スジシマドジョウ種群
ソウギョ
ドジョウ属

706050403020
100

Taxa

( ■：直接採捕での確認あり，□：eDNA検出のみ，：別名で検出されたtaxaの多型である可能性)

検出期待値が 80 %程度に達する1,200 m間隔での採水を想定したケースで①分布範囲の狭いtaxa、②資源量の少ないtaxa、の検出率が高まると判断

魚類リスト間の相関係数（採捕確認－eDNA検出）

18●：地区A，●：地区B，●：地区C，●：地区D
0.7

採捕

採捕

採捕

採捕

0.6

ピアソン積率相関係数0.5

y = -0.0036x2 + 0.0712x + 0.2023

R² = 0.7027

0.40.3y = -0.0026x2 + 0.0539x + 0.1236

R² = 0.6192

0.2

y = -0.0022x2 + 0.0317x + 0.1929

0.1

R² = 0.3753

0-0.1

y = 0.0013x2 - 0.0305x + 0.0138

R² = 0.5013
-0.2
-0.3

024

6810121416

河口からの距離(km）感潮区間の地区Aは純淡水域とは負の相関

汽水/海産性魚類の優占

相関係数の変動幅が最大となったのは地区C

最多数の淡水魚類を検出

環境DNA含有物質の流下範囲：相関係数に基づく推定
表 採捕地区の魚類リストに対して高い正の相関を示したeDNA魚類リストの検出地点

地区A（感潮区間）

地区B地区C
地区D

調査区間

0.5～1.5 km
4.8～6.2 km(セグメント,河川型)(2-2, Bc型)
1/ 1,300(2-1, Bc型)

相関値
最大※

1.8 km(-0.3 km)*
4.0 km(0.8 km)9.8
1 / 1,000
8.6 km～11.1 km (2-1, Bc-Bb型) (1.2 km)
13.2～14.8 km

1 / 500(2-1, Bb型)※: 相関係数が最大に達するリストが得られた採水地点＊:（調査地区末端からの距離）10.4 km(2.8 km)3.0

最大相関値を示す下流地点までの距離

調査地区

勾配19

地区D

2.52.01.5地区C1.0

地区B0.5y = 1556.4x - 0.3416
R² = 0.9988

0.0

地区A-0.5
00.00050.001
勾配0.00150.002

図 水国調査地区の勾配と各地区で得られた魚類リストに対して最も高い相関係数を示すリストが得られたMB
解析（採水）地点までの距離➢ 魚類相とeDNA検出リストの相関係数は0.8～2.3 km程度下流の地点で最大➢ 最大相関値を示した下流地点までの距離は各地区の勾配と強い正相関➢ 感潮区間では潮汐による海水の流入の影響を受けた可能性

推定される環境DNA含有物質の有効検出範囲

20① 魚類リストとeDNA検出リストとの相関性に基づく推定（本研究）➢ 魚類相とeDNA検出リストの相関係数は0.8～2.3 km程度下流の地点で最大➢ 最大相関値を示す下流地点までの距離は各地区の勾配と強い正相関② 河川外由来の魚類（OTUs）の検出傾向に基づく推定 (北川ほか，2021)➢ 全体の60.8 %は流下範囲が> 200 mで > 1,600 mまでが99 % 信頼区間※に含まれる※Smirnov-Grubbs‘ test, p<0.01➢ MB解析での検出範囲は1,600 m程度と推定➡eDNA含有物質の供給量や流況次第では、5,000 m以上に達する可能性

有効検出範囲の検証
OTU検出区間の頻度※雲出川河川維持管理計画の値に基づき算出

勾配に関連するパラメータの活用によって有効検出範囲の推定式が得られる可能性

河川外OTUsに基づく推定範囲

距離 (km)

河川外OTUsの検出傾向に基づく推定範囲に調査区間の平均勾配※を割り当てると、相関係数の変化に基づく推定で得られた流況と検出範囲の変化に関する関係式とほぼ整合

雲雲雲4雲雲雲3雲雲雲2雲雲雲1勾配